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—— 原理 与方法 

METABOLIC ENGINEERING 

Principles and Methodologies 



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[美] Gregory N . Stephanopomos 

[美] Aristos A. Aristidou 著 

[丹 麦] Jens Nielsen 
赵学明 白冬梅 等译 





Principles and Methodologies 




中科 院植物 fip 图书馆 

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代 谢 




—— 原理 与方法 

METABOLIC ENGINEERING 
— Principles and Methodologies 



美] Gregory N . Stephanopoulos 

[ 美 ] Aristos A . Aristidou 著 

[丹 麦] Jens Nielsen 
赵学明 白冬梅 等译 



化^ 工夂 * 版 fi 

• 北 京. 



27831 



(京) 新登字 039 号 



图书在 版编目 (CIP) 数据 

代谢 工程: 原理 与方法 / [美] 斯蒂芬 那保罗 (StephanopoulosG.N.), 
[美] 阿里 斯泰道 (Aristidou A.A.), [丹 麦] 尼尔森 (Nielsen J.) 著; 
赵, 明, 白冬梅 等译. 一 北京: 化学 工业出 版社, 2003.12 

书名 原文: Metabolic Engineering ― Principles and Methodologies 

ISBN 7-5025-4568-9 

I. 代… n. ①斯… ②阿… ③尼… ④赵… ⑤白… m. 代 谢-生 物工程 IV.Q591 

中 国版本 图书馆 CIP 数 据核字 (2003) 第 093746 号 

METABOLIC ENGINEERING— Principles and Methodologies/ 
by Gregory N . Stephanopoulos , Aristos A. Aristidou, Jens Nielsen 
ISBN 0-12-666260-6 
Copyright © 1998 by Academic Press. 

Translation Copyright @ 2003 by Chemical Industry Press. All rights reserved . 

本书中 文简体 字版由 Academic Press 授 权化学 工业出 版社独 家出版 发行。 
未经 出版者 许可, 不得 以任何 方式复 制或抄 袭本书 的任何 部分。 

北京市 版权局 著作权 合同登 记号: 01-2001-4512 



国外名 校名著 
代 谢工程 
—— 原理 与方法 
METABOLIC ENGINEERING 

Principles and Methodologies 

[美] Gregory N . Stephanopoulos 

[美] Aristos A. Aristidou 著 

[丹 麦] Jens Nielsen 
赵学明 白冬梅 等译 
责任 编辑: 路文敏 
文字 编辑: 丁建华 
责任 校对: 郑 捷 
封面 设计: 郑小红 

化学 工业出 版社出 版发行 
(北 京市 朝阳区 惠新里 3 号 邮 政编码 100029) 
发行 电话: (010) 64982530 
http: www . dp . com . cn 

新华 书店北 京发行 所经销 
化学工 业出版 社印刷 厂印刷 
三 河市东 柳装订 厂装订 
开本 787 毫米 X 1092 毫米 1/16 印张 28 字数 685 千字 
2003 年 12 月第 1 版 2003 年 12 月 北京第 1 次印刷 
ISBN 7-5025-4568-9/G-1237 
定 价: 39.00 元 



版 权所有 违 者必究 

该 书如有 缺页、 倒页、 脱 页者, 本社发 行部负 责退换 



原 序 



代谢工 程是关 于代谢 途径的 分析与 修饰的 科学。 该领 域出现 于过去 10 年, 并由 来自应 

用分子 生物学 和反应 工程的 技术所 驱动, 目前正 变成生 物学、 生 物化学 工程、 细胞生 物学和 
应用微 生物学 等许多 学科研 究活动 的一个 焦点。 虽 然途径 操作的 概念以 前已讨 论过, 但代谢 

工程 的远景 以独特 的方式 作为一 个明确 定义的 学科是 1991 年由 Bailey 首先提 出的, 之后很 
快就被 生物工 程师和 生命科 学家所 接受, 他 们看到 捕获由 基因组 学研究 所产生 的序列 和其它 
信息 的潜力 方面所 存在的 机遇。 

1993 年, 我们 首先在 MIT (美 国麻 省理工 学院) 开 设的一 门课中 对我们 的学生 传授表 
达 了代谢 工程的 基本概 念及其 引起的 兴奋与 激动。 这种 试验在 1995 年、 1997 年又重 复进行 
几次。 在 那时, 一个 明确的 教学大 纲和一 套教学 笔记作 为这些 奉献的 结果出 现了。 在 丹麦工 
业大学 (DTU) 有一个 类似的 发展: 在本 科生和 研究生 的生物 化学工 程课程 中代谢 工程已 
成为一 个中心 主题。 19% 年首次 正式提 供了关 于代谢 工程的 标准的 一学期 课程。 对 代谢工 
程 增长着 的兴趣 及分享 该课程 教学材 料的需 求导致 我们确 定写这 本书。 在这样 做的过 程中, 
我们试 图对薛 反应途 径的分 析构建 一个定 量生物 化学的 框架。 在 这种意 义上, 本书反 映了焦 
点 从设备 向单个 细胞的 变换, 焦点集 中到细 胞生物 化学功 能的阐 明与操 作上。 因此, 这本教 
科 书可向 研究生 和高年 级本科 生提供 一门代 谢工程 课程以 补充生 物化学 工程领 域目前 开出的 
课程。 

本 书初稿 曾用于 MIT 和 DTU 的代 谢工程 教学, 也 曾用于 MIT 的 暑期代 谢工程 课程。 
本 书的内 容可覆 盖一个 学期而 没有先 修特定 课程的 要求, 当然先 修一些 生物化 学人门 性的课 
程 是有帮 助的。 该学期 的第一 个四分 之一从 生物化 学书中 指定了 一些阅 读材料 以补充 本书的 
第一 部分。 有 助于理 解基本 概念的 习题集 将在下 面列出 的网页 上定期 公布。 虽 然本书 的焦点 
是 代谢, 但 途径分 析的概 念是广 泛的, 因 而对其 它类型 的反应 系列一 般都是 可以应 用的, 这 
包括 蛋白质 表达、 翻 译后修 饰或信 号转导 途径等 过程的 分析。 

写一本 仍在形 成中的 学科方 面的书 是一种 挑战, 接受 这种挑 战也就 增加了 责任。 为此, 
我们设 定的目 标是: 详 细说明 对于途 径设计 和分析 处于中 心位置 的核心 原理, 同时用 从最近 
研 究中得 出的方 法加以 补充。 我们期 待着这 些方法 进一步 发展, 并 希望这 本书在 "催 化" 这 
种活 动中起 作用。 实现 这些方 法的软 件可在 相关的 网页上 找到。 此外, 本书中 的数学 复杂性 
已 经保持 到一个 最低的 水平, 并在可 能的地 方提供 了背景 材料, 以辅 助尽可 能少地 采用数 
学。 我 们知道 这个任 务的挑 战性以 及满足 读者范 围广泛 的各个 层面的 困难。 我 们鼓励 读者继 
续对 本书的 评审, 而不要 被任何 暂时的 困难所 阻挡。 

我们要 感谢很 多人, 其 中一些 对本书 做出过 直接的 贡献, 一 些在该 任务的 计划及 执行中 
提供了 间接的 帮助。 首先, 我 们对我 们学生 的无穷 的干劲 及高度 的创新 性表示 感谢, 特别 
是: Maria Klapa 对代谢 通量分 析深入 细致的 核查; Troy Simpson 的研 究提供 了复杂 途径分 
析的 基础。 同样, 我 们感谢 Martin Bastian Pedersen 对很 多图的 绘制; Christian MuUer, 
Susanne Sloth Larsen, Birgitte Karsbol 和 Kristen Nielsen 在最 后确定 初稿中 提供的 帮助。 
我们 感谢我 们的同 事们, 特 别是: Tony Sinskey 对代 谢工程 的无限 广阔可 能性的 热情; Sue 



Harrison 和 EduardoAgosin 所作的 最具建 设性的 评论。 最后, 我们感 谢我们 的合作 者和朋 
友, 特另 1] 是: Barry Buckland , Bernhard Palsson , John Villadsen , Maish Yarmush 和 D. 
Ramkrishna, 对他 们的洞 察力和 对许多 重要问 题坚定 不移的 支持。 

Gregory N . Stephanopoulos 
Aristos A.Aristidou 
Jens Nielsen 



中 译本序 



五年 以前, 我们的 教科书 "代 谢工程 —— 原理和 方法" 出 版了。 从那 时起, 我们 的著作 
成 功地用 于国际 上若干 大学的 教学, 而且两 年以前 该书已 译成日 文出版 发行。 对这部 著作的 
兴趣 很可能 是由于 工业生 物技术 的迅速 发展。 在 工业生 物技术 领域, 通 过对特 定细胞 工厂引 
人定向 基因修 饰而进 行的新 的生物 过程的 开发正 被越来 越多的 世界一 流发酵 公司所 应用。 随 
着 中国生 物技术 的迅速 发展及 中国大 学教育 标准的 提高, 中国已 使自己 处于工 业生物 技术领 
域一个 主要的 国际参 赛者的 位置。 在 这种情 况下, 出版一 本中文 代谢工 程的教 科书是 非常及 

时的。 我 代表本 书的共 同作者 Gregory N . Stephanopoulos 教授和 Aristos A.Aristidou 博士 
谨对选 用我们 的著作 译成中 文深表 感激。 我们感 谢本书 译者们 所做的 贡献及 付出的 辛勤劳 
动。 我们希 望本书 中译本 对中国 的新一 代代谢 工程工 作者能 起鼓舞 和激励 作用。 



Jens Nielsen 



2003 年 9 月 16 日 



译 序 



人们利 用微生 物生产 有用产 品已有 很长的 历史, 但自 然界的 微生物 只能生 产微量 产品而 
且 所需的 生产条 件很难 在工业 条件下 实现。 因此需 要对这 些微生 物菌种 进行改 进才能 满足工 
业 生产的 需要。 五十多 年来, 人们 用随机 诱变及 筛选的 方法进 行菌种 改进, 已在抗 生素、 氣 
基酸、 有 机酸等 工业生 产上取 得很大 进展。 代价 是随机 性大, 需要 漫长的 时间, 而且 生产能 
力低, 往往在 经济上 竞争不 过化学 路线, 因 而远远 不能满 足工业 生产的 需要。 原因是 我们对 
细胞的 生理特 性理解 不深, 不能 定向施 加必要 的遗传 变化和 (或) 环境 条件来 改进细 胞的性 

能。 20 世纪 80 年代发 展起来 的重组 技术引 起了人 们通过 引人赋 有所希 望性质 的基因 进行菌 
种定向 改进的 兴趣; 具有上 百年历 史的化 学工程 技术, 在 对从分 子水平 到整个 生产过 程乃至 
生态环 境复杂 系统分 析与集 成中, 积 累了丰 富的理 论知识 和实践 经验。 由于发 展的需 要及支 
撑 技术提 供的可 能性, 于 是诞生 了一门 新学科 ——代谢 工程。 

代谢 工程是 应用分 子生物 学与反 应工程 技术不 断发展 融合的 结果, 是 对细胞 (包 括微生 
物、 植物、 动物乃 至人体 细胞) 内 代谢途 径网络 系统分 析的基 础上进 行定向 地有目 的地改 
变, 以更 好地理 解和利 用细胞 代谢进 行化学 转化、 能量 转导和 超分子 组装。 代 谢工程 可在细 
胞与 分子水 平上认 识和改 造细胞 过程, 其不 仅在解 释细胞 生理特 性上具 有重要 的科学 意义, 

而且其 潜在的 应用跨 越了生 物技术 的全部 领域, 主要 包括: (1) 异源 蛋白的 生产; (2) 扩大 
底 物利用 范围; (3) 生产原 来不存 在的新 物质; (4) 对环 境有害 物质的 降解; (5) 提 高菌体 
对环境 的适应 能力; (6) 阻断或 降低副 产物的 生成; (7) 代谢产 品生产 速率和 生产能 力的提 
高; (8) 植 物代谢 工程; (9) 动 物代谢 工程; (10) 人体和 组织代 谢工程 —— 新药发 现及人 
类疾 病诊断 和基因 治疗。 

1991 年美 国加州 理工学 院和麻 省理工 学院化 学工程 系教授 Bailey 和 Stephanopoulos 等 
在 同一期 《Science》 上分另 (J 发 表了: "Toward a Science of Metabolic Engineering" "Net- 
work Rigidity and Metabolic Engineering in Metabolite Overproduction" 两 篇重要 文章, 标 
志 着代谢 工程新 学科的 诞生。 1993 年 Cameron 等 发表了 "Cellular and Metabolic Engineer- 
ing" 的长 篇综述 文章, 举出了 100 多 个细胞 和代谢 工程的 实例。 1995 年 Bailey 又 发表了 
"Chemical Engineering of Cellular Processes" 的长篇 文章, 详细 讨论了 生物网 络工程 及代谢 
工程。 1996 年 召开了 第一次 国际代 谢工程 会议。 此后, 国际代 谢工程 会议定 期两年 举行一 
次。 1998 年本 书作者 Stephanopoulos G. , Aristidou A. 及 Nielsen J. 出版了 国际上 第一部 
代谢 工程教 科书。 1999 年以 Bailey 教授为 主编的 《Metabolic Engineering) 刊物 正式出 
版。 此后, 代 谢工程 研究及 工业实 践发展 迅速, 大 量研究 论文及 综述文 章不断 发表, 这可从 
本书 两位作 者近两 年的综 述文章 看到。 Stephanopoulos 教授 的文章 包括: "After a decade of 
progress , an expanded role for metabolic engineering" (Adv. Biochem . Eng. , 2001), "How 
to make a superoor cell" ( Science , 2001), "Metabolic engineering as an integrating plant- 
form for strain development" (Cur. Opi. Biotech. , 2001), "Metabolic engineering : a new 
frontier of chemical reaction engineering" (Chem.Eng.Sci. , 2002), "Metabolic engineering 
by genome shuffling" (Nature Biotech. , 2002 ) o Nielsen 教授的 文章: "Metabolic engineer- 



ing" (Appl. Microbiol. Biotechnol . , 2001), "An expanded role for microbial physiology in 
metabolic engineering and functional genomics : moving toward systems biology" (FEMS 
Yeast Research , 2002), "A functional genomics approach using metabolomics and in silico 
pathway analysis" (Biotechnol. Bioeng. , 2002)。 他们的 文章总 结了代 谢工程 的研究 进展, 
进 一步阐 明了后 基因组 时代代 谢工程 的任务 及研究 方法。 

代谢 工程诞 生仅十 余年, 引 起了全 世界学 术界、 企业 界及政 府部门 的广泛 重视。 1995 
年底, 美 国科学 技术政 策办公 室下属 的生物 技术分 委员会 发布了 "21 世 纪的生 物技术 —— 
新 展望" 报告, 确定了 若干优 先研究 领域, 代 谢工程 为其中 之一, 并成 立了由 国家科 技专家 
组成的 "代谢 工程工 作组" (MEWG), 专门 协调美 国各部 委以促 进代谢 工程的 研究。 该工 
作组通 过组织 美国八 个部委 (基 金委、 能 源部、 农 业部、 国 防部、 国家 卫生研 究院、 国家标 
准局、 国家环 保局、 国家 航空宇 航局) 共同 资助代 谢工程 研究。 从 1998〜2003 年已 连续资 
助五年 代谢工 程的科 学基础 研究, 资助金 额已达 2800 万 美元。 同时, 由于代 谢工程 潜在的 
应用 价值, 许多公 司投巨 资与学 校及研 究机构 (如 DuPont 公司与 Genencor, Merck 公司 
与 MIT) 合作进 行代谢 工程研 究改进 菌种。 欧盟多 次在其 "框架 计划" 中专 门设立 "细胞 
工厂" 研究 项目, 大力 资助代 谢工程 研究。 由于 生物科 学技术 的飞速 发展、 多 学科的 交叉、 
政 府的高 额资助 及企业 的积极 参与, 使得代 谢工程 研究在 科学基 础及应 用方面 均取得 巨大进 
展, 集中 体现在 如下两 篇评论 文章: BBA 以 "用 途径工 程进行 化学品 的商业 生产" 为题介 
绍了 代谢途 径工程 与发酵 技术的 集成在 芳香化 合物、 有机酸 (琥 珀酸、 乳酸、 维生素 C)、 
醇 (乙 醇、 甘油、 1,3- 丙 二醇) 和次级 代谢物 (类 异戊 二稀、 聚酮、 非核糖 体肽) 等 生产中 
的成 功例子 [BBA, 1543, 434-455 (2000)]; 《Science》 以 "如 何制 造性能 优良的 细胞" 
为题介 绍了用 大肠杆 菌制造 靛蓝、 合成 i9- 胡 萝卜素 的金色 水稻、 用链 霉菌制 造优良 的聚酮 
分子、 通过 导入一 个编码 红细胞 葡萄糖 传递蛋 白的人 类基因 (glutl) 把 专性硅 藻菌转 化为一 
个异 养菌, 从 而改变 了其代 谢途径 而能在 没光的 情况下 代谢葡 萄糖。 所 有这些 均是在 对细胞 
代 谢网络 及调控 机理深 入研究 的基础 上的重 要科学 发现, 具有划 时代的 科学意 义及工 业和医 
用 价值。 

本书 作者所 在学校 (美 国麻省 理工学 院和丹 麦工业 大学) 是 国际上 从事代 谢工程 研究最 
早最 活跃的 单位, Stephanopoulos 和 Nielsen 两位 教授在 代谢工 程及相 关领域 发表科 学论文 
都在 200 篇 以上, 他们 都因在 代谢工 程领域 的开拓 性贡献 以及在 将生物 学成功 结合到 化学工 
程研 究中的 领导作 用而分 别当选 为美国 工程科 学院院 士和丹 麦工程 科学院 院士。 他们 都分别 
担任过 国际代 谢工程 会议的 主席。 在 Bailey 教授两 年前病 逝后, 他们分 别担任 "代谢 工程" 
刊 物的主 编与副 主编。 两位教 授在生 物工程 教学中 不断进 行学科 交叉的 创新与 改革, 并分别 
获得 优秀教 学奖。 本 书不仅 是代谢 工程科 学发展 及大量 实例的 总结, 而 且对代 谢工程 的原理 
及方 法首次 进行了 科学的 阐述, 为 代谢工 程乃至 复杂生 物系统 的研究 奠定了 坚实的 基础。 相 
信 本书中 译本的 出版将 会大大 促进我 国代谢 工程的 教学、 科研 以及生 物技术 产业的 发展。 

从 1999 年 开始, 本 书英文 版就作 为我校 "生 物反应 与代谢 工程" 科 研组的 主要参 考书, 
并先 后作为 硕士、 博 士研究 生学位 课的双 语教学 用书。 2000 年在 新加坡 -MIT 研讨 会上, 译 
者向本 书作者 Stephanopoulos 教授请 教了代 谢工程 教学中 的一些 问题。 他对 双语教 学的做 
法表示 肯定, 同时表 示如果 出版中 译本, 他们可 以提供 全书所 有插图 (电子 版)。 为 了促进 
我国代 谢工程 研究的 发展, 也为了 加深对 "代谢 工程" 一书的 理解, 2003 年 3 月我 们邀请 
本 书作者 Nielsen 教授来 校讲学 一周。 除了 当面讨 论外, 我们就 翻译中 的一些 问题经 常通过 



电子邮 件进行 交流。 我们非 常感谢 Nielsen 教授和 Aristidou 博士 所提供 的所有 电子版 插图, 
非 常感谢 Nielsen 教授多 次通过 电子邮 件对所 提问题 的及时 回答与 解释。 

参加 本书翻 译工作 的有天 津大学 化工学 院生物 工程系 的有关 教师、 博士后 及参加 双语教 
学的 博士研 究生, 他 们是: 白 冬梅、 赵学明 (第 1、 2 章); 娄凯、 白 冬梅、 赵学明 (第 3、 
4 章); 李 文钊、 班睿、 赵学明 (第 5 章); 李 文钊、 赵学明 (第 6 章); 王 昌禄、 李 文钊、 
赵学明 (第 7、 8 章); 王 国海、 赵学明 (第 9、 10 章); 陈涛、 赵学明 (第 11、 12 章); 沈 
玉宝、 孔 庆学、 赵学明 (第 13 章); 马 红武、 白 冬梅、 赵学明 (第 14 章); 专 业词汇 (陈 
洵、 马平生 ); 索引 (白冬 梅); 符 号说明 (白冬 梅)。 白 冬梅博 士还承 担了全 书图表 的翻译 
工作、 有关 物质名 词和菌 种名称 的翻译 或核对 工作、 全书格 式调整 及符号 统一工 作等。 

由于原 著是国 际上第 一本代 谢工程 书籍, 译者 对其中 一些内 容缺乏 科研及 教学的 实践经 
验, 再加 上时间 仓促, 错误之 处在所 难免, 如 蒙读者 指出, 我们 将不胜 感谢。 



赵学明 

2003 年 9 月 16 日 于天津 大学化 工学院 



a 



录 



符 号说明 

第 1 章 代 谢工程 的实质 1 

1.1 代谢 工程的 重要性 5 

1.2 本书 的概要 8 

11 

第 2 章 细胞代 谢综述 12 

2.1 细胞代 谢概述 12 

2.2 运 输过程 15 

2.2.1 被 动运输 15 

2.2.2 促 进扩散 17 

2.2.3 主 动运输 19 

2.3 供 能反应 21 

2.3.1 糖酵解 21 

2.3.2 发 酵途径 26 

2.3.3 TCA 循环 和氧化 磯酸化 28 

2.3.4 回 补途径 30 

2.3.5 脂类、 有机酸 和氧基 酸的分 解代谢 32 

2.4 生物合 成反应 • …… 33 

2.4.1 氨基 酸的生 物合成 33 

2.4.2 核酸、 脂肪酸 和其它 结构单 元的生 物合成 36 

2.5 聚 合反应 38 

2.6 生 长能学 41 

参 考文献 44 

第 3 章 细胞反 应的综 合模型 48 

3.1 细 胞反应 的化学 计量学 48 

3.2 反 应速率 52 

3.3 动态质 量平衡 54 

3.4 产率 系数与 线性速 率方程 59 

i 参 考文献 66 

第 4 章 物 质平衡 与数据 一致性 67 

4.1 黑 箱模型 67 

4.2 元 素平衡 方程式 68 

4.3 热平衡 73 

4.4 超 定系统 的分析 —— 过失测 量误差 的识别 75 ^ 

参 考文献 8^ 



第 5 章 代 谢途径 的调控 85 

5.1 癉活性 的调控 86 

5.1.1 晦动力 学概述 87 

5.1.2 简单 可逆抑 制系统 90 

5.1.3 不可 逆抑制 94 

5.1.4 别构酶 95 

5.2 酶浓 度调节 98 

5.2.1 转 录起始 的控制 98 

5.2.2 翻译 的控制 101 

5.3 总体 调控: 在完 整细胞 水平上 的调控 102 

5.4 代 谢网络 的调控 107 

5.4.1 分支 点分类 110 

5.4.2 耦合反 应与总 体流通 代谢物 的作用 112 

参 考文献 114 

第 6 章 途径操 作实例 —— 代谢工 程实践 116 

6.1 产品得 率及生 产能力 的提高 116 

6.1.1 乙醇 117 

6.1.2 氨基酸 121 

6.1.3 溶剂 126 

6.2 扩大底 物范围 128 

6.2.1 戊 糖代谢 生产乙 醇的代 谢工程 128 

6.2.2 纤维素 —半纤 维素解 聚作用 132 

6.2.3 乳 糖和乳 清利用 132 

6.2.4 蔗 糖利用 134 

6.2.5 降解 淀粉的 微生物 134 

6.3 扩 展产物 范围, 增加 新产品 135 

6.3.1 抗生素 135 

6.3.2 聚酮 化合物 136 

6.3.3 维生素 139 

6.3.4 生物 聚合物 140 

6.3.5 生 物色素 145 

6.3.6 氣 • 146 

6.3.7 戊糖: 木糖醇 147 

6.4 细 胞性能 的改进 148 

6.4.1 氮代谢 的改造 148 

6.4.2 提高氧 的利用 148 

6.4.3 过 度代谢 的防止 149 

6.4.4 底 物吸收 的改变 151 

6.4.5 遗传 稳定性 的维持 152 

6.5 异生物 的降解 152 



6.5.1 多 氯联苯 (PCBs) 153 

6.5.2 苯、 甲 苯和对 二甲苯 混合物 (BTX) 154 

参 考文献 156 

第 7 章 代谢途 径合成 166 

7.1 代谢 途径合 成算法 167 

7.2 算 法综述 173 

7.3 实 例研究 —— 赖 氨酸生 物合成 176 

7.3.1 草 酰乙酸 的作用 179 

7.3.2 其它替 代途径 179 

7.3.3 关于最 高得率 的限制 179 

7.4 算法 的讨论 180 

参 考文献 181 

第 8 章 代谢通 量分析 182 

8.1 理论 184 

8.2 超 定系统 196 

8.3 不定系 统-线 性规划 201 

8.4 敏感 性分析 204 

参 考文献 206 

第 9 章 利用同 位素标 记实验 测定代 谢通量 的方法 207 

9.1 根据标 记富集 度分数 直接确 定通量 208 

9.1.1 根据 瞬时强 度测量 确定代 谢通量 208 

9.1.2 代谢稳 态和同 位素稳 态实验 209 

9.2 涉及 同位素 标记代 谢物完 全列出 的应用 214 

9.2.1 来自 标记丙 酮酸的 TCA 循 环同位 素标记 代谢物 的分布 216 

9.2.2 来 自标记 乙酸的 TCA 循 环同位 素标记 代谢物 的分布 221 

9.2.3 实验数 据整理 222 

9.3 碳平衡 232 

9.3.1 直接 碳平衡 232 

9.3.2 原子作 图矩阵 的应用 237 

参 考文献 240 

第 10 章 代谢通 量分析 的应用 241 

10.1 由谷 氨酸细 菌生产 氨基酸 242 

10.1.1 谷氨酸 菌的生 物化学 与调节 242 

10.1.2 理 论得率 的计算 245 

10.1.3 C.g/MtowfcMm 菌中赖 氨酸生 物合成 网络的 代谢通 量分析 250 

10.1.4 C.g/i/zamzoim 特定 缺失突 变株的 代谢通 量分析 257 

10.2 哺乳 动物细 胞培养 中的代 谢通量 261 

10.2.1 胞 内通量 的确定 261 

10.2.2 通过 标 记研究 证实通 量估计 265 

10.2.3 通 量分析 在细胞 培养基 设计中 的应用 268 



第 5 章 代 谢途径 的调控 85 

5.1 酶活性 的调控 86 

5.1.1 酶动力 学概述 87 

5.1.2 简单 可逆抑 制系统 90 

5.1.3 不可 逆抑制 94 

5.1.4 别构酶 95 

5.2 SI 浓 度调节 98 

5.2.1 转 录起始 的控制 98 

5.2.2 翻译 的控制 101 

5.3 总体 调控: 在完 整细胞 水平上 的调控 102 

5.4 代 谢网络 的调控 107 

5.4.1 分支 点分类 110 

5.4.2 耦合反 应与总 体流通 代谢物 的作用 112 

参 考文献 114 
第 6 章 途径操 作实例 一 代谢工 程实践 116 

6.1 产品得 率及生 产能力 的提高 116 

6.1.1 乙醇 117 

6.1.2 氨基酸 121 

6.1.3 溶剂 126 

6.2 扩大底 物范围 128 

6.2.1 戊 糖代谢 生产乙 醇的代 谢工程 128 

6.2.2 纤维素 -半纤 维素解 聚作用 132 

6.2.3 乳 糖和乳 清利用 132 

6.2.4 蔗 糖利用 134 

6.2.5 降解 淀粉的 微生物 134 

6.3 扩 展产物 范围, 增加 新产品 135 

6.3.1 抗生素 135 

6.3.2 聚兩 化合物 136 

6.3.3 维生素 139 

6.3.4 生物 聚合物 140 

6.3.5 生 物色素 145 

6.3.6 氣 • 146 

6.3.7 戊糖: 木糖醇 147 

6.4 细 胞性能 的改进 148 

6.4.1 氮代谢 的改造 148 

6.4.2 提高氧 的利用 148 

6.4.3 过 度代谢 的防止 149 

6.4.4 底 物吸收 的改变 151 

6.4.5 遗传 稳定性 的维持 152 

6.5 异生物 的降解 152 



6.5.1 多 氯联苯 (PCBs) 153 

6.5.2 苯、 甲 苯和对 二甲苯 混合物 (BTX) 154 

参 考文献 156 
第 7 章 代谢途 径合成 166 

7.1 代谢 途径合 成算法 167 

7.2 算 法综述 173 

7.3 实 例研究 —— 赖 氨酸生 物合成 176 

7.3.1 草 酰乙酸 的作用 179 

7.3.2 其它替 代途径 179 

7.3.3 关于最 高得率 的限制 179 

7.4 算法 的讨论 180 

参 考文献 181 

第 8 章 代谢通 量分析 182 

8.1 理论 184 

8.2 超 定系统 196 

8.3 不定系 统-线 性规划 201 

8.4 敏感 性分析 204 

206 

第 9 章 利用同 位素标 记实验 测定代 谢通量 的方法 207 

9.1 根据标 记富集 度分数 直接确 定通量 208 

9.1.1 根据 瞬时强 度测量 确定代 谢通量 208 

9.1.2 代谢稳 态和同 位素稳 态实验 209 

9.2 涉及 同位素 标记代 谢物完 全列出 的应用 214 

9.2.1 来自 标记丙 酮酸的 TCA 循 环同位 素标记 代谢物 的分布 216 

9.2.2 来 自标记 乙酸的 TCA 循 环同位 素标记 代谢物 的分布 221 

9.2.3 实验数 据整理 222 

9.3 碳平衡 232 

9.3.1 直接 碳平衡 232 

9.3.2 原子作 图矩阵 的应用 237 

参 考文献 240 

第 10 章 代谢通 量分析 的应用 241 

10.1 由谷 氨酸细 菌生产 氨基酸 242 

10.1.1 谷氨酸 菌的生 物化学 与调节 242 

10.1.2 理 论得率 的计算 245 

10.1.3 C.gZi^famz'o/m 菌中赖氨酸生物合成网络的代谢通量分析 250 

10.1.4 C.g/"famz?"m 特定 缺失突 变株的 代谢通 量分析 257 

10.2 哺乳 动物细 胞培养 中的代 谢通量 261 

10.2.1 胞 内通量 的确定 261 

10.2.2 通过 标 记研究 证实通 量估计 265 

10.2.3 通 量分析 在细胞 培养基 设计中 的应用 268 



参 考文献 268 

第 11 章 代谢控 制分析 270 

11.1 代谢控 制分析 的基础 271 

11.1.1 控制系 数和加 和定理 .• 272 

11.1.2 弹性系 数和连 接定理 274 

11.1.3 MCA 理论的 一般化 276 

11.2 通量控 制系数 的确定 277 

11.2.1 确定通 量控制 系数的 直接法 279 

11.2.2 确定通 量控制 系数的 间接法 282 

11.2.3 瞬 态代谢 物测量 的应用 284 

11.2.4 动力 学模型 286 

11.3 线性 途径的 MCA 286 

11.4 分支 途径的 MCA 291 

11.5 大偏 差理论 299 

11.5.1 未分支 的网络 299 

11.5.2 分 支网络 304 

11.5.3 对营 养物浓 度和外 部效应 物变化 的响应 307 

11.5.4 讨论 307 

参 考文献 308 

第 12 章 代谢网 络的结 构分析 311 

12.1 在单 一分支 点处通 量分布 的控制 313 

12.2 反 应分组 316 

12.2.1 组 通量控 制系数 316 

12.2.2 独 立途径 的识别 317 

12.3 实 例研究 —— 芳 香族氨 基酸的 生物合 成途径 322 

12.3.1 S.cerevisiae 中 芳香族 氨基酸 生物合 成模型 322 

12.3.2 独 立途径 的确定 326 

12.3.3 连接 代谢物 的识别 和组通 量确定 328 

参 考文献 338 

第 13 章 代谢网 络的通 量分析 339 

13.1 组控 制系数 与单个 控制系 数之间 的关系 (自 下而 上法) 339 

13.2 由通量 测量确 定组控 制系数 (自 上而 下法) 341 

13.2.1 从 三个扰 动确定 gFCCs 341 

13.2.2 从已表 征的扰 动确定 gFCCs 343 

13.2.3 gCCCs 的确定 344 

13.2.4 扰 动的可 观察性 344 

13.3 实 例研究 345 

13.3.1 组 控制系 数的解 析确定 (自 下而 上法) 345 

13.3.2 gFCCs 实 验确定 的模拟 (自 上而 下法) 350 

13.4 交叉代 谢物反 应组控 制分析 的扩展 352 



13.4.1 扰 动常数 352 

13.4.2 多 分支点 上重叠 反应组 的分析 352 

13.4.3 实 例研究 354 

13.5 通 量扩增 的优化 355 

13.5.1 优 化算法 的推导 355 
13.5.2 实 例研究 357 

13.6 一致 性检验 与实验 证实二 359 

13.6.1 利 用多次 扰动发 展一致 性检验 360 

13.6.2 对 预苯酸 分支点 的应用 363 

13.6.3 测 量误差 的影响 364 

参 考文献 365 

第 14 章 细 胞过程 热力学 366 

14.1 热力学 原理: 综述 366 

■ 14.2 热力学 可行性 371 

14.2.1 算法 372 

14.2.2 利用基 团贡献 法确定 AGO' 377 

14.3 非平衡 热力学 384 

14.4 热动力 学在代 谢控制 分析中 的应用 : 396 

##^M 400 

402 

躬 1 410 




符 号说明 



下面 是本书 中常用 的一些 符号。 这里所 用的单 位为最 典型的 用法, 在某些 情况下 可能有 
其它的 单位。 
英 文符号 

a cell 细 胞的比 表面积 [m 2 'g — 1( 干重 )] 

a 含有式 (8.26) 中的目 标函数 中的单 个变量 权重的 行向量 

A, 第 i 个 反应的 亲和力 (kj'mol 一 1) 

C 浓度 (mmo 卜 L - 1) 

C. 第 i 个 化合物 的浓度 (mmol'L — 1) 

cf 加人 到生物 反应器 中的第 I 个 化合物 的浓度 (mmol'L_i) 

d.i 第 i 个 雜对第 J' 个稳 态通量 J, 的 通量控 制系数 

*d/ 第 i 个 组对稳 态通量 的组 通量控 制系数 

C^J 第 ! 个醇对 第_; 个 代谢物 浓度的 浓度控 制系数 

•C^ 第 i 个组对 第_; 个代 谢物浓 度的组 浓度控 制系数 

d 包含 通量控 制系数 的矩阵 

CX 包含 浓度控 制系数 的矩阵 

f/men 细 胞质膜 的厚度 (m) 

D 稀 释速率 (h_i) 

Dmem 膜扩 散的扩 散系数 (m 2 'S_l) 

D{ 式 (11.84) 给 出的偏 差指数 

£. 第 i 个酵 的活性 (或 浓度) 

E 元 素组成 矩阵或 包含弹 性系数 的矩阵 

Ee 未 测量化 合物的 元素组 成矩阵 

E„ 已 测量化 合物的 元素组 成矩阵 

f 式 (11.87) 所给的 通量扩 增因子 

fi, 通量 J 与 通量, 的比值 [由式 (11.50) 给出] 

F 进入生 物反应 器的体 积流速 (L'h 一 1) 

Fou, 流出生 物反应 器的体 积流速 (L'h 一 I) 

F 方差 -协方 差矩阵 

gij 在第 J 个反应 中的第 Z' 个 胞内代 谢物的 化学计 量系数 

G 吉布 斯函数 (W'mol - 1) 

厶 G 吉布斯 自由能 的变化 (kj'mol 一 1) 

AGO 在所有 反应物 和产物 均为标 准态时 的吉布 斯自由 能变化 (kj.mol-i) 

G 含有胞 内代谢 物化学 计量系 数矩阵 

Gc 含 有通量 未被测 量的反 应中, 胞内 代谢物 的化学 计量系 数矩阵 

Gm 含 有通量 已被测 量的反 应中, 胞内 代谢物 的化学 计量系 数矩阵 

Gex 含 有正、 反两个 方向所 有反应 的化学 计量系 数的代 谢模型 的化学 计量系 数矩阵 

h 由 方程式 (4.29) 给 出的检 验函数 



/is., 第 i 个 底物的 碳含量 (C-mol'mol_i) 

A p., 第!' 个代谢 产物的 碳含量 (C-mo 卜 mol_') 

H 熔函数 (kJ'mol_i) 

H, 式 (14.29) 给出 的热力 学函数 

I 单位 矩阵, 即, 矩 阵所有 对角线 元素为 1, 其它 元素为 

J 式 (14.46) 给出 的流比 

J, 通过分 支路径 ! 的稳 态通量 [mmol'g — ' (干重 )'h_i] 

J 稳态通 量向量 [mmohg— 1 (干重 )'h — 1] 

Jdep 非 独立通 量向量 [mmo 卜 g— ' (干重 )'h_i] 

J,n 独立通 量向量 [mmol'g — 1 (干重 )'h_i] 

k 速 率常数 

K 分析中 所考虑 的胞内 代谢物 的数目 

K«, 平 衡常数 

Kp., 在液 膜和培 养基之 间的分 配系数 (无因 次的) 

Kn, Micheaelis-Menten 常数 (或 饱和 常数) (mmol'L— ') 

K, 抑 制常数 (mmo 卜 L — i) 

K 符合式 (12.7) 的核 心矩阵 

L,j 表 观系数 

维持 代谢的 ATP 需要 

M 分析 中所考 虑的代 谢产物 的数目 

N 分析中 所考虑 的底物 的数目 

P 影响反 应速率 的参数 [在式 (li.5) 中 用到] 

P 渗 透系数 (nvs 一 I) 

P, 第 I 个代 谢产物 

P 残差 的方差 -协方 差矩阵 或含有 参数弹 性系数 的矩阵 

q 耦合度 

Q 分析 中所考 虑的大 分子库 的数目 

Qhea, 与菌体 生长相 关的热 量生成 [kJ'C-mol— 1 (菌体 )] 

r 比速率 [mmo 卜 g— ' (干重 )'h—'] 

rATP ATP 的生 成速率 [mmol'g — 1 (干重 )'h—i] 

r, 式 (11.86) 所给的 活性扩 增因子 

r„^.ro,. 第 个大 分子库 的比生 成速率 [g'g— I (干重 )'h_i] 

rme,., 第 z 个胞内 代谢物 的比生 成速率 [mmohg— 1 (干重 )'h 一 i] 

rp 产 物比生 成速率 [mmohg— ' (干重 )'h i] 

rs 底 物比消 耗速率 [mmo 卜 g — 1 (干重 )'h — i] 

r,™„ 穿过 细胞膜 的比运 输速率 [mmo 卜 g — 1 (干重 )'h_i] 

rc 非测量 的比速 率向量 [mmohg — 1 (干重 )'h — i] 

rn, 测量 的比速 率向量 [mmol'g — 1 (干重 )'h — i] 

rmacro 含 有大分 子的比 生成速 率向量 [g'g— > (干重 )'h_l] 

rme, 含有胞 内代谢 物的比 生成速 率向量 [mmohg— I (干重 一'] 

rp 含有 代谢产 物的比 生成速 率向鼂 [mmol'g ' (干重 )'h 一 

rs 含有底 物的比 消耗速 率向量 [mmol'g — 1 (干重 )'h 一'] 

R 气 体常数 [=0.008314kJ' (K-moI)-'] 

R. 式 (13.40) 给出的 活性扩 增参数 



rJj^ 式 (11.7) 给 出的响 应系数 

R 式 (4.17) 给 出的冗 余矩阵 

Rr 含有 R 的独 立行的 缩减冗 余矩阵 

S 熵函数 [kj* (K-mol)-'] 

Si 第 个底物 

T 温度 (K) 

T 含有式 (8.12) 确定的 化学计 量系数 的矩阵 

V, 第 J 个 关联的 比速率 [mmol'g— ' (干重 )'h 一 I] 

*v' 第; 个反应 组的总 比速率 (活性 ) [mmo 卜 I (干重 )'h 一 I] 

fmax 薛催 化反应 的最大 比速率 (mmol'h 一 1) 

V 反应速 率向量 (或胞 内稳态 通量) [mmo 卜 g — ' (干重 )'h_i] 
Vc 未 测量的 反应速 率向量 [mmol'g— ' (干重 )'h 一 1] 

Vm 测量的 反应速 率向量 [mmol'g—' (干重 )'h— 1] 

V 生物 反应器 的体积 (L) 
X 菌 体浓度 (g'L—i) 

Xn,acro„ 第 i 个大 分子库 的浓度 [g (干重 )*h_l] 

X„,e,., 第 i 个胞内 代谢物 的浓度 

Yij 得 率系数 [mmolG)'g— 1 (干重 )'h 一 1] 

yr 真实得 率系数 [mmolG)'g- ' (干重 )'h 一'] 

VxATP 细胞 生长的 ATP 需要 [mmol (ATP) -g"' (干重 )'h — '] 
VxATP.growh 细胞 合成的 ATP 需要 [mmol (ATP) -g"' (干重 )'h—i] 

VxATP.iysis 由 于细胞 自溶浪 费的细 胞生长 所需的 ATP [mmol (ATP) -g ' (干重 )'h 一'] 

VxATP.ieak 由 于泄漏 和无效 循环的 ATP 需要 [mmol (ATP) 'g— ' (干重 )'h 一 

Z 式 (14.48) 给出 的表观 化学计 量关系 
希 腊字母 



a,, 第 J 个反应 中的第 Z 个 底物的 化学计 量系数 

A 含 有底物 化学计 量系数 的矩阵 

/3„ 第 J 个反应 中的第 个代谢 产物的 化学计 量系数 

B 包含代 谢产物 化学计 量系数 的矩阵 

X 式 (14.49) 给出 的力比 

X, 式 (11.78) 中 的参数 

8 测量误 差向量 

e 式 (4.20) 给 出的残 差向量 

e' 式 (11.11) 给 出的弹 性系数 

〜 

j^, 式 (11.103) 给 出的代 谢物扩 增因子 

<1> 耗 散函数 (kj'mol — 1) 

Y), 第 J 个反 应中 的第/ 个大分 子库的 化学计 量系数 

r 包含大 分子库 的化学 计量系 数矩阵 

ri、h 热力 学效率 

K 一般化 还原度 

比生 长速率 (h 一 1) 

!上 i 第 个化 合物的 化学势 (kl 'mol l) 

/.? 在参 考状态 下的第 i 个化 合物的 化学势 (kj'mol—') 

〜 式 (11.19) 给出的 参数弹 性系数 

r 特 征时间 (h) 



第 1 章 代 谢工程 的实质 



为了 赋予微 生物所 希望的 性质, 而对其 代谢途 径进行 操作, 这种方 法很早 以前人 们就开 
始 研究和 应用。 这种方 法在氨 基酸、 抗 生素、 溶剂和 维生素 等领域 的成功 应用, 在很 大程度 
上依赖 于化学 诱变剂 和创造 性的篩 选技术 的使用 来识别 符合某 种目的 的优良 菌株。 尽 管这些 
方法已 被广泛 认可, 并已取 得很大 成功, 但 是对于 这些突 变菌株 的遗传 和代谢 却缺乏 表征, 
而且诱 变仍然 是一个 随机的 过程, 该 过程中 科学是 用艺术 原理来 补充增 强的。 

用于 脱氧核 糖核酸 (DNA) 重 组的分 子生物 技术的 发展为 代谢途 径操作 提供了 新的方 
法。 通 过基因 工程可 以对代 谢途径 中特定 的酵反 应进行 精确的 修饰, 从 而进行 遗传背 景意义 
明确 的菌种 构建。 在 DN'A 重组技 术的可 行性被 确证后 不久, 就 出现了 许多术 语来描 述这种 
技术 在途径 定向修 饰方面 的潜在 应用, 如: 分 子育种 (Kellogg et al, 1981)、 体 外进化 
(Timmis et al, 1988)、 (微 生物或 代谢) 途 径工程 (MacQuity, 1988; Tongetal, 1991)、 
细 胞工程 (Nerem, 1991) 和代 谢工程 (Stephanopoulos and Vallino, 1991; Baley, 1991)。 
尽管 每一个 具体的 定义因 作者的 不同而 不同, 但在 代谢工 程总的 目标和 方法方 面都表 达了类 
似的 含义。 在 这里, 我们 把代谢 工程定 义为: 利用 DNA 重组技 术对特 定的生 化反应 进行修 
饰 或引入 新的反 应以定 向改进 产物的 生成或 细胞的 性质。 上述 定义的 基本特 征是: 定 为目标 
要修 饰的、 或 打算要 新引人 的特定 生化反 应的专 一性。 一 旦这样 的反应 目标被 确定, 那么就 
要应用 已建立 的分子 生物学 技术对 相应的 基因或 酸进行 扩增、 抑制或 缺失、 转移、 或 解除调 
控。 为了达 到上述 目的, 广义的 DNA 重组 技术已 被广泛 应用到 各个步 骤中。 

尽 管定向 性从某 种意义 上来讲 是所有 菌种改 进工作 的固有 特性, 但 是代谢 工程与 随机诱 
变 相比, 其工作 焦点致 力于定 向性, 以致 其在目 标醉的 选择、 实 验设计 以及数 据分析 等方面 
都起着 重要的 作用。 另一 方面, 细胞 的定向 改进不 应解释 为合理 的途径 设计与 修饰, 因此在 
这 个意义 上说, 代 谢工程 与随机 诱变是 完全不 同的。 实 际上, 通 过随机 诱变而 得到的 性能优 
良的菌 株能够 作为关 于途径 结构与 控制方 面重要 信息的 来源, 这 可经由 谢 J 程获 取。 

像 其它传 统的工 程领域 一样, 代谢工 程也包 括两个 明确的 步骤: 即 合力 因为代 
谢工程 是随着 DNA 重组 而出现 的可行 技术, 所以 最初代 谢工程 几乎都 集中于 这个领 域的合 
成 方面: 如 在各种 宿主细 胞中新 基因的 表达、 内 源醱的 扩增、 基 因的缺 失或藤 活性的 调节、 
转录的 或鰣的 解除调 控等。 因此, 代 谢工程 在很大 程度上 曾是应 用分子 生物学 的技术 体现, 
而 很少带 有工程 方面的 内容。 生 物过程 所考虑 的事情 并不具 备代谢 工程的 条件。 在代 谢工程 
的分析 方面可 找到更 多重要 的工程 内容: 如 何确定 决定生 理状态 的重要 参数? 如何利 用这些 
信息 来阐明 代谢网 络的控 制结构 并为达 到某一 目的而 提出合 理的靶 标进行 修饰? 为了 设计下 
一轮 的途径 修饰直 至达到 目标, 人们 如何进 一步评 价这些 基因或 酸修饰 的确实 的生物 化学影 
响? 若 不是用 通常的 特定目 标蹄选 过程, 人 们能够 提出一 个合理 的过程 来确定 最有希 望的目 
标进行 代谢操 作吗? 这 些都是 代谢工 程的分 析方面 应强调 重视的 问题。 

在合成 方面, 代谢 工程的 另一个 创新方 面是集 中于整 体的代 谢途径 而不是 单个的 反应。 
因此, 代谢 工程检 验的是 完整的 生物化 学反应 网络, 包括 其途径 合成和 热力学 可行性 问题, 
以及 途径的 通量分 布及其 控制。 因此, 我们 正在目 睹着从 单个的 醜反应 向相互 作用的 生化反 

1 



应系 统这一 范例的 变换。 从这 个意义 上讲, 代谢网 络的含 义极其 重要, 因为通 过考虑 反应的 
整个系 统而不 是相互 独立的 一个个 反应, 从 而就可 增强对 代谢和 细胞功 能透彻 理解的 能力。 
通 过代谢 工程, 人们已 把注意 力变换 到整个 系统, 而不是 其组成 零件。 关于这 一点, 代谢工 
程正在 利用众 多^、 者的研 究而得 来的技 术和信 息寻求 合成和 设计。 转而, 通过对 整体系 
统 行为的 观察, ^^^地指导更加合理的分解和分析。 

尽 管代谢 和细胞 生理学 提供了 分析反 应途径 的主要 内容, 但应该 指出: 通 量确定 与调控 
的结果 具有广 泛的适 用性。 因此, 除了对 通过代 谢途径 中的物 质和能 量通量 分布进 行分析 
外, 代谢 工程的 概念同 样可用 于分析 诸如信 号转导 途径中 的信息 通量。 由于信 号转导 途径及 
其通 量还没 被精确 定义, 因 此本书 集中在 代谢途 径的应 用上。 然而, 一 旦信息 途径的 概念被 
具 体化, 我们预 期这里 所介绍 的方法 和工具 将会在 信号转 导途径 相互作 用的研 究中以 及在外 
部刺 激控制 基因表 达的复 杂机理 的解释 中得到 很好的 应用。 

或许, 代谢 工程最 重要的 贡献在 于强调 在胞内 条件下 代谢通 量及其 调控。 当然, 代谢通 

量 这个概 念本身 并不是 新的。 大约在 30 年前, 代 谢通量 及其控 制就已 引起了 虽然是 一小部 
分但思 维超前 的生物 化学研 究组的 注意。 虽然传 统的生 物化学 家并不 广泛接 受这些 思想, 但 
正是这 一部分 人的工 作使得 代谢控 制的思 想日渐 成熟, 并 被严密 定义。 代谢 工程, 最 初被认 
为 是特定 的途径 操作, 但 很快就 成为工 程师们 施展分 析技能 的天然 场所, 工程 师们看 到了通 
过利 用通用 的代谢 控制分 析平台 技术在 这些过 程中引 入严密 分析的 机会。 代 谢工程 的实质 
是: 将通量 及其控 制进行 量化的 方法与 分子生 物学技 术结合 起来, 用以 执行所 建议的 基因修 
饰 任务。 当 反复利 用代谢 工程方 法时, 它就 为在很 广范围 内系统 改进细 胞的性 质提供 了一种 
强 有力的 方法。 

通量是 细胞生 理学的 一个基 本决定 
因素, 也是 代谢途 径中最 重要的 参数。 
在图 1.1 (a) 所示的 线性途 径中, 通量 
J 等于 稳态条 件下各 个单个 反应的 速率。 
显然, 当中 间代谢 物的浓 度调整 到能使 

所 有反应 速率都 相等时 (t;i = t;2=- 
V, 二… VL), 就 达到稳 态了。 在 瞬态过 
程中, 各个反 应速率 是不相 等的, 途径 
的通量 是变化 的和不 清楚的 (通 常是到 
底物消 耗或产 物生成 改变速 率的时 候)。 
在图 1.1 (b) 所示的 分支途 径中, 在中 
间 代谢物 I 处出 现分支 途径, 每 个分支 
途径有 相应的 通量, 在 稳态时 Ji 二 + 
J30 每一个 分支途 径上的 通量等 于相应 
-E 的分 支途径 上的单 个反应 速率。 如图 
1.1 (C) 所示, 通常 把通量 认 为是线 

性途径 中通量 和 J3 的叠 加。 用这种 
方法可 将如图 1.1 (d) 所 示的复 杂网络 
分 解为一 些线性 途径, 每 一个途 径有其 
各自的 通量。 需 要指出 的是, 在图 1.1 



7'/. 



E, 



E/, 



(a) 



通量 •/ 



(b) 



(c) 



甲 



(d) 



图 1.1 简单途 径举例 



所示的 所有途 径中, 达到 稳态的 一个必 须条件 就是: 初始 的和最 终的反 应速率 (或分 别等价 

于初始 代谢物 与最终 代谢物 A、 B、 C 等的 浓度) 必须 恒定, 这 个条件 可通过 在连续 培养反 
应器 (通 常指 恒化反 应器) 中保 持恒定 的胞外 代谢物 浓度而 实现。 

由 于代谢 途径及 其通量 是代谢 工程的 核心, 因此, 对它 们的定 义与含 义稍加 详述。 我们 
把代谢 途径定 义为: 一 连串可 以进行 的并可 观测的 生物化 学反应 步骤, 这些反 应步骤 是以指 
定 的一组 输入和 输出代 谢物所 连接。 途径 通量定 义为: 输 入代谢 物反应 生成输 出代谢 物的速 
率。 在 这里需 要特别 指出可 行性和 可观测 性的重 要性。 首先, 创 造无意 义的反 应步骤 而催化 
这些 在细胞 中根本 不存在 的反应 的薛, 这样的 工作是 没有价 值的。 类 似地, 列 举那些 通过实 
验观测 不到的 底物与 产物之 间的可 能反应 步骤也 是没有 多大意 义的。 代 谢图谱 的多样 性和复 
杂 性这一 点非常 重要, 这 是过去 50 年生物 化学领 域中开 拓性研 究所构 建的。 尽管在 特定的 
输 人和输 出代谢 物之间 常常存 在多于 一种生 物反应 序列, 但如果 这些反 应序列 的通量 不能独 
立 确定, 那么 包含这 样的反 应序列 就没提 供任何 附加的 信息。 如 果这些 反应序 列可以 合并成 
少 数几个 通量可 观测的 途径, 会更 好些。 在图 1.1 (d) 中, 如果导 致生成 代谢物 E 的每一 
个分支 途径的 通量不 能通过 实验方 法或其 它方法 确定, 那 么两个 分支途 径必须 合并成 一个单 
个途径 (如虚 线所示 )。 很 明显, 应 鼓励进 行可获 取更多 信息的 测量, 例如那 些能够 区别前 
两 个分支 途径的 方法, 因为 其提高 了对生 化途径 的分辨 能力。 胞 内代谢 通量的 确定称 为代谢 
通 量分析 (MFA), 其在 代谢工 程中处 于中心 地位。 

在代 谢途径 及其通 量的框 架中, 代谢工 程的一 个基本 目标就 是阐明 代谢通 量控制 的因素 
和 机理。 对 于通量 控制的 深入理 解为代 谢途径 进行合 理修饰 提供了 基础。 对代 谢通量 及其控 
制进行 系统的 研究包 括三个 步骤。 第一, 开 发能够 观测尽 可能多 的代谢 途径及 测定其 通量的 
方法。 为 了这个 目的, 可 在测定 胞外代 谢物浓 度的基 础上, 以 简单的 物质平 衡为出 发点。 图 
1.1 (d) 代谢 网络中 代谢物 A〜F 的 测定, 可以 确定所 指示的 5 个 通量, 但 并不是 代谢物 F 
之前 的分支 途径的 通量。 取决 于标记 前体物 A 的用 法, 如果 对由特 定分支 形成的 代谢物 F 
进行 不同的 标记, 那么就 该方法 可提供 F 之前的 分支点 处的通 量比的 信息。 这是几 种能被 
用来 提供关 于分支 途径的 一些附 加信息 的技术 之一, 在这 本书中 我们将 用很大 篇幅来 讨论这 
些 技术。 有必 要强调 的是, 代 谢途径 的通量 并不等 同于途 径中一 种酶或 多种酵 的催化 活性。 
实 际上, 除 了表明 在胞外 分析条 件下相 应的酶 存在并 有活性 之外, 酵分 析并不 能提供 有关途 
径实际 通量的 信息。 在 代谢研 究中, 这些 醇分析 包括通 常被误 解为包 含类似 大小的 代谢通 
量, 由此普 遍下结 论当然 是不正 确的。 

第二 步是向 生物反 应网络 引入一 个精确 的扰动 并在系 统达到 新的稳 态之后 确定途 径的通 
量。 由 于所有 的代谢 控制研 究都会 很快地 集中于 某一特 定的代 谢分支 点上, 所 以很容 易考虑 
图 1.2 所 示的分 支途径 的通量 控制。 一般 来说, 为 了研究 这个分 支点, 需 要引入 3 个 扰动, 
即 在三个 相应的 支路中 分别引 入一个 扰动。 理想的 扰动包 括使用 一个恒 化器, 在达到 稳态条 
件后, 其中 一个酸 的活性 被突然 的扰动 (例如 通过使 用诱导 启动子 )。 这种实 验安排 最适合 
于微生 物或细 胞培养 系统。 在 其它系 统中如 植物或 体内器 官功能 体系中 就需要 不同的 实验配 
置。 其它容 易实施 的扰动 措施, 例如 施加一 个底物 脉冲或 切换到 不同的 碳源, 都可以 获得丰 
富的 信息。 虽然 也可以 使用其 它能对 相应分 支途径 通量有 可觉察 影响的 扰动, 但扰动 的目标 
应指 向分支 点附近 的醇。 最后 应注意 的是: 一种扰 动能提 供不只 一个分 支点的 信息, 这对于 
减少 用来阐 明一个 实际代 谢网络 控制结 构所需 的实验 数目是 非常有 用的。 

通量控 制确定 中的第 三步即 最后一 步是通 量扰动 结果的 分析。 很 显然, 利用图 1.2 中 3 

3 



图 1.2 单个 反应分 组的分 支途径 

个分 支途径 的每一 个通量 扰动, 都 可以探 査特定 分支点 处的柔 10 性。 例如, 如 果通量 Ji 的 

一个大 的扰动 并没有 引起其 它两个 支路通 量在大 小或分 布方面 的明显 变化, 那么很 显然, 这 
个节点 对于上 游的扰 动来说 就是一 个刚性 节点。 在 这种情 况下, 想通过 改变上 游的酶 活性来 
改变下 游的通 量是无 效的。 其 它两个 分支途 径可以 采用类 似的方 法进行 分析。 了解一 个通量 
的扰动 是如何 通过分 支点乃 至整个 网络的 传播是 非常重 要的, 这 种通量 的扰动 可以是 反应速 
率 的改变 (诱导 ), 或者 是在整 个代谢 途径中 导人一 个较大 的通量 (底 物脉冲 ), 或可 用其它 
方法来 实现。 在 分支之 一开始 的扰动 会通过 整个网 络的代 谢物而 传播。 例如, 通量 Jl 的增 
加可 能会引 起也可 能不会 引起分 支点处 代谢物 I 的浓度 的显著 变化, 这 反过来 也反映 了该通 

量对那 个代谢 物水平 所施加 的控制 程度。 另一 方面, 如 果通量 J2 和 J3 被严格 调控或 在特定 
的稳态 下其受 代谢物 I 浓度的 影响很 微弱, 那么, 即使 I 改 变了, 对通量 和 人3 也没 什么 
影响。 这 是在分 析分支 点以及 代谢网 络通量 控制时 可能呈 现的很 多情况 之一。 阐明通 量控制 
的 重要性 在于每 一种通 量控制 的结构 将支配 一个不 同的策 略以进 行通量 扩增或 通量分 配比的 
改变。 

代谢工 程的一 个主要 目标就 是对代 谢通量 控制的 理解, 其中 所做的 一个很 重要的 努力就 

是 20 世纪 70 年 代发展 起来的 代谢控 制分析 (MCA) (Kacser and Burns, 1973; Heinrich 
and Rapoport, 1974), 它是通 过途径 中酶的 活性、 代 谢物、 效 应物和 其它参 数所施 加的通 
量控制 程度进 行定量 表述。 本书 将对代 谢控制 分析进 行全面 介绍, 而且 我们还 将主要 通过从 
上至下 的代谢 控制分 析和反 应分组 人手将 基本理 论扩展 到复杂 的代谢 网络。 如图 1.2 所示, 
这种 方法的 主要原 则就是 对围绕 分支点 代谢物 (例如 I) 的单 个体反 应进行 分组, 然 后通过 
引 人组控 制系数 来描述 由这些 反应组 所施加 的控制 程度。 这种方 法成功 的关键 限制通 过共同 
分支点 代谢物 I 的所有 联系, 消 除反应 组之间 的交互 作用。 因此, 应 当指出 的是: 反 应分组 
和从 上至下 MCA 的成 功应用 可以有 助于将 MCA 的主要 决定因 素定位 于明确 定义的 反应组 
内, 该反 应组所 含的酶 的数目 比典型 的反应 系统所 需要涉 及的酶 的数目 比要少 很多。 此外, 
这种 焦点集 中的研 究方法 是合理 分析的 结果, 而不 是主要 考虑单 个反应 影响而 忽视代 谢网络 

系 统特征 的权宜 应付的 方法。 

通量 控制的 关键参 数确定 以后, 人们 需要实 施这些 变化从 而最有 效地达 到预定 目标。 可 
用 多种方 法来实 现这个 目标。 虽然 人们首 先会想 到基因 修饰, 但 也不应 忽略与 基因改 变同等 
重要的 生物反 应器的 控制。 例如, 如果图 1.2 中 代谢物 B 是目标 产物, 而且 分支点 I 对于生 
成 代谢物 C 的通 量变 化是柔 性的, 那么通 过消除 C 分支 途径 上的第 一个酶 (E3), 就 可以获 
得 B 的高产 菌了。 这种基 因改变 会形成 C 的营 养缺 陷型, 为了 最优维 持细胞 的生长 速率和 
产物合 成速率 之间的 平衡, 必须通 过控制 向培养 基中加 入代谢 物(:。 另一个 方法就 是保持 
4 



E3 的较小 活性, 以使 代谢物 C 能够 由细 胞本身 合成, 因而可 以消除 为了加 入适量 代谢物 C 
而采用 的控制 操作。 在实施 通量控 制的策 略中, 无论采 用哪种 路线, 为获得 最佳的 结果, 都 
应将 基因修 饰和环 境条件 改变结 合起来 使用。 

众所 周知, 代谢工 程是多 学科交 叉领域 (Cameron and Tong, 1993)。 生 物化学 已提供 
了基本 的代谢 图谱以 及关于 生化反 应机理 及其计 量学、 动力学 和调控 的大量 信息。 另外, 代 
谢 控制分 析的整 个领域 在得到 工程领 域认可 之前, 是 起源并 扎根于 生物化 学的。 遗传 学和分 
子生 物学提 供了构 建完善 的遗传 背景的 工具, 这 是通量 控制中 重要的 一步。 此外, 这 两门学 
科是 构建高 产菌株 过程中 进行遗 传改变 的有力 工具。 人们 应当记 住在代 谢工程 诞生过 程中重 
组 DNA 技术 的重要 作用。 实 际上, 作 为一项 可行的 技术, DNA 重组 技术为 代谢工 程的定 
义和 发展提 供了原 动力。 细 胞生理 学提供 了细胞 代谢功 能更为 综合的 视野, 因 此确定 了代谢 
速率研 究和生 理状态 表征的 平台。 最后, 化 学工程 是应用 工程方 法来研 究生物 体系最 合适的 
渠道。 从一 般意义 来说, 该方法 中在生 物系统 研究中 融合了 集成、 定 量以及 关联的 概念。 更 
特别 的是, 化学工 程提供 了系统 分析的 工具和 经验。 所涉 及的系 统中, 速率 过程是 控制因 
素, 化学 工程在 这些领 域中非 常擅长 并做出 了突出 贡献。 

代谢工 程的多 学科性 质毫无 疑问成 为代谢 工程实 现其目 标的一 个有利 条件。 与此 同时, 
这就使 得必须 将代谢 工程与 相关领 域区分 幵来。 在我们 看来, 代 谢工程 的独特 点在于 包含如 
下 概念: 代谢 途径、 代谢通 量和在 简单途 径及更 实际的 代谢网 络中控 制代谢 通量的 因素。 此 
外, 代谢 工程必 须包括 实验和 理论两 种方法 用以胞 内代谢 通量的 确定, 具体方 法包括 用物质 
平衡、 同位素 标记、 光谱 学方法 (如 核磁 共振) 及 衍生发 展而来 的方法 (如 气相 色谱- 质谱) 
来测定 关键代 谢物的 同位素 含量和 (或) 分 子量分 布等。 由于这 些测定 结果与 生成这 些代谢 
物的 途径通 量的大 小是相 关的, 因此可 以利用 这些信 息来推 测代谢 通量。 途径 通量的 概念、 
胞内 通量的 确定方 法以及 通过代 谢通量 的系统 研究所 得到的 结论, 被统 称为代 谢通量 分析。 
这在整 个通量 控制研 究中占 据重要 位置, 本 书对此 将详尽 介绍。 

1.1 代谢 工程的 重要性 

代 谢工程 是涉及 宽阔的 基础研 究和重 要实用 价值的 领域。 代 谢工程 的基本 贡献在 于其对 
胞 内通量 控制的 测定和 理解。 如前 所述, 一些代 谢图谱 尽管很 详尽, 但 很少表 达出通 过不同 
途径 的碳、 氮 及能量 的实际 通量的 信息。 结 果是, 尽管这 些代谢 图提供 了营养 物质转 化为产 
品、 能 量以及 还原力 的可能 路线, 但 并没有 揭示出 在特定 条件下 处于活 性状态 的实际 代谢途 
径。 代谢通 量分析 揭示途 径参与 一个总 的代谢 过程的 程度。 此外, 通量 控制的 阐述为 在关键 
代谢分 支点合 理处理 所观察 到的通 量及通 量分布 提供了 机理的 基础。 由 于这些 通量是 在胞内 
条 件下确 定的, 代谢通 量分析 允许对 胞内和 胞外醇 催化特 性进行 正确的 比较。 最后, 代谢通 
量提 供了比 较菌株 变异体 的总的 基础。 即使这 些菌株 的发酵 特性有 区别, 但如 果关键 分支点 
处的 代谢通 量分布 并没有 改变, 那 么这些 发酵特 性的差 异相对 来说是 不太重 要的。 

代 谢工程 给化学 工程师 提供了 从事生 物学研 究的一 个极好 机会, 因 为它可 以直接 利用动 
力学、 传递以 及热力 学的核 心主题 去分析 代谢网 络中的 反应。 在此意 义上, 代 谢网络 可以看 
成 一个化 工厂, 其中 的单元 就是各 个单个 的醇, 因 此也有 类似的 设计、 控制 和优化 问题。 如 
果想 通过对 所选的 SI 的扩 增来扩 大微生 物的碳 通量, 我 们可以 得益于 化工厂 的放大 原理, 即 
一些 关键操 作单元 的协调 放大。 类 似地, 产 率最优 取决于 通过最 优通量 分布所 得到的 副产物 
最小。 当然, 只有当 控制通 量的因 素被首 先识别 并被充 分理解 之后, 通量优 化才有 可能。 

5 



代 谢工程 的另一 贡献源 于其特 别强调 集成和 量化的 方法。 代 谢工程 的一个 重要目 标是理 
解代 谢途径 的整体 功能, 最 好是通 过代谢 途径结 构单元 (即 组成 的生化 反应) 的整 合来进 
行。 然而, 系统 的特性 并不是 其各组 成单元 的简单 加和, 因此, 当利用 一个个 基因和 反应根 
据 遗传学 和酶的 信息来 尝试重 新构建 细胞特 性时, 必 须处理 复杂性 问题。 为了 提供综 合性细 
胞 功能的 需要, 对 于还原 论者多 年研究 成果的 许多单 独的信 息进行 整合, 我们 预期将 会得到 
日益 增多的 关注。 随着 基因组 学研究 所预料 的信息 激增, 这 种需求 将更加 明显。 在这 种情况 
下, 代谢工 程为使 生物信 息得到 升级, 并 综合运 用这些 信息达 到开发 有用产 品和过 程的目 
的, 提供了 有用的 平台。 同样, 得益 于代谢 工程领 域进一 步研究 的基础 生物化 学及代 谢的重 

要性 问题。 包括 总的生 物控制 结构、 分层次 调节结 构及酶 反应的 通道效 J[gj:channeling ef- 
fects) 等 o 

为了研 究细胞 代谢, 由代 谢工程 所提供 的知识 框架还 需要补 充适当 的测量 以取得 最好结 
果。 因此, 为了 解密代 谢或其 它反应 网络, 代 谢工程 在表征 至关重 要的测 量结果 方面, 起着 
关键的 作用。 在代谢 网络研 究中, 这 使人们 更加注 意到与 胞内通 量测量 有关的 问题。 对于信 
息网络 研究, 为了 阐明和 量化以 蛋白质 为中介 的级联 反应所 处理的 信息通 量时, 代谢 工程同 
样 可以确 定分析 方面的 需要。 在所提 供的框 架中, 由于 这些测 量所带 来的益 处日益 明显, 这 
可推 动着这 些检测 仪器的 发展。 

如上节 所述, 对 代谢途 径中通 量控制 结构的 阐明, 为一 个细胞 催化剂 的最优 瞎分布 的合理 
设计 提供了 巨大的 机遇。 这种 活动应 看做是 对分子 生物学 工具箱 的一种 补充, 这 些工具 用于完 
成基 因转移 和其它 类似的 修饰等 工作。 实 际上, 这些 方法在 近几年 已发展 得非常 迅速, 以至于 
为 识别目 标基因 和酶而 进行的 代谢途 径的合 理分析 已成为 定向优 化细胞 功能的 限制性 因素。 之 
所以这 么说, 是因 为直至 目前的 观察, 基因工 程开拓 性发展 20 年后的 今天, 现 代生物 技术在 
燃料、 化学 品或材 料生产 (工 业酶 除外) 等领域 几乎没 有重大 应用。 尽管 前四大 生物技 术公司 
中有两 家最初 将商业 目标集 中在这 几个领 域内, 但由 于后来 又认识 到医药 保健行 业在技 术上更 
容易 鉴别, 且 经济上 更有吸 引力的 机会, 所以这 些公司 又将发 展方向 转移到 了医药 领域。 现在 
有理由 认为, 生 物技术 应用的 前景正 在迅速 改变, 而 且未来 的发展 机会将 包括制 造领域 的许多 
应用。 有 三种驱 动力支 持这种 说法: 两个是 经济方 面的, 一个是 技术方 面的。 

生物 技术在 制造领 域应用 的第一 个驱动 力是: 世界 范围内 糖类原 材料生 产量的 持续增 
加。 这 种资源 的最天 然的应 用就是 通过生 物技术 生产衍 生物。 这些产 品中有 些已开 辟了市 
场, 但 是许多 产品, 尤其是 在材料 领域的 许多产 品将有 全新的 应用, 存 在着令 人鼓舞 的商业 
机遇。 第二个 驱动力 就是生 物技术 产品生 产成本 的持续 下降, 而 化学过 程生产 的产品 成本的 
不断 增加的 趋势。 形 成这种 趋势的 原因虽 不完全 清楚, 但 是大规 模发酵 生产的 规模效 益的实 
现以 及化学 过程所 造成的 日益增 加的环 境负担 都是形 成这种 趋势的 因素。 我们注 意到, 并非 
所有 的生物 技术过 程都完 全能与 化学合 成过程 竞争, 但是 人们已 普遍认 识到两 种过程 的成本 
正以不 同的斜 率在改 变着, 而且 交叉点 将很快 出现。 根据工 业界科 学家的 说法, 加速 这种趋 
势的极 为重要 的因素 就是: 在生物 技术生 物加工 过程中 由代谢 工程所 导致的 产品选 择性的 
改进。 

最后一 个驱动 力是通 过所发 展的技 术力量 —— 现 代分子 生物学 技术。 这些 技术虽 然与用 
来定位 需要操 纵的关 键醇的 匹配能 力还不 一致, 但 近几年 的进展 有理由 使我们 对于方 法学的 
发 展感到 乐观。 这 些进展 将使我 们能够 识别代 谢网络 中的关 键雜, 识别 为使目 标产品 的得率 
得到大 幅度改 变而需 要进行 修饰的 类型。 
6 



在工业 生产中 代谢工 程能做 出重大 贡献的 一些特 定领域 包括: 发酵 法及在 完整植 物中表 

达 (PHA 的生 物合成 )、 生 产热塑 性塑料 (其 目前由 石油路 线生产 )、 新材料 的生产 以及诸 
如聚 酮物等 新的生 物活性 物质的 生产。 胶类、 溶剂、 多糖、 蛋 白质、 各种抗 生素、 食品、 沼 
气、 寡肽、 醇类、 有 机酸、 维 生素、 氨 基酸、 细菌 纤维素 薛、 谷胱 甘肽衍 生物、 脂类、 油类 
以及色 素是目 前通过 生物法 生产的 一部分 产品, 或 是目前 主要在 微生物 中进行 代谢操 作的目 
标 产品。 代 谢工程 原理的 突破将 会对这 些过程 的效率 和经济 学产生 直接的 影响。 

需 要强调 的是: 在工 业上, 代谢 工程的 最终应 用目标 就是设 计和创 造出最 优的生 物催化 
剂, 以达到 目标产 品的最 大得率 和生产 能力。 从这 个意义 上讲, 代谢工 程等同 于化学 加工工 
业中 的催化 作用, 尽管 很难准 确预测 代谢工 程领域 的近期 方向, 但是上 述的类 似使我 们很容 
易 展望其 长期的 影响。 这 种影响 首先来 自 于以应 用分子 生物学 为基本 核心的 全新工 业的发 
展, 以 及由应 用分子 生物学 而产生 的可行 技术。 正 如在世 纪之交 出现的 化学工 程是以 化学为 
中心实 现其工 业应用 的领域 一样, 我们可 以展望 为了发 展分子 生物学 的工业 应用, 将 会出现 
一个生 物化学 (或 生物 代谢) 工 程的新 领域。 代 谢工程 的主要 范例效 仿于化 学工程 范例。 从 
这个方 面讲, 旨在为 过程优 化而开 发生物 催化剂 的代谢 工程, 将 在生物 加工过 程中起 着与在 
化学 过程中 应用多 年的催 化作用 相同的 作用。 正如 许多化 学过程 仅仅是 在开发 出合适 的催化 
剂 后才成 为现实 一样, 生物技 术的巨 大潜力 只有在 很大程 度上通 过代谢 工程开 发出有 效的过 
程生 物催化 剂后才 能变为 现实。 目前 对许多 不同微 生物和 其它种 类生物 基因组 的测序 工作使 
这些可 能性更 加接近 现实。 正是 基于这 一点, 代谢工 程在工 业应用 的长远 潜力应 当予以 
评估。 

除了 上述生 产方面 的应用 之外, 代谢 工程在 医学领 域将产 生重要 影响, 主 要焦点 是通过 
识别 确切的 靶标进 行药物 开发、 疗 法设计 和致力 于基因 疗法的 设计。 目前, 人 们利用 上述方 
法确定 与特定 疾病有 关的一 个单个 酶反应 步骤为 靶标。 然而, 还 不能保 证一个 单个反 应的操 
作会 转化成 人体的 系统的 响应。 从 这个角 度看, 代 谢工程 在医学 方面的 应用与 前面提 到的在 
工业生 产上的 应用没 有什么 不同。 因而可 以得益 于代谢 工程的 发展: 即 在医学 处理中 对实验 
结 果进行 更好的 分析以 及应用 靶标合 理选择 方法。 

最近, 在化 学式中 包含有 几个手 性中心 的一类 新药正 在不断 生产。 由于这 种药物 分子是 
很 难用有 机化学 合成方 法来合 成的, 因而, 在总的 化学合 成过程 中已经 用薛来 进行其 中一个 
或多个 困难的 步骤。 人 们希望 通过将 表达产 品合成 过程中 所需的 所有酶 的基因 转入某 个微生 
物, 从而使 所有反 应步骤 整合在 一个单 个微生 物中。 从不 同生物 体中识 别并转 移这些 基因及 
其在 宿主细 胞中的 表达, 当今 已成为 制药行 业越来 越引人 注目的 主题。 这种应 用是代 谢工程 
的原 理为执 行某种 特定任 务在反 应途径 合成中 的又一 例证, 其不 是使用 相互独 立的单 个薛。 
通过 代谢工 程的引 入而导 致的技 术发展 将有助 于需求 量很大 的药品 生产。 

最后, 代谢工 程的概 念和方 法在医 学领域 的应用 即胞内 组织、 整合 器官的 功能和 总体代 
谢的 分析。 也许 通过肝 脏功能 的分析 能充分 体现出 这些可 能性。 虽然肝 脏的系 统功能 已被广 
泛 研究而 且总的 来说已 被充分 理解, 但是对 于肝脏 内部的 各种代 谢途径 对肝脏 器官功 能的贡 
献还没 阐明。 例如, 已 知肝脏 代谢在 糖原异 生过程 中及通 过脱氣 基作用 在尿素 生产中 起着重 
要 作用; 此外, 在肝脏 的正常 活动过 程中, 氣基 酸的吸 收和生 成有着 复杂的 分布。 然而, 这 
些功能 会因烧 伤而剧 烈变化 或对细 胞因子 和典型 应激激 素的药 物作用 而做出 强烈的 响应, 这 
些激素 包括: 胰增血 糖素、 复化可 的松和 肾上腺 素等。 肝 脏在整 个代谢 过程中 并不是 一个被 
动的参 与者, 相反, 肝 脏在调 节人体 中氮的 排除、 葡萄糖 生成以 及维持 生理的 氧化还 原作用 



和 能量状 态等方 面起着 积极的 作用。 人们已 充分了 解了使 这些功 能起作 用的整 个生化 反应网 
络, 然 而对于 参与加 工碳骨 架和氮 的特定 反应途 径还不 了解, 尤 其是还 不清楚 控制通 过主要 
代 谢途径 的碳、 氮通 量分布 的各种 因素。 由 于这些 因素对 于保持 正常条 件下或 诸如损 伤等干 
扰条件 下的肝 脏的功 能起着 重要的 作用, 因此很 有必要 识别出 这些因 素并对 其充分 表征。 所 
以这个 领域的 研究应 努力表 征肝脏 内正常 条件下 的糖原 异生、 尿 素生成 以及氨 基酸加 工的代 
谢过 程中主 要途径 的通量 分布。 这可 通过在 可控的 环境条 件下, 根据生 理介质 的进料 对灌注 
的肝 脏仿效 连续的 体系而 进行。 必 须通过 酶动力 学和代 谢物调 节来解 释这个 网络的 通量, 尤 
其是由 烧伤或 通过引 入细胞 因子或 激素等 介体而 引起的 通量的 变化。 最后, 正 常条件 下和由 
细 胞因子 及应激 激素等 物质刺 激的条 件下, 肝脏细 胞的细 胞培养 物系内 的关键 代谢途 径都需 
要被 识别。 这 两种条 件下的 关键代 谢途径 不同, 会 给我们 提供有 关整个 器官功 能的胞 内藤动 
力 学和代 谢物调 节是具 有重要 价值的 信息。 正是通 过这种 类型的 研究可 以使我 们对像 肝脏一 
样 的整个 器官的 实际功 能进行 更好地 理解, 这既 可以在 一个范 围广泛 的系统 构架内 进行, 也 
可 进行一 个个生 化反应 的总体 重建。 

1.2 本书 的概要 

本 书用于 阐明代 谢和代 谢工程 的方法 具有普 遍的适 用性。 然而, 有 些体系 根据其 本身的 
特性, 更加 符合这 里所说 的分析 类型。 同时, 我们 也注意 到对于 相似的 目标, 例 如代谢 

mmmmiMMMm^, 本书所 建议的 方法与 其它学 科所用 的方法 不同。 在 其它领 *,—Sffl 

填传^ LMitxii 圭物 系填— 赛〜 努力获 得代谢 通量、 控制 系数、 弹性 系数以 及其它 参数。 这些突 
变 株在竞 争性的 ^ 径上带 有缺陷 , 能 通过一 些胞外 代谢物 浓度变 化速率 的改变 来直接 测量通 
量。 尽 管这种 方法已 取得一 些令人 关注的 结果, 但总的 来说, 由 于一些 原因使 得这种 方法具 
有局 限性。 这种简 化的突 变株并 不总是 很容易 构建出 来的, 它 们通常 表现出 不同的 特性。 最 
后 的但并 非最不 重要, 人 们还不 清楚, 在这 些改变 了的体 系中, 观察到 的途径 是如何 与原来 
体系 中的途 径相联 系的。 本书中 Ji:5:— 法 是用来 研究未 经改变 的生物 系统, 但补 充了现 代仪器 
所允许 的尽可 能多的 测量。 利 用这种 方法, 从重 建的代 谢网络 中得到 了代谢 通量及 其衍生 
量, 以更好 地描述 速率和 标记代 谢物的 测量。 通过 在通量 确定过 程中引 人高冗 余度, 使得实 
际上代 表胞内 实际通 量值的 置信水 平得到 了很大 提高。 

以某种 方式, 我 们可以 在通量 测定和 材料结 构表征 之间寻 求某些 类比。 在 材料科 学中, 
没 有单一 的方法 能够提 供所研 究材料 的全部 结构。 然而 通过使 用若干 不同的 技术, 就 可以测 
定 出这种 材料的 结构, 其与 根据假 定的材 料结构 而进行 重建的 材料结 果极为 一致。 类 似地, 
我们可 以首先 假定一 个生化 网络, 并 确定其 通量, 以致 大量不 同的、 相互独 立的、 多 维的测 
量与 所假定 的生化 结构得 出的通 量预测 值非常 一致。 ' 

在开始 就描述 这个实 验体系 是很重 要的, 因为上 述方法 是最适 用的。 这种 体系包 括一个 
连续的 生物反 应器, 微生物 或其它 细胞在 其中生 长并达 到一个 稳态。 对 反应器 人口处 和出口 
处 的代谢 物进行 测量, 可 以得到 主要代 谢物生 成或消 耗代谢 速率的 精确估 计值。 另外, 还可 
以直接 向生物 反应器 引人精 确设计 的标记 的底物 脉冲, 这 种标记 性底物 被细胞 吸收, 并以各 
种 形式重 新出现 在所分 泌的产 物中。 最终 产物中 f i^'ii 元童的 丰余度 分析, 还有核 磁共振 

(NMR) 波 谱中代 谢物峰 值的精 细铸构 分析, 则^[|^谢通量的进一^解释提供了有力的结 

合。 这种 实验体 系的一 个非常 重要的 方面就 是稳态 概念, 这种稳 态是经 过几倍 于流动 反应器 
的停 留时间 之后最 终才达 到的。 在这 种条件 之下, 代谢通 量达到 稳态, 这时由 代谢控 制分析 

8 



所指 定的所 有重要 响应量 可以被 确定。 为了缩 短这些 实验的 周期, 分批 或流加 培养有 时可以 
代替连 续培养 体系。 然而, 我们 应记住 的是, 在 这种条 件下, 所 有的数 据点中 只有一 部分对 
代谢 通量分 析是有 用的, 这就是 那些当 环境条 件保持 相对不 变的情 况下所 采集的 数据。 然 
而, 在 系统地 改变实 验条件 方面, 其适应 性是有 限的。 很明 通, 从 根本上 来说, 流动 反应器 
系统才 适用于 微生物 和细胞 培养的 研究。 应当寻 求创造 性的替 代实验 系统, 以 利于其 它物系 

(如植 物和器 't'O 的 研究。 在前 述肝脏 功能) > 析中 所建议 的整个 器宫的 灌流培 养就有 可能作 

为一个 稳态恒 化器的 框架, 从而得 到关于 肝脏完 整功能 的宝贵 信息。 

这本书 包括两 部分, 由于读 者的背 景各不 相同, 第 I 部分介 绍了代 谢概论 及对代 谢进行 
综合 性定量 描述的 框架。 在这 里我们 并不打 算取代 能在其 它优秀 教科书 中找到 的生物 化学基 
本 原理。 我 们的目 的是将 这些知 识与总 体代谢 的内容 整合在 一起, 并利 用化学 反应工 程的概 

念 对其进 行系统 定量的 描述。 在第 2 章, 回顾 了细胞 反应: 从 物质运 输过程 开始, 接 下去是 
包括在 分解代 谢和合 成代谢 中基本 的生化 途径。 其中一 个重要 组成部 分就是 解反 一应中 获__ 
^|§量和在合成代谢中能量消耗的问题, 因为, 从中我 们可得 到在菌 体生长 物形 成过程 
^^正能量得率的宝贵信息。 进而, 利 用这些 平衡, 可将 整个代 谢中的 许多不 同的组 成部分 
通过其 对流通 代谢物 生成和 消耗所 做的贡 献整合 起来。 

第 3 章 介绍细 胞反应 模型化 的综合 框架, 包括 化学计 量学考 虑以及 在确定 反应速 率时使 
用的动 态物料 平衡。 额 外引人 关于能 量对细 胞功能 的一些 附加的 假设, 可以导 出一些 有用的 
系数 和速率 方程, 这些 已从经 验观察 到了。 从基本 原理和 合釋的 假设衍 生而来 的系数 的速率 
方程 为解释 实验数 据提供 了一个 合理的 基础。 一般 来讲, 速率方 程在细 胞模型 分析中 是最大 
的不确 定性的 来源。 因此, 不使用 关于生 化反应 动力学 的任何 假设, 而 仅仅根 据元素 平衡和 
能量 平衡来 研究大 量信息 是很有 用的。 这 就是第 4 章的 主题, 其 导致衍 生出速 率测量 必须满 
足的一 些约束 条件。 这 些约束 条件来 自基本 的元素 平衡, 并可用 做检验 测量与 假设的 生物化 
学之 间的一 致性。 当 这些平 衡不满 足时, 也 可用其 判别测 量误差 或假设 的生物 化学误 差的可 
能 来源。 第 I 部 分的结 尾对代 谢途径 的调控 进行了 评述。 从单个 醇或基 因水平 到操纵 子及整 
个细胞 水平, 对转 录调控 和酶调 控进行 了多层 次的代 谢控制 方面的 讨论。 还引 入了模 型来定 
量描 述效应 物和抑 制物在 薛 水平 上对 调控的 影响。 

第 n 部分首 先对途 径操作 的应用 进行了 广泛的 述评。 这是第 6 章的 主题, 其提供 了一些 
代谢 程有益 的应用 实例。 在介绍 这些实 例时, 我们 部分遵 从了在 Cameron 和 Tong 
(1993) 的工 作中建 议的代 谢工程 应用的 分类。 以功能 作为主 要分类 标准, 这 些例子 被分类 
为: 宿 主微生 物已能 生产的 化学品 的生产 改进, 扩 大菌体 生长和 产物合 成所需 底物的 范围, 
增 加了能 降解有 毒化合 物的新 的代谢 活性, 生 产出原 宿主不 能生产 的新化 合物, 使整 体的细 
胞性质 发生极 大的改 变等。 在大 多数情 况下, 举例中 提供了 详细的 途径、 主要 问题摘 要以及 
代谢工 程为解 决这些 问题所 采用的 方法。 书中举 的例子 很多, 旨 在提供 一个广 泛的应 用范围 
以便 能为将 来在其 它类似 的体系 中应用 时提供 指导。 

代谢工 程的一 个重^ £^>ltJ| 为 物购^ 含 成提岀 这可通 过在某 

一 j#^si¥ iggw ri^ir 出连接 一组特 定产物 和 -组 物的 所有可 y 的途径 ,成该 

任、 i。 S 过 ^^fiRT 复杂 T S 导致大 4 途径 产生。 有一种 算法, 能 够生成 途 i, 其 

^|¥整而且适宜于在合理的机时内完成, 这 部分内 容在第 7 章加以 介绍。 

第 8 章 详细介 绍了代 谢通量 分析。 首 先介绍 了理论 背景, 接 下来讨 论了为 解决很 复杂的 

体 系所需 信息的 数量和 类型。 取 决于体 系中所 含的途 径个数 和所做 的测量 个数, 可将 所研究 

9 



的系 统分为 正定、 超定 和未定 系统, 每种 情况具 有不同 的分析 类型。 在 确定胞 内通量 的方法 

中, 胞外 的测量 值是主 要的输 人量, 见第 8 章。 很 明显, 仅仅通 过胞外 的方法 确定通 量的解 
析 是很有 限的, 附加 通量和 (或) 通 量分配 比可通 过引入 更多的 测量而 得到, 尤其是 通过使 
用 同位素 标记来 获得。 在第 9 章 中列举 了一些 实例, 用以 说明在 测定通 量过程 中如何 使用物 
质 平衡、 放射性 标记、 光谱 学方法 以及气 相色谱 -质谱 (GC-MS) 等测量 方法。 在第 10 章 
中 通过对 两个具 体实例 的详细 研究, 完 成了代 谢通量 分析的 主题。 这些 实例研 究来自 于作者 
以谷氨 酸产生 菌生产 氨基酸 和哺乳 动物细 胞培养 的一些 经验。 

在敏 感性分 析的框 架中, 可以 很好地 进行通 量控制 分析, 这 种敏感 性分析 用来定 量描述 
在每一 个途径 上通量 控制的 程度。 代谢控 制分析 (MCA) 提供 了一些 方法, 用于描 述由单 
个酶或 影响酶 活性的 因素所 施加的 (酶) 局部 控制和 (系统 ) 全局 控制的 程度。 在 MCA 的 
框 架中, 有 可能将 局部的 酶反应 动力学 和整个 途径的 通量控 制联系 起来, 这样, 就可 以根据 
组 成的各 个单个 反应的 动力学 和调节 特性, 重新构 建起代 谢网络 的系统 功能。 第 11 章叙述 
了 MCA 的基 本概念 以及线 性途径 和分支 途径中 MCA 的全面 描述, 其中, 许 多讨论 是围绕 
着 运用通 量控制 系数作 为通量 或代谢 物控制 的度量 标准。 取决 于可利 用的信 息量, 可 以选择 
严格的 定量的 MCA 方法, 或第 5 章 中更加 定性地 估计代 谢物或 节点的 刚性。 第 11 章以介 
绍大扰 动的理 论作为 结束, 这是 MCA 的重要 扩展, 它有 助于从 实际的 大扰动 实验中 测定通 
而 不是像 其数学 定义所 表达的 那样, 根据无 限小的 扰动实 验来计 算这些 系数。 

在 复杂的 代谢网 络中, 应用 MCA 的 一个重 要的限 制就是 这样的 系统中 含有大 量的反 
应。 作 为从上 至下方 法的一 部分, 第 12 章 介绍了 反应分 组法及 其分组 规则, 以便得 到可靠 
的 组控制 系数的 估计。 在这 一章中 定义了 组控制 系数和 组弹性 系数, 为 复杂反 应网络 的系统 
解剖 和分析 提供了 标准。 通过使 用一个 代谢网 络的替 代模型 来模拟 实验, 使这 些思想 得到进 
一步 发展并 作举例 说明。 使用替 代细胞 模型是 一种很 有用的 方法, 因为 它允许 我们绕 开在通 
量优 化策略 导出中 所需的 耗时且 昂贵的 实验。 这一 章介绍 了系统 地使用 反应分 组规则 来识别 
代谢网 络中的 关键分 支点。 对 分支点 处的反 应进行 分组, 以 及相应 组控制 系数的 确定, 为每 
个 反应组 对所关 心的通 量或代 谢物的 控制程 度提供 了度量 标准。 这种方 法可以 在复杂 网络中 
将 通量控 制进行 定位。 第 13 章 介绍了 利用这 些结果 进行定 向通量 扩增的 策略。 其目 标是通 
过所 选反应 的协同 放大而 使网络 的通量 增加, 而 不是常 用的单 个反应 策略。 需要 指出, 第 
12 章和第 13 章介 绍的方 法完全 是以组 通量测 量和大 扰动理 论为基 础的, 其 中包括 一些假 
定。 因 此确保 满足这 些假设 是很重 要的, 为此 目的第 13 章发 展并介 绍了一 些内部 的检测 
方法。 

这本 书以第 14 章作为 结尾, 其 中讨论 了几个 关于细 胞途径 热力学 的重要 概念。 首先叙 
述了与 生化反 应相关 的一些 热力学 原理, 然后将 基于单 个反应 的标准 吉布斯 (Gibbs) 自由 
能变化 (包 括数 值及正 负号) 的热 力学可 行性概 念扩展 到反应 途径。 结果 表明, 标准 吉布斯 
自 由能变 化的正 值程度 通过代 谢物浓 度的差 异来克 服的方 法有局 限性。 当 具有正 AGG 的反 
应 数量增 加时, 需 要抵消 这些大 的正值 所需 的所有 代谢物 浓度的 差也要 增加。 在一个 
代谢途 径中, 如果 限制其 所允许 的最小 浓度, 那么 反应步 骤或一 系列反 应步骤 可以看 做在热 
力学上 是不可 行的, 这样就 在代谢 途径中 建立了 局部的 或更加 分散的 热力学 瓶颈。 尽 管热力 
学瓶颈 不一定 要与动 力学限 制条件 相关, 但 是有可 能从热 力学分 析中获 得一些 关于动 力学瓶 
颈的 信息。 通过 使用这 一章所 述的热 力学和 不可逆 热力学 概念, 可以达 到上述 目的。 
10 



参 考文献 



Bailey , J . E. (1991). Towards a science of metabolic engineering. Science 252, 1668-1674. 

Cameron, D. C. & Tong, I. -T. ( 1993). Cellular and metabolic engineering. Applied Biochemistry Biotechnology 
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Heinrich , R. & Rapoport, T. A. (1974). A linear steady-state treatment of enzymatic chains. European Journal Bio- 
chemistry . 42, 89-95. 

Kacser, H. & Burns , J . A. (1973). The control of flux. Symposium Society of Experimental Biology 27, 65-104. 
Kellogg , S. T. , Chatterjee, D. K. & Charkrabarty , A. M. (1981). Plasmid-assisted molecular breeding: new tech- 
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MacQuitty , J. J . (1988). Impact of biotechnology on the chemical industry. ACS Symposium Series 362, 11-29. 
Nerem, R. M. (1991). Cellular engineering. Annals of Biomedical Engineering 19, 529-545. 

Stephanopoulos , G. & Vallino, J . J - ( 1991) . Network rigidity and metabolic engineering in metabolite overproduction. 
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Timmis, K. N. , Rojo, F. & Ramos, J. L. (1988). In Environmental Biotechnology, pp. 61-79. Edited by G. S. 

Omenn. New York, NY: Plenum Press. 
Tong, I. -T. , Liao, H. H. & Cameron , D. C. (1991). 1 ,3-Propanediol production by Escherichia coli expression 

genes from the Klebsiella pneumoniae dha regulon. Applied and Environmental Microbiology . 57, 3541-3546. 



n 



第 2 章 细胞代 谢综述 

代谢途 径化学 计量学 的确立 是细胞 代谢定 量处理 的基础 , 这 需要懂 得一些 基本的 生物化 
学过程 以及活 细胞体 内通常 存在的 不同代 谢途径 方面的 知识。 这 一章我 们将回 顾活细 胞的基 
本代谢 功能。 主要 集中于 细菌和 真菌的 代谢, 也 包括高 等真核 生物生 物化学 的一些 方面。 为 
了更 全面地 讨论一 般的生 化概念 和代谢 过程, 读 者可参 考一些 优秀的 生物化 学书籍 [如 

Zubay (1988), Stryer (1995), 或 Voet and Voet (1995)]。 本章的 目的不 是取代 生物化 
学, 而 是通过 将生物 化学概 念与细 胞代谢 的总体 框架进 行综合 处理, 对 通常的 生物化 学课程 
进行 补充。 从这 一方面 来讲, 这 一章尽 管自成 一体, 但 其内容 紧凑, 对 即使具 有较少 生化背 
景 (例 如只有 大学初 级生物 化学课 水平) 的读者 也能很 好地读 懂它。 

2.1 细胞代 谢概述 

活细 胞体内 含有大 量不同 的化合 物和代 谢物, 其中水 是含量 最多的 组分, 约占细 胞物质 

总量的 709()。 细 胞质量 的其余 部分, 通常 指干细 胞重生 物质, 主 要包括 大分子 DNA, 核糖 
核酸 (RNA), 蛋 白质, 脂类以 及碳水 化合物 (见表 2.1)。 这些 大分子 合成和 组织成 一个功 
能 细胞是 通过几 个独立 反应步 骤而进 行的。 合成 这些大 分子物 质的前 体物来 自 一个数 量不多 
但被快 速利用 的低分 子量前 体库, 这 些低分 子量化 合物是 由葡萄 糖或其 它碳源 最终生 成的代 
谢物 通过生 化合成 而不断 补充的 (见图 2.1)。 根 据其在 整个细 胞合成 过程中 的主要 功能, 
这些不 同的反 应可以 分为如 下几类 (Neidhardt et al, 1990)。 

* 组 装反应 包 括如下 过程: 大分 子物质 的化学 修饰, 进而 运输到 细胞中 预先指 定的位 
置, 最后 缔合形 成细胞 组织, 如细 胞壁、 细胞膜 和细胞 核等。 这 些反应 在本书 中将不 再进一 
步 介绍。 

* 聚 合反应 活化的 分子定 向有序 地键合 成长的 (分 支或不 分支) 聚 合链。 相当 数量的 
结构单 元通过 这些反 应形成 大分子 物质。 

* 生物合 成反应 通过这 类反应 生成聚 合反应 中所需 的结构 单元, 同时也 生成辅 81 和相 
关 的代谢 因子, 包 括信号 分子。 有 一些生 物合成 反应, 发 生在称 为生物 合成途 径的功 能单元 
中, 每 一个反 应包括 一个或 一系列 顺序的 反应, 最终 生成一 个或多 个结构 单元。 这些 途径容 
易 识别, 并 被整体 控制。 在 一些情 况下, 这 些反应 由藤来 催化, 这些晦 是由形 成一个 操纵子 
的一 组相邻 基因转 录来的 mRNA 制得的 (见第 5 章)。 所 有的生 物合成 途径都 起始于 12 种 
前体 代谢物 之一。 一些 途径直 接从这 种前体 代谢物 开始, 另一些 途径间 接地从 一个中 间物的 
分支 或一个 相关途 径的末 端产物 开始。 、 

* 供 能反应 用以 生成生 物合成 所需的 12 种前体 代谢物 P 同时, 还以 ATP 的形 式产生 
吉布斯 自由能 用于生 物合成 反应、 聚合 反应和 装配反 最后, 供能 反应还 生成生 物合成 
反应所 需的还 原力。 供能 反应包 括称作 分解代 谢途径 (降 解底物 及氧化 底物) 的所 有生化 
途径。 ' 

不同 的生化 途径借 助于参 与多个 途径的 代谢物 而联系 起来, 这些途 径通过 不同分 支将一 
个又 一个反 应顺序 连接了 起来。 途径 之间另 一种层 次的整 合是通 过辅助 因子分 子来协 调的。 
12 



表 2.1 大 肠杆菌 细胞的 一般大 分子平 均组成 



大分子 


占 总细胞 千重的 百分率 


分 子的不 同种类 


大分子 


山- 总细胞 干重的 分率 


分 f 的不 同种类 


蛋白质 


55.0 


1050 


脂类 


9.1 


4 


RNA 


20.5 




脂多糖 


3.4 


1 


rRNA 


16.7 


3 


肽聚糖 




1 


tRNA 


3.0 


60 


铕原 




1 


mRNA 


0.8 


400 


可溶库 


3.9 




DNA 


3.1 


1 









注: 此 表数据 来自于 Ingrahamet al (1983)。 



糖类 



i5 输和 « 酸化 



前体代 ffl 物 



生 物合成 



< ATI 



ADPHi 



«!J 酸 d 糖库 



ATP 



NADU J 糖酵解 -i* 酸戊 糖途径 
丽 H 1 NADH 

发 W 



丙嗣酸 



结 构单元 



NADH 



aw 八 

3k. 口 



代谢 



TCA- 循环 



大分子 



代 谢产物 




^化 《 酸化 



合 成代谢 分 解代谢 

图 2.1 利用 糖类进 行细胞 合成的 总框架 
糖 类被运 输进人 细胞, 首先被 酸化然 后进入 8? 酸己 糖库。 8? 酸化 可独立 于运输 过程或 与之相 耦合。 8? 酸己搪 
进入 搪酵解 反应并 生成丙 銅酸, 或被 用于合 成一些 碳水化 合物: 丙銅酸 可通过 呼吸循 环氧化 成二氧 化碳, 还可 
以通过 发酵途 径转化 成代谢 产物。 对于 好氧微 生物, 在糖 酵解和 TCA 循环中 生成的 NADH 形式 的还原 力可通 
过 氧化磯 酸化被 氧化成 NAD' , 而对于 厌氧微 生物. NAD' 是通 过发酵 途径生 成的。 糖酵解 途径和 TCA 循环 
中 的一些 中间代 谢物可 作为前 体代谢 物用于 生物合 成结构 单元。 这 些结构 单元被 聚合成 大分子 物质. 并 最终被 

组 装成不 同的细 胞结构 

这些辅 助因子 包括总 的流通 代谢物 ATP, NADH 和 NADPH 等, 其对 许多反 应是必 不可少 
的。 由于这 些辅助 因子在 供能生 物合成 反应中 的中心 作用, 通 过它们 连续地 生成, 并 且利用 
这 些辅助 因子把 同一途 径中和 不同途 径中的 各个反 应连接 起来, 如图 2.1 所示。 

生化 途径可 以用化 学方法 通过在 一长串 反应中 进行的 代谢物 的连续 转化来 组织, 也可用 
物理方 法通过 在细胞 的不同 部位和 不同结 构中起 作用来 组织。 这 种物理 上的组 织结构 在真核 
生 物中最 明显, 其中膜 结合的 结构为 系列或 单个生 物化学 反应的 定位提 供了明 M 的证 据。 因 
此, DNA 和 RNA 的合 成在细 胞核中 进行, 许 多供能 反应和 圭物合 ^反应 在线 ^^^!»进 行。 

这种组 织结构 也许对 细胞的 整体代 谢具有 重要的 影响, 但由于 杂 i^r 而且 缺乏有 关局部 

浓 度变化 的详细 信息, 我们将 不再进 一步讨 论代谢 途径组 织结构 方面的 内容。 

除了代 谢反应 和途径 的化学 和物理 (结构 ) 的组 织外, 另一 个非常 有用的 分类依 据是以 
特征时 间来表 示其动 力学。 细 胞代谢 中许多 不同的 反应都 影响着 各种途 径和整 个生长 过程的 
动 力学。 由于不 同反应 在不同 的时间 尺度上 进行, 因此, 当考 虑一个 反应途 径时, 只 需包含 
那 些在时 间尺度 上有可 比性的 反应。 可以假 设较快 反应在 慢速反 应的上 游处于 平衡, 或在一 
• 13 



个慢 速反应 的下游 使代谢 物处于 稳态。 同时, 更 慢的反 应可被 忽略, 因 为这些 反应在 完全不 
同 的时间 尺度内 进行, 同时在 感兴趣 的时间 框架内 其影响 极小。 在一个 给定时 间框架 内的反 
应的相 关性通 常通过 比较各 个反应 的松弛 时间来 评价, 松 弛时间 被定义 为近似 一级反 应过程 

的特 征时间 (见 方框 2.1)。 图 2.2 对活 细胞内 进行的 不同过 程的松 弛时间 进行了 比较。 当 
某过 程的松 弛时间 比目的 系统的 松弛时 间长很 多时, 那么通 常认为 这个过 程是冻 结的。 例 
如, 突 变过程 一般慢 于细胞 生长, 因此 在研究 细胞生 长时, 可以忽 略突变 过程。 相反, 当某 
一过 程的松 弛时间 远小于 系统的 松弛时 间时, 通常认 为这个 系统正 处于拟 平衡。 因此, 薛催 
化反 应只有 毫秒级 的松弛 时间, 与 细胞生 长的松 弛时间 (通 常为小 时级) 相比 雜反应 速率非 
常快。 因此, 酶 反应能 对新的 环境条 件迅速 响应, 反应 速率和 相关的 代谢物 可达拟 稳态。 如 
果一 个过程 的松弛 时间是 目的系 统松弛 时间的 10 倍, 那么 这个过 程可认 为是冻 结的, 如果 
一 个过程 的松弛 时间是 目的系 统松弛 时间的 1/3, 那么 该过程 可认为 处于拟 稳态。 这 就导出 
如 下重要 结论: 通过忽 略在目 的系统 时间尺 度范围 之外进 行着的 反应和 途径可 显著简 化代谢 
过程。 

10_6 10— ■* 10—2 10" 10^ 10"* 10* 

1 1 1 1 1 h- —— I 松 弛时间 /S 

物 质反应 mRNA 控制 突变 

, 别 构控制 . 酶诱导 

混 合梯度 

分批、 流 加-分 批或连 续培养 转变的 动力 学 
细 胞生长 

图 2.2 不同 细胞过 程的松 弛时间 与生物 反应器 操作松 弛时间 的比较 



方框 2.1 松 弛时间 

对于 反应物 为一级 反应速 率的化 学反应 

r = kc ( 1 ) 

松 弛时间 定义为 反应速 率常数 的倒数 

r = \/k (2) 
松弛 时间等 于过程 的特征 时间。 如果 对一个 处于稳 态的体 系进行 扰动, 那 么松弛 时间就 
是体 系从原 来的稳 态达到 新的稳 态所需 时间的 0.63 倍 [(1 - l/e)=0.63]o 如果过 程不是 
一 级的, 那 么松弛 时间的 定义被 扩展为 

r = c/r(c) (3) 
表示如 果该过 程是一 级过程 时应有 的特征 时间。 

对于 非一级 过程, 很 明显松 弛时间 是反应 物浓度 的函数 (更 一般 地说, 是所 有状态 
变量 的函数 )。 因此, 松弛时 间不是 常数。 但实 际上代 谢物浓 度的变 化一般 都限制 在一定 
范 围内, 这 也就将 实际的 松弛时 间限定 在一个 合理的 时间范 围内。 

对于一 个单分 子反应 

A-^B (4) 



14 



通 过物料 平衡, 其动 力学可 描述为 




= - ViKc^) + z;-i(cb); <:a + cb = 定值 


(5) 


通 过围绕 体系平 衡进行 线性化 处理, 我们可 以写出 A 物 质浓度 与其平 衡浓度 


CA,0 的偏 


差, 艮卩 <TA 二 CA 一 CA.Oo 




"d7 UcA dcB h "A(0- <^A"0)CXp( r ) 


(6) 


式中特 征时间 r 由下 式表示 




( dvi 1 dv - 1 \ 
\dcA dcB / 


(n\ 
\1) 


或对一 级 动力学 ("l = yhcA 和 t^2=々- ICB) 




々 

々 

II 


(o\ 
\o) 


类 似地, 对于 双分子 反应有 




A + B*^ C + D 


(9) 


其特征 时间为 




T = [^l(cA,0+ C"B,o) + k -l(Cc,0+ Cd.0)]—1 


(10) 


这里, 下 标中的 指平衡 浓度。 





2.2 运 输过程 

不同种 类的物 质穿越 原生质 膜运输 有三种 不同的 机制: (1) 自由 扩散; (2) 促进 扩散; 
(3) 主动 运输。 前两种 机制是 被动的 过程, 原 则上不 需要吉 布斯自 由能的 供应。 在自 由扩散 
和 促进扩 散中, 物质沿 着浓度 梯度被 运输。 这两种 运输机 制的不 同之处 在于促 进扩散 是需要 
以载 体为中 介的, 也就 是说, 在物质 运输过 程中需 要特定 的载体 或跨膜 蛋白, 而自由 扩散是 
分子 运输, 在 化学势 能差的 驱动下 进行。 第 三种运 输机制 即主动 运输, 它允许 物质逆 着浓度 
梯 度进行 运输, 但 需要吉 布斯自 由能的 参与。 主动 运输在 需要特 定的膜 定位蛋 白或渗 透醇调 
节方 面与促 进扩散 相似。 
2.2.1 被 动运输 

一个化 合物以 自由扩 散的方 式通过 脂膜包 括三个 步骤: (1) 化合物 从胞外 培养基 到膜相 
的 传递; (2) 化合 物在脂 双层中 扩散; (3) 化合 物从膜 相到细 胞质的 传递。 通 常细胞 质和胞 
外 培养基 具有相 似的物 理化学 特性, 因此第 (1) 步和第 (3) 步十分 类似。 一个化 合物在 
两 相之间 的传递 (即 从胞外 培养基 到膜或 从膜到 细胞质 ), 与扩 散过程 相比一 般是很 快的, 
因此可 假定处 于平衡 状态。 因此, 所 运输的 化合物 在脂层 相际间 的浓度 应等于 其在水 相中的 

浓 度与分 配系数 Kpar 的乘积 (分配 系数被 定义为 化合物 在脂双 层中的 溶解度 与在水 中的溶 

解度之 比)。 分子 扩散的 质量通 量遵从 Fick 第一 定律, 所产 生的扩 散通量 (mol 'm — 2 ) 可 
用下 式表示 

rtran = Ca - C = P(c^- cj (2.1) 

" mem 

式中, Dmem 表示化 合物在 脂双层 中的扩 散系数 (m 2 'S— '); C^mem 为膜 的厚度 (m) ; 和 

15 



Cc 分别 表示该 化合物 在非生 物相中 和细胞 质中的 浓度。 方程式 (2.1) 中的三 个参数 Dmem, 
^^mem和Kpar通常可合并为一个参数[(DmemKpar)/^^me^J, 称为渗 透系数 P (Stein, 1990)。 

在式 (2.1) 中, 质量通 量的定 义基于 细胞表 面积, 但通过 乘以细 胞的比 表面积 aeeii[m 2 - 

g 一 1( 干重 )] 就可以 将其转 化成每 克干重 的质量 通量。 

通过被 动扩散 所运输 的化合 物有: 二氧 化碳、 氧、 氨、 脂肪酸 和一些 醇类。 在解 离状态 
时, 有机酸 在脂膜 中实际 上是不 溶的, 但 许多未 解离的 有机酸 却是非 常可溶 解的。 未 解离的 

乳 酸和乙 酸的渗 透系数 分别为 5.0X l(r 7 m's — 1 和 6.9X 10 — 5 m's— 1, 这 就意味 着这些 化合物 
穿越 原生质 膜时扩 散得很 迅速。 由于 主要是 未解离 形式可 以自由 扩散, 因 此像乳 酸和乙 酸这样 
的化 合物, 总的运 输情况 对其解 离程度 进而对 细胞质 和胞外 培养基 两者的 pH 都很 敏感。 对于 
许多生 物体, 穿越细 胞质膜 有一个 pH 梯度 (细 胞内的 pH 高), 这 就会形 成质子 进入细 胞的净 
流人。 为 了保持 胞内低 的质子 浓度, 必须 在消耗 ATP (腺 昔三 磷酸) 的条 件下, 由质膜 ATP 酯 
酶将这 些质子 泵出细 胞外。 因此, 有机酸 的存在 会导致 ATP 的 净消耗 (见例 2.1)。 



【例 2.1】 有 机酸引 起的能 量产生 与消耗 的解耦 

Verduynet 等 (1992) 的一 个研究 中列举 了活细 胞内有 机酸对 ATP 消耗的 影响。 通过 
分析苯 甲酸对 酿酒酵 母呼吸 作用的 影响, 他 们发现 菌体量 对葡萄 糖的得 率随酸 浓度的 增加而 
下降, 同时 葡萄糖 和氧气 的比吸 收速率 增加。 因此, 对菌 体合成 来说, 葡萄糖 并没有 被有效 
利用, 这种结 果可解 释为: 由于苯 甲酸的 质子解 耦作用 导致了 ATP 的 消耗。 在另一 个研究 
中, Schulze (1995) 分析了 酿酒酵 母厌氧 培养中 苯甲酸 对菌体 合成时 ATP 消耗的 影响, 发 
现菌体 合成时 消耗的 ATP 随着 苯甲酸 浓度的 增加而 呈线性 增加, 这是 苯甲酸 质子解 稱作用 
的又一 结果。 Henriksen 等 (1998) 推导出 一系列 方程, 以定量 表示由 于有机 酸质子 梯度的 
解稱 作用所 引起的 ATP 消耗 情况。 其 研究的 目的是 定量表 示苯氧 基乙酸 (青 霉素 V 生产的 
前 体物) 对产黄 青霉菌 中质子 梯度的 影响。 苯氧基 乙酸的 解离和 未解离 形式均 可以以 被动扩 
散 的方式 通过细 胞膜, 但未 解离的 酸有更 大的溶 解度, 也就 是说具 有较大 的分配 系数, 因此 
运输得 更快。 为了描 述以这 两种形 式通过 细胞膜 的质量 通量, Henriksen 等 (1998) 应用式 
(2.1) 得 出下式 

rtTan,,= Pi^cMiCaJ - (1) 

式中, 下标 Z' 表示酸 的解离 形式或 未解离 形式。 产黄青 霉细胞 的比表 面积为 2.5rn 2 *g 一 1 
(干重 ), 苯 氧基乙 酸的未 解离形 式和解 离形式 的渗透 系数被 求出, 分别为 3. 2X10 一 6 
m's— 1 和 2.6Xl0 — i0m's — i (Nielsen, 1997)。 

由于酸 的未解 离形式 和解离 形式在 细胞质 膜两边 处于平 衡状态 (HA— H++A— ) 且 
平衡 常数为 Ka, 所以两 种形式 的酸浓 度和总 酸浓度 的关系 可用下 式表示 

r 丄 = r r lOPKa-pH 二 ^Mal —— f?) 

C undiss Cdiss 丄 U i + iOpH — pK„ v^/ 

式中, 苯氧基 乙酸的 pKa 值为 3.1。 在拟 稳态条 件下, 未 解离酸 的净输 人通量 

(rundiss,,n) 等于 解离酸 的净输 出通量 (rd, &。 ut) 

广 undiss, in ― ^diss.oui 

P undiss^ cell ( ^ undiss , a ^ undiss, c ) ― -Pdiss^ cell( ^ diss,c ^ diss, a ) (3) 

16 



式中, 下标 a 和 c 分别 表示细 胞膜非 生物相 一边和 细胞质 一边。 将式 (2) 中膜 两侧的 
总 酸浓度 用膜两 侧的未 解离形 式和解 离形式 的酸浓 度代替 并重新 排列, 我们得 到膜两 侧酸的 
总浓度 之比, 如下 式所示 

l + lQPHc- I + IQPH.-PK, 

" , tot P diss 1 QPHc PK » + p undiss 

由于 未解离 形式酸 的渗透 系数的 数量级 远远大 于解离 形式, 因此, 式 (4) 可 简化为 

Cc,tot = l + 10PHc- PK, 
7:;;^— 1 + 10PH,-PK, 

因为, 在 青霉素 生产中 胞内的 pH 通常高 于培养 基中代 表性的 pH, 所以式 (5) 表明 细胞内 
的总酸 浓度比 细胞外 的高。 利 用这个 方程, Henriksen 等 (1998) 计算了 当胞内 pH 值为 
7.2 时, 不 同胞外 pH 条件 下的酸 的浓度 之比。 当胞外 pH 值为 6.5 时, 酸的积 累量低 (约 
2.3 倍), 而 当胞外 pH 值为 5.0 时, 酸的积 累量高 (达 100 倍)。 

在给 定胞外 总酸浓 度的条 件下, 可 利用式 (2) 计算出 膜两侧 两种形 式酸的 浓度, 进而 
可 利用式 (1) 计算 出通过 细胞膜 的质量 通量。 由 于解离 形式酸 的净输 出通量 等于未 解离形 
式酸的 净输入 通量, 因 此酸运 输的结 果是质 子的净 输入, 而 为了保 持恒定 的胞内 pH, 这些 
质子 必须由 细胞膜 ATP 酯 醇重新 输出。 如果假 定每向 胞外运 输一个 质子需 要通过 ATP 酯 
酶的反 应而消 耗一个 ATP, 那么 当胞外 pH 值为 6.5, 胞内 pH 值为 7.2 时, Henriksen 等 
(1997) 计 算出这 种无效 循环所 消耗的 ATP 达到了 0.15mmo 卜 g— 1( 干重) 'h — 1。 与其 它非生 
长相 关联但 也消耗 ATP 的过程 相比, 这 个值是 较低的 (见 2.6 节)。 然而, 当胞外 pH 值为 
5.0 (胞内 pH 值仍为 7.2) 时, 这个值 变为约 7mrno 卜 g — 1( 干重 ), 这是一 种值得 注意的 
ATP 消耗 (见 2.6)。 从 中可以 看出为 了生物 合成的 需要, 维持 穿越细 胞质膜 的酸浓 度梯度 
是如何 有助于 ATP 生成 与消耗 精确的 解稱。 



2.2.2 促 进扩散 

许 多化合 物以极 低的速 率通过 自由扩 散方式 运输, 因为它 们在质 膜中的 溶解度 很低。 这 
类 物质的 运输可 由于镶 嵌在细 胞质膜 中的载 体中介 物分子 而显著 增强。 这种运 输是被 动发生 
的, 不需 要能量 消耗, 称 为促进 扩散。 在真 核生物 中许多 物质的 运输采 用这种 方式, 原核生 
物中 促进扩 散仅有 的几例 是甘油 在大肠 杆菌中 的运输 以及葡 萄糖在 Z_y7Womomz5 mobilis 和 
S《re/>toa)a:ws6oT;z'5 中 的运输 (Moat 和 Foster, 1995)。 与自 由扩散 一样, 促 进扩散 只能顺 
着 浓度梯 度方向 进行。 然而, 只 有存在 着游离 载体分 子时, 这个化 合物才 能进入 膜相, 其运 
输的速 率遵从 饱和型 动力学 (如同 酶催化 反应的 米氏动 力学) (见例 2.2)。 因此, 在 低底物 
浓度时 ,扩散 速率为 一级; 在高 底物浓 度时, 为 零级。 

在真 菌中, 许多 糖类物 质通过 促进扩 散进行 运输。 据报道 (Bisson 和 Fraenkel, 1983; 
Bisson 等, 1993), 在 酿酒酵 母中, 葡萄 糖通过 促进扩 散进行 运输, 而 且存在 着一个 葡萄糖 
阻 遏型的 高亲和 性体系 (Km 为 Immo 卜 L— 1) 和 一个组 成型的 低亲和 性体系 (Km 为 
20mmol*L — 1)。 最近, 通过克 隆编码 己糖转 运蛋白 的全部 基因, 进一 步证明 了酷酒 酵母中 
葡萄糖 运输的 复杂性 [见 Kruckeberg 的综述 (1996)]。 对 于丝状 真菌, 已经 报道了 不同的 
促进 糖运输 的转运 蛋白, 其 Km 范围为 8〜20mmo 卜 L — 1 (Neilsen, 1997)。 

17 



【例 2.2】 促 进运输 的饱和 动力学 

在许多 生物体 系中, 已 经发现 化合物 的促进 扩散速 率遵从 米氏饱 和型动 力学, 这 样的速 
率 表达式 可由如 下机理 推出。 首先, 一个底 物分子 S 与一 个载 体分子 C 结合 形成 复合物 
(CS), 并自 由扩散 通过细 胞膜。 稳 态条件 需要那 些反复 将底物 分子运 进细胞 的载体 分子, 

从 膜的胞 内一侧 重新扩 散至胞 外非生 物相。 该机理 涉及的 底物载 体复合 物浓度 分布、 游离载 
体以 及所假 定的平 衡和运 输过程 如下。 

细胞膜 

(CS) 



非 生物相 




C: 载体 
细胞 质一侧 S: 基质 

CS: 载 体基质 复合物 



Ca + Sa 



:(cs): 



'(cs)( 



-Ce + Sc 



Ki ° " K2 

总 的运输 速率可 以以底 物载体 复合物 或自由 载体膜 浓度表 示如下 



D 



complex 



D 



transport ― i ( ^ cs , a ^ cs , c ) 一 / 

" TTipm " 



:,a) 



(1) 



式中, 带 有下标 的参数 De。mplex 和 ^earner 分别 为底物 载体复 合物和 游离载 体在膜 中的扩 
散 系数; dmem 为膜的 厚度; 和 分别 为载体 和复合 物的膜 浓度。 如上述 所示, 假 定复合 
物的 形成与 解离反 应处于 平衡, 则消 去复合 物的浓 度可得 

D complex ( ^ 1 C C , a C S , a K 2 ^c,c^s,a ) ― D carrier ( C c,c ,a ) ( 2 ) 

总的载 体守恒 方程是 

Cc,a + Cc,c + KiCcaCs.a + ^2 l^c'cCs-c = C total (3) 

结合式 (2) 和式 (3), 可以 解出游 离载体 的浓度 Cc,a 和 Cc,c, 再 代入式 (1) 中, 就 可以得 
到运输 速率。 会出 现一个 有趣的 限制性 情况: 如果胞 内底物 浓度为 0, 即 Cs,c = 0, 即 一旦底 
物被运 输进人 细胞, 就 被迅速 代谢转 化掉。 在 这些条 件下, 膜 的非生 物相一 边的载 体浓度 
如下: 

a 、 ,一 1 



C total 



2 + 



complex 



D 



+ 1 K1C3., 



(4) 



如果 我们进 一步假 定载体 和载体 底物复 合物的 扩散系 数近似 相等, 那 么将式 (4) 代人式 
(1), 就 得出运 输速率 



_ £^ complex y C total y KiS; 



transport 



dmem 2 1 + KiS^ ^ 

前面 的方程 展示了 相应于 非生物 相中底 物浓度 的饱和 特性, 需指出 的是: 前述 的运输 机制与 

通常的 Michaelis-Menten (M-M) 酶 催化反 应机制 相同, 运输 步骤作 为整个 过程中 的慢速 
步 骤代替 了酶反 应过程 中产物 的形成 步骤。 其 结果是 M-M 方程 中的反 应速率 常数被 扩散系 
数与 1/2 载体 总浓度 的乘积 取代, 这 一半正 好是运 输过程 中在任 何时刻 都可有 效利用 的载体 
量 (另一 半与底 物结合 形成了 复合物 )。 

文 献中已 介绍了 若干促 进扩散 的定性 机制。 其 中一些 包括载 体分子 的实际 运输, 正如本 
例所 描述的 情况。 其它 机制描 述了载 体是穿 越整个 膜的蛋 白质, 因此是 相对固 定的。 在后一 
18 



种情 况下, 小分 子通过 载体蛋 白形成 膜内通 道进行 运输。 这种运 输机制 仍然包 括一些 前面提 
到过的 底物- 载体蛋 白结合 的一些 形式。 然而, 除非 包括一 个慢速 步骤, 否则 不可能 得到饱 
和型动 力学。 该慢 速步骤 在性质 上可以 是扩散 步骤或 是反应 步骤, 其在 整个运 输过程 中是一 
个关键 步骤。 仅靠平 衡过程 (这 里, 载体 蛋白分 子结合 底物, 并 立即将 其运送 到胞内 处于另 
一平衡 态的反 应中) 不 足以描 述实验 上观察 到的饱 和型运 输速率 方程。 



2.2.3 主 动运输 

主动运 输类似 于协助 扩散, 因为 其也是 通过称 为通透 酵的特 定膜定 位蛋白 来促进 该运输 
过程。 与协 助扩散 相反, 主动运 输可以 逆着浓 度梯度 的方向 进行, 因此 是一个 消耗自 由能的 
过程。 运 输过程 中需要 的自由 能可由 ATP 中的高 能碟酸 键提供 (初级 主动运 输)。 另外, 
这 个运输 过程可 以与另 一个顺 着浓度 梯度进 行的运 输过程 相耦合 (次级 主动运 输), 后一过 
程中 净生成 的自由 能与驱 动主动 运输过 程中的 自由能 消耗相 平衡。 最后, 在一 种称为 基团转 
位的特 别主动 运输过 程中, 所运 输的化 合物被 转化成 为一个 衍生物 (碟 酸化的 衍生物 ), 这 
种衍生 物不能 反向通 过膜来 运输。 

一 组重要 的初级 主动运 输体系 是一些 ATP 酯薛, 它涉 及到需 要消耗 ATP 的质子 分泌。 
一些 这样的 薛 可在 两个方 向上起 作用, 因 而在有 质子输 入时就 会生成 ATP, 在原核 生物的 
氧 化瞵酸 化过程 中这是 非常重 要的组 成部分 (见 2.3.3 节)。 还 存在其 它的初 级主动 运输体 
系, 该 体系包 括特定 的结合 蛋白, 其 结合要 传递的 化合物 并将它 传递到 相容的 膜结合 复合物 
(Moat 和 Foster, 1995)。 这种传 递触发 ATP 水解, 进而 导致膜 小孔打 开使得 底物单 向扩散 
进细 胞质。 在大肠 杆菌中 通过这 些起交 通运输 作用的 ATP 酯 醇所运 输的物 质有: 组 氨酸、 
麦 芽糖、 阿拉 伯糖和 半乳糖 (Moat 和 Foster, 1995)。 

在次 级主动 运输过 程中, 化合 物的运 
输是顺 着有利 的浓度 梯度方 向与另 一个化 
合物 耦联运 输的。 如 果这两 种化合 物沿同 
一 物理方 向进行 运输, 这种 运输就 叫同向 
运输, 例如质 子同向 运输, 这是次 级主动 
运输中 最重要 的一种 机制。 如果化 合物沿 
相反的 物理方 向进行 运输, 则称为 反向运 
输。 对于质 子同向 运输, 输 入的质 子必须 
借助于 ATP 酯酵再 运输出 去以维 持胞内 
的 pH (见图 2.3)。 即使质 子同向 运输是 
最普 通的次 级主动 运输, Na +、 K+ 和 
Mg^ + 也可以 进行同 向运输 或反向 运输。 

在 基团转 位中, 运输过 程都伴 随有被 
运输 物质的 进一步 转化。 基 团转位 系统最 
好的例 证是磷 酸转移 薛系统 (PTS), 通 
过这个 系统可 使某些 糖类物 质运输 进细菌 
中。 这个系 统相当 复杂, 包 括至少 有四种 
不同 蛋白的 参与, 这 些蛋白 质作为 高能磷 
酸基 团的碟 酸载体 把磯酸 錄醇 丙醐酸 (PEP) 上 的磯酸 基团转 移给进 来的糖 (见图 2.4)。 

19 



胞外 培养基 



糖 IT 




细胞质 

图 2.3 糖类 通过质 子的同 向运输 

特定 的膜结 合通透 11 将 糖类运 輪进入 细胞, 整个 过程由 n 
个质 子同时 运输来 驱动。 对于大 肠杆菌 (£.ro/i) 中的乳 
糖通透 腾, n = \ (Stein, 1990). 而 且对于 大多数 其它的 
糖通 透藤可 能也是 这样。 为 了将细 胞内的 pH 维持 在一个 
恒定的 水平, 质子 必须被 运输出 细胞。 在厌 H 细 菌中, 须 
通 过电子 传递链 实现, 而在真 菌中, 在细胞 膜上的 腺苷三 
磷酸 a^SI 的作 用下通 过消耗 ATP 而 完成。 对于几 种真核 
微 生物, 包括 ; V.cmsia ( Perlin et al, 1986 ) 和 
S . cerevisiae (Malpartida and Serrano, 1981), 细胞膜 flfe 
苻三 8? 酸醋 11 的 /ATP 化学计 量比为 1。 在一 定的胞 
外范 围内, 胞内通 常相当 稳定, 并通 常高于 胞外的 pH 
(Cartwright et al, 1989) 



这些 蛋白有 两种是 可溶的 细胞质 蛋白酶 I 和组氨 酸蛋白 (HPr), 它们 分别由 大肠杆 菌中的 
/>f5J 和/) fsH 所 编码。 这两种 蛋白对 所有的 PTS 糖类来 说是共 同的, 因此 被称为 通用的 
PTS 蛋白。 相反酶 n 对 糖是具 有特异 性的, 它具 有三个 结构域 (A, B, C), 这三个 结构域 
可 以结合 成一个 单个膜 结合蛋 白或分 裂成两 个或多 个蛋白 EHA, EIIB 和 EnC。 在 PTS 
系统中 PEP 的 磯酸基 团通过 EI 、 HPr、 En A 和 EIIB 的磯酸 化中间 物传递 给进来 的糖。 
EH (EnC 蛋白) 的 C 域形 成转位 的通道 及至少 一部分 特定的 糖结合 位点。 基于序 列同源 
性, En 蛋白 可归为 四类: 甘 露醇、 葡 萄糖、 甘露糖 和乳糖 (Moat Foster, 1995)。 




图 2.4 憐 酸转移 酶系统 (PTS) 的组织 
EI 和 HPr 是 所有磯 酸转移 酵系统 的普通 蛋白, 此合 成却需 要许多 专一的 En 蛋白。 在图中 
A、 B、 C 三步都 要用到 En 蛋 fi, 此处的 En 蛋白 可能被 联入一 个单一 的膜结 合蛋白 (如图 
中所 示的甘 露醇磷 酸转移 醉 系统 ), 也可 能分解 为两个 或多个 蛋白。 在 葡萄糖 碟酸转 移膀系 
统中, B、 C 两步需 要引人 nBC 蛋白, 采 用的是 膜结合 形式, 但第 A 步是可 溶的。 在甘露 > 
磯 酸转移 醉 系统, 第八、 B 两 步需引 入可溶 性蛋白 DAB. 但 C 步采 用的 是膜结 合形式 

主动 运输过 程中的 ATP 消耗 在细胞 生物合 成全部 ATP 消耗 中占重 要部分 (见 2.6)。 
在质子 同向运 输的过 程中, ATP 消 耗依赖 于运输 过程的 化学计 量关系 和质子 重新输 出的化 
学计量 关系。 研 究得最 透彻的 体系是 大肠杆 菌中的 乳糖渗 透酶, 其同时 运输一 个质子 和一个 
乳糖 (见图 2.3)。 对 许多其 它物质 的运输 相似的 化学计 量比也 成立, 例如原 核生物 和真核 
生 物中许 多氨基 酸的运 输以及 丝状真 菌中通 过高度 亲和系 统对葡 萄糖、 果糖和 半乳糖 等的运 
输 (见表 2.2)。 原核生 物和真 核生物 中质子 的重新 输出过 程有一 些不同 之处。 在好 氧细菌 
中, 电子传 递链位 于细胞 质膜, 质子 可通过 电子传 递链从 胞液中 重新运 输出去 (见 2.3.3)。 
然而, 质子 还可由 FoFi-ATP 酯酶再 转运至 胞外。 ATP 酯酶在 原核生 物中位 于细胞 质膜, 
它 主要涉 及氧化 磷酸化 过程中 ATP 的 合成, 但 它是可 逆的, 并可以 在消耗 ATP 的 情况下 
将质子 泵出细 胞外。 目前还 不能准 确知道 FoFi-ATP 酷薛的 化学计 量比, 但在 大肠杆 菌中通 
常 使用的 化学计 量比是 2H + /ATP。 在 真核生 物中, FoFi-ATP 酯酶位 于线粒 体中, 但其也 
具 有属于 另一类 ATP 酯薛 的质膜 ATP 酯酶。 这种 ATP 酯醜可 能只在 ATP 水解方 向起作 
用, 通常其 化学计 量比为 H+/ATP。 利用 前面的 化学计 量学, 有可能 计算出 通过主 动运输 
运送 不同物 质时的 ATP 消耗, 表 2.2 总 结了其 结果。 
20 



表 2.2 细菌和 真菌中 一些化 合物的 主动运 输概述 



种 类 


含有 化合物 


机 理 


消耗 ATP 量 






n i。j i"j its. m 


05 




葡葡糖 餘社 (^或 酷) 

mj »0 ra m. fin. 、 iyC. HH / 




05 




有机酸 




0.5 




tlX WL 




0.5 






H ^ IhI fDl IS Ift 


0.5 








① 




氣基酸 


H ^ ffl fpl 1E fife 


1 






仆学渗 


1 




碟酸盐 


同向 i 云輪 

» 1 門 門 ■iti tW , 


2 






Na+ 反 相运糁 






糖 


H+ 同 向运输 


1 






促 进扩散 







硫酸盐 


Ca" 和 H' 同 向运输 


1 



① 通过磷 酸转移 醉系统 糖在运 输过程 中被碟 酸化。 即使 在磯酸 錄醇内 翻酸中 出现一 个高能 的磷酸 基团, 在糖 的磷酸 

化过 程中高 能磷酸 键的能 量并不 释放, 因此 ATP 能耗为 0。 



2.3 供 能反应 

供能 反应用 于三种 目的: (1) 主要以 ATP 的形式 生成吉 布斯自 由能, 给 其它细 胞反应 
提供 能量; (2) 主 要以辅 助因子 NADPH 的形 式生成 生物合 成反应 所需的 还原力 (或 还原 
当量 ); (3) 生 成生物 合成结 构单元 所需的 代谢前 体物。 在结构 单元生 物合成 中提供 碳骨架 
的底 物通常 被称为 碳源, 而提供 生物合 成所需 吉布斯 自由能 和还原 力的底 物称为 能源。 许多 
底 物既作 为碳源 又作为 能源, 像工 业生产 中常用 的底物 情况, 如葡 萄糖、 果糖、 半 乳糖、 乳 
糖、 庶糖和 麦芽糖 等糖类 物质。 糖 类代谢 始于糖 酵解, 末端产 物为丙 酮酸。 然后, 丙 酮酸进 
人发酵 途径、 回补 途径、 用 于氨基 酸合成 的转氨 途径、 三羧酸 循环或 其它途 径而进 一步加 
工。 生物合 成结构 单元所 需全部 前体代 谢物都 是由糖 酵解和 TCA 循环生 成的, 但为 了补充 
这 些生物 合成所 消耗的 前体代 谢物, 还 需要一 组回补 途径。 在 工业培 养基中 (如 糖蜜、 玉米 
紫), 还常常 存在着 额外的 碳源和 能源, 如氨 基酸、 有 机酸或 脂肪, 当 存在一 种糖或 单一的 
碳 源和能 源时, 许 多生物 具有代 谢这些 物质的 能力。 

由于 供能途 径在中 心碳代 谢和生 物合成 中的重 要性, 我们将 在本节 介绍糖 酵解、 发酵、 
回补 等几种 途径, 还有 TCA 循环、 氧 化鱗酸 化以及 脂肪、 油 类和有 机酸代 谢的一 些基础 
知识。 

2.3.1 糖酵解 

糖 酵解是 将葡萄 糖转化 成丙酮 酸的所 有生化 反应的 总和。 糖酵 解由多 个途径 (或 代谢路 
线) 来 完成。 最常遇 到的途 径有: (1) 糖酵 解途径 (EMP); (2) 戊糖磷 酸途径 (PP); (3) 
Entner-Doudoroff 途径 (ED)。 糖类 进入糖 酵解途 径的常 见入口 是通过 三种单 磯酸己 糖进入 
酵解 途径, 即 1- 磔酸 葡萄糖 (G1P), 6- 磷酸 葡萄糖 (G6P) 和 6- 磯 酸果糖 (F6P), 三者之 
间很 容易通 过葡萄 糖磷酸 变位酶 (对 G1P 和 G6P) 和 磷酸己 糖异构 81 (对 G6P 和 F6P) 而 
相互 转化。 这些 薛一般 都过量 存在, 在 这种条 件下, 这三 种化合 物处于 一种平 衡状态 并构成 
一个单 独的代 谢库。 这 个代谢 库可通 过生成 三种组 分中的 任何一 种而得 到补充 (见图 2.5), 
而 且在平 衡时, 这个 库中约 3% 为 1- 磷酸葡 萄糖, 65% 为 6- 磯酸葡 萄糖, 32% 为 6- 磷 酸果糖 
(Zubay, 1988) 

21 



单 磯酸己 糖相互 转化库 



糖类 
半乳糖 



葡萄糖 



糖 原异生 

果糖 



1- 磯酸 葡萄糖 



葡萄 糖磯酸 变位瞎 



6- 磯酸 葡萄糖 



磷 酸己糖 异构薛 



6- 磯酸 -果糖 



多 糖合成 



PP (磯酸 戊糖) 途径 



EMP 途径 



图 2.5 单磷 酸己糖 库及其 在不同 途径中 的作用 
1- 磔酸 葡萄糖 由所存 储的碳 水化合 物碟酸 化形成 
或是 Lebir 代 谢中乳 酸同化 的最终 产物, 用于 多糖的 
合成。 6- 磷酸 葡萄糖 由葡萄 糖消耗 ATP 磔酸化 形成, 
用于 PP 途径 (或 ED 途径 )。 6- 碟酸果 糖由糖 原异生 
或由果 糖消耗 ATP 磯酸化 形成, 用于 EMP 途径。 
因此, 单 碟酸己 糖在代 谢途径 中既是 起点也 是终点 



胞内 的葡萄 糖和果 糖通过 6 位 上的碳 
的磷 酸化作 用直接 进入单 磷酸己 糖库。 在 
细 菌中, 糖类主 要通过 PTS 系统被 吸收, 
憐 酸化作 用与转 运同时 进行, 而在 真核生 
物内, 磯 酸化作 用是由 己糖激 醉 催 化的。 
在酿酒 酵母中 有三种 不同的 蘇参与 葡萄糖 

和果 糖的磯 酸化: 即己 糖激酶 A、 己糖激 
酶 B 和葡萄 糖激酶 (Gancedo 和 Serrano, 
1989) 两种 己糖激 酶可使 葡萄糖 和果糖 
两者磯 酸化, 而葡萄 糖激醇 只特异 性地作 
用于葡 萄糖。 来自胞 外的半 乳糖或 胞内水 
解生 成的半 乳糖, 以 一种更 复杂的 方式进 
入单 磯酸己 糖库。 如 果半乳 糖由质 子驱动 
通 透酶进 行运输 , 则通过 Leloir 途 径进行 
磯酸化 作用。 这里半 乳糖在 C-1 位 置上进 
行磷 酸化, 然后与 UDP- 葡萄 糖进行 反应, 生成 1- 磯酸葡 萄糖和 UDP- 半 乳糖。 UDP- 半乳糖 
可通过 其它的 反应使 UDP- 葡萄糖 再生。 如 果半乳 糖通过 PTS 系 统进行 运输, 则在 C-6 位 
置 上进行 憐酸化 并经塔 格糖途 径进行 代谢, 其中 6- 磷酸 半乳糖 转化成 6- 磯酸塔 格糖, 并在 
消 耗一个 ATP 的条件 下进一 步憐酸 化生成 1,6- 二 磷酸塔 格糖, 最后 1,6- 二磔 酸塔格 糖裂解 
成磷 酸二轻 丙酮和 3- 憐酸甘 油醛。 

在 EMP 途 径中, Imol 6- 磯 酸果糖 转化成 2mol 丙酮酸 (见图 2.6)。 其 中一个 反应, 即 
6- 磷 酸果糖 转化成 1,6- 二碟酸 果糖的 反应, 需要以 ATP 形式存 在的自 由能, 但在 EMP 途 
径中 每分解 lmol6- 磯酸葡 萄糖总 计获得 3molATP。 在图 2.6 的反应 (6) (即 3- 磷酸 甘油酸 
氧 化生成 1,3- 二磯 酸甘油 酸酯的 反应) 还 产生了 NADH。 因 此通过 EMP 途径 葡萄糖 转化成 
丙酮 酸的总 化学计 量式为 

2pyruvate + 2ATP + 2NADH + ZHjO + 2H + - glucose - 2ADP - 2 ~ P - 2NAD + = (2.2) 
(丙 嗣酸) (葡 萄糖) 

在 PP 途 径中, 6- 磯酸葡 萄糖氧 化生成 6- 磷 酸葡萄 糖酸, 并 进一步 转化成 5- 磯 酸核酮 糖和二 
氧化碳 (见图 2.6)。 在这 两个反 应中, 进人途 径的每 Imol 6- 磯酸 葡萄糖 各生成 imol 
NADPH。 接 下去, 5- 磯酸核 酮糖转 化生成 5- 磷酸 核糖和 4- 磷酸赤 藓糖, 它们 都是结 构单元 
(如 芳香族 氨基酸 和核昔 酸等) 生物合 成的前 体物。 通 过不同 的反应 次序, 5- 磷酸核 酮糖反 
过 来还可 转化成 6- 憐酸 果糖和 3- 磷酸甘 油酸, 从而 再进入 EMP 途径 (见图 2.6)。 
PP 途 径中的 各步反 应分别 如下: 

6-P-gluconate + NADPH + H + — glucose-6-P - NADP + - H2O = 
(6- 磷 酸葡萄 糖酸) (6- 磯酸葡 萄糖) 

COz + ribulose-5-P + NADPH + H + — 6-P-gluconate - NADP + - H2O = 

(5- 磷酸核 SH 糖) 
ribose-5-P ― ribulose-5-P = 

(5- 碟酸 核糖) 
xylulose-5-P - ribulose-5-P = 

(5- 碟酸木 嗣糖) 

22 



(2.3a) 
(2.3b) 
(2.3c) 
(2.3d) 



葡萄糖 



NADP NADPH 



磯酸二 轻丙酮 




6- 磯酸葡 萄糖酸 



NADP NADPH 

- - - ^5- 碑 酸核嗣 IT 



(12) 



CO, 



(16) 



4- 磯酸 赤藓糖 



7-81 酸景天 ifi 糖 



5- 璣酸 甘油醛 



-« 酸核糖 * 

(14) 



(15) 



-磯酸 木翻糖 



(13) 



EMP 途径 
PP 途径 



2- 磯酸 甘油酸 
(9) 

磯 酸烯醇 丙兩酸 

― ADP 



(10) 



丙酮酸 



ATP 



图 2.6 真 菌中的 EMP 途径和 PP 途径 
(1) 己糖 瀲解; (2) 憐酸己 糖异构 醉; (3) 碟酸 果糖激 酵; (4) 酵 縮藤; (5) 碟酸甘 油薛异 构酶: 
(6) 3- 磔酸甘 油酸脱 氣雜; (7) 3- 碟酸甘 油酸激 雜; (8) 3- 磯酸甘 油酸变 位醉; (9) 稀醇 鯓; 
(10) 丙兩酸 激菌; (11) 6- 碟 酸葡萄 糖脱氢 SS; (12) 6- 碟 酸葡萄 糖脱氢 解; (13) 二 磷酸核 
酮糖 3- 差向异 构雜; (14) 二 碟酸核 ffi 糖异构 醉; (15) 转经乙 酸酵; (16) 转二轻 丙嗣基 雜 



(2.3e) 



(2.3f) 



(2.3g) 



glyceraldehycle-3-P + sedoheptulose-7-P 一 xylulose-5-P 一 ribose-5-P = 

(3- 磯酸甘 油薛) (7- 磷 酸景天 酮糖) 

fructose-6-P + erythrose-4-P 一 sedoheptulose-7-P - glyceraldehyde-3-P = 

(6- 碟酸 果糖) (4- 磔酸赤 藓搪) 

fructose-6-P + glyceraldehyde-3-P - xylulose-5-P ― erythrose-4-P 二 
PP 途 径的总 反应计 量式取 决于如 下两种 情况: 进入 PP 途径的 碳再循 环进入 EMP 途径 
氧 化成二 氧化碳 (同 时生成 还原力 NADPH), 或消耗 于生成 生物合 成前体 物(, 五碳 糖用于 
合成核 糖核昔 酸)。 PP 途径也 因此被 认为具 有氧化 和回补 功能, 分别用 总计量 式描述 如下。 
回补 PP 功能: 

6ribose-5-P + 5ADP + 4H2O + 4 〜 P - 5glucose-6-P - 5ATP = (2.4) 

(5- 碟酸 核糖) (6- 燐酸葡 萄糖) 

氧化 PP 功能: 

23 



12NADPH+12H+ +6CO2+ 〜P-glucose 6-P — 12NADP+ -7H2O = (2.5) 
在 ED 途 径中, 6- 磯 酸葡萄 糖酸在 6- 磯 酸葡萄 糖酸脱 水酶的 作用下 转化成 2- 酮基 -3- 脱 
氧 -6- 磯酸葡 萄糖酸 (KDPG), 接着 KDPG 在 KDPG 醛 缩酶的 作用下 裂解成 3- 磷酸 甘油酵 
和 丙酮酸 (Conway, 1992)。 因 此通过 ED 途 径将葡 萄糖转 化成丙 酮酸的 总反应 式为: 
2pyruvate + ATP + NADPH + NADH + 2H2O + 2H + 
(丙 函酸) 

- glucose- ADP-1〜P-NAD+ - NADP+ =0 (2.6) 
(葡 萄糖) 

需指出 的是: 在 ED 途径中 只生成 ImolATP 和 ImolNADPH, 而糖 酵解途 径是其 2 倍 
(其 中生 成的是 NADH 而不是 NADPH)。 ED 途径还 有一个 非憐酸 化途径 的相当 途径, 其中 
葡萄糖 酸通过 2- 酮 -3 脱氧- 葡萄糖 酸转化 成丙酮 酸和甘 油酸, 但 这个途 径只有 当细胞 代谢葡 
萄糖酸 时才是 活跃的 (Conway, 1992)。 

EMP 途径 中的三 个中间 代谢物 (3- 憐酸甘 油酵, 3- 磷酸 甘油酸 和憐酸 燦醇丙 酮酸) 和 
PP 途径 中的两 个中间 代谢物 (5- 磯酸 核糖和 4- 磷酸赤 藓糖) 是 氨基酸 和核酸 生物合 成的前 
体代 谢物。 这 两条糖 酵解途 径的相 对通量 的大小 取决于 对于吉 布斯自 由能、 NADH 和 
NADPH 形式 的还原 力以及 前面的 前体代 谢物的 需求。 已 经用实 验方法 对一些 生物测 定了两 
条 糖酵解 途径间 的通量 分布, 如利用 所谓的 呼吸测 量法, 测 定标记 i 4 C 的 葡萄糖 形成的 i 4 C02 
(Blumenthal, 1965), 或利用 NMR 来测量 胞内代 谢物中 i 3 C 的富集 度分数 (见第 9 章)。 表 
2.3 列出了 一些微 生物的 EMP 和 PP 途径上 的通量 分布。 大多数 研究结 果表明 EMP 途径是 
主要 的代谢 途径, 然而对 于那些 产物合 成需要 NADPH 而 过量生 产代谢 物的微 生物, 例如 
用 谷氨酸 棒杆菌 生产赖 氨酸, PP 途 径上的 通量可 能大于 EMP 途径上 的通量 (见第 10 章)。 
通过 PP 途径 通量的 相对大 小一般 取决于 比生长 速率和 培养基 组成。 在稳 态恒化 器中, As- 
/>ergz7/M5 mWM/cms 胞内 PP 途径的 相对通 量随稀 释速率 的增加 而增加 [见图 2.7 (a)], 这 
与观 察到的 EMP 途 径上的 一个酶 (醛 缩酶) 相 对活性 的减小 (当稀 释速率 增加) 和 PP 途 
径上的 一个酶 (6- 磯酸葡 萄糖脱 氢酶) 相对 活性的 增加是 一致的 [见图 2.7 (a)] (需 指出的 
是, 上述两 种酶的 相对活 性是通 过相应 于提供 EMP 和 PP 途径 全部碳 源的己 糖激酶 的活性 
而测定 的)。 在高比 生长速 率下, PP 途径 活性的 增加可 以认为 是由于 在高比 生长速 率下, 细 
胞对 PP 途径上 生成的 NADPH 和前 体代谢 物需求 的增加 , 尤其是 RNA 生物 合成对 5- 磷酸 
核 糖需求 的增加 [见图 2.7 (b)]。 然而, 应当 指出, 这 样一个 通量与 酶活性 测量之 间的对 

应关 系并不 能普遍 发现, 因为 后者是 指体外 确定的 Z^max 测 量值, 由于 酶的调 控或某 一特定 

途径 参与整 个代谢 过程的 不确定 程度, 这 个值可 能与胞 内的活 性完全 不同。 



表 2.3 不同 种类微 生物中 EMP 途径和 PP 途 径上的 相对通 量分布 /% 



种 类 


EMP 


PP 


条 件 


参 考文献 


A . niger 


78 




间 歇培养 


Shu et al(1954) 


C . glutamic um 


32 


66 


恒化 器培养 


Marx et al(1996) 


P . chrysogenum 


77 


23 


间 歇培养 


Wang et al(1958) 




56〜70 




间 歇培养 


Lewis et al(1954) 


P . digital um 


83 


17 


间 歇培养 


Wang et al(1958) 




77 


23 


间 歇培养 


Reed and Wang(1959) 



EMP 途径和 PP 途径 的主要 控制位 点处于 途径的 那些人 口处, 即 分别在 磯酸果 糖激醇 
和 6- 碟酸 葡萄糖 脱氛酶 催化的 反应处 (Zubay, 1988)。 6- 磯酸葡 萄糖脱 氢酶受 NADPH/NADP ^ 
24 



0.7 



50 







0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 



0.2 



10 







0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 

稀释 速率/ h_' 稀释 速率/ h— I 

(a) (b) 

图 2.7 葡萄糖 受限的 连续培 养中, PP 途 径上的 相对通 量随稀 释速率 的变化 

(a) A. 菌PP 途径 上的相 对通量 (♦), 由呼 吸方法 测定。 同时标 出糖酵 
解 » 薛縮 81 的相对 解活性 (A), PP 途径中 酸葡 萄糖脱 氡蘇与 己糖激 SI 的相 对活性 
(〇)。 己糖激 餘的活 性随着 生长速 率的增 加成线 性增加 (数 据引自 Carter 和 Bull, 1969) 

(b) 考察 P. r/«r:y«)g-n"« 菌 的生长 速率, 计算 所得的 NADPH 需求量 (□), 5- 磯 
酸 核糖的 需求量 (■), 4-«^酸赤蘇糖的需求量 (AO (数 据引自 Nielsen, 1997) 

的 比值来 调节, 而憐 酸果糖 激酵是 一个复 杂的别 构薛, 它有 几个效 应物。 在 酿酒酵 母中, 此 

薛受 AMP、 氨、 憐 酸以及 2,6- 二碟 酸果糖 (ATP 存 在下, 6- 磯 酸果糖 经碟酸 化而生 成的一 
个 代谢调 节物) 激活, 被 ATP 抑制 (Gancedo 和 Serrano, 1989)。 与 ATP 的结合 会导致 
薛对 6- 磯酸 果糖亲 和力的 降低, 而与 调节物 2,6- 二 磯酸果 糖的结 合会导 致醇对 6- 磯 酸果糖 
亲和 力的极 大增加 (Zubay, 1988) 因此 2,6- 二 磷酸果 糖对于 EMP 途 径上的 通量具 有促进 
作用, 而 ATP 具 有抑制 作用。 这种 调节状 况能使 磯酸果 糖激酵 的活性 增加以 适应增 加着的 
6- 磷 酸果糖 的浓度 (这 也导致 2, 6- 二碟酸 果糖水 平的提 高); 然 而在高 能荷水 平下, 由于抑 
制 着的磯 酸果糖 激薛活 性而使 ATP 的 生成进 一步被 阻断。 磯酸 果糖激 薛 的这 种关键 作用成 
为 分析复 杂代谢 途径中 的一个 中心点 (见第 12 章)。 

在 细胞代 谢中, 辅 助因子 NADH 和 NADPH 用 于两种 不同的 目的。 在好 氧微生 物中, 
NADH 主要涉 及通过 氧化磯 酸化反 应生成 吉布斯 自由能 (见 2.3.3 节), 而 NADPH 主要用 
于 结构单 元的生 物合成 (见 2.4 节)。 因此, NAD+ 作 为供能 反应的 底物, 而 NADPH 用做 
生 物合成 反应的 底物, 因而 NADH/NAD + 及 NADPH/NADP+ 这些比 值在不 同的水 平上被 
调 节着。 在细 菌中, NADH/NAD+ 为 0.03〜0.08, NADPH/NADP+ 为 0.7~ 1 .0 (Ingra- 
ham 等, 1983)。 在酵母 中这两 个比值 分别为 0.25〜0.30 和 0.58〜0.75。 然而, 这 两种辅 
醉 可在 烟酰胺 核昔酸 转氢瞎 的作用 下相互 转化, 它 通过下 面的反 应进行 催化实 现氢在 
NAD+ 和 NADP + 之间的 转移。 

NADH + NADP+ -NAD + -NADPH = (2.7) 

这 种酶存 在于细 菌和哺 乳动物 细胞中 (Hoek 和 Rydstrom, 1988), 而 在酵母 (Lagunas 
和 Gancedo, 1973; Bruinenberg, 1985) 和丝状 真菌中 (Eagon, 1963) 还未被 确认。 在哺 
乳 动物细 胞中, 这个醉 位于线 粒体内 膜上, 在这里 其提供 了一个 机制, 使得转 氢反应 与在线 
粒 体膜上 的其它 与能量 相关的 反应得 以联系 (Hoek 和 Rydstrom, 1988)。 这 种薛的 生理作 
用还不 知道, 但 是它能 对细胞 的氧化 还原力 或线粒 体能量 供应的 消耗提 供一种 保护性 的缓冲 
作用。 一般 来讲, 在正常 生长条 件下, 即使 这种瞎 存在, 但其在 总的细 胞代谢 中可能 不会起 
到 重要的 作用。 

25 



-jr」. 一了. M.lotu/HdavNT 





o o o o 

4 3 2 1 



2.3.2 发 酵途径 

糖 酵解的 最后一 个代谢 物是丙 酮酸, 它可通 过几条 途径被 进一步 转化, 这 取决于 细胞的 
氧化还 原作用 和能量 状态。 在 好氧生 物中, 大多数 丙酮酸 经过乙 酰辅酶 A 进入 TCA 循环, 
进而 被完全 氧化成 二氧化 碳和水 (见 2.3.3 节)。 然而, 在氧受 限制的 条件下 或在厌 氧生物 
中, 丙酮酸 可通过 发酵途 径转化 成诸如 乳酸、 乙酸 和乙醇 等代谢 产物。 

最简单 的发酵 途径是 丙酮酸 在乳酸 脱氢酶 的作用 下生成 乳酸, 这 个反应 的化学 计量式 
如下。 

lactic acid + NAD + ― pyruvate ― NADH — H + = (2.8) 
(乳酸 ) 

在式 (2.8) 中, EMP 途径 中氧化 3- 憐酸甘 油酸所 生成的 NADH 被用 来还原 丙酮酸 而生成 
乳酸, 因此, 在葡 萄糖转 化成乳 酸过程 中并没 有净生 NADH。 在高等 真核生 物中, 如肌肉 



丙翻酸 



NAD+ NADH 

(2) 



NAD+- 

NADH-* 
NAD+ NADH 



ADP ATP 



乙 K 



(1) 



乙 酰辅薛 A 



酷-磯 酸- 



乙 it 辅薛 A - 



辅酶 A- 



(3) 



(4) 



(5) 



乙酰乙 酰辅酶 A 
NADH X /\ ( 乙酸 
NAD*-*-^^. ,.^V 乂乙 K 辅薛 A 




丁酰 -磯酸 
ADP- 



ATP- 



(II) 



(12) 



轻基丁 酰辅酶 A 



(7) 



丁烯 酰辅酶 A 

NADH-^ 

乂 8) 
NAD+Z 

— 丁 酷辅酶 A 

(9) 



乙 酰乙酸 



(14) 



、 



( C 丙兩 D 

-NADH 



(15) 



■NAD* 



NADH 
NAD" 



Cfm^ 丁薛 

NADH- 



NAD ,一 



(10) 



图 2.8 丙 S 丁醇 梭状 芽孢杆 菌的混 合发酵 
(1) 乙 醒脱氣 81; (2) 乙 醇脱氢 醉; (3) 碟 酸乙醜 基转移 酵; (4) 乙酸 激酶; (5) 乙 酷辅薛 A 乙酰 转移 翁; 
(6) L( + )-/?- 轻基丁 酸辅醉 A 脱氛 嗨; (7) 1,3- 二轻 醜辅酶 A 脱氢 酵; (8) 丁酰辅 酵.\ 脱氣 酵; 
(9) 丁酸脱 氢解; (10) 丁醇脱 氧雜; (11) 憐酸丁 酰基转 移解; (12) 丁酸 激聽; 
(13) 辅 SIA 转移 SI; (14) 乙酰 乙酸脱 羧酶; (15) 异丙 醇脱氢 酵 



26 



细胞 在缺氧 条件下 这个途 径是活 跃的。 在 许多细 菌中这 个途径 也是活 跃的。 在乳酸 菌中, 该 
途 径是主 要的, 而且在 某种情 况下是 惟一活 跃的发 酵途径 ®。 

在 乳酸菌 中还存 在着其 它的一 些发酵 途径, 这会 形成几 种不同 的代谢 产物, 除乳 酸外, 

还有 乙酸、 乙醇、 甲 酸和二 氧化碳 (见例 8.3 对乳酸 菌混合 酸发酵 的分析 )。 在 大肠杆 菌中, 
在厌氧 条件下 反应式 (2.8) 是很重 要的, 但 在混合 酸发酵 中它总 是与其 它的途 径一同 存在, 
从 而生成 几种不 同的代 谢产物 (见例 3.1, 对大肠 杆菌混 合酸发 酵的分 析)。 革兰阳 性菌梭 
状菌 属具有 复杂的 发酵代 谢途径 (见图 2.8), 从而能 生成许 多不同 的代谢 产物。 该 菌属中 
丙酮丁 醇梭状 芽孢杆 菌是一 种最重 要的工 业生产 菌株。 图 2.8 表明, 除乙 酰辅薛 A 转化成 
乙 醇和乙 酸外, 两个乙 酰辅醇 A 分子 可以反 应生成 乙醜乙 銑辅醇 A。 这个化 合物可 依次通 
过三 个反应 生成丁 酰辅酶 A (见图 2.8)。 同乙 酰辅藤 A 转化 成乙酸 和乙醇 类似, 丁酰辅 SI 
A 可 分别经 丁酰磷 酸和丁 酲生成 丁酸和 丁醇。 另外, 在另一 分支途 径中, 乙酷 乙酸可 脱羧生 
成 丙酮, 并可进 一步还 原为异 丙醇。 

酵 母的发 酵代谢 与细菌 的有些 不同, 其主要 
的最终 产物为 乙醇, 因 此也称 该过程 为酒精 发酵, 
然而 此过程 也生成 一些乙 酸和少 量的琥 珀酸。 生 
成乙醇 和乙酸 的发酵 途径始 于丙酮 酸脱接 生成乙 
m, 乙 酸再由 乙醇脱 氢醇还 原生成 乙醇或 被氧化 
生 成乙酸 (见图 2.9)。 酵母 发酵代 谢与细 菌发酵 
的主要 不同在 于它不 经过乙 醜辅酵 A 来进 行。 已 
经确认 了乙醇 脱氣瞎 的四种 同功醇 (ADH I , 
ADHD, ADH in, ADHW)o 在以 葡萄糖 为基质 
的 厌氧生 长中, 细胞质 ADHI 是组 成型表 达的, 
并负 责生成 乙醇。 ADHn 是 细胞质 中的蛋 白并受 
葡萄糖 阻遏, 而且主 要与以 乙醇为 底物的 好氧生 
长 有关。 线粒体 ADHin 也 是受葡 萄糖阻 遏的, 其 
功能 未知, 但 它可能 在平衡 胞质溶 胶和线 粒体的 
氧化还 原电势 中起穿 梭作用 (Nissen 等, 1997)。 
已经 确认了 两种乙 酸脱氛 嗨的同 功酶, 其 中一个 
可 以利用 NAD+ 和 NADP + 二 者为辅 因子, 而另一 个同功 薛只能 特异性 地利用 NADP+ 为辅 
因子。 因此, 乙酸 的形成 会导致 NADPH 的 形成, 这 可能是 酵母中 NADPH 供应 的重要 
来源。 

在 酿酒酵 母利用 葡萄糖 转化为 乙醇的 整个过 程中, 没有 NADH 的净 生成。 然而, 由于 
前体 代谢物 以及生 物合成 所需结 构单元 的合成 过程中 会引起 NADH 的 净生成 (例如 从葡萄 
糖每 生成一 个丙酮 酸会生 成一个 NADH), 细胞 需要一 个代谢 途径来 消耗所 产生的 过剩的 
NADH。 一个这 样的可 能性就 是利用 瞵酸二 经丙酮 (DAP) 生成 甘油。 此途 径的总 反应式 
如下。 

glycerol + NAD ^ + ~P - DAP - NADH - H+ =0 (2.9) 

(甘油 ) 



丙酮酸 



NADH 



CO, 




(1) 



.CO2 

(2) NADH 



乙醛 

(3) 



(5) 



NAD(P)H 



乙酵 




乙 酰辅酶 A 



图 2.9 酵母 菌的发 酵代谢 
(1) 丙 S 酸脱 氢解; (2) 丙 S 酸脱羧 雜; 
(3) 乙 薛脱氢 酸; (4) 乙 酰辅酶 A 合成 醇; 
(5) 乙醇 脱氢雜 
反应 (1) 在线 粒体中 进行, 
其它 反应在 细胞质 中进行 



如果 乳酸脱 ft 酶催化 的反应 是惟一 活跃的 途径, 那么 此代谢 通常称 为同型 发酵。 



27 



从葡 萄糖生 成甘油 的总过 程中会 净消耗 NADH, 因此上 述途径 可以对 如下几 种过程 进行补 
偿: 在前体 代谢物 和结构 单元合 成过程 中产生 NADH, 但在生 物合成 中没被 利用的 过程或 
其 它需要 NADPH 的反应 过程。 
2.3.3 TCA 循环 和氧化 磷酸化 

丙酮酸 完全氧 化的第 一步是 生成乙 酰辅雜 A 的氧 化脱 羧反应 (见图 2.10), 这个 反应是 
一系 列复杂 反应的 结果, 由 总称为 丙酮酸 脱氣酶 复合物 (PDC) 的一组 三种酶 来催化 完成。 
在 真核细 胞中, 和 其它所 有与丙 酮酸的 好氧分 解代谢 反应有 关的酶 一样, 这个 酶复合 物位于 
线粒 体上。 在丙 酮酸的 氧化反 应中, 辅酶 NAD+ 作 为电子 受体。 



NADPH NADP+ NAD+ NADH 乙酸辅 HA 藝 A 




辅 HA ATP ADP 



图 2.10 真菌 体内的 TCA 循 环和回 补途径 
(1) 丙 爾酸脱 氧醉复 合物; (2) 柠檬 酸合成 醉; (3) 顺乌头 酸雜; (4) 异柠 檬酸脱 氢醉; (5) a- 酮戊二 
酸脱 氢酶; (6) 號珀 酸硫激 雜; (7) 瑭 拍酸脱 氣酶; (8) 延胡索 酸醉; (9) 苹 果酸脱 氨醉; (10) 丙銅酸 
羧化 藤; (11) 异柠檬 酸裂解 薛; (12) 苹 果酸合 成雜; (13) ATP- 柠 檬酸裂 解雜; (14) 苹 果酸脱 氣翁; 
(15) 苹 果酶。 在 真核细 胞中, 丙嗣 酸脱氣 酸复合 物与膜 结合, 因此, 丙 酮酸转 化为乙 K 辅雜 A 是和 丙兩 
酸向线 粒体的 运输相 关联的 (在线 粒体膜 上没有 丙酮酸 的载体 )。 而且, 乙酸 酸等循 环的反 应由酶 (2)、 
(3)、 (11)、 (12) 和 (9) 催化, 反应 不是在 线粒体 中进行 (如 图所示 ), 而是 在乙酸 酸循环 体中进 行的, 
由乙 酰辅薛 A 转化 为號珀 酸的合 成也是 在此处 进行。 琥 珀酸在 乙酸酸 循环中 形成, 然 后运输 到线粒 体中, 
由 此进入 TCA 循环。 在 原核细 胞中, 在 胞液中 发生的 TCA 不 是有组 织的, 不存在 (13)、 (14) 和 (15) 

碳进人 TCA 循环是 通过乙 酰辅酶 A 与 草酰乙 酸在柠 檬酸合 成酶的 催化下 缩合生 成柠檬 
酸的 反应而 发生的 (见图 2. 10)。 柠檬 酸随后 在乌头 酸酶的 作用下 生成其 异构体 —— 异柠檬 
酸, 这个反 应要经 过顺乌 头酸, 它在 细胞代 谢中没 有其它 作用, 因此在 TCA 循环中 不考虑 
它。 柠檬酸 转化成 异柠檬 酸的总 平衡常 数接近 1, 表明 等量的 柠檬酸 和异柠 檬酸处 于平衡 
中, 这两 个代谢 产物通 常归进 一个单 独代谢 库中。 TCA 循环中 接下来 的两步 是氧化 脱羧反 
28 



应。 首先, 异柠檬 酸在异 柠檬酸 脱氣酵 的作用 下生成 a- 酮戊 二酸。 接着, a- 酮戊 二酸经 

酮戊 二酸脱 氢醇催 化转化 成琥珀 酰辅醇 A, 该步反 应类似 于丙酮 酸脱氛 81 催化 的丙酮 酸脱竣 
反应。 实 际上, 这 两个酶 系使用 同样的 脱氣歸 亚基。 在下 面的反 应中, 琥珀 醜辅酶 A 水解 
生成琥 珀酸, 同时 在辅酶 A 酯键 水解过 程中释 放出吉 布斯自 由能, 通过 GDP 憐酸 化生成 
GTP 而 回收这 部分自 由能。 然后 琥珀酸 脱氣生 成延胡 索酸, 这个反 应需要 一强氧 化剂, 
FAD 被 还原成 FADH2。 FAD 整合 在琥珀 酸脱氣 酵黄素 蛋白薛 中来催 化这个 反应。 延胡索 
酸 在延胡 索酸醇 的作用 下生成 L- 苹 果酸。 最后, L- 苹果 酸在苹 果酸脱 氣醇的 作用下 生成草 
醜 乙酸, 从 而完成 了这个 循环。 

TCA 循环 的主要 调节位 点在柠 檬酸合 成酷、 异柠 檬酸脱 氣醇和 《 -酮戊 二酸脱 复瞎。 显 
然这三 种酶的 活性都 偏爱低 水平的 NADH/NAD+ 比, 但 这个比 值尤其 强烈地 影响着 异柠檬 
酸脱 氣醇的 活性。 此外, 在酵 母中, 异柠 檬酸脱 氛酵受 AMP 激活, 受 ATP 抑制 (Zubay, 
1988) 

TCA 循环 中丙酮 酸完全 氧化的 总化学 计量式 如下。 

3C02 + GTP + 4NADH + FADHz + 4H + - pyruvate 

- 3H20_GDP- 2〜P- 4NAD+ -FAD =0 (2.10) 
这样, 每氧化 Imol 丙 酮酸, 就生成 4mol NADH 和 Imol FADH2。 很 明显, 只有当 这两种 
辅助 因子被 重新氧 化生成 NAD+ 和 FAD 时, TCA 循环才 能继续 进行。 在 好氧条 件下, 通 
过一个 电子受 体链把 电子从 这些辅 醇上转 移给自 由氧。 大多数 电子受 体组成 一个大 的复合 
物, 镶嵌 在原核 生物的 质膜上 和真核 生物的 线粒体 内膜上 (见图 2.11)。 电子 通过电 子传递 
链从 NADH 到氧上 的运动 是受一 个大的 负的自 由能驱 动的, 即 厶00= - 220kJ-(mol 
NADH) — 1, 而且 该自由 能的一 部分以 ATP 的形式 捕获。 Peter Mitchell 1961 年提出 的化学 
渗透理 论可以 解释这 两种完 全不同 的过程 (电子 运输和 ATP 合成 过程) 是如 何稱联 在一起 
的 (Mitchell, 1961; Mitchell 和 Moyle, 1965; Senior, 1988)。 这 个理论 认为: 当 电子通 
过此电 子链运 输时, 质子被 泵出线 粒体外 (或被 泵出原 核生物 的细胞 外), 因 此穿越 线粒体 
内膜 (或 原核 生物的 质膜) 上 形成了 pH 梯度 (约 0.05pH 单位, 细胞 内或线 粒体内 高些) 
和 电子电 势梯度 (约 -0.15V) (见图 2.11)。 当质 子通过 FiFo- ATP 瞎 复合物 (或 ATP 合 
成龍) 再进 人线粒 体基质 (或细 胞质) 中时, 就 产生了 ATP。 对真 核生物 而言, 氧 化磯酸 
化 的理论 化学计 量关系 (即 所谓的 P/0 比) 是 每氧化 lmolNADH2 生成 3mol ATP, 或每 
氧化 Imol 琥珀酸 (或 FADH2) 合成 2molATP (见图 2.11)。 对原 核生物 而言, 质 子只在 
两 个位点 上运输 (每个 位点两 个质子 ), 而且由 于原核 生物的 FiFc-ATP 酯瞎 的化学 计量关 
系为 1ATP/2H+ , 所以 氧化磯 酸化的 理论化 学计量 关系是 每氧化 Imol NADH2 合成 2mol 
ATP。 由 于氧化 作用和 隣酸化 作用的 不完全 稱联, 实际 上所谓 有效的 P/0 比 远低于 理论值 
(见例 13.6)。 这是由 于穿越 膜的质 子梯度 所驱动 的外来 过程的 结果。 因此, 像在 2.2.3 中 
讨 论过的 一样, 许 多化合 物由质 子同向 运输所 驱动, 而且 这影响 着原核 生物中 穿越质 膜的质 
子 梯度。 类 似地, 在 真核生 物中, 线粒 体内膜 上有碟 酸盐、 ATP、 ADP 以及代 谢物丙 酮酸、 
柠 檬酸、 异柠 檬酸、 琥 珀酸和 苹果酸 的特异 载体, 这些化 合物的 运输也 是由质 子梯度 所驱动 
的 (LaNoue 和 Schoolwerth, 1979; Zubay, 1988)。 

由于线 粒体内 膜是不 能渗透 NADH 的, 因 此真核 生物中 细胞质 NADH 的 氧化需 要运用 
除 NADH 脱氢醇 以外的 手段把 电子运 输到电 子传递 链上。 NADH 脱氢 酶是专 门作用 于线粒 
体 NADH 的, 为此 目的, 真菌的 线粒体 装备有 NADH 脱氢酶 ,它位 于线粒 体内膜 的外表 

29 



膜 质溶胶 




號珀酸 富马酸 

图 2.11 真 核生物 的电子 传递链 和氧化 憐酸化 



通过 电子传 递链, 电子从 NADH 或號珀 酸传给 氧气。 电子 传递链 基本单 元以较 大复合 物的形 式位于 线粒体 
内膜。 来自 NADH 的 电子首 先传给 复合物 I , 即 NADH 脱氢 薛, 它 是含有 黄素单 核昔酸 的黄素 蛋白。 来自 
琥 珀酸的 电子首 先转给 FDA, 然后在 复合物 n, 即號 珀酸脱 11 酸中进 行整合 (TCA 中的 酶之一 )。 来自复 
合物 I 和 复合物 n (或 来自 位于线 粒体内 膜的其 它黄素 蛋白) 的 电子传 给辅酷 Q (UQ). UQ 可以在 脂质膜 
中自由 扩散。 电子从 UQ 传给细 胞色素 系统。 首先, 电 子传给 复合物 in, 它包 含两个 b 型细 胞色素 (b566 
和 b562) 和细 胞色素 cl。 然后, 电子 通过细 胞色素 C 传给 复合物 IV (或细 胞色素 氧化酶 ), 复合物 IV 包括细 
胞色素 a 和 33, 最后, 电 子传给 氧气。 复合物 I、 复合物 m 和 复合物 IV 穿越 细胞质 内胰, 当这 些复合 物运输 
两个电 子时, 每种 复合物 向膜间 空间中 释放四 个质子 C 这些 电子将 被质子 传导的 ATP 合成 薛 (或 FiFoATP 
酷醉复 合物) 运输回 线粒体 基质。 在这 个复合 物中, 运输 三个质 子会产 生一个 ATP。 多余的 一个质 子将运 
输回 线粒体 基质, 用于 ADP 和〜 P 的 吸收、 ATP 的 输出。 因此, 整个过 程每产 生一个 ATP 需 要四个 质子。 
所以, 每对 电子从 复合物 I 传到 复合物 IV, 会有 12 个电子 (每种 复合物 需四个 质子) 从线粒 体基质 泵人膜 
间 空间。 当质 子通过 ATP 合成 瞎再次 进人线 粒体基 质时, 会产生 3molATP (每个 ATP 需四个 质子) 。 所以, 
氧 化憐酸 化的理 计量 式是: 每氧化 Imol DADH 合成 3mol 的 ATP , 每氧化 Imol 的琥珀 酸合成 2mol 的 ATP 

面, 接 收来自 细胞质 NADH 的电子 (von Jagow Klingenberg, 1970; Watson, 1976)。 这个 
脱氣酶 可能把 它的电 子释放 给共同 的受体 UQ, 因为在 细胞质 NADH 氧化中 只有两 个碟酸 
化位点 (Watson, 1976)。 来自 细胞质 NADH 的电 子在电 子传递 链上加 工处理 的其它 机制是 
借 助所谓 的穿梭 系统, 其中 最简单 的涉及 在细胞 质中将 憐酸二 经丙酮 还原为 3- 磯 酸甘油 
(DHAP + NADH ~~ -G3P + NAD" ) , 然后在 线粒体 3- 磯酸甘 油脱氣 醜的作 用下将 3- 磷酸甘 
油再氧 化成憐 酸二经 丙酮。 线粒体 3- 憐 酸甘油 脱氢醇 的催化 位点位 于线粒 . U 膜的外 表面, 
因 此为了 再氧化 3- 磷酸 甘油不 必通过 线粒体 内膜。 线粒体 3- 憐酸甘 油脱氢 雜是一 个含有 
FAD 的黄素 蛋白, 它 把电子 提供给 UQ 位 点上的 电子传 递链。 当电子 通过这 个穿梭 体系进 
行运 输时, NADH 氧化的 P/0 比将 类似于 琥珀酸 氧化的 P/0 比。 
2.3.4 回 补途径 

TCA 循环中 的两个 中间代 谢物, a- 酮 戊二酸 和草酰 乙酸是 氣基酸 和核昔 酸生物 合成所 
需的前 体代谢 物0。 在 TCA 循环中 这两种 物质没 有净的 生成, 为满足 其它的 细胞功 能而消 
耗的这 些物质 必须通 过别的 途径来 补偿。 能完成 这些作 用的一 系列反 应总称 为回补 途径。 回 
补途径 (见图 2.10) 包括: (1) 丙酮 酸在丙 酮酸羧 化酶作 用下的 梭化; (2) PEP 在 PEP 幾 
化醇的 作用下 羧化; (3) 苹 果酸在 苹果酸 薛 的作用 下氧化 生成丙 酮酸; (4) 乙酵酸 循环。 



在合成 亚铁红 素的类 亚铁红 素时, 琥 珀跣辅 HA 是作为 前体代 谢物, 但在这 里不是 这样。 这里號 珀醜辅 81 A 作 
为 合成其 它基团 的辅助 因子, 生成琥 珀酸。 號珀 酰辅雜 A 可由 琥珀 酸消耗 ATP 再生。 

30 



最重 要的回 补途径 是由丙 酮酸羧 化醇或 PEP 羧化醇 催化的 二氧化 碳固定 反应, 这导致 
草酰乙 酸生成 (见图 2.10)。 丙酮 酸羧化 SI 受高 水平的 ATP/ADP 比和乙 酰辅晦 A 激活, 而 
被 L- 天 冬氨酸 抑制, 因 此这个 SI 的调 控儿乎 完全与 丙酮酸 脱氢醉 复合物 的情况 相反, 后者 
被高 水平的 ATP/ADP 比或 NADH/NAD 比以 及高浓 度的乙 酰辅醜 A 所抑制 (Zubay, 
1988) 在 酸酒酵 母的细 胞质和 线粒体 中都发 现丙嗣 酸羧化 醉 的活动 (Haarasila 和 Taskinen, 
1977) 在许多 原核生 物中, 丙酮酸 羧化酶 是很活 泼的, 但在 真菌中 还没被 确认。 与 丙酮酸 
羧化醇 的调控 相似, PEP 按 化醇受 L- 天冬氨 酸抑制 而被乙 酰辅醉 A 激活 (Jerren 等, 1994)。 

乙酰辅 薛 A 不能 通过线 粒体内 膜运输 到细胞 质中, 而在细 胞质中 它是氨 基酸和 脂类生 
物 合成的 关键前 体物。 对 于真核 生物, 如果细 胞在能 量需求 和生物 合成所 'ril 碳架之 间不平 
衡, 那么就 必须在 细胞质 中合成 乙酰辅 SlA, 这可通 过两条 不同的 途径来 实现。 (1) 首先利 
用柠 檬酸能 在线粒 体膜中 自 由 运输, 并利用 柠檬酸 裂解解 将细胞 质柠檬 酸分解 成草醜 乙酸和 
乙 醜辅瞎 A, 并 同时将 ATP 水解成 ADP [图 2.10 中反应 (13)]。 通常, 对于乙 醜辅醉 A 
的需求 要超过 对草酰 乙酸的 需求, 由 该反应 所产生 的过剩 量草醜 乙酸在 细胞质 苹果酸 脱氢酶 
的催化 下生成 L- 苹 果酸。 然后 L- 苹 果酸或 者再进 人线粒 体或者 在苹果 酸酵的 作用下 氧化脱 
羧生成 丙酮酸 [图 2. 10 中反应 (15)]。 在苹 果酸醇 催化的 L- 苹 果酸氧 化中, 形成 NADPH, 
这个反 应可能 是真核 生物细 胞质中 NADPH 合成 的主要 来源。 (2) 第 二条途 径是经 由乙酸 
生成 细胞质 乙酰辅 BIA。 首先 丙酮酸 被氧化 脱羧生 成乙酸 ' 

acetate + CO2 + NADH + H + - pyruvate - NAD + = (2.11) 
(乙酸 ) (丙 S 酸) 

之后, 在乙 醜辅酶 A 合成酶 作用下 乙酸转 化成乙 酰辅瞎 A: 

acetyl-CoA + H2O + AMP + FP, - acetate - CoA ― ATP = (2.12) 
(乙 酰辅 HA) (乙酸 ) 

酿 酒酵母 采用这 个途径 (Frenkel 和 Kitchens, 1977), 但在 A . mW"/"". 、中, 乙 酰辅醜 A 合 
成 51 被乙酸 i 秀导而 受葡萄 糖阻遏 (Kelly 和 Hynes, 1982), 因 此反应 (2.12) 主要在 以乙酸 
为 底物时 才是活 泼的。 

在乙酸 酸循环 (也称 乙薛酸 支路) 中, 异柠檬 酸在异 柠檬酸 裂解酷 的作用 下裂解 成琥珀 
酸和 乙醛酸 [图 2. 10 中反应 (U)], 乙酵 酸可与 乙醜辅 薛 A 在苹 果酸合 成酶的 作用下 [图 
2. 10 中反应 (12)] 生成 L- 苹 果酸。 之后, L- 苹果 酸经一 系列与 TCA 循环中 相同的 反应转 
化成异 柠檬酸 [图 2.10 中 的反应 (9) 和反应 (2)]。 因此, 乙 酲酸循 环的净 结果是 从两分 
子乙 醜辅晦 A 合成 W 碳的號 珀酸。 这 个途径 在乙酸 代谢中 和脂肪 酸代谢 中是重 要的。 这里, 
乙酰辅 嗨 A 是中 间代 谢物。 

在 真核生 物中, 为细胞 质提供 a- 酮戊 二酸对 生物合 成是重 要的。 这个前 体代谢 物可由 
一个特 定的通 透醉穿 越线粒 体内膜 运输, 也可以 在细胞 质中由 细胞质 异柠檬 酸脱氣 醉来合 
成。 在 真菌中 已经识 别出两 种不同 的异柠 檬酸脱 氢薛: -种 依赖丁 NAiy, — 种是与 
NADP + 有 关的。 NAD 、异 柠檬 酸脱氢 薛 总与 线粒体 结合, 在 A. 中, 依赖于 

NADP+ 的异柠 檬酸脱 氢薛受 葡萄糖 阻遏, 主要在 以乙酸 为生长 基质时 有活性 (Kelly 和 
Hynes, 1982)。 这可以 解释有 两种异 柠檬酸 脱氧晦 存在的 原因: 在以 乙酸为 生长底 物时, 可 
以生成 NADPH。 这 里若经 PP 途 径生成 NADPH, 则在 能量上 是很昂 贵的。 对其它 生物体 
而言, 当以 葡萄糖 为生^ 基质 时也会 发现与 NADP' 相关的 异柠檬 酸脱氢 醉, 这 琴-, 它可能 
在 NAUPH 的 供应中 起重要 作用。 

31 



2.3.5 脂类、 有机酸 和氨基 酸的分 解代谢 

长 链脂肪 酸的分 解代谢 始于脂 肪酸的 活化, 即 与辅酶 A 和 ATP 反应 生成脂 酰辅酶 A 

RCO-CoA + AMP + PP, — RCOOH - ATP ― CoA = (2.13) 
此反 应由酰 基辅酶 A 连接酶 (或硫 激酶) 催化, 在哺乳 动物细 胞中发 生于胞 液中。 脂醜辅 
酶 A 在 i9- 碳上氧 化并先 后通过 四个反 应裂解 生成乙 酰辅酶 A 和减 少了两 个碳的 脂酰辅 g|A。 
这个 过程连 续进行 直到脂 酰辅酶 A 完全降 解成乙 酖辅酶 A。 该降 解反应 总化学 计量式 如下: 

in + l)acetyl-CoA+ "NADH+ "FADH2+ "H+ - CH3(CH2)2,,CO - CoA 

- «NAD+ - ,/FAD- 〃CoA = (2.14) 
在 哺乳动 物中, 这个过 程发生 在线粒 体内, 脂 酷辅酶 A 作为酰 基肉碱 衍生物 运输到 线粒体 
上。 FDAH2 捕获的 电子被 传递到 电子传 递链的 UQ 上。 在酵 母中, 脂 肪酸的 氧化发 生在微 
体中, 在过氧 化氢释 放过程 中电子 直接从 FADH2 转 移给自 由氧, 随后 过氧化 复由过 氧化氢 
瞎降解 (Tanaka 和 Fukui, 1989)。 

乙 醜辅酶 A 是乙 酸代 谢和脂 肪酸代 谢中常 用的中 间体, 如果 以这些 物质作 为惟一 碳源, 
需要一 些特殊 的途径 来合成 通常在 糖酵解 过程中 合成的 前体代 谢物, 如丙 酮酸、 3- 憐 酸甘油 
酸和 6- 憐酸 己糖。 这可通 过乙醛 酸支路 (由乙 酰辅醇 A 合成 了琥 珀酸) 和糖异 生途径 (可 
认 为是与 EMP 途径 相反的 途径) 来 实现。 当 利用乙 酸和脂 肪酸生 长时, 糖异 生从草 酖乙酸 
(由 琥珀酸 生成) 开始, 通过 GTP 进 行脱羧 及磯酸 化后, 进而在 PEP 羧化激 酶的作 用下生 
成 PEP。 接着, PEP 由 EMP 途 径的酶 转化成 1,6- 二憐酸 果糖。 最后, 1,6- 二 隣酸果 糖在二 
磷酸果 糖磯酸 酯酶的 作用下 水解成 6- 憐酸 果糖, 它是 单磯酸 己糖库 的一个 组分。 当 利用乳 
酸 生长时 乳 酸吸收 并转化 成丙酮 酸后, 糖异生 的第一 步就是 在丙酮 酸羧化 酶的作 用下由 
丙酮酸 生成草 酰乙酸 (见图 2.10)。 然后草 酰乙酸 通过一 系列与 前面相 同的糖 异生途 径的反 
应 转化成 PEP 以及其 它的糖 酵解中 间物。 当然, 只有当 糖酵解 途径上 的两个 关键反 应由磷 
酸果 糖激酶 和丙酮 酸激酶 作用, 并 在正反 应方向 (即 糖酵解 方向) 上不活 跃时, 糖异 生途径 
才能 进行。 这可通 过控制 这些酶 (它 总是存 在的) 的 活性来 实现。 通过使 2,6- 二磯 酸果糖 
(憐酸 果糖激 酶的激 活剂) 缺乏 或控制 1,6- 二憐 酸果糖 (丙 酮酸激 酶的激 活剂) 在较 低的水 
平 就可以 达到上 述目的 (Gancedo 和 Serrano, 1989)。 当 利用葡 萄糖生 长时, 糖异生 途径的 
两 个特异 酶受到 葡萄糖 阻遏。 

许多 生物体 能合成 和分泌 胞外蛋 白酶, 能把蛋 白质水 解成低 分子量 的肽和 氨基酸 C 肽在 
吸收之 前不必 完全水 解为氨 基酸, 因 为许多 微生物 能够运 输小的 寡肽, 即直到 五肽。 只要是 
在细 胞内, 这些寡 肽就被 胞内的 蛋白酶 或肽酶 水解。 胞 内和胞 外的蛋 白酶都 受氨的 阻遏, 而 
且 蛋白酶 的合成 受过量 的碳、 硫 和磯酸 阻遏。 蛋 白质水 解后, 大 多数生 成的氨 基酸分 解代谢 
始 于转氨 反应, 即 通过谷 氨酸转 氨酶将 a- 氨基氮 转移至 a- 酮戊 二酸: 

glutamate + a -keto acid ― a-ketoglutarate 一 L-amino acid = (2.15) 

(谷 氣酸) U- 酮酸) (a- 嗣戊 二酸) U-氣 基酸) 

接着, 谷氨 酸由与 NAD 相 关的谷 氨酸脱 氢酶进 行氧化 脱氨, 重 新生成 a- 酮戊 二酸: 

a -ketogluiarate + NH3 + NADH + H ' 一 glutamate — NAD + - H2O = (2.16) 



真菌中 的乳酸 代谢始 于在乳 酸脱氢 醜的作 用下丙 酮酸的 生成。 真菌的 乳酸脱 氢解是 黄素蛋 白不能 催化该 反应的 

逆 反应, 此时, 这种 真菌不 能产生 乳酸。 酵 母中的 乳酸脱 氣膀位 于线粒 体的膜 间隙, i^^f 辅晦 FDA, 此漪 可把电 子直接 
传给细 胞色素 C, 并受乳 糖诱发 葡萄糖 抑制. 

32 



与 NAD 相关 的谷氨 酸脱氛 藤主要 适合分 解代谢 功能, 当 在不含 有氧基 酸的基 本培养 基中生 
长时, 其活 性通常 很低。 脱 氨之后 的碳骨 架断开 生成丙 酮酸、 乙 酰辅瞎 A 或 TCA 循 环的一 
个中间 代谢物 (见表 2.4)。 对某些 氨基酸 而言, 碳骨 架断开 过程包 含很多 步骤, 如 色氧酸 
生成乙 酰辅酶 A 包括 12 步。 其 它的氨 基酸脱 氣后可 直接转 化成其 最终代 谢物。 



表 2.4 氨基 酸的分 解产物 



产 品种类 


t (基酸 


丙銅酸 


丙氨酸 (1), 丝氣酸 (1), 巯基 丙? S 酸 (3),® 基乙酸 (1) 


乙 St 辅 SI A 


苏氣酸 (1), 赖氣酸 (10), 亮第酸 (8), 酪教酸 (7), 苯基丙 酸 (8), 色 t (酸 (12) 


a- 銅 戊二酸 


谷氛酸 (1), 谷 氨酸盐 (2), 脯 酸 (3). 精 IS 酸 (4), 组 酸 (5) 


琥珀 Rit 辅雜 A 


蛋氣酸 (9), 异 亮氣酸 (9),嬢«酸(8) 


草 醜乙酸 


天 冬氣酸 (1), 天 冬銑胺 (2) 



注: 表 中带括 号的数 字表示 髙级真 核细胞 的分支 途径。 根据式 (2.16), 对于 大多数 S 基酸 来说, 括号 中的数 字常常 
是一 个分支 途径中 去氨基 作用的 结果。 



2.4 生物合 成反应 

细胞合 成所需 的结构 单元、 辅酶以 及辅基 的数量 大约为 75〜100 个, 这些 都是由 生物合 
成 途径中 合成的 12 种前体 代谢物 合成的 Ungraham 等, 1983)。 本节概 述了生 物合成 途径, 
重点集 中在这 些生物 合成途 径在细 胞生长 中的所 起的作 用以及 操作这 些途径 所需的 策略。 因 
此 没有详 述该途 径中具 体的单 个反应 步骤, 而 只是考 虑了主 要的生 物合成 途径, 如氨 基酸、 
核 苻酸、 糖类、 氨基 糖和脂 类的生 物合成 途径。 更 多的细 节可参 见一些 生物化 学书籍 和有关 
综 述文献 [如 Umbarger (1978) 关于 真菌中 氨基酸 的生物 合成; Jone 和 Fink (1982) 关于 
真菌 中氨基 酸和核 苷酸的 生物合 成以及 Neidhardt 等 (1987) 关 于细菌 中结构 单元的 生物合 
成的 广泛处 理]。 
2.4.1 氨基 酸的生 物合成 

众所 周知, 氨基酸 是合成 蛋白质 的结构 单元, 而且这 确实是 细胞中 常见的 20 种 氨基酸 
的主要 功能。 然而, 氨 基酸也 可作为 其它结 构单元 和重要 次级代 谢产物 如青霉 素生物 合成的 
前 体物。 氨 基酸生 物合成 的第一 步是氮 的同化 吸收, 由此 氮以氣 的形式 被固定 和结合 在有机 
分 子中。 这 主要通 过利用 a- 酮戊 二酸生 物合成 L- 谷 氣酸来 实现: 

L-glutamate + NADP ' + H2O 一 a -ketoglutarate — NH3 — NADPH — H + 二 (2.17) 
(L- 谷 氨酸) 

这 个反应 由连接 NADP 的 谷氨酸 脱氛醜 (GDH) 来催化 完成。 这个酶 是细胞 代谢中 的关键 
酶 一 而且 不同于 NAD-GDH, 后者催 化相反 的反应 (2.16), 这两种 醜代表 不同类 型的调 
节 机制。 NADP-GDH 受 L- 谷氨酸 阻遏, 而 且当利 用葡萄 糖生长 时活性 很高, 而 NAD-GDH 

受葡萄 糖阻遏 C 

L- 谷氨酸 生物合 成的另 一路线 是经过 所谓的 途径, 由两步 组成: 第 一步, 
L- 谷氨酰 胺作为 氣基的 供体, 把氨 基给" -酮戊 二酸, 结果生 成两个 L- 谷 镇酸: 

2L-glutamate + NADP+ - a -ketoglutarate - L-glutamine - NADPH - H ' =0 (2. 18) 

(L- 谷 ®K 胺) 

催化 这个反 应的是 谷氨酸 合成酶 (缩 写为 GOGAT, 来自先 前的俗 名谷氧 ft 胺酰胺 -2- 酮 lit 

二酸截 基转移 雜)。 第二步 是谷氣 酰胺的 再生: 

L-glutamine + ADP + ~P - L-glutamate - NH3 - ATP = (2.19) 

33 



此反 应由谷 氨醜胺 合成酶 (GS) 催化 完成。 上述两 步反应 (2.18) 和反应 (2.19) 的总和 
是从 a- 酮戊 二酸到 L- 谷氨 酸的净 合成, 这 与反应 (2.17) 相似, 但重 要差别 在于这 里需要 
能量, 即 每生成 一个谷 氨醜胺 需要水 解一个 ATP。 GS-GOGAT 途径对 于氣的 同化吸 收是一 
个高亲 和力的 系统, 其 主要在 低氨浓 度时才 活拨, 因为 谷氨酸 合成酶 受氨的 阻遏。 L- 谷氨醜 
胺在好 几种含 氮化合 物的生 物合成 中都可 作为氨 (氮) 的 供体, 这在整 个细胞 代谢中 是一个 
重 要的分 支点。 谷氨 醜胺合 成酶受 严格的 调控: 它受 L- 谷氨 酰胺的 阻遏, 同时 它也受 (起 
因可以 追溯到 L- 谷氨 酰胺) 代谢 途径的 许多末 端产物 (如 AMP, GTP, L- 甘 氨酸和 L- 组 
氨酸) 的 抑制。 许多 生物体 也可以 利用硝 酸盐或 亚硝酸 盐作为 惟一的 氮源, 这 些化合 物在同 
化吸 收前都 要转化 成氨, 因 此氨是 整个氮 代谢中 的一个 中心化 合物。 将 亚硝酸 盐还原 为氨要 



生 物台成 



谷 氨酸族 (5) 



酮 戊二酸 



谷 氨酸! 



谷 氨酷胺 
乌氨酸 



精氨酸 



« -氨基 己二酸 脯氨酸 



赖氨酸 



蛋氨酸 

天冬 氛酸族 (5) 草酷乙 酸"^ 经氨酸 高丝氨 酸^^ 苏氨酸 "^异 亮氨酸 



天 冬酰胺 



芳香族 (3) 碑酸 稀醇式 丙酮酸 + 4- 碑酸 赤藓糖 —— ► 分支酸 —— - 预苯酸 

色氨酸 



^苯 丙氨酸 



酷氨酸 



丙 靦酸族 (3) 



丙酮酸 酮异 i3i 酸 

丙氨酸 




甘氨酸 



亮^ 酸 



丝 氨酸族 (3) 



• fiS? 酸廿汕 酸 ~" = ~ - 丝氨酸 : 



甘氨酸 



半 胱氨酸 



组 氨酸族 (I) 



;-碑 酸核糖 ~ ► 组氨酸 



图 2. 12 真核体 内氨基 酸的生 物合成 
根 据合成 起点的 特定前 提代谢 物和氨 基酸, 这些氨 基酸可 以分为 五组。 L- 组氛酸 因为具 有复杂 的生物 
合成 途径, 与其它 的氨基 酸均不 I'lj 组。 图 中数字 表示代 谢途径 中所需 的反应 步骤。 除了 L- 赖 氨酸, 
这些数 字对丁 -细菌 的代谢 tii 是适 用的。 在细 菌中, L- 赖^ 酸通过 二氣基 庚二酸 (细 菌细 胞壁的 重要构 

成 单元) 由 天冬氣 酸经过 9 步合成 



34 



经过硝 酸盐、 低硝酸 (hyponitrate, N2O2). 一氧 化二氮 (N2O) 和经氧 (NH20H)。 在这 
些还 原反应 中氢的 供体为 NADPH。 硝酸盐 和亚硝 酸盐的 吸收可 能与胞 液中这 些物质 的还原 
相 耦合。 

已 经阐明 了许多 真核生 物和原 核生物 中所有 20 种常 见氧基 酸的生 物合成 途径, 图 2.12 
概括 了这些 途径。 这些 生物合 成路线 有一些 差别, 其 中赖氣 酸生物 合成最 重要。 在细 菌和高 
等植 物中, 赖 氨酸由 丙酮酸 和天门 冬氣酸 -/?- 半 酵中间 再经由 二氨基 庚二酸 (细 菌细 胞壁合 
成的重 要结构 单元) 合成。 而在真 菌中, 赖 氨酸由 a- 酮戊二 酸经由 a- 氣基 己二酸 合成。 

表 2.5 总 结了细 菌和真 菌中氣 基酸生 物合成 的代谢 消耗。 L- 蛋 氧酸和 L- 组氨 酸的生 物合成 
需要 转移一 个一碳 基团, 分别由 iV 5 - 甲 基四氣 叶酸和 10- 甲酰 四氣叶 酸提供 (都 转化成 四氢叶 
酸)。 这 两种不 同形式 的四氢 叶酸可 以相互 转化, 为了分 析代谢 消耗, 方 便的方 法是使 用一个 
共同的 基础。 在表 2.5 中, 5,10- 次 甲基四 氢叶酸 (5,10-MTHF) 转 化成四 氣叶酸 (THF) 用 
做 共同的 基础, 因为 这个转 化与从 L- 丝氨 酸合成 L- 甘 氨酸相 联系。 然而在 L- 甘 氨酸生 物合成 
中 生成的 5, 10-MTHF 的数 量一般 不能满 足对一 碳转移 基团的 需求。 另外 所需要 的一碳 转移基 
团 最可能 的来源 是甘氨 酸中的 a- 碳, 甘氣酸 在甘氨 酸氧化 醇作用 下按式 (2.20) 降解: 

C02 + NH3 + 5 , 10-MTHF + NADH + H + — L-glycine ― THF - NAD + = (2.20) 



a- 甘 S 酸) 

表 2.5 细菌和 真菌中 20 种 S 基酸 生物合 成的代 谢消耗 



i (基酸 


前体代 谢物' f 


ATP® 


NADH 


NADPH 


1-C® 


NH, 


S® 


L- 丙胺酸 


Ipyr 








- 1 





- 1 





L- 精氨酸 


lakg 




1 







-4 





L- 天冬 St 胺酸 


loaa 


-3 





- 1 





-2 





L- 天 冬氧酸 


loaa 








- 1 










L- 巯基 丙氡酸 ® 


Ipga 


一 4 


1 









- 1 


L- 谷 t [酸 


lakg 








- 1 










L- 谷 氨酸盐 


lakg 


- 1 





一 1 










L- 氨 基乙酸 


Ipga 





1 


- 1 


1 







L- 组氨酸 


IpenP 


-6 


3 


- 1 


- 1 







L- 异 亮氨酸 


loaa, Ipyr 

















L- 亮 S 酸 


2pyr, lacCoA 





1 


-2 










L- 赖氨酸 (真菌 ) 


lakg, lacCoA 


-2 




一 4 


Q 







L- 赖氨酸 


Ipyr, loaa 







-4 










L- 蛋氛酸 


loaa 







-8 


- 1 




- 1 


L- 苯基 丙氨酸 


2pep, leryP 


- 1 















L- 脯氣酸 


lakg 


- 1 





-3 










L- 丝氨酸 


Ipga 





1 


- 1 










L- 苏 S 酸 


loaa 







-3 










色氨酸 


2 pep , leryP , IpenP 






- 3 










酪氨酸 


2pep, leryP 


- 1 


1 


- 2 










缘氣酸 


2pyr 








-2 











① acCoA— 乙 St 辅 81 A; eryP— 4- 磯酸赤 藓搪; fruP — 6- 磯酸 果糖; gluP — 6-8? 酸葡 萄糖; 。kg — a-S 戊 :酸; 



glyp 一 3- 磯酸甘 油醒; oaa —草 St 乙酸; penP — 5 8? 酸 核糖; pep —礞酸 « 醇丙 S 酸; pga — 3-« 酸 甘油; py 「丙 銅酸。 

② 对于 上述反 应一个 ATP 水解 为一个 AMPiJ 程需消 耗两个 ATP。 

③ 5, 10- 二亚甲 基四水 合叶酸 是作为 碳供体 转化为 四水合 叶酸。 其它形 式的四 水合叶 酸作生 物合成 L- 蛋 S 酸和 L- 组 

it 酸 的基质 C 

④ 琉 酸盐是 S 的来 源, 并在 同化前 还原为 H^S 
© 假设 L- 丝 S 酸直 接? t 硫化。 

35 



2.4.2 核酸、 脂肪酸 和其它 结构单 元的生 物合成 

以 核糖核 苷酸和 脱氧核 糖核昔 酸形式 存在的 核昔酸 分别是 RNA 和 DNA 的结构 单元, 
然而 它们在 细胞中 还有许 多其它 功能。 它们是 一些辅 助因子 (如: NADH, NADPH, 
FAD, CoA) 和其 它一些 核苷酸 (如 在整个 细胞代 谢中具 有特殊 功能的 ATP) 的主要 组分。 
核 音酸由 三部分 组成: (1) 一 个杂环 的含氮 碱基, 嘌 呤或嚒 P 定; (2) —个糖 (RNA 中的核 
糖和 DNA 中的 2- 脱氧核 糖); (3) 一 个磯酸 基团。 DNA 的碱基 是嘌呤 [腺 噤呤 (A)、 鸟嘌 
呤 (G)] 及嘧啶 [胸 腺嘧啶 (T) 和 胞啼啶 (C)], 在 RNA 中存 在其中 的三种 碱基, 但第 
四种胸 腺嘧啶 (T) 被尿嘧 ijS (U) 所 代替。 

脱 氧核糖 核昔酸 (clAMP, dGMP, dUMP 和 dCMP) 是由相 应的核 糖核酸 (AMP, 
GMP, UMP 和 CMP) 通过由 氢取代 2'-OH 基团 而来的 (氣 是由 NADPH 提供 ) , dTMP 
是 dUMP 通 过甲基 化而得 到的。 核昔 酸是由 5- 磯酸 核糖和 3- 磷酸 甘油酸 (用 于嘌呤 生物合 
成) 或草 酖乙酸 (用 于啼 P 定生物 合成) 合 成的。 表 2.6 列 出了核 昔酸生 物合成 的代谢 消耗。 



表 2.6 生物合 成核苷 酸的代 谢消耗 



核昔酸 


代谢前 体物' P 


ATP 


NADH 


NAI3PH 


1-C 


NH, 


AMP 


Ipga, IpenP 


-9 


3 


一 1 


-1 




GMP 


Ipga, IpenP 


-11 


3 





- 1 




UMP 


loaa.lpenP 







- 1 





-2 


CMP 


loaa, IpenP 







- 1 





- 3 


dAMP 


Ipga, IpenP 


-9 


3 


-2 


-1 




dGMP 


Ipga, IpenP 


- 11 


3 


- 2 


- 1 




dTMP® 


loaa, IpenP 


-5 







- 1 


-2 


dCMP 


loaa , IpenP 















① 相 关术语 査阅表 2.5。 



② dTMP 生物 合成的 消耗等 同于从 dUMP 的合成 C dTMP 也可由 dCMP 合成, 但需要 更多的 消耗, 也就是 9 个 
ATPc 对于 £.",/!• , Inhraham et al. (1983) 指 出它的 dTMP 75% 来自于 dCMP, 25% 来自于 dUMP。 

脂类 是一种 异源化 合物, 包括: (1) 酰基 甘油; (2) 憐脂; (3) 固醇。 这 些脂类 组分的 
主要 结构单 元为脂 肪酸, 它存在 于醜基 甘油、 磯脂和 固醇酯 (固 醇的主 要库) 中。 主 要的脂 

肪 酸有: 棕榈酸 (C16: 0), 棕 榈油酸 (C16: 1), 硬脂酸 (C18: 0), 油酸 (C18: 1), 亚 
油酸 (C18: 2) 和 亚麻酸 (C18: 3)。 在真 菌中, 棕 榈酸、 油酸 和亚油 酸要占 75% 以上 
(Ratledge 和 Evans, 1989), 而 细菌中 最常见 的脂肪 酸为棕 榈酸、 棕 榈油酸 和油酸 (Ingra- 
ham 等, 1983)。 饱 和脂肪 酸的生 物合成 是通过 在活化 了的乙 酰辅酶 A 上连续 添加两 个碳单 
位而实 现的。 这些 碳单位 是由丙 二酸单 酰辅酶 A 提供 的, 而丙 二酸单 酰辅醇 A 是由 乙酰辅 
SIA 竣化 而成的 (Walker 和 Woodbine, 1976)。 在酵母 (也 可能 在其它 真菌) 中, 末端产 
物 为脂肪 酖辅醇 A 酯, 而不是 脂肪酸 (Ratledge 和 Evans, 1989)。 生物 合成" 个链 的脂酖 
辅酶 A 的总 化学计 量式为 

CH3(CH2)„ -2CO-C0A + ^^CoA + JH2O + ^^ADP + 

+ ^^NADP+ - yacetyl-CoA - ^^ATP - ( n - 2)NADPH -" - 2)H+ =0 (2.21) 

细 菌中, 单不饱 和脂肪 酸的合 成是通 过厌氧 途径进 行的, 从这 个名字 中就可 知道, 这 个途径 
在缺 氧条件 下才起 作用。 前已 提及, 只有当 4 个丙 二酸单 酰辅酶 A 已经 加到 增长着 的碳链 
上后, 这 个途径 才开始 进行。 生成的 化合物 /?- 经 癸酰基 -ACP 成 为生物 合成饱 和脂肪 酸和单 
36 



不饱和 脂肪酸 之间的 一个分 支点。 在 i9- 经癸 酸基硫 酷脱水 醜的作 用下, 插 人了 个 /?, y- 
顺式 双键, 然后 p, y- 不饱 和酰基 延长生 成棕榈 油酸。 在 真核生 物中, 第九个 碳原子 上的双 
键是在 Ci6 或 Ci8 饱 和脂肪 酖辅醇 A 已经合 成后才 引人的 (Walker 和 Woodbine, 1976; Ra- 
tledge 和 Evans, 1989)。 这个转 化是由 结合在 内脂网 上的特 定酷系 催化完 成的, 反 应需要 
NADH 和分 子氧, 反应 式如下 

oleoyl-CoA + 2H2O + NAD+ ― stearol-CoA — O2 — NADH — H + = (2.22) 

(油 酸辅雜 A) (硬脂 St 辅 K A) 

细菌 中不具 有多不 饱和脂 肪酸, 而 真核生 物能产 生大量 的多不 饱和脂 昉酸, 多 不饱和 脂肪酸 

的合 成可通 过与式 (2.22) 相似的 反应来 完成。 另外, 单 不饱和 脂肪酸 在结合 一个辚 脂后可 
以进一 步减小 饱和度 (Walker 和 Woodbine, 1976; Ratledge 和 Evans, 1989)。 

脂类组 分的其 它重要 结构单 元有: (1) 3- 磷酸 甘油, 它是磯 脂和三 酰甘油 酯的重 要组成 
部分; (2) 磯 脂的醇 部分; (3) 固醇。 3- 碟酸甘 油是从 EMP 途 径中的 燐酸二 经丙酮 直接转 
化 来的。 在 真菌中 最常见 的碟脂 醇有: 胆碱, 胆胺 和肌醇 (Rose, 1976)。 因 此在酿 酒酵母 
中, 磷脂 醜胆碱 (PC), 胆 胺憐脂 (PE) 和磯脂 酰肌醇 (PI) 占整个 脂类的 90% 以上 (Ra- 
tledge 和 Evans, 1989) 胆 胺和胆 碱不能 以游离 的形式 合成, 相 应的碟 脂是 从其它 的磷脂 
生 成的。 因此 PE 是由 碟脂醜 丝氨酸 (一种 含量很 低的以 L- 丝氨酸 为醇部 分的瞵 脂) 直接脱 
羧生 成的, PC 是 PE 连 续甲基 化而生 成的。 PI 是 由游离 的肌醇 相互结 合而生 成的, 而肌醇 
是 6- 碟 酸葡萄 糖经过 一个两 步途径 生成的 (Umezawa 和 Kishi, 1989)。 首先 碟酸肌 醇合成 
鹏用 NAD+ 为电子 受体将 6- 磷酸 葡萄糖 转化成 1- 憐酸 肌醇, 然 后肌醇 -1- 憐酸 酯薛将 1- 磷酸 
肌醇 转化成 肌醇。 在酿 酒酵母 中麦角 固醇占 固醇的 90% 以上。 到麦 角固醇 的途径 要途经 鲨稀, 
它是固 醇生物 合成中 常见的 一个中 间物。 目前 酷酒酵 母中生 成鲨' 浠的步 骤已研 究得很 清楚, 但 
是由 鲨稀进 一步转 化成麦 角固醇 (或 其它 固醇) 的详 细步骤 还不很 清楚。 细菌中 最重要 的憐脂 
种 类有: 胆 胺磷脂 (75%〜85%), 磯脂 醜甘油 (10%〜20%) 和 双磯脂 醜甘油 (5%〜15%)。 
这三 种磯脂 在直到 CDP- 二酰基 甘油以 前的途 径是相 同的, 然后途 径开始 分支。 胆胺磯 脂是经 
碟脂酰 丝氨酸 脱羧合 成的, 而憐脂 醜丝氨 酸是由 L- 丝氨 酸取代 CDP 而生 成的。 用 3- 隣 酸甘油 
取代 CDP- 二 酰基甘 油中的 CDP, 接着将 磷酸与 甘油部 分中的 连接处 断开即 生成了 SI 脂酰 甘油。 
最后, 两个 磷脂酰 甘油缩 合生成 双磷脂 醜薛甘 油并同 时释放 出一个 甘油。 

合 成糖原 的结构 单元为 UDP- 葡 萄糖, 同时它 也是合 成大肠 杆菌和 其它革 兰阴性 菌中脂 
多糖 层以及 真菌细 胞壁的 结构竿 -元。 UDP- 葡 萄糖由 1- 隣酸葡 萄糖在 焦磯酸 化醜作 用下生 
成。 当己糖 结合进 一个聚 合物时 释放出 UDP, 因此在 一个延 伸的糖 链中加 入一个 d 糖 ¥-磯 
酸的 总消耗 是一个 UTP (相当 于一个 ATP)。 构成细 菌细胞 壁的肽 聚糖的 生物合 成需要 5 
个 单体: UDP-.V- 乙醜葡 萄糖咹 (UDP-NAG), UDP-N- 乙酰 胞壁酸 (UDP-NAM), 丙氨 
酸 (L- 型和 D- 型), 二氛 基庚二 酸和谷 氨酸。 UDP-/V- 乙 醜 葡 萄糖胺 (它 也是 真菌中 合成几 
丁质 的结构 单元) 是由 6- 碟酸果 糖和乙 酰辅醇 A 合成 的, L- 谷 氨酰胺 为氣基 供体, 总化学 
计量 式如下 

UDP-NAG + L-glutamate + CoA + 〜PP - fructose-6-phosphate - acetyl-CoA 
(L- 谷 S 酸盐) (6-SS 酸 果糖) 

-L-glutamine-UTP = (2.23) 
当 UDP-Glc-NAc 结合成 肽聚糖 或几丁 质时, 释放出 U【)P, 因此合 成一个 几丁质 体的总 
能耗为 UTP。 糖 类结构 单元和 脂类的 生物合 成的代 谢消耗 列于表 2.7 中。 

37 



表 2.7 生物合 成脂类 和糖类 结构单 元的代 谢消耗 



结 构单元 


代谢 前体物 ® 


ATP 


NA[)H 


NADPH 


1-C 


NHj 


酸 tt 油 


1 glyP 





- 1 











栋榈 醜辅酶 A 


8 acCoA 


一 7 





- 14 








椋榈 油酷辅 藤 


8 acCoA 


-7 





― 14 








硬脂 酰辅醜 A 


9 acCoA 


-8 


1 


- 16 








油 酸辅酸 A 


9 acCoA 


-8 


2 


- 16 








亚油 醜辅醜 A 


9 acCoA 


-8 


3 


- 16 








亚 麻酰辅 SI A 


9 acCoA 


-8 


1 


- 16 








乙 醇胺③ 


1 pga 





1 


- 1 





-1 


维生素 B 


1 pga 





1 


- 1 


- 3 


一 1 


肌糖 


1 gluP 





1 











麦 角固醇 


18 acCoA 


-18 





- 13 








UDP- 葡萄糖 


1 gluP 


- 1 














UDP- 半乳糖 


1 gluP 


- 1 














UDP-NA (; 


1 fruP.l acCoA 


-2 











- 1 


UDP-NAM 


1 fruP , 1 pep , 1 acCoA 







- 1 





- 1 


二 氣基庚 二酸盐 


1 oaa , 1 pyr 


- 2 





-3 








① 相 关术语 査阅表 2.5。 

② 棕榈油 酰辅醇 A 的生物 合成消 耗是通 过厌氧 途径。 

③ 由于从 1: 條 到麦角 固醇的 途径尚 未完全 了解, 因 此我们 认为麦 角固醇 在生物 合成的 代谢消 耗等同 于鲨稀 的值。 



2.5 聚 合反应 

细胞生 物质中 的大分 子可分 成以下 几类: (1) RNA; (2) DNA; (3) 蛋 白质; (4) 糖 
类; (5) 氨 基糖和 (6) 脂类。 大分 子组成 随生物 种类的 不同而 不同, 对 于一个 已给的 生物, 
其大分 子组成 随比生 长速率 和环境 条件而 改变。 图 2.13 列出了 细菌和 真菌中 最重要 的大分 
子 库与比 生长速 率之间 的函数 关系。 细 菌中, 蛋 白质和 RNA 占生 物质的 80% 以上, 稳定的 
RNA 含量随 比生长 速率而 增加, 而 蛋白质 含量随 比生长 速率而 降低, 而其它 的库中 组分如 
DNA, 脂类, 脂 多糖, 氨基糖 (肽 聚糖) 以 及糖类 (主 要为 糖原) '则 基本 恒定。 在 真菌中 
则存 在很大 不同, 总糖库 (糖 和氨 基糖的 总合) 占 生物质 的很大 比例, 约 20%〜30%, 而 
且这个 比例随 比生长 速率而 降低。 糖 类库主 要存在 于细胞 壁中, 这说明 随比生 长速率 的不断 
增 加而生 物质比 例不断 降低。 如 同细菌 一样, 真菌中 RNA 含量随 比生长 速率而 增加, 但与 
细菌 相反, 真 菌中蛋 白质组 分也随 比生长 速率而 增加。 在 细菌和 真菌中 稳定的 RNA 的这种 
线性 增加, 在 其它许 多不同 种类生 物中也 存在, 据 报道, 酿酒酵 母中蛋 白质含 量随比 生长速 
率的增 加而有 个慢的 增加。 

细胞 RNA 总库 由信使 RNA (mRNA), 核糖体 RNA (rRNA) 和转运 RNA (tRNA) 
组成。 在 大肠杆 菌中, 当 比生长 速率为 1.0 h_i 时, RNA 组分为 5% mRNA, 18% tRNA, 
77% rRNA (Ingraham 等, 1983)。 在低比 生长速 率下, 当 rRNA 含量消 耗时, tRNA 的相 
对含量 增加。 在 iVeimxs/wracrasM 中也 可看到 类似的 情况, 每个核 糖体中 tRNA 分 子的数 
目 随比生 长速率 的增加 而降低 (Alberghina 等, 1979)。 然而, 即使在 低的比 生长速 率条件 
下, rRNA 也占 稳定的 RNA (即 rRNA 与 tRNA 之和) 7596 以上。 因此, 稳定的 RNA 库 
是细 胞内核 糖体水 平的一 个很好 的度量 标准。 黑曲 霉中核 糖体由 53% 的 rRNA 和 47% 的蛋 
白 质组成 (Berry 和 Berry, 1976), 大 肠杆菌 中核糖 体含有 60% 的 rRNA 和 400^ 的蛋 白质。 
核糖体 在蛋白 质合成 中起了 重要的 作用, 核 糖体和 一些嗨 一起构 成了所 谓的蛋 白质合 成系统 
(protein synthesizing system, PSS) (Ingraham 等, 1983)。 
38 



25 



60 



0.4 08 12 1.6 

稀 释速勒 h— • 

0.02 0.04 06 08 1 0.12 
时间 /h- 1 

(a) (b) 
图 2.13 细菌 和真菌 中最重 要的大 分子库 随比生 长速率 的变化 

(a) 在 £. o)/; 中的蛋 白质库 (A), RNA 库 (♦) 以及 DNA 库 (口), 数据 来自于 Ingraham et al (1983); 

(b) 在 P. chrysogenurn 中的蛋 白质库 (□), RNA 库 (■) 以及 糖类库 (A), 数据 来自于 Nielesen ( 1997) 

由于 细胞的 蛋白质 合成耗 能甚多 (见表 2.8), 因 此细胞 中存在 PSS 的严密 控制。 所以, 
细胞根 据需要 调节其 核糖体 水平。 这也 解释了 为什么 稳定的 RNA 库与 比生长 速率呈 正相关 

(见图 2.13)。 当环 境条件 发生动 态变化 以及改 变实验 条件使 比生长 速率下 降时, 在 稳定的 
RNA 含量与 比生长 速率之 间可以 观察到 类似的 关系: 直 到核糖 体的含 量已经 适应于 新的生 
长条 件时, rRNA 的合成 才停止 (Sturani 等, 1973)。 在 低的比 生长速 率下, N.c 嶋 a 的 
核 糖体水 平接近 定值, 但 核糖体 的效率 随比生 长速率 的升高 而下降 (Alberghina 等, 1979)。 
因此, PSS 的 净效率 随比生 长速率 趋于零 而继续 下降。 在 A.nidula" (Bushell 和 Bull, 
1976) 和大 肠杆菌 (Ingraham 等, 1983) 中也 观察了 类似的 结果。 因此, 在 低比生 长速率 
时, 细胞中 具有一 些未使 用的和 未被有 效使用 的代谢 机能。 一旦 环境条 件发生 改变, 该机能 
可 被迅速 激活。 

表 2.8 不 同种类 生物中 细胞蛋 白质的 «1 基 酸组成 (以摩 尔分数 表示) 



氨基酸 


E. coli ① 


P . c7i rysogen u "i ② 


S . cerecisiae® 


L- 丙氨酸 


9.6% 


10% 


4.7% 


L- 精氨酸 


5.5% 


4.8% 


5.6% 


L- 天冬酰 氨酸/ L- 天冬 氨酸盐 


9.0% 


9.6% 


12.7% 


L- 胱氨酸 


1.7% 


1.4% 


0.9% 


L- 谷氛 酸盐/ L- 谷氧酸 


9.8% 


14.9% 


13.4% 


L-S 基乙酸 


11.5% 


9.2% 


5.6% 


L- 组第酸 


1.8% 


2.4% 


9.1% 


L- 异亮 S 酸 


5.4% 


4.3% 


5.2% 


L- 亮氣酸 


8.4% 


7.5% 


7.9% 


L- 赖氨酸 


6.4% 


5.6% 


3.1% 


L- 蛋氨酸 


2.9% 


1.7% 


4.7% 


L- 苯基丙 S 酸 


3.5% 


3.4% 


4.0% 


L- 脯氣酸 


4.1% 


4.7% 


4.3% 


L- 丝氣酸 


4.0% 


6.1% 


5.2% 


L- 苏気酸 


4.7% 


5.3% 


1.4% 


L- 色氛酸 


1.1% 




4.0% 


L- 酪氨酸 


2.6% 


2.6% 


6.5% 


L- 缀氨酸 


7.9% 


6.4% 


1.7% 



① 有关 £. coll 的数 据来自 于 Ingraham et al (1983)。 

② 有关 P. chrysogenurn 的 数据来 自 于 Henriksen et al (19%)( 

③ 有关 S . cerevisiae 的数据 来自于 Cook (1958)。 



o o o o c 

5 4 3 2 " 




M ^ m 5 



VNCrvi 



39 



mRNA 翻译成 蛋白质 主要发 生在由 60S 和 40S 两 个亚基 组成的 细胞质 80S 核糖 体上。 
真核生 物中, 一些蛋 白质, 如 FiFo-ATP 酶, 细 胞色素 b 和 TCA 循环 中的某 些酶, 是在线 
粒 体中合 成的, 而线粒 体包含 DNA 和核 糖体。 翻译 过程包 括三个 独立的 阶段: 起始, 延长 
和 终止。 起始阶 段是由 相当多 数量的 特定蛋 白因子 催化的 (至少 10 个), 其结果 是一个 80S 
起始复 合物的 形成。 起始复 合物形 成后, 通过在 延伸着 的肽链 上连续 添加氨 基酸使 肽链延 
长。 延长阶 段包括 四步: (1) 氨基酸 与同族 tRNA 连接; (2) 氨基酰 -tRNA 与核糖 体的结 
合; (3) 形成 肽键; (4) 移位, 导 致肽基 -tRNA 在核糖 体中的 移动及 伴随着 mRNA 移动一 
个密 码子。 氨基酰 -tRNA 的激活 与形成 需要将 ATP 水解成 AMP, 氨基酰 -tRNA 结 合到核 
糖体 上需要 GTP 水 解成为 GDP, 肽基 -tRNA 在核糖 体中的 移位需 GTP 水解成 GDP。 因 
此, 在延 伸的肽 链上添 加一个 氨基酸 共需要 4 个 ATP 等 价物。 另外, 在 mRNA 合 成与校 
对等 过程中 还需要 一些自 由能, 总 计是每 结合一 个氨基 酸约需 0.3 ATP (Ingraham 等, 
1983) 对 于微生 物细胞 的氨基 酸组分 (见表 2.8), 摩尔质 量约为 llOg/mol 蛋白质 结合氨 
基酸, Ig 蛋 白质的 聚合总 化学计 量式为 (所 有计量 系数以 mmol 表示) 

"Ig of protein" + 39.1 ADP + 39. 1 〜P _ 9. 1 amino acid- 39.1 ATP = (2.24) 
(ig 蛋 白质) (氣 基酸) 

核 DNA 转录成 RNA 需 要三种 RNA 聚 合酶来 完成: RNA 聚合酶 A, 用 于合成 rRNA; 
RNA 聚合酶 B, 用 于合成 mRNA; RNA 聚合酶 C, 负 责合成 tRNA。 单磷酸 核昔酸 结合形 
成 RNA 之前, 必须转 化成三 磯酸核 苷酸, 这 对每个 核昔酸 来说需 要两个 ATP。 而且, 在 
RNA 合成过 程中, 最初转 录产物 的一个 片段, 在转 录后需 被移走 并水解 成为单 磷酸核 昔酸, 
重新 激活这 些核昔 酸也需 要两个 ATP。 Ingraham 等 (1983) 认为 大约有 20% 的初始 转录物 
被 丢弃, 因此 结合一 个核糖 核昔酸 (作 为单 磯酸) 的能量 消耗为 2.4 个 ATP。 酿酒 酵母中 
以 Imol 为基准 的全部 RNA 的核 昔酸组 成为: 25.60/6 AMP, 26.2% UMP, 28.6% GMP, 
19.6% CMP (Mounolou, 1975), 因此, 可得 RNA 的摩尔 质量为 323g/mol 的 RNA 结合 
核 昔酸。 因此, 合成 IgRNA 的总 化学计 量式为 (所 有计量 系数以 mmol 表示) 

"Ig of RNA" + 7.44 ADP + 7.44〜P- 0.79 AMP -0.81 UMP-0.89GM 

-0.61 CMP -7.44 ATP = (2.25) 

DNA 复制 是一个 复杂的 过程。 在 DNA 聚 合醉能 够复制 DNA 双链 之前, 双螺旋 结构必 
须被 打开, 这 需要一 组特殊 的酶来 完成, 而 且这个 过程需 要输入 吉布斯 自由能 来打开 互补碱 
基 之间的 氣键。 螺 旋中缠 绕的双 链的分 离在单 链中形 成环, 称为 超螺旋 卷曲。 为避免 在已解 
开的 DNA 链 上产生 超螺旋 卷曲, DNA 旋转 酶定期 地打开 其中一 个链上 的憐酸 酯键, 以允 
许相 对的链 能自由 旋转。 旋转 之后, 同样的 酶使之 重新形 成键。 解幵双 螺旋的 总能耗 为每对 
碱 基两个 ATP, 即 DNA 每 结合一 个核昔 酸需要 1 个 ATP (Ingraham 等, 1983)。 双 链一旦 
分离, DNA 聚合酶 就开始 复制, 即 核昔酸 (活 化成三 磷酸的 形式) 的 组装。 DNA 的 复制是 
非常精 确的, 即复制 101" 个 核苷酸 可能出 现一个 错误。 这 种准确 性部分 是通过 DNA 聚合醜 
中 的一种 固有的 外切核 酸酶活 性来实 现的。 这种 DNA 聚 合酶通 过向后 移动而 除去其 自己的 
错配, 而且 只有它 后面是 一个正 确匹配 的碱基 对时, 它 才能沿 前进方 向催化 复制地 进行。 校 
正所 需的能 耗估计 是每个 核苷酸 0.4 个 ATP (Ingraham 等, 1983)。 因此, 结 合一个 脱氧核 
糖 核苷酸 (作 为单 磔酸) 的总 能耗为 3.4 个 ATP。 不 同种类 生物间 的细胞 DNA 的 组成只 
有少许 差别, 组成 近似是 24.5% dAMF, 24.5% dTMP, 25.5% cJGMP, 25.5% cJCMP。 
由 此得出 DNA 的摩尔 质量为 310g/mol DNA 结合核 昔酸, 而合成 Ig 结合 1)NA 核昔 酸的总 
40 



化学计 量式为 (所 有计量 系数以 mmol 表示) 

"Ig of DNA" + 11.0 ADP+ U.O〜P- 0.79 dAMP-0.79 dTMP 

-0.82 dGMP-0.82 dCMP- 11.0 ATP = (2.26) 

磷脂的 生物合 成首先 是由脂 酰辅酸 A 与 3- 憐酸 甘油的 1 碳和 2 碳结合 生成碟 脂酸, 按 
着由 CTP 活化 而生成 CDP- 二脂醜 甘油。 最后, 醇 结合到 磯酸基 团上, 释放出 CMP。 因此, 
从结 构单元 合成磯 脂的能 耗是从 CTP 转化为 CMP, 这对应 于两个 ATP。 为 了计算 合成磯 
脂生 物合成 总代谢 消耗, 需 要知道 不同种 类磷脂 的相对 含量和 脂肪酸 的相对 含量。 酿 酒酵母 
中憐 脂的组 分有: 约 50% PC, 20% PI 和 30O/6 PE, 大肠杆 菌中约 950/6 的 憐脂是 PE 和磯 
脂酰 甘油, 两 种成分 约等量 存在。 总的 脂肪酸 组分依 生物的 不同而 不同, 也取 决于环 境条件 
[见 Ratledge 和 Evans (1989) 的关于 酵母脂 肪酸组 分的综 述]。 酸酒酵 母中的 典型组 分为: 
15.6% C16: 0, 31.4% C16: 1, 5.1% C18: 0, 32% C18: 1 和 3.40/(> C18: 2。 在 产黄青 
霉 中总脂 肪酸组 分为: 8% C16: 0, 7% C18: 0, 24% C18: I, 59% C18: 2 和 20/6C18: 3 
(MeLsgeier 等, 1990)。 大 肠杆菌 中的脂 肪酸组 分为: 约 43%C16: 0, 33% C16: 1 和 24% 
C18: 1 (Ingraham 等, 1983)。 

固醇 酯是通 过直接 把固醇 (代 表性的 是麦角 固醇) 加到脂 酰辅醇 A 上而 得的, 三脂醜 
甘 油是用 脂酰辅 51 A 取代 磷脂酸 上的磔 酸基团 而得。 磷脂 酸是随 着把脂 酰辅薛 A 加到 3- 磷 
酸 甘油的 鱗酸化 的碳上 而得。 

2.6 生 长能学 

生 长能学 描述了 吉布斯 自由能 (通 常是 ATP 的 形式) 的 产生与 消耗的 关系, 因 此涉及 
到 运输、 供能 反应、 生 物合成 反应以 及大分 子合成 反应。 生长能 学起源 于经典 的得率 研究, 
其中 质量得 率系数 ys>c (见 3.4 节), 是通 过同时 直接测 定底物 的消耗 和生物 质的生 成而确 
定的 (Monod, 1942)。 由于能 源的作 用是以 ATP 的形 式提供 吉布斯 自由能 来驱动 生物合 
成反应 和聚合 反应, 因此 ATP 得 率系数 YxATP [即 合成 生物质 所消耗 ATP 的量 (mmol 
ATP'g_i (干重 ))] 与 质量得 率系数 Ysx 相比, 其是 细胞更 基本的 特性。 Bauchop 和 Elsden 

(1960) 最初的工作引入了 八丁?得率系数 V^ATP。 遵从上 述工作 十多年 之后, YxATP 被认为 

是普遍 常数, 其值为 95mmol ATP'g — 1 (干重 ) (Forrest 和 Walker, 1971)。 然而, 1973 年 
Stouthamer 和 Bettenhaussen 认为 ATP 形成 与消耗 之间呈 下列线 性关系 

厂 ATI' = ^xATP/^ + f" ATP (2.27) 
现在, 这个 方程是 解释生 长能学 的权威 框架, 它 是基于 ATP 水平的 拟稳态 假定。 根据 

细 胞能量 水平的 强调控 机制和 ATP 库的 高转换 速率, 也就 是说, 其松 弛时间 是以秒 计的, 

而细 胞生长 的松弛 时间是 以小时 计的, 所 以这个 假设是 非常合 理的。 因此, 即 使对突 然的环 
境 扰动, 例 如向酿 酒酵母 的稳态 连续培 养中加 入一个 葡萄糖 脉冲, 那么 也能在 扰动后 的几分 

钟内 达到新 的稳态 ATP 水平 (Theobald 等, 1993)。 

式 (2.27) 表明 ATP 的生 成速率 rATP[mmol ATP'g — 1( 干重) 'h — I] 与 ATP 的 消耗速 
率是平 衡的, 后 者表示 为以下 两部分 之和: 一部分 是菌体 生长的 ATP 消耗, 而另一 部分是 
与生 长无关 的过程 (如 维持) 的 ATP 消耗 (以 "ZAiT 表示 )。 实 际上, 与生长 无关的 过程的 
ATP 消 耗更加 普遍, 它包 括所有 与生长 无关的 ATP 消耗, 其中 也含无 效循环 和其它 难以说 
明的 ATP 应用 (见 方框 2.2)。 与生长 有关的 ATP 消耗 可进一 步分为 三部分 (Benthin 等, 
1994) 

41 



YxATP= YxATP, growth + ^xATP , lysis T 1 xAT,lcak 

(2.28) 

式中, Y=cATP,gr。wth 是 指用于 运输、 生物 合成和 聚合的 ATP 消耗, \^ATP,lysis 是指 用于已 
降 解的大 分子等 进行再 聚合的 ATP 消耗, Y^TPJeak 包 括所有 其它的 ATP 消耗, 即 由于渗 
漏、 无效循 环及与 生长相 关的维 持等。 

方框 2.2 用于 维持的 ATP 消耗 

许 多细胞 反应需 要消耗 ATP, 但 并没贡 献于菌 体的净 合成, 这 些反应 通常称 为维持 
反应 (或过 程)。 其中 一些维 持反应 与生长 有关, 例如 用于维 持细胞 穿越质 膜的电 化学梯 
度, 而其它 的是与 细胞的 比生长 速率无 关的。 因此我 们需要 区分与 生长相 关的和 与生长 

无关的 维持。 与生长 相关的 维持的 ATP 消 耗分为 两种, 即 l^ATP.Iysis 和 YxATP,leak。 很难 
把不同 的过程 分为与 生长相 关的和 与生长 无关的 维持, 但是 有一些 最重要 的维持 过程可 
叙述 如下。 

* 浓度梯 度和电 势梯度 的维持 

为确保 适当的 功能, 细胞要 维持穿 越质膜 以及真 核细胞 要穿越 线粒体 膜的各 种浓度 
梯度和 电化学 梯度。 这 些过程 需要吉 布斯自 由能, 但 不会导 致新菌 体量的 合成, 因此是 
维 持过程 的典型 例子。 这些 过程中 有一部 分是与 生长相 关的, 例 如细胞 膨胀变 大时, 这 
些梯度 需要在 增大着 的面积 (或 体积) 上 维持; 但也 有一部 分是与 生长无 关的, 即当细 

胞 不生长 时梯度 也需要 维持。 维持 梯度的 ATP 消耗 估计可 达全部 生成的 ATP 的 50% 
(Stouthamer, 1979) o 
• 无 效循环 

细胞 内有一 系列反 应其净 结果是 ATP 的 水解。 这样的 一个例 子是: 6- 磯酸果 糖在磯 
酸果 糖激酶 的作用 下生成 1,6- 二憐酸 果糖, 随后 1,6- 二磷酸 果糖在 二磷酸 果糖磯 酸酯醇 
的 作用下 降解成 6- 磯酸 果糖。 这 两步反 应导致 ATP 的净 消耗。 这 类循环 最初被 当作是 
代谢控 制的一 个缺陷 (因此 称为无 效循环 ), 但目前 这种循 环被认 为是当 两种酶 都存在 
时, 允 许迅速 调整到 新环境 条件的 一种重 要的代 谢控制 机制。 

* 大分子 的周转 

为保持 细胞控 制代谢 功能的 能力, 许多 分子需 要不断 降解和 合成。 因此 mRNA 具 
有典型 的几分 钟的半 衰期。 大分子 的这种 连续的 降解和 再聚合 导致了 ATP 的净 消耗, 
而没 有新生 物量的 产生, 因此 也被认 为是一 种维持 过程。 

基于对 运输、 生 物合成 和聚合 的代谢 消耗的 估计, 有可能 计算出 yxATP,gr。wth 的理 论值, 

但不可 能从理 论上估 算出其 它两种 形式的 ATP 消耗, 因 此也就 不能估 算出用 于菌体 生长, 
总的 ATP 消 耗的理 论值。 然而, 通 过把化 学计量 学与底 物消耗 速率及 产物形 成速率 的精确 
测 量结合 起来, 我 们可以 计算出 ATP 的 生成。 当 生成的 ATP 作为比 生长速 率的函 数时, 
可 以确定 >^八1-[>和 ^«&17的实验值 (见例 3.3)。 在 好氧生 长时, 这需要 实际的 P/0 比值。 
而 在厌氧 生长条 件下, 通常 有可能 利用代 谢产物 形成的 测量值 精确地 估算出 ATP 的 生成。 

表 2.9 列出 了一些 YxATT 和 mATP 的 实验测 定值。 

利 用在前 一部分 中给出 的用于 运输、 生物 合成和 聚合的 代谢消 耗的估 计值, 有可 能计算 
出细胞 合成所 需的总 ATP 和 NADPH。 这 种计算 的基础 是碳源 (通常 是葡萄 糖), 而 前一部 
分 的计算 基础是 12 种 前体代 谢物。 2.3 节 中已讨 论过, 这 12 种 前体代 谢物是 由能量 供应反 
应中的 碳源合 成的。 表 2. 10 列 出了从 Imol 葡萄 糖合成 12 种前 体代谢 物的化 学计量 系数。 
42 



表 2.9 y^ATP 和 /«ATP 的实验 测定值 



菌 名 






参 考文献 


Aerolyucter aerogeties 


7 1 
/ 1 


. o 


Stouthamer and Bettenhaussen (1976) 




c-7 

J/ 


z .3 


Stouthamer and bettenhaussen ( 1976) 


Escherichia coiz 


V / 


1 Q Q 


Hempfling and Mainzer ( 1975) 


Lactobacillus cas€z 


A 1 


1 C 
1 .J 


de V ries et al \\y 


Lactobcictllus dclbfucki t 


f L 




iviajor ana DUll 、 lyoo ) 


Lactococcus creinoris 


73 


1.4 


Otto et al (1980) 




53 




Brown and Collins (1977) 




15〜50 


7〜18 


Benthin et al (1993P 


Lactococcus diacetilactis 


47 




Brown and Collins (1977) 


Saccharojny cescerevisiae 


71-91 


<1 


Verduyn et al (1990) 



① 单位为 mmol ATP'g— I (干重 )。 

② 单位为 mmol ATP'g— I (干重 )'h— 

③ 根据 他们的 分析, Benthin etal (1993) 发现 依赖于 培养基 组成的 高能参 数存在 很大的 变动。 



如果用 于形成 前体代 谢物、 结 构单元 和大分 子的代 谢消耗 已知, 那 么就可 以计算 出合成 
整 个细胞 所需的 ATP。 表 2.11 列 出了一 个典型 的细菌 细胞和 一个典 型的真 菌细胞 中的结 

果, 结果发 现两种 细胞的 ATP 消 耗几乎 相同。 在细 菌和真 菌中, 用于 合成蛋 白质、 RNA、 
DNA 和 糖类的 ATP 消 耗几乎 相同。 而 在真核 体中, 用 于脂类 合成的 ATP 消 耗要明 显高于 
细 菌中的 ATP 消耗, 这是 由于真 核细胞 中要合 成更加 复杂的 特殊的 磷脂。 还需 指出, 细菌 
中用于 运输的 ATP 消耗 是低的 (见 2.2.3 节), 净 结果是 用于合 成细菌 细胞的 ATP 需求要 
低于真 菌细胞 合成的 ATP 需求。 表 2.11 中列 出的总 ATP 消耗 是针对 所指定 的大分 子组成 
的。 而且 ATP 消 耗是随 大分子 组成的 变化而 改变的 (见图 2.13)。 因此, 在产 黄青霉 菌中, 
ATP 的消 耗从低 比生长 速率的 35mmol ATP'g — 1 (干重 ) 变 化到高 比生长 速率的 40mmol 
ATP'g — 1 (干重 ) (见表 2.11) (Nielsen, 1997)。 



表 2.10 利 用葡萄 糖合成 12 种前体 代谢物 的化学 计量学 



代谢 前体物 


葡萄糖 '工 


ATP 


NADH 


NADPH 


(^0: 


6- 碟酸 葡萄糖 


- 1 


- 1 











酸果糖 


-1 


- 1 











5-SI 酸核糖 


- 1 


- 1 







1 


4- 磯酸 赤藓糖 


- 1 


- 1 





4 


2 


3- 碟酸 甘油酵 


-0.5 


- 1 











碟酸 甘油酸 


-0.5 





1 








« 酸稀醇 丙兩酸 


-0.5 





1 








丙銅酸 


-0.5 


1 


1 





1 


乙酸辅 SS 


-0.5 


1 


2 








乙 St 辅 SS A + 草 St 乙酸③ 


- 1 





3 








乙 St 辅 BS A 士 


- 0.5 


- 1 


1 


1 


1 


乙酰辅 iSA® 


-0.5 


- 1 


2 





1 


a- 銅 戊二酸 


一 1 


1 


4 





1 


號珀 酸辅醇 A® 


- 1 


1 









草酰 乙酸⑦ 


-0.5 





1 





- 1 



① 所 有的计 量系数 均指每 摩尔葡 萄糖. 

② 通 过丙銅 酸脱氛 SI 形成 (活跃 于原核 细胞中 )。 

③ 通 过柠檬 酸裂解 81 形成。 

④ 通 过柠檬 酸裂解 解和过 S 的草 銑乙酸 形成。 
© 由 丙銅酸 经醋酸 形成。 

© 通 过一种 NADH 连接异 佇椽酸 裂解脱 ^SS 形成。 
⑦ 通过丙 S 酸羧化 81 形成。 

43 



表 2.11 利用 基本培 养基合 成细菌 细胞和 真菌细 胞的典 型组成 

[g'g— 1( 干重 )] 和 ATP 消耗 [mmol ATP'g — > (干重 )]® 



大分子 



£ . coli 



组 分 



ATP 



P . chrysogenum 



组 分 



ATP 



蛋白质 
RNA 
DNA 
脂类 

碟脂 

固醇脂 

三元酷 基甘油 
糖类 

几丁质 

糖原质 
可溶解 的库② 

氨基酸 

核酸 

代谢物 
灰分 
运输 

氣水 

硫酸盐 

隣酸盐 
共计 



0.52 
0.16 
0.03 
0.09 



0.17 



21.88 
4.37 
1.05 
0.14 



!. 06 



0.03 



45 

08 

01 

05 

035 

010 

005 

25 

22 

03 

08 

04 

02 

02 

08 



1.00 



0.77 
34.71 



4.24 



1.00 



39 



.10 
.14 
,12 
,02 



① 有关 £. coli 的数据 来自于 Stouthamer (1979), 有关 P. cfiry 零画" 的数据 来自于 Nielsen (1997)。 所做 的计算 
都是 基于在 最简单 的培养 基上的 设置, 也就 是说葡 萄糖作 为碳源 和能源 来源, 无 机盐作 为其它 元素的 来源。 

② 代 谢物可 溶解的 库合成 所需的 ATP 消 耗包括 在大分 子的生 物合成 的消耗 当中, 比如, 游离的 氨基酸 的生物 合成的 
ATP 消耗 包括在 蛋白质 合成的 ATP 消耗 当中。 

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47 



第 3 章 细胞反 应的综 合模型 

在上一 章中讨 论了一 些主要 的代谢 途径, 通过 这些途 径碳- 能源分 解代谢 成代谢 合成及 

细胞 生长所 需的自 由能及 碳架。 为了完 整地描 述中间 代谢, 需向第 2 章 中复杂 的代谢 途径中 
补 充各个 反应的 化学计 量学、 动力 学及热 力学等 信息。 主 要涉及 反应及 代谢途 径可行 性问题 
的 热力学 将在第 14 章详细 讨论。 关于 反应动 力学, 尤其 是在体 内条件 下的动 力学信 息是特 
别难获 得的, 但这样 的信息 对于理 解代谢 通量控 制是必 需的。 代 谢通量 控制是 代谢工 程当然 
也是本 书的一 个中心 问题。 从大量 的中间 代谢研 究中很 容易得 到各个 单个反 应的化 学计量 
式, 将其 扩展到 整个代 谢途径 就提供 了建立 能量、 物质平 衡及解 释相互 耦联的 反应和 途径之 
间相互 作用的 基础。 代 谢途径 的化学 计量学 提出了 某些必 须通过 细胞培 养测定 才能满 足的限 
制 条件, 由此而 引出下 一章将 要讨论 的数据 一致性 问题。 

本章将 讨论通 过汇集 细胞中 所有的 反应以 提供细 胞代谢 的综合 模型的 方法。 显然, 仅能 
考虑所 有可能 反应中 的一少 部分, 因为其 中很多 反应甚 至还不 知道, 或 将其包 括就有 可能产 
生 难以处 理的大 系统。 同时, 还不清 楚增加 代谢反 应描述 的细节 能把细 胞模型 的精确 度及实 
用 性提高 到什么 程度。 尽 管有许 多方法 可进行 反应的 汇集, 但 其合理 性及一 致性是 最重要 
的。 本章 将为构 建细胞 模型的 化学计 量学提 供一个 框架, 它也适 用于分 析很大 的反应 网络。 

3.1 细 胞反应 的化学 计量学 

所 有细胞 反应的 最终结 果是底 物转变 为自由 能和代 谢产物 (如初 级代谢 物)、 或 更复杂 

的产物 (如次 级代谢 物)、 胞外 蛋白、 生物 质组分 如细胞 蛋白、 RNA、 DNA 及脂 类等。 这 
些转化 反应是 经由大 量的代 谢物进 行的, 这 些代谢 物包括 代谢前 珠 物及 合成大 分子库 的结构 
单元。 若 要分析 这个巨 大的反 应组, 就必 须详细 说明其 化学计 量学, 这 将以一 个通用 的方式 
进行。 为此, 有必 要区分 底物、 代谢 产物、 胞内代 谢物及 生物质 组分, 本书对 其定义 如下。 

• 底物 指存 在于无 菌培养 基中的 物质, 能 被细胞 进一步 代谢或 直接结 合进细 胞中。 
用如 此广的 定义, 底 物的数 量通常 很多, 范围 从碳、 氮及 能源到 对细胞 功能所 必需的 各种矿 
物质。 在绝大 多数情 况下, 仅考 虑碳、 氮 及能源 物质。 由 于葡萄 糖通常 作为碳 源及自 由能的 
来源, 因此所 考虑的 底物的 种类通 常很少 (葡 萄糖、 氨, 或许 还有氧 )。 

• 代 谢产物 指由细 胞生成 并分泌 至培养 基中的 物质。 它或 者是初 级代谢 产物, 如二 
氧 化碳、 乙醇、 乙酸、 乳 酸等; 或者 是更复 杂的次 级代谢 产物; 或者是 分泌到 胞外培 养基中 
的异源 蛋白。 

• 生物 质组分 指构 成生物 质的大 分子库 (或者 是一个 单个的 大分子 ), 包括真 正的细 
胞 组分如 RNA、 DNA. 蛋 白质、 脂类、 糖类等 的大分 子库, 还 包括积 累在细 胞内的 大分子 
产物, 如 多糖、 生物聚 合物或 未分泌 的异源 蛋白。 

• 胞内 代谢物 指一 类包括 在细胞 内的所 有其它 物质。 因此, 它 既包括 不同代 谢途径 
的中间 产物, 如糖酵 解中间 产物, 也 包括用 于大分 子合成 的结构 单元, 如氨基 酸等。 

上述 在生物 质组分 和胞内 代谢物 之间所 作的区 分不同 于根据 它们在 细胞反 应中转 换的时 
间 尺度所 对应的 胞内化 合物。 与 大分子 相比, 小分 子物质 如糖酵 解中间 产物库 (还 有氣基 
48 



酸) 有 非常快 的转换 (见例 8.1)。 因此 它们符 合拟稳 态假设 (见第 8 章)。 另一 方面, 在瞬 
态 生长过 程中, 生 物质组 分随时 间变化 缓慢。 在某 些时候 很难断 定某物 质是作 为胞内 代谢物 
还 是代谢 产物。 例如, 醜 酒酵母 糖酵解 途径的 通量很 高时, 丙 酮酸能 积累并 分泌至 胞外, 而 
当糖 酵解通 量由于 葡萄糖 浓度降 低而减 少时, 菌 体可重 新吸收 利用丙 酮酸进 行代谢 反应。 很 
明显 丙酮酸 是一个 途径的 中间代 谢物, 但由 于它被 分泌至 胞外, 所以 也可作 为代谢 产物。 在 
本 书中, 我们 将这类 物质视 为代谢 产物。 因此, 在菌 体培养 过程中 的任一 时刻, 凡在 培养基 
中 所能检 测到的 物质均 应视为 底物或 代谢终 产物。 

下面 两个例 子将说 明上述 分类, 第一个 例子是 通过活 跃在许 多细菌 中的憐 酸转移 酷系统 
(PTS) 吸收葡 萄糖。 实际的 PTS 运 输机理 涉及到 许多酸 (见 2.2.3 节), 但为 了讨论 方便, 
通过 下列总 的化学 计量反 应式将 PTS 概 括为: 

glucose ― PEP + glucose-6-phosphate + pyruvate = (3.1) 

(葡 萄糖) (碟酸 炼醇丙 兩酸) (6- 碟酸葡 萄糖) (was 酸) 
另一个 例子是 由结合 NADPH 的谷 氨酸脱 氧鹏所 催化的 氨的吸 收同化 (见 2. 4.1 节), 其计 
量反应 式为: 

a -ketoglutarate — NH3 - NADPH 一 H + + L-glutamate + NADP + + H2O 二 (3.2) 

(a- 嗣戊 二酸) (L- 谷 第 酸) 

在上 述反应 式中, 在正 反应中 的物质 (作 为反 应物) 的计 量系数 为负, 而在正 反应中 生成物 

的计 量系数 为正。 除符号 之外, 这 些计量 系数还 提供了 重要的 信息, 例如 Imol 葡萄 糖的吸 
收及 磷酸化 消耗了 Imol PEP, 同 时生成 Imor 丙 酮酸。 

为了 用通式 表示, 底物、 代谢产 物及胞 内中间 代谢物 的化学 计量系 数分别 以 a、 P、 g 
来 表示。 需 要注意 的是: 底物 的化学 计量系 数一般 为负, 代 谢产物 为正, 而中 间代谢 物可正 
可负。 尽管谷 氨酸和 a- 酮戊 二酸是 细胞生 物质的 组分, 但根 据上述 定义, 在反应 (3.2) 中 
可认 为它们 是胞内 中间代 谢物。 在 这些例 子中, 没有 考虑生 物质, 但在 通常情 况下, 其化学 
计量 系数以 y 表示。 2.4.2 节推导 了合成 生物质 大分子 组分的 总化学 计量反 应式, 正 是在这 
些反 应中以 y 表示细 胞组分 的计量 系数使 其与参 加其它 代谢反 应的胞 内代谢 物被区 分开。 

定义了 底物、 代谢 产物、 胞内代 谢物、 生物质 组分的 化学计 量系数 之后, 现在 可重新 审视反 
应 (3.1) 与反应 (3.2)。 显然 葡萄糖 和氨是 底物, 除质 子和水 之外, 所有 其它物 质是胞 内代谢 
物。 因此 在反应 (3.1) 中 a^it. 及 gpKP 为- 1, 反应 (3.2) 中 ggiut 为 1。 尽管 由于质 子和水 的含量 
与 其它细 胞组分 中相比 独占优 势从而 不被包 括在反 应计量 式中, 但 它们仍 可被视 为代谢 产物。 

现继续 说明如 何建立 细胞反 应的一 般化学 计量反 应式。 为此, 考 虑某一 iV 个底物 转化为 
M 个代谢 产物及 Q 个生 物质 组分的 系统, 转化 反应在 •/ 个反应 进行, 其中 K 个胞内 代谢物 
作 为途径 中间产 物参与 反应。 化学反 应计量 系数的 下标用 两个字 母分别 表示反 应数及 反应物 
质, 例如 a,, 是第 Z 个底 物在第 _ /个 反应中 的计量 系数。 在普 遍化的 化学反 应计量 式中, 我们 
引人化 学计量 系数, 对 应于全 部反应 中每步 反应的 底物、 代谢 产物、 胞内 代谢物 以及生 物质组 
分。 由于有 的物质 没有参 与某一 反应, 因此有 许多计 重系数 为零。 如 在反应 (3.2) 中, 葡萄 
糖 的计量 系数就 为零。 底物、 代 谢产物 及生物 质组分 分别用 S,、 P.. X„^„n,, 表示, 另外, K 

个途径 的中间 产物以 Xmeu, 表示。 在此定 义下, 第 J 个细胞 反应的 化学反 应计量 式为: 

N M Q K 

1] a„S, + 1]/?;,P, + 1] y,,Xmacr。., + AV^mt", = (3.3) 

,=1 .=1 <=! '=1 

在 代谢模 型中, J 个细胞 反应中 的每一 个反应 均可得 到像式 (3.3) — 样的计 量式, 因 

49 



此可 以很方 便地用 矩阵以 很简洁 的形式 将所有 J 个反 应的 化学计 量式表 示为: 

AS + BP + rXmacro + GXmet = (3.4) 

这里, A、 B、 r 及 G 分别 表示 J 个反 应中 底物、 代谢 产物、 生物质 组分、 途 径中间 代谢物 
的计 量系数 矩阵。 其中矩 阵中的 行代表 反应, 列 代表代 谢物。 因此, 矩阵 A 的第 行及第 
列的元 素就代 表着第 个反应 中的第 Z' 个 底物的 化学反 应计量 系数。 前 面已讨 论过, 计量系 
数 可正、 可负或 为零。 对于式 (3.4) 这样通 用型的 化学计 量式, 许 多计量 系数变 为零。 尽 
管 确定模 型中所 有反应 和所有 物质的 计量系 数比较 繁琐, 但矩阵 形式的 优点是 能对矩 阵进行 
运算, 从而便 于随后 的分析 (对 矩阵的 表示法 及运算 不熟悉 者可参 看方框 4.2)。 另外, 以 
矩阵表 示化学 计量反 应式, 很容 易得到 不同化 合物参 与各种 反应的 概况, 因为 只需察 看该物 
质在 特定的 矩阵中 所处的 那一列 即可。 化 学计量 系数矩 阵的列 汇集了 某一特 定物质 在所有 
个 反应中 的计量 系数。 通过例 3.1 可 说明这 一点, 在此例 中根据 方程式 (3.3) 及式 (3.4), 
建立了 大肠杆 菌混合 酸发酵 的化学 计量反 应式。 

在细胞 反应中 有一些 辅助因 子对, 其中 ATP/ADP、 NAD+/NADH 及 NADP+/ 
NADPH 是最重 要的。 辅助 因子对 中的两 种物质 的计量 系数通 常大小 相等, 符号 相反, 例如 
在反应 (3.2) 中, NADPH 及 NADP+ 的化 学计量 系数分 别为- 1 和 1。 因而, 这些 辅助因 
子的不 同形式 的胞内 浓度是 密切相 关的, 例如在 任何反 应中, NADPH 及 NADP+ 浓 度的总 
和是恒 定的。 若化学 计量反 应式含 有某一 辅助因 子对, 在其 计量系 数矩阵 G 中将产 生线性 
相关 的列, 即某 一列是 其它列 的线性 组合, 这将 在随后 的分析 中产生 问题。 由 于辅助 因子对 
之间是 直接相 关的, 因此没 有必要 同时考 虑它们 两个。 在 所有情 况下, 我们仅 考虑辅 助因子 
对中 的一个 即可。 但 有一点 很值得 注意, 即如 果只考 虑某一 辅助因 子对中 的一个 物质, 那么 
它们之 间的相 互转化 也应遵 循同一 原则, 如 ATP 与 ADP 之间 的相互 转化。 若在某 些反应 
中另外 的化合 物是由 此辅助 因子对 之一形 成的, 如从 ATP 生成 AMP, 就有 必要将 其计量 
系 数考虑 进去, 这与 2.6 节 中能耗 的计算 相似, 它是以 ATP 生成 ADP 作为基 础的。 在某 
些情 况下, 不能直 接识别 是否保 存着像 辅助因 子对中 一半的 物质, 但通 过检验 计量矩 阵中行 
的相关 性就可 确认。 



【例 3.1】 大 肠杆菌 的混合 酸发酵 

大 肠杆菌 是一个 兼性厌 氧菌, 它调节 着一个 较复杂 的发酵 过程, 通 常称该 过程为 混合酸 
发酵。 在此过 程中, 共 生成七 种代谢 产物, 除琥珀 酸是由 磯酸' 烯 醇丙酮 酸生成 之外, 其余均 
由 丙酮酸 生成。 琥 珀酸是 经草酰 乙酸生 成的, 而 草酰乙 酸经谷 氨酸转 氨反应 生成天 冬氨酸 
(1 分子 NADPH 及 一分子 氨用于 a- 酮戊 二酸再 生为谷 氨酸, 因此它 们在图 3.1 中是 作为反 
应物 ), 天 冬氨酸 脱氨生 成延胡 索酸, 再经延 胡索酸 脱氣酶 (它 与作用 方向相 反的琥 珀酸脱 
氢酶 不同) 还 原为琥 珀酸。 图 3.1 描述 了混合 酸发酵 的关键 步骤, 表 3.1 列出 了某些 典型产 
物的 得率。 建立 化学计 量模型 的目的 是为了 说明在 一个典 型的大 肠杆菌 细胞中 进行分 解代谢 
反应时 培养基 中代谢 物的净 变化。 

我 们现在 建立一 个简单 的混合 酸发酵 的代谢 模型。 为了将 不必要 的复杂 性减至 最低, 不 
考 虑糖酵 解的所 有中间 产物。 因此, 葡萄糖 至磔酸 稀醇丙 酮酸的 转化可 汇集成 一个具 有如下 
化学 计量关 系的总 反应: 

- yglucose + PEP + N ADH = (1) 

50 



表 3.1 大 肠杆菌 混合酸 发酵典 型产物 的得率 



代 谢产物 


每 100 mol 葡萄 糖发酵 生成产 物的量 /niol 


代 谢产物 


每 100 niol 葡萄 糖发酵 生成产 物的量 /mol 


甲酸 


2.4 


乙醉 


49.8 


乙酸 


36.5 


C02 


88.0 


乳酸 


79.5 


H2 


75.0 


號珀酸 


10.7 







注: 数据 来自于 Ingraham et al (1983)。 



葡萄糖 



NADH 



PEP 
ATP V 



( ? 2 ] NADH 
~^^草酰乙酸 "^^^天冬氨酸一^ 



延 胡索酸 



NADH 



唬珀酸 



NADH 



NH3 



丙酮酸 

^( 甲酸 



乳酸 



乙酷 醜 A 



NADH 



乙酰 碑酸 
^ ATP 



乙薛 

广 NADH 



乙酸 



乙醇 



图 3.1 大肠杆 菌混合 酸发酵 
底物 (葡 萄糖) 及 7 种代 谢产物 置于方 框中, 代谢 模型中 的胞内 代谢物 和辅助 因子为 
黑体。 从草 St 乙酸形 成天冬 氣 酸的转 氨反应 以直接 S 化表 示, 为 

了减少 复杂性 就没有 列出谷 氣酸及 a-S 戊二酸 

號珀 酸生成 途径中 的中间 产物, 如草酖 乙酸、 天冬 氨酸、 延胡 索酸均 省略。 另外, NADH 
和 NADPH 被 汇集在 一个单 个还原 力库, 这在本 质上表 明用于 将草醜 乙酸转 变为天 冬氨酸 
的 谷氨酸 再生过 程中, 只以 NADH 而不是 NADPH 作 为辅助 因子。 因此, 碟 酸稀醇 丙酮酸 

转化 至琥珀 酸的总 化学计 量反应 式为: 

- PEP - C02 - 2N ADH + succinate = (2) 

(琥 珀酸) 

憐酸 稀醇 丙酮酸 转化至 丙酮酸 及其进 一步转 化生成 乳酸、 甲酸、 乙 酰辅醯 A 的计量 反应式 
可直 接从图 3.1 得到: 

- PEP + pyruvate + ATP = (3) 
- pyruvate - NADH + lactate = (4) 
(乳酸 ) 

― pyruvate + acetyl -Co A + formate = (5) 
(乙 酸 辅 iSA) (甲酸 ) 

同样, 甲酸 水解为 C02 和 H2 可写为 : 

- formate + CO2 + H2 = (6) 

最后, 还需 列出生 成乙酸 和乙醇 的代谢 途径的 计量反 应式。 省略中 间产物 (乙 醜碟 酸和乙 

51 



(7) 



(8) 



醛) 后, 总计量 反应式 变为: 

- acetyl- CoA + acetate + ATP 二 
(乙酸 ) 

― acetyl-CoA ― 2NADH + ethanol = 

(乙醇 ) 

至此, 大 肠杆菌 混合酸 发酵可 用上述 8 个总反 应式来 表示。 值 得注意 的是, 在 此过程 中省略 
了代谢 途径中 直线部 分的所 有中间 产物, 而只 考虑了 分支点 处的代 谢物。 之所 以这样 做是对 
所有 胞内代 谢物作 拟稳态 假设的 结果, 在第 8 章 将详细 讨论。 

根据式 (3.4) 的 矩阵表 示法可 对上述 8 个方 程进行 分类。 葡 萄糖为 底物, 琥 珀酸、 
C02、 乳酸、 甲酸、 H2、 乙酸 及乙醇 为代谢 产物, 磯酸 烯醇丙 酮酸、 丙 酮酸、 乙酰辅 酶八、 
ATP 及 NADH 为 胞内代 谢物。 此模 型不含 生物质 组分, 这是因 为没有 涉及到 合成反 应而仅 
考虑 了供能 反应。 据此 由反应 (1) 〜反应 (8) 的 化学计 量式, 可得 

G 



A 
丄 

— T 











B 
























fp 1 

' sue 




1 











1 、 


1 


一 1 

















f CO, 




- 1 











- 2 























Plac 




- 1 


1 





1 











1 





















- 1 








- 1 
















Plor 























1 


















-1 


1 











1 





- 1 


1 










































1 





p 

■* ac 










- 1 


1 























1 


Pe, 










-1 





-2. 



(9) 



式 (9) 提供 了所考 虑反应 的方便 概况。 因此, 通过 察看最 后一个 计量系 数矩阵 G 中的 第四 
列, 可看 出只有 两个反 应生成 ATP, 即磷 酸烯醇 丙酮酸 转化至 丙酮酸 [反应 (3)] 及乙酰 
辅酶 A 转化 至乙酸 的反应 [反应 (7)]。 因为 这两个 反应的 通量是 可测的 (至 乙酸的 通量可 
通过 乙酸的 生成速 率直接 测量, 磷酸' 烯醇丙 酮酸至 丙酮酸 的通量 可通过 直接测 量除琥 珀酸之 
外所有 代谢产 物的生 成速率 之和、 或者葡 萄糖吸 收速率 与琥珀 酸形成 速率之 差来获 得), 所 
以就 可获得 ATP 总合成 速率的 信息。 由于在 厌氧条 件下, 无 其它来 源提供 ATP, 因 此也可 
用后者 估算用 于菌体 生长及 维持的 ATP 消耗 速率。 此外, 由于 葡萄糖 转化为 不同的 代谢物 
时必 须达到 氧化还 原平衡 (或 相当于 NADH 平衡 ), 葡 萄糖的 吸收必 须与琥 珀酸、 乳 酸及乙 
醇 的形成 有关。 因此, 利用表 3.1 的数据 以及胞 内代谢 产物计 量系数 矩阵中 的最后 一列数 
据, 就可 得到每 100 mol 葡萄糖 消耗的 NADH 为: 

2 X 10.7 + 79.5 + 2x49.8 = 200.5 
这与每 lOOmol 葡萄 糖转化 为磯酸 條醇丙 酮酸而 生成的 200mol NADH 非常 吻合。 



3.2 反 应速率 

3.1 节 中的化 学计量 反应式 表明了 J 个胞内 反应中 每一个 反应生 成或消 耗物质 的量, 但 
不能计 算出代 谢产物 分泌至 培养基 的速率 或相对 数量。 通 过引入 单个反 应的速 率并进 一步将 
其耦联 起来就 可确定 产物分 泌的总 速率。 某一化 学反应 的速率 用正反 应速率 (或 速度) 表 
示, 它 指计量 系数为 /9 的 化合物 的生成 速率是 /3t^。 通常, 每个 反应的 某一化 学计量 系数可 
52 



任 意定为 1, 因 此在特 定的反 应中, 正反 应速率 就等于 该物质 的消耗 或生成 速率, 例如, 反 

应 (3.1) 的速 率就等 于通过 PTS 系统的 葡萄糖 的吸收 速率。 为此, 正 反应速 率的舉 位通常 
表示为 mo 卜 1, 当考 虑到体 积的因 素时, 其 单位可 表示为 mo 卜 (L.h) — 1。 对 于细胞 反应, 
常 以生物 质作为 参考, 定义所 谓的比 速率, 其 单位为 mo 卜 g-i (干重 ) .h— I。 将 3.1 节中 J 
个 反应的 正反应 速率汇 集于速 率向量 V 中, 那么 (3j,Vj 就 表示第 J 个 反应中 的第/ 个代 谢产物 

的 比生成 速率。 由于底 物的计 量系数 (即 矩阵 A 的元素 ) 通常 为负, 则第 J 个反应 中第/ 个 
底 物的比 转化速 率就为 -a,,T,,。 若 要计算 某物质 的总生 成速率 或消耗 速率, 则 必须将 其在不 
同 反应中 的贡献 相加。 例 3.1 的 大肠杆 菌混合 酸发酵 可说明 此点: 在一 个反应 (甲酸 脱梭基 
反应) 生成的 C02 被 用于另 一反应 (碟酸 烯醇丙 酮酸的 羧化反 应), 显然 C02 的总生 成速率 
由这 两个反 应的相 对速率 确定。 因此, 第; 个 底物的 净比吸 收速率 可用其 在所有 J 个 反应中 
的 消耗率 之和来 表示: 

= - 2] (3.5) 
同样, 第 个代 谢产物 的净比 生成速 率为: J 

r,„ =- (3.6) 

; =1 

式 (3.5) 及式 (3.6) 说明 在可直 接测定 的底物 比吸收 速率、 产 物比生 成速率 与不可 直接测 
定的不 同的胞 内反应 速率之 间有着 重要的 关系。 通 常以通 量代表 后者用 以说明 它们是 通过途 
径而 非单个 反应的 速率。 若某 物质仅 在一个 反应中 生成, 其消耗 或生成 速率的 测量就 是这个 
反应速 率的一 个间接 测量。 因此, 回到例 3.1 大肠杆 菌混酸 发酵的 例子, 可以 看到, 乙酸的 
生成速 率就等 于从乙 酰辅酶 A 经憐酸 乙酰至 乙酸的 通量。 换 言之, 本 例中的 第七个 反应的 
速率 (或 通量) 可通 过测定 乙酸的 生成速 率进行 计算。 

与式 (3.5) 及式 (3.6) 相似, 对 生物质 组分及 胞内代 谢物, 可 得出: 

r macro,' - 〉 ^ 7 力" _) (3.7) 

j = l 

J 

rmetj = 2 Sji'^j (3.8) 

这些 速率不 像底物 比吸收 速率及 产物比 生成速 率那样 容易进 行实验 测定。 式 (3.7)、 式 
(3.8) 中的速 率是净 比生成 速率, 并 且可通 过胞内 组分的 测量对 其进行 量化。 因此, 一个物 
质可以 在一个 反应中 消耗, 而在另 一反应 生成。 式 (3.7) 与式 (3.8) 中左边 的速率 就是在 
全部 J 个 胞内反 应中该 物质生 成及消 耗的净 结果。 若速率 rme,,, 为正, 则 表示第 / 个 胞内代 
谢 物的净 生成, 若 为负, 则为净 消耗, 如 果速率 为零, 就 表明在 J 个反 应中, 生成 与消耗 
比速率 正好互 相平衡 (这 种平 衡是代 谢通量 分析的 基础, 在第 8 章〜 第 10 章将详 细讨论 )。 
式 (3.5) 〜式 (3.8) 的加 和方程 可用矩 阵表示 如下: 



r 、二- A'〜 (3.9) 

rp = B^v (3.10) 

rniacro ― F v ( 3 . 11) 

rme, = GTv (3.12) 



这 默比速 率向量 r, 包括 N 个比底 物吸收 速率, fp 包括 M 个比产 物生成 速率。 

53 



【例 3.2】 大 肠杆菌 混合酸 发酵的 比速率 

现 在将例 3.1 中 8 个 反应的 速率以 VI 



当然 通过式 (3.9) 也可 得到该 结果: 



=- ( 



表示, 则立即 可得出 葡萄糖 比吸收 率为: 
_ 1 



(1) 



0) 



^'8 



1 



(2) 



因此, 如果知 磷酸' 烯醇丙 酮酸的 通量以 表示, 则 其等于 葡萄糖 比吸收 速率的 2 倍。 
同 样可得 到代谢 产物的 比生成 速率, 例 如对于 C02 来说: 

rco,= ve- V2 (3) 

由于 H2 的比 生成 速率一 定等于 t^6, 琥 珀酸的 比生成 速率一 定等于 1^2, 则 C02 生成 速率应 

等于 上述两 个速率 之差, 这一点 可作为 限制条 件用以 检验数 据的一 致性。 注意表 3.1 中的数 
据 似乎不 一致, 因为 每代谢 lOOmol 葡萄糖 形成的 C02 多于 H2, 这 或是由 于实验 误差, 或 
是由于 模型太 简单造 成的。 

在 这样简 单的模 型中, 很 容易直 接从单 个反应 速率与 底物比 吸收速 率及产 物比生 成速率 
之间推 导出相 互关系 (不 必用矩 阵形式 )。 然而 对胞内 代谢物 却不是 这样, 因 为它们 可以参 
与几个 不同的 反应。 因此, 对于所 考虑的 5 个 胞内代 谢物, 可 得如下 结果: 



(4) 



如例 3.1 中所讨 论的, rATP 可视为 磷酸稀 醇丙酮 酸至丙 酮酸的 通量与 丙酮酸 至乙酸 的通量 

之和。 



'厂 PEP 




1 


-1 


- 1 














0, 






rpyr 










1 


- 1 


-1 













Vi - V4 - V5 


r AcCoA 
















1 





- 1 


-1 




V5 - Vy- Vfi 


厂 ATP 










1 











1 







V3+ V, 


,NADH J 




1 


- 2 





一 1 











-2. 







3.3 动态质 量平衡 

在前一 节中, 推 导出了 关联胞 内反应 速率与 底物吸 收速率 及产物 生成速 率的方 程式。 后 
者可 通过实 验测定 底物及 代谢产 物浓度 得到。 在 讨论如 何通过 这些测 量求得 比速率 之前, 有 

必 要考虑 生物反 应器的 动态, 因为这 样的测 量通常 是在生 物反应 器中进 行的。 图 3.2 是生物 
反应器 的一般 表示, 其 体积为 V (L), 新鲜 无菌培 养基以 F,„ (L'h_i) 的 流率进 入反应 
器, 用过的 培养基 以^„„1 (L-h-') 的流率 流出反 应器。 反应 器中的 培养基 假定处 于完全 
(或 理想) 混合 状态, 即不 同培养 基组分 的浓度 不随空 间位置 变化。 对 于小体 积的生 物反应 
54 



器 (<1L, 包括摇 瓶), 经通气 及搅梓 可达此 目的。 而对 于实验 室的搅 拌生物 反应器 (1~ 
10L), 为了保 证反应 器内培 养基处 处均勾 一致, 需引入 一些特 殊设计 (Sonnleitner and Fi- 
ethter 1988; Nielsen and Villadsen 1993)。 并不是 所有的 生物反 应器都 涉及到 培养基 的连续 
流动, 其 可有几 种不同 的操作 方式, 现 仅考虑 三种最 常用的 方式: 

• 分 批式, F,n = F。ut = 0, 即培养 液体积 恒定, 

它是传 统的发 酵操作 方式, 而且 由于实 验设施 相对简 
单, 也 为许多 生命科 学家所 使用。 分批 式实验 具有操 
作 简单、 在短时 间内能 获得大 量实验 数据的 优点。 其 
缺 点是: 由于 整个实 验过程 的动态 变化, 即细 胞所经 
历 的环境 条件随 时间而 变化, 使 得解释 实验数 据变得 
困难。 若使 用装备 精良的 生物反 应器, 那么至 少某些 

变量如 pH 及溶解 氧等, 可控制 在恒定 水平。 

• 连 续式, F,。 = F。ut#0, 培养 液体积 恒定。 典 
型 的连续 式生物 反应器 称为恒 化器, 所 设计的 加料培 
养基 中有一 种限速 底物, 以允许 生物质 的比生 长速率 
在可 控制的 范围内 变化。 连续式 生物反 应器的 优点是 
可获 得稳态 的操作 条件, 允许在 非常确 定的环 境条件 
下 精确地 测定比 速率。 通过改 变加料 速率, 可 进一步 
改 变实验 条件, 由 此可得 到环境 条件对 细胞生 理影响 
的有用 信息。 连 续式生 物反应 器的缺 点是: 需要准 备大量 新鲜无 菌的培 养基, 因此劳 动强度 
大, 而且 经过很 长时间 才能达 到稳定 状态。 尽 管连续 操作有 优点, 但在 工业化 生产中 极少使 
用, 这 是因其 对污染 敏感, 如 经由加 料流的 污染。 此外, 对遗 传不稳 定性也 敏感, 可 导致快 
速 生长的 突变株 产生, 在与 生产菌 株竞争 中处于 优势。 连续式 操作的 其它例 子是恒 pH 器, 
它是通 过调节 加料流 以维持 生物反 应器的 pH 恒定。 还有恒 浊器, 调节 加料流 以维持 生物量 
浓度 恒定。 

• 流加式 (或半 间歇式 ), Fin^O, F。ui = 0, 即反 应体积 增加。 这 也许是 在工业 生产中 

最常用 的一种 方法, 因 为它允 许环境 条件的 控制, 例 如使葡 萄糖浓 度维持 在某种 水平, 能产 
生很高 的效价 (代谢 产物浓 度可高 达每升 几百克 ), 这对 下游处 理非常 重要。 同时, 流加操 
作是 一种很 方便的 能维持 稳定环 境条件 的实验 系统, 尽管 稳定期 有限, 它便于 进行细 胞生理 
研究。 

对于图 3.2 所示的 生物反 应器, 第/ 个 底物的 动态质 量平衡 式如下 (推导 见方框 3.1): 
底物积 累速率 =- 底物消 耗速率 + 底物 添加 速率- 底物流 出速率 

^=-r,.,x + D(ci„-c,„) (3.13) 

式中, cs., 为生 物反应 器中第 Z 个底物 的浓度 (mo 卜 L — 1); cL, 为加料 中第; 个底 物的浓 
度 (mo 卜 L — 1); rs,, 为第 Z 个底 物的 比消耗 速率; :r 为生物 质的质 量浓度 [g — » (干重 ) • 
L 一 1]; D 是所 谓的稀 释速率 (h-'), 分批式 操作的 D 为零。 恒 化器及 流加式 操作的 稀释速 
率 如下: 

D = y (3.14) 

55 



□-■a 

1Z40 



图 3.2 具 有流加 入新鲜 无菌培 养基及 
移出 反应过 的培养 基装置 的生物 反应器 
一加料 液中第 I 个化 合物的 浓度; 
一流 出培养 基中第 i 个 化合物 的浓度 
(假 设该 反应器 中的物 料完全 (或 理想) 混合, 
那么流 出培养 基中每 种化合 物的浓 度就等 
于它们 在反应 器中的 浓度) 



在 方程式 (3.13) 中, 右 边第一 项是底 物消耗 的体积 速率, 它等于 底物的 比消耗 速率乘 
以 生物质 浓度。 第 二项涉 及生物 反应器 底物的 加料及 出料。 式左 边为积 累项, 它表示 底物随 
时 间的变 化率, 在分批 式反应 器中, 它 等于底 物的体 积消耗 速率。 稳定状 态时, 积 累项为 
零, 因此底 物的体 积消耗 速率就 等于稀 释速率 乘以流 入及流 出反应 器的底 物浓度 之差。 

与 底物的 动态质 量平衡 相似, 代谢 产物的 平衡方 程为: 

^=r,„x + D(ci,-c,,.) (3.15) 

式中, 右边 第一项 为第/ 个产 物的体 积生成 速率, 通常无 菌加料 中代谢 产物不 存在, 所 
以 cfp,, 为零, 在 此情况 下稳态 时产物 体积生 成速率 等于稀 释速率 乘以反 应器中 的代谢 产物浓 
度 (该浓 度也等 于流出 反应器 的代谢 产物浓 度)。 

对于 生物质 组分, 通 常以生 物质为 参照, 即 浓度是 以生物 质作为 基准, 此 时可得 如下的 
质量平 衡方程 (推导 见方框 3.1): 

dX 



d t - r macro , i macro ,i (3 . 16 ) 

式中, Xmacr。,, 为第/ 个 生物质 组分的 浓度; 为比生 长速率 (h_l)。 生 物质组 分浓度 
可 用不同 单位来 表示, 但 通常为 g,g— 1 (干重 )。 用 这些单 位可以 表明, 所有 生物质 组分浓 
度之 和等于 1: 

Q 

2 macro,; ~ 1 (3.17) 
此外, 上述单 位与经 实验测 定的细 胞;^ 分 子组成 一致, 该组成 通常以 质量分 数表示 (见表 

2.11)。 从式 (3.16) 中可看 出生物 质组分 的质量 平衡与 生物反 应器操 作方式 无关, 因为稀 
释速 率没直 接出现 在质量 平衡方 程中。 但它与 该方程 中的最 后一项 有间接 关系, 最后 一项表 

示 由于生 长而使 生物质 膨胀时 生物质 组分的 稀释。 因此 假如没 有大分 子库的 净合成 (r^ero,,- 

0) 而生物 质仍发 育长大 (/^〉0) 时, 其胞内 水平将 降低。 利用 方程式 (3.17), 比 生长速 
率等于 所有生 物质组 分的净 生成速 率之和 (见 方框 3.1): 

Q 

= 2 ^ macros- ' (3. 18) 



方框 3.1 动态 质量平 衡方程 的推导 

在此 将说明 底物及 生物质 组分质 量平衡 方程的 推导。 代 谢产物 及胞内 产物的 质量平 
衡方程 可类似 导出。 
底物 

现 考虑第 f 个底 物, 其通过 加料流 进人生 物反应 器并被 反应器 中细胞 消耗, 该化合 
物的质 量平衡 式为: 

广) 二 ― r,.^V + Fci,, - F。utCs,, (1) 

式中, rs,, 为物质 f 的比消 耗速率 [mohg_i (干重 ) 'h — i]; c's,, 为其 在反应 器中的 
浓度 (假 设等 于出口 的浓度 mo 卜 L—1); 为 其在加 料流中 的浓度 (mo 卜 L— 1); 、r 是反 

应器 中生物 质的质 量浓度 [g (干重 ) '1—1]。 方程式 (1) 中 的第一 项是累 积项, 第二 
项是 消耗项 (或 反应项 ), 第三 项是供 给项, 最后一 项是该 化合物 的移出 速率。 重 新安排 
方程式 (1) 可 得到: 



56 



V ^ + ^ =- rs.^V + Fcl, - Fou.c,., (2) 



方 程两侧 同除以 V 后得到 



对于流 加式反 应器: 



F = f (4) 
而且由 于^。,1 = 0, 则 方程式 (3) 括 弧中的 项就等 于稀释 速率。 对 于连续 式操作 的反应 
器, 培养 液体积 恒定, 并且 F = F。ut, 所以括 弧中的 项也等 于稀释 速率。 于是 方程式 
(2) 就还原 为适用 于任何 操作形 式的质 量平衡 方程式 (3.13)。 
生物 质组分 

生 物质组 分的质 量平衡 方程为 (假设 加料流 无菌) : 

^ (-^ macro ,!工 ^ ) ― t r ― j-^ y" / c \ 

― ^ macro, ^ ^ out macro, V *^ / 

式中, 是生物 反应器 中第, 个生 物质组 分的质 量浓度 (g*L — 1); rma。r。,, 为其比 
净生成 速率。 重排 方程式 (5) 后 得到: 



d -X^ macro, y ( F c 



dt ―, 隨 ro,, k y 
此外, 对 任何操 作形式 的生物 反应器 

f\、 



D = f + +《 (7) 
方程式 (7) 与生物 质总浓 度的质 量平衡 方程式 (3.20) —起 可得到 方程式 (3.16)。 
为 了推导 方程式 (3.18), 我 们可用 方程式 (3.17), 其 意指: 

〉 : ' ~jT - 〉 : ''macro, / - {^ ^ i ^ macro , i - 。 (8) 

,. = 1 , = 1 ; = 1 

由 此可直 接得到 方程式 (3.18)。 



对于 胞内代 谢物, 使用 与生物 质组分 相同的 浓度单 位不太 方便。 这些代 谢物溶 于胞液 
中, 因此, 以 单位细 胞液体 体积的 摩尔表 示其浓 度更为 恰当。 选 择这个 单位, 还可直 接对胞 
内 代谢物 浓度与 薛亲和 性进行 比较, 后 者常以 它们的 Km 值来 量化, 其 单位为 mohL_i。 对 
于用某 一单位 表示的 浓度, 如 果生物 质密度 (在 Ig 细胞 /ml 细胞范 围内) 及水 的含量 (在 
0.67ml 水 /ml 细胞范 围内) 已知, 则 很容易 将该单 位转换 成另一 单位。 尽管 胞内代 谢物使 
用 了不同 的浓度 单位, 生物 质仍是 基准, 并 且胞内 代谢物 的质量 平衡方 程也用 生物质 组分的 
相同 形式来 表示: 

dfm t i 

= rmei.i - /^C'met" (3.19) 
式中, Cmct,, 为第 Z 个胞 内代 谢物的 浓度。 重 要的是 对两种 浓度单 位做出 区别: 它是用 

mol/ 反 应器液 体体积 还是用 mol/ 细胞液 体体积 表示。 若浓 度的单 位采用 前者, 那么 质量平 

衡 方程式 将完全 不同。 

式 (3.13)、 式 (3.15)、 式 (3.16) 及式 (3.19) 代表 了细胞 化学计 量学中 4 种 不同类 

57 



型物质 的质量 平衡。 此外, 总的生 物质平 衡也很 重要, 其方程 如下: 

^ = (/. - D)x (3.20) 

从这 个方程 中容易 看出在 稳态时 的比生 长速率 等于稀 释率。 因此, 在连 续培养 中通过 改变稀 
释速率 (或加 料速率 ), 就 可得到 不同的 比生长 速率。 

式 (3.13)、 式 (3.15)、 式 (3.16) 及式 (3.19) 的 质量平 衡形成 了细胞 培养过 程以任 
何方 式定量 处理的 基础, 其范围 包括从 比速率 (或 体积 速率) 的 计算到 生物过 程的设 计与模 
拟。 对于生 物过程 设计及 模拟, 必须 给出速 率向量 V 中各个 反应速 率的动 力学表 达式, 即提 
供反应 速率与 系统变 量之间 的函数 关系。 将 化学计 量反应 式与反 应速率 动力学 方程结 合就构 
成 了一个 动力学 模型。 其可用 于过程 模拟, 例 如确定 在不同 操作条 件下, 系 统如何 工作。 在 
一些生 化工程 教科书 [如 Bailey and Ollis (1986) 或 Nielsen and ViUadsen (1994)] 中已广 
泛讨 论了利 用简单 的动力 学模型 (也 称为 非结构 模型) 或 高级的 结构模 型进行 培养过 程的设 
计及 模拟, 为此本 文不作 进一步 讨论。 下面 讨论如 何利用 实验数 据确定 代谢物 及生物 质组分 
的比 速率等 方面的 问题。 

表 3.2 列 出了不 同的方 程式, 用它可 以计算 在不同 的操作 条件下 生物反 应器中 底物吸 
收、 代谢产 物形成 及生物 质组分 (包括 生物质 组分和 胞内代 谢物) 净合 成的比 速率。 在所有 
情 况下, 均可看 到生物 质浓度 是一个 重要的 变量。 若得不 到可靠 的生物 质浓度 数据, 则应采 
用体积 速率而 不是比 速率。 然 而体积 速率的 缺点是 不能直 接比较 不同实 验中的 数据。 例如在 
一个实 验中, 生物质 的生长 速率为 2.0g (干重 )*L-i*h-i, 而在 另一实 验中为 l.Og (干重 )• 
L_i*h — 1, 尽管比 生长速 率可以 相同为 0.2h — 1, 伹 第一个 实验中 生物质 浓度为 lOg (干重 )• 
L_i, 而第 二个实 验中为 5g (干重 )'L 一 1。 



表 3.2 用 实验数 据计算 比速率 所使用 的方程 



生物 反应器 


底 物 


代 谢产物 


胞 内物质 


分批式 


"― X dt 




1 dcp 
X dt 


r mac 


° dt 


ro . Y" 

^ macro 


连续式 














动 态条件 


r, = ^[D(ci-cJ 


del 
- I」 






mac 

" dt 


macro 


稳态 








r maci 


■o 一 f^X maci 




流加式 


n 厂 


del 
:」 


II 

? 、 

、 Z 




d^X" mac 

。 dt 


macro 



注: 对 于胞内 物质, 仅 列出生 物质组 分的表 达式, 它与 胞内代 谢物的 表达式 相似。 



从表 3.2 还可 看出, 除了 处于稳 态的连 续式生 物反应 器外, 确定其 它条件 下的比 速率需 
要计算 浓度对 时间的 导数。 根据浓 度测量 曲线切 线的斜 率即可 得到对 时间的 导数。 然 而应该 
认 识到由 于实验 数据通 常稀疏 并且有 噪声, 因此, 通过这 种方法 对时间 求导数 难以得 到好的 
估值。 由此 可清楚 显示稳 态连续 培养的 优点, 它能 精确估 算出比 速率。 然而, 有关细 胞生理 
的许 多信息 是从分 批培养 及处于 动态条 件下的 连续培 养中获 得的, 因此 通过应 用稳健 的步骤 
从这 类实验 中获取 有关比 速率的 信息是 非常重 要的。 

另一种 方法是 将数据 用函数 表示, 例 如用多 项式样 条函数 表示, 以 便用所 拟合的 函数计 
算导 数和比 速率。 但这种 方法也 能使比 速率产 生大的 波动, 因为 难以找 出合适 的函数 形式来 
表 示培养 过程实 验数据 (应 注意到 的是, 为了 获得比 速率, 必须 推导出 目标化 合物浓 度及生 
58 



物质浓 度的两 种函数 式)。 由于 大多数 细胞反 应过程 可用指 数函数 表示, 所以 用多项 式样条 
函 数式来 表达是 不太适 当的。 有一种 较好的 方法, 尤 其适用 于分析 分批式 培养的 数据, 即用 

简单的 模型如 Monod 模型 进 行参数 拟合, 然 后直接 从模型 计算比 速率。 由于像 Monod 
模 型这样 的简单 模型, 其 本质属 经验性 质的, 因此 原则上 这种方 法与寻 求一种 合适的 函数形 
式 表示数 据是相 同的。 但 由于这 些模型 通常很 适于处 理分批 培养的 数据, 其结 果还是 令人满 
意的。 

前面介 绍的实 验数据 的函数 表示法 (或 完全 经验性 的或用 简单的 动力学 模型) 适 用于可 
获得 足够多 数据的 场合。 然而由 于胞内 物质只 是零星 测定, 因 而就很 难正确 估算其 时间导 
数。 一般 来说, 对 胞内代 谢物可 假设为 拟稳态 (见 8.1 节)。 另外, 在 分批培 养的指 数生长 
期, 所 谓的平 衡生长 通常占 优势。 这意味 着生物 质的胞 内组分 不发生 变化, 即 生物质 组分的 
浓度处 于稳定 状态, 因此, 只 是通过 测量一 个或一 些大分 子组分 及比生 长速率 好的估 计值, 

就可确 定向量 rmaer 。的 各组成 元素。 

3.4 产率 系数与 线性速 率方程 

正如本 章引言 中所提 到的, 代谢 模型是 细胞生 理定量 分析的 基础。 但通 常是这 样的情 
况: 人 们并不 是对胞 内反应 的所有 细节感 兴趣, 而是想 对总的 代谢通 量分布 作更宏 观的评 
估, 例 如葡萄 糖中的 碳有多 少用于 生成目 标代谢 物等。 总 的通量 分布通 常以产 率系数 表示, 
它 指相对 于某一 参照物 (通 常为碳 源或生 物质) 的总 通量。 因此产 率系数 是无因 次的, 其形 
式为: 每单位 质量参 照物生 成单位 质量代 谢物。 例如, 消 耗每摩 尔葡萄 糖生成 的赖氨 酸的物 

质的量 (摩尔 )。 然 而在不 同的情 况下也 可采用 其它参 照物, 因 而消耗 每摩尔 氧生成 C02 的 

物 质的量 [称为 呼吸商 (RQ)] 常 用于表 示好氧 培养的 特征。 遗憾 的是, 在文 献中出 现了几 
种不同 的产率 系数表 示法。 在此 将采用 Nielsen 与 ViUadsen (1994) 的 命名法 [Roels 
(1983) 文献介 绍]。 产 率系数 以双下 标表示 Y,j, 指 每消耗 (或 形成) 单 位质量 Z' 物 质所形 
成 (或 消耗) J 物质 的量。 以第 Z 个 底物为 参照, 产 率系数 可表示 如下: 

J 二 1, ' ,N (3.21) 
J = 1,-,M (3.22) 
丄 (3.23) 

+ (3.24) 

产 率系数 对评估 实验数 据极有 价值, 其通 常是从 原始发 酵数据 中提取 出的首 批定量 数据。 产 
率 系数的 重要性 首先在 于它是 向本征 速率中 引入某 些有用 关系的 工具。 例如某 一产率 系数确 
定为或 假设为 常数, 这 就立刻 暗示着 在两个 速率之 间存在 着一定 关系。 这种关 系也许 完全是 



在 Monod 模 型中, 比 生长速 率可由 表示, 式中, /i™, 为最 大比生 速率; K, 为 Monod 常数; 为 
限制 型基质 浓度。 该模型 假定基 于限制 型基质 的生物 质得率 为常数 (见 3.4 节), 因此' 基质比 消耗速 率可由 r,= Y„// 
表示 (也见 3.4 节)。 

59 



Ys, = 

很明显 

y.j = 



经验性 的或可 从其它 基本的 生化及 生理关 系中推 导出, 讨论 如下: 

由 Monod (1942) 引入的 对细胞 生长的 经典描 述中, 产 率系数 被视为 常数, 所有的 
细胞反 应汇集 为一个 底物转 变为生 物量的 总生长 反应。 1959 年, Herbert (1959) 研 究表明 
了 生物质 对底物 的得率 并不是 常数。 为了 说明这 一点, 他引人 了内源 代谢的 概念, 并 指出总 
的 底物消 耗除用 于生物 质合成 之外, 有一部 分参与 了内源 代谢。 同年, Luedeking 与 Piret 
(1959a, b) 发 现在非 生长条 件下, 乳酸 菌能产 乳酸, 这 与细胞 的内源 代谢相 一致。 他们的 
结果表 明了在 乳酸的 比生成 速率与 比生 长速率 之间存 在着线 性关系 : 

rp = aix+b (3.25) 

Pirt (1965) 在底物 比吸收 速率与 比生成 速率之 间引入 了相似 的线性 关系, 他建 议用维 
持这 个词, 此 词现在 是最常 用的用 以描述 内源代 谢的一 个词。 Pirt 所描 述的线 性关系 如下: 

Y^-> + /n, (3.26) 

式中, 指 真实生 长得率 系数; 为维持 系数。 引 入这些 线性关 系后, 很 明显, 得 
率系数 不再是 常数, 因此 生物质 对底物 的得率 变为: 



y = 



(3.27) 



0,3 



0.3 



式 (3.27) 表明 在低比 生长速 率的条 件下, 有越 来越多 的底物 用于满 足细胞 的维持 需要, 此 
时实 际得率 Ysx 可 小于真 实生长 得率。 对 于高的 比生长 速率, 产率系 数接近 Y^e^ 的 倒数, 
即 在快速 生长时 由于大 多数底 物用于 生长, 实际生 长得率 系数接 近于真 实生长 得率。 

根据 经验得 出的线 性关系 对生长 数据的 关联很 有用, 尤其是 对那些 从稳态 连续培 养中所 
得的 数据。 对于大 部分重 要的比 速率, 利用 这些速 率可推 导出与 方程式 (3.26) 相似 的线性 
关 系式。 图 3.3 可 说明这 一点, 图 中绘制 了葡萄 糖的吸 收率、 C02 比生 成速率 及氧比 吸收率 
与处 于稳态 的丝状 真菌产 黄青霉 (Penicmium chrysogenum) 连续培 养的比 生长速 率的函 
数 关系。 类 似的线 性关系 也可从 文献中 找到, 这种 线性产 率关系 的异常 强健及 普遍适 应性表 

明它们 都来自 于一个 可能的 根本的 基础。 一 
个可能 性是在 ATP 的 连续供 给与消 耗之间 
的 平衡, 这是由 于所有 细胞中 ATP 的产生 
与耗尽 的紧密 稱合。 在此假 设下, 产 能底物 
的作 用就是 产生足 够多的 ATP 以驱 动细胞 
中的生 物合成 和聚合 反应, 此 外还有 不同的 
维持 过程。 这种稱 合由式 (2.27) 所 示的线 
性关系 表示: 

^ATP = YxATP/" + '"ATP (3.28) 

式 (3.28) 是 Pirt (1965) 所述 线性关 
联的一 个类似 形式。 如 2.6 节所讨 论的, 方 
程式 (3.28) 说明 生成的 ATP 与在 生长和 
维持过 程中所 消耗的 ATP 严格 平衡。 此外, 

如 果产能 底物的 ATP 得率为 恒定, 即 rATP 

与 成 正比, 那么很 明显, 从式 (3.28) 可 
直接推 导出式 (3.26) 的线性 关系。 还需注 
意 的是: 式 (3.28) 中的 YxATP 实际 上是真 



0.02 0.04 0.06 0.08 
稀 释速率 /IT' 



0.12 



图 3.3 在 P. chry 零誰 I 葡萄糖 限制性 

连续 培养中 的相关 速率函 数关系 
■ 葡萄 糖比吸 收速率 r,; A 氧气比 

吸 收速率 ru; 參 CO2 比生 成速率 

比 生长速 率等同 于稀释 速率。 这 些速率 是以单 位浓度 
细胞 为基准 而表示 的各个 组分变 化速率 e 给生 物反应 
器提供 的为限 制性培 养基, 包括葡 萄糖、 按、 无机盐 
和苯 氧基醋 酸盐。 数据 来自于 Nidsen (1997) 

60 



.M • - WM^-- 1 . 一 0E/。.< 




实的 ATP 得率 系数, 但 通常表 示时不 加上标 "true"。 

平衡 ATP 产生 与消耗 这个概 念可扩 大到其 它辅助 因子, 如 NADH 及 NADPH, 由此就 
可能导 出三种 不同条 件下的 线性速 率方程 (Nielsen and Villadsen, 1994): (1) 厌氧 生长, 
ATP 由底 物水平 瞵酸化 产生; (2) 无 代谢产 物形成 的好氧 生长; (3) 有代谢 产物形 成的好 
氧 生长。 现用下 列例子 (例 3.3 及例 3.4) 说明 前两种 情况。 



【例 3.3】 产黄青 霄的代 谢模型 

对于无 代谢产 物形成 的需氧 过程, 为了 说明其 线性速 率方程 的推导 过程, 现 使用由 
Nielsen (1997) 提 出的丝 状真菌 产黄青 霉的简 单代谢 模型。 其 化学计 量模型 概括了 总的细 
胞代谢 反应, 对 ATP、 NADH 及 NADPH 作拟 稳态假 设后, 就可推 导出线 性速率 方程, 其 
中葡 萄糖、 氧的 比吸收 速率及 C02 比 形成速 率可用 比生长 速率的 形式来 表示。 通过 与实验 
数 据进行 比较就 可求出 这些线 性速率 式中的 参数, 进而可 获得关 键的能 量参数 信息。 在分析 
过 程中, 略 去了代 谢产物 的形成 (包 括初 级代谢 产物, 如 葡萄糖 酸及与 青霉素 生物合 成有关 
的一些 代谢物 ), 这 是因为 流向这 些产物 的碳的 通量比 流向生 物质及 C02 的 通量小 很多。 

用 于合成 产黄青 霉细胞 组分的 总化学 计量反 应式可 概括为 (Nielsen, 1997): 

biomass + q . BQCO^ + . 458NADH - 1 . BQCHzO - . 2ONH3 - . OO4H2SO4 
(生 物质) " 

-O.OIH3PO4- y ^TpATP - . 243N ADH - (1) 

当底 物为葡 萄糖、 无 机盐, 氨为 N 源, 硫 酸盐为 S 源, 憐 酸盐为 P 源时, 对于 含有表 2.8 
中组分 的细胞 来说, 该化学 计量式 成立。 该式以 C-mol 为 基础, 即葡 萄糖用 CH2O 表示, 
并且根 据大分 子组分 计算出 的生物 质元素 组成为 CHi.8iOo.58No.2oSo.oo4Po.om (Nielsen, 
1997) , 这与文 献报道 的实验 测定的 组分非 常吻合 (见表 4.1)。 由于 ADP、 NAD+ 及 
NADP+ 为稱 联的辅 助因子 (见 3.1 节的讨 论), 在化学 计量式 中就没 有包括 它们。 用 于生物 
质合成 所需的 ATP 及 NADPH 由 分解代 谢途径 提供, 在 生物合 成反应 中过量 生成的 NADH 
与在分 解代谢 途径中 形成的 NADH — 起经电 子传递 链将电 子转移 给氧而 被重新 氧化。 

反应式 (2) 〜反应 (4) 概括 了分解 代谢途 径总的 化学计 量式。 反应 (2) 表明 
NADPH 由葡 萄糖完 全被氧 化生成 C02 的 磔酸戊 糖途径 产生; 反应 (3) 是将 EMP 途径及 
TCA 循 环综合 后的总 化学计 量式。 最后, 反应 (4) 是氧 化磯酸 化的总 化学计 量式。 在上述 
化 学计量 式中, 没考虑 细胞中 的内部 结构, 即 不区分 细胞质 的和线 粒体的 NADH, 并且将 
TCA 循环中 形成的 FADH2 与 NADH 汇集在 一起, 因 此反应 (4) 中的 P/0 比是氧 化碟酸 
化 的总的 (或 操作) P/0 比。 

C02 + 2NADH - CH2O : (2) 
C02 + 2NADH + . 677ATP - CH2O = (3) 
P/OATP -0.5O2- NADH = (4) 

最 后用于 维持所 消耗的 ATP 简 单地包 含在一 个利用 ATP 的反 应中: 

- ATP = (5) 
需 注意: 上述 化学计 量反应 式是以 C-mol 为基 础的, 所以源 于生物 化学的 化学计 量系数 
[例 如在 EMP 途 径中, Imol 葡萄 糖生成 2mol ATP] 应除以 6, 因为 Imol 葡 萄糖含 6 C- 
molo 

61 



前 面的化 学计量 式是以 方程式 (3.3) 的 形式写 出的, 但很容 易将之 转变为 方程式 
(3.4) 那 样的更 紧凑的 矩阵表 达式: 



-1.139 




-1 






-1 




S02, 


-0.5 




. 





0.139 




1 




一 ^xATP 


0.458 


0.243 




0' 


1 















2 




Xatp 







1 


PCO2 + 





x + 


0.667 


2 







Xnadh 

















P/O 


-1 







Xnadph , 







、 . 




OJ 




一 1 





- 




-0, 



式中, X 代表生 物质。 若 在反应 (1) 

速率: 



(6) 

反应 (5) 中以速 率向量 V 的形 式引人 正反应 



V = 



■^EMP 
^OP 
W ATP 



(7) 



那么, 三个辅 助因子 ATP、 NADH 及 NADPH 的 生成与 消耗之 间就可 以获得 平衡, 与方程 
(3.28) 类似, 可 列出下 面三个 方程: 



ATP 



=0 



― YxATP;" + 0.667z;EMP + P/Ot;op — 
0.458〃+ 2t;£i^p - vqp = 
-0.243ju + 2z;pp = 

注 意到这 些平衡 相应于 上述三 种辅助 因子的 净比生 成速率 为零。 因此, 用 方程式 (3.12) 也 
可推导 出这些 平衡方 程式: 



(8) 
(9) 
(10) 





''ATP 




rmet = 


^NADH 


= GTv = 




T NADPH. 





一 ^xATP 

0.458 
-0.243 



0.677 

2 




P/O 
-1 






, 




-V 




vpp 












■i^EMP 







0, 




I OP 









、mATP' 





(11) 

除了 三个稳 态平衡 方程式 [方 程式 (8) 〜方 程式 (10)] 之外, 以 5 个反 应速率 [方程 
式 (7)] 的 形式, 还有葡 萄糖和 氧的比 吸收速 率以及 C02 比生 产速率 之间的 关系。 这些关 
系 可通过 方程式 (3.5) 和 方程式 (3.6) 表示, 或用 方程式 (3.9) 及 方程式 (3.10) 的矩 
阵形式 表示: 



rgic 



1.139 





vpp 

^EMP 



(12) 



62 



rco = (0.139 1 1 0) 



T/pp 
/"ATP 



= 0.139// + T^pp+ t^EMP 



(13) 



消除 方程式 (11) 〜方 程式 (13) 中的三 个速率 t;E:MP、 t^PP、 t^OP, 可推 导出线 性速率 方程式 

(14) 〜方 程式 (16): 

rgic=(a +0.261)/^ + 6= Yir^z + ms (14) 
rco^ =(a+0.261);i+ft= YTf^ + m, (15) 

ro={a + 0.261)/i + 6=nr/i + "" (16) 
根据 方程式 (17) 和 方程式 (18) 可得到 两个共 同参数 a 与 6, 它 们是能 量参数 yxATP、 
m ATP 及 P/O 比的 函数: 

YxATP — 0.458P/O 



b = 



0.667 + 2P/0 
m ATP 



(17) 
(18) 



0.667 + 2P/0 

方程式 (14) 可 视为与 Pirt 推 荐的线 性速率 方程式 (3.26) 基本 相同, 差别 在于前 者是根 
据细胞 基本的 能量参 数得到 得率关 系式。 这对于 上述线 性关系 式中的 所有参 数来说 都是对 
的, 因为它 们是经 ATP、 NADH 及 NADPH 平 衡而耦 合的。 可以 看出, 若不 是它们 实际上 
通 过这些 平衡来 稱合, 这三 个得率 系数没 有任何 价值。 此外, 这些 维持系 数是相 同的。 这是 
由于选 择以每 C-mol 的生 物质每 小时为 基准的 C- mol 作为比 速率的 单位。 若 比速率 采用其 
它 单位, 维持 系数的 值将会 不同, 但它们 是有关 系的。 这些 参数的 耦合, 表明 系统仅 有两个 
自由度 [等 价于 方程式 (14) 〜方 程式 (16) 中定义 的参数 a 与 6], 因 此实际 上只需 测定一 
个产率 系数和 一个维 持系数 即可, 其它参 数可利 用三个 方程式 (14) 〜方 程式 (16) 算出。 



, 糊 

6 H- 





200 「 


細 






150 - 




100 - 








50 - 














- 




5 1 15 2 2.5 3 
P/0 比 

图 3.4 P. £72r:y,50ge«MW 的能 量参数 Y 
m ATP 与操作 P/() 比之 间的函 数关系 



和 



导 出的线 性速率 方程对 关联实 验数据 当然很 有用, 但 是也可 用于关 键的能 量参数 

YxATP、 WAIT 及操作 P/O 比的 求取。 因此, 如 果求出 方程式 (14) 〜方 程式 (16) 的 真实产 
率系 数和维 持系数 (通 过葡 萄糖、 氧及 C02 的速率 实验数 据对比 生长速 率进行 线性回 归), 

就可确 定"、 b 的值, 进而利 用"、 b 的值及 方程式 (17) 和 方程式 (18), 就 可得到 3 个 
根据图 3.3 的 数据可 确定" 与 /7 的值 分别为 0.436 C-mo 卜 c-mol — I (干重 ) 及 

63 



0.018 C-mo 卜 C-mol — I'h — 1 (Nielsen, 1997)。 利用 3 个产 率系数 (相 对标准 误差为 2.796 ) 

可得到 a 是一 个平 均值。 仅 用两个 方程不 可能求 出所有 三个能 量参数 yxATP、 及操作 

P/0 比, 但如果 其中一 个参数 已知, 就 可计算 出另外 两个。 图 3.4 描绘了 7、八1?和 //^&1?与 
操作 P/0 比之间 的函数 关系。 产 黄青霉 的准确 的操作 P/0 比 值还不 知道, 但 可能在 1.0〜 
2.0 的 范围内 (Nielsen, 1997)。 若 P/0 比为 1.5, I^^tp 约为 2.29mmol ATP • (C-mol 生 
物质广 1 [或 80mmo 卜 g — 1 (干重 ), 摩尔 质量为 26.33g • (C-mol) _i , 灰分 8%]。 这 与所报 
道的 酿酒酵 母的值 在同一 范围内 (见表 2.6)。 



【例 3.4】 酿 酒酵母 的能学 

厌氧生 长时, 大 多数细 胞通过 底物水 平磷酸 化产生 ATP 同 时将能 源转化 为一种 或多种 
代 谢物。 在复 合培养 基中生 长时, 生物合 成反应 中没有 (或 很少) NADH 生成 及没有 (或 
很小) NADPH 消耗, 因 为从充 足供给 的培养 基组分 中可得 到这些 物质。 因此, 能源 的氧化 
还原 水平被 保存于 分解代 谢途径 所形成 的代谢 物中, 即在糖 酵解中 所形成 的所有 NADH 均 
消 耗于丙 酮酸转 化成不 同代谢 物的反 应中。 例 3.1 的 大肠杆 菌混合 酸发酵 就说明 了这一 
点, 这在乳 酸同型 发酵中 也是一 个重要 考虑, 该过 程中丙 酮酸通 过乳酸 脱氛酶 转化成 乳酸。 
在上述 反应过 程中, 正 是仅有 ATP 耦 合着分 解代谢 与合成 代谢, 因 此有可 能单从 ATP 平 
衡 推导出 Leudeking 和 Piret 的线 性速率 方程式 (3. 25) [还 可参照 Nielsen 和 Villadsen (1994)]。 

在基 本培养 基上生 长时, 伴 随着生 物合成 反应的 进行, 有大量 NADH 的产生 及大量 
NADPH 的消耗 (见 2.4 节)。 这些 辅助因 子必须 在供能 反应中 再生, 结果在 分解代 谢与合 
成 代谢之 间产生 紧密的 耦合。 在 酿酒酵 母厌氧 生长过 程中, 这种 耦合导 致除了 初级代 谢产物 
外 (在 这种 情况下 当然是 乙醇) 甘油的 生成。 甘 油是通 过还原 反应生 成的, 其 包括由 将鱗酸 
二 经基丙 酮催化 转化成 3- 磯酸 甘油, 进而由 3- 磷酸 甘油脱 氢酶催 化去磷 酸而生 成甘油 [见 
反应 (2.6)]。 在第 一个反 应中, NADH 被 氧化为 NAD+, 因此 葡萄糖 至甘油 的总反 应将导 
致 NADH 的 消耗。 由于在 3- 磷 酸甘油 的去磯 酸反应 中没有 ATP 再生, 所以 葡萄糖 至甘油 
的总 转化过 程是一 个消耗 ATP 的 过程。 

醜酒酵 母的厌 氧生理 学已由 Schulze (1995) 进行 了广泛 研究, 在本 例中, 我们 将用一 
个 简单的 代谢模 型对其 部分结 果进行 分析。 通过酿 酒酵母 大分子 组分的 分析, Schulze 计算 
了 与生物 质合成 相关的 NADH 及 NADPH 的化 学计量 系数。 利 用他的 数据可 得到细 胞生长 
的 总化学 计量反 应式: 

CHi.820o.58No. 16 + 0. 105CO2 + • 355NADH - 1 . lOSCHzO ― • I6NH3 

- YxATpATP - . 231NADPH = ( 1 ) 

元 素组分 取自表 4.1, 底物为 葡萄糖 和氨。 硫酸 盐和磷 酸盐包 含于灰 分中, 为 8%。 如同例 
3.3, 化 学计量 反应以 C-mol 为 基础, 即 葡萄糖 表示为 CH20, 假 定生物 合成所 需要的 
NADPH 仅在 PP 途径中 生成, 因 此与例 3.3 — 样可得 下式: 

C02 + 2NADPH - CH2O = (2) 
用 于生物 合成的 ATP 由葡 萄糖生 成乙醇 的反应 提供, 其计 量反应 式为: 

. 5C02 + CH3O0.5 + . 5ATP - 1 . 5CH20 = (3) 
如前 所述, 与生 物合成 相关而 生成的 NADH 用 于葡萄 糖生成 甘油的 反应。 因为 Imol 葡萄糖 
转 化为甘 油时, 2molNADH 被 氧化, 葡萄 糖生成 1 ,6- 二憐酸 果糖需 2mol ATP (生 成甘油 
过 程中无 ATP 再生 ), 所以 生成甘 油的总 化学计 量反应 式为: 
64 



(4) 



(5) 



(6) 



CH8/30 - . 333NADH - . 333 ATP - CH2O = 
最后, 还要 包括用 于维持 反应的 ATP 的 消耗, 这同例 3.3 —样, 可 表示为 

-ATP=0 

遵从 前面的 步骤, 可 将上述 5 个 反应的 正反速 率以速 率向量 V 表示: 

、 

V = rEtOH 
W ATI' 

用 所确定 的化学 计量系 数与胞 内反应 速率, 对三 个辅助 因子建 立平衡 方程。 NADPH 的平衡 
给出了 z;pp 和 比生长 速率之 间的直 接耦合 关系: 

-0.231// +2t;pp = (7) 
同样, NADH 的平衡 使比生 长速率 与甘油 比生成 速率产 生如下 关系: 

0.355/i -0.333rgiy = (8) 
方程式 (8) 相当 于甘油 产率为 1.066 C-mol 甘油 *((:-11101 生 物质) —1。 在 Schulze (1995) 的 
分 析中, 他提出 的值为 lO.Olmmol 甘油 (干重 ), 考 虑到前 面给出 的生物 质元素 组成及 
80/6 的 灰分, 该值 相当于 0.827 C-mol 甘油 • (C-mol 生物质 ) — " , 这个 值远低 于通过 代谢模 
型计算 所得到 的值。 此外, 实验观 察到琥 珀酸的 分泌, 其 伴随着 更多的 NADH 的形成 
(Imol 琥 Jfi 酸生成 5mol NADH)。 因此琥 珀酸的 生成迫 使形成 更多的 甘油, 以 便容纳 所增产 
的 NADH。 琥珀 酸对生 物质的 得率为 0.25 mmol 琥珀酸 'g— 1 (干重 ), 这相当 于形成 1.25 
mmol 甘油 'g— 1 (干重 )。 因此, 所生成 的甘油 中仅有 8.76 mmo 卜 g — I (干重 ) 或 0.724C- 
mol 甘油 • (C-mol 生物质 )—1 是由于 生物合 成而产 生的, 它 使得偏 离自代 谢模型 更大。 这或 
是 由于在 方程式 (1) 中与生 物合成 相关的 NADH 生 产可能 过大, 或是由 于存在 着转氧 醉 的 
一些活 动使得 NADH 转化为 NADPH。 
由 ATP 平衡 可得: 

0.5 /"EtoH - . 333rgiy = V^xAtpa« + 〃' atp (9) 
由 方程式 (8) 将 甘油形 成速率 带人式 (9) 即: 

rEtOH = 2( VxAiT + 0.355);^/+ 2m atp (10) 
这相当 于应用 到乙醇 生成的 Luedeking-Piret 模型。 Schuhce 的分析 发现, 乙醇 对生物 质的真 
实得率 系数为 85.05mmo 卜 g — 1 (干重 ), 其 相当于 4.69C-mol 乙醇' (C-mol 生物质 )— 、 因 
此, Y^^TP 为 1 .9511101 ATP' (C-mol 生物质 )—1 或大约 71mmol ATP'g—i (干重 )。 若方程 
式 (9) 直接用 于计算 ATP 生产, 而 YxATP 是通过 rvip 对 /2 作图来 确定, 那 么就得 到一个 
稍高 的值, 即 73mmol ATP'g— I (干重 ) (schulze, 1995)。 这 种差别 是由于 代谢模 型中甘 
油生成 的过高 估计, 这 一点前 面已讨 论过。 
对于葡 萄糖吸 收速率 

r,= 1.105^ + 1.5rK,()H+r,,y (11) 
将 方程式 (8) 和 方程式 (10) 代入 方程式 (U) 可得到 方程式 (12): 



0.355 



1. 105 十 3.0( Watp + 0.355) + [y^」A< + 2," atp 



(12) 
65 



通 过此例 可再次 看到线 性速率 方程式 (3.26) 可以 推导, 而且 真实得 率系数 是 通过细 
胞合 成的关 键参数 (即 消耗的 ATP、 NADPH 与 生成的 NADH) 所确 定的。 此外还 可推导 
出 类似于 方程式 (12) 的生成 C02 的线 性速率 方程。 



Bailey , J.E. & Ollis. D. F. (1986) .Biochemical Engineering Fundamentals , 2nd ed. New York: MacGraw-Hill . 
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199-205. 



66 



第 4 章 物 质平衡 与数据 一致性 

代谢的 定量分 析需要 用实验 数据对 很多参 数尤其 是代谢 通量、 通量 分布以 及通量 控制的 
度量 (见第 11 章) 进行 确定。 因而, 这些 计算将 举例说 明原始 发酵数 据信息 内容升 级的方 
法与 程序。 虽然本 书的重 点是代 谢及其 控制, 但只 要可得 到定量 测定, 那么信 息内容 升级的 
基本哲 理可适 用于整 个生命 科学。 

由于 信息升 级的方 法是由 数据驱 动的, 因 此保证 所用数 据的可 靠性是 极端重 要的。 为 
此, 可采 用常用 的随机 误差最 小法, 例如, 重复 实验、 多种传 感器、 仔细校 正等。 另 外一个 
考虑 (是 本章之 主题) 是引入 数据冗 余以验 证实际 的测量 数据和 对这些 测量进 行分析 的更广 
泛 的机理 框架。 例如, 进行 代谢分 析时, 通 量计算 是基于 底物吸 收及产 物形成 的比速 率的测 
量, 它代 表进出 细胞的 通量。 在进行 任何此 类派生 的计算 之前, 进一步 证实数 据的一 致性是 
很重 要的, 例如, 碳收 支完全 平衡。 

当使 用多种 检测器 测定同 一变量 或由此 所得的 测量必 须满足 某些限 制条件 (例如 物质收 
支完全 平衡) 时, 就 可引入 数据冗 余这个 概念。 显然, 冗余度 越大, 数 据及其 衍生参 数的可 
信度就 越高。 此外, 还 可用冗 余数据 系统地 检测过 失测量 误差的 来源, 或识 别该框 架体系 
(如模 型等) 的 一个特 定部分 是否最 可能造 成数据 的不一 致性。 在这一 章中, 我 们将在 通量、 
代谢及 质量平 衡的范 围内证 实这些 思想。 因此, 用于 定量分 析的实 验数据 必须: 

* 完整 这并不 意味着 必须测 量所有 的底物 及代谢 产物, 只 需量化 那些足 量存在 的物质 
以便 允许验 证碳、 氮 (有 些情 况下还 包括硫 和磔) 平衡。 这就要 求必须 使用成 分确定 的基本 
培 养基, 并且 本质上 在系统 的代谢 研究中 要排除 天然培 养基。 

* 尽可能 无噪声 如 3.3 节所讨 论的, 比速率 是由浓 度分布 的测量 推导而 来的, 因此, 

如 果这些 数据有 噪声, 将使 速率的 计算很 困难。 因此, 细 胞代谢 定量分 析的一 个重要 方面是 
开发精 确可靠 的分析 技术, 这通常 是由计 算机控 制的、 高 性能生 物反应 器在线 监测最 重要的 

培 养变量 C 

评 估实验 数据的 一致性 有两种 方法, 第 一种是 基于非 常简单 的代谢 模型, 即黑箱 模型。 
该模 型将所 有细胞 反应汇 集为一 个单个 反应, 用以 描述整 个细胞 生物质 生长, 该方法 本质上 
是由验 证元素 平衡所 构成。 由于 只需要 底物、 代谢 产物和 生物质 的元素 组成信 息以及 进出细 
胞的 通量, 所 以该法 使用起 来相当 容易。 第 二种方 法重视 从底物 到生物 质及代 谢产物 总转化 
过程的 更多生 物化学 细节。 因而, 它在数 学上更 复杂, 当然, 它 也比黑 箱模型 对实际 自由度 
提 供了更 真实的 描述。 我们开 发这种 代谢模 型以与 代谢通 量分析 (在 8.3 节) 的讨 论相联 
系。 因为本 章的重 点主要 是数据 一致性 分析方 法论的 开发, 因此, 消除 了由于 代谢复 杂性所 
产生 的不必 要的麻 烦而使 用黑箱 模型。 

4.1 黑 箱模型 

在 黑箱模 型中, 细胞 生物质 是与环 境交换 着物质 的黑箱 (如图 4.1 所示 ), 它将 许多细 
胞反 应汇集 为单一 的生物 质生长 反应。 进 出黑箱 的通量 以比速 率表示 (单 位时 间克或 摩尔物 
质每克 或每摩 尔生物 质), 它 们是底 物比吸 收速率 (1% 中的 元素) 和产 物比形 成速率 (fp 中 

67 




的元素 )。 此外, 黑箱中 还有生 物质的 积累, 它以比速率^1 
作 为一个 通量来 表示。 由于所 有的细 胞反应 被汇集 为一个 

总 反应, 因此, 在这个 总反应 中化学 计量系 数可由 3.4 节引 
人的得 率系数 表示, 于是: 



图 4.1 黑 箱模型 示意图 

将 细胞视 为一个 黑箱, 所测 的变量 
只 是进出 细胞的 通量。 进人 细胞的 
底 物通量 为向量 1% 中的 元素, 从 
细胞出 来的代 谢产物 的通量 是向量 

rp 中的 元素。 最初存 在于底 物中的 
某些物 质在黑 箱内以 比速率 形成 
新的 生物质 而积累 







(4.1) 



这 里以生 物质比 生成速 率作为 参照。 由于生 物质的 化学计 
量 系数为 1, 正反 应速率 由生物 质比生 长速率 表示, 它与方 
程式 (4.1) 得 率系数 一起, 就完 全表示 了这个 系统。 用黑箱 
模 型分析 数据一 致性时 可采用 下述四 种方法 之一: (1) 方 
程式 (4.1) 中的一 组得率 系数及 比生长 速率; (2) 相应于 
另一 参照物 (如 底物 之一) 的一 组得率 系数以 及该参 照物的 比形成 / 消耗 速率; (3) 所有底 
物、 产 物及生 物质的 一组比 速率; (4) 由生 物质浓 度与比 速率乘 积所得 到的所 有体积 速率。 
所有这 些变量 均提供 同样的 信息。 在下 文中, 我们 既可用 方程式 (4.1) 的得 率系数 也可用 
方程式 (4.2) 表示 的总速 率向量 r 的变量 中的比 速率: 



r = 



二』 



■p.i 



(4.2) 



【例 4.1】 简 单的黑 箱模型 

考虑 在基本 培养基 (如葡 萄糖为 碳源及 能源, 氨为 氮源) 中 对酿酒 酵母进 行需氧 培养。 
在需氧 生长过 程中, 葡萄糖 被完全 氧化为 C02。 但 当糖酵 解途径 通量很 高时, 丙酮酸 氧化中 
的瓶 颈效应 将导致 乙醇的 形成。 因此, 在 高的糖 酵解通 量下, 乙醇和 C02 均应视 为代谢 产物。 
最后, 细 胞代谢 所生成 的水也 应作为 总反应 一个的 产物。 于是, 这个 系统的 黑箱模 型为: 

- X + Yxeethand + YxcCO? + YxwHsO - y,,glucose - Y^oOz - Y^nNH., 二 ( 1 ) 

(乙醇 ) (^葡 萄糖) 

用比 速率向 量可表 示成: 

r 二、 {X re rc 〜 -' 、 - r(> - r^) (2) 
显然 方程式 (1) 中的化 学计量 (或 得率) 系 数不是 常数, 因为比 生长速 率低时 (相 当于低 
的糖酵 解通量 ), Yxe 为零, 而 比生长 速率较 高时, !^^^将大于零。 



4.2 元 素平衡 方程式 

在黑 箱模型 中共有 M + iV + l 个 变量, 即: M 个代 谢产物 的得率 系数, iV 个底 物得率 
系数, 还有 正反应 速率/ i [见 方程式 (4.1)], 或 方程式 (4.2) 中 M + iV + 1 个比 速率。 因 
为在底 物转变 为代谢 产物和 生物质 的反应 中质量 守恒, 所以 黑箱模 型中的 M + A/ + 1 个速 
率 并不是 完全独 立的, 但必须 满足一 些限制 条件。 因此, 进 出此系 统的元 素必需 平衡, 例 
如, 通 过底物 进人系 统中的 碳必须 在代谢 产物及 生物质 中得到 回收。 显 然在黑 箱中所 考虑的 
每一个 元素均 产生一 个限制 条件。 因此, 碳 平衡方 程为: 
68 



1 + S 卜., Yxp, — I>s.,Yxs, = (4.3) 

1=1 1=1 

式中, As., 与 Ap,, 分别代 表第/ 个底物 及第/ 个代谢 产物的 碳含量 (C-mo 卜 mori)。 在 
此方 程中, 以 碳为参 照物, 对生物 质的元 素组分 进行标 准化, 如 可以用 CH„OaN<. 的形 式表 
示。 生 物质的 元素组 成取决 于其大 分子的 含量因 而也取 决于生 长条件 及比生 长速率 [例 如, 
在氮源 受限制 条件下 的氮含 量远低 于在碳 源受限 制条件 下的值 (见表 4.1)]。 但是除 某些极 
端情 况外, 当还 不确切 知道生 物质组 成时, 使用 一般的 组成式 CH1.8O0.5N0.2 是合 理的。 

用比 速率也 可表示 方程式 (4.3) 的碳平 衡式, 用/ i 乘以 方程式 (4.3) 并利用 得率系 
数的定 义就可 得到: 

M S 

+ Z>p"rp,, - Y^h.^.r.j = (4.4) 

通常, 相应于 底物及 代谢产 物中的 碳含量 来对它 们的元 素组成 进行标 准化, 例如葡 萄糖用 

CH2O 表示。 以每 C-mol 为 基础, 方程式 (4.3) 可 写为: 

1+ 2 Vxp, - SVxs, =0 (4.5) 

/ =1 f - I 



表 4.1 几种 微生物 的生物 质的元 素组成 



微生物 


基 本组分 


灰分 (质量 分数) /% 


条 件 


Candida ulilis 


CH, 


.83O0.46N0.19 







葡萄糖 限制, L> = o.05ir' 




CH, 


.87(io.56No.20 







葡萄搪 限制, D = 0.45h — " 




CH, 


.83O0.54N0.IO 







氣限制 , /)=(). 05 




CH| 


.87O0. 56^0.20 







氣 限制, D=0.45h 1 


Klebsiella aerogenes 


CH, 


.75O0.43N0.22 


3.6 


甘油 限制, D = 0.10h 1 




CH, 


.73O0.43N0.24 


3 


6 


甘油 限制, D = 0.85h 一' 




CH, 


.75O0.47N0.17 


3 


6 


氨 限制, D = 0.10h — 1 




CH, 


.73O0.43N0.24 


3 


6 


氣 限制, D = 0.08h — ' 


Saccharomyces cerevisiae 


CH, 


.82O0.58N0.I6 




3 


葡萄糖 限制, D = 0.08h_' 




CH, 


.78(Vm)N|).i9 


9 




葡萄搪 限制, D = 0.255h 一" 




CH, 


.940o.52^'o.25Po.025 






无限 制生长 


Escherichia coli 


CH, 


.77O0.49N0.24P0.OI7 






无限 制生长 




CH, 


.83Oo.50No.22Pn.O2i 






无限 制生长 




CH, 


.%Oo. 55 No. 25 Po. 022 






无限 制生长 




CH, 


■ wOb.55M0.25P0. 021 




5 


无限 制生长 


Pseudonionas fluorescetis 


CH, 


.8300,55^0.26?0.024 






无限 制生长 


\erdHicter aerogenes 


CH, 


.mOo.52No.I6 




9 


无限 制生长 


Pen iciiliu tn ch rysogetium 


CH, 


.7oOo.58No.l5 






葡^ 糖限制 ,/) = 0.038h」 




CH, 


.68O0.53M0.I7 






葡萄糖 限制, D = ().098h " 


Aspergillus niger 


CHi 


.720o,55No.l7 






无限 制生长 


平均 


CH, 


.8iOn..s2No.2i 


6 








注: 只 列出了 某些微 生物的 * 组分。 Pe'liciUiu'" cfiry 零 的 m 分来 A T Christensen et al (1995), !^它数据来 
自于 Roels (1983)。 



在 方程式 (4.5) 中, 得率 系数的 单位为 ('-mol/C-mol 生 物质。 方框 4. 1 说明 f 如何 将其它 单位换 算为此 单位。 方程 
式 (4.5) [或 方程式 (4.4)] 对检验 实验数 据的一 致性是 非常有 用的。 因此, 假 如生物 》5 及 代谢产 物中的 总碳不 等于底 

物中的 总碳, 那么实 验数据 就出现 r 不一 致性 r 

69 



【例 4.2】 简单 黑箱模 型中的 碳平衡 

现在 回到例 4.1 中 的黑箱 模型, 用 所指定 的底物 及代谢 产物的 元素组 成重写 方程式 

(1), 对生 物质, 其元素 组成为 CHi.830o.56No.17, 因此 可得: 

CHi.830o.65No. 17+ yxeCH30o.5+yxcC02+ YxwHzO - 7x5^20- YxoOz - YxnNHj = 

(1) 

也许 发现将 CH3O0.5 确认为 乙醇很 困难, 但是 当观察 碳平衡 式时就 会立刻 发现以 C-mol 为基 

础的 优点: 

1+ Yxe+Yxc- Yxs = (2) 

这个 简单的 方程对 于检验 实验数 据的一 致性很 有用。 因此, 通 过采用 Von Meyenburg 
(1969) 的经典 数据, 我们 求出: 在以 葡萄糖 限制、 稀释 速率为 0.3h — 1 的 连续培 养中, 
Yxe = 0.713, yxc = 1.313 及 yxs = 3.636。 显然该 数据是 不一致 性的, 因为 没有达 到碳平 
衡。 另外一 个更详 细的数 据分析 (Nielsenand Villadsen, 1994) 表 明丢失 的碳是 乙醇, 因为 
生物 反应器 中的很 强的通 气夹带 会造成 乙醇的 蒸发。 
与 方程式 (4.4) 类似, 氮平 衡方程 式为: 

YxN = 0.17 (3) 

或以 比速率 表示: 

r^ = 0A7ju (4) 
如果 所测定 的氣吸 收速率 及生物 质形成 速率与 方程式 (4) 不符, 那么 就可认 定其中 一项测 
量的 数据不 一致性 或者生 物质的 氮含量 与其所 表示的 不同。 

与 方程式 (4.3) 相似, 可写 出所有 其它参 与转化 的元素 平衡式 [方 程式 (4.1)]。 将生 
物质、 底物及 代谢产 物的元 素组成 用矩阵 E 中的列 表示, 可以 很方便 写出这 些元素 的平衡 
式, 矩阵 E 中的第 一列为 生物质 的元素 组成, 第 2 列至第 M + 1 列为 M 个代 谢产物 的元素 
组成, 第 M + 2 至第 M + iV + l 列为 iV 个底物 的元素 组成。 如 果考虑 / 个元素 (通 常是 4 
个, 即 C、 H、 0、 N), 那 么矩阵 E 中就有 /行, 并且/ 个元素 平衡式 可用同 样数目 的类似 
于 方程式 (4.3) 的代数 方程来 表示, 现概 括为: ' 

Er = (4.6) 
其中 共有/ V + M + 1 个 比速率 (或 体积 速率) 及/ 个限制 条件, 自由度 为 F = M + iV + l- 
^ 如 果恰好 测定了 F 个速 率, 那么就 有可能 利用由 方程式 (4.6) 给出的 / 个代数 方程计 
算其它 速率, 但在 这种情 况下, 就 没有多 余的数 据用于 检验数 据的一 致性。 为此, 明 智的做 
法是应 努力进 行更多 速率的 测量, 使之 大于系 统的自 由度。 

【例 4.3】 简单 黑箱模 型的元 素平衡 

回到例 4.1 及例 4.2 的黑箱 模型, 用前面 所给出 的生物 质元素 组成, 可将 元素组 成的矩 
阵 E 写为: 

-carbon (碳) 

- -—— hydrogen (氢) 

E= -- --- -.. -- ,^、 \1) 

-oxygen {m.) 





1 


1 


1 





1 








1 


.83 


3 





2 


2 





3 





.56 


0.5 


2 


1 


1 


2 








.17 

















1 



-nitrogen (氮) 



70 



其中行 分别代 表碳、 氣、 氧、 氣的 含量, 列分别 代表生 物质、 乙醇、 C02、 水、 葡 萄糖、 氧 

及氨 的元素 组成。 利用 方程式 (4.6) (其中 r 被表 示得率 系数的 向量所 代替) 可 得到: 

1 



1 1 

1.83 3 

0.56 0.1 

0.17 



1 
2 2 

1 1 




3 
2 



1 



Y 

- y, 

- 



1+ Vxe+Vxc-y^ 

1.83 + 3y,e + 2Y,„-2y,3-3Y^ 

o.56 + o.5Y,e + 2y,e+ Vxw- yx.s-2y, 
0.17- y,M 




















0' 



(2) 



第 一行及 最后一 行分别 与由例 4.2 推导出 的碳、 氮平衡 方程式 相同。 氣 和氧的 平衡式 引入了 
两 个附加 的限制 条件。 但由于 不可能 测量水 的生成 速率, 就必须 用其中 的一个 方程计 算该速 
率 (或得 率), 那么 上述两 个平衡 中就仅 剩下一 个附加 限制条 件了。 



方框 4.1 以 C-mol 为 基础计 算得率 

得 率系数 的单位 通常为 mol'g— 1 (干重 ) 或 g'g — 1 (干重 ), 要 将其转 换为以 C-mol 
为 基础的 单位, 必须获 得生物 质的元 素组成 和灰分 含量的 信息。 为 了举例 说明该 转换过 
程, 现将 得率为 0.5g (干重 ) 生物质 (g 葡 萄糖广 1 以 C-mol 来 表示。 首 先将克 干重的 
生 物质转 换成无 灰分的 基准, 即确定 由碳、 氮、 氣 (有些 情况还 包括磯 与硫) 组 成的生 
物质 的量。 若 灰分为 8% , 那么就 可得到 0.92g 无 灰分的 生物质 (g 干重生 物质) — 1, 据 
此可得 0.46g 无 灰分的 生物质 (g 葡萄糖 广'。 使用 单位为 g*C-mol — 1 的无 灰分生 物质及 
葡萄糖 的摩尔 质量, 可 将此得 率直接 转换为 C-mol 基准。 生 物质标 准元素 组成为 
CHi.80o.5No.2» 其摩尔 质量为 24. 6g 无灰分 生物质 c-mol — 1, 因此 可得到 0.46/24.6 = 
0.0187C-mol 生物质 .(g 葡萄糖 广 1。 最后, 乘以 基准为 C-mol 的葡 萄糖摩 尔质量 (30g* 
C-mol -1), 可求出 得率为 0. 56C-mol 生物质 • (C-mol 葡 萄糖) _ i 。 



方程式 (4.6) 概括 了所有 元素的 平衡。 如例 4.3 中所讨 论的, 由 于必须 用氢或 氧的平 
衡 式计算 (不 可测 量的) 水 的生成 速率, 实际 上只有 一个限 制可供 使用。 显然通 过消除 
与 H 平衡 之间水 的得率 系数就 可将水 排除。 一个 更高明 的方法 是使用 所谓的 "一般 化的还 
原度" 平 衡法, 是作为 方程式 (4.6) 元 素平衡 式的线 性组合 而推导 出的。 这个 平衡由 
Rods (1983) 引入, 是 Erickson 等人 (1978) 早期研 究的普 遍化。 将 元素平 衡式乘 以特定 
因子并 将其相 加就得 到该平 衡式。 通过选 择合适 的乘数 因子, 水、 C02 及氮 源的得 率系数 
(或 速率) 就可 从所产 生的方 程中被 消除。 为了 说明该 过程, 现 考虑例 4.3 给定 的元素 平衡, 
将碳、 氢、 氧、 氮的平 衡式分 别乘以 4、 1、 -2 及 -3 可 得到: 

4 +4Y„ +4y„ -4y„ =0 

1.83 +3y„ +2Y,„ -2Y„ -3Y,n =0 
(-2)0.56 +(-2)0.5Y„ +(-2)2Y„ +(- 2)V\w -(-2)Y„ -(- 2)2y,。 =0 
(-3)0.17 - (- 3)V\n =0 



71 



所产 生的方 程式就 是该系 统的一 般化还 原度平 衡式。 当然它 并不独 立于其 它的元 素平衡 
而 存在, 一 般用它 代替氧 或氢平 衡式, 而 另外的 可用来 计算水 的生成 速率。 至 此就得 到碳、 

氮及 还原度 平衡, 利用它 们可检 验数据 的一致 性或计 算没能 测定的 速率。 在 Erickson 等人 
(1978) 的原 始表达 式中, C、 H、 0、 N 平衡中 的每一 个乘数 因子被 解释为 分别在 C、 H、 
0、 N 中可 利用的 自由电 子数, 它们 被传递 至氧, 每 个元素 燃烧生 成水、 C02 及氣 (作 为氮 
源)。 对于 氮平衡 来说, 乘数 因子总 是取- 3, 因为这 是生物 质中氮 的主要 价态。 在 Rods 的 
一 般化概 念中, 乘 数因子 是可自 由选择 的任意 系数以 使所得 的水、 C02 及氮 源的系 数变为 
零。 按这种 方法, 如 果使用 了另外 一种氮 源如硝 酸铵, 为 了消除 一般化 还原度 平衡中 氮源的 
得率 系数, 可对氮 平衡选 择不同 的乘数 因子。 

在 一般化 还原度 平衡式 中与得 率相乘 的系数 被称为 相应物 质的还 原度, 对上述 系统, 生 
物 质的还 原度为 4.2, 乙醇为 6, 葡 萄糖为 4, 水、 氮及 C02 均为 0, 氧为- 4。 用 Rods 的 
结果, 含氮 物质的 还原度 取决于 所用的 氮源。 在大 多数情 况下, 氣或作 为惟一 氮源或 与其它 
氮源 相结合 使用, 于是形 成元素 组成为 CHuO^Nf 的某物 质的还 原度/ C 的 一般表 达式: 

K=4 + a-2b-3c (4.7) 

表 4.2 列出了 发酵过 程中通 常所遇 到的物 质的还 原度。 关于 还原度 更详细 的概念 可参考 
Rods (1983) 或 Nielsen 和 Villadsen (1994) 出版 的书。 引人 物质还 原度/ c 后, 任 何系统 
的一般 化还原 度平衡 式为: 

M N 
+ 2kp,!Yxp, - 2ks,,Yxs, = (4.8) 



该 式非常 有用, 因为 其容易 建立, 加 上碳、 氮平 衡式, 它 就包括 了由四 种元素 平衡所 施加的 
全 部限制 条件。 

表 4.2 标准 条件下 (298K, latm, pH7), 各种物 质的燃 烧热① 



物 质 


分子式 


还原度 


厶 H^/kJ.C-mol-i 


物 质 


分子式 


还原度 


AH^.,/kJ-C-mor' 


乙酸 


C2H40 




583 


甘油 


C3H8O3 


4.67 


554 


乙酸 


C2H402 


4 


437 


异丙醇 


CjHgO 


6 


673 


丙酮 


C3H50 


5.33 


597 


乳酸 . 


C3H6O3 


4 


456 


氨 


NH3 




383 ③ 


乳糖 


C,2H220m 


4 


471 


生物质 


CHi.gOo.sNo.a 


4.2 


560 


苹果酸 


C4H6O5 


3 


332 


丁醇 


C4H10O 


6 


669 


甲院 


CH4 


8 


890 ③ 


丁酸 


C4H8O2 




546 


甲醇 


CH4O 


6 


727 


柠檬酸 


C6H8O7 


3 


327 


草 酰乙酸 


C2H2O4 


1 


123 


乙院 


C2H6 




780® 


掠榈酸 


C16H32O2 


5.75 


624® 


乙醇 


C2H6O 


6 


683 


丙院 


C3H8 


6.67 


740 ③ 


甲酵 


CH2O 


4 


571® 


丙酸 




4.67 


509 


甲酸 


CH2O2 


2 


255 


琥珀酸 


C4H6O4 


3.5 


373 


果糖 


C6H,206 


4 


469 


庶糖 


C12H22O11 


4 


470 


延 胡索酸 


C4H4O4 


3 


334 


尿素 


CH4ON2 




632 


半乳糖 




4 


468 


戊酸 


C5H10O2 




568 


葡萄糖 




4 


467. 











① 以 C02、 H2O 和 N2 为参 比的燃 烧热, latni=10l3#Pa。 

② 固态。 、、 

③ 气态。 -、 

72 



【例 4.4】 酵母 厌氧培 养的数 据一致 性分析 

为 了举例 说明如 何利用 一般化 还原度 分析数 据的一 致性, 我们 使用由 Schulze (1995) 
获得 的酷酒 酵母厌 氧连续 培养的 数据。 在葡 萄糖限 制的条 件下对 葡萄糖 (Yxs)、 乙醇, 
(Yxe)、 CO2 (Yxc) 及甘油 (Yxg) 的得 率系数 (单 位为 C-mol 或 mol/C-mol 生 物质) 列出 
如下: 

稀释率 /h- 1 Yxe Vxc Vxg 

0.1 7.81 3.88 2.13 0.67 

0.2 8.06 4.00 2.26 0.73 

首先, 碳 平衡: 

l+y.e+Vxc+yxg- Vxs = (1) 

在 D=0.1h — 1 时 误差在 2% 以 内及在 D=0.2h — 1 时 误差在 1% 以内。 这样 的偏差 (相 对于以 
葡萄 糖形式 的碳的 供应所 评估) 是 非常满 意的。 
一般 化还原 度平衡 式为: 

Kx + 6Yxc + 4.67Yxg — 4Y%s 二 (2) 

所确定 的酵母 的元素 组成为 CHi.780o.6oNo.19。 因 此生物 质的还 原度为 4.01, 将前面 表中的 
得 率系数 代入式 (2), 可知 在这两 种情况 下一般 化还原 度平衡 的偏差 (同 样, 偏差是 相对于 
葡 萄糖) 都在 3% 以内。 很有 趣的情 况是: 当 D 二 O.lh — 1 时, 发现 "丢失 的碳" 的 还原度 
(也是 利用碳 平衡) 非常 接近于 6, 这表 明乙醇 的测量 值可能 偏低。 在 产生挥 发性物 质的酵 
母及其 它菌体 培养过 程中, 这是一 个普遍 存在的 问题, 一般 丢失的 碳小于 2% 左右是 可以接 
受的。 



4.3 热平衡 

在 底物转 化成代 谢产物 和生物 质的过 程中, 底物 中部分 Gibbs 自由 能以热 的形式 耗散于 
周围环 境中。 尤其在 需氧条 件下, 散失 的能量 可能相 当大。 能量 耗散可 通过底 物的总 Gibbs 
自由 能与从 代谢产 物及生 物质回 收的总 Gibbs 自由能 之差来 确定。 通常, 能量 散失导 致系统 
的焓 和熵的 变化, 其很 难量化 (见 13.1 节)。 因此 人们的 注意力 通常集 中于通 过熔的 变化所 
确定 的热量 产生, 因为 这种热 量产生 对过程 温度控 制冷却 需要有 直接的 影响。 在黑 箱模型 
中, 总过 程的热 量产生 Qheat[kJ'(C-mol 生物质 广 1] 可用式 (4.9) 计算: 

Qhea, = - AH« = 1] YxsAHj., - AHj., - £、 YxpAHj,, (4.9) 

式中, 厶/<^,, 为标准 条件下 (298K, latm) ( latm = 101325Pa) 第/ 个 物质的 燃烧热 
[kJ-(C-mol)-']o 上式 中得率 系数以 C-mol 为 基准。 表 4.2 列 出了发 酵培养 基中一 些典型 
物 质的燃 烧热。 应注意 Qheai 实 际上是 热的产 生量而 不是热 的产生 速率。 为了 确定热 量产生 
的 速率, 可 将上述 方程乘 以生长 速率。 方程式 (4.9) 对 于由得 率系数 计算热 量产生 非常有 
用, 并可 用于设 计生物 反应器 的冷却 能力, 如例 4.5 所说 明的。 



【例 4.5】 厌 氧与需 氧生长 中的热 量产生 

现考虑 在厌氧 及需氧 条件下 醜酒酵 的 生长, 厌氧 生长的 黑箱模 型为: 



73 



CHi .62Ob.53N0.15 + 4 . 78CH30b.5 + 2 . 42C02 + • 媽0 - 8 . 2OCH2O - . ISNHj = (1) 
需氧 生长的 黑箱模 型为: 

CH1.62O0.53N0.15 + . 67C02 + 1 . 08H2O - 1 . 67CH20 - . ISNHs - . 6402 = ( 2) 
现可计 算出这 两个反 应的热 量产生 (下标 anarob 表示 厌氧, aerob 表 示需氧 —— 译者 
注) 为: 

Qanarob = 8.20X467 + 0.15x383 -560 -4.78X683 

= 62.11kJ'(C-mol 生物质 )— 1 (3) 
Qaerob = 1 • 67 X 467 + . 15 X 383 " 560 = 277 . 3kJ ' (C-mol 生物质 ) — i (4) 
由此可 看出, 需氧过 程产生 的热量 [相 当于 165kJ*(C-mol 代 谢的葡 萄糖) _1] 远大于 
厌 氧过程 [相 当于 8kJ*(C-mol 葡 萄糖) — 1]。 因此, 在 需氧过 程下, 最 初存在 于葡萄 糖中的 
大部 分自由 能以热 的形式 散失, 而在 厌氧条 件下, 其回 收于乙 醇中。 为 了说明 大规模 生物反 
应器 的冷却 要求, 现计 算一个 典型的 工业面 包酵母 发酵的 总生成 热量。 生物 反应器 体积为 
100m 3 , 生物质 浓度为 50g*L — 1 (约 相当于 1.96C-mol*L — 1)。 对于 分批式 操作, 其 比生长 
速率 约等于 0.25h — 1, 利用这 些数据 首先可 得到热 量产生 的比速 率为: 

rc=QaerobA' = [277 . 3kJ « (C-mol 生物质 广 1] X (0.25h — i) 

= 69kJ'(C-mol 生物质 )— I'h — 1 (5) 
据此 求出总 热量产 生为: 

[69kJ- (C-mol 生物质 )— I'h — i]x(1.96C-mo 卜 L — i)x(100.000L) = 3.8MW (6) 
这么 大的热 量产生 清楚地 表明需 要大量 的冷却 水以维 持生物 反应器 恒温。 



如果 能精确 测量热 量生成 速率, 例 如使用 热量计 [正如 在几个 出版物 中已列 举的, 如参 
见 Larsson 等 (1991) 及 Von stockar 和 Birou ( 1989) ] 或 测量反 应器中 的温度 变化, 那么 
热 平衡式 [方 程式 (4.9)] 与 4.2 节的元 素平衡 式一起 就可提 供一个 额外的 冗余。 然而, 如 
不 能测定 热量生 成速率 (例 如在 厌氧条 件下, 生成的 热量很 小), 那么 引人一 个附加 的方程 
并不能 改变自 由度, 这是由 于所附 加了未 知变量 (Qheat)。 对 于需氧 过程, 通 常发现 热量生 
成速率 与氧吸 收率成 正比: 

Qheat=ano (4.10) 

经验 发现式 (4.10) 适 用于在 不同底 物上的 微生物 生长, 式中比 例常数 约等于 460kl/mol Qz 
[见表 4.3 及例 4.3, 其值为 433kJ*(mol02;ri]。 方程式 (4.10) 也可 从一般 化还原 度平衡 
导出, 其中以 N2 作为 含氮 物质的 参照物 (Roels, 1983; Nielsen and ViUladsen, 1994)。 方 
程式 (4.10) 的 一个推 论是: 热量生 成速率 的测量 很适合 于检验 氧吸收 速率的 测量, 或者可 
作为这 种测量 的一种 替代。 



表 4.3 利用不 同碳源 生长的 细菌的 及 Qheal 比较 



底 物 


/mmol 02.g — 1 

(干重 ) 


Qheai 

/kJ'g-1 

(干重 ) 


Q/Yxo 

/kJ-(mol O2) — ' 


底 物 


/mmol O^.g — 1 

(干重 ) 


Qheat 

/kJ-g-' 
(干重 ) 


Q/Vxo 

/kJ-(mol O2)"' 


苹果酸 


30.6 


14.0 


458 


乙醇 


51.2 


23.2 


453 


乙酸 


44.6 


19.9 


446 


异丙醇 


135.8 


56.5 


416 


葡萄糖 


21.3 


10.0 


469 


石蜡 


62.5 


26.2 


419 


甲醇 


71.0 


34.9 


492 


甲焼 


156.3 


68.6 


439 



注: 数 据取自 Abbott 及 Clamen (1973)。 



74 



4.4 超 定系统 的分析 —— 过失测 量误差 的识别 

如果可 获得的 测量数 目大于 自由度 F, 该 系统通 常被称 为超定 系统。 在此情 况下, 测 
量的 冗余可 用于: (1) 计 算没测 量的代 谢物的 速率; (2) 通过运 用本质 上的最 小二乘 计算提 
高可 利用的 测量的 精度; (3) 识别最 可能的 过失测 量误差 来源或 甚至在 黑箱模 型框架 构建中 
不一 致性的 来源。 这可 以直接 的方式 进行。 例如, 若只 有一个 速率没 测量, 我 们可以 用碳平 
衡计算 该速率 并且用 剩下的 (氮 及还 原度) 平衡 来检验 数据的 总体一 致性。 有 一种更 有效的 
分 析方法 是基于 同时使 用所有 的平衡 (元素 的及其 它的) 来计算 没被测 量的速 率及进 行数据 
一致性 分析。 最好运 用矩阵 运算来 进行。 这里, 我们遵 从这个 程序, 然而, 为 了便于 对该法 
接触 有限的 读者的 理解, 已将 矩阵运 算的运 用减至 最少。 另外, 在方框 4.2 中 还介绍 了矩阵 
的基本 运算。 最后, 提 供几个 例子用 以说明 应用于 无酒精 生成的 酵母有 氧培养 时这些 运算方 
法的 运用。 

现以 方程式 (4.6) 的元 素平衡 式作为 分析的 开始, 以 如下方 式重写 该式, 即将 速率向 
量 r 分为 两个 向量: 一个是 rm, 其包括 所有已 测量的 速率, 另 一个是 !•<:, 其包 括剩余 的速率 
(指需 计算的 速率, 因此 下标为 c), 得到式 (4.11): 

Er = Ecrc + Emrm = (4.11) 
同样 可将元 素矩阵 E 按 列分为 两部分 Em 和 Ee 。将 E 中 已测速 率的物 质所在 的全部 列放入 
Em 中, 将 E 中没 测速率 的物质 (即 必须 从平衡 中要计 算的) 所在 的全部 列放人 Ec 中。 当 
然, 如 果刚好 测量了 F 个变 量, 那么 就有正 好足够 多的方 程用于 计算没 测量的 速率。 在这 
种情 况下, 是一 个方阵 (Jx/), 其 维数等 于限制 条件数 (或平 衡数, /)。 若 Ee 为 满秩, 
即秩 (Ec) = J (见 方框 4.2), 那么解 方程式 (4.11) 就可计 算出没 测量的 比速率 rc: 

rc= - Ec- lEmfm (4.12) 
如果 Ee 为方 阵而且 满秩, 则该系 统被称 为可观 测的, 因为 它有恰 好足够 多的测 量值用 
于计算 未知的 速率, 即系 统是超 定的。 若所测 量的速 率的数 目大于 自由度 F, 所得 到的方 
程 数目就 大于计 算未知 速率所 需的最 少方程 数目。 在此情 况下, 通 常使用 最小二 乘法, 从可 
利用 的平衡 方程的 组合来 计算未 知速率 以提高 所得估 值的精 确性。 这种 情况的 等价矩 阵是元 
素 子矩阵 Ec, 其不是 方阵, 因 此不能 求其逆 矩阵。 但将 方程式 (4.11) 乘以 Ec 的转 置矩阵 
eJ (见 方框 4.2) 就 得到: 

EcT(Ecrc + Emrm) = (EjEe)re + EjE^r^ = (4.13) 
Ej^Ee 肯定 是方阵 (见 方框 4.2), 而 且如果 满秩, 就可 求逆, 并进 而给出 re 的解: 

rc=- EfEmfm (4.14) 
式中, Ef 为拟 逆矩阵 (或 Moore-Penrose 逆矩阵 ): 

Ef = (EjE,)-'Ej (4.15) 

式 (4.14) 本质上 是向量 fc 中未 测量速 率的最 小二乘 估计, 其 用了所 有的平 衡以确 定这些 
速率。 可以 表明, 若 Et. 为满秩 (即 至少线 性无关 的平衡 方程的 数目与 未测速 率的数 目一样 

多), 那么 eJ^Ec 也 为满秩 并且其 拟逆矩 阵也可 求出。 

在超定 系统情 况下, 用 方程式 (4.14) 计算 出未测 量速率 (fc) 之后, 可 能还留 着一个 
未使 用的平 衡式, 其可用 来检验 所测量 的和所 计算的 速率的 整体一 致性, 为此, 将 方程式 
(4.14) 代入 方程式 (4.11) 得到: 

75 



Rrm = (4.16) 
式中, R 被 称为冗 余矩阵 (VanderHeijdenetal, 1994a, b): 

R = Em — Ec(eJEc) - 'eJe^ (4.17) 
冗 余矩阵 的秩数 表示必 须由测 量的和 计算的 [按式 (4.14)] 速率 所满足 的独立 方程的 数目, 
因此 冗余矩 阵含有 /- 秩 (R) 个相关 的行。 如果 去掉相 关行, 就得 到关联 所测变 量的秩 
(R) 个独立 方程, 即 

Rrrm = (4.18) 
Rr 为缩减 的冗余 矩阵, 它只 含矩阵 R 中的独 立行。 方程式 (4.16) 是 进一步 分析过 失误差 识别的 
基础。 在 继续此 项工作 之前, 将首 先举例 说明上 述概念 及确定 R, 的方法 (见例 4.6 〜例 4.8)。 



方框 4.2 矩 阵运算 

矩阵只 是按某 种点阵 形式排 列的一 组数。 本文中 所用到 的点阵 或者是 多组分 的某一 
向 量形式 或是一 个方的 / 矩形 的阵。 在此将 介绍本 书用到 的最简 单的矩 阵运算 [更 详细的 
可参见 Strang (1988)]。 

考 虑一个 两行两 列的普 通矩阵 A: 

fAi.i Ai,: 

A 

IA2.1 A2,: 

在 矩阵表 示法中 指第 Z' 行第 _ ;' 列的 元素, 其中 i 
表示, 在此 情况下 A 为 2X2 矩阵。 



1 



1' 



其 阶数以 nXm 



矩 阵的基 本运算 
考虑上 述矩阵 A 及另 



-个 2X2 矩阵 B: 



B 



,1 



Bi,: 



矩阵 A 与 B 的 和及差 分别为 2 X 2 矩阵 C 与 D: 



C = A + B 







Ai 


2+Bu2 


A2.1 


+ ^2,1 


A2 


2 + B2,2 


Ai.i 




Ai 


2 - Bi,2 


A2,l 


-B2., 


A2 


2-B2.2 



D = A-B 



矩阵与 某个常 数的数 积等于 该数乘 以各矩 阵元素 形成的 矩阵, 例如 



E = 2A = 2 



2A,a 
2A2,i 



2A1.2 

2 A, z 



Ai.i Ai,2 
A2.1 A2.2, 

某一向 量与矩 阵相乘 或矩阵 之间的 相乘较 复杂, 现举例 如下。 考虑一 个向量 V, V 的元素 

数 目等于 A 的列数 : 

、1 



A 与 V 相乘 可得到 





Ai.i Ai,2 








II 

< 

II 










A2.I A2,2, 









76 



在本 质上, F 中的 每一个 元素为 A 的相 应行与 V 的乘积 之和。 对于 阶数为 X „ 的 及 
阶数为 rXl 的向量 V, 显然 r 必等于 (即 A 的列数 ), 乘积 矩阵为 mX„。 

用 类似的 方式, 可将 两个阶 数相配 的矩阵 相乘, A 中 的每一 行乘以 B 中相应 的列得 
到 2X2 矩阵 G: 

' ■ Ai, 1^1, i + Ai, 2^2.1 Ai.iBi,2 + Ai,2B2 

,A2,iB,,, + A2.2B2A A2,lBi.2+ A2,2B2._, 

矩阵 相乘是 可结合 的及可 分配的 但不可 交换, 即 (AB)C = A(BC), A(B + C) = AB + AC, 
但 ABt^BAc 
例 1 

考虑含 有下列 元素值 的矩阵 A、 B 及向量 V。 作为 练习, 建议读 者重新 计算其 结果。 



G = AB 





A, ,2" 








A2A 


A2.2, 


力 2,1 


B2.2 





A = 



'0 



2A = 



A + B = 

^0 2 



1\ 
3/ 

(4 4 
[4 5 



B = 



、4 6 



Av = 



'4 3 

a 1. 

A-B = 
、2i) 



AB 



(3) 

-2\ 
1 ) 
2 2 
14 12 



矩阵 的转置 

以 AT 表示 A 的转置 矩阵, PJ 中的 列直接 取自于 A 的行, 即 A 的第 i 行变为 A 7 ' 
的第 列。 因此 对一般 情况: 





Ai,2 


T 


Ai.i 




A2.1 


A2.2. 




A1.2 


A2.2. 



注意, AB 的 转置矩 阵是: (AB)T 二 A'^BT 
矩 阵的逆 

某一 72X„ 矩阵 A 的逆以 A— I 表示, 它是 另一个 "X" 的矩阵 B, 因此, AB 二 BA 二 I, 
I 为所谓 的单位 矩阵, 在其对 角线元 素均为 1, 其 余均为 0。 例如当 "=2 时 1 为: 

a 0\ 

、0 1/ 

矩阵 A 的逆矩 阵计算 如下: 



I 



A 



I 一 





A,,2 


— 1— 1 


A2,2 - A1.2' 


A2.1 


A2.2 


det(A) 


,-A2.i Ai,i , 



det (A) 是 A 的行 列式, 表 示如下 
Ai.i A, .2 



det(A) =det 



_ A,.i A2,i 
A2,i A2.2J Ui,2 A2.2 
对于阶 数大于 2X2 的矩 阵的行 列式的 运算可 参考线 性代数 教科书 [例如 Strang 
(1988)]。 当 A 的行 列式 det (A) 为 零时, A 的逆不 存在, 注意到 这点很 重要。 这种不 
能求逆 的矩阵 通常称 为奇异 矩阵。 还有 一点应 注意: (A— i)'f = (AM I 

矩阵的 另一个 重要性 质是矩 阵的秩 (r), 其相应 于该矩 阵中真 正独立 的行的 数目。 
对 n X „ 的方阵 A, 当 r 二; 2 时, 可 证明: (1) A 的逆 存在, (2) 且它的 逆是惟 一的。 



77 



对于例 1 中 的矩阵 A 和 B, 其 det(A)= _2 及 det(B)=2, 这 表明它 们是非 奇异矩 
阵, 它 们是逆 存在。 计算 如下: 



1 = 


Ai.i 


A1.2 


- 1 




0.5 




A2,l 


A2.2 




( 1 





1 = 




Bl,2、 


-1 


/ 1 - 


-1.5 




.-62,1 


B2.2, 




1-1 


2 



这种 2X2 的系统 很容易 在纸上 运算。 然而 对于阶 数高的 矩阵, 为 了便于 运算, 应使用 
MATLAB. MATHCAD 或 MATHEMATICA 等软 件包。 



【例 4.6】 无 乙醇生 成的酵 母需氧 培养过 程分析 

现在 回到酵 母需氧 培养的 情况, 其在例 4.1 〜例 4.3 已被讨 论过, 但现在 只考虑 不生成 
乙醇的 情况。 此时 Yxe 为 0, 所以在 黑箱模 型中将 不包括 乙醇。 于 是以; 《、 re. rs、 r。 

及 表示模 型中的 速率。 运用葡 萄糖、 氧的 比吸收 速率, C〇2 的比生 成率及 生物质 比生长 
速率 (它等 于处于 稳态的 恒化器 的稀释 速率) 的测量 数据, 元 素矩阵 可划分 如下: 



(1) 



其 中矩阵 Em 的 4 个列 分别对 应于葡 萄糖、 氧、 C02 及生 物质的 4 个 速率, 矩阵 中 的两个 
列 分别对 应于氨 和水的 速率。 当然, 上述两 个矩阵 中的行 代表四 个元素 平衡方 程式。 对于含 
有 6 个化 合物及 4 个 元素平 衡式的 系统, 其 自由度 F 为 2。 因为有 4 个速 率可以 测定, 所以 
它 是超定 系统。 利用 方程式 (4.17) 可 得冗余 矩阵: 



葡萄糖 


◦2 


C02 


生物质 


NH3 


H2O 




1 





1 


1 














2 








1.83 




3 


2 




m ― 






0.56 


; Ec = 











1 


2 


2 


1 






.0 








0.17 J 




1 








R 



1 





1 


1 





-0.286 


-0.286 


0.014 





0.572 


0.572 


-0.028 





0.858 


0.858 


一 0.042 



矩阵 R 的秩为 2。 很容易 发现, R 中 的最后 两行与 第二行 成比例 (第二 行乘以 
别与 第三、 四行相 等)。 因此消 去这两 行就得 到化简 的冗余 矩阵: 

\\ 1 1 \ 

、0 —0.286 -0.286 0.014/ 

-起, 根据 方程式 (4.18) 就 可得到 下列冗 余方程 



(2) 



2 及 -3 分 



(3) 



方程 (3) 与 4 个所; 



I 定 的比速 率- 



(4) 



— r.s + Tc + 
10.286r„-0.286re + 0.014;/, , 
显然 第一行 被认定 为碳平 衡式, 但 第二行 就不那 么容易 确认, 尽 管其包 含了来 自其它 三个元 
素 平衡限 制条件 的全部 信息。 . 



78 



通常实 验数据 充满噪 声并且 在某些 情况下 甚至出 现系统 误差。 由 于这些 误差, 方程式 

(4.16) 通常不 准确。 用 所测量 的速率 (或 得率) 乘以 化简的 冗余矩 阵时, 结果不 为零。 这 
一 点用式 (4.19) 能 更好地 表示: 

i^ = rm + 5 (4.19) 

式中, 为 测量的 速率的 向量; fm 为实 际速率 向量; 5 为 其不可 靠的总 的测量 误差。 

将 方程式 (4.19) 代人式 (4.18) 就得 到残差 的向量 e, 如式 (4.20) 所示: 

£=RrI^ 二 Rr(rm + 5)=RrS , (4.20) 

如果 该模型 正确并 且无系 统或随 机误差 存在, 即<^ = 0, 那么所 有方程 [方 程式 (4.18)] 均 
能被完 全满足 且残差 为零。 但在所 有数据 组中, 测量 中存在 噪声使 得残差 向量不 为零。 最好 
的速率 估计是 使残差 最小, 可 通过如 下过程 确定。 

假 设误差 向量服 从正态 分布, 其 平均值 为零, 方差- 协方差 矩阵为 F: 

£(0 = (4.21) 
F=E[i^-rJ(^-rJT] = E{d8'^) (4.22) 
式中, £: 为 期望值 算子, 能够 表明残 差也是 服从正 态分布 且均值 为零: 

E(e) = R,E(5) = (4.23) 

方 差-协 方差矩 阵为: 

P = E(ee^) = RrE(5^^)Rj = RJRJ (4.24) 

误 差向量 5 的 最小方 差估计 是通过 根据其 方差所 衡量的 误差平 方和最 小而得 到的: 

mm(d'^¥-^d) (4.25) 

其 解为: 

= FRrTp- le =FRrTp-iRrrm (4.26) 

这 里符号 表示 <5 的值是 一个估 计值。 因为 S 为正态 分布, 方程式 (4.25) 中 的函数 
最小 化就如 同最小 二乘最 小化问 题及最 大似然 最小化 问题。 若误差 向量不 是正态 分布, 方程 
式 (4.26) 的估计 值仍可 用于最 小二乘 最小化 问题, 但 不再是 最大似 然估计 (wang 及 
Stephanopoulos, 1983)。 利用 方程式 (4.26), 可 得到所 测量速 率的最 佳估计 值为: 

『二 二 1^- ^ = (l-FRrTp- iRr)i^ (4.27) 
其中 I 为单位 矩阵。 可以 表明, 通过 方程式 (4.27) 得到 的所测 量速率 的估计 值的标 准偏差 
小于原 始测量 值的标 准偏差 (wang 及 Stephanopoulos, 1983), 因此该 值很可 能比实 测的数 
据更 可靠。 通 过利用 所测量 速率的 最佳估 计值及 方程式 (4.14), 就可 计算出 黑箱模 型中的 
未 测量的 速率。 



【例 4.7】 无 乙醇生 成的酵 母需氧 培养过 程分析 (续) 

现在 继续分 析例题 4.6 开始的 酵母需 氧培养 过程, 该例已 推导出 了化简 的冗余 矩阵。 当 
稀释 速率为 0.15h-' 时, 葡 萄糖、 氧、 C02 及生 物质的 比速率 的测量 值为: 





― rs 




-0.250 








-0.113 


rm 二 






0.113 








0.141 - 



(1) 



这里, 所有速 率的单 位均为 C-mol'(C-mol 生物质 — 假定 生物质 及葡萄 糖的; 
为 5%, 气体 的测量 误差为 10% (即 氧与 C02 的测量 ), 现在要 计算所 测量速 率的最 佳估计 
值。 对 于这些 误差, 其方 差-协 方差矩 阵为: 

f 0.1563 

0.1277 
0.0139 

0.1988 



F=10 — 3 



利用 方程式 (4.24) 可得: 



P = 10 



0.3870 
-0.0563 





-0.0563 
0.0267 



(2) 



(3) 



化 简的冗 余矩阵 来自例 4.6。 根据 方程式 (4.26) 可得 到所; 

0.0055 



: 通量的 误差向 量为: 



8 



0.0115 
-0.0013 
0.0108 



(4) 



r „ = 



由 此导致 所测量 通量的 最佳估 计值: 

-0.24451 
-0.1245 
0.1143 
0.1302 

由此, 仅对测 量值有 很小的 校正, 因而原 始测量 值似乎 是很好 < 
元 素平衡 方程, 所 以它们 比原始 测量值 更好。 



(5) 



然而已 校正的 测量值 更符合 



通常方 差-协 方差矩 阵假定 为对角 矩阵, 它意味 着这些 测量值 是不相 关的。 然而比 速率、 
得 率系数 甚至体 积速率 很少是 直接测 量而是 从基本 变量的 测量值 中导出 来的, 这可影 响到不 
只 一个所 测定的 速率。 一个 例子是 氧吸收 速率及 C02 生成 速率的 测量, 二者 均基于 流过生 
物反 应器中 的气体 流速的 测量、 连同罐 顶气相 中两种 气体的 分压的 测量。 若气 体流速 测量有 
误差, 它对 两个速 率均有 影响。 因此所 测量的 速率中 的误差 就间接 相关。 对其 它速率 的测量 
也存在 同样的 缺点, 这些速 率一般 是通过 将浓度 测量与 流速测 量相结 合而得 到的。 在 所有具 
有间接 误差相 关的情 况下, 指 定真实 的方差 -协方 差矩阵 F 是很困 难的。 Madron 等人 
(1977) 提出 了一个 简单的 算法, 当基 本变量 的噪声 性质已 知时, 用该 算法就 可建立 真实的 
方差 -协方 差矩阵 (见 方框 4.3)。 但在 很多情 况下, 即使是 对基本 变量的 噪声, 我们 只有不 
充分的 信息, 因 此就不 能导出 真实的 方差- 协方差 矩阵。 在 这些情 况下, 可以 忽略协 方差并 
利用一 个对角 方差- 协方差 矩阵, 其中采 用了误 差的合 理值。 此外, 还 可用下 式进行 最小二 
乘 估计: ― 

rm=[I- RrT(RrRrO — LRJi^ (4.28) 

它 是基于 所有所 测量的 速率均 具有相 同的绝 对误差 这一假 设的。 由于使 用了误 差的绝 对值, 

当变量 的数量 级相同 时使用 方程式 (4.28) 才是合 理的。 

若任 何约束 残差与 零相差 很大, 那么或 是至少 某一个 测量有 系统误 差或是 所用的 模型不 
正确。 为 了量化 "与 零相差 很大" 这个 说法, 可 引入检 验函数 /?, 它等于 残差的 加权平 
80 



方和: 

h =e^p-ie (4.29) 
当 原始测 量不相 关时, 检 验函数 /2 为; ( 2 分布 (wang 和 Stephanopoulos, 1983), 对 于相关 
的原始 数据, 已表明 也是这 种情况 (VanderHeijden 等, 1994b)。 2 分布 的自由 度等于 P 
的秩, 也等于 R 的秩, 即独立 限制条 件数。 在自由 度等于 R 的秩 的条 件下, 将检 验函数 /2 
的计算 值与; ( 2 分 布的值 相比, 就有可 能在某 一置信 水平检 验数据 的系统 误差。 因此, 假如 
在一 个足够 高的置 信水平 下所得 到的检 验函数 值大于 ;^ 2 分 布值, 那 么数据 或模型 就有问 
题。 表 4. 4 列出了 在不同 置信水 平及不 同自由 度下的 ; 分 布值。 



表 4.4 ; f 2 分布值 



自由度 






置 信 


水 平 






0.500 


0.750 


0.900 


0.950 


0.975 


0.990 


1 


0.46 


1.32 


2.71 


3.84 


5.02 


6.63 


2 


1.39 


2.77 


4.61 


5.99 


7.38 


9.21 


3 


2.37 


4.11 


6.25 


7.81 


9.35 


11.30 


4 


3.36 


5.39 


7.78 


9.49 


11.10 


13.30 




4.35 


6.63 


9.24 


11.10 


12.80 


15.10 



方框 4.3 基本 变量误 差的方 差-协 方差矩 阵计算 

通常所 测的速 率是由 所谓的 基本变 量的测 量值确 定的, 例如, 在稳态 恒化器 中葡萄 
糖的 体积吸 收速率 是作为 加料中 与反应 器中的 葡萄糖 浓度之 差与稀 释速率 的乘积 而确定 
的。 因此 方差- 协方差 矩阵的 详细表 述不是 直截了 当的。 Madron 等 (1977) 提出 了一个 
利用 基本变 量的测 量噪声 来计算 F 的简单 方法。 首先, 将所 测量的 速率表 示为基 本变量 
的 函数。 以向量 表 示这些 基本变 量时, 可得第 /个 速率: 

(1) 

通 常函数 /, 是非线 性的, 为了 获得方 差及协 方差的 近似估 计值, 需将 这些函 数线性 
化。 所 测的第 I 个速率 的误差 5, 以 基本变 量误差 5/ 的线性 组合来 表示: 

& = 二 (2) 

式中, )^ 为基本 变量的 个数; g,;; 为敏 感度。 若将敏 感度纳 入矩阵 G 中, 那么方 差- 
协方 差矩阵 F 可 通过下 式计算 : 

F = GF*GT (3) 

式中, 是含有 基本变 量方差 的对角 矩阵。 用上述 方法计 算协方 差非常 简便, 但很 
明显, 所 计算的 结果由 方程式 (2) 线性 化的精 确度所 限制。 



【例 4.8】 无 乙醇生 成的酵 母好氧 培养过 程分析 (续) 

现 在我们 继续分 析在例 4.6 中 提出的 并在例 4.7 中 进一步 分析的 酵母好 氧培养 过程。 根 
据例 4.7 中推 导出的 矩阵, 用 方程式 (4.20) 可计算 残差: 

81 



_ / 0.0040 \ 
1 -0.0064/ 

用 方程式 (4.29) 可计 算出检 验函数 的值: 

/2=e^p-^e = 1.87 (2) 
因 为在化 简的冗 余矩阵 中有两 个独立 的行, 所以 其秩为 2, 即 检验函 数的值 需与自 由度为 2 
的; t 2 分 布值相 比较。 从表 4.4 可 看出, 即 使置信 水平为 0.75, 检 验函数 的值也 小于; 分 
布值。 因此, 只有在 置信水 平非常 低时, 才 能得出 数据含 有过失 误差的 结论, 所以数 据的质 
量令人 满意。 



在一 给定的 置信水 平下, 求得 一个大 的检验 函数, h〉i\ 并不容 许人们 得出结 论是否 
不满 意的大 的系统 误差是 由于数 据的系 统误差 还是由 于大的 随机误 差所造 成的。 有一 个方法 
可 解决此 问题, 即在给 定的数 据中一 次消除 一个测 量值, 然后利 用某一 限制条 件计算 该测量 
值, 其余的 限制条 件用于 一致性 分析, 以重新 计算检 验函数 A 并与 少了一 个自由 度的; ( 2 统 
计值相 比较。 如果消 除某一 测量值 后所得 到的检 验函数 值显著 地小, 这 就足以 证明所 消除的 
测 量值中 有过失 (系统 ) 误差 存在。 这 同样适 用于除 元素平 衡式之 外的其 它限制 条件, 例如 
那些对 胞内代 谢物作 稳态假 定所产 生的限 制等。 这 种误差 诊断的 方法需 要系统 是超定 系统而 
且至 少有两 个冗余 测量, 即秩 (R)>2。 这种 超定系 统便于 一个限 制用于 计算所 消除的 测量, 
其 它的限 制用于 重新计 算检验 函数。 测量 消除的 步骤很 简单, 如例 4.9 所述, 它能迅 速确定 
某一系 统误差 的可能 来源。 



' - 厂 S 




-2.1 


― 厂 




-3.8 




= 0.008 








1 






1.4 , 



【例 4.9】 酵母 培养测 量的误 差诊断 

对 于以葡 萄糖为 碳源、 氨为 氮源的 酿酒酵 母需氧 生长, 当 比生长 速率为 0.008h — 1 时, 
葡萄糖 及氧的 比吸收 速率、 生物质 比生长 速率和 C02 比生 成速率 [所有 速率以 C-mol*(C- 
mol 生物质 'h 广 1 表示] 的测量 值为: 



(1) 



生物质 的元素 组成假 定与例 4. 6 〜例 4.8 相同。 葡 萄糖、 氧、 生 物质及 C02 的 测量误 差分别 
为 6%、 11.7%、 5% 及 11.1%, 无协 方差。 现 在要检 验是否 有实验 误差。 因 为化学 计量反 
应式 及所测 的速率 均与例 4. 6 〜例 4.8 相同, 因此 可用例 4.6 导 出的化 简冗余 矩阵。 此外, 
利用给 定的误 差可得 方差- 协方差 矩阵: 

(0.0102 

0.1265 
0.0016 

0.0155 



F 二 10 



-4 



(2) 



按例 4.8 计 算检验 函数, 可 得到: 



82 



h =35.06 



(3) 



它表示 即使在 0.99 的置信 水平仍 有测量 误差。 审 视所测 定的速 率似乎 可发现 误差或 存在于 
氧或 存在于 C02 的测 量中, 因为 呼吸商 (RQ=re/V。) 小于 1, 而酿酒 酵母在 低比生 长速率 
进行 需氧培 养时的 正常呼 吸商为 1。 为了确 定测量 误差, 每次 一个, 分别消 除四个 反应速 
率, 然后计 算检验 函数, 其结果 如下: 

所 消除的 化合物 /2( 检验 函数) 所 消除的 化合物 /!( 检验 函数) 

葡萄糖 27.06 生物质 26.43 

氧 2.12 C02 34.96 

显然, 如果葡 萄糖、 生 物质或 C02 三个测 量值中 的任何 一种被 消除, 仍有测 量误差 存在。 
只有 消除了 氧测量 值后, 检 测函数 值才降 至一个 低值, 通 过与自 由度为 1 的; 分布 值相比 
较, 发现当 置信水 平大于 90% 时, 还不能 断定有 过失测 量误差 存在。 因此氧 测量值 很可能 
是误差 来源。 

若消 除氧测 量值, 就有可 能计算 得到三 个所测 定速率 的更好 的估计 值以及 三个没 测量速 
率 (包 括氧) 的 更好估 计值。 首先, 通过用 方程式 (4.27), 对于所 测量的 速率可 得到: 





广 S 




-2.21 






= 0.008 


0.98 




厂 C 




, 1.23 , 



此后用 方程式 (4.14) [对所 测量的 速率用 方程式 (4) 代入] 可求出 未测量 的速率 (氨 吸收 
速率、 水生成 速率及 氧吸收 速率) 为: 





. ― 广 N' 




-0.17 


八 

r C 二 




= 0.008 


1.56 








-1.18. 



由此 可见, 氧吸收 率得到 大幅度 校正。 此外, 利用估 出的速 率可得 RQ 为 1.04, 这 是一个 
更 加真实 的值。 



参 考文献 

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83 



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84 



第 5 章 代 谢途径 的调控 

在生物 体中, 生理功 能的调 控发生 在细胞 水平和 分子水 平上, 这些 调控是 通过调 节参加 

生化 反应的 各种物 质的浓 度来实 现的。 此类 调控变 量包括 薛 (E)、 底物 (S)、 产物 (P) 及 
调节 物分子 (R) 等的 浓度, 于是 酶反应 速率一 般可表 示为: 

V = v{c^, Cs, Cp, Cr) 

在一 个典型 的细胞 中上述 物质分 子大量 存在, 并且参 与特定 的相互 作用。 尽管其 极其复 
杂, 但 生化系 统仍可 由它们 达到稳 定态的 能力来 表征, 相信 这是通 常称作 "控 制" 的 分子特 
性 间特定 的相互 作用的 结果。 代谢调 控的研 究试图 阐明各 个酶的 活性被 调节乃 至在分 子水平 

上 被控制 的机理 (Atkinson, 1970 ; Khoshland, 1970 ; Khoshland 和 Neet, 1968 ; Van 
Dam et al, 1993)。 一旦 在局部 水平理 解了酶 的调节 特性, 就可 利用代 谢控制 分析结 果推断 
途径通 量的总 体控制 (见第 11 章)。 

对某些 途径, 一 个个反 应是这 样组织 的以至 于构成 途径的 代谢中 间物总 是结合 到酶表 
面, 而产物 作为下 一个反 应的底 物而依 次传递 (Hofmeyr, 1991)。 一个例 子是脂 酰辅酶 A 
衍 生物转 化为乙 酰辅酶 A 的 f 氧化 途径。 在 这种情 况下, 中间 代谢物 通常参 加一个 特定的 
反应, 而且 在溶液 中检测 不到其 存在。 另一 方面, 一些代 谢途径 不是以 这样的 方式组 织的, 
如 EMP 途径、 葡萄糖 异生、 TCA 循 环和磯 酸戊糖 (PP) 途 径等。 这 些途径 的中间 物尽管 
在细胞 中浓度 很低, 但确实 是可检 测的。 代 谢的相 互关联 的性质 需要一 些化合 物对多 于一条 
途 径起中 间物和 (或) 前体物 的作用 (如: G6P, PEP, PYR, OAA)o 这样 的代谢 物不能 
是薛结 合物, 因为 它们必 须是在 多于一 条途径 中可利 用的, 并且 更重要 的是, 这些途 径的速 
率 在不同 条件下 可能会 变化。 随着 代谢性 质开始 阐明, 理由就 变得很 明显: 细 胞利用 一些代 
谢物用 于代谢 调控的 目的, 以致某 些化合 物既起 代谢中 间物的 作用, 又 起关键 酶的代 谢调节 
物的 作用。 

导致 细胞结 构单元 (如氨 基酸、 嘌呤和 定核 昔酸以 及类固 醇等) 形成的 生物合 成反应 
序列源 于简单 的细胞 材料, 而这 些材料 产生于 碳水化 合物或 脂肪酸 的代谢 (见第 2 章)。 每 
条代 谢途径 与一个 关键步 骤发生 联系, 即生 产第一 个代谢 中间物 的反应 注定了 特定反 应序列 
最终 产物的 生成。 在 多数情 况下, 该 关键步 骤是放 能反应 (即 AGG'<0, K'>1), 以致该 
反 应几乎 是不可 逆的。 普遍认 为企图 调节最 终产品 生成的 代谢控 制在代 谢节点 处所起 作用最 
满意, 而中间 步骤的 控制不 常用。 

当 被一个 复杂的 代谢网 络所困 惑时, 一 个重要 问题是 识别由 不同中 间反应 所施加 的相对 
控制。 尽管 代谢系 统结构 上及功 能上的 高度复 杂性, 但其 表现了 相当简 单的动 力学及 独特的 
稳 定态。 这 归因于 醜的分 层次的 结构, 特别是 它们的 时间尺 度跨越 15 个数量 级以上 (de 
Koning 和 van Dam, 1992; Heinrich 和 Sonntag, 1982 ; Hiromi , 1979)。 在 快的一 边是代 
谢反应 动力学 (松 弛时间 10 — 2 〜10 4 s), 在最 慢的一 边是遗 传调控 及进化 (参见 2.1 节及方 
框 2.1)。 

表 5.1 概括了 红细胞 中糖酵 解反应 的松弛 时间。 基 于这些 数值, 人 们可以 区分两 组酶催 
化的 反应。 一 组包括 HK, PFK, DPGM, DPGP, PK, ATP 酯酶, 这些酸 催化慢 反应; 

85 



而其 它反应 的松弛 时间要 比这些 反应快 2~6 个数 量级。 对这些 快反应 来说, 底物与 产物浓 
度基 本上处 于平衡 状态, 它们对 整个代 谢系统 的动态 响应相 对来说 是不重 要的。 换 言之, 系 
统的动 态响应 实质上 能用慢 反应来 表示, 这 进而可 相当大 地减少 需要考 虑的变 量数及 整个体 
系的复 杂性。 



表 5.1 红细 胞中糖 酵解反 应的松 弛时间 



81 反应 


松 弛时间 /s 


醉反应 


松 弛时间 /s 


己 糖激酷 (HK) 

酸 果糖激 BS(PFK) 
2,3- 二碟酸 甘油酸 变位薛 (DPGM) 
2,3- 二 磯酸甘 油酸碟 酸酯酶 (DPGP) 
丙酮 酸激酶 (PK) 
腺昔三 磷酸醉 (ATPase) 
磔 酸葡糖 异构酷 (PGI) 
酸缩雜 (Aid) 


>1100 
>75 
4 

34000 
28 

1800 
约 10_2 
约 10 一 2 


丙 糖磔酸 异构酶 

磯酸 甘油酵 脱氢醇 (GAPD) 

磯酸甘 油激醉 (PGK) 

磷酸甘 油变位 Bi(PGM) 

稀醇酷 

乳 酸脱氧 SI(LDH) 
腺苷 酸激醉 (AD) 


约 10_2 
约 10 一 2 
约 10 一 2 
约 10_2 

约 10_2 
约 10 一 2 
约 10 一 2 



注: 取自 Rappoport 等, 1974; Schuster 等, 1989。 



不稳 定性的 概率随 变量数 而提高 (见第 1 章)。 因此, 本质 上时间 层次可 能是通 过减少 
重 要的动 态变量 而稳定 代谢系 统的一 个重要 因素。 所以, 尽管在 微观水 平上生 物系统 极其复 
杂, 但代 谢系统 可用相 对简单 的表达 式来成 功地进 行汇总 及模型 模拟。 否则, 对所有 的实际 
目的, 生物系 统的理 论分析 都不会 达到。 

数目众 多的代 谢调控 机理之 间的一 个基本 区别, 是它 们直接 调节细 胞中存 在的酶 的活性 
(见 方框 5.1), 还 是需要 改变特 定蛋白 质合成 净速率 的二次 响应。 活细 胞使用 过多的 调控机 
制来 调节酶 活性。 在极端 范围, 人们发 现通过 共价修 饰可使 酶完全 失活或 活化。 对此, 磯酸 
化是 常见的 机理, 但也观 察到添 加或去 掉腺苷 酰基、 乙 酰基、 甲基及 其它部 分基团 时的作 
用。 更 常见的 是通过 与另一 个分子 (如 反应 产物) 的可 逆締合 而引起 的酶活 性逐渐 变化。 酶 
水 平的控 制可以 取几种 形式, 包括酶 合成和 (或) 其 降解的 调控。 一般 说来, 高等植 物或动 
物 的分化 细胞由 于其特 有的性 质从而 展现出 很少且 很小的 酶水平 调节。 另一 方面, 细 菌等单 
细 胞生物 体除酶 活性调 节外, 则很强 地依赖 于酶水 平的修 饰以协 调不同 反应。 

下 面我们 将回顾 酶调控 机理。 5.1 节描 述细胞 中酶活 性调控 的不同 模式, 而 5.2 节则涉 

及发生 在基因 水平上 实际酶 浓度的 调控。 5.3 节和 5.4 节 强调了 在细胞 水平上 的调控 问题: 

例如, 细胞 如何调 控相关 的酶反 应组, 以及最 终系统 的或整 体的调 控如何 发生。 
5.1 酶活性 的调控 

代 谢调控 的最为 普通的 形式是 通过调 节酶的 活性水 平而发 生的。 反 馈抑制 或激活 是各种 
类型 细胞中 对调节 酶活性 的极端 迅速的 响应。 酶合成 的抑制 或诱导 (或 消除 抑制) 代 表缓慢 

而长期 的调节 机制, 由 此使细 胞中特 定酶的 量得到 优化。 例如, 从 20t: 和 371: 下生 长的大 
肠杆菌 制得的 细胞抽 提物的 2-D 蛋白 凝胶是 没有区 别的, 尽管细 胞做了 非常大 的调整 以适应 
这 两种生 长温度 下的生 理差别 (Ingraham, 1987)。 这样 的调整 必须主 要通过 改变酶 的活性 
而不 使酷浓 度明显 变化来 达到。 调整是 由代谢 物来促 成的, 该代 谢物可 以是一 个反应 序列的 
底物或 产物, 或 者是总 体的代 谢物, 例如 ATP 或 NAD (P) H。 起调 节作用 的代谢 物可以 
充 当活化 剂或抑 制剂, 它们 通常分 别被称 为效应 物或配 位体。 
86 



方框 5.1 反 馈抑制 / 激 活模式 (Neidhardt 等, 1990) 

在连续 反馈抑 制中, 不同 分支的 调控被 解稱, 而 且分支 点代谢 物充当 途径中 第一个 
薛的调 节物。 含有多 个共同 代谢物 的更复 杂的途 径需要 更复杂 的控制 方式, 该控 制方式 
可 以将激 活和抑 制两者 结合起 来以协 调代谢 通量。 这些 调控方 式在整 个细菌 界都可 发现。 

例如, 同 功醇的 存在, 或 经一特 定途径 (或是 顺序的 或是分 叉的) 而 有多个 最终产 
物的 生产, 都 需要本 节所讨 论的这 些调控 机制的 结合。 催化 一个共 同步骤 中的第 一个反 
应的 同功酶 通常对 该途径 的终端 产物之 一是敏 感的。 该机制 (合 作的或 协助的 抑制) 保 
证 终端产 物抑制 不会使 细胞缺 乏由相 同代谢 途径获 得的代 谢物。 累积的 (局 部的) 反馈 
抑 制是前 述机理 的一种 更复杂 的调节 形式, 其 中在一 个单个 酶上含 有相应 于该途 径不同 
终端 产品中 每一个 产品的 多个别 构位点 (见图 5.1)。 



* F t / 

A =1^ B— C A— B — C 



D 



E — G 



(a) 同功酶 



E— G 
(b) 累积反 馈抑制 



A— B— C\ 



F 



A ~~ - B\ 

N ^ \ 

t E — G — i _ ^ 

、 " n r\ 



(c) 顺序反 馈抑制 



CD G G 
(d) 抑制 加活化 



图 5.1 包括 反馈抑 制和激 活的调 控网络 



5.1.1 酶动力 学概述 

Michaelis 和 Menten 最早 尝试分 析薛反 应的动 力学, 他们 的工作 导致引 人酶反 应速率 
的 两个基 本动力 学参数 (Dixon 和 Webb, 1979; Laidler 和 Bunting, 1973; Schulz, 1994; 
Segel, 1993)。 第一 个参数 7;max 称为最 大反应 速率, 表示 在给定 的醇量 下反应 可达的 最大速 
率, 即醇 被底物 饱和时 的反应 速率。 这是薛 的催化 效率的 度量, 而且 直接与 酶的转 换数相 
关, 该转换 数定义 为每秒 钟底物 分子转 化成为 产物的 数目。 转换 数的范 围从每 秒几十 万个分 
子 (如 碳酸 酐酶转 换数达 600000 S—1) 降 到每秒 少于一 个分子 (如溶 菌醇为 0.5s_i)。 

另 一个重 要的动 力学参 数是米 氏常数 Km, 定义 为反应 速率为 t;max/2 时 的底物 浓度。 
两参 数的一 个重要 区别是 Km 的值与 晦浓度 无关。 Km 值 的重要 性有以 下几个 原因: (1) 它 
提供 了酶对 其底物 相对亲 合性的 一个有 用指示 (Km 值 越小, 表示亲 和性越 高); (2) 它确 
立 了胞内 底物水 平的近 似值, 当 Cs>〉Km 时, 没 有生理 意义, 因为 会 接近于 Z^max, 以及 
X; 会对 的 变化不 敏感, 还有, 当 Cs«Km 时, 意味着 t^<"max, 因 此瞎的 催化活 性的大 
部 分会浪 费掉; (3) 通 过研究 不同化 合物对 Km 的 影响, 有可能 对某特 定的酶 识别出 潜在的 
另 IJ 构效 应物; (4) Km 值 的有关 知识能 使醇分 析中选 择合适 的底物 浓度; (5) Km 表 示一个 
特定 薛的替 代底物 的相对 适应性 (具有 最高的 t^max/Km 值的底 物是最 满意的 )。 

以 t^max 和 Km 为 参数, 反应速 率与底 物浓度 间的关 系如图 5 . 2 所示。 其数学 表达式 
如下: 

^-K~T7 (5.1) 

八 m *- S 

应当 注意, 尽管 Michaelis- Menten 方 程最初 是作为 描述实 验测量 结果的 经验式 而提出 
的, 但后 来基于 特定的 分子机 理得到 证实。 一种机 理假定 81 与底 物先形 成一个 复合物 
(ES), 然后 复合物 再进一 步分解 为产物 (P) 和 游离酶 (E): 

87 



E + S 



k,, k 



•(ES)- 



'E + P 



(5.2) 



嗨- 底物 复合物 生成步 骤的平 衡假定 允许我 们由式 (5.2) 的反应 机理导 出反应 速率式 

(5.1) 。 后 来证明 "平衡 假说" 是不正 确的, 酶- 底物复 合物不 是处于 稳态。 然而, 酶 -底物 
复合物 (ES) 的 拟稳态 假说推 出与式 (5.1) 同 样的速 率式, 虽然速 率常数 Km 现在 是与式 

(5.2) 的速 率常数 yh, 々-1 和^ 不同 的函数 (推导 见方框 5.2)。 



Cc=2c 



l/2Vma、 



1/2 Vma: 




Y 




Cc=e y' 


;> 






1/Vmax 










1 斜卞 =/:„,/vw| 




1/Cs 






(b) 





图 5.2 不同醉 浓度时 的速率 -底物 浓度关 系曲线 
(a) 薛浓度 分别为 ce = e 和 re = 2e 时的速 率-底 物浓度 曲线; 
(b) 通常 应用双 倒数法 对 即 Lineweaver-Burk 法 来确定 z^ma^c 和 值 

注意 T^max 是一 个宏观 性质, 其随着 而 改变, 而 iC„ 是 一个本 征值, 与 无关 

Lineweaver 与 Burk 将上 等式转 换为线 性形式 , 以使 Km 值和 t^rnax 值能被 更准确 地确定 

1 1 . / Km U 



(5.3) 



因此, 由 1/z; 对 1々, 作图, 就可得 到一条 直线, 其斜率为 K:m/^^Tu«, y 轴截距 (即 

时) 为 1/Vmax, 而 X 轴截距 (即 1A; 二 时) 为— 1/Km, [见图 5.2 (b)]。 



方框 5.2 方程式 (5.1) 的推导 

最 简单的 酶反应 是由单 一底物 (S) 经由一 种中间 复合物 (ES) 转 化为单 一产物 

(P) 的 过程。 通常称 作单- 单反应 体系, 可表示 如下: 

k,, k-, . . 



E + S 



《ES)- 



►E + P 



速率 方程式 (5.1) 可 由下面 两种方 法分别 推出, (1) 快速平 衡法; (2) 稳态 (或 
Briggs 和 Haldane) 法。 
(1) 快速 平衡法 

顾名 思义, 该 简单方 法假定 快速平 衡条件 成立, 即: 与 ES 转化成 E + P 的 反应相 
比, E、 S 及 ES 非常迅 速达到 平衡。 因此, 瞬时 速率仅 取决于 ES 的 浓度: 

V = ^pCes (1) 

这里/^称为催化速率常数。 所 有的酶 分布于 E 和 ES 之间, 即: 

C et - C e + C es (2 ) 

式 (1) 除以式 (2) 得 



(3) 



88 



根据快 速平衡 假定, 可由 

C 丄 e 



,及尺, 表示, 是 ES 复合物 的解离 常数: 



k、 



因此, 



(4) 



将式 Ces 表达式 (4) 代入式 (3): 



'k: 



将/^移到等式左边, 并同 时消去 



k pC*et 



令 々pCet= t^max ,推出 ;:;^二 



1, ^ s '-' max 1 , ^ s 

八 s 八 s 

式 (5) 重排 可得更 熟悉的 Henri-Michaelis-Menten 方 程式: 



K. + 



(5) 



(6) 



这样, 该式 给出了 在任何 底物浓 度下, 瞬时速 率或初 始速率 相对于 ^;m&>c的 变化关 
系。 重要的 是要记 住该式 成立的 条件: 只有在 足够短 的时间 里进行 的 测量, 以致 Cs 基 
本 上保持 恒定, 或换 言之, 在分析 期间, 不 超过约 5% 的底 物将被 利用。 
(2) 稳态法 (Briggs 和 Haldane 法) (Haldane, 1965; Walter, 1965) 
如果我 们假定 ES 转化为 产物的 速率比 ES 解 离成为 E + S 的速率 要快, 那么 E 与 S 混 
合后 不久, 将建 立一个 稳态, 这时 ES 的浓度 将不随 时间而 改变。 通过如 下程序 (其 类似 
于第 1 部分快 速平衡 的情况 ), 基 于稳态 假定, 可推导 出速率 方程。 类似于 前面的 推导: 

E + S (ES)~^E + P 



k p^es 



k、 



(7) 
(8) 

(9) 
(10) 

r^ = irT7 (11) 

"max ^ m ^ s 

这样, 两 种情况 所得的 速率方 程形式 一样, 但 速率常 数不同 [式 (6) 中 与式 
(11) 中 Km 不 同]。 注意, 当 y^p«y^-i 时, Km 可 简化为 Ks。 (或 K,) 的物 理意义 
是当 酵反应 速率达 最大反 应速率 一半时 的底物 浓度, 即当 c, = Km 时: 

m max \ ― _1_ / 1 q 、 

+ /一 2 V max \ / 



Cet C e + C es 

因 为假定 Ces 不随 时间而 改变, 其形成 速率与 分解速 率相等 

k iC eC S 二 k -iCe.s+ ^pCes= — 1 + 走 p)Ces 推出 C 

定义 Km= (lV+~) 推出 C&s= 〜 

将式 (10) 代入式 (7) 整理 后得: 



89 



5.1.2 简单 可逆抑 制系统 

任何 降低酶 反应速 率的分 子被当 作是抑 制剂。 已知许 多自然 存在的 和合成 的物质 干扰酶 
的 活性, 这些 作用或 者是可 逆的, 或 者是不 可逆的 (Webb, 1963) 本 节概括 了只有 一种底 
物和 一种抑 制剂时 可逆抑 制的四 种基本 类型: 即底物 抑制, 竞争性 抑制, 非竞 争性抑 制和反 
竞争性 抑制。 

底 物抑制 

在 很多情 况下, 当 有大量 底物存 在时, 酶反 应由于 底物过 量而受 到负面 影响。 正如图 
5.3 所显 示的, 当底物 浓度增 加时, 反应速 率达到 一个最 大值。 之后, 底物浓 度的增 加引起 
酷反 应速率 下降。 




(a) (b) 

图 5.3 底 物抑制 

(a) 在 底物水 平大于 C,.m>„ 后, 底 物浓度 增加导 致薛反 应速率 下降; 
(b) 以 1/" 对 Cs 作图, 可确定 K2 值 (参见 正文) 

由快速 平衡法 (方框 5.2) 可以推 导一个 模型。 假 设底物 S 与复 合物 ES 结合成 一个非 
反应的 中间物 ES2, 达平 衡时: 

E + S "> ES (解 离常数 /<:1 = /^— 
ES + S— ES2 (解 离常数 K2) 

ES-^E + P (慢 反应 步骤) 

根 据方框 5.2 的 分析, 速率方 程为: 

一 k pC QI 

" = 1 + Ki/cs+Cs/K:2 

如图 5.3 所示, 由实验 数据以 1A; 对 作图, 由所得 直线与 X 轴 的交点 可求得 -K2, 进而 
可 由下式 求出: 



注: 当 Cs=Cs,max 时, cl"/ck=0。 

竟争 性抑制 

竞争性 抑制剂 是一种 分子, 其与 底物之 一具有 共同的 特征, 因而使 之能与 该底物 竞争可 
利用的 酶活性 中心。 反应 产物、 不可 代谢的 底物类 似物、 底物衍 生物及 替代底 物都可 作为竞 

90 



争性抑 制剂。 丙二 酸是众 所周知 的琥珀 酸脱氣 
薛的竞 争性抑 制剂, 琥珀 酸脱氢 11 催化琥 珀酸氧 

化反应 生成延 胡索酸 [succinate (琥 酸 ) + 
FAD ^= fumarate (延 胡索酸 ) + FADH2 ] 。 如 
图 5.4 所示, 由丙 二酸、 戊 二酸和 草酸引 起的琥 
珀酸脱 氧薛的 竞争性 抑制主 要是由 于它们 与主要 
底物琥 珀酸的 结构类 似性。 由果糖 及甘露 糖抑制 
的己糖 激藤催 化的葡 萄糖与 ATP 的 反应, 是另 
一 个由替 代底物 引起的 竞争性 抑制的 例子。 

由于抑 制剂与 醇的结 合是可 逆的, 于 是在游 
离酶分 子与结 合了抑 制剂的 薛抑制 剂复合 物分子 
之间 就建立 了一个 平衡, 如图 5.5 中反 应方程 式所示 
率为: 




戊二酸 



丁二酸 



丙二酸 



乙二酸 



15.4 底物 (琥 珀酸) 与號 拍酸脱 氢酷的 
竞争 性抑制 剂之间 的结构 类似性 

由此 反应机 理可推 出竞争 性抑制 反应速 



1 Ki 



1 + 



I 丄 + 



1 



(5.4) 



一个竞 争性抑 制剂只 是起了 线性地 增加了 底物的 表观米 氏常数 的作用 [Km,app= Km(l + C, V 
K,)], 而 t^max 保持 不变。 式中抑 制参数 K, 的数值相当于使双倒数图直线斜率加倍时的抑制 
剂 浓度, 但 并不等 于发生 50% 抑 制时的 抑制剂 浓度。 因为在 相对于 而言的低底物浓度下, 
活性 中心更 可能被 抑制剂 占据, 反之 亦然。 故可通 过增加 提 高反应 速率, 用非常 高的底 
物浓 度克服 抑制, 因为在 这些条 件下, 薛遇到 抑制剂 分子的 概率变 小了。 

E+S ■ • ES —— ^ E+P 



K,=ci.c,/c^ 



EI 



(a) 




图 5.5 竞争 性抑制 

(a) 反应 图解, 在 典型模 型中, S 与 1 竞 争相同 的结合 位点, 1 与 S 结构 相似, K, =reC,々e,, 

)fep 是 ES 分解为 E 和 P 的反 应速率 常数; (b) 竞 争性抑 制剂浓 度不同 (0, K,. 2K,) 时的双 倒数图 



竞争性 抑制原 理已在 医学领 域和生 化过程 中开发 利用。 例如, 像磺 胺这样 的药物 是基于 

91 



它们的 结构与 细菌关 键底物 结构类 似而设 计的。 磺胺 非常类 似于对 胺基苯 甲酸的 结构, 是细 
菌用 来作为 合成叶 酸的前 体物。 于是被 细菌感 染的病 人可通 过此药 物得到 有效的 治疗, 因横 
胺 药物通 过相应 细菌酶 的竞争 性抑制 阻止了 叶酸的 合成, 这对人 类没有 任何有 害影响 (人体 
不存在 叶酸合 成途径 )。 
非竟争 性抑制 

这类 抑制剂 与酶的 结合也 是非共 价的、 可 逆的。 这些 抑制剂 结合到 薛分子 的同源 调节位 
点 (离 开活性 位点) 并 触发酶 的构型 改变, 从而 干扰酶 的催化 效率。 非 竞争性 抑制剂 对底物 

的结 合没有 影响, 而 且与其 竞争对 手形成 对比, S 与 I 随 机地、 独立 地在醇 的不同 位点结 

合。 这 样的抑 制在稳 态多反 应物系 中普遍 存在。 非竞争 性抑制 机理及 对应的 双倒数 图如图 

5.6 所示。 图中 表示, I 能与 E 及 ES 结合, S 能与 E 及 EI 结合。 酶与 一个配 基的结 合对另 
一个的 解离常 数没有 影响, 但是所 生成的 ESI 复合物 是无活 性的。 

快 



翁, 丄 癰丄翁 



W 



⑩, 秦 i 翁骨 V 



慢 



★ 抑制 剂使酶 活性中 心失活 

(a) 











1/v 














斜率 =Km/v>„a>^( 1+C,/K,) 






截距 = IAw、(l+c,/K,) 









\ICs 

(b) 

图 5.6 非竞争 性抑制 

(a) 抑 制剂和 底物可 逆地、 随 机地、 独立 地在不 同位点 结合; (b) 非竞 争性抑 制剂在 不同固 定浓度 (0, K,, 2K,) 
下的 图。 一个典型的非竞争性抑制剂使 1^^„降低, 但 不影响 Km 值 



非 竞争性 抑制存 在时, 



1 Kt 



K, 



, 和 K, 间 的关系 式可由 快速平 衡假定 推出: 

1+1;) (5.5) 



式 (5.5) 表明在 通常的 lA^ 对 图中 直线斜 率和在 Y 轴 上的截 距均为 c", 的 函数。 



92 



机 理上, 这 是由于 非竞争 性抑制 对底物 结合及 催化效 率二者 的双重 影响。 如图 5.6 所示, 由 
于 y 轴截 距和 斜率均 以相同 的因子 (l + c,/K,) 增加, 而 X 轴截 距保持 不变, 并等于 

-1/Km。 正 如所预 见的, 非竞争 性抑制 剂的惟 一影响 是减小 T^max 而 Km 保持 不变。 重要的 

是要注 意到: 也没 改变, 而 正是由 于部分 ES 转 变为非 反应的 ESI 形式使 ES 的稳 态浓度 

实 际上减 小了。 

因 为非竞 争性抑 制剂通 常不类 似于任 何特定 底物, 故 一种单 一类型 的抑制 剂往往 能够影 

响范围 很广的 酸类。 例如, 螯合剂 (如 EDTA 和氰化 物分别 结合镇 和铁) 就 属于此 类抑制 
剂。 由于含 铁蛋白 质在氧 化还原 反应中 具重要 作用, 而对 所有含 ATP 的反应 中都需 要镇离 
子, 故 这类抑 制剂可 能会产 生有害 的生理 影响。 
反竟争 性抑制 

反竞 争性抑 制剂是 这样的 分子, 它 可逆地 结合到 薛- 底物复 合物, 并形成 一个无 活性的 
ESI 复 合物。 这 类抑制 普遍存 在于多 反应物 系统, 如图 5.7 所示。 根据 通常的 平衡假 定可得 
出如 下速率 方程: 

丄 = 1x1 + 1(1+*) (5.6) 

"max C S *^max \ 八// 
IX 和表观 Km 都以 相同因 子降低 [t,max,, = "maxA 1 + VK, ) , 
Km 的减 小产生 于反应 ES+ I —ESI , 该 反应使 ES 数量 减少, 

所示。 



反竞 争性抑 制剂使 X; 
Km,app = Km/(l + C,/K,)], 

引起 E + S 一 ES 的平 衡向右 移动。 反 竞争性 抑制的 反应平 衡式与 双倒数 图如图 



当 C, 增 加时, y 轴 截距也 增加, 形成一 系列平 行线, 



E*S ' . ES ~ -* E+P 



ESI 
(a) 



1/v 






c,=2K, 




















I/V'n.a\ . 



1/c. 



(b) 



图 5.7 反竞争 性抑制 
(a) 反应 图解, 典型 的反竞 争性抑 制剂可 
逆 地与醇 -底物 复合物 结合, 产生无 活性的 
ESI 复 合物; (b) 双 倒数图 表明, 斜 率仍为 
Km/u, 而 lA^ 轴截距 随因子 (l + c,/K,) 
而 增大, 这样增 加抑制 剂浓度 可产生 一系列 
平 行线, 其 y 轴截 距随抑 制剂浓 度增加 而增大 



E+S 
I 

EI+S 



ES E+P 



1 

US 



11^^ 争 性抑制 




图 5.8 不可逆 抑制与 非竞争 性抑制 的比较 

Ce, 代表 由不可 逆抑制 剂所滴 定的酶 的数量 



93 



SI. 3 不可 逆抑制 

不 可逆抑 制剂是 这样的 分子, 它与 K 分子 共价结 合并永 久地破 坏了酶 的催化 活性。 一个 
典 型的不 可逆抑 制剂是 二异丙 基磷酸 氟化物 (DIPF), 它 与丝氨 酸部分 的经基 结合而 使瞎失 
活。 在 其它情 况下, 不可 逆抑制 剂是极 具选择 性的, 如抗 生素青 霉素, 它有选 择性地 抑制参 

与细胞 壁合成 的酶。 因为 t^max 被减 小了, 使酶不 可逆失 活的物 质可能 被曲解 为非竞 争性抑 
制剂。 不可 逆抑制 剂和可 逆的非 竞争性 抑制剂 可通过 Z^mgx 对 作图 来区分 (Cet 是用 于试验 
的酶 活性总 的浓度 )。 如图 5.8 所示, 对 一个可 逆的非 竞争性 抑制剂 来说, "附 加的抑 制剂" 
直线比 对照直 线斜率 要小, 且两 条直线 都经过 原点。 另一 方法, 对 不可逆 抑制剂 而言, "附 
加的抑 制剂" 直线的 斜率与 对照直 线斜率 相同, 但与 X 轴相交 于数值 等于不 可逆失 活酶浓 
度 Ce, 的 位置。 

【例 5.1】 通 过调节 酶活性 控制生 物合成 网络; 天 冬氨酸 氨基酸 途径中 的反馈 控制结 

构 (Umbarger, 1978) 

氨基 酸中天 冬氨酸 族成员 (赖 氨酸、 蛋 氨酸、 苏氨酸 和异亮 氨酸) 是 通过图 5.9 所示的 
分支 途径生 产的。 通常, 这 类分支 途径的 调控很 复杂, 因 为它需 一种结 构以使 得一种 产品过 
量时 不会意 外地关 掉整个 途径。 例如, 在大 肠杆菌 中这种 特殊途 径的调 节机制 确实是 非常复 
杂的, 因为 这些机 制还包 括了同 功酶的 参与。 如图 5.9 所示, 每种 产物都 抑制和 (或) 阻遏 
共 同途径 中的第 一个酶 —— 天 冬氨酸 激酶。 然而, 为使一 种产物 不能阻 遏所有 激酶的 活性, 
存在着 天冬氨 酸激酶 的三种 不同的 同功酶 (指催 化同一 化学反 应的不 同的酶 ): 一个对 L- 赖 



灭冬 氨酸 



-氢吡 啶一. 梭酸 



© 



01 4- g| 酸天 冬氨酸 

* 1 



天 冬氨酸 



0-琥珀酰|^^*.氨酸 



L- 蛋氨酸 







〇 



\ 



L- ^亮 氡酸 



图 5.9 肠 道细菌 氣基酸 的天冬 氨酸族 的调控 
L- 赖第 酸抑制 天冬氨 酸激雜 in 和二 氢甲基 吡啶合 成酶; L- 蛋氣 酸抑制 0- 號 珀酰高 丝氣酸 
合 成雜; L- 苏 氨酸抑 制天冬 氨酸激 藤1 和 高丝氣 酸脱氢 81; L- 异亮 氣 酸抑制 苏氣酸 脱氧醉 



94 



氨 酸抑制 敏感, 一个 对苏氨 酸抑制 敏感, 一个 主要受 过量的 蛋氨酸 阻遏。 另外, 大肠 杆菌还 
能够调 节存在 着途径 产物混 合物不 平衡的 情况。 例如: 蛋 氨酸过 量而其 它产物 (赖 氨酸、 异 
亮氣 酸和苏 氨酸) 水平低 不能通 过单独 调节天 冬氨酸 激酶来 校正, 因为 这不会 产生蛋 氣酸与 
其 它三种 氨基酸 的适当 比例。 因此, 每种氨 基酸通 常调控 自己的 特定分 支途径 的第一 个薛。 
蛋 氨酸和 异亮氨 酸通过 反馈抑 制和阻 遏机制 两种方 式来调 节代谢 途径, 而赖氨 酸和苏 氣酸参 
与 更复杂 的调控 类型。 

很 幸运, 对于代 谢工程 目的, 众多的 微生物 具有更 加简单 的调节 机制, 也 许是因 为这些 
微生物 在它们 的环境 中不常 遇到组 成不平 衡的氨 基酸混 合物。 如 果一个 生物体 通常生 活在氨 
基酸贫 乏的环 境中, 那 么氨基 酸生物 合成的 主要调 节功能 是调整 其速率 以适应 于微生 物的生 
长 速率。 分支 途径的 主要调 节功能 可通过 只有一 个或一 些产品 抑制第 一酶的 系统来 实现。 在 
氨 基酸生 产菌中 的土壤 细菌谷 氨酸棒 杆菌和 "棒 状菌 株群" 的其 它成员 中确实 已发现 这种类 
型的简 单调控 系统。 短杆菌 属-棒 杆菌属 菌群中 调控系 统的简 易性, 使 得仅通 过简易 地分离 
营养缺 陷型突 变株或 调节突 变株, 就可 利用这 些菌株 大量生 产赖氨 酸成为 可能。 

在这 些突变 株中, 催 化一个 代谢物 生物合 成步骤 的酶活 性已被 破坏。 营养 缺陷型 突变株 

需要在 其培养 基中补 充所说 的代谢 物以利 生长。 例如, 高 丝氨酸 脱氣酶 (HDH, 催 化天冬 
氨酸 半醛转 化为高 丝氨酸 的酶) 缺 失的突 变株是 高丝氨 酸或苏 氨酸和 蛋氨酸 营养缺 陷型。 这 
种谷氨 酸棒杆 菌营养 缺陷型 大量产 生赖氨 酸而不 产生任 何一种 其它氨 基酸, 有两个 原因: 
(1) 由于 HDH 酶 破坏, 所有天 冬氨酸 激酶的 通量都 转到赖 氨酸的 形成; (2) 赖氨酸 与苏氨 
酸混 合物约 Immo 卜 L — 1 时, 对天冬 氨酸激 酶的抑 制接近 94%, 而仅单 独有约 Immo 卜 L — i 赖 
氨 酸时, 其 对此酶 的抑制 很勉强 (仅达 12%〜2096)。 由 于这样 的突变 株需要 对其生 长培养 
基 精确补 充蛋氨 酸和苏 氨酸, 故 调节突 变株对 赖氨酸 的商业 生产更 有用。 

通常, 利用 赖氨酸 类似物 S- 氨 乙基半 胱氨酸 (AEC), 已经 获得改 变了赖 氨酸生 物合成 
调控 的棒杆 菌属突 变株。 像 赖氨酸 一样, 该类 似物可 抑制天 冬氨酸 激酶的 活性, 从而 也抑制 
野生型 菌株的 生长。 另一 方面, AEC- 抗性 突变株 似乎使 其天冬 氨酸激 酶有了 改变, 以致该 
酶改变 了的别 构调控 位点对 AEC 也对赖 氨酸的 亲和力 较低。 这 些突变 株的酶 可能以 低的亲 
和 力与赖 氨酸结 合而且 在通过 赖氣酸 的反馈 调控中 是有缺 点的。 通过一 系列调 控突变 株的选 
择, 目前 商业生 产上可 应用的 菌株产 赖氨酸 量超过 60g/L。 



5.1.4 别构酶 

上节 介绍的 薛具有 多个但 相互独 立的底 物结合 位点, 即一个 分子的 结合并 不影响 空位点 
原有 的结合 或解离 作用。 第二类 完全不 同的调 节酶包 括这样 的酷, 它与 一个分 子的结 合引起 
结 构的或 电子的 变化, 结 果导致 酶的剩 余空位 亲和力 发生了 改变。 这种 相互作 用可以 或是同 
促的, 即仅包 括底物 (简单 协同性 ); 或是异 促的, 即这 种相互 作用包 括底物 与抑制 剂或底 
物与 激活剂 分子。 这组 酶更通 俗地被 称为别 构酶, 它通 常是由 许多亚 基组成 并且由 S 形速 
率曲线 来表征 (Harford 与 Wdtzman, 1975; Kurganov, 1982; Monod 等, 1963; Sanw- 
al, 1969, 1970; Stadtman, 1966)。 

在控制 途径通 量中, 与遵循 Michealis-Menten (M-M) 动 力学、 满足双 曲线响 应的酶 
相比, 别构 醇动力 学具有 明显的 优点。 别构 酶这种 S 形动力 学曲线 表明: 在低 时, 小 
的变化 促使酶 变得更 有效。 当 增 加时, 正 协同性 使酶活 性比通 常情况 提高得 更快, 而负 
协 同性使 酶活性 比通常 增加得 更慢。 协同性 在生理 上是重 要的, 因为它 提供了 酶对底 物水平 

95 



波动或 别构调 节水平 波动的 敏感性 变化的 程度。 因此, S 形响应 本质上 在低或 高浓度 时分别 
起 "关 -开" 的开关 作用。 而在 中等浓 度时, S 形响应 提供了 反应速 率更加 敏感的 控制。 这 

种 调节的 另一个 重要性 质是存 在着一 个浓度 闺值, 低 于该阈 值就没 有催化 活性。 这种 阔值现 
象 在激素 响应、 神经信 号或细 胞分化 等情况 下极端 重要。 

"别 构" 这 一术语 最早被 Monod, Changeux 和 Jacob 在给酶 分类时 使用, 这些酶 在与底 
物没有 结构类 似的分 子存在 时改变 了动力 学特征 (通 常是 Km 值) (Monod 等, 1963)。 其后 
又扩 大到包 括由于 底物或 效应物 分子结 合而以 不同构 形存在 的酶。 

这种 响应在 代谢控 制中是 极其重 要的。 例如, 在一串 联的雜 反应步 骤中, 细胞可 以通过 
终产物 对第一 步反馈 抑制的 开-关 作用来 调节此 途径的 通量。 这 就能确 保一条 避免细 胞结构 
单元过 量生成 和积累 的经济 路线。 别构酶 的通用 重要特 性概括 如下。 

* 它们是 由多肽 亚基聚 集而成 的多聚 体酶复 合物构 成的。 典 型的别 构酶由 2、 4、 6 或更 
多 个亚基 组成。 这些亚 基可以 不同, 其中 一种亚 基具有 催化功 能而其 它的具 有调节 功能; 或 
是完全 相同, 同样 的亚基 具有催 化和调 节两种 功能。 

* 效应 物和底 物通常 具有非 常不同 的化学 结构, 并 在不同 位点与 酶结合 (调 节位 点对催 
化位点 )。 

* 通常认 为别构 效应物 是通过 修饰酶 的构形 状态的 方式以 使其活 性可以 增加或 降低。 这 

意味 着酶可 以不同 的构形 存在, 故 称为别 构酶。 配 基的结 合引起 变化, 或者通 过使薛 从一种 
构形 变化到 另一种 构形, 或 者通过 改变两 种构形 之间的 平衡。 在 两种情 况下, 都会使 薛 从不 
太活 泼状态 转变到 更活泼 状态, 因 此效应 物能够 调节其 活性。 

• 别 构酶的 一个明 显特征 是其动 力学性 质偏离 M-M 动 力学: ■v 对 作图呈 S 形 曲线而 
不是 M-M 双 曲线。 由 于大多 数别构 薛呈现 S 形动 力学, 别构性 已成为 S 形响 应的同 义词。 
然 而严格 地说, 这并不 确切, 因 为并非 所有的 S 形曲线 都产生 于别构 作用。 例如一 个随机 
的双反 应物反 应系统 (两个 底物或 底物加 效应物 ), 这里 有一个 比三元 复合物 更合适 的动力 

学途 径会产 生一个 类似的 响应。 
E-P 非协 同位点 

作 为对别 构性的 介绍, 让我们 考虑二 
聚酶的 情况, 该 酶的两 个位点 相同, 并且 
互相 独立, 如图 5. 10 所示。 对这样 一个机 
理, 速率方 程由下 式给出 



E+S 



ES 



K、 



E+P 



SE+S 



SES 



2kp 



ES+P 
SE+P 



图 5.10 非 协同作 用的二 聚酶的 底物结 合序列 

二聚体 (两个 位点) 模 型中两 个位点 是相同 的而且 
是 互相独 立的, 称为 本征解 离常数 



K, K: 



1 + 



1 + 



(5.7) 



其中 



K = 



― 2 是 pC et 



通常, 对具有 „ 个 相同且 相互独 立位点 的醇, 其速率 方程可 表示为 



1 + 



96 



或者 



K. + 



(5.8) 



由此 可见, 不考虑 n 值, t; 对 作图总 是双曲 形的, 因此 不可能 由动力 学数据 来确定 
换句 话说, 不 可能区 分具有 " 个相同 位点的 Imol 薛 和具有 1 个 位点的 "mol m。 
协 同结合 

另一 方面, 协 同相互 作用的 实质是 一个底 物分子 的结合 引起结 构的和 / 或 电子的 变化, 



从而 影响空 位点上 的结合 特性。 在这 类薛中 
物分子 的亲和 力从而 能促进 另外的 分子的 
结合。 这种现 象也称 为正协 同效应 或正促 
响应, 意 味着它 包括一 类结合 分子, 即底 
物。 包 括不同 配基对 (如: 底 物和激 活剂, 
底 物和抑 制剂, 抑制 剂和激 活剂) 的相互 
作用称 为异促 响应, 它 可以是 正异促 响应, 
也 可以是 负异促 响应。 

让 我们再 次考虑 具有两 个位点 的酸, 
但 此时第 一分子 的结合 将影响 第二个 结合。 
如图 5.11 所示, 此时 第二个 空位点 的解离 
常 数变为 (这 里, a<l 为 正协同 效应, 



第一 个分子 的结合 通过增 强空的 结合位 点对底 



E+S 



ES 



E+P 



E+P 



SE-^S 



SES 



2kp 



ES+P 
SE+P 



图 5.11 具有双 结合位 点的别 构酶的 底物结 合序列 
在 一个底 物位点 的结合 (导致 ES) 可改变 
本征解 离常数 为 aK,, a<l 

而0〉1 为负协 同效应 )。 

该机 理产生 如下反 应速率 动力学 表达式 (5.9)。 与非协 同情况 不同, 式 (5.9) 不能简 
化为 简单的 M-M 方程, 相应于 其 展现出 特有的 S 形特 征。 



, 2cs Cs 
1 +T7^ + ~ -' 



(5.9) 



其中 



对更复 杂的四 聚体, 速率方 程变为 



=2k 



3cs 3 



K ^ 。2 队 3 a^jS^yKt 



(5.10) 



注意: 在 这个模 型中, 影响 是渐进 的和累 积的, 即 第二个 分子的 结合使 剩下两 个位点 的解离 
常数以 /?到 a/?K, 的因 子发生 改变, 而 第三个 分子的 结合使 最后一 个位点 的解离 常数以 y 到 
a/?yK 、的因 子发生 改变。 

Hill 方程 —— 别 构醉简 化的速 率方程 

对 于呈现 显著协 同效应 的薛, 其因子 a、 (3、 y 等都非 常小, 因此, 速率 方程主 要取决 
于 (Cs)" 项 (即: 对于 r,〉K, 的任何 情况, 含有 少于" 个 分子底 物的所 有薛- 底物复 合物的 
浓度 将可忽 略不计 )。 例如, 4 个位点 薛 的速 率方程 此时可 简化为 



1 + 



1 + 



+ K' 



(5.11) 



97 



对具有 w 个相 当的 底物结 合位点 的酶, 已 提出如 下动力 学方程 (Hill 方程) : 

^ = (5.12) 

"max K + C" 

式中, = — 1/?"— 2y"- 3_Ki 式 (5.12) 中 的常数 K' 相当于 t;=0.5t;max 时 底物浓 
度的 次幂 (即: c=)。 它包含 本征解 离常数 K:,, 还有 相互作 用因子 (<1 为正 协同作 

用; 〉1 为负协 同作用 )。 

Hill 方程式 (5.12) 可 写成更 有用的 形式: 

Ig ^_ = n applgc, - IgK ' (5.13) 

这样, 上式 左边对 Ig(Cs) 作 图可得 斜率为 Wapp 的 直线。 如果 协同性 不高, 那么 " 的计 

算值将 小于实 际的位 点数, 具 有高于 r^app 的 最接近 的高整 数值, 而 n,pp 代表 最小的 实际位 

点数。 

5.2 酶浓 度调节 

上节我 们讨论 了酶活 性调节 的不同 方式。 这些 机制担 负修饰 细胞中 已存在 的酶分 子的速 
率, 它 们包括 可逆或 不可逆 反应, 这些反 应实质 上影响 总的可 利用分 子中活 性醇分 子的数 
量。 结果, 这 些调节 机制在 极短的 特征时 间里迅 速作出 反应。 当然, 能 够修饰 一个酶 反应速 
率 的一个 替代的 方法是 通过改 变酶的 总量。 因为 酶是基 因表达 过程的 产物, 其 数量实 质上可 

在两种 水平上 控制: DNA 转录和 RNA 翻译。 大 多数处 于调控 中的原 核生物 是在转 录水平 
上控 制的, 这防 止了不 必要的 mRNA 生产 浪费。 
5.2.1 转 录起始 的控制 

当 RNA 聚合酶 与编码 基因上 端的启 动子区 域相结 合时, 转录起 始发生 (见 方框 5.3)。 
调 控转录 最明显 的地方 会在基 因的启 动子区 域或其 附近。 通 过控制 RNA 聚合 酶与启 动子结 
合的 速率, 细胞能 够调节 mRNA 产生的 数量, 最终决 定所合 成酶的 水平。 与 包括在 该控制 
中 的实际 编码区 (结构 基因) 相邻 的序列 称为调 节区。 该区除 了启动 子外, 还 包括一 个能与 
调节 分子相 结合的 操纵基 因区。 调 节蛋白 或可阻 止转录 (负 调控) 或可增 加转录 (正 调控) 
(Hoopes 和 McClure, 1987)。 

操纵 子是指 由共同 调节区 控制的 依次排 列的几 个不同 基因。 从一个 操纵子 形成的 
mRNA 包含 着构成 操纵子 (多顺 反子) 全 部结构 基因的 信息。 它用于 通常参 与在一 个共同 
生化途 径中的 所有基 因产物 的协调 控制。 

方框 5.3 细菌 启动子 

启 动子是 DNA 片段, 通常位 于某些 基因的 上游, RNA 聚合酶 在此与 其结合 以起始 
mRNA 的 合成。 通过不 同的方 式可对 细菌启 动子的 活性水 平进行 调控。 正 调控是 研究得 
最多 的机理 之一, 它包 括一种 激活剂 在启动 子的- 35 区 附近的 结合。 一种 研究得 非常充 
分的激 活剂是 cAMP 结 合蛋白 (CAP), 它是一 种别构 蛋白, 在结合 cAMP 后构 形发生 
改变。 有 些蛋白 激活剂 的活性 也能通 过共价 修饰来 调节, 例如 NRi 蛋白 被憐酸 化后, 能 
够激活 Ntr (氣- 调节) 启 动子的 转录。 正调 控的第 二种方 式包括 不同的 a 因子与 RNA 
聚合酶 全酶的 结合。 利 用这类 调控的 启动子 含有特 征序列 (通 常在 -10 区), 而 且认为 
转 录调节 是通过 在相关 a 因 子的细 胞水平 上的变 化而发 生的。 



98 



下调 转录起 始的机 理也很 常见。 一 个基本 机制包 括阻遏 物与操 纵区的 结合以 降低启 

动子的 活性。 阻 遏物分 子的结 合区位 点是变 化的, 范围 包括从 启动子 -35 区的 上游到 

- 10 区的 下游。 一些大 肠杆菌 操纵子 、gal, 和 ara) 有 两个互 相独立 的抑制 剂结合 
位点。 与 激活剂 一样, 阻 遏物也 是别构 蛋白, 在与它 们的同 源性配 体结合 后构形 发生变 
化, 而共 价修饰 是不常 见的。 其它 尚未很 好理解 的负调 控类型 包括启 动子区 DNA 甲基 
化 和超卷 曲等。 自 体调控 是另一 种有趣 的调节 机制。 据此, 基因调 控通过 基因自 身产物 
来 实现。 这类 控制遵 从酶反 应反馈 抑制的 主题, 提 供了一 个反馈 机制, 通 过该机 制阻遏 
物或 激活剂 能够防 止自身 的过量 生产。 典型的 例子包 括如下 基因: cfp (碳 代谢 全局调 
控)、 amC(L- 阿拉 伯糖操 纵子调 节基因 )、 trpR (Trp 生物合 成操纵 子的阻 遏物) 和 
glnG (氨同 化作用 调节基 因)。 图 5.13 给出了 从大肠 杆菌及 其噬菌 体中所 选的部 分启动 
子, 并 简述了 其一般 特征。 通过对 100 多个大 肠杆菌 启动子 的检测 显示出 Pribnow 框 

(mRNA 起 始位点 左侧的 5〜10 个 碱基) 出现 的频率 如下: 丁80八95丁45八60八50丁96。 这个区 

域的功 能被认 为是使 RNA 聚合酶 定向, 以致 合成从 左向右 进行, 同时这 也是双 螺旋打 
开的 地方。 

启动 子区域 的进一 步检验 表明: 大 多数启 动子在 Pribnow 框的 左侧都 存在另 外一个 
重要 的保守 序列。 这个 6 碱 基序列 (其 被称为 -35 序列 并且有 共同的 TTGACA 序列) 
被 认为是 RNA 聚合 酶结合 的初始 位点。 弱启 动子与 强启动 子之间 的区别 在于- 35 区和 

- 10 区的 序列。 

在 真核细 胞中, 启 动子序 列随所 包括的 RNA 聚 合酶的 类型而 变化。 由 RNA 聚合酶 
n 转 录的编 码蛋白 质基因 的启动 子通常 含有共 同序列 TATAAA, 它位于 转录起 始位点 
上游约 30 个碱 基处。 这 个序列 被称为 TATA 框, 大约 80% 的 RNA 聚合酶 II 转 录基因 
都含 有这个 序列。 该序列 类似于 原核细 胞基因 -10 区, 在 RNA 聚合酶 n 定位中 起关键 
作用, 而 且它的 去除会 完全破 坏转录 起始。 除了 TATA 框外 (或 而不是 TATA 框), 有 
10%~1596 的由 RNA 聚合酶 n 转录 的基 因含有 两类其 它控制 序列, 它们 通常位 于转录 
起 始位点 上游的 60~120 碱 基处: 一 种有共 同序列 CCAAT (CCAAT 框), 另 一种为 
GGGCG (GC 框)。 

个别 操纵子 —— 乳糖 操纵子 Ucic operon) 

最 早最充 分表征 的操纵 子之一 是乳糖 操纵子 (Miiller-Hill, 1996)。 这个 操纵子 的完全 
调 控十分 复杂。 尽管 如此, 我 们在这 节对其 性能仅 提供一 个相当 基础的 叙述。 乳糖操 纵子带 
有 利用乳 糖作为 碳源时 所必需 的结构 基因, 如图 5.12 所示。 乳 糖是由 葡萄糖 和半乳 糖构成 
的 双糖, 是该操 纵子的 主要调 节分子 0。 乳糖 操纵子 的启动 子和操 纵区分 别是/ c^cP 和 /acO。 
/acJ 基因编 码阻遏 蛋白, 当 缺乏乳 糖时, 阻遏 蛋白与 操纵区 结合, 因此完 全阻碍 RNA 聚合 薛 
与启 动子的 结合。 在 乳糖存 在的条 件下, 乳糖操 纵子的 表达被 诱导。 乳糖 (诱 导物) 在 阻遏物 
分 子特定 位点的 结合, 引起 阻遏蛋 白发生 变构, 降 低了它 与乳糖 操纵子 DNA 结 合的亲 和力。 
因此, RNA 聚合酷 就能够 发挥其 转录多 顺反子 mRNA 的 功能, 而多 顺反子 mRNA 编码 /?- 半 



更确切 地说, 调节分 子是乳 糖的异 构体, 异 乳糖, 它 充当诱 导物。 这种 物质是 通过; 3- 半 乳糖昔 餘 原位把 乳糖转 
化 为异乳 糖而形 成的。 因此, 实际 上处于 luc 操纵子 控制的 /3- 半 乳糖昔 SI 还必 须以基 本水平 进行组 成型表 达以作 为诱导 
序列的 引子。 - 

99 



乳 糖苷醇 (/acZ), 乳糖 通透酶 UacY) 和 /3- 半乳糖 昔转乙 酰基酶 (/ao4)。 与 典型的 操纵子 
一样, 这些 基因产 物分担 相关的 功能。 通透酶 确保乳 糖进人 细胞, 而 /?- 半乳糖 昔酶打 开乳糖 
的 fl,4 糖 苷键, 释放出 游离的 单糖。 因此, 乳 糖操纵 子是一 个负调 控诱导 系统。 

乳糖操 纵子还 有一个 另外的 正调控 系统。 正 调控的 目 的是防 止过量 葡萄糖 存在时 产生能 
量 浪费。 因 为大肠 杆菌利 用葡萄 糖的酶 是组成 型的, 所以当 葡萄糖 与乳糖 同时存 在时, 生产 
乳糖代 谢酶对 细胞是 没有意 义的。 例如, 当大 肠杆菌 利用葡 萄糖生 长时, 胞内环 腺昔酸 
(cAMP) 水平是 低的, 而利 用其它 碳源生 长时, cAMP 的水平 趋向于 增高。 可以 认为, 
cAMP 为乳糖 操纵子 提供了 正调控 信号。 当 cAMP 处于 高水平 (表明 缺乏葡 萄糖) 时, 其 
能够与 一种特 定蛋白 (CAP, 降解 物激活 蛋白) 结合, 生成的 CAP-cAMP 复 合物将 进而结 
合于乳 糖操纵 子上的 CAP 结合 位点。 结果 发现促 进了更 下游的 DNA 螺 旋失去 稳定, 这进 
而促进 RNA 聚 合酶的 结合, 因此 提高启 动子的 效率。 



乳 糖缺乏 



lad 




lac P 


lac 


lacZ 


lac Y 


lac A 



无转录 



mRNA 



遏蛋白 (有活 性的) 



乳 糖存在 

瞧 /SF^ 

聚合酶 



1 lucl II 


1 lacP 


1 lacO 


1 lacZ 


lac Y 


lac A 








mRNA 


1 

mRNA 


1 

mRNA 



mRNA 



\ 

转 录 







一乳糖 - 

e ® ® 




阻 遏蛋白 -乳糖 
复合物 (无活 性的) 



图 5.12 乳 糖操纵 子的转 录控制 
乳糖 缺乏时 (上图 ), 乳糖 阻遏物 与乳糖 操纵子 DNA 结合, 阻断 RNA 聚合 SI 对 /ar 基 因的转 
录。 乳糖 存在时 (下图 ), 其 结合到 乳糖阻 遏物, 形 成一个 不能与 乳糖操 纵子结 合的无 活性复 合物。 这样 
就允许 RNA 聚合 醉与启 动子区 结合, 并转录 编码乳 糖操纵 子三个 81 的基因 mRNAs, 这三个 
SI 是: /?- 半乳 糖苷醉 UacZ). 通透酶 (h'cY) 和 /?- 半乳糖 昔转乙 酰基酶 (/ac'A) 

转录 一旦开 始就继 续进行 下去, 直到 RNA 聚 合酶遇 到一段 DNA 终 止序列 (富含 GC 
100 



的序列 之后由 RNA 上的 一连串 U 残基跟 随), 或者 中止的 RNA 聚合 酸面临 于转录 终止剂 
分子, 如 Rho 因子。 尽管这 种事件 一般都 发生在 操纵子 末端, 但是在 某些情 况下它 们能提 
前 发生, 因此 作为一 种调节 功能。 例如: 在新 合成的 mRNA 中发 卡环的 形成, 引起 RNA 

聚 合酶的 中止, 有 80% 〜90% 的时间 会导致 晦从转 录泡囊 排出, CGTATAAIGTGTGGA 
而终止 mRNA 的 延长。 这种 调控转 录终止 的机制 被称为 "弱 化作 GGTACGAIGTACCACA 
用", 其 通过转 录和翻 译之间 的一种 特定的 偶联来 运行。 这 类调控 AGTAAGAIACAAATC2 

的 一个典 型例子 是大肠 杆菌色 氨酸操 纵子。 当 色氨酸 (更确 切地说 (^TCDATAAiacrrrceA 
是 色氣酸 -tRNA) 的供应 水平较 低时, 录产物 开始附 近的初 f^^^^^^^t^^^A 

CGTATGTTGTGTGGA 

期终止 环不能 形成, 而化/ ) mRNA 被完整 转录。 相反, 高 水平的 图 5 13 大— 肠杆菌 其 
色氨酸 触发弱 化作用 机制, 从而使 色氨酸 生物合 成基因 的合成 终止。 噬菌体 的启动 子片段 
5.2.2 翻译 的控制 加粗 的字母 表示共 同序列 

某 些醉的 遗传控 制也能 够发生 在翻译 水平, 被 称为转 录后调 (Pribnowti)' #T*iJ@ 

表示 "保守 T", 双 下划线 

控。 这种 调控机 制控制 着一个 完整的 mRNA 分子被 翻译的 次数。 表示 mRNA 合 成的起 始位点 

已阐 明的第 一个系 统是被 噬菌体 R17 感 染的大 肠杆菌 中一种 酵的产 

生。 R17 只编码 三种基 因产物 —— 两种 结构蛋 白和该 醇的复 制晦。 因为 噬菌体 需要大 量的外 
壳 蛋白, mRNA 分子 在外壳 蛋白基 因的终 止密码 与复制 薛 基因的 AUG 密码 之间有 一个外 
壳蛋白 的结合 位点。 当合成 外壳蛋 白时, 该 位点逐 渐被蛋 白分子 充满, 阻塞了 核糖体 对复制 
酶的 翻译。 当 包装病 毒粒子 所需的 外壳粒 子被全 部合成 以后, 其 被释放 出来以 形成一 个新的 
病毒 并使复 制酷翻 译接着 发生。 一般情 况下, 翻译 调节可 以通过 调控如 下措施 之一来 进行: 
(l)mRNA 稳 定性; (2) 翻 译起始 概率; (3) 蛋白质 合成的 总速率 (Iserentant 和 Fiers, 
1980; Stormo 等, 1982)。 

许多编 码核糖 体蛋白 的操纵 子都是 在翻译 水平上 进行调 控的。 所有 细菌的 生长速 率都随 
其生长 培养基 组成而 变化。 以葡萄 糖为碳 源的基 本培养 基中, 在 37t: 下 大肠杆 菌大约 45min 
分裂 一次, 而较 差碳源 例如脯 氨酸为 碳源, 则 需要约 500mm。 在 含有葡 萄糖、 氨 基酸、 嘌 
呤、 啼 f!$、 维生 素和脂 肪酸的 营养丰 富培养 基中, 细 胞不必 合成这 些基本 单元, 因此 生长极 
为 迅速, 世代时 间低于 30mm。 因为核 糖体对 蛋白质 的合成 能力是 有限的 (37t: 下每 秒钟约 
15 个氨基 酸), 所以在 不同的 比生长 速率下 (因 而, 也有不 同的蛋 白质合 成速率 ), 每个细 
胞 的核糖 体数目 也随之 变化。 例如, 以倍增 时间为 25min 生 长的大 肠杆菌 每个细 胞含有 
70000 个核 糖体, 当 以倍增 时间为 300min 生 长时, 每 个细胞 只含有 2000 个核 糖体。 进一步 
的 "向下 变换" 实验 (即: 把 细菌细 胞从营 养丰富 培养基 转移到 基本培 养基) 表明, 每个细 
胞的 核糖体 含量通 过暂停 rRNA 的 合成而 相应地 减少。 

在不同 生长速 率下, rRNA 与核 糖体和 r- 蛋白 质与核 糖体的 恒定比 例可通 过两种 反馈机 
制来 调节: 第 一种, 核糖体 被少许 地过量 合成而 且游离 的非翻 译状态 的核糖 体抑制 rRNA 
的合成 (核 糖体反 馈调节 ); 第 二种, 某些 r- 蛋白质 抑制编 码一种 或多种 r- 蛋 白质的 mRNA 
的翻译 (翻 译抑制 )。 研究 表明, 翻 译抑制 是一个 特殊的 r- 蛋白 质与核 糖体结 合位点 附近的 
一个碱 基序列 结合的 结果。 另一 方面, 当 翻译抑 制不发 生时, 每个 mRNA 都 被完全 翻译, 
结 果产生 由特定 mRNA 编码 的每个 r- 蛋白质 的数目 相等。 这种机 制确保 r- 蛋 白质以 相同速 
率合成 并与核 糖体的 合成相 稱联。 

另一种 重要的 rRNA 调 节系统 是所谓 的严紧 响应。 某个培 养物在 生长过 程中, 如果一 
种生 长培养 一种氨 基酸被 耗尽, 就会 导致形 成空载 tRNA, 进 而触发 基因的 诱导。 

101 



re/A 基 因的产 物是一 种被称 为严紧 因子的 蛋白质 (仅 存在于 核糖体 50S 亚单位 ), 其负责 
ppGpp 的 生产。 ppGpp 的生产 发出停 止蛋白 质合成 的信号 (因 为氡基 酸缺乏 ), 进 而触发 
rRNA 合成的 终止。 



【例 5.2】 遗 传调控 网络: 胆固 醇合成 与消除 (Hardie, 1992; Ku, 1996) 
包 括改变 了基因 表达的 典型病 例是高 胆固醇 血症, 其表 现为高 胆固醇 水平。 像冠 状血管 
病、 肥 胖症、 糖尿病 等慢性 疾病, 都存 在影响 途径中 特定基 因表达 的代谢 成分。 胆固 醇主要 
以极 低密度 脂蛋白 (VLDL) 的形 式进入 血液, VLDL 是在肝 脏和小 肠中形 成的。 虽 然胆固 
醇合成 需要几 种酶, 但认为 3- 经基 -3 甲 基戊二 酰辅酶 A (HMG-CoA) 还原酶 是生理 条件下 
的控 制酶。 降低胆 固醇水 平的药 物之一 是阻遏 HMG-CH 还原 SI 的 一类抑 制剂。 胆固 醇生物 
合成途 径及其 主要的 反馈机 制如图 5. 14 所示。 

' ( AMP 激 il ) 

HMG-CoA 

t HMG-CoA 还原睡 




© 



mRNA 



整煉 



排泄 
摄入 



i 







© 



■* 翻译 



—转录 



基因 



胆固醇 



图 5.14 胆 固醇生 物合成 途径及 其调控 



甲经 戊酸对 HMG-CoA 还原 酶在两 个不同 水平上 施加负 调控。 甲 羟戊酸 或一种 相关代 
谢物可 使编码 HMG-CoA 还 原酶的 mRNA 的 翻译速 率降低 5 倍 之多, 与此 同时它 也增加 
HMG-CoA 还原酶 的降解 速率。 两 种效应 都导致 HMG-CoA 还原 酶水平 减少, 以保 护细胞 
抵抗该 途径中 间代谢 物毒性 水平的 累积。 已经 发现升 高胆固 醇水平 抑制该 基因的 转录达 8 倍 
之多。 这些 负反馈 回路对 HMG-CoA 还原 酸的浓 度产生 200 倍 范围内 的动态 变化。 对这条 
途径更 远的负 调控是 由抑制 作用施 加的, 该抑制 作用产 生于一 个依赖 AMP 的蛋白 激酶对 
HMG-CoA 还原 酶的磷 酸化。 



5.3 总体 调控: 在完 整细胞 水平上 的调控 

大约 30 年前, 乳 糖操纵 子作为 一个基 因调控 详例的 阐明激 起了人 们研究 其它操 纵子的 
102 



强烈 兴趣。 这 些努力 导致很 多新操 纵子的 发现。 对 这些操 纵子系 统的研 究和分 析得出 共识: 

这 些操纵 子不是 独立起 作用, 而是 作为一 个高水 平调控 网络的 成员发 挥作用 (Neidhardtet 
al, 1990) o 这类 总体调 控是生 物体性 能构成 整体所 必需的 部分, 该性 能是生 物体维 持在不 
同 的和变 化着的 环境中 生长的 能力。 例如: 从 富营养 培养基 变换到 基本培 养基、 改变 碳源、 
氣基酸 限制、 好氧 和厌氧 环境间 的变换 (仅 对兼性 微生物 )、 热休克 以及磯 酸盐、 氮 源和碳 
源极度 匮乏。 

总体控 制是指 细胞利 用调控 信号控 制细胞 多种生 理状态 的能力 , 这 些生理 状态产 生于前 
一段所 提到的 对任何 一种环 境变化 的协调 响应。 这 样的调 控网络 包括功 能明显 无关而 且在染 
色体 图上的 物理位 置也不 连续的 多套操 纵子和 多套调 节子。 在一 个总体 调控网 络中, 各组操 
纵子 都被统 一协调 控制, 尽管 它们在 物理上 分布于 整个细 菌基因 组并且 有时表 现出完 全不同 
的 功能。 总体调 节子定 义为在 一个总 体调节 网络中 处于一 个共同 调节蛋 白控制 下的一 个操纵 
子 网络。 然而, 即使简 单的环 境变化 通常都 会诱导 几个调 节子。 因此, 刺激子 用以指 相应于 
单 一环境 刺激的 全部调 节子。 为强 调总体 调节网 络的复 杂关系 和重叠 性质, 引 入术语 调控代 
谢子 (modubn), 其 定义为 通过共 享一个 多效调 节蛋白 处于不 同的特 定控制 之下的 一组操 
纵子和 (或) 调 节子。 近年 来已经 变得很 明显: 整 体调控 是原核 生物界 的共同 主题。 

这种整 体调控 网络的 存在至 少有两 个理由 (见图 5.15)。 第一, 某 些细胞 过程所 涉及的 
基 因多于 一个单 个操纵 子所能 容纳的 基因。 以细 菌的翻 译机器 为例, 其涉 及至少 150 个基因 
产物 的一组 基因, 包括: rRNA, 核糖体 蛋白, 起始、 延长 及终止 因子, 氨酰基 - tRNA 合成 
酵和 tRNAs。 如此为 数众多 的相互 关联组 分的协 调控制 对细胞 生长的 总效率 是很重 要的, 
然而, 将所有 这些基 因包含 在一个 操纵子 内几乎 是不可 能的。 第二, 尽 管有些 基因需 要被独 
立 调控, 但有 更高级 的协调 控制系 统也是 至关重 要的。 这 些情况 的例子 常见于 编码分 解代谢 

刺激 



反馈 




外 界刺激 



传感器 



1 j^Dl- 
\ 

网络 
蛋白 
♦ 

响应 



N- 末端 [ 



]C- 末端 



1 I 



(a) 



调节 T 11 标响应 
I 

(b) 



图 5.15 总 体调控 

(a) 响 应于环 境条件 (如 温度、 pH、 营养 状态) 所产生 的信号 直接或 间接地 (通 过一个 
或 多个转 导物) 控制调 节分子 (调 节器) 的合成 速率。 随后, 调节 器控制 成员操 纵子的 
蛋白 质合成 速率, 这些蛋 白质的 功能会 促进生 长或给 予细胞 生存的 能力。 - 个反馈 
控制机 制容许 系&, ;回到 一个新 的平衡 状态。 (b) 传感器 与调节 器之间 的信号 转导。 
保 守区域 用类似 的阴影 (十 字形) 表示 



103 



器 

-感- 



nlT 物子 

SJ 



酶的基 因中, 而这些 酶参与 碳源和 能源的 利用。 葡萄糖 是大多 数细菌 的优质 底物, 当 存在于 
生 长培养 基时, 它 总是抑 制第二 种或冗 余底物 的代谢 所需酶 的表达 (分解 代谢抑 制)。 然而 
当缺乏 优质底 物时, 每个 操纵子 都必须 有在其 同源底 物存在 时独立 诱导的 能力。 这些 例子表 
明需要 一个调 控组织 机构替 代单个 操纵子 的独立 调控。 

据 估计, 细 菌细胞 已演化 形成了 几百个 多基因 系统, 其中至 今没有 几个已 被深入 研究。 

表 5.2 给出 一些来 自各种 细菌的 例子, 按 照细胞 对营养 限制、 氧 化还原 变化及 不利环 境条件 
的响 应以三 大类条 目整理 列出。 很 显然, 细菌 已演变 形成了 各种各 样的总 体调控 机理, 对这 
些机理 刚刚开 始进行 阐述。 毫不 意外, 这种 调控网 络的许 多组成 部分是 借用于 操纵子 的调节 
系统, 例如 蛋白阻 遏物、 激 活物或 a 因子。 热休克 和孢子 形成系 统利用 CT 因子为 RNA 聚合 
酶重 新编制 程序, 以 便让它 识别成 员操纵 子的启 动子。 SOS、 氧 化损伤 和厌氧 电子传 递系统 
利 用蛋白 阻遏物 / 激 活物, 以识别 为组成 型操纵 子调控 区所共 用的一 段特定 序列。 另一 方面, 
作为 最普遍 最难理 解的操 纵子之 一的严 紧控制 系统, 其没有 明显的 蛋白调 节剂, 而是 利用核 
苷 酸鸟苷 四磯酸 (ppGpp) 作为总 体调节 分子。 



表 5.2 细菌多 基因调 节系统 



刺 激 


系 统 


生 物 


调 节基因 


被调 节基因 


宫乔! ^制 










碳 


分解 代谢阻 


肠细菌 


t-r/> :编码 激活剂 


lac , mal , gal , ara , tna , dsd , hut 




遏 




cya :腺苷 酸环化 SI 


等分解 代谢所 含基因 


氣 基酸或 ATP 


严 紧反应 


肠或 其它细 


RelA 或 SpoT : 编 码 


核 糖体及 蛋白翻 译和生 物合成 SI 






菌 


(p)ppGpp 代谢 的醇系 


基因 (>200) 


氣 


Ntr 系统 


肠细菌 


蛋白质 Pn 


gin A , hut 等 








„/„n . I TP /T IT ^ 










glnG: 蛋白质 NRi 










glnL: 蛋白质 NRn 






Nif 系统 


克雷伯 (氏) 


包括调 控氨的 多基因 


编码固 氮醉的 多基因 






杆菌属 、产气 










菌等 






m 


Pho 系统 


肠细菌 


PhoB: PhoB 的活性 


PhoA 及其它 








调节子 










P/ioL/: 碟转 运的传 










感器 




饥饿 


孢 子形成 


枯草 芽孢杆 


SpoOA : 激活剂 


控制孢 子形成 的基因 (〉100) 






菌 


S/wOF: 调节子 




饥饿 或抑制 


稳定期 


所 有细菌 


未知 


上百 个基因 


能 量代谢 










供氧 


Arc 系 统 


大 肠杆菌 


ArcA: 阻 遏蛋白 


需 氧代谢 




(需氧 ) 




ArcB: ArcA 的活性 










调节子 




非 02 电 子受体 


厌 氧呼吸 


大 肠杆菌 


fnr: 编码 激活剂 


硝酸 还原雜 和厌氧 呼吸醉 系的基 

因 


电子受 体缺失 


发酵 


大肠 杆菌及 


未知 


发酵薛 系基因 (>20) 






其它 兼性菌 







104 



续表 



刺 激 


系 统 


生 物 


调 节基因 


被调 节基因 


应激 

紫外 或其它 DNA 损 

伤 


SOS 反应 


大肠 杆菌及 
其它菌 


LexA: 阻 遏蛋白 
recA : LexA 活性调 
节子 


约 20 个修 复紫外 损伤的 DNA 的 
基因 


DNA 垸化 


Ada 系统 


大肠 杆菌及 
其它菌 


Ada : 激活剂 


去掉 DNA 上垸 基的四 个基因 


H2O2 或类似 氧化剂 


氧 化反应 


肠细菌 


Oo^K: 阻 遏蛋白 


约 12 个 氧化防 护基因 


升 高温度 


热刺激 


大肠 杆菌及 
其它菌 


HtpR 。32 


约 20 个用于 大分子 合成、 加工与 
降解 的基因 


降 低温度 


冷刺激 


大 肠杆菌 


未知 


一些用 于大分 子合成 的基因 


高渗透 


(膜) 孔蛋白 
反应 


大肠 杆菌及 
其它菌 


£nvZ : 传感器 
ompR-.DNA 结合蛋 

白 


(膜) 孔蛋 白基因 



注: 摘自 Neidhardt, 1987; Neidhardt et al, 1990。 



多基因 系统的 一个重 要方面 是处理 信息的 能力, 这 是常由 蛋白质 -蛋白 质相互 作用来 
执行 的一种 功能。 细菌 对环境 刺激响 应的遗 传及生 化分析 表明, 响应 于这种 刺激的 信号转 
导 常常是 通过两 类蛋白 质对之 间的通 讯而发 生的。 每 对蛋白 都由传 感器蛋 白和调 节器蛋 
白 组成, 传感器 蛋白能 够检测 环境的 变化进 而将信 号传送 到与其 合作的 调节器 蛋白。 随后受 
感应 的调节 器蛋白 将影响 (正面 地或负 面地) 某些操 纵子组 的转录 起始。 每类 信号转 导蛋白 
成 员之间 已观察 到相当 大的同 源性。 在 多数情 况下, 传感 器蛋白 C- 末 端的保 守区域 延伸到 
超过 250 个氨 基酸, 而调 节蛋白 N- 末端的 保守区 域延伸 到超过 120 个 氨基酸 [见图 

5.15 (b)]。 

碌 酸化作 用的信 号转导 

到 20 世纪 80 年代 中期, 已很 清楚许 多多基 因系统 含有一 个蛋白 质对, 其 组成分 别属于 
两 种蛋白 质家族 (Warmer, 1992)。 在 一个典 型的传 感器- 调节器 两组分 调节系 统中, 跨膜 
结构 域把传 感器蛋 白分成 周质空 间域, 周质空 间域感 受特定 的环境 刺激, 随后 诱导其 C- 末 
端自动 磯酸化 [比 较图 5.15 (b)]。 在第二 步中, 磷酸 基团被 传递到 相应调 节器的 N- 末端。 
第 一个蛋 白质家 族的成 员是蛋 白激醇 (PKs), 它 能够将 ATP 的 磷酸基 团转移 到该激 酶的组 
氣 酸残基 而被磷 酸化。 在第 二步, 这 些碟酰 基基团 又被转 移到称 为磷酸 化响应 调节器 
(PRRs) 的第 二个蛋 白质家 族成员 的天冬 氨酸残 基上。 最后 一步, 该磷 酰基基 团可以 通过水 
解 作用从 PRR- 磷酸天 冬氨酸 残基上 除去。 整个磷 酸化过 程可归 纳如下 

ATP + PK-His ^ ^ADP + PK-His-P 
PK-His-P + PRR-Asp ~~ ^PK-His + PRR-Asp-P 
PRR-His-P ^PRR-Asp + P, 
在 一个典 型的细 菌中, 估计可 能存在 50 种这样 的转导 系统。 已经 发现通 过磯酸 化作用 
产 生信号 在细菌 界广泛 存在, 调 控着诸 如基因 表达的 调控、 趋药性 (chemotaxis) 或 发育途 
径等 各种各 样的调 控功能 (见表 5.3)。 组氨酸 蛋白激 醇家族 成员具 有保守 的羧基 未端, 而 
响 应调节 器蛋白 则在氨 基末端 附近具 有大约 100 个氨基 酸残基 的保守 序列。 这 种保守 序列的 
重 要意义 在于, 在 一些情 况下, 可以允 许不同 系统之 间的相 互作用 (对话 )。 例如: 在 

105 



P/zoR 突 变株中 (即 带有已 破坏的 P/roR 基因的 细胞, 因此, 缺乏 fVioR 活性 ), PhoM 基 
因 的产物 (显 然是 另一种 PK) 在对 P/u>B(RRP) 的 修饰中 可部分 替代有 缺陷的 P/zoR 。 



表 5.3 同源 磷酸基 转移雜 的例子 



系 统 


蛋 白激薛 


响应 调节子 


系 统 


蛋 白激雜 


响应 调节子 


a 调节子 (Ntr) 


NRd 


NRi 


(膜) 孔蛋白 调节子 


EnvZ 


OmpR 


SI 调节子 (Pho) 


PhoR 


PhoB 


(Omp) 






需 氧呼吸 (Arc) 


ArcB 


ArcA 


抱 子形成 (Spo) 


SpoIIJ 


SpoOA/SpoOF 



注: 摘自 Neidhardt et al, 1990。 



作 为这种 对话的 结果, 一种适 应性响 应的活 化作用 可容许 细胞通 过交叉 磷酸化 而部分 地激活 
一 个同源 系统。 

对于真 核细胞 的基因 调控, 碟酸 化作用 是一种 更可取 的调控 机制。 存在于 哺乳动 物细胞 
质中的 蛋白磷 酸酶已 被分成 为两种 类型。 第 一类磷 酸酶能 够被纳 摩尔浓 度的两 种热稳 定性蛋 
白 (称为 抑制剂 1 和 抑制剂 2) 所 抑制, 而 且这两 种蛋白 能够优 先使磯 酸化酶 激酶的 亚基 
脱 磯酸。 另一 方面, 第二 种类蛋 白憐酸 酶不受 抑制剂 1 和 抑制剂 2 的 影响, 能 够优先 使磯酸 
化酶 激酶的 a- 亚基脱 磯酸。 各 种蛋白 激酶已 被证实 是磷酸 化酶, 它们 在哺? L 动物的 骨豁肌 

和肝 脏中, 参 与糖原 分解、 糖原 合成、 糖 酵解、 糖原 异生、 芳香族 氣基酸 降解、 脂 肪酸合 
成、 胆固醇 的合成 及蛋白 质的合 成过程 的调节 作用。 

尽管 在调控 网络中 蛋白质 -蛋白 质相互 作用是 非常重 要的, 但是不 同操纵 子组被 协调的 

方式是 多种多 样的。 例如, 大 肠杆菌 对热休 克的响 应是被 RNA 聚合酶 的一种 a 32 因 子在细 
胞内的 水平所 控制, a 32 水平 的升高 会诱导 一组约 20 个 基因。 能够诱 导大约 20 个 DNA 修补 
蛋白的 SOS 系统, 它 是通过 成员操 纵子阻 遏物的 蛋白质 分解破 裂所诱 导的。 在另一 种机制 
中, 一 组基因 (约含 12 个) 被氧化 损伤所 诱导, 诱导 作用是 通过正 调节器 OxyR 的 活化而 
促 成的。 



【例 5.3】 交叉 调控: Pho 调节子 

交叉 调控在 中心碳 代谢途 径的控 制中可 能特别 重要。 交叉调 控最著 名的例 子是大 肠杆菌 
的磯酸 (Pho) 调节子 (Lee et al, 1990; shin 和 Seo, 1990; Wanner 和 wilmes-Tiesen- 
berg, 1992) o 该调节 子包括 P/ioA 基因 (编 码细菌 碱性磯 酸酶, BAP)、 编码 磷源降 解和吸 
收用 薛的几 个其它 基因。 胞外 P, 是细胞生长的优先磯源, 并通过 PstSCAB 系统被 吸收结 
合。 然 后胞内 P, 在中心代谢途径中经过几条不同的途径形成八丁? (见图 5.16)。 




吸收 



PstSCAB 




进人- 



中 心途径 




糖 解 
Pta-AckA 






TCA 
ATP 合成姆 






图 5.16 P, 吸收与 同化为 ATP 
P, 分 别经糖 酵解途 径中的 3- 磷酸 甘油醒 脱氢薛 和磯酸 甘油酸 激藤、 经碟酸 转乙酷 基酶和 
乙 酸激醉 (Pta-AckA) 、 经有 氧生长 条件下 TCA 循环 中的琥 珀醜辅 酵 A 合成 II 
或经 FiFo- ATP 合成 醉 作 用形成 ATP 



106 



作用于 Pho 调 节子的 3 种 控制方 式如图 5.17 所示, 其中 两种包 括交叉 调控。 一 种控制 
利用 传感器 CreC, 由葡 萄糖所 诱导。 第 二种控 制是通 过丙酮 酸上的 生长而 诱导。 后 一种调 
控方式 或许是 探测乙 酰磯酸 的水平 并激活 P/ioB, 该激活 过程通 过一种 未知的 传感器 或直接 
由 乙醜磯 酸或通 过磯酸 激酶来 完成。 因此, Pho 调 节子的 控制经 由乙酰 磯酸与 Pta-AckA 途 
径相 联系。 在葡萄 糖上生 长时, 乙酰 磯酸由 Pta 产 生并被 AckA 进一步 利用, 对于在 乙酸或 
丙 酮酸培 养基上 生长, 情况也 确实是 这样。 已经 证明, 在丙 酮酸、 前 体物, 或乙 酰辅薛 A 
存在条 件下, Pho 调 节子被 诱导。 此外, 在 pfa 和 ao^ 缺失 突变菌 株内, 经由 乙酰磷 酸的调 
控 机制则 被完全 破坏。 



控制 



PstSCAB 转 运蛋白 
中 心途径 

Pta-Ack 途径 



信号 

Xl(?) 
[ATP] 



传慼器 



调节子 



[乙 酷 碟酸] 




( X2(?) Y < X3(?) ) 



碟酸转 乙酰酶 (PTA), 乙 酸激薛 (ACK) 途径 



乙酰 -CoA 


PTA 


乙 酰碟酸 


ACK 


乙酸 







P, 



CoA 



ADP ATP 



图 5.17 Pho 调节子 的控制 
虚线箭 头表示 伙伴蛋 白之间 的相互 作用, 而实线 箭头表 示非伙 伴蛋白 之间交 叉调控 



5.4 代 谢网络 的调控 

代 谢调控 的实质 就是作 为调控 变量的 反应速 率对各 种信号 的响应 (这 些信 号通常 包括代 
谢物、 效应物 及其它 调节分 子的浓 度)。 这 种控制 系统的 基本性 质是其 实际输 出仅由 信号决 
定, 因而 是与该 控制系 统各个 组分的 性质无 关的。 与控制 液体流 动的一 个阔门 类似, 一个反 
馈调 节的藤 反应能 力大于 最大的 可能的 通量, 而通量 本身仅 由信号 决定。 虽然 酶和信 号的总 
量 分别决 定了最 大通量 及实际 通量的 大小, 但该 控制的 动态性 质是特 定调控 机制的 函数, 如 
下述 讨论。 

在由多 于一种 薛构成 的一条 代谢途 径中, 途径 通量是 由途径 中各个 薛的动 力学及 调控来 
决 定的。 对于中 心碳代 谢途径 (如糖 酵解和 TCA 循环) 中, 虽 然这些 酶不是 以物理 方式组 
织的, 但 它们在 一个化 学框架 中被高 度组织 起来。 在 一些情 况下, 途径 通量由 存在的 一个酶 
的 总量所 控制, 该 薛量低 得足以 将其定 为一个 速率控 制步骤 (见第 11 章 )。. 在另一 些情况 
下, 途径通 量控制 分布在 几个薛 当中, 而途 径中其 它反应 进行得 很快并 变得由 底物或 辅因子 
浓度所 限制。 在这种 代谢框 架中, 催 化活动 不是酶 的惟一 功能, 因为它 们在途 径通量 的调控 
中也 起重要 作用。 尽管 不必在 物理上 接触, 但每 个酶可 通过特 定的化 学信号 (如 底物、 产物 

107 



或 特定调 节物如 ATP, NADH 等的 浓度) 向其报 告代谢 途径的 状态, 这些化 学信号 控制瞎 
反 应速率 进而扩 大到控 制途径 通量。 在 一个功 能性细 胞中, 反应速 率必须 被精确 调整。 因 
此, 很容 易把别 构酶看 做动态 实体, 其中酶 的结构 对在底 物水平 和别构 激活剂 或抑制 剂水平 
的相 当小的 变化很 敏感。 这 些结构 改变是 通过改 变酶与 其底物 的亲和 力而影 响醇活 性的, 这 
显著 不同于 通过抑 制剂的 共价结 合而引 起酶的 失活。 

催 化非平 衡反应 的醃的 识别为 网络的 调节控 制提供 线索。 理 解代谢 控制的 困难之 一在于 
调 节醇的 确定, 因为在 某种程 度上, 一个途 径中所 有酶的 活性都 需与通 过途径 的通量 改变相 
协调。 于是, 关键问 题就变 成是否 存在一 种酶, 其首先 响应于 原始代 谢信号 (主宰 癬), 从 
而在 剩余酶 (从 属酶) 的活 性中启 动次级 响应。 用于识 别调节 酶而发 展的一 系列判 据简述 
如下。 

* 这 种酶应 当催化 非平衡 (不 可逆) 反应。 一个 "非平 衡醇" 具有低 的催化 活性, 因此 
其能限 制通过 途径的 通量。 另一 方面, 一个 "平 衡藤" 被认 为是过 量的, 而且 通量对 其扰动 
不 会显著 地产生 响应。 

* 这种酶 应当具 有调节 性质, 例 如别构 位点。 

也可 能没有 单独的 调节酶 存在, 但可以 说一条 途径中 几种酶 的活性 是先后 响应于 变化着 
的条 件和随 之引起 的代谢 信号而 改变。 

确立代 谢通量 J 和一 条途径 中某种 酵的量 (或 活性) Ce 之间 的关系 是很重 要的, 虽然 
确 切的关 系取决 于很多 参数, 包括途 径酶的 本征动 力学和 产物及 别构调 节物的 影响, 但在大 
多数情 况下, 已经 提到一 个如下 所示的 通用双 曲线关 系式: 



式中, J 为观 测到的 通量; Jmax 为 无限多 的酶存 在时所 得到的 通量; Ce 为 对特定 薛可分 
析的最 大体外 活性; K 为一个 常数, 定 义为当 J 二 时的 Ce 值 (与 类似 )。 因此, 

当活性 小时, 途 径通量 随酶的 可利用 率线性 增加, 但 最终途 径通量 将被其 它因素 限制, 例如 
底 物可利 用率, 途径 中另一 个酶的 活性, 或一个 抑制性 产物的 累积。 

方框 5.4 真核 生物相 对于原 核生物 的调节 

真核生 物与原 核生物 的调控 系统是 非常不 同的, 这 是它们 的不同 "生活 方式" 的反 
映。 虽然 原核细 胞与真 核细胞 所具有 的很多 功能是 十分类 似的, 但 它们在 若干结 构的及 
遗传 的性能 方面有 区别。 原核细 胞通常 是自由 生活的 单细胞 生物, 在环境 条件适 宜且营 
养充 足的情 况下, 它们可 进行无 限制的 生长和 分裂。 原核生 物系统 的调节 是为了 适合最 
大生 长而营 养利用 尽可能 高效。 由于没 有核, 原核 生物的 DNA 连 续暴露 到来自 细胞质 
的调节 信号; 因此蛋 白质合 成的开 -关控 制常在 转录水 平上来 完成。 另一 方面, 真 核生物 
通 常是多 细胞的 (酵 母、 藻类 和原生 动物门 除外) 更大及 结构上 更复杂 的生物 (Towle, 
1995) 细 胞分化 尤其需 要特定 的调控 类型, 因为不 同组织 的细胞 有不同 的需求 (Hofes- 
tadt 等, 1996; krauss 和 Quant, 1996)。 例如, 在 一个胚 胎中, 一 个细胞 不仅需 产生新 

一代 细胞, 而 且也需 经历许 多相当 大的形 态的和 生化的 变化, 并需 无限维 持这些 变化。 
这 类永久 的开关 需要在 这类细 胞中运 用其它 的调控 策略, 例 如基因 丢失、 基因 失活、 基 

因扩增 和基因 重排。 

哺乳 动物代 谢可通 过营养 底物和 激素在 遗传水 平进行 调控。 第 一个清 楚的证 据是通 



108 



过 如下发 现而提 供的: 色 氨酸和 肾上腺 糖皮质 激素调 节肝脏 中色氨 酸二氧 化薛的 活性。 
当存在 的氨基 酸超过 蛋白质 合成需 要时, 该醉启 动了色 氨酸的 利用。 这条 途径对 葡萄糖 
异 生中的 色氣酸 利用及 含烟醜 胺辅助 因子的 内源性 合成是 必不可 少的。 与 细菌中 乳糖利 

用的迅 速增加 相比, 色氣酸 二氧化 醇的研 究表明 类固醇 (例 如皮 质醇) 需要 8〜12h 才能 
达到稳 态薛和 相应的 mRNA 水平。 这是一 个普遍 现象: 细菌 中的酵 诱导在 30~40min 
达 到最高 水平, 而 在哺乳 动物中 此过程 需几个 小时, 有 时甚至 需要几 天才能 完成。 

单细 胞和多 细胞生 物体显 著差别 详见表 5.4, 这 代表着 在基因 调控理 解中的 一个重 
要 方面。 根据 这两种 基因的 大小, /ac 操纵 子可在 2miri 之内 转录, 而色氨 酸二氧 化醇基 
因 需要约 6min 才能完 成一轮 转录。 这 种时间 差别与 转录起 始速率 的显著 差别相 比仍然 
是 小的, 因此, 转录 起始就 变成速 率控制 步骤。 此外, 原核 生物的 翻译效 率比真 核生物 
高约 3 倍。 这些 影响, 连同比 较如下 事实: 一 个生长 中的大 肠杆菌 细胞的 典型细 胞体积 
约1|^1111 3 , 一个典 型的肝 细胞体 积约为 llOOOpm 3 , 从 而使得 原核细 胞可非 常快地 达到高 
的 催化剂 浓度。 与 相对较 长的哺 乳动物 mRNAs 的半衰 期相比 (其 范围是 20mh !〜 
lOOh), 细菌 mRNAs 的半 衰期一 般只有 l〜3min。 细菌中 大部分 蛋白是 相对稳 定的, 但 
是细 胞分化 的结果 使得每 个细胞 内的蛋 白被稀 释了。 因此, 细胞中 实际的 蛋白质 半衰期 
与世代 时间相 一致, 介于 20〜60mm 的 范围。 总的 说来, 遗 传控制 机制本 质上更 适合于 
原核 生物, 允许它 们迅速 地调节 薛浓度 以满足 变化着 的细胞 要求。 

如前 所述, 真核 生物与 原核生 物系统 之间存 在一些 基本的 差别。 关于 两个系 统之间 
的 遗传学 及调控 方面的 一些区 别概括 如下。 

* 真核细 胞仅将 mRNA 翻译成 一条单 独的多 肽链, 因 而排除 在原核 细胞中 常见的 
多 基因操 纵子的 存在。 

* 和原 核细胞 DNA 不同, 真 核细胞 DNA 只有 一小部 分是裸 露的。 其 与组蛋 白大量 
结合以 形成染 色质。 

* 高等真 核细胞 大部分 DNA 序 列由不 被翻译 的区域 (内 含子) 组成。 

* 真 核细胞 具有以 可控的 方式重 新排列 DNA 片段的 机制, 因 而允许 它们根 据需要 
而 增加基 因的拷 贝数。 

* 原 核生物 的转录 调节区 很小, 靠近 并常在 启动子 上游, 蛋白 与这些 位点的 结合直 
接刺激 RNA 聚 合酵的 结合。 相 对地, 相 应的真 核细胞 转录调 节区大 很多, 且与 启动子 
相 距约达 几百个 碱基。 虽然它 们结合 蛋白, 但由于 特定的 限制, 它 们不能 同时与 启动子 
发 生相互 作用。 

* 在 真核细 胞中, RNA 在细 胞核中 合成, 并且必 须穿过 核膜被 运输到 细胞质 后才被 

翻译。 

总之, 真核 细胞中 mRNA 的 生产比 在原核 细胞中 要复杂 得多, 因此 可以想 象有许 
多调 节点。 例如, 启动子 可利用 率可由 染色质 状态、 转录 因子的 活性或 浓度, 或 强化因 
子可利 用率来 确定。 来 自初级 转录的 mRNA 的生产 可以通 过拼接 及多聚 腺背酸 化的控 
制 来进行 调控。 mRNA 寿命的 调控在 原核细 胞很少 遇到, 因 为频繁 需要相 当快地 打开或 
关闭 所调控 的基因 产物的 合成。 另一 方面, 通 常有更 多的时 间去应 答的真 核细胞 当大量 
特定蛋 白需要 时可使 用延长 mRNA 寿命的 战略。 



109 



表 5.4 大肠杆 菌和哺 乳动物 细胞间 转录和 翻译时 间尺度 的比较 



项 目 


大 肠杆菌 


哺 乳动物 


起始 


ls_i 


lOmin — 1 


转录 


2500nfmin"' 


3000nfmm-' 


RNA 加工 




大约 lOmin 


核 (内) RNA 




大约 lOmin 


核 质转运 




大约 lOmin 


mRNA ti/2 


l~3min 


l~20h 


mRNA 翻译 


2700nfmin~' 


720nt'min— 1 


蛋白质 t\n 


20 ~ 60min 


2~100h 



注: 111 =核 昔酸。 



对 于处于 "基 础" 水平 的控制 用酶, 酶浓度 的小的 增加可 能使通 过途径 的通量 线性增 
加。 然而, 酶浓度 的增加 超过某 一水平 则是无 效的, 因此, 为了 优化及 协调通 量就需 考虑其 

它 因素。 根据 经验, 在 许多情 况下, 将某特 定酸的 转录水 平增加 10 倍以上 是不实 际的。 从 • 

细胞经 济观点 来看, 这是 十分重 要的, 因为细 胞的资 源是有 限的, 而且 在许多 途径中 存在着 
相 同前体 库竞争 要求。 例如, 对某一 结构单 元的需 求突然 下降, 经济的 办法就 是将产 生这种 I 
特定单 体的酶 水平和 酶活性 两者都 减少。 对在 基本培 养基中 生长的 细胞, 通过 利用放 射性标 ', 
记的底 物可以 表明, 在 氨基酸 加人后 的几秒 钟内, 所 有流向 其生物 合成的 碳流停 止了。 这些 , 
途径 通量控 制问题 将在第 11 章讨论 代谢控 制分析 时再次 遇到。 

5.4.1 分支 点分类 

通常, 在 生物过 程中很 差的产 品得率 归因于 由酶水 平或薛 活性而 引起的 限制。 虽 然产品 
分支 处的酶 的总活 性决定 着生产 能力, 然而, 产 品得率 是在中 间分支 点处通 量分配 比的函 
数。 中间 分支点 又称为 节点, 它是代 谢网络 中一个 反应序 列分叉 成两条 或更多 条不同 途径的 
一 些点。 例如, 图 5.18 中产物 Pi 的得率 取决于 在节点 I 处的 通量分 配比, 而不是 取决于 I 
到 Pi 分支 本身的 活性。 因为合 成初级 代谢物 的途径 通常能 够支撑 相当的 通量, 代谢 工程的 
努力 应集中 于在所 选择的 代谢分 支点处 改变通 量的分 配以提 高产物 收率。 

S S i 



一 \ 



-- 一 z 

(a) (b) 

图 5.18 代 谢节点 

(a) 柔性或 弱刚性 节点; (b) 强刚 性节点 
虚 线表明 (负 或正) 反馈控 制机制 

虽 然一个 网络可 由大量 的节点 组成, 一 般相信 在相当 少的节 点处的 分配比 实际上 影响产 
物 得率。 这 些节点 称为主 节点。 虽然 由不同 生物体 调节通 量所用 的控制 结构显 著地变 化着, 

然而基 于其分 支点刚 性有可 能将节 点分成 三大类 (Vallino, 1991)。 

* 柔 性节点 (对调 节显著 亚敏感 ): 在此 类节点 处通量 分配响 应于细 胞代谢 需求, 将容 
易发生 改变。 这些 节点通 过有类 似的底 物亲和 力和类 似的反 应速率 的竞争 性酶来 表征。 由定 
110 



— 4 '' 



n 



n 



D: 



义, 柔 性节点 将不限 制产物 得率, 因为 无论何 时只要 需要, 任何 分支可 以得到 100% 的分 

配比。 

* 弱刚 性节点 (对调 节适度 敏感) : 在这些 节点处 通量分 配由一 个支路 控制。 起 支配作 
用 的薛通 过具有 高的比 活性和 / 或底 物亲和 力以及 与没有 反馈抑 制一起 来进行 表征。 

* 强刚 性节点 (对调 节高度 敏感) : 在这些 节点处 的通量 分配在 1 个 或多个 支路, 通过 
反 馈控制 与酶转 移活化 的结合 而被严 格控制 , 该转移 活化是 通过来 自 一 条分支 途径的 代谢物 
而进 行的。 

在一 个柔性 节点, 通 量分配 比仅取 决于细 胞对两 个产物 Pi 和 P2 的需求 [见图 5.18 
(a)]。 弱 刚性节 点与柔 性节点 类似, 但 有如下 不同: 一条 分支途 径比其 它一条 (一些 ) 分支 
途径呈 现显著 优势。 这 是由于 相应的 酶对共 同代谢 物有更 大的亲 和力和 / 或比 下一级 分支途 
径的 酶有更 大的总 活性。 在 这种情 况下, 完 全解除 对下一 级支路 的调控 对通量 将不会 有显著 
影响。 另一 方面, 如果优 势分支 途径的 活性被 减弱, 这会 显著增 加通过 下一级 分支途 径的通 
量。 一个 强刚性 节点是 由终端 产物激 活或抑 制高度 调控, 如图 5.18 (b) 所示。 在此 例中, 
每 个产物 代谢物 作为竞 争分支 途径的 一个激 活剂, 同时 又作为 其自己 形成的 一个抑 制剂。 一 
个刚性 节点对 途径产 物得率 能有控 制性的 影响, 它的解 除调控 比酶活 性减弱 可能更 复杂。 

让我 们假定 所希望 的目标 是增加 Pi 分 支途径 通量分 配比, 而且在 激活剂 P2 不存 在时, 
Pi 的稳态 浓度高 得足以 抑制它 本身的 合成。 在 这种情 况下, 增加 Pi 分 支途径 的分配 比会要 
求去 P2 的通 量被 减弱。 然而, 在 强刚性 节点, 这种 方法将 导致低 水平的 P2, 所以 Pi 分支途 
径将 会由于 P2 而失去 其活化 作用。 简而 言之, 一 条分支 途径的 减弱导 致竞争 分支途 径的减 
弱 (整 个节点 的衰弱 ), 结 果是每 条分支 途径的 分配比 相对来 说没有 改变。 

因为复 杂的及 多样的 控制结 构和酶 动力学 (Srere, 1994), 代谢网 络并不 总是呈 现上述 
分 类所包 含的通 量分配 的双重 响应。 因此, 一个强 刚性节 点的一 条分支 途径的 减弱可 能仅导 
致 竞争分 支途径 的部分 减弱, 以致产 物得率 的改进 可以在 一个含 有刚性 节点的 互相关 联的网 
络中 得到。 也有 可能减 弱不要 的途径 会引起 中间代 谢物的 分泌, 而 不是通 量减小 或通量 
改向。 

虽 然其它 可能的 控制结 构也能 提出而 且其会 产生一 个刚性 节点, 任 何此类 控制的 关键方 
面 是竞争 分支途 径之间 一个反 馈调节 机制的 
存在 (相互 影响, cross-talk), 这将有 保持一 
个恒定 通量分 配比的 趋势。 一 个刚性 节点不 
仅能限 制产物 得率, 而 且通过 简单的 醇活性 
减弱不 容易减 轻这种 影响。 

图 5. 19 所示 的乙酵 酸支路 是一个 全面研 
究了的 代谢分 支点。 当 细胞在 醋酸盐 上生长 
时, 异 柠檬酸 裂合醇 (IL) 被 诱导, 而且在 
提供 补碳方 面起重 要作用 (见第 2 章), 否则 



裂 &SI(1L) 
Kn,=604jumol-L-' 
Vmax=289mmol- L"'- min 



乙薛酸 



行檬酸 



柠檬酸 I 



脱氢 Sg(IDH) 

K„,=8A^mol-L-' ― _ 
126mmol L"' min" 




« -酮 戊二酸 



图 5.19 异柠檬 酸分叉 点处酷 的动力 学参数 



会在 TCA 循环 中作为 C02 而被 失去。 当 在醋酸 盐上生 长时, 异 柠檬酸 脱氣酶 (IDH) 主要 
处 于磯酸 化状态 (大约 80%), 从而使 其没有 活性。 当 给予细 胞更有 利的碳 源时, 如葡萄 
糖, IDH 就会 迅速脱 磯酸而 导致其 活化。 

图 5. 19 概 括了在 乙酸盐 上生长 时两种 竞争酸 的动力 学参数 (葡萄 糖可使 IDH 的 t^mex 增 
加 5 倍)。 该分支 点的一 个重要 特征是 各自的 Km 值极不 一致: IL 有一个 75 倍高的 Km 值。 

111 



生 长发育 



在 异柠檬 酸生理 浓度时 (约 16(Vmo 卜 L — 1), IL 对 于异柠 檬酸为 一级, 而 IDH 被共 同底物 
所 饱和。 因 为这两 种酶的 动力学 的共同 控制, 通过 该支路 的通量 对异柠 檬酸浓 度水平 的变化 

极端 敏感。 在 乙酸盐 生长培 养基中 加入葡 萄糖, 不 仅引起 IDH 的 X^max 的 提高, 同时 引起通 

过 柠檬酸 合成酶 的碳流 的相应 减少, 其 总结果 是降低 了胞内 异柠檬 酸水平 (大约 170 倍)。 
因为与 IDH 相比, IL 对异柠 檬酸有 一个显 著高的 Km, 所以异 柠檬酸 浓度的 下降使 通过该 
支路 的通量 减少到 一个很 大程度 (约 990/0)。 因此, 虽然 没有已 知的别 构调节 剂直接 作用到 
IL 上, 通 过它的 通量可 从总的 30O/6 下降到 实际上 为零。 这种控 制有很 有趣的 特性: 最受影 
响的嗨 IL 是不易 直接控 制的, 这已经 被称做 "分 支点效 应"。 
5.4.2 耦合反 应与总 体流通 代谢物 的作用 

生物合 成反应 一般都 依赖于 ATP 的 供应, 若 ATP 供应不 足则生 物合成 受阻。 ATP 及 
其相 关分子 ADP、 AMP 在中 心碳代 谢供能 反应的 调控中 比其仅 仅参与 在代谢 反应中 起着更 
加 重要的 作用。 这 些中心 分解代 谢过程 (糖 酵解和 TCA 循环) 为 生物合 成提供 原料, 如图 
5.20 所示 (也 可见 2.1 节)。 这些途 径通过 不仅提 供前体 代谢物 同时也 提供自 由能和 辅助因 
子 而提供 一个基 本的合 成代谢 功能。 因此, 此 类途径 被称为 "无定 向代谢 途径" 以表 明它们 
在 分解代 谢和合 成代谢 中的双 重作用 (Sanwal, 1969, 1970)。 这些途 径的调 节应当 反映出 
其双重 功能, 即确保 正确的 及协调 的碳骨 架流进 生物合 成途径 和产能 途径。 严 格地说 生物合 
成 或分解 途径主 要区别 于用以 通量控 制的调 节信号 的性质 (Vaulom and Kahn, 1994)。 



分 解代谢 



脂肪 

蛋白质 




合 成代谢 



己糖 -P 

PEP 

丙18 酸- 
乙銑辅 SlA 
a- 戊 刚二酸 
狭珀 酰辅酷 A 
草 酷乙酸 



图 5.20 需氧异 养代谢 的图解 方块图 



生物膜 
m 

细胞器 



在 两种情 况下, 反 馈抑制 总是施 加在催 化途径 第一步 反应的 酶上。 如果糖 酵解或 TCA 
循环仅 由能荷 调节, 那么 在充足 的能量 供应条 件下, 通 过这些 途径的 通量将 会急剧 减少。 然 
而, 伴随着 ATP 再生的 减少, 这种反 馈机制 也会限 制生长 中间物 的可利 用率, 从而 损害生 
长。 这样 的响应 只会是 次优, 因为当 资源供 应丰富 时生长 也会被 限制。 

为了 满意地 调控一 个同时 具有两 种服务 功能的 过程, 已经发 展了一 个需要 两个输 入的高 
级 机制: 一 个是生 物合成 中间物 水平的 测量, 另 一个是 能量水 平预示 (Anthong, 1988; 
Atkinson, 1970, 1977; Dietzler et al, 1979; NichoUs, 1992)。 信号 1 : 第一信 号是一 个特定 
途 径的终 端产物 而且通 常在严 格合成 过程中 找到。 现在有 大量例 子可以 用来表 明大多 数生物 
112 




质 脂 

白 酸"。 

蛋^ 复 



合成途 径的调 控都包 括简单 的反馈 机制, 其 中最终 产物抑 制包括 在该产 物合成 过程中 的第一 
步, 例如苏 氨酸抑 制高丝 氨酸脱 氛酶, 异 亮氨酸 抑制苏 氨酸脱 氨酶, 组氨 酸抑制 磷酸核 糖- 

ATP 焦磷酸 化酶, 色氨 酸抑制 氨基苯 甲酸合 成酶等 (见例 5.1)。 信号 2: 第 二信号 是严格 
分 解代谢 途径的 特征, 而且 是能量 代谢的 最终的 (中 间的) 产物 (即 P,, AMP, ADP, 
ATP, NADH, NADPH), 例如, 由 AMP 激活 的产气 肠杆菌 的生物 可降解 性苏氨 酸脱氨 
醇, 或由 P, 抑制 的铜绿 假单胞 菌的生 物可降 解性组 氨酸酶 以及由 AMP 和 GDP 所 解除的 
抑制。 

无定 向代谢 途径采 用两种 通量控 制方式 (即 由终 端产物 抑制, 及由 作为细 胞能量 状态指 
示器 的代谢 物的活 性抑制 )。 当 任何一 个信号 低时, 糖酵解 将继续 进行; 当两 者均处 于正常 
范 围时, 糖 酵解功 能适度 提供, 通过 该途径 的通量 减小。 当然在 一个正 在代谢 葡萄糖 的细胞 
中糖 酵解途 径决不 会完全 关闭, 因为 ATP 持续 不断被 需要。 相应于 12 种前体 代谢物 相互之 
间 以及相 应于生 物合成 需要的 12 种前 体代谢 物生成 速率的 平衡, 包括 了一个 高度复 杂的调 
控 机制。 协调 的需要 超过了 含碳代 谢物; 供能 反应必 须提供 能量和 还原力 (NADH 和 
NADPH 两者 ), 因此, 毫不 奇怪, 在网络 中许多 节点, 这些 化合物 本身是 异构效 应物。 



能荷 (EC) 二 



CATP + 



cadp 



(5.15) 



.21 中 



catp + cadp + Camp 

由式 (5.15) 给 出的能 荷对通 量的协 调控制 及生物 合成前 体的可 利用率 示于图 

通过 腺昔酸 库的实 验测量 所确定 的能荷 可以在 
(全部 AMP) 和 1 (全部 ATP) 之间 变化。 实际 
上, 对 细菌, 这 个值在 0.87~0.95 的 范围内 变化, 
而且 随比生 长速率 改变没 有显著 变化。 一般 说来, 
高水 平能荷 值通常 抑制补 充能量 的酶, 而它 们激活 
利用 ATP 的酸 (例 如生物 合成酶 ), 反之 亦然。 

对氧化 -还原 反应, 存 在一个 类似的 情况, 这时 
反应通 过一个 "还 原荷" 进行 类似的 调控。 吡啶核 
昔 酸用作 H 离子或 还原力 的运输 载体, 而 NAD 主 
要在供 能途径 的氧化 还原反 应中起 作用, NADP 通 

常 用干生 物合成 反应。 在 供能反 应中, 氧 化了的 NAD 是反 应物而 合成反 应利用 NADP 的 
还原 形式。 因 此毫不 奇怪, 在生理 条件下 大部分 NAD 在 胞内以 氧化了 的形式 存在而 NADP 
以还 原形式 存在。 氧 化还原 状态的 有用指 标是分 解代谢 还原荷 (约 0.03〜0.07) 和 合成代 
谢 还原荷 (约高 10 倍)。 



通量 



低 









中间 物水平 


\h 


L: 低 


N: 正常 




H: 高 





能荷 



图 5.21 在调 节无定 向代谢 途径的 速率中 
能荷 与代谢 中间物 浓度之 间的相 互作用 



分 解代谢 还原荷 (CRC) 



合 成代谢 还原荷 (ARC) 



t'NADH 



cnadh + cnad 



C NADPH 



(5.16) 



(5.17) 



C NADPH + CnADP 

ARC 和 CRC 在协 调供能 反应与 生物合 成反应 中都起 着重要 作用, 尽管它 们的作 用不如 
能 荷的作 用那样 清楚。 在大部 分细胞 中四种 供能反 应引起 NADPH 生产以 用于生 物合成 
(两 种在碟 酸戊糖 途径, 一种 是异佇 檬酸脱 氛醇; 一种是 苹果酸 醇)。 CRC 和 ARC 的 调节被 
认 为是通 过转氣 醉而发 生的, 该薛 催化如 下可逆 反应: 

113 



NADP + NADH2 ^=^NADPH2 + NAD 
这 是一个 膜-结 合薛, 它 由质子 驱动力 驱动; 因 此其只 能在具 有能量 的膜上 进行, 该反 
应 的平衡 认为是 由质子 驱动力 来改变 (参 见第 2 章)。 

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第 6 章 途径操 作实例 —— 代谢工 程实践 



大自然 已提供 大量值 得注意 的代谢 途径, 现 存微生 物的多 样性可 证实这 一点。 某 些情况 
下, 在 一特定 生物体 中这些 途径的 组装及 动力学 协调对 于一个 有用的 商业应 用来说 是适合 
的。 然而, 大 多数情 况下, 需 要进行 遗传改 进以使 细胞的 转化反 应及动 力学特 性得到 优化, 
使 之适宜 于实际 需要。 这些改 进是以 目前对 微生物 代谢和 分子遗 传学的 理解来 指导, 而通过 

分 子生物 学技术 和重组 DNA 技 术来实 行的。 转化 途径的 合理转 移已经 在许多 细胞中 产生了 
新 的合乎 需要的 功能, 因此 有益于 制药、 农业、 食品、 化学和 环境等 方面。 

本章, 将 回顾代 谢途径 操作的 应用。 主 要根据 Cameron 和 Tong (1993) 的分类 方法, 
稍加 调整, 将大 量实例 组成五 种基本 类型, 即应用 目的: (a) 微 生物生 产的产 品得率 和生产 
能力; (b) 扩大 生物体 可代谢 的底物 范围; (C) 产生 新的和 独创的 产品; (d) 细胞性 能的总 
体 改进; (e) 异生物 的降解 (xenobiotic degradation )。 结 合本书 上下文 的前后 关系, 综述 
这 些应用 有三个 目的。 首先, 提供一 个可能 性范围 确实非 常大的 样本, 该可能 性是指 由途径 
操作及 代谢工 程所提 供的对 生物催 化剂改 进的可 能性。 特 别提出 本概述 几乎排 除其它 而只集 
中 于工业 应用。 除 了绪论 (第 1 章) 和 一些偶 尔提到 以外, 几乎 没包括 代谢工 程在医 学领域 
的广泛 应用。 原因仅 仅是在 该领域 的大部 分工作 刚刚流 行而不 足以在 本书的 综述中 定形。 然 
而, 所 报告的 进展对 代谢工 程的工 具和方 法的影 响几乎 没有留 下任何 疑问, 这 些工具 及方法 
涉 及在体 内或体 外对组 织和器 官进行 分析, 同时也 为信号 转导途 径的组 织及功 能的合 理设计 I 
提供 基础。 1 

综 述的第 二个目 的是向 读者提 供代谢 途径、 还 有它们 的调控 及与总 体代谢 协调等 方面复 
杂 性的意 识和辨 别力。 这些途 径公认 的复杂 结构的 一个重 要推论 是对它 们系统 分析的 方法并 
不总是 像人们 所希望 的那样 简单。 当我 们在钻 研代谢 通量确 定方法 (第 8 章、 第 9 章)、 研 
究复杂 代谢网 络中的 控制及 代谢通 量扩增 问题时 (第 11 章、 第 12 章), 就会 清楚认 识到这 
一点。 以 同样的 方式, 对细胞 代谢的 状态、 代谢生 产途径 或信号 转导途 径进行 具有代 表性的 ^ 
分 析时, 可能 需要一 批多维 的分析 测量, 这不同 于目前 的实际 做法。 在 大量测 量中真 正辨认 , 
出 类型的 识别将 是一个 挑战, 而通 量分析 会为此 目的提 供一个 有用的 框架。 , 

本综述 的第三 个目的 是强调 那些为 了工业 应用或 医学的 原因, 在细 胞体系 中为实 现所希 , 
望 的变化 所用的 方法。 最成功 的应用 需要对 一个代 谢网络 中多于 一个酶 反应步 骤进行 协调修 
饰, 这将会 变得很 明显。 这对 扩大到 超出一 条简单 的产品 形成途 径和包 括中心 碳代谢 的复杂 
结构 等应用 来说几 乎是必 需的。 我们相 信这将 变成一 个普遍 需求, 因为 研究焦 点逐渐 从高度 
简化的 模型系 统变换 到实际 的工业 或医学 处境的 范围。 正如前 面提及 的复杂 测量的 解释一 
样, 代 谢工程 能对合 理修饰 代谢途 径产生 影响。 

6.1 产品得 率及生 产能力 的提高 

大多数 主要的 工业应 用都可 归于此 类型。 注 意到, 尽 管得率 和生产 能力通 常在不 太严格 《 
时可以 互换, 但 得率和 生产能 力代表 着不同 价值的 数字, 使 它们提 高需要 不同的 策略。 得率 
主 要影响 原料的 成本, 并 受代谢 通量向 有助于 目标产 物生成 的方向 改向所 影响。 另一 方面, 

116 



生产 能力是 生物加 工设备 基本投 资费用 的关键 性决定 因素, 它 可通过 代谢通 量的扩 增而改 
进。 大家 公认, 整个 过程的 优化必 须包括 得率和 生产能 力二者 都关心 的事, 尽 管在某 些情况 
下, 二者的 解耦也 许是可 能的。 生产能 力首先 依赖于 底物吸 收的比 速率, 对大 多数工 业微生 

物 来说, 该值 范围为 0.2〜0.5g 底物 /(g 生物基 质'小 时)。 如果 在生产 条件下 该比吸 收速率 
可以 实现, 那么倘 若副产 品生成 最小, 则 生产能 力在经 济上是 可以接 受的。 在 这些条 件下, 
得率和 生产能 力的优 化方法 可以真 正趋于 一致。 另一 方面, 若 底物吸 收速率 太低, 那 么生产 
能力 的优化 应先从 底物运 输系统 的扩大 开始, 接着进 行通量 改向, 这 已由得 率优化 策略所 
阐明。 

很 明显, 得率和 生产能 力在大 规模、 低 成本工 业生产 中更为 重要。 下面我 们将叙 述目的 
在 于通过 代谢工 程改进 乙醇、 氨基 酸和溶 剂的得 率及生 产能力 所做的 努力。 
6.1.1 乙醇 

乙 醇是一 种重要 的工业 化学品 , 并正显 露出作 为一种 生物燃 料取代 正在耗 尽的化 石燃料 
的 潜力。 此外, 乙醇 对环境 会有有 意义的 影响, 这 是由于 乙醇燃 烧时污 染小, 并且它 还能作 
为原料 生产含 氧燃料 (oxygenated fuel) 。 还有, 因为乙 醇的生 产主要 基于农 产品, 这将加 
快大气 C02 移除的 "碳循 环"。 据 目前的 估计, 到 2010 年, 美国 将进口 50% 以上的 原油及 
其 精制产 品以满 足能源 之需。 从经 济观点 来看, 通 过提供 国内资 源以满 足部分 需要, 乙醇 
(及其 它生物 燃料) 在稳 定能源 价格、 改善 国家能 源安全 及确保 农村和 区域经 济发展 中能够 
起重要 作用。 

乙醇 可由一 些可再 生原料 制得。 包括糖 类作物 (如甘 蔗), 含淀 粉谷物 (如玉 米), 或木 
质纤维 素材料 (包括 农业废 弃物、 草本 作物和 树木等 )。 乙醇过 程经济 学取决 于糖的 费用。 
美 国每年 23 亿升燃 料乙醇 几乎全 是由玉 米生产 
的, 据 估计用 剩余的 玉米每 年还可 生产约 200 亿 
升 乙醇。 在 过去的 10 年间, 乙 醇生产 成本从 1.0 
美元/ L 以上 降至约 0.3〜0.5 美元 /L, 预 计在不 
久的 将来, 其成本 将低于 0.25 美元/ L。 

木 质纤维 素材料 是来源 丰富且 价廉的 一种资 
源, 其 目前的 供应能 够以美 国总的 液体运 输燃料 

消耗量 的同样 规模支 持液体 运输燃 料的可 持续生 
产。 美国国 家可再 生能源 实验室 (NREL) 估计, 
目前 由木质 纤维素 生产的 乙醇成 本约为 0.32 美元 
/L, 这 是基于 每吨干 重原料 价格为 42 美元 的假定 
(National Renewable Energy Laboratory , 1996)。 
这个 平均生 物质成 本相当 于每千 克糖约 0.06 美 
元, 或折算 为生产 乙醇产 品的原 料成本 0.10 美元 
/L。 所 考虑的 木质纤 维作物 作为生 产燃料 乙醇的 
合适 原料, 包 括快速 生长的 树木、 农业或 林业的 
残余物 和各种 各样的 废物, 例 如制架 废物、 废报 
纸和城 巿固体 废物。 木质纤 维素原 料的半 纤维素 
组分 (硬 木材 干重的 25%, 且 主要是 D- 木糖) 的 
有效利 用为降 低燃料 乙醇生 产成本 (约 25%) 提 

117 



木质 纤维素 







酸水解 



醜水解 









\ 


木质素 葡萄糖 木糖 











木质 素加工 







液 体燃料 



发酵 







乙醇 



图 6.1 木 质纤维 素转化 为乙醇 

结晶 状纤维 素是含 量最大 (50%) 和最困 难的部 
分, 是通过 酸法、 醉 法两 个过程 的组合 而水解 
的。 在此 过程中 95% 〜98% 的木 糖与葡 萄糖被 

回收, 这些单 糖接着 由合适 的微生 物转化 为乙醇 



供了一 个机会 (Bull, 1990) o 虽然木 质纤维 素价格 低廉, 但由于 它不能 被人体 消化, 因而 
不 能作为 食物来 竞争, 它不 能被消 化也使 它难以 转化为 可发酵 的糖。 此外, 木 质纤维 素是含 
有 三种主 要组分 (即纤 维素、 半纤维 素和木 质素) 的一 种复杂 结构, 每 一个组 分必须 单独处 
理以充 分利用 生物过 程中固 有的高 功效。 图 6.1 所示为 由木质 纤维素 转化为 乙醇的 一般过 
程。 经 预水解 和水解 处理后 产生的 水解产 物中含 有单糖 (其量 在改变 着), 其存 在形式 包括: 
戊糖 (D- 木糖和 L- 阿拉 伯糖) 和己糖 (见表 6.1)。 水 解产物 中还包 括范围 很广的 物质, 其 
衍 生于原 材料或 在过程 预处理 阶段作 为反应 副产物 而形成 (糖和 木质素 降解产 物)。 在硬木 
和 作物残 余物的 半纤维 素中, 木糖 是含量 最丰富 的糖, 而 在软木 的半纤 维素中 甘露糖 含量更 
丰富。 此外, 自 然界中 木糖的 含量仅 次于葡 萄糖。 单单是 残存在 废纸中 和美国 掩埋式 垃圾处 
理场 的庭院 垃圾中 的糖类 残渣, 经 微生物 转化就 会提供 4000 亿 升以上 的乙醇 (Lyndetal, 
1991), 10 倍 于每年 燃烧的 由谷物 生产的 乙醇。 乙 醇是以 10% 与 汽油混 合后作 为液体 燃料燃 
烧的 (Keim and Venkatasubramanian , 1989) o 

用于发 酵的微 生物必 须能利 用水解 产物中 存在的 所有的 单糖, 还必 须能耐 受可能 存在的 
抑 制剂。 使用最 普遍的 乙醇生 产菌啤 酒酵母 (^ccharomyces cerevisiae) 不能 发酵约 占原料 
80/ &〜 28% 的戊糖 (Ladisch et al, 1983)。 酵母可 通过丙 酮酸脱 羧酶- 乙醇脱 氣酶系 (PDC- 
ADH) 由己 糖有效 地生产 乙醇。 然而, 在木 糖发酵 期间会 积累副 产物木 糖醇, 从而 降低乙 
醇 得率。 另据 报道, 酵母 只能非 常微弱 地发酵 L- 阿拉 伯糖。 为了 开发一 个经济 上能生 存的、 
从生物 质生产 乙醇的 过程, 可以 证明木 糖和其 它半纤 维素组 分的有 效发酵 是最基 本的。 



表 6.1 典型 软木材 (如山 毛榉) 的木质 纤维素 中碳水 化合物 结构的 多聚体 



多聚体 


单 体 


含量 /% 


多聚体 


单 体 


含量 /% 


纤维素 


葡萄糖 


40 


半 纤维素 


葡萄糖 




半 纤维素 


木糖 


30 




半乳糖 






阿 拉伯糖 




木质素 


苯丙焼 


25 




甘露糖 




果胶 


糖酸酸 





在 细菌、 酵母 菌和真 菌中都 能找到 发酵戊 糖的微 生物, 如 柄状毕 赤酵母 (Pidiia stipi- 
tis ) s 假 丝酵母 (Xandida shehatae"} 和管 囊酵母 (^Pacfiysolen tannophilus) 是最有 希望的 
天然存 在的微 生物。 已 经知道 只有少 数几种 细菌确 实具有 重要的 PDC-ADH 途 径生产 乙醇。 
其中运 动发酵 单胞菌 (Zymomonas mobUis) 具有最 活泼的 PDC-ADH 系统; 然而它 不能异 
化分解 戊糖。 近几 年来, 应用代 谢工程 得到重 组细菌 (Alterhum and Ingram, 1989; Feid- 
mann et al, 1989; Ingram et al, 1987; Ohta et al, 1991a, b; Tolan and Finn, 1987a, b) 
和重组 酵母菌 (Hallborn et al, 1991; Kotter et al, 1990; Tantirungkij et al, 1993) 作为 
适宜的 乙醇生 产菌。 最 近的研 究在富 含木糖 的玉米 芯水解 物中比 较了各 种乙醇 生产菌 (包括 
野生 菌和重 组菌) 的 性能, 结果表 明重组 乙醇基 因的大 肠杆菌 K011 (Escherichia coli 
KOll) [大 肠杆菌 上载有 整合到 染色体 上的运 动发酵 单胞菌 U. 画 bilis) 的 pdc 和 adhB 
基因] 是 目前最 好的乙 醇发酵 微生物 (Hahn-H 砲 erdal et al, 1993)。 

最初的 研究在 改变发 酵代谢 途径方 面仅仅 是部分 成功, 如以下 菌种: 菊欧 文氏菌 (£>- 
■winia chrysanthemi) (Tolan and Finn, 1987a, b), 克雷伯 氏杆菌 ( Klebsiella planticola ) 
(Tolan and Finn, 1987a, b) 和大 肠杆菌 (£. coli ) (Brau and Sahm, 1986)。 第一 代重组 
生物 体仅仅 增强了 PDC 活性, 并且是 依赖于 ADH 活性 的内源 水平以 进一步 耦合乙 酸还原 
反应和 NADH 氧 化反应 (见图 6.2)。 由于 乙醇仅 仅是由 这些肠 道细菌 正常产 生的若 干发酵 
118 



产品 之一, ADH 活性 缺乏与 NADH 积累共 同导致 多种不 希望的 副产物 形成。 这个问 题是由 
增加 ADH 活性的 方法解 决的, 通过过 量表达 Z. mo6z7z'5aff/2B 基因, 产生大 肠杆菌 (In- 
gram etal, 1987) 与克雷 伯氏属 (K. oxytoca ) 的 重组体 (Ohta et al, 1991a, b; Wood 
and Ingram, 1992), 它能有 效地发 酵多种 糖生产 乙醇。 这是 通过将 Z. mobilis 基 m 、pdc 
与 adhB"} 装配在 一个人 工操纵 子上, 产 生一个 可携带 的用于 乙醇生 产的遗 传因子 (PET 操 
纵子) 来完 成的。 大肠 杆菌是 一种便 利的宿 主菌, 尤其是 因为它 能在范 围很广 的碳源 (包括 
五 碳糖) 上 有效地 生长。 



葡萄糖 



EMP 




乙醇 



乙酸 




H2 




CO: 



图 6.2 在 丙酮酸 分支点 的竞争 性途径 
縮写 EMP —糖 酵解途 径中的 薛 与中间 产物; PDC —丙嗣 酸脱竣 SI; ADH —乙 醇脱氛 81; 
PFL —丙 嗣酸甲 酸裂合 SS; ACK/PTA —碟酸 转乙酸 SS 和乙酸 激薛; ALDH— 乙 酸脱氢 
FHL — 甲酸脱 氢膀; LDH —乳 酸脱氛 醉; PDH— 丙銅酸 脱氧解 

丙酮酸 脱羧酵 催化丙 酮酸的 非氧化 脱羧化 生成乙 酸和二 氧化碳 (见图 6.2)。 在 大肠杆 

菌中存 在两种 乙醇脱 氢薛同 功酶, 在由 NADH 氧化成 NAD+ 所 伴随的 发酵过 程中, 这些酶 
催 化乙酵 还原反 应生成 乙醇。 在重组 大肠杆 菌中, 需 要把丙 酮酸代 谢转向 乙醇的 两种醇 [丙 
酮酸 脱复薛 (PDC) 与乙醇 脱氣薛 (ADH)] 都以 高浓度 水平存 在着。 这种 酶的高 PDC 水 
平与低 的表观 Km 值 (见表 6.2) 的 组合影 响是为 了丙酮 酸有效 地把碳 流转向 乙醇, 即使是 
在像 乳酸脱 氣酶这 样的天 然发酵 酶存在 时也是 如此。 

表 6.2 比较 大肠杆 菌和运 动发酵 单胞菌 中作用 于丙酮 酸的各 翁 的表观 Km 值 



生物体 


m 


K 




丙銅酸 


NADH 




PDH 


. 4mmol . L — ' 


O.lSmmol-L"' 




LDH 


7 . 2mmol . L — ' 


>0.5mniol"L"' 


大 肠杆菌 (£.0)/') 


PFL 
ALDH 
NADH-OX 


2.0mmol-L~ ' 


SO^mol-L"' 
SOftmol . L 一 1 


运 动发酵 单胞菌 (Z. mobilts) 


PDC 

ADH n 


. 4mmol . L _ ' 


12;imol'L ' 



注: 缩写 PDH— 丙銅 酸脱氢 SI; LDH— 乳 酸脱氢 K; PFL —丙 銅酸甲 酸裂合 SS; ALDH — 乙醒脱 氢醉; NADH- 
OX—NADH 氧化 翁; PDC— 丙 S 酸脱竣 瞎; ADH 11 一乙 醇脱氢 1111。 



119 



含有 pet 操 纵子的 重组大 肠杆菌 在好氧 和厌氧 条件下 都能产 生大量 的乙醇 (见表 6.3)。 
在 好氧条 件下, 野生型 大肠杆 菌通过 PDH 和 PFL (Km 分别为 0.4mmo 卜 L — 1 和 2.0mmol- 
L 一 1, 见表 6.3) 代谢丙 酮酸, 主要产 品为二 氧化碳 和乙酸 (由过 量的乙 醜辅酶 A 转化而 
来)。 Z.mobilis PDC 的表观 Km 值 类似于 PDH 的 Km 值, 但低于 PFL 和 LDH 的 值, 
因此利 于乙酸 生成。 在好氧 情况下 NAD + 再 生主要 产生于 生物合 成以及 NADH 氧化醇 (与 
电子 传递系 统偶联 )。 另外, 由于 Z. mohilis ADH 11 的表观 Km 值比大 肠杆菌 NADH 氧化 
醇 Km 值低 4 倍多, 所以 外源的 ADH n 能 与内源 NADH 库进 行有效 竞争, 因此使 得乙醛 
还原为 乙醇。 在 厌氧情 况下, 野生型 £. «>// 主要经 LDH 和 PFL 代谢丙 酮酸。 如表 6.2 所 
示, 此 两种嗨 的表观 Km 值 分别比 Z. mobilis PDC 的 Km 值大 18 倍和 5 倍。 此外, 参与 
NAD + 再生的 初级代 谢天然 酸 的表观 Km 值在 £. coli 中也大 大高于 Z. mohilis ADH 的表 
观 Km 值。 总的 说来, 在 大肠杆 菌中, 乙 醇基因 Z. 酶的 过量表 达相应 于天然 薛系, 

在打 通到乙 醇的碳 (丙 酮酸) 和 还原力 (NADH) 通量 方面, 具有很 强的竞 争性。 



表 6.3 野生型 和重组 型大肠 杆菌在 好氧与 厌氧生 长时发 酵产物 的比较 



生 长条件 


质 粒 


发 酵产物 /mmol'L_' 


乙 醇 


乳 酸 


醋 酸 


琥珀酸 


好氧 


无 





0.6 


55 


0.2. 




PLO1380- lO(PET) 


337 


1.1 


17 


4.9 


厌氧 


无 


0.4 


22 




0.9 




PLO1380-10(PET) 


482 


10 


1 .2 


5.0 



注: 来自 Ingram and Conway , 1988c 



1991 年 3 月, 佛 罗里达 大学食 品和农 业科学 院为其 创造的 设计精 巧的微 生物获 得美国 
专利 (US 5000000)。 大量的 研究已 经报道 了大肠 杆菌重 组菌株 的发酵 特性。 有代表 性的最 
终乙醇 质量浓 度超过 50g*L — 1 (例 如从 100/ 。葡 萄糖和 8% 木糖分 别得到 54.4g,L — 1 和 41.6g* 
L 一 >) (Ohtaetal, 1991a, b), 与 理论最 高得率 0.5g 乙醇 /g 糖十 分接近 (葡 萄糖— 2 乙 
醇 + 2C02)。 公开发 表的木 糖简单 分批发 酵所得 乙醇的 体积生 产速率 与比生 产速率 分别为 
0.6g 乙醇 'L — ''h — 1 和 1.3g 乙醇 'g (干重 )— I'h — 1 (Alterhum and Ingram, 1989)。 进一步 
的改进 使乙醇 体积生 产速率 提高到 1.8g 乙醇 'L — I'h — 1 (Ohtaetal, 1991)。 由 £. coli 
KOll 发 酵戊糖 (如 柳木和 松木) 生 产乙醇 的成本 估计约 0.13 美元/ L (von Si vers and Zac- 
chi, 1995; von Sivers et al, 1994), 它很 容易使 乙醇最 终生产 成本大 大低于 2000 年 的目标 
0.18美元丄—1。 此外, 含乙醇 基因的 £. «)/ /除 发酵木 糖外, 还有能 力发酵 木质纤 维素材 
料的 所有其 它糖类 组分: 葡 萄糖、 甘 露糖、 阿拉伯 糖和半 乳糖。 当重组 菌株在 通常存 在于半 
纤 维素水 解产物 的混合 糖中生 长时, 先 利用葡 萄糖, 然后 依次利 用阿拉 伯糖和 木糖, 乙醇生 
产接近 最高理 论得率 (Takahashi et al, 1994) o 

最近, Ohta 等研究 的 pck' 和" 基因在 相关肠 细菌产 酸克雷 伯氏菌 meb- 
siella oxytoca ) 中 的表达 (Ohtaetal, 1991a, b)。 与 £: . // 相比, 在克雷 伯氏菌 属菌株 
中 存在着 另外两 条发酵 途径, 将丙 酮酸转 化为琥 珀酸和 丁二醇 (见图 6.2)。 正如在 £. coli 
中 一样, 该菌 可以将 90% 以上 的碳流 从天然 发酵途 径的糖 分解代 谢途径 转向乙 醇生成 途径。 
仅 仅重组 PDC 的 过量表 达产生 了至少 2 倍于 野生菌 的乙醇 水平。 然而, 当在 K. oxytoca 
M5A1 中同 时提高 PDC 和 ADH 的表达 量时, 则 乙醇的 生产是 很快的 和很有 效的: 对于葡 
萄 糖和木 糖两种 碳源, 体 积生产 能力〉 2.0g'L — I'h — I, 得率 0.5g 乙醇 'g— 1 糖, 最终 乙醇质 
120 



量 浓度为 45g'L_i。 
6.1.2 氨基酸 

氣 基酸有 着广泛 的商业 用途, 可作为 食品添 加剂、 饲料补 充剂、 输 注物、 治疗药 剂以及 
作 为肽类 或农业 化学品 的合成 前体。 大多数 微生物 具有利 用碳和 氮源合 成所有 基本氨 基酸的 
代 谢机器 (见图 6.3)。 某些 微生物 还可过 量生产 一种或 一组氨 基酸。 例如 20 世纪 50 年代 
中期, 日本科 学家分 离出一 株能大 量分泌 L- 谷氨 酸的新 细菌, 开辟了 发酵法 生产氨 基酸的 
新纪元 (Kinoshitaetal, 1957)。 在那 以前, 氨基 酸主要 来源是 天然蛋 白质, 少部分 由化学 
合成。 这 种细菌 后来被 命名为 谷氨酸 棒杆菌 (^Corynebacterium glutamicum), 是一 种革兰 
氏阳 性菌, 是 好氧短 杆菌, 能向培 养基中 分泌大 量的谷 氣酸, 在某 些条件 下接近 100g,L_i。 



组氨酸 (C^Nj) 

苯 丙氨酸 (C9N) 
酷氨酸 (C9N3) 
色氨酸 (CmN:) 

丙氨酸 (C3N) 




甘氨酸 (C2N) 
♦ 

丝氨酸 (C;N) 
♦ 



半 胱氨酸 (C3NS) 



丙嗣酸 (C3) ~-(C5) — ^ 缀氨酸 (C5N) 



賴氨酸 (CoNi)- 



DAPCCtN:) 



I 

天 冬氨酸 (C4N)- 



乙 酷辅龍 A(C:) 



亮氨酸 (C^N) 



草 酷乙酸 (C4) 



行懞酸 (C<,) 



苏氨酸 (C4N) 
异 亮氨酸 (C6N) 蛋氨酸 (C;NS) 



a- 嗣 戊二酸 (C 5 > 



脯氨酸 (ON) 
寺 

S "氨酸 (C5N) 
寺 

精氨酸 (Cf,N4) 



图 6.3 由葡 萄糖生 物合成 氛基酸 

DAP —二氨 基庚酸 

谷氨酸 工业生 产的成 功进一 步刺激 了人们 的兴趣 去分离 能生产 其它氨 基酸的 菌株。 野生 
型 谷氨酸 细菌有 只能生 产几种 胞外氨 基酸的 能力, 如谷 氨酸、 缬 氨酸、 脯 氨酸、 谷氨 醜胺和 
丙 氨酸。 为 了所需 氨基酸 的胞外 积累, 需要改 变细胞 代谢和 (或) 调控。 随着 这些菌 株的发 
现, 多年来 人们试 着研究 诱导营 养缺陷 型和调 节突变 型菌株 (见例 5.1)。 利 用营养 缺陷型 
突变株 的理论 基础是 绕过反 馈调控 (见第 5 章), 这可通 过使胞 内反馈 抑制剂 或阻遏 剂的积 
累减 到最小 程度或 通过修 饰抑制 剂结合 位点, 从 而导致 酵对抑 制剂的 存在不 敏感。 例如, 利 
用精氨 酸营养 缺陷型 突变株 可分离 得到鸟 氨酸生 产菌, 一 年后, 又由高 丝氨酸 营养缺 陷型突 
变菌 株分离 到成功 的赖氨 酸发酵 生产菌 (Kinoshitaetal, 1957)。 目前, 大多 数氨基 酸是通 
过 结合营 养缺陷 型和调 控型的 突变菌 株而生 产的。 每年 50 万吨的 L- 谷 氨酸是 用谷氨 酸棒杆 

121 



菌生 产的, 同时, 它的营 养缺陷 型突变 菌株每 年产约 40 万吨 L- 赖 氨酸。 氨基 酸的需 求仍在 
不断 增长。 

鉴于 天冬氨 酸族氣 基酸特 别是赖 氣酸的 商业重 要性, 为了 分离具 有优良 性能的 菌种, 开 
展 了强有 力的菌 种改进 计划。 最初, 这些工 作使用 了随机 变异方 式和营 养缺陷 型选择 步骤, 
该 步骤利 用了已 充分理 解的氨 基酸生 物合成 和调控 的代谢 途径。 野生型 棒杆菌 属由于 苏氨酸 
和赖 氨酸协 同反馈 抑制天 冬氨酸 激酶而 不积累 赖氨酸 (见 10.1.1 节和图 10.1)。 这样, 最 
早的 产赖氨 酸突变 株是高 丝氨酸 脱氣酶 (HDH) 缺乏, 因而是 高丝氨 酸营养 缺陷型 菌株; 
它 不能合 成高丝 氨酸, 故 在培养 基中需 补充高 丝氨酸 或苏氨 酸和蛋 氨酸。 后者 是以一 个可控 
制的速 率提供 以满足 蛋白质 合成的 需要, 同时 允许赖 氨酸积 累到高 浓度。 进一 步改进 包括抗 
S-(2- 氨乙基 )-L- 半 胱氨酸 (AEC, 一种赖 氨酸类 似物) 的 菌株。 因为 AEC 与 赖氨酸 类似, 
它诱 导类似 的抑制 效应, 例如天 冬氨酸 激酶的 抑制和 赖氨酸 合成的 阻止。 抗 AEC 的 菌株中 
显 然含有 解除调 控的天 冬氨酸 激酶, 此 酶不被 赖氨酸 抑制, 因此 就能在 培养基 中积累 大量的 
赖 氨酸。 接下 来的努 力集中 于中心 碳代谢 过程, 试 图将更 多的碳 从呼吸 途径转 人回补 途径。 
为此 目的, 分离出 柠檬酸 合成酶 活性减 弱的突 变株, 并 发现赖 氨酸收 率得到 进一步 改进, 特 
别是 与前面 提到的 HDH 缺乏和 AEC 抗 性两种 表型结 合在一 起时, 情 况更是 如此。 这种方 
法后来 已经应 用于具 有很多 变化的 情况: 得到氟 丙酮酸 敏感型 突变株 (即 丙酮 酸脱氣 酶活性 
减弱的 突变株 ), 丙氨 酸营养 缺陷型 突变菌 株和很 多其它 菌株。 由 于对随 机变异 很差的 表征, 
还有对 谷氨酸 棒杆菌 糖回补 途径的 功能和 调控的 不完全 理解, 因 此任何 声称相 应于这 些菌株 
的 改进, 我们 还不知 道其改 进机制 的确切 性质。 

近 年来, 通过 进一步 的途径 操作, 已 获得了 更有效 的生产 菌株, 例 如通过 消除生 产菌株 
降解产 物的能 力或改 善细胞 通透性 以有助 于目标 产物的 分泌。 几 个研究 组独立 启动了 集中于 
棒杆菌 属菌种 代谢工 程工具 开发的 研究项 目 。 基本的 前提是 由内源 质粒和 有效的 DNA 转移 
系 统获得 的载体 的可利 用性。 在过 去的几 年中, 在 不同的 棒杆菌 属菌株 中已分 离出一 些小的 
隐蔽性 质粒, 并已 开发出 一些新 的有效 的转化 技术。 这就 促进了 从棒杆 菌属中 氨基酸 生物合 
成 基因的 分离, 其 数量约 50 个 [见 Jetten and Sinskey (1995) 的 评论文 章]。 这些 基因可 
以单个 利用, 也可 以组合 利用, 通过 提高酶 活性或 解除关 键酶的 反馈调 节以改 进生产 菌株。 
这些 基因的 使用, 也考 虑到被 用作特 异性探 针以便 阐明氨 基酸合 成的生 物化学 及中心 碳代谢 
(CCM)o 

色氨酸 

在 £. colt 中色氨 酸合成 由一组 复杂的 反馈机 制高度 调控。 通过 一次一 个转导 每个突 
变, 研究 人员在 一个单 一菌内 将一长 串改变 与这些 机理相 结合, 因此创 造了一 株色氣 酸过量 
生产菌 (Aibaetal, 1980; Shio, 1986)。 芳 香族氨 基酸合 成途径 (见图 6.4) 的第 一步, 
由 4- 磯 酸-赤 藓糖与 PEP 转 化形成 3- 脱氧 -D- 阿 拉伯庚 酮糖酸 -7- 憐酸 (DAHP), 这一 步由三 
个 同功酶 (AroF、 AroG、 AroH) 催化, 此三个 酶又分 别由酪 氨酸、 色 氨酸和 苯丙氨 酸所调 
节。 最初的 方法之 一是通 过删除 aroG 和 aroH 来 简化该 系统的 调控。 此外, 通 过突变 
(aroF394) 致使酪 氨酸调 控的酶 (AroF) 对反馈 抑制不 敏感, 并且 通过失 活阻遏 物基因 
UyrR) 以 消除对 该基因 的阻遏 作用。 其它 修饰, 包括切 断产酪 氨酸和 苯丙氨 酸的分 支途径 
(O^A 和 p/jf>A)、 失活 色氨酸 酶基因 (ZmO 以 防止所 合成的 色氨酸 可能的 降解、 通 过使邻 
氨基 苯甲酸 合成酶 (trpE3m 对色 氨酸不 敏感来 减弱色 氨酸分 支途径 的反馈 抑制、 色氣酸 
阻遏物 UrpR) 的 失活、 通 过突变 色氨醜 -ZRNA 合成 酶基因 UrpS") 而破坏 细胞的 衰减控 
122 



制。 工 业用的 £:. co/z' 菌株 (NST100) 在含 葡萄糖 5% 培养基 中培养 24h 后可产 色氨酸 
6.2g*L — 1。 在培养 基中添 加邻氨 基苯甲 酸有可 能提高 色氨酸 得率。 

最近, 一 株能产 18g 色氨酸 'L — i 的谷氨 酸棒杆 菌已改 为生产 大量的 酪氣酸 (26g'L — 1), 
这 是通过 过量表 达解除 调控的 3- 脱氧 阿 拉伯庚 酮糖酸 -7- 磯酸 (DAHP) 合 酶与分 支酸变 
位酵而 实现的 (Ikedaand Katsumata, 1992)。 在先 前的构 建中一 个额外 的基因 (预 苯酸脱 
水醉) 的过量 表达, 导致苯 丙氨酸 占优势 的生产 (28g'L — 1)。 



4- 碑酸 赤藓糖 



PEP 



DAHP 合酶 
一 AroF 
一 AroG 一 
— AroH-^ 



DAHP 



分支酸 



氨 基苯甲 酸合酷 (frp£) 分支酸 变位賴 



邻氨基 苯甲酸 



哪 4 
丙嗣酸 

•NH, 



预苯酸 



tna [ 色氣酸 



1 

预苯酸 脱水雜 


一预 苯酸脱 氢雜" J 


苯 丙酮酸 


对 -1^3 苯 丙酮酸 






( 苯 丙氨酸 ) 〔 酷 M 酸 ) 



图 6.4 芳香 族氧基 酸的生 物合成 
在 £.a>/z 中, 结构 基因构 成一个 操纵子 Urp£DCa4) 从 属于一 个共同 的操纵 基因。 
调 节基因 远离操 纵子, 通 过终产 物色氣 酸反馈 抑制醜 的形成 (阻遏 ) 

丙氛酸 

Uhlenbusch 等人将 球形芽 孢杆菌 (^Bacillus sphaericus) 的 丙氨酸 脱氢酶 (a/aD) 基 
因 引人运 动发酵 单胞菌 、1. mobilis ) 中, 构建 了一株 丙氨酸 高产菌 (Uhlenbusch et al, 
1991), 得 率为每 280mmol 葡萄糖 可生产 丙氨酸 10mmol。 后来通 过添加 85mmo 卜 L— i 氨使 
丙氣 酸产量 提高到 41mrnol, 可以 看出在 此之前 氨显然 是限制 条件。 在此 生产速 率下, 生长 
停 止了, 这也许 是由于 丙酮酸 脱羧酶 (PDC) 与丙氨 酸脱氣 酶间对 丙酮酸 的强烈 竞争。 使 
PDC 辅 助因子 焦磔酸 硫胺素 匮乏, 结 果导致 菌株生 长进一 步受到 抑制, 而使 丙氨酸 产量提 
高 (25h 内达 84mmol)。 

苏氨酸 

虽然, 赖 氨酸和 蛋氨酸 能被经 济地生 产用作 饲料添 加剂, 而 苏氨酸 由于现 有工艺 得率太 
低而不 能满足 需要。 然而, 最近通 过代谢 工程构 建有效 的苏氨 酸生产 菌的工 作取得 重大进 
展。 通过 £. co/z'f/irB 突 变株的 互补, 编 码苏氨 酸途径 前两步 酶的谷 氧酸棒 杆菌基 因被分 
离 出来, 这两 种酶分 别是高 丝氨酸 脱氣酶 (HD) 和 高丝氣 酸激酶 (HK) (Follettie et al, 

123 



1988)。 这 两种基 因形成 一个操 纵子, 它是从 hom 基 因的一 个单一 启动子 上游被 表达的 
(Peoples et al, 1988), /20m 基因是 由蛋氨 酸经一 独特的 衰减体 系在转 录水平 上进行 调节的 
(Jetten et al, 1993)。 苏 氨酸合 成途径 的最后 一步包 括通过 组成型 酶苏氨 酸合酶 (TS) 将磷 
酸高丝 氨酸转 化为苏 氨酸。 最近, 通 过谷氨 酸棒杆 菌营养 缺陷菌 株的互 补得到 了编码 TS 
(thrC) 的基因 (Hanetal, 1990)。 

苏氨 酸生产 是由共 同底物 L- 天冬 氨酸- &半醛 (ASA) 到 两个分 支途径 (苏 氨酸 生物合 
成途 径和赖 氨酸生 物合成 途径) 的 代谢通 量分布 决定的 (见图 6. 5)。 该通量 的分布 由竞争 
性 酶对共 同底物 ASA 的 相对亲 和力所 控制, 竞争 性的酶 为高丝 氨酸脱 氛薛和 二氛吡 P 定二羧 
酸合 成酷。 由 于高丝 氨酸脱 氣酶的 活性对 L- 苏氨 酸的别 构抑制 效应十 分敏感 (K, : 
0.16mmol*L— 1), 因此 在名义 生长条 件下, ASA 优 先进入 赖氨酸 途径。 理解 高丝氨 酸脱氧 
酶对苏 氨酸抑 制的分 子基础 的关键 和构建 苏氨酸 高产菌 的关键 是分离 抗反馈 抑制的 HD 
(HDdf)。 有两 个研究 组独自 分离并 表征了 编码去 除了调 控的、 抗反馈 的高丝 氨酸脱 氧酶基 
因 (Archer etal, 1991; Reinscheid et al, 1991)。 Archer 等 (1^1) 确定了 Aowdr 突变型 



葡萄糖 




乙 醜辅醒 A 




ASA 


horn 


变 丝氨酸 


ihrB 







dapA 



5^ 酸变 丝氨酸 



thrC 



甘 氨酸 



苏氨酸 



ilvA 

ilvBN 

ihC 



异:^ 氧酸 



DHP 



dapB 



ddh 



THDP 



DAP 



赖氛酸 



图 6.5 天 冬氨酸 家族氨 基酸的 生物合 成途径 
缩写 DHP — 2, 3- 二 氢吡啶 -2, 6- 二 羧酸; THDP — 四氣吡 IS 二 羧酸; ppc —憐酸 稀醇丙 酮酸羧 化雜; 
—丙酮 酸羧化 晦; M— 丙酮酸 激嗨; ".vA —天 冬氣酸 激晦; — ASA 脱 氢醜; dupA—DH? 
c/a/>£i— DHP 还 原雜; cW/i — DAP 脱氲 藤; 6'.、A— DHP 脱 羧晦; 一高丝 氣酸脱 氢雜; /ArB— 高 丝氨一 
一 苏氣酸 合嗨; — 苏氨酸 脱水贿 (脱 氨基 H); z7"iiiV— 乙酰 经酸合 成酶, 
乙 酰经酸 同分异 构还原 贜, 二经 酸脱水 醉; ! 转氨 酶 C 

124 



是 由于一 个碱基 缺失, 这从根 本上改 变了接 基末端 结构, 导致相 对于野 生型菌 来说有 10 个 
氨基 酸发生 改变以 及最后 7 个 残基的 缺失。 这 些残基 显然是 苏氨酸 结合位 点的一 部分, 它们 
从 HDdf 突变株 中的去 除致使 HD 醇 活性对 苏氨酸 的反馈 抑制不 敏感。 

为 了研究 ASA 节 点处碳 通量的 调控, 构建了 意义明 确的重 组菌株 (Colon etal, 1993; 
Eikmanns et al, 1991; Reinscheid et al, 1994)。 苏氨酸 基因在 野生型 谷氨酸 棒杆菌 13032 
中的扩 增并没 有产生 任何苏 氨酸的 分泌, 这 也许是 由于苏 氨酸对 天冬氨 酸激醉 和高丝 氨酸脱 
氢 薛的反 馈抑制 (Eikmanns etal, 1991)。 仅 仅去除 调控的 Ao^dr (质粒 pJD4, 见表 6.4) 
的 扩增, 在赖 賓酸和 苏氨酸 途径之 间产生 了近似 相等的 通量分 配以及 苏氨酸 (lOOmmo 卜 
L 一 I) 和高 丝氨酸 (74mmo 卜 L 1) 的胞内 积累, 其导 致如下 结论: 苏 氣酸的 生产可 能是由 
于其流 出量和 (或) HD 与 HK 活力 之间没 有平衡 而受到 限制。 为防 止胞内 高丝氨 酸的积 
累, Col6n 等将 基因与 tac 启 动基因 (质粒 pGC42, 见表 6.4) 融合, 并通 过添加 
IPTG 调控 /K),"dVPto 。〃! 的表达 (Col6netal, 1993; Colon et al, 1995a, b)。 通过提 
高高丝 氨酸激 酶相对 于高丝 氨酸脱 氢酶的 活性, 基本 上消除 了高丝 氨酸的 分泌, 最终 苏氨酸 
滴度 (或 效价) 提高约 120% (见表 6.4)。 



表 6.4 用重组 谷氨酸 棒杆菌 (C\ g! 咖" ic"",) 生产苏 氨酸' ^ 



谷氨酸 棒扞菌 

(C . g/utarnicurn ) 


分泌的 氨基酸 /g*L ' 


赖' 氨酸 


苏氨酸 


高 丝氣酸 


甘氨酸 


异 亮第酸 


AT(X、 21799(pM2)® 


22.0± 1.0 


<0.1 


<0.1 


<0.1 


<0.1 


ATCC 21799(pJD4) 


4.5±0.2 


d 
寸 


2.0±0.1 


2.0±0.1 


1.3±0.1 


ATCC 21799(pGC42) ③ 












没 有诱导 


0.9 ±0.1 


5.6±0.3 


6.7±0.3 


1.3 上 0.1 


1.0±0.1 


l.Smmol I FT (; 


0.9 ±0.1 


U .8±0.6 


<0.1 


4.6±0.2 


1.9±0.2 



① 取自 Colon et al, 1995a. be 

② E . co!i-C . g!i'ta,"k u," 穿梭 载体; rID4, -〃, 操 纵子; pGC42, KmR Ap" /"(/^f /"""dW。"/irB。 
® ATCC 21799 (pGC42) 由适量 已给的 IFRi 所 诱导。 



表 6.4 表明, 大 部分的 苏氨酸 或转化 为异亮 氨酸, 或进 一步降 解为甘 氨酸。 经标 记物交 
换 诱变法 (marker exchange mutagenesis) 构建 意义明 确的〃 突 变株, 防 止了苏 氨酸向 
异 亮氨酸 的转变 (Col6netal, 1997)。 对此, 重 点放在 阻断苏 氨酸进 一步降 解为甘 氨酸。 

这 是一个 更具挑 战性的 难题, 其 包括多 于一条 途径, 这些基 因在棒 状杆菌 中尚未 被表征 C 

异 亮氨酸 

谷氨酸 棒杆菌 (X. g! 咖" ic 謂、 中异亮 氨酸的 生物合 成是从 L- 苏 氣酸经 L- 苏 氨酸脱 
氨基晦 (LTD, ilvA ) 催化 转化为 a- 酮基 丁酸开 始的, 然后 由乙酰 经酸合 臃 (AHAS, //- 
vB-ilvN) 催化 c^- 酮基 丁酸与 a- 乙酰 乳酸的 缩合。 此 代谢途 径也为 另外两 条支链 氣基酸 
(BCAA) 即缬 氨酸和 亮氨酸 的合成 提供前 体物。 尽管 有报道 称在肠 道细菌 中存在 5 种不同 
的 AHAS 同 功酸, 但在 (:. glutamicum 中只 知道有 一种。 LTD 和 AHAS 二 者均受 异亮氨 
酸的 抑制, 而 AHAS 还 受亮氣 酸与顯 氨酸的 抑制。 此外, 这三种 BCAA 都抑制 AHAS 的基 
因 表达。 在棒 状菌属 中参与 BACC 生物合 成的基 因识别 与表征 是在最 近几年 集中研 究的主 
题 (Colbnetal, 1995; Cordes et al , 1992; Keilhauer et al, 1993)。 

通过 与质粒 pGC42 的/ jomdf 与/ ArB 基因组 合及/ 基因 (质粒 pGC77, 见表 6.5) 
的 扩增, 可以实 现异亮 氨酸过 量生产 (见苏 氨酸情 况)。 编码 苏氨酸 脱水醜 的棒杆 菌仏, A 
基因通 过一株 £. coli ilvA 突变株 的异源 补充, 从一 个基于 pM2 的谷 氨酸棒 杆菌基 因组文 

125 



库 中分离 得到。 所产生 的质粒 (pGC77), 当插 入赖氣 酸菌株 (ATCC 21799) 时, 生产 
亮 氨酸约 15g*L — 1, 同时 也有少 量的赖 氨酸和 甘氨酸 生成。 碳 平衡表 明先前 转化到 苏氨酸 
赖 氨酸、 甘 氨酸和 异亮氨 酸的大 部分碳 (菌株 21799/pGC42) 现 在通过 新菌株 (21799 
pGC77) 结合进 异亮氨 酸中。 

表 6.5 重组 谷筻酸 棒杆菌 (C. glutamkum ) 生 产异亮 氣酸① 



谷氨酸 棒杆菌 



分泌的 氨基酸 /g'L — 



(C . glutainicum ) 


赖氣酸 


苏氣酸 


高 丝氣酸 


甘氨酸 


异 亮氣酸 


ATCC 21799(pM2) 


22.0± 1.0 


<0.1 


<0.1 


<0.1 


<0.1 ^ 


ATCC 21799(pGC42) 


0.9±0.1 


11.8±0.6 


<0.1 


4.6±0.2 


1.9±0.2 


ATCC 21799(pGC77)® 


0.4±0.1 


<0.1 


<0.1 


0.5±0.1 


15.1±0.2 



① 取自 Cokrn et al, 1995。 

② 由 pGC42 ( 见表 6.4) KmR ApR /ag/" hom"^' ilvA tac-thrB 派生。 

6.1.3 溶剂 

丙酮、 丁醇 和乙醇 (ABE) 工业 发酵生 产史可 追溯到 20' 世 纪初。 由于 缺乏天 然橡胶 
英 国商行 Strange 和 Graham 调查 了生产 合成橡 胶的可 能性。 后来确 定合成 橡胶的 前体丁 
'烯 和异 戊二熾 可由丁 醇或异 戊醇成 功生产 出来。 正是 在此形 势下, Perkins 教授和 他的助 
Chaim Weizmann (后来 他成为 以色列 第一任 总统) 被 招募来 研究橡 胶前体 的化学 生产。 
管 Weizmann 是学化 学的, 但 他不久 便得出 结论: 这一过 程成功 的关键 是通过 发酵, 于是他 
将 自己再 教育成 为一名 微生物 学家。 在 1912〜1914 年间, 他筛 选了几 株细菌 菌株并 从中成 
功分 离出一 株菌, 最 初称为 BY, 后 被称为 丙酮丁 醇梭菌 (Clostrid 画 acetobutylicum ), 
该菌 由淀粉 生产可 使丙酮 和丁醇 的得率 最高。 

由 于第一 次世界 大战的 爆发, 作为 硝化纤 维素胶 体溶剂 的丙酮 需求量 大增, 使 ABE 发酵 
过 程的发 展加速 进行。 第二 次世界 大战导 致丙酮 需求量 进一步 增长, 发 酵底物 从玉米 改为糖 
蜜, 因为在 20 世纪 30 年代 这种原 料丰富 廉价。 第二次 世界大 战后, ABE 发酵业 开始衰 退而且 
在美国 和英国 实际上 已停止 生产, 这是因 为出现 由石油 生产的 溶剂, 且 糖蜜价 格不断 上涨。 

ABE 发酵 过程的 衰亡是 由于一 些自身 系统的 限制造 成的: 如 终产物 浓度、 得率 和生产 
能力都 很低, 不合 适的溶 剂比, 相 对高的 原料成 本等。 微 生物溶 剂生产 菌的基 因工程 可潜在 
地振兴 ABE 发酵 过程, 这需强 调如下 挑战: 

* 提 高产品 收率, 并以 木质纤 维素或 废弃原 料作为 底物; 

* 开发在 连续和 固定化 细胞系 统展现 高生产 能力的 菌株; 

* 开 发最终 产物浓 度高且 增强了 对最终 产物耐 受性的 菌种; 

* 开发 容易调 节溶剂 比例的 菌种。 

在溶剂 形成的 开始, 几种溶 剂基因 醇的诱 导表明 溶剂形 成的基 因控制 是非常 重要的 
(Bennett and Rudolph, 1995; Sauer and Duerre, 1995)。 然而, 尽管 与几种 酸及溶 剂有关 
的基 因已经 克隆和 测序, 但代 谢通量 调控机 制的理 解仍然 是很困 难的。 已为一 些梭菌 菌株开 
发出一 些遗传 工具, 例 如质粒 载体。 其中 包括: (1) 克隆运 载体, 利用 与大范 围宿主 结合的 
粪 肠球菌 {Enterococcus faecalis) 的 pAM/31 复 制子, 或 枯草芽 孢杆菌 (^Bacillus subtiUs) 
的 pIM13 复 制子; (2) 合 适的选 择标记 物是红 霉素或 clarinthromycin, 其 在低的 通用的 pH 
中是稳 定的; (3) 在表达 载体构 建中已 经开发 利用了 高度表 达的梭 状芽孢 杆菌属 QClostrid- 
ium) 铁氧 还原蛋 白启动 基因; (4) 结合 转座子 Tn916、 Tn925 和 Tnl545 在梭 菌中起 作用, 
126 



二 轻丙兩 

(DHA) 



因此转 座子突 变是可 能的。 大量 的梭菌 基因在 coli 中已 被克隆 和研究 (Bennett and 
Rudolph, 1995; Durre et al, 1995; Papoutsakis and Bennett, 1991), 等候 用于梭 菌的基 
因 -失活 生理研 究中。 

丙酮丁 醇梭菌 (X . acetobutylicum) 中 酸和溶 剂形成 基因首 次成功 克隆是 1992 年报道 
的, 其用 于菌种 ATTC 824 中乙 醜乙酸 脱羧薛 (adc) 和磷酸 转丁酰 醉 (pth) 的异 源过量 
表达 (Mermelstein et al, 1992) (见图 2.8)。 随着 B . subtilis/C. acetobutylicum 穿梭载 
体 (pFNKl) 的 发展, 连同 一个改 进了的 电转化 方案, 做 到这一 点是可 能的。 乙酰 乙酸脱 
羧酵 (AADC) 是 丙酮生 产途径 中的末 端薛, 它把乙 酰乙酸 转化为 丙酮和 C02。 磯酸 转丁酰 
酶 (PTB) 是丁 酸生产 的分支 点薛, 把丁 醜辅酵 A 与无机 磯酸转 化成丁 酖磷酸 (随 后再由 
丁 酸激酵 转化成 丁酸) 和还 原辅醉 A。 或以 另外的 方式, 丁酰辅 薛 A 经两步 薛催化 过程转 
化为 丁醇。 重 组菌中 AADC 活力 在指数 期提高 9 倍多, 在 稳定期 提高了 33 倍多, 而 工程菌 
PTB 活力 在指数 期提高 20 多倍, 稳定 期提高 40 多倍。 经转化 的菌株 表明了 丙酮、 丁醇、 
乙醇的 水平分 别提高 95%、 37% 和 90%。 此外, 工程菌 中发酵 终点的 酸浓度 比对照 组低得 
多 (低 22 倍), 而且重 新设计 的菌种 由葡萄 糖为原 料的溶 剂收率 提高约 50%。 

在一不 同的研 究中, 通 过改变 C. a«>toZmO^/z'c«/w NCIMB 8052 的底物 范围, 证 明了在 
梭菌中 遗传操 作的可 行性: 将含 有取自 C. acetobutylicum 的 ce/C 和 tWA 基 因的人 工操纵 
子 转移到 NCIMB 8052 菌 株中, 产生的 转化体 能以地 衣淀粉 (一种 /?- 聚糖) 作为惟 一碳源 
进行 生长。 

1,3- 丙二醇 

1,3- 丙二醇 (1,3-PD) 是化 学和聚 合物合 成中的 一个中 间物, 例如 在聚氨 酯与聚 酯的合 
成中。 其目前 由石油 生产, 而且 相对于 类似的 二醇, 其 生产成 本十分 昂贵。 Tong 等 (1991) 
最 近构建 了一株 丙 二醇生 产菌, 它 携带着 来自肺 炎克雷 伯氏菌 (^Klebsiella pneu- 
moniae) dha 调 节子的 基因。 在 肺炎克 雷伯氏 菌中的 调节 子能使 菌体在 甘油培 养基上 
厌 氧生长 并产生 1,3-PD。 E. coll 中不含有^^/2" 系统, 如果 没有一 个外 源电子 受体, 其不 
能在甘 油培养 基上厌 氧生长 ,也 不产生 1,3-PD。 在 第一步 (见图 6. 6), 甘 油在以 Bi2 为辅 



甘油 脱水酸 

(dhaB) 



轻丙薛 



NADH 
NAD' 



NADH 
. NAD+ 



1,3- 丙二醇 

氧化 还原酶 (</>wn 



二 轻丙酮 

鶴、 dhalO 




DHA-P 



J 



1,3- 两二醇 



图 6.6 甘油在 K. pneumoniae 中的异 化途径 
在 E. colt 中/ C. pneumomae 的 dhaB 和 c^/wT 基 因的克 隆得到 一株重 组菌, 
其 能将甘 油转化 为工业 上有用 的产品 1,3- 丙二醇 
DHA-P — 磯酸二 经丙銅 



} 

油 

甘 



D 



127 



酶的 脱水醇 作用下 转化为 3- 经基 丙醛, 然 后在以 NAD 为 辅助因 子的氧 化还原 SI 作用 下还原 
为 1,3- 丙 二醇。 

在 £. coli AG1 中 构建的 K. pneumoniae ATCC 25955 基因组 文库, 增 加了在 甘油和 
二 轻丙酮 上厌氧 生长的 能力, 并篩 选用于 1,3- 丙 二醇的 生产。 从产 1,3- 丙 二醇的 £. coli 菌 
株 中分离 到點粒 pTCl, 并 发现它 具有与 tZ/za 调节 子的四 个基因 相关的 嗨催化 活性: 甘油脱 
水酶 (MaB), 1,3- 丙二 醇氧化 还原酶 (dhaTh 甘油 脱氛醉 (dhaD) 和 二经丙 酮激酶 
(dhaK) (见图 6.6)。 这四 种酶的 活性均 可通过 甘油的 存在而 诱导。 当 £. coli AGl/pTCl 
在复 合培养 基加甘 油上生 长时, 1,3- 丙 二醇对 甘油的 得率为 0.46mo 卜 mol_i。 主要的 发酵副 
产物是 甲酸、 乙酸和 D- 乳酸。 1,3- 丙二醇 发酵为 研究一 个外源 宿主中 生化途 径的相 互作用 
及 为代谢 途径工 程发展 策略提 供了一 个有用 的模型 系统。 

该 领域还 需进一 步发展 以满足 最小化 副产物 形成、 消 除甘油 补充的 需要, 还要扩 大底物 
范围到 丰富的 可再生 物质。 最 大理论 收率为 0.875mol l,3-PD/mol 甘油, 这 一结果 表明收 
率还能 提高。 由于 需要还 原力的 再生, 因此没 有一种 微生物 能将甘 油全部 转化为 1,3-PD 和 
C020 细胞 通过形 成一个 副产物 混合物 (如 乙酸、 甲 酸等) 而^^还原力 (NADH) 再生, 因 
此 实质上 将最大 理论得 率降至 0.667mo 卜 mol — 1。 原 则上, 有可 能用戊 糖或己 糖补充 甘油发 
酵以 提供还 原力的 另一个 来源。 这些过 程的理 论得率 (每 摩尔甘 油可得 1,3-PD 的量, 以摩 
尔计) 概 括如下 (Tong and Cameron, 1992): 

- 2glycerol - glucose + 21, 3-PD + 2acetate + 2formate = ( 理 论得率 = 1 . Omol • mol — 【 ) 

(甘油 ) (葡 萄糖) (乙酸 ) (甲酸 ) 

一 Sglycerol 一 3xylose + 5 1,3-PD + Sacetate + 5formate = (理 论得率 = 1 .Omo 卜 mol 一 【) 
(木糖 ) 

用 携带有 K. pneumoniae dha 调 节子的 £. coli 菌 株进行 中试, 在加有 共同底 物的甘 
油中 生长, 确实 提高了 1,3-PD 收率: 仅 甘油为 底物, 收率为 0.46mo 卜 mol — 1; 甘油 + 葡萄 | 
糖为 底物, 收率为 0.63mo 卜 mol — 1; 甘油 + 木糖为 底物, 收率为 0.55mol'mol — i。 这 些提高 
在经 济上是 十分重 要的, 因为葡 萄糖和 木糖的 价格明 显低于 甘油的 价格。 

6.2 扩大底 物范围 

该 领域的 大部分 工作集 中于工 程菌以 便利用 木糖和 乳糖, 木 糖是半 纤维素 生物质 中的主 
要五 碳糖, 乳 糖是乳 品工业 主要副 产品, 其 它一些 努力考 虑了另 外一些 丰富的 碳源如 乳清、 

淀 粉和纤 维素的 利用。 一般 说来, 微 生物菌 种利用 一系列 碳能源 能力的 扩大提 供了在 设计中 if 
增 加的适 应性, 并改进 了发酵 过程的 经济可 行性。 这一 点对一 些大宗 产品生 产来说 特别重 

要, 因其 底物费 用在总 生产成 本中占 了相当 大比例 (对乙 醇约占 6096 〜65%, 赖氨酸 
40%〜45%, 抗生 素和工 业用藤 25%~35%)。 由 于大多 数微生 物分享 大量共 同代谢 途径, 
因此 扩大底 物范围 通常只 需添加 少数几 个酶反 应步骤 即可。 然而, 有时 这些步 骤需要 与下游 
反应 协调, 而且 正是在 这种情 况下, 代谢工 程工具 确实是 非常有 用的。 
6.2.1 戊 糖代谢 生产乙 醇的代 谢工程 

在 向肠细 菌中引 人乙醇 基因的 同时, 类似的 工作也 在着手 进行, 以 便在乙 醇生产 野生菌 
S. cer^ex^fw'ae 和 mobilis 中构建 组成戊 糖代谢 途径。 通常, 微生物 经两条 独立路 线将木 
糖 代谢为 木酮糖 (见图 6.7)。 由木糖 异构酶 所催化 的一步 途径在 细菌中 是很典 型的, 而包 
括木糖 还原酶 和木糖 醇脱氣 酶的两 步反应 通常存 在于酵 母中。 木酮糖 接着被 ATP 磯 酸化, 
128 



经戊 糖碟酸 途径和 EMP (糖 酵解) 途径 (或 ED 途径, 如 Z. 等菌 体中) 发 生分解 

代谢。 最近 儿年, 编码木 糖利用 瞎的基 因已在 £. CO// 和其 它一些 细菌中 被克隆 和表征 

(Lawlis et al, 1984; Rygus et al, 1991)。 分离能 利用木 糖的野 生乙醇 基因微 生物的 努力还 
没 有取得 成功, 这 些为向 生物体 导人木 糖利用 基因提 供了原 动力。 这些 生物体 主要是 用于乙 
醇 生产, 这样就 会有高 的乙醇 抗性的 优点。 



木糖 异构瞎 




木酮糖 


木酮 糖激睡 


5-«5 酸木 酮糖 





NADH 
木糖醇 脱氢酶 



碑酸戊 糖途径 
I 

EMP (或 ED) 
途径 
丄 



乙醇 



图 6.7 在细菌 和酵母 中的木 糖代谢 



酵母 



尽 管某些 类型的 酵母, 例如 Pachysden tannopliiius 、 柄状毕 赤酵母 {Pichia stipitis") 或 
Gznc^/ 丄 等酵 母菌可 以发酵 木糖, 但是与 S. «>ret;7'.s/a^ 等 普通的 发酵葡 萄糖的 酵母相 
比, 它 们的乙 醇得率 很低且 乙醇耐 受力也 很低。 最初, 试图在 S. cerevisiae 中克 隆来自 £. 
coli (Sarthy et al, 1987) 或 B. subtilis (Hollenberg and Sahm, 1988) 的木糖 异构酶 基因, 以 
引人 一步木 糖代谢 途径, 结果 由于在 重组宿 主细胞 中异源 蛋白质 的失活 都没能 成功。 

在大部 分酵母 菌和真 菌中, 木糖 还原薛 和木糖 醇脱氢 醉分别 依赖于 NADPH 和 NAD 
(图 6.8)。 然而, 有这样 的一些 例子, 酵 母木糖 还原酶 (例 如来自 P. stipitis 和 C. she- 
hatae) 具有双 重辅酶 特异性 (即 NADPH 与 NADH) 。 这种类 型的酶 有防止 NAD/NADH 
氧 化还原 系统不 平衡的 优势, 尤其是 在限制 氧的情 况下。 最近, P. 、中 对于木 糖还原 

醇 和木糖 醇脱氢 薛 的基因 被导人 S. cerevisiae (菌株 H) 中 (Kdtter et al, 1990; Tan- 
tirungkij et al, 1993)。 尽管 P . i 力'/ n'fz's 在厌 氧条件 下将木 糖主要 转化为 乙醇, 但 重组菌 S . 
cerevisiae (菌株 H) 的乙醇 生产处 于很低 的边缘 (2.7g*L — 1), 伴随着 大量的 木糖醇 的累积 
(35g*L — 1)。 观察 到好氧 条件下 乙醇得 率和生 产能力 较高, 这可 解释为 改进了 NAD 从 
NADH 的 再生, 进而刺 激了木 糖醇脱 氢酶。 在 S. cer6>t,/.、7'a^^ 中木糖利用能力附加的限制也 
归因于 非氧化 PPP 的低效 无能, 如 7- 磷酸- 景天庚 酮糖的 积累所 显示。 

试图 对细胞 经随机 突变和 菌种蹄 选来进 一步改 进菌株 H, 使 所说的 细胞能 在木糖 培养基 
上迅 速生长 (Tantirungkij et al, 1994)。 有趣 的是, 菌株 IM2 在木糖 培养基 中生长 速率比 
菌株 H 快 3 倍, 这 表明了 木糖还 原酶和 木糖醇 脱氢醇 二者的 活力都 很低, 但 木酮糖 激酶的 
比 活性高 1.5 倍。 然而, 尽 管较高 的生长 速率, 但菌株 IM2 乙醇生 产勉强 改进到 4.2g* 
L — i, 收率为 0.08g'g — i。 

运 动发酵 单胞菌 {Zymomonas mohilis) 

对 于乙醇 生产菌 Z. mobUis^i 义、 木 糖也会 是一种 有用的 碳源。 运动发 酵单胞 菌是一 
种 杆菌, 是生产 含酒精 饮料的 天然发 酵剂, 已 经表明 其乙醇 生产能 力高于 酵母。 总之, 这表 
现出作 为生产 乙醇的 理想催 化剂所 尝试的 很多所 希望的 特性, 例如高 的乙醇 得率、 选 择性和 
比生产 能力、 对低 pH 值 和高乙 醇浓度 耐受力 强等。 在葡萄 糖培养 基中, Z. mobilis 产 ZM 
水平至 少可达 12%(w/zO, 得率 高达理 论值的 97%。 与酵母 相比, 展 现收率 

129 




图 6.8 重组菌 S. cerevisiae 中厌氧 木糖利 用与辅 助因子 的再生 
縮写: EMP — 糖酵解 途径; PPP —戊 糖憐酸 途径; XR — 木糖还 原酶; XDH —木 糖醇脱 氛酵; XK- 木 i*】 搪激 91; 

GAP— 3- 碟酸甘 油酵; F6P — 6 -憐 酸果糖 j 

高出 5%〜10%, 体积 生产能 力大于 5 倍。 该菌引 人注目 的高得 率归因 于发酵 期间减 少了生 

物 菌体的 形成, 其 显然受 ATP 可利 用性的 限制。 注意, 该菌经 ED 途径 [见 反应式 (2.6) 
和方框 6.1] 每摩尔 葡萄糖 仅产生 Imol ATP, 而 酵母菌 (EMP 途径) 每 摩尔葡 萄糖产 
2mol ATPo 事 实上, 发 酵单胞 菌属是 至今惟 一被确 认为仅 限于厌 氧利用 ED 途径的 菌属。 
此外, 葡萄糖 能以促 进扩散 方式很 容易地 穿过细 胞膜, 被高度 活跃的 丙酮酸 脱羧瞎 / 乙醇脱 
氢 雜系统 有效地 转化为 乙醇。 该菌属 被公认 为是一 种安全 (GRAS) 微生物 而用作 动物饲 I 
料。 正 如前面 所述, 此 微生物 的主要 缺陷是 它只能 利用葡 萄糖、 果糖和 庶糖, 因此不 能发酵 
可广泛 利用的 戊糖。 • 

上述 情况导 致美国 国家再 生能源 实验室 (Golden , CO) 的 Zhang 等人 试图在 Z . 
mo6z7z's 中引 人一条 戊糖代 谢途径 (Zhang etal, 1995)。 早期其 它一些 研究组 尝试用 取自克 
130 



雷 伯氏菌 {Klebsiella) 或黄 单胞菌 (^Xanthomo 廳") 的木糖 异构薛 (xylA) 和木酮 糖激嗨 
(xylB) 基因 (见图 6.7), 尽管 这些基 因能在 Z. moZ>z7/5 中进行 功能性 表达, 但并 没有真 
正 成功。 后来不 久就清 楚了, 这些 失败是 由于在 Z. mo6f//.s 中 不存在 可觉察 的转酮 糖酵和 
转酸 糖鱒的 活性, 而这些 醇活性 对完成 一条功 能性戊 糖代谢 途径是 必要的 (见图 6.9)。 在 
克隆了 £. co/z 转酮 糖雜基 因并将 其引入 Z. mobilis :t 后, 小部分 木糖转 化成了 C02 和乙 
醇 (Feldmannetal, 1992)。 下一 步是要 引入转 酵糖薛 反应, 因 为该菌 体胞内 积累了 大量的 
7- 磯酸- 景天庚 酮糖。 应用精 密的克 隆技术 构建一 个携带 有两个 独立操 纵子的 嵌合型 穿梭载 
体 (pZB5): 其中一 个操纵 子编码 £. coli xylA 和: rjy/B 基因, 另一 个表达 £. coli 转酮糖 
酵 itktA) 和转 酲糖酶 Ual) 的 基因。 含有 4 个 木糖同 化和无 氧化性 的磷酸 戊糖途 径基因 
的 两个操 纵子成 功地在 Z. CP4 中进行 表达, 该 重组菌 有能力 在以木 糖为惟 一碳源 

的 培养基 上快速 生长, 而 且可有 效地将 葡萄糖 和木糖 转化为 乙醇, 对木 糖和葡 萄糖的 得率分 
别 可达理 论值的 86% 和 94%。 对前 面所讨 论的在 £. coli 中表达 Z. mobilis PET 操 纵子生 
产乙 醇来说 是一个 互补的 方法。 



1— 木兩糖 



-XDH- 









—— 


木糖醇 





-XR- 



木糖 



XK 



5- 碑 酸核糖 — I 



-TK-* 



酸 甘油薛 — I 



碟酸 木酮腌 *J 7- 5^ 酸 -景天 庚酮糖 J 



— TV— 



r 酸果糖 



51? 酸 赤藓糖 



6- 53? 酸果糖 



TK 



•BI 酸 甘油薛 



丙酮酸 



乙薛 



乙醇 



图 6.9 用代 I. 程菌 Z. mohilis 由 戊糖生 产乙醇 
縮写: XR —木 糖还原 81; XDH —木搪 醇脱氛 解; TK 一转銅 糖解; TA —转 薛糖騎 



方框 6.1 重 组发酵 单胞菌 株基于 木糖的 理论乙 醇得率 

此重组 菌中乙 醇生产 的化学 计量学 (见图 6.8) 可总 结如下 [忽略 NAD (P) H 的 
平衡] : 

3 木糖 + 3ADP + 3P,— 5 乙醇 + 5C02 + 3ATP + 3H2O 



131 



于是, 乙 醇理论 得率为 0.51g 乙醇 'g— 1 木糖 (1.67mo 卜 mol_i)。 值得 重视的 是经过 
代谢 工程的 途径从 Imol 木糖 仅生成 Imol ATP, 与通 过戊糖 磷酸和 EMP 两条途 径的组 
合 相比, 后者 Imol 木糖 可生成 5/3mol ATP。 能量 限制导 致形成 较少的 生物菌 体量, 进 
而 使底物 向产物 有效地 转化。 

6.2.2 纤维素 -半纤 维素解 聚作用 

如果能 利用木 质纤维 素生产 乙醇的 微生物 也有能 力利用 纤维素 、 半 纤维素 及相关 的碳水 
化 合物, 这 会是非 常吸引 人的。 许 多植物 致病菌 (软 -腐 细菌) 例如 胡萝卜 软腐欧 文氏菌 
{Er-winia carotovora) 和菊欧 文氏菌 (^Erwinia chrysanthemi) 已经 进化有 复杂精 密的水 
解酶 和裂解 酸系。 该酶系 有助于 木质纤 维素的 增溶, 允 许它们 浸软并 渗入植 物组织 (Kado, 
1992) 这些 细菌的 基因工 程用于 生产乙 醇是一 个有吸 引力的 选择, 它 可取代 化学法 或薛法 
对 木质纤 维素生 物质的 增溶。 用 PET 操 纵子对 £. carotovora SR38 和 E. chrysanthemi 
EC16 进 行基因 工程, 结果 表明可 从纤维 二糖、 葡萄 糖和木 糖高效 地生产 乙醇和 C02 作为初 
级发 酵产物 (BealUnd Ingram, 1993)。 这两 种含乙 醇基因 的欧文 氏菌属 (^Erwinia") 菌株 
在 48h 以 内可由 lOOg'L — 1 纤 维二糖 生产约 50g'L — 1 乙醇, 乙醇 最大体 积生产 能力达 1.5g' 
L 一 i*h— 1。 此速率 是所报 道的利 用纤维 二糖的 酵母菌 Bre"am)m:yce5CM5«er5fz' 生产乙 醇速率 
的 两倍多 (Spindler et al, 1992)。 - 

沿着 类似的 路线, 也尝试 着将糖 化特性 导入乙 醇生产 菌中。 从 嗜热菌 C. thermocellum 
中 获得的 编码木 聚糖酶 的基因 (、r_ywZ), 在乙醇 基因菌 £. coli KOU 和 oxytoca M5A1 
(pL01555) 高细胞 质水平 被表达 (Burchhardt & Ingram, 1992)。 木聚糖 薛 是一种 热稳定 
酶, 它将木 聚糖解 聚为其 主要的 单体物 (99%)- 木糖。 为了增 加培养 基中木 聚糖薛 的量, 以 
利于 木聚糖 水解, 在 一个二 级循环 过程中 使用单 一基因 工程菌 进行高 分子原 料发酵 生产乙 
醇, 收集 含木聚 糖酶的 细胞, 并将它 们加到 60t: 的木 聚糖溶 液中, 从 而从细 胞中溶 解并释 
放出木 聚糖酶 以进行 糖化。 冷却至 30t: 后, 水 解物发 酵生产 乙醇, 与此 同时, 再补 充木聚 
糖酶以 进一步 糖化。 在 这种应 用中, 发现 K. ar:vtoai 是 一株优 良菌, 因为 除木糖 (£. co/i 
可代 谢的) 之外, 它 也能消 耗木二 糖和木 三糖。 尽管 M5A1 (pL01555) 的最 大理论 得率超 
过了 48g'L — 1 乙醇 /(lOOg'L — 1) 木糖, 但 是该过 程只达 到最大 得率的 1/3, 因 为该菌 体不能 
代 谢木四 糖和更 长的低 聚物。 得率 显然是 由工业 木聚糖 的可消 化性所 限制, 而 不是由 于木聚 
糖醇 活性的 缺乏及 乙醇的 毒性。 

6.2.3 乳 糖和乳 清利用 I 

乳清 (WHEY) 是 乳品工 业一种 营养丰 富的副 产物, 它可 为生物 工艺过 程提供 廉价的 
碳源和 氮源。 乳清 中含大 量乳糖 (干 重的 75%) 和 蛋白质 (12%〜14%), 还 含有少 量有机 
酸、 矿物 质和维 生素, 其年 产量达 10iikg。 虽然乳 清中的 蛋白质 经分离 浓缩用 于食品 (见图 
6.10), 但在 渗透物 中的乳 糖和盐 类利用 价值低 而常常 废弃。 这 除了造 成有用 营养物 的浪费 
外, 对其 处置也 需要很 高的污 水处理 费用。 于是人 们正在 强化努 力以寻 找乳清 尤其是 渗透物 
利 用的新 方法。 图 6. 10 归纳 了一些 利用乳 清副产 物为原 料的发 酵过程 举例。 

尽管 许多微 生物可 以利用 乳清, 但工 业上最 重要的 一些微 生物如 S. cerevhiae 、 Z. 
wo6z7/.、 和真养 产碱菌 (Alcaiigeneseutrophus) 却不 能利用 乳清。 乳 糖的利 用需要 有分解 
代谢醇 i9- 半? L 糖昔酶 (由 /acZ 基因编 码), 以便 将乳糖 二糖水 解为其 组成糖 葡萄糖 和半乳 
糖。 此外, 与葡 萄糖和 半乳糖 分解代 谢途径 一起, 一个 有效的 乳糖运 转系统 也是需 要的。 这 
132 



牛乳 




乳制品 





80% ~ 90% (质量 ) 



乳糖: 4%^5^A 

蛋白质 : 0.7»/。 

脂 K : 0.3% 

无 m 盐 : 0.4% ""^0.5% 

水溶性 维生素 



~~ 废 物利用 ~ 

高化学 需氧量 
(COD:60〜80 g/L) 




乳清 




蛋白 





薛水解 

(膀 蛋白 薛) 



肽类 



水解 
f 半 乳糖苷 薛 



葡萄糖 / 

半乳 糖糖^ 



食品方 面应用 *J 



好 氧发酵 



厌 氧发酵 



各 种发酵 



厌 氧消化 



生物质 乙醇 
n 甘油 
脂类 丙酮 

fei I I TBI 

图 6.10 发酵过 程中乳 清组分 的利用 (von Stockar and Marison, 1990) 

些需要 在早期 的工作 中是明 显的, 这 些工作 包括: 从 小肠结 肠炎菌 (^Yersinia enterocoUti- 
ca) 将乳糖 转座子 Tn951 (包 含有 /ac/, /acZ 和 /acY 基因: 见第 5 章有关 /czc 操纵子 部分) 
导入 Z. mobilis 中 (Carey et al, 1983; Goodman et al, 1984)。 尽管 £ . coli 半 乳糖苷 
醇在 该菌株 中成功 表达, 但乙 醇得率 比理论 值要低 得多, 原因 至少有 两点: 第一, 乳 糖虽由 
/9- 半乳糖 昔酶切 为葡萄 糖和半 乳糖, 但 重组菌 Z. mo6f/f5 只利 用葡 萄糖发 酵生产 乙醇, 而 
半乳糖 不断累 积到抑 制浓度 (Yanaseetal, 1988)。 这表 明除乳 糖操纵 子外, 还需要 半乳糖 
操 纵子。 第二, 很低的 乙醇生 产能力 是由于 乳糖吸 收慢造 成的。 后 来的研 究利用 Tn951 在 
嗜糖假 单胞菌 (Pseudomonas saccharophila ) 和真养 产碱菌 (Alcaligenes eutrophus ) 中表 
达 i9- 半乳 糖昔酶 (Pries etal, 1990)。 这使得 P. saccharophila 的转 结合体 (transconju- 
gam) 可 在乳糖 无机培 养基上 缓慢生 长而其 原菌株 完全不 生长。 质粒 pPL76, 包含 着一个 
A. 启动基因-/0^^融合, 能使 A. 不 仅表达 /?- 半乳糖 苷酶, 还 能在乳 

糖 培养基 上缓慢 生长。 随后, 又将 £. co/f ga/ 操 纵子转 入这些 菌株中 以允许 利用半 乳糖。 

E . colHacZY 橾 ijk 子 (编码 /?- 半乳糖 昔酶和 乳糖通 透酶) 也被整合在 P.sf>iV(^//2onas 
aeruginosa 的染色 体上, P. aeruginosa 是生物 表面活 性剂鼠 李糖脂 的重要 生产菌 (Koch et 
al, 1988)。 转 结合体 (transconjugant) 在乳糖 培养基 (基础 培养基 + 乳清) 中生长 良好, 
并在稳 定期生 产鼠李 糖脂。 在噬菌体^^^)启动基因控制下, £. a;///cicZY 基 因也被 插人野 
油菜黄 单胞菌 (^Xanthomonas campestris) 中, X. campesfW.s' 是一种 给世界 范围内 农业造 
成巨大 损失的 细菌, 但 它可用 来生产 黄原胶 (Fu and Tseng, 1990)。 通常, 都是利 用葡萄 
糖、 蔗糖 或淀粉 培养基 生产黄 原胶。 然而, 该重 组菌表 达了高 水平的 /?- 半乳 糖昔酶 并在包 

133 



氨基酸 
乳酸 、 乙酸 
佇樣酸 

黄原胶 



生物气 (CH4) 



含既糖 为惟一 疾源的 培养基 中生长 良好: 已经 对以^ 糖或 稀乳清 为原料 用工程 菌生产 黄原胶 

进行了 评价, 结 果发现 用这些 底物生 产黄原 胶与用 葡萄糖 为原料 的产量 相当: 这些实 例显示 

出一些 极具吸 引力的 过程, 其 在处理 工业废 物的同 时可生 产出十 分有用 的物质 C 

另一 种可供 选择的 策略是 构建一 株菌. 它能向 培养基 或周质 中分泌 半乳糖 昔酵, 而 

乳 糖在此 可自由 扩散: 应用 此法于 酵母, 通过表 达来自 黑曲霉 (Aspergi!!us niger) 的分泌 
^、 热稳定 性好的 A 半 乳糖昔 酶基因 〔lacA") 而 构建一 株利用 乳糖的 S. cerevisiae 菌 
(Kumar et al. 1992): 研究 证实, 有 40% 的 重组蛋 白分泌 到培养 基中, 使 S . 能 
在乳清 渗透物 (4%TrA; 乳糖) 中 生长, 倍增 时间为 1.6h: 与 早期的 乳清发 酵过程 相比, 
该方 法具有 明显的 优点: 早 期的过 程或是 利用, 半乳糖 苷酶预 水解的 乳清, 或是将 酵母与 
:半 乳糖昔 酶共固 定化: 

完整的 £. coll 乳糖操 纵子曾 被插入 氣基酸 生产菌 C. glut 纖 cm" R163 中 (Brabetz et al, 
1991): 带有/^基因的重组(:. g/z^tomioi/Ti 在强 启动基 因的控 制下. 在 以乳糖 为惟一 碳源的 
特定 培养基 (3%if/t ,;) 中迅速 生长: 生 长特征 (与在 葡萄糖 培养基 的生长 没什么 区别) 取 决于除 
ZflcZ 以外/ ory 基因 (乳 糖通 透酶) 的 存在: 此外, 醇分析 表明, 所 有的& 半乳糖 昔酵活 性都是 
胞 内的: 不过, 该体 系的主 要缺陷 在于细 胞不能 利用? L 糖 中另一 种单糖 —— 半 乳糖。 
6.2.4 蔗 糖利用 

^糖 f 由 葡萄糖 和果糖 组成的 双糖) 是另一 种资源 丰富、 价格 低廉的 碳源, 其在 甘荒废 
糖蜜中 常见。 尽 管某些 £. a>/z 菌株 能利用 蔗糖, 但氨 基酸工 业极有 潜力的 生产菌 £. coli 
K-12 却 不能在 蔗糖中 生长: 许多研 究人员 试图表 达其它 菌种的 蔗糖利 用系统 (Scr+), 但却 
不能在 £. co/z K-12 中稳定 地保持 Scr— 表型: 最近, 一个 尝试从 下述方 法获得 成功: 将 £. 
coli B-62 中 编码蔗 糖酵的 5crA 基因 克隆在 一个质 粒上, 然后将 克隆的 DNA 片 段转到 £. 
coli K-12 染色 体上。 表达 scrA 基因的 £. coll K-12 衍生 的色氨 酸生产 菌株在 蔗糖培 养基中 
生长 良好, 与在葡 萄糖上 生长的 类似菌 株相比 (Tsunekawa et al, 1992), 它 分泌了 大量色 
氨酸 (5.7g'L— 1)。 
6.2.5 降解 淀粉的 微生物 

由 玉米、 谷物等 再生资 源获得 的淀粉 是生物 工艺过 程中十 分重要 的碳源 和能源 物质。 淀 
粉代替 葡萄糖 不仅能 降低发 酵原料 成本, 并 且可以 减至最 小甚至 消除葡 萄糖引 起的负 面生理 
效应, 如 分解代 谢阻遏 或产酸 

淀粉是 1> 葡萄 糖的直 链和支 链均聚 物的混 合物, 这些均 聚物直 链由! >葡 萄糖经 a (1-4) 
糖苷键 连接, 在分 支点由 a (1—6) 糖昔键 连接: 作为植 物体中 糖 物质, 淀粉 大量存 在于薯 
类 作物和 小麦、 玉米、 大麦、 高梁等 作物种 子中: 线性组 分直链 淀粉由 a-l,4-t> 吡喃型 葡萄糖 
的链 组成, 聚合度 范围是 10^〜(4/^105)。 在分 支组分 支链淀 粉中, 由 (17~23 个 单位) a- 
l,44>P|t 喊塑葡 萄糖组 成的短 链通过 a (1-*6) 糖昔 键连在 一起形 成分支 结构, 其聚合 度范围 
约为 10^~(4X10 7 )- 重要 的分解 淀粉醇 有四种 类型: a- 淀 粉薛、 ,3- 淀 粉酵、 支 链淀粉 薛 或异 
淀粉瞎 (晚 支藝) 以及糖 化醇: a- 淀粉 醇是内 切葡聚 糖酶, 可随 机切断 a (1-4) 糖 昔键, 将 
淀粉 转化为 糊精. 麦芽 糖和葡 萄糖: a- 淀 粉酵主 要产自 细菌和 真菌, 尤 其是杆 菌属、 假单胞 
属、 現杆 菌属及 曲霉属 菌种: 淀粉驊 通常存 在于植 物中, 它是一 种外切 葡聚糖 薛, 可 从淀粉 
分 子非还 原端开 始连续 地切下 麦芽糖 单位。 支链 淀粉薛 和异淀 粉薛属 于脱支 SI 族, 可水解 a 
(1—6) 糖 昔键: 糖化 酵是一 种真菌 薛, 其从淀 粉分子 非还原 端移走 葡萄糖 残基。 

因 为多数 微生物 不能降 解这种 葡萄糖 生物聚 合物, 故工 作的重 点集中 于将淀 粉水解 SI 基 
134 



因克 隆到不 同菌体 (Kennedy etal, 1988)。 这种 方法提 供了一 个很有 吸引力 的替代 目前过 
程的 方法。 目前 的过程 是先用 酶法把 淀粉转 化为葡 萄糖和 一些低 聚糖, 然后将 其作为 一个独 
立发酵 步骤的 碳源。 沿 着这条 路线, 构 建了一 株含有 Aspergillus sp . 糖化酶 基因的 S. 
cerevisiae 菌株 (Innisetal, 1985)。 这 株重组 菌能够 在淀粉 糊精中 生长, 尽 管与培 养基中 
加有 糖化薛 的情况 相比, 其生长 速率要 慢些。 

这种重 组菌有 益的应 用还包 括酿造 业和烘 焙业。 酿 造上, 大 麦淀粉 在制麦 芽过程 中部分 
水解, 产 生大量 不能被 S. «7"6>Z;Z5Z'«^^ 菌发酵的糊精。 这些糊 精含高 热量, 在 生产浅 色啤酒 
时必 须将它 除去, 目前是 通过外 加糖化 醇来完 成的。 因此, 具有 淀粉水 解特性 的工程 菌为酿 
造业提 供了一 个合适 的替代 选择, 尤 其是在 生产低 热量产 品时。 另外, 这种菌 还可消 除某些 
面包 生产中 对富含 a- 淀 粉酶的 面粉的 要求。 

具 有上述 所希望 的特性 的菌株 最近已 经构建 成功, 它是 通过在 S. ceret^fsz'ae 菌 中表达 
酵母&/1^^1"^'0^3^65 0〔&^^6»"&//5 a- 淀粉酶 (AMY1) 和 糖化酶 (GAM1) 基因而 进行的 
(Hollenberg and Strasser, 1990)。 比较性 的酶催 化研究 表明, 工程化 的淀粉 水解系 统像原 
来的 S. oca't/er2Za/z5 菌一样 有效。 在液化 小麦粉 发酵过 程中, 与通常 的在发 酵之前 先加糖 
化 醇的酒 精酵母 相比, 这种 重组菌 具有同 样的乙 醇生产 速率。 

6.3 扩 展产物 范围, 增加 新产品 

这对代 谢工程 来说是 一个具 有巨大 潜力的 领域。 异源基 因的合 理表达 可扩展 宿主生 物体中 
现有 的代谢 途径, 以便大 量生产 已知的 和全新 的有吸 引力的 化学和 (或) 物理性 质的化 合物。 

6.3.1 抗生素 

由微生 物生产 抗生素 是其更 有意义 的性能 之一, 尤其 是从医 学和商 业的角 度来看 更是如 
此。 已从 微生物 >f 分离出 10000 多种 抗生素 和类似 的生物 活性代 谢物。 同时, 每年还 公布约 
500 种新的 低分^ 量化 合物。 从 金融财 政看, 抗生 素目前 是最重 要的一 类微生 物生物 技术产 
品, 全世界 年销售 额超过 150 亿 美元。 主 要品种 包括: 头孢 菌素、 青霉 素和四 环素, 并且这 
些 药剂的 大部分 是由链 霉菌属 (和 其它放 线菌) 及不 同杆菌 生产。 尽管 相当数 量的抗 生素在 
农 业上和 兽医中 应用, 但其 主要的 用途还 是人类 感染性 疾病的 治疗。 

抗生 素是由 次级代 谢途径 产生, 次级代 谢途径 比初级 代谢以 不太专 一的、 有时更 复杂的 
方 式利用 共同代 谢物。 例如, 聚酮化 合物抗 生素由 简单的 脂肪酸 经一条 表面上 类似于 形成长 
链脂肪 酸的代 谢途径 生成, 但是所 产生的 化合物 呈现出 一系列 结构复 杂性, 远 远超过 基本脂 
肪 酸简单 的碳氣 化合物 骨架。 最近, 已经变 得非常 明显, 包括抗 生素的 次级代 谢物的 得率也 
可通过 基因技 术消除 生物合 成速率 控制步 骤的方 法得以 提高。 此外, 代 谢工程 技术已 被用于 
修饰 已知抗 生素以 改进它 们的性 质及合 成新的 抗生素 (Summers etal, 1992)。 多 年来, 用 
丝状真 菌和链 霉菌属 生产抗 生素是 通过随 机诱变 / 蹄 选的方 法来改 进的, 在很 少的情 况下是 
通 过选择 高产抗 生素的 初级代 谢前体 物突变 株来改 进的。 跨跃四 十年的 工作开 发的生 产菌种 
是不太 情愿通 过这些 传统技 术来改 进的。 

重组 DNA 技术 的应用 是基于 /?- 内醜 胺生产 菌遗传 转化系 统和生 物合成 基因克 隆的发 
展。 转化重 要工业 微生物 (例如 P. chrysogenum 和 C. acremonium ) 的能力 为生物 合成途 
径 的精确 操作提 供了一 个强有 力的工 具和实 际应用 方法, 例如对 可能限 速步骤 的基因 剂量研 
究或 基因破 坏以改 变最终 产品。 研 究发现 许多抗 生素基 因是成 簇的, 而 且相关 途径的 某些基 
因表 现出交 叉杂交 现象, 此发现 为该领 域开辟 了一些 新的研 究途径 (Charter, 1990)。 基因 

' 135 



成 簇便于 克隆, 并且这 些基因 通常受 正调控 的事实 增加了 通过基 因调节 分子的 过量表 达来提 
高生 产的可 能性。 例如, 在野生 型菌株 中过量 表达这 些调节 基因引 起了链 霉素、 十一 院基灵 

菌红 素和放 线菌紫 素的超 量生产 (Charter, 1990)。 

链霉菌 属在具 有工业 重要性 的微生 物中排 名接近 最高, 尤 其是作 为抗生 素的生 产菌。 放 
线菌 紫素生 物合成 基因是 从菌种 Streptomyces coelicitor (是 遗传 背景十 分清楚 的惟一 菌属) 
转人 浅青紫 链霉菌 、 Streptomyces lividam") 中的, 从而 能使后 者生产 放线菌 紫素。 后来又 
将 Sfre/)tom3ces ^>o;《/ireMS 中的 成簇红 霉素基 因转人 S . lividans 中, 使重组 菌生产 红霉素 

A。 真 菌粗糙 脉孢菌 、M€urospora cr 瞧") 和 黑曲霉 (^Aspergillus niger) 与 含有产 黄青霉 
菌 (^Penicillium chrysogermm") 的青 霉素生 物合成 基因的 點粒的 转化, 导致 由这些 菌种生 
产青霉 素丫。 

通 过代谢 工程提 高得率 已在一 些系统 中得到 证明。 例如, 通过在 产黄头 孢霉属 
iCephalosporium acremonium ) 中过 量表达 cefEF 基因, 使 头孢菌 素产量 提高了 15 96 
(Skatrud et al, 1989)。 该 基因编 码一个 具有顺 序表现 活性的 双功能 蛋白: 去 乙醜氧 基头孢 
菌素 C 合成酶 和去乙 酰基头 孢菌素 C 合成酶 (DACS)。 重组 菌由于 DACS 雜活性 增加两 
倍, 因而 能将大 量分泌 的一个 前体物 青霉素 N 转化为 终产物 头孢菌 素(:。 这 项工作 也识别 
出头 孢菌素 C 合成 途径中 最后一 步反应 是潜在 的控制 步骤, 其 对应的 酶是去 乙酰基 头孢菌 
素 C (DAC) 乙 酰基转 移酶, 因 为在培 养基中 观察到 相当数 量的去 乙酰头 孢菌素 (DAC)。 

重组 DNA 技术 也能用 于制造 杂交的 甚至全 新的抗 生素。 当然, 在 这样的 应用中 主要的 
根 本的障 碍是生 产菌对 新抗生 素有抵 抗力, 才能 达到高 得率。 在 不同生 物体中 生物合 成步骤 
的基因 可以在 同一生 物体中 组合, 因此, 就扩 展了天 然抗生 素的多 样性。 起先, 将菌种 
Streptomyces coelicitor 中合 成放线 菌紫素 途径克 隆了的 部分转 入一株 生产麦 迪霉素 的链霉 
菌中 (Hopwoodetal, 1985)。 该重 组菌生 产一种 杂交抗 菌素, 被 称为麦 迪紫素 (meder- 
rhodm)o 天 然的麦 迪霉素 转变为 麦迪紫 素的过 程中包 含一个 i3- 经基化 步骤, 且假定 该步由 
具有 很宽的 底物专 一性酶 的异源 /?- 经基化 活性所 催化。 McAlpine 等已 使用一 种类似 的策略 
去转化 Saccharopolyspora erythmea 的 一个突 变株, 其在 红霉素 生物合 成的一 个初期 步骤由 
来自 竹桃霉 素生产 菌抗生 链霉菌 ( Streptomyces antibioticus ) 的 DNA 文库 所阻断 
(McAlpine et al, 1987)。 其中一 支重组 菌产生 一种具 有新结 构的抗 生素, 称为 2-norery- 
thromycin。 在 产生新 抗生素 中的一 个更大 挑战超 出单一 基团的 取代, 还包括 其主链 结构的 
改变。 菌株 加利利 链霉菌 (^Streptomyces galilae"" 通常生 产阿克 拉霉素 A 和阿克 拉霉素 

B, 随后 用聚酮 化合物 合酶基 因对其 转化, 获得生 产蒽醌 的克隆 (Baneletal, 1990)。 这些 
激 动人心 的结果 为将来 合理设 计及合 成新抗 生素不 断进行 的努力 提供了 基础。 

6.3.2 聚酮 化合物 

在 许多生 物体中 发现了 聚酮化 合物, 尤 其是在 一类丝 状细菌 —— 放线菌 中量特 别多。 聚酮 
化合物 家族是 具有抗 菌性质 (如 四环 素和红 霉素) 和药 理性质 (如 抗癌 制剂和 免疫抑 制剂) 的 
生 物活性 分子。 这 些分子 的合成 包括称 做聚酮 物合酶 (PKS) 的 巨型模 块酶。 聚 酮化合 物是由 
简单脂 肪酸经 一条表 面上类 似合成 长链脂 肪酸的 途径生 成的, 但所 得化合 物展现 了一系 列复杂 
的 结构, 该 结构远 比生物 脂肪酸 的简单 碳氣骨 架复杂 得多。 与脂肪 酸生物 合成的 一个主 要区别 
在 于最初 的缩合 (/?- 酮基酸 还原、 脱水、 氢化) 不 是按常 规方式 进行, 而 是依赖 于所给 聚酮物 
合醜 的模块 结构。 在脂 肪酸合 成中, 每 合成一 轮增加 一个乙 酰基以 产生无 支链的 长链, 而在每 
轮 引人的 碳基被 还原为 CH2。 而 在聚酮 化合物 生物合 成中, 所添加 的单元 常大于 乙酰基 (如丙 

136 



二酸单 酰辅酶 A), 并且每 个缩合 步骤于 延伸着 的链上 增加两 个碳, 而添 加单元 的剩余 部分从 
主链 伸出作 为一个 分支。 一些 碳基完 全不被 还原, 另一 些仅被 还原为 CHOH。 

将聚 酮化合 物作为 代谢工 程中一 个诱人 的研究 模式的 原因包 括如下 几点: (1) 它 们的复 
杂 结构产 生于以 多种方 式组合 的简单 单元; (2) 薛 催化剂 (PKS) 的模 块结构 允许酸 结构控 
制, 进 而聚酮 化合物 的类型 能在基 因水平 上进行 控制。 本 领域最 近的进 展已经 建立了 通过聚 
酮物合 醉的基 因工程 产生新 型聚酮 化合物 结构的 基础, 同 时也为 获得阐 明聚酮 化合物 合薛的 
结构- 功能关 系的知 识奠定 了基础 (Kao, 1997; McDaniel et al, 1993)。 此外, 该系 统提供 
了 在遗传 学和化 学之间 建立桥 梁的好 机会, 而且最 重要的 是使科 学家在 DNA 水平上 合理设 

计新分 子成为 可能。 

由 红色糖 多孢菌 ( Saccharopolyspora erythrea ) 生产 红審素 

由 S. erythrea 生产的 这种聚 酮化合 物产品 仅涉及 3 个巨 基因, 其 中每个 都编码 一个分 
ORF1 ORF2 ORF3 



模块 



模块 2 



模块 3 



模块 4 



模块 5 



模块 6 



AT ACP KS AT KR ACP KS AT KR ACP) KS AT ACP KS AT DH ER KR ACP) KS AT KR ACP KS AT KR ACP TE〉 



s 


S 


1 

CO 


CO 

1 


1 


CH— CHj 


1 

CHj 


CHOH 











s 



CO 
CH— CH3 



CHOH 
I 

CH— CH3 

CHOH 
I 

CH2 
I 

CH, 



S 



CO 
CH— CH3 



I 

CH— CH3 
I 

CHOH 
I 

CH— CH3 
I 

CHOH 

I 

CH2 
CH. 



S 



CO 

I 

CH— CH3 



CH2 
I 

CH— CH3 

C=0 
I 

CH— CH3 
I 

CHOH 
I 

CH— CH3 

CHOH 

CH2 
I 

CH3 





I5CH3 

图 6. 11 红色糖 多孢菌 (^Saccharopolyspom erythrea ) 中 红霉素 A 生物合 成基因 的组织 
DNA 区分 为三个 开放阅 读框架 (ORFs), 每个编 码一个 大的复 杂的醇 分子。 依次 每个薛 又可分 为两个 模块, 每 
个 连续模 块为增 长链添 加一个 新的丙 酸基团 (方框 中)。 亚 单元: St 基 转移解 (AT). 酸基载 体蛋白 (ACP)、 
;?- 銅 酷銑基 -ACP- 合成酶 (KS)、 嗣 酯醜基 -ACP- 还原 81 (KR)、 脱水騎 (DH) 以及娣 酸基 还原雜 (ER) 

137 



子 量大于 300kDa 的 蛋白质 (Caneetal, 1983, 1987)。 每个蛋 白质依 次由两 次不准 确的重 
复所 组成, 因 此可分 为六个 模块, 如图 6.11 所示。 每个 模块含 有至少 六个单 功能多 肽的组 
合, 每个相 应于一 个反应 步骤: 酰基 转移酶 (AT)、 酖基载 体蛋白 (ACP)、 i9- 酮酯醜 基- 
ACP- 合成薛 (KS)、 ; 3- 酮 酯酰基 -ACP- 还原酶 (KR)、 脱水醜 (DH) 以及' 烯酰 基还原 囀 
(ER) (见图 6.11)。 一个有 趣的和 / 或 许是所 期待的 观察, 是这 些基因 中的一 些与脂 肪酸生 
物 合成途 径的基 因高度 同源。 关于这 类组织 令人着 迷的是 新分子 可以通 过这些 基本模 块的组 
合和 变换而 产生, 也可 以在功 能域内 通过点 突变来 产生。 自然界 通过这 种同样 的技术 已经产 
生了聚 酮化合 物的巨 大的多 样性。 代 谢工程 在该领 域的主 要贡献 是通过 所谓的 "遗传 设计" 
来设 计目前 已知或 未知的 具有潜 在用途 的分子 的化学 结构。 

在 过去几 年中, Khosla 及 其同事 们集中 注意力 于解释 聚酮化 合物合 成薛的 规律, 是通 
过 开发一 个链霉 菌素宿 主-载 体系统 以表达 重组聚 酮化合 物合酶 (PKS) 而 进行的 (Kao, 
1997; McDaniel et al, 1993)。 这 项工作 导致提 出一个 "最 小聚 酮化合 物形成 系统" 的概 
念, 该 小系统 包括缩 合酶、 酰基 载体蛋 白和丙 二酸单 酰辅酶 A 转移酶 (McDaniel et al, 
1994) o 其 它蛋白 质可以 起如下 作用: 或 作为决 定链延 长程度 的链长 因子, 或 作为指 导链环 
化 方式的 环化酶 (Hutchinson and Fujii, 1995)。 最近, 用包 括最小 系统的 PKS 基因 的多种 
组合转 化的链 霉菌属 菌株, 已生 产了一 些聚酮 化合物 分子, 这些 为组合 生物合 成法铺 平了道 
路 (Shen and Hutchinson, 1996; Tsoi and Khosla, 1995)。 对这 些代谢 物的表 征已为 PKS 
基 因编程 方面提 供了新 的理解 (方框 6.2)。 

方框 6.2 最小聚 酮化合 物形成 系统和 PKS 编程规 则举例 

S . coelicolor A3 (2) 是一株 遗传背 景非常 清楚, 能产 蓝色聚 酮化合 物放线 菌紫素 
的放 线菌。 act PKS 基 因族已 被克隆 并全部 测序, 此外, 通 过同源 重组删 除整个 act 簇 
而构建 了一支 S. oWzVo/or 菌株 (CH999)。 再 用携带 有不同 PKS 基因 组合的 "最 小" 
基 因族的 质粒转 化该突 变株, 以阐明 PKSs 达到其 高度专 一性的 机制。 

例如, 重组菌 CH999/pRM37 表 达一个 "最 小" act PKS 基 因簇, 同 时对丁 省霉素 
item) PKS 表达 了一个 最小基 因系列 (见 下图: AT, 酰基转 移酶; ACP, 酰基 载体蛋 
白; KS, /?- 酮 酯酰基 -ACP- 合 成酶; KR, 酮 酯酰基 -ACP- 还 原酶; CYC, 环 化酶; 
OMT, 0- 甲基 转移酷 )。 放线 菌紫素 、act、 PKS 在 9 次 缩合环 化后催 化链的 终止, 而 
tern (PKS) 在 9 次 环化后 做这些 事情。 人们 发现这 种特殊 菌株可 以产生 两种新 的芳香 
聚酮化 合物, 其结 构已由 1H 和 i 3 C NMR 确定。 通过 利用不 同的最 小基因 簇已对 类似的 
实 验进行 重复, 并对所 得的聚 酮化合 物进行 了识别 和结构 分析。 

放线菌 紫素聚 酮化合 物合醇 (act PKS)" 最小" 基因簇 I 
模块 1 模块 2 



KR I I KS AT ~~ 〉 CLF' 



丁省 霉素聚 酮化合 物合酷 ( tern PKS ) "最 小" 基因簇 



模块 1 模块 2 





从这 些研究 得出一 些主要 结论概 括如下 (McDanieletal, 1993)。 
* 链的 长度是 (至少 部分) 由一 种特定 蛋白所 支配, 这种特 定蛋白 被称为 "链 长决 
定 因子" (chain length determining factor) (CLF)。 

* 一 些异源 酮合酵 / 想象 的酰基 转移薛 (KS/AT) 的 CLF 对产生 功能性 PK_Ss, 但 
其它 的对是 单一功 能的。 

* 酰 基-载 体蛋白 (ACP) 能在 不同合 成酵之 间相互 交换, 且不影 响产物 结构。 

* 一种特 定的酮 还原酵 (KR) 还原 不同长 度的聚 酮化合 物链, 这很可 能是在 完整的 
聚 酮化合 物链已 经合成 之后进 行的。 

• 不管链 的长度 如何, 这种 酮还原 薛 从接基 末端开 始还原 C-9 穀基。 
* 第一次 环化的 区域专 一性由 KS/AT 和 (或) CLF 控制。 

* 催化第 二次环 化反应 的特定 环化醇 (CYC), 显然能 在不同 长链的 中间体 及其还 

原 程度之 间进行 识别。 

这些 发现, 为在这 些复杂 体系中 结构- 功能关 系的系 统研究 奠定了 基础, 并为 基于最 
小 聚酮化 合物形 成系统 而合理 设计新 聚酮化 合物分 子提供 依据。 

随着对 PKS 策略 进一步 解释, 可以 预期: 组合 方法所 产生的 PKS 系统将 允许聚 酮化合 
物库的 合成, 该库 包括数 千个新 分子。 这 些库进 而可对 具有任 何性质 的分子 (从药 物到材 
料) 进行 蹄选。 显然, 模块 PKS 研 究的未 来几年 很可能 是非常 令人兴 奋的, 特别是 当人们 
考虑到 这些迷 人的薛 系统的 丰富多 样及工 程潜力 时更是 如此。 
6.3.3 维生素 

维生素 C 

已商 业化的 维生素 C (抗坏 血酸) 前体物 2- 酮 基-葡 萄糖酸 (2-KLG) 的生 产包含 两步发 
酵 过程。 首 先利用 草生欧 文氏菌 {Erwinia herbicol" 将 葡萄糖 转化为 2,5- 二酮 -I> 葡萄 糖酸, 
随后 再经棒 杆菌属 {Corynebactenum sp .、 菌发酵 转化为 2-KLG。 为将此 两步发 酵过程 变为一 
步 过程, 用编码 2,5-DKG 还原瞎 (DKGR, 其催化 2,5-DKG 转化为 2,5-KLG) 的 Cbo/^eAac- 
i^n'"w 菌基因对草生欧文氏菌进行遗传转化 (Anderson etal, 1985; Grindley et al, 1988) (见 
图 6.12)。 在优化 培养条 件后, 这些重 组£>^7>»'" 菌在 120h 内 生产约 120g'L— i2-KLD, 基于 
葡萄糖 的摩尔 收率约 60%。 随后的 研究显 示了代 谢工程 菌生产 维生素 C 潜在 的经济 优势, 并 
已申 请了一 系列美 国专利 (Anderson et al, 1991; Hardy et al, 1990)。 

生物素 

对 于许多 微生物 和动物 来说, 生 物素是 一种基 本的营 养素。 它作为 多种酵 的辅助 因子参 
与 脂肪酸 和碳水 化合物 代谢, 被用于 动物饲 料和工 业发酵 过程的 一种添 加剂。 目前, 生物素 
是通过 复杂而 昂贵的 化学合 成法生 产的。 尽管 目前经 济上仍 有利于 化学合 成法, 但生 物素微 
生物 生产过 程的进 一步改 进使生 物转化 法比现 有技术 更具竞 争性。 Barker 等 最先在 £. coli 
菌中 描述了 由庚二 酸辅酶 A (pimelic-CoA) 合 成生物 素的代 谢途径 (Barker and Campbell, 
1980), 并且 识别出 球形芽 孢杆菌 (B. sphaericus ) 中参与 庚二酸 (pimelic acid) 生 物素合 
成的 所有酵 (Izumietal, 1981)。 B. sp/^aer/cMS 分泌大 量生物 素合成 途径中 间体的 发现导 
致在 此菌中 分离到 Z^/o 基因。 这些基 因参与 生物素 合成, 并组织 为两个 基因簇 和 
bioDAYB, 最近 这些基 因已被 克隆在 £. ro// 载体上 (Gbecker et al, 1990)。 用这 些基因 
转化的 £. "; // 菌生产 了高达 457mg*L— 1 的生 物素和 350mg'L_i 的 生物素 中间体 (sabatiS 

139 



et al, 1991) 



Envinia herbicola 



Corynebacterium sp. 



CHO 



HO- 



-OH 



COOH 
■OH 



HO- 



-OH 
-OH 



COOH 
=0 



COOH 



HO- 



■OH 
-OH 



HO- 



-OH 
-OH 



CH2OH 
G 



CH2OH 
GA 



CH2OH 
2-KDG 



-OH 
=0 



CH2OH 
2,5-KDG 



COOH 



HO- 



OH 
OH 



CH2OH 
2-KLG 



Envinia herbicola fDKGR 
图 6.12 葡萄糖 (G) 生物 转化为 2- 酮基 -L- 葡 萄糖酸 (2-KLG) 

包含 草生欧 文氏菌 (^Erwitiia herbicola) 和棒 杆菌属 (^Corynebacterium sp.) 的两步 发酵法 与基于 £. herbicola 
表达异 源二銅 -D- 葡萄搪 酸还原 SI (DKGR) 的 一步法 比较。 
中间 产物: GA —葡萄 糖酸; 2-KDG — 2- 兩基 -D- 葡萄 糖酸; 2,5-DKG — 2,5-二酮基-0-葡萄糖酸 

维生素 A 

另 一个应 用代谢 工程, 将天然 的代谢 中间产 物转化 为所希 望的终 产物的 例子, 是 维生素 

A 的前体 胡萝 卜素的 生产。 过去, 曾考 虑应用 藻类和 真菌类 [例 如, 粗糙 脉孢菌 (Neu- 
rospora crassa ) , 硬壳 青毒菌 ( PenicilLium sclerotiorum ) , 布莱 须霉菌 ( Phycomyces 
blakesleeanus)] 以 及红酵 母菌属 (^Rhodotortda) 生产 胡萝 卜素, 但发现 不合适 (Ninet 
and Renaut, 1979)。 由于类 胡萝卜 素生物 合成的 前体香 叶基焦 碟酸存 在于许 多生物 体中, 
用于 甾醇、 何 帕醇和 萜稀等 物质的 合成, 因 此可用 适当的 基因工 程利用 上述基 础生产 胡 
萝 卜素。 最近, 已克 隆并分 析了噬 夏孢欧 文氏菌 (^Erwinia "redovora") 中包括 胡 萝卜素 
的环状 类胡萝 卜素的 生物合 成基因 (Misawaetal, 1990)。 随后 用四个 /?- 胡 萝卜素 基因对 
Z. wo6z7/5 菌 和根瘤 农杆菌 (^Agrobacterium tumefaciens ) 进 行遗传 转化, 在琼脂 平板上 
获得黄 色菌群 (Misawaetal, 1991)。 尽管这 两种菌 株都不 是产生 ^9- 胡萝卜 素的天 然生产 
菌, 但 是转化 接合体 在液体 培养中 生产出 维生素 A 前体 物达 220~350mg (干重 )。 这些结 
果还建 议生产 胡萝 卜素的 Z. mobilis m (Z. mo6z7z'5 菌被用 于乙醇 大规模 生产) 能够接 
着用 作动物 饲料, 这 样由于 其中的 胡萝 卜素而 增强了 其营养 价值。 

在 相关研 究中, 又对 Ero^/m'a 菌的六 个类胡 萝卜素 基因进 行异源 表达, 结果在 S. 
cerevisiae 菌中获 得一系 列香叶 基焦磷 酸盐副 产物。 取决 于线性 途径中 实际所 表达的 基因数 
量, 可 测得如 下一个 或多个 产物: 八 氣番茄 红素、 番茄 红素、 i9- 胡萝 卜素、 玉 米黄素 及玉米 
黄素二 (葡) 糖苷 (Ausichetal, 1991)。 
6.3.4 生物 聚合物 

由生物 体生产 聚合物 的改进 (例 如, 黄 原胶和 细菌纤 维素) 及新的 生物聚 合物的 生产是 
代谢 工程另 一个主 要应用 (Peoples and Sinskey, 1990)。 世界 上约有 93% 的 化石资 源消耗 
是为了 能量的 生产, 而仅 7% 被 工业上 用来生 产包括 溶剂和 塑料等 的有机 化学品 (Eggers- 
dorfer et al, 1992)。 因此, 用 再生资 源生产 的可生 物降解 聚合物 代替部 分合成 塑料, 似乎 
对 化石燃 料的总 消耗仅 有极为 有限的 影响。 然而, 可生物 降解塑 料的更 多使用 会给环 境污染 
140 



和废 物处理 等相关 问题的 解决做 出突出 贡献。 同样 的本身 原有的 坚固性 和抗降 解性曾 使塑料 
成 为理想 的工业 和消费 材料, 但今 天被认 为是环 境和废 物处理 问题的 根源。 与之 相比, 可生 
物降解 聚合物 或部分 或完全 由可降 解材料 组成, 其或可 由非醇 水解法 降解, 或 由微生 物分泌 

的酶 来降解 C 虽 然一些 聚合物 (如 淀粉、 聚乙 悌的混 合物) 只能部 分生物 降解, 但像聚 3- 
经 基丁酸 [P (3HB)] 等聚 合物是 100% 生 物可降 解的, 因为它 们能被 细菌、 真菌和 藻类等 
微生 物转化 为二氧 化碳和 能量。 目 前市场 上已出 现了多 种可生 物降解 塑料, 代 表了适 合于不 
同消 费品的 一系列 性质, 目 前全球 市场对 这种可 生物降 解塑料 的需求 估计高 达每年 130 万吨 
(Lindsay, 1992)。 
聚羟基 绽酸醋 

在 众多可 利用的 可生物 降解塑 料中, 聚经基 烧酸酯 (PHAs) 日 益引起 人们的 重视。 
PHAs 是一 类细胞 内用于 It 存碳和 能源的 物质, 多数 细菌在 环境条 件受限 (例 如, 氧 和氮枯 
竭 及硫酸 盐或镁 缺乏) 时积累 PHAs。 环境条 件的变 化通常 引起中 间代谢 的巨大 变换。 这些 
变换 大都由 总体调 节网络 控制, 该网络 有能力 对酶所 有组成 成分的 诱导或 阻遏进 行协调 (第 
5 章)。 最近, 这些聚 合物因 有潜力 作为可 生物降 解热塑 性塑料 而吸引 了相当 大的注 意力。 
通 过改变 发酵过 程中的 碳源和 (或) 菌种, 就 有可能 生产各 种生物 材料, 它们 的性质 可从硬 
塑料、 脆 塑料到 有弹性 的聚合 物范围 内广泛 变化。 

1926 年, 聚经基 丁酸酯 (PHB) 作为 巨大芽 孢杆菌 (^Bacillus '"egateriu— 中 的一种 
组 成成分 首次被 发现。 从那 以后, 已表明 PHB 与 相关的 PHAs 存在于 90 多类细 菌中。 大部 
分PHAs是由长度为3~14碳原子的 i^(-)-3-经基烷酸单体组成 (见图 6.13)。 由 细菌合 
成的 PHAs 可大 致分为 两组: 具有 C3~C5 单体 的短链 PHAs [如 真养 产碱菌 (^Akaligenes 
eutrcphus)] 和具有 C6 〜(: 14 单体 的中链 PHAs [如 食油假 单胞菌 {Pseudomonas oleovo- 
rar7s)]。 超过 40 种 不同的 PHAs 已被 表征, 有些聚 合物含 有不饱 和键或 其它功 能基团 
(Steinbuchel, 1991)。 

R 



[-O-CH-CHj-C-]^ 




3- 轻 基丙酸 


(3HP) 


3- 轻 基丁酸 


(3HB) 


3-5£5 基戊酸 


(3HV) 


ru 


(3HC) 


3- 经 基庚酸 


(3HH) 


m 
驟 


(3H0) 


趙 

m 


(3HN) 


3-)ei 基癸酸 


(3HD) 


基 十一酸 


(3HUD) 


3-5£5 基 十二酸 


(3HDD) 




II 




[-0(-CH2-)„C-], 




4- 3^5 基丁酸 


(4HB) 


5- 轻 基戊酸 


(5HV) 



图 6.13 主要 的生物 聚经基 焼酸酷 的结构 

PHB 是分布 最广泛 且充分 表征的 PHA。 PHB 生物合 成的大 部分知 识已从 细菌真 养产碱 
菌 {Alcaligenes etitrophus) 中 获得, 该 菌由乙 醜辅酶 A 通过三 种薛的 相继作 用得到 PHB 

141 



基基 基基基 基基基 基 

氢 甲乙丙 丁戊己 庚辛壬 

11 II -_ 一一 II II = 11 11 11 

RRRRRRRRRR 



(图 6.14)。 该途径 的第一 个酶为 3- 酮基 硫解酶 (或 /?- 酮基 硫解酶 ), 它催化 两个乙 酰辅酶 A 
分子的 可逆缩 合形成 乙酰乙 酰辅酶 A, 其 进而被 乙酰乙 酰辅酶 A 还原酶 (第二 种酶) 还原 
为 )-3- 经基丁 酰辅酶 A, 最 后通过 PHA 合酶 (第三 种酶) 将 其催化 聚合成 PHB。 分 
子研 究显示 这三种 酶的基 因被组 织在一 个操纵 子中。 PHA 通常是 作为一 个含有 10 3 ~10 4 个 
单体 的聚合 物而形 成的, 其在 胞内以 直径约 0.2~0.5^tm 的包 含体形 式积累 起来。 当细菌 
A. e"Zrop/z"s 生长的 培养基 中含过 量碳源 (如葡 萄糖) 而 缺乏某 种基本 营养物 (如氮 或憐) 
时, 菌体内 积累的 PHB 包含体 通常可 达细胞 干重的 80%。 在 这些条 件下, PHB 合成 担当碳 
的贮备 和电子 C 槽的 作用。 当生长 条件通 过憐或 氮的补 充而恢 复后, PHB 就 被催化 形成乙 
酰辅酶 A, 而 PHB 又 回到先 期诱导 水平。 

对 3- 酮基硫 解酶和 乙酰乙 酰辅酶 A 还 原酶的 诱导研 究显示 两种酶 的活性 响应于 PHB- 刺 
激限制 都显著 提高。 这些实 验表明 PHB 途径 呈现出 一种转 录控制 模式, 这类 似于由 于环境 
压力所 诱导的 其它代 谢途径 的调控 方式。 这种 总体调 节网络 的例子 包括热 休克调 节子、 pho 
调 节子和 碳匱乏 调节子 (见 5.4 节)。 最近, 真养 产碱菌 (A. eutrophus) 的 PHB 生物合 
成基因 、phaA、 phaB 、 phaC) 已被 克隆, 并在 £:. coli (Peoples and Sinskey, 1989; 
Schubert et al, 1988; Slater et al, 1988) 和多 种假单 胞菌属 (Timm and Steibiichel, 
1990) 中 表达。 研 究发现 在真养 产碱菌 (A. eutrophus) 的 PHB 途径 在所有 重组细 菌中都 
发挥 功能, 当重组 菌在碳 源过量 和氮缺 乏的条 件下生 长时, PHB 的积 累在细 胞干重 中占显 
著 比例。 有趣 的是, 重组 £. co/z' 菌 产生的 PHB 量约为 A . eutrophus H16 菌 水平的 50%, 
然而 £. coli 菌中表 达的还 原酶水 平才比 A. eutrophus H16 菌的 还原酶 水平小 2% 以下。 进 
一步 亚克隆 识别出 A . 67^化0/>/?^/5 菌3-酮基硫解酶的两种不同形式, 一 个认为 是起生 物合成 
的 作用, 而 另一个 起分解 代谢的 作用。 某 些重组 £. co/z' 菌株中 PHB 所达到 高水平 (高达 
细胞 干重的 90%) 表明 或是由 于高度 的转录 多种多 样性, 或是 由于不 同菌种 间高度 的转录 
同 源性。 另一 个有趣 的结果 是重组 P. aeruginosa 菌 株中具 有三条 不同的 途径、 用于 聚经基 
院酸 酯类的 合成。 当这些 细胞在 葡萄糖 上生长 时积累 一种聚 合物, 在此聚 合物的 组成中 /?- 
经基丁 酸酯、 /?- 经基癸 酸酯和 /?- 经 基十二 焼酸酯 是主要 成分, 而 经基辛 酸酯和 /?- 经基己 
酸醋 作为次 要成分 (Timm and Steibiichel, 1990)。 

共聚物 . ' 

目前, 最 具工业 价值的 PHA 共聚 物是聚 3- 经 基丁酸 -a>-3- 经' 基戊酸 [P(3HB-«>- 
3HV)], 因为 其比均 聚合物 [P(3HB)] 具 有增强 了的柔 籾性。 在含葡 萄糖培 养基中 添加丙 
酸或 戊酸, 会导 致产生 一个由 3- 经基丁 酸酯和 3- 经 基戊酸 酯组成 的随机 共聚物 (见图 
6.14)。 该随机 共聚物 目前由 Monsanto 公司利 用杆菌 A. ei^fro/^/m." ;发 酵葡萄 糖和丙 酸进行 
工业 生产, 商 品名为 Biopol。 因为 PHA 合 成中所 含的酶 具有很 宽的专 一性, 因此在 PHA 
中掺人 C3~C5 单元 是可 能的。 例如, 在 A. e«m)/>Ai^5 菌中已检测到两种 3-酮基硫解酶, 
其一 起接受 来自从 C4 到至少 C10 的 3- 酮酰 基辅酶 A, 而且已 经表明 乙酰乙 酰辅酶 A 还原酶 
对 C4〜C6 的 3- 酮酰 基辅酶 A 都有 活力。 通过改 变中间 代谢, Slater 等 已构建 一支高 产这种 
共 聚物的 £. raZz 菌株 (Slater etal, 1992)。 其 策略是 基于丙 酸途径 £ . co// 基因转 录调节 
的遗 传消除 (组成 型表达 ), 因此 导致所 得菌株 能有效 利用丙 酸并将 之掺进 共聚物 
[P (3HB-CO-3HV)] 中。 此外, 该策略 还导入 了控制 P (3HB-CO-3HV) 中两 种聚合 物的比 
例 的能力 , 这 可通过 调节培 养基中 丙酸和 (或) 葡萄糖 浓度来 进行。 

用真养 产碱菌 (A. eutrophus) 生 产可生 物降解 聚合物 PHB 所 用的底 物包括 果糖、 葡 
142 



ATP+CoASH 
AMP+PPix_y 



丙酷辅 SiiA 



CoASH ^ 



(Ix) 

翻誦 





/^NADPH+H' 
S-^NADP' 



/H -) -3-]fini5t 辅飽 A 



广 

CoASH 



PHB 



图 6. 14 真养 产喊菌 (Mcaligenes eutrophus) PHB 和 P(3HB-3HV) 的合 成途径 

萄糖、 乙 酸或丁 酸以及 1^2和(:02 的混 合物。 该 菌通常 不利用 乙醇作 碳源, 但 通过表 达乙醇 
脱 氣薛基 因构建 了一支 利用乙 醇的工 程菌, 可 将乙醇 转化为 乙酸, 而 乙酵可 进人乙 酰辅酶 A 
库, 其是 PHB 的前 体物。 更重要 的是, 同样 基因的 表达也 能利用 丙醇, 其导 致共聚 物聚经 

基丁酯 -戊酷 (PHBV) 的 产生, 该共 聚物与 PHB 相比, 溶点降 低并改 进了加 工性能 
(Alderete et al, 1993)。 63g'L — i 干细胞 中获得 74% (质 量比) 的 PHB。 该共 聚物含 量随培 
养基 中丙醇 分率的 增加而 增加, 相对 于纯的 丙醇, 最大 摩尔得 率可达 35.2%。 

代谢工 程在生 物聚合 物生产 中的一 个中心 问题, 是 通过硫 解酶、 还 原酶和 聚合酶 的协调 
扩增 使聚合 物生成 达到最 大化。 简单 使所有 三种酸 活性最 大并不 能解决 问题。 PHB 合成依 
赖于乙 酰辅醇 A 的 供应和 NADPH 的可利 用性。 前 者可通 过增加 糖酵解 的速率 进行最 大化, 
然而, 糖酵解 通量的 增加会 使戊糖 磯酸途 径通量 减少, 进 而减少 NADPH 的 产生。 因此, 
PHA 产量 最大化 不是三 种薛活 性简单 扩大的 问题, 更为 关键的 问题是 优化平 衡代谢 通量在 
分支点 G6P 处的 分布。 顺便说 一下, 此平 衡也可 能取决 于生长 条件, 因为当 细胞从 生长期 
转移 到生产 期时对 还原力 和碳的 需求可 能发生 变换。 

需要指 出的另 一个重 要方面 是前述 三种醇 (硫 解酵、 还原 醉、 聚 合酵) 之 间相对 活性对 
产品 质量有 深刻的 影响: 增加 聚合酶 活性而 保持其 它两种 酶活性 不变获 得低分 子量的 PHB, 
这似 乎是一 个违反 直觉的 结果, 但当考 虑实际 的聚合 机制时 就能对 此进行 解释。 最后, 该共 
聚 物的生 产可通 过在发 酵过程 中补加 丙酸来 完成, 或者 通过构 建工程 菌使其 能自己 提供丙 
酸, 例如通 过苏氨 酸降解 途径来 提供。 

植 物聚羟 基坑酸 g 旨 

最近, 聚 经基院 酸酯途 径已在 谷物作 物中被 表达, 这是 一个非 常有吸 引力的 系统, 它有 
潜 力以低 成本大 量生产 几类化 学品。 最初, 在 植物中 PHB 的合成 是通过 在植物 

中表 达杆菌 的 PHB 生物合 成基因 来进行 研究的 (Poirier et al, 
1992)。 尽管 A.f/ia//flmz 在农业 上并不 重要, 但选择 A . f/ja/zana 作为 研究对 象是基 于如下 

143 



原因 :. 在 植物中 进行遗 传和分 子研究 时它常 作为一 种模式 系统, 并且它 与油料 作物油 菜籽密 

切 相关, 而油 菜是农 业规模 上生产 PHB 的目标 作物。 合成 PHB 所需要 的三种 酷 当中, 仅 
3- 酮硫 解酶存 在于植 物中。 为了 完成该 途径, 编码乙 醜辅薛 A 还原 酶和 PHA 聚 合醇的 

A. eM《rop/m5 基因 在转基 因植物 A. thaliana 中 进行了 表达, 发 现酶活 性定位 于细胞 质中。 
这种最 初尝试 合成的 PHB 仅 占菌体 干重的 0.14% (比所 要求的 商业生 产水平 约低两 个数量 
级), 并且 对细胞 生长有 不利的 影响。 

第 二代产 PHB 的转基 因植物 表明了 更大的 成功。 在植 物中, 由乙 酰辅酶 A 合成 脂肪酸 
发 生于质 体中, 因此 质体是 通过乙 酰辅酶 A 的高的 碳通量 的一个 位点。 这个 通量在 积累油 
的植物 种子中 被特别 增强, 例如 Am6zVfo/m5, 其种子 干重的 40% 是甘油 三酯。 此外, 质体 
也 是积累 淀粉的 位点, 因 此质体 能够容 纳大量 的包含 体而不 破坏细 胞器的 功能。 最近, 
PHB 途径 在质体 中的表 达已经 在转基 因植物 A. thaliana 中得 到证实 (Nawrath et al, 
1994) o 质体 表达是 通过将 核酮糖 二磯酸 酶羧化 酶的小 亚基的 运转肽 (transit peptide) 与 3- 
酮基硫 解酶和 乙酰乙 酰辅酶 A 还 原酶的 N- 端溶 合而完 成的。 PHB 含量 在植物 寿命期 内逐渐 
增加, 最 大可达 10mg*g — 1 鲜重, 即约 干重的 14%。 这样, PHB 合成 从细胞 质改向 质体导 
致 PHB 生 产提高 100 倍。 

果聚糖 

果 聚糖是 一种聚 (果糖 ) 分子, 其在有 限数量 的植物 中作为 C 存物 质天然 产生, 其聚合 
度较低 (5〜60 单位 )。 它能被 酶法或 化学法 水解成 果糖, 果糖 在很多 食品产 品中正 在变为 
一种 普遍流 行的甜 味剂。 由 于低聚 果糖分 子具有 甜味, 故 果聚糖 本身可 直接作 为天然 甜味剂 
使用。 由于 人体消 化系统 中不含 能分解 果糖中 ^(2—1) 或 ^9(2— 6) 糖 昔键的 酶类, 从而使 
果 聚糖可 作为低 热量食 品成分 更具吸 引力。 除 了植物 以外, 微生 物也有 能力生 产分子 量很高 
的 果聚糖 (〉100000 单位 )。 例如, 在芽 孢菌属 (^Bacim、、 假单 孢菌属 (^Pseudomo 謹、 
和链 球菌属 (Streptococci) 中, 胞 外果糖 转移酶 将蔗糖 转化为 细菌果 聚糖, 通常称 为左聚 
糖。 果聚 糖生物 合成中 的主要 反应是 rzGF (庶糖 )— G- (果糖 ) + (" - 1)G。 为此 目的, 将 

B. subtilis 中编 码果糖 转移酶 (通常 称为果 聚糖庶 糖酶) 的 SacB 基因 进行修 饰并导 入烟草 
植 株中, 获 得的转 基因植 株能够 积累果 聚糖。 产量达 干重的 3%〜8o/o, 分子 量大小 和特性 
等与 B. subtilis 合成的 果聚糖 相似。 这种 重组果 聚糖的 一个重 要特性 是其在 植物中 的稳定 
性, 这使 得该项 工作能 够在许 多食品 和非食 品产品 应用中 很有吸 引力。 

黄原胶 

黄原胶 是由革 兰氏- 阴性野 油菜黄 单胞菌 (Xanthomonas campestris) 生 产的一 种胞外 
多糖。 黄原 胶所具 有的高 點度、 假 塑性等 独特的 流变学 特性, 是 其在各 种食品 和工业 应用中 
广泛 使用的 原因。 黄原 胶化学 结构由 一个纤 维质的 4)- 葡 萄糖骨 架与三 糖侧链 组成, 
而三 糖侧链 由两个 甘露糖 残基和 一个葡 (萄) 糖醛 酸残基 组成, 并与骨 架上葡 萄糖分 子间隔 
连接。 一般情 况下, 甘 露糖在 特定位 点上被 乙酰化 和丙酮 酰化, 但程度 不同。 参与胞 外多糖 
合成 的很多 基因通 常是成 簇的。 在野 油菜黄 单胞菌 (X. campestris ) 中已分 离到一 簇合成 
黄原 胶的基 本基因 (Barrereetal, 1986)。 最 近的研 究已经 表明利 用重组 DNA 技术 能改变 
黄 原胶的 结构与 性质的 潜力。 一个含 有几个 黄原胶 生物合 成基因 的质粒 使黄原 胶的生 产提高 
了 10%。 此外, 通过克 隆和超 量表达 酮缩醇 丙酮酸 转移酶 基因, 使黄 原胶侧 链的丙 酮酸化 
程度 增加到 45% (Harding et al, 1987)。 相 反地, 利用转 座子诱 变技术 可构建 菌株, 使之 
合 成的黄 原胶中 丙酮酸 含量大 大减少 (Marzocca et al, 1991)。 这些研 究表明 代谢工 程在产 
144 



物 结构控 制和黄 原胶合 成机理 的阐明 等方面 的应用 前景。 

6.3.5 生 物色素 

拔蓝 

代谢 工程应 用的一 个典型 例子, 就是 利用携 带取自 恶臭假 单胞菌 (P5eii^mo72as/>MfzV^) 
的萘双 加氧酶 (NDO) 基因的 工程菌 £. co/z' 生产 靛蓝, NDO 催化靛 蓝生物 合成的 最后一 
步反应 (Ensley, 1985) (见图 6.15)。 靛蓝, 



HC 



HQ ^ 



-CH 



"51 哚 



、mr 



萘双 加氧薛 



HC 
H 



.OH 



;、, 



吲噪二 氣二酵 



'HC. 



HC 



、HC 



,1 



OH 



OH 



CH 



mm 



又叫 靛青, 作为 一种葡 糖昔存 在于多 种植物 
中, 并 且自古 以来一 直被用 作蓝色 颜料。 在 
过去一 个多世 纪中, 靛 蓝是用 化学合 成法先 

得到吲 噪酚, 然后 再经氧 化得到 靛蓝。 1927 
年, 利用 选择培 养技术 分离出 一支土 壤微生 
物氧化 吲噪假 单胞菌 Pseudomonas in- 
doloxidam), 它能分 解吲哚 (见图 6.4) 形 
成蓝色 结晶, 该结晶 后来被 确定为 靛蓝。 尽 
管后来 又分离 到几种 能够由 n 引噪 生产 靛蓝的 
微 生物, 但没有 一种能 够实际 用于大 规模微 
生物 法生产 靛蓝, 原因主 要是: (1) 前体物 >» 引 
哚不 易得, (2) 靛蓝 最后一 步生物 合成醇 
NDO 活性 太低。 这些早 期的靛 蓝生产 菌株需 
要联合 提供色 氨酸或 游离的 吲噪, 其 成本限 
制 了它们 在工业 过程的 应用。 

早期的 尝试集 中于过 量表达 Pseu- 
domo?ias putida 的 NDO 酶, 以提高 吲哚转 
化率。 将 组成萘 双加氧 酶系的 前四个 基因与 
一 个由强 启动子 控制 的多拷 贝质粒 结合, 
获得较 高的酶 活性。 为提高 £. coll 中异源 
NDO 的稳 定性, 需要 进一步 的遗传 操作。 这 
项工作 已导致 稳定的 NDO 的高 水平表 达从而 
能够用 于靛蓝 的生物 合成。 

与此 同时, 同样的 努力研 究了直 接由葡 
萄糖进 行靛蓝 前体物 吲噪的 合成。 正 常情况 
下, P 引哚以 n 引噪 -3- 甘 油磷酸 (IGP) 或色氨 
酸一 部分的 形式存 在于细 胞中。 在 重组菌 £. 
co/z 中, 色氨酸 的合成 是由色 氨酸操 纵子的 五个基 因产物 完成的 (见图 6.16 和图 6.4)。 对 
于细 菌和真 菌二者 来说, 分支酸 是芳香 氨基酸 (包 括苯丙 氨酸、 酪氨 酸和色 氨酸) 生 物合成 
途径的 主要分 支点化 合物。 细胞 中也存 在色氨 酸醜, 其 分解色 氨酸并 释放出 吲噪。 然而, 早 
期 曾尝试 通过过 量表达 色氨酸 醇来刺 激吲噪 的生产 并不太 成功, 这是由 于受色 氨酸合 成总通 
量 的明显 限制。 为 纠正这 一点, 扩增了 色氨酸 合成途 径的所 有薛。 特 别是, 通 过位点 专一性 
诱变使 — 部分被 修饰, 这导致 吲噪生 物合成 增加一 个数量 级以上 (Murdocket al, 
1993) o 通 过结合 增强吲 噪生产 (突 变的 Zr/>B) 和增强 n 引 转化 为靛蓝 (NDO) 这 两个方 

145 



MC 



HC 

11 

HC, 



、HN' 



空 气氧化 



O 



、 



CH 



HC 



CH 



SI 青 



图 6.15 吲 (^经 萘双 加氧酶 (NDO) 生物合 成靛蓝 
吲 |» (见图 6.4) 被 NDO 氧化 形成不 稳定的 n 引 二 氣二醇 
或吲 %酌, 吲 酌 再经空 气氧化 缩合形 成靛蓝 



面, 最 终开发 出一支 £. co/z 菌株, 其 能用于 由葡萄 糖从头 生物合 成靛蓝 

0、 ,0H 



HC^^^CH 
II I 



CH2 



OH 
trpEG 



C=0 
I 

OH 



分支酸 



,HC\ 
HC*' C 



、// 



O 



、Z 

I 



OH 



HC、 



trpD 



HC^ \oH 



HC^ r 



HC 



HC、 



trpF 



HC\, 



H、C— HC 

7 \ 

^CH CH, 



CH ,- 



氨基 苯甲酸 



OH 

'0~-p=o 瞵 酸核糖 

„l 氢基 苯甲酸 

HU 



、/ 



OH 



OH 



OH 



HC 



、HN 



trpC 

HCZ 、。- 



\CH=C -CH-CH-CH -0-P=0 烯醇 式按基 苯氨基 

HO OH HO 脱氧核 糖碑酸 ( ) 



HC^ \hn/ 



trpAB 



T 

C — CH— CH— CH,— O— P=0 

II I I - I 

CH HO OH HO 



D^l 噪甘 油碑酸 (IGP) 



HC/HC、c- 



C— CH,— CH— C 



HC 



、OH 



色氨酸 



NH, 



图 6.16 色 氨酸生 物合成 
结 构基因 名称: frpAB — 色氨酸 合魏; frpC— 吲 噪甘油 磔酸合 藤; /rpD— 邻 氨基苯 
甲酸 隣酸核 糖基转 移薛; fr/>£G —邻氨 基苯甲 酸合藤 

6.3.6 氢 

氛 气对用 于运输 、 直接加 热或发 电造成 的污染 及不能 恢复的 化石燃 料来说 会成为 最终代 
用品。 因为 氣气燃 烧仅放 出水蒸 气和少 量氮氧 化物, 氛燃 料汽车 和其它 装置不 会影响 全球变 
暖 (C02), 而且 很少造 成空气 污染。 由 制造商 (如 Mercedes Benz) 生 产的原 型车辆 表明, 
从 性能、 舒 适度与 安全角 度看, 以氢 气为能 源的汽 车是实 用的。 氢气并 不比甲 院或者 汽油危 
险, 事 实上, 氣 气在工 业生产 中常规 使用。 美国太 空计划 已依赖 氢气为 能源近 40 年, 这一 
事 实为氣 燃料的 广泛使 用提供 了知识 基础。 

常规 电解技 术从水 中制取 氢气, 尽 管水是 取之不 尽的, 但是 制取过 程中所 需的能 量还是 
比 氢气燃 烧放出 的能量 要稍多 一点。 已经建 议采用 其它方 式生产 氢气, 例如利 用风能 或太阳 
146 



可再 生资源 
(纤 维素、 淀粉、 乳糖) 








葡萄糖 







葡萄糖 脱氢酶 




NADP* 



氧化雜 
NADPH 




葡 萄糖酸 



图 6.17 可 再生资 源转化 为复气 



能 (光 电技术 )、 气 化和裂 解等。 

目前, 也在 探索利 用发酵 或薛技 术作为 潜在的 
生物 路线生 产复气 (Kitani and Hall, 1989; Taguchi 
etal, 1995) (见图 6.17)。 众所 周知, 筛选 的微生 
物 可以将 氣气作 为代谢 终产物 而高效 生产。 代谢工 
程 技术将 表明, 在把细 胞代谢 改向高 于生理 水平的 
氣 气生产 方面这 将十分 有用。 至今, 已分离 出参与 
氣合成 的几个 基因, 例如 取自弗 氏柠檬 酸杆菌 
( Citrobacter freudii ) 的 氣 化薛基 因已在 £ . coli 菌 
中克隆 (Kanamayia et al, 1988)。 

最近, 已经研 究了体 外生产 氣气的 可能性 
(Woodward et al, 1996)。 此系统 由两种 SI 组成, 即 
从嗜酸 热原体 ( Thermoplasma acidophilum ) 中分 
离到的 葡萄糖 脱氢醇 (GDH) 和 从激烈 火球菌 
iPyrococcus furiosus) 中分离 到的氢 化藤。 GDH 催 
化葡萄糖的氧化生成葡糖酸-<^内酯, 其用 NADH 或 NADPH 作 为辅助 因子进 一步水 解形成 
葡萄 糖酸。 尽 管细菌 氣化瞎 由于不 适当的 低势能 极少与 NADPH 相互 作用, 但取自 激烈火 
球菌 (P. furiosus) 和真养 产碱菌 (A. eutrophus) 的氢化 藤已表 明利用 NADPH 作为一 
个电子 供体。 Woodward 等 (1996) 证实 GDH 与 氢化醇 的组合 具有在 体外由 葡萄糖 生产氣 
气 的能力 (见图 6.17)。 在辅助 因子不 断循环 (至少 20 次) 的情 况下, 由葡 萄糖生 产的氢 
气量可 达到化 学计量 得率。 这 条新发 现的途 径似乎 是从可 再生资 源生产 氢气的 一个有 吸引力 
的 选择, 该 过程中 也不会 直接产 生废气 (如 C02 和 CO 等)。 有 一个限 制需要 识别: 即需考 
虑葡萄 糖酸的 进一步 利用, 因 为即使 是小规 模氢气 生产厂 也会产 生大量 的葡萄 糖酸副 产物。 
该 过程的 将来几 代可包 括将这 些醇以 固定化 形式用 于连续 的氛气 合成。 

绿藻 (例如 Chiamydomonas reihardtiO 可提供 一种捕 获光能 进入燃 料氛气 的模式 
(Cinco et al, 1993; Lee et al, 1995)。 近期 的研究 (Greenbaum et al, 1995) 表明膜 结合光 
合系统 I 反应中 心的突 变不会 破坏整 个光合 系统。 此原 始创新 发现否 认如下 说法: 光 能转化 
为化学 能时光 合体系 I 和光 合体系 11 都需要 , 而且 该发现 还将光 能转化 为化学 能的最 大理论 
转化率 加倍, 由 109{) 提高到 20%。 
6.3.7 戊糖: 木糖醇 

木 糖醇是 一种可 作为理 想的防 龋齿甜 味剂的 糖醇; 并 且消化 它时不 需要胰 岛素而 适用于 
糖尿 病病人 (Emodi, 1978) 自然 界中只 有某些 水果和 蔬菜中 含有少 量的木 糖醇, 这就使 
得 大量提 取困难 而且不 经济。 目前, 主要是 在碱性 条件下 用化学 方法通 过木糖 的催化 还原制 
木 糖醇, 而木糖 来自半 纤维素 的水解 产物。 后来, 研究 集中在 利用微 生物由 D- 木糖 生产木 
糖醇。 据 报道, 木 糖醇可 由酵母 生产, 尤其 是假丝 酵母属 (Candida) , 如 C. peUiculosa 
(Nishio et al, 1989)、 C . boidinii ( Vongsuvanlert and Tani, 1989)、 C . guilliermondi 
(Meyrial et al, 1991) 和 热带假 丝酵母 (C. tropica"" (Gong et al, 1981) R Petromyces 
albertensis (Dahiya et al, 1991), 还可由 细菌, 如乳 红化沙 雷氏菌 (^Enterobacter liquefa- 
ciens) (Yoshitake et al, 1973)、 棒 杆菌属 ( Corynebacterium sp . ) (Yoshitake et al, 1971) 
和 耻塘分 支杆菌 (Mycobacterium smegmatis) (Izumori and Tuzaki, 1988)。 酵母通 常含有 

147 



代 谢木糖 的前两 种酶: 木糖 还原酶 (XR) 和木糖 脱氢酶 (XDH) (见图 6.7)。 通过 培养条 1 
件 优化已 将木糖 醇生产 能力和 得率提 高到中 等水平 (0.32〜2.67g'L — I'h — 1) (Horitsu et •! 
al, 1992) o 于是, 重点放 在通过 基因修 饰来提 高木糖 转化到 木糖醇 的生产 能力和 得率。 

在 一项初 始的研 究中, 选择 P. stipitis XR 来构 建生产 木糖醇 的重组 酵母菌 (Hallborn 
et al, 1991)。 这 种选择 是基于 XR 的高 度专一 活性及 NADH、 NADPH 都 可作为 此特定 XR 
的辅 助因子 (Verduyn et al, 1985)。 由 于缺乏 XDH (NADH 再生 时需要 ), 在含葡 萄糖和 1| 
木 糖的培 养基上 对重组 菌进行 研究。 葡萄糖 耗尽后 木糖利 用开始 并继续 进行, 最后木 糖转化 
为木糖 醇达到 97% 的理论 得率, 比生产 能力为 0.08g'g — 1( 细胞) 'h — 1。 后来 的一项 研究, 其 
目 的在于 通过过 量表达 P. stipitis 中 XR 和 XDH 的 基因, 扩展 含乙醇 基因的 S. cerevisiae 
菌的底 物利用 范围, 很幸 运地使 木糖醇 产量达 35g'L — 1 (Tantimngkij etal, 1993)。 

6.4 细 胞性能 的改进 

这类代 谢工程 目的在 于把生 物体作 为一个 整体, 因 此也称 为细胞 工程。 已 经有若 干细胞 
工 程成功 应用的 例子, 其中包 括从细 菌到动 物细胞 范围很 广的生 物体。 这些应 用已把 目标定 
在提 高比生 长速率 和生长 得率、 提 供对有 毒化合 物的抵 抗力、 改进特 定产物 的分泌 能力、 提 
高 植物细 胞的耐 旱和耐 盐能力 以及改 变重组 多肽的 糖基化 序列。 这是一 个挑战 与机遇 并存的 
极为 重要的 领域。 

6.4.1 氮代谢 的改造 

代谢工 程早期 成功的 一个例 子是专 性甲基 营养菌 (MethyhphUus methyhtrophm) 的 
氮同 化吸收 途径的 改造, 目 的是提 高单细 胞蛋白 (SCP) 的 得率。 M. methylotrophus 蔑曾 
被选 择从甲 醇进行 SCP 的工业 生产, 这是 因其具 有高的 碳转化 效率、 对甲醇 的高耐 受性以 

及营养 背景。 然而此 微生物 的氨同 化吸收 
途 径有一 个主要 缺点: 它利 用谷氨 酰胺合 
酶 (GS) 和谷氨 酸合酶 (GOGAT) 系 
统, 该系 统每将 imol 氨运 输进细 胞中需 
要 Imol ATP (见 2.4.1 节)。 相比 之下, 
对应的 大肠杆 菌氣同 化吸收 途径利 用谷氨 
酸 脱复酶 (GDH), 不需 要消耗 ATP (见 
图 6.18)。 为了氨 的同化 吸收, M. 
methylotrophus 菌可 能在利 用能量 亚优途 
径, 因 为它是 在一个 氨浓度 较低环 境中进 
行的, 而 GS 对 氨的亲 和力比 GDH 要高。 g 
克隆在 一个穿 梭载体 上的大 肠杆菌 谷氣酸 , 
脱氣 酶基因 、gdh), 已表明 可补充 M. methylotrophus 菌的 g5 突变株 (Windass et al, I 
1980)。 结果, 工程 菌展现 了高的 甲醇转 化为胞 内碳的 能力, 也许是 由于经 GDH 的 氣吸收 , 
途径比 偶合的 GS/GOGAT 途径 能量更 有效。 碳的转 化效率 提高了 4%〜7%。 

该工作 是代谢 工程的 第一批 工业应 用实例 之一, 它表 明为使 其在自 然生长 环境下 生存机 
会 最大, 生物体 所进化 的性质 在大规 模生物 反应器 的人工 环境中 并不是 必然处 于最佳 状态。 I 
6.4.2 提高氧 的利用 

在大 规模好 氧发酵 过程中 一个共 同的挑 战是确 保一个 适当的 氧水平 以达到 所希望 的细胞 
148 



a.gs/gogat 途径 
nh;+atp 



谷氨酸 





谷氨酸 

+NAD(P) 



ADP+P, 




谷 氨酷胺 



2- 氧 戊二酸 
+NAD(P)H 



B.GDH 途径 

GDH— Glutamate+NAD(P) 
(谷 氨酸) 

图 6. 18 细菌氣 同化吸 收途径 



2-Oxoglutarate+NH;+NAD(P)H 
(2- 氧戊 二酸) 



生长 和生产 能力。 在 微通气 条件下 (例如 非理想 混合造 成的情 况), 会发 生如下 情况: 呼吸 
和 发酵代 谢各单 元均处 于活泼 状态, 并争 着完善 能量合 成和氧 化还原 平衡。 这 种氧波 动不可 
避免 地导致 不希望 的生理 结果, 例如 总体的 和特定 的氧调 节响应 机制的 失效, 该响应 机制激 
活或抑 制中心 碳代谢 中的关 键酶。 这些生 存响应 由生长 速率和 产物生 成的变 动表现 出来。 

最近 研究发 现可以 用克隆 来自透 明颤菌 、Vit 應 ciUa) (VHb) 中的 血红蛋 白基因 
(vgb) (Khosla and Baily, 1988a, b) 来部 分减轻 这种氧 波动和 缺氧环 境所造 成的不 希望的 
结果。 尽 管它在 体内的 确切功 能尚未 确认, 但认为 VHb 是 一种氧 结合蛋 白质, 从 而能使 
Vitreoscilla 在其 自然生 境的微 氧条件 特性中 生存。 最近 的研究 表明, VHb 可 增加每 个还原 
态氧 原子穿 越细胞 质膜时 所逐出 的质子 数目, 并提 高大肠 杆菌在 微氧条 件下由 ATP 酶催化 
的 ATP 合 成速率 (Chen and Baily, 1994; Kalio et al, 1994) (见 2.3.3 节)。 通量分 布分析 
(第 8 章) 也 揭示了 VHb+ 细胞由 底物水 平磷酸 化合成 ATP 速率 很小, 但在微 氧条件 下有更 
大的 ATP 总生 产速率 (Tsaietal, 1995a~c)。 此外, }kcyo/cyd (通气 / 微 通气末 端氧化 
酵) 突变株 得出的 结果表 明大肠 杆菌中 VHb 的表达 可提高 末端氧 化酶的 水平和 活力, 从而 
可以 提高微 氧呼吸 和生长 的效率 (Tsaietal, 1995)。 在 线培养 NAD (P) H 荧光和 氧化还 
原电 位测量 (CRP) 表明 VHb 缓冲 由胞内 DO (溶氧 ) 波动 所造成 的氧化 还原电 位紊乱 
(Tsai et al, 1995)。 

受 这种酶 在氧限 制条件 下有利 于菌体 生长的 学说所 激励, x^gb 基因 被转入 多种重 要工业 
微生 物中。 这种 蛋白质 在范围 广泛的 宿主中 异源表 达已经 证明: 其诱 导体内 降低氧 缺乏效 
应, 促进了 细胞生 长并增 加了产 品生成 (DeModena et al, 1993; Khosla and Bailey, 1998a, 
b; Khosravi et al, 1990; Magnolo et al, 1991)。 例如, 携 带有该 基因单 个拷贝 并已整 合到其 
染色体 的大肠 杆菌, 在氧限 制条件 下合成 的总细 胞蛋白 的速率 比同基 因野生 型菌株 要快得 
多。 此外, 相 对于氧 限制条 件下的 £. CO// 的对照 培养, VHb 的 共表达 增加了 克隆的 iS- 半乳 
糖昔 藤、 氯霉 素乙酰 转移薛 (CAT) 和 a- 淀粉酶 的表达 1.5〜3.3 倍。 在其它 一些例 子中, 
此 蛋白的 表达在 链霉菌 (Streptomyces) 中 使一种 抗生素 的产量 提高了 13 倍, 在棒 状杆菌 
中 使氨基 酸的产 量提高 1.2 倍。 为研 究这项 技术而 成立的 Exogene 公司, 已 在青霉 属和哺 
乳动物 的细胞 中成功 表达了 VHb。 此外, 在生 物修复 领域, 用 z;g^; 对嗜麦芽黄单胞菌 
(Xanthomonas maltophilia ) 的 转化导 致苯甲 酸转化 为生物 质效率 的增加 ( Liu et al , 
1996) o 

6.4.3 过 度代谢 的防止 

当前, 利用 大肠杆 菌生产 重组蛋 白质过 程中, 主要的 技术挑 战之一 是要在 高细胞 浓度下 
仍保持 高的胞 内产物 水平。 由于 抑制性 培养副 产物的 积累, 这种 双重目 标很难 达到。 不论是 
在 厌氧还 是好氧 生长过 程中, 碳 通量和 还原剂 通量是 通过酸 性副产 物的分 泌来平 衡的, 分泌 
量最多 的酸性 物质是 乙酸, 这种 弱酸是 公认的 生长抑 制剂。 最重 要的是 它降低 重组产 物表达 
的细胞 功效, 好 像是通 过干扰 二硫键 的形成 而影响 胞内蛋 白质的 质量。 

与无机 酸的抑 制水平 相比, 有机酸 在低浓 度下就 可影响 细胞的 生长。 乙酸 等在细 胞内产 
生的 非解离 形式的 短链脂 肪酸, 例如 乙酸可 自由地 透过细 胞膜并 且在培 养基中 积累。 随后, 
存 在于胞 外的一 部分非 解离的 酸又重 新进入 胞内并 解离, 产生 相对高 的胞内 pH 值。 这表 
明, 弱 酸实际 上充当 着质子 的导体 (见 2. 2.1 节和例 2.1)。 如果这 个过程 不减缓 地继续 下去, 
胞内 pH 值将达 到胞外 pH 值 水平, 将 使质子 动力的 ApH 组分 (见 2.33 节和例 13.6) 瓦解崩 
溃 (Diaz- Ricci etal, 1990; Slonczewski et al, 1981)。 此外, 低 的胞外 pH 值 (<5) 几乎 能引起 

149 



完全生 长停滞 (没有 细胞溶 菌发生 ), 这或许 是因为 DNA 和蛋 白质的 不可逆 变性。 

除了 上述细 胞能学 的影响 之外, 还有 很多其 它因素 在弱有 机酸的 抑制性 质中起 作用, 这 
就使 得使乙 酸分泌 最小成 为优化 重组过 程生产 得率的 一个先 决条件 (Yee and Blanch, 1992; 
Zabriskie and Arcuri , 1986)。 Jensen 和 Carlsen (1990) 等人研 究了乙 酸对于 £. coli 中人 
生 长激素 生产的 影响, 恒化器 数据清 楚表明 乙酸在 此重组 系统中 的重要 作用。 通过改 变进料 
中 乙酸的 量已经 确定: 40mmo 卜 L— 1 的乙酸 水平使 重组蛋 白得率 降低约 35%, 但对生 物量得 
率 无任何 影响。 这 个结果 与一般 观察相 符合, 即影 响重组 蛋白得 率的乙 酸低限 浓度低 于造成 
显 著生长 抑制的 浓度。 在 同一研 究中, 乙 酸浓度 提高到 lOOmmo 卜 L — 1 时使生 物质得 率减少 
70% 以上, 而 重组产 品得率 下降了 2 倍。 其 它一些 研究者 也涉及 把乙酸 作为重 组过程 生产能 
力降 低的一 个重 要因素 (Brandes et al, 1993; Brown et al, 1985; Curless et al, 1988; Luli 
and Strohl , 1990; Starrenburg and Hugenholtz , 1991)。 

如下 事实已 被广泛 接受: 乙酸的 分泌是 由于糖 酵解通 量和细 胞对代 谢前体 物及能 量的实 
际 需要量 之间不 平衡造 成的。 丙酮酸 是糖酵 解作用 的最终 产物, 同时也 是乙酸 的前体 物质。 
因 此丙酮 酸为实 现乙酸 的积累 提供了 一个恰 当的接 合点。 该策 略包括 引人一 个异源 藤, 以催 
化过剩 的碳通 量改向 到比乙 酸不太 有害的 副产物 方向。 枯草芽 孢杆菌 (B. subttlis) 乙酰乳 
酸 合成酶 (ALS) 曾 被选中 用于此 目的, 这是 基于这 组微生 物的发 酵特性 (Johansen et al, 
1975)。 表 6.6 是 £. coZz' 等进行 混合酸 发酵菌 的副产 物量与 £a«7/iissii6《z7z'5 和多點 气芽孢 
杆菌 (Aerobacillus polymyxa) 等 丁二醇 生产菌 的副产 物量的 比较。 很 明显: 第二 组成员 
与大 肠杆菌 相比仅 生成非 常少量 的酸, 因为 它们把 葡萄糖 主要转 化为中 性物质 2,3- 丁 二醇。 



表 6.6 混合 酸发酵 与丁二 醇发酵 的比较 ® 





混合酸 


丁 二 


二 醇 




E . coli 


P. 


form leans 


to 


A . 


polymyxa 


2, 3- 丁二醇 


0.26 








54.60 




65.1 


3- 经 基丁酮 


0.19 








1.56 




2.8 


甘油 


0.32 








56.80 






乙醇 


50.5 






64.0 


7.65 




66.2 


甲酸 


86.0 






105.0 


1.32 






乙酸 


38.7 






62.0 


0.16 




2.9 


乳酸 


70.0 






43.0 


17.61 






號珀酸 


14.8 






22.0 


1.08 






二 氧化碳 


1.75 








117.8 




199.6 


氧气 


0.26 








0.16 




70.9 


碳 回收率 /% 


94.7 






96.0 


98.0 




101.6 


氧化 / 还 原平衡 


0.91 






1.02 


0.99 




0.99 



①取自 Wood, 1961c 



② mmol'lOOmmori 发 酵的葡 萄糖。 

图 6-19 表明, 丁二醇 生产菌 通常有 两种不 同的酶 将丙酮 酸转化 为乙醜 乳酸: 即 "pH6" 
乙 酰乳酸 合成醇 (ALS) 和乙 酰经酸 合成酶 (AHAS)。 AHAS, 在 许多微 生物中 都已发 现的一 
种 合成代 谢酶, 它 也催化 由丙酮 酸出发 合成缬 氨酸、 亮氨酸 和异亮 氨酸等 支链氨 基酸的 那些初 
始 步骤。 AHAS 也是一 种黄素 蛋白, 它受 终产物 (如缬 氨酸) 的反 馈抑制 调控。 另一 方面, 
ALS 既不需 FAD 来辅助 活化, 也不 被支链 氨基酸 所抑制 (Stormer, 1968)。 
150 



丙酮酸 



+ 丁酸 
卜丙 iH 酸 



AHAS 



a 乙酰 -or- 酸 



异 壳氨酸 



ALS 




a- 乙 酰乳酸 



織氨酸 



NAD+ 



AR 



«-ALDC 



NADH 

-经 基丁銅 
,NADH 

、NAD+ 

2,3- 丁二醇 亮氨酸 

图 6.19 ALS 与 AHASSI 的 比较以 及它们 在支链 氣基酸 合成与 丁二醇 形成中 的作用 
缩写: ALS —乙 銑乳酸 合酶; AHAS —乙酰 羟酸合 成雜; a-ALDC— a- 乙酰 乳酸脱 羧雜; 
AR — 3- 经基丁 兩还原 解 (或 2, 3- 丁二醇 脱氢薛 ); DAR — 双乙酸 还原藤 

B. subtilis 中 编码乙 酰乳酸 合薛的 cz/sS 基因在 £. coli 中被成 功表达 (Aristidouetal, 1994a, 
b)。 这 个薛作 用于丙 酮酸分 支点, 使过 量的碳 通量离 开乙酸 分支途 径改向 生成非 抑制性 副产物 
乙酰 乳酸。 所 得工程 菌株的 表征说 明即使 在富葡 萄糖培 养基中 高密度 培养, 乙酸分 泌量仍 可维持 
在 20mmohL— 1 以下。 此外, 这种工 程菌是 重组蛋 白生产 更有效 的宿主 (Aristidouetal, 1994): 
重组 /?- 半 乳糖昔 醇体积 表达在 分批培 养中可 提高约 500/6, 而在 高细胞 浓度流 加培养 中可以 提高约 
220%。 这些结 果都证 实了代 谢工程 在细胞 特性改 进方面 的成功 应用。 
6.4.4 底 物吸收 的改变 

营养 物质通 过跨膜 运输而 被吸收 是所有 生物机 体的一 项重要 任务。 除自 由扩散 以外, 运 
输过 程通常 可分为 三类: (i) 促进 扩散; (ii) 基团 转位; (iii) 主 动运输 (见 2.2 节)。 葡萄 
糖、 甘露 糖和果 糖等己 糖进入 细胞主 要是通 过依赖 磯酸' 烯醇丙 酮酸的 碳水化 合物, 磯 酸转移 
酶系统 (PTS), 这是一 个 基因转 位过程 (DiUsetal, 1980; Postma et al, 1993; Saier et al, 
1988) o 不管 糖或微 生物, 由 PTS 催化的 总过程 可以总 结如下 

一 (PEP) IN ― (carbohydrate) OUT + (pyruvate) in + ( carbohydrate-P, )in =0 
(糖) (丙 兩酸) (糖 -P,) 

PTS 在含有 细胞质 以及膜 结合蛋 白的一 系列步 骤中, 完 成糖的 转位和 磷酸化 (见 2.2.3 节)。 

PEP 除了 在糖吸 收上起 重要作 用外, 也是几 个专用 化学品 的基本 前体, 包括芳 香族氨 
基酸、 靛蓝、 肠 杆菌素 和黑色 素等。 因此, 通 过提供 一种非 -PTS 糖吸 收替换 系统, 那么, 
从 原理上 每消耗 Imol 葡 萄糖就 可节约 Imol PEPc 为 了改进 PEP 用于生 物合成 目的 的可利 
用 性所使 用的一 些方法 包括: 非 -PTS 碳源的 使用、 通过 PEP 合 薛超量 生产使 丙酮酸 循环到 
PEP (Patnaik and Liao, 1994; Patnaik et al, 1995) 以 及丙酮 酸激酶 的灭活 (Mori et al, 
1987) o 该领域 的一个 重要突 破产生 于一株 £. coli 菌株中 葡萄糖 PTS 基因 ptsH、 ptsi 和 
err 的 缺失, 以致 葡萄糖 不再经 PEP- 消 耗系统 被运输 进细胞 (Floresetal, 1996)。 后来, 在 
恒化器 培养中 "回 复体" (Revertant) 菌株被 选择, 其后 来被表 征具有 一个能 够有效 运输葡 
萄糖的 半乳糖 通透醇 基因。 这株稳 定的、 快速 生长的 工程菌 NF9 后来被 用于被 提高的 
DAHP 合薛 (此 醇縮合 PEP 和 4- 隣酸- 赤藓糖 形成 DAHP) 的遗传 本底, 证明 了葡萄 糖运输 
中所 节约的 PEP 被改 变方向 进入芳 香族氨 基酸途 径中。 

151 



6.4.5 遗传 稳定性 的维持 

近几 年间, 已普遍 应用质 粒克隆 载体作 为基因 的运输 工具, 这些基 因的产 品具有 科学或 
商业 兴趣。 一个质 粒载体 所希望 的特征 包括: 相 对分子 量小、 依 应用情 况可具 有高或 可控制 
的拷 贝数、 为 高水平 基因表 达的强 而可控 制的启 动子, 而 更重要 的是其 结构和 遗传稳 定性。 
遗 传不稳 定性是 重组微 生物工 业利用 的主要 障碍。 导致 这种不 稳定性 的原因 可能有 多种, 而 
且一般 说来, 那些在 指导蛋 白质生 产中最 有效的 表达载 体通常 更加不 稳定。 这 可能是 施加于 
细 胞的代 谢负荷 增加的 结果, 而 且在几 代之内 可能导 致出现 无质粒 群体。 除 分离不 稳定性 
外, 由于同 源重组 事件的 结构不 稳定性 可导致 不再产 生所需 产品的 质粒衍 生物。 

分 离不稳 定性和 结构不 稳定性 的防止 是过去 15〜20 年 中集中 研究的 主题。 结构 不稳定 
性一 般可通 过宿主 细胞上 recA 基因 的缺失 而降至 最小。 这种 缺失应 严格限 制在染 色体外 
DNA 和 染色体 DNA 之间 的同源 重组。 Csonka 和 Clark (1979) 在其 早期的 研究工 作中已 
表明 厶(.、7"/-「604)306 突变 使重组 率降低 36000 倍。 此外, Laban 和 Cohen (1981) 已表明 
reo4 基因点 突变使 一个质 粒内的 重组事 件的频 率降低 100 倍。 另一 方面, 分 离不稳 定性是 
一个 更具挑 战性的 问题, 其需要 更复杂 更精细 的解决 办法。 

已经设 计提出 一些获 得遗传 上稳定 的质粒 的策略 方案, 最简 单基本 的解决 方法似 乎是在 
生长培 养基中 添加抗 生素, 从 而选择 包含具 有抗菌 素抗性 的质粒 载体的 细胞。 该方法 有一些 
明显的 缺点, 例 如需使 用价格 昂贵且 形成污 染的抗 生素。 后来, Skogman 和 Diderichsen 提 
出 一种讲 究实用 的方法 (Diderichsen, 1986; Skogman et al, 1983)。 他 们使用 了一种 特定的 
宿主 -载体 系统, 在此系 统中, 导致 一株营 养缺陷 型宿主 的一个 特定染 色体突 变是由 目的质 
粒载 体上一 个相应 的功能 基因所 补充。 虽 然这是 一个强 有力的 方法, 但 其应用 性受到 限制, 
原因是 需要具 有特定 突变的 特定宿 主菌。 

具 有更广 适用性 的一项 技术包 括质粒 R1 的/ 基因座 (以前 的/) arB)。 该 系统是 
通过其 协调能 力而发 现的, 该能 力是协 调促进 革兰氏 阴性菌 中多种 质粒的 稳定化 (Gerdes, 
1988; Gerdes et al, 1986)。 后来, 证 实更多 的质粒 保持是 由于细 胞的有 选择性 杀死的 结果, 
这 些细胞 指其在 分开点 失去含 hok/sok 的 质粒。 hok/sok 基 因座编 码两种 RNA, 即 hok 
(杀死 宿主) mRNA 和 50;^ (抑制 杀死) RNA。 Ao;^ 产物是 很强的 细胞致 死剂, 它从 内部通 
过破坏 细胞膜 来杀死 细菌。 5oy^ 产物是 一个反 式反义 RNA {sok RNA, 见方框 6.3), 它在 
转 录后水 平抑制 hok 基因的 表达。 迅速而 选择性 杀死无 质粒分 离体可 用以下 理论来 解释: 
hok mRNA 是极端 稳定的 约 20min), 而. w/^ mRNA 迅速 衰亡。 因此, 在含有 质粒的 
细 胞中, sok RNA 阻止了 蛋白 质的合 成而细 胞仍能 存活。 另一 方面, 当 无质粒 的分离 
体出 现时, 不 稳定的 50/^ RNA 分子 衰亡, 因 此致使 稳定的 RNA 容 易得到 转录。 结果, 
Ao;^ 蛋白被 合成, 因而 导致无 质粒分 离体的 死亡。 

6.5 异生物 的降解 

天 然过程 (包括 生物过 程和地 球化学 过程) 都产 生大量 的各种 各样的 有机化 合物, 而且 
经过无 数代的 进化, 不 同的微 生物已 经渐渐 形成几 乎可以 降解所 有这些 天然化 合物的 能力, 
进而 将其作 为碳和 (或) 能量 的一种 来源。 然而, 为了工 业或农 业目的 由人类 生产的 数万种 
人 工合成 的有机 化合物 在微生 物世界 还没有 明显的 对手。 这些合 成的新 的化合 物被称 做异生 

物, 这 一称谓 来源于 希腊语 •remj5, 意 思是指 "外来 的"。 异生物 (如 后面 讨论的 PBC 等) 
是稳定 的而且 是脂溶 性的, 因此在 其穿越 经过食 物链时 被不断 地富集 浓縮。 
152 



异生 物的降 解是一 个迅速 发展的 领域, 给 代谢过 程带来 巨大的 机遇。 它主 要包括 利用基 
因 工程菌 降解污 染物, 这通 常被称 为生物 修复。 生 物修复 目前正 被用于 降解废 有机化 合物, 
它 们来自 土壤, 地 下水, 化 工厂和 食品加 工厂的 废水, 以 及石油 炼制厂 排出的 含油污 泥等。 

早期异 生物降 解微生 物的分 离工作 集中于 恒化器 培养选 择法。 这项 技术是 基于用 取自不 
同的有 毒废物 垃圾点 的微生 物样品 接种于 恒化器 培养, 进而 选择所 希望的 菌种。 通过 这种方 

法, 已经 分离到 一株假 单胞菌 (Pseudomo 廳), 它能 够降解 化物 (如 除草剂 2,4,5- 三氯 
苯 氧基乙 酸等) (Kilbaneetal, 1983)。 这 种菌在 一周内 成功地 除去了 土壤中 98% 的污 染物, 
然 后迅速 死亡, 因为 它不能 与内源 菌种相 抗衡。 

除 了恒化 器选择 法外, 设 计有用 的分解 代谢途 径的理 性方法 在过去 10 年 已经有 一些相 
关 报道, 下 面将讨 论之。 



方框 6.3 反义 RNA 

天然 的反义 RNAs 是小的 (15〜50 个核苷 酸)、 不被翻 译的、 具 有调节 作用的 RNA 
分子, 它抑制 了它们 的目标 RNAs 的 功能, 这 些目标 RNAs 与 之是互 补的。 反义 RNAs 
调节如 此多种 多样的 功能, 如质粒 复制、 连接、 维持、 转座及 细菌噬 菌体溶 菌-溶 源性的 
断 定等。 反义 RNAs 通过 该反义 RNA 中的 一个单 链环与 目 标 RNA 中的一 个补充 环之间 
的一 个初始 可逆接 触联系 来识别 其目标 RNA。 该初始 可逆接 触联系 之后是 这两个 RNA 
分子 之间一 个热力 学上非 常稳定 的复式 结构的 形成。 

反义 RNAs 可能 通过几 个不同 的机制 来抑制 其目标 RNA 的 功能。 例如 TnlO 的可 
转座 基因受 RNA-OUT 调节, 而 RNA-OUT 是对 可转座 mRNA 的翻译 起始区 (TRI) 
的反义 补充。 在 这种情 况下, 已经表 明反义 RNA 对 mRNA 的杂交 物理上 阻塞了 在该可 
转座基 因上核 糖体的 进入, 这 是由一 个反义 RNA 促 成的直 接目标 RNA 抑制的 例子。 

由反义 RNAs 引 起的间 接目标 RNA 的抑制 已经在 几个例 子中描 述了。 经典 的例子 
可能 是质粒 ColEl 的复 制控制 回路。 反义 RNA (RNA I) 与复 制起始 的引物 RNA E 
相互 作用, 从而诱 导了杂 交位点 下游几 百个核 昔酸分 子二级 结构的 改变。 这种二 级结构 
的 变化阻 止了依 赖核糖 核酸酶 (RNase) H 的引物 RNA 的 切割, 而这种 切割是 复制起 
始的 前提。 




6.5.1 多 氯联苯 (PCBs) 

PCBs 是 一类含 有一个 联苯, 并且其 上带有 1〜10 个氯 的人工 
合成化 合物, 共 209 种 (见图 6.20)。 从 1929〜1978 年, 大 约生产 
了 70 万吨的 PCBs, 其中 大部分 (几十 万吨) 被释 放到环 境中。 虽 ^^20 mmmpcB) 
然有 一些天 然的微 生物能 够氧化 一氯、 二氯 及三氯 PCBs, 但并没 '的 一般 结构式 

有能 够氧化 更高氯 化了的 PCBs 的微 生物。 在 自然界 中降解 PCB 数字 示可能 的氯化 位点。 
的最普 通的方 法可能 是协同 代谢, 但是, 这 是一个 非常缓 慢的过 经 ^aA:Q^H>^— „a' 
程, 由于最 初的转 变不能 为微生 物的生 长提供 碳源或 能源。 ^+'" = 1~10 

PCB 降解 SI 基因 、bph A, bph B, bph C 和 bph D) 已从假 单胞菌 Pseudo 囊讓 
LB400 中分 离得到 (见图 6.21), 并进而 在一株 £. a>/z' 菌中 已过量 表达。 以 PCB 降 解的特 
效性和 程度来 表示, 重组 菌的降 解能力 可以与 LB400 菌 相比。 

通过在假单胞菌 Ps^^u^fomorias 中引 人特定 基因, 有可能 构建出 菌株降 解芳香 化合物 的混合 
物, 例 如工业 废物中 常见的 3- 氯 (或 4- 甲基) 苯等 (Rojoetal, 1987)。 另一 种十分 有意义 的降解 

153 




HC 

II 

HC 



XH 



c— 

I 



-c 

HC、 



C 



芳香化 合物的 薛系是 白腐菌 Phanerochaete chrysosporium 的 
木质 素瞎, 它能 够分解 范围很 广的异 生物, 甚 至包括 各种结 
构, 如苯 并芘与 苯甲焼 染料等 (Bumpus and Brock, 1988)。 
6.5.2 苯、 甲 苯和对 二甲苯 混合物 (BTX) 

这 组来自 石油的 污染物 是水溶 性的, 因此能 污染水 资源, 
给人 类的健 康造成 严重的 威胁。 一些研 究已集 中在构 建基因 
工 程菌, 它 能够将 这类污 染物单 个地或 共同地 转化为 没什么 
毒害的 物质, 如丙 酮酸。 下 面讨论 两个这 方面的 例子。 
TOL (pWWO) 分解代 谢质粒 

分解代 谢质粒 通常包 含某些 降解途 径所需 要的一 套完整 
基因, 特别是在假单胞菌 Pseji^iomomzs, 其无处 不在。 它们 
是 可自传 递的, 并且许 多都具 有广泛 的宿主 范围, 这 使得它 
们在 自然界 中特别 有用, 在自然 界这样 一些分 解代谢 途径能 
被不 同物种 利用。 至今很 多分离 得到的 分解代 谢质粒 具有降 
解 芳香族 化合物 的代谢 途径, 这 也许是 因为, 在自然 界中除 
葡萄 糖外, 苯 环是第 二种含 量丰富 而可作 为结构 单元的 物质。 
来自 恶臭假 单胞菌 ( Pseudomonas putida ) 的 TOL 
(pWWO) 分 解代谢 质粒, 已 表明赋 予其宿 主降解 甲苯、 间或 
对- 二甲苯 以及其 它苯衍 生物的 能力。 这 些基因 组成两 个操纵 
子 (见表 6.7 和图 6.22): (1) xylCAB , 其编 码可将 甲苯和 
二甲 苯分别 降解为 苯甲酸 和甲苯 (甲) 酸 (上 部途径 ), (2) 
xylXYZLEGFJKIH , 其编 码可将 苯甲酸 和甲苯 (甲) 酸分 
别 降解为 乙酵和 丙酮酸 (下 部途径 )。 在 2- 经 基己二 條二酸 
半酵 ( 2-hydroxymuconic semialdehyde ) 处的 分支, 点, 拓宽 
了由 此途径 可降解 底物的 范围。 例如, 甲苯 (甲) 酸经: cyZF 
分 支途径 降解, 而苯和 对二甲 苯经: 分 支途径 降解。 

为了 拓宽一 种生物 可利用 的底物 范围, 基 因工程 技术已 
被 应用。 例如, 带有 TOL 质粒的 putida 菌可以 在各种 
烷 基苯上 生长, 如 苯甲酸 (盐 )、 3- 甲基 苯甲酸 (盐) 和 4- 甲 
基 苯甲酸 (盐 )(3MB 和 4MB) 、3,4- 二甲基 苯甲酸 (盐 )(3,4DMB) 以及 3- 乙基 苯甲酸 

表 6.7 TOL 分解代 谢质粒 pWWO 的基因 和相应 的产物 



HC" 



CH 



bphD 



HC/HC、CZ 

U I 
HCv..^CH 



、0H 



CI, 



图 6.21 氯化 联苯由 假单胞 
菌 Pseudomonas LB400 中 
2,3^ 双加氧 醉 途径 的降解 
基 因名称 联苯 2,3" 
双加 氧解; 6/>/iB —二 醇脱 氣雜; 
— 2,3^ 二氣二 苯双加 氧醇; 
— 2- 氧 -6"氧- 2,4^ 二稀酸 水化醉 



基 因 


薛 或功能 


基 因 


SI 或功能 


上 部途径 操纵子 






4- 草 酸丁稀 酸互变 异构酶 


xylA 


二甲 苯加氧 SI 


xyll 


4- 草 酸丁炼 酸脱按 醉 


xylB 


苯乙醇 脱氛醉 


工 yU 


2- 氧 -4- 戊稀酸 (2- Oxopent-4-enoate) 水合 麻 


xyLC 


苯甲 酸脱氣 SI 


xylK 


2- 氧 -丰 经基戊 煤酸 (2-Qxc>4"hydroxypentenoate) 


下 部途径 操纵子 




xylL 


二轻基 环己二 稀羧化 醉脱氢 n 


xylX ,xylY jXylZ 


甲苯 双加氧 SI 


调节 




xylE 


邻苯二 酷2,3- 双 加氧酶 


xylR 


转 录调节 


xyLF 


2- 经基點 康酸半 K 水解解 


xylS 


转 录调节 


JcylG 


2- 轻基點 康酸半 醒脱氢 81 







154 




2-if2 基 站康酸 
半薛 

項舍 HCOOH 



2- 轻基 -2,4- 

己 二炼二 氧六环 



COOH 
COOH 
2- 氧 -3- 己炼 -1,6- 

二 氧六环 




COOH 



基 -2- 
氧戊酸 xyiK 



"COOH 



2- 氧 -4- 戊稀酸 



xyil 





X + —OH 
"^COOH 
丙酮酸 乙醒 



图 6.22 由 Pseudomcmas putida 重组菌 mt-2 降 解甲苯 

(盐) (3EB) 等, 但不能 在密切 相关的 化合物 4- 乙基 苯甲酸 (盐) (4EB) 上 生长。 解释这 
种现象 的一系 列实验 已得出 结论: (1) 4EB 没有 激活关 键的调 节蛋白 UylS), 从而 不能诱 
导苯 甲酸盐 分解代 谢途径 的基因 UylABC, 见图 6.22); (2) 原 来的邻 苯二毆 2,3- 双加氧 
醇 UylE , 见图 6.22) 不 能利用 4- 乙 基邻苯 二酚作 为底物 (但可 以利用 4- 甲 基邻苯 二酚) 
(Ramos and Timmis, 1987)。 这样, 要想通 过此途 径降解 4EB 就 需要: (1) 具有更 广效应 
物专 一性的 调 节器; (2) 能降解 4- 乙基 邻苯二 酚的邻 苯二酷 2,3- 双加氧 酸突变 酶的产 
生。 这些策 略都已 执行, 导致突 变了的 和 _r3^/£: 基因的 分离, 其 产品表 现出与 上述需 
要一致 UyiS, 和 _3::^/£')。 带 有一个 TOL 质粒 (质 粒上 含有: r3;/S' 和 :0;/£, 基因) 的 P. 
putida 菌 确实能 够在上 述提到 的各种 通常底 物以及 4EB 上 生长。 
BTX 混合物 同时生 物降解 

由于 BTX 物质通 常是作 为三种 芳香族 化合物 的混合 物被释 放到自 然环境 中的, 因此菌 
种选育 的目的 都是为 了获得 能够同 时降解 这三种 芳香族 化合物 的菌株 (Leeetal, 1994)。 为 
此, 已经获 得一株 P. /?«//cfa 菌, 它包含 两条分 解代谢 途径: 一条是 前面讨 论过的 TOL 途 
径, 另 一条是 TOD 途径。 TOD 途径的 醇系可 以作用 于全部 三种芳 香族化 合物, 然 而此途 
径 终产物 (苯、 甲苯、 对二甲 苯-顺 式-乙 二醇) 不能被 进一步 代谢。 另一 方面, TOL 途径 
的酶 只能作 用于甲 苯和二 甲苯, 但 其终产 物可以 用做能 源和碳 源的中 间体。 图 6.23 总结了 
这 种组合 分解代 谢途径 的一般 形式。 

通 过包括 TOL 和 TOD 所 有酶曾 构建一 株原始 菌株。 然而表 征研究 显示: 这种菌 株积累 

155 



大量的 TOD 代谢终 产物, 即苯、 甲苯、 对二甲 苯-顺 -乙二 醇等。 为了减 弱这种 现象, TOD 途 
径的 最后一 步的酶 —— 甲苯 -顺- 乙二醇 脱氣酵 被阻断 (如图 6.23 所示 )。 最后所 得的菌 种能够 
以 显著的 速率降 解所有 三种芳 香族化 合物, 其降 解速率 对苯、 甲苯和 对-二 甲苯分 别为: 
0.27mg'mg— 1( 生 物质) 'h— 1, 0.86mg'mg— K 生 物质) 'h—i, 2.89 mg'mg— 1( 生 物质) '卜一!。 




二甲苯 氧化酶 
苯甲醇 脱氢薛 
苯甲 薛脱氢 SS 



COOH 



CH, 、 
甲苯 -顺- 乙二醇 



HOOC 



甲苯 (甲) 酸 双氧酶 
丁 




苯 甲酸酷 -顺- 乙二醇 



甲苯- 顺-乙 二醇脱 



环 分裂, 进一步 
降解为 TCA 循 
环中间 代谢物 




CH3 
甲苯 -顺- 乙二酵 



未 确定的 
中间物 



图 6.23 P. putida 菌降 解苯、 甲苯和 对二甲 苯的代 谢途径 
虚 线代表 TOD 途径, 实 线代表 TOL 途径 (见表 6.7 和图 6.22) (—) 代表 TOD 途径中 的遗传 性阻碍 

(甲苯 顺式乙 二醇脱 氣酶) 

这是一 个很有 意义的 例子, 它 说明了 如何对 现有的 分解代 谢质粒 (其 组成 完整的 途径) 
明智地 组合, 以 产生具 有新性 质的新 菌株, 例如 具有更 广泛的 底物利 用范围 或更好 的产物 
形成。 

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第 7 章 代谢途 径合成 

代谢途 径合成 涉及满 足某些 规定的 化学计 量关系 协调一 致的生 物化学 (酶 催化) 反应路 
线的 构建。 有各种 不同的 规定, 可 根据代 谢途径 中代谢 物和生 化反应 的作用 来确定 这些规 
定。 一 个常见 的规定 是从指 定的一 组底物 合成一 个代谢 产物。 本 书尤其 把重点 集中在 代谢物 
和 生物反 应上, 因为它 们组成 代谢途 径的基 本结构 单元。 因而, 一些代 谢物被 指定为 需要的 

(required substrates) 底 物或需 要的最 终产物 (required final products) , 而大 多数其 它代谢 
物被 指定为 允许的 (allowed reactants ) 反应 物或副 产物。 类 似地, 很 多生化 反应被 允许参 
与一条 途径的 构建, 而 在该代 谢网络 中另一 些生化 反应则 被禁止 参与。 

导 致某一 特定产 物的所 有可能 路线的 系统列 举不仅 与代谢 途径分 析的来 龙去脉 有关, 而 
且还 与生物 过程设 计的早 期阶段 有关。 第一, 在生物 过程设 计的情 况下, 如果 导致一 个所希 
望 的产物 的所有 可供选 择的途 径都被 识别, 那么 由不同 途径所 共享的 共同特 性就会 出现, 这 
在以一 个有意 义的方 式评价 各种生 物合成 选择方 案时可 能是非 常有帮 助的。 这些共 同特性 
是: 由 所有不 同途径 所共享 的一个 中间代 谢物; 或 者是一 个或多 个对产 物合成 所绝对 必需的 
酶; 或 者是对 整个过 程的得 率至关 重要的 因素。 第二, 可以进 行各种 可选择 途径的 得率计 
算, 从中可 识别具 有最适 得率的 途径。 第三, 所 有可能 途径的 知识, 在 更精确 地确定 某特定 
酷缺 失突变 株的表 型中是 非常重 要的。 人 们还需 要确定 哪些底 物能使 突变株 生长, 哪 些底物 
不 能使之 生长。 由于微 生物的 生长能 力主要 取决于 与其分 解代谢 所允许 的碳源 和氮源 相适应 
的 途径的 功能, 途径 列举能 够指导 阻碍生 长的特 定酶的 消除。 第四, 通 过了解 生长限 制性底 
物能 被微生 物分解 代谢, 而 产物能 由微生 物形成 的各种 可能的 方法, 将 会改进 我们在 发酵实 
验中 解释实 验观察 结果的 方法。 

在 代谢途 径分析 和通量 确定的 前后关 系中, 途 径列举 在协调 代谢通 量分析 过程中 得到的 
大 量代谢 物速率 和同位 素标记 数据方 面能够 具有极 为关键 的重要 作用。 如第 9 章所 述的, 代 
谢 通量估 计必须 通过试 差过程 中的冗 余测量 来证实 确认, 该过 程也包 括途径 修饰。 在 此过程 
中, 明 显重要 的是: 知 道如何 产生与 同位素 标记分 布相关 的所有 可能的 途径, 并选择 一条途 
径, 使 其能在 预计的 和测量 的速率 与标记 分布之 间给出 最好的 一致。 注 意到, 除了证 实通量 
估 计外, 途径列 举与同 位素标 记协调 平衡相 结合可 以是发 现新途 径的强 有力的 工具。 

一条 途径并 不是生 化反应 单纯的 集合, 因为许 多截然 不同的 途径可 能包括 相同的 生化反 
应, 但 却实现 不同的 转化。 例如, 反应 A— B + C 和 2B + C— D 能够形 成途径 2A— — D + C, 
也 可以形 成途径 A + B— — D, 这 取决于 组合反 应时的 比例是 2:1 还是 1:1。 一 条完全 确定的 
途径 必须包 括一组 系数, 其 中一种 系数是 对应于 包括在 该途径 中的每 个生物 反应, 表 示反应 
化 学计量 组分被 结合的 比例。 这 些系数 中的这 一组系 数是途 径化学 计量学 (Pathway Stoi- 
chiometry) , 而 经此途 径以净 反应物 和净产 物的形 式所达 到的总 转化是 途径的 分子化 学计量 
学 (Molecular Stoichiometry of the pathway )。 在下 一节, 将定 义专门 的符号 来反映 这些差 
别, 特别 是途径 化学计 量学。 

图 7.1 描绘 了代谢 途径的 系统合 成的一 种直观 方法, 它反映 了一种 方法: 从一个 已给的 
底物 开始, 列 出所有 可能的 反应, 这 些反应 能消耗 这种已 指定的 底物。 这些反 应的每 一个生 
166 



产产物 (Bi, B2, B3), 又依次 变得适 用于其 它反应 利用。 这样, 底 物到产 物递归 进行, 途 
径 因而被 构成。 对任 何正在 扩展的 途径, 其 下一轮 扩展可 利用的 底物应 包括在 途径运 行至此 
已产生 的所有 产物。 由 于这种 方法相 当快地 导致组 合爆炸 (combinatorial explosion), 因此 
必须引 人冗余 途径消 除的方 法手段 以使由 上述方 法引起 的高度 计算复 杂性得 以部分 简化。 尽 
管有 限制可 能组合 的数目 的各种 方法, 但这种 方法仍 有一些 缺点: (1) 这种方 法在这 种意义 
上 是不完 善的, 如 有些途 径确实 存在, 但该方 法不能 合成; (2) 该问题 是以一 种相当 限制性 
的方法 用列出 式子的 方式进 行的, 因为它 仅包括 所需的 底物和 产物, 但 没有为 所允许 的反应 
物 和副产 物做好 准备; (3) 该方法 应用于 大的生 物反应 网络时 要求以 指数增 长的计 算机时 
间; (4) 该 方法只 是一种 计算机 程序, 而不是 真正的 算法。 




图 7.1 来自指 定最初 反应物 A 的三 条途径 扩展计 划示意 
这 种方法 的途径 列举会 导致组 合爆炸 

本 章提出 一种生 化途径 合成的 方法, 它 通过完 全不同 的体系 来克服 上述方 法所存 在的问 
题。 首先 通过例 子一步 步详细 地说明 算法的 应用, 然后用 一节总 结这种 代谢途 径合成 算法的 
一般 特征。 最后, 介 绍一个 实例研 究来总 结这种 方法学 的内在 特征, 同 时给出 从与代 谢途径 
合 成类似 的练习 中 能够预 见的该 类结果 实例。 

7.1 代谢 途径合 成算法 

依从 Mavrovouniotis 等人 (1992 a,b) 关于 算法基 本原理 和精确 度及完 整性证 明的大 
部 分讨论 的原始 参考。 这里, 在 构成如 下反应 的酶反 应数据 库中, 通 过考虑 导致从 代谢物 A 
到 代谢物 L 产生的 所有可 能的生 物合成 路线中 的问题 举例来 说明这 种程序 步骤: 

(a) A— B 

(b) 

(c) 

(d) C + D"F + K 

(e) F + K->H + E 

(f) H + D"E + F 

(g) A-E 

(h) E— F + G 
(k) F《 
(m) G— L 

除 A 作为所 需的反 应物、 D 作为所 需的产 物外, 所 有其它 代谢物 被指定 为排除 反应物 

167 



(excluded reactants) 和排 除产物 (excluded products )。 排除反 应物或 排除产 物都不 能参加 
到 代谢途 径中, 因为 这会意 味着这 样一个 反应物 必须由 外界来 提供, 或 者此产 物能够 伴随目 
标代 谢物一 起形成 (见例 7.1 和例 7.2)。 

首先建 立反应 (b), (c), (d), (e), (0, (g) 和 (k) 的逆 反应。 并 指定这 些逆反 应分别 
为 (― b), (― c), (-d), (- e), (-f), (- g) 和 (-k)。 每一个 (正 或逆) 反应现 在都看 
做一条 "一 步" 分途径 (one-step partial pathway )。 为了完 善此问 题初始 状态的 描述, 还分 
别列 出每一 个代谢 物及其 参与的 途径。 在 这里, 应用 两种符 号体系 来表示 途径。 为了 仅仅表 
示构成 途径的 反应, 表达式 [如 2a, 2(-g), b] 表示 一条途 径是作 为反应 (a)、 (-g) 和 (b) 的 
线性组 合而构 建的, 这 些反应 的系数 分别为 2、 2 和 1。 另外, 为了表 示由这 个途径 所完成 
的总的 转化, 使用 表达式 2E — — B + C。 这两种 可供选 择的表 达式可 结合成 2E— [2a, 
2(-g), b]— B + C。 通过使 用这种 符号, 此问题 的初始 状态必 然伴有 如下的 途径: 



A- 
B- 
C- 
C- 
D- 
C + D- 
F + K- 
F + K- 
H + E- 
H + D- 
E + F- 
A- 
E- 
E- 
F- 
G- 
G- 

各 代谢物 分别参 与的代 谢途径 如下: 



a] — B 

b] — C 
-b]— B 

c] — D 
-c]— C 

d] — F + K 

- d]— C + D 

e] — H + E 
_e]— F + K 

f] — E + F 
_f]— H + D 

g] — E 

- g]— A 

h] — F + G 
k]— G 

- k]— F 
m]— L 



(A) 


[a], 


[g], [ 


- g] 












(B) 


[b], 


[- b], 


[a] 












(C) 


[b], 


[_b], 


[c], 


[- 


-c], 


[d], 


[ 


- d] 


(D) 


[c], 


[_c], 


[d], 


[- 


-d], 


[f], 


[ 


-f] 


(E) 


[e], 


[一 e] , 


[f], 


[- 


f], 


[g], 


[- 


- g], 


(F) 


[d], 


[-d], 


[e], 


[- 


- e] , 


[f], 


[ 


-f], 


(G) 


[h], 


[k], [ 


- k], 


[i 


n] 








(H) 


[e], 


[- e], 


m, 


[- 


■f] 








(K) 


[d], 


[- d], 


[e], 


[- 


- e] 








(L) 


[m] 

















遵循该 算法, 必须先 处理参 与在较 少途径 中的代 谢物。 因此, 首先 处理仅 参与一 条途径 

168 



的代谢 物!^。 L 是一个 所需要 的产物 (并 且是一 个排除 反应物 )。 因为 L 由一 个分途 径产生 
而 且不会 被其它 任何分 途径所 消耗, 因此处 理这个 代谢物 的约束 不会改 变任何 途径。 下一步 
处理的 代谢物 必须是 A 或者 B, 这两 个代谢 物处理 的先后 顺序不 会影响 结果, 因此 可以任 
意选择 B。 一 个新的 途径被 构建: [a, b] 作为 [a] 和 [b] 的 组合, 此运算 过程以 符号表 
示为 [a] + [b] = [a,b]。 注意, 不 允许建 立途径 [b] + [- b], 因为 它正、 反两 个方向 包括同 
一个 反应, 这样 的途径 将产生 一个无 价值的 循环, 不完 成任何 转化。 组合 [a, b] 构建之 
后, 途径 [a]、 [b] 和 [-b] 可从所 允许的 反应数 据库中 删除。 这就把 这组活 性途径 (ac- 
tive pathway) 简化 如下: 



A— 
C— 
D-^ 
C + D— 
F + K— 
F + K— 
H + E— 
H + D— 
E + F— 
A— 
E— 
E— 
F— 
G— 
G— 



a,b]— C 

c] — D 

- c]— C 

d] — F + K 
-d]— C + D 

e] — H + E 

- e]— F + K 

f] — E + F 

- f]— H + D 

g] -E 
-g]— A 

h] — F + G 
k]— G 

- k]— F 
m]— L 



更 新后仍 需进一 步处理 的这组 代谢物 变为: 



(A) 
(C) 
(D) 
(E) 
(F) 
(G) 
(H) 
(K) 



-f] 
g], 
-f]. 



[h] 

[h], [k], [-k] 



a,b], [g], [- g] 
b], [c], [- c],[d], [_d] 

, [- c], [d], [- d], [f], [ 

, [- e], [f], [_f], [g], [- 
, [-d], [e], [- e], [f], [ 
[k], [-k], [m] 
[- e], [f], [-f] 
[- d], [e], [- e] 

下一 步处理 代谢物 A。 因为 A 是所 需要的 反应物 和排除 产物, 一 个新的 组合途 径构建 
[- g] + [a,b] 二 [- g,a,b], 而且仅 仅删除 了途径 [_g]。 对下 一步, 从 代谢物 G, H 
和 K 中任 意选出 G (因为 这三者 参与反 应的数 目都相 同)。 在处理 G 的过 程中, 有两 条途径 
[- k] 和 [m] 消 耗它, 有两 条途径 [h] 和 [k] 产 生它。 因此, 可构 建四种 组合, 除了 
[k] 不能和 [- k] 组合 之外, 可以保 留三种 合理的 组合, 即: [h] + [-k] = [h,-k], 
[h] + [m] = [h,m] 和 [k] + [m] = [k,m]。 G 参与 的原来 的四个 途径被 删除。 处理完 A 和 G 
之后, 活 性途径 如下: 

A— [a,b]— C 

169 



为 



C— [c]— D 
EhK_c]— C 
C + D-^[d]-*F + K 
F + K— [_cl]— C + D 
F + K— [e]— H + E 
H + E— [-e]— F + K 
H + r>*[f]— E + F 
E + F— [- f]— H + D 
A— [g]— E 
E— [-g,a,b]< 
E— [h ,- k]— 2F 
E— [h,m]— F + L 
F— [k,m]— L 
更新后 仍需进 一步处 理的这 组代谢 物变为 : 



(C) [a,b], 


[c], 


[- c], 


[d], 


[-d]. 


[- g,a,b] 








(D) [c], [ 


- c], 


[d], [ 


- d], 


[f], [ 


-f] 








(E) [e], [ 


- e], 


[f], [- 


-f], 


[g], [- 


- g,a,b], [h,i 


m], 


[h, 


-k] 


(F) [d], [ 


_d], 


[e], [ 


-e], 


[f], [ 


-f], [h,m], 


[k,i 




[h, 


(H) [e], [ 


- e], 


[f], [ 


-f] 












(K) [d], [ 


— d], 


[e], [ 


一 e] 













代谢物 K 参与 四条 途径, 下一 步对其 处理。 建立 [d] + [e] = [d,e] 和 [- e] + [- d]= 
[-e ,- d] 两种 组合, 而途径 [d], [-d], [e] 和 [- e] 被 删除。 于是活 性途径 变为: 

A— [a,b]— C 

C— [C]— D 

I>^[-c]— C 
C + I>-*[d,e]-^H + E 
H + E— [_e, - d]— C + D 
H + I>^[f]— E + F 
E + F— [_f]— H + D 

A— [g]— E 

E— [- g,a,b]— C 

E— [h ,- k]— 2F 

E— [h,m]— F + L 

F— [k,m]— L 

更新后 仍需进 一步处 理的这 组代谢 物变为 : 

(C) [a,b], [c], [-c], [d,e], [-e,-d], [— g,a,b] 

(D) [c], [- c], [d,e], [- e ,- d], [f], [_f] 

(E) [d,e], [一 e ,一 d], [f], [-f], [g], [— g,a,b], [h,m], [h ,― k] 

(F) [f], [-f], [h,m], [k,m], [h,-k] 
(H) [d,e], [-e,-d], [f], [- f] 



用类 似的方 法处理 H, 建立 如下两 个组合 途径: [_f] + [-e ,- d] = [- f ,- e,_d] 和 
[d,e] + [f] = [d,e,f]。 需 要再一 次指出 的是, 在正、 负 方向包 括相同 反应的 途径不 能被构 
建。 因 此新的 途径就 变为: 

A— [a,b]— C 

C— [C]— D 

D— [-c]-^C 
C + 2D— [d,e,f]-^2E + F 
2E + F— [-f, - e ,- d]— C + 2D 

A— [g]— E 

E— [_g,a,b]— C 

E— [h, -k]— 2F 

E— [h,m]— F + L 

F— [k,m]— L 
更新后 仍需进 一步处 理的这 组代谢 物变为 : 

(C) [a,b], [c], [一 c], [d,e,f], [一 f ,一 e ,一 d], [一 g,a,b] 

(D) [c], [-c], [d,e,f], [- f ,- e ,- d] 

(E) [d,e,f], [— f ,― e ,― d], [g], [— g,a,b], [h,m], [h ,― k] 

(F) [d,e,f], [-f ,- e ,― d], [h,m], [k,m], [h ,一 k] 

因为代 谢产物 D 仅参 与四条 途径, 下面对 它进行 处理。 因为 在反应 [d, e, f] 和 [-f, 
-e, -d] 中, 代谢物 D 的系 数是 2, 这 一点必 须反映 在新建 立的组 合中。 新建立 的途径 
为: [2(:] + [01,6,(]二[2(:,€1,6,{]和[-£,—6,—3]+2[-(:]=[—【,-6,-3,2(-(:)], 而 D 
原来所 参与的 四个途 径都被 删除。 现在 该组活 性途径 变得非 常小: 

A— [a,b]— C 
3C— [2c,d,e,f]— 2E + F 
2E + F— [ _f ,- e, - d,2( _c)]— 3C 
A— [g]— E 
E— [_g,a,b]— C 
E— [h ,- k]— 2F 
E— [h,m]— F + L 
F— [k,m]— L 
目 前只有 三个代 谢物仍 需处理 : 

(C) [a,b], [2c,d,e,f], [ — f ,― e ,― d,2( _ c) ] , [― g,a,b] . 

(E) [2c,cl,e,f], [—f,_e ,一 d,2(_c)], [g], [— g,a,b], [h,m], [h ,一 k] 

(F) [2c,d,e,f], [— f,— e ,一 cl,2(— c)], [h,m], [k,m], [h ,一 k] 

因为 代谢物 C 只参 与四条 途径, 因此 下一步 对它处 理且产 生两种 组合: 3[a,b] + [2c, 
d,e,f] = [3a,3b,2c,cl,e,f] 和 3[ — g,a,b] + [2c,d,e,f ] = [3( — g) ,3a,3b,2c,d,e,f ]。 删除原 
来 C 所参 与的 四条途 径后, 活 性途径 变为: 

3A— [3a,3b,2c,d,e,f]— 2E + F 
A— [g]— E 

E— [3(— g),3a,3b,2c,d,e,f]— F 

171 



E— [h,-k]— 2F 
E— [h,m]— F + L 
F— [k,m]— L 

还需处 理的两 个代谢 物是: 

(E) [3a,3b,2c,cl,e,f], [g], [3( _g) ,3a,3b,2c,d,e,f] , [h,m], [h ,一 k] 

(F) [3a,3b,2c,d,e,f], [3( - g) ,3a,3b,2c,d,e,f ] , [h,m], [k,m], [h,-k] 
上述这 两种代 谢物参 与的途 径个数 相等, 以任一 顺序进 行处理 都可得 到最后 结果。 首先 

选择 代谢物 F, 于是得 到三种 新组合 途径: [3a,3b,2c,cl,e,f] + [k,m] = [3a,3b,2c,d,e,f, 
k,m]; [卜,111] + |>,111] = |>,1^,2111]和[3(—8),3&,31),2(:,(1,6,(] + !>,111] = [3(—8),33,31), 
2c,d,e,f,k,m]。 代谢物 F 原来 所参与 的五条 途径被 删除, 剩余的 活性途 径是: 

3A— [3a,3b,2c,d,e,f,k,m]— 2E + L 
A— [g]— E 

E— [3( — g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]— L 
E— [h,k,2m]— 2L 

剩下 没有处 理的是 代谢物 E, 参与所 有四条 路径。 E 的处理 (而且 略去在 相反方 向包含 
相同 反应的 途径) 导 致如下 组合: (l/3)[3a,3b,2c,d,e,f,k,m] + (2/3)[3( — g),3a,3b,2c, 
d,e,f,k,m] = [2( — g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m];[3a,3b,2c,d,e,f,k,m] +2[h,k,2m] = [3a, 
3b,2c,d,e,f,3k,5m,2h] 和更 简单的 [g] + [h,k,2m] = [g ,h,k,2m]。 应 当注意 的是, 为了 
使组合 途径获 得较小 的整数 系数, 在 构建组 合时, 用 了分数 1/3 和 2/3 而不是 1 和 2。 当所 
产 生的途 径除以 3 时可得 同样的 效果。 ― 

很 显然, 相乘常 数没有 影响途 径的转 化和总 结果的 实质, 仅 仅是代 谢物和 反应物 的摩尔 
比例有 关系, 因此 最后途 径是: 

A— [2( — g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]— L [PI] 
3A— [3a,3b,2c,d,e,f,3k,5m,2h]— 5L [P2] 
A— [g,h,k,2m]— 2L [P3] 
这三 条途径 对于最 初合成 问题都 是可行 的解, 所有其 它途径 只是这 组途径 的线性 组合, 且用 
正的 系数。 途径 合成的 一些其 它方法 利用特 定的规 则以便 仅仅产 生基本 途径, 比如, 它们应 
用如 下一条 规则: "如 果一 种酶需 要一种 底物, 而该底 物已被 此途径 用于那 个酶, 那 么这个 
底物 必须被 这个途 径中的 同一酶 系所产 生。" 该例子 表明, 这里所 介绍的 方法, 在没 有这种 
类型的 附加规 则的情 况下, 能 实现基 本途径 的构建 (并且 避免了 多余途 径的建 立)。 

人们 可以观 察到, 所 构建的 三条途 径中, 只有 两条是 线性独 立的: 途径 [P2] 可以由 
途径 [P1]+2[P3] 得到。 然而, 所 有这三 个途径 都是有 用的, 因为它 们在基 因型上 是独立 
的, 即, 它 们包含 独立的 酶系。 尽 管途径 [P2] 是途径 [P1] 和 2 [P3] 的和, 但 是途径 
[P2] 中 酶系不 是途径 [P1] 和 [P3] 中各自 酶系的 联合, 特 别是, 酶 g 在途径 [P1] 和 
[P3] 中都 存在, 但不 存在于 [P2] 中。 

如果 希望基 于底物 A 的产物 L 的高 得率, 那么 可以看 出途径 [P3] 是三 个途径 中最好 
的。 因此, 除了 研究由 底物和 代谢产 物之间 存在的 不同路 线外, 途径合 成算法 对于评 估当碳 
源经不 同代谢 途径加 工时的 总得率 是很有 用的。 然而在 许多情 况下, 由 这种算 法所产 生的途 
径 将取决 于细胞 的生理 状态, 例如, 一些用 于生化 合成的 代谢物 的消耗 或排泄 取决于 细胞的 
生长 条件。 因此, 对于总 得率的 计算, 后 面几章 所阐述 的代谢 通量分 析通常 是更适 合的, 因 
172 



为在 进行总 得率计 算时, 有可能 对某些 途径通 量要规 定限制 条件。 

7.2 算 法综述 

代 谢物能 以下列 三种身 份之一 参与生 化反应 途径: (1) 作为 该途径 的净反 应物, 即该代 
谢 物被净 消耗; (2) 作 为该途 径的净 产物, 即 该代谢 物被净 生成; (3) 作为 中间代 谢物参 
与, 换句 话说, 没 有净消 耗或净 生成。 

此外, 可以对 在代谢 途径构 建中所 考虑的 不同代 谢物施 加一些 约束。 它们 可以被 如下的 
事实所 约束: G) 被指定 为所需 要的反 应物, 由此 它们一 定被这 个途径 所消耗 而且它 们的化 
学计量 系数是 严格小 于零; (li) 被 指定作 为所允 许的反 应物, 它们可 以被该 途径所 消耗, 
也可 以不被 消耗, 在这个 途径中 其化学 计量系 数是小 于或等 于零; (iii) 被指 定为排 除反应 
物 (或禁 止反应 物), 其一定 不被该 途径所 消耗。 在大 多数情 况下, 只 有少数 几个反 应物被 
分类 为所需 要的反 应物, 而 大多数 代谢物 呈现排 除反应 物的缺 席规则 特征。 以这种 资格, 它 
们在 途径中 既不被 合成, 也不被 消耗, 而且 一定要 提供一 些反应 以至于 它们变 化的净 速率等 
于零。 

除了 对代谢 物约束 之外, 用户还 可以对 生物反 应施加 约束。 因此, 人们需 要规定 那些生 
物 反应是 以所需 要的、 所允 许的和 被禁止 的身份 参与该 途径。 这些约 束中的 一些很 容易满 
足。 例如, 指定某 些反应 是排除 反应这 样的约 束能够 从开始 就完全 满足, 这可 通过从 活性数 
据库 中完全 删除上 述反应 即可。 人们 还应注 意反应 可从正 的或逆 的方向 进行。 指定一 些生物 
反 应在这 两个方 向之一 是排除 反应这 样的约 束也可 能是存 在的。 这样的 一些约 束是从 热力学 
或关于 生物反 应的不 可逆性 的机理 论据中 推导出 来的。 这些 生物反 应约束 不是独 立的。 例 
如, 一 个在正 方向的 所需要 的生物 反应一 定在反 方向被 排除。 

本 质上, 上述所 有约束 都是化 学计量 约束。 前 一节所 阐述的 算法从 根本上 说是试 图满足 
施 加于生 化途径 中代谢 物参与 方面的 约束。 算法执 行的第 一步就 是收集 建立一 个所允 许的生 
化反应 及其化 学计量 学的数 据库。 以这种 形式, 最 初的这 组生化 反应一 般不满 足这些 约束条 
件, 因 为它们 需要排 除反应 物的净 消耗, 而排 除反应 又必须 不被该 途径所 消耗。 该算 法尝试 
不同 约束条 件的重 复迭代 满足, 由此, 最 初一组 生化反 应以逐 步的方 式转化 为一组 途径, 它 
能满足 所施加 的所有 约束。 

算法的 主体是 一次处 理一个 约束。 在每 个迭代 阶段, 途径合 成算法 的状态 由如下 两方面 
所 表征: 由满足 已经被 处理的 约束条 件的一 组分途 径所表 征及由 还必须 被满足 的一组 化学计 
量约束 条件所 表征。 在下 一个途 径扩展 步骤, 通过 选择剩 余的代 谢物之 一作为 目标, 再一个 
约 束将被 满足。 被选 为最合 适的代 谢物是 参与在 尽可能 最少数 目的活 性途径 中的代 谢物。 代 
谢 物能作 为反应 物或产 物参与 这样的 途径。 根据所 说的最 合适代 谢物的 选择, 该组活 性途径 
因而 被修饰 以满足 此约束 条件。 例如, 如果 此约束 指定一 个代谢 物作为 排除反 应物或 排除产 
物, 则所 有可能 的组合 途径必 须通过 结合一 条途径 消耗此 代谢物 和一条 途径生 产该代 谢物而 
被 构建, 以至于 该代谢 物从总 的化学 计量关 系中被 消除。 一旦 这个组 合被构 建成, 所 有消耗 
或 合成这 个代谢 物的途 径都被 删除, 因为它 们违背 约束的 要求: 该代谢 物在途 径中没 有净消 
耗或净 合成。 如果这 个代谢 物除了 是一个 所需要 的产物 以外, 还 是一个 排除反 应物, 那么同 
样的 组合途 径可被 构建。 然而在 这种情 况下, 只是删 除消耗 这个代 谢物的 途径。 

这些约 束的线 性性质 有一个 重要的 影响。 一 旦一个 限制被 所有依 然存在 的途径 满足, 则 
这些 途径的 进一步 线性组 合也将 决不违 背这一 约束。 因此, 每个约 束处理 之后, 则新 的活性 

173 



途 径会满 足所有 先前处 理过的 约束。 

途径 合成算 法应用 需要是 一个可 能的酵 反应数 据库。 具有 250 个醜 反应和 400 种 代谢物 
的 这样一 个数据 库已由 Maurovouniotis (1989) 建成。 下面 用这个 数据库 [见 Maurovounio- 
tisetal, (1992a, b)] 所产 生的一 些例子 (例 7.1、 例 7.2) 说明该 算法的 应用。 

【例 7.1】 丝氨酸 的合成 

利用 下面的 规定, 途径 合成问 题定义 如下: 在 能导致 丝氨酸 (所 需要的 产物) 合 成的单 
一 薛反应 数据库 范围内 列举所 有可能 途径, 以葡 萄糖作 为所需 要的反 应物, 以 NH3 为所允 
许的反 应物, 以 C02 为所 允许的 产物。 此外, 还 引入如 下所允 许的代 谢物: 氧 化-还 原流通 
代谢物 (NAD, NADH, NADP, NADPH, FAD 和 FADHz), 直接能 量流通 代谢物 
(ATP, ADP, AMP), 间接能 量流通 代谢物 (GTP, GDP, GMP, TTP, TDP, TMP, 
UTP, UDP, UMP, CTP, CDP 和 CMP) 以及 一些其 它物质 [辅酶 A、 磯酸 (P,) 和焦 
磷酸 (PP,)] 等。 

用这个 系统, 算法 滞留在 处理关 于给乙 酰辅酶 A 和苹 果酸 代谢物 约束条 件的步 骤中, 
这 是代谢 物在丝 氨酸合 成途径 中非常 重要的 证据。 为此 原因, 它 们被明 确规定 为所允 许的代 
谢物, 这意味 着如果 它们出 现在总 的丝氨 酸生物 合成途 径中, 则 为它们 的产生 的附加 途径也 
必须 被包括 在内。 通过添 加这些 途径, 这 个算法 运行到 完成。 它 产生了 1526 个 途径, 其中 
最长 的途径 包含有 26 个 反应。 其中一 些途径 将讨论 如下。 

图 7.2 所 示为丝 氨酸生 物合成 的正常 途径。 葡 萄糖首 先通过 糖酵解 分解为 3- 磷酸 甘油酸 
(3-PG), 其经 3- 磷酸 轻基丙 酮酸和 3- 磯酸丝 氨酸转 化为丝 氨酸, 提供 丝氨酸 合成所 需的氮 
的谷 氨酸由 谷氨酸 脱氣酶 提供。 



FruDP Fru6P -* Glc6P 



Glc 



i I 

GAP —— DHAP 

DPG 

I 碑酸 甘油酸 脱氢酶 5 ^酸 丝氨酸 转氨酸 51¥ 酸 丝氨酸 碑酸酶 
-碑酸 甘油酸 一" - 3-8? 酸) ^2 基丙 嗣酸 , ^ » 3- 碑酸 丝氨酸 一" - 丝氨酸 



谷氨酸 《- 酮戊 二酸 



谷氨酸 脱氢酶 

图 7.2 由葡萄 糖合成 丝氨酸 的途径 
伴随 着谷氛 酸通过 谷氨酸 脱氢酶 的回收 

; FruDP— 1,6- 二碟酸 果糖; DPG— 1,3 二磯酸 甘油酵 



縮写: Fru6P~6 

图 7.3 所 示为丝 氨酸合 成的一 条替代 途径, 其与图 7.2 类似, 但 有如下 不同: 谷 氨酸的 
再生 不是通 过谷氨 酸脱氢 醇而是 通过包 括延胡 索酸, 天冬 氣酸, 草醜乙 酸和苹 果酸等 中间物 
的一组 反应。 对于从 a- 酮戊 二酸和 氣转化 为谷氨 酸这种 特殊的 选择只 是许多 可能性 之一。 

174 



另一个 类似的 可能性 是众所 周知的 路线: 通 过谷氨 酰胺, 用由谷 氨酖胺 合成酶 和谷氨 醜胺合 
醇所 催化的 反应。 



FruDP 



Fru6P 



Glc6P 



Glc 



GAP-« —— DHAP 



DPG 



J 碑酸 甘油酸 脱氢酶 碑酸 丝氨酸 转氨酶 碑酸 丝氨酸 碑酸酷 

3- 碑酸 甘油酸 一" - 3-;!^ 酸)^ 3 基 丙酮酸 Z 、 » 3- 碑酸 丝氨酸 一- 丝氨酸 



OxAc 



Mai 



谷氨酸 a- 酮 戊二酸 
Asp 



Fum 



图 7.3 由葡萄 糖合成 丝氨酸 
伴 随着谷 氨酸的 回收, 并且经 由一个 包括延 胡索酸 (Fum)、 天 冬氨酸 (Asp)、 
草 醜乙酸 (OxAc) 和 苹果酸 (Mai) 的回路 

这样, 该 算法规 定谷氨 酸回收 的不同 路线, 而且 这清楚 地说明 细胞代 谢的复 杂性。 在生 
物 化学教 科书中 人们可 能形成 印象, 认为书 中所列 出的途 径即为 细胞内 运行的 途径。 然而, 
一 些物质 (像 谷氨酸 ), 当作 为一些 关键化 合物出 现时, 对 其回收 可能会 有几种 不同的 路线, 
而 且其中 几条可 以平行 运行。 这 可由该 算法产 生的不 同途径 来举例 说明。 在下 面几章 关于代 
谢通 量的分 析中, 将 研究这 些不同 途径中 的相对 贡献如 何能被 量化。 



【例 7.2】 丙氨 酸合成 

在丙 氨酸合 成的情 况下, 最初 的系统 是规定 葡萄糖 为所需 要的反 应物, 丙 氨酸为 所需要 
的 产物, NH3 和 C02 分别 为所允 许的反 应物及 产物。 与 丝氨酸 一样, 苹果 酸和乙 酰辅醇 A 
被分 别指定 为所允 许的反 应物及 产物。 图 7.4 所示 为以葡 萄糖为 主反应 物对于 丙氨酸 合成的 
通常途 径应当 考虑的 问题。 如前 所述, 葡萄糖 由糖酵 解途径 分解代 谢为丙 酮酸, 其进 而由丙 
氨酸 氨基转 移酵转 化为丙 氨酸。 该 反应所 需要的 谷氨酸 是经谷 氨酸脱 氣酶从 a- 酮戊 二酸所 
回收。 

可供选 择的替 代途径 可通过 结合谷 氨酸回 收的不 同方法 类似地 产生, 例如图 7.3 所示的 
合 成丝氨 酸的包 括延胡 索酸、 天冬 氨酸、 草 酸乙酸 及苹果 酸的回 路等。 还有, 另一个 途径能 
将 丙酮酸 不是通 过丙氨 酸氨基 转移酶 转化为 丙氨酸 (Ala), 而 是经丙 氨酸脱 氣薛。 因 为后一 
个 反应可 直接利 用氨, 而对于 a- 酮戊二 酸到谷 氨酸的 转化, 不 必利用 谷氨酸 脱氢酶 或任何 
其它 系统。 

175 



FruDP ■* Fru6P Glc6P 



Glc 



GAP -* —— DHAP 
DPG 

I 丙氨酸 转氨雜 

SPG *■ 2PG PEP Pyr ^ 丫 丙氨酸 

谷氨酸 a- 酮 戊二酸 

U 

谷氨酸 脱氢醇 

图 7.4 由葡萄 糖合成 丙氨酸 的途径 

伴 随谷氨 酸经谷 氣酸脱 氢酷的 回收。 谷 氣酸也 能被图 7.3 所 示替代 途径所 回收。 
通过丙 氨酸脱 氢酶, 氨可直 接整合 进入丙 氨酸, 而 绕开所 有的谷 氨酸回 收反应 
缩写: 3PG — 3- 磯酸甘 油酸; 2PG — 2- 雜酸 甘油酸 



7.3 实 例研究 —— 赖 氨酸生 物合成 

本节介 绍从葡 萄糖和 氨合成 赖氨酸 的实例 研究, 以便 证明示 范从途 径合成 算法的 应用所 
能得到 的不同 类型的 结果。 应 当注意 的是, 这里的 目的不 是提供 所有可 能途径 的完全 列举, 
因为 这能很 容易地 数出几 百条。 目的 是举例 说明一 般可接 受的途 径的构 建并探 索关于 "关键 
酶和代 谢物的 参与" 的替代 选择。 这 种过程 能导致 关于赖 氨酸生 产途径 的结构 和得率 的一些 
基本 限制。 

应 注意, 所建立 的这组 途径仅 仅相对 于所使 用的生 物反应 数据库 才是完 整的。 当 附加的 
生 物反应 引人该 数据库 中时, 则该搜 索的结 果就变 得不完 整了, 但是, 先前已 构建的 途径仍 
然是有 效的。 另外, 如果 所建途 径的数 目是不 可抵挡 的大, 则可 以考虑 酶反应 数据库 的适当 
减小以 便减少 所产生 的途径 数目。 

通过使 用与丝 氨酸和 赖氨酸 合成一 样的数 据库, 该算 法产生 了大约 500 条 不同的 途径。 
为简化 此实例 研究, 假定 a- 酮戊 二酸脱 氣酶是 不起作 用的, 从 而从数 据库中 排除。 除了简 
化 这些结 果外, 这个实 例还说 明在缺 失上述 酶的突 变株中 赖氨酸 生产需 要什么 条件。 图 7.5 
显示了 所得的 途径, 从 中可以 看出, 为 了补充 TCA 循环 和弥补 a- 酮戊 二酸脱 氢藤活 性的缺 
失, 利用了 乙醒酸 旁路。 整 个途径 包括的 基本单 元有糖 酵解、 TCA 循环、 从 草酰乙 酸到天 
冬 氨酸的 途径以 及天冬 氨酸与 赖氨酸 之间的 一系列 反应。 

途 径合成 算法的 应用之 一是: 如果 一个反 应已被 证明构 成了整 个途径 的一个 瓶颈, 探索 
绕过这 样一个 单个反 应的可 能性。 例如, 如 果我们 假定苹 果酸脱 氣酶是 这个途 径的一 个关键 
限 制酶, 因此希 望产生 一些替 代途径 绕过这 个酶。 图 7. 6(a) 显示 了一条 这样的 途径, 其排 
除了苹 果酸脱 氢酶。 事 实上, 该途 径绕开 了整个 TCA 循环, 它 是通过 由丙酮 酸直接 羧化成 
草酰乙 酸而进 行的, 这 个反应 可由丙 酮酸羧 化嗨或 草醜乙 酸脱羧 嗨催化 完成。 该途径 也产生 
一 个更具 吸引力 的摩尔 得率。 如果 忽略来 自氧化 还原和 ATP 平衡的 限制, 图 7. 6(a) 中这条 

176 



FruDP Fru6P Glc6P 



Glc 



GAP-« —— DHAP 



图 7.5 从葡萄 糖合成 赖氨酸 的一种 可能的 生物反 应网络 
粗 体箭头 指的是 a- 兩戊二 酸脱氛 醉 缺失而 经乙醒 酸旁路 的赖氨 酸合成 途径。 
另一 种可能 性包括 碟酸稀 醇丙酮 酸和丙 酮酸竣 化作用 的回补 反应。 
此 途径仅 考虑碳 骨架的 形成, 不 包括能 量和氧 化还原 代谢物 的再生 
縮写: Cit 一柠 檬酸; z-Cit —异柠 檬酸; SucCoA —琥 珀酷辅 SIA; 
Sue —琥 珀酸; ASA —天 冬氣酸 半酸; Lys— 赖 氨酸; a-KG — a- 酮 戊二酸 

途径 的最高 得率是 100Q/6 (以摩 尔为基 准), 与图 7.5 所 示途径 相比, 那条途 径的摩 尔得率 
仅为 67%。 

如果人 们宁愿 仅仅在 紧临一 个限制 反应之 处绕开 而保留 原途径 的大部 分结构 (包括 
TCA 循环 ), 则可 以探索 较小的 扰动。 这样 一个替 代途径 由仅有 两个反 应的一 组反应 就可绕 
开 苹果酸 脱氢酶 将苹果 酸转化 为草酸 乙酸。 其 一是: 

苹果酸 + 丙酮酸 —草酰 乙酸 + 乳酸 
该 反应由 乳酸- 苹果酸 转氢酶 催化。 另一 个是: 

乳酸— 丙酮酸 

该反应 是由乳 酸脱氣 酶逆向 催化。 

另一条 替代途 径如图 7. 6(b) 所示, 它包括 由延胡 索酸酶 在与图 7. 6(a) 相 反的方 向将苹 
果 酸转化 为延胡 索酸, 及 由琥珀 酸脱氛 酶像在 原始途 径一样 将琥珀 酸转化 为延胡 索酸。 此 
外, 延胡索 酸通过 天冬氨 酸裂解 醜转化 为天冬 氨酸。 因为 草醜乙 酸被利 用以便 形成柠 檬酸, 
一 半天冬 氨酸必 须循环 进人草 酰乙酸 以闭合 TCA 循环。 在图 7. 6(b) 的途 径中, 天冬氨 酸- 
谷氨 酸转氨 酶转化 天冬氨 酸到草 酰乙酸 的反应 是通过 与原始 生化反 应网络 (图 7.5) 中该反 
应的 相反方 向来运 行的。 如果应 用从天 冬氨酸 转化为 草醜乙 酸的这 组反应 (含两 个反应 ), 
图 7. 6(b) 所 示的先 前的途 径会产 生一个 小改变 (见图 7. 7)。 首先, 由 甘氨酸 (Gly)- 草酰 

177 




G G 

D 3 



02 

C 



FruDP Fru6P -* Glc6P Glc 



GAP -* —— DHAP 



DPG 



FruDP -* Fru6P Glc6P -* Glc 



GAP -* —— DHAP 



DPG 




1 

3PG 




6- 



卜 



o 



卜 



v\ u 




OxAc 



NH 



图 7.7 天 冬氨酸 转化为 

草酸乙 酸的替 代途径 



乙酸 氨基转 移醇转 化乙酵 酸和天 冬氨酸 成为甘 氨酸和 草酰乙 
酸, 然后, 甘氨酸 脱氣醇 将甘氨 酸循环 进入乙 醛酸。 

7.3.1 草 酸乙酸 的作用 

从上 述几种 途径中 可以观 察到, 草 酰乙酸 在所有 这些途 
径中是 一个关 键的代 谢物。 虽然 草酸乙 酸在图 7.6(b) 的途径 
中是被 部分旁 流的, 但是, 一个 关键问 题是, 是否这 个代谢 
物能 被完全 旁流, 并且是 否能够 构建由 丙酮酸 或葡萄 糖生产 
赖 氨酸的 途径, 而 在任何 一处都 没有牵 连草醜 乙酸。 根据所 
产 生的全 部途径 的检验 证明, 在 所使用 的酶反 应数据 库内, 这 种情况 是不可 能的。 而且, 在 
它存在 于所有 途径这 种意义 上讲, 没有安 置单个 反应环 绕草酰 乙酸。 消 耗和产 生草酰 乙酸的 
那些 特定反 应可以 改变, 然而, 该 中间物 本身是 始终存 在的。 因此, 草 醜乙酸 是赖氨 酸生产 
的一 个关键 节点。 

在图 7. 6(b) 的途 径中, 天冬 氨酸和 赖氨酸 不是直 接起源 于草酖 乙酸, 因 为延胡 索酸用 
一 个单一 薛转化 为天冬 氨酸。 事 实上, 天冬氨 酸转化 为草酰 乙酸, 而不是 相反。 因此, 在这 
种情 况下, 在天冬 氣酸、 延胡 索酸、 苹果酸 和草醜 乙酸附 近的代 谢与人 们通常 发现的 是相当 
不 同的, 这部 分代谢 建议: 没有 草酰乙 酸的介 人也有 可能获 得天冬 氨酸。 然而, 事实 证明没 
有草酰 乙酸的 介入, 不能 从葡萄 糖生产 TCA 循环所 必需的 中间物 (苹 果酸或 琥珀酸 )。 这 
个限制 使得导 致从葡 萄糖合 成赖氨 酸的任 何途径 都必须 有草酰 乙酸的 存在。 

为了 进一步 说明这 一点, 假 设除了 葡萄糖 之外还 可用琥 珀酸作 为所允 许的反 应物, 根据 
经验 的生物 合成分 类仍然 要求草 酰乙酸 作为一 个所需 要的中 间物。 然而, 检验图 7. 6(b) 中 
的途径 表明, 琥 珀酸能 够转化 到延胡 索酸, 而且从 那时起 在没有 苹果酸 或草酰 乙酸介 入的情 
况下, 由天 冬氨酸 裂解酶 催化生 成天冬 氨酸。 因此, 用 琥珀酸 作为另 一种所 允许的 底物, 用 
一条 不需要 草酰乙 酸的途 径完全 有可能 合成赖 氨酸。 
7.3.2 其它替 代途径 

到目前 为止, 所检 验的赖 氣酸合 成途径 或者以 丙酮酸 脱氣酶 或者以 丙酮酸 羧化酶 作为天 

冬氨 酸形成 的关键 反应, 但是, 也存在 着绕开 这两种 酶的其 
它 途径, 指 向其它 方法, 通过该 方法丙 酮酸能 进入柠 檬酸循 
环。 丙酮 酸的另 一条羧 化途径 可通过 甲基丙 二酸辅 醉 A 羧基 
转移 醇和丙 酰辅酶 A 羧化酶 完成, 如图 7.8 所示。 当然, 还 
有另一 种可能 性是磷 酸稀醇 丙酮酸 的直接 羧化, 使糖 酵解和 
TCA 循环间 通过一 条完全 旁流丙 酮酸的 路线相 连接。 

由合成 算法所 产生的 所有可 能的替 代途径 当中, 仅仅对 
其 中最简 单的一 些作了 介绍。 然而, 应 当记住 该算法 可以找 
些是 非常复 杂的。 作 为一个 例子, 考 虑了从 憐酸' 烯醇丙 酮酸到 丙酮酸 



OxAc 



甲 基丙二 酰辅薛 A 丙 酰辅酶 A 





图 7.8 丙酮 酸竣化 

作 用的替 代途径 



-个单 一步骤 中完成 )。 该算 法对这 



出所有 途径而 且其中 

的转 化这样 一个简 单任务 (该 过程 可通过 丙酮酸 激瞎在 

个转 化产生 了几条 途径, 其 中最长 的如图 7.9 所示。 
7.3.3 关于最 高得率 的限制 

途径 合成算 法最有 趣的应 用之一 在于理 论假说 研究。 例如, 前 面已经 提到, 如果 没有包 
括草酰 乙酸作 为中间 代谢物 的话, 没有 发现由 葡萄糖 合成赖 氨酸的 途径。 该算 法还揭 示只有 
通 过羧化 反应固 定二氧 化碳, 这 个途径 的最高 得率可 以超过 67%。 当然, 如 果接化 反应被 

179 




消除, 则 得率被 限制在 67% 或 更少。 没有 
系 统的列 举所有 可能的 途径, 人们 就不能 
确保不 存在其 它途径 能以更 高的得 率生产 
这种 产物。 例如, 如果设 计一条 途径将 
2mol 丙酮酸 转化为 3mol 乙 酰辅酶 A (没有 
二氧化 碳的消 耗或产 生), 



2CH3OOOOO— +3HSCoA+4H+ +2NAffl 



(丙 酮酸) (辅 SSA) 



3CH3CO-S-C0A + 3H2O + 2NAD+ 



(乙 酷辅 SIA) 



图 7.9 转化磷 酸烯醇 丙酮酸 
为丙酮 酸的最 长的可 能途径 



则基 于葡萄 糖的赖 氨酸得 率高于 67% 会是 
可 能的。 考虑 到丙酮 酸和草 酰乙酸 都参与 
大 量的酶 反应, 根据 先前的 经验并 不明显 
知道 这种途 径的存 在能被 排除。 合 成算法 
表明在 一个合 理完整 的数据 库内, 不存在 
这种 途径。 需再 一次注 意到, 所获 得的最 



高 得率仅 相对于 碳的消 耗量。 当能 量和还 原当量 平衡也 被包含 在计算 中时, 这 种得率 可能还 
要 进一步 减小。 正如第 9 章〜 第 U 章中 所阐 述的。 

7.4 算法 的讨论 

这一 章所介 绍的途 径合成 算法是 非常有 效的, 而且能 在最短 的时间 内处理 大量化 学计量 
约束 限制。 最 坏的情 况是其 复杂性 与反应 的数目 成指数 关系。 但是, 这 种情形 只在一 些非常 
特 殊的情 况下才 发生, 如图 7.10 所示的 情况。 对 于每一 个菱形 编号为 Di, D2 等, 一条途 
径 可沿上 面的分 支也可 沿下面 的分支 前进。 如果有 iV 个 菱形, 则有 iV-1 个 交叉汇 合点, 
在此 处需要 选择如 何走。 因此, 有 2iV- 1 个 不同的 途径, 它 们在基 因型上 都是独 立的。 



在 这种情 形下, 因为 算法将 构建所 有在基 因型上 独立的 途径, 因此, 途径 建立时 所需时 
间与 储存量 将随反 应数而 呈指数 增长。 然而, 这只是 最坏的 设想。 实 际上, 代 谢约束 限制长 
的 序列反 应而不 是如图 7.10 所 示的平 行分支 类型的 反应。 这种 长的反 应序列 用已介 绍的方 
法可以 非常有 效地被 处理, 并可导 致所有 替代选 择途径 的很快 产生。 此 算法的 一个特 征是: 
它的 效率方 面的贡 献是它 不必从 作为所 需要的 反应物 的代谢 物开始 (如图 7.1 所示会 是这种 
情况 ), 而是从 那些参 与最容 易满足 的约束 代谢物 开始, 即: 参 与最小 反应数 目途径 的那些 
代 谢物。 这种 特性, 使 人想起 渴望的 算法, 大大 有助于 通过所 有可能 解产生 的反应 空间的 
搜索。 

所介绍 的方法 论的另 一个优 点是: 在 代谢物 -处理 阶段, 代 谢物是 基于它 们参加 的反应 




途径数 呈指数 增长的 反应组 



数目 而被选 择的。 通 过这种 方法, 它 们从约 束限制 中被消 除而问 题的规 模大小 被连续 减小。 
如果 这些代 谢物参 与很长 的反应 序列, 那 么这些 反应序 列仅只 需考虑 一次, 因 此对于 存储及 
计算资 源并不 是一个 特别的 负担。 

最后 一点涉 及共同 流通代 谢物的 处理。 这些代 谢物必 须被定 为所允 许的代 谢物, 否则算 
法将运 算很长 的时间 以为了 满足所 有的化 学计量 约束。 比如, 考虑 包括在 吉布斯 自由能 

(P, 、 ATP 和 ADP) 使 用中的 流通代 谢物和 两类子 途径: 这些代 谢物充 当无效 循环将 ATP 
转化为 ADP 和 P, 的作用, 这些代 谢物完 成由特 定合成 问题所 规定的 转化, 除 非这些 途径也 
产生 ATP 和消耗 ADP 和 P,。 如果 ATP 和 ADP 是 所允许 的反应 物和所 允许的 产物, 来自 
第 二类的 途径是 可接受 的解并 且它们 不要进 一步被 扩展。 然而, 如果 ATP 和 ADP 从出现 
在净化 学计量 式中被 消除, 则二类 途径必 须组合 以形成 可接受 的解。 换句 话说, 来自 第二类 
的一 条途径 必须与 来自第 一类的 途径组 合以便 从化学 计量式 中消除 ATP 和 ADP。 所 产生的 
组 合数目 是非常 大的, 这就导 致严重 的执行 问题。 因此建 议把共 同流通 代谢物 包括在 所允许 
的 反应物 和产物 之中。 

参 考文献 

Mavrovouniotis, M. L.(1989). Computer-aided design of biochemical pathways. Ph. D. Thesis , MIT, Cambridge , 
MA. 

Mavrovouniotis, M. L. , Stephanopoulos , G. & Stephanopoulos, G. (1992a). Computer-aided synthesis of biochemical 

pathways. Biotechnology and Bioengineering 36, 1119-1132. 
Mavrovouniotis, M. L. , Stephanopoulos , G & Stephanopoulos , G. (1992b). Synthesis of biochemical production 

routes. Computers and Chemical Engineering 16, 605-619. 



181 



第 8 章 代谢通 量分析 

在第 1 章中论 述了代 谢通量 构成细 胞生理 学的基 本决定 因素, 主要 因为代 谢通量 提供了 
在整 体细胞 功能和 代谢过 程中, 各种 途径参 与程度 的度量 标准。 因此, 体内途 径通量 大小的 
精 确量化 是细胞 生理学 和代谢 工程学 中的一 个重要 目标, 尤 其是从 代谢生 产的角 度看, 总是 

希望 尽可能 地将底 物转化 成有用 产物。 代谢通 量分析 (MFA) 是 代谢途 径通量 确定的 一个强 
有力的 方法, 因此, 通 过利用 主要胞 内反应 的化学 计量模 型及应 用围绕 代谢物 的质量 平衡关 
系, 就 可计算 出胞内 通量。 一 组已测 量的胞 外通量 被用作 计算的 输入, 通常是 底物的 吸收速 
率和 代谢物 的分泌 速率。 通量计 算的最 后结果 是一幅 代谢通 量图, 图中 显示通 量计算 中所包 
括的 生化反 应及稳 态速率 (即 通量) 的估 计值, 图中 的每个 反应就 发生在 该稳定 状态。 图 8.1 
对此作 了举例 说明, 其描 绘了酿 酒酵母 (S. 在 厌氧培 养期间 通过分 解代谢 途径的 

通 量分布 情况。 所有通 量是由 胞内代 谢物物 料平衡 和细胞 与环境 之间交 换的化 合物通 量的测 
量经 计算得 到的。 图 8.1 所示的 这种类 型的代 谢通量 图中, 含有 不同途 径对底 物利用 和产物 
形成的 整个代 谢过程 所做的 贡献这 种十分 有用的 信息。 然而, 这 种代谢 通量图 的真正 价值在 
于所 观测到 的通量 差别: 即当 用不同 菌种或 在不同 条件下 所得到 的代谢 通量图 进行互 相比较 
所得 的通量 差别。 正是通 过这种 比较, 遗 传和环 境扰动 的影响 才能充 分予以 评价, 而 且在这 
样的 途径内 的特定 途径及 反应的 重要性 才能被 准确地 描述。 

除 了途径 通量量 化外, 代 谢通量 分析能 够提供 关于其 它重要 的细胞 生理特 征方面 附加的 
洞 察力。 这 里提供 此类附 加信息 的概括 说明, 这 类信息 可以从 MFA 及 本书参 考文献 部分得 
到, 参考 文献中 对其应 用有更 详细的 说明。 

(1) 细 胞途径 中分支 点控制 (节 点的 刚性) 的 识别。 通过比 较由不 同操作 条件的 变化及 
用 不同变 异株所 导致的 分支点 通量分 配比的 变化, 分支 点的柔 性或刚 性就可 被评估 
(Stephanopoulos and Vallino, 1991)。 一般 来说, 刚 性分支 点抵抗 通量分 配比的 变化, 而柔 
性 分支点 倾向于 更适应 通量分 配比的 变化。 代谢网 络这些 特征方 面的知 识在合 理地解 释通量 
变化 的类型 中是重 要的, 而这些 变化对 改变产 物得率 是最有 效的。 在 5.4 节已 定义了 节点刚 
性的 概念, 在 10. 1.3 节 将举例 说明如 何利用 它来研 究氨基 酸生物 合成。 

(2) 替代 途径的 识别。 生物反 应化学 计量式 的列出 (其是 MFA 的基础 ), 需要由 底物转 
化为 产物的 实际的 生化反 应路线 的详细 知识。 然而, 这 对许多 微生物 来说可 能不是 很清楚 
的, 因为已 在不同 生物体 中识别 出几条 替代途 径并且 知道是 在不同 条件下 运行。 在此, 重要 
的是重 复途径 的定义 (见第 1 章) 为: 连接一 组输入 代谢物 与一组 输出代 谢物的 可行的 及可观 
察 的反应 序列。 MFA 在识 别途径 中是重 要的: 其 能同样 好地重 复产生 胞外代 谢物的 宏观通 
量 测量, 在这 方面, 其 能消除 由于不 能满足 物料平 衡而是 不可能 的替代 途径。 Aiba 和 Mat- 
suoka(1979) 在柠 檬酸发 酵中证 明了第 一个这 类方法 的应用 (见例 8.3), 在 10.1 节, 提供了 
应用 MFA 识别 C.glutamicum 中 转氣酸 活性的 例子。 

(3) 未测量 的胞外 通量的 计算。 有时, 能被测 量的胞 外通量 数目小 于计算 未知胞 内通量 
所需的 数目。 在 这种情 况下, 通过利 用先前 实验所 确定的 通量分 配比, 有可能 计算胞 外未测 
量 通量, 例如, 各种 副产物 的生产 速率, 这可通 过利用 化学计 量模型 和已测 量的通 量来计 

182 



算。 如果这 些通量 的测量 是变得 可以利 用的, 那么 它们与 模型预 测的一 致性程 度可用 于模型 

证实或 修正, 可以作 为实例 (见 8.1.2 节关于 超定系 统的讨 论)。 

(4) 最 大理论 得率的 计算。 计 算理论 得率是 基于从 一个指 定的底 物生产 最多的 产物, 以 
构 成代谢 网络的 化学计 量式。 通量 分配比 以生成 产物量 最大来 确定。 此外, 必 须关注 代谢中 
间物 和流通 代谢物 之间的 关系。 当然, 有 可能确 定特定 条件下 的理论 得率, 然而, 在 复杂的 
代谢网 络中, 以 MFA 为基 础的更 为正规 的方法 是更可 取的。 理 论得率 的计算 为实际 过程提 
供 了一个 基准, 而且 对于已 给的应 用也能 识别具 有特别 吸引力 的替代 途径。 此外, 它 们提供 
了 在最高 得率的 条件下 代谢活 性的一 个有用 的标记 (即 呼吸商 ), 而最高 得率是 在寻求 最优控 
制策略 时所追 求的。 这些方 法的例 子将在 10.1 节 给出。 

在 本章, 将介 绍代谢 通量分 析理论 并阐述 类似于 得到图 8.1 所 示结果 的计算 基础。 MFA 
的一个 独特方 面是: 胞内 代谢通 量的化 学计量 确定既 可基于 相同数 目的代 谢物平 衡式, 也可 
以基于 大于或 等于这 些代谢 物的平 衡式, 这取 决于可 利用的 测量的 数目。 在第 一种情 况下没 
有冗 余度, 而 具有更 多的测 量则可 使过程 的真实 性得到 严格地 评估。 如 果较少 的测量 是可以 



葡萄糖 




细胞质 



图 8.1 S. cerevisiae 厌氧生 长时不 同代谢 途径上 的通量 
这 些通量 是利用 Nissen 等 (1997) 的化学 计量模 型和一 些测量 值通过 计算得 到的, 
测量值 包括葡 萄糖和 S 的吸收 速率, 二氧 化碳、 乙酸、 乙醇、 甘油、 丙兩酸 和號珀 
酸 的产生 速率, 以及重 要大分 子库如 DNA、 RNA、 蛋 白质、 脂 类和糖 类的合 成速率 

183 



利 用的, 优化约 束可以 引入, 以提供 平衡方 程完全 闭合。 这些方 面将在 8.2〜8.4 节 讨论。 
在下 一章, 将讨论 利用同 位素标 记的底 物进行 代谢通 量实验 确定的 方法, 而在第 10 章, 用 
来自微 生物和 细胞培 养实例 研究中 的具体 例子示 范证明 MFA 的 应用。 

8.1 理论 

MFA 的起 点是描 述底物 如何转 化为代 谢产物 和生物 质组成 (或 大分 子库) 的反应 网络化 
学计 量学。 利用第 3 章的 框架, 考 虑经由 K 个途径 代谢物 进行的 J 个胞内 反应, 其 质量平 
衡式 已由式 (3. 19) 给出, 或 以向量 符号表 示为: 

d 艺 ~~ ― rmet ― /^Xmet (8.1) 

在式 (8.1) 中, Xmet 是胞内 代谢物 (或 途径中 间物) 的浓度 向量, rmet 是一个 包含在 /个 
反应中 的胞内 代谢物 形成净 速率的 向量。 

普遍 承认, 大 多数代 谢物库 有着非 常高的 周转。 因此, 甚至 在细胞 所经历 的环境 受到强 
烈扰动 之后, 不同代 谢物库 的浓度 也会迅 速调整 到新的 水平。 因此, 假 定途径 代谢物 处于拟 
稳定状 态是合 理的。 这 意味着 没有代 谢物的 积累, 艮卩: 

― fmet - f^^met (8.2) 

式 (8. 2) 右 边第一 项表示 /个 反应中 途径中 间物的 净合成 速率, 即 流进和 流出一 条途径 的代谢 
物通量 的和。 第二项 表示由 于生物 质生长 而对代 谢物库 的稀释 作用。 如果 这种稀 释效果 被认为 
是一 种人为 的消耗 反应, 那么式 (8. 2) 表 明流进 和流出 一个途 径代谢 物库的 通量是 相互匹 配的, 
即围绕 一个已 给途径 代谢物 库的通 量是守 恒的。 因 为大部 分途径 代谢物 的胞内 水平是 非常低 
的, 所以这 种稀释 影响一 般是很 小的, 特别是 与影响 同一个 代谢物 的其它 通量相 比较时 情况更 
是 这样。 因此, 上式最 后一项 一般可 被忽略 (见例 8.1)。 于是得 到更简 单的平 衡式: 

= rmet = GTv (8.3) 
其中 已代入 用于代 谢物合 成净速 率的式 (3.12)。 

【例 8.1】 途 径代谢 物的稀 释影响 

为了 说明式 (8. 2) 中的稀 释项是 可以忽 略的, 考虑三 种不同 类型的 胞内化 合物: (1) 糖 
酵解途 径的中 间物; (2) 氨 基酸; (3) ATP 。在表 8.1 中 收集了 这三组 化合物 的相关 数据。 

在 S. cerew'w'ae 的 好氧生 长中, 在连 续培养 (稀释 速率为 0.1 h — 1) 条 件下, 已 测得糖 
酵解途 径中的 代谢物 胞内水 平是在 0.05 〜1.0/umohg_i( 干重) 的范围 (Theobald et al, 
1997) o 在这些 生长条 件下, 通过 EMP 途径 的通量 大约为 l.lmmol'g — 1( 干重) 'h — 1, 因此 
可以 看出通 过一个 代谢物 库的通 量大大 高于式 (8. 2) 中的稀 释项, 该 稀释项 值约为 0.005〜 
0.1|Lxmol,g — 1( 干重) 'h — 1。 因此, 即 使对于 较低的 糖酵解 通量, 稀释 项也可 以是忽 略的。 对 
于哺 乳动物 细胞, 胞 内代谢 物库的 水平是 大约相 同的, 但通量 是比较 小的, 在 周转率 和稀释 
率之 间的差 别就比 较小, 但一般 说来, 也 会得到 类似的 结果。 

在产 黄青霉 〔P.chrysogenum、 中, 胞内氨 基酸浓 度是在 1 〜45/^mo 卜 g — i ( 干重) 的范 
围。 通过氨 基酸库 的通量 取决于 蛋白质 的合成 速率, 其在 稳定状 态下, 可从细 胞的蛋 白质含 
184 



表 8.1 不同代 谢物的 典型胞 内水平 



化合物 


质量摩 尔浓度 
nmol-g" ' (干重 ) 


代 谢路线 


微生物 


参 考文献 


6- 磯酸 葡萄糖 


0.90 


分 解代谢 (EMP) 


S . cerevisiae 


Theobald et al 
( 1997 严 


6-« 酸果糖 
1,6- 二磯 酸果糖 
3- 磯酸 甘油酸 
碟酸' 烯醇 丙銅酸 

丙氣酸 


0.20 
0.10 
0.065 
0.052 

22.8 


合 成代谢 


P . ch rysogen u m 


Nielsen 
(1997) ② 


谷氨酸 
赖氣酸 

苯 丙氨酸 

ATP 


44.5 
3.9 
0.9 

8.0 


能 量代谢 


S . cerevisiae 


Theobald et al 
(1997) ① 



①数 据取自 S. cerevisiae 的稳态 连续好 氧生长 (D = 0. lh_ i )。 



②数据 取自比 生长速 率较高 (即, 约 o.ih-') 补 料-间 歇培养 的初始 阶段。 没有发 现游离 氨基酸 库的浓 度随环 境条件 
的 改变而 大幅度 变化。 

量和 比生长 速率来 确定。 对 于一个 45% (质 量比) 的 典型的 蛋白质 含量, 比生 长速率 O.lh— 1, 蛋 
白 质合成 速率为 0.045g (蛋白 )'g — 1( 干重) 'h— 1。 对于 P.c:/rr3«ogen"m 中 蛋白质 库的氨 基酸组 
成, 其平 均摩尔 质量为 112g/mol (蛋白 质结合 氨基酸 ), 因此, 为 合成蛋 白质而 消耗氨 基酸的 
速率为 0.4 mmoKO. 045/0. 112, 蛋白质 结合氨 基酸) 'g—K 干重) 'h— UNielsen, 1997)。 对于丙 
氨酸、 谷 氨酸、 赖氨 酸和苯 丙氨酸 的含量 (基 于摩尔 基准) 分别为 6.6%、 12.8%、 5.3% 和 
3. 7% 的 情况, 通 过上述 四种氨 基酸库 的通量 分别为 26.4;mio 卜 g— 1( 干重) •}!— 1, 51.2^tmol-g-' 
(干重 )'h— 1, 21.2^tmol'g— 1(干重)'卜_1和 14.8ptmol'g— 1(干重)'11— 1。 由 此可以 看出, 对 少数几 
个氨 基酸, 其游离 库是很 大的, 例 如丙氣 酸和谷 氨酸, 稀 释项比 通过游 离氨基 酸库的 通量小 
10 倍的数 量级。 对这些 氨基酸 忽略稀 释项在 计算上 可能引 起小的 误差, 但是, 如果对 于库的 
大小的 数据是 可以利 用的, 则 有可能 计及稀 释项, 这 可通过 包括作 为一个 人为消 耗反应 的稀释 
项 来进行 [参见 Reardonetal(1987)]。 对于 游离库 很小的 氨基酸 (大多 数氨基 酸是这 种情况 ) , 
稀释项 也可以 忽略, 因为 其比通 过库的 通量小 50 倍 左右。 

在 S. ceret;z'sz'ae 中的 ATP 库 大约是 8.0 /Lono 卜 g — i( 干重 )。 由于 ATP 参 与很多 反应, 
因 此难以 估计通 过库的 通量。 然而, 从 ATP 得率 YxATP 和 比生长 速率, 人们 可以得 到细胞 
生长的 ATP 总需 要量的 估计。 如果取 l^cATP 为 70mmoKATP)'g — 1( 干重) (见例 3.4), 可 
以 求出在 比生长 速率为 O.lh — 1 时 所需的 ATP 是 7.0 mmo 卜 g— 1( 干重) 'h — 1。 因此, 通过 
ATP 库的通 量比稀 释项高 10000 倍, 很 显然在 ATP 平 衡计算 中稀释 项可以 忽略。 即 使对于 
具 有较高 ATP 库的 细胞, 例如乳 酸菌, 这个结 论仍然 成立。 对 NADH 和 NADPH 等其它 
辅助 因子也 能得到 类似的 结论。 

从前 面的分 析可以 看出, 对于 代谢物 和辅助 因子, 因为它 们的胞 内库具 有非常 高的周 
转, 故可 忽略稀 释项。 这 可以特 征时间 的形式 来表示 (见 2.1 节)。 因此, 如果 代表一 个库周 
转的特 征时间 (其等 于库的 大小与 通过库 的通量 之比) 大 大小于 代表生 长的特 征时间 (其 等于 
比生 长速率 的倒数 ), 则稀释 项可以 忽略。 



拟 稳态假 设的一 个推论 是只需 考虑位 于代谢 反应网 络分支 点的代 谢物。 在 线性反 应序列 
中的所 有途径 中间物 都可以 消除。 这可 以通过 EMP 途 径中的 6- 磯酸果 糖转化 为憐酸 二经丙 
酮和 3- 碟酸甘 油酲的 过程来 说明。 这 个转化 过程包 括两步 反应, 它们的 化学反 应计量 式为: 

185 



一 fructose-6-P - ATP + fructose- 1 , 6-bisP = (8.4) 
(6- 碟酸 果糖) (1,6- 二磯酸 果糖) 

一 fructose- 1 , 6-bisP + di hydroxyacetone-P + glyceraldehyde-3-P = (8.5) 
(8? 酸 二经丙 S) (3-9^ 酸甘 油酸) 

如在 3.1 节所讨 论的, 忽略在 第一步 反应中 形成的 ADP。 上 述两个 反应是 1,6- 二磷酸 
果 糖参与 的仅有 的细胞 反应, 围 绕此代 谢物的 稳态质 量平衡 式为: 

vi-v2 = (8.6) ' 

式中, VI, 1;2 分别 表示上 述两个 反应的 正反应 净速率 0。 因此, 第 一个反 应速率 等于第 
二 个反应 速率。 可以把 这两个 反应集 总进一 个总的 反应, 这个 反应将 6- 碟酸 果糖转 化为磷 
酸二轻 丙酮和 3- 磷酸甘 油酵, 正反应 速率为 t;i。 注意这 种集总 不改变 总的自 由度, 因为一 
个反 应速率 (即一 个未知 的反应 速率) 的 移除的 同时也 伴随着 一个质 量平衡 (对 1,6- 二 碟酸果 ! 
糖 的质量 平衡) 的 消除。 无论 何时只 要是线 性序列 反应, 就能 进行类 似的反 应集总 (另 一个 
例 子是在 EMP 途 径中的 3- 磯酸甘 油酸到 磷酸條 醇丙酮 酸的转 化)。 因此, 在 建立代 谢途径 
的 化学反 应计量 式时, 只需考 虑在网 络分支 点的代 谢物, 这就使 在代谢 通量分 析中通 常用到 
的 化学计 量模型 的复杂 性明显 降低。 这在例 8.2 中 将给以 说明。 



【例 8.2】 赖氣酸 生物合 成中代 谢通量 的确定 

表 10.1 更详 细地描 述了赖 氨酸生 物合成 的代谢 网络, 有关 在这里 所考虑 的特定 反应及 
其化 学反应 计算式 的更多 信息可 以参考 该表。 图 8.2 已 经给出 各种胞 内反应 进行的 速率, 它 
从每 单位时 间每克 干重细 胞微生 物消耗 Imol 葡萄糖 开始。 下述 总计量 式已分 别用于 磷酸戊 
糖 途径和 三羧酸 循环: 

3Glc6P + 3H20 + 6N ADP— 3C02 + 6NADPH + 2Fru6P + GAP ( 1 ) 

Pyr + 3NAD + NADP + FAD + ADP— 3C02 + NADPH + 3NADH + FADH + ATP ( 2 ) 
在 6- 磯酸 葡萄糖 (Glc6P) 到 6- 磷 酸果糖 (Fru6P) 的 方向糖 酵解净 通量是 正的。 产物为 
海藻糖 (速 率为 rT)、 糖酵 解产物 (即 乳酸、 丙 氨酸、 缬氨 酸集总 在一起 速率为 rc)、 C02( 速 
率为 rco2) 及 赖氨酸 (速 率为 rj, 同 时生化 合成中 要用到 葡萄糖 (Glc)( 速率为 Imol/ 单位时 
间)、 氨 和氧。 葡萄 糖运输 是通过 PTS 系统: 

Glc + PEP— Glc6P + Pyr (3) 
单 独的反 应包括 丙酮酸 的接化 (通 量为 ^), PEP 的羧化 (通 量为 1;3) 和 OAA 的脱 羧反应 (通量 
为 1;4)。 由 于这三 个反应 不能从 上述代 谢物的 测量而 独立观 察到, 通量^^3, 和 t^6 累 加起来 

得到 ^;8=1;3-^+^。 通过忽 略为生 物合成 而消耗 的代谢 物量, 可以写 出如下 平衡式 以确定 



这两 个未知 的通量 分配比 和 t^2: 

海藻糖 r'Y=l - VI - V2 (4) 

赖氨酸 ri^= V8= V3- V4 + (5) 

糖酵 解产物 rG=t;5 (6) 

NADPH = 2vi-4v8+z [其中 z 为三羧 酸循环 TCA 通量, 见图 8.2] (7) 



在本 章中, 胞内反 应速率 "是 指正向 反应净 速率。 此速率 等于不 可逆反 应的正 向反应 速率, 也等 于可逆 反应的 
正向与 逆向反 应速率 之差。 因为 本章所 考虑的 宏观平 衡不能 区分正 向与逆 向反应 速率, 因此用 "来描 述二者 之间的 差别, 
即净 速率。 

186 



1 mol/ 单 位时间 



— 海藻糖 



(1-。,— "3) 



葡萄糖 
I 



G6P 



F6P 



[P2+(2/3)i^]| 



FruDP 



COj 



NADPH 



(顯 



(1/3)", 



Lac,Ala,Val 



H4D 




: 氢化症 二羧酸 乂'. ― 

NADPH ^ ~ ^r^NH, 

Sue Glu a-KG 

NHj^ NADPH 
^ 



图 8.2 赖氨 酸生物 合成代 谢网络 
描述 了中间 代谢物 与流通 代谢物 的消耗 和产生 速率。 可 参考表 10.1 的反应 化学计 量学。 
正 通量值 表明净 通量正 向的。 平 衡式总 结于例 8.2 中的式 (4) 〜式 (10) 
缩写: H4D —六氢 吡啶二 竣酸; w«oDAP —消旋 二氣基 庚二酸 

氣 ^ amm ― 2x^8 

C02 的释放 rcO-=x;i + 3z 

O2 的吸收 ro,=(l/2)rNADH=(l/2)(5"i/3 + 2"2 + 4z) 

以上 方程式 对未知 数求解 可得: 

z;i = (3/5)(rG-2 + 6rL + 2rT) 
x^2=l-rT-(3/5)(rG-2 + 6rL + 2rT) 
W8= 广 L 



(8) 
(9) 
(10) 



(11) 
(12) 
(13) 

v^^rQ (14) 
就额 外的测 量数据 而言, 虽 然不能 描述羧 化作用 通量, 但对 试验数 据提供 如下的 约束: 

rco +6rL + 3r-G + 6rT = 6 (15) 



^ r A 



187 



2ro^+ 14rL + 5rG+ 12rT= 12 



= 2rL 



(16) 
(17) 



式 (8.3) 形成代 谢通量 分析的 基础, 即, 在 胞内速 率向量 V 中未 知途径 通量的 确定。 
这 个向量 方程表 示对于 K 个代 谢物的 J 个未 知数 (途径 通量) 的 K 个线性 代数平 衡式。 因 
为反 应数目 m 总是 大于途 径代谢 物数目 (K), 该代数 方程组 有确定 的自由 度为: F-ij 
J-K。 因此, 向量 V 中的一 些元素 必须被 测量以 便允许 其余未 知量的 确定。 反应速 率能被 
测 的一个 典型例 子是葡 萄糖到 6- 磯酸葡 萄糖的 转化, 可以取 其等于 葡萄糖 的吸收 速率。 如 
果 V 中恰好 F 个通量 (或 反应 速率) 被 测定, 该系统 就成为 确定性 的系统 (determined sys- 
tem) 并有惟 一解, 且 能很容 易得到 (见下 面)。 如 果多于 F 个通 量被 测量, 则 这个体 系就是 
超定 的系统 (overdetermined system), 意味着 存在着 额外的 方程, 其 可用于 总体平 衡一致 
性的 检验、 通量测 量的准 确度、 拟稳 态假设 证实, 及未知 胞内更 准确的 通量的 计算。 如果少 
于 F 个通 量被 测量, 那 么这个 系统就 是不定 的系统 (underdetermined system )。 这时, 只 
有 在代谢 物平衡 中引入 额外的 约束, 或者对 代谢物 平衡施 加一个 整体优 化准则 (见 8.3 节), 
才 能确定 未知的 通量。 

在 一个确 定性系 统中, 正好 F 个通量 (或 向量 V 中的 反应 速率) 被 测量, 其余 的通量 
可通 过解式 (8.3) 的 线性方 程组来 计算。 引 人矩阵 代数来 描述各 个步骤 是很方 便的。 为此 
目的, 通 过把测 量的速 率集中 在一个 新向量 Vm 中, 向量 V 中剩余 的元素 (其 是要计 算的速 
率) 集中 在另一 个向量 Vc 中, 则可 求出式 (8.3) 的解。 类 似地, 通过 把测量 的反应 的计算 
系 数集中 在矩阵 Gm 中, 而把 其余的 反应的 计量系 数集中 在矩阵 中, 从而 对矩阵 G 的化 
学 计量系 数作了 上述的 分配。 于是式 (8.3) 可以改 写为: 

= GTv 二 Gk + GTvc (8.7) 
因 为正好 F = J-K 个 通量被 测量, Ge 是一 个方阵 (维 数为 KxK:), 而且如 果矩阵 能够求 
逆 (见下 文), 则 Ve 的元素 可以表 示为: 

Vc= — (G;n — iG^m (8.8) 

在例 8.3 中将 证明示 范矩阵 代数在 通量确 定中的 应用, 而且 甚至已 经用上 述方法 表示每 
一个矩 阵已提 供一个 模板以 便于这 个方法 对其它 系统的 应用。 



【例 8.3】 利用 解脂假 丝酵母 (C.Updytica) 进行 柠檬酸 发酵的 代谢通 量分析 

为了 进一步 阐述代 谢通量 分析的 概念, 考虑 Aiba 和 Matsuoka (1979) 进行 的利用 C. 
lipolytica 生产 柠檬酸 研究, 其 可能是 利用代 谢物平 衡来处 理发酵 数据的 第一个 应用。 在他 
们的分 析中, Aiba 和 Matsuoka 利 用如图 8.3 所示的 简化了 的代谢 网络, 包括 EMP 途径、 
TCA 循环、 乙醒酸 支路、 丙酮酸 羧化和 主要大 分子库 (即蛋 白质、 碳 水化合 物和脂 类等) 
形成。 当柠檬 酸和异 柠檬酸 被分泌 到胞外 培养基 中时, 为 了补充 TCA 循环 中的代 谢物, 这 
两 条回补 途径显 然是必 须的。 

注意此 模型的 结构, 特 别是一 些代谢 产物, 例 如被描 述为代 谢中间 物的柠 檬酸、 异柠檬 
酸。 分 泌反应 (图 8.3 中 用虚线 所示) 的引 入允许 拟稳态 假设可 应用于 所有途 径的中 间代谢 

物。 C02 参 与几个 反应, 因此 C02 作为胞 内化合 物也被 包括并 以速率 T,i6 被 分泌。 围绕 C02 

也 可引入 一个平 衡式。 用这 种模型 结构, 一些 通量能 被直接 测定。 
188 



葡萄糖 



G6P ~ *• 糖类 




图 8 . 3 简化的 C . lipolytka 代 谢网络 
缩写: G6P — 6- 隣酸葡 萄糖; Pyr —丙 酮酸; AcCoA —乙 酰辅薛 A; OAA —草 Bit 乙酸; Cit— 柠 檬酸; 
I'-Cit 一异柠 檬酸; a-KG— a- 酮戊 二酸; Sue —琥 拍酸; Mai— 苹 果酸; GOX— 乙醒酸 
虚线表 示运输 反应, 而实线 表示胞 内反应 

单个 反应的 化学计 量式是 相当简 单的, 因 为除了 葡萄糖 到丙酮 酸的转 化外, 其余 的化学 
计量系 数都为 1 或 -1。 对网络 (见图 8.3) 中所 有的分 支点应 用拟稳 定状态 假设, 对所有 
单个反 应的速 率可以 非常容 易得出 方程式 (1) 〜式 (11)。 所有反 应速率 单位均 为每克 干重生 

物 体在每 小时内 形成该 化合物 的摩尔 [rnol*g— 1( 干重) 'h — 1]。 



G6P: 


V\ ― - = 


(1) 


Pyr: 


7^2 — — *!^5 = 


(2) 


AcCoA: 


1;4 — 1;6 - t^l3 - "^^4 = 


(3) 


Cit: 


V(> - VT - vn = 


(4) 


z- Cit: 


Vj- V^- Vl2~ 'i'lfi-O 


(5) 


a -KG: 


778 - 779 - *!^15 = 


(6) 


Sue : 


Vg - ViO+ t^l2 = 


(7) 


Mai: 


,― vn + ^13 = 


(8) 


GOX: 


V\2- t'l3 二 


(9) 


OOA: 


V5+ vn~ V(, = 


(10) 


CO2: 


V4+ Vg- Vi(, = 


(11) 



注意, 反应 (13) 应 该已被 删除, 因为 对乙酸 酸应用 拟稳态 假设表 明这个 反应速 率等于 t;i2。 

用 18 个反应 速率和 11 个平衡 方程, 则 可得自 由度为 7。 因此, 如果有 7 个反应 速率被 

' 189 



测定, 那么 其它的 反应速 率就可 以计算 出来。 在 Alba 和 Matsuoka 的分 析中, 他们 测量了 
网 络中的 6 个反应 速率: 葡萄 糖的吸 收速率 (rgie=^M)、 CO2 产 生速率 (re=z^i6)、 柠檬酸 

的产 生速率 (rc,t=t^n)、 异柠檬 酸的产 生速率 (nct=tn8)、 蛋 白质合 成速率 (rpr。t=ZM5) 
和 碳水化 合物合 成速率 (rear=t^3) (下标 : glc 表示葡 萄糖; C 表 示二氧 化碳; cit 表 示柠檬 

酸; ict 表 示异柠 檬酸; car 表示 碳水化 合物, prot 表示蛋 白质—— 译者注 )。 其 中速率 rv。t 
和 r„r 通过分 别测量 生物质 (在 稳定 的恒化 器中) 中的蛋 白质和 碳水化 合物含 量而可 得到。 
除这 6 个测 量外, 他们 通过设 定网络 中的反 应速率 之一为 零而施 加了一 个约束 条件。 检验了 
三 种不同 情况, 反映 柠檬酸 生物化 学的三 种不同 模型: 

* 模型 1: 乙酵 酸支路 是无活 性的, 即 1;12 = 0。 

* 模型 2: 丙酮酸 羧化醋 是无活 性的, 即 1;5 = 0。 
* 模型 3: TCA 循环 是不完 全的, 即 t;9 = 0。 

用上述 6 个已 测定的 速率, 准 确确定 了每个 模型对 应的方 程组, 解 这些方 程组就 可确定 
未知 的反应 速率。 通过不 断地消 除未知 速率来 进行, 比如, 可以迅 速发现 

V2 = 2(rg\c - Tear) (12) 

对 其它反 应速率 也可以 得到类 似的表 达式。 一 种更普 遍的方 法是利 用矩阵 代数来 计算。 下面 
将阐述 在模型 1 的情 况下如 何计算 未知的 通量。 为此, 首 先利用 化学计 量矩阵 G 以矩 阵形 
式 重写式 (1) 〜式 (11): 、 



1- 


0.5 


一 1 












































0, 










1 





一 1 


- 1 























































1 





-1 




















- 1 


一 1 


































1 


-1 





























一 1 




























1 


- 1 











- 1 

















-1 




























1 


- 1 

















一 1 











v = 





























1 


一 1 





1 




















































1 


- 1 





1 























































1 


一 1 


































1 


- 1 














1 





































1 


一 1 








1 


1 




















- 1 





0. 




0- 



(13) 



当速率 t;i、 1;16 和 被测量 (即 由相应 署名的 r 变量 来表示 ), 并且 没有异 

柠檬 酸分泌 (即 t;i8 = 0) 时, 在模型 1 的 情况, z;i2 被 设定为 0, 第 1、 3、 12、 15、 16、 17 
和 18 列 被集中 在矩阵 Gm 中, 而剩 余的列 被集中 在矩阵 Gc 中, 于 是由式 (8.8) 得出 



V2 ' 




-0.5 





























0、 


V4 




1- 


- 1 


-1 


























V5 







1 





- 1 

















- 1 


- 1 


Vb 













1 


- 1 




















VI 
















1 


一 1 

















^8 



















1 


-1 














•U9 






















1 


- 1 











■^10 

























1 


- 1 


1 




































- 1 





'!^ 13 










1 


一 1 














1 








"14」 







1 


- 1 








1 


1 











0」 



190 

I 



或 





1 


一 1 



































































































- 1 









ar 









一 1 













- 1 













X 








一 1 















厂 1 


)r()t 









1 


















































il 









1 




















ct J 













































1 





0J 








"1 




2- 


2 
















01 






1;4 








1 


一— 


1 





- 1 




1 






t'5 







- 


1 




1 





1 


1 






t'6 






1 





1 


5 


0.5 


2 


2 




, car 


V, 






1 





1 


5 


0.5 


1 


2 









•fg 






1 ― 


1 


1 


5 


0.5 


1 


1 




广 pro 


■f 9 






1 - 


1 





5 


0.5 


1 


1 






t'lO 
















0.5 


1 


1 




r tit 


•f 11 








1 







0.5 


1 


1 




^ ict 


TJ\}, 










1 




















V 14 ' 




3- 


3 


- 


2 


5 


-0.5 


-3 




3 J 







(14) 



应 注意该 解的复 杂性, 即胞 内通量 是几乎 全部所 测量的 速率的 函数。 在这种 情况, 利用 
高斯 消去法 来解上 述代数 方程组 可能是 非常烦 琐的, 而矩阵 方程则 可以利 用计算 机程序 (如 
Mathemetica, Mable 或 Matlab 等) 容易地 求解。 从式 (15) 的 第一行 可看出 z;2 的 解与式 
(12) 给 出的解 相同。 显然, 当乙醛 酸支路 是无活 性时, "13 = 0、 vio=vno 通过计 算稳定 
状态恒 化器中 不同稀 释速率 (即不 同组的 测量的 速率) 时的未 知速率 (或通 量), Aiba 和 
Matsuoka (1979) 得出 结论: 模型 1 所描 述的通 量是合 理的。 此外, 在四种 不同酶 (丙酮 
酸羧 化醇、 柠 檬酸合 成酶、 异 柠檬酸 脱氣酶 和异柠 檬酸裂 解酶) 的体外 活性测 量与所 计算的 
通量关 联得相 当好。 当检 验其它 两种模 型时, 发 现一些 通量是 负的, 如, 模型 2 预测 a- 酮 
戊二酸 被转化 为异柠 檬酸。 这 不是不 可能, 但是 大多数 反应在 热力学 被证明 是按图 8.3 中箭 
头 所示的 方向进 行的。 这样, 从异柠 檬酸到 a- 酮 戊二酸 转化的 AGO 是 -20.9kJ'mori, 而 
要使反 应逆向 进行, 会需要 很大的 a- 酮戊 二酸对 异柠檬 酸的浓 度比。 此外, 用模型 1 在所 
测量的 酷活性 与所预 测的通 量之间 的拟合 程度比 其它两 种模型 都好。 Aiba 和 Matsuoka 
(1979) 因 而做出 结论: 在柠檬酸生产条件下 C\/z>o/3;Z/a^ 中乙酸酸途径是没活性的或者是 
以 很低的 速率在 运行。 



式 (8.8) 实际上 表示, 当 利用矩 阵符号 表示法 (见 方框 4.2) 来解 K 个线 性代 数方程 
组时 所得的 结果。 对于惟 一解的 需要是 该代数 方程组 必须是 线性无 关的, 即方 程组中 没有一 
个方 程是其 它方程 的线性 组合。 这 种线性 独立对 G 。矩 阵求 逆是必 要的, 而且 通过确 定矩阵 
的秩就 很容易 检验。 因此, 只要矩 阵满秩 (等于 K), 即, 矩阵 Ge 的行列 式值不 为零, 则矩 

191 



阵就可 求逆, 未测 量的通 量就能 计算。 如 果矩阵 G 。的 秩小于 K, 则 该矩阵 为奇异 矩阵, 这 
意味 着矩阵 Ge 的行 列式值 为零, 则用式 (8.8) 得不 到解, 在 这种情 况下, 本 质上我 们正在 
涉及一 个不定 系统。 

矩阵 的秩可 能小于 K 主 要有两 个原因 : 

(1) 集中 在矩阵 Gc 中的反 应计量 方程组 (例如 由几行 组成的 一组) 是 线性相 关的, 即 
包括 在矩阵 Ge 的 一行或 多行可 以写成 其它行 的线性 组合。 在一 个代谢 网络中 各反应 计量式 
是否存 在线性 相关可 很容易 地通过 确定总 化学计 量矩阵 G 的秩来 检验。 如果 G 为满 秩, 也 
就是 rank (G) = K, 则表 明至少 存在一 个方阵 子矩阵 其能用 于求逆 计算。 如果 rank 
(G) <K, 则矩阵 Gc 的行 中至少 有一行 与其它 行线性 相关。 由 于代谢 网络中 通常存 在大量 
反应, 因此 各化学 反应计 量式之 间的线 性相关 性问题 是经常 产生的 (见例 8.4)。 在 这些情 
况下, 有必要 消除所 有线性 相关的 反应和 (或) 在求 解程序 中包括 额外的 信息。 

(2) 即 使矩阵 G 是满 秩, 也 有可能 测量数 据组以 这样的 方式被 选择, 以致 有 一个小 
于 K 值的 秩。 在 这种情 况下, 一 些已测 量的速 率是多 余的。 它们可 以用于 一致性 检验, 但 
仅仅是 在不同 测量数 据组首 先被用 以确定 未知通 量之后 (详 见例 8.5)。 



【例 8.4】 线性相 关的化 学反应 计量式 

因为大 多数活 性细胞 能够利 用许多 种化合 物作为 碳源、 能源和 氮源, 因此 存在着 很多互 
补 途径, 如果它 们同时 在运行 则会起 类似的 作用。 当进 行代谢 通量分 析时, 所 有这样 一些途 
径的 包含会 引起能 观测性 问题, 这 意味着 这些途 径通常 仅胞外 测量是 不可辨 识的。 由此, 不 
可 观测的 途径表 现为线 性相关 的化学 反应计 量式。 许多最 常遇到 的问题 是由于 如下一 条或多 
条 代谢路 线所引 起的: 

* 原核 生物中 的乙酵 酸循环 

* 经由 GS-GOAT 系统 的氮同 化作用 

* 转 氢酶系 

* 异 构酶系 

在 原核生 物中, TCA 循环和 所有补 给反应 (包括 乙醛酸 循环) 都 是在胞 质基质 中进行 
的。 通常, 乙醛酸 循环被 认为是 TCA 循环 的一条 旁路, 这是因 为它与 TCA 循环共 享许多 
反应 (见图 2.10)。 然而, 这两条 途径具 有非常 不同的 目的: TCA 循 环有把 丙酮酸 氧化为 
C02 的 目的, 而乙醛 酸循环 有合成 前体代 谢物的 目的, 例如, 由乙 酰辅晦 A 合成 草酰 乙酸。 
仅考虑 这二者 本身, TCA 循环 和乙醛 酸循环 不存在 线性相 关性, 但是 如果包 括其它 补给途 
径 (例如 丙酮酸 羧化酶 ), 则奇 异性会 产生。 这可 通过对 三个途 径写出 集总的 反应来 举例说 
明 (见图 2. 10 对于途 径总览 )。 在所 有的情 况下, 我们 用丙酮 酸作为 起点。 

TCA 循环 : 一 pyruvate + 3C02 + NADH + FADH? + GTP = (1) 

乙醛酸 循环: — 2pyruvate + 2C02 + oxaloacetate + 4NADH + FADH2 = (2) 

(草酰 乙酸) 

丙 酮酸羧 化酶: ― pyruvate - ATP ― CCk + oxaloacetate = (3) 

如果 ATP 和 GTP 汇集 在一起 (在胞 内反应 的分析 中经常 这样做 ), 则很 显然乙 酸酸循 
环是 其它两 个途径 的线性 组合, 并 且通过 通量分 析不能 独立确 定所有 这三个 途径。 要 决定该 
消除哪 一条途 径是很 困难的 任务, 而 且如图 8.4 所示, 当或 者包括 TCA 循环, 或者 包括乙 
醛酸循 环时, 两种 情况所 计算出 的通量 分布可 能完全 不同。 但幸运 的是, 这些 途径很 少同时 
192 



葡萄糖 



葡萄糖 




35 



72 




丙酮酸 



213 



乙 酷辅薛 A 




, 赖氨酸 



(a) (b) 

图 8.4 在 谷氛酸 棒杆菌 (C.giutam 請") 中, 赖氨 酸摩尔 得率为 0.35 时 所需的 理论通 量分布 
通 量是通 过使用 ValHnoandStephanopoulos (1993) 的 化学计 量模型 而计算 出来的 (见 10.1 节) 
8? 酸稀醇 丙兩酸 和丙酮 酸之间 的两个 通量分 别对应 着丙酮 酸激酵 (a) 和 葡萄糖 PTS 运 输系统 (b) 催化 的反应 
(a) TCA 循环 有活性 而乙酸 酸循环 无活性 的通量 分布; (b) 乙醒酸 循环有 活性而 TCA 循 环无活 性的通 量分布 

RibuSP: 5- 磷酸 核酮糖 

运行, 因为它 们的酶 是被不 同地诱 导的。 关 于相应 酶活性 的诱导 和调节 的信息 对于在 一组环 
境条 件下要 考虑的 准确途 径做出 一个有 根据的 决定是 非常关 键的。 例如, 在很 多微生 物中异 
柠檬酸 裂解酶 (乙酸 酸循环 的第一 个酶) 的表 达受葡 萄糖的 抑制, 以致 乙醛酸 循环的 可能性 
可以因 在葡萄 糖中生 长而被 消除。 在 真核细 胞中, 乙酸酸 循环没 有引起 线性相 关性, 这是由 

于 不同反 应的分 区化, 即 TCA 循 环在线 粒体中 运行, 而 乙酵酸 循环或 者在胞 液中或 者在微 
体中 进行。 所 有三条 路线都 包括在 Aiba 和 Matsuoka (1979) 的分 析中, 但在 所考虑 的三种 
模 型中, 在 每一模 型中的 三条路 线之一 是无活 性的。 在例 8.2 对 Aiba 和 Matsuoka 的 模型的 
处 理中, 已 把所有 三条途 径的化 学计量 式包括 在总的 计量矩 阵中, 但在求 解时, 则把 这些途 
径之一 (用 乙醛 酸支路 来举例 说明) 的 计量式 收集在 子矩阵 Gm 中, 因 为这个 通量被 设定为 
零。 另外, 应 该从网 络中消 除这条 途径的 反应计 量式, 但这 会导致 同解。 

线性相 关反应 的另一 个例子 是两条 氨同化 路线: 谷氨酸 脱氣酶 反应和 GS-GOGAT 系统 
(见 2.4.1 节), 这两条 路线的 化学计 量式是 

GDH : - a-ketoglutarate - NH3 - NADPH + glutamate = (4) 

U- 兩戊 二酸) (谷 氨酸) 

GS-GOGAT: 一 a-ketoglutarate — NH3 — NADPH — ATP + glutamate = (5) 

193 



可见, 二者惟 一的差 别在于 ATP 用于 GS^GOGAT 路线 (其 是高 亲和力 系统) 而 没用于 GDH 
反应。 这 里的问 题是, 由于 缺少足 够的有 关所有 ATP 消耗 反应的 信息, 因而不 易写出 ATP 
平衡。 在二 者之间 以缺乏 ATP 平 衡进行 区分, 这两条 氮同化 反应是 线性相 关的, 因 此是不 
可观 测的。 因为这 两条路 线之间 的惟一 差别是 GS- GOGAT 系统中 ATP 的 消耗, 两 条路线 
之 间的差 别可能 是不重 要的, 因此, 它们常 被集总 进化学 反应计 量模型 的一个 单个反 应中。 

可能 导致奇 异性的 另一个 反应是 NADH 与 NADPH 互 相转化 的转氢 酶反应 [见式 
(2.4)]。 在该 反应存 在时, 两个 辅因子 的平衡 式是稱 合的, 显然变 成线性 相关。 虽然 报道转 
氧薛系 存在于 很多生 物体, 但是 在正常 生长条 件下这 些酶通 常不是 非常活 泼的。 然而, 在某 
些 条件下 已对它 们进行 了分析 (见 10.1 节), 而且它 们在耗 散大量 NADPH 过程中 起非常 
重要的 作用, 而这些 NADPH 是在 非常高 的戊糖 循环活 性条件 下所形 成的。 在此, 重 要的一 
点是 能通过 化学计 量平衡 式缺乏 一致性 而发现 转氢酶 活性的 存在, 这也是 MFA 应用 于超定 
系统的 另一个 特征。 

在 很多生 物中存 在着不 同的同 功醇, 它们 催化相 同的反 应但利 用不同 的辅助 因子。 一个 
熟 知的例 子就是 谷氨酸 脱氢酶 反应, 为此, 很多 细胞有 两种同 功酶, 一种 连接到 NADH 作 
为辅 助因子 (叫做 GDH-NADH), 另一种 连接到 NADPH 作为辅 助因子 (叫做 GDH- 
NADPH)。 如果 这两种 酶都是 可供使 用的, 它们将 都充当 转氧酶 反应而 导致奇 异性。 然而, 
GDH-NADH 主 要参与 氨基酸 分解代 谢并且 因此受 葡萄糖 抑制, 而 GDH-NADPH 主 要参与 
谷 氨酸合 成并被 谷氨酸 抑制。 取决 于微生 物生长 的环境 条件, 这 两种酶 之一因 此常可 在网络 
表述 中不加 考虑。 

如果在 化学反 应计量 矩阵中 出现奇 异性, 人 们有如 下两种 选择。 

(1) 借 用有关 特定酶 调节与 诱导的 信息, 从模 型中去 除线性 相关的 反应。 

(2) 引入 附加的 信息, 例如两 条途径 的相对 通量。 这些信 息可以 从酶活 性的测 定中获 
得, 例如 在两条 路线中 关键酶 的相对 活性。 然而, 这 种方法 由如下 事实而 受阻: 体外 酵活性 
的 测定常 被发现 与实际 的体内 通量分 布几乎 没有显 示什么 关系。 另一个 强有力 的方法 是标记 
底物的 应用, 例如, i 3 C- 富集 的葡 萄糖, 接 着进行 在不同 产物中 i 3 C 标记 分布的 NMR 测定。 
这种 方法能 够提供 关于通 过线性 相关途 径的通 量分布 所缺少 的信息 (见第 9 章)。 



【例 8.5】 乳 酸菌的 异型发 酵代谢 

乳酸菌 通常是 在富含 氨基酸 (如 酵母抽 提物、 酪蛋白 胨等) 的复合 培养基 上生长 ,为生 
化合成 提供碳 骨架。 因此在 合成代 谢途径 中没有 (或 极少) 氧化 还原当 量的净 消耗。 这导致 
在 从能源 (葡 萄糖或 乳糖) 到 初级代 谢产物 (如 乳酸、 乙醇、 乙酸、 甲酸和 C02) 的 转化过 
程中氧 化还原 当量的 储备。 乳 酸菌所 利用的 分解代 谢途径 (见图 8.5) 因此与 乳酸菌 的生长 
是解 稱的, 因此 可以单 独进行 分析。 因为菌 体在复 杂培养 上生长 时可以 忽略用 于菌体 生长所 
消耗的 前体代 谢物, 故 EMP 途径可 以看做 是没有 分支点 的直线 途径, 以致从 葡萄糖 到丙酮 
酸之间 的所有 中间产 物都像 本章早 些时候 讨论的 那样被 消除。 在好的 生长条 件下, 一 些乳酸 
菌仅利 用从葡 萄糖到 乳酸的 途径, 常 称为同 型发酵 代谢, 因为产 生单一 产物。 此时氧 化还原 
平 衡完全 闭合, 因为 在葡萄 糖到丙 酮酸的 转化中 生成的 NADH 在丙酮 酸到乳 酸的转 化中又 
被 再生。 然而, 在 极端饥 饿的条 件下, 细 胞力求 从分解 代谢反 应中获 得更多 ATP, 这可以 
通 过把一 些丙酮 酸引向 乙酸来 实现。 但在 这种情 况下, 导 致氧化 还原不 平衡, 需要一 部分丙 
酮 酸被引 向乙醇 而再生 NAD、 因此, 为了 在葡萄 糖分解 代谢途 径中获 得更多 ATP, 形成 
194 



几 种代谢 产物, 这种情 况下的 代谢被 称为异 型发酵 
(或 称混合 酸发酵 )。 

丙酮酸 显然是 一个途 径分支 节点代 谢物, 因此, 
围 绕这个 代谢物 可以建 立一种 平衡。 在 丙酮酸 到代谢 
产 物的转 化中, 包括三 种其它 中间代 谢物: 乙 醜辅醇 

A、 乙酰 嶙酸和 乙酸。 其中, 只有乙 酰辅瞎 A 位于一 
个 分支点 而需要 考虑。 最后, 在 分解代 谢途径 中氧化 
还原 当量的 储存产 生一个 附加的 NADH 平衡。 人们 
也可以 建立一 个关于 NAET 的 平衡, 但是因 这种化 
合 物总是 连接到 NADH, 这样的 平衡与 NADH 平衡 
会是 线性相 关的, 其不 会提供 更多的 信息。 注意, 
ATP 的平衡 也可以 建立, 但因 为只考 虑分解 代谢, 
其 中没有 ATP 消耗, 因此这 个平衡 是不闭 合的。 总 
之, 在乳酸 途径分 析中, 涉及三 个途径 代谢物 (丙酮 
酸、 乙酰辅 SI A 和 NADH), — 个底物 (葡 萄糖) 和 五个代 谢产物 (乳 酸、 C02、 甲酸、 乙 
酸和乙 醇)。 根据 一般式 (3.4), 在该途 径中所 考虑的 六个反 应的化 学计量 式可表 述如下 
(注意 : 署名 的变量 r 表示相 应代谢 物的胞 外累积 速率, 同时因 所有的 通量都 能直接 测量, 
因此用 比速率 r, 代替胞 内通量 t;,)。 



ATP 




乳酸 菌的分 解代谢 



丄 

T 









•Sglc + 









1 
1 




■Plac 

Pco. 

iFe, 



0-1 - 



Xpyr 

XacCoA 

^NADH 



(1) 



式中, 下标 lac— 乳酸; fo 「甲 酸; ac — 乙酸; et — 乙醇; ?7「丙 酮酸; AcCoA— 乙酰 
辅 SI A。 

利用式 (1) 的 化学反 应计量 关系, 并对三 个胞内 化合物 (丙 酮酸, 乙 酰辅酶 A 和 
NADH) 应用 拟稳态 假设, 可 得如下 的线性 方程: 



'0 




1 


- 1 


- 1 













1 


.0, 




1 


一 1 


1 



1 01 

1 - 1 - 1 

一 2 







rpyr 



(2) 



上述方 程中的 第一个 (对 应于矩 阵中第 一行) 是 丙酮酸 平衡, 第 二个为 乙酰辅 薛 A 平 
衡, 最后 一个是 NADH 平衡。 注 意到, 在 这个例 子中, 该 途径中 的所有 通量, 实际 上能够 
直接 由底物 吸收通 量和产 物分泌 通量的 测量来 确定。 然而, 这是一 个相当 例外的 情况, 正如 
例 8.3 所说 明的, 其中有 几个通 量不能 直接观 测到。 

在 这条途 径中没 有线性 相关的 反应, 这可通 过矩阵 G 的秩来 证实, 因为 已求出 它的秩 
为 3。 因此, 可以 找出一 组三个 已测的 速率用 来求解 未知的 速率。 如果 我们选 择这三 个已测 

195 



速率为 葡萄糖 (从中 rpyr 被 确定为 2rgic)、 乳酸和 甲酸, 利用式 (8.8) 可得: 








1-1 


一 1 




rpyr 




- 1 
















1 






+ 


1 


-1 


一 1 


.0 




1-1 


0, 




Tfor . 




, 1 








(3) 



最后一 个矩阵 (GD 有一个 不等于 零的行 列式, 因此对 它求逆 得到: 



1 

1-1 - 1 

1 -2 
1 - 1 - 1 

。 I 



1 一 1 



fl-1 - 1 

1 

1 - 1 0J 

''Pyr 

厂 lac 
J for 



rpyr 
''lac- 
Tor 



(4) 



可以 观察到 在形成 2mol 甲酸 的同时 会得到 Imol 乙酸。 这 两个胞 外代谢 物生成 速率之 
间 的固定 比例可 以通过 NADH 平衡来 解释: 当乙 酰辅酶 A 与甲酸 一起生 成时, 每生成 Imol 
乙 酰辅酶 A 就必 须正 好再生 Imol NAD+ (即, EMP 途径中 所用的 NAD+ ) , 因此, 来自乙 
酰辅酶 A 的通 量在乙 醇生成 (在 此两个 NAD' 分子被 再生) 和乙酸 生成之 间平均 分配。 类 
似地, 如果没 有甲酸 生成, 则丙酮 酸到乙 酰辅酶 A 的转化 仅通过 丙酮酸 脱氢酶 路线, 这导致 
另外的 NADH 产生。 在 这种情 况下, 所 有的乙 酰辅酶 A 必须 被引向 乙醇, 在这里 所需的 
NAD + 被 再生。 

根 据前面 已测的 葡萄糖 (等于 丙酮酸 速率的 1/2)、 乳酸和 甲酸的 速率, 在 确定式 (4) 
的 通量时 不存在 困难。 然而, 如果 选择葡 萄糖、 乙 酸和甲 酸进行 测量, 则有: 

-1-1 

det(G7)= 1 -1 =0 (5) 
- 1 1 - 2 

换句 话说, 上述 测量不 能用来 惟一地 计算剩 下的三 个未知 途径通 i, 即 乳酸、 和 乙醇的 

通量。 原因自 然是用 甲酸、 乙 酸作为 仅有的 代谢产 物的测 量时, 没 有关于 NADH 消 耗速率 
的信息 (通量 rk、 r"c 或 ret 中 的一个 必须被 测量) 而 NADH 平衡 是没有 用的。 因此, 甲酸 
和 乙酸的 通量的 测定没 有提供 附加的 信息, 因 为一个 可以从 另一个 确定。 注 意到, 没 有必要 
去计 算行列 式的值 (即 使利用 商业数 学软件 包这很 容易做 ), 因 为很容 易观察 到最后 一行可 
以被 写成: 行 3 = 行 1+2 (行 2)。 



8.2 超 定系统 

在 8.1 节, 对完全 确定性 系统我 们发展 了通量 分析的 方法。 然而, 常常有 这样的 情况, 
多 于系统 自由度 的通量 测量是 可以利 用的。 这就自 然产生 了超定 系统, 在该系 统中, 类似于 
4.4 节 对黑箱 模型的 处理, 利 用冗余 变不仅 能计算 未测通 量的更 好的估 计值, 也能计 算已测 
量通 量的更 好的估 计值。 此外, 用 超定系 统有可 能对胞 内代谢 物验证 稳态假 设的有 效性。 

在超定 系统情 况下, 式 (8.8) 中 的矩阵 Ge'' 是 非方形 矩阵, 因 此不能 求逆, 通过 利用其 
Moore-Perose 拟- 逆矩阵 (见 4.4 节), 可得 一个简 单解: 
196 



v^^-iGjVGly^ (8.9) 

其中, (GD** 是 的拟- 逆矩阵 

(G?" 二 (GcG?)- (8.10) 

式 (8.9) 当 然可以 使用, 只 要矩阵 0。0?~是 非奇异 矩阵, 这是 当矩阵 Ge 是满 秩时所 满足的 
一个 条件。 这样, 对一个 超定系 统的解 的要求 与对确 定性系 统的要 求是一 样的。 对于 一个方 
形 矩阵, 其拟 -逆矩 阵同它 的逆矩 阵是一 样的, 当测 量数目 大于或 等于系 统自由 度时, 式 
(8.9) 是式 (8.7) 的 通解。 

当 测量中 噪声很 小时式 (8.9) 是 非常有 用的。 它代 表对非 测量通 量在如 下假设 下的最 
小二乘 估计, 该假 设是: 由测量 噪声所 引起的 约束残 差被均 勾分布 于系统 的约束 (即 胞内代 
谢物的 拟稳态 平衡) 当中。 然而, 如果 显著的 噪声存 在于仅 仅一些 已测通 量中, 式 (8.9) 
的 解不满 足围绕 某些网 络节点 的通量 守恒, 这意味 着流进 该节点 的通量 之和与 流出该 节点的 
通量 之和不 相等。 在研 究通量 分布中 这显然 是有问 题的, 因此我 们期望 识别通 量测量 中所包 
含的过 失误差 (其 类似于 4.4 节中黑 箱的处 理)。 因为式 (8.7) 类似 于由式 (4.10) 给出的 
元素平 衡式, 因此 4.4 节的分 析完全 可用在 这里。 首先计 算冗余 矩阵: 

R 二 Gm- GcGc#Gm (8.11) 

由 此可确 定简化 的冗余 矩阵, 其被 用于类 似于式 (4. 15) 〜式 (4.17) 所概 述的计 算中, 例 
4.6 对 此已经 阐述。 

一个稍 微不同 的程序 [由 Tsai 和 Lee (1988) 给出] 可对 未测量 的和已 测量的 通量二 
者提供 更好的 估计。 为此 目的, 式 (8.7) 被重新 构成以 解释: 







I 






、0 








Vc , 



式中, I 是单位 矩阵, 它的 维数等 于已测 通量的 个数。 式 (8. 12) 中第一 行简单 地规定 

Vm = Vm,然而第二行等同于式(8.7)。 文献 中大多 数代谢 模型有 或能很 容易简 化为式 (8. 12) 
的 形式。 在这种 形式中 ,式 (8. 12) 在所计 算的通 量向量 Vc 和已测 量的通 量向量 Vm 之 间引人 

严格的 分离, 而且通 过测量 噪声的 消除不 允许对 所测量 的通量 有任何 改进。 这 可通过 通量向 
量更 一般的 分配来 完成, 由此, 已 测量的 和未测 量的通 量不被 分离: 



Vmj 一 


Tu Ti2 






厂 


T21 T22. 




V2, 



(8.13) 



上述方 程的第 二行清 楚地反 映稳态 代谢物 平衡。 矩阵 Tu 和 Ti2 均由单 位矩阵 确定, 并 
且 GT 如例 8.6 中 所述。 可选 择向量 VI 和 V2 分别 等于 Vm 和 (此 情况下 该方法 等同于 先前的 
方法 ), 或者不 这样, 只 要矩阵 T22 能被 求逆以 产生以 VI 表示 的向量 V2 的解: 

V2= -T22%lVi (8.14) 
当将这 个方程 代入式 (8. 13), 在 已测量 的速率 Vm 与 VI 的 元素之 间的关 系得出 如下: 

Vm = TrVi (8.15) 

其中, T, 由下 式给出 

T, = Tn-T,2T22'T2, (8.16) 

]97 



式 (8.15) 表示一 个超定 系统, 就像原 始的平 衡方程 一样。 而且, 如果测 量误差 以正态 
分 布且平 均值为 零及方 差-协 方差矩 阵等于 F, 于是对 VI 的元 素的最 大似然 估计由 Madron 
等 (1977) 给出 如下: 

VI = (T7F- iTr) - iT?~F- 、 (8. 17) 

式中, VI 上方 " 符号表 示对于 正态分 布的测 量误差 相应量 的最好 估计。 通 过把式 
(8.17) 代人式 (8.14) 可得 V2 的元 素的估 计值, ^为: 

V2= -T2VT21V, (8.18) 
式 (8.17) 和式 (8.18) 给出该 代谢模 型中所 有通量 的最好 估计, 即: 那 些已测 量的通 
量和未 测量的 通量。 通 常不易 得到方 差与协 方差的 信息, 但如果 在已测 量的通 量中的 误差具 

有相同 的数量 级并且 是不相 关的, 人们 就可对 VI 的元素 利用最 小二乘 估计: 

◊i = (T?"Tr) — iT?Vm (8.19) 



【例 8.6】 超定系 统的通 量确定 

现在回 到在例 8.5 中处理 的乳酸 菌的异 型发酵 代谢, 并且 考虑四 个速率 已被测 量的情 
况, 因此 产生一 个超定 系统。 如 果丙酮 酸的生 产速率 (等于 2rgie)、 乳酸生 产速率 (riae)、 
甲酸生 产速率 (n。r) 和 乙醇生 产速率 (ret) 的 测量都 是可利 用的, 则式 (8.7) 变为: 



0, 




1 


- 1 


- 1 
















1 


一 1 


Oj 




1 


- 1 





一 2 



^lac 



1 

1 - 1 

1 OJ 



(1) 



其中 第一行 是对丙 酮酸的 平衡, 第二行 是对乙 醜辅酶 A 的平 衡, 最后一 行是对 NADH 的平 
衡。 再次 说明, 署名 的变量 r 已经 引人以 表示相 应代谢 物的胞 外累积 速率。 现在 利用式 
(8.9) 的简单 方法和 基于式 (8.12) 和式 (8.13) 的程序 对这两 种情况 对未测 量的速 率进行 
最小二 乘估计 计算。 

首 先从式 (8.10) 计 算矩阵 的 Moor-penrose 拟-逆 矩阵: 



(Gj) 



1 1 1 

0-1 0, 



- 1 
1 
1 



1 1 

1 



然 后从式 (8. 9) 对未 测量的 速率进 行求解 



0.: 
0.: 



0.: 

1 0.: 



rpyr 
nor 



-0.: 
0.: 



0. 

1 0. 



(2) 



rPyr 

nac 



(3) 



这个 解与例 8.3 中对 确定性 系统所 求出的 解是一 致的, 即: 如果没 有测量 误差, 则上 述解与 
例 8.3 中 求出的 解相同 [尝试 将由例 8.5 的式 (4) 所得的 rt,t 表 达式代 入上述 式中, 将求得 
的 和 rat 的表达 式与例 8.5 中 的那些 表达式 进行比 较]。 由式 (3) 看 到对未 测量通 量的估 
计与丙 酮酸通 量和乳 酸的积 累速率 的测量 无关。 

为了改 进遵从 Tsai 和 Lee (1988) 的 方法所 得的未 测量的 和已测 量的代 谢物通 量的估 
计, 以式 (8.12) 所表示 的形式 改写式 (1) 为: 
198 



rPyr 




1 



















' 尸 yr 


















''lac 







1 




































' lac 


nor 










1 





































r for 


厂 et 







1 









1 


一 1 


- 1 





一 1 







厂 et 













1 


-1 


1 


-1 











1 


-1 





一 2 


1 










(4) 



其中虚 线表示 出矩阵 T 的分 解。 注 意化学 反应计 量矩阵 GT (最 后三行 )、 4x4 单 位矩阵 和零矩 
阵的 出现。 上 面的方 程这样 写以致 VI 仅由 已测定 的通量 组成, 但 这不必 一定要 这样。 未测量 
的速率 能与已 测定的 速率一 起完全 包含在 VI 中。 利用 所表示 的矩阵 求出: 



1 






















1 






















1 













-0 










1 









0- 


1 





-1 


1 


- 1 


-1 


-1 


1 


-1 










1 


-2 


1 


0, 






-1 


0, 



1 











1 











1 


1- 


-1 


一 0.5 



(5) 



从 而给出 



和 





rpyr 








1 


VI = 


^lac 


一 13 




'广 for 






''et 








1 


V2 = 




一 n 




、 ''ac - 





9 4 
4 9 

2-2 



4-4 
3-3 
1-1 



2 
-2 
12 



9 
10 

-1 



rPyr 
''lac 



^Pyr 
厂 for 



(6) 



(7) 



其 中方程 右边的 速率向 量表示 相应代 谢物通 量的测 定值。 还注意 到这个 解与例 8.3 中 确定性 
系统 的解是 一致的 [再 尝试 将由例 8.5 的式 (4) 中对 ret 的表达 式代人 上式, 并将 得到的 re 
和 表达 式与上 述方程 得出的 结果相 比]。 然而, 在这里 在任何 已测量 速率中 的测量 噪声的 
存在 会影响 对已测 的和未 测的速 率的最 小二乘 的最佳 估计。 因此, 丙嗣 酸通量 的估计 是所有 
四 个已测 速率的 函数。 



在上述 估计程 序中, 间 接假定 稳态假 设完全 满足并 且噪声 仅分布 在已测 量的通 量中。 如 
果 在拟稳 态方程 中也存 在噪声 (意味 着相应 代谢物 的小的 积累是 可能的 ), 则式 (8.12) 仍 
然 形成胞 内通量 估计的 基础, 但直接 得出该 解为: 



S=(tTf— It) — itTf 







其中, F 是针 对已测 量的通 量和拟 稳态假 设二者 的残差 的方差 -协方 差矩阵 < 
声 具有相 同的数 量级, 则由式 (8.21) 所给出 的最小 二乘估 计可以 应用: 



还有, 



^^(jTj)-ljT 







(8.20) 
如果噪 

(8.21) 



199 



一般说 来最好 使用假 定噪声 仅分布 于所测 量的速 率这样 的程序 步骤, 但是 由于式 (8.21) 的 
简 单结构 因而常 常用于 代谢物 通量的 计算。 然而, 人 们可以 利用式 (8.20) 并 且对拟 稳态假 
设规定 非常低 的方差 (Vallino and Stephanopoulos, 1993), 因 为这将 给出等 同于用 先前描 
述 的程序 所得出 的估计 (见例 8.7)。 



【例 8.7】 超 定系统 的分析 

现 在我们 再次回 到在例 8.5 和例 8.6 所处 理的乳 酸菌的 异型发 酵代谢 并用式 (8.20) 和 
式 (8.21) 对 胞内通 量计算 估计。 首先, 假 定没有 协方差 而且在 所测定 的通量 中的方 差是相 
同的 (任 意设为 1)。 拟 稳态假 设的方 差由一 个非常 小的值 (10 — 9 ) 给出, 实际 上相当 于没有 
噪声。 用式 (8.20), 得出: 

r Pyr 
厂 lac 
厂 for I 

(1) 





这 些估计 值都等 于在例 8.6 中从式 (6) 和式 (7) 中得 出的值 (注 意矩阵 中仅仅 虚线左 边的元 
素是重 要的, 因为虚 线右边 的元素 都与零 向量相 乘)。 相反, 如果直 接用式 (8.21), 求出估 
计值 由下式 给出: 

厂 Pyr 
厂 lac 
^for 



厂 Pyr 




9 4 


2 


4 


2 





2, 






4 9 


- 2 


一 4 


- 2 





- 2 




1 


2-2 


12 


- 2 


-1 





-1 


ret 


一 13 


4-4 


-2 


9 


-2 





- 2 


广 c 




3-3 


-8 


10 


-8 







r at J 




1-1 


6 


-1 




-13 


6 



rpyr 




11 


4 


2 


4 


2 





2、 


nac 




4 


11 


- 2 


一 4 


- 2 





-2 




1 


2 


- 2 


14 


-2 


-1 





-1 


r et 


—15 


4 


-4 


-2 


11 


- 2 





- 2 






3 


- 3 


一 9 


12 


-9 





6 






1 


-1 


7 


- 1 


-8 


-15 


7, 



(2) 



它 非常不 同于式 (1) 的估计 < 



与 4.4 节 中对超 定黑箱 模型的 分析相 类似, 如 果所测 量的速 率的数 目大于 F + l, 那么 
就也有 可能利 用测量 冗余度 并结合 代谢模 型以进 行误差 诊断。 如果假 定拟稳 态假设 是正确 
的, 则这 种误差 诊断是 基于式 (8.11) 的简 化的冗 余矩阵 (Rr), 如 4.4 节一样 ,检 验函数 
h 可以 从下式 计算: 

h =e^p-U (8.22) 
其中 P 根据式 (4.22) 计 算出, 而 e 是残差 向量并 由下式 给出: 

e=RrVm (8.23) 
检 验函数 h 与 4.4 节 所述的 X 2 分布的 比较可 以识别 在一定 置信度 下的过 失测量 误差。 
通过一 次消除 一个测 量并接 着计算 所产生 的检验 函数, 就 有可能 识别过 失测量 误差的 来源。 
如 果存在 着一个 或多个 拟稳态 假设被 违背的 迹象, 仍可以 进行误 差诊断 以验证 这些假 设的一 
200 



致性。 这里, 式 (8.12) 是 分析的 基础, 而且, 除了 通量测 量外, 拟稳 态假设 也可一 次消除 
一个, 每 次之后 计算新 的冗余 矩阵、 新的检 验函数 /1 [式 (8.22)] 和一 个对; C 2 分布 的类似 
比较。 

根 据化学 反应计 量学的 Gibbs 规则 , 在 一个代 谢模型 中的自 由度总 是小于 或等于 在黑箱 
模 型中的 自由度 (Nielseand Viladsen, 1994)。 因此, 利 用代谢 模型对 过失测 量误差 和误差 
诊断的 识别应 当是很 有吸引 力的, 因 为这种 分析只 需较少 的测量 即可。 然而, 对于简 单代谢 
模型, 其自 由度通 常与代 表该系 统的黑 箱模型 的自由 度相同 [在例 8.3 中的 乳酸模 型中有 3 
个自 由度, 具有六 种代谢 物和三 种元素 (C、 H、 0), 这个系 统的黑 箱模型 的自由 度也为 
3], 而 对于更 复杂的 模型, 作 为大的 化学反 应计量 矩阵的 结果, 这种 分析可 能变得 非常烦 
琐。 因此, 误差 诊断将 优先使 用黑箱 模型来 进行, 并且, 可疑 的测量 被识别 并改正 之后, 该 
组 改进了 的速率 估计值 就可用 以计算 代谢通 量的更 好的估 计值。 

8.3 不定系 统-线 性规划 

如果 已测量 的通量 的个数 小于系 统的自 由度, 则 对网络 通量存 在无数 个解。 在这 种情况 
下, 倘若能 够规定 一个合 适的目 标函数 (例 如, 使细 胞比生 长速率 最大这 样的目 标函数 ), 
那么 就能利 用线性 规划来 确定胞 内通量 分布。 用这种 方法, 通过 优化以 代谢物 平衡的 约束为 
条件 的目标 函数, 就有 可能得 到胞内 通量的 一个惟 一解。 在举例 说明这 种方法 在细胞 系统研 
究 的用途 之前, 我 们利用 一个非 常简单 的例子 (其 对线性 规划问 题的本 质提供 一个有 用的洞 
察力) 来介绍 该方法 的基本 描述。 

考 虑一个 具有两 个变量 、r 和_>, 的 系统, 其通 过如下 约束所 关联: 

2x + y = 4 (8.24) 
其给 定上式 的解落 在直线 AB 上 (见图 8.6)。 除 
了式 (8.24) 之外, 为所有 的线性 规划问 题所共 
有 的另一 个约束 是所有 的变量 (此 例中即 和 3;) 
都需 要是非 负的。 这 就违背 了我们 对代谢 通量的 
定义: 其可正 可负。 因此, 线性规 划对解 决代谢 
通 量平衡 的应用 需要扩 展通常 的代谢 模型, 以包 
括 该模型 J 个 反应中 每个反 应的正 向或逆 向通量 
或至 少可能 是可逆 的那些 反应的 通量。 用 约束条 
件 .r〉0、 3'>0, 因此, 上 述问题 的解被 限定在 
(x, y) 空间 的正象 限中。 这 仍表示 有无数 个解, 
通过施 加让问 题的解 能最大 化或最 小化某 一成本 
(或 目标) 函数 这样的 要求, 可以将 无数个 解进一 
步减 少到一 个解。 例如, 如 果想最 大化上 例中的 
目 标函数 问 题是要 求出一 个解, 这个解 
落 在直线 上, 而同 时又能 最大化 该目标 函数。 
图 8.6 显示了 一族成 本线。 这条线 能得出 目标函 
数的 最大值 而同时 满足由 2:r +3^;= 12 给出 的约束 条件。 该线 与直线 相交于 =0 及 
y = 4。 在这 个例子 中可以 得到一 个可行 的解, 但 是人们 也可遇 到没有 可行解 或有无 穷多个 
解 的情况 [在 上述例 子中, 如果 目标函 数与式 (8.24) 相 同或是 它的倍 数]。 




图 8.6 线 性规划 的图解 
可行 解限制 在非负 象限中 直 线上。 目标函 
数由一 组平行 线组成 (图中 三条虚 线所示 )。 最大 
化 目标函 数的线 与直线 AB 交于点 (_r, .v) = 
(0, 4). 该点 为此最 优化问 题的解 



201 



现 在返回 到我们 的代谢 模型, 其 约束条 件由式 (8.7) 给出。 因为 在线性 规划公 式表示 
中所有 的变量 (即 通量) 都 必须是 正的, 因 此我们 这样改 写模型 以使其 化学反 应计量 式中包 
含 正向反 应和逆 向反应 (在那 些包含 可逆向 反应的 情况下 )。 因此, 该 约束条 件可概 括为: 

Gj,Ve, = 且 Vex^O (8.25) 

式中, GL 是修改 过的化 学反应 计量矩 阵以包 含正向 和逆向 反应的 反应计 量式, 而 Vex 是 
相应 修改后 的通量 向量, 维数为 Jex。 在上述 简单例 子中, 该约 束确定 了二维 空间中 的一条 
直线。 具有 Jex 个变量 (或通 量), 则每个 约束是 Jex 维空 间中的 一个超 平面。 因为必 须满足 
所有的 约束, 式 (8.25) 确定 一个解 必须落 在这个 Jex 维 空间中 K 个超平 面的交 集上。 如果 
有 一个超 平面不 与其它 超平面 相交, 则对 于这个 通量的 可行解 不存在 (也 就是 说在这 种情况 
下这 组可行 的解都 是空的 )。 然而, 这 种情况 在实际 中很少 遇到。 下一 步是要 确定一 个目标 
函数, 其是这 些通量 的线性 函数, 即向量 Vex 的元素 的函数 。通 过求解 相应的 最大化 或最小 
化 问题, 即可 求得最 优解。 

min(avex) 或 max(aVex), 服从式 (8.25) 的约束 (8.26) 

上式 表示对 avex 求最小 值或最 大值, 其中, a 是 包含各 个单个 变量权 重的行 向量, 这 些单个 
变 量表示 各个单 个通量 对目标 函数的 影响。 

求式 (8.26) 问题 的最优 解可能 是很复 杂的, 因为 潜在的 大量可 行解满 足所有 约束。 然 
而, 正如上 述简单 的例子 一样, 最 优解位 于一组 可行解 的末端 (或 角上, 约束 和目标 函数二 
者线性 的结果 )。 因此, 通过 首先列 举出所 有解角 (solution comers), 然后在 可行解 空间的 
每一 点评价 该目标 函数, 则会 (在原 理上) 找到最 优解。 但 是由于 解角的 数目非 常大, 这个 
方法 实际上 是不可 行的。 替 代地, 应用 所谓单 纯形法 (Dantzig, 1963), 其是 为解决 约束线 
性 优化问 题精选 的方法 (Gyr, 1978)。 这种方 法应用 如下: 首先, 确 定可行 组的一 个角, 
然后沿 着可行 解的边 缘从一 个角到 另一个 角继续 进行。 在一 个给定 的角, 有几 条边缘 可供选 
择, 一些 引离最 优解, 其它 的逐渐 引向最 优解。 在 单纯形 法中, 沿 着确保 目标函 数减小 (或 
增加) 的边缘 移动。 这条边 导向具 有更低 (或 更高) 数值的 一个新 的角, 且没 有可能 性返回 
到 任何一 个角, 其 产生一 个更高 (或 更低) 的 目标函 数值。 最终, 可以 达到一 个特定 的角, 
从 该角, 所 有的边 都导致 更高的 目标函 数值, 而且, 这 个角就 代表最 优解。 尽 管它的 简单描 
述, 这种单 纯形法 执行起 来相当 复杂, 但是 已开发 出强健 的算法 [Gyr (1978)], 而 且在几 
个软件 包中是 可以得 到的, 例如 Mathematica 和 Matlab。 



【例 8.8】 大 肠杆菌 代谢的 化学计 量解释 

对几 种代谢 模型, 利用线 性规划 已经得 到其最 优通量 分布。 在这个 例子中 将考虑 大肠杆 
菌代谢 的分析 (Varmaetal, 1993a, b)。 基于 £ . co/z' 代谢的 详细化 学计量 模型, 他 们分析 
了 这个微 生物的 葡萄糖 分解代 谢和生 物化学 的生产 能力。 他们的 模型由 107 个 代谢物 (包括 
底物 和代谢 产物) 和 95 个可 逆反应 组成, 而且 因为每 个反应 都被包 含正和 逆两个 方向, 这 
就产 生一个 107X190 的化 学计量 矩阵, 即有 83 个自 由度。 没有一 个通 量被 测量, 但 用了一 
个通量 (葡 萄糖 比吸收 速率) 来度量 这些通 量值, 以使它 们的单 位均为 mmo 卜 g — 1( 干重) • 
h 一 1。 用于 通量计 算的仅 有的实 验数据 如下: 

* 菌 体生长 的代谢 需求被 用来计 算生物 量合成 所消耗 的代谢 物量。 事 实上, 代谢 物的消 
耗量 是作为 导致生 物量合 成的一 个反应 中的计 量系数 而被包 括的。 
202 



* 用 于维持 ATP 的 需求。 通过 不同比 

生 长速率 下葡萄 糖的比 吸收速 率对实 验数据 
的 拟合, 分别估 算出对 与生长 相关及 与生长 
无关的 维持需 求量是 23mmo 卜 g — 1( 干重) • 
h_i 和 5.87mmo 卜 g-i( 干重) 'h — 1, 这些值 
被 用于计 算中。 




* 氧 的最大 比吸收 速率为 20mmo 卜 g 



(干重 )*h— 1。 

目 标函数 是比生 长速率 最大。 因此, 如 
果葡 萄糖比 吸收速 率已经 给出, 那么 该模型 



比生 长速率 /fT 



就 决定着 相应的 最大比 生长速 率以及 网络中 图 8.7 葡萄糖 和氧的 比吸收 速率和 乙酸、 甲酸、 
的所有 通量。 所 选择的 网络通 量可以 对相应 乙 薛的比 生成速 率与比 生长速 率的函 数关系 



低的比 生长速 率), 没有 副产物 生成, 即, 处 于完全 呼吸。 结果, 在这 个范围 氧的比 吸收速 
率随 比生长 速率线 性增加 (3.4 节)。 当葡 萄糖比 吸收速 率达到 8mmohg_i( 干重) — 1 时 
(相 应的 比生长 速率为 0.9h_i), 从葡萄 糖完全 氧化为 C02 的 氧需求 量超过 规定的 最大值 
20mmol*g — 1( 干重) •}! — 1。 因此, 细胞 转换到 呼吸和 发酵同 时进行 的混合 代谢。 所分 泌的第 
一个 发酵代 谢物是 乙酸, 而 在更高 的糖酵 解通量 (或 更高的 比生长 速率) 下, 也分泌 甲酸。 
最后, 在非常 高的糖 酵解通 量下, 乙醇 也被分 泌了。 有趣 的是, 这个模 型预测 了代谢 物分泌 
的正确 次序, 目 P, 首先是 乙酸, 然后是 甲酸, 最后是 乙醇, 其与实 验结果 一致。 Vama 等 
(1993a) 将之 解释为 乙酸所 含的能 量较低 的结果 (乙酸 氧化的 ATP 得 率低于 甲酸和 乙醇氧 
化的 ATP 得率 )。 

对 于氧的 最大比 吸收速 率低于 20mmol,g — 1( 干重) 'h — 1 (其 可能是 生物反 应器供 氧限制 
的 结果) 的情 况下, 计 算了临 界糖酵 解通量 (或比 生长速 率)。 结果发 现这些 通量值 与对细 
胞的氧 供给之 间是一 种线性 关系。 

线 性规划 的优点 是通过 计算目 标函数 Z 相应 于系统 变量的 敏感度 就能够 获得更 多的信 
息。 这 些敏感 度被称 之为影 子价格 (shadow prices), 对 £.a)/z 代谢 模型, 其 由下式 给出: 



式中, 是第/ 个 化合物 (例 如氧、 乙 酸或者 一种氨 基酸) 的净 比消耗 速率。 因此, 影 
子价 格反映 了代谢 速率的 变化对 比生长 速率的 影响。 表 8.2 给 出了对 不同的 氧比吸 收速率 
(r。) 下 由代谢 模型计 算的一 些影子 价格。 当 r 。较 低时, 对 氧的影 子价格 为正, gp, 提高 
r 。会 使比生 长速率 增加。 当 r 。达 最大 值时, 提高 r 。不能 使比生 长速率 进一步 增加, 因此 
影 子价格 为零。 在厌氧 条件下 (r。 = 0), NADH 的影 子价格 为负, 这是 由于不 能氧化 这个辅 
助 因子, 即, 如果 NADH 的产量 增加, 则 比生长 速率将 下降。 这表明 在厌氧 条件下 辅助因 
子再生 可以限 制生长 。对于 ATP, 发 现在厌 氧条件 下影子 价格是 高的, 并且随 r。 的 增加而 
减小。 因此, 与厌 氧生长 相比, ATP 对生长 的供给 对细胞 好氧生 长变得 不太限 制了。 所有 
这 些代谢 物的影 子价格 都随着 r。 的 增加而 增加, 因为在 好氧条 件下这 些化合 物能被 细胞氧 
化 并提供 菌体生 长所需 的额外 ATP。 有 趣地注 意到, 在 厌氧条 件中, 琥珀酸 的影子 价格高 



的比生 长速率 作图, 如图 8.7 所示。 从中看 
到, 在 葡萄糖 比吸收 速率比 较低时 (相 应于 



比生 长速率 是利用 线性规 划通过 £.a)/Z 
代谢模 型的比 生长速 率最大 化而计 算出的 



于 其它代 谢物。 该化合 物的氧 化将导 致增加 NADH 的生产 (在 这些条 件下细 胞再氧 化它有 
困难 ), 但是 很可能 的是, 对于 前体代 谢物的 供应, 该 化合物 可能是 很有价 值的。 I 



表 8.2 利用 Varma 等 (1993a) 描 述的代 谢模型 计算的 不同的 氧比吸 收速率 

[mmol'g— 1( 干重) 'h — 1] 下的影 子价格 



代谢物 


影 子价格 /[g (干重 )*mmol — 1( 代谢物 )] 





12 


20 


氧 


0.0399 


0.0282 





ATP 


0.0109 


0.0106 


0.0049 


NADH 


— 0.0054 





0.0065 


乙酸 








0.0242 


乙醇 





0.0106 


0.0422 


乳酸 


0.0054 


0.0106 


0.0422 


琥珀酸 


0.0109 


0.0177 


0.0504 



注: 葡萄糖 比吸收 速率为 lOmmo 卜 g— 1( 干重) '11一1。 



这 个模型 也允许 计算通 过不同 途径的 通量。 这里还 发现, 在 厌氧条 件下, 通过 PP 途径 

氧 化分支 的通量 为零, 即 6- 磷酸葡 萄糖脱 氣酶是 没有活 性的, 而生 物合成 所需的 NADPH 
由一 个转氢 酶反应 提供。 对于 高的氧 比吸收 速率, 大约 60% 的 6- 碟酸葡 萄糖经 PP- 路线代 
谢, 而 且转氣 晦没有 活性。 

这个模 型也用 来研究 E.coli 生 产其它 代谢物 如各种 氣基酸 的潜力 (Varma et al, 
1993b)。 这 个潜力 的大小 可以通 过相应 的影子 价格的 大小来 确定, 因为 后者为 菌体生 长与特 
定 代谢物 (如氨 基酸) 生产 之间的 权衡提 供了一 个度量 标准, 结果 发现, 对甘 氨酸、 丙氨酸 
和 天冬氨 酸等生 物合成 路线简 单的氨 基酸, 其影子 价格比 较低; 而对芳 香族氣 基酸如 苯丙氨 
酸、 色 氨酸、 酪氨 酸等生 物合成 路线复 杂的氨 基酸, 其影 子价格 较高。 因此, 如果细 胞打算 
通 过一条 长而复 杂的生 物合成 路线生 产一种 产物, 则细 胞代谢 的需求 就大, 而 且对菌 体生长 
的影 响是严 重的。 相反, 一个具 有简单 代谢路 线的化 合物能 以很低 的成本 由细胞 生产, 而且 
对菌 体生长 的影响 因而也 很小。 



8.4 敏感 性分析 



在前 一节, 已经 推导出 确定性 系统、 超 定系统 和不定 系统的 质量平 衡方程 的解。 尽管在 
每种 情况下 都获得 一个惟 一解, 但 是相应 于测量 中的小 干扰, 度量 解的敏 感性或 "脆 弱性" 

是很重 要的。 在敏 感性分 析中的 第一步 是检验 这个系 统是否 是很好 形成的 (well-posed), 即 
检 验是否 化学计 量矩阵 是状态 良好的 ( well-conditioned )。 对一 个病态 (ill-conditioned) 化 
学计量 矩阵, 即使 测量中 的很小 变化也 可能对 通量计 算有非 常大的 影响。 为 了对其 举例说 
明, 我们 考虑两 个方程 系统: 



1 1 

1 1.0001 



■V2 



.0001 



(8.27) 



12\ ^ /1 1 、卜 1 12 

和 二 
12/ \1 1.0001/ vi] \2, 

尽 管等式 右边差 别仅为 很小的 一个数 0.0001, 但 该解从 z;i = 2 和 1;2 = 变化为 = 

Z;2=lo 因 为解一 般都是 使用数 值法得 出的, 如 果化学 计量矩 阵是病 态的, 那 么由计 算上小 
的舍人 误差所 引起的 通量估 计中的 误差就 可能被 放大。 一 个矩阵 敏感性 的度量 被称做 条件数 

{condition number), 其由式 (8.28) 给出: 
204 



C(G^)- II GT II II (G^VW (8.28) 
式中, II II 表 示任何 矩阵的 范数; (GT)* 表示 化学计 量矩阵 的拟- 逆矩阵 (见 8.2 节)。 
条件数 的计算 是相当 复杂的 (见 方框 8.1), 但实 际上, 可利用 商业软 件包如 Matlab、 
Mathematica 或 Maple 求得。 对于 具有正 特征值 的对称 矩阵, 条 件数等 于特征 值的最 大值和 
最小值 之比, 因此条 件数总 是大于 1 (这对 非对称 矩阵也 是成立 的), 而且大 的条件 数象征 
一个病 态矩阵 0。 因此, 对于式 (8.27) 的 矩阵, 它 是对称 矩阵, 特 征值为 2 与 10 — 4 /2, 条 
件数为 10 4 。 条 件数的 大小对 所测量 通量精 度的要 求将提 供重要 信息, 这是由 于测量 必须以 
一定 精度来 进行, 而精 度所带 有的数 字的位 数与条 件数中 的位数 相同。 因此, 在上 例中, 条 
件数 有五位 数字, 通量必 须精确 地测量 到五位 数字。 因为发 酵速率 很少能 精确到 2 位 数以上 
来量化 (例 如, 微生 物的比 生长速 率能被 表示为 0.37h— 1, 其具 有很好 的精度 ), 因 此对一 
个状态 良好的 化学计 量矩阵 的要求 是条件 数处于 1〜100 之间。 这对大 多数代 谢模型 都能实 
现。 因此, Vallino 和 Stephanopoulos (1993) 的模 型的条 件数为 62, Nissen 等 (1997) 的模 
型的条 件数为 22。 如 果条件 数大于 100, 则说明 此化学 计量矩 阵是病 态的。 就 有必要 改变这 
个模 型建立 中所用 的生物 化学。 应 当注意 的是, 在计算 条件数 时不需 要进行 测量, 因此, 代 
谢模型 能在进 行任何 计算之 前进行 检验。 

方框 8.1 条件数 的计算 

式 (8.28) 已 给出了 条件数 的一般 定义。 然而, 要利 用这个 方程, 必 须计算 矩阵的 
范数。 在此 简要描 述如何 进行该 过程。 对更多 细节, 请参 见线性 代数教 科书。 
一个矩 阵的范 数是任 何矢量 X 通 过矩阵 相乘而 被扩大 的最大 程度: 

II G^ll =maxJ^^|i (1) 
而且 可以表 明它等 于矩阵 GGT 的最 大特征 值的平 方根: 

II GT II 二 yA 匪 (GG^O (2) 
因此, 求矩 阵的范 数的问 题相当 于一个 特征值 问题, 而且通 过矩阵 GGT 的特 征值和 拟- 
逆矩阵 (GT) 的相似 矩阵的 特征值 [由 (GGT)-1g 给 出], 就可以 利用式 (8.28) 计算 
条 件数。 但是 求特征 值一般 比较费 时间, 因此 在计算 机算法 中利用 不同的 方法。 矩阵 
GGT 的特 征值平 方根等 于矩阵 GT 的所 谓的奇 异值, 它 可以通 过奇异 值分解 很容易 得到, 
而奇 异值分 解计算 过程可 以利用 计算机 软件包 来迅速 完成。 这样, 就能得 到矩阵 GT 及 
其拟- 逆矩阵 (GT) 的 最大奇 异值, 然 后两值 相乘。 

前已 讨论, 条件 数计算 应当总 是代谢 模型敏 感性分 析的第 一步。 然而, 这 并没有 给相应 
于 所测量 的通量 中的变 化的计 算的敏 感性提 供任何 信息。 这些信 息是由 解矩阵 的元素 所提供 
的, 在确 定性系 统中, 有: 

^=-(Gj)-'Gl (8.29) 

在式 (8.29) 中, 第 J 行和第 /列 的元素 说明了 在相应 于第/ 个 通量测 量中第 J 个通量 (它 
是计算 出的) 的敏 感性。 因此, 解矩 阵的元 素提供 了有关 系统敏 感性的 信息。 



根据 条件数 的这种 定义, 在 一组线 性代数 式中病 态矩阵 与一个 稱合的 一阶微 分方程 刚性系 统之间 存在一 个直接 

的 类似, 后者 为许多 化学工 程师所 熟知。 

205 



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206 



第 9 章 利用 同位素 标记实 验测定 
代 谢通量 的方法 

在前面 一章, 提 出了通 过胞内 代谢物 浓度的 测量来 确定胞 内代谢 通量的 一般方 法学, 并 
提出 了证明 该实践 合理性 的几个 理由。 显然, 胞内 通量在 建立一 个生物 系统的 生理状 态方面 
是非 常有价 值的。 正如 后面几 章将要 描述的 一样, 代谢通 量也起 着另一 个重要 作用, 即: 它 
们为代 谢网络 的控制 结构提 供一幅 综合的 画卷。 本 书也将 说明代 谢控制 系数, 其已被 建议作 
为代 谢网络 中所施 加的控 制程度 的度量 标准, 可直 接根据 代谢通 量的大 小及随 代谢扰 动的引 
人 而产生 的通量 变化来 确定。 在这 方面, 精 确测定 胞内通 量的方 法就变 得极为 重要, 这是由 
于它 们可以 直接得 出对代 谢网络 中通量 控制的 解释。 

正 如前一 章所讨 论的, 测定胞 内通量 所要求 的主要 输入是 胞外代 谢物的 通量, 也就是 
底物 吸收速 率和产 品分泌 速率。 这 些速率 可以从 稳态恒 化实验 最好地 获得, 因为 在恒化 
实 验中, 所有代 谢物的 浓度都 是在稳 态下测 定的。 相应 的吸收 / 分 泌速率 则可通 过代谢 物浓度 
乘 以恒化 器稀释 速率来 计算。 由 于恒化 实验持 续时间 很长, 因此, 往往采 用批式 实验来 测定通 
量。 微生物 的分批 培养可 在相对 短的时 间内获 得大量 数据。 然而, 由于胞 外代谢 物速率 的确定 
要求计 算相应 浓度对 时间的 微分, 该运算 常常引 入大的 误差, 因此, 这种 速率的 确定是 相当复 
杂的。 此外, 分 批培养 实验期 间生理 稳态的 缺乏也 会使分 批培养 数据的 解释复 杂化。 

无 论是采 用恒化 实验, 还是 采用分 批培养 实验, 应 该牢记 的是, 仅 仅采用 胞外代 谢物的 
浓度测 量结果 来阐明 代谢网 络的程 度是有 限的。 这 样的测 量至多 提供代 谢网络 中少数 分支点 
上 碳通量 分布的 信息。 这一 点可能 会由于 建立代 谢网络 方程式 的复杂 性而使 人难以 理解。 本 

书提 供了几 个例子 (见第 12 章) 来 说明将 相当复 杂的多 组生化 反应简 化为简 单的网 络等价 
表示。 特 别地, 胞外 代谢物 浓度测 量在阐 明代谢 网络的 特征方 面具有 有限的 潜力, 例 如汇合 
于网 络另一 点的分 叉点上 的通量 分布、 代谢 循环以 及阐明 网络结 构达较 高的生 化分辨 率等。 
这些情 况在图 9.1 中 进行了 说明, 图 9.1 表 示主要 化合物 A 在两 条竞 争途径 (净速 率分别 
为 和 z;2) 之间的 分流。 A 的消耗 速率以 及?、 G 的分泌 速率的 测定足 以确定 分支点 D、 
H 的通量 分布, 并独立 计算分 泌的另 一代谢 物厌。 然而, 代谢物 A 在途径 1 和途径 2 之间 
的 通量分 配比, 或 者说, 经 过循环 A— B— C— A 的 通量是 无法确 定的。 同 样地, 如 果更多 
的反应 包含于 C 至 2D 的转 化中, 则必须 把它们 全部归 并为一 个单一 反应。 如 果需要 有关途 
径 1 和途径 2 之间的 分配比 的更多 信息, 或所 述步骤 的较高 的生化 分辨率 的更多 信息, 则必 
须采用 不同的 方法。 

本章将 要叙述 的一类 方法是 使用在 " 
特定碳 位用' 3 C 或 "C 标记化 合物。 通过 
使用这 样的化 合物, 那些 在中间 代谢物 
的碳 原子分 布上引 入不对 称性的 途径就 
可以与 另一途 径区别 开来, 即使 它们导 

致 相同终 产物的 形成。 该 不对称 性导致 图 9.1 代 谢网络 通量分 流示意 

在 一个或 多 个代谢 物中具 有根本 不同的 代谢网 络按第 8 章所述 的胞外 代谢物 (框内 ) 平衡 方法部 分分解 

207 



2D 



C02 



标 记富集 模式, 这 些代谢 物的测 量可为 竞争性 反应的 速率确 定提供 必要的 信息。 i 3 C 或 "c 标 

记的化 合物用 于联系 胞外或 胞内代 谢物中 标记富 集度的 测量。 此外, 应 用这样 的方法 所获得 
的 信息种 类极大 地依赖 于所用 的标记 底物的 种类、 所标记 的特定 碳原子 以及富 集度已 测的特 
定 代谢物 (胞内 或胞外 )。 由 于情况 通常是 决定要 采用的 标记碳 底物和 要测量 的特定 化合物 
仅仅是 基于对 它们的 熟悉和 经验, 而 很少考 虑可从 标记底 物与具 体代谢 物测量 的特定 组合中 
获取 信息的 种类, 因此, 这 是非常 重要的 一点。 

本章将 提出通 过使用 标记化 合物来 确定胞 内代谢 通量的 方法。 虽 然该基 本思想 贯穿全 
章, 但 仍将可 能的方 法分为 三类, 这主要 是依据 要分析 的网络 的大小 和复杂 程度。 在 第一种 

情 况中, 提出 适用于 代谢物 可直接 测定, 或总是 服从解 析解的 简单网 络情况 的方法 (9.1 
节)。 对于含 有循环 的代谢 网络, 直接 计算标 记转移 是不适 当的。 另一 方法是 在列举 所有可 
能的代 谢物同 位素标 记化合 物的基 础上进 行选择 的方法 (9.2 节)。 除 了有利 于准确 确定特 
定代谢 物的标 记富集 度外, 同位 素标记 化合物 列举也 允许通 过气相 色谱- 质谱仪 (GC-MS) 
对可测 量的特 定代谢 物的分 子量分 布进行 估计。 由于分 子量分 布取决 于代谢 通量, 因此, 
与 i 3 C- 核 磁共振 波谱法 联用的 GC-MS 是 有关细 胞内代 谢通量 的另一 个有价 值的信 息源。 关 
于 代谢物 同位素 标记化 合物的 最后一 点是, 这样 的同位 素标记 化合物 在确定 相应代 谢物的 
NMR 波谱的 精细结 构方面 所起的 作用。 将可 看出, NMR 波谱 的精细 结构取 决于相 应同位 
素标记 化合物 的相对 数量; 而且, 它 与细胞 内导致 这样的 同位素 标记化 合物形 成的反 应速率 
直接 有关。 最后, 对于 大网络 的复杂 情况, 数值 解是需 要的。 关 于这种 情况, 9.3 节 介绍的 
原子 作图矩 阵的概 念为有 效地进 行标记 分布计 算提供 了一个 便利的 框架, 特别 是当需 要迭代 
步 骤时。 为了保 证通过 采用核 磁共振 (NMR) 波谱 法可能 得到的 大量测 量的一 致性, 这种 
网 络分析 将包含 相当多 的反复 迭代。 这 些计算 可通过 采用原 子作图 矩阵而 简化。 

9.1 根据标 记富集 度分数 直接确 定通量 

该 类方法 依赖于 为了代 谢通量 的直接 测定而 仔细选 择的一 个代谢 物的标 记强度 (或 富集 
度) 的 测量。 所介 绍的两 种基本 方法要 求瞬时 强度测 量或稳 态强度 测量。 

9.1.1 根据 瞬时强 度测量 确定代 谢通量 

放 射性标 记化合 物的瞬 时强度 测量可 以用来 直接探 测特定 的代谢 途径, 这 就要求 标记化 

. 合物通 过细胞 膜进行 运输, 而且其 强度是 



该方 法在图 9.2 中 说明, 它表示 的图式 代谢途 径涉及 代谢物 M 以等 于途 径通量 J 的速率 

被 合成和 消耗。 通量 J 可以 通过引 人放射 性标记 M(Nr) 的一 个脉冲 并测量 纯化] vr 样 品的放 

射性来 确定。 通过 假设实 验期间 处于代 谢稳定 状态, 细胞 内放射 性标记 M 的库将 按下式 变化: 




作为 时间的 函数来 测量。 由 于其放 射性测 
量 的专一 性和高 精度, 该方 法能适 用于通 
过物质 平衡技 术不能 观测的 小数量 级的代 
谢 通量的 确定。 另一 方面, 它也要 求专用 
设 备来分 离和测 量被放 射性污 染的化 合物。 



M* (外部 放射性 标记的 M) 

图 9.2 用于 直接测 定代谢 通量的 
放 射性标 记代谢 物示意 




(9.1) 



常数为 J 和 M (由于 代谢稳 态), 积 分给出 




(9.2) 



式 (9.2) 表明, 未知的 通量/ 可以根 据放射 性计数 的半对 数图和 M 的总细 胞内浓 度来确 
定。 应 该注意 的是, 代谢稳 态是必 要的, 但仅对 于标记 实验期 间内。 由 于这样 的实验 持续时 
间 较短, 因此, 他们 可以在 取自大 容器的 小样品 上重复 进行, 以 便确定 在瞬态 期间的 代谢通 
量。 当然, 只 有当标 记测量 和实际 实验的 时间尺 度相差 很大而 能充分 分开, 而 且确保 标记测 
量期间 实际的 环境条 件扰动 最小, 这 才是可 能的。 为此, 作为胞 内代谢 物库的 函数的 脉冲大 

小应仔 细选择 C 

9.1.2 代谢稳 态和同 位素稳 态实验 

图 9.3 描绘了 将标记 化合物 用于确 定细胞 内代谢 通量的 另一种 方法。 该图 表示对 应于图 
9.1 中网络 的标记 分布示 意图。 如果 代谢物 A 是一个 六碳化 合物, 其第 1 个碳 原子被 标记, 则 
假 定形成 代谢物 B 的反 应是一 个除去 标记碳 的脱竣 反应, 那么, 经过 代谢物 B 的途 径将 产生代 

谢物 C 的一个 未标记 分子, 同时, 经直 接途径 (速 率为 1;2) 产生的 C 分子 将按 图中所 示位置 1 

保留 标记碳 原子。 标记 分子中 代谢物 C 的富 集将 直接正 比于反 应速率 2, 反 应速率 2 与 代谢物 
A 的总消 耗速率 有关。 对于 代谢物 D, 特别 是分泌 代谢物 F 来说, 也是 如此。 代谢物 F 可通过 
对 胞外的 培养基 分析来 测定。 已发现 代谢物 F 第 1 位 点上的 i 3 C 富 集可提 供有关 相对反 应速率 
2 的 信息, 相对反 应速率 2 可 用于与 总代谢 通量的 联结, 以区 别速率 z;i 和 1;2。 

H —— - K 



图 9.3 借助 同位素 标记化 合物, 确 定分叉 代谢途 径的通 量分配 比简图 

(标 记的 碳原子 用圆点 表示) 

本章 将通过 两个例 子来说 明这些 方法的 细节。 在此 之前, 应注意 重要的 两点。 第一 点是该 
方 法仅在 代谢稳 态和同 位素稳 态下才 有效。 代谢稳 态就是 这样的 状态, 即 在此状 态下, 所有参 
与 代谢网 络的胞 内代谢 物浓度 都是恒 定的。 而在同 位素稳 态下, 代 谢物同 位素标 记化合 物的相 
对群体 也是恒 定的。 在代谢 或同位 素瞬态 期间, 胞内 代谢通 量的确 定显然 是更复 杂的, 它需要 
广泛 的体内 动力学 信息。 由 于这样 的信息 是得不 到的, 因此, 为了 达到稳 态而以 这样的 方法来 
设计 实验是 绝对必 要的。 这是 应该注 意的第 二点。 显然, 稳 态恒化 器是进 行实验 的优先 系统。 
然而, 将标记 底物引 入系统 的方式 也存在 着某些 限制。 一种方 法就是 通过有 限脉冲 方式, 其浓 
度使进 料中的 底物浓 度不会 改变。 而 且其持 续时间 具有足 够的长 度使同 位素稳 态可以 达到。 实 
例 提供了 一些检 测点, 它们有 助于评 价令人 满意的 稳态是 否已经 达到。 也可注 意到, 根 据竞争 

途 径之间 产生不 对称性 的具体 机理, 图 9.3 所 描绘的 简单方 式也会 有一些 变化。 除了 所标记 
C02 的脱 羧作用 之外, 差向异 构嗨、 异构酶 及其它 反应也 可产生 所要求 的不对 称性。 



【例 9.1】 赖氨 酸生物 合成中 支路途 径通量 的确定 

该实 例说明 使用标 记丙酮 酸来区 别赖氨 酸合成 途径的 最终支 路中两 条竞争 途径。 如图 9.4 
所示, 赖氨酸 生物合 成的最 后步骤 包括四 氣吡唳 二羧酸 (H4D) 至消旋 -a, £- 二氨基 庚二酸 
(m^5o-DAP) 的 转化。 该转 化既可 以通过 一条四 反应步 骤途径 进行, 也可 通过由 mftio-DAP 脱 
氣薛 (DDH) 催化的 单一反 应步骤 进行。 me5o-DAP 脱羧后 形成赖 氨酸。 仅依 靠赖氨 酸的合 

209 



A 

•ooooo 



1'2 



C 

•ooooo 

o-oooo-o 



'CO, 



ooooo 
B 



] " [ oSo ] 



i ooo J 
F 



成 速率不 能区别 这两条 途径, 这两条 途径的 总通量 等于赖 氨酸分 泌的总 速率。 然而, 通过使 
用 标记丙 酮酸, 可以估 计转化 为赖氨 酸的每 条途径 的通量 分数。 

H4D 由草 酰乙酸 (OAA) 和 丙酮酸 (Pyr) 通过缩 合反应 生成。 在 H4D 通过单 步途径 
(图 9.4 的左边 支路) 转化 为赖氨 酸的过 程中, 碳原 子的排 列保持 不变。 另一 方面, 四步途 
径的 最后一 步反应 是差向 异构酶 反应, 它导 致两种 me5o-DAP 分子的 形成, 并进一 步形成 
赖 氨酸, 两种 me5o-DAP 分 子互为 镜像, 这 可通过 使用标 记碳原 子区别 出来。 正是 该最后 
步骤在 H4D 转变 为赖氨 酸过程 中引人 了不对 称性, 因此, 它为 区分赖 氨酸合 成的四 步途径 
和一 步途径 (或 支路) 提供了 依据。 



草 酸乙酸 

dXIXIKD 




丙 PI 酸 

EHm] 




DAP DAP 

(iX2X3XM}WB [IHIHIKiKlKM) 
(\-y)/2 (卜少 )/2' 



赖氨酸 

CIXIKIKiKIHI] 



L- 赖 氨酸 



L- 赖氨酸 

[IHIHMKIKD 



图 9.4 丙酮酸 和草酰 乙酸通 过两条 途径形 成的赖 氨酸标 记模式 

通量 (l-y)i^iy,,ne (下标 lysine 表示 赖氨酸 —— 译 者注) 的 四步骤 號拍醜 薛 途径 包括雜 序列: 

iv- 號珀醜 -2,6- 嗣庚 二酸合 成酶; iv- 琥 珀酰氣 基兩庚 二酸谷 氨酸转 氣酸; yv- 琥珀酸 二氣基 庚二酸 

脱號珀 酰醉及 二氨基 庚二酸 差向异 构酷。 通量 胃的 单步途 径包含 ,Me«>-DAP 
脱氢 BI 的 作用, 和 P 的下 标表 示原来 的碳位 

使用 标记第 3 位碳 原子的 丙酮酸 ([3-i 3 C] 丙 酮酸) 作为碳 源也会 产生某 些碳原 子带有 i 3 C 
标 记的草 酰乙酸 分子。 在本分 析中, 所关注 的是图 9.4 中化 合物第 3 和第 5 位碳 原子所 带的标 
记, 并用 [0/6OAA3] 和 [%Pyr3] 分别表 示草酰 乙酸库 和丙酮 酸库的 分数。 草 酰乙酸 (OAA) 
和 丙酮酸 (Pyr) 都标 记了第 3 位碳 原子。 应注意 的是, 这 些分数 也可包 括标记 了其它 碳位置 
的 OAA 和 Pyr, 只要 OAA 和 Pyr 的第 3 位 碳原子 上带有 i 3 C 标记。 在 代谢稳 态下, 没 有胞内 
代 谢物的 积累, 则对图 9.4 的途径 通量得 出下列 等式: 

"^condensation ― "single step "four step ― "lysine (1) 

式中, 下标 condensation 表 缩合; single step 表 单步; four step 表示 四步。 
现在推 导有关 H4D 的不 同同 位素标 记化合 物库的 方程。 縮写 如下: H4D3,。„iy, 仅第 3 
位碳 原子被 标记的 同位素 标记化 合物; H4D5,。„iy, 仅第 5 位碳原 子被标 记的同 位素标 记化合 
物; H4D35, 第 3、 5 位碳原 子都被 标记的 同位素 标记化 合物; (H4D3 = H4D3,。niy + H4D35), 
第 3 位碳 原子被 标记的 H4D 同位素 标记化 合物的 总库; (H4D5 = H4D5,。„iy + H4D35), 第 5 
位碳 原子被 标记的 同位素 标记化 合物的 总库。 关于 其中一 种同位 素标记 化合物 (如 H4D3) 
库的 平衡, 可以 写为: 

= Z^conden.sation[ %OAA3]( 1 ― [ 96Pyr3] ) + condensation [ O/6OAA3] [ 96Pyr3] 



210 



一 ( "single step + four step ) [ % H4D3 ] 
= "lysi J O/6OAA3] - 1;1>雷[ % 腸 3] (2) 

式 (2) 中的前 两项分 别表示 H4D3,。niy 和 H4D35 同位 素标记 化合物 的合成 速率, 第 3 项为 
H4D3 通过图 9.4 中两 条途径 的消耗 速率。 在同 位素稳 态下, 上式的 导数等 于零, 则得 

H4D3 库的 表达 式为: 

[%H4D3] = [0/6OAA3] (3) 
同 样可得 H4D 的其 它同 位素标 记化合 物库, 并按下 列等式 给出: 

[%H4D5] = [%Pyr3] (4) 

[ %H4D35] = [ O/6OAA3] [ %Pyr3] (5) 

[ %H4D3.oniy] = [ %OAA3](l — [ %Pyr3]) (6) 

[ %H4D5.oniy] = [ %Pyr3] (1 - [ %OAA3] ) (7) 

[ %H4Dunlabeled] = ( 1 — [ %Pyr3] ) ( 1 _ [ O/6OAA3] ) (8) 

式中, 下标 unlabeled 表示未 标记。 

前面的 H4D 同位素 标记化 合物将 产生第 3 和 (或) 第 5 位 碳原子 标记的 赖氣酸 同位素 

标记化 合物。 假设经 单步途 径合成 赖氨酸 的通量 分数为 即: Z^singlestep = >^lysine, 则从所 
指 H4D 同 位素标 记化合 物前体 产生各 种赖氣 酸同位 素标记 化合物 的速率 如下: 

从 H4D35 产生 L35: "iysine[ % AA3 ] [ % Py r3 ] (9) 

从 H4D3,。nly 产生 L3 ,only : single step[ %H4D3,only] + ( "four step々) [ %H4D3.only] 

e[a + y)/2][0/6OAA3](l- [96Pyr3]) (10) 

从 H4D5,。nly 产生 U.orUy: ( four step /2 )[% H4D5. only ] 

二 fiysine[(l- y ) /2 ] [ % Pyrj ] ( 1 " [ % OAA3 ] ) (11) 

从 H4D3,。nly 产生 L5,。nly: ( t^four step /2) [ %H4D3, only] 

= V lysine [ ( 1 " Y ) /2 ] [ % O AA3 ] ( 1 " [ % Py r3 ] ) (12) 

从 H4D5,。nly 产生 L5, only • "^single step 

[ % H4D5 .only ] + (v four step ^)[% H4D5,only ] 

= t;,ysine[ ( 1 + y ) /2] [ %Pyr3] ( 1 - [ %OAA3] ) (13) 
对于 稳态恒 化器, 可 运用式 (9) 〜式 (13), 将 所有第 3 位碳原 子带有 i 3 C 标记的 赖氨酸 

同位 素标记 化合物 (L3) 的总量 平衡写 成如下 形式: 

^=t;iysinel[%OAA3][%Pyr3] + [(l + y)/2][%OAA3](l-[%Pyr3]) 

+ [(l-y)/2][%Pyr3](l-[%OAA3])l -DcL.3 = (14) 
同 样地, 对于 所有第 5 位带有 i 3 C 的赖氨 酸同位 素标记 化合物 (L5) 的总 量平衡 则有: 

^ = V iys,„e 1 [ % OAA3 ] [ % Pyra ] + [(l-y)/2][% OAA3 ](!-[% ?yr, ] ) 

+ [(l + y)/2][%Pyr3](l — [O/6OAA3])! — DcL,5 = (15) 
式中, D 为恒化 器稀释 速率。 式 (14) 和式 (15) 可与总 赖氨酸 的稳态 平衡式 (16) 相 
结 合以消 除测量 OAA 富 集分数 ( [%0AA3]) 的 困难。 

• = "lysine- DCL = (16) 

对通量 分配比 >^ 求解, 得出: 

211 



3'= l[cL.5-CL,3]/cLl/|2[%Pyr3]-[cL.3 + CL,5]/cLi (17) 
式 (17) 表明 如何根 据碳位 3 标 记的丙 酮酸的 给予, 从 赖氨酸 在碳位 3 和 5 的相 对富集 

度来 确定两 条赖氣 酸合成 途径的 通量分 配比。 此 计算需 要细胞 内丙酮 酸的富 集度, 这 可通过 
直接 测量来 确定。 另 一方法 可以分 泌的缬 氨酸和 (或) 丙氨酸 的标记 富集度 测量为 基础, 这 
两 种氨基 酸是直 接从丙 酮酸合 成的。 由于胞 内丙酮 酸库的 可能的 稀释及 其程度 一般是 不知道 

的, 因此, 建议 不要把 [%Pyr3] 设定为 等于胞 外丙酮 酸的富 集度。 

上述方 法仅在 代谢稳 态和同 位素稳 态下才 有效。 这 种稳态 可在恒 化器中 达到, 然而, 在 
稳定的 赖氨酸 生产条 件下, 实 验上也 可采用 批式反 应器。 倘若式 (17) 中所标 记的赖 氨酸分 

数 : CL,3々L 或 CL,5々L 分别用 比率 (dcL,3/df )/(dcL/ck ) 或 (dc L.s/d^ A ck i/df ) 代替 , 则前 

面 的公式 对批式 反应器 仍是有 效的。 当然, 在 批式反 应器情 况下, 关于 代谢稳 态和同 位素稳 
态假设 的有效 性是可 疑的。 然而, 应注意 的是, 即使在 一个本 质上的 瞬态系 统中, 胞 内代谢 
物也 可在一 段时间 内处于 稳态。 例如, 在 分批培 养中经 常遇到 的恒定 生物量 浓度条 件下, 平 
衡生长 或稳定 生产就 是这种 情况。 由于这 些方法 的不适 当运用 会产生 错误的 结果, 因此, 寻 
找可为 稳态假 设的有 效性提 供证据 的内部 检验点 是很重 要的。 本 例中, 检验稳 态假设 有效性 

的 一个方 法就是 当产品 在反应 器中积 累时, 将 [3-i 3 C] 赖 氨酸和 [5-i 3 C] 赖 氨酸的 分数与 

总赖 氨酸浓 度一起 作图。 线性曲 线可为 相应时 间内的 代谢稳 态和同 位素稳 态提供 支持。 
前 述方法 已在摇 瓶实验 和批式 培养实 验中检 验过。 摇瓶 实验得 出的估 计是: 由单 步途径 

贡 献的总 赖氨酸 通量在 30% 〜50% 范 围内。 在一 段短时 间内在 一个自 动控制 的分批 培养中 
进 行的仔 细实验 提供了 惊人的 信息。 经 过单步 途径的 通量, 或者等 价地, 在 H4D 分支 点的 
通量 分配比 随时间 不是恒 定的, 而在发 酵进程 中是变 化的。 特 别地, 单 步途径 的通量 在导人 
标记的 葡萄糖 脉冲后 的短时 间内, 会 显著地 从几乎 为零, 上升 至接近 100%, 经过 5〜7h 
后, 又 下降至 类似于 引人脉 冲前的 水平。 这 个结果 证实了 胞内代 谢物及 催化相 应反应 的酶的 
体 内调节 对代谢 通量所 施加的 控制, 这两个 重要因 子决定 了代谢 网络中 的通量 分布。 然而, 
应该注 意到, 由 于没有 采取适 当的措 施来确 保或检 验稳态 环境, 因此, 应谨 慎对待 这些结 
果。 这 些结果 在提供 一个总 趋势的 判断力 方面可 能是正 确的, 但 要对图 9.4 中 两条途 径的体 
内 通量进 行定量 评价, 则必 须进行 仔细设 计好的 实验。 

【例 9.2】 乙 酰辅酶 A 代谢 中标 记分布 的分析 

举例 说明同 位素标 记分布 和代谢 通量估 计的第 二个例 子如图 9.5 中的简 单网络 所示, 它 
表示乙 酰辅酶 A (AcCoA) 代 谢的双 库模型 [改自 Blum and Stein (1982)]。 这样一 个模型 

OAA-^ . &帛酸 可用来 描述乙 醜辅酶 A 在线 粒体 和胞质 溶胶之 间的分 

V, f 布。 在 这个系 统中, 丙酮酸 和己酸 是能潜 在地用 或 

ACCOA, ^ ACCOA. 二匚 脂肪酸 标记的 底物。 在库 I 和库 11 中, AcCoA 的原 子当中 

同位素 标记分 布将是 碳通量 T;1 〜!; 6, 以及 底物标 记水平 
"5 和 模式的 函数。 通量 1;1〜1;6 的 单位为 毫摩尔 /( 细胞 ,小 

-,^ 时)。 这 里由于 AcCoA 是 胞内代 谢物, 可 以假设 一个同 

丙酮酸 cLBS. 

、 位素 稳态, 这 意味着 流入胞 内中间 代谢物 特定碳 位上的 

^^'^ ^f:J^^^t^'^^^ l^i 己"^ '流 fcb 的标记 碳是? ^格平 衡的。 推导 出关于 AcCoA 
简单代 谢网络 

考虑了 AccoA 的两 个库, 分 别代表 线粒体 mm^^m^-Mmmm^^^.^, ii^f^ 系、 式&确 
部分和 细胞质 部分, "1~"6 表 示通量 定胞 内代谢 通量, 一 个特定 碳原子 的富集 度是用 代谢物 

212 



CO, 



名加 上括号 内的该 碳位来 表示。 

现 在对库 I 中 AcCoA 的第 1 个碳 原子构 建稳态 平衡。 用 AcCoAi (1) 和 AcCoA(2) 分别 
表示库 I 中 AcCoA 的第 1、 2 个 碳原子 的标记 富集。 有 两个反 应产生 AcCoAi: (1) 丙酮酸 
的脱羧 反应, 总 通量为 iM, 和 (2) AcCoAn 从库 n 到库 I 的 转移, 总 通量为 1^3。 

丙酮 酸的第 1 个 碳原子 脱羧为 C02, 而第 2、 3 个碳 原子分 别变为 AcCoAi 的第 1、 2 位 
碳 原子。 因此, 从丙 酮酸到 AcCoAi 的第 1 个碳原 子的标 记通量 由乘积 T;2Pry(2) 给出。 Ac- 
CoAu 转移到 AcCoAi 不涉 及化学 反应, 因此, AcCoAn 的第 1、 2 位碳 原子分 别变为 Ac- 
CoAi 的第 1、 2 位碳 原子。 这样, 从 AcCoAn 至 AcCoAi 的第 1 位碳 的标记 通量是 由乘积 
t;3AcCoAii(l) 给定。 进人 AcCoAi(l) 的总标 记通量 为这两 个通量 之和: 

进入 AcCoAi(l) 的通量 = z;iPyr(2) + z;3AcCoAn(l) (1) 

移去 AcCoAi 的 两个反 应是: 与草 醜乙酸 (OAA) 缩合 形成柠 檬酸, 其 通量为 tM; Ac- 
CoA 从库 I 至库 n 的 转移, 其 通量为 1;2。 流出 AcCoAi 中的第 1 个 碳原子 的标记 通量为 

AcCoAl(l) 乘 以通量 1^2、 之和。 

流出 AcCoAi(l) 的通量 = (T;2+tM)AcCoAi(l) (2) 
在稳 态下, 进入 AcCoAi(l) 的 标记通 量将与 流出通 量严格 平衡, 使式 (1) 和式 (2) 
相等, 可 得关于 AcCoAi 的第 1 个碳原 子的稳 态标记 平衡: 

( V2 + x^4)AcCoAi(l) = i;iPyr(2) + "sAcCoAn (1) (3) 
同 样地, 对于 AcCoAi 的第 2 位 碳原子 的稳态 同位素 平衡, 由下式 给出: 

( V2 + tM)AcCoA I (2) 二 xnPyrO) + t^sAcCoAn (2) (4) 
对于库 n 中的 AcCoA, 重复 上述步 骤即可 推出其 稳态方 程式。 有 两个反 应产生 
AcCoAn : (1) 己酸 的氧化 反应, 其总 通量为 1^5; (2)AcCoA 从库 I 至库 n 的转 移, 其通量 
% V2。 己酸的 六个碳 原子通 过/? -氧 化作用 被成对 移去, 以致每 个奇数 碳原子 和偶数 碳原子 
分别对 AcCoAn 的第 1、 2 位碳原 子贡献 1/3 的比 活性。 因此, 从 己酸至 AcCoAn 的第 1 位 
碳原子 的标记 通量由 乘积: (t;5/3)[Hex(l) + Hex(3)+Hex(5)] 给定。 由于 AcCoAn 转换为 
AcCoAi 不涉 及化学 反应, 因此, AcCoAi 至 AcCoAii 的第 1 位碳原 子的标 记通量 由乘积 
t;2AcCoAi(l) 给定。 进入 AcCoAn (1) 的总标 记通量 为这两 个通量 之和: 

进人 AcCoAn (1) 的 通量二 ("3/3)[Hex(l) +Hex(3) + Hex(5)] + "zAcCoA! (1) (5) 
流出 AcCoAn 第 1 位 碳原子 的标记 通量等 于通量 t;3、 之 和乘以 比活性 AcCoAn (0: 
流出 AcCoAn (1) 的通量 = ("3+ t^6)AcCoAn(l) (6) 
使式 (5) 和式 (6) 相等, 得到 AcCoAii 的第 1 位碳原 子的稳 态标记 平衡: 

("3+ "6)AcCoAn (1) 二 (t'5/3)[Hex(l) + Hex(3) + Hex(5)] + "aAcCoA! (1) (7) 
同 样地, AcCoAn 第 2 位碳原 子的稳 态同位 素平衡 可由下 式给出 : 

("3 + "6)AcCoAn (2) = ( t;5/3)[Hex(2) + Hex(4) + Hex(6)] + "zAcCoAi (2) (8) 
式 (3), 式 (4), 式 (7) 和式 (8) 可用 矩阵形 式表示 如下: 



V2 + V4 





_ ^ 





















_ yj 


3V2 





、 ^ - 

















3(z;3 + ve) 


"05 


V5 



AcCoAi(l) 
AcCoAi(2) 
AcCoAn (1) 
AcCoAn (2) 



213 



Pyr(2) 
Pyr(3) 

Hex(l) + Hex(3) + Hex(5) 
,Hex(2) + Hex(4) + Hex(6) 
式 (9) 可求出 AcCoA 两 个库中 的富集 度的解 析解, 例如, AcCoAna) 的 解由下 式给出 



(9) 



AcCoAn(l) 



Pyr(2) 



+ 



-[Hex(l) + Hex(3)+Hex(5)] 



3(z^2"6+x^3tM+tWLnex、i「nex、"Tnexw 门 (10) 

可以 看出, 式 (9) 提供了 指定代 谢物的 富集度 与六个 代谢反 应速率 t;i〜t;6 之 间的关 
系。 在 对丙酮 酸和己 酸采用 预先确 定了标 记的实 验中, 式 (9) 中 的右边 项是已 知的。 此外, 
对 丙酮酸 和己酸 的总吸 收速率 以及脂 肪酸积 累速率 的测量 结果也 会分别 得出反 应速率 t;i、 
1;5 和 1^6 的 估值。 因此, 两个 AcCoA 库中 的两个 碳原子 的富集 度的测 量也可 得出反 应速率 

V2. 1^3 和 估 计值, 并可提 供一个 额外冗 余度, 以检验 整个系 统的一 致性。 式 (9) 关于 

代谢 物吸收 和富集 度测量 的解可 为两个 库中的 AcCoA 相 互转换 以及因 产能而 进入柠 檬酸循 
环 的碳速 率等提 供很有 价值的 估计。 



9.2 涉及 同位素 标记代 谢物完 全列出 的应用 > 

正如 前面提 到的, 先前 直接解 释通过 标记底 物引入 的同位 素标记 的结局 (fate) 的方 
法, 能用于 不含代 谢循环 的相对 简单的 网络。 对于更 复杂的 网络, 特别 是那些 含有循 环的网 
络, 用 这样的 方法来 处理是 非常困 难的。 在 这种情 况下, 需要对 所有可 能的同 位素标 记代谢 
物 (metabolite isotopomers) 的产 生进行 解释, 并 且通过 它们, 确定代 谢物不 同碳位 的预计 
标记富 集度。 

为了证 明由于 包含代 谢循环 而增加 的复杂 程度, 跟踪经 过一轮 TCA 循环 后存在 于丙酮 
酸第 3 位碳原 子上的 i 3 C 标记 ( [3-i 3 C] 丙 酮酸) 的结局 (见图 9.6)。 从 100% [3-i 3 C] 丙 
酮酸 开始, 所 有的乙 酰辅酶 A 都经 丙酮酸 脱氢酶 反应在 C2 位上被 标记。 如果 固定的 碳酸氣 
盐是用 i 3 C02 标记, 则 由丙酮 酸羧化 酶催化 的回补 反应生 成的草 酰乙酸 (OAA) 将具有 034 
形式; 如果 固定的 碳酸氣 盐未被 标记, 则 草酰乙 酸具有 03 形式。 此外, 假设 从草酰 乙酸到 
富马酸 的逆反 应与柠 檬酸合 成酶、 PEP 羧激酶 催化的 反应相 比是非 常快速 的话, 则 将导致 
草酰 乙酸, 號 珀酸, 苹果 酸及富 马酸中 C1 和 C4 之间, 以及 C2 和 C3 之间的 碳标记 完全对 

称 平衡。 该假 设导致 034 和 〇12 的 浓度及 03 和 02 的浓 度分别 相等。 TCA 循环 之后, 034 与 

Ac2 缩 合将相 继产生 Ci24, Ki24, Si3, 0.5Fi3 + 0.5F24, 0.5Mi3 + 0.5M24, 以及 O.5O13 + 

0.5024。 这 样可以 看出, 〇34 和 03 这两个 同位素 标记代 谢物现 已产生 两个额 外的草 醜乙酸 
同位素 标记代 谢物, 即 Oi3 和 024。 后者 (024) 将 经过另 外几轮 TCA 循环 而进一 步被改 

变, 导 致更多 TCA 循 环中间 代谢物 的同位 素标记 代谢物 产生。 显然, 先 前解释 i 3 C 标记命 

运的 方法, 在 处理由 于多轮 代谢循 环而引 人的额 外复杂 性时, 是不充 分的。 处 理这些 情况的 

另一方 法是使 用同位 素标记 代谢物 平衡。 本节首 先对整 个方法 作一般 说明, 然后对 TCA 循 
环同位 素标记 代谢物 作全面 分析。 最后, 用具 体例子 说明各 种模式 在阐明 细胞代 谢中的 
应用。 
214 



图 9.6 使用 100% 富集的 [3-i 3 C] 丙兩酸 经多轮 TCA 循环 中间代 谢物碳 原子的 连续标 记示意 
缩写 Ac, 0, C, K, S, M 分 别代表 乙銑辅 SI A, 草酸 乙酸, 杵 檬酸, a-S 戊 二酸, 
琥珀 酸及苹 果酸。 代 谢物符 号后面 的数字 表示由 i 3 C 标记 的碳位 

为 采用该 方法, 应 从完全 列出所 有可能 的同位 素标记 代谢物 开始, 当应用 于采用 100% 
[3-i 3 C] 丙 酮酸作 为标记 底物的 TCA 循 环时, 草酰 乙酸、 柠 檬酸、 a- 酮戊 二酸、 號 珀酸以 
及苹果 酸等的 可能同 位素标 记代谢 物如图 9.6 中 所示。 在这种 情况下 没有其 它种类 形成。 应 
该注意 的是, 并 不是所 有可能 的同位 素标记 代谢物 种类的 组合都 出现。 在 这种情 况下, 例 
如, 存在 2 5 = 32 种 a- 酮戊 二酸, 但根 据假设 的生物 化学, 只有 6 种 出现。 

下一 步是写 出出现 在网络 中的所 有代谢 物及其 同位素 标记代 谢物的 平衡方 程式。 这些方 
程 包含代 谢物及 同位素 标记代 谢物的 浓度, 以及人 们想要 确定的 胞内转 化速率 (通量 )。 在 
假 设代谢 稳态和 同位素 稳态条 件下, 这些平 衡方程 对于未 知的代 谢通量 来说是 线性方 程式, 
并 可直截 了当地 求出作 为通量 的函数 的同位 素标记 化合物 的相对 浓度。 最后一 步是一 个迭代 
试差 过程, 通过 它确定 未知的 通量, 以便最 好地描 述实验 数据。 从未知 代谢通 量的猜 测值出 
发, 相对同 位素标 记代谢 物群体 首先被 确定, 然后, 核 对下列 一种或 几种情 况进行 计算: 
(a) 各种 代谢物 碳原子 的标记 富集, (b) 借助 GC-MS (气 相色 谱-质 谱仪) 测 量代谢 物分子 
量 分布, 或 (C) 代谢物 NMR 谱 的精细 结构。 将 模型预 测值与 相应的 标记富 集度、 分子量 
分布及 NMR 谱 线强度 等实验 值进行 比较, 可 得出未 知通量 的新估 计值。 这种 迭代过 程重复 
进行, 直 到模型 预测值 令人满 意地与 测量值 一致, 最终集 中于其 它观察 不出的 代谢通 量的确 
定。 图 9.7 给出 了该试 差过程 的流程 C 

215 



生 物化学 



建立同 位素标 
记代谢 物平衡 
方程式 



求出 同位素 标记代 
谢物库 



预測: 

• 矛示记 富集度 

• 同位素 标记代 谢物分 

子 量分布 

• NMR 谱的精 细结构 



通 量初始 




重新调 整通量 


否 


与实 验数据 比较. 


估计值 




估计值 




一致性 是否满 意"^ 



通量 估计值 



PEP 



GLU 



外部 
P 



图 9.7 根据 同位素 富集、 GC-MS 及 NMR 谱的细 微结构 等的测 量确定 胞内代 谢通量 的迭代 法流程 

在 下面两 节里, 将推 导出因 引入标 记丙酮 酸或乙 酸底物 而产生 的所有 TCA 循环 同位素 
标记代 谢物分 布的表 达式。 这 些推导 可用来 说明一 个非常 普遍的 代谢循 环中的 同位素 标记代 
谢物 的列举 方法。 此外, 将已 报道的 TCA 结 果用于 几个实 例中, 以表 明如何 能从标 记底物 

的实验 中得到 细胞生 理学额 外的洞 察力。 
最后, 在 9.2.3 节, 我们 将说明 怎样根 
据前 几节中 得到的 相对同 位素标 记代谢 
物群 体来计 算同位 素标记 富集、 分子量 
分 布以及 NMR 谱 的细微 结构。 
9.2.1 来自 标记丙 酮酸的 TCA 循环同 
位 素标记 代谢物 的分布 
图 9.8 描绘 了经由 TCA 循环 途径和 
普遍 存在于 真核生 物中的 糖异生 途径的 
丙酮 酸利用 反应。 假设磷 酸烯醇 丙酮酸 
(PEP) 不 是由丙 酮酸经 PEP 醇 直接形 
成的, 而 是由草 酰乙酸 (OAA) 经 PEP 
羧 激醇生 成的。 丙 酮酸直 接羧化 为草酰 
乙酸 (OAA), 或可转 化为乙 酰辅醇 A, 
然后, 乙 酖辅酵 A 与草醜 乙酸缩 合形成 
柠 檬酸, 柠檬 酸经过 TCA 循环, 最终 
又生 成草酰 乙酸。 最后, PEP 经 过糖酵 
解的 EM 途 径的逆 方向, 或者说 糖异生 
途径, 可 合成葡 萄糖。 

首先, 写出图 9.8 网 络中标 出的代 
谢物 的质量 平衡。 

dcAcCoA 




^MDH 



"SUDH 



图 9.8 经 由柠檬 酸循环 和糖异 生途径 的丙酮 酸利用 
通 量的下 标縮写 如下: GP — 糖异生 途径; PDH —丙 兩酸脱 
氢解; CS —柠 檬酸合 成蘭; ACON' — 顺乌头 酸酶: 
KGDH— 0- 兩戊 二酸脱 氢酷; SUDH —號 珀酸脱 氣雜; 
FUM — 富马酸 醉; MDH— 苹 果酸脱 氛瞎; PPCK —碟 酸炼醇 
丙 S 酸羧 激醉; PC — 丙銅酸 梭化膀 
代谢 物的縮 写如下 PEP —碟酸 梯醇丙 嗣酸; P —丙 酮酸; 

AcCoA —乙 git 辅 SIA; C —柠 棣酸; IC 一异柠 檬酸; 
K 一 a- 銅戊 二酸; S —琥 珀酸; F —富 马酸; M —苹 果酸; 
0~ 草酷乙 酸; C02— 二氧 化碳; GLU— 葡萄糖 
诸如 PEP— P— O^PEP 等 无效循 环假设 是不活 动的, 
其它 反应, 如 用于生 物合成 的谷氣 酸-草 酷乙酸 转氨解 
以及谷 S 酸脱氡 SI 等可 被忽略 

216 



dec 



"^CS ~ f ACON 



(9.3) 
(9.4) 



dcic_ 

"jj" 一 "i^ACON ~ "OlDH 
■^^IDH— "KGDH 

dcs 一 

- "KGDH 一 "SUDH 

dcM 

"dT 



■= T^SUDH ― "i^FUM 



VpUM 一 VmDH 



O 



dc"— 本 

- ^MDH 十 "i^PC ― ^CS —― 'iypPCK 
rcO^ - VlDH'^ "i^KGDH ― ^'PC + I^PPCK 
dcpEP 



dt 



- ^PPCK 一 ^GP 



dcp 



IMPORT 一"! ^PC 一 VPDH 

在 代谢稳 态下, 没 有胞内 代谢物 积累, 由式 (9.3) 〜式 (9. 13) 可得: 

"OCS - "!^ PDH 二 "i^ACON = ■iMDH = ^^KGDH 
= T^SUDH = t'FUM = ^MDH 
■ypC = t^ppCK 



(9.5) 

(9.6) 

(9.7) 

(9.8) 

(9.9) 

(9.10) 
(9.11) 

(9.12) 
(9.13) 

(9.14) 

(9.15) 
(9.16) 

(9.17) 
(9.18) 



■UpC— f GP 
IMPORT -■ ― V?C + "!^ CS 

与 总代谢 物浓度 相似, 根据 10096 [3-i 3 C] 丙酮 酸的给 予而出 现于图 9.6 中的每 个同位 
素标 记代谢 物的浓 度写出 平衡方 程式: 

' 1 - C02* 

~~ 2 ~~ 

1 -C02 



dcQ 

"dT 



— cV 




' ― 


02 







O34 







O12 







Oi3 


= ^'MDH 


Mi3 


O24 




M24 


O123 




M123 


O234 




M234 


.023_ 




-M23. 



2 

、丁 

'C02* 









"03" 




"O3" 


02 




O2 


034 




O34 


012 




O12 


Oi3 


一 "i^PPCK 


Oi3 


O24 




O24 


O123 




Oi23 


O234 




O234 


.O23. 




O23. 



(9.19) 



代 谢物 



在 前面等 式中, 每 个同位 素标记 化合物 种类是 以相对 群体表 示的, 即, 其浓 度用同 

的总 浓度进 行归一 化处理 (如 03 二 Co,3々0), CO2' 是带有 1 3 C 标记的 CO2 的 分数。 

类似 于草酰 乙酸, 也可对 柠檬酸 / 异 柠檬酸 (用 C 表示 )、 a- 嗣戊 二酸、 號 珀酸、 苹果 

217 



酸 以及用 i 3 C 标记的 C02 的分数 C02* 等 写出同 位素标 记化合 物平衡 [分 别为式 (9.20) 〜式 
(9.24)]。 



dec 



C24 




◦3 一 




1 
1 


C34 




〇2 




C34 


Cl24 




O34 




C124 


C346 




Oio 
^12 




C346 


C246 




Oi3 


一 '! ^IDH 


C246 


Cl34 




◦24 




C134 


C2346 




Ol23 




C2346 


C1234 




O234 




C1234 


-C234- 




-O23J 




-C234- 



(9.20) 









C24 + C246 




K24 




K34 




C34 + C346 




K34 


dcK 


Kl24 




Cl24 




Kl24 


dt 


K134 


= "!^ IDH 


Cl34 


― "i^KGDH 


Kl34 




K234 




C2346 + C234 




K234 




-K1234- 




- Ci234 - 




j^l234- 



dcs 



S23 

Sl3 
-Sl23- 



- ■J^KGDH 



K134 + K34 
K24 + Ki24 



S23 





"S23' 


― "i^SUDH 


Sl3 




Si23- 



dcM 



'M23 

Mi3 

M24 
M123 
LM234J 



= 't'SUDH 



2 



>13 



>123 



L2 



S123 



"M23 
Mi3 
M24 
M123 
LM234J 



rojoCOi = "IDH(C346 + C246 + C2346) + "KGDH(Ki24 + K134 + K1234) 
- "PC(C02* ) + "PPCK(034 + O24 + O234) 

在代 谢和同 位素稳 态下, 运用式 (9.22)、 式 (9.23) 和式 (9.14), 可得 

Ki34 + K34 



(9.21) 



(9.22) 



(9.23) 



(9.24) 



— M23 

Mi3 

M24 
M123 
M234J 



+ (K24 + Ki24) 
+ (K24 + Ki24) 



T(Kl234 + K234) 



y(Ki234 + K.234) 



(9.25) 



218 



同 样地, 从式 (9.20)、 式 (9.21) 和式 (9.14), 可得: 







(J3 + Ui3 






U2 + U12 


Ki24 




O34 


Ki34 




O24 


K234 




Oi23 + 023 


-K1234- 




- 0234 - 



(9.26) 



结合式 (9.25) 和式 (9.26), 并将 所得的 苹果酸 同位素 标记化 合物的 表达式 插人式 
(9.19) 的 稳态形 式中, 则 可得代 谢及同 位素稳 态下, 草 醜乙酸 的同位 素标记 化合物 平衡: 



■OCS 



〇 

〇 

d 




'/1 -C02* ] 

/1-C02*\ 

\ 2 / 

/C02* \ 

1 2 ) 


〇 
6 




(COz ] 


y(0234 + O123 + 023) 








y(0234 + O123 + 023) 
― (O24 + O2 + O12) ― 







- _ 



03 
02 
◦34 
Oi2 

= ("CS+ "PC) Oi3 (9.27) 
O24 
O123 
O234 
LO23. 



式 (9.27) 表明 所有的 草酰乙 酸同位 素标记 化合物 可仅仅 从二氧 化碳的 相对富 集度、 柠 

檬 酸合成 薛通量 (t^cS) 和丙酮 酸羧化 醒通量 (t^PC) 来 求得。 前面的 分析也 可直接 应用于 
所有 其它的 同位素 标记化 合物, 以推 导它们 在代谢 及同位 素稳态 下也以 T;cS 和 X^PC 的 形式来 

确 定的方 程式。 因此, t;cs 和 t^pc 是 仅有的 一些未 知项, 根据它 们就可 计算所 有同位 素标记 
化合物 的相对 群体, 而 且通过 它们也 可计算 中间代 谢物的 标记富 集度。 

可用: C 和 3; 很方 便地表 示解析 结果。 定义 为 草酰乙 酸经由 PEP 羧激酶 (PPCK) 反 
应 而离开 TCA 循环 的概率 [ (l-:r) 则表 示草酰 乙酸经 柠檬酸 合成酵 (CS) 反应而 重新进 
人 TCA 循 环的概 率], 而定义 为固定 到将被 i 3 C 标记的 丙酮酸 的碳酸 氧盐, 即 C02* 的概 
率。 若用 :r 表示, 则可 写出: 

^ = ^ = ^ (9.28) 

此外, 如果 除了模 型中指 出的反 应外, 没有 其它途 径产生 和消耗 C02, 则 可只用 T 来 
表示 y。 表 9.1 总结 了当用 1009() 富 集丙酮 酸作底 物时, 以: r 和 3; 这两 个概率 表示的 草醜乙 
酸和谷 氨酸同 位素标 记化合 物相对 群体的 结果。 表 9.1 也提 供了用 1 确定 3^ 的表 达式, 以 
及表示 了从所 指出的 在三个 不同碳 原子标 记的丙 酮酸合 成葡萄 糖和谷 氣酸分 子的相 对富集 
度。 图 9.9 表 示了当 分别用 100% 富集 [2-i 3 C] 丙 酮酸和 10096 富集 [1- i 3 C] 丙酮酸 作标记 
底物时 产生的 可能的 同位素 标记化 合物。 应 注意, 表 9.1 的结果 可以用 来对任 何其它 的同位 
素标记 化合物 或代谢 物富集 度与实 验数据 (若 可获得 的话) 进行 比较。 另外, G 和 K 可交 
换 使用, 因为谷 氨酸和 a- 酮戊二 酸的同 位素标 记化合 物的分 布是相 同的。 

219 



表 9.1 萆 酸乙酸 (O) 和谷 S 酸 (G) 的同位 素标记 化合物 的稳态 分布及 
葡萄 糖和谷 g 酸中的 相对碟 富集度 



项目 

y 

草 酷 乙酸同 
位素标 记化合 
物分布 



02 = 03 



[3-' 3 C] 丙銅酸 



(l-y) 



O2 



(l-x)x 

"any 



n -n - (1 一工) 工 

0,3-024- 2(1 + ^) 



0,23=0, 



(l-x)^ 
■2(l + x) 



[2-i 3 C] 丙銅酸 



^x(l-.v) 



02=0,= 



Oi3 = OM = "l-2fi++;:;") 



o, 



_x(l-x) 
'― (1 + x) 



D -n - (1一~^)2 



[1-' 3 C] 丙銅酸 



Oi = 04 = 

= l-x 



(l-y) 



葡萄 糖富集 
模式 



C-1 



C-2 



1 



(1 + x) 
1 



2(l + x) 



C-1: 



C-2 



C-3: 



(1 + x) 



1 + X - + + x^3r 



C-1 = 



C-2 = 



谷第 酸同位 
素标记 化合物 
分布 



K24- 2(l + x) 



K3 



X 

T 



K\M — 



x(l-x) 
2il + x) 

l-x 
2 

(1- :r)2 
2(l + x) 



K35 = : 



K25 = 



(l-v) 



• ( 1 - J + .y + ) 
2(l + x) 



K,5 = 



1 + x 

1- J 

2(l + x) 



2 — 工 — 



(l + v) 



谷氣 酸富集 
模式 



C-l = 

c-2=r 

C-3= j- 

C-4 = l 
C-5 = 



1 - J + J V + j^y 
2(l + x) 



C-1 

C-3 = -j- 

C-4 = 
C-5 = l 



1 + x - 2a-- 



2(1 十工) 



C-1 



_.r(l+v) 



C-2 = 

C-3 = 

C-4 = 
C-5 = 



注: 通过图 9.8 所示的 主要途 径利用 100% [3-i 3 C] 丙 S 酸、 100% [2-'^C] 丙 S 酸及 100% [l-'^C] 丙銅酸 
标记。 

正如 第一行 所示, 3« 只 能作为 I 的 函数而 求得。 G 和 K 可交换 使用, 因为这 二者的 标记模 式是相 同的。 用这 些底物 
经糖异 生途径 生成的 葡萄糖 具有下 列富集 模式: C-4 = C-3; C-5 = C-2; C-6=C-1。 

220 




(a) (b) 

图 9.9 中间 代谢物 经多轮 TCA 循环的 连续标 记示意 
通过用 (a) 100% 富集的 [2-i 3 C] 丙 S 酸, (b) 100% 富集的 [1-' 3 C] 丙 酮酸进 行标记 

现对在 推导表 9.1 中的 表达式 时所运 用的假 设作一 总结, 并作为 本节的 结束。 

• 由 于无效 循环, 如: 丙酮酸 ""KDAA^^PEP— 丙 酮酸, 以及苹 果酸— 丙酮酸 — OAA— 
苹果 酸等的 运行, 不存 在标记 循环。 

• 不 存在代 谢物区 室化, 但存在 TCA 循环 和其它 途径共 用的均 一库。 
• 除葡萄 糖生成 之外, 没 有到生 物合成 的净的 通量。 

• PPP 的运行 不会造 成标记 争夺, PPP 会 使经糖 异生途 径合成 的葡萄 糖的标 记重新 

分布。 

• 可以达 到代谢 稳态及 同位素 稳态。 

• 输入 底物是 同位素 纯的。 它 们在指 定的碳 位上是 100% 富 集的, 在未指 定的碳 位上则 

没有 富集。 

• 由于存 在未标 记的内 源库, 同位素 稀释可 忽略。 

9.2.2 来 自标记 乙酸的 TCA 循 环同位 素标记 代谢物 的分布 

图 9.10 总 结了关 于乙酸 利用的 3 种可能 模型。 模型 I 表示经 由乙酸 酸支路 (GS) 的乙 
酸 利用, 这 条途径 在许多 细菌中 存在。 由 于该途 径补充 因生物 合成而 流出的 TCA 循 环中间 
物, 所以, 它的运 行对以 乙酸作 为单一 碳源的 细菌来 说是必 需的。 通过 控制异 柠檬酸 分支点 
处的碳 流量, 细菌 对碳的 利用保 持严格 平衡, 以 满足产 能和生 物合成 要求。 当 异柠檬 酸相继 
被 异柠檬 酸脱氢 酶以及 TCA 循 环的一 些酶催 化时, 将产 生用于 产能的 NADH。 另一 方面, 
在 异柠檬 酸裂合 酶的作 用下, 异 柠檬酸 可转化 为琥珀 酸和乙 醛酸, 而乙酸 酸与乙 酰辅酷 A 
缩合 形成苹 果酸。 这样, 经过 GS 途径, 2 分子乙 酸形成 1 分 子草酰 乙酸。 

已经 证实, 哺乳 动物只 通过转 化为乙 酰辅薛 A 来利用 乙酸, 乙 酰辅薛 A 随后在 TCA 循 
环中 进行分 解代谢 (见图 9. 10 模型 11)。 然而, 由于一 些中间 代谢物 要流出 TCA 循环, 提 
供生 物合成 前体, 诸如谷 氨酸、 谷 氨酰胺 C 因此, 为 了保持 一平衡 的稳态 流量, 必须 存在独 
立的回 补源, 以供 草酰乙 酸生物 合成。 将考虑 有关乙 酸利用 的两种 情况, 第一 个情况 如模型 

221 





模型 I 模型 u 模型 m 



图 9.10 关 于乙酸 利用所 建议的 3 种模型 

在模型 I 中, 乙酸 是通过 TCA 循环和 乙酵酸 支路这 两条途 径被利 用的。 在模型 n 中, 

乙酸 仅通过 转化为 乙醜辅 HA 而被 利用。 乙醜辅 SIA 经过 TCA 循环。 草敏 乙酸是 从其它 

内 源性代 谢物补 充的。 在模型 m 中, 乙酸转 化为乙 酰辅酶 A, 而且也 可通过 乙醜乙 酸- 
乳酸- 丙兩酸 途径成 为草酸 乙酸生 物合成 的来源 C 模型 in 途径 尚未完 全证实 

n 所述, 就 是普遍 接受的 途径, 乙 酸在乙 酰辅酶 A 合成 酶作用 下仅经 乙酰辅 醉 A 转 化而被 

利用。 在 这种情 况下, 存在另 一代谢 物源供 草酰乙 酸生成 之用。 第二种 情况就 是模型 m 中的 
草 醜乙酸 补充, 是一 条假设 途径, 在 这条途 径中, 草酰乙 酸直接 从乙酸 生成。 这可通 过两个 

乙 酰辅酶 A 分子 缩合生 成草酰 乙酸来 实现。 草酰乙 酸进而 又脱羧 生成乳 酸或丙 酮酸, 它们 

最后成 为草酰 乙酸的 来源。 从 草酜乙 酸合成 C3 代谢物 (例 如乳 酸或丙 酮酸) 的途径 尚未完 

全 证实。 但由于 有证据 表明, 在绵 羊中存 在从乙 酸合成 3- 经 基丁酸 (Annisonetal, 1963), 
且在 鼠肝脏 中存在 从标记 的乙酸 合成标 记的草 酰乙酸 (Desmaulin et al, 1985), 因此, 这 

条 假设途 径并不 是行不 通的。 包 括模型 m 的目 的 就是检 验任何 标记研 究是否 与该模 型相一 

致。 由于在 这种情 况下, 若输 入的乙 酸是标 记的, 则进人 TCA 循环的 草酰乙 酸也总 是标记 
的。 在 哺乳动 物中没 有发现 GS 途径。 

为了分 析这种 情况, 完 全按照 9.2.1 节 所述相 同的方 法继续 进行, 首先列 出如图 9.11 
和图 9.12 所示的 可能的 同位素 标记化 合物, 这两 图分别 对应于 100%[2-i 3 C] 乙酸和 10096 
[l-i 3 C] 乙酸的 情况。 然 后写出 代谢物 平衡和 同位素 平衡, 并应 用稳态 假设, 求出草 酰乙酸 
同位素 标记化 合物相 对浓度 的解, 进而通 过它们 得到葡 萄糖和 谷氨酸 的富集 模式。 有关 
[2-i 3 C] 乙酸和 [l-i 3 C] 乙酸的 结果分 别总结 列于表 9.2 和表 9.3 中。 关 于乙酸 利用, 还可 
引 入另一 个变量 Z 以表 示异柠 檬酸经 GS 途径被 利用的 概率。 而 (1-Z) 则 表示经 TCA 循 
环 所利用 的异柠 檬酸的 分数。 因此, 经由 GS 途径 的通量 与经由 TCA 循环的 通量之 比可表 
示为 



注意: 表 9.1 〜表 9.3 的 结果对 100% 富集 丙酮酸 和乙酸 有效。 
9.2.3 实验数 据整理 

大多 数代谢 NMR 实 验主要 集中在 特定代 谢物碳 原子的 i 3 C 标记富 集度。 表 9. 1 〜表 9.3 
222 



乙酸 2 



Ac2 




(a) 



乙 酰乙酸 24^ 一 乙酸 2 

丙嗣酸 乙酸 2 I 




图 9.11 对于 100%[2-i 3 C] 乙酸经 过多轮 TCA 循环后 中间代 谢物碳 原子的 连续标 记示意 
图 9. 10 的模型 I ~in 分别 对应于 (a)~(c) 



的结 果不仅 允许这 样的标 记富集 度数据 的正确 解释, 而 且也可 扩大信 息量, 这 些信息 可通过 

分析 NMR 谱的细 微结构 以及标 记代谢 物的分 子量分 布测量 结果而 得到。 

关于 i 3 C 富集度 数据, 不同碳 原子的 富集度 可通过 运用表 9.1 〜表 9.3 中的表 达式, 计 

算 相应同 位素标 记化合 物的相 对浓度 之和来 求得。 例如, 参照 10096 [3-i 3 C] 丙酮 酸的使 

用, a- 酮 戊二酸 每个碳 位上的 相对富 集度可 按在特 定碳位 含有标 记碳的 所有同 位素标 记化合 
, 223 



乙酸 1 -Acl 

乙酸 1 Acl 





(c) 

图 9.12 对于 10096 [l-'^C] 乙酸经 过多轮 TCA 循环后 中间代 谢物碳 原子的 连续标 记示意 
图 9.10 的模型 I 〜[! I 分别 对应于 (a)~(c) 

物种类 之和来 计算, 这 反映在 下列等 式中: 

CA = K 124 + Ki34 + K 1234 
C-2= K24 + K 124 + K234 + K 1234 

C-3=K34+Ki34+K234 + K,234 (9 
C-4 二 K24 + K34 +K,24+K 134 + K234 + K 1234 = 1 

C-5 = 



如表 9.1 〜表 9.3 中 表达式 所示, a- 酮戊二 酸同位 素标记 化合物 的相对 浓度是 代谢通 量或代 
谢通 量比的 函数, 因此, 标记富 集度数 据提供 了有关 体内代 谢通量 大小的 信息。 

表 9.2 通过图 9. 10 所 示的三 条不同 模型途 径引入 100% [2-"C] 乙 酸后, 草酰 乙酸和 
谷 S 酸的 同位 素标记 化合物 的稳态 分布及 葡萄糖 和谷氣 酸中的 相对碳 富集度 



项目 



经模型 I 途 径利用 [2-i 3 C] 乙酸 



经模型 n 途径 利用 [2-' 3 c] 乙酸 



经模型 m 途 径利用 [2-i 3 c] 乙酸 



1 



草 Bit 乙酸同 

位素标 记化合 
物分布 



023= Z 
0,23=02 



0, = 04 = f 



•(l--r) 



2 



_(l-.r)- 



O 

0,3=0: 

0,2, =0 



(l+-r) 

― 2(l + x) 
— (卜工)3 



2(l + :r) 



Ou- O24- 2(l + x) 



0,34=0,24 = ^ 
n - •rU 一丄) 



(1 



x) 

= (l-:r)2 
'"2(l + x) 



葡萄 糖富集 
模式 



c:- 1 = 1 

C-2 = l 
1 



C-3 = 



C-l = 



C'2 



C-3 = 



1 



(1 + x) 
1 一 



+ 

卜 2j~ + 工2 + + j^2y 

2(l + x) 



C-l = 
C-2 = 



1 



(1+x) 
1 



" 2(1 + 1) 



谷氨 酸同位 
素标记 化合物 
分布 



K234 = 



1 一 



Ku = f 

(l--r) 



K24 = 
K34 = 

K 1234 



(1 + x) 

(l-gQ-r 
2 

x(l-x)^ 
2(l + x) 

(l-x)^ 
2 

(卜 a")3 
-2(1 + 丄) 



_ j(2- .y -xy) 
― 2(1 + a) 



(1 + a) 



2 



K 1234 = 



2(l + x) 



谷氨 酸富集 
模式 



C-l = -5- 
C-2= 1 

C-3=l 

C-4 = l 

C-5 = 



C-l = 



l-2x 



2(l + x) 



■•O 十 r—y 



C-2: 



C-3: 



1 + , 
1 一. 



r-4 = l 

r-5=o 



CM: 
C-2: 
C-3 



2(l + x) 



1 



(l + .r) 
1 



I 



C:-4= 1 
C-5 = 



注: 在模型 n、 in 中, T 表示 9.2.1 节所述 的经丙 兩酸竣 化酵进 入草銑 乙酸库 的相对 通量。 此外, 正如 第一行 所示, 

可 作为: r 的 函数而 求得。 本表对 应于图 9. 11 所示的 途径。 



225 



表 9.3 通过图 9. 10 所 示的三 条不同 模型途 径引入 100% [l-i 3 C] 乙 酸后, 草酸 乙酸和 
谷氨酸 的同位 素标记 化合物 的稳态 分布及 葡萄糖 和谷氨 酸中的 相对碳 富集度 



项目 


经模型 I 途 径利用 [1-' 3 C] 乙酸 


经模型 n 途径 利用 [i-i 3 c] 乙酸 


经模型 IE 途 径利用 [1-"C] 乙酸 


y 




l-x 








3'- 2 + J- - 2 


草 BSt 乙酸同 
位素标 记化合 

物分布 








1 _ 




上"" X 下^ 1 i 

II, I, I II 

o c d d 


葡萄 糖富集 
tni ^H) va m 

模式 


C-1=0 
C-2 = 


o o — 

II II II 
u 


II II II 

, ^ 

H 才 










谷氨 酸同位 
素标记 化合物 
分布 


K, -々 


A '5 2 . 

l + a-xy 
/\5 2 


X ^ —丄 丄〜 丄二 


谷氨 酸富集 
模式 


C-2 = 

C-3 = 

C-4 = 
C-5=l 


II II II II II 


― rsi (^寸 ir> 



注: 本表对 应于图 9.12 所示的 途径。 



根据表 9.1 〜表 9.3 中 的同位 素标记 化合物 分布, 可进 一步分 析特定 碳位上 NMP 峰的 
细微 结构。 由于 同位素 标记化 合物的 相对数 量取决 于相对 代谢通 量分布 (正 如表 9.1 〜表 
9.3 中 等式的 参数: r 和 3; 表示的 )。 因此, 很 显然, NMR 谱的 细微结 构包含 有关代 谢通量 
总 体分布 的有用 信息。 有关同 位素标 记化合 物相对 数量的 同样表 达式, 可进一 步用来 确定不 
同 标记代 谢物的 分子量 分布。 例如, 由于 所有的 谷氨酸 同位素 标记化 合物可 望带有 至少一 
个 i 3 C 碳 原子, 因此, 从表 9.1 可以 看出, 具 有正常 分子量 M 的谷氨 酸分子 (相当 于所有 
碳原子 都没有 i 3 C) 的相 对数量 为零。 同 样地, 分 子量为 (M + 1) 的同 位素标 记化合 物的相 
226 



对数 量也等 于零。 然而, 分 子量为 (M+2) 的谷氨 酸的相 对数量 将等于 K24 与 K34 之和。 
分 子量为 (iV/ + 3) 的谷氨 酸的相 对数量 将等于 Ki24、 Ki34 及 K234 之和。 最后, 分 子量为 
(M+4) 的谷氨 酸的相 对数量 将等于 K: 1234。 这样的 分子量 分布可 通过气 相色谱 -质谱 联用来 

, 获得, 并可提 供有关 同位素 标记化 合物的 来源及 相应代 谢通量 的更多 信息。 

应 该注意 的是, 计 算中加 人了大 量的冗 余度。 例如, 在表 9.1 〜表 9.3 所考虑 的情况 
中, 同位 素标记 代谢物 分布、 分 子量分 布以及 NMR 谱的细 微结构 等取决 于两个 参数. r 和 

Z, 这些测量结果中的任何两个可用来确定未知参数.^" 和2, 而 其余的 数据则 可用来 检验所 

得出的 .r 和 Z 值的一 致性。 实 际上, 一个 较好的 方法可 能是, 将全部 测量结 果用于 对两个 
未知 参数: r 和 Z 的值的 拟合, 然后 用残差 均方值 作为该 拟合一 致性的 量度。 残差均 方值小 
则表 示拟合 良好, 值大 则意味 着测量 结果或 假设的 生化途 径存在 误差。 倘若 证明为 不一致 
时, 则可尝 试每次 排除一 个不同 的实验 结果, 然 后检验 用其余 测量结 果所得 的拟合 的一致 
性。 如果一 致性在 排除一 个实验 结果后 有明显 提高, 则可 推测该 被排除 的实验 结果含 有过失 
误差, 建议 在拟合 时不予 考虑。 如 果没有 任何一 个实验 结果被 证明含 有过失 误差, 则 改变相 
应方程 推导中 所包含 的生化 途径, 重 复上述 过程, 直到获 得满意 的拟合 为止。 第四章 中关于 
数据一 致性分 析的步 骤可有 力地用 于光谱 学数据 和代谢 数据的 协调, 以 及准确 的通量 确定。 
最后, 应注意 的是, 该 方法依 赖于所 分泌代 谢物或 细胞裂 解液中 胞内代 谢物的 测量。 不需要 
原位 NMR 测 量和为 此目的 所需的 安排。 

显然, 根据所 提出的 分析, 可 从常规 NMR 数 据提取 大量的 信息。 表 9.1 〜表 9.3 中表 
达 式的可 利用性 使分析 这样的 测量结 果更为 方便。 然而, 对于 所分析 的生化 途径的 任一结 
构, 一般 并不期 望获得 同位素 标记化 合物分 布的解 析解。 很可能 的是, 某些网 络结构 将不服 
从于 所报道 的严格 解析解 类型。 在 这种情 况下, 同位素 标记化 合物分 布只能 求得数 值解。 有 
助 于标记 转移的 分析以 及同位 素标记 化合物 分布计 算的合 适的计 算机程 序在使 从实验 获得的 
信息最 大化, 以 及提供 最优的 实验设 计等方 面将是 非常有 价值的 (见 Schmidt et al, 
1997a) o 这种软 件也将 有助于 一组代 谢的、 光谱学 的及其 它的数 据与代 谢途径 结构拟 合最好 
的试 差研究 (Schmidt et al, 1997b)。 



【例 9.3】 哺乳 动物中 的丙酮 酸利用 

前面 建模概 念的有 效性, 可 通过比 较模型 预测值 与实验 数据来 检验。 Chance 等人 
(1983) 用 90% 富集的 [3-i 3 C] 丙酮酸 注人鼠 的心脏 组织, 得到的 i 3 C-NMR 谱 表明: 在谷 
氨酸的 C-2, C-3 及 C-4 上有共 振和谱 线分裂 (见图 9.13)。 谷氨酸 C-2 共 振分成 9 条谱线 
[中 心在 55.5ppm (10_6) 处], C-4 共 振分成 3 条谱线 [中 心在 34.2ppm (10 — 6) 处], 而 
C-3 共 振分成 5 条谱线 [集 中在 27.8ppm (10_ 6 ) 处]。 谱线 分裂是 由碳原 子中的 i 3 C-i 3 C 自 
旋 耦合引 起的。 

在采用 90% 富集 [3-i 3 C] 丙酮酸 作为底 物的情 况下, 则需 推导出 可能的 同位素 标记化 
合 物的新 分布图 以及类 似于表 9.1 〜表 9. 3 中关 于同位 素标记 化合物 相对浓 度的表 达式。 应 
强调 的是, 它们与 100% 富集度 时的情 况是不 同的。 如果 不把正 确的丙 酮酸标 记考虑 进去, 
则将 会导致 严重的 错误。 

可 分别在 C-3 和 C-2 标 记丙酮 酸和乙 酖辅醇 A, 或者不 标记。 如 果碳酸 氢盐是 未标记 
的, 则由标 记丙酮 酸经回 补反应 生成的 草酰乙 酸将在 C-3 被 标记; 如果 碳酸氢 盐是标 记的, 
则 草酰乙 酸将在 C-3 和 C- 4 被 标记。 然而, 如果碳 酸氛盐 是未标 记的, 则在草 醜乙酸 库中出 

227 



现的 将是从 未标记 的丙酮 酸生成 的未标 记草醜 乙酸; 如果 碳酸氢 盐是标 记的, 则出现 的将是 

同位 素标记 化合物 04, 草酰 乙酸的 7 个 同位素 标记化 合物: 0、 03、 034、 04、 02、 O12 及 
0, [最后 3 个是 由于碳 (2、 3) 和碳 (1、 4) 之间 的平衡 而产生 的], 可以在 TCA 循环中 
与 标记的 (在 C-2) 和未标 记的乙 酰辅酶 A 缩合 形成柠 檬酸。 在稳 态下, 草酰 乙酸库 中存在 
12 种草 酰乙酸 同位素 标记化 合物: O" 02、 03、 034、 Oi2、 023、 Oi3、 024、 O123 和 Q234; 相应 
地, 谷 氨酸库 中存在 16 种 同位素 标记化 合物: G、 G4、 Gi4、 Gi、 Gi24、 Gi2、 G34. G3. G24. 

62、 G234、 G23、 Gi34、 G13 、 G1234 以及 Gi23。 

图 9.13 中, NMR 谱出 现多重 谱线形 式是与 关于不 同同位 素标记 化合物 种类的 预测相 
符 合的。 C-2 处的 9 个谱 线分裂 是下列 之和: 由 G24 和 G2 产生 的一个 单谱线 (两 条不 同的单 
谱线叠 加)、 由 Gi24 和 Gi2 引 起的双 重谱线 (耦合 常数为 Jl2)、 由 G234 和 G23 引 起的双 重谱线 



同位 素标记 
化合物 


C-2 


C-3 


C-4 


02(0.022) 








024(0.201) 












G3(0.020) 








034(0.177) 




1 1 


1 1 


G,2(0.005) 








G,24(0049) 






1 


64(0.039) 






1 


Gi(O.OOl) 








G(0006) 








G"(0012) 








Gr,( 0.008) 








G|34(0.073) 




1 1 


1 1 


G,3(0.027) 








G234(0.24 7) 


1 




1 1 


1 






G|23(0.011) 




I 1 




G,,34(0.102) 




1 1 1 






1 


1 


J 




/vA» J 


1 


56 55 


28 27 


34 



图 9.13 采用 90% [3-'^C] 丙酮酸 时观察 到的谷 氨酸的 多重谱 线形式 [改自 Chanceetal (1983)] 
X 的值 估计为 0.35。 括弧 中的数 字为相 应同位 素标记 化合物 的相对 浓度。 
多重 谱线中 每条线 的强度 应是已 被谱线 数规范 化的相 对浓度 



228 



K14 
— X— Kl 
-^K124 
-•— K12 
— I— K34 

K3 

K24 

-♦— K2 

K234 
-B-K23 
-X— KI34 
-»-K13 
-•— K1234 
— +— K123 



(耦合 常数为 厶3) 以及由 Gi234 和 Gi23 引起 的四重 谱线。 出现两 个不同 的双重 谱线是 由于耦 

合常数 Ji2(53.5Hz) 和_/23 (34.6Hz) 不同。 因 为这种 不同, 由 G1234 和 引起的 C-2 处 

的 谱线分 裂是四 重线, 而由 Gi234 和 G234 引起的 C-3 处的 谱线分 裂是三 重线。 由于 ^23 和 《/34 
1 的值 类似, 该三重 线的强 度比为 1:2:1。 由 于相同 的原因 (J23 = J34), 同位 素标记 化合物 

Gi23. G23. G134 及 G34 在 C-3 处提 供了相 同的双 重线。 这样, C-3 处的 5 个谱 线分裂 就是下 

列 之和: 由 G3 和 Gi3 引 起的单 谱线, 由 Gm、 G23、 Gi34 和 G34 引起 的双重 谱线, 以及由 
Gi234 和 G234 引起 的三重 谱线。 同 样地, 谱 线分裂 应是: C-4 处 3 条 谱线, C-1 处 3 条 谱线, 
C-5 处 没有。 这样, 所有谷 氨酸共 振处的 NMR 谱 细微结 构与对 不同谷 氨酸同 位素标 记化合 
物种类 的预测 是相一 致的。 




0.2 04 0.6 0.8 1 

图 9.14 在 90%[3-' 3 C] 丙酮 酸情况 下作为 •r 的 函数的 a- 酮戊二 酸同位 素标记 化合物 的分布 
存在 16 种 同位素 标记化 合物。 假设 除了图 9.8 中描 述的反 应外, 没 有产生 C02 
的反应 ,则》 作为. r 的 函数惟 一求得 

每条 线的强 度与同 位素标 记化合 物浓度 之和成 比例, 这 些浓度 贡献于 相应谱 线分裂 (双 
重 谱线、 三 重谱线 或四重 谱线) 且被谱 线数归 一化。 例如, 在由 Gi24 和 Gi2 引起的 C-2 处的 

229 



双重谱 线中, 每 条线的 强度与 ([Gi24] + [Gi2])/2 成 正比, 此处 [G,] 为 G, 的 浓度。 通过 
运用 模型, 从. r 的值 (从 TCA 循 环中出 去的草 酰乙酸 分数) 和 3; 的值 (固 定到 i 3 C 标记丙 
酮酸上 的碳酸 氛盐分 数), 决定 NMR 谱线 强度的 谷氨酸 同位素 标记化 合物的 相对分 布可被 
惟一 计算。 假设 除了图 9.8 中所 描述的 那些反 应外, 不存 在产生 C02 的 反应, 3; 值可由 0: 
值惟一 确定。 图 9.14 中 显示了 16 种谷氨 酸同位 素标记 化合物 在不同 :r 值时 的相对 浓度预 
测值。 

由于图 9.13 中 NMR 谱线 的强度 可由谷 氨酸同 位素标 记化合 物的相 对浓度 (其 本身也 
是分数 X 的 函数) 来惟一 预测, 因此, 可从 NMR 谱 的细微 结构获 取通量 信息。 谷氨酸 C- 
2、 C-3 或 C-4 碳原子 上三个 共振中 的任何 一个都 可用来 确定、 r, 而其 它两个 可用来 确证所 
得的: r 估 计值。 表 9.4 给出了 根据图 9.13 的 NMR 谱 估计出 的线强 度比。 采 用一次 仅一个 
碳 原子共 振的方 法时所 得到的 .r 值 与全部 三个共 振时用 于计算 所得到 的最小 二乘估 计值近 
似 相等, 而 且等于 0.35。 相应的 3^ 值为 0.26。 表 9.4 给 出了对 这些: r、 3^ 值 计算所 得的线 
强 度比。 

与实验 数据令 人满意 的一致 性支持 了模型 化方法 论的有 效性。 C-2 上的实 验数据 与理论 
预 测之间 的差异 可用线 强度比 估计中 的不确 定性来 解释。 线强 度比是 根据图 9.13 发表的 
NMR 谱来估 计的。 应 该注意 的是, :r=0.35 时, 算得 的线强 度比是 在实验 误差范 围内。 在 
注有 [3-i 3 C] 丙氨 酸的鼠 离体肝 脏中, 也 得到了 类似于 谷氨酸 和谷氨 酰胺中 的多重 谱线模 
式 (Hall et al, 1988)。 



表 9.4 根据图 9.13 中 NMR 谱的线 强度确 定分数 jc 



C-2 




NMR 谱 
j=0.35 


S/D 12 


S/D2, 


S/Q 


4.20±0.3 
4.13 


0.73±0.1 
0.81 


1.95±0.3 
1.97 


r-3 




NMR 谱 
X =0.35 


T/D 


1.3±0.1 
1.3 


C-4 




NMR 谱 
J- =0.35 


S/D 


0.5±0.2 
0.5 



注: ■r 的 最好估 计值是 0.35。 斜体 的值表 示对丄 的估计 值计算 的线强 度比。 S, D, T 分 别为单 谱线、 双重 谱线、 
三 重谱线 (全 部三 条线) 的 强度, D,, 为 稱合常 数为丄 j 的双 重谱线 强度。 



【例 9.4】 大 肠杆菌 (Escherichia coli) 中的乙 酸利用 

Walsh 和 Koshland (1984) 从以 [2-i3C] 乙酸 盐为惟 一碳源 生长的 £. Co// 得 到了纯 
化的 谷氣酸 i 3 -CNMR 谱 (见图 9.15), 它显 示了在 C-1 有 一双重 谱线, 在 C-2 有 6 条 谱线, 
在 C-3 有一个 三重谱 线以及 C- 4 有 一双重 谱线。 该模式 与乙酸 酸支路 (模型 I) 的运 行是一 
致的, 并严格 符合表 9.2 的 预测。 

在 这种情 况下, 只有一 个变量 z, 其基 本上决 定每个 峰的以 及每个 峰内每 条谱线 的相对 
230 




插图 A 






C-5 

y> — o 


C-1 

■V-— A'— ^ s.,^ 


155 


150 



C-2 



C-4 



C-3 



60 



55 



50 45 
6/ppm 



40 



35 



30 



图 9. 15 采用 [2-l 3 C] 乙 酸为碳 源时观 测到的 谷氨酸 多重谱 线模式 
[改自 Walsh 和 Koshhand (1984)] 
C-2 处 的峰有 6 条 谱线, 包括由 G234 引起的 一双重 谱线, 每 条线的 强度为 0.15; 
以及由 Gi234 引起的 一四重 谱线, 每 条线的 强度为 0.05, 因此, Q/D = 2/3c lppm=10_ 6 

强度。 Z 被定 义为经 乙酵酸 支路所 利用异 柠檬酸 的概率 (或 者, 乙酸酸 支路中 异柠檬 酸的利 
用 分数, TCA 循环 中的转 化平衡 )。 根据 Walsh 和 Koshland (1984) 的 研究, 胞内 谷氨酸 5 
个碳原 子上的 相对富 集度从 C-1 至 C-5 分别为 0.4: 1.0:0. 9: 1.0:0。 模 型预测 C-2 二 C-3 = C- 
4=1, 而 C-5 = 0, 完 全与实 验结果 一致, 而 C-l = (l- z)/2。 将 C-1 的 实验值 0.4 代入该 
式, 可求得 Z 等于 0.2。 这与 Walsh 和 Koshland (1984) 应用基 于中间 代谢物 碳输入 -输出 
平衡的 复杂方 法所估 计的值 相同。 

由于 考虑了 中间代 谢物的 所有同 位素标 记化合 物而不 仅仅是 在特定 代谢物 碳位的 同位素 
富 集度, 因此, 模型结 果也可 准确地 解释所 获得的 NMR 谱 的细微 结构。 即 使标记 示意图 
(见图 9. 11) 显示 有多达 6 种 a- 酮戊二 酸同位 素标记 化合物 存在, 表 9.2 的结果 表明, 在稳 

态下, 只 有两种 a- 酮戊二 酸应当 存在: 相对 浓度为 (l_Z)/2 的 Ki234 (或 Gi234) 和 相对浓 
度为 (l + Z)/2 的 K234 (或 G234)。 可用 类似于 9.2.1 节中 [3-i 3 C] 丙 酮酸情 况的方 式来分 
析多 重谱线 模式。 特别有 趣的是 C-2 处的 模式。 这时, Gi234 应在 C-2 处产生 每条线 强度为 
(1- z)/8 = 0.1 的四重 谱线, 而 G234 应在 C-2 处产生 每条线 强度为 (l + z)/4 = 0.3 的双重 
谱线。 C-2 共 振的各 个峰缺 少强度 数据, 因此, 这些 预测值 不能直 接与图 9.15 的结 果进行 
比较。 然而, 比较各 个峰的 高度, 可以 看出, 实验 值与预 测值一 般是一 致的。 同样也 可分析 
C-3、 C-4 共振的 强度, 虽 然它们 没有包 含有关 通量比 Z 值的 任何 信息, 但非 常符合 前面的 
模式。 

证实细 菌中的 乙酵酸 支路运 行的另 一个实 验是用 99% [l-i 3 C] 乙酸进 行的。 在 这种情 
况下, 也 可根据 2 来求得 谷氨酸 的同位 素标记 化合物 种类。 应 只有两 种出现 (见表 9.3): 
相 对浓度 分别为 (1 + 2)/2 和 (l-z)/2 的 G5 和 Gi5。 因此, 谷氨酸 的富集 度应是 C-1 为 (1- 
z)/2、C-5 为 1,C-2,C-3,C- 4 没有。 这恰 恰是在 £ .to// 中 的脯氨 酸合成 (Crawford et al, 
1987) V 丄航 Brevibacterium fla 丽 1 中 的谷氣 酸合成 (Walker 和 London, 1987) 中观测 

231 



到的。 由于 Crawford 等 (1987) 所 采用的 系统与 Walsh 和 Koshland (1985) 所采用 的系统 
类似, 因此, 可 以假设 2 值都为 0.2, 从 而得出 谷氨酸 C-1 富集 度的估 计值为 0.40。 根据 
Crawford 等人 (1987) 报道的 波谱, 可 以估计 C-1 谷 氨酸富 集度为 30% , 与 模型预 测还是 | 

相当一 致的。 1 



【例 9.5】 细 菌中的 乙酸酸 支路与 TCA 循环 

Z 的值 表示经 乙醛酸 支路转 化的异 柠檬酸 分数, 可通过 三个涉 及运用 GC-MS 和 
i 3 C NMR 的独立 方法来 确定。 第一, 正如 Walsh 和 Koshlad (1984) 所 做的, 可以 使用谷 
氨酸 C-1 处的 相对富 集度。 该方 法要求 对已知 标准进 行额外 测量, 以便 建立将 绝对峰 强度转 
换 为相对 富集度 所要求 的校正 标准。 第二, 在 C-2 峰内, 四 重谱线 (Q) 与双 重谱线 (D) 
的比 可用来 根据表 9.3 确定 Z 值。 



图 9.15 已 给出, 比值 (Q/D) 为 2/3, 由 此用式 (1) 得出 Z 等于 0,2, 该结 果与按 方法一 
得到 的结果 相同。 第三, GC-MS 可用来 测量具 有不同 分子量 (相差 一个原 子质量 单位) 的 
同一代 谢物的 分数。 在 Walsh 和 Koshland (1984) 的例 子中, GC-MS 应对谷 氨酸产 生两个 
峰, 一个 对应于 分子量 (M + 3), 而 另一个 对应于 (M + 4), 此处 M 表示 所有碳 原子都 

为 1 2 C 的谷氨 酸的分 子量。 谷氨 酸同位 素标记 化合物 G234 的分 子量为 (M+3)、 Gi234 的分子 

量为 (M + 4), 因此 (M + 3) 与 (M + 4) 之比为 

M + 3 = l + z . . 

M + 4~l-z "J 

类 似地, 在采用 [l-i 3 C] 乙 酸盐情 况下, Z 的值可 通过两 种不同 的方法 求得: 根据 i 3 C 
NMR 测量的 每个碳 原子的 相对富 集度, 以 及根据 GC-MS 测量的 (M + 2) 与 (M + 1) 之比。 



9.3 碳平衡 

在大 代谢网 络中, 详尽列 出所有 的同位 素标记 代谢物 是很困 难的。 当缺少 有关同 位素标 

记化合 物的分 子量或 NMR 细微结 构的信 息时, 这简直 是不必 要的。 通常, 仅 仅总的 同位素 
富集度 (或 强度) 连同 同位素 标记实 验一起 测量, 而且在 不增加 全部同 位素标 记化合 物列举 
和平 衡的复 杂性情 况下, 也可分 析这些 数据。 在这一 节里, 将阐 述直接 使用代 谢物碳 平衡和 
原 子作图 矩阵来 分析同 位素强 度数据 的两个 方法。 
9.3.1 直接 碳平衡 

由于该 方法包 括总代 谢物平 衡以及 网络代 谢物的 每个碳 原子的 平衡, 因此, 它是 相当直 
接明 了的。 这样 对每个 碳原子 的命运 都作了 解释, 而且也 可确定 某个代 谢物的 特定碳 原子的 
富 集度。 我们将 通过在 戊糖憐 酸途径 (PPP) 上的应 用来说 明这个 方法。 

图 9. 16 所示为 描述戊 糖磔酸 途径的 示意。 正 如第二 章中提 到的, PPP 有一条 氧化支 
路, 其 起始于 Glc6P (6- 磯酸葡 萄糖) 的 脱氛, 首 先形成 6- 憐 酸葡萄 糖酸, 然 后经过 两个以 
上的 反应, 形成 5- 磯酸 核糖, 用于 RNA 和 DNA 核 苷酸糖 的生物 合成。 

- Glc6P - 2NADP + - H2O + ribose-5-phosphate + 2NADPH + +CO2-O 

(5- 憐酸 核糖) 

232 



葡萄糖 



"0 



6- 5 維葡 
萄 糖 



CHO 



-OH 





CO: 




2NADPH 







CH20H 

=0 



OH 5- 碑酸 核酮糖 




-碑 酸景天 
庚酮糖 



图 9.16 具 有独立 碳原子 图例的 戊糖磷 酸途径 

由于大 多数细 胞需求 NADPH 比 5- 磷酸核 糖多, 因此, 过量的 核糖可 通过转 酮酶和 转酸酸 
作 用下的 酮糖单 位和醛 糖单位 转移而 又转化 回来成 为糖酵 解中间 产物。 PPP 的非氧 化支路 
的净总 和为: 

- 3 ( ribose-S-phosphate ) + 2 ( f ructose-6-phosphate ) + glyceraldehyde-3-phosphate = 

(6- 碟酸 果糖) (3- 磯酸甘 油薛) 

PPP 反 应的化 学计量 在也总 结在表 10.1 中。 通过中 心碳代 谢的通 量分析 要求准 确计算 

PPP 中碳被 氧化的 数量, 以 及所产 生的用 于细胞 生物合 成的还 原力。 正如 10.1 节中 证实的 

一样, 总物 质平衡 可以给 出通过 该途径 的净通 量估计 值以及 PPP 与糖 酵解途 径之间 的通量 
分布。 然而, 获得 对通量 分配比 (通 过物 质平衡 确定) 以及 PPP 关 键反应 (即 转酮 酶反应 
和 转酸醇 反应) 的可逆 性程度 的估计 的独立 确认是 非常需 要的。 如下 所示, 这 可以通 过标记 
葡 萄糖的 引入以 及所选 PPP 中间 代谢物 的同位 素强度 测量来 实现。 

首先, 从图 9.16 中代 谢物库 的平衡 开始。 应注意 的是, 6- 磔酸葡 萄糖与 6- 磷酸 果糖之 
间的异 构藤反 应以及 戊糖憐 酸库之 间的异 构薛和 差向异 构酷反 应是很 快的, 并 假设处 于平衡 

233 



态, 因此, 将 网络中 的己糖 (H6P) 和戊糖 (R5P) 设想为 一个单 一库: 

dcH6P_ 丄 , 

= Vq- VI - V2 + V5 + ve 

dcRsp 



dt 

dcG3P 



= 2V2 - V2+ V4 - V5 + V(y 



dt 

dcE4P 



cks7P 



(9.31a) 
(9.31b) 
(9.31c) 
(9.31d) 
(9.31e) 



dt "4 -" 5 

在稳 态下, 若假 设用于 核苷酸 合成的 戊糖憐 酸库的 消耗可 以忽略 不计, 则上述 等式可 简化为 
下列关 系式: 

VI = 3xvo (9.32a) 
v2=(l-sc)vo (9.32b) 
z;3=(2-x)z;o (9.32c) 
V4 = vs = V()~ xvq (9.32d) 
上述等 式中的 •r 值 表示进 入戊糖 磯酸途 径的己 糖通量 分数。 代 谢物平 衡仅指 通过该 
途 径的总 通量, 还 没考虑 可逆性 的任何 度量。 可以 看出, 通过 非氧化 反应途 径的净 通量是 
相 等的, 并且当 :r 等于 1 时, 所有 输入的 己糖都 流经戊 糖憐酸 途径。 这样, 根据式 
(9.32c), V3=vo, 而且 每消耗 Imol 己糖, 就产生 Imol 的丙 酮酸。 结果, 己 糖的一 半释放 

为 C02。 

当然, 前面的 模型也 可通过 引人标 记葡萄 糖作为 底物, 并测 量一个 或几个 戊糖磯 酸途径 
中间 代谢物 的标记 分布来 检验。 为了 有助于 解释这 种标记 数据, 必须写 出代谢 物碳平 衡式以 

描 述网络 中所考 虑的每 个碳原 子的总 平衡。 这些平 衡在表 9.5 中 给出, 对 应于图 9.17 中关 
于 戊糖瞵 酸途径 (PPP) 非氧化 反应的 碳转移 图式。 进 一步注 意到, 对 于每个 PPP 非氧化 
反应, 假设是 完全可 逆的, 因此, 每个净 反应是 正反应 ) 和 逆反应 (v「) 的 复合。 按 
惯例, 正反应 和逆反 应都用 正号来 表示。 净反应 的符号 (由 正、 逆反 应的相 对大小 决定) 表 
示 净通量 是正反 应方向 (正号 ), 还 是逆反 应方向 (负号 )。 由于 与糖酵 解中间 产物进 行的碳 
原子 交换, 反应可 逆性可 导致标 记进一 步重新 分布, 而且 必须为 全面说 明同位 素标记 模式而 
考虑。 对 戊糖憐 酸途径 三个非 氧化性 反应可 逆性的 考虑需 要三个 额外的 未知量 来描述 这种可 
逆性 程度, 或交 换速率 t,。 对于一 个正的 净反应 速率, &就定 义为正 反应速 率与净 通量之 
差: 〈,二1> 卜 v, = v" 由于交 换速率 直接影 响中间 代谢物 的标记 模式, 因此 它们是 很重要 
的。 此外, 当产 生从总 代谢物 平衡决 定的相 同净通 量时, 它们可 以发生 很显著 变化。 对前面 
3 个 反应引 入交换 速率, 使得表 9.5 的 方程中 的所有 反应速 率可表 示为净 PPP 通量 (等于 
xvq) 和 3 个交换 速率的 函数: 

V4 = (jcvo + ?' 4) (9.33a) 
V4 = ^4 (9.33b) 

234 



v^^ixvo+^s) (9.33c) 

V5 = 5 (9.33d) 

vi = (j:vo+ (9.33e) 

ve = - ^6 (9.33f) 
显然, 净 PPP 通 量和交 换速率 的确定 需要测 量标记 分布。 有很多 识别方 法可用 于这种 
确定。 最简单 的方法 是如图 9.7 所 示的试 差法, 它是以 PPP 通 量和交 换速率 的一些 初始推 
测值 开始, 通过 求解表 9.5 的 线性方 程组, 从而 对一给 定的标 记底物 (己糖 ) 确定 标记分 
布。 通 过与同 位素强 度测量 值进行 比较, 重 新调整 初始推 测值, 并重 复计算 过程, 直 到收敛 
为止。 Mathematica 或 Maple 中的标 准程序 可用来 求解。 采用该 方法时 应记住 两点。 第一, 
这实质 上是对 一个非 线性代 数方程 组进行 求解的 问题。 因此, 它可 能对解 的初值 敏感。 第 
二, 测量 强度的 选择是 最终解 质量的 关键, 或 甚至完 全是得 到解的 关键。 这一 点将进 一步详 
细 说明。 

表 9.5 戊 糖碟酸 途径的 代谢物 碳平衡 



cl[H6P] 



Hexose(l) 
Hexose(2) 
HexoseO) 
Hexose(4) 
Hexose(5) 
Hexose(6) 



rH6P(l)^ 




rS7P(l) 1 


H6P(2) 




S7P(2) 


H6P(3) 




S7P(3) 


H6P(4) 


+ v$ 


G3P(1) 


H6P(5) 




G3P(2) 


-H6P(6) 




G3P(3)' 



H6P(1), 




R5P(1) 


H6P(2) 




R5P(2) 


H6P(3) 




E4P(1) 


H6P(4) 




E4P(2) 


H6P(5) 




E4P(3) 


^H6P(6) 




■E4P(4) 



'H6P(2) 




R5P(1) 




S7P(1) 




S7P(3) 




R5P(1) 




H6P(1)' 


H6P(3) 




R5P(2) 




S7P(2) 




S7P(4) 




R5P(2) 




H6P(2) 


H6P(4) 


- 2V4 


R5P(3) 


+ V4 


G3P(1) 




S7P(5) 




R5P(3) 


+ V6 


G3P(1) 


H6P(5) 




R5P(4) 




G3P(2) 




S7P(6) 




R5P(4) 




G3P(2) 


,H6P(6) 




.R5P(5). 




.G3P(3), 




.S7P(7). 




,R5P(5). 




.G3P(3), 



H6P(3) 




H6P(4) 




R5P(3) 




G3P(1) 




H6P(4) 




R5P(3)' 


H6P(2) 


+ V2 


H6P(5) 




R5P(4) 


N ' 


G3P(2) 


+ V5 


H6P(5) 


+ W 


R5P(4) 


、H6P(1) 




H6P(6), 




,R5P(5). 




.G3P(3). 




H6P(6). 




.R5P(5), 



d[E4P] 
dt 



d[S7P] 
dt 



S7P(4)' 




'E4Pa), 




H6P(3) 


S7P(5) 
S7P(6) 


- (vf + V6 ) 


E4P(2) 
E4P(3) 


+ Vb 


H6P(4) 
H6P(5) 


.S7P(7), 




.E4P(4)j 




、H6P(6)J 


R5P(1)、 




S7P(1)) 




H6P(1) 


R5P(2) 




S7P(2) 




H6P(2) 


R5P(1) 




S7P(3) 




H6P(3) 


R5P(2) 


- (V4 + VS ) 


S7P(4) 


+ Vs 


E4P(1) 


R5P(3) 




S7P(5) 




E4P(2) 


R5P(4) 




S7P(6) 




E4P(3) 


R5P(5)' 




S7P(7). 




、E4P(4) ' 



注: Hexose ― 己糖。 



235 



4 转 移了两 个碳或 三个碳 
^ 单位的 碳原子 

0# 反应代 谢物的 碳原子 



本 节概述 的方法 曾被用 来分析 [2-i 4 C] 葡 萄糖和 胰岛素 (或 没有胰 岛素) 培养 的鼠表 
皮脂肪 组织中 糖原的 "C 标 记分布 (Landau and Katz, 1964)。 表 9.6 给出了 相对于 C-2 的 
糖原 (H6P) 碳 原子的 比活性 以及用 上述模 型和求 解步骤 计算的 结果。 为模型 预测设 置了两 
项: 一项 为假设 3 个 PPP 反应 没有可 逆性, 另一项 为完全 可逆。 可以 看出, 模型预 测值与 
测量 强度之 间的一 致性是 后者比 较好, 后 者也给 出了可 逆反应 的交换 速率估 计值。 表 9.7 总 
结了对 赖氨酸 生产菌 C.g/M^mzci/m 戊 糖磷酸 途径类 似研究 的结果 (Marxetal, 19%)。 
此外, 假 设反应 没有可 逆会对 4- 憐酸 赤藓糖 (E4P)、 磷酸 甘油酸 (G3P) 及 其它产 物的碳 
富 集度预 测值产 生过失 误差。 这可 通过计 人交换 速率来 校正, 并 使标记 富集度 预测值 和测量 
值之间 产生良 好的一 致性。 这 里应当 注意, 仅使用 E4P 富集度 数据并 不足以 允许可 逆反应 
交 换速率 的稳健 确定。 这可通 过引人 5- 碟酸核 糖富集 度数据 来校正 (特 别是 通过从 细胞材 
料中 分离的 鸟昔衍 生物而 测量的 C-1 富集度 ), 5- 磷酸核 糖富集 度数据 可以很 明显地 将一个 
未 确定的 系统转 换为已 确定的 系统。 磯 酸甘油 醒富集 度可用 来代替 R5P, 这 意味着 有好几 
种 富集度 测量的 组合, 它们 产生于 一个可 观测的 系统。 类 似地, 对于表 9.6 的糖原 结果, 如 
果用 G3P (通过 乳酸所 测量) 来代替 糖原, 则 将产生 一个未 确定的 系统。 



转酮酷 ("4) 



5- 磯酸 木酮糖 

转嗣雜 ("5) 



5-5^ 酸核糖 



3- 碑酸 甘油薛 



7- 碑 酸景天 庚酮糖 




4- 碟酸 赤藓糖 



4- 碑酸 赤藓糖 



"6+ 




1 



-碑酸 甘油薛 



6- 碑 酸果糖 




7- 碑 酸景天 庚酮糖 

转酮酷 Ov,) 




5- 碑酸 木酮糖 



•ST 



236 



图 9.17 磯酸戊 糖途径 反应中 的碳转 移示意 



表 9.6 来自 [2-"C] 葡 萄糖的 H6P 的" C 标 记数据 



项 目 


H6P 


C-1 


C-2 


C-3 


C-4 


C-5 


C-6 


试验的 比活性 i 4 C 


Ins' 


15.2 


100 


12.8 


1.9 


13.9 


2.9 




Ins' 


30.7 


100 


17.9 


3.5 


14.8 


5.3 




Ins — 


20.6 


100 


11.5 


0.6 


5.4 


1.1 


模型: 没有 可逆性 


Ins *" 


31.5 


100 


18.7 


1.5 


8.1 


2.5 




Ins' 


18.8 


100 


15.8 


2.1 


13.4 




模型: 可逆 


Ins ' 


30.5 


100 


20.9 




13.1 


4.0 



注: 实验 值与假 设转兩 酶反应 和转薛 Bl 反应 没有 可逆性 和有可 逆性的 模型预 测值进 行比较 (Landau and Katz, 
1964)。 计算 中采用 _1"|„<-=0.13 和 _ri„^,+=0.23。 对于 具有可 逆性的 模型, 在没 有或存 在胰岛 素的情 况下分 别采用 下列参 
数: C4 = 0.5, ? 5 = 0. 2, ? 6 = 和? 4 = 0. 8, ? 5 = 0. 08, ?6 = 0。 

表 9.7 在以 [l-i 3 C] 葡萄 糖为底 物的恒 化器培 养中, Co/7/ie&acfen'w/ng/«m/m'CM/n 中的 4- 磷酸 赤蘇糖 
(Ery4P) 和 3- 磷酸 甘油酸 (G3P) 的 "C 富集 度的测 量值和 估计值 



方 法 


代谢物 


在不同 C 位上 i 3 C 富集度 


CI 


C2 


C3 


C4 


实验 


Ery4P 
G3P 


2.5% 
2.7% 


2.0% 
2.6% 


1.9% 
26.3% 


15.3% 


模型 1 












$4 = ^5=^6 = 


Ery4P 
G3P 


0.0% 
0.0% 


0.0% 
0.0% 


0.0% 
32.4% 


5.2% 


模型 2 












$4 = 0. 5. $5 = 0.1, 
$6 = 0. 2 


Ery4P 
G3P 


3.7% 
1.9% 


0.9% 
0.6% 


0.3% 
31.0% 


15.6% 



注: 实 验值与 假设转 銅酶反 应和转 醒醒反 应没有 可逆性 (模型 1) 和有 可逆性 (模型 2) 的 模型预 测值进 行比较 
[Marx et al, (1996), FoUstad and Stephanopoulos (1998)]。 

9.3.2 原子作 图矩阵 的应用 

对同位 素分布 建模的 另一个 方法可 避免常 规分析 的几个 缺点, 而且 特别适 用于大 代谢网 
络。 在 这个方 法中, 原子作 图矩阵 (AMMs) 被用来 描述碳 原子从 反应物 到产物 的转移 
(Zupke and Stephanopoulos, 1994)。 AMMs 使生 化网络 的细节 从控制 同位素 分布的 稳态方 
程建立 中得到 解耦。 得到 的方程 式易于 推导、 修改及 求解。 AMMs 的 方法特 别适合 于数据 
库 开发、 大 代谢网 络的应 用以及 试差的 情况, 这里每 次迭代 后网络 结构要 修改。 将通 过使用 
图 9.5 中的简 单生化 网络来 介绍该 方法。 

第一 步是以 向量形 式表示 每个代 谢物碳 原子的 比活性 (即 富集度 )。 一个 代谢物 向量的 
第 72 个元素 含有第 72 个 碳的比 活性。 对于图 9.5 中 的反应 网络, 建 立下列 代谢物 向量: 

Pyr(l) 



Pyr = 



Hex = 



Pyr(2) 
iPyrO). 
Hex(l) 
Hex(2) 
Hex(3) 
Hex(4) 
Hex(5) 
Hex(6) 



AcCoA 1 = 



AcCoA u = 



AcCoA 1(1) 
AcCoAi(2) 



AcCoAn(l) 
AcCoAn(2) 



(9.34) 



(9.35) 



237 



采 用向量 符号, 一 个代谢 物的所 有碳原 子可以 清楚而 又简洁 的形式 表示。 
下 一步是 对代谢 网络中 的反应 构建原 子作图 矩阵。 这 些矩阵 描述原 子从反 应物至 产物的 
转移。 对 于每个 反应, 每个反 应物- 产物对 将有一 个作图 矩阵。 例如, 考虑包 括两个 反应物 

A 和 B, 两 个产物 C 和 P, 并由酶 E 催化 的一 个普通 反应: 

A + B^C + D (9.36) 

该反 应将有 4 个作 图矩阵 描述碳 原子从 A 到 C、 A 到 D、 B 到 C 及 B 到 D 的 转移。 用 
带 有下标 为酶名 (或反 应名) 的方 括号来 表示每 个反应 的作图 矩阵, 方 括号内 表示的 是特定 
的反应 物-产 物对, 并 用一个 符号〉 分开 (以表 示方向 )。 这样, 反应样 本中的 4 个作 图矩阵 
如下: 

[A〉C]E 描述碳 原子从 A 到 C 的转移 
[A>D]E 描述碳 原子从 A 到 D 的转移 
[B〉C]E 描述碳 原子从 B 到 C 的转移 
[B>D]E 描述碳 原子从 B 到 D 的转移 

原子 作图矩 阵这样 构建, 使得反 应物的 比活性 向量与 AMM 的乘 积可以 详细说 明反应 
物 对产物 比活性 向量的 贡献。 所得 产物的 比活性 是每个 反应物 的贡献 之和: 

[A>C]eA+[B>C]eB = C (9.37) 
[A>D]eA+[B>D]eB = D (9.38) 

作 图矩阵 的维数 是由反 应物- 产物对 中的碳 原子数 决定。 列数 等于反 应物中 的碳原 子数, 
而行 数等于 产物中 的碳原 子数。 作图 矩阵第 / 行和第 J 列的元 素说明 反应物 第_; 个碳 衍生为 
产物第 Z 个碳的 数量。 通常, 反应 物碳到 产物碳 的作图 是有限 的和惟 一的, 因此, 作 图矩阵 
的元素 通常为 或 1。 但分 数元素 也是可 能的。 

返 回到样 本代谢 网络, 并对该 系统构 建作图 矩阵, 反应 1 是由 丙酮酸 脱氣酶 (PDH) 
催 化的, 丙 酮酸为 惟一反 应物, AcCoAi 和 C〇2 为两个 产物。 在 这个分 析中, 不把 C02 作 
为可 测量的 代谢物 计人, 因此, 只 需要一 个作图 矩阵: [Pyr〉AcCoAi]PDH。 可知, 丙酮酸 
的第 1 个 碳原子 转化为 C02, 而第 2、 3 个碳原 子分别 转化为 AcCoAi 的第 1、 2 碳 原子, 这 
就得 到下面 的作图 矩阵。 

「 , /0 1 0\ , 、 

[Pyr〉AcCoA]PDH= (0 q J (9.39) 

如果 AcCoAi 只从丙 酮酸衍 生出, 则 它的比 活性将 由下式 给定: 

'Pyr(l) 
Pyr(2) 
、Pyr(3)J 
AcCoAi(l) 

AcCoAi(2), 

然而, 在库 I 和库 n 之间 也存在 AcCoA 的 转移, 因此, 式 (9.40) 不能完 全确定 AcCoAi 
的比 活性。 

反应 2 为 AcCoA 从库 I 至库 n 的运 输, 并用 trans I 表示。 而反应 3 为 AcCoA 从库 11 
至库 I 的 运输, 并用 transn 表示。 由于 AcCoA! 和 AcCoAn 中 的碳原 子可直 接相互 作图, 
因此, [AcCoAi 〉AcCoAnLransi 和 [ AcCoA > AcCoA i ] !凯、 1| 都是 2 X 2 单位 矩阵: 
238 



「 n /0 1 

[Pyr>AcCoAi]pDHPyr = L 。 ^ 



Tyr(2) 
.Pyr(3) 



= AcCoA I (9.40) 



[AcCoAl >AcCoAn]transI =[AcCoAu >AcCoAi ],ransn = (二 ?) (9.41) 

终反应 是反应 5, 即己酸 氧化为 AcCoAn, 用) 3ox 表示, 有 一个原 子作图 矩阵。 己酸的 
氧化成 对移去 碳原子 而生成 3 个 AcCoA 分子。 己酸的 奇数碳 原子因 转化为 AcCoAii 难以 
区分, 因此, 它们 在矩阵 [Hex〉AcCoAi ] 〜中的 系数为 1/3, 并且 对偶数 碳原子 也是如 
此。 将奇、 偶数 碳原子 分别对 AcCoAn 的碳 1, 碳 2 作图, 得到: 



[Hex>AcCoAn ]/?ox 



+ + + 
y y y 



(9.42) 



所 有必需 的原子 作图矩 阵构已 经建好 并可用 来建立 稳态同 位素平 衡式。 进 入一个 代谢物 
的标 记通量 仅仅是 作图矩 阵与反 应物比 活性向 量用相 应的反 应通量 加权后 的乘积 之和。 对于 
AcCoAi , 两个有 贡献的 反应是 通量为 1;1 的 PDH 以及 通量为 1^2 的 transn : 

进入 AcCoAi 的 通量: 

"i[Pyr>AcCoAi JpoHPyr + 3 [AcCoAn >AcCoAi ] trans n AcCoAn (9.43) 

流出 AcCoAi 的标记 通量: 

("2+"4)AcCoAi (9.44) 
两式 [式 (9.43) 和式 (9.44)] 相 等得出 AcCoAi 的稳态 同位素 平衡: 

("2+ tM)AcCoAi 二 "!71[?乂1"〉八。0)八1 jFDHPyr + 3 [AcCoAn 〉AcCoAi ] trans n AcCoAn 

(9.45) 

类 似地, AcCoAn 的稳态 同位素 平衡为 ' 
(1;3+ ■y6)AcCoAii ― z;2[AcCoAi >AcCoAu ] trans lAcCoAi + t; 5 [ Hex > AcCoA n ] ^oxHex 

(9.46) 

式 (9.45) 和式 (9.46) 等 价于例 9.2 的式 (3)、 式 (4)、 式 (7) 和式 (8), 它们是 
通过分 别处理 每个原 子而得 出的。 在像 本例这 类小网 络中, 这 两种方 法的复 杂程度 是相同 
的。 然而, 对 于较大 网络, 特别是 那些很 多代谢 物具有 3 个 以上碳 原子的 网络, 构建 原子作 
图 矩阵和 以矩阵 形式列 出稳态 平衡式 将得到 更具代 表性的 简洁方 程组。 此外, 如果有 关碳原 
子 从反应 物到产 物的转 移方式 的新信 息可以 获取, 则只要 改变描 述受影 响反应 的原子 作图矩 
阵 即可。 这是 相当直 接的, 而 且不需 新的代 数学。 

通 过使用 原子作 图矩阵 描述代 谢网络 中同位 素分布 的方程 组可借 助计算 机迭代 求解。 这 
要求 对底物 碳原子 的比活 性设置 初始值 (对于 分数富 集度, 则 设置为 0〜1 之间的 值), 并提 
供 一组一 致的通 量值。 然后, 按序 求解每 个稳态 方程, 得到 输出代 谢物的 活性, 重 复此过 
程, 直到达 到收敛 为止。 本 质上, 这等 价于用 Gauss-Seidel 方 法求解 As = b。 所有矩 阵都是 
小的, 而且不 需矩阵 变换。 因此, 即 使对非 常大的 生化反 应该方 法在计 算上并 不需要 费很大 
功夫。 

类 似于原 子作图 矩阵, 也 可以构 建同位 素标记 化合物 作图矩 阵来描 述生化 反应中 的同位 
素 标记化 合物的 转化。 当要分 析复杂 代谢网 络时, 这些矩 阵与同 位素标 记化合 物分布 向量都 
是 非常有 用的, 但本 书将不 处理这 些复杂 网络, 而且 仅提及 Schmidt 等人 (1997a, b) 的研 
究。 对于 怎样构 建这些 矩阵, 以及 在分析 复杂代 谢网络 方面的 应用, Schmidt 给出了 详细的 

叙述。 

239 



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240 



第 10 章 代谢通 量分析 的应用 

前 面两章 叙述了 胞内代 谢通量 的测定 方法, 以 及它们 在提供 细胞代 谢状态 的全面 情况方 
面的重 要性。 应 该强调 的是, 代谢通 量是细 胞生理 学的最 基本的 量度。 与胞内 代谢物 浓度一 
起, 为解 释代谢 通量控 制的复 杂机理 (即代 谢工程 的中心 要素) 提供了 必需的 信息。 就这点 
而论, 代 谢通量 分析并 不是简 单地做 一下矩 阵变换 的数学 练习, 而是要 试图获 得细胞 状态最 

全面的 状况, 其 与测得 的胞内 通量、 同位 素标记 分布、 GC-MS 以及其 它特定 的探查 反应的 
数据相 一致。 更 应注意 的是, 胞内通 量估计 作为实 际体内 代谢通 量的可 靠度量 标准, 而被接 
受的 程度取 决于带 人计算 中的冗 余度。 应谨 慎对待 仅从相 等数量 的代谢 物平衡 代数式 计算所 
得 的胞内 通量, 这是因 为它们 完全取 决于假 设的生 物化学 和胞外 代谢物 测量结 果的精 确性。 
另一 方面, 计 算的代 谢通量 是相应 的活体 内胞内 通量的 更可靠 量度, 所 计算的 通量也 与直接 
取决于 通量的 额外物 理量的 测量相 一致。 这些 物理量 包括: 在胞 内或胞 外代谢 物特定 碳位上 
i 3 C 标 记的富 集度、 代谢物 NMR 谱 的细微 结构、 由于标 记碳同 位素而 产生的 代谢物 分子量 
分 布等。 

本 章将对 两个代 谢通量 分析实 例展开 研究。 这 些实例 的目的 有三个 方面。 首先, 它们可 
用来检 验读者 对所提 出的概 念和计 算步骤 的理解 程度。 为 了有助 于这种 练习, 在大多 数情况 
下, 给出 了足够 信息, 以便 可以独 立确定 通量, 以 及可与 本章中 报道的 结果进 行比较 的其它 
参量。 如果 所需的 数据量 太大而 不能包 含在本 书中, 这种情 况下, 将为 遗漏的 信息提 供足够 
的参考 文献。 这 些例子 的第二 个目的 是说明 怎样通 过代谢 通量分 析来提 升实验 信息的 水平, 
以 便更深 入地了 解细胞 的代谢 状态, 然后提 出进一 步实验 的有用 建议。 在 许多情 况下, 从原 
始测 量结果 获取的 额外信 息与派 生实验 的结果 一起, 并不 只是对 原始发 酵数据 进行代 谢通量 
分析 所要求 的勉强 够格的 工作的 补偿。 最后, 所述 方法论 的步骤 可以作 为类似 研究计 划的蓝 
图, 这 类研究 方案的 目的, 在 于识别 代谢网 络中的 关键分 支点和 最可能 限制产 物得率 及生产 
能力的 反应。 

在文 献中, 人 们可以 发现代 谢网络 分析的 很多其 它实例 研究, 例如, 对于下 列一些 
系统。 

* 用丝 状真菌 黄青霉 (^PenkilUum chrysogenum ) 生产青 霉素。 该系 统已被 Jorgensen 
等人 (1995) 和 Henriken 等人 (19%) 分 析过, 他 们应用 代谢通 量分析 (MFA) 来计 算流加 
和连续 培养期 间的代 谢通量 分布。 此外, 他们用 MFA 计 算了导 向半胱 氨酸的 不同生 物合成 
途径 (半 胱氨酸 是青霉 素生物 合成的 前体) 的最 大理论 得率。 在分 析中, 他们 发现了 经过戊 
糖磷酸 途径的 通量与 青霉素 生产之 间的相 关性。 他 们的模 型是第 一个考 虑胞内 分区的 实例, 
即, 该 模型在 胞质反 应和线 粒体反 应之间 进行了 区分。 

*酿 酒酵母 (^Saccharomyces cerevisiae") 的厌氧 生长。 此系 统已由 Nissen 等人 (1997) 
分 析过, 他们分 析的通 量示意 图之一 示于图 8.1。 除 了计算 代谢通 量分布 之外, 他们 还应用 
MFA 来分析 S. cerez;fsz'ae 中各种 同工雜 的可能 作用。 在 他们的 分析中 也考虑 了胞内 分区, 
并 证实了 这实际 上可以 解释乙 醇脱氢 薛的同 工醇的 作用。 

*酿 酒酵母 (S. cerevisiae ) 在 葡萄糖 / 乙 醇混合 物上的 生长。 此系 统已由 Van Gulik 

241 



和 Heijnen (1995) 研 究过, 他们 采用线 性规划 来估计 在不同 葡萄糖 / 乙 醇混合 物上生 长时的 
通量, 并 证实了 当乙醇 分数增 大时, 糖异 生通量 升高。 

* 大 肠杆菌 (^Escherichia coU) 的 生长。 Palsson 小组对 此系统 进行了 广泛的 研究, 其 
中 一些结 果在例 8.8 中已讨 论过。 

所 有这些 案例研 究将为 学生的 训练形 成一个 良好的 基础, 与 此类似 的更为 详细的 讨论将 
在下面 两个所 处理的 案例中 进行。 

10.1 由谷 氨酸细 菌生产 氨基酸 

在商 业上, 最重要 的天冬 氨酸族 氨基酸 就是赖 氨酸。 在大 多数动 物饲料 谷物, 诸如玉 
米, 大米, 以 及小麦 中发现 它数量 有限。 因此, 这 些谷物 的营养 价值可 通过补 充外部 赖氨酸 
而得 以显著 提高。 起初, 赖氨 酸是从 蛋白质 水解产 物中分 离的, 而现在 则是采 用廉价 碳源、 
利 用微生 物发酵 大规模 生产。 已经分 离出了 大量可 以分泌 赖氨酸 和谷氨 酸的微 生物。 作为一 
类, 把 这些细 菌称为 谷氨酸 细菌。 虽然 这类细 菌似乎 跨越几 个不同 的类, 但已 经发现 这种分 

类是 未经授 权的, 而且大多数谷氨酸菌可以分类在 Coo;rze<^^zc《eW«/72 .sfWcto 属。 研究 

已经 表明, 黄色 短杆菌 (Brevibacterium flavum) 应当 归类为 谷氨酸 棒杆菌 QCorynebac- 
teriumglutamicum)o 在 本章, 将 使用后 者名称 来描述 用于天 冬氨酸 族氨基 酸生产 的所有 
微 生物。 

本 章的分 析将集 中在赖 氨酸的 过量生 产上, 并特别 强调得 率和生 产能力 问题。 对 于像赖 
氣酸这 类的大 体积、 低 附加值 产品, 这两个 有价值 的数值 即使是 轻微的 提高, 在经济 上也是 
很关 键的。 根据 报道, 基 于葡萄 糖的工 业摩尔 得率在 300/0 〜40o/o 的 范围。 由 于理论 得率估 
计高达 75% (见 10. 1.2 节), 因此, 还有 相当大 的提高 余地。 为了判 别各种 因子在 改善赖 
氨酸发 酵特性 中的重 要性, 提出了 下列步 骤作为 系统工 作的一 部分。 (a) 确 定碳源 (如 葡萄 
糖) 转化为 赖氨酸 的理论 得率。 (b) 进行 标准的 通量分 析以及 选择性 的扰动 发酵, 以 便对作 
为 产物得 率决定 因子的 不同代 谢分支 点的重 要性按 优先顺 序进行 排队。 (C) 证 实使用 的标记 

化合物 和突变 株的特 殊遗传 背景, 以 区分两 条可能 的回补 途径。 (d) 严 密分析 恒化器 及其它 
数据, 评价合 成反应 和分解 反应对 限制性 碳前体 的竞争 结果。 (e) 说明 通量分 析在鉴 别转氣 
酶活 性中的 应用, 以及在 平衡生 物合成 还原当 量中的 作用。 
10.1.1 谷氨酸 菌的生 物化学 与调节 

表 10.1 给 出了描 述谷氨 酸菌生 物化学 时所考 虑的所 有反应 的综合 清单。 关于 支持表 
10.1 中 所述生 物化学 的已测 醇活性 证据, 可查阅 J.J.Vallino 的 博士论 文及其 所列的 参考文 
献。 可 以找出 主要的 葡萄糖 加工、 氨吸 收及产 物合成 途径。 这样, 表 10.1 构 建了一 个基础 
框架, 并 具有各 种变化 (诸如 TCA 循环中 乙酸酸 支路的 运行等 ), 其中 首先分 析基本 情况, 
各种 变化将 在后面 研究。 



表 10.1 谷氨酸 棒杆菌 (^Coryrwbactermm glutamkum) 代谢模 型中包 括的生 化反应 



谷氣 酸棒杆 菌的生 物化学 


代谢物 积累速 率向量 


PEP: 葡萄 糖转移 酵系统 


(1) AC 


乙酸 


( 1 ) GLC + PEP - GLC6P + PYR 


(2) ACCOA 


乙酰辅 SI A 




(3) AKG 


a- 酮戊 二酸 


r: 存化 合物: 海藻糖 


(4) ALA 


丙氛酸 , 


(2) GLC6P + 0. 5ATP = . 5TREHAL + . 5ADP 


(5) ASP 


天 冬氣酸 




(6) ATP 


腺昔 -5'- 三磷酸 



242 



续表 



谷 tc 酸棒杆 菌的生 物化学 


代谢物 积累速 率向量 


bMr HETi 


(7) BIOMAS 


生物质 


/ 1 \ 广 1 f^fit> ― ITD 1 TAP 


(8) C02 


二 氧化碳 


/ J \ roT TAD 4- A TP ― A P + A f^P 


(9) E4P 


4- 碟酸 赤蘇糖 


/ c\ A D J. A r\D J. XI A r\ — M A T\U _i_ "ID 4. A TD 

(5 ) LiAi^ + AUr 十 INAU— INAJJli 十 Lr^^r 十 /\ 1 r 


(10) FADH 


还原型 黄素腺 嘿呤二 核昔酸 








/n\ DITD -i- A r\0 ― ATP 4- DVD 


(11) FRU6P 


6- 磯 酸果糖 


/Q\ Dv D 4. Ni A r^u ― I A f j_ NT A 


(12) G3P 


3- 碟酸 甘油酸 




(13) GAP 


3- 碟酸 甘油薛 


fnl Ik In DITU ^-(1^ ii& 


(14) GLC 


葡萄糖 


/qA pep J. prv — OA A 


(15) GLC6P 


6- 磯酸 葡萄糖 




(16) GLUM 


谷 氨酷胺 


1 LA m*i' 


(17) GLUT 


谷氨酸 


f pvD + POA 4- M An ― APPOA 4- fW + NI AHH 


(18) ISOCIT 


异 柠檬酸 


Ml、 AnpOA + OA A + H.,nr= mOPTT + POA 


(19) LAC 


乳酸 


f \ 0\ I QTV^ IT + \I AHP — AKr^ 4- \I AnPH + PPt, 
、 iZ ) ^J\J^^^ 1 卞 iN/\Ur^ ― /Vi\vj 卞 .N/VUr n 卞 \^kJ2 


(20) LYSE 


赖 氣酸, 胞外的 


( 1 Kicr + poA 4- \i An — QT TPPOA 4- 厂 ru + m ahh 

\Vj) t\r\\j V__AJ/\ • 丄、/ 一 o \J \jy^\Jr\ ' y^\J2 ~ IN/TuLTl 


(21) LYSI 


赖 氨酸, 胞内的 


( 14 ) SUCLUA + AUr ― bUL + LUA + Al r 


(22) MAL 


苹果酸 


(15) bUL + H2U + r AU— MAL + r AUH 


(23) NADH 


还 原型烟 酰胺腺 噤呤二 核昔酸 


(16) MAL + NAD = OAA + N ADH 


(24) NADPH 


还原 型烟酰 胺腺噤 呤二核 酸磷酸 


乙 酸生成 或消耗 






( 17) ACCOA + ADP = AC + COA + ATP 


(25) NH3 


氣 




(26) O2 


氧 


谷 ft 酸、 谷氨 酸胺、 丙氨酸 及缬氣 酸生成 


(27) OAA 


草 酷乙酸 


(18) NHs + AKG + NADPH = GLUT + H2O + NADP 


(28) PEP 


碟 酸燦醇 丙繭酸 


( 19) GLUT + NHj + ATP = GLUM + ADP 


(29) PYR 


丙嗣酸 


(20) PYR + GLUT = ALA + AKG 


(30) RIB5P 


5- 碟 酸核糖 


(21) 2PYR + NADPH + GLUT = VAL + CO2 + H2O + NADP + AKG 


(31) RIBU5P 


5- 碟酸 核銅糖 




(32) SED7P 


7- 磔 酸景天 庚嗣糖 


磯酸戊 糖途径 


(33) sue 


號拍酸 


(22) GLC6P + H2O + 2NADP = RIBU5P + CO2 + 2NADPH 


(34) SUCCOA 


號拍 酷辅醇 A 




(35) TREHAL 


海藻糖 


(23) R1BU5P = RIB5P 


(36) VAL 


缬氨酸 


(24) RIBU5P = XYL5P 


(37) XYL5P 


5- 磯酸木 S 糖 


(25) XYL5P + RIB5P = SED7P + GAP 






(26) SED7P + GAP = FRU6P + E4P 






(27) XYL5P + E4P = FRU6P + GAP 






氧化 8!^ 酸化: P/0 = 2 






(28) 2NADH + O2 + 4 ADP = 2H2O + 4ATP + 2NAD 






(29) 2FADH + O2 + 2ADP = 2H:0 + 2ATP + 2FAD 






天冬 氣酸族 15 基酸 






(30) OAA 十 GLUT = ASP + AKG 






(31) ASP + PYR + 2NADPH + SUCCOA + GLUT + 






ATP = sue + AKG + C02 + LYSI + 2NADP + 






COA + ADP 






(32) LYbl - LYbL 






生物质合成:C|.97,H6.46,0,.94,No.J45,3.02%灰分 






(33) 0.021(;L(、6P + 0.007FRU6P + 0.09RIB5P + 






. 036E4P + 0.01 3GAP + . 15G3P + . 052PEP + 






. 03FYR + . 332ACrOA + . 08ASP + . 033LYSI 







243 



续表 


谷氨 酸棒杆 菌的生 物化学 


代谢物 积累速 率向量 


+ . 446GLUT + . 025GLUM + . 054ALA + . 04VAL 
1 n n^'7Ti-ip 4- f\ ni ^N/ttrx -+- n rviw itt t + i qo a tp -+- 

十 .lJZ>ii 1 rlK 十 U . Ul jME- 1 卞 U . U^JLJLU 卞 J . oZ/\ 丄 卞 

. 476NADPH + 0.31 2NAD = BIOMAS + 3 . 82ADP + 

. 364 AKG + . 476NADP + .312NADH 

+ 0.143CO2 

(34) ATP = ADP + P, 





对于表 10.1 中所述 的生物 化学, 有一 些重要 的地方 应予以 注意。 

(a) 好 几次, 序列反 应已通 过消除 中间代 谢物而 归并为 一个单 一反应 步骤。 例如, 
EMP 途径 的反应 4 就 是这种 情况, 反应 4 是由磷 酸果糖 激酶、 1,6- 二憐酸 果糖醛 縮酸、 磷 
酸 丙糖异 构酶等 反应归 并的。 这种归 并减少 了反应 步数, 而 不会影 响所得 的通量 结果。 归并 
的反 应假设 按相同 (稳态 ) 速率 进行, 并且 假设中 间代谢 物处于 稳态。 

(b) 将 PEP 羧化 酶反应 [反应 (9)] 表示为 一个代 表性的 总回补 反应, 而不是 "单 独" 
的回补 反应。 事 实上, 丙 酮酸羧 化酶、 异柠檬 酸裂解 酶和苹 果酸合 成薛的 组合、 苹果 酸酶、 
OAA 脱羧 酶以及 PEP 幾激酸 等反应 与其它 可能性 一道, 已被建 议为这 些细菌 的回补 途径。 
准 确的反 应尚在 争论, 本节部 分篇幅 将试图 确认其 性质。 

(C) 由 于天冬 氨酸酶 的活性 很小或 没有, 且丙 氨酸脱 氣酶和 亮氨酸 脱氣酶 尚未检 测出, 
因此, 铵吸收 主要是 通过谷 氨酸脱 氢酶和 谷氨酰 胺合成 酶来实 现的。 此外, 在 发酵实 验中使 
用的高 铵离子 浓度条 件下, GS/GOGAT 铵同化 途径被 认为是 不起作 用的。 在 这些微 生物中 
所 检测的 五个氨 基转移 酶中, 仅天 冬氨酸 转氨酶 就占总 转氨酶 活性的 90% 以上。 

(d) 赖氨酸 合成途 径的细 节如图 9.4 所示。 除了四 步骤的 内消旋 二氨基 庚二酸 Ueso- 
DAP) 途 径外, 又证 实了四 氢吡唳 二羧酸 (H4D) 直接 转化为 meso-DAP 的另一 途径。 这 
两条途 径似乎 支持显 著的碳 通量。 

(e) 表 10.1 中也 列出归 并的方 程式, 并与已 确定的 代谢物 得率系 数一起 表示生 物质合 
成。 代谢 物得率 系数与 测量的 C. glutamicum 的元素 组成相 匹配, 元素组 成为: C, 
47.6%; 〇, 31.0%; N, 11.8%; 灰分, 3.0296。 

(f) 虽然在 flavum 的呼吸 链中可 能存在 三个能 量稱合 位点, 但在 C. glutamicum 
中, 似乎只 有两个 位点改 变质子 位置。 因此, 使 P/0 比等于 2。 为了 解释维 持需要 和无效 
循环, 对 于过量 ATP 的耗 散反应 (34) 已 经包括 在内。 然而, 应注意 的是, 由于它 们的不 
确 定性, 能 量平衡 并不用 于通量 确定。 将 它简单 地包括 在内, 只 是为了 估计发 酵过程 中过量 
能量的 可用性 及可能 的能量 限制。 

(g) 葡 萄糖运 输是通 过磷酸 转移酶 系统, 并 伴随有 PEP 转 化为丙 酮酸。 在不存 在丙酮 
酸 羧化活 性时, 这对理 论得率 特别是 对苏氨 酸的生 产具有 深远的 影响。 

(h) 在方 程组中 不包含 转氢酶 (THD) 反应, 这 是由于 起初并 没有检 测出其 活性。 这 
种省略 会导致 在某些 突变株 中以及 THD 的最终 实验验 证中违 背关于 NADPH (通过 一致性 
分析检 测的) 的稳态 假设。 

图 10.1 概括 了赖氨 酸生产 途径的 调控。 在赖 氨酸合 成中, 天冬氨 酸激酶 (AK) 是一个 
关 键酶, 它受苏 氨酸与 赖氨酸 的协同 -多价 -反馈 抑制, 但 单独受 其中一 个氨基 酸的抑 制不明 
显。 第 1 个 赖氨酸 生产菌 株是高 丝氨酸 脱氛酶 (HDH) 活性缺 乏的, 即, 不 能合成 苏氣酸 
(如 ATCC 21253 菌株 )。 它 们因此 可以积 累高浓 度的赖 氨酸, 而不存 在反馈 抑制, 只要培 
244 



养 基中补 充有足 够的高 丝氣酸 或苏氨 酸加蛋 氨酸, 这些都 是该菌 种自己 不能合 成的。 鉴于过 
量 的苏氨 酸会导 致赖氨 酸合成 中断及 细胞生 长重新 开始, 因此, 这种 补充必 须仔细 保持平 

衡。 最近的 赖氨酸 发酵过 程大多 是采用 AK 对反馈 抑制不 敏感的 C. glutamicum 菌株, 其 
可以积 累高浓 度的赖 氨酸。 这样的 菌株, 例如 ATCC 21799 菌 株等, 由于其 对不可 代谢的 
赖氨酸 类似物 S-(2- 氨乙基 )-L- 半 胱氨酸 (AEC) 的反馈 抑制的 抗性, 被 称为抗 AEC 菌株。 
另 一个调 控点是 ASA 分支点 后的第 1 个酶, 即高丝 氣酸脱 氣醇, 其受 苏氨酸 强烈抑 制和异 
亮氨酸 的微弱 抑制, 也受蛋 氨酸的 阻遏。 有文献 报道, 在 flavum 中, 高 丝氨酸 脱氢酶 
是 一个别 构酶。 在更 为最近 的突变 株中, 高丝氨 酸脱氣 酶活性 已被减 弱到这 样一个 水平, 即 
可 以内源 性地供 给足够 的苏氨 酸和蛋 氨酸的 下游氨 基酸, 但又低 得足以 防止它 们积累 到抑制 
水平。 因此, 在 这种菌 株中, 含苏氨 酸培养 基的生 物反应 器进料 控制已 由等效 的苏氨 酸和蛋 
氨酸 总供给 的遗传 调节所 代替。 由于 这些氨 基酸的 供给限 制这些 菌株的 生长, 因此, 后者已 
被称为 bradytrophs , 即生长 缓慢生 物体。 



② 



DDP 

OTDAP 

④ I -- 
I ~ 赖氨酸 



天 冬氨酸 
=卞 
AspP 

ASA 

z ③、 



Met 



Leu 



Homo 



Thr 



lie —I 



縮写: AspP —天 冬氨酰 碟酸; 
ASA —天 冬氣酸 半酵; 
Leu —亮 氨酸; 
Homo —高丝 氨酸; 
Met ― 蛋 氨酸; 
Th 「苏 氨酸; 
lie —异亮 氨酸; 
DDP —二氢 吡啶二 竣酸; 
wDAP —消旋 -a ,e- 二氨基 庚二酸 



图 10.1 Corynebacterium glutumicum 中天冬 氨酸族 氨基酸 的调控 
调节 薛是: ①天 冬氨酸 激酶; ②二氢 吡啶二 羧酸合 成雜; ③高丝 氨酸脱 氢酷; ④二氨 基庚二 酸脱羧 雜。 
实线表 示抑制 (-) 或激活 ( + ), 虚线表 示阻遏 (-) 或诱导 (+ ) 

10.1.2 理 论得率 的计算 

理论得 率可以 根据底 物转化 为产物 的总反 应式来 计算, 或根 据考虑 辅助因 子的更 详尽的 
平 衡式来 计算, 或根 据生物 反应网 络的理 论通量 分析来 计算。 本 节将对 赖氨酸 生物合 成举例 
说 明这些 方法。 首先 要强调 两点, 第一, 这三 种方法 应得到 同样的 结果, 第二, 最大 理论得 
率不是 特定产 物-底 物对的 一个固 有性质 (正 如一些 出版物 中经常 暗示的 )。 相 反地, 它严格 
取 决于促 进总转 化的特 定代谢 途径。 

葡萄糖 转化为 赖氨酸 可用下 列总反 应式来 表示: 

― a CelinOe — bCh - c NH3 + C6H14N2O2 + dC02 + eH20 = (10.1) 

反应式 (10.1) 中 5 个化学 计量系 数中的 4 个可根 据碳、 氮、 氣 及还原 度的平 衡来确 
定, 得到: 

一 [ (4 + e ) /6]C6Hi206 — (^^ — 3)02 — 2NH3 + C6H14N2O2 

+ (^-2)CO2 + ^'H2O = (10.2) 
由此 可得赖 氨酸的 摩尔得 率被看 做等于 y = 6/(4 + e)。 氧 的化学 计量系 数根据 基本原 
理是 不可确 定的。 由 于氧不 会有净 产生, 因此, ^^>3。 对于^^ = 3, 得 到赖氨 酸的最 大化学 

245 



计 量得率 Y 二 0.857 (6/7) mol 赖氨酸 /mol 葡 萄糖。 

当然, 上述 计算没 有考虑 任何辅 助因子 要求。 换句 话说, 该 方程式 为赖氨 酸的合 成提供 
了足够 的碳、 氮、 氢 及氧。 这 个事实 并不意 味着可 按要求 的数量 获得能 量流通 代谢物 和还原 
当量, 也不意 味着满 足所有 中间代 谢物的 平衡。 理论 得率计 算应考 虑这些 限制。 

首先 列出表 10.1 中主 要代谢 途径的 总化学 讨量方 程式。 

糖 酵解: _GLC + PEP + Pyr + 2NADH + ATP = (10.3) 

PEP 羧 化酶: -PEP-CO2 + OAA = (10.4) 

转 氨酶: _OAA — GLUT + ASP + AKG = (10.5) 

赖氨 酸途径 : ― ASP - Pyr - 2NADPH ― GLUT - 2ATP 

+ LYS + AKG + CO2 = (10.6) 
谷氨 酸合成 : — NH3 — AKG - NADPH + GLUT 二 (10.7) 

将 反应式 (10.3) 〜式 (10.7) 加和, 得 到下列 更详细 的赖氨 酸生物 合成方 程式: 

- GLC ― 4NADPH - 2NH3 - ATP + LYS + 2NADH = (10.8) 
由此 可见, 取决于 转氢酶 (THD) 活性 (使 NADH 可逆地 转化为 NADPH) 是否存 
在, 合成 Imol 赖氨 酸需要 额外的 2mol 或 4molNADPH。 这反 映了这 样一个 事实, 即: 赖 
氨酸 比葡萄 糖还原 性更强 (与葡 萄糖的 还原度 4 比较 而言, 还 原度为 4.67)。 所需的 
NADPH 主 要是由 戊糖磯 酸途径 供给, 在碳 完全氧 化的条 件下, 戊糖磯 酸途径 的总化 学计量 
方程式 如下。 

PPP (完全 氧化途 径): - GLC6P + 6C02 + 12NADPH = (10.9) 

在葡 萄糖是 由激酶 运输并 直接磯 酸化这 样一个 简单情 况下, 上述 方程式 表明: 需 要额外 
的 1/6 或 l/3mol 葡萄糖 来为赖 氨酸合 成反应 [如 (10. 8)] 提供 NADPH 还原 当量, 这 又取决 
于 THD 活 性是否 存在。 得到 的赖氨 酸摩尔 得率为 6/7 (=0.857) 或 6/8( =0.75), 这 分别对 
应于总转化反应中6=3或^>=4。 然而, 要考 虑的另 一个情 况与葡 萄糖磷 酸转移 酶系统 
(PTS) 有关, 每运输 Imol 葡 萄糖进 细胞, 需将 Imol PEP 转 化为丙 酮酸: 

- GLC - PEP + GLC6P + Pyr 二 (10.10) 
可将 方程式 (10.3)、 式 (10.9) 和式 (10.10) 都乘以 1/6, 并 与赖氨 酸合成 方程式 
(10.8) 相加, 假设 NADPH 和 NADH 由 THD 活性 等价, 则得: 

_(8/6)GLC — 2NH3— (5/6)ATP + LYS+(l/3)Pyr + C〇2+ (1/3)NADH = 

(10.11) 

只要不 发生使 丙酮酸 转化为 OAA 的丙酮 酸羧化 反应, 或者 为了葡 萄糖运 输形成 的丙酮 
酸 循环而 PEP 合成酸 活性不 存在, 则 上述方 程式表 明理论 得率为 6/8 = 0. 75mol 赖氣酸 /mol 
葡 萄糖。 之所以 这样, 是由 于除赖 氨酸合 成所需 之外, 任何 额外产 生的丙 酮酸在 TCA 循环 
中被 氧化, 而 且对产 物得率 不会有 贡献。 但在 相反情 况下, 所合 成的丙 酮酸在 回补途 径中进 
一步 羧化, 从而增 加赖氨 酸的生 产量, 但也 改变为 此目的 所需的 NADPH 量。 这转 而会改 
变 为合成 额外的 NADPH 以及 其它物 质而在 PPP 途 径中必 须氧化 的葡萄 糖量。 可以 容易地 
看出, 虽然理 论得率 的这个 直接计 算方法 在某些 简单情 况下是 有吸引 力的, 但 当代谢 产物在 
所考虑 的途径 中被循 环时, 这会导 致相当 复杂的 计算。 

一个 更一般 的方法 是使用 代谢物 平衡: 根据 方程式 (10.10), 每运输 Imol 葡萄 糖进人 
细胞, 要消耗 Imol PEP, 并产生 Imol 丙 酮酸和 lmolGLC6P。 设: r 是 PP 途 径中完 全氧化 
的 GLC6P 的分数 (PP 途 径产生 12:r mol NADPH), 贝 ij (l-.r) 是糖 酵解中 被分解 代谢的 
246 



分数, 对 于总共 (1-2.7") 的 GLC6P, 将产生 2(1- :r)molPEP。 当存在 THD 活性, 但没 
有丙酮 酸竣化 薛 时, 可 根据下 列有关 NADPH 的平 衡确定 分数: r。 

产生的 NADPH: 12:r =2(1 —2:r): 消耗的 NADPH (10.12) 
由式 (10.12) 得出 T = l/8, 从 而计算 出理论 得率为 l-2:r=0.75。 当丙 酮酸幾 化薛反 
作为 另一回 补途径 包括在 内时, 或者 PEP 合 成酶活 性可以 使通过 PTS 产生 的过量 丙酮酸 
循 环时, 则 引入另 一变量 3^ 来表示 转化为 PEP 的丙酮 酸量。 该转化 应产生 等量的 PEP 和丙 
酮 酸以确 保碳完 全利用 [参 看表 10.1, 反应 (31)], 这 样结合 NADPH 平衡, 得到 下列确 
定: r 和 >^ 的方 程式。 

形成的 PEP:(l_2:r+:yO = (1-30: 形成的 Pyr (10.13) 
NADPH 平衡: 2(1— 2;r + y) = l2x (10.14) 
求解 方程式 (10.13) 和式 (10.14), 得出 3; = _r = l/7, 赖氨 酸理论 得率为 0.857 (6/7)。 
在只消 耗必要 的葡萄 糖产生 NADPH 条 件下, 该理论 得率可 通过完 全利用 所有可 利用的 碳来获 
得。 类 似地, 当 THD 不存 在时, 根据 丙酮酸 羧化醇 活性是 否补充 PEP 回补 途径, 理论 得率分 
别为 0.75 和 0.60。 应注意 的是, 在 这个途 径中, ATP 需 求是最 小的, 且容易 满足。 

缩写: Glc-6-P — 6- 憐酸葡 萄糖; 
Ribu-5-P — 5- 磯酸核 覿糖; 
Fru-6-P— 6- 碟酸 果糖; 
Xyl5P— 5- 磯酸木 酮糖; 
Rib5P — 5- 磯酸 核糖; 
Gap — 3- 磷酸甘 油酸; 
E4P_4- 磷酸赤 薛糖; 
Sed-7-P — 7- 碟酸 景天庚 銅糖; 
G3P — 3- 磷酸甘 油酸; 
Ala —丙 氨酸; 
PEP —磯酸 烯醇丙 酮酸; 
Val —織 氨酸; 

Pyr— 丙 酮酸; . 
La 「乳 酸; 
AcCoA— 乙酰辅 HA; 
Ac— 乙酸; 
AsP —天冬 氣酸; 
Lysi — 赖氨酸 (胞内 ); 
LysE — 赖氣酸 (胞外 ); 
OaA —草醜 乙酸; 
Mai— 苹 果酸; 
Sue —琥 珀酸; 
/-Cit— 异柠 檬酸; 
a-KG — a- 兩戊 二酸; 
SucCoA —琥 珀酰辅 BSA; 
Glut —谷 氣酸; 
Glum —谷 氣跣胺 

图 10.2 赖氨 酸摩尔 得率为 64% 时的 理论通 量分布 基于表 10.1 中模 型所述 的限制 
限 制是由 于丙酮 酸激瞎 的不可 逆性造 成的。 由于 TCA 循环 中产生 额外的 NADPH, 
所以 64% 得 率超过 文中的 60%, 引自 Vallino (1991) 

247 



海藻糖 

牛 CO;; 




LysE 



生物质 



图 10.3 赖氣酸 得率为 75% 时的 理论通 量分布 
得 率极限 是由于 TCA 循环 通量的 限制造 成的。 (丙 嗣酸激 醉不可 逆性的 限制被 放松) 引自 ValHno (1991) 



248 



虽然 前面的 方法无 疑是正 确的, 但正 如有关 PTS 复 杂性方 面的例 子完全 证实的 那样, 
它们 易产生 误差。 误差 的主要 来源在 于部分 途径的 总化学 计量关 系式的 列出, 以及中 间代谢 
物 和通用 代谢物 的所有 来源和 贮库的 考虑。 此处所 述的步 骤建议 一个关 于代谢 物平衡 的更加 
结构化 的方法 可以避 免这些 问题, 并可得 到一普 遍适用 的正规 方法。 代 谢通量 分析非 常适合 
于此 目的。 在得率 计算模 式中, 代谢通 量分析 (MFA) 的目的 不再是 确定内 部代谢 通量, 
因为 它们的 大部分 值已被 设定以 保证产 品得率 最大。 这时 MFA 的目标 是确定 一些通 量分配 
比, 从而 在产生 最大产 品的网 络中所 有的代 谢物平 衡能被 满足。 例如, 在赖 氨酸途 径中, 通 
过 设定生 物质生 成速率 为零, 除 赖氨酸 之外的 所有其 它分泌 的产物 (乙 酸、 乳 酸及海 藻糖) 
的 速率也 为零, 葡萄糖 吸收速 率为- 100, 赖氨 酸合成 速率等 于得率 Y。 对于给 定值的 y, 
总共有 34 个 代谢物 平衡, 可 以求解 它们来 确定表 10. 1 的代谢 网络的 34 个 反应的 通量。 

第 8 章中 的矩阵 方程式 可用来 构建和 方便地 求解表 10. 1 中赖氨 酸代谢 网络的 34 个方程 
式。 对不断 增大的 赖氨酸 得率求 出理论 通量, 直到出 现不可 能的通 量分布 为止。 对 于没有 
THD 和丙酮 酸羧化 酶活性 的网络 来说, 当赖 氨酸得 率接近 60%, 此 时丙酮 酸激酷 (PK) 
通量 达到零 (见图 10.2), 这种情 况就会 发生。 零 PK 通量 是前述 PTS 的直接 结果。 如果将 
PEP^ 成 薛或利 用产生 的丙酮 酸的另 一出口 (像丙 酮酸羧 化酶) 加入到 反应网 络中, 则当 



1 



I 



海藻糖 



葡萄糖 



Ribu-5-P 





CO 



■Cit 
A。 



■KG 



CO 



SucCoA 



"Y*- Glut 
NHb 、 
^ Glum 



赖 氨酸得 率达到 75% 时, 会出 现下一 个不可 能性, 此时受 TCA 循 环支持 的通量 降为零 (见 
图 10.3)。 进 一步增 大得率 会导致 TCA 循环 通量为 负值。 因此, 在 这些条 件下, 赖 氨酸的 
最 大理论 得率为 7596。 如果再 把转氢 龍 活性 加到代 谢网络 中以使 NADPH 与 NADH 相互转 
化, 那 么类似 的计算 得出赖 氨酸的 最大理 论得率 分别为 7596 或 85.7%, 这取 决于是 否存在 
丙 酮酸羧 化酶, 而且这 与本节 前述的 辅助因 子平衡 方法的 结果相 一致。 应注意 的是, 由于 
ATP 的消 耗反应 (表 10.1 中 的反应 34) 为 非零, 得 率不受 ATP 可 利用性 限制。 

图 10.4 (a) 描述 了在假 设没有 THD 和 丙酮酸 羧化酶 活性, 赖 氨酸得 率等于 35% 的条 
件下, 对 前述网 络所得 的理论 通量。 在图 10.4 (b) 中, 提供了 理论通 量图, 这 时仍对 35% 
的 赖氨酸 得率的 情况, 但针 对一修 改过的 生物反 应网络 [在 此网 络中, PEP 羧化酶 的回补 
反 应已由 乙醒酸 支路和 OAADC 取代, 并同时 移除了 a- 酮 戊二酸 脱氣酶 (aKGDH)]。 作此 
计算的 意图是 要人们 注意这 一点: 对生 物反应 网络即 使只作 轻微的 改变, 通量 分布也 会有显 
著的 差别。 



(a) (b) 

图 10.4 支持 赖氨酸 得率为 35% 所 必需的 理论通 量分布 
基于 (a) TCA 循环或 (b) 乙酸酸 支路的 C. glutamicum 网 络中, PEP 与丙 嗣酸之 间的两 个通量 
用 于丙兩 酸激酵 (左) 和 葡萄糖 PTS (右) 的 反应。 弓 I 自 valHno 和 Stephanopoulosl993 (c) 
缩写: G6P — 6- 碟酸葡 萄糖; F6P — 6 -隣 酸果糖 

现补充 下列四 点作为 本节的 结束。 

① 进行 理论通 量计算 之后, 可 以计算 C02 释放 速率及 Oz 吸收 速率, 从 而确定 呼吸商 

(RQ) 的理 论值。 在最 大理论 得率为 7596 时, RQ 等于 2.0, 该数值 可用来 按照其 接近理 论最大 
值 的程度 对发酵 过程进 行基准 标定, 也 可用于 生物反 应器加 料策略 的设计 以寻找 最优操 作点。 

② 通过设 定赖氨 酸生产 速率为 零并改 变生物 质合成 速率, 人们可 以重复 前面的 计算。 
这 可得到 生物质 的最大 得率为 75%, 这肯定 过高, 因 为没有 考虑维 持需要 和无效 循环。 

③ 如表 10. 2 所示, 去 掉有关 C02, NH3 及 O2 的平 衡式会 急剧增 加所得 化学计 量关系 
矩 阵的条 件数。 但此 值仍可 接受, 特别 是考虑 以下事 实时, 即: 在 这种情 况下, 测量 向量的 
值不存 在不确 定性。 一 般地, 那样大 小的条 件数可 能是因 为要考 虑平衡 式是否 用实际 的实验 
数据来 求解。 

249 




70 



-Ribu-5-P 



J 



100 



A. 



-Cit 



赖氨酸 ^^Suc 



^ p p p 

萄 If ^i-^ It E 

000 F p 



^ p p p Iv r o 

萄 I If ^ IE r Jyi, c. 



^ 1^ 



表 10.2 当从网 络中删 除所选 择的产 生胞外 代谢物 的反应 (括 号中 所示) 时, 
赖氨 酸代谢 网络的 条件数 (见 8.4 节) 



从 网络中 删除的 
代谢物 


条件数 


从 网络中 删除的 
代谢物 


条件数 


无 




59 


生物质 


葡萄糖 




155 


生物质 (7) 




140 


生物质 


NHj 




174 


C02(8) 




59 


生物质 


O2 




207 


葡萄糖 (14) 




61 


生物质 


赖氨酸 




445 


赖氨酸 (20) 




60 


C02 


02 




762 


NHjCZS) 




61 


生物质 


赖氨酸 


NHj 


462 


02(26) 




132 


生物质 


葡萄糖 


NH3 


519 


葡萄糖 


02 


136 


生物质 


葡萄糖 


赖 t (酸 


726 


NH3 




138 


生物质 


C02 


02 


845 


生物质 


C02 


143 


C02 


NHj 


02 


881 


赖氨酸 


02 


144 











® 最后一 点是, 在进 行理论 得率计 算时, 应 有足够 的方程 数以便 确定全 部理论 内部通 
量。 只需注 意对网 络所加 的额外 限制, 就可 得到最 大产物 得率。 

10.1.3 C. glutamicum 菌中赖 氨酸生 物合成 网络的 代谢通 量分析 

本 节将证 明代谢 通量分 析如何 对代谢 网络所 选分支 点的控 制结构 提供附 加的洞 察力。 问 
题的 焦点在 于提高 赖氨酸 得率, 正如 前面讲 到的, 赖氨 酸得率 可在当 前工业 水平上 显著提 
高。 通常, 为了提 高产物 得率, 要增大 产物途 径中反 应的酶 活性。 然而, 产物 得率最 终是受 
关键分 支点的 通量分 配比控 制的。 例如, 在网络 A— B, B— C, 以及 B— D 中, D 对 A 的得 
率严 格取决 于节点 B 的分 配比。 毫无 疑问, 产物 途径中 限制酶 的增强 可间接 地影响 节点分 
配比; 但产 物得率 最终还 是取决 于这些 节点对 通量扰 动的适 应性。 在 刚性节 点中, 通 量分配 
比对产 物分支 途径的 活性不 敏感, 仅 增强产 物途径 不会提 高产物 得率。 此外, 如果在 正常条 
件 下产物 是以适 当的速 率进行 合成, 那么, 通过减 弱副产 物分支 途径来 影响分 配比可 能更有 
利。 代谢工 程研究 的一个 焦点应 该是把 改变节 点分配 比作为 提高产 物得率 的主要 机制。 在这 
方面, 一个 关键问 题是识 别那些 对产物 合成或 导致副 产物生 成起决 定性作 用的分 支点。 这些 
分支 点构成 代谢网 络的主 节点, 必须首 先识别 出来。 

一旦识 别出网 络中的 关键分 支点, 就必须 进行特 定扰动 实验, 以表征 这些分 支点的 控制。 
在常规 发酵过 程中, 代谢 通量和 代谢通 量分配 比会有 变化, 这些变 化可以 提供关 于节点 柔性或 
刚性 的详细 情况。 然而, 由 于代谢 物效应 物浓度 (其也 在不同 实验中 改变) 强烈 地影响 节点刚 
性, 因此, 对于由 生物质 和产物 合成速 率交换 所诱导 的全局 变化所 提供的 信息必 须谨慎 解释。 
非 常可能 的是, 这 种全局 扰动包 括很多 附加的 影响, 而这些 影响在 代谢平 衡中不 能精确 地预料 
及 说明。 结果, 为了 阐明节 点控制 的具体 特征, 就需 要更多 的局部 扰动。 本 章将通 过探讨 6- 磷 
酸葡 萄糖和 PEP/i^ 酮酸 复合分 支点这 两个具 体节点 的代谢 控制来 说明这 一点。 

应 该注意 的是, 对 于通量 控制, 本节 的讨论 采用了 5.4 节所 介绍的 节点柔 性和刚 性的概 
念。 为 了完全 理解此 处所给 结果的 解释, 应复习 一下那 一节。 此外, 在 5.4 节 中从定 性方面 
介 绍的刚 性和柔 性概念 将在第 12 章中在 代谢控 制分析 (MCA) 范围内 进一步 扩展并 进行定 
量 描述。 MCA 通 常是描 述线性 或分支 代谢途 径中各 个反应 区段的 柔性。 同样 的概念 已在第 
12 章中 延伸, 以表 征代谢 网络分 支点的 刚性。 

根据本 章的总 目标, 为了 可以独 立计算 通量、 通量分 配比以 及其它 可通过 应用代 谢通量 
分析 (MFA) 得到的 结果, 要提供 足够的 信息。 为 了示范 MFA 的一般 哲理, 也提 供了在 
250 



设 计所介 绍的实 验中所 用的策 略及其 理由的 评述。 生 物网络 (Bionet) 可用来 重现此 处所给 
的 结果。 

主节点 的识别 

虽 然代谢 网络包 含大量 节点, 但 情况通 常是, 当产物 得率改 变时, 只有几 个节点 的通量 
分配 比实际 上发生 改变。 这 些节点 由于直 接影响 产物得 率而被 称作主 节点。 其 余节点 的分配 
比相 对不受 影响, 不值得 进一步 研究。 为了找 出主节 点在网 络中的 位置, 首 先要识 别出产 
物、 副 产物和 底物。 然后 进行类 似于前 节所述 的理论 产物得 率计算 进行理 论通量 分析。 主节 
点是 通过产 物得率 的系统 变化和 不同节 点的通 量分配 比的观 察而被 识别。 

将此 方法应 用于赖 氨酸生 物合成 网络, 当 赖氨酸 得率升 高时, 五个 分支点 (即: 
Glc6P、 Fru6P、 PEP. 丙 酮酸和 OAA) 的分 配比受 到明显 影响。 其 中只有 两个分 支点, 即 
Glc6P 和 PEP/Pyr 组由 于下列 原因而 被认为 是有兴 趣的主 节点。 当赖 氨酸得 率小于 60% 时, 
Fru6P 被证 明是 一个汇 合点, 而当赖 氨酸得 率高于 60% 时, Fru6P 是一 个分 支点。 在后一 
种情 况中, 异构 雜反应 逆转, 而且 Glc6P 变成 一个汇 合点。 因此, 在 Glc6P 和 Fm6P 之间, 
其 中一个 总是分 支点, 而另一 个是汇 合点; 而且由 于一般 得率总 是低于 60%, 因此, 在分 
析 中仅把 Glc6P 考虑 为一 个主分 支点。 就 OAA 来说, 对该节 点的仔 细研究 表明, 由 于所有 
被柠檬 酸合成 藤 消耗的 OAA 必 须通过 苹果酸 脱氛酶 (TCA 循 环中的 最后一 个酶) 返回, 
所以它 基本上 是不重 要的。 本 质上, TCA 循环 通量仅 仅通过 OAA 节点, 结果, 用 于赖氨 
酸合成 所消耗 的全部 OAA 是 由回补 途径产 生的。 这 就强调 了理解 TCA 循环 及有关 回补途 
径 中质量 平衡限 制的重 要性。 应注意 的是, 所有经 AcCoA 进入 TCA 循环的 碳必须 被氧化 
为 C02, 而通过 其它反 应进入 TCA 循 环的碳 不能被 氧化, 而且 最终必 须离开 循环以 便为生 
物质及 产物合 成提供 前体。 鉴于 对这些 概念的 误解, 已建 议通过 直接接 入富马 酸库, 天冬氨 
酸 醉 会提高 天冬氨 酸的利 用率。 然而, 富 马酸并 不比草 酰乙酸 可利用 性高, 因 为它们 任何一 
个的 净产量 都受回 补途径 通量的 支配。 这一 点已被 引人天 冬氨酸 酶活性 试图提 高赖氨 酸得率 
而 失败的 事实所 证实。 

上述主 节点, Glc6P 和 PEP/Pyr 组, 简 单地反 映了这 样一个 事实: 赖氨 酸合成 所需的 
四 个前体 (碳、 NADPH、 ATP 及氨) 中, 两个 (碳和 NADPH) 依赖于 葡萄糖 供给, 并因 
此依 赖于上 述分支 点的代 谢通量 分布。 其余两 个前体 (ATP 及氨) 显 然不存 在任何 限制。 
这 是由于 (a) 伴随产 生碳前 体的葡 萄糖分 解代谢 的反应 可产生 足够的 ATP, 以及 (b) 为 
了 氨基酸 和赖氨 酸生物 合成的 氮吸收 反应是 通过谷 氨酰胺 合成酶 和谷氨 酸脱氣 酶同化 系统充 
足提 供的。 如果后 者不是 这样, 那么, 提供 ATP 和补充 谷氨酸 用于氨 同化途 径的反 应也应 
包含在 赖氨酸 生物合 成网络 的主分 支点清 单中。 

总结 一下赖 氨酸得 率对两 个主节 点分配 比的依 赖性, 注 意到当 赖氨酸 得率提 高时, 必须 
有较 高比例 的葡萄 糖转入 戊糖憐 酸途径 (PPP) 以满 足不断 增长的 NADPH 需求。 如 果该节 
点的实 际醉动 力学是 糖酵解 途径对 Glc6P 的争 夺超过 PPP (戊 糖磯酸 途径) 这种 情况, 那 
么, 赖氨 酸将是 NADPH 限 制的, 而 且进入 糖酵解 的过量 碳最终 会导致 副产物 产生。 然而, 
如果 Glc6P 节点分 配比是 柔性的 而容易 改变, 以致准 确满足 NADPH 需求, 则赖氨 酸得率 
限制由 PEP/Pyr 主节点 的次优 分配所 引起。 如果 PEP/Pyr 支路的 回补途 径分配 比小于 
50%, 则不 充足的 OAA 将被 合成, 且 产生过 量的丙 酮酸, 其很 可能在 TCA 循 环中被 氧化。 
如果 回补支 路分配 比大于 50%, 则 将合成 过量的 OAA, 其可能 导致天 冬氨酸 或谷氨 酸分泌 
(虽 然这一 点尚未 观察到 )。 在 Glc6P 和 PEP/Pyr 节点, 最优的 分配将 导致最 优的赖 氨酸合 

251 



成和理 论产物 得率。 这是否 可行取 决于影 响上述 分支点 分配比 的酶反 应的动 力学和 调控。 通 • 
过 引人如 下所述 的特定 的局部 扰动, 可以确 定它们 对赖氨 酸生产 的限制 程度。 I 

Glc6P 分 支点的 通量扰 动分析 

为 了研究 Glc6P 分支 点的 柔性, 进 行了两 个特定 的扰动 实验。 第一 个扰动 是减弱 Glc6P ir 
异构藤 (GPI), 即 糖酵解 的第一 个酶, 然 后进行 发酵, 并对 所得的 ATCC 21253 菌株 C. 
glutamicum 的 突变株 NFG068 进 行通量 分析。 将 该突变 株分离 出来, 以试图 使代谢 通量改 
向 进人戊 糖磯酸 途径。 第 二个扰 动是在 C. glutamicum ATCC 21253 菌的发 酵过程 中使用 
葡糖酸 盐作为 惟一碳 能源。 通过提 供直接 进人戊 糖憐酸 途径的 碳源, 葡 糖酸盐 有效地 绕过了 
Glc6P 分支点 , 并提供 了有关 Glc6P 对赖酸 合成施 加控制 的额外 信息。 

关于 发酵规 程和所 获结果 的详细 情况, 应 当参考 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 的 
原始 文献。 如果与 ATCC 21253 菌 的控制 发酵相 比较, GPI 突 变株则 表现出 在生长 期间所 
有胞 外代谢 物的比 生产速 率和比 消耗速 率都减 弱了。 其以 低的比 生长速 率生长 而以原 始菌株 
50% 的速率 呼吸。 所得的 最终生 物质浓 度也比 较低。 赖 氨酸最 终效价 大于控 制发酵 25%。 
与 3096 的 标准摩 尔得率 相比, 赖氨 酸合成 起始时 的瞬时 得率是 34%。 上述变 化可按 偏离标 
准发酵 来进行 解释。 然而, 这将 会导致 错误的 结论, 因为 根据对 由此发 酵数据 构建的 代谢通 
量图的 仔细检 查可以 看出, 它与 基准发 酵的差 异是最 小的。 此外, 产 物得率 的升高 并不持 
续, 终产 物效价 较高是 较长期 的运转 而不是 一个延 续的高 得率。 

表 10.3 给出了 测量的 和估计 的代谢 物积累 速率, 以 及反映 质量平 衡约束 的闭合 (clo- 
sure) 程度的 一致性 指数。 与控制 发酵相 比较, NFG068 发酵 的代谢 物积累 速率要 小将近 
2〜3 倍, 主要 是生物 质生长 减小的 结果。 图 10.5 的通量 分布图 与在同 样条件 下控制 发酵期 
间所 观测到 的非常 类似。 因此, 即使突 变使总 生长和 生产动 力学发 生显著 改变, NFG068 突 
变 株中的 GPI 活 动减弱 90% 也不 会导致 Glc6P 分支 点的通 量分配 发生任 何显著 改变。 突变 
不会显 著改变 赖氨酸 的瞬时 得率, 但在 生长期 间和生 产初期 降低了 通过网 络的比 通量。 这些 
结 果与拥 有刚性 分支点 的依赖 性网络 概念是 一致的 (参 看下面 内容及 5.4 节)。 



表 10.3 34.3h 时, NFG068 发酵的 代谢物 积累速 率的测 量值、 估计值 以及标 准偏差 



代谢物 


积 累速率 /mmo 卜 (L'h 广' 


代 谢 物 


积 累速率 /mmo 卜 (L*h 广' 


测量值 


估 计值① 


测量直 


估 计值① 


乙酸 


0± 1 


0.02 


赖氧酸 


3.16±0.2 


3.16 


丙氨酸 


0± 1 





NH3 


- 5.5±5.8 


-6.3 


生物质 


- 0.17±0.9 


-0.15 


02 


-22.7±2.3 


-23.0 


C02 


26.5±2.7 


26.2 


丙嗣酸 


0±1 





葡萄糖 


- 9.0±2.5 


-8.7 


海藻糖 


0.46± 1 


0.57 


乳酸 


0±1 


0.03 


缬氨酸 


0± 1 


0.08 



注: 数 据取于 31h 和 37.5h 的测量 结果。 一致 性指数 /! =0.09, 数 据取自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 



① 所估 计的速 率是那 些严格 满足质 量平衡 限制, 而且是 从估计 的通量 推导出 来的。 

要把 Glc6P 分支点 归为柔 性的, 或弱刚 性的, 或强 刚性的 (见 5.4 节), 对上述 每种情 
况将实 际结果 与期望 的扰动 结果进 行比较 是有启 发的。 如 果由于 GPI 对 Glc6P 的亲 和力比 
Glc6P 脱氢 酶高 (PPP 中的第 1 个醜 ), 而使碳 通量优 先进人 糖酵解 途径, 则 Glc6P 分支点 
是弱刚 性的。 如果 赖氨酸 得率受 弱刚性 Glc6P 分支 点的 限制, 那么 GPI 扰动 应当已 经提高 
了 得率, 因为 GPI 减弱应 当增加 Glc6P 并允 许更多 Glc6P 进入 PPP 途径。 但 这一点 并没有 
观 察到。 为 了研究 Glc6P 是强 刚性的 可能性 (即: 由于分 支点中 两个酶 的有力 调控, 通量分 
252 



葡萄糖 




LysE 生物质 

图 10.5 34.3h 时, NFG068 赖 氨酸发 酵的通 量分布 
通 量是根 据取于 31h 和 37. 5h 的测量 结果估 计的, 并经葡 萄糖吸 收速率 [示 于括 号中, mmol- 
归一化 处理。 改自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 



(L-h) 



配比是 不服从 变化的 ), 第 二个扰 动实验 是通过 使用葡 糖酸盐 作为碳 源来进 行的。 葡 糖酸盐 

基本 上绕过 Glc6P 分支点 而直接 进人戊 糖磯酸 途径。 结果, 如果 Glc6P 分支点 是强刚 性的, 
并限 制了赖 氨酸的 得率, 那么, 在葡 糖酸盐 上培养 C. glutamicum ATCC 21253 应 当提高 
赖氨酸 得率。 在没有 任何提 高的情 况下, 应 意味着 Glc6P 确实是 柔性分 支点, 而且 其能通 
过适应 其通量 分配比 而响应 于代谢 网络变 化着的 要求。 表 10.4 给出 了当以 葡糖酸 盐作为 碳- 
能 源时代 谢物积 累速率 的测量 值和估 计值。 应注意 的是, 单 独在葡 糖酸盐 上时, C. glutcu- 
mo^m ATCC 21253 生长并不好; 然 而一旦 加人葡 萄糖, 其 生长速 率又恢 复正常 (约 
0.3h_i)。 赖氨酸 合成开 始后, 一旦 培养基 中的葡 萄糖被 耗尽, 葡糖酸 盐作为 惟一碳 源时, 
就 得到表 10.4 中的 数据。 结果 表明, 瞬时摩 尔得率 不超过 3496。 其 它显著 的发酵 特征包 
括: 呼吸商 高于正 常水平 (1.35), 通 常观测 到的发 酵副产 物完全 没有。 缺少 副产物 合成使 
一致性 指数非 常令人 满意。 图 10.6 表示 从这些 数据所 得的通 量图。 对表 10.1 中的代 谢网络 
作 了下列 改进, 以 表示葡 糖酸盐 的附属 的化学 过程。 用下 式表示 葡糖激 醉 反应: 

- Glen _ ATP + Glcn6P + ADP 二 (10.15) 
式中, Glen 表示 葡萄糖 激嗨; Glcn6P 表示 6- 憐酸葡 糖酸。 

253 



而且 ppp 的氧化 性分支 分为两 个反应 : 

― Glc6P - H2〇 - NADP + Glcn6P + NADPH = (10.16) 

- Glcn6P - NADP + RibuSP + CO2 + NADPH = (10.17) 
此处 6- 磯 酸葡糖 酸内酯 酶反应 已经与 G6PDH 归并 在反应 (10.16) 中。 

表 10.4 用葡 糖酸盐 作碳源 时赖氨 酸发酵 中的代 谢物积 累速率 



代 谢 物 


积 累速率 /mmol 


(L-h) — 1 


代 谢 物 


积 累速率 /mmol'(L*h 广' 


测量值 


估计值 '1 


测量值 


估 计值① 


乙酸 


0±2 







赖氨酸 


5.48±0.4 


5.48 


丙氛酸 


0±2 




0.02 


NHi 


- 12.8±1.1 


-12.3 


生物质 


1.67±3.2 




1.72 


O2 


_48.0±4.8 


-48.0 


C02 


62.4±6.2 




62.4 


丙嗣酸 


0±2 





葡萄糖 


一 17.0±3.9 




- 17.0 


海藻糖 


0±2 


0.02 


乳酸 


0±2 







缬氣酸 


0±2 


0.03 



① 所估 计的速 率是那 些严格 满足质 量平衡 约束, 并从估 计通量 推导出 来的。 



注: 一致 性指数 /! =0.003。 数 据是进 入发酵 [8h 和 21h 时采 集的。 引自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a)]。 

当 根据表 10.4 的速率 计算通 量分布 图时, 反应 (10.16) 表 现为负 通量。 这 是由于 
NADPH 的 合成速 率显著 高于生 物质和 赖氨酸 合成所 需而造 成的。 然而, 由于非 常大、 正的 
标准自 由能, 使该 反应本 质上不 可逆, 因此, 反应 (10.16) 不 能逆向 进行。 为 了允许 
NADPH 达到拟 稳态, 从网 络中删 除反应 (10.16), 并用一 直接的 NADPH 氧 化反应 代替: 

-2NADPH — 〇2 + 2H2〇 + 2NADP = (10.18) 

应注意 的是, 上述 反应只 是用一 简单的 氧化反 应表示 NADPH 的 消耗。 另一方 法可以 
是 转氛酶 反应。 在 这个反 应中, NADPH 被 氧化为 NADP, 同时, NAD 还原为 NADH + 。 
在 进行前 面的研 究时, 并未证 实存在 转氢酶 活性, 因此, 反应 (10.18) 的 加入可 以满足 
NADPH 拟稳态 和代谢 物质量 平衡。 进行 这些修 改后, 所 得的通 量分布 图如图 10.6 所示。 
除 戊糖碟 酸途径 (PPP) 之外, 通 量分布 图与控 制发酵 的相当 相似。 使 用葡糖 酸盐所 产生的 
过量 NADPH 没 有增加 赖氨酸 得率。 正如 以前建 议的, 这 强烈地 暗示赖 氨酸得 率不受 
NADPH 的可利 用性所 限制, 而且 Glc6P 也不是 刚性分 支点。 结合 GPI 通量 分析的 结果, 
可以得 出以下 结论: Glc6P 分支 点确实 是一个 柔性分 支点, 容易 满足对 产物和 生物质 合成的 
NADPH 需 求变化 而产生 响应。 

虽然 本节的 讨论主 要集中 于延长 期内恒 定生理 状态的 通量图 特征的 推导, 但应 指出的 

是, 只要不 违背有 关胞内 代谢物 的稳态 假设, 而 且可以 在线测 量胞外 代谢物 的积累 速率, 那 
么, 也可获 得瞬态 期间的 胞内通 量图。 在 这些条 件下, 可 以进行 在线代 谢通量 分析, 而且通 
常可以 得到具 有重要 价值和 意义的 结果。 

已对 C. glutamicum 的 分批赖 氨酸发 酵进行 了这样 的在线 代谢通 量分析 (Takiguchi 
等人, 1997), 图 10.7 描 绘了通 过戊糖 碟酸途 径的计 算通量 (r7) 与赖氨 酸通量 (rs) 之间 
的 关系。 应注 意以下 三点。 

* 第一, 可以看 出有两 个不同 的生理 状态, 其中一 个是细 胞生长 (状态 1), 另 一个是 
赖氨 酸合成 (状态 2); 以及 从状态 1 到状态 2 过渡期 间所得 到的瞬 态点。 

* 第二, 状态 2 中的 直线斜 率等于 1/2, 反 映了赖 氨酸合 成时对 NADPH 的化学 计量需 
要。 参照式 (10.8), 可以 看出, 假设 转氛酶 活性存 在时, 即: 实 质上以 NADH 和 NADPH 
的形 式使还 原当量 相等, 合成每 摩尔赖 氨酸需 2mol NADPH。 当 不存在 THD 活 性时, 图 
254 i 



海藻糖 



葡萄糖 



葡 糖酸盐 

I00|(17.0) 
Glcn-6-P 




LySE 生物质 

图 10.6 葡糖酸 盐发酵 19h 时的 代谢通 量分布 
通 量是根 据取于 18h 和 21h 时 的测量 结果估 计的, 并 经葡糖 酸盐吸 收速率 [示 于括 号中, mmo 卜 (L-h)"'] 
归 --化 处理。 注意: 根据 文中的 讨论, PPP 的第 1 个 雜已被 去掉, 并增 加了葡 糖酸激 醇 反应和 NADPH 
的直 接氧化 反应, 从 而消除 了不一 致性。 改自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 

10.7 中表 示状态 2 的直 线斜率 应等于 1/4 以反 映赖氨 酸合成 新的化 学计量 关系。 

* 第三, 通 过戊糖 磯酸途 径的通 量与赖 氣酸生 产之间 的线性 相关性 表明: 戊糖磯 酸途径 
通 量具有 为满足 赖氣酸 的生物 合成需 求而进 行自我 调节的 能力。 这 是本节 讨论的 Glc6P 分 

支点的 柔性的 补充的 证实。 应注意 的是, 这些信 息中没 有一件 能从薛 活性的 分析中 得到。 在 
进行图 10.7 的实 验时, 醜 活性保 持相当 平稳。 
在 PEP/Pyr 分 支点的 通量扰 动分析 

由于 PEP 羧化酵 反应和 Pyr 竣化 酵反应 这两个 回补反 应对赖 氨酸合 成的贡 献尚未 描述, 
为简单 起见, 将 PEP 和 Pyr 组合在 一起。 缺乏这 样的信 息时, 要区别 这两个 羧化反 应是不 
可 能的, 因此, 将这 两个接 化反应 组合为 一个。 丙酮 酸代表 一个重 要的分 支点, 这是 因为, 
除了 回补反 应外, 在 赖氣酸 合成途 径中, 它 也在二 氢吡啶 二羧酸 合成醇 反应中 与天冬 氨酸半 
醛进行 縮合。 此外, 它可在 丙酮酸 脱氧雜 复合体 (PDC) 反应中 形成乙 酰辅酶 A, 并在 
TCA 循 环中进 一步被 氧化。 如果 PEP/Pyr 分支点 是弱刚 性的, 则由于 PDC 酷对丙 酮酸的 
亲 和性比 PEP 和 Pyr 羧化醇 的要高 得多, 因此, 碳 通量优 先进入 TCA 循环。 在这 种情况 

255 





下, TCA 循环通 量相对 不受赖 氨酸途 径中通 
量 变化的 影响, 而产物 得率受 丙酮酸 可利用 
性的 限制。 因此, 如果 赖氨酸 得率受 到弱刚 
性丙 酮酸分 支点的 损害, 那么, PDC 的减弱 
应增大 丙酮酸 的可利 用性, 从 而提高 赖氨酸 
得率。 另一 方面, 如果 赖氨酸 得率低 是由于 
PEP/Pyr 分支点 的强刚 性或者 回补活 性非常 
低, 那么, PDC 减弱应 导致某 些中间 代谢物 
的分泌 或总网 络通量 降低。 



图 10.7 通过 戊糖隣 酸途径 的通量 (r7) 和流 
向 赖氨酸 的通量 (rs) 的相 平面图 
数据 取自分 批发酵 的不同 阶段。 
改自 Takiguchi et al (1997) 



为 了检验 PEP/Pyr 分支点 的刚性 通量分 
配 限制赖 氨酸得 率的可 能性, 进行了 两个扰 
动 实验。 第 一个实 验包含 C. glutamicum 
ATCC 21253 的一株 PDC 减 弱突变 体的分 
离、 发酵 及通量 分析。 第二个 实验涉 及在赖 
氨 酸过量 合成开 始之后 通过加 人特异 抑制剂 
氟 丙酮酸 (FP) 而抑制 PDC 活性, 然后监 
测 PEP/Pyr 分支点 的通量 变化。 



在常 规葡萄 糖培养 基上, PDC- 减 弱突变 



株表现 出生长 困难, 因此 在培养 基中加 入了乙 酸钾。 加入 乙酸盐 的生长 促进作 用与该 菌株的 
PDC 减弱相 一致。 由于 (a) 通量计 算是在 乙酸盐 消耗完 之后进 行的, 以及 (b) 葡 萄糖存 
在时 乙酵酸 支路被 抑制, 因此, 乙酸盐 的加入 并不会 使通量 分析复 杂化。 与控 制发酵 相比较 
而言, 生 长速率 及所有 胞外代 谢物的 积累- 消耗速 率严重 减弱, 但它们 随时间 的变化 图与控 
制发 酵中观 察到的 相似。 比 速率大 约降低 到控制 发酵的 1/2〜1/3。 然而, 在赖 氨酸生 产期, 
得到 的通量 分布图 [VallinoandStephanopoulos, (1994b)] 与控 制发酵 的非常 相似。 此 夕卜, 
PEP/Pyr 分支点 的通量 分配比 也与控 制发酵 类似。 因此, PDC 活 性减弱 98% 没有改 变主分 
支点 的通量 分布, 也 没有导 致赖氨 酸得率 提高, 虽然 其确实 使总网 络的通 量显著 减弱。 

如果赖 氨酸得 率仅受 弱刚性 PEP/Pyr 分支 点限制 (即, 如 果碳优 先进入 TCA 循环, 以 
致赖氨 酸合成 实质上 是丙酮 酸限制 的), 那么, PDC 减弱 应当提 高丙酮 酸的利 用率和 赖氨酸 
得率。 由于 这一点 并未观 察到, 因此, 可以得 出以下 结论: 赖氨 酸得率 不是由 弱刚性 PEP/ 
Pyr 分 支点所 限制。 

如前 所述, 赖 氨酸生 物合成 发生在 一个依 赖型网 络中。 在 这种网 络中, 必 须协调 分配所 
有 主分支 点上的 通量, 以 获得高 得率。 如果 一个依 赖型网 络中有 一个或 多个主 分支点 是刚性 
的或 者包含 活性非 常低的 反应, 那么, 通量 分配就 不能协 调一致 改变来 满足产 物的化 学计量 
要求。 此外, 如果 代谢控 制阻碍 中间代 谢物的 分泌或 积累, 那么 一个依 赖型网 络的某 一刚性 
节 点的任 何支路 的减弱 将导致 总通量 降低。 因此, 从 PDC 的减 弱中观 察到的 结果与 依赖型 
网 络是一 致的, 该网 络拥有 刚性分 支点或 由一个 支路的 活性所 限制。 由于 Gk:6P 分 支点是 
柔 性的, 因此, 该网 络的刚 性一定 是由于 PEP/Pyr 分支 点的反 应之一 的刚性 或限制 所带来 
的。 这 个结论 已通过 使用氟 丙酮酸 (FP)(PDC 活 性的抑 制剂) 进行的 抑制实 验得到 了进一 
步的 证实。 紧接着 FP 的 加人, 呼 吸急剧 下降, 并 伴随着 比生长 速率减 小以及 胞外丙 酮酸的 
积累。 但赖氨 酸合成 速率和 葡萄糖 消耗速 率未受 影响。 加人 FP 儿个小 时后, 呼吸 重新开 
256 



始, 分泌的 丙酮酸 被重新 消耗, 而 且可能 是由于 丙酮酸 的重新 消耗, 葡 萄糖吸 收表现 为暂时 

下降。 扰动的 暂时特 性无疑 是由于 FP 的破坏 作用, FP 在短 时间后 可被代 谢掉。 余 下来的 
发 酵表现 出类似 于控制 发酵的 特征。 在 这种情 况下, 计算出 通量, 得到 的通量 图描述 了丙酮 
酸从 TCA 循环 到丙酮 酸分泌 的转向 情况。 与 控制发 酵比较 而言, 其余 途径中 的通量 分布相 
对不受 影响。 这些结 果在图 10.8 中 进行了 描述, 其 分别表 示控制 发酵和 扰动发 酵围绕 
PEP/Pyr 分支点 的通量 分布。 相对于 PEP 合成 速率, 通量 已经归 一化。 FP 对 PDC 的抑制 
作用 可使受 PDC 支持 的通量 降低约 50% , 但分 支点的 通量分 布仍相 对未受 影响。 




赖氨酸 AcCoA 赖氨酸 AcCoA 

(a) (b) 

图 10.8 PEP 和 Pyr 主分 支点周 围已用 PEP 合成速 率归一 化的通 量分布 
(a) 为 13. 5h 时的 控制 发酵, (b) 为 13. 5h 时的氟 丙嗣酸 (FP) 扰 动发酵 
实心矩 形表示 FP 抑制的 位置、 PyrE,, 表示 胞外丙 兩酸。 不是所 有涉及 PEP、 草酰 乙酸, 
或丙酮 酸的通 量都被 标出: 引自 Vallino and Stephanopoulos (1994b) 

氟丙酮 酸抑制 实验可 视为在 PDC- 减弱突 变株中 所展现 出的对 TCA 通量 的更长 期破坏 
的瞬态 模拟。 在 PDC- 减 弱突变 株中, 葡萄糖 吸收、 糖 酵解和 TCA 这 些通量 降低到 野生型 
的 1/3〜1/2, 而且观 察不到 中间代 谢物的 积累或 分泌。 在氟 丙酮酸 抑制条 件下, 正 常情况 
下 较高的 PDC 通 量急剧 降低, 并促使 丙酮酸 作为糖 酵解通 量的一 个出口 而分泌 出来, 糖酵 
解通 量在加 入氟丙 酮酸之 后仍保 持较高 水平。 偏爱 回补途 径的通 量分配 的变化 在两个 扰动实 
验中都 没有观 察到。 结果, 尽 管在羧 化反应 以及与 二氛吡 徒二羧 酸合成 酶反应 中的天 冬氨酸 
半醛 (ASA) 縮合反 应中, 丙酮酸 的可利 用性相 当高, 但赖氨 酸得率 仍未受 影响。 可以得 
出 结论: 赖氨 酸得率 不受在 TCA 循环 中丙酮 酸优先 消耗所 限制, 因此, PEP/Pyr 分 支点不 
是弱刚 性的。 赖氨酸 生产因 而或受 强刚性 PEP/Pyr 分支点 限制, 或受 回补反 应的低 活性的 
限制。 要提高 赖氨酸 得率, 应集 中解除 PEP/Pyr 分 支点一 些反应 (PDC、 Pyr 羧 化嗨、 
PEP 竣 化醇) 的 调节, 或 试图提 高回补 反应的 通量, 最 可能的 是催化 丙酮酸 羧化的 反应。 
10.1.4 C. glutamic 賺 特定 缺失突 变株的 代谢通 量分析 

在前 面几节 中发现 了两个 在生理 学和生 物技术 方面具 有重要 意义的 问题, 即: 由 超活性 
戊糖 隣酸途 径产生 的过量 还原当 量的消 耗方式 的阐明 , 以 及为生 物质和 产物合 成提供 碳的精 
确回补 路线的 确定。 由于这 些问题 不能用 通常的 野生型 菌株来 解决, 因此, 寻 找了具 有简化 
了 的遗传 背景的 突变株 以易于 研究。 特 别地, PEP 羧化薛 (PPC) 和丙酮 酸激酶 (PK) 被 
作为 目标, 这 是由于 这两个 酶在经 TCA 循环产 生能量 的碳代 谢物的 供应途 径中, 或 者在为 
通过 OAA 前 体合成 而进行 的生物 合成的 碳代谢 物的供 应途径 中都起 着关键 作用。 这 两个薛 

257 



组合 的破坏 突变株 (disruption mutants) 是 通过转 移接合 (transconj ligation) 构 建的, 在 
标 准分批 发酵中 培养, 而且在 代谢通 量分析 的框架 内对结 果进行 了评价 (Park et al, 
1997a )o 表 10.1 的生物 反应网 络增加 了下列 5 个 反应以 考虑附 加的可 能性: 丙酮酸 羧化反 
应 (10.19)、 转氣 酶活性 (10.20) 以及 另外三 个胞外 代谢物 I 蛋白质 [PROP, (10.21)]、 
甘油醛 [GLY, (10.22)] 及二 经丙酮 [DHA, (10.23)]f。 在 上述突 变株的 发酵培 养基中 
发现 PROP、 GLY、 DHA 这 三个胞 外代谢 物发生 积累。 

-Pyr-CO2-ATP + OAA + ADP = (10.19) 

(丙 酮酸) (草醜 乙酸) 

- NADPH - NAD + NADP + NADH = (10.20) 

- Sue + PROP + CO2 = (10.21) 

(號 珀酸) (丙酸 ) 

-G3P-ADP + GLY + ATP = (10.22) 

(3- 碟酸甘 油酸) (甘 油酵) 

- G3P - ADP + DHA + ATP = (10.23) 

(二经 丙銅) 

实验 结果总 结在表 10.5 中, 并 给出了 4 种菌株 在单纯 生长期 (I) 和没 有生长 且高赖 

氨酸 合成期 (n) 的 比生长 速率、 葡萄糖 比消耗 速率、 赖 氨酸比 合成速 率以及 在葡萄 糖培养 
基 上的细 胞质量 得率和 赖氨酸 得率。 

表 10.5 C. glutamicum ATCC 21253® 与缺失 突变株 fippc、 \pyk 及 fippcHpyk 
在两个 不同时 期的发 酵结果 比较② 



参数 


I 期 


n 期 


wt 


厶/) pf 


Lpyk 


厶/) 厶/) :yjfe 


wt 


^PPc 


Apyk 






0.35 


0.26 


0.27 


0.12 












0.54 


0.59 


0.50 


0.36 












0.59 


0.59 


0.53 


0.33 


0.35 


0.29 


0.25 


0.11 
















0.08 


0.11 


0.04 


0.02 
















0.25 


0.27 


0.17 


0.21 



① wt 表示 野生型 菌株。 

② 比生长 速率, 比速率 及得率 分别以 h 



g'g 



(消 耗的葡 萄糖) 表示。 



i(DW)'h- ' 及 g,g- 
C. glutamicum 中 丙嗣酸 羧化对 PPC 的补偿 

表 10.5 的 结果应 根据图 10.9 来 评价, 图 10.9 总结 了导致 OAA 生成的 可能的 回补路 
线。 基 因的破 坏使生 长及赖 氨酸生 产本质 上未受 影响这 一事实 表明: 在 C. glutam- 
/omz 菌中存 在一条 (一些 ) 额外 的回补 途径。 可 能地, 有两条 替代途 径用于 OAA 的 合成: 
(1) 一 条是通 过除了 PPC 外的 一些酷 (诸如 PEP 羧 激薛、 PEP 羧 基转磯 酸酶, 或 转羧化 
酶) 作用的 PEP 接化; (2) 另一条 是经丙 酮酸的 羧化。 

用 pyk 和/) pyk 突变株 所得结 果并不 支持一 条替代 PEP 羧化 途径的 存在。 如 果这样 
一条途 径真的 存在, 那么, 在/ )3« ^突变 株中, PEP 转化为 丙酮酸 的阻断 应导致 PEP 积累并 
增加 OAA 合成 (因而 也增加 赖氨酸 合成) (注意 : 葡萄糖 PTS 运输的 丙酮酸 足够用 于与天 
冬氨酸 半酵缩 合)。 相反 的是, 赖氨 酸的生 产能力 和得率 分别减 小了约 50% 和 30%, 这与丙 
酮酸羧 化是主 回补途 径这一 观点相 符合: 因为在 />3,^ 突 变株中 丙酮酸 可用性 降低, 回补通 
量 和赖氨 酸生产 能力也 下降。 
258 




(a) 野生型 (b)P/K 突变株 (c)/?yA 突变株 (e)P/?c/^A 突变株 

图 10.9 不同 突变株 中围绕 PEP 和 丙酮酸 节点的 通量图 

带 箭头曲 线的粗 细表示 通量的 大小。 引自 Parketal (1997a) 



同 样地, 如果 PEP 羧 化是主 要回补 途径, 则在 /)/>C 突 变株情 况下, 应当 观察到 赖氨酸 
生产 下降。 然而, 这并未 得到表 10.5 中的 数据的 支持。 最后, 在该 C. glutamicum 菌株 
中丙 酮酸羧 化是主 要回补 途径这 一假设 已被/ >A: pyk 双突 变株中 观察到 的生长 及赖氨 酸生产 
均 减弱所 证实。 在 这种情 况下, 丙酮 酸生成 的惟一 路线是 PEP: 葡 萄糖碟 酸转移 酶系统 
(PTS), 对于输 人的每 分子葡 萄糖, 其产生 1 分 子的丙 酮酸。 显然, 可 用于经 丙酮酸 羧化而 
进行 OAA 合 成及用 于经丙 酮酸脱 氣酵而 进行乙 酰辅酷 A 合 成可利 用的丙 酮酸都 较少。 这就 
限制 了能量 和生物 合成前 体物的 产生。 由于 在与天 冬氣酸 半醛的 缩合以 合成赖 氨酸的 步骤中 
一 定也会 有一些 丙酮酸 流失, 因此, 在赖氨 酸合成 阶段这 种影响 就更为 严重。 因此, 这些数 
据为 丙酮酸 羧化活 动作为 这些菌 株中的 主回补 途径的 存在提 供了强 有力的 支持。 

转氛 晦活性 的发现 

在 这个网 络中, 有 40 个代谢 物参与 了总共 39 个 反应。 这意 味着有 39 个未知 通量和 40 
个 方程, 原 则上, 这已足 够为系 统提供 一个惟 一解, 以及 为生化 假设和 发酵测 量结果 的总一 
致性检 验提供 一个剩 余度。 然而, 在试 图求解 之前, 必 须先建 立非奇 异的, 且 存在惟 一解的 
化 学计量 矩阵。 例如, 如果 PEP 和 丙酮酸 羧化反 应都存 在于网 络中, 则矩阵 G 是奇 异的, 
这表明 PEP 接化 通量不 能仅根 据胞外 测量的 丙酮酸 羧化通 量独立 确定。 当 THD 或 PYK 活 
性 至少有 一个存 在时, 情 况也是 这样。 然而, 对于 THD 和 PYK 活性都 缺失的 菌株, 矩阵 
G 则变 为非奇 异的, 且 PEP 和丙 酮酸羧 化通量 可独立 确定。 

显然, 有 很多可 能性要 考虑, 这取决 于菌株 的遗传 背景。 表 10.6 总 结了关 于矩阵 G 性质 
的 结果, 其 对应于 4 个关 键薛: PPC、 rc、 THD 及 PYK 的所 有可能 排列相 对应的 16 种 情况。 
与 矩阵奇 异性之 一起, 同 时还提 供了每 种组合 的生化 可行性 的行。 由于没 有任何 菌株可 在缺少 
这两 个回补 反应的 情况下 生长, 因此, PPC 和 PC 活性 都缺失 的菌株 被认为 是不可 行的。 

对于 每个突 变株, 必须重 新构建 化学计 量矩阵 G, 以 便反映 相应的 遗传背 景和酶 反应数 
据。 反映 PYK 活性存 在的野 生菌, 在给予 对应于 回补反 应确切 性质适 应性的 时候, 可用 
Gi、 G2、 G5、 G6、 G9 或 Gio 中的 任何一 个来 描述。 Gi、 G2、 G5 是奇 异的, 因此, 对 于胞内 
通量, 仅可对 G6、 G9 和 Gio 的情 况进行 求解。 从矩阵 G9 的结果 表明: THD 通量非 常高, 
与糖酵 解通量 的大小 相近。 由于 这样的 高通量 并未得 到所测 THD 活性的 支持, 因此, 这种 
情形应 排除。 不可能 根据通 量分析 来区别 PEP (Ge) 羧化 途径和 丙酮酸 (Gio) 羧化 途径的 
可 能性, 这是因 为这二 者都产 生同样 的误差 估计。 事 实上, 除了 回补通 量是分 别通过 PPC, 

259 



表 10.6 对于各 种途径 结构的 化学计 量矩阵 G 的性质 



反 应 


1 


2 


3 


4 


5 


6 


1 


8 


9 


10 


11 


12 


13 


14 


15 


16 


36(PPC) 


+ 


+ 






+ 


+ 


+ 


+ 


















37(PC) 






+ 


+ 


- 


- 


- 


- 


+ 


+ 


+ 


+ 


- 


- 


- 


- 


38(PYK) 


































39(THD) 


































矩阵 奇异性 


S 


S 


S 


N 


S 


N 


N 


N 


. N 


N 


N 


N 


N 


N 


N 


N 


生化 可行性 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


F 


I 


I 


I 


I 



注: 考虑了 16 种 情况。 每种情 况包括 一组基 本反应 [包 含反应 (10.21) 〜反应 (10.23), 以及表 10.1 中除 PYK 和 
PPC 之外的 所有反 应], 以及 每列中 所注明 的附加 反应。 反应 (36) 表示 PEP 羧 化薛的 薛反应 步骤, 反应 (37) 表示丙 
兩酸羧 化酷的 酶反应 步骤, 反应 (38) 表示 丙兩酸 激薛的 酵反应 步骤, 反应 (39) 为转 氛酷的 醉 反应 歩骤 C 縮写: +, 
反应 存在; -, 反应不 存在; S, 矩阵 G 是奇 异的; N, 矩阵 G 是非奇 异的; F, 途 径在生 物化学 上是可 行的; I, 途径在 
生物 化学上 是不可 行的。 



或 PYK 和 PC 之外, 这两个 背景都 给出相 同的通 量解。 这意味 着基于 G6 和 Gio 的解 的任何 
线 性组合 都是可 能的, 即: 通过 PEP 羧化 和丙酮 酸羧化 的碳流 都是可 能的。 

对于/ j/jc 突 变株, 根据 前面的 结果, 以及 i 3 C- 标记 研究所 提供的 进一步 支持, 主 要关注 
丙酮酸 羧化活 性存在 的情况 (G9〜Gi2)。 i 3 C- 标 记研究 表明, 这 条途径 在体内 (in vivo) 是 
有效的 (Parketal, 1997b)。 在矩阵 G9〜Gi2 表示的 4 种可能 性中, Gu 和 Gi2 被 剔除, 因为 
它 们对应 于没有 PYR 活性, 与测 量结果 相反。 在其 余两个 可能性 G9 和 Gk) 中, Gu) 是最可 
能的, 因为 它的总 一致性 指数的 值明显 更高。 对于 />/^「突 变株, THD 活性即 使有也 很小, 
这个结 论得到 了体外 (in vitro) 活性测 量结果 的支持 (表 10.7; Parketal, 1997a )o 

在/ >3v^ 突 变株情 况下, 分析 了如下 化学计 量关系 (注意 : G3 是奇 异的, 而 Gi5 和 Gi6 不 
是可行 的): G4, G7, Gg, Gu 及 Gi2。 由于 不能满 足冗余 方程, 且产 生非常 高的一 致性指 
数, 要剔 除情况 Gs 和 Gi2。 由 于导致 TCA 循环 通量为 负值, Gu 的 解也要 去掉。 同 样地, 
由于得 到丙酮 酸接化 途径的 通量为 负值, 基于 G4 的解 是不可 能的。 结果, G7 是该突 变株最 
可 能的化 学计量 关系。 应注意 的是, 经 THD 步骤 的高通 量也到 得酶反 应数据 (表 10.7) 的 
支持。 /)A:/):yy^ 突 变株的 发酵数 据也按 类似于 分析/ >3,/^ 突变株 的方法 进行了 分析。 类 似地, 
基于 Gu 的估 计是该 突变株 的最合 理解。 



表 10.7 C. glutamicum ATCC 21253 (野 生型) 和 3 株缺 失突变 

株中 所选酶 的活性 /nmol'g I (蛋 白质) 'mirr' 



菌 株 


丙爾 酸激醇 


PEP 羧化醇 


转氢醇 


菌 株 


丙嗣 酸激酷 


PEP 羧化解 


转氛畴 


野生型 


822 


344 


220 


厶/) 


n.d® 


279 


310 




677 


n.d. 


150 


AppcApyk 


n.d. 


n.d. 


490 



① n.d. 表示 未检测 



为了 从实验 上证实 如同代 谢通量 分析所 建议的 THD 的 功能, 在这 4 株菌 株的粗 提物中 
测量了 THD 活性, 这 4 株菌 株是在 1L 摇 瓶中用 PMB 培养基 培养, 并 在指数 期中期 收获。 
表 10.7 的第 4 栏 给出了 THD 活性的 数据。 pyr 突 变株和 Av々 突 变株的 THD 活 性明显 
高 于其它 两株, 正如 胞内通 量分析 表明的 那样, 胞内 通量分 析显示 PPP 通量和 NADPH 合 
成速率 升高。 

应注意 的是, 通量一 致性检 验失败 表明了 THI) 存在, 而且也 指出: NADPH 积 累是所 
观察到 的不一 致性的 最可能 原因。 从 通量分 析得到 的其它 观察结 果是: 在/) :^/^ 突变 株中, 
260 



特别是 在々/ >c Ay/^ 突变 株中, 糖 酵解通 量显著 降低, 而 PPP 通 量随之 升高。 对于上 述突变 
株, 葡萄糖 -6- 憐 酸异构 酶的通 量是反 向的, 而且展 现减少 的回补 通量。 最后, 在分 批发酵 
过 程中, 比葡 萄糖运 输速率 减小, ATP 需求 也遵从 同样的 趋势。 然而, 发现 后者在 四个菌 
株中 是很相 似的, 表明这 4 个 遗传背 景的相 对恒定 的比代 谢能量 需求。 图 10. 9 通过 列出这 
3 个突 变株的 最可能 途径, 概括 了本节 的分析 结果。 

10.2 哺乳 动物细 胞培养 中的代 谢通量 

第 2 个例子 是将代 谢通量 分析用 于哺乳 动物细 胞培养 中的能 量代谢 途径。 细胞培 养作为 
生产复 杂药物 蛋白的 重要技 术已经 出现。 在重 组产品 (在 原核细 胞中表 达的简 单非糖 基化蛋 
白质: 人生长 激素、 胰 岛素、 a- 干 扰素) 第一 次浪潮 之后, 第二 代生物 技术产 品主要 集中于 
生产 分泌在 哺乳动 物培养 基中的 活性糖 基化的 复合糖 蛋白。 用于 单克隆 生产的 中国仓 鼠卵细 
胞 (CHO)、 BHK 细 胞及杂 交瘤细 胞是最 通用的 系统。 当前, 通过哺 乳动物 细胞生 产的一 
些 生物医 药已在 市场上 销售, 诸如: 促 红细胞 生成素 (EPO)、 因 子環、 组织 纤溶酶 原激活 
物 (TPA) 以及 粒细胞 集落刺 激因子 (G-CSF) 等。 还有很 多在等 待法规 批准, 有 望在不 
久的将 来进入 市场。 哺 乳动物 细胞是 生产这 些分子 的装置 手段, 因此, 在 过去十 年里, 它们 
的重要 性迅速 上升。 

哺乳动 物细胞 用于范 围广泛 的复合 糖蛋白 的生产 已变得 明显, 人们 就以极 大的努 力尝试 
提高 这些系 统的培 养密度 和生产 能力。 哺乳 动物细 胞比微 生物细 胞更加 脆弱, 而且对 生长因 
子和营 养的要 求更为 苛刻。 在 哺乳动 物细胞 培养中 获得高 生产能 力的主 要障碍 就是在 这些系 
统中可 得到的 细胞密 度低。 其主要 原因, 特 别是在 分批培 养时, 是细胞 生长期 间葡萄 糖代谢 
和谷氨 醜胺代 谢的抑 制性副 产物的 积累, 如乳酸 和氨的 积累。 降 低培养 基中这 些副产 物的量 
有助 于得到 高细胞 密度及 产物积 累速率 的相应 增加。 由 于上述 副产物 与中央 碳代谢 直接有 
关, 因此, 自然要 进行代 谢通量 分析, 并确 定导致 副产物 生成的 主要碳 水化合 物和氨 基酸通 
量的 分布。 

时 常地, 细 胞培养 中的另 一个问 题是细 胞生存 力低, 特 别是细 胞密度 高时。 这是 由于程 
序性细 胞死亡 (凋亡 ) 的诱导 作用。 凋 亡过程 已在工 业和实 验室观 察中, 对与 能量代 谢直接 
有关 的乳酸 吸收、 丙 氨酸及 其它代 谢产物 分泌, 进行了 广泛的 关联。 最后, 大 量观察 结果表 
明了 葡萄糖 利用率 作为分 泌产物 质量的 决定因 子的重 要性, 特别 是因为 产物质 量与糖 基化位 
点 占用率 有关。 糖基 化反应 中的糖 利用率 是一个 问题, 它可通 过分析 6- 磯酸 葡萄糖 分支点 
的 碳通量 分布来 阐明。 Glc6P 是进 入戊 糖憐酸 途径的 主要入 口点, 该途 径为完 全糖基 化蛋白 
的生产 提供碳 前体。 胞内 通量的 确定, 特别 是当与 胞内代 谢物浓 度和酶 活性结 合在一 起时, 
可提高 我们对 这些细 胞中蛋 白质糖 基化的 理解。 
10.2.1 胞 内通量 的确定 

本节将 总结对 杂交瘤 细胞系 ATCC CRL 1606 [其 产生 抗人纤 连蛋白 的免疫 球蛋白 G 
(IgG)] 进行 代谢通 量分析 所做的 工作。 将说 明如何 从细胞 培养数 据来估 计这些 通量, 以及如 
何通过 比较预 测的同 位素富 集度与 在细胞 培养基 中加入 i 3 C 标记的 葡萄糖 之后在 分泌的 乳酸中 
所 测的同 位素分 布来进 一步证 实这些 通量。 杂交 瘤细胞 是采用 标准的 DMEM 培养基 
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 在 2L 充分 搅梓的 Celligen 生物反 应器中 进行培 养的。 有 
关 实验规 程的详 情可査 看原文 (Zupke and stephanopoulos, 1994; Zupke et al, 1995)。 表 10.8 
列出 了两个 不同实 验中所 测的代 谢物。 在实验 1 中, 当细胞 浓度为 4.8X105 个细胞 •mL—i 时加 

261 



人 标记葡 萄糖, 而且乳 酸盐允 许积累 20h。 在实验 2 中, 细胞 浓度为 6.8X105 个细胞 'ml- 1 时 
加人葡 萄糖, 允 许乳酸 盐积累 10h。 两次 实验数 据如表 10.8 的两列 所示。 



表 10.8 在用 于代谢 通量估 计的杂 交瘤细 胞培养 中所测 的速率 



代谢物 


实验 1 


实验 2 


代谢物 


实验 1 


实验 2 


葡萄糖 


- 2.92±0.16 


- 3.9±0,19 


生物质 


3.71±0.19 


3.97±0.20 


丙氣酸 


0.31±0.03 


0.31±0.03 


02 


- 2.0±0.2 


一 2.0±0.2 


乳酸盐 


6.2±0.32 


7.03±0.35 


C02 


2.6±0.3 


2.6±0.3 


谷 氣銑胺 


一 0.86±0.09 


一 1.1±0.1 


IgG 


0.%±0.1 


0.99±0.1 




0.73±0.07 


- 0.70±0.07 









注: 所有 速率以 lO — iGmmo 卜 (细胞 — i)'h_i 表示。 负 号表示 消耗, 生 物质和 IgG 的 单位分 别是以 C-mol 和 N-mol 
表示。 



通过向 生物反 应器液 面上空 间通人 氮气, 并监 测溶解 氧浓度 (Co) 从 60% 衰减 至大约 
20%, 对 氧比吸 收速率 ro, [mmo 卜 (细胞 — i)*h — 1] 进 行动态 测量。 下 式用来 计算氧 比吸收 

速率, 其中传 质系数 )^La 是 单独测 量的: 

jf=kLa(co*-cJ-r,x (10.24) 

式中, c。^ 为与 气相平 衡时的 溶解氧 浓度; :t 为生 物反 应器中 的细胞 浓度。 
在哺 乳动物 细胞培 养中, 由于 在培养 基中用 碳酸氢 盐控制 pH, 总 CO2 产 生速率 的测量 
因 而变得 复杂。 由于 C02/ 碳酸氣 盐相互 作用, 液相中 可能有 C〇2 积累或 损失, 其不 能由出 
口气中 C02 浓度的 测量所 检测。 在 细胞培 养基常 见的条 件下, 碳酸复 盐更易 生成; 然而, 
在高 通气速 率下, 会存在 C02 的 汽提。 为了正 确计算 C02 的总生 产速率 (CPR), 水相中 
C02 的积 累速率 必须加 上气相 C02 的挥发 速率。 C02 挥 发速率 (CER) 是按 F(c。ut- cj 
测 量的, 此处 F 为气体 流速, 。和 C。ut 分别 是生物 反应器 进出气 流中的 C02 浓度。 通过使 
用没有 C02 (即: c,D = 0) 的瓶装 气体, 将排出 的气体 通入饱 和碳酸 溶 液中, 并测 量溶液 
的 pH 值, 这样就 可测量 排出气 流中的 C02 浓度。 在平 衡时, 碳酸^ 溶液的 pH 值与 气相中 
的 C02 浓度 成线性 关系。 液相 C02 浓度是 这样测 量的: 将没有 细胞的 样品在 4t: 下 存放, 
并用 测定试 剂盒薛 法测量 C02/ 碳酸氧 盐的总 浓度。 在 杂交瘤 细胞的 分批培 养期间 (大约 
3.5d), 发 现液相 CO2 浓度变 化非常 显著: 首先是 由于通 气气体 的汽提 效应而 降低, 然后是 
因细 胞呼吸 导致的 C02 连续 积累而 上升。 胞外代 谢物的 比生成 速率是 通过测 量相对 短的时 
间 (10~15h) 内的 胞外代 谢物浓 度来确 定的, 以致培 养条件 和细胞 代谢没 有显著 变化。 根 
据 下式, 对浓度 数据进 行最小 二乘法 拟合: 



式中, 为测量 浓度; cs.o 为代谢 物的初 始浓度 (即 10〜15h 测量 期起始 的浓度 ); 
为 代谢物 的单位 吸收速 率或单 位消耗 速率; •TO 为细 胞初始 浓度; 为细胞 比生长 速率。 在 
谷氨 酰胺情 况下, 考虑到 谷氣醜 胺自发 分解产 生氣, 上式 要进行 改进。 

在 深层培 养中, 哺乳动 物细胞 的主要 碳源和 能量是 葡萄糖 和谷氨 酰胺。 谷 氨酰胺 也作为 
主要的 氮源。 在杂 交瘤细 胞中, 也要 消耗谷 氨醜胺 之外的 其它氨 基酸, 而且它 们的消 耗量可 
接 近谷氣 酰胺的 5096。 然而 80% 以上的 消耗量 是用于 蛋白质 合成, 因此, 谷 氨酰胺 之外的 
氣 基酸对 产能的 贡献非 常少。 添加 成分, 如维 生素、 微量 元素以 及生长 因子对 细胞生 长有显 
著 作用, 但 对能量 代谢的 贡献非 常小。 葡萄 糖和谷 氨酰胺 代谢的 主要产 物是生 物质、 以抗体 
262 



形式 分泌的 蛋白、 能量、 用于生 物合成 的还原 能力、 二氧 化碳、 废产 物乳酸 和氣。 此外, 根 
据细胞 系和生 长条件 不同, 也 可能分 泌天冬 氣酸、 丙 氨酸、 谷 氨酸。 与正 常组织 相反, 培养 
的 细胞倾 向于展 现出高 速率的 好氧糖 酵解。 这 是葡萄 糖经糖 酵解代 谢为丙 酮酸的 结果。 葡萄 

搪也 可经戊 糖磯酸 途径代 谢产生 NADPH 和生物 合成中 间体。 丙 酮酸可 转化在 TCA 循环中 
被 分泌、 被 氧化的 乳酸, 或经转 氣作用 形成丙 氣酸。 此外, 丙酮 酸也可 通过回 补途径 而被羧 
化, 或通 过苹果 酸薛反 应而合 成回丙 酮酸。 在许 多转化 细胞和 肿瘤细 胞中, 胆 固醇的 合成被 
提高, 膜 M 成的 改变 可能有 助于其 通常展 现的已 改变的 代谢。 然而, CRL 1606 通常将 90% 
以上所 消耗的 葡萄糖 转化为 乳酸, 这表明 碳从乙 醜辅酶 A 到胆 固醇合 成没有 明显的 分流。 
在生 物质合 成方程 式中, 要把脂 质的合 成考虑 进去, 但在 计算乳 酸中的 i 3 C 分 布时, 不予考 
虑。 谷氨 酰胺可 以结合 进生物 质中, 或经 TCA 循环 氧化。 已经发 现在很 多细胞 系中, 谷氨 
銑胺是 主要的 能源。 对于 CRL 1606 杂交瘤 细胞, 葡萄糖 和谷氨 酰胺是 主要的 能源, 而氨、 
乳 酸及丙 氨酸是 主要的 产物。 

图 10. 10 和表 10. 9 分 别描述 和总结 了哺乳 动物细 胞中的 能量代 谢生物 化学。 通 过将出 



ATP 



葡萄糖 



Glc-6-P 



C02+2NADPH 



Ribu-5-P 



ATP-^ 




1 






■■■ } 










… G 


A 






i4P 


\ 

Sed,7-P 



NADH 



叫 

DH T 



PEP 

ATP W^^NADH 




Glu 



图 10.10 杂交瘤 细胞中 的能量 代谢生 物化学 
代 谢途径 包括铕 酵解、 谷 第酰胺 酵解、 戊 糖磯酸 途径及 TCA 循环。 苹果酸 薛可在 回补反 应或丙 S 酸 合成中 起作用 
縮写: Glc-6-P — 6- 磯酸葡 萄糖; Ribu-5-P— 5- 碟酸核 銅糖; Fru-6-P — 6- 碟酸 果糖; Xyl-5-P—5- 碟酸木 銅糖; 
Rib-5-P — 5- 碟酸 核糖; GAP — 3- 磷酸甘 油醒; Sed-7-P — 7- 碟酸 景天庚 S 糖; Gin —谷 氣銑 胺 

263 





表 10.9 描 述杂交 瘤细胞 中能量 代谢的 反应组 



1. 葡萄糖 + ATP— 6- 踏酸 葡萄糖 + ADP 

2. 6- 璣酸葡 萄糖— 6- 碟 酸果糖 

3. 6- 碟 酸果糖 + ATP— 2- 三碟酸 甘油酸 + ADP 

4. 三碟酸 甘油醛 + 2ADP + NAI> —丙嗣 酸 + NADH + 2ATP 

5. 丙 S 酸 + NADH— 乳酸 + NAD 

6. 6- 碟酸 葡萄糖 + 2NADP— 5- 碟酸核 BH 糖 + 2NADPH + CO2 

7. 5- 碜酸核 醒糖— 5-8!| 酸 木銅搪 

8. 5- 磔酸 核銅糖 + 5- 憐酸木 酮糖— 7- 碟 酸景天 庚爾糖 + 三磯酸 甘油酵 

9. 7- 碟酸 景天庚 酮糖— 6- 磔 酸果糖 + 4- 碟酸 赤藓糖 

10. 5- 碟酸木 S 糖 + 4- 碟酸赤 薛糖— 6- 碟 酸果糖 + 三碟酸 甘油酸 

11. 丙銅酸 + 苹果酸 + 3NAD— a-KG + 3NADH + 2C02 

12 . a -KG + 2NAD + ADP— 2NADH + CO2 + ATP + 苹果酸 

13. 谷氨 酸胺— 谷氣酸 + NH3 

14. 丙兩酸 + 谷氣 酸一 丙氣酸 + a-KG 

15. 谷氨酸 + NADP—a-KG + NADH + NH3 

16. 2NADH + 6ADP + O.— 2NAD + 6ATP 

17. 苹果酸 + NADP— 丙銅酸 + C02 + NADPH 

18. ATP— ADP 

19. 0.036 谷 氣酰胺 + 0.062 谷氨酸 + 0.0031 酸葡 萄糖 + 0.013 5- 磯酸 核嗣糖 + 0.042 三碟酸 甘油酵 + 123 丙嗣酸 
+ 0.019 苹果酸 + 0.74ATP + 0.188NADPH + 0.23NAD— 生物质 + 0.072a -KG + 0.23NADH + 0.12CO2 + 
0.74ADP + 0.188NADP 

20. 0.012 谷 氨醜胺 + 0.07 谷氣酸 + 0.04GAP + 0.011NADPH + 0.012 苹果酸 + 0.082NAD— 抗体 + 0.082NADH + 
0.057。-KG + 0.011NADP 

注: 在反应 12 (TCA 循 环的一 部分) 中, FAD 已用 NAD 代替, 所 产生的 GTP 已 省略。 由 于通过 电子传 递链, 一 
个 NADH 可产 生三个 ATP, FADH2 可以产 生两个 ATP, 因此, 产生了 正确的 ATP 当量数 c 缩写: FAI> —黄素 腺噤呤 
二核 昔酸; NAI> —烟銑 胺腺嘌 呤二核 昔酸; GTP — 鸟噤呤 核苷三 磷酸; ADP — 腺噤呤 核昔二 磯酸; GAP —三碟 酸甘油 
酸; a-KG— «-嗣 戊 二酸。 

现在反 应链中 的中间 代谢物 归并, 代谢 网络已 经得到 简化。 代谢 途径提 供能量 (ATP)、 还 

原力 (NADPH) 以及 生物质 和抗体 合成的 前体。 所 归并的 方程也 为遵从 2.5 节所述 步骤的 

生物质 合成和 抗体合 成提供 准备。 即: 通过 使用从 生化网 络中存 在的前 体合成 大分子 的反应 
推导出 这些方 程式, 并与描 述细胞 大分子 组成的 方程式 组合在 一起。 典 型的蛋 白质组 成已假 

定适 合于这 些细胞 分泌的 抗体, 如表 2.8 所示。 

通过 使用来 自两个 不同实 验的速 率数据 (详情 见下一 节和表 10.8), 可以 得到表 10.10 
的胞内 通量。 在 95% 置信 水平, 随机 测量误 差足以 解释数 据中的 差异。 对于 本研究 中存在 
的 三个冗 余测量 结果, 一致 性指数 (CI) 小于 7.81。 这再次 强调, 一 致性指 数对于 识别错 
误测量 结果是 非常有 用的。 在本研 究中, 一致 性指数 (CI) 识别 了二氧 化碳产 生速率 
(CPR) 测 量中的 问题。 已经 发现, 采用 直接从 C02 释 放速率 (CER) 测 量结果 得到的 
CPR 值会产 生显著 的不一 致性, 它 可通过 去掉测 量速率 表中的 CER 来 消除。 这表明 CER 
是过 失误差 的一个 来源, 实 际上已 发现, 这是由 于液相 C02 和气相 C02 之间 的相互 作用造 
成的。 正 如前面 所述, 在计算 真实的 CPR 时, 把 C02 积累速 率包含 在内, 则 可修正 误差。 

胞内 通量是 在不同 溶氧水 平上确 定的, 并用来 评价氧 对细胞 代谢的 影响。 表 10.11 总结 
了最 重要的 通量及 其不确 定性。 丙 酮酸到 TCA 循 环的通 量在正 常溶解 氧水平 时是显 著的, 
而在 1% 溶解 氧水平 时仅为 很小的 正值, 在氧限 制条件 下基本 为零。 通 过丙氨 酸转氨 酶的通 
量在 各种溶 氧水平 下大致 不变。 通过谷 氨酸脱 氢酶的 通量在 溶氧 水平时 为正, 而在低 
264 



表 10.10 从测 量的速 率估计 杂交瘤 培养中 的通量 /l(r'"mmol* (细胞 广' ,11_ 



反 应 


头腔 1 


头股 L 




fir 1 
头胺 1 




1 


3.18±0.11 


3.91 ±0.13 


11 


0.211±0.060 


0.203±0.060 


2 


2.85±0.11 


3.54±0.13 


12 


0.922 ±0.063 


0.925 ±0.063 


3 


3.03±0.11 


3.74±0.13 


13 


0.683 ±0.036 


0.691 ±0.036 


4 


5.%±0.22 


7.38±0.26 


14 


0.314±0.031 


0.318±0.031 




0.315±0.028 


7.00±0.26 


15 


0.073±0.039 


0.054 ±0.038 


6 


0.315±0.028 


0.355 ±0.029 


16 


1.88±0.17 


1.92±0.17 




0.178±0.018 


0.202±0.019 


17 


0.629±0.036 


0.634 ±0.037 


8 


0.089±0.010 


0.101±0.010 


18 


15.2± 1.1 


16.6± 1.2 


9 


0.089±0.010 


0.101±0.010 


19 


3.69±0.18 


4.01 ±0.20 


10 


0.090±0.010 


0.101±0.010 


20 


0.961 ±0.096 


0.999±0.099 



注: 反应 号指表 10.9 中的生 化反应 e 数 据取自 Zupke and Stephanopoulo (1995)。 



溶氧 水平时 为负。 如表 10.11 所示, 从通量 也可计 算一些 有趣的 参量。 当 溶氧减 小时, 产生 

的总 ATP 从 1.95pmo 卜 (细胞 )— I'h — 1 降低到 1.58pmo 卜 (细 胞广 i 'h — 1, 变化 不是太 明显。 
这使 人想到 在微生 物细胞 情况下 所得的 结果, 即: ATP 的比生 成速率 似乎与 培养条 件确实 
无关。 当溶 解氧下 降时, 不断 增加的 ATP 从 葡萄糖 产生, 而且 平行于 糖酵解 产生的 ATP 
分数, 糖酵解 产生的 ATP 分数从 0.34 增加到 0.69。 所得的 结果也 表明: 溶 解氧对 氮代谢 
和 通过谷 氨酸脱 氣酶的 通量具 有显著 影响。 在低溶 解氧水 平时, 谷氨 酸脱氛 酶逆转 反应方 
向, 从而 有利于 谷氨酸 形成。 通 过通量 分析, 弄清楚 了一些 东西, 并 指出胞 内氧化 / 还原在 
细胞生 理学中 的基本 作用, 以 及通过 溶氧调 节控制 生理过 程的可 能性。 



表 10.11 根 据杂交 瘤培养 中所测 量的胞 外代谢 物变化 的速率 

计算 的所选 通量的 估计值 /mol* (细胞 广 



反应 / 参量 


通 量 


DO = 


DO=l% 


DO = 60% 


进人 TCA 循 环的丙 S 酸 


0.0±0.3 


0.28±0.3 


0.94±0.28 


丙 銅酸至 丙氨酸 


0.33±0.3 


0.26±0.2 


0.33±0.3 


谷 氣酸经 GDH 至 a- 兩 戊二酸 


- 0.29±0.3 


- 0.14±0.2 


0.4±0.3 


苹 果酸至 丙銅酸 


- 0.24±0.3 


0.41±0.3 


0.59±0.4 


总 ATP/pmo 卜 (细胞 )— "h— ' 


1.58 


1.67 


1.95 


搪酵解 产生的 ATP 分数 


0.69 


0.5 


0.34 


来自葡 萄糖的 ATP 分数 


0.85 


0.75 


0.67 


来 自葡萄 糖的乳 酸分数 


0.99 


0.98 


0.96 


用于 维持的 ATP 分数 


0.29 


0.46 


0.62 



注: 总 ATP 生产与 各种途 径的贡 献及维 持反应 所消耗 的没有 考虑的 ATP 量同 时给出 f 数 据取自 Zupke et al 
(1995) 



10.2.2 通过 i 3 C 标 记研究 证实通 量估计 

为了证 实通过 物质平 衡所得 的通量 估计, i 3 C 标记葡 萄糖作 为一个 特定探 针用于 细胞培 
养 基中。 与 Walsh 和 Koshland (1984) 在研 究大肠 杆菌中 的乙酸 酸支路 时使用 的方法 类似, 
将测得 的乳酸 中的同 位素分 布与从 胞内通 量估计 所预测 的进行 比较。 还 要注意 的是, 对于一 
组给 定的胞 内通量 (例 如, 通过物 质平衡 确定的 ), 以及 从反应 物到产 物的碳 原子作 图的途 
径, 可以对 代谢网 络中的 全部代 谢物确 定稳态 同位素 分布。 选择 可以从 代谢通 量中作 出辨别 
的标 记底物 是很重 要的。 已经 发现, 如 果葡萄 糖用作 标记化 合物, 则分 泌的乳 酸的三 个碳位 
上的' 3 C 富集 度明 显取决 于胞内 通量。 具 体地, 分 泌的乳 酸中的 同位素 富集度 分布是 两个通 

265 



量比 /i (糖 酵解 产生的 丙酮酸 分数) 和 /2 (从 谷氨酸 衍生的 a- 酮 戊二酸 分数) 的 函数。 

标记 实验是 这样进 行的: 先让 细胞在 未标记 葡萄糖 上生长 一短暂 时间, 一旦达 到指数 
期, 则将 lg99% [l-i 3 C] 葡 萄糖加 人到生 物反应 器中。 lOh 或 20h 之后 收集培 养基, 通过 
离 心除去 细胞。 上清 液通过 冷冻干 燥进行 浓缩, 并进行 NMR 分析。 得到关 于乳酸 3 个碳原 
子的富 集度的 NMR 数据。 它们被 表示为 C1:C2 和 C3:C1 富集度 之比, 结 果如表 10.12 所 
示。 同位 素富集 度比可 用来与 富集度 预测值 比较, 从而减 小基线 变化所 造成的 误差。 



表 10.12 为 了证实 通过物 质平衡 方法确 定的杂 交癯代 谢通量 

而 进行的 两个标 记实验 的同位 素富集 度数据 



参 量 


实验 1 


实验 2 


13C 比, 乳酸的 C1:C2® 


0.98±0.01 


0.98±0.01 


i 3 C 比, 乳酸的 C3:C1® 


3.5±0.11 


3.0±0.09 


未标 记乳酸 的分数 


0.39±0.02 


0.55±0.03 


标记 葡萄糖 的分数 


0.115±0.006 


0.117±0.006 


糖酵 解产生 的丙酮 酸分数 (/i) 


0.905 ±0.006 


0.921 ±0.005 


来 自谷氨 酸胺的 a-KG 分数 (/2) 


0.77±0.05 


0.78±0.05 



① 在估计 C1:C2 比时, 这 两个实 验的误 差概率 分别是 16% 和 0.5%。 

② 在估计 C3:C1 比时, 这 两个实 验的误 差概率 分别是 5% 和 1%。 

注: 3 个 乳酸的 i 3 C 峰 面积已 定量, 并 用来计 算富集 度比。 葡 萄糖和 乳酸的 富集度 是通过 测量标 记葡萄 糖加人 前后的 



浓度来 确定的 C 通量比 /i 和 /2 是 根据代 谢网络 化学计 量和代 谢物速 率变化 的测量 结果来 估计的 C 数 据取自 Zupke et al 
(1995)。 

实验 测得的 同位素 富集度 可与由 所分泌 的代谢 物物质 平衡从 胞内通 量计算 所得结 果进行 
比较。 一 般地, /i 和 /2 这 两个通 量比足 以确定 乳酸的 i 3 C 富 集度。 图 10.11 和图 10.12 表 
示了 1 3 C 乳酸富 集度比 对这两 个通量 比的依 赖性。 这 两个图 表明, 恒富 集度比 的计算 等值线 
是 /l 和 /2 的 函数。 一 个单个 同位素 比将通 量比限 制在一 条等值 线上, 但并不 能惟一 地决定 
/l 和 /2。 这两个 通量的 确定需 要测量 两个相 互独立 的同位 素比, 然 后在图 10.11 和图 

10. 12 所示 曲线簇 中的两 条等值 线相交 处确定 /i 和 /2。 通过 使用图 10.11 和图 10.12 中的 

等 值线, 并直 接与实 验测定 的同位 素比值 比较, 则可按 相反的 顺序, 利用 /i 和 /2 来 确定同 

位素比 C1:C2 和 C3:C1。 因此, 分 泌的乳 酸中的 同位素 富集度 测量结 果既可 用来证 实其它 
方 式得到 的胞内 通量估 计值, 也可用 来直接 确定图 10.11 与图 10.12 等 值线相 交处的 胞内通 



C1 :C2 比是 /i 和 /2 的 g 
数。 C1 和 C2 分别是 乳酸第 1 位 
和第 2 位碳原 子上的 i 3 C 的 数量。 
通量比 f、 是糖酵 解产生 的丙銅 
酸的 分数, 而 /2 是从谷 tC 酸衍 
生的 a- 酮戊 二酸的 分数。 等值线 

是通 过计算 机模拟 生化网 络计算 
的。 生化网 络采用 的实验 条件为 

11. 5% 的葡 萄糖在 第一位 碳标记 
有 i 3 C, 39% 的积累 乳酸未 富集。 
改 自 Zupke 和 Stephanopoulos 
0.2 0.4 0.6 0.8 1 (1994) 

/2 




266 



图 10.11 杂 交瘤培 养实验 1 中, 乳酸中 的恒定 C1:C2 比的 等值线 




C3 : CI 比是 /i 和 /2 的函 
数。 C3 和 CI 分别是 乳酸第 3 位 
和第 1 位碳原 子上的 i 3 C 的 数量。 
通量比 /i 是糖酵 解产生 的丙銅 
酸的 分数, 而 h 是从谷 S 酸衍 
生的 a- 銅戊 二酸的 分数。 等值线 
是通 过计算 机模拟 生化网 络计算 
的。 生化网 络采用 的实验 条件为 
11.5% 的葡 萄糖在 第一位 碳标记 
有' 3 C, 39% 的积累 乳酸未 富集。 
改 自 Zupke 和 Stephanopoulos 
(1994) 



图 10.12 杂 交瘤培 养实验 1 中, 乳酸中 的恒定 C3:C1 比的 等值线 
量比。 应注意 的是, 虽然 可在单 个同位 素比情 况下证 实胞内 通量, 但胞 内通量 的确定 通常要 

求 测量一 个以上 的同位 素比。 此外, 鉴于图 10.11 和图 10.12 中等 值线的 形状, 通过 联合使 
用 一个以 上的同 位素比 测量, 通量 证实的 精确度 将显著 提高。 

图 10.13 表 示将测 量的同 位素比 与根据 代谢通 量估计 值预测 的同位 素比进 行比较 时实验 
1 和实验 2 的 结果。 图 中显示 了对应 于两个 测量的 同位素 比及其 估计的 不定性 (±1 标准偏 
差) 的 等值线 交点。 此外, 图中还 给出了 通过物 质平衡 计算的 通量比 及其不 定性。 虽 然根据 
NMR 得 到的通 量比的 估计值 具有较 大的不 定性, 但 两种方 法之间 具有良 好的一 致性。 为了 
检验一 致性的 统计显 著性, 要进 行两个 检验。 首先, 要检 验计算 的比值 和测得 的比值 是相同 
的这个 假设, 并 发现在 90% 置信 区间内 这个假 设是成 立的。 其次, 要 检验比 值相差 一个以 
上的 指定增 量这个 假设。 选择的 增量要 对应于 /i 或 /2 的 20% 差数。 对于 C1:C2 和 C3:C1, 
增量分 别等于 0.04 和 0.4。 在表 10.12 中所示 误差概 率的情 况下, 可 以否定 测量的 比值和 



1 






0.8 






、― 




+ — 根 据通量 估计值 




0.6 




根据 NMR 












/, 和 h 是在杂 交瘤培 养中根 据乳酸 

' 3 C 同位 素比, 以及 根据采 用物质 平衡和 

胞 外测量 所做的 通量估 计而得 到的。 恒 

比 C1:C2 和 C3:C1 这两 条等值 线的交 
点, 根据 分泌乳 酸中的 i 3 C 体外 (in vit- 
ro) NMR 测量 来确定 /| 和 /2。 虚线表 
示 对应于 NMR 测 量的正 或负标 准偏差 
的等 值线, 实线表 示根据 估计的 胞内通 
量计 算的通 量比中 的不确 定度。 上图为 
实验 1, 下图 为实验 2。 改自 Zupke 和 
Stephanopoulos (1994) 



图 10.13 通量比 /i 和 /2 的比较 



267 



计 算的比 值相差 几个增 量这个 假设。 从 这一点 可以得 出以下 结论: NMR 测量 结果与 根据通 
量预测 的 比 值具有 良 好的一 致性。 

这 个例子 说明了 应用标 记实验 是如何 有利地 证实通 过物质 平衡得 到的通 量图。 应 注意的 
是, 标记底 物的选 择对根 据同位 素富集 度来对 胞内通 量进行 定量的 能力, 特 别地, 区 分不同 
底 物的贡 献等具 有重要 影响。 在本 例中, 采用了 两个乳 酸比。 正 如在图 10.12 中看 到的, 
C3:C1 比 的测量 结果对 /i 的值 敏感, 但对 /2 的值 相当不 敏感。 将 C3:C1 比测量 结果与 C1: 
C2 比的 测量 结果组 合在一 起可以 修正这 一点。 类似 的分析 表明: 采用 标记谷 氨酰胺 可以较 
好 地确定 /2, 这是因 为谷氨 酰胺更 直接地 包含在 反应分 开时, 并导 致乳酸 标记。 标 记谷氣 
酰胺 与标记 葡萄糖 同时使 用会得 到一个 区分胞 内通量 的更好 系统, 并提 高标记 比期望 值和测 
量值 之间的 一致性 精度。 - 
10.2.3 通 量分析 在细胞 培养基 设计中 的应用 

在上 节中, 给出 了生物 质合成 及抗体 合成的 归并方 程式。 应注意 的是, 除 了方程 式中确 
认的 代谢物 之外, 生 物质合 成还需 要其它 营养, 它 们不能 从基本 的碳水 化合物 源和谷 氨酖胺 
源中 获取。 这样的 营养, 譬如 必需氨 基酸, 它们作 为培养 基中的 添加成 分而被 提供。 尽管一 
些 营养成 分可以 从葡萄 糖和谷 氨酰胺 合成, 但在培 养基中 应加人 它们, 从而尽 量减少 用于合 
成它 们的葡 萄糖和 谷氨酰 胺的消 耗量。 例如, 典型 细胞培 养基中 已知的 非必需 氨基酸 就是这 
种 情况, 它 们可以 从培养 基中的 谷氨酰 胺衍生 出来。 这 对氨的 产生会 有不良 影响, 氨 在培养 
基中 积累, 并最终 引起细 胞培养 过程的 结束。 通过 向培养 基中补 充那些 可以从 谷氨酰 胺衍生 
的非 必需氨 基酸, 可以 减少谷 氨醜胺 在培养 基中的 用量, 从 而降低 氨的积 累量。 这种 方法已 
用于开 发哺乳 动物培 养基的 新配方 (Xie and Wang, 1996)。 该 配方反 映了基 于生物 质合成 
和 抗体合 成的一 般方程 式的准 确的化 学计量 平衡。 培 养基配 制的准 则是: (a) 提供生 物质合 
成 和抗体 合成所 需的全 部营养 成分; (b) 在培养 基中按 化学计 量平衡 补充非 必需氨 基酸, 尽 
量减 少用于 非必需 氨基酸 合成的 谷氨醜 胺量; (C) 供给 按化学 计量平 衡的培 养基, 以 便培养 
基 中的葡 萄糖浓 度保持 在限制 水平, 以及培 养基的 渗透压 在加料 过程中 不会发 生显著 变化。 

作为 按化学 计量平 衡的培 养基与 上述补 料策略 的组合 运用的 结果, 在 CRL 1606 培养中 
的细胞 密度和 产品滴 度大幅 提高。 细胞 生长达 到密度 为每毫 升几百 万个, 抗体积 累达到 
2.4g/L 的特别 水平。 发现该 抗体的 生产与 活细胞 总数乘 以它们 在生物 反应器 培养基 中的存 
在时 间直接 相关。 当然意 味着抗 体的比 生产速 率在细 胞密度 低时, 或 非常高 时是恒 定的, 这 
是细胞 培养技 术所有 开发努 力中一 个非常 重要的 发现。 

参 考文献 

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268 



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269 



第 11 章 代谢控 制分析 



代谢工 程的一 个最重 要目的 是阐明 负责通 量控制 参数的 意义。 在 前述章 节中, 描述 
了 如何通 过胞内 代谢的 质量平 衡和包 括同位 素标记 在内的 更专一 化的方 法来确 定代谢 

通量。 代谢通 量分析 (MFA) 的 概念, 对于 研究不 同代谢 途径之 间的相 互作用 和量化 
围绕代 谢分支 点的通 量分布 是很有 用的。 然而, MFA 本身 并不能 给我们 提供任 何通量 
控制 的定量 的度量 标准。 通量 控制对 于保持 代谢物 的合成 和转化 速率的 严格平 衡是很 
重 要的, 该 平衡要 覆盖非 常广泛 的外部 条件, 而使 胞内代 谢物的 浓度不 会发生 剧烈的 
上升或 下降。 此外, 正 确理解 通量控 制对代 谢通量 的合理 调整也 是很重 要的, 这种合 
理 的调整 正是代 谢工程 的主要 目的。 在 20 世纪 50 年代, 反馈 抑制、 协 同性、 薛 的共价 
修饰作 用以及 酶的合 成控制 机理的 发现揭 示了若 干分子 机制, 这 些机制 在通量 控制中 
起着 重要的 作用。 由 于在通 量控制 方面存 在形形 色色的 机制, 对 于一个 给定的 代谢途 
径, 在其通 量是如 何被控 制的问 题上存 在许多 争论就 不足为 奇了。 因为 大部分 关于酶 
的控 制的研 究报道 主要是 定性的 (例如 : "果 糖磷酸 激酶是 肌肉细 胞中糖 酵解途 径的主 
要通 量控制 酶。" Voet and Voet , 1990), 所 以对大 量的有 关通量 控制的 研究结 果的重 
要性进 行评估 是很困 难的。 在 许多情 况下, 这些研 究结果 之间似 乎有相 互矛盾 之处。 
在讨论 通量控 制时, 关于限 速步骤 和关键 酶的陈 述以及 参考文 献大量 存在。 对 这些可 
能以不 同的方 式进行 解释, 这经 常导致 关于控 制代谢 中这些 反应步 骤实际 作用的 误解。 
例如: 早期 发现, 一条代 谢途径 中第一 个酶, 或者 在一个 分支点 后的第 一个雜 受到某 
种类型 的调节 (如反 馈抑制 )。 这 往往导 致如下 说法: "在 一条代 谢途径 中的第 一步反 
应是 限速步 骤", 而这 并不一 定是正 确的。 

在酶 动力学 相互作 用和通 量控制 通常的 定性处 理中, 代谢控 制分析 (MCA) 的引 
人帮助 其建立 一些严 密性。 此外, 它 还对通 量控制 中重要 代谢参 数的系 统评价 及描述 
提供 了一个 有用的 框架。 从本质 上说, MCA 是代谢 网络酶 动力学 本身非 线性问 题的一 
种线 性扰动 理论。 因此, MCA 的预测 在性质 上是局 部的, 任何外 推至多 是尝试 性的。 
尽管有 这些局 限性, MCA 在如 下方面 已表明 是很有 用的: 提供各 单个反 应代谢 通量控 
制 的度量 标准, 阐明酶 反应网 络中速 率控制 步骤的 概念, 描述酶 活性对 于胞内 代谢物 
浓度的 影响, 联系局 部的酶 动力学 和系统 的代谢 行为。 

MCA 的概 念是在 Kacser 和 Burns (1973) 以及 Heinrich 和 Rapoport (1974) 发表 
的 两篇具 有里程 碑意义 的文章 中提出 来的, 它们 均是对 Higgins (1963, 1965) 关于这 | 
方面 思想的 发展。 另外 两种用 于代谢 控制定 量研究 的框架 一- 一 生化系 统理论 (Biochem- 
ical Systems Theory 见方框 11.1) 及 Crabtree 和 Newsholme 提出的 通量定 向理论 | 
(flux -oriented theory, Crabtree and Newsholme, 1987a, b) 具有许 多相似 之处。 虽然 | 
最 初的注 意力集 中于这 三种方 法的不 同点, 后来 人们认 识到尽 管形式 不同, 但 它们确 
实 汇聚于 同样的 概念。 在本 章中, 将描述 MCA 的 基本思 想及其 结果, 由 于其更 偏向于 
描述代 谢网络 的通量 控制。 
270 



方框 11.1 生化系 统理论 

由 Savagean 在 20 世纪 60 年 代后期 提出的 生化系 统理论 用于处 理复杂 系统的 模型模 
拟 问题, 其 中这些 系统之 间也许 存在许 多不同 程度上 的相互 作用。 它的出 发点是 反应速 
率可 用如下 类型的 常规幂 函数表 达式: 

V, = a, Tlx;-' (1) 

式中, X, 是系 统变量 (如 代谢物 浓度、 酶活性 和效应 物浓度 等); 参数 a, 和 g,, 分别 
是 表观速 率常数 和表观 动力学 级数。 式 (1) 可 被看作 为非线 性动力 学在对 数坐标 上的线 
性化。 由 于大多 数生化 反应都 是非线 性的, 因 此该式 对反应 动力学 的近似 化程度 要比线 
性方程 更好。 按 照这种 理论, 所 有产生 代谢物 X, 的 反应都 组合进 一个净 速率为 t;, 的单 
个 反应。 同样, 所有 消耗同 一代谢 物的反 应也都 组合进 一个净 速率为 z;-, 的单个 反应。 
这 些所组 合的反 应中每 一个反 应的速 率由幂 函数方 程近似 表达。 依 据所有 代谢物 的质量 
平衡 可以列 出一个 微分方 程系统 用于详 细研究 其控制 特性, 这种系 统被称 为协同 系统, 
或 S- 系统。 

生化系 统理论 (BST) 是一 种对复 杂系统 进行模 型模拟 的极好 方法, 利用从 模型与 
实 验数据 拟合所 确定的 参数, 它 也可以 被用来 获取关 于通量 控制的 信息。 从 这一点 来说, 
BST 可被当 作一个 通用的 理论, 而 MCA 代表一 种适用 于线性 化的系 统的一 个特例 
(Savageau, et al, 1987a, b)。 这已是 一个经 常争论 的问题 (Discussion Forum, 1987; 
Savageau, et al, 1987a; Kacser, 1991), 很可 能反映 MCA 的目 的和假 定的一 个误解 
(Cornish-Bowden, 1989)。 这里, BST 的目的 是建立 动力学 模型, 以便对 途径中 的通量 
进行 量化, 其不仅 适用于 稳态, 也 适用于 非稳态 条件; MCA 的基 本目的 是借助 于定量 
的参 数对代 谢控制 讨论中 所用概 念赋予 明确的 意义。 为了 支持其 观点, Savageau 等 
(1987a, b) 已表 明可由 BST 的方程 推导出 MCA 基 础方程 (后 面所 要讨论 的加和 定理和 
连接定 理), MCA 中的参 数也可 从幂函 数表达 式中的 动力学 参数中 获得。 然而这 种比较 
是基于 另一种 误解, 即: MCA 参数 (控 制系数 和弹性 系数) 是 常数, 这根本 不需要 
(Cornish-Borden, 1989)。 



11.1 代谢控 制分析 的基础 

代谢控 制分析 仅能严 格地应 用于稳 态条件 (或拟 稳态条 件), 一个 基本假 定是: 一个稳 
定的 稳态是 由一条 代谢途 径中催 化各个 单一步 骤的薛 的活性 所惟一 定义。 因此 薛活性 同代谢 
途 径中第 一个反 应的底 物和最 后一步 反应的 产物的 浓度一 起被当 作系统 参数。 通过控 制环境 
条件 (例 如, 在 一个处 于稳态 的恒化 器中) 或作为 细胞内 调节的 结果, 可使该 途径第 一个底 
物和 最终产 物的浓 度保持 恒定。 在原 则上, 系统 参数可 被任意 改变, 因 此它们 完全规 定了该 
系统。 由 这些参 数值所 确定的 性质, 例如, 通过 途径的 通量或 中间代 谢物的 浓度, 被 作为系 
统 变量。 

为了举 例说明 酶动力 情况下 参数和 变量的 定义, 可以 考虑一 个简单 的两步 途径, 该途径 
中底物 S 通过中 间产物 X 转变 为产物 P: 

S-^ X*^ P (11.1) 

271 



在 稳态下 S 转变为 P 的净 速率由 JO 给出。 显然, 一 个稳态 由系统 参数, 即醇 的活性 
水平 El 和 E2 及底物 S 和产物 P 的浓 度惟一 确定。 稳态 的定义 决定了 必须对 中间代 谢物浓 
度 cx、 通量 J 和其 它导出 量进行 测定。 如 果系统 参数改 变了, 例如, 如果 £i 增 加了, 则将 
出现一 个新的 稳态, 这 个新稳 态的特 点将由 这些变 量的其 它值, 即 中间物 X 的浓度 和通过 
途径的 净通量 J 来表 征。 因为 代谢物 X 的 浓度是 独特的 变量, 因此假 定它们 被均勾 地分布 
在与 其发生 作用的 酶中。 亚细 胞区室 在代谢 控制分 析中并 非是个 问题, 因为运 输过程 可被作 
为 具有自 己速率 的附加 的加工 步骤归 入分析 之中。 然而, 尚不能 考虑一 个区室 中代谢 物浓度 

的空 间分布 情况, 因为这 将需要 一个复 杂的模 型来提 供代谢 物浓度 位置的 信息。 
11.1.1 控制系 数和加 和定理 

代谢 控制分 析的一 个目的 是将一 个代谢 系统的 变量同 它的参 数联系 起来。 一旦完 成这一 
目的 之后, 一个系 统变量 (如 通量) 对系 统参数 (即酸 活性) 的 敏感性 就能被 确定。 这些敏 
感性代 表了通 量控制 的基本 方面, 因 为它们 概括了 一条代 谢途径 中由单 个薛的 活性所 施加的 
系统 的通量 控制的 程度。 类 似地, 能 够求解 胞内代 谢物的 浓度而 且也能 确定其 对于薛 活性、 
效应 物浓度 和其它 系统参 数的敏 感性, 这些 敏感性 可由一 组系数 概括地 描述, 其中最 重要的 
是控制 系数。 它们 描述一 个参数 (例如 代谢途 径中一 个酶的 活性) 如何 影响系 统变量 (例如 
通过这 条途径 的通量 )。 控 制系数 仅适用 于研究 的稳态 条件, 这 就解释 了为什 么诸如 薛活性 
等 途径的 "组 成零 部件" 被作为 参数来 描述, 而可 随参数 的变化 而变化 的系统 性质, 如通量 
和代谢 物浓度 被作为 变量。 

最重 要的控 制系数 就是所 谓的通 量控制 系数, 常 缩写为 FCCs。 它的定 义为: 由 代谢途 
径中 一个酶 活性的 无穷小 变化所 引起的 通量的 相对变 化与这 个酶活 性的相 对变化 之比。 值得 
注意 的是: 由 于酶活 性是一 个独立 的系统 参数, 因此 它的变 化将直 接影响 通量, 或通 过引起 
1「 其它 系统变 量的变 化而间 接影响 通量。 式 

(11.2) 中所 用的全 导数符 号试图 表明这 一点: 

) 在 一个稳 态通量 -酶活 性的关 系图中 (见图 

11.1), 在某 一鹏活 性处的 FCC 值等于 曲线中 
该酶 活性处 切线的 斜率用 相应的 稳态通 量及酶 



0.8 

_ 0.6 

m " 

® 0.2 



0.5 1 1.5 2 活性归 一化: 

隱 (£) cJ=fx 恶二^ (11.2) 

图 11.1 稳态途 径通量 _ /与途 径中 因为 FCCs 是 用相对 通量和 相对酶 活性的 

一个 酵活性 的函数 关系图 形式定 义的, 所 以它们 是无因 次的。 它 们的大 

该酶 在特定 餘 活 性时的 通量控 制系数 等于该 81 活性处 ,|、fcT6fi:$raifi/i;S*Biiife.)£,W:g/^^qP:if: 

切线 的斜率 乘以酶 活性, 然后賺 态通量 归-化 戶 乂 — 

个 线性代 谢途径 来说, FCCs 的 值介于 和 1 之 
间。 在分 支代谢 途径的 一般情 况下, FCCs 被用 来描述 每一个 酶活性 (共 L 个) 对通 过不同 
反 应的每 一通量 (共 L 个) 的 影响: 

Chgx^ = n ..e|l,2,..-,Ll (11.3) 



O 在代 谢通量 分析中 (第 8 章), 用" 代表 通量。 因为 MFA 的一 个假定 是代谢 途径中 的中间 产物处 于稳态 (或拟 

稳态 ), 这就暗 示着, 通过- -条线 性代谢 途径中 的通量 等于这 条途径 中各个 单个反 应的反 应速率 (或速 率)。 而 MCA 的 
目 的是研 究参数 (即醉 活性) 对稳态 通量的 影响, 因此 要将单 个反应 的反应 速率" 和总体 稳态通 量区分 开来, 所以用 
表示 后者。 

272 



式中, 是代谢 途径中 通过第 个反应 的稳态 通量; £, 是第 i 个酶的 活性。 对 于这样 
一个一 般系统 来说, FCCs 可以是 任何值 (正值 或负值 )。 

式 (11.3) 的定 义是由 Kacser 和 Burns (1973) 给 出的原 始式。 一个更 普遍的 定义是 
基于第 i 个反应 速率而 不是酸 活性: 

d^.f x^ = f^ /,^e|l,2,-,L} (11.4) 
' J k dv, dint;, 

Heinrich 等 (1997) 将这个 定义表 示为: 

C;*=^x^(|) — 1 .•,^e|l,2,..-,Li (11.5) 

式中, /> 可以是 专门作 用于第 /个反 应速率 的任何 参数。 如 果酶活 性被选 为参数 /^, 倘 
若反应 速率同 嗨活性 成正比 (情 况经常 是这样 ), 则式 (11.5) 可简 化成式 (11.3) 所示的 
FCCs 的原 始式。 然而, 由式 (11.4) 或式 (11.5) 给出 FCCs 的一般 定义, 考 虑到对 酶-酶 
相互 作用这 种特殊 情况的 处理, 如 同在代 谢物通 道开通 (Metabolite channeling) 的 情况, 
代谢物 按顺序 被直接 从一个 酶运输 到下一 个酶。 

从 FCCs 的定 义中明 显可以 看出, 具有 最大通 量控制 系数的 酶对特 定稳态 下的通 量施加 
最大的 控制, 当这 个酶的 活性增 大时, 将导致 整个通 量最大 程度的 上升。 FCCs 归一 化后的 
一个 重要结 果是: 对每一 个通量 而言, 它们 的控制 系数之 和必为 1, 这就 是通量 的加和 
定理: 

ScJ* = 1 k e ll,2,--,Ll (11.6) 

该 式清楚 表明: FCCs 完全' 取决于 系统的 结构, 关于 它们的 单个值 不能表 示一般 情况。 
对 于非常 长的代 谢途径 来说, 大多数 FCCs 的值比 较小, 然而, 可能 仍然存 在一个 步骤, 其 
对通 量施加 显著的 控制, 只 要这个 步骤的 FCC 值 比其它 FCCs 值 大得多 即可。 对于 较短的 
代 谢途径 来说, 即 使在通 量控制 分布于 多个步 骤的情 况下, FCCs 也 可能具 有更大 的值。 因 
此只能 在同一 代谢途 径中对 FCCs 值进行 比较, 而不能 在不同 的代谢 途径之 间进行 比较。 在 
长的 代谢途 径中存 在小的 通量控 制系数 解释了 为什么 为了提 高菌株 的代谢 物产量 (如 氨基酸 
和抗生 素), 需要 如此多 轮的连 续诱变 和筛选 步骤。 

应当 注意: 对于 FCCs 的 名称和 概念均 存在着 异议, 这 些异议 的一些 主要背 景已由 Fell 
(1992) 评 论过, 现简 单总结 如下。 

①在最 初的公 式中, 酶 的浓度 被用 作描述 酶反应 速率的 参数。 然而, 考虑到 酶活性 
主要受 到同别 构酶相 结合的 效应物 作用的 影响, 因 此酶浓 度与酶 活性及 通量控 制之间 并没有 
特别的 关系。 为了 纠正这 一点, Kacser 和 Burns (1973) 引入 了另一 组控制 系数, 称 为响应 
系数, 用于 代谢通 量对这 些效应 物的敏 感性的 量化: 

W 々二 fx, i,k^\l,2,-,L\ (11.7) 

上 述响应 系数的 定义与 FCCs 的定义 类似, 实际上 可以看 作为关 于外部 效应物 的通量 控制系 
数。 而且, 容 易表明 [见式 (11.12)], 响应 系数表 示相对 于外部 效应物 的净敏 感性, 这样 



由于酶 活仅同 雜 的活 性形式 有关, 这 与诸如 通过蛋 白质印 记法所 确定的 BI 的 浓度是 非常不 同的, 因 此在此 文中, 

我们喜 欢用雜 活而不 用翁的 浓度。 这样可以把醉活解释为瞎的 t^n„, 而 这样做 并没有 暗示出 和胞内 酵活力 有关的 信息, 
由 于异构 调节, 胞 内酶活 力可能 同它的 Vm,, 完全 不同。 

273 



它们 就可以 被划分 为一个 FCC 部分和 一个局 部动力 学部分 (由下 面要讨 论的弹 性来描 述)。 

② 一 个通量 对一种 酶活性 的敏感 性并不 是该醇 是控制 薛还是 调节酵 的度量 标准, 因此 
一 些人发 现控制 系数这 一术语 是令人 误解的 (Crabtree and Newsholme, 1987; Savageau et 
al, 1987a, b; Atkinson, 1990)。 在许多 代谢途 径中, 对终产 物合成 速率是 通过第 一步反 
应的 反馈抑 制来调 节的, 在 这种情 况下, 催化 第一步 反应的 薛是经 典意义 上的调 节薛, 但通 
常它将 有一个 小的通 量控制 系数。 调 节酶具 有小的 FCC 值这 一明显 的自相 矛盾在 Kacser 和 
Burns (1973) 最初 的论文 中作过 专门的 讨论。 在引人 FCCs 的概念 之前, 常 常意味 着一个 
调节 酵是作 为限速 步骤的 一个潜 在的候 选者, 但 FCCs 的引 人揭示 不一定 是这种 情况。 而且 
正如在 本章的 前言中 所说的 那样, MCA 告诉我 们限速 步骤这 一概念 是无意 义的, 而 FCCs 
值可量 化速率 限制的 程度。 

③ 由于 FCCs 只适用 于稳态 研究, 随 着系统 状态的 变化, 它 们也相 应发生 变化, 因此 
FCCs 没有多 少预测 价值, 这 一点是 不容置 疑的。 但是 MCA 还 没被提 倡作为 像生化 系统理 
论 那样的 一种用 于系统 模拟的 工具, 而只 是作为 描述代 谢控制 的一个 工具。 显 然我们 希望建 
立一 个能预 测酶活 性大的 扰动如 何影响 通量的 理论, 但 这是一 项非常 困难的 任务, 这 是由于 
细 胞反应 动力学 的非线 性特点 和胞内 薛反应 动力学 的难以 描述的 性质。 

同 FCCs 类似, 可以 定义系 统参数 对胞内 代谢物 浓度影 响的敏 感性。 这些 敏感性 被称为 
浓度控 制系数 (concentration control coefficients), 缩写为 CCCs。 其中, 受酶活 性 £, 影响 
的变量 是代谢 物浓度 



cXj=:lx》f^ ^ell,2,-,Ll,;e|l,2,-,K 
' Cj aE, dint. 



或者, 更一 般地有 



Cx^^x^ 二》 z6U,2,"',U,^ll,2r",K 



(11.8) 

I 

(11.9) 



这些系 数说明 了当第 z' 个酶 活性变 化时, 第 J 个中 间产物 X, 浓度水平的相对变化。 由 
于 当所有 的酶活 性同等 程度地 发生变 化时, 任 何中间 代谢物 浓度水 平保持 不变, 因此, 遵从 
以下 关系: 对 K 个代谢 物中的 每一个 来说, 其浓 度控制 系数的 总和应 为零: 

2 cf' = ; e \i,2,-',K\ (11.10) 

式 (U.IO) 显 示了对 每一个 代谢物 而言, 至少存 在一种 起负控 制作用 的酶。 也就 是说, 当 

该 醇活性 水平上 升时, 代 谢物浓 度却下 降了。 这样, 在式 (11.1) 所示 的简单 两步反 应途径 

中 浓度控 制系数 cf 通常是 负值, 因 为代谢 物浓度 rx 将 随着第 二个酶 活性的 上升而 下降。 
11.1.2 弹性系 数和连 接定理 

MCA 中另一 个重要 的概念 是弹性 系数, 同描 述整个 代谢体 系系统 性质的 控制系 数有所 
不同, 弹性系 数是代 谢网络 中各个 单个醉 的局部 性质。 最 常见的 弹性系 数是反 应速率 对代谢 
物 浓度的 敏感性 (或弹 性)。 正如控 制系数 的情况 一样, 弹性系 数也相 对于反 应速率 及代谢 
物浓 度而归 一化。 因此, 第 Z 个 反应速 率对于 代谢物 X, 的浓 度的弹 性被定 义为: 在 假定所 
有其 它系统 变量相 对于其 稳态值 保持不 变的条 件下, 由代 谢物浓 度的无 穷小变 化所引 起的反 
应 速率相 对变化 之比: 

^'x=^x^-^ fai,2,...,",,ai,2, …,幻 (11.11) 

274 



因为 弹性系 数表示 对相应 的变量 求导, 因此用 了偏导 数以表 示所有 其它变 量必须 保持恒 
定。 弹性系 数可被 看作是 对于特 定代谢 物的表 观反应 速率的 级数, 因此 它们等 于生化 体系理 
论 (见 方框 11.1) 中的幂 函数的 指数。 它 们具有 正值时 表明促 进一个 反应的 进行, 例 i 口一 
种 底物和 一种激 活剂; 而负 值表示 减慢了 反应的 进行, 例 如一种 产物和 一种抑 制剂。 弹性系 

数 在数值 上等同 于酵对 代谢物 浓度的 响应性 这一模 糊概念 (Fell, 1992)。 它 们也允 许对几 
种 底物对 反应速 率的影 响进行 定量化 (大多 数细胞 反应有 两个或 两个以 上的底 物), 产物浓 
度的影 响也是 如此, 其常 有显著 作用, 这 是由于 细胞反 应的可 逆性。 

除了对 代谢物 的弹性 之外, 弹 性系数 也可以 应用于 非代谢 中间产 物的效 应物, 即: X, 
可被更 广义地 解释为 影响第 个反应 速率的 任何化 合物。 根据 弹性系 数这个 广义的 定义, 可 
以看 出在式 (11.7) 中导 入一种 效应物 的响应 系数是 一个受 影响的 薛 的弹 性系 数和该 薛通量 
控制 系数的 乘积。 

^x, = ^^*x i,k^\l,2,-',L\,j^\l,2,-,K\ (11.12) 
如果 一个代 谢物或 一个效 应物作 用于一 个以上 的薛, 则总响 应系数 是每个 藤的响 应系数 

之和 

I ^爻 二 T^C^A ' G I1,2,---,L!,; e !l,2,--.Kl (11.13) 

式 (11.12) 向我们 提供了 一个有 价值的 信息: 即 使一个 酶对一 个代谢 物或一 个效应 物的弹 
性比 较大, 通 量对这 种化合 物变化 的响应 也仅仅 在其相 应的通 量控制 系数不 为零时 才是重 
要的。 

对它们 的底物 或产物 的浓度 变化高 度敏感 的薛, 也就 是说对 代谢中 间产物 具有高 的弹性 
系数 的龍, 其 FCCs 倾向于 低的值 (Westerhoff, et al, 1984), 这可 以用式 (11.1) 所示的 
简单 两步反 应途径 来形象 地说明 如下: 第 二个薛 E2 活性 的降低 (例 如由 特定抑 制剂所 引起) 
将导致 其底物 S 和产物 P 的浓度 升高。 如果 E2 对 3和? 具有大 的弹性 系数, 则上述 代谢物 
浓 度的变 化将补 偿减少 着的薛 活性。 结果, 薛活性 的降低 对总的 稳态通 量将有 很小的 影响, 
这 意味着 被扰动 的醇的 通量控 制系数 值是很 小的。 类 似地, 对中 间代谢 物具有 小的弹 性系数 
的 酶的扰 动会引 起显著 的通量 变化。 FCCs 与 弹性的 关系可 由下面 的通量 -控制 连接定 理所表 
达, 这是由 Kacser 和 Bums (1973) 导 出的。 

SdVx =0 I e ii,2,"-,L!,> e 1i,2,-,k1 (11.14) 

* = i ' ' 

连 接定理 通常被 认为是 MCA 定理 中最重 要的, 因为 它提供 了理解 局部的 酶动力 是如何 
影响通 量控制 的方法 手段。 作为进 一步的 说明, 考虑式 (11.1) 所示简 单两步 途径。 对这个 
途径, 由连 接定理 给出: 

C{e],+ C{ei = (11.15) 

或 



--f (11.16) 



从式 (11.16) 可 以明显 看出: 大的 弹性是 和小的 FCCs 相联 系的, 反之 亦然。 在接 近热力 
学平 衡条件 下进行 的反应 通常对 代谢物 浓度的 变化是 非常敏 感的, 即它们 的弹性 很大, 这也 
表示 这些反 应的通 量控制 通常将 很小。 

如同 FCCs 的情况 一样, 也推 导出了 浓度控 制系数 的连接 定理, 虽 然它们 是少许 更复杂 

275 



些。 当控制 系数和 弹性涉 及不同 的代谢 物时, 连接 定理有 如下的 形式: 

1; Cf 'ek^ = J, I e il,2,-,K!,; (11.17) 
而 涉及相 同代谢 物时, 连接定 理的形 式为: 

L 

2 Cf'z]^^ = - 1 j e |l,2,-,Kt (11.18) 

通常, 很 少关注 浓度控 制系数 (CCCs), 但正如 将在第 13 章 中所证 明的, 当 MCA 结果被 
用于酶 活性扩 增的设 计时, CCCs 可 以给我 们提供 重要的 信息。 而且, 在 Heinrich 和 
Rapoport (1974) 的 原始推 导中, 它 们被用 来推导 FCCs 的 表达式 [见式 (11.24)、 式 
(11.25)]。 

相 应于代 谢物浓 度的弹 性系数 是最常 用的, 但是 Kacser 等 (1990) 引人 了所谓 的参数 
弹 性系数 (parameter elasticity coefficients), 用它 来作为 酶对其 它参数 (例如 II 活性 或抑制 
剂, 后者不 是所研 究途径 中的代 谢物) 变化的 敏感性 的度量 标准。 对于一 个一般 的参数 
以 下式来 定义参 数弹性 系数: 

吒 =e 鲁 zai,2,..,Ll (11.19) 

如果酶 活性被 选为该 参数, 则当 i 等于 / 时, 参 数弹性 系数通 常等于 1; 而当 i 不等于 / 时, 
参 数弹性 系数通 常等于 0。 即第 i 个反 应速率 和第/ 个酶的 活性之 间存在 着直接 的比例 关系, 
而第 个酶对 途径中 的其它 反应速 率没有 影响。 当酶活 性被作 为该参 数时, 对 这些规 则一个 
重要的 例外是 当酶- 酶相互 作用的 情况。 
11.1.3 MCA 理论的 一般化 

前 两节中 介绍的 概念和 定理是 MCA 的 基础。 在这一 节中, 它们将 被扩展 到一般 的多反 
应 网络的 情况。 然而, 在此 之前, 进 一步调 查通量 对酶调 节的系 统响应 是如何 能被分 成它的 
源组分 (source components) 的 是很有 趣的。 这样, 酶活 性的一 个变化 将对途 径中的 通量产 
生 直接的 影响, 也能通 过代谢 物浓度 的变化 对其产 生间接 影响。 随着式 (11.19) 中 参数弹 
性 系数的 导人, 还 存在其 它参数 对通量 可能的 影响。 因为 稳态通 量是系 统参数 (其中 一些是 
醇 活性) 和 代谢物 浓度的 函数, 即丄 (/>/, Cj), 因此 FCCs 可以用 下式来 定义, 它是式 
(11.3) 最 初定义 的扩展 形式: 

d-f (Sfx^.SlJx^) .,.ell,2,.-,Ll (11.20) 

在大 多数情 况下, 这些参 数之间 并没有 耦合, 所 以一个 参数的 变化不 会改变 其它的 参数, 因 
此有: 

则式 (11.20) 可以整 理为: 

C' = T-^^^ t¥^x^x^x- z ,; ^ 6 !1,2,",U (11.22) 

因为稳 态下第 个反应 的速率 (t^J 等于稳 态通量 /^, 弹 性系数 和参数 弹性系 数的定 
义 表达式 可在式 (11.22) 中被辨 认出, 此 式可重 写为: 

K 

= + 2 e*x Cf ' "k e ! 1,2,--,L| (11.23) 

276 



在大 多数情 况下, 当 i 等于 k 时 [即, 当第 i 个酶 通过它 自己的 (第 i 个) 反 应速率 来调节 
通量 响应而 且反应 速率的 变化同 酷活性 的变化 成比例 时], 参数弹 性系数 化简为 1; 当 不 
等于; ^时 (即, 当第 Z 个薛的 活性变 化对通 过第) ^个 反应的 通量没 有直接 影响时 ), 参数弹 

性系数 为零。 因此式 (11.23) 可以进 一步简 化为: 



Cj' = 1 + 2 e X Cf^ i e |1,2广',乙 



(11.24) 



(11.25) 



这些 首先由 Heinrich 和 Repoport (1974) 在 他们最 初的论 文中导 出的方 程说明 FCCs 
是 如何依 赖于弹 性系数 (即 单个 酷的动 力学) 和 浓度控 制系数 (即 通过 代谢物 水平上 的酶的 
相互作 用)。 因此式 (11.24) 表明当 一个薛 活性变 化时, 由酶活 性调节 所产生 的直接 影响与 
由 代谢物 浓度变 化产生 的影响 结合以 产生总 通量的 变化。 这种总 通量的 变化可 以每个 代谢物 
的影响 之和来 表示, 每 个代谢 物的影 响是由 该代谢 物的浓 度变化 (CCC) 与这 种变化 对通量 
的影响 (弹性 系数) 的 乘积所 给出。 式 (11.25) 显 示了第 Z' 个 醇仅通 过代谢 物浓度 变化来 
影 响稳态 通量, 而 这种变 化是由 其它酶 反应的 间接影 响所引 起的。 

式 (11.22) 总共有 个方 程式, 利 用矩阵 符号, 可以写 成一个 更简洁 的形式 (Ehlde 
and Zacchi, 1997) : 



《' 






《2 






《L 







1 

冗 £1 



兀 £1 



1 

冗 £2 



El 



%2 



El 



L 



.1 

-xi 

2 

Xi 



1 

•X2 
2 

•X2 



-Xl ^X2 



1 

Xk 
2 

Xk 



c》 



c 
c] 



(11.26) 



或 

CJ = P + E'CX (11.27) 
用在式 (11.24) 和式 (11.25) 的 推导过 程中所 应用的 假定, 参数 弹性系 数矩阵 P 变为一 
个单位 矩阵, 即 一个所 有对角 元素为 1 的对角 矩阵。 式 (11.27) 是 MCA 的 所有定 理的一 
个完 整的和 通用的 公式。 它 是一个 包括了 加和定 理和连 接定理 的简洁 形式, 因 此它在 后面的 
分 析中, 特别 在对分 支代谢 途径的 分析中 是很有 用的。 然而, 该式 的一个 缺点是 MCA 的作 
为例 证的定 理是含 蓄的而 且不易 辨认。 

11.2 通量控 制系数 的确定 

通量控 制系数 的大小 给我们 提供了 通量增 加的相 对度量 标准, 而通 量增加 是从特 定薛活 

性的扩 增所期 待的。 当然, 这并 不意味 着对于 任何酵 活性的 扩增, 通 量的增 加将同 FCC 成 
比例。 但是, 由 FCCs 提 供的这 种度量 是一个 合理的 近似, 尤其是 对醜活 性小的 变化。 特别 
是 FCCs 值 接近于 1 的酶 反应步 骤可以 被确定 为限速 步骤, 而且 在一个 通量扩 增计划 中应当 

277 



被首先 强调。 另一 方面, FCCs 小显 示在许 多步骤 中通量 控制的 分散, 没有哪 一步在 通量控 
制中 能起决 定性的 作用。 由 此可以 推断: FCCs 是通量 控制的 一个重 要度量 标准, FCCs 的 
确 定在揭 示代谢 网络通 量控制 结构的 努力中 是一个 重要里 程碑。 

为了 确定控 制系数 和弹性 系数, 已经 提出许 多实验 方法。 所 有这些 方法都 包括以 这种或 
那 种方式 来确定 非线性 函数的 导数, 即非线 性函数 在一些 特定点 切线的 斜率。 正 如方框 
11.2 中所讨 论的, 这暗 示了一 个基本 问题, 由于 无穷小 的差分 只是一 种数学 抽象, 因此确 
定一个 未知函 数导数 的惟一 方法是 用一个 有限小 的差分 来去近 似它。 

方框 11.2 非线 性函数 的导数 

Ehlde (1995) 讨 论了非 线性函 数求导 过程中 的核心 问题, 它是 MCA 参数实 验确定 



上 的误差 线表明 了从这 两组数 据中的 每一个 的, 可以得 到一个 对实际 斜率的 精确估 计值。 



误差会 很大, 因此估 计值敏 感性也 很大。 相 反地, 如 果有限 差分是 基于在 实心方 块处的 
测量, 则 有限差 分将比 较大, 在估 测中可 能会出 现系统 误差。 但是在 这种情 况下, 估计 
值对 测量误 差更不 敏感。 

文献中 已提出 各种方 法用于 FCCs 的 确定。 这 些方法 可以分 为以下 三类。 
• 直 接法。 在小的 而且有 限的雜 活性变 化之后 ,直接 从通量 和酶活 性的测 量来确 定控制 系数。 
♦ 间 接法。 首先确 定弹性 系数, 随 后通过 MCA 定理 计算得 出控制 系数。 值得注 意的是 
MCA 理论产 生了一 个封闭 体系, 由此, 通过这 些定理 的运用 FCCs 和弹性 系数可 以互相 计算。 
* 通过瞬 时代谢 物浓度 的测量 来确定 FCCs。 

还有第 四种方 法也已 提出, 它 是利用 大范围 酶活性 扰动所 产生的 通量和 醱活性 测量。 由 
于此 法简单 实用, 具 有重要 的应用 前景, 将在 11.5 节中 对其进 行更为 详细的 检验。 

最 近已经 在进行 这样的 争论: 除 非首先 用双曲 线回归 分析对 实验数 据进行 处理, 并且实 
际 的通量 对薛活 性的曲 线图必 须密切 符合图 11.1 所 示双曲 线图, 否则 没有任 何实验 方法可 
以给 出满意 的结果 (Pettersson, 1996)。 这 种争论 暗示, 如 果上述 条件不 满足, MCA 应该 
以 能够直 接计算 FCCs、 CCCs 和弹性 系数的 动力学 模型为 基础。 虽然 对利用 动力学 模型来 
确定 FCCs 值 的精确 性毫无 争议, 但仍 要注意 的是, 这种 方法被 模型的 有效性 和模型 证实所 
严格 限制。 因此, FCC 确定的 实验方 法步骤 是很有 用的, 应该 花更多 的精力 来对其 进行完 
278 



图 11.2 基 于有限 差分的 导数的 两种近 似方法 
数据 点的误 差线表 明了随 机测量 误差, 坐标 




的 基础。 测量一 个未知 函数的 导数的 惟一方 
法是 用一个 有限差 分来近 似它。 这要 求在目 
标 点的附 近进行 测量, 接着确 定经过 测量点 
所画 直线的 斜率。 在该 点的导 数近似 值的准 
确度 随着有 限差分 长度的 增加而 减小。 同时, 
如 果有限 差分不 是以目 标点为 中心, 则对目 
标点 处导数 的估计 会产生 偏差。 随机 误差也 
将对结 果产生 影响, 当 有限近 似的尺 寸减小 
时, 则 对测量 误差的 敏感性 会随之 增加。 图 
11.2 对 这些点 进行了 说明。 在 这里, 希望确 
定实心 圆点处 切线的 斜率。 如 果有限 差分是 
基于 实心三 角处的 测量, 则该 有限差 分是小 



数据 所得的 导数估 计值的 敏感性 



但是 这种情 况下由 于扰动 的程度 很小, 测量 



善。 此外, 一个给 定代谢 途径的 通量控 制分析 的结果 不应该 打算作 为一种 最终的 回答, 而仅 
仅可 作为途 径中的 通量控 制是如 何分布 的一种 表示。 

11.2.1 确定通 量控制 系数的 直接法 

确定 FCCs 的最 直接的 方法是 在保持 所有其 它代谢 参数不 变时, 观 察一条 代谢途 径中酶 
活 性操纵 对通量 的影响 结果。 根据与 从薛的 有限变 化进行 导数确 定相联 系的根 本问题 (见方 
框 11.3), 应该 做足够 多的实 验来首 先确立 薛 活 性和通 量之间 的基本 关系, 即 得到一 个类似 
于图 11.1 的关 系图。 一旦 这样的 图可以 利用, 就 可从图 中相应 薛活性 对应的 曲线切 线的斜 
率 来确定 FCCs。 这导致 FCCs 的一 种非常 精确的 确定。 它的主 要缺点 是需要 大量的 实验来 
建 立通量 -酵活 性关系 曲线。 

所表达 的醉活 性的遗 传变更 

随着 分子生 物技术 的快速 发展, 改变 薛 活性 的最直 接的方 法是通 过在基 因水平 控制表 
达。 这种 方法使 我们可 以研究 细胞内 醇活性 改变的 效果。 但是实 际的薛 活性变 化会产 生大的 
扰动, 这 可能不 适合于 用无穷 小的分 析方法 来确定 斜率。 在 11.5 节的 大扰动 法更适 合于利 
用这种 方法的 结果。 或者, 需要 做大量 的实验 以得到 一个类 似于前 面讨论 的如图 11.1 所示 
的曲线 图来解 决这个 问题。 

利 用遗传 手段来 改变酸 活性, 这 可以通 过改变 目的薛 的基因 剂量或 插人一 个调节 型启动 
子来随 意操纵 基因的 表达来 实现。 可 以通过 选育不 同等位 基因的 纯合子 和杂合 子的经 典方法 
来改 变基因 剂量, Flint 等 (1981) 对 这种方 法作了 说明, 他们 研究了 丝状真 菌粗糙 脉孢菌 
{Neurospora crassa) 的精 氨酸生 物合成 途径。 除了 改变有 效基因 的剂量 之外, 这种 方法也 
能通过 利用不 同比活 性的多 态等位 基因使 催化活 性得到 改变。 但 经典法 的缺点 是不能 对酷活 
性进行 精细的 调节, 此外, 需要 构建许 多不同 突变株 的遗传 工程, 其工作 量是很 大的。 

一个 更具有 目 的性 的提高 基因剂 量的方 法是导 入带有 目 的基 因的多 拷贝质 粒或将 多个基 
因整合 在染色 体上。 这 种方法 不能提 供减少 基因剂 量的适 应性, 但是 对多倍 体菌株 来说, 有 
可能 对薛活 性进行 下调, 这 可以通 过构建 缺少目 的基因 的缺失 突变株 (或 者导 入点缺 失而破 
坏 编码目 的薛的 基因) 来 实现, 缺失 可以发 生在一 条或多 条染色 体上。 Niederberger 等 
(1992) 对 这种方 法作了 说明, 他们 研究了 酿酒酵 母的四 倍体菌 株中色 氨酸生 物合成 途径。 
这条 途径中 的五个 醇的活 性可以 通过改 变其基 因剂量 来进行 下调, 通过 这条途 径的代 谢通量 
并没有 被直接 确定, 但是 研究了 这些薛 活性对 该酵母 比生长 速率的 影响, 并 确定了 相应的 
FCCs。 所有的 FCCs 都很小 0, 并 由下调 实验所 验证, 薛活性 的增加 (通过 多拷贝 质粒获 
得) 对通 量只有 很小的 影响。 在充 分表达 了的菌 种中, 例如在5. ceret;z'5/a^^ (其 整个 基因组 
已经 测序) 和 £. coZf (其 缺失 突变株 通常可 以获得 或容易 构建) 中, 对醜活 性的下 调相对 
来说是 比较容 易的, 但对于 性质了 解得比 较少的 菌种就 比较困 难了, 在 这种情 况下要 把大量 
的 工作用 在构建 所必须 的突变 株上。 

用基 因工程 调节酶 活性的 极好的 方法是 在所研 究的途 径中编 码目标 薛的基 因前插 入调节 
型启 动子, 例如 大肠杆 菌中的 tac 启动子 (由 lac 启动 子和? 启动子 杂交而 成)。 这种方 
法具 有双重 益处: 既可以 调节酵 活性的 大小, 又 能实现 酶活性 的上调 节或下 调节。 Ruyter 



十分 明显, 当通 过诸如 测定比 生长速 率的方 法来测 定通过 色氣酸 合成途 径的通 量时, 得到 了小的 FCCs 值, 它 
实 际上表 示单个 BI 对整 个生物 质合成 总通量 的影响 事实 上作者 吃惊地 发现, FCCs 值介于 0.05~0.17 的 量级, 正如所 
期望的 那样, 生物质 合成通 量的控 制分布 于整个 生物合 成途径 的大量 雜中。 

279 



等 (1991) 介 绍了调 节型启 动子的 应用, 他们研 究了雜 IlG'e (在 葡萄糖 -PTS 中 的一个 蛋白, 
见 2.2.3 节) 的基 因控制 (通过 toe 启 动子) 及其对 £. coli 中 葡萄糖 代谢的 影响。 质粒中 
含 有编码 /aciq 阻 遏物的 基因, 因此允 许通过 变动培 养基中 的诱导 物异丙 基硫代 -/?-D- 半乳糖 
昔 (IPTG) 的量 来控制 《ac 启动子 的表达 效率。 将 该质粒 导入了 在染色 体上不 含编码 nGic 
基 因的菌 株中, 因 此就有 可能在 20%〜600% (同 野生 型中的 酶活性 比较) 的 范围内 来改变 
该 蛋白的 活性。 从 该研究 中得出 结论: 在葡萄 糖限制 的培养 基中, PTS 蛋白 对比生 长速率 
或 葡萄糖 氧化速 率没有 (或 仅有很 小的) 影响。 然而 却发现 IJGie 对 葡萄糖 的类似 物甲基 -a- 
吡喃半 乳糖昔 (其 FCC 值约为 0.6) 的吸收 和憐酸 化施加 重要的 控制。 

方框 11.3 式 (11.39) 的推导 

Delgadoh 和 Liao (1991) 在他 们的原 始论文 中推导 出了式 (11.39), 他们假 定关于 
代谢 物浓度 的动力 学是线 性的: 

K 

Vi = 2 kifj + bi i e ii,2,--,Li (1) 

式中, 是 动力学 常数, 并且由 于反应 速率的 线性化 6, 也是常数。 从弹性 系数的 定义中 
可以 写出: 

A=]^'j ze|l,2,-,Lt,;e|l,2,-,Kl (2) 
其中 丄 是 通过第 个反应 的稳态 通量。 将式 (2) 代 人连接 定理表 达式可 推导出 

,K\ (3) 



K\ (4) 



(5) 



(6) 

因为 Az;, = T;,(d- 丄, 它 是瞬时 反应速 率与稳 态通量 的差, 因此式 (11.39) 很 容易用 
加 和定理 导出。 

纯 化酶的 滴定法 

无细胞 抽提物 可用纯 化醉来 滴定, 而且如 果酶活 性被作 为一个 参数来 测定, 则通 量控制 
系数可 被直接 确定。 这种方 法的缺 点是实 验结果 对实验 误差的 敏感性 很大, 特 别是当 FCCs 
比较 小时。 Torres 等 (1986, 1991) 提出 了一种 减小对 实验误 差的敏 感性的 程序, 这种程 
序是基 于途径 缩短, 由此, 途径中 所有的 其它酶 (所 谓的附 属酶) 都被 过量供 给以减 小它们 
对通量 控制的 贡献。 在 这些条 件下, 通量 控制分 布在所 研究的 SI 中, 在这些 臃 之间通 量控制 
的相对 分布可 用酷滴 定法来 量化, 由 此确定 的体外 FCCs 与 体内的 FCCs 成 比例, 但 前者稍 
大。 这 种方法 的一个 重要假 定是所 有的反 馈和前 馈调节 回路都 被限定 在所研 究的途 径区段 
280 



£; d'k^j 7^ = i e U,2 ,…丄 |,j € U,2,〜 

或 

= i e \i,2,--',L\,j e li,2,''', 

因为 c,^0。 乘以 Ac, 后, 对 所有代 谢物进 行加和 则有: 

i;i;c;*^Ac, = k ^ U,2,...,U 

由 上式推 导出: 

,二。 k € jl,2r",U 



内, 并且 薛的饱 和度在 滴定过 程中不 会发生 变化。 Torres 等 (1986) 曾用滴 定法来 研究鼠 
肝脏细 胞抽提 物中糖 酵解途 径的催 化前几 步反应 的薛。 醛 缩酶、 磷酸 丙糖异 构醇和 3- 瞵酸 
甘油 脱氧薛 被过量 添加, 用己 糖激酸 (HK)、 6- 磯酸 葡萄糖 异构薛 (GPI) 和磯酸 果糖激 嗨 
(PFK) 来进行 滴定。 从他们 的滴定 分析中 发现: 实 际上, GPI 对糖酵 解途径 的通量 没有控 
制作用 [这同 磯酸己 糖构成 了一个 单独的 代谢库 这一普 遍发现 相一致 (见 2.3.1)]。 而 HK 
和 PFK 的通 量控制 系数被 确定为 分别是 0.77 和 0.24 (注意 这满足 加和定 理)。 滴定 程序非 
常好, 但 是很明 显它只 能应用 于纯化 薛可利 用的系 统中。 此外, 需要将 目的途 径部分 与代谢 
的 其余部 分进行 解耦, 这 就加人 了一个 限制, 特别是 对那些 调节回 路尚未 识别的 系统。 
特异性 抑制剂 滴定法 

对许多 薛 来说, 存在特 异性抑 制剂, 其可用 来滴定 体内酶 活性, 当产生 的通量 被测之 
后, 就能得 到相对 于抑制 剂的响 应系数 [见式 (U.7)] 的估 计值。 如 果酷相 对于抑 制剂的 
响应 (即 弹性) 已知, 就可以 通过式 (11.12) 算出通 量控制 系数。 因 为所要 确定的 FCCs 
是 对于不 存在抑 制剂的 情况, 因此, 必须对 抑制剂 浓度为 零的情 况下的 响应系 数进行 计算: 



£1 ^ a; 

J dci 



Vi oci 



或 



' J dci 



1 dxji 
— X ^ 
Vi oc I 



(11.28) 



(11.29) 



对于不 可逆抑 制剂, 酶活 性随抑 制剂浓 度线性 减小。 在此情 况下, 式 (11.29) 括号中 

的数值 等于薛 活性完 全控制 时的抑 制浓度 的负值 (- Ci,max), 因此 可由下 式得出 FCCs 值 

(Groen, et al, 1982): 



(11.30) 



式 (U.30) 的最后 一项可 从抑制 曲线在 起始点 处切线 的斜率 求出, 对于 可逆竞 争性抑 
制剂 和非竞 争性抑 制剂, 其它 的表达 式成立 (Groen, etal, 1982), 但 是如果 抑制剂 对反应 
速率 的影响 已知, 则 很容易 算出式 (11.29) 中 的最后 一项。 

抑 制剂滴 定也许 是确定 FCCs 最广泛 应用的 方法, 特 别是在 对分离 到的线 粒体和 细胞中 
的呼 吸的研 究中。 在 对鼠肝 脏线粒 体的研 究中, Groen 等 (1982) 用特 异性抑 制剂确 定了以 
琥 珀酸为 底物的 氧化磷 酸化途 径中各 个单一 步骤的 FCCs, 结 果如表 11.1 所示。 Fell 
(1992) 叙述 了抑制 剂滴定 法确定 FCCs 的许 多其它 应用。 其中, 要提及 Walter 等 (1987) 
对 巴氏梭 状杆菌 (Clostridium pasteurianum) 中 葡萄糖 PTS 系统在 糖酵解 途径调 节中的 
作用 的一项 研究。 在 此项研 究中, 木糖醇 被用作 葡萄糖 PTS 的特 异性抑 制剂, 研究 结果发 
现 在糖酵 解通量 中运输 系统的 FCC 等于 0.14。 

抑制剂 滴定法 的一个 主要问 题是: 通量 -抑制 剂曲线 初始斜 率必须 外推至 n 为零 以确定 
式 (11.30) 的最后 一项。 由于抑 制剂对 通量的 影响通 常是高 度非线 性的, 这就引 起方框 
11.3 中所 讨论的 问题。 把一 条线拟 合成曲 线的准 线性初 始部分 是不可 靠的, 而拟合 成非线 
性 函数, 如 多项式 函数, 确实使 估计值 得到一 些改进 (Small, 1993)。 这种方 法的另 一限制 
是 抑制剂 必须是 非常特 异的, 它 对系统 的其它 反应绝 对没有 影响。 

281 



表 11.1 鼠 肝脏线 粒体的 氧化碟 酸化途 径中, 不同 步骤的 通量控 制系数 





止 m 

步 骤 


4f7i itil -^1 

抑 制 剂 


FCC 


腺噤呤 核昔转 运蛋白 


将 ATP 从 线粒体 运输到 细胞质 


胶 苍术苷 


0.29±0.05 


质子 泄漏① 


质 子梯度 的泄露 


质子 解耦剂 


0.04±0.01 


二羧 酸盐运 输蛋白 


将 琥珀酸 盐运入 细胞质 


苯基號 拍酸盐 


0.33±0.04 


细 胞色素 C 氧化 醉 


将 电子传 递给氧 


叠 15 [化物 


0.17±0.01 


6c 1 复合体 


琥珀酸 盐脱氢 薛 


氣醌 -N- 氧化物 


0.03±0.005 


己糖激 SI ② 


ATP 消耗 








① 在质子 泄漏的 FCC 值的 估算过 程中, 添 加了不 同量的 寡霄素 和一种 质子解 耦联剂 [乙 二酵双 (/3-IS (基乙 8)-iV, N, 
AT, iV'- 四 乙酸] 来切 断氧化 磯酸化 作用。 这个过 程暗中 假定了 当没有 ADP 再 生时, 质子 泄漏的 FCC 值为 1, 这 一假定 
受到 Brand 等 (1988) (见例 12.3) 的 否定。 数 据来自 Groen 等 (19821))。 

② 己糖激 麻 的 FCC 值通 过酶滴 定法来 测定。 

11.2.2 确定通 量控制 系数的 间接法 

本节 所描述 的方法 之所以 被称为 间接法 是因为 首先通 过实验 确定了 弹性, 然 后利用 MCA 
定理 确定出 F(Xs。 构成这 种方法 的基础 有两个 主要的 假定: (1) 该代谢 系统是 充分描 述的, 
即所 有反应 和有关 的调节 相互作 用都已 包括在 系统描 述中; (2) 系 统处于 稳态, 初始底 物和最 
后 产物的 浓度是 定值。 为 了确保 这些条 件得到 满足, 最好至 少直接 确定系 统的一 个控制 系数来 
对结 果进行 检验。 Groen 等 (1986) 在他 们对鼠 肝脏细 胞的糖 异生途 径的研 究中, 确定 了所有 
的弹 性系数 (见例 11.2), 并用了 MCA 定 理计算 这条途 径中的 FCCs。 为了 检验该 结果, 他们 
也确 定了途 径对应 于底物 丙酮酸 的响应 系数。 由于 也测定 了第一 步反应 (丙 酮酸 脱羧) 对应于 
丙 酮酸的 弹性, 所以第 一步的 FCC 可 通过响 应系数 的定义 来计算 [式 (11.12)]。 

许多 不同方 法可被 用来确 定弹性 系数。 下 面是对 最常用 方法的 简述。 

双 调节法 (Double Modulation) 

为了对 这种方 法进行 说明, 考虑 EMP 途径中 的己糖 异构酶 反应: 

GPI 



'glucose-6-phosphate 
(6- 磷酸葡 萄糖) 



'fructose-6-phasphate- 
(6- 碟酸 果糖) 



该异 构酶反 应的速 率仅依 赖于所 示的化 合物的 浓度, 即 t^GPI 二 /(CG6P, CF6P)< 
该反应 速率等 于通过 EMP 途径 的通量 J , 因 此有: 



, r _ GPI . 

dJ acG6P 



acF6P 



(11.31) 

在稳 态下, 

(11.32) 



(11.33) 



3CG6P 9cf6P 

用稳 态通量 J 对该 式进 行衡量 并对结 果进行 整理后 可得: 

GPI GPI 

F6P 

在一个 控制实 验中, 测定 两个代 谢物的 浓度和 稳态通 量是可 能的。 通过引 入一个 扰动, 

例如 改变细 胞外葡 萄糖的 浓度, 以产生 一组新 的通量 和代谢 物浓度 的稳态 测量值 o。 通过用 

差分 来对式 (11.33) 中的微 分进行 近似, 这个 扰动实 验就产 生一个 方程, 此 方程将 通量和 
浓度 的测量 同两个 弹性系 数联系 起来。 如 果引入 第二个 扰动, 则 另一组 稳态通 量和代 谢物浓 
度的 数据可 以产生 第二个 方程, 从而可 由此计 算出两 个弹性 系数。 

这 个被称 为双调 节的方 法是由 Kacser 和 Burns (1979) 首先提 出的。 很 显然, 必须恰 



十分 明显, 恒化培 养实验 对这种 类型的 研究是 非常合 适的, 因 为对每 一种细 胞外的 葡萄糖 浓度都 能达到 稳态, 

此外, 通过 EMP 途径的 通量能 在恒化 培养中 被精确 估计, 并 且可以 取得足 够大的 样品以 获得胞 内代谢 物浓度 的完整 
数据。 



282 



当地 设计两 个扰动 实验以 产生两 个线性 无关的 方程, 即下 面的不 等式必 须得到 满足: 

-Tr-f^T^rr-F (11.34) 
alncp5p dlncp5p 

式 (11.34) 中 的上标 与相应 的扰动 得到的 测量相 对应。 如果式 (11.34) 两边 之间的 差别很 

小, 则表明 产生的 两个方 程对弹 性的计 算是病 态的, 方程 的解对 实验误 差会变 得非常 敏感。 
实 际上, 在很多 途径中 很难得 到一组 线性无 关的测 量值来 满足式 (11.34)。 为 了提高 这些测 
量真 正相互 独立的 概率, Fell (1992) 建议调 节既要 在所研 究途径 的上游 进行, 又要 在下游 
进行。 这 种方法 的另一 个缺点 是为了 满意地 用有限 差分来 近似微 分而需 要尽可 能小的 变化, 
但这种 变化很 可能被 与之不 成比例 的实验 误差所 支配。 值 得注意 的是, 对于 大多数 醉 反应来 
说, 除了 反应物 和产物 之外还 存在诸 如辅因 子和抑 制剂等 其它效 应物。 这意味 着反应 速率是 
多于 前面例 题所用 的两个 变量的 函数。 由于 需要用 一个不 同弹性 来描述 每一个 变量的 作用, 
因此有 必要进 行两次 以上的 扰动实 验来产 生线性 无关的 方程。 
单 调节法 (Single Modulation) 

对于一 个像式 (11.31) 所 示那样 的反应 序列, 如 果知道 其中一 个弹性 系数, 则 其它的 
弹性系 数可通 过单调 节实验 获得。 这 种方法 的优点 是可以 应用几 个同类 型的但 调节幅 度不同 
的 调节, 并 且可用 作图法 来确定 方程式 (11.33) 中的微 分项。 Greon 等 (1986) 用 此法确 
定了 丙酮酸 激醇对 磯酸烯 醇丙酮 酸的弹 性系数 和丙酮 酸羧化 嗨 对 细胞质 中草酰 乙酸的 弹性系 
数 (见例 11.2)。 此 法显然 比双调 法的稳 定性更 强健, 但它 仍依靠 方程式 (11.33) 中的微 
分项 有一个 精确的 估计, 当然还 需要一 个弹性 系数的 信息。 

自上 而下法 (Top-Down Approach) 

在 许多情 况下, 由 所有的 FCCs 所提供 的详细 信息对 我们来 说并不 真是必 需的, 而识别 
出 大部分 通量控 制所在 的一组 (Group) 却更为 重要。 这 可帮我 们将注 意力集 中在代 谢的重 
要 部分。 而且, 重 复此过 程可以 使我们 将通量 控制定 位于逐 渐更小 的反应 组中。 反应 分组在 
代谢途 径通量 控制分 析中是 一个很 有用的 概念, 对此 将在第 13 章 中详细 讨论。 其基 本想法 
出自由 Brand 、 Brown 及其同 事们对 MCA 引人的 自上而 下法, 由此将 所研究 的代谢 途径分 
为 只有一 个共同 的代谢 物的几 个部分 (或几 个组) (Brown et al, 1990a; Hafner et al, 
1990): 

S^^X^^P (11.35) 
在 分支途 径中, 共 同的中 间产物 X 显然是 分支点 处的代 谢物, 而对于 一个线 性代谢 途径, X 
将是 K 个代谢 物中的 一个。 可以引 入组通 量控制 系数以 提供一 种度量 标准, 用于度 量该组 
中的反 应所施 加的通 量控制 程度。 很容易 看出式 (11.35) 的两个 反应组 中的每 一个的 
FCCs 等 于该组 中各步 反应的 FCCs 之和 (Brown etal, 1990a), 而组 FCCs 服 从加和 定理: 

^Groupl + ^GroupZ =1 ( 1 1 . 36 ) 

除了 FCCs 之外, 可引入 一组关 于中间 代谢物 的弹性 系数来 描述那 个代谢 物对该 组中反 
应速率 的影响 (见第 13 章)。 

Group, ^_£)^X Group, 2| (11.37) 

A "Group, 

类似 于连接 定理, 组 弹性系 数和组 通量控 制系数 有以下 关系: 

CI (iroupl , W Group2 _ r, / 1 i ooN 

Groupie X 卞 iGroupZSx — U VI 丄. "50 乂 

283 



对 于组浓 度控制 系数, 类似 的定理 也成立 (Brown etal, 1990a)。 

当代 谢途径 被分割 之后, 总弹 性系数 可以被 确定, 例如, 通过双 调节法 实验, 或 如果弹 
性系 数之一 已知, 可 通过单 调节法 确定其 它弹性 系数。 从式 (11.36) 和式 (11.38) 中, 可 
以 算出组 FCCs, 以提供 存在于 两部分 代谢途 径中的 每一个 部分通 量控制 的度量 标准。 原则 
上, 由 于可在 任意位 置对途 径进行 分割, 这就将 有可能 渐渐缩 小具有 最大组 FCC 的 一组单 
个 反应。 然而, 应 用双调 节法或 单调节 法的一 个前提 是除了 代谢中 间产物 X 外没有 任何其 
它的效 应物, 也就 是说, 反 应组之 间除了 通过中 间产物 X 之外, 相互 之间不 能发生 任何对 
话 (cross-talk)。 这也是 这种方 法的一 个主要 缺点, 因为在 许多情 况下, 除了 通过共 同的中 
间产物 X 外, 两个组 之间的 相互作 用经常 发生。 在第 13 章 中介绍 了一种 方法, 用于 对这种 
相互作 用的强 度及其 影响从 通量测 量进行 FCCs 确定的 程度的 评估。 自上而 下法被 Brand, 
Brown 及 其同事 们用来 分析氧 化磷酸 化作用 (见例 11.3), 并且 它在复 杂反应 网络的 分析中 
也很 有用, 在第 13 章中将 对此作 详细的 介绍。 

从动力 学模型 计算弹 性系数 

如果一 个有效 的数学 模型可 用于表 达一个 薛反应 的速率 , 则它对 效应物 和底物 的弹性 
很容易 用弹性 系数的 定义来 计算。 为 了控制 分析的 目的, 并不需 要动力 学方程 是基于 机理而 
得 出的, 只 要它正 确地描 述不同 效应物 的动力 学影响 即可。 这种方 法简单 直接, 而且 非常强 
健, 但 它引起 了一个 基本的 问题: 体外 酶动力 学是否 正确描 述了体 内晦的 功能? 幸运 的是, 

t^max 值在弹 性系数 的计算 中被消 除了, 这 样问题 就简化 成为对 亲和性 (或 Km 值) 的 计算。 

在这些 研究中 考虑到 所有可 能的效 应物也 是很重 要的。 此外, 因 为小弹 性系数 值通常 与大的 
控制 系数有 联系, 因 此具有 小的弹 性系数 的效应 物对通 量控制 是最重 要的, 而 在大多 数薛动 
力学的 体外研 究中存 在着集 中到具 有大弹 性系数 的效应 物上的 趋势。 在 用体外 薛动力 学的数 
据的另 一个告 诫是, 大 多数酶 动力学 研究是 基于初 始反应 速率的 测量, 此时没 有反应 产物存 
在。 显 然这种 实验情 景是代 表不了 体内条 件的。 

有许多 通过动 力学模 型来计 算弹性 系数的 例子。 在 Groen 等 (1986) 对 鼠肝脏 细胞中 
糖异生 作用的 分析中 用此法 确定了 一些弹 性系数 (见例 11.2)。 Galazzo 和 Bailey (1990) 在 
对 S. crerex;z'sz'ae 中糖 酵解途 径的分 析中计 算了所 有关键 步骤的 组弹性 系数, 并用它 们分别 
计算 出悬浮 细胞和 固定化 细胞培 养中从 葡萄糖 到乙醇 途径的 FCCs。 这 个主题 将在第 12 章、 
第 13 章 中进行 详述。 
11.2.3 瞬 态代谢 物测量 的应用 

即使 FCCs 是 对稳态 系统定 义的, Delgado 和 Liao (1992a, b) 提 出了通 过直接 测定代 
谢 物的瞬 态浓度 来确定 FCCs 的 方法, 该 方法提 出四个 假定。 

(1) 外部 代谢物 库对代 谢途径 的动力 学没有 影响, 或它们 的浓度 被控制 在一个 稳态水 
平。 这也是 MCA — 个普遍 假定。 

(2) 在 稳态点 附近酶 动力学 的线性 近似在 一个较 宽的代 谢物浓 度范围 内是有 效的。 此限 
制 条件在 随后的 讨论中 可以被 放宽。 

(3) 从 代谢物 浓度的 测量来 确定通 过途径 中每一 反应的 瞬时通 量在理 论上一 定是可 
行的。 

(4) 代谢 物在体 系中均 勾分布 (MCA 的另 一个普 遍假定 )。 

基 于上述 假定, 可 以推导 FCCs 与通过 每个酶 的瞬时 通量之 间的如 下关系 (见 方框 
11.3): 
284 



v.(t) 
J, 



= 1 (11.39) 



式中, v.U") 是 通过第 z 个反应 的瞬时 通量, 丄 是稳态 通量。 瞬 时通量 可由代 谢物浓 
度的 测量估 算出, 式 (11.39) 可用 来计算 途径的 FCCs。 然而, 从代 谢物测 量浓度 来精确 
估计瞬 时通量 (包括 导数的 确定) 是 一个很 难进行 并容易 出错的 过程。 由 于这个 原因, Del- 
gado 和 Liao (1992a) 提出 了另一 种可供 选择的 方法, 此法 基于式 (11.39) 的积分 形式。 
按照 此法, 可通过 利用式 (11.40) 从 瞬态代 谢物测 量首先 确定一 组系数 a, , 式 (11.40) 
等 价于式 (11.39) 的积分 形式: 

f]a,[c,{t) -c,m = t (11.40) 

对该途 径中的 FCCs 与式 (U.40) 的系数 a, 进行 关联。 对于一 个线性 途径, 这个关 系如下 
所示: 

((:々,CV",Ci) = Ui,a2,'",aK)GV (11.41) 
式中, J 是流 经途径 的稳态 通量; 是途 径的化 学计量 矩阵。 式 (11.41) 中的 化学计 
量矩 阵与第 3 章 中介绍 的关于 胞内代 谢物的 化学计 量矩阵 G 不完全 一样, 因 为其需 要被扩 
充到包 括途径 中底物 和代谢 产物的 化学计 量系数 (分别 置于矩 阵中的 第一列 和最后 一列中 )。 
对于一 个分支 途径, 等 价于式 (11.41) 的 FCC 计算 式为: 

CJ = Ui,a2,"',aK)G*J (11.42) 
式中, d 是包 含所有 FCCs 的矩阵 [见式 (11.26)]; J 是 在对角 线上含 有通过 途径的 
各个单 个分支 的通量 的对角 矩阵。 

在对一 个稳态 恒化器 注入一 个脉冲 之后所 产生的 瞬态期 间内代 谢物浓 度测量 值用式 
(11.40) 进 行回归 拟合, 就可确 定系数 a, 的值。 然后可 以利用 这些系 数从式 (11.41) 或式 
(11.42) 来计算 FCCs。 如果 在代谢 物浓度 之间存 在线性 约束, 也就 是说, 一 个代谢 物浓度 
是其它 代谢物 浓度的 线性组 合时, 则对式 (11.40) 的 最小平 方拟合 是不可 能的。 这 种约束 
的 一个例 子是质 量平衡 方程: 

l][c,(0 -c,(0)] = (11.43) 

对 于诸如 NAD+ 和 NADHO 等作 为被保 存一半 的化合 物也可 能存在 化学计 量上的 约束限 
制。 即 使在式 (11.40) 中 可能已 经滤掉 了这些 限制, 但 通过删 除该代 谢物浓 度的测 量值及 
其 在化学 计量矩 阵中的 相应行 来消除 这些限 制是明 智的。 最好的 选择是 删除那 些具有 最大不 
确定 性的测 量值。 

即使 没有化 学计量 学上的 限制, 由于动 力学的 原因, 一些代 谢物之 间可能 仍然是 线性相 
关的。 例如, 如果一 个反应 的反应 速率大 大快于 其它的 反应, 这 个反应 在发生 扰动之 后可以 
很 快达到 准平衡 状态, 结果其 底物和 产物的 浓度将 与平衡 常数相 关联。 Delgaclo 和 Liao 
(1992a) 建议: 如 果事先 知道这 些平衡 反应, 应将 这些受 平衡反 应约束 的代谢 物一起 归并进 
一个共 同代谢 库中。 



要注 意到: 在对 胞内代 谢物的 化学计 量矩阵 G 的定 义中 仅仅包 括了一 个代表 了所有 的作为 储存部 分的化 合物的 
化 学计量 系数, 例如: 包 括一个 仅代表 化合物 NAD+ 或 NADH 的化 学计量 系数。 这样在 化学计 量矩阵 (;中 不存在 线性相 

关的代 谢物, 因此在 对矩阵 的定义 中不存 在化学 计量上 的限制 C 

. 285 



Scf4^1=l-^ (11.44) 



基 于瞬时 代谢物 测量的 方法也 可以用 来确定 CCCs (Delgado 和 Liao, 1992b)。 这里的 
分析类 似于式 (11.39) 的 一个方 程式: 

vM]_ , c,(t) 
- ― Ji 

式中, 是稳态 代谢物 浓度。 式 (11.39) 和式 (11.44) 清楚地 表明: 代谢物 浓度和 
通过 各个单 个反应 的通量 不能随 着对一 个稳态 的扰动 而独立 地发生 变化, 这是 由于它 们被在 
稳态时 的控制 系数所 限制。 式 (11.44) 的积分 形式可 以用来 确定浓 度控制 系数, 这 允许对 
代谢 物测量 值进行 线性函 数的最 小二乘 回归, 接 着就可 以计算 CCCs 了。 

这 种瞬时 代谢物 测定的 方法非 常好, 因它能 使控制 系数的 确定相 对比较 容易。 这 种方法 
的 主要批 评性意 见是线 性化的 动力学 假定。 但 是最近 的研究 (Nielsen, 1997) 表明, 当反 
应动 力学能 用相对 于代谢 物浓度 的对数 的线性 函数描 述时, 这种方 法也可 应用。 这类 线性化 
通 常可以 对反应 动力学 进行更 精确的 描述。 目前还 没有用 此方法 对一个 完整代 谢途径 进行分 
的实际 例证。 Delgado 等 (1993) 用这种 方法确 定了一 个体外 重建的 部分糖 酵解途 径中己 
糖激 歸和磯 酸果糖 激酵的 FCCs, 同时 也用薛 滴定法 确定了 FCCs, 发 现两种 方法所 得的结 
果非常 一致。 该 方法中 的另一 个问题 是所确 定的控 制系数 对测量 误差有 很高的 敏感性 
(Ehlde 和 Zacchi, 1996), 这 是各个 代谢物 浓度之 间存在 高度相 关性的 结果。 基于该 方法的 
理 论分析 (用 Monte Carlo 模拟法 ), Ehlde 和 Zacchi (1996) 得出 结论: 不可 能从实 际的实 
验数据 得到控 制系数 的合理 确定, 因为这 样的数 据总是 由于带 有某种 噪声而 变坏。 
11.2.4 动力 学模型 

当对所 研究的 代谢途 径建立 了完整 的动力 学模型 之后, 原则上 MCA 的 概念就 不需要 
了。 如果这 种生化 模型是 足够强 健的, 它可 用来预 测薛活 性的小 的扰动 和大的 变化两 种情况 
的 影响。 此外, 生化模 型的结 构通常 将揭示 代谢物 和效应 物水平 对反应 速率的 影响。 尽管这 
种 事实, 应 用动力 学模型 来确定 不同条 件下的 MCA 系 数仍是 很有价 值的, 因 为它们 提供了 
关于通 量控制 的简明 定量的 信息。 对于动 力学模 型在完 整代谢 途径中 的应用 的一个 总评判 
是: 尽管 包含了 细节的 程度, 但它 们不能 包括系 统中所 有可能 的相互 作用, 因 此它们 只代表 
系统的 一种模 型, 特 别是当 动力学 模型被 用于预 测时, 其 强健性 (robustness) 是极 端重要 
的。 但不幸 的是, 大多 数生化 模型, 即使 是非常 详细的 模型, 也 只是在 接近对 参数进 行估计 
的 操作条 件下才 有效, 也就 是说, 它们 的预测 力是有 限的。 然而, 对 于复杂 系统的 分析来 
说, 模 型对所 有变量 给出定 量正确 的描述 是不必 要的, 因 为有些 模型甚 至只对 系统中 最重要 
的相互 作用给 出定量 正确的 描述, 但其 在通量 控制研 究中可 能非常 有用。 

11.3 线性 途径的 MC A 

在本节 和下一 节中, 将 把代谢 控制分 析运用 到线性 和分支 代谢途 径中。 MCA 方 程的特 
殊形 式就是 在这些 情况下 推导出 来的, 它们的 应用将 用作为 例证的 实例来 说明。 

对一个 线性代 谢途径 来说, 代 谢物的 个数是 L- 1, L 是酶反 应数, 也就 是说, 代谢物 
数 比醇反 应数少 1。 在 这种情 况下只 有一个 通量, 它 等于稳 态下所 有反应 的反应 速率。 同时 
还存在 L 个未 知通 量控制 系数, 每 一个系 数表示 代谢途 径中每 一反应 对整个 代谢途 径通量 
的 影响。 FCCs 可 以通过 连接定 理和加 和定理 共同来 确定。 对于 L-1 个 中间代 谢物有 L - 1 
个连接 定理, 与加 和定理 一起, 就提供 了恰好 足够多 的方程 以从弹 性系数 计算出 L 个通量 
控制 系数。 类 似地, 浓 度控制 系数也 能从相 应的连 接定理 和加和 定理来 确定。 对于 (通 量和 
286 



浓度) 控制系 数方程 (总共 个 方程) 能以矩 阵形式 方便地 概括为 下式, 这是由 Fell 和 
Sauro (1985) 提 出的。 



1 



1 1 

L 

-X, 



^1 



ci -c: 



-a 



c 



1 
1 





(11.45) 



容易表 明该式 完全等 同于式 (11.26) 对线性 途径的 一般化 形式。 其中 参数弹 性矩阵 P 等于 
单位 矩阵。 如果 弹性系 数矩阵 是非奇 异的, 则可 以通过 矩阵求 逆来计 算控制 系数。 以 这种方 
法, 由 控制系 数所表 示的系 统性质 与在弹 性系数 中所反 映的局 部醇动 力学就 被联系 起来。 

为说 明这些 概念, 我们 回到式 (11.1) 所 示的简 单二步 途径, 为此, 式 (11.45) 简化 
为 下式: 



1 1 



C{ 



II 
[0 I 



(11.46) 



其解为 



c{ c? 



X 



1 



X tx 



(11.47) 



通常, 一个反 应的弹 性对其 产物为 负值, 而对其 底物为 正值。 这样, 是 负值, e 2 x 是正 
值, 控制系 数表达 式中的 分母是 正值。 这就 使两个 FCCs 的 值均为 正的。 通量 控制的 分布取 
决于 相应的 弹性系 数值: 大弹 性系数 与小的 FCC 值相 联系, 反之 亦然。 如果 相应于 该代谢 
物的 第一个 反应的 弹性非 常低, 正如对 一个实 际上的 不可逆 反应, 第一步 反应的 FCC 将接 
近于 1, 在 这种情 况下就 产生一 个真正 的限速 步骤。 仅仅 当相应 于该代 谢物的 第一步 反应的 
弹性为 时, 即反 应产物 对反应 速率绝 对没有 影响, 这两个 反应的 FCCs 值 将精确 地达到 1 
和 而与 代谢物 的浓度 无关。 然而, 甚至 对实际 上是不 可逆的 反应, 相 应于反 应产物 总是有 
一些 弹性, 一个真 正的瓶 颈反应 实际上 决不会 达到。 实际 上具有 瓶颈效 应的反 应是从 不存在 
的。 注 意到下 述情况 是很有 趣的: 如 果一条 线性代 谢途径 中的所 有反应 都用不 可逆的 
Michaelis-Memen 动 力学来 描述, 则相 应于反 应产物 的弹性 为零, 而且 除了第 一步外 的所有 
FCCs 都等 于零, 第 一步的 FCC 等于 1。 然而在 实际中 很明显 的是: 如 果第一 步反应 的醇活 
性急剧 上升, 中间代 谢物的 浓度将 上升, 最终 第二步 反应将 变得被 这种代 谢物所 饱和。 这将 
使该 反应相 应于代 谢物的 弹性非 常低, 因而具 有非常 高的通 量控制 系数。 确实, 第二 步反应 
活性的 微小提 高将对 通量产 生重要 影响, 因 为很容 易将积 累的代 谢中间 物催化 耗尽。 还应注 
意: 在这 种情况 下将产 生一个 病态方 程组, 从矩阵 求逆中 得到的 解对于 可利用 的代谢 物浓度 
数据 可能是 非常敏 感的。 



注意, 此 解同式 (11.26) 所 表示的 MCA 的通 式一致 C 在此 例中这 个通式 取以下 形式: 

(C 人 。1 仁厂 ON /ei \ 



287 



如果我 们假定 代谢物 X 对第 一个反 应的影 响是负 的而对 第二个 反应的 影响是 正的, 则 

第一个 反应的 浓度控 制系数 为正值 (意 味着当 反应速 率增加 时代谢 物浓度 也增加 ), 而第二 
个 反应的 浓度控 制系数 为负值 (意 味着当 第二个 反应速 率增加 时代谢 物浓度 将变小 )。 如果 
至少 一个弹 性系数 很大, 则浓 度控制 系数将 很小, 反之 亦然。 因此, 如 果反应 相应于 代谢物 
浓 度的变 化是非 常有弹 性的, 反 应速率 被调整 至新的 条件, 变化 着的反 应速率 将对代 谢物浓 
度有 很小的 影响。 



【例 11.1】 青 霄素生 物合成 途径的 MCA 

对青霉 素生物 合成途 径已经 了解得 很清楚 [见 Nielsen (1996) 的综 述]。 该途径 中包括 
:步 晦反应 (见图 11.3), 其中 头两步 在所有 i9- 内酰胺 抗生素 的生物 合成途 径中都 



HN, 



HOOC' 



COOH 



or- 氨基 己二酸 



HOOC' 

半 胱氛酸 




織氨酸 




ACV 合成酶 



SH 



— NH- 



HOOC 

L-a- 氨基 己二酰 -L- 半 胱氨酰 -D- 缬氨酸 




\COOH 



1PN 合成 II 




COOH 



a- 氨基 己二酸 




\COOH 
6-APA 



-0— CHj— C— CoA 




XOOH 



HOOC 

a- 氨基 己二酸 



O— CHj-c— NH 




图 11.3 产 黄青霄 iPenicillium chrysogenum ) 中的 青霄素 生物合 成途径 

288 



是 一样的 (不同 生物的 醇之间 有很高 的同源 性)。 途径中 的第一 步反应 是三种 氨基酸 (L- 
a- 氨基己 二酸、 L- 半胱 氣酸和 D- 缬 氨酸) 缩合成 L-a- 氣基己 二酰- L- 半 胱氨酰 -D- 颡氨酸 
(LLD-ACV)o L- 半胱 氨酸和 L- 缬氨酸 是所有 细胞代 谢中众 所周知 的中间 产物, 而 L-a- 氨基 
己 二酸是 真菌中 合成赖 氨酸的 一个中 间物。 由一个 单一多 功能酶 —— ACV 合成 薛 (ACVS) 
催化形 成三肽 LLD-ACV。 途径中 第二步 反应是 LLD-ACV 的氧 化闭环 反应以 形成异 青霉素 
N。 这一步 是由异 青霉素 N 合成 薛用自 由氧作 为电子 受体完 成的。 到 青霉素 V 的最 后转化 
是由乙 酰辅酶 A: 异 青霉素 酰基转 移酸催 化的, 而 且可以 通过一 个一步 或两步 的反应 机制。 
在两步 反应机 制中, a- 氣 基己二 酸的部 分发生 断裂并 释放出 6-APA (6- 氨基青 霉烧酸 )。 如 
果 一个活 化的前 体物即 苯氧基 乙醜辅 薛 A 是可利 用的, 则 6-APA 就会和 AT (转酰 氨醜) 
结合, 随后被 转变为 青霉素 V。 在一步 反应机 制中, 《- 氨 基己二 酸的异 青霉素 N 侧链 同前 
体物 发生了 交换, 而没有 从瞎中 释放出 6-APA。 

Nielsen 和 Jorgensen (1995) 已 对这条 途径进 行了代 谢控制 分析。 他们在 分析中 提出了 
前两个 醇的动 力学表 达式, 从 ACVS 和 IPNS 的动力 学表达 式确定 了弹性 系数, 并用 MCA 
定理计 算了前 两步反 应的通 量控制 系数。 从 对最后 一个酶 (AT) 活性 的测定 中得出 结论, 
由 AT 施加的 通量控 制是最 小的。 这 个结论 后来被 Pissara 等 (1996) 对这条 途径中 的所有 
反应进 行的更 详细的 分析所 证实。 

ACVS 已经 表明, 对于参 与该合 成贿反 应的每 一个氨 基酸, 都 可以用 Michaelis-Menten 
动 力学来 表示。 Nielsen 和 J<l>rgensen (1995) 在他们 的分析 中提出 了由反 应产物 LLD-ACV 
的反 馈抑制 作用, 因此, 对于 ACVS 催化的 反应, 提出以 下的动 力学表 达式: 



(1 + KaaaCaai + ^cysCcy.s + ^ val C vaf ) (l + CACvK^Cv) 

最近, P. chrysogenum 中的 ACVS 被 提纯, 并 证实了 LLD-ACV 对其有 反馈抑 制作用 
(Theilgaard, et al, 1992)。 在式 (1) 中, z^max 是 不同效 应物的 函数, 这 些效应 物包括 
ATP、 AMP. 焦磷 酸盐、 磷 酸盐、 CoA 和 Mg2+, 其中 ATP 对反应 有促进 作用而 AMP 和 

焦 磷酸盐 对反应 有抑制 作用。 取 三个米 氏参数 Kaaa、 Keys 和 K val 的值 等于所 报道的 S . 

clavuligerus 的值, 即 依次为 0.63mmol/L、 0.12mmol/L 和 0.30mmol/L (当 时对 P. 
chrysogenum ACVS 还没 表征, 其它 Km 的应用 对分析 结果并 无太大 的影响 )。 Kacv 的值可 

以通过 /"Aev 对通过 青霉素 生物合 成途径 的通量 的拟合 而估计 出来。 

异 青霉素 N 合成酶 (IPNS) 是 /3- 内 醜胺抗 生素的 生物合 成途径 中充分 表征了 的一个 
m。 该醇 是一种 依赖于 铁的氧 化醇, 它从 LLD-ACV 中移走 4 当 量氣, 同 时消耗 Imol 氧。 
已经从 P. chrysogenum 纯化出 1PNS (Ramos et al, 1985), 其体外 活性都 需要分 子氧、 
Fe 2 +、 二硫苏 糖醇和 抗坏血 酸盐。 这 个酶和 LLD-ACV 浓 度之间 的关系 可以用 Michaelis- 
Menten 动力学 方程来 表示, 其 Km 值为 0.13mmol/L。 此外, 谷胱甘 肽可能 是该酶 的竞争 
性抑 制剂, 其 表观抑 制常数 K, 为8.9011^01几。 目前还 没有氧 浓度对 纯化的 IPNS 动 力学影 
响 的研究 报道。 但是 对于从 P. chrysogenum 中部分 纯化的 IPNS, Bainbridge 等 (1992) 
发 现当氧 浓度在 0.070 〜 0.18mmol/L 的 范围内 (对 应于 25% 〜75% 的空气 饱和度 ) , 该雜 
的动力 学方程 对氧是 一级。 这 表示将 LLD- ACV 转 变为异 青霉素 N 的 反应对 溶解氧 浓度的 
变化是 非常敏 感的。 在对其 它几个 i9- 内酰胺 产品的 实验中 也观察 到了这 一点。 基于 这些结 
果, 提出如 下表达 式用于 LLD-ACV 转 化为异 青霉素 N (IPN) 的动 力学: 

289 



riPN = 



cCACV 



CaCV + Km(l + CglutK ■ 1) 



(2) 



其中两 个参数 Km 和 K, 取自文献值, 分别是 O.13mmol/L 和 8.9mmol/L。 

从前 体物氨 基酸的 胞内代 谢库、 LLD-ACV 及 ACVS 的 活性等 测量, 就 可以通 过动力 
学 表达式 (1) 计算出 LLD-ACV 的合 成速率 (rAcv)。 通过将 计算出 的速率 与青霉 素总合 
成测 量进行 拟合, 可 估计出 Km.v 值为 12.5mmol/L, 这个 值比纯 化薛的 值略高 (Theilgaard 
et al, 1997)。 显然, 在体 外条件 下所确 定的抑 制参数 是在机 理概念 上的正 确值, 而 从生产 
能 力拟合 所确定 的值可 能被体 内存在 的其它 影响掩 盖了。 拟合值 在通过 ACVS 催化 的反应 
的 实际通 量与从 动力学 表达式 预测的 通量之 间得到 非常好 的一致 结果。 因为对 IPNS 反应也 
发 现非常 一致, 所以 可得出 结论: 简单的 动力学 表达式 (1) 和 表达式 (2) 可 以很好 地表示 
前 两步反 应的动 力学, 从而允 许弹性 系数和 通量控 制系数 的精确 确定。 

对 ACVS 和 IPNS 反应的 弹性系 数可以 首先通 过对速 率方程 求偏导 而得出 : 



ACVS 
•ACTs 



cacvK 



ACV 



1 + CACVK 

ACV 



IPNS 

: - CACV + Km(l + CgiutK,- 1) 



(3) 



(4) 




式 (3) 和式 (4) 表明弹 性系数 是谷胱 甘肽和 LLD-ACV 浓度的 函数。 由 于反馈 抑制, 第 
一 个反应 相应于 LLD-ACV 的弹性 系数为 负值, 而第二 个弹性 系数为 正值。 流 加培养 期间, 
胞内途 径代谢 物的浓 度发生 变化, 因 此不能 严格满 足稳态 假定。 然而从 时间尺 度分析 已经发 

现整个 流加过 程中, 尽 管积累 了很多 LLD- 
ACV, 途径 代谢物 库处于 拟稳态 (Pissaraet 
al, 19%), 这样, MCA 理论仍 然是适 用的。 
通过 对谷胱 甘肽和 LLD-ACV 瞬时浓 度的测 
定, 已计算 出流加 培养期 间在不 同时间 时的弹 
性 系数, 如图 11.4 所示。 

要注 意到, 对于 ACVS, 弹性系 数是负 
的, 也就 是说, 增 加着的 LLD-ACV 浓 度将减 
小由 ACVS 催化的 LLD-ACV 合成 速率; 在整 
个 流加培 养的过 程中, 由于 不断增 加着的 
LLD-ACV 浓 度使弹 性系数 的值也 变大。 在另 
一 方面, 对于 IPNS, 弹性系 数值为 正值, 也就 是说, LLD-ACV 浓度 不断增 加所产 生的影 
响是 正的, 但是当 IPNS 变得由 LLD- ACV 饱 和时, 弹性系 数在整 个流加 期间将 减小。 

通量控 制系数 是用式 (11.47) 从 弹性系 数计算 出的, 结 果如图 U. 5 所示。 最初, 对 
于 ACVS 的 通量控 制系数 是高的 (接 近于 1), 因为几 乎不存 在来自 中间物 LLD-ACV 的 
抑制。 但是, 当 LLD-ACV 的 浓度增 大时, 通 量控制 逐渐由 ACVS 转移到 IPNS, 并 在培养 
大约 70h 之后, 通量基 本上由 IPNS 所 控制。 随 着通量 控制从 ACVS 到 IPNS 的 转移, 这两 



—■—ACVS 

— ©— IPNS 



吋间 /h 

图 11.4 在 流加培 养期间 两个酶 ACVS 和 
IPNS 相应于 LLD-ACV 的弹 性系数 
注意: ACVS 的弹 性系数 是负值 



个醇 没有哪 个能被 看做限 速薛, 
变的。 

290 



这证 明对一 个给定 的代谢 途径, FCCs 值 并不是 恒定不 



另 一个有 趣的观 察是: 式 (2) 所 推荐的 IPN 形成的 动力学 揭示溶 氧浓度 的增加 将导致 
通 过途径 的通量 的显著 增加, 这 是因为 IPNS 活 性的微 小增加 将阻止 LLD-ACV 的积 累并因 
此而防 止了对 ACVS 的 抑制。 Pissara 等 (1996) 对该途 径用一 个完整 的动力 学模型 (即用 
图 11.3 中所 考虑到 的所有 反应) 来检 验溶氧 对青霉 素生物 合成的 影响。 他们 发现: 合成青 
霉 素的代 谢通量 确实对 溶氧的 浓度很 敏感, 在溶 氧浓度 
低的情 况下, 对于 IPNS 的 FCC 将 增加。 这一发 现最近 
已被 Henriksin 等 (1997) 用实验 证实, 他们 发现: 在 
一个 以葡萄 糖限制 的恒化 器中, 在低 溶氧浓 度下, 
LLD-ACV 的浓度 将逐渐 上升。 从式 (3) 和式 (4) 中 
明 显可以 看出, 对 ACVS 催化的 反应, 这 将导致 一个数 
值 上很大 的弹性 系数, 对 IPNS 催化的 反应, 则 为一个 
较小 的弹性 系数, 这 再次意 味着对 IPNS 有 更高的 
FCC。 

从这 些弹性 系数, 用式 (11.47) 也 可以计 算出浓 
度控制 系数。 对于 ACVS, 其浓度 控制系 数在流 加培养 
的开 始阶段 大约为 5, 在 培养结 束时大 约降至 2。 这表 
明代 谢库对 ACVS 活 性变得 不太敏 感了。 这也是 LLD-ACV 积累的 结果, 因 为在高 浓度时 
的 反馈抑 制使反 应速率 及代谢 物浓度 对酶活 性变化 不太敏 感了。 




100 200 
时间/ h 

图 11.5 在 流加培 养期间 
两个薛 ACVS 和 IPNS 的 
通量控 制系数 



300 



11.4 分支 途径的 MC A 

分支 (代谢 ) 途径 MCA 的应用 包括额 外的复 杂度。 首先, 我们要 处理多 于一个 单一通 
量 的情况 (单一 通量是 线性途 径的情 况)。 分支途 径中的 每一个 通量都 可能受 到代谢 网络中 
任何薛 反应的 影响, 这就 需要一 个能够 对通量 控制进 行完整 描述的 通量控 制系数 矩阵。 第 
二, 分 支代谢 途径中 的代谢 物的数 目少于 L-1 (L 是反应 数), 一般 来说, 连接定 理和加 
和定 理并不 能提供 足够数 目的方 程以便 从弹性 系数计 算控制 系数。 但是, 在 这种途 径中, 通 
量并 不是独 立的, 通量之 间的守 衡方程 将产生 附加的 限制, 这也 允许从 酶的弹 性来确 定控制 
系数。 这些限 制已被 称作结 构关系 (Reader, 1988), 它 们由网 络中反 应的化 学计量 学所确 
定。 其结果 是将有 恰好足 够的结 构关系 以弥补 "缺 少的" 方程, 以致控 制系数 总能由 弹性系 
数来 计算。 结构 关系公 式构建 相对来 说是复 杂的。 为 了有利 于一般 情况的 表示, 将首 先讨论 
如图 11.6 所 示的简 单分支 途径。 

图 11.6 所 示的三 个通量 Ji、 和 /3 在稳 态条件 下并不 
是独 立的, 因为 它们通 过围绕 途径中 代谢物 X 的质量 平衡而 
被关联 起来: 

;1 = Ji + Ji (11.48) 

或 

l = /i2 + /i3 (11.49) 
其中 是分数 通量, 由下式 求出: 
Jk 




图 U.6 含 有一个 分支点 
代谢物 X, 一 种底物 S, 
两种代 谢产物 Pi 和 P2 的 
简单分 支途径 



fik 二 



J 



k G 12,3} 



(11.50) 
291 



如 果导入 一个扰 动使得 J2 发生 改变而 ^/i 保持 不变, 那 么由式 (11.48) 表示 的结构 关系式 直接表 
明 也必须 变化。 这 就对通 量控制 系数加 入一个 限制, 这是由 Kacser (1983) 首 先推导 出的: 

- fndf + /nCi- = (11.51) 

结合连 接定理 和加和 定理, 这 个方程 允许我 们从弹 性系数 和通过 分支途 径之一 的分数 通量来 
计算 FCCs: 



1 



/i2ex_ (1 -/i2)ex 



- /l24- (1- /l2)4 

/i2eJc 

(1- /l2)e!c 



(11.52) 



在 方程式 (11.51) 中 参考通 量取为 Ji, 但 类似的 结构关 系对途 径中其 它两个 通量的 FCCs 

也 成立: , , 

(l-/i2)C《2+C— (11.53) 

/i2CVci^ 二 (11.54) 
式 (11.53) [或式 (11.54)] 与 加和定 理和连 接定理 结合, 得 到计算 其它两 个通量 J2 和 》/3 
的 FCCs 的类似 表达式 [见式 (11.68) 和式 (11.69)]。 

在更复 杂的途 径中, 在 每一个 分支点 几个反 应都可 能正在 发生, 可以推 导出类 似的方 
程。 Fell 和 Sauro (1985) 通 过关联 导向和 离开一 个分支 (Branch) 点 代谢物 X, 的 不同分 
支 途径的 FCCs 推导 出方程 (11.55), 导向代 谢物的 通量取 为丄, 通过第 个 分支的 分数通 
量是 即 通过这 个分支 的通量 是厶。 

- fik S 4 + (1 - /,,) 2 Ci- = (11.55) 

Branchife Branch m 

通 过运用 反应分 组和自 上而下 MCA 的 概念, 式 (11.55) 中的几 个加和 只不过 是参与 相应分 支反应 
的组 PCC。 因此, 上述方 程是式 (11.51) 的 组类似 方程。 如果 途径中 进一步 分支, 式 (11.55) 的加 
和 (或, 等 价地, 反 应组) 将包 括出自 代谢物 X, 的每一个分支的所有亚分支中的全部!^。 

注意 到在式 (11.53) 和式 (11.54) 中 两项的 符号都 为正, 而式 (11.51) 中两 项的符 
号 相反。 如 果通量 J2 增加而 Ji 不变, 则 J3 必然 变小, 反之 亦然。 这就解 释了式 (11.51) 
中 符号的 不同。 相 反地, 当通量 J2 增加而 J3 保持不 变时, 则 Ji 也必然 增加, 这就 解释了 
式 (11.53) 和式 (U.54) 中的符 号为什 么都为 正的。 显然, 化学 计量学 也在起 作用。 这已 
由 Reder (1988) 所做的 工作所 证明, 他推导 了一组 包含了 MCA 理论 和由化 学计量 学限制 
所施 加的结 构关系 的一组 通用方 程式。 通 过这组 方程, 就 有可能 推导出 MCA 系数中 所有的 
独立 关系, 甚至对 非常复 杂的途 径也行 0。 由 Reader (1997) 导 出的结 构关系 是以非 定标的 
(nonscaled) 控制系 数为基 础的, 但 Ehlde 和 Zacchi (1997) 也推 导出了 定标的 (scaled) 控 
制系 数的类 似结构 关系, 下面将 提供这 些一般 关系的 推导。 

考虑一 个包括 K 个中 间代谢 物通过 L 个酶 反应相 互连接 的反应 网络, 可 以写出 K 个通 
量平 衡式, 每一 个对应 于网络 中的每 一个代 谢物。 通 过导入 化学计 量矩阵 G 和 LX1 
通 量向量 J, 这 些通量 平衡式 可概括 为下面 的矩阵 方程, 它等 同于式 (8.3)©: 



在前 面的分 析中并 没有包 括代谢 循环, 对于 代谢循 环可以 规定另 外一组 关系式 (FellSauro, 1985)。 
在此, 关于 胞内代 谢物的 化学计 量矩阵 G 的定义 不允许 存在有 线性相 关的行 (或线 性相关 的代谢 物), 因 此它仅 
含有辅 因子对 (例如 NAD+ 和 NADH) 中两个 化合物 之一。 在 Ehlde 和 Zacchi (1997) 的 分析中 [还有 Reder (1988) 
的分 析], 在对化 学计量 矩阵的 说明中 没有此 要求, 因 此他们 的分析 方法更 为通用 (但也 更复杂 )。 

292 



GTJ = (11.56) 

这 个表达 式表示 连接着 L 个稳态 通量的 K 个线性 方程, 而且很 明显, 通 过重排 公式, 
可以把 K 个通量 [称作 非独立 的通量 (dependent fluxes)] 指定为 剩下的 L-K 个通量 
[独 立通量 (independent fluxes)] 的线性 函数。 为此, 将 化学计 量矩阵 中含有 非独立 通量的 
行 集中在 子矩阵 Gc 中, 剩 下的行 集中在 亚矩阵 Go 中, 式 (11.56) 重 写为: 

G?Jdep + Gjj,n = (11.57) 

子矩阵 Gc 是一个 非奇异 方阵, 因 此独立 通量可 通过式 (11.58) 由 非独立 通量来 计算: 

Jdep= -(GD"'GjJi„ (11.58) 
此式等 同于式 (8.8), 是确定 性系统 (determined system) 的代 谢通量 分析的 基础。 通 

过式 (11.58), 所有 的通量 能以非 独立通 量的形 式表示 如下: 

J = LJj,n (11.59) 

其 中矩阵 Lj 由下式 算出: 

' Il-k , 

式中, Iz^-K 是 维数为 (L- K)x(L- K) 的单位 矩阵。 由于式 (11.59) 实质 上提供 
出 这些通 量之间 的结构 关系, Ehlde 和 Zacchi (1997) 推 导出了 一个由 独立的 FCCs 确定 
FCC 的通式 (见 方框 11.4): 

C^^VpCl (11.61) 
式中, 矩阵 是矩阵 Lj 中 的每一 个元素 同式 (11.50) 所给 出的分 数通量 相乘 
而得 到的, 将式 11.61 代人式 (11.27) 所 给出的 MCA 系数 之间的 一般关 系式, 得到: 

l{,C|„ = P + EC^ (11.62) 

其可重 排成: 



V 二 



(11.60) 



(U-E) 



P (11.63) 



这就是 从弹性 系数、 参数弹 性系数 和通过 途径的 不同分 支的分 数通量 来确定 控制系 数的通 
式。 注意, 式 (11.45) 仅对 线性代 谢途径 有效, 它 可从式 (11.63) 中 导出, 后者适 用于各 
种类 型途径 结构。 Ehlde 和 Zacchi (1997) 在对式 (11.65) 的 推导中 允许非 独立代 谢物的 
存在 (如辅 因子对 中的两 种化合 物的存 在), 这就需 要引人 另一个 矩阵, 该矩 阵将所 有的浓 
度控 制系数 表示为 独立浓 度控制 系数的 函数。 先前曾 假定不 存在非 独立代 谢物, 即在 化学计 
量矩阵 G 中不 存在线 性相关 的列。 正常情 况下, 化学计 量式经 过在整 理后很 容易满 足这一 
要求, 而且 如果存 在线性 相关列 的话, 可以 在不违 反通用 性原则 的情况 下除去 一个或 多个线 
性相 关的代 谢物。 



方框 11.4 式 (11.61) 的推导 

式 (11.61) 推 导的出 发点是 途径中 所有通 量和独 立通量 之间的 关系, 正如式 
(11.59) 所 给出。 对 £, 微分 得到: 

d£, L d£, 



或 



dE, ― 乙、" dE, 、" 



293 



由 乘以式 (2) 得到 



或 



(3) 



C{* 二 X] I km ^^{^ i = S hmfkmC\^ - (4) 
m = l " , m = l , 

由于 丄, M 是矩阵 中第/ ^行; 7z 列的 元素, 因此式 (4) 被 看成等 同于式 (11.61)。 



为 了对式 (11.63) 的应 用进行 说明, 回到图 11.6 中所 示的简 单代谢 途径。 对 于此途 
径, 化学计 量矩阵 G 为: 



G 



(11.64) 



因 为有三 个通量 (L=3) 和一个 代谢物 (K = l), 因此 有两个 独立的 通量和 一个非 独立通 
量。 如果 J3 被取为 非独立 通量, 则 LJ 变成: 



下一 步是用 乘以 LJ 中的元 素得到 Lt: 
以 及从式 (11.63) 得: 



1 





-A 





1 


- ex 


/31 


一 fyi 





1 



1 

1 



hi 





1 

■ /32 



(11.65) 



(11.66) 



C】 



C3 





1 













1 













1. 



(11.67) 



当用式 (11.67) 来计算 控制系 数时, 通量 /3 的 FCCs 可 以从式 (11.61) 中 获得。 式 
(11.67) 的解看 起来似 乎冗长 乏味, 总 共包括 9 个 方程, 但是其 结果可 立刻给 出所有 的控制 
系数。 而且, 有 几种软 件包将 很容易 对矩阵 方程进 行数值 求解, 或者 甚至可 导出解 析解。 这 
样通 过解式 (11.67), 得到: 



厂 2 c 2 

CX /~<X 厂 X 
1 ^2 。3 



1 



- _ /32f 



/32eJc 
/3iex - 4 
/32ex 



4 



利用式 (11.61), 就 可以得 到通量 J3 的 FCCs: 



1 



/3iex ― fyiA 一 



/31 
/32 
1 



/3l£x - /32£\. 

(11.68) 



(11.69) 



式 (11.68) 中的第 一行如 果乘以 h 并除 Ji 就等 同于式 (11.52) 的解 [由 此, 分数 通量转 
294 



换为 /i2 和 /i3, 并应 用于式 (11.49) 中]。 除 了给出 所有的 FCCs 值 之外, 矩 阵的解 也直接 
给 出了浓 度控制 系数。 



【例 11.2】 鼠 肝脏细 胞中的 糖异生 和糖酵 解途径 

几乎没 有研究 报道, 通过 测定所 有相关 的弹性 系数一 条代谢 途径的 FCCs 已被 确定。 然 
而, 在对 鼠肝胀 细胞中 糖异生 途径的 详细研 究中, Groen 等 (1983, 1986) 确 定了在 高浓度 
乳酸和 丙酮酸 的条件 下这条 途径中 的所有 FCCs。 这条途 径如图 11.7 所示。 他 们在分 析中通 



葡萄糖 
si 

G6P 
8 
F6P 

FDP 




DHAP 



OAAc 



PYRc 



OAA„ 
2 

PYRm 



1 一线粒 体丙酮 酸转位 蛋白; 

2 — 丙酮 酸羧化 雜 (PC); 

3 — 草酰 乙酸的 运输; 

4 一 碟酸唏 醇丙酮 酸激酶 (PEPCK); 

5 — 丙嗣 酸激酵 (PYK); 

6 — 稀 醇薛, 磔酸 甘油酸 变位酷 (PGM), 
3- 磷酸- 甘油酸 脱氣酶 (GAPDH) 

和 3- 磯酸甘 油酸激 薛 (3PG); 

7 — 磷 酸丙糖 异构酶 (TPI); 

8— 磯酸 葡萄糖 异构薛 (PGI), 
葡萄糖 -6- 磯酸薛 (G6PE) 

縮写: FDP — 1,6- 二磷酸 果糖; 
DHAP — 碟酸二 经丙酮 
下标: m —线 粒体; C 一 细胞质 



乳酸 



线 粒体膜 



图 11.7 糖 异生途 径略图 

过龍动 力学、 单调 节法或 双调节 法确定 了弹性 系数。 在 利用酶 动力学 确定弹 性系数 的过程 
中, 他 们用式 (2) 和式 (3), 这是基 于可逆 的米氏 动力学 方程: 



= t;f - t>r - 1 + cs/Ks + Cp/Kp 
式中, CS 和 CP 分别 是该酶 反应的 底物和 产物的 浓度; Z^f.max 和 t^f.m 
反应 速率。 用 这些动 力学, 得到 了相应 于产物 和底物 的反应 的弹性 系数: 

1 V[ 



cs 3 



CP 



9 Cs 

d V 



1 - r/K, 
1 



(1) 

e 分 别是最 大正、 逆 

(2) 
(3) 



y 3 Cp 1 - r/Keq t^r.max 
式中, t;f 和 T^r 分别 是正反 应和逆 反应的 速率; r 是 质量作 用率。 可由式 (4) 算出 



而 Ke 。是 平衡 常数, 由下 式算出 



CS,eq 



Kp 



(4) 



(5) 



如 果酶在 远离平 衡时起 作用, 即 r/Keq《l 时, 则 弹性系 数几乎 仅由式 (2) 和式 (3) 中的 
最后 一项, 也就是 SI 被底 物和 产物所 饱和的 程度来 确定。 另一 方面, 如 果酶在 接近平 衡时起 

295 



作用, 即 r/Keq&l, 则弹性 系数主 要由式 (2) 和式 (3) 中的第 一项来 确定。 

表 11.2 中 总结了 所确定 的弹性 系数。 对于丙 酮酸运 转蛋白 (反应 1) 来说, 对 线粒体 

和胞 质溶胶 两处的 丙酮酸 的测量 (在乳 酸和丙 酮酸的 高饱和 浓度下 进行) 表明 了比值 r/Keq 

为 0.860±0.11, 得出 这一步 反应在 接近于 平衡的 条件下 运行的 结论。 丙酮酸 脱羧嗨 在远离 
平衡的 情况下 工作, 因 此这步 反应的 弹性系 数由式 (2) 和式 (3) 中 的最后 一项所 决定。 为 
了计算 相应于 丙酮酸 的弹性 系数, 从 流向葡 萄糖的 通量和 通过丙 酮酸激 薛 反应 的通量 确定了 
正反应 速率。 类 似地, 从 流向葡 萄糖的 最大通 量确定 了最大 正反应 速率。 草酰 乙酸运 输步骤 
的弹 性系数 通过双 调节法 确定。 通 过改变 底物浓 度或用 3- 巯 基-吡 P 定甲 酸抑制 PEP 羧 激雜的 
活性, 通 过这一 步的通 量会被 改变。 从 草醜乙 酸浓度 的相应 变化的 测量就 可以确 定弹性 系数。 
对于 PEP 羧 激酶, 弹性系 数也是 通过式 (2) 和式 (3) 计算 出的。 正 反应速 率作为 净通量 

与 逆反应 的速率 之和被 确定, 即 Z;f=t^ + Z;r。 因为 "rA^f^r/Keq, 得到: 

^f=i-r/Ke, (6) 

表 11.2 图 11.7 中 所示途 径的弹 性系数 



反 应 


PYRc 


PYR„ 


OAA„ 


OAAc 


PEP 


GAP 


G6P 


1 


7.1 


- 6.1 












2 




0.05 


-0.04 










3 






0.86 


-0.74 
















0.35 


-0.09 
















3.5 






6 










2.0 


- 1.0 
















1.2 


-0.08 


8 














1.0 



注: 假定没 有数值 的栏中 的弹性 系数为 0。 

通过 此反应 的净通 量又从 葡萄糖 生成速 率和通 过丙酮 酸激酶 反应的 通量来 确定, 而从质 
量作 用比的 测量可 以确定 正反应 速率。 对 丙酮酸 激酶的 弹性系 数通过 单调节 法确定 (注 意, 

假 定此步 反应为 不可逆 反应, 相应于 丙酮酸 的弹性 系数为 零), 通 过改变 PEP 的浓度 并测定 
相应的 通量, 可以 直接确 定弹性 系数。 对于' 烯醇 化酶、 磷 酸甘油 变位酶 (PGM)、 3- 磷酸甘 
油醒 脱氛酶 (GAPDH) 和 3- 磷酸甘 油激酶 (3PG) 所催 化的反 应组, 发现在 所有条 件下, 
所 有反应 接近于 平衡, 而测得 r/Keq 为 0.51。 磷 酸丙糖 异构酶 (TPI)、 醛缩酸 和果糖 -1,6- 
二磯 酸酶所 催化的 反应组 被认为 是一个 反应, 其 弹性系 数由式 (7) 确定: 



-7"^ = eoAP + eF6P + ep, 一 

Jglc CgaP Cp6p Cp 



(7) 



相应于 自由磷 酸的弹 性系数 假定是 很小, 因 此最后 一项可 以忽略 不计。 从酶 动力学 知识可 

知, 相应于 6- 磷 酸果糖 (假定 6- 磷酸 果糖和 6- 磯酸葡 萄糖一 起组成 一个共 同库) 的 弹性系 

数确 定为- 0.08。 dcp6P々p6P 这一项 并不是 很大, 因此式 (7) 中 的第二 项也可 以忽略