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METABOLIC ENGINEERING 
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化 学 工业 出 版 社 
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( 京 ) MEF 039 号 


图 书 在 版 编目 (CIP) 数据 


代谢 工程 : 原理 ae A ee (Stephanopoulos G.N.), 
[ 美 ] 阿 里 斯 泰 道 (Aristidou A.A.), [FH] 尼尔森 (Nielsen J.) ¥; 
赵 学 明 ， 白 冬 梅 等 译 . 一 北京 : 化 学 工业 出 版 社 ，2003.12 
书 名 原文 : Metabolic Engineering 一 Principles and Methodologies 
ISBN 7-5025-4568-9 


L 代 … I. Off -OM--@e--OR--OH-:: O. RHAWMLE IV.Q591 
中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2003) 第 093746 号 


METABOLIC ENGINEERING—Principles and Methodologies/ 

by Gregory N.Stephanopoulos, Aristos A.Aristidou, Jens Nielsen 

ISBN 0-12-666260-6 

Copyright © 1998 by Academic Press. 

Translation Copyright @ 2003 by Chemical Industry Press. All rights reserved. 


本 书 中 文 简体 字 版 由 Academic Press 授权 化 学 工业 出 版 社 独家 出 版 发 行 。 
未 经 出 版 者 许可 ， 不 得 以 任何 方式 复制 或 抄袭 本 书 的 任何 部 分 。 


北京 市 版 权 局 著作 权 合 同 登 记号 : 01-2001-4512 


国外 名 校 名 著 
代谢 工程 
一 一 原理 与 方法 
METABOLIC ENGINEERING 
Principles and Methodologies 


[3] Gregory N.Stephanopoulos 
[ 美 ] Aristos A.Aristidou “ 著 
[丹麦 】Jens Nielsen 
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责任 编辑 : 骆 文敏 
文字 编辑 : 丁 建华 
责任 校对 : 郑 捷 
封面 设计 : 郑 小 红 


化 学 工业 出 版 社 出 版 发 行 
(北京 市 朝阳 区 惠 新 里 3 号 ”邮政 编码 100029) 
发 行 电话 : (010) 64982530 
http: www.cip.com.cn 
关 


新 华 书 店 北 京 发 行 所 经 销 
化 学 工业 出 版 社 印 刷 厂 印刷 
三 河 市 东 柳 装 订 厂 装订 
开本 787 毫米 x1092 毫米 1/16 ”印张 28 字数 685 千 字 
2003 年 12 月 第 1 版 2003 年 12 月 北京 第 工 次 印刷 
ISBN 7-5025-4568-9/G 1237 
定 价 : 39.00 70 


版 权 所 有 ASE 
该 书 如 有 缺 页 、 倒 页 、 脱 页 者 ， 本 社 发 行 部 负责 退换 


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代谢 工程 是 关于 代谢 途径 的 分 析 与 修饰 的 科学 。 该 领域 出 现 于 过 去 10 年 ， 并 由 来 自 应 
用 分 子 生 物 学 和 反应 工程 的 技术 所 驱动 ， 目 前 正 变 成 生物 学 、 生 物化 学 工程 、 细 胞 生物 学 和 
应 用 微生物 学 等 许多 学 科研 究 活动 的 一 个 焦点 。 虽 然 途 径 操 作 的 概念 以 前 已 讨论 过 ， 但 代谢 
工程 的 远景 以 独特 的 方式 作为 一 个 明确 定义 的 学 科 是 1991 年 由 Bailey 首先 提出 的 ， 之 后 很 
快 就 被 生物 工程 师 和 生命 科学 家 所 接受 ， 他 们 看 到 捕获 由 基因 组 学 研究 所 产生 的 序列 和 其 它 
信息 的 潜力 方面 所 存在 的 机 遇 。 

1993 年 ， 我 们 首先 在 MIT 《美国 麻 省 理工 学 院 ) 开设 的 一 门 课 中 对 我 们 的 学 生 传 授 表 
达 了 代谢 工程 的 基本 概念 及 其 引起 的 兴奋 与 激动 。 这 种 试验 在 1995 年 、1997 年 又 重复 进行 
几 次 。 在 那 时 ， 一 个 明确 的 教学 大 纲 和 一 套 教 学 笔记 作为 这 些 奉献 的 结果 出 现 了 。 在 丹麦 工 
WKY (DTU) 有 一 个 类 似 的 发 展 : 在 本 科 生 和 研究 生 的 生物 化 学 工程 课程 中 代谢 工程 已 
成 为 一 个 中 心 主题 。1996 年 首次 正式 提供 了 关于 代谢 工程 的 标准 的 一 学 期 课程 。 对 代谢 工 
程 增长 着 的 兴趣 及 分 享 该 课程 教学 材料 的 需求 导致 我 们 确定 写 这 本 书 。 在 这 样 做 的 过 程 中 ， 
我 们 试图 对 酶 反应 途径 的 分 析 构 建 一 个 定量 生物 化 学 的 框架 。 在 这 种 意义 上 ， 本 书 反映 了 焦 
点 从 设备 向 单个 细胞 的 变换 ， 焦 点 集中 到 细胞 生物 化 学 功能 的 曾 明 与 操作 上 。 因 此 ， 这 本 教 
科 书 可 向 研究 生 和 高 年 级 本 科 生 提供 一 门 代 谢 工 程 课程 以 补充 生物 化 学 工程 领域 目前 开 出 的 
课程 。 

本 书 初稿 曾 用 于 MIT 和 DTTU 的 代谢 工程 教学 ， 也 曾 用 于 MIT 的 暑期 代谢 工程 课程 。 
本 书 的 内 容 可 覆盖 一 个 学 期 而 没有 先 修 特定 课程 的 要 求 ， 当 然 先 修 一 些 生 物化 学 人 门 性 的 课 
程 是 有 帮助 的 。 该 学 期 的 第 一 个 四 分 之 一 从 生物 化 学 书 中 指定 了 一 些 阅 读 材 料 以 补充 本 书 的 
第 一 部 分 。 有 助 于 理解 基本 概念 的 习题 集 将 在 下 面 列 出 的 网 页 上 定期 公布 。 虽 然 本 书 的 焦点 
是 代谢 ， 但 途径 分 析 的 概念 是 广泛 的 ， 因 而 对 其 它 类 型 的 反应 系列 一 般 都 是 可 以 应 用 的 ， 这 
包括 蛋白 质 表 达 、 翻 译 后 修饰 或 信号 转 导 途径 等 过 程 的 分 析 。 

写 一 本 仍 在 形成 中 的 学 科 方 面 的 书 是 一 种 挑战 ， 接 受 这 种 挑战 也 就 增加 了 责任 。 为 此 ， 
我 们 设 定 的 目标 是 : 详细 说 明 对 于 途径 设计 和 分 析 处 于 中 心 位 置 的 核心 原理 ， 同 时 用 从 最 近 
研究 中 得 出 的 方法 加 以 补充 。 我 们 期 待 着 这 些 方法 进一步 发 展 ， 并 希望 这 本 书 在 “催化 ”这 
种 活动 中 起 作用 。 实 现 这 些 方法 的 软件 可 在 相关 的 网 页 上 找到 。 此 外 ， 本 书 中 的 数学 复杂 性 
已 经 保持 到 一 个 最 低 的 水 平 ， 并 在 可 能 的 地 方 提供 了 背景 材料 ， 以 辅助 尽 可 能 少 地 采用 数 
学 。 我 们 知道 这 个 任务 的 挑战 性 以 及 满足 读者 范围 广泛 的 各 个 层面 的 困难 。 我 们 鼓励 读者 继 
续 对 本 书 的 评审 ， 而 不 要 被 任何 暂时 的 困难 所 阻挡 。 

我 们 要 感谢 很 多 人 ， 其 中 一 些 对 本 书 做 出 过 直接 的 贡献 ， 一 些 在 该 任务 的 计划 及 执行 中 
提供 了 间接 的 帮助 。 首 先 ， 我 们 对 我 们 学 生 的 无 穷 的 干劲 及 高 度 的 创新 性 表示 感谢 ， 特 别 
是 : Maria Klapa 对 代谢 通 量 分 析 深 入 细致 的 核查 ; Troy Simpson 的 研究 提供 了 复杂 途径 分 
析 的 基础 。 同 样 ， 我 们 感谢 Martin Bastian Pedersen 对 很 多 图 的 绘制 ; Christian Muller, 
Susanne Sloth Larsen, Birgitte Karsbol 和 Kristen Nielsen 在 最 后 确定 初稿 中 提供 的 帮助 。 
我 们 感谢 我 们 的 同事 们 ， 特 别 是 : Tony Sinskey 对 代谢 工程 的 无 限 广 阅 可 能 性 的 热情 ; Sue 


Harrison 和 Eduardo Agosin 所 作 的 最 具 建设 性 的 评论 。 最 后 ， 我 们 感谢 我 们 的 合作 者 和 朋 
友 ， 特 别 是 : Barry Buckland, Bernhard Palsson, John Villadsen, Maish Yarmush 和 D. 
Ramkrishna， 对 他 们 的 洞察 力 和 对 许多 重要 问题 坚定 不 移 的 支持 。 


Gregory N .Stephanopoulos 
Aristos A.Aristidou 
Jens Nielsen 


中 译本 序 


五 年 以 前 ， 我 们 的 教科 书 “ 代 谢 工 程 一 一 原理 和 方法 ”出 版 了 。 从 那 时 起 ， 我 们 的 著作 
成 功 地 用 于 国际 上 若干 大 学 的 教学 ， 而 且 两 年 以 前 该 书 已 译 成 日 文 出 版 发 行 。 对 这 部 著作 的 
兴趣 很 可 能 是 由 于 工业 生物 技术 的 迅速 发 展 。 在 工业 生物 技术 领域 ， 通 过 对 特定 细胞 工厂 引 
人 定向 基因 修饰 而 进行 的 新 的 生物 过 程 的 开发 正 被 越 来 越 多 的 世界 一 流 发 酵 公司 所 应 用 。 随 
着 中 国生 物 技 术 的 迅速 发 展 及 中 国 大 学 教育 标准 的 提高 ， 中 国 已 使 自己 处 于 工业 生物 技术 领 
域 一 个 主要 的 国际 参赛 者 的 位 置 。 在 这 种 情况 下 ， 出 版 一 本 中 文 代谢 工程 的 教科 书 是 非常 及 
时 的 。 我 代表 本 书 的 共同 作者 Gregory N.Stephanopoulos 教授 和 Aristos A.Aristidou 博士 
谨 对 选用 我 们 的 著作 译 成 中 文 深 表 感激 。 我 们 感谢 本 书 译 者 们 所 做 的 贡献 及 付出 的 辛勤 劳 
动 。 我 们 希望 本 书 中 译本 对 中 国 的 新 一 代 代 谢 工程 工作 者 能 起 鼓舞 和 激励 作用 。 


Jens Nielsen 
2003 年 9 月 16 日 


译 序 


大 们 利用 微生物 生产 有 用 产品 已 有 很 长 的 历史 ， 但 自然 界 的 微生物 只 能 生产 微量 产品 而 
且 所 需 的 生产 条 件 很 难 在 工业 条 件 下 实现 。 因 此 需要 对 这 些微 生物 菌 种 进行 改进 才能 满足 工 
业 生 产 的 需要 。 五 十 多 年 来 ， 人 们 用 随机 诱 变 及 筛选 的 方法 进行 菌 种 改进 ， 已 在 抗生素 、 氮 
基 酸 、 有 机 酸 等 工业 生产 上 取得 很 大 进展 。 代 价 是 随机 性 大 ， 需 要 漫长 的 时 间 ， 而 且 生产 能 
力 低 ， 往 往 在 经 济 上 竞争 不 过 化 学 路 线 ， 因 而 远 远 不 能 满足 工业 生产 的 需要 。 原 因 是 我 们 对 
细胞 的 生理 特性 理解 不 深 ， 不 能 定向 施加 必要 的 遗传 变化 和 (或 ) 环境 条 件 来 改进 细胞 的 性 
能 。20 世纪 80 年 代 发 展 起 来 的 重组 技术 引起 了 人 们 通过 引入 赋 有 所 希望 性 质 的 基因 进行 菌 
种 定向 改进 的 兴趣 ; 具有 上 百年 历史 的 化 学 工程 技术 ， 在 对 从 分 子 水 平 到 整个 生产 过 程 乃 至 
生态 环境 复杂 系统 分 析 与 集成 中 ， 积 累 了 丰富 的 理论 知识 和 实践 经 验 。 由 于 发 展 的 需要 及 支 
撑 技 术 提供 的 可 能 性 ， 于 是 诞生 了 一 门 新 学 科 一 一 代谢 工程 。 

代谢 工程 是 应 用 分 子 生 物 学 与 反应 工程 技术 不 断 发 展 融 合 的 结果 ， 是 对 细胞 《包括 微 生 
MD. BW. DOWIE RAM) 内 代谢 途径 网 络 系统 分 析 的 基础 上 进行 定向 地 有 目的 地 改 
变 ， 以 更 好 地 理解 和 利用 细胞 代谢 进行 化 学 转化 、 能 量 转 导 和 超 分 子 组 装 。 代 谢 工程 可 在 细 
胞 与 分 子 水 平 上 认识 和 改造 细胞 过 程 ， 其 不 仅 在 解释 细胞 生理 特性 上 具有 重要 的 科学 意义 ， 
而 且 其 潜在 的 应 用 跨越 了 生物 技术 的 全 部 领域 ， 主 要 包括 : 1) 异 源 蛋白 的 生产 ; (2) 扩大 
底 物 利用 范围 ; (3) 生产 原来 不 存在 的 新 物质 ; (4) 对 环境 有 害 物 质 的 降解 ; (5) 提高 菌 体 
对 环境 的 适应 能 力 ; (6) 阻 断 或 降低 副 产 物 的 生成 ; (7) 代谢 产品 生产 速率 和 生产 能 力 的 提 
高 ; (8) 植物 代谢 工程 ; (9) 动物 代谢 工程 ; 〈10) 人 体 和 组 织 代谢 工程 一 一 新 药 发 现 及 人 
类 疾病 诊断 和 基因 治疗 。 

1991 年 美国 加 州 理工 学 院 和 麻 省 理工 学 院 化 学 工程 系 教 授 Bailey 和 Stephanopoulos 等 
在 同一 期 《Science》 上 分 别 发 表 了 :“Toward a Science of Metabolic Engineering” 和 “Net- 
work Rigidity and Metabolic Engineering in Metabolite Overproduction ”两 篇 重要 文章 ,， 标 
志 着 代谢 工程 新 学 科 的 诞生 。1993 年 Cameron 等 发 表 了 “Cellular and Metabolic Engineer- 
ing” 的 长 篇 综述 文章 ， 举 出 了 100 多 个 细胞 和 代谢 工程 的 实例 。1995 年 Bailey 又 发 表 了 
“Chemical Engineering of Cellular Processes” 的 长 篇 文章 ， 详 细 讨论 了 生物 网 络 工 程 及 代谢 
工程 。1996 年 召开 了 第 一 次 国际 代谢 工程 会 议 。 此 后 ， 国 际 代谢 工程 会 议定 期 两 年 举行 一 
次 。1998 年 本 书 作 者 Stephanopoulos G. Aristidou A. 及 Nielsen J. 出 版 了 国际 上 第 一 部 
代谢 工程 教科 书 。1999 年 以 Bailey 教授 为 主编 的 《Metabolic Engineering》 刊 物 正 式 出 
版 。 此 后 ， 代 谢 工程 研究 及 工业 实践 发 展 迅速 ， 大 量 研究 论文 及 综述 文章 不 断 发 表 ， 这 可 从 
本 书 两 位 作者 近 两 年 的 综述 文章 看 到 。Stephanopoulos 教授 的 文章 包括 : “After a decade of 
progress, an expanded role for metabolic engineering” (Adv. Biochem. Eng. , 2001), “How 
to make a superoor cell” ( Science, 2001), “Metabolic engineering as an integrating plant- 
form for strain development” (Cur. Opi. Biotech. , 2001), “Metabolic engineering: a new 
frontier of chemical reaction engineering” (Chem.Eng.Sci., 2002), “Metabolic engineering 


by genome shuffling” (Nature Biotech. , 2002). Nielsen MZ HY XH: “Metabolic engineer- 


ing” (Appl. Microbiol. Biotechnol. , 2001), “An expanded role for microbial physiology in 
metabolic engineering and functional genomics: moving toward systems biology” (FEMS 
Yeast Research, 2002), “A functional genomics approach using metabolomics and in silico 
pathway analysis” (Biotechnol. Bioeng. ，2002)。 他 们 的 文章 总 结 了 代谢 工程 的 研究 进展 ， 
进一步 前 明了 后 基因 组 时 代 代 谢 工 程 的 任务 及 研究 方法 。 

代谢 工程 诞生 仅 十 余年 ， 引 起 了 全 世界 学 术 界 、 企 业界 及 政府 部 门 的 广泛 重视 。1995 
年 底 ， 美 国 科学 技术 政策 办 公 室 下 属 的 生物 技术 分 委员 会 发 布 了 “21 世纪 的 生物 技术 一 一 
新 展望 ”报告 ， 确 定 了 若干 优先 研究 领域 ， 代 谢 工 程 为 其 中 之 一 ， 并 成 立 了 由 国家 科技 专家 
组 成 的 “代谢 工程 工作 组 ”(MEWG)， 专 门 协调 美国 各 部 委 以 促进 代谢 工程 的 研究 。 该 工 
作 组 通过 组 织 美国 八 个 部 委 (基金 委 、 能 源 部 、 农 业 部 、 国 防 部 、 国 家 卫生 研究 院 、 国 家 标 
准 局 、 国 家 环保 局 、 国 家 航空 宇航 局 ) 共同 资助 代谢 工程 研究 。 从 1998 一 2003 年 已 连续 资 
助 五 年 代谢 工程 的 科学 基础 研究 ， 资 助 金 额 已 达 2800 万 美元 。 同 时 ， 由 于 代谢 工程 潜在 的 
应 用 价值 ， 许 多 公司 投 巨 资 与 学 校 及 研究 机 构 (4 DuPont 公司 与 Genencor, Merck 公司 
与 MIT) 合作 进行 代谢 工程 研究 改进 菌 种 。 欧 盟 多 次 在 其 “框架 计划 ”中 专门 设立 “细胞 
工厂 ”研究 项 目 ， 大 力 资助 代谢 工程 研究 。 由 于 生物 科学 技术 的 飞速 发 展 、 多 学 科 的 交叉 、 
政府 的 高 额 资助 及 企业 的 积极 参与 ， 使 得 代谢 工程 研究 在 科学 基础 及 应 用 方面 均 取 得 巨大 进 
展 ， 集 中 体现 在 如 下 两 篇 评论 文章 : BBA 以 “用 途径 工程 进行 化 学 品 的 商业 生产 ”为 题 介 
绍 了 代谢 途径 工程 与 发 酵 技 术 的 集成 在 芳香 化 合 物 、 有 机 酸 (GRAM. FRM. AERC), 
醇 〈 乙 醇 、 甘 油 、1,3- 两 二 醇 ) WKAR (KARO RE. IER) 等 生产 中 
的 成 功 例子 [BBA，1543，434 一 455 (2000)]; 《Science》 以 “如 何 制造 性 能 优良 的 细胞 ” 
为 题 介绍 了 用 大 肠 杆菌 制造 靛蓝 、 合 成 8- 胡 葛 卜 素 的 金色 水 稻 、 用 链 霉 菌 制造 优良 的 聚 酮 
分 子 、 通 过 导入 一 个 编码 红细胞 葡萄 糖 传递 蛋白 的 人 类 基因 (glutl) 把 专 性 硅 藻 菌 转化 为 一 
个 异 养 菌 ， 从 而 改变 了 其 代谢 途径 而 能 在 没 光 的 情况 下 代谢 和 葡萄糖。 所 有 这 些 均 是 在 对 细胞 
代谢 网 络 及 调控 机 理 深 入 研究 的 基础 上 的 重要 科学 发 现 ， 具 有 划时代 的 科学 意义 及 工业 和 医 
用 价值 。 

本 书 作 者 所 在 学 校 〈 美 国 麻 省 理工 学 院 和 和 丹麦 工业 大 学 ) 是 国际 上 从 事 代 谢 工 程 研究 最 
BARRA 412, Stephanopoulos 和 Nielsen 两 位 教授 在 代谢 工程 及 相关 领域 发 表 科 学 论文 
都 在 200 篇 以 上 ， 他 们 都 因 在 代谢 工程 领域 的 开拓 性 贡献 以 及 在 将 生物 学 成 功 结合 到 化 学 工 
程 研究 中 的 领导 作用 而 分 别 当 选 为 美国 工程 科学 院 院士 和 丹麦 工程 科学 院 院 士 。 他 们 都 分 别 
担任 过 国际 代谢 工程 会 议 的 主席 。 在 Bailey 教授 两 年 前 病逝 后 ， 他 们 分 别 担任 “代谢 工程 ” 
刊物 的 主编 与 副 主 编 。 两 位 教授 在 生物 工程 教学 中 不 断 进 行 学科 交 叉 的 创新 与 改革 ， 并 分 别 
获得 优秀 教学 奖 。 本 书 不 仅 是 代谢 工程 科学 发 展 及 大 量 实例 的 总 结 ， 而 且 对 代谢 工程 的 原理 
及 方法 首次 进行 了 科学 的 前 述 ， 为 代谢 工程 妃 至 复杂 生物 系统 的 研究 奠定 了 坚实 的 基础 。 相 
信 本 书 中 译本 的 出 版 将 会 大 大 促进 我 国 代 谢 工 程 的 教学 、 科 研 以 及 生物 技术 产业 的 发 展 。 

从 1999 年 开始 ， 本 书 英文 版 就 作为 我 校 “生物 反应 与 代谢 工程 ”科研 组 的 主要 参考 书 ， 
并 先后 作为 硕士 、 博 士 研 究 生 学 位 课 的 双语 教学 用 书 。2000 年 在 新 加 坡 -MIT 研讨 会 上 ， 译 
者 向 本 书 作 者 Stephanopoulos 教授 请 教 了 代谢 工程 教学 中 的 一 些 问 题 。 他 对 双语 教学 的 做 
法 表示 肯定 ， 同 时 表示 如 果 出 版 中 译本 ， 他 们 可 以 提供 全 书 所 有 插图 (电子 版 )。 为 了 促进 
我 国 代 谢 工程 研究 的 发 展 ， 也 为 了 加 深 对 “代谢 工程 ”一 书 的 理解 ，2003 年 3 月 我 们 邀请 
本 书 作 者 Nielsen 教授 来 校 讲学 一 周 。 除 了 当面 讨论 外 ， 我 们 就 翻译 中 的 一 些 问题 经 常 通过 


电子 邮件 进行 交流 。 我 们 非常 感谢 Nielsen 教授 和 Aristidou 博士 所 提供 的 所 有 电子 版 插图 ， 
非常 感谢 Nielsen 教授 多 次 通过 电子 邮件 对 所 提问 题 的 及 时 回答 与 解释 。 

参加 本 书 翻译 工作 的 有 和 天津 大 学 化 工学 院 生 物 工 程 系 的 有 关 教 师 、 博 士 后 及 参加 双语 教 “ 
学 的 博士 研究 生 ， 他 们 是 : 白 冬 梅 、 赵 学 明 (第 1、2 章 ); BI, ARB, RSH (第 3、 
4 章 ); Exel, HEA. A (BSH); Stl, MSH (HOR); 王 昌 神 、 李 文 钊 、 
赵 学 明 (第 7、8 章 ); 王国 海 、 赵 学 明 (第 9、10 章 ); 陈涛 、 赵 学 明 (第 11、12 章 ); 沈 
玉 宝 、 孔 庆 学 、 赵 学 明 (第 13 章 ); 马 红 武 、 白 冬 梅 、 赵 学 明 (第 14 章 ); 专业 词汇 〈 陈 
淘 、 马 平生 ); 索引 ( 白 冬 梅 ); 符号 说 明 〈 白 冬 梅 )。 白 冬 梅 博士 还 承担 了 全 书 图 表 的 翻译 
工作 、 有 关 物 质 名 词 和 菌 种 名 称 的 翻译 或 核对 工作 、 全 书 格 式 调 整 及 符号 统一 工作 等 。 

由 于 原著 是 国际 上 第 一 本 代谢 工程 书籍 ， 译 者 对 其 中 一 些 内 容 缺 乏 科 研 及 教学 的 实践 经 
验 ， 再 加 上 时 间 人 仓促， 错误 之 处 在 所 难免 ， 如 蒙 读者 指出 ， 我 们 将 不 胜 感谢 。 


赵 学 明 
2003 年 9 月 16 日 于 天 津 大 学 化 工学 院 


A 录 

符号 说 明 
#15 代谢 工程 的 实质 人 1 
161 代谢 工程 的 重要 性 dcuiemynnvwiaanuiaseisuiesaminemenineewise ces aiewia\siseis\o.ssieie wale i> 人 和 下 机 凡生 二 solele's 5 
1.2 AA 的 概要 Rn eWaceseaucedeccvcsdcdcacececcatecaccevesccucecccsacceveucnacdectWsessis phic cuelabecccceciee 8 
参考 文献 Se slelacciecnvacnceceenccccncconccecsccacecceneucclasioelvielsiiceis ouids see ules ele sme cise aieievcedbeinie silsssecce 11 
第 2 章 细胞 代谢 综述 PPPTTTTT TTI TTTTTITrrrri rere rrr rrr et oa。 12 
2 细胞 代谢 概述 .ee 12 
12 运输 过 程 Mineincidenicccanncccsccccescesccccsecesecs cise cise ssieislelesisiesiclebnessiesieis.ciele ss csslodcoduiscieiciecclocsines 15 
2.2.1 被 动 运输 uscanccuncemavacenconucadcecncaacdeeumaalwcncuccuwuneelactedulstsstsinistassnsicslslviac sckecte om 15 
2.2.2 促进 扩散 相生 人 有 sae anise se ce 17 
2.9.3 主动 运输 人 19 
2F3 供 能 反应 Sadinles acicawenaecuasccvereaecccseccemansetacucesauslicnpisscendes cas oesaccnamualsn eto tole dal sits s 2 
9.3+1 ie Slew cluele cuivealsscisavicule ses usta wadiainnscielclswclelels naace'uiviseu iviacuis call mtalatatals cel auieian aimtcteles telat 人 让 21 
2.3.2 发 酵 途 径 下 Malalelaicln cialelsiclteiwiatelsia/siaic,aielais\e d'e'cla\cla'c'c'slu selaluie/ejastelsiainialutets slclaicla is Mite tis eslele siete ote 26 
913.3--TCA 循环 和 和 氧化 磷酸 化 1 28 
2.3.4 Bl hie Ga wiaiasinin wes dain Quin dius et o.cleinsiele elaine.cde cee clalec's e\slelw/ajcle Glals Malus to ctelelatetalsiala Sielelbieie eisisls'o cbc clein'e 30 
93:5 脂 类 、 有 机 酸 和 氨基 酸 的 分 解 代 谢 enc cccccccccccese ene ao 二 ai。 32 
2.4 生物 合成 反应 ee 5 33 
2.4:1 氨基 酸 的 生物 合成 pp Biciele ee 33 
94:2 核酸 、 脂肪 酸 和 其 它 结 构 单元 的 生物 合成 oooeeeeoeasssaiesseoasseoscoeceaoosuaedooiooiooao。 36 
2. § 聚合 反应 -本 38 
2.6 生长 能 学 RCE RACAL CORE POCCOCCUL CE TUCEEOERREERERERTCCC CO COee CC OCROCCCESACSG: SOc Egcaperoeo IC 41 
参考 文献 pe 44 
第 3 章 “细胞 反应 的 综合 模型 pp 48 
3.41 细胞 反应 的 化 学 计量 学 1 48 
3.2 反应 速率 52 
3.3 DIE rere c ec ec cece een cree rene ereeeeseeeneeeseeeeeneneaeesenseseeeeeeecereseteeeeneoes 54 
3.4 产 率 系数 与 线性 速率 方程 二 59 
参考 文献 ae 66 
第 4 章 物质 平衡 与 数据 一 致 性 pp 67 
4.1 黑箱 模型 er 67 
本 元 来 平 街 友 各 二 .和 68 
4.3 热平衡 an ae ame 二 73 
4.4 超 定 系统 的 分 析 一 一 过 失 测 量 误差 的 识别 和 pp 75 


BS Bo SSR GA. Lk. RRS Dee B.. Be ccs a St aa g2 


第 5 章 代谢 途径 的 调控 ovis 00 90.0 wine 0c 0 oniceccceeeee cicc'cc cece s0\0cnceese\c6 ose ces ehe ods sacicieeleieiaamanmman mm 85 


5.1 酶 活性 的 调控 本 86 
52404 酶 动力 学 概述 S's'« a\p'o e\ne'vie.c vv vine 00-008 eeiee wnes'siece vieele sie ssvcsisicveccves sue os anna aaan emma. 87 
5 22 简单 可 逆 抑 制 系统 本 90 
5.18 不 可 逆 抑 制 © ible -0 e Wiele vie ¥'0 winln 0'0.e 010.010 610.0 0000060 6c 600ccsleie'siee oevc.cc cine sisinleelsie 让 二 全 全 94 

Le) 酶 浓度 调节 ee 98 
ee | 转录 起 始 的 控制 ee 二 Ga 过 二 5 ela elie iahes sieht ein aa aials 98 
5.2.2 翻译 的 控制 Eeeoaeseeoeaeseeeeeoeeeosaaiidon 证 0 汪汪 全 全 仙人 101 

S.3 .总体 调控 : 在 完 束 细 胞 水 平 上 的 调控 pe ee 102 

5.4 代谢 网 络 的 调控 ppp 107 
Sit 分 支点 分 类 Per TTTTrTrrrrrrrrrerrrrrrrrrrrirrerrrrrtrrrr er 110 
5.4.2 FES RMS BRR E DD ppp 112 

参考 文献 .ee 114 

第 6 章 途径 操作 实例 一 一 代谢 工程 实践 PPITITITITI TIT T rt ri re 116 

6.1 产品 得 率 及 生产 能 力 的 提高 pp 116 
6.1.1 乙醇 occ c ever rcteeterecreeedseratevcevecccscccsesscceceeessceseseeeseceseue sed seusles mmmananys 17 
6.1.2 氨基 酸 occ ccvcwcccecesaneseececccsccccccosssccecscesccocsseceseccesceseessoeseiabasemmntemasias 121 
6.1.3 溶剂 ooosoeooeoeoooeoeeooeoeoeoooooooooeoosooooooooooooooodaooooooooooooo65005 126 

6.2 扩大 底 物 范围 oooeooesosoeooeeoeooooeoeooeooooovoooeooooacoooiboiooaieooooia 128 
6.2.1 皮 糖 代谢 生产 乙醇 的 代谢 工程 occ cr ccc ccccsccccsccscvcccccccccescccssusmpensianeessanees 128 
6.2.2 纤维 素 - 半 纤维 素 解 聚 作 用 oe once ve ccuieie sive sldieic’vte dele ciple oo 132 
6.2.3 乳糖 和 乳 清 利用 cen dvecwoccecedecccncccccveseccscoorecoessesseees deed da nisin mn a. 132 
6.2.4 FE REA FF pp 134 
6.2.5 降解 淀粉 的 微生物 oc cccccccccecne tee suvacigediscleecesensecssccese see cveccususs@iemnsadao gs 134 

6.3 扩展 产物 范围 ， 增 加 新 产品 ee 135 
6.3.1 抗生素 可 人 全 人 135 
6.3.2 聚 酮 化 合 物 oooooooooooovooooooooooooooooooooooooooovoooooooosiosiasaas55aaaaaaoeaaos。 136 
6.3.3 维生素 eeoiea5aoaeesaoreaoceeooosooecoiooodai5ceao0c towels Sammie eRmM abs siscls s's's 139 
6.3.4 生物 聚合 物 Sa dvwe des edddenvesnseddeduens¥cseeviccrsccedesesscee.siss Jn eC: ce sana 140 
6.3.5 生物 色素 ee reer Le CLE CUCL OL CLERC EEE EEE UT 145 
6.3.6 A swaooooooooseoososesosescsessossscsaasssosossseooosdoodoossoaaoooooodi * 146 
6.3.7 皮 糖 ， 木 糖 醇 oo 147 

6.4 细胞 性 能 的 改进 pe 148 
6.4.1 氨 代 谢 的 改造 Se cscdenedamnervecccsecceccesseccongeddccdvocse cee cW@ueees sets belie MEME sal 148 
6.4.2 #2 a AA Peer rer eee Eee eee CE EER 148 
6.4.3 过 度 代 谢 的 防止 pe 149 
6.4.4 底 物 吸收 的 改变 P PreeTere eee Eee ee ee er 全 二 151 
6.4.5 遗传 稳定 性 的 维持 ee 152 


6.5 异 生物 的 降解 os 152 


6.5.1 BAKRK (PCBs) PVTTTTTTTI TTT Trirriirrirtri errr err ec 153 
4.5.2 XK, HAA HOI PRES (BTX) oer acecesencnncccencees osisinitciolisielviclslsinie dele cccince 154 
参考 文献 quand wine. cidls mG ec ee Seweceqesedegecasdeceseecnecadcceancgeuccandaunen nuls amin a Mkaiel ws 156 
第 7 章 代谢 途径 合成 ee wemeeee ene ages ee cecen ce cesecesccnceeedecencechh 166 
1 代谢 途径 合成 算法 aoeesseseseseeoeesseosaasossesesesaeeaeosasaaaasaascssooaaocuaodgouoossaoooioodoou。 167 
7T.2 算法 综述 EERSTE ESSERE EEEEEEEEOEOREOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO OC EEEESESSSS 173 
7.3 实例 研究 一 一 赖 氨 酸 生物 合成 PAE cee aeanearenncacsoccncaaeceulngs cule duis liseli deipcincliectvccccs 176 
hh a1 草 酰 乙酸 的 作用 wasessaaeesesesoaeseeeeoeeooeoaeoccasaesshsiaoaodaoudaesaoosassasaaeoooooieooo 179 
3 其 它 替 代 途 径 Sa weenie a asrccncenencccncccncenccene cise osedbib cine deccindceciuinesocepcciccccdeccccels 179 
N33 关于 最 高 得 率 的 限制 Perrier oO rer ee eer 179 
7.4 算法 的 讨论 aaaesesasesasesseeeesesesaeseeesaeeeaseeseseeeeassseaseeesoeesssesaaasssssasseasaseesaeoaesa 180 
参考 文献 irae nin ini wianin wine’ wine cee caqecnccucqccnqancacnanqancsanscucnccansenwnccescmauhle duces einndieeanaiiveesds 181 
第 8 章 代谢 通 量 分析 eee e a neenccecncnecccecnneceecccneceneccenaccecenanesasemecbledocsislasccneseceseccse 182 
8.1 理论 aaswaaeasaaaaaaessaasaaaaaaaeaaaaeaEaaaaasssesaaseaeaaeasaaagaaessgsosaso soso 元 184 
8-2 BERR ae 196 
8.3 不 定 系统 -线性 规划 sala asain afl a alm ACerS tyinas oi aces namie 6s an ere wim esaiu. 6 =, 90/0 ie aie Cie aes mien eit eeioiene ais 201 
8.4 敏感 性 分 析 we aaa age nein gegen ac encne.cclae alia ciple iail\esia\s simin.cldis clmiaieleis esis «Gls che clalsialeit slots. dete olals aiawahawafarwiche 204 
参考 文献 aa qanaccanceanens ac ncnanesemenndneiinisa a. danickisichs 206 
#98 利用 同位 素 标 记 实 验 测定 代谢 通 量 的 方法 WSF RE See ene 990.6: Ke oe mala mn.elmmeeiMled meld acetate 207 
9.1 根据 标记 富 集 度 分 数 直接 确定 通 量 anne cance ansqunicinneneleaculiaeeleiabete gine sible slsisls Galan cia /cele 208 
O11. A EE Ht BE PEG FR Enno ee sen cnn cone steed entpaapednetncenednednow ens 208 
Se Be) 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 实 验 ORO eR Ahad eaaeecancnena casinos meicasinnisiaininisaibietis cies «ae ss «te 209 
9.2 涉及 同位 素 标 记 代 谢 物 完全 列 出 的 应 用 waaeeeeweaaoss ai 全 214 
9.2.1 来 自 标记 丙酮 酸 的 TCA 循环 同位 素 标 记 代 谢 物 的 分 布 serene te ceteeeeeeeneee 216 
9.2.2 来 自 标记 乙酸 的 TCA 循环 同位 素 标记 代谢 物 的 分 布 veer eeeee eet eeee ee ee eens 221 
9.2.3 实验 数据 整理 人 ales cash ciate. «dp 222 
9.3 和 碳 平 衡 pp 232 
ee BERLE 本 232 
9.3.2. JRE A RERE BIJ nrennenecennneeeecceeencnneneensensousconenaeenesaenssccssseesane sees 237 
参考 文献 pe 240 
第 10 章 代谢 通 量 分 析 的 应 用 weeeeeeeecc eee eecee ee eeeecec cee eeeceneaneeeceeeeeeeeeeessccesaeeeeesees 241 
10.1. 由 大 妆 酸 细菌 生产 氨基 酸 -9 242 
10.1.1 谷 氨 酸 菌 的 生物 化 学 与 调节 pp 242 
101 2 本 本 得 率 的 计算 245 
10.1.3 C.glutamicum 菌 中 赖 氨 酸 生物 合成 网 络 的 代谢 通 量 分 析 “pp 250 
10.1.4 C.glutamicum 特定 缺失 突变 株 的 代谢 通 量 分 析 pp 237 
10.2 哺乳 动物 细胞 培养 中 的 代谢 通 量 站 pp 261 
10.2.1 胞 内 通 量 的 确定 ppp 261 
10.2.2 通过 18C 标记 研究 证 实 通 量 估 计 pp 265 


10.2.3 ， 通 量 分 析 在 细胞 培养 基 设 计 中 的 应 用 .这 计 ， 二 . 汪 时 268 


第 5 章 代谢 途径 的 调控 AS 85 


524 酶 活性 的 调控 si 86 
Os Wed 酶 动力 学 概述 aieeoeaio clslocdsiess cinscescnscecccesveceliaicnvicdiasluisieD sls 87 
5.1.2 简单 可 逆 抑 制 系统 ppp 90 
§.1:3 不 可 逆 抑 制 5 94 

可 2 酶 浓度 调节 ee sie ersiviere/oiele.e «leis act hain are nea 98 
5.241 转录 起 始 的 控制 ee 98 
5$.2.2 翻译 的 控制 pp 101 

5.3 总 体 调控 ， 在 完整 细胞 水 平 上 的 调控 ai 102 

5.4 代谢 网 络 的 调控 oo 107 
5.4.1 分 支点 分 类 deedao weeo0eow5E 二 全 全 生 相信 机 全 110 
5.4.2 耦合 反应 与 总 体 流通 代谢 物 的 作用 pp 112 

参考 文献 aes anaisacvionacawchbeavsisuecineGbinusincedasceercidencice se cust Gildéle cule «tls ops 0.daiss ER 人 汪汪 114 

第 6 章 途径 操作 实例 一 一 代谢 工程 实践 Cece cedevcvescccssescccncscoceseeeesseaccialps Eup ampaame mene 116 

6.1 产品 得 率 及 生产 能 力 的 提高 TITTITTTITREP TEETER TREE 116 
6.1.1 乙醇 wsooeesseseeoeescoesosoossssooeeooeooooooeoooooeooovooooooooooooooooodooooosa55ao oa 117 
6.1.2 氨基 本 BUGn aie nds vesecdenvideuddesudeccecccsescotocccscccocccccccescsetes sda 50s 三 全 人 生计 生生 121 
6.1.3 SAF cececcececeececeeeeceeeeeeeeeceeeeeeeeeseeeeeeseeeseeeseesesesseceeeeeeneeeenereseeeeenes 126 

6.2 扩大 底 物 范围 i sivieleite dea ede vnc wOs ease nc sides veip'eiee esse vie os sid'sle cule Suis Co's clus aldle dels akin s pee men 128 
6.2.1 皮 糖 代谢 生产 乙醇 的 代谢 工程 TITTITISTIPELETT ETT TEKTEe erie 128 
6.2.2 纤维 素 - 半 纤 维 素 解 聚 作 用 村 132 
6.2.3 乳糖 和 乳 清 利用 suisse Se eee R APT USSR USSU sides evcceen elses unseelss cence cihinn = na 132 
6.2.4 FE # Ail A Wiva\n Sle R aici en ele dere ececenasc eee sescwrceess seccscccsie cee ceeeale colt dat aimem—aan ina 134 
6.2.5 降解 淀粉 的 微生物 1 134 

6.3 扩展 产物 范围 ， 增加 新 产品 Prrrrree PULERE EEE EEE EE EERE EEE 人 135 
6.3.1 抗生素 ieweaaeaee ee oo ooo cocoeedt 区 交 站 和 和 和 半生 和 和 135 
6.3.2 聚 酮 化 合 物 本 136 
6.3.3 维生素 5 139 
6.3.4 生物 聚合 物 aia aniche ciel lca aOR AMA ERO PA TO TA td odd Coc rd eds r scene cee snacc see h dot vee 140 
6.3.5 生物 色素 Bee OP BPP Oe ete er bo OEE: POOLE EEE EEETEETEETREE Sc 145 
6.3.6 Al ceceeceeceeeeeeeeeeeeesereeeeeensenecneeueseceeseesesceeeescesceeeecreceesensenseeeweewens * 146 
6.3.7 皮 糖 ， TK He Salve HTAE AG ARRAS woe «eset eee Uwe dae es vale 000 0e cone oe y cae SR 147 

6.4 细胞 性 能 的 改进 BPP tO aLC EEL 0 DOR OOn: CL ELOLE CCU COLEEE LEER ELE EEEEEe re 148 
6.4.1 BAR a BY ie Pee he ee Ere EEL Eee oe 148 
6.4.2 BAW AIA Peo er cere RE CO LOR EEE 148 
6.4.3 过 度 代 谢 的 防止 Ere, Pee Co. Oe ne ee CEE eEr er eerie. foe io. 4 149 
6.4.4 底 物 吸收 的 改变 人 151 
6.4.5 遗传 稳定 性 的 维持 oO Swisint ww cisiandeSelMb cla wslds Mlb oMs oe sed widest’ meee vive ah depcclncucewee ss cee we 152 


6.5 异 生物 的 降解 Tee cai dh Me cade cde vad hed ivdawede Mee Tarde rehd cede chee berde buteed dbetcee otaO ee 152 


6.5.4: BAKR (PCBs) gin. 0:9 49 4:00:60 41460. s'il n0)0.0.0'6.0 Wa'e'aieinin Naleleaeineiie twa ais'ars ais ca giles welstebiete sia 153 


6.5.2 茶 、 甲 茶 和 对 二 甲 茶 混合 物 (BTX) oinsins Rien duces eciem nine cs aarptattoigtivigioiaisis\esle vigle Gde 154 
参考 文献 aaaeaeaeeeeeaeseaweseaaaaeaeaasesdaseaasaeaeedaaasiaisS wa 7 二 soc 156 
#75 代谢 途径 合成 wee c ccc cence te ee tent eencenceecenscneneceeecsinb suse sie esedsiwcisiennciocciccswecccccccons 166 
‘oa 代谢 途径 合成 算法 qa aicmnesinsis s <00c'e6uaiele qucinele we sigadeniang aah nme gem citable dt tthe ties oe s'e 0 cdtaeads 167 
7.2 算法 综述 waassseeeeeoeeosoeeeooeeeoeseoeesaesoseeeooeooseeeeoeoeooeoeosoeaoossoesseesooaeooaoooeosseeseoaooo。 173 
a 3 SC il At 98 —— Bi BBR A > a aceneaneanegncnccnccccencase cans aisla dnc cisleccio clip seb ccibaiveccde 176 
ye | 草 酰 乙 酸 的 作用 whee nce de cee ce nent eeccancccccviccioee duces cibacepesecsscaleeosesdueccesecdcose 179 
1, 3a 其 它 替 代 途 径 ea neeeenncncnnsccnceccncensecec cine clone seetiscinlaessiecioccucilncsocccesiecccdecdcocies 179 
大 3 关于 最 高 得 率 的 限制 $5.0. g'e:0/s Sisiaqnnige a cecnhedecigaie latbicieie alnibis'slwclele Wieilisisineisibiejle cliWis es'soesse de 179 
7.4 算法 的 讨论 creeeeeeeeeeeeeeeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeeeeseauseeeeeeaeaeaeesssssssenseoeeseesseeeseseees 180 
人 参考 文献 oooeoeeaeeeeieoeeseeaaeeasaeeseaeeaasaeeaesaeae 所 oo 证 5 二 oo 181 
第 8 章 代谢 通 量 分 析 OA Penance casecaecenaceeenqeeescctcecnacannciecienccienseecicime spl sieceisiviniscainecelees cede 182 
8.1 理论 aeassaaesassaesaeeaeassassaaaaeaaaeseaeseaseseaaesaeaeasiesassadsasegseseeaaesaeo 旋 184 
8.2 超 定 系统 RNa e500. 6.600 C aa cc meencaneceeceegnacneagaenedenncececcecncseunsvalun delninwlecbine gs tisealsvieacls 196 
8.3 “不定 项 希 2 绕 性 规划 .ee 201 
8.4 敏感 性 分 析 AR 204 
参考 文献 ae 206 
第 9 章 ， 利 用 同位 素 标记 实验 测定 代谢 通 量 的 方法 .pp 207 
Or 1 根据 标记 富 集 度 分 数 直 接 确定 通 量 村 208 
9 根据 瞬时 强度 测量 确定 代谢 通 量 ai 208 
9 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 实 验 eq nsieenodic.ddalse a ngale cma aqemndietanecincnnadecalteetsiciags tees aide 209 
9.2 涉及 同位 素 标 记 代 谢 物 完全 列 出 的 应 用 本 214 
9.2.1 来 自 标记 丙酮 酸 的 TCA 循环 同位 素 标 记 代 谢 物 的 分 布 veers eee teeter eee eee ees 216 
9.2.2 来 自 标记 乙酸 的 TCA 循环 同位 素 标记 代谢 物 的 分 布 cece eee eseereecencencens 221 
Que 实验 数据 整理 人 222 
9.3 和 碳 平 衡 ae 
9.38 直接 碳 平衡 站 生生 后生 及- 全 相生 本 全 放下 本 全 232 
9.3.2 原子 作 图 和 矩阵 的 应 用 ppp 237 
参考 文献 ee 240 
第 10 章 代谢 通 量 分 析 的 应 用 Ree oe cco cece 241 
10.1 由 谷 氨 酸 细菌 生产 氨基 酸 站 pe 242 
10.1.1 谷 氨 酸 菌 的 生物 化 学 与 调节 站 pp 242 
10s462 理论 得 率 的 计算 Saas xo.0,0.0,0.0,0.01010.0,0,010)0.0,0,0,0,0,0 6 0 9:0 ate oo 仙人 和 245 
10.1.3 C.giutamicum 菌 中 赖 氨 酸 生物 合成 网 络 的 代谢 通 量 分 析 sense 250 
10.1.4 C.glutamaicuzma 特定 缺失 突变 株 的 代谢 通 量 分 析 ree eeeeeeeeteeeneeeeens 257 
10.2 哺乳 动物 细胞 培养 中 的 代谢 通 量 人 261 
10.2.1 胞 内 通 量 的 确定 .ppp 261 
10.2.2 通过 1C 标记 研究 证 实 通 量 估计 pp 265 


10.2.3 通 量 分 析 在 细胞 培养 基 设 计 中 的 应 用 Sc cia w@bie v coreg c dite aliis plain o.0.0 duel: Gitare oi 268 


第 11 章 代谢 控制 分 析 sosaeeaedaeese5eaeaseaesesaiod isooiaoaaoseoaeeioooooiioaioaaeoioooeaeooade ea 270 
14..4 代谢 控制 分 析 的 基础 Coes esc rec es cet n ces es ee secc cet s esses ees ce ess eees ees sneeebesscssstcncenses 271 
14. 444 控制 系数 和 加 和 定理 Meret er eee DO CLEEDOLEER ETRE oes sess ablecep eons 972 
14:42 弹性 系数 和 连接 定理 6 G10 00s asain dis eee asses dee cccdsesesecesee ses cc¥.o nse cieascualeMnsielsclsin 274 
14.1.3 MCA 理论 的 一 般 化 wooaoososossseeossssssissesossoioeeseoeeoosioososi5a5eoalaamaloae ee 276 
11.2 通 量 控制 系数 的 确定 .ppp 277 
11.2.1 -确定 通 量 控制 系数 的 直接 法 ee 279 
11.2.2 确定 通 量 控制 系数 的 间接 法 ppp 282 
11.2.3.: 瞬 态 代谢 物 测量 的 上 应用， 284 
11.2.4 动力 学 模型 wold eoeecerinn dus ddsedbwoenedissesvceteveseresedecedeues sce sidde wcueuan ee MeMmE sans 286 
11..3 线性 途径 的 MCA oe ecirerserccvcccrenseeceescedere neces sesesseensesceedecessececeecesSdeaseseus 286 
11.4 分 支 途 径 的 MCA weasesiaaeaaesaasaaoaoeoeeueeaeoendeosacsaaaeaoa665560856 本 二 二 人 和 291 
11.5 大 偏差 理论 weeooooeososssoseooseooeoosssossoooesoosooeooooosoosoooosoieoooooososississsasassacaaio os 299 
11:5:4 未 分 支 的 网 络 oseoeooooosssoesoossosooooovooooooooooooooooooosoooooooooooooioooooseosoi5asse 299 
1425-2 分 支 网 络 oaeoseosoeseseesseeoesesessseoeoeeoesoseoooooouoooooosooooooios5eoiodeeoseoaaoaaaaisao ae 304 
11.5.3 对 营养 物 浓度 和 外 部 效应 物 变 化 的 响应 本 而 本 直人 人 ce ce 307 
14.524 讨论 ooeeeooosoooosseooooooooooooeoeoiossoooooooooooooooooooooooooooaoooaioooasos6a6a5aaaso oa 307 
参考 文献 pe 308 
第 12 章 代谢 网 络 的 结构 分 析 We viGiSie Wel D Wine sea elecsee ee ccna seecce ceieticesesce bee veecescwocessieieusteetele tin 311. 
2 在 单一 分 支点 处 通 量 分 布 的 控制 Core rrcceccrcecccccecccccesencccccceccceseesesocesecesecceso 313 
12.2 反应 分 组 sia onielelusi owe nipiaisleisisinie ciwicielesieie neisieiewaice'wibeweeontccsescecceeesecessecccccvecsaciedsnbonoume tes 316 
13-2-4 组 通 量 控制 系数 ee 316 
12.3.2 独立 途径 的 识别 0 317 
12.3 | FI ——§_ BABB EIA RAR Bervrrrrrc ec ece ec eceeceeceeeeceeseeeeeeenens 399 
12.34 Swcerevisiae PSE HERI Re Hy SEI wore eeee eee eeeesse ie deems 322 
12-3;2 独立 途径 的 确定 eaaeeeeeneeeeewmeeweweeeeeeoeeeeeoooaeeeadrae 肛交 和 326 
12.3.3 连接 代谢 物 的 识别 和 组 通 量 确定 :pp 328 
参考 文献 .sseees seeseeee nes enn nnnnnn 338 
第 13 章 代谢 网 络 的 通 量 分 析 2181610101010) o'ol0ivivisio\o(e\eis\eielsistaie'sieleiele\ee'e'sieiecieweie cece cccee ce cle sleieisetetstelstodiesees 339 
13.1 组 控制 系数 与 单个 控制 系数 之 间 的 关系 (BALI) reece ecsecseeenneeneeeaee 339 
2 由 通 量 测 量 确定 组 控制 系数 ( 自 上 而 下 法 ) woooeeeoesooeoooooooooooooooooooosoiosaioosi 341 
13: 2e4 从 三 个 扰动 确定 gFCCs ee «ciel 0.0 cites ana 341 
43.:2:3 从 已 表征 的 扰动 确定 gFCCs wweaeeaaGGaaoeieeereeeaeeseoesaeeeeieooeo 有 人 343 
13.2.3 gCCCs 的 确定 Seen aaa aieys sini oig)s =/al» c's 's o/a(m oleic olsis diel sleipieis.e 0 000 visbebiccss cece oc cle saeieeiae 344 
13:2..4 扰动 的 可 观察 性 0 344 
13.3 实例 研究 人 345 
13.3.1 组 控制 系数 的 解析 确定 〈( 自 下 而 上 法 ) pp 345 
13.3.2 gFCCs SE hy Hh TE BY AR AY ( 自 上 而 下 法 ) 本 350 


13.4 交叉 代谢 物 反 应 组 控制 分 析 的 扩展 E cigs olebio bin'o Mele elute sine Mp wis'e Gielsilisle Gig oisidieidreieesb bisiee eck ccus om 352 


044 扰动 常数 Refi Calsain(ei ahve Wee dav aly annclora pv unialninoicicede nue sme scales dae ene deine pelsmsne Men sean sen aes 352 


13.4.2 BAK RE BER MAND eee cee cecceeeeeeeeeesseeestessseneereeaeeeeeeeeeees 352 
13.4.3 实例 研究 本人 354 
13.5 通 量 扩 增 的 优化 aassesssoesseeecssaiaesaaaeseaogesesieaeesesseeeessaesaeseseessssseseoaesseeeeeoeseia 355 
13: Sak 优化 算法 的 推导 assiaeeeuoseaeesseseeseseeeseeosaeaeesaeess5aseseesesoaesseeseosseeseeeseeeoa 355 
13.5.2 实例 研究 辣 于 全 半生 生生 357 
13.6 一 致 性 检验 与 实验 证 实 … 业主 PEGA arg AEE IN dang h oe Sais vin kde dee Kekandnl 村 王 359 
13.6.1 利用 多 次 扰动 发 展 一 致 性 检验 ooeeeosseeseeeeeeooeoessseseosseeoeoooseeeeeesoeoseesseseesesssee 360 
13.6.3 对 预 茶 酸 分 支点 的 应 用 ooeoeeosseoseoeeeeooeosseseeooeesoooesesoeoeesoeesoeeosooooesesesseseosoe 363 
13.6.3 测量 误差 的 影响 0 6 08d 080 86060 60050 nc wne.d.0 0190/00 00:0:06000 once vise ciccccecessccetecscceccceencs 364 
参考 文献 oe meeisdaabpleesebislcees vein asdaiiecisees nccncccencciecee cece elev bcoiseced bese sip slesWieseevledusbedigcceseess 365 
第 14 章 细胞 过 程 热力 学 eae emecaegecceusseececccensscnuecasceveveneisuchewesdevebivaesienecectleMesioccces 366 
14.1 热力 学 原理 综述 站 366 
14.2 热力 学 可 行 性 ooeseooeeseeeoeeoooessoiaiooooesooooooossesaeeseooieosboosoesossdsiooseoocoseseseoeoeeooeo。 371 
14.2.1 算法 .ee 372 
下 利用 基 团 贡献 法 确定 人 AGO ceccccceeeeeeeeceeeceeccceesececcenccsssesesseessenseeeseese 377 
14.3 非 平衡 热力 学 ev oceccrccccccciccsccescee siglnale cinpicidis whale oisis selaisly oNo bse on 000 cosiiesiessodecesblecocccods 384 
14.4 $A Bt A EAR 2B Fl DTP BN BD Fd oe seeeee eee WE 396 
参考 文献 习作 400 
专业 词汇 和 402 
索引 Sia ainie(o\0\e oiclo SWeieNs Ue SNM erpiasn wens ne ves ccvcncsceccvesecccseccscacessctoe shames Siinviopm vappiciunppmunce csceses 410 


符号 说 明 


下 面 是 本 书 中 常用 的 一 些 符号 。 这 里 所 用 的 单位 为 最 典型 的 用 法 ， 在 某 些 情况 下 可 能 有 
其 它 的 单位 。 
英文 符号 
acal ”细胞 的 比 表 面积 [m2.g (FB) ] 
含有 式 (8.26) 中 的 目标 函数 中 的 单个 变量 权重 的 行 向 量 
A; Bi + RMNRAA (kJ mol- 1) 
c 浓度 (mmol-L~!) 
Ci 第 ;个 化 合 物 的 浓度 (mmol-L~!) 
cf 加 入 到 生物 反应 器 中 的 第 ;个 化 合 物 的 浓度 (mmol'L 1) 
Ci 第 ; 个 酶 对 第 ) BAIR, 的 通 量 控制 系数 


“Ch Hi 个 组 对 稳 态 通 量 万 的 组 通 量 控制 系数 
C5 第 ;个 酶 对 第 7 个 代谢 物 浓 度 的 浓度 控制 系数 
*C5 第 ;个 组 对 第 7 个 代谢 物 浓 度 的 组 浓度 控制 系数 


CI 包含 通 量 控制 系数 的 矩阵 

c 包含 浓度 控制 系数 的 矩阵 

细胞 质 膜 的 厚度 (mm) 

稀释 速率 (h 71) 

膜 扩 散 的 扩散 系数 (m2.s- 1) 

式 (11.84) 给 出 的 偏差 指数 

Bi 个 酶 的 活性 (或 浓度 ) 

元 素 组 成 矩阵 或 包含 弹性 系数 的 矩阵 

未 测量 化 合 物 的 元 素 组 成 矩阵 

已 测量 化 合 物 的 元 素 组 成 矩阵 

式 (11.87) 所 给 的 通 量 扩 增 因子 

通 量 ) 与 通 量 ; 的 比值 [由 式 (11.50) 给 出 ] 

进入 生物 反应 器 的 体积 流速 (Lh- 1) 

For 流出 生物 反应 器 的 体积 流速 (L.h-I) 

F 方差 - 协 方差 矩阵 

8 在 第 7 个 反应 中 的 第 ; 个 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 系数 

G 吉 布 斯 函数 (kJ -mol~!) 

AG 吉 布 斯 自由 能 的 变化 〈kJ .mol 1) 

AG® ”在 所 有 反应 物 和 产物 均 为 标准 态 时 的 吉 布 斯 自由 能 变化 (kJ .mol-U 
G 含有 胞 内 代谢 物化 学 计量 系数 矩阵 

G. 含有 通 量 未 被 测量 的 反应 中 ， 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 系数 矩阵 

Gin 含有 通 量 已 被 测量 的 反应 中 ， 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 系数 矩阵 
G 


8 


FI 
= 


Te 


ex 含有 正 、 反 两 个 方向 所 有 反应 的 化 学 计量 系数 的 代谢 模型 的 化 学 计量 系数 矩阵 
由 方程 式 (4.29) 给 出 的 检验 函数 


> > 
> 


amt, 


Sem 


8 


eg 


= < 
> : 
-j 
~ 


Dyevze 


E 


+ Da 


第 ; 个 底 物 的 碳 含量 (C-mol-mol') 

Bi 个 代谢 产物 的 碳 含量 (C-mol.mol- 1) 

烩 函数 (kJ mol 7) 

式 (14.29) 给 出 的 热力 学 函数 

单位 矩阵 ， 即 ， 和 矩阵 所 有 对 角 线 元 素 为 1， 其 它 元 素 为 0 
式 (14.46) 给 出 的 流 比 

通过 分 支 路 径 ; 的 稳 态 通 量 [mmol.g-! (FH#)-h!) 
稳 态 通 量 向 量 [mmol'g-1 (FH#)-h!) 

非 独立 通 量 向 量 [mmol'g -1 ( 王 重 ).h- 9 
独立 通 量 向 量 [mmol'g-! ( 干 重 ).h- 1 

速率 常数 

分 析 中 所 考虑 的 胞 内 代谢 物 的 数目 

平衡 常数 

在 液 膜 和 培养 基 之 间 的 分 配 系数 〈 无 因 次 的 ) 
Micheaelis-Menten 常数 (或 饱和 常数 ) (mmol'L 1) 
抑制 常数 (mmol'L 0) 

符合 式 (12.7) 的 核心 矩阵 

表 观 系数 

维持 代谢 的 ATP 需要 

分 析 中 所 考虑 的 代谢 产物 的 数目 

分 析 中 所 考虑 的 底 物 的 数目 

影响 反应 速率 的 参数 [在 式 〈1i.5) 中 用 到 ] 

BAAR (mss ') 

Bi 个 代谢 产物 

残 差 的 方差 - 协 方差 矩阵 或 含有 参数 弹性 系数 的 矩阵 
耦合 度 

分 析 中 所 考虑 的 大 分 子 库 的 数目 

与 菌 体 生长 相关 的 热量 生成 [kJ .C-mol-1 ( 菌 体 )] 

比 速率 [mmol'g-1!L ( 干 重 ).h-1] 

ATP 的 生成 速率 [mmol'.g -1 ( 干 重 ).h-!] 

式 〈11.86) 所 给 的 活性 扩 增 因子 

Bi 个 大 分 子 库 的 比 生成 速率 [g.g-! ( 干 重 ).h- 1] 

第 ; 个 胞 内 代谢 物 的 比 生成 速率 [mmol.g-! (FH)-h-!] 
产物 比 生 成 速率 [mmol'g-1 ( 干 重 ).h-1] 

底 物 比 消耗 速率 [mmol'.g-1 (F#)-h-') 

穿 过 细胞 膜 的 比 运输 速率 [mmol'.g-! (于 重 ).h- |] 
非 测 量 的 比 速率 向 量 [mmol'g -1! ( 干 重 ).h 
测量 的 比 速率 向 量 [mmol'g- 1 ( 干 重 ).h -1 

含有 大 分 子 的 比 生成 速率 向 量 [gg | (FH)-h 1 


含有 胞 内 代谢 物 的 比 生成 速率 向 量 [mmol'g ! (〈 干 重 )"h 1!] 


含有 代谢 产物 的 比 生成 速率 向 量 [mmol'.g -1! ( 干 重 ).h- 
含有 底 物 的 比 消耗 速率 向 量 [mmol'g 上 (F#)-h-!) 
气体 常数 [=0.008314kJ， (K-mol)~!] 

XX (13.40) 给 出 的 活性 扩 增 参数 


RY 式 (11.7) 给 出 的 响应 系数 


R HK (4.17) Se AIT AR 

R, 含有 了 R AY SF AY) ek A 

S Wi pK [JJ (K-mol)~'] 

S; i NED 

P 温度 (K) 

T BAX (8.12) 确定 的 化 学 计量 系数 的 矩阵 

vj Bj 个 关联 的 比 速 率 [mmol-g ! (于 重 ).h 9 

下 第 ;个 反应 组 的 总 比 速率 GAPE) [mmol-g™! ( 干 重 ).h 
Uraax Wis HE 1, 2 or A eK ECR (mmol +h!) 

v 反应 速率 向 量 (或 胞 内 稳 态 通 量 ) [(mmol-g |! ( 干 重 ).h -9 
Ve 未 测量 的 反应 速率 向 量 [mmol+g™! (FH)+h-'] 

Vin 测量 的 反应 速率 向 量 [mmol'.g 1 (FH#)-h-!] 

V 生物 反应 器 的 体积 (L) 

x PAYEE (g-L7') 

X macro,i 第 ;个 大 分 子 库 的 浓度 [g (FH)-h!) 

X met, i 第 ;个 胞 内 代谢 物 的 浓度 

1 得 率 系数 [mmol(j)-g ! (FH)-h '] 

ye 真实 得 率 系数 [mmol(j):g 7! (FH)-h |) 


Y xaTP 细胞 生长 的 ATP 需要 [mmol (ATP) .g -1 (FH#)-h-'] 
YxATP,growth 细胞 合成 的 ATP 需要 [mmol (ATP) +g 1 ( 干 重 ).h -号 

YxATpwlwsis ”由 于 细胞 自 溶 浪费 的 细胞 生长 所 需 的 ATP [mmol (ATP) .g -1 (F#)-h~!] 
Y xATP, leak 由 于 泄漏 和 无 效 循 环 的 ATP 需要 [mmol (ATP) -g™! (F#)-h-!] 
24 (14.48) 给 出 的 表 观 化 学 计量 关系 

希腊 字母 

a, 第) 个 反应 中 的 第 ; 个 底 物 的 化 学 计量 系数 

A “含有 底 物 化 学 计量 系数 的 矩阵 

Pi 第 7 个 反应 中 的 第 ; 个 代谢 产物 的 化 学 计量 系数 

B 包含 代谢 产物 化 学 计量 系数 的 矩阵 

X HK (14.49) 给 出 的 力 比 

yi 式 (11.78) 中 的 参数 

6 ， 测量 误差 向 量 

e sh (4.20) 给 出 的 残 差 向 量 

ey FR (11.11) 给 出 的 弹性 系数 


上 st (11.103) 给 出 的 代谢 物 扩 增 因子 

®, 耗 散 函 数 (kJ.mol 1) 

Xi 第 7 个 反应 中 的 第 ; 个 大 分 子 库 的 化 学 计量 系数 
T ， 包含 大 分 子 库 的 化 学 计量 系数 矩阵 

nh ”热力 学 效率 

k 一般 化 还 原 度 

ae 比 生长 速率 (Ch!) 

证 第 ;个 化 合 物 的 化 学 势 (kJj'mol )) 

wo 在 参考 状态 下 的 第 i 个 化 合 物 的 化 学 势 (kJ mol 0) 
mi, 式 〈11.19) 给 出 的 参数 弹性 系数 

Ta 特征 时 间 Ch) 


第 1 章 ， 代谢 工程 的 实质 


为 了 赋予 微生物 所 希望 的 性 质 ， 而 对 其 代谢 途径 进行 操作 ， 这 种 方法 很 早 以 前 人 们 就 开 
始 研 究 和 应 用 。 这 种 方法 在 氨基 酸 、 抗 生 素 、 溶 剂 和 维生素 等 领域 的 成 功 应 用 ， 在 很 大 程度 
上 依赖 于 化 学 诱 变 剂 和 创造 性 的 筛选 技术 的 使 用 来 识别 符合 某 种 目的 的 优良 菌株 。 尽 管 这 些 
方法 已 被 广泛 认可 ， 并 已 取得 很 大 成 功 ， 但 是 对 于 这 些 突变 菌株 的 遗传 和 代谢 却 缺 乏 表征 ， 
而 且 诱 变 仍然 是 一 个 随机 的 过 程 ， 该 过 程 中 科学 是 用 艺术 原理 来 补充 增强 的 。 

用 于 脱氧 核糖 核酸 (DNA) 重组 的 分 子 生 物 技术 的 发 展 为 代谢 途径 操作 提供 了 新 的 方 
法 。 通 过 基因 工程 可 以 对 代谢 途径 中 特定 的 酶 反应 进行 精确 的 修饰 ， 从 而 进行 遗传 背景 意义 
明确 的 菌 种 构建 。 在 DNA 重组 技术 的 可 行 性 被 确证 后 不 久 ， 就 出 现 了 许多 术语 来 描述 这 种 
技术 在 途径 定向 修饰 方面 的 潜在 应 用 ， 如 : 分 子 育 种 (Kellogg et al，1981)、 体 外 进化 
(Timmis et al，1988) 、( 微 生物 或 代谢 ) 途径 工程 (MacQuity，1988; Tong et al, 1991), 
细胞 工程 (Nerem，1991) 和 代谢 工程 (Stephanopoulos and Vallino, 1991; Baley, 1991). 
尽管 每 一 个 具体 的 定义 因 作 者 的 不 同 而 不 同 ， 但 在 代谢 工程 总 的 目标 和 方法 方面 都 表达 了 类 
似 的 含义 。 在 这 里 ， 我 们 把 代谢 工程 定义 为 : 利用 DNA 重组 技术 对 特定 的 生化 反应 进行 修 
饰 或 引入 新 的 反应 以 定向 改进 产物 的 生成 或 细胞 的 性 质 。 上 述 定 义 的 基本 特征 是 : 定 为 目标 
要 修饰 的 、 或 打算 要 新 引入 的 特定 生化 反应 的 专 一 性 。 一 旦 这 样 的 反应 目标 被 确定 ， 那 么 就 
要 应 用 已 建立 的 分 子 生 物 学 技术 对 相应 的 基因 或 酶 进行 扩 增 、 抑 制 或 缺失 、 转 移 、 或 解除 调 
控 。 为 了 达到 上 述 目的 ,广义 的 DNA 重组 技术 已 被 广泛 应 用 到 各 个 步骤 中 。 

尽管 定向 性 从 某 种 意义 上 来 讲 是 所 有 菌 种 改进 工作 的 固有 特性 ， 但 是 代谢 工程 与 随机 诱 
变相 比 ， 其 工作 焦点 致力 于 定向 性 ， 以 致 其 在 目标 酶 的 选择 、 实 验 设计 以 及 数据 分 析 等 方面 
都 起 着 重要 的 作用 。 另 一 方面 ， 细 胞 的 定向 改进 不 应 解释 为 合理 的 途径 设计 与 修饰 ， 因 此 在 
这 个 意义 上 说 ， 代 谢 工程 与 随机 诱 变 是 完全 不 同 的 。 实 际 上 ， 通 过 随机 诱 变 而 得 到 的 性 能 优 
良 的 菌株 能 够 作为 关于 途径 结构 与 控制 方面 重要 信息 的 来 源 ， 这 可 经 由 反 向 代谢 工程 获取 。 

像 其 它 传统 的 工程 领域 一 样 ， 代 谢 工程 也 包括 两 个 明确 的 步骤 : 即 分 析 与 合成 。 因 为 代 
谢 工 程 是 随 着 DNA 重组 而 出 现 的 可 行 技 术 ， 所 以 最 初代 谢 工 程 几乎 都 集中 于 这 个 领域 的 合 
成 方面 : 如 在 各 种 宿主 细胞 中 新 基因 的 表达 、 内 源 酶 的 扩 增 、 基 因 的 缺失 或 酶 活性 的 调节 、 
转录 的 或 酶 的 解除 调 探 等。 因此， 代谢 工程 在 很 大 程度 上 曾 是 应 用 分 子 生 物 学 的 技术 体现 ， 
而 很 少 带 有 工程 方面 的 内 容 。 生 物 过 程 所 考虑 的 事情 并 不 具备 代谢 工程 的 条 件 。 在 代谢 工程 
的 分 析 方 面 可 找到 更 多 重要 的 工程 内 容 : 如 何 确定 决定 生理 状态 的 重要 参数 ?” 如 何 利 用 这 些 
信息 来 前 明代 谢 网 络 的 控制 结构 并 为 达到 某 一 目的 而 提出 合理 的 靶 标 进行 修饰 ? 为 了 设计 下 
一 轮 的 途径 修饰 直至 达到 目标 ， 人 们 如 何 进一步 评价 这 些 基 因 或 酶 修饰 的 确实 的 生物 化 学 影 
响 ? 若 不 是 用 通常 的 特定 目标 筛选 过 程 ， 人 们 能 够 提出 一 个 合理 的 过 程 来 确定 最 有 希望 的 目 
标 进 行 代 谢 操作 吗 ? 这 些 都 是 代谢 工程 的 分 析 方 面 应 强调 重视 的 问题 。 

合成 方面 ， 代 谢 工程 的 另 一 个 创新 方面 是 集中 于 整体 的 代谢 途径 而 不 是 单个 的 反应 。 

因此 ， 代 谢 工程 检验 的 是 完整 的 生物 化 学 反应 网 络 ， 包 括 其 途径 合成 和 热力 学 可 行 性 问题 ， 

以 及 途径 的 通 量 分 布 及 其 控制 。 因此 ， 我 们 正在 目睹 着 从 单个 的 酶 反应 向 相互 作用 的 生化 反 
了 


应 系统 这 一 范例 的 变换 。 从 这 个 意义 上 讲 ， 代 谢 网 络 的 含义 极其 重要 ， 因 为 通过 考虑 反应 的 
整个 系统 而 不 是 相互 独立 的 一 个 个 反应 ， 从 而 就 可 增强 对 代谢 和 细胞 功能 透彻 理解 的 能 力 。 
通过 代谢 工程 ， 人 们 已 把 注意 力 变换 到 整个 系统 ， 而 不 是 其 组 成 零件 。 关 于 这 一 点 ， 代 谢 工 
程 正在 利用 众多 还 原 论 者 的 研究 而 得 来 的 技术 和 信息 寻求 合成 和 设计 。 转 而 ， 通 过 对 整体 系 
统 行为 的 观察 ， 可 更 好 地 指导 更 加 合理 的 分 解 和 分 析 。 

尽管 代谢 和 细胞 生理 学 提供 了 分 析 反 应 途径 的 主要 内 容 ， 但 应 该 指出 : 通 量 确定 与 调控 
的 结果 具有 广泛 的 适用 性 。 因 此 ， 除 了 对 通过 代谢 途径 中 的 物质 和 能 量 通 量 分 布 进行 分 析 
外 ， 代 谢 工程 的 概念 同样 可 用 于 分 析 诸 如 信号 转 导 途 径 中 的 信息 通 量 。 由 于 信号 转 导 途径 及 
其 通 量 还 没 被 精确 定义 ， 因 此 本 书 集中 在 代谢 途径 的 应 用 上 。 然 而 ， 一 旦 信息 途径 的 概念 被 
具体 化 ,我们 预期 这 里 所 介绍 的 方法 和 工具 将 会 在 信号 转 导 途 径 相互 作 用 的 研究 中 以 及 在 外 
部 刺激 控制 基因 表达 的 复杂 机 理 的 解释 中 得 到 很 好 的 应 用 。 

或 许 ， 代 谢 工 程 最 重要 的 贡献 在 于 强调 在 胞 内 条 件 下 代谢 通 量 及 其 调控 。 当 然 ， 代 谢 通 
量 这 个 概念 本 身 并 不 是 新 的 。 大 约 在 30 年 前 ， 代 谢 通 量 及 其 控制 就 已 引起 了 虽然 是 一 小 部 
分 但 思维 超前 的 生物 化 学 研究 组 的 注意 。 虽 然 传 统 的 生物 化 学 家 并 不 广泛 接受 这 些 思想 ， 但 
正 是 这 一 部 分 人 的 工作 使 得 代谢 控制 的 思想 日 渐 成 熟 ， 并 被 严密 定义 。 代 谢 工 程 ， 最 初 被 认 
为 是 特定 的 途径 操作 ， 但 很 快 就 成 为 工程 师 们 施展 分 析 技 能 的 天 然 场 所 ， 工 程 师 们 看 到 了 通 
过 利用 通用 的 代谢 控制 分 析 平 台 技 术 在 这 些 过 程 中 引入 严密 分 析 的 机 会 。 代 谢 工程 的 实质 
是 : 将 通 量 及 其 控制 进行 量化 的 方法 与 分 子 生物 学 技术 结合 起 来 ， 用 以 执行 所 建议 的 基因 修 
饰 任务 。 当 反复 利用 代谢 工程 方法 时 ， 它 就 为 在 很 广 范 围 内 系统 改进 细胞 的 性 质 提供 了 一 种 
强 有 力 的 方法 。 

通 量 是 细胞 生理 学 的 一 个 基本 决定 


Am em aT eB) io Ba HN ao 
@  milty 在 图 1.1 (a) 所 示 的 线性 途径 中 ， 通 量 

J 等 于 稳 态 条 件 下 各 个 单个 反应 的 速率 。 

pin 显然 ， 当 中 间 代 谢 物 的 浓度 调整 到 能 使 
deere SL 所 有 反应 速率 都 相等 时 (vp = v2 = 
i WE v=" uL), RAABAT. EMAL 

(b) 程 中 ， 各 个 反应 速率 是 不 相等 的 ， 途 径 

h 28 Ai EL A AEA GH 

Paes. eee JES PO TE BN Fy HE NC AE RAYE AR) 
J; ae 在 图 1.1 (b) 所 示 的 分 支 途径 中 ， 在 中 


间 代 谢 物 I 处 出 现 分 支 途径 ， 每 个 分 支 
途径 有 相应 的 通 量 ， 在 稳 态 时 万 = 万 + 
J3。 每 一 个 分 支 途 径 上 的 通 量 等 于 相应 
的 分 支 途 径 上 的 单个 反应 速率 。 如 图 
1.1 (c) Pra, 通常 把 通 量 万 认为 是 线 
性 途径 中 通 量 J. 和 .Ja 的 到 加 。 用 这 种 
方法 可 将 如 图 1.1 (d) 所 示 的 复杂 网 络 
分 解 为 一 些 线性 途径 ， 每 一 个 途径 有 其 
各 自 的 通 量 。 需 要 指出 的 是 ， 在 图 1.1 


(c) 


所 示 的 所 有 途径 中 ， 达 到 稳 态 的 一 个 必须 条 件 就 是 : 初始 的 和 最 终 的 反应 速率 〈 或 分 别 等 价 
于 初始 代谢 物 与 最 终 代谢 物 A、B、C 等 的 浓度 ) 必须 恒定 ， 这 个 条 件 可 通过 在 连续 培养 反 
应 器 〈 通 常 指 恒 化 反应 器 ) 中 保持 恒定 的 胞 外 代谢 物 浓度 而 实现 。 

由 于 代谢 途径 及 其 通 量 是 代谢 工程 的 核心 ， 因 此 ， 对 它们 的 定义 与 含义 稍 加 详 述 。 我 们 
把 代谢 途径 定义 为 : 一 连 串 可 以 进行 的 并 可 观测 的 生物 化 学 反应 步 又， 这 些 反应 步骤 是 以 指 
定 的 一 组 输入 和 输出 代谢 物 所 连接 。 途 径 通 量 定义 为 : 输入 代谢 物 反 应 生成 输出 代谢 物 的 速 
率 。 在 这 里 需要 特别 指出 可 行 性 和 可 观测 性 的 重要 性 。 首 先 ， 创 造 无 意义 的 反应 步骤 而 催化 
这 些 在 细胞 中 根本 不 存在 的 反应 的 酶 ， 这 样 的 工作 是 没有 价值 的 。 类 似 地 ， 列 举 那些 通过 实 
验 观测 不 到 的 底 物 与 产物 之 间 的 可 能 反应 步骤 也 是 没有 多 大 意义 的 。 代 谢 图谱 的 多 样 性 和 复 
杂 性 这 一 点 非常 重要 ， 这 是 过 去 50 年 生物 化 学 领域 中 开拓 性 研究 所 构建 的 。 尽 管 在 特定 的 
输入 和 输出 代谢 物 之 间 常 常 存在 多 于 一 种 生物 反应 序列 ， 但 如 果 这 些 反应 序列 的 通 量 不 能 独 
立 确 定 ， 那 么 包含 这 样 的 反应 序列 就 没 提供 任何 附加 的 信息 。 如 果 这 些 反 应 序列 可 以 合并 成 
少数 几 个 通 量 可 观测 的 途径 ， 会 更 好 些 。 在 图 1.1 (d) 中 ， 如 果 导 致 生成 代谢 物 正 的 每 一 
个 分 支 途 径 的 通 量 不 能 通过 实验 方法 或 其 它 方法 确定 ， 那 么 两 个 分 支 途径 必须 合并 成 一 个 单 
个 途径 〈 如 虚线 所 示 )。 很 明显 ， 应 鼓励 进行 可 获取 更 多 信息 的 测量 ， 例 如 那些 能 够 区 别 前 
两 个 分 支 途 径 的 方法 ， 因 为 其 提高 了 对 生化 途径 的 分 辨 能 力 。 胞 内 代谢 通 量 的 确定 称 为 代谢 
通 量 分 析 《MEFA)， 其 在 代谢 工程 中 处 于 中 心地 位 。 

在 代谢 途径 及 其 通 量 的 框架 中 ， 代 谢 工 程 的 一 个 基本 目标 就 是 阑 明代 谢 通 量 控制 的 因素 
和 机 理 。 对 于 通 量 控制 的 深入 理解 为 代谢 途径 进行 合理 修饰 提供 了 基础 。 对 代谢 通 量 及 其 控 
制 进行 系统 的 研究 包括 三 个 步骤 。 第 一 ， 开 发 能 够 观测 尽 可 能 多 的 代谢 途径 及 测定 其 通 量 的 
方法 。 为 了 这 个 目的 ， 可 在 测定 胞 外 代谢 物 浓 度 的 基础 上 ， 以 简单 的 物质 平衡 为 出 发 点 。 图 
1.1 (d) 代谢 网 络 中 代谢 物 A~F 的 测定 ， 可 以 确定 所 指示 的 35 个 通 量 ， 但 并 不 是 代谢 物 下 
之 前 的 分 支 途 径 的 通 量 。 取 决 于 标记 前 体 物 A 的 用 法 ， 如 果 对 由 特定 分 支 形成 的 代谢 物 下 
进行 不 同 的 标记 ， 那 么 就 该 方法 可 提供 王 之 前 的 分 支点 处 的 通 量 比 的 信息 。 这 是 几 种 能 被 
用 来 提供 关于 分 支 途径 的 一 些 附 加 信息 的 技术 之 一 ， 在 这 本 书 中 我 们 将 用 很 大 篇 幅 来 讨论 这 
些 技术 。 有 必要 强调 的 是 ， 代 谢 途 径 的 通 量 并 不 等 同 于 途径 中 一 种 酶 或 多 种 酶 的 催化 活性 。 
实际 上 ， 除 了 表明 在 胞 外 分 析 条 件 下 相应 的 酶 存在 并 有 活性 之 外 ， 酶 分 析 并 不 能 提供 有 关 途 
径 实际 通 量 的 信息 。 在 代谢 研究 中 ， 这 些 酶 分 析 包 括 通常 被 误解 为 包含 类 似 大 小 的 代谢 通 
量 ， 由 此 普遍 下 结论 当然 是 不 正确 的 。 

第 二 步 是 向 生物 反应 网 络 引 入 一 个 精确 的 扰动 并 在 系统 达到 新 的 稳 态 之 后 确定 途径 的 通 
量 。 由 于 所 有 的 代谢 控制 研究 都 会 很 快 地 集中 于 某 一 特定 的 代谢 分 支点 上 ， 所 以 很 容易 考虑 
图 1.2 所 示 的 分 支 途径 的 通 量 控制 。 一 般 来 说 ， 为 了 研究 这 个 分 支点 ， 需 要 引入 3 个 扰动 ， 
即 在 三 个 相应 的 支 路 中 分 别 引 入 一 个 扰动 。 理 想 的 扰动 包括 使 用 一 个 恒 化 器 ， 在 达到 稳 态 条 
件 后 ， 其 中 一 个 酶 的 活性 被 突然 的 扰动 〈 例 如 通过 使 用 诱导 启动 子 )。 这 种 实验 安排 最 适合 
于 微生物 或 细胞 培养 系统 。 在 其 它 系统 中 如 植物 或 体内 器 官 功能 体系 中 就 需要 不 同 的 实验 配 
置 。 其 它 容易 实施 的 扰动 措施 ， 例 如 施加 一 个 底 物 脉冲 或 切换 到 不 同 的 碳 源 ， 都 可 以 获得 丰 
富 的 信息 。 虽 然 也 可 以 使 用 其 它 能 对 相应 分 支 途径 通 量 有 可 觉察 影响 的 扰动 ， 但 扰动 的 目标 
应 指向 分 支点 附近 的 酶 。 最 后 应 注意 的 是 : 一 种 扰动 能 提供 不 只 一 个 分 支点 的 信息 ， 这 对 于 
减少 用 来 阐明 一 个 实际 代谢 网 络 控制 结构 所 需 的 实验 数目 是 非常 有 用 的 。 

通 量 控制 确定 中 的 第 三 步 即 最 后 一 步 是 通 量 扰动 结果 的 分 析 。 很 显然 ， 利 用 图 1.2 中 3 

3 


图 1.2 单个 反应 分 组 的 分 支 途径 


个 分 支 途径 的 每 一 个 通 量 扰动 ， 都 可 以 探查 特定 分 支点 处 的 柔韧 性 。 例 如 ， 如 果 通 量 万 的 
一 个 大 的 扰动 并 没有 引起 其 它 两 个 支 路 通 量 在 大 小 或 分 布 方 面 的 明显 变化 ， 那 么 很 显然 ， 这 
个 节点 对 于 上 游 的 扰动 来 说 就 是 一 个 刚性 节点 。 在 这 种 情况 下 ， 想 通过 改变 上 游 的 酶 活性 来 
改变 下 游 的 通 量 是 无 效 的 。 其 它 两 个 分 支 途径 可 以 采用 类 似 的 方法 进行 分 析 。 了 解 一 个 通 量 
的 扰动 是 如 何 通 过 分 支点 帮 至 整个 网 络 的 传播 是 非常 重要 的 ， 这 种 通 量 的 扰动 可 以 是 反应 速 
率 的 改变 (诱导 )， 或 者 是 在 整个 代谢 途径 中 导 人 一 个 较 大 的 通 量 〈 底 物 脉冲 ) ， 或 可 用 其 它 
方法 来 实现 。 在 分 支 之 一 开始 的 扰动 会 通过 整个 网 络 的 代谢 物 而 传播 。 例 如 ， 通 量 J, 的 增 
加 可 能 会 引起 也 可 能 不 会 引起 分 支点 处 代谢 物 工 的 浓度 的 显著 变化 ， 这 反 过 来 也 反映 了 该 通 
量 对 那个 代谢 物 水 平 所 施加 的 控制 程度 。 另 一 方面 ， 如 果 通 量 J 和 .13 被 严格 调控 或 在 特定 
的 稳 态 下 其 受 代谢 物 工 浓 度 的 影响 很 微弱 ， 那 么 ， 即 使 I 改变 了 ， 对 通 量 J. 和 Js 也 没什么 
影响 。 这 是 在 分 析 分 支点 以 及 代谢 网 络 通 量 控制 时 可 能 呈现 的 很 多 情况 之 一 。 阐 明 通 量 控制 
的 重要 性 在 于 每 一 种 通 量 控制 的 结构 将 支配 一 个 不 同 的 策略 以 进行 通 量 扩 增 或 通 量 分 配 比 的 
BLE 

代谢 工程 的 一 个 主要 目标 就 是 对 代谢 通 量 控制 的 理解 ， 其 中 所 做 的 一 个 很 重要 的 努力 就 
是 20 世纪 70 年 代 发 展 起 来 的 代谢 控制 分 析 (MCA) (Kacser and Burns, 1973; Heinrich 
and Rapoport，1974)， 它 是 通过 途径 中 酶 的 活性 、 代 谢 物 、 效 应 物 和 其 它 参 数 所 施加 的 通 
量 控制 程度 进行 定量 表述 。 本 书 将 对 代谢 控制 分 析 进 行 全 面 介 绍 ， 而 且 我 们 还 将 主要 通过 从 
上 至 下 的 代谢 控制 分 析 和 反应 分 组 人 手 将 基本 理论 扩展 到 复杂 的 代谢 网 络 。 如 图 1.2 所 示 ， 
这 种 方法 的 主要 原则 就 是 对 围绕 分 支点 代谢 物 〈 例 如 I) 的 单个 体 反 应 进行 分 组 ， 然 后 通过 
引入 组 控制 系数 来 描述 由 这 些 反 应 组 所 施加 的 控制 程度 。 这 种 方法 成 功 的 关键 限制 通过 共同 
分 支点 代谢 物 工 的 所 有 联系 ， 消 除 反 应 组 之 间 的 交互 人 作用。 因此， 应当 指 出 的 是 : 反应 分 组 
和 从 上 至 下 MCA 的 成 功 应 用 可 以 有 助 于 将 MCA 的 主要 决定 因素 定位 于 明确 定义 的 反应 组 
内 ， 该 反应 组 所 含 的 酶 的 数目 比 典 型 的 反应 系统 所 需要 涉及 的 酶 的 数目 比 要 少 很 多 。 此 外 ， 
这 种 焦点 集中 的 研究 方法 是 合理 分 析 的 结果 ， 而 不 是 主要 考虑 单个 反应 影响 而 忽视 代谢 网 络 
系统 特征 的 权宜 应 付 的 方法 。 

通 量 控制 的 关键 参数 确定 以 后 ， 人 们 需要 实施 这 些 变化 从 而 最 有 效 地 达到 预定 目标 。 可 
用 多 种 方法 来 实现 这 个 目标 。 虽 然 人 们 首先 会 想到 基因 修饰 ， 但 也 不 应 忽略 与 基因 改变 同等 
重要 的 生物 反应 器 的 控制 。 例 如 ， 如 果 图 1.2 中 代谢 物 马 是 目标 产物 ， 而 且 分 支点 工 对 于 生 
成 代谢 物 C 的 通 量变 化 是 柔性 的 ， 那 么 通过 消除 C 分 支 途 径 上 的 第 一 个 酶 〈(E3)， 就 可 以 获 
得 B 的 高 产 菌 了 。 这 种 基因 改变 会 形成 C 的 营养 缺陷 型 ， 为 了 最 优 维持 细胞 的 生长 速率 和 
产物 合成 速率 之 间 的 平衡 ， 必 须 通过 控制 向 培养 基 中 加 入 代谢 物 C。 另 一 个 方法 就 是 保持 

4 


E3 的 较 小 活性 ， 以 使 代谢 物 C 能 够 由 细胞 本 身 合 成 ， 因 而 可 以 消除 为 了 加 入 适量 代谢 物 C 
而 采用 的 控制 操作 。 在 实施 通 量 控制 的 策略 中 ， 无 论 采用 哪 种 路 线 ， 为 获得 最 佳 的 结果 ， 都 
应 将 基因 修饰 和 环境 条 件 改变 结合 起 来 使 用 。 

众所周知 ， 代 谢 工 程 是 多 学 科 交 叉 领域 (Cameron and Tong，1993)。 生 物化 学 已 提供 
了 基本 的 代谢 图 谱 以 及 关于 生化 反应 机 理 及 其 计量 学 、 动 力学 和 调控 的 大 量 信息 。 另 外 ， 代 
谢 控制 分 析 的 整个 领域 在 得 到 工程 领域 认可 之 前 ， 是 起 源 并 扎根 于 生物 化 学 的 。 遗 传 学 和 分 
子 生物 学 提供 了 构建 完善 的 遗传 背景 的 工具 ， 这 是 通 量 控制 中 重要 的 一 步 。 此 外 ， 这 两 门 学 
科 是 构建 高 产 菌 株 过 程 中 进行 遗传 改变 的 有 力 工 具 。 人 们 应 当 记 住 在 代谢 工程 诞生 过 程 中 重 
组 DNA 技术 的 重要 作用 。 实 际 上 ， 作 为 一 项 可 行 的 技术 ，DNA 重组 技术 为 代谢 工程 的 定 
义 和 发 展 提供 了 原动力 。 细 胞 生理 学 提供 了 细胞 代谢 功能 更 为 综合 的 视野 ， 因 此 确定 了 代谢 
速率 研究 和 生理 状态 表征 的 平台 。 最 后 ， 化 学 工程 是 应 用 工程 方法 来 研究 生物 体系 最 合适 的 
渠道 。 从 一 般 意 义 来 说 ， 该 方法 中 在 生物 系统 研究 中 融合 了 集成 、 定 量 以 及 关联 的 概念 。 更 
特别 的 是 ， 化 学 工程 提供 了 系统 分 析 的 工具 和 经 验 。 所 涉及 的 系统 中 ， 速 率 过 程 是 控制 因 
素 ， 化 学 工程 在 这 些 领域 中 非常 擅长 并 做 出 了 突出 贡献 。 

代谢 工程 的 多 学 科 性 质 毫 无 疑问 成 为 代谢 工程 实现 其 目标 的 一 个 有 利 条 件 。 与 此 同时 ， 
这 就 使 得 必须 将 代谢 工程 与 相关 领域 区 分 开 来 。 在 我 们 看 来 ， 代 谢 工 程 的 独特 点 在 于 包含 如 
PRE: 代谢 途径 、 代 谢 通 量 和 在 简单 途径 及 更 实际 的 代谢 网 络 中 控制 代谢 通 量 的 因素 。 此 
外 ， 代 谢 工程 必须 包括 实验 和 理论 两 种 方法 用 以 胞 内 代谢 通 量 的 确定 ， 具 体 方法 包括 用 物质 
平衡 、 同 位 素 标记 、 光 谱 学 方法 〈 如 核磁 共振 ) 及 衍生 发 展 而 来 的 方法 〈 如 气相 色谱 -质谱 ) 
来 测定 关键 代谢 物 的 同位 素 含量 和 (或 ) 分 子 量 分 布 等 。 由 于 这 些 测 定 结果 与 生成 这 些 代谢 
物 的 途径 通 量 的 大 小 是 相关 的 ， 因 此 可 以 利用 这 些 信息 来 推测 代谢 通 量 。 途 径 通 量 的 概念 、 
胞 内 通 量 的 确定 方法 以 及 通过 代谢 通 量 的 系统 研究 所 得 到 的 结论 ， 被 统称 为 代谢 通 量 分 析 。 
这 在 整个 通 量 控制 研究 中 占据 重要 位 置 ， 本 书 对 此 将 详尽 介绍 。 


1.1 代谢 工程 的 重要 性 


代谢 工程 是 涉及 宽阔 的 基础 研究 和 重要 实用 价值 的 领域 。 代 谢 工 程 的 基本 贡献 在 于 其 对 
胞 内 通 量 控制 的 测定 和 理解 。 如 前 所 述 ， 一 些 代 谢 图 谱 尽管 很 详尽 ， 但 很 少 表达 出 通过 不 同 
途径 的 碳 、 氮 及 能 量 的 实际 通 量 的 信息 。 结 果 是 ， 尽 管 这 些 代谢 图 提供 了 营养 物质 转化 为 产 
品 、 能 量 以 及 还 原 力 的 可 能 路 线 ， 但 并 没有 揭示 出 在 特定 条 件 下 处 于 活性 状态 的 实际 代谢 途 
径 。 代 谢 通 量 分 析 揭 示 途 径 参 与 一 个 总 的 代谢 过 程 的 程度 。 此 外 ， 通 量 控制 的 阐述 为 在 关键 
代谢 分 支点 合理 处 理 所 观 察 到 的 通 量 及 通 量 分 布 提供 了 机 理 的 基础 。 由 于 这 些 通 量 是 在 胞 内 
条 件 下 确定 的 ， 代 谢 通 量 分 析 允 许 对 胞 内 和 胞 外 酶 催化 特性 进行 正确 的 比较 。 最 后 ， 代 谢 通 
量 提供 了 比较 菌株 变异 体 的 总 的 基础 。 即 使 这 些 菌 株 的 发 酵 特性 有 区 别 ， 但 如 果 关 键 分 支点 
处 的 代谢 通 量 分 布 并 没有 改变 ， 那 么 这 些 发 酵 特性 的 差异 相对 来 说 是 不 太 重 要 的 。 

代谢 工程 给 化 学 工程 师 提供 了 从 事 生 物 学 研究 的 一 个 极 好 机 会 ， 因 为 它 可 以 直接 利用 动 
力学 、 传 递 以 及 热力 学 的 核心 主题 去 分 析 代 谢 网 络 中 的 反应 。 在 此 意义 上 ， 代 谢 网 络 可 以 看 
成 一 个 化 工厂 ， 其 中 的 单元 就 是 各 个 单个 的 酶 ， 因 此 也 有 类 似 的 设计 、 控 制 和 优化 问题 。 如 
果 想 通过 对 所 选 的 酶 的 扩 增 来 扩大 微生物 的 碳 通 量 ， 我 们 可 以 得 益 于 化 工厂 的 放大 原理 ， 即 
一 些 关 键 操作 单元 的 协调 放大 。 类 似 地 ， 产 率 最 优 取 决 于 通过 最 优 通 量 分 布 所 得 到 的 副 产 物 
最 小 。 当 然 ， 只 有 当 控 制 通 量 的 因素 被 首先 识别 并 被 充分 理解 之 后 ， 通 量 优化 才 有 可 能 。 


代谢 工程 的 另 一 贡献 源 于 其 特别 强调 集成 和 量化 的 方法 。 代 谢 工程 的 一 个 重要 目标 是 理 
解 代谢 途径 的 整体 功能 ， 最 好 是 通过 代谢 途径 结构 单元 〈 即 组 成 的 生化 反应 ) 的 整合 来 进 
行 。 然 而 ， 系 统 的 特性 并 不 是 其 各 组 成 单元 的 简单 加 和 ， 因 此 ， 当 利用 一 个 个 基因 和 反应 根 
据 遗 传 学 和 酶 的 信息 来 尝试 重新 构建 细胞 特性 时 ， 必 须 处 理 复杂 性 问题 。 为 了 提供 综合 性 细 
胞 功能 的 需要 ， 对 于 还 原 论 者 多 年 研究 成 果 的 许多 单独 的 信息 进行 整合 ， 我 们 预期 将 会 得 到 
日 益 增 多 的 关注 。 随 着 基因 组 学 研究 所 预料 的 信息 激增 ， 这 种 需求 将 更 加 明显 。 在 这 种 情况 
下 ， 代 谢 工程 为 使 生物 信息 得 到 升级 ， 并 综合 运用 这 些 信 息 达 到 开发 有 用 产品 和 过 程 的 目 
的 ， 提 供 了 有 用 的 平台 。 同 样 ， 得 益 于 代谢 工程 领域 进一步 研究 的 基础 生物 化 学 及 代谢 的 重 
要 性 问题 。 伯 括 总 的 生物 控制 结构 、 分 层次 调节 结构 及 酶 反应 的 通道 效应 (channeling ef- 
fects) 等 。 

为 了 研究 细胞 代谢 ， 由 代谢 工程 所 提供 的 知识 框架 还 需要 补充 适当 的 测量 以 取得 最 好 结 
果 。 因 此 ， 为 了 解密 代谢 或 其 它 反应 网 络 ， 代 谢 工 程 在 表征 至 关 重 要 的 测量 结果 方面 ， 起 着 
关键 的 作用 。 在 代谢 网 络 研究 中 ， 这 使 人 们 更 加 注意 到 与 胞 内 通 量 测量 有 关 的 问题 。 对 于 信 
息 网 络 研究 ， 为 了 阐明 和 量化 以 蛋白 质 为 中 介 的 级 联 反应 所 处 理 的 信息 通 量 时 ， 代 谢 工 程 同 
样 可 以 确定 分 析 方 面 的 需要 。 在 所 提供 的 框架 中 ， 由 于 这 些 测 量 所 带 来 的 益处 目 益 明显 ， 这 
可 推动 着 这 些 检测 仪器 的 发 展 。 

如 上 节 所 述 ， 对 代谢 途径 中 通 量 控制 结构 的 前 明 ， 为 一 个 细胞 催化 剂 的 最 优 酶 分 布 的 合理 
设计 提供 了 巨大 的 机 遇 。 这 种 活动 应 看 做 是 对 分 子 生 物 学 工具 箱 的 一 种 补充 ， 这 些 工具 用 于 完 
成 基因 转移 和 其 它 类 似 的 修饰 等 工作 。 实 际 上 ， 这 些 方法 在 近 几 年 已 发 展 得 非常 迅速 ， 以 至 于 
为 识别 目标 基因 和 酶 而 进行 的 代谢 途径 的 合理 分 析 已 成 为 定向 优化 细胞 功能 的 限制 性 因素 。 之 
所 以 这 么 说 ， 是 因为 直至 目前 的 观察 ， 基 因 工 程 开 拓 性 发 展 20 年 后 的 今天 ， 现 代 生 物 技术 在 
燃料 、 化 学 品 或 材料 生产 〈 工 业 酶 除外 ) 等 领域 几乎 没有 重大 应 用 。 尽 管 前 四 大 生物 技术 公司 
中 有 两 家 最 初 将 商业 目标 集中 在 这 几 个 领域 内 ， 但 由 于 后 来 又 认识 到 医药 保健 行业 在 技术 上 更 
容易 鉴别 ， 且 经 济 上 更 有 吸引 力 的 机 会 ， 所 以 这 些 公司 又 将 发 展 方向 转移 到 了 医药 领域 。 现 在 
有 理由 认为 ， 生 物 技术 应 用 的 前 景 正 在 迅速 改变 ， 而 且 未 来 的 发 展 机 会 将 包括 制造 领域 的 许多 
应 用 。 有 三 种 驱动 力 支持 这 种 说 法 : 两 个 是 经 济 方面 的 ， 一 个 是 技术 方面 的 。 

生物 技术 在 制造 领域 应 用 的 第 一 个 驱动 力 是 : 世界 范围 内 糖 类 原材料 生产 量 的 持续 增 
加 。 这 种 资源 的 最 天 然 的 应 用 就 是 通过 生物 技术 生产 衍生 物 。 这 些 产品 中 有 些 已 开辟 了 市 
场 ， 但 是 许多 产品 ， 尤 其 是 在 材料 领域 的 许多 产品 将 有 全 新 的 应 用 ， 存 在 着 令 人 鼓舞 的 商业 
机 遇 。 第 二 个 驱动 力 就 是 生物 技术 产品 生产 成 本 的 持续 下 降 ， 而 化 学 过 程 生产 的 产品 成 本 的 
不 断 增 加 的 趋势 。 形 成 这 种 趋势 的 原因 虽 不 完全 清楚 ， 但 是 大 规模 发 酵 生产 的 规模 效益 的 实 
现 以 及 化 学 过 程 所 造成 的 日 益 增 加 的 环境 负担 都 是 形成 这 种 趋势 的 因素 。 我 们 注意 到 ， 并 非 
所 有 的 生物 技术 过 程 都 完全 能 与 化 学 合成 过 程 竞争 ， 但 是 人 们 已 普遍 认识 到 两 种 过 程 的 成 本 
正 以 不 同 的 斜率 在 改变 着 ， 而 且 交 叉 点 将 很 快 出 现 。 根 据 工 业界 科学 家 的 说 法 ， 加 速 这 种 趋 
势 的 极为 重要 的 因素 就 是 : 在 生物 技术 生物 加 工 过 程 中 由 代谢 工程 所 导致 的 产品 选择 性 的 
改进 。 

最 后 一 个 驱动 力 是 通过 所 发 展 的 技术 力量 一 一 现代 分 子 生 物 学 技术 。 这 些 技术 虽然 与 用 
来 定位 需要 操纵 的 关键 酶 的 匹配 能 力 还 不 一 致 ， 但 近 几 年 的 进展 有 理由 使 我 们 对 于 方法 学 的 
发 展 感到 乐观 。 这 些 进 展 将 使 我 们 能 够 识别 代谢 网 络 中 的 关键 酶 ， 识 别 为 使 目标 产品 的 得 率 
得 到 大 幅度 改变 而 需要 进行 修饰 的 类 型 。 

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在 工业 生产 中 代谢 工程 能 做 出 重大 贡献 的 一 些 特 定 领域 包括 ; 发 酵 法 及 在 完整 植物 中 表 
达 (PHA 的 生物 合成 )、 生 产 热塑性 塑料 〈 其 目前 由 石油 路 线 生 产 )、 新 材料 的 生产 以 及 诸 
如 聚 酮 物 等 新 的 生物 活性 物质 的 生产 。 胶 类 、 溶 剂 、 多 糖 、 和 蛋白质、 各 种 抗生素 、 食 品 、 沼 
气 、 寡 肽 、 醇 类 、 有 机 酸 、 维 生 素 、 和 氨基酸、 细菌 纤 维 素 酶 、 谷 胱 甘 肽 衍生 物 、 脂 类 、 油 类 
以 及 色素 是 目前 通过 生物 法 生产 的 一 部 分 产品 ， 或 是 目前 主要 在 微生物 中 进行 代谢 操作 的 目 
标 产 品 。 代 谢 工程 原理 的 突破 将 会 对 这 些 过 程 的 效率 和 经 济 学 产生 直接 的 影响 。 

需要 强调 的 是 : 在 工业 上 ， 代 谢 工程 的 最 终 应 用 目标 就 是 设计 和 创造 出 最 优 的 生物 催化 
剂 ， 以 达到 目标 产品 的 最 大 得 率 和 生产 能 力 。 从 这 个 意义 上 讲 ， 代 谢 工程 等 同 于 化 学 加 工 工 
业 中 的 催化 作用 ， 尽 管 很 难 准确 预测 代谢 工程 领域 的 近期 方向 ， 但 是 上 述 的 类 似 使 我 们 很 容 
易 展 望 其 长 期 的 影响 。 这 种 影响 首先 来 自 于 以 应 用 分 子 生物 学 为 基本 核心 的 全 新 工业 的 发 
展 ， 以 及 由 应 用 分 子 生 物 学 而 产生 的 可 行 技术 。 正 如 在 世纪 之 交 出 现 的 化 学 工程 是 以 化 学 为 
中 心 实现 其 工业 应 用 的 领域 一 样 ， 我 们 可 以 展望 为 了 发 展 分 子 生物 学 的 工业 应 用 ， 将 会 出 现 
一 个 生物 化 学 (或 生物 代谢 ) 工程 的 新 领域 。 代 谢 工程 的 主要 范例 效仿 于 化 学 工程 范例 。 从 
这 个 方面 讲 ， 旨 在 为 过 程 优化 而 开发 生物 催化 剂 的 代谢 工程 ， 将 在 生物 加 工 过 程 中 起 着 与 在 
化 学 过 程 中 应 用 多 年 的 催化 作用 相同 的 作用 。 正 如 许多 化 学 过 程 仅仅 是 在 开发 出 合适 的 催化 
剂 后 才 成 为 现实 一 样 ， 生 物 技术 的 巨大 潜力 只 有 在 很 大 程度 上 通过 代谢 工程 开发 出 有 效 的 过 
程 生物 催化 剂 后 才能 变 为 现实 。 目 前 对 许多 不 同 微生物 和 其 它 种 类 生物 基因 组 的 测序 工作 使 
这 些 可 能 性 更 加 接近 现实 。 正 是 基于 这 一 点 ， 代 谢 工 程 在 工业 应 用 的 长 远 潜力 应 当 予 以 
评估 。 

除了 上 述 生 产 方面 的 应 用 之 外 ， 代 谢 工 程 在 医学 领域 将 产生 重要 影响 ， 主 要 焦点 是 通过 
识别 确切 的 靶 标 进行 药物 开发 、 疗 法 设计 和 致力 于 基因 疗法 的 设计 。 目 前 ， 人 们 利用 上 述 方 
法 确定 与 特定 疾病 有 关 的 一 个 单个 酶 反应 步骤 为 靶 标 。 然 而 ， 还 不 能 保证 一 个 单个 反应 的 操 
作 会 转化 成 人 体 的 系统 的 响应 。 从 这 个 角度 看 ， 代 谢 工程 在 医学 方面 的 应 用 与 前 面 提 到 的 在 
工业 生产 上 的 应 用 没有 什么 不 同 。 因 而 可 以 得 益 于 代谢 工程 的 发 展 : 即 在 医学 处 理 中 对 实验 
结果 进行 更 好 的 分 析 以 及 应 用 靶 标 合理 选择 方法 。 

最 近 ， 在 化 学 式 中 包含 有 几 个 手 性 中 心 的 一 类 新 药 正在 不 断 生 产 。 由 于 这 种 药物 分 子 是 
很 难 用 有 机 化 学 合成 方法 来 合成 的 ， 因 而 ， 在 总 的 化 学 合成 过 程 中 已 经 用 酶 来 进行 其 中 一 个 
或 多 个 困难 的 步骤 。 人 们 希望 通过 将 表达 产品 合成 过 程 中 所 需 的 所 有 酶 的 基因 转 入 某 个 微 生 
物 ， 从 而 使 所 有 反应 步骤 整合 在 一 个 单个 微生物 中 。 从 不 同 生物 体 中 识别 并 转移 这 些 基因 及 
其 在 宿主 细胞 中 的 表达 ， 当 今 已 成 为 制药 行业 越 来 越 引 人 注目 的 主题 。 这 种 应 用 是 代谢 工程 
的 原理 为 执行 某 种 特定 任务 在 反应 途径 合成 中 的 又 一 例证 ， 其 不 是 使 用 相互 独立 的 单个 酶 。 
通过 代谢 工程 的 引入 而 导致 的 技术 发 展 将 有 助 于 需求 量 很 大 的 药品 生产 。 

最 后 ， 代 谢 工 程 的 概念 和 方法 在 医学 领域 的 应 用 即 胞 内 组 织 、 整 合 器 官 的 功能 和 总 体 代 
谢 的 分 析 。 也 许 通过 肝脏 功能 的 分 析 能 充分 体现 出 这 些 可 能 性 。 虽 然 肝 脏 的 系统 功能 已 被 广 
泛 研 究 而 且 总 的 来 说 已 被 充分 理解 ， 但 是 对 于 肝脏 内 部 的 各 种 代谢 途径 对 肝脏 器 官 功能 的 贡 
献 还 没 阑 明 。 例 如 ， 已 知 肝 脏 代谢 在 糖 原 异 生 过 程 中 及 通过 脱 氨 基 作用 在 尿素 生产 中 起 着 重 
要 作用 ; 此 外 ， 在 肝脏 的 正常 活动 过 程 中 ， 氨 基 酸 的 吸收 和 生成 有 着 复杂 的 分 布 。 然 而 ， 这 
些 功 能 会 因 烧 伤 而 剧烈 变化 或 对 细胞 因子 和 典型 应 激 激素 的 药物 作用 而 做 出 强烈 的 响应 ， 这 
些 激素 包括 : 胰 增 血糖 素 、 氢 化 可 的 松 和 肾上腺 素 等 。 肝 脏 在 整个 代谢 过 程 中 并 不 是 一 个 被 
动 的 参与 者 ， 相 反 ， 肝 脏 在 调节 人 体 中 氢 的 排除 、 葡 萄 糖 生 成 以 及 维持 生理 的 氧化 还 原作 用 

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和 能 量 状态 等 方面 起 着 积极 的 作用 。 人 们 已 充分 了 解 了 使 这 些 功 能 起 作用 的 整个 生化 反应 网 
络 ， 然 而 对 于 参与 加 工 碳 骨 架 和 氮 的 特定 反应 途径 还 不 了 解 ， 尤 其 是 还 不 清楚 控制 通过 主要 
代谢 途径 的 碳 、 氮 通 量 分 布 的 各 种 因素 。 由 于 这 些 因 素 对 于 保持 正常 条 件 下 或 诸如 损伤 等 干 
扰 条 件 下 的 肝脏 的 功能 起 着 重要 的 作用 ， 因 此 很 有 必要 识别 出 这 些 因素 并 对 其 充分 表征 。 所 
以 这 个 领域 的 研究 应 努力 表征 肝脏 内 正常 条 件 下 的 糖 原 异 生 、 尿 素 生 成 以 及 氨基酸 加 工 的 代 
谢 过 程 中 主要 途径 的 通 量 分 布 。 这 可 通过 在 可 控 的 环境 条 件 下 ， 根 据 生 理 介质 的 进 料 对 灌注 
的 肝脏 仿效 连续 的 体系 而 进行 。 必 须 通过 酶 动力 学 和 代谢 物 调 节 来 解释 这 个 网 络 的 通 量 ， 万 
其 是 由 烧伤 或 通过 引入 细胞 因子 或 激素 等 介 体 而 引起 的 通 量 的 变化 。 最 后 ， 正 常 条 件 下 和 由 
细胞 因子 及 应 激 激素 等 物质 刺激 的 条 件 下 ， 肝 脏 细胞 的 细胞 培养 物 系 内 的 关键 代谢 途径 都 需 
要 被 识别 。 这 两 种 条 件 下 的 关键 代谢 途径 不 同 ， 会 给 我 们 提供 有 关 整 个 器 官 功能 的 胞 内 酶 动 
力学 和 代谢 物 调节 是 具有 重要 价值 的 信息 。 正 是 通过 这 种 类 型 的 研究 可 以 使 我 们 对 像 肝脏 一 
样 的 整个 器 官 的 实际 功能 进行 更 好 地 理解 ， 这 既 可 以 在 一 个 范围 广泛 的 系统 构架 内 进行 ， 也 
可 进行 一 个 个 生化 反应 的 总 体重 建 。 


1.2 本 书 的 概要 


本 书 用 于 阐明 代谢 和 代谢 工程 的 方法 具有 普遍 的 适用 性 。 然 而 ， 有 些 体 系 根据 其 本 身 的 
特性 ， 更 加 符合 这 里 所 说 的 分 析 类 型 。 同 时 ， 我 们 也 注意 到 对 于 相似 的 目标 ， 例 如 代谢 通 量 
和 通 量 控制 系数 的 测定 ， 本 书 所 建议 的 方法 与 其 它 学 科 所 用 的 方法 不 同 。 在 其 它 领域 ， 使 用 
遗传 上 简化 了 的 生物 系统 来 努力 获得 代谢 通 量 、 控 制 系数 、 弹 性 系数 以 及 其 它 参数 。 这 些 突 
变 株 在 竞争 性 的 途径 上 带 有 缺陷 ， 能 通过 一 些 胞 外 代谢 物 深 度 变化 速率 的 改变 来 直接 测量 通 
量 。 尽 管 这 种 方法 已 取得 一 些 令 人 关注 的 结果 ， 但 总 的 来 说 ， 由 于 一 些 原因 使 得 这 种 方法 具 
有 局 限 性 。 这 种 简化 的 突变 株 并 不 总 是 很 容易 构建 出 来 的 ， 它 们 通常 表现 出 不 同 的 特性 。 最 
后 的 但 并 非 最 不 重要 ， 人 们 还 不 清楚 ， 在 这 些 改变 了 的 体系 中 ， 观 察 到 的 途径 是 如 何 与 原来 
体系 中 的 途径 相 联系 的 。 本 书 中 的 方法 是 用 来 研究 未 经 改变 的 生物 系统 ， 但 补充 了 现代 仪器 
所 人 允许 的 尽 可 能 多 的 测量 。 利 用 这 种 方法 ， 从 重建 的 代谢 网 络 中 得 到 了 代谢 通 量 及 其 衍生 
量 ， 以 更 好 地 描述 速率 和 标记 代谢 物 的 测量 。 通 过 在 通 量 确定 过 程 中 引入 高 宛 余 度 ， 使 得 实 
际 上 代表 胞 内 实际 通 量 值 的 置信 水 平 得 到 了 很 大 提高 

以 某 种 方式 ， 我 们 可 以 在 通 量 测定 和 材料 结构 表征 之 间 寻 求 某 些 类 比 。 在 材料 科学 中 ， 
没有 单一 的 方法 能 够 提供 所 研究 材料 的 全 部 结构 。 然 而 通过 使 用 若干 不 同 的 技术 ， 就 可 以 测 
定 出 这 种 材料 的 结构 ， 其 与 根据 假定 的 材料 结构 而 进行 重建 的 材料 结果 极为 一 致 。 类 似 地 ， 
我 们 可 以 首先 假定 一 个 生化 网 络 ， 并 确定 其 通 量 ， 以 臻 大量 不 同 的 、 相 互 独立 的 、 多 维 的 测 
量 与 所 假定 的 生化 结构 得 出 的 通 量 预测 值 非常 一 致 。 

在 开始 就 描述 这 个 实验 体系 是 很 重要 的 ， 因 为 上 述 方法 是 最 适用 的 。 这 种 体系 包括 一 个 
连续 的 生物 反应 器 ， 微 生物 或 其 它 细胞 在 其 中 生长 并 达到 一 个 稳 态 。 对 反应 器 和 人 口 处 和 出 唱 
处 的 代谢 物 进行 测量 ， 可 以 得 到 主要 代谢 物 生成 或 消耗 代谢 速率 的 精确 估计 值 。 另 外 ， 还 可 
以 直接 向 生物 反应 器 引入 精确 设计 的 标记 的 底 物 脉冲 ， 这 种 标记 性 底 物 被 细胞 吸收 ， 并 以 各 
种 形式 重新 出 现在 所 分 泌 的 产物 中 。 最 终 产 物 中 标记 性 元 素 的 不 余 度 分 析 ， 还 有 核磁 共振 
(NMR) 波谱 中 代谢 物 峰 值 的 精细 结构 分 析 ， 则 为 代谢 通 量 的 进一步 解释 提供 了 有 力 的 结 
合 。 这 种 实验 体系 的 一 个 非常 重要 的 方面 就 是 稳 态 概 念 ， 这 种 稳 态 是 经 过 几 倍 于 流动 反应 器 
的 停食 时 间 之 后 最 终 才 达 到 的 。 在 这 种 条 件 之 下 ， 代 谢 通 量 达到 稳 态 ， 这 时 由 代谢 控制 分 析 

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所 指定 的 所 有 重要 响应 量 可 以 被 确定 。 为 了 缩短 这 些 实验 的 周期 ， 分 批 或 流 加 培养 有 时 可 以 
代替 连续 培养 体系 。 然 而 ， 我 们 应 记 住 的 是 ， 在 这 种 条 件 下 ， 所 有 的 数据 点 中 只 有 一 部 分 对 
代谢 通 量 分 析 是 有 用 的 ， 这 就 是 那些 当 环境 条 件 保持 相对 不 变 的 情况 下 所 采集 的 数据 。 然 
而 ， 在 系统 地 改变 实验 条 件 方面 ， 其 适应 性 是 有 限 的 。 很 明显 ， 从 根本 上 来 说 ， 流 动 反 应 器 
系统 才 适 用 于 微生物 和 细胞 培养 的 研究 。 应 当 寻 求 创造 性 的 替代 实验 系统 ， 以 利于 其 它 物 系 
(如 植物 和 器 官 ) 的 研究 。 在 前 述 肝脏 功能 分 析 中 所 建议 的 整个 器 官 的 灌流 培养 就 有 可 能 作 
为 一 个 稳 态 恒 化 器 的 框架 ， 从 而 得 到 关于 肝脏 完整 功能 的 宝贵 信息 。 

这 本 书包 括 两 部 分 ， 由 于 读者 的 背景 各 不 相同 ， 第 工 部 分 介绍 了 代谢 概论 及 对 代谢 进行 
综合 性 定量 描述 的 框架 。 在 这 里 我 们 并 不 打算 取代 能 在 其 它 优秀 教科 书 中 找到 的 生物 化 学 基 
本 原理 。 我 们 的 目的 是 将 这 些 知识 与 总 体 代谢 的 内 容 整合 在 一 起 ， 并 利用 化 学 反应 工程 的 概 
念 对 其 进行 系统 定量 的 描述 。 在 第 2 章 ， 回 顾 了 细胞 反应 ; 从 物质 运输 过 程 开 始 ， 接 下 去 是 
包括 在 分 解 代谢 和 合成 代谢 中 基本 的 生化 途径 。 其 中 一 个 重要 组 成 部 分 就 是 从 分 解 反应 中 获 、 
得 能 量 和 在 合成 代谢 中 能 量 消耗 的 问题 ， 因 为 ， 从 中 我 们 可 得 到 在 菌 体 生长 和 产物 形成 过 程 
中 真正 能 量 得 率 的 宝贵 信息 。 进 而 ， 利 用 这 些 平衡 ， 可 将 整个 代谢 中 的 许多 不 同 的 组 成 部 分 
通过 其 对 流通 代谢 物 生成 和 消耗 所 做 的 贡献 整合 起 来 。 

第 3 章 介绍 细胞 反应 模型 化 的 综合 框架 ， 包 括 化 学 计量 学 考虑 以 及 在 确定 反应 速率 时 使 
用 的 动态 物料 平衡 。 额 外 引入 关于 能 量 对 细胞 功能 的 一 些 附加 的 假设 ， 可 以 导出 一 些 有 用 的 
系数 和 速率 方程 ， 这 些 已 从 经 验 观察 到 了 。 从 基本 原理 和 合理 的 假设 衍生 而 来 的 系数 的 速率 
方程 为 解释 实验 数据 提供 了 一 个 合理 的 基础 。 一 般 来 讲 ， 速 率 方程 在 细胞 模型 分 析 中 是 最 大 
的 不 确定 性 的 来 源 。 因 此 ， 不 使 用 关于 生化 反应 动力 学 的 任何 假设 ， 而 仅仅 根据 元 素平 衡 和 
能 量 平衡 来 研究 大 量 信息 是 很 有 用 的 。 这 就 是 第 4 章 的 主题 ， 其 导致 衍生 出 速率 测量 必须 满 

一 些 约 东 条件 。 这 些 约束 条 件 来 自 基本 的 元 素平 衡 ， 并 可 用 做 检验 测量 与 假设 的 生物 化 
学 之 间 的 一 致 性 。 当 这 些 平衡 不 满足 时 ， 也 可 用 其 判别 测量 误差 或 假设 的 生物 化 学 误差 的 可 
能 来 源 。 第 工 部 分 的 结尾 对 代谢 途径 的 调控 进行 了 评述 。 从 单个 酶 或 基因 水 平 到 操纵 子 及 整 
个 细胞 水 平 ， 对 转录 调控 和 酶 调控 进行 了 多 层次 的 代谢 控制 方面 的 讨论 。 还 引入 了 模型 来 定 
量 描述 效应 物 和 抑制 物 在 酶 水 平 上 对 调控 的 影响 。 

第 下 部 分 首先 对 途径 操作 的 应 用 进行 了 广泛 的 述评 。 这 是 第 6 章 的 主题 ， 其 提供 了 一 
代谢 工程 有 益 的 应 用 实例 。 在 介绍 这 些 实例 时 ， 我 们 部 分 遵从 了 在 Cameron 和 rae 
(1993) 的 工作 中 建议 的 代谢 工程 应 用 的 分 类 。 以 功能 作为 主要 分 类 标准 ， 这 些 例子 被 分 类 
为 : 宿主 微生物 已 能 生产 的 化 学 品 的 生产 改进 ， 扩 大 菌 体 生 长 和 产物 合成 所 需 底 物 的 范围， 
增加 了 能 降解 有 毒化 合 物 的 新 的 代谢 活性 ， 生 产 出 原宿 主 不 能 生产 的 新 化 合 物 ， 使 整体 的 细 
胞 性 质 发 生 极 大 的 改变 等 。 在 大 多 数 情况 下 ， 举 例 中 提供 了 详细 的 途径 、 主 要 问题 摘要 以 及 
代谢 工程 为 解决 这 些 问题 所 采用 的 方法 。 书 中 举 的 例子 很 多 ， 旨 在 提供 一 个 广泛 的 应 用 范围 
以 便 能 为 将 来 在 其 它 类 似 的 体系 中 应 用 时 提供 指导 。 

代谢 工程 的 一 个 重要 目标 就 是 为 特定 产物 的 生物 合成 提出 可 选择 的 途径 。 这 可 通过 在 某 
一 特定 的 酶 数据 库 两 ， 竞 全 列 出 连接 一 组 特定 产物 和 二 组 反应 物 的 所 有 可 能 的 途径 来 完成 该 
任务 。 该 过 程 可 能 很 复杂 ， 会 导致 大 量 过 共产 生 。 有 一 种 算法 ， 能 够 生成 所 有 这 些 途 径 ， 其 
很 壳 束 而 且 适 宜 于 在 合理 的 机 时 内 完成 ， 这 部 分 内 容 在 第 7 章 加 以 介绍 。 

第 8 章 详细 介绍 了 代谢 通 量 分 析 。 首 先 介绍 了 理论 背景 ， 接 下 来 讨论 了 为 解决 很 复杂 的 
体系 所 需 信息 的 数量 和 类 型 。 取 决 于 体系 中 所 含 的 途径 个 数 和 所 做 的 测量 个 数 ， 可 将 所 研究 

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的 系统 分 为 正定 、 超 定 和 未 定 系统 ， 每 种 情况 具有 不 同 的 分 析 类 型 。 在 确定 胞 内 通 量 的 方法 
中 ， 胞 外 的 测量 值 是 主要 的 输入 量 ， 见 第 8 章 。 很 明显 ， 仅 仅 通过 胞 外 的 方法 确定 通 量 的 解 
析 是 很 有 限 的 ， 附 加 通 量 和 《或 ) 通 量 分 配 比 可 通过 引入 更 多 的 测量 而 得 到 ， 尤 其 是 通过 使 
用 同位 素 标记 来 获得 。 在 第 9 章 中 列举 了 一 些 实例 ， 用 以 说 明 在 测定 通 量 过 程 中 如 何 使 用 物 
质 平衡 、 放 射 性 标记 、 光 谱 学 方法 以 及 气相 色谱 -质谱 (GC-MS) 等 测量 方法 。 在 第 10 章 
中 通过 对 两 个 具体 实例 的 详细 研究 ， 完 成 了 代谢 通 量 分 析 的 主题 。 这 些 实例 研究 来 自 于 作者 
以 谷 氨 酸 产生 菌 生产 氨基 酸 和 哺乳 动物 细胞 培养 的 一 些 经 验 。 

在 敏感 性 分 析 的 框架 中 ， 可 以 很 好 地 进行 通 量 控制 分 析 ， 这 种 敏感 性 分 析 用 来 定量 描述 
在 每 一 个 途径 上 通 量 控制 的 程度 。 代 谢 控制 分 析 (MCA) 提供 了 一 些 方法 ， 用 于 描述 由 单 
个 酶 或 影响 酶 活性 的 因素 所 施加 的 〈 酶 ) 局 部 控制 和 (系统 ) 全 局 控制 的 程度 。 在 MCA 的 
框架 中 ， 有 可 能 将 局 部 的 酶 反应 动力 学 和 整个 途径 的 通 量 控制 联系 起 来 ， 这 样 ， 就 可 以 根据 
组 成 的 各 个 单个 反应 的 动力 学 和 调节 特性 ， 重 新 构建 起 代谢 网 络 的 系统 功能 。 第 11 BERL 
了 MCA 的 基本 概念 以 及 线性 途径 和 分 支 途径 中 MCA 的 全 面 描述 ， 其 中 ， 许 多 讨论 是 围绕 
着 运用 通 量 控制 系数 作为 通 量 或 代谢 物 控 制 的 度量 标准 。 取 决 于 可 利用 的 信息 量 ， 可 以 选择 
严格 的 定量 的 MCA 方法 ， 或 第 5 章 中 更 加 定性 地 估计 代谢 物 或 节点 的 刚性 。 第 11 章 以 介 
绍 大 扰动 的 理论 作为 结束 ， 这 是 MCA 的 重要 扩展 ， 它 有 助 于 从 实际 的 大 扰动 实验 中 测定 通 
量 控制 系数 ， 而 不 是 像 其 数学 定义 所 表达 的 那样 ， 根据 无 限 小 的 扰动 实验 来 计算 这 些 系数 。 

在 复杂 的 代谢 网 络 中 ， 应 用 MCA 的 一 个 重要 的 限制 就 是 这 样 的 系统 中 含有 大 量 的 反 
应 。 作 为 从 上 至 下 方法 的 一 部 分 ， 第 12 章 介 绍 了 反应 分 组 法 及 其 分 组 规则 ， 以 便 得 到 可 靠 
的 组 控制 系数 的 估计 。 在 这 一 章 中 定义 了 组 控制 系数 和 组 弹性 系数 ， 为 复杂 反应 网 络 的 系统 
解剖 和 分 析 提 供 了 标准 。 通 过 使 用 一 个 代谢 网 络 的 蔡 代 模型 来 模拟 实验 ， 使 这 些 思 想得到 进 
一 步 发 展 并 作 举 例 说 明 。 使 用 替代 细胞 模型 是 一 种 很 有 用 的 方法 ， 因 为 它 允 许 我 们 绕 开 在 通 
量 优化 策略 导出 中 所 需 的 耗 时 且 晶 贵 的 实验 。 这 一 章 介 绍 了 系统 地 使 用 反应 分 组 规则 来 识别 
代谢 网 络 中 的 关键 分 支点 。 对 分 支点 处 的 反应 进行 分 组 ， 以 及 相应 组 控制 系数 的 确定 ， 为 每 
个 反应 组 对 所 关心 的 通 量 或 代谢 物 的 控制 程度 提供 了 度量 标准 。 这 种 方法 可 以 在 复杂 网 络 中 
将 通 量 控制 进行 定位 。 第 13 章 介 绍 了 利用 这 些 结 果 进 行 定向 通 量 扩 增 的 策略 。 甚 目标 是 通 
过 所 选 反 应 的 协同 放大 而 使 网 络 的 通 量 增加 ， 而 不 是 常用 的 单个 反应 策略 。 需 要 指出 ， 第 
12 章 和 第 13 章 介绍 的 方法 完全 是 以 组 通 量 测量 和 大 扰动 理论 为 基础 的 ， 其 中 包括 一 些 假 
定 。 因 此 确保 满足 这 些 假 设 是 很 重要 的 ， 为 此 目的 第 13 章 发 展 并 介绍 了 一 些 内 部 的 检测 
方法 。 

这 本 书 以 第 14 章 作为 结尾 ， 其 中 讨论 了 几 个 关于 细胞 途径 热力 学 的 重要 概念 。 首 先 叙 
述 了 与 生化 反应 相关 的 一 些 热力 学 原理 ， 然 后 将 基于 单个 反应 的 标准 吉 布 斯 (《Gibbs) 自由 
能 变化 〈 包 括 数值 及 正 负 号 ) 的 热力 学 可 行 性 概念 扩展 到 反应 途径 。 结 果 表 明 ， 标 准 吉 布 斯 
自由 能 变化 的 正 值 程度 通过 代谢 物 浓 度 的 差异 来 克服 的 方法 有 局 限 性 。 当 具有 正 AG 的 反 
应 数量 增加 时 ， 需 要 抵消 这 些 大 的 正 值 AG" 所 需 的 所 有 代谢 物 浓 度 的 差 也 要 增加 。 在 一 个 
代谢 途径 中 ， 如 果 限 制 其 所 允许 的 最 小 浓度 ， 那 么 反应 步骤 或 一 系列 反应 步骤 可 以 看 做 在 热 
力学 上 是 不 可 行 的 ， 这 样 就 在 代谢 途径 中 建立 了 局 部 的 或 更 加 分 散 的 热力 学 瓶颈 。 尽 管 热力 
学 瓶颈 不 一 定 要 与 动力 学 限制 条 件 相 关 ， 但 是 有 可 能 从 热力 学 分 析 中 获得 一 些 关 于 动力 学 撼 
颈 的 信息 。 通 过 使 用 这 一 章 所 述 的 热力 学 和 不 可 逆 热 力学 概念 ， 可 以 达到 上 述 目的 。 

10 


参考 文 献 


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genes from the Klebsiella pneumoniae dha regulon. Applied and Environmental Microbiology. 57, 3541-3546. 


11 


第 2 章 细胞 代谢 综述 


代谢 途径 化 学 计量 学 的 确立 是 细胞 代谢 定量 处 理 的 基础 ， 这 需要 懂得 一 些 基本 的 生物 化 
学 过 程 以 及 活 细胞 体内 通常 存在 的 不 同 代 谢 途 径 方面 的 知识 。 这 一 章 我 们 将 回顾 活 细胞 的 基 
本 代谢 功能 。 主 要 集中 于 细菌 和 真菌 的 代谢 ， 也 包括 高 等 真 核 生 物 生 物化 学 的 一 些 方面 。 为 
了 更 全 面 地 讨论 一 般 的 生化 概念 和 代谢 过 程 ， 读 者 可 参考 一 些 优 秀 的 生物 化 学 书籍 [如 
Zubay (1988), Stryer (1995) ， 或 Voet and Voet (1995)]。 本 章 的 目的 不 是 取代 生物 化 
学 ， 而 是 通过 将 生物 化 学 概念 与 细胞 代谢 的 总 体 框 架 进 行 综合 处 理 ， 对 通常 的 生物 化 学 课程 
进行 补充 。 从 这 一 方面 来 讲 ， 这 一 章 尽 管 自 成 一 体 ， 但 其 内 容 紧 凑 ， 对 即使 具有 较 少 生化 背 
景 〈 例 如 只 有 大 学 初级 生物 化 学 课 水 平 ) 的 读者 也 能 很 好 地 读 懂 它 。 


2.1 细胞 代谢 概述 


活 细胞 体内 含有 大 量 不 同 的 化 合 物 和 代谢 物 ， 其 中 水 是 含量 最 多 的 组 分 ， 约 占 细胞 物质 
总 量 的 70% 。 细 胞 质量 的 其 余部 分 ， 通 常 指 干 细胞 重生 物质 ， 主 要 包括 大 分 子 DNA， 核 糖 
核酸 (RNA)， 蛋 白质 ， 脂 类 以 及 碳水 化 合 物 〈 见 表 2.1)。 这 些 大 分 子 合成 和 组 织 成 一 个 功 
能 细胞 是 通过 几 个 独立 反应 步骤 而 进行 的 。 合 成 这 些 大 分 子 物 质 的 前 体 物 来 自 一 个 数量 不 多 
但 被 快速 利用 的 低 分 子 量 前 体 库 ， 这 些 低 分 子 量化 合 物 是 由 葡萄 糖 或 其 它 碳 源 最 终生 成 的 代 
谢 物 通过 生化 合成 而 不 断 补充 的 《 见 图 2.1)。 根 据 其 在 整个 细胞 合成 过 程 中 的 主要 功能 ， 
这 些 不 同 的 反应 可 以 分 为 如 下 几 类 〈Neidhardt et al, 1990). 

e@ 组 装 反应 ”包括 如 下 过 程 : 大 分 子 物 质 的 化 学 修饰 ， 进 而 运输 到 细胞 中 预先 指定 的 位 
置 ， 最 后 缔 合 形成 细胞 组 织 ， 如 细胞 壁 、 细 胞 膜 和 细胞 核 等 。 这 些 反 应 在 本 书 中 将 不 再 进 一 
步 介绍 。 

e 聚合 反应 ”活化 的 分 子 定向 有 序 地 键 合 成 长 的 〈 分 支 或 不 分 支 ) 聚合 链 。 相 当 数 量 的 
结构 单元 通过 这 些 反 应 形成 大 分 子 物质 。 

© 生物 合成 反应 ， 通 过 这 类 反应 生成 聚合 反应 中 所 需 的 结构 单元 ， 同 时 也 生成 辅酶 和 相 
关 的 代谢 因子 ， 包 括 信号 分 子 。 有 一 些 生 物 合成 反应 ， 发 生 在 称 为 生物 合成 途径 的 功能 单元 
中 ， 每 一 个 反应 包括 一 个 或 一 系列 顺序 的 反应 ， 最 终生 成 一 个 或 多 个 结构 单元 。 这 些 途 径 容 
易 识 别 ， 并 被 整体 控制 。 在 一 些 情 况 下 ， 这 些 反 应 由 酶 来 催化 ， 这 些 酶 是 由 形成 一 个 操纵 子 

的 一 组 相 邻 基因 转录 来 的 mRNA 制 得 的 〈 见 第 5 章 )。 所 有 的 生物 合成 途径 都 起 始 于 12 种 
前 体 代 谢 物 之 一 。 一 些 途 径直 接 从 这 种 前 体 代谢 物 开始 ， 另 一 些 途径 间接 地 从 一 个 中 间 物 的 
分 支 或 一 个 相关 途径 的 末端 产物 开始 。 

@ 供 能 反应 用 以 生成 生物 合成 所 需 的 12 种 前 体 代谢 物 》 同 时 ， 还 以 ATP 的 形式 产生 
吉 布 斯 自由 能 用 于 生物 合成 反应 、 聚 合 反 应 和 装配 反应 中 。 最 后 ， 供 能 反应 还 生成 生物 合成 
反应 所 需 的 还 原 力 。 供 能 反应 包括 称 作 分 解 代 谢 途 径 《〈 降 解 底 物 及 氧化 底 物 ) 的 所 有 生化 
途径 。 

不 同 的 生化 途径 借助 于 参与 多 个 途径 的 代谢 物 而 联系 起 来 ， 这 些 途 径 通过 不 同 分 支 将 一 

一 个 反应 顺序 连接 了 起 来 。 途 径 之 间 另 一 种 层次 的 整合 是 通过 辅助 因子 分 子 来 协调 的 。 

12 


表 2.1 大 肠 杆菌 细胞 的 一 般 大 分 子平 均 组 成 


占 总 细胞 干 重 的 百分率 “| 分 子 的 不 同 种 类 | 。 大 分 子 | 占 总 细胞 干 重 的 百分率 “| 分 子 的 不 同 种 类 
4 


\ 同 
1050 
3 
60 
400 
1 


合成 代谢 分 解 代谢 


图 2.1 利用 糖 类 进行 细胞 合成 的 总 框架 

糖 类 被 运输 进入 细胞 ， 首 先 被 磷酸 化 然后 进入 磷酸 已 糖 库 。 磷 酸化 可 独立 于 运输 过 程 或 与 之 相 耦合 。 磷 酸 已 粮 

进入 糖 酵 解 反应 并 生成 丙酮 酸 ， 或 被 用 于 合成 一 些 碳水 化 合 物 。 丙 酮 酸 可 通过 呼吸 循环 氧化 成 二 氧化 碳 ， 还 可 

以 通过 发 酵 途径 转化 成 代谢 产物 。 对 于 好 氧 微生物 ， 在 糖 酵 解 和 TCA 循环 中 生成 的 NADH 形式 的 还 原 力 可 通 

过 氧化 磷酸 化 被 氧化 成 NAD+ ， 而 对 于 厌 氧 微生物 ，NAD+ 是 通过 发 酵 途径 生成 的 。 糖 酵 解 途径 和 TCA 循环 

中 的 一 些 中 间 代谢 物 可 作为 前 体 代谢 物 用 于 生物 合成 结构 单元 。 这 些 结构 单元 被 聚合 成 大 分 子 物质 ， 并 最 终 被 

组 装 成 不 同 的 细胞 结构 

这 些 辅助 因子 包括 总 的 流通 代谢 物 ATP，NADH 和 NADPH 等 ， 其 对 许多 反应 是 必 不 可 少 
的 。 由 于 这 些 辅助 因子 在 供 能 生物 合成 反应 中 的 中 心 作 用 ， 通 过 它们 连续 地 生成 ， 并 且 利 用 
这 些 辅助 因子 把 同一 途径 中 和 不 同 途 径 中 的 各 个 反应 连接 起 来 ， 如 图 2.1 所 示 。 

生化 途径 可 以 用 化 学 方法 通过 在 一 长 串 反 应 中 进行 的 代谢 物 的 连续 转化 来 组 织 ， 也 可 用 
物理 方法 通过 在 细胞 的 不 同 部 位 和 不 同 结构 中 起 作用 来 组 织 。 这 种 物理 上 的 组 织 结构 在 真 核 
生物 中 最 明显 ， 其 中 膜 结合 的 结构 为 系列 或 单个 生物 化 学 反应 的 定位 提供 了 明显 的 证 据 。 因 
ik, DNA 和 RNA 的 合成 在 细胞 核 中 进行 ， 许 多 供 能 反应 和 生物 合成 反应 在 毕 中 进行 。 
这 种 组 织 结构 也 许 对 细胞 的 整体 代谢 具有 重要 的 影响 ， 但 由 于 其 复杂 性 ， 而 且 缺 乏 有 关 局 部 
浓度 变化 的 详细 信息 ， 我 们 将 不 再 进一步 讨论 代谢 途径 组 织 结构 方 面 的 内 容 。 

除了 代谢 反应 和 途径 的 化 学 和 物理 (结构 ) 的 组 织 外 ， 另 二 个 非常 有 用 的 分 类 依据 是 以 
特征 时 间 来 表示 其 动力 学 。 细 胞 代谢 中 许多 不 同 的 反应 都 影响 着 各 种 途径 和 整个 生长 过 程 的 
动力 学 。 由 于 不 同 反 应 在 不 同 的 时 间 尺 度 上 进行 ， 因 此 ， 当 考虑 一 个 反应 途径 时 ， 只 需 包 含 
那些 在 时 间 尺 度 上 有 可 比 性 的 反应 。 可 以 假设 较 快 反应 在 慢 速 反应 的 上 游 处 于 平衡 ， 或 在 一 
: 13 


个 慢 速 反 应 的 下 游 使 代谢 物 处 于 稳 态 。 同 时 ， 更 慢 的 反应 可 被 忽略 ， 因 为 这 些 反 应 在 完全 不 
同 的 时 间 斥 度 内 进行 ， 同 时 在 感 兴趣 的 时 间 框 架 内 其 影响 极 小 。 在 一 个 给 定时 间 框 架 内 的 反 
应 的 相关 性 通常 通过 比较 各 个 反应 的 松弛 时 间 来 评价 ， 松 弛 时 间 被 定义 为 近似 一 级 反应 过 程 
的 特征 时 间 〈 见 方 框 2.1)。 图 2.2 对 活 细胞 内 进行 的 不 同 过 程 的 松弛 时 间 进 行 了 比较 。 当 
某 过 程 的 松弛 时 间 比 目的 系统 的 松弛 时 间 长 很 多 时 ， 那 么 通常 认为 这 个 过 程 是 冻结 的 。 例 
如 ， 突 变 过 程 一 般 慢 于 细胞 生长 ， 因 此 在 研究 细胞 生长 时 ， 可 以 忽略 突变 过 程 。 相 反 ， 当 某 
一 过 程 的 松弛 时 间 远 小 于 系统 的 松弛 时 间 时 ， 通 常 认为 这 个 系统 正 处 于 拟 平衡 。 因 此 ， 酶 催 
化 反应 只 有 毫秒 级 的 松弛 时 间 ， 与 细胞 生长 的 松弛 时 间 〈 通 常 为 小 时 级 ) 相 比 酶 反应 速率 非 
常 快 。 因 此 ， 酶 反应 能 对 新 的 环境 条 件 迅 速 响应 ， 反 应 速率 和 相关 的 代谢 物 可 达 拟 稳 态 。 如 
果 一 个 过 程 的 松弛 时 间 是 目的 系统 松弛 时 间 的 10 倍 ， 那 么 这 个 过 程 可 认为 是 冻结 的 ， 如 果 
一 个 过 程 的 松弛 时 间 是 目的 系统 松弛 时 间 的 1/3， 那 么 该 过 程 可 认为 处 于 拟 稳 态 。 这 就 导出 
如 下 重要 结论 : 通过 忽略 在 目的 系统 时 间 斥 度 范 围 之 外 进行 着 的 反应 和 途径 可 显著 简化 代谢 
过 程 。 


10 10 1. ki 10 10 10 
eg 
物质 反应 mRNA 控制 突变 
别 构 控 制 酶 诱导 
混合 梯度 
分 批 、 流 加 -分 批 或 连续 培养 转变 的 动力 学 
细胞 生长 


图 2.2 不 同 细胞 过 程 的 松弛 时 间 与 生物 反应 器 操作 松弛 时 间 的 比较 


方 框 2.1 松弛 时 间 
对 于 反应 物 为 一 级 反应 速率 的 化 学 反应 

r=kc (1) 
松弛 时 间 定 义 为 反应 速率 常数 的 倒数 

r=1 人 (2) 
松弛 时 间 等 于 过 程 的 特征 时 间 。 如 果 对 一 个 处 于 稳 态 的 体系 进行 扰动 ， 那 么 松弛 时 间 就 
是 体系 从 原来 的 稳 态 达到 新 的 稳 态 所 需 时 间 的 0.63 倍 [(1-1Me)=0.63]。 如 果 过 程 不 是 
一 级 的 ， 那 么 松弛 时 间 的 定义 被 扩展 为 


tr=c/ri(c) (3) 
表示 如 果 该 过 程 是 一 级 过 程 时 应 有 的 特征 时 间 。 

对 于 非 一 级 过 程 ， 很 明显 松弛 时 间 是 反应 物 浓度 的 图 数 〈 更 一 般 地 说 ， 是 所 有 状态 
变量 的 函数 )。 因 此 ， 松 弛 时 间 不 是 常数 。 但 实际 上 代谢 物 浓 度 的 变化 一 般 都 限制 在 一 定 
范围 内 ， 这 也 就 将 实际 的 松弛 时 间 限 定 在 一 个 合理 的 时 间 范 围 内 。 

Xt F— 7 FD 


ky 
<—B 


k-\ 


通过 物料 平衡 ， 其 动力 学 可 描述 为 
SA = -ai(cA)+o-i(ca): cA+cB 三 定 值 (5) 
通过 围绕 体系 平衡 进行 线性 化 处 理 ， 我 们 可 以 写 出 A 物质 浓度 与 其 平衡 浓度 cA 0 的 偏 


差 ， 即 cA=cA 一 cA,0o 


da’ (avi avs 
dt dca dcB 


式 中 特征 时 间 * 由 下 式 表示 


Jox>oa(t)=oa(to)exp( -*—2) (6) 


r= (1-2-1) (7) 


dca dcg 
或 对 一 级 动力 学 (ul=&icA 和 v2=k-\cp) 
c=(ki+k-1)7! (8) 
类 似 地 ， 对 于 双 分 子 反应 有 


ky 
Aire hie ste 
其 特征 时 间 为 


t=[ki(caot cpio) + k-1€cc,0+ cp,o) ] 1: (10) 


这 里 ， 下 标 中 的 0 指 平衡 浓度 。 


2.2 运输 过 程 

不 同 种 类 的 物质 穿越 原生 质 膜 运输 有 三 种 不 同 的 机 制 ; (1) 自由 扩散 ; (2) 促进 扩散 ; 
(3) 主动 运输 。 前 两 种 机 制 是 被 动 的 过 程 ， 原 则 上 不 需要 吉 布 斯 自由 能 的 供应 。 在 自由 扩散 
和 促进 扩散 中 ， 物 质 沿 着 浓度 梯度 被 运输 。 这 两 种 运输 机 制 的 不 同 之 处 在 于 促进 扩散 是 需要 
以 载体 为 中 介 的 ， 也 就 是 说 ， 在 物质 运输 过 程 中 需要 特定 的 载体 或 跨 膜 蛋 白 ， 而 自由 扩散 是 
分 子 运输 ， 在 化 学 势能 差 的 驱动 下 进行 。 第 三 种 运输 机 制 即 主动 运输 ， 它 允许 物质 送 着 浓度 
梯度 进行 运输 ， 但 需要 吉 布 斯 自由 能 的 参与 。 主 动 运输 在 需要 特定 的 膜 定位 蛋白 或 渗透 酶 调 
节 方 面 与 促进 扩散 相似 。 
2.2.1 被 动 运输 

一 个 化 合 物 以 自由 扩散 的 方式 通过 脂 膜 包括 三 个 步骤 : (1) 化 合 物 从 胞 外 培养 基 到 膜 相 
的 传递 ; (2) 化 合 物 在 脂 双 层 中 扩散 ; (3) 化 合 物 从 膜 相 到 细胞 质 的 传递 。 通 常 细胞 质 和 胞 
外 培养 基 具 有 相似 的 物理 化 学 特性 ， 因 此 第 (1) 步 和 第 (3) 步 十 分 类 似 。 一 个 化 合 物 在 
两 相 之 间 的 传递 〈 即 从 胞 外 培养 基 到 膜 或 从 膜 到 细胞 质 ) ， 与 扩散 过 程 相 比 一 般 是 很 快 的 ， 
因此 可 假定 处 于 平衡 状态 。 因 此 ， 所 运输 的 化 合 物 在 脂 层 相 际 间 的 浓度 应 等 于 其 在 水 相 中 的 
浓度 与 分 配 系数 ,的 乘积 (分配 系 数 被 定义 为 化 合 物 在 脂 双 层 中 的 溶解 度 与 在 水 中 的 溶 
解 度 之 比 )。 分 子 扩散 的 质量 通 量 遵从 Fick 第 一 定律 ， 所 产生 的 扩散 通 量 (mol .m-2) 可 
用 下 式 表示 


Doar ar 
rran=— 7 (Ca Ce) =P(cq~ ee) (2.1) 


KP, Dinemt CE WEAR PT BAK (ms 1); danemn 为 膜 的 厚度 (m); c。 和 
15 


Co 分 别 表 示 该 化 合 物 在 非 生物 相 中 和 细胞 质 中 的 浓度 。 方 程式 (2.1) 中 的 三 个 参数 Don， 
dumem 和 天 pa 通常 可 合并 为 一 个 参数 [(Dnem 开 par)/duem]， 称 为 渗透 系数 P (Stein, 1990). 
在 式 〈2.1) 中 ， 质 量 通 量 的 定义 基于 细胞 表面 积 ， 但 通过 乘 以 细胞 的 比 表 面积 a [m= 
g !( 干 重 )] 就 可 以 将 其 转化 成 每 克 干 重 的 质量 通 量 。 

通过 被 动 扩 散 所 运输 的 化 合 物 有 : 二 氧化 碳 、 氧 、 氨 、 脂 肪 酸 和 一 些 醇 类 。 在 解 离 状态 
时 ， 有 机 酸 在 脂 膜 中 实际 上 是 不 溶 的 ， 但 许多 未 解 离 的 有 机 酸 却 是 非常 可 溶解 的 。 未 解 离 的 
乳酸 和 乙酸 的 渗透 系数 分 别 为 5.0x10 "m's 和 6.9x10-m's-!， 这 就 意味 着 这 些 化 合 物 
穿越 原生 质 膜 时 扩散 得 很 迅速 。 由 于 主要 是 未 解 离 形式 可 以 自由 扩散 ， 因 此 像 乳 酸 和 乙酸 这 样 
的 化 合 物 ， 总 的 运输 情况 对 其 解 离 程度 进而 对 细胞 质 和 胞 外 培养 基 两 者 的 pH 都 很 敏感 。 对 于 
许多 生物 体 ， 穿 越 细胞 质 膜 有 一 个 pH 梯度 (细胞 内 的 pH 高 )， 这 就 会 形成 质子 进入 细胞 的 疤 
流入 。 为 了 保持 胞 内 低 的 质子 浓度 ， 必 须 在 消耗 AITP( 腺 苷 三 磷酸 ) 的 条 件 下 ， 由 质 膜 ATP 酯 
酶 将 这 些 质 子 泵 出 细胞 外 。 因 此 ， 有 机 酸 的 存在 会 导致 AIP 的 净 消 耗 ( 见 例 2.1)。 


【 例 2.1】 有 机 酸 引起 的 能 量 产生 与 消耗 的 解 耦 

Verduynet (1992) 的 一 个 研究 中 列举 了 活 细胞 内 有 机 酸 对 ATP 消耗 的 影响 。 通 过 
分 析 葵 甲酸 对 酿酒 酵母 呼吸 作用 的 影响 ， 他 们 发 现 菌 体 量 对 简 萄 糖 的 得 率 随 酸 浓度 的 增加 而 
下 降 ， 同 时 葡萄 糖 和 氧气 的 比 吸收 速率 增加 。 因 此 ， 对 菌 体 合成 来 说 ， 葡 萄 糖 并 没有 被 有 效 
利用 ， 这 种 结果 可 解释 为 : 由 于 茶 甲 酸 的 质子 解 耦 作用 导致 了 ATP 的 消耗 。 在 另 一 个 研究 
中 ，Schulze (1995) 分 析 了 酿酒 酵母 厌 氧 培养 中 葵 甲 酸 对 菌 体 合成 时 ATP 消耗 的 影响 ， 发 
现 菌 体 合 成 时 消耗 的 ATP 随 着 葵 甲 酸 浓度 的 增加 而 呈 线 性 增加 ， 这 是 葵 甲 酸 质子 解 耦 作用 
的 又 一 结果 。Henriksen 等 (1998) 推导 出 一 系列 方程 ， 以 定量 表示 由 于 有 机 酸 质 子 梯度 的 
解 看 作用 所 引起 的 ATP 消耗 情况 。 其 研究 的 目的 是 定量 表示 葵 氧 基 乙 酸 (青霉素 V 生产 的 
前 体 物 ) 对 产 黄 青 霉 菌 中 质子 梯度 的 影响 。 苯 氧 基 乙 酸 的 解 离 和 未 解 离 形 式 均 可 以 以 被 动 扩 
散 的 方式 通过 细胞 膜 ， 但 未 解 离 的 酸 有 更 大 的 溶解 度 ， 也 就 是 说 具有 较 大 的 分 配 系数 ， 因 此 
运输 得 更 快 。 为 了 描述 以 这 两 种 形式 通过 细胞 膜 的 质量 通 量 ，Henriksen (1998) 应 用 式 
(2.1) 得 出 下 式 


1) (1) 


AP, Fini 表示 酸 的 解 离 形 式 或 未 解 离 形 式 。 产 黄 青 霉 细胞 的 比 表面 积 为 2.$m2.g 1! 
( 干 重 ) ， 葵 氧 基 乙 酸 的 未 解 离 形式 和 解 离 形 式 的 渗透 系数 被 求 出 ， 分 别 为 3.2 x 10 ”4 
m's- 1 和 2.6X10-10m.s-L (Nielsen, 1997). 

由 于 酸 的 未 解 离 形 式 和 解 离 形 式 在 细胞 质 膜 两 边 处 于 平衡 状态 (HA =—=H* +A7) 且 
平衡 常数 为 玉 。， 所 以 两 种 形式 的 酸 浓 度 和 总 酸 浓度 的 关系 可 用 下 式 表示 


SS 
人 ai ~ 1+ 10QPH- pK, (2) 


式 中 ， 葵 氧 基 乙 酸 的 pK。. 值 为 3.1。 在 拟 稳 态 条 件 下 ， 未 解 离 酸 的 净 输 入 通 量 
7rundi 等 于 解 离 酸 的 净 输 出 通 量 CF goin) 
Y undiss,in 一 diss ,out 
或 P et cell ( Cundiss,a Pundate) = P diss cell ( Cdiss,c 一 Cag.) (3) 
16 


式 中 ， 下 标 a Alc 分 别 表示 细胞 膜 非 生物 相 一 边 和 细胞 质 一 边 。 将 式 (2) 中 膜 两 侧 的 
总 酸 浓度 用 膜 两 侧 的 未 解 离 形式 和 解 离 形式 的 酸 浓 度 代 蔡 并 重新 排列 ， 我 们 得 到 膜 两 侧 酸 的 
总 浓度 之 比 ， 如 下 式 所 示 


Ae ea 10pPHe PK, 1+ 10PH.~ PK, 
Ca,tot P gigs 1 OPH PKs ty ide 


由 于 未 解 离 形式 酸 的 渗透 系数 的 数量 级 远 远 大 于 解 离 形式 ， 因 此 ， 式 (4) 可 简化 为 


Co,tot = 1 下 10PH.— PK, 
Ca,tot 1 T 10°H.~ PK, 


因为， 在 青霉素 生产 中 胞 内 的 pH 通常 高 于 培养 基 中 代表 性 的 pPH， 所 以 式 〈$) 表明 细胞 内 
的 总 酸 浓度 比 细 胞 外 的 高 。 利 用 这 个 方程 ，Henriksen 等 (1998) 计算 了 当 胞 内 pH 值 为 
7.2 时， 不 同胞 外 pH 条 件 下 的 酸 的 浓度 之 比 。 当 胞 外 pH 值 为 6.5 时 ， 酸 的 积累 量 低 (A 
2.3 倍 )， 而 当 胞 外 pH 值 为 5.0 时 ， 酸 的 积累 量 高 GA 100 倍 )。 

在 给 定 胞 外 总 酸 浓度 的 条 件 下 ， 可 利用 式 〈2) 计算 出 膜 两 侧 两 种 形式 酸 的 浓度 ， 进 而 
可 利用 式 (1) 计算 出 通过 细胞 膜 的 质量 通 量 。 由 于 解 离 形式 酸 的 净 输 出 通 量 等 于 未 解 离 形 
式 酸 的 净 输 入 通 量 ， 因 此 酸 运输 的 结果 是 质子 的 净 输 入 ， 而 为 了 保持 恒定 的 胞 内 pH, x 
质子 必须 由 细胞 膜 ATP 酯 酶 重新 输出 。 如 果 假 定 每 向 胞 外 运输 一 个 质子 需要 通过 ATP BB 
酶 的 反应 而 消耗 一 个 ATP， 那 么 当 胞 外 pH (HAH 6.5, AAA pH 值 为 7.2 时 ，Henriksen 等 
(1997) 计算 出 这 种 无 效 循环 所 消耗 的 ATP 达到 了 0.1S$mmol'g !( 干 重 )"h- 。 与 其 它 非 生 
长 相关 联 但 也 消耗 ATP 的 过 程 相 比 ， 这 个 值 是 较 低 的 〈 见 2.6 节 )。 然 而 ， 当 胞 外 pH 值 为 
5.0 ( 胞 内 pH 值 仍 为 7.2) 时 ， 这 个 值 变 为 约 7mmol'g-!( 干 重 )， 这 是 一 种 值得 注意 的 
ATP 消耗 〈( 见 2.6)。 从 中 可 以 看 出 为 了 生物 合成 的 需要 ， 维 持 穿 越 细胞 质 膜 的 酸 浓度 梯度 
是 如 何 有 助 于 ATP 生成 与 消耗 精确 的 解 耦 。 


(5) 


2.2.2 促进 扩散 

许多 化 合 物 以 极 低 的 速率 通过 自由 扩散 方式 运输 ， 因 为 它们 在 质 膜 中 的 溶解 度 很 低 。 这 
类 物质 的 运输 可 由 于 灸 艇 在 细胞 质 膜 中 的 载体 中 介 物 分 子 而 显著 增强 。 这 种 运输 是 被 动 发 生 
的 ， 不 需要 能 量 消耗 ， 称 为 促进 扩散 。 在 真 核 生 物 中 许多 物质 的 运输 采用 这 种 方式 ， 原 核 生 
物 中 促进 扩散 仅 有 的 几 例 是 甘油 在 大 肠 杆菌 中 的 运输 以 及 葡萄 糖 在 Zymomonas mobilis 和 
Streptococcus bovis 中 的 运输 (Moat 和 Foster，1995)。 与 自由 扩散 一 样 ， 促 进 扩 散 只 能 顺 
着 浓度 梯度 方向 进行 。 然 而 ， 只 有 存在 着 游离 载体 分 子 时 ， 这 个 化 合 物 才 能 进入 膜 相 ， 其 运 
输 的 速率 遵从 饱和 型 动力 学 〈 如 同 酶 催化 反应 的 米 氏 动力 学 ) 〈 见 例 2.2)。 因 此 ， 在 低 底 物 
浓度 时 ,扩散 速率 为 一 级 ; 在 高 底 物 浓度 时 ， 为 零 级 。 

在 真菌 中 ， 许 多 糖 类 物质 通过 促进 扩散 进行 运输 。 据 报道 (Bisson 和 Fraenkel, 1983; 
Bisson 等 ，1993) ， 在 酿酒 酵母 中 ， 葡 萄 糖 通过 促进 扩散 进行 运输 ， 而 且 存 在 着 一 个 葡萄 糖 
阻 遏 型 的 高 亲 和 人 性 体系 (Ky 为 1Immol'L -) 和 一 个 组 成 型 的 低 亲 和 性 体系 (天 。 为 
20mmol.L-1)。 最 近 ， 通 过 克隆 编码 己 糖 转运 蛋白 的 全 部 基因 ， 进 一 步 证 明了 酿酒 酵母 中 
葡萄 糖 运输 的 复杂 性 [UL Kruckeberg 的 综述 (1996)]。 对 于 丝 状 真菌 ， 已 经 报道 了 不 同 的 
促进 糖 运输 的 转运 蛋白 ， 其 K,, 范围 为 8 一 20mmol'L L (Neilsen, 1997). 

17 


($i 2.2) RitizmMmAmAyS 

在 许多 生物 体系 中 ， 已 经 发 现 化 合 物 的 促进 扩散 速率 遵从 米 氏 饱和 型 动力 学 ， 这 样 的 速 
率 表 达 式 可 由 如 下 机 理 推出 。 首 先 ， 一 个 底 物 分 子 S 与 一 个 载体 分 子 C 结合 形成 复合 物 
《CS)， 并 自由 扩散 通过 细胞 膜 。 稳 态 条 件 需 要 那些 反复 将 底 物 分 子 运 进 细胞 的 载体 分 子 ， 
从 膜 的 胞 内 一 侧重 新 扩散 至 胞 外 非 生 物 相 。 该 机 理 涉 及 的 底 物 载体 复合 物 浓 度 分 布 、 游 离 载 


体 以 及 所 假定 的 平衡 和 运输 过 程 如 下 。 
细胞 膜 


(CS) 
Ss C: 载 体 


非 生物 相 细胞 质 一 侧 S: 基 质 
CS: REREAD 


a c 


Cre %, (CS) eT ec +S, 
总 的 运输 速率 可 以 以 底 物 载体 复合 物 或 自由 载体 膜 浓 度 表 示 如 下 


D compl i 
T transport 一 Bh (Ca i, Cosa] * ec a oe (1) 
mem mem 


式 中 ， 带 有 下 标的 参数 Denpex 和 Desnie 分 别 为 底 物 载体 复合 物 和 游离 载体 在 膜 中 的 扩 
BAR; dunem 为 膜 的 厚度 ; co 和 ces 分 别 为 载体 和 复合 物 的 膜 浓 度 。 如 上 述 所 示 ， 假 定 复 合 
物 的 形成 与 解 离 反应 处 于 平衡 ， 则 消去 复合 物 的 浓度 可 得 

D ecenplex lS Cea 3,0 ee cette ce (2) 
总 的 载体 守恒 方程 是 


=| ae 
Coat C¢,c HK poate ae Co,c&s,c © total (3) 


结合 式 (2) AX (3) ， 可 以 解 出 游离 载体 的 浓度 cco, RAK (1) 中 ， 就 可 以 得 
到 运输 速率 。 会 出 现 一 个 有 趣 的 限制 性 情况 : 如 果 胞 内 底 物 浓 度 为 0， 即 c\.=0， 即 一 旦 底 
物 被 运输 进入 细胞 ， 就 被 迅速 代谢 转化 掉 。 在 这 些 条 件 下 ， 膜 的 非 生 物 相 一 边 的 载体 浓度 
如 下 : 
一 于 
Coon = Crotal| 2+ (Fesnsles +1 | Kc. | (4) 


carrier 


如 果 我 们 进一步 假定 载体 和 载体 底 物 复合 物 的 扩散 系数 近似 相等 ， 那 么 将 式 (4) RAK 
(1) ， 就 得 出 运输 速率 
amie SX cee. (5) 
前 面 的 方程 展示 了 相应 于 非 生物 相 中 底 物 浓度 的 饱和 特性 ， 需 指出 的 是 : 前 述 的 运输 机 制 与 
通常 的 Michaelis-Menten (M-M) 酶 催化 反应 机 制 相同 ， 运 输 步骤 作为 整个 过 程 中 的 慢 速 
步骤 代替 了 酶 反应 过 程 中 产物 的 形成 步骤 。 其 结果 是 M-M 方程 中 的 反应 速率 常数 被 扩散 系 
数 与 1/2 载体 总 浓度 的 乘积 取代 ， 这 一 半 正 好 是 运输 过 程 中 在 任何 时 刻 都 可 有 效 利用 的 载体 
量 〈 另 一 半 与 底 物 结合 形成 了 复合 物 )。 
文献 中 已 介绍 了 若干 促进 扩散 的 定性 机 制 。 其 中 一 些 包括 载体 分 子 的 实际 运输 ， 正 如 本 
例 所 描述 的 情况 。 其 它 机 制 描述 了 载体 是 穿越 整个 膜 的 重 白 质 ， 因 此 是 相对 固定 的 。 在 后 一 
18 


”种 情况 下 ， 小 分 子 通过 载体 蛋白 形成 膜 内 通道 进行 运输 。 这 种 运输 机 制 仍然 包括 一 些 前 面 提 
到 过 的 底 物 -载体 蛋白 结合 的 一 些 形式 。 然 而 ， 除 非 包括 一 个 慢 速 步骤 ， 和 否则 不 可 能 得 到 饱 
和 型 动力 学 。 该 慢 速 步骤 在 性 质 上 可 以 是 扩散 步骤 或 是 反应 步骤 ， 其 在 整个 运输 过 程 中 是 一 
个 关键 步骤 。 仅 人 靠 平衡 过 程 〈 这 里 ， 载 体 蛋白 分 子 结合 底 物 ， 并 立即 将 其 运送 到 胞 内 处 于 另 
一 平衡 态 的 反应 中 ) 不 足以 描述 实验 上 观察 到 的 饱和 型 运输 速率 方程 。 


2.2.3 主动 运输 

主动 运输 类 似 于 协助 扩散 ， 因 为 其 也 是 通过 称 为 通 透 酶 的 特定 膜 定位 蛋白 来 促进 该 运输 
过 程 。 与 协助 扩散 相反 ， 主 动 运输 可 以 逆 着 浓度 梯度 的 方向 进行 ， 因 此 是 一 个 消耗 自由 能 的 
过 程 。 运 输 过 程 中 需要 的 自由 能 可 由 ATP 中 的 高 能 磷酸 键 提 供 (初级 主动 运输 )。 另 外 ， 
这 个 运输 过 程 可 以 与 另 一 个 顺 着 浓度 梯度 进行 的 运输 过 程 相 耦合 (次 级 主动 运输 ) ， 后 一 过 
程 中 净 生 成 的 自由 能 与 驱动 主动 运输 过 程 中 的 自由 能 消耗 相 平衡 。 最 后 ， 在 一 种 称 为 基 团 转 
位 的 特别 主动 运输 过 程 中 ， 所 运输 的 化 合 物 被 转化 成 为 一 个 衍生 物 (磷酸 化 的 衍生 物 ) ， 这 
种 衍生 物 不 能 反 向 通过 膜 来 运输 。 

一 组 重要 的 初级 主动 运输 体系 是 一 些 ATP 酯 酶 ， 它 涉及 到 需要 消耗 ATP 的 质子 分 泌 。 
一 些 这 样 的 酶 可 在 两 个 方向 上 起 作用 ， 因 而 在 有 质子 输入 时 就 会 生成 ATP， 在 原核 生物 的 
氧化 磷酸 化 过 程 中 这 是 非常 重要 的 组 成 部 分 ( 见 2.3.3 节 )。 还 存在 其 它 的 初级 主动 运输 体 
系 ， 该 体系 包括 特定 的 结合 蛋白 ， 其 结合 要 传递 的 化 合 物 并 将 它 传 递 到 相 容 的 膜 结合 复合 物 
(Moat 和 Foster，1995)。 这 种 传递 触发 ATP 水 解 ， 进 而 导致 膜 小 孔 打 开 使 得 底 物 单 向 扩散 
进 细 胞 质 。 在 大 肠 杆 菌 中 通过 这 些 起 交通 运输 作用 的 ATP 酯 酶 所 运输 的 物质 有 : BAR, 
麦芽 糖 、 阿 拉 伯 糖 和 半 乳 糖 (Moat 和 Foster, 1995). 

在 次 级 主动 运输 过 程 中 ， 化 合 物 的 运 
输 是 顺 着 有 利 的 浓度 梯度 方向 与 另 一 个 化 
合 物 看 联运 输 的 。 如 果 这 两 种 化 合 物 沿 同 oe 
— Pay a dE IS Hw, 7 APIS HT BE AY [al fy 
运输 ， 例 如 质子 同 向 运输 ， 这 是 次 级 主动 
运输 中 最 重要 的 一 种 机 制 。 如 果 化 合 物 洽 ADP 
相反 的 物理 方向 进行 运输 ， 则 称 为 反 辕 运 糖 A ATP 


胞 外 培养 基 


nH™ H* 


输 。 对 于 质子 同 向 运输 ， 输 入 的 质子 必须 
借助 于 ATP 酯 酶 再 运输 出 去 以 维持 胞 内 
的 pH ( 见 图 2.3)。 即 使 质子 同 向 运输 是 
最 普通 的 次 级 主动 运输 ，Na* 、K” 和 
Mg2+ 也 可 以 进行 同 向 运输 或 反 向 运输 。 
在 基 团 转 位 中 ， 运 输 过 程 都 伴随 有 被 
运输 物质 的 进一步 转化 。 基 团 转 位 系统 最 
好 的 例证 是 磷酸 转移 酶 系统 (PTS)， 通 
过 这 个 系统 可 使 某 些 糖 类 物质 运输 进 细 落 
中 。 这 个 系统 相当 复杂 ， 包 括 至 少 有 四 种 
AMEAWBS, KH RAMEN Hew 


酸 基 团 的 磷酸 载体 把 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 (PEP) 上 的 磷酸 基 团 转 移 给 进来 的 糖 〈 见 图 2.4)。 


细胞 质 


图 2.3 糖 类 通过 质子 的 同 向 运输 
特定 的 膜 结合 通 透 酶 将 糖 类 运输 进入 细胞 ， 整 个 过 程 由 产 
个 质子 同时 运输 来 驱动 。 对 于 大 肠 杆菌 〈 王 .co ) PRA 
Ei EM, n=1 (Stein，1990)， 而 且 对 于 大 多 数 其 它 的 
糖 通 透 酶 可 能 也 是 这 样 。 为 了 将 细胞 内 的 pH 维持 在 一 个 
恒定 的 水 平 ， 质 子 必 须 被 运输 出 细胞 。 在 厌 氧 细菌 中 ， 须 
通过 电子 传递 链 实 现 ， 而 在 真菌 中 ， 在 细胞 膜 上 的 腺 苷 三 
磷酸 酯 酶 的 作用 下 通过 消耗 ATP 而 完成 。 对 于 几 种 真 核 
和 微生物， 包括 N.crasa (Perlin et al, 1986) 和 
S .cereuisiae (Malpartida and Serrano，1981)， 细 胞 膜 腺 
苷 三 磷酸 酯 酶 的 H*/ATP 化 学 计量 比 为 1。 在 一 定 的 胞 
外 范围 内 ， 胞 内 通常 相当 稳定 ， 并 通常 高 于 胞 外 的 pH 
(Cartwright et al, 1989) 


19 


这 些 蛋 白 有 两 种 是 可 溶 的 细胞 质 蛋 白 酶 工 和 组 氮 酸 蛋白 (HPr)， 它 们 分 别 由 大 肠 杆菌 中 的 
ptsl Fl ptsH 所 编码 。 这 两 种 蛋白 对 所 有 的 PTS 糖 类 来 说 是 共同 的 ， 因 此 被 称 为 通用 的 
PTS 蛋白 。 相 反 酶 IT 对 糖 是 具有 特异 性 的 ， 它 具有 三 个 结构 域 (A，B，C)， 这 三 个 结构 域 
可 以 结合 成 一 个 单个 膜 结合 蛋白 或 分 裂 成 两 个 或 多 个 蛋白 EIA，EIB 和 EIC。 在 PTS 
系统 中 PEP 的 磷酸 基 团 通过 EI、HPr、EIA 和 EIB 的 磷酸 化 中 间 物 传递 给 进来 的 糖 。 
Ell (CEIC 蛋白 ) 的 C 域 形成 转 位 的 通道 及 至 少 一 部 分 特定 的 糖 结合 位 点 。 基 于 序列 同 源 
性 ，EI 和 蛋白 可 归 为 四 类 : 甘露 醇 、 葡 萄 糖 、 甘 露 糖 和 乳糖 (Moat Foster, 1995), 


图 2.4 磷酸 转移 酶 系统 (PTS) HAR 
EW HPr 是 所 有 磷酸 转移 酶 系统 的 普通 蛋白 ， 此 合成 却 需要 许多 专 一 的 EI 和 蛋白 。 在 图 中 
A、B、C 三 步 都 要 用 到 下 开 蛋 白 ， 此 处 的 EI 蛋 白 可 能 被 联 入 一 个 单一 的 膜 结合 蛋白 (WA 
中 所 示 的 甘露 醇 磷 酸 转移 酶 系统 )， 也 可 能 分 解 为 两 个 或 多 个 蛋白 。 在 葡萄 糖 磷酸 转移 酶 系 
统 中 ，B、C 两 步 需要 引入 IBC 蛋白 ， 采 用 的 是 膜 结合 形式 ， 但 第 A 步 是 可 溶 的 。 在 甘露 
磷酸 转移 酶 系统 ， 第 A、B 两 步 需 引入 可 溶性 蛋白 IAB， 但 C 步 采 用 的 是 膜 结合 形式 


主动 运输 过 程 中 的 ATP 消耗 在 细胞 生物 合成 全 部 ATP 消耗 中 占 重要 部 分 ( 见 2.6)。 
在 质子 同 向 运输 的 过 程 中 ，ATP 消耗 依赖 于 运输 过 程 的 化 学 计量 关系 和 质子 重新 输出 的 化 
学 计量 关系 。 研 究 得 最 透彻 的 体系 是 大 肠 杆 菌 中 的 乳糖 渗透 酶 ， 其 同时 运输 一 个 质子 和 一 个 
乳糖 ( 见 图 2.3)。 对 许多 其 它 物 质 的 运输 相似 的 化 学 计量 比 也 成 立 ， 例 如 原核 生物 和 真 核 
生物 中 许多 氨基 酸 的 运输 以 及 丝 状 真菌 中 通过 高 度 亲 和 系统 对 葡萄 糖 、 果 糖 和 半 乳 糖 等 的 运 
fe ( 见 表 2.2)。 原 核 生 物 和 真 核 生 物 中 质子 的 重新 输出 过 程 有 一 些 不 同 之 处 。 在 好 氧 细菌 
中 ， 电 子 传递 链 位 于 细胞 质 膜 ， 质 子 可 通过 电子 传递 链 从 胞 液 中 重新 运输 出 去 ( 见 2.3.3)。 
然而 ， 质 子 还 可 由 FoF\-ATP 酯 酶 再 转运 至 胞 外 。ATP 酯 酶 在 原核 生物 中 位 于 细胞 质 膜 ， 
它 主要 涉及 氧化 磷酸 化 过 程 中 ATP 的 合成 ， 但 它 是 可 逆 的 ， 并 可 以 在 消耗 ATP 的 情况 下 
将 质子 泵 出 细胞 外 。 目 前 还 不 能 准确 知道 FoF ,-ATP 酯 酶 的 化 学 计量 比 ， 但 在 大 肠 杆菌 中 通 
常 使 用 的 化 学 计量 比 是 2H+*/ATP。 在 真 核 生 物 中 ，FoFi-ATP 酯 酶 位 于 线粒体 中 ， 但 其 也 
具有 属于 另 一 类 ATP 酯 酶 的 质 膜 ATP 酯 酶 。 这 种 ATP 酯 酶 可 能 只 在 ATP 水 解 方向 起 作 
用 ， 通 常 其 化 学 计量 比 为 H*AATP。 利 用 前 面 的 化 学 计量 学 ， 有 可 能 计算 出 通过 主动 运输 
运送 不 同 物质 时 的 ATP 消耗 ， 表 2.2 总 结 了 其 结果 。 

20 


2.2 细菌 和 真菌 中 一 些 化 合 物 的 主动 运输 概述 


氨基 酸 
葡萄 糖 酸 盐 ( 或 酯 ) 


H- 同 向 运输 

H* 同 向 运输 

H* 同 向 运输 

H- 同 向 运输 

H * [al fe) 3 

PTS 

H- 同 向 运输 

化 学 渗透 

H- 同 向 运输 ， 

Na‘ 反 相 运输 

H* 同 向 运输 

促进 扩散 

Ca 和 HL- 同 向 运输 
© 通过 磷酸 转移 酶 系统 糖 在 运输 过 程 中 被 磷酸 化 。 即 使 在 磷酸 烯 醇 两 酮 酸 中 出 现 一 个 高 能 的 磷酸 基 团 ， 在 糖 的 磷酸 

化 过 程 中 高 能 磷酸 键 的 能 量 并 不 释放 ， 因 此 ATP 能 耗 为 0。 


2.3 供 能 反应 
供 能 反应 用 于 三 种 目的 (1) 主要 以 ATP 的 形式 生成 吉 布 斯 自由 能 ， 给 其 它 细胞 反应 


真菌 


提供 能 量 ; (2) 主要 以 辅助 因子 NADPH 的 形式 生成 生物 合成 反应 所 需 的 还 原 力 〈 或 还 原 


当量 ); (3) 生成 生物 合成 结构 单元 所 需 的 代谢 前 体 物 。 在 结构 单元 生物 合成 中 提供 碳 骨 架 
的 底 物 通常 被 称 为 碳 源 ， 而 提供 生物 合成 所 需 吉 布 斯 自由 能 和 还 原 力 的 底 物 称 为 能 源 。 许 多 
底 物 既 作为 碳 源 又 作为 能 源 ， 像 工业 生产 中 常用 的 底 物 情况 ， 如 葡萄 糖 、 果 糖 、 半 乳糖 、 乳 
糖 、 蔗 糖 和 麦芽 糖 等 糖 类 物质 。 糖 类 代谢 始 于 糖 酵 解 ， 末 端 产物 为 丙酮 酸 。 然 后 ， 丙 酮 酸 进 
和 人 发酵 途径 、 回 补 途径 、 用 于 氨基 酸 合成 的 转 氨 途 径 、 三 羧 酸 循环 或 其 它 途 径 而 进一步 加 
工 。 生 物 合成 结构 单元 所 需 全 部 前 体 代 谢 物 都 是 由 糖 酵 解 和 TCA 循环 生成 的 ， 但 为 了 补充 
这 些 生 物 合成 所 消耗 的 前 体 代谢 物 ， 还 需要 一 组 回 补 途径 。 在 工业 培养 基 中 (QUA. EK 
浆 )， 还 常常 存在 着 额外 的 碳 源 和 能 源 ， 如 氨基 酸 、 有 机 酸 或 脂肪 ， 当 存在 一 种 糖 或 单一 的 
碳 源 和 能 源 时 ， 许 多 生物 具有 代谢 这 些 物质 的 能 力 。 

由 于 供 能 途径 在 中 心 碳 代 谢 和 生物 合成 中 的 重要 性 ， 我 们 将 在 本 节 介 绍 糖 酵 解 、 发 酵 、 
回 补 等 几 种 途径 ， 还 有 TCA 循环 、 氧 化 磷酸 化 以 及 脂肪 、 油 类 和 有 机 酸 代谢 的 一 些 基 础 
知识 。 
2.3.1 糖 酵 解 

糖 酵 解 是 将 葡萄 糖 转化 成 丙酮 酸 的 所 有 生化 反应 的 总 和 。 糖 酵 解 由 多 个 途径 (或 代谢 路 
线 ) 来 完成 。 最 常 遇 到 的 途径 有 : (1) 糖 酵 解 途 径 (EMP); (2) 成 糖 磷酸 途径 (PP); (3) 
Entner-Doudoroff 途径 (ED)。 糖 类 进入 糖 酵 解 途径 的 常见 人 口 是 通 过 三 种 单 磷酸 己 糖 进入 
酵 解 途径 ， 即 1- 磷 酸 葡萄 糖 (G1P) ，6- 磷 酸 葡 萄 糖 (G6P) 和 6- 磷 酸 果糖 (F6P)， 三 者 之 
间 很 容易 通过 葡萄 糖 磷 酸 变 位 酶 (对 GLP 和 G6P) 和 磷酸 已 糖 异 构 酶 (对 G6P A FOP) 而 
相互 转化 。 这 些 酶 一 般 都 过 量 存在 ， 在 这 种 条 件 下 ， 这 三 种 化 合 物 处 于 一 种 平衡 状态 并 构成 
一 个 单独 的 代谢 库 。 这 个 代谢 库 可 通过 生成 三 种 组 分 中 的 任何 一 种 而 得 到 补充 〈( 见 图 2.5)， 
而 且 在 平衡 时 ， 这 个 库 中 约 3% 为 1- 磷 酸 和 葡萄糖 65% 为 6- 磷 酸 葡 萄 糖 32% 为 6- 磷 酸 果糖 
(Zubay, 1988). 

21 


单 磷酸 己 糖 相互 转化 库 


2.55 单 磷酸 已 糖 库 及 其 在 不 同 途径 中 的 作用 

1- 磷 酸 葡萄 糖 由 所 存储 的 碳水 化 合 物 磷酸 化 形成 
或 是 Leloir 代谢 中 乳酸 同化 的 最 终 产 物 ， 用 于 多 糖 的 
合成 。6- 磷 酸 葡萄 糖 由 葡萄 糖 消耗 ATP RMI me, 
用 于 PP 途径 (MED 途径 )。6- 磷 酸 果糖 由 糖 原 异 生 
或 由 果糖 消耗 ATP 磷酸 化 形成 ， 用 于 EMP 途径 。 


胞 内 的 葡萄 糖 和 果糖 通过 6 位 上 的 碳 
的 磷酸 化 作用 直接 进入 单 磷酸 已 糖 库 。 在 
细菌 中 ， 糖 类 主要 通过 PTS 系统 被 吸收 ， 
磷酸 化 作用 与 转运 同时 进行 ， 而 在 真 核 生 
物 内 ， 磷 酸化 作用 是 由 己 糖 激酶 催化 的 。 
在 酿酒 酵母 中 有 三 种 不 同 的 酶 参与 葡萄 糖 
和 果糖 的 磷酸 化 : 即 己 糖 激酶 A、 已 糖 激 
酶 B 和 葡萄糖 激酶 (Gancedo 和 Serrano, 
1989)。 两 种 己 糖 激酶 可 使 葡萄 糖 和 果糖 
两 者 磷酸 化 ， 而 葡萄 糖 激 酶 只 特异 性 地 作 
用 于 葡萄 糖 。 来 自 胞 外 的 半 乳 糖 或 胞 内 水 
解 生 成 的 半 乳 糖 ， 以 一 种 更 复杂 的 方式 进 
和信 单 磷 酸 己 糖 库 。 如 果 半 乳糖 由 质子 驱动 
通 透 酶 进行 运输 ， 则 通过 Leloir 途径 进行 


因此 ， 单 磷酸 己 糖 在 代谢 途径 中 既是 起 点 也 是 终点 磷酸 化 作用 。 这 里 半 乳 糖 在 C-1 位 置 上 进 
行 磷酸 化 ， 然 后 与 UDP- 和 葡萄 糖 进行 反应 ， 生 成 1- 磷酸 葡萄 糖 和 UDP- 半 乳糖 。UDP- 半 乳糖 
可 通过 其 它 的 反应 使 UDP- 葡 萄 糖 再 生 。 如 果 半 乳糖 通过 PTS 系统 进行 运输 ， 则 在 C-6 位 
置 上 进行 磷酸 化 并 经 塔 格 糖 途 径 进 行 代谢 ， 其 中 6- 磷 酸 半 乳 糖 转 化 成 6- 磷 酸 塔 格 糖 ， 并 在 
消耗 一 个 ATP 的 条 件 下 进一步 磷酸 化 生成 1,6- 二 磷酸 塔 格 糖 ， 最 后 1,6- 二 磷酸 塔 格 糖 裂 解 
成 磷酸 二 羟 两 酮 和 3- 磷酸 甘 油 醛 。 

在 EMP 途径 中 ，lmol 6- 磷 酸 果糖 转化 成 2mol 丙酮 酸 〈 见 图 2.6)。 其 中 一 个 反应 ， 即 
6- 磷 酸 果糖 转化 成 1,6- 二 磷酸 果糖 的 反应 ， 需 要 以 ATP 形式 存在 的 自由 能 ， 但 在 EMP 途 
径 中 每 分 解 1Imol 6- 磷 酸 葡 萄 糖 总 计 获 得 3mol ATP。 在 图 2.6 的 反应 (6) (BN 3- 磷 酸 甘油 醛 
氧化 生成 1,3- 二 磷酸 甘油 酸 酯 的 反应 ) 还 产生 了 NADH。 因 此 通过 EMP 途径 葡萄 糖 转化 成 
丙酮 酸 的 总 化 学 计量 式 为 

2pyruvate + 2ATP + 2NADH + 2H,0 + 2H* — glucose- 2ADP -2~P—-2NAD*=0 (2.2) 

(丙酮 酸 ) (葡萄 糖 ) 
在 PP 途径 中 ，6- 磷 酸 葡 萄 糖 氧化 生成 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 ， 并 进一步 转化 成 SRR A 
氧化 碳 ( 见 图 2.6)。 在 这 两 个 反应 中 ， 进 入 途径 的 每 1mol 6- 磷 酸 和 葡萄糖 各 生成 1mol 
NADPH。 接 下 去 ，5$- 磷 酸 核 酮 糖 转 化 生成 5$- 磷 酸 核糖 和 4- 磷 酸 赤 玫 糖 ， 它 们 都 是 结构 单元 
(如 芳香 族 氨基 酸 和 核 苷 酸 等 ) 生物 合成 的 前 体 物 。 通 过 不 同 的 反应 次 序 ，5- 磷 酸 核 酮 糖 反 
过 来 还 可 转化 成 6- 磷酸 果糖 和 3- 磷 酸 甘油 醛 ， 从 而 再 进入 EMP 途径 〈( 见 图 2.6)。 

PP 途径 中 的 各 步 反 应 分 别 如 下 : 


6-P-gluconate + NADPH + H* ~ glucose-6-P - NADP * -HzO=0 (2.3a) 
(6- 磷 酸 葡萄 糖 酸 ) (6- 磷 酸 葡萄 糖 ) 
CO, + ribulose-5-P + NADPH + H* — 6-P-gluconate - NADP * — H,0=0 (2.3b) 
(5- 磷 酸 核 酮 糖 ) 
ribose-5-P — ribulose-5-P = 0 (2.3c) 
(5- 磷 酸 核糖 ) 
xylulose-5-P — ribulose-5-P = 0 (2.3d) 


(5- 磷 酸 木 酮 糖 ) 
22 


ATP 有 | 
(1) NADP NADPH NADP” NADPH 
Pape ee 
6- BRATS - - = -= 6- 磷酸 葡萄 精 酸 = == ~~ ACC - 5- 磷酸 核 酮 精 - 
加 CO, 
7 5- ~ 
让 See ee 
ATP * PALS ge a ; 
(3) ‘ " gs a — aa a 
ADP : - (16) N (15) "ei 
1.6- 二 磷酸 果 精 h ar C } 
4 4- BIRT BE Hei 3- 磷 酸 甘油 醛 5- 磷 酸 木 酮 糖 <- - - - 
(4) / | (13) 
tN 3 = ~~ Yaxcee- rr 
(5) (15) 
NAD* 
(6) 
NADH 
ADP 
oe 
ATP 
3- 磷酸 甘油 酸 EMP 途径 
2-2/5 > PP 
a | 途径 
2- 磷酸 甘油 酸 
9 
磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 
ADP 
(10) 
ATP 
丙酮 酸 


图 2.6 真菌 中 的 EMP 途径 和 PP 途径 
(1) 己 糖 激酶 ; (2) 磷酸 已 糖 异 构 酶 ; (3) 磷酸 果糖 激酶 ; (4) 醛 缩 酶 ; (5) 磷酸 甘油 醛 异 构 酶 ; 
(6) 3- 磷 酸 甘油 醛 脱 氢 酶 ; (7) 3- 磷 酸 甘油 酸 激酶 ; (8) 3- 磷 酸 甘 油 酸 变 位 酶 ; (9) 烯 醇 酶 ; 
(10) 丙酮 酸 激酶 ;.(11) 6- 磷 酸 葡 萄 糖 脱 氨 酶 ; (12) 6- 磷 酸 葡萄 糖 脱 氨 酶 ; (13) 二 磷酸 核 
酮 糖 3- 差 向 蜡 构 酶 ; (14) 二 磷酸 核 酮 糖 异 构 酶 ; (15) 转 羟 乙 醛 酶 ; (16) HORA 


glyceraldehyde-3-P + sedoheptulose-7-P — xylulose-5-P — ribose-5-P = 0 
(3- 磷 酸 甘油 醛 ) (7- 磷 酸 景 天 酮 糖 ) 
fructose-6-P + erythrose-4-P — sedoheptulose-7-P 一 glyceraldehyde-3-P=0 
(6-BE RRR EE ) (4-B5 BR ah BF BE ) 


fructose-6-P + glyceraldehyde-3-P — xylulose-5-P — erythrose-4-P = 0 


(14) 


---s 


(2.3e) 
(2.3f) 


(2.38) > 


PP 途径 的 总 反应 计量 式 取决 于 如 下 两 种 情况 : 进入 PP 途径 的 碳 再 循环 进入 EMP 途径 
氧化 成 二 氧化 碳 (同时 生成 还 原 力 NADPH) ， 或 消耗 于 生成 生物 合成 前 体 物 ( 如 五 碳 糖 用 于 
Ar RUMP RFMD). PP 途径 也 因此 被 认为 具有 氧化 和 回 补 功能 ， 分 别 用 总 计量 式 描述 如 下 。 


回 补 PP 功能 : 
6ribose-5-P + SADP + 4H20 + 4~P — Sglucose-6-P — SATP =0 
(5- 磷 酸 核 糖 ) (6- 磷 酸 葡萄 糖 ) 
氧化 PP 功能 : 


(2.4) 


23 


12NADPH + 12H* + 6CO,+ ~P — glucose 6-P — 12NADP* -7H2O=0 (2.5) 

在 ED 途径 中 ，6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 在 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 脱水 酶 的 作用 下 转化 成 2- 酮 基 -3- 脱 
氧 -6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 (KDPG)， 接 着 KDPG 在 KDPG 醛 缩 酶 的 作用 下 裂解 成 3- 磷 酸 甘 油 醛 
和 丙酮 酸 (Conway，1992)。 因 此 通过 ED 途径 将 葡萄 糖 转化 成 丙酮 酸 的 总 反应 式 为 : 

2pyruvate + ATP + NADPH + NADH + 2H,0 + 2H* 

(丙酮 酸 ) 
— glucose - ADP — 1~P - NAD* — NADP*=8 (2.6) 
(葡萄 糖 ) 

需 指 出 的 是 : 在 ED 途径 中 只 生成 Imol ATP fl lmol NADPH， 而 糖 酵 解 途径 是 其 2 倍 
(其 中 生成 的 是 NADH 而 不 是 NADPH)。ED 途径 还 有 一 个 非 磷 酸化 途径 的 相当 途径 ， 其 中 
葡萄 糖 酸 通过 2- 酮 -3 脱氧 -葡萄 糖 酸 转化 成 丙酮 酸 和 甘油 醛 ， 但 这 个 途径 只 有 当 细 胞 代谢 葡 
4 BEBE A RETR ERAN (Conway, 1992). 

EMP 途径 中 的 三 个 中 间 代 谢 物 〈3- 磷 酸 甘 油 醛 ，3- 磷 酸 甘 油 酸 和 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 ) 和 
PP 途径 中 的 两 个 中 间 代 谢 物 〈5- 磷 酸 核糖 和 4- 磷 酸 赤 人 玖 糖 ) 是 氨基 酸 和 核酸 生物 合成 的 前 
体 代 谢 物 。 这 两 条 糖 酵 解 途径 的 相对 通 量 的 大 小 取决 于 对 于 吉 布 斯 自由 能 、NADH 和 
NADPH 形式 的 还 原 力 以 及 前 面 的 前 体 代谢 物 的 需求 。 已 经 用 实验 方法 对 一 些 生 物 测定 了 两 
条 糖 酵 解 途径 间 的 通 量 分 布 ， 如 利用 所 谓 的 呼吸 测量 法 ， 测 定 标记 !#C 的 葡萄 糖 形成 的 4CO。， 
(Blumenthal ，1965) ， 或 利用 NMR 来 测量 胞 内 代谢 物 中 2C 的 富 集 度 分 数 〈( 见 第 9 章 )。 表 
2.3 列 出 了 一 些微 生物 的 EMP 和 PP 途径 上 的 通 量 分 布 。 大 多 数 研 究 结 果 表 明 EMP 途径 是 
主要 的 代谢 途径 ， 然 而 对 于 那些 产物 合成 需要 NADPH 而 过 量 生产 代谢 物 的 微生物 ， 例 如 
用 谷 氨 酸 棒 杆 菌 生产 赖 氨 酸 ，PP 途径 上 的 通 量 可 能 大 于 EMP 途径 上 的 通 量 ( 见 第 10 章 )。 
通过 PP 途径 通 量 的 相对 大 小 一 般 取决 于 比 生 长 速率 和 培养 基 组 成 。 在 稳 态 恒 化 器 中 ，As- 
pergillus nidulans 胞 内 PP 途径 的 相对 通 量 随 稀释 速率 的 增加 而 增加 [ 见 图 2.7 (a)]， 这 
与 观察 到 的 EMP 途径 上 的 一 个 酶 〈 醛 缩 酶 ) 相对 活性 的 减 小 〈 当 稀释 速率 增加 ) 和 PP 途 
径 上 的 一 个 酶 〈6- 磷 酸 葡萄 糖 脱 氢 酶 ) 相对 活性 的 增加 是 一 致 的 [ 见 图 2.7 (a)] ( 需 指 出 的 
是 ， 上 述 两 种 酶 的 相对 活性 是 通过 相应 于 提供 EMP 和 PP 途径 全 部 碳 源 的 已 糖 激酶 的 活性 
而 测定 的 )。 在 高 比 生 长 速率 下 ，PP 途径 活性 的 增加 可 以 认为 是 由 于 在 高 比 生长 速率 下 ， 细 
胞 对 PP 途径 上 生成 的 NADPH 和 前 体 代 谢 物 需求 的 增加 ， 尤 其 是 RNA 生物 合成 对 5- 磷 酸 
核糖 需求 的 增加 [ 见 图 2.7 (b)]j。 然 而 ， 应 当 指 出 ， 这 样 一 个 通 量 与 酶 活性 测量 之 间 的 对 
应 关系 并 不 能 普遍 发 现 ， 因 为 后 者 是 指 体外 确定 的 wmax 测 量 值 ， 由 于 酶 的 调控 或 某 一 特定 
途径 参与 整个 代谢 过 程 的 不 确定 程度 ， 这 个 值 可 能 与 胞 内 的 活性 完全 不 同 。 


表 2.3 不 同 种 类 微生物 中 EMP 途径 和 PP 途径 上 的 相对 通 量 分 布 /% 


[i] KS FF 
恒 化 器 培养 
间歇 培养 
Vi BK SS FF 
[ia] BK Ss FF 
间歇 培养 


EMP 途径 和 PP 途径 的 主要 控制 位 点 处 于 途径 的 那些 人 口 处 ， 即 分 别 在 磷酸 果糖 激酶 
和 6- 磷 酸 葡萄 糖 脱 氢 酶 催化 的 反应 处 (Zubay，1988)。6- 磷 酸 葡 萄 糖 脱 氢 酶 受 NADPH/NADP* 
24 


Shu et al(1954) 
Marx et al(1996) 
Wang et al(1958) 
Lewis et al(1954) 
Wang et al(1958) 
Reed and Wang(1959) 


. niger 


C. glutamicum 


P. chrysogenum 


P. digitatum 


PP 途径 /% 


5- 磷酸 核 精 和 4- 磷 酸 赤 
Ha /mol -g-\ + a) 
¢ o> © 

> wn 

oS an 
NADPH/mol«g “\( + ) 


0 0.2 0 
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 


MRR Mn! MERE! 
(a) (b) 


图 2.7 葡萄 糖 受 限 的 连续 培养 中 ，PP 途径 上 的 相对 通 量 随 稀释 速率 的 变化 
(a) A. nidulans 菌 PP 途径 上 的 相对 通 量 (@)， 由 呼吸 方法 测定 。 同 时 标 出 糖 酵 
解 酶 醛 缩 酶 的 相对 酶 活性 (全 )，PP 途径 中 6- 磷 酸 葡萄 糖 脱 氢 酶 与 己 糖 激酶 的 相对 活性 
( 〇 )。 己 糖 激 酶 的 活性 随 着 生长 速率 的 增加 成 线性 增加 (数据 引 自 Carter 和 Bull, 1969) 
(b) 考察 P. chrysogenun 菌 的 生长 速率 ， 计 算 所 得 的 NADPH 需求 量 ( 口 ) 5B 
酸 核糖 的 需求 量 (mw), ，4- 磷 酸 赤 从 糖 的 需求 量 (全 ) (数据 引 自 Nielsen ，1997) 
的 比值 来 调节 ， 而 磷酸 果糖 激酶 是 一 个 复杂 的 别 构 酶 ， 它 有 几 个 效应 物 。 在 酿酒 酵母 中 ， 此 
酶 受 AMP、 氨 、 磷 酸 以 及 2,6- 二 磷酸 果糖 (ATP 存在 下 ，6- 磷 酸 果糖 经 磷酸 化 而 生成 的 一 
个 代谢 调节 物 ) 激活 ， 被 ATP 抑制 (Gancedo 和 Serrano，1989)。 与 ATP 的 结合 会 导致 
酶 对 6- 磷 酸 果 糖 亲 和 力 的 降低 ， 而 与 调节 物 2,6- 二 磷酸 果糖 的 结合 会 导致 酶 对 6- 磷 酸 果糖 
亲和力 的 极 大 增加 (Zubay，1988)。 因 此 2,6- 二 磷酸 果糖 对 于 EMP 途径 上 的 通 量 具有 促进 
作用 ， 而 ATP 具有 抑制 作用 。 这 种 调节 状况 能 使 磷酸 果糖 激酶 的 活性 增加 以 适应 增加 着 的 
6- 磷 酸 果糖 的 浓度 〈 这 也 导致 2,6- 二 磷酸 果糖 水 平 的 提高 ); 然而 在 高 能 荷 水 平 下 ， 由 于 抑 
制 着 的 磷酸 果糖 激酶 活性 而 使 ATP 的 生成 进一步 被 阻 断 。 磷 酸 果糖 激酶 的 这 种 关键 作用 成 
为 分 析 复 杂 代 谢 途 径 中 的 一 个 中 心 点 〈 见 第 12 章 )。 

在 细胞 代谢 中 ， 辅 助 因 子 NADH 和 NADPH 用 于 两 种 不 同 的 目的 。 在 好 氧 微生物 中 ， 
NADH 主要 涉及 通过 氧化 磷酸 化 反应 生成 吉 布 斯 自由 能 (9 2.3.3 47), i NADPH 主要 用 
于 结构 单元 的 生物 合成 (2.447). Alt, NAD* FARRER HWE, iii NADPH 用 做 
生物 合成 反应 的 底 物 ， 因 而 NADHANAD -及 NADPHVMNADP-* 这 些 比值 在 不 同 的 水 平 上 被 
Wie. #AwAF, NADH/NAD*® 0.03~0.08, NADPH/NADP* # 0.7~1.0 (Ingra- 
ham “%, 1983), ERE PRAT HA SA 0.25~0.30 710.58~0.75. Aim, wwe 
酶 可 在 烟 酰 胺 核 苷 酸 转 氢 酶 的 作用 下 相互 转化 ， 它 通过 下 面 的 反应 进行 催化 实现 氢 在 
NAD+ 和 NADP+ 之 间 的 转移 。 

NADH + NADP* -NAD- -NADPH=0 fs) 

这 种 酶 存在 于 细菌 和 哺乳 动物 细胞 中 〈Hoek 和 Rydstrom，1988) ， 而 在 酵母 (Lagunas 
和 Gancedo, 1973; Bruinenberg, 1985) 和 丝 状 真菌 中 (Eagon，1963) 还 未 被 确认 。 在 哺 
乳 动物 细胞 中 ， 这 个 酶 位 于 线粒体 内 膜 上 ， 在 这 里 其 提供 了 一 个 机 制 ， 使 得 转 氨 反 应 与 在 线 
粒 体 膜 上 的 其 它 与 能 量 相 关 的 反应 得 以 联系 〈Hoek 和 Rydstrom，1988)。 这 种 酶 的 生理 作 
用 还 不 知道 ， 但 是 它 能 对 细胞 的 氧化 还 原 力 或 线粒体 能 量 供应 的 消耗 提供 一 种 保护 性 的 缓冲 
作用 。 一 般 来 讲 ， 在 正常 生长 条 件 下 ， 即 使 这 种 酶 存在 ， 但 其 在 总 的 细胞 代谢 中 可 能 不 会 起 
到 重要 的 作用 。 

25 


2.3.2 发 酵 途 径 

糖 酵 解 的 最 后 一 个 代谢 物 是 丙酮 酸 ， 它 可 通过 几 条 途径 被 进一步 转化 ， 这 取决 于 细胞 的 
氧化 还 原作 用 和 能 量 状 态 。 在 好 氧 生物 中 ， 大 多 数 丙酮 酸 经 过 乙酰 辅酶 A 进入 TCA 循环 ， 
进而 被 完全 氧化 成 二 氧化 碳 和 水 〈 见 2.3.3 节 )。 然 而 ， 在 氧 受 限 制 的 条 件 下 或 在 厌 氧 生物 
中 ， 丙 酮 酸 可 通过 发 酵 途 径 转 化 成 诸如 乳酸 、 乙 酸 和 乙醇 等 代谢 产物 。 

最 简单 的 发 酵 途 径 是 丙酮 酸 在 乳酸 脱氧 酶 的 作用 下 生成 乳酸 ， 这 个 反应 的 化 学 计量 式 
如 下 。 

lactic acid + NAD* — pyruvate - NADH — H* =0 (2.8) 
(AR) 

在 式 (2.8) F, EMP 途径 中 氧化 3- 磷 酸 甘 油 醛 所 生成 的 NADH 被 用 来 还 原 丙 酮 酸 而 生成 
乳酸 ， 因 此 ， 在 葡萄 糖 转化 成 乳酸 过 程 中 并 没有 净 生 NADH。 在 高 等 真 核 生 物 中 ， 如 肌肉 


NADH 
NAD* NADH er ale GD) GDF ne 


ep ——_ ze Zit — > za A =e Pais Sy shed 
乙酰 辅酶 A vid 
(5) 
辅酶 A 
乙酰 乙酰 辅酶 A 
NADH 乙酸 
NAD* 6, 43) 乙酰 辅酶 A 


-羟基 丁 酰 辅酶 A 乙酰 乙酸 


(7) 中 《co) 


丁 烯 酰 辅 酶 A 


NADH NADH 
(8) (15) 
NAD" 


(11) 


图 2.8 丙酮 丁 醇 梭 状 芽孢 杆菌 的 混合 发 酵 
(1) 乙 醛 脱 所 酶 ; (2) 乙醇 脱 氢 酶 ; (3) 磷酸 乙酰 基 转 移 酶 ; (4) 乙酸 激酶 ; (5) 乙酰 辅酶 A 乙酰 转移 酶 ; 
(6) L(+ )-8- 羟 基 丁 酸 辅酶 A 脱 氢 酶 ; (7) 1,3- 二 羟 酰 辅酶 A 脱 氢 酶 ; (8) 丁 酰 辅 酶 A 脱 氢 酶 ; 
(9) 丁 醛 脱 氢 酶 ; (10) 丁 醇 脱 氢 酶 ; (11) 磷酸 丁 酰基 转移 酶 ; (12) 丁 酸 激酶 ; 
(13) 辅酶 A RBM; (14) 乙酰 乙酸 脱羧 酶 ; (1S) HARA 


20 


细胞 在 缺 氧 条 件 下 这 个 途径 是 活跃 的 。 在 许多 细菌 中 这 个 途径 也 是 活跃 的 。 在 乳酸 菌 中 ， 该 
途径 是 主要 的 ， 而 且 在 某 种 情况 下 是 惟一 活跃 的 发 酵 途径 @ 。 

在 乳酸 菌 中 还 存在 着 其 它 的 一 些 发 酵 途径 ， 这 会 形成 几 种 不 同 的 代谢 产物 ， 除 乳酸 外 ， 
还 有 乙酸 、 乙 醇 、 甲 酸 和 二 氧化 碳 ( 见 例 8.3 对 乳酸 菌 混合 酸 发 酵 的 分 析 )。 在 大 肠 杆菌 中 ， 
在 厌 氧 条 件 下 反应 式 (2.8) 是 很 重要 的 ， 但 在 混合 酸 发 酵 中 它 总 是 与 其 它 的 途径 一 同 存在 ， 
从 而 生成 几 种 不 同 的 代谢 产物 (LG 3.1， 对 大 肠 杆菌 混合 酸 发 酵 的 分 析 )。 革 兰 阳性 菌 梭 
状 菌 属 具有 复杂 的 发 酵 代 谢 途 径 〈 见 图 2.8)， 从 而 能 生成 许多 不 同 的 代谢 产物 。 该 菌 属 中 
丙酮 丁 醇 梭 状 芽孢 杆菌 是 一 种 最 重要 的 工业 生产 菌株 。 图 2.8 表明 ， 除 乙酰 辅酶 A 转化 成 
乙醇 和 乙酸 外 ， 两 个 乙酰 辅酶 A 分 子 可 以 反应 生成 乙酰 乙酰 辅酶 A。 这 个 化 合 物 可 依次 通 
过 三 个 反应 生成 丁 酰 辅酶 A ( 见 图 2.8)。 同 乙酰 辅酶 A 转化 成 乙酸 和 乙醇 类 似 ， 丁 酰 辅酶 
A 可 分 别 经 丁 酰 磷酸 和 丁 醛 生成 丁 酸 和 丁 醇 。 另 外 ， 在 另 一 分 支 途径 中 ， 乙 酰 乙 酸 可 脱羧 生 
成 丙酮 ， 并 可 进一步 还 原 为 异 丙 醇 。 

酵母 的 发 酵 代 谢 与 细菌 的 有 些 不 同 ， 其 主要 
的 最 终 产 物 为 乙醇 ， 因 此 也 称 该 过 程 为 酒精 发 酵 ， O) NADH 
然而 此 过 程 也 生成 一 些 乙酸 和 少量 的 琥珀 酸 。 生 7a ae 
成 乙醇 和 乙酸 的 发 酵 途 径 始 于 丙酮 酸 脱羧 生成 乙 NADH o 
醛 ， 乙 醛 再 由 乙醇 脱 氢 酶 还 原生 成 乙醇 或 被 氧化 9) 


丙酮 酸 


生成 乙酸 〈 见 图 2.9)。 酵 母 发 酵 代 谢 与 细菌 发 酵 co, eae 

的 主要 不 同 在 于 它 不 经 过 乙酰 辅酶 A 来 进行 。 已 Zi 

经 确认 了 乙醇 脱 氢 酶 的 四 种 同 功 酶 (ADH I, d Z~ ate 

ADHIL, ADHII, ADHIV). FUMBBRABM 

的 厌 氧 生长 中 ， 细 胞 质 ADH I 是 组 成 型 表达 的 ， a ae 

并 负责 生成 乙醇 。ADHI 是 细胞 质 中 的 蛋白 并 受 
AGH, MAE SUZ RW MEM 。。 G) Nmmmnm, C 两 天 开拓， 
长 有 关 。 线 粒 体 ADH he WwW, (3) 乙 醛 脱 氢 酶 ; (4) 乙酰 辅酶 A 合成 酶 ; 
功能 未 知 ， 但 它 可 能 在 平衡 胞 质 溶胶 和 线粒体 的 (5) 乙醇 脱 所 本 


反应 〈1) 在 线粒体 中 进行 ， 


氧化 还 原 电 势 中 起 穿梭 作 用 (Nissen 等 ，1997 )。 其 它 反应 在 细胞 质 中 进行 


已 经 确认 了 两 种 乙 醛 脱氧 酶 的 同 功 酶 ， 其 中 一 个 
可 以 利用 NAD+ 和 NADP+ 二 者 为 辅 因 子 ， 而 另 一 个 同 功 酶 只 能 特异 性 地 利用 NADP+ 为 辅 
因子 。 因 此 ， 乙 酸 的 形成 会 导致 NADPH 的 形成 ， 这 可 能 是 酵母 中 NADPH 供应 的 重要 
来 源 。 
在 酿酒 酵母 利用 葡萄 糖 转 化 为 乙醇 的 整个 过 程 中 ， 没 有 NADH 的 净 生 成 。 然 而 ， 由 于 
前 体 代谢 物 以 及 生物 合成 所 需 结构 单元 的 合成 过 程 中 会 引起 NADH 的 净 生 成 〈 例 如 从 葡萄 
糖 每 生成 一 个 丙酮 酸 会 生成 一 个 NADH)， 细 胞 需要 一 个 代谢 途径 来 消耗 所 产生 的 过 剩 的 
NADH。 一 个 这 样 的 可 能 性 就 是 利用 磷酸 二 羟 两 酮 (DAP) 生成 甘油 。 此 途径 的 总 反应 式 
如 下 。 
glycerol + NAD* + ~P - DAP - NADH - H* =0 (2.9) 
(甘油 ) 


@ 如果 乳酸 脱 氢 酶 催化 的 反应 是 惟一 活跃 的 途径 ， 那 么 此 代谢 通常 称 为 同型 发 酵 。 
27 


从 葡萄 糖 生 成 甘油 的 总 过 程 中 会 净 消 耗 NADH， 因 此 上 述 途 径 可 以 对 如 下 几 种 过 程 进行 补 
偿 : 在 前 体 代 谢 物 和 结构 单元 合成 过 程 中 产生 NADH， 但 在 生物 合成 中 没 被 利用 的 过 程 或 
其 它 需要 NADPH 的 反应 过 程 。 
2.3.3 TCA 循环 和 和 氧化 磷酸 化 

丙酮 酸 完全 氧化 的 第 一 步 是 生成 乙酰 辅酶 A 的 氧化 脱羧 反应 〈 见 图 2.10)， 这 个 反应 是 
一 系列 复杂 反应 的 结果 ， 由 总 称 为 丙酮 酸 脱氧 酶 复合 物 (PDC) 的 一 组 三 种 酶 来 催化 完成 。 
在 真 核 细 胞 中 ， 和 其 它 所 有 与 丙酮 酸 的 好 氧 分 解 代谢 反应 有 关 的 酶 一 样 ， 这 个 酶 复合 物 位 于 
线粒体 上 。 在 丙酮 酸 的 氧化 反应 中 ， 辅 酶 NAD- 作 为 电子 受 体 。 


NADPH NADP* NAD* NADH 乙酰 辅酶 A 辅酶 A 


Finan SRS ze rete 细胞 质 
， ADP ATP / 


| NAD* NADH 


) 辅酶 A 


/ 
A ‘ 
丙酮 酸 “cata ree 
辅酶 A CO, O) mT RE 
p (19) 


AT 草 酰 乙 酸 顺 乌 头 酸 


辅酶 A ATP ADP 


图 2.10 真菌 体内 的 TCA 循环 和 回 补 途径 
(1) 丙酮 酸 脱 氢 酶 复合 物 ; (2) 柠檬 酸 合成 酶 ; (3) 顺 乌 头 酸 酶 ; 〈4) 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 ; (5) c- MK 
酸 脱 氢 酶 ; (6) 琥珀 酸 硫 激酶 ; (7) 琥珀 酸 脱 氢 酶 ; (8) 延 胡 索 酸 酶 ; (9) 苹果 酸 脱氧 酶 ; (10) 丙酮 酸 
ACM; (11) 异 柠檬 酸 裂解 酶 ; (12) 苹果 酸 合成 酶 ; (13) ATP-HRRAMM; (14) 苹果 酸 脱 氢 酶 ; 
(15) 苹果 酶 。 在 真 核 细胞 中 ， 丙 酮 酸 脱 氢 酶 复合 物 与 膜 结合 ， 因 此 ， 丙 酮 酸 转化 为 乙酰 辅酶 A 是 和 丙酮 
酸 向 线粒体 的 运输 相关 联 的 〈 在 线粒体 膜 上 没有 丙酮 酸 的 载体 )。 而 且 ， 乙 醛 酸 等 循环 的 反应 由 酶 (2)、 
(3)、(11)、(12) 和 (9) 催化 ， 反 应 不 是 在 线粒体 中 进行 〈 如 图 所 示 )， 而 是 在 乙 醛 酸 循环 体 中 进行 的 ， 
由 乙酰 辅酶 A 转化 为 琥珀 酸 的 合成 也 是 在 此 处 进行 。 琥 珀 酸 在 乙 醛 酸 循环 中 形成 ， 然 后 运输 到 线粒体 中 ， 
由 此 进入 TCA 循环 。 在 原核 细胞 中 ， 在 胞 液 中 发 生 的 TCA 不 是 有 组 织 的 ， 不 存在 〈13)、(14) 和 (15) 


碳 进 入 TCA 循环 是 通过 乙酰 辅酶 A 与 草 酰 乙 酸 在 柠檬 酸 合成 酶 的 催化 下 缩合 生成 柠檬 

酸 的 反应 而 发 生 的 〈 见 图 2.10)。 柠 檬 酸 随 后 在 乌 头 酸 酶 的 作用 下 生成 其 异 构 体 一 一 异 柠檬 

酸 ， 这 个 反应 要 经 过 顺 乌 头 酸 ， 它 在 细胞 代谢 中 没有 其 它 作 用 ， 因 此 在 TCA 循环 中 不 考虑 

它 。 柠 檬 酸 转 化 成 异 柠檬 酸 的 总 平衡 常数 接近 1， 表 明 等 量 的 柠檬 酸 和 蜡 柠檬 酸 处 于 平衡 

中 ， 这 两 个 代谢 产物 通常 归 进 一 个 单独 代谢 库 中 。TCA 循环 中 接 下 来 的 两 步 是 氧化 脱羧 反 
28 


应 。 首 先 ， 异 柠檬 酸 在 异 柠檬 酸 脱氧 酶 的 作用 下 生成 c- 酮 成 二 酸 。 接 着 ，we- 酮 成 二 酸 经 a- 
酮 成 二 酸 脱 氢 酶 催化 转化 成 琥珀 酰 辅酶 A， 该 步 反 应 类 似 于 丙酮 酸 脱 氢 酶 催化 的 丙酮 酸 脱羧 
反应 。 实 际 上 ， 这 两 个 酶 系 使 用 同样 的 脱氧 酶 亚 基 。 在 下 面 的 反应 中 ， 琥 珀 酰 辅 酶 A 水 解 
生成 琥珀 酸 ， 同 时 在 辅酶 A 酯 键 水 解 过程 中 释放 出 吉 布 斯 自由 能 ， 通 过 GDP 磷酸 化 生成 
GTP 而 回收 这 部 分 自由 能 。 然 后 琥珀 酸 脱氧 生成 延 胡 索 酸 ， 这 个 反应 需要 一 强 氧化 剂 ， 
FAD 被 还 原 成 FADH2z。FAD 整合 在 琥珀 酸 脱 氢 酶 黄 素 蛋 白 酶 中 来 催化 这 个 反应 。 延 胡 索 
酸 在 延 胡 索 酸 酶 的 作用 下 生成 L- 革 果 酸 。 最 后 ，L- 苹 果 酸 在 苹果 酸 脱 氢 酶 的 作用 下 生成 草 
酰 乙 酸 ， 从 而 完成 了 这 个 循环 。 

TCA 循环 的 主要 调节 位 点 在 柠檬 酸 合成 酶 、 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 和 o- KORA. 
然 这 三 种 酶 的 活性 都 偏爱 低 水 平 的 NADHMANAD+ 比 ， 但 这 个 比值 尤其 强烈 地 影响 着 异 柠檬 
酸 脱 氢 酶 的 活性 。 此 外 ， 在 酵母 中 ， 蜡 柠檬 酸 脱 氢 酶 受 AMP 激活 ， 受 ATP 抑制 (Zubay, 
1988)。 

TCA 循环 中 丙酮 酸 完全 氧化 的 总 化 学 计量 式 如 下 。 

3CO2+ GTP +4NADH + FADH; + 4H* 一 pyruvate 

— 3H,O - GDP -2~P-—4NAD* —FAD =0 (2.10) 

这 样 ， 每 氧化 Imol 丙酮 酸 ， 就 生成 4mol NADH 和 lmol FADH2。 很 明显 ， 只 有 当 这 两 种 
辅助 因子 被 重新 氧化 生成 NAD-* 和 EFEAD AY, TCA 循环 才能 继续 进行 。 在 好 氧 条 件 下 ， 通 
过 一 个 电子 受 体 链 把 电子 从 这 些 辅酶 上 转移 给 自由 氧 。 大 多 数 电 子 受 体 组 成 一 个 大 的 复合 
物 ， 镶 典 在 原核 生物 的 质 膜 上 和 真 核 生 物 的 线粒体 内 膜 上 〈 见 图 2.11)。 电 子 通过 电子 传递 
链 从 NADH 到 氧 上 的 运动 是 受 一 个 大 的 负 的 自由 能 驱动 的 ， 即 AG? = — 220kJ - (mol 
NADH)-!， 而 且 该 自由 能 的 一 部 分 以 ATP 的 形式 捕获 。Peter Mitchell 1961 年 提出 的 化 学 
渗透 理论 可 以 解释 这 两 种 完全 不 同 的 过 程 〈 电 子 运输 和 ATP 合成 过 程 ) 是 如 何 耦 联 在 一 起 
的 (Mitchell, 1961; Mitchell 和 Moyle, 1965; Senior，1988 ) 。 这 个 理论 认为 : 当 电 子 通 
过 此 电子 链 运输 时 ， 质 子 被 泵 出 线粒体 外 〈 或 被 泵 出 原核 生物 的 细胞 外 ) ， 因 此 穿越 线粒体 
ARR 〈 或 原核 生物 的 质 膜 ) 上 形成 了 pH 梯度 〈 约 0.0SpH 单位 ， 细 胞 内 或 线粒体 内 高 些 ) 
和 电子 电势 梯度 ( 约 -0.15V) (〈 见 图 2.11)。 当 质子 通过 FIFo-ATP BRAW (或 ATP 合 
成 酶 ) 再 进入 线粒体 基质 〈 或 细胞 质 ) 中 时 ， 就 产生 了 ATP。 对 真 核 生物 而 言 ， 氧 化 磷酸 
化 的 理论 化 学 计量 关系 〈 即 所 谓 的 P/O 比 ) 是 每 氧化 Imol NADH: 生成 3mol ATP, BK 
氧化 1mol 琥珀 酸 (或 FADH2) 合成 2mol ATP ( 见 图 2.11)。 对 原核 生物 而 言 ， 质 子 只 在 
两 个 位 点 上 运输 (每 个 位 点 两 个 质子 ) ， 而 且 由 于 原核 生物 的 FIiFo-ATP 酯 酶 的 化 学 计量 关 
系 为 1ATPLZH-* ， 所 以 氧化 磷酸 化 的 理论 化 学 计量 关系 是 每 氧化 Imol NADH) 合成 2mol 
ATP。 由 于 氧化 作用 和 磷酸 化 作用 的 不 完全 耦 联 ， 实 际 上 所 谓 有 效 的 P/O 比 远 低 于 理论 值 
( 见 例 13.6)。 这 是 由 于 穿越 膜 的 质子 梯度 所 驱动 的 外 来 过 程 的 结果 。 因 此 ， 像 在 2.2.3 中 
讨论 过 的 一 样 ， 许 多 化 合 物 由 质子 同 向 运输 所 驱动 ， 而 且 这 影响 着 原核 生物 中 穿越 质 膜 的 质 
子 梯度 。 类 似 地 ， 在 真 核 生 物 中 ， 线 粒 体内 膜 上 有 磷酸 盐 、ATP、ADP 以 及 代谢 物 丙 酮 酸 、 
柠檬 酸 、 异 柠檬 酸 、 琥 珀 酸 和 苹果 酸 的 特异 载体 ， 这 些 化 合 物 的 运输 也 是 由 质子 梯度 所 驱动 
的 (LaNoue 和 Schoolwerth, 1979; Zubay, 1988). 

由 于 线粒体 内 膜 是 不 能 渗透 NADH 的 ， 因 此 真 核 生 物 中 细胞 质 NADH 的 氧化 需要 运用 
BR NADH 脱氧 酶 以 外 的 手段 把 电子 运输 到 电子 传递 链 上 。NADH 脱 氢 酶 是 专门 作用 于 线 粒 
体 NADH 的 ,为 此 目的 ,真菌 的 线粒体 装备 有 NADH 脱 氢 酶 , 它 位 于 线粒体 内 膜 的 外 表 

29 


FR Bom 


图 2.11 真 核 生物 的 电子 传递 链 和 氧化 磷酸 化 

通过 电子 传递 链 ， 电 子 从 NADH 或 琥珀 酸 传 给 氧气 。 电 子 传递 链 基本 单元 以 较 大 复合 物 的 形式 位 于 线粒体 

内 膜 。 来 自 NADH 的 电子 首先 传 给 复合 物 I ， 即 NADH 脱氧 酶 ， 它 是 含有 黄 素 单 核 苷 酸 的 黄 素 蛋白 。 来 自 

HRN FAI FDA, RELA, MAMMA HTB (TCA 中 的 酶 之 一 )。 来 自 复 

合 物 工 和 复合 物 开 (或 来 自 位 于 线粒体 内 膜 的 其 它 黄 素 蛋白 ) 的 电子 传 给 辅酶 Q (UQ)，UQ 可 以 在 脂 质 膜 

中 自由 扩散 。 电 子 从 UQ 传 给 细胞 色素 系统 。 首 先 ， 电 子 传 给 复合 物 耻 ， 它 包含 两 个 b 型 细胞 色素 (b566 

和 b562) 和 细胞 色素 cl。 然后， 电子 通过 细胞 色素 c 传 给 复合 物 K (或 细胞 色素 氧化 酶 )， 复 合 物 凡 包括 细 

胞 色素 和 sa， 最后， 电子 传 给 氧气 。 复 合 物 工 、 复 合 物 卫 和 复合 物 N 穿越 细胞 质 内 膜 ， 当 这 些 复合 物 运 箱 

两 个 电子 时 ， 每 种 复合 物 向 膜 间 空间 中 释放 四 个 质子 。 这 些 电 子 将 被 质子 传导 的 ATP 合成 酶 (或 FiFoATP 

酯 酶 复合 物 ) 运输 回 线粒体 基质 。 在 这 个 复合 物 中 ， 运 输 三 个 质子 会 产生 一 个 ATP。 多 余 的 一 个 质子 将 运 

答 回 线粒体 基质 ， 用 于 ADP 和 一 P 的 吸收 、ATP 的 输出 。 因 此 ， 整 个 过 程 每 产生 一 个 ATP 需要 四 个 质子 。 

所 以 ， 每 对 电子 从 复合 物 工 传 到 复合 物 W ， 会 有 12 个 电子 〈 每 种 复合 物 需 四 个 质子 ) 从 线粒体 基质 泵 人 膜 

间 空 间 。 当 质子 通过 ATP 合成 栈 再 次 进入 线粒体 基质 时 ， 会 产生 3mcl ATP (每 个 ATP 需 四 个 质子 )。 所 以 ， 

氧化 磷酸 化 的 理论 计量 式 是 : 每 氧化 Imol DADH 合成 3mol 的 ATP ， 每 氧化 1lmol 的 琥珀 酸 合成 2mol 的 ATP 
面 ， 接 收 来 自 细胞 质 NADH 的 电子 (von Jagow Klingenberg, 1970; Wokean ; 1976), ix 
脱氧 酶 可 能 把 它 的 电子 释放 给 共同 的 受 体 UQ， 因 为 在 细胞 质 NADH 氧化 中 只 有 两 个 磷酸 
化 位 点 (Watson，1976)。 来 自 细胞 质 NADH 的 电子 在 电子 传递 链 上 加 工 处 理 的 其 它 机 制 是 
借助 所 谓 的 穿梭 系统 ， 其 中 最 简单 的 涉及 在 细胞 质 中 将 磷酸 二 羟 丙 酮 还 原 为 3- 磷 酸 甘 油 
(DHAP + NADH 一 ~"G3P+NAD-)， 然 后 在 线粒体 3- 磷 酸 甘 油 脱 氢 酶 的 作用 下 将 3- 磷 酸 甘 
油 再 氧化 成 磷酸 二 羟 丙 酮 。 线 粒 体 3- 磷 酸 甘油 脱 氢 酶 的 催化 位 点 位 于 线 粒 作 ,4 膜 的 外 表面 ， 
因此 为 了 再 氧化 3- 磷 酸 甘油 不 必 通 过 线粒体 内 膜 。 线 粒 体 3- 磷 酸 甘 油 脱 氢 酶 是 一 个 含有 
FAD 的 黄 素 蛋 白 ， 它 把 电子 提供 给 UQ 位 点 上 的 电子 传递 链 。 当 电子 通过 这 个 穿梭 体系 进 
行 运输 时 ，NADH Ask P/O 比 将 类 似 于 琥珀 酸 氧化 的 PMO 比 。 
2.3.4 回 补 途 径 

TCA 循环 中 的 两 个 中 间 代 谢 物 ，w- 酮 成 二 酸 和 草 酰 乙酸 是 氨基 酸 和 核 苷 酸 生 物 合成 所 
需 的 前 体 代谢 物 @@。 在 TCA 循环 中 这 两 种 物质 没有 净 的 生成 ， 为 满足 其 它 的 细胞 功能 而 消 
耗 的 这 些 物质 必须 通过 别 的 途径 来 补偿 。 能 完成 这 些 作 用 的 一 系列 反应 总 称 为 回 补 途径 。 回 
ARE (LE 2.10) 包括 : (1) 丙酮 酸 在 丙酮 酸 羧 化 酶 作用 下 的 送 化 ; (2) PEP 在 PEP ® 
化 酶 的 作用 下 羧 化 ; (3) 苹果 酸 在 苹果 酸 酶 的 作用 下 氧化 生成 丙酮 酸 ; (4) 乙 醛 酸 循环 。 


@ 在 合成 亚 铁 红 素 的 类 亚 铁 红 素 时 ， 琥 珀 酰 辅 酶 A 是 作为 前 体 代谢 物 ， 但 在 这 里 不 是 这 样 。 这 里 琥珀 酰 辅 酶 A 作 
为 合成 其 它 基 团 的 辅助 因子 ， 生 成 琥珀 酸 。 琥 珀 酰 辅 酶 A 可 由 琥珀 酸 消耗 ATP 再 生 。 


30 


最 重要 的 回 补 途径 是 由 丙酮 酸 羧 化 酶 或 PEP 羧 化 酶 催化 的 二 氧化 碳 固定 反应 ， 这 导致 
草 酰 乙酸 生成 ( 见 图 2.10)。 丙 酮 酸 羧 化 酶 受 高 水 平 的 ATP/ADP 比 和 乙酰 辅酶 人 激活 ， 而 
被 L- 天 冬 氢 酸 抑制 ， 因 此 这 个 酶 的 调控 几乎 完全 与 丙酮 酸 脱 氢 酶 复合 物 的 情况 相反 ， 后 者 
被 高 水 平 的 ATP/ADP 比 或 NADH/NAD 比 以 及 高 浓度 的 乙酰 辅酶 A 所 抑制 (Zubay， 
1988)。 在 酿酒 酵母 的 细胞 质 和 线粒体 中 都 发 现 丙酮 酸 羧 化 酶 的 活动 (Haarasila 和 Taskinen , 
1977)。 在 许多 原核 生物 中 ， 丙 酮 酸 羧 化 酶 是 很 活泼 的 ， 但 在 真菌 中 还 没 被 确认 。 与 丙酮 酸 
羧 化 酶 的 调控 相似 ，PEP 羧 化 酶 受 L- 天 冬 氨 酸 抑制 而 被 乙酰 辅酶 A 激活 (Jerren 等 ，1994)。 

”乙酰 辅酶 A 不 能 通过 线粒体 内 膜 运 输 到 细胞 质 中 ， 而 在 细胞 质 中 它 是 氨基 酸 和 脂 类 生 
物 合成 的 关键 前 体 物 。 对 于 真 核 生 物 ， 如 果 细 胞 在 能 量 需 求 和 生物 合成 所 需 碳 架 之 间 不 平 
衡 ， 那 么 就 必须 在 细胞 质 中 合成 乙酰 辅酶 A， 这 可 通过 两 条 不 同 的 途径 来 实现 。(1) 首先 利 
用 柠檬 酸 能 在 线粒体 膜 中 自由 运输 ， 并 利用 柠檬 酸 裂 解 酶 将 细胞 质 柠檬 酸 分 解 成 草 酰 乙酸 和 
乙酰 辅酶 A， 并 同时 将 ATP 水 解 成 ADP [图 2.10 中 反应 (13)]j]。 通 常 ， 对 于 乙酰 辅酶 A 
的 需求 要 超过 对 草 酰 乙酸 的 需求 ， 由 该 反应 所 产生 的 过 剩 量 草 酰 乙酸 在 细胞 质 苹果 酸 脱氧 酶 
的 催化 下 生成 LSE RAR. Ra L- 苹 果 酸 或 者 再 进入 线粒体 或 者 在 苹果 酸 酶 的 作用 下 氧化 脱 
凑 生 成 丙酮 酸 [图 2.10 中 反应 (15)]。 在 苹果 酸 酶 催化 的 -苹果 酸 氧 化 中 ， 形 成 NADPHL， 
这 个 反应 可 能 是 真 核 生物 细胞 质 中 NADPH 合成 的 主要 来 源 。(2) 第 一 条 途径 是 经 由 乙酸 
生成 细胞 质 乙 酰 辅酶 A。 首 先 丙 酮 酸 被 氧化 脱羧 生成 乙酸 


acetate + CO, + NADH + H* — pyruvate - NAD* =0 (2.11) 
(乙酸 ) (丙酮 酸 ) 
之 后 , 在 乙酰 辅酶 A 合成 酶 作用 下 乙酸 转化 成 乙酰 辅酶 A: 
acetyl-CoA + HO + AMP + PP; — acetate - CoA —- ATP =0 (2.12) 
(乙酰 辅酶 A) (乙酸 ) 


酿酒 酵母 采用 这 个 途径 (Frenkel 和 Kitchens，1977) ， 但 在 A. nidulans 中 ， 乙 酰 辅酶 A 合 
成 酶 被 乙酸 诱导 而 受 葡 萄 糖 阻 遇 (Kelly 和 Hynes，1982) ， 因 此 反应 (2.12) 主要 在 以 乙酸 


为 底 物 时 才 是 活泼 的 。 
在 乙 醛 酸 循环 (也 称 乙 醛 酸 支 路 ) 中 ， 异 柠檬 酸 在 异 柠檬 酸 裂 解 酶 的 作用 下 裂解 成 琥珀 
酸 和 乙 醛 酸 [ 图 2.10 中 反应 (11)]， 乙 醛 酸 可 与 乙酰 辅酶 A 在 苹果 酸 合成 酶 的 作用 下 [图 


2.10 中 反应 (12)] 生成 L -苹果 酸 。 之 后 ，L- 苹 果 酸 经 一 系列 与 TCA 循环 中 相同 的 反应 转 
化 成 异 柠檬 酸 [图 2.10 中 的 反应 (9) 和 反应 (2)]。 因 此 ， 乙 醛 酸 循环 的 净 结 果 是 从 两 分 
子 乙 酰 辅酶 A 合成 四 碳 的 琥珀 酸 。 这 个 途径 在 乙酸 代谢 中 和 脂肪 酸 代 谢 中 是 重要 的 。 这 里 ， 
乙酰 辅酶 A 是 中 间 代 谢 物 。 

在 真 核 生 物 中 ， 为 细胞 质 提 供 c- 酮 戊 二 酸 对 生物 合成 是 重要 的 。 这 个 前 体 代 谢 物 可 由 
一 个 特定 的 通 透 酶 穿越 线粒体 内 膜 运 输 ， 也 可 以 在 细胞 质 中 由 细胞 质 异 柠檬 酸 脱氧 酶 来 合 
成 。 在 真菌 中 已 经 识别 出 两 种 不 同 的 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 : 一 种 依赖 于 NAD-， 一 种 是 与 
NADP+ 有 关 的 。NAD+- 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 总 与 线粒体 结合 ， 在 A. nidulans 中 ， 依 赖 于 
NADP+ 的 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 受 葡萄 糖 阻 遇 ， 主 要 在 以 乙酸 为 生长 基质 时 有 活性 (Kelly 和 
Hynes，1982)。 这 可 以 解释 有 两 种 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 存在 的 原因 : 在 以 乙酸 为 生长 底 物 时 ， 可 
以 生成 NADPH。 这 里 若 经 PP 途径 生成 NADPH， 则 在 能 量 上 是 很 昂贵 的 。 对 其 它 生 物体 
而 言 ， 当 以 葡萄 糖 为 生长 基质 时 也 会 发 现 与 NADP 相关 的 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 ， 这 里 ， 它 可 能 
在 NADPH 的 供应 中 起 重要 作用 。 

31 


2.3.5 脂 类 、 有 机 酸 和 和 氨基 酸 的 分 解 代 谢 
长 链 脂肪 酸 的 分 解 代 谢 始 于 脂肪 酸 的 活化 ， 即 与 辅酶 A 和 ATP 反应 生成 脂 酰 辅酶 A 
RCO-CoA + AMP + PP; —- RCOOH — ATP — CoA=0 (2.13) 
此 反应 由 酰基 辅酶 A EE) 催化 ， 在 哺乳 动物 细胞 中 发 生 于 胞 液 中 。 脂 酰 畏 
酶 A 在 8- 碳 上 氧化 并 先后 通过 四 个 反应 裂解 生成 乙酰 辅酶 A 和 减少 了 两 个 碳 的 脂 酰 辅酶 A。 
这 个 过 程 连续 进行 直到 脂 酰 辅 酶 A 完全 降解 成 乙酰 辅酶 A。 该 降解 反应 总 化 学 计量 式 如 下 : 
(n + 1)acetyl-CoA + n NADH + n FADH? + nH* -CHsCCH2) CO 一 CoA 
—-nNAD* —- nFAD- nCoA=0 (2.14) 
在 哺乳 动物 中 ， 这 个 过 程 发 生 在 线粒体 内 ， 脂 酰 辅酶 A 作为 酰基 肉 碱 衍生 物 运输 到 线粒体 
上 。FDAH2 捕获 的 电子 被 传递 到 电子 传递 链 的 UQ 上 。 在 酵母 中 ， 脂 肪 酸 的 氧化 发 生 在 微 
体 中 ， 在 过 氧化 所 释放 过 程 中 电子 直接 从 FADH2 转移 给 自由 氧 ， 随 后 过 氧化 氢 由 过 氧化 氢 
酶 降解 (Tanaka 和 Fukui, 1989). 
乙酰 辅酶 A 是 乙酸 代谢 和 脂肪 酸 代谢 中 常用 的 中 间 体 ， 如 果 以 这 些 物 质 作 为 惟一 碳 源 ， 
需要 一 些 特殊 的 途径 来 合成 通常 在 糖 酵 解 过 程 中 合成 的 前 体 代 谢 物 ， 如 丙酮 酸 、3- 磷 酸 甘油 
醛 和 6- 磷酸 己 糖 。 这 可 通过 乙 醛 酸 支 路 (由 乙酰 辅酶 A 合成 了 琥珀 酸 ) 和 糖 异 生 途 径 (可 
认为 是 与 EMP 途径 相反 的 途径 ) 来 实现 。 当 利用 乙酸 和 脂肪 酸 生长 时 ， 糖 异 生 从 草 酰 乙酸 
(由 琥珀 酸 生 成 ) 开始 ， 通 过 GTP 进行 脱羧 及 磷酸 化 后 ， 进 而 在 PEP 羧 化 激酶 的 作用 下 生 
成 PEP。 接 着 ，PEP ei EMP 途径 的 酶 转化 成 1,6- 二 磷酸 果糖 。 最 后 ，1,6- 二 磷酸 果糖 在 二 
磷酸 果糖 磷酸 酯 酶 的 作用 下 水 解 成 6- 磷 酸 果 糖 ， 它 是 单 磷酸 已 糖 库 的 一 个 组 分 。 当 利用 乳 
酸 生 长 时 @， 乳 酸 吸 收 并 转化 成 丙酮 酸 后 ， 糖 异 生 的 第 一 步 就 是 在 丙酮 酸 羧 化 酶 的 作用 下 由 
丙酮 酸 生成 草 酰 乙酸 ( 见 图 2.10)。 然 后 草 酰 乙 酸 通 过 一 系列 与 前 面相 同 的 糖 异 生 途 径 的 反 
应 转化 成 PEP 以 及 其 它 的 糖 酵 解 中 间 物 。 当 然 ， 只 有 当 糖 酵 解 途径 上 的 两 个 关键 反应 由 磷 
酸 果 糖 激酶 和 丙酮 酸 激酶 作用 ， 并 在 正 反 应 方向 《〈 即 糖 酵 解 方向 ) 上 不 活跃 时 ， 糖 异 生 途 径 
才能 进行 。 这 可 通过 控制 这 些 酶 〈 它 总 是 存在 的 ) 的 活性 来 实现 。 通 过 使 2,6- 二 磷酸 果糖 
《磷酸 果糖 激酶 的 激活 剂 ) 缺乏 或 控制 1,6- 二 磷酸 果糖 (丙酮 酸 激 酶 的 激活 剂 ) 在 较 低 的 水 
平 就 可 以 达到 上 述 目的 〈Gancedo 和 Serrano，1989)。 当 利用 葡萄 糖 生 长 时 ， 糖 异 生 途径 的 
两 个 特异 酶 受到 葡萄糖 阻 过 。 
许多 生物 体能 合成 和 分 泌 胞 外 和 蛋白酶 ， 能 把 蛋白 质 水 解 成 低 分 子 量 的 肽 和 和 氨基酸 。 肽 在 
吸收 之 前 不 必 完 全 水 解 为 氨基 酸 ， 因 为 许多 微生物 能 够 运输 小 的 守 肽 ， 即 直到 五 肽 。 只 要 是 
在 细胞 内 ， 这 些 寡 肽 就 被 胞 内 的 蛋白 酶 或 肽 酶 水 解 。 胞 内 和 胞 外 的 有 蛋白酶 都 受 氮 的 阻 遇 ， 而 
且 和 蛋白 酶 的 合成 受过 量 的 碳 、 硫 和 磷酸 阻 遇 。 和 蛋 昌 质 水 解 后 ， 大 多 数 生 成 的 氨基 酸 分 解 代 谢 
始 于 转 氨 反 应 ， 即 通过 谷 氨 酸 转氨酶 将 w- 氮 基 氮 转移 至 c- 酮 戊 二 酸 : 


glutamate + w-keto acid — a-ketoglutarate — L-amino acid=0 (2.15) 
(FAR) ( a- Fel FR ) (oa- 酮 戊 二 酸 ) (ou- 氨 基 酸 ) 
接着 ， 谷 氮 酸 由 与 NAD 相关 的 谷 氨 酸 脱 氢 酶 进行 氧化 脱 氮 ， 重 新 生成 c- 酮 成 二 酸 : 
a-ketoglutarate + NH3 + NADH + H* — glutamate - NAD* — H,0=0 (2.16) 


@ 真菌 中 的 乳酸 代谢 始 于 在 乳酸 脱 氢 酶 的 作用 下 丙酮 酸 的 生成 。 真 菌 的 乳酸 脱 氢 酶 是 黄 素 蛋 白 不 能 催化 该 反应 的 
逆反 应 ， 此 时 ， 这 种 真菌 不 能 产生 乳酸 。 酵 母 中 的 乳酸 脱氧 酶 位 于 线粒体 的 膜 间 队 ， 含 有 辅酶 FDA， 此 酶 可 把 电子 直接 
传 给 细胞 色素 c， 并 受 乳 糖 诱发 葡萄 糖 抑制 。 


a2 


与 NAD 4A AY 4 SAAB ht A EBS ad FS B,C AN A AE YE SHG FE AE 
长 时 ， 其 活性 通常 很 低 。 脱 氨 之 后 的 碳 骨 架 断 开 生 成 丙酮 酸 、 乙 酰 辅酶 A 或 TCA 循环 的 一 
个 中 间 代 谢 物 〈 见 表 2.4)。 对 某 些 氨基 酸 而 言 ， 碳 骨架 断 开 过 程 包含 很 多 步 又， 如 色 氮 酸 
生成 乙酰 辅酶 A 包括 12 步 。 其 它 的 氨基 酸 脱 氨 后 可 直接 转化 成 其 最 终 代谢 物 。 


表 2.4 和 氨基酸 的 分 解 产物 


两 氨 酸 (1) ,丝氨酸 (1), 琉 基 丙 氨 酸 (3), 氨 基 乙 酸 (1) 


“乙酰 辅酶 A 苏 氨 酸 (1) , 赖 氨 酸 (10) , 亮 氨 酸 (8) , 酪 氨 酸 (7), 葵 基 丙 氨 酸 (8), 色 氢 酸 (12) 
a- 酮 成 二 酸 $F AMR 1) , A ARR ER (2) , HA UR (3) , 精 氨 酸 (4), 组 氨 酸 (5) 
琥珀 酰 辅酶 A 蛋氨酸 (9), 异 亮 氨 酸 (9) , GH LMR (8) 


天 冬 氨 酸 (1) ,天 冬 酰 胺 (2) 


TE: 表 中 带 括号 的 数字 表示 高 级 真 核 细 胞 的 分 支 途 径 。 根 据 式 (2.16)， 对 于 大 多 数 氨基 酸 来 说 ， 括 号 中 的 数字 常常 
是 一 个 分 支 途径 中 去 氨基 作用 的 结果 。 


2.4 生物 合成 反应 


细胞 合成 所 需 的 结构 单元 、 辅 酶 以 及 辅 基 的 数量 大 约 为 75 一 100 个 ， 这 些 都 是 由 生物 合 
成 途径 中 合成 的 12 种 前 体 代 谢 物 合成 的 (Ingraham 等 ,1983) 。 本 节 概 述 了 生物 合成 途径 ， 
重点 集中 在 这 些 生 物 合成 途径 在 细胞 生长 中 的 所 起 的 作用 以 及 操作 这 些 途 径 所 需 的 策略 。 因 
此 没有 详 述 该 途径 中 具体 的 单个 反应 步 又， 而 只 是 考虑 了 主要 的 生物 合成 途径 ， 如 氮 基 酸 、 
核 苷 酸 、 糖 类 、 和 氨基 糖 和 脂 类 的 生物 合成 途径 。 更 多 的 细节 可 参见 一 些 生物 化 学 书籍 和 有 关 
综述 文献 【如 Umbarger (1978) 关于 真菌 中 氨基 酸 的 生物 合成 ; Jone 和 Fink (1982) 关于 
真菌 中 氨基 酸 和 核 苷 酸 的 生物 合成 以 及 Neidhardt 等 (1987) 关于 细菌 中 结构 单元 的 生物 合 
成 的 广泛 处 理 ]。 
2.4.1 氨基酸 的 生物 合成 
众所周知 ， 氨 基 酸 是 合成 蛋白 质 的 结构 单元 ， 而 且 这 确实 是 细胞 中 常见 的 20 种 氨基 酸 
的 主要 功能 。 然 而 ， 所 基 酸 也 可 作为 其 它 结构 单元 和 重要 次 级 代谢 产物 如 青霉素 生物 合成 的 
前 体 物 。 和 氨基酸 生物 合成 的 第 一 步 是 氮 的 同化 吸收 ， 由 此 氮 以 所 的 形式 被 固定 和 结合 在 有 机 
分 子 中 。 这 主要 通过 利用 vc - 酮 成 二 酸 生物 合成 L- 谷 氨 酸 来 实现 : 
L-glutamate + NADP ”+ H2zO — a-ketoglutarate — NH3 — NADPH — H* =0 (2597) 
(L- 谷 氨 酸 ) 
这 个 反应 由 连接 NADP MAHAR (GDH) 来 催化 完成 。 这 个 酶 是 细胞 代谢 中 的 关键 
酶 一 一 而 且 不 同 于 NAD-GDH， 后 者 催化 相反 的 反应 〈2.16)， 这 两 种 酶 代表 不 同类 型 的 调 
节 机 制 。NADP-GDH  L-4# 2A AR AHL , 而 且 当 利用 葡萄 糖 生 长 时 活性 很 高 ， 而 NAD-GDH 
受 葡萄 糖 阻 遏 。 
L- 谷 氨 酸 生物 合成 的 另 一 路 线 是 经 过 所 谓 的 GS-GOGAT 途径 ， 由 两 步 组 成 : 第 一 步 ， 
L_ 谷 氨 酰 胺 作为 氨基 的 供 体 ， 把 氨基 给 c- 酮 戌 三 酸 ， 结 果 生成 两 个 L- 谷 氨 酸 : 
2L-glutamate + NADP* — a-ketoglutarate 一 L-glutamine - NADPH - H* =0 (2.18) 
(L-4 EAE ) 
催化 这 个 反应 的 是 谷 氨 酸 合成 酶 (缩写 为 GOGAT,， 来 自 先前 的 俗名 谷 氨 酰 胺 酰胺 -2- 酮 戊 
二 栈 氨 基 转 移 酶 )。 第 二 步 是 谷 氨 酰 胺 的 再 生 : 
L-glutamine + ADP + ~P — L-glutamate - NH3— ATP =0 (2.19) 
33 


此 反应 由 谷 氮 酰胺 合成 酶 (GS) 催化 完成 。 上 述 两 步 反 应 (2.18) 和 反应 (2.19) 的 总 和 
是 从 c- 酮 成 二 酸 到 LL- 谷 氮 酸 的 净 合 成 ， 这 与 反应 (2.17) 相似 ， 但 重要 差别 在 于 这 里 需要 
能 量 ， 即 每 生成 一 个 谷 氢 酰胺 需要 水 解 一 个 ATP。GS-GOGAT 途径 对 于 氮 的 同化 吸收 是 一 
个 高 亲和力 的 系统 ， 其 主要 在 低 氨 浓度 时 才 活 泼 ， 因 为 谷 氨 酸 合成 酶 受 氨 的 阻 遇 。L- 谷 氮 酰 
胺 在 好 几 种 含 氮 化 合 物 的 生物 合成 中 都 可 作为 氨 〈 氮 ) 的 供 体 ， 这 在 整个 细胞 代谢 中 是 一 个 
重要 的 分 支点 。 谷 氮 酰 胺 合成 酶 受 严格 的 调控 : 它 受 L- 谷 所 酰胺 的 阻 遇 ， 同 时 它 也 受 (起 
因 可 以 追溯 到 L- 谷 氨 酰 胺 ) 代谢 途径 的 许多 末端 产物 (如 AMP, GTP, L-HARMA L-4A 
ARR) 的 抑制 。 许 多 生物 体 也 可 以 利用 硝酸 盐 或 亚 硝 酸 盐 作为 惟一 的 氮 源 ， 这 些 化 合 物 在 同 
化 吸收 前 都 要 转化 成 氮 ， 因 此 所 是 整个 氮 代 谢 中 的 一 个 中 心 化 合 物 。 将 亚 硝酸 盐 还 原 为 氨 要 


] 
谷 氨 酸 族 (5) wx - 酮 成 - 酸 < 上 ~ 谷 氨 酸 所 二 ~ sam 一 3 > 精 氨 酸 
5 3 
c- 氨 基 已 二 酸 AR 


天 冬 氨 酸 族 (5) 


芳香 族 (G3) 磷酸 炳 醇 式 丙酮 酸 +4- 磋 酸 赤 花 糖 -~ 分 支 酸 —— 


ys 
丙酮 酸 族 (3) ae 
) Sh 
rita reat 


3 


丝氨酸 族 (3) 3- 磷酸 甘油 酸 


组 氨 酸 族 (1) 5- mem 


Al 2.12 真 核 体内 氨基 酸 的 生物 合成 
根据 合成 起 点 的 特定 前 提 代 谢 物 和 氨基 酸 ， 这 些 氨基 酸 可 以 分 为 五 组 。L- 组 所 酸 因为 具有 复杂 的 生物 
合成 途径 ， 与 其 它 的 氨基 酸 均 不 同 组 。 图 中 数字 表示 代谢 途径 中 所 需 的 反应 步骤 。 除 了 LR, 
这 些 数 字 对 于 细菌 的 代谢 也 是 适用 的 。 在 细菌 中 ，L- 赖 氨 酸 通过 二 氮 基 庚 二 酸 (细菌 细胞 壁 的 重要 构 
成 单元 ) 由 天 冬 氨 酸 经 过 9 步 合成 


34 


经 过 硝酸 盐 、 低 硝酸 (hyponitrate，N20>) 、 一 氧化 二 所 (NO) MHA 〈(NH2OH)。 在 这 
些 还 原 反 应 中 氢 的 供 体 为 NADPH。 硝 酸 盐 和 亚 硝酸 盐 的 吸收 可 能 与 胞 液 中 这 些 物 质 的 还 原 
相 耦 合 。 

已 经 阐明 了 许多 真 核 生物 和 原核 生物 中 所 有 20 种 常见 氨基 酸 的 生物 合成 途径 ， 图 2.12 
概括 了 这 些 途 径 。 这 些 生物 合成 路 线 有 一 些 差别 ， 其 中 赖 氨 酸 生物 合成 最 重要 。 在 细菌 和 高 
等 植物 中 ， 赖 氨 酸 由 丙酮 酸 和 天 门 冬 氢 酸 -8- 半 醛 中 间 再 经 由 二 氨基 庚 二 酸 (细菌 细胞 壁 合 
成 的 重要 结构 单元 ) Akh. MERA, MARA w- 酮 成 二 酸 经 由 w- 氮 基 己 二 酸 合成 。 

表 2.5 总 结 了 细菌 和 真菌 中 氨基 酸 生 物 合成 的 代谢 消耗 。L -蛋氨酸 和 LL- 组 氨 酸 的 生物 合成 
需要 转移 一 个 一 碳 基 团 ， 分 别 由 N3- 甲 基 四 氢 叶 酸 和 10- 甲 酰 四 氢 叶 酸 提供 〈 都 转化 成 四 氢 叶 
酸 )。 这 两 种 不 同形 式 的 四 氢 叶 酸 可 以 相互 转化 ， 为 了 分 析 代 谢 消耗 ， 方 便 的 方法 是 使 用 一 个 
共同 的 基础 。 在 表 2.5 中 ，5,10- 次 甲 基 四 氢 叶 酸 (5,10-MTHF) 转化 成 四 氧 叶酸 (THF) 用 
做 共同 的 基础 ， 因 为 这 个 转化 与 从 -丝氨酸 合成 L- 甘 氨 酸 相 联系 。 然 而 在 L- 甘 氨 酸 生物 合成 
中 生成 的 5,10-MTHF 的 数量 一 般 不 能 满足 对 一 碳 转移 基 团 的 需求 。 另 外 所 需要 的 一 碳 转移 基 
团 最 可 能 的 来 源 是 甘氨酸 中 的 w- 碳 ， 甘 氨 酸 在 甘氨酸 氧化 酶 作用 下 按 式 (2.20) 降解 : 

CO +NH3+5,10-MTHF+NADH+H+ -L-glycine-THF-NAD+=0 (2.20) 
(L-H AR) 
表 2.5 细菌 和 真菌 中 20 种 氨基 酸 生物 合成 的 代谢 消耗 


a | =i 


L-ARR 1pyr 0 0 0 0 
L- 精 氢 酸 lakg 1 0 0 
L- 天 冬 酰胺 酸 loaa 0 0 0 
L- 天 冬 氨 酸 Taas 0 
LH ARO 1pga 1 0 log 
L- 谷 氨 酸 lakg 0 0 0 
L- 谷 氢 酸 盐 lakg 0 0 0 
L- 氨 基 乙 酸 Ipga 1 1 0 
LAA lpenP 3 一 并 0 
L-FEAR loaa, lpyr 0 0 0 
L- 亮 氨 酸 2pyr, lacCoA 1 0 0 
L- 赖 氨 酸 (真菌 ) lakg, lacCoA 2 0 0 
L- 赖 氨 酸 1pyr ,loaa 0 0 0 
LEAR loaa 0 =1 =F 
LEA AR 2pep, leryP 0 0 0 
LH Se take 0 
L- 丝 氨 酸 lpga 1 0 0 
L- 苏 氨 酸 loaa 0 0 0 
fam 2pep, leryP, lpenP 2 0 0 
MAR 2pep, leryP 1 0 0 
RAR 2pyr 0 0 


@ acCoA 一 乙酰 辅酶 A; eryP—4-8 2 a BE; fruP—6-F MR; gluP 一 6- 磷 酸 葡萄 糖 ; akg—a-M KR — MR; 
glyP 一 3- 磁 酸 甘油 醛 ; oaa 一 草 酰 乙酸 ; penP 一 5- 磷 酸 核糖 ; pep—RRMM BAMA; pga 一 3- 磷 酸 甘 油 ; pyr 一 丙酮 酸 。 

© 对 于 上 述 反 应 一 个 ATP 水 解 为 一 个 AMP 过 程 需 消耗 两 个 ATP。 

@ 5,10- 二 亚 甲 基 四 水 合 叶酸 是 作为 碳 供 体 转 化 为 四 水 合 叶酸 。 其 它 形式 的 四 水 合 叶酸 作 生 物 合成 二 -蛋氨酸 和 LL- 组 
氨 酸 的 基质 。 

@ 硫酸 盐 是 S 的 来 源 ， 并 在 同化 前 还 原 为 H2S 

© 假设 L- 丝 氨 酸 直接 氢 硫 化 。 

35 


2.4.2 核酸、 脂肪酸 和 其 它 结构 单元 的 生物 合成 

以 核糖 核 苷 酸 和 脱氧 核糖 核 苷 酸 形式 存在 的 核 苷 酸 分 别 是 RNA #1 DNA 的 结构 单元 ， 
然而 它们 在 细胞 中 还 有 许多 其 它 功 能 。 它 们 是 一 些 辅助 因子 (如 : NADH, NADPH, 
FAD, CoA) 和 其 它 一 些 核 苷 酸 (如 在 整个 细胞 代谢 中 具有 特殊 功能 的 ATP) 的 主要 组 分 。 
核 苷 酸 由 三 部 分 组 成 : (1) 一 个 杂 环 的 含 氮 碱 基 ， 味 叭 或 喀 啶 ; (2) 一 个 糖 (RNA 中 的 核 
糖 和 DNA 中 的 2- 脱氧 核糖 ); (3) 一 个 磷酸 基 团 。DNA 的 碱 基 是 味 叭 [REY (A). SE 
me (G)] mene [胸腺 喀 啶 (T) 和 胞 喀 啶 (C)]， 在 RNA 中 存在 其 中 的 三 种 碱 基 ， 但 第 
四 种 胸腺 喀 啶 (T) 被 尿 喀 啶 (U) 所 代替 。 

脱氧 核糖 核 苷 酸 (d4AMP，dGMP，dUMP 和 dCMP) 是 由 相应 的 核糖 核酸 (AMP, 
GMP, UMP 和 CMP) 通过 由 氧 取代 2 -OH 基 团 而 来 的 〈 氢 是 由 NADPH 提供 )，dTMP 
是 dUMP 通过 甲 基 化 而 得 到 的 。 核 苷 酸 是 由 5$- 磷 酸 核糖 和 3- 磷 酸 甘 油 酸 (用 于 味 叭 生物 合 
Mm) 或 草 酰 乙 酸 (用 于 喀 啶 生物 合成 ) 合成 的 。 表 2.6 列 出 了 核 苷 酸 生 物 合成 的 代谢 消耗 。 


表 2.6 生物 合成 核 背 酸 的 代谢 消耗 


<A 
lpga, lpenP 3 
GMP lpga, lpenP 3 
UMP loaa, lpenP 0 
CMP loaa, lpenP 0 
dAMP Ipga, lpenP 3 
dGMP lpga, lpenP 3 
dTMP® loaa, lpenP 0 
loaa, lpenP 0 


@ 相关 术语 查阅 表 2.5. 

@ dTMP 生物 合成 的 消耗 等 同 于 从 dUMP 的 合成 。dTMP 也 可 由 dCMP 合成 ， 但 需要 更 多 的 消耗 ， 也 就 是 9 个 
ATP. XfFE.coli ，Inhraham et al. (1983) 指出 它 的 dTMP 75% 来 自 于 dCMP，25% 来 自 于 dUMP. 

脂 类 是 一 种 异 源 化 合 物 ， 包 括 : (1) 酰基 甘油 ; (2) 磷脂 ; (3) 固 醇 。 这 些 脂 类 组 分 的 
主要 结构 单元 为 脂肪 酸 ， 它 存在 于 酰基 甘油 、 磷 脂 和 固 醇 酯 (IER) 中 。 主 要 的 脂 
肪 酸 有 : 棕榈 酸 (C16: 0)， 棕 桐油 酸 (C16: 1)， 硬 脂 酸 〈(C18: 0), WHR (C18: 1)， 亚 
THR (C18: 2) 和 亚麻 酸 〈C18: 3)。 在 真菌 中 ， 棕 榈 酸 、 油 酸 和 亚 油 酸 要 占 735% 以 上 
(Ratledge 和 Evans，1989) ， 而 细菌 中 最 常见 的 脂肪 酸 为 棕榈 酸 、 棕 桐油 酸 和 油 酸 (Ingra- 
ham 等 , 1983)。 饱 和 脂肪 酸 的 生物 合成 是 通过 在 活化 了 的 乙酰 辅酶 A 上 连续 添加 两 个 碳 单 
位 而 实现 的 。 这 些 碳 单位 是 由 两 二 酸 单 酰 辅 酶 A 提供 的 ， 而 两 二 酸 单 酰 辅酶 A 是 由 乙酰 辅 
Ai A 羧 化 而 成 的 (Walker 和 Woodbine，1976)。 在 酵母 (也 可 能 在 其 它 真 菌 ) 中 ,未 端 产 
物 为 脂肪 酰 辅 酶 A 酯 ， 而 不 是 脂肪 酸 (Ratledge 和 Evans，1989)。 生 物 合 成 ”个 链 的 脂 酰 
辅酶 A 的 总 化 学 计量 式 为 


CH3(CH3),,-CO-CoA +5 : = ZADP +25 

+ —2NADP* ~ B acetyl-CoA ~">*ATP - (n -2)NADPH —(n-2)H*=0 (2.21) 

细菌 中 ， 单 不 饱和 脂肪 酸 的 合成 是 通过 厌 氧 途径 进行 的 ， 从 这 个 名 字 中 就 可 知道 ， 这 个 途径 

在 缺 氧 条 件 下 才 起 作用 。 前 已 提 有 及， 只 有 当 4 个 两 二 酸 单 酰 辅酶 A 已 经 加 到 增长 着 的 碳 链 

上 后 ， 这 个 途径 才 开 始 进行 。 生 成 的 化 合 物 8- 羟 癸 酰 基 -ACP 成 为 生物 合成 饱和 脂肪 酸 和 单 
36 


RAZA + 8104 22 oe 


P 


不 饱和 脂肪 酸 之 间 的 一 个 分 支点 。 在 BPRS ESE EG MK EM EAP, THAT —+ B, y- 
顺 式 双 键 ， 然 后 8，Y- 不 饱和 酰基 延长 生成 棕榈 油 酸 。 在 真 核 生 物 中 ， 第 九 个 碳 原子 上 的 双 
PETE Ci6 或 Cigs 饱 和 脂肪 酰 辅酶 A 已 经 合成 后 才 引 入 的 (Walker 和 Woodbine, 1976; Ra- 
tledge 和 下 vans，1989)。 这 个 转化 是 由 结合 在 内 脂 网 上 的 特定 酶 系 催 化 完成 的 ， 反 应 需要 
NADH 和 分 子 氧 ， 反 应 式 如 下 
oleoyl-CoA+2H2O+NAD- -stearol-CoA -0 - NADH - H* =0 (2.22) 
( 油 酰 辅 酶 A) ( 硬 脂 酰 辅 酶 A) 
细菌 中 不 具有 多 不 饱和 脂肪 酸 ， 而 真 核 生物 能 产生 大 量 的 多 不 饱和 脂肪 酸 ， 多 不 饱和 脂肪 酸 
的 合成 可 通过 与 式 (2.22) 相似 的 反应 来 完成 。 另 外 ， 单 不 饱和 脂肪 酸 在 结合 一 个 磷脂 后 可 
以 进一步 减 小 饱和 度 (Walker 和 Woodbine, 1976; Ratledge #l Evans, 1989). 

脂 类 组 分 的 其 它 重 要 结构 单元 有 : (1) 3- 磷 酸 甘油 ， 它 是 磷脂 和 三 酰 甘油 酯 的 重要 组 成 
部 分 ; (2) 磷脂 的 醇 部 分 ; (3) 固 醇 。3- 磷 酸 甘油 是 从 EMP 途径 中 的 磷酸 二 羟 两 酮 直接 转 
化 来 的 。 在 真菌 中 最 常见 的 磷脂 醇 有 : 胆 碱 ， 胆 胺 和 肌 醇 (Rose，1976)。 因 此 在 酿酒 酵母 
中 ， 和 磷脂 酰 胆 碱 (PC) ， 胆 胺 磷脂 (PE) 和 磷脂 酰 肌 醇 (PI) 占 整个 脂 类 的 90% 以 上 (Ra- 
tledge 和 Evans，1989)。 胆 胺 和 胆 碱 不 能 以 游离 的 形式 合成 ， 相 应 的 磷脂 是 从 其 它 的 磷脂 
生成 的 。 因 此 PE 是 由 磷脂 酰 丝氨酸 (一 种 含量 很 低 的 以 L -丝氨酸 为 醇 部 分 的 磷脂 ) 直接 脱 
羧 生 成 的 ，PC 是 PE 连续 甲 基 化 而 生成 的 。PI 是 由 游离 的 肌 醇 相互 结合 而 生成 的 ， 而 肌 醇 
是 6- 磷 酸 葡 萄 糖 经 过 一 个 两 步 途径 生成 的 〈《Umezawa 和 Kishi，1989)。 首 先 磷 酸 肌 醇 合 成 
酶 用 NAD+ 为 电子 受 体 将 6- 磷 酸 和 葡萄糖 转化 成 1- 磷酸 肌 醇 ， 然 后 肌 醇 -1- 磷 酸 酯 酶 将 1- 磷 酸 
肌 醇 转化 成 肌 醇 。 在 酿酒 酵母 中 麦角 国 醇 占 固 醇 的 90% 以 上 。 到 麦角 固 醇 的 途径 要 途经 鲨 炳 ， 
它 是 固 醇 生 物 合成 中 常见 的 一 个 中 间 物 。 目 前 酿酒 酵母 中 生成 获 烯 的 步骤 已 研究 得 很 清楚 ， 但 
是 由 警 烯 进一步 转化 成 麦角 固 醇 (或 其 它 固 醇 ) 的 详细 步骤 还 不 很 清楚 。 细 菌 中 最 重要 的 磷脂 
种 类 有 : 胆 胺 磷脂 (75% 一 85% ) ， 磷 脂 酰 甘油 (10% ~20%) 和 双 磅 脂 酰 甘油 (5% ~15%). 
这 三 种 磷脂 在 直到 CDP- 二 酰基 甘油 以 前 的 途径 是 相同 的 ， 然 后 途径 开始 分 支 。 胆 胺 磷脂 是 经 
磷脂 酰 丝氨酸 脱羧 合成 的 ， 而 磷脂 酰 丝氨酸 是 由 [丝氨酸 取代 CDP 而 生成 的 。 用 3- 磷 酸 甘 油 
取代 CDP- 二 酰基 甘油 中 的 CDP， 接 着 将 磷酸 与 甘油 部 分 中 的 连接 处 断 开 即 生成 了 磅 脂 酰 甘油 。 
最 后 ， 两 个 磷脂 酰 甘 油 缩合 生成 双 磷 脂 酰 酶 甘油 并 同时 释放 出 一 个 甘油 。 

合成 糖 原 的 结构 单元 为 UDP- 葡 萄 糖 ， 同 时 它 也 是 合成 大 肠 杆菌 和 其 它 革 兰 阴 性 菌 中 脂 
多 糖 层 以 及 真菌 细胞 壁 的 结构 单元 。UDP- 葡 萄 糖 由 1- 磷 酸 和 葡萄糖 在 焦 磷 酸化 酶 作用 下 生 
成 。 当 已 糖 结合 进 一 个 聚合 物 时 释放 出 UDP， 因 此 在 一 个 延伸 的 糖 链 中 加 入 一 个 己 糖 单 磷 
酸 的 总 消耗 是 一 个 UTP (相当 于 一 个 ATP)。 构 成 细菌 细胞 壁 的 肽 聚 糖 的 生物 合成 需要 5 
个 单 体 ; UDP-N- 乙 酰 葡萄 糖 胺 (UDP-NAG)，UDP-N- 乙 酰 胞 壁 酸 (UDP-NAM)， 丙 氨 
Mm 〈(L- 型 和 D- 型 )， 二 氨基 庚 二 酸 和 谷 氨 酸 。UDP-N- 乙 酰 葡 萄 糖 胶 〈 它 也 是 真菌 中 合成 几 
丁 质 的 结构 单元 ) 是 由 6- 磷酸 果 糖 和 乙酰 辅酶 A 合成 的 ，L- 谷 氨 酰 胺 为 氨基 供 体 ， 总 化 学 
计量 式 如 下 

UDP-NAG + L-glutamate + CoA + 一 PP 一 fructose-0-phosphate 一 acetyl-CoA 

(L- 谷 氨 酸 盐 ) (6- 磷 酸 果糖 ) 
— L-glutamine - UTP =0 (2223) 
“4 UDP-Gle-NAc 结合 成 肽 聚 糖 或 几 丁 质 时 ， 释 放出 UDP， 因 此 合成 一 个 几 丁 质 单 体 的 总 
能 耗 为 UTP。 糖 类 结构 单元 和 脂 类 的 生物 合成 的 代谢 消耗 列 于 表 2.7 中 。 
37 


2.7 生物 合成 脂 类 和 糖 类 结构 单元 的 代谢 消耗 


1 glyP 

8 acCoA 
8 acCoA 
9 acCoA 
9 acCoA 
9 acCoA 
9 acCoA 
1 pga 

1 pga 

1 gluP 

18 acCoA 
1 gluP 

1 gluP 

1 fruP ,1 acCoA 

1 fruP,1 pep, 1 acCoA 
1 oaa ,1 pyr 


3- 磷 酸 甘 油 
棕榈 酰 辅酶 A 
棕榈 油 酰 辅酶 A2 
硬 脂 酰 辅酶 A 
油 酰 辅 酶 A 
亚 油 酰 辅酶 A 


cooocorrocoooocmcwmlhlCUcOm 


eco oacocoo @woedcoeoqocoeose 


UDP- 半 乳糖 
UDP-NAG 
UDP-NAM 

二 氨基 庚 二 酸 盐 
D 相关 术语 查阅 表 2.5。 

QO 棕榈 油 酰 辅酶 A 的 生物 合成 消耗 是 通过 厌 氧 途径 。 

@ 由 于 从 获 烯 到 麦角 固 醇 的 途径 尚未 完全 了 解 ， 因 此 我 们 认为 麦角 固 醇 在 生物 合成 的 代谢 消耗 等 同 于 获 烯 的 值 。 


2.5 聚合 反应 


细胞 生物 质 中 的 大 分 子 可 分 成 以 下 几 类 : (1) RNA; (2) DNA; (3) 蛋白 质 ; (4) 糖 
类 ; (5) AAA (6) 脂 类 。 大 分 子 组 成 随 生 物种 类 的 不 同 而 不 同 ， 对 于 一 个 已 给 的 生物 ， 
其 大 分 子 组 成 随 比 生长 速率 和 环境 条 件 而 改变 。 图 2.13 列 出 了 细菌 和 真菌 中 最 重要 的 大 分 
子 库 与 比 生长 速率 之 间 的 困 数 关系 。 细 菌 中 ， 和 蛋白 质 和 RNA 占 生 物质 的 80% 以 上 ， 稳 定 的 
RRNA 含量 随 比 生长 速率 而 增加 ， 而 蛋 白 质 含量 随 比 生长 速率 而 降低 ， 而 其 它 的 库 中 组 分 如 
DNA, ARE, ARSE, BEBE ( 肽 聚 糖 ) 以 及 糖 类 〈 主 要 为 糖 原 ) 则 基本 恒定 。 在 真菌 中 
则 存在 很 大 不 同 ， 总 糖 库 OP MAREN ERA) 占 生物 质 的 很 大 比例 ， 约 20% 一 30%， 而 
且 这 个 比例 随 比 生长 速率 而 降低 。 糖 类 库 主 要 存在 于 细胞 壁 中 ， 这 说 明 随 比 生长 速率 的 不 断 
增加 而 生物 质 比 例 不 断 降 低 。 如 同 细菌 一 样 ， 真 菌 中 RNA 含量 随 比 生长 速率 而 增加 ， 但 与 
细菌 相反 ， 真 菌 中 蛋白 质 组 分 也 随 比 生长 速率 而 增加 。 在 细菌 和 真菌 中 稳定 的 RNA 的 这 种 
线性 增加 ， 在 其 它 许 多 不 同 种 类 生物 中 也 存在 ， 据 报道 ， 酿 酒 酵母 中 蛋白 质 含量 随 比 生长 速 
率 的 增加 而 有 个 慢 的 增加 。 

细胞 RNA 总 库 由 信使 RNA (mRNA)， 核 糖 体 RNA (rRNA) 和 转运 RNA (tRNA) 
组 成 。 在 大 肠 杆菌 中 ， 当 比 生长 速率 为 1.0 h AT, RNA 组 分 为 5% mRNA，18% tRNA, 
77% rRNA (Ingraham 等 , ,1983)。 在 低 比 生长 速率 下 ， 当 rRNA 含量 消耗 时 ，tRNA 的 相 
对 含量 增加 。 在 Neurospora crassa 中 也 可 看 到 类 似 的 情况 ， 每 个 核糖 体 中 tRNA 分 子 的 数 
目 随 比 生长 速率 的 增加 而 降低 (Alberghina 等 ,1979)。 然 而 ， 即 使 在 低 的 比 生长 速率 条 件 
下 ，rRNA 也 占 稳定 的 RNA ( 即 rRNA 5 tRNA 之 和 ) 7$S% 以 上 上。 因此， 稳定 的 RNA JE 
是 细胞 内 核糖 体 水 平 的 一 个 很 好 的 度量 标准 。 黑 曲霉 中 核糖 体 由 S3% 的 rRNA 和 47% 的 蛋 
白质 组 成 (Berry 和 Berry，1976) ， 大 肠 杆菌 中 核糖 体 含 有 60% 的 rRNA 和 40% 的 蛋白 质 。 
核糖 体 在 蛋白 质 合成 中 起 了 重要 的 作用 ， 核 糖 体 和 一 些 酶 一 起 构成 了 所 谓 的 蛋白 质 合成 系统 
(protein synthesizing system, PSS) (Ingraham %, 1983). 

38 


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25 


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时 间 /Hi! 
(a) (b) 


图 2.13 细菌 和 真菌 中 最 重要 的 大 分 子 库 随 比 生长 速率 的 变化 
(a) HE. coli 中 的 蛋白 质 库 (&), RNAF (@) 以 及 DNA 库 ( 口 )， 数 据 来 自 于 Ingraham et al (1983); 
(b) #£ P. chrysogenum 中 的 蛋白 质 库 ( 口 )，RNA (M) 以 及 糖 类 库 (4), B4BHKAF Nielesen (1997) 


由 于 细胞 的 蛋白 质 合 成 耗 能 甚 多 〈 见 表 2.8) ， 因 此 细胞 中 存在 PSS 的 严密 控制 。 所 以 ， 
细胞 根据 需要 调节 其 核糖 体 水 平 。 这 也 解释 了 为 什么 稳定 的 RNA 库 与 比 生长 速率 呈正 相关 
( 见 图 2.13)。 当 环境 条 件 发 生动 态 变化 以 及 改变 实验 条 件 使 比 生 长 速率 下 降 时 ， 在 稳定 的 
RNA 含量 与 比 生长 速率 之 间 可 以 观察 到 类 似 的 关系 : 直到 核糖 体 的 含量 已 经 适应 于 新 的 生 
长 条 件 时 ，rRNA 的 合成 才 停止 (Sturani 等 ，1973)。 在 低 的 比 生长 速率 下 ，N.crassa 的 
核糖 体 水 平 接近 定 值 ， 但 核糖 体 的 效率 随 比 生长 速率 的 升 高 而 下 降 (Alberghina 等 ,1979)。 
因此 ，PSS 的 净 效 率 随 比 生 长 速率 趋 于 零 而 继续 下 降 。 在 A.nidulan (Bushell 和 Bull, 
1976) 和 大 肠 杆菌 (Ingraham 等 , 1983) 中 也 观察 了 类 似 的 结果 。 因 此 ,在 低 比 生长 速率 
时 ， 细 胞 中 具有 一 些 未 使 用 的 和 未 被 有 效 使 用 的 代谢 机 能 。 一 旦 环境 条 件 发 生 改 变 ， 该 机 能 
可 被 迅速 激活 。 


表 2.8 不 同 种 类 生物 中 细胞 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 〈 以 摩尔 分 数 表示 ) 


@ 


L- 丙 氨 酸 


L- 精 氢 酸 

L- 天 冬 酰 氨 酸 /全 -天 冬 氨 酸 盐 12.7% 
L- 胱 氨 酸 0.9% 
LGARH/LFAR 13.4% 
L- 氨 基 乙 酸 5.6% 
L-AAR 9.1% 
L-FEAR 5.2% 
L- 亮 氨 酸 7.9% 
L- 赖 氨 酸 3.1% 
L- 和 蛋氨酸 4.7% 
L- 葵 基 丙 氮 酸 4.0% 
L-fii AR 4.3% 
L-4am 5.2% 
L- 苏 氨 酸 1.4% 
L- 色 氢 酸 4.0% 
L-MAR 4 


L-i AR 
® AXE. coli 的 数据 来 自 于 Ingraham et al (1983). 
@ HP. chrysogenum 的 数据 来 自 于 Henriksen et al (1996). 
@ HS. cerevisiae 的 数据 来 自 于 Cook (1958). 


39 


mRNA 翻译 成 蛋白 质 主要 发 生 在 由 60S 和 40S 两 个 亚 基 组 成 的 细胞 质 80S 核糖 体 上 。 
真 核 生 物 中 ， 一 些 蛋 白质 ， 如 FiFu-ATP 酶 ， 细 胞 色素 b M TCA 循环 中 的 某 些 酶 ， 是 在 线 
粒 体 中 合成 的 ， 而 线粒体 包含 DNA 和 核糖 体 。 翻 译 过 程 包括 三 个 独立 的 阶段 : 起 始 ， 延 长 
和 终止 。 起 始 阶段 是 由 相当 多 数量 的 特定 蛋白 因子 催化 的 〈 至 少 10 个 ) ， 其 结果 是 一 个 80S 
起 始 复合 物 的 形成 。 起 始 复合 物 形成 后 ， 通 过 在 延伸 着 的 肽 链 上 连续 添加 氨基 酸 使 肽 链 延 
长 。 延 长 阶段 包括 四 步 : (1) APRS KH tRNA 连接 ; (2) 氮 基 酰 -tRNA 与 核糖 体 的 结 
4; (3) 形成 肽 键 ; (4) 移 位 ， 导 致 肽 基 -tRNA 在 核糖 体 中 的 移动 及 伴随 着 mRNA 移动 一 
个 密码 子 。 氮 基 栈 -tRNA 的 激活 与 形成 需要 将 ATP 水 解 成 AMP， 和 氨基 酰 -tRNA BABE 
糖 体 上 需要 GTP 水 解 成 为 GDP， 肽 基 -tRNA 在 核糖 体 中 的 移 位 需 GTP 水 解 成 GDP。 因 
此 ， 在 延伸 的 肽 链 上 添加 一 个 氨基 酸 共 需 要 4 个 ATP 等 价 物 。 另 外 ,在 mRNA 合成 与 校 
对 等 过 程 中 还 需要 一 些 自由 能 ， 总 计 是 每 结合 一 个 氨基 酸 约 需 0.3 ATP (Ingraham 等 ， 
1983)。 对 于 微生物 细胞 的 氨基 酸 组 分 (LE 2.8)， 摩 尔 质量 约 为 110gM:mol 蛋白 质 结 合 氮 
基 酸 ，lg 蛋白 质 的 聚合 总 化 学 计量 式 为 〈 所 有 计量 系数 以 mmol 表示 ) 

“Te of protein” + 39.1 ADP + 39.1~P—9.1 amino acid —- 39.1 ATP=0 (2.24) 
(ig AK) (氨基 酸 ) 

核 DNA 转录 成 RNA 需要 三 种 RNA 聚合 酶 来 完成 : RNA RAMA, AFAR rRNA; 
RNA 聚合 酶 B， 用 于 合成 mRNA; RNA 聚合 酶 C， 负 责 合 成 长 NA。 单 磷酸 核 苷 酸 结合 形 
RRNA 之 前 ， 必 须 转 化 成 三 磷酸 核 苷 酸 ， 这 对 每 个 核 苷 酸 来 说 需要 两 个 ATP。 而 且 ,， 在 
RNA 合成 过 程 中 ， 最 初 转录 产物 的 一 个 片段 ， 在 转录 后 需 被 移 走 并 水 解 成 为 单 磷酸 核 苷 酸 ， 
重新 激活 这 些 核 昔 酸 也 需要 两 个 ATP。Ingraham 等 (1983) 认为 大 约 有 20% 的 初始 转录 物 
被 丢弃 ， 因 此 结合 一 个 核糖 核 苷 酸 CEA RRR) 的 能 量 消 耗 为 2.4 个 ATP。 酿 酒 酵母 中 
以 1mol 为 基准 的 全 部 RNA 的 核 苷 酸 组 成 为 : 23.6% AMP, 26.2% UMP, 28.6% GMP, 
19.6% CMP (Mounolou，1975)， 因 此 ， 可 得 RNA 的 摩尔 质量 为 323gMmol 的 RNA 结合 
核 苷 酸 。 因 此 ， 合 成 lg RNA 的 总 化 学 计量 式 为 〈( 所 有 计量 系数 以 mmol 表示 ) 

“lg of RNA” +7.44 ADP+7.44~P-0.79 AMP -0.81 UMP -0.89GM 
—0.61 CMP-7:44 ATP=0 (02225) 


DNA 复制 是 一 个 复杂 的 过 程 。 在 DNA 聚合 酶 能 够 复制 DNA 双 链 之 前 ， 双 螺旋 结构 必 
须 被 打开 ， 这 需要 一 组 特殊 的 酶 来 完成 ， 而 且 这 个 过 程 需要 输入 吉 布 斯 自由 能 来 打开 互补 碱 
基 之 间 的 氢 键 。 螺 旋 中 缠绕 的 双 链 的 分 离 在 单 链 中 形成 环 ， 称 为 超 螺 旋 卷 曲 。 为 避免 在 已 解 
开 的 DNA 链 上 产生 超 螺旋 卷曲 ，DNA 旋转 酶 定期 地 打开 其 中 一 个 链 上 的 磷酸 酯 键 ， 以 允 
许 相 对 的 链 能 自由 旋转 。 旋 转 之 后 ， 同 样 的 酶 使 之 重新 形成 键 。 解 开 双 螺旋 的 总 能 耗 为 每 对 
碱 基 两 个 ATP， 即 DNA 每 结合 一 个 核 苷 酸 需要 1 个 ATP (Ingraham 等 , 1983)。 双 链 一 旦 
分 离 ，DNA 聚合 酶 就 开始 复制 ， 即 核 苷 酸 (活化 成 三 磷酸 的 形式 ) 的 组 装 。DNA 的 复制 是 
非常 精确 的 ， 即 复制 1028 个 核 苷 酸 可 能 出 现 一 个 错误 。 这 种 准确 性 部 分 是 通过 DNA 聚合 酶 
中 的 一 种 固有 的 外 切 核酸 酶 活性 来 实现 的 。 这 种 DNA 聚合 酶 通过 向 后 移动 而 除去 其 自己 的 
错 配 ， 而 且 只 有 它 后 面 是 一 个 正确 匹配 的 碱 基 对 时 ， 它 才能 沿 前 进 方向 催化 复制 地 进行 。 校 
正 所 需 的 能 耗 估 计 是 每 个 核 苷 酸 0.4 个 ATP (Ingraham 等 , 1983)。 因 此 ， 结 合 一 个 脱氧 核 
RIA (作为 单 磷酸 ) 的 总 能 耗 为 3.4 个 ATP。 不 同 种 类 生物 间 的 细胞 DNA 的 组 成 只 
有 少许 差别 ， 组 成 近似 是 24.5% dAMP, 24.5% dTMP, 25.5% dGMP, 25.5% dCMP。 
由 此 得 出 DNA 的 摩尔 质量 为 310gMmol DNA 结合 核 苷 酸 ， 而 合成 lg 结合 DNA BHR 

40 


+ Be SR RL Epes ee, ee 


化 学 计量 式 为 《所 有 计量 系数 以 mmol 表示 ) 

“1g of DNA” "+11.0ADP+11.0~P-0.79 dAMP -0.79 dTMP 

-0.82 dGMP -0.82 dCMP - 11.0 ATP=0 (2.26) 

磷脂 的 生物 合成 首先 是 由 脂 酰 辅 酶 A 与 3- 磷 酸 甘 油 的 1 碳 和 2 碳 结合 生成 磷脂 酸 ， 按 
着 由 CTP 活化 而 生成 CDP- 二 脂 酰 甘 油 。 最 后 ， 醇 结合 到 磷酸 基 团 上， 释放 出 CMP。 因 此 ， 
从 结构 单元 合成 磷脂 的 能 耗 是 从 CTP 转化 为 CMP， 这 对 应 于 两 个 ATP。 为 了 计算 合成 磷 
脂 生 物 合成 总 代谢 消耗 ， 需 要 知道 不 同 种 类 磷脂 的 相对 含量 和 脂肪 酸 的 相对 含量 。 酿 酒 酵母 
中 磷脂 的 组 分 有 : 24 50% PC, 20% PI 和 30% PE， 大 肠 杆菌 中 约 95% 的 磷脂 是 PE ABE 
脂 栈 甘油， 两 种 成 分 约 等 量 存 在 。 总 的 脂肪 酸 组 分 依 生 物 的 不 同 而 不 同 ， 也 取决 于 环境 条 件 
[ 见 Ratledge 和 Evans (1989) 的 关于 酵母 脂肪 酸 组 分 的 综述 ]。 酿 酒 酵母 中 的 典型 组 分 为 : 
15.6% C16: 0, 31.4% C16: 1, 5.1% C18: 0, 32% C18: 1#13.4% C18: 2. ERA 
霉 中 总 脂肪 酸 组 分 为 : 8% C16: 0, 7% C18: 0, 24% C18: 1, 59% C18: 2 和 2% C18: 3 
(Meisgeier 等 ，1990)。 大 肠 杆菌 中 的 脂肪 酸 组 分 为 : 443% C16: 0, 33% C16: 1 和 24% 
C18: 1 (Ingraham 等 ，1983 ) 。 

固 醇 酯 是 通过 直接 把 固 醇 〈 代 表 性 的 是 麦角 固 醇 ) 加 到 脂 酰 辅酶 A 上 而 得 的 ， 三 脂 酰 
甘油 是 用 脂 酰 辅酶 A BBR ABA FERRE ITS. BRAS AR AE BFE AS eB A 加 到 3- 磷 
酸 甘 油 的 磷酸 化 的 碳 上 而 得 。 


2.6 生长 能 学 


生长 能 学 描述 了 吉 布 斯 自由 能 (通常 是 ATP 的 形式 ) 的 产生 与 消耗 的 关系 ， 因 此 涉及 
到 运输 、 供 能 反应 、 生 物 合成 反应 以 及 大 分 子 合成 反应 。 生 长 能 学 起 源 于 经 典 的 得 率 研 究 ， 
其 中 质量 得 率 系 数 Y.、( 见 3.4 节 )， 是 通过 同时 直接 测定 底 物 的 消耗 和 生物 质 的 生成 而 确 
定 的 (Monod，1942)。 由 于 能 源 的 作用 是 以 ATP 的 形式 提供 吉 布 斯 自由 能 来 驱动 生物 合 
成 反应 和 聚合 反应 ， 因 此 ATP 得 率 系 数 YxaTrp [ 即 合成 生物 质 所 消耗 ATP 的 量 (mmol 
ATP.g-1 ( 干 重 ))] 与 质量 得 率 系数 Y. 相 比 ， 其 是 细胞 更 基本 的 特性 。Bauchop 和 Elsden 
(1960) 最 初 的 工作 引入 了 ATP 得 率 系 数 YxATp。 遵 从 上 述 工作 十 多 年 之 后 ，YxATp 被 认为 
是 普遍 常数 ， 其 值 为 93mmol ATP*g ! (4 #) (Forrest 和 Walker，1971)。 然 而 ，1973 年 
Stouthamer 和 Bettenhaussen 认为 ATP 形成 与 消耗 之 间 呈 下 列 线性 关系 

ratp= Yxatp# + marp (2.27) 

现在 ， 这 个 方程 是 解释 生长 能 学 的 权威 框架 ， 它 是 基于 ATP 水 平 的 拟 稳 态 假定 。 根 据 
细胞 能 量 水 平 的 强调 控 机 制 和 ATP 库 的 高 转换 速率 ， 也 就 是 说 ， 其 松弛 时 间 是 以 秒 计 的 ， 
而 细胞 生长 的 松弛 时 间 是 以 小 时 计 的 ， 所 以 这 个 假设 是 非常 合理 的 。 因 此 ， 即 使 对 突然 的 环 
境 扰动 ， 例 如 向 酿酒 酵母 的 稳 态 连续 培养 中 加 入 一 个 葡萄 糖 脉 冲 ， 那 么 也 能 在 扰动 后 的 几 分 
钟 内 达到 新 的 稳 态 ATP 水 平 (Theobald 4, 1993). 

式 (2.27) 表明 ATP 的 生成 速率 rATp[mmol ATP.g-!( 干 重 ).h -1 与 ATP 的 消耗 速 
率 是 平衡 的 ， 后 者 表示 为 以 下 两 部 分 之 和 : 一 部 分 是 菌 体 生长 的 ATP 消耗 ， 而 另 一 部 分 是 
与 生长 无 关 的 过 程 (如 维持 ) 的 ATP 消耗 〈 以 思 ATP 表 示 )。 实 际 上 ， 与 生长 无 关 的 过 程 的 
ATP 消耗 更 加 普遍 ， 它 包括 所 有 与 生长 无 关 的 ATP 消耗 ， 其 中 也 含 无 效 循环 和 其 它 难以 说 
AAA ATP 应 用 (见方 框 2.2)。 与 生长 有 关 的 ATP 消耗 可 进一步 分 为 三 部 分 (Benthin 等 ， 
1994) 

4] 


Y sate > MyarPicwth * YGirpiyes eat (2.28) 

式 中 ，YxATp,erowth 是 指 用 于 运输 、 生 物 合成 和 聚合 的 ATP 消耗 ，YxATP,iwss 是 指 用 于 已 

降解 的 大 分 子 等 进行 再 聚合 的 ATP 消耗 ，YxATpuleak 包 括 所 有 其 它 的 ATP 消耗 ， 即 由 于 渗 
漏 、 无 效 循环 及 与 生长 相关 的 维持 等 。 


方 框 2.2 ”用 于 维持 的 ATP 消耗 
许多 细胞 反应 需要 消耗 ATP， 但 并 没 贡献 于 菌 体 的 净 合 成 ， 这 些 反 应 通常 称 为 维持 
应 〈 或 过 程 )。 其 中 一 些 维持 反应 与 生长 有 关 ， 例 如 用 于 维持 细胞 穿越 质 膜 的 电化 学 梯 
而 其 它 的 是 与 细胞 的 比 生 长 速率 无 关 的 。 因 此 我 们 需要 区 分 与 生长 相关 的 和 与 生长 
无 关 的 维持 。 与 生长 相关 的 维持 的 ATP 消耗 分 为 两 种 ， 即 Y arp tysistl YATPleake 很 难 
把 不 同 的 过 程 分 为 与 生长 相关 的 和 与 生长 无 关 的 维持 ， 但 是 有 一 些 最 重要 的 维持 过 程 可 
叙述 如 下 。 


@ 浓 度 梯 度 和 电势 梯度 的 维持 

为 确保 适当 的 功能 ， 细 胞 要 维持 穿越 质 膜 以 及 真 核 细 胞 要 穿越 线粒体 膜 的 各 种 浓度 
梯度 和 电化 学 梯度 。 这 些 过 程 需 要 吉 布 斯 自由 能 ， 但 不 会 导致 新 菌 体 量 的 合成 ， 因 此 是 
维持 过 程 的 典型 例 于 。 这 些 过 程 中 有 一 部 分 是 与 生长 相关 的 ， 例 如 细胞 膨胀 变 大 时 ， 这 
些 梯 度 需 要 在 增 大 着 的 面积 〈 或 体积 ) 上 维持 ; 但 也 有 一 部 分 是 与 生长 无 关 的 ， 即 当 细 


胞 不 生长 时 梯度 也 需要 维持 。 维 持 梯度 的 ATP 消耗 估计 可 达 全 部 生成 的 ATP BY 50% 
(Stouthamer, 1979), 

© 无 效 循环 

细胞 内 有 一 系列 反应 其 净 结 果 是 ATP 的 水 解 。 这 样 的 一 个 例子 是 : 6- 磷 酸 果糖 在 磷 
酸 果 糖 激酶 的 作用 下 生成 1,6- 二 磷酸 果糖 ， 随 后 1,6-— BERR EE — BF RRO ER 
的 作用 下 降解 成 6- 磷 酸 果糖 。 这 两 步 反 应 导致 ATP 的 净 消 耗 。 这 类 循环 最 初 被 当 作 是 
代谢 控制 的 一 个 缺陷 〈 因 此 称 为 无 效 循环 ) ， 但 目前 这 种 循环 被 认为 是 当 两 种 酶 都 存在 
时 ， 人 允许 迅速 调整 到 新 环境 条 件 的 一 种 重要 的 代谢 控制 机 制 。 

@ 大 分 子 的 周转 

为 保持 细胞 控制 代谢 功能 的 能 力 ， 许 多 分 子 需 要 不 断 降 解 和 合成 。 因 此 mRNA 有 具 
有 典型 的 几 分 钟 的 半 训 期。 大 分 子 的 这 种 连续 的 降解 和 再 聚合 导致 了 ATP 的 净 消 耗 ， 
而 没有 新 生物 量 的 产生 ， 因 此 也 被 认为 是 一 种 维持 过 程 。 


基于 对 运输 、 生 物 合成 和 聚合 的 代谢 消耗 的 估计 ， 有 可 能 计 算出 YxATp,erowth 的 理论 值 ， 
但 不 可 能 从 理论 上 估算 出 其 它 两 种 形式 的 ATP 消耗 ， 因 此 也 就 不 能 估算 出 用 于 菌 体 生长 ， 
总 的 ATP 消耗 的 理论 值 。 然 而 ， 通 过 把 化 学 计量 学 与 底 物 消 耗 速 率 及 产物 形成 速率 的 精确 
测量 结合 起 来 ， 我 们 可 以 计算 出 ATP 的 生成 。 当 生成 的 ATP 作为 比 生 长 速率 的 函数 时 ， 
可 以 确定 YATp 和 marpHI Soh (UPI 3.3)。 在 好 氧 生长 时 ， 这 需要 实际 的 PZO 比值 。 
而 在 厌 氧 生长 条 件 下 ， 通 常 有 可 能 利用 代谢 产物 形成 的 测量 值 精 确 地 估算 出 ATP 的 生成 。 
表 2.9 列 出 了 一 些 YATrp 和 思 ATp 的 实验 测定 值 。 

利用 在 前 一 部 分 中 给 出 的 用 于 运输 、 生 物 合成 和 聚合 的 代谢 消耗 的 估计 值 ， 有 可 能 计算 
出 细胞 合成 所 需 的 总 ATP 和 NADPH。 这 种 计算 的 基础 是 碳 源 (通常 是 葡萄 糖 , 下 
分 的 计算 基础 是 12 种 前 体 代 谢 物 。2.3 节 中 已 讨论 过 ， 这 12 种 前 体 代 谢 物 是 由 能 量 供应 
应 中 的 碳 源 合成 的 。 表 2.10 列 出 了 从 lmol 葡萄 糖 合 成 12 种 前 Ae Es cme 

42 


表 2.9 YArp 和 mArp 的 实验 测定 值 


® 


参考 文 m 
Stouthamer and Bettenhaussen (1976) 
Stouthamer and Bettenhaussen (1976) 
Hempfling and Mainzer (1975) 
de Vries et al (1970) 
Major and Bull (1985) 
Otto et al (1980) 
Brown and Collins (1977) 
Benthin et al (1993)® 
Brown and Collins (1977) 
Verduyn et al (1990) 


772 ATP 


Aerobacter aerogenes 


Escherichia coli 
Lactobacillus casei 
Lactobacillus delbruckii 
Lactococcus cremoris 


Lactococcus diacetilactis 
Saccharomy cescerevisiae 


® 单位 为 mmol ATP.g-! (F#). 
@ 单位 为 mmol ATP.g-! ( 干 重 ).h 1。 
@ 根据 他 们 的 分 析 ，Benthin et al (1993) 发 现 依赖 于 培养 基 组 成 的 高 能 参数 存在 很 大 的 变动 。 

如 果 用 于 形成 前 体 代谢 物 、 结 构 单 元 和 大 分 子 的 代谢 消耗 已 知 ， 那 么 就 可 以 计算 出 合成 
整个 细胞 所 需 的 ATP。 表 2.11 列 出 了 一 个 典型 的 细菌 细胞 和 一 个 典型 的 真菌 细胞 中 的 结 
果 ， 结 果 发 现 两 种 细胞 的 ATP 消耗 几乎 相同 。 在 细菌 和 真菌 中 ， 用 于 合成 蛋白 质 、RNA、 
DNA 和 糖 类 的 ATP 消耗 几乎 相同 。 而 在 真 核 体 中 ， 用 于 脂 类 合成 的 ATP 消耗 要 明显 高 于 
细菌 中 的 ATP 消耗 ， 这 是 由 于 真 核 细 胞 中 要 合成 更 加 复杂 的 特殊 的 磷脂 。 还 需 指 出 ， 细 菌 
中 用 于 运输 的 ATP 消耗 是 低 的 〈 见 2.2.3 节 )， 净 结果 是 用 于 合成 细菌 细胞 的 ATP 需求 要 
低 于 真菌 细胞 合成 的 ATP 需求 。 表 2.11 中 列 出 的 总 ATP 消耗 是 针对 所 指定 的 大 分 子 组 成 
的 。 而 且 ATP 消耗 是 随 大 分 子 组 成 的 变化 而 改变 的 〈 见 图 2.13)。 因 此 ， 在 产 黄 青 霉 菌 中 ， 
ATP 的 消耗 从 低 比 生长 速率 的 35mmol ATP.g -1! (FH) 变化 到 高 比 生长 速率 的 40mmol 
ATP.g-1 (F#) ( 见 表 2.11) (Nielsen, 1997). 


表 2.10 利用 葡萄 糖 合成 12 种 前 体 代谢 物 的 化 学 计量 学 


代谢 前 体 物 


6- 磷 酸 葡萄 糖 
6- 磷 酸 果糖 
5- 磷 酸 核糖 
4-BE RR a BEE 
3- 磷 酸 甘油 醛 
磷酸 甘油 酸 
BE ARMS BETS BR 
丙酮 酸 
乙酰 辅酶 AS 
乙酰 辅酶 A+ 草 酰 乙 酸 Q 
乙酰 辅酶 AS 
乙酰 辅酶 A 
a- 酮 戊 二 酸 
琥珀 酰 辅酶 AQ 
草 酰 乙 酸 〇 
@ 所 有 的 计量 系数 均 指 每 摩尔 葡萄 糖 。 
@ 通过 丙酮 酸 脱 氢 酶 形成 活跃 于 原核 细胞 中 )。 
@ 通过 柠檬 酸 裂解 酶 形成 。 
® 通过 柠檬 酸 裂 解 酶 和 过 量 的 草 酰 乙酸 形成 。 
© 由 丙酮 酸 经 醋酸 形成 。 
© 通过 一 种 NADH 连接 异 柠檬 酸 裂解 脱 氢 酶 形成 。 
@ 通过 丙酮 酸 羧 化 酶 形成 。 


| 
a 
yee re SCOR COONKeF OO]? 
tb 


—- Unb NRK WN KH KH COCO CO SO 
一 


oo ococorccococs no © 


43 


表 2.11 利用 基本 培养 基 合 成 细菌 细胞 和 真菌 细胞 的 典型 组 成 
[e-g '( 4) #0 ATP 消耗 [mmol ATP+g (FH) J® 


P.chrysogenum 


蛋白 质 
RNA OPA 
DNA 0.39 
脂 类 
磷脂 1.65 
固 醇 脂 0.81 
三 元 酰基 甘油 0.30 
糖 类 
几 丁 质 2.90 
糖 原 质 0.37 
可 溶解 的 库 2 
ALR 
核酸 
代谢 物 
灰分 
运输 
氨水 7.10 
硫酸 盐 0.14 
磷酸 盐 219 


共计 
@ AXE. coli 的 数据 来 自 于 Stouthamer (1979), AAP. chrysogenum 的 数据 来 自 于 Nielsen (1997)。 所 做 的 计算 
都 是 基于 在 最 简单 的 培养 基 上 的 设置 ， 也 就 是 说 葡萄 糖 作为 碳 源 和 能 源 来 源 ， 无 机 盐 作 为 其 它 元 素 的 来 源 。 
Q 代谢 物 可 溶解 的 库 合 成 所 需 的 ATP 消耗 包括 在 大 分 子 的 生物 合成 的 消耗 当中 ， 比 如 , 游离 的 氨基 酸 的 生物 合成 的 
ATP 消耗 包括 在 蛋白 质 合成 的 ATP 消耗 当中 。 


Bo 5 xX m@ 


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47 


第 3 章 细胞 反应 的 综合 模型 


在 上 一 章 中 讨论 了 一 些 主要 的 代谢 途径 ， 通 过 这 些 途径 碳 -能 源 分 解 代 谢 成 代谢 合成 及 
细胞 生长 所 需 的 自由 能 及 碳 架 。 为 了 完整 地 描述 中 间 代 谢 ， 需 向 第 2 章 中 复杂 的 代谢 途径 中 
补充 各 个 反应 的 化 学 计量 学 、 动 力学 及 热力 学 等 信息 。 主 要 涉及 反应 及 代谢 途径 可 行 性 问题 
的 热力 学 将 在 第 14 章 详细 讨论 。 关 于 反应 动力 学 ， 尤 其 是 在 体内 条 件 下 的 动力 学 信息 是 特 
别 难 获得 的 ， 但 这 样 的 信息 对 于 理解 代谢 通 量 控制 是 必需 的 。 代 谢 通 量 控制 是 代谢 工程 当然 
也 是 本 书 的 一 个 中 心 问 题 。 从 大 量 的 中 间 代 谢 研 究 中 很 容易 得 到 各 个 单个 反应 的 化 学 计量 
式 ， 将 其 扩展 到 整个 代谢 途径 就 提供 了 建立 能 量 、 物 质 平衡 及 解释 相互 耦 联 的 反应 和 途径 之 
间 相 互 作用 的 基础 。 代 谢 途 径 的 化 学 计量 学 提出 了 某 些 必须 通过 细胞 培养 测定 才能 满足 的 限 
制 条 件 ， 由 此 而 引出 下 一 章 将 要 讨论 的 数据 一 致 性 问题 。 

本 章 将 讨论 通过 汇集 细胞 中 所 有 的 反应 以 提供 细胞 代谢 的 综合 模型 的 方法 。 显 然 ， 仅 能 
考虑 所 有 可 能 反应 中 的 一 少 部 分 ， 因 为 其 中 很 多 反应 甚至 还 不 知道 ， 或 将 其 包括 就 有 可 能 产 
生 难 以 处 理 的 大 系统 。 同 时 ， 还 不 清楚 增加 代谢 反应 描述 的 细节 能 把 细胞 模型 的 精确 度 及 实 
用 性 提高 到 什么 程度 。 尽 管 有 许多 方法 可 进行 反应 的 汇集 ， 但 其 合理 性 及 一 致 性 是 最 重要 
的 。 本 章 将 为 构建 细胞 模型 的 化 学 计量 学 提供 一 个 框架 ， 它 也 适用 于 分 析 很 大 的 反应 网 络 。 


3.1 细胞 反应 的 化 学 计量 学 


所 有 细胞 反应 的 最 终结 果 是 底 物 转变 为 自由 能 和 代谢 产物 〈 如 初级 代谢 物 ) 、 或 更 复杂 
的 产物 〈 如 次 级 代谢 物 ) 、 胞 外 蛋白 、 生 物质 组 分 如 细胞 蛋白 、RNA、DNA 及 脂 类 等 。 这 
些 转化 反应 是 经 由 大 量 的 代谢 物 进行 的 ， 这 些 代谢 物 包 括 代谢 前 体 物 及 合成 大 分 子 库 的 结构 
单元 。 若 要 分 析 这 个 巨大 的 反应 组 ， 就 必须 详细 说 明 其 化 学 计量 学 ， 这 将 以 一 个 通用 的 方式 
进行 。 为 此 ， 有 必要 区 分 底 物 、 代 谢 产物 、 胞 内 代谢 物 及 生物 质 组 分 ， 本 书 对 其 定义 如 下 。 

CRW ” 指 存在 于 无 菌 培养 基 中 的 物质 ， 能 被 细胞 进一步 代谢 或 直接 结合 进 细 胞 中 。 
用 如 此 广 的 定义 ， 底 物 的 数量 通常 很 多 ， 范 围 从 碳 、 氮 及 能 源 到 对 细胞 功能 所 必需 的 各 种 矿 
物质 。 在 绝 大 多 数 情况 下 ， 仅 考虑 碳 、 氮 及 能 源 物质 。 由 于 葡萄 糖 通常 作为 碳 源 及 自由 能 的 
来 源 ， 因 此 所 考虑 的 底 物 的 种 类 通常 很 少 〈 葡 萄 糖 、 氨 ， 或 许 还 有 和 氧 )。 

@ 代谢 产物 “ 指 由 细胞 生成 并 分 泌 至 培养 基 中 的 物质 。 它 或 者 是 初级 代谢 产物 ， 如 二 
氧化 碳 、 乙 醇 、 乙 酸 、 乳 酸 等 ; 或 者 是 更 复杂 的 次 级 代谢 产物 ; 或 者 是 分 泌 到 胞 外 培养 基 中 
的 异 源 蛋 白 。 

© 生物 质 组 分 “ 指 构 成 生物 质 的 大 分 子 库 (或 者 是 一 个 单个 的 大 分 子 )， 包 括 真正 的 细 
胞 组 分 如 RNA、DNA、 蛋 白质、 脂 类 、 糖 类 等 的 大 分 子 库 ， 还 包括 积累 在 细胞 内 的 大 分 子 
产物 ， 如 多 糖 、 生 物 聚 合 物 或 未 分 泌 的 异 源 和 蛋 日 。 

@ 胞 内 代谢 物 “ 指 一 类 包括 在 细胞 内 的 所 有 其 它 物 质 。 因 此 ， 它 既 包 括 不 同 代 谢 途 径 
的 中 间 产 物 ， 如 糖 酵 解 中 间 产 物 ， 也 包括 用 于 大 分 子 合成 的 结构 单元 ， 如 氮 基 酸 等 。 

上 述 在 生物 质 组 分 和 胞 内 代谢 物 之 间 所 作 的 区 分 不 同 于 根据 它们 在 细胞 反应 中 转换 的 时 
间 尺 度 所 对 应 的 胞 内 化 合 物 。 与 大 分 子 相 比 ， 小 分 子 物 质 如 糖 酵 解 中 间 产 物 库 (还 有 氨基 

48 


RM) 有 非常 快 的 转换 〈 见 例 8.1)。 因 此 它们 符合 拟 稳 态 假设 〈 见 第 8 章 )。 另 一 方面 ， 在 瞬 
态 生长 过 程 中 ， 生 物质 组 分 随时 间 变 化 缓慢 。 在 某 些 时 候 很 难 断 定 某 物 质 是 作为 胞 内 代谢 物 
还 是 代谢 产物 。 例 如 ， 酿 酒 酵母 糖 酵 解 途径 的 通 量 很 高 时 ， 丙 酮 酸 能 积累 并 分 泌 至 胞 外 ， 而 
当 糖 酵 解 通 量 由 于 葡萄 糖 浓 度 降低 而 减少 时 ， 菌 体 可 重新 吸收 利用 丙酮 酸 进行 代谢 反应 。 很 
明显 丙酮 酸 是 一 个 途径 的 中 间 代 谢 物 ， 但 由 于 它 被 分 刻 至 胞 外 ， 所 以 也 可 作为 代谢 产物 。 在 
本 书 中 ， 我 们 将 这 类 物质 视 为 代谢 产物 。 因 此 ， 在 菌 体 培养 过 程 中 的 任 一 时 刻 ， 凡 在 培养 基 
中 所 能 检测 到 的 物质 均 应 视 为 底 物 或 代谢 终 产物 。 
下面 两 个 例子 将 说 明 上 述 分 类 ， 第 一 个 例子 是 通过 活跃 在 许多 细菌 中 的 磷酸 转移 酶 系统 
(PTS) 吸收 葡萄 糖 。 实 际 的 PTS 运输 机 理 涉及 到 许多 酶 〈 见 2.2.3 节 )， 但 为 了 讨论 方便 ， 
通过 下 列 总 的 化 学 计量 反应 式 将 PTS 概括 为 : 
glucose 一 PEP + glucose-6-phosphate + pyruvate = 0 (3.1) 
(葡萄 糖 ) (OER ALAAR) (6- 磷 酸 葡萄 糖 ) (丙酮 酸 ) 
另 一 个 例子 是 由 结合 NADPH 的 谷 氨 酸 脱 氢 酶 所 催化 的 氨 的 吸收 同化 ( 见 2.4.1 节 )， 其 计 
量 反应 式 为 : 
a-ketoglutarate - NH; - NADPH — H* + L-glutamate+ NADP* +H,O=0 ， (3.2) 
(ca- 酮 戊 二 酸 ) (L- 谷 氨 酸 ) 
在 上 述 反 应 式 中 ， 在 正 反 应 中 的 物质 〈 作 为 反应 物 ) 的 计量 系数 为 负 ， 而 在 正 反 应 中 生成 物 
的 计量 系数 为 正 。 除 符号 之 外 ， 这 些 计量 系数 还 提供 了 重要 的 信息 ， 例 如 lmol 葡萄 糖 的 吸 
收 及 磷酸 化 消耗 了 lmol PEP， 同 时 生成 Imol 丙酮 酸 。 
为 了 用 通 式 表示 ， 底 物 、 代 谢 产 物 及 胞 内 中 间 代 谢 物 的 化 学 计量 系数 分 别 以 < 、B8、g 
来 表示 。 需 要 注意 的 是 : 底 物 的 化 学 计量 系数 一 般 为 负 ， 代 谢 产物 为 正 ， 而 中 间 代 谢 物 可 正 
可 负 。 尽 管 谷 氨 酸 和 a- 酮 成 二 酸 是 细胞 生物 质 的 组 分 ， 但 根据 上 述 定 义 ， 在 反应 (3.2) 中 
可 认为 它们 是 胞 内 中 间 代 谢 物 。 在 这 些 例子 中 ， 没 有 考虑 生物 质 ， 但 在 通常 情况 下 ， 其 化 学 
计量 系数 以 y 表示 。2.4.2 节 推 导 了 合成 生物 质 大 分 子 组 分 的 总 化 学 计量 反应 式 ， 正 是 在 这 
些 反 应 中 以 y 表示 细胞 组 分 的 计量 系数 使 其 与 参加 其 它 代 谢 反 应 的 胞 内 代谢 物 被 区 分 开 。 
定义 了 底 物 、 代 谢 产物 、 胞 内 代谢 物 、 生 物质 组 分 的 化 学 计量 系数 之 后 ， 现 在 可 重新 审视 反 
应 (3.1) 与 反应 (3.2)。 显 然 葡萄 糖 和 氨 是 底 物 ， 除 质子 和 水 之 外 ， 所 有 其 它 物 质 是 胞 内 代谢 
物 。 因 此 在 反应 (3.1) 中 as 及 gpFp 为 -1， 反 应 (3.2) 中 gs 为 1。 尽 管 由 于 质子 和 水 的 含量 
与 其 它 细 胞 组 分 中 相 比 独占 优势 从 而 不 被 包括 在 反应 计量 式 中 ， 但 它们 仍 可 被 视 为 代谢 产物 。 
现 继续 说 明 如 何 建立 细胞 反应 的 一 般 化 学 计量 反应 式 。 为 此 ， 考 虑 某 一 N 个 底 物 转化 为 
M 个 代谢 产物 及 Q 个 生物 质 组 分 的 系统 ， 转 化 反应 在 J 个 反应 进行 ， 其 中 天 个 胞 内 代谢 物 
作为 途径 中 间 产 物 参与 反应 。 化 学 反应 计量 系数 的 下 标 用 两 个 字母 分 别 表 示 反 应 数 及 反应 物 
质 ， 例 如 凡是 第 ;个 底 物 在 第 ) 个 反应 中 的 计量 系数 。 在 普遍 化 的 化 学 反应 计量 式 中 ， 我 们 
引入 化 学 计量 系数 ， 对 应 于 全 部 反应 中 每 步 反 应 的 底 物 、 代 谢 产 物 、 胞 内 代谢 物 以 及 生物 质 组 
分 。 由 于 有 的 物质 没有 参与 某 一 反应 ， 因 此 有 许多 计量 系数 为 零 。 如 在 反应 (3.2) 中 ， 葡 萄 
糖 的 计量 系数 就 为 零 。 底 物 、 代 谢 产物 及 生物 质 组 分 分 别 用 Si 、 已 、Xnace,i 表 示 ， 另 外 ， 天 
个 途径 的 中 间 产 物 以 Xu ;表示 。 在 此 定义 下 ， 第 7j 个 细胞 反应 的 化 学 反应 计量 式 为 : 


> ws 贡 > BP + >) 1X macro,i + Dik inns = (3. 3) 


在 代谢 模型 中 ， ] 个 细胞 反应 中 的 每 一 个 反 应 均 可 得 到 像 式 (3.3) 一 样 的 计量 式 ， 因 
49 


we BY PA 4 Pr (8 FR a TB SO A J SB A eh eH : 

AS+BP+TX +GX =(0 (3.4) 
这 里 ，A、B、 工 及 G 分 别 表示 了 个 反应 中 底 物 、 代 谢 产物 、 生 物质 组 分 、 途 径 中 间 代 谢 物 
的 计量 系数 矩阵 。 其 中 和 矩阵 中 的 行 代表 反应 ， 列 代表 代谢 物 。 因 此 ， 和 抑 阵 A 的 第 ) ARS: 
列 的 元 素 就 代表 着 第 7) 个 反应 中 的 第 ; 个 底 物 的 化 学 反应 计量 系数 。 前 面 已 讨论 过 ， 计 量 系 
数 可 正 、 可 负 或 为 零 。 对 于 式 (3.4) 这 样 通用 型 的 化 学 计量 式 ， 许 多 计量 系数 变 为 零 。 尽 
管 确定 模型 中 所 有 反应 和 所 有 物质 的 计量 系数 比较 繁琐 ， 但 矩阵 形式 的 优点 是 能 对 矩阵 进行 
运算 ， 从 而 便于 随后 的 分 析 〈 对 矩阵 的 表示 法 及 运算 不 熟悉 者 可 参看 方 框 4.2)。 另 外 ， 以 
和 矩阵 表示 化 学 计量 反应 式 ， 很 容易 得 到 不 同化 合 物 参与 各 种 反应 的 概况 ， 因 为 只 需 察看 该 物 
质 在 特定 的 抢 阵 中 所 处 的 那 一 列 即 可 。 化 学 计量 系数 矩阵 的 列 汇集 了 某 一 特定 物质 在 所 有 J 
个 反应 中 的 计量 系数 。 通 过 例 3.1 可 说 明 这 一 点 ， 在 此 例 中 根据 方程 式 (3.3) 及 式 (3.4), 
建立 了 大 肠 杆 菌 混合 酸 发 酵 的 化 学 计量 反应 式 。 

在 细胞 反应 中 有 一 些 辅助 因子 对 ， 其 中 ATP/ADP,. NAD*/NADH 及 NADP*/ 
NADPH 是 最 重要 的 。 辅 助 因子 对 中 的 两 种 物质 的 计量 系数 通常 大 小 相等 ， 符 号 相反 ， 例 如 
在 反应 (3.2) 中 ，NADPH 及 NADP+* 的 化 学 计量 系数 分 别 为 =1 和 1。 因而， 这 些 辅助 因 
子 的 不 同形 式 的 胞 内 浓度 是 密切 相关 的 ， 例 如 在 任何 反应 中 ，NADPH 及 NADP+ 浓 度 的 总 
和 是 恒定 的 。 若 化 学 计量 反应 式 含 有 某 一 辅助 因子 对 ， 在 其 计量 系数 抢 阵 G 中 将 产生 线性 
相关 的 列 ， 即 某 一 列 是 其 它 列 的 线性 组 合 ， 这 将 在 随后 的 分 析 中 产生 问题 。 由 于 辅助 因子 对 
之 间 是 直接 相关 的 ， 因 此 没有 必要 同时 考虑 它们 两 个 。 在 所 有 情况 下 ， 我 们 仅 考虑 辅助 因子 
对 中 的 一 个 即 可 。 但 有 一 点 很 值得 注意 ， 即 如 果 只 考虑 某 一 辅助 因子 对 中 的 一 个 物质 ， 那 么 
它们 之 间 的 相互 转化 也 应 遵循 同一 原则 ， 如 ATP 与 ADP 之 间 的 相互 转化 。 若 在 某 些 反应 
中 另外 的 化 合 物 是 由 此 辅助 因子 对 之 一 形成 的 ， 如 从 ATP 生成 AMP， 就 有 必要 将 其 计量 
系数 考虑 进去 ， 这 与 2.6 节 中 能 耗 的 计算 相似 ， 它 是 以 ATP 生成 ADP 作为 基础 的 。 在 某 
些 情 况 下 ， 不 能 直接 识别 是 否 保 存 着 像 辅助 因子 对 中 一 半 的 物质 ， 但 通过 检验 计量 矩阵 中 行 
的 相关 性 就 可 确认 。 


【 例 3.1】 大 肠 杆 菌 的 混合 酸 发 酝 

大 肠 杆菌 是 一 个 兼 性 厌 氧 菌 ， 它 调节 着 一 个 较 复 杂 的 发 酵 过 程 ， 通 常 称 该 过 程 为 混合 酸 
发 酵 。 在 此 过 程 中 ， 共 生成 七 种 代谢 产物 ， 除 琥珀 酸 是 由 磷酸 焕 醇 丙酮 酸 生成 之 外 ， 其 余 均 
由 丙酮 酸 生 成 。 琥 珀 酸 是 经 草 酰 乙酸 生成 的 ， 而 草酸 乙酸 经 谷 氨 酸 转 所 反应 生成 天 冬 氨 酸 
(1 分 子 NADPH 及 一 分 子 氨 用 于 w- 酮 成 二 酸 再 生 为 谷 氨 酸 ， 因 此 它们 在 图 3.1 中 是 作为 反 
应 物 ) ， 天 冬 氨 酸 脱 所 生成 延 胡 索 酸 ， 再 经 延 胡 索 酸 脱 氢 酶 ( 它 与 作用 方向 相反 的 琥珀 酸 脱 
氢 酶 不 同 ) 还 原 为 琥珀 酸 。 图 3.1 描述 了 混合 酸 发 酵 的 关键 步 又， 表 3.1 列 出 了 某 些 典型 产 
物 的 得 率 。 建 立 化 学 计量 模型 的 目的 是 为 了 说 明 在 一 个 典型 的 大 肠 杆 菌 细胞 中 进行 分 解 代 谢 
反应 时 培养 基 中 代谢 物 的 净 变 化 。 

我 们 现在 建立 一 个 简单 的 混合 酸 发 酵 的 代谢 模型 。 为 了 将 不 必要 的 复杂 性 减 至 最 低 ， 不 
考虑 糖 酵 解 的 所 有 中 间 产 物 。 因 此 ， 葡 萄 糖 至 磷酸 烯 醇 现 酮 酸 的 转化 可 汇集 成 一 个 具有 如 下 
化 学 计量 关系 的 总 反应 : 


-glucose+PEP+NADH= 0 (1) 


50 


3.1 大 肠 杆菌 混合 酸 发 酵 典 型 产物 的 得 率 


代谢 产物 | 每 100 mol 葡萄 糖 发 酵 生 成 产物 的 量 /mol | 代谢 产物 | 4 100 mol 葡萄 糖 发 酵 生成 产物 的 量 /mol 


葡萄 精 
NADH CO? NADH NADH 
PEP 草 酰 乙 本 一 一 RA sesame > (estat ) 
ATP NADH NHs ore 
两 本 琶 下、 (Ar 


Gre} 一 四 


乙酰 辅酶 A NADH 


“ae 
NADH 
he ae rc 


图 3.1 大 肠 杆 菌 混合 酸 发 酵 
底 物 (葡萄 糖 ) 及 7 种 代谢 产物 置 于 方 框 中 ， 代 谢 模型 中 的 胞 内 代谢 物 和 辅助 因子 为 
黑体 。 从 草 酰 乙酸 形成 天 冬 氨 酸 的 转 氨 反 应 以 直接 氨 化 表示， 为 

了 减少 复杂 性 就 没有 列 出 谷 氨 酸 及 w- 酮 戊 二 酸 
琥珀 酸 生成 途径 中 的 中 间 产 物 ， 如 草 酰 乙酸 、 天 冬 氨 酸 、 延 胡 索 酸 均 省 略 。 另 外 ，NADH 
和 NADPH 被 汇集 在 一 个 单个 还 原 力 库 ， 这 在 本 质 上 表明 用 于 将 草 酰 乙酸 转变 为 天 冬 氢 酸 
的 谷 氨 酸 再 生 过 程 中 ， 只 以 NADH 而 不 是 NADPH 作为 辅助 因子 。 因 此 ， 磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 
转化 至 琥珀 酸 的 总 化 学 计量 反应 式 为 : 

— PEP — CO, -2NADH + succinate = 0 zd 

(琥珀 酸 ) 

磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 转 化 至 丙酮 酸 及 其 进一步 转化 生成 乳酸 、 甲 酸 、 乙 酰 辅酶 A 的 计量 反应 式 
可 直接 从 图 3.1 得 到 : 


— PEP + pyruvate + ATP =0 (3) 

— pyruvate - NADH + lactate = 0 (4) 
(乳酸 ) 

— pyruvate + acetyl-CoA + formate = 0 (5) 


(乙酰 辅酶 A) (甲酸 ) 
同样 ， 甲 酸 水 解 为 CO 和 Hz 可 写 为 : 
一 {formate+COz+H2z=(0 (6) 
最 后 ， 还 需 列 出 生成 乙酸 和 乙醇 的 代谢 途径 的 计量 反应 式 。 省 略 中 间 产 物 〈 乙 酰 磷 酸 和 乙 
51 


— acetyl-CoA + acetate + ATP =0 (7) 
(乙酸 ) 
— acetyl-CoA -2NADH + ethanol =0 (8) 
(乙醇 ) 


至 此 ， 大 肠 杆菌 混合 酸 发 酵 可 用 上 述 8 个 总 反应 式 来 表示 。 值 得 注意 的 是 ， 在 此 过 程 中 省 略 
了 代谢 途径 中 直线 部 分 的 所 有 中 间 产 物 ， 而 只 考虑 了 分 支点 处 的 代谢 物 。 之 所 以 这 样 做 是 对 
所 有 胞 内 代谢 物 作 拟 稳 态 假设 的 结果 ， 在 第 8 章 将 详细 讨论 。 

根据 式 (3.4) 的 矩阵 表示 法 可 对 上 述 8 个 方程 进行 分 类 。 葡 萄 糖 为 底 物 ， 焉 珀 酸 、 
CO 、 乳 酸 、 甲 酸 、H2z 、 乙 酸 及 乙醇 为 代谢 产物 ， 磷 酸 焕 醇 丙 酮 酸 、 丙 酮 酸 、 乙 酰 辅 酶 A、 
ATP 及 NADH 为 胞 内 代谢 物 。 此 模型 不 含 生 物质 组 分 ， 这 是 因为 没有 涉及 到 合成 反应 而 仅 
考虑 了 供 能 反应 。 据 此 由 反应 (1) 一 反应 (8) 的 化 学 计量 式 ， 可 得 


A B S 

-+ io aoa in > oF er: 1° Oley Orton eee 0 

‘ 1-10 0 00 Olpy FH 210: {Din} 2} Se 0 
人 
0 Sale F Pi sa ‘ 和 X Ac Te 9 
5 SD edt Ds cd Oe tia 出 Geo Pa eee oe pn, o| 
é te. OSI IO | 2 0- o™pl 0 6 fo 0 

: DUO  0...0. © f. Olt 0° Oo -t t ol 0 

0 Ce OCC CoN 0 0 -10 -2 0 


式 (9) 提供 了 所 考虑 反应 的 方便 概况 。 因 此 ， 通 过 察看 最 后 一 个 计量 系数 矩阵 G 中 的 第 四 
列 ， 可 看 出 只 有 两 个 反应 生成 ATP， 即 磷酸 烯 醇 两 酮 酸 转化 至 丙酮 酸 [反应 (3)] 及 乙酰 
辅酶 A 转化 至 乙酸 的 反应 [反应 〈7)]。 因 为 这 两 个 反应 的 通 量 是 可 测 的 〈 至 乙酸 的 通 量 可 
通过 乙酸 的 生成 速率 直接 测量 ， 磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 至 丙酮 酸 的 通 量 可 通过 直接 测量 除 琥珀 酸 之 
外 所 有 代谢 产物 的 生成 速率 之 和 、 或 者 葡萄 糖 吸 收 速率 与 驴 珀 酸 形成 速率 之 差 来 获得 )， 所 
以 就 可 获得 ATP 总 合成 速率 的 信息 。 由 于 在 厌 氧 条 件 下 ， 无 其 它 来 源 提 供 ATP， 因 此 也 可 
用 后 者 估算 用 于 菌 体 生长 及 维持 的 ATP 消耗 速率 。 此 外 ， 由 于 葡萄 糖 转化 为 不 同 的 代谢 物 
时 必须 达到 氧化 还 原平 衡 或 相当 于 NADH 平衡 ) ， 葡 萄 糖 的 吸收 必须 与 琥珀 酸 、 乳 酸 及 乙 
醇 的 形成 有 关 。 因 此 ， 利 用 表 3.1 的 数据 以 及 胞 内 代谢 产物 计量 系数 矩阵 中 的 最 后 一 列 数 
据 ， 就 可 得 到 每 100 mol 葡萄 糖 消 耗 的 NADH 为 : 
2x10.7+79.$S+2X49.8=200.5 
这 与 每 100mol 葡萄 糖 转 化 为 磷酸 烯 醇 现 酮 酸 而 生成 的 200mol NADH 非常 吻合 。 


3.2 反应 速率 


3.1 节 中 的 化 学 计量 反应 式 表 明了 了 个 胞 内 反应 中 每 一 个 反应 生成 或 消耗 物质 的 量 ， 但 
不 能 计算 出 代谢 产物 分 泌 至 培养 基 的 速率 或 相对 数量 。 Oe Ach ene 一 步 将 
其 耦 联 起 来 就 可 确定 产物 分 泌 的 总 速率 。 某 一 化 学 反应 的 速率 用 正 反 应 速率 (或 速度 ) RR 
示 ， 它 指 计量 系数 为 8 的 化 合 物 的 生成 速率 是 Po。 通常， 每 个 反应 的 某 一 化 学 计量 系数 可 
52 


任意 定 为 1， 因此 在 特定 的 反应 中 ， 正 反应 速率 就 等 于 该 物质 的 消耗 或 生成 速率 ， 例 如 ， 反 
应 〈3.1) 的 速率 就 等 于 通过 PTS 系统 的 葡萄 糖 的 吸收 速率 。 为 此 ， 正 反应 速率 的 单位 通常 
表示 为 mol"h ”“， 当 考虑 到 体积 的 因素 时 ， 其 单位 可 表示 为 mol(L'h)-!。 对 于 细胞 反应 ， 
常 以 生物 质 作 为 参考 ， 定 义 所 谓 的 比 速率 ， 其 单位 为 mol"g -1 (FH) .h-!l。 将 3.1 节 中 J 
个 反应 的 正 反应 速率 汇集 于 速率 向 量 " 中 ,那么 Bio, 就 表示 第 j) 个 反应 中 的 第 ; 个 代谢 产物 
的 比 生成 速率 。 由 于 底 物 的 计量 系数 〈 即 矩阵 A 的 元 素 ) 通常 为 负 ， 则 第 j 个 反应 中 第 ; 个 
底 物 的 比 转化 速率 就 为 - wjiw。 若 要 计算 某 物质 的 总 生成 速率 或 消耗 速率 ， 则 必须 将 其 在 不 
同 反 应 中 的 贡献 相 加 。 例 3.1 的 大 肠 杆菌 混合 酸 发 酵 可 说 明 此 点 : 在 一 个 反应 (甲酸 脱 羧基 
反应 ) 生成 的 CO; 被 用 于 另 一 反应 (磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 的 羧 化 反应 ) ， 显 然 CO; 的 总 生成 速率 
由 这 两 个 反应 的 相对 速率 确定 。 因 此 ， 第 ;个 底 物 的 净 比 吸收 速率 可 用 其 在 所 有 J 个 反应 中 
的 消耗 率 之 和 来 表示 : 


J 
| <n a= aay Dy Bid; (3.5) 
同样 ， 第 ;个 代谢 产物 的 净 比 生成 速率 为 : 
J 
yee Ds Bi (3.6) 


式 (3.5) 及 式 (3.6) 说 明 在 可 直接 测定 的 底 物 比 吸收 速率 、 产 物 比 生成 速率 与 不 可 直接 测 
定 的 不 同 的 胞 内 反应 速率 之 间 有 着 重要 的 关系 。 通 常 以 通 量 代表 后 者 用 以 说 明 它 们 是 通过 途 
径 而 非 单个 反应 的 速率 。 若 某 物 质 仅 在 一 个 反应 中 生成 ， 其 消耗 或 生成 速率 的 测量 就 是 这 个 
反应 速率 的 一 个 间接 测量 。 因 此 ， 回 到 例 3.1 大 肠 杆菌 混 酸 发 酵 的 例子 ， 可 以 看 到 ， 乙 酸 的 
生成 速率 就 等 于 从 乙酰 辅酶 A 经 磷酸 乙酰 至 乙酸 的 通 量 。 换 言 之 ， 本 例 中 的 第 七 个 反应 的 
RA (BGM St) 可 通过 测定 乙酸 的 生成 速率 进行 计算 。 

与 式 (3.5) RK (3.6) 相似 ， 对 生物 质 组 分 及 胞 内 代谢 物 ， 可 得 出 : 


J 
Tmacro,i 一 > Yji0; (329) 
j=l 


J 
rmet,i 一 > Bi (3.8) 
j=l 


这 些 速率 不 像 底 物 比 吸收 速率 及 产物 比 生 成 速率 那样 容易 进行 实验 测定 。 式 (3.7), 

(3.8) 中 的 速率 是 净 比 生成 速率 ， 并 且 可 通过 胞 内 组 分 的 测量 对 其 进行 量化 。 因 此 ， 一 个 物 

质 可 以 在 一 个 反应 中 消耗 ， 而 在 另 一 反应 生成 。 式 (3.7) 与 式 (3.8) 中 左边 的 速率 就 是 在 

全 部 J 个 胞 内 反应 中 该 物质 生成 及 消耗 的 净 结 果 。 若 速率 rmet,; 为 正 ， 则 表示 第 ;个 胞 内 代 

谢 物 的 净 生 成 ， 若 为 负 ， 则 为 净 消 耗 ， 如 果 速 率 为 零 ， 就 表明 在 HRP, EMH 

比 速 率 正 好 互相 平衡 〈( 这 种 平衡 是 代谢 通 量 分 析 的 基础 ， 在 第 8 章 一 第 10 章 将 详细 讨论 )。 
xt (3.5) ~sk (3.8) 的 加 和 方程 可 用 矩阵 表示 如 下 : 


m= — APY (3.9) 
r,=B'v (3.10) 
人 (3.11) 
Emet = GV (3.12) 


这 里 比 速率 向 量 rm 包括 N POR E, ry de M 个 比 产物 生成 速率 。 
53 


($3.2) 大 肠 杆 菌 混 合 酸 发 酵 的 比 速率 
现在 将 例 3.1 中 8 个 反应 的 速率 以 wl 一 zg 表示 ， 则 立即 可 得 出 葡萄 糖 比 吸收 率 为 : 


rbe= Zl (1) 
当然 通过 式 (3.9) 也 可 得 到 该 结果 


U 
re=- (-F 000000 0) | ‘|=> (2) 


FA, Wn SR Al ee ie i BS A A A A et Lo, 表示 ， 则 其 等 于 葡萄糖 比 吸收 速率 的 2 倍 。 
同样 可 得 到 代谢 产物 的 比 生成 速率 ， 例 如 对 于 CO 来 说 : 
rco, = V67 V2 (3) 


由 于 Hp AS EAE RES F ove, RAW ERR ESF wz， 则 CO; 生成 速率 应 
等 于 上 述 两 个 速率 之 差 ， 这 一 点 可 作为 限制 条 件 用 以 检验 数据 的 一 致 性 。 注 意 表 3.1 中 的 数 
据 似乎 不 一 致 ， 因 为 每 代谢 100mol 和 葡萄糖 形成 的 CO. 多 于 Hz， 这 或 是 由 于 实验 误差 ， 或 
是 由 于 模型 太 简 单 造 成 的 。 

在 这 样 简单 的 模型 中 ， 很 容易 直接 从 单个 反应 速率 与 底 物 比 吸收 速率 及 产物 比 生成 速率 
之 间 推 导出 相互 关系 (不 必用 和 抑 阵 形式 )。 然 而 对 胞 内 代谢 物 却 不 是 这 样 ， 因 为 它们 可 以 参 
与 几 个 不 同 的 反应 。 因 此 ， 对 于 所 考虑 的 5 个 胞 内 代谢 物 ， 可 得 如 下 结果 : 


TEP eS =1 0 0 0 0 0 V1— U2— U3 

I Pyr 0 0 1 Pee SAPO 0 0 U3— V4— US 

EA aie OOO. OF TREK A tle Us— U7— Ug (4) 
Ge DLE PDEA, FOE HOH Oh sh Lee ages 

rene Rete epithe i oe Oya egy. 0. 7-2 it 20st = ee 


如 例 3.1 PATTER, rrp AY ty Be AR Mai FA Bl Be 3 AN el 9 a SA A EC 
之 和 。 


Je 3 动态 质 量 平衡 


在 前 一 节 中 ， 推 导出 了 关联 胞 内 反应 速率 与 底 物 吸收 速率 及 产物 生成 速率 的 方程 式 。 后 
者 可 通过 实验 测定 底 物 及 代谢 产物 浓度 得 到 。 在 讨论 如 何 通过 这 些 测量 求 得 比 速率 之 前 ， 有 
必要 考虑 生物 反应 器 的 动态 ， 因 为 这 样 的 测量 通常 是 在 生物 反应 器 中 进行 的 。 图 3.2 是 生物 
反应 器 的 一 般 表 示 ， 其 体积 为 V 〈L)， 新 鲜 无 菌 培 养 基 以 Fi (Leh!) 的 流 率 进 入 反应 
器 ， 用 过 的 培养 基 以 Fou (Leh!) 的 流 率 流出 反应 器 。 反 应 器 中 的 培养 基 假 定 处 于 完全 
(或 理想 ) 混合 状态 ， 即 不 同 培养 基 组 分 的 浓度 不 随 空间 位 置 变 化 。 对 于 小 体积 的 生物 反应 

54 


器 (< 1L， 包 括 摇 瓶 )， 经 通气 及 搅拌 可 达 此 目的 。 而 对 于 实验 室 的 搅拌 生物 反应 器 (1 一 
10L)， 为 了 保证 反应 器 内 培养 基 处 处 均匀 一 致 ， 需 引入 一 些 特 殊 设计 (Sonnleitner and Fi- 
ethter 1988; Nielsen and Villadsen 1993)。 并 不 是 所 有 的 生物 反应 器 都 涉及 到 培养 基 的 连续 
流动 ， 其 可 有 几 种 不 同 的 操作 方式 ， 现 仅 考虑 三 种 最 常用 的 方式 : 

。 分 批 式 ，Fis= Fo = 0， 即 培养 液体 积 便 定 ， - 
它 是 传统 的 发 酵 操 作 方式 ， 而 且 由 于 实验 设施 相对 简 cf ¢; 
单 ， 也 为 许多 生命 科学 家 所 使 用 。 分 批 式 实 验 具 有 操 
作 简 单 、 在 短 时 间 内 能 获得 大 量 实验 数据 的 优点 。 其 
缺点 是 : 由 于 整个 实验 过 程 的 动态 变化 ， 即 细胞 所 经 
历 的 环境 条 件 随 时 间 而 变化 ， 使 得 解释 实验 数据 变 得 
困难 。 若 使 用 装备 精良 的 生物 反应 器 ， 那 么 至 少 某 些 
变量 如 pH 及 浴 解 氧 等 ， 可 控制 在 恒定 水 平 。 

@ 连续 式 ，Fis= 下 .和 0， 培养 液体 积 恒 定 。 典 
型 的 连续 式 生物 反应 器 称 为 恒 化 器 ， 所 设计 的 加 料 培 。 束 ，72 stsvinaaee maaan mae 
养 基 中 有 一 种 限 速 底 物 ， 以 允许 生物 质 的 比 生长 速率 cf 一 加 料 液 中 第 ; 个 化 合 物 的 浓度 ; 

在 可 控制 的 范围 内 变化 。 连 续 式 生物 反应 器 的 优点 是 dling hated oe 
可 获得 稳 态 的 操作 条 件 ， 人 允许 在 非常 确定 的 环境 条 件 5 ge eet ated — 
下 精确 地 测定 比 速 率 。 通 过 改变 加 料 速率 ， 可 进一步 人 

改变 实验 和 条件， 由 此 可 得 到 环境 条 件 对 细胞 生理 影响 

的 有 用 信息 。 连 续 式 生物 反应 器 的 缺点 是 : 需要 准备 大 量 新 鲜 无 菌 的 培养 基 ， 因 此 劳动 强度 
大 ， 而 且 经 过 很 长 时 间 才 能 达到 稳定 状态 。 尽 管 连续 操作 有 优点 ， 但 在 工业 化 生产 中 极 少 使 
用 ， 这 是 因 其 对 污染 敏感 ， 如 经 由 加 料 流 的 污染 。 此 外 ， 对 遗传 不 稳定 性 也 敏感 ， 可 导致 快 
速生 长 的 突变 株 产 生 ， 在 与 生产 菌株 竞争 中 处 于 优势 。 连 续 式 操作 的 其 它 例子 是 恒 pH 器 ， 
它 是 通过 调节 加 料 流 以 维持 生物 反应 器 的 pH 恒定。 还 有 恒 浊 器， 调节 加 料 流 以 维持 生物 量 
浓度 恒定 。 

@ 流 加 式 (或 半 间 软 式 )，Fia 和 关 0，Fu=0， 即 反应 体积 增加 。 这 也 许 是 在 工业 生产 中 
最 常用 的 一 种 方法 ， 因 为 它 允 许 环境 条 件 的 控制 ， 例 如 使 葡萄 糖 浓度 维持 在 某 种 水 平 ， 能 产 
生 很 高 的 效 价 (代谢 产物 浓度 可 高 达 每 升 几 百 克 )， 这 对 下 游 处 理 非常 重要 。 同 时 ， 流 加 操 
作 是 一 种 很 方便 的 能 维持 稳定 环境 条 件 的 实验 系统 ， 尽 管 稳定 期 有 限 ， 它 便于 进行 细胞 生理 
研究 。 

对 于 图 3.2 所 示 的 生物 反应 器 ， 第 ; 个 底 物 的 动态 质量 平衡 式 如 下 (推导 见方 框 3.1): 

底 物 积累 速率 = - 底 物 消耗 速率 + 底 物 添加 速率 - 底 物 流出 速率 
dc, i 
ae 

式 中 ，c、; 为 生物 反应 器 中 第 ; 个 底 物 的 浓度 (mol"L 59; ct 为 加 料 中 第 ; SE wR 
FE (mol.L -1); 7, ;为 第 i 个 底 物 的 比 消耗 速率 ; z 为 生物 质 的 质量 浓度 [g ' (FR): 
L-']; D 是 所 谓 的 稀释 速率 (h-1) ， 分 批 式 操作 的 D 为 零 。 恒 化 器 及 流 加 式 操作 的 稀释 速 
率 如 下 : 


= 一 rs ii 十 (cf 人 三 Ci (3.13) 


/p— 


<5 


(3.14) 
55 


在 方程 式 (3.13) 中 ， 右 边 第 一 项 是 底 物 消耗 的 体积 速率 ， 它 等 于 底 物 的 比 消耗 速率 乘 
以 生物 质 浓 度 。 第 二 项 涉及 生物 反应 器 底 物 的 加 料及 出 料 。 式 左边 为 积累 项 ， 它 表示 底 物 随 
时 间 的 变化 率 ， 在 分 批 式 反应 器 中 ， 它 等 于 底 物 的 体积 消耗 速率 。 稳 定 状态 时 ， 积 累 项 为 
零 ， 因 此 底 物 的 体积 消耗 速率 就 等 于 黎 释 速率 乘 以 流入 及 流出 反应 器 的 底 物 浓度 之 差 。 

与 底 物 的 动态 质量 平衡 相似 ， 代 谢 产 物 的 平衡 方程 为 : 


dep. 
Pgh Hihededee ey: (3.15) 


式 中 ， 右 边 第 一 项 为 第 ;个 产物 的 体积 生成 速率 ， 通 常 无 菌 加 料 中 代谢 产物 不 存在 ， 所 
以 cp,; 为 零 ， 在 此 情况 下 稳 态 时 产物 体积 生成 速率 等 于 稀释 速率 乘 以 反应 器 中 的 代谢 产物 浓 
BE 〈 该 浓度 也 等 于 流出 反应 吉 的 代谢 产物 浓度 )。 

对 于 生物 质 组 分 ， 通 常 以 生物 质 为 参照 ， 即 浓度 是 以 生物 质 作为 基准 ， 此 时 可 得 如 下 的 
质量 平衡 方程 〈 推 导 见 方 框 3.1): 


人 
[ee YT macro,i _ WER iach. i S. 16) 


AFH, X macro,i JF t 个 生物 质 组 分 的 浓度 ; L 为 比 生长 速率 Ch ie 生物 质 组 分 浓度 
可 用 不 同 单位 来 表示 ， 但 通常 为 g"g | ( 干 重 )。 用 这 些 单位 可 以 表明 ， 所 有 生物 质 组 分 浓 
度 之 和 等 于 1: 


Q 
人 a 1 (3.17) 
i=l 


此 外 ， 上 述 单位 与 经 实验 测定 的 细胞 大 分 子 组 成 一 致 ， 该 组 成 通常 以 质量 分 数 表 示 〈 见 表 
2.11)。 从 式 (3.16) 中 可 看 出 生物 质 组 分 的 质量 平衡 与 生物 反应 器 操作 方式 无 关 ， 因 为 稀 
释 速率 没 直接 出 现在 质量 平衡 方程 中 。 但 它 与 该 方程 中 的 最 后 一 项 有 间接 关系 ， 最 后 一 项 表 
示 由 于 生长 而 使 生物 质 膨胀 时 生物 质 组 分 的 稀释 。 因 此 假如 没有 大 分 子 库 的 净 合 成 〈rmaco,i = 
0) 而 生物 质 仍 发 育 长 大 〈w >0) 时 ， 其 胞 内 水 平 将 降低 。 利 用 方程 式 《3.17)， 比 生长 速 
率 学 于 所 有 生物 质 组 分 的 净 生成 速率 之 和 《见方 杠 3.1): 


人 和 See ‘ (3.18) 
ey 


方 框 3.1 动态 质量 平衡 方程 的 推导 

在 此 将 说 明 底 物 及 生物 质 组 分 质量 平衡 方程 的 推导 。 代 谢 产 物 及 胞 内 产物 的 质量 平 
衡 方程 可 类 似 导 出 。 

底 物 

现 考虑 第 ; 个 底 物 ， 其 通过 加 料 流 进入 生物 反应 器 并 被 反应 器 中 细胞 消耗 ， 该 化 合 
物 的 质量 平衡 式 为 : 


d(c,,iV) ad 


dt rm r,.;xV + Fel; = MitCs, i (1) 


式 中 ，r。; 为 物质 ; 的 比 消耗 速率 [mol-g | (FH) -h''); c, HHERMA PH 
浓度 〈 假 设 等 于 出 口 的 浓度 mol'L -1); ci, 为 其 在 加 料 流 中 的 浓度 (mol'L 1); x ER 
应 器 中 生物 质 的 质量 浓度 [g (FH) +L). eK 〈1) 中 的 第 一 项 是 累积 项 ， 第 二 
项 是 消耗 项 〈 或 反应 项 ) ， 第 三 项 是 供给 项 ， 最 后 一 项 是 该 化 合 物 的 移出 速率 。 重 新 安排 
方程 式 (1) 可 得 到 : 


as 


方程 两 侧 同 除 以 V 后 得 到 : 


dc, ; 


dt Si Sy th Ne ea V Si (3) 
对 于 流 加 式 反 应 器 : 
(4) 


而 且 由 于 Fo. =0, WRX (3) 括 弧 中 的 项 就 等 于 稀释 速率 。 对 于 连续 式 操作 的 反应 
器 ， 培 养 液体 积 恒定 ， 并 且 下 = Fo， 所 以 括 弧 中 的 项 也 等 于 稀释 速率 。 于 是 方程 式 
(2) 就 还 原 为 适用 于 任何 操作 形式 的 质量 平 衔 方 程式 (3.13)。 

生物 质 组 分 

生物 质 组 分 的 质量 平衡 方程 为 〈 假 设 加 料 流 无 菌 ) : 


1. eae V) 
SE Rit aaiots ibis eM 更 FF 全 过 (5) 


式 中 ，Xiz 是 生物 反应 器 中 第 ; 个 生物 质 组 分 的 质量 浓度 〈g .上  ); rmacro,; 为 其 比 
净 生 成 速率 。 重 排 方程 式 (5) 后 得 到 : 


a 
dt 


此 外 ， 对 任何 操作 形式 的 生物 反应 器 


«: Poa 54 te, SVG 
De (7) 


AEX (7) 与 生物 质 总 浓度 的 质量 平衡 方程 式 〈3.20) 一 起 可 得 到 方程 式 (3.16)。 
为 了 推导 方程 式 (3.18) ， 我 们 可 用 方程 式 〈3.17),， 其 意 指 : 


Q dX Q Q 

macro,i __ Le 
5 dt - pe Fmacro,i [4 Eels: Ts 0 
i=1 i=1 i=1 


由 此 可 直接 得 到 方程 式 (3.18). 


对 于 胞 内 代谢 物 ， 使 用 与 生物 质 组 分 相同 的 浓度 单位 不 太 方 便 。 这 些 代谢 物 溶 于 胞 液 
中 ， 因 此 ， 以 单位 细胞 液体 体积 的 摩尔 表示 其 浓度 更 为 怡 当 。 选 择 这 个 单位 ， 还 可 直接 对 胞 
内 代谢 物 浓 度 与 酶 亲 和 性 进行 比较 ， 后 者 常 以 它们 的 K,, 值 来 量化 ， 其 单位 为 mol'L !。 对 
于 用 某 一 单位 表示 的 浓度 ， 如 果 生 物质 密度 〈 在 lg 细胞 MAml 细胞 范围 内 ) 及 水 的 含量 CE 
0.67ml *K /nl 细胞 范围 内 ) 已 知 ， 则 很 容易 将 该 单位 转换 成 另 一 单位 。 尽 管 胞 内 代谢 物 使 
用 了 不 同 的 浓度 单位 ， 生 物质 仍 是 基准 ， 并 且 胞 内 代谢 物 的 质量 平衡 方程 也 用 生物 质 组 分 的 
相同 形式 来 表示 : 


=Tmacro,i 一 ( + x Fi x macro, i (6) 


de nets 


dt = Tmet,i  /4C met,i (3.19) 


式 中 ，cmet,; 为 第 ; 个 胞 内 代谢 物 的 浓度 。 重 要 的 是 对 两 种 浓度 单位 做 出 区 别 : 它 是 用 
mol/ 反 应 器 液体 体积 还 是 用 mol/ 细 胞 液体 体积 表示 。 若 浓度 的 单位 采用 前 者 ， 那 么 质量 平 
衡 方程 式 将 完全 不 同 。 

式 (3.13)、 式 (3.1$)、 式 (3.16) BH (3.19) 代表 了 细胞 化 学 计量 学 中 4 种 不 同类 

SF 


型 物质 的 质量 平衡 。 此 外 ， 总 的 生物 质 平衡 也 很 重要 ， 其 方程 如 下 : 

of = (4 -D)x (3.20) 
从 这 个 方程 中 容易 看 出 在 稳 态 时 的 比 生长 速率 等 于 稀释 率 。 因 此 ， 在 连续 培养 中 通过 改变 稀 
RRS 〈 或 加 料 速 率 ) ， 就 可 得 到 不 同 的 比 生长 速率 。 

式 (3.13)、 式 (3.15). HK (3.16) RH (3.19) 的 质量 平衡 形成 了 细胞 培养 过 程 以 任 
何方 式 定 量 处 理 的 基础 ， 其 范围 包括 从 比 速率 (或 体积 速率 ) 的 计算 到 生物 过 程 的 设计 与 模 
拟 。 对 于 生物 过 程 设 计 及 模拟 ， 必 须 给 出 速率 向 量 v 中 各 个 反应 速率 的 动力 学 表达 式 ， 即 提 
供 反 应 速率 与 系统 变量 之 间 的 函数 关系 。 将 化 学 计量 反应 式 与 反应 速率 动力 学 方程 结合 就 构 
成 了 一 个 动力 学 模型 。 其 可 用 于 过 程 模拟 ， 例 如 确定 在 不 同 操作 条 件 下 ， 系 统 如 何 工 作 。 在 
一 些 生化 工程 教科 书 [如 Bailey and Ollis (1986) 或 Nielsen and Villadsen (1994)] 中 已 广 
泛 讨 论 了 利用 简单 的 动力 学 模型 〈 也 称 为 非 结 构 模 型 ) 或 高 级 的 结构 模型 进行 培养 过 程 的 设 
计 及 模拟 ， 为 此 本 文 不 作 进 一 步 讨 论 。 下 面 讨论 如 何 利 用 实验 数据 确定 代谢 物 及 生物 质 组 分 
的 比 速率 等 方面 的 问题 。 

表 3.2 列 出 了 不 同 的 方程 式 ， 用 它 可 以 计算 在 不 同 的 操作 条 件 下 生物 反应 器 中 底 物 吸 
收 、 代 谢 产 物 形 成 及 生物 质 组 分 〈 包 括 生物 质 组 分 和 胞 内 代谢 物 ) 净 合 成 的 比 速率 。 在 所 有 
情况 下 ， 均 可 看 到 生物 质 浓 度 是 一 个 重要 的 变量 。 若 得 不 到 可 靠 的 生物 质 浓度 数据 ， 则 应 采 
用 体积 速率 而 不 是 比 速率 。 然 而 体积 速率 的 缺点 是 不 能 直接 比较 不 同 实验 中 的 数据 。 例 如 在 
一 个 实验 中 ， 生 物质 的 生长 速率 为 2.0g( 干 重 ).L 1.h-!， 而 在 另 一 实验 中 为 1.0g( 王 重 )， 
L -1Lh 1， 尽管 比 生长 速率 可 以 相同 为 0.2h-!， 但 第 一 个 实验 中 生物 质 浓 度 为 10g (FH): 
Lo, MB—ITLM PH Sg (TH)-L. 


表 3.2 用 实验 数据 计算 比 速率 所 使 用 的 方程 


EL f acs] 
r= 4[p(d--$ 


Pee Oras, 


a 
r=+|D(cf-e)-S 
注 : 对 于 胞 内 物质 ， 仅 列 出 生物 质 组 分 的 表达 式 ， 它 与 胞 内 代谢 物 的 表达 式 相 似 。 


从 表 3.2 还 可 看 出 ， 除 了 处 于 稳 态 的 连续 式 生物 反应 器 外 ， 确 定 其 它 条 件 下 的 比 速率 需 
要 计算 浓度 对 时 间 的 导数 。 根 据 浓度 测量 曲线 切线 的 斜率 即 可 得 到 对 时 间 的 导数 。 然 而 应 该 
认识 到 由 于 实验 数据 通常 稀疏 并 且 有 噪声 ， 因 此 ， 通 过 这 种 方法 对 时 间 求 导数 难以 得 到 好 的 
估 值 。 由 此 可 清楚 显示 稳 态 连续 培养 的 优点 ， 它 能 精确 佑 算出 比 速率 。 然 而 ， 有 关 细 胞 生理 
的 许多 信息 是 从 分 批 培 养 及 处 于 动态 条 件 下 的 连续 培养 中 获得 的 ， 因 此 通过 应 用 稳健 的 步骤 
从 这 类 实验 中 获取 有 关 比 速率 的 信息 是 非常 重要 的 。 

另 一 种 方法 是 将 数据 用 函数 表示 ， 例 如 用 多 项 式样 条 函数 表示 ， 以 便 用 所 拟 合 的 函数 计 
算 导 数 和 比 速 率 。 但 这 种 方法 也 能 使 比 速率 产 生 大 的 波动 ， 因 为 难以 找 出 合适 的 函数 形式 来 
表示 培养 过 程 实验 数据 〈 应 注意 到 的 是 ， 为 了 获得 比 速率 ， 必 须 推 导出 目标 化 合 物 浓度 及 生 

58 


物质 浓度 的 两 种 函数 式 )。 由 于 大 多 数 细胞 反应 过 程 可 用 指数 函数 表示 ， 所 以 用 多 项 式样 条 
函数 式 来 表达 是 不 太 适 当 的 。 有 一 种 较 好 的 方法 ， 尤 其 适用 于 分 析 分 批 式 培 养 的 数据 ， 即 用 
简单 的 模型 如 Monod 模型 @ 进行 参数 拟 合 ， 然 后 直接 从 模型 计算 比 速率 。 由 于 像 Monod 
模型 这 样 的 简单 模型 ， 其 本 质 属 经 验 性 质 的 ， 因 此 原则 上 这 种 方法 与 寻求 一 种 合适 的 函数 形 
式 表 示 数 据 是 相同 的 。 但 由 于 这 些 模 型 通常 很 适 于 处 理 分 批 培养 的 数据 ， 其 结果 还 是 令 人 满 
意 的 。 

前 面 介绍 的 实验 数据 的 函数 表示 法 〈 或 完全 经 验 性 的 或 用 简单 的 动力 学 模型 ) 适用 于 可 
获得 足够 多 数据 的 场合 。 然 而 由 于 胞 内 物质 只 是 零星 测定 ， 因 而 就 很 难 正 确 估 算 其 时 间 导 
数 。 一 般 来 说 ， 对 胞 内 代谢 物 可 假设 为 拟 稳 态 〈 见 8.1 节 )。 另 外 ， 在 分 批 培养 的 指数 生长 
期 ， 所 谓 的 平衡 生长 通常 占 优 势 。 这 意味 着 生物 质 的 胞 内 组 分 不 发 生变 化 ， 即 生物 质 组 分 的 
浓度 处 于 稳定 状态 ， 因 此 ， 只 是 通过 测量 一 个 或 一 些 大 分 子 组 分 及 比 生长 速率 好 的 估计 值 ， 
就 可 确定 向 量 rmacee 的 各 组 成 元 素 。 


3.4 产 率 系数 与 线性 速率 方程 


正如 本 章 引 言 中 所 提 到 的 ， 代 谢 模型 是 细胞 生理 定量 分 析 的 基础 。 但 通常 是 这 样 的 情 
况 : 人 们 并 不 是 对 胞 内 反应 的 所 有 细节 感 兴趣 ， 而 是 想 对 总 的 代谢 通 量 分 布 作 更 宏观 的 评 
估 ， 例 如 葡萄 糖 中 的 碳 有 多 少 用 于 生成 目标 代谢 物 等 。 总 的 通 量 分 布 通常 以 产 率 系数 表示 ， 
它 指 相对 于 某 一 参照 物 (通常 为 碳 源 或 生物 质 ) 的 总 通 量 。 因 此 产 率 系数 是 无 因 次 的 ， 其 形 
AW: 每 单位 质量 参照 物 生 成 单位 质量 代谢 物 。 例 如 ， 消 耗 每 摩尔 葡萄 糖 生成 的 赖 氨 酸 的 物 
质 的 量 (摩尔 )。 然 而 在 不 同 的 情况 下 也 可 采用 其 它 人 参照 物 ， 因 而 消耗 每 摩尔 氧 生成 CO; 的 
物质 的 量 [ 称 为 呼吸 商 (RQ) ] 常用 于 表示 好 氧 培养 的 特征 。 遗 憾 的 是 ， 在 文献 中 出 现 了 几 
种 不 同 的 产 率 系 数 表 示 法 。 在 此 将 采用 Nielsen 与 Villadsen (1994) 的 命名 法 [Roels 
(1983) 文献 介绍 ] 。 产 率 系 数 以 双 下 标 表 示 Yy ， 指 每 消耗 REM) 单位 质量 i 物质 所 形 
成 〈 或 消耗 ) ) 物质 的 量 。 以 第 ; 个 底 物 为 参照 ， 产 率 系数 可 表示 如 下 : 


Ye ey feet BO (3.21) 
了 f= tseee (3.22) 
eae (3.23) 
很 明显 
ix er (3.24) 


产 率 系 数 对 评估 实验 数据 极 有 价值 ， 其 通常 是 从 原始 发 酵 数 据 中 提取 出 的 首 批 定 量 数据 。 产 
率 系 数 的 重要 性 首先 在 于 它 是 向 本 征 速 率 中 引入 某 些 有 用 关系 的 工具 。 例 如 某 一 产 率 系数 确 
定 为 或 假设 为 常数 ， 这 就 立刻 暗示 着 在 两 个 速率 之 间 存 在 着 一 定 关系 。 这 种 关系 也 许 完全 是 


@ 在 Monod 模型 中 ， 比 生长 速率 可 由 pe = ne 表示 ， 式 中 ，pmx 为 最 大 比 生长 速率 ; 天、 为 Monod 常数 ; ,为 


限制 型 基质 浓度 。 该 模型 假定 基于 限制 型 基质 的 生物 质 得 率 为 常数 ( 见 3.4 节 )， 因 此 ， 基 质 比 消耗 速率 可 由 痊 = Yu 
表示 (也 见 3.4 节 )。 
59 


经 验 性 的 或 可 从 其 它 基 本 的 生化 及 生理 关系 中 推导 出 ， 讨 论 如 下 : 

由 Monod (1942) 引入 的 对 细胞 生长 的 经 典 描述 中 ， 产 率 系 数 Ys 被 视 为 常数 ， 所 有 的 
细胞 反应 汇集 为 一 个 底 物 转变 为 生物 量 的 总 生长 反应 。1959 年 ，Herbert (1959) 研究 表明 
了 生物 质 对 底 物 的 得 率 并 不 是 常数 。 为 了 说 明 这 一 点 ， 他 引入 了 内 源 代谢 的 概念 ， 并 指出 总 
的 底 物 消耗 除 用 于 生物 质 合 成 之 外 ， 有 一 部 分 参与 了 内 源 代谢 。 同 年 ，Luedeking 与 Piret 
(1959a，b) 发 现在 非 生 长 条 件 下 ， 乳 酸 菌 能 产 乳 酸 ， 这 与 细胞 的 内 源 代 谢 相 一 致 。 他 们 的 
结果 表明 了 在 乳酸 的 比 生成 速率 与 比 生 长 速率 之 间 存 在 着 线性 关系 : 

rp =ap +b (3.25) 

Pirt (1965) 在 底 物 比 吸收 速率 与 比 生成 速率 之 间 引 入 了 相似 的 线性 关系 ， 他 建议 用 维 

持 这 个 词 ， 此 词 现 在 是 最 常用 的 用 以 描述 内 源 代谢 的 一 个 词 。Pirt 所 描述 的 线性 关系 如 下 : 
rs= Yxs +m, (3.26) 

式 中 ，Yge 指 真实 生长 得 率 系 数 ; m, NHAM. VAKHAHKAB, RAR, EG 

率 系数 不 再 是 常数 ， 因 此 生物 质 对 底 物 的 得 率 变 为 : 


Yx = (3227) 


= ee 
Y¥Rra + wy 
式 (3.27) 表明 在 低 比 生长 速率 的 条 件 下 ， 有 越 来 越 多 的 底 物 用 于 满足 细胞 的 维持 需要 ， 此 
时 实际 得 率 Y. 可 小 于 真实 生长 得 率 。 对 于 高 的 比 生长 速率 ， 产 率 系数 接近 Yona, 
即 在 快速 生长 时 由 于 大 多 数 底 物 用 于 生长 ， 实 际 生长 得 率 系 数 接近 于 真实 生长 得 率 。 

根据 经 验 得 出 的 线性 关系 对 生长 数据 的 关联 很 有 用 ， 尤 其 是 对 那些 从 稳 态 连续 培养 中 所 
得 的 数据 。 对 于 大 部 分 重要 的 比 速率 ， 利 用 这 些 速率 可 推导 出 与 方程 式 (3.26) 相似 的 线性 
关系 式 。 图 3.3 可 说 明 这 一 点 ， 图 中 绘制 了 葡萄 糖 的 吸收 率 、CO; 比 生成 速率 及 氧 比 吸收 率 
与 处 于 稳 态 的 丝 状 真菌 产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum) 连续 培养 的 比 生长 速率 的 郴 
数 关系 。 类 似 的 线性 关系 也 可 从 文献 中 找到 ， 这 种 线性 产 率 关系 的 异常 强健 及 普遍 适应 性 表 
明 它 们 都 来 自 于 一 个 可 能 的 根本 的 基础 。 一 


S 
oe) 


i 个 可 能 性 是 在 ATP 的 连续 供给 与 消耗 之 间 

= 二 ”的 平衡 ， 这 是 由 于 所 有 细胞 中 ATP 的 产生 

hs 26 ”与 耗 尽 的 紧密 耦合 。 在 此 假设 下 ， 产 能 底 物 

E 二 ”的 作用 就 是 产生 足够 多 的 ATP 以 驱动 细胞 

3 2 PHAEDA MARA i, bE AY 

aie 2 MAE EE. APRA st (2.27) 所 示 的 线 
2 © RR HR: 

| 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0. 0 了 2 iol YxaTPy a 本 

和 式 (3.28) 是 Pirt (1965) 所 述 线性 关 

图 3.3 在 己 . chrysogenum 葡萄 糖 限制 性 联 的 一 个 拓 似 形 去 。 如 2.6 节 所 讨论 的 ， 方 

mw 葡萄 糖 比 吸收 速率 ~.; 全 氧气 比 维持 过 程 中 所 消耗 的 ATP 严格 平衡 。 此 外 ， 

BEE ros @ CO: 比 生成 速率 r。 如 果 产 能 底 物 的 ATP 得 率 为 恒定 ， 即 rar 


比 生长 速率 等 同 于 稀释 速率 。 这 些 速率 是 以 单位 浓度 上 en : 
AMHRETEROSTHOEAR. aeyem 2 TSE, MARR, AX ae ed 
Scie Hk yn, Me, ee. eos «= BE FN (3.26) 的 线性 关系 。 还 需 注 

AAR ABE AG REE. BK A F Nielsen (1997) 意 的 是 : Sh (3.28) 中 的 YxATP 实 际 上 是 真 


60 


实 的 ATP 得 率 系 数 ， 但 通常 表示 时 不 加 上 标 “true"”。 

平衡 ATP 产生 与 消耗 这 个 概念 可 扩大 到 其 它 辅助 因子 ， 如 NADH 及 NADPH， 由 此 就 
可 能 导出 三 种 不 同 条 件 下 的 线性 速率 方程 (Nielsen and Villadsen, 1994): (1) 厌 氧 生长 ， 
ATP 由 底 物 水 平 磷 酸化 产生 ; (2) 无 代谢 产物 形成 的 好 氧 生 长 ; (3) 有 代谢 产物 形成 的 好 
氧 生长 。 现 用 下 列 例子 〈( 例 3.3 及 例 3.4) 说 明 前 两 种 情况 。 


【 例 3.3】 产 黄 青 雪 的 代谢 模型 

对 于 无 代谢 产物 形成 的 需 氧 过 程 ， 为 了 说 明 其 线性 速率 方程 的 推导 过 程 ， 现 使 用 由 
Nielsen (1997) 提出 的 丝 状 真菌 产 黄 青 霉 的 简单 代谢 模型 。 其 化 学 计量 模型 概括 了 总 的 细 
胞 代谢 反应 ， 对 ATP. NADH 及 NADPH 作 拟 稳 态 假设 后 ， 就 可 推导 出 线性 速率 方程 ， 其 
中 葡萄 糖 、 氧 的 比 吸收 速率 及 CO; 比 形成 速率 可 用 比 生 长 速率 的 形式 来 表示 。 通 过 与 实验 
数据 进行 比较 就 可 求 出 这 些 线性 速率 式 中 的 参数 ， 进 而 可 获得 关键 的 能 量 参数 信息 。 在 分 析 
过 程 中 ， 略 去 了 代谢 产物 的 形成 (包括 初级 代谢 产物 ， 如 葡萄 糖 酸 及 与 青霉素 生物 合成 有 关 
的 一 些 代谢 物 ) ， 这 是 因为 流向 这 些 产 物 的 碳 的 通 量 比 流向 生物 质 及 CO; 的 通 量 小 很 多 。 

用 于 合成 产 黄 青 霉 细胞 组 分 的 总 化 学 计量 反应 式 可 概括 为 (Nielsen ，1997) : 


biomass +0.139CO2 + 0.458NADH — 1.139CH20 — 0.20NH3 — 0.004H2SO, 
—0.01H3PO,4- YxatrpATP — 0.243NADH =0 (1) 


当 底 物 为 葡萄 糖 、 无 机 盐 ， 氨 为 N 源 ， 硫 酸 盐 为 S 源 ， 磷 酸 盐 为 了 源 时 ， 对 于 含有 表 2.8 
中 组 分 的 细胞 来 说 ， 该 化 学 计量 式 成 立 。 该 式 以 C-mol 为 基础 ， 即 葡萄 糖 用 CH2O 表示 ， 
并 且 根 据 大 分 子 组 分 计算 出 的 生物 质 元 素 组 成 为 CHi.slOo.5sNo.z0So.oo4Pooio (Nielsen, 
1997)， 这 与 文献 报道 的 实验 测定 的 组 分 非常 吻合 (WH4.1). HF ADP、NAD -及 
NADP+ 为 看 联 的 辅助 因子 ( 见 3.1 节 的 讨论 ) ， 在 化 学 计量 式 中 就 没有 包括 它们 。 用 于 生物 
质 合 成 所 需 的 ATP 及 NADPH 由 分 解 代 谢 途 径 提供 ， 在 生物 合成 反应 中 过 量 生成 的 NADH 
与 在 分 解 代谢 途 径 中 形成 的 NADH 一 起 经 电子 传递 链 将 电子 转移 给 氧 而 被 重新 氧化 。 

反应 式 (2) 一 反应 (4) 概括 了 分 解 代 谢 途 径 总 的 化 学 计量 式 。 反 应 (2) 表明 
NADPH 由 葡萄 糖 完全 被 氧化 生成 CO; 的 磷酸 戊 糖 途径 产生 ; 反应 (3) 是 将 EMP 途径 及 
TCA 循环 综合 后 的 总 化 学 计量 式 。 最 后 ， 反 应 (4) 是 氧化 磷酸 化 的 总 化 学 计量 式 。 在 上 述 
化 学 计量 式 中 ， 没 考虑 细胞 中 的 内 部 结构 ， 即 不 区 分 细胞 质 的 和 线粒体 的 NADH， 并 且 将 
TCA 循环 中 形成 的 FADH: 与 NADH 汇集 在 一 起 ， 因 此 反应 (4) “PA P/O 比 是 氧化 磷酸 
化 的 总 的 (或 操作 ) P/O 比 。 


CO;+2NADH -CH2O=0 (2) 
CO, + 2NADH + 0.677ATP — CH,0 =0 (3) 
P/OATP —- 0.50) — NADH =0 (4) 
最 后 用 于 维持 所 消耗 的 ATP 简单 地 包含 在 一 个 利用 ATP 的 反应 中 : 
-ATP=0 (5) 


需 注 意 : 上 述 化 学 计量 反应 式 是 以 C-mol 为 基础 的 ， 所 以 源 于 生物 化 学 的 化 学 计量 系数 
[例如 在 EMP 途径 中 ，lmol 葡萄 糖 生成 2mol ATP] 应 除 以 6， 因为 lmol 葡萄 糖 含 6 C- 
mol。 


61 


前 面 的 化 学 计量 式 是 以 方程 式 (3.3) 的 形式 写 出 的 ， 但 很 容易 将 之 转变 为 方程 式 
(3.4) 那样 的 更 紧凑 的 矩阵 表达 式 : 


-1.139 0 0.139 1 —Y,arp 0.458 0.243 0 
= 4 | 0 Sete 0 0 0 2 和 ATP 0 
=a 0 So 证 1 Poo,* 0| X+ 0.667 2 0 XNADH | = |0 
0 =0.5 : 0 0 P/O =1 0 X NADPH 0 
0 0 0 0 —] 0 0 0 


(6) 
式 中 ，X 代表 生物 质 。 若 在 反应 (1) 一 反应 (5) 中 以 速率 向 量 v 的 形式 引入 正 反应 
速率 : 


v= | WEMP (7) 
只 OP 
™ ATP 


那么 ， 三 个 辅助 因子 ATP. NADH & NADPH 的 生成 与 消耗 之 间 就 可 以 获得 平衡 ， 与 方程 
(3.28) 类 似 ， 可 列 出 下 面 三 个 方程 : 


内 Y xATPH 十 0.667 vgup +t P/O vop — Mm ATP 三 (0 (8) 
0.458% + 2VEMP a Vop—90 (9) 
— 0.2434 十 2Upp=0 (10) 


注意 到 这 些 平衡 相应 于 上 述 三 种 辅助 因子 的 净 比 生成 速率 为 零 。 因 此 ， 用 方程 式 〈3.12) 也 
可 推导 出 这 些 平 衡 方程 式 : 


多 
Y ATP —Y vate a0 0697. R/O «= ween 0 
rmet 三 | TNADH |= Glv=| 0.458 0 之 cit | WEMP | = q 
r NADPH =).243, 2 0 0 0) | vop 0 
M ATP’ 


(11) 


除了 三 个 稳 态 平衡 方程 式 [方程 式 〈8) 一 方程 式 (10)] SH, US 个 反应 速率 [方程 
式 (7)] 的 形式 ， 还 有 葡萄 糖 和 氧 的 比 吸收 速率 以 及 CO; 比 生产 速率 之 间 的 关系 。 这 些 关 
系 可 通过 方程 式 (3.5) 和 方程 式 (3.6) 表示 ， 或 用 方程 式 (3.9) 及 方程 式 (3.10) WE 
阵 形 式 表 示 : 


多 
Upp 
7 gle ety MS BE | 0 0 1.139% + upp + WEMP 
= 一 | WEMP | = (12) 
ro, 0 0 wey.” UY 0.5vop 
了 OP 
UATP 


62 


Le 
Upp 

rco,= (0.139 1 1 0 0)| vem | =0.139% + vpp+ vemp (13) 
了 WOP 


mM ATP 


消除 方程 式 〈11) 一 方程 式 (13) 中 的 三 个 速率 vfMp、wpp、wop， 可 推导 出 线性 速率 方程 式 
(14) 一 方程 式 〈16) : 


rgic= (a +0.261) up +b = Yip + mg (14) 
rco,=(a +0.261) np +b= Yin + m, (15) 
ro,=(at 0.261)u +b = Yxo%u +m, (16) 


根据 方程 式 (17) 和 方程 式 (18) 可 得 到 两 个 共同 参数 a 5b, EMBRASR YATP、 
martp& P/O 比 的 郴 数 : 


亲 了 让 和亲 三 砚 傅 


4 = 0.667 + 2P/0 (17) 
+ mM ATP 
6 = 0.667 + 2P70 (18) 


方程 式 (14) 可 视 为 与 Pirt 推荐 的 线性 速率 方程 式 (3.26) 基本 相同 ， 差 别 在 于 前 者 是 根 
据 细胞 基本 的 能 量 参数 得 到 得 率 关 系 式 。 这 对 于 上 述 线 性 关系 式 中 的 所 有 参数 来 说 都 是 对 
的 ， 因 为 它们 是 经 ATP. NADH 及 NADPH 平衡 而 耦合 的 。 可 以 看 出 ， 若 不 是 它们 实际 上 
通过 这 些 平衡 来 耦合 ， 这 三 个 得 率 系数 没有 任何 价值 。 此 外 ， 这 些 维持 系数 是 相同 的 。 这 是 
由 于 选择 以 每 C-mol 的 生物 质 每 小 时 为 基准 的 C-mol 作为 比 速率 的 单位 。 若 比 速率 采 用 其 
它 单 位 ， 维 持 系数 的 值 将 会 不 同 ， 但 它们 是 有 关系 的 。 这 些 参数 的 耦合 ， 表 明 系 统 仅 有 两 个 
自由 度 [等 价 于 方程 式 (14) 一方 程式 (16) 中 定义 的 参数 a 与 5]， 因 此 实际 上 只 需 测定 一 
个 产 率 系数 和 一 个 维持 系数 即 可 ， 其 它 参数 可 利用 三 个 方程 式 (14) 一 方程 式 (16) 算出 。 


200 87 
ed = 
= Am 
et 

Wr isd 6 十 
‘an = 
: , 

: : 
¢ 3 
50 2. a 

£ E 
Se a 
ss < 
0 Ores 

0 08 ft be oo eee 
P/O LL 


A3.4 P. chiens 的 能 量 参数 YATrp 和 


导出 的 线性 速率 方程 对 关联 实验 数据 当然 很 有 用 ， 但 是 也 可 用 于 关键 的 能 量 参数 
y wp、mmArp 及 操作 P/O 比 的 求 取 。 因 此 ， 如 果 求 出 方程 式 〈 环 ) 一 方程 式 (16) 的 真实 产 
率 系数 和 维持 系数 (通过 葡萄 糖 、 氧 及 CO; 的 速率 实验 数据 对 比 生长 速率 进行 线性 回归 )， 
就 可 确定 w b 的 值 ， 进 而 利用 a. b 的 值 及 方程 式 (17) 和 方程 式 (18)， 就 可 得 到 3 个 
能 量 参数 。 根 据 图 3.3 的 数据 可 确定 a 5b 的 值 分 别 为 0.436 C-mol.C-mol-1 (FH) 及 
63 


0.018 C-mol:C-mol~!+h~! (Nielsen, 1997). AIF 3 个 产 率 系数 (相对 标准 误差 为 2.7% ) 
可 得 到 a 是 一 个 平均 值 。 仅 用 两 个 方程 不 可 能 求 出 所 有 三 个 能 量 参数 Yiarp. mare PRE 
P/O 比 ， 但 如 果 其 中 一 个 参数 已 知 ， 就 可 计算 出 另外 两 个 。 图 3.4 描绘 了 YATp 和 mare 
操作 P/O 比 之 间 的 函数 关系 。 产 黄 青 霉 的 准确 的 操作 P/O 比值 还 不 知道 ， 但 可 能 在 1.0 一 
2.0 的 范围 内 (Nielsen, 1997), @P/OWA1.5, YyarpP4A 2.29mmol ATP. (C-mol 生 
物质 )-!L [或 80mmol'g-! (FH), BARRA 26.33g-(C-mol)!, KA 8%]. KSA 
道 的 酿酒 酵母 的 值 在 同一 范围 内 (LE 2.6). 

【 例 3.4】 酿酒 酵母 的 能 学 

厌 氧 生长 时 ， 大 多 数 细 胞 通过 底 物 水 平 磷 酸化 产生 ATP 同时 将 能 源 转化 为 一 种 或 多 种 
代谢 物 。 在 复合 培养 基 中 生长 时 ， 生 物 合成 反应 中 没有 (或 很 少 ) NADH 生成 及 没有 (或 
很 小 ) NADPH 消耗 ， 因 为 从 充足 供给 的 培养 基 组 分 中 可 得 到 这 些 物 质 。 因 此 ， 能 源 的 氧化 
还 原水 平 被 保存 于 分 解 代 谢 途 径 所 形成 的 代谢 物 中 ， 即 在 糖 酵 解 中 所 形成 的 所 有 NADH 均 
消耗 于 丙酮 酸 转 化 成 不 同 代 谢 物 的 反应 中 。 例 3.1 的 大 肠 杆菌 混合 酸 发 酵 就 说 明了 这 一 
点 ， 这 在 乳酸 同型 发 酵 中 也 是 一 个 重要 考虑 ， 该 过 程 中 丙酮 酸 通 过 乳酸 脱氧 酶 转化 成 乳酸 。 
在 上 述 反 应 过 程 中 ， 正 是 仅 有 ATP 耦合 着 分 解 代谢 与 合成 代谢 ， 因 此 有 可 能 单 从 ATP 平 
衡 推导 出 Leudeking 和 Piret 的 线性 速率 方程 式 (3.25)L 还 可 参照 Nielsen 和 Villadsen (1994) ]。 

在 基本 培养 基 上 生长 时 ， 伴 随 着 生物 合成 反应 的 进行 ， 有 大 量 NADH 的 产生 及 大 量 
NADPH 的 消耗 〈( 见 2.4 节 )。 这 些 辅助 因子 必须 在 供 能 反应 中 再 生 ， 结 果 在 分 解 代 谢 与 合 
成 代谢 之 间 产 生 紧密 的 耦合 。 在 酿酒 酵母 厌 氧 生长 过 程 中 ， 这 种 耦合 导致 除了 初级 代谢 产物 
外 (在 这 种 情况 下 当然 是 乙醇 ) 甘油 的 生成 。 甘 油 是 通过 还 原 反 应 生成 的 ， 其 包括 由 将 磷酸 
二 羟基 丙酮 催化 转化 成 3- 磷 酸 甘 油 ， 进 而 由 3- 磷 酸 甘油 脱氧 酶 催化 去 磷酸 而 生成 甘油 [ 见 
反应 (2.6)]。 在 第 一 个 反应 中 ，NADH 被 氧化 为 NAD- ， 因 此 葡萄 糖 至 甘油 的 总 反应 将 导 
致 NADH 的 消耗 。 由 于 在 3- 磷 酸 甘 油 的 去 磷酸 反应 中 没有 ATP 再 生 ， 所 以 葡萄糖 至 甘油 
的 总 转化 过 程 是 一 个 消耗 ATP 的 过 程 。 

酿酒 酵母 的 厌 氧 生理 学 已 由 Schulze (1995) 进行 了 广泛 研究 ， 在 本 例 中 ， 我 们 将 用 一 
个 简单 的 代谢 模型 对 其 部 分 结果 进行 分 析 。 通 过 酿酒 酵母 大 分 子 组 分 的 分 析 ，Schulze 计算 
了 与 生物 质 合 成 相关 的 NADH 及 NADPH 的 化 学 计量 系数 。 利 用 他 的 数据 可 得 到 细胞 生长 
的 总 化 学 计量 反应 式 : 

CHy..g200.ssNo.16 + 0. 105CO2 + 0.355NADH — 1.105CH20 -0.16NH3 
一 YATPATP- 0.231INADPH=0 (1) 

元 素 组 分 取 自 表 4.1， 底 物 为 葡萄 糖 和 氨 。 硫 酸 盐 和 磷酸 盐 包 含 于 灰分 中 ， 为 8%。 如 同 例 
3.3， 化 学 计量 反应 以 C-mol 为 基础 ， 即 葡萄 糖 表 示 为 CHO， 假 定 生物 合成 所 需要 的 
NADPH 仅 在 PP 途径 中 生成 ， 因 此 与 例 3.3 一 样 可 得 下 式 : 


COz+2NADPH -CH2O=0 (2) 
用 于 生物 合成 的 ATP 由 葡萄 糖 生成 乙醇 的 反应 提供 ， 其 计量 反应 式 为 : 
053CO 计 CH3O05+0.SATP=T SCH2O=0 (3) 


如 前 所 述 ， 与 生物 合成 相关 而 生成 的 NADH 用 于 葡萄 糖 生 成 甘油 的 反应 。 因 为 1mol 葡萄 糖 
转化 为 甘油 时 ，2mol NADH 被 氧化 ， 葡 萄 糖 生 成 1,6- 二 磷酸 果糖 需 2mol ATP (生成 甘油 
过 程 中 无 ATP 再 生 )， 所 以 生成 甘油 的 总 化 学 计量 反应 式 为 : 

64 


CHg30 - 0.333NADH — 0.333ATP — CHO =0 (4) 
最 后 ， 还 要 包括 用 于 维持 反应 的 ATP 的 消耗 ， 这 同 例 3.3 一 样 ， 可 表示 为 ， 


~ATP=0 (5) 
遵从 前 面 的 步骤 ， 可 将 上 述 5 个 反应 的 正 反 速 率 以 速率 向 量 v FER: 
723 
Upp 
V= | EtOH (6) 
7 gly 
7I7 ATP 


用 所 确定 的 化 学 计量 系数 与 胞 内 反应 速率 ， 对 三 个 辅助 因子 建立 平衡 方程 。NADPH 的 平衡 
给 出 了 wpp 和 比 生长 速率 之 间 的 直接 耦合 关系 : 


— 0.231. + 2upp =0 (7) 
同样 ， NADH 的 平衡 使 比 生长 速率 与 甘油 比 生成 速率 产生 如 下 关系 : 
0.355 —0.333rgy=0 (8) 


方程 式 (8) 相当 于 甘油 产 率 为 1.066 C-mol Hi: (C-mol 生物 质 )-1。 在 Schulze (1995) 的 
分 析 中 ， 他 提出 的 值 为 10.01mmol 甘油 “g | 〈 干 重 ) ， 考 虑 到 前 面 给 出 的 生物 质 元 素 组 成 及 
8% 的 灰分 ， 该 值 相 当 于 0.827 C-mol Hit: (C-mol 生物 质 )-!， 这 个 值 远 低 于 通过 代谢 模 
型 计算 所 得 到 的 值 。 此 外 ， 实 验 观察 到 琥珀 酸 的 分 记 ， 其 伴随 着 更 多 的 NADH 的 形成 
(lmol 焉 珀 酸 生 成 Smol NADH)。 因 此 焉 珀 酸 的 生成 迫使 形成 更 多 的 甘油 ， 以 便 容 纳 所 增产 
的 NADH。 琥 珀 酸 对 生物 质 的 得 率 为 0.25 mmol 琥珀 酸 .g | ( 干 重 )， 这 相当 于 形成 1.25 
mmol 甘油 .g-1 (FH). Ask, Pre aka With FILA 8.76 mmol.g-! (FH) 或 0.724C- 
mol 甘油 . (C-mol 生物 质 ) -1 是 由 于 生物 合成 而 产生 的 ， 它 使 得 偏离 自 代 谢 模 型 更 大 。 这 或 
是 由 于 在 方程 式 (1) 中 与 生物 合成 相关 的 NADH 生产 可 能 过 大 ， 或 是 由 于 存在 着 转氨酶 的 


一 些 活 动 使 得 NADH 441624 NADPH. 
由 ATP 平衡 可 得 : 
0.5 ren — 9.3337 giy= Yxatrpye + mate (9) 
由 方程 式 (8) 将 甘油 形成 速率 带 入 式 〈9) BI: 
rEtOH 王 2(YxATP 十 0.353) 太 十 2777 ATP (10) 


这 相当 于 应 用 到 乙醇 生成 的 Luedeking-Piret 模型 。Schulze 的 分 析 发 现 ， 乙 醇 对 生物 质 
实 得 率 系 数 为 85.0Smmol'g =! ( 干 重 ) ， 其 相当 于 4.69C-mol 乙醇 ' (C-mol 生物 质 ) 1!。 

此 ，Y ATrp 为 1.9Smol ATP. (C-mol 生物 质 )-:! 或 大 约 7immol ATP'.g : (FH). br 
st (9) 直接 用 于 计算 ATP 生产 ， 而 YxArp 是 通过 ~ATp 对 « 作 图 来 确定 ， 那 么 就 得 到 一 
稍 高 的 值 ， 即 aie ATP+g ! (FH) (schulze，1995$)。 这 种 差别 是 由 于 代谢 模型 中 甘 
油 生成 的 过 高 估计 ， 这 一 点 前 面 已 讨论 过 。 


at 
r,=1.105u +1.5reE0n t rely (11) 
将 方程 式 (8) 和 方程 式 (10) 代 和 人 方程式 (C11) 可 得 到 方程 式 〈12 ) : 
oa be 105 + 3.0( Y,arp + 0. 355) + 0299 |p + 2marp (12) 


通过 此 例 可 再 次 看 到 线性 速率 方程 式 (3.26) 可 以 推导 ， 而 且 真 实 得 率 系数 Yea 
胞 合成 的 关键 参数 (BHR ATP. NADPH 与 生成 的 NADH) 所 确定 的 。 此 外 还 可 推导 
出 类 似 于 方程 式 (12) WAM CO. 的 线性 速率 方程 。 


参 考 文 献 


Bailey, J.E. & Ollis. D. F. (1986) . Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd ed. New York: MacGraw-Hill. 

Herbert, D. (1959). Some principles of continuous culture. Recent Progress in Microbiology 7, 381'-396. 

Ingraham, J. L., Maaloe, O.& Neidhardt. F. C. (1983).Growth of the Bacterial Cell . Sunderland: Sinnauer Associ- 
ated. 

Luedeking, R.& Piret, E. L. (1959a). A kinetic study of the lactic acid fermentation. Batch process at controlled pH. 
Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering 1, 393-412. 

Luedeking, R. & Piret, E. L. (1959b) . Transient and steady state in continuous fermentation. Theory and experi- 
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Monod, J. (1942). Recherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Paris: Hermann et Cie. 

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Sonnleitner. B. & Fiechter. A. (1988) High performance bioreactors: A new generation Analytica Chimica Acta 213, 
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66 


第 4 章 物质 平衡 与 数据 一 致 性 


代谢 的 定量 分 析 需 要 用 实验 数据 对 很 多 参数 尤其 是 代谢 通 量 、 通 量 分 布 以 及 通 量 控制 的 
度量 〈 见 第 11 章 ) 进行 确定 。 因 而 ， 这 些 计算 将 举例 说 明 原始 发 酵 数据 信息 内 容 升 级 的 方 
法 与 程序 。 虽 然 本 书 的 重点 是 代谢 及 其 控制 ， 但 只 要 可 得 到 定量 测定 ， 那 么 信息 内 容 升级 的 
基本 哲理 可 适用 于 整个 生命 科学 。 

由 于 信息 升级 的 方法 是 由 数据 驱动 的 ， 因 此 保证 所 用 数据 的 可 靠 性 是 极端 重要 的 。 为 
此 ， 可 采用 常用 的 随机 误差 最 小 法 ， 例 如 ， 重 复 实验 、 多 种 传感器 、 仔 细 校 正 等 。 另 外 一 个 
考虑 〈 是 本 章 之 主题 ) 是 引入 数据 宛 余 以 验证 实际 的 测量 数据 和 对 这 些 测 量 进行 分 析 的 更 广 
泛 的 机 理 框架 。 例 如 ， 进 行 代谢 分 析 时 ， 通 量 计算 是 基于 底 物 吸收 及 产物 形成 的 比 速率 的 测 
量 ， 它 代表 进出 细胞 的 通 量 。 在 进行 任何 此 类 派生 的 计算 之 前 ， 进 一 步 证 实数 据 的 一 致 性 是 
很 重要 的 ， 例 如 ， 碳 收 支 完全 平衡 。 

当 使 用 多 种 检测 器 测定 同一 变量 或 由 此 所 得 的 测量 必须 满足 某 些 限 制 条 件 〈 例 如 物质 收 
支 完全 平衡 ) 时 ， 就 可 引入 数据 元 余 这 个 概念 。 显 然 ， 元 余 度 越 大 ， 数 据 及 其 衍生 参数 的 可 
信 度 就 越 高 。 此 外 ， 还 可 用 宛 余 数据 系统 地 检测 过 失 测 量 误差 的 来 源 ， 或 识别 该 框架 体系 
《如 模型 等 ) 的 一 个 特定 部 分 是 否 最 可 能 造成 数据 的 不 一 致 性 。 在 这 一 章 中 ， 我 们 将 在 通 量 、 
代谢 及 质量 平衡 的 范围 内 证 实 这 些 思想 。 因 此 ， 用 于 定量 分 析 的 实验 数据 必须 : 

Oc ”这 并 不 意味 着 必须 测量 所 有 的 底 物 及 代谢 产物 ， 只 需 量化 那些 足 量 存在 的 物质 
以 便 允 许 验证 碳 、 氨 〈 有 些 情况 下 还 包括 硫 和 磷 ) 平衡 。 这 就 要 求 必 须 使 用 成 分 确定 的 基本 
培养 基 ， 并 且 本 质 上 在 系统 的 代谢 研究 中 要 排除 天 然 培养 基 。 

@ 尽 可 能 无 噪声 如 3.3 节 所 讨论 的 ， 比 速率 是 由 浓度 分 布 的 测量 推导 而 来 的 ， 因 此 ， 
如 果 这 些 数据 有 噪声 ， 将 使 速率 的 计算 很 困难 。 因 此 ， 细 胞 代谢 定量 分 析 的 一 个 重要 方面 是 
开发 精确 可 靠 的 分 析 技 术 ， 这 通常 是 由 计算 机 控制 的 、 高 性 能 生物 反应 器 在 线 监测 最 重要 的 
培养 变量 。 

评估 实验 数据 的 一 致 性 有 两 种 方法 ， 第 一 种 是 基于 非常 简单 的 代谢 模型 ， 即 黑箱 模型 。 
该 模型 将 所 有 细胞 反应 汇集 为 一 个 单个 反应 ， 用 以 描述 整个 细胞 生物 质 生 长 ， 该 方法 本 质 上 
是 由 验证 元 素平 衡 所 构成 。 由 于 只 需要 底 物 、 代 谢 产 物 和 生物 质 的 元 素 组 成 信息 以 及 进出 细 
胞 的 通 量 ， 所 以 该 法 使 用 起 来 相当 容易 。 第 二 种 方法 重视 从 底 物 到 生物 质 及 代谢 产物 总 转化 
过 程 的 更 多 生物 化 学 细节 。 因 而 ， 它 在 数学 上 更 复杂 ， 当 然 ， 它 也 比 黑 箱 模 型 对 实际 自由 度 
提供 了 更 真实 的 描述 。 我 们 开发 这 种 代谢 模型 以 与 代谢 通 量 分 析 (在 8.3 节 ) 的 讨论 相 联 
系 。 因 为 本 章 的 重点 主要 是 数据 一 致 性 分 析 方 法 论 的 开发 ， 因 此 ， 消 除了 由 于 代谢 复杂 性 所 
产生 的 不 必要 的 麻烦 而 使 用 黑箱 模型 。 


4.1 黑箱 模型 


在 黑箱 模型 中 ， 细 胞 生物 质 是 与 环境 交换 着 物质 的 黑箱 〈 如 图 4.1 所 示 )， 它 将 许多 细 

胞 反应 汇集 为 单一 的 生物 质 生 长 反应 。 进 出 黑箱 的 通 量 以 比 速率 表示 (单位 时 间 克 或 摩尔 物 

质 每 克 或 每 摩尔 生物 质 ) ， 它 们 是 底 物 比 吸 收 速率 〈rs 中 的 元 素 ) 和 产物 比 形成 速率 (rp 中 
67 


的 元 素 )。 此 外 ， 黑 箱 中 还 有 生物 质 的 积累 ， 它 以 比 速率 
作为 一 个 通 量 来 表示 。 由 于 所 有 的 细胞 反应 被 汇集 为 一 个 

ca 总 反应 ， 因 此 ， 在 这 个 总 反应 中 化 学 计量 系数 可 由 3.4 节 引 
人 的 得 率 系数 表示 ， 于 是 : 


AM N 
图 4.1 黑箱 模型 示意 图 其 二 必 ) no 六 二 二 ED (4.1) 

将 细胞 视 为 一 个 黑箱 ， 所 测 的 变量 e 部 
只 是 进出 细胞 的 通 量 。 进 入 细胞 的 这 里 以 生物 质 比 生成 速率 作为 参照 。 由 于 生物 质 的 化 学 计 
底 物 通 量 为 向 量 上 中 的 元 素 , 从 。 量 系数 为 1， 正 反应 速率 由 生物 质 比 生长 速率 表示 ， 它 与 方 
。 中 的 元 素 ， 最 和 存在 于 度 儿 中 的 程式 4.1) 得 率 系数 一 起 ， 就 完全 表示 了 这 个 系统 ”用 黑箱 
某 些 物 质 在 黑箱 内 以 比 速 率 “ 形成“ 模型 分 析 数 据 一 致 性 时 可 采用 下 述 四 种 方法 之 一 : 〈1) 方 
新 的 生物 质 而 积累 程式 (4.1) 中 的 一 组 得 率 系 数 及 比 生 长 速率 ; (2) 相应 于 
另 一 参照 物 〈 如 底 物 之 一 ) 的 一 组 得 率 系数 以 及 该 参照 物 的 比 形成 /消耗 速率 ; (3) 所 有 底 
物 、 产 物 及 生物 质 的 一 组 比 速率 ; 〈4) 由 生物 质 浓度 与 比 速率 乘积 所 得 到 的 所 有 体积 速率 。 
所 有 这 些 变量 均 提 供 同样 的 信息 。 在 下 文中 ,我 们 既 可 用 方程 式 〈4.1) 的 得 率 系 数 也 可 用 

方程 式 〈4.2) 表示 的 总 速率 向 量 r 的 变量 中 的 比 速率 : 

Le 
Bier bahay our eitiees Pk chat (4.2) 


r= 


a 


(4.1) 简单 的 黑箱 模型 

考虑 在 基本 培养 基 (如 和 葡萄糖 为 碳 源 及 能 源 ， 氢 为 氮 源 ) 中 对 酿酒 酵母 进行 需 氧 培养 。 
在 需 氧 生长 过 程 中 ， 和 葡萄 糖 被 完全 氧化 为 CO。 但 当 糖 酵 解 途径 通 量 很 高 时 ， 丙 酮 酸 氧化 中 
的 瓶颈 效应 将 导致 乙醇 的 形成 。 因 此 ， 在 高 的 糖 酵 解 通 量 下 ， 乙 醇和 CO; 均 应 视 为 代谢 产物 。 
最 后 ， 细 胞 代谢 所 生成 的 水 也 应 作为 总 反应 一 个 的 产物 。 于 是 ， 这 个 系统 的 黑箱 模型 为 : 


X + Y,-ethand+ Y,-CO.+ Y,.H2O — Y,,glucose - Y,,.O2- Y,xnNH3=0 (1) 
(乙醇 ) (葡萄 糖 ) 
用 比 速率 向 量 可 表示 成 : 
TEA (2) 


显然 方程 式 〈1) 中 的 化 学 计量 〈 或 得 率 ) 系数 不 是 常数 ， 因 为 比 生 长 速率 低 时 〈 相 当 于 低 
的 糖 酵 解 通 量 ) ，Yxe 为 零 ， 而 比 生长 速率 较 高 时 ，Yxe 将 大 于 零 。 


4.2 元 素平 衡 方程 式 


在 黑箱 模型 中 共有 M+N+1 74208, BI: M 个 代谢 产物 的 得 率 系数 ，N 个 底 物 得 率 
系数 ， 还 有 正 反应 速率 六 [见方 程式 《4.1)]， 或 方程 式 《4;2) 中 M + N+1 个 比 速 率 。 因 
为 在 底 物 转变 为 代谢 产物 和 生物 质 的 反应 中 质量 守恒 ， 所 以 黑箱 模型 中 的 M+ N+1 个 速 
率 并 不 是 完全 独立 的 ， 但 必须 满足 一 些 限 制 条 件 。 因 此 ， 进 出 此 系统 的 元 素 必 需 平衡 ， 例 
如 ， 通 过 底 物 进入 系统 中 的 碳 必 须 在 代谢 产物 及 生物 质 中 得 到 回收 。 显 然 在 黑箱 中 所 考虑 的 
每 一 个 元 素 均 产 生 一 个 限制 条 件 。 因 此 ， 碳 平衡 方程 为 : 

68 


1+ en Sealed = (4.3) 


AF, Te tS 个 底 物 及 第 ; 个 代谢 产物 的 碳 含 量 (C-mol'mol- 1)。 在 
此 方程 中 ， 以 碳 为 参照 物 ， 对 生物 质 的 元 素 组 分 进行 标准 化 ， 如 可 以 用 CH,O,N, 的 形式 表 
示 。 生 物质 的 元 素 组 成 取决 于 其 大 分 子 的 含量 因而 也 取决 于 生长 条 件 及 比 生长 速率 【例如 ， 
在 氮 源 受 限 制 条 件 下 的 氮 含 量 远 低 于 在 碳 源 受 限制 条 件 下 的 值 ( 见 表 4.1)]。 但 是 除 某 些 极 
端 情况 外 ， 当 还 不 确切 知道 生物 质 组 成 时 ， 使 用 一 般 的 组 成 式 CH sOu sNo ;是 合理 的 。 

用 比 速率 也 可 表示 方程 式 (4.3) ROR MR, Ap 乘 以 方程 式 (4.3) 并 利用 得 率 系 
数 的 定义 就 可 得 到 


M N 
wet DU hpi ps 去 Dabs sui = 0 (4.4) 


通常 ， 相 应 于 底 物 及 代谢 产物 中 的 碳 含量 来 对 它们 的 元 素 组 成 进行 标准 化 ， 例 如 葡萄 糖 用 
CH2O 表示 。 以 每 C-mol 为 基础 ， 方 程式 (4.3) 可 写 为 : 


M N 
1+ >) Ya — D) Meson (4.5) 
i=l i=l 


4.1 几 种 微生物 的 生物 质 的 元 素 组 成 


Candida utilis CH1.3309.46No.19 。 葡萄 糖 限 制 ,D =0.05h 
CHI.s7O0.56No.20 . 葡萄 糖 限制 ,D =0.45h~! 
CHIs3Oo.s4No.no APR if] ,D =0.05 
CH1.870p.s6No.20 : RR hil ,D =0.45h~! 

Klebsiella aerogenes CH .75OD0.43No.22 甘油 限制 ,D=0.10h-: 
CHI.73O0.43No.24 AY THER Ht , D =0.85h~! 
CH1..7500.47No.17 。 氨 限 制 ,D=0.10h 
CHi.73Oo.43No.24 . 氨 限 制 ,D =0.08h~! 

Saccharomyces cerevisiae CH .8200.58No.16 . 葡萄 糖 限制 ,D =0.08h~! 
CHI.78Oo.6oNo.19 。 葡萄 糖 限制 ,D =0.255h 
CH .9400.52No.25Po.025 : 无 限制 生长 

Escherichia coli CH1.7709.49No.24Po.017 : 无 限制 生长 
CHi.s3Oo.sNo.22Po.oi 无 限制 生长 
CHi.%Oo.55No.25Po.oz2 无 限制 生长 
CH .9300.ssNo.25Po.021 , 无 限制 生长 

Pseudomonas fluorescens CH1.8309.ssNo.26Po.024 ‘ 无 限制 生长 

Aerobacter aerogenes CH) .6400.52No.16 ’ 无 限制 生长 

Penicillium chrysogenum CHy.7000.s8No.15 Wh) 4 BE PR itl, D =0.038h~! 
CH, ..6800.53No.17 fit 40 BH PR iil , D =0.098h ~! 

Aspergillus niger CHI .72Oo.55No.0 无 限制 生长 


平均 CHy.8100.52No.21 
注 ， 只 列 出 了 某 些 微生物 的 磷 组 分 。 Penicillium chrysogenum 的 组 分 来 自 于 Christensen et al (1995)， 其 它 数据 来 
自 于 Roels (1983). 
在 方程 式 (4.5) 中 ， 得 率 系数 的 单位 为 C-molMC-mol 生物 质 。 方 框 4.1 说 明了 如 何 将 其 它 单 位 换算 为 此 单位 。 方 程 
st (4.5) [或 方程 式 (4.4)] 对 检验 实验 数据 的 一 致 性 是 非常 有 用 的 。 因 此 ， 假 如 生物 质 及 代谢 产物 中 的 总 碳 不 等 于 底 
物 中 的 总 碳 ， 那 么 实验 数据 就 出 现 了 不 一 致 性 ， 
69 


(14.2) 简单 黑箱 模型 中 的 碳 平衡 
现在 回 到 例 4.1 中 的 黑箱 模型 ， 用 所 指定 的 底 物 及 代谢 产物 的 元 素 组 成 重 写 方程 式 
《1)， 对 生物 质 ， 其 元 素 组 成 为 CHI.s3Oo.56No.i7， 因 此 可 得 : 
CH.8300.65No.17 + Y xeCH300.5 + Y¥xCO2 + YxwH20 — Y,,CH20 — Y,.02- YxnNH3=0 
(1) 
也 许 发 现 将 CH300 .5 确认 为 乙醇 很 困难 ， 但 是 当 观 察 碳 平衡 式 时 就 会 立刻 发 现 以 C-mol 为 基 
础 的 优点 : 
BA ae ee (2) 
这 个 简单 的 方程 对 于 检验 实验 数据 的 一 致 性 很 有 用 。 因 此 ， 通 过 采用 Von Meyenburg 
(1969) 的 经 典 数据 ， 我们 求 出 : 在 以 葡萄 糖 限 制 、 稀 释 速 率 为 0.3h ! 的 连续 培养 中 ， 
Yxe=0.713，Yx=1.313 及 Yxs=3.636。 显 然 该 数据 是 不 一 致 性 的 ， 因 为 没有 达到 碳 乎 
衡 。 另 外 一 个 更 详细 的 数据 分 析 (Nielsen and Villadsen, 1994) 表明 丢失 的 碳 是 乙醇 ， 因 为 
生物 反应 器 中 的 很 强 的 通气 夹带 会 造成 乙醇 的 蒸发 。 
与 方程 式 (4.4) 类 似 ， 氢 平衡 方程 式 为 : 
YN=0.17 (3) 
或 以 比 速率 表示 : 
rn=0.17 (4) 
QO FR Ft WU FE BY) A CR 8 OR AE IT RE ATT EK (4) 不 符 ， 那 么 就 可 认定 其 中 一 项 测 
量 的 数据 不 一 致 性 或 者 生物 质 的 氮 含 量 与 其 所 表示 的 不 同 。 


与 方程 式 (4.3) 相似 ， 可 写 出 所 有 其 它 参 与 转化 的 元 素平 衡 式 [方程 式 (4.1)]。 将 生 
物质 、 底 物 及 代谢 产物 的 元 素 组 成 用 矩阵 下 中 的 列表 示 ， 可 以 很 方便 写 出 这 些 元 素 的 平衡 
式 ， 和 殖 阵 正中 的 第 一 列 为 生物 质 的 元 素 组 成 ， 第 2 列 至 第 M +1 列 为 M 个 代谢 产物 的 元 素 
组 成 ,第 M+2 至 第 M+N+19HN 个 底 物 的 元 素 组 成 。 如 果 考 虑 工 个 元 素 (通常 是 4 
个 , 即 C、H、O、N)， 和 那么 矩阵 正中 就 有 工行 ， 并 且 工 个 元 素平 衡 式 可 用 同样 数目 的 类 似 
于 方程 式 (4.3) 的 代数 方程 来 表示 ， 现 概括 为 : 

Er=0 (4.6) 
其 中 共有 N + M +1 个 比 速率 (或 体积 速率 ) 及 工 个 限制 条 件 ， 自 由 度 为 下 =M+N+1-- 
T。 如 果 恰 好 测定 了 下 个 速率 ， 那 么 就 有 可 能 利用 由 方程 式 (4.6) 给 出 的 工 个 代数 方程 计 
算 其 它 速率 ， 但 在 这 种 情况 下 ， 就 没有 多 余 的 数据 用 于 检验 数据 的 一 致 性 。 为 此 ， 明 智 的 做 
法 是 应 努力 进行 更 多 速率 的 测量 ， 使 之 大 于 系统 的 自由 度 。 


【 例 4.3】 简单 黑箱 模型 的 元 素平 衡 
回 到 例 4.1 及 例 4.2 的 黑箱 模型 ， 用 前 面 所 给 出 的 生物 质 元 素 组 成 ， 可 将 元 素 组 成 的 和 矩 
BESSA: 


1 1 10 1 O 0)< carbon (KR) 
4 1-83. 3 Gee 20 Bi=-hydrogen (3) (1) 
0.56 0.5 2.1 1 2 O}<-oxygen (A) 
0.177 0° OF 0 0 0 P<nitrogen K * 


70 


其 中 行 分 别 代表 碳 、 氢 、 氧 、 氮 的 含量 ， 列 分 别 代表 生物 质 、 乙 醇 、CO;、 水 、 葡 萄 糖 、 氧 
及 氮 的 元 素 组 成 。 利 用 方程 式 (4.6) (其 中 上 被 表示 得 率 系数 的 向 量 所 代替 ) 可 得 到 ; 


= 
1 1 tO ft oO Y ey Se en 0 
1633 0 2°20 3) | |_| 1.88+3Y%4+2Vse-2¥ a 3¥ in 0 
05 O25 2-1 1-°2' 6 a 0.56+0.5Yxe+2Y net Yuw-Yys—2Yyo| 10 (2) 
mine ~o'o'0°0 和 0.17- Y,n 0 

一 YN 


第 一 行 及 最 后 一 行 分 别 与 由 例 4.2 推导 出 的 碳 、 氮 平衡 方程 式 相同 。 氢 和 氧 的 平衡 式 引 入 了 
两 个 附加 的 限制 条 件 。 但 由 于 不 可 能 测量 水 的 生成 速率 ， 就 必须 用 其 中 的 一 个 方程 计算 该 速 
率 〈 或 得 率 )， 那 么 上 述 两 个 平衡 中 就 仅 剩 下 一 个 附加 限制 条 件 了 。 


方 杠 4.1 以 C-mol 为 基础 计算 得 率 

得 率 系数 的 单位 通常 为 mol'g ! (FH) 或 gg | ( 干 重 )， 要 将 其 转换 为 以 C-mol 
为 基础 的 单位 ， 必 须 获 得 生物 质 的 元 素 组 成 和 灰分 含量 的 信息 。 为 了 举例 说 明 该 转换 过 
程 ， 现 将 得 率 为 0.Sg (FH) EWR 〈g BME) ! 以 C-mol 来 表示 。 首 先 将 克 干 重 的 
生物 质 转换 成 无 灰分 的 基准 ， 即 确定 由 碳 、 氮 、 和 氨 (AAR RSH) 组 成 的 生 
物质 的 量 。 若 灰分 为 8% ， 那 么 就 可 得 到 0.92g 无 灰分 的 生物 质 (g 干 重生 物质 )-1， 据 


此 可 得 0.46g 无 灰分 的 生物 质 (g 葡萄 糖 ) !:。 使 用 单位 为 g'C-mol 1! 的 无 灰分 生物 质 及 
葡萄 糖 的 摩尔 质量 ， 可 将 此 得 率直 接 转 换 为 C-mol 基准 。 生 物质 标准 元 素 组 成 为 
CH, sgOu ;No z， 其 摩尔 质量 为 24.6g 无 灰分 生物 质 C-mol 上， 因此 可 得 到 0.46/24.6= 
0.0187C-mol 生物 质 .(g HHH) -!。 最 后 ， 乘 以 基准 为 C-mol 的 葡萄 糖 摩尔 质量 (30g. 
C-mol-1) ， 可 求 出 得 率 为 0.56C-mol 生物 质 .(C-mol 葡萄 糖 ) 1。 


方程 式 (4.6) 概括 了 所 有 元 素 的 平衡 。 如 例 4.3 中 所 讨论 的 ， 由 于 必须 用 和 氢 或 氧 的 平 
衡 式 计算 (不 可 测量 的 ) 水 的 生成 速率 ， 实 际 上 只 有 一 个 限制 可 供 使 用 。 显 然 通过 消除 O 
与 卫 平 衡 之 间 水 的 得 率 系数 就 可 将 水 排除 。 一 个 更 高 明 的 方法 是 使 用 所 谓 的 “一 般 化 的 还 
原 度 ”平衡 法 ， 是 作为 方程 式 (4.6) 元 素平 衡 式 的 线性 组 合 而 推导 出 的 。 这 个 平衡 由 
Roels (1983) 引入 ， 是 Erickson 等 人 (1978) 早期 研究 的 普遍 化 。 将 元 素平 衡 式 乘 以 特定 
因子 并 将 其 相 加 就 得 到 该 平衡 式 。 通 过 选择 合适 的 乘 数 因子 ， 水 、CO: 及 氮 源 的 得 率 系数 
(REX) 就 可 从 所 产生 的 方程 中 被 消除 。 为 了 说 明 该 过 程 ， 现 考虑 例 4.3 SENTRA, 
将 碳 、 氢 、 氧 、 氮 的 平衡 式 分 别 乘 以 4、1、-2 及 -3 可 得 到 : 


4 十 4 二 Ayu. —4V% =0 
1.83 +3Y xe 二 之 了 -2 一 和 =0 
(-2)0.56 +(-2)0.5Y. +(-2)2Y. +(-2)¥ew —(-2)¥0n § GhS2)2Y¥un =0 
(-3)0.17 ~{-S) Twa, 70 


4.20 + 6Y xe 一 4Ym +4Y x0 =0 


所 产生 的 方程 式 就 是 该 系统 的 一 般 化 还 原 度 平 衡 式 。 当 然 它 并 不 独立 于 其 它 的 元 素平 衡 
而 存在 ， 一 般 用 它 代替 氧 或 氢 平 衔 式 ， 而 另外 的 可 用 来 计算 水 的 生成 速率 。 至 此 就 得 到 碳 有 、 
氮 及 还 原 度 平衡 ， 利 用 它们 可 检验 数据 的 一 致 性 或 计算 没 能 测定 的 速率 。 在 Erickson 等 人 
(1978) 的 原始 表达 式 中 ，C、H、O、N 平衡 中 的 每 一 个 乘 数 因 子 被 解释 为 分 别 在 C、 世 、 
O、N 中 可 利用 的 自由 电子 数 ， 它 们 被 传递 至 氧 ， 每 个 元 素 燃 烧 生 成 水 、CO; RA 〈 作 为 氮 
源 )。 对 于 氮 平 衔 来 说 ， 乘 数 因子 总 是 取 -3， 因 为 这 是 生物 质 中 氮 的 主要 价 态 。 在 Roels 的 
一 般 化 概念 中 ， 乘 数 因子 是 可 自由 选择 的 任意 系数 以 使 所 得 的 水 、CO; 及 氮 源 的 系数 变 为 
零 。 按 这 种 方法 ， 如 果 使 用 了 另外 一 种 氮 源 如 硝酸 铵 ， 为 了 消除 一 般 化 还 原 度 平衡 中 氮 源 的 
得 率 系数 ， 可 对 氮 平 衡 选择 不 同 的 乘 数 因子 。 

在 一 般 化 还 原 度 平衡 式 中 与 得 率 相 乘 的 系数 被 称 为 相应 物质 的 还 原 度 ， 对 上 述 系统 ， 生 
物质 的 还 原 度 为 4.2， 乙 醇 为 6， 和 葡萄 糖 为 4， 水 、 氮 及 CO; 均 为 0， 氧 为 =4。 用 Roels 的 
结果 ， 含 氮 物 质 的 还 原 度 取 决 于 所 用 的 氮 源 。 在 大 多 数 情况 下 ， 氨 或 作为 惟一 氮 源 或 与 其 它 
氮 源 相 结合 使 用 ， 于 是 形成 元 素 组 成 为 CH.,ON。 的 某 物 质 的 还 原 度 k 的 一 般 表达 式 : 

K=4+a-2b-3c (4.7) 

表 4.2 列 出 了 发 酵 过 程 中 通常 所 遇 到 的 物质 的 还 原 度 。 关 于 还 原 度 更 详细 的 概念 可 参考 
Roels (1983) 或 Nielsen 和 Villadsen (1994) 出 版 的 书 。 引 入 物质 还 原 度 < 后 ， 任 何 系统 
的 一 般 化 还 原 度 平 衡 式 为 : 


M N 
Kx + Dy Hpi¥ xpp— Dy Ks,iY xs; = 0 (4.8) 
i=) i=1 


该 式 非常 有 用 ， 因 为 其 容易 建立 ， 加 上 碳 、 氮 平衡 式 ， 它 就 包括 了 由 四 种 元 素平 衡 所 施加 的 
全 部 限制 条 件 。 


表 4.2 标准 条 件 下 (298K，latm，pH7)， 各 种 物质 的 燃烧 热 


AH? , AJ +C-mol~! 


C,H,O C3HgO3 


乙酸 CH4O， 437 C3HgO 
丙酮 CsHoO 597 C3H6O3 456 
A NH; 383® ClzH22OU 471 
生物 质 CHI.sOo.5No > | 4. 560 C4H6Os 332 
丁 醇 C4HioO 6 669 CH, 890® 
TR C4Hg02 5 546 CH,O 727 
柠檬 酸 CsHgO7 3 327 C2H2O4 123 
乙 烷 CrH6 7 Ci6H3202 6242 
乙醇 CzHoO 6 683 Cs3Hs 7409 
甲醛 CH2O 4 C3H6O> 509 
甲酸 CH,0, 2 255 C4H6O, 373 
果糖 CsHi205 4 469 CH2Oii 470 
延 胡 索 酸 | C4H4O4 3 334 CH4JON2 632 
oF FL C6H120¢ 4 468 CsHioO2 568 
CsHi2O6 4 467 


® WUCO2, HO 和 No 为 参 比 的 燃烧 热 ，latm= OE 
@ 固态 。 


@ 气态 。 


72 


($14.4) 酵母 厌 氧 培养 的 数据 一 致 性 分 析 

为 了 举例 说 明 如 何 利用 一 般 化 还 原 度 分 析 数 据 的 一 致 性 ， 我 们 使 用 由 Schulze (1995) 
获得 的 酿酒 酵母 厌 氧 连续 培养 的 数据 。 在 葡萄 糖 限制 的 条 件 下 对 葡萄 糖 (Y.)、 乙 醇 。 
(Y:xe)、COz (¥ xc) 及 甘油 〈(Yxg) 的 得 率 系数 (单位 为 C-mol 或 mol/C-mol 生物 质 ) 列 出 


OF: 
fi FE! Ye Y xe Y xe Y xg 
0.1 7.81 3.88 2.13 0.67 
0.2 8.06 4.00 2.26 0.73 
首先 ， 碳 平衡 : 
AY bY 4 ee 8 (1) 


#2 D=0.1h ‘Hike 2%*UARE D=0.2h ! 时 误差 在 1% 以 内 。 这 样 的 偏差 〈 相 对 于 以 
葡萄 糖 形 式 的 碳 的 供应 所 评估 ) 是 非常 满意 的 。 
一 般 化 还 原 度 平 衡 式 为 : 

kx 十 OYae 士 4.07Yx5 一 4X2s=0 (2) 
所 确定 的 酵母 的 元 素 组 成 为 CHi.78Oo.oNo.le。 因此 生物 质 的 还 原 度 为 4.01， 将 前 面 表 中 的 
得 率 系数 代 人 式 (2)， 可 知 在 这 两 种 情况 下 一 般 化 还 原 度 平衡 的 偏差 〈 同 样 ， 偏 差 是 相对 于 
葡萄 糖 ) 都 在 3% 以 内 。 很 有 趣 的 情况 是 : 当 D=0.1h :时 ， 发现“ 丢失 的 碳 ” 的 还 原 度 
(也 是 利用 碳 平衡 ) 非常 接近 于 6， 这 表明 乙醇 的 测量 值 可 能 偏 低 。 在 产生 挥发 性 物质 的 酵 
母 及 其 它 菌 体 培养 过 程 中 ， 这 是 一 个 普遍 存在 的 问题 ， 一 般 丢 失 的 碳 小 于 2% 左 右 是 可 以 接 
受 的 。 


4.3 热平衡 
在 底 物 转 化 成 代谢 产物 和 生物 质 的 过 程 中 ， 底 物 中 部 分 Gibbs 自由 能 以 热 的 形式 耗 散 于 
周围 环境 中 。 尤 其 在 需 氧 条 件 下 ， 散 失 的 能 量 可 能 相当 大 。 能 量 耗 散 可 通过 底 物 的 总 Gibbs 
自由 能 与 从 代谢 产物 及 生物 质 回 收 的 总 Gibbs 自由 能 之 差 来 确定 。 通 常 ， 能 量 散失 导致 系统 
Ate PAS ek, a te 〈 见 13.1 节 )。 因 此 人 们 的 注意 力 通 常 集中 于 通过 烩 的 变化 所 
确定 的 热量 产生 ， 因 为 这 种 热量 产生 对 过 程 温度 控制 冷却 需要 有 直接 的 影响 。 在 黑箱 模型 
中 ， 总 过 程 的 热量 产生 QheatLkJ + (C-mol 生物 质 )-!] 可 用 式 (4.9) 计算 : 
Quen =- AH? = >) YAHOEIAH — >) 了 二 AH0 1 (4.9) 


i=l 


sth, AH® ,为 标准 条 件 下 (298K, latm), (latm=101325Pa) 第 ;个 物质 的 燃烧 热 
[kJ-(C-mol)~'], Est"? 79% ARV C-mol 为 基准 。 表 4.2 列 出 了 发 酵 培养 基 中 一 些 典 型 
物质 的 燃烧 热 。 应 注意 Qi 实际 上 是 热 的 产生 量 而 不 是 热 的 产生 速率 。 为 了 确定 热量 产生 
的 速率 ， 可 将 上 述 方程 乘 以 生长 速率 。 方 程式 (4.9) 对 于 由 得 率 系数 计算 热量 产生 非常 有 
用 ， 并 可 用 于 设计 生物 反应 器 的 冷却 能 力 ， 如 例 4.5 所 说 明 的 。 


【 例 4.5】 厌 氧 与 需 氧 生长 中 的 热量 产生 
现 考虑 在 厌 氧 及 需 氧 条 件 下 酿酒 酵母 的 生长 ， 厌 氧 生长 的 黑箱 模型 为 : 
73 


CH, .620p.53No.15 + 4. 78CH3Op.5 + 2.42CO, + 0.41H,O — 8.20CH,O-0.15NH3;=0 (1) 
需 氧 生长 的 黑箱 模型 为 : 
CH} oO 53No .15+0.67CO;+1.08H2O -1.67CH2O -0.15NH3;—0.640,=0 (2) 
现 可 计算 出 这 两 个 反应 的 热量 产生 (下 标 anarob 表示 厌 氧 ，aerob 表示 需 氧 一 一 译 者 
注 ) 为 : 
Q anarob = 8-20 X 467 + 0.15 X 383 — 560 — 4.78 x 683 
=62.11kJ-(C-mol 生物 质 )-1 (3) 
Q serob = 1.67 X 467 + 0.15 X 383 — 560 =277.3kJ *(C-mol 生物 质 )-1 - (4) 
由 此 可 看 出 ， 需 氧 过 程 产生 的 热量 [相当 于 165k) .(C-mol 代谢 的 葡萄 糖 ) -1] 远大 于 
厌 氧 过 程 [相当 于 8kJ .(C-mol 葡萄 糖 ) -!j]。 因 此 ， 在 需 氧 过 程 下 ， 最 初 存在 于 葡萄 糖 中 的 
大 部 分 自由 能 以 热 的 形式 散失 ， 而 在 厌 氧 条 件 下 ， 其 回收 于 乙醇 中 。 为 了 说 明 大 规模 生物 反 
应 器 的 冷却 要 求 ， 现 计算 一 个 典型 的 工业 面包 酵母 发 酵 的 总 生成 热量 。 生 物 反 应 器 体积 为 
100m3， 生 物质 浓度 为 S0g'L -L ( 约 相 当 于 1.96 C-mol.L -1)。 对 于 分 批 式 操作 ， 其 比 生长 
速率 约 等 于 0.25h- 1， 利用 这 些 数 据 首 先 可 得 到 热量 产生 的 比 速率 为 : 
rd= Qaerobft =[277.3kJ.(C-mol 生物 质 )-1] x(0.25h-1) 
=69kJ'(C-mol 生物 质 )-1.h-1 (5) 
据 此 求 出 总 热量 产生 为 : 
[69kJ.(C-mol 4 Wii) ~!+h7~!] x (1.96C-mol*L~!) x (100.000L) =3.8MW (6) 
这 么 大 的 热量 产生 清楚 地 表明 需要 大 量 的 冷却 水 以 维持 生物 反应 器 恒温 。 


如 果 能 精确 测量 热量 生成 速率 ， 例 如 使 用 热量 计 [正如 在 几 个 出 版 物 中 已 列举 的 ， 如 人 参 
见 Larsson 等 (1991) 及 Von stockar 和 Birou (1989) ] 或 测量 反应 器 中 的 温度 变化 ， 那 么 
热平衡 式 [方程 式 (4.9)] 54.2 节 的 元 素平 衡 式 一 起 就 可 提供 一 个 额外 的 宛 余 。 然 而 ， 如 
不 能 测定 热量 生成 速率 〈 例 如 在 厌 氧 条 件 下 ， 生 成 的 热量 很 小 ) ， 那 么 引入 一 个 附加 的 方程 
并 不 能 改变 自由 度 ， 这 是 由 于 所 附加 了 未 知 变量 (Qheat)。 对 于 需 氧 过 程 ， 通 常 发 现 热 量 生 
成 速率 与 氧 吸收 率 成 正比 : 
Dicet — BE x0 (4.10) 
经 验 发 现 式 (4.10) 适用 于 在 不 同 底 物 上 的 微生物 生长 ， 式 中 比例 常数 约 等 于 460k] Amol O, 
[ 见 表 4.3 及 例 4.3， 其 值 为 433kJ (mol O2z) 一 ]。 方 程式 (4.10) 也 可 从 一 般 化 还 原 度 平 衡 
导出 ， 其 中 以 N， 作为 含 氮 物质 的 参照 物 (Roels，1983; Nielsen and Villladsen, 1994), FF 
程式 (4.10) 的 一 个 推论 是 : 热量 生成 速率 的 测量 很 适合 于 检验 氧 吸收 速率 的 测量 ， 或 者 可 
作为 这 种 测量 的 一 种 替代 。 


表 4.3 利用 不 同 碳 源 生长 的 细菌 的 Yo 及 Ceat 比 较 


/kJ + (mol O2)~! 


注 : 数据 取 自 Abbott 及 Clamen (1973). 
74 


(4.4 超 定 系统 的 分 误差 的 识别 


如 果 可 获得 的 测量 数目 大 于 自由 度 下 ， 该 系统 通常 被 称 为 超 定 系统 。 在 此 情况 下 ， 测 
量 的 宛 余 可 用 于 : (1) 计算 没 测量 的 代谢 物 的 速率 ; (2) 通过 运用 本 质 上 的 最 小 二 乘 计 算 提 
高 可 利用 的 测量 的 精度 ; (3) 识别 最 可 能 的 过 失 测量 误差 来 源 或 甚至 在 黑箱 模型 框架 构建 中 
不 一 致 性 的 来 源 。 这 可 以 直接 的 方式 进行 。 例 如 ， 若 只 有 一 个 速率 没 测 量 ， 我 们 可 以 用 碳 乎 
衡 计 算 该 速率 并 且 用 剩 下 的 〈 和 氮 及 还 原 度 ) 平衡 来 检验 数据 的 总 体 一 致 性 。 有 一 种 更 有 效 的 
分 析 方法 是 基于 同时 使 用 所 有 的 平衡 (元 素 的 及 其 它 的 ) 来 计算 没 被 测量 的 速率 及 进行 数据 
一 致 性 分 析 。 最 好 运用 矩阵 运算 来 进行 。 这 里 ， 我 们 遵从 这 个 程序 ， 然 而 ， 为 了 便于 对 该 法 
接触 有 限 的 读者 的 理解 ， 已 将 矩阵 运算 的 运用 减 至 最 少 。 另 外 ， 在 方 框 4.2 中 还 介绍 了 和 矩阵 
的 基本 运算 。 最 后 ， 提 供 几 个 例子 用 以 说 明 应 用 于 无 酒精 生成 的 酵母 有 氧 培养 时 这 些 运算 方 
法 的 运用 。 

现 以 方程 式 (4.6) 的 元 素平 衡 式 作为 分 析 的 开始 ， 以 如 下 方式 重 写 该 式 ， 即 将 速率 向 
量 r 分 为 两 个 向 量 : 一 个 是 rm， 其 包括 所 有 已 测量 的 速率 ， 另 一 个 是 r*， 其 包括 剩余 的 速率 
( 指 需 计 算 的 速率 ， 因 此 下 标 为 c)， 得 到 式 (4.11): 

Er=E,r, HE =0 (4.11) 

同样 可 将 元 素 矩 阵 ERI ARE, 和 E.。 将 正中 已 测速 率 的 物质 所 在 的 全 部 列 放 人 

E, 中 ,将 也 中 没 测速 率 的 物质 〈 即 必须 从 平衡 中 要 计算 的 ) 所 在 的 全 部 列 放 人 E. 中 。 当 

然 ， 如 果 刚 好 测量 了 F 个 变量 ， 那 么 就 有 正好 足够 多 的 方程 用 于 计算 没 测量 的 速率 。 在 这 

种 情况 下 ，E. 是 一 个 方 阵 (TXT) ， 其 维 数 等 于 限制 条 件数 (或 平衡 数 ，T)。 若 E. 为 满 秩 ， 
即 秩 (E.) =T 工 (见方 框 4.2)， 那 么 解 方程 式 (4.11) 就 可 计算 出 没 测 量 的 比 速率 re: 

-= —E,'Enlm (4.12) 

MRE 为 方 阵 而 且 满 秩 ， 则 该 ee 因为 它 有 恰好 足够 多 的 测量 值 用 
于 计算 未 知 的 速率 ， 即 系统 是 超 定 的 。 若 所 测量 的 速率 的 数目 大 于 自由 度 下 ， 所 得 到 的 方 
程 数目 就 大 于 计算 未 知 速率 所 需 的 最 少 方程 数目 。 在 此 情况 下 ， 通 常 使 用 最 小 二 乘法 ， 从 可 
利用 的 平衡 方程 的 组 合 来 计算 未 知 速率 以 提高 所 得 估 值 的 精确 性 。 这 种 情况 的 等 价 和 矩阵 是 元 
素 子 矩阵 E.， 其 不 是 方 阵 ， 因 此 不 能 求 其 逆 和 矩阵 。 但 将 方程 式 (4.11) RUE 的 转 置 矩 阵 
E! (见方 框 4.2) 就 得 到 : 

E! (Er. + Emt'm) = (E2 E.)r. +E) Emm =0 (4.13) 
ETE, 肯定 是 方 阵 (见方 框 4.2) ， 而 且 如 果 满 秩 ， 就 可 求 着 ， 并 进而 给 出 r 的 解 : 
r= —E*Entm (4.14) 
st, EP Was 〈 或 Moore-Penrose 逆 和 矩阵 ) : 
Ee 下》 (4.15) 
式 (4.14) 本 质 上 是 向 量 r 中 未 测量 速率 的 最 小 二 乘 估计 ， 其 用 了 所 有 的 平衡 以 确定 这 些 
速率 。 可 以 表明 ， 若 E。 为 满 秩 〈 即 至 少 线性 无 关 的 平衡 方程 的 数目 与 未 测速 率 的 数目 一 样 
多 )， 那 么 ETE.。 也 为 满 秩 并 且 其 拟 逆 矩 阵 也 可 求 出 。 

在 超 定 系统 情况 下 ， 用 方程 式 (4.14) 计算 出 未 测量 速率 (r.) 之 后 ， 可 能 还 留 着 一 个 
未 使 用 的 平衡 式 ， 其 可 用 来 检验 所 测量 的 和 所 计算 的 速率 的 整体 一 致 性 ， 为 此 ， 将 方程 式 
(4.14) 代 人 方程 式 (4.11) 得 到 : 

75 


Rr, =0 (4.16) 

式 中 ，R 被 称 为 宛 余 矩阵 (Van der Heijden et al, 1994a, b): 
R=E,,—E.(E/E.) ‘EJ En (4.17) 
宛 余 矩 阵 的 秩 数 表示 必须 由 测量 的 和 计算 的 [ 按 式 (4.14) ] 速率 所 满足 的 独立 方程 的 数目 ， 
“因此 宛 余 矩 阵 含有 J- 秩 〈(R) 个 相关 的 行 。 如 果 去 掉 相 关 行 ， 就 得 到 关联 所 测 变量 的 秩 


(R) 个 独立 方程 ， 即 
Rirn=0 (4.18) 


R, 为 缩减 的 元 余 矩 阵 ， 它 只 含 矩 阵 R 中 的 独立 行 。 方 程式 (4.16) 是 进一步 分 析 过 失误 差 识别 的 
基础 。 在 继续 此 项 工作 之 前 ， 将 首先 举例 说 明 上 述 概念 及 确定 R, 的 方法 〈 见 例 4.6 一 例 4.8)。 


方 框 4.2 Ras 
和 矩阵 只 是 按 某 种 点 阵 形 式 排 列 的 一 组 数 。 本 文中 所 用 到 的 点 阵 或 者 是 多 组 分 的 某 一 
向 量 形式 或 是 一 个 方 的 /矩形 的 阵 。 在 此 将 介绍 本 书 用 到 的 最 简单 的 矩阵 运算 [更 详细 的 
可 参见 Strang (1988) }. 
考虑 一 个 两 行 两 列 的 普通 矩阵 A: 
ie at 
fho.1 sy Ap,2 
在 矩阵 表示 法 中 Ai; 指 第 ; TH NCR, HP i=le-n, j=le-m, RRR nm 
表示 ， 在 此 情况 下 A 为 2x2 移 阵 。 
$6 TE oy AEH 
Sie EIR A RAPS 2X2 EB: 
ot 
Bai a2 
FEMA 与 也 的 和 及 差分 别 为 2x2 和 矩阵 C 与 D: 
inte a 
VW yaa 8 Ye 


a eae 
Aas — Hhoi9 
ei A ES BY BS FF IK EW FF IE BS AE, BA: 

Ait calle ra rin 
Az1 Ar2) (2A21 2A2,2 
某 一 向 量 与 矩阵 相 乘 或 矩阵 之 间 的 相 乘 较 复杂 ， 现 举例 如 下 。 考 虑 一 个 向 量 v, 的 元 素 
数目 等 于 A 的 列 数 : 


A 与 v 相 乘 可 得 到 ; 
人 275 


A2,101 + A2,2v2 


在 本 质 上 ，F 中 的 每 一 个 元 素 为 A 的 相应 行 与 v 的 乘积 之 和 。 对 于 阶 数 为 2 <n WAR 
阶 数 为 >X1 的 向 量 v， 显 然 > 必 等 于 (BA 的 列 数 ) ， 乘 积 矩 阵 为 m Xn. 
用 类 似 的 方式 ， 可 将 两 个 阶 数 相配 的 矩阵 相 乘 ，A 中 的 每 一 行 乘 以 B 中 相应 的 列 得 
#22 24% G: 
Aisi “a a ahi a cs tae A,,1B1,2+ Ai,2B2,2 
A21 A22)'\82,1 Bo,2 Aj2, 18,1? 44,2591  A2,1B81,2 + A2;2B82,2 
和 矩阵 相 乘 是 可 结合 的 及 可 分 配 的 但 不 可 交换 ， 即 (AB)C=A(BC)，A(B+C)=AB+AC， 
但 ABABA. 
例 1 
考虑 含有 下 列 元 素 值 的 矩阵 A、B 及 向 量 v。 作 为 练习 ， 建 议 读者 重新 计算 其 结果 。 
区- 了 一 
A= B= v= 
2's Ah 5 


4 age BS 
A+B= A-B=| 
5 ort | 
0 2 5 22 
Phi go ate 
4 6 21 14 12 


FE 84 He 
UA’ 表示 A 的 转 置 矩 阵 ，A: 中 的 列 直 接 取 自 于 A ATT, BIA AS i 7H AT 
的 第 ; 列 。 因 此 对 一 般 情况 : 


x Aad wey Bee ree 
A = = 
A2,1 A2,2 Ai,2. A2,2 
注意 ，AB 的 转 置 矩阵 是 : (AB)’=A'B! 


Fo wf) ah 
K— n Xn FEB AWB A LRM, ERA—P n Xn WEE B, Alt, AB=BA=I, 
TARA Apes, ERMA TRA 1, RRO. M4 n =2HN 1H: 


te 
| <= 
0 3 
矩阵 A 的 逆 和 矩阵 计算 如 下 : 
Ai 本 hae 1 és al 
Az, A2,2 det(A) -Ai Ain 


det (A) 是 A 的 行列 式 ， 表 示 如 下 : 
Ait hehe ae 
As Alo) TALS es 
对 于 阶 数 大 于 2x<2 的 矩阵 的 行列 式 的 运算 可 参考 线性 代数 教科 书 [例如 Strang 
(1988)]。 当 和 A 的 行列 式 det (A) 为 去 时 ，A 的 逆 不 存在 ， 注 意 到 这 点 很 重要 。 这 种 不 
能 求 逆 的 矩阵 通常 称 为 奇异 矩阵 。 还 有 一 点 应 注意 : (A- 07 =(AI) -1 
矩阵 的 另 一 个 重要 性 质 是 矩阵 的 秩 (~ )， 其 相应 于 该 矩阵 中 真正 独立 的 行 的 数目 。 
对 7 xm? 的 方 阵 A， 当 -=7 时， 可 证 明 : (1) A 的 逆 存 在 ，(2) 且 它 的 逆 是 惟一 的 。 


da(A)=aer| = Ay1A2,2— A1,2A2,1 


77 


例 2 
对 于 例 1 中 的 矩阵 A 和 B， 其 det(A)= —2 & det(B)=2, KRAEMER RE 
阵 ， 它 们 是 逆 存 在 。 计 算 如 下 : 
eRe coe RP 
A2,2 =| 1 i 


Pie fe +S 

| Sag 2 
这 种 2x2 的 系统 很 容易 在 纸 上 运 算 。 然 而 对 于 阶 数 高 的 矩阵 ， 为 了 便于 运算 ， 应 使 用 
MATLAB、MATHCAD 或 MATHEMATICA 等 软件 包 。 


【 例 4.6】 无 乙醇 生成 的 酵母 需 氧 培养 过 程 分 析 

现在 回 到 酵母 需 氧 培养 的 情况 ， 其 在 例 4.1 一 例 4.3 已 被 讨论 过 ， 但 现在 只 考虑 不 生成 
乙醇 的 情况 。 此 时 Y,。 为 0， 所 以 在 黑箱 模型 中 将 不 包括 乙醇 。 于 是 以 六、re、rw、rs、ro 
及 rN 表示 模型 中 的 速率 。 运 用 葡萄 糖 、 氧 的 比 吸收 速率 ，CO, 的 比 生成 率 及 生物 质 比 生长 
速率 ( 它 等 于 处 于 稳 态 的 恒 化 器 的 稀释 速率 ) 的 测量 数据 ， 元 素 矩 阵 可 划分 如 下 : 


葡萄 糖 ”0O CO. 生物 质 NH; H,O 
, > ed 1 | Oeil 
a a ton = a 亿 

Bal PS a Mgt Tne. 4 (1) 
OO ate Ont te 


其 中 矩阵 下 的 4 SPAS A. COD 及 生物 质 的 4 个 速率 ， 和 矩阵 正 . 中 的 两 个 
列 分 别 对 应 于 所 和 水 的 速率 。 当 然 ， 上 述 两 个 矩阵 中 的 行 代 表 四 个 元 素平 衔 方程 式 。 对 于 含 
有 6 个 化 合 物 及 4 个 元 素平 衔 式 的 系统 ， 其 自由 度 下 为 2。 因 为 有 4 个 速率 可 以 测定 ， 所 以 
它 是 超 定 系统 。 利 用 方程 式 (4.17) 可 得 元 余 和 矩阵: 
1 0 ii 1 
_|0 -0.286 -0.286 0.014 
NO. Wesaa ie Ossme “ ~0.028 
0 0.858 0.858 -0.042 
aE RATA 2,. BRADGRR, RPOREAT SAAMI (第 二 行 乘 以 -2 及 -3 分 
别 与 第 三 、 四 行 相 等 )。 因 此 消去 这 两 行 就 得 到 化 简 的 隐 余 矩阵 : 
ud 0 1 1 
R= (, -0.286 -—0.286 an 9) 
方程 (3) 与 4 个 所 测定 的 比 速 率 一 起 ， 根 据 方程 式 (4.18) 就 可 得 到 下 列 元 余 方 程 : 
= tis t Tc tae 0 
人 a 286r,- 0.2867. +0. a " 四 (4) 
显然 第 一 行 被 认定 为 碳 平衡 式 ， 但 第 二 行 就 不 那么 容易 确认 ， 尽 管 其 包含 了 来 自 其 它 三 个 元 
素平 衡 限 制 条 件 的 全 部 信息 。 


(2) 


78 


a a a ne 


通常 实验 数据 充满 噪声 并 且 在 某 些 情况 下 甚至 出 现 系统 误差 。 由 于 这 些 误差 ， 方 程式 
(4.16) 通常 不 准确 。 用 所 测量 的 速率 〈 或 得 率 ) 乘 以 化 简 的 元 余 矩 阵 时 ， 结 果 不 为 零 。 这 
一 点 用 式 (4.19) 能 更 好 地 表示 : 
人 (4.19) 
式 中 ，ra 为 测量 的 速率 的 向 量 ; rn 为 实际 速率 向 量 ; 8 为 其 不 可 靠 的 总 的 测量 误差 。 
将 方程 式 (4.19) 代入 式 (4.18) 就 得 到 残 差 的 向 量 s ， 如 式 (4.20) Mm: 
e=R.rn=R,(r,+6)=R,6 ; (4.20) 
如 果 该 模型 正确 并 且 无 系统 或 随机 误差 存在 ， 即 $=0， 那 么 所 有 方程 [方程式 (4.18)] 8 
能 被 完全 满足 且 残 差 为 零 。 但 在 所 有 数据 组 中 ， 测 量 中 存在 噪声 使 得 残 差 向 量 不 为 零 。 最 好 
的 速率 估计 是 使 残 差 最 小 ， 可 通过 如 下 过 程 确定 。 
假设 误差 向 量 服从 正 态 分 布 ， 其 平均 值 为 零 ， 方 差 - 协 方差 矩阵 为 下 : 


E(e)=0 (4.21) 
F=E (ra - Tm) (Fn Fm) 4] = B00") (4.22) 
Af, 为 期 望 值 算 子 ， 能 够 表明 残 差 也 是 服从 正 态 分 布 且 均 值 为 零 : 
E(e)=R,E(6)=0 (4.23) 
方差 - 协 方差 矩阵 为 : 
P= E(ee’)=R,E(08")R; =R,FR, (4.24) 
误差 向 量 8 的 最 小 方差 估计 是 通过 根据 其 方差 所 衡量 的 误差 平方 和 最 小 而 得 到 的 : 
min(67F~'d) (4.25) 
其 解 为 : 
§ =FRTP-le =FRTP-IRir。 (4.26) 


这 里 符号 “ “人 ”表示 8 的 值 是 一 个 估计 值 。 因 为 8 为 正 态 分 布 ， 方 程式 (4.25) 中 的 函数 
最 小 化 就 如 同 最 小 二 乘 最 小 化 问题 及 最 大 似 然 最 小 化 问题 。 若 误差 向 量 不 是 正 态 分 布 ， 方 程 
式 (4.26) 的 估计 值 仍 可 用 于 最 小 二 乘 最 小 化 问题 ， 但 不 再 是 最 大 似 然 估 计 (wang 及 
Stephanopoulos，1983)。 利 用 方程 式 (4.26) ， 可 得 到 所 测量 速率 的 最 佳 估 计 值 为 : 

Pm=lm— 6 =(1—-FR!P"!R,) ra (4.27) 
其 中 工 为 单位 矩阵 。 可 以 表明 ， 通 过 方程 式 (4.27) 得 到 的 所 测量 速率 的 估计 值 的 标准 偏差 
小 于 原始 测量 值 的 标准 偏差 (wang 及 Stephanopoulos，1983) ， 因 此 该 值 很 可 能 比 实测 的 数 
据 更 可 靠 。 通 过 利用 所 测量 速率 的 最 佳 估 计 值 及 方程 式 〈4.14)， 就 可 计算 出 黑箱 模型 中 的 
未 测量 的 速率 。 


【 例 4.7】 无 乙醇 生成 的 酵母 需 氧 培养 过 程 分 析 (2) 
现在 继续 分 析 例 题 4.6 开始 的 酵母 需 氧 培养 过 程 ， 该 例 已 推导 出 了 化 简 的 元 余 和 矩阵 。 当 
稀释 速率 为 0.15Sh NM, WAH. AL CO. 及 生物 质 的 比 速率 的 测量 值 为 : 


本 —0.250 

_ |=re} ) | =0.113 

| 和 os 
ri 0.141 


79 


这 里 ， 所 有 速率 的 单位 均 为 C-mol+(C-mol 生物 质 .h) :。 假 定 生 物质 及 葡萄 糖 的 测量 误差 
为 5% ， 气 体 的 测量 误差 为 10% 〈 即 氧 与 CO; 的 测量 ) ， 现 在 要 计算 所 测量 速率 的 最 佳 估计 
值 。 对 于 这 些 误 差 ， 其 方差 - 协 方差 矩阵 为 : 


0.1563 0 0 0 
0 0.1277 0 0 
F=10-3 2 
0 0 0.0139 0 (2) 
0 0 0 0.1988 


利用 方程 式 (4.24) 可 得 : 
p= 19-3( 9:3870 - 0.0563 ” 
~0.0563 0.0267 
化 简 的 元 余 矩 阵 来 自 例 4.6。 根 据 方 程式 (4.26) 可 得 到 所 测量 通 量 的 误差 向 量 为 : 
-0.0055 
全 | 0.0115 全 
-0.0013 
0.0108 
由 此 导致 所 测量 通 量 的 最 佳 估计 值 ， 
-0.2445 
BS Dds 
ve Ge TiaS (5) 
0.1302 - 
由 此 ， 仅 对 测量 值 有 很 小 的 校正 ， 因 而 原始 测量 值 似 乎 是 很 好 。 然 而 已 校正 的 测量 值 更 符合 
元 素平 衡 方程 ， 所 以 它们 比 原始 测量 值 更 好 。 


通常 方差 - 协 方差 矩阵 假定 为 对 角 抢 阵 ， 它 意味 着 这 些 测量 值 是 不 相关 的 。 然 而 比 速率 、 
得 率 系数 甚至 体积 速率 很 少 是 直接 测量 而 是 从 基本 变量 的 测量 值 中 导出 来 的 ， 这 可 影响 到 不 
只 一 个 所 测定 的 速率 。 一 个 例子 是 氧 吸收 速率 及 CO, 生成 速率 的 测量 ， 二 者 均 基 于 流 过 生 
物 反应 器 中 的 气体 流速 的 测量 、 连 同 饶 项 气相 中 两 种 气体 的 分 压 的 测量 。 若 气体 流速 测量 有 
误差 ， 它 对 两 个 速率 均 有 影响 。 因 此 所 测量 的 速率 中 的 误差 就 间接 相关 。 对 其 它 速率 的 测量 
也 存在 同样 的 缺点 ， 这 些 速率 一 般 是 通过 将 浓度 测量 与 流速 测量 相 结合 而 得 到 的 。 在 所 有 具 
有 间接 误差 相关 的 情况 下 ， 指 定 真 实 的 方差 - 协 方差 矩阵 下 是 很 困难 的 。Madron 等 人 
(1977) 提出 了 一 个 简单 的 算法 ， 当 基本 变量 的 噪声 性 质 已 知 时 ， 用 该 算法 就 可 建立 真实 的 
方差 - 协 方差 矩阵 (见方 框 4.3)。 但 在 很 多 情况 下 ， 即 使 是 对 基本 变量 的 噪声 ， 我 们 只 有 不 
充分 的 信息 ， 因 此 就 不 能 导出 真实 的 方差 - 协 方 差 矩 阵 。 在 这 些 情况 下 ， 可 以 忽略 协 方 差 并 
利用 一 个 对 角 方 差 - 协 方差 矩阵 ， 其 中 采用 了 误差 的 合理 值 。 此 外 ， 还 可 用 下 式 进 行 最 小 二 
乘 估计 : 
Pn =(1-R/ (R RD IR 同 ra (4.28) 
它 是 基于 所 有 所 测量 的 速率 均 具 有 相同 的 绝对 误差 这 一 假设 的 。 由 于 使 用 了 误差 的 绝对 值 ， 
当 变 量 的 数量 级 相同 时 使 用 方程 式 (4.28) 才 是 合理 的 。 
若 任 何 约束 残 差 与 零 相 差 很 大 ， 那 么 或 是 至 少 某 一 个 测量 有 系统 误差 或 是 所 用 的 模型 不 
正确 。 为 了 量化 “与 零 相差 很 大 ”这 个 说 法 ， 可 引入 检验 图 数 刀 ， 它 等 于 残 差 的 加 权 平 
80 


方 和 : 

h=e'P'e (4.29) 
4a AAT, RSPB A Hy? 分 布 (wang 和 Stephanopoulos, 1983), XfFHXK 
的 原始 数据 ， 已 表明 也 是 这 种 情况 (Van der Heijden F, 1994b). y? 分 布 的 自由 度 等 于 了 
的 秩 ， 也 等 于 尺 的 秩 ， 即 独立 限制 条 件数 。 在 自由 度 等 于 R 的 秩 的 条 件 下 ， 将 检验 函数 六 
的 计算 值 与 “分 布 的 值 相 比 ， 就 有 可 能 在 某 一 置信 水 平 检验 数据 的 系统 误差 。 因 此 ， 假 如 
在 一 个 足够 高 的 置信 水 平 下 所 得 到 的 检验 函数 值 大 于 x” 分 布 值 ， 那 么 数据 或 模型 就 有 问 
题 。 表 4.4 列 出 了 在 不 同 置信 水 平 及 不 同 自由 度 下 的 xy? 分 布 值 。 


表 4.4 VRE 


方 框 4.3 ”基本 变量 误差 的 方差 - 协 方差 矩阵 计算 

通常 所 测 的 速率 是 由 所 谓 的 基本 变量 的 测量 值 确定 的 ， 例 如 ， 在 稳 态 恒 化 器 中 葡萄 
糖 的 体积 吸收 速率 是 作为 加 料 中 与 反应 器 中 的 葡萄 糖 浓度 之 差 与 稀释 速率 的 乘积 而 确定 
的 。 因 此 方差 - 协 方差 矩阵 的 详细 表述 不 是 直截了当 的 。Madron (1977) 提出 了 一 个 
利用 基本 变量 的 测量 噪声 来 计算 下 的 简单 方法 。 首 先 ， 将 所 测量 的 速率 表示 为 基本 变量 
的 函数 。 以 向 量 y 表示 这 些 基 本 变量 时 ， 可 得 第 ; 个 速率 : 

rm,i = fily) (1) 

通常 函数 f; 是 非 线 性 的 ， 为 了 获得 方差 及 协 方差 的 近似 估计 值 ， 需 将 这 些 函 数 线性 

化 。 所 测 的 第 i 个 速率 的 误差 6 Per in ee 的 线性 组 合 来 表示 : 


or = > (327 = > 68} (2) 


KH, k 为 基本 变量 的 个 数 ; gy 为 铀 感度。 若 将 敏感 度 纳入 矩阵 G 中 ,那么 方差 - 
协 方差 矩阵 了 可 通过 下 式 计算 : 


F=GF*G! (3) 
式 中 ，F* 是 含有 基本 变量 方差 的 对 角 和 矩阵 。 用 上 述 方 法 计算 协 方差 非常 简便 ， 但 很 
明显 ， 所 计算 的 结果 由 方程 式 (2) 线性 化 的 精确 度 所 限制 。 


【 例 4.8】 无 乙醇 生成 的 酵母 好 氧 培养 过 程 分 析 〈 续 ) 
现在 我 们 继续 分 析 在 例 4.6 中 提出 的 并 在 例 4.7 中 进一步 分 析 的 酵母 好 氧 培养 过 程 。 根 
据 例 4.7 中 推导 出 的 矩阵 ， 用 方程 式 (4.20) 可 计算 残 差 : 
81 


0.0040 

a eda 1) 
用 方程 式 (4.29) 可 计算 出 检验 函数 的 值 : 

bac pale = 1.87 (2) 
Ay Eb ial CAR EE A RT, PTA 2, Be ee 5 BED 2 
的 y* 分 布 值 相 比较 。 从 表 4.4 可 看 出 ， 即 使 置信 水 平 为 0.75， 检 验 函数 的 值 也 小 于 X 分 
布 值 。 因 此 ， 只 有 在 置信 水 平 非常 低 时 ， 才 能 得 出 数据 含有 过 失误 差 的 结论 ， 所 以 数据 的 质 
量 令 人 满意 。 


在 一 给 定 的 置信 水 平 下 ， 求 得 一 个 大 的 检验 函数 ， 疡 >X“， 并 不 容许 人 们 得 出 结论 是 否 
不 满意 的 大 的 系统 误差 是 由 于 数据 的 系统 误差 还 是 由 于 大 的 随机 误差 所 造成 的 。 有 一 个 方法 
可 解决 此 问题 ， 即 在 给 定 的 数据 中 一 次 消除 一 个 测量 值 ， 然 后 利用 某 一 限制 条 件 计算 该 测量 
值 ， 其 余 的 限制 条 件 用 于 一 致 性 分 析 ， 以 重新 计算 检验 函数 户 并 与 少 了 一 个 自由 度 的 X“* 统 
计 值 相 比 较 。 如 果 消 除 某 一 测量 值 后 所 得 到 的 检验 函数 值 显 著 地 小 ， 这 就 足以 证 明 所 消除 的 
测量 值 中 有 过 失 (AS) 误差 存在 。 这 同样 适用 于 除 元 素平 衡 式 之 外 的 其 它 限 制 条 件 ， 例 如 
那些 对 胞 内 代谢 物 作 稳 态 假定 所 产生 的 限制 等 。 这 种 误差 诊断 的 方法 需要 系统 是 超 定 系 统 而 
且 至 少 有 两 个 宛 余 测量 ， 即 秩 (R) 盖 2。 这 种 超 定 系统 便于 一 个 限制 用 于 计算 所 消除 的 测量 ， 
其 它 的 限制 用 于 重新 计算 检验 函数 。 测 量 消除 的 步骤 很 简单 ， 如 例 4.9 所 述 ， 它 能 迅速 确定 
某 一 系统 误差 的 可 能 来 源 。 


【 例 4.9】 酵母 培养 测量 的 误差 诊断 

对 于 以 葡萄 糖 为 碳 源 、 氨 为 氮 源 的 酿酒 酵母 需 氧 生长 ， 当 比 生长 速率 为 0.008h-:! 时 ， 
葡萄 糖 及 氧 的 比 吸 收 速率 、 生 物质 比 生长 速率 和 CO; 比 生成 速率 [所 有 速率 以 C-mol'(C- 
mol 生物 质 .h) aN] 的 测量 值 为 : 


Ra ore | 
ahs = Siac 
r= =0.008 (1) 
也 1 
Es 1.4 


生物 质 的 元 素 组 成 假定 与 例 4.6 一 例 4.8 相同 。 葡 萄 糖 、 氧 、 生 物质 及 CO. 的 测量 误差 分 别 
为 6%、11.7% 、5% 及 11.1% ， 无 协 方差 。 现 在 要 检验 是 否 有 实验 误差 。 因 为 化 学 计量 反 
应 式 及 所 测 的 速率 均 与 例 4.6 一 例 4.8 相同 ， 因 此 可 用 例 4.6 导出 的 化 简 宛 余 矩 阵 。 此 外 ， 
利用 给 定 的 误差 可 得 方差 - 协 方 差 矩阵 : 


0.0102 0 0 0 
oY, 0 2 
0 0 0.0016 0 
0 0 0 0.0155 


按 例 4.8 计算 检验 函数 ， 可 得 到 : 
h =35.06 (3) 
82 


. - Dit. gi Oar Bec ep me 


它 表 示 即 使 在 0.99 的 置信 水 平 仍 有 测量 误差 。 审 视 所 测定 的 速率 似乎 可 发 现 误差 或 存在 于 
氧 或 存在 于 CO, 的 测量 中 ， 因 为 呼吸 商 (RQ=r./r.) 小 于 1， 而 酿酒 酵母 在 低 比 生长 速率 
进行 需 氧 培养 时 的 正常 呼吸 商 为 1。 为 了 确定 测量 误差 ， 每 次 一 个 ， 分 别 消 除 四 个 反应 速 
率 ， 然 后 计算 检验 函数 ， 其 结果 如 下 : 


所 消除 的 化 合 物 hI) 所 消除 的 化 合 物 彤 (检验 函数 ) 
葡萄 糖 27.06 生物 质 26.43 
氧 相生 CO, 34.96 


显然 ， 如 果 葡 萄 糖 、 生 物质 或 CO; 三 个 测量 值 中 的 任何 一 种 被 消除 ， 仍 有 测量 误差 存在 。 
只 有 消除 了 氧 测 量 值 后 ， 检 测 函 数值 才 降 至 一 个 低 值 ， 通 过 与 自由 度 为 1 的 X 分布 值 相 比 
较 ， 发 现 当 置信 水 平 大 于 90% 时 ， 还 不 能 断定 有 过 失 测 量 误差 存在 。 因 此 氧 测 量 值 很 可 能 
是 误差 来 源 。 

若 消除 氧 测量 值 ， 就 有 可 能 计算 得 到 三 个 所 测定 速率 的 更 好 的 估计 值 以 及 三 个 没 测 量 速 
率 (WA) 的 更 好 估计 值 。 首 先 ， 通 过 用 方程 式 〈4.27)， 对 于 所 测量 的 速率 可 得 到 : 


= Tis me Sev ; 
rn=| » | =0.008| 0.98 (4) 
i. | 


此 后 用 方程 式 (4.14) [对 所 测量 的 速率 用 方程 式 〈4) KA] 可 求 出 未 测量 的 速率 〈 氢 吸收 
速率 、 水 生成 速率 及 氧 吸 收 速率 ) 为 : 


= =i 1a 
r.=| rw |=0.008| 1.56 (5) 
Tien = $48 


由 此 可 见 ， 氧 吸收 率 得 到 大 幅度 校正 。 此 外 ， 利 用 估 出 的 速率 可 得 RQ 为 1.04， 这 是 一 个 
更 加 真实 的 值 。 


参考 文 献 


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84 


第 5 章 代谢 途径 的 调控 


在 生物 体 中 ， 生 理 功 能 的 调控 发 生 在 细胞 水 平和 分 子 水 平 上 上， 这些 调控 是 通过 调节 参加 
生化 反应 的 各 种 物质 的 浓度 来 实现 的 。 此 类 调控 变量 包括 酶 (上 E)、 底 物 (S) 、 产 物 (P) 及 
调节 物 分 子 (R) 等 的 浓度 ， 于 是 酶 反应 速率 一 般 可 表示 为 : 

Uo Ol Gas CE Cul) 

在 一 个 典型 的 细胞 中 上 述 物质 分 子 大 量 存在 ， 并 且 参 与 特定 的 相互 作用 。 尽 管 其 极其 复 
杂 ， 但 生化 系统 仍 可 由 它们 达到 稳定 态 的 能 力 来 表征 ， 相 信 这 是 通常 称 作 “ 控 制 ” 的 分 子 特 
性 间 特 定 的 相互 作用 的 结果 。 代 谢 调控 的 研究 试图 阐明 各 个 酶 的 活性 被 调节 帮 至 在 分 子 水 平 
上 被 控制 的 机 理 (Atkinson，1970 ; Khoshland, 1970 ; Khoshland 和 Neet，1968 ; Van 
Dam et al，1993) 。 一 且 在 局 部 水 平 理 解 了 酶 的 调节 特性 ， 就 可 利用 代谢 控制 分 析 结 果 推 断 
途径 通 量 的 总 体 控 制 〈 见 第 11 章 )。 

对 某 些 途径 ， 一 个 个 反应 是 这 样 组 织 的 以 至 于 构成 途径 的 代谢 中 间 物 总 是 结合 到 酶 表 
面 ， 而 产物 作为 下 一 个 反应 的 底 物 而 依次 传递 《Hofmeyr，1991)。 一 个 例子 是 脂 酰 辅酶 A 
衍生 物 转化 为 乙酰 辅酶 A 的 8- 氧化 途径 。 在 这 种 情况 下 ， 中 间 代 谢 物 通常 参加 一 个 特定 的 
反应 ， 而 且 在 溶液 中 检测 不 到 其 存在 。 另 一 方面 ， 一 些 代 谢 途 径 不 是 以 这 样 的 方式 组 织 的 ， 
如 EMP 途径 、 葡 萄 糖 异 生 、TCA 循环 和 磷酸 戊 糖 (PP) 途径 等 。 这 些 途 径 的 中 间 物 尽管 
在 细胞 中 浓度 很 低 ， 但 确实 是 可 检测 的 。 代 谢 的 相互 关联 的 性 质 需 要 一 些 化合 物 对 多 于 一 条 
途径 起 中 间 物 和 (或 ) 前 体 物 的 作用 (an: G6P，PEP，PYR，OAA)。 这 样 的 代谢 物 不 能 
是 酶 结合 物 ， 因 为 它们 必须 是 在 多 于 一 条 途径 中 可 利用 的 ， 并 且 更 重要 的 是 ， 这 些 途 径 的 速 
率 在 不 同 条 件 下 可 能 会 变化 。 随 着 代谢 性 质 开 始 阐明 ， 理 由 就 变 得 很 明显 : 细胞 利用 一 些 代 
谢 物 用 于 代谢 调控 的 目的 ， 以 致 某 些 化 合 物 既 起 代谢 中 间 物 的 作用 ， 又 起 关键 酶 的 代谢 调节 
物 的 作用 。 

导致 细胞 结构 单元 (如 氮 基 酸 、 味 叭 和 喀 啶 核 苷 酸 以 及 类 固 醇 等 ) 形成 的 生物 合成 反应 
序列 源 于 简单 的 细胞 材料 ， 而 这 些 材料 产生 于 碳水 化 合 物 或 脂肪 酸 的 代谢 LS 2 章 )。 每 
条 代谢 途径 与 一 个 关键 步骤 发 生 联 系 ， 即 生产 第 一 个 代谢 中 间 物 的 反应 注定 了 特定 反应 序列 
最 终 产 物 的 生成 。 在 多 数 情 况 下 ， 该 关键 步骤 是 放 能 反应 (BI AG’<0, K’>1), UR 
反应 几乎 是 不 可 逆 的 。 普 遍 认 为 企图 调节 最 终 产品 生成 的 代谢 控制 在 代谢 节点 处 所 起 作用 最 
满意 ， 而 中 间 步 又 的 控制 不 常用 。 

当 被 一 个 复杂 的 代谢 网 络 所 困惑 时 ， 一 个 重要 问题 是 识别 由 不 同 中 间 反 应 所 施加 的 相对 
控制 。 尽 管 代 谢 系统 结构 上 及 功能 上 的 高 度 复杂 性 ， 但 其 表现 了 相当 简单 的 动力 学 及 独特 的 
稳定 态 。 这 归 因 于 酶 的 分 层次 的 结构 ， 特 别 是 它们 的 时 间 尺 度 跨 越 15 个 数量 级 以 上 (de 
Koning 和 van Dam, 1992; Heinrich 和 Sonntag, 1982 ; Hiromi，1979)。 在 快 的 一 边 是 代 
谢 反应 动力 学 〈 松 弛 时 间 10 一 10's)， 在 最 慢 的 一 边 是 遗传 调控 及 进化 〈 参 见 2.1 节 及 方 
框 2.1)。 

表 5.1 概括 了 红细胞 中 糖 酵 解 反应 的 松弛 时 间 。 基 于 这 些 数值 ， 人 们 可 以 区 分 两 组 酶 催 
化 的 反应 。 一 组 包括 HK, PFK, DPGM, DPGP, PK, ATP 酯 酶 ， 这 些 酶 催化 慢 反应 ; 

85 


而 其 它 反应 的 松弛 时 间 要 比 这 些 反应 快 2 一 6 个 数量 级 。 对 这 些 快 反应 来 说 ， 底 物 与 产物 浓 
度 基本 上 处 于 平衡 状态 ， 它 们 对 整个 代谢 系统 的 动态 响应 相对 来 说 是 不 重要 的 。 换 言 之 ， 系 
统 的 动态 响应 实质 上 能 用 慢 反 应 来 表示 ， 这 进而 可 相当 大 地 减少 需要 考虑 的 变量 数 及 整个 体 
系 的 复杂 性 。 


表 5.1 红细胞 中 糖 酝 解 反应 的 松弛 时 间 


松弛 时 间 A 


己 糖 激 酶 (HK ) FA BE BRR eH Bt 


磷酸 果糖 激酶 (PFK) BF A Ht th RE BE ZLB (GAPD) 4 10-2 
2,3-— BRR ith BE (2,8 (DPGM) Be Ht 1h BENE (PGK) 16 
2, 3-— BEAR Ht nh AY ARAL (DPGP) 磷酸 甘油 变 位 酶 (PGMD) ie 
丙酮 酸 激酶 (PK) Hi high. 
iF = BRAG (ATPase) 乳酸 脱 氢 酶 (LDH) cae 


磷酸 葡 糖 异 构 酶 (PGI) 
醛 缩 酶 (Ald) 


腺 苷 酸 激酶 (AD) ah 


注 : 取 自 Rappoport 4, 1974; Schuster #, 1989. 


不 稳定 性 的 概率 随 变量 数 而 提高 ( 见 第 1 章 )。 因 此 ， 本 质 上 时 间 层 次 可 能 是 通过 减少 
重要 的 动态 变量 而 稳定 代谢 系统 的 一 个 重要 因素 。 所 以 ， 尽 管 在 微观 水 平 上 生物 系统 极其 复 
杂 ， 但 代谢 系统 可 用 相对 简单 的 表达 式 来 成 功 地 进行 汇总 及 模型 模拟 。 否 则 ， 对 所 有 的 实际 
目的 ， 生 物 系统 的 理论 分 析 都 不 会 达到 。 

数目 众多 的 代谢 调控 机 理 之 间 的 一 个 基本 区 别 ， 是 它们 直接 调节 细胞 中 存在 的 酶 的 活性 
(见方 框 S.1) ， 还 是 需要 改变 特定 蛋白 质 合 成 净 速 率 的 二 次 响应 。 活 细胞 使 用 过 多 的 调控 机 
制 来 调节 酶 活性 。 在 极端 范围 ， 人 们 发 现 通过 共 价 修饰 可 使 酶 完全 失 活 或 活化 。 对 此 ， 磷 酸 
化 是 常见 的 机 理 ， 但 也 观察 到 添加 或 去 掉 腺 苷 酰基 、 乙 酰基 、 甲 基 及 其 它 部 分 基 团 时 的 作 
用 。 更 常见 的 是 通过 与 另 一 个 分 子 〈 如 反应 产物 ) 的 可 逆 缔 合 而 引起 的 酶 活性 逐渐 变化 。 酶 
水 平 的 控制 可 以 取 几 种 形式 ， 包 括 酶 合成 和 (或 ) 其 降解 的 调控 。 一 般 说 来 ， 高 等 植物 或 动 
物 的 分 化 细胞 由 于 其 特有 的 性 质 从 而 展现 出 很 少 且 很 小 的 酶 水 平 调节 。 另 一 方面 ， 细 菌 等 单 
细胞 生物 体 除 酶 活性 调节 外 ， 则 很 强 地 依赖 于 酶 水 平 的 修饰 以 协调 不 同 反应 。 

下 面 我 们 将 回顾 酶 调控 机 理 。5.1 节 描 述 细 胞 中 酶 活性 调控 的 不 同 模式 ， 而 $.2 节 则 涉 
及 发 生 在 基因 水 平 上 实际 酶 浓度 的 调控 。5.3 节 和 5.4 节 强 调 了 在 细胞 水 平 上 的 调控 问题 : 
例如 ， 细 胞 如 何 调控 相关 的 酶 反应 组 ， 以 及 最 终 系 统 的 或 整体 的 调控 如 何 发 生 。 

5.1 BAPE DATE 

代谢 调控 的 最 为 普通 的 形式 是 通过 调节 酶 的 活性 水 平 而 发 生 的 。 反 馈 抑 制 或 激活 是 各 种 
类 型 细胞 中 对 调节 酶 活性 的 极端 迅速 的 响应 。 酶 合成 的 抑制 或 诱导 (或 消除 抑制 ) 代表 缓慢 
而 长 期 的 调节 机 制 ， 由 此 使 细胞 中 特定 酶 的 量 得 到 优化 。 例 如 ， 从 20C 和 37 下 生长 的 大 
肠 杆菌 制 得 的 细胞 抽 提 物 的 2-D 和 蛋白 凝 胶 是 没有 区 别 的 ， 尽 管 细胞 做 了 非常 大 的 调整 以 适应 
这 两 种 生长 温度 下 的 生理 差别 (Ingraham，1987)。 这 样 的 调整 必须 主要 通过 改变 酶 的 活性 
而 不 使 酶 浓度 明显 变化 来 达到 。 调 整 是 由 代谢 物 来 促成 的 ， 该 代谢 物 可 以 是 一 个 反应 序列 的 
底 物 或 产物 ， 或 者 是 总 体 的 代谢 物 ， 例 如 ATP 或 NAD (P) H。 起 调节 作用 的 代谢 物 可 以 
充当 活化 剂 或 抑制 剂 ， 它 们 通常 分 别 被 称 为 效应 物 或 配 位 体 。 

86 


— 


FAES.1 反馈 抑制 /激活 模式 (Neidhardt $, 1990) 

在 连续 反馈 抑制 中 ， 不 同 分支 的 调控 被 解 耦 ， 而 且 分 支点 代谢 物 充 当 途 径 中 第 一 
酶 的 调节 物 。 含 有 多 个 共同 代谢 物 的 更 复杂 的 途径 需要 更 复杂 的 控制 方式 ， per 
可 以 将 激活 和 抑制 两 者 结合 起 来 以 协调 代谢 通 量 。 这 些 调 控 方 式 在 整个 细菌 界 都 可 发 现 。 

例如 ， 同 功 酶 的 存在 ， 或 经 一 特定 途径 (或 是 顺序 的 或 是 分 叉 的 ) 而 有 多 个 最 终 产 
物 的 生产 ， 都 需要 本 节 所 讨论 的 这 些 调控 机 制 的 结合 。 催 化 一 个 共同 步骤 中 的 第 一 
应 的 同 功 酶 通常 对 该 途径 的 终端 产物 之 一 是 敏感 的 。 该 机 制 〈 合 作 的 或 协助 的 抑制 ) 保 
证 终端 产物 抑制 不 会 使 细胞 缺乏 由 相同 代谢 途径 获得 的 代谢 物 。 累 积 的 〈 局 部 的 ) 反馈 
抑制 是 前 述 机 理 的 一 种 更 复杂 的 调节 形式 ， 其 中 在 一 个 单个 酶 上 含有 相应 于 该 途径 不 同 


终端 产品 中 每 一 个 产品 的 多 个 别 构 位 点 〈 见 图 $.1)。 


(a) 同 功 酶 (b) 累积 反馈 抑制 (c) 顺序 反馈 抑制 (d) 抑制 加 活化 


图 5$.1 包括 反馈 抑制 和 激活 的 调控 网 络 


5.1.1 MAAR 

Michaelis 和 Menten 最 早 尝试 分 析 酶 反应 的 动力 学 ， 他 们 的 工作 导致 引入 酶 反应 速率 
的 两 个 基本 动力 学 参数 (Dixon 和 Webb, 1979; Laidler 和 Bunting, 1973; Schulz, 1994; 
Segel，1993)。 第 一 个 参数 wmax 称 为 最 大 反应 速率 ， 表 示 在 给 定 的 酶 量 下 反应 可 达 的 最 大 速 
率 ， 即 酶 被 底 物 饱和 时 的 反应 速率 。 这 是 酶 的 催化 效率 的 度量 ， 而 且 直 接 与 酶 的 转换 数 相 
关 ， 该 转换 数 定义 为 每 秒 钟 底 物 分 子 转化 成 为 产物 的 数目 。 转 换 数 的 范围 从 每 秒 几 十 万 个 分 
子 (如 碳酸 栈 酶 转换 数 达 600000 s 1) 降 到 每 秒 少 于 一 个 分 子 〈 如 溶菌 酶 为 0.$ s-1)。 

另 一 个 重要 的 动力 学 参数 是 米 氏 常数 氏 w， 定 义 为 反应 速率 为 waaxZ2 时 的 底 物 浓度 。 
两 参数 的 一 个 重要 区 别 是 K, 的 值 与 酶 浓度 无 关 。 天 。 值 的 重要 性 有 以 下 几 个 原因 : (1) 它 
提供 了 酶 对 其 底 物 相 对 亲 合 性 的 一 个 有 用 指示 (K, 值 越 小 ， 表 示 亲 和 性 越 高 ); (2) CR 
立 了 胞 内 底 物 水 平 的 近似 值 ， 当 c, 之 开 。 时 ， 没 有 生理 意义 ， 因 为 vw SER Foun, UR 
v 会 对 c。 WEA BUR, BA, 4csKK, HN, BRA w< wmnax， 因 此 酶 的 催化 活性 的 大 
部 分 会 浪费 掉 ; (3) 通过 研究 不 同化 合 物 对 K, 的 影响 ， 有 可 能 对 某 特 定 的 酶 识别 出 潜在 的 
别 构 效 应 物 ; (4) Ky 值 的 有 关 知 识 能 使 酶 分 析 中 选择 合适 的 底 物 浓度 ; (5) 天 表示 一 
特定 酶 的 替代 底 物 的 相对 适应 性 〈 具 有 最 高 的 wmax/ 开 m 值 的 底 物 是 最 满意 的 )。 

以 wmax 和 Km 为 参数 ， 反 应 速率 与 底 物 浓度 间 的 关系 如 图 $.2 所 示 。 其 数学 表达 式 
如 下 : 


Umax€s 


UF Rita (5.1) 
应 当 注 意 ， 尽 管 Michaelis-Menten 方程 最 初 是 作为 描述 实验 测量 结果 的 经 验 式 而 提出 
的 ， 但 后 来 基于 特定 的 分 子 机 理 得 到 证 实 。 一 种 机 理 假 定 酶 与 底 物 先 形成 一 个 复合 物 
(ES)， 然 后 复合 物 再 进一步 分 解 为 产物 (P) Mea (E): 
87 


ki, k-4 
E+ Sas ES) C572) 


酶 - 底 物 复合 物 生 成 步骤 的 平衡 假定 允许 我 们 由 式 〈5.2) 的 反应 机 理 导 出 反应 速率 式 
《5.1)。 后 来 证 明 “ 平 衡 假 说 ”是 不 正确 的 ， 酶 - 底 物 复合 物 不 是 处 于 稳 态 。 然 而 ， 酶 - 底 物 
BED (ES) 的 拟 稳 态 假说 推出 与 式 〈3$.1) 同样 的 速率 式 ， 虽 然 速 率 常 数 K, 现在 是 与 式 
(5.2) 的 速率 常数 ky, 有 &-1 和 ko 不 同 的 图 数 〈 推 导 见 方 框 5.2)。 


Ce=2e 


Ce=e 


(a) 


图 $.2 不 同 酶 浓度 时 的 速率 - 底 物 浓度 关系 曲线 
(a) 酶 浓度 分 别 为 cs=e 和 ce。=2e 时 的 速率 - 底 物 浓度 曲线 ; 
(b) 通常 应 用 双 倒 数 法 〈1Mv 对 1/c,) 即 Lineweaver-Burk 法 来 确定 wmax 和 天。 值 
注意 vmax 是 一 个 宏观 性 质 ， 其 随 着 ce 而 改变 ， 而 玉 。 是 一 个 本 征 值 ， 与 ce 无 关 


Lineweaver 与 Burk 将 上 等 式 转换 为 线性 形式 ， 以 使 Ky, 值 和 wmax 值 能 被 更 准确 地 确定 。 
4 +(Am)t | (5.3) 


U Umax Umax / Cs 
因此 ， 由 1 对 1Mc, 作 图 ， 就 可 得 到 一 条 直线 ， 其 斜率 为 Ku/onsx，Y RE (BI 1/c,= 
0 时 ) Wi/vmax> Wi X RAE (BN 1/v=ON) 为 -=1XK,。，[ 见 图 $.2 (b)]。 


FAtES.2 方程式 (5.1) 的 推导 
最 简单 的 酶 反应 是 由 单一 底 物 (S) 经 由 一 种 中 间 复 合 物 (ES) 转化 为 单一 产物 
(P) 的 过 程 。 通 常 称 作 单 - 单 反应 体系 ， 可 表示 如 下 : 


E+S<2-4(Es)—>E+P 
速率 方程 式 (5.1) 可 由 下 面 两 种 方法 分 别 推 出 ，(〈1) 快速 平衡 法 ; (2) BA (或 
Briggs 和 Haldane) 法 。 
(1) 快速 平衡 法 
顾名思义 ， 该 简单 方法 假定 快速 平衡 条 件 成 立 ， 即 : 与 ES 转化 成 下 + 了 P 的 反应 相 
It, 已 、S 及 ES 非常 迅速 达到 平衡 。 因 此 ， 了 瞬时 速率 仅 取决 于 ES 的 浓度 : 


Moe sCes (1) 
这 里 &， 称 为 催化 速率 常数 。 所 有 的 酶 分 布 于 下 AES 之 间 ， 即 : 


人 (2) 


sk (1) 除 以 式 (2) 得 
(3) 


根据 快速 平衡 假定 ，ce 可 由 cy, cR KRM, KEES 复合 物 的 解 离 常数 


Cecas as 


Ces ky 


将 式 Coste ATK (4) 代入 式 (3): 


U 
RpCet= Umax» 推出 = 
Umax 


式 (5) 重 排 可 得 更 熟悉 的 Henri-Michaelis-Menten 方程 式 : 
Cs (6) 


二 

这 样 ， 该 式 给 出 了 在 任何 底 物 浓 度 下 ， 瞬 时 速率 或 初始 速率 v 相对 于 vamax 的 变化 关 
系 。 重 要 的 是 要 记 住 该 式 成 立 的 条 件 : 只 有 在 足够 短 的 时 间 里 进行 v OMe, Wc 
本 上 保持 恒定 ， 或 换言之 ， 在 分 析 期 间 ， 不 超过 约 S% 的 底 物 将 被 利用 。 

(2) 稳 态 法 (Briggs 和 Haldane 法 ) (Haldane, 1965; Walter, 1965) 

如 果 我 们 假定 ES BIL AT WHE ES 解 离 成 为 下 +S 的 速率 要 快 ， 那 么 下 与 S 混 
合 后 不 久 ， 将 建立 一 个 稳 态 ， 这 时 ES 的 浓度 将 不 随时 间 而 改变 。 通 过 如 下 程序 (其 类 似 
于 第 1 部 分 快速 平衡 的 情况 )， 基 于 稳 态 假定 ， 可 推导 出 速率 方程 。 类 似 于 前 面 的 推导 : 


Ris ko k 
E+S<——>(ES)——*E#P 
Be Rules (7) 


vo Ape (8) 
Cet CET Ces 


因为 假定 ce 不 随时 间 而 改变 ， 其 形成 速率 与 分 解 速率 相等 


三 cs 


1 a es (9) 
iG P 


定义 Km 全 -全 如 推出 c= (10) 


Kn ¥ £5 


将 式 (10) 代 入 式 (7) 整 理 后 得 : 
Y= (11) 


ee 
这 样 ， 两 种 情况 所 得 的 速率 方程 形式 一 样 ， 但 速率 常数 不 同 [ 式 (6) PKL SH 
(11) #K, 不同 ]。 注 意 ， 当 Ap<< -1 时 ， 开 wm VGA Koo Km (XK,) 的 物理 意义 
是 当 酶 反应 速率 达 最 大 反应 速率 一 半 时 的 撒 物 浓度 ， 即 当 cs= 天 m 时 : 


(12) 


5.1.2 简单 可 逆 抑 制 系统 

任何 降低 酶 反应 速率 的 分 子 被 当 作 是 抑制 剂 。 已 知 许 多 自然 存在 的 和 合成 的 物质 于 扰 酶 
的 活性 ， 这 些 作用 或 者 是 可 逆 的 ， 或 者 是 不 可 逆 的 (Webb，1963)。 本 节 概 括 了 只 有 一 种 底 
物 和 一 种 抑制 剂 时 可 逆 抑 制 的 四 种 基本 类 型 : 即 底 物 抑制 ， 竞 争 性 抑制 ， 非 竞争 性 抑制 和 反 
竞争 性 抑制 。 

底 物 抑制 

在 很 多 情况 下 ， 当 有 大 量 底 物 存在 时 ， 酶 反应 由 于 底 物 过 量 而 受到 负面 影响 。 正 如 图 
5.3 所 显示 的 ， 当 底 物 浓度 增加 时 ， 反 应 速率 达到 一 个 最 大 值 。 之 后 ， 底 物 浓 度 的 增加 引起 
酶 反应 速率 下 降 。 


| #458 =1/Klye| 


A5.3 底 物 抑制 | 
(a) 在 底 物 水 平 大 于 c。max 后 ， 底 物 浓 度 增 加 导致 酶 反应 速率 下 降 ; 
(b) 以 1Mo Mc. FER, VRE KA (参见 正文 ) 


由 快速 平衡 法 〈 方 框 S.2) 可 以 推导 一 个 模型 。 假 设 底 物 S 与 复合 物 ES 结合 成 一 个 非 
反应 的 中 间 物 ESz， 达 平衡 时 : 


E+S< 45s (BHR K,=h-1/k) 
ES +S<—ES, ( 解 离 常 数 Kz) 


ES—+E4+P ( 慢 反 应 步骤 ) 
根据 方 框 S.2 的 分 析 ， 速 率 方程 为 : 
四 kpCet 
014+ Kj/c.+ c./K2 
如 图 5.3 所 示 ， 由 实验 数据 以 1/o Mc 作 图 ， 由 所 得 直线 与 X 轴 的 交点 可 求 得 = 开 ?， 进 而 
K, 可 由 下 式 求 出 : 


Cs,max 一 V K,K2 


HE: 4 cs=Cs,maxtt, dv/dt=0. 
竞争 性 抑制 
竞争 性 抑制 剂 是 一 种 分 子 ， 其 与 底 物 之 一 具有 共同 的 特征 ， 因 而 使 之 能 与 该 底 物 竞争 可 
利用 的 酶 活性 中 心 。 反 应 产物 、 不 可 代谢 的 底 物 类 似 物 、 底 物 衍 生物 及 蔡 代 底 物 都 可 作为 竟 
90 


” 争 性 抑制 剂 。 丙 二 酸 是 众所周知 的 琥珀 酸 脱 氢 
酶 的 竞争 性 抑制 剂 ， 琥 珀 酸 脱 氢 酶 催化 琥珀 酸 氧 ONO NN oo 
化 反应 生成 延 胡 索 酸 [ succinate ( #HE FAM) + Oo 小 
FAD = 一 一 fumarate( 延 胡 索 酸 ) +FADH2 ]。 如 ot A Sar Ba“ Te 
图 5.4 所 示 ， 由 丙 二 酸 、 戊 二 酸 和 草酸 引起 的 琥 
” 瑚 酸 脱氧 酶 的 竞争 性 抑制 主要 是 由 于 它们 与 主要 oT NON Noe 两 二 酸 
底 物 琥珀 酸 的 结构 类 似 性 。 由 果糖 及 甘露 糖 抑制 
的 已 糖 激酶 催化 的 葡萄 糖 与 ATP 的 反应 ， 是 另 preter ice ars 
二 个 由 替代 底 物 引起 的 竞争 性 抑制 的 例子 。 

由 于 抑制 剂 与 酶 的 结合 是 可 北 的 ， 于 是 在 游 SOA OR ,名和 
离 酶 分 子 与 结合 了 抑制 剂 的 酶 抑制 剂 复 合 物 分 子 ee oe Cee 
之 间 就 建立 了 一 个 平衡 ， 如 图 $.5 中 反应 方程 式 所 示 。 由 此 反应 机 理 可 推出 竞争 性 抑制 反应 速 
率 为 : 


= An (1+o)14 A (5.4) 


0 Whe Ties. ete 
一 个 竞争 性 抑制 剂 只 是 起 了 线性 地 增加 了 底 物 的 表 观 米 氏 常数 的 作用 [Kinsaop = Ka(1+ci/ 
K;)], 10 wmax 保 持 不 变 。 式 中 抑制 参数 K; 的 数值 相当 于 使 双 倒 数 图 直线 斜率 加 倍 时 的 抑制 
剂 浓 度 ， 但 并 不 等 于 发 生 50% 抑 制 时 的 抑制 剂 浓 度 。 因 为 在 相对 于 c; 而 言 的 低 底 物 浓度 下 ， 
活性 中 心 更 可 能 被 抑制 剂 占 据 ， 反 之 亦 然 。 故 可 通过 增加 cs。 提高 反应 速率 ， 用 非常 高 的 底 
物 浓 度 克 服 抑制 ， 因 为 在 这 些 条 件 下 ， 酶 遇 到 抑制 剂 分 子 的 概率 变 小 了 。 


Ks kp 
E+S ~~ ES 一 一 “~ E+P 


K=¢.C;/Ce; 


(a) 


斜率 = Kin/Vinax(1 +¢;/k;) 


1/cs 
(b) 


图 $.5 竞争 性 抑制 
(a) 反应 图 解 ， 在 典型 模型 中 ，S 与 工 竞 争 相同 的 结合 位 点 ，I 与 S 结构 相似 ， 开 ; = ceciyc。i， 
K.=cecs/c<，A 是 ES 分 解 为 E 和 了 的 反应 速率 常数 ; (b) 竞争 性 抑制 剂 浓 度 不 同 (0, K;, 2K,) 时 的 双 倒 数 图 
竞争 性 抑制 原理 已 在 医学 领域 和 生化 过 程 中 开发 利用 。 例 如 ， 像 磺胺 这 样 的 药物 是 基于 
91 


它们 的 结构 与 细菌 关键 底 物 结构 类 似 而 设计 的 。 磺 胺 非常 类 似 于 对 胺 基 茶 甲酸 的 结构 ， 是 细 


菌 用 来 作为 合成 叶酸 的 前 体 物 。 于 是 被 细菌 感染 的 病人 可 通过 此 药物 得 到 有 效 的 治疗 ， 因 磺 
胺 药物 通过 相应 细菌 酶 的 竞争 性 抑制 阻止 了 叶酸 的 合成 ， 这 对 人 类 没有 任何 有 害 影响 (人 体 
不 存在 叶酸 合成 途径 )。 

非 竞争 性 抑制 

这 类 抑制 剂 与 酶 的 结合 也 是 非 共 价 的 、 可 逆 的 。 这 些 抑 制剂 结合 到 酶 分 子 的 同 源 调 节 位 
点 (离开 活性 位 点 ) 并 触发 酶 的 构 型 改变 ， 从 而 干扰 酶 的 催化 效率 。 非 竞争 性 抑制 剂 对 底 物 
的 结合 没有 影响 ， 而 且 与 其 竞争 对 手 形成 对 比 ,S 与 工 随机 地 、 独 立地 在 酶 的 不 同位 点 结 
合 。 这 样 的 抑制 在 稳 态 多 反应 物 系 中 普遍 存在 。 非 竞争 性 抑制 机 理 及 对 应 的 双 倒 数 图 如 图 
5.6 所 示 。 图 中 表示 ，I 能 与 下 及 ES 结合 ，S 能 与 下 及 EI 结 合 。 酶 与 一 个 配 基 的 结合 对 另 
一 个 的 解 离 常数 没有 影响 ， 但 是 所 生成 的 ESI 复合 物 是 无 活性 的 。 


(a) 


斜率 =Km/vmax(1+ cr/ 天，) 
一 ~ 和 蕉 距 =1wWa(+c/ Ks) 


1/Vinax 


—1/Km 


l/c, 


(b) 


图 5.6 非 竞 争 性 抑制 
(a) 抑制 剂 和 底 物 可 逆 地 、 随 机 地 、 独 立地 在 不 同位 点 结合 ; (b) 非 竞争 性 抑制 剂 在 不 同 固定 浓度 (0, K;, 2K;) 
下 的 1/0-1/c, 图 。 一 个 典型 的 非 竞争 性 抑制 剂 使 wmax 降 低 ， 但 不 影响 人 值 


ARSE EM HEE, 0, Umaxs Csr Km, c; 和 天; 间 的 关系 式 可 由 快速 平衡 假定 推出 : 
1 了 (LE (146) (3.5) 


U Umax | a is Umax K; 
sk (5.5) 表明 在 通常 的 1/ 对 1Mcs 图 中 直线 斜率 和 在 Y 轴 上 的 截 距 均 为 ci 的 函数 。 
92 


机 理 上 ， 这 是 由 于 非 竞争 性 抑制 对 底 物 结合 及 催化 效率 二 者 的 双重 影响 。 如 图 5.6 所 示 ， 由 
于 立轴 截 距 和 斜率 均 以 相同 的 因子 (1+ ci/K;) 增加 ， 而 X 轴 截 距 保持 不 变 ， 并 等 于 
=1XKun。 正 如 所 预见 的 ， 非 竞争 性 抑制 剂 的 惟一 影响 是 减 小 wmax 而 Km 保持 不 变 。 重 要 的 
是 要 注意 到 : kp 也 没 改变 ， 而 正 是 由 于 部 分 ES 转变 为 非 反应 的 ESI 形式 使 ES 的 稳 态 浓度 
实际 上 减 小 了 。 

因为 非 竞争 性 抑制 剂 通常 不 类 似 于 任何 特定 底 物 ， 故 一 种 单一 类 型 的 抑制 剂 往往 能 够 影 
MR ARES. PIM, BAA (如 EDTA 和 和 氰 化 物 分别 结 合 镁 和 铁 ) 就 属于 此 类 抑制 
剂 。 由 于 含 铁 蛋 白质 在 氧化 还 原 反应 中 具 重 要 作用 ， 而 对 所 有 含 ATP 的 反应 中 都 需要 镁 离 
子 ， 故 这 类 抑制 剂 可 能 会 产生 有 害 的 生理 影响 。 

反 竞 争 性 抑制 

反 竞 争 性 抑制 剂 是 这 样 的 分 子 ， 它 可 逆 地 结合 到 酶 - 底 物 复合 物 ， 并 形成 一 个 无 活性 的 
ESI 复合 物 。 这 类 抑制 普遍 存在 于 多 反应 物 系 统 ， 如 图 5.7 所 示 。 根 据 通常 的 平衡 假定 可 得 
出 如 下 速率 方程 : 


全 第 本 证: 型 | Z| 
三 > 二 1+ 开 ， (5.6) 


U Umax Cs Umax 
oe EM AE Umax AH K,, 都 以 相同 因子 降低 [unaxi = Umax/(1 + ¢;/K;), 
K mvapp = Km/(1 + ¢:/K;) ]o Km 的 减 小 产生 于 反应 ES+I = ESI, KRAEES 数量 减少 ， 
引起 下 + S 一 二 ES 的 平衡 向 右 移动 。 反 竞争 性 抑制 的 反应 平衡 式 与 双 倒数 图 如 图 $.7 所 示 。 
当 c; 增加 时 ，Y 轴 截 距 也 增加 ， 形 成 一 系列 平行 线 。 


Ks k K. 
Ee > ES ——~ EP oe oe = ce 
T + + 
I I 
5| 
ESI 人 9 
(a) 
EI+S EIS 


1/v 


斜率 =Kmyvmax 非 竞争 性 抑制 


截 距 = Lvmax(1+ci/ 人 站 


1/cs 


一 1 人 Km 
(b) 
不 可 逆 抑 制 
图 5.7 反 竞 争 性 抑制 
(a) 反应 图 解 ， 典 型 的 反 竞争 性 抑制 剂 可 
逆 地 与 酶 - 底 物 复合 物 结合 ， 产 生 无 活性 的 


ESI 复合 物 ; (b) 双 倒 数 图 表明 ， 斜 率 仍 为 Cei Cet 

Kyn/Umax> Mi 1/v 轴 截 距 随 因 子 (1+ c;/K;) 

而 增 大 ， 这 样 增加 抑制 剂 浓度 可 产生 一 系列 图 $.8 不 可 逆 抑 制 与 非 竞争 性 抑制 的 比较 
平行 线 ， 其 立轴 截 距 随 抑 制剂 浓度 增加 而 增 大 cu 代表 由 不 可 逆 抑 制剂 所 滴定 的 酶 的 数量 


93 


5.1.3 ARAM 

不 可 逆 抑 制剂 是 这 样 的 分 子 ， 它 与 酶 分 子 共 价 结合 并 永久 地 破坏 了 酶 的 催化 活性 。 一 个 
典型 的 不 可 逆 抑 制剂 是 二 异 两 基础 酸 氟 化 物 (DIPF)， 它 与 丝氨酸 部 分 的 羟基 结合 而 使 酶 失 
活 。 在 其 它 情况 下 ， 不 可 逆 抑 制剂 是 极 具 选 择 性 的 ， 如 抗生素 青霉素 ， 它 有 选择 性 地 抑制 参 
与 细胞 壁 合 成 的 酶 。 因 为 wmax 被 减 小 了 ， 使 酶 不 可 逆 失 活 的 物质 可 能 被 曲解 为 非 竞 争 性 抑 
制剂 。 不 可 逆 抑 制剂 和 可 道 的 非 竞争 性 抑制 剂 可 通过 wmax 对 ce 作 图 来 区 分 〈ce。 是 用 于 试验 
的 酶 活性 总 的 浓度 )。 如 图 $.8 所 示 ， 对 一 个 可 逆 的 非 竞争 性 抑制 剂 来 说 , “附加 的 抑制 剂 ” 
直线 比 对 照 直线 斜率 要 小 ， 且 两 条 直线 都 经 过 原点 。 另 一 方法 ， 对 不 可 逆 抑 制剂 而 言 ,“ 附 
加 的 抑制 剂 ” 直 线 的 斜率 与 对 照 直 线 斜 率 相 同 ， 但 与 X 轴 相 交 于 数值 等 于 不 可 逆 失 活 酶 浓 
BE c. AME 


(615.1) 通过 调节 酶 活性 控制 生物 合成 网 络 ; 天 冬 氢 酸 氨基 酸 途径 中 的 反馈 控制 结 
#4] (Umbarger, 1978) 

氨基 酸 中 天 冬 氢 酸 族 成 员 MAR, BAR. HARAFRAR) 是 通过 图 $.9 所 示 的 
分 支 途 径 生 产 的 。 通 常 ， 这 类 分 支 途径 的 调控 很 复杂 ， 因 为 它 需 一 种 结构 以 使 得 一 种 产品 过 
量 时 不 会 意外 地 关 掉 整个 途径 。 例 如 ， 在 大 肠 杆菌 中 这 种 特殊 途径 的 调节 机 制 确实 是 非常 复 
杂 的 ， 因 为 这 些 机 制 还 包括 了 同 功 酶 的 参与 。 如 图 $.9 所 示 ， 每 种 产物 都 抑制 和 (或 ) BAe 
共同 途径 中 的 第 一 个 酶 一 一 天 冬 氢 酸 激酶 。 然 而 ， 为 使 一 种 产物 不 能 阻 遇 所 有 激酶 的 活性 ， 
存在 着 天 冬 氨 酸 激酶 的 三 种 不 同 的 同 功 酶 ( 指 催化 同一 化 学 反应 的 不 同 的 酶 ) : 一 个 对 世 - 赖 


1 
1 
1 
1 
| 
一 氢 吡 吓 二 羧 酸 天 冬 氨 酸 
| FW | 
: | 
1 
| | 
| 高 丝氨酸 
_. “REY 
af] | 
: | 1 O-SR EER eS 24 a 
| | [ee 
: | 
| ES He 
MY : 
: 要 — 
, | 
7 | et | 
1 | | 
| | | 
Ha Ane — 
| 
L- eA - 2 


图 5.9 肠 道 细菌 氨基 酸 的 天 冬 氨 酸 族 的 调控 
L- 赖 氨 酸 抑制 天 冬 氨 酸 激酶 凡 和 二 氢 甲 基 吡 啶 合成 酶 ; 世 - 和 蛋氨酸 抑制 O- 琥 珀 酰 高 丝氨酸 
合成 酶 ; 世 - 苏 氮 酸 抑制 天 冬 氨 酸 激酶 I 和 高 丝氨酸 脱 氢 酶 ; L- 蜡 亮 氨 酸 抑制 苏 氨 酸 脱氧 酶 


94 


ARM BUR, —TURARM BR, —TERLURNHSARMA. AN, KTH 
能 够 调节 存在 着 途径 产物 混合 物 不 平衡 的 情况 。 例 如 : 蛋氨酸 过 量 而 其 它 产 物 (MAR. FH 
亮 氨 酸 和 苏 氨 酸 ) 水 平 低 不 能 通过 单独 调节 天 冬 所 酸 激酶 来 校正 ， 因 为 这 不 会 产生 蛋 氢 酸 与 
其 它 三 种 氨基 酸 的 适当 比例 。 因 此 ， 每 种 氨基 酸 通 常 调控 自己 的 特定 分 支 途径 的 第 一 个 酶 。 
蛋氨酸 和 蜡 亮 氨 酸 通过 反馈 抑制 和 阻 过 机 制 两 种 方式 来 调节 代谢 途径 ， 而 赖 氨 酸 和 苏 氨 酸 参 
_ 与 更 复杂 的 调控 类 型 。 

很 幸运 ， 对 于 代谢 工程 目的 ， 众 多 的 微生物 具有 更 加 简单 的 调节 机 制 ， 也 许 是 因为 这 些 
微生物 在 它们 的 环境 中 不 常 遇 到 组 成 不 平衡 的 氨基 酸 混合 物 。 如 果 一 个 生物 体 通 常生 活 在 氢 
基 酸 贫乏 的 环境 中 ， 那 么 氨基 酸 生物 合成 的 主要 调节 功能 是 调整 其 速率 以 适应 于 微生物 的 生 
长 速率 。 分 支 途 径 的 主要 调节 功能 可 通过 只 有 一 个 或 一 些 产品 抑制 第 一 酶 的 系统 来 实现 。 在 
氨基 酸 生产 菌 中 的 土壤 细菌 谷 氨 酸 棒 杆 菌 和 “棒状 菌株 群 ” 的 其 它 成 员 中 确实 已 发 现 这 种 类 
型 的 简单 调控 系统 。 短 杆菌 属 - 棒 杆 菌 属 菌 群 中 调控 系统 的 简易 性 ， 使 得 仅 通过 简易 地 分 离 
营养 缺陷 型 突变 株 或 调节 突变 株 ， 就 可 利用 这 些 菌 株 大 量 生 产 赖 氨 酸 成 为 可 能 。 

在 这 些 突变 株 中 ， 催 化 一 个 代谢 物 生物 合成 步骤 的 酶 活性 已 被 破坏 。 和 营养 缺陷 型 突变 株 
需要 在 其 培养 基 中 补充 所 说 的 代谢 物 以 利生 长 。 例 如 ， 高 丝氨酸 脱 氢 酶 (HDH， 催 化 天 冬 
氨 酸 半 醛 转化 为 高 丝氨酸 的 酶 ) 缺失 的 突变 株 是 高 丝氨酸 或 苏 氨 酸 和 蛋氨酸 营养 缺陷 型 。 这 
种 谷 氢 酸 棒 杆 菌 营养 缺陷 型 大 量 产生 赖 氨 酸 而 不 产生 任何 一 种 其 它 氮 基 酸 ， 有 两 个 原因 : 
(1) 由 于 HDH 酶 破坏 ， 所 有 天 冬 氨 酸 激酶 的 通 量 都 转 到 赖 氨 酸 的 形成 ; (2) MARTHA 
酸 混合 物 约 1Immol'L :时 ， 对 天 冬 氢 酸 激酶 的 抑制 接近 94% ， 而 仅 单 独 有 约 lmmol'L :! 赖 
氨 酸 时 ， 其 对 此 酶 的 抑制 很 勉强 〈 仅 达 12% 一 20% )。 由 于 这 样 的 突变 株 需 要 对 其 生长 培养 
基 精 确 补 充 蛋 氨 酸 和 苏 氨 酸 ， 故 调节 突变 株 对 赖 氨 酸 的 商业 生产 更 有 用 。 

通常 ， 利 用 赖 氨 酸 类 似 物 S- 氨 乙 基 半 胱 氨 酸 \AEC)， 已 经 获得 改变 了 赖 氨 酸 生物 合成 
调控 的 棒 杆 菌 属 突变 株 。 像 赖 氨 酸 一 样 ， 该 类 似 物 可 抑制 天 冬 氨 酸 激酶 的 活性 ， 从 而 也 抑制 
野生 型 菌株 的 生长 。 另 一 方面 ，AEC- 抗 性 突变 株 似乎 使 其 天 冬 氨 酸 激酶 有 了 改变 ， 以 致 该 
酶 改变 了 的 别 构 调控 位 点 对 ARC 也 对 赖 氨 酸 的 亲和力 较 低 。 这 些 突变 株 的 酶 可 能 以 低 的 亲 
和 力 与 赖 氨 酸 结合 而 且 在 通过 赖 氨 酸 的 反馈 调控 中 是 有 缺点 的 。 通 过 一 系列 调控 突变 株 的 选 
择 ， 目 前 商业 生产 上 可 应 用 的 菌株 产 赖 氨 酸 量 超过 60g /L. 


5.1.4 别 构 酶 
上 节 介 绍 的 酶 具有 多 个 但 相互 独立 的 底 物 结合 位 点 ， 即 一 个 分 子 的 结合 并 不 影响 空位 点 
原 有 的 结合 或 解 离 作 用 。 第 二 类 完全 不 同 的 调节 酶 包括 这 样 的 酶 ， 它 与 一 个 分 子 的 结合 引起 
结构 的 或 电子 的 变化 ， 结 果 导 致 酶 的 剩余 空位 亲和力 发 生 了 改变 。 这 种 相互 作用 可 以 或 是 同 
促 的 ， 即 仅 包 括 底 物 〈 简 单 协同 性 ); 或 是 异 促 的 ， 即 这 种 相互 作用 包括 底 物 与 抑制 剂 或 底 
物 与 激活 剂 分 子 。 这 组 酶 更 通俗 地 被 称 为 别 构 酶 ， 它 通常 是 由 许多 亚 基 组 成 并 且 由 S 形 速 
率 曲 线 来 表征 (Harford 与 Weitzman, 1975; Kurganov, 1982; Monod 等 ，1963; Sanw- 
al, 1969, 1970; Stadtman, 1966). 

在 控制 途径 通 量 中 ， 与 遵循 Michealis-Menten (M-M) a) 777%. YR EO HAR Og Dy AY 
相 比 ， 别 构 酶 动力 学 具有 明显 的 优点 。 别 构 酶 这 种 S 形 动力 学 曲线 表明 : 在 低 co, cy 
的 变化 促使 酶 变 得 更 有 效 。 当 c. 增加 时 ， 正 协同 性 使 酶 活性 比 通 常情 况 提高 得 更 快 ， 而 负 
协同 性 使 酶 活性 比 通常 增加 得 更 慢 。 协 同性 在 生理 上 是 重要 的 ， 因 为 它 提供 了 酶 对 底 物 水 平 

95 


波动 或 别 构 调 节 水 平 波动 的 敏感 性 变化 的 程度 。 因 此 ，S 形 响应 本 质 上 在 低 或 高 浓度 时 分 别 


起 “ 关 - 开 ”的 开关 作用 。 而 在 中 等 浓度 时 ，S 形 响 应 提供 了 反应 速率 更 加 敏感 的 控制 。 这 
种 调节 的 另 一 个 重要 性 质 是 存在 着 一 个 浓度 靖 值 ， 低 于 该 靖 值 就 没有 催化 活性 。 这 种 阔 值 现 
象 在 激素 响应 、 神 经 信和 号 或 细胞 分 化 等 情况 下 极端 重要 。 

“ 别 构 ”这 一 术语 最 早 被 Monod ，Changeux 和 Jacob 在 给 酶 分 类 时 使 用 ， 这 些 酶 在 与 底 
物 没 有 结构 类 似 的 分 子 存在 时 改变 了 动力 学 特征 (通常 是 K,, 值 )(Monod 等 ，1963)。 其 后 
又 扩大 到 包括 由 于 底 物 或 效应 物 分 子 结合 而 以 不 同 构 形 存在 的 酶 。 

这 种 响应 在 代谢 控制 中 是 极其 重要 的 。 例 如 ， 在 一 串联 的 酶 反应 步骤 中 ， 细 胞 可 以 通过 
终 产 物 对 第 一 步 反 馈 抑 制 的 开 - 关 作用 来 调节 此 途径 的 通 量 。 这 就 能 确保 一 条 避免 细胞 结构 
单元 过 量 生成 和 积累 的 经 济 路 线 。 别 构 酶 的 通用 重要 特性 概括 如 下 。 

@ 它 们 是 由 多 肽 亚 基 聚集 而 成 的 多 聚 体 酶 复合 物 构成 的 。 典 型 的 别 构 酶 由 2、4、6 或 更 
多 个 亚 基 组 成 。 这 些 亚 基 可 以 不 同 ， 其 中 一 种 亚 基 具有 催化 功能 而 其 它 的 具有 调节 功能 ; 或 
是 完全 相同 ， 同 样 的 亚 基 具有 催化 和 调节 两 种 功能 。 

e@ 效 应 物 和 底 物 通常 具有 非常 不 同 的 化 学 结构 ， 并 在 不 同位 点 与 酶 结合 〈 调 节 位 点 对 众 
化 位 点 )。 

@ 通 常 认为 别 构 效 应 物 是 通过 修饰 酶 的 构 形 状态 的 方式 以 使 其 活性 可 以 增加 或 降低 。 这 
意味 着 酶 可 以 不 同 的 构 形 存在 ， 故 称 为 别 构 酶 。 配 基 的 结合 引起 变化 ， 或 者 通过 使 酶 从 一 种 
构 形 变化 到 另 一 种 构 形 ， 或 者 通过 改变 两 种 构 形 之 间 的 平衡 。 在 两 种 情况 下 ， 都 会 使 酶 从 不 
太 活 泼 状 态 转变 到 更 活泼 状态 ， 因 此 效应 物 能 够 调节 其 活性 。 

@ 别 构 酶 的 一 个 明显 特征 是 其 动力 学 性 质 偏离 M-M 动力 学 : v 对 cs 作 图 呈 S 形 曲 线 而 
不 是 M-M 双 曲 线 。 由 于 大 多 数 别 构 酶 呈现 S 形 动力 学 ， 别 构 性 已 成 为 S 形 响 应 的 同义词 。 
然而 严格 地 说 ， 这 并 不 确切 ， 因 为 并 非 所 有 的 S 形 曲 线 都 产生 于 别 构 作用 。 例 如 一 个 随机 
的 双 反 应 物 反应 系统 (两 个 底 物 或 底 物 加 效应 物 )， 这 里 有 一 个 比 三 元 复合 物 更 合适 的 动力 

学 途径 会 产生 一 个 类 似 的 响应 。 


BS or ee 非 协同 位 点 
作为 对 别 构 性 的 介绍 ， 让 我 们 考虑 二 
聚 酶 的 情况 ， 该 酶 的 两 个 位 点 相同 ， 并 且 
K, K, 互相 独立 ， 如 图 5.10 AT AR o 对 这 样 一 个 机 
理 ， 速 率 方程 由 下 式 给 出 
2kp ___ ES+P 2 
Erp Beg ee ES m gt es es es 
SE+P 552 K,' K2 KtE) 
图 5.10 非 协同 作用 的 二 聚 酶 的 底 物 结合 序列 Vmax 1 二 2cs 1 cq (i4see) 
二 聚 体 PLA) 模型 中 两 个 位 点 是 相同 的 而 且 i Ke Kk. 


是 互相 独立 的 ， 天 、 称 为 本 征 解 离 常数 


_ fsCe £ 
其 中 ia C ’ Umax Aged 


es 


通常 ， 对 具有 n 个 相同 且 相 互 独立 位 点 的 酶 ， 其 速率 方程 可 表示 为 


96 


或 者 ee (5.8) 


了 ,. Daa en 
AKA L, ASB n (A, v Xtc. 作 图 总 是 双 曲 形 的 ， 因 此 不 可 能 由 动力 学 数据 来 确定 
j.。 换 名 话说， 不 可 能 区 分 具有 个 相同 位 点 的 lmol BABA 1 个 位 点 的 nmol 酶 。 
协同 结合 
另 一 方面 ， 协 同 相 互 作 用 的 实质 是 一 个 底 物 分 子 的 结合 引起 结构 的 和 /或 电子 的 变化 ， 
从 而 影响 空位 点 上 的 结合 特性 。 在 这 类 酶 中 ， 第 一 个 分 子 的 结合 通过 增强 空 的 结合 位 点 对 底 
物 分 子 的 亲和力 从 而 能 促进 另外 的 分 子 的 


结合 。 这 种 现象 也 称 为 正 协同 效应 或 正 促 ES 

响应 ， 意 味 着 它 包 括 一 类 结合 分 子 ， 即 底 

物 。 包 括 不 同 配 基 对 (如 : 底 物 和 激活 剂 ， 

底 物 和 抑制 剂 ， 抑 制剂 和 激活 剂 ) 的 相互 K. aK. 

作用 称 为 异 促 响 应 ， 它 可 以 是 正 异 促 啊 应 ， 

也 可 以 是 负 异 促 响应 。 oe ee 
让 我 们 再 次 考虑 具有 两 个 位 点 的 酶 ， 图 5.11 具有 双 结合 位 点 的 别 构 酶 的 底 物 结合 序列 

但 此 时 第 一 分 子 的 结合 将 影响 第 二 个 结合 。 在 一 个 底 物 位 点 的 结合 〈 导 致 ES) 可 改变 

如 图 $.11 所 示 ， 此 时 第 二 个 空位 点 的 解 离 本 征 解 离 常数 开 、 为 xKs.，a<1 


常数 变 为 多 。、( 这 里 ，ax<<1 为 正 协同 效应 ， 而 x >1 为 负 协 同 效 应 )。 
该 机 理 产 生 如 下 反应 速率 动力 学 表达 式 (5.9)。 与 非 协同 情况 不 同 ， 式 (5.9) 不 能 简 
化 为 简单 的 M-M 方程 ， 相 应 于 cs 其 展现 出 特有 的 S 形 特征 。 


2 


Cs | cs 
U Ks ak? 
Hs OCs c2 (5.9) 
ore tee 
其 中 K,===, Winag Ok Oct 
MRSA RA, RR TRE A 
Cs, 3c3 | 3cs_ 8 
or Rs ak? a*BK3 a> B’yK3 


“本 了 1 4 fos y 6c2 4c3 ct (5.10) 


K, ak? ao28K3 a3p2yK$ 
注意 : 在 这 个 模型 中 ， 影 响 是 渐进 的 和 累积 的 ， 即 第 二 个 分 子 的 结合 使 剩 下 两 个 位 点 的 解 离 
常数 以 8 到 uc8K。 的 因子 发 生 改 变 ， 而 第 三 个 分 子 的 结合 使 最 后 一 个 位 点 的 解 离 常数 以 y 到 
aby¥K, HAF RARE. 

Hill 方程 一 一 别 构 酶 简化 的 速率 方程 

对 于 呈现 显著 协同 效应 的 酶 ， 其 因子 c BL y 等 都 非常 小 ， 因 此 ， 速 率 方程 主要 取决 
F (c.)" 项 ( 即 : 对 于 c.> 开 .的 任何 情况 ， 含 有 少 于 个 分 子 底 物 的 所 有 酶 - 底 物 复合 物 的 
浓度 将 可 忽略 不 计 )。 例 如 ，4 个 位 点 酶 的 速率 方程 此 时 可 简化 为 


3 A2 4 7 4 

a) F a” B°YK, = K > Cs 

nr c4 c4 4 + K’ >. 11) 
23827K4 一 全 天 7 


97 


对 具有 n 个 相当 的 底 物 结合 位 点 的 酶 ， 已 提出 如 下 动力 学 方程 (Hill 方程 ) : 
CS 
二 
HP, K’ =a" lpr yt 3K, 式 (5.12) 中 的 常数 K MY F v =0.50max At wR 
BEN n WKF (BI: cz)。 它 包含 本 征 解 离 常 数 氏 .， 还 有 相互 作用 因子 (<1 为 正 协同 作 
用 ; >1 为 负 协 同 作 用 )。 
Hill 方程 式 (5.12) 可 写成 更 有 用 的 形式 : 


(5.12) 


re: - ) Pt eedic. lek. (5.13) 


这 样 ， 上 式 左 边 对 lg(cs) 作 图 可 得 斜率 为 wapp 的 直线 。 如 果 协 同性 不 高 ， 那 么 n Wit 
算 值 将 小 于 实际 的 位 点 数 ， 具 有 高 于 app 的 最 接近 的 高 整数 值 ， 而 za 代表 最 小 的 实际 位 
点 数 。 


5.2 酶 浓度 调节 


上 节 我 们 讨论 了 酶 活性 调节 的 不 同方 式 。 这 些 机 制 担负 修饰 细胞 中 已 存在 的 酶 分 子 的 速 
率 ， 它 们 包括 可 逆 或 不 可 逆 反 应 ， 这 些 反 应 实质 上 影响 总 的 可 利用 分 子 中 活性 酶 分 子 的 数 
量 。 结 果 ， 这 些 调 节 机 制 在 极 短 的 特征 时 间 里 迄 速 作出 反应 。 当 然 ， 能 够 修饰 一 个 酶 反应 速 
率 的 一 个 替代 的 方法 是 通过 改变 酶 的 总 量 。 因 为 酶 是 基因 表达 过 程 的 产物 ， 其 数量 实质 上 可 
在 两 种 水 平 上 控制 : DNA 转录 和 RNA 翻译 。 大 多 数 处 于 调控 中 的 原核 生物 是 在 转录 水 平 
上 控制 的 ， 这 防止 了 不 必要 的 mRNA 生产 浪费 。 
5.2.1 转录 起 始 的 控制 

当 RNA 聚 合 酶 与 编码 基因 上 端的 启动 子 区 域 相 结合 时 ， 转 录 起 始 发 生 (LAKE S.3). 
调控 转录 最 明显 的 地 方 会 在 基因 的 启动 子 区 域 或 其 附近 。 通 过 控制 RNA 聚合 酶 与 启动 子 结 
合 的 速率 ， 细 胞 能 够 调节 mRNA 产生 的 数量 ， 最 终 决 定 所 合成 酶 的 水 平 。 与 包括 在 该 控制 
中 的 实际 编码 区 〈 结 构 基 因 ) 相 邻 的 序列 称 为 调节 区 。 该 区 除了 启动 子 外 ， 还 包括 一 个 能 与 
调节 分 子 相 结合 的 操纵 基因 区 。 调 节 和 蛋白 或 可 阻止 转录 (MIE) 或 可 增加 转录 ( 正 调控 ) 
(Hoopes 和 McClure, 1987). 

操纵 子 是 指 由 共同 调节 区 控制 的 依次 排列 的 几 个 不 同 基 因 。 从 一 个 操纵 子 形成 的 
mRNA 包含 着 构成 操纵 子 〈 多 顺 反 子 ) 全 部 结构 基因 的 信息 。 它 用 于 通常 参与 在 一 个 共同 
生化 途径 中 的 所 有 基因 产物 的 协调 控制 。 


方 框 S.3 ”细菌 启动 子 

启动 子 是 DNA 片段 ， 通 常 位 于 某 些 基 因 的 上 游 ，RNA 聚合 酶 在 此 与 其 结合 以 起 始 
mRNA 的 合成 。 通 过 不 同 的 方式 可 对 细菌 启动 子 的 活性 水 平 进行 调控 。 正 调控 是 研究 得 
最 多 的 机 理 之 一 ， 它 包括 一 种 激活 剂 在 启动 子 的 -35 区 附近 的 结合 。 一 种 研究 得 非常 充 
分 的 激活 剂 是 cAMP 结合 蛋白 (CAP)， 它 是 一 种 别 构 和 蛋白， 在 结合 <AMP 后 构 形 发 生 


改变 。 有 些 蛋 白 激活 剂 的 活性 也 能 通过 共 价 修饰 来 调节 ， 例 如 NR, 蛋白 被 磷酸 化 后 ， 能 
够 激活 Ntr ( 氮 - 调 节 ) 启动 子 的 转录 。 正 调控 的 第 二 种 方式 包括 不 同 的 c 因子 与 RNA 
聚合 酶 全 酶 的 结合 。 利 用 这 类 调控 的 启动 子 含 有 特征 序列 〈 通 常 在 - 10 区 )， 而 且 认为 
转录 调节 是 通过 在 相关 o 因子 的 细胞 水 平 上 的 变化 而 发 生 的 。 


98 


Fae Re AY LR SL, EARL Hl LS 1 SRA K YB 
BTW. HBWOFTHAAK i ee, WEA — 35 区 的 上 游 到 
=-10 区 的 下 游 。 一 些 大 肠 杆 菌 操纵 子 (ga! ，ceo Mara) 有 两 个 互相 独立 的 抑制 剂 结合 
位 点 。 与 激活 剂 一 样 ， 阻 遏 物 也 是 别 构 和 蛋白 ， 在 与 它们 的 同 源 性 配 体 结合 后 构 形 发 生变 
化 ， 而 共 价 修饰 是 不 常见 的 。 其 它 尚未 很 好 理解 的 负 调 控 类 型 包括 启动 子 区 DNA 甲 基 
化 和 超 卷曲 等 。 自 体 调 控 是 另 一 种 有 趣 的 调节 机 制 。 据 此 ， 基 因 调 控 通 过 基因 自身 产物 
来 实现 。 这 类 控制 遵从 酶 反应 反馈 抑制 的 主题 ， 提 供 了 一 个 反馈 机 制 ， 通 过 该 机 制 阻 过 
物 或 激活 剂 能 够 防止 自身 的 过 量 生产 。 典 型 的 例子 包括 如 下 基因 : crp 《〈 碳 代谢 全 局 调 
控 ) 、araC(L- 阿 拉 伯 糖 操 纵 子 调节 基因 )、tirpR (Trp EWA RRA Bie) 和 
ginG (〈 氢 同化 作用 调节 基因 )。 图 5.13 给 出 了 从 大 肠 杆菌 及 其 噬菌体 中 所 选 的 部 分 启动 
子 ， 并 简 述 了 其 一 般 特 征 。 通 过 对 100 多 个 大 肠 杆菌 启动 子 的 检测 显示 出 Pribnow ff 
(mRNA 起 始 位 点 左 侧 的 SU 个 碱 基 ) 出 现 的 频率 如 下 : TgoAos T4sAcoAso T9606 这 ”人 区 
域 的 功能 被 认为 是 使 RNA 聚合 酶 定向 ， 以 致 合成 从 左 向 右 进行 ， 同 时 这 也 是 双 螺 旋 打 
开 的 地 方 。 

启动 子 区 域 的 进一步 检验 表明 : 大 多 数 启动 子 在 Pribnow 框 的 左 侧 都 存在 另外 一 个 
重要 的 保守 序列 。 这 个 6 碱 基 序列 〈 其 被 称 为 - 35 序列 并 且 有 共同 的 TTGACA 序列 ) 
被 认为 是 RNA 聚合 酶 结合 的 初始 位 点 。 弱 启动 子 与 强 启动 子 之 间 的 区 别 在 于 - 35 区 和 
-10 区 的 序列 。 

在 真 核 细胞 中 ， 启 动 子 序列 随 所 包括 的 RNA 聚合 酶 的 类 型 而 变化 。 由 RNA RAB 
开 转 录 的 编码 蛋白 质 基因 的 启动 子 通常 含有 共同 序列 TATAAA， 它 位 于 转录 起 始 位 点 
EVA 30 个 碱 基 处 。 这 个 序列 被 称 为 TATA 框 ， 大 约 80% 的 RNA 聚合 酶 开 转 录 基 因 
都 含有 这 个 序列 。 该 序列 类 似 于 原核 细胞 基因 - 10 区 ， 在 RNA 聚合 酶 开 定 位 中 起 关键 
作用 ， 而 且 它 的 去 除 会 完全 破坏 转录 起 始 。 除 了 TATA ES (IMA TATA TE), A 
10% ~15% MH RNA 聚合 酶 开 转 录 的 基因 含有 两 类 其 它 控制 序列 ， 它 们 通常 位 于 转录 
起 始 位 点 上 游 的 60 一 120 碱 基 处 : 一 种 有 共同 序列 CCAAT (CCAAT 框 )， 另 一 种 为 
GGGCG (GC 框 )。 


个 别 操纵 子 一 一 乳糖 操纵 子 〈Lac operon) 
最 早 最 充分 表征 的 操纵 子 之 一 是 乳糖 操纵 子 (Miiller-Hill，1996)。 这 个 操纵 子 的 完全 
调控 十 分 复杂 。 尽 管 如 此 ， 我 们 在 这 节 对 其 性 能 仅 提供 一 个 相当 基础 的 叙述 。 乳 糖 操纵 子 带 
有 利用 乳糖 作为 碳 源 时 所 必需 的 结构 基因 ， 如 图 5.12 所 示 。 乳 糖 是 由 葡萄 糖 和 半 乳 糖 构成 
的 双 糖 ， 是 该 操纵 子 的 主要 调节 分 子 9。 乳 糖 操纵 子 的 启动 子 和 操纵 区 分 别 是 LacP 和 /acO。 
lacl 基因 编码 阻 过 蛋白 ， 当 缺乏 乳糖 时 ， 阻 遏 蛋白 与 操纵 区 结合 ， 因 此 完全 阻碍 RNA RAM 
与 启动 子 的 结合 。 在 乳糖 存在 的 条 件 下 ， 乳 糖 操纵 子 的 表达 被 诱导 。 乳 糖 (诱导 物 ) MED 
分 子 特定 位 点 的 结合 ， 引 起 阻 遏 蛋 白 发 生变 构 ， 降 低 了 它 与 乳糖 操纵 子 DNA 结合 的 亲和力 。 
因此 ，RNA 聚合 酶 就 能 够 发 挥 其 转录 多 顺 反 子 mRNA 的 功能 ， 而 多 顺 反 子 mRNA 编码 8- 半 


@ 更 确切 地 说 ， 调 节 分 子 是 乳糖 的 异 构 体 ， 异 乳糖 ， 它 充当 诱导 物 。 这 种 物质 是 通过 8 半 乳 糖苷 酶 原 位 把 乳糖 转 
化 为 异 乳 糖 而 形成 的 。 因 此 ， 实 际 上 处 于 ac 操纵 子 控制 的 及 半 乳糖 苷 酶 还 必须 以 基本 水 平 进行 组 成 型 表达 以 作为 诱导 
序列 的 引子 。 


99 


乳糖 苷 酶 (ccZ)， 乳 糖 通 透 酶 (lacY) 和 8- 半 乳糖 苷 转 乙酰 基 酶 (acA )。 与 典型 的 操纵 子 
一 样 ， 这 些 基 因 产 物 分 担 相关 的 功能 。 通 透 酶 确保 乳糖 进入 细胞 ， 而 8- 半 乳糖 苷 酶 打开 乳糖 
的 8-1,4 糖苷 键 ， 释 放出 游离 的 单 糖 。 因 此 ， 乳 糖 操纵 子 是 一 个 负 调 控 诱 导 系 统 。 

乳糖 操纵 子 还 有 一 个 另外 的 正 调控 系统 。 正 调控 的 目的 是 防止 过 量 葡萄 糖 存 在 时 产生 能 
量 浪费 。 因 为 大 肠 杆 菌 利用 葡萄 糖 的 酶 是 组 成 型 的 ， 所 以 当 葡 萄 糖 与 乳糖 同时 存在 时 ， 生 产 
乳糖 代谢 酶 对 细胞 是 没有 意义 的 。 例 如 ， 当 大 肠 杆 菌 利 用 葡萄 糖 生 长 时 ， 胞 内 环 腺 苷 酸 | 
(cAMP) 水 平 是 低 的 ， 而 利用 其 它 碳 源 生长 时 ，cAMP 的 水 平 趋向 于 增高 。 可 以 认为 ， 
cAMP 为 乳糖 操纵 子 提供 了 正 调控 信号 。 当 cAMP 处 于 高 水 平 (表明 缺乏 葡萄 糖 ) 时 ， 其 
能 够 与 一 种 特定 蛋白 (CAP ， 降 解 物 激活 蛋白 ) 结合 ， 生 成 的 CAP-cAMP 复合 物 将 进而 结 
合 于 乳糖 操纵 子 上 的 CAP 结合 位 点 。 结 果 发 现 促进 了 更 下 游 的 DNA 螺旋 失去 稳定 ， 这 进 
而 促进 RNA 聚合 酶 的 结合 ， 因 此 提高 启动 子 的 效率 。 


乳 粳 缺乏 


TEST 


无 转录 
mRNA 


| 
MA 


lac 阻 歇 蛋 白 ( 有 活性 的 ) 


乳糖 存在 
RNA 
聚合 酶 


[er [pur [wo ez [er [me | 


mRNA mRNA mRNA 
mRNA | | | 


SAA o-- @ 阻 遏 蛋白 -乳糖 
@0e8 复合 物 (无 活性 的 ) 


图 5.12 乳糖 操纵 子 的 转录 控制 
乳糖 缺乏 时 (EA), FLW SILA FT DNA 结合 ， 阻 断 RNA 聚合 酶 对 /ac 基因 的 转 
录 。 乳 糖 存在 时 (下 图 )， 其 结合 到 乳糖 阻 遏 物 ， 形 成 一 个 不 能 与 乳糖 操纵 子 结合 的 无 活性 复合 物 。 这 样 
就 允许 RNA 聚合 酶 与 启动 子 区 结合 ， 并 转录 编码 乳糖 操纵 子 三 个 酶 的 基因 mRNAs， 这 三 个 
酶 是 : BOF FLORA (lacZ )、 通 透 酶 (lacY) 和 B- 半 乳糖 苷 转 乙 酰基 酶 (LacA ) 


转录 一 旦 开始 就 继续 进行 下 去 ， 直 到 RNA 聚合 酶 遇 到 一 段 DNA 终止 序列 〈 富 含 GC 
100 


”的 序列 之 后 由 RNA 上 的 一 连 串 U 残 基 跟 随 )， 或 者 中 止 的 RNA 聚合 酶 面临 于 转录 终止 剂 
分 子 ， 如 Rho 因子 。 尽 管 这 种 事件 一 般 都 发 生 在 操纵 子 末 端 ， 但 是 在 某 些 情况 下 它们 能 提 
前 发 生 ， 因 此 作为 一 种 调节 功能 。 例 如 : 在 新 合成 的 mRNA 中 发 卡 环 的 形成 ， 引 起 RNA 
RAMA PIE, A 80% ~ 90% 的 时 间 会 导致 酶 从 转录 泡 宫 排出 ， CGTATAATGTGTGGA 
而 终止 mRNA 的 延长 。 这 种 调控 转录 终止 的 机 制 被 称 为 “弱化 作 © GGTACGATGTACCACA 
”用 ”， 其 通过 转录 和 翻译 之 间 的 一 种 特定 的 偶 联 来 运行 。 这 类 调控 AGTAAGATACAAATCG 
的 一 个 典型 例子 是 大 肠 杆 菌 色 氨 酸 操 纵 子 。 当 色 氨 酸 〈 更 确切 地 说 人 

是 色 氨 酸 -IRNA) 的 供应 水 平 较 低 时 ，zrb 转录 产物 开始 附近 的 初 CorArGrTGTGTGCA 
期 终止 环 不 能 形成 ， 而 trp mRNA 被 完整 转录 。 相 反 ， 高 水 平 的 图 5.13 大 肠 杆 菌 及 其 
色 氮 酸 触 发 弱化 作用 机 制 ， 从 而 使 色 氨 酸 生 物 合成 基因 的 合成 终止 。 ，” 叭 菌 体 的 启动 子 片段 
5.2.2 翻译 的 控制 加 粗 的 字母 表示 共同 序列 

某 些 酶 的 遗传 控制 也 能 够 发 生 在 翻译 水 平 ， 被 称 为 转录 后 调 ie ae 机 
控 。 这 种 调控 机 制 控 制 着 一 个 完整 的 mRNA 分 子 被 翻译 的 次 数 。 wa 
已 阐明 的 第 一 个 系统 是 被 噬菌体 R17 感染 的 大 肠 杆 菌 中 一 种 酶 的 产 
生 。R17 只 编码 三 种 基因 产物 一 一 两 种 结构 蛋白 和 该 酶 的 复制 酶 。 因 为 叭 菌 体 需要 大 量 的 外 
壳 蛋 白 ，mRNA 分 子 在 外 壳 蛋 白 基 因 的 终止 密码 与 复制 酶 基因 的 AUG 密码 之 间 有 一 个 外 
壳 蛋 自 的 结合 位 点 。 当 合成 外 壳 蛋 白 时 ， 该 位 点 逐渐 被 蛋白 分 子 充满 ， 阻 塞 了 核糖 体 对 复制 
酶 的 翻译 。 当 包装 病毒 粒子 所 需 的 外 壳 粒 子 被 全 部 合成 以 后 ， 其 被 释放 出 来 以 形成 一 个 新 的 
病毒 并 使 复制 酶 翻译 接着 发 生 。 一 般 情 况 下 ， 翻 译 调 节 可 以 通过 调控 如 下 措施 之 一 来 进行 : 
(1)mRNA 稳 定性 ; (2 ) 翻 译 起 始 概率 ; (3) 和 蛋白 质 合成 的 总 速率 (Iserentant 和 Fiers ， 
1980; Stormo 等 ，1982 ) 。 

许多 编码 核糖 体 蛋 白 的 操纵 子 都 是 在 翻译 水 平 上 进行 调控 的 。 所 有 细菌 的 生长 速率 都 随 
其 生长 培养 基 组 成 而 变化 。 以 简 萄 糖 为 碳 源 的 基本 培养 基 中 , 在 37 上 下 大 肠 杆 菌 大 约 4Smin 
分 裂 一 次 ， 而 较 差 碳 源 例 如 且 氨 酸 为 碳 源 ， 则 需要 约 S00min。 在 含有 葡萄糖、 氨基 酸 、 味 
吟 、 喀 啶 、 维 生 素 和 脂肪 酸 的 营养 丰富 培养 基 中 ， 细 胞 不 必 合 成 这 些 基本 单元 ， 因 此 生长 极 
为 迅速 ， 世 代 时 间 低 于 30min。 因 为 核糖 体 对 蛋白 质 的 合成 能 力 是 有 限 的 (37 下 每 秒 钟 约 
15 个 氨基 酸 ) ， 所 以 在 不 同 的 比 生长 速率 下 〈 因 而 ， 也 有 不 同 的 蛋白 质 合 成 速率 )， 每 个 细 
胞 的 核糖 体 数目 也 随 之 变化 。 例 如 ， 以 倍增 时 间 为 25min 生长 的 大 肠 杆 菌 每 个 细胞 含有 
70000 个 核糖 体 ， 当 以 倍增 时 间 为 300min 生长 时 ， 每 个 细胞 只 含有 2000 个 核糖 体 。 进 一 步 
的 “向 下 变换 ”实验 〈 即 : 把 细 基 细胞 从 营养 丰富 培养 基 转 移 到 基本 培养 基 ) 表明 ， 每 个 细 
胞 的 核糖 体 含量 通过 和 暂停 rRNA 的 合成 而 相应 地 减少 。 

在 不 同 生 长 速率 下 , rRNA 与 核糖 体 和 T- 蛋 白质 与 核糖 体 的 恒定 比例 可 通过 两 种 反馈 机 
制 来 调节 : 第 一 种 ， 核 糖 体 被 少许 地 过 量 合成 而 且 游 离 的 非 翻 译 状 态 的 核糖 体 抑制 rRNA 
的 合成 〈 核 糖 体 反馈 调节 ); 第 二 种 ， 某 些 r~- 和 蛋白 质 抑制 编码 一 种 或 多 种 r- 蛋 白质 的 mRNA 
的 翻译 〈 翻 译 抑制 )。 研 究 表明 ， 翻 译 抑制 是 一 个 特殊 的 r- 蛋 白质 与 核糖 体 结合 位 点 附近 的 
一 个 碱 基 序列 结合 的 结果 。 另 一 方面 ， 当 翻译 抑制 不 发 生 时 ， 每 个 mRNA 都 被 完全 翻译 ， 
结果 产生 由 特定 mRNA 编码 的 每 个 r- 和 蛋白 质 的 数目 相等 。 这 种 机 制 确保 r- 蛋 白质 以 相同 速 
率 合 成 并 与 核糖 体 的 合成 相 耦 联 。 

另 一 种 重要 的 rRNA 调节 系统 是 所 谓 的 严 紧 响应 。 某 个 培养 物 在 生长 过 程 中 ， 如 果 一 
种 生长 培养 一 种 氨基 酸 被 耗 尽 ， 就 会 导致 形成 空 载 tRNA， 进 而 触发 relA 基因 的 诱导 。 

101 


relA 基因 的 产物 是 一 种 被 称 为 严 紧 因子 的 蛋白 质 〈 仅 存在 于 核糖 体 50S 亚 单 位 )， 其 负责 
ppGpp 的 生产 。ppGpp 的 生产 发 出 停止 蛋白 质 合成 的 信号 〈 因 为 氨基 酸 缺 乏 )， 进 而 触发 
rRNA 合成 的 终止 。 


【 例 5.2】 遗传 调控 网 络 : 胆固醇 合成 与 消除 (Hardie，1992; Ku, 1996) 

包括 改变 了 基因 表达 的 典型 病例 是 高 胆固醇 血 症 ， 其 表现 为 高 胆固醇 水 平 。 像 冠状 血管 
病 、 肥 胖 症 、 糖 尿 病 等 慢性 疾病 ， 都 存在 影响 途径 中 特定 基因 表达 的 代谢 成 分 。 胆 固 醇 主要 
以 极 低 密 度 脂 蛋白 (VLDL) 的 形式 进入 血液 ，VLDL 是 在 肝脏 和 小 肠 中 形成 的 。 虽 然 胆 固 
醇 合 成 需要 几 种 酶 ， 但 认为 3- 羟基 -3 甲 基 戊 二 酰 辅酶 A (HMG-CoA) 还 原 酶 是 生理 条 件 下 
AO Hil a, MEAS ok FAIS HMG-CH 还 原 酶 的 一 类 抑制 剂 。 胆 固 醇 生物 
合成 途径 及 其 主要 的 反馈 机 制 如 图 $.14 所 示 。 


乙酰 -CoA+ 乙 酰 乙酰 -CoA 


HMG-CoA 1 


甲 兰 成 酸 “ 小---~ 
本 > 


elt 六 基山 许可 > 翻译 

| : Or Dabs 
— iit — | 
胆 因 醇 。 六---= 


图 5.14 胆固醇 生物 合成 途径 及 其 调控 


FA #3 EXT HMG-CoA 还 原 酶 在 两 个 不 同 水 平 上 施加 负 调 控 。 甲 产 戊 酸 或 一 种 相关 代 ， 
谢 物 可 使 编码 HMG-CoA 还 原 酶 的 mRNA 的 翻译 速率 降低 5 倍 之 多 ， 与 此 同时 它 也 增加 
HMG-CoA 还 原 酶 的 降解 速率 。 两 种 效应 都 导致 HMG-CoA 还 原 酶 水 平 减少 ， 以 保护 细胞 
抵抗 该 途径 中 间 代谢 物 毒 性 水 平 的 累积 。 已 经 发 现 升 高 胆固醇 水 平抑 制 该 基因 的 转录 达 8 倍 
之 多 。 这 些 负 反馈 回路 对 HMG-CoA 还 原 酶 的 浓度 产生 200 倍 范围 内 的 动态 变化 。 对 这 条 
途径 更 远 的 负 调 控 是 由 抑制 作用 施加 的 ， 该 抑制 作用 产生 于 一 个 依赖 AMP 的 蛋白 激酶 对 
HMG-CoA 还 原 酶 的 磷酸 化 。 


5.3 总 体 调控 : 在 完整 细胞 水 平 上 的 调控 


KA 30 年 前 ， 乳 糖 操纵 子 作为 一 个 基因 调控 详 例 的 阐明 激 起 了 人 们 研究 其 它 操纵 子 的 
102 


”强烈 兴趣 。 这 些 努 力 导 致 很 多 新 操纵 子 的 发 现 。 对 这 些 操纵 子 系统 的 研究 和 分 析 得 出 共识 : 
这 些 操纵 子 不 是 独立 起 作用 ， 而 是 作为 一 个 高 水 平 调控 网 络 的 成 员 发 挥 作用 〈Neidhardt et 
al，1990)。 这 类 总 体 调控 是 生物 体 性 能 构成 整体 所 必需 的 部 分 ， 该 性 能 是 生物 体 维 持 在 不 
同 的 和 变化 着 的 环境 中 生长 的 能 力 。 例 如 : 从 富 营 养 培养 基 变 换 到 基本 培养 基 、 改 变 碳 源 、 
氨基 酸 限 制 、 好 氧 和 厌 氧 环境 间 的 变换 〈 仅 对 兼 性 微生物 ) 、 热 休克 以 及 磷酸 盐 、 氮 源 和 碳 
” 源 极度 匮乏 。 

总 体 控制 是 指 细胞 利用 调控 信号 控制 细胞 多 种 生理 状态 的 能 力 ， 这 些 生理 状态 产生 于 前 
一 段 所 提 到 的 对 任何 一 种 环境 变化 的 协调 响应 。 这 样 的 调控 网 络 包括 功 能 明显 无 关 而 且 在 染 
色 体 图 上 的 物理 位 置 也 不 连续 的 多 套 操纵 子 和 多 套 调节 子 。 在 一 个 总 体 调控 网 络 中 ， 各 组 操 
纵 隆 都 被 统一 协调 控制 ， 尽 管 它 们 在 物理 上 分 布 于 整个 细菌 基因 组 并 且 有 时 表现 出 完全 不 同 
的 功能 。 总 体 调 节 子 定义 为 在 一 个 总 体 调 节 网 络 中 处 于 一 个 共同 调节 蛋白 控制 下 的 一 个 操纵 
子 网 络 。 然 而 ， 即 使 简单 的 环境 变化 通常 都 会 诱导 几 个 调节 子 。 因 此 ， 和 刺激 子 用 以 指 相 应 于 
单一 环境 刺激 的 全 部 调节 子 。 为 强调 总 体 调 节 网 络 的 复杂 关系 和 重 至 性质 ， 引 和 人 术语 调控 代 
谢 子 (modulon) ， 其 定义 为 通过 共享 一 个 多 效 调 节 和 蛋白 处 于 不 同 的 特定 控制 之 下 的 一 组 操 
AFA (或 ) 调节 子 。 近 年 来 已 经 变 得 很 明显 : 整体 调控 是 原核 生物 界 的 共同 主题 。 

这 种 整体 调控 网 络 的 存在 至 少 有 两 个 理由 〈 见 图 5.15)。 第 一 ， 某 些 细 胞 过 程 所 涉及 的 
基因 多 于 一 个 单个 操纵 子 所 能 容纳 的 基因 。 以 细菌 的 翻译 机 器 为 例 ， 其 涉及 至 少 150 个 基因 
产物 的 一 组 基因 ， 包 括 : rRNA， 核 糖 体 蛋 白 ， 起 始 、 延 长 及 终止 因 了 于 ， 氢 酰基 -tRNA 合成 
酶 和 tRNAs。 如 此 为 数 众多 的 相互 关联 组 分 的 协调 控制 对 细胞 生长 的 总 效率 是 很 重要 的 ， 
然而 ， 将 所 有 这 些 基因 包含 在 一 个 操纵 子 内 几乎 是 不 可 能 的 。 第 二 ， 尽 管 有 些 基因 需要 被 独 
立 调控 ， 但 有 更 高 级 的 协调 控制 系统 也 是 至 关 重要 的 。 这 些 情 况 的 例子 常见 于 编码 分 解 代 谢 


i 


orate 转 导 物 


\ 


1 
> 调节 子 
外 界 刺 激 


fe ax 
ai | CE A LT 


| Cr 144 
: oo eer 1c 
网 络 调节 子 ”目标 响应 
1 重 白 | 
~-------- 2 ify 
(a) (b) 
图 5.15 总 体 调 控 


(a) 响应 于 环境 条 件 〈 如 温度 、pH、 营 养 状 态 ) 所 产生 的 信号 直接 或 间接 地 (通过 一 个 
或 多 个 转 导 物 ) 控制 调节 分 子 〈 调 节 器 ) 的 合成 速率 。 随 后 ， 调 节 器 控制 成 员 操纵 子 的 
蛋白 质 合成 速率 ， 这 些 蛋 白质 的 功能 会 促进 生长 或 给 予 细胞 生存 的 能 力 。 一 个 反馈 
控制 机 制 容 许 系 绒 回 到 一 个 新 的 平衡 状态 。(b) 传感器 与 调节 器 之 间 的 信号 转 导 。 
保守 区 域 用 类 似 的 阴影 (十 字形 ) 表示 


103 


酶 的 基因 中 ， 而 这 些 酶 参与 碳 源 和 能 源 的 利用 。 葡 萄 糖 是 大 多 数 细菌 的 优质 底 物 ， 当 存在 于 
生长 培养 基 时 ， 它 总 是 抑制 第 二 种 或 元 余 底 物 的 代谢 所 需 酶 的 表达 〈 分 解 代谢 抑 制 )。 然 而 
当 缺 乏 优质 底 物 时 ， 每 个 操纵 子 都 必须 有 在 其 同 源 底 物 存在 时 独立 诱导 的 能 力 。 这 些 例子 表 
明 需 要 一 个 调控 组 织 机 构 蔡 代 单 个 操纵 子 的 独立 调控 。 

据 估 计 ， 细 菌 细胞 已 演化 形成 了 几 百 个 多 基因 系统 ， 其 中 至 今 没 有 几 个 已 被 深入 研究 。 
表 53.2 给 出 一 些 来 自 各 种 细菌 的 例子 ， 按 照 细胞 对 营养 限制 、 氧 化 还 原 变 化 及 不 利 环境 条 件 
的 响应 以 三 大 类 条 目 整理 列 出 。 很 显然 ， 细 菌 已 演变 形成 了 各 种 各 样 的 总 体 调 控 机 理 ， 对 这 
些 机 理 刚 刚 开 始 进行 前 述 。 毫 不 意外 ， 这 种 调控 网 络 的 许多 组 成 部 分 是 借用 于 操纵 子 的 调节 
系统 ， 例 如 蛋白 阻 遇 物 、 激 活 物 或 e 因子 。 热 休克 和 孢子 形成 系统 利用 5 因子 为 RNA 聚合 
酶 重新 编制 程序 ， 以 便 让 它 识别 成 员 操 纵 子 的 启动 子 。SOS、 氧 化 损伤 和 厌 氧 电子 传递 系统 
AAS AD /激活 物 ， 以 识别 为 组 成 型 操纵 子 调控 区 所 共用 的 一 段 特定 序 列 。 另 一 方面 ， 
作为 最 普遍 最 难 理解 的 操纵 子 之 一 的 严 紧 控制 系统 ， 其 没有 明显 的 蛋白 调节 剂 ， 而 是 利用 核 
HBS FR (ppGpp) 作为 总 体 调节 分 子 。 


表 5.2 细菌 多 基因 调节 系统 


lac,mal,gal,ara,tna,dsd ,hut 


cya : 腺 苷 酸 环 化 酶 “| 等 分 解 代谢 所 含 基因 


氨基 酸 或 ATP RelA 或 SpoT :编码 | 核糖 体 及 蛋白 翻译 和 生物 合成 酶 
(p)ppGpp 代谢 的 酶 系 | 基因 (>200) 
氢 GinB :和 蛋白质 Pr glnA, hut 等 
glnD: UR/UT fi 
ginG: & AJR NR, 
ginL: & AUR NRyg 
a Nif 系统 oe we (A(R) 包括 调控 氨 的 多 基因 编码 固氮 酶 的 多 基因 
杆菌 属 、 产 气 
AS 
BE PhoB : PhoB 的 活性 PhoA 及 其 它 
调节 子 
PhoU: 磷 转运 的 传 
感 器 
饥饿 SpoOA : 激活 剂 控制 钨 子 形成 的 基因 (>100) 
SpoOF :调节 子 
饥饿 或 抑制 未 知 上 百 个 基因 
能 量 代 谢 
供 氧 ArcA : iA 需 氧 代谢 
ArcB: ArcA 的 活性 
调节 子 
非 O; 电子 受 体 far: 编码 激活 剂 硝酸 还 原 酶 和 厌 氧 呼吸 酶 系 的 基 
因 


未 知 


电子 受 体 缺 失 发 酵 酶 系 基因 (> 之 20) 


104 


续 表 


紫外 或 其 它 DNA 损 


伤 
节 子 
DNA 烷 化 Ada : 激活 剂 去 掉 DNA 上 烷 基 的 四 个 基因 
HO, 或 类 似 氧 化 剂 OxyR : ia &A 约 12 个 氧化 防护 基因 
升 高 温度 HtpR o® 约 20 个 用 于 大 分 子 合成 加 工 与 
降解 的 基因 
降低 温度 未 知 一 些 用 于 大 分 子 合 成 的 基因 
高 渗透 EnvZ :传感器 ( 膜 ) 孔 蛋白 基因 


ompR :DNA 结合 


注 : 摘自 Neidhardt，1987; Neidhardt et al，1990。 


多 基因 系统 的 一 个 重要 方面 是 处 理 信 息 的 能 力 ， 这 是 常 由 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 来 
执行 的 一 种 功能 。 细 菌 对 环境 刺激 响应 的 遗传 及 生化 分 析 表 明 ， 响 应 于 这 种 刺激 的 信号 转 
导 常 常 是 通过 两 类 和 蛋白质 对 之 间 的 通讯 而 发 生 的 。 每 对 蛋白 都 由 传感器 蛋白 和 调节 器 和 蛋 
自 组 成 ， 传 感 器 蛋白 能 够 检测 环境 的 变化 进而 将 信号 传送 到 与 其 合作 的 调节 器 蛋白 。 随 后 受 
感应 的 调节 器 蛋白 将 影响 〈 正 面 地 或 负面 地 ) 某 些 操纵 子 组 的 转录 起 始 。 每 类 信号 转 导 蛋白 
成 员 之 间 已 观察 到 相当 大 的 同 源 性 。 在 多 数 情况 下 ， 传 感 器 蛋白 C- 末 端的 保守 区 域 延 伸 到 
超过 250 个 氨基 酸 ， 而 调节 蛋白 N- 末 端的 保守 区 域 延 伸 到 超过 120 个 氨基 酸 [ 见 图 
5.15 (b)]. 

磷酸 化 作用 的 信号 转 导 

到 20 世纪 80 年 代 中 期 ， 已 很 清楚 许多 多 基因 系统 含有 一 个 蛋白 质 对 ， 其 组 成 分 别 属于 
两 种 蛋白 质 家 族 (Wanner，1992)。 在 一 个 典型 的 传感器 -调节 器 两 组 分 调节 系统 中 ， 跨 膜 
结构 域 把 传感器 蛋白 分 成 周 质 空间 域 ， 周 质 空间 域 感 受 特定 的 环境 刺激 ， 随 后 诱导 其 C- 末 
端 自动 磷酸 化 【比较 图 5.15 (b)]j。 在 第 二 步 中 ， 磷 酸 基 团 被 传递 到 相应 调节 器 的 N- 末 端 。 
第 一 个 蛋白 质 家 族 的 成 员 是 蛋白 激酶 (PKs)， 它 能 够 将 ATP 的 磷酸 基 团 转移 到 该 激酶 的 组 
氨 酸 残 基 而 被 磷酸 化 。 在 第 二 步 ， 这 些 磷 酰基 基 团 又 被 转移 到 称 为 磷酸 化 响应 调节 器 
(PRRs) 的 第 二 个 蛋白 质 家 族 成 员 的 天 冬 氢 酸 残 基 上 。 最 后 一 步 ， 该 磷 酰 基 基 团 可 以 通过 水 
解 作 用 从 PRR- 磷 酸 天 冬 氨 酸 残 基 上 除去 。 整 个 磷酸 化 过 程 可 归纳 如 下 

ATP + PK-His —~ADP + PK-His-P 
PK-His-P + PRR-Asp ——>PK-His + PRR-Asp-P 
PRR-His-P ——>PRR-Asp + P; 

在 一 个 典型 的 细菌 中 ， 估 计 可 能 存在 50 种 这 样 的 转 导 系统 。 已 经 发 现 通过 磷酸 化 作用 
产生 信和 号 在 细菌 界 广泛 存在 ， 调 挖 着 诸如 基因 表达 的 调控 、 趋 药性 (chemotaxis) 或 发 育 途 
径 等 各 种 各 样 的 调控 功能 〈 见 表 5$.3)。 组 氢 酸 蛋白 激酶 家 族 成 员 具 有 保守 的 羧基 未 端 ， 而 
响应 调节 器 蛋白 则 在 氨基 末端 附近 具有 大 约 100 个 氨基 酸 残 基 的 保守 序列 。 这 种 保守 序列 的 
重要 意义 在 于 ， 在 一 些 情 况 下 ， 可 以 允许 不 同系 统 之 间 的 相互 作用 (对话 )。 例 如 : 在 

105 


PhoR 突变 株 中 《〈《 即 带 有 已 破坏 的 PhoR 基因 的 细胞 ， 因 此 ， 缺 乏 PhoR 活性 ) ，PhoM 基 
因 的 产物 (显然 是 另 一 种 PK ) 在 对 PhoB(RRP) 的 修饰 中 可 部 分 替代 有 缺陷 的 PhoR 。 


表 5.3 同 源 磷酸 基 转 移 酶 的 例子 


磷 调 节 子 (Pho) 


NRI NR] ( 膜 ) 孔 蛋白 调节 子 
PhoR PhoB 
fe SF MR (Arc) ArcB ArcA 


(Omp) 
注 : 摘自 Neidhardt et al, 1990. 


响应 调节 子 


氮 调 节 子 (Ntr) OmpR 


孢子 形成 (Spo) SpoOA/SpoOF 


作为 这 种 对 话 的 结果 ， 一 种 适应 性 响应 的 活化 作用 可 容许 细胞 通过 交叉 磷酸 化 而 部 分 地 激活 
一 个 同 源 系统 。 

对 于 真 核 细胞 的 基因 调控 ， 磷 酸化 作用 是 一 种 更 可 取 的 调控 机 制 。 存 在 于 哺乳 动物 细胞 
质 中 的 蛋白 磷酸 酶 已 被 分 成 为 两 种 类 型 。 第 一 类 磷酸 酶 能 够 被 纳 摩 尔 浓度 的 两 种 热 稳定 性 蛋 
白 〈 称 为 抑制 剂 1 和 抑制 剂 2) 所 抑制 ， 而 且 这 两 种 蛋白 能 够 优先 使 磁 酸化 酶 激酶 的 8B- 亚 基 
脱 磷酸 。 另 一 方面 ， 第 二 种 类 和 蛋白 磷酸 酶 不 受 抑制 剂 1 和 抑制 剂 2 的 影响 ， 能 够 优先 使 磷酸 
化 酶 激酶 的 c- 亚 基 脱 磷酸 。 各 种 蛋 日 激酶 已 被 证 实 是 磷酸 化 酶 ， 它 们 在 哺乳 动物 的 骨骼 肌 
和 肝脏 中 ， 参 与 糖 原 分 解 、 糖 原 合成 、 糖 酵 解 、 糖 原 异 生 、 芳 香 族 氨基 酸 降 解 、 脂 肪 酸 合 
成 、 胆 固 醇 的 合成 及 蛋 白 质 的 合成 过 程 的 调节 作用 。 

尽管 在 调控 网 络 中 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 是 非常 重要 的 ， 但 是 不 同 操纵 子 组 被 协调 的 
方式 是 多 种 多 样 的 。 例 如 ， 大 肠 杆菌 对 热 休 克 的 响应 是 被 RNA 聚合 酶 的 一 种 oP A EM 
胞 内 的 水 平 所 控制 ，c” 水 平 的 升 高 会 诱导 一 组 约 20 个 基因 。 能 够 诱导 大 约 20 个 DNA 修补 
蛋白 的 SOS 系统 ， 它 是 通过 成 员 操纵 子 阻 巡 物 的 蛋白 质 分 解 破裂 所 诱导 的 。 在 另 一 种 机 制 
中 ， 一 组 基因 〈 约 含 12 个 ) 被 氧化 损伤 所 诱导 ， 诱 导 作 用 是 通过 正 调节 器 OxyR 的 活化 而 
促成 的 。 


【 例 5.3】 交叉 调控 : Pho 调节 子 

交叉 调控 在 中 心 碳 代谢 途径 的 控制 中 可 能 特别 重要 。 交 叉 调 控 最 著名 的 例子 是 大 肠 杆菌 
的 磷酸 (Pho) 调节 子 (Lee et al, 1990; shin 和 Seo, 1990; Wanner 和 wilmes-Tiesen- 
berg, 1992). Ki F HIE PhoA 基因 (编码 细菌 碱 性 磷酸 酶 ，BAP) 、 编 码 磷 源 降解 和 吸 
收 用 酶 的 几 个 其 它 基 因 。 胞 外 P, 是 细胞 生长 的 优先 磷 源 ， 并 通过 PstSCAB 系统 被 吸收 结 
合 。 然 后 胞 内 P; 在 中 心 代 谢 途 径 中 经 过 几 条 不 同 的 途径 形成 ATP 〈 见 图 $.16)。 


中 心 途径 


糖 酵 解 
经 吸收 进入 Pta-AckA 
一 PstSCADB TCA 


AIP 合 成 酶 


图 5.16 P; 吸收 与 同化 为 ATP 
P; 分 别 经 糖 酵 解 途径 中 的 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 和 磷酸 甘油 酸 激酶 、 经 磷酸 转 乙酰 基 酶 和 
乙酸 激酶 〈(Pta-AckA)、 经 有 氧 生长 条 件 下 TCA 循环 中 的 琥珀 酰 辅 酶 A 合成 酶 
或 经 FiFu-ATP 合成 酶 作用 形成 ATP 


106 


作用 于 Pho 调节 子 的 3 种 控制 方式 如 图 5.17 所 示 ， 其 中 两 种 包括 交叉 调控 。 一 种 控制 
利用 传感器 CreC， 由 葡萄 糖 所 诱导 。 第 二 种 控制 是 通过 丙酮 酸 上 的 生长 而 诱导 。 后 一 种 调 
控 方 式 或 许 是 探测 乙酰 磷酸 的 水 平 并 激活 PhoB ， 该 激活 过 程 通过 一 种 未 知 的 传感器 或 直接 
由 乙酰 磷酸 或 通过 磷酸 激酶 来 完成 。 因 此 ，Pho 调节 子 的 控制 经 由 乙酰 磷酸 与 Pta-AckA & 
径 相 联系 。 在 葡萄 糖 上 生长 时 ， 乙 酰 磷酸 由 Pta 产生 并 被 AckA 进一步 利用 ， 对 于 在 乙酸 或 
”丙酮 酸 培 养 基 上 生长 ， 情 况 也 确实 是 这 样 。 已 经 证 明 ， 在 丙酮 酸 、 前 体 物 ， 或 乙酰 辅酶 A 
存在 条 件 下 ，Pho 调节 子 被 诱导 。 此 外 ， 在 pta Mack 缺失 突变 菌株 内 ， 经 由 乙酰 磷酸 的 调 
控 机 制 则 被 完全 破坏 。 


pe 信号 传感器 De. bie om 
PstSCAB 转运 蛋 白 (P; ioe 
中 心 途径 
[ATP] 
Pta-Ack 途 径 [乙酰 磷酸 ] 


磷酸 转 乙 酰 酶 (PTA), 乙 酸 激酶 (ACK) 途 径 


P 


CoA ADP ATP 


图 $.17 Pho 调节 子 的 控制 
虚线 箭头 表示 伙伴 蛋白 之 间 的 相互 作用 ， 而 实 线 箭 头 表示 非 伙伴 蛋白 之 间 交 叉 调 控 


5.4 代谢 网 络 的 调控 


代谢 调控 的 实质 就 是 作为 调控 变量 的 反应 速率 对 各 种 信号 的 响应 〈 这 些 信 号 通常 包括 代 
谢 物 、 效 应 物 及 其 它 调节 分 子 的 浓度 )。 这 种 控制 系统 的 基本 性 质 是 其 实际 输出 仅 由 信和 号 决 
定 ， 因 而 是 与 该 控制 系统 各 个 组 分 的 性 质 无 关 的 。 与 控制 液体 流动 的 一 个 阀门 类 似 ， 一 个 反 
饥 调 节 的 酶 反应 能 力 大 于 最 大 的 可 能 的 通 量 ， 而 通 量 本 身 仅 由 信号 决定 。 虽 然 酶 和 信和 号 的 总 
量 分 别 决定 了 最 大 通 量 及 实际 通 量 的 大 小 ， 但 该 控制 的 动态 性 质 是 特定 调控 机 制 的 函数 ， 如 
下 述 讨论 。 

在 由 多 于 一 种 酶 构成 的 一 条 代谢 途径 中 ， 途 径 通 量 是 由 途径 中 各 个 酶 的 动力 学 及 调控 来 
REN. MEP ORR (UR ATCA 循环 ) 中 ， 虽 然 这 些 酶 不 是 以 物理 方式 组 
织 的 ， 但 它们 在 一 个 化 学 框架 中 被 高 度 组 织 起 来 。 在 一 些 情况 下 ， 途 径 通 量 由 存在 的 一 个 酶 
的 总 量 所 控制 ， 该 酶 量 低 得 足以 将 其 定 为 一 个 速率 控制 步骤 OLS 11 章 )。 在 另 一 些 情 况 
下 ， 途 径 通 量 控制 分 布 在 几 个 酶 当中 ， 而 途径 中 其 它 反应 进行 得 很 快 并 变 得 由 底 物 或 辅 因 子 
浓度 所 限制 。 在 这 种 代谢 框架 中 ， 催 化 活动 不 是 酶 的 惟一 功能 ， 因 为 它们 在 途径 通 量 的 调控 
中 也 起 重要 作用 。 尽 管 不 必 在 物理 上 接触 ， 但 每 个 酶 可 通过 特定 的 化 学 信号 〈 如 底 物 、 产 物 

107 


或 特定 调节 物 如 ATP，NADH 等 的 浓度 ) 向 其 报告 代谢 途径 的 状态 ， 这 些 化 学 信号 控制 酶 和 


反应 速率 进而 扩大 到 控制 途径 通 量 。 在 一 个 功能 性 细胞 中 ， 反 应 速率 必须 被 精确 调整 。 因 


此 ， 很 容易 把 别 构 酶 看 做 动态 实体 ， 其 中 酶 的 结构 对 在 底 物 水 平和 别 构 激活 剂 或 抑制 剂 水 平 ， 


的 相当 小 的 变化 很 敏感 。 这 些 结构 改变 是 通过 改变 酶 与 其 底 物 的 亲和力 而 影响 酶 活性 的 ， 这 
显著 不 同 于 通过 抑制 剂 的 共 价 结合 而 引起 酶 的 失 活 。 

催化 非 平衡 反应 的 酶 的 识别 为 网 络 的 调节 控制 提供 线索 。 理 解 代谢 控制 的 困难 之 一 在 于 
调节 酶 的 确定 ， 因 为 在 某 种 程度 上 ， 一 个 途径 中 所 有 酶 的 活性 都 需 与 通过 途径 的 通 量 改变 相 
协调 。 于 是 ， 关 键 问题 就 变 成 是 否 存在 一 种 酶 ， 其 首先 响应 于 原始 代谢 信号 (ESR), MK 
而 在 剩余 酶 〈 从 属 酶 ) 的 活性 中 启动 次 级 响应 。 用 于 识别 调节 酶 而 发 展 的 一 系列 判 据 简 述 
如 下 。 

© 这 种 酶 应 当 催 化 非 平衡 〈 不 可 逆 ) 反应 。 一 个 “ 非 平衡 酶 ”具有 低 的 催化 活性 ， 因 此 
其 能 限制 通过 途径 的 通 量 。 另 一 方面 ， 一 个 “平衡 酶 ”被 认为 是 过 量 的， 而 且 通 量 对 其 扰动 
不 会 显著 地 产生 啊 应 。 

e@ 这 种 酶 应 当 具 有 调节 人 性质， 例如 别 构 位 点 。 

也 可 能 没有 单独 的 调节 酶 存在 ， 但 可 以 说 一 条 途径 中 几 种 酶 的 活性 是 先后 响应 于 变化 着 
的 条 件 和 随 之 引起 的 代谢 信号 而 改变 。 

确立 代谢 通 量 J 和 一 条 途径 中 某 种 酶 的 量 〈 或 活性 ) ce 之 间 的 关系 是 很 重要 的 ， 虽 然 
确切 的 关系 取决 于 很 多 参数 ， 包 括 途 径 酶 的 本 征 动 力学 和 产物 及 别 构 调节 物 的 影响 ， 但 在 大 
多 数 情况 下 ， 已 经 提 到 一 个 如 下 所 示 的 通用 双 曲 线 关 系 式 : 


Tienes 


iar, (5.14) 


式 中 ，J 为 观测 到 的 通 量 ; Jamax 为 无 限 多 的 酶 存在 时 所 得 到 的 通 量 ; ce 为 对 特定 酶 可 分 
析 的 最 大 体外 活性 ; K 为 一 个 常数 ， 定 义 为 当 了 = Jias 包 时 的 ce 值 (5 Kn RW). Ast, 
当 活性 小 时 ， 途 径 通 量 随 酶 的 可 利用 率 线 性 增加 ， 但 最 终 途 径 通 量 将 被 其 它 因素 限 制 ， 例 如 
底 物 可 利用 率 ， 途 径 中 另 一 个 酶 的 活性 ， 或 一 个 抑制 性 产物 的 累积 。 


方 框 5.4，” 真 核 生物 相 对 于 原核 生物 的 调节 

真 核 生物 与 原核 生物 的 调控 系统 是 非常 不 同 的 ， 这 是 它们 的 不 同 “生活 方式 ”的 反 
上 映 。 虽 然 原 核 细胞 与 真 核 细胞 所 具有 的 很 多 功能 是 十 分 类 似 的 ， 但 它们 在 若干 结构 的 及 
遗传 的 性 能 方面 有 区 别 。 原 核 细 胞 通常 是 自由 生活 的 单 细 胞 生物 ， 在 环境 条 件 适 宜 且 营 
养 充 足 的 情况 下 ， 它 们 可 进行 无 限制 的 生长 和 分 裂 。 原 核 生物 系统 的 调节 是 为 了 适合 最 
大 生长 而 营养 利用 尽 可 能 高 效 。 由 于 没有 核 ， 原 核 生 物 的 DNA 连续 暴露 到 来 自 细胞 质 
的 调节 信号 ; 因此 蛋白 质 合 成 的 开 - 关 控制 常 在 转录 水 平 上 来 完成 。 另 一 方面 ， 真 核 生物 


通常 是 多 细胞 的 (酵母 、 藻 类 和 原生 动物 门 除外 ) 更 大 及 结构 上 更 复杂 的 生物 (Towle， 
1995)。 细 胞 分 化 尤其 需要 特定 的 调控 类 型 ， 因 为 不 同 组 织 的 细胞 有 不 同 的 需求 (Hofes- 
tadt 等 ，1996; krauss 和 Quant，1996)。 例 如 ， 在 一 个 豚 胎 中 ， 一 个 细胞 不 仅 需 产生 新 
一 代 细 胞 ， 而 且 也 需 经 历 许多 相当 大 的 形态 的 和 生化 的 变化 ， 并 需 无 限 维持 这 些 变化 。 
这 类 永久 的 开关 需要 在 这 类 细胞 中 运用 其 它 的 调控 策略 ， 例 如 基因 丢失 、 基 因 失 活 、 基 
因 扩 增 和 基因 重 排 。 

哺乳 动物 代谢 可 通过 营养 底 物 和 激素 在 遗传 水 平 进行 调控 。 第 一 个 清楚 的 证 据 是 通 


108 


过 如 下 发 现 而 提供 的 : 色 氢 酸 和 肾上腺 糖 皮质 激素 调节 肝脏 中 色 氢 酸 二 氧化 酶 的 活性 。 
当 存 在 的 氨基 酸 超 过 和 蛋白质 合成 需要 时 ， 该 酶 启动 了 色 氮 酸 的 利用 。 这 条 途径 对 葡萄 糖 
异 生 中 的 色 氢 酸 利用 及 含 烟 酰胺 辅助 因子 的 内 源 性 合成 是 必 不 可 少 的 。 与 细菌 中 乳糖 利 
用 的 迅速 增加 相 比 ， 色 氨 酸 二 氧化 酶 的 研究 表明 类 固 醇 〈 例 如 皮质 醇 ) 需要 8 一 12h 才能 
达到 稳 态 酶 和 相应 的 mRNA 水 平 。 这 是 一 个 普遍 现象 : 细菌 中 的 酶 诱导 在 30 一 40min 
达到 最 高 水 平 ， 而 在 哺乳 动物 中 此 过 程 需 几 个 小 时 ， 有 时 甚至 需要 几 天 才能 完成 。 

单 细 胞 和 多 细胞 生物 体 显 著 差 别 详 见 表 5.4， 这 代表 着 在 基因 调控 理解 中 的 一 个 重 
要 方面 。 根 据 这 两 种 基因 的 大 小 ，lac 操纵 子 可 在 2min 之 内 转录 ， 而 色 氢 酸 二 氧化 酶 基 
因 需 要 约 6min 才能 完成 一 轮转 录 。 这 种 时 间 差 别 与 转录 起 始 速率 的 显著 差别 相 比 仍然 
是 小 的 ， 因 此 ， 转 录 起 始 就 变 成 速率 控制 步 又。 此 外 ， 原 核 生 物 的 翻译 效率 比 真 核 生物 
高 约 3 倍 。 这 些 影 响 ， 连 同比 较 如 下 事实 : 一 个 生长 中 的 大 肠 杆 菌 细胞 的 典型 细胞 体积 
约 lm3， 一 个 典型 的 肝 细 胞 体积 约 为 11000km3， 从 而 使 得 原核 细胞 可 非常 快 地 达到 高 
的 催化 剂 浓度 。 与 相对 较 长 的 哺乳 动物 mRNAs 的 半衰期 相 比 (其 范围 是 20min 一 
100h), 40K mRNAs 的 半衰期 一 般 只 有 1 一 3min。 细 菌 中 大 部 分 蛋白 是 相对 稳定 的 ， 但 
是 细胞 分 化 的 结果 使 得 每 个 细胞 内 的 蛋白 被 稀释 了 。 因 此 ， 细 胞 中 实际 的 蛋白 质 半 衰 期 
与 世代 时 间 相 一 致 ， 介 于 20 一 60min 的 范围 。 总 的 说 来 ， 遗 传 控制 机 制 本 质 上 更 适合 于 
原核 生物 ， 人 允许 它们 迅速 地 调节 酶 浓度 以 满足 变化 着 的 细胞 要 求 。 

如 前 所 述 ， 真 核 生 物 与 原核 生物 系统 之 间 存 在 一 些 基本 的 差别 。 关 于 两 个 系统 之 间 
的 遗传 学 及 调控 方面 的 一 些 区 别 概 括 如 下 。 

@ 真 核 细 胞 仅 将 mRNA 翻译 成 一 条 单独 的 多 肽 链 ， 因 而 排除 在 原核 细胞 中 常见 的 
多 基因 操纵 子 的 存在 。 

e@ 和 原核 细胞 DNA 不 同 ， 真 核 细胞 DNA 只 有 一 小 部 分 是 裸露 的 。 其 与 组 蛋白 大 量 
结合 以 形成 染色 质 。 

e@ 高 等 真 核 细胞 大 部 分 DNA 序列 由 不 被 翻译 的 区 域 (内 含 子 ) Am. 

@ 真 核 细 胞 具有 以 可 控 的 方式 重新 排列 DNA 片段 的 机 制 ， 因 而 允许 它们 根据 需要 
而 增加 基因 的 拷贝 数 。 

@ 原核 生物 的 转录 调节 区 很 小 ， 靠 近 并 常 在 启动 子 上 游 ， 蛋 白 与 这 些 位 点 的 结合 直 
接 刺激 RNA 聚合 酶 的 结合 。 相 对 地 ， 相 应 的 真 核 细 胞 转录 调节 区 大 很 多 ， 且 与 启动 子 
相距 约 达 几 百 个 碱 基 。 虽 然 它 们 结合 蛋白 ， 但 由 于 特定 的 限制 ， 它 们 不 能 同时 与 启动 子 
发 生 相 互 作 用 。 

@ 在 真 核 细胞 中 ，RNA 在 细胞 核 中 合成 ， 并 且 必 须 穿 过 核 膜 被 运输 到 细胞 质 后 才 被 
翻译 。 

总 之 ， 真 核 细 胞 中 mRNA 的 生产 比 在 原核 细胞 中 要 复杂 得 多 ， 因 此 可 以 想象 有 许 
多 调节 点 。 例 如 ， 启 动 子 可 利用 率 可 由 染色 质 状 态 、 转 录 因 子 的 活性 或 浓度 ， 或 强化 因 
子 可 利用 率 来 确定 。 来 自 初 级 转录 的 mRNA 的 生产 可 以 通过 拼接 及 多 聚 腺 苷 酸化 的 控 
制 来 进行 调控 。mRNA 寿命 的 调控 在 原核 细胞 很 少 遇 到 ， 因 为 频繁 需要 相当 快 地 打开 或 
关闭 所 调控 的 基因 产物 的 合成 。 另 一 方面 ， 通 常 有 更 多 的 时 间 去 应 答 的 真 核 细 胞 当 大 量 
特定 蛋白 需要 时 可 使 用 延长 mRNA 寿命 的 战略 。 


109 


5.4 大 肠 杆菌 和 哺乳 动物 细胞 间 转 录 和 翻译 时 间 尺 度 的 比较 


ise 10min~! 


2500nt*min~! 3000nt* min! 
RNA 加 工 大 约 10min 
核 ( 内 )RNA tir 大 约 10min 
核 质 转运 大 约 10min 
mRNA fi, 1~3min 1~20h 
mRNA 翻译 2700nt* min“! 720nt'min 1 


EAR tin 
iE: nt=KRR, 


对 于 处 于 “基础 ”水 平 的 控制 用 酶 ， 酶 浓度 的 小 的 增加 可 能 使 通过 途径 的 通 量 线性 增 
加 。 然 而 ， 酶 浓度 的 增加 超过 某 一 水 平 则 是 无 效 的 ， 因 此 ， 为 了 优化 及 协调 通 量 就 需 考虑 其 
它 因素 。 根 据 经 验 ， 在 许多 情况 下 ， 将 某 特定 酶 的 转录 水 平 增 加 10 倍 以 上 是 不 实际 的 。 从 
细胞 经 济 观 点 来 看 ， 这 是 十 分 重要 的 ， 因 为 细胞 的 资源 是 有 限 的 ， 而 且 在 许多 途径 中 存在 着 
相同 前 体 库 竞争 要 求 。 例 如 ， 对 某 一 结构 单元 的 需求 突然 下 降 ， 经 济 的 办 法 就 是 将 产生 这 种 
特定 单 体 的 酶 水 平和 酶 活性 两 者 都 减少 。 对 在 基本 培养 基 中 生长 的 细胞 ， 通 过 利用 放射 性 标 
记 的 底 物 可 以 表明 ， 在 氨基 酸 加 入 后 的 几 秒 钟 内 ， 所 有 流向 其 生物 合成 的 碳 流 停 止 了 。 这 些 
途径 通 量 控制 问题 将 在 第 11 章 讨论 代谢 控制 分 析 时 再 次 遇 到 。 
5.4.1 ”分 支点 分 类 

通常 ， 在 生物 过 程 中 很 差 的 产品 得 率 归 因 于 由 酶 水 平 或 酶 活性 而 引起 的 限制 。 虽 然 产品 
分 支 处 的 酶 的 总 活性 决定 着 生产 能 力 ， 然 而 ， 产 品 得 率 是 在 中 间 分 支点 处 通 量 分 配 比 的 函 
数 。 中 间 分 支点 又 称 为 节点 ， 它 是 代谢 网 络 中 一 个 反应 序列 分 叉 成 两 条 或 更 多 条 不 同 途径 的 
一 些 点 。 例 如 ， 图 5.18 中 产物 P; 的 得 率 取决 于 在 节点 工 处 的 通 量 分配 比 ， 而 不 是 取决 于 TI 
到 P; 分 支 本 身 的 活性 。 因 为 合成 初级 代谢 物 的 途径 通常 能 够 支撑 相当 的 通 量 ， 代 谢 工 程 的 
努力 应 集中 于 在 所 选择 的 代谢 分 支点 处 改变 通 量 的 分 配 以 提高 产物 收 率 。 


20 一 60min 


2 一 100h 


图 5.18 代谢 节点 
(a) 柔性 或 弱 刚 性 节点 ; (b) 强 刚性 节点 
虚线 表明 〈 负 或 正 ) 反馈 控制 机 制 


虽然 一 个 网 络 可 由 大 量 的 节点 组 成 ， 一 般 相 信 在 相当 少 的 节点 处 的 分 配 比 实际 上 影响 产 
物 得 率 。 这 些 节点 称 为 主 节 点 。 虽 然 由 不 同 生物 体 调节 通 量 所 用 的 控制 结构 显著 地 变化 着 ， 
然而 基于 其 分 支点 刚性 有 可 能 将 节点 分 成 三 大 类 (Vallino, 1991). 

@ 和 柔性 节点 (对 调节 显著 亚 敏 感 ) : 在 此 类 节点 处 通 量 分 配 响应 于 细胞 代谢 需求 ， 将 容 
易 发 生 改 变 。 这 些 节 点 通过 有 类 似 的 底 物 亲和力 和 类 似 的 反应 速率 的 竞争 性 酶 来 表征 。 由 定 

110 


， 义 ， 和 柔性 节点 将 不 限制 产物 得 率 ， 因 为 无 论 何 时 只 要 需要 ， 任 何 分 支 可 以 得 到 100% 的 分 
配 比 。 

@ 弱 刚 性 节点 〈 对 调节 适度 敏感 ): 在 这 些 节点 处 通 量 分 配 由 一 个 支 路 控制 。 起 支配 作 
用 的 酶 通过 具有 高 的 比 活性 和 /或 底 物 亲 和 力 以 及 与 没有 反馈 抑制 一 起 来 进行 表征 。 

@ 强 刚性 节点 〈 对 调节 高 度 敏感 ): 在 这 些 节点 处 的 通 量 分 配 在 1 个 或 多 个 支 路 ， 通 过 
反馈 控制 与 酶 转移 活化 的 结合 而 被 严格 控制 ， 该 转移 活化 是 通过 来 自 一 条 分 支 途径 的 代谢 物 
而 进行 的 。 

在 一 个 柔性 节点 ， 通 量 分 配 比 仅 取 决 于 细胞 对 两 个 产物 P! 和 P; 的 需求 [ 见 图 5.18 
(a)]。 弱 刚性 节点 与 柔性 节点 类 似 ， 但 有 如 下 不 同 : 一 条 分 支 途 径 比 其 它 一 条 (一 些 ) 分 支 
途径 呈现 显著 优势 。 这 是 由 于 相应 的 酶 对 共同 代谢 物 有 更 大 的 亲和力 和 /或 比 下 一 级 分 支 途 
径 的 酶 有 更 大 的 总 活性 。 在 这 种 情况 下 ， 完 全 解除 对 下 一 级 支 路 的 调控 对 通 量 将 不 会 有 显著 
影响 。 另 一 方面 ， 如 果 优 势 分 支 途 径 的 活性 被 减弱 ， 这 会 显著 增加 通过 下 一 级 分 支 途径 的 通 
量 。 一 个 强 刚性 节点 是 由 终端 产物 激活 或 抑制 高 度 调控 ， 如 图 5.18 (b) 所 示 。 在 此 例 中 ， 
每 个 产物 代谢 物 作为 竞争 分 支 途径 的 一 个 激活 剂 ， 同 时 又 作为 其 自己 形成 的 一 个 抑制 剂 。 一 
个 刚性 节点 对 途径 产物 得 率 能 有 控制 性 的 影响 ， 它 的 解除 调控 比 酶 活性 减弱 可 能 更 复杂 。 

让 我 们 假定 所 希望 的 目标 是 增加 Pi 分 支 途 径 通 量 分 配 比 ， 而 且 在 激活 剂 P 不 存在 时 ， 
Pi; 的 稳 态 浓度 高 得 足以 抑制 它 本 身 的 合成 。 在 这 种 情况 下 ， 增 加 Pi 分 支 途 径 的 分 配 比 会 要 
求 去 P; 的 通 量 被 减弱 。 然 而 ， 在 强 刚性 节点 ， 这 种 方法 将 导致 低 水 平 的 Pz， 所 以 Pi 分 支 途 
径 将 会 由 于 P; 而 失去 其 活化 作用 。 简 而 言 之 ， 一 条 分 支 途径 的 减弱 导致 竞争 分 支 途径 的 减 
弱 〈 整 个 节点 的 误 弱 ) ， 结 果 是 每 条 分 支 途径 的 分 配 比 相 对 来 说 没有 改变 。 

因为 复杂 的 及 多 样 的 控制 结构 和 酶 动力 学 (Srere，1994) ， 代 谢 网 络 并 不 总 是 呈现 上 述 
分 类 所 包含 的 通 量 分 配 的 双重 响应 。 因 此 ， 一 个 强 刚性 节点 的 一 条 分 支 途径 的 减弱 可 能 仅 导 
致 竞争 分 支 途径 的 部 分 减弱 ， 以 致 产物 得 率 的 改进 可 以 在 一 个 含有 刚性 节点 的 互相 关联 的 网 
络 中 得 到 。 也 有 可 能 减弱 不 要 的 途径 会 引起 中 间 代 谢 物 的 分 泌 ， 而 不 是 通 量 减 小 或 通 量 
改 向 。 

虽然 其 它 可 能 的 控制 结构 也 能 提出 而 且 其 会 产生 一 个 刚性 节点 ， 任 何 此 类 控制 的 关键 方 
面 是 竞争 分 支 途径 之 间 一 个 反馈 调节 机 制 的 
存在 〈 相 互 影响 cross-talk), RHA RR 
个 恒定 通 量 分 配 比 的 趋势 。 一 个 刚性 节点 不 


柠檬 酸 


仅 能 限制 产物 得 率 ， 而 且 通 过 简单 的 酶 活性 ReMi | ， FPR wg con 

减弱 不 容易 减轻 这 种 影响 。 wmax=289mmol-L-Lminmr was=126mmolLItmin-! 
图 5.19 所 示 的 乙 醛 酸 支 路 是 一 个 全 面 研 

究 了 的 代谢 分 支点 。 当 细胞 在 醋酸 盐 上 生长 Zt at 


时 ， 异 柠檬 酸 裂 合 酶 〈IL) RAS, MA 
提供 补 碳 方 面 起 重要 作用 〈 见 第 2 ee), AMM 
会 在 TCA 循环 中 作为 CO, 而 被 失去 。 当 在 醋酸 盐 上 生长 时 ， 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 (IDH) 主要 
处 于 磷酸 化 状态 (KH 80%)， 从 而 使 其 没有 活性 。 当 给 予 细 胞 更 有 利 的 碳 源 时 ， 如 葡萄 
糖 ，IDH 就 会 迅速 脱 磷 酸 而 导致 其 活化 。 

图 5.19 概括 了 在 乙酸 盐 上 生长 时 两 种 竞争 酶 的 动力 学 参数 〈 葡 萄 糖 可 使 IDH 的 wmax 增 
INS 倍 )。 该 分 支点 的 一 个 重要 特征 是 各 自 的 K,, 值 极 不 一 致 : IL 有 一 个 75 倍 高 的 Ky 值 。 

111 


图 5.19 异 柠 檬 酸 分 叉 点 处 酶 的 动力 学 参数 


在 异 柠 檬 酸 生 理 浓度 时 (4 160pumol'L 1) ，IL 对 于 蜡 柠檬 酸 为 一 级 ， 而 IDH 被 共同 底 物 
所 饱和 。 因 为 这 两 种 酶 的 动力 学 的 共同 控制 ， 通 过 该 支 路 的 通 量 对 异 柠檬 酸 浓度 水 平 的 变化 
极端 敏感 。 在 乙酸 盐 生 长 培养 基 中 加 入 葡萄 糖 ， 不 仅 引 起 IDH 的 wmax 的 提高 ， 同 时 引起 通 
过 柠檬 酸 合成 酶 的 碳 流 的 相应 减少 ， 其 总 结果 是 降低 了 胞 内 异 柠檬 酸 水 平 (大 约 170 倍 )。 
因为 与 IDH HH, IL 对 异 柠檬 酸 有 一 个 显著 高 的 Ku， 所 以 异 柠檬 酸 浓度 的 下 降 使 通过 该 
支 路 的 通 量 减 少 到 一 个 很 大 程度 〈 约 99% )。 因 此 ， 虽 然 没 有 已 知 的 别 构 调节 剂 直接 作用 到 
IL 上 ， 通 过 它 的 通 量 可 从 总 的 30% 下 降 到 实际 上 为 零 。 这 种 控制 有 很 有 趣 的 特性 : 最 受 影 
响 的 酶 IL 是 不 易 直 接 控 制 的 ， 这 已 经 被 称 做 “分 支点 效应 ”。 
5.4.2 耦合 反应 与 总 体 流 通 代 谢 物 的 作用 

生物 合成 反应 一 般 都 依赖 于 ATP 的 供应 ， 若 ATP 供应 不 足 则 生物 合成 受阻 。ATP 及 
其 相关 分 子 ADP、AMP 在 中 心 碳 代谢 供 能 反应 的 调控 中 比 其 仅仅 参与 在 代谢 反应 中 起 着 更 
加 重要 的 作用 。 这 些 中 心 分 解 代谢 过 程 〈 糖 酵 解 和 TCA 循环 ) 为 生物 合成 提供 原料 ， 如 图 
5.20 所 示 (也 可 见 2.1 节 )。 这 些 途 径 通过 不 仅 提供 前 体 代 谢 物 同时 也 提供 自由 能 和 辅助 因 
子 而 提供 一 个 基本 的 合成 代谢 功能 。 因 此 ， 此 类 途径 被 称 为 “无 定向 代谢 途径 ”以 表明 它们 
在 分 解 代 谢 和 合成 代谢 中 的 双重 作用 (Sanwal，1969，1970)。 这 些 途 径 的 调节 应 当 反 映 出 
其 双重 功能 ， 即 确保 正确 的 及 协调 的 碳 骨 架 流 进 生物 合成 途径 和 产能 途径 。 严 格 地 说 生物 合 
成 或 分 解 途 径 主 要 区 别 于 用 以 通 量 控制 的 调节 信和 号 的 性 质 (Vaulont and Kahn, 1994), 


ABR 


BB 
等 
a 
脂肪 一 “a. ADP 
蛋白 质 一 | 分 解 代谢 ee 生长 发 育 
NADPH 
两 粮 -P | 
T ##-P 
成 糖 -P 蛋白 质 
己 糖 -P 核酸 
CO2 PEP 复合 酯 
Ane nts 
a- JX file] = BR oe 
HMA A ARE 
草 酰 乙 酸 


图 5.20 需 氧 异 养 代谢 的 图 解 方块 图 


在 两 种 情况 下 ， 反 馈 抑制 总 是 施加 在 催化 途径 第 一 步 反 应 的 酶 上 。 如 果糖 酵 解 或 TCA 
循环 仅 由 能 荷 调节 ， 和 那么 在 充足 的 能 量 供应 条 件 下 ， 通 过 这 些 途 径 的 通 量 将 会 急剧 减少 。 然 
而 ， 伴 随 着 ATP 再 生 的 减少 ， 这 种 反馈 机 制 也 会 限制 生长 中 间 物 的 可 利用 率 ， 从 而 损害 生 
长 。 这 样 的 响应 只 会 是 次 优 ， 因 为 当 资 源 供应 丰富 时 生长 也 会 被 限制 。 

为 了 满意 地 调控 一 个 同时 具有 两 种 服务 功能 的 过 程 ， 已 经 发 展 了 一 个 需要 两 个 输入 的 高 
级 机 制 : 一 个 是 生物 合成 中 间 物 水 平 的 测量 ， 另 一 个 是 能 量 水 平 预示 (Anthong，1988; 
Atkinson, 1970, 1977; Dietzler et al, 1979; Nicholls, 1992). fa5 1: 第 一 信号 是 一 个 特定 
途径 的 终端 产物 而 且 通 常 在 严格 合成 过 程 中 找到 。 现 在 有 大 量 例子 可 以 用 来 表明 大 多 数 生 物 

I 


”合成 途径 的 调控 都 包括 简单 的 反馈 机 制 ， 其 中 最 终 产物 抑制 包括 在 该 产物 合成 过 程 中 的 第 一 
步 ， 例 如 苏 氨 酸 抑制 高 丝氨酸 脱氧 酶 ， 异 亮 氨 酸 抑制 苏 氨 酸 脱 氨 酶 ， 组 氨 酸 抑制 磷酸 核糖 - 
ATP 焦 磷 酸化 酶 ， 色 氮 酸 抑制 氨基 苯 甲 酸 合成 酶 等 ( 见 例 $.1)。 信 号 2: 第 二 信号 是 严格 
分 解 代谢 途 径 的 特征 ， 而 且 是 能 量 代谢 的 最 终 的 (中 间 的 ) 产物 ( 即 P;，AMP，ADP， 
ATP，NADH，NADPH)， 例 如 ， 由 AMP 激活 的 产 气 肠 杆 菌 的 生物 可 降解 性 苏 氨 酸 脱 氮 
酶 ， 或 由 P,; 抑制 的 铜绿 假 单 胞 菌 的 生物 可 降解 性 组 氨 酸 酶 以 及 由 AMP 和 GDP 所 解除 的 
抑制 。 

无 定向 代谢 途径 采用 两 种 通 量 控制 方式 〈 即 由 终端 产物 抑制 ， 及 由 作为 细胞 能 量 状态 指 
示 器 的 代谢 物 的 活性 抑制 )。 当 任何 一 个 信号 低 时 ， 糖 酵 解 将 继续 进行 ; 当 两 者 均 处 于 正常 
范围 时 ， 糖 酵 解 功能 适度 提供 ， 通 过 该 途径 的 通 量 减 小 。 当 然 在 一 个 正在 代谢 葡萄 糖 的 细胞 
中 糖 酵 解 途径 决 不 会 完全 关闭 AA ATP 持续 不 断 被 需要 。 相 应 于 12 种 前 体 代 谢 物 相 互 之 
间 以 及 相应 于 生物 合成 需要 的 12 种 前 体 代谢 物 生 成 速率 的 平衡 ， 包 括 了 一 个 高 度 复杂 的 调 
控 机 制 。 协 调 的 需要 超过 了 含 碳 代谢 物 ; 供 能 反应 必须 提供 能 量 和 还 原 力 (NADH 和 
NADPH 两 者 ) ， 因 此 ， 训 不 奇怪 ， 在 网 络 中 许多 节点 ， 这 些 化 合 物 本 身 是 异 构 效 应 物 。 


CADP 
PALS Ae 


CA 本 
AE fat (EC) = 


==> 一 一 一 一 一 | 
CATP 十 CADP 十 CAMP f9- 15) 


由 式 (5.15) 给 出 的 能 荷 对 通 量 的 协调 控制 及 生物 合成 前 体 的 可 利用 率 示 于 图 5.21 中 。 
通过 腺 苷 酸 库 的 实验 测量 所 确定 的 能 荷 可 以 在 
0 (全 部 AMP) 和 1 (全 部 ATP) 之 间 变 化 。 实 际 
上 ， 对 细菌 ， 这 个 值 在 0.87 一 0.95 的 范围 内 变化 ， 
而 且 随 比 生 长 速率 改变 没有 显著 变化 。 一 般 说 来 ， 
高 水 平 能 荷 值 通 常 抑制 补充 能 量 的 酶 ， 而 它们 激活 
利用 ATP 的 酶 〈 例 如 生物 合成 酶 ) ， 反 之 亦 然 。 ge | HE 
对 氧化 -还 原 反 应 ， 存 在 一 个 类 似 的 情况 ， 这 时 8 aE 
反应 通过 一 个 “还 原 荷 ”进行 类 似 的 调控 。 吡 啶 核 图 5.21 在 调节 无 定向 代谢 途径 的 速率 中 
TRAV H 离子 或 还 原 力 的 运输 载体 ， 而 NAD 主 ”能 荷 与 代谢 中 间 物 浓度 之 间 的 相互 作用 
要 在 供 能 途径 的 氧化 还 原 反 应 中 起 作用 ，NADP 通 
常用 于 生物 合成 反应 。 在 供 能 反应 中 ， 氧 化 了 的 NAD 是 反应 物 而 合成 反应 利用 NADP 的 
还 原形 式 。 因 此 毫 不 奇怪 ， 在 生理 条 件 下 大 部 分 NAD 在 胞 内 以 氧化 了 的 形式 存在 而 NADP 
以 还 原形 式 存 在 。 氧 化 还 原状 态 的 有 用 指标 是 分 解 代谢 还 原 荷 ( 约 0.03 一 0.07) 和 合成 代 
谢 还 原 荷 〈 约 高 10 倍 )。 


高 


县 
黑 


Hi 


分 解 代谢 还 原 荷 (CRC) = —— SAD —— (5.16) 
合成 代谢 还 原 荷 (ARC) = NADPH 一 (5.17) 


CNADPH 十 CNADP 
ARC 和 CRC 在 协调 供 能 反应 与 生物 合成 反应 中 都 起 着 重要 作用 ， 尽 管 它 们 的 作用 不 如 
能 荷 的 作用 那样 清楚 。 在 大 部 分 细胞 中 四 种 供 能 反应 引起 NADPH 生产 以 用 于 生物 合成 
(两 种 在 磷酸 戊 糖 途径 ， 一 种 是 异 柠檬 酸 脱氧 酶 ; 一 种 是 苹果 酸 酶 )。CRC 和 ARC 的 调节 被 
认为 是 通过 转 氢 酶 而 发 生 的 ， 该 酶 催化 如 下 可 逆反 应 : 
113 


NADP + NADH; ==NADPH) + NAD 


这 是 一 个 膜 -结合 酶 ， 它 由 质子 驱动 力 驱动 ; 因此 其 只 能 在 具有 能 量 的 膜 上 进行 ， 该 反 
应 的 平衡 认为 是 由 质子 驱动 力 来 改变 〈 参 见 第 2 章 )。 


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115 


第 6 章 途径 操作 实例 一 一 代谢 工程 实践 


大 自然 已 提供 大 量 值得 注意 的 代谢 途径 ， 现 存 微生物 的 多 样 性 可 证 实 这 一 点 。 某 些 情 况 
下 ， 在 一 特定 生物 体 中 这 些 途 径 的 组 装 及 动力 学 协调 对 于 一 个 有 用 的 商业 应 用 来 说 是 适合 
的 。 然 而 ， 大 多 数 情况 下 ， 需 要 进行 遗传 改进 以 使 细胞 的 转化 反应 及 动力 学 特性 得 到 优化 ， 
使 之 适宜 于 实际 需要 。 这 些 改进 是 以 目前 对 微生物 代谢 和 分 子 遗传 学 的 理解 来 指导 ， 而 通过 
分 子 生物 学 技术 和 重组 DNA 技术 来 实行 的 。 转 化 途径 的 合理 转移 已 经 在 许多 细胞 中 产生 了 
新 的 合乎 需要 的 功能 ， 因 此 有 益 于 制药 、 农 业 、 食 品 、 化 学 和 环境 等 方面 。 

本 章 ， 将 回顾 代谢 途径 操作 的 应 用 。 主 要 根据 Cameron 和 Tong (1993) 的 分 类 方法 ， 
稍 加 调整 ， 将 大 量 实例 组 成 五 种 基本 类 型 ， 即 应 用 目的 : (a) 微生物 生产 的 产品 得 率 和 生产 
能 力 ; (b) 扩大 生物 体 可 代谢 的 底 物 范围 ; (c) 产生 新 的 和 独创 的 产品 ; (d) 细胞 性 能 的 总 
体 改进 ; (e) 异 生物 的 降解 (xenobiotic degradation ) 。 结 合 本 书 上 下 文 的 前 后 关系 ， 综 述 
这 些 应 用 有 三 个 目的 。 首 先 ， 提 供 一 个 可 能 性 范围 确实 非常 大 的 样本 ， 该 可 能 性 是 指 由 途径 
操作 及 代谢 工程 所 提供 的 对 生物 催化 剂 改 进 的 可 能 性 。 特 别提 出 本 概述 几乎 排除 其 它 而 只 集 
中 于 工业 应 用 。 除 了 绪论 〈 第 1 章 ) 和 一 些 偶尔 提 到 以 外 ， 几 乎 没 包括 代谢 工程 在 医学 领域 
的 广泛 应 用 。 原 因 仅仅 是 在 该 领域 的 大 部 分 工作 刚刚 流行 而 不 足以 在 本 书 的 综述 中 定形 。 然 
而 ， 所 报告 的 进展 对 代谢 工程 的 工具 和 方法 的 影响 几乎 没有 留 下 任何 疑问 ， 这 些 工具 及 方法 
涉及 在 体内 或 体外 对 组 织 和 器 官 进 行 分 析 ， 同 时 也 为 信号 转 导 途径 的 组 织 及 功能 的 合理 设计 
提供 基础 。 

综述 的 第 二 个 目的 是 向 读者 提供 代谢 途径 、 还 有 它们 的 调控 及 与 总 体 代 谢 协调 等 方面 复 
杂 性 的 意识 和 辨别 力 。 这 些 途 径 公 认 的 复杂 结构 的 一 个 重要 推论 是 对 它们 系统 分 析 的 方法 并 
不 总 是 像 人 们 所 希望 的 那样 简单 。 当 我 们 在 钻研 代谢 通 量 确定 方法 (第 8 章 、 第 9 章 )、 研 
究 复杂 代谢 网 络 中 的 控制 及 代谢 通 量 扩 增 问题 时 (第 11 章 、 第 12 章 )， 就 会 清楚 认识 到 这 
一 点 。 以 同样 的 方式 ， 对 细胞 代谢 的 状态 、 代 谢 生 产 途 径 或 信号 转 导 途径 进行 具有 代表 性 的 
分 析 时 ， 可 能 需要 一 批 多 维 的 分 析 测 量 ， 这 不 同 于 目前 的 实际 做 法 。 在 大 量 测量 中 真正 辨认 
出 类 型 的 识别 将 是 一 个 挑战 ， 而 通 量 分 析 会 为 此 目的 提供 一 个 有 用 的 框架 。 

本 综述 的 第 三 个 目的 是 强调 那些 为 了 工业 应 用 或 医学 的 原因 ， 在 细胞 体系 中 为 实现 所 希 
望 的 变化 所 用 的 方法 。 最 成 功 的 应 用 需要 对 一 个 代谢 网 络 中 多 于 一 个 酶 反应 步骤 进 行 协 调 修 
饰 ， 这 将 会 变 得 很 明显 。 这 对 扩大 到 超出 一 条 简单 的 产品 形成 途径 和 包括 中 心 碳 代谢 的 复杂 
结构 等 应 用 来 说 几乎 是 必需 的 。 我 们 相信 这 将 变 成 一 个 普遍 需求 ， 因 为 研究 焦点 逐渐 从 高 度 
简化 的 模型 系统 变换 到 实际 的 工业 或 医学 处 境 的 范围 。 正 如 前 面 提 及 的 复杂 测量 的 解释 一 
样 ， 代 谢 工程 能 对 合理 修饰 代谢 途径 产生 影响 。 


6.1 产品 得 率 及 生产 能 力 的 提高 


大 多 数 主 要 的 工业 应 用 都 可 归于 此 类 型 。 注 意 到 ， 尽 管 得 率 和 生产 能 力 通常 在 不 太 严 格 
时 可 以 互 换 ， 但 得 率 和 生产 能 力 代 表 着 不 同 价值 的 数字 ， 使 它们 提高 需要 不 同 的 策略 。 得 率 
主要 影响 原料 的 成 本 ， 并 受 代谢 通 量 向 有 助 于 目标 产物 生成 的 方向 改 向 所 影响 。 另 一 方面 ， 
116 


”生产 能 力 是 生物 加 工 设 备 基本 投资 费用 的 关键 性 决定 因素 ， 它 可 通过 代谢 通 量 的 扩 增 而 改 
进 。 大 家 公认 ， 整 个 过 程 的 优化 必须 包括 得 率 和 生产 能 力 二 者 都 关心 的 事 ， 尽 管 在 某 些 情况 
下 ,， 三 者 的 解 耦 也 许 是 可 能 的 。 生 产能 力 首 先 依赖 于 底 物 吸收 的 比 速率 ， 对 大 多 数 工 业 微 生 
物 来 说 ， 该 值 范围 为 0.2 一 0.Sg 底 物 人 g 生物 基质 小时)。 如 果 在 生产 条 件 下 该 比 吸收 速率 
可 以 实现 ， 那 么 倘若 副产品 生成 最 小 ， 则 生产 能 力 在 经 济 上 是 可 以 接受 的 。 在 这 些 条 件 下 ， 
得 率 和 生产 能 力 的 优化 方法 可 以 真正 趋 于 一 致 。 另 一 方面 ， 若 底 物 吸收 速率 太 低 ， 那 么 生产 
能 力 的 优化 应 先 从 底 物 运输 系统 的 扩大 开始 ， 接 着 进行 通 量 改 向 ， 这 已 由 得 率 优化 策略 所 
阐明 。 

很 明显 ， 得 率 和 生产 能 力 在 大 规模 、 低 成 本 工业 生产 中 更 为 重要 。 下 面 我 们 将 叙述 目的 
在 于 通过 代谢 工程 改进 乙醇 、 氨 基 酸 和 溶剂 的 得 率 及 生产 能 力 所 做 的 努力 。 
6.1.1 乙醇 

乙醇 是 一 种 重要 的 工业 化 学 品 ， 并 正 显 露出 作为 一 种 生物 燃料 取代 正在 耗 尽 的 化 石 燃料 
的 潜力 。 此 外 ， 乙 醇 对 环境 会 有 有 意义 的 影响 ， 这 是 由 于 乙醇 燃烧 时 污染 小 ， 并 且 它 还 能 作 
为 原料 生产 含 氧 燃料 (oxygenated fuel)。 还 有 ， 因 为 乙醇 的 生产 主要 基于 农产品 ， 这 将 加 
快 大 气 CO; 移 除 的 “ 碳 循环 " 。 据 目前 的 估计 ， 到 2010 年 ， 美 国 将 进口 S0% 以 上 的 原油 及 
其 精制 产品 以 满足 能 源 之 需 。 从 经 济 观点 来 看 ， 通 过 提供 国内 资源 以 满足 部 分 需要 ， 乙 醇 
(及 其 它 生 物 燃 料 ) 在 稳定 能 源 价 格 、 改 善 国家 能 源 安全 及 确保 农村 和 区 域 经 济 发 展 中 能 够 
起 重要 作用 。 

乙醇 可 由 一 些 可 再 生 原 料 制 得 。 包 括 糖 类 作物 〈 如 甘蔗 )， 含 淀粉 谷物 〈 如 玉米 ) ， 或 木 
质 纤 维 素材 料 〈 包 括 农业 废弃 物 、 草 本 作物 和 树木 等 )。 乙 醇 过 程 经 济 学 取决 于 糖 的 费用 。 
美国 每 年 23 亿 升 燃料 乙醇 几乎 全 是 由 玉米 生产 
的 ， 据 估计 用 剩余 的 玉米 每 年 还 可 生产 约 200 亿 
升 乙醇 。 在 过 去 的 10 年 间 ， 乙 醇 生产 成 本 从 1.0 
美元 7 以 上 降 至 约 -0.3 一 0.5 SUL, MiteA 
入 的 将 来 ， 其 成 本 将 低 于 0.25 美元 [L。 

木质 纤维 素材 料 是 来 源 丰 富 且 价 廉 的 一 种 资 
源 ， 其 目前 的 供应 能 够 以 美国 总 的 液体 运输 燃料 
消耗 量 的 同样 规模 支持 液体 运输 燃料 的 可 持续 生 
产 。 美 国 国 家 可 再 生 能 源 实 验 室 (NREL) 估计 ， 
目前 由 木质 纤维 素 生 产 的 乙醇 成 本 约 为 0.32 美元 
人 几 L， 这 是 基于 每 吨 干 重 原料 价格 为 42 美元 的 假定 
(National Renewable Energy Laboratory, 1996). 
这 个 平均 生物 质 成 本 相当 于 每 千克 糖 约 0.06 美 
元 ， 或 折算 为 生产 乙醇 产品 的 原料 成 本 0.10 美元 
沁 L。 所 考虑 的 木质 纤维 作物 作为 生产 燃料 乙醇 的 
合适 原料 ， 包 括 快 速生 长 的 树木 、 农 业 或 林业 的 
残余 物 和 各 种 各 样 的 废物 ， 例 如 制 浆 废物 、 废 报 图 6.1 木质 纤维 素 转化 为 乙醇 
纸 和 城市 固体 废物 。 木 质 纤维 素 原 料 的 半 纤 维 素 结晶 状 纤维 素 是 含量 最 大 (50%) 和 最 困难 的 部 
组 分 【硬木 材 干 重 的 25%, 县 主要 是 DAM) Hg ewaenoen onnarewonmen 
有 效 利 用 为 降低 燃料 乙醇 生产 成 本 (4 25%) 提 回收 ,这 些 单 糖 接着 由 合适 的 微生物 转化 为 乙醇 

117 


木质 素 加 工 


供 了 一 个 机 会 (Bull，1990)。 虽 然 森 质 纤 维 素 价 格 低廉 ， 但 由 于 它 不 能 被 人 体 消 化 ， 因 而 
不 能 作为 食物 来 竞争 ， 它 不 能 被 消化 也 使 它 难以 转化 为 可 发 酵 的 糖 。 此 外 ， 木 质 纤 维 素 是 含 
有 三 种 主要 组 分 〈 即 纤维 素 、 半 纤维 素 和 木质 素 ) 的 一 种 复杂 结构 ， 每 一 个 组 分 必须 单独 处 
理 以 充分 利用 生物 过 程 中 固有 的 高 功效 。 图 6.1 所 示 为 由 木质 纤维 素 转化 为 乙醇 的 一 般 过 
程 。 经 预 水 解 和 水 解 处 理 后 产生 的 水 解 产 物 中 含有 单 糖 〈 其 量 在 改变 着 ) ， 其 存在 形式 包括 : 
戊 糖 (D- 木 糖 和 -阿拉 伯 糖 ) AOR ( 见 表 6.1)。 水 解 产物 中 还 包括 范围 很 广 的 物质 ， 其 
衍生 于 原材料 或 在 过 程 预 处 理 阶段 作为 反应 副 产 物 而 形成 〈 糖 和 木质 素 降 解 产 物 )。 在 硬木 
和 作物 残余 物 的 半 纤 维 素 中 ， 木 糖 是 含量 最 丰富 的 糖 ， 而 在 软木 的 半 纤 维 素 中 甘露 糖 含量 更 
丰富 。 此 外 ， 自 然 界 中 木 糖 的 含量 仅 次 于 和 葡萄糖。 单单 是 残存 在 废 纸 中 和 美国 掩埋 式 垃圾 处 
理 场 的 庭院 垃圾 中 的 糖 类 残 酒 ， 经 微生物 转化 就 会 提供 4000 亿 升 以 上 的 乙醇 (Lynd et al, 
1991) ，10 倍 于 每 年 燃烧 的 由 谷物 生产 的 乙醇 。 乙 醇 是 以 10% 与 汽油 混合 后 作为 液体 燃料 燃 
8 (Keim and Venkatasubramanian, 1989), 

用 于 发 酵 的 微生物 必须 能 利用 水 解 产 物 中 存在 的 所 有 的 单 糖 ， 还 必须 能 耐 受 可 能 存在 的 
抑制 剂 。 使 用 最 普遍 的 乙醇 生产 菌 啤酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 不 能 发 酵 约 占 原 料 
8% 一 28% 的 成 糖 (Ladisch et al，1983)。 酵 母 可 通过 丙酮 酸 脱羧 酶 -乙醇 脱 氢 酶 系 (PDC- 
ADH) 由 己 糖 有 效 地 生产 乙醇 。 然 而 ， 在 木 糖 发 酵 期 间 会 积累 副 产 物 木 糖 醇 ， 从 而 降低 乙 
Bee, Ais, ， 酵 母 只 能 非常 微弱 地 发 酵 L- 阿 拉 伯 糖 。 为 了 开发 一 个 经 济 上 能 生存 的 、 
从 生物 质 生 产 乙 醇 的 过 程 ， 可 以 证 明 木 糖 和 其 它 半 纤 维 素 组 分 的 有 效 发 酵 是 最 基本 的 。 


表 6.1 典型 软木 材 (WEE) 的 木质 纤维 素 中 碳水 化 合 物 结构 的 多 聚 体 


ae 
30 ERLE 

木质 素 苯 丙 烷 
糖 醛 酸 


在 细菌 、 酵 母 菌 和 真菌 中 都 能 找到 发 酵 成 糖 的 微生物 ， 如 柄 状 毕 赤 酵 母 (Pichia stipi- 
tis), 1244 (Candida shehatae) Fi #H A (Pachysolen tannophilus) 是 最 有 希望 的 
天 然 存 在 的 微生物 。 已 经 知道 只 有 少数 几 种 细菌 确实 具有 重要 的 PDC-ADH 途径 生产 乙醇 。 
其 中 运动 发 酵 单 胞 菌 (2Zymzomoxzas mobilis) 具有 最 活泼 的 PDC-ADH AZ; 然而 它 不 能 蜡 
化 分 解 成 糖 。 近 几 年 来 ， 应 用 代谢 工程 得 到 重组 细菌 (Alterhum and Ingram, 1989; Feld- 
mann etal, 1989; Ingram et al，1987; Ohtaet al, 1991a, b; Tolan and Finn, 1987a, b) 
和 重组 酵母 菌 (Hallborn et al, 1991; Kotter et al, 1990; Tantirungkij et al, 1993) 作为 
适宜 的 乙醇 生产 菌 。 最 近 的 研究 在 富 含 木 糖 的 玉米 芯 水 解 物 中 比较 了 各 种 乙醇 生产 菌 (a 
野生 菌 和 重组 菌 ) 的 性 能 ， 结 果 表 明 重 组 乙醇 基因 的 大 肠 杆 菌 KO11 (Escherichia coli 
KO11) [大 肠 杆 菌 上 载 有 整合 到 染色 体 上 的 运动 发 酵 单 胞 菌 〈2Z .xzopoilis ) 的 pde 和 adhB 
基因 ] 是 目前 最 好 的 乙醇 发 酵 微 生物 〈Hahn-Hagerdal et al, 1993). 

最 初 的 研究 在 改变 发 酵 代 谢 途 径 方面 仅仅 是 部 分 成 功 ， 如 以 下 菌 种 : 菊 欧 文 氏 菌 (Er- 
winia chrysanthemi) (Tolan and Finn，1987a，b)， 克 雷 伯 氏 杆 菌 (Klebsiella planticola ) 
(Tolan and Finn, 1987a, b) FAIA (CE. coli) (Brau and Sahm，1986)。 第 一 代 重 组 
生物 体 仅 仅 增强 了 PDC 活性 ， 并 且 是 依赖 于 ADH 活性 的 内 源 水 平 以 进一步 耦合 乙 醛 还 原 
反应 和 NADH 氧化 反应 〈 见 图 6.2)。 由 于 乙醇 仅仅 是 由 这 些 肠 道 细 菌 正常 产生 的 若干 发 酵 

118 


品 之 一 ，ADH 活性 缺乏 与 NADH 积累 共同 导致 多 种 不 希望 的 副 产 物 形成 。 这 个 问题 是 由 
增加 ADH 活性 的 方法 解决 的 ， 通 过 过 量 表达 Z. mobilis adhB 基因 ， 产 生 大 肠 杆菌 〈In- 
gram et al, 1987) 与 克 雷 伯 氏 属 〈 开 . ozytoca ) 的 重组 体 (Ohta et al, 1991a, b; Wood 
and Ingram，1992)， 它 能 有 效 地 发 酵 多 种 糖 生产 乙 醇 。 这 是 通过 将 Z. modilis 基因 (pdc 
SadhB) 装配 在 一 个 人 工 操纵 子 上 ， 产 生 一 个 可 携带 的 用 于 乙醇 生产 的 遗传 因子 (PET 操 
WF) 来 完成 的 。 大 肠 杆 菌 是 一 种 便利 的 宿主 菌 ， 尤 其 是 因为 它 能 在 范围 很 广 的 碳 源 〈 包 括 
五 碳 糖 ) 上 有 效 地 生长 。 


乳酸 


图 6.2 在 丙酮 酸 分 支点 的 竞争 性 途径 
缩写 EMP 一 糖 酵 解 途径 中 的 酶 与 中 间 产 物 ，PDC 一 丙酮 酸 脱羧 酶 ;， ADH 一 乙醇 脱 氢 酶 ; 
PFL 一 丙酮 酸 甲酸 有 裂 合 酶 ; ACK/PTA 一 磷酸 转 乙 酰 酶 和 乙酸 激酶 ; ALDH—-LERAS; 
FHL 一 甲酸 脱氧 酶 ; LDH 一 乳酸 脱 氢 酶 ; PDH 一 丙酮 酸 脱氧 酶 


丙酮 酸 脱羧 酶 催化 丙酮 酸 的 非 氧化 脱羧 化 生成 乙 醛 和 二 氧化 碳 ( 见 图 6.2)。 在 大 肠 杆 
菌 中 存在 两 种 乙醇 脱 氢 酶 同 功 酶 ， 在 由 NADH 氧化 成 NAD+ 所 伴随 的 发 酵 过 程 中 ， 这 些 酶 
催化 乙 醛 还 原 反应 生成 乙醇 。 在 重组 大 肠 杆菌 中 ， 需 要 把 丙酮 酸 代 谢 转 向 乙醇 的 两 种 酶 [两 
酮 酸 脱 氢 酶 (PDC) 与 乙醇 脱 氢 酶 (ADH)] 都 以 高 浓度 水 平 存在 着 。 这 种 酶 的 高 PDC 水 
平 与 低 的 表 观 KK, 值 ( 见 表 6.2) 的 组 合影 响 是 为 了 丙酮 酸 有 效 地 把 碳 流转 向 乙醇 ， 即 使 是 
在 像 乳酸 脱氧 酶 这 样 的 天 然 发 酵 酶 存在 时 也 是 如 此 。 


表 6.2 比较 大 肠 杆 菌 和 运动 发 酵 单 胞 菌 中 作用 于 丙酮 酸 的 各 酶 的 表 观 K,, A 


0.4mmol'L - 
7.2mmol:L7! 
2.0mmol+L~ 


0.18mmol:L~! 
>0.5mmol-L~! 


PDH 
LDH 
PFL 
ALDH 
NADH-OX 
PDC 
ADH II 12mol*L~! 
注 : 缩写 PDH-AMMRAM; LDH 一 乳酸 脱 氢 酶 ;， PFL 一 丙酮 酸 甲酸 裂 合 酶 ;ALDH 一 乙 醛 脱 氢 酶 ， NADHL 
OX—NADH 氧化 酶 ; PDC 一 丙酮 酸 脱羧 酶 ; ADH [一 乙醇 脱 氢 酶 I。 


KF CE «coli ) 


50kmol'L 1 
50umol+L~! 


.4 ‘Lo! 
运动 发 酵 单 胞 菌 (Z .zzobilis ) 0.4mmol*L 


119 


含有 pet 操纵 子 的 重组 大 肠 杆菌 在 好 氧 和 厌 氧 条 件 下 都 能 产生 大 量 的 乙醇 〈 见 表 6.3)。 
在 好 氧 条 件 下 ， 野 生 型 大 肠 杆菌 通过 PDH 和 PFL (K,, 分 别 为 0.4mmol.L -1 和 2.0mmol， 
L-1， 见 表 6.3) 代谢 丙酮 酸 ， 主 要 产品 为 二 氧化 碳 和 乙酸 (由 过 量 的 乙酰 辅酶 A 转化 而 
%). Z.mobilis PDC 的 表 观 开 。 值 类 似 于 PDH 的 天。 值 ， 但 低 于 PFL 和 LDH 的 天 。 值 ， 
因此 利于 乙 醛 生 成 。 在 好 氧 情况 下 NAD+ 再 生 主 要 产生 于 生物 合成 以 及 NADH AB (5 
电子 传递 系统 偶 联 )。 另 外 ， 由 于 Z. xzopilis ADH 1 WH K,, 值 比 大 肠 杆 菌 NADH 氧化 
mK, 值 低 4 倍 多 ， 所 以 外 源 的 ADH 开 能 与 内 源 NADH FHA AMES, ABLE 
RACE. CRAG, HEME. coli 主要 经 LDH 和 PFL 代谢 丙酮 酸 。 如 表 6.2 所 
示 ， 此 两 种 酶 的 表 观 K,, 值 分 别 比 Z. mobilis PDC 的 天 。 值 大 18 倍 和 5S 倍 。 此 外 ， 参 与 
NAD+ 再 生 的 初级 代谢 天 然 酶 的 表 观 K,, (AE E. coli 中 也 大 大 高 于 Z. mobilis ADH HH 
观 开 。 值 。 总 的 说 来 ， 在 大 肠 杆 菌 中 ， 乙 醇 基因 Z. xzobilis 酶 的 过 量 表达 相应 于 天 然 酶 系 ， 
在 打通 到 乙醇 的 碳 (ARM) 和 还 原 力 (NADH) 通 量 方面 ， 具 有 很 强 的 竞争 性 。 


表 6.3 ”野生 型 和 重组 型 大 肠 杆 菌 在 好 氧 与 厌 氧 生长 时 发 酵 产 物 的 比较 
发 酵 产 物 上 /mmol'L -1 


PLO1380-10(PET ) 
无 
PLO1380-10(PET ) 


注 : 38 Ingram and Conway, 1988. 


1991 年 3 月 ， 佛 罗 里 达 大 学 食品 和 农业 科学 院 为 其 创造 的 设计 精巧 的 微生物 获得 美国 
专利 (US 5000000)。 大 量 的 研究 已 经 报道 了 大 肠 杆菌 重 组 菌株 的 发 酵 特性 。 有 代表 性 的 最 
终 乙 醇 质 量 浓度 超过 S0g.L | (例如 从 10% 葡 萄 糖 和 8% 木 糖分 别 得 到 54. 4g-L :和 41.6g. 
L-)》 (Ohta et al，1991a，b)， 与 理论 最 高 得 率 0.5g 乙醇 4 加 糖 十 分 接近 (葡萄 糖 一 2 乙 
醇 +2CO;)。 公 开发 表 的 木 糖 简单 分 批发 酵 所 得 乙醇 的 体积 生产 速率 与 比 生 产 速率 分 别 为 
0.6g 乙醇 .L 1.h- -1 和 1.3g 乙醇 *g ( 干 重 )-1h 1 (Alterhum and Ingram，1989)。 进 一 步 
的 改进 使 乙醇 体积 生产 速率 提高 到 1.8g 乙醇 .L L.h-l (Ohta et al, 1991), HE. coli 
KO11 发 酵 戊 糖 (如 柳 木 和 松木 ) 生产 乙醇 的 成 本 估计 约 0.13 美元 人 人 L (von Sivers and Zac- 
chi, 1995; von Sivers et al，1994) ， 它 很 容易 使 乙醇 最 终生 产 成 本 大 大 低 于 2000 年 的 目标 
0.18 美元 .L- 1。 此 外 ， 含 乙醇 基因 的 ELE. coli 除 发 酵 木 糖 外 ， 还 有 能 力 发 酵 木质 纤维 素材 
料 的 所 有 其 它 糖 类 组 分 : BOB. ARR. 、 阿 拉 伯 糖 和 半 有 乳糖 。 当 重组 菌株 在 通常 存在 于 半 
纤维 素 水 解 产 物 的 混合 糖 中 生长 时 ， 先 利用 葡萄 糖 ， 然 后 依次 利用 阿拉 伯 糖 和 木 糖 ， 乙 醇 生 
产 接近 最 高 理论 得 率 (Takahashi et al, 1994). 

Rit, Ohta 等 研究 Z.mobilis HW pdc Fladh 基因 在 相关 肠 细菌 产 酸 克 雷 伯 氏 菌 (Kleb- 
siella ozytoca ) 中 的 表达 (Ohta et al, 199la, b). SE. coli 相 比 ， 在 克 雷 伯 氏 菌 属 菌株 
中 存在 着 另外 两 条 发 酵 途径 ， 将 丙酮 酸 转 化 为 琥珀 酸 和 丁 二 醇 (LA 6.2). EME. coli 
中 一 样 ， 该 菌 可 以 将 90% 以 上 的 碳 流 从 天 然 发 酵 途径 的 糖分 解 代 谢 途 径 转 向 乙醇 生成 途径 。 
仅仅 重组 PDC 的 过 量 表 达 产 生 了 至 少 2 倍 于 野生 菌 的 乙醇 水 平 。 然 而 ， 当 在 开 . ozytoca 
MSA1 中 同时 提高 PDC 和 ADH 的 表达 量 时 ， 则 乙醇 的 生产 是 很 快 的 和 很 有 效 的 : WA 
萄 糖 和 木 糖 两 种 碳 源 ， 体 积 生 产能 力 >2.0g:L L.h- 1， 得 率 0.Sg 乙醇 .g ! 糖 ， 最 终 乙 醇 质 

120 


RA 


“BREA 45g°L'. 
6.1.2 ABR 

氨基 酸 有 着 广泛 的 商业 用 途 ， 可 作为 食品 添加 剂 、 饲 料 补充 剂 、 输 注 物 、 治 疗 药剂 以 及 
作为 肽 类 或 农业 化 学 品 的 合成 前 体 。 大 多 数 微生物 具有 利用 碳 和 和 氮 源 合成 所 有 基本 氨基 酸 的 
代谢 机 器 〈 见 图 6.3)。 某 些微 生物 还 可 过 量 生产 一 种 或 一 组 氨基 酸 。 例 如 20 世纪 50 年 代 
中 期 ， 日 本 科学 家 分 离 出 一 株 能 大 量 分 记 L- 谷 氨 酸 的 新 细菌 ， 开 辟 了 发 酵 法 生产 氨基 酸 的 
新 纪元 (Kinoshita et al，1957)。 在 那 以 前 ， 氢 基 酸 主要 来 源 是 天 然 蛋 白质 ， 少 部 分 由 化 学 
合成 。 这 种 细菌 后 来 被 命名 为 谷 氨 酸 棒 杆 菌 (Corynebacterium glutamicum), fe—FP EX 
氏 阳 性 菌 ， 是 好 氧 短 杆 菌 ， 能 向 培养 基 中 分 记 大 量 的 谷 氨 酸 ， 在 某 些 条 件 下 接近 100g'.L -1!。 


$A ARR (CoN3) 
H ARR (C2N) 
4 
AAR (CoN) 丝氨酸 (CsN) 
酷 氨 酸 (Cs N3) 
半 胱 氨 酸 (C3NS) 
色 氢 酸 (CNN2) 


FAR (CIN) FY BRR (C3) SAB (C sN) 


AAR (C6N) 


Fp ARR (C4N) | anna 其 
| 谷 氨 酸 (CsN) 
异 亮 氨 酸 (CeN) 蛋氨酸 (CsNS) | 
精 氨 酸 (CeN4) 


图 6.3 由 葡萄 糖 生物 合成 氨基 酸 
DAP—— ARR 


谷 氨 酸 工业 生产 的 成 功 进一步 刺激 了 人 们 的 兴趣 去 分 离 能 生产 其 它 氨 基 酸 的 菌株 。 野 生 
型 谷 氨 酸 细菌 有 只 能 生产 几 种 胞 外 氨基 酸 的 能 力 ， 如 谷 氨 酸 、 统 氨 酸 、 且 氨 酸 、 谷 氨 酰 胺 和 
两 氨 酸 。 为 了 所 需 氨 基 酸 的 胞 外 积累 ， 需 要 改变 细胞 代谢 和 或) 调控 。 随 着 这 些 菌 株 的 发 
现 ， 多 年 来 人 们 试 着 研究 诱导 营养 缺陷 型 和 调节 突变 型 菌株 〈 见 例 S.1)。 利 用 营养 缺陷 型 
突变 株 的 理论 基础 是 绕 过 反馈 调控 〈 见 第 5 章 )， 这 可 通过 使 胞 内 反馈 抑制 剂 或 阻 过 剂 的 积 
累 减 到 最 小 程度 或 通过 修饰 抑制 剂 结合 位 点 ， 从 而 导致 酶 对 抑制 剂 的 存在 不 敏感 。 例 如 ， 利 
用 精 氨 酸 营养 缺陷 型 突变 株 可 分 离 得 到 乌 氮 酸 生产 菌 ， 一 年 后 ， 又 由 高 丝氨酸 营养 缺陷 型 突 
变 菌株 分 离 到 成 功 的 赖 氨 酸 发 酵 生产 菌 (Kinoshita et al，1957)。 目 前 ， 大 多 数 氨基 酸 是 通 
过 结合 营养 缺陷 型 和 调控 型 的 突变 菌株 而 生产 的 。 每 年 SO 万 吨 的 世 - 谷 氢 酸 是 用 谷 氨 酸 棒 杆 

121 


菌 生产 的 ， 同 时 ， 它 的 营养 缺陷 型 突变 菌株 每 年 产 约 40 万 吨 L- 赖 氨 酸 。 氮 基 酸 的 需求 仍 在 
不 断 增 长 。 

鉴于 天 冬 氨 酸 族 氨基 酸 特 别 是 赖 氨 酸 的 商业 重要 性 ， 为 了 分 离 具有 优良 性 能 的 菌 种 ， 开 
展 了 强 有 力 的 菌 种 改进 计划 。 最 初 ， 这 些 工 作 使 用 了 随机 变异 方式 和 营养 缺陷 型 选择 步骤 ， 
该 步骤 利用 了 已 充分 理解 的 氨基 酸 生物 合成 和 调控 的 代谢 途径 。 野 生 型 棒 杆 菌 属 由 于 苏 氨 酸 
和 赖 氨 酸 协同 反馈 抑制 天 冬 氢 酸 激酶 而 不 积累 赖 氨 酸 ( 见 10.1.1 节 和 图 10.1)。 这 样 ， 最 
早 的 产 赖 氨 酸 突变 株 是 高 丝氨酸 脱氧 酶 (HDH) 缺乏 ， 因 而 是 高 丝氨酸 营养 缺陷 型 菌株 ; 
它 不 能 合成 高 丝氨酸 ， 故 在 培养 基 中 需 补 充 高 丝氨酸 或 苏 氨 酸 和 和 蛋 氢 酸 。 后 者 是 以 一 个 可 控 
制 的 速率 提供 以 满足 蛋白 质 合 成 的 需要 ， 同 时 允许 赖 氨 酸 积累 到 高 浓度 。 进 一 步 改 进 包括 抗 
S-(2- 氨 乙 基 )-L- 半 胱 氨 酸 (AEC， 一 种 赖 氨 酸 类 似 物 ) 的 菌株 。 因 为 AEC 与 赖 氨 酸 类 似 ， 
它 诱 导 类 似 的 抑制 效应 ， 例 如 天 冬 氢 酸 激酶 的 抑制 和 赖 氨 酸 合成 的 阻止 。 抗 AEC 的 菌株 中 
显然 含有 解除 调控 的 天 冬 氨 酸 激酶 ， 此 酶 不 被 赖 氨 酸 抑制 ， 因 此 就 能 在 培养 基 中 积累 大 量 的 
赖 氨 酸 。 接 下 来 的 努力 集中 于 中 心 碳 代谢 过 程 ， 试 图 将 更 多 的 碳 从 呼吸 途径 转 人 回 补 途径 。 
为 此 目的 ， 分 离 出 柠檬 酸 合成 酶 活性 减弱 的 突变 株 ， 并 发 现 赖 氨 酸 收 率 得 到 进一步 改进 ， 特 
别 是 与 前 面 提 到 的 HDH 缺乏 和 AEC 抗 性 两 种 表 型 结合 在 一 起 时 ， 情 况 更 是 如 此 。 这 种 方 
法 后 来 已 经 应 用 于 具有 很 多 变化 的 情况 : 得 到 所 丙酮 酸 敏感 型 突变 株 〈 即 丙酮 酸 脱 氢 酶 活性 
减弱 的 突变 株 ) ， 丙 氨 酸 营养 缺陷 型 突变 菌株 和 很 多 其 它 菌 株 。 由 于 对 随机 变异 很 差 的 表征 ， 
还 有 对 谷 氮 酸 棒 杆 菌 糖 回 补 途径 的 功能 和 调控 的 不 完全 理解 ， 因 此 任何 声称 相应 于 这 些 菌株 
的 改进 ， 我 们 还 不 知道 其 改进 机 制 的 确切 性 质 。 

近年 来 ， 通 过 进一步 的 途径 操作 ， 已 获得 了 更 有 效 的 生产 菌株 ， 例 如 通过 消除 生产 菌株 
降解 产物 的 能 力 或 改善 细胞 通 透 性 以 有 助 于 目标 产物 的 分 记 。 几 个 研究 组 独立 启动 了 集中 于 
棒 杆 菌 属 菌 种 代谢 工程 工具 开发 的 研究 项 目 。 基 本 的 前 提 是 由 内 源 质 粒 和 有 效 的 DNA 转移 
系统 获得 的 载体 的 可 利用 性 。 在 过 去 的 几 年 中 ， 在 不 同 的 棒 杆 菌 属 菌株 中 已 分 离 出 一 些小 的 
隐蔽 性 质粒 ， 并 已 开发 出 一 些 新 的 有 效 的 转化 技术 。 这 就 促进 了 从 棒 杆 菌 属 中 氮 基 酸 生物 合 
成 基因 的 分 离 ， 其 数量 约 50% [ 见 Jetten and Sinskey (1995) 的 评论 文章 ]。 这 些 基 因 可 
以 单个 利用 ， 也 可 以 组 合 利用 ， 通 过 提高 酶 活性 或 解除 关键 酶 的 反馈 调节 以 改进 生产 菌株 。 
这 些 基 因 的 使 用 ， 也 考虑 到 被 用 作 特 异性 探 针 以 便 阐 明 氮 基 酸 合成 的 生物 化 学 及 中 心 碳 代谢 
(CCM). 

色 氢 酸 

FEE. coli 中 色 氨 酸 合成 由 一 组 复杂 的 反馈 机 制 高 度 调控 。 通 过 一 次 一 个 转 导 每 个 突 
变 ， 研 究 人 员 在 一 个 单一 菌 内 将 一 长 串 改 变 与 这 些 机 理 相 结合 ， 因 此 创造 了 一 株 色 氮 酸 过 量 
生产 菌 (Aiba et al, 1980; Shio，1986)。 芳 香 族 氨基 酸 合成 途径 〈 见 图 6.4) 的 第 一 步 ， 
由 4- 磷 酸 - 赤 伦 糖 与 PEP 转化 形成 3- 脱 氧 -D- 阿 拉 伯 上 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (DAHP)， 这 一 步 由 三 
个 同 功 酶 (AroF、AroG 、AroH) 催化 ， 此 三 个 酶 又 分 别 由 酷 氨 酸 、 色 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 所 调 
节 。 最 初 的 方法 之 一 是 通过 删除 aroG 和 azro 五 来 简化 该 系统 的 调控 。 此 外 ， 通 过 突变 
(aroF394) 致使 酷 氨 酸 调控 的 酶 (AroF) 对 反馈 抑制 不 敏感 ， 并 且 通 过 失 活 阻 遏 物 基 因 
(tyrR) 以 消除 对 该 基因 的 阻 过 作用。 其 它 修饰 ， 包 括 切 断 产 酷 氨 酸 和 共 丙 氢 酸 的 分 支 途径 
(tyrA 和 ppeA)、 失 活 色 氮 酸 酶 基因 (tna) 以 防止 所 合成 的 色 氨 酸 可 能 的 降解 、 通 过 使 邻 
氨基 茶 甲 酸 合成 酶 (trpE382) 对 色 氮 酸 不 敏感 来 减弱 色 氮 酸 分 支 途径 的 反馈 抑制 、 色 氢 酸 
Hib (zirpR ) 的 失 活 、 通 过 突变 色 氨 酰 -RNA 合成 酶 基因 (trpS) 而 破坏 细胞 的 衰减 控 

122 


fil, TAR E. coli 菌株 (NST100) 在 含 葡萄 糖 3% 35 FF AEP GE 24h DA BAR 
6.2g°L !。 在 培养 基 中 添加 邻 氨基 葵 甲 酸 有 可 能 提高 色 氢 酸 得 率 。 

最 近 ， 一 株 能 产 18g 色 氮 酸 .L ! 的 谷 氨 酸 棒 杆 菌 已 改 为 生产 大 量 的 酷 氨 酸 (26g'L 1)， 
这 是 通过 过 量 表达 解除 调控 的 3- 脱 氧 -D- 阿 拉 伯 上 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (DAHP) 合 酶 与 分 支 酸 变 
位 酶 而 实现 的 〈Ikeda and Katsumata，1992)。 在 先前 的 构建 中 一 个 额外 的 基因 (FE AR 
永 酶 ) 的 过 量 表 达 ， 导 致 葵 丙 氨 酸 占 优势 的 生产 (28g:'L 1)。 


DAHP Ail 
4- fal BR ir BE HH oe 
十 一 人 roG 一 DAHP 


—AroH > 


BES ARAN (pL) 分支 酸 变 位 酶 


1 
邻 氨基 革 甲 本 
预 革 酸 脱水 酶 EMAL ANG 


2 A ARS 对 - 羟 葵 丙酮 酸 
ee ar 


图 6.4 芳香 族 氨 基 酸 的 生物 合成 
在 下 .coii 中 ， 结 构 基 因 构 成 一 个 操纵 子 (trpEDCBA) 从 属于 一 个 共同 的 操纵 基因 。 
调节 基因 远离 操纵 子 ， 通 过 终 产 物色 所 酸 反馈 抑制 酶 的 形成 〈 阻 遏 ) 


ARR 

Uhlenbusch 等 人 将 球形 芽孢 杆菌 (Bacillus sphaericus) 的 两 氨 酸 脱 氢 酶 CalaD) 基 
因 引 入 运动 发 酵 单 胞 菌 〈Z. mobilis) 中 ， 构 建 了 一 株 丙 氨 酸 高 产 菌 〈Uhlenbusch et al, 
1991) ， 得 率 为 每 280mmol 葡萄 糖 可 生产 两 氨 酸 10mmol。 后 来 通过 添加 8Smmol'L 1! 氮 使 
两 氨 酸 产量 提高 到 4lmmol， 可 以 看 出 在 此 之 前 所 显然 是 限制 条 件 。 在 此 生产 速率 下 ， 生 长 
停止 了 ， 这 也 许 是 由 于 丙酮 酸 脱羧 酶 (PDC) 与 丙 氨 酸 脱 氢 酶 间 对 丙酮 酸 的 强烈 竞争 。 使 
PDC 辅助 因子 焦 磷 酸 硫 胺 素 匮 乏 ， 结 果 导 致 菌株 生长 进一步 受到 抑制 ， 而 使 两 所 酸 产 量 提 
高 (25h 内 达 84mmol ) 。 

Tr BR 

虽然 ， 赖 氨 酸 和 和 蛋氨酸 能 被 经 济 地 生产 用 作 饲 料 添加 剂 ， 而 苏 氨 酸 由 于 现 有 工艺 得 率 太 
低 而 不 能 满足 需要 。 然 而 ， 最 近 通 过 代谢 工程 构建 有 效 的 苏 氨 酸 生产 菌 的 工作 取得 重大 进 
展 。 通 过 巨 . coli thrB 突变 株 的 互补 ， 编 码 苏 氨 酸 途 径 前 两 步 酶 的 谷 氮 酸 棒 杆 菌 基因 被 分 
离 出 来 ， 这 两 种 酶 分 别 是 高 丝氨酸 脱 氢 酶 (HD) 和 高 丝氨酸 激酶 (CHK) (Follettie et al, 

123 


1988)。 这 两 种 基因 形成 一 个 操纵 子 ， 它 是 从 hom 基因 的 一 个 单一 启动 子 上 游 被 表达 的 
(Peoples et al, 1988), hom 基因 是 由 蛋氨酸 经 一 独特 的 衰减 体系 在 转录 水 平 上 进行 调节 的 
(Jetten et al，1993)。 苏 氨 酸 合成 途径 的 最 后 一 步 包 括 通过 组 成 型 酶 苏 氨 酸 合 酶 (TS) 将 磷 
酸 高 丝氨酸 转化 为 苏 氨 酸 。 最 近 ， 通 过 谷 氨 酸 棒 杆 菌 营 养 缺陷 菌株 的 互补 得 到 了 编码 TS 
(thrC) 的 基因 〈Han et al, 1990). 

苏 氨 酸 生 产 是 由 共同 底 物 L- 天 冬 氨 酸 -8- 半 醛 (ASA) 到 两 个 分 支 途 径 〈 苏 氨 酸 生物 合 
成 途径 和 赖 氨 酸 生 物 合成 途径 ) 的 代谢 通 量 分 布 决定 的 ( 见 图 6.5)。 该 通 量 的 分 布 由 竞争 
性 酶 对 共同 底 物 ASA 的 相对 亲和力 所 控制 ， 竞 争 性 的 酶 为 高 丝氨酸 脱 氨 酶 和 二 氢 吡 啶 二 羧 
酸 合成 酶 。 由 于 高 丝氨酸 脱氧 酶 的 活性 对 直 - 苏 氨 酸 的 别 构 抑 制 效应 十 分 敏感 〈( 开 ; = 
0.16mmol'L -1!)， 因 此 在 名 义 生长 条 件 下 ，ASA 优先 进入 赖 氨 酸 途径 。 理 解 高 丝氨酸 脱氧 
酶 对 苏 氨 酸 抑 制 的 分 子 基础 的 关键 和 构建 苏 氨 酸 高 产 菌 的 关键 是 分 离 抗 反馈 抑制 的 HD 
(HDi)。 有 两 个 研究 组 独自 分 离 并 表征 了 编码 去 除了 调控 的 、 抗 反馈 的 高 丝氨酸 脱 氢 酶 基 
Fl (Archer et al, 1991; Reinscheid et al，1991)。Archer 等 (1991) 确定 了 hom 突变 型 


| 


ask 


ppe 


dapA ilvC Faw 


ddh 
dapB 


图 6.5 天 冬 氨 酸 家 族 氨 基 酸 的 生物 合成 途径 
缩写 _DHP 一 2,3- 二 氢 吡 啶 -2 ,6- 二 羧 酸 ; THDP 一 四 氢 吡 啶 二 羧 酸 ; ppc—wBe WRI EPS Ae ARR LM 
zc 一 丙酮 酸 羧 化 酶 ; 灵 一 丙酮 酸 激酶 ;ca 一 天 冬 氨 酸 激酶 ;asd 一 ASA 脱 氢 酶 ;dapA 一 DHP 合 酶 ; 
dapB—DHP 还 原 酶 ;du 一 DAP 脱 氢 酶 ; /ysA 一 DHP 脱羧 酶 ; hom 一 高 丝氨酸 脱 氢 酶 ; 如 hrB 一 高 丝氨酸 激酶 ; 
ihrC 一 苏 氨 酸 合 酶 ;ivA 一 苏 氨 酸 脱水 酶 〈 脱 氨基 酶 ); ozBN 一 乙酰 产 酸 合成 酶 ， 
乙酰 羟 酸 同 分 异 构 还 原 酶 ， 二 羟 酸 脱水 酶 ;iuC 一 转氨酶 C 


124 


“是 由 于 一 个 碱 基 缺 失 ， 这 从 根本 上 改变 了 羧基 末端 结构 ， 导 致 相对 于 野生 型 菌 来 说 有 10 个 
”所 基 酸 发 生 改 变 以 及 最 后 7 个 残 基 的 缺失 。 这 些 残 基 显 然 是 苏 氨 酸 结 合 位 点 的 一 部 分 ， 它 们 
“人 捧 HDd 突 变 株 中 的 去 除 致 使 HD 酶 活性 对 苏 氢 酸 的 反馈 抑制 不 敏感 。 


为 了 研究 ASA 节点 处 碳 通 量 的 调控 ， 构 建 了 意义 明确 的 重组 菌株 (Colon et al, 1993; 
Eikmanns et al, 1991; Reinscheid et al，1994)。 苏 氨 酸 基因 在 野生 型 谷 氨 酸 棒 杆 菌 13032 


中 的 扩 增 并 没有 产生 任何 苏 氨 酸 的 分 沁 ， 这 也 许 是 由 于 苏 氨 酸 对 天 冬 氨 酸 激酶 和 高 丝氨酸 脱 


氢 酶 的 反馈 抑制 (Eikmanns et al，1991)。 仅 仅 去 除 调控 的 hom*® (质粒 pJD4， 见 表 6.4) 
的 扩 增 ， 在 赖 氨 酸 和 苏 氨 酸 途 径 之 间 产 生 了 近似 相等 的 通 量 分 配 以 及 苏 氨 酸 (100mmol 
L 0 和 高 丝氨酸 (74mmol'L 1) 的 胞 内 积累 ， 其 导致 如 下 结论 : 苏 氨 酸 的 生产 可 能 是 由 
于 其 流出 量 和 (或 ) HDS HK 活力 之 间 没 有 平衡 而 受到 限制 。 为 防止 胞 内 高 丝氨酸 的 积 
%, Colon 等 将 thrB 基因 与 tac 启动 基因 (质粒 pGC42， 见 表 6.4) 融合 ， 并 通过 添加 
IPTG 调控 hox /Ptac-thrB 的 表达 (Colon et al, 1993; Colon et al，199$a，b)。 通 过 提 
高 高 丝氨酸 激酶 相对 于 高 丝氨酸 脱氧 酶 的 活性 ， 基 本 上 消除 了 高 丝氨酸 的 分 这， 最 终 苏 氨 酸 
滴 度 〈 或 效 价 ) 提高 约 120% 〈 见 表 6.4)。 


表 6.4 用 重组 谷 氨 酸 棒 杆 菌 〈C glutamicum) 生产 苏 氨 酸 J 


分 刻 的 氨基 酸 /eg"L 


谷 氨 酸 棒 杆菌 


(C. glutamicum ) 


ATCC 21799(pM2)® 


22.0+1.0 


ATCC 21799(pJD4) 4.5+0.2 1.3+0.1 
ATCC 21799(pGC42)® 
没有 诱导 0.9+0.1 


1.5mmol IPTG 0.9+0.1 


@® RA Colon et al, 1995a, bo 
@ E. coli-C. glutamicum 穿梭 载体 ; pJD4, Km® hom“ -thrB #AF; pGC42, Km® Ap® lagI* hom" tac-thrB 
@ ATCC 21799 (pGC42) 由 适量 已 给 的 IPTG 所 诱导 。 


# 6.4 表明， 大 部 分 的 苏 氨 酸 或 转化 为 异 亮 氨 酸 ， 或 进一步 降解 为 甘氨酸 。 经 标记 物 交 
换 诱 变法 (marker exchange mutagenesis) 构建 意义 明确 的 vA 突变 株 ， 防 止 了 苏 氮 酸 向 
异 亮 氨 酸 的 转变 (Colon et al，1997)。 对 此 ， 重 点 放 在 阻 断 苏 氨 酸 进 一 步 降解 为 甘氨酸 。 
这 是 一 个 更 具 挑 战 性 的 难题 ， 其 包括 多 于 一 条 途径 ， 这 些 基因 在 棒状 杆菌 中 尚未 被 表征 。 

FBR 

SABER (CC. glutamicum) 中 蜡 亮 氨 酸 的 生物 合成 是 从 工 - 苏 氨 酸 经 L-FABM 
氨基 酶 (LTD, ilvA) 催化 转化 为 w- 酮 基 丁 酸 开 始 的 ， 然 后 由 乙酰 羟 酸 合 酶 (AHAS, il- 
vB-iluN ) 催化 e- 酮 基 丁 酸 与 w- 乙 酰 乳 酸 的 缩合 。 此 代谢 途径 也 为 另外 两 条 支 链 氨基 酸 
(BCAA) BUSA RAE BMRA A WHE HT A. JS AAR IE Pe Ei A PE $ 种 不 同 
的 AHAS 同 功 酶 ， 但 在 C. glutamicum 中 只 知道 有 一 种 。LTD 和 AHAS 二 者 均 受 异 亮 氢 
酸 的 抑制 ， 而 AHAS 还 受 亮 氢 酸 与 顷 氢 酸 的 抑制 。 此 外 ， 这 三 种 BCAA 都 抑制 AHAS 的 基 
因 表 达 。 在 棒状 菌 属 中 参与 BACC 生物 合成 的 基因 识别 与 表征 是 在 最 近 几 年 集中 研究 的 主 
题 (Colon et al, 1995; Cordes et al, 1992; Keilhauer et al, 1993). 

通过 与 质粒 pGC42 的 hom" 45 thrB HAAG R ilvA 3A (KE pGC77, W# 6.5) 
的 扩 增 ， 可 以 实现 异 亮 氨 酸 过 量 生 产 CLO AR TAL). Ban Dy 2A BR ABE 7K GY EAE iv A 
基因 通过 一 株 已 . coli ilvuA 突变 株 的 异 源 补充 ， 从 一 个 基于 pM2 的 谷 氨 酸 棒 杆 菌 基 因 组 文 

125 


库 中 分 离 得 到 。 所 产生 的 质粒 (pGC77), 4 A Mi RRR (ATCC 21799) Wt, EPR 
ZARA 1Sg.L 1， 同时 也 有 少量 的 赖 氨 酸 和 甘氨酸 生成 。 碳 平衡 表明 先前 转化 到 苏 氨 酸 、 
赖 氨 酸 、 甘 氨 酸 和 异 亮 氨 酸 的 大 部 分 碳 (菌株 21799/pGC42) 现在 通过 新 菌株 (217997 
pGC77) 结合 进 异 亮 氨 酸 中 。 


表 6.5 重组 谷 氨 酸 棒 杆 菌 (C. glutamicum) 生产 异 亮 氨 酸 中 


分 泌 的 氨基 酸 名 'L -1! 
< 人 
<0.1 
<0.1 


BARE A 


(C. glutamicum ) 
ATCC 21799(pM2) 
ATCC 21799(pGC42) 
ATCC 21799(pGC77)2 

® RA Colon et al, 1995. 
@ 由 pGC42 (W# 6.4) KmR ApR lagl* hom™ ilvA tac-thrB 派生 。 
6.1.3 溶剂 

丙酮 、 丁 醇和 乙醇 (ABE) 工业 发 酵 生 产 史 可 追 湖 到 20 人 世纪 初 。 由 于 缺乏 天 然 橡 胶 ， 
英国 商行 Strange 和 Graham 调查 了 生产 合成 橡胶 的 可 能 性 。 后 来 确定 合成 橡胶 的 前 体 丁 二 
烽 和 异 戊 二 烯 可 由 丁 醇 或 异 戊 醇 成 功 生 产 出 来 。 正 是 在 此 形势 下 ，Perkins 教授 和 他 的 助手 
Chaim Weizmann (后 来 他 成 为 以 色 列 第 一 任 总 统 ) 被 招募 来 研究 橡胶 前 体 的 化 学 生产 。 尽 ， 
管 Weizmann 是 学 化 学 的 ， 但 他 不 久 便 得 出 结论 : 这 一 过 程 成 功 的 关键 是 通过 发 酵 ， 于 是 他 
将 自己 再 教育 成 为 一 名 微生物 学 家 。 在 1912 一 1914 年 间 ， 他 筛选 了 几 株 细菌 菌株 并 从 中 成 
功 分 离 出 一 株 菌 ， 最 初 称 为 BY， 后 被 称 为 丙酮 丁 醇 权 菌 (Clostridium acetobutylicum ), 
该 菌 由 淀粉 生产 可 使 丙酮 和 丁 醇 的 得 率 最 高 。 

由 于 第 一 次 世界 大 战 的 爆发 ， 作 为 硝化 纤维 素 胶 体 溶 剂 的 丙酮 需求 量 大 增 ， 使 ABE 发 酵 
过 程 的 发 展 加 速 进行 。 第 二 次 世界 大 战 导 致 丙酮 需求 量 进一步 增长 ， 发 酵 底 物 从 玉米 改 为 糖 “ 
#, AA 20 世纪 30 年 代 这 种 原料 丰富 廉价 。 第 二 次 世界 大 战 后 ，ABE 发 酵 业 开始 衰退 而 且 
在 美国 和 英国 实际 上 已 停止 生产 ， 这 是 因为 出 现 由 石油 生产 的 溶剂 ， 且 糖 密 价 格 不 断 上 涨 。 

ABE 发 酵 过 程 的 衰亡 是 由 于 一 些 自身 系统 的 限制 造成 的 : 如 终 产物 浓度 、 得 率 和 生产 
能 力 都 很 低 ， 不 合适 的 溶剂 比 ， 相 对 高 的 原料 成 本 等 。 微 生物 溶剂 生产 菌 的 基因 工程 可 潜在 
地 振兴 ABE 发 酵 过 程 ， 这 需 强调 如 下 挑战 : 

@ 提高 产品 收 率 ， 并 以 木质 纤维 素 或 废弃 原料 作为 底 物 ; 

e@ 开 发 在 连续 和 固定 化 细胞 系统 展现 高 生产 能 力 的 菌株 ; 

@ 开 发 最 终 产物 浓度 高 且 增 强 了 对 最 终 产物 耐 受 性 的 菌 种 ; 

@ 开 发 容易 调节 溶剂 比例 的 菌 种 。 

在 溶剂 形成 的 开始 ， 几 种 溶剂 基因 酶 的 诱导 表明 溶剂 形成 的 基因 控制 是 非常 重要 的 
(Bennett and Rudolph, 1995; Sauer and Duerre，1995)。 然 而 ， 尽 管 与 几 种 酸 及 溶剂 有 关 
的 基因 已 经 克隆 和 测序 ， 但 代谢 通 量 调控 机 制 的 理解 仍然 是 很 困难 的 。 已 为 一 些 梭 菌 菌株 开 
发 出 一 些 遗 传 工 具 ， 例 如 质粒 载体 。 其 中 包括 : 〈1) 克隆 运载 体 ， 利 用 与 大 范围 宿主 结合 的 
数 肠 球菌 (Enterococcus faecalis) 的 pPAMB81 复制 子 ， 或 枯草 芽孢 杆菌 ( Bacillus subtilis ) 
的 pIM13 复制 子 ; (2) 合适 的 选择 标记 物 是 红 霉 素 或 clarinthromycin ， 其 在 低 的 通用 的 pH 
中 是 稳定 的 ; (3) 在 表达 载体 构建 中 已 经 开发 利用 了 高 度 表达 的 梭 状 芽孢 杆菌 属 ( Clostrid- 
ium) 铁 氧 还 原 蛋 白 启动 基因 ; (4) 结合 转 座 子 Tn916, Tn925 和 Tn1545 在 梭 菌 中 起 作用 ， 

120 


FRAB 
<0.1 
1.9+0.2 
15.1+0.2 


22.02 teu 
0.9+0.1 
0.4+0.1 


<0.1 
11.8+0.6 
051 


<0.1 
4.6+0.2 
0.5+0.1 


-因此 转 座 子 突变 是 可 能 的 。 大 量 的 梭 菌 基因 在 EC. coli 中 已 被 克隆 和 研究 (Bennett and 
Rudolph, 1995; Durre et al, 1995; Papoutsakis and Bennett，1991) ， 等 候 用 于 梭 菌 的 基 
因 - 失 活 生 理 研究 中 。 

FART BRE (CC. acetobutylicum) 中 酸 和 溶剂 形成 基因 首次 成 功 克 隆 是 1992 年 报道 
的 ， 其 用 于 菌 种 ATTC 824 中 乙酰 乙酸 脱羧 酶 (adc) BRET RA (pth) 的 异 源 过 量 
“表达 (Mermelstein et al, 1992) ( 见 图 2.8)。 随 着 B. subtilis/C. acetobutylicum FRR 
体 (pFNK1) 的 发 展 ， 连 同一 个 改进 了 的 电 转 化 方案 ， 做 到 这 一 点 是 可 能 的 。 乙 栈 乙 酸 脱 
WM (AADC) 是 丙酮 生产 途径 中 的 末端 酶 ， 它 把 乙酰 乙酸 转化 为 丙酮 和 CO。 磷酸 转 丁 酰 
酶 (PTB) 是 丁 酸 生产 的 分 支点 酶 ， 把 丁 酰 辅酶 A 与 无 机 磷酸 转化 成 丁 酰 磷酸 (随后 再 由 
丁 酸 激 酶 转化 成 丁 酸 ) 和 还 原 辅酶 A。 或 以 另外 的 方式 ， 丁 酰 辅酶 A 经 两 步 酶 催化 过 程 转 
MATE. ita AADC 活力 在 指数 期 提高 9 倍 多 ， 在 稳定 期 提高 了 33 倍 多 ， 而 工程 菌 
PTB 活力 在 指数 期 提高 20 多 倍 ， 稳 定期 提高 40 多 倍 。 经 转化 的 菌株 表明 了 丙酮 、 丁 醇 、 
乙醇 的 水 平分 别提 高 953% 、37% 和 90% 。 此 外 ， 工 程 菌 中 发 酵 终 点 的 酸 浓度 比 对 照 组 低 得 
Z (MK 22 倍 ) ， 而 且 重 新 设计 的 菌 种 由 葡萄 糖 为 原料 的 溶剂 收 率 提 高 约 S0% 。 

在 一 不 同 的 研究 中 ， 通 过 改变 C . acetobutylicum NCIMB 8052 的 底 物 范围 ， 证 明了 在 
梭 菌 中 遗传 操作 的 可 行 性 : 将 含有 取 自 C. acetobutylicum WcelC McelA 基因 的 人 工 操纵 
子 转移 到 NCIMB 8052 菌株 中 ,产生 的 转化 体能 以 地 衣 淀 粉 〈 一 种 8- 聚 糖 ) 作为 惟一 碳 源 
进行 生长 。 

1,3- 丙 二 醇 

1,3- 两 二 醇 (1,3-PD) 是 化 学 和 聚合 物 合成 中 的 一 个 中 间 物 ， 例 如 在 聚氨酯 与 聚 酯 的 合 
成 中 。 其 目前 由 石油 生产 ， 而 且 相 对 于 类 似 的 二 醇 ， 其 生产 成 本 十 分 昂贵 。Tong 等 (1991) 
RW SRE. oli ABET A, CRPAKAMR GE BIARA (Klebsiella pneu- 
moniae) dha 调节 子 的 基因 。 在 肺炎 克 雷 们 氏 菌 中 的 dha 调节 子 能 使 菌 体 在 甘油 培养 基 上 
RBA KFS 1,3-PD. E. coli PRAA dha 系统 ， 如 果 没 有 一 个 外 源 电 子 受 体 ， 其 不 
能 在 甘油 培养 基 上 厌 氧 生长 ,也 不 产生 1,3-PD。 在 第 一 步 ( 见 图 6.6)， 甘 油 在 以 B,> 为 畏 


、 甘油 脱水 酶 
chad) 


NADH 


NAD* 


1.3- 丙 二 醇 
氧化 还 原 酶 (dja7) 


图 6.6 甘油 在 K. pneumoniae 中 的 异化 途径 
#£ E.coli #K. pneumoniae 的 dhaB 和 dhaT 基因 的 克隆 得 到 一 株 重 组 菌 
pe ate Ro cy 1,3- 丙 二 醇 
DHA-P 一 磷酸 二 羟 丙 酮 


127 


酶 的 脱水 酶 作用 下 转化 为 3- 羟基 两 醛 ， 然 后 在 以 NAD 为 辅助 因子 的 氧化 还 原 酶 作用 下 还 原 
为 1,3- 两 二 醇 。 

#£ E. coli AGI 中 构建 的 K. pneumoniae ATCC 25955 基因 组 文库 ， 增 加 了 在 甘油 和 
二 产 丙 酮 上 厌 氧 生长 的 能 力 ， 并 筛选 用 于 1,3- 两 二 醇 的 生产 。 从 产 1,3- 两 二 醇 的 正 . coli A 
株 中 分 离 到 黏 粒 PTC1， 并 发 现 它 具有 与 dha 调节 子 的 四 个 基因 相关 的 酶 催化 活性 : 甘油 脱 
水 酶 (dhaB), 1,3-A— BAIR (dhaT), HARARE (dhaD) MHRA 
(dhaK) 〈( 见 图 6.6)。 这 四 种 酶 的 活性 均 可 通过 甘油 的 存在 而 诱导 。 当 下 .coli AGA/TCI 
在 复合 培养 基 加 甘油 上 生长 时 ，1,3- 两 二 醇 对 甘油 的 得 率 为 0.46mol'mol !。 主 要 的 发 酵 副 
产物 是 甲酸 、 乙 酸 和 D- 乳 酸 。1,3- 两 二 醇 发 酵 为 研究 一 个 外 源 宿 主 中 生化 途径 的 相互 作用 
及 为 代谢 途径 工程 发 展 策略 提供 了 一 个 有 用 的 模型 系统 。 

该 领域 还 需 进 一 步 发 展 以 满足 最 小 化 副 产 物 形成 、 消 除 甘 油 补 充 的 需要 ， 还 要 扩大 底 物 
范围 到 丰富 的 可 再 生物 质 。 最 大 理论 收 率 为 0.87$mol 1,3-PD/mol 甘油 ， 这 一 结果 表明 收 
率 还 能 提高 。 由 于 需要 还 原 力 的 再 生 ， 因 此 没有 一 种 微生物 能 将 甘油 全 部 转化 为 1,3-PD 和 
CO:。 细 胞 通过 形成 一 个 副 产 物 混合 物 〈 如 乙酸 、 甲 酸 等 ) 而 使 还 原 力 (NADH) 再 生 ， 因 
此 实质 上 将 最 大 理论 得 率 降 至 0.667mol.mol-:。 原 则 上 ， 有 可 能 用 成 糖 或 己 糖 补充 甘油 发 
酵 以 提供 还 原 力 的 另 一 个 来 源 。 这 些 过 程 的 理论 得 率 〈 每 摩尔 甘油 可 得 1,3-PD 的 量 ， 以 摩 
尔 计 ) 概括 如 下 (Tong and Cameron, 1992): 

— 2glycerol — glucose+2 1,3-PD + 2acetate + 2formate=0 (理论 得 率 =1.0mol'mol 1) 


(甘油 ) (葡萄 糖 ) (ZR) (FAR) 
— 5glycerol — 3xylose + 5 1,3-PD + S5acetate + Sformate=0 (理论 得 率 =1.0mol'mol “!) 
(AE) 


用 携带 有 OK. pneumoniae dha ATIF IE. coli 菌株 进行 中 试 ， 在 加 有 共同 底 物 的 甘 
油 中 生长 ， 确 实 提高 了 1,3-PD 收 率 : 仅 甘油 为 底 物 ， 收 率 为 0.46mol'mol !; 甘油 + 葡萄 
糖 为 底 物 ， 收 率 为 0.63mol.mol-!; 甘油 + 木 糖 为 底 物 ， 收 率 为 0.5Smol.mol !。 这 些 提 高 
在 经 济 上 是 十 分 重要 的 ， 因 为 葡萄 糖 和 木 糖 的 价格 明显 低 于 甘油 的 价格 。 


6.2 扩大 底 物 范围 


该 领域 的 大 部 分 工作 集中 于 工程 菌 以 便利 用 木 糖 和 乳糖 ， 木 糖 是 半 纤 维 素 生 物质 中 的 主 
要 五 碳 糖 ， 乳 糖 是 乳品 工业 主要 副产品 ， 其 它 一 些 努力 考虑 了 另外 一 些 丰富 的 碳 源 如 乳 清 、 
淀粉 和 纤维 素 的 利用 。 一 般 说 来 ， 微 生物 菌 种 利用 一 系列 碳 能 源 能 力 的 扩大 提供 了 在 设计 中 
增加 的 适应 性 ， 并 改进 了 发 酵 过 程 的 经 济 可 行 性 。 这 一 点 对 一 些 大 宗 产 品 生产 来 说 特别 重 
要 , 因 其 底 物 费用 在 总 生产 成 本 中 占 了 相当 大 比例 〈 对 乙醇 约 占 60% ~65%, MAR 
40% 一 45% ， 抗生素 和 工业 用 酶 23% 一 35% )。 由 于 大 多 数 微生物 分 享 大 量 共 同 代 谢 途 径 ， 
因此 扩大 底 物 范围 通常 只 需 添 加 少数 几 个 酶 反应 步骤 即 可 。 然 而 ， 有 时 这 些 步骤 需要 与 下 游 
反应 协调 ， 而 且 正 是 在 这 种 情况 下 ， 代 谢 工 程 工 具 确 实 是 非常 有 用 的 。 
6.2.1 成 糖 代谢 生产 乙醇 的 代谢 工程 

在 向 肠 细菌 中 引入 乙醇 基因 的 同时 ， 类 似 的 工作 也 在 着 手 进 行 ， 以 便 在 乙醇 生产 野生 菌 
S. cerevisiae MZ. mobilis 中 构建 组 成 戌 糖 代 谢 途 径 。 通 常 ， 微 生物 经 两 条 独立 路 线 将 木 
糖 代谢 为 木 酮 糖 (COLES 6.7)。 由 木 糖 异 构 酶 所 催化 的 一 步 途径 在 细菌 中 是 很 典型 的 ， 而 包 
括 木 糖 还 原 酶 和 木 糖 醇 脱 氢 酶 的 两 步 反 应 通常 存在 于 酵母 中 。 木 酮 糖 接着 被 ATP 磷酸 化 ， 

128 


”经 戊 糖 磷酸 途径 和 EMP ( 糖 酵 解 ) 途径 (RED RE, OZ. mobdilis FRAP) 发 生 分 解 
Rit, RULE, WIAA EAC EL. coli 和 其 它 一 些 细菌 中 被 克隆 和 表征 
(Lawlis et al, 1984; Rygus et al，1991)。 分 离 能 利用 木 糖 的 野生 乙醇 基因 微生物 的 努力 还 
没有 取得 成 功 ， 这 些 为 向 生物 体 导 人 木 糖 利用 基因 提供 了 原动力 。 这 些 生 物体 主要 是 用 于 乙 
醇 生产 ， 这 样 就 会 有 高 的 乙醇 抗 性 的 优点 。 


NADPH 磷酸 戊 糖 途 径 


木 糖 醇 脱 氨 酶 
EMP( 或 ED) 


NAD 途径 


图 6.7 在 细菌 和 酵母 中 的 木 糖 代 谢 

酵母 

尽管 某 些 类 型 的 酵母 ， 例 如 Pachysolen tannophilus, HAIR EAR EEE (Pichia stipitis) 或 
Candida shehatae 等 酵母 菌 可 以 发 酵 木 糖 ， 但 是 与 S . cerevisiae 等 普通 的 发 酵 葡萄 糖 的 酵母 相 
比 ， 它 们 的 乙醇 得 率 很 低 且 乙醇 耐 受 力也 很 低 。 最 初 ， 试 图 在 S. cerevisiae PREKA E. 
coli (Sarthy et al, 1987) 或 再. subtilis (Hollenberg and Sahm, 1988) 的 木 糖 异 构 酶 基因 ， 以 
引入 一 步 木 糖 代谢 途径 ， 结 果 由 于 在 重组 宿主 细胞 中 异 源 蛋 白质 的 失 活 都 没 能 成 功 。 

在 大 部 分 酵母 菌 和 真菌 中 ， 木 糖 还 原 酶 和 木 糖 醇 脱 氢 酶 分 别 依赖 于 NADPH 和 NAD 
(图 6.8)。 然 而 ， 有 这 样 的 一 些 例子 ， 酵 母 木 糖 还 原 酶 〈 例 如 来 自己 .stipitis AC. she- 
hatae) 具有 双重 辅酶 特异 性 (BI NADPH 与 NADH)。 这 种 类 型 的 酶 有 防止 NADANADH 
氧化 还 原 系 统 不 平衡 的 优势 ， 尤 其 是 在 限制 氧 的 情况 下 。 最 近 ， 已 .sipitis 中 对 于 木 糖 还 原 
酶 和 木 糖 醇 脱 氢 酶 的 基因 被 导入 S. cerevisiae (ARH) (Kotter et al, 1990; Tan- 
tirungkij et al, 1993), SP. stipitis 在 厌 氧 条 件 下 将 木 糖 主要 转化 为 乙醇 ， 但 重组 菌 S . 
cerevisiae (菌株 H) 的 乙醇 生产 处 于 很 低 的 边缘 (2.7g'L 1)， 伴随 着 大 量 的 木 糖 醇 的 累积 
(3$g'"L 1)。 观 察 到 好 氧 条 件 下 乙醇 得 率 和 生产 能 力 较 高 ， 这 可 解释 为 改进 了 NAD 从 
NADH 的 再 生 ， 进 而 刺激 了 木 糖 醇 脱 氧 酶 。 在 S . cerevisiae 中 木 糖 利 用 能 力 附加 的 限制 也 
归 因 于 非 氧化 PPP 的 低 效 无 能 ， 如 7- 磷 酸 - 景 天 庚 酮 糖 的 积累 所 显示 。 

试图 对 细胞 经 随机 突变 和 菌 种 筛选 来 进一步 改进 菌株 再 ， 使 所 说 的 细胞 能 在 木 糖 培养 基 
上 迅速 生长 (Tantirungkij et al, 1994), AWE, BPR IM2 在 木 糖 培 养 基 中 生长 速率 比 
菌株 百 快 3 倍 ， 这 表明 了 木 糖 还 原 酶 和 木 糖 醇 脱 氢 酶 二 者 的 活力 都 很 低 ， 但 木 酮 糖 激酶 的 
比 活性 高 1.5 倍 。 然 而 ， 尽 管 较 高 的 生长 速率 ， 但 菌株 IM2 乙醇 生产 勉强 改进 到 4.2¢- 
Lo, WH 0.08g-g7!. 

运动 发 酵 单 胞 菌 (Zymomonas mobilis ) 

对 于 乙醇 生产 菌 Z. mobilis 来 说 ， 木 糖 也 会 是 一 种 有 用 的 碳 源 。 运 动 发 酵 单 胞 菌 是 一 
种 杆菌 ， 是 生产 含 酒 精 饮料 的 天 然 发 酵 剂 ， 已 经 表明 其 乙醇 生产 能 力 高 于 酵母 。 总 之 ， 这 表 
现 出 作为 生产 乙醇 的 理想 催化 剂 所 尝试 的 很 多 所 希望 的 特性 ， 例 如 高 的 乙醇 得 率 、 选 择 性 和 
比 生 产能 力 、 对 低 pH 值 和 高 乙醇 浓度 耐 受 力 强 等 。 在 葡萄 糖 培养 基 中 ，Z .xzopilis 产 乙 醇 
水 平 至 少 可 达 12%(zw/u)， 得 率 高 达 理 论 值 的 97% 。 与 酵母 相 比 ，Z .xzopzlis 展现 收 率 
129 


==} 


氧化 PPP 


3 5- 磷酸 木 酮 糖 


图 6.8 重组 菌 S cerevisiae 中 厌 氧 木 糖 利 用 与 辅助 因子 的 再 生 
#5: EMP 一 糖 酵 解 途径 ; PPP 一 戊 糖 磷酸 途径 ; XR 一 木 糖 还 原 酶 ; XDH 一 木 糖 醇 脱 氢 酶 ; XK 一 木 酮 糖 激酶 ; 
GAP 一 3- 磷 酸 甘 油 醛 ; F6P 一 6- 磷 酸 果糖 


高 出 5% 一 10% ， 体 积 生 产能 力 大 于 5$ 倍 。 该 菌 引 人 注目 的 高 得 率 归 因 于 发 酵 期 间 减 少 了 生 
物 菌 体 的 形成 ， 其 显然 受 ATP 可 利用 性 的 限制 。 注 意 ， 该 菌 经 ED 途径 [ 见 反 应 式 (2.6) 
和 方 框 6.1] 每 摩尔 葡萄 糖 仅 产 生 Amol ATP， 而 酵母 菌 (EMP 途径 ) 每 摩尔 葡萄 糖 产 
2mol ATP。 事 实 上 ， 发 酵 单 胞 菌 属 是 至 今 惟一 被 确认 为 仅 限 于 厌 氧 利用 ED 途径 的 菌 属 。 
此 外 ， 葡 萄 糖 能 以 促进 扩散 方式 很 容易 地 穿 过 细胞 膜 ， 被 高 度 活跃 的 丙酮 酸 脱羧 酶 /乙醇 脱 
氢 酶 系统 有 效 地 转化 为 乙醇 。 该 菌 属 被 公认 为 是 一 种 安全 (GRAS) 微生物 而 用 作 动 物 饲 
料 。 正 如 前 面 所 述 ， 此 微生物 的 主要 缺陷 是 它 只 能 利用 和 葡萄糖、 果糖 和 蔗糖 ， 因 此 不 能 发 酝 
可 广泛 利用 的 戊 糖 。 

上 述 情况 导致 美国 国家 再 生 能 源 实验 室 (Golden , CO) 的 Zhang 等 人 试图 在 QZ . 
mopilzs 中 引入 一 条 戊 糖 代谢 途径 (Zhang et al，1995)。 早 期 其 它 一 些 研 究 组 尝试 用 取 自 克 

130 


BARE (Klebsiella) 或 黄 单 胞 菌 (Xanthomonas) HARE RAB 〈zyLA ) 和 木 酮 糖 激酶 
(zyWB) 基因 ( 见 图 6.7)， 尽 管 这 些 基 因 能 在 Z. mobdilis 中 进行 功能 性 表达 ， 但 并 没有 真 
正成 功 。 后 来 不 久 就 清楚 了 ， 这 些 失 败 是 由 于 在 Z. mobilis 中 不 存在 可 觉察 的 转 酮 糖 酶 和 
转 醛 糖 酶 的 活性 ， 而 这 些 酶 活性 对 完成 一 条 功能 性 成 糖 代谢 途径 是 必要 的 〈 见 图 6.9)。 在 
RMSE. coli 转 酮 糖 酶 基因 并 将 其 引入 QZ. mobilis 之 后 ， 小 部 分 木 糖 转 化 成 了 CO. AS 
醇 (Feldmann et al，1992)。 下 一 步 是 要 引入 转 醛 糖 酶 反应 ， 因 为 该 菌 体 胞 内 积累 了 大 量 的 
也 磷酸 - 景 天 庚 酮 糖 。 应 用 精密 的 克隆 技术 构建 一 个 携带 有 两 个 独立 操纵 子 的 嵌 合 型 穿梭 载 
fK (pZB5): 其 中 一 个 操纵 子 编码 E. coli zyLA 和 zyiB 基因 ， 另 一 个 表达 E. coli 转 酮 糖 
Bi O(rktA) FARR (ral) 的 基因 。 含 有 4 个 木 糖 同化 和 无 氧化 性 的 磷酸 戊 糖 途 径 基 因 
的 两 个 操纵 子 成 功 地 在 Z. mobilis CP4 中 进行 表达 ， 该 重组 菌 有 能 力 在 以 木 糖 为 惟一 碳 源 
的 培养 基 上 快速 生长 ， 而 且 可 有 效 地 将 葡萄 糖 和 木 糖 转化 为 乙醇 ， 对 木 糖 和 葡萄 糖 的 得 率 分 
吻 可 达 理 论 值 的 86% 和 94% 。 对 前 面 所 讨论 的 在 E. coli 中 表达 QZ . mobilis PET 操纵 子 生 
产 乙醇 来 说 是 一 个 互补 的 方法 。 


图 6.9 用 代谢 工程 菌 Z. modilis 由 成 糖 生产 乙醇 
缩写 : XR 一 木 糖 还 原 酶 ; XDH 一 木 糖 醇 脱 氢 酶 ; ITK 一 转 酮 糖 酶 ;TA 一 转 醛 糖 酶 


方 框 6.1 重组 发 酵 单 胞 菌株 基于 木 糖 的 理论 乙醇 得 率 
此 重组 菌 中 乙醇 生产 的 化 学 计量 学 〈 见 图 6.8) 可 总 结 如 下 [忽略 NAD (P) HAD 
平衡 ]: 


3 木 糖 +3ADP + 3P, 一 5 GH + SCO, + 3ATP + 3H20 


于 是 ， 乙 醇 理 论 得 率 为 0.5lg 乙醇 .g 1! 木 糖 (1.67mol.mol-1)。 值 得 重视 的 是 经 过 
代谢 工程 的 途径 从 lmol 木 糖 仅 生 成 1Imol ATP， 与 通过 成 糖 磷酸 和 下 MP 两 条 途径 的 组 


合 相 比 ， 后 者 lmol 木 糖 可 生成 S 人 3mol ATP。 能 量 限制 导致 形成 较 少 的 生物 菌 体 量 ， 进 
而 使 底 物 向 产物 有 效 地 转化 。 


6.2.2 ”纤维 素 - 半 纤 维 素 解 聚 作用 

如 果 能 利用 木质 纤维 素 生 产 乙 醇 的 微生物 也 有 能 力 利用 纤维 素 、 半 纤维 素 及 相关 的 碳水 
化 合 物 ， 这 会 是 非常 吸引 人 的 。 许 多 植物 致 病菌 〈 软 - 腐 细 菌 ) 例如 胡 葛 卜 软 腐 欧文 氏 菌 
(Erwinia carotovora) FI4G EK XC (Erwinia chrysanthemi) 已 经 进化 有 复杂 精密 的 水 ， 
解 酶 和 有 裂解 酶 系 。 该 酶 系 有 助 于 木质 纤维 素 的 增 溶 ， 人 允许 它们 浸 软 并 渗 和 人 植物 组 织 (Kado， | 
1992)。 这 些 细菌 的 基因 工程 用 于 生产 乙醇 是 一 个 有 吸引 力 的 选择 ， 它 可 取代 化 学 法 或 酶 法 
对 木质 纤维 素 生 物质 的 增 溶 。 用 PET 操纵 子 对 E. carotovora SR38 和 E. chrysanthemi 
EC16 进行 基因 工程 ， 结 果 表明 可 从 纤维 二 糖 、 葡 萄 糖 和 木 糖 高 效 地 生产 乙醇 和 CO? 作为 初 
级 发 酵 产物 (Beall and Ingram，1993)。 这 两 种 含 乙醇 基因 的 欧文 氏 菌 属 (Erwinia) 菌株 
在 48h 以 内 可 由 100g'L ! 纤 维 二 糖 生 产 约 50g'L ! 乙 醇 ， 乙 醇 最 大 体积 生产 能 力 达 1.5¢- 

L -1L.h- 1。 此 速率 是 所 报道 的 利用 纤维 二 糖 的 酵母 菌 Brettanomyces custersii 生产 乙醇 速率 

的 两 倍 多 (Spindler et al, 1992). 

沿 着 类 似 的 路 线 ， 也 尝试 着 将 糖化 特性 导 和 人 乙醇 生产 菌 中 。 从 嗜 热 菌 C . thermocellum 
中 获得 的 编码 木 聚 糖 酶 的 基因 (zyzZ )， 在 乙醇 基因 菌 正 . coli KO11 和 开 . oxytoca MSA1 
(pLO1555) 高 细胞 质 水 平 被 表达 (Burchhardt & Ingram，1992 )。 木 聚 糖 酶 是 一 种 热 稳 定 
酶 ， 它 将 木 聚 糖 解 聚 为 其 主要 的 单 体 物 (99% )- 木 糖 。 为 了 增加 培养 基 中 木 聚 糖 酶 的 量 ， 以 
利于 木 聚 糖水 解 ， 在 一 个 二 级 循环 过 程 中 使 用 单一 基因 工程 菌 进行 高 分 子 原料 发 酵 生 产 乙 
醇 ， 收 集 含 木 聚 糖 酶 的 细胞 ， 并 将 它们 加 到 6057 的 木 聚 糖 溶液 中 ， 从 而 从 细胞 中 涂 解 并 释 
放出 木 聚 糖 酶 以 进行 糖化 。 冷 却 至 30 人 后， 水 解 物 发 酵 生 产 乙 醇 ， 与 此 同时 ， 再 补充 木 聚 
糖 酶 以 进一步 糖化 。 在 这 种 应 用 中 ， 发 现 久 . ozytoca 是 一 株 优良 菌 ， 因 为 除 木 糖 (下 .coii — 
可 代谢 的 ) 之 外 ， 它 也 能 消耗 木 二 糖 和 木 三 糖 。 尽 管 MSA1 (pLO1555) 的 最 大 理论 得 率 超 
过 了 48g'L -! 乙 醇 人 100g'L 1) 木 糖 ， 但 是 该 过 程 只 达到 最 大 得 率 的 1/3， 因 为 该 菌 体 不 能 
代谢 木 四 糖 和 更 长 的 低 聚 物 。 得 率 显 然 是 由 工业 木 聚 糖 的 可 消化 性 所 限制 ， 而 不 是 由 于 木 聚 
糖 酶 活性 的 缺乏 及 乙醇 的 毒性 。 
6.2.3 乳糖 和 乳 清 利用 

乳 清 (WHEY) 是 乳品 工业 一 种 营养 丰富 的 副 产 物 ， 它 可 为 生物 工艺 过 程 提 供 廉价 的 
碳 源 和 氮 源 。 乳 清 中 含 大 量 乳 糖 (FEW 5%) 和 有 和 蛋白质 (12% 一 14%)， 还 含有 少量 有 机 
酸 、 矿 物质 和 维生素 ， 其 年 产量 达 101kg。 虽 然 乳 清 中 的 和 蛋白质 经 分 离 浓 缩 用 于 食品 OLA 
6.10)， 但 在 渗透 物 中 的 乳糖 和 盐 类 利用 价值 低 而 常常 废弃 。 这 除了 造成 有 用 营养 物 的 浪费 
外 ， 对 其 处 置 也 需要 很 高 的 污水 处 理 费 用 。 于 是 人 们 正在 强化 努力 以 寻找 乳 清 尤其 是 渗透 物 
利用 的 新 方法 。 图 6.10 归纳 了 一 些 利 用 乳 清 副 产 物 为 原料 的 发 酵 过 程 举例 。 

尽管 许多 微生物 可 以 利用 乳 清 ， 但 工业 上 最 重要 的 一 些微 生物 如 S$. cerevisiae. Z. 
mobilis MAF WK (Alcaligenes eutrophus) 却 不 能 利用 乳 清 。 乳 糖 的 利用 需要 有 分 解 
代谢 酶 8- 半 乳糖 苷 酶 (由 lacZ 基因 编码 ) ， 以 便 将 乳糖 二 糖水 解 为 其 组 成 糖 葡萄 糖 和 半 乳 
糖 。 此 外 ， 与 葡萄 糖 和 半 乳 糖分 解 代 谢 途 径 一 起 ， 一 个 有 效 的 乳糖 运转 系统 也 是 需要 的 。 这 

132 


80% ~ 90% (质量 ) 


>1.15 
SM. 0.7% 
脂肪 : 0.3% 

无 机 盐 : 0.4% ~0.5% 
水 溶性 维生素 


发 物 利 用 
高 化 学 需 氧 量 
(COD: 60~80 g/L) 


hi eae 
Leper ine ramen 


| 食品 方面 应 用 | 


ff AA KARE SHARE 厌 氧 消化 


2) | [ate 
脂 类 丙酮 err 
色素 丁 醇 黄 原 胶 
图 6.10 发 酵 过 程 中 乳 清 组 分 的 利用 (von Stockar and Marison, 1990) 


些 需要 在 早期 的 工作 中 是 明显 的 ， 这 些 工作 包括 : MW) BARE (Yersinia enterocoliti- 
ca) 将 乳糖 转 座 子 Tn95$1 (44 lacl, lacZ MlacY 基因 : WS BAK /ac 操纵 子 部 分 ) 
SA Z. mobilis (Carey et al, 1983; Goodman et al, 1984), 8 E. coli 8- 半 乳糖 苷 
酶 在 该 菌株 中 成 功 表达 ， 但 乙醇 得 率 比 理论 值 要 低 得 多 ， 原 因 至 少 有 两 点 : 第 一 ， 乳 糖 虽 由 
有 - 半 乳 糖苷 酶 切 为 葡萄 糖 和 半 乳 糖 ， 但 重组 菌 Z. mopilis 只 利用 葡萄 糖 发 酵 生产 乙醇 ， 而 
半 乳 糖 不 断 累 积 到 抑制 浓度 (Yanase et al，1988)。 这 表明 除 乳 糖 操 纵 子 外 ， 还 需要 半 乳 糖 
操纵 子 。 第 二 ， 很 低 的 乙醇 生产 能 力 是 由 于 乳糖 吸收 慢 造 成 的 。 后 来 的 研究 利用 Tn951 在 
嗜 糖 假 单 胞 菌 «(Pseudomonas saccharophila) 和 真 养 产 碱 菌 (Alcaligenes eutrophus) PR 
达 8- 半 乳糖 苷 酶 (Pries et al，1990)。 这 使 得 P. saccharophila 的 转 结 合体 (transconju- 
gant) 可 在 乳糖 无 机 培养 基 上 缓慢 生长 而 其 原 菌 株 完 全 不 生长 。 质 粒 pPL76， 包 含 着 一 个 
A. eutrophus 启动 基因 -Lac2 HRA, BEE A. eutrophus 不 仅 表 达 8- 半 乳糖 苷 酶 ， 还 能 在 乳 
糖 培养 基 上 缓慢 生长 。 随 后 ， 又 将 正 . coli gal 操纵 子 转 人 这 些 菌 株 中 以 允许 利用 半 乳 糖 。 
E. coli lacZY 操纵 子 (编码 8- 半 乳糖 苷 酶 和 乳糖 通 透 酶 ) 也 被 整合 在 Pseudomonas 
aeruginosa 的 染色 体 上 ， 尸 . aerxgizosa 是 生物 表面 活性 剂 鼠 李 糖 脂 的 重要 生产 菌 (Koch et 
al，1988) 。 转 结合 体 (transconjugant) 在 乳糖 培养 基 〈 基 础 培养 基 + 乳 清 ) 中 生长 良好 ， 
并 在 稳定 期 生产 鼠 李 糖 脂 。 在 噬菌体 %LO 启动 基因 控制 下 ， 巨 . coli lacZY 基因 也 被 插入 野 
油菜 黄 单 胞 菌 (Xanthomonas campestris) 中 ，X. campestris 是 一 种 给 世界 范围 内 农业 造 
成 巨大 损失 的 细菌 ， 但 它 可 用 来 生产 黄 原 胶 (Fu and Tseng，1990)。 通 常 ， 都 是 利用 葡萄 
糖 、 莽 糖 或 淀粉 培养 基 生 产 黄 原 胶 。 然 而 ， 该 重组 菌 表达 了 高 水 平 的 8- 半 乳糖 苷 酶 并 在 包 
133 


SASH -REHBREPLKAS. CAHUABREA SRNR LERE RR 
进行 了 评价 ， 结 果 发 现 用 这 些 底 物 生产 黄 原 腕 与 用 葡萄 糖 为 原料 的 产量 相当 。 这 些 实例 显示 
出 一 些 极 具 吸引 力 的 过 程 。 其 在 处 理工 业 废物 的 同时 可 生产 出 十 分 有 用 的 物质 。 

另 一 种 可 供 选择 的 策略 是 构建 一 株 菌 ， 它 能 向 培养 基 或 周 质 中 分 沁 PLAREM, 
羽 糖 在 此 可 自由 扩散 。 应 用 此 法 于 苹 母 ， 8H GMA (Aspergillus niger) HA: 
i. RREEEH PEAREMER (IacA ) THE RAMA S. cerevisiae BL 
(Kumar et al, 1992), BRIER, A 40% 的 重组 蛋白 分 这 到 培养 基 中 ， 使 S cerevisiae 能 
在 乳 清 渗透 物 (4% zu AE) PEK, SHH 1.6h。 与 早期 的 乳 清 发 酵 过 程 相 比 
该 方法 具有 明显 的 优点 。 早 期 的 过 程 或 是 利用 8_ 半 乳糖 音 酶 预 水 解 的 乳 清 。 或 是 将 酵母 
oR EL. } 

完整 的 E. coli ARATE BES A REBATE C. glutamicum R163 中 (Brabez et al, 
1991). 4H lac HAMEA C. glutamicum 在 强 启动 基因 的 控制 下 ， 在 以 乳糖 为 惟一 碳 源 的 上 
特定 培养 基 (3% io/u) 中 迅速 生长 。 生 长 特征 (与 在 葡萄 糖 培养 基 的 生长 没什么 区 别 ) 取 决 于 际 汪 
lacZ 以 外 lacY EAA ME. Hob, BRE, rae) 8 OESL REEDS 
HAM. Ki, RARWER RET ATER Se? Se ESL. 
6.2.4 BHA 


BEZEL. REZ E. coli 菌株 能 利用 蔗糖 ， 但 氨基 酸 工业 极 有 潜力 的 生产 菌 下 - coli 
K-12 却 不 能 在 芒 糖 中 生长 。 许 多 研究 人 员 试 图 表达 其 它 菌 种 的 蔗糖 利用 系统 (Scr*), BA 
不 能 在 瓦 . coli K-12 中 稳定 地 保持 Scr”* 表 型 。 最 近 ， 一 个 尝试 从 下 述 方法 获得 成 功 : HE 
coli B-62 中 编码 蔗糖 酶 的 xcrA 基因 克隆 在 一 个 质粒 上 ， 然 后 将 克隆 的 DNA 片段 转 到 开 
coli K-12 染色 体 上 。 胡 达 scrA ZWBAE. coli K-12 衍生 的 色 氢 酸 生产 菌株 在 蔗糖 培养 基 申 | 
生长 良好 ， 与 在 葡萄 糖 上 生长 的 类 似 菌株 相 比 (Tsunekawa et al, 1992), EDBIKBEA 
AB (5.7g-L- 1)。 
6.2.5 降解 淀粉 的 微生物 
和 由 琅 米 、 谷 物 等 再 生 资 源 获 得 的 淀粉 是 生物 工艺 过 程 中 十 分 重要 的 兢 源 和 能 源 物质 ; kB 
粉 代替 葡萄 糖 不 仅 能 降低 发 酵 原 料 成 本 ， 并 且 可 以 减 至 最 小 甚至 消除 葡萄 糖 引起 的 负面 生理 
效应 ， 如 分 解 代谢 阻 遏 或 产 酸 。 
淀粉 是 D -葡萄糖 的 直 链 和 支 链 均 聚 物 的 混合 物 ， 这 些 均 聚 物 直 链 由 D- 葡 萄 糖 经 c (1-4) 
糖苷 键 连接 ， 在 分 支点 由 (1-6) 糖苷 键 连接 。 作 为 植物 体 中 贮 糖 物质 ， 淀 粉 大 量 存在 于 慕 
类 作物 和 人 小麦、 玉米、 大麦、 高 粱 等 作物 种 子 中。 线性 组 分 直 链 淀粉 由 c-1,4-D- 吡 喃 型 葡萄 糖 局 
的 链 组 成 ， 聚 合 度 范围 是 192 一 (4x 10)。 在 分 支 组 分 支 链 淀 粉 中 ， 由 (17 一 23 个 单位 ) a 


约 为 104--(4x107)。 重 要 的 分 解 淀粉 酶 有 四 种 类 型 : v_ 淀 粉 酶 、p_ 泻 粉 酶 、 支 链 淀 粉 酶 或 异 
SHE (BAB) 以 及 糖化 酶 。x._ 演 粉 酶 是 内 切 葡 到 樟 酶 ， 可 随机 切断 ” (1-*4) ER, 


属 、 她 杆菌 属 及 曲霉 属 苗 种 。 8 淀粉 本 通常 存在 于 植物 中 ， 5 am 种 外 切 葡 取 六 本 FI SAE 
分 子 非 还 原 端 开 始 连续 地 切 下 麦芽 糖 单位 。 支 链 淀 粉 酶 和 异 淀粉 酶 属于 脱 支 酶 族 ， 可 水 解 . 
(1>6) 272. @UB2 FAAS, AWE TELE RE EMBER. t 
BAZBALDFERALRARBEEDZAD, AIMMESEPTHED KCBS 
134 


因 克 隆 到 不 同 菌 体 (Kennedy et al，1988)。 这 种 方法 提供 了 一 个 很 有 吸引 力 的 替代 目前 过 
程 的 方法 。 目 前 的 过 程 是 先 用 酶 法 把 淀粉 转化 为 葡萄 糖 和 一 些 低 聚 糖 ， 然 后 将 其 作为 一 个 独 
立 发 酵 步骤 的 碳 源 。 沿 着 这 条 路 线 ， 构 建 了 一 株 含 有 Aszpergillus sp. 糖化 酶 基因 的 S. 
cerevisiae 菌株 (Innis et al，1985S)。 这 株 重 组 菌 能 够 在 淀粉 糊 精 中 生长 ， 尽 管 与 培养 基 中 
加 有 糖化 酶 的 情况 相 比 ， 其 生长 速率 要 慢 些 。 

这 种 重组 菌 有 益 的 应 用 还 包括 酿造 业 和 烘焙 业 。 酿 造 上 ， 大 麦 淀 粉 在 制 才 芽 过 程 中 部 分 
永 解 ， 产 生 大 量 不 能 被 S cerevisiae 菌 发 酵 的 糊 精 。 这 些 糊 精 含 高 热量 ， 在 生产 浅 色 啤酒 
时 必须 将 它 除 去 ， 目 前 是 通过 外 加 糖化 酶 来 完成 的 。 因 此 ， 具 有 淀粉 水 解 特性 的 工程 菌 为 酿 
造 业 提供 了 一 个 合适 的 替代 选择 ， 尤 其 是 在 生产 低热 量 产品 时 。 另 外 ， 这 种 菌 还 可 消除 某 些 
面包 生产 中 对 富 含 -淀粉 酶 的 面粉 的 要 求 。 

具有 上 述 所 希望 的 特性 的 菌株 最 近 已 经 构建 成 功 ， 它 是 通过 在 S. cerevisiae 菌 中 表达 
酵母 Schwanniomyces occidentalis wx- 淀粉 酶 (AMY1) 和 糖化 酶 (GAM1) 基因 而 进行 的 
(Hollenberg and Strasser，1990) 。 比 较 性 的 酶 催化 研究 表明 ， 工 程 化 的 淀粉 水 解 系统 像 原 
来 的 S . occidentalis 菌 一 样 有 效 。 在 液化 小 麦 粉 发 酵 过 程 中 ， 与 通常 的 在 发 酵 之 前 先 加 糖 
兹 酶 的 酒精 酵母 相 比 ， 这 种 重组 菌 具有 同样 的 乙醇 生产 速率 。 


6.3 扩展 产物 范围 ， 增 加 新 产品 


这 对 代谢 工程 来 说 是 一 个 具有 巨大 潜力 的 领域 。 异 源 基因 的 合理 表达 可 扩展 宿主 生物 体 中 
现 有 的 代谢 途径 ， 以 便 大 量 生产 已 知 的 和 全 新 的 有 吸引 力 的 化 学 和 (或 ) 物理 性 质 的 化 合 物 。 
6.3.1 抗生素 

由 微生物 生产 抗生素 是 其 更 有 意义 的 性 能 之 一 ， 尤 其 是 从 医学 和 商业 的 角度 来 看 更 是 如 
此 。 已 从 微生物 中 分 离 出 10000 多 种 抗生素 和 类 似 的 生物 活性 代谢 物 。 同 时 ， 每 年 还 公布 约 
500 种 新 的 低 分 子 量化 合 物 。 从 金融 财政 看 ， 抗 生 素 目 前 是 最 重要 的 一 类 微生物 生物 技术 产 
品 ， 全 世界 年 销售 额 超过 150 亿美 元 。 主 要 品种 包括 : 头孢 菌 素 、 青 霉 素 和 四 环 素 ， 并 且 这 
些 药剂 的 大 部 分 是 由 链 霉 菌 属 〈 和 其 它 放 线 菌 ) 及 不 同 杆菌 生 产 。 尽 管 相当 数 量 的 抗生素 在 
农业 上 和 兽医 中 应 用 ， 但 其 主要 的 用 途 还 是 人 类 感染 性 疾病 的 治疗 。 

抗生素 是 由 次 级 代谢 途径 产生 ， 次 级 代谢 途径 比 初级 代谢 以 不 太 专 一 的 、 有 时 更 复杂 的 
方式 利用 共同 代谢 物 。 例 如 ， 聚 酮 化 合 物 抗 生 素 由 简单 的 脂肪 酸 经 一 条 表面 上 类 似 于 形成 长 
链 脂肪 酸 的 代谢 途径 生成 ， 但 是 所 产生 的 化 合 物 呈 现 出 一 系列 结构 复杂 性 ， 远 远 超过 基本 脂 
肪 酸 简 单 的 碳 氧 化 合 物 骨架 。 最 近 ， 已 经 变 得 非常 明显 ， 包 括 抗 生 素 的 次 级 代谢 物 的 得 率 也 
可 通过 基因 技术 消除 生物 合成 速率 控制 步骤 的 方法 得 以 提高 。 此 外 ， 代 谢 工 程 技术 已 被 用 于 
修饰 已 知 抗生素 以 改进 它们 的 性 质 及 合成 新 的 抗生素 (Summers et al，1992 )。 多 年 来 ， 用 
丝 状 真菌 和 链 霉菌 属 生产 抗生素 是 通过 随机 诱 变 / 筛 选 的 方法 来 改进 的 ， 在 很 少 的 情况 下 是 
通过 选择 高 产 抗生素 的 初级 代谢 前 体 物 突变 株 来 改进 的 。 览 跃 四 十 年 的 工作 开发 的 生产 菌 种 
是 不 太 情 愿 通 过 这 些 传 统 技术 来 改进 的 。 

重组 DNA 技术 的 应 用 是 基于 8- 内 酰胺 生产 菌 遗 传 转化 系统 和 生物 合成 基因 克隆 的 发 
展 。 转 化 重要 工业 微生物 (BI P. chrysogenum AIC. acremonium) 的 能 力 为 生物 合成 途 
径 的 精确 操作 提供 了 一 个 强 有 力 的 工具 和 实际 应 用 方法 ， 例 如 对 可 能 限 速 步骤 的 基因 剂量 研 
究 或 基因 破坏 以 改变 最 终 产 品 。 研 究 发 现 许 多 抗生素 基因 是 成 复 的 ， 而 且 相 关 途 径 的 某 些 基 
因 表 现 出 交叉 杂交 现象 ， 此 发 现 为 该 领域 开辟 了 一 些 新 的 研究 途径 〈Charter，1990)。 基 因 

135 


AM RRB Fee, FA ie He BE A a FF SSE DE AY SS EA TORRE ， 
高 生产 的 可 能 性 。 例 如 ， 在 野生 型 菌株 中 过 量 表达 这 些 调 节 基 因 引 起 了 链 霉 素 、 十 一 烷 基 灵 
菌 红 素 和 放 线 菌 紫 素 的 超 量 生产 〈Charter，1990)。 

链 霉 菌 属 在 具有 工业 重要 性 的 微生物 中 排名 接近 最 高 ， 尤 其 是 作为 抗生素 的 生产 菌 。 放 
线 菌 紫 素 生物 合成 基因 是 从 菌 种 Streptomyces coelicitor (是 遗传 背景 十 分 清楚 的 惟一 菌 属 ) 
转 人 浅 青紫 链 霉 菌 〈(Streptomyces lividans) 中 的 ， 从 而 能 使 后 者 生产 放 线 菌 紫 素 。 后 来 又 ， 
Streptomyces erythreus 中 的 成 复 红 霉 素 基 因 转 人 S . lividans 中 ， 使 重组 菌 生产 红 霉 素 
A。 真 菌 粗 糙 脉 孢 菌 (Neurospora crassa) MMH (Aspergillus niger) 与 含有 产 黄 青 霉 
fA (Penicillium chrysogenum) 的 青霉素 生物 合成 基因 的 黏 粒 的 转化 ， 导 致 由 这 些 菌 种 生 
产 青 霉 素 V 。 

通过 代谢 工程 提高 得 率 已 在 一 些 系 统 中 得 到 证 明 。 例 如 ， 通 过 在 产 黄 头孢 霉 属 
(Cephalosporium acremonium) 中 过 量 表达 cefEF 基因 ， 使 头孢 菌 素 产 量 提高 了 15% 
(Skatrud et al，1989)。 该 基因 编码 一 个 具有 顺序 表现 活性 的 双 功 能 蛋白 : 去 乙酰 氧 基 头 欧 
菌 素 C 合成 酶 和 去 乙酰 基 头 孢 菌 素 C 合成 酶 (DACS)。 重 组 菌 由 于 DACS 酶 活性 增加 两 
倍 ， 因 而 能 将 大 量 分 刻 的 一 个 前 体 物 青霉素 N 转化 为 终 产 物 头 孢 菌 素 C。 这 项 工作 也 识别 
出 头孢 菌 素 C 合成 途径 中 最 后 一 步 反 应 是 潜在 的 控制 步骤 ， 其 对 应 的 酶 是 去 乙酰 基 头 孢 菌 
素 C (DAC) 乙酰 基 转 移 酶 ， 因 为 在 培养 基 中 观察 到 相当 数量 的 去 乙酰 头孢 菌 素 (DAC). . 

重组 DNA 技术 也 能 用 于 制造 杂交 的 甚至 全 新 的 抗生素 。 当 然 ， 在 这 样 的 应 用 中 主要 的 
根本 的 障碍 是 生产 菌 对 新 抗生素 有 抵抗 力 ， 才 能 达到 高 得 率 。 在 不 同 生物 体 中 生物 合成 步骤 
的 基因 可 以 在 同一 生物 体 中 组 合 ， 因 此 ， 就 扩展 了 天 然 抗 生 素 的 多 样 性 。 起 先 ， 将 菌 种 
Streptomyces coelicitor 中 合成 放 线 菌 紫 素 途径 克隆 了 的 部 分 转 和 人 一 株 生 产 麦 迪 霉 素 的 链 霉 
菌 中 (Hopwood et al, 1985), RBA BEM MACHR, RAKAKW RA (meder- 
rhodi7zz )。 天 然 的 麦迪 霉 素 转变 为 麦迪 紫 素 的 过 程 中 包含 一 个 PHELER, AER 
具有 很 宽 的 底 物 专 一 性 酶 的 异 源 8- 羟 基 化 活性 所 催化 。McAlpine 等 已 使 用 一 种 类 似 的 策略 “ 
去 转化 Saccharopolyspora erythraea 的 一 个 突变 株 ， 其 在 红 霉 素 生 物 合成 的 一 个 初期 步骤 由 
来 自 竹 桃 霉 素 生 产 菌 抗 生 链 霉菌 (Streptomyces antibioticus) 的 DNA 文库 所 阻 断 
(McAlpine et al，1987)。 其 中 一 支 重组 菌 产 生 一 种 具有 新 结构 的 抗生素 ， 称 为 2-norery- 
thromycin。 在 产生 新 抗生素 中 的 一 个 更 大 挑战 超出 单一 基 团 的 取代 ， 还 包括 其 主 链 结构 的 
BLAS, PARKIN A ABER A (Streptomyces galilaeus) 通常 生产 阿 克 拉 霉 素 A 和 阿 克 拉 霉 素 
B， 随 后 用 聚 酮 化 合 物 合 酶 基因 对 其 转化 ， 获 得 生产 意 醒 的 克隆 (Bartel et al，1990)。 这 些 
激动 人 心 的 结果 为 将 来 合理 设计 及 合成 新 抗生素 不 断 进 行 的 努力 提供 了 基础 。 

6.3.2 RMA 

TEVA IAP RIL ST ROMA, THEE A A PRIS Bie 
化 合 物 家 族 是 具有 抗菌 性 质 〈 如 四 环 素 和 红 霉 素 ) 和 药理 性 质 〈 如 抗 癌 制 剂 和 免疫 抑制 剂 ) 的 
生物 活性 分 子 。 这 些 分 子 的 合成 包括 称 做 聚 酮 物 合 酶 (PKS) 的 巨型 模块 酶 。 聚 酮 化 合 物 是 由 
简单 脂肪 酸 经 一 条 表面 上 类 似 合成 长 链 脂 肪 酸 的 途径 生成 的 ， 但 所 得 化 合 物 展 现 了 一 系列 复杂 
的 结构 ， 该 结构 远 比 生物 脂肪 酸 的 简单 碳 氢 骨 架 复 杂 得 多 。 与 脂肪 酸 生 物 合成 的 一 个 主要 区 别 
在 于 最 初 的 缩合 〈8- 酮 基 酸 还 原 、 脱 水 、 氢 化 ) AEE ETT SET, TE RR PR 
合 酶 的 模块 结构 。 在 脂肪 酸 合成 中 ， 每 合成 一 轮 增加 一 个 乙酰 基 以 产生 无 支 链 的 长 链 ， 而 在 每 
轮 引 入 的 岂 基 被 还 原 为 CH。 而 在 聚 酮 化 合 物 生物 合成 中 ， 所 添加 的 单元 常 大 于 乙酰 基 〈 如 两 

136 


三 酸 单 酰 辅酶 A)， 并 且 每 个 缩合 步骤 于 延伸 着 的 链 上 增加 两 个 碳 ， 而 添加 单元 的 剩余 部 分 从 
主 链 伸 出 作为 一 个 分 支 。 一 些 痰 基 完 全 不 被 还 原 ， 另 一 些 仅 被 还 原 为 CHOHL。 

将 聚 酮 化 合 物 作 为 代谢 工程 中 一 个 诱 人 的 研究 模式 的 原因 包括 如 下 几 点 : (1) 它们 的 复 
杂 结 构 产 生 于 以 多 种 方式 组 合 的 简单 单元 ; (2) BEA (PKS) 的 模块 结构 允许 酶 结构 控 
制 ， 进 而 聚 酮 化 合 物 的 类 型 能 在 基因 水 平 上 进行 控制 。 本 领域 最 近 的 进展 已 经 建立 了 通过 聚 
酮 物 合 酶 的 基因 工程 产生 新 型 聚 酮 化 合 物 结构 的 基础 ， 同 时 也 为 获得 阐明 聚 酮 化 合 物 合 酶 的 
”结构 -功能 关系 的 知识 葛 定 了 基础 (Kao, 1997; McDaniel et al，1993)。 此 外 ， 该 系统 提供 
了 在 遗传 学 和 化 学 之 间 建 立 桥梁 的 好 机 会 ， 而 且 最 重要 的 是 使 科学 家 在 DNA 水 平 上 合理 设 
计 新 分 子 成 为 可 能 。 

由 红色 糖 多 孢 菌 〈Saccharopolyspora erythrea ) 生产 红 霉 素 

由 S .erythzrea 生产 的 这 种 聚 酮 化 合 物产 品 仅 涉 及 3 个 巨 基因 ， 其 中 每 个 都 编码 一 个 分 


ORF1 ORF2 ORF3 
.模块 1 模块 2 模块 3 模块 4 模块 5 模块 6 
| | 
S S S S S S S 
Si co CO CO CO CO 1 沁 
be i Gs ae oe aguas 1 hey ay 2 |CH—CH, 
oa CHOH CHOH c=0O CH; CHOH 3 » i 
on haces | sme shy ers 4 CH—CH; 
oa ae ue a us 5 eo 
nt dat Linea 2 6 pare 
bes bis bic bs 7 a 
af es. a 8 Gaia 
ue ihe er 9 a i 
ult Lapcihe 10CH—CH, 
os ion 11 CHOH 
ba: 12 rn 
be 13 CHOH 
14 本 
it 


Fl 6.11 2 HEA (Saccharopolyspora erythrea) 中 红 霉 素 A 生物 合成 基因 的 组 织 
DNA 区 分 为 三 个 开放 阅读 框架 (ORFs)， 每 个 编码 一 个 大 的 复杂 的 酶 分 子 。 依 次 每 个 酶 又 可 分 为 两 个 模块 ， 每 
个 连续 模块 为 增长 链 添加 一 个 新 的 丙 酸 基 团 ( 方 框 中 )。 亚 单元 : 酰基 转移 酶 (AT)、 栈 基 载 体 蛋 白 (ACP), 
8- 酮 酯 酰基 -ACP- 合 成 酶 (KS)、B8- 酮 酯 酰基 -ACP- 还 原 酶 (KR)、 脱 水 酶 (DH) 以 及 烯 酰基 还 原 酶 (ER) 


137 


子 量 大 于 300kDa 的 蛋白 质 (Cane et al，1983，1987)。 每 个 蛋白 质 依 次 由 两 次 不 准确 的 重 
复 所 组 成 ， 因 此 可 分 为 六 个 模块 ， 如 图 6.11 所 示 。 每 个 模块 含有 至 少 六 个 单 功 能 多 肽 的 组 
合 ， 每 个 相应 于 一 个 反应 步骤 : 酰基 转移 酶 (AT)、 栈 基 载 体 蛋 白 (ACP)、8- 酮 酯 酰基 - 
ACP- 合 成 酶 (KS)、8- 酮 酯 酰基 -ACP- 还 原 酶 (KR)、 脱 水 酶 (DH) 以 及 烯 酰基 还 原 酶 
(ER) 〈 见 图 6.11)。 一 个 有 趣 的 和 /或 许 是 所 期 待 的 观察 ， 是 这 些 基因 中 的 一 些 与 脂肪 酸 生 
物 合成 途径 的 基因 高 度 同 源 。 关 于 这 类 组 织 令 人 着 迷 的 是 新 分 子 可 以 通过 这 些 基 本 模块 的 组 
合 和 变换 而 产生 ， 也 可 以 在 功能 域内 通过 点 突变 来 产生 。 自 然 界 通过 这 种 同样 的 技术 已 经 产 
生 了 聚 酮 化 合 物 的 巨大 的 多 样 性 。 代 谢 工 程 在 该 领域 的 主要 贡献 是 通过 所 谓 的 “遗传 设计 ” 
来 设计 目前 已 知 或 未 知 的 具有 潜在 用 途 的 分 子 的 化 学 结构 。 

在 过 去 几 年 中 ，Khosla 及 其 同事 们 集中 注意 力 于 解释 聚 酮 化 合 物 合成 酶 的 规律 ， 是 通 
过 开发 一 个 链 霉 菌 素 宿 主 - 载 体系 统 以 表达 重组 聚 酮 化 合 物 合 酶 (PKS) 而 进行 的 〈Kao， 
1997; McDaniel et al，1993)。 这 项 工作 导致 提出 一 个 “最 小 聚 酮 化 合 物 形成 系统 ”的 概 
念 ， 该 小 系统 包括 缩合 酶 、 酰 基 载 体 蛋白 和 丙 二 酸 单 酰 辅酶 A 转移 酶 (McDaniel et al, 
1994)。 其 它 蛋 白质 可 以 起 如 下 作用 : 或 作为 决定 链 延 长 程度 的 链 长 因子 ， 或 作为 指导 链 环 
化 方式 的 环 化 酶 (Hutchinson and Fujii，1995)。 最 近 ， 用 包括 最 小 系统 的 PKS 基因 的 多 种 
组 合 转化 的 链 霉 菌 属 菌株 ， 已 生产 了 一 些 聚 酮 化 合 物 分 子 ， 这 些 为 组 合生 物 合成 法 铺 平 了 道 


路 (Shen and Hutchinson, 1996; Tsoi and Khosla，1995$)。 对 这 些 代 谢 物 的 表征 已 为 PKS 


基因 编程 方面 提供 了 新 的 理解 ( 方 框 6.2)。 


方 框 6.2 ”最 小 聚 酮 化 合 物 形成 系统 和 PKS 编程 规则 举例 

S. coelicolor A3 (2) 是 一 株 遗 传 背景 非常 清楚 ， 能 产 蓝 色 聚 酮 化 合 物 放 线 菌 紫 素 
的 放 线 菌 。act PKS 基因 簇 已 被 克隆 并 全 部 测序 ， 此 外 ， 通 过 同 源 重组 删除 整个 act i 
而 构建 了 一 支 S coelicolor 菌株 (CH999), FRA HA AT PKS 基因 组 合 的 “最 小 ” 
基因 簇 的 质粒 转化 该 突变 株 ， 以 阐明 PKSs 达到 其 高 度 专 一 性 的 机 制 。 

例如 ， 重 组 菌 CH999/pRM37 表达 一 个 “最 小 ”act PKS RAR, AN MT ABR 
(tem) PKS 表达 了 一 个 最 小 基因 系列 ( 见 下 图 : AT， 栈 基 转 移 酶 ; ACP, MERA 
Al; KS，B8- 酮 酯 酰基 -ACP- 合 成 酶 ; KR，p8- 酮 酯 酰基 -ACP- 还 原 酶 ; CYC， 环 化 酶 ; 
OMT ，o- 甲 基 转 移 酶 )。 放 线 菌 紫 素 (act) PKS 在 9 次 缩合 环 化 后 催化 链 的 终止 ， 而 
tem (PKS) 在 9 次 环 化 后 做 这 些 事情 。 人 们 发 现 这 种 特殊 菌株 可 以 产生 两 种 新 的 芳香 
聚 酮 化 合 物 ， 其 结构 已 由 HH ASC NMR 确定 。 通 过 利用 不 同 的 最 小 基因 簇 已 对 类 似 的 
实验 进行 重复 ， 并 对 所 得 的 聚 酮 化 合 物 进 行 了 识别 和 结构 分 析 。 


WER BA RL GD GB (act PKS ) “最 小 "基因 敌 


_ 模块 1 Hex = 
丁 省 霉 素 聚 酮 化 合 物 合 酶 ( lcmz PKS) ) “最 小 ERR 


RR. 


Se ee) 


138 


从 这 些 研 究 得 出 一 些 主要 结论 概括 如 下 (McDaniel et al, 1993). 

@ 链 的 长 度 是 〈 至 少 部 分 ) 由 一 种 特定 蛋白 所 支配 ， 这 种 特定 蛋白 被 称 为 “ 链 长 决 
定 因 子 ”(chain length determining factor) (CLF). 

eo 一 些 异 源 酮 合 酶 /想象 的 酰基 转移 酶 CKS/AT) 的 CLF 对 产生 功能 性 PKSs， 但 
其 它 的 对 是 单一 功能 的 。 

@ 酰基 -载体 蛋白 (ACP) 能 在 不 同 合成 酶 之 间 相 互 交 换 ， 且 不 影响 产物 结构 。 

e@ 一 种 特定 的 酮 还 原 酶 (KR) 还 原 不 同 长 度 的 聚 酮 化 合 物 链 ， 这 很 可 能 是 在 完整 的 


育 酮 化 合 物 链 已 经 合成 之 后 进行 的 。 

@ 不 管 链 的 长 度 如 何 ， 这 种 酮 还 原 酶 从 送 基 末端 开始 还 原 C-9 BRE, 

@ 第 一 次 环 化 的 区 域 专 一 性 由 KSVAT 和 (或 ) CLF 控制 。 

@ 催 化 第 二 次 环 化 反应 的 特定 环 化 酶 (CYC)， 显 然 能 在 不 同 长 链 的 中 间 体 及 其 还 
原 程 度 之 间 进 行 识别 。 

这 些 发 现 ， 为 在 这 些 复 杂 体 系 中 结构 -功能 关系 的 系统 研究 商定 了 基础 ， 并 为 基于 最 
小 聚 酮 化 合 物 形成 系统 而 合理 设计 新 聚 酮 化 合 物 分 子 提供 依据 。 


随 着 对 PKS 策略 进一步 解释 ， 可 以 预期 : 组 合 方法 所 产生 的 PKS 系统 将 允许 聚 酮 化 合 
物 库 的 合成 ， 该 库 包 括 数 千 个 新 分 子 。 这 些 库 进 而 可 对 具有 任何 性 质 的 分 子 〈 从 药物 到 材 
料 ) wT. WIR, BIR PKS 研究 的 未 来 几 年 很 可 能 是 非常 令 人 兴奋 的 ， 特 别 是 当 人 们 
考虑 到 这 些 迷 人 的 酶 系统 的 丰富 多 样 及 工程 潜力 时 更 是 如 此 。 
6.3.3 维生素 

维生素 C 

已 商业 化 的 维生素 C (抗坏血酸 ) 前 体 物 2- 酮 基 - 葡 萄 糖 酸 (2-KLG) 的 生产 包含 两 步 发 
醇 过 程 。 首 先 利用 草 生 欧 文 氏 菌 (Erwinia herbicola) 将 葡萄 糖 转 化 为 2,5- 二 酮 -D- 葡 萄 糖 酸 ， 
随后 再 经 棒 杆 菌 属 〈Corynrebacterizzz sp.) 菌 发 酵 转 化 为 2-KLG。 为 将 此 两 步 发 酵 过 程 变 为 一 
步 过程 ， 用 编码 2,5-DKG 还 原 酶 (DKGR ， 其 催化 2,5-DKG 转化 为 2,5-KLG) 的 Corynebac- 
terium 菌 基 因 对 草 生 欧文 氏 菌 进行 遗传 转化 (Anderson et al, 1985; Grindley et al, 1988) ( 见 
6.12). 在 优化 培养 条 件 后 ， 这 些 重组 Erwinia ATE 120h 内 生产 约 120 g.L -12-KLD， 基 于 
葡萄 糖 的 摩尔 收 率 约 60% 。 随 后 的 研究 显示 了 代谢 工程 菌 生产 维生素 C 潜在 的 经 济 优势 ， 并 
电 趾 请 了 一 系列 美国 专利 (Anderson et al, 1991; Hardy et al, 1990). 

对 于 许多 微生物 和 动物 来 说 ， 生 物 素 是 一 种 基本 的 营养 素 。 它 作为 多 种 酶 的 辅助 因子 参 
与 脂肪 酸 和 碳水 化 合 物 代 谢 ， 被 用 于 动物 饲料 和 工业 发 酵 过 程 的 一 种 添加 剂 。 目 前 ， 生 物 素 
是 通过 复杂 而 昂贵 的 化 学 合成 法 生产 的 。 尽 管 目前 经 济 上 仍 有 利于 化 学 合成 法 ， 但 生物 素 微 
生物 生产 过 程 的 进一步 改进 使 生物 转化 法 比 现 有 技术 更 具 竞 争 性 。Barker 等 最 先 在 正 . coii 
菌 中 描述 了 由 庚 二 酸 辅酶 A_ (pimelic-CoA) 合成 生物 素 的 代谢 途径 (Barker and Campbell, 
1980) ， 并 且 识 别 出 球 形 芽 孢 杆菌 (B. sphaericus) 中 参与 庚 二 酸 (pimelic acid) 生物 素 合 
成 的 所 有 酶 (Izumi et al, 1981), B. sphaericus 分 泌 大 量 生物 素 合 成 途径 中 间 体 的 发 现 导 
致 在 此 菌 中 分 离 到 bio 基因 。 这 些 基 因 参 与 生物 素 合成 ， 并 组 织 为 两 个 基因 簇 WoXWF 和 
pioDAYB ， 最 近 这 些 基 因 已 被 克隆 在 E. coli 载体 上 (Gloecker et al，1990)。 用 这 些 基 因 
转化 的 正 . coli 菌 生产 了 高 达 457mg-L :的 生物 素 和 350mg-L ! 的 生物 素 中 间 体 (sabatie 

139 


et al, 1991). 


Erwinia herbicola Corynebacterium sp. 
一 一 一 一 一 一 一- 一 
CHO COOH COOH COOH COOH 
OH OH 9 O ¢ 
HO HO HO HO HO 
OH OH OH OH OH 
OH OH OH O OH 
CH, OH CH OH CH, OH CH» OH CH,OH 
G GA 2-KDG 2,5-KDG 2-KLG 
Erwinia herbicola/DKGR 


图 6.12 葡萄 糖 (G) 生物 转化 为 2- 酮 基 -L- 葡 萄 糖 酸 (2-KLG) 
包含 草 生 欧 文 氏 菌 (Erwinia herbicola) 和 棒 杆 菌 属 (Corynebacterium sp.) 的 两 步 发 酵 法 与 基于 E. herbicola 
表达 蜡 源 二 酮 -D- 葡 萄 糖 酸 还 原 酶 (DKGR) 的 一 步 法 比较 。 

中 间 产 物 : GA 一 葡萄 糖 酸 ; 2-KDG 一 2- 酮 基 -D- 葡 萄 糖 酸 ; 2,5-DKG 一 2,5- 二 酮 基 -D- 葡 萄 糖 酸 


维生素 A 

另 一 个 应 用 代谢 工程 ， 将 天 然 的 代谢 中 间 产 物 转化 为 所 希望 的 终 产物 的 例子 ， 是 维生素 
A 的 前 体 8- 胡 萝卜 素 的 生产 。 过 去 ， 曾 考虑 应 用 藻类 和 真菌 类 [例如 ， 粗 糙 脉 孢 菌 〈Nez- 
rospora crassa), ， 硬 壳 青 霉菌 (Penicillium sclerotiorum ), 4h #7 % WW ( Phycomyces 
blakesleeanus )| 以 及 红 酵 母 菌 属 (Rhodotorula) 生产 B- 胡 昔 仆 素 ， 但 发 现 不 合适 (Ninet 
and Renaut，1979)。 由 于 类 胡 葛 卜 素 生物 合成 的 前 体 香 叶 基 焦 磷 酸 存在 于 许多 生物 体 中 ， 


用 于 省 醇 、 何 帕 醇 和 蔡 烯 等 物质 的 合成 ， 因 此 可 用 适当 的 基因 工程 利用 上 述 基础 生产 8- 胡 “ 


萝卜 素 。 最 近 ， 已 克隆 并 分 析 了 吹 夏 孢 欧文 氏 菌 (Erwinia uredovora) 中 包括 B- 胡 萝卜 素 
的 环 状 类 胡 昔 卜 素 的 生物 合成 基因 (Misawa et al，1990)。 随 后 用 四 个 B-Ab REA Mt 
Z. mobilis 菌 和 根瘤 农 杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens) 进行 遗传 转化 ， 在 琼脂 平板 上 
获得 黄色 菌 群 (Misawa et al，1991)。 尽 管 这 两 种 菌株 都 不 是 产生 8- 胡 葛 卜 素 的 天 然 生产 
菌 ， 但 是 转化 接合 体 在 液体 培养 中 生产 出 维生素 A 前 体 物 达 220~350mg (FE), KH 
果 还 建议 生产 8- 胡 昔 卜 素 的 QZ. mobilis 菌 (Z. mobilis 菌 被 用 于 乙醇 大 规模 生产 ) 能 够 接 
着 用 作 动 物 饲料 ， 这 样 由 于 其 中 的 8- 胡 葛 卜 素 而 增强 了 其 营养 价值 。 

在 相关 研究 中 ， 又 对 Erwinia 菌 的 六 个 类 胡 葛 卜 素 基 因 进 行 异 源 表 达 ， 结 果 在 S . 
cerevisiae 菌 中 获得 一 系列 香 叶 基 焦 磷酸 盐 副 产物 。 取 决 于 线性 途径 中 实际 所 表达 的 基因 数 
量 ， 可 测 得 如 下 一 个 或 多 个 产物 : 八 氢 番茄 红 素 、 番 茄 红 素 、p8- 胡 昔 卜 素 、 玉 米黄 素 及 玉米 
黄 素 二 ( 葡 ) BH (Ausich et al, 1991). 

6.3.4 生物 聚合 物 

由 生物 体 生产 聚合 物 的 改进 〈 例 如 ， 黄 原 胶 和 细菌 纤维 素 ) 及 新 的 生物 聚合 物 的 生产 是 
代谢 工程 另 一 个 主要 应 用 (Peoples and Sinskey，1990)。 世 界 上 约 有 93% 的 化 石 资 源 消 耗 
是 为 了 能 量 的 生产 ， 而 仅 7% 被 工业 上 用 来 生产 包括 溶剂 和 塑料 等 的 有 机 化 学 品 (Eggers- 
dorfer et al，1992)。 因 此 ， 用 再 生 资 源 生 产 的 可 生物 降解 聚合 物 代 替 部 分 合成 塑料 ， 似 乎 
对 化 石 燃 料 的 总 消耗 仅 有 极为 有 限 的 影响 。 然 而 ， 可 生物 降解 塑料 的 更 多 使 用 会 给 环境 污染 

140 


| 和 上 废物 处 理 等 相关 问题 的 解决 做 出 突出 贡献 。 同 样 的 本 身 原 有 的 坚固 性 和 抗 降解 性 曾 使 塑料 
”成 为 理想 的 工业 和 消费 材料 ， 但 今天 被 认为 是 环境 和 废物 处 理 问 题 的 根源 。 与 之 相 比 ， 可 生 
物 降解 聚合 物 或 部 分 或 完全 由 可 降解 材料 组 成 ， 其 或 可 由 非 酶 水 解法 降解 ， 或 由 微生物 分 泌 
的 酶 来 降解 。 虽 然 一 些 聚 合 物 〈 如 淀粉 、 聚 乙烯 的 混合 物 ) 只 能 部 分 生物 降解 ， 但 像 聚 3- 
“羟基 丁 酸 [P (3HB)]j 等 聚合 物 是 100% 生 物 可 降解 的 ， 因 为 它们 能 被 细菌 、 真 菌 和 藻类 等 
微生物 转化 为 二 氧化 碳 和 能 量 。 目 前 市 场 上 已 出 现 了 多 种 可 生物 降解 塑料 ， 代 表 了 适合 于 不 
同 消费 品 的 一 系列 性 质 ， 目 前 全 球 市 场 对 这 种 可 生物 降解 塑料 的 需求 估计 高 达 每 年 130 万 吨 
(Lindsay, 1992). 
Fe ZR BG 
在 众多 可 利用 的 可 生物 降解 塑料 中 ， 聚 羟基 烷 酸 酯 (PHAs) 日 益 引起 人 们 的 重视 。 
PHAs 是 一 类 细胞 内 用 于 贮存 碳 和 能 源 的 物质 ， 多 数 细菌 在 环境 条 件 受 限 〈 例 如 ， 氧 和 氮 枯 
竭 及 硫酸 盐 或 镁 缺乏 ) 时 积累 PHAs。 环 境 条 件 的 变化 通常 引起 中 间 代 谢 的 巨大 变换 。 这 些 
变换 大 都 由 总 体 调节 网 络 控制 ， 该 网 络 有 能 力 对 酶 所 有 组 成 成 分 的 诱导 或 阻 遇 进行 协调 〈 第 
5 章 )。 最 近 ， 这 些 聚 合 物 因 有 潜力 作为 可 生物 降解 热塑性 塑料 而 吸引 了 相当 大 的 注意 力 。 
通过 改变 发 酵 过 程 中 的 碳 源 和 (或 ) 菌 种 ， 就 有 可 能 生产 各 种 生物 材料 ， 它 们 的 性 质 可 从 硬 
塑料 、 脆 塑料 到 有 弹性 的 聚合 物 范 围 内 广泛 变化 。 
1926 年 ， 聚 羟基 丁 酸 酯 (PHB) 作为 巨大 芽孢 杆菌 〈Bacillus megaterium) 中 的 一 种 
组 成 成 分 首次 被 发 现 。 从 那 以 后 ， 已 表明 PHB 与 相关 的 PHAs 存在 于 90 多 类 细菌 中 。 大 部 
分 PHASs 是 由 长 度 为 3 一 14 碳 原子 的 R-(— )-3- 羟 基 烷 酸 单 体 组 成 〈 见 图 6.13)。 由 细菌 合 
成 的 PHASs 可 大 致 分 为 两 组 : 具有 C3~CS 单 体 的 短 链 PHAs [如 真 养 产 碱 菌 ( Alcaligenes 
eutrcphus) | MBA C6~C14 单 体 的 中 链 PHAs [oN THR AHA (Pseudomonas oleovo- 
rans)]. it 40 种 不 同 的 PHAs 已 被 表征 ， 有 些 聚 合 物 含有 不 饱和 键 或 其 它 功能 基 团 
(Steinbiichel, 1991). 
i i 
[一 0 一 CH 一 CH: 一 C 一 ]. 


R= 氢 3- BEAR (3HP) 
R= 甲 基 3- 羟基 丁 酸 (3HB) 
R= 乙 基 3- 羟基 戊 酸 (3HV) 
R= WE 3- #23E OR (3HC) 
R= 丁 基 3- 羟基 庚 酸 (3HH) 
R= 戊 基 3- FREER (3HO) 
R= 己基 3- #SE EMR (3HN) 
R= RE 3- Fest RMR (3HD) 
R= ¥# 3- 羟基 十 一 酸 GHUD) 
R= £% 3- 羟 基 十 二 酸 (3HDD) 
i 
(—O(—CH)—),C—], 

n=3 4- #22 TR (4HB) 
n=4 5- #255 XR (SHV) 


图 6.13 主要 的 生物 聚 羟基 烷 酸 酯 的 结构 


PHB 是 分 布 最 广泛 且 充 分 表征 的 PHA。PHB 生物 合成 的 大 部 分 知识 已 从 细菌 真 养 产 碱 
fA (Alcaligenes eutrophus) 中 获得 ， 该 菌 由 乙酰 辅酶 A 通过 三 种 酶 的 相继 作用 得 到 PHB 
141 


(Al 6.14). KBE TAN 3- Ae SE ae (BB - ASE RE), EHEC ZR A 


分 子 的 可 逆 缩 合 形成 乙酰 乙酰 辅酶 A， 其 进而 被 乙酰 乙酰 辅酶 A 还 原 酶 〈 第 二 种 酶 ) 还 原 
为 尽 -(- )-3- 羟 基 丁 酰 辅酶 A， 最 后 通过 PHA Ai 〈 第 三 种 酶 ) 将 其 催化 聚合 成 PHB。 分 


子 研 究 显示 这 三 种 酶 的 基因 被 组 织 在 一 个 操纵 子 中 。PHA 通常 是 作为 一 个 含有 10 一 10 个 ， 


单 体 的 聚合 物 而 形成 的 ， 其 在 胞 内 以 直径 约 0.2 一 0.S$wm 的 包含 体形 式 积累 起 来 。 当 细菌 
A. eutrophus 生长 的 培养 基 中 含 过 量 碳 源 QE) 而 缺乏 某 种 基本 营养 物 (ARH) 
时 ， 菌 体内 积累 的 PHB 包含 体 通常 可 达 细 胞 干 重 的 80% 。 在 这 些 条 件 下 ，PHEB @ HA 4 
的 贮备 和 电子 贮 槽 的 作用 。 当 生长 条 件 通过 磷 或 所 的 补充 而 恢复 后 ，PHB 就 被 催化 形成 乙 
酰 辅酶 A， 而 PHB 又 回 到 先期 诱导 水 平 。 


对 3- 酮 基 硫 解 酶 和 乙酰 乙酰 辅酶 A 还 原 酶 的 诱导 研究 显示 两 种 酶 的 活性 响应 于 PHB- 刺 ， 
激 限 制 都 显著 提高 。 这 些 实验 表明 PHB 途径 呈现 出 一 种 转录 控制 模式 ， 这 类 似 于 由 于 环境 


压力 所 诱导 的 其 它 代 谢 途 径 的 调控 方式 。 这 种 总 体 调 节 网 络 的 例子 包括 热 体 克 调 节 子 、zpa 
调节 子 和 碳 荐 乏 调 节 子 ( 见 5.4 节 )。 最 近 ， 真 养 产 碱 菌 (A. eutrophus) 的 PHB 生物 合 
成 基因 (phaA. phaB, phaC) 已 被 克隆 ， 并 在 E. coli (Peoples and Sinskey, 1989; 
Schubert et al, 1988; Slater et al, 1988) 和 多 种 假 单 胞 菌 属 (Timm and Steibiichel, 
1990) 中 表达 。 研 究 发 现在 真 养 产 碱 菌 (A. eutrophus) 的 PHB 途径 在 所 有 重组 细菌 中 都 


发 挥 功能 ， 当 重组 菌 在 碳 源 过 量 和 氮 缺 乏 的 条 件 下 生长 时 ，PHB 的 积累 在 细胞 干 重 中 占 显 ， 
Stl, AMM, HE. coli 菌 产生 的 PHB BAA A. eutrophus H16 菌 水 平 的 50%， 


然而 五 . coli 菌 中 表达 的 还 原 酶 水 平 才 比 A . eutrophus H16 菌 的 还 原 酶 水 平 小 2% 以 下 。 进 
一 步 亚 克 隆 识别 出 A . eutrophus 菌 3- 酮 基 硫 解 酶 的 两 种 不 同形 式 ， 一 个 认为 是 起 生物 合成 
的 作用 ， 而 另 一 个 起 分 解 代 谢 的 作用 。 某 些 重组 OE. coli 菌株 中 PHB 所 达到 高 水 平 〈 高 达 
细胞 干 重 的 90% ) 表明 或 是 由 于 高 度 的 转录 多 种 多 样 性 ， 或 是 由 于 不 同 菌 种 间 高 度 的 转录 


同 源 性 。 另 一 个 有 趣 的 结果 是 重组 已 . aeruginosa ATE PRA HAAR MIRE. AFR 1 


烷 酸 酯 类 的 合成 。 当 这 些 细 胞 在 葡萄 糖 上 生长 时 积累 一 种 聚合 物 ， 在 此 聚合 物 的 组 成 中 B- 
羟基 丁 酸 酯 、p8- 羟 基 癸 酸 酯 和 B8- 羟 基 十 二 烷 酸 酯 是 主要 成 分 ， 而 8- 羟 基 辛 酸 酯 和 CHS 
酸 酯 作为 次 要 成 分 (Timm and Steibiichel, 1990). 

共聚 物 | 

目前 ， 最 具 工 业 价值 的 PHA 共聚 物 是 聚 3- 羟 基 丁 酸 -co-3- 羟 基 戊 酸 [P (3HB-co- 
3HV)]， 因 为 其 比 均 聚 合 物 [P(3HB)] 具有 增强 了 的 柔韧 性 。 在 含 葡 萄 糖 培养 基 中 添加 两 
酸 或 戌 酸 ， 会 导致 产生 一 个 由 3- 羟基 丁 酸 酯 和 3- 羟基 成 酸 酯 组 成 的 随机 共聚 物 〈 见 图 
6.14)。 该 随机 共聚 物 目前 由 Monsanto 公司 利用 杆菌 A. eutrophus 发 酵 简 萄 糖 和 两 酸 进 行 
工业 生产 ， 商 品名 为 Biopol。 因 为 PHA 合成 中 所 含 的 酶 具有 很 宽 的 专 一 性 ， 因 此 在 PHA 
HBA C3 一 C5 Hoc a REA. HUN, ZEA. eutrophus 菌 中 已 检测 到 两 种 3- 酮 基 硫 解 酶 ， 
其 一 起 接受 来 自从 C4 到 至 少 C10 的 3- 酮 酰基 辅酶 A， 而 且 已 经 表明 乙酰 乙酰 辅酶 A 还 原 酶 
Xt C4~C6 的 3- 酮 酰基 辅酶 A 都 有 活力 。 通 过 改变 中 间 代 谢 ，Slater 等 已 构建 一 支 高 产 这 种 
FER HH E. coli 菌株 〈Slater et al，1992)。 其 策略 是 基于 内 酸 途 径 已 . coli 基因 转录 调节 
的 遗传 消除 (组 成 型 表达 )， 因 此 导致 所 得 菌株 能 有 效 利 用 两 酸 并 将 之 挨 进 共聚 物 
[P (3HB-co-3HV)] 中 。 此 外 ， 该 策略 还 导入 了 控制 P (3HB-co-3HV) 中 两 种 聚合 物 的 比 
例 的 能 力 ， 这 可 通过 调节 培养 基 中 两 酸 和 (或 ) 葡 萄 糖 浓度 来 进行 。 

用 真 养 产 碱 菌 CA. eutrophus) 生产 可 生物 降解 聚合 物 PHB 所 用 的 底 物 包括 果糖 、 葡 

142 


ATP+CoASH 
AMP+PPi 


PY ica A 


oo eee Beene ame 


3- A CHA A 


geen eee wenn e -=-=--=-、\ 


. 


wens e mee ww ene enanen? 


R-(-)-3-F2 KC HABA 


CoASH pe : CoASH 


P(3HB-3HV 


图 6.14 真 养 产 碱 菌 (Alcaligenes eutrophus) PHB #l P(3HB-3HV) 的 合成 途径 


萄 糖 、 乙 酸 或 丁 酸 以 及 H 和 CO; 的 混合 物 。 该 菌 通 常 不 利用 乙醇 作 碳 源 ， 但 通过 表达 乙醇 
脱 氢 酶 基因 构建 了 一 支 利 用 乙醇 的 工程 菌 ， 可 将 乙醇 转化 为 乙 醛 ， 而 乙 醛 可 进入 乙酰 辅酶 A 
库 ， 其 是 PHB 的 前 体 物 。 更 重要 的 是 ， 同 样 基因 的 表达 也 能 利用 两 醇 ， 其 导致 共聚 物 聚 羟 
基于 酯 - 戊 酯 (PHBV) 的 产生 ， 该 共聚 物 与 PHB 相 比 ， 熔 点 降低 并 改进 了 加 工 性 能 
(Alderete et al, 1993). 63g°L -1 干细胞 中 获得 74% 〈 质 量 比 ) 的 PHB。 该 共聚 物 含量 随 培 
养 基 中 两 醇 分 率 的 增加 而 增加 ， 相 对 于 纯 的 丙 醇 ， 最 大 摩尔 得 率 可 达 35.2% 。 

代谢 工程 在 生物 聚合 物 生产 中 的 一 个 中 心 问题 ， 是 通过 硫 解 酶 、 还 原 酶 和 聚合 酶 的 协调 
扩 增 使 聚合 物 生 成 达到 最 大 化 。 简 单 使 所 有 三 种 酶 活性 最 大 并 不 能 解决 问题 。PHB 合成 依 
赖 于 乙酰 辅酶 A 的 供应 和 NADPH 的 可 利用 性 。 前 者 可 通过 增加 糖 酵 解 的 速率 进行 最 大 化 ， 
然而 ， 糖 酵 解 通 量 的 增加 会 使 成 糖 磷酸 途径 通 量 减少 ， 进 而 减少 NADPH 的 产生 。 因 此 ， 
PHA 产量 最 大 化 不 是 三 种 酶 活性 简单 扩大 的 问题 ， 更 为 关键 的 问题 是 优化 平衡 代谢 通 量 在 
分 支点 G6P 处 的 分 布 。 顺 便 说 一 下 ， 此 平衡 也 可 能 取决 于 生长 条 件 ， 因 为 当 细 胞 从 生长 期 
转移 到 生产 期 时 对 还 原 力 和 碳 的 需求 可 能 发 生变 换 。 

需要 指出 的 另 一 个 重要 方面 是 前 述 三 种 酶 〈 硫 解 酶 、 还 原 酶 、 聚 合 酶 ) 之 间 相 对 活性 对 
产品 质量 有 深刻 的 影响 : 增加 聚合 酶 活性 而 保持 其 它 两 种 酶 活性 不 变 获 得 低 分 子 量 的 PHB， 
这 似乎 是 一 个 违反 直觉 的 结果 ， 但 当 考 虑 实际 的 聚合 机 制 时 就 能 对 此 进行 解释 。 最 后 ， 该 共 
聚 物 的 生产 可 通过 在 发 酵 过 程 中 补 加 丙 酸 来 完成 ， 或 者 通过 构建 工程 菌 使 其 能 自己 提供 丙 
酸 ， 例 如 通过 苏 氨 酸 降解 途径 来 提供 。 

植物 聚 羟基 烷 酸 酯 

最 近 ， 聚 羟基 烷 酸 酯 途径 已 在 谷物 作物 中 被 表达 ， 这 是 一 个 非常 有 吸引 力 的 系统 ， 它 有 
潜力 以 低 成 本 大 量 生产 几 类 化 学 品 。 最 初 ， 在 植物 中 PHB 的 合成 是 通过 在 植物 Arapicdozpsis 
thaliana 中 表达 杆菌 A .eutrophus 的 PHB 生物 合成 基因 来 进行 研究 的 (Poirier et al, 
1992)。 尽 管 A. thaliana 在 农业 上 并 不 重要 ， 但 选择 A . thaliana 作为 研究 对 象 是 基于 如 下 

143 


原因 : FED PET ae ot TET EEA PRK ARS, FACS EWS 


切 相 关 ， 而 油菜 是 农业 规模 上 生产 PHB 的 目标 作物 。 合 成 PHB 所 需要 的 三 种 酶 当中 , 仅 量 


3- 酮 硫 解 酶 存在 于 植物 中 。 为 了 完成 该 途径 ， 编 码 乙 酰 辅酶 A 还 原 酶 和 PHA 聚合 酶 的 
A. evtrophnas 基 因 在 转基因 植物 A . thaliana 中 进行 了 表达 ， 发 现 酶 活性 定位 于 细胞 质 中 。 
这 种 最 初 尝 试 合成 的 PHB 仅 占 菌 体 干 重 的 0.14% ( 比 所 要 求 的 商业 生产 水 平 约 低 两 个 数量 
级 )， 并 且 对 细胞 生长 有 不 利 的 影响 。 

第 二 代 产 PHB 的 转基因 植物 表明 了 更 大 的 成 功 。 在 植物 中 ， 由 乙酰 辅酶 A 合成 脂肪 酸 | 
发 生 于 质 体 中 ， 因 此 质 体 是 通过 乙酰 辅酶 A 的 高 的 碳 通 量 的 一 个 位 点 。 这 个 通 量 在 积累 油 ， 
的 植物 种 子 中 被 特别 增强 ， 例 如 Arapidozpsis ， 其 种 子 干 重 的 40% 是 甘油 三 酯 。 此 外 ， 质 体 
也 是 积累 淀粉 的 位 点 ， 因 此 质 体 能 够 容纳 大 量 的 包含 体 而 不 破坏 细胞 器 的 功能 。 最 近 ，， 
PHB 途径 在 质 体 中 的 表达 已 经 在 转基因 植物 A thaliana 中 得 到 证 实 (Nawrath et al, 
1994)。 质 体 表 达 是 通过 将 核 酮 糖 二 磷酸 酶 羧 化 酶 的 小 亚 基 的 运转 肽 (transit peptide) 与 3- 
酮 基 硫 解 酶 和 乙酰 乙酰 辅酶 A 还 原 酶 的 N- 端 熔 合 而 完成 的 。PHEB 含量 在 植物 寿命 期 内 逐渐 
增加 ， 最 大 可 达 10mg.g ! 鲜 重 ， 即 约 干 重 的 14% 。 这 样 ，PHB 合成 从 细胞 质 改 向 质 体 导 | 
致 PHB 生产 提高 100 倍 。 

果 聚 糖 

RR EPR RH) 分 子 ， 其 在 有 限 数量 的 植物 中 作为 贮存 物质 天 然 产 生 ， 其 聚合 ， 
度 较 低 (S~60 单位 )。 它 能 被 酶 法 或 化 学 法 水 解 成 果糖 ， 果 糖 在 很 多 食品 产品 中 正在 变 为 “ 
一 种 普遍 流行 的 甜 味 剂 。 由 于 低 聚 果糖 分 子 具 有 甜 味 ， 故 果 聚 糖 本 身 可 直接 作为 天 然 甜 味 剂 
使 用 。 由 于 人 体 消 化 系统 中 不 含 能 分 解 果 糖 中 B(2>1) K B(2>6) 糖苷 键 的 酶 类 ， 从 而 使 
果 聚 糖 可 作为 低热 量 食品 成 分 更 具 吸 引力 。 除 了 植物 以 外 ， 微 生物 也 有 能 力 生 产 分 子 量 很 高 
WR (> 100000 iz). PN, FARR (Bacilli). (hf JR (Pseudomonas ) 
和 链球 菌 属 (Streptococci) 中 ， 胞 外 果糖 转移 酶 将 蔗糖 转化 为 细菌 果 聚 糖 ， 通 常 称 为 左 聚 “ 
糖 。 果 聚 糖 生物 合成 中 的 主要 反应 是 2GF( 莽 糖 )->G-F7z (果糖 )+ (2 -1)G。 为 此 目的 ， 将 
B. subtilis 中 编码 果糖 转移 酶 GHEE MARA RM) 的 SacB 基因 进行 修饰 并 导入 烟草 
植株 中 ， 获 得 的 转基因 植株 能 够 积累 果 聚 糖 。 产 量 达 干 重 的 3% 一 8% ， 分 子 量 大 小 和 特性 
等 与 3B. subtilis 合成 的 果 聚 糖 相 似 。 这 种 重组 果 聚 糖 的 一 个 重要 特性 是 其 在 植物 中 的 稳定 
性 ， 这 使 得 该 项 工作 能 够 在 许多 食品 和 非 食 品 产品 应 用 中 很 有 吸引 力 。 

黄 原 胶 是 由 革 兰 氏 -阴性 野 油 菜 黄 单 胞 菌 ( Xanthomonas campestris) 生产 的 一 种 胞 外 
多 糖 。 黄 原 胶 所 具有 的 高 黏度 、 假 塑性 等 独特 的 流 变 学 特性 ， 是 其 在 各 种 食品 和 工业 应 用 中 
广泛 使 用 的 原因 。 黄 原 胶 化 学 结构 由 一 个 纤维 质 的 8B(1->~4)- 葡 萄 糖 骨 架 与 三 糖 侧 链 组 成 ， 
而 三 糖 侧 链 由 两 个 甘露 糖 残 基 和 一 个 葡 〈( 萄 ) 糖 醛 酸 残 基 组 成 ， 并 与 骨架 上 葡萄 糖分 子 间 隔 
连接 。 一 般 情 况 下 ， 甘 露 糖 在 特定 位 点 上 被 乙酰 化 和 丙酮 酰 化 ， 但 程度 不 同 。 参 与 胞 外 多 糖 
合成 的 很 多 基因 通常 是 成 复 的 。 在 野 油菜 黄 单 胞 菌 (CX. campestris) 中 已 分 离 到 一 复合 成 
黄 原 胶 的 基本 基因 (Barrere et al，1986)。 最 近 的 研究 已 经 表明 利用 重组 DNA 技术 能 改变 
黄 原 胶 的 结构 与 性 质 的 潜力 。 一 个 含有 几 个 黄 原 胶 生物 合成 基因 的 质粒 使 黄 原 胶 的 生产 提高 
了 10% 。 此 外 ， 通 过 克隆 和 超 量 表 达 酮 缩 醇 丙酮 酸 转移 酶 基因 ， 使 黄 原 胶 侧 链 的 丙酮 酸化 
程度 增加 到 45% (Harding et al，1987)。 相 反 地 ， 利 用 转 座 子 诱 变 技 术 可 构建 菌株 ， 使 之 
合成 的 黄 原 胶 中 丙酮 酸 含量 大 大 减少 (Marzocca et al，1991)。 这 些 研 究 表 明代 谢 工 程 在 产 

144 


物 结构 控制 和 黄 原 胶 合成 机 理 的 阐明 等 方面 的 应 用 前 景 。 


6.3.5 生物 色素 

RE 

ARS TL FE FS — 7 Ba, A) BS RBH A ( Pseudomonas putida ) 
的 鞭 双 加 氧 酶 (NDO) #AA LHR E. coli 生产 靛蓝 ，NDO 催化 靛蓝 生物 合成 的 最 后 一 
步 反 应 (Ensley, 1985) (5116.15). BK, 


ite, (ey — Ah aE EE TS afm 

中 , 并 且 自 古 以 来 一 直 被 用 作 蓝 色 颜料 。 在 a. I maine 
MATS UE, EME LAE A eee Bey” 
BAG%M, Kia BAA Bae. 1927 

年 ， 利 用 选择 培养 技术 分 离 出 一 支 土壤 微 生 

hy FB Ab, 85) WE (Ee Ad GAL ( Pseudomonas in- NE 

doloxidans), ‘E fea SIME (OLA 6.4) 形 

A Ah, AR HE WRI. OS cS Bs, 08 

PEGE SL Sy BS BIL BP eb | OR Ae eae + ial RS 
微生物 ， 但 没有 一 种 能 够 实际 用 于 大 规模 微 。 io mR 
生物 法 生产 能 蓝 ， 原 因 主 要 是 : (1) 前 体 物 呵 4 

RAD G, (2) KR PAA MD ? 


NDO wi HE AK. 32-5 GO Be a AE PR a 

BRA Ht fe SM RES AU MSIE, EC AAR BR He pester 

制 了 它们 在 工业 过 程 的 应 用 。 He I sis 

早期 的 尝试 集中 于 过 量 表 达 Pseu- HN 一 
domonas putida 的 NDO ff, Wik IRR | 

化 率 。 将 组 成 蔡 双 加 氧 酶 系 的 前 四 个 基因 和 与 空气 氧化 

一 个 由 强 启动 子 Xp， 控制 的 多 拷贝 质粒 结合 ， | 

获得 较 高 的 酶 活性 。 为 提高 E. coli PRR yo So__ ”0 

NDO 的 稳定 性 ， 需 要 进一步 的 遗传 操作 。 Bye ob | 
项 工作 已 导致 稳定 的 NDO 的 高 水 平 表达 从 而 入 
fe AT RHE A AR. 

与 此 同时 ， 同 样 的 努力 研究 了 直接 由 葡 

萄 糖 进 行 靛 蓝 前 体 物 呀 吕 的 合成 。 正 常情 况 ”图 6.15 SRA aA (NDO) 生物 合成 靛蓝 
PF, MS|ME LL 03] WE-3-H HERR (IGP) MAA 吗 | 叭 〈 见 图 6.4) 被 NDO 氧化 形成 不 稳定 的 吗 吃 二 氧 二 醇 
酸 一 部 分 的 形式 存在 于 细胞 中 。 在 重组 菌 正 . 或 叫 吃 酚 ， 吗 | 唆 酚 再 经 空气 氧化 缩合 形成 靛蓝 

coli 中 ， 色 氨 酸 的 合成 是 由 色 氨 酸 操纵 子 的 五 个 基因 产物 完成 的 〈 见 图 6.16 和 图 6.4)。 对 
于 细菌 和 真菌 二 者 来 说 ， 分 支 酸 是 芳香 氨基 酸 (包括 苯 丙 氨 酸 、 酷 氨 酸 和 色 氨 酸 ) 生物 合成 
途径 的 主要 分 支点 化 合 物 。 细 胞 中 也 存在 色 氨 酸 酶 ， 其 分 解 色 氨 酸 并 释放 出 叫 唆 。 然 而 ， 早 
期 曾 尝试 通过 过 量 表达 色 氨 酸 酶 来 刺激 叫 唆 的 生产 并 不 太 成 功 ， 这 是 由 于 受 色 氨 酸 合成 总 通 
量 的 明显 限制 。 为 纠正 这 一 点 ， 扩 增 了 色 氨 酸 合成 途径 的 所 有 酶 。 特 别 是 ， 通 过 位 点 专 二 性 
诱 变 使 trpB 一 部 分 被 修饰 ， 这 导致 叫 吃 生物 合成 增加 一 个 数量 级 以 上 (Murdock et al, 
1993)。 通 过 结合 增强 叮 唆 生产 (突变 的 opB) 和 增强 叫 喉 转化 为 靛蓝 (NDO) 这 两 个 方 

145 


i, RAA RH—ME. coli 菌株 ， 其 能 用 于 由 葡萄 糖 从 头 生 物 合成 靛蓝 。 


O OH 
SC- 
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HC.pyC-O—C 
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trpEG 
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HC HO OH HO 
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HC 9 
HC~ eee ee fe SS 
me mal a = Se 
Aie AB Mele 


图 6.16 BAREDAM 
结构 基因 名 称 : trpAB 一 色 氢 酸 合 酶 ; trpC 一 叫 吃 甘油 磷酸 合 酶 ;trpD 一 邻 氨基 共 
甲酸 磷酸 核糖 基 转移 酶 ;trpEG 一 邻 氨基 葵 甲 酸 合 酶 


6.3.6 & 


氧气 对 用 于 运输 、 直 接 加 热 或 发 电 造成 的 污染 及 不 能 恢复 的 化 石 燃料 来 说 会 成 为 最 终 代 
用 品 。 因 为 氢气 燃烧 仅 放出 水 蒸气 和 少量 氮 氧 化 物 ， 氢 燃料 汽车 和 其 它 装 置 不 会 影响 全 球 变 
Rm (CO;) ， 而 且 很 少 造成 空气 污染 。 由 制造 商 〈 如 Mercedes Benz) 生产 的 原型 车 辆 表明 ， 
从 性 能 、 和 舒适 度 与 安全 角度 看 ， 以 氢气 为 能 源 的 汽车 是 实用 的 。 和 氢气 并 不 比 甲烷 或 者 汽油 危 
险 ， 事 实 上 ， 和 氢气 在 工业 生产 中 常规 使 用 。 美 国 太 空 计划 已 依赖 氢气 为 能 源 近 40 年 ， 这 一 


事实 为 氢 燃 料 的 广泛 使 用 提供 了 知识 基础 。 


常规 电解 技术 从 水 中 制 取 氢 气 ， 尽 管 水 是 取 之 不 尽 的 ， 但 是 制 取 过 程 中 所 需 的 能 量 还 是 
比 氢气 燃烧 放出 的 能 量 要 稍 多 一 点 。 已 经 建议 采用 其 它 方式 生产 氢气 ， 例 如 利用 风能 或 太阳 


146 


| 


能 【光电 技术 ) 、 气 化 和 裂解 等 。 


程 技术 将 表明 ， 在 把 细胞 代谢 改 向 高 于 生理 水 平 的 


可 再 生 资源 
目前 ， 也 在 探索 利用 发 醇 或 酶 技术 作为 潜在 的 
千 物 路 线 生 产 氢气 (Kitani and Hall, 1989; Taguchi 
etal, 1995) ( 见 图 6.17)。 人 众所周知， 筛选 的 微 生 


物 可 以 将 氢气 作为 代谢 终 产物 而 高 效 生 产 。 代 谢 工 


氢气 生产 方面 这 将 十 分 有 有 用。 至今 ， 已 分 离 出 参与 
氨 合 成 的 几 个 基因 ， 例 如 取 自 弗 氏 柠檬 酸 杆 菌 
(Citrobacter freudii) 的 氢化 酶 基因 已 在 已. coli 菌 NADP* 
中 克隆 (Kanamayia et al, 1988). rn 氢化 酶 eae) 

最 近 ， 已 经 研究 了 体外 生产 氢气 的 可 能 性 NADPH 
(Woodward et al，1996)。 此 系统 由 两 种 酶 组 成 ， 即 
从 嗜 酸 热 原 体 ( Thermoplasma acidophilum ) 中 分 
离 到 的 葡萄 糖 脱 氢 酶 (GDH) 和 从 激烈 火球 菌 
(Pyrococcus furiosus) 中 分 离 到 的 氢化 酶 。GDH 催 和 
化 葡萄 糖 的 氧化 生成 葡 糖 酸 -9- 内 酯 ， 其 用 NADH 或 NADPH 作为 辅助 因子 进一步 水 解 形成 
葡萄 糖 酸 。 尽 管 细菌 氢化 酶 由 于 不 适当 的 低 势 能 极 少 与 NADPH 相互 作用 ， 但 取 自 激烈 火 
球菌 (P. furiosus) 和 真 养 产 碱 菌 (A. eutrophus) 的 氢化 酶 已 表明 利用 NADPH 作为 一 
个 电子 供 体 。Woodward (1996) 证 实 GDH 与 氢化 酶 的 组 合 具有 在 体外 由 葡萄 糖 生 产 所 
气 的 能 力 〈 见 图 6.17)。 在 辅助 因子 不 断 循 环 〈 至 少 20 次 ) HHT, FABRE HWA 
气量 可 达到 化 学 计量 得 率 。 这 条 新 发 现 的 途径 似乎 是 从 可 再 生 资源 生产 氧气 的 一 个 有 吸引 力 
的 选择 ， 该 过 程 中 也 不 会 直接 产生 废气 (如 CO, 和 CO 等 )。 有 一 个 限制 需要 识别 : MBS 
虑 葡萄 糖 酸 的 进一步 利用 ， 因 为 即使 是 小 规模 氢气 生产 三 也 会 产生 大 量 的 葡萄 糖 酸 副 产 物 。 
该 过 程 的 将 来 几 代 可 包括 将 这 些 酶 以 固定 化 形式 用 于 连续 的 氧气 合成 。 

RS (例如 Chlamydomonas reihardtii) 可 提供 一 种 捕获 光 能 进入 燃料 氢气 的 模式 
(Cinco et al, 1993; Lee et al,，1995)。 近 期 的 研究 (Greenbaum et al, 1995) 表明 膜 结 合 光 
合 系统 工 反应 中 心 的 突变 不 会 破坏 整个 光合 系统 。 此 原始 创新 发 现 否 认 如 下 说 法 : 光 能 转化 
为 化 学 能 时 光合 体系 工 和 光合 体系 开 都 需要 ， 而 且 该 发 现 还 将 光 能 转化 为 化 学 能 的 最 大 理论 
转化 率 加 倍 ， 由 10% 提 高 到 20% 。 


6.3.7 KH: 木 糖 醇 


木 糖 醇 是 一 种 可 作为 理想 的 防 龋齿 甜 味 剂 的 糖 醇 ; 并 且 消 化 它 时 不 需要 胰岛 素 而 适用 于 
糖尿 病 病人 (Emodi，1978)。 自 然 界 中 只 有 某 些 水 果 和 蔬菜 中 含有 少量 的 木 糖 醇 ， 这 就 使 
得 大 量 提取 困难 而 且 不 经 济 。 目 前 ， 主 要 是 在 碱 性 条 件 下 用 化 学 方法 通过 木 糖 的 催化 还 原 制 
木 糖 醇 ， 而 木 糖 来 自 半 纤维 素 的 水 解 产物 。 后 来 ， 研 究 集中 在 利用 微生物 由 D- 木 糖 生 产 木 
Be. Hii, KER URE, CHERAB (Candida), WC. pelliculosa 
(Nishio et al, 1989), C. boidinii (Vongsuvanlert and Tani, 1989), C. guilliermondi 
(Meyrial et al, 1991) 和 热带 假 丝 酵母 〈(C. tropicalis) (Gong et al, 1981) 及 Petromyces 
albertensis (Dahiya et al, 1991), 5) HAR, WFLZ044W HR (Enterobacter liquefa- 
ciens) (Yoshitake et al, 1973). #4F AJB (Corynebacterium sp.) (Yoshitake et al, 1971) 
和 耻 垢 分 支 杆 菌 ( Mycobacterium smegmatis ) (Izumori and Tuzaki，1988)。 酵 母 通常 含有 

147 


代谢 森 糖 的 前 两 种 酶 : ORS CXR) 和 木 糖 脱 氢 酶 (XDH) ( 见 图 6.7)。 通 过 培养 条 
件 优 化 已 将 木 糖 醇 生产 能 力 和 得 率 提高 到 中 等 水 平 (0.32 一 2.67g.L 1.h 1l) (Horitsu et 
al，1992)。 于 是 ， 重 点 放 在 通过 基因 修饰 来 提高 木 糖 转化 到 木 糖 醇 的 生产 能 力 和 得 率 。 

在 一 项 初始 的 研究 中 ， 选 择 已 ,stipitis XR 来 构建 生产 木 糖 醇 的 重组 酵母 菌 (Hallborn 
et al，1991)。 这 种 选择 是 基于 XR 的 高 度 专 一 活性 及 NADH、NADPH 都 可 作为 此 特定 XR 
的 辅助 因子 (Verduyn et al, 1985), HF#RZ XDH (NADH 再 生 时 需要 )， 在 含 葡 萄 糖 和 
木 糖 的 培养 基 上 对 重组 菌 进行 研究 。 葡 萄 糖 耗 尽 后 木 糖 利 用 开始 并 继续 进行 ， 最 后 木 糖 转化 
为 木 糖 醇 达 到 97% 的 理论 得 率 ， 比 生产 能 力 为 0.08g.g-!( 细 胞 )"h 1。 后 来 的 一 项 研究 ， 其 
目的 在 于 通过 过 量 表 达 P. stipitis 中 XR 和 XDH 的 基因 ， 扩 展 含 乙醇 基因 的 S cerevisiae 
菌 的 底 物 利用 范围 ， 很 幸运 地 使 森 糖 醇 产量 达 3Sg.L -1 (Tantirungkij et al, 1993). 


6.4 细胞 性 能 的 改进 


这 类 代谢 工程 目的 在 于 把 生物 体 作为 一 个 整体 ， 因 此 也 称 为 细胞 工程 。 已 经 有 若干 细胞 
工程 成 功 应 用 的 例子 ， 其 中 包括 从 细菌 到 动物 细胞 范围 很 广 的 生物 体 。 这 些 应 用 已 把 目标 定 
在 提高 比 生 长 速率 和 生长 得 率 、 提 供 对 有 毒化 合 物 的 抵抗 力 、 改 进 特定 产物 的 分 记 能 力 、 提 
高 植物 细胞 的 耐 旱 和 耐 盐 能 力 以 及 改变 重组 多 肽 的 糖 基 化 序列 。 这 是 一 个 挑战 与 机 遇 并 存 的 
极为 重要 的 领域 。 

6.4.1 和 氮 代 谢 的 改造 

代谢 工程 早期 成 功 的 一 个 例子 是 专 性 甲 基 营 养 菌 (Methyioppnilus methylotrophus ) 的 
氮 同 化 吸收 途径 的 改造 ， 目 的 是 提高 单 细 胞 蛋白 (SCP) 的 得 率 。M . methylotrophus AS 
被 选择 从 甲醇 进行 SCP 的 工业 生产 ， 这 是 因 其 具有 高 的 碳 转化 效率 、 对 甲醇 的 高 耐 受 性 以 


A.GS/GOGAT 途 径 及 营养 背景 。 然 而 此 微生物 的 氨 同 化 吸收 
NHi+ATP ADP+P， 途径 有 一 个 主要 缺点 : 它 利 用 谷 所 酰胺 人 台 
are Bi (GS) #14 SM 4M (GOGAT) 系 

(Gs) 统 ， 该 系统 每 将 lmol 所 运输 进 细 胞 中 需 

谷 氢 酸 谷 务 酰胺 要 lmol ATP ( 见 2.4.1 节 )。 相 比 之 下 ， 
sa 对 应 的 大 肠 杆菌 所 同化 吸收 途径 利用 谷 氮 

酸 脱氧 酶 (GDH ) ， 不 需要 消耗 ATP ( 见 

a. inp 图 6.18)。 为 了 氨 的 同化 吸收 ，M: 
B.GDH 途径 methylotrophus 菌 可 能 在 利用 能 量 亚 优 途 
2-Oxoghutarate+NH;+NAD(DJH 一 GDH 一 ~GlutamatefNAD(P) 径 ， 因 为 它 是 在 -- 个 所 浓度 较 低 环境 中 进 
(2- 氧 成 二 酸 ) ( 谷 氨 酸 ) 行 的 ， 而 GS 对 氨 的 亲和力 比 GDH 要 高 。 
图 6.18 细菌 氨 同 化 吸收 途径 ” 克隆 在 一 个 穿梭 载体 上 的 大 肠 杆菌 谷 氢 酸 


脱氧 酶 基因 (gdh), BAA BT Hh FE M . methylotrophus AW gs 突变 株 (Windass et al, 
1980)。 结 果 ， 工 程 菌 展现 了 高 的 甲醇 转化 为 胞 内 碳 的 能 力 ， 也 许 是 由 于 经 GDH 的 所 吸收 
途径 比 偶 合 的 GS/GOGAT 途径 能 量 更 有 效 。 碳 的 转化 效率 提高 了 4% ~7% 。 

该 工作 是 代谢 工程 的 第 一 批 工业 应 用 实例 之 一 ， 它 表明 为 使 其 在 自然 生长 环境 下 生存 机 
会 最 大 ， 生 物体 所 进化 的 性 质 在 大 规模 生物 反应 器 的 人 工 环境 中 并 不 是 必然 处 于 最 佳 状 态 。 
6.4.2 提高 氧 的 利用 

在 大 规模 好 氧 发 酵 过 程 中 一 个 共同 的 挑战 是 确保 一 个 适当 的 氧 水 平 以 达到 所 希望 的 细胞 

148 


生长 和 生产 能 力 。 在 微 通气 条 件 下 〈 例 如 非 理 想 混合 造成 的 情况 )， 会 发 生 如 下 情况 : 呼吸 
和 发 酵 代 谢 各 单元 均 处 于 活泼 状态 ， 并 争 着 完善 能 量 合成 和 氧化 还 原平 衡 。 这 种 氧 波 动 不 可 
避免 地 导致 不 希望 的 生理 结果 ， 例 如 总 体 的 和 特定 的 氧 调节 响应 机 制 的 失效 ， 该 响应 机 制 激 
活 或 抑制 中 心 碳 代谢 中 的 关键 酶 。 这 些 生存 响应 由 生长 速率 和 产物 生成 的 变动 表现 出 来 。 

最 近 研 究 发 现 可 以 用 克隆 来 自 透明 闸 菌 ( Vitreoscilla) (VHb) 中 的 血红 和 蛋白 基因 
(vgb) (Khosla and Baily, 1988a, b) 来 部 分 减轻 这 种 氧 波 动 和 缺 氧 环境 所 造成 的 不 希望 的 
结果 。 尽 管 它 在 体内 的 确切 功能 尚未 确认 ， 但 认为 VHb 是 一 种 氧 结合 蛋白 质 ， 从 而 能 使 
Vitreoscilla 在 其 自然 生境 的 微 氧 条 件 特性 中 生存 。 最 近 的 研究 表明 ，VHb 可 增加 每 个 还 原 
态 氧 原 子 穿 越 细胞 质 膜 时 所 逐 出 的 质子 数目 ， 并 提高 大 肠 杆菌 在 微 氧 条 件 下 由 ATP 酶 催化 
A) ATP 合成 速率 (Chen and Baily, 1994; Kalio et al, 1994) ( 见 2.3.3 节 )。 通 量 分 布 分 析 
(第 8 章 ) 也 揭示 了 VHb -细胞 由 底 物 水 平 磷酸 化 合成 ATP 速率 很 小 ， 但 在 微 氧 条 件 下 有 更 
大 的 ATP 总 生产 速率 (Tsai et al，199$a 一 c)。 此 外 ， 从 cyo/cyd (通气 / 微 通气 末端 氧化 
酶 ) 突变 株 得 出 的 结果 表明 大 肠 杆 菌 中 VHb 的 表达 可 提高 末端 氧化 酶 的 水 平和 活力 ， 从 而 
可 以 提高 微 氧 呼吸 和 生长 的 效率 (Tsai et al，1995 ) 。 在 线 培 养 NAD (P) H 荧光 和 氧化 还 
原 电 位 测量 (CRP) 表明 VHb 缓冲 由 胞 内 DO (RA) 波动 所 造成 的 氧化 还 原 电 位 北 乱 
(Tsai et al, 1995). 

受 这 种 酶 在 氧 限制 条 件 下 有 利于 菌 体 生 长 的 学 说 所 激励 ，zvg 基因 被 转 人 多 种 重要 工业 
微生物 中 。 这 种 蛋白 质 在 范围 广泛 的 宿主 中 异 源 表达 已 经 证 明 : 其 诱导 体内 降低 氧 缺 乏 效 
应 ， 促 进 了 细胞 生长 并 增加 了 产品 生成 (DeModena et al, 1993; Khosla and Bailey, 1998a, 
b; Khosravi et al, 1990; Magnolo et al，1991)。 例 如 ， 携 带 有 该 基因 单个 拷贝 并 已 整合 到 其 
染 色 体 的 大 肠 杆 菌 ， 在 氧 限制 条 件 下 合成 的 总 细胞 蛋白 的 速率 比 同 基因 野生 型 菌株 要 快 得 
多 。 此 外 ， 相 对 于 氧 限制 条 件 下 的 焉 .coli 的 对 照 培 养 ，VHb 的 共 表 达 增 加 了 克隆 的 8- 半 乳 
糖苷 酶 、 氧 霉 素 乙酰 转移 酶 (CAT) 和 vc- 淀粉 酶 的 表达 1.5 一 3.3 倍 。 在 其 它 一 些 例子 中 ， 
此 和 蛋白 的 表达 在 链 霉菌 (Streptomyces) 中 使 一 种 抗生素 的 产量 提高 了 13 倍 ， 在 棒状 杆菌 
申 使 氨基 酸 的 产量 提高 1.2 倍 。 为 研究 这 项 技术 而 成 立 的 Exogene 公司 ， 已 在 青 霉 属 和 哺 
乳 动 物 的 细胞 中 成 功 表 达 了 VHb。 此 外 ,在 生物 修复 领域 ， 用 ough 对 嗜 麦 芽 黄 单 胞 菌 
(Xanthomonas maltophilia) 的 转化 导致 葵 甲 酸 转 化 为 生物 质 效率 的 增加 (Liu et al, 
1996). 

6.4.3 过 度 代 谢 的 防止 

当前 ， 利 用 大 肠 杆菌 生产 重组 蛋白 质 过 程 中 ， 主 要 的 技术 挑战 之 一 是 要 在 高 细胞 浓度 下 
仍 保持 高 的 胞 内 产物 水 平 。 由 于 抑制 性 培养 副 产 物 的 积累 ， 这 种 双重 目标 很 难 达 到 。 不 论 是 
在 厌 氧 还 是 好 氧 生长 过 程 中 ， 碳 通 量 和 还 原 剂 通 量 是 通过 酸性 副 产 物 的 分 沁 来 平衡 的 ， 分 这 
量 最 多 的 酸性 物质 是 乙酸 ， 这 种 弱酸 是 公认 的 生长 抑制 剂 。 最 重要 的 是 它 降低 重组 产物 表达 
的 细胞 功效 , 好 像 是 通过 干扰 二 硫 键 的 形成 而 影响 胞 内 蛋白质 的 质量 。 

与 无 机 酸 的 抑制 水 平 相 比 ， 有 机 酸 在 低 浓度 下 就 可 影响 细胞 的 生长 。 乙 酸 等 在 细胞 内 产 
生 的 非 解 离 形 式 的 短 链 脂肪 酸 ， 例 如 乙酸 可 自由 地 透 过 细胞 膜 并 且 在 培养 基 中 积累 。 随 后 ， 
存在 于 胞 外 的 一 部 分 非 解 离 的 酸 又 重新 进入 胞 内 并 解 离 ,产生 相对 高 的 胞 内 pH 值 。 这 表 
明 ， 弱 酸 实际 上 充当 着 质子 的 导体 ( 见 2.2.1 节 和 例 2.1)。 如 果 这 个 过 程 不 减缓 地 继续 下 去 ， 
HEY pH 值 将 达到 胞 外 pH 值 水 平 ， 将 使 质子 动力 的 ApH 组 分 ( 见 2.33 节 和 例 13.6) 瓦解 裔 
Yt (Diaz-Ricci et al, 1990; Slonczewski et al，1981)。 此 外 ， 低 的 胞 外 pH 值 (<5) 几乎 能 引起 

149 


完全 生长 停滞 〈 没 有 细胞 溶菌 发 生 ) ， 这 或 许 是 因为 DNA AI A AS aE, 

除了 上 述 细 胞 能 学 的 影响 之 外 ， 还 有 很 多 其 它 因素 在 弱 有 机 酸 的 抑制 性 质 中 起 作用 ， 这 
就 使 得 使 乙酸 分 泌 最 小 成 为 优化 重组 过 程 生产 得 率 的 一 个 先决 条 件 (Yee and Blanch, 1992; 
Zabriskie and Arcuri, 1986). Jensen 和 Carlsen (1990) 等 人 研究 了 乙酸 对 于 瓦 .col PA 
生长 激素 生产 的 影响 ， 恒 化 器 数据 清楚 表明 乙酸 在 此 重组 系统 中 的 重要 作用 。 通 过 改变 进 料 
中 乙酸 的 量 已 经 确定 : 40mmol-L -的 乙酸 水 平 使 重组 蛋白 得 率 降 低 约 335% ， 但 对 生物 量 得 
率 无 任何 影响 。 这 个 结果 与 一 般 观 察 相 符合 ， 即 影响 重组 蛋白 得 率 的 乙酸 低 限 浓度 低 于 造成 
显著 生长 抑制 的 浓度 。 在 同一 研究 中 ， 乙 酸 浓度 提高 到 100mmol'L-! 时 使 生物 质 得 率 减 少 
70% 以 上 ， 而 重组 产品 得 率 下 降 了 2 倍 。 其 它 一 些 研究 者 也 涉及 把 乙酸 作为 重组 过 程 生产 能 
力 降 低 的 一 个 重要 因素 (Brandes et al, 1993; Brown et al, 1985; Curless et al, 1988; Luli 
and Strohl, 1990; Starrenburg and Hugenholtz, 1991). 

如 下 事实 已 被 广泛 接受 : 乙酸 的 分 刻 是 由 于 糖 酵 解 通 量 和 细胞 对 代谢 前 体 物 及 能 量 的 实 
际 需要 量 之 间 不 平衡 造成 的 。 丙 酮 酸 是 糖 酵 解 作用 的 最 终 产物 ， 同 时 也 是 乙酸 的 前 体 物质 。 
因此 丙酮 酸 为 实现 乙酸 的 积累 提供 了 一 个 恰当 的 接合 点 。 该 策略 包括 引入 一 个 异 源 酶 ， 以 催 
化 过 剩 的 碳 通 量 改 向 到 比 乙 酸 不 太 有 害 的 副 产 物 方向 。 枯 草 芽 孢 杆 菌 CB. subtilis) 乙酰 乳 
酸 合成 酶 (ALS) 曾 被 选中 用 于 此 目的 ， 这 是 基于 这 组 微生物 的 发 酵 特性 (Johansen et al, 
1975)。 表 6.6 是 正 . coli 等 进行 混合 酸 发 酵 菌 的 副 产 物 量 与 Baczllzus subtilis MERAF HB 
FFA (Aerobacillus polymyxza) 等 丁 二 醇 生 产 菌 的 副 产 物 量 的 比较 。 很 明显 : BAMA 
与 大 肠 杆菌 相 比 仅 生成 非常 少量 的 酸 ， 因 为 它们 把 葡萄 糖 主 要 转化 为 中 性 物质 2,3- 丁 二 醇 。 


表 6.6 混合 酸 发 酵 与 本 二 醇 发 酵 的 比较 中 


甘油 
乙醇 

甲酸 

乙酸 

乳酸 

琥珀 酸 

二 氧化 碳 

氢气 

碳 回收 率 /% 
氧化 /还 原平 衡 
@ 取 自 Wood，1961。 

@® mmol.100mmol-! 发 酵 的 葡萄 糖 。 


图 6-19 表明 ， 丁 二 醇 生 产 菌 通常 有 两 种 不 同 的 酶 将 丙酮 酸 转化 为 乙酰 乳酸 : BY “pH 6” 
乙酰 乳酸 合成 酶 (ALS) 和 乙酰 产 酸 合成 酶 (AHAS)。AHAS， 在 许多 微生物 中 都 已 发 现 的 一 
种 合成 代谢 酶 ， 它 也 催化 由 丙酮 酸 出 发 合成 顷 氨 酸 、 亮 氨 酸 和 异 亮 氨 酸 等 支 链 氨 基 酸 的 那些 初 
始 步骤 。AHAS 也 是 一 种 黄 素 蛋白 ， 它 受 终 产 物 〈 如 纺 氨 酸 ) 的 反馈 抑制 调控 。 另 一 方面 ， 
ALS 既 不 需 FAD 来 辅助 活化 ， 也 不 被 支 链 氨基 酸 所 抑制 《Stormer，1968 ) 。 

150 


DSSS 


+a-Ma ym —AHAS a-ZB-a-327R —~- 一 -~ 一 -~ 异 亮 氨 酸 


Pina es 
imme SS oz —~ —- 一 一 ~ maim 


a-ALDC 


| 


AR 
NAD* 


2,3-7 —# FAR 
6.19 ALS 45 AHAS 酶 的 比较 以 及 它们 在 支 链 氨 基 酸 合成 与 丁 二 醇 形成 中 的 作用 
缩写 : ALS 一 乙酰 乳酸 合 酶 ; AHAS 一 乙酰 产 酸 合成 酶 ; -ALDC 一 ax- 乙酰 乳酸 脱羧 酶 ; 
AR 一 3- 产 基 丁 酮 还 原 酶 (或 2，3- 丁 二 醇 脱 氢 酶 ); DAR 一 双 乙 酰 还 原 酶 

B. subtilis 中 编码 乙酰 乳酸 合 酶 的 alsS ZEAE E. coli 中 被 成 功 表 达 (Aristidou et al, 1994a, 
5)。 这 个 酶 作用 于 丙酮 酸 分 支点 ， 使 过 量 的 碳 通 量 离开 乙酸 分 支 途 径 改 向 生成 非 抑 制 性 副 产 物 a- 
乙酰 乳酸 。 所 得 工程 菌株 的 表征 说 明 即 使 在 富 葡萄 糖 培养 基 中 高 密度 培养 ， 乙 酸 分 沁 量 仍 可 维持 
在 20mnmol.L ! 以 下 。 此 外 ， 这 种 工程 菌 是 重组 蛋白 生产 更 有 效 的 宿主 (Aristidou et al, 1994): 
重组 8 . 半 乳 糖苷 酶 体积 表达 在 分 批 培养 中 可 提高 约 50% ， 而 在 高 细胞 浓度 流 加 培养 中 可 以 提高 约 
220% 。 这 些 结果 都 证 实 了 代谢 工程 在 细胞 特性 改进 方面 的 成 功 应 用 。 
6.4.4 底 物 吸收 的 改变 

营养 物质 通过 跨 膜 运输 而 被 吸收 是 所 有 生物 机 体 的 一 项 重要 任务 。 除 自由 扩散 以 外 ， 运 
输 过 程 通常 可 分 为 三 类 : (i) 促进 扩散 ; Gi) 基 团 转 位 ; Gi) 主动 运输 ( 见 2.2 节 )。 葡 萄 
糖 、 甘 露 糖 和 果糖 等 已 糖 进 入 细胞 主要 是 通过 依赖 磷酸 烯 醇 两 酮 酸 的 碳水 化 合 物 ， 磷 酸 转移 
酶 系统 (PTS) ， 这 是 一 个 基因 转 位 过 程 (Dills et al, 1980; Postma et al, 1993; Saier et al, 
1988)。 不 管 糖 或 微生物 ， 由 PTS 催化 的 总 过 程 可 以 总 结 如 下 

— (PEP), n — (carbohydrate)ouT+ (pyruvate) nj + (carbohydrate-P; )IN=0 
(#8) 〈 丙 酮 酸 ) ( 糖 -P; ) 

PTS 在 含有 细胞 质 以 及 膜 结合 蛋白 的 一 系列 步骤 中 ， 完 成 糖 的 转 位 和 磷酸 化 ( 见 2.2.3 节 )。 

PEP 除了 在 糖 吸收 上 起 重要 作用 外 ， 也 是 几 个 专用 化 学 品 的 基本 前 体 ， 包 括 芳 香 族 氮 
基 酸 、 欧 蓝 、 肠 杆菌 素 和 黑色 素 等 。 因 此 ， 通 过 提供 一 种 非 -PTS 糖 吸 收 蔡 换 系统 ， 那 么 ， 
从 原理 上 每 消耗 1Imol 葡萄 糖 就 可 节约 lmol PEP。 为 了 改进 PEP 用 于 生物 合成 目的 的 可 利 
用 性 所 使 用 的 一 些 方法 包括 : 非 -PTS 碳 源 的 使 用 、 通 过 PEP 合 酶 超 量 生产 使 丙酮 酸 循环 到 
PEP (Patnaik and Liao, 1994; Patnaik et al, 1995) 以 及 丙酮 酸 激酶 的 灭 活 (Mori et al, 
1987), MR N—*> BE RBA THRE. coli 菌株 中 葡萄 糖 PTS 基因 ptsH, ptsI 和 
crr 的 缺失 ， 以 致 葡萄 糖 不 再 经 PEP- 消 耗 系 统 被 运输 进 细 胞 (Flores et al, 1996)。 后 来 ,在 
恒 化 器 培养 中 “回复 体 ”(Revertant) 菌株 被 选择 ， 其 后 来 被 表征 具有 一 个 能 够 有 效 运输 葡 
萄 糖 的 半 乳 糖 通 透 酶 基因 。 这 株 稳 定 的 、 快 速生 长 的 工程 菌 NGO 后 来 被 用 于 被 提高 的 
DAHP 合 酶 〈 此 酶 缩合 PEP 和 4- 磷 酸 - 赤 父 糖 形成 DAHP) 的 遗传 本 底 ， 证 明了 葡萄 糖 运输 
中 所 节约 的 PEP 被 改变 方向 进入 芳香 族 氨 基 酸 途径 中 。 

151 


6.4.5 遗传 稳定 性 的 维持 

近 几 年 间 ， 已 普遍 应 用 质粒 克隆 载体 作为 基因 的 运输 工具 ， 这 些 基因 的 产品 具有 科学 或 
商业 兴趣 。 一 个 质粒 载体 所 希望 的 特征 包括 : 相对 分 子 量 小 、 依 应 用 情况 可 具有 高 或 可 控制 
的 拷贝 数 、 为 高 水 平 基因 表达 的 强 而 可 控制 的 启动 和子， 而 更 重要 的 是 其 结构 和 遗传 稳定 性 。 
遗传 不 稳定 性 是 重组 微生物 工业 利用 的 主要 障碍 。 导 致 这 种 不 稳定 性 的 原因 可 能 有 多 种 ， 而 
且 一 般 说 来 ， 那 些 在 指导 蛋白 质 生 产 中 最 有 效 的 表达 载体 通常 更 加 不 稳定 。 这 可 能 是 施加 于 
细胞 的 代谢 负荷 增加 的 结果 ， 而 且 在 几 代 之 内 可 能 导致 出 现 无 质粒 群体 。 除 分 离 不 稳定 性 
外 ， 由 于 同 源 重 组 事件 的 结构 不 稳定 性 可 导致 不 再 产生 所 需 产 品 的 质粒 衍生 物 。 

分 离 不 稳定 性 和 结构 不 稳定 性 的 防止 是 过 去 15$ 一 20 年 中 集中 人 研究 的 主题 。 结 构 不 稳定 
性 一 般 可 通过 宿主 细胞 上 recA 基因 的 缺失 而 降 至 最 小 。 这 种 缺失 应 严格 限制 在 染色 体外 
DNA 和 染色 体 DNA 之 间 的 同 源 重 组 。Csonka 和 Clark (1979) 在 其 早期 的 研究 工作 中 已 
表明 A(srl-recA )306 罕 变 使 重组 率 降 低 36000 倍 。 此 外 ，Laban 和 Cohen (1981) 已 表明 
recA 基因 点 突变 使 一 个 质粒 内 的 重组 事件 的 频率 降低 100 倍 。 另 一 方面 ， 分 离 不 稳定 性 是 
一 个 更 具 挑战 性 的 问题 ， 其 需要 更 复杂 更 精细 的 解决 办 法 。 

已 经 设计 提出 一 些 获得 遗传 上 稳定 的 质粒 的 策略 方案 ， 最 简单 基本 的 解决 方法 似乎 是 在 
生长 培养 基 中 添加 抗生素 ， 从 而 选择 包含 具有 抗菌 素 抗 性 的 质粒 载体 的 细胞 。 该 方法 有 一 些 


明显 的 缺点 ， 例 如 需 使 用 价格 昂贵 且 形 成 污染 的 抗生素 。 后 来 ，Skogman 和 Diderichsen 提 ， 


出 一 种 讲究 实用 的 方法 (Diderichsen, 1986; Skogman et al,，1983)。 他 们 使 用 了 一 种 特定 的 
宿主 -载体 系统 ， 在 此 系统 中 ， 导 致 一 株 营养 缺陷 型 宿主 的 一 个 特定 染色 体 突 变 是 由 目的 质 
粒 载体 上 一 个 相应 的 功能 基因 所 补充 。 虽 然 这 是 一 个 强 有 力 的 方法 ， 但 其 应 用 性 受到 限制 ， 
原因 是 需要 具有 特定 突变 的 特定 宿主 菌 。 

具有 更 广 适 用 性 的 一 项 技术 包括 质粒 R1 的 hok /sok 基因 座 (以 前 的 aazB )。 该 系统 是 


通过 其 协调 能 力 而 发 现 的 ， 该 能 力 是 协调 促进 昔 兰 氏 阴 性 菌 中 多 种 质粒 的 稳定 化 〈Gerdes，“ 


1988; Gerdes et al，1986)。 后 来 ， 证 实 更 多 的 质粒 保持 是 由 于 细胞 的 有 选择 性 杀 死 的 结果 ， 
这 些 细胞 指 其 在 分 开 点 失去 含 hok/sok WIRE. hok/sok 基因 座 编码 两 种 RNA， 即 hok 
( 杀 死 宿主 ) mRNA 和 sok (抑制 杀 死 ) RNA. hok 产物 是 很 强 的 细胞 致死 剂 ， 它 从 内 部 通 
过 破坏 细胞 膜 来 杀 死 细菌 。soR& 产物 是 一 个 反 式 反 义 RNA (sok RNA， 见 方 框 6.3)， 它 在 
转录 后 水 平抑 制 hok 基因 的 表达 。 迅 速 而 选择 性 杀 死 无 质粒 分 离 体 可 用 以 下 理论 来 解释 : 
hok mRNA 是 极端 稳定 的 (zip2 约 20min)， 而 sok mRNA 迅速 衰亡 。 因 此 ， 在 含有 质粒 的 
SAP, sok RNA 阻止 了 hok 蛋白 质 的 合成 而 细胞 仍 能 存活 。 另 一 方面 ， 当 无 质粒 的 分 离 
体 出 现时 ， 不 稳定 的 sok RNA 分 子 衰亡 ， 因 此 致使 稳定 的 hok RNA 容易 得 到 转录 。 结 果 ， 
hok 蛋白 被 合成 ， 因 而 导致 无 质粒 分 离 体 的 死亡 。 


6.5 异 生 物 的 降解 


天 然 过程 (包括 生物 过 程 和 地 球 化 学 过 程 ) 都 产生 大 量 的 各 种 各 样 的 有 机 化 合 物 ， 而 且 
经 过 无 数 代 的 进化 ， 不 同 的 微生物 已 经 渐渐 形成 几乎 可 以 降解 所 有 这 些 天 然 化 合 物 的 能 力 ， 
进而 将 其 作为 碳 和 (或 ) 能 量 的 一 种 来 源 。 然 而 ， 为 了 工业 或 农业 目的 由 人 类 生产 的 数 万 种 
人 工 合成 的 有 机 化 合 物 在 微生物 世界 还 没有 明显 的 对 手 。 这 些 合成 的 新 的 化 合 物 被 称 做 异 生 
物 ， 这 一 称谓 来 源 于 希腊 语 zexzos ， 意 思 是 指 “ 外 来 的 "。 异 生物 (如 后 面 讨 论 的 PBC 等 ) 
是 稳定 的 而 且 是 脂 溶性 的 ， 因 此 在 其 穿越 经 过 食物 链 时 被 不 断 地 富 集 浓缩 。 
152 


异 生 物 的 降解 是 一 个 迅速 发 展 的 领域 ， 给 代谢 过 程 带 来 巨大 的 机 遇 。 它 主要 包括 利用 基 
因 工 程 菌 降解 污染 物 ， 这 通常 被 称 为 生物 修复 。 生 物 修 复 目 前 正 被 用 于 降解 度 有 机 化 合 物 ， 
它们 来 自 土壤 ， 地 下 水 ， 化 工厂 和 食品 加 工厂 的 废水 ， 以 及 石油 炼 制 厂 排出 的 含油 污 泥 等 。 

早期 异 生物 降解 微生物 的 分 离 工 作 集 中 于 恒 化 器 培养 选择 法 。 这 项 技术 是 基于 用 取 自 不 
同 的 有 毒 废 物 垃圾 点 的 微生物 样品 接种 于 恒 化 器 培养 ， 进 而 选择 所 希望 的 菌 种 。 通 过 这 种 方 
%, BAAR SHRI (Pseudomonas), ERE WRB Rw (RFA 2,4,5-=A 
茉 氧 基 乙酸 等 ) (Kilbane et al,，1983)。 这 种 菌 在 一 周 内 成 功 地 除去 了 土壤 中 98% 的 污染 物 ， 
然后 迅速 死亡 ， 因 为 它 不 能 与 内 源 菌 种 相 抗衡 。 

除了 恒 化 器 选择 法 外 ， 设 计 有 用 的 分 解 代 谢 途 径 的 理性 方法 在 过 去 10 年 已 经 有 一 些 相 
关 报 道 ， 下 面 将 讨论 之 。 


方 框 6.3 反 义 RNA 

FAW RNAs 是 小 的 (15~50 个 核 苷 酸 )、 不 被 翻译 的 、 具 有 调节 作用 的 RNA 
分 子 ， 它 抑制 了 它们 的 目标 RNAs 的 功能 ， 这 些 目标 RNAs 与 之 是 互补 的 。 反 义 RNAs 
调节 如 此 多 种 多 样 的 功能 ， 如 质粒 复制 、 连 接 、 维 持 、 转 座 及 细菌 噬菌体 溶菌 - 溶 源 性 的 
断定 等 。 反 义 RNAs 通过 该 反 义 RNA 中 的 一 个 单 链 环 与 目标 RNA 中 的 一 个 补充 环 之 间 
的 一 个 初始 可 逆 接 触 联 系 来 识别 其 目标 RNA。 该 初始 可 逆 接 触 联系 之 后 是 这 两 个 RNA 
分 子 之 间 一 个 热力 学 上 非常 稳定 的 复式 结构 的 形成 。 

反 义 RNASs 可 能 通过 几 个 不 同 的 机 制 来 抑制 其 目标 RNA 的 功能 。 例 如 Tnl0 的 可 
转 座 基 因 受 RNA-OUT 调节 ， 而 RNA-OUT 是 对 可 转 座 mRNA 的 翻译 起 始 区 (TRI) 
的 反 义 补 充 。 在 这 种 情况 下 ， 已 经 表明 反 义 RNA 对 mRNA 的 杂交 物理 上 阻塞 了 在 该 可 
转 座 基 因 上 核糖 体 的 进入 ， 这 是 由 一 个 反 义 RNA 促成 的 直接 目标 RNA 抑制 的 例子 。 

由 反 义 RNAs 引起 的 间接 目标 RNA 的 抑制 已 经 在 几 个 例子 中 描述 了 。 经 典 的 例子 
可 能 是 质粒 ColE1 的 复制 控制 回路 。 反 义 RNA (RNA 1) 与 复制 起 始 的 引物 RNA I 
相互 作用 ， 从 而 诱导 了 杂交 位 点 下 游 几 百 个 核 苷 酸 分 子 二 级 结构 的 改变 。 这 种 二 级 结构 
的 变化 阻止 了 依赖 核糖 核酸 酶 (RNase) H 的 引物 RNA 的 切割 ， 而 这 种 切割 是 复制 起 
始 的 前 提 。 


6.5.1 SRA (PCBs) 


PCBs 是 一 类 含有 一 个 联 茶 ， 并 且 其 上 带 有 1 一 10 个 氯 的 人 工 CES 


谷 成 化 合 物 ， 共 209 种 (FLA 6.20). M1929~1978 年 ， 大 约 生 产 oe) tL ae 


KE 
T 70 万 吨 的 PCBs， 其 中 大 部 分 〈 几 十 万 吨 ) BUF EEE To es aca 4 8B3E(PCB) 
RA ETRE DEB AE — A, — AR =A PCBs, 但 并 没 的 一 般 结 构 式 


有 能 够 氧化 更 高 氯 化 了 的 PCBs 的 微生物 。 在 自然 界 中 降解 PCB 数字 表示 可 能 的 氧化 位 点 。 
的 最 普通 的 方法 可 能 是 协同 代谢 ， 但 是 ， 这 是 一 个 非常 缓慢 的 过 经 验 式 为 :CpHp-vCh， 
程 ， 由 于 最 初 的 转变 不 能 为 微生物 的 生长 提供 碳 源 或 能 源 。 人 

PCB 降解 酶 基因 (bph A, bph B, bph C Mbph D) 已 从 假 单 胞 菌 Pseudomonas 
LB400 中 分 离 得 到 (LA 6.21), FH ME—-KE. coli 菌 中 已 过 量 表 达 。 以 PCB 降解 的 特 
效 性 和 程度 来 表示 ， 重 组 菌 的 降解 能 力 可 以 与 LB400 菌 相 比 。 

通过 在 假 单 胞 菌 Pseudomonas 中 引入 特定 基因 ， 有 可 能 构建 出 菌株 降解 芳香 化 合 物 的 混合 
物 ， 例 如 工业 废物 中 常见 的 3- 氯 (或 4- 甲 基 ) 葵 等 〈(Roio et al, 1987)。 另 一 种 十 分 有 意义 的 降解 

153 


EKA DW Rt A 4 AB A Phanerochaete chrysosporium 的 
木质 素 酶 ， 它 能 够 分 解 范围 很 广 的 异 生 物 ， 甚 至 包括 各 种 结 
构 ， 如 葵 并 花 与 葵 甲 烷 染 料 等 (Bumpus and Brock, 1988). 
6.5.2 葵 、 甲 茶 和 对 二 甲 葵 混 合 物 (BTX) 

这 组 来 自 石油 的 污染 物 是 水 溶性 的 ， 因 此 能 污染 水 资源 ， 
给 人 类 的 健康 造成 严重 的 威胁 。 一 些 研究 已 集中 在 构建 基因 
工程 菌 ， 它 能 够 将 这 类 污染 物 单 个 地 或 共同 地 转化 为 没什么 
毒害 的 物质 ， 如 丙酮 酸 。 下 面 讨论 两 个 这 方面 的 例子 。 

TOL (pPWW0) 分 解 代 谢 质 粒 

分 解 代 谢 质粒 通常 包含 某 些 降解 途径 所 需要 的 一 套 完整 
基因 ， 特 别 是 在 假 单 胞 菌 Psexdoxzozas ， 其 无 处 不 在 。 它 们 
是 可 自传 递 的 ， 并 且 许 多 都 具有 广泛 的 宿主 范围 ， 这 使 得 它 
们 在 自然 界 中 特别 有 用 ， 在 自然 界 这 样 一些 分 解 代 谢 途 径 能 


Ho. 被 不 同 物种 利用 。 至 今 很 多 分 离 得 到 的 分 解 代谢 质粒 具有 降 
uc CN Ed 解 芳 香 族 化 合 物 的 代谢 途径 ， 这 也 许 是 因为 ， 在 自然 界 中 除 
He, An HE 葡萄糖 外 ， 苯 环 是 第 二 种 含量 丰富 而 可 作为 结构 单元 的 物质 。 


来 自 恶 臭 假 单 胞 菌 (Pseudomonas putida) 的 TOL . 
(pWWO) 分 解 代 谢 质粒 ， 已 表明 赋予 其 宿主 降解 甲苯 、 间 或 


° Xt BIE A EOE HT» HEHE A 
HeraCse on 子 (WH 6.7 和 图 6.22): (1) zwWCAB, 其 编码 可 将 甲苯 和 
Her SFOS) Hi EAE EAE ( 甲 ) 酸 〈 上 部 途径 )，(2) 


图 6.21 SRR A 
fA Pseudomonas LB400 中 
2,3- 双 加 氧 酶 途径 的 降解 
3A : bphA IK 2,3 

WLAN ANS ; bphB— — BEB ; 

bphC—2,3-—A— RUIN ALS ; 


bphD—2-A-6-A-2 ,4- — BRK ACB 


ZyXYZLEGEFEJKTI 万 ， 其 编码 可 将 葵 甲 酸 和 甲苯 ( 甲 ) 酸 分 
别 降解 为 乙 醛 和 丙酮 酸 (下 部 途径 )。 在 2- 羟 基 已 二 烯 二 酸 


半 醛 (2-hydroxymuconic semialdehyde) AMARA, A 


了 由 此 途径 可 降解 底 物 的 范围 。 例 如 ， 甲 苯 ( 甲 ) RA rylF 
分 支 途径 降解 ， 而 葵 和 对 二 甲苯 经 rylGHI 分 支 途径 降解 。 

为 了 拓宽 一 种 生物 可 利用 的 底 物 范围 ， 基 因 工 程 技术 已 
被 应 用 。 例 如 ， 带 有 TOL 质粒 的 P. putida 菌 可 以 在 各 种 
eee LEK, ， 如 葵 甲 酸 ( 盐 )、3- 甲 基 苯 甲酸 (Eh) 和 4- 甲 


基 葵 甲酸 ( 盐 )(3MB 和 4MB )、3 ,4- 二 甲 基 葵 甲酸 ( 盐 )(3,4DMB ) 以 及 3- 乙 基 葵 甲酸 


表 6.7 TOL 分 解 代 谢 质粒 pwwo 的 基因 和 相应 的 产物 


上 部 途径 操纵 子 4- 草 酰 丁 烯 酸 互 变异 构 酶 
aylA — AE hn 4-H BBE THe BR AE I 
azylB AZ BG BE A 2- 氧 -4- 戊 烯 酸 (2-Oxopent-4-enoate) 水 合 酶 
aylC FA A 2-A-4 FE 3G (2-Oxo-4 hydroxypentencate) 
下 部 途径 操纵 子 二 羟基 环 已 二 烯 羧 化 酶 脱 氢 酶 
ZWX,zWY,zXWZ | PROM 
rylE 40 3 — MH 2,3- 双 加 氧 酶 转录 调节 
aylF 2- 羟 基 黏 康 酸 半 醛 水 解 酶 转录 调节 


ZXyLG 2- 羟 基 黏 康 酸 半 醛 脱 氢 酶 


154 


CH; CH2OH CHO COOH 


HOOC、 .OH 
x : OH 
VIA xyIB XVIC XV XYZ 


甲苯 a FARE FARR 1,2- 二 羟基 -3,5- 
二 己 二 炳 羧 酸 
xy/L 
H CO 
OH 
Shae — 
VIE! 
A ~cooHZ/G, A ~COOH IH OOH 
COOH COOH 
2, He 24. 2-8 -3-C hi -1,6- 
ea 己 二 烯 二 氧 六 环 二 氧 六 环 


mk ll 
fe) 
em xy — 
HO 2-3 -4- Kh 
ety . Bac 
氧 戊 酸 XVIK he + 一 -OH 


图 6.22 由 Pseudomonas putida 重组 菌 mt-2 降解 甲苯 


( 盐 ) (3EB) 等 ， 但 不 能 在 密切 相关 的 化 合 物 4- 乙 基 葵 甲酸 (2) (4EB) 上 生长 。 解 释 这 
种 现象 的 一 系列 实验 已 得 出 结论 : (1) 4EB 没有 激活 关键 的 调节 蛋白 (zy'S )， 从 而 不 能 诱 
导 葵 甲酸 盐分 解 代谢 途径 的 基因 (zyLABC ， 见 图 6.22); (2) 原来 的 邻 葵 二 酚 2,3- 双 加 氧 
BE (zy 下 ， 见 图 6.22) 不 能 利用 4- 乙 基 邻 茶 二 酚 作 为 底 物 〈 但 可 以 利用 4-7 SE SBE — BH) 
(Ramos and Timmis，1987) 。 这 样 ， 要 想 通过 此 途径 降解 4EB 就 需要 : (1) 具有 更 广 效应 
物 专 一 性 的 zyLS 调节 器 ; (2) 能 降解 4- 乙 基 邻 葵 二 酚 的 邻 茶 二 酚 2,3- 双 加 氧 酶 突变 酶 的 产 
生 。 这 些 策 略 都 已 执行 ， 导 致 突变 了 的 zyLS MawE 基因 的 分 离 ， 其 产品 表现 出 与 上 述 需 
要 一 致 (zyLS” MaylE’). #A—* TOL 质粒 〈 质 粒 上 含有 zyS” 和 zy 开 ”基因 ) WP. 
putida 菌 确 实 能 够 在 上 述 提 到 的 各 种 通常 底 物 以 及 4EB 上 生长 。 

BTX 混合 物 同时 生物 降解 

由 于 BTX 物质 通常 是 作为 三 种 芳香 族 化 合 物 的 混合 物 被 释放 到 自然 环境 中 的 ， 因 此 菌 
种 选 育 的 目的 都 是 为 了 获得 能 够 同时 降解 这 三 种 芳香 族 化 合 物 的 菌株 (Lee et al, 1994), W 
此 ， 已 经 获得 一 株 P. putida 菌 ， 它 包含 两 条 分 解 代 谢 途 径 : 一 条 是 前 面 讨 论 过 的 TOL 途 
径 ， 另 一 条 是 TOD 途径 。TOD 途径 的 酶 系 可 以 作用 于 全 部 三 种 芳香 族 化 合 物 ， 然 而 此 途 
径 终 产物 ( 葵 、 甲 茶 、 对 二 甲苯 - 顺 式 - 乙 二 醇 ) 不 能 被 进一步 代谢 。 另 一 方面 ，TOL 途径 
的 酶 只 能 作用 于 甲苯 和 二 甲 茉 ， 但 其 终 产物 可 以 用 做 能 源 和 碳 源 的 中 间 体 。 图 6.23 总 结 了 
这 种 组 合 分 解 代 谢 途 径 的 一 般 形 式 。 

通过 包括 TOL 和 TOD 所 有 酶 曾 构 建 一 株 原 始 菌株 。 然 而 表征 研究 显示 : 这 种 菌株 积累 

155 


KEW TOD Rit”, BEL FAL CAE IOC BS, AT WXLHRA, TOR 

径 的 最 后 一 步 的 酶 一 一 甲苯 - 顺 - 乙 二 醇 脱 氢 酶 被 阻 断 〈 如 图 6.23 as). BREA RE 
以 显著 的 速率 降解 所 有 三 种 芳香 族 化 合 物 ， 其 降解 速率 对 苯 、 甲 茶 和 对 -二 甲苯 分 别 为 
0.27mg'mg !( 生 物质 )"h- 1，0.86mg.mg- !( 生 物质 ).h-1，2.89 mg'mg-!( 生 物质 )"h-1。 | 


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甲苯 - 顺 - 乙 二 醇 脱 
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Fl 6.23 P. putida 菌 降解 茶 、 甲 茶 和 对 二 甲 茶 的 代谢 途径 
虚线 代表 TOD 途径 ， 实 线 代表 TOL 途径 〈 见 表 6.7 和 图 6.22) (一 ) 代表 TOD 途径 中 的 遗传 性 阻碍 
(甲苯 顺 式 乙 二 醇 脱 氢 酶 ) 


这 是 一 个 很 有 意义 的 例子 ， 它 说 明了 如 何 对 现 有 的 分 解 代 谢 质粒 〈 其 组 成 完整 的 途径 ) 
明智 地 组 合 ， 以 产生 具有 新 性 质 的 新 菌株 ， 例 如 具有 更 广泛 的 底 物 利用 范围 或 更 好 的 产物 


形成 。 
Bt 文 献 


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第 7 章 代谢 途径 合成 


代谢 途径 合成 涉及 满足 某 些 规 定 的 化 学 计量 关系 协调 一 致 的 生物 化 学 〈 酶 催化 ) 反应 路 
线 的 构建 。 有 各 种 不 同 的 规定 ， 可 根据 代谢 途径 中 代谢 物 和 生化 反应 的 作用 来 确定 这 些 规 
定 。 一 个 常见 的 规定 是 从 指定 的 一 组 底 物 合成 一 个 代谢 产物 。 本 书 尤 其 把 重点 集中 在 代谢 物 
和 生物 反应 上 ， 因 为 它们 组 成 代谢 途径 的 基本 结构 单元 。 因 而 ， 一 些 代谢 物 被 指定 为 需要 的 
(required substrates) 底 物 或 需要 的 最 终 产 物 (required final products) ， 而 大 多 数 其 它 代谢 
物 被 指定 为 允许 的 (allowed reactants ) 反应 物 或 副 产 物 。 类 似 地 ， 很 多 生化 反应 被 允许 参 
与 一 条 途径 的 构建 ， 而 在 该 代谢 网 络 中 另 一 些 生 化 反应 则 被 禁止 参与 。 

导致 某 一 特定 产物 的 所 有 可 能 路 线 的 系统 列举 不 仅 与 代谢 途径 分 析 的 来 龙 去 脉 有 关 ， 而 
且 还 与 生物 过 程 设 计 的 早期 阶段 有 关 。 第 一 ， 在 生物 过 程 设 计 的 情况 下 ， 如 果 导 致 一 个 所 和 希 
望 的 产物 的 所 有 可 供 选择 的 途径 都 被 识别 ， 那 么 由 不 同 途 径 所 共享 的 共同 特性 就 会 出 现 ， 这 
在 以 一 个 有 意义 的 方式 评价 各 种 生物 合成 选择 方案 时 可 能 是 非常 有 帮助 的 。 这 些 共同 特性 
是 : 由 所 有 不 同 途径 所 共享 的 一 个 中 间 代 谢 物 ; 或 者 是 一 个 或 多 个 对 产物 合成 所 绝对 必需 的 
酶 ; 或 者 是 对 整个 过 程 的 得 率 至 关 重 要 的 因素 。 第 二 ， 可 以 进行 各 种 可 选择 途径 的 得 率 计 
算 ， 从 中 可 识别 具有 最 适 得 率 的 途径 。 第 三 ， 所 有 可 能 途径 的 知识 ， 在 更 精确 地 确定 某 特 定 
酶 缺失 突变 株 的 表 型 中 是 非常 重要 的 。 人 们 还 需要 确定 哪些 底 物 能 使 突变 株 生 长 ， 哪 些 底 物 
不 能 使 之 生长 。 由 于 微生物 的 生长 能 力主 要 取决 于 与 其 分 解 代谢 所 允许 的 碳 源 和 氮 源 相 适 应 
的 途径 的 功能 ， 途 径 列举 能 够 指导 阻碍 生长 的 特定 酶 的 消除 。 第 四 ， 通 过 了 解 生长 限制 性 底 
物 能 被 微生物 分 解 代 谢 ， 而 产物 能 由 微生物 形成 的 各 种 可 能 的 方法 ， 将 会 改进 我 们 在 发 酵 实 
验 中 解释 实验 观察 结果 的 方法 。 

在 代谢 途径 分 析 和 通 量 确定 的 前 后 关系 中 ， 途 径 列 举 在 协调 代谢 通 量 分 析 过 程 中 得 到 的 
大 量 代谢 物 速率 和 同位 素 标 记 数 据 方面 能 够 具有 极为 关键 的 重要 作用 。 如 第 9 章 所 述 的 ， 代 
谢 通 量 估计 必须 通过 试 差 过 程 中 的 元 余 测 量 来 证 实 确认 ， 该 过 程 也 包括 途径 修饰 。 在 此 过 程 
中 ， 明 显 重要 的 是 : 知道 如 何 产生 与 同位 素 标记 分 布 相关 的 所 有 可 能 的 途径 ， 并 选择 一 条 途 
径 ， 使 其 能 在 预计 的 和 测量 的 速率 与 标记 分 布 之 间 给 出 最 好 的 一 致 。 注 意 到 ， 除 了 证 实 通 量 
估计 外 ， 途 径 列举 与 同位 素 标记 协调 平衡 相 结合 可 以 是 发 现 新 途径 的 强 有 力 的 工具 。 

一 条 途径 并 不 是 生化 反应 单纯 的 集合 ， 因 为 许多 截然 不 同 的 途径 可 能 包括 相同 的 生化 反 
应 ， 但 却 实现 不 同 的 转化 。 例 如 ， 反 应 A->B+C 和 2B+C->D 能 够 形成 途径 2A>—>D + C, 
也 可 以 形成 途径 A+B->->D， 这 取决 于 组 合 反应 时 的 比例 是 2:1 还 是 1:1。 一 条 完全 确定 的 
途径 必须 包括 一 组 系数 ， 其 中 一 种 系数 是 对 应 于 包括 在 该 途径 中 的 每 个 生物 反应 ， 表 示 反 应 
化 学 计量 组 分 被 结合 的 比例 。 这 些 系数 中 的 这 一 组 系数 是 途径 化 学 计量 学 (Pathway Stoi- 
chiometry) ， 而 经 此 途径 以 净 反 应 物 和 净 产 物 的 形式 所 达到 的 总 转化 是 途径 的 分 子 化 学 计量 
学 (Molecular Stoichiometry of the pathway)。 在 下 一 节 ， 将 定义 专门 的 符号 来 反映 这 些 差 
别 ， 特 别 是 途径 化 学 计量 学 。 

图 7.1 描绘 了 代谢 途径 的 系统 合成 的 一 种 直观 方法 ， 它 反映 了 一 种 方法 : 从 一 个 已 给 的 
底 物 开始 ， 列 出 所 有 可 能 的 反应 ， 这 些 反应 能 消耗 这 种 已 指定 的 底 物 。 这 些 反 应 的 每 一 个 生 

166 


产 产 物 (BI，B:，B3)， 又 依次 变 得 适用 于 其 它 反 应 利用 。 这 样 ， 底 物 到 产物 递归 进行 ， 途 
径 因 而 被 构成 。 对 任何 正在 扩展 的 途径 ， 其 下 一 轮 扩展 可 利用 的 底 物 应 包括 在 途径 运行 至 此 
忆 产 生 的 所 有 产物 。 由 于 这 种 方法 相当 快 地 导致 组 合 爆炸 (combinatorial explosion ) ， 因 此 
必须 引入 宛 余 途径 消除 的 方法 手段 以 使 由 上 述 方法 引起 的 高 度 计 算 复 杂 性 得 以 部 分 简化 。 尽 
管 有 限制 可 能 组 合 的 数目 的 各 种 方法 ， 但 这 种 方法 仍 有 一 些 缺 点 : (1) 这 种 方法 在 这 种 意义 
诗 是 不 完善 的 ， 如 有 些 途 径 确实 存在 ， 但 该 方法 不 能 合成 ; (2) 该 问题 是 以 一 种 相当 限制 性 
的 方法 用 列 出 式 子 的 方式 进行 的 ， 因 为 它 仅 包括 所 需 的 底 物 和 产物 ， 但 没有 为 所 允许 的 反应 
物 和 副 产 物 做 好 准备 ; (3) 该 方法 应 用 于 大 的 生物 反应 网 络 时 要 求 以 指数 增长 的 计算 机 时 
ll; (4) 该 方法 只 是 一 种 计算 机 程序 ， 而 不 是 真正 的 算法 。 


7.1 来 自 指 定 最 初 反 应 物 A 的 三 条 途径 扩展 计划 示意 
这 种 方法 的 途径 列举 会 导致 组 合 爆 炸 


本 章 提 出 一 种 生化 途径 合成 的 方法 ， 它 通过 完全 不 同 的 体系 来 克服 上 述 方法 所 存在 的 问 
题 。 首 先 通过 例子 一 步 步 详细 地 说 明 算 法 的 应 用 ， 然 后 用 一 节 总 结 这 种 代谢 途径 合成 算法 的 
一 般 特征 。 最 后 ， 介 绍 一 个 实例 研究 来 总 结 这 种 方法 学 的 内 在 特征 ， 同 时 给 出 从 与 代谢 途径 
合成 类 似 的 练习 中 能 够 预见 的 该 类 结果 实例 。 

7.1 代谢 途径 合成 算法 

依从 Mavrovouniotis 等 人 (1992 a, b) 关于 算法 基本 原理 和 精确 度 及 完整 性 证 明 的 大 
部 分 讨论 的 原始 参考 。 这 里 ， 在 构成 如 下 反应 的 酶 反应 数据 库 中 ， 通 过 考虑 导致 从 代谢 物 A 
到 代谢 物 L 产生 的 所 有 可 能 的 生物 合成 路 线 中 的 问题 举例 来 说 明 这 种 程序 步骤 : 

(a) A>B 

(b) BoC 

(c) CD 

(d) C+D@F+K 

(e) F+K@H+E 

(f) H+DeE+F 

(g) AE 

(h) E>F+G 

(k) FeG 

(m) GL 

除 A 作为 所 需 的 反应 物 、D 作为 所 需 的 产物 外 ， 所 有 其 它 代 谢 物 被 指定 为 排除 反应 物 
167 


(excluded reactants) 和 排除 产物 (excluded products)。 排 除 反应 物 或 排除 产物 都 不 能 参加 
到 代谢 途径 中 ， 因 为 这 会 意味 着 这 样 一 个 反应 物 必 须 由 外 界 来 提供 ， 或 者 此 产物 能 够 伴随 目 
标 代 谢 物 一 起 形成 〈 见 例 7.1 和 例 7.2)。 


首先 建立 反应 (b)，(c)，(d)，(e)，(\f)，(g) 和 (k) 的 逆反 应 。 并 指定 这 些 逆反 应 分 别 | 
为 (-b), (-c), (-d), (~e), (-f), (-g) M@(-k). B-F GERM) RMR 


做 一 条 “一 步 ” 分 途径 (one-step partial pathway)。 为 了 完善 此 问题 初始 状态 的 描述 ， 还 分 
别 列 出 每 一 个 代谢 物 及 其 参与 的 途径 。 在 这 里 ， 应 用 两 种 符号 体系 来 表示 途径 。 为 了 仅仅 表 
示 构 成 途径 的 反应 ， 表 达 式 [如 2a，2(-g), bj 表示 一 条 途径 是 作为 反应 (a)、( 一 g) 和 (b) 的 
线性 组 合 而 构建 的 ， 这 些 反应 的 系数 分 别 为 2、2 和 1。 另外 ， 为 了 表示 由 这 个 途径 所 完成 
的 总 的 转化 ， 使 用 表达 式 2E-~ 一 B+C。 这 两 种 可 供 选 择 的 表达 式 可 结合 成 2E 一 [2a， 
2(-g)，b]->B+C 。 通 过 使 用 这 种 符号 ， 此 问题 的 初始 状态 必然 伴 有 如 下 的 途径 : 
A>[a]>B 
B>[b]>C 
Co E=—b]-8 
C>[c]>D 
psc] 
C+D>[d]>F+K 
F+K—>[-d]>C+D 
F+K—>[e]>H+E 
H+E>[-e]>F+K 
H+D->[f]>E+F 
E+ =|[—il-HeD 
A>[g]-E 
E>[-gl>A 
E>[h]>F+G 
F>[k]-G 
G>[-k]-F 
G>[m]-L 
各 代谢 物 分 别 参 与 的 代谢 途径 如 下 : 
CA 本 
(Bete bis ha) 
(Cy? Phish, els Eeleatd), “b+ d] 
(D) (cl, [eels dl ia sit), it] 
(Ey fe] 4 el 7 Tears le], Cel, [h] 
CF) [dee die ele ers rts (eal, th], (kl, [-ki 
(G) fy el =k], [m] 
CH) peel LE} 148] 
(K) feet —d], [el, [-e] 
(L) [m] 
遵循 该 算法 ， 必 须 先 处 理 参与 在 较 少 途径 中 的 代谢 物 。 因 此 ， 首 先 处 理 仅 参与 一 条 途径 
168 


的 代谢 物 L。L 是 一 个 所 需要 的 产物 〈 并 且 是 一 个 排除 反应 物 )。 因 为 L 由 一 个 分 途径 产生 
| 而 且 不 会 被 其 它 任何 分 途径 所 消耗 ， 因 此 处 理 这 个 代谢 物 的 约束 不 会 改变 任何 途径 。 下 一 步 
处 理 的 代谢 物 必 须 是 A 或 者 B， 这 两 个 代谢 物 处 理 的 先后 顺序 不 会 影响 结果 ， 因 此 可 以 任 
意 选 择 B。 一 个 新 的 途径 被 构建 : [la，bj] 作为 la] 和 [bj 的 组 合 ， 此 运算 过 程 以 符号 表 
示 为 [a]+ [b] = [a,b]。 注 意 ， 不 人 允许 建立 途径 [b] + [一 b] ， 因 为 它 正 、 反 两 个 方向 包括 同 
三 个 反应 ， 这 样 的 途径 将 产生 一 个 无 价值 的 循环 ， 不 完成 任何 转化 。 组 合 la, b] 构建 之 
Ja, 途径 [a]. [b]) 和 [-bj 可 从 所 允许 的 反应 数据 库 中 删除 。 这 就 把 这 组 活性 途径 (ac- 
tive pathway) 简化 如 下 : 
A>[a,b]~>C 
C>[c]=D 
D>[-c]>C 
C+D—>[d]>F+K 
F+K—>[-d]>-C+D 
F+K—[e]>H+E 
H+E>[-e]>F+K 
H+D->[f]~E+F 
E+ F--L.-fl-HAe 
A>[g]>E 
E> — git 
E>[h]>F+G 
F>[k]>G 
G>[-k]-F 
G>[m]~L 
更 新 后 仍 需 进 一 步 处 理 的 这 组 代谢 物 变 为 : 
DEL-g] 
dl 
rie). tel. idl,«l ~dt;| be era 
(ey tel, f=el, Lf], |-f], eee 
itd), ed}, le], [-el+ RAs, kl, Hk) 
to th), Hell =k], [m] 
cerelahsel, (f{], 一 汉 
tdi jaleal, (el, [-e 
下 一 步 处 理 代 谢 物 A。 因 为 A 是 所 需要 的 反应 物 和 排除 产物 ， 一 个 新 的 组 合 途 径 构建 
A: [-g]j+[a,b]j=[-g,a,b]， 而 且 仅 仅 删 除了 途径 [-g]。 对 下 一 步 ， 从 代谢 物 G，H 
AK 中 任意 选 出 G (因为 这 三 者 参与 反应 的 数目 都 相同 )。 在 处 理 G 的 过 程 中 ， 有 两 条 途径 
[-k] 和 [m] 消耗 它 ， 有 两 条 途径 [hj 和 [kj] 产生 它 。 因 此 ， 可 构建 四 种 组 合 ， 除 了 
[k] 不 能 和 [-k] 组 合 之 外 ， 可 以 保留 三 种 合理 的 组 合 ， 即 : [hj]+ [=Kk]=[h, -k], 
[hj+[m]j=[h,m]j 和 [k]+[m]=[k,m]j。G 参与 的 原来 的 四 个 途径 被 删除 。 处 理 完 A 和 G 
之 后 ， 活 性 途径 如 下 : 
A>T[a,b]~C 
169 


C>[c]>D 

D->[ 一 cj] 一 C 
C+D>[d]>F+K 
F+K~>[-d]>C+D 
F+K—[e]>H+E 
H+E>[-e]>F+K 
H+D->[f]>E+F 
E+F—>[-f]->-H+D 

A>([g]>E 

E>[ -g,a,b]-C 

E-([h, —k]~2F 

E>[h,m]>F+L 

F>[k,m]—L 


更 新 后 仍 需 进一步 处 理 的 这 组 代谢 物 变 为 : 


(C) [La,b]，[ 困 2， 

(D) [ec]，[= 可 ， 园 ] Ed 二 全 RE 

(E) [e], [-el, Lf}, [-£].. ight Me gea.bd st ign ee 
(F) [d], [-d], le], [-e], Lf], fetlath/m]), [kimi 
(H) tel, | ~el. fey bat 

(K) (dl, b—dl, belize! 


代谢 物 K 参与 四 条 途径 ， 下 一 步 对 其 处 理 。 建 立 [dj] + [e] =[d,e] Ml -e] +[-d]= 
[ -。, -d] 两 种 组 合 ， 而 途径 [d]，[ -dj]，[e] 和 [ -e] 被 删除 。 于 是 活性 途径 变 为 


A 一 [a,bj 一 C 
他 | 让 > 加 
D+Ereled 
C+D [d,e]>H+E 
H+E>([-e/Ad +o +p 
H+D->[f{]>E+F 
EeF>(—£)-H+D 
A>([g]-E 
E>[ -g,a,b]>C 
E>[h, —k]~2F 
E>[h,m]>F+L 
F>([k,m]>L 


更 新 后 仍 需 进一步 处 理 的 这 组 代谢 物 变 为 : 


170 


(©) "la, bli teletrc].7d76]. [-e, -d],abee.a,b] 

(D) [c], heel, dd,el) -ey~d), [fe tae] 

(E))(d, ceed) 0bhhel- fl [eli b-g,e.b], Chim], fhg=k] 
(F) [f]), L=#], [hm], [k,m], [h, -E] 

fH) (d,edumb—e. 二 二 国人 


FAW AEH, SP AtAaee!: [-f]+[-e,-d]=[-f,-e,-d]M™ 
[d,el+[fl=[d,e,f]. HERKEN, EE. AFH AEHARWHREAERY 
建 。 因 此 新 的 途径 就 变 为 : 

A-~>[a,b] 一 C 
C- 寺 < 下 3 
| D+[ eC 
C+2D—>[d,e,f]>2E+F 
2E+F>[-f,-e,-d]>C+2D 
A>([g]-E 
E>[ -g,a,b]->-C 
E>([h, —k]~2F 
E>[h,m]>F+L 
F>[k,m]>L 
更 新 后 仍 需 进一步 处 理 的 这 组 代谢 物 变 为 : 
(C) [a,b], [c], [-c], [d,e,f], [-f,-e,-d], [-g,a,b] 
(D) [c], [-c]l, [d,e,f], [-f, -e,-d] 
REP idseyfly {| -f,-e, -d)¥ [eat ggahbieath, mi), o[h, —k] 
eel diethyl -f,-—e,—di, [hymn), eit k} 

因为 代谢 产物 D 仅 参 与 四 条 途径 ， 下 面 对 它 进行 处 理 。 因 为 在 反应 [d, e, f] M[-f, 
-e, -d] 中 ,代谢 物 D 的 系数 是 2， 这 一 点 必须 反映 在 新 建立 的 组 合 中 。 新 建立 的 途径 
为 : [2c]+[d,e,f]=[2c,d,e,f]#l —f, -e, -d]+2[ —c]=[-f, -e, -d,2(-c)], f/D 
原来 所 参与 的 四 个 途径 都 被 删除 。 现 在 该 组 活性 途径 变 得 非常 小 : 

A->[a,b]->C 
3C—[2c,d,e,f]>2E+F 
2E+F—>[-f,-e, -d,2(-c)]~3C 
A>(g]>E 
E>[-g,a,b]-C 
E->[h, —k]~2F 
E>[h,m]>F+L 
F>[k,m]>L 
目前 只 有 三 个 代谢 物 仍 需 处 理 : 
(C) [a,b], [2c,d,e,f], [-f, -e, -d,2(-c)], [-g,a,b] 
(E) [2c,d,e,f], [-f, --e, -—d,2(-c)], [g], [-g,a,b], [h,m], [h, -k] 
(F) [2c,d,e,f], [-f, -e,-d,2(-c)], [h,m], [k,m], [h,-k] 

因为 代谢 物 C 只 参与 四 条 途径 ， 因 此 下 一 步 对 它 处 理 且 产生 两 种 组 合 : 3[a,b] + [2c， 
d,evf]=[3a,3b,2c,d,e,f]M 3[ —g,a,b] + [2c,d,e,f] =[3( —g),3a,3b,2c,d,e,f], HR 
来 C 所 参与 的 四 条 途径 后 ， 活 性 途径 变 为 : 

3A—>[3a,3b,2c,d,e,f]>2E+F 
A>([g]~E 
E—[3(—g),3a,3b,2c,d,e,f]—>F 


171 


E>[h, —k]>2F 

E>[h,m]>F+L : 

F>[k,m]—~L 
还 需 处 理 的 两 个 代谢 物 是 : 

(E) [3a,3b;2c,d,e,f], [g],*l3(—g),3a,3b;2c,dye;f], [hsm], [hy = 

(F) [3a,3b,2c,d,e,f], [3(—g),3a,3b,2c,d,e,f],; [h,m], [k,m], [h, -k] | 

上 述 这 两 种 代谢 物 参 与 的 途径 个 数 相等 ， 以 任 一 顺序 进行 处 理 都 可 得 到 最 后 结果 。 首 先 ， 
选择 代谢 物 下 ， 于 是 得 到 三 种 新 组 合 途径 : [3a,3b,2c,d,e,fj+[k,m]=[3a,3b,2c,d,e | 
k,m]; [h,m]+[{k,m]=[h,k,2m]#1[3( - g),3a,3b,2c,d,e,f]+[k,m]=[3(—g),3a,3b, | 
2c,d,e,f,k,mj]j。 代 谢 物 下 原来 所 参与 的 五 条 途径 被 删除 ， 剩 余 的 活性 途径 是 : 

3A—>([3a,3b,2c,d,e,f,k,m]>2E+L 

A>[g]>E 

E—[3(—-g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]—>L | 
E>[h,k,2m]—2L 

剩 下 没有 处 理 的 是 代谢 物 下， 参与 所 有 四 条 路 径 。 匡 的 处 理 〈 而 且 略 去 在 相反 方向 包含 ， 
相同 反应 的 途径 ) 导致 如 下 组 合 : (1/3)[3a,3b,2c,d,e,f,k,m] + (2/3)[3(-g),3a,3b,2c, 
d,e,f,k,m]=[2(—g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m];[3a,3b,2c,d,e,f,k,m]+2[h,k,2m] = [3a, 
3b,2c,d,e,f,3k,Sm,2h] 和 更 简单 的 [g] + [h,k,2m]=[g ,h,k,2m]。 应 当 注 意 的 是 ， 为 了 
使 组 合 途径 获得 较 小 的 整数 系数 ， 在 构建 组 合 时 ， 用 了 分 数 1/3 和 2/3 而 不 是 1 和 2。 当 所 
产生 的 途径 除 以 3 时 可 得 同样 的 效果 。 

很 显然 ， 相 乘 常数 没有 影响 途径 的 转化 和 总 结果 的 实质 ， 仅 仅 是 代谢 物 和 反应 物 的 摩尔 
比例 有 关系 ， 因 此 最 后 途径 是 : 

A->([2(-g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]—~L. [【P1] 
3A>[3a,3b,2c,d,e,f,3k,5m,2h]>5L_[P2] 
A>([g,h,k,2m]~2L [P3] 
这 三 条 途径 对 于 最 初 合成 问题 都 是 可 行 的 解 ， 所 有 其 它 途 径 只 是 这 组 途径 的 线性 组 合 ， 且 用 
正 的 系数 。 途 径 合成 的 一 些 其 它 方法 利用 特定 的 规则 以 便 仅 仅 产 生 基 本 途径 ， 比 如 ， 它 们 应 
用 如 下 一 条 规则 :“ 如 果 一 种 酶 需要 一 种 底 物 ， 而 该 底 物 已 被 此 途径 用 于 那个 酶 ， 那 么 这 个 
底 物 必须 被 这 个 途径 中 的 同一 酶 系 所 产生 。 该 例子 表明 ， 这 里 所 介绍 的 方法 ， 在 没有 这 种 
类 型 的 附加 规则 的 情况 下 ， 能 实现 基本 途径 的 构建 (并且 避免 了 多 余 途 径 的 建立 )。 

人 们 可 以 观察 到 ， 所 构建 的 三 条 途径 中 ， 只 有 两 条 是 线性 独立 的 : 途径 [P2] 可 以 由 
途径 L[P1]+2[P3] 得 到 。 然 而 ， 所 有 这 三 个 途径 都 是 有 用 的 ， 因 为 它们 在 基因 型 上 是 独 置 
的 ， 即 ， 它 们 包含 独立 的 酶 系 。 尽 管 途径 [P2] 是 途径 [P1] 和 2 [P3] 的 和 ,但 是 途径 
[P2] 中 酶 系 不 是 途径 [P1j] 和 [P3]j 中 各 自 酶 系 的 联合 ， 特 别 是 ， 酶 g 在 途径 (PI) 和 
[P3] 中 都 存在 ， 但 不 存在 于 [P2] 中 。 

如 果 和 希望 基于 底 物 A 的 产物 世 的 高 得 率 ， 那 么 可 以 看 出 途径 [P3] 是 三 个 途径 中 最 好 
的 。 因 此 ， 除 了 研究 由 底 物 和 代谢 产物 之 间 存 在 的 不 同 路 线 外 ， 途 径 合 成 算法 对 于 评估 当 碳 
源 经 不 同 代谢 途径 加 工时 的 总 得 率 是 很 有 用 的 。 然 而 在 许多 情况 下 ， 由 这 种 算法 所 产生 的 途 
径 将 取决 于 细胞 的 生理 状态 ， 例 如 ， 一 些 用 于 生化 合成 的 代谢 物 的 消耗 或 排泄 取决 于 细胞 的 
生长 条 件 。 因 此 ， 对 于 总 得 率 的 计算 ， 后 面 几 章 所 阅 述 的 代谢 通 量 分 析 通 常 是 更 适合 的 ， 因 

72 


为 在 进行 总 得 率 计 算 时 ， 有 可 能 对 某 些 途径 通 量 要 规定 限制 条 件 。 

‘7.2 算法 综述 

| 代谢 物 能 以 下 列 三 种 身份 之 一 参与 生化 反应 途径 : 1) 作为 该 途径 的 净 反 应 物 ， 即 该 代 
谢 物 被 净 消 耗 ; (2) 作为 该 途径 的 净 产 物 ， 即 该 代谢 物 被 净 生 成 ; (3) 作为 中 间 代谢 物 参 
与 ， 换 句 话 说， 没有 净 消 耗 或 净 生 成 。 

， 此 外 ， 可 以 对 在 代谢 途径 构建 中 所 考虑 的 不 同 代 谢 物 施加 一 些 约 束 。 它 们 可 以 被 如 下 的 
事实 所 约束 : (i) 被 指定 为 所 需要 的 反应 物 ， 由 此 它们 一 定 被 这 个 途径 所 消耗 而 且 它 们 的 化 
学 计量 系数 是 严格 小 于 零 ; (i) 被 指定 作为 所 允许 的 反应 物 ， 它 们 可 以 被 该 途径 所 消耗 ， 
也 可 以 不 被 消耗 ， 在 这 个 途径 中 其 化 学 计量 系数 是 小 于 或 等 于 零 ; 《iii) 被 指定 为 排除 反应 
物 〈 或 禁止 反应 物 ) ， 其 一 定 不 被 该 途径 所 消耗 。 在 大 多 数 情况 下 ， 只 有 少数 几 个 反应 物 被 
分 类 为 所 需要 的 反应 物 ， 而 大 多 数 代谢 物 呈 现 排除 反应 物 的 缺席 规则 特征 。 以 这 种 资格 ， 它 
们 在 途径 中 既 不 被 合成 ， 也 不 被 消耗 ， 而 且 一 定 要 提供 一 些 反应 以 至 于 它们 变化 的 净 速 率 等 
于 零 。 

除了 对 代谢 物 约束 之 外 ， 用 户 还 可 以 对 生物 反应 施加 约束 。 因 此 ， 人 们 需要 规定 那些 生 
物 反应 是 以 所 需要 的 、 所 允许 的 和 被 禁止 的 身份 参与 该 途径 。 这 些 约束 中 的 一 些 很 容易 满 
是 。 例如， 指定 某 些 反应 是 排除 反应 这 样 的 约束 能 够 从 开始 就 完全 满足 ， 这 可 通过 从 活性 数 
据 库 中 完全 删除 上 述 反 应 即 可 。 人 们 还 应 注意 反应 可 从 正 的 或 逆 的 方向 进行 。 指 定 一 些 生物 
反应 在 这 两 个 方向 之 一 是 排除 反应 这 样 的 约束 也 可 能 是 存在 的 。 这 样 的 一 些 约束 是 从 热力 学 
或 关于 生物 反应 的 不 可 逆 性 的 机 理论 据 中 推导 出 来 的 。 这 些 生物 反应 约束 不 是 独立 的 。 例 
如 ， 一 个 在 正方 向 的 所 需要 的 生物 反应 一 定 在 反方 向 被 排除 。 

本 质 上 ， 上 述 所 有 约束 都 是 化 学 计量 约束 。 前 一 节 所 并 述 的 算法 从 根本 上 说 是 试图 满足 
施加 于 生化 途径 中 代谢 物 参与 方面 的 约束 。 算 法 执行 的 第 一 步 就 是 收集 建立 一 个 所 允许 的 生 
化 反应 及 其 化 学 计量 学 的 数据 库 。 以 这 种 形式 ， 最 初 的 这 组 生化 反应 一 般 不 满足 这 些 约束 条 
件 ， 因 为 它们 需要 排除 反应 物 的 净 消 耗 ， 而 排除 反应 又 必须 不 被 该 途径 所 消耗 。 该 算法 尝试 
不 同 约束 条 件 的 重复 和 迭 代 满 足 ， 由 此 ， 最 初 一 组 生化 反应 以 逐步 的 方式 转化 为 一 组 途径 ， 它 
能 满足 所 施加 的 所 有 约束 。 

算法 的 主体 是 一 次 处 理 一 个 约束 。 在 每 个 迭代 阶段 ， 途 径 合 成 算法 的 状态 由 如 下 两 方面 
所 表征 : 由 满足 已 经 被 处 理 的 约束 条 件 的 一 组 分 途径 所 表征 及 由 还 必须 被 满足 的 一 组 化 学 计 
量 约束 条 件 所 表征 。 在 下 一 个 途径 扩展 步 又， 通过 选择 剩余 的 代谢 物 之 一 作为 目标 ， 再 一 个 
约束 将 被 满足 。 被 选 为 最 合适 的 代谢 物 是 参与 在 尽 可 能 最 少数 目的 活性 途径 中 的 代谢 物 。 代 
谢 物 能 作为 反应 物 或 产物 参与 这 样 的 途径 。 根 据 所 说 的 最 合适 代谢 物 的 选择 ， 该 组 活性 途径 
因而 被 修饰 以 满足 此 约束 和 条件。 例如， 如 果 此 约束 指定 一 个 代谢 物 作 为 排除 反应 物 或 排除 产 
物 ， 则 所 有 可 能 的 组 合 途径 必须 通过 结合 一 条 途径 消耗 此 代谢 物 和 一 条 途径 生产 该 代谢 物 而 
被 构建 ， 以 至 于 该 代谢 物 从 总 的 化 学 计量 关系 中 被 消除 。 一 旦 这 个 组 合 被 构建 成 ， 所 有 消耗 
或 合成 这 个 代谢 物 的 途径 都 被 删除 ， 因 为 它们 违背 约束 的 要 求 : 该 代谢 物 在 途径 中 没有 净 消 
耗 或 净 合 成 。 如 果 这 个 代谢 物 除 了 是 一 个 所 需要 的 产物 以 外 ， 还 是 一 个 排除 反应 物 ， 那 么 同 
样 的 组 合 途径 可 被 构建 。 然 而 在 这 种 情况 下 ， 只 是 删除 消耗 这 个 代谢 物 的 途径 。 

这 些 约束 的 线性 性 质 有 一 个 重要 的 影响 。 一 且 一 个 限制 被 所 有 依然 存在 的 途径 满足 ， 则 
这 些 途 径 的 进一步 线性 组 合 也 将 决 不 违背 这 一 约束 。 因 此 ， 每 个 约束 处 理 之 后 ， 则 新 的 活性 

173 


途径 会 满足 所 有 先前 处 理 过 的 约束 。 

途径 合成 算法 应 用 需要 是 一 个 可 能 的 酶 反应 5 数据库。 具有 250 个 酶 反应 和 400 种 代谢 四 上 
的 这 样 一 个 数据 库 已 由 Maurovouniotis (1989) 建成 。 下 面 用 这 个 数据 库 [ 见 Maurovounio- 
tis et al, (1992a, b)] 所 产生 的 一 些 例子 〈 例 7.1、 例 7.2) 说 明 该 算法 的 应 用 。 


【 例 7.1】 丝氨酸 的 合成 

利用 下 面 的 规定 ， 途 径 合成 问题 定义 如 下 : 在 能 导致 丝氨酸 〈 所 需要 的 产物 ) 合成 的 单 ， 
一 酶 反应 数据 库 范围 内 列举 所 有 可 能 途径 ， 以 葡萄 糖 作为 所 需要 的 反应 物 ， 以 NHs APT 
许 的 反应 物 ， 以 CO; 为 所 允许 的 产物 。 此 外 ， 还 引入 如 下 所 允许 的 代谢 物 : 氧化 -还 原 流 通 
代谢 物 (NAD, NADH, NADP, NADPH, FAD 和 FADH2 )， 直 接 能 量 流 通 代 谢 物 | 
(ATP，ADP，AMP)， 间 接 能 量 流通 代谢 物 (GTP, GDP, GMP, TTP, TDP, TMP，| 
UTP, UDP, UMP, CTP, CDP 和 CMP) 以 及 一 些 其它 物 质 [辅酶 A、 磷 酸 (P;) 和 焦 
磷酸 (PP,)] 等 。 

用 这 个 系统 ， 算 法 滞留 在 处 理 关 于 给 乙酰 辅酶 A 和 苹果 酸 代谢 物 约束 条 件 的 步骤 中 ， 
这 是 代谢 物 在 丝氨酸 合成 途径 中 非常 重要 的 证 据 。 为 此 原因 ， 它 们 被 明确 规定 为 所 允许 的 代 ， 
谢 物 ， 这 意味 着 如 果 它 们 出 现在 总 的 丝氨酸 生物 合成 途径 中 ， 则 为 它们 的 产生 的 附加 途径 也 ， 
必须 被 包括 在 内 。 通 过 添加 这 些 途 径 ， 这 个 算法 运行 到 完成 。 它 产生 了 1526 个 途径 ， 二 
最 长 的 途径 包含 有 26 个 反应 。 其 中 一 些 途径 将 讨论 如 下 。 

图 7.2 所 示 为 丝氨酸 生物 合成 的 正常 途径 。 葡 萄 糖 首 先 通过 糖 酵 解 分 解 为 3- 磷 酸 甘 油 酸 
(3-PG) ， 其 经 3- 磷 酸 羟 基 丙 酮 酸 和 3- 磷酸 丝氨酸 转化 为 丝氨酸 ， 提 供 丝 氢 酸 合成 所 需 的 氮 
的 谷 氢 酸 由 谷 氨 酸 脱 氢 酶 提供 。 


FruDP ~—— Fru6P ~— Glc6P Gle 


DPG 
| 磷酸 甘油 酸 脱 氢 酶 磷酸 丝氨酸 转氨酶 ”磷酸 丝氨酸 磷酸 酶 
3- 磷 酸 甘油 酸 一 -~ 3-H Fe SE WR con. 3- 磷 酸 丝氨酸 一 > 22 IR 


A AMR x- 酮 戊 二 酸 


4 ABAD 


图 7.2 由 葡萄 糖 合 成 丝氨酸 的 途径 
伴随 着 谷 氢 酸 通 过 谷 氨 酸 脱 氢 酶 的 回收 
缩写 : Fru6P 一 6- 磷 酸 果糖 ;FruDP 一 1,6- 二 磷酸 果糖 ; DPG 一 1,3 二 磷酸 甘油 醛 


图 7.3 所 示 为 丝氨酸 合成 的 一 条 蔡 代 途径 ， 其 与 图 7.2 类 似 ， 但 有 如 下 不 同 : SAR 

再 生 不 是 通过 谷 氨 酸 脱氧 酶 而 是 通过 包括 延 胡 索 酸 ， 天 冬 氮 酸 ， 草 酰 乙 酸 和 苹果 酸 等 中 间 物 

的 一 组 反应 。 对 于 从 wx- 酮 成 二 酸 和 氮 转 化 为 谷 氨 酸 这 种 特殊 的 选择 只 是 许多 可 能 性 之 一 。 
174 


FARADAY FY BE EE Oe PT Pd BAG | HA SRE, A Sk RE A EO HE 
| 酶 所 催化 的 反应 。 


| FruDP ~—— Fru6P <—— Glc6P Gle 
| | 


GAP ~——DHAP 


DPG 
| 磷酸 甘油 酸 脱 氢 酶 磷酸 丝氨酸 转氨酶 ”磷酸 丝氨酸 磷酸 酶 


3- 磷 酸 甘 油 酸 一 一 ~ 3- 磷 酸 羟基 丙酮 酸 3- 磷 酸 丝氨酸 — 丝氨酸 
SAR w- 酮 戊 二 酸 
OxAc Asp 


图 7.3 由 葡萄 糖 合成 丝氨酸 
伴随 着 谷 氨 酸 的 回收 ， 并 且 经 由 一 个 包括 延 胡 索 酸 (Fum), KZAM (Asp), 
草 酰 乙酸 (OxAc) 和 苹果 酸 (Mal) 的 回路 


这 样 ， 该 算法 规定 谷 所 酸 回收 的 不 同 路 线 ， 而 且 这 清楚 地 说 明细 胞 代谢 的 复杂 性 。 在 生 
物化 学 教科 书 中 人 们 可 能 形成 印象 ， 认 为 书 中 所 列 出 的 途径 即 为 细胞 内 运行 的 途径 。 然 而 ， 
一 些 物质 〈 像 谷 氨 酸 ) ， 当 作为 一 些 关 键 化 合 物 出 现时 ， 对 其 回收 可 能 会 有 几 种 不 同 的 路 线 ， 
而 且 其 中 几 条 可 以 平行 运行 。 这 可 由 该 算法 产生 的 不 同 途径 来 举例 说 明 。 在 下 面 几 草 关于 代 
谢 通 量 的 分 析 中 ， 将 研究 这 些 不 同 途 径 中 的 相对 贡献 如 何 能 被 量化 。 


【 例 7.2】 丙 氨 酸 合成 

在 丙 氮 酸 合成 的 情况 下 ， 最 初 的 系统 是 规定 葡萄 糖 为 所 需要 的 反应 物 ， 丙 氨 酸 为 所 需要 
的 产物 ，NH3a 和 CO; 分 别 为 所 允许 的 反应 物 及 产物 。 与 丝氨酸 一 样 ， 苹 果 酸 和 乙酰 辅酶 A 
被 分 别 指定 为 所 允许 的 反应 物 及 产物 。 图 7.4 所 示 为 以 葡萄 糖 为 主 反应 物 对 于 丙 氨 酸 合成 的 
通常 途径 应 当 考 虑 的 问题 。 如 前 所 述 ， 葡 萄 糖 由 糖 酵 解 途径 分 解 代 谢 为 丙酮 酸 ， 其 进而 由 丙 
氨 酸 氮 基 转移 酶 转化 为 丙 氨 酸 。 该 反应 所 需要 的 谷 氮 酸 是 经 谷 氨 酸 脱 氢 酶 从 w- 酮 成 二 酸 所 
回收 。 

可 供 选 择 的 替代 途径 可 通过 结合 谷 氨 酸 回收 的 不 同方 法 类 做 地 产生 ， 例 如 图 7.3 所 示 的 
合成 丝氨酸 的 包括 延 胡 索 酸 、 天 冬 氨 酸 、 草 酸 乙 酸 及 苹果 酸 的 回路 等 。 还 有 ， 另 一 个 途径 能 
将 丙酮 酸 不 是 通过 丙 氨 酸 氨基 转移 酶 转化 为 两 氨 酸 (Ala) ， 而 是 经 丙 氨 酸 脱 氢 酶 。 因 为 后 一 
个 反应 可 直接 利用 氨 ， 而 对 于 w- 酮 成 二 酸 到 谷 氮 酸 的 转化 ， 不 必 利 用 谷 氢 酸 脱氧 酶 或 任何 
其 它 系统 。 

175 


PR GPR Glc 


GAP <——DHAP 


DPG 


丙 氨 酸 转氨酶 
3PG 一 一 ~ 2PG ———> PEP 一 一 一 > Pyr AAR 


谷 氨 酸 x- 酮 成 二 酸 


A AMR ht AMG 


图 7.4 RR MA REE 


伴随 谷 氨 酸 经 谷 氨 酸 脱 氢 酶 的 回收 。 谷 氨 酸 也 能 被 图 7.3 所 示 蔡 代 途 径 所 回收 。 
通过 丙 氨 酸 脱氧 酶 ， 氨 可 直接 整合 进入 丙 氨 酸 ， 而 绕 开 所 有 的 谷 氨 酸 回收 反应 
缩写 : 3PG 一 3- 磷 酸 甘油 酸 ; 2PG 一 2- 磅 酸 甘油 酸 


7.3 实例 研究 一 一 赖 腕 酸 生 物 合成 


本 节 介 绍 从 葡萄 糖 和 氨 合 成 赖 氨 酸 的 实例 研究 ， 以 便 证 明示 范 从 途径 合成 算法 的 应 用 所 
能 得 到 的 不 同类 型 的 结果 。 应 当 注意 的 是 ， 这 里 的 目的 不 是 提供 所 有 可 能 途径 的 完全 列举 ， 
因为 这 能 很 容易 地 数 出 几 百 条 。 目 的 是 举例 说 明 一 般 可 接受 的 途径 的 构建 并 探索 关于 “关键 


酶 和 代谢 物 的 参与 ”的 替代 选择 。 这 种 过 程 能 导致 关于 赖 氨 酸 生产 途径 的 结构 和 得 率 的 一 些 


基本 限制 。 

应 注意 ， 所 建立 的 这 组 途径 仅仅 相对 于 所 使 用 的 生物 反应 数据 库 才 是 完整 的 。 当 附加 的 
生物 反应 引入 该 数据 库 中 时 ， 则 该 搜索 的 结果 就 变 得 不 完整 了 ， 但 是 ， 先 前 已 构建 的 途径 仍 
然 是 有 效 的 。 另 外 ， 如 果 所 建 途径 的 数目 是 不 可 抵挡 的 大 ， 则 可 以 考虑 酶 反应 数据 库 的 适当 
减 小 以 便 减 少 所 产生 的 途径 数目 。 

通过 使 用 与 丝氨酸 和 赖 氨 酸 合成 一 样 的 数据 库 ， 该 算法 产生 了 大 约 500 条 不 同 的 途径 。 
为 简化 此 实例 研究 ， 假 定 w- 酮 成 二 酸 脱氧 酶 是 不 起 作用 的 ， 从 而 从 数据 库 中 排除 。 除 了 简 
化 这 些 结果 外 ， 这 个 实例 还 说 明 在 缺失 上 述 酶 的 突变 株 中 赖 氨 酸 生 产 需 要 什么 条 件 。 图 7.5 
显示 了 所 得 的 途径 ， 从 中 可 以 看 出 ， 为 了 补充 CA 循环 和 弥补 c- 酮 成 二 酸 脱 氢 酶 活性 的 缺 
失 ， 利 用 了 乙 醛 酸 旁 路 。 整 个 途径 包括 的 基本 单元 有 糖 酵 解 、TCA 循环 、 从 草 酰 乙酸 到 天 
冬 氨 酸 的 途径 以 及 天 冬 氢 酸 与 赖 氨 酸 之 间 的 一 系列 反应 。 

途径 合成 算法 的 应 用 之 一 是 : 如 果 一 个 反应 已 被 证 明 构 成 了 整个 途径 的 一 个 瓶颈 ， 探 索 
绕 过 这 样 一 个 单个 反应 的 可 能 性 。 例 如 ， 如 果 我 们 假定 苹果 酸 脱 氢 酶 是 这 个 途径 的 一 个 关键 
限制 酶 ， 因 此 希望 产生 一 些 替 代 途 径 绕 过 这 个 酶 。 图 7.6(a) 显 示 了 一 条 这 样 的 途径 ， 其 排 
除了 苹果 酸 脱 氢 酶 。 事 实 上 ， 该 途径 绕 开 了 整个 TCA 循环 ， 它 是 通过 由 丙酮 酸 直接 羧 化 成 
草 酰 乙 酸 而 进行 的 ， 这 个 反应 可 由 丙酮 酸 羧 化 酶 或 草 酰 乙 酸 脱羧 酶 催化 完成 。 该 途径 也 产生 
一 个 更 具 吸 引力 的 摩尔 得 率 。 如 果 忽略 来 自 氧 化 还 原 和 ATP 平衡 的 限制 ， 图 7.6(a) 中 这 条 

176 


FruDP ———— Fru6P ——— Glc6P Glc 


DPG 


3PG 一- 2PG 一 ”PEP 一- 一” Pyr 一 一 Lac 


CO; CO, 
AcCoA 
NH, 


ASA / 

Mal 一 一 “二 醋酸 a 
\. CO, i SucCoA 
Lys pr 


PA 7.5 从 葡萄 糖 合 成 赖 氨 酸 的 一 种 可 能 的 生物 反应 网 络 
粗 体 箭 头 指 的 是 - 酮 成 二 酸 脱 氢 酶 缺失 而 经 乙 醛 酸 旁 路 的 赖 氨 酸 合成 途径 。 
另 一 种 可 能 性 包括 磅 酸 烯 醇 丙酮 酸 和 丙酮 酸 羧 化 作用 的 回 补 反 应 。 
此 途径 仅 考虑 碳 骨 架 的 形成 ， 不 包括 能 量 和 氧化 还 原 代 谢 物 的 再 生 
缩写 : Cit 一 柠檬 酸 ; 1i-Cit 一 异 柠檬 酸 ; SucCoA 一 琥珀 酰 辅 酶 A; 
Suc 一 琥珀 酸 ; ASA 一 天 冬 氨 酸 -8- 半 醛 ; Lys 一 赖 氨 酸 ; -KG 一 xc- 酮 戊 二 酸 


途径 的 最 高 得 率 是 100% (以 摩尔 为 基准 )， 与 图 7.5 所 示 途 径 相 比 ， 那 条 途径 的 摩尔 得 率 
仅 为 67% 。 

如 果 人 们 宁愿 仅仅 在 紧 临 一 个 限制 反应 之 处 绕 开 而 保留 原 途 径 的 大 部 分 结构 (包括 
TCA 循环 ) ， 则 可 以 探索 较 小 的 扰动 。 这 样 一 个 替代 途径 由 仅 有 两 个 反应 的 一 组 反应 就 可 绕 
开 苹果 酸 脱 氢 酶 将 苹果 酸 转化 为 草酸 乙酸 。 其 一 是 : 

苹果 酸 + AMR RRR + FR 
该 反应 由 乳酸 -苹果 酸 转氨酶 催化 。 另 一 个 是 : 
乳酸 -> 丙酮 酸 
该 反应 是 由 乳酸 脱氧 酶 逆向 催化 。 

另 一 条 替代 途径 如 图 7.6(b) 所 示 ， 它 包括 由 延 胡 索 酸 酶 在 与 图 7.6(a) 相 反 的 方向 将 苹 
果 酸 转化 为 延 胡 索 酸 ， 及 由 琥珀 酸 脱 氢 酶 像 在 原始 途径 一 样 将 琥珀 酸 转 化 为 延 胡 索 酸 。 此 
外 ， 延 胡 索 酸 通过 天 冬 氨 酸 裂解 酶 转化 为 天 冬 氨 酸 。 因 为 草 酰 乙酸 被 利用 以 便 形成 柠檬 酸 ， 
一 半天 冬 氢 酸 必须 循环 进入 草 酰 乙酸 以 闭合 TCA 循环 。 在 图 7.6(b) 的 途径 中 ， 天 冬 氨 酸 - 
谷 氨 酸 转氨酶 转化 天 冬 氨 酸 到 草 酰 乙酸 的 反应 是 通过 与 原始 生化 反应 网 络 〈 图 7.5) PRR 
应 的 相反 方向 来 运行 的 。 如 果 应 用 从 天 冬 氢 酸 转化 为 草酸 乙酸 的 这 组 反应 ( 含 两 个 反应 )， 
图 7.6(b) 所 示 的 先前 的 途径 会 产生 一 个 小 改变 ( 见 图 7.7)。 首 先 , 由 甘氨酸 (Gly)- 草 酰 

177 


FruDP < Fn6Ps<——— GileéP Gle 


DPG 


3PG 一 一 > 2PG 一 PEP Pytr ———— Lac 


Glin 
AcCoA 
NH; 
it Glu 
Asp —————— OxAcc 
| i-Cit 
ASA NH; 
Mal a CER a-KG 
CO; . SucCoA 
_ Fum 
Lys 
Suc 
(a) 
FruDP <—— Fru6P <— Glc6P Glc 
GAP ———DHAP 
DPG 
3PG —— 2PG ——— _ PEP———> Pyr ———— Lac 
Gln 
CO, CO, 
AcCoA 
NH; 


SucCoA 


Fum 
Lys se a 
Suc 


(b) 
P76 PPR ALY ENE 
绕 开 了 苹果 酸 脱 氢 酶 ， 该 酶 催化 苹果 酸 转化 为 草酸 乙酸 
178 


| 已 酸 氢 基 转移 酶 转化 乙 醛 酸 和 天 冬 氨 酸 成 为 甘氨酸 和 草 酰 乙 Ap poke 

| 酸 ， 然 后 ， 甘 氨 酸 脱氧 酶 将 甘氨酸 循环 进入 乙 醛 酸 。 

(7.3.1 草 酰 乙酸 的 作用 乙 醋酸 Gly 

从 上 述 几 种 途径 中 可 以 观察 到 ， 草 酰 乙 酸 在 所 有 这 些 途 

| 大 让 是 一 个 关键 的 代谢 物 。 虽 然 草酸 乙酸 在 图 7.6(b) 的 途径 esia 

allie 但 是 ， 一 个 关键 问题 是 ， 是 否 这 个 代谢 a sa eee 

| 物 能 被 完全 旁 流 ， 并 且 是 否 能够 构建 由 丙酮 酸 或 葡萄 糖 生产 草酸 乙酸 的 替代 途径 
赖 氨 酸 的 途径 ， 而 在 任何 一 处 都 没有 牵连 草 酰 乙 酸 。 根 据 所 
产生 的 全 部 途径 的 检验 证 明 ， 在 所 使 用 的 酶 反应 数据 库 内 ， 这 种 情况 是 不 可 能 的 。 而 且 ， 在 
它 存 在 于 所 有 途径 这 种 意义 上 讲 ， 没 有 安置 单个 反应 环绕 草 栈 乙酸。 消耗 和 产生 草 酰 乙酸 的 
那些 特定 反应 可 以 改变 ， 然 而 ， 该 中 间 物 本 身 是 始终 存在 的 。 因 此 ， 草 酰 乙 酸 是 赖 氨 酸 生产 
的 一 个 关键 节点 。 

在 图 7.6(b) 的 途径 中 ， 天 冬 氨 酸 和 赖 氨 酸 不 是 直接 起 源 于 草 酰 乙酸 ， 因 为 延 胡 索 酸 用 
三 个 单一 酶 转化 为 天 冬 氨 酸 。 事 实 上 ， 天 冬 氨 酸 转化 为 草 酰 乙酸 ， 而 不 是 相反 。 因 此 ， 在 这 
种 情况 下 ， 在 天 冬 所 酸 、 延 胡 索 酸 、 苹 果 酸 和 草 酰 乙酸 附近 的 代谢 与 人 们 通常 发 现 的 是 相当 
不 同 的 ， 这 部 分 代谢 建议 : 没有 草 酰 乙 酸 的 介入 也 有 可 能 获得 天 冬 氨 酸 。 然 而 ， 事 实证 明 没 
有 草 酰 乙 酸 的 介入 ， 不 能 从 葡萄 糖 生产 TCA 循环 所 必需 的 中 间 物 (苹果 酸 或 琥珀 酸 )。 这 
个 限制 使 得 导致 从 葡萄 糖 合 成 赖 氨 酸 的 任何 途径 都 必须 有 草 酰 乙酸 的 存在 。 

为 了 进一步 说 明 这 一 点 ， 假 设 除 了 和 葡萄糖 之 外 还 可 用 琥珀 酸 作为 所 允许 的 反应 物 ， 根 据 
经 验 的 生物 合成 分 类 仍然 要 求 草 酰 乙 酸 作 为 一 个 所 需要 的 中 间 物 。 然 而 ， 检 验 图 7.6(b) 中 
的 途径 表明 ， 琥 珀 酸 能 够 转化 到 延 胡 索 酸 ， 而 且 从 那 时 起 在 没有 苹果 酸 或 草 酰 乙酸 介 人 的 情 
况 下 ， 由 天 冬 氨 酸 裂解 酶 催化 生成 天 冬 氨 酸 。 因 此 ， 用 焉 珀 酸 作为 另 一 种 所 允许 的 底 物 ， 用 
一 条 不 需要 草 酰 乙酸 的 途径 完全 有 可 能 合成 赖 氨 酸 。 
7.3.2 其它 替 代 途 径 
到 目前 为 止 ， 所 检验 的 赖 氨 酸 合成 途径 或 者 以 丙酮 酸 脱氧 酶 或 者 以 丙酮 酸 羧 化 酶 作为 天 
Ook: 冬 氨 酸 形成 的 关键 反应 ， 但 是 ， 也 存在 着 绕 开 这 两 种 酶 的 其 
它 途 径 ， 指 向 其 它 方法 ， 通 过 该 方法 丙酮 酸 能 进入 柠檬 酸 循 
甲 基 丙 二 酰 辅酶 A ”两 酰 辅 酶 A 环 。 丙 酮 酸 的 另 一 条 羧 化 途径 可 通过 甲 基 丙 二 醛 辅酶 A 羧基 
转移 酶 和 丙 酰 辅酶 A 羧 化 酶 完成 ， 如 图 7.8 所 示 。 当 然 ， 还 
Sa CO, AB Fs — Fe YE HE A TBE a a PS PS) RE He PRE A 
TCA 循环 间 通 过 一 条 完全 旁 流 丙酮 酸 的 路 线 相 连接 。 
由 合成 算法 所 产生 的 所 有 可 能 的 替代 途径 当中 ， 仅 仅 对 
其 中 最 简单 的 一 些 作 了 人 介绍。 然而， 应 当 记 住 该 算法 可 以 找 
出 所 有 途径 而 且 其 中 一 些 是 非常 复杂 的 。 作 为 一 个 例子 ， 考 虑 了 从 磷酸 烯 醇 珍 酮 酸 到 丙酮 酸 
的 转化 这 样 一 个 简单 任务 (该 过 程 可 通过 丙酮 酸 激酶 在 一 个 单一 步骤 中 完成 )。 该 算法 对 这 
个 转化 产生 了 几 条 途径 ， 其 中 最 长 的 如 图 7.9 ra. 
7.3.3 关于 最 高 得 率 的 限制 
途径 合成 算法 最 有 趣 的 应 用 之 一 在 于 理论 假说 研究 。 例 如 ， 前 面 已 经 提 到 ， 如 果 没 有 包 
括 草 酰 乙 酸 作为 中 间 代谢 物 的 话 ， 没 有 发 现 由 葡萄 糖 合 成 赖 氨 酸 的 途径 。 该 算法 还 揭示 只 有 
通过 羧 化 反应 固定 二 氧化 碳 ， 这 个 途径 的 最 高 得 率 可 以 超过 67% 。 当 然 ， 如 果 羧 化 反应 被 
了 79 


图 7.8 丙酮 酸 羧 化 
作用 的 替代 途径 


Prev NAEP psp —— rum ”消除 ， 则 得 率 被 限制 在 67% 或 更 少 。 没有 | 
sre ay 系统 的 列举 所 有 可 能 的 途径 ， 人 们 就 不 能 
确保 不 存在 其 它 途 径 能 以 更 高 的 得 率 生产 
这 种 产物 。 例 如 ， 如 果 设 计 一 条 途径 将 
2mol 丙酮 酸 转 化 为 3mol 乙酰 辅酶 A (没有 
二 氧化 碳 的 消耗 或 产生 )， 


2CH3;COCOO™ + 3HS-CoA +4H* +2NADH 


Gly ZB 


[aa (两 醋酸) (辅酶 A) 
-3GCHsGOD_SiCaaA 3H,O + 2NAD* 
~ (乙酰 辅酶 A) 
则 基于 和 葡萄糖 的 赖 氨 酸 得 率 高 于 67% 会 是 
Ala Mal ”可 能 的 。 考 虑 到 丙酮 酸 和 草 酰 乙酸 都 参与 
\ ane 大 量 的 酶 反应 ， 根 据 先前 的 经 验 并 不 明显 


知道 这 种 途径 的 存在 能 被 排除 。 合 成 算法 
表明 在 一 个 合理 完整 的 数据 库 内 ， 不 存在 
这 种 途径 。 需 再 一 次 注意 到 ， 所 获得 的 最 
高 得 率 仅 相 对 于 碳 的 消耗 量 。 当 能 量 和 还 原 当 量 平 衡 也 被 包含 在 计算 中 时 ， 这 种 得 率 可 能 还 
要 进一步 减 小 。 正 如 第 9 章 一 第 11 章 中 所 阐述 的 。 


7.4 算法 的 讨论 

这 一 章 所 介绍 的 途径 合成 算法 是 非常 有 效 的 ， 而 且 能 在 最 短 的 时 间 内 处 理 大 量化 学 计量 
约束 限制 。 最 坏 的 情况 是 其 复杂 性 与 反应 的 数目 成 指数 关系 。 但 是 ， 这 种 情形 只 在 一 些 非常 
特殊 的 情况 下 才 发 生 ， 如 图 7.10 所 示 的 情况 。 对 于 每 一 个 菱形 编号 为 Di，D; 等 ， 一 条 途 ， 
径 可 沿 上 面 的 分 支 也 可 沿 下 面 的 分 支 前 进 。 如 果 有 N SHB, WA N -1 工 个 交叉 汇合 点 ， 
在 此 处 需要 选择 如 何 走 。 因 此 ， 有 2N -1 个 不 同 的 途径 ， 它 们 在 基因 型 上 都 是 独立 的 。 


A; Ag Ao A3n 
Ai eo <a> <> Alio … Asn-2 < A3n41 
Ay As Ag Aao-l 


图 7.10 途径 数 呈 指数 增长 的 反应 组 


在 这 种 情形 下 ， 因 为 算法 将 构建 所 有 在 基因 型 上 独立 的 途径 ， 因 此 ， 途 径 建 立时 所 需 时 
间 与 储存 量 将 随 反 应 数 而 呈 指 数 增长 。 然 而 ， 这 只 是 最 坏 的 设想 。 实 际 上 ， 代 谢 约束 限制 长 
的 序列 反应 而 不 是 如 图 7.10 所 示 的 平行 分 支 类 型 的 反应 。 这 种 长 的 反应 序列 用 已 介绍 的 方 
法 可 以 非常 有 效 地 被 处 理 ， 并 可 导致 所 有 替代 选择 途径 的 很 快 产生 。 此 算法 的 一 个 特征 是 : 
它 的 效率 方面 的 贡献 是 它 不 必 从 作为 所 需要 的 反应 物 的 代谢 物 开 始 〈 如 图 7.1 所 示 会 是 这 种 
情况 ) ， 而 是 从 那些 参与 最 容易 满足 的 约束 代谢 物 开 始 ， 即 : 参与 最 小 反应 数目 途径 的 那些 
代谢 物 。 这 种 特性 ， 使 人 想起 兆 望 的 算法 ， 大 大 有 助 于 通过 所 有 可 能 解 产 生 的 反应 空间 的 
搜索 。 

所 介绍 的 方法 论 的 另 一 个 优点 是 : 在 代谢 物 -处 理 阶段 ， 代 谢 物 是 基于 它们 参加 的 反应 

180 


FA 7.9 转化 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 
为 丙酮 酸 的 最 长 的 可 能 途径 


数目 而 被 选择 的 。 通 过 这 种 方法 ， 它 们 从 约束 限制 中 被 消除 而 问题 的 规模 大 小 被 连续 减 小 。 
万 果 这 些 代谢 物 参与 很 长 的 反应 序列 ， 那 么 这 些 反应 序列 仅 只 需 考虑 一 次 ， 因 此 对 于 存储 及 
计算 资源 并 不 是 一 个 特别 的 负担 。 

最 后 一点 涉及 共同 流通 代谢 物 的 处 理 。 这 些 代谢 物 必须 被 定 为 所 允许 的 代谢 物 ， 否 则 算 
法 将 运算 很 长 的 时 间 以 为 了 满足 所 有 的 化 学 计量 约束 。 比 如 ,考虑 包括 在 吉 布 斯 自由 能 
(Bj, ATP 和 ADP) 使 用 中 的 流通 代谢 物 和 两 类 子 途径 : 这 些 代谢 物 充当 无 效 循环 将 ATP 
fei) ADP AIP, 的 作用 ， 这 些 代谢 物 完成 由 特定 合成 问题 所 规定 的 转化 ， 除 非 这 些 途 径 也 
产生 ATP 和 消耗 ADP 和 P,。 如 果 ATP 和 ADP 是 所 允许 的 反应 物 和 所 允许 的 产物 ， 来 自 
第 二 类 的 途径 是 可 接受 的 解 并 且 它 们 不 要 进一步 被 扩展 。 然 而 ， 如 果 ATP 和 ADP 从 出 现 
在 净化 学 计量 式 中 被 消除 ， 则 二 类 途径 必须 组 合 以 形成 可 接受 的 解 。 换 名 话说， 来自 第 二 类 
的 一 条 途径 必须 与 来 自 第 一 类 的 途径 组 合 以 便 从 化 学 计量 式 中 消除 ATP 和 ADP。 所 产生 的 
组 合 数目 是 非常 大 的 ， 这 就 导致 严重 的 执行 问题 。 因 此 建议 把 共同 流通 代谢 物 包括 在 所 允许 
的 反应 物 和 产物 之 中 。 


SB Fx mM 


Mavrovouniotis, M. L.(1989). Computer-aided design of biochemical pathways. Ph. D. Thesis, MIT, Cambridge, 
MA. ; 

Mavrovouniotis, M. L., Stephanopoulos, G. & Stephanopoulos, G.(1992a). Computer-aided synthesis of biochemical 
pathways. Biotechnology and Bioengineering 36, 1119-1132. 

Mavrovouniotis, M. L., Stephanopoulos, G & Stephanopoulos, G.(1992b). Synthesis of biochemical production 
routes. Computers and Chemical Engineering 16, 605-619. 


181 


第 8 章 代谢 通 量 分 析 


在 第 1 章 中 论述 了 代谢 通 量 构成 细胞 生理 学 的 基本 决定 因素 ， 主 要 因为 代谢 通 量 提供 了 ， 


在 整体 细胞 功能 和 代谢 过 程 中 ， 各 种 途径 参与 程度 的 度量 标准 。 因 此 ， 体 内 途径 通 量 大 小 的 
精确 量化 是 细胞 生理 学 和 代谢 工程 学 中 的 一 个 重要 目标 ， 尤 其 是 从 代谢 生产 的 角度 看 ， 总 是 
希望 尽 可 能 地 将 底 物 转化 成 有 用 产物 。 代 谢 通 量 分 析 (MFA) 是 代谢 途径 通 量 确定 的 一 个 强 
有 力 的 方法 ， 因 此 ， 通 过 利用 主要 胞 内 反应 的 化 学 计量 模型 及 应 用 围绕 代谢 物 的 质量 平衡 关 
系 ， 就 可 计算 出 胞 内 通 量 。 一 组 已 测量 的 胞 外 通 量 被 用 作 计 算 的 输入 ， 通 常 是 底 物 的 吸收 速 
率 和 代谢 物 的 分 沁 速 率 。 通 量 计算 的 最 后 结果 是 一 幅 代 谢 通 量 图 ， 图 中 显示 通 量 计算 中 所 包 
括 的 生化 反应 及 稳 态 速率 ( 即 通 量 ) 的 估计 值 ， 图 中 的 每 个 反应 就 发 生 在 该 稳定 状态 。 图 8.1 
对 此 作 了 举例 说 明 ， 其 描绘 了 酬 酒 酵母 (S . cerevisiae ) 在 厌 氧 培养 期 间 通 过 分 解 代 谢 途 径 的 
通 量 分 布 情况 。 所 有 通 量 是 由 胞 内 代谢 物 物 料 平衡 和 细胞 与 环境 之 间 交 换 的 化 合 物 通 量 的 测 
量 经 计算 得 到 的 。 图 8.1 所 示 的 这 种 类 型 的 代谢 通 量 图 中 ， 含 有 不 同 途 径 对 底 物 利 用 和 产物 
形成 的 整个 代谢 过 程 所 做 的 贡献 这 种 十 分 有 用 的 信息 。 然 而 ， 这 种 代谢 通 量 图 的 真正 价值 在 
于 所 观测 到 的 通 量 差别 : 即 当 用 不 同 菌 种 或 在 不 同 条 件 下 所 得 到 的 代谢 通 量 图 进行 互相 比较 


= 


所 得 的 通 量 差别 。 正 是 通过 这 种 比较 ， 遗 传 和 环境 扰动 的 影响 才能 充分 予以 评价 ， 而 且 在 这 


样 的 途径 内 的 特定 途径 及 反应 的 重要 性 才能 被 准确 地 描述 。 

除了 途径 通 量 量化 外 ， 代 谢 通 量 分 析 能 够 提供 关于 其 它 重 要 的 细胞 生理 特征 方面 附加 的 
洞察 力 。 这 里 提供 此 类 附加 信息 的 概括 说 明 ， 这 类 信息 可 以 从 MFA 及 本 书 参考 文献 部 分 得 
到 ， 参 考 文献 中 对 其 应 用 有 更 详细 的 说 明 。 


(1) 细胞 途径 中 分 支点 控制 〈 节 点 的 刚性 ) 的 识别 。 通 过 比较 由 不 同 操作 条 件 的 变化 及 


用 不 同 变 异 株 所 导致 的 分 支点 通 量 分 配 比 的 变化 ， 分 支点 的 柔性 或 刚性 就 可 被 评估 
(Stephanopoulos and Vallino，1991)。 一 般 来 说 ， 刚 性 分 支点 抵抗 通 量 分 配 比 的 变化 ， 而 柔 
性 分 支点 倾向 于 更 适应 通 量 分 配 比 的 变化 。 代 谢 网 络 这 些 特 征 方面 的 知识 在 合理 地 解释 通 量 
变化 的 类 型 中 是 重要 的 ， 而 这 些 变化 对 改变 产物 得 率 是 最 有 效 的 。 在 5.4 节 已 定义 了 节点 刚 
性 的 概念 ， 在 10.1.3 节 将 举例 说 明 如 何 利 用 它 来 研究 氨基 酸 生 物 合 成 。 

(2) 替代 途径 的 识别 。 生 物 反 应 化 学 计量 式 的 列 出 (其 是 MPA 的 基础 )， 需 要 由 底 物 转 
化 为 产物 的 实际 的 生化 反应 路 线 的 详细 知识 。 然 而 ， 这 对 许多 微生物 来 说 可 能 不 是 很 清楚 
的 ， 因 为 已 在 不 同 生物 体 中 识别 出 几 条 替代 途径 并 且 知 道 是 在 不 同 条 件 下 运行 。 在 此 ， 重 要 
的 是 重复 途径 的 定义 ( 见 第 1 章 ) 为 : 连接 一 组 输入 代谢 物 与 一 组 输出 代谢 物 的 可 行 的 及 可 观 
察 的 反应 序列 。MFA 在 识别 途径 中 是 重要 的 : 其 能 同样 好 地 重复 产生 胞 外 代谢 物 的 宏观 通 
量 测量 ， 在 这 方面 ， 其 能 消除 由 于 不 能 满足 物料 平 衔 而 是 不 可 能 的 替代 途径 。Aiba 和 Mat- 
suoka(1979) 在 柠檬 酸 发 酵 中 证 明了 第 一 个 这 类 方法 的 应 用 ( 见 例 8.3),， 在 10.1 节 ， 提 供 了 
IFA MFA 识别 C. glutamicum 中 转 氢 酶 活性 的 例子 。 

(3) 未 测量 的 胞 外 通 量 的 计算 。 有 时 ， 能 被 测量 的 胞 外 通 量 数目 小 于 计算 未 知 胞 内 通 量 
所 需 的 数目 。 在 这 种 情况 下 ， 通 过 利用 先前 实验 所 确定 的 通 量 分 配 比 ， 有 可 能 计算 胞 外 未 测 
量 通 量 ， 例 如 ， 各 种 副 产 物 的 生产 速率 ， 这 可 通过 利用 化 学 计量 模型 和 已 测量 的 通 量 来 计 

182 


| 
| 


| 


算 。 如 果 这 些 通 量 的 测量 是 变 得 可 以 利用 的 ， 那 么 它们 与 模型 预测 的 一 致 性 程度 可 用 于 模型 
， 证 实 或 修正 ， 可 以 作为 实例 ( 见 8.1.2 节 关 于 超 定 系统 的 讨论 )。 


(4) 最 大 理论 得 率 的 计算 。 计 算 理 论 得 率 是 基于 从 一 个 指定 的 底 物 生产 最 多 的 产物 ， 以 


“构成 代谢 网 络 的 化 学 计量 式 。 通 量 分 配 比 以 生成 产物 量 最 大 来 确定 。 此 外 ， 必 须 关 注 代谢 中 


间 物 和 流通 代谢 物 之 间 的 关系 。 当 然 ， 有 可 能 确定 特定 条 件 下 的 理论 得 率 ， 然 而 ， 在 复杂 的 
代谢 网 络 中 ， 以 MFA 为 基础 的 更 为 正规 的 方法 是 更 可 取 的 。 理 论 得 率 的 计算 为 实际 过 程 提 


供 了 一 个 基准 ， 而 且 对 于 已 给 的 应 用 也 能 识别 具有 特别 吸引 力 的 替代 途径 。 此 外 ， 它 们 提供 


了 在 最 高 得 率 的 条 件 下 代谢 活性 的 一 个 有 用 的 标记 ( 即 呼 吸 商 )， 而 最 高 得 率 是 在 寻求 最 优 控 
制 策略 时 所 追求 的 。 这 些 方 法 的 例子 将 在 10.1 节 给 出 。 
在 本 章 ， 将 介绍 代谢 通 量 分 析 理 论 并 阐述 类 似 于 得 到 图 8.1 所 示 结 果 的 计算 基础 。MFA 
的 一 个 独特 方面 是 : 胞 内 代谢 通 量 的 化 学 计量 确定 既 可 基于 相同 数目 的 代谢 物 平衡 式 ， 也 可 
以 基于 大 于 或 等 于 这 些 代谢 物 的 平衡 式 ， 这 取决 于 可 利用 的 测量 的 数目 。 在 第 一 种 情况 下 没 
有 元 余 度 ， 而 具有 更 多 的 测量 则 可 使 过 程 的 真实 性 得 到 严格 地 评估 。 如 果 较 少 的 测量 是 可 以 
葡萄 糖 


100.00 | (0.0333C-molg-h-) 


Co, 


1.06 


wick 一 全 ~ 6. mee ppp — > 生物 质 


磷酸 三 羟 丙 酮 一 388 ~ 3- 磷 酸 甘 油 醋 
8.56 oe 
3- 磷 酸 甘 油 0.05 3- 磷 酸 甘 油 酸 OS). 丝氨酸 -050 。 生物 质 
有 85.46 
甘油 rare 生物 质 一 一 -磷酸 燃 醇 丙酮 酸 乙醇 
Fem 1.75 N| 85.08 co, Jon 
1.08 酮 酸 乙 醛 Te ee 
一 -二 me ol 
is S 
\ 乙酰 辅酶 A 
# 
| 
异 柠檬 酸 | ele 
| 


2.87 0.60 0.96 
| 

<“- 丽 成 二 酸 —_- ax —_— 4 in 
| 


1 
| 
| 
| 
| 
| 
| 
| 
| 0.14 
| 

| 


一 031 CO; | 

0.94 me Re | 

NADH —— NADH 线粒体 id 
in a 


图 8.1 S. cerevisiae 厌 氧 生长 时 不 同 代 谢 途 径 上 的 通 量 
这 些 通 量 是 利用 Nissen 等 (1997) 的 化 学 计量 模型 和 一 些 测 量 值 通过 计算 得 到 的 ， 
测量 值 包 括 葡萄 糖 和 氢 的 吸收 速率 ， 二 氧化 碳 、 乙 酸 、 乙 醇 、 甘 油 、 丙 酮 酸 和 琥珀 
酸 的 产生 速率 ， 以 及 重要 大 分 子 库 如 DNA、RNA、 和 蛋白 质 、 脂 类 和 糖 类 的 合成 速率 


183 


利用 的 ， 优 化 约束 可 以 引入 ， 以 提供 平衡 方程 完全 闭合 。 这 些 方 面 将 在 8.2 一 8.4 Ht, 
在 下 一 章 ， 将 讨论 利用 同位 素 标记 的 底 物 进行 代谢 通 量 实验 确定 的 方法 ， 而 在 第 10 章 ， 用 
来 自 微 生物 和 细胞 培养 实例 研究 中 的 具体 例子 示范 证 明 MFA 的 应 用 。 


8.1 理论 


MEFA 的 起 点 是 描述 底 物 如 何 转化 为 代谢 产物 和 生物 质 组 成 (或 大 分 子 库 ) 的 反应 网 络 化 
学 计量 学 。 利 用 第 3 章 的 框架 ， 考 虑 经 由 天 个 途径 代谢 物 进行 的 J 卫 个 胞 内 反应 ， 其 质量 平 
衡 式 已 由 式 (3.19) 给 出 ， 或 以 向 量 符号 表示 为 : 


AXmet 
dt Pike peel (8.1) 


在 式 (8.1) 中 ，Xme 是 胞 内 代谢 物 (或 途径 中 间 物 ) 的 浓度 向 量 ，rmet 是 一 个 包含 在 了 个 
反应 中 的 胞 内 代谢 物 形成 净 速 率 的 向 量 。 

普遍 承认 ， 大 多 数 代谢 物 库 有 着 非常 高 的 周转 。 因 此 ， 甚至 在 细胞 所 经 历 的 环境 受到 强 
” 烈 扰 动 之 后 ， 不 同 代谢 物 库 的 浓度 也 会 迅速 调整 到 新 的 水 平 。 因 此 ， 假 定 途径 代谢 物 处 于 拟 
稳定 状态 是 合理 的 。 这 意味 着 没有 代谢 物 的 积累 ， 即 : 


山 主 Imet _ UXmet (8. 2) 


式 (8.2) 右 边 第 一 项 表示 J PRM 中 途径 中 间 物 的 净 合成 速率 ， 即 流 进 和 流出 一 条 途径 的 代谢 
物 通 量 的 和 。 第 二 项 表示 由 于 生物 质 生 长 而 对 代谢 物 库 的 稀释 作用 。 如 果 这 种 稀释 效果 被 认为 
是 一 种 人 为 的 消耗 反应 ， 那 么 式 (8.2) 表 明 流 进 和 流出 一 个 途径 代谢 物 库 的 通 量 是 相互 匹配 的 ， 
即 围绕 一 个 已 给 途径 代谢 物 库 的 通 量 是 守恒 的 。 因 为 大 部 分 途径 代谢 物 的 胞 内 水 平 是 非常 低 
的 ， 所 以 这 种 稀释 影响 一 般 是 很 小 的 ， 特 别 是 与 影响 同一 个 代谢 物 的 其 它 通 量 相 比 较 时 情况 更 
是 这 样 。 因 此 ， 上 式 最 后 一 项 一 般 可 被 忽略 ( 见 例 8.1)。 于 是 得 到 更 简单 的 平衡 式 : 


0=t,..= 68 (8.3) 
其 中 已 代 人 用 于 代谢 物 合成 净 速 率 的 式 (3.12)。 


【 例 8.1】 途径 代谢 物 的 稀释 影响 

为 了 说 明 式 (8.2) 中 的 稀释 项 是 可 以 忽略 的 ， 考 虑 三 种 不 同类 型 的 胞 内 化 合 物 : (1) 糖 
酵 解 途径 的 中 间 物 ; (2) BEM; (3) ATP. 在 表 8.1 中 收集 了 这 三 组 化 合 物 的 相关 数据 。 

TES. cerevisiae 的 好 氧 生 长 中 ， 在 连续 培养 (稀释 速率 为 0.1 h 1) 条 件 下 ， 已 测 得 糖 
酵 解 途径 中 的 代谢 物 胞 内 水 平 是 在 0.05 一 1.0pnmol'g !( 干 重 ) 的 范围 (Theobald et al, 
1997)。 在 这 些 生 长 条 件 下 ， 通 过 EMP 途径 的 通 量 大 约 为 1.1mmol'g !( 干 重 ).h 1， 因 此 
可 以 看 出 通过 一 个 代谢 物 库 的 通 量 大 大 高 于 式 (8.2) 中 的 稀释 项 ， 该 稀释 项 值 约 为 0.005 一 
0.1lxmol'g-!( 王 重 )"h 1。 因 此 ， 即 使 对 于 较 低 的 糖 酵 解 通 量 ， 稀 释 项 也 可 以 是 忽略 的 。 对 
于 哺乳 动物 细胞 ， 胞 内 代谢 物 库 的 水 平 是 大 约 相同 的 ， 但 通 量 是 比较 小 的 ， 在 周转 率 和 稀释 
率 之 间 的 差别 就 比较 小 ， 但 一 般 说 来 ， 也 会 得 到 类 似 的 结果 。 

在 产 黄 青 霉 (P.chrysogenum) 中 ， 胞 内 氨基 酸 浓度 是 在 1 一 4Spumol.g '( FH) 的 范 
围 。 通 过 氮 基 酸 库 的 通 量 取决 于 蛋白 质 的 合成 速率 ， 其 在 稳定 状态 下 ， 可 从 细胞 的 蛋白 质 含 

184 


8.1 不 同 代谢 物 的 典型 胞 内 水 平 


mol:g | (于 重 ) 
分 解 代 谢 (EMP) 


te DB 
6- 磷 酸 葡萄 糖 


6- 磷 酸 果 糖 
1,6- 二 磷酸 果糖 
3- 磷 酸 甘 油 醛 
磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 


AAR 
BAR 
MAR 
SAAR 


ATP 


© 数据 取 自 S cerevisiae 的 稳 态 连续 好 氧 生长 (D=0.1h 1)。 
@) 数据 取 自 比 生长 速率 较 高 ( 即 ， 约 0.1h-2) 补 料 : 间 欢 培 养 的 初始 阶段 。 没 有 发 现 游 离 氨基 酸 库 的 浓度 随 环境 条 件 
的 改变 而 大 幅度 变化 。 


量 和 比 生长 速率 来 确定 。 对 于 一 个 45%( 质 量 比 ) 的 典型 的 蛋白 质 含 量 ， 比 生长 速率 0.1h-!, 和 蛋 
白质 合成 速率 为 0.04Sg( 和 蛋白 ).g !( 干 重 ).h |, MF P.chrysogenum 中 蛋白 质 库 的 氨基 酸 组 
成 ， 其 平均 摩尔 质量 为 112 gmol( 蛋 白质 结 合 氢 基 酸 )， 因 此 ， 为 合成 蛋白 质 而 消耗 氨基 酸 的 
速率 为 0.4 mmol(0.045/0.112, ZARAA AEM) +g !( 于 重 )"h 1(Nielsen，1997)。 对 于 两 
氨 酸 、 谷 氢 酸 、 赖 氨 酸 和 葵 丙 氢 酸 的 含量 (基于 摩尔 基准 ) 分 别 为 6.6%、12.8%、5.3% 和 
3.7% 的 情况 ， 通 过 上 述 四 种 氨基 酸 库 的 通 量 分 别 为 26.4pmol'*g !( 干 重 )"h 1，5$1.2pmol.g 1! 
( 王 重 ).h 1,，21.2pmol'g !( 干 重 )'h- Al 14.8umol-g (FF )-h 1。 由 此 可 以 看 出 ， 对 少数 几 
个 氨基 酸 ， 其 游离 库 是 很 大 的 ， 例 如 两 氨 酸 和 谷 氨 酸 ， 稀 释 项 比 通过 游离 氨基 酸 库 的 通 量 小 
10 倍 的 数量 级 。 对 这 些 氨基 酸 忽 略 稀释 项 在 计算 上 可 能 引起 小 的 误差 ， 但 是 ， 如 果 对 于 库 的 
大 小 的 数据 是 可 以 利用 的 ， 则 有 可 能 计 及 稀释 项 ， 这 可 通过 包括 作为 一 个 人 为 消耗 反应 的 稀释 
项 来 进行 [参见 Reardon et al(1987) ]。 对 于 游离 库 很 小 的 氨基 酸 (大 多 数 氨基 酸 是 这 种 情况 )， 
稀释 项 也 可 以 忽略 ， 因 为 其 比 通过 库 的 通 量 小 50 倍 左右 。 

在 S$ ._cerevisiae 中 的 ATP 库 大 约 是 8.0 nmol.g- (FH), HF ATP 参与 很 多 反应 ， 
因此 难以 估计 通过 库 的 通 量 。 然 而 ， 从 ATP 得 率 YArp 和 比 生长 速率 ， 人 们 可 以 得 到 细胞 
生长 的 ATP 总 需要 量 的 估计 。 如 果 取 YATrp 为 70 mmol(ATP).g-!( 干 重 )( 见 例 3.4)， 可 
以 求 出 在 比 生 长 速率 为 0.1h-! 时 所 需 的 ATP 是 7.0 mmol-g !(FH)-h!, Al, at 
ATP 库 的 通 量 比 稀释 项 高 10000 倍 ， 很 显然 在 ATP 平衡 计算 中 稀释 项 可 以 忽略 。 即 使 对 于 
RARE ATP 库 的 细胞 ， 例 如 乳酸 菌 ， 这 个 结论 仍然 成 立 。 对 NADH 和 NADPH 等 其 它 
辅助 因子 也 能 得 到 类 似 的 结论 。 

从 前 面 的 分 析 可 以 看 出 ， 对 于 代谢 物 和 辅助 因子 ， 因 为 它们 的 胞 内 库 具 有 非常 高 的 周 
转 ， 故 可 忽略 稀释 项 。 这 可 以 特征 时 间 的 形式 来 表示 ( 见 2.1 节 )。 因 此 ， 如 果 代 表 一 个 库 周 
转 的 特征 时 间 ( 其 等 于 库 的 大 小 与 通过 库 的 通 量 之 比 ) 大 大 小 于 代表 生长 的 特征 时 间 ( 其 等 于 
比 生 长 速率 的 倒数 )， 则 稀释 项 可 以 忽略 。 


Theobald et al 
(1997)® 


S. cerevisiae 


Nielsen 


(1997)® 


P. chrysogenum 


Theobald et al 
(1997)® 


S. cerevisiae 


拟 稳 态 假设 的 一 个 推论 是 只 需 考 虑 位 于 代谢 反应 网 络 分 支点 的 代谢 物 。 在 线性 反应 序列 

中 的 所 有 途径 中 间 物 都 可 以 消除 。 这 可 以 通过 下 MP 途径 中 的 6- 磷 酸 果糖 转化 为 磷酸 二 羟 丙 

酮 和 3- 磷 酸 甘油 醛 的 过 程 来 说 明 。 这 个 转化 过 程 包括 两 步 反 应 ， 它 们 的 化 学 反应 计量 式 为 : 
185 


— fructose-6-P — ATP + fructose-1 ,6-bisP =0 (8.4) 
(6-Be RE ) (1,6- 二 磷酸 果糖 ) 
一 fructose-1,6-bisP + dihydroxyacetone-P + glyceraldehyde-3-P=0 (8.5) 
(RR— HAM) (3- 磷 酸 甘油 醛 ) 
如 在 3.1 节 所 讨论 的 ， 忽 略 在 第 一 步 反 应 中 形成 的 ADP。 上 述 两 个 反应 是 1,6- 二 磷酸 
果糖 参与 的 仅 有 的 细胞 反应 ， 围 绕 此 代谢 物 的 稳 态 质量 平衡 式 为 : 
201 一 2=0 (8.6) | 
AP, vi, v2 分 别 表 示 上 述 两 个 反应 的 正 反 应 净 速 率 @。 因 此 ， 第 一 个 反应 速率 等 于 第 | 
二 个 反应 速率 。 可 以 把 这 两 个 反应 集 总 进 一 个 总 的 反应 ， =A tae 6- 磷 酸 果糖 转化 为 磷 ， 
BHAA 3- 磷 酸 甘油 醛 ， 正 反应 速率 为 wl。 注 意 这 种 集 总 不 改变 总 的 自由 度 ， 因 为 一 
个 反应 速率 ( 即 一 个 未 知 的 反应 速率 ) 的 移 除 的 同时 也 伴随 着 一 个 质量 平衡 (对 1,6- 二 磷酸 果 | 
糖 的 质量 平衡 ) 的 消除 。 无 论 何 时 只 要 是 线性 序列 反应 ， 就 能 进行 类 似 的 反应 集 总 ( 另 一 个 
例子 是 在 EMP 途径 中 的 3- 磷 酸 甘 油 酸 到 磷酸 烯 醇 两 酮 酸 的 转化 )。 因 此 ， 在 建立 代谢 途径 
的 化 学 反应 计量 式 时 ， 只 需 考虑 在 网 络 分 支点 的 代谢 物 ， 这 就 使 在 代谢 通 量 分 析 中 通常 用 到 
的 化 学 计量 模型 的 复杂 性 明显 降低 。 这 在 例 8.2 中 将 给 以 说 明 。 


【 例 8.2】 赖 氨 酸 生物 合成 中 代谢 通 量 的 确定 
表 10.1 更 详细 地 描述 了 赖 氨 酸 生物 合成 的 代谢 网 络 ， 有 关 在 这 里 所 考虑 的 特定 反应 
其 化 学 反应 计算 式 的 更 多 信息 可 以 参考 该 表 。 图 8.2 已 经 给 出 各 种 胞 内 反应 进行 的 速率 ， 它 
从 每 单位 时 间 每 克 干 重 细胞 微生物 消耗 lmol 葡萄 糖 开 始 。 下 述 总 计量 式 已 分 别 用 于 磷酸 戊 
糖 途 径 和 三 送 酸 循环 : 
3Glc6P + 3H2O + 6NADP->3CO, + 6NADPH + 2Fru6P + GAP (1) 
Pyr + 3NAD + NADP + FAD + ADP->3CO, + NADPH + 3NADH+FADH+ATP (2) 
在 6- 磷 酸 葡萄 糖 (Glc6P) 到 6- 磷 酸 果 糖 (Fru6P) 的 方向 糖 酵 解 净 通 量 是 正 的 。 产 物 为 “ 
海藻 糖 ( 速 率 为 rr)、 糖 酵 解 产物 ( 即 乳 酸 、 丙 氨 酸 、 细 氢 酸 集 总 在 一 起 速率 为 rc) 、CO:( 速 
率 为 ~co,) 及 赖 氨 酸 (速率 为 "L)， 同 时 生化 合成 中 要 用 到 葡萄 糖 (Glc) 速 率 为 tmol/ 单 位 时 
间 )、 氮 和 氧 。 葡 萄 糖 运输 是 通过 PTS 系统 : 
Glc + PEP—Glc6P + Pyr (3) 
单独 的 反应 包括 丙酮 酸 的 羧 化 ( 通 量 为 wug6)，PEP 的 羧 化 ( 通 量 为 va) 和 OAA 的 脱羧 反应 ( 通 量 
为 w4)。 由 于 这 三 个 反应 不 能 从 上 述 代谢 物 的 测量 而 独立 观察 到 ， 通 量 wa，z4 和 v6 累 加 起 来 
得 到 vsg= ua- w4+ vo. 通过 忽略 为 生物 合成 而 消耗 的 代谢 物 量 ， 可 以 写 出 如 下 平衡 式 以 确定 
这 两 个 未 知 的 通 量 分 配 比 vy 和 v2: 


海藻 糖 六 本 二 下 (4) 
Hi AR rL= vg= 03 v4t x6 (5) 
糖 酵 解 产物 1G= 05 (6) 
NADPH 0=2v,-4vgtz [其 中 > 为 三 羧 酸 循环 TCA HH, 1A 8.2] (7) 


@ ”在 本 章 中 ， 胞 内 反应 速率 v 是 指正 向 反应 净 速 率 。 此 速率 等 于 不 可 道 反应 的 正 向 反应 速率 ， 也 等 于 可 疼 反 应 的 
正 向 与 逆向 反应 速率 之 差 。 因 为 本 章 所 考虑 的 宏观 平衡 不 能 区 分 正 向 与 道 向 反应 速率 ， 因 此 用 v 来 描述 二 者 之 间 的 差别 ， 
即 净 速率 。 


186 


1 mol/ 单 位 时 间 


NADPH 
(1-v,-2,) 


[v,+(2/3)2] 


FruDP (1/3)¥, 


[20,+(4/3)0, + (1/3), 


=202+(5/3)2, | 
NADH 
3 PF Sa oe oo 
1 
Co, PEP | Glc 
NADPH © 机 | 
NH, > | 1420246 )Z -—V,+0,) ! 
| G6P 
a-KG CO. Lingea a Ses 


ASA 3 CO， 
TCA | 
4z——> NADH 

= AE — FRR NADPH * . ae. 
NADPH y—S—NH, vad 2 

if Suc Glu a-KG Suc CO, 

H4D 一 一 -一 mesoDAP Mame 
| 和 和 NADPH (0;-V4+0¢) 


A8.2 赖 氨 酸 生物 合成 代谢 网 络 
描述 了 中 间 代 谢 物 与 流通 代谢 物 的 消耗 和 产生 速率 。 可 参考 表 10.1 的 反应 化 学 计量 学 。 
正 通 量 值 表 明净 通 量 正 向 的 。 平 衡 式 总 结 于 例 8.2 中 的 式 (4) 一 式 (10) 
缩写 : H4D 一 六 氢 吡 啶 二 羧 酸 ; exoDAP 一 消 旋 二 氨基 庚 二 酸 


氨 ramm 二 之 08 

CO, 的 释放 rco, = V1 + 32z 

Op 的 吸收 ro,=(1/2)rNApH=(1/2)(5ulX3+2u2+4z) 
以 上 方程 式 对 未 知 数 求解 可 得 : 


1=(3/3)(rc 一 2+6rL+27rT) 
v2=1-rz- (34)(rg-2+6r_t+2rz7) 
VOX Weer ae 


U5—Té 


(8) 
(9) 
(10) 


(11) 
(12) 
(13) 
(14) 


就 额外 的 测量 数据 而 言 ， 虽 然 不 能 描述 羧 化 作用 通 量 ， 但 对 试验 数据 提供 如 下 的 约束 : 


rcoj+0rL+3rc+0orT=6 


(15) 
187 


2ro,+ 14r_t+5ret lar7=12 (16) 
Fiano y. (17) 


st (8.3) 形成 代谢 通 量 分 析 的 基础 ， 即 ， 在 胞 内 速率 向 量 v 中 未 知 途径 通 量 的 确定 。| 
这 个 向 量 方程 表示 对 于 K 个 代谢 物 的 J 个 未 知 数 (途径 通 量 ) HK 个 线性 代数 平衡 式 。 因 
为 反应 数目 J) 总 是 大 于 途径 代谢 物 数目 (天 ) ， 该 代数 方程 组 有 确定 的 自由 度 为 : FEsl 
J-K. Ak, We v 中 的 一 些 元 素 必 须 被 测量 以 便 允 许 其 余 未 知 量 的 确定 。 反 应 速率 能 被 
测 的 一 个 典型 例子 是 葡萄 糖 到 6- 磷 酸 葡 萄 糖 的 转化 ， 可 以 取 其 等 于 葡萄 糖 的 吸收 速率 。 如 
Rv 中 恰好 下 个 通 量 (或 反应 速率 ) 被 测定 ， 该 系统 就 成 为 确定 性 的 系统 (determined sys- 
tem) 并 有 惟一 解 ， 且 能 很 容易 得 到 ( 见 下 面 )。 如 果 多 于 下 个 通 量 被 测量 ， 则 这 个 体系 就 是 
超 定 的 系统 (overdetermined system) ， 意 味 着 存在 着 额外 的 方程 ， 其 可 用 于 总 体 平 衡 一 致 
性 的 检验 、 通 量 测量 的 准确 度 、 拟 稳 态 假设 证 实 ， 及 未 知 胞 内 更 准确 的 通 量 的 计算 。 如 果 上 
于 下 个 通 量 被 测量 ， 那 么 这 个 系统 就 是 不 定 的 系统 (underdetermined system), KAY, A 
有 在 代谢 物 平 衡 中 引入 额外 的 约束 ， 或 者 对 代谢 物 平 衡 施 加 一 个 整体 优化 准则 ( 见 8.3 节 )， 
才能 确定 未 知 的 通 量 。 

在 一 个 确定 性 系统 中 ， 正 好 F 个 通 量 (或 向 量 v 中 的 反应 速率 ) 被 测量 ， 其 余 的 通 量 ， 
可 通过 解 式 (8.3) 的 线性 方程 组 来 计算 。 引 入 矩阵 代数 来 描述 各 个 步骤 是 很 方便 的 。 为 此 
目的 ， 通 过 把 测量 的 速率 集中 在 一 个 新 向 量 v 中 ， 向 量 v 中 剩余 的 元 素 (其 是 要 计算 的 速 
率 ) 集中 在 另 一 个 向 量 v 中 ， 则 可 求 出 式 (8.3) 的 解 。 类 似 地 ， 通 过 把 测量 的 反应 的 计算 
系数 集中 在 矩阵 Gu 中 ， 而 把 其 余 的 反应 的 计量 系数 集中 在 矩阵 G. 中 ， 从 而 对 和 矩阵 G 的 化 
学 计量 系数 作 了 上 述 的 分 配 。 于 是 式 (8.3) 可 以 改写 为 : 

0=G'y—G*v,. + G!v. (8.7) 
AAIEM F=J-K SiR, CG. 是 一 个 方 阵 ( 维 数 为 KX K), i AR RE OR 
逆 ( 见 下 文 )， 则 ve 的 元 素 可 以 表示 为 : 
vo=, (65) Go, (8.8) 

在 例 8.3 中 将 证 明示 范 矩 阵 代数 在 通 量 确定 中 的 应 用 ， 而 且 甚至 已 经 用 上 述 方 法 表示 每 

一 个 矩阵 已 提供 一 个 模板 以 便于 这 个 方法 对 其 它 系 统 的 应 用 。 


【 例 8.3】 利用 解 脂 假 丝 酵母 〈C .itpolytica ) 进行 柠檬 酸 发 酵 的 代谢 通 量 分 析 

为 了 进一步 前 述 代谢 通 量 分 析 的 概念 ， 考 虑 Aiba 和 Matsuoka (1979) 进行 的 利用 C . 
lipolytica 生产 柠檬 酸 研究 ， 其 可 能 是 利用 代谢 物 平衡 来 处 理发 酵 数据 的 第 一 个 应 用 。 在 他 
们 的 分 析 中 ，Aiba 和 Matsuoka 利用 如 图 8.3 所 示 的 简化 了 的 代谢 网 络 ， 包 括 EMP 途径 、 
TCA 循环 、 乙 醛 酸 支 路 、 丙 酮 酸 羧 化 和 主要 大 分 子 库 〈 即 和 蛋白质、 碳水 化 合 物 和 脂 类 等 ) 
形成 。 当 柠檬 酸 和 蜡 柠 檬 酸 被 分 泌 到 胞 外 培养 基 中 时 ， 为 了 补充 TCA 循环 中 的 代谢 物 ， 这 
两 条 回 补 途径 显然 是 必须 的 。 

注意 此 模型 的 结构 ， 特 别 是 一 些 代谢 产物 ， 例 如 被 描述 为 代谢 中 间 物 的 柠檬 酸 、 异 柠檬 
酸 。 分 泌 反 应 (图 8.3 中 用 虚线 所 示 ) 的 引入 允许 拟 稳 态 假设 可 应 用 于 所 有 途径 的 中 间 代 谢 
物 。CO,，, 参与 几 个 反应 ， 因 此 CO, 作为 胞 内 化 合 物 也 被 包括 并 以 速率 wl6 被 分 沁 。 围 绕 CO> 
也 可 引入 一 个 平衡 式 。 用 这 种 模型 结构 ， 一 些 通 量 能 被 直接 测定 。 

188 


ee Se Se we 


v4 co,- = “6 — +co, 
AcCoA —H—» 脂 类 
------- “ORE 
NS 
om ----B- +— 8m 
ore 


me P 
RA 
图 8.3 简化 的 C.2izpolytica 代谢 网 络 
缩写 : G6P 一 6- 磷 酸 葡 萄 糖 ; Pyr 一 丙酮 酸 ; -AcCoA 一 乙酰 辅酶 A; OAA 一 草 酰 乙酸 ; Cit 一 柠檬 酸 ; 
i-Cit 一 异 柠檬 酸 ; wx-KG 一 a- 酮 戊 二 酸 ; Suc 一 琥珀 酸 ; Mal 一 苹果 酸 ; GOX 一 乙 醛 酸 
虚线 表示 运输 反应 ， 而 实 线 表 示 胞 内 反应 
单个 反应 的 化 学 计量 式 是 相当 简单 的 ， 因 为 除了 简 萄 糖 到 丙酮 酸 的 转化 外 ， 其 余 的 化 学 
计量 系数 都 为 1 或 -1。 对 网 络 〈 见 图 8.3) 中 所 有 的 分 支点 应 用 拟 稳定 状态 假设 ， 对 所 有 
单个 反应 的 速率 可 以 非常 容易 得 出 方程 式 〈1) 一 式 (11)。 所 有 反应 速率 单位 均 为 每 克 干 重生 
物体 在 每 小 时 内 形成 该 化 合 物 的 摩尔 [mol'g !( 干 重 )'h 9 。 


G6P: v1 — v2/2— v3=0 (1) 
Pyr: 02— v4— 05=0 (2) 
AcCoA: VU4— V6— V13— V14=0 (3) 
Cit: Vg 07 OY (4) 
i-Cit: V7 — Vg — V12— Vig=O (5) 
a-KG: Vg — V9— 015=0 (6) 
Suc: 29 一 WwW10 十 上 12 三 0 (7) 
Mal: Vio ~ Vint V43=0 (8) 
GOX: v2~ 013=0 (9) 
OOA: vs+ v11— 06—9 (10) 
CO): vat vgt vg— V16=0 (11) 


注意 ， 反 应 (13) 应 该 已 被 删除 ， 因 为 对 乙 醛 酸 应 用 拟 稳 态 假设 表明 这 个 反应 速率 等 于 vp. 
用 18 个 反应 速率 和 11 个 平衡 方程 ， 则 可 得 自由 度 为 7。 因 此， 如 果 有 7 个 反应 速率 被 
189 


测定 ， 那 么 其 它 的 反应 速率 就 可 以 计算 出 来 。 在 Aiba 和 Matsuoka 的 分 析 中 ， 他 们 测量 了 
网 络 中 的 6 个 反应 速率 : 葡萄 糖 的 吸收 速率 (rete = v1). CO, 产生 速率 (rc= zl16)、 TERR 
的 产生 速率 (rcit = 017) 异 柠檬 酸 的 产生 速率 (rict = 018)» 蛋白 质 合 成 速率 (rprot= Vis) 


和 碳水 化 合 物 合成 速率 〈rear= 03) (PO: gle 表示 葡萄 糖 ; c 表示 二 氧化 碳 ; cit 表示 柠檬 | 


酸 ; ict 表示 异 柠檬 酸 ; car 表示 碳水 化 合 物 ，prot 表示 有 蛋白质 一 一 译 者 注 )。 其 中 速率 rpm 
和 re 通过 分 别 测量 生物 质 〈 在 稳定 的 恒 化 器 中 ) 中 的 蛋白 质 和 碳水 化 合 物 含量 而 可 得 到 。 
除 这 6 个 测量 外 ， 他 们 通过 设 定 网 络 中 的 反应 速率 之 一 为 零 而 施加 了 一 个 约束 和 条件。 检验 了 
三 种 不 同情 况 ， 反 映 柠檬 酸 生 物化 学 的 三 种 不 同 模型 : 

@ 模型 1: 乙 醛 酸 支 路 是 无 活性 的 ， 即 vp=0. 

e@ 模 型 2: 丙酮 酸 羧 化 酶 是 无 活性 的 ， 即 "5=0。 

@ 模 型 3: TCA 循环 是 不 完全 的 ， 即 ve=0。 

用 上 述 6 个 已 测定 的 速率 ， 准 确 确定 了 每 个 模型 对 应 的 方程 组 ， 解 这 些 方程 组 就 可 确定 
未 知 的 反应 速率 。 通 过 不 断 地 消除 未 知 速率 来 进行 ， 比 如 ， 可 以 迅速 发 现 

v2= ZA reais Tet) (12) 

对 其 它 反 应 速率 也 可 以 得 到 类 似 的 表达 式 。 一 种 更 普遍 的 方法 是 利用 矩阵 代数 来 计算 。 下 面 
将 阑 述 在 模型 1 的 情况 下 如 何 计算 未 知 的 通 量 。 为 此 ， 首 先 利用 化 学 计量 矩阵 CURR 
ABS h(1)~HXC11): ; 


i-0.5-=1..0 0, 0.0 0 0-0 0 0 0 UO 10) tee 0 
6 1. 6-1-1 CAO. 00. oO. ORO OC ae 0 
Oo 0 OM PSE! 0 OO". OF CO OV b-1 45 OP CORR 0 
0 NO SOO ier =i 080% 0 070/00 +o 全 全 人 0 
0 0 0 0 0. COtterrerD . O=T° 00" 0 OF Oeg 0 
0 Zo. 0 04 Ooi ede 8.0 0 0. 0-1, 0) Cee (13) = 
. 0) © 0.0 0 tet tO 1 lO 人 于 0 
OT 0 OOO OU eee. “to OO ee 0 
oo" 8 OO O00 (0 404080 Bet. ‘0° 0 oO" Oo 0 
0 0 0'0 1-1, 0 (ORO Oe Oo 0) Oa 0 
6 oO O 1-1 © O Diet OAD eee 0-1 0 0 0 


当 速 率 AAA CTSS 16 和 v1 7B) ( 即 由 相应 署名 的 Lf 变量 来 表示 )， FF ARA FR 
柠檬 酸 分 泌 〈( 即 vig=0) 时 ， 在 模型 1 的 情况 ，vlz 被 设 定 为 0, B11, 3, 12, 15, 16, 17 
和 18 列 被 集中 在 矩阵 Gu 中 ， 而 剩余 的 列 被 集中 在 和 矩阵 G. 中 ， 于 是 由 式 (8.8) 得 出 


U2 


-0.5) 0D <0° 0 Tee -o 0 oye 
os iio: 0 0, sue <0 0 © 
vs a ol 0 OLD 0 -1 -4 
U6 oo 0 1-1 0 See 0 0 10 
v7 ooo 0 1-1 lo Clo 
vg |=- Oo 070 0 me 0 OO 0 
v9 020 O00 Ope 0 0.0 
ad DO 0 0. Geom -1 i, 0 
rd 00° 0 0 Om 0 -1) 0 
‘x 001 o ORD RO 1 -0}0 
his 0 dea 0.0 10 0 02,0 


190 


174 Dori .*® 

OF OMe) 40 (204) OHO 

0 tees: 0: 0  Bhits 

0 0 0 0 0 Th 0 T car 

HH Hee) OAC Hi 0 

x 0 0 0 > 9 0 0 0 T prot (14) 

0 O eA 30s) (Os: WE, 

0: Oar wei DO 470) ha 

0 O Deen sat GO Fict 

0 0: “GRRE SOF PO 0 

0 0! GRAPH) 10. 0 

或 
o2 2-2 0O 0 re 0 
rar 2>72 Lil wae O11 
U5 0 @ = 1 ee | T gle 
V6 Hi 0 LS 0.5 2 2, T car 
v7 =s Y 0 1.5 Gs)’ ha? 0 
@exi= |} —1) 1: = Leper tel chess (15) 
v9 -1 1-1 (ae ee 
V10 =e 0 - "Oi > eee eee T cit 
ON = a a | 1. Oe? ERS >: 1 Fiet 
re 0 0 1 0 Oy 0. 0 
3-3 0-22 -2o 3 

Via 


应 注意 该 解 的 复杂 性 ， 即 胞 内 通 量 是 几乎 全 部 所 测量 的 速率 的 函数。 在 这 种 情况 ， 利 用 
高 斯 消去 法 来 解 上 述 代 数 方程 组 可 能 是 非常 烦琐 的 ， 而 和 矩阵 方程 则 可 以 利用 计算 机 程序 〈 如 
Mathemetica, Mable 或 Matlab 等 ) 容易 地 求解 。 从 式 (15) 的 第 一 行 可 看 出 v2 的 解 与 式 
(12) 给 出 的 解 相 同 。 显 然 ， 当 乙 醛 酸 支 路 是 无 活性 时 ，zi=0、mio= vile。 通过 计算 稳定 
状态 恒 化 器 中 不 同 稀释 速率 〈( 即 不 同 组 的 测量 的 速率 ) 时 的 未 知 速率 (或 通 量 )，Aiba 和 
Matsuoka (1979) 得 出 结论 : 模型 1 所 描述 的 通 量 是 合理 的 。 此 外 ， 在 四 种 不 同 酶 (丙酮 
酸 羧 化 酶 、 柠 檬 酸 合成 酶 、 异 柠檬 酸 脱 氨 酶 和 异 柠檬 酸 裂解 酶 ) 的 体外 活性 测量 与 所 计算 的 
通 量 关联 得 相当 好 。 当 检验 其 它 两 种 模型 时 ， 发 现 一 些 通 量 是 负 的 ， 如 ， 模 型 2 预测 w- 酮 
成 二 酸 被 转化 为 异 柠檬 酸 。 这 不 是 不 可 能 ， 但 是 大 多 数 反应 在 热力 学 被 证 明 是 按 图 8.3 PAT 
头 所 示 的 方向 进行 的 。 这 样 ， 从 异 柠檬 酸 到 c- 酮 戊 二 酸 转 化 的 AG" 是 -20.9 kJ .mol 1， 而 
Be Rw mgs, Se BRAN w- 酮 成 二 酸 对 异 柠檬 酸 的 浓度 比 。 此 外 ， 用 模型 1 在 所 
测量 的 酶 活性 与 所 预测 的 通 量 之 间 的 拟 合 程度 比 其 它 两 种 模型 都 好 。Aiba 和 Matsuoka 
(1979) 因而 做 出 结论 : 在 柠檬 酸 生 产 条 件 下 C .zzpolytica 中 乙 醛 酸 途 径 是 没 活性 的 或 者 是 
以 很 低 的 速率 在 运行 。 


式 (8.8) 实际 上 表示 ， 当 利用 和 矩阵 符号 表示 法 《见方 框 4.2) 来 解 玉 个 线性 代数 方程 

组 时 所 得 的 结果 。 对 于 惟一 解 的 需要 是 该 代数 方程 组 必须 是 线性 无 关 的 ， 即 方程 组 中 没有 一 

个 方程 是 其 它 方程 的 线性 组 合 。 这 种 线性 独立 对 Ge FE OR aah a EY), TTT A a eI 

的 秩 就 很 容易 检验 。 因 此 ， 只 要 矩阵 满 秩 〈 等 于 天 ), BN, AG. 的 行列 式 值 不 为 零 ， 则 和 拢 
191 


阵 就 可 求 道 ， 未 测量 的 通 量 就 能 计算 。 如 果 和 矩阵 Ge 的 秩 小 于 天 ， 则 该 矩阵 为 奇异 矩阵 , 这 


意味 着 矩阵 Ge 的 行列 式 值 为 零 ， 则 用 式 (8.8) 得 不 到 解 ， 在 这 种 情况 下 ， 本 质 上 我 们 正在 
涉及 一 个 不 定 系统 。 

矩阵 Ge 的 秩 可 能 小 于 K 主要 有 两 个 原因 : 

(1) 集中 在 矩阵 Ge 中 的 反应 计量 方程 组 《例如 由 几 行 组 成 的 一 组 ) 是 线性 相关 的 ， 即 
包括 在 矩阵 Ge 的 一 行 或 多 行 可 以 写成 其 它 行 的 线性 组 合 。 在 一 个 代谢 网 络 中 各 反应 计量 式 
是 否 存 在 线性 相关 可 很 容易 地 通过 确定 总 化 学 计量 和 矩阵 G 的 秩 来 检验 。 如 果 G AR, th 
就 是 rank (G) = 天 ， 则 表明 至 少 存在 一 个 方 阵子 矩阵 其 能 用 于 求 逆 计 算 。 如 果 rank 
(G) < 天 ， 则 矩阵 Ge 的 行 中 至 少 有 一 行 与 其 它 行 线性 相关 。 由 于 代谢 网 络 中 通常 存在 大 量 
反应 ， 因 此 各 化 学 反应 计量 式 之 间 的 线性 相关 性 问题 是 经 常 产生 的 〈 见 例 8.4)。 在 这 些 情 
况 下 ， 有 必要 消除 所 有 线性 相关 的 反应 和 或) 在 求解 程序 中 包括 额外 的 信息 。 

(2) 即使 矩阵 G 是 满 秩 ， 也 有 可 能 测量 数据 组 以 这 样 的 方式 被 选择 ， 以 致 G. 有 一 个 本 
于 天 值 的 秩 。 在 这 种 情况 下 ， 一 些 已 测量 的 速率 是 多 余 的 。 它 们 可 以 用 于 一 致 性 检验 ， 但 
仅仅 是 在 不 同 测量 数据 组 首先 被 用 以 确定 未 知 通 量 之 后 〈 详 见 例 8.3)。 


【 例 8.4】 线性 相关 的 化 学 反应 计量 式 


因为 大 多 数 活 性 细胞 能 够 利用 许多 种 化 合 物 作 为 碳 源 、 能 源 和 氮 源 ， 因 此 存在 着 很 多 互 ， 
补 途 径 ， 如 果 它 们 同时 在 运行 则 会 起 类 似 的 作用 。 当 进行 代谢 通 量 分 析 时 ， 所 有 这 样 一 些 途 


径 的 包含 会 引起 能 观测 性 问题 ， 这 意味 着 这 些 途 径 通常 仅 胞 外 测量 是 不 可 辨识 的 。 由 此 ,不 
可 观测 的 途径 表现 为 线性 相关 的 化 学 反应 计量 式 。 许 多 最 常 遇 到 的 问题 是 由 于 如 下 一 条 或 多 
条 代谢 路 线 所 引起 的 : 

e@ 原核 生物 中 的 乙 醛 酸 循环 

© 4 GS-GOAT 系统 的 氮 同 化 作用 

© AMA 

e@ 异 构 酶 系 

在 原核 生物 中 ，TCA 循环 和 所 有 补给 反应 〈 包 括 乙 醛 酸 循环 ) 都 是 在 胞 质 基质 中 进行 
的 。 通 常 ， 乙 醛 酸 循环 被 认为 是 TCA 循环 的 一 条 旁 路 ， 这 是 因为 它 与 TCA 循环 共享 许多 
反应 ( 见 图 2.10)。 然 而 ， 这 两 条 途径 具有 非常 不 同 的 目的 : TCA 循环 有 把 丙酮 酸 氧 化 为 
CO;， 的 目的 ， 而 乙 醛 酸 循环 有 合成 前 体 代 谢 物 的 目的 ， 例 如 ， 由 乙酰 辅酶 A 合成 草 酰 乙 酸 。 
仅 考虑 这 二 者 本 身 ，TCA 循环 和 乙 醛 酸 循环 不 存在 线性 相关 性 ， 但 是 如 果 包 括 其 它 补 给 途 
径 〈 例 如 丙酮 酸 羧 化 酶 ) ， 则 奇异 性 会 产生 。 这 可 通过 对 三 个 途径 写 出 集 总 的 反应 来 举例 说 
明 〈 见 图 2.10 对 于 途径 总 览 )。 在 所 有 的 情况 下 ， 我 们 用 丙酮 酸 作 为 起 点 。 


TCA 循环 : — pyruvate + 3CO, + NADH + FADH2 + GTP =0 (1) 

乙 醛 酸 循环 : —2pyruvate + 2CO; + oxaloacetate + 4NADH + FADH2 =0 (2) 
(ZR) 

丙酮 酸 羧 化 酶 : — pyruvate — ATP — CO) + oxaloacetate = 0 (3) 


如 果 ATP 和 GTP 汇集 在 一 起 〈 在 胞 内 反应 的 分 析 中 经 常 这 样 做 ) ， 则 很 显然 乙 醛 酸 循 
环 是 其 它 两 个 途径 的 线性 组 合 ， 并 且 通 过 通 量 分 析 不 能 独立 确定 所 有 这 三 个 途径 。 要 决定 该 
消除 哪 一 条 途径 是 很 困难 的 任务 ， 而 且 如 图 8.4 所 示 ， 当 或 者 包括 TCA 循环 ， 或 者 包括 乙 
醛 酸 循环 时 ， 两 种 情况 所 计算 出 的 通 量 分 布 可 能 完全 不 同 。 但 幸运 的 是 ， 这 些 途 径 很 少 同时 
192 


葡萄 糖 葡萄 糖 


100 100 


6 Ribu5P GoP }— 70 一 ~| RibusP 
94 + 
F6P FOP 


(a) (b) 


图 8.4 4A ARBRE (C.glutamicum) P, MAREE A 0.35 时 所 需 的 理论 通 量 分 布 
通 量 是 通过 使 用 Vallino and Stephanopoulos (1993) 的 化 学 计量 模型 而 计算 出 来 的 〈 见 10.1 节 ) 
磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 和 丙酮 酸 之 间 的 两 个 通 量 分 别 对 应 着 丙酮 酸 激酶 (a) 和 和 葡萄糖 PTS 运输 系统 (b) 催化 的 反应 
(a) TCA 循环 有 活性 而 乙 醛 酸 循环 无 活性 的 通 量 分 布 ; (b) 乙 醛 酸 循环 有 活性 而 TCA 循环 无 活性 的 通 量 分 布 
Ribu5P: 5- 磷 酸 核 酮 糖 

运行 ， 因 为 它们 的 酶 是 被 不 同 地 诱导 的 。 关 于 相应 酶 活性 的 诱导 和 调节 的 信息 对 于 在 一 组 环 
境 条 件 下 要 考虑 的 准确 途径 做 出 一 个 有 根据 的 决定 是 非常 关键 的 。 例 如 ， 在 很 多 微生物 中 蜡 
柠檬 酸 裂解 酶 〈( 乙 醛 酸 循环 的 第 一 个 酶 ) 的 表达 受 葡萄 糖 的 抑制 ， 以 致 乙 醛 酸 循环 的 可 能 性 
可 以 因 在 葡萄 糖 中 生长 而 被 消除 。 在 真 核 细胞 中 ， 乙 醛 酸 循环 没有 引起 线性 相关 性 ， 这 是 由 
于 不 同 反应 的 分 区 化 ， 即 TCA 循环 在 线粒体 中 运行 ， 而 乙 醛 酸 循环 或 者 在 胞 液 中 或 者 在 微 
体 中 进行 。 所 有 三 条 路 线 都 包括 在 Aiba 和 Matsuoka (1979) 的 分 析 中 ， 但 在 所 考虑 的 三 种 
模型 中 ， 在 每 一 模型 中 的 三 条 路 线 之 一 是 无 活性 的 。 在 例 8.2 对 Aiba 和 Matsuoka 的 模型 的 
处 理 中 ,已 把 所 有 三 条 途径 的 化 学 计量 式 包括 在 总 的 计量 和 矩阵 中 ， 但 在 求解 时 ， 则 把 这 些 途 
径 之 一 〈 用 乙 醛 酸 支 路 来 举例 说 明 ) 的 计量 式 收 集 在 子 和 矩阵 Gu 中 ， 因 为 这 个 通 量 被 设 定 为 
零 。 另 外 ， 应 该 从 网 络 中 消除 这 条 途径 的 反应 计量 式 ， 但 这 会 导致 同 解 。 

线性 相关 反应 的 另 一 个 例子 是 两 条 所 同化 路 线 : 谷 氨 酸 脱 氢 酶 反应 和 GS-GOGAT 系统 
( 见 2.4.1 节 )， 这 两 条 路 线 的 化 学 计量 式 是 


GDH: - a-ketoglutarate - NH; -NADPH+glutamate=0 (4) 
(a- 酮 成 二 酸 ) (FAR) 
GS-GOGAT: — a-ketoglutarate - NH; - NADPH — ATP + glutamate =0 (5) 


193 


可 见 ， 二 者 惟一 的 差别 在 于 ATP 用 于 GS-GOGAT 路 线 (其 是 高 亲和力 系统 ) 而 没 用 于 GDH 
反应 。 这 里 的 问题 是 ， 由 于 缺少 足够 的 有 关 所 有 ATP 消耗 反应 的 信息 ， 因 而 不 易 写 出 ATP 
平衡 。 在 二 者 之 间 以 缺乏 ATP 平衡 进行 区 分 ， 这 两 条 氮 同 化 反应 是 线性 相关 的 ， 因 此 是 不 
可 观测 的 。 因 为 这 两 条 路 线 之 间 的 惟一 差别 是 GS-GOGAT 系统 中 ATP 的 消耗 ， 两 条 路 线 
之 间 的 差别 可 能 是 不 重要 的 ， 因 此 ， 它 们 常 被 集 总 进化 学 反应 计量 模型 的 一 个 单个 反应 中 。 

可 能 导致 奇异 性 的 另 一 个 反应 是 NADH 与 NADPH 互相 转化 的 转氨酶 反应 [WX 
(2.4)j]。 在 该 反应 存在 时 ， 两 个 辅 因 子 的 平衡 式 是 耦合 的 ， 显 然 变 成 线性 相关 。 虽 然 报 道 转 
氢 酶 系 存在 于 很 多 生物 体 ， 但 是 在 正常 生长 条 件 下 这 些 酶 通常 不 是 非常 活 泌 的。 然而， 在 某 
些 条 件 下 已 对 它们 进行 了 分 析 (〈 见 10.1 节 )， 而 且 它 们 在 耗 散 大 量 NADPH 过 程 中 起 非常 
重要 的 作用 ， 而 这 些 NADPH 是 在 非常 高 的 成 糖 循环 活性 条 件 下 所 形成 的 。 在 此 ， 重 要 的 一 
点 是 能 通过 化 学 计量 平衡 式 缺 乏 一 致 性 而 发 现 转 氢 酶 活性 的 存在 , 这 也 是 MEFA 应 用 于 超 定 
系统 的 另 一 个 特征 。 

在 很 多 生物 中 存在 着 不 同 的 同 功 酶 ， 它 们 催化 相同 的 反应 但 利用 不 同 的 辅助 因子 。 一 个 
熟知 的 例子 就 是 谷 氢 酸 脱氧 酶 反应 ， 为 此 ， 很 多 细胞 有 两 种 同 功 酶 ， 一 种 连接 到 NADH fF 
为 辅助 因子 (叫做 GDH-NADH )， 另 一 种 连接 到 NADPH 作为 辅助 因子 (叫做 GDH- 
NADPH)。 如 果 这 两 种 酶 都 是 可 供 使 用 的 ， 它 们 将 都 充当 转氨酶 反应 而 导致 奇异 性 。 然 而 ， 
GDH-NADH 主要 参与 氨基 酸 分 解 代 谢 并 且 因此 受 葡 萄 糖 抑 制 ， 而 GDH-NADPH 主要 参与 
谷 氮 酸 合成 并 被 谷 氨 酸 抑制 。 取 决 于 微生物 生长 的 环境 条 件 ， 这 两 种 酶 之 一 因此 常 可 在 网 络 
表述 中 不 加 考虑 。 

如 果 在 化 学 反应 计量 矩阵 中 出 现 奇 异性 ， 人 们 有 如 下 两 种 选择 。 

(1) 借用 有 关 特 定 酶 调节 与 诱导 的 信息 ， 从 模型 中 去 除 线 性 相关 的 反应 。 

(2) 引入 附加 的 信息 ， 例 如 两 条 途径 的 相对 通 量 。 这 些 信息 可 以 从 酶 活性 的 测定 中 获 
得 ， 例 如 在 两 条 路 线 中 关键 酶 的 相对 活性 。 然 而 ， 这 种 方法 由 如 下 事实 而 受阻 : 体外 酶 活性 
的 测定 常 被 发 现 与 实际 的 体内 通 量 分 布 几乎 没有 显示 什么 关系 。 另 一 个 强 有 力 的 方法 是 标记 
底 物 的 应 用 ， 例 如 ，bB3C- 富 集 的 葡萄 糖 ， 接 着 进行 在 不 同 产物 中 2C 标记 分 布 的 NMR 测定 。 
这 种 方法 能 够 提供 关于 通过 线性 相关 途径 的 通 量 分 布 所 缺少 的 信息 〈 见 第 9 章 )。 


【 例 8.5】 乳酸 菌 的 异型 发 酵 代 谢 

乳酸 菌 通常 是 在 富 含 氨基 酸 (如 酵母 抽 提 物 BRAS) 的 复合 培养 基 上 生长 ,为 生 
化 合成 提供 碳 骨 架 。 因 此 在 合成 代谢 途径 中 没有 (或 极 少 ) 氧化 还 原 当 量 的 净 消 耗 。 这 导致 
在 从 能 源 〈 葡 萄 糖 或 乳糖 ) 到 初级 代谢 产物 〈 如 乳酸 、 乙 醇 、 乙 酸 、 甲 酸 和 CO.) 的 转化 过 
程 中 氧化 还 原 当 量 的 储备 。 乳 酸 菌 所 利用 的 分 解 代谢 途径 〈 见 图 8.5) 因此 与 乳酸 菌 的 生长 
是 解 耦 的 ， 因 此 可 以 单独 进行 分 析 。 因 为 菌 体 在 复杂 培养 上 生长 时 可 以 忽略 用 于 菌 体 生长 所 
消耗 的 前 体 代 谢 物 ， 故 EMP 途径 可 以 看 做 是 没有 分 支点 的 直线 途径 ， 以 致 从 葡萄 糖 到 丙酮 
酸 之 间 的 所 有 中 间 产 物 都 像 本 章 早 些 时 候 讨 论 的 那样 被 消除 。 在 好 的 生长 条 件 下 ， 一 些 乳 酸 
菌 仅 利用 从 葡萄 糖 到 乳酸 的 途径 ， 常 称 为 同型 发 酵 代 谢 ， 因 为 产生 单一 产物 。 此 时 氧化 还 原 
平衡 完全 闭合 ， 因 为 在 葡萄 糖 到 丙酮 酸 的 转化 中 生成 的 NADH 在 丙酮 酸 到 乳酸 的 转化 中 又 
被 再 生 。 然 而 ， 在 极端 饥饿 的 条 件 下 ， 细 胞 力求 从 分 解 代 谢 反 应 中 获得 更 多 ATP, 这 可 以 
通过 把 一 些 丙 酮 酸 引 向 乙酸 来 实现 。 但 在 这 种 情况 下 ， 导 致 氧化 还 原 不 平衡 ， 需 要 一 部 分 两 
酮 酸 被 引 向 乙醇 而 再 生 NAD* 。 因 此 ， 为 了 在 葡萄 糖分 解 代谢 途径 中 获得 更 多 ATP， 形 成 

194 


几 种 代谢 产物 ， 这 种 情况 下 的 代谢 被 称 为 异型 发 酵 


(REA BRE). eae 
丙酮 酸 显然 是 一 个 途径 分 支 节点 代谢 物 ， 因 此 ， wasn. 

Bee MUN LL OE, PEP RE 3 oa 

产物 的 转化 中 ， 包 括 三 种 其 它 中 间 代谢 物 : 乙酰 辅酶 sd - 

A, CRRBAIZR. Job, VAC REMME A 位 于 一 

个 分 支点 而 需要 考虑 。 最 后 ， 在 分 解 代谢 途径 中 氧化 [eol 

还 原 当量 的 储存 产生 一 个 附加 的 NADH 平衡 。 人 们 ZARA NADH 

也 可 以 建立 一 个 关于 NAD+ 的 平衡 ， 但 是 因 这 种 化 

合 物 总 是 连接 到 NADH, 这 样 的 平衡 与 NADH 平衡 OMAR oh cme 

会 是 线性 相关 的 ， 其 不 会 提供 更 多 的 信息 。 注 意 ， a4 [ 

ATP 的 平衡 也 可 以 建立 ， 但 因为 只 考虑 分 解 代谢 ， 

其 中 没有 ATP 消耗 ， 因 此 这 个 平衡 是 不 闭合 的 。 总 Ca 

之 ， 在 乳酸 途径 分 析 中 ， 涉 及 三 个 途径 代谢 物 〈 丙 本 ah Be aaa 


酸 、 乙 酰 辅酶 A 和 NADH)， 一 个 底 物 〈 葡 萄 糖 ) 和 五 个 代谢 产物 〈 乳 酸 、COz、 甲 酸 、 乙 
酸 和 乙醇 )。 根 据 一 般 式 (3.4)， 在 该 途径 中 所 考虑 的 六 个 反应 的 化 学 计量 式 可 表述 如 下 
(注意 : 署名 的 变量 ~ 表示 相应 代谢 物 的 胞 外 累积 速率 ， 同 时 因 所 有 的 通 量 都 能 直接 测量 ， 
”因此 用 比 速率 六 代替 胞 内 通 量 w )。 


| 一 


0 0 0 0 0);p, i 6.4 0 
0 10.00 Ol lp} fq1 0-1] iy. 0 
Rial Seigl®s 2°... Ol 4p, ale Nea ta (1) 
0 00°10 OL 0 
i 0001 0|\F« ee lo 
0 00/0 0 1)Pe 0-1 -2 0 


KP, Ptr lac 一 乳酸 ; for 一 甲酸 ; ac 一 乙酸 ; et 一 乙醇 ;》Pyr 一 丙酮 酸 ; AcCoA 一 乙酰 
辅酶 A。 

利用 式 (1) 的 化 学 反应 计量 关系 ， 并 对 三 个 胞 内 化 合 物 (丙酮 酸 ， 乙 酰 辅酶 A 和 
NADH) 应 用 拟 稳 态 假设 ， 可 得 如 下 的 线性 方程 : 


+ -1 -f oe 
0 tf t= (2) 
1 T fo 


上 述 方程 中 的 第 一 个 〈 对 应 于 矩阵 中 第 一 行 ) 是 丙酮 酸 平衡 ， 第 二 个 为 乙酰 辅酶 A 平 
衡 ， 最 后 一 个 是 NADH 平衡 。 注 意 到 ， 在 这 个 例子 中 ， 该 途径 中 的 所 有 通 量 ， 实 际 上 能 够 
直接 由 底 物 吸收 通 量 和 产物 分 沁 通 量 的 测量 来 确定 。 然 而 ， 这 是 一 个 相当 例外 的 情况 ， 正 如 
fil 8.3 所 说 明 的 ， 其 中 有 几 个 通 量 不 能 直接 观测 到 。 

在 这 条 途径 中 没有 线性 相关 的 反应 ， 这 可 通过 和 矩阵 G 的 秩 来 证 实 ， 因 为 已 求 出 它 的 秩 
为 3。 因 此 ， 可 以 找 出 一 组 三 个 已 测 的 速率 用 来 求解 未 知 的 速率 。 如 果 我 们 选择 这 三 个 已 测 

195 


速率 为 葡萄 糖 〈 从 中 py BBE A 2r gic), FLUBAM HR, ASK (8.8) 可 得 : 


0) (1-1 -1) frer -1 0 0)(r 
中 区 1] | | 于 ele (3) 
O) ln=4 OP 1 0 -2) lre 
最 后 一 个 矩阵 (GI) 有 一 个 不 等 于 零 的 行列 式 ， 因 此 对 它 求 逆 得 到 : 
r, -1 0. 0)-1(1-1 -1) (rey 
as -| a “| 0 0 Taare 
ret moms) (t-1° OA. 
1-1 -1) (rey, 
aati 
= 2 | | Tac (4) 


By 3a 
i~1 2 Y for 


可 以 观察 到 在 形成 2mol 甲酸 的 同时 会 得 到 lmol 乙酸 。 这 两 个 胞 外 代谢 物 生 成 速率 之 
间 的 固定 比例 可 以 通过 NADH 平衡 来 解释 : 当 乙酰 辅酶 A 与 甲酸 一 起 生成 时 ,每 生成 Imol 
乙酰 辅酶 A 就 必须 正好 再 生 lmol NAD* ( 即 ，EMP 途径 中 所 用 的 NAD‘), 因此， 来 自己 
酰 辅酶 A 的 通 量 在 乙醇 生成 〈 在 此 两 个 NAD+ 分 子 被 再 生 ) 和 乙酸 生成 之 间 平 均 分 配 。 类 
似 地 ， 如 果 没 有 甲酸 生成 ， 则 丙酮 酸 到 乙酰 辅酶 A 的 转化 仅 通过 丙酮 酸 脱 氢 酶 路 线 ,这 导致 
另外 的 NADH 产生 。 在 这 种 情况 下 ， 所 有 的 乙酰 辅酶 A 必须 被 引 向 乙醇 , 在 这 里 所 需 的 
NAD+ 被 再 生 。 

根据 前 面 已 测 的 葡萄 糖 (等 于 丙酮 酸 速 率 的 12)、 乳 酸 和 甲酸 的 速率 ， 在 确定 式 (4) 
的 通 量 时 不 存在 困难 。 然 而 ， 如 果 选 择 葡萄 糖 、 乙 酸 和 甲酸 进行 测量 ， 则 有 : 
—L =i 0 
(过 | 二 过 
一 
换 句 话说 ， 上 述 测量 不 能 用 来 惟一 地 计算 剩 下 的 三 个 未 知 途径 通 量 ， 即 乳酸 、CO， 和 乙醇 的 
通 量 。 原 因 自 然 是 用 甲酸 、 乙 酸 作为 仅 有 的 代谢 产物 的 测量 时 ， 没 有 关于 NADH 消耗 速率 
的 信息 ( 通 量 rw、r。 或 re 中 的 一 个 必须 被 测量 ) 而 NADH 平衡 是 没有 用 的 。 因 此 ， 甲 酸 
和 乙酸 的 通 量 的 测定 没有 提供 附加 的 信息 ， 因 为 一 个 可 以 从 另 一 个 确定 。 注 意 到 ， 没 有 必要 
去 计算 行列 式 的 值 〈 即 使 利用 商业 数学 软件 包 这 很 容易 做 ) ， 因 为 很 容易 观察 到 最 后 一 行 可 
以 被 写成 : 行 3= 行 1+2 ( 行 2)。 


det(G!) = =(0) (5) 


8.2 超 定 系统 


在 8.1 节 ， 对 完全 确定 性 系统 我 们 发 展 了 通 量 分 析 的 方法 。 然 而 ， 常 常 有 这 样 的 情况 ， 
多 于 系统 自由 度 的 通 量 测量 是 可 以 利用 的 。 这 就 自然 产生 了 超 定 系统 ， 在 该 系统 中 ， 类 似 于 
4.4 节 对 黑箱 模型 的 处 理 ， 利 用 宛 余 变 不 仅 能 计算 未 测 通 量 的 更 好 的 估计 值 ， 也 能 计算 已 测 
量 通 量 的 更 好 的 估计 值 。 此 外 ， 用 超 定 系统 有 可 能 对 胞 内 代谢 物 验 证 稳 态 假设 的 有 效 性 。 


在 超 定 系统 情况 下 ， 式 〈8.8) 中 的 和 矩阵 Ge 是 非 方 形 和 矩阵 ， 因 此 不 能 求 递 ， 通 过 利用 其 ， 


Moore-Perose 拟 - 逆 和 矩阵 〈 见 4.4 节 )， 可 得 一 个 简单 解 : 
196 


vs WG?) Fb (8.9) 
Ht, (GT)? EG! Hw wee 
(GS)4 = (G:C) 1G, (8.10) 


式 (8.9) SRA, REAM GG: BARA RS, RS Ge 是 满 秩 时 所 满足 的 
一 个 条 件 。 这 样 ， 对 一 个 超 定 系统 的 解 的 要 求 与 对 确定 性 系统 的 要 求 是 一 样 的 。 对 于 一 个 方 
形 和 矩阵 ， 其 拟 - 逆 和 矩阵 同 它 的 逆 和 矩阵 是 一 样 的 ， 当 测 量 数目 大 于 或 等 于 系统 自由 度 时 ， 式 
(8.9) 是 式 (8.7) 的 通 解 。 

当 测 量 中 噪声 很 小 时 式 (8.9) 是 非常 有 用 的 。 它 代表 对 非 测量 通 量 在 如 下 假设 下 的 最 
小 二 乘 估计 ， 该 假设 是 : 由 测量 噪声 所 引起 的 约束 残 差 被 均匀 分 布 于 系统 的 约束 〈 即 胞 内 代 
谢 物 的 拟 稳 态 平衡 ) 当中 。 然 而 ， 如 果 显 著 的 噪声 存在 于 仅仅 一 些 已 测 通 量 中 ， 式 (8.9) 
的 解 不 满足 围绕 某 些 网 络 节点 的 通 量 守恒 ， 这 意味 着 流 进 该 节点 的 通 量 之 和 与 流出 该 节点 的 
通 量 之 和 不 相等 。 在 研究 通 量 分 布 中 这 显然 是 有 问题 的 ， 因 此 我 们 期 望 识别 通 量 测量 中 所 包 
含 的 过 失误 差 〈 其 类 似 于 4.4 节 中 黑箱 的 处 理 )。 因 为 式 〈8.7) 类 似 于 由 式 〈4.10) 给 出 的 
元 素平 衡 式 ， 因 此 4.4 节 的 分 析 完 全 可 用 在 这 里 。 首 先 计算 元 余 矩 阵 : 


R=G,-G.G*G,, (8.11) 


由 此 可 确定 简化 的 元 余 和 矩阵 ， 其 被 用 于 类 似 于 式 (4.15) 一 式 (4.17) 所 概述 的 计算 中 ， 例 
4.6 对 此 已 经 前 述 。 

一 个 稍微 不 同 的 程序 [由 Tsai 和 Lee (1988) 给 出 】 可 对 未 测量 的 和 已 测量 的 通 量 二 
者 提供 更 好 的 估计 。 为 此 目的 ， 式 (8.7) 被 重新 构成 以 解释 : 


国人 
本 is be 

式 中 , 工 是 单位 矩阵 , 它 的 维 数 等 于 已 测 通 量 的 个 数 。 式 (8.12) 中 第 一 行 简单 地 规定 
w= ww, 然 而 第 二 行 等 同 于 式 (8.7)。 文 献 中 大 多 数 代谢 模型 有 或 能 很 容易 简化 为 式 (8.12) 
的 形式 。 在 这 种 形式 中 , 式 (8.12) 在 所 计算 的 通 量 向 量 w 和 已 测量 的 通 量 向 量 w, 之 间 引 人 
严格 的 分 离 ,而 且 通 过 测量 噪声 的 消除 不 允许 对 所 测量 的 通 量 有 任何 改进 。 这 可 通过 通 量 向 
量 更 一 般 的 分 配 来 完成 ,由 此 ,已 测量 的 和 未 测量 的 通 量 不 被 分 离 : 


Vin bi Ti a 
0} V2 


ai Ta (Ee 
LAABWA_TREMRARBARAD ES. BRT) ATpwH eee he, IF 
BG! OG) 8.6 中 所 述 。 可 选择 向 量 vv 和 v 分 别 等 于 v。 Aly. (此 情况 下 该 方法 等 同 于 先前 的 
FE), MAAR, ABE Tf RMU EW vi 表示 的 向 量 v 的 解 : 


=Tv (8.12) 


(8.13) 


v2 = —Ty'Tavi (8.14) 
当 将 这 个 方程 代入 式 (8.13), 在 已 测量 的 速率 vm 与 vi 的 元 素 之 间 的 关系 得 出 如 下 : 
Vm = TY} (8.15) 
其 中 , T, 由 下 式 给 出 
T=Tui-TizT2lT21 (8.16) 


197 


: 


式 (8.15) 表示 一 个 超 定 系 统 ， 就 像 原始 的 平衡 方程 一 样 。 而 且 ， 如 果 测 量 误 差 以 正 态 
分 布 且 平均 值 为 零 及 方差 - 协 方差 矩阵 等 于 下 ， 于 是 对 vi 的 元 素 的 最 大 似 然 估 计 由 Madron 
等 (1977) 给 出 如 下 : 

VI=(TIRT ED)-ITIP=Lv (8.17) 

AH, vy kA“ “人 ” 符 号 表示 对 于 正 态 分 布 的 测量 误差 相应 量 的 最 好 估计 。 通 过 把 式 
(8.17) 代入 式 (8.14) 可 得 v HICK AIHA, vo 为 : 


4 
: 


| 


WE 一 TIT2ivi (8.18) | 


式 (8.17) 和 式 (8.18) 给 出 该 代谢 模型 中 所 有 通 量 的 最 好 估计 , 即 : 那些 已 测量 的 通 
量 和 未 测量 的 通 量 。 通 常 不 易 得 到 方差 与 协 方差 的 信息 ， 但 如 果 在 已 测量 的 通 量 中 的 误差 具 
有 相同 的 数量 级 并 且 是 不 相关 的 ， 人 们 就 可 对 vi 的 元 素 利 用 最 小 二 乘 估计 : 


Vi 7 (T/T,) ? Pity, (8 ° 19) : 


【 例 8.6】 超 定 系统 的 通 量 确定 


现在 回 到 在 例 8.5 中 处 理 的 乳酸 菌 的 异型 发 酵 代 谢 ， 并 且 考 虑 四 个 速率 已 被 测量 的 情 
况 ， 因 此 产生 一 个 超 定 系 统 。 如 果 丙 酮 酸 的 生产 速率 (等 于 2raske)、 乳 酸 生产 速率 (rac). | 


甲酸 生产 速率 (rie) 和 乙醇 生产 速率 (ra) 的 测量 都 是 可 利用 的 ， 则 式 (8.7) 变 为 : 


l Pyr 

0 ii -Tw =H 0 
T lac Te 

C7=(0 0 Lz 于 | | (1) 
T for Tac 

0 1 _ OrZ 1 0) 


Tet 


其 中 第 一 行 是 对 丙酮 酸 的 平衡 ， 第 二 行 是 对 乙酰 辅酶 A 的 平衡 ， 最 后 一 行 是 对 NADH 的 平 


衡 。 再 次 说 明 ， 署 名 的 变量 ~ 已 经 引入 以 表示 相应 代谢 物 的 胞 外 累积 速率 。 现 在 利用 式 
(8.9) 的 简单 方法 和 基于 式 (8.12) 和 式 (8.13) 的 程序 对 这 两 种 情况 对 未 测量 的 速率 进行 
最 小 二 乘 估 计 计 算 。 

首先 从 式 (8.10) 计算 矩阵 GL 的 Moor-penrose 拟 - 逆 矩阵: 


一 1 =! 
Sere | “1 11) (205 eae 
CE 
(Ge) ( Hl 0-10 ~0.5-1 0.5 (2) 
0 
然后 从 式 (8.9) 对 未 测量 的 速率 进行 求解 : 

r r  & r 

a 7 730 -0.5°-% 7 

Te 7 和 帮 二 。 T lac | = ris 
| 区 | = 人。 0 0.5 3 | (3) 

Tac . . J 0 = T for . T for 

Tet T et 


这 个 解 与 例 8.3 中 对 确定 性 系统 所 求 出 的 解 是 一 致 的 ， 即 : 如 果 没 有 测量 误差 ， 则 上 述 解 与 
例 8.3 中 求 出 的 解 相 同 [尝试 将 由 例 8.5 的 式 (4) 所 得 的 re 表达 式 代 人 上 述 式 中 ， 将 求 得 
的 or. 和 rs 的 表达 式 与 例 8.5 中 的 那些 表达 式 进行 比较 ]。 由 式 〈3) 看 到 对 未 测量 通 量 的 估 
计 与 丙酮 酸 通 量 和 乳酸 的 积累 速率 的 测量 无 关 。 
为 了 改进 遵从 Tsai 和 Lee (1988) 的 方法 所 得 的 未 测量 的 和 已 测量 的 代谢 物 通 量 的 佑 
计 ， 以 式 (8.12) 所 表示 的 形式 改写 式 1) 为 : 
198 


rp] (1 0 0; 0 O 0),, 
: Pyr 

T lac 0 1 0: 0 0 0 ri 

Pe] «FORT Qzolgaogidag? lg eae 

PAD i S8s SOI he (4) 

0 rE rweoer Ol) 

0 Te 2 eal it as 

0 f Sp AE 49) P= 


其 中 虚线 表示 出 矩阵 了 的 分 解 。 注 意 化 学 反应 计量 矩阵 GI (最 后 三 行 )、4Xx4 单位 矩阵 和 零 矩 
阵 的 出 现 。 上 面 的 方程 这 样 写 以 致 w 仅 由 已 测定 的 通 量 组 成 ， 但 这 不 必 一 定 要 这 样 。 未 测量 
的 速率 能 与 已 测定 的 速率 一 起 完全 包含 在 vi 中 。 利 用 所 表示 的 矩阵 求 出 : 


:.. 0) 3 »D 0. 8 Ne > 0 0 
0-1 0) ~!f1-1 -1 
or 71.-9 0 0 0 Oo 1 0 
T,= 二 -1 4-2 040 i1)/= (5) 
三 
0 0 0 | i 5 
从 而 给 出 : 
加 l Pyr 
l Pyr 9 4 = 4 * 
Vi 三 rik =% 4 Dee As (6) 
7 for 2-2 12 -2)| ™ 
Tet 
和 
T Pyr 
Tet 4-4 +2 9 
A A 1 VT lac 
V2 r. |=~.|3- 2 =o (7) 
4 13 T for 
oe 11 MeRST 


其 中 方程 右边 的 速率 向 量 表示 相应 代谢 物 通 量 的 测定 值 。 还 注意 到 这 个 解 与 例 8.3 中 确定 性 
系统 的 解 是 一 致 的 【再 尝试 将 由 例 8.5 的 式 (4) 中 对 re 的 表达 式 代 人 上 式 ， 并 将 得 到 的 ~。 
和 rase 表 达 式 与 上 述 方程 得 出 的 结果 相 比 ]。 然 而 ， 在 这 里 在 任何 已 测量 速率 中 的 测量 噪声 的 
存在 会 影响 对 已 测 的 和 未 测 的 速率 的 最 小 二 乘 的 最 佳 估 计 。 因 此 ， 丙 酮 酸 通 量 的 估计 是 所 有 
四 个 已 测速 率 的 函数 。 


在 上 述 估 计 程 序 中 ， 间 接 假定 稳 态 假设 完全 满足 并 且 噪 声 仅 分 布 在 已 测量 的 通 量 中 。 如 
果 在 拟 稳 态 方程 中 也 存在 噪声 (意味 着 相应 代谢 物 的 小 的 积累 是 可 能 的 )， 则 式 〈8.12) 仍 
然 形成 胞 内 通 量 估计 的 基础 ， 但 直接 得 出 该 解 为 : 


b Vin 
v= (T'F-'T)-'T'F? i | (8.20) 


其 中 ,FF 是 针对 已 测量 的 通 量 和 拟 稳 态 假设 二 者 的 残 差 的 方差 - 协 方差 矩阵 。 还 有 ， 如 果品 
声 具 有 相同 的 数量 级 ， 则 由 式 (8.21) 所 给 出 的 最 小 二 乘 估计 可 以 应 用 : 


v=(T'T) ‘T° 


‘| 
0 (8.21) 


199 


一 般 说 来 最 好 使 用 假定 噪声 仅 分 布 于 所 测量 的 速率 这 样 的 程序 步骤 ， 但 是 由 于 式 (8.21) 的 
简单 结构 因而 常常 用 于 代谢 物 通 量 的 计算 。 然 而 ， 人 们 可 以 利用 式 〈8.20) 并 且 对 拟 稳 态 假 
设 规定 非常 低 的 方差 (Vallino and Stephanopoulos，1993) ， 因 为 这 将 给 出 等 同 于 用 先前 描 
述 的 程序 所 得 出 的 估计 〈 见 例 8.7)。 


【 例 8.7】 超 定 系统 的 分 析 
现在 我 们 再 次 回 到 在 例 8.5 和 例 8.6 所 处 理 的 乳酸 菌 的 异型 发 酵 代谢 并 用 式 〈8.20) 和 
式 〈《8.21) 对 胞 内 通 量 计算 估计 。 首 先 ， 假 定 没有 协 方差 而 且 在 所 测定 的 通 量 中 的 方差 是 相 
同 的 〈 任 意 设 为 1)。 拟 稳 态 假设 的 方差 由 一 个 非常 小 的 值 (10 ?) 给 出 , 实际 上 相当 于 没有 
噪声 。 用 式 〈8.20)， 得 出 : 


I Pyr 9. 41m | Big 21) 8 ee 

rac 人 

Hen LG .1 darth AB 2 eR Ol oe 

Feet) lao Oe yee © 
7d hese ss | 1, ee ee 

a il <6 le? Hlal © : 


这 些 估计 值 都 等 于 在 例 8.6 中 从 式 (6) 和 式 (7) 中 得 出 的 值 (注意 矩阵 中 仅仅 虚线 左边 的 元 
素 是 重要 的 ， 因 为 虚线 右边 的 元 素 都 与 零 向 量 相 乘 )。 相 反 ， 如 果 直 接 用 式 (8.21)， 求 出 估 
计 值 由 下 式 给 出 : 


Y Pyr 


rpyr Wed e Oke 2 oh 
T lac 4idi <2 -432.) 0 -2 


Tlac 


Y for 


fee eos : 2 
STE Ee EE i 6 Gey RW 人 
a 3-3 -9 12:-9 0 5 
2 Pin 7 (Oy Redige 2 fH ih HHP 
at 
0 
它 非常 不 同 于 式 (1) 的 估计 。 


与 4.4 节 中 对 超 定 黑箱 模型 的 分 析 相 类 似 ， 如 果 所 测量 的 速率 的 数目 大 于 下 +1, 那么 
就 也 有 可 能 利用 测量 宛 余 度 并 结合 代谢 模型 以 进行 误差 诊断 。 如 果 假 定 拟 稳 态 假设 是 正确 
的 ， 则 这 种 误差 诊断 是 基于 式 (8.11) 的 简化 的 宛 余 矩 阵 (R,), 04.4 节 一 样 ， 检 验 函 数 
岂可 以 从 下 式 计算 : 


h=e'P le (8.22) 
其 中 卫 根据 式 (4.22) 计算 出 ， 而 e BRAM aH A PAA: 
E > RVn (8.23) 


iB h 与 4.4 节 所 述 的 X 分 布 的 比较 可 以 识别 在 一 定 置信 度 下 的 过 失 测 量 误差 。 

通过 一 次 消除 一 个 测量 并 接着 计算 所 产生 的 检验 函数 ， 就 有 可 能 识别 过 失 测 量 误差 的 来 源 。 

如 果 存 在 着 一 个 或 多 个 拟 稳 态 假设 被 违背 的 迹象 ， 仍 可 以 进行 误差 诊断 以 验证 这 些 假设 的 一 
200 


致 性 。 这 里 ， 式 (8.12) 是 分 析 的 基础 ， 而 且 ， 除 了 通 量 测 量 外 ， 拟 稳 态 假设 也 可 一 次 消除 
二 个 ， 每 次 之 后 计算 新 的 吉 余 矩阵 、 新 的 检验 函数 六 [ 式 (8.22)] 和 一 个 对 六 分 布 的 类 似 
比较 。 

根据 化 学 反应 计量 学 的 Gibbs 规则 ， 在 一 个 代谢 模型 中 的 自由 度 总 是 小 于 或 等 于 在 黑箱 
模型 中 的 自由 度 (Nielse and Viladsen ，1994) 。 因 此 ， 利 用 代谢 模型 对 过 失 测量 误 差 和 误差 
诊断 的 识别 应 当 是 很 有 吸引 力 的 ， 因 为 这 种 分 析 只 需 较 少 的 测量 即 可 。 然 而 ， 对 于 简单 代谢 
模型 ， 其 自由 度 通常 与 代表 该 系统 的 黑箱 模型 的 自由 度 相 同 [在 例 8.3 中 的 乳酸 模型 中 有 3 
个 自由 度 ， 具 有 六 种 代谢 物 和 三 种 元 素 (C、H、O)， 这 个 系统 的 黑箱 模型 的 自由 度 也 为 
3]， 而 对 于 更 复杂 的 模型 ， 作 为 大 的 化 学 反应 计量 矩阵 的 结果 ， 这 种 分 析 可 能 变 得 非常 烦 
琐 。 因 此 ， 误 差 诊断 将 优先 使 用 黑箱 模型 来 进行 ， 并 且 ， 可 疑 的 测量 被 识别 并 改正 之 后 ， 该 
组 改进 了 的 速率 估计 值 就 可 用 以 计算 代谢 通 量 的 更 好 的 估计 值 。 


8.3 不 定 系统 -线性 规划 


如 果 已 测量 的 通 量 的 个 数 小 于 系统 的 自由 度 ， 则 对 网 络 通 量 存 在 无 数 个 解 。 在 这 种 情况 
下 ， 倘 若 能 够 规定 一 个 合适 的 目标 函数 〈 例 如 ， 使 细胞 比 生长 速率 最 大 这 样 的 目标 函数 )， 
那么 就 能 利用 线性 规划 来 确定 胞 内 通 量 分 布 。 用 这 种 方法 ， 通 过 优化 以 代谢 物 平 衡 的 约 东 为 
条 件 的 目标 函数 ， 就 有 可 能 得 到 胞 内 通 量 的 一 个 惟一 解 。 在 举例 说 明 这 种 方法 在 细胞 系统 研 
究 的 用 途 之 前 ， 我 们 利用 一 个 非常 简单 的 例子 〈 其 对 线性 规划 问题 的 本 质 提 供 一 个 有 用 的 洞 
察 力 ) 来 介绍 该 方法 的 基本 描述 。 

考虑 一 个 具有 两 个 变量 x My 的 系统 ， 其 通过 如 下 约束 所 关联 : 

2xz+y=4 
其 给 定 上 式 的 解 落 在 直线 AB 上 (WA 8.6). 
了 式 (8.24) 之 外 ， 为 所 有 的 线性 规划 问题 所 共 
有 的 另 一 个 约束 是 所 有 的 变量 〈 此 例 中 即 zx My) 4 
都 需要 是 非 负 的 。 这 就 违背 了 我 们 对 代谢 通 量 的 
定义 : 其 可 正 可 负 。 因 此 ， 线 性 规划 对 解决 代谢 3 
通 量 平衡 的 应 用 需要 扩展 通常 的 代谢 模型 ， 以 包 


(8.24) 


SS 2x+3y¥=12 


括 该 模型 J 个 反应 中 每 个 反应 的 正 向 或 逆向 通 量 
或 至 少 可 能 是 可 逆 的 那些 反应 的 通 量 。 用 约束 条 
件 z>0、y>0， 因 此 ， 上 述 问题 的 解 被 限定 在 
(z，y) 空间 的 正 象限 中 。 这 仍 表 示 有 无 数 个 解 ， 
通过 施加 让 问题 的 解 能 最 大 化 或 最 小 化 某 一 成 本 
《或 目标 ) 函数 这 样 的 要 求 ， 可 以 将 无 数 个 解 进 一 
步 减少 到 一 个 解 。 例 如 ， 如 果 想 最 大 化 上 例 中 的 
目标 函数 2z + 3y， 问 题 是 要 求 出 一 个 解 ， 这 个 解 
落 在 直线 AB 上 ， 而 同时 又 能 最 大 化 该 目标 函数 。 
图 8.6 显示 了 一 族 成 本 线 。 这 条 线 能 得 出 目标 函 


SS 
2x+y=4 a 
AS 


™ 
SN 2 oy =6 
B 


1 2 3 4 


图 8.6 线性 规划 的 图 解 
可 行 解 限 制 在 非 负 象限 中 AB 直线 上 。 目 标 函 
数 由 一 组 平行 线 组 成 〈 图 中 三 条 虚线 所 示 )。 最 大 
化 目标 函数 的 线 与 直线 AB 交 于 点 (2, y)= 
《0，4) ， 该 点 为 此 最 优化 问题 的 解 


数 的 最 大 值 而 同时 满足 由 2z + 3y = 12 给 出 的 约束 条 件 。 该 线 与 直线 AB 相交 于 过 =0 及 
y=4。 在 这 个 例子 中 可 以 得 到 一 个 可 行 的 解 ， 但 是 人 们 也 可 遇 到 没有 可 行 解 或 有 无 穷 多 个 
解 的 情况 [在 上 述 例子 中 ， 如 果 目 标 函 数 与 式 (8.24) 相同 或 是 它 的 倍数 ]。 


201 


现在 返回 到 我 们 的 代谢 模型 ， 其 约束 条 件 由 式 (8.7) 给 出 。 因 为 在 线性 规划 公式 表示 
中 所 有 的 变量 〈 即 通 量 ) 都 必须 是 正 的 ， 因 此 我 们 这 样 改写 模型 以 使 其 化 学 反应 计量 式 中 包 
含 正 向 反应 和 逆向 反应 〈 在 那些 包含 可 逆向 反应 的 情况 下 )。 因 此 ， 该 约束 条 件 可 概括 为 : 
0 (8.25) 
At, GLEE HNkAR MT SERV AS EAM ARMA RMI, TH ve 
相应 修改 后 的 通 量 向 量 ， 维 数 为 Js。 在 上 述 简 单 例子 中 ， 该 约束 确定 了 二 维 空间 中 的 一 条 
直线 。 具 有 Je 个 变量 (或 通 量 ) ， 则 每 个 约束 是 Je. 维 空间 中 的 一 个 超 平面 。 因 为 必须 满足 
所 有 的 约束 ， 式 (8.25) 确定 一 个 解 必 须 落 在 这 个 Je. 维 空间 中 开 个 超 平面 的 交集 上 。 如 果 
有 一 个 超 平 面 不 与 其 它 超 平 面相 交 ， 则 对 于 这 个 通 量 的 可 行 解 不 存在 (也 就 是 说 在 这 种 情况 
下 这 组 可 行 的 解 都 是 空 的 )。 然 而 ， 这 种 情况 在 实际 中 很 少 遇 到 。 下 一 步 是 要 确定 一 个 目标 
图 数 ， 其 是 这 些 通 量 的 线性 函数 ， 即 向 量 vex 的 元 素 的 函数 。 通 过 求解 相应 的 最 大 化 或 最 小 
化 问题 ， 即 可 求 得 最 优 解 。 
min(avex) 或 max(avex)， 服 从 式 (8.25) HAR (8.26) 


上 式 表示 对 avex 求 最 小 值 或 最 大 值 ， 其 中 ，a 是 包含 各 个 单个 变量 权重 的 行 向 量 ， 这 些 单个 


变量 表示 各 个 单个 通 量 对 目标 函数 的 影响 。 

ARK (8.26) 问题 的 最 优 解 可 能 是 很 复杂 的 ， 因 为 潜在 的 大 量 可 行 解 满足 所 有 约束 。 然 
而 ， 正 如 上 述 简单 的 例子 一 样 ， 最 优 解 位 于 一 组 可 行 解 的 末端 AL, ARAB eR 
者 线性 的 结果 )。 因 此 ， 通 过 首先 列举 出 所 有 解 角 (solution corners)， 然 后 在 可 行 解 空间 的 
每 一 点 评价 该 目标 函数 ， 则 会 〈 在 原理 上 ) 找到 最 优 解 。 但 是 由 于 解 角 的 数目 非常 大 ， 这 个 


方法 实际 上 是 不 可 行 的 。 蔡 代 地 ， 应 用 所 谓 单纯 形 法 《Dantzig，1963) ， 其 是 为 解决 约束 线 二 


性 优化 问题 精 选 的 方法 (Gyr，1978)。 这 种 方法 应 用 如 下 : 首先 ， 确 定 可 行 组 的 一 个 角 ， 
然后 沿 着 可 行 解 的 边缘 从 一 个 角 到 另 一 个 角 继 续 进 行 。 在 一 个 给 定 的 角 ， 有 几 条 边缘 可 供 选 


择 ， 一 些 引 离 最 优 解 ， 其 它 的 逐渐 引 向 最 优 解 。 在 单纯 形 法 中 ， 沿 着 确保 目标 郴 数 减 小 或， 


增加 ) 的 边缘 移动 。 这 条 边 导 向 具有 更 低 RES) 数值 的 一 个 新 的 角 ， 且 没有 可 能 性 返回 
到 任何 一 个 角 ， 其 产生 一 个 更 高 (或 更 低 ) 的 目标 函数 值 。 最 终 ， 可 以 达到 一 个 特定 的 中 ， 
从 该 和 角 ， 所 有 的 边 都 导致 更 高 的 目标 函数 值 ， 而 且 ， 这 个 角 就 代表 最 优 解 。 尽 管 它 的 简单 描 
述 ， 这 种 单纯 形 法 执行 起 来 相当 复杂 ， 但 是 已 开发 出 强健 的 算法 [Gyr (1978)]， 而 且 在 几 
个 软件 包 中 是 可 以 得 到 的 ， 例 如 Mathematica 和 Matlab。 


【 例 8.8】 大 肠 杆 菌 代 谢 的 化 学 计量 解释 

对 几 种 代谢 模型 ， 利 用 线性 规划 已 经 得 到 其 最 优 通 量 分 布 。 在 这 个 例子 中 将 考虑 大 肠 杆 
菌 代 谢 的 分 析 (Varma et al, 1993a, b). HEF E.coli 代谢 的 详细 化 学 计量 模型 ， 他 们 分 析 
了 这 个 微生物 的 葡萄 糖分 解 代谢 和 生物 化 学 的 生产 能 力 。 他 们 的 模型 由 107 个 代谢 物 (包括 
底 物 和 代谢 产物 ) MOS 个 可 逆反 应 组 成 ， 而 且 因 为 每 个 反应 都 被 包含 正和 逆 两 个 方向 ， 这 
就 产生 一 个 107x 190 的 化 学 计量 矩阵 ， 即 有 83 个 自由 度 。 没 有 一 个 通 量 被 测量 ， 但 用 了 一 
MAE 〈 葡 萄 糖 比 吸 收 速率 ) 来 度量 这 些 通 量 值 ， 以 使 它们 的 单位 均 为 mmol:g 1!( 于 重 ) 
“1。 用 于 通 量 计算 的 仅 有 的 实验 数据 如 下 : 

e@ 菌 体 生 长 的 代谢 需求 被 用 来 计算 生物 量 合成 所 消耗 的 代谢 物 量 。 事 实 上 ， 代 谢 物 的 消 
耗 量 是 作为 导致 生物 量 合 成 的 一 个 反应 中 的 计量 系数 而 被 包括 的 。 

202 


| 
站 
| ee 用 于 维持 ATP 的 需求 。 通 过 不 同比 
生长 速率 下 葡萄 糖 的 比 吸收 速率 对 实验 数据 
的 拟 合 ， 分 别 估算 出 对 与 生长 相关 及 与 生长 
无 关 的 维持 需求 量 是 23mmol:g !(+#): 
h-'#15.87mmol:g !(FH#):h', MH 
被 用 于 计算 中 。 

@ 氧 的 最 大 比 吸收 速率 为 20mmol'g-1i 
(FH). as 

目标 函数 是 比 生 长 速率 最 大 。 因 此 ， 如 
果 葡 萄 糖 比 吸收 速率 已 经 给 出 ， 那么 该 模型 比 生长 速率 /h-: 

就 决定 着 相应 的 最 大 比 生长 速率 以 及 网 络 中 ”图 8.7 葡萄 糖 和 氧 的 比 吸收 速率 和 乙酸 、 甲 酸 、 
的 所 有 通 量 。 所 选择 的 网 络 通 量 可 以 对 相应 乙醇 的 比 生成 速率 与 比 生长 速率 的 函数 关系 

的 比 生 长 速率 作 图 ， 如 图 8.7 所 示 。 从 中 看 比 生 长 速率 是 利用 线性 规划 通过 下 .coli 

al, 在 葡萄 糖 比 吸 收 速率 比 较 低 时 (相应 于 代谢 模型 的 比 生长 速率 最 大 化 而 计算 出 的 

夏 的 比 生 长 速率 )， 没 有 副 产 物 生成 , 即 ， 处 于 完全 呼吸 。 结 果 ， 在 这 个 范围 氧 的 比 吸收 速 
率 随 比 生长 速率 线性 增加 (3.4 节 )。 当 葡萄 糖 比 吸收 速率 达到 8mmol:g '(FH)-h ' Bt 
(相应 的 比 生长 速率 为 0.9h-1)， 从 葡萄 糖 完全 氧化 为 CO. 的 氧 需求 量 超 过 规定 的 最 大 值 
20mmol.g- !( 干 重 )"h- 1。 因 此 ， 细 胞 转换 到 呼吸 和 发 酵 同 时 进行 的 混合 代谢 。 所 分 沁 的 第 
三 个 发 酵 代 谢 物 是 乙酸 ， 而 在 更 高 的 糖 酵 解 通 量 (或 更 高 的 比 生长 速率 ) 下 ， 也 分 沁 甲 酸 。 
最 后 ， 在 非常 高 的 糖 酵 解 通 量 下 ， 乙 醇 也 被 分 泌 了 。 有 趣 的 是 ， 这 个 模型 预测 了 代谢 物 分 泌 
的 正确 次 序 ， 即 ， 首 先是 乙酸 ， 然 后 是 甲酸 ， 最 后 是 乙醇 ， 其 与 实验 结果 一 致 。Vama 等 
(1993a) 将 之 解释 为 乙酸 所 含 的 能 量 较 低 的 结果 (CRAIN ATP 得 率 低 于 甲酸 和 乙醇 氧 
化 的 ATP 得 率 )。 

对 于 氧 的 最 大 比 吸收 速率 低 于 20mmol.g-!( 于 重 ).h- 1 (其 可 能 是 生物 反应 器 供 氧 限制 
WAR) 的 情况 下 ， 计 算 了 临界 糖 酵 解 通 量 (或 比 生长 速率 )。 结 果 发 现 这 些 通 量 值 与 对 细 
胞 的 氧 供给 之 间 是 一 种 线性 关系 。 

线性 规划 的 优点 是 通过 计算 目标 函数 Z 相应 于 系统 变量 的 敏感 度 就 能 够 获得 更 多 的 信 
息 。 这 些 敏 感度 被 称 之 为 影子 价格 (shadow prices), Xf E.coli 代谢 模型 ， 其 由 下 式 给 出 : 


pee: 


式 中 ， 交 是 第 ; 个 化 合 物 〈 例 如 氧 、 乙 酸 或 者 一 种 氨基 酸 ) 的 净 比 消耗 速率 。 因 此 ， 影 
隆 价格 反映 了 代谢 速率 的 变化 对 比 生长 速率 的 影响 。 表 8.2 给 出 了 对 不 同 的 氧 比 吸收 速率 
(ro) 下 由 代谢 模型 计算 的 一 些 影子 价格 。 当 ~。 较 低 时 ， 对 氧 的 影子 价格 为 正 ， 即 ， 提 高 
ro 会 使 比 生 长 速率 增加 。 当 r。 达 最 大 值 时 ， 提 高 ~。 不 能 使 比 生 长 速率 进一步 增加 ， 因 此 
影子 价格 为 零 。 在 厌 氧 条 件 下 (ro=0)，NADH 的 影子 价格 为 负 ， 这 是 由 于 不 能 氧化 这 个 辅 
助 因子 ， 即 ， 如 果 NADH 的 产量 增加 ， 则 比 生长 速率 将 下 降 。 这 表明 在 厌 氧 条 件 下 辅助 因 
子 再 生 可 以 限制 生长 。 对 于 ATP， 发 现在 厌 氧 条 件 下 影子 价格 是 高 的 ， 并 且 随 ~。 的 增加 而 
wi). Ak, 与 厌 氧 生长 相 比 ，ATP 对 生长 的 供给 对 细胞 好 氧 生长 变 得 不 太 限 制 了 。 所 有 
这 些 代 谢 物 的 影子 价格 都 随 着 >。 的 增加 而 增加 ,因为 在 好 氧 条 件 下 这 些 化 合 物 能 被 细胞 氧 
化 并 提供 菌 体 生 长 所 需 的 额外 ATP。 有 趣 地 注意 到 ， 在 厌 氧 条 件 中 ， 琥 珀 酸 的 影子 价格 高 

203 


比 速率 / mmolg ( 干 重 )h 
吉 
a 
a 
a 


于 其 它 代 谢 物 。 该 化 合 物 的 氧化 将 导致 增加 NADH 的 生产 〈 在 这 些 条 件 下 细胞 再 氧化 它 有 
困难 )， 但 是 很 可 能 的 是 ， 对 于 前 体 代 谢 物 的 供应 ， 该 化 合 物 可 能 是 很 有 价值 的 。 


表 8.2 利用 Varma 等 (1993a) 描述 的 代谢 模型 计算 的 不 同 的 氧 比 吸收 速率 
[mmol'g-1!( 干 重 )'h-! 下 的 影子 价格 


影子 价格 人 g( 干 重 ) ,mmol-I( 代 谢 物 )] 


注 : 葡萄 糖 比 吸 收 速率 为 10mmol'g- !( 干 重 )"h 1!。 


这 个 模型 也 允许 计算 通过 不 同 途径 的 通 量 。 这 里 还 发 现 ， 在 厌 氧 条 件 下 ， 通 过 PP 途径 
氧化 分 支 的 通 量 为 零 ， 即 6- 磷 酸 葡萄 糖 脱 氢 酶 是 没有 活性 的 ， 而 生物 合成 所 需 的 NADPH 
由 一 个 转氨酶 反应 提供 。 对 于 高 的 氧 比 吸收 速率 ， 大 约 60% 的 6- 磷 酸 葡萄 糖 经 PP- 路 线 代 
谢 ， 而 且 转 氢 酶 没有 活性 。 

这 个 模型 也 用 来 研究 E.coli 生产 其 它 代 谢 物 如 各 种 氨基 酸 的 潜力 (Varma et al, 
1993b)。 这 个 潜力 的 大 小 可 以 通过 相应 的 影子 价格 的 大 小 来 确定 ， 因 为 后 者 为 菌 体 生 长 与 特 
定 代谢 物 〈 如 氨基 酸 ) 生产 之 间 的 权衡 提供 了 一 个 度量 标准 ， 结 果 发 现 ， 对 甘氨酸 、 丙 氢 酸 
和 天 冬 氨 酸 等 生物 合成 路 线 简 单 的 氨基 酸 ， 其 影子 价格 比较 低 ; 而 对 芳香 族 氨基 酸 如 共 丙 氨 
酸 、 色 氨 酸 、 栈 氨 酸 等 生物 合成 路 线 复杂 的 氨基 酸 ， 其 影子 价格 较 高 。 因 此 ， 如 果 细 胞 打算 ， 
通过 一 条 长 而 复杂 的 生物 合成 路 线 生 产 一 种 产物 ， 则 细胞 代谢 的 需求 就 大 ， 而 且 对 菌 体 生长 
的 影响 是 严重 的 。 相 反 ， 一 个 具有 简单 代谢 路 线 的 化 合 物 能 以 很 低 的 成 本 由 细胞 生产 ， 而 且 ， 
对 菌 体 生 长 的 影响 因而 也 很 小 。 


8.4 敏感 性 分 析 


在 前 一 节 ， 已 经 推导 出 确定 性 系统 、 超 定 系统 和 不 定 系统 的 质量 平衡 方程 的 解 。 尽 管 在 
每 种 情况 下 都 获得 一 个 惟一 解 ， 但 是 相应 于 测量 中 的 小 干扰 ， 度 量 解 的 敏感 性 或 “脆弱 性 - 
是 很 重要 的 。 在 敏感 性 分 析 中 的 第 一 步 是 检验 这 个 系统 是 否 是 很 好 形成 的 《well-posed)， 即 ， 
检验 是 否 化 学 计量 矩阵 是 状态 良好 的 〈(well-conditioned )。 对 一 个 病态 (il-conditioned) 化 — 
学 计量 矩阵 ， 即 使 测量 中 的 很 小 变化 也 可 能 对 通 量 计算 有 非常 大 的 影响 。 为 了 对 其 举例 说 ， 
明 ， 我 们 考虑 两 个 方程 系统 : 

=(;) "le (8.27) 


1 itt V1 I vt 
( prey i ies v2 2.0001 
尽管 等 式 右 边 差别 仅 为 很 小 的 一 个 数 0.0001， 但 该 解 从 v1, =2 M v2=0 BUA v= 
2 三 1。 因 为 解 一 般 都 是 使 用 数值 法 得 出 的 ， 如 果 化 学 计量 矩阵 是 病态 的 ， 那 么 由 计算 上 小 
的 伟人 误差 所 引起 的 通 量 估 计 中 的 误差 就 可 能 被 放大 。 一 个 和 矩阵 敏感 性 的 度量 被 称 做 条 件数 
(condition number), FLAK (8.28) 给 出 : 
204 


C(G™)= || G" || || (G*)# | (8.28) 
式 中 ，|| || 表示 任何 矩阵 的 范 数 ; (GTI)# 表 示 化 学 计量 矩阵 的 拟 - 逆 和 矩阵 〈 见 8.2 节 )。 
条 件数 的 计算 是 相当 复杂 的 〈 见 方 框 8.1)， 但 实际 上 ， 可 利用 商业 软件 包 如 Matlab, 
Mathematica 或 Maple 求 得 。 对 于 具有 正 特征 值 的 对 称 和 矩阵 ， 条 件数 等 于 特征 值 的 最 大 值 和 
最 小 值 之 比 ， 因 此 条 件数 总 是 大 于 1 (这 对 非 对 称 和 矩阵 也 是 成 立 的 )， 而 且 大 的 条 件数 象征 
一 个 病态 矩阵 @。 因 此 ， 对 于 式 (8.27) 的 和 矩阵， 它 是 对 称 和 矩阵， 特征 值 为 2 与 10-*2， 条 
件数 为 104+。 条 件数 的 大 小 对 所 测量 通 量 精 度 的 要 求 将 提供 重要 信息 ， 这 是 由 于 测量 必须 以 
一 定 精 度 来 进行 ， 而 精度 所 带 有 的 数字 的 位 数 与 条 件数 中 的 位 数 相同 。 因 此 ， 在 上 例 中 ， 条 
件数 有 五 位 数字 ， 通 量 必 须 精 确 地 测量 到 五 位 数字 。 因 为 发 酵 速率 很 少 能 精确 到 2 位 数 以 上 
来 量化 〈 例 如 ， 微 生物 的 比 生长 速率 能 被 表示 为 0.37h 1， 其 具有 很 好 的 精度 ) ， 因 此 对 一 
个 状态 良好 的 化 学 计量 和 矩阵 的 要 求 是 条 件数 处 于 1 一 100 之 间 。 这 对 大 多 数 代 谢 模 型 都 能 实 
现 。 因 此 , Vallino 和 Stephanopoulos (1993) 的 模型 的 条 件数 为 62, Nissen 等 (1997) 的 模 
型 的 条 件数 为 22。 如 果 条 件数 大 于 100， 则 说 明 此 化 学 计量 抢 阵 是 病态 的 。 就 有 必要 改变 这 
个 模型 建立 中 所 用 的 生物 化 学 。 应 当 注 意 的 是 ， 在 计算 条 件数 时 不 需要 进行 测量 ， 因 此 ， 代 
谢 模型 能 在 进行 任何 计算 之 前 进行 检验 。 


方 框 8.1 条 件数 的 计算 

XX (8.28) 已 给 出 了 条 件数 的 一 般 定义 。 然 而 ， 要 利用 这 个 方程 ， 必 须 计算 和 矩阵 的 
范 数 。 在 此 简要 描述 如 何 进行 该 过 程 。 对 更 多 细节 ， 请 参见 线性 代数 教科 书 。 

一 个 矩阵 的 范 数 是 任何 矢量 x 通过 矩阵 相 乘 而 被 扩大 的 最 大 程度 : 


Tipe | G*x || 
| GT || =max Ix| (1) 


而 且 可 以 表明 它 等 于 矩阵 GGT 的 最 大 特征 值 的 平方 根 : 

| GT ll =VAaax(GG ) (2) 
PAU, ie Fee PE AS 9 BY Dd a SS I, A GGT 的 特征 值 和 拟 - 
逆 和 矩阵 (GT) 的 相似 矩阵 的 特征 值 [由 (GG")"'G 给 出 ]， 就 可 以 利用 式 (8.28) 计算 
条 件数 。 但 是 求 特征 值 一 般 比 较 费 时 间 ， 因 此 在 计算 机 算法 中 利用 不 同 的 方法 。 和 矩阵 
GG! 的 特征 值 平方 根 等 于 矩阵 GT 的 所 谓 的 奇异 值 ， 它 可 以 通过 奇异 值 分 解 很 容易 得 到 ， 
而 奇异 值 分 解 计算 过 程 可 以 利用 计算 机 软件 包 来 迅速 完成 。 这 样 ， 就 能 得 到 矩阵 GI 及 
其 拟 - 逆 和 矩阵 〈GI) 的 最 大 奇异 值 ， 然 后 两 值 相 乘 。 


前 已 讨论 ， 条 件数 计算 应 当 总 是 代谢 模型 敏感 性 分 析 的 第 一 步 。 然 而 ， 这 并 没有 给 相应 
于 所 测量 的 通 量 中 的 变化 的 计算 的 敏感 性 提供 任何 信息 。 这 些 信息 是 由 解 矩阵 的 元 素 所 提供 
的 ， 在 确定 性 系统 中 ， 有 : 
R= ~ (GG (8.29) 
fest (8.29) 中 ,第 ; 行 和 第 ; 列 的 元 素 说 明了 在 相应 于 第 ;i 个 通 量 测量 中 第 ; 个 通 量 〈 它 
是 计算 出 的 ) 的 敏感 性 。 因 此 ， 解 矩阵 的 元 素 提 供 了 有 关系 统 敏 感性 的 信息 。 


@ ”根据 条 件数 的 这 种 定义 ， 在 一 组 线性 代数 式 中 病态 矩阵 与 一 个 耦合 的 一 阶 微分 方程 刚性 系统 之 间 存 在 一 个 直接 
的 类 似 ， 后 者 为 许多 化 学 工程 师 所 熟知 。 


205 


参考 xX 献 


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206 


a i I Fee desea 


第 9 章 ， 利 用 同位 素 标记 实验 测定 
代谢 通 量 的 方法 

在 前 面 一 章 ， 提 出 了 通过 胞 内 代谢 物 浓 度 的 测量 来 确定 胞 内 代谢 通 量 的 一 般 方法 学 ， 并 
提出 了 证 明 该 实践 合理 性 的 几 个 理由 。 显 然 ， 胞 内 通 量 在 建立 一 个 生物 系统 的 生理 状态 方面 
是 非常 有 价值 的 。 正 如 后 面 几 章 将 要 描述 的 一 样 ， 代 谢 通 量 也 起 着 另 一 个 重要 作用 ， 即 : 它 
们 为 代谢 网 络 的 控制 结构 提供 一 幅 综合 的 画卷 。 本 书 也 将 说 明代 谢 控制 系数 ， 其 已 被 建议 作 
为 代谢 网 络 中 所 施加 的 控制 程度 的 度量 标准 ， 可 直接 根据 代谢 通 量 的 大 小 及 随 代 谢 扰动 的 引 
天 而 产生 的 通 量变 化 来 确定 。 在 这 方面 ， 精 确 测定 胞 内 通 量 的 方法 就 变 得 极为 重要 ， 这 是 由 
手 它们 可 以 直接 得 出 对 代谢 网 络 中 通 量 控制 的 解释 。 

正如 前 一 章 所 讨论 的 ， 测 定 胞 内 通 量 所 要 求 的 主要 输入 是 胞 外 代谢 物 的 通 量 ， 也 就 是 
底 物 吸收 速率 和 产品 分 泌 速 率 。 这 些 速率 可 以 从 稳 态 恒 化 实验 最 好 地 获得 ， 因 为 在 恒 化 
实验 中 ， 所 有 代谢 物 的 浓度 都 是 在 稳 态 下 测定 的 。 相 应 的 吸收 /分 刻 速 率 则 可 通过 代谢 物 浓 度 
乘 以 恒 化 器 稀释 速率 来 计算 。 由 于 恒 化 实验 持续 时 间 很 长 ， 因 此 ， 往 往 采 用 批 式 实验 来 测定 通 
量 。 微 生物 的 分 批 培 养 可 在 相对 短 的 时 间 内 获得 大 量 数据 。 然 而 ， 由 于 胞 外 代谢 物 速 率 的 确定 
要 求 计 算 相 应 浓度 对 时 间 的 微分 ， 该 运算 常常 引入 大 的 误差 ， 因 此 ， 这 种 速率 的 确定 是 相当 复 
杂 的 。 此 外 ， 分 批 培养 实验 期 间 生 理 稳 态 的 缺乏 也 会 使 分 批 培养 数据 的 解释 复杂 化 。 

无 论 是 采用 恒 化 实验 ， 还 是 采用 分 批 培养 实验 ， 应 该 牢记 的 是 ， 仅 仅 采 用 胞 外 代谢 物 的 
浓度 测量 结果 来 前 明代 谢 网 络 的 程度 是 有 限 的 。 这 样 的 测量 至 多 提供 代谢 网 络 中 少数 分 支点 
上 碳 通 量 分 布 的 信息 。 这 一 点 可 能 会 由 于 建立 代谢 网 络 方程 式 的 复杂 性 而 使 人 难以 理解 。 本 
书 提供 了 几 个 例子 〈 见 第 12 章 ) 来 说 明 将 相当 复杂 的 多 组 生化 反应 简化 为 简单 的 网 络 等 价 
表示 。 特 别 地 ， 胞 外 代谢 物 浓 度 测 量 在 阐明 代谢 网 络 的 特征 方面 具有 有 限 的 潜力 ， 例 如 汇合 
于 网 络 另 一 点 的 分 叉 点 上 的 通 量 分 布 、 代 谢 循环 以 及 阐明 网 络 结构 达 较 高 的 生化 分 辩 率 等 。 
这 些 情 况 在 图 9.1 中 进行 了 说 明 ， 图 9.1 表示 主要 化 合 物 A 在 两 条 竞争 途径 〈 净 速率 分 别 
为 mwl1 和 v2) 之 间 的 分 流 。A 的 消耗 速率 以 及 FE、G 的 分 记 速 率 的 测定 足以 确定 分 支点 D、 
百 的 通 量 分 布 ， 并 独立 计算 分 泌 的 另 一 代谢 物 Ko Ain, Rw A 在 途径 1 和 途径 2 之 间 
的 通 量 分 配 比 ， 或 者 说 ， 经 过 循环 A>B>C—A 的 通 量 是 无 法 确定 的 。 同 样 地 ， 如 果 更 多 
的 反应 包含 于 C 至 2D 的 转化 中 ， 则 必须 把 它们 全 部 归并 为 一 个 单一 反应 。 如 果 需 要 有 关 途 
径 1 和 途径 2 之 间 的 分 配 比 的 更 多 信息 ， 或 所 述 步 骤 的 较 高 的 生化 分 辩 率 的 更 多 信息 ， 则 必 
须 采 用 不 同 的 方法 。 


本 章 将 要 叙述 的 一 类 方法 是 使 用 在 2 | ¢ |—2» 一 -日 一 -K 


特定 碳 位 用 3C 或 %C 标记 化 合 物 。 通 过 | 
Pe ce ee 、a 
RTA LAR RIE AEF | 
可 以 与 另 一 途径 区 别 开 来 ， 即 使 它们 导 

致 相同 终 产 物 的 形成 。 该 不 对 称 性 导致 图 9.1 “代谢 网 络 通 量 分 流 示意 


在 一 个 或 多 个 代谢 物 中 具有 根本 不 同 的 ”代谢 网 络 按 第 8 章 所 述 的 胞 外 代谢 物 ( 框 内 ) 平 衡 方法 部 分 分 解 
207 


PIC BRK, HER ASW eT Oy Fe Pe ES HE He A OC 或 2C 标 | 
记 的 化 合 物 用 于 联系 胞 外 或 胞 内 代谢 物 中 标记 富 集 度 的 测量 。 此 外 ， 应 用 这 样 的 方法 所 获得 | 


的 信息 种 类 极 大 地 依赖 于 所 用 的 标记 底 物 的 种 类 、 所 标记 的 特定 碳 原子 以 及 富 集 度 已 测 的 特 
定 代谢 物 〈 胞 内 或 胞 外 )。 由 于 情况 通常 是 决定 要 采用 的 标记 碳 底 物 和 要 测量 的 特定 化 合 物 
仅仅 是 基于 对 它们 的 熟悉 和 经 验 ， 而 很 少 考虑 可 从 标记 底 物 与 具体 代谢 物 测 量 的 特定 组 合 中 
获取 信息 的 种 类 ， 因 此 ， 这 是 非常 重要 的 一 点 。 


本 章 将 提出 通过 使 用 标记 化 合 物 来 确定 胞 内 代谢 通 量 的 方法 。 虽 然 该 基本 思想 贯穿 全 ， 


章 ， 但 仍 将 可 能 的 方法 分 为 三 类 ， 这 主要 是 依据 要 分 析 的 网 络 的 大 小 和 复杂 程度 。 在 第 一 种 
情况 中 ， 提 出 适用 于 代谢 物 可 直接 测定 ， 或 总 是 服从 解析 解 的 简单 网 络 情况 的 方法 〈9.1 
节 )。 对 于 含有 循环 的 代谢 网 络 ， 直 接 计 算 标记 转移 是 不 适当 的 。 另 一 方法 是 在 列举 所 有 可 
能 的 代谢 物 同位 素 标 记 化 合 物 的 基础 上 进行 选择 的 方法 (9.2 节 )。 除 了 有 利于 准确 确定 特 
定 代谢 物 的 标记 富 集 度 外 ， 同 位 素 标 记 化 合 物 列举 也 允许 通过 气相 色谱 -质谱 仪 〈《GC-MS) 
对 可 测量 的 特定 代谢 物 的 分 子 量 分 布 进行 估计 。 由 于 分 子 量 分 布 取决 于 代谢 通 量 ， 因 此 ， 
与 3C- 核 磁 共 振 波谱 法 联 用 的 GC-MS 是 有 关 细 胞 内 代谢 通 量 的 另 一 个 有 价值 的 信息 源 。 关 


于 代谢 物 同 位 素 标 记 化 合 物 的 最 后 一 点 是 ， 这 样 的 同位 素 标记 化 合 物 在 确定 相应 代谢 物 的 


NMR 波谱 的 精细 结构 方面 所 起 的 作用 。 将 可 看 出 ，NMR 波谱 的 精细 结构 取决 于 相应 同位 


素 标 记 化 合 物 的 相对 数量 ; 而且 ， 它 与 细胞 内 导致 这 样 的 同位 素 标记 化 合 物 形成 的 反应 速率 


直接 有 关 。 最 后 ， 对 于 大 网 络 的 复杂 情况 ， 数 值 解 是 需要 的 。 关 于 这 种 情况 ，9.3 节 介绍 的 
原子 作 图 矩阵 的 概念 为 有 效 地 进行 标记 分 布 计 算 提 供 了 一 个 便利 的 框架 ， 特 别 是 当 需 要 迭代 
步骤 时 。 为 了 保证 通过 采用 核磁 共振 (NMR) 波谱 法 可 能 得 到 的 大 量 测量 的 一 致 性 ， 这 种 
网 络 分 析 将 包含 相当 多 的 反复 和 迭代。 这 些 计算 可 通过 采用 原子 作 图 矩阵 而 简化 。 


9.1 根据 标记 富 集 度 分 数 直 接 确定 通 量 ， 


该 类 方法 依赖 于 为 了 代谢 通 量 的 直接 测定 而 仔细 选择 的 一 个 代谢 物 的 标记 强度 〈 或 富 集 


度 ) 的 测量 。 所 介绍 的 两 种 基本 方法 要 求 瞬时 强度 测量 或 稳 态 强度 测量 。 
9.1.1 根据 瞬时 强度 测量 确定 代谢 通 量 
放射 性 标记 化 合 物 的 瞬时 强度 测量 可 以 用 来 直接 探测 特定 的 代谢 途径 ， 这 就 要 求 标 记 化 
合 物 通 过 细胞 膜 进行 运输 ， 而 且 其 强度 是 


4 作为 时 间 的 函数 来 测量 。 由 于 其 放射 性 测 
tt ™ “HWS HAE, BORAT 
M* ( 外 部 放射 性 标记 的 M) 过 物质 平衡 技术 不 能 观测 的 小 数量 级 的 伐 

图 9.2 用 于 直接 测定 代谢 通 量 的 谢 通 量 的 确定 。 另 一 方面 ， 它 也 要 求 专用 


放射 性 标记 代谢 物 示意 设备 来 分 离 和 测量 被 放射 性 污染 的 化 合 物 。 
该 方法 在 图 9.2 中 说 明 ， 它 表示 的 图 式 代 谢 途 径 涉及 代谢 物 M 以 等 于 途径 通 量 J 的 速率 
被 合成 和 消耗 。 通 量 矿 可 以 通过 引入 放射 性 标记 M(M* ) 的 一 个 脉冲 并 测量 纯化 M* 样品 的 放 
射 性 来 确定 。 通 过 假设 实验 期 间 处 于 代谢 稳定 状态 ， 细 胞 内 放射 性 标记 M 的 库 将 按 下 式 变化 ; 
aM = sia JJ (9.1) 

BAI 和 M (由 于 代谢 稳 态 ) ， 积 分 给 出 


gatas) ee? (9.2) 


208 


| 


| 
] 
| 
; 


ZH (9.2) 表明 ， 未 知 的 通 量 J 可 以 根据 放射 性 计数 的 半 对 数 图 和 M 的 总 细胞 内 浓度 来 确 
定 。 应 该 注意 的 是 ， 代 谢 稳 态 是 必要 的 ， 但 仅 对 于 标记 实验 期 间 内 。 由 于 这 样 的 实验 持续 时 
间 较 短 ， 因 此 ， 他 们 可 以 在 取 自 大 容器 的 小 样品 上 重复 进行 ， 以 便 确定 在 瞬 态 期 间 的 代谢 通 
量 。 当 然 ， 只 有 当 标 记 测 量 和 实际 实验 的 时 间 尺 度 相 差 很 大 而 能 充分 分 开 ， 而 且 确 保 标 记 测 
量 期 间 实际 的 环境 条 件 扰 动 最 小 ， 这 才 是 可 能 的 。 为 此 ， 作 为 胞 内 代谢 物 库 的 函数 的 脉冲 大 
小 应 仔细 选择 。 
9.1.2 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 实 验 

图 9.3 描绘 了 将 标记 化 合 物 用 于 确定 细胞 内 代谢 通 量 的 另 一 种 方法 。 该 图 表示 对 应 于 图 
9.1 中 网 络 的 标记 分 布 示 意图 。 如 果 代 谢 物 A 是 一 个 六 碳化 合 物 ， 其 第 1 个 碳 原子 被 标记 ， 则 
假定 形成 代谢 物 B 的 反应 是 一 个 除去 标记 碳 的 脱羧 反应 ， 那 么 ， 经 过 代谢 物 B 的 途径 将 产生 代 
谢 物 C 的 一 个 未 标记 分 子 ， 同 时 ， 经 直接 途径 (速率 为 v2) 产生 的 C 分 子 将 按 图 中 所 示 位 置 1 
保留 标记 碳 原子 。 标 记分 子 中 代谢 物 C 的 富 集 将 直接 正比 于 反应 速率 2， 反 应 速率 2 与 代谢 物 
A 的 总 消耗 速率 有 关 。 对 于 代谢 物 D， 特 别 是 分 泌 代谢 物 下 来 说 ， 也 是 如 此 。 代 谢 物 下 可 通过 
对 胞 外 的 培养 基 分 析 来 测定 。 已 发 现代 谢 物 下 第 1 位 点 上 的 BC 富 集 可 提供 有 关 相 对 反应 速率 
2 的 信息 ， 相 对 反应 速率 2 可 用 于 与 总 代谢 通 量 的 联结 ， 以 区 别 速率 wl 和 v2. 


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图 9.3 借助 同位 素 标记 化 合 物 ， 确 定 分 叉 代 谢 途 径 的 通 量 分 配 比 简 图 
《标记 的 碳 原 子 用 圆 点 表示 ) 


本 章 将 通过 两 个 例子 来 说 明 这 些 方法 的 细节 。 在 此 之 前 ， 应 注意 重要 的 两 点 。 第 一 点 是 该 
方法 仅 在 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 下 才 有 效 。 代 谢 稳 态 就 是 这 样 的 状态 ， 即 在 此 状态 下 ， 所 有 参 
与 代谢 网 络 的 胞 内 代谢 物 浓度 都 是 恒定 的 。 而 在 同位 素 稳 态 下 ， 代 谢 物 同位 素 标 记 化 合 物 的 相 
对 群体 也 是 恒定 的 。 在 代谢 或 同位 素 瞬 态 期 间 ， 胞 内 代谢 通 量 的 确定 显然 是 更 复杂 的 ， 它 需要 
广泛 的 体内 动力 学 信息 。 由 于 这 样 的 信息 是 得 不 到 的 ， 因 此 ， 为 了 达到 稳 态 而 以 这 样 的 方法 来 
设计 实验 是 绝对 必要 的 。 这 是 应 该 注意 的 第 二 点 。 显 然 ， 稳 态 恒 化 器 是 进行 实验 的 优先 系统 。 
然而 ， 将 标记 底 物 引入 系统 的 方式 也 存在 着 某 些 限制 。 一 种 方法 就 是 通过 有 限 脉冲 方式 ， 其 浓 
度 使 进 料 中 的 底 物 浓度 不 会 改变 。 而 且 其 持续 时 间 具 有 足够 的 长 度 使 同位 素 稳 态 可 以 达到 。 实 
例 提 供 了 一 些 检测 点 ， 它 们 有 助 于 评价 令 人 满意 的 稳 态 是 否 已 经 达到 。 也 可 注意 到 ， 根 据 竞 争 
途径 之 间 产 生 不 对 称 性 的 具体 机 理 ， 图 9.3 所 描绘 的 简单 方式 也 会 有 一 些 变化 。 除 了 所 标记 
CO, 的 脱羧 作用 之 外 ， 差 向 异 构 酶 、 异 构 酶 及 其 它 反应 也 可 产生 所 要 求 的 不 对 称 性 。 


【 例 9.1】 赖 氨 酸 生物 合成 中 支 路 途径 通 量 的 确定 
该 实例 说 明 使 用 标记 丙酮 酸 来 区 别 赖 氨 酸 合成 途径 的 最 终 支 路 中 两 条 竞争 途径 。 如 图 9.4 
所 示 ， 赖 氨 酸 生物 合成 的 最 后 步骤 包括 四 氢 吡 啶 二 羧 酸 CH4D) 至 消 旋 -c,e- 二 氨基 康 二 酸 
(meso-DAP) 的 转化 。 该 转化 既 可 以 通过 一 条 四 反应 步骤 途径 进行 ， 也 可 通过 由 meso-DAP 脱 
氢 酶 (DDH) 催化 的 单一 反应 步骤 进行 。zexo-DAP i RIT MMAR. MKS MAMA A 
209 


成 速率 不 能 区 别 这 两 条 途径 ， 这 两 条 途径 的 总 通 量 等 于 赖 氨 酸 分 泌 的 总 速率 。 然 而 ， 通 过 全 


用 标记 丙酮 酸 ， 可 以 估计 转化 为 赖 氨 酸 的 每 条 途径 的 通 量 分 数 。 

H4D 由 草 酰 乙酸 (OAA) 和 丙酮 酸 (Pyr) 通过 缩合 反应 生成 。 在 H4D 通过 单 步 途径 
(图 9.4 的 左边 支 路 ) 转化 为 赖 氨 酸 的 过 程 中 ， 碳 原子 的 排列 保持 不 变 。 另 一 方面 ， 四 步 途 
径 的 最 后 一 步 反 应 是 差 向 异 构 酶 反应 ， 它 导致 两 种 weso-DAP 分 子 的 形成 ， 并 进一步 形成 


赖 氨 酸 ， 两 种 meso-DAP 分 子 互 为 镜像 ， 这 可 通过 使 用 标记 碳 原子 区 别 出 来 。 正 是 该 最 后 


步骤 在 H4D 转变 为 赖 氨 酸 过 程 中 引入 了 不 对 称 性 ， 因 此 ， 它 为 区 分 赖 氨 酸 合成 的 四 步 途 径 
和 一 步 途 径 ( 或 支 路 ) 提 供 了 依据 。 


草 酰 乙酸 丙酮 酸 
0UDOGGO 
H4D 
‘yp 


DAP DAP 
O+2)3)443H2Hi + WH2H3K)-G2-0 


| [ome 


L- 赖 氨 酸 L- RAR L- RAB 
+2343 H2! ‘O2-B44H3H2] 11 H2H3K43H2) 


图 9.4 丙酮 酸 和 草 酰 乙酸 通过 两 条 途径 形成 的 赖 氨 酸 标记 模式 
通 量 (1 —y) viysine (下 标 lysine 表示 赖 氨 酸 一 译 者 注 ) 的 四 步骤 琥珀 酰 酶 途径 包括 酶 序列 : 
N- 下 珀 酰 -2 ,6- 酮 庚 二 酸 合成 酶 ，N- 琥 珀 酰 氨基 柄 庚 二 酸 - 谷 氨 酸 转 氨 酸 ;N- 琉 珀 酸 二 氨基 庚 二 酸 
脱 琥珀 酰 酶 及 二 氨基 庚 二 酸 差 向 异 构 酶 。 通 量 yotsine 的 单 步 途 径 包含 meso-DAP 
脱 氢 酶 的 作用 ，O 和 了 的 下 标 表示 原来 的 碳 位 

使 用 标记 第 3 位 碳 原 子 的 丙酮 酸 ([3-SC] 丙酮 酸 ) 作为 碳 源 也 会 产生 某 些 碳 原子 带 有 13C 
标记 的 草 酰 乙酸 分 子 。 在 本 分 析 中 ， 所 关注 的 是 图 9.4 中 化 合 物 第 3 和 第 5 位 碳 原子 所 带 的 标 
记 ， 并 用 [%OAA3) 和 [%Pyr] 分 别 表示 草 酰 乙酸 库 和 丙酮 酸 库 的 分 数 。 草 酰 乙 酸 (OAAI) 
和 丙酮 酸 (Pyr) 都 标记 了 第 3 位 碳 原 子 。 应 注意 的 是 ， 这 些 分 数 也 可 包括 标记 了 其 它 碳 位 置 
的 OAA 和 了 Pyr， 只 要 OAA 和 Pyr 的 第 3 AUR EAPC 标记 。 在 代谢 稳 态 下 ， 没 有 胞 内 
代谢 物 的 积累 ， 则 对 图 9.4 的 途径 通 量 得 出 下 列 等 式 : 


Ucondensation = Usingle step 十 V four step 三 Vlysine (1) 
式 中 ， 下 标 condensation 表示 缩合 ; single step 表示 单 步 ; four step 表示 四 步 。 
现在 推导 有 关 H4D 的 不 同 同位 素 标 记 化 合 物 库 的 方程 。 缩 写 如 下 : H4D3 ony, MH 3 
位 碳 原子 被 标记 的 同位 素 标 记 化 合 物 ; H4Ds ony, MBS 位 碳 原子 被 标记 的 同位 素 标记 化 合 
物 ; H4D35s， 第 3、5 位 碳 原子 都 被 标记 的 同位 素 标记 化 合 物 ; (H4D3 = H4D3 ony + H4Ds35), 
第 3 位 碳 原子 被 标记 的 H4D 同位 素 标记 化 合 物 的 总 库 ; CH4Ds = H4Ds ony + H4D35)， 第 5 
位 碳 原子 被 标记 的 同位 素 标记 化 合 物 的 总 库 。 关 于 其 中 一 种 同位 素 标 记 化 合 物 (如 H4D;) 
库 的 平衡 ， 可 以 写 为 : 


d 
cs = weondensation[ % OAA3 ](1— [ %Pyr3]) + wondesarion[ % OAA3 ][ %Pyrs ] 


210 


| Usingle step + Vfour sap) [ % H4D; | 
= Vlysine [ % OAA3 is U lysineL % H4D3 ] (2 ) 
8 (2) 中 的 前 两 项 分 别 表示 H4D3 only MI H4Dss 同 位 素 标 记 化 合 物 的 合成 速率 ， 第 3 项 为 
H4D3 通过 图 9.4 中 两 条 途径 的 消耗 速率 。 在 同位 素 稳 态 下 ， 上 式 的 导数 等 于 零 ， 则 得 


H4D3; 库 的 表达 式 为 : 


[ %H4D3]=[%OAA3] (3) 
同样 可 得 HID 的 其 它 同 位 素 标记 化 合 物 库 ， 并 按 下 列 等 式 给 出 : 
[%H4D5]=[%Pyrs] (4) 
[ % H4D35 ] = | %OAAS JL % Pyrs | (5) 
[ %H4D3 only] = [ %OAA3](1 — [ % Pyrs]) (6) 
[ %H4Ds only ] = [ % Pyr3](1 - [ %OAA3]) (7) 
[ % H4Duntabetea | = (1 — [ % Pyr3])(1- [ %OAA3]) (8) 


Kf, Fp unlabeled 表示 未 标记 。 

前 面 的 H4D 同位 素 标 记 化 合 物 将 产生 第 -3 和 (或 ) BS 位 碳 原 子 标记 的 赖 氨 酸 同位 素 
标记 化 合 物 。 假 设 经 单 步 途径 合成 赖 氨 酸 的 通 量 分 数 为 >， 即 : vsingle sep = yolysine， 则 从 所 
指 HAD 同位 素 标记 化 合 物 前 体 产 生 各 种 赖 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 的 速率 如 下 : 


从 H4D35 产 生 L35: Viysinel %OAA3][%Pyr3] (9) 
MM H4DS3 only AE L3,only: Usingle stepl %H4D3,only | + (v four step/2) [ % H4D3 onty | 

= Viysinel (1 + y) /2][ %OAA3 (1 — [ %Pyr3]) (10) 
SA H4Ds only? L3, only: (Vfour step/2) L %H4Ds5,only ] 

= ViysineL (1 — y) /2][ % Pyr3](1 - [ %OAA3]) (11) 
从 H4D3 only? ZE Ls,only? (Vfour step/2) | % H4D3, only | 

= Viysinel (1 — y) /2][ %OAA3](1 — [ %Pyr3]) (12) 
从 HADS oni?” 4E Ls,only? Using step %H4DS, only] + (Yfourstep/2)[ %HA4DS ony ] 

= ViysinelL (1 + y) 2] [ %Pyr3](1 — [ %OAA3]) (13) 


对 于 稳 态 恒 化 器 ， 可 运用 式 (9) 一 式 (13)， 将 所 有 第 3 位 碳 原子 带 有 23C 标记 的 赖 氨 酸 
同位 素 标记 化 合 物 (L;) 的 总 量 平衡 写成 如 下 形式 : 


Be3 usel[%OAA5][%Pym]+[(1+y) 人 2][%OAA3](1- [%Pym]) 
+[(1-y)/2][ %Pyr3](1—-[%OAA3])} — Dec.s=0 (14) 
同样 地 ， 对 于 所 有 第 5 位 带 有 3C 的 赖 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 〈Ls) 的 总 量 平衡 则 有 
es = = Viysine | L %OAA3][ % Pyrs | + [(1 币 y)/2\[ %OAA3](1 B [ %Pyr3]) 


+[(1+y)/2][%Pyr3](1 — [%OAA3])} — De_,5=0 (15) 
式 中 ，D 为 恒 化 器 稀释 速率 。 式 (14) 和 式 15) 可 与 总 赖 氨 酸 的 稳 态 平衡 式 (16) 相 
结合 以 消除 测量 OAA 富 集 分 数 ( [%OAA535]) 的 困难 。 
ou = Vlysine — De, =90 (16) 
对 通 量 分 配 比 > 求解 ， 得 出 
211 


y = {Ller,s—er,3]/er} 121 %Pyrs] -Ler3+cr,s]/cx} (17) 

KX (17) 表明 如 何 根据 碳 位 3 标记 的 丙酮 酸 的 给 予 ， 从 赖 氨 酸 在 碳 位 3 和 5 的 相对 富 集 
度 来 确定 两 条 赖 氨 酸 合成 途径 的 通 量 分 配 比 。 此 计算 需要 细胞 内 丙酮 酸 的 富 集 度 ， 这 可 通过 
直接 测量 来 确定 。 另 一 方法 可 以 分 记 的 纺 氨 酸 和 (或 ) 丙 氨 酸 的 标记 富 集 度 测 量 为 基础 ， 这 
两 种 氨基 酸 是 直接 从 丙酮 酸 合成 的 。 由 于 胞 内 丙酮 酸 库 的 可 能 的 稀释 及 其 程度 一 般 是 不 知道 
的 ， 因 此 ， 建 议 不 要 把 [%Pyrs] 设 定 为 等 于 胞 外 丙酮 酸 的 富 集 度 。 

上 述 方法 仅 在 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 下 才 有 效 。 这 种 稳 态 可 在 恒 化 器 中 达到 ， 然 而 ， 在 
稳定 的 赖 氨 酸 生产 条 件 下 ， 实 验 上 也 可 采用 批 式 反应 器 。 倘 大 式 〈17) 中 所 标记 的 赖 氨 酸 分 
Bl: cl,3vcl 或 cl swcr 分 别 用 比率 (dcr ,3Mdz ) A dce_/dt )&(dei,s/dt) A dce_/dt ARF, WAT 
面 的 公式 对 批 式 反应 器 仍 是 有 效 的 。 当 然 ， 在 批 式 反 应 器 情况 下 ， 关 于 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 
态 假设 的 有 效 性 是 可 疑 的 。 然 而 ， 应 注意 的 是 ， 即 使 在 一 个 本 质 上 的 瞬 态 系统 中 ， 胞 内 代谢 
物 也 可 在 一 段 时 间 内 处 于 稳 态 。 例 如 ， 在 分 批 培养 中 经 常 遇 到 的 恒定 生物 量 浓度 条 件 下 ， 平 
衡 生 长 或 稳定 生产 就 是 这 种 情况 。 由 于 这 些 方 法 的 不 适当 运用 会 产生 错误 的 结果 ， 因 此 ， 寻 
找 可 为 稳 态 假设 的 有 效 性 提供 证 据 的 内 部 检验 点 是 很 重要 的 。 本 例 中 ， 检 验 稳 态 假设 有 效 性 
的 一 个 方法 就 是 当 产 品 在 反应 器 中 积累 时 ， 将 [3-5C] 赖 氨 酸 和 [5-3C] 赖 氨 酸 的 分 数 与 
总 赖 氨 酸 浓度 一 起 作 图 。 线 性 曲线 可 为 相应 时 间 内 的 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 提供 支持 。 

前 述 方法 已 在 播 瓶 实验 和 批 式 培养 实验 中 检验 过 。 摇 瓶 实验 得 出 的 估计 是 : 由 单 步 途径 
贡献 的 总 赖 氨 酸 通 量 在 30% 一 50% 范 围 内 。 在 一 段 短 时 间 内 在 一 个 自动 控制 的 分 批 培养 中 
进行 的 仔细 实验 提供 了 惊人 的 信息 。 经 过 单 步 途径 的 通 量 ， 或 者 等 价 地 ， 在 H4D 分 支点 的 
通 量 分 配 比 随时 间 不 是 恒定 的 ， 而 在 发 酵 进 程 中 是 变化 的 。 特 别 地 ， 单 步 途径 的 通 量 在 导 人 


标记 的 葡萄 糖 脉冲 后 的 短 时 间 内 ， 会 显著 地 从 几乎 为 零 ， 上 升 至 接近 100%, AW S~Th © 


后 ， 又 下 降 至 类 侯 于 引入 脉冲 前 的 水 平 。 这 个 结果 证 实 了 胞 内 代谢 物 及 催化 相应 反应 的 酶 的 
体内 调节 对 代谢 通 量 所 施加 的 控制 ， 这 两 个 重要 因子 决定 了 代谢 网 络 中 的 通 量 分 布 。 然 而 ， 
应 该 注意 到 ， 由 于 没有 采取 适当 的 措施 来 确保 或 检验 稳 态 环境 ， 因 此 ， 应 谨慎 对 待 这 些 结 
果 。 这 些 结果 在 提供 一 个 总 趋势 的 判断 力 方面 可 能 是 正确 的 ， 但 要 对 图 9.4 中 两 条 途径 的 体 
内 通 量 进行 定量 评价 ， 则 必须 进行 仔细 设计 好 的 实验 。 


【 例 9.2】 乙酰 辅酶 A 代谢 中 标记 分 布 的 分 析 
举例 说 明 同位 素 标 记分 布 和 代谢 通 量 估 计 的 第 二 个 例子 如 图 9.5 中 的 简单 网 络 所 示 ， 它 
表示 乙酰 辅酶 A (AcCoA) 代谢 的 双 库 模型 [ 改 自 Blum and Stein (1982)]。 这 样 一 个 模型 
OAA per 可 用 来 描述 乙酰 辅酶 A 在 线粒体 和 胞 质 溶 胶 之 间 的 分 
| 布 。 在 这 个 系统 中 ， 丙 酮 酸 和 已 酸 是 能 潜在 地 用 283C 或 
过 -= AccoA， = menage MC 标记 的 底 物 。 在 库 1 和 库 贡 中 ，AcCoA 的 原子 当中 
同位 素 标 记分 布 将 是 碳 通 量 wi 一 z6， 以 及 底 物 标 记 水 平 
Us APE SK AN PAK, GH vp ~ v6 WAM A SERA A) 
时 )。 这 里 由 于 AcCoA 是 胞 内 代谢 物 ， 可 以 假设 一 个 同 


V4 


AcCoA; 


3 


丙酮 酸 Cw 
saccon reamay 位 素 稳 态 ， 这 意味 着 流入 胞 内 中 间 代 谢 物 特定 破位 上 的 
phi ink phe 标记 与 流出 的 标记 碳 是 严格 平衡 的 。 推 导出 关于 AcCoA 


考虑 了 AcCoA 的 两 个 库 ， 分 别 代表 线粒体 碳 原 子 的 相对 富 集 度 的 数学 关系 式 ， 由 这 个 关系 式 可 确 
部 分 和 细胞 质 部 分 ，vwi~ 6 表示 通 量 ” 定 胞 内 代谢 通 量 ， 一 个 特定 碳 原子 的 富 集 度 是 用 代谢 物 
212 


名 加 上 括号 内 的 该 碳 位 来 表示 。 
现在 对 库 工 中 AcCoA 的 第 1 个 碳 原子 构建 稳 态 平衡 。 用 AcCoA ; (1) 和 AcCoA(2) 分 别 


“表示 库 工 中 AcCoA 的 第 1、2 个 碳 原子 的 标记 富 集 。 有 两 个 反应 产生 AcCoAT : (1) 丙酮 酸 


的 脱羧 反应 ， 总 通 量 为 wy， 和 (2) AcCoAT 从 库 开 到 库 工 的 转移 ， 总 通 量 为 wa。 
丙酮 酸 的 第 1 个 碳 原子 脱羧 为 CO， 而 第 2、3 SRIF AREA AcCoATI 的 第 1、2 位 
碳 原子 。 因 此 ， 从 丙酮 酸 到 AcCoA, 的 第 1 个 碳 原子 的 标记 通 量 由 乘积 wzPry(2) 给 出 。Ac- 
CoA 1 BF AcCoAI 不 涉及 化 学 反应 ， 因 此 ，AcCoAT 的 第 1、2 位 碳 原 子 分 别 变 为 Ac- 
CoAi 的 第 1、2 位 碳 原子 。 这 样 ， 从 AcCoAI 至 AcCoA, 的 第 1 位 碳 的 标记 通 量 是 由 乘积 
v3AcCoA 4 (1) 给 定 。 进 入 AcCoAT(1) 的 总 标记 通 量 为 这 两 个 通 量 之 和 : 
进入 AcCoAT(1) 的 通 量 = wlPyr(2) + wa3AcCoAT(1) (1) 
BE AcCoA; 的 两 个 反应 是 : 与 草 酰 乙酸 (OAA) 缩合 形成 柠檬 酸 ， 其 通 量 为 w4; Ac- 
CoA 从 库 工 至 库 开 的 转移 ， 其 通 量 为 wz。 流 出 AcCoAT 中 的 第 1 个 碳 原子 的 标记 通 量 为 
AcCoAT(1) 乘 以 通 量 v2, v4 之 和 。 
流出 AcCoA ; (1) A938 = (v2 + v4)AcCoA 7 (1) (2) 
在 稳 态 下 ， 进 入 AcCoA, (1) 的 标记 通 量 将 与 流出 通 量 严 格 平衡 ， 使 式 (1) 和 式 (2) 
相等 ， 可 得 关于 AcCoAi 的 第 1 个 碳 原子 的 稳 态 标记 平衡 : 


(zz+ v4)AcCoA 7 (1) = zlPyr(2) + v3AcCoAT (1) (3) 
同样 地 ， 对 于 AcCoA 的 第 2 位 碳 原 子 的 稳 态 同位 素平 衡 ， 由 下 式 给 出 : 
(v2 + v4)AcCoA | (2) = vyPyr(3) + ws3AcCoAT(2) (4) 


对 于 库 OT PA AcCoA,， 重 复 上 述 步骤 即 可 推出 其 稳 态 方程 式 。 有 两 个 反应 产生 
AcCoAy: (1) 已 酸 的 氧化 反应 ， 其 总 通 量 为 wu5; (2)AcCoA 从 库 工 至 库 开 的 转移 ， 其 通 量 
为 wp。 已 酸 的 六 个 碳 原子 通过 8- 氧 化 作用 被 成 对 移 去 ， 以 致 每 个 奇数 碳 原 子 和 偶数 碳 原子 
分 别 对 AcCoAT 的 第 1、2 位 碳 原子 贡献 1/3 的 比 活 性 。 因 此 ， 从 已 酸 至 AcCoAr 的 第 1 位 
碳 原子 的 标记 通 量 由 乘积 : (vs/3)LHex(1) + Hex(3)+ Hex(5)] 给 定 。 由 于 AcCoAT 转换 为 
AcCoAT 不 涉及 化 学 反应 ， 因 此 ，AcCoAT 至 AcCCoA, 的 第 1 位 碳 原 子 的 标记 通 量 由 乘积 
2AcCoATI(1) 给 定 。 进 入 AcCoAy (1) 的 总 标记 通 量 为 这 两 个 通 量 之 和 : 

进入 AcCoAr (1) A938 Bt = (v3/3)[Hex(1) + Hex(3) + Hex(5)]+v2AcCoA;(1) (5) 

流出 AcCoAT 第 1 位 碳 原子 的 标记 通 量 等 于 通 量 va、m6 之 和 乘 以 比 活性 AcCoAy (1): 

流出 AcCoAT(1) 的 通 量 =(va+ v6)AcCoAy (1) (6) 

使 式 (5) 和 式 (6) 相等 ， 得 到 AcCoAT 的 第 1 位 碳 原子 的 稳 态 标记 平衡 : 

(v3+ v¢6)AcCoA q (1) = (vs/3)Hex(1) + Hex(3) + Hex(5) ] + v2AcCoA ; (1) (7) 
同样 地 ，AcCoAr 第 2 位 碳 原子 的 稳 态 同位 素平 衡 可 由 下 式 给 出 : 
(v3+ v6) AcCoA 9 (2) = (v5/3)[Hex(2) + Hex(4) + Hex(6) ] + vzAcCoA ; (2) (8) 

式 (3), K (4), HK (7) 和 式 (8) 可 用 矩阵 形式 表示 如 下 : 


es 0 4 = 0 
0 U2+ U4 0 Pd ACC (1) 
V1 V1 AcCoA | (2) 
_ 32 0 3( v3 + v6) 0 AcCoA 9 (1) 
pe — AcCoA 4 (2) 
5 _ 32 0 3(v3 + v6) 


US U5 


213 


Pyr(2) 
a Pyr(3) 
~ |Hex(1) + Hex(3) + Hex(5) (9) 
Hex(2) + Hex(4) + Hex(6) 
式 (9) 可 求 出 AcCoA 两 个 库 中 的 富 集 度 的 解析 解 ， 例 如 ，AcCoAI(1) 的 解 由 下 式 给 出 : 
AcCoAT (1) = 


二 Pyr(2) 


UV2V6 + U3U4t U4V6 


RES Tad 1) ES 
SCusoEs wsuet DJLHex(1) + Hex(3) +Hex(5) ] (10) 


可 以 看 出 ， 式 (9) 提供 了 指定 代谢 物 的 富 集 度 与 六 个 代谢 反应 速率 vi ~ v6 之 间 的 关 
系 。 在 对 丙酮 酸 和 己 酸 采用 预先 确定 了 标记 的 实验 中 ,， 式 〈9) 中 的 右边 项 是 已 知 的 。 此 外 ， 
对 丙酮 酸 和 己 酸 的 总 吸收 速率 以 及 脂肪 酸 积累 速率 的 测量 结果 也 会 分 别 得 出 反应 速率 vl、 
v5 和 v6 的 估 值 。 因 此 ， 两 个 AcCoA 库 中 的 两 个 碳 原子 的 富 集 度 的 测量 也 可 得 出 反应 速率 
v2, 03 和 v4 估计 值 ， 并 可 提供 一 个 额外 宛 余 度 ， 以 检验 整个 系统 的 一 致 性 。 式 (9) 关于 
代谢 物 吸 收 和 富 集 度 测量 的 解 可 为 两 个 库 中 的 AcCoA 相互 转换 以 及 因 产 能 而 进入 柠檬 酸 循 ， 
环 的 碳 速率 等 提供 很 有 价值 的 估计 。 


9.2 涉及 同位 素 标记 代谢 物 完 全 列 出 的 应 用 


正如 前 面 提 到 的 ， 先 前 直接 解释 通过 标记 底 物 引入 的 同位 素 标记 的 结局 (fate) 的 方 
法 ， 能 用 于 不 含 代 谢 循环 的 相对 简单 的 网 络 。 对 于 更 复杂 的 网 络 ， 特 别 是 那些 含有 循环 的 网 “ 


络 ， 用 这 样 的 方法 来 处 理 是 非常 困难 的 。 在 这 种 情况 下 ， 需 要 对 所 有 可 能 的 同位 素 标记 代谢 


物 (metabolite isotopomers) 的 产生 进行 解释 ， 并 且 通 过 它们 ， 确 定 代谢 物 不 同 碳 位 的 预计 
标记 富 集 度 。 
为 了 证 明 由 于 包含 代谢 循环 而 增加 的 复杂 程度 ， 跟 踪 经 过 一 轮 TCA 循环 后 存在 于 丙酮 
酸 第 3 位 碳 原子 上 的 3C 标记 ( [3-3C] AAR) 的 结局 ( 见 图 9.6)。 从 100% [3-83C] A 
酮 酸 开 始 ， 所 有 的 乙酰 辅酶 A 都 经 丙酮 酸 脱 氢 酶 反应 在 C2 位 上 被 标记 。 如 果 固 定 的 碳酸 氢 
盐 是 用 BCO, 标记 ， 则 由 丙酮 酸 羧 化 酶 催化 的 回 补 反应 生成 的 草 酰 乙酸 (OAA) BABA Oxy 
形式 ; 如 果 固 定 的 碳酸 氢 盐 未 被 标记 ， 则 草 酰 乙酸 具有 0O3 形式 。 此 外 ， 假 设 从 草 酰 乙酸 到 
富 马 酸 的 逆反 应 与 柠檬 酸 合成 酶 、PEP 羧 激 酶 催化 的 反应 相 比 是 非常 快速 的 话 ， 则 将 导致 
草 酰 乙酸 ， 琥 珀 酸 ， 苹 果 酸 及 富 马 酸 中 C1 和 C4 之 间 ， 以 及 C2 和 C3 之 间 的 碳 标记 完全 对 
称 平衡 。 该 假设 导致 044 和 Op KE R O3 和 Or 的 浓度 分 别 相 等 。TCA 循环 之 后 ，Oj4 与 
Aco 484 4 ADS PEE Cig, Kira, Six, 0.5F 13 + 0.5F 24, 0.5Mi3 + 0.5M2， WAR 0.503 + 
0.50.40 FA WAH, O44 O; 这 两 个 同位 素 标 记 代 谢 物 现 已 产生 两 个 额外 的 草 栈 乙酸 
同位 素 标记 代谢 物 ， 即 03 和 Ou. A (Ou) 将 经 过 另外 几 轮 TCA 循环 而 进一步 被 改 
变 ， 导 致 更 多 TCA 循环 中 间 代 谢 物 的 同位 素 标记 代谢 物产 生 。 显 然 ， 先 前 解释 BC 标记 命 
运 的 方法 ， 在 处 理由 于 多 轮 代 谢 循环 而 引入 的 额外 复杂 性 时 ， 是 不 充分 的 。 处 理 这 些 情况 的 
另 一 方法 是 使 用 同位 素 标记 代谢 物 平 衡 。 本 节 首 先 对 整个 方法 作 一 般 说 明 ， 然 后 对 TCA 循 
环 同 位 素 标 记 代 谢 物 作 全 面 分 析 。 最 后 ， 用 具体 例子 说 明 各 种 模式 在 阐明 细胞 代谢 中 的 
应 用 。 
214 


P, ————————> Ac? 


$23 


图 9.6 使 用 100% 富 集 的 [3-3C] 丙酮 酸 经 多 轮 TCA 循环 中 间 代谢 物 碳 原子 的 连续 标记 示意 
缩写 Ac，O，C, K，S，M 分 别 代表 乙酰 辅酶 A， 草 酰 乙 酸 ， 柠 檬 酸 ，xu- 酮 戊 二 酸 ， 
琥珀 酸 及 苹果 酸 。 代 谢 物 符号 后 面 的 数字 表示 由 SC 标记 的 碳 位 

为 采用 该 方法 ， 应 从 完全 列 出 所 有 可 能 的 同位 素 标记 代谢 物 开 始 ， 当 应 用 于 采用 100% 
(3-3C] 丙酮 酸 作 为 标记 底 物 的 TCA AN, SROR. PRR, o ROR. RAR 
及 苹果 酸 等 的 可 能 同位 素 标记 代谢 物 如 图 9.6 中 所 示 。 在 这 种 情况 下 没有 其 它 种 类 形成 。 应 
该 注意 的 是 ， 并 不 是 所 有 可 能 的 同位 素 标记 代谢 物种 类 的 组 合 都 出 现 。 在 这 种 情况 下 ， 例 
如 ， 存 在 2=32 种 c- 酮 成 二 酸 ， 但 根据 假设 的 生物 化 学 ， 只 有 6 种 出 现 。 

下 一 步 是 写 出 出 现在 网 络 中 的 所 有 代谢 物 及 其 同位 素 标 记 代 谢 物 的 平衡 方程 式 。 这 些 方 
程 包含 代谢 物 及 同位 素 标记 代谢 物 的 浓度 ， 以 及 人 们 想 要 确定 的 胞 内 转化 速率 〈 通 量 )。 在 
假设 代谢 稳 态 和 同位 素 稳 态 条 件 下 ， 这 些 平 衡 方程 对 于 未 知 的 代谢 通 量 来 说 是 线性 方程 式 ， 
并 可 直截了当 地 求 出 作为 通 量 的 函数 的 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 浓度 。 最 后 一 步 是 一 个 迭代 
试 差 过 程 ， 通 过 它 确定 未 知 的 通 量 ， 以 便 最 好 地 描述 实验 数据 。 从 未 知 代谢 通 量 的 猜测 值 出 
发 ， 相 对 同位 素 标记 代谢 物 群 体 首先 被 确定 ， 然 后 ， 核 对 下 列 一 种 或 几 种 情况 进行 计算 : 
(a) 各 种 代谢 物 碳 原子 的 标记 富 集 ，(b) 借助 GC-MS 〈 气 相 色 谱 - 质 谱 仪 ) 测量 代谢 物 分 子 
量 分 布 ， 或 (c) 代谢 物 NMR 谱 的 精细 结构 。 将 模型 预测 值 与 相应 的 标记 富 集 度 、 分 子 量 
分 布 及 NMR 谱 线 强度 等 实验 值 进行 比较 ， 可 得 出 未 知 通 量 的 新 估计 值 。 这 种 迭 代 过 程 重 复 
进行 ， 直 到 模型 预测 值 令 人 满意 地 与 测量 值 一 致 ， 最 终 集 中 于 其 它 观 察 不 出 的 代谢 通 量 的 确 
定 。 图 9.7 给 出 了 该 试 差 过 程 的 流程 。 

215 


建立 同位 素 标 
记 代 谢 物 平 衡 
方程 式 


求 出 同位 素 标记 代 
谢 物 库 


= ae 


Mca RE 
e 同 位 素 标记 代谢 物 分 
子 量 分 布 
© NMR 谱 的 精细 结构 


与 实验 数据 比较 ， 
一 致 性 是 否 满意 ? 


图 9.7 根据 同位 素 富 集 、GC-MS 及 NMR 谱 的 细微 结构 等 的 测量 确定 胞 内 代谢 通 量 的 迭代 法 流程 
在 下 面 两 节 里 ， 将 推导 出 因 引 入 标记 丙酮 酸 或 乙酸 底 物 而 产生 的 所 有 TCA 循环 同位 素 
标记 代谢 物 分 布 的 表达 式 。 这 些 推导 可 用 来 说 明 一 个 非常 普遍 的 代谢 循环 中 的 同位 素 标 记 代 
谢 物 的 列举 方法 。 此 外 ， 将 已 报道 的 TCA 结果 用 于 几 个 实例 中 ， 以 表明 如 何 能 从 标记 底 物 ， 


PEP apie} 


GLU 
co, 


Uppck 


O e ee 
IG 
UMDH 
M co, -7 UIDH 
ie K 
Uv, 
FUM “ bp il 
FSS ae S 


VSUDH 


图 9.8 经 由 柠檬 酸 循环 和 糖 异 生 途 径 的 丙酮 酸 利用 
通 量 的 下 标 缩 写 如 下 : GP 一 糖 异 生 途 径 ; PDH 一 丙酮 酸 脱 
AM; CS 一 柠檬 酸 合成 酶 ; ACON—IRS RM; 
KGDH 一 “- 酮 成 二 酸 脱 氢 酶 ， SUDH 一 琥珀 酸 脱 氢 酶 ; 
FUM 一 富 马 酸 酶 ; MDH 一 苹果 酸 脱 氢 酶 ; PPCK 一 磷酸 烯 醇 
丙酮 酸 羧 激酶 ; PC 一 丙酮 酸 关 化 酶 
代谢 物 的 缩写 如 下 “PEP 一 磁 酸 烯 醇 丙 酮 酸 ; P 一 丙酮 酸 ; 
AcCoA 一 乙酰 辅酶 A; C 一 柠檬 酸 ; IC 一 异 柠檬 酸 ; 

K 一 c- 酮 友 二 酸 ; SHAM; F 一 富 马 酸 ; M 一 苹果 酸 ; 
O 一 草 酰 乙酸 ; CO: 一 二 氧化 碳 ; GLU 一 葡萄 糖 
诸如 PEP->~P->~>O->PEP 等 无 效 循 环 假设 是 不 活动 的 ， 

其 它 反应 ， 如 用 于 生物 合成 的 谷 氨 酸 - 草 酰 乙 酸 转氨酶 
以 及 谷 氨 酸 脱 氢 酶 等 可 被 忽略 


216 


的 实验 中 得 到 细胞 生理 学 额外 的 洞察 力 s 
Ba, 在 9.2.3 节 ， 我 们 将 说 明 怎 样 根 
据 前 几 节 中 得 到 的 相对 同位 素 标记 代谢 
物 群 体 来 计算 同位 素 标 记 富 集 、 分 子 量 
分 布 以 及 NMR 谱 的 细微 结构 。 
9.2.1 来 自 标记 丙酮 酸 的 TCA 循环 同 
位 素 标 记 代谢 物 的 分 布 

图 9.8 HAT AR TCA 循环 途径 和 
普遍 存在 于 真 核 生 物 中 的 糖 异 生 途 径 的 
丙酮 酸 利用 反应 。 假 设 磷酸 烯 醇 丙酮 酸 
(PEP) 不 是 由 丙酮 酸 经 PEP 酶 直接 形 
成 的 ， 而 是 由 草 酰 乙酸 (OAA) 经 PEP 
羧 激 酶 生成 的 。 丙 酮 酸 直接 羧 化 为 草 酰 
乙酸 (OAA)， 或 可 转化 为 乙酰 辅酶 A， 
然后 ， 乙 酰 辅酶 A 与 草 酰 乙 酸 缩合 形成 
柠檬 酸 ， 柠 檬 酸 经 过 TCA 循环 ， 最 终 
又 生成 草 酰 乙 酸 。 最 后 ，PEP 经 过 糖 本 
解 的 EM 途径 的 道 方向 ， 或 者 说 糖 异 生 
途径 ， 可 合成 葡萄 糖 。 

首先 ， 写 出 图 9.8 网 络 中 标 出 的 代 
谢 物 的 质量 平衡 。 
(9.3) 


(9.4) 


dcic _ 
es thea 人 
dt ACON IDH 


dcx _ 

dt — VIDH~ UKGDH 
CS_ 
dt 一 WKGDH USUDH 


dcr _ 
五 一 三 也 90 
dt SUDH ~ UFUM 


dcm 
isn =O 
dt FUM MDH 


dc 


和 
ae UMDH + Upc — UcsS — UPPCK 
TCO, = VIDH + UKGDH— UPC + uppcK 


d¢pmp? 4 is 
A: PPCK 一 UGP 


dcp _ 
“dz VIMPORT — UPC ~ UPDH 


(9.5) 


(9.6) 


(9.7) 


(9.8) 


(9.9) 


(9. 
(9. 


(9. 


(9. 


在 代谢 稳 态 下 ， 没 有 胞 内 代谢 物 积累 ， 由 式 (9.3)~X(9.13) 可 得 : 


UCS— UPDH — UVACON— VIDH > UKGDH 


= USUDH — UFUM— UMDH 
UPC — UPPCK 
veo, =2vcs 
UPC — UGP 


VIMPORT = Upc + Ucs 


(9. 


Ko. 
(9. 
(9. 
(9. 


10) 
11) 


12) 


13) 


14) 


15) 
16) 
17) 
18) 


与 总 代谢 物 浓度 相似 ， 根 据 100% [3-3C] 丙酮 酸 的 给 予 而 出 现 于 图 9.6 中 的 每 个 同位 


素 标记 代谢 物 的 浓度 写 出 平衡 方程 式 : 
Ges 
2 
二 1 —COF 
O, 0 ( 9) 
O34 0 CO; 
On ( 2 
“0 Oy |= vwMDH Mis | + vpc ($2) = 
Ong M24 2 
On3 Mil23 0 
Ons, M234 a 
O M23 " 
23 0 
0 


— vppcx | O13 | (9. 


19) 


在 前 面 等 式 中 ， 每 个 同位 素 标记 化 合 物种 类 是 以 相对 群体 表示 的 ， 即 ， 其 浓度 用 同一 代谢 物 

的 总 浓度 进行 归 一 化 处 理 (如 O3=c0,3/co), COF HAC 标记 的 CO; 的 分 数 。 
类 似 于 草 酰 乙酸 ， 也 可 对 柠檬 酸 / 异 本 檬 酸 CFC 表示 )、xe- 酮 成 二 酸 、 焉 珀 酸 、 苹 果 

217 


酸 以 及 用 13C 标记 的 CO, 的 分 数 CO; 等 写 出 同位 素 标记 化 合 物 平衡 [分 别 为 式 (9.20)~ 武 ， 
(9.24) ]. 


C24 O3 C24 
Ca34 Or C34 
Ci24 O34 Cl24 
(Ca346 Ov (Ca346 
a Cras | = vcs | O13 | 一 vip | Cras (9.20) 
Ci34 Or C134 
Cr346 O13 Cr346 
C1234 O234 Cl234 
C234 O23 Cr34 
Ky Cr + (246 Ky 
K34 C34 + (346 K34 
Se = on] |= aaaoa| (9.20) 
K234 (C2346 + C234 天 234 
123 Cl234 12 
S23 K134 + K3q S23 
aes Si3 | = vxepu| Kes + Kiza | 一 vsupH | Sis (9.22) 
S123 Kiz34 + 天 234 S123 
S23 
M23 $813 M23 | 
4 Mis 1 Mis 
or M24 | = vsupH 23 E MDH | Mag (9.23) 
My3 1s. M23 
Z 
Mo34 Mo34 
79123 


rco,COz = vwpwH (C346 + Crag + C2346) + vKGDH(Kiz4 + Ki34 + Ki234) 


4 
— vpc(COF ) + vppcx (O34 + Org + Or34) (9.24) — 
在 代谢 和 同位 素 稳 态 下 ， 运 用 式 (9.22), HR (9.23) 和 式 (9.14), WE: q 
Ki34 + 天 34 
M23 5 (Kg + Ky4) 
M3 1 
Mo Ls > (Kos a K124) (9.25) 
M 1 
we 5 (Kia34 + Ko34) 
M34 


1 
(Kil234 + Ko34) 


218 


} 


同样 地 ， 从 式 (9.20)、 式 (9.21) FAR (9.14)， 可 得 : 


Kr } O03 + O13 
K34 OQ, = Ov 
Ki24 二 O34 (9.26) 
Ki34 Org 
Ko34 O23 + O3 
1 O234 


BAK (9.25) 和 式 (9.26)， 并 将 所 得 的 苹果 酸 同 位 素 标记 化 合 物 的 表达 式 插 人 式 
(9.19) 的 稳 态 形式 中 ， 则 可 得 代谢 及 同位 素 稳 态 下 ， 草 酰 乙 酸 的 同位 素 标记 化 合 物 乎 衡 : 


0 (7 — COs 
ze 
0 
0 1 —- CO; Os 
0 ae NG 
1 (oe O34 
> (O3 + O13 + O34) 2 Oy 
v + upc CO; = (vcs + upc) | O13 (9.27) 
"ys (03 + Oy3 + O34) 人 7 】 On 
0 
5 (Onss + O23 + Op3) 0 Ons 
O 
1 0 a 
> (Or34 + Oy23 + Oy3) | i O23 


〈O24 + Op + Or2) 0 
式 (9.27) 表明 所 有 的 草 酰 乙 酸 同 位 素 标记 化 合 物 可 仅仅 从 二 氧化 碳 的 相对 富 集 度 、 柠 


檬 酸 合成 酶 通 量 (vcs) 和 丙酮 酸 羧 化 酶 通 量 (wpPc) 来 求 得 。 前 面 的 分 析 也 可 直接 应 用 于 


所 有 其 它 的 同位 素 标记 化 合 物 ， 以 推导 它们 在 代谢 及 同位 素 稳 态 下 也 以 wcs 和 wpc 的 形式 来 
确定 的 方程 式 。 因 此 ，zwcs 和 vpc 是 仅 有 的 一 些 未 知 项 ， 根 据 它们 就 可 计算 所 有 同位 素 标记 
化 合 物 的 相对 群体 ， 而 且 通 过 它们 也 可 计算 中 间 代 谢 物 的 标记 富 集 度 。 

可 用 zx Ay 很 方便 地 表示 解析 结果 。 定 义 z 为 草 酰 乙酸 经 由 PEP 羧 激酶 (PPCK) 反 
应 而 离开 TCA 循环 的 概率 [ (1- z) 则 表示 草 酰 乙酸 经 柠檬 酸 合成 酶 (CS) 反应 而 重新 进 
A TCA 循环 的 概率 ]， 而 定义 y 为 固定 到 将 被 SC 标记 的 丙酮 酸 的 碳酸 氢 盐 ， 即 CO; 的 概 
率 。 若 用 z km, WISH: 


x _ UPPCK _ UPC 
一 (9.28) 


此 外 ， 如 果 除 了 模型 中 指出 的 反应 外 ， 没 有 其 它 途 径 产 生 和 消耗 CO;， 则 可 只 用 z 来 
表示 y。 表 9.1 总 结 了 当 用 100% 富 集 丙 酮 酸 作 底 物 时 ， 以 zx My 这 两 个 概率 表示 的 草 酰 乙 
酸 和 谷 氢 酸 同位 素 标记 化 合 物 相 对 群体 的 结果 。 表 9.1 也 提供 了 用 z hey 的 表达 式 ， 以 
及 表示 了 从 所 指出 的 在 三 个 不 同 碳 原子 标记 的 丙酮 酸 合成 葡萄 糖 和 谷 氨 酸 分 子 的 相对 富 集 
度 。 图 9.9 表示 了 当 分 别 用 100% 富 集 [2-BC] 丙酮 酸 和 100% 富 集 [1-3C] 丙酮 酸 作 标 记 
底 物 时 产生 的 可 能 的 同位 素 标记 化 合 物 。 应 注意 ， 表 9.1 的 结果 可 以 用 来 对 任何 其 它 的 同位 
素 标 记 化 合 物 或 代谢 物 富 集 度 与 实验 数据 ( 若 可 获得 的 话 ) 进行 比较 。 另 外 ，G 和 开 可 交 
换 使 用 ， 因 为 谷 氨 酸 和 ca- 酮 戊 二 酸 的 同位 素 标记 化 合 物 的 分 布 是 相同 的 。 

219 


9.1 草 酰 乙酸 (O) MEA (CGC) 的 同位 素 标 记 化 合 物 的 稳 态 分 布 及 


葡萄 糖 和 谷 氨 酸 中 的 相对 碳 富 集 度 
项 目 [3-3C] 丙 酮 酸 [2-3Cj] 丙 酮 酸 [1-3C] 丙 酮 酸 
| Tere jt 28 eA 
了 2 二 工 一 并 了 2-2 
草 酰 乙酸 同 = a 
位 素 标记 化 合 Go:= 邱 呈 兴 OF Cis ee 
物 分 布 过 gt 二 PY ee eae Daal Oyw= xy 
On=Ox= 1+ x) nips 
eee) 
Ow= (1+2z) 
BP ee oer 
O1> Os OG ie) 
TL Le. aS 
模式 
C-2=0 
ita =27?+syt 29 c3-20+y) 
Bs 2(1+ z) 4 2 
ARIA 天 主人 本 
素 标 记 化 合 物 2 
分 布 起 _zQ-ztytzy) zGt+s) 
Kiss= 2(1+2z) Het 2 
SAREE _l-axtayter’y mer — 227+ ry + 2x7y C ,-2ty) 
模式 Ce BEF z) 2(1+ x) 和 
C-2=0 
C-3=0 
C-4=0 
C-5=0 


注 : HUA 9.8 所 示 的 主要 途径 利用 100% [(3-°C] AMM, 100% [2-5C] HMR 100% [1-9C] HMR 
标记 。 

正如 第 一 行 所 示 ，y 只 能 作为 z 的 函数 而 求 得 。G 和 天 可 交换 使 用 ， 因 为 这 二 者 的 标记 模式 是 相同 的 。 用 这 些 底 物 
经 糖 异 生 途 径 生成 的 葡萄 糖 具 有 下 列 富 集 模式 : C-4=C-3; C-5=C-2; C-6=C-1。 


220 


(a) (b) 


图 9.9 中 间 代 谢 物 经 多 轮 TCA 循环 的 连续 标记 示意 
通过 用 (a) 100% 富 集 的 [2-BC] 丙酮 酸 ，(b) 100% 富 集 的 [1-3C] 丙酮 酸 进行 标记 


现 对 在 推导 表 9.1 中 的 表达 式 时 所 运用 的 假设 作 一 总 结 ， 并 作为 本 节 的 结束 。 

e 由 于 无 效 循环 ， 如 : 丙酮 酸 ->OAA->PEP-> 丙 酮 酸 ， 以 及 苹果 酸 - 丙 酮 酸 一 OAA-~~> 
苹果 酸 等 的 运行 ， 不 存在 标记 循环 。 

© 不 存在 代谢 物 区 室 化 ， 但 存在 TCA 循环 和 其 它 途 径 共 用 的 均一 库 。 

e 除 葡 萄 糖 生成 之 外 ， 没 有 到 生物 合成 的 净 的 通 量 。 

e PPP 的 运行 不 会 造成 标记 争夺 ，PPP 会 使 经 糖 异 生 途 径 合成 的 葡萄 糖 的 标记 重新 
分 布 。 

e 可 以 达到 代谢 稳 态 及 同位 素 稳 态 。 

e 输入 底 物 是 同位 素 纯 的 。 它 们 在 指定 的 碳 位 上 是 100% 富 集 的， 在 未 指定 的 碳 位 上 则 
没有 富 集 。 

e@ 由 于 存在 未 标记 的 内 源 库 ， 同 位 素 稀 释 可 忽略 。 
9.2.2 来 自 标记 乙酸 的 TCA 循环 同位 素 标记 代谢 物 的 分 布 

图 9.10 总 结 了 关于 乙酸 利用 的 3 种 可 能 模型 。 模 型 工 表示 经 由 乙 醛 酸 支 路 (GS) 的 乙 
酸 利用 ， 这 条 途径 在 许多 细菌 中 存在 。 由 于 该 途径 补充 因 生 物 合成 而 流出 的 TCA 循环 中 间 
物 ， 所 以 ， 它 的 运行 对 以 乙酸 作为 单一 碳 源 的 细菌 来 说 是 必需 的 。 通 过 控制 异 柠 檬 酸 分 支点 
处 的 碳 流量 ， 细 菌 对 碳 的 利用 保持 严格 平衡 ， 以 满足 产能 和 生物 合成 要 求 。 当 蜡 柠 檬 酸 相 继 
被 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 以 及 TCA 循环 的 一 些 酶 催化 时 ， 将 产生 用 于 产能 的 NADH。 另 一 方面 ， 
在 异 柠檬 酸 裂 合 酶 的 作用 下 ， 蜡 柠檬 酸 可 转化 为 琥珀 酸 和 乙 醛 酸 ， 而 乙 醛 酸 与 乙酰 辅酶 A 
缩合 形成 苹果 酸 。 这 样 ， 经 过 GS 途径 ，2 分 子 乙酸 形成 1 分 子 草 酰 乙酸 。 

已 经 证 实 ， 哺 乳 动物 只 通过 转化 为 乙酰 辅酶 A 来 利用 乙酸 ， 乙 酰 辅酶 A 随后 在 TCA 16 
环 中 进行 分 解 代 谢 COLA 9.10 模型 下 )。 然 而 ， 由 于 一 些 中 间 代 谢 物 要 流出 TCA 循环 ， 提 
供 生 物 合成 前 体 ， 诸 如 谷 氨 酸 、 谷 所 酰胺 。 因 此 ， 为 了 保持 一 平衡 的 稳 态 流量 ， 必 须 存 在 独 
立 的 回 补 源 ， 以 供 草 酰 乙 酸 生物 合成 。 将 考虑 有 关 乙 酸 利用 的 两 种 情况 ， 第 一 个 情况 如 模型 

221 


乙酰 乙酸 
a 
[去 SS 


AcCoA AcCoA 二 


aS 


IC 


这 ta 
Vi. 加 1 5 ( 
evs ies oS 


型 焉 


图 9.10 关于 乙酸 利用 所 建议 的 3 种 模型 
在 模型 工 中 ， 乙 酸 是 通过 TCA 循环 和 乙 醛 酸 支 路 这 两 条 途径 被 利用 的 。 在 模型 开 中 ， 
乙酸 仅 通过 转化 为 乙酰 辅酶 A 而 被 利用 。 乙 酰 辅酶 A 经 过 TCA 循环 。 草 酰 乙 酸 是 从 其 它 
内 源 性 代谢 物 补充 的 。 在 模型 焉 中， 乙酸 转化 为 乙酰 辅酶 A， 而 且 也 可 通过 乙酰 乙酸 - 
乳酸 -丙酮 酸 途 径 成 为 草 酰 乙酸 生物 合成 的 来 源 。 模 型 亚 途 径 尚未 完全 证 实 

开 所 述 ， 就 是 普遍 接受 的 途径 ， 乙 酸 在 乙酰 辅酶 A 合成 酶 作用 下 仅 经 乙酰 辅酶 A 转化 而 被 
利用 。 在 这 种 情况 下 ， 存 在 另 一 代谢 物 源 供 草 酰 乙酸 生成 之 用 。 第 二 种 情况 就 是 模型 焉 中 的 
草 酰 乙酸 补充 ， 是 一 条 假设 途径 ， 在 这 条 途径 中 ， 草 酰 乙 酸 直接 从 乙酸 生成 。 这 可 通过 两 个 
乙酰 辅酶 A 分 子 缩合 生成 草 酰 乙 酸 来 实现 。 草 酰 乙 酸 进 而 又 脱羧 生成 乳酸 或 丙酮 酸 ， 它 们 


最 后 成 为 草 酰 乙 酸 的 来 源 。 从 草 酰 乙酸 合成 Cs 代谢 物 〈 例 如 乳酸 或 丙酮 酸 ) 的 途径 尚未 完 “ 


全 证 实 。 但 由 于 有 证 据 表 明 ， 在 绵羊 中 存在 从 乙酸 合成 3- 羟 基 丁 酸 (Annison et al, 1963), 
且 在 鼠 肝 脏 中 存在 从 标记 的 乙酸 合成 标记 的 草 酰 乙酸 (Desmaulin et al, 1985), Ak, 
条 假设 途径 并 不 是 行 不 通 的 。 包 括 模型 亚 的 目的 就 是 检验 任何 标记 研究 是 否 与 该 模型 相 一 
致 。 由 于 在 这 种 情况 下 ， 阁 输入 的 乙酸 是 标记 的 ， 则 进入 TCA 循环 的 草酸 乙酸 也 总 是 标记 
的 。 在 哺乳 动物 中 没有 发 现 GS 途径 。 | 
为 了 分 析 这 种 情况 ， 完 全 按照 9.2.1 节 所 述 相 同 的 方法 继续 进行 ， 首 先 列 出 如 图 9.11 
和 图 9.12 所 示 的 可 能 的 同位 素 标记 化 合 物 ， 这 两 图 分 别 对 应 于 100%[2-3C] 乙酸 和 100% 
[1-3C] 乙酸 的 情况 。 然 后 写 出 代谢 物 平 衡 和 同位 素平 衡 ， 并 应 用 稳 态 假设 ， 求 出 草 酰 乙酸 
同位 素 标记 化 合 物 相 对 浓度 的 解 ， 进 而 通过 它们 得 到 葡萄 糖 和 谷 氨 酸 的 富 集 模式 。 有 关 
[2-B3C] 乙酸 和 [1-3C] 乙酸 的 结果 分 别 总 结 列 于 表 9.2 和 表 9.3 中 。 关 于 乙酸 利用 ， 还 可 
引入 另 一 个 变量 z 以 表示 异 柠檬 酸 经 GS 途径 被 利用 的 概率 。 而 (1- x) 则 表示 经 TCA 循 
环 所 利用 的 异 柠 檬 酸 的 分 数 。 因 此 ， 经 由 GS 途径 的 通 量 与 经 由 TCA 循环 的 通 量 之 比 可 表 
示 为 
Tees | TOGs 
l1-z vtca 
注意 : #9.1~#9.3 的 结果 对 100% 富 集 两 酮 酸 和 乙酸 有 效 。 
9.2.3 实验 数据 整理 
大 多 数 代 谢 NMR 实验 主要 集中 在 特定 代谢 物 碳 原子 的 2C 标记 富 集 度 。 表 9.1 一 表 9.3 
222 


(9.29) 


cua’ 24. <«— 2B2 


丙酮 酸 乙酸 2 


Ac2 


M 
M K 33 4 K1234 
M2 K24 K234 
$123 44 ee K124 
S13 = A 
$23 


(b) (c) 


图 9.11 对 于 100%[2-BC] 乙酸 经 过 多 轮 TCA 循环 后 中 间 代 谢 物 碳 原子 的 连续 标记 示意 
图 9.10 的 模型 工 一 亚 分 别 对 应 于 〈a) 一 (c) 


的 结果 不 仅 允 许 这 样 的 标记 富 集 度数 据 的 正确 解释 ， 而 且 也 可 扩大 信息 量 ， 这 些 信息 可 通过 
分 析 NMR 谱 的 细微 结构 以 及 标记 代谢 物 的 分 子 量 分 布 测 量 结果 而 得 到 。 
FC 富 集 度数 据 ， 不 同 碳 原子 的 富 集 度 可 通过 运用 表 9.1 一 表 9.3 中 的 表达 式 ， 计 
算 相 应 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 浓度 之 和 来 求 得 。 例 如 ， 参 照 100% [3-PC] 丙酮 酸 的 使 
用 ，。- 酮 成 二 酸 每 个 碳 位 上 的 相对 富 集 度 可 按 在 特定 碳 位 含有 标记 碳 的 所 有 同位 素 标 记 化 合 
223 


Acl 


(c) 


图 9.12 对 于 100% [1L-2C] 乙酸 经 过 多 轮 TCA 循环 后 中 间 代 谢 物 碳 原子 的 连续 标记 示意 
图 9.10 的 模型 工 一 下 分 别 对 应 于 (a) 一 (c) 


物种 类 之 和 来 计算 ， 这 反映 在 下 列 等 式 中 : 
C-1= K 124+ K 434+ K 1234 
C-2= K4+ K 124 + K 734 + K 1034 
C-3= K3q+ K 134+ K 234 + K 234 0.3m 
C-4= Ko4 + K3q4t K 124+ K 134+ K234+ K 1334= 1 
C-5=0 


224 


如 表 9.1 一 表 9.3 中 表达 式 所 示 ，vx- 酮 成 二 酸 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 浓度 是 代谢 通 量 或 代 
谢 通 量 比 的 函数 ， 因 此 ， 标 记 富 集 度数 据 提供 了 有 关 体内 代谢 通 量 大 小 的 信息 。 


表 9.2 通过 图 9.10 所 示 的 三 条 不 同 模型 途径 引入 100% [2-3C] 乙酸 后 ， 草 酰 乙 酸 和 
谷 氨 酸 的 同位 素 标记 化 合 物 的 稳 态 分 布 及 葡萄 糖 和 谷 氨 酸 中 的 相对 碳 富 集 度 


项 目 经 模型 [途径 利用 [2-2SC] 乙 酸 经 模型 开 途 径 利 用 [2-8C] 乙 酸 | 经 模型 焉 途径 利用 [2-3C] 乙 酸 


sie zy 1+ 2? 
y eye x? Cire zx 


草 酰 乙酸 同 *@—y-—zy) 
位 素 标记 化 合 O13= On=* +x) 
raid O1m= Oin= > 

On== ali=z) 


(+z) 


2 
O123 = O234= Hak 


a ( = 
2(1+ 2) 


mb ie 


Weer 


(142) 


Cl= 


ia 


(1l+2z) 


C-2= 


c.3aitatt ayt ay 


3 _1+2eF tay t+ ey 
oa 2(1+2) 


2( 1 a) 


谷 氨 酸 同位 EEC ay) 
素 标记 化 合 物 m 20+ a) 
分 布 x 
K 134 (+z) 
Kane 
Km=15 
(1-x)? 
K 1234 = 211+ 2x) 
(1 一 元 )3 
K 1234 = 2(1+-2) 
SAREE Lake + z?+2y+27y C poet eri 2? 
模式 2(1+ 2) ey 2(1+ 2) 
| 
C25Ge 5) 
Pen at 
人 
C4=] 
C-5=0 


注 : ARH. UP, c 表示 9.2.1 节 所 述 的 经 丙酮 酸 羧 化 酶 进入 草 酰 乙酸 库 的 相对 通 量 。 此 外 ， 正 如 第 一 行 所 示 ， 
> 可 作为 并 的 函数 而 求 得 。 本 表 对 应 于 图 9.11 所 示 的 途径 。 


225 


表 9.3 通过 图 9.10 所 示 的 三 条 不 同 模型 途径 引入 100% [1-BC] 乙酸 后 ， 草 酰 乙 酸 和 
谷 氨 酸 的 同位 素 标记 化 合 物 的 稳 态 分 布 及 葡萄 糖 和 谷 氨 酸 中 的 相对 碳 富 集 度 


项 目 经 模型 工 途 径 利 用 [1-3C] 乙 酸 | 经 模型 开 途 径 利 用 [1-3C] 乙 酸 | 经 模型 亚 途 径 利用 Li-3C] 乙 酸 


和 2 2x? 
ey. NE y= x 一 7 二 元 三 zx? 


草 酰 乙酸 同 
位 素 标记 化 合 
物 分 布 


02=0;=24-Y ) 


=¢—, =z aaa sey) 
Os Oa eae) 


‘ _l+e—22*t ats’ y 
sa 214) 


2 
素 标记 化 合 物 sie 


分 布 K y= 2c zt yt ay) 


2(1+z) 


Kes=Teg 


Ruse 
(1-z)? 
Bsa ak 


AIR 
模式 


开交 
Ci 2142) 


TE: 本 表 对 应 于 图 9.12 所 示 的 途径 。 


根据 表 9.1 一 表 9.3 中 的 同位 素 标记 化 合 物 分 布 ， 可 进一步 分 析 特 定 碳 位 上 NMP 峰 的 
细微 结构 。 由 于 同位 素 标 记 化 合 物 的 相对 数量 取决 于 相对 代谢 通 量 分 布 〈 正 如 表 9.1 一 表 
9.3 中 等 式 的 参数 x 和 y 表示 的 )。 因 此 ， 很 显然 ， NMR 谱 的 细微 结构 包含 有 关 代谢 通 量 
总 体 分 布 的 有 用 信息 。 有 关 同 位 素 标记 化 合 物 相 对 数量 的 同样 表达 式 ， 可 进一步 用 来 确定 不 
同 标记 代谢 物 的 分 子 量 分 布 。 例 如 ， 由 于 所 有 的 谷 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 可 望 带 有 至 少 一 
SBC 碳 原子 ， 因 此 ， 从 表 9.1 可 以 看 出 ， 具 有 正常 分 子 量 M 的 谷 氮 酸 分 子 〈 相 当 于 所 有 
碳 原子 都 没有 93C) 的 相对 数量 为 零 。 同 样 地 ， 分 子 量 为 (CM +1) 的 同位 素 标记 化 合 物 的 相 

226 


i 
- 


对 数量 也 等 于 零 。 然 而 ， 分 子 量 为 (M +2) 的 谷 氨 酸 的 相对 数量 将 等 于 Ky Ky ZA. 
BF (M+3) 的 谷 氨 酸 的 相对 数量 将 等 于 Ky. Ki KeuZ Al. Ba, FW 
(M44) 的 谷 氨 酸 的 相对 数量 将 等 于 K yyyyo 这 样 的 分 子 量 分 布 可 通过 气相 色谱 -质谱 联 用 来 
获得 ， 并 可 提供 有 关 同 位 素 标记 化 合 物 的 来 源 及 相应 代谢 通 量 的 更 多 信息 。 

应 该 注意 的 是 ， 计 算 中 加 入 了 大 量 的 宛 余 度 。 例 如 ， 在 表 9.1 一 表 9.3 所 考虑 的 情况 
中 ,同位 素 标 记 代谢 物 分 布 、 分 子 量 分 布 以 及 NMR 谱 的 细微 结构 等 取决 于 两 个 参数 rz 和 
过 ， 这 些 测量 结果 中 的 任何 两 个 可 用 来 确定 未 知 参 数 zx 和 > ， 而 其 余 的 数据 则 可 用 来 检验 所 
得 出 的 过 和 >z 值 的 一 致 性 。 实 际 上 ， 一 个 较 好 的 方法 可 能 是 ， 将 全 部 测量 结果 用 于 对 两 个 
未 知 参 数 x Me 的 值 的 拟 合 ， 然 后 用 残 差 均 方 值 作 为 该 拟 合 一 致 性 的 量度 。 残 差 均 方 值 小 
则 表示 拟 合 良好 ， 值 大 则 意味 着 测量 结果 或 假设 的 生化 途径 存在 误差 。 倘 若 证 明 为 不 一 致 
时 ， 则 可 尝试 每 次 排除 一 个 不 同 的 实验 结果 ， 然 后 检验 用 其 余 测 量 结果 所 得 的 拟 合 的 一 至 
性 。 如 果 一 致 性 在 排除 一 个 实验 结果 后 有 明显 提高 ， 则 可 推测 该 被 排除 的 实验 结果 含有 过 失 
误差 ， 建 议 在 拟 含 时 不 子 考虑 。 如 果 没 有 任何 一 个 实验 结果 被 证 明 含 有 过 失误 差 ， 则 改变 相 
应 方程 推导 中 所 包含 的 生化 途径 ， 重 复 上 述 过 程 ， 直 到 获得 满意 的 拟 合 为 止 。 第 四 章 中 关于 
数据 一 致 性 分 析 的 步骤 可 有 力 地 用 于 光谱 学 数据 和 代谢 数据 的 协调 ， 以 及 准确 的 通 量 确定 。 
最 后 ， 应 注意 的 是 ， 该 方法 依赖 于 所 分 泌 代 谢 物 或 细胞 裂解 液 中 胞 内 代谢 物 的 测量 。 不 需要 
原 位 NMR 测量 和 为 此 目的 所 需 的 安排 。 

显然 ， 根 据 所 提出 的 分 析 ， 可 从 常规 NMR 数据 提取 大 量 的 信息 。 表 9.1 一 表 9.3 中 表 
达 式 的 可 利用 性 使 分 析 这 样 的 测量 结果 更 为 方便 。 然 而 ， 对 于 所 分 析 的 生化 途径 的 任 一 结 
构 ， 一 般 并 不 期 望 获得 同位 素 标 记 化 合 物 分 布 的 解析 解 。 很 可 能 的 是 ， 某 些 网 络 结构 将 不 服 
从 于 所 报道 的 严格 解析 解 类 型 。 在 这 种 情况 下 ， 同 位 素 标记 化 合 物 分 布 只 能 求 得 数值 解 。 有 
助 于 标记 转移 的 分 析 以 及 同位 素 标记 化 合 物 分 布 计算 的 合适 的 计算 机 程序 在 使 从 实验 获得 的 
信息 最 大 化 ， 以 及 提供 最 优 的 实验 设计 等 方面 将 是 非常 有 价值 的 〈 见 Schmidt et al, 
1997a) 。 这 种 软件 也 将 有 助 于 一 组 代谢 的 、 光 谱 学 的 及 其 它 的 数据 与 代谢 途径 结构 拟 合 最 好 
的 试 差 研 究 (schmidt et al，1997b ) 。 


【 例 9.3】 哺乳 动物 中 的 丙酮 酸 利用 

前 面 建 模 概念 的 有 效 性 ， 可 通过 比较 模型 预测 值 与 实验 数据 来 检验 。Chance 等 人 
(1983) 用 90% 富 集 的 [3-BC] 丙酮 酸 注 和 人 鼠 的 心脏 组 织 ， 得 到 的 BC-NMR 谱 表 明 : 在 谷 
氨 酸 的 C-2，C-3 及 C-4 上 有 共振 和 谱 线 分 裂 (A913), FAM C-2 共振 分 成 9 条 谱 线 
[中 心 在 $$.Sppm (10-5) 处 ]，C-4 共振 分 成 3 条 谱 线 [中 心 在 34.2ppm (10-5) Ab], i 
C-3 共振 分 成 5 条 谱 线 [集中 在 27.8ppm (10-5) 处 ]。 谱 线 分 裂 是 由 碳 原子 中 的 BC-HC A 
were 5] 2H. 

在 采用 90% BH [3-3C] 丙酮 酸 作为 底 物 的 情况 下 ， 则 需 推导 出 可 能 的 同位 素 标记 化 
合 物 的 新 分 布 图 以 及 类 似 于 表 9.1 一 表 9.3 中 关于 同位 素 标记 化 合 物 相对 浓度 的 表达 式 。 应 
强调 的 是 ， 它 们 与 100% 富 集 度 时 的 情况 是 不 同 的 。 如 果 不 把 正确 的 丙酮 酸 标记 考虑 进去 ， 
则 将 会 导致 严重 的 错误 。 

可 分 别 在 C-3 和 C-2 标记 丙酮 酸 和 乙酰 辅酶 A， 或 者 不 标记 。 如 果 碳 酸 氢 盐 是 未 标记 
的 ， 则 由 标记 丙酮 酸 经 回 补 反应 生成 的 草 酰 乙酸 将 在 C-3 被 标记 ; 如 果 碳 酸 氢 盐 是 标记 的 ， 
则 草 酰 乙酸 将 在 C-3 和 C-4 被 标记 。 然 而 ， 如 果 碳 酸 氢 盐 是 未 标记 的 ， 则 在 草 酰 乙 酸 库 中 出 

227 


现 的 将 是 从 未 标记 的 丙酮 酸 生 成 的 未 标记 草 酰 乙 酸 ; 如 果 碳 酸 氢 盐 是 标记 的 ， 则 出 现 的 将 是 


同位 素 标记 化 合 物 O0;:， 草 酰 乙 酸 的 7 个 同位 素 标记 化 合 物 : O. O3, Ou. O4. Or, OU 及 | 
O [最 后 3 个 是 由 于 碳 (2、3) WR (1、4) 之 间 的 平 衔 而 产生 的 ]， 可 以 在 TCA 循环 中 


与 标记 的 〈 在 C-2) 和 未 标记 的 乙酰 辅酶 A 缩合 形成 森 檬 酸 。 在 稳 态 下 ， 草 酰 乙 酸 库 中 存在 
12 种 草 酰 乙酸 同位 素 标记 化 合 物 : Oy. Or. O3, O34. Ov. Ox. O13. Ong, O123F] Onzy3 相应 
th, GABE PAZ 16 种 同位 素 标记 化 合 物 : G. Gy. Gis. Gi. Gig, Go. Gy. G3, Gy, 
Gz. Gy34. Go3. Gy34. Gia, Grol  Gi230 

图 9.13 FP, NMR 谱 出 现 多 重 谱 线形 式 是 与 关于 不 同 同位 素 标记 化 合 物种 类 的 巴 预测 相 
符合 的 。C-2 处 的 9 个 谱 线 分 裂 是 下 列 之 和 : 由 Gol Gp 产生 的 一 个 单 谱 线 (两 条 不 同 的 单 
ABI). A Glzs 和 Gliz 引 起 的 双重 谱 线 〈 耦 合 常数 为 ji) 、 由 Gz34 和 Gz3 引 起 的 双重 谱 线 


SU $$ 


rt (G10 20)A5 (ON AT Re eT St 


CU a nT TS 


| G(0.001) | 


G(0.006 LIM ttle anieeear oe 
Gii(0.012 a 
Gj3(0.008 COE rr SPC ae Rb “TO TE et 


fn ri ata 


图 9.13 采用 9%0% [3-BC] 丙酮 酸 时 观察 到 的 谷 氨 酸 的 多 重 谱 线形 式 [MA Chance et al (1983) ] 
x 的 值 估计 为 0.35。 括 弧 中 的 数字 为 相应 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 浓度 。 
多 重 谱 线 中 每 条 线 的 强度 应 是 已 被 谱 线 数 规范 化 的 相对 浓度 


228 


; 

| GBR BBA Jos) UR Gras Al Gilt DAR, PNR A A HR 
| 和 常数 Jiz(53.5Hz) 和 Ja (34.6Hz) 不 同 。 因 为 这 种 不 同 ， 由 Girsy Al Glzs 引 起 的 C-2 处 
的 谱 线 分 裂 是 四 重 线 ， 而 由 Glz34 和 Gaz34 引 起 的 C-3 处 的 谱 线 分 裂 是 三 重 线 。 由 于 J23 和 Ja 
的 值 类 似 ， 该 三 重 线 的 强度 比 为 1:2:1。 由 于 相同 的 原因 (J2z =Jsa4)， 同 位 素 标记 化 合 物 
Gis. Gos. Gu 及 Ga 在 C-3 处 提供 了 相同 的 双重 线 。 这 样 ，C-3 处 的 5 个 谱 线 分 裂 就 是 下 
列 之 和 : 由 G3 和 Gi 引 起 的 单 谱 线 ， 由 .Gltza、Gz、Gla 和 Ga 引起 的 双重 谱 线 ， 以 及 由 
@ 坟 和 G2a4 引 起 的 三 重 谱 线 。 同 样 地 ， 谱 线 分 裂 应 是 : C-4 处 3 条 谱 线 ，C-L 处 3 条 谱 线 ， 
C.5 处 没有 。 这 样 ， 所 有 谷 氨 酸 共振 处 的 NMR 谱 细微 结构 与 对 不 同 谷 氨 酸 同位 素 标 记 化 合 
物种 类 的 预测 是 相 一 致 的 。 


0.4 


相对 同位 素 标记 化 合 物 分 布 


0 0.2 0.4 0.6 0.8 


图 9.14 在 90%[3-83C] 丙 酮 酸 情况 下 作为 x 的 函数 的 w- 酮 成 二 酸 同 位 素 标记 化 合 物 的 分 布 
存在 16 种 同位 素 标记 化 合 物 。 假 设 除 了 图 9.8 中 描述 的 反应 外 ， 没 有 产生 CO， 
的 反应 ， 则 > 作为 过 的 函数 惟一 求 得 
每 条 线 的 强度 与 同位 素 标记 化 合 物 浓度 之 和 成 比例 ， 这 些 浓 度 贡 献 于 相应 谱 线 分 裂 〈( 双 
重 谱 线 、 三 重 谱 线 或 四 重 谱 线 ) 且 被 谱 线 数 归 一 化 。 人 例如， 在 由 Gyo Fl Gilz 引 起 的 C-2 处 的 
229 


双重 谱 线 中 ， 每 条 线 的 强度 与 ([Giz] + [Gi])/2 成 正比 ， 此 处 [Gi] WG, 的 浓度 。 通 过 
运用 模型 ， 从 z 的 值 (从 TCA 循环 中 出 去 的 草 酰 乙 酸 分 数 ) 和 y 的 值 (固定 到 SC 标记 两 
酮 酸 上 的 碳酸 氧 盐 分 数 )， 决 定 NMR 谱 线 强度 的 谷 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 分 布 可 被 
惟一 计算 。 假 设 除 了 图 9.8 中 所 描述 的 那些 反应 外 ， 不 存在 产生 CO; 的 反应 ，y AAT A x 
值 惟一 确定 。 图 9.14 中 显示 了 16 种 谷 氢 酸 同位 素 标记 化 合 物 在 不 同 z 值 时 的 相对 浓度 预 
测 值 。 

由 于 图 9.13 中 NMR 谱 线 的 强度 可 由 谷 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 的 相对 浓度 《其 本 身世 
是 分 数 z 的 函数 ) 来 惟一 预测 ， 因 此 ， 可 从 NMR 谱 的 细微 结构 获取 通 量 信息 。 谷 氨 酸 C- 
2、C-3 或 C-4 碳 原子 上 三 个 共振 中 的 任何 一 个 都 可 用 来 确定 zx， 而 其 它 两 个 可 用 来 确证 所 
得 的 x 估计 值 。 表 9.4 给 出 了 根据 图 9.13 的 NMR 谱 估 计 出 的 线 强度 比 。 采 用 一 次 仅 一 个 
碳 原子 共振 的 方法 时 所 得 到 的 z 值 与 全 部 三 个 共振 时 用 于 计算 所 得 到 的 最 小 二 乘 估计 值 近 
似 相等 ， 而 且 等 于 0.35。 相 应 的 y 值 为 0.26。 表 9.4 给 出 了 对 这 些 zx y 值 计 算 所 得 的 线 
强度 比 。 

与 实验 数据 令 人 满意 的 一 致 性 支持 了 模型 化 方法 论 的 有 效 性 。C-2 上 的 实验 数据 与 理论 


预测 之 间 的 差异 可 用 线 强 度 比 估计 中 的 不 确定 性 来 解释 。 线 强度 比 是 根据 图 9.13 发 表 的 ， 
NMR 谱 来 估计 的 。 应 该 注意 的 是 ，z =0.35 时 ， 算 得 的 线 强 度 比 是 在 实验 误差 范围 内 。 在 ， 


HA [3-BC] 两 氨 酸 的 鼠 离 体 肝脏 中 ， 也 得 到 了 类 似 于 谷 氨 酸 和 谷 氨 酰胺 中 的 多 重 谱 线 模 
xt (Hall et al, 1988). 


39.4 根据 图 9.13 NMR 谱 的 线 强 度 确定 分 数 x 


G2 
S/D 12 月 更 S/Q 
NMR 谱 
A 4.20+0.3 0.73+0.i 1.95+0.3 
z=0.35 
4.13 0.81 1.97 
C3 
To 
NMR if 
+ 
exits 1.3#0.1 
123 
C4 
S/D 
NMR 谱 
+ 
aes 0.5+0.2 
0.5 


TE: z 的 最 好 估计 值 是 0.35。 和 斜体 的 值 表示 对 z 的 估计 值 计 算 的 线 强 度 比 。S，D ，T 分 别 为 单 谱 线 、 双 重 谱 线 、 
三 重 谱 线 (全 部 三 条 线 ) 的 强度 ，DDi 为 耦合 常数 为 万 的 双重 谱 线 强 度 。 


【 例 9.4】 大 肠 杆菌 (Escherichia coli) 中 的 乙酸 利用 
Walsh 和 Koshland (1984) 从 以 [2-8C] 乙酸 盐 为 惟一 碳 源 生 长 的 瓦 .Coii 得 到 了 纯 
化 的 谷 氨 酸 3-C NMR 谱 ( 见 图 9.15)， 它 显示 了 在 C-1 有 一 双重 谱 线 ， 在 C-2 有 6 条 谱 线 ， 
在 C-3 有 一 个 三 重 谱 线 以 及 C-4 有 一 双重 谱 线 。 该 模式 与 乙 醛 酸 支 路 (模型 工 ) 的 运行 是 一 
致 的 ， 并 严格 符合 表 9.2 的 预测 。 
在 这 种 情况 下 ， 只 有 一 个 变量 x ， 其 基本 上 决定 每 个 峰 的 以 及 每 个 峰 内 每 条 谱 线 的 相对 
230 


60 55 50 45 40 35 30 


6/ppm 


图 9.15 采用 [2-BC] 乙酸 为 碳 源 时 观测 到 的 谷 氮 酸 多 重 谱 线 模式 
[ 改 自 Walsh 和 Koshhand (1984) ] 
C-2 处 的 峰 有 6 RMA, WHR Gza4 引 起 的 一 双重 谱 线 ， 每 条 线 的 强度 为 0.15; 
以 及 由 Ga4 引 起 的 一 四 重 谱 线 ， 每 条 线 的 强度 为 0.05， 因 此 ，QZD =2/3。lppm=10- 


强度 。>z 被 定义 为 经 乙 醛 酸 支 路 所 利用 异 森 檬 酸 的 概率 (或 者 ， 乙 醛 酸 支 路 中 异 柠檬 酸 的 利 
用 分 数 ，TCA 循环 中 的 转化 平衡 )。 根 据 Walsh fl Koshland (1984) 的 研究 ， 胞 内 谷 氮 酸 $ 
RF EAA BEM C-1 至 C-5 分 别 为 0.4:1.050.9:1.0:0。 模 型 预测 C-2=C-3=C- 
4=1, MC-5=0, C@5RBAR—-RM, MC1I=(1-z2)2. HCINLWAI4KAB 
式 ， 可 求 得 = 等 于 0.2。 这 与 Walsh A Koshland (1984) 应 用 基于 中 间 代 谢 物 碳 输入 -输出 
平衡 的 复杂 方法 所 估计 的 值 相同 。 

由 于 考虑 了 中 间 代 谢 物 的 所 有 同位 素 标 记 化 合 物 而 不 仅仅 是 在 特定 代谢 物 碳 位 的 同位 素 
富 集 度 ， 因 此 ， 模 型 结果 也 可 准确 地 解释 所 获得 的 NMR 谱 的 细微 结构 。 即 使 标记 示意 图 
( 见 图 9.11) 显示 有 多 达 6 种 w- 酮 成 二 酸 同 位 素 标记 化 合 物 存在 ， 表 9.2 的 结果 表明 ， 在 稳 
态 下 ， 只 有 两 种 w- 酮 成 二 酸 应 当 存 在 : 相对 浓度 为 (1-2) 289 Kyoxy (BK Gro) 和 相对 浓 
FEA (1+ 2)/269 Koss (或 G234)。 可 用 类 似 于 9.2.1 节 中 [3-83C] 丙酮 酸 情况 的 方式 来 分 
析 多 重 谱 线 模式 。 特 别 有 趣 的 是 C-2 处 的 模式 。 这 时 ，Gi2z34 应 在 C-2 处 产生 每 条 线 强 度 为 
(1—2)/A=0.1 的 四 重 谱 线 ， 而 Gosh TE C-2 处 产生 每 条 线 强度 为 (1+ =) 人 =0.3 的 双重 
谱 线 。C-2 共振 的 各 个 峰 缺 少 强 度数 据 ， 因 此 ， 这 些 预测 值 不 能 直接 与 图 9.15 的 结果 进行 
比较 。 然 而 ， 比 较 各 个 峰 的 高 度 ， 可 以 看 出 ， 实 验 值 与 预测 值 一 般 是 一 致 的 。 同 样 也 可 分 析 
C-3、C-4 共振 的 强度 ， 虽 然 它 们 没有 包含 有 关 通 量 比 ze 值 的 任何 信息 ， 但 非常 符合 前 面 的 
模式 。 

证 实 细菌 中 的 乙 醛 酸 支 路 运行 的 另 一 个 实验 是 用 99% (1-5C] 乙酸 进行 的 。 在 这 种 情 
况 下 ， 也 可 根据 = 来 求 得 谷 氨 酸 的 同位 素 标记 化 合 物种 类 。 应 只 有 两 种 出 现 ( 见 表 9.3): 
相对 浓度 分 别 为 (1+ z)/ 和 (1=- >z)Z2 的 G5s 和 Gilis。 因 此 ， 谷 氨 酸 的 富 集 度 应 是 C-l 为 (1-- 
2)/2.C-5 为 1,C-2,C-3,C-4 没 有 。 这 恰恰 是 在 下 .coli PRARARA RK (Crawford et al, 
1987) 以 及 在 Brevibacterium flavum 中 的 谷 氨 酸 合成 (Walker 和 London, 1987) 中 观测 

231 


到 的 。 由 于 Crawford & (1987) 所 采用 的 系统 与 Walsh #l Koshland (1985) 所 采用 的 系统 
类 似 ， 因 此 ， 可 以 假设 z 值 都 为 0.2， 从 而 得 出 谷 氢 酸 C1 富 集 度 的 估计 值 为 0.40。 根 据 
Crawford 等 人 (1987) 报道 的 波谱 ， 可 以 估计 C-1 谷 氨 酸 富 集 度 为 30% ， 与 模型 预测 还 是 
相当 一 致 的 。 


【 例 9.5】 细菌 中 的 乙 醛 酸 支 路 与 TCA 循环 

z 的 值 表 示 经 乙 醛 酸 支 路 转化 的 异 柠檬 酸 分 数 ， 可 通过 三 个 涉及 运用 GC-MS 和 
BC NMR 的 独立 方法 来 确定 。 第 一 ， 正 如 Walsh 和 Koshlad (1984) 所 做 的 ， 可 以 使 用 从 
氨 酸 C-1 处 的 相对 富 集 度 。 该 方法 要 求 对 已 知 标准 进行 额外 测量 ， 以 便 建 立 将 绝对 峰 强 度 转 
换 为 相对 富 集 度 所 要 求 的 校正 标准 。 第 二 ， 在 C-2 峰 内 ， 四 重 谱 线 (Q ) 与 双重 谱 线 (D) 
的 比 可 用 来 根据 表 9.3 HAZE x 值 。 


D- {2 
图 9.1$ 已 给 出 ， 比 值 (Q/D) 为 243， 由 此 用 式 1) 得 出 zx 等 于 0.2， 该 结果 与 按 方法 三 


(1) 


得 到 的 结果 相同 。 第 三 ，GC-MS 可 用 来 测量 具有 不 同 分 子 量 〈 相 差 一 个 原子 质量 单位 ) 的 ， 


同一 代谢 物 的 分 数 。 在 Walsh Fl Koshland (1984) 的 例子 中 ，GC-MS 应 对 谷 氢 酸 产生 两 个 

峰 ， 一 个 对 应 于 分 子 量 (M +3)， 而 另 一 个 对 应 于 `(M+4)， 此 处 M 表示 所 有 碳 原子 都 

为 2C 的 谷 氨 酸 的 分 子 量 。 谷 氨 酸 同位 素 标记 化 合 物 G?34 的 分 子 量 为 (M +3)、Gl234 的 分 子 
量 为 (M+4)， 因 此 (M+3) 与 (M+4) ZEW 
M+3 1+> 

M+4 1-2z (2) 

类 似 地 ， 在 采用 [1-8C] 乙酸 盐 情 况 下 ，>z 的 值 可 通过 两 种 不 同 的 方法 求 得 : 根据 BC 

NMR 测量 的 每 个 碳 原子 的 相对 富 集 度 ， 以 及 根据 GC-MS 测量 的 (M+2) 与 (M+1T) 之 比 。 


9.3 Ber hy 


在 大 代谢 网 络 中 ， 详 尽 列 出 所 有 的 同位 素 标记 代谢 物 是 很 困难 的 。 当 缺少 有 关 同 位 素 标 
记 化 合 物 的 分 子 量 或 NMR 细微 结构 的 信息 时 ， 这 简直 是 不 必要 的 。 通 常 ， 仅 仅 总 的 同位 素 
BEE (或 强度 ) 连同 同位 素 标 记 实 验 一 起 测量 ， 而 且 在 不 增加 全 部 同位 素 标记 化 合 物 列举 
和 平衡 的 复杂 性 情况 下 ， 也 可 分 析 这 些 数据 。 在 这 一 节 里 ， 将 阐述 直接 使 用 代谢 物 碳 平衡 和 
原子 作 图 矩阵 来 分 析 同 位 素 强度 数据 的 两 个 方法 。 

9.3.1 HERES 

由 于 该 方法 包括 总 代谢 物 平衡 以 及 网 络 代谢 物 的 每 个 碳 原子 的 平衡 ， 因 此 ， 它 是 相当 直 
接 明 了 的 。 这 样 对 每 个 碳 原子 的 命运 都 作 了 解释 ， 而 且 也 可 确定 某 个 代谢 物 的 特定 碳 原子 的 
富 集 度 。 我 们 将 通过 在 戊 糖 磷酸 途径 (PPP) 上 的 应 用 来 说 明 这 个 方法 。 

图 9.16 所 示 为 描述 戊 糖 磷酸 途径 的 示意 。 正 如 第 二 章 中 提 到 的 ，PPP 有 一 条 氧化 支 
路 ， 其 起 始 于 Glec6P (6- 磷 酸 葡萄 糖 ) WA, AEM 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 ， 然 后 经 过 两 个 以 
上 的 反应 ， 形 成 5- 磷 酸 核糖 ， 用 于 RNA 和 DNA 核 苷 酸 糖 的 生物 合成 。 

— Glc6P — 2NADP* — HO + ribose-5-phosphate + 2NADPH + 2H* +CO,=0 
(5-BR ARM ) 
232 


CH, OH 


HO 
6- 磷酸 葡 2NADPH | 
萄 糖 OH an OH | 5- 磷 酸 核 酮 糖 
HO OH 


| 一 人 


CHO H-® 
HO 
CH, OH 
CH-D) 
rt HO 
a ) 
CHO ¥ 
coe a 
2 


图 9.16， 具有 独立 碳 原 子 图 例 的 戊 糖 磷酸 途径 


由 于 大 多 数 细胞 需求 NADPH 比 5- 磷 酸 核糖 多 ， 因 此 ， 过 量 的 核糖 可 通过 转 酮 酶 和 转 醛 酶 
作用 下 的 酮 糖 单位 和 醛 糖 单位 转移 而 又 转化 回来 成 为 糖 酵 解 中 间 产 物 。PPP 的 非 氧化 支 路 
的 净 总 和 为 : 
— 3(ribose-5-phosphate ) +2(fructose-6-phosphate) + glyceraldehyde-3-phosphate = 0 
(6- 磷 酸 果 糖 ) (3- 磷 酸 甘 油 醛 ) 

PPP 反应 的 化 学 计量 在 也 总 结 在 表 10.1 中 。 通 过 中 心 碳 代谢 的 通 量 分 析 要 求 准 确 计 算 
PPP 中 碳 被 氧化 的 数量 ， 以 及 所 产生 的 用 于 细胞 生物 合成 的 还 原 力 。 正 如 10.1 节 中 证 实 的 
一 样 ， 总 物质 平衡 可 以 给 出 通过 该 途径 的 净 通 量 估 计 值 以 及 PPP 与 糖 酵 解 途径 之 间 的 通 量 
分 布 。 然 而 ， 获 得 对 通 量 分 配 比 (通过 物质 平衡 确定 ) 以 及 PPP 关键 反应 〈( 即 转 酮 酶 反应 
和 转 醛 酶 反应 ) 的 可 逆 性 程度 的 估计 的 独立 确认 是 非常 需要 的 。 如 下 所 示 ， 这 可 以 通过 标记 
葡萄 糖 的 引入 以 及 所 选 PPP 中 间 代 谢 物 的 同位 素 强度 测量 来 实现 。 

首先 ， 从 图 9.16 中 代谢 物 库 的 平衡 开始 。 应 注意 的 是 ，6- 磷 酸 葡 萄 糖 与 6- 磷 酸 果糖 之 
间 的 异 构 酶 反应 以 及 戊 糖 磷酸 库 之 间 的 异 构 酶 和 差 向 异 构 酶 反应 是 很 快 的 ， 并 假设 处 于 平衡 
233 


态 ， 因 此 ， 将 网 络 中 的 己 糖 〈H6P) AH CRSP) 设想 为 一 个 单一 库 : 


dcH6p _ 


人 《9.31a) 
Re | 
qe = V1 204 V6~ V7 (9.31b) 
SCP = 249 — 09+ v4 vst U6 (9.31c) 
en (9.31d) 

5 = 中 4 一 os (9.31e) 


在 稳 态 下 ， 阁 假设 用 于 核 苷 酸 合成 的 成 糖 磷酸 库 的 消耗 可 以 忽略 不 计 ， 则 上 述 等 式 可 简化 为 
下 列 关系 式 : 
1 三 3zuw0 (9.32a) 


v2=(1-x) v9 (9.32b) — 


v3=(2-2x) v9 (9.32c) — 


U4= U5 = U6=XVO (9.32d) 
上 述 等 式 中 的 z 值 表示 进入 成 糖 磷酸 途径 的 己 糖 通 量 分 数 。 代 谢 物 平衡 仅 指 通过 该 
途径 的 总 通 量 ， 还 没 考虑 可 逆 性 的 任何 度量 。 可 以 看 出 ， 通 过 非 氧 化 反应 途径 的 净 通 量 是 
相等 的 , 并 且 当 z 等 于 1 时 ， 所 有 输入 的 己 糖 都 流 经 成 糖 磷酸 途径 。 这 样 ， 根 据 式 
(9.32c), v3=vo, MA BIA Imo 已 糖 ， 就 产生 lmol 的 丙酮 酸 。 结 果 ， 己 糖 的 一 半 释 放 
为 CO。 
当然 ， 前 面 的 模型 也 可 通过 引入 标记 葡萄 糖 作为 底 物 ， 并 测量 一 个 或 几 个 戊 糖 磷 酸 途 径 ”。 
中 间 代 谢 物 的 标记 分 布 来 检验 。 为 了 有 助 于 解释 这 种 标记 数据 ， 必 须 写 出 代谢 物 碳 平 衡 式 以 
描述 网 络 中 所 考虑 的 每 个 碳 原子 的 总 平衡 。 这 些 平衡 在 表 9.5 中 给 出 ， 对 应 于 图 9.17 PR 
于 戊 糖 磷酸 途径 (PPP) 非 氧化 反应 的 碳 转移 图 式 。 进 一 步 注意 到 ， 对 于 每 个 PPP 非 氧化 
反应 ， 假 设 是 完全 可 逆 的 ， 因 此 ， 每 个 净 反 应 是 正 反应 (v;) ABR (v;) 的 复合 。 
惯例 ， 正 反应 和 逆反 应 都 用 正 号 来 表示 。 净 反应 的 符号 〈 由 正 、 赣 反应 的 相对 大 小 决定 ) 表 
示 净 通 量 是 正 反 应 方向 〈 正 号 ) ， 还 是 逆反 应 方向 〈 负 号 )。 由 于 与 糖 酵 解 中 间 产 物 进 行 的 碳 
原子 交换 ， 反 应 可 逆 性 可 导致 标记 进一步 重新 分 布 ， 而 且 必 须 为 全 面 说 明 同 位 素 标记 模式 而 “ 
考虑 。 对 成 糖 磷酸 途径 三 个 非 氧 化 性 反应 可 逆 性 的 考虑 需要 三 个 额外 的 未 知 量 来 描述 这 种 可 
逆 性 程度 ， 或 交换 速率 向 。 对 于 一 个 正 的 净 反 应 速率 ， 吕 就 定义 为 正 反 应 速率 与 净 通 量 之 
#: CG =v) —v, =v; 。 由 于 交换 速率 直接 影响 中 间 代 谢 物 的 标记 模式 ， 因 此 它们 是 很 重要 
的 。 此 外 ， 当 产生 从 总 代谢 物 平 衡 决 定 的 相同 净 通 量 时 ， 它 们 可 以 发 生 很 显著 变化 。 对 前 面 
3 个 反应 引入 交换 速率 ， 使 得 表 9.5 的 方程 中 的 所 有 反应 速率 可 表示 为 净 PPP 通 量 〈 等 于 
xvy) 和 3 个 交换 速率 的 函数 : 
v4 =(xvot C4) (9 .33a) 
vs = 04 (9.33b) 
234 


| vs 三 (Zu0 二 55) (9.33c) 


| vs =—f5 (9.33d) 
| v6 =(xvo9t &6) (9.33e) 
新 hh Ete Be (9.33f) 


显然 ， 净 PPP 通 量 和 交换 速率 的 确定 需要 测量 标记 分 布 。 有 很 多 识别 方法 可 用 于 这 种 
确定。 最 简单 的 方法 是 如 图 9.7 所 示 的 试 差 法 ， 它 是 以 PPP 通 量 和 交换 速率 的 一 些 初始 推 

测 值 开 始 ， 通 过 求解 表 9.5 的 线性 方程 组 ， 从 而 对 一 给 定 的 标记 底 物 (已 糖 ) 确定 标记 分 
布 。 通 过 与 同位 素 强度 测量 值 进行 比较 ， 重 新 调整 初始 推测 值 ， 并 重复 计算 过 程 ， 直 到 收敛 
为 止 。Mathematica 或 Maple 中 的 标准 程序 可 用 来 求解 。 采 用 该 方法 时 应 记 住 两 点 。 第 一 ， 
这 实质 上 是 对 一 个 非 线 性 代数 方程 组 进行 求解 的 问题 。 因 此 ， 它 可 能 对 解 的 初 值 敏感 。 第 
三 ， 测 量 强度 的 选择 是 最 终 解 质量 的 关键 ， 或 甚至 完全 是 得 到 解 的 关键 。 这 一 点 将 进一步 详 
细 说 明 。 

表 9.5 ” 戊 糖 磷酸 途径 的 代谢 物 碳 平衡 


Hexose(1) H6P(1) S7P(1) H6P(1) RSP(1) 
Hexose(2) H6P(2) S7P(2) H6P(2) R5P(2) 
dLHcP]- Hexose(3) Bet H6P(3) a5 S7P(3) iat H6P(3) 2 E4P(1) 
Hexose(4) H6P(4) G3P(1) H6P(4) E4P(2) 
Hexose(5) H6P(5) G3P(2) H6P(5) E4P(3) 
Hexose(6) H6P(6) G3P(3) H6P(6) E4P(4) 
H6P(2) RSP(1) S7P(1) S7P(3) RSP(1) H6P(1) 
H6P(3) R5P(2) S7P(2) S7P(4) R5P(2) H6P(2) 
dRSP} _ ,, H6P(4) | —2v¢ | RSP(3) | + vs |G3P(1) | + vg |S7P(S) | — v¢ | RSP(3)| + ve |G3P(1) 
H6P(5) R5P(4) G3P(2) S7P(6) R5P(4) G3P(2) 
H6P(6) RS5SP(5) G3P(3) S7P(7) R5P(5) G3P(3) 
H6P(3) H6P(4) RSP(3) G3P(1) H6P(4) RSP(3) 
dCs?) -= 。， H6P(2) | + v2 | H6P(5) | + vg | RSP(4) | — (ug + vs + v6 + v3) |G3P(2) | + vs | H6P(5) | + v¢ 四 
H6P(1) H6P(6) RSP(5) G3P(3) H6P(6) R5P(5) 
S7P(4) E4P(1) H6P(3) 
d(E4P]__, | S7P(S) jo ex eeAe@ _ | H6P(4) 
de? loypcg)| °F * | egpcsy | * 7 | H6P(5) 
S7P(7) E4P(4) H6P(6) 
RSP(1) S7P(1) H6P(1) 
R5P(2) S7P(2) H6P(2) 
RSP(1) S7P(3) H6P(3) 
as7P] _ yy RSP(2) | - (vg + vd) |S7P(4) | + vs | E4P(1) 
R5P(3) S7P(5) E4P(2) 
R5P(4) S7P(6) E4P(3) 
RS5P(5) S7P(7) E4P(4) 


注 : Hexose 一 己 糖 。 
235 


7A BGR WATE SS RK L2-4C)] 葡萄 糖 和 胰岛 素 (或 没有 胰岛 素 ) BRORA - 
皮脂 肪 组 织 中 糖 原 的 &C 标记 分 布 《Landau and Katz，1964)。 表 9.6 给 出 了 相对 于 CIN 
UR (HOP) 碳 原子 的 比 活性 以 及 用 上 述 模型 和 求解 步骤 计算 的 结果 。 为 模型 预测 设置 了 两 星 
项 : 一 项 为 假设 3 个 PPP 反应 没有 可 逆 性 ， 另 一 项 为 完全 可 逆 。 可 以 看 出 ， 模 型 预测 值 与 
测量 强度 之 间 的 一 致 性 是 后 者 比较 好 ， 后 者 也 给 出 了 可 逆反 应 的 交换 速率 估计 值 。 表 9.7 总 量 
结 了 对 赖 氨 酸 生产 菌 C .glutaxzicxzza 成 糖 磷 酸 途 径 类 似 研 究 的 结果 (Marx et al，1996)。 
此 外 ， 假 设 反 应 没有 可 逆 会 对 4-BE RT BERR (上 E4P) 、 磷 酸 甘油 醛 (G3P) 及 其 它 产 物 的 碳 
富 集 度 预测 值 产 生 过 失误 差 。 这 可 通过 计 人 交换 速率 来 校正 ， 并 使 标记 富 集 度 预测 值 和 测量 而 
值 之 间 产 生 良 好 的 一 致 性 。 这 里 应 当 注 意 ， 仅 使 用 E4P 富 集 度数 据 并 不 足以 允许 可 逆反 应 | 
交换 速率 的 稳健 确定 。 这 可 通过 引入 3- 磷酸 核糖 富 集 度 数据 来 校正 〈 特 别 是 通过 从 细胞 材 
料 中 分 离 的 鸟 苷 衍生 物 而 测量 的 C-1 富 集 度 ) ，5- 磷 酸 核糖 富 集 度数 据 可 以 很 明显 地 将 一个 
未 确定 的 系统 转换 为 已 确定 的 系统 。 磷 酸 甘 油 醛 富 集 度 可 用 来 代替 RSP， 这 意味 着 有 好 几 
种 富 集 度 测量 的 组 合 ， 它 们 产生 于 一 个 可 观测 的 系统 。 类 似 地 ， 对 于 表 9.6 的 糖 原 结 果 ， 如 
果 用 G3P (通过 乳酸 所 测量 ) 来 代 蔡 糖 原 ， 则 将 产生 一 个 未 确定 的 系统 。 


转 酮 酶 (2z4) 1 
1 ] 
ie 1@ 
@ . et ry & " 
© (a Q D 
2) OQ) 5 4 (P) 
(P) 7 
ee ee 3A ERE = 7- RRR RN 
转 酮 酶 (z5 ) 
] ] 
1 
@ 
| 向 
Q 
E) oe 3 中 十 
Y vs 4Q 
@ G 6 
7 ED) 
(P) 
7- PE EAR 3-H THRE 4- BERRA OE 6- BERR 
FE AIR (Uc) ' 
1 
1 a 1 
@ e i 28 - 
€) 4 U6 4 
5 OQ 6 
@ 
5- 磷 酸 木 酮 精 4- 磷 酸 赤 蕉 粮 3- 磷 酸 甘 油 醋 6- 磷 酸 果 粮 


t 转移 了 两 个 碳 或 三 个 碳 
单位 的 碳 原子 


@ 全 ” 反 应 代谢 物 的 碳 原子 


图 9.17 磷酸 成 糖 途径 反应 中 的 碳 转移 示意 
236 


| 
] 
| 
| 表 9.6 XB [(2-“c] 葡萄 糖 的 HOP HMC 标记 数据 


武 验 的 比 活性 4C 

Se 
Lek 
模型 :没有 可 逆 性 2.5 
[aE 


TE: 实验 值 与 假设 转 酮 酶 反应 和 转 醛 酶 反应 没有 可 逆 性 和 有 可 逆 性 的 模型 预测 值 进行 比较 (Landau and Katz, 
1964)。 计 算 中 采用 zim- =0.13 Mx}. =0.23。 对 于 具有 可 逆 性 的 模型 ， 在 没有 或 存在 胰岛 素 的 情况 下 分 别 采用 下 列 参 
R: €,=0.5, ¢5=0.2, 56=0 和 54=0.8， 65=0.08, 56=0 


表 9.7 在 以 [1-BC] 葡萄 糖 为 底 物 的 恒 化 器 培养 中 ，Coryrebacteriuma glutamicum 中 的 4-RBRR 
(Ery4P) 和 3- 磷 酸 甘油 醛 (G3P) 的 3C 富 集 度 的 测量 值 和 估计 值 


TEAR TA C 位 上 SC BRE 


模型 1 


&,=€5= &=—0 5.2% 
模型 2 
&4=0.5,&5= 

15.6% 


&6= 
注 : 实验 值 与 假设 转 酮 酶 反应 和 转 醛 酶 反应 没有 可 逆 性 〈 模 型 1) MATH (模型 2) 的 模型 预测 值 进行 比较 
[Marx et al, (1996), Follstad and Stephanopoulos (1998) ] 。 


9.3.2 原子 作 图 矩阵 的 应 用 
对 同位 素 分 布 建 模 的 另 一 个 方法 可 避免 常规 分 析 的 几 个 缺点 ， 而 且 特 别 适 用 于 大 代谢 网 
络 。 在 这 个 方法 中 ， 原 子 作 图 矩阵 (AMMs) 被 用 来 描述 碳 原子 从 反应 物 到 产物 的 转移 
(Zupke and Stephanopoulos, 1994), AMMs 使 生化 网 络 的 细节 从 控制 同位 素 分 布 的 稳 态 方 
程 建立 中 得 到 解 斐 。 得 到 的 方程 式 易于 推导 、 修 改 及 求解 。AMMEs 的 方法 特别 适合 于 数据 
库 开 发 、 大 代谢 网 络 的 应 用 以 及 试 差 的 情况 ， 这 里 每 次 迭代 后 网 络 结构 要 修改 。 将 通过 使 用 
9.5 中 的 简单 生化 网 络 来 介绍 该 方法 。 
第 一 步 是 以 向 量 形式 表示 每 个 代谢 物 碳 原子 的 比 活性 〈 即 富 集 度 )。 一 个 代谢 物 向 量 的 
第 ”个 元 素 含 有 第 ”个 碳 的 比 活性 。 对 于 图 9.5 中 的 反应 网 络 ， 建 立 下 列 代谢 物 向 量 : 
Pyr(1) 
Pyr(2) |; 
Pyr(3) 
Hex(1) 
Hex(2) 
Hex = F : AcCoAy =| 
Hex(5) 
Hex(6) 


Pyr= AcCoAT = | (9.34) 


AcCoA ; (1) | 
AcCoA | (2) 


ey 


AcCoA q (2) “pes 


237 


采用 向 量 符号 ， 一 个 代谢 物 的 所 有 碳 原子 可 以 清楚 而 又 简洁 的 形式 表示 。 

下 一 步 是 对 代谢 网 络 中 的 反应 构建 原子 作 图 矩阵 。 这 些 和 矩阵 描述 原子 从 反应 物 至 产物 的 
转移 。 对 于 每 个 反应 ， 每 个 反应 物 -产物 对 将 有 一 个 作 图 和 矩阵。 例如， 考虑 包括 两 个 反应 物 
A 和 也 ， 两 个 产物 C 和 了 ， 并 由 酶 下 催化 的 一 个 普通 反应 : 


A+B<sC+D (9.36) 


反应 将 有 4 个 作 图 矩阵 描述 碳 原子 从 A 到 C、A 到 D、B 到 C 及 B 到 D 的 转移 。 用 
带 有 下 标 为 酶 名 (或 反应 名 ) 的 方 括号 来 表示 每 个 反应 的 作 图 矩阵 ， 方 括号 内 表示 的 是 特定 
的 反应 物 - 产 物 对 ， 并 用 一 个 符号 > 分 开 (以 表示 方向 )。 这 样 ， 反 应 样本 中 的 4 个 作 图 矩阵 
如 下 : 
[A>Cle 描述 碳 原子 从 A 到 CC 的 转移 
[A>D]p 描述 碳 原子 从 A 到 D 的 转移 
[B>Cle 描述 碳 原子 从 B 到 C 的 转移 
[B>DJj]s 描述 碳 原子 从 B 到 D 的 转移 
原子 作 图 矩阵 这 样 构建 ， 使 得 反应 物 的 比 活性 向 量 与 AMM 的 乘积 可 以 详细 说 明 反 应 
物 对 产物 比 活性 向 量 的 贡献 。 所 得 产物 的 比 活 性 是 每 个 反应 物 的 贡献 之 和 : 
[A>C]pA+[B>C]pB=C (9.37) 
[A>D]-A+[B>D]-B=D (9.38) 
作 图 和 矩阵 的 维 数 是 由 反应 物 -产物 对 中 的 碳 原子 数 决定 。 列 数 等 于 反应 物 中 的 碳 原 子 数 ， 
而 行 数 等 于 产物 中 的 碳 原子 数 。 作 图 和 矩阵 第 ; 行 和 第 ) 列 的 元 素 说 明 反 应 物 第 7 个 碳 衔 生 为 
产物 第 ; 个 碳 的 数量 。 通 常 ， 反 应 物 碳 到 产物 碳 的 作 图 是 有 限 的 和 惟一 的 ， 因 此 ， 作 图 和 矩阵“ 
的 元 素 通常 为 0 或 1。 但 分 数 元 素 也 是 可 能 的 。 
返回 到 样本 代谢 网 络 ， 并 对 该 系统 构建 作 图 和 矩阵， 反应 1 BAA ARAB (PDH) 
催化 的 ， 丙 酮 酸 为 惟一 反应 物 ，AcCoAT 和 CO, 为 两 个 产物 。 在 这 个 分 析 中 ,不 把 COE 
为 可 测量 的 代谢 物 计 人， 因此 ， 只 需要 一 个 作 图 和 矩阵: [Pyr>AcCoA, jepaia 可 知 ， 丙 酮 酸 
的 第 1 个 碳 原子 转化 为 CO， 而 第 2、3 个 碳 原子 分 别 转化 为 AcCoAT 的 第 1、2 碳 原子 ， 这 
就 得 到 下 面 的 作 图 矩阵 。 | 


(9.39) 


Of BRD 
[Pyr>AcCoA ]ppy = | 


OF Ol 
如 果 AcCoA, RMA MARAT HH, UNE AY HOT HORE ea PG 


0 Pyr(1) Bless 
[Pyr >AcCoA |ppuPyr = Pyr(2) = yr 
(\ y | Pyr(3) Pm) 
4 ho a pans 
VN 2)} deat 


然而 ， 在 库 1 和 库 开 之 间 也 存在 AcCoA 的 转移 ， 因 此 ， 式 (9.40) 不 能 完全 确定 AcCoA] 
的 比 活性 。 
反应 2 为 AcCoA 从 库 工 至 库 下 的 运输 ， 并 用 trans 工 表示 。 而 反应 3 为 AcCoA ME II 
至 库 工 的 运输 ， 并 用 trans I] Ha. HF AcCoAT 和 AcCoAT 中 的 碳 原子 可 直接 相互 作 图 ， 
Flt, [AcCoA ; >AcCoAT ] .TI 和 [AcCoAT >AcCOA 7 Jerans | ABA 2X 2 MARLEE: 
238 


1: 
[AcCoA ; >AcCoA g Jrrans | = LAcCoAy >AcCoA 1 Jeans fl = ( ie (9.41) 


终 反应 是 反应 5S， 即 己 酸 氧化 为 AcCoAT ， 用 Box 表示 ， 有 一 个 原子 作 图 矩阵 。 己 酸 的 
应 氧 化 成 对 移 去 碳 原子 而 生成 3 个 AcCoA 分 子 。 己 酸 的 奇数 碳 原 子 因 转化 为 AcCoAT 难以 
区 分 ， 因 此 ， 它 们 在 矩阵 [Hex >AcCoAy jsox 中 的 系数 为 1/3， 并 且 对 偶数 碳 原子 也 是 如 
it. 将 奇 、 偶 数 碳 原子 分 别 对 AcCoAy 的 碳 1， 碳 2 作 图 ， 得 到 : 

7 04 0 5.0 
[Hex >AcCoA g J gx = (9.42) 
iit cdei.gas A 

所 有 必需 的 原子 作 图 和 矩阵 构 已 经 建 好 并 可 用 来 建立 稳 态 同位 素平 衡 式 。 进 入 一 个 代谢 物 
的 标记 通 量 仅仅 是 作 图 矩阵 与 反应 物 比 活 性 向 量 用 相应 的 反应 通 量 加 权 后 的 乘积 之 和 。 对 于 
AcCoA | ， 两 个 有 贡献 的 反应 是 通 量 为 wl 的 PDH 以 及 通 量 为 vw? & trans: 

进入 AcCoA ; 的 通 量 : 

li[Pyr>>AcCoAT |ppyPyr + v3L AcCoAy >AcCoAT ] ITAcCoAI (9.43) 
流出 AcCoA, 的 标记 通 量 : 
(v2 + v4)AcCoA 1 (9.44) 
两 式 [ 式 (9.43) 和 式 (9.44) ] 相等 得 出 AcCoA 的 稳 态 同位 素平 衡 : 

(v2+ ud4)AcCoAT =wli[Pyr>AcCoAT |ppyPyr + v3L AcCoAq >AcCoAT Jrrans] ACCoA 4 
(9.45) 
类 似 地 ，AcCoAT AY a ASIF i RF 

(v3+ v6) AcCoA q = v2[ AcCoA | >AcCoA y Jeans t ACCoA 1 + vs[ Hex >AcCoAy ] goxHex 

(9.46) 

(9.45) 和 式 (9.46) 等 价 于 例 9.2 的 式 (3), HK (4). HK (7) MH (8), EM 
通过 分 别处 理 每 个 原子 而 得 出 的 。 在 像 本 例 这 类 小 网 络 中 ， 这 两 种 方法 的 复杂 程度 是 相同 
的 。 然 而 ， 对 于 较 大 网 络 ， 特 别 是 那些 很 多 代谢 物 具 有 3 个 以 上 碳 原 子 的 网 络 ， 构 建 原 子 作 
图 矩阵 和 以 抢 阵 形式 列 出 稳 态 平衡 式 将 得 到 更 具 代 表 性 的 简洁 方程 组 。 此 外 ， 如 果 有 关 碳 原 
子 从 反应 物 到 产物 的 转移 方式 的 新 信息 可 以 获取 ， 则 只 要 改变 描述 受 影 响 反 应 的 原子 作 图 矩 
阵 即 可 。 这 是 相当 直接 的 ， 而 且 不 需 新 的 代数 学 。 

通过 使 用 原子 作 图 矩阵 描述 代谢 网 络 中 同位 素 分 布 的 方程 组 可 借助 计算 机 迭代 求解 。 这 
要 求 对 底 物 碳 原 子 的 比 活性 设置 初始 值 〈 对 于 分 数 富 集 度 ， 则 设置 为 0 一 1 之 间 的 值 ) ， 并 提 
供 一 组 一 致 的 通 量 值 。 然 后 ， 按 序 求解 每 个 稳 态 方程 ， 得 到 输出 代谢 物 的 活性 ， 重 复 此 过 
程 ， 直 到 达到 收敛 为 止 。 本 质 上 ， 这 等 价 于 用 Gauss-Seidel 方法 求解 As=b。 所 有 和 矩阵 都 是 
小 的 ， 而 且 不 需 矩 阵 变换 。 因 此 ， 即 使 对 非常 大 的 生化 反应 该 方法 在 计算 上 并 不 需要 费 很 大 
功夫 。 

类 似 于 原子 作 图 矩阵 ， 也 可 以 构建 同位 素 标 记 化 合 物 作 图 矩阵 来 描述 生化 反应 中 的 同位 
素 标 记 化 合 物 的 转化 。 当 要 分 析 复 杂 代谢 网 络 时 ， 这 些 和 矩阵 与 同位 素 标记 化 合 物 分 布 向 量 都 
是 非常 有 用 的 ， 但 本 书 将 不 处 理 这 些 复杂 网 络 ， 而 且 仅 提 及 Schmidt 等 人 (1997a, b) 的 研 
究 。 对 于 怎样 构建 这 些 矩 阵 ， 以 及 在 分 析 复 杂 代 谢 网 络 方面 的 应 用 ，Schmidt 给 出 了 详细 的 
叙述 。 


239 


参考 文 献 


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240 


Te 


第 10 章 ， 代谢 通 量 分 析 的 应 用 


前 面 两 章 叙 述 了 胞 内 代谢 通 量 的 测定 方法 ， 以 及 它们 在 提供 细胞 代谢 状态 的 全 面 情 况 方 
面 的 重要 性 。 应 该 强调 的 是 ， 代 谢 通 量 是 细胞 生理 学 的 最 基本 的 量度 。 与 胞 内 代谢 物 浓度 一 
起 ， 为 解释 代谢 通 量 控制 的 复杂 机 理 〈 即 代谢 工程 的 中 心 要 素 ) 提供 了 必需 的 信息 。 就 这 点 
而 论 ， 代 谢 通 量 分 析 并 不 是 简单 地 做 一 下 和 抢 阵 变换 的 数学 练习 ， 而 是 要 试图 获得 细胞 状态 最 

全 面 的 状况 ， 其 与 测 得 的 胞 内 通 量 、 同 位 素 标记 分 布 、GC-MS 以 及 其 它 特 定 的 探查 反应 的 
数据 相 一 致 。 更 应 注意 的 是 ， 胞 内 通 量 估计 作为 实际 体内 代谢 通 量 的 可 靠 度量 标准 ， 而 被 接 
受 的 程度 取决 于 带 入 计算 中 的 宛 余 度 。 应 谨慎 对 待 仅 从 相等 数量 的 代谢 物 平 衡 代 数 式 计 算 所 
得 的 胞 内 通 量 ， 这 是 因为 它们 完全 取决 于 假设 的 生物 化 学 和 胞 外 代谢 物 测 量 结果 的 精确 性 。 
另 一 方面 ， 计 算 的 代谢 通 量 是 相应 的 活体 内 胞 内 通 量 的 更 可 靠 量 度 ， 所 计算 的 通 量 也 与 直接 
取决 于 通 量 的 额外 物理 量 的 测量 相 一 致 。 这 些 物 理 量 包括 : 在 胞 内 或 胞 外 代谢 物 特定 碳 位 上 
BC 标记 的 富 集 度 、 代 谢 物 NMR 谱 的 细微 结构 、 由 于 标记 碳 同 位 素 而 产生 的 代谢 物 分 子 量 
分 布 等 。 

本 章 将 对 两 个 代谢 通 量 分析 实 例 展 开 研 究 。 这 些 实例 的 目的 有 三 个 方面 。 首 先 ， 它 们 可 
用 来 检验 读者 对 所 提出 的 概念 和 计算 步骤 的 理解 程度 。 为 了 有 助 于 这 种 练习 ， 在 大 多 数 情况 
下 ， 给 出 了 足够 信息 ， 以 便 可 以 独立 确定 通 量 ， 以 及 可 与 本 章 中 报道 的 结果 进行 比较 的 其 它 
参量 。 如 果 所 需 的 数据 量 太 大 而 不 能 包含 在 本 书 中 ， 这 种 情况 下 ， 将 为 遗漏 的 信息 提供 足够 
的 参考 文献 。 这 些 例子 的 第 二 个 目的 是 说 明 怎 样 通过 代谢 通 量 分 析 来 提升 实验 信息 的 水 平 ， 
以 便 更 深入 地 了 解 细胞 的 代谢 状态 ， 然 后 提出 进一步 实验 的 有 用 建议 。 在 许多 情况 下 ， 从 原 
始 测量 结果 获取 的 额外 信息 与 派生 实验 的 结果 一 起 ， 并 不 只 是 对 原始 发 酵 数据 进 行 代谢 通 量 
分 析 所 要 求 的 勉强 够 格 的 工作 的 补偿 。 最 后 ， 所 述 方法 论 的 步骤 可 以 作为 类 似 研 究 计划 的 蓝 
图 ， 这 类 研究 方案 的 目的 ， 在 于 识别 代谢 网 络 中 的 关键 分 支点 和 最 可 能 限制 产物 得 率 及 生产 
能 力 的 反应 。 

在 文献 中 ， 人 们 可 以 发 现代 谢 网 络 分 析 的 很 多 其 它 实例 研究 ， 例 如 ， 对 于 下 列 一 些 
系统 。 

@ 用 丝 状 真菌 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum) 生产 青霉素 。 该 系统 已 被 Jorgensen 
等 人 (1995) 和 Henriken $A (1996) 分 析 过 ， 他 们 应 用 代谢 通 量 分析 (MFA) 来 计算 流 加 
和 连续 培养 期 间 的 代谢 通 量 分 布 。 此 外 ， 他 们 用 MFA 计算 了 导向 半 胱 氨 酸 的 不 同 生物 合成 
途径 〈 半 胱 氨 酸 是 青霉素 生物 合成 的 前 体 ) 的 最 大 理论 得 率 。 在 分 析 中 ， 他 们 发 现 了 经 过 戊 
糖 磷酸 途径 的 通 量 与 青霉素 生产 之 间 的 相关 性 。 他 们 的 模型 是 第 一 个 考虑 胞 内 分 区 的 实例 ， 
即 ， 该 模型 在 胞 质 反 应 和 线粒体 反应 之 间 进 行 了 区 分 。 

@ 酿酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的 厌 氧 生长 。 此 系统 已 由 Nissen 等 人 (1997) 
分 析 过 ， 他 们 分 析 的 通 量 示 意图 之 一 示 于 图 8.1。 除 了 计算 代谢 通 量 分 布 之 外 ， 他 们 还 应 用 
MEFA 来 分 析 S . cerevisiae 中 各 种 同 工 酶 的 可 能 作用 。 在 他 们 的 分 析 中 也 考虑 了 胞 内 分 区 ， 
并 证 实 了 这 实际 上 可 以 解释 乙醇 脱 氢 酶 的 同 工 酶 的 作用 。 

@ 酿酒 酵母 (S. cerevisiae) 在 葡萄 糖 /乙醇 混合 物 上 的 生长 。 此 系统 已 由 Van Gulik 

241 


和 Heijnen (1995) 研究 过 ， 他 们 采用 线性 规划 来 估计 在 不 同和 葡萄糖/ 乙醇 混合 物 上 生长 时 的 ， 
通 量 ， 并 证 实 了 当 乙 醇 分 数 增 大 时 ， 糖 异 生 通 量 升 高 。 

© Kitt (Escherichia coli) 的 生长 。Palsson 小 组 对 此 系统 进行 了 广泛 的 研究 ， 其 
中 一 些 结果 在 例 8.8 中 已 讨论 过 。 

所 有 这 些 案例 研究 将 为 学 生 的 训练 形成 一 个 良好 的 基础 ， 与 此 类 似 的 更 为 详细 的 讨论 将 
在 下 面 两 个 所 处 理 的 案例 中 进行 。 


10.1 由 谷 妥 酸 细 菌 生 产 须 基 酸 


在 商业 上 ， 最 重要 的 天 冬 氨 酸 族 氨基 酸 就 是 赖 氨 酸 。 在 大 多 数 动物 饲料 谷物 ， 诸 如 瑟 
米 ， 大 米 ， 以 及 小 麦 中 发 现 它 数量 有 限 。 因 此 ， 这 些 谷物 的 营养 价值 可 通过 补充 外 部 赖 氨 酸 
而 得 以 显著 提高 。 起 初 ， 赖 氨 酸 是 从 和 蛋白质 水 解 产 物 中 分 离 的 ， 而 现在 则 是 采用 廉价 碳 源 。 
利用 微生物 发 酵 大 规模 生产 。 已 经 分 离 出 了 大 量 可 以 分 沁 赖 氨 酸 和 谷 氨 酸 的 微生物 。 作 为 三 
类 ， 把 这 些 细 菌 称 为 谷 氨 酸 细菌 。 虽 然 这 类 细菌 似乎 跨越 几 个 不 同 的 类 ， 但 已 经 发 现 这 种 分 
类 是 未 经 授权 的 ， 而 且 大 多 数 谷 氢 酸 菌 可 以 分 类 在 Corynebacterium sensu stricto 属 。 研 究 
CARH, BARE (Brevibacterium flavum) 应 当归 类 为 谷 氨 酸 棒 杆 菌 (Corynebac- : 
terium glutamicum )。 在 本 章 ， 将 使 用 后 者 名 称 来 描述 用 于 天 冬 氨 酸 族 氨基 酸 生 产 的 所 有 
微生物 。 

本 章 的 分 析 将 集中 在 赖 氨 酸 的 过 量 生 产 上 ， 并 特别 强调 得 率 和 生产 能 力 问 题 。 对 于 像 赖 
氨 酸 这 类 的 大 体积 、 低 附加 值 产 品 ， 这 两 个 有 价值 的 数值 即使 是 轻微 的 提高 ， 在 经 济 上 也 是 
很 关键 的 。 根 据 报道 ， 基 于 葡萄 糖 的 工业 摩尔 得 率 在 30% ~ 40% 的 范围 。 由 于 理论 得 率 估 
计 高 达 75% ( 见 10.1.2 节 )， 因 此 ， 还 有 相当 大 的 提高 余地 。 为 了 判别 各 种 因子 在 改善 赖 年 
氨 酸 发 酵 特性 中 的 重要 性 ， 提 出 了 下 列 步骤 作为 系统 工作 的 一 部 分 。(a) 确定 碳 源 〈 如 葡萄 
糖 ) 转化 为 赖 氨 酸 的 理论 得 率 。(b) 进行 标准 的 通 量 分 析 以 及 选择 性 的 扰动 发 酵 ， 以 便 对 作 
为 产物 得 率 决 定 因子 的 不 同 代谢 分 支点 的 重要 性 按 优先 顺序 进行 排队 。(c) 证 实 使 用 的 标记 © 
化 合 物 和 突变 株 的 特殊 遗传 背景 ， 以 区 分 两 条 可 能 的 回 补 途径 。(d) 严密 分 析 恒 化 器 及 其 它 
数据 ， 评 价 合成 反应 和 分 解 反 应 对 限制 性 碳 前 体 的 竞争 结果 。(e) 说 明 通 量 分 析 在 鉴别 转 氢 
酶 活性 中 的 应 用 ， 以 及 在 平衡 生物 合成 还 原 当 量 中 的 作用 。 

10.1.1 谷 氨 酸 菌 的 生物 化 学 与 调节 

表 10.1 给 出 了 描述 谷 氨 酸 菌 生物 化 学 时 所 考虑 的 所 有 反应 的 综合 清单 。 关 于 支持 表 
10.1 中 所 述 生 物化 学 的 已 测 酶 活性 证 据 ， 可 查阅 J.J.Vallino 的 博士 论文 及 其 所 列 的 参考 文 
献 。 可 以 找 出 主要 的 葡萄 糖 加 工 、 氮 吸收 及 产物 合成 途径 。 这 样 ， 表 10.1 构建 了 一 个 基础 
框架 ， 并 具有 各 种 变化 GAM TCA 循环 中 乙 醛 酸 文 路 的 运行 等 )， 其 中 首先 分 析 基 本 情况 ， 
各 种 变化 将 在 后 面 研究 。 

表 10.1 BABA (Corynebacterium glutamicum) 代谢 模型 中 包括 的 生化 反应 


谷 氨 酸 棒 杆 菌 的 生物 化 学 代谢 物 积累 速率 向 量 


PEP: 葡 萄 糖 转移 酶 系统 (1) AC 乙酸 
(1) GLC + PEP=GLC6P + PYR (2) ACCOA 乙酰 辅酶 A 


(3) AKG ax- 酮 成 二 酸 
贮存 化 合 物 :海藻 糖 (4) ALA AAR 
(2) GLC6P +0.5ATP=0.5TREHAL + 0.5ADP (5) ASP RAAB 


(6) ATP 腺 苷 -5 -三 磷酸 


242 


4 ABE HT RE 
EMP 途径 

(3) GLC6P = FRU6P 

(4) FRU6P + ATP = 2GAP + ADP 

(5) GAP + ADP + NAD= NADH + G3P + ATP 
(6) G3P = PEP + H,O 

(7) PEP + ADP=ATP+PYR 

(8) PYR + NADH=LAC + NAD 


回 补 反应 :PEP 羧 化 酶 
(9) PEP+ CO =OAA 


TCA 循环 

(10) PYR + COA + NAD= ACCOA + CO, + NADH 
(11) ACCOA + OAA + H,O= ISOCIT + COA 

(12) ISOCIT + NADP = AKG + NADPH + CO, 

(13) AKG + COA + NAD=SUCCOA + CO, + NADH 
(14) SUCCOA + ADP=SUC + COA + ATP 

(15) SUC + HO + FAD= MAL + FADH 

(16) MAL + NAD=OAA + NADH 

乙酸 生成 或 消耗 

(17) ACCOA + ADP=AC+COA+ ATP 


SAR GAR AAR BAR K 

(18) NH; +AKG + NADPH =GLUT + H,0 + NADP 

(19) GLUT + NH; + ATP=GLUM + ADP © 

(20) PYR+ GLUT= ALA + AKG 

(21) 2PYR + NADPH + GLUT = VAL + CO, + H,O + NADP + AKG 


磷酸 戊 糖 途径 
(22) GLC6P+HO+2NADP=RIBU5P+ COz+2NADPH 


(23) RIBUSP = RIBSP 

(24) RIBUSP= XYLSP 

(25) XYLSP + RIBSP = SED7P + GAP 

(26) SED7P + GAP = FRU6P + E4P 

(27) XYLS5P + E4P = FRU6P + GAP 

氧化 磷酸 化 :P/D=2 

(28) 2NADH + O, + 4ADP = 2H,0 + 4ATP + 2NAD 

(29) 2FADH + O, + 2ADP = 2H20 + 2ATP + 2FAD 

KA ARAB 

(30) OAA+ GLUT = ASP + AKG 

(31) ASP + PYR + 2NADPH + SUCCOA + GLUT + 
ATP=SUC + AKG + CO; + LYSI + 2NADP + 
COA + ADP 

(32) LYSI=LYSE 

生物 质 合成 :Ci.% ,H6.46,O1.% ,No.34s,3.02% 灰 分 

(33) 0.021GLC6P + 0.007FRU6P + 0.09RIBSP + 

0.036E4P + 0.013GAP + 0.15G3P + 0.052PEP + 

0.03PYR + 0.332ACCOA + 0.08ASP +0.033LYSI 


代谢 物 积累 速率 向 量 
(7) BIOMAS ”生物 质 
(8) CO; 二 氧化 碳 
(9) E4P 4- 磷 酸 赤 从 糖 
(10) FADH 还 原型 黄 素 腺 味 叭 二 核 苷 酸 
(11) FRU6P 6- 磷酸 果糖 
(12) G3P 3-Be RH Th 
(13) GAP 3-Be MR H wth RE 
(14) GLC 葡萄 糖 
(15) GLC6P 6- 磷酸 葡萄 糖 
(16) GLUM BK 
(17) GLUT BAR 
(18) ISOCIT 。 蜡 柠 样 酸 
(19) LAC 乳酸 
(20) LYSE 赖 氨 酸 , 胞 外 的 
(21) LYSI 赖 氨 酸 , 胞 内 的 
(22) MAL 苹果 酸 
(23) NADH 还 原型 烟 酰 胺 腺 嗓 叭 二 核 苷 酸 
(24) NADPH ”还 原型 烟 酰胺 腺 味 叭 二 核酸 磷酸 
(25) NH3 氢 
(26) O, 氧 
(27) OAA 草 酰 乙酸 
(28) PEP 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 
(29) PYR 丙酮 酸 
(30) RIBSP 5- 磷 酸 核 糖 
(31) RIBUSP 5- 磷酸 核 酮 糖 
(32) SED7P 7- 磷 酸 景 天 庚 酮 糖 
(33) SUC TAR 
(34) SUCCOA “琥珀 酰 辅 酶 A 
(35) TREHAL 海藻 糖 
(36) VAL Sl AR 
(37) XYLSP 5- 磷酸 木 酮 糖 


续 表 


243 


续 表 


谷 氨 酸 棒 杆 菌 的 生物 化 学 
+0.446GLUT + 0.025GLUM + 0.054ALA + 0.04VAL 
+0.052THR+0.01SMET + 0.043LEU + 3.82ATP + 
0.476NADPH + 0.312NAD = BIOMAS + 3.82ADP + 
0.364AKG + 0.476NADP + 0.312NADH 

+0.143CO, 

(34) ATP= ADP + P; 


代谢 物 积累 速率 向 量 


对 于 表 10.1 中 所 述 的 生物 化 学 ， 有 一 些 重 要 的 地 方 应 了 以 注意 。 

(a) 好 几 次 ， 序 列 反应 已 通过 消除 中 间 代 谢 物 而 归并 为 一 个 单一 反应 步骤 。 例 如 ， 
EMP 途径 的 反应 4 就 是 这 种 情况 ， 反 应 4 SRR. 1,6 RRR. 
酸 两 糖 异 构 酶 等 反应 归并 的 。 这 种 归并 减少 了 反应 步 数 ， 而 不 会 影响 所 得 的 通 量 结果 。 归 并 
的 反应 假设 按 相 同 〈 稳 态 ) 速率 进行 ， 并 且 假 设 中 间 代 谢 物 处 于 稳 态 。 

(b) 将 PEP 羧 化 酶 反应 [反应 〈9)] 表示 为 一 个 代表 性 的 总 回 补 反应 ， 而 不 是 “单独 ” 
的 回 补 反应 。 事 实 上 ， 丙 酮 酸 羧 化 酶 、 异 柠檬 酸 裂 解 酶 和 苹果 酸 合成 酶 的 组 合 、 苹 果 酸 酶 、 
OAA 脱羧 酶 以 及 PEP 羧 激酶 等 反应 与 其 它 可 能 性 一 道 ， 已 被 建议 为 这 些 细菌 的 回 补 途径 。 
准确 的 反应 尚 在 争论 ， 本 节 部 分 篇 幅 将 试图 确认 其 性 质 。 

(c) 由 于 天 冬 氢 酸 酶 的 活性 很 小 或 没有 ， 且 丙 氨 酸 脱 氢 酶 和 亮 氨 酸 脱 氢 酶 尚未 检测 出 ， 
因此 ， 和 匀 吸 收 主要 是 通过 谷 氨 酸 脱 氢 酶 和 谷 所 酰胺 合成 酶 来 实现 的 。 此 外 ， 在 发 酵 实 验 中 使 
用 的 高 铵 离子 浓度 条 件 下 ，GSVMGOGAT 铵 同化 途径 被 认为 是 不 起 作用 的 。 在 这 些微 生物 中 
所 检测 的 五 个 氨基 转移 酶 中 ， 仅 天 冬 氨 酸 转氨酶 就 占 总 转氨酶 活性 的 90% 以 上 。 


(d) 赖 氨 酸 合成 途径 的 细节 如 图 9.4 所 示 。 除 了 四 步骤 的 内 消 旋 二 氮 基 庚 二 酸 (zzeso- 


DAP) 途径 外 ， 又 证 实 了 四 氢 吡 啶 二 羧 酸 (H4D) 直接 转化 为 meso-DAP 的 另 一 途径 。 这 
两 条 途径 似乎 支持 显著 的 碳 通 量 。 

(e) 表 10.1 中 也 列 出 归并 的 方程 式 ， 并 与 已 确定 的 代谢 物 得 率 系 数 一 起 表示 生物 质 合 
成 。 代 谢 物 得 率 系数 与 测量 的 C. glutamicum 的 元 素 组 成 相 匹配 ， 元素 组 成 为 : C， 
47.6%; O, 31.0%; N, 11.8%; 灰分 ，3.02%。 

(f) BAB. flavum 的 呼吸 链 中 可 能 存在 三 个 能 量 耦 合 位 点 ， 但 在 C. glutamicum 
中 ， 似 乎 只 有 两 个 位 点 改变 质子 位 置 。 因 此 ， 使 PZMO 比 等 于 2。 为 了 解释 维持 需要 和 无 效 
循环 ， 对 于 过 量 ATP 的 耗 散 反应 (34) 已 经 包括 在 内 。 然 而 ， 应 注意 的 是 ， 由 于 它们 的 不 
确定 性 ， 能 量 平 衡 并 不 用 于 通 量 确定 。 将 它 简单 地 包括 在 内 ， 只 是 为 了 估计 发 酵 过 程 中 过 量 
能 量 的 可 用 性 及 可 能 的 能 量 限制 。 

(g) 葡萄 糖 运 输 是 通过 磷酸 转移 酶 系统 ， 并 伴随 有 PEP 转化 为 丙酮 酸 。 在 不 存在 丙酮 
酸 羧 化 活性 时 ， 这 对 理论 得 率 特别 是 对 苏 氨 酸 的 生产 具有 深远 的 影响 。 

(h) 在 方程 组 中 不 包含 转氨酶 (THD) 反应 ， 这 是 由 于 起 初 并 没有 检测 出 其 活性 。 这 
种 省 略 会 导致 在 某 些 突变 株 中 以 及 THD 的 最 终 实验 验证 中 违背 关于 NADPH (通过 一 致 性 
分 析 检 测 的 ) 的 稳 态 假设 。 

图 10.1 概括 了 赖 氨 酸 生产 途径 的 调控 。 在 赖 氨 酸 合成 中 ， 天 冬 氢 酸 激酶 (AK) 是 一 个 
关键 酶 ， 它 受 苏 氨 酸 与 赖 氨 酸 的 协同 -多 价 -反馈 抑制 ， 但 单独 受 其 中 一 个 氨基 酸 的 抑制 不 明 
显 。 第 1 个 赖 氨 酸 生产 菌株 是 高 丝氨酸 脱 氢 酶 (HDH) 活性 缺乏 的 ， 即 ， 不 能 合成 苏 氨 酸 
(如 ATCC 21253 菌株 )。 它 们 因此 可 以 积累 高 浓度 的 赖 氨 酸 ， 而 不 存在 反馈 抑制 ， 只 要 培 

244 


养 基 中 补充 有 足够 的 高 丝氨酸 或 苏 氨 酸 加 蛋氨酸 ， 这 些 都 是 该 菌 种 自己 不 能 合成 的 。 鉴 于 过 
量 的 苏 氨 酸 会 导致 赖 氨 酸 合成 中 断 及 细胞 生长 重新 开始 ， 因 此 ， 这 种 补充 必须 仔细 保持 平 
| 衡 。 最 近 的 赖 氢 酸 发 酵 过 程 大 多 是 采用 AK 对 反馈 抑制 不 敏感 的 C. glutamicum 菌株 ， 其 
可 以 积累 高 浓度 的 赖 氨 酸 。 这 样 的 菌株 ， 例 如 ATCC 21799 菌株 等 ， 由 于 其 对 不 可 代谢 的 
| MARKUM S-(2- 氨 乙 基 )-L- 半 胱 氨 酸 (AEC) 的 反馈 抑制 的 抗 性 ， 被 称 为 抗 AEC 菌株 。 
“ 另 一 个 调控 点 是 ASA 分 支点 后 的 第 1 个 酶 ， 即 高 丝氨酸 脱 氢 酶 ， 其 受 苏 氨 酸 强烈 抑制 和 异 
误 氨 酸 的 微弱 抑制 ， 也 受 蛋 氨 酸 的 阻 遇 。 有 文献 报道 ， 在 Biaoum 中 ， 高 丝氨酸 脱 氢 栈 
是 一 个 别 构 酶 。 在 更 为 最 近 的 突变 株 中 ， 高 丝氨酸 脱 氢 酶 活性 已 被 减弱 到 这 样 一 个 水 平 ， 即 
可 以 内 源 性 地 供给 足够 的 苏 氨 酸 和 蛋氨酸 的 下 游 氨基 酸 ， 但 又 低 得 足以 防止 它们 积累 到 抑制 
东平 。 因 此 ， 在 这 种 菌株 中 ， 含 苏 氨 酸 培养 基 的 生物 反应 器 进 料 控制 已 由 等 效 的 苏 氨 酸 和 和 蛋 
氨 酸 总 供给 的 遗传 调节 所 代替 。 由 于 这 些 氨基 酸 的 供给 限制 这 些 菌 株 的 生长 ， 因 此 ， 后 者 已 
被 称 为 bradytzropjhis ， 即 生长 缓慢 生物 体 。 


天 冬 氨 酸 


缩写 : AspP—KA ARB R ; 
ASA—KAZ ABE ; 
Leu— AR; 
Homo 一 高 丝氨酸 ; 
Met 一 蛋氨酸 ; 
Thr 一 苏 氨 酸 ; 
Jle 一 异 亮 氨 酸 ; 
DDP 一 二 氢 吡 啶 二 羧 酸 ; 
MDAP 一 消 旋 -c ,e- 二 氨基 庚 二 酸 


图 10.1 Corynebacterium glutumicum 中 天 冬 氨 酸 族 氨基 酸 的 调控 
调节 酶 是 : @ 天 冬 氨 酸 激酶 ; @ 二 氢 吡 啶 二 羧 酸 合成 酶 ; @) 高 丝氨酸 脱 氢 酶 ; 四 二 氨基 庚 二 酸 脱 羧 酶 。 
实 线 表示 抑制 〈- ) 或 激活 〈+ )， 虚 线 表示 阻 遇 (-) 或 诱导 (+) 
10.1.2 理论 得 率 的 计算 
理论 得 率 可 以 根据 底 物 转化 为 产物 的 总 反应 式 来 计算 ， 或 根据 考虑 辅助 因子 的 更 详尽 的 
平衡 式 来 计算 ， 或 根据 生物 反应 网 络 的 理论 通 量 分 析 来 计算 。 本 节 将 对 赖 氨 酸 生物 合成 举例 
说 明 这 些 方法 。 首 先 要 强调 两 点 ， 第 一 ， 这 三 种 方法 应 得 到 同样 的 结果 ， 第 二 ， 最 大 理论 得 
率 不 是 特定 产物 - 底 物 对 的 一 个 固有 性 质 〈 正 如 一 些 出 版 物 中 经 常 暗示 的 )。 相 反 地 ， 它 严格 
取决 于 促进 总 转化 的 特定 代谢 途径 。 
葡萄 糖 转化 为 赖 氨 酸 可 用 下 列 总 反应 式 来 表示 : 
-4aCgHi2O05 一 620 一 <cNH3s+ CH4N2O+wCO+eH2O=0 (10.1) 
反应 式 〈10.1) 中 5 个 化 学 计量 系数 中 的 4 个 可 根据 碳 、 氮 、 氢 及 还 原 度 的 平衡 来 确 
定 ， 得 到 : 
—[(4+ e) 4 JCoHi20¢6 — (e — 3)O2 — 2NH3 + Cs5Hy4N20> 
+ (e —2)CO2 + eH,0=0 (10.2) 
由 此 可 得 赖 氨 酸 的 摩尔 得 率 被 看 做 等 于 Y=6/ 上 4+e)。 氧 的 化 学 计量 系数 根据 基本 原 
理 是 不 可 确定 的 。 由 于 氧 不 会 有 净 产 生 ， 因 此 ，e 三 3。 对 于 e=3， 得 到 赖 氨 酸 的 最 大 化 学 
245 


计量 得 率 了 =0.857 (6/7) mol 赖 氨 酸 /mol 葡萄 糖 。 
当然 ， 上 述 计 算 没 有 考虑 任何 辅助 因子 要 求 。 换 句 话 说， 该 方程 式 为 赖 氨 酸 的 合成 提供 
了 足够 的 碳 、 氮 、 氢 及 氧 。 这 个 事实 并 不 意味 着 可 按 要 求 的 数量 获得 能 量 流 通 代 谢 物 和 还 原 
当量 ， 也 不 意味 着 满足 所 有 中 间 代 谢 物 的 平衡 。 理 论 得 率 计算 应 考虑 这 些 限制 。 
首先 列 出 表 10.1 中 主要 代谢 途径 的 总 化 学 计量 方程 式 。 


糖 酵 解 : -GLC+PEP+Pyr+2NADH+ATP=0 (10.3) 
PEP #2 (4b Ai : ~ PEP -CO,+OAA=0 (10.4) 
转氨酶 : -OAA-GLUT+ASP+AKG=0 (10.5) 
赖 氨 酸 途径 : -ASP-Pyr-2NADPH-GLUT=-2ATP 
+LYS+AKG+CO,=0 (10.6) 
BARAK : —NH;3- AKG —- NADPH + GLUT =0 (10.7) 
将 反应 式 (10.3)~sk (10.7) 加 和 ， 得 到 下 列 更 详细 的 赖 氨 酸 生物 合成 方程 式 : 
-GLC-4NADPH=-2NH3-ATP+LYS+2NADH=0 (10.8) 


由 此 可 见 ， 取 决 于 转氨酶 (THD) 活性 《使 NADH 可 逆 地 转化 为 NADPH) 是 否 存 
在 ， 合 成 lmol 赖 氨 酸 需要 额外 的 2mol 或 4mol NADPH。 这 反映 了 这 样 一 个 事实 ， 即 : 赖 
氨 酸 比 葡萄 糖 还 原 性 更 强 (与 葡萄 糖 的 还 原 度 4 比较 而 言 ， 还 原 度 为 4.67)。 所 需 的 
NADPH 主要 是 由 成 糖 磷酸 途径 供给 ， 在 碳 完全 氧化 的 条 件 下 ， 戊 糖 磷酸 途径 的 总 化 学 计量 
方程 式 如 下 。 
PPP 〈 完 全 氧化 途径 ) : — GLC6P + 6CO, + 12NADPH = 0 (10.9) 
在 葡萄 糖 是 由 激酶 运输 并 直接 磷酸 化 这 样 一 个 简单 情况 下 ， 上 述 方程 式 表 明 : 需要 额外 


的 146 或 1/3mol 葡萄 糖 来 为 赖 氨 酸 合成 反应 [如 (10.8)] 提 供 NADPH 还 原 当 量 ， 这 又 取决 和 


于 THD 活性 是 否 存 在 。 得 到 的 赖 氨 酸 摩尔 得 率 为 6 (=0.857) 或 68(=0.75)， 这 分 别 对 

应 于 总 转化 反应 中 e=3 或 e=4。 然 而 ， 要 考虑 的 另 一 个 情况 与 葡萄 糖 磷酸 转移 酶 系统 

(PTS) 有 关 ， 每 运输 lmol 葡萄 糖 进 细 胞 ， 需 将 lmol PEP 转化 为 丙酮 酸 : 
-GLC-PEP+GLC6P+Pyr=0 (10.10) 

可 将 方程 式 (10.3)、 式 (10.9) 和 式 (10.10) 都 乘 以 16， 并 与 赖 氨 酸 合成 方程 式 是 
(10.8) 相 加 ， 假 设 NADPH 和 NADH 由 THD 活性 等 价 ， 则 得 : 

— (8/6)GLC — 2NH; — (5/46)ATP + LYS + (1/3)Pyr + CO, + (13)NADH=0 
(10.11) 

只 要 不 发 生 使 丙酮 酸 转 化 为 OAA 的 丙酮 酸 羧 化 反应 ， 或 者 为 了 葡萄 糖 运 输 形 成 的 丙酮 
酸 循环 而 PEP 合成 酶 活性 不 存在 ， 则 上 述 方 程式 表明 理论 得 率 为 648=0.7$mol 赖 氨 酸 /mol 
葡萄 糖 。 之 所 以 这 样 ， 是 由 于 除 赖 氨 酸 合成 所 需 之 外 ， 任 何 额 外 产生 的 丙酮 酸 在 TCA 循环 
中 被 氧化 ， 而 且 对 产物 得 率 不 会 有 贡献 。 但 在 相反 情况 下 ， 所 合成 的 丙酮 酸 在 回 补 途 径 中 进 
一 步 羧 化 ， 从 而 增加 赖 氨 酸 的 生产 量 ， 但 也 改变 为 此 目的 所 需 的 NADPH 量 。 这 转 而 会 改 
变 为 合成 额外 的 NADPH 以 及 其 它 物质 而 在 PPP 途径 中 必须 氧化 的 葡萄 糖 量 。 可 以 容易 地 
看 出 ， 虽 然 理 论 得 率 的 这 个 直接 计算 方法 在 某 些 简单 情况 下 是 有 吸引 力 的 ， 但 当代 谢 产 物 在 
所 考虑 的 途径 中 被 循环 时 ， 这 会 导致 相当 复杂 的 计算 。 

一 个 更 一 般 的 方法 是 使 用 代谢 物 平 衡 : 根据 方程 式 (10.10)， 每 运输 lmol 葡萄 糖 进 人 
细胞 ， 要 消耗 lmol PEP， 并 产生 lmol 丙酮 酸 和 lmol GLC6P. ik a 是 PP 途径 中 完全 氧化 
的 GLC6P 的 分 数 (PP 途径 产生 12z mol NADPH), Jl] (1- xz) 是 糖 酵 解 中 被 分 解 代 谢 的 

246 


| 
eG: 
] 


ym, 对 于 总 共 (1-2z) 的 GLC6P， 将 产生 2 (1-2)mol PEP。 当 存在 THD 活性 ， 但 没 
ninth 可 根据 下 列 有 关 NADPH 的 平衡 确定 分 数 z。 

产生 的 NADPH:12z =2(1-2z) :消耗 的 NADPH (10.12) 

由 式 (10.12) 得 出 z=1X， 从 而 计算 出 理论 得 率 为 1-2z =0.75$。 当 丙酮 酸 羧 化 酶 反 

应 作为 另 一 回 补 途径 包括 在 内 时 ， 或 者 PEP 合成 酶 活性 可 以 使 通过 PTS 产生 的 过 量 丙酮 酸 

称 环 时 ， 则 引入 另 一 变量 y 来 表示 转化 为 PEP 的 两 醒 酸 量 。 该 转化 应 产生 等 量 的 PEP 和 两 

RD RRR ES AF [BAR 10.1, KM (31)], KHAA NADPH 平衡， 得 到 下 列 确 

定 过 和 >y 的 方程 式 。 

BMA PEP: (1-22+y)=(1-y): JBN Pyr (10.13) 

NADPH 平衡 :2(1-2z+y)=12z (10.14) 

求解 方程 式 (10.13) Ast (10.14)， 得 出 >= 工 =1/7， 赖 氨 酸 理论 得 率 为 0.8$7 (6/7). 

在 只 消耗 必要 的 葡萄 糖 产 生 NADPH 条 件 下 ， 该 理论 得 率 可 通过 完全 利用 所 有 可 利用 的 碳 来 获 

得 。 类 似 地 ， 当 THD 不 存在 时 ， 根 据 丙酮 酸 羧 化 酶 活性 是 否 补充 PEP 回 补 途 径 ， 理 论 得 率 分 


HA 0.75 和 0.60。 应 注意 的 是 ， 在 这 个 途径 中 ，ATP 需求 是 最 小 的 ， 且 容易 满足 。 
eee 
{ 0 缩写 ，Glc-6.-P_6 BER MAD ; 

葡萄 精 ee Gile-6-P Ribu-5-P Ribu-5-P—5-BEARE: RMR ; 
Fru-6-P 一 6- 磷 酸 果糖 ; 
Xyl5P 一 5- 磷 酸 木 酮 糖 ; 
Rib5P 一 5- 磷 酸 核 糖 ; 
Gap 一 3- 磷 酸 甘油 醛 ; 
E4P 一 4- 磷 酸 赤 从 糖 ; 
Sed-7-P 一 7- 磷 酸 景 天 庚 酮 糖 ; 
G3P 一 3- 磷 酸 甘 油 酸 ; 
Ala 一 两 所 酸 ; 
PEP 一 磷酸 烯 醇 丙酮 酸 ; 
Val—4il AR ; 
Pyr—W Bal R ; 
Lac 一 乳酸 ; 
AcCoA 一 乙酰 辅酶 A; 
Ac 一 乙酸 ; 
AsP 一 天 冬 氨 酸 ; 
Lysr 一 赖 氨 酸 CHA); 
Lysp—#i ARR ( 胞 外 ); 
OaA 一 草 酰 乙 酸 ; 
Mal 一 苹果 酸 ; 
Suc 一 琥珀 酸 ; 
i-Cit 一 异 柠檬 酸 ; 
ax-KG 一 a- 酮 戊 二 酸 ; 
SucCoA—Se FH Mt Hi MF A ; 
Glut—# AR ; 
Glum—#¥ & BEAK 


Lyse 生物 质 


图 10.2 ” 赖 氨 酸 摩尔 得 率 为 64% 时 的 理论 通 量 分 布 基于 表 10.1 中 模型 所 述 的 限制 
限制 是 由 于 丙酮 酸 激酶 的 不 可 逆 性 造成 的 。 由 于 TCA 循环 中 产生 额外 的 NADPH, 
所 以 64% 19 KiB et XP AY 60%, 51 Vallino (1991) 


247 


虽然 前 面 的 方法 无 疑 是 正确 的 ， 但 正如 有 关 PTS 复杂 性 方面 的 例子 完全 证 实 的 那样 ， 
它们 易 产 生 误 差 。 误 差 的 主要 来 源 在 于 部 分 途径 的 总 化 学 计量 关系 式 的 列 出 ， 以 及 中 间 代 谢 
物 和 通用 代谢 物 的 所 有 来 源 和 贮 库 的 考虑 。 此 处 所 述 的 步骤 建议 一 个 关于 代谢 物 平 衡 的 更 加 ， 
结构 化 的 方法 可 以 避免 这 些 问 题 ， 并 可 得 到 一 普遍 适用 的 正规 方法 。 代 谢 通 量 分 析 非 常 适 谷 | 
于 此 目的 。 在 得 率 计 算 模 式 中 ， 代 谢 通 量 分 析 (MFA) 的 目的 不 再 是 确定 内 部 代谢 通 量 ， 
因为 它们 的 大 部 分 值 已 被 设 定 以 保证 产品 得 率 最 大 。 这 时 MFA 的 目标 是 确定 一 些 通 量 分 配 
比 ， 从 而 在 产生 最 大 产品 的 网 络 中 所 有 的 代谢 物 平 衔 能 被 满足 。 例 如 ， 在 赖 氨 酸 途径 中 , 通 
过 设 定 生物 质 生 成 速率 为 零 ， 除 赖 氨 酸 之 外 的 所 有 其 它 分 泌 的 产物 (乙酸 、 乳 酸 及 海藻 糖 ) 
的 速率 也 为 零 ， 葡 萄 糖 吸收 速率 为 - 100， 赖 氨 酸 合成 速率 等 于 得 率 Y。 对 于 给 定 值 的 芯 ， 
总 共有 34 个 代谢 物 平衡 ， 可 以 求解 它们 来 确定 表 10.1 的 代谢 网 络 的 34 个 反应 的 通 量 。 

第 8 章 中 的 和 矩阵 方程 式 可 用 来 构建 和 方便 地 求解 表 10.1 中 赖 氨 酸 代谢 网 络 的 34 个 方程 
式 。 对 不 断 增 大 的 赖 氨 酸 得 率 求 出 理论 通 量 ， 直 到 出 现 不 可 能 的 通 量 分 布 为 止 。 对 于 没有 
THD 和 丙酮 酸 羧 化 酶 活性 的 网 络 来 说 ， 当 赖 氨 酸 得 率 接 近 60% ， 此 时 丙酮 酸 激 酶 (PK) 
通 量 达到 零 ( 见 图 10.2) ， 这 种 情况 就 会 发 生 。 零 PK 通 量 是 前 述 PTS 的 直接 结果 。 如 果 将 
PEP 合 成 酶 或 利用 产生 的 丙酮 酸 的 另 一 出 口 ( 像 丙 酮 酸 羧 化 酶 ) 加 入 到 反应 网 络 中 ， 则 当 


cae 


wh 


LysE 生物 质 
Al 10.3 赖 氨 酸 得 率 为 73% 时 的 理论 通 量 分 布 
得 率 极限 是 由 于 TCA 循环 通 量 的 限制 造成 的 。( 丙 酮 酸 激酶 不 可 逆 性 的 限制 被 放松 ) 引 自 Vallino (1991) 
248 


3 


赖 氨 酸 得 率 达 到 7$% 时 ， 会 出 现下 一 个 不 可 能 性 ， 此 时 受 TCA 循环 支持 的 通 量 降 为 零 ( 见 
图 10.3)。 进 一 步 增 大 得 率 会 导致 TCA 循环 通 量 为 负 值 。 因 此 ， 在 这 些 条 件 下 ， 赖 氨 酸 的 
最 大 理论 得 率 为 73% 。 如 果 再 把 转 氢 酶 活性 加 到 代谢 网 络 中 以 使 NADPH 5 NADH 相互 转 
化 ,那么 类 似 的 计算 得 出 赖 氨 酸 的 最 大 理论 得 率 分 别 为 73% 或 85.7% ， 这 取决 于 是 否 存在 
丙酮 酸 羧 化 酶 ， 而 且 这 与 本 节 前 述 的 辅助 因子 平衡 方法 的 结果 相 一 致 。 应 注意 的 是 ， 由 于 
ATP 的 消耗 反应 (4 10.1 中 的 反应 34) 为 非 零 ， 得 率 不 受 ATP 可 利用 性 限制 。 

图 10.4 (a) 描述 了 在 假设 没有 THD 和 丙酮 酸 羧 化 酶 活性 ， 赖 氨 酸 得 率 等 于 35% 的 条 
件 下 ， 对 前 述 网 络 所 得 的 理论 通 量 。 在 图 10.4 (b) 中 ， 提 供 了 理论 通 量 图 ， 这 时 仍 对 35% 
的 赖 氨 酸 得 率 的 情况 ， 但 针对 一 修改 过 的 生物 反应 网 络 [在 此 网 络 中 ，PEP 羧 化 酶 的 回 补 
反应 已 由 乙 醛 酸 支 路 和 OAADC 取代 ， 并 同时 移 除 了 c- 酮 成 二 酸 脱 氢 酶 〈cKGDH)j。 作 此 
计算 的 意图 是 要 人 们 注意 这 一 点 : 对 生物 反应 网 络 即 使 只 作 轻 微 的 改变 ， 通 量 分 布 也 会 有 显 
著 的 差别 。 


葡萄 糖 ao 
100 | 100 
G6P Ribu-5-P G6P ——> Ribu-5-P 
94 | 30} 
F6P F6P 
9 | 88 | 
35 PEP PEP 
63] | 100 761 {100 
a pie yt Pyr 
i! | 128 | 213 
AcCoA Al aH AcCoA 
107 
OaA ai OaA 六 Cit 
= af 107 
3 Mal 
O2 a 07 
赖 氨 酸 赖 氨 酸 Suc 


(a) (b) 


图 10.4 支持 赖 氨 酸 得 率 为 33% 所 必需 的 理论 通 量 分 布 
基于 (a) TCA 循环 或 (b) 乙 醛 酸 支 路 的 C glutamicum 网 络 中 ，PEP 与 丙酮 酸 之 间 的 两 个 通 量 
用 于 丙酮 酸 激酶 ( 左 ) 和 葡萄 糖 PTS (4) 的 反应 。 引 自 vallino 和 Stephanopoulos1993 (c) 
缩写 : G6P 一 6- 磷 酸 和 葡萄 糖 ， F6P 一 6- 磷 酸 果糖 


现 补充 下 列 四 点 作为 本 节 的 结束 。 

O 进行 理论 通 量 计算 之 后 ， 可 以 计算 CO 释放 速率 及 O, 吸收 速率 ， 从 而 确定 呼吸 商 
(RQ) 的 理论 值 。 在 最 大 理论 得 率 为 73% 时 ，RQ 等 于 2.0， 该 数值 可 用 来 按照 其 接近 理论 最 大 
值 的 程度 对 发 酵 过 程 进 行 基准 标定 ， 也 可 用 于 生物 反应 器 加 料 策略 的 设计 以 寻找 最 优 操作 点 。 

@ 通过 设 定 赖 氨 酸 生产 速率 为 零 并 改变 生物 质 合 成 速率 ， 人 们 可 以 重复 前 面 的 计算 。 
这 可 得 到 生物 质 的 最 大 得 率 为 753% ， 这 肯定 过 高 ， 因 为 没有 考虑 维持 需要 和 无 效 循环 。 

@ 如 表 10.2 所 示 ， 去 掉 有 关 CO2，NH3 及 O; 的 平衡 式 会 急剧 增加 所 得 化 学 计量 关系 
和 矩阵 的 条 件数 。 但 此 值 仍 可 接受 ， 特 别 是 考虑 以 下 事实 时 ， 即 : 在 这 种 情况 下 ,测量 向 量 的 
值 不 存在 不 确定 性 。 一 般 地 ， 那 样 大 小 的 条 件数 可 能 是 因为 要 考虑 平衡 式 是 否 用 实际 的 实验 
数据 来 求解 。 

249 


10.2 当 从 网 络 中 删除 所 选择 的 产生 胞 外 代谢 物 的 反应 〈 括 号 中 所 示 ) 时 ， 
ssh octalannoni (Ki 8.4 77) 


从 网 络 中 删除 的 
代谢 物 


无 
生物 质 (7) 

CO2(8) 

葡萄 糖 (14) 
赖 氨 酸 (20) 

NH3(25) 

O,(26) 

葡萄 糖 O2 
NH3 Oz 
生物 质 
MAR 


图 最 后 一 点 是 ， 在 进行 理论 得 率 计 算 时 ， 应 有 足够 的 方程 数 以 便 确 定 全 部 理论 内 部 通 ， 
量 。 只 需 注 意 对 网 络 所 加 的 额外 限制 ， 就 可 得 到 最 大 产物 得 率 。 

10.1.3 C. glutamicum 菌 中 赖 氨 酸 生物 合成 网 络 的 代谢 通 量 分 析 

本 节 将 证 明代 谢 通 量 分 析 如 何 对 代谢 网 络 所 选 分 支点 的 控制 结构 提供 附加 的 洞察 力 。 问 
题 的 焦点 在 于 提高 赖 氨 酸 得 率 ， 正 如 前 面 讲 到 的 ， 赖 氨 酸 得 率 可 在 当前 工业 水 平 上 显著 提 
高 。 通 常 ， 为 了 提高 产物 得 率 ， 要 增 大 产物 途径 中 反应 的 酶 活性 。 然 而 ， 产 物 得 率 最 终 是 受 
关键 分 支点 的 通 量 分 配 比 控制 的 。 例 如 ， 在 网 络 A->B，B->C， 以 及 B->D 中 , DH AMA 
率 严格 取决 于 节点 B 的 分 配 比 。 毫 无 疑问 ， 产物 途径 中 限制 酶 的 增强 可 间接 地 影响 节点 分 
配 比 ;但 产物 得 率 最 终 还 是 取决 于 这 些 节点 对 通 量 扰动 的 适应 性 。 在 刚性 节点 中 ， 通 量 分 配置 
比 对 产物 分 支 途径 的 活性 不 敏感 ， 仅 增强 产物 途径 不 会 提高 产物 得 率 。 此 外 ， 如 果 在 正常 条 和 
件 下 产物 是 以 适当 的 速率 进行 合成 ， 那 么 ， 通 过 减弱 副 产 物 分 支 途径 来 影响 分 配 比 可 能 更 有 上 
利 。 代 谢 工程 研究 的 一 个 焦点 应 该 是 把 改变 节点 分 配 比 作为 提高 产物 得 率 的 主要 机 制 。 在 这 时 
方面 ， 一 个 关键 问题 是 识别 那些 对 产物 合成 或 导致 副 产 物 生成 起 决定 性 作用 的 分 支点 。 这 些 时 
分 支点 构成 代谢 网 络 的 主 节点 ， 必 须 首先 识别 出 来 。 iy 

一 旦 识别 出 网 络 中 的 关键 分 支点 ， 就 必须 进行 特定 扰动 实验 ， 以 表征 这 些 分 支点 的 控制 .看 
在 常规 发 酵 过 程 中 ， 代 谢 通 量 和 代谢 通 量 分 配 比 会 有 变化 ， 这 些 变化 可 以 提供 关于 节点 柔性 或 生 
刚性 的 详细 情况 。 然 而 ， 由 于 代谢 物 效应 物 浓度 〈 其 也 在 不 同 实验 中 改变 ) 强烈 地 影响 节点 刚 时 
性 ， 因 此 ， 对 于 由 生物 质 和 产物 合成 速率 交换 所 诱导 的 全 局 变化 所 提供 的 信息 必须 谨慎 解释 。 
非常 可 能 的 是 ， 这 种 全 局 扰动 包括 很 多 附加 的 影响 ， 而 这 些 影响 在 代谢 平衡 中 不 能 精确 地 预料 
及 说 明 。 结 果 ， 为 了 阐明 节点 控制 的 具体 特征 ， 就 需要 更 多 的 局 部 扰动 。 本 章 将 通过 探讨 6- 磷 
酸 葡萄 糖 和 PEP/ 丙 酮 酸 复合 分 支点 这 两 个 具体 节点 的 代谢 控制 来 说 明 这 一 点 。 

应 该 注意 的 是 ， 对 于 通 量 控制 ， 本 节 的 讨论 采用 了 5.4 节 所 介绍 的 节点 柔性 和 刚性 的 概 
念 。 为 了 完全 理解 此 处 所 给 结果 的 解释 ， 应 复习 一 下 那 一 节 。 此 外 ， 在 5.4 节 中 从 定性 方面 
介绍 的 刚性 和 和 柔性 概念 将 在 第 12 章 中 在 代谢 控制 分 析 (MCA) 范围 内 进一步 扩展 并 进行 定 
量 描述 。MCA 通常 是 描述 线性 或 分 支 代谢 途径 中 各 个 反应 区 段 的 柔性 。 同 样 的 概念 已 在 第 
12 章 中 延伸 ， 以 表征 代谢 网 络 分 支点 的 刚性 。 

根据 本 章 的 总 目标 ， 为 了 可 以 独立 计算 通 量 、 通 量 分 配 比 以 及 其 它 可 通过 应 用 代谢 通 量 
分 析 (MFA) 得 到 的 结果 ， 要 提供 足够 的 信息 。 为 了 示范 MEFA 的 一 般 哲 理 ， 也 提供 了 在 

250 


L 
| 


设计 所 介绍 的 实验 中 所 用 的 策略 及 其 理由 的 评述 。 生 物 网 络 (Bionet) 可 用 来 重 现 此 处 所 给 
的 结果 。 
ER RRA 

虽然 代谢 网 络 包含 大 量 节点 ， 但 情况 通常 是 ， 当 产物 得 率 改变 时 ， 只 有 几 个 节点 的 通 量 
分 配 比 实际 上 发 生 改 变 。 这 些 节点 由 于 直接 影响 产物 得 率 而 被 称 作 主 节点 。 其 余 节 点 的 分 配 
紫 相 对 不 受 影响 ， 不 值得 进一步 研究 。 为 了 找 出 主 节点 在 网 络 中 的 位 置 ， 首 先 要 识别 出 产 
对 。 副 产物 和 底 物 。 然 后 进行 类 似 于 前 节 所 述 的 理论 产物 得 率 计算 进行 理论 通 量 分 析 。 主 节 
起 是 通过 产物 得 率 的 系统 变化 和 不 同 节点 的 通 量 分 配 比 的 观察 而 被 识别 。 

将 此 方法 应 用 于 赖 氨 酸 生物 合成 网 络 ， 当 赖 氨 酸 得 率 升 高 时 ， 五 个 分 支点 CM: 
Gile6P、Fru6P、PEP、 丙 酮 酸 和 OAA) 的 分 配 比 受到 明显 影响 。 其 中 只 有 两 个 分 支点 ， 即 
Gle6P 和 PEP/Pyr 组 由 于 下 列 原因 而 被 认为 是 有 兴趣 的 主 节 点 。 当 赖 氨 酸 得 率 小 于 60% 时 ， 
Fru6P 被 证 明 是 一 个 汇合 点 ， 而 当 赖 氨 酸 得 率 高 于 60% 时 ，Fru6P 是 一 个 分 支点 。 在 后 一 
种 情况 中 ， 异 构 酶 反应 逆转 ， 而 且 Glc6P 变 成 一 个 汇合 点 。 因 此 ,在 Glc6P 和 Fru6P 之 间 ， 
其 中 二 个 总 是 分 支点 ， 而 另 一 个 是 汇合 点 ; 而 且 由 于 一 般 得 率 总 是 低 于 60% ， 因 此 ， 在 分 
rep WE GIE6P 考虑 为 一 个 主 分 支点 。 就 OAA 来 说 ， 对 该 节点 的 仔细 研究 表明 ， 由 于 所 有 
被 柠檬 酸 合成 酶 消耗 的 OAA 必须 通过 苹果 酸 脱氧 酶 (TCA 循环 中 的 最 后 一 个 酶 ) 返回 ， 
所 以 它 基本 上 是 不 重要 的 。 本 质 上 ，TCA 循环 通 量 仅仅 通过 OAA TA, SR, AF MA 
酸 合成 所 消耗 的 全 部 OAA 是 由 回 补 途径 产生 的 。 这 就 强调 了 理解 TCA 循环 及 有 关 回 补 途 
径 中 质量 平衡 限制 的 重要 性 。 应 注意 的 是 ， 所 有 经 AcCoA 进入 TCA 循环 的 碳 必须 被 氧化 
为 GO,， 而 通过 其 它 反应 进入 TCA 循环 的 碳 不 能 被 氧化 ， 而 且 最 终 必 须 离 开 循环 以 便 为 生 
物质 及 产物 合成 提供 前 体 。 鉴 于 对 这 些 概念 的 误解 ， 已 建议 通过 直接 接 人 富 马 酸 库 ， 天 冬 氨 
酸 酶 会 提高 天 冬 氨 酸 的 利用 率 。 然 而 ， 富 马 酸 并 不 比 草 酰 乙酸 可 利用 性 高 ， 因 为 它们 任何 一 
不 的 净 产 量 都 受 回 补 途径 通 量 的 支配 。 这 一 点 已 被 引入 天 冬 氨 酸 酶 活性 试图 提高 赖 氨 酸 得 率 
而 失败 的 事实 所 证 实 。 

上 述 主 节点 ，Glc6P 和 PEP/Pyr 组 ， 简 单 地 反映 了 这 样 一 个 事实 ; 赖 氨 酸 合成 所 需 的 
四 个 前 体 (ie. NADPH, ATP R&) 中 ， 两 个 (RAI NADPH) 依赖 于 葡萄 糖 供 给 ， 并 因 
此 依赖 于 上 述 分 支点 的 代谢 通 量 分 布 。 其 余 两 个 前 体 (ATP 及 氨 ) 显然 不 存在 任何 限制 。 
这 是 由 于 (a) 伴随 产生 碳 前 体 的 葡萄 糖分 解 代谢 的 反应 可 产生 足够 的 ATP， 以 及 (b) 为 
了 氨基 酸 和 赖 氨 酸 生 物 合成 的 氮 吸 收 反应 是 通过 谷 氨 酰胺 合成 酶 和 谷 氨 酸 脱 氢 酶 同化 系统 充 
足 提供 的 。 如 果 后 者 不 是 这 样 ， 那 么 ， 提 供 ATP 和 补充 谷 氨 酸 用 于 所 同化 途径 的 反应 也 应 
包含 在 赖 氨 酸 生物 合成 网 络 的 主 分 支点 清单 中 。 

总 结 一 下 赖 氨 酸 得 率 对 两 个 主 节点 分 配 比 的 依赖 性 ， 注 意 到 当 赖 氨 酸 得 率 提高 时 ， 必 须 
有 较 高 比例 的 葡萄 糖 转 人 成 糖 磷酸 途径 (PPP) 以 满足 不 断 增 长 的 NADPH 需求 。 如 果 该 节 
点 的 实际 酶 动力 学 是 糖 酵 解 途径 对 Glc6P 的 争夺 超过 PPP ( 戊 糖 磷酸 途径 ) 这 种 情况 ， 那 
A, URE NADPH 限制 的 ， 而 且 进 入 糖 酵 解 的 过 量 碳 最 终 会 导致 副 产 物产 生 。 然 而 ， 
如 果 Gle6P 节点 分 配 比 是 柔性 的 而 容易 改变 ， 以 致 准确 满足 NADPH 需求 ， 则 赖 氨 酸 得 率 
限制 由 PEP/Pyr 主 节点 的 次 优 分 配 所 引起 。 如 果 PEP/Pyr 支 路 的 回 补 途径 分 配 比 小 于 
50% ， 则 不 充足 的 OAA 将 被 合成 ， 且 产生 过 量 的 丙酮 酸 ， 其 很 可 能 在 TCA 循环 中 被 氧化 。 
如 果 回 补 支 路 分 配 比 大 于 50% ， 则 将 合成 过 量 的 OAA， 其 可 能 导致 天 冬 氨 酸 或 谷 氨 酸 分 泌 
(虽然 这 一 点 尚未 观察 到 )。 在 Glc6P 和 PEP/Pyr 节点 ， 最 优 的 分 配 将 导致 最 优 的 赖 氨 酸 合 

251 


成 和 理论 产物 得 率 。 这 是 否 可 行 取 决 于 影响 上 述 分 支点 分 配 比 的 酶 反应 的 动力 学 和 调控 。 通 | 
过 引入 如 下 所 述 的 特定 的 局 部 扰动 ， 可 以 确定 它们 对 赖 氨 酸 生产 的 限制 程度 。 | 

Glc6P 分 支点 的 通 量 扰 动 分 析 

为 了 研究 Glc6P 分 支点 的 柔性 ， 进 行 了 两 个 特定 的 扰动 实验 。 第 一 个 扰动 是 减弱 Glc6P 
异 构 酶 (GPI)， 即 糖 酵 解 的 第 一 个 酶 ， 然 后 进行 发 酵 ， 并 对 所 得 的 ATCC 21253 菌株 C. 
glutamicum 的 突变 株 NFG068 进行 通 量 分 析 。 将 该 突变 株 分 离 出 来 ， 以 试图 使 代谢 通 量 或 
向 进入 戊 糖 磷酸 途径 。 第 二 个 扰动 是 在 C. glutamicum ATCC 21253 BH KBE PEA 
葡 糖 酸 盐 作 为 惟一 碳 能 源 。 通 过 提供 直接 进入 成 糖 磷 酸 途 径 的 碳 源 ， 葡 糖 酸 盐 有 效 地 绕 过 也 
Glc6P 分 支点 ， 并 提供 了 有 关 Glc6P 对 赖 酸 合成 施加 控制 的 额外 信息 。 

关于 发 酵 规程 和 所 获 结果 的 详细 情况 ， 应 当 参 考 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 的 
原始 文献 。 如 果 与 ATCC 21253 菌 的 控制 发 酵 相 比较 ，GPI 突变 株 则 表现 出 在 生长 期 间 所 
有 胞 外 代谢 物 的 比 生 产 速率 和 比 消 耗 速 率 都 减弱 了 。 其 以 低 的 比 生长 速率 生长 而 以 原始 菌株 
50% 的 速率 呼吸 。 所 得 的 最 终生 物质 浓度 也 比较 低 。 赖 氨 酸 最 终 效 价 大 于 控制 发 酵 253%8 
与 30% 的 标准 摩尔 得 率 相 比 ， 赖 氨 酸 合成 起 始 时 的 瞬时 得 率 是 34%。 上 述 变化 可 按 偏 离 标 
准 发 酵 来 进行 解释 。 然 而 ， 这 将 会 导致 错误 的 结论 ， 因 为 根据 对 由 此 发 酵 数据 构建 的 代谢 通 ， 
量 图 的 仔细 检查 可 以 看 出 ， 它 与 基准 发 酵 的 差异 是 最 小 的 。 此 外 ， 产 物 得 率 的 升 高 并 不 持 
续 ， 终 产物 效 价 较 高 是 较 长 期 的 运转 而 不 是 一 个 延续 的 高 得 率 。 

表 10.3 给 出 了 测量 的 和 估计 的 代谢 物 积累 速率 ， 以 及 反映 质量 平衡 约束 的 闭合 〈cles 
sure) 程度 的 一 致 性 指数 。 与 控制 发 酵 相 比较 ，NFG068 发 酵 的 代谢 物 积累 速 率 要 小 将 近 
2 一 3 倍 ， 主 要 是 生物 质 生 长 减 小 的 结果 。 图 10.5 的 通 量 分 布 图 与 在 同样 条 件 下 控制 发 酵 期 
间 所 观测 到 的 非常 类 似 。 因 此 ， 即 使 突变 使 总 生长 和 生产 动力 学 发 生 显著 改 变 ，NFG068 突 
变 株 中 的 GPI 活动 减弱 90% 也 不 会 导致 Glc6P 分 支点 的 通 量 分 配 发 生 任何 显著 改变 。 突 变 
不 会 显著 改变 赖 氨 酸 的 瞬时 得 率 ， 但 在 生长 期 间 和 生产 初期 降低 了 通过 网 络 的 比 通 量 。 这 些 
结果 与 拥有 刚性 分 支点 的 依赖 性 网 络 概念 是 一 致 的 〈 人 参看 下 面 内 容 及 5$.4 节 )。 


表 10.3 34.3h 时 ，NFG068 发 酵 的 代谢 物 积 累 速率 的 测量 值 、 估 计 值 以 及 标准 偏差 


| BURR /mmol-(L+h)-! | (L+h)~ | BURR /mmol-(L+h)-! | fA Rik /mmol: (Lh) 7! 
代谢 物 
See sea 


3.16£0.2 
-5.5+5.8 
=22 57 32k 
0+1 
0.46+1 
(Ooms | 

YE: 数据 取 于 31h 和 37.5h SWAB. — BEM h =0.09, RHERA Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 

CD) 所 估计 的 速率 是 那些 严格 满足 质量 平衡 限制 ， 而 且 是 从 估计 的 通 量 推导 出 来 的 。 

要 把 Glc6P 分 支点 归 为 柔性 的 ， 或 弱 刚 性 的 ， 或 强 刚性 的 〈 见 $.4 节 )， 对 上 述 每 种 情 

况 将 实际 结果 与 期 望 的 扰动 结果 进行 比较 是 有 启发 的 。 如 果 由 于 GPI 对 Glc6P 的 亲和力 比 
Glc6P 脱氧 酶 高 (PPP 中 的 第 1 个 酶 )， 而 使 碳 通 量 优先 进入 糖 酵 解 途径 ， 则 Glc6P 分 支点 
是 弱 刚 性 的 。 如 果 赖 氨 酸 得 率 受 弱 刚 性 Glc6P 分 支点 的 限制 ， 那 么 GPI 扰动 应 当 已 经 提高 
了 得 率 ， 因 为 GPI 减弱 应 当 增加 Glc6P 并 允许 更 多 Glc6P 进入 PPP 途径 。 但 这 一 点 并 没有 
观察 到 。 为 了 研究 Glc6P 是 强 刚性 的 可 能 性 ( 即 : 由 于 分 支点 中 两 个 酶 的 有 力 调 控 ， 通 量 分 

252 


91 
com 
73 
a-KG a Glut 
91 


cond NH3 =~ 0.0 
Glum 


SucCoA 


Lysp 生物 质 
图 10.5 34.3h 时 ，NFG068 赖 氨 酸 发 酵 的 通 量 分 布 


通 量 是 根据 取 于 31h 和 37.5h 的 测量 结果 估计 的 ， 并 经 葡萄 糖 吸 收 速率 【 示 于 括号 中 ，mmol(L.h) 1] 
归 一 化 处 理 。 改 自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 


配 比 是 不 服从 变化 的 ) ， 第 二 个 扰动 实验 是 通过 使 用 葡 糖 酸 盐 作 为 碳 源 来 进行 的 。 葡 糖 酸 盐 
基本 上 绕 过 Glc6P 分 支点 而 直接 进入 戊 糖 磷酸 途径 。 结 果 ， 如 果 Glc6P 分 支点 是 强 刚性 的 ， 
并 限制 了 赖 氨 酸 的 得 率 ， AA, EMRE LIFE CC. glutamicum ATCC 21253 应 当 提高 
赖 氨 酸 得 率 。 在 没有 任何 提高 的 情况 下 ， 应 意味 着 Glc6P 确实 是 柔性 分 支点 ， 而 且 其 能 通 
过 适应 其 通 量 分 配 比 而 响应 于 代谢 网 络 变化 着 的 要 求 。 表 10.4 给 出 了 当 以 葡 糖 酸 盐 作为 碳 - 
能 源 时 代谢 物 积累 速率 的 测量 值 和 估计 值 。 应 注意 的 是 ， 单 独 在 葡 糖 酸 盐 上 时 ，C .glutcw- 
nicum ATCC 21253 生长 并 不 好 ; 然而 一 旦 加 入 葡萄 糖 ， 其 生长 速率 又 恢复 正常 (A 
0.3h- 1)。 赖 氨 酸 合成 开始 后 ， 一 旦 培养 基 中 的 葡萄 糖 被 耗 尽 ， 葡 糖 酸 盐 作为 惟一 碳 源 时 ， 
就 得 到 表 10.4 中 的 数据 。 结 果 表 明 ， 瞬 时 摩尔 得 率 不 超过 34% 。 其 它 显 著 的 发 酵 特 征 包 
括 : 呼吸 商 高 于 正常 水 平 (1.35)， 通 常 观测 到 的 发 酵 副 产物 完全 没有 。 缺 少 副 产物 合成 使 
一 致 性 指数 非常 令 人 满意 。 图 10.6 表示 从 这 些 数据 所 得 的 通 量 图 。 对 表 10.1 中 的 代谢 网 络 
作 了 下 列 改 进 ， 以 表示 葡 糖 酸 盐 的 附属 的 化 学 过 程 。 用 下 式 表 示 葡 糖 激 酶 反应 : 

— Glen — ATP + Glen6P + ADP =0 (10.15) 

SAP, Glen 表示 葡萄 糖 激酶 ; Glcn6P 表示 6- 磷 酸 葡 糖 酸 。 
253 


而 且 PPP 的 氧化 性 分 支 分 为 两 个 反应 : 
— Glc6P — HO — NADP + Glen6P + NADPH =0 (10.16) 
— Glen6P — NADP + Ribu5P + CO, + NADPH =0 (10.17) 
此 处 6- 磷 酸 葡 糖 酸 内 酯 酶 反应 已 经 与 GOPDH 归并 在 反应 (10.16) 中 。 


表 10.4 用 葡 糖 酸 盐 作 碳 源 时 赖 氨 酸 发 酵 中 的 代谢 物 积累 速率 


fA Rik /mmol: (Lh)! fe it fA BF /mmol:(L-h) 7! 
0 


0+2 5.48+0.4 


代谢 物 


AAR 0+2 -—12.8+1.1 

生物 质 6723.2 一 48.0 土 4.8 — 48.0 
CO; 62.4+6.2 0 
葡萄 糖 -17.0 土 3.9 


0+2 


© 所 估计 的 速率 是 那些 严格 满足 质量 平衡 约束 ， 并 从 估计 通 量 推导 出 来 的 。 
注 : 一 致 性 指数 刀 =0.003。 数 据 是 进入 发 酵 [8h 和 21h 时 采集 的 。 引 自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a)]。 


当 根 据 表 10.4 的 速率 计算 通 量 分 布 图 时 ， 反 应 (10.16) 表现 为 负 通 量 。 这 是 由 于 ， 
NADPH 的 合成 速率 显著 高 于 生物 质 和 赖 氨 酸 合成 所 需 而 造成 的 。 然 而 ， 由 于 非常 大 、 正 的 
标准 自由 能 ， 使 该 反应 本 质 上 不 可 逆 ， 因 此 ， 反 应 (10.16) 不 能 逆向 进行 。 为 了 允许 
NADPH 达到 拟 稳 态 ， 从 网 络 中 删除 反应 (10.16)， 并 用 一 直接 的 NADPH 氧化 反应 代替 : 

-2NADPH-O+2HO+2NADP=0 (10.18) 

应 注意 的 是 ， 上 述 反 应 只 是 用 一 简单 的 氧化 反应 表示 NADPH 的 消耗 。 另 一 方法 可 以 
是 转氨酶 反应 。 在 这 个 反应 中 ，NADPH 被 氧化 为 NADP， 同 时 ，NAD 还 原 为 NADH 5 
在 进行 前 面 的 研究 时 ， 并 未 证 实 存在 转 氢 酶 活性 ， 因 此 ， 反 应 (10.18) 的 加 入 可 以 满足 
NADPH 拟 稳 态 和 代谢 物质 量 平 衡 。 进 行 这 些 修改 后 ， 所 得 的 通 量 分 布 图 如 图 10.6 Pra. 
除 戊 糖 磷酸 途径 (PPP) 之 外 ， 通 量 分 布 图 与 控制 发 酵 的 相当 相似 。 使 用 葡 糖 酸 盐 所 产生 的 ” 
过 量 NADPH 没有 增加 赖 氨 酸 得 率 。 正 如 以 前 建议 的 ， 这 强烈 地 暗示 其 氨 酸 得 率 不 受 
NADPH 的 可 利用 性 所 限制 ， 而 且 Glc6P 也 不 是 刚性 分 支点 。 结 合 GPI 通 量 分 析 的 结果 ,， 
可 以 得 出 以 下 结论 ; Glc6P 分 支点 确实 是 一 个 柔性 分 支点 ， 容 易 满 足 对 产物 和 生物 质 合 成 的 ” 
NADPH 需求 变化 而 产生 响应 。 

虽然 本 节 的 讨论 主要 集中 于 延长 期 内 恒定 生理 状态 的 通 量 图 特征 的 推导 ， 但 应 指出 的 
是 ， 只 要 不 违背 有 关 胞 内 代谢 物 的 稳 态 假设 ， 而 且 可 以 在 线 测量 胞 外 代谢 物 的 积累 速率 ， 那 ， 
么 ， 也 可 获得 瞬 态 期 间 的 胞 内 通 量 图 。 在 这 些 条 件 下 ， 可 以 进行 在 线 代 谢 通 量 分 析 ， 而 且 通 
常 可 以 得 到 具有 重要 价值 和 意义 的 结果 。 

已 对 C. glutamicum 的 分 批 赖 氨 酸 发 酵 进 行 了 这 样 的 在 线 代谢 通 量 分 析 (Takiguchi 
等 人 ，1997)， 图 10.7 描绘 了 通过 戊 糖 磷酸 途径 的 计算 通 量 (7) 与 赖 氨 酸 通 量 (rs) 之 间 
的 关系 。 应 注意 以 下 三 点 。 

@ 第 一 ， 可 以 看 出 有 两 个 不 同 的 生理 状态 ， 其 中 一 个 是 细胞 生长 (状态 1)， 另 一 个 是 
Mi BARA MR (状态 2); 以 及 从 状态 1 到 状态 2 过 渡 期 间 所 得 到 的 瞬 态 点 。 

@ 第 二 ， 状 态 2 中 的 直线 斜率 等 于 1/2， 反 映 了 赖 氢 酸 合成 时 对 NADPH 的 化 学 计量 需 
要 。 参 照 式 (10.8)， 可 以 看 出 ， 假 设 转氨酶 活性 存在 时 ， 即 : 实质 上 以 NADH 和 NADPH 
的 形式 使 还 原 当 量 相 等 ， 合 成 每 摩尔 赖 氨 酸 需 2mol NADPH。 当 不 存在 THD 活 性 时 ， 图 

254 


gH RE 


CO， 
oF 100 417.0 


100 - 
葡萄 糖 Glen-6- Ribu-5-P 


LysE 生物 质 


图 10.6 葡 糖 酸 盐 发 酵 19h 时 的 代谢 通 量 分 布 
通 量 是 根据 取 于 18h 和 21h 时 的 测量 结果 估计 的 ， 并 经 葡 糖 酸 盐 吸收 速率 【 示 于 括号 中 ，mmol' (L.h)-1] 
归 一 化 处 理 。 注 意 : 根据 文中 的 讨论 ，PPP 的 第 1 个 酶 已 被 去 掉 ， 并 增加 了 葡 糖 酸 激 酶 反应 和 NADPH 
的 直接 氧化 反应 ， 从 而 消除 了 不 一 致 性 。 改 自 Vallino 和 Stephanopoulos (1994a) 


10.7 中 表示 状态 2 的 直线 斜率 应 等 于 1/[4 以 反映 赖 氨 酸 合成 新 的 化 学 计量 关系 。 

@ 第 三 ， 通 过 戊 糖 磷酸 途径 的 通 量 与 赖 氨 酸 生产 之 间 的 线性 相关 性 表明 : 成 糖 磷酸 途径 
通 量具 有 为 满足 赖 氨 酸 的 生物 合成 需求 而 进行 自我 调节 的 能 力 。 这 是 本 节 讨 论 的 Glc6P 分 
支点 的 柔性 的 补充 的 证 实 。 应 注意 的 是 ， 这 些 信息 中 没有 一 件 能 从 酶 活性 的 分 析 中 得 到 。 在 
进行 图 10.7 的 实验 时 ， 酶 活性 保持 相当 平稳 。 

在 PEPLZPyr 分 支点 的 通 量 扰 动 分 析 

由 于 PEP 羧 化 酶 反应 和 Pyr 羧 化 酶 反应 这 两 个 回 补 反应 对 赖 氨 酸 合成 的 贡献 尚未 描述 ， 
为 简单 起 见 ， 将 PEP 和 Pyr 组 合 在 一 起 。 缺 乏 这 样 的 信息 时 ， 要 区 别 这 两 个 羧 化 反应 是 不 
可 能 的 ， 因 此 ， 将 这 两 个 羧 化 反应 组 合 为 一 个 。 丙 酮 酸 代 表 一 个 重要 的 分 支点 ， 这 是 因为 ， 
除了 回 补 反 应 外 ， 在 赖 氨 酸 合成 途径 中 ， 它 也 在 二 氢 吡 啶 二 羧 酸 合成 酶 反应 中 与 天 冬 氨 酸 半 
醛 进 行 缩合 。 此 外 ， 它 可 在 丙酮 酸 脱 氢 酶 复合 体 (PDC) 反应 中 形成 乙酰 辅酶 A， 并 在 
TCA 循环 中 进一步 被 氧化 。 如 果 PEP/Pyr 分 支点 是 昱 刚 性 的 ， 则 由 于 PDC 酶 对 丙酮 酸 的 
ARAIVE LE PEP 和 Pyr 羧 化 酶 的 要 高 得 多 ， 因 此 ， 碳 通 量 优先 进入 TCA 循环 。 在 这 种 情况 

255 


FB, TCA 循环 通 量 相对 不 受 赖 氨 酸 途径 中 通 
量变 化 的 影响 ， 而 产物 得 率 受 丙酮 酸 可 利用 
性 的 限制 。 因 此 ， 如 果 赖 氨 酸 得 率 受 到 弱 刚 
性 丙酮 酸 分 支点 的 损害 ， 那 么 ，PDC 的 减弱 
应 增 大 丙酮 酸 的 可 利用 性 ， 从 而 提高 赖 氨 酸 
得 率 。 另 一 方面 ， 如 果 赖 氨 酸 得 率 低 是 由 于 
PEP /Pyr 分 支点 的 强 刚 性 或 者 回 补 活性 非常 
低 ， 那 么 ，PDC 减弱 应 导致 某 些 中 间 代 谢 物 

的 分 沁 或 总 网 络 通 量 降低 。 
为 了 检验 PEP /Pyr 分 支点 的 刚性 通 量 分 
配 限 制 赖 氨 酸 得 率 的 可 能 性 ， 进 行 了 两 个 扰 
动 实验 。 第 一 个 实验 包含 C. glutamicum 
ATCC 21253 的 一 株 PDC 减弱 突变 体 的 分 
离 、 发 酵 及 通 量 分 析 。 第 二 个 实验 涉及 在 赖 
氨 酸 过 量 合成 开始 之 后 通过 加 入 特异 抑制 剂 

向 赖 氨 酸 的 通 量 (rs) 的 相 平面 图 
ine 4s eee AAR (FP) 而 抑制 POC 活性 ， 然 后 监 
改 自 Takiguchi et al (1997) Wl) PEP/Pyr 分 支点 的 通 量变 化 。 

在 常规 葡萄 糖 培养 基 上 ，PDC- 减 弱 突 变 
株 表 现 出 生长 困难 ， 因 此 在 培养 基 中 加 入 了 乙酸 钾 。 加 入 乙酸 盐 的 生长 促进 作用 与 该 菌株 的 
PDC 减弱 相 一 致 。 由 于 (a) 通 量 计算 是 在 乙酸 盐 消耗 完 之 后 进行 的 ， 以 及 (b) 葡萄 糖 存 


0.02 


%/mol-h7! 
° 
S 


%/mol-h7! 


图 10.7 通过 成 糖 磷酸 途径 的 通 量 〈r7) 和 流 


在 时 乙 醋酸 支 路 被 抑制 ， 因 此 ， 乙 酸 盐 的 加 入 并 不 会 使 通 量 分 析 复 杂 化 。 与 控制 发 酵 相 比较 


而 言 ， 生 长 速率 及 所 有 胞 外 代谢 物 的 积累 -消耗 速率 严重 减弱 ， 但 它们 随时 间 的 变化 图 与 控 
制 发 酵 中 观察 到 的 相似 。 比 速率 大 约 降 低 到 控制 发 酵 的 1/2 一 1/3。 然 而 ， 在 赖 氨 酸 生产 期 ， 
得 到 的 通 量 分 布 图 [vallino and Stephanopoulos，(1994b)] 与 控制 发 酵 的 非常 相似 。 此 外 ， 
PEP/Pyr 分 支点 的 通 量 分 配 比 也 与 控制 发 酵 类 似 。 因 此 ，PDC 活性 减弱 98% 没 有 改变 主 分 
支点 的 通 量 分 布 ， 也 没有 导致 赖 氨 酸 得 率 提 高 ， 虽 然 其 确实 使 总 网 络 的 通 量 显 著 减 弱 。 

如 果 赖 氨 酸 得 率 仅 受 弱 刚 性 PEPAPyr 分 支点 限制 〈 即 ， 如 果 碳 优先 进入 TCA 循环 ， 以 
致 赖 氨 酸 合成 实质 上 是 丙酮 酸 限 制 的 )， 那 么 ，PDC 减弱 应 当 提高 丙酮 酸 的 利用 率 和 赖 氨 酸 


得 率 。 由 于 这 一 点 并 未 观察 到 ， 因 此 ， 可 以 得 出 以 下 结论 : 赖 氨 酸 得 率 不 是 由 弱 刚 性 PEP7 


Pyr 分 支点 所 限制 。 

如 前 所 述 ， 赖 氨 酸 生物 合成 发 生 在 一 个 依赖 型 网 络 中 。 在 这 种 网 络 中 ， 必 须 协 调 分 配 所 
有 主 分 支点 上 的 通 量 ， 以 获得 高 得 率 。 如 果 一 个 依赖 型 网 络 中 有 一 个 或 多 个 主 分 支点 是 刚性 
的 或 者 包含 活性 非常 低 的 反应 ， 那 么 ， 通 量 分 配 就 不 能 协调 一 致 改变 来 满足 产物 的 化 学 计量 
要 求 。 此 外 ， 如 果 代 谢 控制 阻碍 中 间 代 谢 物 的 分 刻 或 积累 ， 那 么 一 个 依赖 型 网 络 的 某 一 刚性 
节点 的 任何 支 路 的 减弱 将 导致 总 通 量 降低 。 因 此 ， 从 PDC 的 减弱 中 观察 到 的 结果 与 依赖 型 
网 络 是 一 致 的 ， 该 网 络 拥有 刚性 分 支点 或 由 一 个 支 路 的 活性 所 限制 。 由 于 Glc6P 分 支点 是 
柔性 的 ， 因 此 ， 该 网 络 的 刚性 一 定 是 由 于 PEPMPyr 分 支点 的 反应 之 一 的 刚性 或 限制 所 带 来 
的 。 这 个 结论 已 通过 使 用 氟 丙 酮 酸 (FP)(PDC 活性 的 抑制 剂 ) 进行 的 抑制 实验 得 到 了 进 一 
步 的 证 实 。 紧 接着 FP 的 加 入 ， 呼 吸 急剧 下 降 ， 并 伴随 着 比 生长 速率 减 小 以 及 胞 外 丙酮 酸 的 
积累 。 但 赖 氨 酸 合成 速率 和 和 葡萄糖 消 耗 速率 未 受 影响 。 加 入 FP 几 个 小 时 后 ， 呼 吸 重 新 开 

256 


| 始 ， 分 这 的 丙酮 酸 被 重新 消耗 ， 而 且 可 能 是 由 于 丙酮 酸 的 重新 消耗 ， 葡 萄 糖 吸收 表现 为 暂时 
下 降 。 扰 动 的 暂时 特性 无 疑 是 由 于 FP 的 破坏 作用 ，FP 在 短 时 间 后 可 被 代谢 掉 。 余 下 来 的 
发 酵 表 现 出 类 似 于 控制 发 酵 的 特征 。 在 这 种 情况 下 ， 计 算出 通 量 ， 得 到 的 通 量 图 描述 了 丙酮 
BMA TCA 循环 到 丙酮 酸 分 泌 的 转向 情况 。 与 控制 发 酵 比较 而 言 ， 其 余 途径 中 的 通 量 分 布 相 
对 不 受 影响 。 这 些 结果 在 图 10.8 中 进行 了 描述 ， 其 分 别 表示 控制 发 醇和 扰动 发 酵 围 绕 
PEP/Pyr 分 支点 的 通 量 分 布 。 相 对 于 PEP 合成 速率 ， 通 量 已 经 归 一 化 。FP 对 PDC 的 抑制 
帮 用 可 使 受 PDC 支持 的 通 量 降低 约 50% ， 但 分 支点 的 通 量 分 布 仍 相 对 未 受 影响 。 


| 100 | 100 
PEP PEP 
0 29 
OAA Pyr Pyrexr OAA 一 一 ~Pyrexr 
FP 
Hi ARR AcCoA fA AcCoA 


(a) (b) 


图 10.8 PEP fl Py 主 分 支点 周围 已 用 PEP 合成 速率 归 一 化 的 通 量 分 布 
(a) 为 13.Sh 时 的 控制 发 酵 ，(b) 为 13.5$h 时 的 氟 丙 酮 酸 (FP) KARE 
实心 矩形 表示 FP 抑制 的 位 置 、Pyrgx 表 示 胞 外 丙酮 酸 。 不 是 所 有 涉及 PEP、 草 酰 乙 酸 ， 
或 丙酮 酸 的 通 量 都 被 标 出 。 引 自 Vallino and Stephanopoulos (1994b) 


氟 丙 酮 酸 抑 制 实验 可 视 为 在 PDC- 减 弱 突变 株 中 所 展现 出 的 对 TCA 通 量 的 更 长 期 破坏 
的 瞬 态 模拟 。 在 PDC- 减 弱 突 变 株 中 ， 葡 萄 糖 吸收 、 糖 酵 解 和 TCA 这 些 通 量 降 低 到 野生 型 
的 143 一 1 ， 而 且 观 察 不 到 中 间 代 谢 物 的 积累 或 分 泌 。 在 所 丙酮 酸 抑制 条 件 下 ， 正 常情 况 
下 较 高 的 PDC 通 量 急 剧 降低 ， 并 促使 丙酮 酸 作为 糖 酵 解 通 量 的 一 个 出 口 而 分 记 出 来 ， 糖 酵 
解 通 量 在 加 入 氟 丙 酮 酸 之 后 仍 保持 较 高 水 平 。 偏 爱 回 补 途 径 的 通 量 分 配 的 变化 在 两 个 扰动 实 
验 中 都 没有 观察 到 。 结 果 ， 尽 管 在 羧 化 反应 以 及 与 二 氧 吡啶 二 羧 酸 合成 酶 反应 中 的 天 冬 氢 酸 
+R (ASA) 缩合 反应 中 ， 丙 酮 酸 的 可 利用 性 相当 高 ， 但 赖 氨 酸 得 率 仍 未 受 影 响 。 可 以 得 
出 结论 : 赖 氨 酸 得 率 不 受 在 TCA 循环 中 丙酮 酸 优先 消耗 所 限制 ， 因 此 ，PEPAPyr 分 支点 不 
是 弱 刚 性 的 。 赖 氨 酸 生产 因而 或 受 强 刚性 PEP/Pyr 分 支点 限制 ， 或 受 回 补 反应 的 低 活 性 的 
限制 。 要 提高 赖 氨 酸 得 率 ， 应 集中 解除 PEPPyr 分 支点 一 些 反 应 (PDC、Pyr 羧 化 酶 、 
PEP 羧 化 酶 ) 的 调节 ， 或 试图 提高 回 补 反应 的 通 量 ， 最 可 能 的 是 催化 丙酮 酸 羧 化 的 反应 。 
10.1.4 C. glutamicum 特定 缺失 突变 株 的 代谢 通 量 分 析 
在 前 面 几 节 中 发 现 了 两 个 在 生理 学 和 生物 技术 方面 具有 重要 意义 的 问题 ， 即 : 由 超 活性 
成 糖 磷酸 途径 产生 的 过 量 还 原 当 量 的 消耗 方式 的 阐明 ， 以 及 为 生物 质 和 产物 合成 提供 碳 的 精 
确 回 补 路 线 的 确定 。 由 于 这 些 问 题 不 能 用 通常 的 野生 型 菌株 来 解决 ， 因 此 ， 寻 找 了 具有 简化 
了 的 遗传 背景 的 突变 株 以 易于 研究 。 特 别 地 ，PEP 羧 化 酶 (PPC) 和 丙酮 酸 激酶 (PK) 被 
作为 目标 ， 这 是 由 于 这 两 个 酶 在 经 TCA 循环 产生 能 量 的 碳 代 谢 物 的 供应 途径 中 ， 或 者 在 为 
通过 OAA 前 体 合 成 而 进行 的 生物 合成 的 碳 代 谢 物 的 供应 途径 中 都 起 着 关键 作用 。 这 两 个 酶 
257 


组 合 的 破坏 突变 株 (disruption mutants) 是 通过 转移 接合 (transconjugation) 构建 的 ,在 
标准 分 批发 酵 中 培养 ， 而 且 在 代谢 通 量 分 析 的 框架 内 对 结果 进行 了 评价 (Park et al, 
1997a)。 表 10.1 的 生物 反应 网 络 增加 了 下 列 5 个 反应 以 考虑 附加 的 可 能 性 : 丙酮 酸 羧 化 反 
应 (10.19) 、 转 氢 酶 活性 (10.20) 以 及 另外 三 个 胞 外 代谢 物 1 蛋白 质 (PROP, (10.21)], 
甘油 醛 [GLY，(10.22)] RAB [DHA，(10.23)]}。 在 上 述 突变 株 的 发 酵 培养 基 中 
HR PROP. GLY. DHA 这 三 个 胞 外 代谢 物 发 生 积累 。 


— Pyr —-CO,- ATP +OAA + ADP=0 (10.19) 
(丙酮 酸 ) ( 草 酰 乙酸 ) 
-NADPH-NAD+NADP+NADH=0 (10.20) 
-Suc+PROP + CO,=0 (10.21) 
(琥珀 酸 ) ( 丙 酸 ) 
-G3P-ADP+GLY+ATP=0 (10.22) 
(3-BERR H 7h R ) (甘油 醛 ) 
-G3P-ADP+DHA+ATP=0 (10.23) 
(—# Ass) 


实验 结果 总 结 在 表 10.5 中 ， 并 给 出 了 4 种 菌株 在 单纯 生长 期 ( 工 ) 和 没有 生长 且 高 赖 


氨 酸 合成 期 (1) 的 比 生长 速率 、 葡 萄 糖 比 消耗 速率 、 赖 氨 酸 比 合成 速率 以 及 在 葡萄 糖 培养 ” 
基 上 的 细胞 质量 得 率 和 赖 氨 酸 得 率 。 


表 10.5 C. glutamicum ATCC 212530 与 缺失 突变 株 Appc、ApyK 及 AppcApyK 
在 两 个 不 同时 期 的 发 酵 结 果 比 较 @ 


0.35 0.26 0.27 0.12 
0.59 0.50 0.36 
0.53 0.33 
0 0 
0 


0.11 


GD wt 表示 野生 型 菌株 。 
@ 比 生长 速率 ， 比 速率 及 得 率 分 别 以 h-L、g'`g -LI(DW)h- ‘Reg! (消耗 的 葡萄 糖 ) 表示 。 


C. glutamicum 中 丙酮 酸 羧 化 对 PPC 的 补偿 


表 10.5 的 结果 应 根据 图 10.9 来 评价 ， 图 10.9 总 结 了 导致 OAA 生成 的 可 能 的 回 补 路 ， 


2 ppc 基因 的 破坏 使 生长 及 赖 氨 酸 生产 本 质 上 未 受 影 响 这 一 事实 表明 : 在 C. glutam- 
icum 菌 中 存在 一 条 (一 些 ) 额外 的 回 补 途径 。 可 能 地 ， 有 两 条 替代 途径 用 于 OAA 的 合成 : 
(1) 一 条 是 通过 除了 PPC 外 的 一 些 酶 (诸如 PEP 羧 激酶 、PEP 羧基 转 磷酸 酶 ， 或 转 羧 化 
酶 ) 作用 的 PEP 羧 化 ; (2) 另 一 条 是 经 丙酮 酸 的 送 化 。 

用 pyk Fl ppc pyk 突变 株 所 得 结果 并 不 支持 一 条 替代 PEP 羧 化 途径 的 存在 。 如 果 这 样 
一 条 途径 真 的 存在 ， 那 么 ， 在 pyk 突变 株 中 ，PEP 转化 为 丙酮 酸 的 阻 断 应 导致 PEP 积累 并 
增加 OAA 合成 〈 因 而 也 增加 赖 氨 酸 合成 ) (注意 : 葡萄 糖 PTS 运输 的 丙酮 酸 足 够 用 于 与 天 
冬 氢 酸 半 醛 缩合 )。 相 反 的 是 ， 赖 氢 酸 的 生产 能 力 和 得 率 分 别 减 小 了 约 S0% 和 30% ， 这 与 丙 
酮 酸 送 化 是 主 回 补 途径 这 一 观点 相符 合 : 因为 在 pyk 突变 株 中 丙酮 酸 可 用 性 降低 ， 回 补 通 
量 和 赖 氨 酸 生产 能 力也 下 降 。 

258 


人 Xe 1K (EX i EX. 


AcCoA AcCoA AcCoA 


OAA OAA ae OAA 


(a) 野生 型 (b) PPC 突变 株 (©) pyk 突变 株 (e) ppc pyk RK 
10.9 不 同 突变 株 中 国 绕 PEP 和 丙酮 酸 节点 的 通 量 图 
带 箭头 曲线 的 粗细 表示 通 量 的 大 小 。 引 自 Park et al (1997a) 

同样 地 ， 如 果 PEP 羧 化 是 主要 回 补 途径 ， 则 在 ppc 突变 株 情 况 下 ， 应 当 观 察 到 赖 氨 酸 
第 产 下 降 。 然 而 ， 这 并 未 得 到 表 10.5 中 的 数据 的 支持 。 最 后 ， 在 该 C. glutamicum 菌株 
中 丙酮 酸 羧 化 是 主要 回 补 途 径 这 一 假设 已 被 zpc pyk 双 突 变 株 中 观察 到 的 生长 及 赖 氨 酸 生产 
均 减 弱 所 证 实 。 在 这 种 情况 下 ， 丙 酮 酸 生成 的 惟一 路 线 是 PEP: 葡萄 糖 磷酸 转移 酶 系统 
(PTS)， 对 于 输入 的 每 分 子 葡萄 糖 ， 其 产生 1 分 子 的 丙酮 酸 。 显 然 ， 可 用 于 经 丙酮 酸 羧 化 而 
进行 OAA 合成 及 用 于 经 丙酮 酸 脱氧 酶 而 进行 乙酰 辅酶 A 合成 可 利用 的 丙酮 酸 都 较 少 。 这 就 
限制 了 能 量 和 生物 合成 前 体 物 的 产生 。 由 于 在 与 天 冬 氨 酸 半 醛 的 缩合 以 合成 赖 氨 酸 的 步骤 中 
一 定 也 会 有 一 些 丙 酮 酸 流失 ， 因 此 ， 在 赖 氨 酸 合成 阶段 这 种 影响 就 更 为 严重 。 因 此 ， 这 些 数 
据 为 丙酮 酸 羧 化 活动 作为 这 些 菌 株 中 的 主 回 补 途 径 的 存在 提供 了 强 有 力 的 支持 。 

转氨酶 活性 的 发 现 

在 这 个 网 络 中 ， 有 40 个 代谢 物 参 与 了 总 共 39 个 反应 。 这 意味 着 有 39 个 未 知 通 量 和 40 
个 方程 ， 原 则 上 ， 这 已 足够 为 系统 提供 一 个 惟一 解 ， 以 及 为 生化 假设 和 发 酵 测量 结果 的 总 一 
致 性 检验 提供 一 个 剩余 度 。 然 而 ， 在 试图 求解 之 前 ， 必 须 先 建立 非 奇 异 的 ， 且 存在 惟一 解 的 
化 学 计量 矩阵 。 例 如 ， 如 果 PEP 和 丙酮 酸 羧 化 反应 都 存在 于 网 络 中 ， 则 和 抢 阵 G 是 奇异 的 ， 
这 表明 PEP 羧 化 通 量 不 能 仅 根 据 胞 外 测量 的 丙酮 酸 羧 化 通 量 独立 确定 。 当 THD 或 PYK 活 
性 至 少 有 一 个 存在 时 ， 情 况 也 是 这 样 。 然 而 ， 对 于 THD 和 PYK 活性 都 缺失 的 菌株 ， 和 矩阵 
G 则 变 为 非 奇 异 的 ， 且 PEP 和 丙酮 酸 羧 化 通 量 可 独立 确定 。 

显然 ， 有 很 多 可 能 性 要 考虑 ， 这 取决 于 菌株 的 遗传 背景 。 表 10.6 总 结 了 关于 和 矩阵 G 性 质 
的 结果 ， 其 对 应 于 4 个 关键 酶 : PPC. PC. THD & PYK 的 所 有 可 能 排列 相对 应 的 16 种 情况 。 
与 矩阵 奇异 性 之 一 起 ， 同 时 还 提供 了 每 种 组 合 的 生化 可 行 性 的 行 。 由 于 没有 任何 菌株 可 在 缺少 
这 两 个 回 补 反应 的 情况 下 生长 ， 因 此 ，PPC 和 PC 活性 都 缺失 的 菌株 被 认为 是 不 可 行 的 。 

对 于 每 个 突变 株 ， 必 须 重新 构建 化 学 计量 矩阵 G， 以 便 反 映 相 应 的 遗传 背景 和 酶 反应 数 
据 。 反 映 PYK 活性 存在 的 野生 菌 ， 在 给 予 对 应 于 回 补 反应 确切 性 质 适 应 性 的 时 候 ， 可 用 
Gi. Go. Gs. Go. Go 或 G10 中 的 任何 一 个 来 描述 。GIi、G2z 、G5 是 奇异 的 ， 因 此 ， 对 于 胞 内 
通 量 ， 仅 可 对 Go. Go 和 Gilo 的 情况 进行 求解 。 从 和 矩阵 Gy 的 结果 表明 : THD 通 量 非常 高 ， 
与 糖 酵 解 通 量 的 大 小 相近 。 由 于 这 样 的 高 通 量 并 未 得 到 所 测 THD 活性 的 支持 ， 因 此 ， 这 种 
情形 应 排除 。 不 可 能 根据 通 量 分 析 来 区 别 PEP (Go) 羧 化 途径 和 丙酮 酸 (Go) 羧 化 途径 的 
可 能 性 ， 这 是 因为 这 二 者 都 产生 同样 的 误差 估计 。 事 实 上， 除了 回 补 通 量 是 分 别 通过 PPC, 

259 


10.6 ”对 于 各 种 途径 结构 的 化 学 计量 矩阵 G 的 性 质 


36(PPC) 
37(PC) 
38(PYK) 
39(THD) 


| | + | 
s|n in [win [nw | w|i 


生化 可 行 性 


注 : 考虑 了 16 种 情况 。 每 种 情况 包括 一 组 基本 反应 [包含 反应 〈10.21) 一 反应 〈10.23)， 以 及 表 10.1 中 除 PYK 和 
PPC 之 外 的 所 有 反应 ]， 以 及 每 列 中 所 注 明 的 附加 反应 。 反 应 (36) 表示 PEP 羧 化 酶 的 酶 反应 步骤 ， 反 应 (37) 表示 两 
酮 酸 羧 化 酶 的 酶 反应 步 又， 反应 (38) 表示 丙酮 酸 激酶 的 酶 反应 步 又， 反应 (39) 为 转氨酶 的 酶 反应 步骤 。 缩 写 : +, 
反应 存在 ; - ， 反 应 不 存在 ; S, MR G 是 奇异 的 ; N, BAG 是 非 奇 异 的 ; FF， 途径 在 生物 化 学 上 是 可 行 的 ; I， 途 径 在 
生物 化 学 上 是 不 可 行 的 。 | 


Bm PYK 和 PC 之 外 ， 这 两 个 背景 都 给 出 相同 的 通 量 解 。 这 意味 着 基于 Go 和 Go 的 解 的 任何 
线性 组 合 都 是 可 能 的 ， 即 : 通过 PEP 羧 化 和 丙酮 酸 羧 化 的 碳 流 都 是 可 能 的 。 


对 于 ppc 突变 株 ， 根 据 前 面 的 结果 ， 以 及 2C- 标 记 研 究 所 提供 的 进一步 支持 ， 主 要 关注 


丙酮 酸 羧 化 活性 存在 的 情况 〈G9 一 Gtz)。PC- 标 记 研 究 表明 ， 这 条 途径 在 体内 (in vivo) 是 和 


有 效 的 〈Park et al，1997b)。 在 和 矩阵 Go 一 Gi 表 示 的 4 种 可 能 性 中 ，Gll 和 Gi> 被 剔除 ， 因 为 


它们 对 应 于 没有 PYR 活性 ， 与 测量 结果 相反 。 在 其 余 两 个 可 能 性 Gs 和 Go, Gok 


能 的 ， 因 为 它 的 总 一 致 性 指数 的 值 明 显 更 高 。 对 于 ppc 突变 株 ，THD 活性 即使 有 也 很 小 ， 
这 个 结论 得 到 了 体外 (in vitro) 活性 测量 结果 的 支持 〈 表 10.7; Park et al, 1997a). 

在 pyk 突变 株 情况 下 ， 分 析 了 如 下 化 学 计量 关系 (注意 : G; 是 奇异 的 ， 而 Gl5 和 Gil6 不 
是 可 行 的 ): G4，G7，Gg，Gii 及 Giz。 由 于 不 能 满足 元 余 方 程 ， 且 产生 非常 高 的 一 致 性 指 
数 ， 要 剔除 情况 Gs 和 Giz。 由 于 导致 TCA 循环 通 量 为 负 值 ，Gli 的 解 也 要 去 掉 。 同 样 地 ， 
由 于 得 到 丙酮 酸 羧 化 途径 的 通 量 为 负 值 ， 基 于 G4 的 解 是 不 可 能 的 。 结 果 ，6G7 是 该 突变 株 最 
可 能 的 化 学 计量 关系 。 应 注意 的 是 ， 经 THD 步骤 的 高 通 量 也 到 得 酶 反应 数据 ( 表 10.7) 的 
MF. ppc pyk 突变 株 的 发 酵 数据 也 按 类 似 于 分 析 pyvk 突变 株 的 方法 进行 了 分 析 。 类 似 地 ， 
基于 Gil 的 估计 是 该 突变 株 的 最 合理 解 。 

表 10.7 C. glutamicum ATCC 21253 (野生 型 ) 和 3 株 缺 失 突 变 
株 中 所 选 酶 的 活性 Amol`g (蛋白质 ) min : 


EDOEZOIEZCNRRCEETIIOICEITOEEZ 

677 下 150 AppcApyk Nae i... 490 

O n.d. 表示 未 检测 。 

为 了 从 实验 上 证 实 如 同 代 谢 通 量 分 析 所 建议 的 THD 的 功能 ， 在 这 4 株 菌 株 的 粗 提 物 中 
测量 了 THD 活性 ， 这 4 株 菌 株 是 在 1L 摇 瓶 中 用 PMB 培养 基 培 养 ， 并 在 指数 期 中 期 收获 。 
表 10.7 的 第 4 栏 给 出 了 THD HEN RHE. pyr 突变 株 和 pzpzc pyk 突变 株 的 THD 活性 明显 
高 于 其 它 两 株 ， 正 如 胞 内 通 量 分 析 表 明 的 那样 ， 胞 内 通 量 分 析 显 示 PPP 通 量 和 NADPH 合 
成 速率 升 高 。 

应 注意 的 是 ， 通 量 一 致 性 检验 失败 表明 了 THD 存在 ， 而 且 也 指出 : NADPH 积累 是 所 
观察 到 的 不 一 致 性 的 最 可 能 原因 。 从 通 量 分 析 得 到 的 其 它 观察 结果 是 : 在 pyk 突变 株 中 ， 

260 


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人 


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特别 是 在 ppc pyk 突变 株 中 ， 糖 酵 解 通 量 显著 降低 ， 而 PPP 通 量 随 之 升 高 。 对 于 上 述 突变 
株 ， 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 异 构 酶 的 通 量 是 反 向 的 ， 而 且 展 现 减少 的 回 补 通 量 。 最 后 ， 在 分 批发 酝 
过 程 中 ， 比 葡 萄 糖 运输 速率 减 小 ，ATP 需求 也 遵从 同样 的 趋势 。 然 而 ， 发 现 后 者 在 四 个 菌 


株 中 是 很 相似 的 ， 表明 这 4 个 遗传 背景 的 相对 恒定 的 比 代谢 能 量 需 求 。 图 10.9 通过 列 出 这 
B8 个 突变 株 的 最 可 能 途径 ， 概 括 了 本 节 的 分 析 结果 。 


10.2 “哺乳 动物 细胞 培养 中 的 代谢 通 量 


第 2 个 例子 是 将 代谢 通 量 分 析 用 于 哺乳 动物 细胞 培养 中 的 能 量 代 谢 途 径 。 细 胞 培养 作为 
共产 复杂 药物 蛋白 的 重要 技术 已 经 出 现 。 在 重组 产品 〈 在 原核 细胞 中 表达 的 简单 非 糖 基 化 蛋 
Alm: 人 生长 激素 、 胰 岛 素 、a- 干 扰 素 ) 第 一 次 浪潮 之 后 ， 第 二 代 生 物 技 术 产 品 主要 集中 于 
生产 分 泌 在 哺乳 动物 培养 基 中 的 活性 糖 基 化 的 复合 糖 蛋 白 。 用 于 单 克 隆 生 产 的 中 国 仓鼠 卵 细 
fd (CHO)、BHK 细胞 及 杂交 瘤 细 胞 是 最 通用 的 系统 。 当 前 ， 通 过 哺乳 动物 细胞 生产 的 一 
些 生 物 医药 已 在 市 场 上 销售 ， 诸 如 : 促 红细胞 生成 素 (EPO) 、 因 子 姐 、 组 织 纤 溶 酶 原 激活 
% (TPA) 以 及 粒 细 胞 集落 刺激 因子 (G-CSF) 等 。 还 有 很 多 在 等 待 法 规 批准 ， 有 望 在 不 
次 的 将 来 进入 市 场 。 哺 乳 动物 细胞 是 生产 这 些 分 子 的 装置 手段 ， 因 此 ， 在 过 去 十 年 里 ， 它 们 
的 重要 性 迅速 上 升 。 

哺乳 动物 细胞 用 于 范围 广泛 的 复合 糖 蛋 白 的 生产 已 变 得 明显 ， 人 们 就 以 极 大 的 努力 尝试 
提高 这 些 系 统 的 培养 密度 和 生产 能 力 。 哺 乳 动物 细胞 比 微生物 细胞 更 加 脆弱 ， 而 且 对 生长 因 
子 和 营养 的 要 求 更 为 苛刻 。 在 哺乳 动物 细胞 培养 中 获得 高 生产 能 力 的 主要 障碍 就 是 在 这 些 系 
统 中 可 得 到 的 细胞 密度 低 。 其 主要 原因 ， 特 别 是 在 分 批 培养 时 ， 是 细胞 生长 期 间 葡 萄 糖 代谢 
和 和 谷 所 酰胺 代谢 的 抑制 性 副 产 物 的 积累 ， 如 乳酸 和 氨 的 积累 。 降 低 培 养 基 中 这 些 副 产物 的 量 
有 助 于 得 到 高 细胞 密度 及 产物 积累 速率 的 相应 增加 。 由 于 上 述 副 产物 与 中 央 碳 代谢 直接 有 
关 ， 因 此 ， 自 然 要 进行 代谢 通 量 分 析 ， 并 确定 导致 副 产 物 生 成 的 主要 碳水 化 合 物 和 氨基 酸 通 
量 的 分 布 。 

时 常 地 ， 细 胞 培养 中 的 另 一 个 问题 是 细胞 生存 力 低 ， 特 别 是 细胞 密度 高 时 。 这 是 由 于 程 
序 性 细胞 死亡 GAT) 的 诱导 作用 。 凋 亡 过 程 已 在 工业 和 实验 室 观察 中 ， 对 与 能 量 代 谢 直接 
有 关 的 乳酸 吸收 、 丙 氨 酸 及 其 它 代谢 产物 分 刻 ， 进 行 了 广泛 的 关联 。 最 后 ， 大 量 观察 结果 表 
明了 葡萄 糖 利 用 率 作为 分 泌 产 物质 量 的 决定 因子 的 重要 性 ， 特 别 是 因为 产物 质量 与 糖 基 化 位 
点 占用 率 有 关 。 糖 基 化 反应 中 的 糖 利 用 率 是 一 个 问题 ， 它 可 通过 分 析 6- 磷 酸 葡 萄 糖分 支点 
的 碳 通 量 分 布 来 阐明。Glc6P 是 进入 成 糖 磷酸 途径 的 主要 人 口 点 ， 该 途径 为 完全 糖 基 化 蛋白 
的 生产 提供 碳 前 体 。 胞 内 通 量 的 确定 ， 特 别 是 当 与 胞 内 代谢 物 浓 度 和 酶 活性 结合 在 一 起 时 ， 
可 提高 我 们 对 这 些 细胞 中 蛋白 质 糖 基 化 的 理解 。 

10.2.1 胞 内 通 量 的 确定 

本 节 将 总 结对 杂交 瘤 细 胞 系 ATCC CRL 1606 [其 产生 抗 人 纤 连 蛋白 的 免疫 球 蛋 白 G 
(IgG)] 进行 代谢 通 量 分 析 所 做 的 工作 。 将 说 明 如 何 从 细胞 培养 数据 来 估计 这 些 通 量 ， 以 及 如 
何 通过 比较 预测 的 同位 素 富 集 度 与 在 细胞 培养 基 中 加 入 BC- 标 记 的 葡萄 糖 之 后 在 分 泌 的 乳酸 中 
所 测 的 同位 素 分 布 来 进一步 证 实 这 些 通 量 。 杂 交 瘤 细胞 是 采用 标准 的 DMEM 培养 基 
(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 在 2L 充分 搅拌 的 Celligen 生物 反应 器 中 进行 培养 的 。 有 
关 实 验 规 程 的 详情 可 查看 原文 (Zupke and stephanopoulos, 1994; Zupke etal，1995)。 表 10.8 
列 出 了 两 个 不 同 实验 中 所 测 的 代谢 物 。 在 实验 1 中 ， 当 细胞 浓度 为 4.8x105 个 细胞 .mL-1! 时 加 

261 


人 标记 葡萄 糖 ， 而 且 乳 酸 盐 允 许 积 累 20h。 在 实验 2 中 ， 细 胞 浓度 为 6.8x10 个 细胞 :ml 时 
加 入 葡萄 糖 ， 人 允许 乳酸 盐 积 累 10h。 两 次 实验 数据 如 表 10.8 的 两 列 所 示 。 


表 10.8 在 用 于 代谢 通 量 估计 的 杂交 瘤 细 胞 培养 中 所 测 的 速率 


—2.92+0.16 ; ; 3.71+0.19 
0.31+0.03 .31+0. -2.0+0.2 
乳酸 盐 6.2 土 0.32 .03 +0. 2.6+0.3 
—0.86+0.09 aes 0.96+0.1 
0.73+0.07 —0.70+0.07 


注 : 所 有 速率 以 10° mmol: (Mid ')-h 表示 。 负 号 表示 消耗 ， 生 物质 和 IgG 的 单位 分 别 是 以 C-mol 和 N-mol 
表示 。 


通过 向 生物 反应 器 液 面 上 空间 通 入 氮气 ， 并 监测 溶解 氧 浓 度 〈c。) 从 60% EM BKA 
20% ， 对 氧 比 吸收 速率 ro，[mmol' (细胞 -1)'h-:] 进行 动态 测量 。 下 式 用 来 计算 氧 比 吸收 
速率 ， 其 中 传 质 系 数 ALa 是 单独 测量 的 : 


2 bales id At iek (10.24) 


XP, co 为 与 气相 平衡 时 的 溶解 氧 浓度 ; z 为 生物 反应 器 中 的 细胞 浓度 。 


在 哺乳 动物 细胞 培养 中 ， 由 于 在 培养 基 中 用 碳酸 氢 盐 控制 pDH， 总 CO; 产生 速率 的 测量 


因而 变 得 复杂 。 由 于 CO?/ 碳 酸 氢 盐 相 互 作用 ， 液 相 中 可 能 有 CO, 积累 或 损失 ， 其 不 能 由 册 
口气 中 CO, 浓度 的 测量 所 检测 。 在 细胞 培养 基 常 见 的 条 件 下 ， 碳 酸 氢 盐 更 易 生 成 ; 然而 ， 
在 高 通气 速率 下 ， 会 存在 CO, 的 汽 担 。 为 了 正确 计算 CO. 的 总 生产 速率 (CPR), KAP 
CO, 的 积累 速率 必须 加 上 和 气相 CO, 的 挥发 速率 。CO; 挥发 速率 (CER) 是 按 F (cou - Cin) 


测量 的 ， 此 处 下 为 气体 流速 ，cu 和 cuu 分 别 是 生物 反应 器 进出 气流 中 的 CO, REE. GE 


用 没有 CO, (BN: cin=0) 的 瓶装 气体 ， 将 排出 的 气体 通 人 饱和 碳酸 钙 溶 液 中 ， 并 测量 溶液 
的 pH 值 ， 这 样 就 可 测量 排出 气流 中 的 CO, 浓度 。 在 平衡 时 ， 碳 酸 钙 溶液 的 pH SAH 
的 CO, 浓度 成 线性 关系 。 液 相 CO. 浓度 是 这 样 测量 的 : 将 没有 细胞 的 样品 在 4C 下 存放 ， 
并 用 测定 试剂 盒 酶 法 测量 CO 碳酸 氢 盐 的 总 浓度 。 在 杂交 瘤 细胞 的 分 批 培养 期 间 (大 约 
3.5d) ， 发 现 液 相 CO, 浓度 变化 非常 显著 : 首先 是 由 于 通气 气体 的 汽 提 效应 而 降低 ， 然 后 是 
因 细 胞 呼吸 导致 的 CO; 连续 积累 而 上 升 。 胞 外 代谢 物 的 比 生成 速率 是 通过 测量 相对 短 的 时 息 
间 (10~15h) 内 的 胞 外 代谢 物 浓度 来 确定 的 ， 以 致 培养 条 件 和 细胞 代谢 没有 显著 变化 。 根 
据 下 式 ， 对 浓度 数据 进行 最 小 二 乘法 拟 合 : 


7 s 之 0 
pet —1) 


C5—Cs,0 


(10.25) 


式 中 ，c。 为 测量 浓度 ;<c。 0 为 代谢 物 的 初始 浓度 〈 即 10~ 15h 测量 期 起 始 的 浓度) ry 


为 代谢 物 的 单位 吸收 速率 或 单位 消耗 速率 ; zo 为 细胞 初始 浓度 ; 5w 为 细胞 比 生长 速率 。 在 
谷 氮 酰 胺 情况 下 ， 考 虑 到 谷 氮 酰 胺 自发 分 解 产 生 氨 ， 上 式 要 进行 改进 。 

在 深层 培养 中 ， 哺 乳 动物 细胞 的 主要 碳 源 和 能 量 是 葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 。 谷 氨 酰 胺 也 作为 
主要 的 氮 源 。 在 杂交 瘤 细 胞 中 ， 也 要 消耗 谷 所 酰胺 之 外 的 其 它 氨基 酸 ， 而 且 它 们 的 消耗 量 可 
接近 谷 所 酰胺 的 50% 。 然 而 80% 以 上 的 消耗 量 是 用 于 蛋 自 质 合 成 ， 因 此 ， 谷 所 酰胺 之 外 的 
氨基 酸 对 产能 的 贡献 非常 少 。 添 加 成 分 ， 如 维生素 、 微 量 元 素 以 及 生长 因子 对 细胞 生长 有 显 
著作 用 ， 但 对 能 量 代谢 的 贡献 非常 小 。 和 葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 代谢 的 主要 产物 是 生物 质 、 以 抗体 

262 


t 


| 
| 形 武 分泌 的 蛋白 、 能 量 、 用 于 生物 合成 的 还 原 能 力 、 二 氧化 碳 、 记 产物 乳酸 和 氨 。 此 外 ， 根 
| 据 细 胞 系 和 生长 条 件 不 同 ， 也 可 能 分 泌 天 冬 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 谷 氨 酸 。 与 正常 组 织 相反 ， 培 养 
的 细胞 倾向 于 展现 出 高 速率 的 好 氧 糖 酵 解 。 这 是 葡萄 糖 经 糖 酵 解 代谢 为 丙酮 酸 的 结果 。 葡 萄 
糖 也 可 经 戊 糖 磷酸 途径 代谢 产生 NADPH 和 生物 合成 中 间 体 。 丙 酮 酸 可 转化 在 TCA 循环 中 
被 分 沁 、 被 氧化 的 乳酸 ， 或 经 转 氨 作 用 形成 丙 氨 酸 。 此 外 ， 丙 酮 酸 也 可 通过 回 补 途径 而 被 羧 
化 ， 或 通过 苹果 酸 酶 反应 而 合成 回 丙 酮 酸 。 在 许多 转化 细胞 和 肿瘤 细胞 中 ， 胆 固 醇 的 合成 被 
提高 ， 膜 组 成 的 改变 可 能 有 助 于 其 通常 展现 的 已 改变 的 代谢 。 然 而 ，CRL 1606 通常 将 90% 
以 上 所 消耗 的 葡萄 糖 转 化 为 乳酸 ， 这 表明 碳 从 乙酰 辅酶 A 到 胆固醇 合成 没有 明显 的 分 流 。 
在 生物 质 合 成 方程 式 中 ， 要 把 脂 质 的 合成 考虑 进去 ， 但 在 计算 乳酸 中 的 3C 分 布 时 ， 不 予 考 
虑 。 谷 氨 酰 胺 可 以 结合 进 生 物质 中 ， 或 经 TCA 循环 氧化 。 已 经 发 现在 很 多 细胞 系 中 ， 谷 氨 
酰胺 是 主要 的 能 源 。 对 于 CRL 1606 杂交 瘤 细 胞 ， 葡 萄 糖 和 谷 氨 酰胺 是 主要 的 能 源 ， 而 氢 、 
弛 酸 及 丙 氨 酸 是 主要 的 产物 。 

图 10.10 和 表 10.9 分 别 描述 和 总 结 了 哺乳 动物 细胞 中 的 能 量 代谢 生物 化 学 。 通 过 将 出 


ATP CO2+2NADPH 


aoe pe Mt Gle-6-P ‘Sees Ribu-5-P 


-5-P ib-5- 
aia Xyl Rib-5-P 


GAP 4P Sed-7-P 


Suc Suc CoA 
GTP 
aes Gp 


图 10.10 杂交 瘤 细 胞 中 的 能 量 代谢 生物 化 学 
代谢 途径 包括 糖 酵 解 、 谷 所 酰胺 酵 解 、 戊 糖 磷酸 途径 及 TCA 循环 。 苹 果 酸 酶 可 在 回 补 反 应 或 丙酮 酸 合成 中 起 作用 
缩写 : Glc-6-P 一 6- 磷 酸 葡萄 糖 ; Ribu-5-P 一 5- 磁 酸 核 酮 糖 ;Fru-6-P 一 6- 磷 酸 果糖 ; Xyl-S$-P 一 5- 磷 酸 木 酮 糖 ; 
Rib-5-P 一 5$- 磷 酸 核糖 ; GAP 一 3- 磷 酸 甘 油 醛 ; Sed-7-P 一 7- 磷 酸 景 天 庚 酮 糖 ; Gln 一 谷 氨 酰 胺 


263 


10.9 描述 杂交 瘤 细 胞 中 能 量 代谢 的 反应 组 


. 葡萄 糖 + ATP-~6- 磷 酸 葡 萄 糖 + ADP 

. 6- 磷 酸 葡萄 糖 一 6- 磷酸 果糖 

. 6- 磷 酸 果 糖 + ATP->~2- 三 磷酸 甘油 醛 +ADP 

. 三 磷酸 甘油 醛 +2ADP+ NAD-~~ 丙 酮 酸 +NADH+2ATP 

. 丙酮 酸 +NADH-> 乳 酸 +NAD 

. 6- 磷 酸 葡萄 糖 + 2NADP—>5-BE ME MAE + 2NADPH + CO, 

. 5- 磷 酸 核 酮 糖 一 5- 磷 酸 木 酮 糖 

. 5- 磷 酸 核 酮 糖 + 5-RRAM HE 7-RRRAKRME + RRA HE 

. 7- 磷 酸 景 天 庚 酮 糖 一 6- 磷 酸 果糖 + 4- 磷 酸 赤 侈 糖 

10. 5-BERA MARE + 4- 磷 酸 赤 玖 糖 一 6- 磷 酸 果 糖 + = RRM 

11. 丙酮 酸 + 苹果 酸 +3NAD->a-KG+3NADH+2CO， 

12. c-KG+2NAD+ADP->2NADH+ CO, + ATP + ##R 

13. FARK-F AR + NH; 

14. 丙酮 酸 + FAR—-AAR + a-KG 

15. @&M + NADP-a-KG + NADH + NH; 

16. 2NADH + 6ADP + O,>2NAD + 6ATP 

17. # RM + NADP>A MM + CO, + NADPH 

18. ATP-ADP 

19. 0.036 FARK + 0.062 FAM + 0.0031 6- 磷 酸 葡 萄 糖 + 0.013 5- 磷 酸 核 酮 糖 + 0.042 三 磷酸 甘油 醛 + 123 丙酮 酸 
+0.019 苹 果 酸 + 0.74ATP + 0.188NADPH + 0.23NAD 一 生物 质 + 0.072a-KG + 0.23NADH + 0.12CO, + 
0.74ADP + 0. 188NADP 

20. 0.012 F AMHK + 0.07 4 AM + 0.04GAP + 0.011NADPH + 0.012 苹果 酸 + 0.082NAD— fi fF + 0.082NADH + 

0.057a-KG + 0.011INADP 


注 : 在 反应 12 (TCA 循环 的 一 部 分 ) 中 ，FAD 已 用 NAD 代替 ， 所 产生 的 GTP 已 省 略 。 由 于 通过 电子 传递 链 ,三 
个 NADH 可 产生 三 个 ATP，FADH2: 可 以 产生 两 个 ATP， 因 此 ， 产 生 了 正确 的 ATP 当量 数 。 缩 写 : FAD 一 黄 素 腺 嘎 叭 


OarAI NUN FW NY 


性 


二 核 苷 酸 ; NAD-ARERRES KER; GTP 一 乌 味 叭 核 背 三 磷酸 ; ADP 一 腺 味 叭 核 苷 二 磷酸 ; GAPR—=RRAM 


BR; ac-KG 一 c- 酮 戊 二 酸 。 
现在 反应 链 中 的 中 间 代 谢 物 归并 ， 代 谢 网 络 已 经 得 到 简化 。 代 谢 途 径 提 供 能 量 (ATP), 
JRA (NADPH) 以 及 生物 质 和 抗体 合成 的 前 体 。 所 归并 的 方程 也 为 遵从 2.5 节 所 述 步骤 的 
生物 质 合 成 和 抗体 合成 提供 准备 。 即 : 通过 使 用 从 生化 网 络 中 存在 的 前 体 合 成 大 分 子 的 反应 
推导 出 这 些 方程 式 ， 并 与 描述 细胞 大 分 子 组 成 的 方程 式 组 合 在 一 起 。 典 型 的 蛋白 质 组 成 已 假 
定 适合 于 这 些 细胞 分 泌 的 抗体 ， 如 表 2.8 Ara. 

通过 使 用 来 自 两 个 不 同 实验 的 速率 数据 〈 详 情 见 下 一 节 和 表 10.8)， 可 以 得 到 表 10.10 
的 胞 内 通 量 。 在 95% 置 信 水 平 ， 随 机 测量 误差 足以 解释 数据 中 的 差异 。 对 于 本 研究 中 存在 
的 三 个 元 余 测 量 结果 ， 一 致 性 指数 (CI) 小 于 7.81。 这 再 次 强调 ， 一 致 性 指数 对 于 识别 错 
误 测 量 结果 是 非常 有 用 的 。 在 本 研究 中 ， 一 致 性 指数 (CI) 识别 了 二 氧化 碳 产 生 速 率 
(CPR) 测量 中 的 问题 。 已 经 发 现 ， 采 用 直接 从 CO. 释放 速率 (CER) 测量 结果 得 到 的 
CPR 值 会 产生 显著 的 不 一 致 性 ， 它 可 通过 去 掉 测 量 速率 表 中 的 CER 来 消除 。 这 表明 CER 
是 过 失误 差 的 一 个 来 源 ， 实 际 上 已 发 现 ， 这 是 由 于 液 相 CO 和 气相 CO, 之 间 的 相互 作用 造 
成 的 。 正 如 前 面 所 述 ， 在 计算 真实 的 CPR 时 ， 把 CO， 积累 速率 包含 在 内 ， 则 可 修正 误差 。 

胞 内 通 量 是 在 不 同 溶 氧 水 平 上 确定 的 ， 并 用 来 评价 氧 对 细胞 代谢 的 影响 。 表 10.11 总 结 
了 最 重要 的 通 量 及 其 不 确定 性 。 丙 酮 酸 到 TCA 循环 的 通 量 在 正常 溶解 氧 水 平时 是 显著 的 ， 
而 在 1% 洲 解 氧 水 平时 仅 为 很 小 的 正 值 ,在 氧 限制 条 件 下 基本 为 零 。 通 过 丙 氨 酸 转 氨 酶 的 通 
量 在 各 种 溶 所 水平 下 大 致 不 变 。 通 过 谷 氮 酸 脱 氢 酶 的 通 量 在 60% 深 氧 水 平时 为 正 ， 而 在 低 

204 


表 10.10 从 测量 的 速率 估计 杂交 瘤 培养 中 的 通 量 /10 mmol: (细胞 ) “+h! 


3.18 土 0.11 3.91+0.13 0.211 +0.060 0.203 +0.060 
2.85+0.11 3.54+0.13 0.922 + 0.063 0.925 +0.063 
5.0320.11 3.74+0.13 0.683 + 0.036 0.691 40.036 
5.96+0.22 7.38+0.26 0.314+0.031 0.318+0.031 
0.315 +0.028 7.00 +0.26 0.073 +0.039 0.054 +0.038 
0.315 +0.028 0.355+0.029 1.88+0.17 4292.20.17 


0.178 +0.018 
0.089 +0.010 
0.089+0.010 
0.090 +0.010 


0.202+0.019 0.629 + 0.036 0.634 +0.037 
0.101 +0.010 BOLD ded 16:621.2 

0.101 +0.010 3.69+0.18 4.01+0.20 
0.101+0.010 0.961+0.096 0.999 +0.099 


SMP ANI ADAMHFwWHN 


HE: 反应 号 指 表 10.9 中 的 生化 反应 。 数 据 取 自 Zupke and Stephanopoulo (1995). 


溶 氧 水 平时 为 负 。 如 表 10.11 所 示 ， 从 通 量 也 可 计算 一 些 有 趣 的 参量 。 当 深 氧 减 小 时 ， 产 生 
的 总 ATP 从 1.95pmol: (4H id)! +h BEAR 2 1.58pmol' (细胞 )-1h 1， 变化 不 是 太 明 显 。 
这 使 人 想到 在 微生物 细胞 情况 下 所 得 的 结果 ， 即 : ATP 的 比 生成 速率 似乎 与 培养 条 件 确实 
无 关 。 当 溶解 氧 下 降 时 ， 不 断 增 加 的 ATP 从 葡萄 糖 产 生 ， 而 且 平 行 于 糖 酵 解 产生 的 ATP 
分 数 ， 糖 酵 解 产生 的 ATP 分 数 从 0.34 增加 到 0.69。 所 得 的 结果 也 表明 : 溶解 氧 对 氮 代 谢 
和 通过 谷 氨 酸 脱 氢 酶 的 通 量 具有 显著 影响 。 在 低 溶解 氧 水 平时 ， 谷 氨 酸 脱 氢 酶 逆转 反应 方 
向 ， 从 而 有 利于 谷 氢 酸 形成 。 通 过 通 量 分 析 ， 和 弄 清楚 了 一 些 东 西 ， 并 指出 胞 内 氧化 /还 原 在 
细胞 生理 学 中 的 基本 作用 ， 以 及 通过 溶 氧 调节 控制 生理 过 程 的 可 能 性 。 


村 表 10.11 根据 杂交 瘤 培 养 中 所 测量 的 胞 外 代谢 物 变 化 的 速率 
; i+ S90 BTA HB /mol- (4A) “ho? 


BEA TCA 循环 的 丙酮 酸 0.0+0.3 0.28+0.3 0.94+0.28 
丙酮 酸 至 丙 氨 酸 0.33+0.3 0.26+0.2 0.3340.3 
#@ARZ GDH 至 c- 酮 戊 二 酸 —0.29+0.3 —0.14+0.2 0.4+0.3 
苹果 酸 至 丙酮 酸 =-0.24 土 0.3 0.41+0.3 0.59+0.4 
总 ATP/pmol.( 细 胞 )-1.h-1 1.58 1.67 1.95 
糖 酵 解 产生 的 ATP 分 数 0.69 0.5 0.34 
来 自 葡 萄 糖 的 ATP 分 数 0.85 0.75 0.67 
来 自 葡萄 糖 的 乳酸 分 数 0.99 0.98 0.96 


用 于 维持 的 ATP 分 数 0.29 0.46 0.62 
注 : 总 ATP 生产 与 各 种 途径 的 贡献 及 维持 反应 所 消耗 的 没有 考虑 的 ATP 量 同 时 给 出 。 数 据 取 自 Zupke et al 
(1995). 
10.2.2 通过 2C 标记 研究 证 实 通 量 估计 
为 了 证 实 通过 物质 平衡 所 得 的 通 量 估计 ，9BC 标记 葡萄 糖 作为 一 个 特定 探 针 用 于 细胞 培 
养 基 中 。 与 Walsh 和 Koshland (1984) 在 研究 大 肠 杆 菌 中 的 乙 醛 酸 支 路 时 使 用 的 方法 类 似 ， 
将 测 得 的 乳酸 中 的 同位 素 分 布 与 从 胞 内 通 量 估计 所 预测 的 进行 比较 。 还 要 注意 的 是 ， 对 于 一 
组 给 定 的 胞 内 通 量 〈 例 如 ， 通 过 物质 平衡 确定 的 )， 以 及 从 反应 物 到 产物 的 碳 原 子 作 图 的 途 
径 ， 可 以 对 代谢 网 络 中 的 全 部 代谢 物 确定 稳 态 同位 素 分 布 。 选 择 可 以 从 代谢 通 量 中 作出 辨别 
的 标记 底 物 是 很 重要 的 。 已 经 发 现 ， 如 果 葡萄 糖 用 作 标 记 化 合 物 ， 则 分 沁 的 乳酸 的 三 个 碳 位 
上 的 SC 富 集 度 明 显 取决 于 胞 内 通 量 。 具 体 地 ， 分 泌 的 乳酸 中 的 同位 素 富 集 度 分 布 是 两 个 通 
265 


量 比 亡 〈 糖 酵 解 产 生 的 丙酮 酸 分 数 ) 和 户 〈 从 谷 氢 酸 衍生 的 oH RORTR) 的 函数 。 

标记 实验 是 这 样 进行 的 : 先 让 细胞 在 未 标记 葡萄 糖 上 生长 一 短暂 时 间 ， 一 旦 达到 指数 
期 ， 则 将 lg99% [1-83C] 葡萄 糖 加 入 到 生物 反应 器 中 。10h 或 20h 之 后 收集 培养 基 ， 通 过 
离心 除去 细胞 。 上 清 液 通过 冷冻 干燥 进行 浓缩 ， 并 进行 NMR 分 析 。 得 到 关于 乳酸 3 个 碳 原 
子 的 富 集 度 的 NMR 数据 。 它 们 被 表示 为 C1:C2 和 C3:C1 富 集 度 之 比 ， 结 果 如 表 10.12 所 
示 。 同 位 素 富 集 度 比 可 用 来 与 富 集 度 预测 值 比较 ， 从 而 减 小 基线 变化 所 造成 的 误差 。 


#1012 为 了 证 实 通过 物质 平衡 方法 确定 的 杂交 瘤 代谢 通 量 
而 进行 的 两 个 标记 实验 的 同位 素 富 集 度数 据 


BC 比 ,乳酸 的 C1:C29 
BC 比 ,乳酸 的 C3:C1@ 
未 标记 乳酸 的 分 数 
标记 葡萄 糖 的 分 数 
糖 酵 解 产生 的 丙酮 酸 分 数 (万 ) 0.905 土 0.006 
来 自 谷 氢 酸 胺 的 -KG 分 数 ( 户 ) 0.77+0.05 


@ 在 估计 C1:C2 比 时 ， 这 两 个 实验 的 误差 概率 分 别 是 16% 和 0.5%。 

@ 在 估计 C3:C1 比 时 ， 这 两 个 实验 的 误差 概率 分 别 是 5% 和 1%。 

注 : 3 个 乳酸 的 3C 峰 面 积 已 定量 ， 并 用 来 计算 富 集 度 比 。 葡 萄 糖 和 乳酸 的 富 集 度 是 通过 测量 标记 葡萄 糖 加 入 前 后 的 
浓度 来 确定 的 。 通 量 比 方 和 户 是 根据 代谢 网 络 化 学 计量 和 代谢 物 速 率 变化 的 测量 结果 来 估计 的 。 数 据 取 自 Zupke et al 
(1995). 

实验 测 得 的 同位 素 富 集 度 可 与 由 所 分 泌 的 代谢 物 物质 平衡 从 胞 内 通 量 计 算 所 得 结果 进行 
HR. AH, fi 和 户 这 两 个 通 量 比 足 以 确定 乳酸 的 2C 富 集 度 。 图 10.11 和 图 10.12 表 
示 了 813C 乳酸 富 集 度 比 对 这 两 个 通 量 比 的 依赖 性 。 这 两 个 图 表明 ， 恒 富 集 度 比 的 计算 等 值 线 
是 方 和 户 的 函数 。 一 个 单个 同位 素 比 将 通 量 比 限 制 在 一 条 等 值 线 上 ， 但 并 不 能 惟一 地 决定 
方 和 户 。 这 两 个 通 量 的 确定 需要 测量 两 个 相互 独立 的 同位 素 比 ， 然 后 在 图 10.11 和 图 
10.12 所 示 曲 线 徐 中 的 两 条 等 值 线 相 交 处 确定 户 和 户 。 通 过 使 用 图 10.11 和 图 10.12 中 的 
等 值 线 ， 并 直接 与 实验 测定 的 同位 素 比 值 比 较 ， 则 可 按 相 反 的 顺序 ， 利 用 方 和 户 来 确定 同 
位 素 比 C1:C2 和 C3:C1。 因 此 ， 分 沁 的 乳酸 中 的 同位 素 富 集 度 测 量 结果 既 可 用 来 证 实 其 它 
方式 得 到 的 胞 内 通 量 估计 值 ， 也 可 用 来 直接 确定 图 10.11 与 图 10.12 等 值 线 相交 处 的 胞 内 通 


0.98+0.01 
oo OF 11 
0.39+0.02 
0.115+0.006 


0.98+0.01 
3.0+0.09 
0.55+0.03 
0.117+0.006 
0.921 +0.005 
0.78+0.05 


C1:C2 KE fi Al fo Hh 
RK. CLA C2 分 别 是 乳酸 第 1 位 
和 第 2 位 碳 原子 上 的 3C 的 数量 。 
通 量 比 亡 ERB BoE 
酸 的 分 数 ， 而 fo ZARA 
生 的 c- 酮 戊 二 酸 的 分 数 。 等 值 线 
是 通过 计算 机 模拟 生化 网 络 计算 
的 。 生 化 网 络 采用 的 实验 条 件 为 
11.5% 的 葡萄 糖 在 第 一 位 碳 标记 
有 BC，39% 的 积累 乳酸 未 富 集 。 
改 自 Zupke 和 Stephanopoulos 
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 (1994) 

f, 


图 10.11 杂交 瘤 培养 实验 1 中 ， 乳 酸 中 的 恒定 C1:C2 比 的 等 值 线 
200 


C3:Cl KH ff, M fo HH 
数 。C3 和 Cl 分 别 是 乳酸 第 3 位 
和 第 1 位 碳 原子 上 的 BC 的 数量 。 
通 量 比 廊 是 糖 酵 解 产生 的 丙酮 
酸 的 分 数 ， 而 户 是 从 谷 氨 酸 衍 
AW c- 酮 戊 二 酸 的 分 数 。 等 值 线 
是 通过 计算 机 模拟 生化 网 络 计 算 
的 。 生 化 网 络 采用 的 实验 条 件 为 
11.5% 的 葡萄 糖 在 第 一 位 碳 标 记 
有 HBC，39% 的 积累 乳酸 未 富 集 。 
改 自 Zupke 和 Stephanopoulos 
(1994) 


图 10.12 杂交 瘤 培养 实验 1 中 ， 乳 酸 中 的 恒定 C3:Cl 比 的 等 值 线 


量 比 。 应 注意 的 是 ， 虽 然 可 在 单个 同位 素 比 情 况 下 证 实 胞 内 通 量 ， 但 胞 内 通 量 的 确定 通常 要 
求 测量 二 个 以 上 的 同位 素 比 。 此 外 ， 鉴 于 图 10.11 和 图 10.12 中 等 值 线 的 形状 ， 通 过 联合 使 
用 二 个 以 上 的 同位 素 比 测量 ， 通 量 证 实 的 精确 度 将 显著 提高 。 

图 10.13 表示 将 测量 的 同位 素 比 与 根据 代谢 通 量 估计 值 预测 的 同位 素 比 进行 比较 时 实验 
1 和 实验 2 的 结果 。 图 中 显示 了 对 应 于 两 个 测量 的 同位 素 比 及 其 估计 的 不 定性 (+1 标准 偏 
差 ) 的 等 值 线 交点 。 此 外 ， 图 中 还 给 出 了 通过 物质 平衡 计算 的 通 量 比 及 其 不 定性 。 虽 然 根 据 
NMR 得 到 的 通 量 比 的 估计 值 具有 较 大 的 不 定性 ， 但 两 种 方法 之 间 具 有 良好 的 一 致 性 。 为 了 
检验 一 致 性 的 统计 显著 性 ， 要 进行 两 个 检验 。 首 先 ， 要 检验 计算 的 比值 和 测 得 的 比值 是 相同 
的 这 个 假设 ， 并 发 现在 90% 置 信 区 间 内 这 个 假设 是 成 立 的 。 其 次 ， 要 检验 比值 相差 一 个 以 
上 的 指定 增 量 这 个 假设 。 选 择 的 增 量 要 对 应 于 万 或 户 的 20% 差 数 。 对 于 C1:C2 和 C3:C1， 
增 量 分 别 等 于 0.04 和 0.4。 在 表 10.12 中 所 示 误 差 概 率 的 情况 下 ， 可 以 否定 测量 的 比值 和 


1 


万 和 户 是 在 杂交 瘤 培养 中 根据 乳酸 
BC 同位 素 比 ， 以 及 根据 采用 物质 平衡 和 
胞 外 测量 所 做 的 通 量 估计 而 得 到 的 。 人 恒 
比 C1:C2 和 C3:Cl 这 两 条 等 值 线 的 交 
点 ， 根 据 分 泌乳 酸 中 的 SC 体外 (in vit- 
ro) NMR 测量 来 确定 户 和 fo. MARR 
示 对 应 于 NMR 测量 的 正 或 负 标 准 偏差 
的 等 值 线 ， 实 线 表示 根据 估计 的 胞 内 通 
量 计算 的 通 量 比 中 的 不 确定 度 。 上 图 为 
实验 1， 下 图 为 实验 2。 改 自 Zupke 和 
Stephanopoulos (1994) 


图 10.13 通 量 比方 和 户 的 比较 
267 


计算 的 比值 相差 几 个 增 量 这 个 假设 。 从 这 一 点 可 以 得 出 以 下 结论 : NMR 测量 结果 与 根据 通 
量 预 测 的 比值 具有 良好 的 一 致 性 。 
这 个 例子 说 明了 应 用 标记 实验 是 如 何 有 利 地 证 实 通过 物质 平衡 得 到 的 通 量 图 。 应 注意 的 “ 
是 ， 标 记 底 物 的 选择 对 根据 同位 素 富 集 度 来 对 胞 内 通 量 进行 定量 的 能 力 ， 特 别 地 ， 区 分 不 同 
底 物 的 贡献 等 具有 重要 影响 。 在 本 例 中 ， 采 用 了 两 个 乳酸 比 。 正 如 在 图 10.12 中 看 到 的 ， | 
C3:C1 比 的 测量 结果 对 方 的 值 敏 感 ， 但 对 户 的 值 相 当 不 敏感 。 将 C3:Cl 比 测量 结果 与 C1: 4 
C2 比 的 测量 结果 组 合 在 一 起 可 以 修正 这 一 点 。 类 似 的 分 析 表明 : 采用 标记 谷 氨 酰 胺 可 以 较 
好 地 确定 疡 ， 这 是 因为 谷 氨 酰 胺 更 直接 地 包含 在 反应 分 开 时 ， 并 导致 乳酸 标记 。 标 记 谷 氨 
酰胺 与 标记 葡萄 糖 同 时 使 用 会 得 到 一 个 区 分 胞 内 通 量 的 更 好 系统 ， 并 提高 标记 比 期 望 值 和 测 
量 值 之 间 的 一 致 性 精度 。 - 
10.2.3 通 量 分 析 在 细胞 培养 基 设 计 中 的 应 用 
在 上 节 中 ， 给 出 了 生物 质 合成 及 抗体 合成 的 归并 方程 式 。 应 注意 的 是 ， 除 了 方程 式 中 确 
认 的 代谢 物 之 外 ， 生 物质 合成 还 需要 其 它 营养 ， 它 们 不 能 从 基本 的 碳水 化 合 物 源 和 谷 氨 酰 胺 | 
源 中 获取 。 这 样 的 营养 ， 璧 如 必需 氨基 酸 ， 它 们 作为 培养 基 中 的 添加 成 分 而 被 提供 。 尽 管 三 
些 营 养 成 分 可 以 从 葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 合成 ， 但 在 培养 基 中 应 加 入 它们 ， 从 而 尽量 减少 用 于 咎 
成 它们 的 葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 的 消耗 量 。 例 如 ， 典 型 细胞 培养 基 中 已 知 的 非 必需 氨基 酸 就 是 这 
种 情况 ， 它 们 可 以 从 培养 基 中 的 谷 氨 酰 胺 衍生 出 来 。 这 对 氨 的 产生 会 有 不 良 影 响 ， 氨 在 培养 
基 中 积累 ， 并 最 终 引起 细胞 培养 过 程 的 结束 。 通 过 向 培养 基 中 补充 那些 可 以 从 谷 氢 酰 胺 衔 生 
的 非 必需 氨基 酸 ， 可 以 减少 谷 氨 酰 胺 在 培养 基 中 的 用 量 ， 从 而 降低 氨 的 积累 量 。 这 种 方法 已 
用 于 开发 哺乳 动物 培养 基 的 新 配方 (Xie and Wang，1996)。 该 配方 反映 了 基于 生物 质 合 成 
和 抗体 合成 的 一 般 方程 式 的 准确 的 化 学 计量 平衡 。 培 养 基 配 制 的 准则 是 : (a) 提供 生物 质 谷 
成 和 抗体 合成 所 需 的 全 部 营养 成 分 (b) 在 培养 基 中 按 化 学 计量 平衡 补充 非 必需 氨基 酸 ， 尽 
量 减少 用 于 非 必需 氨基 酸 合成 的 谷 氨 酰 胺 量 ; (c) 供给 按 化 学 计量 平衡 的 培养 基 ， 以 便 培 养 
基 中 的 葡萄 糖 浓 度 保持 在 限制 水 平 ， 以 及 培养 基 的 渗透 压 在 加 料 过 程 中 不 会 发 生 显著 变化 避 
作为 按 化 学 计量 平衡 的 培养 基 与 上 述 补 料 策略 的 组 合 运用 的 结果 ， 在 CRL 1606 培养 中 
的 细胞 密度 和 产品 滴 度 大 幅 提高 。 细 胞 生长 达到 密度 为 每 毫升 几 百 万 个 ， 抗 体积 累 达 到 
2.4g/ 的 特别 水 平 。 发 现 该 抗体 的 生产 与 活 细胞 总 数 乘 以 它们 在 生物 反应 器 培养 基 中 的 存 
在 时 间 直 接 相 关 。 当 然 意味 着 抗体 的 比 生 产 速率 在 细胞 密度 低 时 ， 或 非常 高 时 是 恒定 的 ， 这 
是 细胞 培养 技术 所 有 开发 努力 中 一 个 非常 重要 的 发 现 。 


参考 文 献 


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269 


第 11 章 代谢 控制 分 析 


代谢 工程 的 一 个 最 重要 目的 是 前 明 负责 通 量 控制 参数 的 意义 。 在 前 述 章节 中 ， 描 述 ， 
了 如 何 通过 胞 内 代谢 的 质量 平衡 和 包括 同位 素 标记 在 内 的 更 专 一 化 的 方法 来 确定 代谢 
通 量 。 代 谢 通 量 分 析 (MEFA) 的 概念 ， 对 于 研究 不 同 代 谢 途 径 之 间 的 相互 作用 和 量化 ) 
围绕 代谢 分 支点 的 通 量 分 布 是 很 有 用 的 。 然 而 ，MFA 本 身 并 不 能 给 我 们 提供 任何 通 量 
控制 的 定量 的 度量 标准 。 通 量 控制 对 于 保持 代谢 物 的 合成 和 转化 速率 的 严格 平衡 是 很 星 
重要 的 ， 该 平衡 要 覆盖 非常 广泛 的 外 部 条 件 ， 而 使 胞 内 代谢 物 的 浓度 不 会 发 生 剧 烈 的 量 
上 升 或 下 降 。 此 外 ， 正 确 理解 通 量 控制 对 代谢 通 量 的 合理 调整 也 是 很 重要 的 ， 这 种 合 
理 的 调整 正 是 代谢 工程 的 主要 目的 。 在 20 世纪 30 年代， 反馈 抑制 、 协 同性 、 酶 的 共 价 
修饰 作用 以 及 酶 的 合成 控制 机 理 的 发 现 揭示 了 若干 分 子 机 制 ， 这 些 机 制 在 通 量 控 制 中 
起 着 重要 的 作用 。 由 于 在 通 量 控制 方面 存在 形形色色 的 机 制 ， 对 于 一 个 给 定 的 代谢 途 ， 
径 ， 在 其 通 量 是 如 何 被 控制 的 问题 上 存在 许多 争论 就 不 足 为 奇 了 。 因 为 大 部 分 关于 酶 
的 控制 的 研究 报道 主要 是 定性 的 〈 例 如 : “果糖 磷酸 激酶 是 肌肉 细胞 中 糖 酵 解 途径 的 主 | 
要 通 量 控制 酶 。 Voet and Voet，1990) ， 所 以 对 大 量 的 有 关 通 量 控制 的 研究 结果 的 重 
要 性 进行 评估 是 很 困难 的 。 在 许多 情况 下 ， 这 些 研 究 结 果 之 间 似 乎 有 相互 矛盾 之 处 。 
在 讨论 通 量 控制 时 ， 关 于 限 速 步骤 和 关键 酶 的 陈述 以 及 参考 文献 大 量 存在 。 对 这 些 可 
能 以 不 同 的 方式 进行 解释 ， 这 经 常 导 致 关于 控制 代谢 中 这 些 反 应 步骤 实际 作用 的 误解 。 
例如 : 早期 发 现 ， 一 条 代谢 途径 中 第 一 个 酶 ， 或 者 在 一 个 分 支点 后 的 第 一 个 酶 受到 某 ， 
种 类 型 的 调节 (如 反馈 抑制 )。 这 往往 导致 如 下 说 法 :“ 在 一 条 代谢 途径 中 的 第 一 步 反 
应 是 限 速 步骤 ”， 而 这 并 不 一 定 是 正确 的 。 

在 酶 动力 学 相互 作用 和 通 量 控制 通常 的 定性 处 理 中 ， 代 谢 控 制 分 析 (MCA) 的 引 
和 帮助 其 建立 一 些 严密 性 。 此 外 ， 它 还 对 通 量 控制 中 重要 代谢 参数 的 系统 评价 及 描述 
提供 了 一 个 有 用 的 框架 。 从 本 质 上 说 ，MCA 是 代谢 网 络 酶 动力 学 本 身 非 线性 问题 的 一 
种 线性 扰动 理论 。 因 此 ，MCA 的 预测 在 性 质 上 是 局 部 的 ， 任 何 外 推 至 多 是 尝试 性 的 。 
尽管 有 这 些 局 限 性 ，MCA 在 如 下 方面 已 表明 是 很 有 用 的 : 提供 各 单个 反应 代谢 通 量 控 
制 的 度量 标准 ， 阐 明 酶 反应 网 络 中 速率 控制 步骤 的 概念 ， 描 述 酶 活性 对 于 胞 内 代谢 物 
浓度 的 影响 ， 联 系 局 部 的 酶 动力 学 和 系统 的 代谢 行为 。 

MCA 的 概念 是 在 Kacser 和 Burns (1973) 以 及 Heinrich 和 Rapoport (1974) 发 表 
的 两 篇 具有 里 程 碑 意义 的 文章 中 提出 来 的 ， 它 们 均 是 对 Higgins (1963, 1965) 关于 这 | 
方面 思想 的 发 展 。 另 外 两 种 用 于 代谢 控制 定量 研究 的 框架 一 -生化 系统 理论 (Biochem- | 
ical Systems Theory 见方 框 11.1) 及 Crabtree 和 Newsholme 提出 的 通 量 定向 理论 
(flux-oriented theory, Crabtree and Newsholme, 1987a, b) 具有 许多 相似 之 处 。 虽 然 
最 初 的 注意 力 集中 于 这 三 种 方法 的 不 同 点 ， 后 来 人 们 认识 到 尽管 形式 不 同 ， 但 它们 确 
实 汇聚 于 同样 的 概念 。 在 本 章 中 ， 将 描述 MCA 的 基本 思想 及 其 结果 ， 由 于 其 更 偏向 于 
描述 代谢 网 络 的 通 量 控制 。 

270 


| 方 框 11.1 生化 系统 理论 

| 由 Savagean 在 20 世纪 60 年 代 后 期 提出 的 生化 系统 理论 用 于 处 理 复 杂 系 统 的 模型 模 
(| 拟 问题， 其 中 这 些 系 统 之 间 也 许 存在 许多 不 同 程度 上 的 相互 作用 。 它 的 出 发 点 是 反应 速 
| 直率 可 用 如 下 类 型 的 常规 寒 函数 表达 式 : 


Oy Srey [| x* (1) 


是 表 观 速率 常数 和 表 观 动力 学 级 数 。 式 (1) 可 被 看 作为 非 线性 动力 学 在 对 数 坐 标 上 的 线 
性 化 。 由 于 大 多 数 生 化 反应 都 是 非 线 性 的 ， 因 此 该 式 对 反应 动力 学 的 近似 化 程度 要 比 线 
性 方程 更 好 。 按 照 这 种 理论 ， 所 有 产生 代谢 物 Xi 的 反应 都 组 合 进 一 个 净 速 率 为 的 单 
不 反应 。 同 样 ， 所 有 消耗 同一 代谢 物 的 反应 也 都 组 合 进 一 个 净 速 率 为 w_; 的 单个 反应 。 
| 这 些 所 组 合 的 反应 中 每 一 个 反应 的 速率 由 震 函 数 方程 近似 表达 。 依 据 所 有 代谢 物 的 质量 
| 平衡 可 以 列 出 一 个 微分 方程 系统 用 于 详细 研究 其 控制 特性 ， 这 种 系统 被 称 为 协同 系统 ， 
或 S- 系 统 。 
生化 系统 理论 (BST) 是 一 种 对 复杂 系统 进行 模型 模拟 的 极 好 方法 ， 利 用 从 模型 与 
实验 数据 拟 合 所 确定 的 参数 ， 它 也 可 以 被 用 来 获取 关于 通 量 控制 的 信息 。 从 这 一 点 来 说 ， 
BST 可 被 当 作 一 个 通用 的 理论 ， 而 MCA 代表 一 种 适用 于 线性 化 的 系统 的 一 个 特例 
(Savageau, et al,，1987a，b)。 这 已 是 一 个 经 常 争 论 的 问题 (Discussion Forum, 1987; 
Savageau, et al, 1987a; Kacser，1991)， 很 可 能 反映 MCA 的 目的 和 假定 的 一 个 误解 
(Cornish-Bowden, ，1989)。 这 里 ，BST 的 目的 是 建立 动力 学 模型 ， 以 便 对 途径 中 的 通 量 
| 进行 量化 ， 其 不 仅 适 用 于 稳 态 ， 也 适用 于 非 稳 态 条 件 ; MCA 的 基本 目的 是 借助 于 定量 
| 的 参数 对 代谢 控制 讨论 中 所 用 概念 典 了 予 明确 的 意义 。 为 了 支持 其 观点 ，Savageau 等 
(1987a, b) 已 表明 可 由 BST 的 方程 推导 出 MCA 基础 方程 〈 后 面 所 要 讨论 的 加 和 定理 和 
连接 定理 ) ，MCA 中 的 参数 也 可 从 宕 函数 表达 式 中 的 动力 学 参数 中 获得 。 然 而 这 种 比较 
是 基于 另 一 种 误解 ， 即 : MCA 参数 (控制 系数 和 弹性 系数 ) 是 常数 ， 这 根本 不 需要 
(Cornish-Borden, 1989). 


| 
| 
AP, X; 是 系统 变量 〈 如 代谢 物 浓度 、 酶 活性 和 效应 物 浓度 等 ); 参数 w 和 8 分 别 


11.1 代谢 控制 分 析 的 基础 


. 代谢 控制 分 析 仅 能 严格 地 应 用 于 稳 态 条 件 〈 或 拟 稳 态 条 件 ) ， 一 个 基本 假定 是 : 一 个 稳 
定 的 稳 态 是 由 一 条 代谢 途径 中 催化 各 个 单一 步骤 的 酶 的 活性 所 惟一 定义 。 因 此 酶 活性 同 代 谢 
途径 中 第 一 个 反应 的 底 物 和 最 后 一 步 反 应 的 产物 的 浓度 一 起 被 当 作 系统 参数 。 通 过 控制 环境 
条 件 〈 例 如 ， 在 一 个 处 于 稳 态 的 恒 化 器 中 ) 或 作为 细胞 内 调节 的 结果 ， 可 使 该 途径 第 一 个 底 
物 和 最 终 产 物 的 浓度 保持 恒定 。 在 原则 上 ， 系 统 参数 可 被 任意 改变 ， 因 此 它们 完全 规定 了 该 
系统 。 由 这 些 参数 值 所 确定 的 性 质 ， 例 如 ， 通 过 途径 的 通 量 或 中 间 代 谢 物 的 浓度 ， 被 作为 系 
统 变 量 。 

为 了 举例 说 明 酶 动力 情况 下 参数 和 变量 的 定义 ， 可 以 考虑 一 个 简单 的 两 步 途径 ， 该 途径 
中 底 物 S 通过 中 间 产 物 X HARA DP: 
s+ x= p (11.1) 
| 271 


在 稳 态 下 S 转变 为 P 的 净 速 率 由 JO 给 出 。 显 然 ， 一 个 稳 态 由 系统 参数 ， 即 酶 的 活性 
KEE, 和 下 > 及 底 物 S 和 产物 了 的 浓度 惟一 确定 。 稳 态 的 定义 决定 了 必须 对 中 间 代 谢 物 浓 
度 cx、 通 量 J PRESHRATMW EE. MRATZERMES, Hi, MRE, MMS, WH 
出 现 一 个 新 的 稳 态 ， 这 个 新 稳 态 的 特点 将 由 这 些 变量 的 其 它 值 ， 即 中 间 物 X 的 浓度 和 通过 
途径 的 净 通 量 J 来 表征 。 因 为 代谢 物 X 的 浓度 是 独特 的 变量 ， 因 此 假定 它们 被 均匀 地 分 布 
在 与 其 发 生 作 用 的 酶 中 。 亚 细胞 区 室 在 代谢 控制 分 析 中 并 非 是 个 问题 ， 因 为 运输 过 程 可 被 作 
为 具有 自己 速率 的 附加 的 加 工 步骤 归 和 人 分析 之 中 。 然 而 ， 尚 不 能 考虑 一 个 区 室 中 代谢 物 浓 度 
的 空间 分 布 情况 ， 因 为 这 将 需要 一 个 复杂 的 模型 来 提供 代谢 物 浓度 位 置 的 信息 。 

11.1.1 控制 系数 和 加 和 定理 

代谢 控制 分 析 的 一 个 目的 是 将 一 个 代谢 系统 的 变量 同 它 的 参数 联系 起 来 。 一 旦 完成 这 一 
目的 之 后 ， 一 个 系统 变量 〈 如 通 量 ) 对 系统 参数 (BNE) 的 敏感 性 就 能 被 确定 。 这 些 敏 
感性 代表 了 通 量 控制 的 基本 方面 ， 因 为 它们 概括 了 一 条 代谢 途径 中 由 单个 酶 的 活性 所 施加 的 
系统 的 通 量 控制 的 程度 。 类 似 地 ， 能 够 求解 胞 内 代谢 物 的 浓度 而 且 也 能 确定 其 对 于 酶 活性 、 
效应 物 浓 度 和 其 它 系统 参数 的 敏感 性 ， 这 些 敏 感性 可 由 一 组 系数 概括 地 描述 ， 其 中 最 重要 的 
是 控制 系数 。 它 们 描述 一 个 参数 〈 例 如 代谢 途径 中 一 个 酶 的 活性 ) 如 何 影响 系统 变量 〈 例 如 
通过 这 条 途径 的 通 量 )。 控 制 系数 仅 适 用 于 研究 的 稳 态 条 件 ， 这 就 解释 了 为 什么 诸如 酶 活性 
等 途径 的 “组 成 零 部 件 ” 被 作为 参数 来 描述 ， 而 可 随 参 数 的 变化 而 变化 的 系统 性 质 ， 如 通 量 
和 代谢 物 浓 度 被 作为 变量 。 


最 重要 的 控制 系数 就 是 所 谓 的 通 量 控制 系数 ， 常 缩写 为 FCCs。 它 的 定义 为 : 由 代谢 途 ， 


径 中 一 个 酶 活性 的 无 穷 小 变化 所 引起 的 通 量 的 相对 变化 与 这 个 酶 活性 的 相对 变化 之 比 。 值 得 
注意 的 是 : 由 于 酶 活性 是 一 个 独立 的 系统 参数 ， 因 此 它 的 变化 将 直接 影响 通 量 ， 或 通过 引起 
其 它 系统 变量 的 变化 而 间接 影响 通 量 。 式 “ 
(11.2) 中 所 用 的 全 导数 符号 试图 表明 这 一 点 : ， 
在 一 个 稳 态 通 量 - 酶 活性 的 关系 图 中 ( 见 图 


a 11.1)， 在 某 一 酶 活性 处 的 FCC 值 等 于 曲线 中 
ia 该 酶 活性 处 切线 的 斜率 用 相应 的 稳 态 通 量 及 酶 
jer dy sda 
酶 活性 (有 ) 三  、 aa 
了 (11.2) 
图 11.1 稳 态 途径 通 量 J 与 途径 中 因为 FCCs 是 用 相对 通 量 和 相对 酶 活性 的 


六 as 形式 定义 的 ， 所 以 它们 是 无 因 次 的 。 它 们 的 大 
该 酶 在 特定 酶 活性 时 的 通 量 控制 系数 等 于 i 和 28 
切线 的 斜率 乘 以 本 活性， 然后 用 稳 态 通 量 归 -- 化 ”小 与 所 采用 的 通 量 及 酶 活性 单位 无 关 。 对 于 
个 线性 代谢 途径 来 说 ，FCCs 的 值 介 于 0 和 1 之 
间 。 在 分 支 代 谢 途 径 的 一 般 情况 下 ，FCCs 被 用 来 描述 每 一 个 酶 活性 CGE L 个 ) 对 通过 不 同 


反应 的 每 一 通 量 〈 共 工 个 ) 的 影响 : 
ch Ei, dle -dh 
i Jy) dE;  dinE; 


i,kEj{1,2,°°,L} (11.3) 


@ 在 代谢 通 量 分 析 中 (A8H), Av 代表 通 量 。 因 为 MFA 的 一 个 假定 是 代谢 途径 中 的 中 间 产 物 处 于 稳 态 (或 拟 
稳 态 ) ， 这 就 暗示 着 ， 通 过 一 条 线性 代谢 途径 中 的 通 量 等 于 这 条 途径 中 各 个 单个 反应 的 反应 速率 (或 速率 )。 而 MCA 的 
目的 是 研究 参数 〈( 即 酶 活性 ) 对 稳 态 通 量 的 影响 ， 因 此 要 将 单个 反应 的 反应 速率 ” 和 总 体 稳 态 通 量 区 分 开 来 ， 所 以 用 JJ 
表示 后 者 。 


272 


At, J, 是 代谢 途径 中 通过 第 & 个 反应 的 稳 态 通 量 ; E; 是 第 ; 个 酶 的 活性 。 对 于 这 样 
个 一 般 系 统 来 说 ，FCCs 可 以 是 任何 值 〈 正 值 或 负 值 )。 
st (11.3) 的 定义 是 由 Kacser 和 Burns (1973) 给 出 的 原始 式 。 一 个 更 普遍 的 定义 是 
和 i 个 反应 速率 而 不 是 酶 活性 : 
ene vd 大 _dlnJ;, 


See er ainda Ihe mein alee (11.4) 
Heinrich (1997) seers is 
oT He (Be) i,kE{1,2,°°,L} (11.5) 


AH, pal nea ey oe YRMREAETBRM. WRB RIEABR p, fini 
RRA MERU (HOARE SE), WSK (11.5) 可 简化 成 式 (11.3) 所 示 的 
FCCs 的 原始 式 。 然 而 ， 由 式 (11.4) Best (11.5) 给 出 FCCs 的 一 般 定 义 ， 考 虑 到 对 酶 - 酶 
相互 作用 这 种 特殊 情况 的 处 理 ， 如 同 在 代谢 物 通道 开通 (Metabolite channeling) 的 情况 ， 
代谢 物 按 顺序 被 直接 从 一 个 酶 运输 到 下 一 个 酶 。 

从 FCCs 的 定义 中 明显 可 以 看 出 ， 具 有 最 大 通 量 控制 系数 的 酶 对 特定 稳 态 下 的 通 量 施加 
最 大 的 控制 ， 当 这 个 酶 的 活性 增 大 时 ， 将 导致 整个 通 量 最 大 程度 的 上 升 。FCCs 归 一 化 后 的 
一 个 重要 结果 是 : 对 每 一 个 通 量 而 言 ， 它 们 的 控制 系数 之 和 必 为 1， 这 就 是 通 量 的 加 和 
定理 : 


Doha ke M2 -,L| (11.6) 


该 式 清楚 表明 : FCCs 完全 取决 于 系统 的 结构 ， 关于 它们 的 单个 值 不 能 表示 一 般 情况 。 
对 于 非常 长 的 代谢 途径 来 说 ， 大 多 数 FCCs 的 值 比较 小 ， 然 而 ， 可 能 仍然 存在 一 个 步 又 ， 其 
对 通 量 施加 显著 的 控制 ， 只 要 这 个 步骤 的 FCC 值 比 其 它 FCCs 值 大 得 多 即 可 。 对 于 较 短 的 
代谢 途径 来 说 ， 即 使 在 通 量 控制 分 布 于 多 个 步骤 的 情况 下 ，FCCs 也 可 能 具有 更 大 的 值 。 因 
此 只 能 在 同一 代谢 途径 中 对 FCCs 值 进行 比较 ， 而 不 能 在 不 同 的 代谢 途径 之 间 进 行 比 较 。 在 
长 的 代谢 途径 中 存在 小 的 通 量 控制 系数 解释 了 为 什么 为 了 提高 菌株 的 代谢 物产 量 (AR 
和 抗生素 ) ， 需 要 如 此 多 轮 的 连续 诱 变 和 筛选 步骤 。 

应 当 注 意 : 对 于 FCCs 的 名 称 和 概念 均 存 在 着 异议 ， 这 些 异 议 的 一 些 主 要 背景 已 由 Fell 
(1992) 评论 过 ， 现 简单 总 结 如 下 。 

@ 在 最 初 的 公式 中 ， 酶 的 浓度 @ 被 用 作 描述 酶 反应 速率 的 参数 。 然 而 ， 考 虑 到 酶 活性 
主要 受到 同 别 构 酶 相 结合 的 效应 物 作 用 的 影响 ， 因 此 酶 浓度 与 酶 活性 及 通 量 控制 之 间 并 没有 
特别 的 关系 。 为 了 纠正 这 一 点 ，Kacser 和 Burns (1973) SIA SAAB HARM, PAM Ny 
系数 ， 用 于 代谢 通 量 对 这 些 效应 物 的 敏感 性 的 量化 : 

R =O XS EL525 记 1 (11.7) 
上 述 响 应 系数 的 定义 与 FCCs 的 定义 类 似 ， 实 际 上 可 以 看 作为 关于 外 部 效应 物 的 通 量 控制 系 
数 。 而 且 ， 容 易 表 明 [ 见 式 (11.12)]， 响 应 系数 表示 相对 于 外 部 效应 物 的 净 敏 感性 ， 这 样 


@ 由 于 酶 活 仅 同 酶 的 活性 形式 有 关 ， 这 与 诸如 通过 和 蛋白质 印 记 法 所 确定 的 酶 的 浓度 是 非常 不 同 的 ， 因 此 在 此 文中 ， 
我 们 喜欢 用 酶 活 而 不 用 酶 的 浓度 。 这 样 可 以 把 酶 活 解释 为 酶 的 wmax， 而 这 样 做 并 没有 暗示 出 和 胞 内 酶 活力 有 关 的 信息 ， 
由 于 异 构 调节 ， 胞 内 酶 活力 可 能 同 它 的 wmax 完 全 不 同 。 


273 


它们 就 可 以 被 划分 为 一 个 FCC 部 分 和 一 个 局 部 动力 学 部 分 (由 下 面 要 讨论 的 弹性 来 描述 ) 。 

G@) 一 个 通 量 对 一 种 酶 活性 的 敏感 性 并 不 是 该 酶 是 控制 酶 还 是 调节 酶 的 度量 标准 ， 因 此 
一 些 人 发 现 控制 系数 这 一 术语 是 令 人 误解 的 (Crabtree and Newsholme, 1987; Savageau et 
al, 1987a, b; Atkinson，1990)。 在 许多 代谢 途径 中 ， 对 终 产物 合成 速率 是 通过 第 一 步 反 
应 的 反馈 抑制 来 调节 的 ， 在 这 种 情况 下 ， 催 化 第 一 步 反 应 的 酶 是 经 典 意 义 上 的 调节 酶 ， 但 通 
常 它 将 有 一 个 小 的 通 量 控制 系数 。 调 节 酶 具有 小 的 FCC 值 这 一 明显 的 自 相 矛盾 在 Kacser 和 
Burns (1973) 最 初 的 论文 中 作 过 专门 的 讨论 。 在 引入 FCCs 的 概念 之 前 ， 常 常 意味 着 一 个 
调节 酶 是 作为 限 速 步骤 的 一 个 潜在 的 候选 者 ， 但 FCCs 的 引入 揭示 不 一 定 是 这 种 情况 。 而 且 
正如 在 本 章 的 前 言 中 所 说 的 那样 ，MCA 告诉 我 们 限 速 步骤 这 一 概念 是 无 意义 的 ， 而 FCCs 
值 可 量化 速率 限制 的 程度 。 

@ 由 于 FCCs 只 适用 于 稳 态 研究 ， 随 着 系统 状态 的 变化 ， 它 们 也 相应 发 生变 化 ， 因 此 
FCCs 没有 多 少 预测 价值 ， 这 一 点 是 不 容 置 疑 的 。 但 是 MCA 还 没 被 提倡 作为 像 生 化 系统 理 
论 那样 的 一 种 用 于 系统 模拟 的 工具 ， 而 只 是 作为 描述 代谢 控制 的 一 个 工具 。 显 然 我 们 希望 建 
立 一 个 能 预测 酶 活性 大 的 扰动 如 何 影响 通 量 的 理论 ， 但 这 是 一 项 非常 困难 的 任务 ， 这 是 由 于 
细胞 反应 动力 学 的 非 线 性 特点 和 胞 内 酶 反应 动力 学 的 难以 描述 的 性 质 。 

同 FCCs 类 似 ， 可 以 定义 系统 参数 对 胞 内 代谢 物 浓 度 影 响 的 敏感 性 。 这 些 敏 感性 被 称 为 
浓度 控制 系数 (concentration control coefficients), 44554 CCCs. HP, SMBH E; 影响 


的 变量 是 代谢 物 浓度 Ci : 
Cie Kaas sane $SjL2 57+, L | FEU D5e2 (11.8) 
或 者 ， 更 一 般 地 有 : 
Okra Sigg S44 wi dingy #€ (L244) pe 11 2, (11.9) | 


Cj dv; ~ dinv; 

这 些 系数 说 明了 当 第 ; 个 酶 活性 变化 时 ， 第 7 个 中 间 产 物 Xi 浓度 水 平 的 相对 变化 。 由 

于 当 所 有 的 酶 活性 同等 程度 地 发 生变 化 时 ， 任 何 中 间 代 谢 物 浓度 水 平 保持 不 变 ， 因 此 ， 遵 从 
以 下 关系 : MK 个 代谢 物 中 的 每 一 个 来 说 ， 其 浓度 控制 系数 的 总 和 应 为 零 : 


L 
cs =0 7 € {1,2,-,K} (11.10) 
i=l ' 


x (11.10) 显示 了 对 每 一 个 代谢 物 而 言 ， 至 少 存在 一 种 起 负 控 制作 用 的 酶 。 也 就 是 说 ， 当 
该 酶 活性 水 平 上 升 时 ， 代 谢 物 浓度 却 下 降 了 。 这 样 ， 在 式 (11.1) 所 示 的 简单 两 步 反 应 途径 
中 浓度 控制 系数 CX 通常 是 负 值 ， 因 为 代谢 物 浓 度 cx 将 随 着 第 二 个 酶 活性 的 上 升 而 下 降 。 
11.1.2 弹性 系数 和 连接 定理 

MCA 中 另 一 个 重要 的 概念 是 弹性 系数 ， 同 描述 整个 代谢 体系 系统 性 质 的 控制 系数 有 所 
不 同 ， 弹 性 系数 是 代谢 网 络 中 各 个 单个 酶 的 局 部 性 质 。 最 常见 的 弹性 系数 是 反应 速率 对 代谢 
物 浓度 的 敏感 性 (或 弹性 )。 正 如 控制 系数 的 情况 一 样 ， 弹 性 系数 也 相对 于 反应 速率 及 代谢 
物 浓 度 而 归 一 化 。 因 此 ， 第 ;个 反应 速率 对 于 代谢 物 Xi 的 浓度 的 弹性 被 定义 为 : 在 假定 所 
有 其 它 系统 变量 相对 于 其 稳 态 值 保持 不 变 的 条 件 下 ， 由 代谢 物 浓度 的 无 穷 小 变化 所 引起 的 反 
应 速率 相对 变化 之 比 : 


se。 
Uj 


dv; Any; 
ex 二 


EY Ane; 


2€ 31,2,°°-,L} yy € 11,2,°*, K} (11.11) 


J 


因为 弹性 系数 表示 对 相应 的 变量 求 导 ， 因 此 用 了 偏 导数 以 表示 所 有 其 它 变 量 必须 保持 恒 


| 定 。 弹 性 系数 可 被 看 作 是 对 于 特定 代谢 物 的 表 观 反应 速率 的 级 数 ， 因 此 它们 等 于 生化 体系 理 


论 〈 兄 方 框 11.1) 中 的 寡 函 数 的 指数 。 它 们 具有 正 值 时 表明 促进 一 个 反应 的 进行 ， 例 如 一 
种 底 物 和 一 种 激活 剂 ;而 负 值 表示 减 慢 了 反应 的 进行 ， 例 如 一 种 产物 和 一 种 抑制 剂 。 弹 性 系 
数 在 数值 上 等 同 于 酶 对 代谢 物 浓 度 的 响应 性 这 一 模糊 概念 〈(Fell，1992)。 它 们 也 允许 对 几 
种 底 物 对 反应 速率 的 影响 进行 定量 化 〈 大 多 数 细胞 反应 有 两 个 或 两 个 以 上 的 底 物 ) ， 产 物 浓 
度 的 影响 也 是 如 此 ， 其 常 有 显著 作用 ， 这 是 由 于 细胞 反应 的 可 逆 性 。 

际 了 对 代谢 物 的 弹性 之 外 ， 弹 性 系数 也 可 以 应 用 于 非 代 谢 中 间 产 物 的 效应 物 ， 即 : X， 
可 被 更 广义 地 解释 为 影响 第 ; 个 反应 速率 的 任何 化 合 物 。 根 据 弹 性 系数 这 个 广义 的 定义 ， 可 
以 看 出 在 式 〈11.7) 中 导入 一 种 效应 物 的 响应 系数 是 一 个 受 影响 的 酶 的 弹性 系数 和 该 酶 通 量 
控制 系数 的 乘积 。 
RX = Cex, i,kE{1,2,°°,L},j€ {1,2,-°,K} (11.12) 


如 果 一 个 代谢 物 或 一 个 效应 物 作 用 于 一 个 以 上 的 酶 则 总 响应 系数 是 每 个 酶 的 响应 系数 
之 和 


Ri, = dicle', i © (1,2,-,L} 59 © (252,-°°,K} (11.13) 


HK (11.12) 向 我 们 提供 了 一 个 有 价值 的 信息 : 即使 一 个 酶 对 一 个 代谢 物 或 一 个 效应 物 的 弹 
性 比较 大 ， 通 量 对 这 种 化 合 物 变化 的 响应 也 仅仅 在 其 相应 的 通 量 控制 系数 不 为 零 时 才 是 重 
要 的 。 

对 它们 的 底 物 或 产物 的 浓度 变化 高 度 敏 感 的 酶 ， 也 就 是 说 对 代谢 中 间 产 物 具 有 高 的 弹性 
系数 的 酶 ， 其 FCCs 倾向 于 低 的 值 (Westerhoff，et al，1984) ， 这 可 以 用 式 (11.1) 所 示 的 
简单 两 步 反 应 途径 来 形象 地 说 明 如 下 : 第 二 个 酶 下 活性 的 降低 〈 例 如 由 特定 抑制 剂 所 引起 ) 
将 导致 其 底 物 S 和 产物 了 的 浓度 升 高 。 如 果 E2z 对 SS 和 了 具有 大 的 弹性 系数 ， 则 上 述 代谢 物 
浓度 的 变化 将 补偿 减少 着 的 酶 活性 。 结 果 ， 酶 活性 的 降低 对 总 的 稳 态 通 量 将 有 很 小 的 影响 ， 
这 意味 着 被 扰动 的 酶 的 通 量 控制 系数 值 是 很 小 的 。 类 似 地 ， 对 中 间 代 谢 物 具有 小 的 弹性 系数 
的 酶 的 扰动 会 引起 显著 的 通 量变 化 。FCCs 与 弹性 的 关系 可 由 下 面 的 通 量 -控制 连接 定理 所 表 
达 ， 这 是 由 Kacser 和 Burns (1973) 导出 的 。 


上 
2 Cex 二 0 FE 11,2,,L1,7 € 112… 天 | (11.14) 


k=1 


连接 定理 通常 被 认为 是 MCA 定理 中 最 重要 的 ， 因 为 它 提供 了 理解 局 部 的 酶 动力 是 如 何 
影响 通 量 控制 的 方法 手段 。 作 为 进一步 的 说 明 ， 考 虑 式 (11.1) 所 示 简 单 两 步 途径 。 对 这 个 
途径 ， 由 连接 定理 给 出 : 

Ciel + Chet =0 (11.15) 
或 


也 = 一任 (11.16) 


从 式 (11.16) 可 以 明显 看 出 : 大 的 弹性 是 和 小 的 FCCs 相 联 系 的 ， 反 之 亦 然 。 在 接近 热力 
学 平衡 条 件 下 进行 的 反应 通常 对 代谢 物 浓度 的 变化 是 非常 敏感 的 ， 即 它们 的 弹性 很 大 ， 这 也 
表示 这 些 反 应 的 通 量 控制 通常 将 很 小 。 
如 同 FCCs 的 情况 一 样 ， 也 推导 出 了 浓度 控制 系数 的 连接 定理 ， 虽 然 它 们 是 少许 更 复杂 
275 


些 。 当 控制 系数 和 弹性 涉及 不 同 的 代谢 物 时 ， 连 接 定 理 有 如 下 的 形式 : 


L 
DC; ex = 0 ff € 11,2,-,K1,j AL (11.17) 
mA RAC, ER ERATED: | 
mone ==1-°9 E11,2,"",K} (11.18) 


通常 ， 很 少 关注 浓度 控制 系数 (CCCs), 但 正如 将 在 第 13 章 中 所 证 明 的 ， 当 MCA 结果 被 
用 于 酶 活性 扩 增 的 设计 时 ，CCCs 可 以 给 我 们 提供 重要 的 信息 。 而 且 ， Heinrich 和 
Rapoport (1974) 的 原始 推导 中 ， 它 们 被 用 来 推导 FCCs 的 表达 式 [WH (11.24)、 式 
CS。 

相应 于 代谢 物 浓 度 的 弹性 系数 是 最 常用 的 ， 但 是 Kacser (1990) 引入 了 所 谓 的 参数 
弹性 系数 (parameter elasticity coefficients) ， 用 它 来 作为 酶 对 其 它 参数 〈 例 如 酶 活性 或 抑制 
剂 ， 后 者 不 是 所 研究 途径 中 的 代谢 物 ) 变化 的 敏感 性 的 度量 标准 。 对 于 一 个 一 般 的 参数 方 ， 
以 下 式 来 定义 参数 弹性 系数 : 
we 

ma, v; Op) An( p; ) 

如 果 酶 活性 被 选 为 该 参数 ， 则 当 ; 等 于 ! 时 ， 参 数 弹性 系数 通常 等 于 1; M47 ASF A, 
参数 弹性 系数 通常 等 于 0。 即 第 ; 个 反应 速率 和 第 ; 个 酶 的 活性 之 间 存 在 着 直接 的 比例 关系 ， 
而 第 ;个 酶 对 途径 中 的 其 它 反应 速率 没有 影响 。 当 酶 活性 被 作为 该 参数 时 ， 对 这 些 规 则 一 个 
重要 的 例外 是 当 酶 - 酶 相互 作用 的 情况 。 
11.1.3 MCA 理论 的 一 般 化 

前 两 节 中 介绍 的 概念 和 定理 是 MCA 的 基础 。 在 这 一 节 中 ， 它 们 将 被 扩展 到 一 般 的 多 反 


PUL 2. ye (11.19) 


应 网 络 的 情况 。 然 而 ， 在 此 之 前 ， 进 一 步调 查 通 量 对 酶 调节 的 系统 响应 是 如 何 能 被 分 成 它 的 是 


源 组 分 (source components) 的 是 很 有 趣 的 。 这 样 ， 酶 活性 的 一 个 变化 将 对 途径 中 的 通 量 产 
生 直 接 的 影响 ， 也 能 通过 代谢 物 浓度 的 变化 对 其 产生 间接 影响 。 随 着 式 (11.19) 中 参数 弹 
性 系数 的 导入 ， 还 存在 其 它 参 数 对 通 量 可 能 的 影响 。 因 为 稳 态 通 量 是 系统 参数 (其 中 一 些 是 
酶 活性 ) 和 代谢 物 浓度 的 函数 ， 即 矿 ( 户 ，ci ),， 因 此 FCCs 可 以 用 下 式 来 定义 ， 它 是 式 
iin ue 


Sey APL Sy Se : i. 
=e op) aE ee Oc; x 4) i,k e iM 32s yl (11.20) 


在 大 多 数 情况 下 ， spe estan ， 所 以 一 个 参数 的 变化 不 会 改变 其 它 的 参数 ， 因 
此 有 : 


pe 


0; FE; 
a (11.21) 
1 Cy an 1 
则 式 (11.20) 可 以 整理 为 
a 网 
ce = Ei y, Sey Se x 员 X GES a2 aeh 11.2% 
aie) a 3 Jc; ae dB; i ( ) 


AAAS FoR k 个 反应 的 速率 (vp) crests Jn» FARE AR BASS Be SH HE A BC HS FE 
义 表 达 式 可 在 式 〈11.22) 中 被 辨认 出 ， 此 式 可 重 写 为 : 


K 
Chart DekC i,k € {1,2,--,L} (11.23) 
ju ‘ 


276 


在 大 多 数 情况 下 ， 当 ; 等 于 上 时 【 即 ， 当 第 ; 个 酶 通过 它 自己 的 〈 第 i +) 反应 速率 来 调节 
通 量 响应 而 且 反 应 速率 的 变化 同 酶 活性 的 变化 成 比例 时 ]， 参 数 弹性 系数 化 简 为 1; 当 ;不 
SEA 时 〈 即 ， 当 第 ; 个 酶 的 活性 变化 对 通过 第 上 个 反应 的 通 量 没有 直接 影响 时 ) ， 参 数 弹 
性 系数 为 零 。 因 此 式 〈11.23) 可 以 进一步 简化 为 ; 


altel Pe Sa 1 ee RRS (11.24) 


K 
eb ici i,k € {1,2,°-,L},74k Cit 239 


这 些 首先 由 Heinrich 和 sp (1974) 在 他 们 最 初 的 论文 中 导出 的 方程 说 明 FCCs 
是 如 何 依赖 于 弹性 系数 〈( 即 单个 酶 的 动力 学 ) 和 浓度 控制 系数 〈 即 通过 代谢 物 水 平 上 的 酶 的 
相互 作用 )。 因 此 式 (11.24) 表明 当 一 个 酶 活性 变化 时 ， 由 酶 活性 调节 所 产生 的 直接 影响 与 
由 代谢 物 浓 度 变 化 产生 的 影响 结合 以 产生 总 通 量 的 变化 。 这 种 总 通 量 的 变化 可 以 每 个 代谢 物 
的 影响 之 和 来 表示 ， 每 个 代谢 物 的 影响 是 由 该 代谢 物 的 浓度 变化 (CCC) 与 这 种 变化 对 通 量 
的 影响 〈 弹 性 系数 ) 的 乘积 所 给 出 。 式 (11.25) 显示 了 第 ;个 酶 仅 通 过 代谢 物 浓 度 变 化 来 
影响 稳 态 通 量 ， 而 这 种 变化 是 由 其 它 酶 反应 的 间接 影响 所 引起 的 。 

XK (11.22) 总 共有 二 个 方程 式 ， 利 用 和 抢 阵 符号 ， 可 以 写成 一 个 更 简洁 的 形式 〈(Ehlde 
and Zacchi, 1997): 


1 Hehe aoe 1 1 1 ise 1 1 1 see 1 
gy i Ce Gi Trey TE TEL Ex) EX2 ExK 
2 yMaielaye ME Te ee aoe 
C CP? us C? _ |rEl Te Tey 3 EX, €X> Exx 
PM bine a ET Matias 
CE CL lp Ce TE, TE? TEL a4 SX €Xk 
XIi Par) ag XI 
Ci Cy Cy 
C1 C}? sk pee 
Aide ae i i (11.26) 
Xx Ta a wae Xk 
Ci Ca CL 
或 
C)=P+E-c* (11.27) 


用 在 式 (11.24) 和 式 (11.25) 的 推导 过 程 中 所 应 用 的 假定 ， 参 数 弹 性 系数 矩阵 P 变 为 一 
个 单位 矩阵 ， 即 一 个 所 有 对 角 元 素 为 1 的 对 角 和 矩阵 。 式 〈11.27) 是 MCA 的 所 有 定理 的 一 
个 完整 的 和 通用 的 公式 。 它 是 一 个 包括 了 加 和 定理 和 连接 定理 的 简洁 形式 ， 因 此 它 在 后 面 的 
分 析 中 ， 特 别 在 对 分 支 代谢 途径 的 分 析 中 是 很 有 用 的 。 然 而 ， 该 式 的 一 个 缺点 是 MCA 的 作 
为 例证 的 定理 是 含蓄 的 而 且 不 易 辨 认 。 


11.2 通 量 控制 系数 的 确定 


通 量 控制 系数 的 大 小 给 我 们 提供 了 通 量 增加 的 相对 度量 标准 ， 而 通 量 增加 是 从 特定 酶 活 

性 的 扩 增 所 期 待 的 。 当 然 ， 这 并 不 意味 着 对 于 任何 酶 活性 的 扩 增 ， 通 量 的 增加 将 同 FCC 成 

比例 。 但 是 ， 由 FCCs 提供 的 这 种 度量 是 一 个 合理 的 近似 ， 尤 其 是 对 酶 活性 小 的 变化 。 特 别 

是 FCCs 值 接近 于 1 的 酶 反应 步骤 可 以 被 确定 为 限 速 步 又， 而 且 在 一 个 通 量 扩 增 计划 中 应 当 
277 


被 首先 强调 。 另 一 方面 , FCCs 小 显示 在 许多 步骤 中 通 量 控制 的 分 散 ， 没 有 哪 一 步 在 通 量 控 


制 中 能 起 决定 性 的 作用 。 由 此 可 以 推断 : FCCs 是 通 量 控制 的 一 个 重要 度量 标准 ，FCCS 的 


确定 在 揭示 代谢 网 络 通 量 控制 结构 的 努力 中 是 一 个 重要 里 程 碑 。 

为 了 确定 控制 系数 和 弹性 系数 ， 已 经 提出 许多 实验 方法 。 所 有 这 些 方法 都 包括 以 这 种 或 ， 
那 种 方式 来 确定 非 线 性 函数 的 导数 ， 即 非 线性 函数 在 一 些 特定 点 切线 的 斜率 。 正 如 方 框 
11.2 中 所 讨论 的 ， 这 暗示 了 一 个 基本 问题 ， 由 于 无 穷 小 的 差分 只 是 一 种 数学 抽象 ， 因 此 确 。 
定 一 个 未 知 函 数 导数 的 惟一 方法 是 用 一 个 有 限 小 的 差分 来 去 近似 它 。 


方 框 11.2 ” 非 线 性 函数 的 导数 
Ehlde (1995) 讨论 了 非 线性 函数 求 导 过 程 中 的 核心 问题 ， 它 是 MCA 参数 实验 确定 
~ 的 基础 。 测 量 一 个 未 知 函 数 的 导数 的 惟一 方 
: 法 是 用 一 个 有 限 差分 来 近似 它 。 这 要 求 在 目 
: 标点 的 附近 进行 测量 ， 接 着 确定 经 过 测量 点 
所 画 直 线 的 斜率 。 在 该 点 的 导数 近似 值 的 准 | 
: 确 度 随 着 有 限 差 分 长 度 的 增加 而 减 小 。 同 时 ， 
- 如 果 有 限 差 分 不 是 以 目标 点 为 中 心 ， 则 对 目 
标点 处 导数 的 估计 会 产生 偏差 。 随 机 误差 也 
将 对 结果 产生 影响 ， 当 有 限 近 似 的 尺 才 减 小 
时 ， 则 对 测量 误差 的 敏感 性 会 随 之 增加 。 图 
11.2 对 这 些 点 进行 了 说 明 。 在 这 里 ， 和 希望 确 
Su? LPaReON SRE 征 条 内 大 原生 汪 和 
二 二、 的 县 大 全 去 0 二 辽 机 测量 受益 生 所 基于 实心 三 角 处 的 测量 ， 则 该 有 限 差分 是 小 
上 的 误差 线 表明 了 从 这 两 组 数据 中 的 每 一 个 的 ， 可 以 得 到 一 个 对 实际 斜率 的 精确 估计 值 。 
数据 所 得 的 导数 估计 值 的 敏感 性 但 是 这 种 情况 下 由 于 扰动 的 程度 很 小 ， 测 量 
误差 会 很 大 ， 因 此 估计 值 敏 感性 也 很 大 。 相 反 地 ， 如 果 有 限 差 分 是 基于 在 实心 方块 处 的 
测量 ， 则 有 限 差 分 将 比较 大 ， 在 估 测 中 可 能 会 出 现 系 统 误 差 。 但 是 在 这 种 情况 下 ， 估 计 
值 对 测量 误差 更 不 敏感 。 


文献 中 已 提出 各 种 方法 用 于 FCCs 的 确定 。 这 些 方法 可 以 分 为 以 下 三 类 。 

e@ 直接 法 。 在 小 的 而 且 有 限 的 酶 活性 变化 之 后 ,直接 从 通 量 和 酶 活性 的 测量 来 确定 控制 系数 。 

e@ 间接 法 。 首 先 确定 弹性 系数 ， 随 后 通过 MCA 定理 计算 得 出 控制 系数 。 值 得 注意 的 是 
MCA 理论 产生 了 一 个 封闭 体系 ， 由 此 ， 通 过 这 些 定理 的 运用 FCCs 和 弹性 系数 可 以 互相 计算 。 

e@ 通 过 瞬时 代谢 物 浓 度 的 测量 来 确定 FCCs。 

还 有 第 四 种 方法 也 已 提出 ， 它 是 利用 大 范围 酶 活性 扰动 所 产生 的 通 量 和 酶 活性 测量 。 由 。 
于 此 法 简单 实用 ， 具 有 重要 的 应 用 前 景 ， 将 在 11.5 节 中 对 其 进行 更 为 详细 的 检验 。 

最 近 已 经 在 进行 这 样 的 争论 : 除非 首先 用 双 曲 线 回 归 分 析 对 实验 数据 进行 处 理 ， 并 且 实 
际 的 通 量 对 酶 活性 的 曲线 图 必须 密切 符合 图 11.1 所 示 双 曲线 图 ， 否 则 没有 任何 实验 方法 可 
以 给 出 满意 的 结果 (Pettersson，1996)。 这 种 争论 暗示 ， 如 果 上 述 条 件 不 满足 ，MCA 应 该 
以 能 够 直接 计算 FCCs、CCCs 和 弹性 系数 的 动力 学 模型 为 基础 。 虽 然 对 利用 动力 学 模型 来 
确定 FCCs 值 的 精确 性 毫 无 争议 ， 但 仍 要 注意 的 是 ， 这 种 方法 被 模型 的 有 效 性 和 模型 证 实 所 
严格 限制 。 因 此 ，FCC 确定 的 实验 方法 步骤 是 很 有 用 的 ， 应 该 花 更 多 的 精力 来 对 其 进行 完 

278 


善 。 此外， 一 个 给 定 代谢 途径 的 通 量 控制 分 析 的 结果 不 应 该 打算 作为 一 种 最 络 的 回答 ， 而 仅 
机 可 作为 途径 中 的 通 量 控制 是 如 何 分 布 的 一 种 表示 。 

11.2.1 确定 通 量 控制 系数 的 直接 法 

确定 FCCs 的 最 直接 的 方法 是 在 保持 所 有 其 它 代谢 参数 不 变 时 ， 观 察 一 条 代谢 途径 中 酶 


| 
活性 操纵 对 通 量 的 影响 结果 。 根 据 与 从 酶 的 有 限 变化 进行 导数 确定 相 联系 的 根本 问题 (见方 
人 oe oa tae 
FA 11.1W*RA. —BXRMAR AWA, BEAM Et AO A RO 
率 来 确定 FCCs。 这 导致 FCCs 的 一 种 非常 精确 的 确定 。 它 的 主要 缺点 是 需要 大 量 的 实验 来 
建立 通 量 - 酶 活性 关系 曲线 。 

所 表达 的 酶 活性 的 遗传 变更 

随 着 分 子 生 物 技术 的 快速 发 展 ， 改 变 酶 活性 的 最 直接 的 方法 是 通过 在 基因 水 平 控制 表 
达 。 这 种 方法 使 我 们 可 以 研究 细胞 内 酶 活性 改变 的 效果 。 但 是 实际 的 酶 活性 变化 会 产生 大 的 
扰动 ， 这 可 能 不 适合 于 用 无 穷 小 的 分 析 方法 来 确定 斜率 。 在 11.5 节 的 大 扰动 法 更 适合 于 利 
用 这 种 方法 的 结果 。 或 者 ， 需 要 做 大 量 的 实验 以 得 到 一 个 类 似 于 前 面 讨论 的 如 图 11.1 所 示 
的 曲线 图 来 解决 这 个 问题 。 

利用 遗传 手段 来 改变 酶 活性 ， 这 可 以 通过 改变 目的 酶 的 基因 剂量 或 插入 一 个 调节 型 启动 
子 来 随意 操纵 基因 的 表达 来 实现 。 可 以 通过 选 育 不 同等 位 基因 的 纯 合 子 和 杂 合 子 的 经 典 方法 
来 改变 基因 剂量 ，Flint 等 (1981) 对 这 种 方法 作 了 说 明 ， 他 们 研究 了 丝 状 真菌 粗糙 脉 孢 菌 
(Neurospora crassa) 的 精 氨 酸 生物 合成 途径 。 除 了 改变 有 效 基 因 的 剂量 之 外 ， 这 种 方法 也 
能 通过 利用 不 同比 活性 的 多 态 等 位 基因 使 催化 活性 得 到 改变 。 但 经 典 法 的 缺点 是 不 能 对 酶 活 
性 进行 精细 的 调节 ， 此 外 ， 需 要 构建 许多 不 同 突变 株 的 遗传 工程 ， 其 工作 量 是 很 大 的 。 
一 个 更 具有 目的 性 的 提高 基因 剂量 的 方法 是 导 人 带 有 目的 基因 的 多 拷贝 质粒 或 将 多 个 基 
因 整 合 在 染色 体 上 。 这 种 方法 不 能 提供 减少 基因 剂量 的 适应 性 ， 但 是 对 多 倍 体 菌株 来 说 ， 有 
可 能 对 酶 活性 进行 下 调 ， 这 可 以 通过 构建 缺少 目的 基因 的 缺失 突变 株 (或 者 导 人 点 缺失 而 破 
坏 编码 目的 酶 的 基因 ) 来 实现 ， 缺 失 可 以 发 生 在 一 条 或 多 条 染色 体 上 。Niederberger 等 
(1992) 对 这 种 方法 作 了 说 明 ， 他 们 研究 了 酿酒 酵母 的 四 倍 体 菌 株 中 色 氨 酸 生 物 合成 途径 。 
这 条 途径 中 的 五 个 酶 的 活性 可 以 通过 改变 其 基因 剂量 来 进行 下 调 ， 通 过 这 条 途径 的 代谢 通 量 
并 没有 被 直接 确定 ， 但 是 研究 了 这 些 酶 活性 对 该 酵母 比 生长 速率 的 影响 ， 并 确定 了 相应 的 
FCCs。 所 有 的 FCCs 都 很 小 9， 并 由 下 调 实验 所 验证 ， 酶 活性 的 增加 (通过 多 拷贝 质粒 获 
得 ) 对 通 量 只 有 很 小 的 影响 。 在 充分 表达 了 的 菌 种 中 ， 例 如 在 S$ cerevisiae (其 整个 基因 组 
已 经 测序 ) ME. coli (其 缺失 突变 株 通常 可 以 获得 或 容易 构建 ) 中 ， 对 酶 活性 的 下 调 相 对 
来 说 是 比较 容易 的 ， 但 对 于 性 质 了 解 得 比较 少 的 菌 种 就 比较 困难 了 ， 在 这 种 情况 下 要 把 大 量 
的 工作 用 在 构建 所 必须 的 突变 株 上 。 

用 基因 工程 调节 酶 活性 的 极 好 的 方法 是 在 所 研究 的 途径 中 编码 目标 酶 的 基因 前 插 人 调节 
型 启动 子 ， 例 如 大 肠 杆菌 中 的 tac 启动 子 (由 lac 启动 子 和 trp 启动 子 杂 交 而 成 )。 这 种 方 
法 具有 双重 益处 : 既 可 以 调节 酶 活性 的 大 小 ， 又 能 实现 酶 活性 的 上 调节 或 下 调节 。Ruyter 


@ 十 分 明显 ， 当 通过 诸如 测定 比 生 长 速率 的 方法 来 测定 通过 色 氨 酸 合成 途径 的 通 量 时 ， 得 到 了 小 的 FCCs 值 ， 它 
实际 上 表示 单个 酶 对 整个 生物 质 合 成 总 通 量 的 影响 。 事 实 上 作者 吃惊 地 发 现 ，FCCs 值 介 于 0.05 一 0.17 的 量 级 ， 正 如 所 
期 望 的 那样 ， 生 物质 合成 通 量 的 控制 分 布 于 整个 生物 合成 途径 的 大 量 酶 中 。 


279 


% (1991) Aa Sa BF LA, MATTOS Tm I C' (在 葡萄 糖 -PTS 中 的 一 个 蛋白 ， 
见 2.2.3 节 ) 的 基因 控制 〈 通 过 tac BAF) REX E. coli 中 葡萄 糖 代 谢 的 影响 。 质 粒 中 
含有 编码 /ac' 阻 过 物 的 基因 ， 因 此 允许 通过 变动 培养 基 中 的 诱导 物 异 丙 基 硫 代 -8-D- 半 乳糖 
fH (IPTG) 的 量 来 控制 tac 启动 子 的 表达 效率 。 将 该 质粒 导 人 了 在 染色 体 上 不 含 编码 [st 
基因 的 菌株 中 ， 因 此 就 有 可 能 在 20% 一 600% 〈《 同 野生 型 中 的 酶 活性 比较 ) 的 范围 内 来 改变 
该 蛋 白 的 活性 。 从 该 研究 中 得 出 结论 : 在 葡萄 糖 限制 的 培养 基 中 ，PTS 蛋白 对 比 生 长 速率 
或 葡萄 糖 氧 化 速率 没有 《或 仅 有 很 小 的 ) 影响 。 然 而 却 发 现 革 * 对 葡萄 糖 的 类 似 物 甲 基 -a- 
吡 喃 半 乳 糖苷 〈 其 FCC 值 约 为 0.6) 的 吸收 和 磷酸 化 施加 重要 的 控制 。 


方 框 11.3 式 (11.39) 的 推导 
Delgadoh 和 Liao (1991) 在 他 们 的 原始 论文 中 推导 出 了 式 (11.39)， 他 们 假定 关于 
代谢 物 浓度 的 动力 学 是 线性 的 : 


K 
vi = 2 bigs eg Py Bp Ap A (1) 


AP, ky eas IR, 并 且 由 于 反应 速率 的 线性 化 0; 也 是 常数 。 从 弹性 系数 的 定义 中 
可 以 写 出 : 


C 


ex 一 FE1L2,° 7 11,2,°,K] (2) 
其 中 J; RR i 个 反应 的 稳 态 通 量 。 将 式 (2) 代 人 连接 定理 表达 式 可 推导 出 
> hey & = 0 i€ {1,2,--,L},j € {1,2,--,K} (3) 
>) ot at | egg ee 8 PO a a 3 (4) 
因为 cj #0. FEU Ac; 后 ， 对 所 有 代谢 物 进行 加 和 则 有 : 
Dabs BAG = k € {1,2,°°°,L| (5) 
由 上 式 推 导出 : Re 
li he Cid. pong Tl (6) 


i=1 Ji 
AWA Av;=v(t)-Ji, CRBEN RRB SRAM RN, Abst (11.39) 很 容易 用 
加 和 和 定理 导出 。 


纯化 酶 的 滴定 法 

无 细胞 抽 提 物 可 用 纯化 酶 来 滴定 ， 而 且 如 果 酶 活性 被 作为 一 个 参数 来 测定 ， 则 通 量 控制 
系数 可 被 直接 确定 。 这 种 方法 的 缺点 是 实验 结果 对 实验 误差 的 敏感 性 很 大 ， 特 别 是 当 FCCs 
比较 小 时 。Teorres (1986, 1991) 提出 了 一 种 减 小 对 实验 误差 的 敏感 性 的 程序 ， 这 种 程 
序 是 基于 途径 缩短 ， 由 此 ， 途 径 中 所 有 的 其 它 酶 〈 所 谓 的 附属 酶 ) 都 被 过 量 供给 以 减 小 它们 
对 通 量 控制 的 贡献 。 在 这 些 条 件 下 ， 通 量 控制 分 布 在 所 研究 的 酶 中 ， 在 这 些 酶 之 间 通 量 控制 
的 相对 分 布 可 用 酶 滴定 法 来 量化 ， 由 此 确定 的 体外 FCCs 与 体内 的 FCCs 成 比例 ， 但 前 者 稍 
大 。 这 种 方法 的 一 个 重要 假定 是 所 有 的 反馈 和 前 馈 调 节 回路 都 被 限定 在 所 研究 的 途径 区 段 

280 


A, 并 且 酶 的 伯 和 度 在 滴定 过 程 中 不 会 发 生变 化 。 Torres 等 〈1986) 曾 用 滴定 法 来 研究 鼠 
肝脏 细胞 抽 提 物 中 糖 酵 解 途径 的 催化 前 几 步 反应 的 酶 。 醛 缩 酶 、 磷 酸 丙 糖 异 构 酶 和 3- 磷酸 


甘油 脱氧 酶 被 过 量 添加 ， 用 已 糖 激 酶 (HK ) 、6- 磷 酸 葡萄 糖 异 构 酶 (GPI) 和 磷酸 果糖 激酶 
(PFK) 来 进行 滴定 。 从 他 们 的 滴定 分 析 中 发 现 : 实际 上 ，GPI 对 糖 酵 解 途径 的 通 量 没 有 控 
制作 用 [这 同 磷酸 己 糖 构成 了 一 个 单独 的 代谢 库 这 一 普遍 发 现 相 一 臻 〈 见 2.3.1)]。 而 HK 
和 了 PFK 的 通 量 控制 系数 被 确定 为 分 别 是 0.77 和 0.24 (注意 这 满足 加 和 定理 )。 滴 定 程 序 非 
常 好 ， 但 是 很 明显 它 只 能 应 用 于 纯化 酶 可 利用 的 系统 中 。 此 外 ， 需 要 将 目的 途径 部 分 与 代谢 
的 其 余部 分 进行 解 耦 ， 这 就 加 入 了 一 个 限制 ， 特 别 是 对 那些 调节 回路 尚未 识别 的 系统 。 

特异 性 抑制 剂 滴定 法 

对 许多 酶 来 说 ， 存 在 特异 性 抑制 剂 ， 其 可 用 来 滴定 体内 酶 活性 ， 当 产生 的 通 量 被 测 之 
后 ， 就 能 得 到 相对 于 抑制 剂 的 响应 系数 [ 见 式 〈11.7)] 的 估计 值 。 如 果 酶 相对 于 抑制 剂 的 
响应 〈 即 弹性 ) 已 知 ， 就 可 以 通过 式 (11.12) 算出 通 量 控制 系数 。 因 为 所 要 确定 的 FCCs 
是 对 于 不 存在 抑制 剂 的 情况 ， 因 此 ， 必 须 对 抑制 剂 浓度 为 零 的 情况 下 的 响应 系数 进行 计算 : 


eS dy, “RS ae ait je 9U; 
ce cadr sci abl clea ee (11.28) 
或 
Es aber: FB gear sires. og ohputin 
C; /? ay “dci|- esha x Ic] nad (11.29) 


对 于 不 可 逆 抑 制剂 ， 酶 活性 随 抑 制剂 浓度 线性 减 小 。 在 此 情况 下 ， 式 (11.29) 括号 中 
的 数值 等 于 酶 活性 完全 控制 时 的 抑制 浓度 的 负 值 〈(- cr max)， 因 此 可 由 下 式 得 出 FCCs 值 
(Groen, et al, 1982): 


pew _ €1,max max X dj 
iid J “deil, 


(11.30) 


式 (11.30) WRI — IAT MAW) al A Ae Ee A A OR, MF MES HEM 
fil 5) ASE SEH EM a, Fa eA SUI (Groen, et al，1982) ， 但 是 如 果 抑 制剂 对 反应 
速率 的 影响 已 知 ， 则 很 容易 算出 式 (11.29) 中 的 最 后 一 项 。 

抑制 剂 滴定 也 许 是 确定 FCCs 最 广泛 应 用 的 方法 ， 特 别 是 在 对 分 离 到 的 线粒体 和 细胞 中 
的 呼吸 的 研究 中 。 在 对 鼠 肝 脏 线粒体 的 研究 中 ，Groen 等 (1982) 用 特异 性 抑制 剂 确定 了 以 
琥珀 酸 为 底 物 的 氧化 磷酸 化 途径 中 各 个 单一 步骤 的 FCCs， 结 果 如 表 11.1 Ha. Fell 
(1992) 叙述 了 抑制 剂 滴定 法 确定 FCCs 的 许多 其 它 应 用 。 其 中 ， 要 提 及 Walter 等 (1987) 
Xt BRA A (Clostridium pasteurianum ) 中 葡萄 糖 PTS 系统 在 糖 酵 解 途径 调节 中 的 
作用 的 一 项 研究 。 在 此 项 研究 中 ， 木 糖 醇 被 用 作 和 葡萄糖 PTS 的 特异 性 抑制 剂 ， 研 究 结果 发 
现在 糖 酵 解 通 量 中 运输 系统 的 FCC 等 于 0.14。 

抑制 剂 滴定 法 的 一 个 主要 问题 是 : 通 量 -抑制 剂 曲 线 初始 斜率 必须 外 推 至 cr 为 零 以 确定 
式 〈11.30) 的 最 后 一 项 。 由 于 抑制 剂 对 通 量 的 影响 通常 是 高 度 非 线 性 的 , 这 就 引起 方 框 
11.3 中 所 讨论 的 问题 。 把 一 条 线 拟 合成 曲线 的 准 线性 初始 部 分 是 不 可 靠 的 ， 而 拟 合 成 非 线 
性 函数 ， 如 多 项 式 函 数 ， 确 实 使 估计 值得 到 一 些 改进 〈Small，1993)。 这 种 方法 的 另 一 限制 
是 抑制 剂 必 须 是 非常 特异 的 ， 它 对 系统 的 其 它 反应 绝对 没有 影响 。 

281 


RRB H His BA 将 ATP 从 线粒体 运输 到 细胞 质 RERE 0.29+0.05 


表 11.1 鼠 肝 脏 线粒体 的 氧化 磷酸 化 途径 中 ， 不 同步 骤 的 通 量 控制 系数 
| 


iF itte© 质子 梯度 的 泄露 质子 解 耦 剂 0.04+0.01 
二 羧 酸 盐 运输 蛋白 AAR ES A AA 苯 基 琥珀 酸 盐 0.33+0.04 | 
细胞 色素 C 氧化 酶 将 电子 传递 给 氧 BALD 0.17+0.01 
bc, 复合 体 FRI BE Hh SS A-N-AkD 0.03 +0.005 


己 糖 激酶 2 ATP 消耗 0 
© 在 质子 泄漏 的 FCC 值 的 估算 过 程 中 ， 添 加 了 不 同 量 的 寡 霉 素 和 一 种 质子 解 耦 联 剂 [ 乙 二 醇 双 (8- 氨 基 乙 醚 )-N，N， 
N“ ，N“ -四 乙酸 ] 来 切断 氧化 磷酸 化 作用 。 这 个 过 程 暗中 假定 了 当 没 有 ADP 再 生 时 ， 质 子 泄 漏 的 FCC 值 为 1， 这 一 假定 
受到 Brand 等 (1988) (2G) 12.3) 的 和 否定。 数据 来 自 Groen 等 (1982b). 

@ 己 糖 激酶 的 FCC 值 通过 酶 滴定 法 来 测定 。 
11.2.2 确定 通 量 控制 系数 的 间接 法 
本 节 所 描述 的 方法 之 所 以 被 称 为 间接 法 是 因为 首先 通过 实验 确定 了 弹性 ， 然 后 利用 MCA 
定理 确定 出 FCCs。 构 成 这 种 方法 的 基础 有 两 个 主要 的 假定 : 1) 该 代谢 系统 是 充分 描述 的 ， 
即 所 有 反应 和 有 关 的 调节 相互 作用 都 已 包括 在 系统 描述 中 ; (2) 系统 处 于 稳 态 ， 初 始 底 物 和 最 和 
后 产物 的 浓度 是 定 值 。 为 了 确保 这 些 条 件 得 到 满足 ， 最 好 至 少 直接 确定 系统 的 一 个 控制 系数 来 
对 结果 进行 检验 。Groen 等 (1986) 在 他 们 对 鼠 肝 脏 细胞 的 糖 异 生 途 径 的 研究 中 ， 确 定 了 所 有 
的 弹性 系数 〈 见 例 11.2)， 并 用 了 MCA 定理 计算 这 条 途径 中 的 FCCs。 为 了 检验 该 结果 ， 他 们 
也 确定 了 途径 对 应 于 底 物 丙酮 酸 的 响应 系数 。 由 于 也 测定 了 第 一 步 反 应 〈 丙 酮 酸 脱羧 ) 对 应 于 
丙酮 酸 的 弹性 ， 所 以 第 一 步 的 FCC 可 通过 响应 系数 的 定义 来 计算 [sk (11.12)]. 
许多 不 同方 法 可 被 用 来 确定 弹性 系数 。 下 面 是 对 最 常用 方法 的 简 述 。 
双 调 节 法 (Double Modulation ) 
为 了 对 这 种 方法 进行 说 明 ， 考 虑 EMP 途径 中 的 已 糖 异 构 酶 反应 
-++—>glucose-6-phosphate te “e 
(6- 磷 酸 葡萄 糖 ) (6-FEBR MR ) (11.31) 
该 异 构 酶 反应 的 速率 仅 依赖 于 所 示 的 化 合 物 的 浓度 ， 即 ucpr=f (coer, crep)o THEERA F, 
该 反应 速率 等 于 通过 下 MP 途径 的 通 量 J， 因 此 有 : 


dite Fede + 


dv 
WCE Decent FOP (11.32) 


用 稳 态 通 量 J VERE CER aw Awa eae. 
dinJ = Geidinc cep + € pepdlnc pep (11.33) 
在 一 个 控制 实验 中 ， 测 定 两 个 代谢 物 的 浓度 和 稳 态 通 量 是 可 能 的 。 通 过 引入 一 个 扰动 ， 
例如 改变 细胞 外 葡萄 糖 的 浓度 ， 以 产生 一 组 新 的 通 量 和 代谢 物 浓 度 的 稳 态 测量 值 @。 通 过 用 
差分 来 对 式 (11.33) 中 的 微分 进行 近似 ， 这 个 扰动 实验 就 产生 一 个 方程 ， 此 方程 将 通 量 和 
浓度 的 测量 同 两 个 弹性 系数 联系 起 来 。 如 果 引 入 第 二 个 扰动 ， 则 另 一 组 稳 态 通 量 和 代谢 物 浓 © 
度 的 数据 可 以 产生 第 二 个 方程 ， 从 而 可 由 此 计算 出 两 个 弹性 系数 。 : 
这 个 被 称 为 双 调 节 的 方法 是 由 Kacser 和 Burns (1979) 首先 提出 的 。 很 显然 ， 必 须 恰 


O ”十 分 明显 ， 恒 化 培养 实验 对 这 种 类 型 的 研究 是 非常 合适 的 ， 因 为 对 每 一 种 细胞 外 的 葡萄 糖 浓度 都 能 达到 稳 态 ， 
此 外 ， 通 过 EMP 途径 的 通 量 能 在 恒 化 培养 中 被 精确 估计 ， 并 且 可 以 取得 足够 大 的 样品 以 获得 胞 内 代谢 物 浓 度 的 完整 
数据 。 


282 


7 


dinc} G6P dinc2 G6P 


| 
[lsiniaiiedchaadiabiaiteaaaheg 即 下 面 的 不 等 式 必 须 得 到 满足 ; 
os 


11.34 
dinc io dinc 时 ( ; ) 


x (11.34) 中 的 上 标 与 相应 的 扰动 得 到 的 测量 相对 应 。 如 果 式 (11.34) 两 边 之 间 的 差别 很 
处 ， 则 表明 产生 的 两 个 方程 对 弹性 的 计算 是 病态 的 ， 方 程 的 解 对 实验 误差 会 变 得 非常 敏感 。 
实际 上 ， 在 很 多 途径 中 很 难得 到 一 组 线性 无 关 的 测量 值 来 满足 式 〈11.34)。 为 了 提高 这 些 测 
量 真正 相互 独立 的 概率 ，Fell (1992) 建议 调节 既 要 在 所 研究 途径 的 上 游 进行 ， 又 要 在 下 游 
进行 。 这 种 方法 的 另 一 个 缺点 是 为 了 满意 地 用 有 限 差 分 来 近似 微分 而 需要 尽 可 能 小 的 变化 ， 
得 这 种 变化 很 可 能 被 与 之 不 成 比例 的 实验 误差 所 支配 。 值 得 注意 的 是 ， 对 于 大 多 数 酶 反应 来 
说 ， 除 了 反应 物 和 产物 之 外 还 存在 诸如 辅 因子 和 抑制 剂 等 其 它 效 应 物 。 这 意味 着 反应 速率 是 
多 于 前 面 例 题 所 用 的 两 个 变量 的 函数 。 由 于 需要 用 一 个 不 同 弹性 来 描述 每 一 个 变量 的 作用 ， 
因此 有 必要 进行 两 次 以 上 的 扰动 实验 来 产生 线性 无 关 的 方程 。 

单调 节 法 (Single Modulation ) 

对 于 一 个 像 式 (11.31) 所 示 那 样 的 反应 序列 ， 如 果 知 道 其 中 一 个 弹性 系数 ， 则 其 它 的 
弹性 系数 可 通过 单调 节 实 验 获 得 。 这 种 方法 的 优点 是 可 以 应 用 几 个 同类 型 的 但 调节 幅度 不 同 
的 调节 ， 并 且 可 用 作 图 法 来 确定 方程 式 (11.33) 中 的 微分 项 。Greon 等 (1986) 用 此 法 确 
定 了 丙酮 酸 激酶 对 磷酸 烯 醇 两 酮 酸 的 弹性 系数 和 丙酮 酸 羧 化 酶 对 细胞 质 中 草 酰 乙 酸 的 弹性 系 
数 ( 见 例 11.2)。 此 法 显然 比 双 调 法 的 稳定 性 更 强健 ， 但 它 仍 依靠 方程 式 (11.33) 中 的 微 
分 项 有 一 个 精确 的 估计 ， 当 然 还 需要 一 个 弹性 系数 的 信息 。 

自 上 而 下 法 (Top-Down Approach) 

在 许多 情况 下 ， 由 所 有 的 FCCs 所 提供 的 详细 信息 对 我 们 来 说 并 不 真是 必需 的 ， 而 识别 
出 大 部 分 通 量 控制 所 在 的 一 组 (Group) 却 更 为 重要 。 这 可 帮 有 我 们 将 注意 力 集中 在 代谢 的 重 
要 部 分 。 而 且 ， 重 复 此 过 程 可 以 使 我 们 将 通 量 控 制定 位 于 逐渐 更 小 的 反应 组 中 。 反 应 分 组 在 
代谢 途径 通 量 控制 分 析 中 是 一 个 很 有 用 的 概念 ， 对 此 将 在 第 13 章 中 详细 讨论 。 其 基本 想法 
出 自由 Brand 、Brown 及 其 同事 们 对 MCA 引入 的 自 上 而 下 法 ， 由 此 将 所 研究 的 代谢 途径 分 
为 只 有 一 个 共同 的 代谢 物 的 几 个 部 分 〈 或 几 个 组 ) (Brown et al, 1990a; Hafner et al, 


1990): 


Groupl Group2 
S ie (11.35) 


在 分 支 途径 中 ， 六 二 RUSS Eee 而 对 于 一 个 线性 代谢 途径 ，X 
将 是 K 个 代谢 物 中 的 一 个 。 可 以 引入 组 通 量 控制 系数 以 提供 一 种 度量 标准 ， 用 于 度量 该 组 
中 的 反应 ees 很 容易 看 出 式 (11.35) 的 两 个 反应 组 中 的 每 一 个 的 
FCCs 等 于 该 组 中 各 步 反 应 的 FCCs 之 和 (Brown et al, 1990a), ， 而 组 FCCs he EU 
Croup + Croup = 1 (11.36) 
除了 FCCs 之 外 ， 可 引入 一 组 关于 中 间 代 谢 物 的 弹性 系数 来 描述 那个 代谢 物 对 该 组 中 反 

应 速率 的 影响 〈 见 第 13 章 )。 


9 
¢ Grout =X _ x “UGroups i€ {1,2} (全 
UGroupi dc CX 


类 似 于 连接 定理 ， 组 弹性 系数 和 组 通 量 控制 系数 有 以 下 关系 : 


Cé.. exe * Sy, Group2© = 0 (11 . 38) 


283 


对 于 组 浓度 控制 系数 ， 类 似 的 定理 也 成 立 (Brown et al, 1990a). 

当代 谢 途 径 被 分 割 之 后 ， 总 弹性 系数 可 以 被 确定 ， 例 如 ， 通 过 双 调节 法 实验 ， 或 如 果 弹 | 
性 系数 之 一 已 知 ， 可 通过 单调 节 法 确定 其 它 弹性 系数 。 从 式 (11.36) 和 式 (11.38) 中 , 可 
以 算出 组 FCCs， 以 提供 存在 于 两 部 分 代谢 途径 中 的 每 一 个 部 分 通 量 控制 的 度量 标准 。 原 则 
上 ， 由 于 可 在 任意 位 置 对 途径 进行 分 割 ， 这 就 将 有 可 能 渐渐 缩小 具有 最 大 组 FCC 的 一 组 单 ， 
个 反应 。 然 而 ， 应 用 双 调节 法 或 单调 节 法 的 一 个 前 提 是 除了 代谢 中 间 产 物 X 外 没有 任何 其 
它 的 效应 物 ， 也 就 是 说 ， 反 应 组 之 间 除 了 通过 中 间 产 物 X 之 外 ， 相 互 之 间 不 能 发 生 任何 对 
话 (cross-talk)。 这 也 是 这 种 方法 的 一 个 主要 缺点 ， 因 为 在 许多 情况 下 ， 除 了 通过 共同 的 申 
间 产 物 X 外 ， 两 个 组 之 间 的 相互 作用 经 常 发 生 。 在 第 13 章 中 介绍 了 一 种 方法 ， 用 于 对 这 种 
相互 作用 的 强度 及 其 影响 从 通 量 测量 进行 FCCs 确定 的 程度 的 评估 。 自 上 而 下 法 被 Brand， 
Brown 及 其 同事 们 用 来 分 析 氧 化 磷酸 化 作用 ( 见 例 11.3)， 并 且 它 在 复杂 反应 网 络 的 分 析 申 
也 很 有 用 ， 在 第 13 章 中 将 对 此 作 详细 的 介绍 。 

从 动力 学 模型 计算 弹性 系数 

如 果 一 个 有 效 的 数学 模型 可 用 于 表达 一 个 酶 反应 的 速率 ， 则 它 对 效应 物 和 底 物 的 弹性 
很 容易 用 弹性 系数 的 定义 来 计算 。 为 了 控制 分 析 的 目的 ， 并 不 需要 动力 学 方程 是 基于 机 理 而 
得 出 的 ， 只 要 它 正 确 地 描述 不 同 效应 物 的 动力 学 影响 即 可 。 这 种 方法 简单 直接 ， 而 且 非 常 强 
健 ， 但 它 引起 了 一 个 基本 的 问题 : 体外 酶 动力 学 是 否 正 确 描 述 了 体内 酶 的 功能 ? 幸运 的 是 ， 
zus 值 在 弹性 系数 的 计算 中 被 消除 了 ， 这 样 问题 就 简化 成 为 对 亲 和 人 性 (或 K。 (A) 的 计算 。 
在 这 些 研究 中 考虑 到 所 有 可 能 的 效应 物 也 是 很 重要 的 。 此 外 ， 因 为 小 弹性 系数 值 通常 与 大 的 
控制 系数 有 联系 ， 因 此 具有 小 的 弹性 系数 的 效应 物 对 通 量 控制 是 最 重要 的 ， 而 在 大 多 数 酶 动 
力学 的 体外 研究 中 存在 着 集中 到 具有 大 弹性 系数 的 效应 物 上 的 趋势 。 在 用 体外 酶 动力 学 的 数 。 
RNR ONES a HERRON SAE THERON NE: 
在 。 显 然 这 种 实验 情景 是 代表 不 了 体内 条 件 的 。 

有 许多 通过 动力 学 模型 来 计算 弹性 系数 的 例子 。 在 Groen 等 (1986) 对 鼠 肝 脏 细胞 中 
糖 异 生 作用 的 分 析 中 用 此 法 确定 了 一 些 弹性 系数 〈 见 例 11.2)。Galazzo 和 Bailey (1990) 在 时 
对 S. cerevisiae 中 糖 酵 解 途径 的 分 析 中 计算 了 所 有 关键 步骤 的 组 弹性 系数 ， 并 用 它们 分 别 
计算 出 悬浮 细胞 和 固定 化 细胞 培养 中 从 葡萄 糖 到 乙醇 途径 的 FCCs。 这 个 主题 将 在 第 12 章 、 
第 13 章 中 进行 详 述 。 

11.2.3 ” 瞬 态 代谢 物 测量 的 应 用 

即使 FCCs 是 对 稳 态 系统 定义 的 ，Delgado 和 Liao (1992a，b) 提出 了 通过 直接 测定 代 
谢 物 的 瞬 态 浓度 来 确定 FCCs 的 方法 ， 该 方法 提出 四 个 假定 。 

(1) 外 部 代谢 物 库 对 代谢 途径 的 动力 学 没有 影响 ， 或 它们 的 浓度 被 控制 在 一 个 稳 态 水 上 
平 。 这 也 是 MCA 一 个 普遍 假定 。 

(2) 在 稳 态 点 附近 酶 动力 学 的 线性 近似 在 一 个 较 宽 的 代谢 物 浓度 范围 内 是 有 效 的 。 此 限 
制 条 件 在 随后 的 讨论 中 可 以 被 放宽 。 

(3) 从 代谢 物 浓 度 的 测量 来 确定 通过 途径 中 每 一 反应 的 瞬时 通 量 在 理论 上 一 定 是 可 
行 的 。 

(4) 代谢 物 在 体系 中 均匀 分 布 (MCA 的 另 一 个 普遍 假定 )。 

基于 上 述 假定 ， 可 以 推导 FCCs 与 通过 每 个 酶 的 瞬时 通 量 之 间 的 如 下 关系 (见方 杠 
11.3): 

284 


I ee he ae ee Sere 


yaar 1 (11.39) 


AY, v(t) 是 通过 第 TROD, J 是 稳 态 通 量 。 瞬 时 通 量 可 由 代谢 物 浓 
度 的 测量 估算 出 ， 式 (11.39) 可 用 来 计算 途径 的 FCCs。 然 而 ， 从 代谢 物 测量 浓度 来 精确 
估计 了 瞬时 通 量 (包括 导数 的 确定 ) 是 一 个 很 难 进 行 并 容易 出 错 的 过 程 。 由 于 这 个 原因 ，Del- 
gado 和 Liao (1992a) 提出 了 另 一 种 可 供 选 择 的 方法 ， 此 法 基于 式 (11.39) 的 积分 形式 。 
按照 此 法 ， 可 通过 利用 式 (11.40) 从 瞬 态 代谢 物 测量 首先 确定 一 组 系数 w ， 式 (11.40) 
等 价 于 式 (11.39) 的 积分 形式 : 


K 


Dale (t) - ¢(0)] = t (11.40) 


y= 


对 该 途径 中 的 FCCs 与 式 (11.40) 的 系数 ui 进行 关联 。 对 于 一 个 线性 途径 ， 这 个 关系 如 下 
iim: 

(C1,Ch.°, CL) =(@1,02,°", aK )G* J (11.41) 
At, J RRMAREAHRBABE,; GC 是 途径 的 化 学 计量 矩阵 。 式 (11.41) 中 的 化 学 计 
量 和 矩阵 与 第 3 章 中 介绍 的 关于 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 抢 阵 G 不 完全 一 样 ， 因 为 其 需要 被 扩 
充 到 包括 途径 中 底 物 和 代谢 产物 的 化 学 计量 系数 (分别 置 于 矩阵 中 的 第 一 列 和 最 后 一 列 中 )。 
对 于 一 个 分 支 途径 ， 等 价 于 式 (11.41) 的 FCC 计算 式 为 : 

C=(a1,a2,°*,aK)G*J (11.42) 

A, C 是 包含 所 有 FCCs 的 矩阵 [ 见 式 (11.26)j; 本 是 在 对 角 线 上 含有 通过 途径 的 
各 个 单个 分 支 的 通 量 的 对 角 和 矩阵 。 

在 对 一 个 稳 态 恒 化 器 注入 一 个 脉冲 之 后 所 产生 的 瞬 态 期 间 内 代谢 物 浓度 测量 值 用 式 
(11.40) 进行 回归 拟 合 ， 就 可 确定 系数 o 的 值 。 然 后 可 以 利用 这 些 系数 从 式 (11.41) 或 式 
(11.42) 来 计算 FCCs。 如 果 在 代谢 物 浓 度 之 间 存 在 线性 约束 ， 也 就 是 说 ， 一 个 代谢 物 浓 度 
是 其 它 代谢 物 浓度 的 线性 组 合 时 ， 则 对 式 (11.40) 的 最 小 平方 拟 合 是 不 可 能 的 。 这 种 约束 
的 一 个 例子 是 质量 平衡 方程 : 


> [ec -ca(O] =0 (11.43) 


对 于 诸如 NAD”* 和 NADH@ 等 作为 被 保存 一 半 的 化 合 物 也 可 能 存在 化 学 计量 上 的 约束 限 
制 。 即 使 在 式 〈11.40) 中 可 能 已 经 滤 掉 了 这 些 限制 ， 但 通过 删除 该 代谢 物流 度 的 测量 值 及 
其 在 化 学 计量 矩阵 中 的 相应 行 来 消除 这 些 限 制 是 明智 的 。 最 好 的 选择 是 删除 那些 具有 最 大 不 
确定 性 的 测量 值 。 

即使 没有 化 学 计量 学 上 的 限制 ， 由 于 动力 学 的 原因 ， 一 些 代谢 物 之 间 可 能 仍然 是 线性 相 
关 的 。 例 如 ， 如 果 一 个 反应 的 反应 速率 大 大 快 于 其 它 的 反应 ， 这 个 反应 在 发 生 扰 动 之 后 可 以 
很 快 达到 准 平 衡 状 态 ， 结 果 其 底 物 和 产物 的 浓度 将 与 平衡 常数 相关 联 。Delgado 和 Liao 
(1992a) 建议 : 如 果 事先 知道 这 些 平衡 反应 ， 应 将 这 些 受 平衡 反应 约束 的 代谢 物 一 起 归并 进 
一 个 共同 代谢 库 中 。 


@@ ”要 注意 到 : 在 对 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 矩阵 G 的 定义 中 仅仅 包括 了 一 个 代表 了 所 有 的 作为 储存 部 分 的 化 合 物 的 
化 学 计量 系数 ， 例 如 : 包括 一 个 仅 代表 化 合 物 NAD NADH 的 化 学 计量 系数 。 这 样 在 化 学 计量 和 矩阵 G 中 不 存在 线性 相 
关 的 代谢 物 ， 因 此 在 对 和 矩阵 的 定义 中 不 存在 化 学 计量 上 的 限制 。 


285 


基于 瞬时 代谢 物 测量 的 方法 也 可 以 用 来 确定 CCCs (Delgado 和 Liao, 1992b). ix BAY 
分 析 类 似 于 式 (11.39) 的 一 个 方程 式 : 
Ce pe (11.44) 


Gi 4 

式 中 ，ci,s 是 稳 态 代谢 物 浓 度 。 式 (11.39) MA (11.44) 清楚 地 表明 : 代谢 物 浓 度 和 
通过 各 个 单个 反应 的 通 量 不 能 随 着 对 一 个 稳 态 的 扰动 而 独立 地 发 生变 化 ， 这 是 由 于 它们 被 在 
稳 态 时 的 控制 系数 所 限制 。 式 〈11.44) 的 积分 形式 可 以 用 来 确定 浓度 控制 系数 ， 这 允许 对 
代谢 物 测量 值 进行 线性 函数 的 最 小 二 乘 回 归 ， 接 着 就 可 以 计算 CCCs 了 。 

这 种 瞬时 代谢 物 测 定 的 方法 非常 好 ， 因 它 能 使 控制 系数 的 确定 相对 比较 容易 。 这 种 方法 
的 主要 批评 性 意见 是 线性 化 的 动力 学 假定 。 但 是 最 近 的 研究 (Nielsen, 1997) 表明 ， 当 反 
应 动力 学 能 用 相对 于 代谢 物 浓 度 的 对 数 的 线性 函数 描述 时 ， 这 种 方法 也 可 应 用 。 这 类 线性 化 
通常 可 以 对 反应 动力 学 进行 更 精确 的 描述 。 目 前 还 没有 用 此 方法 对 一 个 完整 代谢 途径 进行 分 
析 的 实际 例证 。Delgado (1993) 用 这 种 方法 确定 了 一 个 体外 重建 的 部 分 糖 酵 解 途径 中 己 
糖 激酶 和 磷酸 果糖 激酶 的 FCCs， 同 时 也 用 酶 滴定 法 确定 了 FCCs， 发 现 两 种 方法 所 得 的 结 “ 
果 非 常 一 致 。 该 方法 中 的 另 一 个 问题 是 所 确定 的 控制 系数 对 测量 误差 有 很 高 的 敏感 性 
(Ehlde 和 Zacchi，1996) ， 这 是 各 个 代谢 物 浓度 之 间 存 在 高 度 相 关 性 的 结果 。 基 于 该 方法 的 
理论 分 析 (FA Monte Carlo 模拟 法 )，Ehlde 和 Zacchi (1996) 得 出 结论 : 不 可 能 从 实际 的 实 
验 数据 得 到 控制 系数 的 合理 确定 ， 因 为 这 样 的 数据 总 是 由 于 带 有 某 种 噪声 而 变 坏 。 
11.2.4 动力 学 模型 


当 对 所 研究 的 代谢 途径 建立 了 完整 的 动力 学 模型 之 后 ， 原 则 上 MCA 的 概念 就 不 需要 


了 。 如 果 这 种 生化 模型 是 足够 强健 的 ， 它 可 用 来 预测 酶 活性 的 小 的 扰动 和 大 的 变化 两 种 情况 
的 影响 。 此 外 ， 生 化 模型 的 结构 通常 将 揭示 代谢 物 和 效应 物 水 平 对 反应 速率 的 影响 。 尽 管 这 上 


种 事实 ， 应 用 动力 学 模型 来 确定 不 同 条 件 下 的 MCA 系数 仍 是 很 有 价值 的 ， 因 为 它们 提供 了 是 


关于 通 量 控制 的 简明 定量 的 信息 。 对 于 动力 学 模型 在 完整 代谢 途径 中 的 应 用 的 一 个 总 评判 
是 : 尽管 包含 了 细节 的 程度 ， 但 它们 不 能 包括 系统 中 所 有 可 能 的 相互 作用 ， 因 此 它们 只 代表 
系统 的 一 种 模型 ， 特 别 是 当 动力 学 模型 被 用 于 预测 时 ， 其 强健 性 (robustness) 是 极端 重要 
的 。 但 不 幸 的 是 ， 大 多 数 生化 模型 ， 即 使 是 非常 详细 的 模型 ， 也 只 是 在 接近 对 参数 进行 估计 
的 操作 条 件 下 才 有 效 ， 也 就 是 说 ， 它 们 的 预测 力 是 有 限 的 。 然 而 ， 对 于 复杂 系统 的 分 析 来 
说 ， 模 型 对 所 有 变量 给 出 定量 正确 的 描述 是 不 必要 的 ， 因 为 有 些 模型 甚至 只 对 系统 中 最 重要 
的 相互 作用 给 出 定量 正确 的 描述 ， 但 其 在 通 量 控制 研究 中 可 能 非常 有 用 。 


11.3 线性 途径 的 MCA 


在 本 节 和 下 一 节 中， 将 把 代谢 控制 分 析 运 用 到 线性 和 分 支 代 谢 途 径 中 。MCA 方程 的 特 上 
殊 形式 就 是 在 这 些 情 况 下 推导 出 来 的 ， 它 们 的 应 用 将 用 作为 例证 的 实例 来 说 明 。 

对 一 个 线性 代谢 途径 来 说 ， 代 谢 物 的 个 数 是 工 -1, 工 是 酶 反应 数 ， 也 就 是 说 ， 代 谢 物 
数 比 酶 反应 数 少 1。 在 这 种 情况 下 只 有 一 个 通 量 ， 它 等 于 稳 态 下 所 有 反应 的 反应 速率 。 同 时 
还 存在 L 个 未 知 通 量 控制 系数 ， 每 一 个 系数 表示 代谢 途径 中 每 一 反应 对 整个 代谢 途径 通 量 
的 影响 。FCCs 可 以 通过 连接 定理 和 加 和 定理 共同 来 确定 。 对 于 工 -1 个 中 间 代 谢 物 有 工 -1 
个 连接 定理 , 与 加 和 定理 一 起 ， 就 提供 了 恰好 足够 多 的 方程 以 从 弹性 系数 计算 出 工 个 通 量 
控制 系数 。 类 似 地 ， 浓 度 控制 系数 也 能 从 相应 的 连接 定理 和 加 和 定理 来 确定 。 对 于 〈 通 量 和 

286 


KE) 控制 系数 方程 COBH 三 ? 个 方程 ) EUR BAA wD Ps, KE Fell 和 
Sauro (1985) 提出 的 。 


1 era aT én -Ch %, 一 Ci 
1 2 
<< <x, Ex, ‘ek — CF ist — Cpt 7 01 0 Aries 
ex, ex ， eee eX, ch -cn Pr. = CX Oo. Gx. 7 


容易 表明 该 式 完全 等 同 于 式 (11.26) 对 线性 途径 的 一 般 化 形式 。 其 中 参数 弹性 矩阵 P 等 于 
单位 和 矩阵。 如 果 弹 性 系数 矩阵 是 非 奇异 的 ， 则 可 以 通过 矩阵 求 逆 来 计算 控制 系数 。 以 这 种 方 
法 ， 由 控制 系数 所 表示 的 系统 性 质 与 在 弹性 系数 中 所 反映 的 局 部 酶 动力 学 就 被 联系 起 来 。 

为 说 明 这 些 概念 ， 我 们 回 到 式 (11.1) 所 示 的 简单 二 步 途径 ， 为 此 ,， 式 (11.45) 简化 
为 下 式 : 


1 “19 (ESS Reh Fite 
= 11.46) ~ 
ex F) Ch es f 1 46) 
其 解 为 @: 
ex 1 
Cte ex 一 EX ch -ex 
BS ; (11.47) 
C, CC ex aici § 


ex —e ex—ek 


通常 ， 一 个 反应 的 弹性 对 其 产物 为 负 值 ， 而 对 其 底 物 为 正 值 。 这 样 ，el BA, 2 BE 
“ 值 ， 控 制 系数 表达 式 中 的 分 母 是 正 值 。 这 就 使 两 个 FCCs 的 值 均 为 正 的 。 通 量 控制 的 分 布 取 
决 于 相应 的 弹性 系数 值 : 大 弹性 系数 与 小 的 FCC 值 相 联系 ， 反 之 亦 然 。 如 果 相 应 于 该 代谢 
物 的 第 一 个 反应 的 弹性 非常 低 ， 正 如 对 一 个 实际 上 的 不 可 逆反 应 ， 第 一 步 反 应 的 FCC 将 接 
近 于 1， 在 这 种 情况 下 就 产生 一 个 真正 的 限 速 步 又。 仅仅 当 相应 于 该 代谢 物 的 第 一 步 反 应 的 
弹性 为 0 时 ， 即 反应 产物 对 反应 速率 绝对 没有 影响 ， 这 两 个 反应 的 FCCs 值 将 精确 地 达到 1 
和 0 而 与 代谢 物 的 浓度 无 关 。 然 而 ， 甚 至 对 实际 上 是 不 可 逆 的 反应 ， 相 应 于 反应 产物 总 是 有 
一 些 弹 性 ， 一 个 真正 的 瓶颈 反应 实际 上 决 不 会 达到 。 实 际 上 具有 瓶颈 效应 的 反应 是 从 不 存在 
的 。 注 意 到 下 述 情况 是 很 有 趣 的 : 如 果 一 条 线性 代谢 途径 中 的 所 有 反应 都 用 不 可 逆 的 
Michaelis-Menten 动力 学 来 描述 ， 则 相应 于 反应 产物 的 弹性 为 零 ， 而 且 除 了 第 一 步 外 的 所 有 
FCCs 都 等 于 零 ， 第 一 步 的 FCC 等 于 1。 然 而 在 实际 中 很 明显 的 是 : 如 果 第 一 步 反 应 的 酶 活 
性 急剧 上 升 ， 中 间 代 谢 物 的 浓度 将 上 升 ， 最 终 第 二 步 反 应 将 变 得 被 这 种 代谢 物 所 饱和 。 这 将 
使 该 反应 相应 于 代谢 物 的 弹性 非常 低 ， 因 而 具有 非常 高 的 通 量 控制 系数 。 确 实 ， 第 二 步 反 应 
活性 的 微小 提高 将 对 通 量 产生 重要 影响 ， 因 为 很 容易 将 积累 的 代谢 中 间 物 催化 耗 尽 。 还 应 注 
意 : 在 这 种 情况 下 将 产生 一 个 病态 方程 组 ， 从 和 抢 阵 求 逆 中 得 到 的 解 对 于 可 利用 的 代谢 物 浓度 
数据 可 能 是 非常 敏感 的 。 


@ 注意 ， 此 解 同 式 (11.26) 所 表示 的 MCA 的 通 式 一 致 。 在 此 例 中 这 个 通 式 取 以 下 形式 : 


CI 1 0\ [ex 
CI C; 0 1 EX 


287 


如 果 我 们 假定 代谢 物 X 对 第 一 个 反应 的 影响 是 负 的 而 对 第 二 个 反应 的 影响 是 正 的 , 则 ， 
第 一 个 反应 的 浓度 控制 系数 为 正 值 意味 着 当 反 应 速率 增加 时 代谢 物 浓 度 也 增加 )， 而 第 三 ， 
个 反应 的 浓度 控制 系数 为 负 值 意味 着 当 第 二 个 反应 速率 增加 时 代谢 物 浓度 将 变 小 )。 如 果 
至 少 一 个 弹性 系数 很 大 ， 则 浓度 控制 系数 将 很 小 ， 反 之 亦 然 。 因 此 ， 如 果 反 应 相应 于 代谢 物 
浓度 的 变化 是 非常 有 弹性 的 ， 反 应 速率 被 调整 至 新 的 条 件 ， 变 化 着 的 反应 速率 将 对 代谢 物 浓 
度 有 很 小 的 影响 。 


【 例 11.1】 青霉素 生物 合成 途径 的 MCA 
对 青霉素 生物 合成 途径 已 经 了 解 得 很 清楚 [ 见 Nielsen (1996) 的 综述 ]。 该 途径 中 包括 
三 步 酶 反应 ( 见 图 11.3)， 其 中 头 两 步 在 所 有 8- 内 酰胺 抗生素 的 生物 合成 途径 中 都 


HN, HN, HN; 
pew, COOH + ley, SH + —~< 
HOOC HOOC HOOC 
oh ARG 


cx- 氨 基 己 二 酸 FARR 


ACV & ras 


Q 
& , 
xo 

are le 


L-a-BEC — MR -L- FMAM -D- BAB 


IPN & AaB 


HN 


O 
I oaAgzo Ke 
¢ \—-o—cu,-c— CoA 
CoA CH 
《 oe et © 4 ac 3 
和 CH, 


青霉素 V 


图 11.3 产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum) 中 的 青霉素 生物 合成 途径 
288 


— 


是 一 样 的 (不 同 生 物 的 酶 之 间 有 很 高 的 同 源 性 )。 途 径 中 的 第 一 步 反 应 是 三 种 氨基 酸 (L- 
&- 氨 基 己 二 酸 、L- 半 胱 氨 酸 和 D- 纺 氢 酸 ) 缩合 成 L-a- 氨 基 己 二 酰 - L-FRAR-D- WAR 
(LLD-ACV)。L- 半 胱 氨 酸 和 革 L- 统 氨 酸 是 所 有 细胞 代谢 中 众所周知 的 中 间 产 物 ， 而 L-a- 氮 基 
已 二 酸 是 真菌 中 合成 赖 氨 酸 的 一 个 中 间 物 。 由 一 个 单一 多 功能 酶 一 一 ACYV 合成 酶 (ACVS) 
催化 形成 三 肽 LLD-ACV。 途 径 中 第 二 步 反 应 是 LLD-ACYV 的 氧化 闭环 反应 以 形成 异 青霉素 
N。 这 一 步 是 由 异 青霉素 N 合成 酶 用 自由 氧 作 为 电子 受 体 完成 的 。 到 青霉素 V 的 最 后 转化 
是 由 乙酰 辅酶 A: 异 青霉素 酰基 转移 酶 催化 的 ， 而 且 可 以 通过 一 个 一 步 或 两 步 的 反应 机 制 。 
在 两 步 反 应 机 制 中 ，wa- 氨 基 己 二 酸 的 部 分 发 生 断 裂 并 释放 出 6-APA (6- 氮 基 青 霉 烷 酸 )。 如 
果 一 个 活化 的 前 体 物 即 葵 氧 基 乙 酰 辅酶 A 是 可 利用 的 ， 则 6-APA 就 会 和 AT (Fe BEA A) 
结合 ， 随 后 被 转变 为 青霉素 V。 在 一 步 反 应 机 制 中 ，w- 氨 基 已 二 酸 的 异 青霉素 N 侧 链 同 前 
体 物 发 生 了 交换 ， 而 没有 从 酶 中 释放 出 6-APA。 

Nielsen 和 Jorgensen (1995) 已 对 这 条 途径 进行 了 代谢 控制 分 析 。 他 们 在 分 析 中 提出 了 
前 两 个 酶 的 动力 学 表达 式 ， 从 ACVS 和 IPNS 的 动力 学 表达 式 确定 了 弹性 系数 ， 并 用 MCA 
定理 计算 了 前 两 步 反 应 的 通 量 控制 系数 。 从 对 最 后 一 个 酶 (AT) 活性 的 测定 中 得 出 结论 ， 
由 AT 施加 的 通 量 控制 是 最 小 的 。 这 个 结论 后 来 被 Pissara F (1996) 对 这 条 途径 中 的 所 有 
反应 进行 的 更 详细 的 分 析 所 证 实 。 

ACVS 已 经 表明 ， 对 于 参与 该 合成 酶 反应 的 每 一 个 氨基 酸 ， 都 可 以 用 Michaelis-Menten 
动力 学 来 表示 。Nielsen 和 Jorgensen (1995) 在 他 们 的 分 析 中 提出 了 由 反应 产物 LLD-ACV 
的 反馈 抑制 作用 ， 因 此 ， 对 于 ACVS 催化 的 反应 ， 提 出 以 下 的 动力 学 表达 式 : 


Ss Rc MMR al (GD 
< 一 1 一 es 
+ Prasat = K cys cys + Keats + cacvK acy) 


Ba, P. chrysogenum 中 的 ACVS 被 提纯 ， 并 证 实 了 LLD-ACV 对 其 有 反馈 抑制 作用 
(Theilgaard, et al，1992)。 在 式 (1) 中 ，zpmax 是 不 同 效 应 物 的 函数 ， 这 些 效 应 物 包 括 
ATP、AMP 、 焦 磷酸 盐 、 磷 酸 盐 、CoA 和 Mg ， 其 中 ATP 对 反应 有 促进 作用 而 AMP 和 
焦 磷 酸 盐 对 反应 有 抑制 作用 。 取 三 个 米 氏 参数 氏 ss、 天 os 和 天 的 值 等 于 所 报道 的 S . 
clavuligerus 的 值 ， 即 依次 为 0.63mmol 人 L、0.12mmol 亿 和 0.30mmol/L (当时 对 P. 
chrysogenum ACVS 还 没 表征 ， 其 它 Kn 的 应 用 对 分 析 结 果 并 无 太 大 的 影响 )。 开 Acv 的 值 可 
以 通过 ~Acv 对 通过 青霉素 生物 合成 途径 的 通 量 的 拟 合 而 估计 出 来 。 

BBA N 合成 酶 (IPNS) 是 8- 内 酰胺 抗生素 的 生物 合成 途径 中 充分 表征 了 的 一 个 
酶 。 该 酶 是 一 种 依赖 于 铁 的 氧化 酶 ， 它 从 LLD-ACV 中 移 走 4 当量 氨 ， 同 时 消耗 Imol A. 
已 经 从 P. chrysogenum 纯化 出 IPNS (Ramos et al，1985$)， 其 体外 活性 都 需要 分 子 氧 、 
Fe2+ 、 二 硫 苏 糖 醇和 抗坏血酸 盐 。 这 个 酶 和 LLD-ACYV 浓度 之 间 的 关系 可 以 用 Michaelis- 
Menten 动力 学 方程 来 表示 ， 其 开 , 值 为 0.13mmol 人 L。 此 外 ， 谷 胱 甘 肽 可 能 是 该 酶 的 竞争 
性 抑制 剂 ， 其 表 观 抑制 常数 OK; 为 8.9mmol/L。 目 前 还 没有 氧 浓 度 对 纯化 的 IPNS 动力 学 影 
响 的 研究 报道 。 但 是 对 于 从 P. chrysogenum 中 部 分 纯化 的 IPNS, Bainbridge 等 (1992) 
发 现 当 氧 浓度 在 0.070 ~ 0.18mmol/L 的 范围 内 〈 对 应 于 25% 一 75% 的 空气 饱和 度 )， 该 酶 
的 动力 学 方程 对 氧 是 一 级 。 这 表示 将 LLD-ACYV 转变 为 异 青霉素 N 的 反应 对 溶解 氧 浓 度 的 
变化 是 非常 敏感 的 。 在 对 其 它 几 个 8- 内 酰胺 产品 的 实验 中 也 观察 到 了 这 一 点 。 基 于 这 些 结 
果 ， 提 出 如 下 表达 式 用 于 LLD-ACV 转化 为 异 青霉素 N (IPN) HHA: 

289 


Umax€ ACV 
= pA 
cacvt+ Km(1+ cork ; 时 ) 


其 中 两 个 参数 K, MK; RAMA, 25 0.13mmol/L 和 8.9mmol/L. 

从 前 体 物 氨基 酸 的 胞 内 代谢 库 、LLD-ACYV 及 ACVS 的 活性 等 测量 ， 就 可 以 通过 动力 
学 表达 式 (1) 计算 出 LLD-ACYV 的 合成 速率 (raAcv)。 通 过 将 计算 出 的 速率 与 青霉素 总 合 
成 测量 进行 拟 合 ， 可 估计 出 久 Acv 值 为 12.Smmol 人 L， 这 个 值 比 纯化 酶 的 值 略 高 (Theilgaard 
et al，1997)。 显 然 ， 在 体外 条 件 下 所 确定 的 抑制 参数 是 在 机 理 概 念 上 的 正确 值 ， 而 从 生产 
能 力 拟 合 所 确定 的 值 可 能 被 体内 存在 的 其 它 影响 掩盖 了 。 拟 合 值 在 通过 ACVS 催化 的 反应 
的 实际 通 量 与 从 动力 学 表达 式 预 测 的 通 量 之 间 得 到 非常 好 的 一 致 结果 。 因 为 对 IPNS 反应 也 
发 现 非常 一 致 ， 所 以 可 得 出 结论 : 简单 的 动力 学 表达 式 〈1) 和 表达 式 (2) 可 以 很 好 地 表示 
前 两 步 反 应 的 动力 学 ， 从 而 允许 弹性 系数 和 通 量 控制 系数 的 精确 确定 。 

对 ACVS 和 IPNS 反应 的 弹性 系数 可 以 首先 通过 对 速率 方程 求 偏 导 而 得 出 : 


T IPN 一 


K 二 
ACVS_ CACVLACV (3 
© ACTs ) 


=1 
1+ cacvK acy 


4 

_IPNS _ Mott hea.) 
AGV =-1 
Grey t ml lh eK; ) 


式 (3) 和 式 (4) 表明 弹性 系数 是 谷 胱 甘 肽 和 LLD-ACV 浓度 的 函数 。 由 于 反馈 抑制 ， 第 
一 个 反应 相应 于 LLD-ACYV 的 弹性 系数 为 负 值 ， 而 第 二 个 弹性 系数 为 正 值 。 流 加 培养 期 间 ， 
胞 内 途径 代谢 物 的 浓度 发 生变 化 ， 因 此 不 能 严格 满足 稳 态 假定 。 然 而 从 时 间 尺 度 分 析 已 经 发 
7" 现 整个 流 加 过 程 中 ， 尽 管 积累 了 很 多 LLD- 
ACV, 途径 代谢 物 库 处 于 拟 稳 态 (Pissara et 
& al, 1996), xX #F, MCA 理论 仍然 是 适用 的 。 
# 5 10 15 iit Xt 4 Bt A AK Al LLD-ACV 瞬时 浓度 的 测 
定 ， 已 计算 出 流 加 培养 期 间 在 不 同时 间 时 的 弹 
性 系数 ， 如 图 11.4 所 示 。 
要 注意 到 ， 对 于 ACVS， 弹 性 系数 是 负 
的 ， 也 就 是 说 ， 增 加 着 的 LLD-ACV 浓度 将 减 
图 11.4 在 流 加 培养 期 间 两 个 酶 ACVS 和 小 由 ACVS 催化 的 LLD-ACV 合成 速率 ; 在 整 
IPNS 相应 于 LLD-ACYV 的 弹性 系数 个 流 加 培养 的 过 程 中 ,由 于 不 断 增加 着 的 
注意 : ACVS 的 弹性 系数 是 负 值 
LLD-ACV 浓度 使 弹性 系数 的 值 也 变 大 。 在 另 
一 方面 ， 对 于 IPNS， 弹 性 系数 值 为 正 值 ， 也 就 是 说 ，LLD-ACYV 浓度 不 断 增加 所 产生 的 影 
响 是 正 的 ， 但 是 当 IPNS 变 得 由 LLD-ACYV 饱和 时 ， 弹 性 系数 在 整个 流 加 期 间 将 减 小 。 
通 量 控制 系数 是 用 式 (11.47) 从 弹性 系数 计算 出 的 ， 结 果 如 图 11.5 所 示 。 最 初 ， 对 
于 ACVS 的 通 量 控制 系数 是 高 的 《接近 于 1)， 因 为 几乎 不 存在 来 自 中 间 物 LLD-ACV 的 
抑制 。 但 是 ， 当 LLD-ACYV 的 浓度 增 大 时 ， 通 量 控制 逐渐 由 ACVS 转移 到 IPNS， 并 在 培养 
大 约 70h 之 后 ， 通 量 基 本 上 由 IPNS 所 控制 。 随 着 通 量 控制 从 ACVS 到 IPNS 的 转移 ， 这 两 
个 酶 没有 哪个 能 被 看 做 限 速 酶 。 这 证 明 对 一 个 给 定 的 代谢 途径 ，FCCs 值 并 不 是 恒定 不 
变 的 。 
290 


(4) 


时 间 /h 


另 一 个 有 趣 的 观察 是 : st (2) 所 推荐 的 IPN 形成 的 动力 学 揭示 溶 氧 浓度 的 增加 将 导致 
通过 途径 的 通 量 的 显著 增加 ， 这 是 因为 IPNS 活性 的 微小 增加 将 阻止 LLD-ACV 的 积累 并 因 
此 而 防止 了 对 ACVS 的 抑制 。Pissara 等 (1996) 对 该 途径 用 一 个 完整 的 动力 学 模型 ( 即 用 
11.3 中 所 考虑 到 的 所 有 反应 ) 来 检验 溶 氧 对 青霉素 生物 合成 的 影响 。 他 们 发 现 : 合成 青 
霉 素 的 代谢 通 量 确实 对 溶 氧 的 浓度 很 敏感 ， 在 溶 氧 浓度 
低 的 情况 下 ， 对 于 IPNS 的 FCC 将 增加 。 这 一 发 现 最 近 
已 被 Henriksin 等 (1997) 用 实验 证 实 ， 他 们 发 现 : 在 
一 个 以 葡萄 糖 限制 的 恒 化 器 中 ,在 低 溶 氧 浓 度 下 ， —#— ACVS 
LLD-ACV 的 浓度 将 逐渐 上 升 。 从 式 (3) 和 式 (4) 中 0.4 —4— IPNS 
明显 可 以 看 出 ， 对 ACVS 催化 的 反应 ， 这 将 导致 一 个 数 0.2 
值 上 很 大 的 弹性 系数 ， 对 IPNS 催化 的 反应 ， 则 为 一 个 
较 小 的 弹性 系数 ， 这 再 次 意味 着 对 IPNS 有 更 高 的 
PU. 

从 这 些 弹性 系数 ， 用 式 (11.47) HA Wit Re 
度 控制 系数 。 对 于 ACVS， 其 浓度 控制 系数 在 流 加 培养 
的 开始 阶段 大 约 为 S， 在 培养 结束 时 大 约 降 至 2。 这 表 
明代 谢 库 对 ACVS 活性 变 得 不 太 敏 感 了 。 这 也 是 LLD-ACYV 积累 的 结果 ， 因 为 在 高 浓度 时 
的 反馈 抑制 使 反应 速率 及 代谢 物 浓度 对 酶 活性 变化 不 太 敏 感 了 。 


1.2 


时 间 几 
11.5 在 流 加 培养 期 间 
两 个 酶 ACVS 和 IPNS 的 
通 量 控制 系数 


11.4 分 支 途径 的 MCA 


分 支 (代谢 ) 途径 MCA 的 应 用 包括 额外 的 复杂 度 。 首 先 ， 我 们 要 处 理 多 于 一 个 单一 通 
量 的 情况 (单一 通 量 是 线性 途径 的 情况 )。 分 支 途径 中 的 每 一 个 通 量 都 可 能 受到 代谢 网 络 中 
任何 酶 反应 的 影响 ， 这 就 需要 一 个 能 够 对 通 量 控制 进行 完整 描述 的 通 量 控制 系数 矩阵 。 第 
二 ， 分 支 代谢 途径 中 的 代谢 物 的 数目 少 于 世 -1 (LER), BOK, AREA 
和 定理 并 不 能 提供 足够 数目 的 方程 以 便 从 弹性 系数 计算 控制 系数 。 但 是 ， 在 这 种 途径 中 , 通 
量 并 不 是 独立 的 ， 通 量 之 间 的 守 衡 方程 将 产生 附加 的 限制 ， 这 也 允许 从 酶 的 弹性 来 确定 控制 
系数 。 这 些 限 制 已 被 称 作 结构 关系 (Reader，1988)， 它 们 由 网 络 中 反应 的 化 学 计量 学 所 确 
定 。 其 结果 是 将 有 恰好 足够 的 结构 关系 以 弥补 “缺少 的 ”方程 ， 以 致 控制 系数 总 能 由 弹性 系 
数 来 计算 。 结 构 关 系 公式 构建 相对 来 说 是 复杂 的 。 为 了 有 利于 一 般 情况 的 表示 ， 将 首先 讨论 
如 图 11.6 所 示 的 简单 分 支 途径 。 
图 11.6 所 示 的 三 个 通 量 ,. J. 和 J3 在 稳 态 条 件 下 并 不 
i 是 独立 的 ， 因 为 它们 通过 围绕 途径 中 代谢 物 X 的 质量 平衡 而 


被 关联 起 来 : 
0 m= J2+ 39 (11.48) 
Jy 4 =3 
11.6 含有 一 个 分 支点 1= fot fs (11.49) 
代谢 物 X， 一 种 底 物 S， 其 中 六 "是 分 数 通 量 ， 由 下 式 求 出 : 
两 种 代谢 产物 P, 和 P。 的 J 


ide 
简单 分 支 途径 fir 7 k € {2,3} (11.50) 
291 


如 果 导 和 人 一 个 扰动 使 得 jz 发 生 改 变 而 万 保持 不 变 ， 那 么 由 式 〈11.48) 表示 的 结构 关系 式 直接 表 


明 3 也 必须 变化 。 这 就 对 通 量 控制 系数 加 入 一 个 限制 ， 这 是 由 Kacser (1983) 首先 推导 出 的 : 
= PC3 + fi3Ch = (11.51) 

结合 连接 定理 和 加 和 和 定理， 这 个 方程 允许 我 们 从 弹性 系数 和 通过 分 支 途径 之 一 的 分 数 通 量 来 
计算 FCCs : 

CE Dey (1 ~ ies 

J,| 4... SE ee 1 

© ex — frex— (1- firdex is ae 

Cy (1 fees 
在 方程 式 (11.51) PES HERA I, HRUHAWKAWNREPHEATIASBA FCCs 


也 成 立 : 
(1— fp)Cz+ Cz=0 (11.53) 


foCet+ Ce=0 (11.54) 
式 (11.53) [或 式 (11.54)] 与 加 和 定理 和 连接 定理 结合 ， 得 到 计算 其 它 两 个 通 量 J 和 万 
的 FCCs 的 类 似 表达 式 [Wk (11.68) AH (11.69)]。 


在 更 复杂 的 途径 中 ， 在 每 一 个 分 支点 几 个 反应 都 可 能 正在 发 生 ， 可 以 推导 出 类 似 的 方 _ 


程 。Fell 和 Sauro (1985) 通过 关联 导向 和 离开 一 个 分 支 (Branch) 点 代谢 物 Xi 的 不 同 分 
支 途径 的 FCCs 推导 出 方程 (11.55) ， 导 向 代谢 物 的 通 量 取 为 厂 ， 通 过 第 & 个 分 支 的 分 数 通 
Bi 认 ， 即 通过 这 个 分 支 的 通 量 是 大 。 

- fu >, GG). >; Cy, =0 (11.55) 


Branchk Branchm 


通过 运用 反应 分 组 和 自 上 而 下 MCA 的 概念 ， 式 (11.55) 中 的 几 个 加 和 只 不 过 是 参与 相应 分 支 反 应 
的 组 FCC。 因 此 ， 上 述 方程 是 式 (11.51) 的 组 类 似 方 程 。 如 果 途 径 中 进一步 分 支 ， 式 (11.55) 的 加 
和 (或 ， 等 价 地 ， 反 应 组 ) 将 包括 出 自 代 谢 物 X; 的 每 一 个 分 支 的 所 有 亚 分 支 中 的 全 部 FOCs。 
注意 到 在 式 (11.53) AK (11.54) 中 两 项 的 符号 都 为 正 ， 而 式 (11.51) 中 两 项 的 符 
号 相反 。 如 果 通 量 JIM 万 RE, WI 必然 变 小 ， 反 之 亦 然 。 这 就 解释 了 式 (11.51) 
中 符号 的 不 同 。 相 反 地 ， 当 通 量 J. 增加 而 Js 保持 不 变 时 ， 则 万 也 必然 增加 ， 这 就 解释 了 
x (11.53) 和 式 (11.54) 中 的 符号 为 什么 都 为 正 的 。 显 然 ， 化 学 计量 学 也 在 起 作用 。 这 已 
由 Reder (1988) 所 做 的 工作 所 证 明 ， 他 推导 了 一 组 包含 了 MCA 理论 和 由 化 学 计量 学 限制 
所 施加 的 结构 关系 的 一 组 通用 方程 式 。 通 过 这 组 方程 ， 就 有 可 能 推导 出 MCA 系数 中 所 有 的 
独立 关系 ， 甚 至 对 非常 复杂 的 途径 也 行 @。 由 Reader (1997) 导出 的 结构 关系 是 以 非 定 标的 


(nonscaled) 控制 系数 为 基础 的 ， 但 Ehlde 和 Zacchi (1997) 也 推导 出 了 定 标的 (scaled) 控 | 


制 系数 的 类 似 结构 关系 ， 下 面 将 提供 这 些 一 般 关 系 的 推导 。 


考虑 一 个 包括 K 个 中 间 代 谢 物 通过 工 个 酶 反应 相互 连接 的 反应 网 络 ， 可 以 写 出 开 个 通 


量 平衡 式 ， 每 一 个 对 应 于 网 络 中 的 每 一 个 代谢 物 。 通 过 导入 世 x 天 化 学 计量 矩阵 G 和 工 Xx1 
通 量 向 量 J, 这 些 通 量 平衡 式 可 概括 为 下 面 的 矩阵 方程 ， 它 等 同 于 式 〈8.3)@: 


@ 在 前 面 的 分 析 中 并 没有 包括 代谢 循环 ， 对 于 代谢 循环 可 以 规定 另外 一 组 关系 式 〈FellSauro，1985)。 


O 在 此 ， 关 于 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 矩阵 G 的 定义 不 允许 存在 有 线性 相关 的 行 〈 或 线性 相关 的 代谢 物 ) ， 因 此 它 仅 


含有 辅 因子 对 (例如 NAD* 和 NADH) 中 两 个 化 合 物 之 一 。 在 Ehlde 和 Zacchi (1997) 的 分 析 中 [还 有 Reder (1988) 
的 分 析 ]， 在 对 化 学 计量 矩阵 的 说 明 中 没有 此 要 求 ， 因 此 他 们 的 分 析 方 法 更 为 通用 〈 但 也 更 复杂 )。 


292 


G'J = 0 (11.56) 

这 个 表达 式 表示 连接 着 工 个 稳 态 通 量 的 天 个 线性 方程 ， 而 且 很 明显 ， 通 过 重 排 公式 ， 

可 以 把 K 个 通 量 [ 称 作 非 独 立 的 通 量 (dependent fluxes)] 指定 为 剩 下 的 工 - 开 个 通 量 

[独立 通 量 (independent fluxes)] 的 线性 函数 。 为 此 ， 将 化 学 计量 抢 阵 中 含有 非 独 立 通 量 的 
行 集 中 在 子 和 矩阵 G。 中 ， 剩 下 的 行 集 中 在 亚 矩 阵 Go, HX (11.56) 重 写 为 : 


GdJae+GoJin=0 (11.57) 
Fe G。 是 一 个 非 奇 异 方 阵 ， 因 此 独立 通 量 可 通过 式 (11.58) 由 非 独 立 通 量 来 计算 : 
Jdep = a (GI) 'GdTin (11.58) 


此 式 等 同 于 式 (8.8) ， 是 确定 性 系统 (determined system) 的 代谢 通 量 分 析 的 基础 。 通 
过 式 (11.$8)， 所 有 的 通 量 能 以 非 独立 通 量 的 形式 表示 如 下 : 


J=L,, (11.59) 
其 中 矩阵 LI 由 下 式 算 出 : 
于 (11.60) 
— (G?)- Gg 


式 中 , 工 -K 是 维 数 为 (L-K)X(L-K) 的 单位 和 矩阵。 由 于 式 (11.59) 实质 上 提供 
出 这 些 通 量 之 间 的 结构 关系 ，Ehlde 和 Zacchi (1997) 推导 出 了 一 个 由 独立 的 FCCs 确定 
FCC 的 通 式 〈 见 方 框 11.4): 
C=6, (11.61) 
tp, FO LE 是 矩阵 LI 中 的 每 一 个 元 素 Ll, AX (11.50) FAHD fF, HR 
而 得 到 的 ， 将 式 11.61 HAS (11.27) 所 给 出 的 MCA 系数 之 间 的 一 般 关 系 式 ， 得 到 : 


LLC), =P + EC* (11.62) 
其 可 重 排 成 : 
gy (ot 
(Li ~E) ox =P (11.63) 


这 就 是 从 弹性 系数 、 参 数 弹性 系数 和 通过 途径 的 不 同 分 支 的 分 数 通 量 来 确定 控制 系数 的 通 
HK. HER, HK (11.45) 仅 对 线性 代谢 途径 有 效 ， 它 可 从 式 (11.63) 中 导出 ， 后 者 适用 于 各 
种 类 型 途径 结构 。Ehlde 和 Zacchi (1997) 在 对 式 (11.65) 的 推导 中 允许 非 独立 代谢 物 的 
存在 〈 如 辅 因 子 对 中 的 两 种 化 合 物 的 存在 ) ， 这 就 需要 引 和 人 另 一 个 矩阵 ， 该 矩阵 将 所 有 的 浓 
度 控制 系数 表示 为 独立 浓度 控制 系数 的 函数 。 先 前 曾 假定 不 存在 非 独立 代谢 物 ， 即 在 化 学 计 
量 和 矩阵 G 中 不 存在 线性 相关 的 列 。 正 常情 况 下 ， 化 学 计量 式 经 过 在 整理 后 很 容易 满足 这 一 
要 求 ， 而 且 如 果 存 在 线性 相关 列 的 话 ， 可 以 在 不 违反 通用 性 原则 的 情况 下 除去 一 个 或 多 个 线 
性 相关 的 代谢 物 。 


方 框 11.4 式 (11.61) 的 推导 
式 (11.61) 推导 的 出 发 点 是 途径 中 所 有 通 量 和 独立 通 量 之 间 的 关系 ， 正 如 式 
(11.59) PRA. ME; 微分 得 到 : 


(1) 
或 


293 


HEI, HUSK (2) 得 到 


(3) 


(4) 


ArT Xt (11. a 的 应 用 进行 说 明 ， 回 到 图 11.6 中 所 示 的 简单 代谢 途径 。 对 于 此 途 
径 ， 化 学 计量 矩阵 G 为 : 


C= 


1 
bul (11.64) 
=i 

因为 有 三 个 通 量 (L=3) 和 一 个 代谢 物 〈 玫 =1)， 因 此 有 两 个 独立 的 通 量 和 一 个 非 独立 通 
量 。 如 果 Js 被 取 为 非 独立 通 量 ， 则 LI Sm: 


1. 0 
0 (11.65) 
1 -1 
下 一 步 是 用 fi. FRU L) PICK LI: 
1 0 
L170 1 (11.66) 
fu  —f32 
以 及 从 式 (11.63) 得 : 
J J; J 
1 0 -ek)/(C, C, C, ae 
J2 J2 Jo 
0 Per ee eye ee Cs =" 10 1° 6 (11.67) 
fant > fa. — ex) Cz Cy C3 00 1 


4 FAX (11.67) 来 计算 控制 系数 时 ， 通 量 Js AY FCCs 可 以 从 式 (11.61) PRE. H 
(11.67) 的 解 看 起 来 似乎 元 长 乏味 ， 总 共 包括 9 个 方程 ， 但 是 其 结果 可 立刻 给 出 所 有 的 控制 
系数 。 而 且 ， 有 几 种 软件 包 将 很 容易 对 抢 阵 方程 进行 数值 求解 ， 或 者 甚至 可 导出 解析 解 。 这 
样 通过 解 式 (11.67), 得 到 : 


J1 Jy Cc! 3 3 : : 
C, ©, C; ox Saex  frex ek 
cz Ce Cc? on ae eee’ —f e2 于 el Pe 2 
Ci Cry te f31€x fex fuek — farex 
(11.68) 
利用 式 (11.61)， 就 可 以 得 到 通 量 J 的 FCCs: 
J3 
ms : . 531 
3 
2 7 fuek — fnex —€3 4; (11.69) 


3 
st (11.68) 中 的 第 一 行 如 果 乘 以 J, 并 除 万 就 等 同 于 式 (11.52) 的 解 [由 此 ， 分 数 通 量 转 
294 


换 为 fp fis, FMA FR (11.49) 中 ]。 除 了 给 出 所 有 的 FCCs 值 之 外 ， 和 矩阵 的 解 也 直接 
给 出 了 浓度 控制 系数 。 


【 例 11.2】 鼠 肝 脏 细胞 中 的 糖 异 生 和 糖 酵 解 途 径 

几乎 没有 研究 报道 ， 通 过 测定 所 有 相关 的 弹性 系数 一 条 代谢 途径 的 FCCs 已 被 确定 。 然 
而 ,在 对 鼠 肝 胀 细 胞 中 糖 异 生 途 径 的 详细 研究 中 ，Groen 等 (1983，1986) 确定 了 在 高 浓度 
乳酸 和 丙酮 酸 的 条 件 下 这 条 途径 中 的 所 有 FCCs。 这 条 途径 如 图 11.7 所 示 。 他 们 在 分 析 中 通 


葡萄 精 
s| 
G6P 
. 1 一 线粒体 丙酮 酸 转 位 蛋白 ; 
2 一 丙酮 酸 羧 化 酶 (PC); 
3 一 草 酰 乙酸 的 运输 ; 
4 一 磷酸 烯 醇 丙酮 酸 激酶 (PEPCK); 
ae 5 一 丙酮 酸 激酶 (PYK ); 
外 6 一 烯 醇 酶 ， 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 (PGMD)， 
GAP +—— DHAP 3- 磷 酸 -甘油 醛 脱 氢 酶 (GAPDH) 
和 3- 磷 酸 甘 油 酸 激酶 (3PG); 
lly 7 一 磷酸 丙 糖 异 构 酶 (TPI); 
OAAc < 二 | OAAm 8 一 磷酸 葡萄 糖 异 构 酶 (PGI), 
葡萄 糖 -6- 磷 酸 酶 (G6PE) 
] 缩写 : FDP 一 1,6- 二 磷酸 果糖 ; 
[了 YRm DHAP 一 磷酸 二 羟 丙 本 
下 标 : m 一 线粒体 ; c 一 细胞 质 


乳酸 线粒体 膜 


图 11.7 糖 异 生 途 径 略 图 


过 酶 动力 学 、 单 调节 法 或 双 调 节 法 确定 了 弹性 系数 。 在 利用 酶 动力 学 确定 弹性 系数 的 过 程 
中 ， 他 们 用 式 (2) 和 式 (3) ,这 是 基于 可 逆 的 米 氏 动力 学 方程 : 


us —y.= Uf,maxCs/Kg on Ur,max¢ p/K p (1) 
pao el 1+ cs/Ks + cp/Kp 


HP, cs 和 cp 分 别 是 该 酶 反应 的 底 物 和 产物 的 浓度 ; Up max Al vwr,max 分 别 是 最 大 正 、 逆 
反应 速率 。 用 这 些 动力 学 ， 得 到 了 相应 于 产物 和 底 物 的 反应 的 弹性 系数 : 


e. 6s) 30 ae 
PS u “Ics 7 DETAR (2) 
ae eP au = Bae Ur 
SP wy Z Icp Ln PAG Br «Pie (3) 
AP, up 和 ur 分 别 是 正 反 应 和 逆反 应 的 速率 ; 工 是 质量 作用 率 。 可 由 式 (4) 算出 : 
r=% (4) 


CS 
而 天。 是 平衡 常数 ， 由 下 式 算 出 : 


K — £P.eq _ Uismax Kp (5) 
eq K 
CS,eq Ur,max S 


OR MG Ee OP SE, BI /K gp <1 时， 则 弹性 系数 几乎 仅 由 式 (2) 和 式 (3) 中 的 
最 后 一 项 ， 也 就 是 酶 被 底 物 和 产物 所 饱和 的 程度 来 确定 。 另 一 方面 ， 如 果 酶 在 接近 平衡 时 起 
295 


作用 ， 即 下 人 Ke:*1， 则 弹性 系数 主要 由 式 (2) MX (3) 中 的 第 一 项 来 确定 。 

表 11.2 中 总 结 了 所 确定 的 弹性 系数 。 对 于 丙酮 酸 运转 蛋白 〈 反 应 1) 来 说 ， 对 线粒体 
和 胞 质 溶胶 两 处 的 丙酮 酸 的 测量 〈 在 乳酸 和 丙酮 酸 的 高 饱和 浓度 下 进行 ) 表明 了 比值 PT/K。。 
为 0.860 土 0.11， 得 出 这 一 步 反 应 在 接近 于 平衡 的 条 件 下 运行 的 结论 。 丙 酮 酸 脱羧 酶 在 远离 
平衡 的 情况 下 工作 ， 因 此 这 步 反应 的 弹性 系数 由 式 〈2) AX (3) 中 的 最 后 一 项 所 决定 。 为 
了 计算 相应 于 丙酮 酸 的 弹性 系数 ， 从 流向 葡萄 糖 的 通 量 和 通过 丙酮 酸 激酶 反应 的 通 量 确定 了 
正 反 应 速率 。 类 似 地 ， 从 流向 葡萄 糖 的 最 大 通 量 确定 了 最 大 正 反应 速率 。 草 酰 乙 酸 运 输 步 又 
的 弹性 系数 通过 双 调 节 法 确定 。 通 过 改变 底 物 浓度 或 用 3- 开 基 -吡啶 甲酸 抑制 PEEP 羧 激 酶 的 
活性 ， 通 过 这 一 步 的 通 量 会 被 改变 。 从 草 酰 乙酸 浓度 的 相应 变化 的 测量 就 可 以 确定 弹性 系数 。 
对 于 PEP 羧 激 酶 ， 弹 性 系数 也 是 通过 式 〈2) AX (3) 计算 出 的 。 正 反应 速率 作为 净 通 量 
与 逆反 应 的 速率 之 和 被 确定 ， 即 vp=vtv,. AW v,/vp=T/Keq, FE: 


> U 
人 (6) 
# 11.2 11.7 中 所 示 途 径 的 弹性 系数 


注 : 假定 没有 数值 的 栏 中 的 弹性 系数 为 0。 


通过 此 反应 的 净 通 量 又 从 葡萄 糖 生成 速率 和 通过 丙酮 酸 激酶 反应 的 通 量 来 确定 ， 而 从 质 
量 作用 比 的 测量 可 以 确定 正 反应 速率 。 对 丙酮 酸 激 酶 的 弹性 系数 通过 单调 节 法 确定 GER, 
假定 此 步 反 应 为 不 可 道 反应 ， 相 应 于 丙酮 酸 的 弹性 系数 为 零 ) ， 通 过 改变 PEP 的 浓度 并 测定 
相应 的 通 量 ， 可 以 直接 确定 弹性 系数 。 对 于 炳 醇化 酶 、 磷 酸 甘 油 变 位 酶 (PGM)、3- 磷 酸 甘 
THRE A ABE (GAPDH) 和 3- 磷 酸 甘 油 激 酶 (3PG) 所 催化 的 反应 组 ， 发 现在 所 有 条 件 下 ， 
所 有 反应 接近 于 平衡 ， 而 测 得 [Ke 为 0.51。 磷 酸 丙 糖 异 构 酶 (TPI) 、 醛 缩 酶 和 果糖 -1,6- 
二 磷酸 酶 所 催化 的 反应 组 被 认为 是 一 个 反应 ， 其 弹性 系数 由 式 〈7) 确定 : 


dJ lc dc dcr P dc 
7 GAP 7 0 7 Pp 
—E = eGap — + Efop — + 人 和 eT) 
Pal CGAP C rep Cp 


相应 于 自由 磷酸 的 弹性 系数 假定 是 很 小 ,因此 最 后 一 项 可 以 忽略 不 计 。 从 酶 动力 学 知识 可 
知 ， 相 应 于 6- 磷 酸 果糖 (假定 6- 磷 酸 果糖 和 6- 磷酸 葡萄 糖 一 起 组 成 一 个 共同 库 ) 的 弹性 系 
数 确 定 为 -0.08。dcfep/crep 这 一 项 并 不 是 很 大 ， 因 此 式 (7) 中 的 第 二 项 也 可 以 忽略 不 计 。 
这 就 允许 通过 测定 不 同 GAP 浓度 时 的 通 量 来 确定 相应 于 GAP 的 弹性 系数 。 最 后 已 知 葡萄 
糖 -6- 磷 酸 酶 所 催化 的 反应 在 远离 平衡 的 条 件 下 进行 ， 发 现 葡萄 糖 -6- 磷 酸 的 浓度 远 低 于 OK 
值 ， 因 此 在 所 有 条 件 下 的 弹性 系数 大 约 为 1。 

从 所 确定 的 弹性 系数 可 以 计算 通 量 控制 系数 ， 其 结果 汇总 于 表 11.3。 观 察 到 有 几 个 步 
又 反应 在 接近 平衡 条 件 下 进行 ，FCC 非常 低 。 然 而 ， 被 假定 处 于 平衡 状态 的 将 PEP 转化 为 
1,6- 二 磷酸 果糖 的 组 合 反应 有 相对 高 的 FCC ， 因 此 不 可 能 得 出 平衡 反应 不 能 表示 通 量 控制 这 
样 的 一 般 性 结论 。 最 高 的 FCC 是 对 丙酮 酸 羧 化 酶 反应 《注意 ， 这 一 步 也 有 最 低 的 弹性 系 

296 


数 )， 这 个 反应 当然 就 是 糖 异 生 的 一 个 关键 反应 。 然 而 ， 有 趣 的 是 ，PEP 羧 激酶 有 非常 低 的 
表 11.3 图 11.7 中 所 示 途 径 的 通 量 控制 系数 


1. 丙酮 酸 转 位 蛋白 
2. 丙酮 酸 羧 化 酶 6. Se BFR /PGM/GAPDH/3PK 0.29 
3. 草 酰 乙酸 的 运输 7. TIM/ 醛 缩 酶 /1L,6- 二 磷酸 果糖 酶 0.27 


4. 磷酸 烯 醇 丙酮 酸 羧 激酶 8. PGI/6- 磷 酸 葡萄 糖 酶 


注 :FCCs 是 流向 葡萄 糖 的 通 量 。 


FCC， 这 一 定 是 因为 此 反应 与 丙酮 酸 羧 化 酶 紧密 看 联 的 结果 ， 后 者 具有 高 的 通 量 控制 。 丙 酮 
酸 激酶 明显 有 一 个 负 的 FCC 值 ， 这 证 明了 分 支 途 径 中 有 负 的 FCCs 的 出 现 。 

Groen (1983, 1986) 也 确定 了 在 乳酸 浓度 不 高 的 条 件 下 (对 应 于 5 mmol/L) 的 
FCCs。 对 于 不 断 减 少 着 的 乳酸 浓度 ， 丙 酮 酸 羧 化 酶 的 FCC 值 进一步 上 升 (在 0.5 mmol/L 
乳酸 时 上 升 至 0.7$)。 当 添加 糖 异 生 途 径 的 刺激 物 一 一 胰 高 血糖 素 后 ， 存 在 着 通 量 控制 的 完 
全 转移 。 这 样 丙 酮 酸 激酶 表示 没有 通 量 控制 ， 丙 酮 酸 羧 化 酶 的 FCC 上 升 至 0.83。 此 外 ， 由 
PEP 到 1,6- 二 磷酸 果糖 的 转化 有 非常 低 的 FCC (0.003)， 由 1,6- 二 磷酸 果糖 到 葡萄 糖 的 进 
一 步 转化 反应 的 FCC 也 较 低 (0.03)， 其 它 反应 的 FCC 近似 一 样 。 因 此 ， 在 这 些 条 件 下 ， 
PEP 羧 激 酶 是 具有 第 二 个 最 大 的 FCC (0.08) 的 反应 步骤 。 

Groen (1983, 1986) 的 分 析 精 确 彻底 ， 而 且 如 前 所 述 ， 这 是 一 个 对 完整 途径 进行 分 
析 的 好 范例 。 但 是 他 们 确定 的 FCCs 值 ， 如 Ehlde (1995) 证 明 的 那样 ， 具 有 相当 高 的 标准 
偏差 ， 所 估计 FCCs 的 标准 偏差 在 50% 一 275% 的 范围 内 变化 ， 尤 其 对 于 小 的 FCCs， 标 准 
偏差 特别 高 。 但 即使 存在 这 些 高 标准 偏差 ， 它 仍然 可 以 清楚 地 表明 通 量 控制 主要 是 在 丙酮 酸 
羧 化 酶 。 

【 例 11.3】 氧化 磷酸 化 

Brand 及 其 同事 们 已 经 在 分 离 到 的 线粒体 中 分 析 了 氧化 磷酸 化 作用 的 控制 (Brand et al, 
1988; Brown et al, 1990b; Hafner et al, 1990)。 这 个 系统 由 三 个 反应 组 代表 ， 通 过 质子 动力 (the 
proton-motive force) Ap KA, WA 11.8 所 示 。 以 这 种 反应 分 组 ， 应 用 了 自 上 而 下 的 方法 。 注 
意 到 因为 质子 动力 是 三 个 反应 组 之 间 的 惟一 联系 ， 因 此 可 以 应 用 此 法 。 


磷酸 化 系统 


葡萄 糖 


ome + 


图 11.8 呼吸 作用 中 三 个 反应 组 的 略图 
琥珀 酸 是 呼吸 作用 的 底 物 ， 当 电子 通过 电子 传递 链 被 泵 出 线粒体 后 将 产生 一 个 质子 
HHA Ap ( 见 图 2.11)。 质 子 动力 可 以 促进 FuF, 一 一 ATPase 催化 产生 ATP, 
也 可 以 发 生 泄漏 。 为 了 再 生 ATPase 的 底 物 ADP， 加 入 了 己 糖 激酶 和 葡萄 糖 。 磷 酸化 作 
用 系统 也 包括 腺 味 吟 核 苷 酸 转 位 蛋白 ， 它 可 以 穿 过 线粒体 膜 运输 ATP 和 ADP 


297 


在 分 析 中 以 如 下 两 种 不 同方 式 对 质子 动力 进行 扰动 。 

@ 加 入 不 同 量 的 质子 解 耦 剂 ， 如 痰 基 握 化物 一 一 对 三 氟 甲 氧 基 茶 腕 (FCCD)， 它 可 以 
穿越 线粒体 膜 运 输 质子 。 

@ 加 入 两 二 酸 盐 ， 抑 制 呼吸 链 。 
由 此 ， 每 组 反应 相应 于 Az 的 弹性 系数 可 以 从 单调 节 法 实验 来 确定 ， 从 呼吸 通 量 -Azp 数据 的 
线性 回归 ， 对 质子 泄漏 和 非 磷 酸 氧化 条 件 下 呼吸 的 弹性 系数 就 可 估计 出 @: 


ek = —18.7; ee 人 Ce=7.9 (1) 
式 中 ， 上 标 resp 表示 呼吸 ; leak RANE. 
其 相应 的 FCCs 为 : td es 
CT - 0.30 (2) 


这 样 ， 在 这 些 条 件 下 ， 泄 漏 对 通 量 起 着 重要 的 控制 作用 ， 质 子 动力 的 移 除 比 质 子 动力 的 
产生 具有 更 大 的 通 量 控制 。 

在 对 这 个 完整 系统 的 分 析 中 ，Brown 等 (1990b) 利用 ATPase 的 抑制 剂 (9BR) 与 
FCCP 一 起 通过 抑制 剂 实验 确定 了 相应 于 Az 的 弹性 系数 和 饲养 细胞 (fed cells) 中 的 FCCs。 表 
11.4 总 结 了 他 们 的 分 析 结果 。 对 于 呼吸 通 量 ， 所 有 的 FCCs 是 正 的 ， 而 对 于 非 磷酸 化 作用 条 
件 ， 通 量 控制 主要 在 质子 动力 移 走 的 过 程 中 ， 而 磷酸 化 作用 具有 最 大 的 FCC， 这 与 Groen 等 
(1982) 的 发 现 是 一 致 的 ， 后 者 发 现 了 与 呼吸 作用 有 关 的 反应 步骤 有 低 的 FCCs〈 见 表 11.1). 
对 于 质子 泄漏 和 磷酸 化 作用 的 通 量 ， 由 它们 自己 的 步 又 ， 存 在 着 最 大 的 通 量 控制 ， 而 其 它 的 质 
子 动力 泄漏 步骤 有 一 个 负 的 FCC 值 。Brown 等 〈1990b) 对 饥饿 细胞 中 的 情况 也 进行 了 研究 ， 
发 现 了 非常 类 似 的 FCCs 值 ， 这 表明 先前 的 结论 对 于 这 个 系统 总 体 上 是 适用 的 。 

表 11.4 和 氧化 磷酸 化 作用 的 弹性 系数 和 FCCs 


= 10922021 
0.29+0.05 
0.42+0.03 
0.23+0.07 


4.69+0.78 
0.22+0.04 
0.87+0.01 
-—0.07£0.03 


2.77+1.03 

0.49+0.04 
—0.29+0.04 
0.84+0.05 


在 另 一 项 研究 中 ， 确 定 了 在 不 同 呼吸 速 率 下 通过 呼吸 途径 的 通 量 〈Hanfer F, 1990). 
在 低 呼吸 速率 下 ， 通 量 控制 主要 由 质子 泄漏 执行 ， 随 着 呼吸 速率 的 增加 ， 质 子 泄 漏 所 决定 的 
通 量 控制 降 到 一 个 非常 低 的 值 〈 几 乎 为 0) ， 而 磷酸 化 作用 的 通 量 控制 升 至 约 0.8。 当 呼吸 速 
率 非 常 高 时 ， 则 磷酸 化 的 通 量 控制 又 下 降 了 ， 通 量 控制 由 呼吸 作用 和 磷酸 化 作用 所 大 致 均 
分 。 类 似 地 ， 其 它 两 步 反 应 在 不 同 呼吸 速率 下 的 通 量 控制 也 被 确定 。 对 于 磷酸 化 通 量 ， 除 了 
在 呼吸 速率 非常 高 的 以 外 ， 磷 酸化 本 身 有 大 部 分 控制 。 在 呼吸 速率 非常 高 时 ， 对 磷酸 化 作用 
的 通 量 的 控制 几乎 由 呼吸 作用 和 磷酸 化 作用 所 均 分 。 然 而 ， 对 于 质子 泄漏 ， 情 况 要 更 复杂 一 
些 。 在 低 呼吸 速率 下 ， 通 量 控制 主要 在 泄露 反应 组 本 身 。 在 高 呼吸 速率 下 ， 泄 漏 反 应 对 于 本 
身 的 通 量 仍然 有 高 的 通 量 控制 ， 但 此 时 磷酸 化 作用 有 一 个 大 的 负 通 量 控制 〈 一 个 约 等 于 
-1.0 的 FCC 值 ) 和 呼吸 途径 的 大 通 量 控制 〈 一 个 约 等 于 1.0 的 FCC)。 这 证 明 在 分 支 途径 


@ Ehlde (1995) 分 析 了 Brand 等 (1988) 的 数据 ， 他 在 双 对 数 坐标 上 对 数据 进行 了 线性 回归 ， 给 出 对 实验 数据 的 
更 好 的 拟 合 。 从 分 析 中 他 得 出 sx 吕 = -12.9; e&=10.9。 相 应 的 FCCs 值 分 别 为 Cs =0.54; Csp=- 0.46， 这 和 式 (2) 
中 的 结果 是 很 不 同 的 。 


298 


二 


中 的 FCCs 值 有 一 种 比较 复杂 的 解释 ， 这 里 一 个 FCC 接近 于 1.0 并 不 意味 着 其 它 步 骤 就 没 
有 通 量 控制 作用 了 。 

前 已 提 及 ，Brand 及 其 同事 们 的 分 析 是 基于 将 氧化 磷酸 化 途径 中 的 各 个 单个 反应 步骤 汇 
总 为 三 个 反应 组 《通过 自 上 而 下 法 )。 如 果 想 得 到 关于 一 个 反应 组 中 单个 反应 的 更 多 信息 ， 
则 需要 一 个 更 详细 的 分 析 。 但 是 ， 常 常 有 可 能 得 出 关于 这 些 反 应 组 中 各 单个 步骤 所 做 贡献 的 
一 些 定性 结论 。 因 此 ， 组 FCCs 就 直接 给 出 了 各 单个 反应 的 信息 。 在 图 11.8 所 示 的 磷酸 化 
反应 组 中 ， 组 FCC 代表 着 来 自 ATPase 和 己 糖 激酶 二 者 的 贡献 。 由 于 己 糖 激酶 和 和 葡萄糖 一 
般 被 过 量 添 加 ， 对 己 糖 激酶 反应 的 FCC 可 能 是 低 的 ， 其 确实 是 由 Groen 等 〈1983) 在 他 们 
的 分 析 中 发 现 的 〈 见 表 11.1)。 这 样 ， 磷 酸化 反应 组 的 FCC 值 可 能 等 于 FoFi-ATPase 的 
FCC 值 。 


11.5 大 偏差 理论 


代谢 控制 分 析 的 一 个 中 心 规则 是 弹性 和 控制 系数 的 定义 。 实 际 上 ， 这 些 量 之 间 的 重要 的 
KA 〈 即 加 和 定理 和 连接 定理 ) 是 对 这 些 系数 定义 的 直接 结果 。 但 重要 的 是 要 认识 到 : 
MCA 的 系数 仅仅 定义 为 全 导 或 偏 导 的 形式 ， 这 样 只 能 通过 系统 变量 (RE, BHA 
量 ) 的 无 穷 小 变化 才 可 直接 测量 。 换 一 种 方法 ， 详 细 的 动力 学 模型 可 被 用 于 所 需 导 数 的 数学 
计算 ， 因 此 允许 借助 于 MCA 理论 来 计算 其 余 的 量 。 在 方 框 11.3 中 ， 讨 论 了 一 个 双重 的 难 
题 : 通过 实验 来 实现 一 个 小 的 扰动 ， 同 时 这 种 小 扰动 实验 又 最 低 限 度 地 被 实验 误差 所 变 坏 。 
现实 上， 只 有 当 一 个 系统 变量 的 变化 处 于 可 测量 国之 上 时 〈 因 此 ， 是 有 限度 的 )， 才 能 通过 
实验 对 这 种 变化 进行 定量 测量 。 由 于 扰动 越 大 实验 误差 就 越 小 ， 因 此 显然 企图 通过 大 的 系统 
扰动 来 估计 控制 系数 ， 当 然 条 件 是 这 样 的 : 计算 能 提供 控制 系数 的 精确 的 估计 。 直 到 最 近 ， 
还 没有 可 用 的 方法 将 有 限度 的 实验 结果 同 MCA 衍生 出 的 系数 联系 起 来 。 一 组 作为 对 MCA 
理论 的 扩展 延伸 而 产生 的 新 关系 (Small and Kacser, 1993a, b), MIFBARRAW KHER 
于 的 弹性 和 控制 系数 的 确定 。 这 一 节 中 将 详细 讨论 这 些 关 系 及 其 产生 的 影响 。 为 了 简便 起 
见 ， 从 一 个 没有 分 支 的 网 络 的 叙述 开始 讨论 ， 然 后 将 理论 延伸 到 分 支 代 谢 网 络 。 

11.5.1 未 分 支 的 网 络 

如 11.1.1 节 所 述 ， 当 途径 中 任何 特 
定 酶 活性 被 扩 增 时 ， 通 过 一 条 未 分 支 途 径 
的 通 量 将 增加 。 由 酶 活性 提高 所 达到 的 通 
量 扩 增 程度 依赖 于 初始 酶 活性 所 施加 的 控 
制程 度 ， 如 初始 酶 活性 处 的 FCC 所 定义 
( 见 图 11.1)。 

按照 一 个 特定 酶 的 通 量 控制 系数 的 定 
义 [ 式 (11.2)]， 可 以 从 该 酶 活性 的 无 限 
小 变化 ， 通 过 确定 相应 稳 态 条 件 下 的 通 量 - 
酶 活性 关系 曲线 (图 11.1) 的 切线 斜率 来 We 
得 到 FCCs。 显 然 酶 在 低 酶 活性 时 强烈 地 图 11.9 酶 活性 大 偏差 的 举例 
影响 通 量 ， 这 通过 较 大 的 FCC 来 反映 。 注意 到 斜率 AJMAE 与 原始 点 处 的 dE 不 同 ， 因 此 用 


AJ /AE 直接 代替 dJ AE 来 计算 通 量 控制 系数 
但 在 较 高 酶 活性 下 ， 酶 对 通 量 几 乎 没有 影 就 会 导致 不 正确 的 结果 


299 


响 ， 导 致 较 小 的 FCC。 应 该 注意 的 是 : FCC 的 不 同 数值 是 在 不 同 酶 活性 下 得 到 的 ， 因 为 斜 
率 是 在 如 图 11.1 所 示 的 通 量 - 酶 活性 关系 曲线 的 不 同 部 位 测量 的 。 

另 一 方面 ， 酶 活性 的 有 限 变 化 将 只 能 近似 于 初始 稳 态 点 通 量 - 酶 活性 曲线 的 斜率 ， 导 致 
不 精确 的 FCC 值 。 考 虑 如 图 11.9 所 示 的 酶 活性 发 生 大 变化 的 影响 。 显 然 ， 这 个 大 变化 的 斜 
率 〈 以 AJMAE 度量 ) ， 不 能 严格 近似 原始 点 处 的 dJ Md 开 。 因 此 ， 需 要 一 种 方法 促进 从 有 限 
扰动 实验 中 来 确定 真实 的 FCC 值 。 通 过 运用 Small 和 Kacser 的 大 偏差 理论 ， 解 决 了 这 个 看 
似 不 和 谐 的 问题 。 

大 偏差 理论 的 基础 

充分 描述 一 个 任意 的 通 量 - 酶 活性 之 间 的 关系 是 不 可 能 的 ， 因 为 其 一 般 非 常 复杂 ， 并 且 
高 度 非 线性 。 然 而 ， 项 蔡 定 义 最 简单 的 系统 是 有 益 的 ， 该 系统 产生 如 图 11.1 描述 的 所 期 望 
的 通 量 - 酶 活性 关系 。 因 此 Small 和 Kacser (1993a) 简化 了 计算 反应 速率 v 的 标准 公式 。 该 
反应 是 一 个 可 逆 的 将 Xi; 转化 为 Xi 的 单 分 子 酶 催化 反应 ， 它 的 速率 v 的 计算 如 下 式 : 


y= 一 一 一 一 一 一 (11.70) 


o=e| 总 | (11.71) 
其 中 


(11.72) 
a 


常数 (11.73) 


(01.73) 中 及。 是 米 氏 机 理 中 产物 生成 步骤 的 反应 速率 常数 ， 带 下 标 〈 指 i，7) 的 
BRK, 是 酶 - 底 物 复合 物 的 生成 - 解 离 反应 的 平衡 常数 。 在 下 列 条 件 下 ， 饱 和 函数 Rk, 是 常 
数 : (a) 当 ss1 时 ，ci 和 Km，c 科 Ka M (b) 当 由 于 所 观察 的 酶 活性 变化 时 ， 不 存在 
酶 的 饱和 度 相 应 于 其 底 物 的 显著 变化 。 通过 大 偏差 理论 对 为 数 众多 的 系统 的 应 用 ， 这 种 简化 
赁 经 验 表 明 ,， 在 广泛 范围 的 条 件 下 都 是 有 效 的 (Small and Kacser，1993a，b)。 如 果 式 
(11.71) 中 的 常数 被 进一步 组 合 ， 显 然 这 种 形式 等 价 于 一 个 可 逆 的 一 级 反应 : 


ie (11.74) 
现在 考虑 一 个 将 Xo HABA X,, 多 
Xo ° ee. X X3°" oe Xx, (14: 75) 


并 假定 在 此 串联 反应 步骤 中 每 一 步 的 反应 速率 由 类 似 于 式 (11.71) 的 方程 来 表示 ， 其 中 酶 
活性 和 由 酶 ; 所 催化 的 反应 的 平衡 常数 分 别 为 e 和 天 ;， 可 以 表明 ， 通 过 这 样 一 条 途径 的 通 
ft J FFs (Kacser and Burns, 1997): 


y= “g Ki:» 
7 2 Os a 
el aKY Kis Suk 


(11.76) 


300 


— ae eee ae 


其 中 
ee = TT th (11.77) 
i=1 
注意 ， 对 于 任意 酶 活性 来 说 ， 这 个 通 量 表达 式 都 是 非 线 性 的 。 实 际 上 , HK (11.76) 可 


”被 重新 整理 为 任意 酶 活性 E; 的 函数 ， 产 生 一 个 一 般 的 双 曲 线 关系 式 : 


(11.78) 


上 式 中 的 Xi 和 X2 对 于 每 种 酶 来 说 是 不 同 的 ， 但 总 是 仅仅 包含 具有 动力 学 常数 形式 的 常数 和 
固定 的 外 部 浓度 。 还 要 注意 ， 如 果 所 有 其 它 酶 的 活性 保持 不 变 ， 式 (11.78) 毫 不 意外 会 产 
生 一 个 像 图 11.1 所 示 那 样 形状 的 通 量 - 酶 活性 关系 曲线 ， 这 证 实 了 简化 的 动力 学 表达 式 
(11.71) 确实 符合 其 基本 的 准则 。 

通 量 控制 系数 估计 式 的 推导 

回想 发 展 一 个 大 偏差 理论 的 目的 是 将 浓度 和 通 量 的 有 限 变化 与 MCA 的 无 限 小 基准 相关 
联 。 记 住 这 一 点 ， 我 们 将 一 般 的 通 量 - 酶 活性 表达 式 (11.78) 运用 到 FCC 的 定义 式 (11.2) 
中 以 得 到 下 面 的 相应 于 酶 活性 的 通 量 J 的 控制 系数 方程 式 : 


1 
C= 11.79 
1+ E°X2 人 ) 


Hp, Fo 是 初始 稳 态 的 酶 活性 。 

现在 让 Et 表示 扰动 后 的 稳 态 的 酶 活性 ， 其 以 一 个 因子 > RRA Eo 的 变化 ， 
以 致 玉 =7E0%， 且 JJ 入 分 别 表 示 初 始 通 量 和 扰动 后 的 通 量 。 因 为 从 图 11.9 中 可 以 明显 
看 出 一 个 有 限 变化 的 斜率 不 能 替代 式 (11.2) 通 量 控制 系数 计算 中 的 导数 部 分 ， 因 此 必须 寻 
找 一 个 使 用 AJ/AE 的 新 的 表达 式 。 为 了 计算 AJMAE ， 从 原始 通 量 : 


0 
P= 5 Rae (11.80) 
转变 到 其 扰动 后 的 状态 ， 通 量 J’: 
0 
re (11.81) 


1+ rE%%X 
以 获得 图 11.9 中 大 偏差 的 斜率 : 
区 (11.82) 

通过 与 式 (11.79) 比较 ， 清 楚 看 出 ， 如 果 用 扰动 后 的 通 量 和 酶 活性 的 值 对 上 述 差分 进行 归 
一 化 〈 同 初始 态 相 对 比 ): 

EX. a 1+ rE°X2 

rr oe (11.83) 
它们 将 产生 一 个 归 一 化 的 斜率 的 表达 式 ， 虽 然 这 个 表达 式 是 从 有 限 差 分 中 导出 的 ， 但 其 等 同 
于 真实 的 通 量 控制 系数 : 
AJ , Ei 1 J 


‘AE <I > 146 
为 了 与 通 量 控制 系数 相 区 别 ，Small 和 Kacser (1993a) 将 新 系数 D! 称 为 偏差 指数 。 虽 然 如 
301 


(11.84) 


Ue, sh (11.84) 表明 : 对 于 任何 满足 上 述 所 讨论 条 件 的 非 分 支 途径 来 说 ， 偏 差 指数 都 提供 
了 对 它 的 相应 通 量 控制 系数 的 一 个 非常 接近 的 估计 。 更 重要 的 是 认识 到 : 即使 在 FCC 的 定 
义 表 达 式 (11.2) 中 用 的 是 初始 值 ， 但 在 式 〈11.84) 的 斜率 归 一 化 中 用 扰动 后 的 值 也 是 完 
全 正确 的 。 这 就 允许 用 图 11.9 所 示 的 通 量 - 酶 活性 关系 曲线 的 两 个 斜率 中 的 任何 一 个 都 能 精 
确 确定 通 量 控制 系数 。 

应 该 注意 偏差 指数 的 一 些 重要 的 性 质 。 第 一 ， 式 〈11.84) 中 的 偏差 指数 同 酶 活性 的 变 
化 因子 r 没有 任何 关系 。 结 果 是 ， 从 同一 稳 态 的 不 同 程度 的 变化 得 出 的 许多 偏差 指数 中 的 
每 一 个 都 应 当 等 于 初始 稳 态 的 通 量 控制 系数 。 如 果 做 了 不 止 一 个 扰动 实验 ， 这 就 提供 了 一 个 
对 FCC 测定 的 有 效 性 进行 内 部 检验 的 便利 方法 。 第 二 ， 由 于 式 (11.78) PA aN A 
活性 的 双 曲 型 关系 对 一 条 途径 完全 是 通用 的 ， 因 此 式 (11.84) 的 结果 可 以 应 用 于 该 途径 的 
任何 一 个 酶 〈 当 然 每 个 都 有 自己 的 参数 Xz)。 第 三 ， 一 条 线性 途径 中 所 有 酶 的 偏差 指数 之 和 
应 为 1， 这 如 同 通 量 控制 系数 一 样 。 在 一 个 反应 组 中 一 组 酶 的 偏差 指数 的 部 分 和 应 类 伏地 等 
于 这 组 酶 的 组 偏差 指数 。 第 四 ， 当 有 限 小 的 变化 AJMAE 接近 于 无 限 小 的 变化 时 ， 偏 差 指 数 
的 定义 就 与 通 量 控制 系数 的 定义 趋 于 一 致 ， 当 初 值 和 终 值 在 物理 上 和 数学 上 不 可 区 分 时 ， 和 斜 
率 就 接近 dJ/dE 了 。 


【 例 11.4】 从 大 偏差 确定 通 量 控制 系数 

Salter 等 〈1986) 研究 的 鼠 肝 脏 细胞 中 的 色 氨 酸 代谢 是 Small 和 Kacser (1993a) 在 介 
绍 大 偏差 理论 时 所 用 到 的 一 个 例子 。 这 个 代谢 被 认为 由 两 步 组 成 : 细胞 吸收 色 氨 酸 和 色 氢 酸 
2,3- 加 双 氧 酶 分 解 色 氨 酸 。 通 过 激素 诱导 ， 色 氨 酸 2,3- 加 双 氧 酶 的 活性 (Comex) 从 基准 态 的 
13.7pmol'g-! (FH#)-h 'F#2 101lpmol-g 1 (于 重 )'h :1。 这 条 途径 在 诱导 条 件 下 的 通 量 
由 基准 态 的 2.6pmol.g-1!L ( 干 重 )'h-! 升 至 7.8pmol'g | (FH) 'h !。 研 究 者 们 想 知 道 是 运输 
步骤 还 是 降解 步骤 是 控制 通过 基准 态 通 量 的 主要 因素 ， 并 想 估计 出 每 一 步 的 通 量 控制 系数 。 

依据 式 (11.84)， 这 条 途径 中 相应 于 色 氨 酸 2,3- 加 双 氧 酶 的 通 量 控制 系数 等 于 它 的 偏 
差 指数 。 这 个 数值 很 容易 从 所 提供 的 酶 活性 和 通 量 测量 来 确定 : 


et _ AJ . Et = Ties, 101 
cm = Dw = AE Gr = 401 13.7% 7.8 = 9-77 


根据 加 和 定理 ， 对 这 两 个 酶 的 通 量 控制 系数 之 和 必 为 1， 因此 运输 步骤 的 FCC 40.23. & 
然 ， 在 基准 态 时 降解 酶 是 主要 的 控制 步骤 (Salter 等 也 得 到 了 同样 的 结论 。 然 而 ， 如 果 不 是 
得 益 于 大 偏差 理论 ， 必 须 做 出 七 个 不 同 的 酶 活性 - 通 量 关系 图 ， 然 后 根据 曲线 切线 的 斜率 来 
估计 FCC). 

有 趣 的 是 ， 这 些 数据 也 解答 了 另外 一 个 问题 ， 即 在 诱导 状态 下 色 氢 酸 2,3- 加 双 氧 酶 的 
活性 仍然 是 控制 因素 吗 ? 通过 交换 在 先前 的 计算 中 用 到 的 基准 态 和 扰动 态 的 定义 ， 就 可 能 确 
定 在 诱导 状态 时 的 通 量 控制 系数 。 通 过 这 样 做， 确定 了 在 诱导 状态 下 色 氮 酸 2,3- 加 双 氧 酶 
的 FCC 实际 上 是 0.31， 运 输 步 又 的 FCC 是 0.69， 表 明 在 诱导 状态 下 色 氮 酸 的 吸收 是 途径 
通 量 的 主要 限制 。 


预测 通 量 的 变化 
在 上 一 节 中 , 证 明了 对 由 酶 活性 变化 引起 的 通 量变 化 的 测量 能 用 于 估计 通 量 控制 系数 。 
反 过 来 ， 如 果 给 出 了 合适 的 FCCs 值 ， 这 个 理论 也 提供 了 对 由 一 个 酶 活性 的 特定 变化 而 产生 
302 


的 新 的 通 量 进行 估计 的 方法 。 在 构筑 一 个 详尽 的 基因 工程 计划 之 前 ， 这 样 的 计算 在 确定 潜在 
的 遗传 改变 的 效果 时 是 有 的 。 简 单 地 说 ， 这 种 估算 只 需要 对 式 〈11.84) 进行 重 排 : 


= CJ = (11.85) 


式 (11.85) 的 无 因 次 表述 证 明 对 通 量 的 估计 是 更 方便 的 。 上 式 要 求 引 入 两 个 扩 增 因子 的 定 
义 来 表征 每 一 个 通 量变 化 和 酶 活性 变化 。 酶 活性 扩 增 因 了 于 〈AAF) 六 描述 了 酶 活性 瑟 ; 变化 


的 程度 。 
_E; 


ri Fo (11.86) 
通 量 扩 增 因 子 (FAF) f ERO Be SMe Ie. 
f= 5 (11.87) 


通过 引入 这 两 个 无 因 次 的 因子 之 后 ， 式 (11.85) 可 以 整理 为 下 面 的 形式 ， 以 便 从 初始 通 量 
和 通 量 扩 增 因子 来 确定 新 的 稳 态 下 的 预期 通 量 值 : 


下 (11.88) 
和 cl 于 *) 
上 式 可 以 整理 成 如 下 的 对 称 形 式 : 
= Ce (11.89) 


至 此 ， 只 考虑 了 单个 酶 的 扩 增 。 大 偏差 理论 也 适用 于 多 个 酶 的 活性 发 生变 化 的 情况 (Small 
and Kacser，1993a)。 在 这 种 情况 下 ， 不 同 的 活性 扩 增 因子 将 被 应 用 于 途径 中 ”个 酶 中 的 每 
一 个 酶 ， 而 且 通 量 的 变化 可 从 下 式 中 求 出 : 

= > [or (2 )] (11.90) 
wt, x (11.90) 对 于 ”个 酶 中 的 每 一 个 使 用 了 不 同 的 FCC 和 AAF。 虽 然 加 和 式 也 包括 
了 酶 活性 没有 发 生变 化 的 酶 ， 但 应 该 注意 的 是 没有 发 生变 化 的 酶 的 是 1， 加 和 式 中 多 了 一 
项 值 为 零 的 项 。 因 此 ， 代 表单 个 酶 关系 的 式 (11.89) 只 是 更 为 通用 的 式 (11.90) 的 一 个 特 
例 。 此 时 式 (11.90) 中 的 加 和 式 只 有 一 项 不 为 零 ， 其 余 的 盖 -1 项 都 为 零 。 


【 例 11.5】 由 酶 活性 变化 引起 的 通 量变 化 的 估计 

Salter 等 (1986) 在 他 们 对 鼠 肝 脏 细 胞 中 色 氨 酸 代谢 的 探索 研究 中 测量 了 色 氮 酸 2,3- 加 
双 氧 酶 的 几 种 浓度 水 平 (超出 例 11.4 所 讨论 的 ) 时 的 影响 。 有 两 个 实验 测 得 酶 活性 〈zwmax) 
分 别 是 30kmol'g !〈 干 重 )`h-1 和 58umol-g | (FH)h 1， 与 其 对 应 的 通 量 分 别 是 (4.6 
+0.35) pmol'g-1!( 干 重 )'h-1 和 (6.7+0.35) pmol'g 1L( 干 重 ).h- 1。 如 果 基 准 态 的 通 量 是 
2.6pmol'g-!( 干 重 ).h-1， 则 测 得 色 氨 酸 2,3- 加 双 氧 酶 的 酶 活性 为 13.7wmol.g-1!( 干 重 )， 
h 1，FCC 为 0.77。 那 么 ， 这 两 个 实验 的 结果 同 大 偶 差 理论 的 预测 相 一 致 吗 ? 

对 这 两 个 实验 的 第 一 个 来 说 ， 酶 活性 扩 增 因子 是 30/13.7 或 2.19。 用 式 (11.88) 计算 
出 的 该 实验 的 通 量 扩 增 因子 是 : 


1 
Sip eo ie ee 
- Cy (7) 1 -0.77x 4 ri 


YTD 


303 


将 基准 态 通 量 乘 以 通 量 扩 增 因子 后 ， 该 实验 预测 的 通 量 是 4.47umol,g-!L( 干 重 ) hol, 


同样 得 出 第 二 个 实验 的 预测 的 通 量 为 6.3lpmol'g !( 干 重 )'h-!。 由 于 这 两 个 预测 结果 没有 
一 个 远离 通 量 测 量 的 标准 偏差 ， 因 此 应 当 得 出 结论 : 这 些 结果 是 一 致 的 。 可 以 得 出 实验 的 结 
果 同 大 偏差 理论 的 预测 相 一 致 的 结论 。 


11.5.2 分支 网 络 

代谢 网 络 一 般 包 括 不 同 的 分 支点 ， 在 分 支点 处 ， 一 种 物质 S 与 可 以 被 两 条 不 同 的 途径 
所 利用 ， 如 图 11.10 所 示 。 实 际 上 ， 几 乎 任何 网 络 结构 都 可 以 通过 在 特定 的 分 支点 处 将 不 同 
的 未 分 支 途径 进行 连接 来 构建 ， 通 常 构成 许多 分 支 互相 编织 的 复杂 体 。 此 外 ， 一 些 网 络 可 能 
包括 收敛 性 的 分 支点 (convergent branch points) ， 在 此 处 S 由 两 条 途径 所 产生 而 被 一 条 途 
径 所 利用 。 由 于 在 式 (11.71) 所 做 的 线性 动力 学 的 简化 假定 ， 所 以 用 大 扰动 理论 来 对 一 个 
分 支点 进行 数学 处 理 在 功能 上 同 前 述 的 这 些 情况 中 的 任何 一 种 都 是 等 价 的 。 

就 像 线 性 途径 的 情况 一 样 ， 在 分 支 网 络 的 表达 式 中 ， 大 偏差 理论 假定 了 式 (11.71) HB 
样 的 线性 化 的 形式 。 因 此 ， 每 个 分 支 途径 都 能 用 一 个 一 级 可 逆 的 动力 学 表达 式 : 


vs=Ex(cs~ 2) (11.91) 


ve=Ec(es— x=} 


作为 这 些 线性 化 的 速率 表达 式 的 结果 ， 图 11.10 中 任何 分 支 途 

径 的 动力 学 都 将 具有 式 (11.91) 所 示 的 形式 〈 即 使 这 些 分 支 是 
a 由 多 个 步骤 和 (或 ) 子 分支 途 径 组 成 )。 类 似 地 ， 通 过 任何 子 分 
支 途径 的 通 量 也 必定 具有 同样 的 一 般 形 式 。 例 如 : 假定 分 支 途 
径 A 实际 上 是 一 条 包括 在 一 个 简单 的 未 分 支 途径 中 的 三 个 反 
应 。 如 前 所 表明 的 ， 通 过 这 条 途径 的 通 量 将 具有 表达 式 
(11.76) 所 示 的 形式 ， 其 具有 如 式 (11.91) 一 样 的 线性 化 的 形 
式 。 由 于 这 个 通 量 依赖 于 外 部 代谢 物 XA 和 分 支点 代谢 物 S 的 
浓度 ， 它 并 不 代表 分 支 网 络 中 通 量 的 一 个 解 ， 而 是 代替 地 定义 


图 11.10 一 个 简单 的 


分 支 网 络 举例 

每 一 个 分 支 途 径 由 一 个 简单 
的 步骤 、 一 系列 未 分 支 步骤 
R-KF AKA. 
个 分 支 途径 在 数学 上 表示 一 
个 单个 虚拟 反应 。 这 个 反应 
具有 式 (11.71) 所 示 的 线性 
化 的 动力 学 形式 ， 催 化 这 个 反 

应 的 酶 的 活性 为 已 ， 通 

过 这 个 反应 的 通 量 为 了 


304 


由 分 支 途径 A 所 代表 的 虚拟 反应 的 动力 学 。 实 际 上 ， 这 个 虚拟 
的 反应 代替 整个 分 支 途径 ， 把 各 个 单个 的 动力 学 常数 和 浓度 组 
合 进 式 (11.91) 中 的 常数 中 。 由 类 似 的 理由 ， 分 支 途径 B 和 C 
也 能 被 表示 为 图 11.10 所 示 形 式 的 虚拟 反应 ， 具 有 等 价 于 式 
(11.91) 的 动力 学 。 
为 了 从 式 11.91) 的 动力 学 确定 稳 态 通 量 ， 有 必要 借助 于 
围绕 分 支点 代谢 物 S 的 平衡 式 : 
Ja=JstJc (11.92) 
如 果 式 〈11.89) 中 的 每 一 个 速率 w 都 被 其 相应 的 稳 态 通 量 配 
Xt); PBR, Ws (11.91) 可 代入 式 (11.92) 中 ， 这 样 就 


可 以 以 动力 学 常数 和 外 部 浓度 的 形式 来 确定 中 间 物 S 的 浓度 和 通过 三 个 分 支 途 径 的 每 一 个 


的 通 量 。 随 后 Small 和 Kacser (1993b) 用 类 似 于 前 节 所 说 的 方法 从 这 些 表达 式 中 推导 出 偏 
差 指数 与 通 量 控制 系数 之 间 的 关系 。 由 于 推导 过 程 相当 的 了 见 长 ， 这 里 就 只 列 出 结果 。 
与 未 分 支 途径 的 分 析 结 果 形 成 对 照 ， 这 个 分 析 结 果 显 示 在 一 个 分 支 体系 中 的 偏差 指数 不 
是 必须 等 于 相应 的 通 量 控制 系数 。 如 果 一 个 酶 活性 E; RAS; He (r; 是 一 个 因子 ) Whe 
离 指数 对 于 通 量 败 〈 以 通 量 控制 系数 的 形式 ) 影响 的 一 般 表 达 式 是 : 
DO “7,RE 1A, B; C} (11.93) 
其 中 


Ft = ———1_____ eelA,B,C| (11.94) 
下 (CC vet 
这 样 ， 偏 差 系数 与 其 相应 的 FCC 不 同 〈 相 差 一 Se FY), F 不 仅 与 通 量 放大 因子 有 关 ， 
还 同 两 个 通 量 控制 系数 有 关 。 然 而 ， 注 意 到 如 果 ;= 有 & ( 即 已 测定 了 分 支 途径 的 活性 的 变化 
对 其 自身 通 量 的 影响 时 )， 玉 =1， 此 时 偏差 指数 等 同 于 通 量 控制 系数 。 因 此 ， 
EC ~ (11.95) 
这 个 结果 不 应 出 人 意料 ， 因 为 分 支 途径 ; 本 身 可 以 被 想像 为 一 个 单个 反应 步骤 或 者 是 一 条 未 
分 支 途径 ， 在 此 情况 下 酶 活性 扰动 和 通 量 测 量 二 者 都 发 生 在 一 个 单一 未 分 支 途径 中 。 因 此 ， 
只 要 分 支点 代谢 物 S 不 介入 被 扰动 的 酶 和 通 量 测量 点 之 中 ， 就 可 以 应 用 11.5.1 节 中 所 介绍 
的 分 析 方 法 。 

HR (11.93) 为 我 们 提供 了 一 种 将 偏差 指数 与 FCCs 相 联系 的 一 般 方法 ， 但 这 种 方 
法 还 是 有 点 烦琐 。 因 为 偏差 指数 可 以 用 在 式 〈11.86) 和 式 〈11.87) 中 分 别 介 绍 的 通 量 扩 增 
因子 和 酶 活性 扩 增 因子 来 表示 : 

=“ HK bt (11.96) 
所 以 式 (11.93) 本 (11.96) 来 代替 。 随 后 进行 整理 ， 在 相应 于 
分 支 写 的 一 个 活性 变化 的 三 个 FCCs 之 间 得 到 一 个 简单 直观 的 关系 式 (Stephanopoulos and 
Simpson, 1997): 


Koa = = eee eC (11.97) 
其 中 


Fee iy 7 € {A,B,C (11.98) 
(11.97) 揭示 了 分 支 途径 ; HTS S| Re), OR, fF -1, HS 
相应 的 控制 系数 Ch 成 比例 ; 此 外 ， 同 样 的 比例 性 也 适用 于 所 有 三 个 分 支 途径 中 的 通 量变 
化 。 这 个 比例 性 被 称 为 扰动 常数 氏 ;,， 可 从 受 扰 动 途径 的 AAF 和 FAF 来 计算 。 然 而 ， 要 记 
住 的 是 ， 这 个 常数 仅仅 反映 了 在 一 条 分 文 途 径 中 发 生 特定 扰动 的 结果 ， 而 不 同 的 扰动 将 产生 
不 同 的 扰动 常数 。 

预测 通 量 的 变化 

一 旦 知道 了 围绕 分 支点 代谢 物 的 一 条 或 多 条 途径 的 通 量 控 制 系数 ， 就 有 可 能 预测 某 种 扰 
动 对 系统 所 产生 的 影响 。 对 于 单一 分 文 途径 1 的 一 个 变化 〈 用 一 个 酶 活性 扩 增 因子 ~ 来 表 
征 这 种 变化 ) ， 对 所 有 三 个 分 支 预期 的 通 量 变化 可 以 以 FAFs 的 形式 来 确定 (Small and 

305 


or 


Kacser, 1993b). 
Ds 1 
hie él (a= = 1 k € {A,B,C} (11.99) 
ri 
注意 ， 这 个 结果 在 功能 上 等 同 于 式 〈11.88)， 因 此 可 整理 成 类 似 于 式 (11.89) 的 一 个 更 对 
称 的 形式 。 


Gok . r;—A 
2 a k € {A,B,C} (11.100) 


最 终 ， 给 出 了 这 些 结果 与 未 分 支 系统 的 严格 类 似 ， 则 在 多 分 支 途径 中 〈 分 别 由 >A，rB rc 
表征 ) 的 扰动 表达 式 同 式 (11.90) 严格 类 似 就 不 令 人 吃惊 了 : 


ae Pao pet R BC (11.101) 


浓度 控制 系数 和 浓度 变化 

因为 分 支点 代谢 物 的 浓度 S 是 在 先前 的 推导 过 程 中 确定 的 ， 因 此 就 有 可 能 用 大 偏差 理 
论 来 确定 浓度 控制 系数 和 利用 浓度 控制 系数 来 预测 一 个 特定 扰动 所 引起 的 浓度 变化 。 此 外 ， 
由 于 分 支 系统 和 非 分 支 系统 之 间 的 类 似 性 ，CCCs 可 以 用 这 种 方式 来 确定 : 即 不 仅 对 分 支点 
代谢 物 S 而 且 对 任何 中 间 代谢 物 Xij。 对 于 酶 (或 分 支 ) 的 活性 已; HH —T AES BEY 的 扰动 
来 说 ， 相 应 于 浓度 c; 变化 的 CCC 可 以 求 出 


r_— (9 Er Derahc + xi 
alegre a5 ania (11.102) 


如 果 将 这 个 表达 式 同 通 量 控制 系数 的 表达 式 (11.84) 相 比较 ， 两 个 有 趣 的 差别 是 立即 值得 
注意 的 : 式 (11.102) 不 仅 被 扰动 了 的 酶 活性 和 初始 代谢 物 浓度 所 归 一 化 ， 还 进一步 被 通过 
改变 了 的 酶 反应 步骤 的 扰动 了 的 通 量 与 初始 的 通 量 之 比 所 归 一 化 。 因 此 ， 浓 度 控制 系数 的 确 
定 不 仅 需要 对 浓度 和 酶 活性 的 变化 的 测量 ， 还 需要 对 通 量变 化 的 确定 。 然 而 ， 如 果 式 
(11.102) 中 变化 趋向 无 限 小 ， 该 式 就 变 为 传统 的 浓度 控制 系数 的 定义 式 。 

为 了 考虑 对 由 酶 活性 变化 所 引起 的 代谢 物 浓度 的 变化 的 预测 ， 将 式 〈11.102) 整理 成 一 
个 无 因 次 的 形式 是 有 用 的 。 为 此 ， 引 入 了 一 个 完全 类 似 于 通 量 扩 增 因子 的 一 个 新 量 一 一 代谢 
物 扩 增 因 子 (MAF) # 。 


r 


4 (11.103) 


5 


Gs 
对 于 一 个 单个 步骤 中 的 酶 活性 变化 ， 其 可 用 六 的 一 个 AAF 来 描述 ， 相 应 于 浓度 c; 变化 的 
MAF 可 用 下 式 来 预测 : 
= Sn 1 内 < 1 
ck (=) = (# - 1) [1 - Gila De, (11.104) 
正如 前 面 所 看 到 的 ， 单 个 酶 活性 的 扰动 是 一 种 特例 。 当 大 偏差 理论 替代 应 用 于 ”个 酶 活性 
改变 的 情况 (Small and Kacser, 1993b), MAF 可 用 下 式 来 计算 : 
y (o(tallae pM Fort Foret (11.105) 
要 记 住 式 (11.105) 中 对 于 ”个 酶 的 每 一 个 都 使 用 了 不 同 的 FCC、CCC 和 AAF 值 。 对 于 
一 个 分 支 网 络 ， 对 所 有 三 个 分 支 (A，B 和 C) 进行 加 和 和。 此 外 ， 尽 管 这 个 加 和 包括 了 酶 活 
306 


性 还 没 被 改变 的 任何 酶 ， 所 有 这 些 酶 的 六 1, BE BU AS 
11.5.3 ”对 营养 物 浓度 和 外 部 效应 物 变化 的 响应 

除了 描述 改变 酶 活性 后 的 影响 之 外 ， 大 偏差 理论 还 能 用 于 描述 由 于 外 部 营养 物 和 其 它 效 
应 物 浓度 变化 所 引起 的 通 量变 化 (Small and Kacser，1993a)。 任 何 这 样 的 效应 物 都 被 假定 
是 通过 诱导 一 个 或 多 个 酶 反应 速率 的 变换 而 起 作用 ， 其 进而 使 途径 中 的 稳 态 通 量 发 生变 化 。 
如 果 诱 导 的 酶 反应 速率 的 变化 可 以 知道 ， 那 么 就 可 以 依据 先前 介绍 的 程序 来 求 出 酶 活性 扩 增 
因子 〈 可 由 此 进一步 求 出 通 量 控制 系数 )。 另 一 方面 ， 如 果 并 不 知道 由 效应 物 所 引起 的 速率 
变化 ， 通 量变 化 就 可 以 通过 式 (11.7) 所 示 的 响应 系数 的 形式 来 表示 。 如 果 用 一 个 效应 物 弹 
性 来 描述 对 酶 E, 的 动力 学 影响 ,响应 系数 就 可 以 通过 式 (11.12) 来 表示 。 如 果 假 定 正 被 扰 
动 的 效应 物 Xo 是 一 条 未 分 支 途径 的 外 部 底 物 ， 则 初始 通 量 可 以 用 下 式 来 表示 : 

E9{ co 一 = 
jvs Flee (11.106) 


而 扰动 后 的 通 量 可 用 下 式 表示 
EY(xoee a aie 
1 + Ey, 


AP, xo 是 效应 物 Xo 的 浓度 co 的 变化 因子 〈 或 效应 物 扩 增 因 了 于 )。 将 式 〈11.106) 代 
和 人 响应 系数 的 定义 式 中 得 到 下 式 : 


j= (11.107) 


Rk =i (11.108) 
60 本 
为 了 将 这 个 结果 同 co 的 大 扰动 相 联 系 ， 由 式 (11.106) 和 式 (11.107) 确定 了 如 下 比值 : 
AJ Jz -J° EY 


Aco xoco — Co 1+ Ety, (11.109) 


Hees (11.108) 和 式 (11.109), RADA co/? 归 一 化 后 ， 就 可 确定 响应 系数 : 


A 
Rx, = ee 3 (11.110) 


此 外 ， 一 旦 对 已 改变 后 的 酶 的 通 量 控制 系数 和 反应 系数 都 可 知道 ， 就 可 以 从 式 (11.105) 中 
求 出 效应 物 弹 性 。 并 且 ， 由 效应 物 浓 度 变 化 导致 的 通 量变 化 可 以 通过 下 式 来 预测 : 
p-1- FGF Rk (x; - 1) (11.111) 


1 


虽然 在 这 个 论证 过 程 中 用 的 是 初始 底 物 的 浓度 变化 ， 但 是 式 〈11.110) 对 任何 外 部 底 物 或 产 
物 的 浓度 变化 都 是 通用 的 〈 这 种 变化 除了 通过 酶 活性 外 不 影响 酶 动力 学 )。 如 果 一 个 效应 物 
通过 改变 酶 的 浓度 、 催 化 活性 或 它 与 底 物 /产物 的 亲 和 性 来 对 酶 活性 产生 直接 的 影响 ， 利 用 
适当 的 动力 学 影响 来 代替 式 (11.107)， 本 节 的 分 析 就 可 替代 重复 。Small 和 Kacser 
(1993a) 推导 出 几 种 这 样 的 情况 的 一 些 结果 。 
11.5.4 讨论 

大 偏差 理论 是 一 种 强 有 力 的 工具 ， 它 将 代谢 控制 分 析 的 无 限 小 的 限制 扩展 到 实验 的 可 测 
量 领域 。 尽 管 如 此 ， 涉 及 该 理论 的 衍生 结果 的 一 些 最 后 的 评论 注释 依次 如 下 。 

第 一 ， 应 该 强调 : 前 面 的 公式 是 用 一 个 简化 的 一 级 动力 学 近似 式 推 导出 来 的 。 所 以 ， 用 

307 


这 些 公 式 来 分 析 一 个 具有 高 度 非 线性 特点 的 系统 就 可 能 导致 可 疑 的 结果 。Small and Kacser 
(1993b) 在 证 明 其 工作 合理 性 的 过 程 中 ， 用 了 几 个 非 线性 模型 来 检验 他 们 的 分 析 结 果 的 一 臻 
性 ， 结 果 表 明 这 种 一 致 性 很 好 。 尽 管 这 样 ， 一 致 性 检验 的 需要 也 不 能 被 过 分 强调 。 对 于 所 研 
究 的 酶 ， 通 过 用 两 个 或 更 多 个 不 同 的 酶 活性 扩 增 水 平 来 重复 一 个 FCC 计算 就 常 可 简单 地 进 
行 这 种 一 致 性 检验 。 而 且 ， 很 容易 确定 由 测量 的 不 确定 性 所 造成 的 对 FCC 计算 的 误差 
(Small and Kacser, 1993b). 

第 二 ， 虽 然 用 这 个 理论 所 推导 出 的 方程 在 表面 上 都 很 简单 ， 但 是 它们 并 不 具有 直观 性 。 
例如 ， 在 扩 增 或 减弱 酶 活性 所 造成 的 影响 中 存在 着 一 些 出 人 意料 的 结果 。 由 于 图 11.9 中 通 
量 - 酶 活性 关系 曲线 的 形状 ， 酶 活性 非常 小 的 降低 都 会 有 重大 的 影响 ， 而 很 大 的 酶 活性 增加 
可 能 被 需要 以 便 产 生 可 测量 的 通 量变 化 。 实 际 上 ， 酶 活性 降 为 零 等 于 废弃 一 条 未 分 支 途 径 。 
另 一 方面 ， 酶 活性 增 大 时 将 只 是 缓慢 地 达到 其 最 大 通 量 的 边界 线 。 

第 三 ， 即 最 后 一 点 ， 了 解 这 个 理论 适用 性 的 限制 性 是 很 关键 的 。 例 如 ， 预 期 将 任何 酶 活 
性 降 为 零 都 可 导致 对 应 于 该 酶 的 FCC 为 正 值 的 那些 通 量 降 为 零 。 尽 管 如 此 ， 如 果 所 减弱 的 
酶 处 于 一 个 分 支 途径 的 分 支 B， 只 要 分 支 C 的 酶 保持 一 些 活 性 ， 通 过 分 支 A 的 通 量 将 不 会 
被 降低 到 零 。 这 些 方程 也 能 预测 通过 不 可 逆反 应 的 负 浓 度 或 负 通 量 。 

因此 必须 像 分 析 任何 其 它 的 理论 一 样 ， 要 用 有 辨别 力 的 眼光 来 分 析 从 大 偏差 理论 中 得 出 
的 结论 。 常 识 应 该 能 帮助 我 们 辨别 什么 时 候 由 于 实验 误差 或 非 线 性 原因 ， 通 量 控制 系数 是 不 
可 靠 的 。 另 外 ， 下 一 章 将 更 深入 地 讨论 网 络 的 稳定 性 的 一 些 问题 ， 这 将 帮助 我 们 避免 在 预测 
上 产生 明显 的 不 一 致 性 。 在 下 一 章 还 将 介绍 一 种 适用 于 更 一 般 情况 的 分 支 途 径 ， 甚 至 是 更 复 
杂 的 网 络 中 的 通过 多 种 扰动 来 确定 通 量 控制 系数 的 方法 。 


BM 献 


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310 


第 12 章 代谢 网 络 的 结构 分 析 


在 上 一 章 中 ， 论 述 了 代谢 控制 分 析 的 基本 概念 及 其 关键 参数 确定 的 方法 。 注 意 到 ， 
MCA 以 控制 系数 的 形式 提供 了 由 代谢 网 络 中 每 个 反应 步骤 对 每 一 个 网 络 通 量 和 代谢 物 所 施 
加 的 控制 程度 。 实 际 上 ， 控 制 系数 提供 了 对 由 一 个 特定 反应 的 扰动 所 产生 影响 的 表征 ， 以 便 
能 够 预测 同一 反应 步骤 的 其 它 扰 动 所 产生 的 影响 。 在 第 11 章 中 所 介绍 的 方法 可 允许 依据 通 
量 的 估 测 来 确定 控制 系数 和 其 它 的 MCA 参数 ， 甚 至 是 在 代谢 网 络 的 动力 学 发 生 了 强烈 扰动 
的 情况 下 也 能 这 样 做 。 基 于 代谢 物 平 衡 、 反 应 计量 学 和 同位 素 标记 ， 在 第 8 章 至 第 10 章 提 
供 了 对 这 些 计算 所 需 通 量 估计 的 一 个 综合 性 方法 。 

在 本 章 中 ， 将 转向 更 具 挑 战 性 的 任务 : 分 析 比 在 第 11 章 讨论 的 简单 的 未 分 支 或 分 支 途 
径 更 复杂 的 代谢 网 络 中 的 通 量 控制 。 一 个 复杂 代谢 网 络 的 定义 为 : 一 个 含有 许多 酶 反应 的 系 
统 ， 这 些 反 应 产生 和 消耗 代谢 物 ， 并 通过 共同 的 前 体 物 、 产 物 或 效应 物 来 相互 影响 。 这 样 的 
网 络 通过 一 系列 反应 对 外 部 底 物 进行 加 工 ， 这 些 反 应 最 终 产生 一 种 或 多 种 所 希望 的 产物 ， 往 
往 还 要 与 不 需要 的 副 产 物 反应 竞争 。 在 本 章 和 下 一 章 中 ， 将 以 芳香 族 氨基 酸 的 生物 合成 途径 
( 见 图 12.1) 作为 实例 来 进行 研究 。 利 用 网 络 反 应 动力 学 模型 (Stephanopoulos and Simp- 
son，1997) ， 将 举例 说 明 这 些 方法 ， 它 们 能 对 这 个 系统 或 任何 类 似 的 复杂 系统 的 控制 结构 给 
出 实验 的 阐明 。 

本 章 和 下 一 章 的 目的 是 提供 一 般 的 和 系统 的 方法 来 用 于 以 下 的 目的 : 

@ 基 于 系统 的 化 学 计量 学 ， 以 可 辨认 的 分 支点 的 形式 来 定义 一 个 网 络 的 本 征 结构 ; 

© 根据 MCA 参数 来 分 析 复 杂 代 谢 网 络 的 动力 学 特性 ; 

@ 识别 关键 反应 和 分 支点 ; 

@ 通 过 增强 或 减弱 关键 反应 来 对 目的 通 量 的 扩 增 进行 优化 。 

本 书 将 首先 对 每 个 方法 提供 一 个 一 般 描 述 ， 接 下 去 用 实例 研究 进行 举例 说 明 ， 该 实例 是 
面包 酵母 中 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 途径 的 动力 学 模型 。 要 记 住 的 是 ， 基 于 Galazzo 和 Bailey 
(1990, 1991) 的 工作 所 提出 的 这 种 模型 仅仅 是 一 个 为 了 举例 目的 而 用 的 代表 细胞 ， 本 书 并 
不 打算 精确 地 描绘 面包 酵母 (Sacchnaromzyces cerevisiae) 的 功能 活动 。 因 此 ， 在 本 章 中 获得 
的 结论 可 能 适用 于 或 可 能 不 适用 于 实际 的 生产 菌株 。 这 里 的 目的 不 是 对 生物 实体 进行 模拟 ， 
而 宁可 说 是 利用 一 个 系统 ， 该 系统 展示 代表 实际 生物 系统 的 调节 机 制 、 严 密 控 制 机制 和 反馈 
机 制 的 许多 方面 ， 为 分 析 这 样 的 系统 探索 各 种 不 同 的 方法 。 从 代表 性 细胞 的 分 析 所 获得 的 经 
验 教训 可 以 形成 对 实际 生物 体系 进行 系统 实验 研究 的 基础 。 

由 于 存在 分 支 是 复杂 系统 所 共有 的 最 简单 的 特征 ， 因 此 对 复杂 系统 的 讨论 从 分 支 代 谢 途 
径 研 究 开 始 。 由 于 每 一 个 分 支点 的 存在 都 增加 了 一 个 网 络 的 复杂 程度 ， 因 此 如 下 两 点 很 重 
要 : (a) 确定 整个 网 络 通 量 控制 中 的 重要 分 支点 ，(b) 理解 在 分 支点 处 的 通 量 控制 分 布 并 提 
供 测量 这 种 控制 的 综合 性 方法 。 

在 上 述 的 介绍 之 后 ， 下 面 将 完全 集中 在 分 析 复 杂 网 络 的 方法 上 来 。 对 于 大 的 生物 合成 网 
络 来 说 ， 要 想 确 定 每 一 个 单个 反应 对 通 量 的 影响 是 不 切实 际 的 ， 认 识 到 这 一 点 是 很 重要 的 。 
一 个 更 有 效 的 方法 是 将 反应 分 组 并 研究 每 一 个 反应 组 对 整个 代谢 途径 通 量 控制 的 影响 。 这 也 

311 


@ ATP} 
Gle 消耗 
° | ? 乙醇 CO, Ze | 8 
Pol : 
— G6P. 
FDP vals 
yy , 
5 
GAP PEP 
|’ 
甘油 


ATP ADP 


Phe Tyr 


图 12.1 芳香 族 氢 基 酸 的 生物 合成 网 络 
在 Saccharomyces cerevisiae 中 参与 芳香 族 氨基 酸 的 生物 合成 的 关键 反应 包括 自由 能 的 生成 。 处 于 稳 态 的 
内 部 代谢 物 ( 见 12.2.2 节 ) 用 大 字体 表示 。 各 反应 〈 用 数字 代表 ) 可 以 包括 一 个 或 多 个 协调 的 酶 催化 
步骤 。 将 FDP 变 为 GAP 的 反应 接近 平衡 ， 其 净 反 应 速率 和 反应 4 的 净 速 率 一 样 。 缩 写 符号 的 意义 如 下 : 
CHR 一 分 支 酸 ; DAHP 一 3- 脱 氧 -D- 阿 拉 伯 型 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 ; FEDP 一 1,6- 二 磷酸 果糖 ; 
G6P 一 6- 磷 酸 -葡萄 糖 ; GAP 一 3- 磷 酸 甘 油 醛 ; Glc 一 葡萄 糖 ; PEP 一 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 ; 
Phe—#A ARM; PPH—M#EM; Pol—#H; Trp—fAR; Tyr-BAR 
是 前 面 提 及 的 自 上 而 下 法 的 实质 。 这 一 章 为 将 自 上 而 下 法 应 用 到 真实 网 络 中 提供 了 一 种 系统 
的 程序 步 又。 虽然 总 体 构思 相当 简单 ， 但 执行 步骤 可 能 变 得 很 复杂 。 因 此 对 单个 步骤 有 关 的 
过 程 的 目的 保持 一 个 清晰 的 认识 是 很 重要 的 ， 简 述 如 下 。 

(1) 第 一 步 是 建立 对 反应 和 途径 进行 分 组 的 规则 。 这 对 简单 的 反应 体系 是 直截了当 的 ， 
但 是 随 着 网 络 的 大 小 和 复杂 性 的 增加 ， 就 变 得 不 那么 清楚 了 。 在 12.2 节 中 ， 提 供 系 统 地 对 
反应 进行 分 组 和 识别 网 络 中 关键 分 支点 的 方法 论 。 在 12.3 节 中 用 氨基 酸 实例 示范 证 明 进 行 
反应 分 组 的 方法 。 

(2) 组 通 量 控制 系数 (gFCCs) 为 我 们 提供 了 一 组 反应 对 途径 通 量 影响 的 一 种 度量 
标准 。 在 下 一 章 的 第 2 节 (13.2) 中 介绍 基于 每 一 组 中 的 战略 扰动 和 通 量 测量 的 gFCCs 
的 确定 方法 。 可 以 以 两 种 方式 来 利用 gFCCs: 第 一 ， 通 过 比较 不 同 gFCCs 的 大 小 有 可 
能 确定 单个 的 通 量 控制 系数 ， 从 而 准确 找 出 对 目的 通 量 施 加 强烈 影响 的 反应 ; 第 二 , 通 
过 连续 的 分 组 和 分 析 ，gFCCs 允许 通 量 控 制 被 限于 很 少 的 反应 中 。 这 些 都 将 在 13.4 节 中 
讨论 。 

(3) 基于 自 上 而 下 MCA 和 反应 分 组 的 结果 ， 在 13.5 节 中 详细 介绍 对 目的 通 量 的 优化 。 

312 


在 优化 的 过 程 中 ， 很 显然 一 般 不 可 能 对 生物 合成 网 络 中 的 任何 反应 的 速率 进行 任意 增 大 。 存 
在 着 中 间 代 谢 物 浓 度 可 人 允许 的 变化 范围 的 限制 。 与 这 些 限 制 相 联系 ， 作 为 一 个 同等 重要 的 参 
数 ， 产 生 组 浓度 控制 系数 〈《gCCCs) ， 其 为 动力 学 变化 对 代谢 物 水 平 的 影响 提供 了 度量 标准 。 
由 于 代谢 物 水 平 的 过 度 变 化 能 够 影响 网 络 的 稳定 性 ， 因 此 希望 把 它们 维持 在 正常 的 稳定 值 附 
近 。 这 意味 着 通过 在 强烈 希望 通 量 大 幅 增加 与 所 允许 的 有 限 的 代谢 物 浓 度 变 化 这 一 约束 条 件 
之 间 实 行 平 衡 ， 将 得 到 最 优 的 通 量 扩 增 。 

(4) 分 析 的 最 后 一 节 〈13.6 节 ) 考虑 实验 误差 对 结果 的 影响 ， 更 重要 的 是 ， 介 绍 了 检 
验 所 用 框架 体系 所 固有 假定 的 有 效 性 的 方法 。 为 此 目的 ， 提 供 了 内 部 一 致 性 检验 以 确保 所 得 
到 的 结果 没有 违反 这 些 关 键 性 假定 。 


12.1 在 单一 分 支点 处 通 量 分 布 的 控制 


在 讨论 复杂 体系 的 性 质 之 前 ， 深 入 了 解 一 下 单一 分 支点 的 功能 职责 是 有 益 的 。 虽 然 此 分 
析 仅 仅 包括 三 个 反应 的 动力 学 相互 作用 ， 但 它 提 供 了 对 更 复杂 系 
统 的 功能 作用 的 洞察 力 。 在 此 讨论 中 出 现 的 重要 概念 包括 分 支点 
的 通 量 分 布 的 柔性 〈 见 第 5 章 、 第 10 章 )、 在 三 个 分 支 途径 中 的 Js 
通 量 控制 的 分 布 和 由 连接 代谢 物 浓 度 的 极端 水 平 所 引起 的 代谢 不 
稳定 的 可 能 性 。 在 本 章 中 用 一 个 详尽 的 动力 学 分 析 来 解释 这 些 问 X 


题 。 通 过 应 用 MCA 概念 和 研究 作为 该 反应 弹性 的 函数 的 通 量 控 Va Xe 
B C 


SA 


制 系数 的 性 质 [如 11.4 sh (11.68) 和 式 (11.69) Pra], th 

能 得 到 同样 的 结论 。 这 一 节 中 的 分 析 将 应 用 到 图 12.2 所 示 的 简 ss Sc 

单 分 支点 ， 这 个 途径 包括 三 个 反应 : A，B 和 C。 由 反应 人 产生 gf 

的 连接 代谢 物 X 可 被 反应 B 或 反应 C 利用 ， 它 可 以 独立 地 改动 。 a 

然而 ， 在 稳 态 下 ， 通 过 反应 A 的 通 量 必须 等 于 通过 反应 BAR 分 支点 代谢 物 X 由 反应 A 生 成 ， 

应 C AY MGB EE. Hh BLM B RIL CINFE, Sa. Sp 
虽然 在 如 图 12.2 BAR = 4+ A 2 Re ene a 

学 形式 ， 但 在 这 里 采用 了 标准 的 Michaelis-Menten 动力 学 方程 。 

这 样 ， 对 于 一 个 将 S 转化 为 下 的 反应 ， 其 反应 速率 可 以 用 下 式 表示 : 

cB pti 
a ae eee . (12.1) 


AP, cs 是 底 物 的 浓度 ; cp 是 产物 的 浓度 ， 剩 下 的 参数 是 特定 反应 的 动力 学 常数 CE 
负 )。 式 〈12.1) 表示 了 三 个 反应 中 每 一 个 反应 的 净 反 应 速率 ， 正 值 表 示 由 SA 转化 到 Sp 和 
Sc 的 方向 。 和 连接 代谢 物 X 的 浓度 一 样 ， 分 支点 处 的 柔性 和 通 量 在 两 条 相互 竞争 的 分 支 途 
径 中 的 分 布 取决 于 三 个 反应 的 动力 学 曲线 的 共同 控制 。 因 此 将 考虑 在 其 它 代 谢 物 浓度 和 参数 
都 固定 不 变 时 ， 分 支点 代谢 物 X 的 浓度 变化 对 速率 的 影响 。 此 时 ， 上 游 反 应 A 的 动力 学 有 
以 下 的 形式 : 


U 


1-k, CX 
VAS Umax,eff, aps (12.2) 
每 一 个 下 游 反应 的 动力 学 有 以 下 的 形式 : 
2 : 、 
Ui — Umax,eff, cxt ko, i€ {B,C} (12.3) 


313 


式 中 对 一 特定 反应 的 三 个 参数 Ri kr 和 umax, ef 均 是 所 固定 的 动力 学 参数 和 A 、B、C 
的 浓度 的 一 个 复合 式 。 应 注意 到 这 些 数 值 在 上 述 三 个 反应 速率 中 是 不 同 的 ， 此 外 ， 每 一 个 参 
数 都 不 是 负 值 ， 正 如 实际 的 动力 学 常数 一 样 〈 这 些 参 数 正 是 从 实际 的 动力 学 常数 导出 的 )。 
如 果 这 些 参数 的 每 一 个 都 不 为 零 ， 则 式 (12.2) 和 式 (12.3) 具有 双 曲 线 的 形式 ， 如 图 
12.3 所 示 。 对 于 每 一 个 方程 ， 正 反应 速率 由 最 大 有 效 速 率 wmax, sff 所 限制 。 当 X 的 浓度 增加 
(对 上 游 分 支 反 应 ) 或 减 小 时 (对 下 游 分 支 反 应 ) ， 反 应 速率 下 降 ， 最 终 达 到 逆反 应 的 最 大 速 
率 (ki/k2) Umax, effe 如 果 Al 和 (或 ) 2. 为 零 ， 这 些 曲线 将 具有 不 同 的 形式 ， 也 如 图 12.3 
所 示 。 在 下 面 的 讨论 中 ， 假 定 每 一 个 速率 方程 都 具有 完全 的 双 曲 线形 式 。 


图 12.3 反应 速率 和 连接 代谢 物 浓 度 的 关系 
(a) 上 游 分 支 途径 A 的 速率 (b) 下 游 一 个 分 支 途径 〈B 或 C) 的 速率 。 图 中 曲线 分 布 
根据 式 〈12.2) 和 式 (12.3) 画 出 。 虚 线 代表 所 指出 的 参数 值 固定 为 堆 的 情况 
在 每 一 个 分 支点 ， 为 了 利用 上 游 分 支 途径 所 产生 的 连接 代谢 物 X, EPA KZA 
着 竞争 。 为 了 能 够 将 这 些 概 念 扩展 到 复杂 网 络 的 控制 中 ， 正 确 理解 发 生 在 一 个 分 支点 的 稳 态 
操作 情况 下 的 竞争 及 因而 围绕 分 支点 的 控制 分 
布 的 复杂 后 果 是 很 重要 的 。 
一 个 分 支点 的 重要 特点 是 它 的 通 量 分 布 ， 
即 两 个 下 游 反应 之 间 的 通 量 比 。 一 般 说 来 ， 通 
量 的 分 布 强烈 地 依赖 于 连接 代谢 物 的 浓度 。 例 
如 ， 考 虑 具有 如 图 12.4 所 示 的 典型 反应 曲线 
的 两 个 下 游 反 应 (BAC). WFR X Ae BEE 
图 12.4 围绕 分 支点 的 三 个 反应 的 速率 平衡 ” 常 高 (cl1)， 则 两 个 反应 都 将 处 于 它们 的 有 效 
0。 全 的 人 化 
的 刚性 取决 于 稳 态 浓度 时 每 条 曲线 的 斜率 手 都 没有 影响 。 也 就 是 说 ， 这 些 反应 每 一 个 对 
cx 的 弹性 几乎 为 零 。 这 意味 着 在 分 支 途径 B 
和 C 之 间 的 通 量 分 布 也 就 固定 了 ， 这 时 的 分 支点 被 定义 为 刚性 分 支点 。 另 一 种 产生 刚性 分 
支点 的 情况 是 cx 的 变化 导致 B 和 C 的 速率 几乎 按 相 同比 例 变化 ， 因 此 通 量 分 布 仍 保持 不 
变 。 也 就 是 说 ， 每 个 反应 对 X 增 量 的 竞争 大 致 是 相等 的 ， 并 导致 相近 的 通 量 比 。 另 一 方面 ， 
如 果 X 的 浓度 为 cx，cx 的 一 个 小 变化 将 导致 C 反应 速率 的 变化 比 也 反应 速率 的 变化 大 得 
多 。 在 这 种 条 件 下 ， 两 个 反应 相应 于 cx 的 弹性 是 不 同 的 ， 此 时 的 分 支点 被 定义 为 柔性 分 支 
点 。 实 质 上 ， 反 应 C 比 反 应 也 能 对 新 增加 的 X 更 有 效 地 竞争 。 
要 注意 : 由 于 在 稳 态 浓度 下 ，B 和 C 的 反应 速率 之 和 必然 等 于 A 反应 的 速率 ， 因 此 连 
接 代谢 物 的 稳 态 浓度 实际 上 依赖 于 三 个 反应 的 动力 学 。 相 应 地 ， 如 果 反 应 A 的 有 效 速 率 被 
314 


诱导 而 改变 〈 例 如 : 通过 改变 SA 的 浓度 或 增 大 酶 A 的 活性 ) cx 将 变化 达到 一 个 不 同 的 稳 
态 水 平 ， 导 致 在 三 个 分 支 途径 中 的 通 量 发 生变 化 。 分 支点 的 刚性 或 柔性 对 通 量 分 布 所 以 变化 
的 趋势 提供 了 一 个 定性 的 解释 。 此 外 ， 利 用 下 游 反应 相对 于 连接 代谢 物 水 平 的 弹性 比 能 够 量 
化 通 量 分 布 的 这 种 组 合 变换 。 

图 12.4 中 的 速率 曲线 也 为 理解 围绕 分 支点 的 通 量 控制 提供 了 基础 。 三 个 反应 中 每 一 个 
本 征 动力 学 的 任何 变化 都 将 由 图 12.4 中 该 速率 曲线 的 变换 来 表示 。 所 产生 的 通 量变 换 的 大 
小 表明 受到 扰动 的 反应 施加 到 每 个 分 支 途径 的 控制 程度 。 例 如 : 考虑 分 支 A 的 速率 变化 ， 
其 会 通过 X 的 稳 态 浓度 的 变化 而 被 传送 到 其 它 的 分 支 途径 。 对 于 一 个 刚性 分 支点 ， 每 一 条 
分 支 途径 的 通 量 将 几乎 按照 同一 比例 变化 。 因 此 对 于 这 样 一 个 变化 来 说 ， 它 对 三 个 反应 的 通 
量 控制 系数 几乎 是 相等 的 。 而 且 ， 如 果 反 应 B 和 反应 C 的 速率 都 接近 于 它们 的 最 大 有 效 反 
应 速率 ， 对 于 所 有 三 个 反应 来 说 ， 分 支 A 中 的 任何 变化 的 FCC 值 将 几乎 均 为 零 。 但 是 浓度 
控制 系数 C 导 可 能 具有 一 个 非常 大 的 正 值 。 另 一 方面 ， 对 于 一 个 柔性 分 支点 ， 反 应 A 的 变化 
将 导致 一 个 下 游 分 支 途径 的 变化 比 另 一 个 大 得 多 。 因 此 ， 在 图 12.4 中 ,初始 浓度 cz 处 ， 反 
应 A 活性 的 很 小 下 降 将 导致 X 的 稳 态 浓度 的 下 降 ， 结 果 反 应 C 中 的 通 量 比 反应 B 中 的 通 量 
下 降 大 得 多 。 确 实 ， 如 果 X 的 稳 态 浓度 降 至 cs 以 下 ， 反 应 C 甚至 可 能 改变 反应 方向 〈 假 定 
Sc 的 供应 保持 不 变 )。 在 这 种 情况 下 ， 浓 度 控制 系数 C 民 要 比 刚性 分 支点 的 情况 具有 较 小 的 
值 ， 这 反映 了 连接 代谢 物 浓度 的 一 个 较 小 的 变化 。 

下 游 分 支 所 施加 的 控制 也 能 用 图 12.4 类 似 地 想像 。 首 先 考虑 在 初始 稳 态 浓度 cl 时 反应 
了 活性 的 增加 。 这 会 有 效 地 使 反应 B 的 曲线 向 上 变化 。 在 这 种 情况 下 ， 由 于 反应 C 的 速率 
已 经 达到 了 稳定 状态 ， 因 此 ， 由 于 X 的 稳 态 浓度 的 下 降 所 引起 的 通过 反应 C 的 通 量 仅 有 少 
许 减 少 。 但 是 ， 通 过 反应 A 和 反应 B 的 通 量 都 将 增加 几乎 相同 的 量 。 因 此 这 样 一 个 变化 对 
反应 C 的 通 量 控制 系数 Cl BAA MED, CEA C 人 具有 相当 大 的 正 值 。 由 于 
通过 反应 B 的 通 量 的 增加 比 通过 反应 A 的 通 量 的 增加 代表 了 相当 大 的 比例 ， 因 此 Ca 要 比 
CA 大 得 多 ， 但 一 般 小 于 1。 浓 度 控 制 系数 Ch 也 将 具有 相当 大 的 负 值 。 

另 一 方面 ， 如 果 分 支点 是 柔性 的 〈 也 就 是 当初 始 稳 态 浓度 为 图 12.4 所 示 的 co 时 的 情 
况 ) ， 则 发 生 竞争 的 反应 速率 曲线 将 会 相对 很 陡 。 在 这 种 情况 下 ， 反 应 B 活性 的 增加 ( 即 B 
的 反应 曲线 向 上 变化 ) 将 增加 反应 也 的 通 量 ， 同 时 伴随 X 的 浓度 下 降 和 反应 C 通 量 的 大 幅 
降低 。 并 且 通 过 反应 A 的 通 量 将 会 适量 增加 ， 而 通过 反应 B 的 通 量 将 大 幅 增加 。 实 际 上 ， 
这 种 活性 变化 主要 引起 通 量 由 反应 C 转向 反应 B。 因 此 ，Cyc 将 具有 一 个 很 大 的 负 值 ，Ce 
具有 一 个 大 的 正 值 ，Cif 具有 一 个 小 的 正 值 。 最 后 ， 由 于 X 的 浓度 在 一 个 柔性 分 支点 比 在 一 
个 刚性 分 支点 变化 得 更 少 ， 浓 度 控制 系数 CX 也 将 具有 小 的 负 值 。 

虽然 当 曲线 具有 不 同 的 形式 时 可 能 发 生 另 外 的 情况 ， 但 这 些 例子 是 典型 分 支点 的 代表 ， 
并 为 我 们 理解 更 复杂 的 网 络 葛 定 了 基础 。 然 而 ， 在 一 个 具有 多 个 分 支点 的 复杂 网 络 中 ， 这 些 
分 支点 之 间 存 在 一 定数 量 的 反馈 作用 。 在 这 种 情况 下 ， 网 络 中 特定 部 分 的 活性 变化 的 影响 不 
易 通过 图 形 来 说 明 。 在 本 章 的 剩余 部 分 和 下 一 章 中 ， 将 用 数学 方法 来 对 与 围绕 单一 分 支点 的 
控制 相 类 似 的 复杂 网 络 中 的 控制 进行 分 析 。 

最 后 应 该 注意 的 是 ， 围 绕 一 个 分 支点 可 能 存在 某 些 条 件 ， 它 们 限制 着 可 允许 的 活性 变 
化 。 尤 其 是 ， 在 一 个 刚性 分 支点 中 ， 上 游 分 支 途径 的 活性 增加 可 能 导致 连接 代谢 物 浓度 陡然 
地 增加 ， 而 没有 显著 改变 下 游 途径 中 的 通 量 。 在 图 12.4 中 的 浓度 为 cl 时 情况 就 真 的 是 这 

315 


样 ， 这 是 由 于 此 时 反应 B 和 反应 C 的 速率 曲线 都 已 接近 它们 对 应 的 最 大 值 。 而 且 ， 如 果 反 
应 A 的 速率 曲线 与 反应 B 和 反应 C 的 速率 之 和 的 曲线 根本 不 相交 ， 对 于 连接 代谢 物 的 浓度 
来 说 将 没有 稳 态 平衡 的 实数 解 。 这 种 情况 代表 了 一 类 代谢 不 稳定 性 ， 在 此 情况 下 实际 代谢 物 
的 水 平 可 能 下 降 为 零 ， 也 可 能 达到 产生 毒性 的 水 平 ， 或 者 诱导 出 利用 它 的 替换 代谢 途径 。 因 
为 其 结果 具有 不 可 预测 性 ， 而 且 可 能 对 细胞 本 身 有 害 ， 所 以 在 实际 中 这 种 代谢 的 不 稳定 性 最 
好 能 够 避免 。 在 13.5 节 ， 将 详细 考虑 这 样 的 代谢 不 稳定 性 的 复杂 后 果 。 


12.2 反应 分 组 


正如 上 一 章 所 讨论 的 ， 代 谢 控制 分 析 传 统 上 已 被 涉及 各 单个 反应 对 网 络 通 量 的 影响 的 确 
定 。 所 以 ， 确 定 控制 系数 的 常用 方法 都 基于 扰动 单个 酶 的 动力 学 ， 并 测量 这 种 动力 学 扰动 对 
通 量 的 影响 。 这 种 自 下 而 上 的 方法 (其 中 每 一 个 步骤 是 依次 研究 的 ) 在 对 简单 途径 或 具有 少 
量 步 又 牵 连 于 代谢 控制 的 途径 这 种 涉及 上 下 前 后 关系 的 研究 中 是 很 有 用 的 。 但 是 ， 对 于 复杂 
的 代谢 途径 ， 训 不 夸张 地 说 ， 其 可 能 包括 数 百 种 不 同 的 酶 反应 和 运输 步 又， 其 中 许多 步骤 对 
通 量 施加 很 小 的 控制 或 没有 施加 控制 ， 因 此 这 种 标准 的 方法 就 变 得 不 切实 际 了 。 自 上 而 下 控 
制 分 析 法 (TDCA， 见 11.2.2 节 ) 作为 一 种 替代 的 方法 而 得 到 发 展 。TDCA 的 主要 原则 是 
将 重点 放 在 反应 组 而 不 是 单个 的 反应 步骤 上 。 随 着 对 不 同 反应 组 的 评估 ， 最 后 汇聚 到 对 整个 
网 络 的 动力 学 控制 施加 主要 控制 的 单个 反应 或 反应 组 上 。 这 种 方法 论 对 于 考虑 在 代谢 网 络 中 
通常 存在 大 量 反 应 的 情况 是 很 必要 的 。 

严格 地 说 ， 应 用 TDCA 的 一 个 要 求 是 ， 环 绕 连接 代谢 物 的 各 反应 组 之 间 必 须 是 完全 相 
互 孤立 的 ， 即 仅仅 通过 连接 代谢 物 发 生 联 系 。 在 许多 情况 下 ， 不 可 能 找到 符合 以 上 原则 的 连 
接 代 谢 物 。 但 是 在 这 里 介绍 的 方法 对 这 种 完全 孤立 的 限制 有 所 放松 ， 人 允许 在 所 研究 的 网 络 中 
展现 诸如 反馈 抑制 这 样 的 相互 作用 。 既 然 存 在 这 些 限制 以 至 这 些 相 互 作 用 能 够 被 现在 的 方法 
所 容纳 ， 将 在 13.6 节 再 次 关注 这 个 重要 的 问题 。 此 外 ， 这 里 介绍 的 方法 能 够 将 诸如 自由 能 
的 产生 过 程 或 生长 导致 的 通 量 膨 胀 过程 这 样 的 偶 联 生物 过 程 与 主要 的 与 碳 有 关 的 生物 合成 通 
量 有 效 地 分 离开 来 。 由 于 这 些 耦 联 生物 过 程 的 特性 ， 通 过 这 种 分 析 所 定义 的 反应 分 组 通常 与 
依据 生化 反应 图 所 建议 的 分 组 是 不 同 的 。 

12.2.1 组 通 量 控制 系数 

一 个 组 通 量 控制 系数 (组 FCC 或 gFCC) 的 定义 是 当 把 整个 反应 组 作为 一 个 单个 的 反 
应 步骤 时 所 应 该 存在 的 通 量 控 制 系数 。 如 图 12.$(a) 中 所 示 的 未 分 支 反 应 途径 中 的 A 组 是 一 
个 反应 组 的 简单 例子 。 如 果 框 A 内 的 每 一 步 反 应 的 活性 按照 相同 的 比例 被 改变 ， 则 反应 组 
A 对 自己 的 通 量 * CA 的 gFCC 可 以 定义 为 : 途径 通 量 所 产生 的 相对 变化 (dJAZ1A) 与 反应 
组 中 每 一 步 反 应 活性 相对 变化 〈 也 就 是 整个 组 的 活性 变化 , d* ua/* va) 的 比值 : 

yo ee (12.4) 
这 个 定义 是 对 经 典 的 FCC 定义 (Kacserh and Burns, 1973) 对 TDCAC (Brown, et al, 
1990) 的 一 个 扩展 。 注 意 ， 通 量 和 反应 速率 的 上 标 (* ) 表示 这 些 量 是 对 应 于 反应 组 而 不 是 
单个 反应 的 。 

由 于 实际 上 不 可 能 使 一 个 反应 组 中 所 有 的 反应 发 生 同 样 幅 度 的 变化 ， 为 了 通过 gFCC 的 
实验 确定 ， 必 须 在 反应 组 中 一 个 或 多 个 反应 发 生 扰 动 之 后 通过 通 量 和 通 量变 化 的 测量 来 进 
行 。 需 要 强调 的 是 反应 分 组 是 用 一 个 事实 上 的 总 反应 替代 了 所 有 的 单个 反应 ， 总 反应 的 

316 


gFCC 等 于 反应 组 中 单个 反应 的 FCCs 之 和 (这 是 MCA 加 和 定理 的 结果 )。 
gFCC 的 概念 很 容易 被 扩展 到 诸如 图 12.5\(b) 所 示 的 网 络 中 的 分 支 代谢 途 径 。 这 里 一 

附加 的 棘手 的 问题 是 : 每 当 有 分 支 反 应 的 时 候 ， 都 需要 确定 其 中 一 个 分 支 途径 的 变化 对 流 经 
所 有 三 个 分 支 途径 通 量 的 影响 。 结 果 是 对 于 每 一 个 代谢 网 络 中 的 分 支 途径 都 有 三 个 gFCCs， 
而 不 是 一 个 通 量 控制 系数 ， 这 样 总 共 就 有 九 个 gFCCs。 在 更 复杂 的 代谢 网 络 中 ， 可 以 围绕 
几 种 不 同 的 代谢 物 识 别 反应 组 。 在 这 种 情况 下 ， 环 绕 每 一 个 连接 代谢 物 的 反应 组 的 gFCCs 
被 分 别 确定 。 依 据 不 同 重 到 反应 组 的 gFCCs 的 数值 可 以 确定 这 些 重 琶 反应 组 之 间 所 共有 的 
反应 的 gFCCs 数值 。 这 些 gFCCs 转 而 定义 了 由 中 间 代 谢 物 连接 较 小 的 反应 组 所 施加 的 控制 
程度 《这 里 ， 中 间 代 谢 物 连接 指 介 于 两 个 不 同 连接 代谢 物 之 间 的 短途 径 )。 正 如 13.4 节 所 讨 
论 的 ， 这 些 gFCCs 能 用 来 缩小 搜索 具有 大 的 FCCs 值 的 单个 步骤 的 范围 。 


EDU Ca =04 
0.1 03 oo | 0.2 0.2 
Myr sap) Lo >A, Ek a BS By 
反应 组 A Jy 反应 组 B Jp 
Ja =Jp 
(a) 
CHT ATT WH Ye: 
ee : ) Bp -*s 
CyB =1 1 “ pele os 
i ey SE a ee 0.5 IG eae 
1 、 Poe ae? 反应 组 B 
! 0.6 03 5 tee B 
; A> ^ D> 43; D>} see ies By 
See ee Ey ee ee Se a ee a ee 7 二 Je 
反应 组 A 0 > Ci 玫 、、~、、 反 应 组 C 
TS -0.3 C, ciel 
Jn =Jg t+ Jc Cd =-0.8 ~~~~_ Sy Tit 
a 三 人 六 C3 yo 


(b) ee? na 


图 12.5 反应 组 
对 未 分 支 途径 (a) 和 分 支 途 径 (b) 中 围绕 连接 代谢 物 X 的 反应 进行 典型 的 分 组 。 图 中 也 标 
出 了 各 组 之 间 的 所 需 的 通 量 平衡 ， 以 及 各 单个 反应 和 反应 组 对 反应 组 B 的 通 量 控制 系数 

12.2.2 ”独立 途径 的 识别 

一 条 独立 途径 的 定义 是 : 将 一 个 单个 的 网 络 输出 同一 些 必需 的 网 络 输入 以 某 种 方式 相连 
接 ， 从 而 使 内 部 物质 的 浓度 水 平 达到 稳 态 的 最 小 的 一 组 反应 (Simpson et al，1995)。 要 求 
有 一 个 稳定 不 变 的 内 部 代谢 库 ， 以 确保 在 一 个 恒定 的 输入 下 系统 能 够 达到 稳 态 。 对 于 一 个 由 
L 个 反应 和 天 个 独立 可 变 的 内 部 代谢 物 〈 内 部 代谢 物 的 代谢 库 都 应 该 能 达到 一 个 稳 态 ) 组 
成 的 网 络 ， 最 大 的 独立 途径 数 已 可 用 式 (12.5) 来 表示 : 

P=L-Ko (12.5) 
对 图 12.6(a) 和 12.6(b) 中 的 简单 例子 来 说 ， 能 够 很 容易 地 识别 三 条 独立 途径 (P1、P2 和 
P3)， 正 如 图 中 所 示 的 。 对 于 更 复杂 的 网 络 ， 例 如 图 12.1 所 示 的 那 种 网 络 ， 独 立 途 径 并 不 
明显 ， 需 要 一 种 系统 的 方法 来 识别 它们 。 为 此 ， 首 先 从 定义 一 个 稳 态 内 部 代谢 物化 学 计量 
(steady-state internal metabolite stoichiometry, SIMS) 和 矩阵 开始 ， 该 矩阵 严格 地 描述 此 网 
317 


络 的 化 学 计量 关系 (Reder, 1988). SIMS 和 矩阵 N (以 另外 的 方式 称 作 图 表 和 矩阵 ) 是 二 个 
开 x 世 和 矩阵， 其 中 K 是 网 络 中 明确 清楚 的 稳 态 代谢 物 数目 ， 工 是 确切 的 反应 数目 。 如 果 每 
一 个 反应 写成 式 (12.6) 的 形式 ， 则 此 矩阵 中 的 每 一 个 元 素 Ni 是 参与 反应 ; 的 代谢 物 X; 的 
化 学 计量 系数 Sjio 

ate giiX;) + 24 (giiX;) =0 (12.6) 
为 了 确保 基于 下 述 方法 的 反应 分 组 能 够 准确 地 进行 ， 上 式 所 描述 的 每 一 个 反应 的 方向 必须 同 
它 在 实际 网 络 中 的 净 通 量 方向 相 一 致 ， 这 一 点 是 很 重要 的 。 这 样 ， 由 于 图 12.6(a) 中 所 示 的 
通过 反应 3 的 净 通 量 方向 同 图 12.6(b) 中 的 相反 ， 所 以 相应 的 SIMS 矩阵 中 两 列 的 符号 是 相 
反 的 。 


图 12.6 独立 途径 的 识别 
图 中 展示 两 个 样本 反应 网 络 和 它们 的 独立 途径 及 其 SIMS 矩阵 和 核心 矩阵 
(a) 在 多 个 输出 间 具 有 分 支 的 网 络 ; (b) 在 多 个 输入 和 一 条 循环 途径 之 间 具 有 分 支 的 网 络 


严格 地 说 ，SIMS 矩阵 是 第 8 章 中 介绍 的 化 学 计量 矩阵 G 的 子 集 ，G 也 由 上 式 定义 但 它 
是 相对 于 网 络 中 的 所 有 代谢 物 而 言 的 。 因 此 ， 任 何 作为 原料 或 汇 点 (sink) 的 外 部 代谢 物 在 
化 学 计量 和 矩阵 中 都 有 相应 的 行 ， 而 在 SIMS HBR PARA. AF BAC 是 图 12.6(a) 中 能 保 
持 稳 态 的 仅 有 的 两 种 代谢 物 ， 因 此 系统 的 开 值 为 2 (由 于 这 两 种 代谢 物 的 浓度 可 独立 变动 ， 
所 以 Ko 也 为 2)。 因 此 物质 A、D、E 和 下 不 包括 在 所 产生 的 SIMS 矩阵 中 。 

在 SIMS 和 矩阵 中 很 容易 识别 两 类 重要 的 反应 : 输出 步骤 和 输入 步骤 。 一 个 输出 步骤 仅仅 
产生 外 部 物质 ， 在 SIMS 矩阵 中 用 没有 正 值 的 列 来 表示 。 一 个 输入 步骤 仅仅 消耗 外 部 物质 ， 
在 SIMS 和 矩阵 中 用 没有 负 值 的 列 来 表示 ， 输 出 步骤 的 识别 特别 有 助 于 下 面 所 示 的 独立 途径 的 

318 


列举 。 
一 旦 令 人 满意 地 构建 了 SIMS 矩阵 ， 独 立 途 径 就 可 作为 SIMS 和 矩阵 N 的 核心 矩阵 的 向 
量 而 被 获得 。 由 定义 ， 一 个 核心 矩阵 (kernel matrix) K 是 式 (12.7 ) 的 任何 非 无 效 解 
(nontrivial solution ) 。 
N:K=0 (12:7) 
12.6(a) 和 12.6(b) 对 相应 的 网 络 用 所 示 的 SIMS 矩阵 N 和 核心 矩阵 K 举 例 说 明了 这 
些 概念 。 注 意 ， 核 心 矩阵 向 量 的 表 列 值 代表 了 在 相应 的 独立 途径 中 被 完全 利用 的 反应 的 相对 
速率 。 这 样 ， 如 果 K5 是 核心 矩阵 K 的 元 素 ， 则 KU 代表 代谢 物 A 专门 对 图 12.6(a) 的 途径 
jiE11，2，3} 所 消耗 的 相对 速率 ( 即 反应 1 的 相对 速率 )。 反 应 1 的 总 速率 (等 于 A 的 总 
消耗 速率 ) MSF Ky+Kpt+Ky K (12.7) 中 核心 矩阵 和 SIMS 和 抢 阵 的 乘积 只 不 过 是 
对 三 条 独立 途径 中 的 每 一 条 对 中 间 代 谢 物 B 和 C 的 稳 态 平衡 (共有 2X3 个 方程 )。 这 样 ， 
12.6(a) 中 核心 矩阵 第 一 列表 明了 途径 P1 包括 反应 1 和 反应 3， 并且 依 所 表示 的 化 学 计量 
学 ，A 将 转化 为 2D 而 没有 B 或 C 的 净 产 生 ， 这 是 通过 如 下 定义 途径 P1 的 一 系列 反应 进 
行 的 : 
A 一 B 
B 一 2D 
A 一 2D 
如 果 各 步骤 之 间 的 化 学 计量 比 不 是 1:1， 则 对 应 于 适当 的 比值 的 数值 将 出 现在 核心 矩阵 的 表 
列 值 中 ( 见 12.3 节 )。 
核心 矩阵 的 确切 组 成 确实 是 任意 的 ， 因 为 如 果 和 矩阵 中 的 任何 一 列 乘 以 一 个 常数 或 同 任何 
其 它 的 列 相 加 ， 式 (12.7) 仍然 是 有 效 的 。 实 际 上 ， 对 核心 矩阵 的 惟一 正式 的 限制 是 它 必 须 
是 满 秩 的 ， 且 各 列 之 间 相 互 独立 。 然 而 ， 为 了 确定 反应 组 和 连接 代谢 物 的 目的 ， 定 义 一 个 可 
能 的 最 简单 的 核心 矩阵 就 已 经 足够 了 。 对 于 一 个 具有 Ky 个 独立 稳 态 代谢 物 的 网 络 来 说 ， 在 
每 条 途径 的 工 个 反应 速率 中 存在 Ko 个 稳 态 关系 。 因 此 ， 在 每 一 条 途径 的 各 个 反应 速率 的 确 
定 中 ， 自 由 度 为 ( 工 -Ko)， 或 者 说 ， 等 价 于 核心 矩阵 的 列 数 。 通 过 选择 核心 矩阵 的 元 素 以 
致 每 一 列 对 应 于 核心 矩阵 的 基 的 基础 向 量 ， 于 是 就 能 够 确立 每 一 条 独立 途径 的 结构 。 核 心 矩 
阵 的 基 通 常 由 核心 矩阵 中 的 〈 工 - Ko) 个 行 组 成 ， 其 所 对 应 的 这 些 反应 步骤 对 一 条 单个 独 
立 途 径 各 自 都 是 惟一 的 。 将 这 些 步 又 称 为 本 征 反应 或 特征 反应 ， 因 为 如 下 面 将 要 讨论 的 ， 它 
们 惟一 地 确定 每 一 条 独立 途径 的 化 学 计量 组 成 和 通 量 。 这 些 步骤 一 般 可 以 识别 为 产生 不 同 产 
物 的 输出 步骤 ， 但 也 可 能 包括 为 了 循环 或 替代 的 输入 所 需 的 步 又。 实际 上 ， 最 常见 的 是 每 一 
条 独立 途径 都 与 一 种 不 同 产物 的 生成 相 联系 ， 并 与 每 一 个 其 它 独立 途径 的 产物 相 竞 争 。 
从 图 12.6 (a) 的 例证 图 示 中 可 以 明显 看 出 ， 三 个 自由 度 定 义 了 三 个 反应 的 基 。 因 为 对 
基 的 明显 的 选择 是 三 个 输出 步骤 〈 反 应 3、 反 应 4 和 反应 $) ， 按 照 这 三 个 反应 步骤 的 基本 向 
量 ， 可 以 确定 核心 矩阵 的 每 一 列 。 分 别 将 核心 矩阵 中 代表 反应 3、 反 应 4 ARS 的 列 的 值 
设 定 为 100，010 和 001， 并 用 式 (12.7) 来 确定 该 矩阵 的 其 它 元 素 。 如 果 用 了 一 个 满意 的 
基 ， 这 种 方法 就 可 以 得 到 一 个 不 含有 负 值 元 素 的 完整 核心 矩阵 。 由 于 利用 了 核心 矩阵 的 基 的 
基本 向 量 ， 网 络 中 观察 到 的 任何 稳 态 都 将 是 通过 由 上 述 方法 所 确立 的 途径 的 基本 通 量 ( 即 通 
过 特征 反应 的 通 量 ) 的 线性 组 合 。 而 且 ， 一 有 旦 每 条 途径 的 特征 反应 已 被 识别 ， 仅 仅 将 通过 特 
征 反应 的 通 量 乘 以 矩阵 中 的 相应 列 的 每 一 个 值 就 可 以 得 到 通过 每 条 途径 的 实际 通 量 。 以 图 
12.6(a) 为 例 ， 由 于 基 是 由 步骤 3 ~ $ 所 组 成 ， 途 径 P1、 途 径 P2 MRE P3 的 特征 反应 分 别 
319 


是 反应 3、 反 应 4 和 反应 S。 这 样 ， 通 过 每 一 步 的 通 量 可 表示 为 : 


Ji Ky Ky K43 
J2 Ky K2 K3 
Jar) 2 UJst |) O Fae @ Wes (12.8) 
J4 0 1 0 
aL 0 1 


【 例 12.1】 通过 和 矩阵 代数 来 确定 核心 矩阵 

对 于 图 12.6 (b) 所 示 的 网 络 和 SIMS 抢 阵 ， 它 的 核心 矩阵 可 以 通过 应 用 式 〈12.7) 得 
出 。 在 该 网 络 中 有 5 个 反应 和 两 个 独立 的 稳 态 代谢 物 ， 所 以 ， 按 照 式 (12.5) 将 有 三 个 独立 
途径 。 对 于 这 个 系统 ， 式 (12.7) BA: 


Ku Ki Ki 
i 

K K K = 1 
: gat hy 31 32 K33 a, (1) 

Ka Ko Ka 

Ks, Ks. Ks3 


如 果 核 心 矩阵 的 元 素 开 5 被 解释 为 全 部 由 途径 Py 所 利用 的 反应 ; 的 速率 , 那么 就 可 以 更 好 地 
领会 式 (1) 的 含义 。 在 这 种 情况 下 ， 在 和 矩阵 表达 式 中 所 概括 的 6 个 式 子 简单 地 反映 了 两 个 
中 间 代 谢 物 B 和 C 对 三 条 独立 途径 中 的 每 一 条 的 稳 态 平衡 。 

式 (1) 表示 了 一 个 由 含有 15 个 未 知 数 的 6 个 方程 组 成 的 方程 组 。 从 这 15 个 未 知 的 天 


中 任意 选 出 其 中 的 9 个 产生 出 不 同 每 种 情况 的 核心 矩阵 。 然 而 ， 所 有 这 些 核心 矩阵 的 列 都 仅 “ 


仅 是 形成 系统 的 基 的 三 个 基本 列 的 线性 组 合 。 显 然 ， 最 简单 的 核心 矩阵 就 是 对 应 于 这 个 基 的 
和 矩阵。 这 可 以 通过 选择 任意 一 些 玉 值 组 成 单位 矩阵 ， 并 使 之 作为 核心 矩阵 中 下 面 的 3x3 部 
分 。 以 这 种 形式 ， 基 就 由 三 个 输出 反应 步骤 3、 步骤 4 和 步骤 3 (它们 分 别 是 途径 P1、 途 径 
P2 和 途径 P3 的 特征 反应 ) 所 定义 ， 这 是 因为 这 些 步骤 的 每 一 个 步骤 仅仅 发 生 在 它 相 应 的 独 
立 途径 中 。 一 有 旦 确定 了 基 ， 核 心 矩 阵 中 的 其 它 表 列 值 的 值 就 可 以 通过 对 式 (2) 所 表示 的 线 
性 方程 组 求解 而 得 到 。 还 要 注意 到 ， 式 1) 矩阵 中 天 的 绝对 值 大 小 是 不 重要 的 ， 因 为 核心 
矩阵 中 的 每 一 列 都 可 以 独立 地 扩大 或 缩小 (be scaled independently)。 


Ku Ky 13] 
局 Ly ES AH _ ia oA 0 07 a 
0 1 ee oO 
0 1 0 
0 0 ] 
如 果 完 成 式 (2) 的 左边 所 示 的 乘法 运算 ， 可 以 得 到 一 组 含有 6 个 线性 方程 的 方程 组 
we 和 Ky2— K2 ee iB 0 °) (3) 
Ky Ky-1 K 3-1 Du 00 
可 容易 解 得 
Ky | 
Kags K=O 


320 


K13— K23=0 (4) 
K2,=0 
Ky=1 
Kx3=1 
将 这 些 方程 转换 成 矩阵 形式 ， 通 过 矩阵 求 逆 可 以 确定 核心 矩阵 中 的 其 余 元 素 : 


0 
Ri |0 1 0 -1 0 Odor it 
Basle. iO Oh edn O- . 0 olde eo 1 
Sod mill tells U to dean alle ante aaa ee (5) 
21 
Ke |0y, 0 ole wells. i hs 40 1 1 
epi Oe AAO. Ons we 0 ox ol | 
所 产生 的 核心 矩阵 同 图 12.6(a) 中 所 示 的 一 样 OW: 
ett ll | 
Bate 
=| 1 70H 6 (6) 
iar 0 
001 


在 一 个 足够 简单 的 系统 中 ， 可 以 按照 以 下 程序 步 又， 通过 对 网 络 图 的 简单 的 查看 来 构建 
核心 矩阵 。 

(1) 从 核心 矩阵 的 第 一 列 开 始 ， 把 1 放 在 对 应 于 一 个 输出 步骤 的 第 一 列 某 一 行 上 ， 并 留 
心 注意 该 反应 所 消耗 的 代谢 物 。 

(2) 确定 哪个 〈 或 哪些 ) 步骤 产生 由 上 述 步骤 〈1) 所 识别 的 输出 步骤 所 消耗 的 代谢 物 。 

(3) 如 果 所 识别 的 代谢 物 仅 由 一 步 反 应 所 产生 ， 则 在 对 应 于 那个 反应 的 当前 列 的 表 列 值 
处 放 人 该 反应 必须 进行 的 次 数 的 数值 ， 该 反应 必须 继续 进行 是 为 了 生产 足够 多 的 代谢 物 以 平 
衡 由 前 面 的 反应 步骤 所 消耗 的 量 ; 通常 这 个 数值 为 1。 如果 多 于 一 个 反应 能 产生 该 代谢 物 ， 
把 全 部 当前 列 的 表 列 值 复制 到 下 一 列 《或 一 些 列 ) 中 并 用 第 一 个 选择 继续 构建 当前 列 。 一 且 
这 一 列 完成 之 后 ， 用 另外 的 选择 构建 下 一 列 (或 一 些 列 )。 

(4) 如 果 所 识别 的 反应 不 是 一 个 输入 步骤 ， 则 用 那个 反应 重复 步骤 (2) 一 步骤 (4)。 如 果 
是 一 个 输入 步骤 ， 则 完成 了 这 一 列 的 构建 ， 而 且 在 它 的 剩余 行 的 值 均 为 零 。 如 果 所 识别 的 反 
应 在 这 一 列 中 已 经 被 使 用 了 ， 这 会 是 在 相应 的 行 已 经 存在 的 一 个 数值 。 这 表示 有 一 个 循环 反 
应 ， 在 此 情况 下 ， 该 已 识别 的 反应 的 下 游 的 表 列 值 应 当 用 零 来 取代 。 

(5) 从 任何 其 它 输出 步骤 着 手 ， 重 复 步 又 (1) 一 步骤 (4)。 

留 作 一 个 练习 : 通过 上 述 方法 以 重新 构建 图 12.6 中 所 示 的 核心 矩阵 。 

在 复杂 网 络 中 ， 反 应 可 能 具有 多 个 反应 物 ， 这 就 使 对 代谢 物 进行 选择 以 保持 平衡 更 复杂 
了 。 在 这 些 情况 下 ， 首 先 从 一 个 仅 由 一 个 特定 反应 生成 的 代谢 物 来 开始 是 最 容易 的 。 在 对 这 
个 代谢 物 的 产生 解决 之 后 ， 任 何 由 先前 步骤 剩 下 的 未 平衡 的 代谢 物 必须 接着 被 平衡 。 包 括 多 
个 输入 、 多 个 输出 和 存在 耦 联 途 径 的 附加 网 络 特性 可 能 使 通过 简单 的 查看 来 确定 一 个 核心 矩 
阵 变 得 很 困难 。 在 这 些 情 况 下 ， 通 过 对 和 抢 阵 方程 求解 来 构建 一 个 核心 矩阵 也 许 要 比 通过 上 面 

321 


的 步骤 靠 手 工 对 反应 进行 平衡 更 为 简单 。 这 些 问 题 将 通过 对 芳香 族 氢 基 酸 生产 的 研究 实例 来 
做 更 详细 的 说 明 。 


12.3 实例 研究 一 一 廊 香 族 妥 基 酸 的 生物 合成 途径 


在 这 一 节 中 ， 将 通过 对 S . cerevisiae 中 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 的 研究 实例 来 示范 证 明 
连接 代谢 物 和 反应 组 识别 的 方法 论 。 首 先 对 这 个 系统 进行 一 下 描述 ， 然 后 接着 进行 独立 途径 
和 连接 代谢 物 的 识别 。 

12.3.1 S. cerevisiae 中 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 模型 

这 个 研究 实例 是 基于 已 发 表 的 S. cerevisiae 生物 化 学 的 动力 学 模型 (Galazz and Bai- 
ley，1990，1991)。 图 12.1 列 出 其 生物 合成 网 络 图 ， 该 网 络 斐 合 了 中 心 碳 代谢 、 自 由 能 的 
生成 及 氨基 酸 生 物 合成 。 这 个 网 络 描述 了 如 何 由 葡萄 糖 为 惟一 碳 源 ， 从 简单 的 前 体 物 来 合成 
三 种 芳香 族 氨 基 酸 : 色 氨 酸 、 葵 两 氨 酸 和 酷 氨 酸 。 这 个 模型 中 的 其 它 代 谢 功 能 包括 以 多 糖 和 
甘油 形式 存在 的 储藏 化 合 物 (storage compounds) 的 合成 、 自 由 能 的 生成 和 利用 ， 以 及 为 
了 维持 生长 对 自由 能 过 量 合成 的 需要 等 。 

为 了 举例 说 明 所 用 的 分 析 方 法 的 目的 而 采用 这 个 系统 时 ， 既 是 出 于 方便 的 需要 ， 也 为 了 
努力 使 它 与 细胞 的 已 知 的 生化 特性 更 好 地 相符 ， 对 原始 模型 作 了 几 处 专门 的 调整 。 更 重要 的 
是 ， 细 胞 生长 对 代谢 物 浓 度 水 平和 氨基酸 平 衔 的 影响 被 忽略 不 计 了 ， 这 样 做 有 简化 代谢 物 平 
衡 和 代谢 途径 表示 的 主要 作用 。 在 一 个 代谢 平衡 网 络 中 的 细胞 生长 包括 用 一 个 扩展 通 量 
(flux to expansion ) 来 表示 ， 它 按照 与 代谢 物 浓度 成 比例 的 一 个 因子 来 消耗 每 一 种 代谢 
物 Xi : 

Ji = pec; (12.9) 

式 中 ，/ 是 比 生 长 速率 ; ci 是 代谢 物 X 的 浓度 。 这 个 扩展 通 量 实 质 上 可 以 处 理 为 与 一 
个 单个 生长 有 关 的 反应 ， 它 以 前 述 的 速率 来 消耗 代谢 网 络 中 每 一 种 与 生长 有 关 的 代谢 物 。 这 
些 通 量 在 分 析 中 没有 直接 明确 地 说 明 ， 但 已 被 并 人 了 一 个 通用 的 一 级 消耗 反应 的 步 又 中 ， 因 
A: (a) 它们 的 量 一 般 比 较 小 ，(b) 在 代谢 网 络 的 控制 结构 和 通 量 扩 增 的 确定 中 ， 它 们 常常 
是 不 重要 的 ，(c) 它们 不 是 代谢 物 被 消耗 的 惟一 机 制 。 这 些 消 耗 反应 步骤 的 速率 常数 已 经 被 
确定 ， 并 达到 了 像 原始 模型 一 样 的 稳 态 条 件 下 的 总 的 氨基 酸 浓度 和 代谢 通 量 。 这 些 反 应 步骤 
(图 12.1 中 反应 16， 反 应 17 和 反应 18) ， 可 以 看 做 是 为 了 进行 蛋白 质 合 成 或 者 其 它 细 胞 过 
程 而 进行 的 氨基 酸 吸收 利用 以 及 这 三 种 氨基 酸 的 降解 和 胞 外 运输 的 总 和 。 此 外 ， 由 转 羧 基 酶 
催化 〈 反 应 9) 生成 的 磷酸 戊 糖 的 生成 和 消耗 在 化 学 计量 学 中 已 经 被 清楚 地 考虑 了 ， 然 而 在 
原始 模型 中 它们 已 被 与 6- 磷 酸 葡萄 糖 归并 在 一 起 。 这 也 引起 了 为 使 S- 磷 酸 木 酮 糖 返回 到 糖 
酵 解 途径 而 引入 的 一 个 的 循环 反应 13。 应 该 注意 的 是 : 尽管 有 了 这 些 变化 ， 但 系统 的 稳 态 
速率 和 浓度 同 Galazzo 和 Bailey 模型 的 结果 严密 匹配 。 

所 产生 的 代谢 网 络 中 包括 13 个 代谢 物 ， 它 们 参与 了 18 个 反应 ， 形 成 了 几 个 分 支 途径 和 
循环 途径 ， 并 且 展 现 出 显著 的 反馈 抑制 和 别 构 抑 制 。 因 此 ， 这 个 系统 非常 适合 用 来 对 复杂 代 
谢 网 络 进 行 描 述 和 分 析 。 

表 12.1 提供 了 这 个 网 络 中 存在 的 反应 一 览 表 。 要 注意 的 是 表 12.1 中 有 几 个 反应 是 由 一 
些 单个 反应 合并 而 成 的 ， 这 些 单个 反应 和 合并 后 的 总 反应 在 化 学 计量 学 上 是 等 价 的 。 这 样 ， 
在 葡萄 糖 被 运输 进 细 胞 内 并 发 生 磷 酸化 作用 之 后 〈 反 应 1, 反应 2) ，6- 磷 酸 葡 萄 糖 (GO6P ) 
通过 一 系列 反应 〈 归 并 成 反应 3) 转化 为 多 糖 (Pol) 或 通过 反应 4 在 糖 酵 解 途径 中 进一步 

322 


被 磷酸 化 以 形成 1,6- 二 磷酸 果糖 (FDP). FDP (或 者 它 的 平衡 等 价 物 : 3- 磷 酸 甘油 醛 ， 
GAP) 被 催化 形成 磷酸 烦 醇 丙酮 酸 (PEP) 并 进一步 形成 乙醇 〈 通 过 丙酮 酸 )， 同 时 以 ATP 
的 形式 释放 出 自由 能 〈 反 应 S 和 反应 6)。 以 另外 的 形式 ，GAP 通过 一 条 不 同 途径 《反应 7) 


”被 转化 为 甘油 〈Gol)。 最 终 形成 芳香 族 氨基 酸 的 莽 草 酸 途 径 由 磷酸 成 糖 途径 中 的 中 间 产 物 


5- 磷 酸 木 酮 糖 (XSP) 和 4- 磷 酸 赤 人 玖 糖 的 合成 开始 (未 标 出 )， 然 后 4-E RR oS BE BE A PEP 缩 
合成 3- 脱氧 -D- 阿 拉 伯 型 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (DAHP)。 这 两 步 结合 成 反应 9。 分 支 酸 (CHR) 
由 DAHP 通过 一 系列 反应 形成 (如 反应 10 所 示 )。 然 后 分 支 酸 进一步 转化 成 预 葵 酸 (PPHI) 
并 最 终 通过 一 系列 反应 形成 苯 丙 氨 酸 (Phe) MBAR (Tyr) (分 别 归并 为 反应 11、 反 应 
12 和 反应 13)。 分 支 酸 的 另 一 个 去 处 是 其 还 可 以 通过 由 反应 14 表示 的 色 氮 酸 合成 途径 形成 
AMR (Trp)。 这 条 途径 除 分 支 酸 外 还 要 消耗 XSP， 并 且 还 需要 将 PEP 转变 为 GAP 的 循 
环 反 应 。 剩 下 的 XSP 通过 反应 15 循环 到 GAP。 反 应 16 一 反应 18 表示 了 和 氢 基 酸 的 输出 、 降 
解 和 利用 步骤 。 


表 12.1 和 毛 基 酸 生物 合成 网 络 中 的 化 学 反应 计量 式 


zw 反应 计量 式 @ 
1 Ge 一 一 >(lc 
2 Gle + ATP 一 ~G6P+ADP 
3 G6P + ATP —>ADP + Pol + 2P; 
4 G6P + ATP —>FDP + ADP 
FDP/GAP® FDP —=2GAP 
5 GAP + ADP + P; —>PEP + ATP 
6 PEP + ADP —>ATP + EtOH + CO, 
7 GAP —~>Gol + P; 
8 ATP —~ADP + P; 
9 G6P + GAP + PEP —>X5P + DAHP + P; 
10 PEP + DAHP + ATP —>CHR + ADP + 3P; 
11 CHR 一 -~PPH 
12 PPH + ATP + NH; —Phe + ADP + P; 
13 PPH + ATP + NH; —>Tyr + ADP + P; 
14 PEP + X5SP + CHR + 4ATP + NH; —>GAP + Trp + 4ADP + EtOH + 2CO, + 3P; + PP; 
15 X5P + ADP + P; —>GAP + ATP + CO, 
16 Phe ——Phe,,, 
Ly fie — > LV Text 
18 Tip—— Trp) 
腺 苷 9 ATP + AMP = 一 2ADP 


® 反应 号 同 图 12.1 中 的 反应 相对 应 。 

@ 表 中 用 黑体 字 表示 的 代谢 物 处 于 稳 态 ， 有 几 个 反应 是 由 一 些 单个 酶 催化 反应 合并 而 成 。 

@ 这 个 反应 代表 了 FDP 和 丙 糖 之 间 的 平衡 ， 因 此 两 糖 被 看 做 一 个 单一 的 代谢 库 。 

® 这 个 反应 代表 了 ATP. ADP 和 AMP 之 间 的 平衡 。 

注 : 缩写 符号 的 意义 如 下 : CHR 一 分 支 酸 ; DAHP 一 3- 脱 氧 -D- 阿 拉 伯 型 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 ; FDP 一 1,6- 二 磷酸 果糖 ; 
G6P 一 6- 磷 酸 葡 萄 糖 ; GAP 一 3- 磷 酸 甘油 醛 ; Glc 一 葡萄 糖 ， PEP 一 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 ; Phe 一 苯 两 氨 酸 ; PPH 一 预 葵 酸 ; 
Pol 一 多 糖 ; Trp 一 色 氨 酸 ; Tyr 一 酷 氨 酸 。 


除了 和 碳 骨 架 合 成 有 关 的 代谢 物 的 生成 和 消耗 之 间 要 保持 平衡 之 外 ， 在 这 个 网 络 中 的 一 

个 稳 态 一 一 ATP 的 生成 和 消耗 也 必须 保持 平衡 ， 如 表 12.1 所 示 。 这 些 ATP 的 生成 和 消耗 

反应 在 图 12.1 中 分 别 以 圆 形 和 菱形 来 代表 ， 并 用 它们 来 强调 各 种 反应 和 网 络 中 不 是 由 直接 

的 化 学 计量 平衡 推导 而 来 的 部 分 之 间 存 在 着 强烈 的 耦合 作用 。 反 应 8 表示 超出 其 它 反应 步骤 
323 


需要 的 ATP 转变 为 ADP， 这 个 反应 可 被 理解 为 ATP 被 其 它 生 物 合成 反应 ， 如 细胞 维持 ， 
或 无 效 循环 所 消耗 。 

表 12.2 提供 了 动力 学 表达 式 和 物质 平衡 ， 用 于 定义 作为 这 项 分 析 的 基准 的 稳 态 条 件 。 
这 个 模型 的 代谢 物 平衡 的 解 所 产生 的 稳 态 代谢 物 浓度 和 通 量 如 表 12.3 所 示 。 


表 12.2 氨基酸 生 物 合成 网 络 中 反应 的 动力 学 表达 式 和 物料 平衡 


反 mm HA RK RK 
1 葡萄 糖 吸收 : 
VGle,in = 200 — 132.5[G6P] 
2 葡萄 糖 磷酸 化 : 
0.00062 0.11 1 
ak 一 =68.5(TGEJTAEET+ TGle] aaTt1j 
3 多 糖 的 形成 : 
号 [G6P ]§-*! 2558 | 2.326 “1 
UPol = 15.74( Tay [Gop = ) (reso + TGePTt 1) 
4 6- 磷 酸 葡萄 糖 异 构 酶 和 磷酸 果糖 激酶 (PFK ) : 
3019[G6P ]L[ATPJR 
UPFK ~ R24 6253L2T? 
R=1+0.5714[G6P] + 16.67[ATP] + 95.24[G6P ][ATP ] 
4 LADP }? [ADP 4), 4 
L=[1+0.76(farpy) |[1+40(tarey) | 
T =1+0.0002857[G6P] + 16.67[ATP] + 0.004762[G6P ][ATP ] 
5 3- 磷 酸 甘油 醛 脱 氢 酶 : 
RE | (0. 09375 + ae ja] 
et [ i ] 
ty ATP ADP] , [ATP] 
AS me of 1°) BES 
6 丙酮 酸 激酶 和 丙酮 酸 还 原生 成 CO 和 乙醇 : 
rE R +0.3964L2T 
vex = 9763[ PEP ]LADP ]o3 377 9) 272 
R=1+157[PEP]+0.2[ADP] +3.14[PEP ][ ADP] 
1 -1+0.05[FDP] 
”1+5[FDP] 
T =1+0.02[PFP]+0.2[ ADP] + 0.004[PEP ][ADP] 
7 甘油 的 生成 : 
UGot = 0.068 vcGapp 
8 非 专 一 性 的 ATP 降解 和 利用 : 
va=12.1[ATP] 
9 转 羧 基 反 应 生成 E4P 和 X5P ,接着 由 E4P 和 PEP 生成 DAHP: 


i 0.2 it 
i+ [Phe | i+ [Tyr | i+ [Trp 
Dace 53 40 16 
oe ( 0.0002, 0.06 [Trp 
‘ 6 


324 


反 - ;应 动力 学 表达 式 @ 
10 通过 莽 草 酸 途 径 消 耗 DAHP ,接着 将 莽 草 酸 变 为 分 支 酸 : 
‘ 116[DAHP ][PEP][ ATP] 
“D~ (2+ [ATP]) (0.008665 + [PEP ])(0.921 + [ATP]) 
11 预 葵 酸 的 生成 : 
opea=475.4[CHR][ 2+[CHRJ)(I+ (+ ) | 
12 PY ARYA AK 
ore=63.4[PPH]| (1+ (PPH]) (1+ tel) ] 
13 酷 氨 酸 的 生成 : 
_ 10.48[PPH] 
Ptr) 1+ (PPHI | 
14 HARA MK: 


vm = 75.6[X5P ][CHR][ATP] 
” (1.269+ [XSP])(2 + [CHR]) (0.9281 + [ATP]) (1 , (Trp) 


16 
15 XSP 降解 为 GAP 和 乙醇 : 
vx= 17, ADP]; PEL 
16 葵 丙 氨 酸 运输 降解 、 利 用 : 
aphe ut=0.013[Phe] 
17 酷 氨 酸 运输 降解 、 利 用 : 
VTyr,out = 0-013[ Tyr] x 10 
18 色 氨 酸 运输 、 降 解 ,利用 : 
vTpaut=0.013[Trp ] 
腺 苷 @ 腺 苷 磷酸 类 总 量 的 平衡 : 


[ATP]+[ADP]+ (次 车 )-: 


代 谢 物 物 料 ¥- & 
Gle UGle,in = UGIc 
G6P UGle = UPol + UPFK 十 UT 
FDP UPFK + ure + Sux=5 vost veut vr 
PEP UGAPD = UPK + UT+ Upt UTrp 
ATP,ADP Ucapp + UpK + UX= UGie + UPa + UPFK + UD + UPhe + UTyr + 4UT:p 
DAHP UT= Up 
CHR Up= UppH + UVTm 
PPH UPPH = UPhe + UTyr 
X5P UT = UTp t Ux 
Phe UPhe — UPhe, out 
Tyr UTyr = UTyr,out 
Trp UTrp — UTrp,out 


© 反应 序号 与 图 12.1 中 的 反应 相对 应 。 
Q 基态 的 摩尔 反应 速率 (mmol'L 1.min- 1) 是 中 间 代 谢 物 浓度 (mmol.L 1) 的 函数 。 
@ 最 后 一 个 表达 式 代 表 总 的 腺 苷 浓度 的 平衡 ， 也 就 是 ATP、ADP 和 AMP 之 间 的 平衡 。 


续 表 


325 


#123 氨基酸 生 物 合 成 网 络 的 稳 态 代谢 物 浓度 和 通 量 


内 部 代谢 物 摩尔 通 量 /mmol-L-Lmin-1 


Gle 1 ， 

2 
G6p 31.67 

3 0.14 
FDP 4 23.30 
PEP 5 43.63 
ATP 6 26.15 

了 2.97 
DAHP 8 2.44 
CHR 9 8.24 

10 8.24 
PPH 

11 7.24 
X5JP 12 3.52 
Pie 13 3,72 

14 1.00 
Al 

‘i 15 7.24 

Trp 16 3.52 


- 

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~ 
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© 反应 序号 与 图 12.1 中 的 反应 相对 应 。 


12.3.2 ”独立 途径 的 确定 

这 个 网 络 的 SIMS 矩阵 是 通过 表 12.1 中 的 化 学 计量 式 来 构建 的 ， 如 表 12.4 所 示 。 注 
意 ， 由 于 相应 于 ATP 和 ADP 的 数据 行 互 为 镜像 关系 ， 因 此 在 这 个 和 矩阵 中 的 13 种 代谢 物 只 
有 12 种 是 真正 独立 的 。 因 此 ， 式 (12.5) 表明 从 18 个 反应 中 可 以 构建 总 共 6 条 独立 途径 ， 
其 中 每 一 条 对 应 于 6 个 输出 反应 中 的 1 个。 这些 反 应 〈 反 应 3、7、8、16、17 和 反应 18) 
被 识别 为 该 网 络 的 特征 反应 ， 因 此 它们 构成 了 核心 矩阵 的 基 〈 严 格 地 说 ， 反 应 3 和 反应 8 是 
ATP 到 ADP 的 循环 步骤 ， 但 是 由 于 ADP 不 是 一 种 独立 的 代谢 物 ， 因 此 这 对 分 析 并 没有 影 
响 )。 第 一 眼 就 看 出 ， 这 好 像 是 一 个 推导 核心 矩阵 〈 见 表 12.5) 的 一 个 直截了当 的 练习 ， 即 
根据 12.2.2 节 中 介绍 的 方法 通过 逆向 工作 和 对 每 种 代谢 物 进行 平衡 来 直接 推导 出 核心 矩阵 ， 
但 是 ， 和 能 量 相 联系 的 反应 之 间 的 相互 依赖 引入 了 一 些 附加 的 环 手 的 问题 。 


表 12.4 氨基酸 生物 合成 网 络 的 SIMS HE 
应 


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注 : 反应 序号 与 图 12.1 中 的 反应 相对 应 。 


表 12.5 氨基酸 生物 合成 网 络 的 SIMS 矩阵 中 的 核心 矩阵 
独立 途径 9 


2 


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DO 这 些 独 立 途径 如 图 12.7 所 示 ， 每 一 条 独立 途径 的 特征 反应 用 黑体 字 和 下 划 线 表示 。 
@ 反应 序号 与 图 12.1 中 的 反应 相对 应 。 


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ZB 甘油 ADP 共同 途径 


图 12.7 ”芳香 族 所 基 酸 生物 合成 网 络 中 的 独立 途径 
如 图 所 示 : 有 六 条 和 六 种 产物 相 联系 的 独立 途径 。 流 经 每 条 途径 的 平衡 后 的 通 量 被 作为 核心 矩阵 中 相应 途径 
的 表 列 值 。 流 经 产能 的 糖 酵 解 途径 的 相对 通 量 也 被 确定 了 ， 糖 酵 解 途径 是 所 有 六 条 独立 途径 的 共同 途径 


327 


例如 ， 考 虑 由 反应 1、2 和 反应 3 组 成 的 生成 多 糖 (Pol) 的 途径 。 从 图 12.1 中 可 以 看 
出 反应 1 和 反应 2 应 当 平衡 由 反应 3 所 消耗 的 6- 磷 酸 葡萄 糖 (G6P)， 因 此 仅仅 从 图 12.1 所 
示 的 碳 转化 的 观点 来 考虑 ， 这 三 步 反 应 应 该 完成 核心 矩阵 中 代表 多 糖 途径 (途径 4) 的 列 。 
但 是 检查 表 12.5 所 示 的 核心 矩阵 中 的 第 四 列 显 示 出 对 这 条 途径 来 说 还 有 另外 的 表 列 值 。 与 
这 些 表 列 值 相 对 应 的 反应 也 必须 被 包括 以 便 与 反应 1、2 和 反应 3 一 起 使 ATP (和 通过 扩 
展 ， 包 括 ADP) 的 平衡 完全 闭合 。 当 发 生 这 种 情况 时 ， 在 这 个 网 络 能 提供 被 任何 反应 所 需 
要 的 ATP 的 惟一 方法 是 通过 以 反应 6 为 终点 的 糖 酵 解 途径 。 这 样 ， 多 糖 途 径 的 完成 需要 再 
加 上 反应 1、2、4， 以 及 等 价 于 反应 $ 和 反应 6 的 反应 。 如 果 每 一 个 其 它 的 输出 步骤 都 遵从 
同样 的 过 程 ， 所 得 结果 将 是 如 表 12.5 所 示 的 核心 矩阵 。 这 个 核心 矩阵 也 可 通过 使 用 前 面 确 
定 的 6 个 输出 步骤 作为 基 ， 求 解 式 (12.8) 来 建立 。 图 12.7 提供 了 核心 矩阵 中 所 识别 的 每 
一 条 途径 所 平衡 的 通 量 的 图 示 。 如 图 12.7 所 示 ， 糖 酵 解 途径 的 ATP 生成 途径 被 所 有 6 条 独 
立 途 径 所 利用 。 

12.3.3 连接 代谢 物 的 识别 和 组 通 量 确定 

在 上 一 节 中 ， 确 定 了 图 12.1 所 示 的 芳香 族 氨 基 酸 的 生物 合成 网 络 包括 6 条 独立 途径 。 
这 当然 也 暗示 着 网 络 中 包含 几 个 分 支点 ， 为 了 生成 不 同 的 终 产 物 ， 在 分 支点 处 途径 发 生 了 分 
贫 。 在 这 里 ， 证 明示 范 一 种 分 支点 定位 的 正式 程序 步骤 ， 它 一 般 可 应 用 于 具有 任何 复杂 性 的 
网 络 。 该 程序 以 独立 途径 的 确定 开始 〈 如 图 12.7 所 示 ) (其 正如 核心 矩阵 所 定义 的 )， 然 后 
按照 下 述 步 又 继续 进行 。 

(1) 识别 由 核心 矩阵 所 限定 的 独立 途径 中 的 最 大 的 共同 反应 组 〈 即 最 长 的 共同 途径 )。 
已 经 表明 对 于 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 网 络 的 6 条 独立 途径 〈 见 图 12.7) 来 说 ， 这 条 共同 途 
径 是 糖 酵 解 途径 。 它 产生 了 网 络 中 第 一 个 分 支点 处 的 连接 代谢 物 。 对 于 作为 实例 研究 的 网 
络 ， 这 个 代谢 物 是 ATP。 参 与 共同 途径 的 反应 一 起 组 成 反应 组 A， 该 反应 组 在 连接 代谢 物 
的 上 游 。 

(2) 在 该 共同 途径 中 ， 识 别 生 成 产物 的 步骤 ， 这 一 步骤 负责 该 连接 代谢 物 的 净 生 成 。 改 
变 核心 矩阵 中 每 一 列 的 比例 使 得 代表 生成 产物 步骤 的 所 有 表 列 值 都 相等 。 平 衡 共 同 途 径 中 的 
任何 其 它 反应 使 得 在 这 条 途径 中 没有 任何 中 间 代 谢 物 的 净 生 成 或 净 消 耗 。 对 于 实例 研究 的 网 
络 ， 平 衡 后 的 共同 途径 中 反应 的 化 学 计量 关系 如 图 12.7 所 示 。 

(3) 将 原始 的 核心 矩阵 分 为 三 个 子 和 矩阵 〈 由 此 产生 三 个 组 核心 矩阵 )， 每 一 个 子 矩 阵 都 
包括 该 组 中 的 反应 。 因 为 由 先前 识别 的 共同 途径 组 成 了 上 游 反 应 组 A， 将 共同 途径 的 已 平衡 
的 反应 的 化 学 计量 系数 输 进 它 的 组 核心 矩阵 的 每 一 列 中 ， 而 所 有 其 它 反应 的 表 列 值 记 为 零 。 
从 原始 核心 矩阵 减 去 这 个 组 核心 矩阵 以 产生 一 个 包括 两 个 下 游 反 应 组 B 和 CC 的 减 缩 核心 
矩阵。 

(4) 确定 包含 尽 可 能 多 的 减 缩 核心 矩阵 的 途径 的 最 大 共同 反应 组 〈( 即 ， 一 条 新 的 共同 途 
径 ， 其 将 被 用 于 确定 反应 组 C 中 的 下 一 个 分 支点 )。 分 成 一 个 新 的 下 游 组 核心 矩阵 B， 它 的 
这 些 列 〈 即 途径 ) 中 的 表 列 值 不 包括 新 的 共同 途径 的 反应 。 从 组 核心 矩阵 A 的 表 列 值 减 去 
组 核心 矩阵 B 的 表 列 值 就 可 以 得 到 组 核心 矩阵 C。 反 应 组 C 中 的 所 有 途径 包括 这 条 新 的 共 
同 途径 。 

(5) 对 于 任何 在 两 列 或 更 多 列 中 有 表 列 值 的 下 游 反 应 组 (B 或 C)， 重 复 步骤 (1) 一 步骤 
(4) 以 便 依 次 识别 每 一 个 连接 代谢 物 。 注 意 到 反应 组 C 中 的 共同 途径 在 步骤 (4) 中 已 经 被 
确定 了 。 相 应 于 这 条 共同 途径 的 组 核心 矩阵 为 新 的 连接 代谢 物 限定 了 组 站 ， 因 为 它 包括 将 新 

328 


的 连接 代谢 物 同 以 前 的 连接 代谢 物 相 连接 的 那些 反应 。 然 而 ， 这 个 连接 代谢 物 上 游 整个 反应 

组 A 包 括 反 应 组 L、 先 前 的 连接 代谢 物 上 游 的 反应 组 A 及 在 先前 的 连接 代谢 物 处 从 该 新 共 

同 途 径 分 岔 出 的 反应 组 〈B 或 C)。 结 果 ， 网 络 中 的 每 一 步 都 将 被 围绕 任何 连接 代谢 物 的 三 

个 反应 组 (A、B 和 C) 之 一 所 说 明 。 正 如 后 面 所 讨论 的 ， 组 A M4 L 的 分 别 考虑 对 于 组 通 

” 量 和 组 控制 系数 的 适当 确定 是 必要 的 。 

(6) 重复 上 述 程序 步骤 直到 没有 更 多 的 共同 途径 能 被 识别 。 此 时 ， 最 后 的 下 游 反 应 组 每 
一- 组 将 仅 由 表 列 值 不 为 零 的 单列 组 成 。 用 这 种 方式 所 识别 的 分 支 


了 点 数 等 于 尸 -1， 这 里 已 是 独立 途径 的 数 。 
个 应 该 注意 ， 这 个 程序 的 最 终 目的 是 寻找 一 个 代谢 网 络 中 的 
i 分 支点 的 位 置 ， 并 合理 地 确定 围绕 每 一 个 分 支点 的 反应 组 及 其 


S67 cj 相应 的 通 量 。 在 图 12.8 中 对 此 进行 了 图 解 表 示 : 分 支点 代谢 
| Wf x | OX; 和 围绕 X; 形成 的 三 个 反应 组 A、B 和 C。 正 如 在 第 13 章 
: ii ”中 用 公式 所 表示 的 那样 ， 这 些 反应 组 的 组 控制 系数 可 以 从 围绕 
分 支点 代谢 物 的 三 个 通 量 J. Jn A Jc 来 确定 。 正 确 地 计算 这 
图 12.8 分 支点 及 围绕 分 支 ” 些 通 量 将 确保 相应 的 组 控制 系数 正确 的 确定 。 

通过 重复 应 用 核心 矩阵 和 组 核心 矩阵 ， 该 程序 对 实例 研究 

反应 组 A_B 和 反应 组 (包括 该 的 应 用 证 明示 范 如 下 。 这 些 重复 的 前 两 个 已 在 图 ,12.9 和 图 

分 支点 代谢 物 的 上 游 和 下 游 ”12.10 中 以 图 示 说 明 。 注 意 ， 为 了 使 组 通 量 容 易 确定 ， 原 始 的 

Pet Bice Pas Bue 核心 矩阵 〈 表 12.5) 中 补充 了 两 个 新 行 。 其 中 第 一 行 是 这 样 一 
行 ， 其 在 随后 将 与 每 一 列 的 其 他 表 列 值 一 起 被 改变 比例 。 第 二 个 新 行 仅仅 表明 每 一 条 独立 途 
径 中 的 特征 通 量 而 且 它们 不 需要 改变 比例 。 

人 TP 

(1) 对 表 12.5 中 核心 矩阵 中 的 列 进行 检查 显示 最 长 的 共同 途径 是 糖 酵 解 途径 ， 它 包括 
反应 1、2、4、5 和 反应 6。 这 条 途径 的 终端 代谢 物 ATP 因而 被 识别 为 这 个 网 络 中 的 第 一 个 
连接 代谢 物 OAR 12.7 的 途径 中 也 可 以 看 出 这 一 点 )。 

(2) 这 条 共同 途径 中 生成 产物 的 步骤 是 反应 6， 它 负责 ATP 的 净 生 成 ， 因 为 在 反应 2、4 
和 反应 5 中 ATP 的 生成 和 消耗 相互 抵消 了 。 因 此 ， 核 心 矩阵 中 的 列 必 须 相 对 于 反应 6 改变 比 
例 。 将 核心 矩阵 中 的 第 二 列 的 表 列 值 乘 以 3 后 ， 代 表 反应 6 的 表 列 值 变 为 6。 核心 矩阵 中 其 它 
每 二- 列 的 表 列 值 都 类 似 地 乘 以 适当 的 因子 以 使 它们 代表 反应 6 的 表 列 值 都 等 于 6。 改 变 比例 后 
的 矩阵 如 图 12.9 所 示 ， 方 框 内 表示 了 所 有 6 条 途径 的 共同 反应 。 为 了 确保 这 条 共同 途径 中 没 
有 中 间 代 谢 物 形成 ， 其 剩余 的 反应 必须 被 平衡 ， 如 图 12.7 中 的 最 后 一 幅 图 所 示 。 这 种 需要 对 
于 确立 通过 每 一 个 反应 组 的 正确 的 通 量 是 很 重要 的 ， 对 此 将 在 以 后 作 更 详细 的 讨论 。 

(3) 形成 ATP 的 平衡 了 的 化 学 计量 反应 一 起 被 汇聚 进 ATP 上 游 的 组 A， 产 生 的 组 核心 
矩阵 如 图 12.9 所 示 。 组 核心 矩阵 (A) 中 的 每 一 列 都 包括 经 过 平衡 的 糖 酵 解 途径 (P6) 的 
拷贝 。 应 注意 ， 反 应 1、2、4 和 反应 5 的 表 列 值 和 改变 了 比例 的 矩阵 中 的 六 列 值 的 不 同 ， 并 
且 这 些 通 量 仅 有 一 部 分 被 包括 在 组 A 的 通 量 中 。 实 际 上 ， 仅 仅 通过 直接 归 因 于 ATP 的 形成 
的 这 四 个 步骤 的 那 部 分 通 量 被 包括 在 组 A 中 。 通 过 这 些 步骤 的 通 量 的 剩余 部 分 与 碳 代谢 物 
有 关 ， 并 围绕 其 它 分 支点 而 被 分 布 。 

(4) 共同 途径 的 矩阵 〈 即 组 核心 矩阵 A) 减 去 之 后 剩余 的 改变 了 比例 的 核心 矩阵 部 分 是 
一 个 仅仅 由 包括 在 下 游 反 应 组 的 反应 所 构成 的 减 缩 核 心 矩 阵 。 从 这 个 减 缩 核 心 矩阵 中 可 以 得 

329 


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331 


到 两 个 下 游 反应 组 B 和 反应 组 C 的 构成 如 下 : 检查 减 缩 核心 矩阵 后 显示 反应 1 和 反应 2 对 前 S 
个 独立 途径 的 是 共同 的 ， 但 对 第 六 个 不 是 。 这 样 ， 反 应 1 和 反应 2 就 组 成 了 新 的 共同 途径 ， 而 
反应 8 是 减 缩 核 心 矩阵 中 独立 途径 PO 的 惟一 表 列 值 。 相 应 地 ， 独 立 途 径 PO 中 的 这 个 剩余 反应 
( 即 反 应 8) 就 构成 了 反应 组 B， 而 由 减 缩 核心 矩阵 中 前 S 个 独立 途径 所 表示 的 网 络 反应 的 剩余 
者 就 构成 了 反应 组 C。 所 有 三 个 组 的 构成 如 图 12.9 中 的 组 核心 矩阵 所 示 。 认 识 到 这 一 点 很 重 
要 : 如 果 将 这 三 个 核心 矩阵 加 起 来 就 是 改变 了 比例 的 核心 矩阵 ， 而 这 三 个 核心 矩阵 就 是 从 它 导 
出 的 。 这 样 就 确定 了 围绕 第 一 个 连接 代谢 物 ATP 的 所 有 三 个 反应 组 的 构成 。 

(5) 在 上 述 (4) 中 所 识别 的 新 的 共同 途径 〈 反 应 1 和 反应 2) 将 用 在 下 面 的 讨论 中 以 识 
别 反应 组 C 中 的 剩余 的 分 支点 。 下 一 个 分 支点 上 游 的 反应 组 A 不 仅仅 包括 这 条 新 的 共同 途 

， 还 包括 这 里 所 识别 的 反应 组 A 和 反应 组 B， 它 们 已 经 从 反应 组 C 中 被 分 离 出 来 。 

在 这 个 网 络 中 要 识别 的 第 一 个 连接 代谢 物 确 实 是 ATP， 理 解 这 一 点 是 很 关键 的 。 从 图 
12.1 的 反应 图 示 中 不 能 立刻 明白 这 个 事实 ， 因 为 绘制 图 12.1 是 为 了 描绘 碳 代 谢 物 之 间 的 转 
换 。 然 而 ， 通 过 糖 酵 解 途径 生成 ATP 是 所 有 独立 途径 的 共有 特点 。 本 质 上 ， 通 过 每 一 条 独 
立 途 径 的 总 通 量 等 于 由 生成 相应 的 末端 代 谢 物 所 需 的 碳 通 量 和 这 条 途径 中 生成 所 消耗 的 
ATP 所 需 的 通 量 的 总 和 。 因 为 随后 每 一 条 独立 途径 以 不 同 的 方式 利用 ATP， 所 以 围绕 连接 
代谢 物 ATP 进行 的 反应 组 分 别 代表 了 通过 糖 酵 解 途径 生物 化 学 能 量 的 净 生 成 以 及 由 所 有 的 
能 量 消耗 反应 〈 反 应 组 C) 随后 对 ATP 的 利用 。 反 应 组 B 代表 了 将 所 剩余 的 ATP 水 解 成 
为 ADP 以 为 维持 或 无 效 循环 ATP 的 使 用 。 

实际 上 ， 通 过 共同 途径 生成 全 部 ATP 而 消耗 的 这 一 部 分 葡萄 糖 通 量 可 以 被 认为 是 归并 
进 一 个 单一 的 库 。 剩 余 的 和 碳 代 谢 有 关 的 葡萄 糖 通 量 被 分 布 在 途径 1~S 中 ， 共 同 的 ATP 库 
能 够 满足 这 些 途 径 对 能 量 的 额外 需求 。 另 外 ， 必 须 强调 的 是 ， 按 照 碳 代 谢 结构 图 所 进行 的 不 
适当 的 反应 分 组 ， 而 且 没 有 把 ATP 作为 一 种 连接 代谢 物 来 识别 ， 如 果 不 是 完全 无 能 得 到 这 
些 估 计 的 话 ， 这 种 做 法 事实 上 将 导致 对 控制 系数 的 估计 明显 的 不 准确 。 在 处 理 任何 其 它 连 接 
代谢 物 (如 NADH) 或 与 生长 相关 的 通 量 要 扩大 时 (这 种 情况 破坏 了 标准 的 反应 图 示 )， 必 
须 遵 循 这 种 分 离 相 联通 量 的 相同 程序 步骤 。 

在 识别 第 一 个 连接 代谢 物 和 反应 组 之 后 ， 剩 下 的 工作 就 是 确定 每 一 个 反应 组 的 实际 通 
量 。 注 意 ， 这 些 通 量 的 单位 应 当 是 分 支点 代谢 物 的 摩尔 量 作 单位 时 间 X 单 位 细胞 ]。 就 反应 
组 也 来 说 ， 显 然 组 通 量 是 通过 反应 8 的 通 量 。 类 似 地 ， 反 应 组 A 的 通 量 等 于 反应 6 的 反应 
速率 ， 该 反应 负责 ATP 的 净 生 成 。 因 为 ATP 被 反应 组 C 中 的 很 多 步骤 所 消耗 ， 因 此 反应 
组 C 的 通 量 是 通过 加 和 所 有 这 些 步骤 对 通 量 的 贡献 来 确定 。 这 个 通 量 也 等 于 通过 反应 组 A 
和 反应 组 也 的 通 量 之 间 的 差 。 

通过 核心 矩阵 的 直接 应 用 可 以 更 严密 地 求 得 这 些 组 通 量 。 回 想到 依据 式 (12.8)， 通 过 
任何 反应 的 总 通 量 等 于 通过 可 归 因 于 每 个 独立 途径 的 反应 的 通 量 之 和 。 这 个 方程 式 也 表明 ， 
通过 经 任何 反应 的 通 量 能 够 从 定义 核心 矩阵 的 基 的 特征 反应 的 通 量 得 到 。 这 就 是 要 在 上 述 的 
核心 矩阵 中 补充 相应 于 特征 通 量 的 行 的 目的 。 通 过 用 此 信息 ， 就 可 以 通过 以 下 的 程序 来 精确 
地 确定 组 通 量 。 

(1) 确定 反应 组 N 〈 即 反应 组 A、 召 或 反应 组 C) 中 的 负责 连接 代谢 物 的 净 生 成 或 净 消 耗 
的 反应 z。 对 于 反应 组 A 来 说 这 个 反应 会 是 反应 6， 对 于 反应 组 也 来 说 这 个 反应 会 是 反应 8。 

(2) 对 于 反应 组 N 所 包含 的 每 一 条 途径 P;, 用 那 一 列 的 改变 了 比例 的 表 列 值 除 组 核心 
矩阵 中 的 表 列 值 Ki ， 并 乘 以 通过 相应 于 途径 P; 的 特征 反应 的 通 量 。 如 果 在 SIMS 矩阵 中 反 

332 


Mi 的 化 学 计量 式 并 没有 产生 连接 代谢 物 的 一 个 等 价 物 ， 则 将 产生 的 通 量 乘 以 合适 的 化 学 计 
量 系 数 。 此 结果 将 是 通过 归 因 于 途径 Pi; 的 反应 组 N 的 通 量 ， 其 单位 是 所 形成 的 连接 代谢 物 
的 摩尔 量 / 单 位 时 间 。 
(3) 将 程序 2 中 得 到 的 通过 反应 组 N 中 所 有 途径 的 通 量 加 和 起 来 以 得 到 总 的 组 通 量 。 
(4) 对 剩 下 的 每 个 反应 组 重复 前 面 的 程序 。 以 另外 的 方式 ， 以 得 到 各 自 的 组 通 量 ， 通 过 
最 后 一 个 反应 组 的 通 量 还 可 以 从 其 它 反应 组 的 通 量 平 衡 求 得 。 
因为 核心 矩阵 中 的 所 有 六 个 列 〈 即 全 部 六 条 独立 途径 ) 都 贡献 于 反应 组 A， 所 以 从 反应 
组 A 流 入 ATP 的 通 量 〈 即 ATP 生成 的 净 通 量 ) 等 于 可 归 因 于 所 有 途径 的 反应 6 的 通 量 。 
这 当然 也 是 通过 反应 6 的 总 通 量 ， 而 且 两 种 结果 都 如 式 (12.10) 所 示 。 在 反应 组 B 中 消耗 
ATP 的 反应 是 反应 8， 它 也 是 反应 组 也 中 的 惟一 反应 。 因 此 ， 反 应 组 BB 的 通 量 等 于 (66) 
Js， 或 者 简单 说 就 是 Js。 因 为 在 反应 组 C 中 相应 于 ATP 净 消 耗 的 反应 不 是 容易 弄 明 白 的 ， 
它 的 组 通 量 可 以 最 容易 地 通过 其 它 两 个 组 通 量 的 差 值 来 求 出 。 根 据 这 个 讨论 ， 围 绕 分 支点 
ATP 来 自 上 游 反 应 组 (A) 流入 下 游 反应 组 (B 和 C) 的 通 量 如 下 式 所 示 : 
aTPJ a= 6J1g + 2J 16+ 2J17+ 2J3+J7+Js=Jo 
atpJB=J8 (3210) 
aTPJ c= 6Jigt 2J 16+ 2J 17+ 2J3+J7=Jo—Js 
4% 2 —— G6P 
分 支点 分 析 的 第 二 次 重复 以 反应 组 C 的 核心 矩阵 作为 起 点 。 注 意 到 ， 由 于 途径 P6 已 经 
被 分 人 一 个 独立 的 组 ， 因 此 在 这 个 核心 矩阵 中 仅 有 表 列 值 零 ， 在 这 个 反应 组 的 分 析 中 可 以 忽 
略 不 计 。 因 此 ， 如 图 12.10 所 示 的 初始 核心 矩阵 含有 来 自 图 12.9 所 示 的 反应 组 C 的 组 核心 
和 抢 阵 中 的 前 五 列 。 将 用 这 个 核心 矩阵 来 确定 围绕 此 新 分 支点 的 反应 组 L、B 和 反应 组 C。 然 
而 ， 如 图 12.10 所 示 ， 这 个 分 支点 的 整个 上 游 反 应 组 A 除了 包括 除 这 里 所 识别 的 反应 组 OL 
外 ， 还 将 包括 分 支点 ATP 的 反应 组 A ARAB. RE, RMA 和 A 的 组 核心 矩阵 将 是 这 三 
个 反应 组 的 组 核心 矩阵 之 和 。 为 了 确保 实际 网 络 中 的 每 一 个 反应 都 被 包含 在 围绕 这 个 连接 代 
谢 物 的 所 有 反应 组 中 的 一 个 反应 组 之 中 ， 这 个 说 明 是 有 必要 的 。 
第 二 个 分 支点 的 分 析 继 续 进行 如 下 。 
(1) 检查 反应 组 C 的 组 核心 矩阵 表明 反应 1 和 反应 2 构成 为 剩 下 的 途径 P1 ~ PS 所 共 
同 的 最 长 的 途径 ， 作 为 这 条 共同 途径 终端 代谢 物 的 GOP 就 被 识别 为 下 一 个 分 支点 。 
(2) 反应 2 被 识别 为 这 个 分 支点 代谢 物 的 生成 步骤 。 因 此 ， 该 矩阵 的 每 一 列 都 相对 于 反 
应 2 而 被 改变 比例 ， 正 如 图 12.10 所 示 。 反 应 1 和 反应 2 在 这 条 途径 中 已 经 按照 1:1 的 比例 
被 平衡 。 
(3) 将 平衡 后 的 共同 途径 的 化 学 计量 系数 6:6 复制 到 每 一 列 中 形成 反应 组 工 的 组 核心 矩 
阵 ， 从 而 导致 途径 P1 一 P5 中 反应 1 和 反应 2 的 表 列 值 均 为 6。 从 改变 了 比例 的 核心 矩阵 中 
减 去 核心 矩阵 L 导致 在 下 游 减 缩 矩 阵 中 反应 1 和 反应 2 的 表 列 值 为 0。 因 此 通过 这 两 个 步骤 
的 通 量 的 剩余 部 分 实际 上 被 认为 存在 于 反应 组 世 内 (会 想到 对 于 分 支点 G6P， 反 应 组 A 除 
了 包括 反应 组 外 ， 还 包括 分 支点 ATP 的 反应 组 A 和 反应 组 B)。 
(4) 检查 下 游 减 缩 矩阵 〈 减 去 核心 矩阵 世 后 形成 的 ) 显示 反应 4 是 4 条 途径 P1 一 P3 和 
P5 惟一 的 共同 步骤 。 因 此 反应 4 就 是 新 的 共同 途径 ， 而 反应 3 是 在 减 缩 核心 矩阵 中 途径 4 
的 惟一 表 列 值 。 相 应 地 ， 反 应 3 构成 了 新 的 反应 组 也 ， 而 剩 下 的 GOP 的 下 游 代 谢 反应 构成 
了 新 的 反应 组 C。 所 产生 的 组 核心 矩阵 如 图 12.10 所 示 ， 为 了 更 清楚 地 表示 ， 将 代表 P4 和 
333 


PS 的 列 进行 了 重 排 。 

《5) 在 下 面 的 讨论 中 ， 在 上 述 步骤 4 中 被 识别 的 新 的 共同 途径 〈 反 应 4) 将 用 来 确定 反 
应 组 C 中 剩余 的 分 支点 。 下 一 个 分 支点 的 上 游 反 应 组 A 将 不 仅 包括 这 个 共同 途径 ， 还 包括 
从 反应 组 C 中 已 经 分 离 出 来 的 G6P 分 支点 的 反应 组 A 和 反应 组 B。 

从 其 上 游 分 支 途径 A 流入 GOP 分 支点 的 通 量 等 于 通过 反应 2 的 与 碳 代 谢 相 联系 的 通 量 。 
这 个 通 量 既 可 以 通过 先前 描述 过 的 矩阵 检查 的 方法 来 确定 ， 或 者 从 通过 反应 2 的 总 通 量 中 减 
去 与 能 量 代 谢 相 联系 的 通 量 而 确定 。 化 学 计量 式 表 明 : 通过 反应 2 的 与 能 量 代谢 相 联系 的 通 
量 一 定 等 于 通过 反应 6 的 总 通 量 的 一 半 。 因 此 有 


co? a= Jig + S16 + 2319+ J3+$I7=J2- SJ 
cop Jp=J3 (12.11) 


oo Jo= BJs ist 21+ $I1=Ja- FJ 6 Js 

分 支点 3 —— FDP/GAP 

(1) 在 分 支点 GOP 的 反应 组 C 中 惟一 与 剩 下 的 途径 所 共用 的 步骤 是 反应 4， 其 将 G6P 
转化 成 为 1,6- 二 磷酸 果糖 (FDP)。 因 此 ，FDP 可 被 识别 为 第 三 个 分 支点 。 注 意 : 由 于 在 这 
个 模型 中 FDP BUNS 3-BERR MAME (GAP) 保持 平衡 的 ， 所 以 这 个 分 支点 实际 上 是 
FDP #1 FDP 复合 库 ， 它 们 之 中 的 任何 一 个 都 可 以 作为 连接 代谢 物 。 

(2) 由 于 反应 4 是 共同 途径 中 的 惟一 反应 ， 显 然 它 也 就 是 产物 生成 步骤 。 如 果 这 个 核心 
矩阵 中 其 余 四 列 相对 于 这 一 列 被 改变 比例 ， 则 改变 了 比例 的 核心 矩阵 如 下 : 


Bl P2 P4 PS 
ae 4 Trp Phe Tyr Gol 
1 0 0 0 0 
2 0 0 0 0 
3 0 0 0 0 
5 6 6 6 0 
6 0 0 0 0 
v/ 0 0 0 6 
8 0 0 0 0 
9 2 3 3 0 
10 2 3 3 0 
比例 因子 2 3 3 6 
特征 通 量 Js Ji6 Ji Ji 


(3) 将 改变 了 比例 的 矩阵 中 第 四 行 的 表 列 值 复 制 到 每 一 列 中 ， 并 使 其 余 的 表 列 值 全 部 为 
零 就 形成 了 反应 组 工 的 核心 矩阵 。 这 个 分 支点 的 反应 组 A， 同 前 述 的 一 样 ， 是 从 这 个 组 加 
到 先前 的 (G6P) 分 支点 的 反应 组 A 和 反应 组 B 而 形成 的 。 当 从 改变 了 比例 的 核心 矩阵 中 
减 去 核心 矩阵 L， 得 到 下 游 减 缩 矩阵 ， 它 包含 着 改变 了 比例 的 核心 矩阵 的 所 有 第 四 行 以 下 的 
所 有 表 列 值 ， 其 余 的 表 列 值 全 部 为 0。 

(4) 从 下 游 减 缩 矩阵 ， 可 以 很 容易 看 出 反应 S、9 和 反应 10 是 途径 P1、P2 和 途径 P3 的 共 
同 途 径 。 因 为 途径 P5 不 含有 这 些 步骤 中 的 任何 一 个 ， 它 的 列 〈 即 反应 7) 中 的 剩余 的 表 列 值 

334 


被 放 进 反应 组 B。 反 应 组 C 包含 了 前 三 条 途径 中 的 剩余 反应 ， 它 的 组 核心 矩阵 包括 了 改变 了 比 
例 的 核心 矩阵 中 的 前 三 列 从 第 五 行 开始 的 表 列 值 ， 如 改变 了 比例 的 矩阵 中 的 方 框 所 示 。 
(5) 分 支 C 中 的 共同 途径 〈 反 应 S、9 和 反应 10) 将 随后 用 于 确定 下 一 个 分 支点 。 那 个 


， 下游 分 支点 的 上 游 反应 组 A 除了 包括 这 条 共同 途径 外 ， 还 包括 这 个 (FDPMGAP) 分 支点 的 


反应 组 A 和 反应 组 B。 

这 些 分 支 途径 的 通 量 很 容易 通过 改变 了 比例 的 和 矩阵 和 与 观测 到 的 有 关 通 量 来 求 出 。 这 
样 ， 分 支 途径 A 的 通 量 就 是 通过 反应 4 的 与 碳 代谢 相 联系 的 通 量 。 分 支 途径 B 的 通 量 仅仅 
是 通过 反应 7 的 通 量 的 一 半 ， 因 为 这 步 反 应 仅 消耗 1/2 当量 FDP。 最 后 ， 通 过 分 支 途径 C 
的 通 量 可 以 通过 其 它 两 个 通 量 的 差 值 来 确定 。 因 此 有 : 


* 1 1 
ps Ja=SJiet ist Jt gd1=Ja- FJ 
poe Ja=3J7 (19 12) 


pos Jo=SSietJis+Ji7=Ja- SJ 6— 1 

分 支点 4 一 一 XSP+CHR 

(1) 三 个 反应 (5、9 和 10) 是 分 支点 EDPVMGAP 下 游 途 径 P1 一 P3 的 共同 途径 。 如 果 对 
这 些 反 应 按照 化 学 计量 比例 2:1:1 进 行 平 衡 ， 则 生成 5- 磷 酸 木 酮 糖 (XSP) 和 分 支 酸 
(CHR) 而 没有 任何 中 间 代 谢 物 的 净 生 成 。 因 此 ， 这 是 具有 两 个 连接 代谢 物 的 一 个 分 支点 的 
不 寻常 的 情况 。 但 是 ， 这 并 不 是 问题 ， 因 为 在 稳 态 条 件 下 XSP 和 CHP 总 是 必须 一 起 被 生成 
和 消耗 。 

(2) 取决 于 连接 代谢 物 的 选择 ， 共 同 途 径 的 生产 步骤 是 反应 9 或 反应 10。 由 于 在 稳 态 下 
这 两 个 步骤 的 通 量 是 相当 的 ， 因 此 选择 XSP 或 CHP 都 可 以 。 任 一 选择 都 可 以 得 到 下 面 改 变 
了 比例 的 核心 矩阵 : 


(3) 将 数值 为 2、1 和 1 的 表 列 值 分 别 置 人 矩阵 的 第 S、9 和 第 10 行 可 以 得 到 在 这 个 分 
335 


支点 上 游 反 应 组 工 核心 矩阵 的 三 个 列 。 从 改变 了 比例 的 核心 矩阵 中 减 去 组 直 后 ， 得 到 如 下 
一 个 下 游 减 缩 核 心 矩 阵 : 


1 
0 
0 
0 
0 
0 
0 
0 
0 
1 
0 
0 
0 
1 
1 


一 一 一 一 一 一 一 
一 


(4) 可 以 看 出 在 第 五 行 有 一 个 非 零 的 表 列 值 ， 这 表明 通过 这 个 反应 的 剩余 的 一 部 分 通 量 
将 包括 在 相应 于 途径 Pl 的 下 游 分 支 途 径 中 。 反 应 5 的 这 一 部 分 是 由 反应 14 所 生成 的 GAP 
循环 所 需要 的 。 从 这 个 下 游 减 缩 核心 矩阵 或 图 12.7 中 可 以 明显 地 看 出 ， 色 氨 酸 途径 消耗 这 
两 种 连接 代谢 物 不 同 于 其 它 两 条 途径 。 因 此 ， 反 应 组 B 由 途径 P1 中 的 剩余 反应 构成 ， 反 应 
组 C 由 途径 P2 和 途径 P3 中 的 剩余 反应 构成 ， 都 使 用 反应 11 和 反应 15. 
(5) 分 支 途径 C 中 的 共同 途径 〈 反 应 11 和 反应 15) 随后 将 被 用 于 确定 下 一 个 分 支点 。 
这 个 下 游 分 支点 的 上 游 反 应 组 A 将 包括 这 两 个 步骤 ， 此 外 还 包括 早 些 时 候 求 出 的 反应 组 A 
和 反应 组 B。 
以 分 支 酸 的 一 个 单一 等 价 物 形式 ， 从 上 游 反 应 组 流 和 人 这 个 分 支点 的 通 量 等 于 反应 10 的 通 
量 。 流 入 反应 组 B 的 通 量 等 于 反应 14， 或 等 价 地 ， 等 于 反应 18 的 通 量 。 流 和 人 反应 组 C 的 通 量 
显然 是 其 它 两 个 组 通 量 的 差 值 ， 而 且 也 等 于 反应 11 的 通 量 。 因 此 这 些 通 量 可 以 用 下 式 来 表示 : 
xtJ a=Jist+Ji6+Ji7=Ji0 
x/cJ B= J1g=J 14 (12.13) 
ecJc— Jip Jit 
分 支点 5 一 一 PPH 
(1) 为 葵 丙 氨 酸 和 酪 氨 酸 两 条 合成 途径 GRE Pl 和 途径 P2) 所 共用 的 两 个 其 余 步 骤 是 
反应 11 和 反应 15。 反应 1S 仅仅 是 循环 1 当量 未 被 利用 的 XSP 返回 到 GAP 分 支点 处 ， 而 反 
应 11 生成 了 最 后 分 支点 代谢 物 ， 预 葵 酸 (PPH). 
(2) 显然 反应 11 是 这 条 途径 的 生产 步 又 。 因 为 反应 组 C 中 的 反应 11 和 反应 15 的 表 列 
值 已 经 被 平衡 过 并 且 相 等 ， 因 此 没有 必要 再 改变 比例 了 。 
(3) 反应 组 世 由 共同 途径 反应 11 和 反应 15 构成 。 反 应 组 A 由 这 些 反 应 以 及 包括 在 分 
A XSP + CHR 的 反应 组 A 和 反应 组 了 组 成 。 当 从 核心 矩阵 中 减 去 第 11 和 第 15 行 的 表 
336 


列 值 后 ， 得 到 一 个 仅 有 以 下 表 列 值 的 下 游 减 缩 矩阵 : 


(4) 因为 在 这 两 条 途径 (P2 和 P3) 中 已 经 没有 更 进一步 的 共同 特征 ， 每 条 途径 中 的 番 
余 反 应 被 分 成 两 个 下 游 反应 组 。 分 支 途 径 了 包括 反应 12 和 反应 16， 其 生成 葵 丙 氮 酸 ， 而 分 
支 途 径 C 是 由 专用 于 酷 氨 酸 的 途径 一 一 反应 13 和 反应 17 所 构成 。 反 应 12 和 反应 13 分 别 是 
这 些 反应 组 的 消耗 步骤 。 
围绕 预 苯 酸 分 支点 的 通 量 的 确定 当然 是 这 个 系统 中 最 简单 的 。 来 自 上 游 分 支 (A) 的 通 
量 是 反应 11 的 通 量 ， 而 下 游 分 支 途 径 的 通 量 等 于 通过 这 些 反 应 中 任何 一 个 的 通 量 。 因 此 ， 
围绕 这 个 分 支点 的 通 量 如 下 所 示 : 
本 二 这 16 二 了 条 二 JJ 
ppHJ B=J16=J 12 (12.14) 
ppHJ c=J17=J 13 
由 上 述 的 程序 所 识别 的 分 支 结 构 如 图 12.11 所 示 。 从 这 张 表 示 与 碳 - 代 谢 相 关 通 量 及 能 
量 -代谢 相关 通 量 的 图 应 当 清楚 看 出 ， 这 个 代谢 网 络 包括 一 系列 分 又 的 分 支点 ; 每 一 条 独立 
途径 都 与 一 种 由 一 个 输出 步骤 形成 的 分 这 产物 相 联 系 。 对 这 些 所 分 弯 的 代谢 物 的 积累 的 测定 
以 及 其 它 副 产物 〈 在 这 个 例子 中 是 CO ACE) 的 测定 ， 为 用 第 8 章 一 第 10 章 中 所 介绍 的 
方法 来 估计 通过 每 一 条 独立 途径 的 通 量 提供 了 方法 手段 。 此 外 ,用 第 13 章 开始 部 分 所 介绍 


{ . 用 于 ATP 生 成 的 
G6P 1 共同 途径 
dh 


P6 P1~PS 


ADP FE ee FR 


(a) 


图 12.11 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 网 络 的 分 支点 
系统 的 五 个 分 支点 及 独立 途径 如 图 所 示 。(a) 和 能 量 有 关 的 分 支点 满足 了 生成 产物 的 途径 P1 一 P5 和 
途径 P6 对 ATP 的 过 量 需求 ; (b) 四 个 下 游 分 支点 将 五 条 独立 途径 分 离 


337 


的 方法 ， 在 发 酵 过 程 的 不 同 阶段 或 啊 应 于 所 诱导 的 扰动 所 引起 的 这 些 积累 物 的 变化 可 以 用 于 
定量 评价 由 每 一 个 反应 组 所 施加 的 动力 学 控制 。 第 13 章 中 将 从 讨论 对 组 控制 系数 的 理论 推 
导 和 依据 通 量 估算 值 对 它们 进行 计算 的 方法 开始 ， 接 着 将 介绍 通过 重大 反应 组 的 分 析 来 确定 
单个 控制 系数 的 程序 。 最 后 将 说 明 如 何 用 这 一 章 所 识别 的 分 支点 来 确定 S. cerevisiae 研究 
实例 中 的 控制 结构 ， 以 及 如 何 将 它们 的 相应 的 反应 组 用 作对 该 网 络 的 控制 结构 进行 详细 检验 
的 基础 。 


参考 Xx wR 


Brown, C., Hafner, R. P., & Brand, M. D. (1990). A “top-down” approach to determination of control coeffi- 
cients in metabolic control theory. European Journal of Biochemistry 188; 321-325. 

Galazzo, J. L. & Bailey, J. E. (1990). Fermentation pathway kinetics and metabolic flux control in suspended and im- 
mobilized Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology 12; 162-172. 

Galazzo, J. L. & Bailey, J. E. (1991). Errata. Enzyme and Microbial Technology 13; 363. 

Kacser, H. & Burns, J. A. (1973). The control of flux. Symposia of the Society for Experimental Biology 27; 65- 
104. 

Reder, C. (1988). Metabolic control theory: a structural approach. Journal of Theoretical Biology 135; 175-201. 

Simpson, T. W., Colon, G. E., & Stephanopoulos, G. (1995). Two paradigms of metabolic engineering applied to 
amino acid biosynthesis. Biochemical Society Transactions 23; 381-387. 

Stephanopoulos, G. & Simpson, T. W. (1997). Flux amplification in complex metabolic networks. Chemical Engi- 
neering Science 52; 2607-2627. 


338 


第 13 章 代谢 网 络 的 通 量 分 析 


借助 于 加 和 定理 ， 控 制 系数 是 可 加 的 。 因 此 ， 有 可 能 把 一 个 代谢 物 上 游 或 下 游 的 任何 数 
目的 反应 看 成 是 一 个 单一 步 又。 事实 上 ， 当 存在 于 一 条 未 分 支 途 径 内 的 反应 不 能 轻易 地 通过 
实验 互相 区 分 时 ， 这 种 反应 集 总 常常 是 必要 的 。 例 如 ， 在 我 们 的 S$ .cerevisiae 实例 研究 中 ， 
这 种 邻近 反应 的 分 组 得 到 广泛 的 实施 ， 并 帮助 减少 所 考虑 的 单个 反应 的 数目 大 约 一 个 数量 
级 。 分 组 对 网 络 控制 结构 确定 的 影响 是 最 小 的 ， 因 为 按 定 义 接 近乎 衡 的 反应 具有 很 小 的 控制 
系数 。 因 此 ， 把 它们 添加 到 局 部 速率 控制 步骤 的 控制 系数 上 ， 仅 能 最 小 限度 地 影响 后 者 的 数 
值 大 小 。 

更 重要 的 是 ， 有 可 能 把 反应 网 络 分 成 少 
量 的 反应 组 ， 正 如 在 第 12 章 说 明 的 。 严 格 地 
讲 ， 只 有 当 一 个 系统 具有 一 个 可 识别 的 连接 
代谢 物 ， 这 种 分 配 才 是 可 适用 的 ， 而 这 种 连 
接 代谢 物 是 惟一 的 渠道 ， 通 过 它 ， 其 它 不 同 
的 途径 或 过 程 被 连接 起 来 。 然 而 ， 正 如 在 前 
一 章 中 所 描述 的 ， 由 于 反应 组 的 构成 ， 有 可 
能 形成 反应 组 并 确定 连接 代谢 物 ， 即 使 组 之 
间或 参与 多 个 组 的 单个 反应 之 间 的 相互 作用 
存在 。 在 13.6 节 里 ， 我 们 会 再 考虑 这 一 点 。 
在 这 里 ， 我 们 还 注意 到 ， 这 种 反应 分 组 有 利 
于 在 具有 很 大 组 控制 系数 的 反应 组 内 ， 通 过 
缩小 搜寻 进行 关键 反应 步骤 的 识别 。 

在 13.1 节 和 13.2 节 ， 介 绍 了 确定 组 探 arms 
制 系数 的 两 种 不 同方 法 。 在 13.1 节 ， 严 格 定 


自 上 而 下 法 


代谢 网 络 的 控制 分 布 图 


组 通 量 
控制 系数 


单个 通 量 


控制 系数 
义 了 单个 控制 系数 与 组 控制 系数 之 间 的 关 一 
系 。 当 单个 FCCs 可 以 利用 时 ， 这 些 关系 允 pines 


VEX gFCCs 进行 确定 。 这 个 过 程 称 为 自 下 而 
上 (bottom-up) 法 , 在 13.3 节 中 通过 实例 
研究 对 其 进行 了 说 明 ， 组 控制 系数 是 通过 动 
力学 模型 确定 的 。13.2 节 引 人 了 一 种 方法 ， 
该 方法 利用 实验 通 量 测量 确定 组 控制 系数 。 通 过 适当 地 比较 这 些 组 控制 系数 ， 就 能 得 到 单个 
控制 系数 (13.4 节 )， 这 种 方法 因此 被 称 为 自 上 而 下 (top-down) 法 。 这 两 种 方法 的 结果 在 
13.3 节 的 实例 研究 中 进行 了 比较 。 图 13.1 以 框图 的 形式 对 这 两 种 方法 进行 了 说 明 。 


13.1 组 控制 系数 与 单个 控制 系数 之 间 的 关系 〈 自 下 而 上 法 ) 


从 数学 方面 讲 ， 对 于 包含 多 个 步骤 的 反应 组 N Xba, 的 影响 的 gFCC (组 通 量 控制 
系数 ) 等 于 这 些 步骤 对 相同 通 量 J, 影响 的 单个 FCC 之 总 和 : 


图 13.1 用 自 上 而 下 法 或 自 下 而 上 法 确定 
控制 分 布 的 信息 流 示意 


339 


"CH= DC} BERD, Hs (13.1) 
通常 gFCC 的 下 标 是 代表 一 个 明确 定义 的 反应 组 的 大 写字 母 ， 而 单个 FCC 的 下 标 是 单个 步 
又 的 序号 。 另 外 ， 因 为 反应 组 可 以 围绕 不 同 的 连接 代谢 物 进 行 描述 ， 如 上 一 章 所 述 ， 上 述 下 
标 可 以 用 来 表示 连接 代谢 物 。 对 之 ， 反 应 组 已 被 定义 。 
组 浓度 控制 系数 (gCCCs) 也 满足 类 似 的 加 和 和 关系， 因此， 反应 组 N 对 代谢 物 X; 的 
影响 : 
CN = Ce FE {1,25 +9 KG (13.2) 
注意 到 ， 组 控制 系数 有 效 地 服从 MCA 原则 ， 就 如 同 它们 就 是 单个 反应 的 控制 系数 一 样 。 同 
单个 反应 的 FCC 类 似 ，gFCC 表示 一 组 反应 对 一 特定 通 量 所 施 控制 的 程度 。 例 如 ， 如 果 已 
经 确定 出 组 控制 系数 ”六 较 小 ， 就 可 以 得 出 这 样 的 结论 : AN 中 各 反应 变化 的 共同 影响 也 
是 小 的 。 推 而 广 之 ， 组 内 单个 反应 的 影响 通常 可 认为 是 同样 的 小 ， 不 过 ， 如 果 在 组 N A 
些 反 应 对 一 个 通 量 施加 很 强 的 相反 的 影响 ， 情 况 就 不 会 严格 地 是 这 样 。. 
当 系统 内 一 个 单个 反应 的 通 量 被 分 配 进 围绕 两 个 (或 多 个 ) 分 支点 形成 的 两 个 〈 或 多 
个 ) 不 同 的 反应 组 时 ， 式 (13.1) AX (13.2) 会 出 现 特殊 的 情况 。 回 忆 一 下 ， 这 种 情况 在 
AEB ETH XPM, Gln, RRR eZ ATP. GOP 及 FDP 分 支点 的 上 
游 和 下 游 反 应 组 的 一 部 分 。 在 这 种 情况 下 ， 应 该 被 添加 到 特定 组 控制 系数 中 的 一 个 反应 的 控 
制 系数 的 部 分 等 于 通过 起 因 于 那个 反应 组 的 该 反应 的 通 量 的 分 数 ， 因 此 ， 式 (13.1) 可 更 一 
般 地 重 写 为 : 


CH= DONC? Beit; (2, webi (13.3) 


Ap, ON 是 通过 反应 ; 的 分 数 通 量 ; 反应 ; 被 认为 属于 反应 组 N A (WL 13.3 节 实 例 研 
究 )。 另 外 , 在 12.3 节 的 实例 研究 中 ， 几 个 组 通 量 是 以 实际 网 络 通 量 之 和 或 之 差 的 形式 被 定 
义 的 ， 如 式 (12.10) 一 式 (12.14) 所 示 。 在 这 种 情况 中 ， 对 于 一 个 反应 或 反应 组 对 所 组 合 的 组 
通 量 的 影响 ， 组 通 量 系 数 被 表示 为 gFCCs 对 各 单个 通 量 的 加 权 平均 。 因 此 ， 如 果 组 2Z 的 通 
BEBE, MJ. 的 和 ， 则 描述 组 N 的 变化 对 组 Z 通 量 的 影响 的 gFCC 可 由 下 式 给 出 : 


， "Cuda + CRJ2 
xmJz N N 
Saw nati 
更 一 般 地 ， 如 果 进 或 出 任 一 反应 组 2 的 通 量 以 网 络 通 量 的 形式 来 定义 : 
Jz= Sofi (13.5) 
k=1 
因此 ， 对 于 任何 组 N 对 通过 组 2 的 通 量 的 影响 ， 所 产生 的 组 通 量 控制 系数 由 下 式 给 出 : 
3 of “Chk k 
‘Cz = (13.6) 


HP, “Ch Hist (13.3) EM. 

对 代谢 物 库 的 gCCC 可 以 写 出 一 组 类 似 的 方程 ， 代 谢 物 库 是 两 个 (或 多 个 ) 实际 代谢 物 
浓度 的 总 计 ， 就 像 在 实例 研究 中 用 X5P 和 分 支 酸 的 情况 一 样 ， 例 如 ， 对 总 的 代谢 物 库 等 于 
cl+ca2 的 情况 〈 即 代谢 物 XI AX, 浓度 的 和 ) ， 其 组 浓度 控制 系数 可 定义 为 : 
CX, + O75 


¥en X1 +X 
ic 1 2 一 
六 cy +c? 


(13.7) 


340 


因为 组 通 量 控制 系数 是 作为 网 络 通 量 控制 的 重要 度量 标准 而 出 现 的 ， 有 必要 规定 其 确定 方 
法 。 显 然 ，gFCC 一 定 来 自 网 络 通 量 和 由 对 网 络 的 实验 扰动 所 导致 的 网 络 通 量 变化 。 在 下 一 
节 ， 将 会 看 到 围绕 连接 代谢 物 的 通 量变 化 测量 是 如 何 确定 组 控制 系数 的 。 


13.2 ”由 通 量 测量 确定 组 控制 系数 ( 自 上 而 下 法 ) 


在 第 11 章 ， 描 述 了 单个 通 量 控制 系数 确定 的 不 同方 法 ， 这 些 方法 常常 需要 接着 对 研究 
中 的 酶 活性 或 反应 速率 的 已 知 变化 进行 通 量变 化 的 测量 。 另 一 方面 ， 组 通 量 控制 系数 一 般 不 
能 用 类 似 的 方法 来 确定 ， 原 因 很 简单 ， 因 为 除非 组 内 每 一 反应 的 活性 发 生 等 同 的 变化 ， 通 常 
不 可 能 控制 整个 反应 组 的 活性 变化 。 因 此 ， 有 必要 开发 一 种 根据 反应 组 内 的 策略 扰动 来 确定 
组 控制 系数 的 方法 。 这 一 节 仿 效 Stephanopoulos 和 Simpson (1997 年 ) 的 工作 介绍 了 这 种 
方法 。 这 种 方法 是 基于 Small 和 Kacser (1933a，b) 所 发 展 的 大 扰动 理论 (11.5 节 )。 对 分 
支 途径 及 复杂 网 络 ， 已 经 扩展 了 Small 和 Kacser 的 理论 ， 以 确定 来 源 于 反应 组 内 单个 步骤 
的 扰动 的 组 控制 系数 。 在 这 种 分 析 中 ， 每 一 反应 的 可 逆 一 级 动力 学 的 假定 ， 自 然 地 扩展 到 每 
个 组 的 总 体 动 力学 ， 如 11.5 节 所 示 的 那样 。 以 下 将 提供 确定 在 平衡 的 分 支 反 应 网 络 中 组 或 
单个 控制 系数 的 程序 。 应 该 注意 到 ， 在 一 个 未 分 支 途 径 中 ，11.5.1 节 中 所 证 明 演 示 的 程序 
是 全 面 的 。 

在 分 支 网 络 中 ， 组 浓度 控制 系数 的 确定 需要 连接 代谢 物 浓度 的 测量 ， 还 需要 测定 由 连接 
代谢 物 进入 每 个 反应 组 的 通 量 。 这 种 测量 必须 在 检查 中 〈 即 基态 ) 的 稳 态 条 件 下 完成 ， 同 时 
还 在 对 基态 不 同 诱导 的 扰动 之 后 得 到 的 稳 态 条 件 下 来 完成 。 此 外 ， 每 一 个 这 样 的 扰动 一 定 来 
源 于 单个 反应 组 内 的 一 个 或 多 个 反应 。 这 些 扰动 的 例子 包括 由 酶 的 调控 变化 而 引起 的 活性 改 
变 、 该 组 内 表达 酶 的 基因 的 拷贝 数 的 增加 或 者 通过 其 外 部 底 物 浓度 的 变化 所 致 的 运输 步骤 的 
增强 。 不 能 被 局 限 在 单个 反应 组 内 的 系统 扰动 〈 例 如 温度 和 pH 的 变化 ) ， 一 般 不 服从 下 面 
叙述 的 分 析 结 果 。 

作为 一 个 经 验 规则 ， 三 个 扰动 的 最 小 值 ， 其 中 每 一 个 均 来 自 不同 的 组 ， 被 用 来 确定 分 支 
网 络 中 的 所 有 组 控制 系数 。 然 而 ， 一 个 设计 良好 的 扰动 可 以 产生 足够 的 信息 ， 以 至 于 只 需要 
一 个 另外 的 扰动 而 不 是 两 个 即 可 。 下 面 介 绍 这 两 种 情况 。 

13.2.1 从 三 个 扰动 确定 gFCCs 

这 里 描述 ， 从 基态 时 的 通 量 和 对 三 个 分 支 的 每 一 个 扰动 所 产生 的 通 量 ， 来 确定 围绕 一 个 
分 又 分 支点 的 组 控制 系数 。 原 则 上 ， 在 基态 下 及 三 种 扰动 状态 下 三 个 组 通 量 的 测量 对 全 部 
gFCCs 的 确定 是 必要 的 和 足够 的 。 另 外 ， 如 果 每 一 个 扰动 对 代谢 物 浓度 的 影响 被 测量 ， 组 
浓度 控制 系数 也 就 可 以 确定 。 

该 方法 是 对 图 12.8 中 描绘 的 简单 分 支点 而 介绍 的 。 该 图 适用 于 所 有 复杂 的 代谢 网 络 。 
因而 ， 围 绕 适 当 定 义 的 分 支点 的 每 一 种 稳定 状态 可 以 通过 连接 代谢 物 Xi 的 水 平 及 三 个 组 通 
量 JA、Ja 及 JJ 来 表征 。 其 中 每 一 个 通 量 代 表 从 连接 代谢 物 进 入 相应 组 的 通 量 ， 反 之 亦 然 
( 见 12.3 节 )。 因 为 这 种 分 析 涉 及 到 四 种 单独 的 状态 〈 基 态 以 及 三 种 扰动 之 后 所 达到 的 状态 ) 
的 通 量 ， 每 一 种 状态 将 以 一 个 下 标 来 表示 ， 结 果 是 用,o 指 的 是 基态 下 通过 组 & 的 通 量 。 
Jens Jews Je cP A AL BAC 的 扰动 所 产生 的 通过 组 & 的 新 稳 态 通 量 。 

回忆 一 下 11.5 节 的 情况 ,每 一 种 扰动 状态 均 可 被 单个 扰动 常数 K; 来 表征 ， 这 样 以 
2T: 

34] 


xo xo xo 
CA CF 2 ie 


nl ih. ey (13.8) 
式 中 ， 太 为 通 量 扩 增 因子 ， 其 定义 为 每 个 扰动 后 的 通 量 与 其 基态 下 扰动 通 量 的 比值 : 
并 = 六 i, RE{A, B, C} (13.9) 
k,0 


式 (13.8) 把 gFCCs 与 放大 因子 及 扰动 常数 给 予 关 联 。 此 方程 的 形式 显示 : 一 个 特定 扰动 
导致 的 每 一 个 组 通 量 的 分 数 变化 正比 于 来 自 扰动 源 与 组 有 关 的 组 分 的 gFCC 值 。 该 比例 常数 
在 所 有 三 个 分 支 上 是 相等 的 ， 并 且 由 扰动 常数 K, 来 定义 。 此 常数 值 反 比 于 相应 扰动 值 的 大 
小 。 此 外 ， 因 为 通 量 扩 增 因子 对 每 一 个 扰动 而 被 测量 ， 如 果 每 一 个 扰动 的 扰动 常数 已 知 的 
话 ，gFCC 就 可 从 式 〈13.8) 计算 出 来 。 扰 动 常 数 的 确定 将 在 下 面 描述 。 
对 此 分 支点 引入 加 和 定理 以 补充 式 (13.8)， 并 对 三 个 分 支 的 每 一 种 情况 可 表示 如 下 : 
Cn (13.10) 
以 通 量 扩 增 因子 和 扰动 常数 的 形式 ， 应 用 式 (13.8) 来 表达 式 (13.10) 中 的 组 控制 系数 ， 
由 加 和 和 定理 得 出 : 


Ka(f4—-1)+ Kp(f$%-1)+ K-(f'¢-1D=1 RE {A,B,C} (13.11) 
这 种 表达 可 按 以 下 定义 进一步 简化 : 
pape yeie es i,kRE {A,B,C} (13.12) 
k,0 


其 产生 以 下 三 种 加 和 方程 的 形式 
Kapat Kpp§+Kcpt=1 
Kapk+ KgpB+ Kcpé=1 (13.13) 
Kapkt+ Kpp$t+ Kcpé=1 
PA pB P Kz 


1 
1 ibe 
PK p& pel lKe 


尽管 看 起 来 这 三 种 扰动 常数 能 由 上 述 方 程 的 矩阵 求 逆 所 确定 ， 但 实际 上 并 非 如 此 ,这 是 
因为 按照 该 分 支点 物质 平衡 的 特性 ， 式 (13.14) 中 的 方 阵 实际 上 是 奇异 的 。 本 质 上 ， 在 分 支 
点 A 的 通 量变 化 不 是 独立 的 ， 因 为 其 通 量 一 定 总 是 等 于 其 它 两 个 分 支 通 量 的 和 。 因 此 ， 式 
(13.14) 仅 提 供 了 计算 扰动 常数 所 必需 的 方程 中 的 两 个 ， 第 三 个 方程 由 分 支 原 理 提 供 ， 即 : 

CE Ico 


或 者 以 矩阵 的 形式 


pa pe pe 
B pe 


PO Pw PP 


“Cp Is.0 (13.15) 
也 可 由 成 比例 的 通 量变 化 和 扰动 常数 的 形式 来 表示 : 
Ke Jcopt 

Ser ea (13.16) 


当 此 式 与 式 (13.14) 连同 使 用 ， 对 前 两 个 扰动 常数 ， 得 到 如 下 解 : 

hoe moe 

Keys LpX ppt+peq- 11 

一 旦 第 三 个 扰动 常数 由 式 (13.16) 确定 ， 所 有 9 个 组 控制 系数 可 从 下 式 计 算 : 
342 


(13.17) 


Ch=KAf—=1) i, RE 1ABSC) (13.18) 


【 例 13.1】 赖 氨 酸 生物 合成 途径 gFCCs 的 确定 

前 面 的 方法 已 被 应 用 到 天 冬 氨 酸 生 物 合成 途径 的 组 通 量 控制 系数 的 确定 (simpson et 
al，1998)。 表 10.1 和 图 10.2 所 概括 的 这 条 途径 是 第 10 章 通 量 确定 实例 研究 的 主题 。 在 那 
章 已 确定 出 赖 氨 酸 生产 的 关键 分 支点 是 丙酮 酸 。 实 际 上 ， 由 于 不 能 对 由 丙酮 酸 羧 化 酶 和 
PEP 羧 化 酶 所 催化 的 回 补 途径 进行 区 分 ， 在 定义 复合 Pyr/PEP 分 支点 时 ， 两 种 代谢 物 Pyr 
Al PEP 被 归并 到 一 起 。 通 过 应 用 上 述 方法 于 各 种 扰动 实验 所 获得 的 数据 〈 包 括 6- 磷 酸 葡 萄 
糖 脱 氢 酶 被 减弱 的 变异 体 、 葡 萄 糖 及 葡萄 糖 酸 发 酵 ， 添 加 氟 丙 酮 酸 以 专门 抑制 丙酮 酸 脱 氢 酶 
复合 物 的 活性 、 添 加 苏 氨 酸 以 抑制 天 冬 氢 酸 激酶 的 活性 以 及 添加 丙酮 酸 激酶 缺失 变异 体 )， 
以 下 三 个 反应 组 的 组 通 量 控制 系数 能 被 确定 : 分 支点 上 游 的 糖 酵 解 反应 〈 组 A) ， 呼 吸 循环 
(AB) 以 及 天 冬 氨 酸 生 物 合成 途径 (组 C)。 结 果 以 gFCCs (Ch) 的 形式 归纳 在 下 表 中 。 


被 扰动 的 组 (i) 受 影响 的 通 量 〈Jx) 


减少 葡萄 糖 添 加 量 
减弱 6- 磷 酸 葡萄 糖 变 异体 
添加 葡萄 糖 酸 

复合 培养 基 〈 工 业 发 酵 ) 
氟 丙 酮 酸 抑制 丙酮 酸 激酶 
天 冬 氨 酸 激酶 的 苏 氨 酸 抑制 


借助 于 组 通 量 控制 系数 的 特性 ， 这 个 表 概 括 了 上 述 反 应 组 中 每 个 组 对 通过 每 个 其 它 组 的 
通 量 所 施加 的 控制 。 可 以 看 到 ， 对 天 冬 氨 酸 的 大 部 分 通 量 控制 是 来 自 同一 条 途径 的 反应 ， 其 
它 两 组 的 影响 是 相当 有 限 的 。 根 据 对 和 赖 氨 酸 形成 的 可 能 限制 反应 的 推测 ， 其 中 包括 由 
NADPH 可 得 性 、ATP 或 丙酮 酸 等 方面 的 限制 ， 这 个 结果 是 有 意义 的 。 

我 们 也 应 注意 到 该 表 是 许多 〈 多 于 三 个 ) 不 同 扰动 实验 的 一 臻 结果， 其 基本 上 都 收敛 到 
相同 的 最 终结 果 。 由 完全 不 同 的 和 宛 余 的 扰动 实验 所 获得 的 gFCC 估计 值 之 间 的 良好 一 致 性 
增强 了 获得 gFCC 值 的 信心 ， 同 时 也 支持 上 述 方法 的 有 效 性 。 


13.2.2 ”从 已 表征 的 扰动 确定 gFCCs 

如 果 起 始 反应 组 总 活性 的 分 数 变化 是 已 知 的 ， 在 这 种 情况 下 ， 通 过 应 用 由 大 偏差 理论 所 
推出 的 关系 〈11.5 节 )，gFCCs 可 直接 从 它们 的 定义 来 确定 。 在 这 种 情况 下 一 个 扰动 被 认为 
是 已 表征 的 扰动 。 一 般 来 讲 ， 这 种 扰动 很 难 实施 ， 因 为 一 个 反应 组 的 总 活性 依赖 于 该 组 中 所 
有 反应 的 动力 学 。 结 果 ， 特 征 化 的 扰动 通常 仅仅 是 在 下 述 情况 下 才 有 可 能 ， 其 包含 一 个 单个 
反应 、 一 个 接近 完全 关闭 的 反应 组 或 整个 组 的 同时 扩 增 。 
引入 活性 扩 增 因子 ~; 以 表征 组 ; 内 的 扰动 : 

下 = 二 本 名 本 入， 有 C| (13.19) 
Ui ,0 

FEAT FE Fu, 0 0; ;分 别 代 表 组 ; 特征 化 扰动 前 后 的 总 活性 。 在 由 大 偏差 方程 所 假定 的 
可 闭 的 和 一 级 反应 动力 学 的 情况 下 ， 在 一 个 分 支 或 未 分 支 网 络 中 每 一 个 的 总 活性 也 是 可 道 的 
和 一 级 的 〈 见 11.5 节 )。 这 些 方程 给 出 了 扩 增 因子 和 扰动 背 数 之 间 的 如 下 关系 : 


343 


are i€ {A} B, C} (13.20) 


例如 ， 如 果 将 一 特征 化 的 扰动 ( 即 具 有 已 知 的 一) 引入 图 12.8 的 组 B， 在 基态 和 扰动 
状态 下 通 量 的 测量 允许 从 式 〈13.20) 直接 确定 Kp. WR KB 值 被 这 样 确定 ， 开 c 就 可 利用 
式 (13.16) MAC 的 未 特征 化 的 扰动 中 计算 出 来 ， 从 这 两 个 扰动 常数 ， 九 个 gFCCs 值 中 的 
六 个 就 可 通过 式 (13.18) 予以 确定 。 其 余 的 三 个 可 通过 加 和 定理 来 确定 ， 即 式 (13.10)。 

根据 这 些 表达 式 单 个 FCC 的 类 似 ， 在 一 个 单一 反应 中 一 个 特征 化 了 的 扰动 也 允许 来 确 
定 那 个 反应 的 单个 通 量 控制 系数 。 因 此 ， 对 于 反应 ; 中 的 一 个 特征 化 了 的 扰动 ， 通 过 每 一 反 
Mk 的 通 量变 化 的 测量 ， 就 可 求 出 一 个 单个 系数 (Small and Kacser, 1993 b) 

qpant iia’ hg ab oe (13.21) 

MAE, 7, 是 单个 步骤 的 活性 扩 增 因子 。 
13.2.3 gCCCs 的 确定 

一 旦 组 通 量 控制 系数 已 知 ， 连 接 代谢 物 的 组 浓度 控制 系数 便 可 确定 。 对 此 计算 所 需要 的 
惟一 附加 的 测量 是 连接 代谢 物 Xi 在 基态 下 〈ci,o) 和 每 一 扰动 态 下 (ci,;) 的 浓度 。 根 据 这 
些 测量 值 ， 通 过 下 面 的 关系 (Small and Kacser, 1993 b) ， 就 可 得 出 gCCC 的 值 : 


| 利 i€{A,BiGbi € it ae (13.22) 
对 未 被 扰动 的 任何 分 支 的 gCCC 值 可 从 加 和 定理 中 得 出 : 
Corre rey 0" meter hl (13.23) 


虽然 ， 仅 对 连接 代谢 物 而 言 ， 这 完全 正确 ， 但 是 通过 代替 适当 的 浓度 值 ， 这 些 方程 也 提供 了 
其 它 代谢 物 的 组 浓度 控制 系数 的 估计 值 。 这 些 gCCC 估计 值 的 重要 性 ， 在 13.5 节 通 量 扩 增 
的 讨论 中 会 很 清楚 。 
13.2.4 扰动 的 可 观察 性 

即使 对 任何 大 动力 学 扰动 的 一 般 情 况 推 出 了 上 述 的 方程 ， 每 一 种 扰动 的 实际 可 允许 的 大 
小 在 功能 上 是 受 约束 的 。 在 酶 活性 无 限 小 变化 的 极端 情况 下 ， 这 些 式 子 的 每 一 个 最 终 都 还 原 
为 系数 的 定义 。 然 而 ， 正 如 第 11 章 所 指出 的 那样 ， 非 常 小 幅度 的 扰动 会 遭受 大 的 测量 误差 ， 
因而 不 是 特别 有 用 。 从 另 一 极端 情况 来 讲 ， 非 常 大 的 扰动 可 能 扰乱 网 络 的 稳定 性 ， 导 致 不 可 
预料 的 代谢 变化 或 甚至 不 能 使 系统 达到 稳定 状态 ( 见 13.5 节 )。 这 两 种 极端 情况 最 好 通过 使 
用 已 知 能 产生 稳定 的 可 测量 的 影响 的 扰动 使 其 予以 避免 ， 或 者 使 用 一 系列 可 接受 的 扰动 来 加 
以 避免 。 

最 后 一 点 是 关于 所 需要 的 扰动 的 数量 。 尽 管 从 原则 上 来 讲 ， 组 通 量 控制 系数 可 仅 从 两 个 
或 三 个 扰动 中 被 确定 ， 但 为 了 检验 结果 的 一 致 性 ， 利 用 多 于 所 需要 的 最 少 测量 是 明智 的 〈 见 
13.6 节 )。 这 一 点 在 例 12.2 中 得 到 了 证 明 。 然 而 ， 多 分 支点 的 分 析 不 能 被 围绕 每 一 分 支点 
的 三 个 或 更 多 个 扰动 的 需要 所 阻碍 。 事 实 上， 如 果 它 们 被 充分 定位 〈( 即 ， 在 围绕 每 个 分 支点 
的 单一 分 支 )， 在 一 个 分 支点 的 分 析 中 所 使 用 的 扰动 也 能 用 于 任何 数目 的 其 它 分 支点 ， 只 要 
适当 的 通 量 能 被 测量 即 可 。 因 此 ， 六 个 战略 上 设置 的 扰动 可 以 容许 围绕 四 个 不 同 连接 代谢 物 
的 gFCCs 的 确定 而 且 也 对 每 一 个 提供 一 个 一 致 性 检验 。 此 概念 的 衍生 结果 在 13.4 节 中 更 充 
分 地 探讨 ， 在 13.4 节 中 将 表明 邻近 分 支点 的 分 析 允 许 关 键 步骤 搜寻 的 定位 ， 同 时 也 允许 某 
些 单 个 控制 系数 的 确定 。 

344 


实例 研究 


在 这 一 节 中 
支点 通 量 控制 前述 中 的 应 用 。 


13.3 


说 明 自 下 而 上 法 及 自 上 而 下 法 在 分 


实例 研究 对 象 ， 举 例 


以 S.cerevisiae 为 


’ 


通过 对 模拟 网 络 应 用 表 12.2 的 动力 学 表达 式 ， 所 有 单个 FCC 及 CCC 可 以 解析 确定 。 
计算 是 通过 稳 态 代谢 物 浓 度 和 通 量 平衡 的 解 来 进行 ， 接 下 来 使 用 11 章 的 方法 确定 控制 系数 。 


13.3.1 组 控制 系数 的 解析 确定 〈 自 下 而 上 法 ) 


反应 4 对 大 部 分 网 络 通 量具 有 


FN 


结果 列 在 表 13.1 和 表 13.2 中 ， 在 这 两 张 表 中 的 数值 检验 显 


很 强 的 ATP 依赖 


型 动力 学 〈 见 表 12.2)。 下 面 将 表明 与 PFK 步骤 相关 的 大 控制 系数 是 如 何 反映 在 适当 的 组 


很 大 的 控制 程度 。 这 是 由 磷酸 果糖 激酶 (PFK) 所 催化 的 步骤 ， 其 展示 出 


以 及 如 何 能 从 适当 的 组 控制 系数 的 大 小 中 推论 出 来 。 


控制 系数 的 大 小 中 的 ， 


AO) 
2 
i Re eh ee 


被 扰动 的 反应 
| 人 3 由 避 村 站 开本 | 5 | 6 | 


aaa. _Sosis 


i — 
| | 


表 13.1 氨基酸 生物 合成 网 络 的 通 量 控制 系数 " 


oooooocoocoocoocoocoococeoco 


a 


SSSSSSSSSESSSES 


coomoocoocococococococo 
| 


ae 


~ 
| Se 


18 


Sal 
wz |laenntnonanSsnaanres 


tTr7FrO 避 Ot Oo 20 
eoeooeooornnocoonrn 


ee 


一 QQoam+TdmnSDCo 小 


@ 用 结构 方法 (Reder， 
WR k 的 通 量 的 影响 。 


1998) 解析 确定 相应 于 网 络 基态 的 通 量 控制 系数 。 每 一 个 系数 Cle 描述 了 反应 ;的 扰动 对 通 


@ 反应 号 与 图 12.1 的 序列 号 一 致 。 


345 


表 13.2 氨基酸 生物 合成 网 络 的 浓度 控制 系数 中 
被 扰动 的 反应 iP 


o:cko ©& oOo 一) 一生 E 一 一 一 人 一 | 


© 用 结构 方法 (Reder, 1998) 解析 确定 相应 于 网 络 基 态 的 浓度 控制 系数 。 每 一 个 系数 C 六 描述 了 反应 ; 的 扰动 对 
代谢 物 Xi 浓度 的 影响 。 

@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 

注 : CHR 一 分 支 酸 ; PPH—MAM; X5P 一 5- 磷 酸 核 酮 糖 ， Phe-KAAR; Tyr 一 酷 氨 酸 ; Try 一 色 氨 酸 。 


分 支点 中 二 一 人] 有 

ATP 是 此 网 络 中 最 主要 的 连接 代谢 物 ， 正 如 12.3 节 所 证 明 的 那样 〈 鼓 励 读 者 在 下 面 的 
讨论 中 参考 该 节 )。 围 绕 此 分 支点 的 组 控制 系数 的 确定 必须 用 一 个 清晰 的 通 量 定义 开始 ， 而 
这 些 通 量 在 每 一 个 反应 组 内 均 应 予以 计算 。 对 与 其 它 分 支 中 的 任何 一 个 都 没有 共同 反应 的 分 
支 B 的 通 量 等 于 反应 8 的 通 量 。 另 一 方面 ， 分 支 A 中 的 反应 与 分 支 C 中 的 反应 发 生 重 春 ， 
因为 通过 糖 酵 解 途径 与 能 量 相关 的 通 量 仅仅 是 通过 反应 1、2、4 与 5 的 通 量 的 一 部 分 。 因 
此 ， 有 必要 确定 应 当 考 虑 属于 分 支 A 的 这 些 步 又 中 每 一 步 的 确切 分 数 。 正 如 在 式 〈12.10) 
中 所 确定 的 ， 通 过 分 支 A 的 真正 通 量 是 由 通过 反应 6 的 通 量 所 定义 的 ， 因 为 这 个 反应 完全 


归属 于 分 支 A 中 。 因 此 ， 给 〈 归 属于 分 支 A 中 的 反应 工 的 通 量 的 分 数 ) SEL. Th 
OS EF Je/Js, GABE JoJo 或 1。 这 些 分 数 也 可 通过 图 12.9 所 示 的 组 A 的 核心 矩阵 予以 
346 


| 
: , 


严格 确定 。 例 如 ， 对 反应 1 ASK (12.8), 组 A 内 反应 1 的 总 通 量 为 : 
Th=3hist ist Int Is+5J1+ 5 Je=Is (13.24) 


[这 个 结果 可 通过 将 组 核心 矩阵 A (图 12.9) 中 反应 1 的 表 列 输入 值 除 以 比例 因子 和 乘 以 特 
征 通 量 而 获得 ] BA, Oh 是 这 个 结果 对 I Mi, J, AR 1 的 总 通 量 。 通 过 反应 1、 
2、4 及 反应 5 的 其 余 通 量 被 置 于 分 支 C 中 ， 在 分 支 C 中 也 包括 反应 3、7 及 反应 9 一 反应 18 
( 见 图 12.9 中 所 示 的 组 核心 矩阵 )。 属 于 每 一 个 组 的 通 量 可 同样 地 确定 。 

一 旦 与 每 组 相关 的 通 量 系数 已 经 弄 清 ，gFCC 就 可 由 表 13.1 的 单个 通 量 控制 系数 用 
13.1 节 的 方程 计算 出 来 。 为 简单 起 见 ， 用 对 应 于 与 分 支 了 的 一 个 扰动 的 gFCC 开始 ， 因 为 
分 支 B 仅 包含 反应 8。 由 于 通过 分 支 A 的 通 量 为 J6，*C 人 = Cg=0.04。 类 似 地 ，“C 年 = 
C 太 = 0.9。 因 为 分 支 C 的 通 量 是 在 两 个 单个 反应 通 量 的 差 , *C 和 f 应当 通过 利用 表 12.4 中 的 
通 量 数据 并 应 用 式 〈13.6) 求 出 。 因 此 ， 

_ ICE 一 JeCe 
Jew ds 
事实 上 ， 这 是 式 (13.6) 的 一 个 一 般 结 果 。 对 应 于 一 个 特定 扰动 了 的 分 支 的 第 三 个 gFCC 可 

由 前 两 个 来 确定 : 


"Cle —0.05 (13.25) 


‘Ia CAAT BC? 
ie: 
对 于 在 分 支 A 中 的 一 个 扰动 对 其 自身 的 影响 ， 有 必要 应 用 式 (13.3): 
C= (ZJo/I1 Cr+ (FJo/Iz)Ce+ (ZJo/Ia)Ce+ Io/Is)Ce+ C8=0.59 (13.27) 
eps, “Cle Waa FA Crs 取代 式 (13.27) 中 的 每 个 Cys 确定 而 得 到 为 1.05。 通 过 用 
式 (13.26)， 从 这 两 个 结果 得 出 *CAx 为 0.54。 其 余 的 三 个 gFCCs 可 从 加 和 定理 求 得 。 这 些 
结果 总 结 在 表 13.3 中 。 


*Clc i€{A,.B, C} (13.26) 


表 13.3，ATP 分 支点 的 组 控制 系数 中 


被 扰动 的 分 支 N 


lo.41 20.41 40.56 Soo 6 
8 
lo.so 20.59 3 40.44 Sog 7 9~18 


@ gFCCs 以 'C 的 形式 表示 。gCCCs A" CA MBRRA 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 下 标 值 代表 归 ， 即 包含 在 分 支 N 中 的 上 述 反应 通 量 的 分 数 。 


所 得 的 gFCC 表明 ， 分 支 A 对 所 有 三 个 分 支 都 施加 着 显著 的 控制 。 另 一 方面 ， 分 支 也 
仅 影 响 其 本 身 。 最 后 ， 分 支 C 对 其 本 身 及 分 支 A 施加 着 显著 的 正 控 制 ， 但 对 分 支 B 施 加 很 
强 的 负 控 制 。 然 而 ， 与 其 它 两 个 相 比 ， 只 给 了 分 支 B 一 个 相当 小 的 通 量 ， 这 可 断定 为 一 个 
非 关 键 分 支点 ， 因 为 从 分 支 A 流 进 分 支 C 显然 居 统 治 地 位 ， 且 实际 上 不 受 分 支 也 的 影响 。 
然而 ， 在 分 支 A 和 C 之 间 控 制 的 分 布 和 组 浓度 控制 系数 的 相对 重要 程度 可 能 使 得 这 个 分 支 
点 值得 更 密切 的 检验 。 

分 支点 2 一 -一 0- 磷酸 葡萄 糖 (GOP) 

在 GOP 分 支点 ， 多 聚 糖 形 成 的 途径 从 糖 酵 解 途径 分 出 又 来 。 因 为 与 能 量 相关 的 酵 解 通 

347 


量 已 经 被 划分 到 上 游 反 应 〈 在 ATP 分 支点 )， 仅 仅 与 碳 相 关 的 通 量 流入 G6P 分 支点 ， 正 如 
式 〈12.11) 所 得 出 的 。 从 图 12.10 回想 到 ， 与 全 部 能 量 有 关 的 糖 酵 解 途 径 部 分 (ATP 分 支 
点 的 组 A 或 组 Anrep) 被 认为 是 在 GOP 分 支点 的 组 A 中 ， 但 从 分 支 Ac6p 进 入 GOP 分 支点 的 
通 量 是 仅 与 碳 有 关 的 通 量 。 分 支 Bcep 全 部 由 反应 3 组成， 分 支 C 由 G6P 下 游 的 其 余 步骤 组 
成 ， 正 如 图 12.10 的 组 核心 矩阵 所 示 。 

让 我 们 转 到 从 表 13.11 中 的 FCCs 值 来 确定 这 个 分 支点 的 gFCCs。 因 为 分 支 了 最 简单 ， 
仅 由 反应 3 组 成 ， 首 先 来 确定 它 相应 的 gFCC fA. GR, “Ce SFC?MI.99, HACER 
C% 均 为 零 ， 由 此 推出 5 作为 零 。 由 这 些 通过 式 (13.25) 得 出 *C 丰 非常 接近 于 零 ， 分 支 A 
中 一 个 扰动 的 影响 必须 根据 13.1 节 中 的 方程 来 确定 。 因 此 ， 


CR= CR= Cet Cet (二 Je 人 014]CP+ (Je[1s)CP+ CB + Ce=0.83 (13.28) 
因为 Js 和 Jc 均 是 从 许多 反应 的 通 量 的 形式 按 式 (12.11) 来 定义 的 ， 必 须 用 式 
(13.6) 确定 出 其 中 一 个 。 考 虑 来 自分 支 A 的 通 量 ， 它 等 于 刀 -十 J6。 首先 "CR (0.53) 


和 ;CN (0.67) 都 必须 以 如 式 (13.28) 同样 的 方式 ， 通 过 用 2 和 6 分 别 取代 该 式 上 标 中 的 3 
而 计算 。 一 旦 这 些 值 求 出 ， 对 分 支 A 通 量 应 用 式 (13.6) ， 得 出 : 
i'Ck-hys'C 
C= a ae ae (13.29) 
J2— 556 

其 余 的 gFFCs 可 通过 加 和 定理 和 式 (13.26) 来 确定 。 结 果 列 在 表 13.4 中 。 这 个 分 支点 可 
有 效 地 处 理 为 一 条 未 分 支 途径 ， 因 为 分 支 B 的 通 量 是 不 显著 的 而 且 分 支 B 对 其 它 两 个 分 支 
几乎 没有 什么 影响 。 由 非常 小 的 组 浓度 控制 系数 的 补充 揭示 ， 很 清楚 ， 这 不 是 一 个 关键 分 
支点 。 


表 13.4 6- 磷酸 葡萄 糖分 支点 的 组 控制 系数 


被 扰动 的 分 支 N i & “J, 的 gFCC gCCC 
D2 4h56 Ob6 (6 8 0.43 0.83 0.43 


3 
40.44 350.4 7 9~18 


® gFCCs W°Ck 的 形式 表示 。gCCCs 以 的 形式 表示 。 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 下 标 值 代表 归 ， 即 包含 在 分 支 N 中 的 上 述 反应 通 量 的 分 数 。 


分 支点 3—1 , 6-— FER RAB (FDP) /3-45 wR + ih HE (GAP) 

#£ FDP/GAP 分 支点 ， 产 生 甘 油 途 径 从 氨基 酸 生 物 合成 途径 发 生 分 又 。 因 此 ， 一 个 下 
游 组 (B) 仅 由 反应 7 组 成 。 上 游 组 (A) 由 反应 1 一 4 和 反应 8 以 及 通过 反应 $ 和 反应 6 的 
与 能 量 相 关 的 途径 组 成 ， 其 位 于 第 一 个 分 支点 的 上 游 。 分 支 C 包括 反应 $ 的 通 量 的 其 余部 
分 及 反应 9 一 18 的 通 量 。 因 为 计算 这 个 分 支点 的 组 通 量 控制 系数 的 程序 基本 上 等 同 于 前 面 分 
支点 计算 的 程序 ， 我 们 将 直接 得 出 结果 ( 表 13.$)。 进 而 ， 因 为 通过 分 支 B 的 通 量 相对 较 
小 ， 且 分 支 B 对 其 它 两 个 分 支 几 乎 没 施加 什么 控制 ， 因 此 这 个 分 支点 可 被 确定 为 非 关 键 分 
支点 。 另 外 ， 对 应 于 分 支 A 的 大 gFCCs 表明 主要 的 起 控制 作用 的 反应 位 于 这 个 分 支点 的 
上 游 。 

348 


# 13.5 FDP/GAP SX AHA HAR 


® gFCCs Vi"Ck 的 形式 表示 。gCCCs 以 *CRPe 的 形式 表示 。 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 下 标 值 代表 归 ， 即 包含 在 分 支 N 中 上 述 反应 通 量 的 分 数 。 


分 支点 4 一 一 3- 磷酸 核 酮 糖 (XSP) + 分 支 酸 (CHR) 

通过 这 个 网 络 的 第 四 个 分 支点 的 通 量 比 前 面 的 三 个 简单 许多 。 因 为 塌 合 的 与 能 量 有 关 的 
途径 全 部 位 于 该 节点 的 上 游 。 只 有 一 步 《〈 即 反应 5) 被 分 进 围绕 此 分 支点 的 不 同 的 组 内 。 这 
是 因为 要 求 通过 反应 5 的 少量 通 量 通过 反应 18 以 对 抗 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 进 入 3- 磷 酸 甘 油 醛 的 
循环 。 这 个 通 量 受 反 应 18 控制 ， 因 此 ， 分 支 也 内 由 计算 所 得 反应 5 HB ($8) 等 于 Jis7/ 
Js。 因 为 围绕 这 些 分 支点 的 组 通 量 的 每 一 个 等 价 于 单个 反应 的 通 量 ，gFCCs 的 计算 很 直接 
的 。 其 结果 列 于 表 13.6 中 。 然 而 ， 连 接 代谢 物 的 组 浓度 控制 系数 的 确定 并 非 如 此 简单 ， 因 
为 该 分 支点 是 按 XSP 和 CHR 产生 和 消耗 的 固定 比率 被 标记 的 。 


表 13.6 X5P+CHR 分 支点 的 组 控制 系数 〇 


EL 


1 一 4 50.98 6~10 


So. 14 18 


M15) 5—17 


D gFCCs WC! 的 形式 表示 。gCCCs 以 "Ci 的 形式 表示 。 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 下 标 值 代表 SY, MAREK N 中 的 上 述 反应 通 量 的 分 数 。 


首先 ， 从 分 支 B 开 始 ，XSP 和 CHR 的 gFCC 值 可 通过 式 (13.3) 的 CCC 类 似 形式 来 确定 : 
Col” = (Lage Oe ec = 0055 (13.30) 
CHR = (Jig ACHE + CHE + CGF == 2.06 (13.31) 
之 后 ， 利 用 式 (13.7) 得 : 
eee 5S 4 ‘OE teat 
Cxsp + CCHR ‘) 
对 其 它 两 个 分 支 ， 类 似 的 计算 也 可 进行 。 所 得 的 结果 CCCs ( 见 表 13.6) 非常 大 ， 表 
明 可 能 是 一 个 关键 分 支点 。 事 实 上 ， 大 的 浓度 控制 系数 暗示 这 会 太 容易 以 致 不 能 提高 或 降低 
这 些 代 谢 物 到 不 稳定 的 水 平 。 另 外 ， 组 通 量 控制 系数 被 跨越 分 布 于 所 有 三 个 分 支 中 ， 超 过 以 
前 的 任何 一 个 分 支点 。 总 之 这 个 分 支点 看 起 来 像 是 一 个 关键 点 。 
分 之 点 $ 一 一 预 某 酸 (PPH) 
此 网 络 中 的 最 后 一 个 分 支点 不 同 于 色 氨 酸 和 栈 氨 酸 途 径 。 这 是 要 分 析 的 最 简单 的 分 支 
点 ， 因 为 所 有 的 组 通 量 是 实际 的 反应 通 量 而 且 在 一 个 单一 分 文 内 每 一 步 都 完全 适合 ， 结 果 见 
# 13.7. 


‘Cc. —1.82 (13.32) 


349 


表 13.7 PPH 分 支点 的 组 控制 系数 


被 扰动 的 分 支 N 


iit J, HY gFCC 
Jp 
0257 
0.72 
—0.29 


@ gFCCs UC! 的 形式 表示 。gCCCs 以 * CH 的 形式 表示 。 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 


注意 到 ， 在 这 种 情况 下 ， 下 游 分 文中 没有 一 个 对 上 游 分 支 施加 显著 的 影响 。 然 而 ， 两 个 
下 游 分 支 强烈 地 控制 它们 自己 并 互相 控制 。 这 显然 是 柔性 分 支点 的 标志 ， 因 为 分 支点 代谢 物 
能 被 显著 地 转向 任 一 产品 。 这 些 数据 同 gFCCs 的 有 意义 的 值 相 结合 以 表明 这 个 分 支点 可 能 
也 是 一 个 关键 分 支点 。 

这 五 个 分 支点 的 每 一 个 组 控制 系数 的 大 小 ， 对 它们 在 控制 通过 该 网 络 的 通 量 中 可 以 起 的 
潜在 作用 有 重要 的 理解 。 在 13.4 节 ， 将 说 明 通 过 对 邻近 分 支点 gFCCs 值 的 比较 而 能 得 到 的 
附加 结果 。 然 而 ， 需 要 记 住 的 是 : 组 控制 系数 不 能 通过 自 下 而 上 法 进行 解析 计算 ， 就 像 我 们 
这 里 所 做 的 那样 ， 这 是 因为 缺乏 单个 通 量 控制 系数 的 信息 。 在 下 一 节 中 ， 将 说 明 如 何 利用 自 
上 而 下 法 通过 通 量 测量 从 实验 上 得 到 组 控制 系数 ， 以 得 出 类 似 于 在 这 里 所 得 出 的 结论 。 
13.3.2 gFCCs 实验 确定 的 模拟 〈 自 上 而 下 法 ) 

13.2 节 概 述 了 从 战略 扰动 实验 后 所 做 的 实验 通 量 测 量 而 计算 gFCCs 的 方法 。 在 本 节 
中 ,用 S . cerevisiae 的 动力 学 模型 通过 所 模拟 的 扰动 实验 对 这 种 方法 进行 证 明示 范 。 通 过 
改变 特定 反应 的 动力 学 参数 、 运 行 所 扰动 的 模拟 实验 、 计 算 所 产生 的 通 量 以 及 稳 态 浓 度 ， 每 
一 个 所 模拟 的 扰动 都 被 影响 。 通 过 这 些 条 件 与 基态 条 件 的 比较 〈 表 12.3 中 所 表示 的 ) ， 对 每 
一 次 模拟 扰动 ， 通 量 扩 增 因子 (FAF) 都 得 以 确定 。 这 些 FAFs 的 值 随后 被 用 于 13.2 节 的 
方程 中 ， 以 提供 在 每 一 分 支点 的 组 控制 系数 的 估计 值 。 

表 13.8 表明 对 每 一 分 支点 的 组 FCCs 所 得 到 的 结果 。 就 像 前 面 讨 论 的 那样 ， 这 些 技术 
BR: 只 要 独立 的 网 络 扰动 之 一 是 已 表征 的 ， 这 些 扰动 将 被 导入 围绕 一 个 连接 代谢 物 的 所 识 
别 的 三 个 分 支 中 的 每 一 个 中 ， 或 导 人 两 个 下 游 分 支 中 。 只 要 扰动 是 被 定位 于 一 个 单个 分 支 
内 ， 在 每 一 个 分 支 中 被 扰动 的 这 个 〈 些 ) 步骤 可 以 任意 选择 。 例 如 ， 在 ATP 分 支点 ， 因 为 
分 支 也 仅 由 单一 步骤 〈 反 应 8) 构成 ， 在 这 一 分 支 中 的 扰动 一 定 是 对 这 一 步 而 进行 的 ， 尽 管 
分 支 A 包含 五 个 反应 ， 其 中 仅 有 一 个 反应 〈 反 应 6) 被 完全 包含 在 该 分 支 中 。 因 此 ， 为 确保 
分 支 A 的 扰动 被 完全 定位 于 分 支 A 内 ， 反 应 6 必须 是 受 影 响 的 惟一 反应 。 由 于 分 支 C HR 
应 3、 反 应 7 和 反应 9 一 18 组 成 ， 所 以 为 在 分 支 C 内 进行 扰动 ， 反 应 CR) 的 选择 范围 就 
更 宽 些 。 在 实际 实验 中 ， 这 种 决定 会 依据 方便 实验 或 适 配 性 。 因 为 在 13.4 节 中 将 会 很 清楚 
的 一 些 原 因 ， 在 这 里 我 们 选择 反应 14。 另 外 ， 对 也 分 支 的 已 表征 的 扰动 的 应 用 使 得 在 这 种 
情况 下 A 分 支 中 的 扰动 没有 必要 了 ， 所 得 的 组 控制 系数 见 表 13.8 的 第 一 小 段 。 

虽然 对 这 些 模 拟 中 所 使 用 的 网 络 动力 学 的 扰动 可 以 采用 任何 数学 形式 ， 但 我 们 选择 使 用 
最 简单 最 直观 的 形式 一 一 比例 模型 (proportional scaling)。 因 为 比例 变化 在 物理 上 有 意义 而 
且 易 于 解释 ， 所 以 这 种 模型 很 方便 。 因 此 ， 通 过 对 反应 8 的 动力 学 表达 式 乘 以 0.5 ERB 
引入 已 表征 的 扰动 ， 通 过 加 倍 反 应 14 的 速率 使 分 支 C 受到 扰动 。 通 过 使 用 每 一 个 扰动 后 的 
动力 学 表达 式 ,就 可 以 计算 新 的 稳 态 .根据 式 (13.9) ,将 这 些 新 稳 态 下 的 通 量 与 其 基准 态 


350 


表 13.8 每 一 分 支点 的 组 控制 系数 
被 扰动 的 分 支 N 人 的 gFCC 
JB 


1. ten 2a27 
此 5 4 — 0.02 0.39 
—0.16 = Nie66 
0.89 0.18 
: 


被 扰动 的 步骤 iO 


亏 之 如 0.00 1.00 

4 之 ae) eit —0.18 
8 28.4 0.94 0.6 
7 —0.74 0.01 0.35 
0.05 


=~ 0:01 
® gFCCs BUC! 的 形式 表示 。gCCCs EW 'CH 的 形式 表示 。 活 性 扩 增 因子 r, 和 扰动 常数 Ky 也 在 表 中 有 所 表示 。 
Q@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 
@A 的 特征 性 扰动 也 被 用 于 这 个 分 支 。 


的 通 量 相 比 较 以 确定 通 量 的 扩 增 因子 。 由 该 分 支点 的 这 三 个 FAFs 值 用 式 (13.12) 一 式 
《13.20) 来 确定 组 通 量 控制 系数 。 这 些 计算 结果 见 表 13.8。 此 表 也 包括 了 每 一 组 对 连接 代谢 
物 ATP 影响 的 组 浓度 控制 系数 。 表 13.8 的 其 余 四 部 分 显示 对 于 网 络 其 它 四 个 分 支点 的 每 一 
个 的 类 似 扰动 的 分 析 。 

将 表 13.8 中 的 结果 与 用 自 下 而 上 法 所 计算 的 相应 的 gFFCs 相 比较 (4 13.3 一 表 BS i 
所 示 的 结果 被 认为 是 我 们 所 研究 的 网 络 的 正确 结果 )， 几 个 观察 结果 依次 如 下 。 第 一 
定量 的 一 致 不 是 特别 好 ， 但 这 些 结果 在 定性 上 是 可 比 的 : rt pds, 
和 gCCCs 的 同样 反应 步骤 ， 而 其 它 则 展现 类 似 的 趋势 。 例 如 ， 对 于 ATP 分 支 ， 它 们 表明 分 
支 A 及 在 一 个 较 小 的 程度 上 分 支 C 正在 强烈 地 控制 着 。 类 似 地 ， 也 表明 了 分 支 Acap 和 ArFpp 
的 显著 控制 。 一 个 分 支 影响 一 个 别 的 分 支 比 影响 另外 又 一 个 分 支 更 强烈 ， 这 种 趋势 也 被 可 靠 
地 估计 。 第 二 ， 不 符 之 处 或 者 是 由 于 实际 动力 学 显著 偏离 大 偏差 理论 所 假定 的 线性 化 的 动力 
学 ， 或 者 是 式 〈13.17) 的 矩阵 近 - 奇 异性 。 这 必然 与 开 ; 参数 中 一 个 参数 的 被 夸张 的 值 相 联 
系 。 在 这 种 情况 下 ， 从 这 个 特定 的 参数 K; 计算 出 的 gFCCs 一 般 是 不 可 靠 的 。 例 如 ， 组 
CppH 的 扰动 常数 比 组 A 或 组 B 的 扰动 常数 要 小 得 多 ， 这 种 情况 表明 分 支 CeppH 的 gFCCs 被 低 
估 了 ， 正 如 表 13.7 中 所 证 实 的 那样 。 第 三 ， 尽 管 努 力 试 图 把 这 些 影响 限定 在 每 个 分 子 内 ， 
对 很 差 的 gFCC 估计 的 另 一 个 原因 是 强烈 的 分 支 间 的 相互 作用 。 由 于 某 些 代谢 物 广 范围 变化 
着 的 影响 使 得 一 般 很 难事 先 预测 和 避免 这 样 的 相互 作用 。 在 13.6 节 中 提出 了 一 种 方法 ， 其 
允许 检测 这 些 相互 作用 并 进而 设计 随后 的 扰动 以 使 这 些 相互 作 用 最 小 。 这 种 方法 是 基于 
gFCC 确定 所 用 的 方程 的 特定 结构 及 所 产生 的 兄 余 。 这 些 宛 余 主 要 允许 人 们 进行 自 相 一 致 性 
检验 ， 并 允许 选择 这 样 一 些 扰动 ， 以 能 使 元 余 方程 〈 质 量 守恒 ) 的 闭合 度 达 到 最 大 。 组 浓度 
控制 系数 加 和 定理 需要 全 部 gFCCs 之 和 为 零 ， 就 是 闭合 度 最 大 〈 即 质量 守恒 ) WAR. A 
以 看 出 ， 表 13.8 中 gCCCs 部 分 的 一 些 数 据 组 不 满足 这 个 判定 准则 。 这 是 一 个 确实 的 信和 号， 

351 


一 些 估 计 的 控制 系数 需要 被 校正 。 这 种 校正 或 者 通过 考虑 一 些 附加 扰动 的 结果 来 完成 ， 或 者 
在 计算 中 包括 多 于 所 必需 的 最 小 扰动 数 并 运用 回归 方法 以 确定 控制 系数 来 完成 。 

最 后 ， 值 得 注意 的 是 : 在 反应 14 中 同样 的 扰动 被 应 用 于 表 13.8 所 示 的 每 一 组 计算 。 一 
个 单个 扰动 对 几 个 分 支点 的 重复 使 用 是 由 于 围绕 不 同 分 支点 的 各 组 的 自然 重 到 的 结果 。 正 如 
在 下 一 节 进 一 步 所 探索 的 ， 这 种 重叠 不 仅 减少 了 阐述 大 网 络 所 需 的 实验 扰动 的 数目 ， 而 且 允 
许 人 们 集中 于 总 网 络 的 一 小 部 分 中 关键 反应 的 搜寻 。 


13.4 交 义 代谢 物 反 应 组 控制 分 析 的 扩展 


在 这 一 节 ， 我 们 扩展 自 上 而 下 法 的 应 用 ， 举 例 说 明 如 何 能 从 不 同 连接 代谢 物 的 gFCCs 
来 获得 交叉 代谢 物 (intermetabolite) 反应 组 及 在 某 些 情况 下 一 些 单个 反应 的 gFCCs。 
13.4.1 扰动 常数 

正如 在 13.2 节 中 引入 的 那样 ， 扰 动 常数 K; EL: 在 围绕 连接 代谢 物 的 每 一 个 分 支 上 ， 
在 组 通 量 控制 系数 与 分 数 通 量变 化 之 间 的 一 种 特殊 的 关系 。 具 体 地 ， 式 (13.8) 表明 : 扰动 
BRK, 表征 组 ;内 的 一 个 特定 的 实验 扰动 ， 而 且 天; 等 于 组 通 量 控制 系数 *C* (Ai MEW 
HEA 的 通 量 的 影响 ) 对 ft -1 (组 开通 量 的 分 数 变化 ) 的 比值 。 以 不 同 的 形式 ， 同 样 
的 关系 可 以 用 于 由 通 量变 化 和 扰动 常数 来 估计 gFCCs: 


(CFA (13.33) 


扰动 常数 的 重要 性 在 于 如 下 事实 : 其 允许 在 组 《产生 扰动 ) SAR 〈 受 此 扰动 影响 ) 
之 间 的 基本 的 解 耦 。 由 于 这 种 解 耦 ， 组 ;对 组 & 的 通 量 影响 的 gFCC 被 表示 为 : 组 ;的 普通 
扰动 常数 与 由 该 扰动 产生 的 组 & 的 分 数 通 量变 化 的 乘积 。 这 种 解 耦 是 Small 和 Kacser 的 大 
偏差 理论 的 基本 假定 的 直接 后 果 ， 该 理论 已 在 11.5 节 论 述 过 (Small and Kacser, 1993a, 
b)。 即 ， 在 一 个 分 支 网 络 中 任何 〈 单 个 的 或 组 ) 反应 具有 式 (11.69) 所 示 的 线性 动力 学 形 
式 ， 导 致 式 (11.76) 形式 的 通 量 。 由 于 前 一 章 的 分 组 方法 已 经 说 明 一 个 复杂 网 络 可 以 作为 
一 系列 分 支 来 处 理 ， 由 此 推断 同样 的 形式 也 能 用 于 描述 一 个 复杂 的 网 络 。 因 此 对 于 围绕 一 个 
连接 代谢 物 的 一 个 特定 组 ; 所 计算 出 的 扰动 常数 可 用 于 确定 同一 组 对 任何 其 它 任 意 组 太 (或 
单个 反应 ) 的 组 通 量 控制 系数 gFCC (或 通 量 控制 系数 FCC)， 只 要 后 者 的 分 数 通 量变 化 被 
测定 就 行 。 此 外 ， 如 果 组 ;由 单一 步骤 组 成 ， 则 该 步 对 任何 其 它 步 又 影响 的 单一 通 量 控制 系 
数 可 用 此 式 求 得 。 

更 重要 的 是 ， 关 于 连接 代谢 物 之 间 的 一 些 反 应 组 所 施加 的 控制 方面 的 信息 不 需 更 多 的 工 
作 就 能 得 到 。 通 过 比较 这 些 重 到 着 的 反应 组 的 gFCCs 值 ， 就 可 得 出 连接 代谢 物 间 的 短途 径 
和 一 些 单 个 反应 对 于 目的 通 量 的 〈g)FCC 值 。 一 旦 该 控制 结构 的 详细 绘图 工作 已 经 完 
关键 反应 和 途径 的 搜寻 就 变 得 很 普通 了 。 

13.4.2 ”多 分 支点 上 重 夺 反应 组 的 分 析 

注意 到 ， 围 绕 一 个 分 支点 所 形成 的 所 有 反应 组 中 全 部 反应 的 总 和 必须 包括 一 个 网 络 中 所 
有 反应 。 因 此 ， 围 绕 不 同 分 支点 所 识别 的 反应 组 仅仅 通过 对 网 络 反 应 进行 不 同 的 分 配 即 可 形 
成 。 对 邻近 分 支点 的 比较 能 够 得 到 从 一 些 单个 分 支点 的 分 析 所 不 易 得 到 的 信息 ， 比 如 ， 确 定 
连接 代谢 物 之 间 的 短 的 线性 途径 万 至 一 些 单一 步骤 的 控制 系数 。 

这 一 点 在 图 13.2 中 得 到 说 明 ， 它 表示 围绕 图 12.6(a) 所 介绍 的 网 络 中 的 两 个 分 支点 的 
每 个 分 支点 所 形成 的 反应 组 。 在 此 网 络 反 应 中 的 四 个 反应 的 单个 FCCs 可 直接 由 gFCCs 确 

352 


定 ， 因 为 这 些 步骤 (1, 3, 4, 5) 每 一 ee: 一 个 连接 代谢 物 或 其 它 构 成 一 个 完整 反 
应 组 。 比 较 起 来 ， 反 应 2 与 反应 4 和 反应 $ 共享 图 13.2(a) 中 代谢 物 B 的 下 游 一 个 反应 组 ， 
而 它 也 与 反应 1 和 反应 3 共享 图 pt 访 re 一 个 反应 组 。 因 此 ， 与 反应 2 相 
对 应 的 通 量 控制 系数 从 那个 分 支点 的 分 析 也 不 能 直接 确定 。 然 而 ， 从 两 个 分 支点 所 得 出 结果 
的 同时 运用 允许 通过 MCA 加 和 定理 的 应 用 来 确定 反应 2 的 FCC。 实 际 上 ， 反 应 2 能 被 置 于 
它 自 己 的 组 (L) 内 ， 如 图 13.2(c) 所 示 。 因 为 在 图 13.2(c) 中 的 其 它 四 个 组 的 gFCCs 值 可 
从 两 个 分 支点 的 分 析 中 得 到 , LAW gFCC 仅仅 是 1 与 其 它 四 组 的 gFCCs 之 和 间 的 差 。 一 
般 来 说 ， 如 果 世 组 在 围 作 上 游 连 接 代 谢 物 分 组 时 位 于 C 组 内 而 在 围绕 下 游 连接 代谢 物 分 组 
时 位 于 A 组 内 (A 13.2), WL 组 对 任何 通 量 J, 的 gFCC 是 : 

本 (13.34) 

式 中 ，upstream 表示 上 游 ; downstream 表示 下 游 。 


A | OA be | 
1 | B i 1 B 
pier Bp ie 8 eee 
hac 4 E c -+—~ Ff B. 
Pods 5 
| F F | 
(a) (c) 


图 13.2 ”围绕 两 个 连接 代谢 物 的 反应 组 的 比较 
(a)、(b) 围绕 代谢 物 B 和 代谢 物 C 形成 的 反应 组 ; (c) 从 围绕 B 和 C 的 重 和 至 反应 组 的 比较 所 识别 的 反应 组 


通过 应 用 式 〈13.34)， 有 可 能 确定 网 络 中 与 任何 交叉 代谢 物 连 接 相 对 应 的 gFCCs， 即 ， 
把 一 种 连接 代谢 物 转化 为 另 一 种 的 任何 途径 。 当 结合 用 13.2 节 和 13.4.1 节 的 方法 已 经 确定 
的 组 控制 系数 时 ， 任 何 输入 、 输 出 途径 或 交叉 代谢 物 连 接 对 任何 所 测量 的 通 量 的 影响 的 组 通 
量 控制 系数 (FCCs) 可 以 被 确定 。 最 后 ， 用 这 种 信息 就 有 可 能 将 关键 反应 步骤 (正如 由 这 
样 的 一 个 反应 步骤 对 一 个 目的 通 量 的 FCC 所 度量 ) 的 搜寻 缩小 到 仅仅 具有 充分 大 的 gFCCs 
的 这 些 反应 组 。 另 外 ， 也 应 注意 到 ， 对 于 组 浓度 控制 系数 ， 一 个 类 似 的 公式 成 立 : 
MN EM nin CO treat yt PLP Cnt BAS CM) (13.35) 
因为 一 个 单一 反应 能 够 参加 在 几 个 不 同 的 反应 组 中 ,在 这 样 一 个 反应 中 ， 只 要 此 扰动 被 
限制 在 围绕 每 个 连接 代谢 物 的 单一 反应 组 内 ， 而 且 此 扰动 产生 对 于 其 它 反 应 组 可 测 的 通 量变 
化 ， 一 个 单一 扰动 就 能 够 用 来 进行 任何 数量 分 支点 的 分 析 。 从 13.2 节 回 想到 ， 一 个 单 分 支 
A 〈 例 如 ， 图 13.2 的 代谢 物 B) 的 分 析 通 常 需要 三 次 扰动 ， 其 中 每 次 应 当 是 在 不 同 的 分 支 
点 。 在 此 情况 下 ， 步 又 1 和 步骤 3 需要 扰动 ， 但 第 三 个 扰动 可 在 任何 其 它 的 步骤 上 进行 。 对 
第 二 个 分 支点 〈 如 代谢 物 C) 的 下 游 的 第 二 个 分 支点 的 分 析 也 需要 三 次 扰动 ， 其 中 的 两 次 必 
须 在 反应 4 和 反应 S。 因 此 ， 为 了 适当 的 分 析 这 两 个 分 支点 ， 在 步骤 1，3，4 和 步骤 5 ( 输 
入 和 输出 步骤 ) 中 必须 引入 这 些 扰 动 。 因 此 ， 围 绕 代谢 物 B 的 这 些 组 可 以 用 反应 4 或 反应 5 HE 
353 


为 对 组 分 C 的 扰动 来 进行 分 析 。 然 而 ， 因 为 来 自 这 两 种 扰动 的 数据 是 可 以 利用 的 ， 这 两 种 结果 
的 比较 提供 了 所 得 结果 的 一 致 性 检验 ( 见 13.6 节 )。 同 样 的 逻辑 推理 对 第 二 个 分 支点 也 成 立 。 
因此 ， 很 显然 ， 对 第 一 个 分 支点 的 分 析 已 经 需要 的 三 个 扰动 增加 一 个 单个 的 良好 设置 的 扰动 ， 
不 仅 允 许 对 第 二 个 分 支点 进行 分 析 ， 而 且 也 对 两 个 分 支点 提供 了 一 致 性 检验 。 事 实 上 ， 对 一 个 
复杂 网 络 的 完整 分 析 通 常 所 需要 的 策略 上 设置 的 扰动 数目 仅仅 比分 支点 数目 多 两 个 。 
13.4.3 实例 研究 

在 这 一 节 中 ， 应 用 通过 模拟 实验 扰动 所 获得 的 gFCC 的 估计 值 (WR 13.8) 来 计算 交 
叉 代 谢 物 连接 的 gFCCs 值 。 在 表 13.9 中 概括 的 所 产生 的 gFCCs 能 用 于 指导 我 们 对 目的 通 
量 施 加 最 大 控制 的 一 个 〈 些 ) 特定 反应 步骤 的 搜寻 ， 为 此 目的 所 选择 的 通 量 是 色 氮 酸 释放 的 
通 量 〈 反 应 18)。 


表 13.9 对 色 氢 酸 通 量 所 估计 的 组 浓度 控制 系数 


AATP 
BATP 
CATP 


LATP/G6P 


Acer 1.60 
Boop —0.02 
Coop —0.58 
Loer/rpp 0.75® 
Arpp 3.10 
Brpp =0.A2 
Crpp -— 0.34 
Lepp/x/c -0.27° 


Ax Ae 
Bx 人 


© gFCCs (AU "C8 表示 ， 通 量 扩 增 因子 f/f 和 扰 动 常数 Ky 也 列 于 表 中 。 
@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 
@ 由 于 总 和 与 FDP 分 支 不 吻合 ， 所 以 这 些 值 是 在 ArpP 或 CFpp 中 由 扰动 计算 所 得 gFCCs 值 的 平均 值 。 


从 这 些 结果 清楚 看 出 ，G6P 任何 一 边 的 连接 在 色 所 酸 通 量 的 控制 中 都 很 重要 。 与 反应 4 
相对 应 的 G6OP/FDP 的 连接 显示 了 一 个 重要 的 gFCC， 其 由 反应 4 ( 表 13.1) 的 实际 FCC 值 
所 证 实 。 另 外 ， 使 分 支 酸 转向 预 葵 酸 途径 的 连接 与 色 氢 酸 的 通 量 强烈 地 竞争 着 。 因 此 ， 这 些 
数据 能 得 出 这 样 的 结论 ， 色 氨 酸 生产 可 通过 如 下 方法 被 最 好 地 改进 : 通过 扩 增 糖 酵 解 途径 
( 即 磷酸 果糖 激酶 反应 ) ， 或 者 通过 削弱 进入 葵 丙 氨 酸 及 酷 氨 酸 的 竞争 性 途径 。 

注意 ,在 13.3 节 中 所 识别 的 那些 夸大 了 的 扰动 常数 ， 也 使 得 这 些 表 中 的 某 些 gFCCs 值 
失真 ， 正 如 以 下 事实 所 证 实 : 对 某 些 反应 组 这 些 系 数 不 能 正确 地 加 和 得 出 。 然 而 ， 通 过 对 
13.6 节 中 的 更 加 精确 的 方法 所 证 实 的 gFCCs 进行 比较 ， 交 叉 代 谢 物 连接 的 gFCCs 值 非常 好 
的 一 致 性 估计 确实 能 被 得 到 。 在 下 一 节 中 我 们 会 强调 这 些 数 据 的 价值 : 基于 已 知 的 控制 系 
数 ， 其 描述 一 个 一 般 的 程序 来 优化 特定 通 量 的 扩 增 。 

354 


13.5 Wimpy Ait 


确定 控制 系数 的 主要 目的 是 表征 代谢 网 络 的 控制 结构 以 便 为 有 效 的 、 有 计划 的 通 量 扩 增 
和 重新 分 配 提供 一 个 坚实 的 基础 。 然 而 ， 对 于 最 优 的 通 量 增强 ， 如 何 最 好 地 利用 这 些 系数 却 
不 是 立即 就 显而易见 的 。 例 如 ， 在 上 节 的 实例 研究 所 得 到 的 磷酸 果糖 激酶 〈 反 应 4) 的 
FCCs 非常 大 的 数值 表明 : 这 些 特定 步骤 对 色 氢 酸 和 葵 丙 氨 酸 的 通 量 施加 了 最 大 的 控制 。 遵 
循 公认 的 知识 ， 为 了 对 氨基 酸 的 过 量 生产 产生 所 期 望 的 效果 ，PFK 应 该 是 活性 扩 增 的 主要 
目标 。 然 而 ， 用 逐步 增加 的 动力 学 速率 来 模拟 这 些 反应 显示 : 活性 增加 超过 11% ， 网 络 的 
结构 妨碍 着 PFK 的 扩 增 。 在 更 高 的 水 平 上 ， 整 个 系统 变 得 不 稳定 ， 不 能 收敛 到 稳 态 条 件 。 

数学 上 ， 这 种 特殊 的 不 稳定 性 的 原因 是 在 所 关注 的 PFK 扩 增 值 处 分 又 进入 一 个 空间 ， 
在 此 空间 内 代谢 物 分 支 酸 的 稳 态 实 解 不 存在 。 换 名 话说， 不 存在 可 接受 的 胞 内 代谢 物 浓 度 来 
平衡 分 支 酸 的 生产 和 消耗 速率 。 出 现 这 种 现象 的 原因 是 ， 正 如 12.1 节 中 所 讨论 的 ， 消 耗 分 
支 酸 的 反应 的 活性 不 足以 平衡 由 于 磷酸 果糖 激酶 步骤 的 扩 增 所 引起 的 分 支 酸 的 增产 速率 。 尽 
管 我 们 不 能 断言 在 一 个 类 似 地 修饰 过 的 S . cerevisiae 菌株 中 这 种 情况 会 确实 发 生 ， 但 这 种 结 
果 是 对 引入 灾变 的 代谢 扰动 的 典型 细胞 响应 。 在 此 情况 下 ， 代 谢 物 分 泌 、 降 解 途径 的 诱导 以 
及 分 泌 产 物 分 布 的 剧烈 变化 通常 都 可 以 观察 到 。 因 为 对 这 种 不 稳定 性 的 、 实 际 的 细胞 响应 是 
高 度 不 可 预测 的 ， 首 先 最 好 避免 引入 这 种 的 扰动 。 因 此 ， 优 化 通 量 扩 增 而 又 避免 代谢 不 稳定 
的 方法 是 所 希望 的 。 

限制 网 络 不 稳定 性 的 一 种 方法 就 是 引入 一 条 额外 的 途径 充当 不 受 欢 迎 的 (offending) 代 
谢 物 的 变换 器 或 旁 路 。 然 而 ， 这 种 方法 是 累 赣 的 ， 而 且 倾 向 于 除 掉 一 种 潜在 的 不 稳定 性 又 会 
产生 另 一 种 不 稳定 ， 而 这 种 不 稳定 性 又 不 得 不 用 同样 的 方法 来 处 理 。 另 一 种 可 能 性 就 是 将 动 
力学 的 提高 的 程度 减 至 最 小 ， 其 最 终 可 能 是 引起 一 系列 问题 而 不 是 产生 有 用 的 结果 (self- 
defeating)。 一 个 更 大 胆 的 方法 是 设计 这 样 的 修饰 ， 其 将 增加 通过 网 络 的 通 量 而 维持 细胞 内 
代谢 物 接近 基态 水 平 。 这 个 战略 扩充 了 Henrik Kacser (Kacser and Acerenza，1993) 最 初 
提出 的 一 项 建议 ， 即 通 量 的 扩 增 仅仅 应 当 以 这 样 的 方式 进行 ， 其 不 允许 胞 内 代谢 物 浓 度 有 任 
何 改变 。 这 个 假定 的 推论 是 为 了 在 任何 特定 的 途径 中 获得 总 通 量 的 扩 增 ， 在 其 相应 的 独立 途 
径 中 所 包括 的 所 有 步骤 必须 依据 某 一 准则 进行 扩 增 。 而 全 部 途径 扩 增 这 种 需要 完全 是 笼统 
的 ， 在 实际 中 这 很 少 是 可 行 的 。 在 此 我 们 的 战略 是 放松 那些 阻止 胞 内 代谢 物 浓度 的 任何 改变 
这 样 的 严格 的 限制 。 通 过 允许 代谢 水 平 的 适度 改变 ， 可 以 表明 仅仅 从 几 个 经 过 仔细 选择 的 酶 
步骤 的 修饰 就 可 得 到 整个 网 络 通 量 的 显著 增加 。 

正如 根据 前 面 几 节 的 方法 所 确定 的 ,在 13.5.1 节 所 描述 的 最 优化 算法 ， 可 以 利用 组 或 
单个 通 量 控制 系数 。 另 外 ， 因 为 它们 提供 了 代谢 物 对 反应 速率 修饰 敏感 性 的 一 种 量度 ， 组 或 
单个 浓度 控制 系数 是 作为 在 最 优化 算法 的 关键 参数 而 出 现 。 这 些 概念 及 优化 程序 利用 氨基 酸 
生物 合成 途径 进行 了 说 明 。 为 简单 起 见 ， 该 程序 是 用 单个 控制 系数 推导 出 的 ， 尽 管 如 此 ， 这 
种 方法 用 精确 确定 出 的 gFCC 和 gCCCs 也 应 工作 得 同样 好 。 
13.5.1 优化 算法 的 推导 

此 处 所 论述 的 问题 是 最 好 的 单个 反应 步骤 ， 或 者 也 许 是 最 好 的 两 个 或 三 个 反应 步骤 的 确 
定 问 题 ， 其 应 当 被 扩 增 以 使 网 络 的 通 量 实 现 最 大 可 能 的 增加 ， 其 服从 所 有 的 胞 内 代谢 水 平 维 
持 在 其 最 初 稳 态 值 的 合理 范围 之 内 这 样 一 种 限制 。 下 面 的 优化 程序 不 仅 找 出 最 好 的 反应 以 进 
行 改变 ， 而 且 对 活性 变化 的 上 限 或 下 限 也 提出 建议 。 在 同时 改变 两 个 或 多 个 步骤 的 活性 的 情 

355 


况 下 ， 这 些 限制 变 得 很 关键 。 而 且 ， 优 化 结果 对 所 人 允许 的 代谢 物 范 围 是 相当 不 敏感 的 ， 只 要 
代谢 物 浓度 保持 离开 不 稳定 点 附近 。 这 是 由 于 存在 这 样 一 个 事实 : 一 旦 接近 一 个 代谢 物 的 分 
又 边缘 ， 向 网 络 不 稳定 性 的 发 展 就 会 发 生得 相当 突然 。 这 些 简化 允许 将 该 优化 简化 成 一 个 简 
单 的 、 线 性 的 形式 。 

通过 大 偏差 理论 (Small 和 Kacser, 1993b) 已 经 表明 : 网 络 中 工 个 反应 中 的 任何 反应 
或 全 部 反应 的 活性 变化 导致 通 量 灰 的 变化 ， 及 ,由 下 式 给 出 : 


vie 2 TRS et he (13.36) 


Jk,0 x J Fisch 
ra eae 


i=1 i 


XX (13.19) Pre CHET AT (AAF)r, 进行 优化 后 ， 就 可 得 出 最 大 通 量变 化 值 。 通 
过 改写 前 面 的 方程 成 如 下 形式 ， 就 可 得 出 优化 问题 的 目标 函数 : 


了 _— 
jhe Jet on deo® > ch (=) bei a (13.37) 


通 量 增加 的 程度 取决 于 代谢 物 网 络 维持 代谢 物 浓 度 在 可 容忍 水 平 上 的 能 力 。 根 据 Small 和 
Kacser 〈1993b)， 从 任何 数目 的 反应 所 改变 的 活性 而 导致 的 任何 代谢 物 水 平 ci 的 变化 
(cir), FH PAA: 


j € [2 0 (13.38) 


显然 ， 式 (13.38) o 的 低 限 为 0， 因 为 从 物理 意义 上 讲 代谢 物 水 平 不 可 能 是 负 值 。 尽 管 上 
面 的 边界 是 任意 的 ， 它 是 通过 把 的 值 限 定 在 2 而 确定 的 ， 其 提供 了 一 个 实际 的 探 试 的 约 
束 值 ， 根 据 需要 也 可 放松 这 个 约束 。 因 此 ， 对 浓度 的 限制 变 成 : 


ee ceCmercicme leer (13.39) 
© J; iar 
a, dC ( 7 ) 
从 式 (13.37) 和 式 (13.39) 可 看 出 : 以 最 小 代谢 物 浓 度 变 化 的 限制 为 条 件 的 通 量 最 大 化 的 
问题 可 以 被 定义 为 关于 活性 扩 增 参数 (AAP) 的 线性 约束 优化 问题 。 其 定义 为 : 


[eri , 
Risser; aE {1,2,°-°,L} (13.40) 
Fiwivri<ca 

4 2 ATR PERT At (7,51), AAP 就 等 同 于 由 式 (13.36) 一 式 (13.39) 中 所 利用 
的 天 的 实际 的 双 曲 函数 ; 而 当 反 应 ; 的 活性 被 减弱 时 〈 王 和 1)， 其 用 一 个 线性 函数 来 近似 
该 函数 。 除 了 当 ~; 变 得 非常 接近 于 零 外 ， 这 种 近似 是 很 好 的 。 用 实例 研究 中 S .cerevisiae 
的 动力 学 模型 进行 广泛 的 模拟 表明 : 此 AAP 的 使 用 对 竞争 性 反应 减弱 的 影响 提供 了 合理 准 
确 的 预测 。 此 外 ， 由 于 物理 上 AAP 的 值 被 限定 在 -1~1 之 间 ， 而 且 ”~ 必须 为 正 ， 因 而 ， 
AAP 是 一 个 非常 方便 的 优化 参数 。 

AAP 的 引入 将 消除 从 削弱 竞争 性 反应 〈( 即 ， 当 很 小 并 且 C 为 负 值 ) 由 式 (13.36) 
所 预测 的 过 大 的 通 量 增 加 。 同 时 ， 它 允许 目标 函数 和 约束 条 件 均 以 一 个 方便 的 线性 形式 被 计 
算 如 下 一 一 确定 R; 使 得 下 式 最 大 化 

356 


don, k € {1,2,-°,L} (13.41) 


根据 被 限制 的 代谢 物 变化 的 约束 条 件 表示 为 ， 
> (CCoOR<1 Vj 专任 ee 
«Seem Vi € {1,2,--,L} 
必须 强调 的 是 : 这 个 不 等 式 的 加 和 利用 通 量 和 浓度 控制 系数 二 者 。 注 意 到 : 式 (13.41) 和 
式 (13.42) 的 加 和 扩展 到 网 络 的 所 有 步骤 ， 但 仅 对 那些 被 调节 的 步骤 包含 着 非 零 项 。 因 此 ， 
对 于 单一 步骤 ， 加 和 包含 一 个 单个 非 零 项 ; 如 果 是 两 步 ， 则 加 和 中 有 两 个 非 零 值 ， 以 此 类 推 。 
上 述 思 维 结构 是 一 个 线性 优化 问题 ， 其 可 利用 现 有 的 技术 进行 求解 以 对 每 个 生化 反应 步 
骤 或 同时 考虑 的 多 步骤 组 合 得 到 最 优 的 活性 扩 增 。 通 过 对 一 组 、 二 组 等 内 的 反应 步骤 的 所 有 
组 合 所 得 到 的 最 优 通 量 进行 比较 ， 则 最 优 的 一 个 步骤 或 一 些 步骤 的 组 合 以 及 相应 的 最 优 活性 
扩 增 就 可 以 被 确定 。 另 外 ， 优 化 了 的 AAP 表示 活性 变化 的 程度 ， 而 这 种 变化 没有 由 于 所 扰 
动 的 代谢 物 水 平 而 引起 网 络 的 不 稳定 性 。 
当 单 一 步骤 要 进行 修饰 时 ， 活 性 的 变化 应 该 是 : R; SC’ 具有 相同 的 符号 ， 并 且 位 于 
式 (13.42) 最 严格 的 约束 条 件 的 边界 上 。 这 是 优化 问题 的 线性 性 质 的 结果 。 一 般 说 来 ， 这 
意味 着 步骤 i 的 活性 的 最 大 变化 由 下 式 定义 : 


(13.42) 


Ki Pe ee eee Le, 二 (13.43) 


oe 2 fe 
(oh de G25 
因为 对 系统 中 的 所 有 K Mi, R; 都 必须 满足 式 (13.42) 的 限制 条 件 ，7 指 的 是 展现 
式 (13.43) 中 分 母 最 大 值 的 那些 代谢 物 。 然 而 ， 对 每 一 种 代谢 物 ， 如 果 这 个 分 母 的 绝对 值 
都 小 于 1，R; 就 能 取 其 上 限 值 或 下 限 值 (1 或 =1)， 它 们 分 别 代表 对 步骤 ; 的 无 限 扩 增 或 完 
SBR; 如 果 ”个 步骤 的 活性 可 以 同时 改变 ， 这 种 优化 就 变 成 ” 维 线性 问题 ， 其 解 则 位 于 
n 个 边界 条 件 的 交点 处 。 实 际 上 ， 为 了 确保 对 网 络 的 响应 的 可 靠 预 测 ，7” 应 限制 在 3 左右 。 

13.52 节 讨 论 了 由 该 优化 问题 的 这 种 公式 表述 所 得 出 某 些 结果 。 上 有 具体 地 讲 ， 规 定 通 量 足 
够 的 变化 所 需要 的 OR; 的 值 也 可 能 是 超过 式 (13.42) 的 边界 的 一 些 数 值 。 因 此 ， 最 优 的 改 
变 将 是 一 个 或 两 个 反应 的 动力 学 的 改变 ， 以 至 于 目的 通 量 会 受到 强烈 影响 而 代谢 物 浓度 却 不 
会 受 影响 。 
13.5.2 ”实例 研究 

用 表 13.1 和 表 13.2 中 的 控制 系数 ， 上 一 节 所 描述 的 优化 程序 被 应 用 于 S cerevisiae 系 
统 中 。 可 选 定 色 氨 酸 的 释放 步骤 《反应 18) 作为 通 量 优化 的 对 象 。 表 13.10 概括 了 这 个 通 
量 的 单 步 和 双 步 的 优化 结果 。 右 栏 中 的 值 是 通过 式 (13.41) 和 式 (13.42) 的 优化 程序 得 出 
的 所 预测 的 通 量变 化 。 实 际 上 ， 这 些 预测 值 相 当 接近 于 通过 所 示 步 骤 中 的 比例 变化 由 完整 的 
网 络 模型 所 得 出 的 实际 最 大 的 稳 态 通 量 。 

从 表 13.10 以 及 表 13.1 和 表 13.2 的 控制 系数 可 以 看 出 : 虽然 PFK 〈 反 应 4) 很 显然 是 
一 个 限制 反应 ， 如 果 一 个 单个 步骤 要 被 扩 增 ， 最 好 是 完全 除 掉 步 又 7， 这 一 步 是 生产 甘油 的 
竞争 性 分 支 步骤 ; 或 者 使 步骤 14 的 活性 增 至 3 倍 ， 该 步骤 生产 色 氮 酸 ; 或 者 使 步骤 18 的 活 
性 增 至 6 倍 ， 该 步骤 释放 色 氨 酸 。 对 于 PFK 的 大 的 FCC 可 通过 对 于 代谢 物 分 支 酸 的 一 个 很 
大 的 CCC 来 被 有 效 地 废弃 ， 这 里 分 支 酸 限制 着 PFK 的 可 允许 的 动力 学 扩 增 。 事 实 上 ， 反 应 
7、14 和 反应 18 对 色 氨 酸 生 产 是 明确 地 作为 最 优 的 单个 步骤 而 出 现 的 ， 因 为 这 些 步 又 能 给 
357 


可 允许 的 扩 增 量 〈 由 CCC 来 度量 ) 与 每 扩 增 单位 对 网 络 通 量 的 影响 〈 由 FCC 来 度量 ) 二 者 
之 间 提 供 最 好 的 平衡 。 而 且 ， 根 据 式 〈13.42) 的 限制 条 件 ， 只 有 那些 展现 适中 的 浓度 控制 
系数 的 步骤 才能 任意 地 被 扩 增 或 减弱 到 任何 水 平 。 然 而 ， 使 色 氢 酸 通 量 增加 20% 一 30% 的 4 
个 不 同步 又 的 识别 提供 了 不 存在 单一 的 速率 限制 步骤 的 进一步 证 据 。 


表 13.10 色 氨 酸 通 量 扩 增 的 最 优 步骤 


BARB ET HH fs 


© 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 


在 此 网 络 中 ， 分 支 酸 的 浓度 控制 系数 如 此 大 以 至 于 几乎 网 络 动力 学 的 任何 变化 都 使 分 支 
酸 的 水 平 产 生 相 当 大 的 变化 。 因 此 ， 分 支 酸 分 支点 形成 一 个 颈 缩 点 (constriction point), fi 
且 被 认为 是 一 个 关键 分 支点 。 在 任何 这 样 的 分 支点 附近 ， 有 必要 限制 活性 改变 的 大 小 以 便 使 
代谢 物 维持 在 一 个 可 接受 的 水 平 。 如 果 目 的 是 发 生 分 叉 的 分 支点 处 增加 通 量 ， 三 种 可 能 的 单 
一 步骤 活性 扰动 可 能 是 有 效 的 : (a) 通过 上 游 分 支 增 加 代谢 物 的 生产 速率 ; (b) 通过 下 游 目 
的 分 支 增加 代谢 物 的 消耗 速率 ; (c) 通过 竞争 性 的 下 游 分 支 来 降低 代谢 物 的 消耗 速率 。 这 三 
种 情况 在 图 13.3(a) 中 进行 了 说 明 。 

当 两 个 步骤 的 活性 能 被 同时 改变 时 ， 优 化 过 程 预示 进入 色 氮 酸 的 通 量 可 被 近似 加 倍 。 然 
而 ， 能 够 形成 这 些 反应 对 的 步骤 的 选择 并 不 是 任意 的 ， 而 是 围绕 关键 分 支点 遵循 一 组 模式 以 
便 调 节 连 接 代谢 物 的 水 平 。 在 此 情况 下 ， 所 表示 的 那些 反应 对 几乎 总 是 包括 扩 增 下 游 目的 途 
径 ， 即 或 者 是 (a) 扩 增 上 游 分 支 或 者 是 (b) 减弱 竞争 性 的 下 游 分 支 ， 因 而 将 代谢 物 转向 目 
的 分 支 。 通 常 ， 在 围绕 颈 缩 点 的 同一 分 支 内 调节 两 个 反应 不 会 大 大 提高 目的 通 量 ， 减 弱 竟 争 
性 分 支 的 通 量 也 不 能 扩 增 上 游 分 支 的 通 量 ， 因 为 这 只 能 增加 连接 代谢 物 的 累积 。 反 应 对 同时 
调整 的 可 接受 类 型 如 图 13.3(b) 所 示 。 

通过 两 个 改变 的 步骤 进行 分 支 酸 水 平 的 调节 可 用 反应 对 4714 举例 说 明 ， 其 是 色 氨 酸 生 
产 的 最 优选 择 之 一 。 本 质 上 ， 这 种 配对 的 影响 是 使 分 支 酸 的 水 平 适中 ， 这 可 通过 离开 〈 反 应 
14) 压倒 性 的 碳 通 量 的 分 支 酸 部 分 来 进行 ， 而 压倒 性 的 碳 通 量 是 通过 PFK 的 扩 增 而 被 推进 
分 支 酸 的 。 因 此 ， 一 个 反应 的 调节 用 来 减轻 代谢 的 不 稳定 性 ， 而 又 是 由 第 二 个 反应 的 扩 增 以 
另外 一 种 方式 引起 的 。 此 外 ， 反 应 配对 允许 对 每 个 配对 反应 比 它们 单独 时 扩 增 得 更 彻底 。 除 
T 15/116 反应 对 之 外 ， 表 13.10 中 的 其 它 反应 对 中 的 每 一 对 均 符 合 图 13.3 所 描述 的 模式 。 

358 


CD 


上 游 扩 增 Pee 削弱 竞争 


(六 一 个 分 支 


上 游 和 下 游 扩 增 下游 扩 增 和 削弱 竞争 ( 通 量 改 向 ) 下 游 扩 增 和 削弱 竞争 (不 可 行 ) 
(b) 两 个 分 支 


图 13.3 ”关键 分 支点 下 游 的 通 量 扩 增 

基于 围绕 关键 分 支点 的 单个 分 支 (a) 或 两 个 分 支 (b) 的 扩 增 〈 粗 线 箭头 ) 或 削弱 Ce 

线 箭头 ) 的 扩 增 通 量 的 一 些 可 接受 的 方法 。 注 意 ， 在 (b) 中 的 三 种 组 合 中 的 两 个 是 可 以 接 

受 的 ， 但 是 第 三 种 组 合 不 能 适当 地 调节 连接 代谢 物 的 水 平 ， 因 此 是 一 个 不 可 以 接受 的 选择 
最 后 一 点 对 于 涉及 多 于 两 个 步骤 的 同时 扩 增 的 可 能 性 问题 是 必要 的 。 一 般 情况 下 ， 如 果 
扰动 一 个 分 支 中 的 单一 步骤 就 足以 达到 式 (13.42) 中 所 表示 的 浓度 限制 条 件 ， 在 那个 分 支 
中 就 不 再 允许 更 进一步 的 活性 变化 。 在 几 个 步骤 可 以 被 扩 增 而 没有 达到 这 些 限 制 条 件 的 这 种 
不 大 可 能 的 情况 下 ， 应 该 在 网 络 中 别处 做 一 些 另外 的 活性 改变 的 工作 。 具 有 一 个 单一 棋 缩 点 
(通常 通过 CCCs 的 大 小 来 识别 )、 如 下 情况 是 不 可 能 发 生 的 : 在 多 于 两 个 分 支点 上 发 生活 性 
变化 将 是 有 必要 的 。 如 果 两 个 不 同 的 颈 缩 点 已 被 识别 出 ， 在 调节 有 颈 缩 代 谢 物 水 平时 ， 两 个 或 
三 个 分 支 必须 被 扩 增 ， 以 扩 增 该 网 络 的 通 量 。 一 般 ， 由 于 代谢 网 络 的 非 线 性 性 质 ， 为 了 避免 
未 预料 到 的 不 稳定 性 ， 最 好 是 限制 一 次 只 对 两 个 或 三 个 步骤 进行 同时 调节 。 之 后 ， 一 旦 一 种 
稳定 的 突变 已 经 得 出 并 显示 出 所 期 望 的 通 量 扩 增 ， 就 可 考虑 第 二 轮 的 通 量 分 析 与 优化 。 通 过 

对 一 些 关键 步骤 的 协同 调节 ， 接 下 来 进行 重复 的 分 析 与 优化 就 能 达到 合理 的 过 程 改 进 。 


13.6 “一致 性 检验 与 实验 证 实 


在 13.2 节 ， 我 们 描述 了 一 种 从 通 量 测量 来 计算 组 通 量 控制 系数 的 方法 ， 并 且 提 供 了 对 
芳香 氨基 酸 实例 研究 中 gFCCs 计算 的 举例 说 明 。 所 产生 的 gFCCs (如 表 13.8 所 示 ) 展现 了 
5#13.3~# 13.7 中 解析 得 出 的 gFCCs 值 定性 一 致 ， 不 过 总 的 定量 一 致 是 缺乏 的 。 从 单个 
的 FCCs 计算 所 得 出 的 gFCCs 值 〈 正 确 的 ) 与 应 用 整个 生物 反应 网 络 进行 模拟 的 实验 扰动 
所 确定 的 这 些 值 之 间 的 不 符合 之 处 是 由 于 两 个 主要 的 原因 。 第 一 ， 对 应 于 产物 或 底 物 浓度 的 
不 同 反 应 步骤 的 动力 学 可 能 偏离 大 扰动 理论 中 所 假定 的 线性 形式 ; 另外 ， 如 果 一 个 反应 的 动 
力学 除了 底 物 和 产物 之 外 还 依赖 于 效应 物 的 水 平 ， 则 其 速率 曲线 也 不 会 呈现 所 假定 的 线性 形 
式 。 第 二 ， 超 出 通过 连接 代谢 物 所 允许 的 分 支 之 间 的 直接 相互 作用 [分 支 间 的 对 话 交 流 
(interbranch cross-talk)] 可 以 使 在 反应 组 的 公式 表示 中 和 在 仅 由 通 量 计 算 组 系数 的 伴随 表 
达 式 的 推导 中 自 上 而 下 法 本 身 固 有 的 基础 变 得 无 效 。 事 实 上 ， 代 谢 效 应 物 或 抑制 物 的 存在 能 
够 有 效 地 绕 过 连接 代谢 物 并 且 引 入 分 支 间 的 在 本 章 所 介绍 的 公式 当中 也 没 说 明 原 因 的 影响 。 
例如 ， 在 实例 研究 中 所 使 用 的 模型 ， 反 应 9 的 动力 学 ( 表 12.2) 包括 由 葵 丙 氨 酸 、 酷 氨 酸 


359 


QD) 
QO i& 


和 色 氮 酸 的 反馈 抑制 。 因 此 ， 在 对 插 在 反应 9 和 三 种 氨基 酸 产物 之 间 的 分 支点 (HW, OX 
酸 /S- 磷 酸 木 酮 糖 及 预 苯 酸 节点 ) 的 分 析 中 ， 上 、 下 游 之 间 的 直接 相互 作用 将 可 能 会 产生 非 
线性 动力 学 ， 进 而 导致 通 量 控制 系数 的 错误 计算 。 

正如 Small 和 Kacser (1993b) 所 讨论 的 ， 动 力学 的 非 线性 不 会 导致 由 大 偏差 理论 
(11.5 节 ) 所 计算 出 的 单个 通 量 控制 系数 显著 和 焉 曲 了 的 估计 。 原 因 是 这 种 方法 是 基于 已 表征 
的 扰动 ， 即 在 扰动 点 处 ， 酶 活性 的 扩 增 是 已 知 的 。 在 此 种 情况 下 ， 由 于 分 支 间 的 强烈 的 相互 
作用 ， 在 FCC 估计 中 的 误差 可 能 仅仅 产生 于 通 量 的 不 适当 的 使 用 。 当 使 用 足够 小 的 扰动 时 ， 
这 种 相互 作用 及 相关 的 误差 就 会 减 小 ， 因 此 也 就 会 提高 所 得 的 FCCs 的 精确 度 。 另 一 方面 ， 
在 反应 组 的 情况 下 ， 每 一 扰动 的 酶 活性 变化 通常 是 不 知道 的 。 因 此 ， 由 式 (13.17) 和 式 
(13.18) 所 给 出 的 gFCCs 值 本 质 上 是 通过 对 实验 数据 应 用 MCA 的 加 和 和 分 支 定 理 来 确定 
的 。 在 此 过 程 中 ， 表 征 产生 实验 扰动 大 小 的 一 个 扰动 常数 (K;) 可 被 计算 。gFCCs TEX 
(13.18) 中 用 这 样 的 扰动 所 影响 的 反应 组 的 通 量变 化 去 乘 产生 扰动 的 扰动 常数 就 可 确定 。 显 
然 ， 动 力学 的 非 线 性 以 及 交叉 -相互 作用 将 会 使 这 些 gFCC 估计 值 失 真 。 

在 本 节 中 我 们 提出 这 些 问题 。 由 于 通常 不 容易 观察 到 这 些 影响 ， 我 们 的 重点 是 放 在 自身 
一 致 性 检验 的 发 展 方面 ， 这 种 检验 可 被 用 来 评估 gFCC 估计 的 精确 度 ， 并 且 通 过 设计 减少 相 
互 影响 的 扰动 来 帮助 提高 精确 度 。 

13.6.1 利用 多 次 扰动 发 展 一 致 性 检验 

前 面 曾 提 到 ， 动 力学 的 非 线 性 并 不 会 显著 地 影响 用 大 偏差 理论 由 已 表征 的 扰动 计算 
FCCs。 类 似 地 ， 如 果 一 个 分 支 中 的 活性 变化 是 知道 的 ， 那 么 由 式 (13.21) 所 确定 的 gFCCs 
值 是 相当 可 靠 的 。 因 此 ， 将 从 反应 3 (WH 12.13) 的 已 表征 的 扰动 所 求 出 的 6- 磷 酸 葡萄 糖 
分 支点 的 gFCCs 值 ， 与 表 12.9 中 正确 的 gFCCs 值 进 行 比较 ， 表 明 极 好 的 一 致 。 在 ATP 分 
支点 的 情况 下 ， 在 反应 8 ( 见 表 13.8) 中 的 扰动 结果 与 表 13.3 中 实际 的 gFCCs 进行 类 似 的 
比较 ， 其 结果 是 不 太 满 意 的 。 其 中 最 大 系数 被 低估 $S0% 。 这 些 错误 进一步 影响 了 其 余 分 支 
的 gFCCs 的 计算 。 

幸好 ， 如 果 在 同一 个 分 支 中 引入 多 于 一 个 扰动 ， 这 样 的 误差 存在 就 可 被 发 现 。 分 支 ; 
中 ， 两 种 不 同 的 扰动 (由 下 标 1 和 下 标 2 表示 ) 会 导致 两 组 不 同 的 通 量变 化 (由 pt 度量 )， 
并 且 因 而 也 得 出 两 个 不 同 的 扰动 常数 值 ; 然而 ， 理 想 地 ， 它 们 的 乘积 应 当 产 生 相 应 的 
gFCCs 的 等 同 估 计 。 正 如 能 从 式 (13.18) 所 看 到 的 ， 当 且 仅 当 最 后 的 分 数 通 量 变化 是 互相 
成 比例 的 ， 由 分 支 二 中 的 二 次 不 同 的 扰动 所 计算 的 两 组 gFCCs 将 是 一 致 的 : 


ph ps 
S| ae, en, | PP i€ {A,B,C} (13.44) 
me pr 1 py 9) 


MEA (13.44) 的 一 个 结果 ， 存 在 着 两 种 扰动 的 一 致 性 的 清楚 的 检验 ， 这 样 以 至 于 : 
wetweho E {A,B,C} (13.45) 


ER, sh (13.45) 的 比 是 通过 通 量变 化 可 直接 观察 到 的 。 这 些 比值 的 差异 会 表明 ， 网 
络 对 扰动 不 一 致 的 响应 ， 其 已 被 假定 是 可 以 直接 相 比 的 。 由 于 分 支点 上 的 物质 平衡 限制 了 一 
个 分 支 的 通 量变 化 ， 只 需要 两 个 通 量 来 表示 式 〈13.44)， 因 此 可 很 容易 地 将 其 用 图 表示 在 二 
维 平 面 上 。 这 样 ， 对 每 一 个 扰动 ， 一 个 单一 的 特征 角 b FT A BRE XA (Simpson et al, 

360 


1998): 
py 


a= tan (Fr i€ {A,B,C} (13.46) 
而 不 同 扰动 的 特征 角 可 进行 如 下 比较 : 
(8; ) (6; )2* (0; actual i€ {A,B,C} (13.47) 


DP, (9; actua IE Dt 3h HY FFE FA © 


AE 13.1 通 量 控制 系数 的 图 解 表示 

对 任何 特定 的 分 支点 ， 可 以 定义 9 个 组 通 量 控制 系数 ， 其 度量 三 条 分 支 中 的 每 一 分 
支 的 一 个 扰动 对 三 个 组 通 量 中 的 每 一 个 的 影响 。 与 任 一 分 支 字 的 一 个 扰动 相对 应 的 三 个 
gFCCs 可 用 三 维 中 的 一 个 矢量 表示 : 

*C=(" Cl," Cp," Cs) dE 1A,B,C} (1) 
事实 上 ， 只 需 二 维 就 可 表示 一 个 分 支点 的 通 量 控制 系数 。 这 是 连接 代谢 物 稳 态 质量 平衡 
的 结果 ， 其 允许 A 组 的 gFCC 与 其 它 两 个 分 支 的 gFCCs 用 下 式 相 关联 : 

0 C2 +Jco* Cx 
Jso+Jc,o (2) 

因此 ， 组 通 量 控制 系数 能 在 二 维 平 面 (* Cj, *Co) 上 充分 地 表示 。 如 果 对 起 源 于 三 个 

分 支 中 的 每 一 个 的 三 个 扰动 相对 应 的 gFCC 矢量 进行 头 尾 相 接 ， 加 和 定理 可 表示 为 : 
1 

这 表明 : 该 平面 的 终点 应 当 是 点 

(1, 1)。 此 外 ， 如 果 一 个 组 内 每 个 反 

应 的 单个 通 量 控制 系数 均 类 似 地 标 绘 ， 

很 清楚 它们 的 矢量 和 一 定 会 得 出 相应 

的 gFCCs。 这 在 图 13.4 中 进行 了 说 “Cc; 

明 ， 该 图 显示 了 相应 于 实例 研究 中 预 

葵 酸 分 文 点 的 单个 及 组 通 量 控制 系数 。 
图 13.4 中 每 一 矢量 的 角 表 明 一 个 

特定 的 分 支点 是 如 何 响应 于 分 支 ; 的 

一 个 扰动 的 。 例 如 ， 如 果 某 一 矢量 是 


at ee 
CA= 


i€ {A,B,C} 


非常 平 的 〈 即 ， 具 有 一 个 接近 于 ON 
特征 角 )。 它 表示 分 支 1 MAB 的 通 
量 比 对 分 支 C 有 更 大 的 控制 。 矢 量 A 
的 特征 角 介 于 0°45 90" 之 间 说 明 增 加 了 
分 支 字 的 活性 将 增加 分 支 B 和 CC 的 通 
HB, AA, Ke A 特征 角 在 90" 与 
180°Z la] & — 90° 与 0" 之 间 则 暗示 一 个 
分 支 中 通 量 的 增加 将 伴随 着 发 生 其 它 
分 支 的 通 量 减 少 。 

式 (13.44) 表明 ， 未 知 的 gFCCs 


“cB 1 
13.4 ”所 基 酸 生物 合成 网 络 中 


预 葵 酸 分 支点 控制 系数 示意 
每 个 矢量 的 大 小 反应 了 相应 的 反应 ， 或 组 对 
一 个 特定 组 通 量 的 控制 程度 。 实 线 代表 相应 
于 三 个 组 通 量 控制 系数 的 矢量 * C,。 虚 线 代 
表 组 成 每 个 gFCC 的 单个 FCCs 的 矢量 。 空 心 圆 
点 旁边 的 数字 指 的 是 最 近 增加 的 矢量 的 反应 。 
因此 ， 相 应 于 组 B 的 矢量 (* Ca) 是 反应 
12 和 反应 16 (分 别 是 Cs 和 Cu) 的 贡献 之 和 。 

反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 相对 应 


361 


与 引入 扰动 所 获得 的 通 量变 化 成 比例 。 因 此 ， 极 为 重要 的 是 实验 的 通 量变 化 是 平行 于 实 
际 的 gFCCs 的 特征 方向 的 。 对 前 面 图 中 所 举例 的 那个 分 支点 ， 很 显然 ， 对 分 支 A 内 的 
任何 扰动 都 应 该 满足 这 种 要 求 ， 因 为 每 一 个 单个 的 FCC 投向 几乎 相同 的 方向 。 另 一 方 


面 ， 构 成 组 C 的 两 个 反应 的 FCCs 有 完全 不 同 的 方向 。 结 果 ， 如 果 这 些 方 向 中 的 任何 一 
个 被 用 来 估计 特征 角 ， 将 会 得 出 组 C 中 一 个 扰动 的 特征 角 的 不 正确 的 估计 ， 进 而 得 出 不 
正确 的 gFCCs。 在 此 情况 下 ， 需 要 更 多 的 扰动 ,包括 一 些 已 特征 化 的 扰动 。 


因为 在 gFCC 计算 中 仅 有 3 个 自由 度 ， 因 此 利用 3 个 实际 的 特征 角 的 知识 就 足以 确定 所 
有 的 9 个 组 通 量 控制 系数 。 然 而 ， 由 每 一 个 扰动 所 确定 的 特征 角 只 是 近似 于 相应 分 支 的 实际 
特征 角 。 因 此 ， 有 必要 或 者 从 多 次 扰动 求 得 一 些 一 致 的 特征 角 ， 或 者 从 已 特征 化 的 扰动 确定 
一 个 或 多 个 分 支 的 特征 角 。 一 个 一 致 的 特征 角 可 以 是 两 个 或 多 个 扰动 特征 角 的 平均 值 ， 但 这 
些 特 征 角 不 应 相互 差别 很 大 。 一 旦 应 用 其 中 的 一 种 方法 独立 地 证 实 了 某 些 特征 角 ， 其 余 的 未 
知 量 就 可 根据 这 些 更 加 可 靠 的 值 求 出 ， 而 不 是 利用 那些 原始 的 扰动 数据 。 因 此 ， 如 果 这 个 角 
被 假定 为 点 ， 就 可 定义 一 个 代表 性 的 扰动 (representative perturbation) 以 取代 gFCC 计算 
中 的 实际 扰动 (actual perturbation ) ， 如 下 式 : 

J§+Jhtang; 

Jé+I5 
= . i€ {A,B,C} (13.48) 
pr r tan 0; 

在 确定 这 样 一 个 一 致 性 角 或 平均 角 o 的 过 程 中 ， 从 不 同 的 扰动 实验 所 得 出 的 特征 角 不 
能 差别 很 大 。 我 们 多 少 有 点 任意 地 限定 此 差别 为 $ 左右 。 如 果 可 以 得 到 任何 gFCCs 值 的 可 
人 靠 估计 值 (比如 由 已 特征 化 的 扰动 得 出 )， 式 〈13.13) 的 加 和 定理 可 以 重新 构建 以 包括 这 些 
值 ， 其 余 的 系数 就 可 从 产生 的 方程 确定 。 然 而 ， 因 为 一 个 未 知 系数 会 减少 一 个 方程 组 的 一 个 
自由 度 ， 其 余 的 系数 要 么 通过 三 个 原始 平衡 方程 中 的 两 个 计算 得 出 ， 要 么 从 所 有 三 个 平衡 的 
最 小 二 乘法 算出 。 

一 个 特定 分 支 内 的 两 个 扰动 可 以 展现 明显 不 同 的 不 能 被 协调 的 特征 角 ， 这 是 那个 分 支 动 
力学 的 非 线 性 和 /或 者 该 分 支 与 其 它 分 支 间 强 烈 的 相互 作用 的 证 据 。 在 此 情况 下 ， 使 用 一 个 
代表 性 的 扰动 是 有 用 的 ， 该 扰动 是 二 者 的 集合 体 。 通 过 利用 分 支 ; 中 的 两 组 实验 扰动 ( 丰 ) 
Al( pt). 的 平均 值 的 形式 ， 式 〈13.48) 中 所 假定 的 特征 角 可 以 是 如 下 形式 : 

PRAIA (2 (pS) (pf )2 和 
gi=tan 本 cad ary | i€ {A,B,C} (13.49) 

对 这 样 一 个 平均 值 的 一 个 替代 选择 是 在 该 分 支 内 用 一 个 或 多 个 已 表征 化 的 扰动 从 求 取 该 
分 支 中 的 各 个 单一 步骤 的 FCC， 之 后 ， 该 分 支 的 gFCCs 就 可 通过 适当 的 加 和 求 出 。 此 外 ， 
即使 当 一 个 分 支 的 所 有 单个 FCC 不 能 被 确定 时 ， 只 要 该 分 支 中 的 其 它 步 骤 不 与 反应 ; 显著 
地 竞争 〈 即 ， 其 它 步 骤 的 特征 角 类 似 于 反应 ;的 特征 角 )， 从 位 于 该 分 支 中 的 任何 反应 i 的 
已 表征 扰动 所 求 出 的 一 个 FCC 通常 也 可 提供 该 分 支 中 gFCC 的 低 限 。 最 后 ， 如 果 在 单一 反 
Mi 中 的 两 种 不 同 扰动 导致 通 量变 化 ， 其 展现 出 根本 不 同 的 且 不 能 被 协调 的 特征 角 ， 则 按 如 
下 方法 进行 可 能 是 有 帮助 的 ， 即 仅仅 利用 其 它 扰动 的 结果 并 从 其 它 已 知 的 FCC 值 通过 加 和 
定理 确定 反应 ;的 FECCs。 

在 应 用 13.2 节 的 方法 确定 gFCCs 值 的 过 程 中 ， 由 于 式 13.17) 的 矩阵 求 逆 会 出 现 进 

302 


a ， 


一 步 的 困难 ， 特 别 地 ， 如 果 和 矩阵 是 几乎 奇异 的 ， 所 产生 的 扰动 常数 就 会 被 明显 夸大 ， 这 会 得 
出 非常 大 的 gFCCs 值 。 回 忆 一 下 在 表 13.8 中 ， 过 大 的 扰动 常数 值 和 gFCC 的 估计 值 从 几 组 
计算 产生 了 (尤其 对 最 后 三 个 分 支点 )。 求 逆 后 矩阵 的 近 - 奇 异性 一 般 产 生 于 对 该 分 支点 的 小 
扰动 的 运用 。 事 实 上 ， 无 论 什 么 时 候 只 要 大 于 5$ 一 10 的 K;, 值 产 生 ， 最 好 是 尝试 进一步 的 实 
验 或 者 用 像 前 面 描述 的 那样 使 用 有 代表 性 的 扰动 。 如 果 必 要 的 话 ， 可 以 利用 更 多 的 控制 系数 
平衡 以 便 限 定 扰 动 常数 的 值 。 在 式 (13.17) 表述 中 ， 用 了 三 个 这 样 的 平衡 : 围绕 分 支点 的 
两 个 独立 通 量 的 加 和 定理 以 及 分 支点 处 的 分 支 定理 。 其 它 的 两 个 加 和 也 可 加 到 这 些 平衡 中 ， 
以 产生 一 个 超 定 系统 ， 从 该 超 定 系统 ， 扰 动 常数 K; 可 用 回归 来 确定 。 这 些 方 程 是 对 于 独立 
于 该 分 支点 的 任何 通 量 或 任何 代谢 物 浓 度 〈 包 括 相应 的 连接 代谢 物 的 浓度 ) 的 FCC 和 CCC 
的 加 和 定理 。 对 任何 独立 通 量 大 或 浓度 cj ， 这 些 方 程 可 取 如 下 形式 : 
Kapht+ Kppbt+Kcpt=1 ek €11,2,°°,L} (13.50) 
Kawa+ Kgr3+Kere=0 j€{1,2,°°,K} (13.51) 
FXHKAEP, pi AMAR 的 一 个 扰动 引起 的 通 量 灰 的 比例 变化 ， 如 式 (13.12) 所 定 
义 ， 而 对 于 浓度 的 变化 到 可 类 似 地 定义 为 : 
mi=ti-1=gi-1,. GE {A,B,Cly 7€11,2,-+,K} (13.52) 


Chi 

如 果 对 于 上 游 分 支 (A) 进入 节点 的 通 量 没 有 可 看 出 的 影响 ， 这 些 附 加 的 平衡 可 能 也 是 
很 有 用 的 ， 因 为 式 (13.16) 中 平衡 定理 的 运用 会 处 于 困境 。 在 此 情况 下 ， 对 分 支点 的 连接 
代谢 物 的 加 和 定理 的 应 用 将 会 产生 最 好 的 结果 ， 因 为 该 系统 动力 学 的 非 理 想 状 态 变 得 更 可 能 
远离 该 分 支点 。 
13.6.2 对 预 葵 酸 分 支点 的 应 用 

上 述 想 法 利用 S . cerevisiae 实例 研究 中 的 围绕 预 茶 酸 分 支点 的 多 次 扰动 而 被 举例 说 明 。 
表 13.11 表明 围绕 该 分 支点 的 六 个 扰动 的 影响 ， 该 扰动 是 在 模拟 试验 中 通过 六 个 不 同 动力 学 
步骤 的 活性 的 变化 而 实现 的 。 


表 13.11 围绕 预 葵 酸 分 支点 的 多 个 扰动 的 影响 了 


扰动 通 量 J, 的 变化 
8 : 


@ 反应 ;的 扰动 导致 通 量 凡 的 比例 变化 在。 

@ 反应 号 与 图 12.1 中 的 序号 一 致 。 

从 表 13.11 中 的 数据 可 清楚 看 出 ,在 A 组 中 两 个 扰动 产生 了 具有 非常 相似 的 特征 角 通 
量 的 变化 。 因 此 ， 一 个 62 的 一 致 的 特征 角 似 乎 适合 于 此 组 。 在 己 组 中 的 两 个 扰动 的 特征 角 
表明 有 些 不 一 致 ， 但 是 如 果 必 要 的 话 ， 可 以 依据 式 〈13.49) 加 以 平均 。 然 而 ， 由 于 在 C 组 
中 的 扰动 表现 出 极端 不 同 的 特性 〈 正 如 在 方 框 13.1 中 所 示 的 )， 因 此 ， 进 一 步 研究 那个 分 支 
点 的 反应 是 慎重 的 。 因 为 在 反应 13 和 反应 17 中 扰动 的 活性 扩 增 因子 已 经 知道 ， 式 (13.20) 
可 以 用 来 求 相应 于 这 些 反 应 的 每 一 个 对 组 通 量 影响 的 FCCs。 反 应 13 的 扰动 对 分 支 A、B 和 

303 


反应 C 上 产生 的 FCCs 值 分 别 为 0.01，-0.37 和 0.36， 而 反应 17 扰动 所 产生 的 FCCs 值 分 
别 为 0.09，0.07 和 0.12。 对 于 分 支 C 中 的 扰动 的 组 通 量 控制 系数 可 通过 对 反应 13 和 反应 
17 的 上 述 的 FCCs 值 求 和 得 到 ， 得 出 如 下 结果 : 
CCK=0.10 
*Cl= -0.30 (13.53) 
Cle =0.48 
可 利用 MCA 的 分 支 理 论 以 便 由 关外 ACL 直接 确定 已 知 的 通 量 : 


YC 从 = ce (722) = 0.10 3:25 =0.09 (13.54) 


将 这 些 结果 代入 式 (13.13) 的 加 和 定理 公式 中 ， 并 利用 分 支 A MBA, ETP KA: 
1.45KA+0.09+0.10=1 


Kat+* Cp-0.30=1 (13.55) 
1.88K,+ *Cie+0.48=1 
三 个 方程 中 的 三 个 未 知 数 可 很 容易 求 出 ， 得 出 其 余 的 gFCCs (A, WH 13.12 所 示 。 
# 13.12 与 表 13.7 中 gFCCs 的 所 示 的 精确 值 比较 表明 ， 一 致 性 非常 好 。 注 意 ， 主 对 和 角 


表 13.12 预 葵 酸 分 支点 证 实 了 的 组 通 量 控制 系数 
ii" J* #9 gFCC 


注 : gFCCs WA" Ck 的 形式 表示 。 


线 系数 均 是 正 的 ， 没 有 哪个 系数 是 显著 大 于 1， 这 就 意味 着 这 些 系 数 在 物理 上 都 是 合理 的 。 
=e) 最后， 利用 表 13.12 中 由 加 和 定理 独立 得 
2 出 的 分 支 B 的 gFCCs fi, RA 了 B 特征 角 
sso, | 为 -35.6"， 其 位 于 表 13.11 所 列 组 B 扰动 
范围 的 中 间 部 分 。 因 此 ， 即 使 在 表 13.7 中 
的 实际 系数 值 不 能 用 于 比较 的 目的 ， 这 些 
gFCCs 值 会 被 认为 是 相当 合理 的 。 
13.6.3 测量 误差 的 影响 

通 量 及 通 量变 化 的 精确 测量 对 于 这 些 
方法 的 成 功 实施 是 很 有 必要 的 。 实 际 上 ， 
测量 中 的 随机 误差 对 于 模拟 非 线性 关系 的 


0 co! gFCC 计算 有 很 大 影响 。 因 此 ， 为 了 减 小 测 
dh 量 误差 ， 确 定 非 理想 因素 是 否 确实 存在 ， 
站 有 必要 进行 重复 测量 和 证 实 这 些 测量 。 
分 支点 的 gFCCs 计算 的 影响 


直线 代表 实际 组 通 量 控制 系数 。 分 散 的 数据 点 代表 随机 测量 误差 的 影响 如 图 13.5 所 示 。 

在 每 次 通 量 恋 化 的 测量 中 通过 假定 1%,， 5%，10% 或 ”此 图 中 所 描绘 的 每 个 数据 的 计算 都 是 遵循 

50% 的 随机 统计 误差 而 计算 出 的 这 些 线 的 终点 13.2.1 节 的 方法 进行 的 ， 它 利用 反映 
364 


(mirroring) 分 支点 的 gFCCs 值 的 理想 特征 角 的 扰动 ， 并 具有 能 被 引入 每 个 通 量 测量 的 随机 
统计 误差 。 重 要 的 是 要 认识 到 ， 即 使 S% 一 10% 的 误差 水 平 也 会 导致 相当 大 的 偏离 了 的 结 
果 。 还 应 注意 ， 由 于 分 支 B、C 中 扰动 的 特征 角 是 类 似 的 《但 方向 相反 )， 相 应 于 这 些 扰 动 
的 gFCCs 值 往往 引起 比分 支 A 中 的 相应 值 过 低 或 过 高 的 估计 。 这 是 式 (13.17) 中 求 逆 后 
的 矩阵 近 - 奇 异性 的 结果 。 不 同 水 平 测量 误差 结果 的 比较 表明 ，10% 的 误差 允许 gFCCs 很 好 
地 定性 估计 。 但 对 于 很 好 的 定量 评估 ， 必 须 将 误差 水 平 控制 在 5% 以 内 。 然 而 ， 由 于 通 量 测 
量 的 精确 度 会 超出 实验 者 的 控制 范围 ， 因 此 ， 改 进 控制 系数 估计 精确 度 的 最 好 办 法 是 通过 对 
多 个 扰动 实验 结果 的 回归 分 析 。 


B&B Fx mM 


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365 


第 14 章 细胞 过 程 热力 学 


前 几 章 对 细胞 反应 过 程 的 分 析 仅 仅 基于 计量 学 和 动力 学 。 在 第 7 章 中 举例 说 明了 如 何 根 
据 对 胞 内 代谢 物 的 化 学 计量 约束 产生 某 一 普遍 转化 过 程 的 所 有 可 能 途径 。 在 第 8 章 一 第 10 
章 介 绍 了 由 化 学 计量 学 模型 和 胞 外 代谢 物 及 同位 素 标记 分 布 的 测量 计算 ， 通 过 不 同 细胞 途径 
的 胞 内 代谢 通 量 的 方法 。 最 后 ， 在 第 11 章 谈 到 了 动力 学 控制 的 问题 ， 并 得 到 了 以 控制 系数 
的 形式 来 表征 某 一 反应 ， 或 一 组 反应 〈 第 12 章 、 第 13 章 ) 所 施加 的 控制 程度 。 到 目前 为 止 
还 没有 考虑 到 细胞 反应 的 另 一 重要 方面 ， 也 就 是 热力 学 方面 ， 它 研究 各 个 细胞 反应 或 整体 代 
谢 途 径 的 可 行 性 。 这 就 是 本 章 要 研究 的 内 容 。 主 要 讨论 两 个 问题 : 第 一 ， 单 个 反应 或 整个 代 
谢 途 径 的 热力 学 可 行 性 。 后 者 对 于 评估 由 第 7 章 介 绍 的 方法 计算 得 到 的 大 量化 学 计量 学 上 可 
能 的 途径 非常 有 用 。 第 二 ， 虽 然 热力 学 主要 针对 平衡 过 程 ， 其 向 非 平衡 过 程 的 推广 可 以 为 从 
开放 系统 角度 描述 生物 过 程 动力 学 提供 有 用 的 信息 。 这 使 得 描述 生物 反应 动力 学 成 为 可 能 ， 
由 此 得 到 速率 信息 以 通过 代谢 控制 分 析 定 理 确定 各 种 控制 系数 。 在 对 热力 学 基本 原理 作 一 简 
短 介绍 后 ， 将 在 本 章 举 例 说 明 上 述 热力 学 的 应 用 。 


14.1 热力 学 原理 : Sk 


热力 学 分 为 平衡 态 热力 学 〈 或 经 典 热力 学 ) 和 非 平衡 热力 学 。 经 典 热力 学 只 考虑 平衡 状 
态 ， 因 此 对 发 生 在 细胞 途径 的 转化 过 程 的 特性 并 不 能 提供 很 多 帮助 。 热 力学 第 二 定律 和 吉 布 
斯 相 平衡 原理 一 起 可 以 描述 某 一 反应 或 转化 过 程 是 否 可 沿 某 一 方向 进行 ， 即 是 否 可 行 等 〈 见 
14.2 节 )， 但 却 不 能 描述 反应 速率 。 它 们 主要 应 用 于 封闭 系统 中 的 可 逆反 应 ， 最 终 都 不 可 避 
免 地 达到 平衡 态 。 然 而 生命 系统 却 是 开放 系统 ， 因 此 永远 不 会 达到 平衡 。 通 过 将 高 烩 低 箭 的 
底 物 转化 为 低 高 六 的 代谢 产物 ， 它 们 不 断 获得 自由 能 。 由 底 物 到 产物 的 转化 经 由 许多 单独 
的 反应 步骤 完成 ， 其 中 某 些 步骤 接近 平衡 态 ， 另 一 些 则 远离 平衡 。 在 EMP 途径 中 ， 一 些 反 
应 步骤 接近 平衡 ， 例 如 磷酸 葡萄 糖 异 构 酶 、 三 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 和 和 炳 醇 酶 催化 的 反应 ， 而 另 
外 如 己 糖 激酶 、 磷 酸 果糖 激酶 、 丙 酮 酸 激 酶 等 催化 的 反应 则 远离 平衡 。 在 本 节 介 绍 的 热力 学 
原理 在 细胞 过 程 的 应 用 中 ， 仅 考虑 平衡 热力 学 ， 而 在 14.3 节 将 处 理 非 平衡 热力 学 问题 。 

在 热力 学 中 ， 系 统 被 定义 为 宇宙 中 我 们 感 兴趣 的 部 分 ， 例 如 一 个 生物 反应 器 或 一 个 细 
胞 ， 而 其 它 部 分 都 作为 它 的 环境 。 系 统 被 称 为 开放 或 封闭 取决 于 其 是 否 可 与 环境 交换 物质 和 
能 量 。 因 为 活 细 胞 利用 营养 物质 、 释 放 代 谢 产物 并 产生 功 和 热 ， 因 此 它们 是 开放 系统 。 系 统 
状态 由 一 组 状态 函数 所 定义 。 这 些 状态 函数 包括 内 部 能 量 〈《U) M(H, SFSRERER 
有 的 功 的 类 型 ， 即 由 于 体积 变化 时 吸收 的 热量 )、 和 〈S ， 系 统 混乱 度 的 测量 )。 这 些 状 态 函 
数 可 用 于 描述 和 解释 两 个 热力 学 定律 ， 经 典 热力 学 就 是 基于 这 两 个 定律 建立 的 。 这 两 个 定律 
做 如 下 假定 。 

e@ 热力 学 第 一 定律 ”能 量 不 能 被 产生 或 消除 ， 用 数学 方式 表达 为 : AU =0。 

e@ 热力 学 第 二 定律 ”自发 过 程 只 能 按 使 宇宙 灶 增 加 的 方 癌 进行 ， 用 数学 方式 表达 为 : 
AS >0. 

热力 学 第 一 定律 前 明了 任何 过 程 都 是 能 量 守恒 的 ， 也 就 是 说 系统 产生 的 能 量 必 须 由 环境 

366 


Rit, BIER SHEN ARERR EA. TER ART A AEE TSE 
重要 的 问题 ， 但 是 由 自发 过 程 导 致 的 宇宙 无 序 化 对 评估 自发 性 并 不 实用 ， 因 为 确定 整个 宇宙 
的 箭 变化 是 不 可 能 的 。 另 外 ， 过 程 的 自发 性 不 能 单独 由 所 研究 系统 的 箭 变化 决定 ， 因 为 即使 
FEARS aD A RL BA RB AEA (SRS A, AA ee 
HiME ERAS KS), PIMA EA BARB He REA HY aa RR. 
Fa Fa EF EE, OB A HET RAS PA —_ aT RE AE : 
G=H-TS (14.1) 
这 是 由 J. Willard Gibbs 于 1878 年 提出 的 。 自 由 能 的 意思 是 ,， 对 一 个 等 温和 等 压 的 过 程 ， 系 
统 所 做 的 最 大 功 (不 包括 功 的 转移 ) 与 系统 的 自由 能 的 减少 量 相等 。 大 多 数 的 生物 系统 都 可 
作为 等 温和 等 压 过程 ， 其 自发 性 的 标准 是 ACG 和 0。 

BAH, ete AGO 的 过 程 ， 被 称 为 外 源 的 〈exogenic)， 它 们 可 以 用 来 做 功 。 非 
自发 过 程 ， 也 就 是 AG 为 正 的 过 程 ， 被 称 为 吸 能 的 〈endergonic)， 它 们 必须 通过 吸收 自由 
能 来 推动 。 处 于 平衡 态 的 过 程 其 正 向 过 程 和 逆向 过 程 正 好 处 于 平衡 ， 其 AG =0。 要 注意 到 
吉 布 斯 自由 能 随 温 度 而 变化 ， 因 此 在 使 用 时 一 定 要 注 明 温度 。 对 温度 的 依赖 性 可 以 解释 为 何 
在 高 于 一 定 温度 时 和 蛋白质 会 自发 变性 。 如 前 面 提 到 的 ， 从 变性 状态 形成 自然 状态 的 蛋白 质 的 
WEHAH MAS 均 为 负 ， 但 它们 以 不 同 速率 随 温 度 变 化 。 在 一 定 温度 下 A 互 STTAS, 在 
该 温度 以 下 ， 变 性 过 程 的 自由 能 为 正 ， 逆 反应 (Nie) 为 一 自发 过 程 。 而 在 该 温度 以 上 
时 ，AGueat 为 负 ， 和 蛋白 趋 于 变性 。 

有 一 点 很 需要 注意 ， 就 是 AG 为 较 大 的 负 值 并 不 意味 着 一 个 化 学 反应 会 以 适当 的 速率 
进行 。 例 如 ，ATP 使 葡萄 糖 磷酸 化 生成 6- 磷 酸 葡 萄 糖 过 程 的 自由 能 变化 很 大 且 为 负 ， 但 当 
ATP 和 葡萄 糖 仅 仅 简单 地 混合 在 一 起 时 该 反应 并 不 进行 。 只 有 已 糖 激酶 加 入 后 反应 才 进 行 。 
与 此 类 似 ， 大 多 数 生物 分 子 ， 包 括 蛋 白质 、 核 酸 、 糖 和 脂 类 在 水 解 条 件 下 都 是 热力 学 不 稳定 
的 ， 但 它们 的 自发 水 解 速率 很 低 。 只 有 在 水 解 酶 加 入 后 反应 才 以 合理 的 速率 进行 。 虽 然 酶 对 
于 加 速 反应 非常 重要 ， 它 们 并 不 改变 反应 的 AG 。 作 为 催化 剂 它 们 只 能 加 快 趋 于 热力 学 平衡 
Wate, HAREM AG 为 正 的 过 程 进行 。 

前 面 对 基 本 热力 学 函数 的 定义 仅 适 用 于 组 成 固定 的 系统 。 对 于 组 成 发 生变 化 的 系统 ， 这 
些 状 态 函 数 并 不 足以 描述 化 学 反应 以 及 一 开始 时 是 分 离 的 物质 间 的 扩散 过 程 中 可 能 发 生 的 变 
化 。 要 修正 这 一 缺陷 ， 就 要 认识 到 口 , 瓦 ，S 和 G 除了 与 固定 组 成 系统 中 所 用 的 两 个 本 征 
热力 学 变量 〈 如 温度 和 压力 ) 相关 外 ， 也 是 溶液 中 各 种 物质 的 总 量 的 函数 。 因 此 ， 自 由 能 可 
表示 为 : 


G=CGUT , 721 722， ,72N ) (14.2) 
其 中 TOS 10) 5. STEN 分 别 是 物质 1 到 | N 的 总 物质 的 量 。 由 前 述 方程 ， 得 到 : 
dG = —-SdT + Vdp + ipidn; (14.3) 
其 中 ， 
放下 
aT yas 了 dp Pin: Bi On; Tp na; pe) 


FEMA AEP, np: 称 为 化 学 势 或 化 合 物 ; 的 吉 布 斯 自由 能 。 这 一 变量 也 由 吉 布 斯 引入 以 
简化 开放 系统 及 组 成 变化 的 封闭 系统 的 分 析 。 它 定义 为 在 恒温 恒 压 下 加 入 无 限 小 量 的 某 种 物 
质 时 系统 自由 能 的 增加 量 除 以 该 物质 的 加 入 量 。 正 如 温度 差 决 定 了 热流 方向 ， 压 力 差 决 定 了 
物体 运动 方向 一 样 ， 化 学 势 的 差异 可 以 用 来 度量 某 一 化 学 反应 发 生 的 趋势 或 某 一 物质 沿 化 学 

367 


势 减 小 方向 扩散 的 趋势 。 在 此 意义 上 ， 化 学 势 可 以 被 看 做 是 一 种 化 学 上 的 压力 ， 它 就 像 温 度 
和 压强 一 样 是 一 种 内 部 强度 性 质 。 
类 似 地 ， 化 学 势 也 可 以 其 它 热 力学 状态 函数 如 U AH 的 形式 来 定义 ， 从 而 可 得 到 ; 


dU=TdS — pdV + Sipidn; (14.5) 
dH =TdS + Vdp + dip;dn; (14.6) 
这 里 化 学 势 可 写作 : 
¥eG _ 9U _ 9H 

fi On. ee ee (14.7) 

考虑 到 这 些 热力 学 状态 函数 定义 的 条 件 ， 可 得 到 下 式 : 
U=TS— pV + iin; (14.8a) 
H=TS+ dipin; (14.8b) 
CED (14.8c) 


这 些 表达 式 ， 尤 其 是 式 〈14.8c) ， 对 于 确定 化 学 反应 自发 性 非常 重要 。 
一 化 合 物 的 吉 布 斯 自由 能 与 其 浓度 相关 ， 其 关系 可 通过 众所周知 的 关于 化 学 势 的 方程 
表示 : 
22)'@ Tx: 
w= 29(p,T) + RTIn( | (14.9) 


i,refCi ,ref 


A, fi 是 化 合 物 ; 的 活 度 系数 ; vo BE ABABA ee MRE ci ia 表示 的 参考 状 
态 下 化 合 物 i 的 化 学 势 。 参 考 化 学 势 是 温度 和 压力 的 函数 。 一 般 参 考 状 态 定义 为 浓度 ci rot = 
lmol'L， 活 度 系 数 万, ef=1。 此 外 ， 生 物体 系 一 般 假 定 为 稀 溶 液 [这 对 很 多 〈 但 不 是 所 有 
的 ) 胞 内 化 合 物 是 一 个 合理 的 假定 ]， 这 意味 着 万 =1， 由 此 式 (14.9) 简化 为 : 

wi=p?(p,T) + RTIn(c;) (14.10) 

AP, ¢ 是 第 ; 种 化 合 物 的 摩尔 浓度 。 

由 化 学 反应 (或 任何 种 过 程 ) 中 反应 物 和 产物 的 化 学 势 可 以 计算 出 该 反应 (或 过 程 ) 的 
自由 能 变化 。 由 此 对 下 面 的 一 般 反 应 : 


cC+dD-aA-— DB=0 (14.11) 
其 自由 能 变化 由 式 〈14.8c) 可 得 到 为 : 
AG =cuct+ dup- apa bys (14.12) 
将 式 (14.9) 代入 式 (14.2) 中 可 得 : 
AG=aG" + RTn( SP) (14.13) 
CACB 


式 中 ，AG" 是 当 反 应 物 和 产物 均 处 于 标准 状态 时 (OLATHE 14.1) 反应 的 自由 能 变化 。 
因此 ， 自 由 能 变化 包括 两 部 分 ， 一 是 仅 决定 于 反应 类 型 〈 及 温度 和 压力 ) 的 常数 项 ， 一 是 决 
定 于 温度 、 反 应 物 和 产物 浓度 及 化 学 计量 系数 的 可 变 部 分 。 对 处 于 平衡 的 反应 ， 自 由 能 为 
零 , 式 (14.13) BA: 


AG” = - RTIn(K) (14.14) 
其 中 天 s 是 反应 的 平衡 常数 : 
c. d ee 
trrcraa «| (14.15) 
ye ,ed 


显而易见 由 式 〈14.15) 可 以 由 标准 自由 能 数据 计算 出 平衡 常数 ， 反 之 亦 然 。 作 为 指数 
368 


相关 的 结果 ， 即 使 非常 小 的 负 标 准 自 由 能 变化 也 会 导致 平衡 常数 远大 于 1。 平 衡 常数 100 对 
应 的 AG0 值 仅 - 11.4kJM:mol。 由 式 (14.13) 可 以 看 出 ， 如 果 反 应 物 浓度 超过 平衡 浓度 ， 
净 反 应 将 正 向 进行 直到 多 余 的 反应 物 都 转化 为 产物 并 达到 平衡 。 与 之 相似 ， 如 果 产 物 浓 度 超 
过 平衡 浓度 ， 净 反应 将 逆向 进行 直到 多 余 的 产物 都 转化 为 反应 物 以 达到 平衡 。 因 此 ， 正 如 
Le Chatelier 原理 所 描述 的 ， 所 有 对 平衡 的 偏离 都 会 激发 一 个 恢复 平衡 的 过 程 ， 因 此 所 有 封 
闭 系统 一 定 都 不 可 避免 地 要 达到 平衡 。 活 细胞 通过 成 为 一 开放 系统 挣脱 了 这 一 热力 学 约束 。 


方 框 14.1 标准 态 规定 

在 物理 化 学 中 通常 规定 溶质 的 标准 态 为 2SC 和 latm (101325Pa) 条 件 下 的 单位 浓 
度 (或 活 度 )。 由 于 生化 反应 通常 在 接近 中 性 的 pH 值 的 稀 水 溶液 中 进行 ， 所 以 稍微 有 点 
不 同 的 标准 态 常 被 用 于 生物 系统 中 。 

@ 水 的 标准 态 规定 为 纯 液 体 的 标准 态 。 因 此 ， 尽 管 实 际 上 水 的 浓度 为 S$.5Smol/LL， 
水 的 浓度 〈 或 活 度 ) 取 作 1。 

@ 氢 离 子 活 度 定义 为 1， 其 对 应 于 有 生理 意义 的 pH 值 为 7 的 条 件 ， 而 不 是 pH AW 
零 的 化 学 标准 态 。 

e@ 一 个 可 经 历 酸 - 碱 反应 的 化 合 物 的 标准 态 以 pH 值 为 7， 其 自然 存在 的 离子 混合 物 
的 总 浓度 的 形式 来 定义 。 优 点 是 : 通常 ， 测 量 一 个 化 合 物 的 总 浓度 比 测 量 其 一 个 离子 物 
质 的 浓度 要 更 容易 些 。 因 此 一 种 酸 或 碱 的 离子 组 成 随 pH 而 变化 ， 然 而 用 总 浓度 计算 的 
标准 自由 能 仅 在 pH 值 为 7 时 才 有 效 。 

用 上 述 参 考 态 ， 标 准 自由 能 变化 一 般 用 符号 AG 来 表示 ， 这 里 加 了 撤 号 “ ”以 区 
别 于 正常 状态 的 标准 自由 能 的 变化 。 由 于 自由 能 变化 与 参考 态 无 关 ， 所 以 参考 态 的 选择 
没有 关系 。 然 而 ， 在 用 公式 表示 水 和 原子 对 自由 能 变化 的 影响 时 ， 规 定 参 考 态 是 很 重要 
的 。 因 此 ， 如 果 用 生物 标准 态 作 参照 ， 水 的 浓度 可 以 从 式 (14.13) 中 省 去 。 类 似 地 ， 如 
果 反 应 在 pH AAT 时 进行 ， 则 质子 浓度 不 必 被 包括 。 如 果 反 应 在 pH 值 不 等 于 7 的 情况 
下 进行 ， 质 子 浓 度 应 当 取 与 10- "有关 的 值 ， 即 应 当 作 为 [H+ ]/X10- 7 出现。 


应 的 标准 自由 能 变化 可 以 简单 地 通过 反应 物 和 产物 的 生成 自由 能 计算 出 。 在 表 14.1 
ew 一 些 与 生物 化 学 有 关 的 物质 的 生成 自由 能 。 此 外 ， 应 用 基 团 贡献 法 可 以 计算 出 一 些 
没有 测定 过 的 物质 的 自由 能 ( 见 14.2.2 节 )。 对 EMP 途径 中 反应 的 AG" 值 的 检查 (WB 
14.1) 表明 其 中 某 些 反应 具有 正 值 ， 另 一 些 则 为 负 。 因 为 在 一 般 条 件 下 有 一 净 通 量 通过 该 途 
径 ， 其 中 的 代谢 物 和 辅 因子 浓度 自动 调节 以 使 每 一 步 反 应 的 吉 布 斯 自由 能 变化 均 为 负 〈 见 例 
14.1)。 因 此 ， 高 水 平 的 NAD*MNADH 比 〈 这 一 比例 由 许多 胞 内 反应 所 控制 ) 保证 了 由 3- 
磷酸 甘油 醛 到 3- 磷 酸 甘油 酸 磷酸 的 反应 是 热力 学 可 行 的 ， 即 使 该 反应 的 AG"? 值 为 6.28kJ/ 
mol。 此 外 ，EMP 途径 中 随后 的 反应 的 标准 自由 能 变化 为 -18.83kJM:ol， 这 保证 了 该 反应 
即使 在 3- 磷 酸 甘油 酸 磷酸 浓度 很 低 时 仍 可 自发 进行 并 推动 产生 它 的 反应 。 因 而 ， 代 谢 途 径 
中 那些 在 热力 学 上 并 不 倾向 正 向 进行 的 反应 可 以 在 其 它 具 有 较 大 的 负 自 由 能 变化 的 反应 推动 
下 进行 。 这 是 14.2 节 中 热力 学 可 行 性 分 析 的 基础 。 

有 一 点 很 值得 注意 ， 就 是 在 大 多 数 代 谢 途 径 中 第 一 步 和 最 后 一 步 反 应 往往 具有 较 大 的 负 

吉 布 斯 自由 能 ， 例 如 葡萄 糖 磷酸 化 生成 葡萄 糖 -6- 磷 酸 反 应 的 AG" 为 =16.7kJMmnol， 丙 酮 酸 

生成 乳酸 的 反应 AG?’ 为 -25.1kjJM4nol。 这 保证 了 即使 在 底 物 浓度 较 低 而 产物 浓度 较 高 时 这 

些 反应 在 热力 学 上 仍 倾向 于 正 向 进行 〈 丙 酮 酸 到 乳酸 的 转化 因为 高 的 NAD+7XNADH 比 而 在 
369 


热力 学 上 进一步 强化 )。 


表 14.1 各 种 物质 的 标准 生成 自由 能 


AG?’ AJ :mol~! 


乳酸 


柠檬 酸 苹果 酸 845.1 
磷酸 二 羟 丙 酮 羟基 157.3 
乙醇 草 酰 乙酸 797.2 
果糖 Be RB His BE BR 1269.5 
6- 磷 酸 果糖 2- 磷 酸 甘油 酸 1285.6 
1,6- 二 磷酸 果糖 3- 磷 酸 甘 油 酸 1515.7 
延 胡 索 酸 丙酮 酸 474.5 

琥珀 酸 690.2 


琥珀 酰 辅酶 A 
O 该 化 合 物 由 自由 元 素 和 自由 辅酶 A 形成 。 


【 例 14.1】 糖 酵 解 反应 的 自由 能 变化 

要 确定 细胞 反应 的 自由 能 变化 ， 必 须要 知道 参与 反应 的 所 有 代谢 物 及 辅 因子 的 浓度 。 这 
些 数 据 仅 对 较 少 的 代谢 途径 是 可 以 得 到 的 ， 因 此 热力 学 考虑 常常 基于 对 标准 自由 能 变化 的 估 
计 。 然 而 这 样 有 可 能 导致 错误 的 结论 ， 因 为 标准 自由 能 变化 假定 某 一 固定 的 反应 物 和 产物 浓 
度 (标准 状态 ) ， 这 与 实际 胞 内 代谢 物 浓度 不 相符 。 而 这 一 浓度 差 可 能 对 实际 的 自由 能 变化 
产生 很 大 影响 。 为 了 说 明 这 一 点 ， 计 算 EMP 途径 中 某 些 反应 的 自由 能 变化 。 表 14.2 列 出 
了 人 体 红 细胞 MEP 途径 中 间 代 谢 物 、ATP、ADP 及 正 磷酸 盐 的 浓度 。 表 14.3 WH THEA 
得 到 的 自由 能 变化 。 


表 14.2 人体 红细胞 EMP 途径 中 间 代 谢 物 和 辅助 因子 的 浓度 


中 间 代谢 物 /辅助 因子 cP de 中 间 代谢 物 /辅助 因子 浓度 mol'L-: 
葡萄 糖 (GLU) 2-Be RH Tih (2PG) 29 3 


6-Be MR Ail 45 HE (GOP ) Be AR i BEA BBA (PEP ) 23 
6-BE BRE (FOP) 丙酮 酸 (PYR) 51 
1,6- 二 磷酸 果糖 (FDP) ATP 1850 
二 羟基 丙酮 (DHAP) ADP 138 
3-9 BH ih RE (GAP) . 1000 


3- 磷 酸 甘 油 (3PG) 

注 : 数据 取 自 Lehninger (1975)。 

从 计算 出 的 自由 能 变化 可 以 看 到 除了 己 糖 激酶 、 磷 酸 果 糖 激 酶 、 丙 酮 酸 激酶 及 可 能 还 有 
三 糖 异 构 酶 催化 的 反应 外 ， 其 它 EMP 途径 中 的 反应 都 接近 平衡 (3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 和 3- 
磷酸 甘油 酸 激酶 催化 的 系列 反应 的 自由 能 变化 也 接近 于 零 )。 因 此 许多 酶 的 胞 内 活性 都 足够 
高 以 使 这 些 反 应 达到 平衡 ， 换 名 话说， 这 些 转化 的 正 反 应 和 逆反 应 都 远 比 通过 该 途径 的 通 量 
快 很 多 。 显 而 易 见 ， 这 些 接近 平衡 态 的 反应 对 中 间 代 谢 物 的 浓度 变化 非常 敏感 ， 也 就 是 说 它 
们 具有 较 大 的 弹性 系数 。 因 此 它们 可 以 迅速 的 对 途径 中 其 余 具 有 较 大 的 负 自 由 能 变化 的 反应 
370 


# 14.3 人体 红 细胞 EMP 途径 中 反应 的 自由 能 变化 


LG6P ]LADP ]~ 


己 糖 激酶 AG’ + RTIn TGLCJTATPT — 33.3 
6-H FE AG" + RTIn fESE ~2.4 
BE FL AG" + RTIn EDEL ADE! ~18.7 
RE 4a AG” + RTIn PHA ARS 0.7 
磷酸 丙 糖 异 构 本 AG" + RTin LOAEL 2.7 
BR EL AE AG" + RTIn BES 1.0 
RAL AG” + RTIn Bical 1.2 
丙酮 酸 激酶 AG” + RTIn eal — 23.0 


形成 的 通 量变 化 做 出 反应 。 

三 个 具有 较 大 的 负 自 由 能 变化 的 反应 是 热力 学 不 可 逆 的 并 且 常 被 看 做 是 代谢 途径 中 的 关 
键 控 制 步骤 〈 参 见 第 5 章 中 关于 平衡 态 酶 的 讨论 ) 。 显 然 己 糖 激 酶 、 磷 酸 果糖 激酶 和 丙酮 酸 
激酶 的 胞 内 活性 都 很 低 以 至 于 不 足以 平衡 其 催化 的 反应 。 这 可 能 是 基因 表达 太 低 的 结果 ， 即 
酶 的 胞 内 wmax 太 低 ， 或 者 是 酶 活性 调控 的 结果 ， 如 别 构 调控 或 共 价 酶 修饰 。 例 如 磷酸 果糖 
激酶 的 别 构 调 控 ， 这 已 经 在 2.3.1 节 中 作 了 深入 阐述 。 


14.2 热力 学 可 行 性 


如 前 面 一 节 所 述 ，AG 为 负 时 化 学 反应 或 运输 过 程 是 可 行 的。 进一步 说 ， 要 使 一 个 生物 
化 学 反应 和 运输 过 程 可 行 ， 所 有 相关 步骤 就 都 要 满足 上 述 规则 。 即 所 有 相关 反应 的 AG 都 
必须 为 负 。 如 果 途 径 中 至 少 有 一 个 反应 的 AG 大 于 零 ， 则 这 个 途径 就 是 不 可 行 的 。 如 果 只 
有 一 个 反应 步骤 是 不 可 行 的 ， 把 它 称 为 局 部 热力 学 瓶颈 ， 反 之 ， 如 果 几 个 反应 都 违反 了 
AG<0 的 标准 ， 则 称 之 为 分 布 式 热 力学 瓶颈 。 


现在 考虑 下 面 的 两 反应 序列 : 
A>B>C (14.16) 
在 下 面 的 不 等 式 同 时 满足 时 ， 这 两 个 反应 将 从 左 至 右 进行 : 
AGI=AGY + RTIn <0 (14.17) 
AG2=AGY + RTIn “<0 (14.18) 


如 果 两 个 反应 的 AG0 都 小 于 零 ， 那么 前 述 反 应 系统 就 可 由 左 向 右 进 行 并 且 代 谢 物 A， 

B, C 的 浓度 可 以 非常 平坦 地 变化 。 然 而 ， 当 AG? 小 于 零 而 AG% 大 于 零 时 ， 代 谢 物 B，C 

就 要 有 一 个 大 的 浓度 梯度 以 克服 第 二 个 反应 的 正 的 标准 自由 能 变化 。 这 些 用 图 表 表 示 在 图 

14.1 中 ， 其 中 也 列 出 了 AG? >0 而 AG% <0 及 二 者 均 大 于 零 的 情况 。 在 后 者 情况 下 ， 反 应 
371 


物 浓度 cn 和 最 终 产 物 浓 度 cc 之 间 需 要 有 很 大 的 浓度 梯度 才能 克服 两 个 反应 的 正 AG0 值 。 
RTE AGO 值 可 以 通过 代谢 物 浓 度 差 来 克服 ， 但 只 能 是 在 一 定 程度 上 。 

当前 述 系 统 推广 到 包括 更 多 反应 的 反应 序列 时 ， 很 显然 为 了 克服 多 个 反应 的 正 AG0 值 
最 终 代谢 物 浓 度 就 要 非常 低 ， 这 有 可 能 会 低 于 生理 条 件 许 可 的 浓度 范围 。 考 虑 到 代谢 物 可 同 
时 参与 许多 反应 进而 对 其 浓度 产生 不 同 的 限定 ， 可 以 看 到 它们 的 浓度 成 为 决定 反应 可 行 性 并 
进而 决定 整个 网 络 的 可 行 性 的 决定 因素 。 显 然 需 要 一 个 系统 的 方法 来 确定 在 何 种 程度 上 在 一 
个 允许 的 代谢 物 浓度 范围 内 使 所 有 的 热力 学 约束 都 可 被 满足 ， 由 此 确定 一 个 代谢 网 络 的 热力 
学 可 行 性 〈Mavrovouniotis，1993)。 在 后 面 将 介绍 这 样 一 种 方法 ， 其 中 通过 对 一 些 原始 变 
量 的 简单 变换 来 简化 分 析 过 程 。 


AG", AG <0 AG'<0, AG!'>0 AG?’>0, AG3'<0 AG}’, AG >0 
图 14.1 使 系统 [HSK (14.16) ] 中 的 反应 在 热力 学 上 可 行 所 需 的 浓度 梯度 
14.2.1 算法 
现在 考虑 具有 如 下 化 学 计量 关系 的 一 组 反应 
Yak sith ol ieee: Saat (14.19) 


对 每 步 反 应 其 吉 布 斯 自由 能 变化 可 写 为 : 

AG; = AG + Ds giRT Inc: 5 v= tH (14.20) 
KP, c; 是 反应 (14.19) 中 代谢 物 X, 的 浓度 。 进 一 步 假 定 某 些 代谢 物 浓 度 恒 定 ， 而 
其 它 的 可 以 在 一 定 范围 内 变化 。 一 般 地 ，ATP、NADH 及 其 它 辅 因子 [ 称 做 流通 代谢 物 
(currency metabolites) ] 的 浓度 常 被 限定 在 一 很 小 的 范围 内 ， 因 此 可 以 假定 实际 上 是 恒定 

的 。 由 这 一 组 代谢 物 ， 可 以 重 写 式 〈14.20) 为 : 
AG; = AGY + Dye giRTInc; + >) g;RT Inc; (14.21) 

流通 代谢 物 3 


式 中 ， 开 “表示 浓度 允许 在 一 定 范围 内 变化 的 代谢 物 数 目 。 若 式 中 前 两 项 合并 在 一 起 并 
BA AG”, WH (14.21) 可 化 为 : 


» 
AG; = AG0 + 28 RT Inc; (14.22) 
则 使 得 代谢 途径 热力 学 可 行 的 要 求 可 由 以 下 不 等 式 表 述 : 
K’ 
ay + Dagalne <05 j = Ase J (14.23) 


为 方便 起 见 ， 可 以 将 每 一 一 代谢 物 浓 度 针对 其 允许 变化 的 范围 进行 归 一 化 。 这 可 通过 以 下 
步骤 完成 ， 首 先 重 写 式 (14.23) AX (14.24): 
372 


AG” K’ r K’ C， 
RT + > Siilncyin 十 24 &iiln spin < 0 (14.24) 
i=1 i=1 z 


AGS" a | min Ss | Gite eye 0 
Br Ds Bi Ue 24 Bj: Coin sega ee (14.25) 


oe oy 


随后 基于 在 允许 浓度 变化 范围 内 实际 代谢 物 浓度 的 相对 值 可 定义 一 无 因 次 浓度 fi FU: 


DG ie 
up a nce rp ey (14.26) 
“yi | 
wi = Bln ss P21 Oped (14.27) 
In in 
oF Rae (14.28) 
In 
Ci 
式 (14.25) 即 可 写 为 : 
b 
H; = hj + >) wyfi < 0; fs F (14.29) 
i=1 


一 个 新 的 热力 学 /计量 学 意义 可 以 赋予 前 述 各 变量 。 例 如 ， 廊 可 以 解释 为 在 每 个 代谢 物 
均 处 于 最 低 允 许 浓度 而 不 是 事先 确定 的 lmol.L -1 的 浓度 时 (其 是 吉 布 斯 自由 能 等 于 AG0 时 
的 状态 ) 的 自由 能 变化 。 与 之 类 似 ，wji 是 一 新 定义 的 化 学 计量 系数 ， 它 保留 了 gi 的 符号 。 
此 外 ， 从 zi 来 说 反应 仍 具 有 加 和 性 ， 它 们 可 以 与 应 用 gz 时 相同 的 方式 进行 组 合 。 最 后 ， 万 
是 归 一 化 的 浓度 ， 它 使 得 可 以 以 线性 的 形式 确定 可 行 性 规则 ， 这 将 大 大 简化 计算 过 程 。 

在 上 述 转换 的 框架 内 ， 热 力学 可 行 性 的 问题 被 简化 为 确定 一 组 归 一 化 的 代谢 物 浓 度 磊 
以 使 得 所 有 的 不 等 式 媚 <0 同时 满足 。 如 果 没 有 解 可 以 满足 这 些 约束 ， 式 〈14.19) 确定 的 
反应 组 就 是 热力 学 不 可 行 的 。 由 于 归 一 化 的 浓度 广 介 于 0 和 1 之 间 ， 这 样 可 以 对 Hy 引入 两 
组 值 ， 即 最 大 值 和 最 小 值 。 在 反应 物 〈 具 有 负 的 计量 系数 ，rwi <0) 浓度 最 小 〈 对 应 于 
万 =0) 而 产物 〈 具 有 正 的 计量 系数 ，wii >0) 浓度 最 大 〈 对 应 于 卢 =1) 时 可 得 到 最 大 值 。 
在 这 一 条 件 下 ， 反 应 的 热力 学 推动 力 显 然 是 最 小 的 。 因 此 可 得 : 

if 
Hi; mex = hj + >, wes we SO (14.30) 
类 似 地 ， 可 得 到 WH, 的 最 小 值 如 下 : 
Hy in = hj + Dd) wis Wii <0 (14.31) 

SHITE 3B BEAT VA Hj nin RE TS BTA DD 9 Sb FA BA) BY a PET BV — 1, 
吉 布 斯 自由 能 。 这 一 新 的 归 一 化 使 得 Aj nin TRAE RA Ee RA PIS. A 
UE, Hy min<O 是 反应 7 在 热力 学 上 可 行 的 必要 条 件 ， 从 而 AG wm >O 是 反应 | 热力 学 上 不 可 
行 的 充分 条 件 。 相 似 地 ， 矶 ,max 则 代表 了 反应 离开 平衡 最 不 利 的 距离 。 因 此 ， 克 ,max 和 0 是 
反应 ) 在 热力 学 上 可 行 的 充分 条 件 ， 丽 ,max>0 是 反应 7 在 热力 学 上 不 可 行 的 必要 条 件 。 此 
外 ， 还 可 看 出 热力 学 可 行 反应 的 线性 组 合 也 产生 一 个 热力 学 可 行 的 反应 ， 而 热力 学 不 可 行 反 

373 


应 的 线性 组 合 形成 一 个 热力 学 不 可 行 反应 。 因 此 ， 如 果 Hy na <<O, 反应) 就 可 在 一 组 热力 
学 上 不 可 行 的 反应 中 被 排除 。 

前 述 转化 反应 的 线性 特性 提供 了 一 些 其 它 的 优点 。 如 果 反 应 ) 是 两 个 其 它 反应 1 和 反应 
2 的 线性 组 合 ， 那 么 对 复合 反应 的 归 一 化 吉 布 斯 参数 A, 就 同样 是 吉 布 斯 参数 站 Mar 的 线性 
He, GH, Hy HRA, Ho 的 线性 组 合 。 若 假定 两 个 组 成 反应 没有 共同 的 代谢 物 
则 对 五 ss 和 瓦 sm 也 可 得 出 类 似 的 式 子 。 在 这 种 情况 下 ， 即 当 一 个 代谢 物 是 一 个 反应 的 产物 
而 又 是 另 一 个 反应 的 反应 物 时 ， 可 以 表明 : 复合 反应 的 Hitt SARL ORAS EK, 
而 瑟 。。, 比 各 组 成 反应 的 线性 组 合 要 小 。 

在 通过 某 一 算法 检验 代谢 途径 的 热力 学 可 行 性 时 ， 应 该 检查 HG wa 和 Hy ww 的 符号 : 

© 4 Hy wa>0， 反 应 /在 热力 学 上 总 是 不 可 行 的 。 

© 405 Hi; min <O Ff Hj mac >O, ERIE j 的 可 行 性 或 不 可 行 性 无 法 给 出 结论 。 在 这 种 
情况 下 ， 反 应 ) 应 该 和 一 个 具有 共同 代谢 物 的 反应 结合 起 来 并 重新 计算 所 产生 的 复合 反应 的 
及 ws 和 Hin PEATE. EMRE, AA RMA RAE Hann 
和 更 低 的 Hanan» SIBLE AS ULE 2 So Bk 48 A Hy EY 45 HE BN 4 EB BH 

© WE Hy max<0, 反应 j 总 是 可 行 的 。 

上 述 思路 可 以 通过 一 个 简单 的 算法 来 实现 以 检验 生化 途径 的 热力 学 可 行 性 〈 见 方 框 
2 


方 框 14.2 ”确定 热力 学 可 行 性 的 算法 

Mavrovounitis (1993) 提出 了 一 个 算法 ， 其 所 依据 的 可 行 性 转换 判 据 已 在 上 述 正文 
中 进行 了 叙述 。 该 算法 有 如 下 几 个 步骤 。 

(1) 假定 每 个 代谢 物 浓 度 的 上 限 和 下 限 。 

(2) 识别 流通 代谢 物 〈 假 设 浓 度 恒 定 )。 

CGI 

(4) 从 瓶颈 反应 组 中 排除 Hj max <0 的 所 有 反应 。 对 于 所 规定 的 代谢 物 浓度 范围 ， 
这 些 反 应 总 是 可 行 的 。 

(5) 保留 瓦 ,mn>0 的 所 有 反应 。 对 于 所 规定 的 代谢 物 浓度 范围 , 这 些 反应 总 是 不 可 
行 的 。 

(6) 对 于 保留 下 的 反应 ， 构 成 两 个 反应 的 组 合 以 使 得 一 个 中 间 代 谢 物 总 是 被 清除 。 
在 没有 这 样 的 中 间 代 谢 物 存在 的 情况 下 ， 反应 就 不 能 被 进一步 组 合 ， 而 且 不 可 能 是 不 可 
TH, WARIS. AMR BAAR (3). 

热力 学 瓶颈 从 步骤 (6) 被 识别 出 。 重 要 的 是 要 强调 : PBA Ee A DR 
度 范 围 而 存在 的 。 如 果 已 经 知道 通过 途径 的 流 ， 该 算法 也 能 用 于 确定 很 可 能 的 体内 代谢 
物 浓度 的 范围 。 


【 例 14.2】 EMP 途径 的 热力 学 可 行 性 分 析 | 
在 本 例 中 ， 通 过 下 MP 途径 来 说 明 热力 学 可 行 性 分 析 的 算法 ， 该 途径 也 在 例 14.1 Pit | 
论 过 。 这 个 例子 是 基于 Mavrovouniotis (1993) 的 工作 ， 他 首先 提出 了 上 述 算法 。EMP & 
径 图 示 于 图 2.6 中 。 本 例 中 所 用 代谢 物 的 缩写 在 表 14.2 给 出 ， 而 表 14.3 则 给 出 了 酶 的 名 称 
374 


和 途径 中 各 酶 反应 的 标准 吉 布 斯 自由 能 变化 。 正 如 在 例 14.1 中 已 经 讨论 过 的 ， 由 于 多 个 反 
应 有 正 的 标准 吉 布 斯 自由 能 ， 反应 和 途径 的 可 行 性 不 能 直接 由 AG 的 值 来 判定 ， 但 众 所 周 
知 这 是 一 个 可 行 的 途径 。 假 定 pH 值 为 7， 因 此 水 、H+ 和 OH 浓度 均 处 于 其 标准 状态 ， 这 
意味 着 它们 可 以 在 计算 中 忽略 。 对 能 量 流通 代谢 物 ADP. ATP 和 Pi; 假定 其 浓度 不 变 。 这 个 
假定 是 与 大 量 的 试验 观测 是 一 致 的 ， 这 些 观察 认为 全 局 控制 把 这 些 代谢 物 的 浓度 维持 在 一 个 
预先 确定 的 很 窗 的 范围 内 。 还 可 进一步 假定 所 有 活 度 系数 恒 等 于 1。 本 例 中 的 流通 代谢 物 浓 
度 使 用 如 下 值 : [AMP]=0.82mmol-L~!, [ADP]=1.04mmol:L~!, [AIFP]=7.9mmol.L 1 以 
及 [Pi]=7.9mmol.L- 1, 这 相当 于 0.87 的 能 荷 。 此 外 ，LNAD- ] =4mmol-L~!, [NADH] = 
0.2mmol.L 1， 这 和 0.05 的 异化 代谢 还 原 负荷 (catabolic reduction charge) 相符 。 下 面 ， 
将 研究 EMP 途径 中 其 它 代谢 物 的 允许 浓度 范围 的 几 个 不 同 的 可 能 性 。 

首先 ， 检 查 0.1 一 1.0mmol.L-! 的 浓度 范围 。 表 14.4 列 出 了 在 该 算法 中 所 概述 的 10 个 

应 步骤 的 计算 结果 。 基 于 计算 的 瓦 min 和 Hnax WAS, fe BF 1, 3. 7108 
pba MRM 5S 和 反应 6 则 被 确定 为 两 个 局 部 瓶颈 。 对 反应 2、4、8 和 反应 9 由 Hain 
和 吾 。,. 的 计算 结果 不 能 得 出 结论 。 因 为 反应 1 和 反应 3 在 所 考察 的 浓度 范围 内 总 是 可 行 的 ， 
它们 本 身 不 是 局 部 瓶颈 ， 而 且 它 们 也 绝 不 可 能 是 分 布 式 瓶 颈 的 一 部 分 。 反 应 2 和 反应 4 SR 
应 1 或 者 反应 3 组 合 在 一 起 也 不 可 能 是 分 布 式 瓶 颈 的 一 部 分 ， 因 此 可 以 从 瓶颈 反应 列表 中 排 
除 。 对 于 反应 5 和 反应 6， 它们 都 是 局 部 瓶颈 ， 而 且 在 考察 的 浓度 范围 内 对 所 有 浓度 值 都 是 
不 可 行 的 。 


表 14.4 第 一 间隔 (0.1 一 1.0mmol.L 1) 各 个 反应 参数 的 计算 结果 


Re | er Ta 


1 
2 
<) 
4 
ay 
6 
7 
8 
9 
10 


注 ， 只 有 最 后 三 列 的 估算 基于 cwin 和 como 在 反应 中 代号 表示 : 1 一 已 糖 激 酶 ; 2 一 6- 磷 酸 葡萄 糖 异 构 酶 ;3 一 磷酸 果 
糖 激酶 ; 4 一 醛 缩 酶 ; 5 一 6- 磅 酸 丙 糖 异 构 酶 ;6 一 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 ;7 一 3- 磅 酸 甘 油 激酶 ;8 一 3- 磷 酸 甘 油 变 位 酶 ;9 一 
烽 醇 酶 ;10 一 丙酮 酸 激酶 。 

对 反应 8 和 反应 9 需要 进一步 检验 。 为 此 构造 了 所 有 两 反应 组 合 的 子 途 径 以 消除 一 个 中 
间 代 谢 物 。 只 有 一 个 这 样 的 组 合 是 可 能 的 ， 即 反应 8 加 上 反应 9， 其 导致 了 2- 磷酸 甘 油 酸 的 
消除 。 下 一 步 迭 代 对 反应 8 和 反应 9 的 组 合计 算 了 归 一 化 吉 布 斯 参数 A, AA 2.533, A 
此 Hmin(8+9) 等 于 0.23>0。 由 此 可 见 ， 反 应 8 和 反应 9 的 组 合 是 分 布 瓶颈 。 分 别 考虑 时 
反应 8 和 反应 9 都 是 可 行 的 ， 即 对 每 一 个 反应 在 允许 浓度 范围 内 都 有 一 个 区 域 ， 可 以 使 每 个 
反应 产生 负 吉 布 斯 自由 能 ， 从 而 在 热力 学 上 可 行 。 然 而 因为 使 它们 可 行 的 浓度 范围 没有 重 
于 ， 使 得 两 个 反应 的 组 合 在 热力 学 上 却 是 不 可 行 的 。 因 此 ， 在 假定 的 代谢 物 浓 度 范 围 内 得 到 
的 最 后 结果 是 反应 5 和 反应 6 是 局 部 瓶颈 ， 而 反应 8 和 反应 9 的 组 合 构成 分 布 上 瓶颈。 应 该 注 
意 的 是 反应 4 具有 最 大 的 正 标准 吉 布 斯 自由 能 ， 实 际 上 却 根本 不 是 瓶颈 反应 。 这 很 清楚 地 说 

375 


明 仅 仅 根 据 标准 吉 布 斯 自由 能 不 可 能 得 出 任何 结论 ， 正 如 在 例 14.1 中 已 讨论 的 。 
现在 考察 其 它 三 个 浓度 范围 : 
e Cin =0.1mmol*L 1 和 cuwx=2mmol'L 1 
e@ cuin=0.02mmol.L 1 和 cmax =4mmol*L7! 
@ Cin =0.004mmol*L -1 和 cx=Smmol' -1! 
在 这 些 浓度 范围 应 用 上 述 算法 计算 的 结果 在 表 14.5 中 给 出 。 对 考察 的 第 一 个 浓度 范围 ， 上 
限 是 以 前 值 的 2 倍 ， 也 就 是 2mmol'L -代替 了 lmmol'L -!。 和 以 前 分 析 的 惟一 不 同 在 于 当 
计算 反应 8 和 反应 9 的 组 合 的 归 一 化 吉 布 斯 参数 刀 时， 结果 是 2.333， 并 且 百 min(8+9)= 一 
0.463<0。 因 此 ， 和 前 面 的 情况 相反 ， 反 应 8 和 9 构成 的 子 途 径 不 能 被 确定 为 瓶颈 ， 但 它们 
也 不 能 被 否定 ， 因 为 Hinax(8+9)=5.529>0. HFRM8 和 9 不 能 和 与 它们 共享 同一 代谢 
物 的 其 它 反 应 进一步 组 合 ， 所 以 算法 执行 到 这 一 步 就 结束 了 ， 其 最 后 结果 得 到 两 个 局 部 瓶 
颈 ， 即 反应 $ 和 反应 6。 第 二 种 情况 中 ， 代 谢 物 浓度 的 上 限 和 下 限 都 被 放宽 。 通 过 观察 表 
14.5 的 结果 ， 可 以 看 出 ， 不 再 有 单个 反应 的 五 os 大 于 零 。 因 此 ， 在 第 一 步 迭 代 计 算 中 没有 
发 现 局 部 瓶颈 。 反 应 2、4、5、6、8 和 反应 9 仍 可 能 是 分 布 上 瓶颈 ， 反 应 组 合 8+9，4+5， 
4+6 和 反应 组 合 S+6 可 以 消除 某 一 中 间 代 谢 物 。 对 这 些 可 能 性 ， 可 以 计算 得 到 : 
hg t ho=2-539, Am,(8 + 9) = —2.769<0, Hix( 819) = 1 oO 
hat is—1.944, Hin 4+ 5) = —3.354<0,. Fin ( 445) - eee 
haPRg=—2:721, H,i,(4+ 6) = —2.577<0,. Hn. (4+6) = 14. 1648 
hs+ho=6.957, Hmin(5+6) =1.659>0 
由 此 可 见 ， 反 应 5 和 反应 OMAR ROHR, MRA 8+9, 44+5MRWAA 
4+6 还 要 进一步 检验 。 然 而 ， 由 于 反应 组 合 8+9 和 反应 组 合 4+5 不 能 生成 新 的 组 合 ， 它 
们 被 排除 了 。 可 以 推断 通过 加 大 浓度 范围 可 使 反应 $ 和 反应 6 不 再 为 局 部 瓶颈 ， 而 其 组 合成 
为 分 布 瓶颈 。 如 果 浓 度 范围 进一步 扩大 ， 就 会 出 现 更 多 分 布 瓶 颈 的 可 能 性 。 反 应 2、4、5、 
6、7、8 和 反应 9 可 以 与 前 面相 似 的 方式 进行 组 合 。 然 而 第 二 步 迭 代 计 算 并 不 充分 ， 因 为 反 
应 组 合 5S+6 和 反应 组 合 4+6 及 其 它 反应 组 合 一 样 ， 仍 然 是 候选 瓶颈 。 这 需要 进行 第 三 步 迭 
代 计 算 ， 计 算 三 反应 组 合 4、5 和 2 倍 的 反应 6 并 发 现 它 是 分 布 瓶 颈 ， 其 值 为 : 
haths+2ho=8.069, Hypin=0.938>0 


表 14.5 ”正文 中 所 给 三 种 浓度 下 各 个 反应 参数 的 估算 


cmin 三 0.004mmol'L-1! 


max = Jmmol*L~! 


Cmin = 0-1mmol*L7! 


max = 2mmol*L~! 


Cmin=0-02mmol*L7! 


max = 4mmol*L~! 


Co mAN AHN fF WN = 


Oo 


若 要 使 所 有 分 布 瓶 颈 都 被 排除 ， 计 算出 下 限 为 0.002Smmol'L -: (上 限 为 Smmol'L 1)。 这 
种 情况 下 可 以 发 现 前 面 反 应 4、5$ 和 2 倍 的 反应 6 的 组 合 的 五 win 是 -0.003 和 0。 这 表明 ， 这 
些 反 应 的 复合 转化 (composite transformation) 作为 一 个 整体 在 热力 学 上 是 很 困难 的 ， 其 复 
合 转化 对 应 于 以 下 方程 
— fructose-2 ,6-bisphosphate — 2NAD* -2P;+2 3-phosphoglycerol phosphate + 2NADH 
(2,6- 二 磷酸 果糖 ) (3- 磷 酸 甘油 酸 磷酸 ) 

为 发 生 这 种 反应 ， 需 要 假定 2,6- 二 磷酸 果糖 为 最 大 可 能 浓度 ， 而 3- 磷 酸 甘 油 酸 磷酸 为 最 小 
可 能 浓度 。 而 且 ，NADH 和 NAD ” 间 的 比率 至 关 重 要 。 如 果 比 率 太 高 ， 热 力学 上 就 会 在 应 
确定 的 位 置 关闭 该 途径 。 


14.2.2 利用 基 团 贡献 法 确定 AG9 
前 面 章节 已 经 表明 了 反应 的 标准 吉 布 斯 自由 能 AG 在 反应 的 热力 学 可 行 性 判定 上 的 重 
要 性 。 少 数 反应 的 AG" 是 可 以 得 到 的 〈 见 表 14.1)， 但 大 多 数 反 应 没有 标准 吉 布 斯 自由 能 
的 实验 数据 (或 平衡 常数 )。 在 这 种 情况 下 ，AG(0 能 通过 相应 反应 的 反应 物 和 产物 的 标准 化 
学 势 9 (六 , 工 ) 或 标准 生成 吉 布 斯 自由 能 AG? ;计算 得 到 ， 此 时 要 将 式 (14.12) 中 的 化 学 
势 用 以 下 变量 代替 : 
AG” = 忆 gIAG9 (14.32) 


现在 出 现 了 一 个 难题 ， 就 是 对 不 同 的 生化 物质 标准 生成 吉 布 斯 自由 能 事先 并 不 知道 。 因 此 需 


要 有 一 种 方法 来 从 现 有 的 实验 数据 中 计算 标准 生成 自由 能 。 值 得 注意 的 是 ， 一 旦 确定 了 这 些 
参数 ， 就 可 以 用 以 计算 有 相应 代谢 物 参 与 的 其 它 生化 反应 的 AG0 。 

有 一 种 方法 广泛 应 用 于 标准 吉 布 斯 自由 能 的 估计 ， 同 时 也 应 用 于 其 它 热力 学 特性 的 估 
计 ， 即 基 团 贡 献 法 。 为 了 计算 一 特定 化 合 物 的 特性 ， 可 以 将 该 物质 分 解 为 几 个 基 团 ， 将 这 些 
基 团 的 贡献 相 加 以 得 到 该 化 合 物 的 特性 值 。 如 果 某 个 功能 基 团 在 一 化 合 物 结构 中 多 次 出 现 ， 
那么 它 的 贡献 就 要 乘 以 其 出 现 次 数 。 在 某 些 情况 下 ， 还 需要 进行 其 它 处 理 以 修正 某 些 化 合 物 
的 特殊 结构 特征 。 时 常 地 ， 这 些 组 成 基 团 的 贡献 值 还 要 加 上 一 个 原点 值 ， 它 是 用 于 估计 某 一 
结构 特性 的 出 发 值 并 对 所 有 具有 该 结构 的 化 合 物 都 是 一 恒定 值 。 上 述 分 析 可 以 用 式 〈14.33) 
来 表示 ， 该 式 表 明了 某 一 化 合 物 的 标准 生成 自由 能 就 是 原点 值 Pu 与 所 有 功能 基 团 贡献 值 的 
加 和 。 在 式 (14.33) 中 ，Pi 表示 了 基 团 7 的 贡献 ，m 表示 了 在 化 合 物 中 基 团 ) HHH 
次 数 。 

AG” = Po 上 + d)nP; (14.33) 


如 式 〈14.33) 所 示 ， 一 旦 知道 各 基 团 的 贡献 值 就 可 计算 出 AG90 的 值 。 为 了 得 到 不 同 基 
团 的 贡献 值 ， 可 以 由 大 量化 合 物 的 实验 测定 的 AG9? 的 值 拟 合 未 知 的 已 的 值 。 因 为 每 个 基 团 
Xt AG 的 贡献 都 假定 为 线性 的 ， 上 述 过 程 可 以 直接 通过 线性 回归 实现 ， 已 有 现成 的 数值 算 
法 可 以 使 用 。 但 是 在 多 元 线性 回归 计算 中 使 用 的 数据 必须 慎重 选择 。 第 一 ， 它 们 必须 与 所 研 
究 的 生化 过 程 中 涉及 的 化 合 物 相 关 。 第 二 ， 它 们 必须 来 源 广 泛 以 使 系统 误差 最 小 。 第 三 ， 它 
们 必须 被 筛选 出 来 以 确保 它们 能 代表 化 合 物 分 子 结构 中 所 有 可 能 功能 基 团 的 贡献 。 最 后 ， 还 
要 针对 基 团 之 间 的 相互 作用 进行 修正 ， 例 如 氮 和 与 其 相 邻 的 痰 基 基 团 之 间 的 相互 作用 。 在 决 
定 要 表示 出 的 基 团 的 确切 类 型 时 ， 要 尽 可 能 包含 尽量 多 的 相应 基 团 以 使 其 能 表示 所 有 可 能 生 
化 组 分 对 所 考虑 的 性 质 的 影响 。 当 然 这 种 基 团 的 分 解 是 有 一 定 限 度 的 ， 因 为 某 些 基 团 根本 就 

377 


不 能 分 解 ， 而 另外 一 些 基 团 仍 可 分 解 但 却 会 导致 大 的 误差 。 在 这 种 情况 下 ， 最 小 的 化 合 物 将 
被 表示 为 只 含有 一 个 特殊 基 团 。 

在 生物 转化 中 ， 某 些 具 有 重要 代谢 功能 的 复杂 生物 化 合 物 组 常常 一 起 同时 出 现 ， 例 如 ， 
一 些 辅 因 子 对 如 NAD+* /NADH 或 ATP/ADP。 在 这 种 情况 下 ， 这 些 因 子 对 常用 一 个 单个 基 
Hist #78 NAD* ANADH 或 ATP/ADP 之 间 的 转化 。 将 这 些 因子 对 作为 一 个 基 团 表 示 ， 就 
使 得 确定 相应 化 合 物 标 准 生 成 自由 能 的 复杂 计算 过 程 只 需 进 行 一 次 ， 而 二 者 的 差异 在 计算 该 
基 团 参与 的 反应 的 AG9 时 被 包含 在 一 个 单个 基 团 中 。 用 这 种 办 法 使 计算 过 程 大 大 简化 ， 而 
由 相应 化 合 物 复杂 结构 导致 的 误差 也 被 最 小 化 了 。 在 发 展 及 应 用 基 团 贡献 法 时 ， 所 有 化 合 物 
都 被 假定 为 处 于 水 溶液 中 的 通常 状态 。 因 此 ， 氨 基 常 常 附带 一 个 质子 (R-NH} 而 不 是 R- 
NH2) ， 羧 酸 常 常 处 于 负离子 状态 〈(R-CO-O -而 不 是 R-CO-OH) ， 氢 基 酸 则 常 处 于 两 性 离子 

由 大 量 相关 生化 物质 ， 已 确定 出 各 种 基 团 的 贡献 值 。 由 Mavrovouniotis (1990, 1991) 
的 工作 所 确定 出 的 值 列 于 表 14.6 一 表 14.12 中 。 从 这 些 表 中 ， 本 部 分 中 讨论 到 的 大 部 分 内 
容 都 已 采用 了 。 此 外 ， 由 于 对 许多 生化 物质 其 分 解 为 基 团 及 进行 各 种 修正 非常 繁琐 ， 大 量 环 
状 化 合 物 的 吉 布 斯 生成 自由 能 已 被 预先 计算 出 来 并 列 于 表 14.13 中 。 这 些 值 可 以 直接 用 于 计 
算 相 关 物 质 参 与 的 化 学 反应 的 吉 布 斯 自由 能 AG0 变化 。 


表 14.6 ”具有 一 个 单 键 基 团 的 贡献 


一 NH2 C007 


一 OH( 连 接 在 葵 环 上 ) 三 Poy 42.7 

一 OH( 主 要 的 ) 一 SO3 — 439.7 

一 OH( 其 次 的 ) 一 CO 一 OPO3 — 301.7 

一 OH( 第 三 的 ) —OPOZ (主要 的 ) — 120.5 

—NH? 一 OPO (其 次 的 ) — 123.0 
一 OPO (第 三 的 ) 


二 
—NH— 


表 14.8 同一 个 环 上 基 团 的 贡献 


Se 40.2 
N*= (在 非 芳香 环 上 为 单 键 或 双 键 ) 
31.0 
河 
一 ( 苯 环 上 ) 
-10.8 
一 (在 非 葵 环 上 是 两 个 单 键 ) 
7 —227.2 
SS 
一 (在 非 葵 环 上 为 单 键 或 双 键 ) -114.6 
N\A — 100.8 
C 
fon 41.4 
Fem 26.4 
SH (#K 5) 65.3 


注 : 如 非特 别 注 明 ， 这 些 化 合 物 参加 的 是 非 芳香 环 反 应 。 
表 14.9 在 两 个 相连 环 上 的 基 团 贡献 


具有 两 环 的 基 团 贡献 必 J «mol! 


BS x 
A (在 两 个 相连 的 葵 环 上 ) : a 《在 两 个 相连 的 非 葵 环 上 ) -5.4 


4 ze 
Ne (在 两 个 相连 的 非 葵 环 上 ) J (FERIA IE HE ) 70.7 


贡献 必 J "mol 
每 个 三 碳 环 
每 个 氨基 化 合 物 (N ETRE LE) 

每 个 芳香 杂 环 ( 含 N\S 和 O 元素 ) 


KALAMA F (ASCH 元 素 ) 
TAH 


注 : 许多 环 状 化 合 物 的 吉 布 斯 的 能 已 经 预先 计算 好 了 (NR 14.13), 
表 14.11 未 分 解 成 基 团 的 小 化 合 物 的 吉 布 斯 能 值 


表 14.12 ”特别 化 合 物 对 的 吉 布 斯 能 差 


吉 布 斯 能 值 差 
人 必 J :mol 1: 


吉 布 斯 能 值 差 
/kJ+mol~! 


NADH (38 4S )-NAD * (氧化 态 ) 19.8 取代 辅酶 A-SH- 辅 酶 A( 为 计算 吉 布 — 55.2 
斯 能 差 , 必 须 修 正 取代 基 团 的 贡献 ) 
NADPH( 还 原 态 )-NADP+( 氧 化 态 ) 19.8 还 原 态 (Pyocyamine )- 氧 化 态 (Py- -74.5 


ocyamine) 


379 


表 14.13 


化 & D 


辅酶 A 的 衍生 物 ( 相 对 吉 布 斯 能 值 ) 了 


乙酰 辅酶 A 
草 酰 辅酶 A 
丙烯 辅酶 A 
丙 栈 辅酶 A 

两 二 酰 辅酶 A 

丁 烯 酰 辅酶 A 
乙酰 乙酰 辅酶 A 
丁 酰 酮 辅酶 A 
丁 酰 辅 酶 A 

甲 基 丙 二 酰 辅酶 A 
琥珀 酰 辅 酶 A 

丙 氨 酰 辅酶 A 
3- 羟 基 丁 酰 辅酶 A 
酮 已 酰 辅 酶 A 
己 酰 辅酶 A 

3- 羟 基 已 酰 COA 
羟基 丁 烯 酰 辅酶 A 
棕榈 酰 辅酶 A 


核 苷 和 碱 


PR ME BE 

4, 5-— ARR ME Be 
KR 

UR (WSK )F 
Fi Fa a Bo 

He RS 


BTR 

2 -脱氧 胞 啶 单 磷酸 (dCMP) 
尿 背 单 磷酸 (UMP) 

3 ,3 - 环 腺 苷 单 磷酸 (cAMP ) 
胞 啶 单 磷 酸 (CMP) 

3 ,5 - 鸟 苷 单 磷酸 (cCGMP) 
2 -脱氧 胸 苷 单 磷酸 (dTMP) 
次 黄 苷 单 磁 酸 (IMP) 

胸 苷 单 磷酸 (TMP) 

腺 苷 单 磷酸 (AMP) 

鸟 背 单 磷酸 (GMP) 

2 -脱氧 胞 啶 二 磷酸 (dCDP) 
尿 苷 二 磷酸 (UDP ) 

胞 啶 二 磷酸 (CDP) 


380 


一 些 环 状 化 合 物 的 标准 生成 吉 布 斯 自由 能 的 估计 值 


标准 生成 吉 布 斯 妈 
EEC 


2 -脱氧 胸 苷 二 磷酸 (dTDP) 


EEC NASLOSERTAEC 从 


次 黄 苷 二 磷酸 (IDP) 
胸 苷 二 磷酸 (TDP) 
腺 苷 二 磷酸 (ADP) 
& 4 BR (GDP) 
RR = BEM (UTP) 
胞 啶 三 磷酸 (CTP) 
次 黄 苷 三 磷酸 (ITP) 
Ka = BB (TTP) 
腺 苷 三 磷酸 (ATP) 
鸟 背 三 磷酸 (GTP) 
核 苷 和 核 苷 酸 的 衍生 物 
UDP- 葡 糖 醛 酸 
UDP- 葡 萄 糖 
CDP- 葡 萄 糖 
GDP- 半 乳糖 
GDP- 葡 萄 粮 
GDP- 甘 露 糖 

WR RET AB 

ig ORS BER 

腺 苷 酰 -x- 氨 基 己 二 酸 
四 氧 叶 酸 和 其 衍生 物 
7,8- 二 氢 叶 酸 
Ant Bw 
N5s,Ni0- 次 甲 基 四 氢 叶 酸 
Ni,NI0- 亚 甲 基 四 氢 叶 酸 
Ni 甲酸 四 氢 叶 酸 
N5- 甲 酸 四 氢 叶 酸 
N5- 甲 基 四 氢 叶 酸 
N5- 亚 胺 甲 基 四 氢 叶 酸 
环 糖 

树胶 醛 酶 

利比亚 糖 

核糖 

核 酮 糖 

AME 

木 酮 糖 

6- 脱 氧 半 乳 糖 
Fuculose 

鼠 李 糖 

鼠 李 酮 糖 

阿 洛 糖 

Bray at 

果糖 

EFL 

葡萄 糖 

艾 杜 糖 

LEE 

甘露 糖 


标准 生成 吉 布 斯 
A A BE kJ mol ! 
i357 22 
= Alen 
— 805.4 
— 23035 
— 431.8 
— 856.0 
— 615.9 
— 492.9 
— 827.6 
—Qazar 
= 453.5 


OBS? 
=149955 
一 1259.4 
= 1097.5 
st 5 
a OTS 
— 3354 
= 8355 ul 
=697 9 


— 310.0 
356.5 
— 286.6 
— 268.6 
— 480.3 
— 482.8 
meee NAY) 
ol? 6 


— 746.0 
— 746.0 
ad ny 
— 746.8 
— 746.0 
— 746.8 
— 747.3 
— 15850 
二 7 
~ T5866 
— 895.8 
— 895.8 
= 006.7 
— 895.8 
— 895.8 
— 895.8 
— 895.8 
= 95580 


喀 喧 


标准 生成 吉 布 斯 
A ABE AJ mol-: 


续 表 


蔗糖 烟 栈 -189.1 
海藻 糖 6- 吡 咯 啉 -5- 羧 酸 — 276.1 
纤维 三 糖 烟 碱 —2.5 
磷酸 根 糖 吡咯 羧 酸 一 477.4 
5 -磷酸 -2 -脱氧 核糖 RAR — 136.0 
5B PR PH BBC AE BE 肌 酸 本 一 28.9 
1- 磷 酸 核糖 二 氢 乳 清 酸 一 620.4 
5- 磷 酸 核糖 2,3- 二 氢 吡 啶 二 羧 酸 527.6 
1- 磷 酸 Fuculose 5- 脱 氢 荆 草酸 一 701.2 
1- 磷 酸 鼠 李 酮 糖 1- 哌 啶 -2,6- 二 羧 酸 — 555.6 
1- 磷 酸 葡 糖 醛 酸 AAR — 223.4 
1- 磷 酸 果糖 RR —728.4 
6- 磷 酸 果糖 葡萄 糖 酸 y- 内 酯 — 892.0 
1- 磷 酸 半 乳 糖 葡萄 糖 酸 O-AB 一 880.3 
1- 磷 酸 葡萄 糖 AA — 37.7 
6- 磷 酸 和 葡萄糖 5- 脱 氢 硅 尼 酸 一 930.9 
1- 磷 酸 甘露 糖 RB — 1092.9 
6- 磷 酸 甘 露 糖 葡 糖 醛 酸 — 1081.6 
1,6- 二 磷酸 果糖 咪唑 丙酮 磷酸 一 149.8 
1,6- 二 磷酸 葡萄 糖 苯 基 丙 氢 酸 212.1 
1,6- 二 磷酸 蔗糖 SER —958.1 
碳 氢 化 合 物 MAR ~— 374.0 
环 丙烷 0- 葡 糖 酸 内 酯 -6- 磷 酸 — 880.7 
x ARR — 38.1 
环 己 烷 7,8- 二 氧 生物 蝶 叭 - 107.1 
葵 5,6,7,8-BA+DRY — 153.6 
简单 的 醇 . 醛 和 酯 蝶 酸 113.8 
Oe O RA AR ~ 318.4 


Po AK Oi 


注 : 在 每 个 分 类 中 ， 以 各 物质 的 原子 个 数 升 序 排 列 。 
© 辅酶 A 衍生 物 的 能 值 以 辅酶 A 为 基准 。 也 就 是 ， 表 中 所 示 的 能 值 为 : 辅酶 A 衍生 物 的 吉 布 斯 自由 能 减 去 辅酶 A 
吉 布 斯 自由 能 。 


【 例 14.3】 谷 氨 酸 盐 生成 的 吉 布 斯 自由 能 
谷 氮 酸 的 结构 式 见 图 14.2 (a)。 为 了 计算 生成 吉 布 斯 自由 能 ， 把 这 个 结构 式 分 解 成 如 
图 14.2 (b) 所 示 的 基 团 。 表 14.14 列 出 了 由 每 个 基 团 的 贡献 量 及 出 现 次 数 计算 的 详细 过 
程 。 采 用 了 表 14.10 中 的 原点 值 ， 没 有 作 专 门 的 修改 。 结 果 值 是 - 689kJ .mol- 1， 与 文献 值 
699kJ .mol -1 相差 10kJ .mol 1。 
381 


0-0 a 
-0 一 CO 一 CH 一 CH: 一 CH -0co 一 一 CH 一 一 CH 一 一 CH 
NHi —NH} 
(a) (b) 


图 14.2 SARA (a) 及 谷 氨 酸 分 解 后 的 基 团 (b) 
表 14.14 由 各 基 团 贡献 值 计 算 谷 氨 酸 生成 的 吉 布 斯 自由 能 


【 例 14.4】 ATP 生成 的 吉 布 斯 自由 能 

ATP 是 一 种 复杂 的 环 状 化 合 物 ， 其 结构 如 图 14.3 所 示 。 其 整体 结构 被 分 解 为 如 图 14.4 
所 示 的 基 团 。 注 意图 14.4 中 还 将 羟基 和 磷酸 盐 基 团 分 成 主要 的 、 其 次 的 或 第 三 的 三 类 ， 并 
给 出 了 环 中 化 学 键 的 参与 及 两 个 杂 芳 香 环 的 修正 。 表 14.15 摘要 给 出 了 由 这 些 基 团 贡献 计算 
吉 布 斯 自由 能 的 过 程 。 其 结果 是 233.SkJ .mol-1， 接 近 于 表 14.13 所 给 出 的 预先 计算 的 
-252.7kJ.mol :1 的 值 (小 偏差 是 由 于 舍 人 误差 造成 的 )。 


vt 


oS. 


PO} —O—PO; —O—PO;—O—CH, co, iy 
O, | 
cA ‘CH 
CH 一 CH 


nee 
OH OH 


图 14.3 ATP 的 结构 


两 个 环 ， 杂 芳香 环 


图 14.4 ATP 的 结构 分 解 成 基 团 
382 


14.15 由 各 基 团 贡献 值 计算 ATP 生成 的 吉 布 斯 自由 能 


现在 应 该 很 清楚 了 ， 应 用 基 团 贡献 法 最 重要 的 要 求 就 是 判定 一 特定 化 合 物 的 组 成 基 团 。 
这 对 像 ATP 这 样 的 复杂 分 子 而 言 是 一 种 特别 的 挑战 。 在 这 方面 ， 表 14.13 给 出 的 能 值 很 有 
用 ， 因 为 他 们 提供 了 一 个 参考 点 ， 这 个 参考 点 可 与 一 个 与 表 中 所 给 化 合 物 类 似 的 化 合 物 相 关 
联 。 要 使 用 这 个 表 ， 只 需要 辨别 出 要 研究 的 化 合 物 与 表 14.13 中 类 似 的 化 合 物 的 区 别 并 加 上 
或 减 去 由 这 一 差别 的 相应 贡献 就 可 以 。 


【 例 14.5】 酒精 脱氧 酶 催化 反应 的 AG" 的 计算 

我 们 来 研究 酒精 脱氧 酶 催化 的 反应 以 说 明 如 何 由 基 团 贡献 的 变化 直接 计算 吉 布 斯 自由 能 。 
在 这 个 反应 中 ， 乙 醇 转 化 为 乙 醛 ， 同 时 伴随 着 NAD+ 转 化 为 NADH。 如 图 14.5 所 示 ， 这 个 反 
应 能 分 解 为 各 种 基 团 。NADHANAD -对 作为 一 个 单独 的 基 团 考虑 。 计 算 在 表 14.16 中 给 出 ， 
其 中 忽略 了 原点 和 一 CH3 基 团 的 贡献 ， 因 为 它们 无 论 在 乙醇 中 还 是 在 乙 醛 中 都 是 相同 的 ， 因 此 
它们 的 净 结 果 为 零 。 这 个 反应 的 AG0' 的 计算 值 为 20.2kJ .mol-1。 


表 14.16 由 各 基 团 的 贡献 值 计 算 醇 脱 氢 酶 催化 反应 的 吉 布 斯 自由 能 


基 团 或 校正 值 


NADH-NAD* 
—CH; 

一 CH 一 

一 OH( 主 要 的 7) 
一 CH 一 0 
总 值 


eee esa 37— CH=—=0 


NAD* NADH H* 
(a) 


化 合 物 对 


(b) 
14.5 由 醇 脱 氢 酶 催化 的 反应 (a) 及 将 反应 分 解 为 基 团 ， 以 便 估算 其 吉 布 斯 能 (b) 


上 面 所 介绍 的 基 团 贡献 法 具有 广泛 的 应 用 ， 因 为 它 提 供 了 一 组 广泛 的 基 团 的 贡献 。 对 回 
归 拟 合 中 使 用 的 数据 点 ， 对 85% 的 数据 点 误差 估计 小 于 8kjJ mol : ，95% 的 数据 点 误差 小 于 
21kJ'mol :。 这 对 吉 布 斯 能 和 生化 系统 的 平衡 常数 是 可 接受 的 第 一 级 近似 ， 因 此 这 个 方法 
在 生化 途径 的 热力 学 分 析 中 是 很 有 用 的 。 


14.3 IEPA Ss 


正如 前 面 提 到 的 ， 细 胞 体系 是 一 开放 系统 ， 其 中 许多 过 程 都 在 远离 平衡 态 下 进行 。 如 果 
它们 处 于 平衡 态 ， 就 不 会 有 代谢 流 流 经 胞 内 途径 ， 细 胞 功能 就 会 停止 。 这 可 通过 跨 膜 的 被 动 
运输 过 程 来 说 明 。 通 过 该 过 程 大 量 物质 从 周围 环境 流入 或 流出 细胞 。 在 平衡 时 ， 膜 两 侧 物质 
浓度 相同 ， 因 而 不 会 有 流动 。 当 有 浓度 梯度 存在 时 ， 就 会 产生 一 个 力 推动 化 合 物 沿 浓度 降低 
的 方向 流动 。 在 被 动 运输 过 程 中 ， 有 一 个 热力 学 推动 力 即 浓度 梯度 ， 在 推动 力 和 由 此 产生 的 
RZAABRHRWKA, BRAHMI (conjugate flow)。 在 大 多 数 细 胞 过 程 中 ， 流 都 是 共 斩 
的 ， 但 某 些 情况 下 热力 学 力也 会 导致 一 非 共 斩 流 。 例 如 在 氧化 磷酸 化 过 程 中 ，ADP 磷酸 化 
生成 ATP 的 过 程 就 是 真 核 细 胞 的 线粒体 内 膜 〈 或 原核 细胞 的 细胞 质 膜 ) 两 侧 的 质子 梯度 推 
动 的 。 这 一 热力 学 激发 的 非 共 恩 流 常 被 称 为 能 量 转 导 (energy transduction ) 。 

非 平衡 热力 学 是 经 典 热力 学 向 非 平 衡 状 态 的 推广 。 它 所 研究 的 主要 问题 就 是 热力 学 推动 
AAR 〈 例 如 反应 或 转化 的 速率 ) 之 间 的 关系 ， 包 括 共 斩 流 与 非 共 斩 流 。 此 外 ， 非 平衡 热力 
学 还 涉及 不 同 细 胞 过 程 间 的 相互 作用 问题 ， 例 如 在 氧化 磷酸 化 的 各 个 过 程 ， 其 中 能 量 转 导 具 
有 重要 作用 。 非 平 衔 热 力学 的 基础 是 流 - 力 (flow-force) 关系 ， 流 响应 于 热力 学 推动 力 而 产 
生 并 且 是 该 力 的 函数 。 对 一 化 学 反应 ， 推 动力 可 以 由 亲和力 A 来 量化 ， 它 是 该 反应 自由 能 
变化 的 负数 。 因 此 ， 对 反应 i AX (14.34): 


A; =— AG; — ee Sez: (14.34) 


j=l 
KH, gy; PHBA] 个 化 合 物 的 化 学 计量 系数 和 化 学 势 。 其 它 的 热力 学 力 ， 如 有 氧 
化 磷酸 化 过 程 中 的 质子 动力 (proton-motive force) 〈 见 例 14.6) 也 可 能 起 到 推动 力 的 作用 ， 
在 下 面 的 讨论 中 ， 用 变量 A,; 来 表示 此 种 推动 力 。 如 前 一 节 所 讨论 的 ， 一 个 自发 反应 需要 负 
384 


的 自由 能 变化 ， 其 对 应 于 A,;>>0。 但 是 由 于 热力 学 耦合 现象 ， 并 非 所 有 过 程 都 需要 一 个 非 负 
的 亲和力 ， 因 为 某 些 过 程 可 以 被 其 它 具 有 正 亲 和 力 的 过 程 推动 。 例 如 EMP RE PHA 
酸 蜡 构 酶 催化 反应 就 具有 负 的 亲和力 (或 一 个 正 的 自由 能 变化 ， 见 表 14.3)。 但 在 途径 中 其 
它 后 续 反 应 的 推动 下 由 磷酸 二 羟基 丙酮 到 3- 磷 酸 甘油 醛 的 转化 确实 发 生 了 。 因 此 生物 过 程 i 
自发 性 的 特定 必要 条 件 A; 三 0 可 以 用 必要 条 件 整 体 亲 和 力 (orerall affinity) 非 负 代替 ， 整 体 
亲和力 由 推动 整体 生物 过 程 ; 的 所 有 单个 过 程 计 算得 到 。 在 评价 过 程 ; 的 整体 亲和力 时 ， 
A; 也 被 称 为 耗 散 函 数 (dissipation function) ®; (kJ 'h  )， 在 计算 时 很 重要 的 一 点 就 是 要 
考虑 到 各 个 单个 过 程 推动 过 程 ; 的 相对 速率 ， 用 下 式 表 示 : 


i 
Abe Dis 21 Ay (14.35) 


式 中 ，z 是 过 程 中 第 7 个 反应 〈 或 过 程 ) 的 速率 (mol"h- 1)，Ai 是 该 反应 对 过 程 ; 整 
体 亲 和 力 (或 推动 力 ) 的 贡献 。 考 虑 到 耗 散 图 数 是 反应 速率 的 图 数 ， 因 此 引入 了 时 间 变 量 。 
此 外 ， 它 代表 了 多 个 不 同 过 程 的 整体 耗 散 ， 因 此 只 要 耗 散 函 数 保持 非 负 就 允许 某 些 单个 亲 和 
AAR (或 正 的 自由 能 变化 ) 的 过 程 同 时 进行 。 这 两 方面 是 其 对 平衡 热力 学 的 主要 偏离 ， 在 
平衡 热力 学 中 每 个 反应 的 可 行 性 仅 由 其 自身 的 自由 能 变化 决定 。 

为 了 举例 说 明 由 耗 散 函 数 表示 的 热力 学 耦合 现象 ， 现 在 考察 包括 两 个 分 反应 〈partial 
reaction) AY Sz ny al EMP 途径 中 的 己 糖 激酶 催化 反应 。 第 一 个 分 反应 是 葡萄 糖 磷 酸化 生成 
6- 磷 酸 葡 萄 糖 : 


glucose-6-phosphate — glucose — P; =0 (14.36) 
(6- 磷 酸 葡萄 糖 ) (葡萄 糖 ) 
第 二 个 分 反应 是 ATP 水 解 生成 ADP 和 磷酸 : 
ADP + P; - ATP=0 (14.37) 


第 一 个 分 反应 的 标准 自由 能 变化 为 14.8kJ .mol-1， 第 二 个 分 反应 的 为 -30.$kJ .mol-1。 即 
使 在 生理 条 件 下 第 一 个 分 反应 的 自由 能 变化 AG 也 是 正 的 〈 对 应 一 负 的 亲和力 ) ， 因 此 其 不 
能 自发 正 向 进行 。 但 是 通过 与 第 二 个 反应 的 耦合 ， 可 能 有 一 个 整体 自由 能 耗 散 过 程 。 总 的 耗 
散 函 数 为 : 


@ = varpAarr + VetcA gle (14.38) 
或 对 亲和力 引入 自由 能 变化 方程 式 〈14.12) 得 : 
加 =~wATP(NATP ~ ADP ~ LP. pk Vele(fegle + HP, — Lelcor ) (14.39) 


两 个 反应 的 速率 不 是 相互 独立 的 ， 因 为 已 糖 激酶 催化 葡萄 糖 磷酸 化 的 反应 只 有 在 另 一 反应 同 
时 进行 时 才 可 进行 。 因 此 vg = vate, 式 (14.39) 简化 为 

D = veic( Mele + MATP ~ ADP ~ fegle6P ) (14.40) 
其 在 所 有 生理 条 件 下 都 是 正 的 。 

前 面 的 己 糖 激酶 催化 反应 例子 说 明了 两 个 反应 的 热力 学 耦合 现象 ， 这 些 反 应 常 被 当 作 一 
个 整体 反应 处 理 。 还 有 许多 类 似 的 例子 ， 但 更 有 趣 的 是 考虑 独立 过 程 〈 即 由 不 同 的 酶 催化 的 
过 程 ) 的 热力 学 耦合 现象 。 例 如 氧化 磷酸 化 过 程 中 各 个 单独 的 过 程 由 热力 学 约束 所 耦合 〈 参 
见 例 14.6) ， 或 一 些 胞 内 反应 与 辅 因子 的 转化 过 程 如 NAD- 到 NADH 相 耦 合 。 后 者 提供 了 
许多 不 同 代谢 途径 之 间 进 行 热力 学 耦合 的 方法 。 此 外 ， 代 谢 途 径 中 两 个 连续 反应 可 以 通过 中 
间 代 谢 物 在 热力 学 上 相 耦 合 ， 中 间 代 谢 物 通过 其 浓度 影响 生成 它 及 消耗 它 的 反应 的 亲和力 。 

385 


这 些 不 同 的 热力 学 耦合 过 程 可 通过 所 谓 的 表 观 方程 (phenomenological equations) 描述 ， 其 
用 下 式 来 表示 力 和 流 之 间 的 关系 ; 


“gal LA, (14.41) 

AH, Lyk RMA A OE | coefficient)。 可 以 看 到 每 一 个 流 v; (MRM 
速率 ) 都 通过 一 直接 系数 〈direct coefficient) L, SHHMHAAA; 相关 联 ， 而 与 其 它 推 动 
力 Ai 通过 交叉 系数 〈cross-coefficient) 工 y 相 关联 。 

表 观 方程 与 其 它 描述 力 和 流 之 间 线 性 关系 的 方程 类 似 ， 如 描述 电流 流动 的 欧姆 方程 ， 费 
克 扩 散 方程 ， 泊 肃 流 体 流动 方程 等 。 此 外 ， 表 观 方程 已 推广 为 包括 所 有 的 交叉 影响 和 干扰 。 
它们 只 有 对 较 慢 的 过 程 才 严 格 满足 ， 即 足够 接近 于 平衡 态 的 过 程 。 快 的 反应 需要 加 入 高 阶 项 
[ 详 见 Westerhoff and van Dam (1987)]， 这 就 会 限制 方程 的 实际 应 用 。 但 是 对 大 多 数 细 胞 
过 程 尤 其 是 运输 过 程 ， 惊 奇 地 发 现 线性 关系 在 推动 力 很 宽 的 数量 级 范围 内 都 满足 (Caplan, 
1971)。 对 化 学 反应 这 一 规则 常常 是 更 加 限制 的 ， 但 正如 后 面 要 说 明 的 ， 线 性 常常 是 一 个 很 
好 的 近似 。 

表 观 系数 是 系统 参数 (动力 学 ， 运 输 及 其 它 过 程 ) 的 函数 ， 因 此 不 是 常数 (见方 框 
14.3 和 下 面 )。 但 这 些 系数 也 不 能 任意 取 值 ， 因 为 正如 Onsager (1931) 的 经 典 工 作 所 指出 
的 它们 要 满足 一 些 重要 的 热力 学 约束 。 第 一 ， 系 数 和 矩阵 是 对 称 的 ， 即 

Lj = Ljis t47 (14.42) 
这 些 一 般 被 称 为 Onsager 倒数 关系 (RAMA Onsager 定律 )。 它 说 明了 某 一 力 Ai; 对 某 一 
流 v; 相对 影响 的 一 阶 近似 与 相反 的 力 流 对 Cforce-flow) 的 相对 影响 的 一 阶 近似 相同 。 这 一 
倒数 关系 只 有 在 接近 平衡 时 才 严 格 成 立 (见方 框 14.3)。 第 二 ， 直 接 系 数 永 不 能 为 负 ， 即 
工 5 人 0， 而 交叉 系数 必须 满足 以 下 条 件 : 

L4SL iL j3 iF7s (14.43) 
这 两 个 对 于 表 观 系数 的 约束 可 以 在 所 有 条 件 下 耗 散 函数 都 不 能 为 负 的 要 求 中 推导 得 到 (PERL 
Westerhoff and van Dam (1987) ]. 

表 观 方程 可 用 来 描述 许多 不 同 过 程 间 的 相互 作用 ， 但 常常 仅 考虑 两 个 流 相 耦合 的 系统 ， 

如 下 所 示 : 
vy=—LyA,t+LypA2 (14.44a) 
v2—=LyA,+ LA? (14.44b) 
其 中 ， 倒 数 关系 预示 Lp=Ly. —MIBM EP, —TRREA-TREREWN Bh REED Ft 
向 进行 。 此 时 提供 自由 能 的 流 作为 输入 流 ， 而 通过 由 这 些 流 所 提供 的 自由 能 的 消耗 被 输入 流 
所 推动 的 流 称 为 输出 流 。 对 这 样 一 个 系统 ， 交叉 系 数 工 2 定量 反映 了 输入 和 输出 过 程 间 的 耦 
合 程度 。 但 是 ， 工 1 本身 的 大 小 并 不 是 耦合 程度 的 很 好 量度 。 其 通过 交叉 系数 与 直接 系数 之 
比 的 值 来 量度 更 好 。 所 谓 的 耦合 度 (degree of coupling) 9 就 用 来 表示 这 一 关系 : 
Lip 
q fi. (14.45) 
由 于 式 (14.43) 的 限定 ， 耦 合 度 的 绝对 值 确定 总 是 小 于 或 等 于 1。 当 gg=1 时 系统 完全 耦 
合 ， 即 两 个 流 互 相 成 正比 ， 因 而 系统 可 用 一 单个 化 学 计量 过 程 很 好 表示 。 当 g =0 时 系统 完 
全 不 耦合 ， 因 此 在 考虑 能 量 转化 时 可 不 予 考虑 。 
对 二 流 系 统 (two-flow system) 一 个 有 意义 的 变量 是 所 谓 的 流 比 (flow ratio)， 其 定义 
380 


党 


为 输出 流 对 输入 流 之 比 : 
_ vy LyAytlypA2 


ir \aeg7 Lacie Ea Z (14.46) 
AP, v, 是 输出 流 〈A; SAH). BAEK (14.46) 得 到 : 
(Zy)+4q 
7) 名 呈现 14.47 
q(Zy)+1 ( 


KHZ EH PRAY H RWI BAR (phenomenological stoichiometry) (Westerhoff and 


van Dam, 1987): 
ee a 
Z= te (14.48) 


X 是 力 比 (force ratio) ， 为 输出 力 对 输入 力 之 比 : 
Al 


LOD, (14.49) 


方 框 14.3” 流 - 力 关系 和 倒数 关系 
在 本 条 目 中 ， 进 一 步 详细 描述 式 (14.2) 线性 流 - 力 关系 的 有 效 性 和 式 〈14.43) 所 
示 的 Onsager 的 倒数 关系 。 
流 - 力 关系 
为 了 举例 说 明 线 性 流 - 力 关系 的 推导 和 有 效 性 ， 考 虑 一 个 由 底 物 S 转化 为 产物 了 的 简 
单 化 学 反应 
P-S=0 (1) 
对 该 反应 ， 正 反应 净 速 率 为 : 
v=kics—k- cp (2) 
从 化 学 势 的 定义 [st (14.10)]， 能 将 S 和 了 的 浓度 表示 为 : 


+2, part 
ci=ciwerexp(A EEE) 1=8,P (3) 
将 式 (3) KAZ (2), FH: | 
EL yet ref 
er kics, exp (28S = 2 1CP， cexp (MEE ) (4) 


这 是 该 化 学 反应 的 一 个 完整 的 非 平 衡 热 力学 的 描述 ， 其 表示 反应 速率 是 底 物 及 产物 化 学 
势 还 有 一 Bees He Bt. 如 果 考 虑 浓度 处 于 接近 参考 态 的 区 域 ， 这 里 

| ws 一 pg << RT > | up- ut (5) 
有 近似 式 ezs:1+Z OF xeK1), HIRES (4) 近似 表示 为 : 


RCs, ref CS,re re k -1¢ Te 
4 RT (as ~ pS!) - er (pp 一 ApBE) + Ric rot — & -1CP ref (6) 


如 果 参 考 态 取 为 平衡 态 ， 则 Aics,ret=&-lcpref。 此 外 ， 在 平衡 态 时 底 物 和 产物 的 化 学 势 
是 相同 的 。 于 是 式 (6) 简化 为 : 


RiC Sire 
v= Rt oe es pp) =L( usm pp) (7) 


其 证 明了 对 于 在 接近 Poway Serer yin ， 流 - 力 关 系 的 有 效 性 。 可 以 看 


U 


出 ， 表 观 系数 是 反应 动力 学 参数 的 函数 ， 因 而 它们 不 能 被 当 作 常数 ， 特 别 是 对 生物 系统 ， 
其 动力 学 参数 取决 于 体内 的 酶 活 。Westerhoff 和 van Dam (1987) 表明 对 很 多 其 它 系 统 ， 
例如 耦合 反应 和 运输 过 程 ， 流 - 力 关 系 也 能 导出 。 在 式 (7) 的 推导 中 ， 接 近 平 衡 这 一 需 
要 能 被 量化 ， 即 通过 式 (5), 其 必须 被 满足 。 AP 25CH RT 是 2.48kJ .mol 1， 
从 表 14.3 看 出 EMP 途径 中 的 几 个 反应 ， 酶 自由 能 变化 小 于 RT (或 非常 接近 它 )， 因 此 
线性 流 - 力 关系 可 应 用 于 它们 。 然 而 对 自由 能 变化 很 大 的 反应 〈 热 力学 上 不 可 逆 的 反应 )， 
接近 平衡 假定 明显 很 差 ， 因 此 建议 在 应 用 线性 流 - 力 关系 时 要 特别 谨慎 。 

倒数 关系 

细胞 生长 是 大 量 过 程 的 〈 包 括 物 质 的 运转 和 化 学 反应 ) 结果 。 这 些 过 程 中 很 多 是 耦 
合 的 ， 而 其 它 一 些 是 独立 的 ， 因 此 该 系统 可 被 考虑 为 一 组 独立 的 子 过 程 ， 其 中 每 个 子 过 
程 可 以 包括 一 个 单个 过 程 或 两 个 或 更 多 的 耦合 过 程 。 在 分 析 总 生长 过 程 中 ， 人 们 常常 用 
一 种 黑箱 方法 ， 其 中 对 所 有 独立 子 过程 假 定 处 于 稳 态 。 在 这 种 分 析 中 ， 有 趣 的 是 要 知道 
是 否 Onsager 的 倒数 关系 适用 于 底 物 到 代谢 产物 和 生物 质 的 总 转换 (或 任何 代表 几 个 子 
过 程 相 加 的 其 它 过 程 )。Westerhoff 和 van Dam (1987) 考虑 了 这 种 局 面 并 表明 如 果 倒 数 
关系 适用 于 每 组 耦合 过 程 ， 那 么 它 也 适用 于 总 过 程 。 

为 了 说 明 对 于 流 - 力 关 系 对 倒数 关系 的 有 效 性 接近 于 平衡 条 件 的 严格 需要 ， 我 们 开始 
考虑 简单 化 学 反应 〈1) ， 其 正 反应 净 速 率 由 式 〈2) 给 出 。 用 这 种 动力 学 ，P 的 生成 速率 
zzp 是 ww， 而 S 的 生成 速率 是 ws= -ww。 这 样 ， 我 们 就 可 能 推导 出 所 谓 的 一 般 化 的 表 观 系 
数 如 下 : 


dvs k- cp 
gen) 2 eae 
L&p Iup RT (8) 


9 kic 

ee ie (9) 
[提示 : 用 化 学 势 式 (4.10) 得 出 必然 后 确定 其 导数 ]。 很 明显 ， 两 个 一 般 化 的 表 观 系数 
仅 在 平衡 时 才 相 同 ， 平 衡 时 反应 的 净 速 率 为 零 (因此 ，&ics=&-icp)。 离 开平 衡 ， 这 两 
个 一 般 化 的 表 观 系数 不 服从 倒数 关系 ， 而 且 它 们 的 差 等 于 反应 的 净 速 率 被 RT 除 。 
Westerhoff 和 van Dam (1987) 对 具有 复杂 动力 学 的 化 学 反应 及 对 两 个 部 分 斐 合 的 过 程 
推出 了 一 般 化 的 表 观 系数 。 在 两 种 情况 下 ， 上 述 结 论 是 有 效 的 : 导数 关系 仅 在 平衡 (或 
非常 接近 于 平衡 ) 时 才 成 立 。 尽 管 这 种 事实 ， 对 一 些 在 远离 平衡 条 件 下 进行 的 系统 ， 倒 
数 关系 仍 从 实验 中 获得 (Rottenberg，1979)， 这 表明 Onsager 倒数 关系 更 普遍 的 适 
用 性 。 


由 于 力 通常 具有 相反 的 符号 〈 一 个 具有 正 推动 力 的 过 程 推动 一 具有 负 推 动力 的 过 程 )， 
力 比 一 般 是 负 的 。 在 g = 士 1 即 完 全 耦合 时 ， 流 比 等 于 QZ， 表 观 计量 系数 与 机 理 计 量 系 数 
(mechanistic stoichiometry) FAl, 4qA tI 时 就 不 是 这 种 情况 ， 即 使 在 氧化 磷酸 化 过 程 
( 见 例 14.6) 中 2Z 常常 与 机 理 计 量 系数 有 关联 。 对 大 量 的 耦合 过 程式 (14.47) 是 确定 操作 
计量 系数 (operational stoichiometry) 〈 等 于 流 比 ) 的 基础 。 图 14.6 所 示 为 在 不 同 耦 合 程度 
下 流 比 《〈 相 对 于 Z) 与 力 比 的 关系 。 可 以 看 出 g 越 接近 1《〈 对 9 接近 -1 也 是 相同 情况 ) 则 
流 比 对 力 比 的 依赖 程度 越 弱 。 当 d 为 零 时 ， 流 比 与 力 比 成 正比 ， 即 每 个 流 都 与 其 共 斩 力 成 

388 


正比 而 不 受 其 它 力 的 影响 。 通 过 测量 力 比 与 耦合 
度 ， 操 作 计 量 系数 可 以 确定 为 Z 的 图 数 。 此 外 ， 
通过 没有 输出 流 的 条 件 〈vi=0， 流 比 为 零 ) 下 的 、 
力 比 的 测量 可 以 确定 该 条 件 下 的 表 观 计量 系数 , 人 
该 条 件 常 被 称 为 静 头 (static head). MBAS | 
用 例 14.6 所 说 明 的 方法 确定 操作 计量 系数 。 式 
(14.47) 也 被 用 来 确定 各 种 运输 过 程 的 计量 系数 ， nil 
例如 大 肠 杆菌 中 通过 质子 同 向 转运 而 吸收 乳糖 AAA 
(Rottenberg，1979)。 表 观 计 量 系 数 亦 可 在 力 比 为 图 14.6 在 不 同 耦合 度 (g ) 水 平 下 ， 
=, BA, =O 的 条 件 下 通过 测量 流 比 来 确定 ， 该 流 比 / 表 观 计量 学 [j]Z = 2 
条 件 被 称 为 水 平流 (level flow). 

能 量 转 导 的 一 般 过 程 中 一 个 值得 关注 的 定量 
参数 是 热力 学 效率 。 其 被 定义 为 输出 自由 能 的 产 
生 速 率 除 以 输入 自由 能 的 消耗 速率 : 


见 式 (14.47)] 与 标准 化 的 力 比 [ZX = 
Z(AIMA;)] 间 的 函数 关系 


(Zy)+q 
q(Zyx)+1 
可 以 看 出 热力 学 效率 是 三 个 变量 的 函数 : 耦合 度 g 、 表 观 计 量 系数 Z 和 力 比 yY。 但 是 由 于 Z 
Ay 同时 出 现 ， 热 力学 效率 实际 上 仅 是 两 个 变量 的 函数 ， 即 g 和 ZXx。 图 14.7 示 出 了 不 同 
耦合 度 下 热力 学 效率 和 ZX 的 关系 。 可 以 看 出 9<1 时 热力 学 效率 经 过 了 一 最 大 值 ， 并 且 这 
一 最 大 值 决定 于 耦合 度 。 由 式 (14.50) 很 容易 看 出 最 大 热力 学 效率 是 在 力 比 为 以 下 值 时 得 
到 的 : 


A 
1h =| sae AL DMA ACPA) (14.50) 


= -—__ (14.51) 
Xopt Z(1+ 让 两 


其 对 应 的 最 优 热力 学 效率 为 : 
2 
Miv.c0t = (Lon)? = WG Tap (14.52) 
虽然 最 大 化 系统 的 热力 学 效率 看 起 来 很 有 吸引 力 ， 但 这 样 一 个 最 大 值 是 否 就 是 整体 系统 
| 的 真实 最 优 值 还 不 清楚 。 例 如 ， 考 虑 完全 耦合 即 
0.8 dq=1 的 情况 ， 此 时 在 力 比 为 - 1ZZ 时 热力 学 效率 达 
到 最 高 值 1。 但 是 这 一 条 件 对 应 于 平衡 态 ， 没 有 净 
流 。 因 此 虽然 过 程 效率 很 高 ， 却 是 没有 用 的 。 为 了 
04 使 过 程 进行 ， 力 比 必须 要 大 于 -1ZZ ， 即 ZX 要 大 于 
3 -1， 这 意味 着 热力 学 效率 要 降低 (OLA 14.7), A 
: 此 要 使 自由 能 转 导 过 程 发 生 就 必须 牺牲 部 分 效率 
mT ~0.5 0 (Westerhoff and van Dam, 1987), WATE AHH 
\4,'4,) 比 对 应 速率 和 效率 的 最 佳 兼顾 ， 很 可 能 这 一 兼顾 会 
图 14.7 在 不 同 耦合 度 (ov ) EF, 因 不 同体 系 而 异 。Kedem 和 Caplan (1965) 考察 了 
自由 能 转换 器 的 热力 学 效率 Cn, 所 谓 最 大 输出 的 一 种 可 能 兼顾 ， 在 该 兼顾 下 viA， 
见 式 (14.44)] 与 标准 化 的 力 比 [Zy = “被 最 优化 。 可 以 看 出 在 任意 耦合 度 下 得 到 最 大 输出 
Z(A1/A2)] 间 的 函数 关系 的 力 比 都 小 于 得 到 最 优 热力 学 效率 的 力 比 (Wester- 
389 


hoff and van Dam ，1987)。 这 些 考 虑 都 清楚 地 表明 一 般 说 来 最 大 效率 并 不 等 于 系统 的 最 优 
状态 ， 因 为 在 该 状态 下 输出 过 程 的 速率 可 能 太 低 。 


(fl 14.6】 和 氧化 磷酸 化 

氧化 磷酸 化 的 机 理 最 近 由 Senior(1988) 作 了 综述 并 在 本 书 第 2.2.3 节 中 作 了 介绍 。 建 
议 读 者 在 阅读 本 例 非 平 衡 热力 学 处 理 之 前 复习 那 一 节 。 这 里 应 用 非 平衡 热力 学 对 该 过 程 进 行 
定量 分 析 并 推导 实际 操作 状况 下 的 PMD， 它 是 工程 上 好 氧 过 程 能 量 代 谢 的 一 个 重要 参数 
(参见 例 3.3)。 

ZEAE, HAH NADH 氧化 生成 NAD+ 过 程 中 产生 的 大 量 自 由 能 都 用 于 推动 磅 酸化 过 
程 。 两 个 过 程 可 以 写 为 : 


NAD* +H,O- NADH - 0.50, —-H* =0 (1) 
ATP + H,0 — ADP — P; =0 (2) 
NADH 氧化 的 标准 自由 能 变化 可 以 通过 考虑 下 面 的 两 个 单一 电极 反应 计算 出 : 
HzO -0.50,—2H* -2e- =0;  e = —0.815V (3) 
-NADH + NAD* + H* +2e” =0; » e® = —0.315V (4) 
反应 式 〈1) 由 式 (3) 和 式 (4) 相 加 得 到 ， 因 而 得 到 下 面 的 标准 自由 能 估计 值 : 
AG” = nF Ae” =2X96.494(kJ'V -lmol DC-1.13V)= 一 218kJ mol : (5) 


该 过 程 产 生 足 够 的 自由 能 推动 ADP 磷酸 化 生成 ATP [反应 (2) 的 标准 吉 布 斯 自由 能 
变化 是 30.$kJ .mol-!]， 这 使 得 每 摩尔 被 氧化 的 NADH 可 以 生成 多 于 lmol 的 ATP. RE 
化 学 渗透 理论 ( 见 图 2.11)， 这 两 个 过 程 是 通过 反应 (3) 和 反应 〈4) 产生 的 质子 和 电势 梯 
度 耦 合 的 ， 并 利用 质子 梯度 来 推动 磷酸 化 反应 (2)。ATP 的 合成 是 由 膜 结 合 的 FoF}-ATP 
酶 复合 物 介 导 的 。 蛋 白 的 圆 形 的 Fi 部 分 能 入 细胞 质 内 〈 对 原核 细胞 ) 或 线粒体 基质 内 〈 对 
真 核 细胞 ) ， 其 上 的 ADP 与 磷酸 之 间 的 反应 进行 得 相当 快 ， 但 只 有 在 有 稳定 的 质子 流通 过 
AR (细胞 质 膜 或 线粒体 内 膜 ) 的 蛋白 质 的 荃 型 的 Fo 部 分 时 ， 合 成 的 ATP 才能 脱离 Fi 使 
得 ATP 可 以 连续 不 断 地 生成 。 因 此 ， 向 Fo 的 质子 流 对 将 ATP 从 Fi 上 释放 出 来 是 非常 必要 
的 ， 该 质子 流 的 最 终结 果 就 是 产生 足够 多 的 自由 能 以 推动 磷酸 化 反应 (2) 对 抗 其 负 的 亲 和 
力 。 磷 酸化 反应 的 推动 力 被 提出 化 学 渗透 理论 的 Mitchell (1961) 称 为 质子 动力 (proton- 
motive force), alibi a 


Ap eet = ~=AW—2.303 ApH = AW —0.059ApH (6) 
Any EEA (SF AW/E) 的 贡献 和 质子 梯度 的 贡献 的 加 和 而 被 确定 的 。Az 的 单 
itt Vemol7!, AW 是 每 摩尔 质子 传递 时 造成 的 以 伏特 表示 的 膜 电 位 〈 膜 的 内 侧 更 偏 负 ， 
因此 AW 为 正 ， 其 值 大 约 为 0.13SV)。ApH 是 膜 两 侧 的 pH 值 差 〈 一 般 为 -0.05)。 由 此 计 
算出 质子 动力 为 0.1$3V.mol -1 (H+)， 对 应 自由 能 为 14.75kJ .mol-! (质子 )。 要 注意 到 大 
部 分 的 质子 动力 来 源 于 电位 差 。pH 值 差 的 贡献 是 最 小 的 ， 这 说 明了 为 什么 在 原核 细胞 中 氧 
化 磷酸 化 过 程 可 在 非常 高 的 胞 外 pH 值 下 进行 。 
基于 上 面 的 叙述 ， 氧 化 磷酸 化 过 程 可 被 设想 为 包含 四 步 的 循环 过 程 : 两 个 标量 的 化 学 反 
和 两 个 矢量 的 传递 过 程 。 一 个 传递 过 程 〈 质 子 外 流 ) 和 一 个 化 学 反应 〈 磷 酸化 ) 的 亲和力 
为 负 ， 而 另外 两 个 过 程 〈 质 子 内 流 和 氧化 ) 的 亲和力 是 足够 地 正 以 确保 整个 系统 的 耗 散 函数 
[st (14.35)] 为 正 。 因 为 质子 外 流 和 氧化 反应 及 质子 内 流 和 磷酸 化 反应 从 两 个 不 同方 面 紧 
390 


密 耦 合 ， 可 以 将 这 四 个 过 程 组 合 为 两 对 : (1) 氧化 伴随 质子 外 流 ，(2) 磷 酸化 伴随 质子 内 流 。 
对 每 摩尔 被 氧化 的 NADH， 两 个 过 程 的 总 亲和力 可 由 下 式 给 出 : 
Au=A0-moFAp RT). 
Ap=Aet npFAp (8) 
A,， 常 被 称 为 磷酸 化 势 。A 9 等 于 氧化 反应 的 自由 能 变化 的 负数 ， 它 是 大 的 正 值 。Ab 是 负 的 
并 且 等 于 磷酸 化 反应 的 自由 能 变化 的 负数 。z。 是 伴随 氧化 反应 的 质子 泵 出 数目 ，”， 是 伴随 
磷酸 化 反应 的 质子 流入 数目 。 它 们 的 值 并 不 确切 知道 ， 但 对 真 核 细 胞 ”。 常 取 12 (相应 于 复 
合 物 工 ， 开 和 复合 物 W 上 每 个 有 四 个 质子 ， 见 图 2.11)，zp 取 2 或 3 (每 多 流入 lmol 质子 
就 伴随 细胞 质 和 线粒体 基质 膜 间 交 换 ATP 和 ADP 及 磷酸 )。 
与 表 观 方程 一 致 ， 现 在 将 两 个 过 程 的 速率 写 为 其 亲和力 的 线性 函数 : 
tj LUA, + LopAy (9) 
eA +L. A, (10) 
Onsager 倒数 关系 意味 着 工 oo= 工 wo。 由 前 面 的 氧化 磷酸 化 模型 可 知 流 比 《zwp/mo。) 等 于 操作 
状态 下 的 PMD， 因 此 确定 生理 条 件 下 的 这 一 比例 很 有 意义 。 力 比 y 可 由 分 离 出 的 线粒体 测 
出 ， 如 果 耦 合 度 和 表 观 计量 系数 已 知 ， 则 可 由 方程 式 (14.47) 计算 出 实际 计量 系数 。 
耦合 度 可 由 静 头 〈 没 有 输出 流 ， 即 wp=0) 和 水 平流 〈 输 出 力 为 零 ， 即 A,=0) 条 件 下 
呼吸 速率 的 测量 来 确定 。 将 这 些 条 件 应 用 于 式 (9) AK (10) 中 并 消去 表 观 系数 得 到 : 
(vp) v=o 
(Copa -0 
在 大 多 数 能 量 守恒 的 膜 中 ， 由 于 输出 力 被 推动 到 其 最 大 电位 ， 静 头条 件 (v,=0) 可 以 很 快 
达到 ， 因 此 方程 式 (11) 中 的 分 子 很 容易 确定 。 但 是 水 平流 的 条 件 却 很 难 达 到 ， 因 为 一 般 情 
况 下 要 完全 消除 输出 力 的 势 是 不 可 能 的 〈Rottenberg，1979)。 即 便 如 此 ，g9 还 是 可 以 通过 
在 静 头 和 其 它 势 非常 低 的 参考 状态 下 测 得 的 输入 反应 速率 〈 在 此 情况 下 是 呼吸 速率 ) 计算 得 
到 。 但 在 这 种 情况 下 ， 静 头 的 输入 势 (Aieee) 值 和 参考 状态 下 的 输出 势 (AM) 值 也 必须 
知道 。 随 后 耦合 度 可 由 下 式 算 出 〈Rottenberg 1979): 
了 1 thal ath 
Art— AsaicR, 
HAH, R. 是 参考 态 下 和 静 头 条 件 下 氧化 速率 之 比 。 


ya (11) 


(12) 


Re= 7 static (13) 


为 了 定量 耦合 度 ， 参 考 状 态 取 为 磷酸 化 的 状态 。 磷 酸化 过 程 中 和 ADP 被 耗 尽 后 的 氧化 速率 
ZMKAA 6 (=R.)o Wb, PAN ABRIL Aste 为 大 约 63kJ 'mol 上 ，ADP 加 入 后 为 
42kJ .mol 1  (Rottenberg，1979)。 由 此 应 用 式 (12) 得 到 耦合 度 为 0.97。 
表 观 计量 系数 Z 可 通过 测量 静 头 条 件 下 的 力 比 xy 得 到 ， 该 条 件 下 流 比 7 为 零 ， 因 此 由 
式 (14.47) 得 : 
Zy + g =0 (14) 
对 NADH 的 氧化 静 头 条 件 下 的 力 比 Xystate 约 为 =0.31， 对 琥珀 酸 的 氧化 为 -0.46 
(Rottenberg ，1979)。 由 此 得 到 的 表 观 计量 系数 对 NADH 的 氧化 约 为 3.0， 对 琥珀 酸 的 氧化 
为 2.0。 这 与 一 般 报 告 的 氧化 磷酸 化 的 机 理 系 数值 非常 符合 ， 但 这 只 是 偶然 巧合 ， 将 在 后 面 
391 


讨论 。 
取 Z 的 值 为 3(NADH 氧化 ) ， 则 由 式 (14.47) 可 将 操作 PI 写 为 力 比 的 函数 : 
3.07 +0.94 
2.82y+1 


图 14.8 汇总 了 这 一 结果 。 当 力 比 小 于 -0.313 时 P/O 值 开 始 为 负 。 这 对 应 于 ATP BR 
工作 时 的 情况 ， 即 其 消耗 ATP 而 将 质子 泵 出 。 力 比 在 该 值 以 上 时 P/O 比 增加 很 快 ， 当 力 比 
为 -=0.15 Bf P/O 比 已 达到 其 最 大 值 的 8$% ， 为 2.82。 用 上 面 确 定 的 参数 值 ， 由 式 (14.51) 
可 以 计算 出 热力 学 效率 最 高 时 的 力 比 为 
-0.23， 这 对 应 于 P/O 比 为 2.1。 在 此 力 比 

2 Bt, FA EH 0.49 [从 式 (14.52) 求 
2 得 ]。 要 注意 到 当 耦 合 度 从 1 降 到 0.94 时 最 优 
iat 热力 学 效率 大 大 降低 。 

Stucki (1980) 应 用 分 离 出 的 肝 细 胞 线 粒 
体 研 究 了 氧化 磷酸 化 过 程 。 通 过 在 分 离 的 线 粒 


P/O=~2=3.0x (15) 


0 
—0.35 —0.25 -0.15 -0.05 


te 体 中 添加 不 同 活性 的 已 糖 激酶 可 以 使 磷酸 势 改 
Hib eee 变 。 通 过 测量 不 同 磷酸 化 势 下 的 磷酸 化 程度 和 
al 》 RY . : 
P/O 比 与 力 比 的 函数 关系 呼吸 速率 ， 可 以 由 速率 对 磷酸 化 势 的 斜率 计算 


出 方程 式 (9) MX (10) 中 的 表 观 系数 工 m 
和 寺 wp。 通 过 计算 输入 力 ， 另 外 两 个 表 观 系数 可 以 通过 相应 曲线 的 截 距 得 到 。 由 这 些 表 观 系 
数 可 求 得 耦合 度 为 0.9$5， 表 观 计 量 系数 为 2.84。 这 些 参数 值 和 前 面 得 到 的 值 非常 接近 。 在 
这 些 实验 中 ,， 力 比 在 -0.31 和 -0.25 之 间 变 化 [类 似 的 数字 在 Westerhoff and van Dam 
(1987) 中 给 出 ]。 由 Stucki (1980) 得 到 的 g MZ 的 值 ， 这 相当 于 操作 磷 氧 比 PZO 范围 为 
1.2 一 2.1。 还 不 知道 为 什么 力 比 在 体内 条 件 下 变化 如 此 大 ， 但 要 注意 的 一 点 是 力 比 似乎 要 在 
一 个 能 对 操作 磷 氧 比 P/O 产生 较 大 影响 的 范围 内 (WA 14.8)。 当 力 比 在 上 述 区 间 时 ， 热 
力学 效率 在 0.37~0.52 之 间 。 

上 述 量化 操作 磷 氧 比 P/MO 的 过 程 曾 被 Westerhoff 和 van Dam (1987) 认真 地 质疑 过 。 
首先 ， 由 方程 式 (9) 和 式 (10) 描述 的 线性 关系 只 有 在 接近 平衡 条 件 下 才 成 立 ， 而 其 是 上 
述 整个 分 析 的 基础 。 但 是 Rottenberg (1979) 和 Stucki (1980) (RHA) 报告 的 实验 数 
据 表明 线性 确实 很 好 。Stucki (1980) 通过 实验 确定 表 观 系数 表明 甚至 于 倒数 关系 也 是 一 个 
站 得 住 脚 的 假定 。 第 二 ， 这 一 分 析 是 通过 某 些 特殊 条 件 推断 体内 条 件 。 耦 合 度 和 表 观 计量 系 
数 都 是 在 极端 状态 (FL) 下 测量 得 到 的 。g MZ 都 是 表 观 系数 的 函数 ， 因 此 也 依赖 于 特定 
的 生理 条 件 例 如 ATP 酶 的 活性 。 因 此 非常 可 能 它们 会 在 不 同 的 生理 状态 下 取 不 同 值 。Z 的 
外 推 是 非常 关键 的 ， 因 为 它 在 生理 条 件 下 可 以 显著 违反 机 理化 学 计量 学 。 考 虑 到 对 氧化 磷酸 
化 过 程 的 上 述 非 平衡 热力 学 分 析 的 不 足 ，Lemasters 及 其 合作 者 (Lemasters and Billica, 
1981; Lemasters et al, 1984) 强调 g MZ 仍然 提供 了 机 理 计 量 系数 的 上 限 和 下 限 ， 即 机 理 
计量 系数 介 于 -qqZ 和 -2ZALe 之 间 。 因 为 g 值 一 般 接近 于 1， 将 2 作为 机 理 系 数 的 误差 是 很 
小 的 。 

上 述 氧 化 磷酸 化 过 程 的 非 平 衡 热 力学 模型 有 助 于 说 明 如 何 应 用 非 平衡 热力 学 分 析 复 杂 的 
生物 系统 。 但 人 们 应 该 知道 黑箱 模型 代表 了 显著 的 简化 。Westerhoff 和 van Dam (1987) 在 

392 


其 对 生物 系统 非 平衡 热力 学 的 广博 的 专著 中 给 出 了 一 个 氧化 磷酸 化 过 程 的 更 详尽 模型 。 在 该 
模型 中 跨越 膜 的 净 质 子 通 量 也 被 包括 了 (参见 例 11.3)。 应 用 该 模型 ，ATP 酶 和 呼吸 链 质 
子 泵 的 计量 系数 被 分 别 确定 ， 并 由 其 确定 了 机 理 计量 系数 。 此 外 ， 由 这 一 更 详细 的 模型 他 们 
表明 表 观 计量 系数 是 系统 动力 学 参数 如 ATP 酶 活性 的 函数 。 
【 例 14.7】 应 用 非 平 衡 热 力学 描述 细胞 生长 过 程 
在 黑箱 模型 中 ， 细 胞 的 生长 是 用 一 输入 培养 基 形式 自由 能 、 输 出 生物 质 形式 自由 能 的 总 
过 程 来 表示 的 。 输 入 和 输出 流通 过 很 多 细胞 内 反应 及 ATP 的 产生 和 利用 而 耦合 起 来 。 因 此 
细胞 生长 过 程 可 以 描述 为 输入 流 为 ~*， 即 异化 代谢 速率 〈C-mol 底 物 'C-mol 生物 质 -1.h-1) 
和 输出 流 为 >。， 即 同化 代谢 速率 (C-mol 生物 质 .C-mol 4 WR '+h7') 的 自由 能 转换 器 。 
Fo=LeAct baAs (1) 
r= Lav ody (2) 


这 里 应 用 了 Onsager 的 倒数 关系 。 对 葡萄 糖 上 的 好 氧 生长 ， 输 入 流 的 推进 力 (A.) 是 葡萄 
糖 氧 化 成 二 氧化 碳 和 水 的 过 程 的 亲和力 〈 或 负 自 由 能 变化 ) : 


6 
C glcCO， 


A.= ~AG?’+RTIn | 


co, 0 


其 中 葡萄 糖 氧 化 的 标准 自由 能 变化 是 大 约 2.9MJ .mol-!。 因 此 输入 流 的 推动 力 决 定 于 葡萄 
糖 浓 度 。 类 似 地 ， 对 输出 流 ， 推 动力 如 下 式 所 示 : 


A, =- AGY - RTIn Tal (4) 
式 中 ，ci,anab 是 合成 代谢 的 培养 基 浓 度 。 在 前 面 的 黑箱 模型 中 ， 分 解 代谢 流通 过 葡萄 糖 
利用 速率 给 出 ， 因 此 葡萄 糖 不 应 该 作为 合成 代谢 的 培养 基 。 相 反 ， 合 成 代谢 反应 的 碳 源 应 该 
是 二 氧化 碳 。 由 CO2, No 和 水 等 合成 生物 质 的 标准 自由 能 是 大 约 536k) .C-mol-!， 而 由 
CO2, NHd 和 水 等 合成 的 标准 自由 能 是 大 约 490kJ 'C-mol-! (Roels, 1983). 
如 果 考 虑 葡萄 糖 限 制 时 的 恒 化 器 培养 条 件 下 的 稳 态 生长 COREE), WN A, 一 般 恒 
定 。 如 果 从 式 〈1) 和 式 (2) 消除 变化 着 的 力 A.， 就 可 以 得 到 ; 


ls _ 8 
re=cgrat Le! 3)A. (5) 
这 和 式 (3.26) 给 出 的 比 生长 速率 和 底 物 比 消 耗 速率 之 间 经 典 的 线性 关系 是 等 同 的 。 上 
式 中 : 
yre-l _ gy (6) 


一 rE 
ci 


m= Lye(L~ 73) A. (7) 
Ast (6) 可 见 ， 只 有 当 g=1 时 ， 系统 的 表 观 计量 系数 Z 等 于 其 机 理 计量 系数 YE, @ 
然 在 这 种 情况 下 过 程 完 美 地 耦合 ， 没 有 自由 能 浪费 于 无 效 循环 中 或 者 维持 过 程 中 。 式 (7) 
表明 ， 表 观 系 数 工 :不 是 常数 ， 而 是 维持 系数 、 比 生长 速率 和 耦合 参数 的 函数 。 
式 (2) AX (3) 结合 可 以 得 出 比 生长 速率 和 葡萄 糖 浓度 之 间 的 关系 。 如 果 仍 维持 葡萄 
393 


糖 限制 条 件 ， 即 A。 恒定 ， 并 且 溶 解 氧 和 二 氧化 碳 同时 保持 恒定 ， 即 可 得 到 : 
=L,RTIn(cg.) +a (8) 
HH, a 是 常数 。 式 (8) ge 可 这 不 
同 于 经 典 的 饱和 型 (Monod) 动力 学 。 然 而 ， 它 
和 Monod 动力 学 一 样 可 以 描述 大 部 分 实验 数据 。 
图 14.9 对 饱和 型 动力 学 和 对 数 函 数 进行 了 比较 。 
只 有 在 高 底 物 浓度 时 ， 对 数 函 数 偏离 饱和 型 动力 
学 。 从 这 两 种 形式 的 动力 学 比较 中 ， 发 现 对 数 天 
数 的 参数 和 Monod 参数 有 如 下 关系 : 


LacRT 0.2344 max } (9) 
—02 WRI (Km ) a0.5-0.23 4 maxln( K m) 
图 14.9 Monod 动力 学 (数据 点 ) 如 果 最 大 比 生 长 率 是 已 知 的 ， 式 (9) 就 可 以 用 
和 对 数 函数 式 (8) 的 比较 以 决定 表 观 系数 工 ,。 


对 数 函 数 中 的 参数 LRT =0.23, a =0.5。 Hee He : Z 
icthippiee Monet wed Ca tak.y eae 本 例 中 提出 的 非 平衡 态 热力 学 黑箱 模型 能 委 


好 地 说 明 耦 合 过 程 的 概念 。 在 生长 情况 下 ， 分 解 
代谢 和 合成 代谢 间 有 着 紧密 的 耦合 。 但 是 由 于 维持 过 程 耦合 并 不 完美 ， 这 可 以 和 和 氧化 磷酸 化 
中 的 质子 泄漏 相 比 。Westerhofft 和 van Dam (1987) 提出 了 更 详细 的 非 平 衡 态 生长 模型 ， 其 
包括 ATP it 〈 他 们 使 用 术语 “ 灸 舱 非 平衡 热力 学 模型 ”以 区 别 于 上 述 例 子 中 的 简单 黑箱 模 
型 )。 这 个 详细 的 模型 可 以 在 更 为 基础 的 水 平 上 独立 估算 生长 过 程 参数 ， 即 YxATrp 和 marp 
( 见 3.4 节 )。 


式 (14.41) 所 示 的 线性 力 关系 是 非 平 衡 热力 学 的 基础 。 如 在 方 框 14.3 中 所 讨论 的 ， 这 
些 关 系 式 只 有 在 接近 平衡 时 才 成 立 。 因 为 许多 胞 内 过 程 都 在 远离 平衡 态 下 进行 ， 如 糖 酵 解 途 
径 中 的 一 些 反 应 〈 见 例 14.1)， 这 就 限制 了 这 一 方法 的 广泛 应 用 。 但 是 ， 即 使 该 过 程 远离 平 
衡 ， 对 各 种 细胞 过 程 的 经 验 分 析 表 明 在 一 个 过 程 的 力 和 流 之 间 常 常 有 线性 关系 存在 4。 FRM 
一 简单 的 可 逆 酶 催化 反应 为 例 对 为 什么 是 这 种 情况 @ 作出 可 能 的 解释 。 反 应 系统 为 : 

kh? k§ Re 
Eye a mag EP E+P (14.53) 
hay 1 \ RA ki 
上 述 方程 中 , E 2M, ES MEP 分 别 是 酶 - 底 物 和 酶 -产物 复合 物 。 该 反应 的 净 正 向 速率 
vA: 


UV cs UV ei 
S,max P,max [7 _ 
K ax 
Ly a aaness (14.54) 
ey, CP 
Ks Kp 


HP, vs maxte AE RR (在 高 底 物 浓度 及 cp=0 时 得 到 )，zvp,max 是 最 大 逆向 
反应 速率 (在 高 产物 浓度 及 cs=0 W182). Ks, Kp 一 般 被 称 为 Michaelis-Menten 常数 ， 
它们 由 式 (14.55) 给 出 : 


@ ”如 下 分 析 是 受 Westerhoff and van Dam (1987) 的 工作 所 启发 ， 他 们 的 工作 对 这 个 问题 给 出 了 更 深入 的 处 理 。 
394 


S P 

生生 各， Kp, (14.55) 
现在 重 写 动力 学 方程 (14.$4) 为 反应 亲和力 的 函数 (等 于 化 学 势 的 变化 )。 由 式 

(14.13) 和 式 (14.14) 可 得 : 


Ks= 


e(#y~#p)/RT — SS x FPiea (14.56) 
CP CS,eq 
此 外 ， 在 平衡 态 下 净 反 应 速率 为 零 ， 由 此 可 得 : 
SC Pieg 3 Kp, US,max 
K CS,eq Ks UP,max il 
用 这 两 个 方程 可 将 动力 学 方程 重 写 为 : 
v e (Hs Hp) /RT — 4 
a 攻 计 的 (14.58) 
S,max Ks ( ) Us,max {Kp 
aa. +1)e a nigh Sig an 


这 一 方程 将 净 正 向 反应 速率 表示 为 反应 亲和力 (A=ps— pp) 或 推动 力 的 函数 。 

直接 应 用 式 (14.58) 受到 如 下 事实 的 限制 ， 即 正 向 反应 速率 是 底 物 和 产物 二 者 浓度 的 
函数 〈 或 两 个 化 合 物 的 化 学 势 )。 但 在 实际 应 用 中 这 两 个 变量 常 由 它们 的 和 的 限定 条 件 关 
KK, Bp: 

cs+ cp 三 常数 (14.59) 

该 式 使 我 们 可 以 将 净 正 向 反应 速率 仅 表示 为 反应 
亲和力 的 函数 。 图 14.10 给 出 了 两 组 动力 学 参数 
下 的 结果 。 5 

常常 要 将 反应 区 分 为 可 逆 的 和 不 可 逆 的 ,但 、 [ 
其 与 微观 可 逆 性 的 原理 相 矛 盾 。 按 照 这 一 原理 , 
图 14.10 的 两 条 曲线 都 应 该 经 过 原点 ,并 且 对 于 
负 的 反应 亲和力 其 净 正 向 反应 速率 也 应 变 为 负 。 
因此 原则 上 说 来 两 个 反应 都 是 可 逆 的 ,但 当 最 大 
正 向 反应 速率 (ws,max) 远 大 于 最 大 逆向 反应 速率 . 内 abe ees Lt hee 
(zP,max) 时 ,反应 实际 上 是 不 可 逆 的 , 即 只 有 在 数 假设 底 物 和 产物 浓度 的 总 和 恒定 (等 于 1) ,函数 由 式 
值 上 非常 大 且 为 负 的 亲和力 时 反应 才 可 逆向 进 (14.58) 计 算得 到 。 实 线 表示 Usman = UP sak “B= 
行 。 对 可 逆反 应 (图 14.10 中 的 实 线 ) 可 以 看 到 在 Oe es 
很 宽 的 净 正 向 反应 速率 范围 内 有 如 下 关系 和 Kr=100 HRM MER MH KD 
成 立 : 亲和力 为 ws 一 pep 

v=LA (14.60) 

与 之 相反 ， 对 不 可 逆反 应 只 有 在 很 小 的 净 正 向 反应 速率 范围 内 速率 w 和 亲和力 间 的 正比 关 
系 才 成 立 〈 图 14.10 中 的 虚线 ) 。 对 不 可 逆反 应 ， 在 相关 反应 速率 范围 内 (在 0.1 和 0.9 之 
间 ) 式 (14.60) 是 速率 w 和 亲和力 间 关 系 的 很 差 的 近似 。 然 而 在 大 约 速率 ww=0.5 时 一 个 
线性 近似 似乎 是 有 可 能 的 : 


ANF / RT 


LA (4s) (14.61) 
式 中 ，A# 是 曲线 折 点 处 的 反应 } inn 了 # 是 曲线 折 点 处 的 切线 斜率 。 这 两 个 参数 是 
动力 学 参数 的 图 数 ，Westerhoff and van Dam (1987) 研究 表明 如 果 它 们 由 下 式 给 出 : 


395 


_ ust vp 
it ABT 


me (28) - Us~ UP 
Bro Up < ust up Sra 


“RAK v 7£0.18~0.93 之 间 时 ， 由 式 (14.61) 计算 出 的 净 正 向 反应 速率 仅 与 真实 值 相 差 
15%. vs, vp 由 下 式 得 到 : 


i (14.62) 


— —_VS,max Ee ds mae 
"S~1+KsAcgtcp)’ “P 1+KpHcst cp) (14.64) 


自由 能 差 与 反应 速率 或 跨 膜 通 量 间 的 线性 关系 已 在 许多 系统 中 实验 观测 到 ， 甚 至 于 包括 
远离 平衡 进行 的 反应 或 过 程 〈 见 Westerhoff and van Dam，1987)。 他 们 还 分 析 了 许多 其 它 
动力 学 方程 并 发 现在 所 有 情况 下 在 一 定 自由 能 差 范围 内 线性 关系 都 可 假定 成 立 。 

既然 在 远离 平衡 态 下 力 流 之 间 的 线性 关系 仍 成 立 ， 我 们 有 兴趣 知道 在 这 种 条 件 下 表 观 系 
数 间 的 倒数 关系 是 否 成 立 。 在 例 14.6 中 已 经 提 到 Stucki (1980) 已 经 实验 观测 到 了 在 远离 
平衡 条 件 下 进行 的 氧化 磷酸 化 的 倒数 关系 。 此 外 Caplan (1981) 研究 表明 对 高 度 耦 合 的 酶 
反应 ， 在 多 维 折 点 附近 进行 反应 不 仅 导 致力 流 之 间 为 线性 关系 ， 而 且 倒 数 关 系 也 成 立 
(Pietrobon and Caplan，1985)。 但 是 ， 这 是 否 是 一 般 情 况 仍 需要 证 明 。 因 此 人 们 应 当 只 能 
在 有 足够 实验 证 据 的 条 件 下 假定 倒数 关系 成 立 。 

上 述 分 析 中 的 一 个 假定 就 是 底 物 和 产物 浓度 之 和 为 常数 。 对 某 些 途径 反应 这 一 假定 并 不 
合理 ， 但 很 多 数 情况 下 对 这 些 浓度 都 有 物理 约束 。 时 常 ， 可 通过 外 部 控制 或 严密 的 胞 内 调控 
使 某 一 浓度 保持 恒定 ， 或 者 其 浓度 大 大 超过 作用 于 这 些 物质 的 酶 的 Michaelis-Menten 常数 。 
在 这 些 情 况 下 ，Rottenberg (1973) 研究 表明 反应 速率 和 驱动 力 之 间 的 关系 接近 线性 。 这 清 
楚 地 表明 对 简单 情况 ， 产 物 浓度 保持 恒定 。 在 这 种 情况 下 ， 推 动力 可 以 写 为 ln(cs) 的 线性 函 
数 。 因 此 反应 速率 也 可 以 写 为 底 物 浓度 的 对 数 的 线性 函数 。 如 图 14.9 所 示 ， 这 样 的 关系 与 
酶 动力 学 研究 中 经 常 遇 到 的 饱和 形式 动力 学 非常 吻合 。 


14.4 热 动力 学 在 代谢 控制 分 析 中 的 应 用 


在 第 11 章 中 已 经 全 面 介 绍 了 代谢 控制 这 一 主题 。 其 中 介绍 了 通 量 控制 系数 (FCC) 的 
概念 ， 该 系数 可 以 定量 地 度量 在 整个 途径 通 量 中 由 某 一 单个 反应 或 一 组 反应 所 施加 的 控制 程 
度 (第 12 章 )。 还 表明 FCCs 可 以 通过 代谢 控制 分 析 的 加 和 原理 和 连接 原理 由 特定 反应 速率 
的 动力 学 模型 分 析 得 到 [ 式 (11.6)、 式 (11.14)、 式 (11.27)]。 在 这 些 分 析 中 ， 弹 性 系数 
[ 式 (11.11)] 由 于 其 体现 了 实际 的 酶 动力 学 而 尤为 重要 。 在 该 章 中 还 指出 由 于 缺乏 可 靠 的 
胞 内 动力 学 模型 而 阻碍 了 FCCs 的 直接 推导 及 代谢 途径 的 控制 分 析 。 

非 平 衡 热 力学 的 目标 之 一 就 是 根据 适当 的 驱动 力 推导 出 描述 某 一 过 程 速度 的 表达 式 [xt 
(14.41)]。 原 则 上 说 这 些 速度 表达 式 可 被 用 来 计算 弹性 系数 并 由 其 计算 通 量 控制 系数 。 在 这 
一 节 ， 我 们 以 一 个 青霉素 生物 合成 过 程 @ 为 例 来 说 明 计算 的 一 般 过 程 。 

考虑 一 个 简单 的 两 步 途径 ，Xi 经 过 X2 转化 为 X3， 其 计量 关系 如 下 : 

guXit gi2X2=0 (14.65) 
£12X2+ g23X3=0 

O 从 反应 速率 的 热力 学 描述 获取 MCA 参数 是 由 Nielsen (1997) 给 出 的 ， 现 在 介绍 的 是 由 这 篇 论文 改写 的 。 

396 


这 个 途径 可 能 是 两 个 实际 的 酶 反应 ， 或 者 是 多 个 酶 反应 结合 为 两 个 总 反应 。 第 守 个 反应 的 亲 
和 力 由 下 式 给 出 : 


3 
A; =- AGY - RTIn( [I] X8 ) = 02 (14.66) 


HP, AGYEBAi 个 反应 的 标准 自由 能 变化 、 进一步 假定 可 以 根据 相应 反应 亲和力 通 
过 式 (14.61) 描述 每 个 反应 的 速度 。 应 用 这 一 反应 动力 学 的 热 动 力学 (thermokinetics) ffi 
述 ， 相 对 于 中 间 代 谢 物 X; 的 两 个 反应 的 弹性 系数 如 下 式 : 


€2,,=— 二 == Xa x a(x)? i=1,2 (14.67) 

FP Pa i FY Ge aie 和 式 ia. is 得 到 : 
E2 ;三 Sent > gel (14.68) 
Auk, MRA, MA? 已 知 ， 就 可 以 计算 两 个 反应 的 弹性 系数 了 。 对 可 逆反 应 # OW 


=, WH (14.68) 从 亲和力 直接 计算 弹性 系数 ， 而 亲和力 可 以 通过 式 (14.66) ees 
代谢 物 浓 度 计 算得 到 。Westerhoff et al (1984) 对 平衡 态 下 的 酶 动力 学 弹性 系数 的 计算 推导 
出 了 类 似 的 关系 式 ， 但 他 们 应 用 了 质量 作用 比 而 不 是 反应 亲和力 来 描述 速率 。 为 了 促进 对 途 
径 的 通 量 控制 ， 一 般 至 少 有 一 步 反 应 是 不 可 逆 的 ， 即 在 远离 平衡 态 下 进行 。 对 这 个 反应 参数 
A? 不 是 零 ， 但 可 以 通过 将 反应 速率 对 反应 亲和力 作 图 得 出 其 值 。A# 只 决定 于 Michaelis- 
Menten 常数 ， 最 大 正 向 与 逆向 反应 速率 之 比 及 cs+cP [ 即 其 与 酶 的 体内 (in vivo) 活性 无 
关 ， 见 式 (14.63) As (14.64)]， 因 此 原则 上 说 A# 可 以 通过 体外 (in vitro) 实验 确 
定 。 但 保证 酶 活性 恒定 是 很 重要 的 ， 和 否则 工 # 就 会 变化 【 见 式 (14.62)], v 和 At+# 间 的 线性 
关系 不 再 满足 。 在 酶 活性 变化 的 情况 下 可 以 将 反应 速率 对 酶 活性 进行 归 一 化 ， 因 为 工 # 与 酶 
活 (或 wmax) 成 正比 (BGI 14.8)。 

在 由 式 (14.68) 计算 出 弹性 系数 后 ， 可 通过 11.1 节 和 11.2 节 中 介绍 的 加 和 原理 及 连 
接 原 理 确 定 通 量 控制 系数 。 由 此 ， 反 应 速率 的 热 动力 学 描述 使 我 们 可 以 由 稳 态 下 测 得 的 代谢 
物 浓 度 进 行 MAC 系数 的 完整 的 求 取 。 

式 (14.68) 还 可 应 用 于 多 于 两 个 反应 的 代谢 途径 的 分 析 ， 但 这 严格 要 求 途径 中 没有 跨 
越 多 于 一 个 反应 的 调节 回路 ， 比 如 说 当 最 后 一 个 代谢 物 反 馈 抑制 多 步 反 应 途径 的 第 一 个 反应 
时 就 不 能 应 用 。 这 是 因为 这 种 热 动力 学 速率 分 析 只 能 描述 底 物 和 产物 对 反应 速率 的 影响 而 不 
能 描述 效应 物 对 速率 的 影响 。 要 考虑 的 另外 一 点 是 反应 集成 的 后 果 。 许 多 途径 都 只 包括 一 个 
或 两 个 不 可 闭 反 应 ， 而 其 它 反应 都 接近 于 平衡 。 在 这 种 情况 下 ， 反 应 可 以 集成 为 两 个 总 反应 
以 产生 一 个 如 式 (14.65) 所 描述 的 途径 结构 ， 其 中 反应 亲和力 针对 总 反应 而 被 确定 。 因 为 
对 所 有 接近 平衡 态 的 反应 其 AF 为 零 ， 集 成 反应 的 A# 值 就 等 于 相应 不 可 逆反 应 的 值 ， 其 
不 为 零 。 类 似 地 ， 对 FCCs 当 平 衡 反应 与 一 不 可 逆反 应 集成 在 一 起 时 ， 集 成 反应 的 总 FCC 
值 也 近似 于 该 不 可 逆反 应 的 值 。 

在 不 能 将 单个 的 途径 中 的 反应 集成 为 两 个 总 反应 以 及 调控 回路 超越 单个 反应 时 ， 上 述 方 
法 不 能 直接 应 用 。 但 此 时 仍 可 能 应 用 热 动 力学 表达 式 修 正 Delgado-Liao 的 方法 以 直接 确定 
FCCs (J 11.23 节 和 方 框 11.4)。 为 此 ， 将 式 (14.66) 引入 式 (14.61) 中 得 到 下 式 : 


L+l 


zi = aj >) Riyln(X;) + 8; (14.69) 
j=l 


397 


Fit 14.4 Delgado 和 Liao 法 的 扩展 
Delgado 和 Liao 法 的 出 发 点 是 式 (1): 


2) CiAn =Q (1) 


其 中 ，Av = 也 一 ws 是 第 ;个 反应 在 瞬 态 过 程 的 反应 速率 与 稳 态 反应 速率 vs 相 比 较 的 变 
化 。 这 个 式 子 从 连接 定理 推导 出 的 假定 是 线性 动力 学 。 下 面 证 明 当 动力 学 由 式 (14.69) 
表示 时 式 (1) 也 成 立 。 首 先 求 弹性 系数 : 

(2) 


Uss 
FP, v WRN RA. SRN (2) 代 人 连接 定理 式 中 ， 得 到 : 


Chk = 0 


i=1 


式 (3) 由 Aln(X;) =In[ X;(¢2) ] —Inl Xj (21) RR, WG: 
y CibikAln(X; ) == 0 


对 于 所 有 的 7) ， 上 式 加 和 后 得 : 


L L L 
va 24 Cee AIC; = > Ge; >, kaAin€X; ) = 0 
i=1 j=2 


j=2% 


该 式 便 可 以 简化 为 式 〈1) ， 因 为 从 式 〈14.61)， 有 : 


L 
Av; = 6; >) ki Aln(X;) = 0 
j=2 


就 如 11.2.3 节 所 述 ， 该 方法 使 得 可 以 通过 测量 瞬 态 过 程 中 的 代谢 物 浓度 来 直接 得 到 
FCCs。 在 式 (14.69) Pa;, 6; 和 有司 是 动力 学 参数 。 对 于 底 物 和 产物 ， 司 和 计量 系数 是 一 
样 的 ， 然 而 对 效应 物 它 们 是 经 验 参 数 。 对 于 不 影响 其 动力 学 的 化 合 物 ( 底 物 、 产 物 和 效应 
物 ) ， 尺 为 零 。 对 于 没有 效应 物 的 简单 情况 ，ai MEPL, 6 等 于 - 工 #A#， 而 一 般 情 况 
下 ， 它 们 应 该 作为 经 验 参 数 考虑 。 基 于 14.3 节 的 讨论 , 式 (14.69) 与 Delgado 和 Liao 
(1992) 所 假定 的 线性 动力 学 相 比 是 对 反应 动力 学 更 好 的 近似 ， 这 使 得 它们 可 以 更 广泛 地 应 
用 于 FCC 的 确定 。 


【 例 14.8】 应 用 热 动力 学 方法 对 青 雪 素 生 物 合成 途径 进行 代谢 控制 分 析 
前 面 的 方法 是 通过 青霉素 生物 合成 途径 的 弹性 系数 和 FCCs 的 计算 来 前述 的 。 它 也 曾 在 
例 11.1 中 应 用 动力 学 模型 加 以 分 析 过 。 在 该 例 中 提 到 了 通 量 控制 主要 是 由 途径 的 头 两 个 步 
又 所 施加 的 ， 因 此 下 面 只 考虑 这 两 个 步骤 。Pissarra 和 Nielsen (1997) 已 经 计算 了 这 些 反应 
398 


a 


的 自由 能 变化 。 两 个 反应 都 是 强 放 热 的 ，ACVS 催化 反应 的 自由 能 变化 为 - 130kJ .mol 1， 
而 IPNS- 催 化 反应 为 -689kJ .mol-!。 因 此 这 两 个 反应 都 在 远离 平衡 态 下 进行 。 


反应 亲和力 /kJ.mol… 反应 亲和力 /kJ.mol-! 


图 14.11 青霉素 生物 合成 最 初 两 步 的 反应 速率 [umol'g (FH): ho!) 
与 反应 亲和力 (kj mol 1) 的 关系 
数据 来 自 两 种 菌 的 流 加 培养 ， 因 此 稍 有 不 同 。 全 流 加 培养 FB023 的 数据 ; ME 流 加 培养 FB028 的 数据 。 
化 学 亲和力 的 计算 依据 Pissara 和 Nielsen (1997) 的 方法 ， 数 据 引 自 Jorgensen 等 (1995a，b)。 
(a) ACVS 催化 的 反应 速率 和 反应 亲和力 ; (b) IPNS 催化 的 反应 速率 和 反应 亲和力 


利用 流 加 培养 数据 可 计算 出 第 一 个 反应 的 自由 能 变化 和 亲和力 。 将 ACVS- 催 化 反应 的 
速率 〈 其 在 流 加 培养 过 程 中 是 变化 的 ) 对 计算 的 反应 亲和力 作 图 得 到 一 线性 关系 [RA 
14.11 (a)]。 此 外 还 发 现 ACVS 的 活性 近似 
为 常数 (Nielsen and Jorgensen ，1995) ， 因 此 二 
可 以 确定 热 动力 学 式 (14.61) 中 的 参数 。 工 # res 
值 计算 为 0.82x 10“mol …g ' ( 干 重 )"h  # 
kJ~'!, A*#H® 115kJ-mol7!, = se 

对 于 IPNS- 催 化 反应 ， 不 但 反应 速率 和 反 = 10 
应 亲 和 力 观察 不 到 线性 关系 [WA 14.11 5 
(b)]j]， 而 且 事实 上 随 着 反应 亲和力 的 增加 反应 0 
速度 反而 降低 。 这 可 以 理解 为 流 加 培养 过 程 中 4 os a0 wm 


RMA AI-mol' 


相应 酶 活性 降低 的 结果 〈Nielsen and Jor- 
gensen，1995)。 这 种 情况 下 不 能 直接 应 用 热 。 图 14.12 IEPNS REPAY 
动力 学 式 〈14.61)。 然 而 如 前 面 已 经 讨论 的 ， 了 
如 果 将 反应 速度 对 测量 的 酶 的 活性 进行 归 一 
化 ， 在 相对 反应 速率 和 反应 亲和力 之 间 就 可 以 得 到 线性 关系 (〈 见 图 14.12)， 进 而 计算 得 到 
A*#F 465k] .mol 1l。 

利用 求 得 的 热 动 力学 表达 式 中 的 参数 ， 可 以 计算 流 加 培养 不 同时 间 时 的 弹性 系数 和 
FCCs。 严 格 地 说 ， 只 有 在 稳 态 下 可 以 应 用 加 和 原理 和 连接 原理 ， 而 上 述 的 流 加 培养 过 程 并 
不 适用 。 不 过 ， 正 如 Pissarra，et al (1996) 所 论述 的 ， 生 物 合成 途径 可 假定 为 处 于 拟 稳 态 。 
对 一 个 流 加 培养 的 计算 结果 见 图 14.13。 可 以 看 出 在 培养 过 程 中 通 量 控制 有 一 个 从 第 一 个 反 
应 到 第 二 个 反应 的 变换 ， 这 和 例 11.1 中 该 途径 的 动力 学 分 析 结 果 是 一 致 的 。 


399 


弹性 系数 
FCCs 


100 200 300 
时 间 /h 时 间 /nh 


14.13 ”基于 青霉素 生物 合成 最 初 两 步 反 应 热力 学 描述 的 MCA 
在 不 同 的 流 加 培养 时 间 计 算 弹 性 系数 和 FCCs[FB028J$rgensen et al(1995b) | 
(a)ACVS 的 弹性 系数 (人 急 );IPNS 的 弹性 系数 ( 国 )。 弹 性 系数 是 在 已 给 时 间 的 自由 能 变化 通过 用 式 (14.68)， 
并 取 A Kevs = 115k] :mol~'!, A fons = 465k) mol-I 而 计算 出 的 。(b)ACVS 的 FCCs(@); 
IPNS 的 FCCs(M). FCCs 是 从 弹性 系数 用 加 和 定理 和 连接 定理 而 计算 出 的 


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401 


=k ow 汇 


腺 味 哈 ”Adenine(A) 一 种 含 氨 碱 基 ， 在 DNA 双 螺 旋 结 构 中 与 胸腺 喀 喧 配对 (A-T)。 

等 位 基因 Alleles 一 个 基因 座 的 不 同形 式 ; 二 倍 体 细 胞 每 个 基因 座 的 两 个 等 位 基因 分 
别 遗 传 自 双亲 的 每 一 方 (例如 : 决定 眼睛 颜色 的 基因 座 的 等 位 基因 可 使 眼睛 成 为 蓝 色 或 棕 
色 )。 

SHIR) Allosteric ”描述 一 类 蛋白质 尤 其 是 酶 的 术语 ， 某 种 化 合 物 能 够 与 这 类 蛋白质 
活性 位 点 之 外 的 某 个 位 点 结合 ， 引 起 活性 位 点 的 构象 发 生 改 变 ， 以 致 于 正常 底 物 不 能 与 之 结 
合 。 变 构 特 性 在 酶 活性 调控 过 程 中 起 作用 。 

ABB Amino acid 一 类 构成 蛋白 质 的 分 子 ， 有 20 种 。 构 成 蛋白 质 的 氨基 酸 种 类 和 
序列 亦 即 蛋白 质 的 功能 由 遗传 密码 决定 。 

扩 增 ”Amplification ”一段 特定 DNA 片断 找 贝 数 的 增加 ; 能 够 在 体内 或 体外 进行 。 见 
克隆 、 聚 合 酶 链 式 反应 。 

合成 代谢 “Anabolism 指 由 较 简 单 的 分 子 [如 有 机 和 (或 ) 无 机 前 体 物 ] 合成 细胞 组 分 
的 代谢 过 程 。 合 成 代谢 过 程 通常 需要 能 量 。 

RAR Anaerobic respiration 发生 在 无 氧 条 件 下 的 呼吸 作用 。 由 CO;、Fe2+ 、 延 
胡 索 酸 、 硝 酸 盐 、 亚 硝酸 盐 、 一 氧化 二 所 、 硫 、 硫 酸 盐 分 子 等 代替 常规 呼吸 作用 中 的 氧 分 子 
作为 终端 电子 受 体 。 需 要 指出 的 是 ， 与 发 酵 过 程 不 同 ， 厌 氧 呼吸 仍然 用 电子 传递 链 转运 
I a 

REF Anticodon 5 mRNA 上 密码 子 配对 的 tRNA 上 的 三 个 连续 的 碱 基 序 列 。 

抗原 Antigen 一 种 可 以 引起 免疫 应 答 的 物质 ， 通 常 是 大 分 子 。 

碱 基 对 ”Base pair(bp) 通过 弱 键 结合 在 一 起 的 两 个 含 氨 碱 基 ( 腺 嗓 吟 和 胸腺 喀 啶 ， 或 
BR Fo UHL). DNA 的 两 条 链 通过 碱 基 对 之 间 的 键 结合 成 为 双 螺 旋 结 构 。 

碱 基 顺 序 Base sequence DNA 分 子 中 核 苦 酸 顺序 。 

生物 技术 Biotechnology 由 基础 研究 发 展 起 来 的 ， 目 前 应 用 于 科学 研究 和 产品 开发 
的 一 系列 生物 学 技术 ， 尤 其 指 应 用 于 工业 的 重组 DNA 技术 、 细 胞 融合 技术 和 新 的 生物 加 工 
技术 。 

RE Capsid ”病毒 的 蛋白 质 外 壳 。 

SAR Catabolism 分解 有 机 化 合 物 的 生物 化 学 过 程 ， 通 常 导 致 能 量 产生 。 

细胞 微生物 学 ”Cellular microbiology ”一 门 新 兴 的 介 于 细胞 生物 学 和 微生物 学 之 间 的 
学 科 。 这 一 新 领域 的 主要 研究 焦点 之 一 是 病源 细菌 对 众多 真 核 细 胞 功能 的 干扰 ， 比 如: 胞 内 
区 室 的 成 熟 ， 细 胞 内 通讯 ， 甚 至 细胞 分 裂 和 分 化 。 从 这 个 意义 上 讲 ， 细 胞 微生物 学 的 研究 为 
哺乳 动物 细胞 生物 学 家 提供 了 先进 的 研究 手段 [(1996) Science 271, 135]. 

陪伴 蛋白 ”Chaperonin 一 种 能 够 帮助 其 它 蛋白 正确 折 登 和 多 亚 基 结构 装配 的 蛋白 质 。 

化 学 渗透 Chemiosmosis 利用 离子 跨 膜 梯度 尤其 是 质子 梯度 产生 ATP 的 作用 。 见 质 
子 动力 。 

染色 体 Chromosome 携带 有 细胞 代谢 所 必需 的 基因 的 遗传 物质 。 原 核 细胞 具有 典型 

402 


的 由 环 状 DNA 分 子 组 成 的 单一 染色 体 。 真 核 细胞 含有 多 条 染色 体 ， 每 一 条 染色 体 都 含有 一 
条 与 特定 蛋白 质 结 合 的 线性 DNA 分 子 。 

克隆 Clones 源 于 单一 祖先 的 一 群 细胞 。 

克隆 Cloning 由 单一 祖先 通过 无 性 方式 ， 产 生 遗 传 上 完全 相同 的 一 群 细胞 的 过 程 。 
在 重组 DNA 技术 中 ， 使 用 DNA 操作 方法 产生 多 拷贝 的 单个 基因 或 DNA 片断 被 称 为 DNA 
克隆 。 

克隆 (有 用) 载体 Cloning vector 源 于 病毒 、 质 粒 或 高 等 生物 细胞 ， 具 有 自我 复制 能 力 
的 环 状 DNA 分 子 。 适 当 大 小 的 DNA 片段 能 够 被 整合 到 克隆 载体 上 而 载体 不 会 失去 自我 复 
制 能 力 ; 载体 将 外 源 DNA 导入 宿主 细胞 并 可 以 在 宿主 中 大 量 复制 。 质 粒 、 夭 粒 (大 的 质粒 ) 
和 酵母 人 工 染 色 体 都 是 克隆 载体 的 例子 ; 克隆 载体 常常 是 包含 几 种 来 源 的 DNA 序列 的 重组 
F's 

辅酶 Coenzyme 通过 接受 和 供给 电子 或 功能 集团 而 参与 酶 反应 的 低 分 子 量化 学 物质 。 
例如 : NAD*, FAD, 

大 宗 化 学 品 Commodity chemical 商品 价值 低 而 且 大 宗 销 售 的 化 学 品 ， 例 如 乙醇 。 

互补 DNA Complementary DNA(cDNA) 由 信使 RNA 为 模板 合成 的 DNA， 单 链 的 形 
式 通常 在 做 物理 图 谱 时 作为 探 针 使 用 。 

保守 序列 Conserved sequence DNA 分 子 的 一 段 碱 基 序列 (或 蛋白 质 的 一 段 氛 基 酸 序 
列 )， 它 在 整个 进化 过 程 中 实质 上 保持 不 变 。 

FFL Cosmid 人工 构 建 的 含有 入 噬菌体 的 cos 基因 的 克隆 载体 。 夭 粒 能 够 被 包 训 在 入 
噬菌体 内 去 感染 大 肠 杆 菌 ， 从 而 可 以 克隆 不 能 用 质粒 来 克隆 转化 细菌 宿主 的 大 片断 DNA。 

胞 喀 了 啶 ”Cytosine(C) 一 种 含 氨 碱 基 ， 在 DNA 双 螺 旋 结 构 中 与 鸟 嗓 叭 配 对 (G-C)。 

=f Diploid 一 套 完 整 的 遗传 物质 由 成 对 的 染色 体 组 成 ， 每 套 染 色 体 分 别 来 自 两 
个 亲本 之 一 。 除 了 配子 外 ， 大 部 分 动物 细胞 具有 一 套 双 倍 体 染 色 体 。 双 倍 体 的 人 类 基因 组 含 
有 46 条 染色 体 。 与 单 倍 体 比 较 。 

脱氧 核糖 核酸 DNA(deoxyribonucleic acid) “编码 遗传 信息 的 分 子 。DNA 是 由 核 苷 酸 
碱 基 对 之 间 的 弱 键 相连 形成 的 双 链 分 子 。DNA PHORRERARREA(A) BEY 
(G)、 胞 喀 喧 (C) 和 胸腺 喀 喧 (T)。 事 实 上 ， 碱 基 对 仅 在 A 与 及 G 与 C 之 间 形 成 ， 这 样 每 
一 条 单 链 的 碱 基 序列 可 以 从 与 其 配对 的 另 一 条 链 的 碱 基 序 列 推断 出 来 。 

DNA 复制 DNAreplication 以 已 有 的 DNA 为 模板 合成 新 的 DNA 链 。 在 人 类 和 其 它 
真 核 生物 中 ，DNA 复制 发 生 在 细胞 核 中 。 

DNA 序列 DNA sequence —f& DNA 片断 、 一 个 基因 、 一 条 染色 体 或 一 个 完整 基因 
组 中 碱 基 对 的 相对 顺序 。 

afk Electron acceptor 在 氧化 还 原 反应 中 接受 电子 的 物质 。 电 子 受 体 是 氧 
AGF 。 

电子 传递 磷酸 化 ”Electron transport phosphorylation ”涉及 与 膜 相 关 的 电子 传递 链 和 
质子 动力 生成 的 ATP 的 合成 。 也 称 为 氧化 磷酸 化 。 

FRik Electrophoresis ”大 分 子 混合 物 ( 例 如 DNA 片断 和 有 蛋 和 白质) 的 一 种 分 离 方 法 。 电 
流通 过 含有 这 类 混合 物 的 介质 时 ， 每 一 种 分 子 由 于 其 所 带电 荷 以 及 大 小 的 差异 而 以 不 同 的 速 
率 穿 过 该 介质 。 分 离 就 是 基于 这 些 差异 。 琼 脂 糖 凝 胶 和 聚 丙 虹 酰 胺 凝 胶 是 蛋白 质 和 核酸 电泳 
常用 的 介质 。 

403 


EMP 途径 Embden-Meyerhof-Parnas pathway EMP 途径 是 将 葡萄 糖 降解 为 丙酮 酸 
的 途径 。 这 个 途径 的 6 碳 阶 段 将 葡萄 糖 转 变 为 1,6- 二 磷酸 果糖 ; 在 3 碳 阶 段 ， 三 磷酸 甘油 醛 
转化 成 丙酮 酸 时 产生 ATP( 与 思 特 纳 -道德 洛 夫 途 径 比 较 )。 

恩 特 纳 -道德 洛 夫 途径 (ED 途径 ) Entner-Doudoroff pathway (ED pathway) “该 途径 
转化 葡萄 糖 为 丙酮 酸 和 通过 产生 6- 磷 酸 葡萄 糖 酸 并 进行 脱水 而 生成 三 磷酸 甘油 醛 。 

酶 Enzyme 起 催化 作用 的 蛋白 质 ， 它 加 快 生 物化 学 反应 进行 的 速率 ， 但 不 改变 反应 
的 方向 和 性 质 。 

大 肠 杆 菌 “ Escherichia coli 是 普通 杆菌 。 由 于 没有 和 致 病 性 而 且 很 容易 在 实验 室 里 培 
养 ， 所 以 遗传 学 家 对 它 进行 了 深入 细致 的 研究 。 

BREW Eukaryote 这 类 生物 的 细胞 有 如 下 特征 : (1) 染 色 体 具 有 核 小 体 结构 并 且 由 
双 层 膜 与 细胞 质 隔 开 ; (2) 在 细胞 质 中 不 同 的 细胞 器 内 将 功能 区 室 化 。 

外 源 DNA Exogenous DNA 来源 于 一 种 生物 之 外 的 DNA. 

外 显 子 Exons 基因 内 编码 蛋白 质 的 DNA 序列 。 与 内 含 子 比较 。 

表达 Expression 在 细胞 内 基因 通过 基因 产物 的 形成 而 行使 功能 的 能 力 。 

表达 载体 Expression vector 含有 必要 的 调控 序列 以 允许 克隆 的 基因 转录 和 翻译 的 一 
种 克隆 载体 。 

反馈 抑制 Feedback inhibition 终端 产物 对 其 生物 合成 途径 的 抑制 作用 。 

发 酵 Fermentation (1) 产 生 ATP 的 分 解 代 谢 反 应 ， 反 应 中 有 机 化 合 物 既 可 以 作为 初 
期 的 电子 供 体 也 可 作为 最 终 的 电子 受 体 ; 〈2) 大 规模 的 微生物 工艺 过 程 。 

融合 蛋白 ”Fusion protein ”两 种 或 多 种 基因 以 保持 有 其 正确 的 可 读 框 架 的 形式 连接 后 
的 翻译 结果 ， 产 物 是 单一 蛋白 质 。 

mit Gel 一 种 惰性 聚合 物 ， 通 常 由 琼脂 糖 和 聚 丙 烽 酰 胺 组 制 成 ， 用 于 电泳 分 离 核酸 
或 蛋白 质 类 大 分 子 。 

基因 Gene 站 传 的 基本 物理 和 功能 单位 。 基 因 是 一 段位 于 特定 染色 体 上 特定 位 点 的 
有 序 核 昔 酸 序列 ， 编 码 一 个 具有 特定 功能 的 产物 ( 即 : 蛋白 质 或 RNA 分 子 )。 见 基因 表达 。 

基因 破坏 ”Gene disruption ”通过 体内 和 体外 重组 ， 以 容易 选择 的 突变 基因 来 取代 野生 
型 基因 。 

基因 表达 “Gene expression 基因 表达 是 基因 的 编码 信息 被 转换 成 细胞 内 结构 并 行使 功 
能 的 过 程 。 表 达 的 基因 包括 被 转录 成 mRNA 然后 被 翻译 成 蛋白 质 的 基因 ， 以 及 被 转录 成 
RNA 但 不 被 翻译 成 蛋白 质 的 基因 (如 : 4648 RNAs 和 核糖 体 RNAs)。 

AYER Gene mapping DNA 分 子 ( 染 色 体 或 质粒 ) 中 基因 的 相对 位 置 和 它们 之 间 的 
距离 (以 连锁 单位 或 物理 单位 ) 的 确定 。 

基因 产物 ”Gene product 由 基因 表达 所 产生 的 生物 化 学 物质 一 一 RNA 或 蛋白 质 。 基 
因 产 物 的 量 用 以 计量 基因 活性 的 高 低 。 异 常量 的 基因 产物 可 能 与 致 病 的 等 位 基因 相关 联 。 

遗传 密码 ”Genetic code mRNA 上 以 三 联 体 ( 密 码 子 ) 形 式 编码 的 ， 在 蛋白 质 合 成 中 决 
定 氨 基 酸 序列 的 核 兰 酸 的 序列 。 一 个 基因 的 DNA 序列 能 用 于 预测 mRNA 序列 ， 而 遗传 密 
码 进 而 可 用 来 预测 氨基 酸 的 顺序 。 

遗传 工程 Genetic engineering 在 DNA 分 离 、 操 作 、 重 组 和 表达 中 体外 技术 的 运用 。 

遗传 图 Genetic map 染色 体 上 基因 的 连锁 图 谱 。 

基因 组 文库 ”Genomic library 由 代表 一 个 生物 体 完 整 基因 组 的 一 系列 随机 产生 的 交 

404 


& DNA 片断 组 成 的 克隆 的 集合 。 

生长 因子 Growth factor 在 生物 体 生 长 的 营养 物 中 必须 提供 的 有 机 化 合 物 ， 因 为 它 
们 是 细胞 的 必须 组 分 或 是 这 些 组 分 的 前 体 物 ， 而 且 不 能 由 生物 体 自己 合成 。 

SBM Guanine 一 种 含 氢 碱 基 ， 在 DNA 双 螺 旋 结 构 中 与 胞 喀 喧 配对 (G-C)。 

单 倍 体 Haploid 一 套 完整 的 遗传 物质 由 单 套 染 色 体 组 成 (二 倍 体 生 物 全 套 遗 传 物质 的 
一 半 )， 存 在 于 动物 的 卵细胞 和 精细 胞 、 植 物 的 卵细胞 和 花粉 以 及 大 多 数 微生物 细胞 中 A 
类 的 生殖 细胞 中 有 23 条 染色 体 。 

同 源 性 Homologies 相同 物种 或 不 同 物种 的 个 体 之 间 DNA 或 蛋白 质 序列 的 相似 性 。 

人 类 基因 治疗 Human gene therapy 直接 在 细胞 中 引入 正常 DNA 以 校正 遗传 缺陷 。 

人 类 基因 组 计划 的 启动 ”Human Genome Initiative 1986 年 ， 始 于 美国 能 源 部 的 几 个 
研究 项 目的 统称 ， 目 标 是 : (1) 在 已 知 的 染色 体位 置 创建 出 一 组 有 序 的 DNA 片断 ; (2) 开 发 
新 的 计算 方法 分 析 遗 传 图 谱 和 DNA 序列 数据 ; (3) 发 展 新 的 技术 和 仪器 ， 检 测 和 分 析 
DNA。 由 美国 能 源 部 (DOE) 发 起 的 这 个 项 目 现在 称 作 人 类 基因 组 项 目 。 由 美国 能 源 部 和 国 
家 卫生 研究 院 (NIH) 领 导 的 这 个 国家 研究 计划 称 为 人 类 基因 组 计划 。 

杂交 ”Hybridization 两 条 互补 的 DNA 链 或 一 条 DNA 链 与 一 条 RNA 链 结合 以 形成 
双 链 分 子 的 过 程 。 

免疫 应 答 (反应 ) Immune response ”由 于 接触 外 源 物 质 而 在 人 类 或 动物 体内 诱导 产生 
的 特异 性 反应 。 这 种 引起 免疫 应 答 的 外 源 物质 称 为 免疫 原 或 抗原 。 免 疫 应 答 包括 抗体 的 产生 
或 者 工 -细胞 的 激活 ， 二 者 也 可 同时 发 生 。 

原 位 杂交 In situ hybridization 在 克隆 的 细菌 或 培养 的 真 核 细 胞 中 利用 DNA 或 
RNA 探 针 检测 互补 DNA 序列 的 存在 。 

体外 Invitro FHESA: 在 器 下 内 ， 离 开 生 物 机体 。 与 “体内 (iz vivo)” —iAAA 
反 ， 用 于 描述 在 试管 中 或 其 它 器 严 中 发 生 的 任何 过 程 。 如 果 研 究 或 试验 是 在 生物 体 以 外 ， 也 
就 是 在 试管 中 进行 ， 即 被 称 为 是 在 “体外 ”进行 的 。 

体内 In vivo 在 体内 ， 在 生物 机 体内 ， 与 “体外 ”一 词 相 反 。 在 生物 机 体内 进行 的 研 
究 或 试验 被 称 为 是 在 “体内 ”进行 的 。 

fa Informatics 研究 计算 机 和 统计 学 技术 在 信息 处 理 中 的 应 用 的 学 科 。 在 基因 
组 计划 中 ， 信 息 学 包括 开发 快速 搜索 数据 库 、 分 析 DNA 序列 信息 以 及 从 DNA 序列 数据 预 
测 蛋 白质 序列 和 结构 等 方面 的 方法 。 

起 始 因 子 Initiation factors(IF) 除 mRNA 和 核糖 体 以 外 的 一 组 蛋白 质 合 成 起 始 所 必 
须 的 具有 催化 活性 的 蛋白 质 。 在 细菌 中 ， 三 种 不 同 的 蛋白 质 已 被 确认 ，IF-1(8kDa)，IF-2 
(75kDa) 和 IF-3 (30kDa)。 在 真 核 生物 中 ， 至 少 6 一 8 种 蛋白 质 已 被 确认 。IF-1 和 IF-2 增强 
起 始 tRNA 与 起 始 复合 物 的 结合 。 

内 含 子 Introns 阻 断 基因 上 和 蛋白质 编码 序列 的 DNA 碱 基 序 列 ; 这 些 序列 被 转录 成 
RNA， 但 是 在 RNA 被 翻译 成 蛋白 质 之 前 这 些 序列 被 剪 切 掉 。 

FH Kilobase(kb) DNA 片段 的 长 度 单 位 ， 等 于 1000 HFM, 

乳糖 阻 遏 物 Lactose repressor 通常 以 非常 高 的 亲和力 结合 到 乳糖 操纵 子 的 操纵 区 域 
的 一 种 蛋白 质 (37kDa 亚 基 的 四 聚 体 )， 通 过 阻 断 RNA 聚合 酶 进入 启动 子 区 而 抑制 下 游 基 因 
的 转录 。 当 乳糖 阻 过 物 结合 异 乳 糖 时 ， 它 与 操纵 基因 的 结合 减弱 ， 因 而 基因 被 解除 阻 过 。 

库 Library 无 序 克隆 ( 即 从 特定 生物 体 克 隆 的 DNA) 的 集合 ， 它 们 之 间 的 相互 关系 可 

405 


以 通过 绘制 物理 图 谱 来 建立 。 

BAR Locus (复数 为 loci) 基因 或 其 它 染 色 体 标记 物 在 染色 体 上 的 位 置 以 及 这 一 位 
置 上 的 DNA。 一 些 情况 下 “基因 座 ” 这 一 术语 的 运用 仅 限 于 表达 的 DNA 区 段 。 

标记 “Marker 染色体 上 可 识别 的 物理 位 置 (如 : 限制 性 内 切 酶 位 点 ， 基 因 )， 它 们 的 
遗传 可 以 被 追踪 。 标 记 可 以 是 表达 的 DNA 区 段 (基因 ) 或 一 些 编码 功能 未 知 ， 但 是 遗传 方式 
能 够 被 确定 的 DNA 片段 。 

信使 RNA Messenger RNA (mRNA) RNA 的 一 种 ， 含 有 指定 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 
并 且 在 核糖 体 上 进行 翻译 的 信息 。 在 真 核 生 物 中 ，mRNA 通常 通过 剪接 大 的 初级 转录 物 而 
形成 。 真 核 生 物 的 mRNA 带 有 一 个 GTP( HF ARM) 1 Fo — FRR M (polyA) 4. 

Riff Metabolism 细胞 中 的 所 有 生物 化 学 反应 ， 包 括 合 成 代谢 和 分 解 代谢 。 

fi) Microorganism 小 得 不 能 用 肉眼 看 见 的 生物 体 ， 包 括 细 菌 、 真 菌 、 原 生动 物 
和 微 荣 ， 也 包括 病毒 。 

线粒体 Mitochondrion (复数 为 mitochondria) 负责 呼吸 和 电子 传递 磷酸 化 过 程 的 真 
核 细胞 器 。 

突变 Mutation 生物 体 DNA 碱 基 序列 可 遗传 的 改变 。 无 义 突变 : 将 有 义 密 码 子 变 成 
不 能 编码 氨基 酸 的 无 义 碱 基 序 列 的 突变 。 琥 珀 突变 : 由 于 在 基因 的 编码 序列 内 引入 终止 密码 
(TAA, TAG, TGA) 而 导致 翻译 提前 终止 的 突变 。 

(磷酸 ) 烟 酰胺 腺 味 叭 二 核 背 酸 Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) [NAD 
(p)] ”一 种 重要 的 辅酶 ， 在 广泛 的 氧化 还 原 反 应 中 起 氢 的 载体 作用 ; H 被 携带 在 烟 酰胺 的 
残 基 上 。 该 辅酶 的 氧化 形式 被 写成 NNA(P) *， 还 原形 为 NAD(P)H。 许 多 氧化 还 原 酶 是 
NAD+ 或 NAD+ 专 一 性 的 ， 虽 然 一 些 氧化 还 原 酶 能 与 二 者 都 起 作用 。 作 为 相当 普遍 的 法 则 ， 
NADP 多 与 生物 合成 反应 相关 ，NAD+ 则 更 常 与 分 解 代 谢 和 产能 反应 相关 。 

RH Nucleotide “由 含 氨 碱 基 ( 在 DNA PERE, LE, BRS EAM, 
在 RNA 中 是 腺 嗓 叭 、 鸟 嘻哈 、 尿 喀 喧 或 胞 喀 啶 ) ， 一 个 磷酸 分 子 和 一 个 糖分 子 ( 在 DNA 中 
是 脱氧 核糖 ， 在 RNA 中 是 核糖 ) 组 成 的 DNA 或 RNA 的 亚 单位 。 成 千 成 万 个 核 苦 酸 连接 在 
一 起 构成 DNA 或 RNA 分 子 。 

细胞 核 Nucleus 真 核 生 物 中 含有 遗传 物质 的 细胞 器 。 

BYR Oligonucleotide ”一段 短 的 核酸 分 子 ， 既 可 从 生物 体 中 也 可 通过 化 学 合成 
获得 。 

癌 基 因 “Oncogene 其 一 种 或 多 种 形式 与 癌 相 关 的 基因 。 许 多 癌 基 因 直 接 或 间接 地 参与 
细胞 生长 速率 的 调控 。 

可 读 框 Open reading frame (ORF) 开始 于 起 始 密码 子 结束 于 终止 密码 子 一 个 DNA 
分 子 的 全 长 。 

操纵 基因 Operator DNA 分 子 上 阻 过 物 的 结合 位 点 ， 是 操纵 子 的 一 部 分 。 

操纵 子 Operon 由 共同 转录 的 若干 结构 基因 组 成 的 可 控制 的 转录 单元 。 至 少 包 括 两 
个 不 同 的 区 域 : 操纵 基因 区 域 和 启动 子 区 域 。 第 一 个 被 描述 的 操纵 子 的 例子 是 lac 操纵 子 。 

氧化 -还 原 反 应 ”Oxidation-reduction (redox) reaction ”一 对 耦 联 的 化 学 反应 ， 其 中 一 
个 化 合 物 被 氧化 ， 而 另 一 个 接受 氧化 反应 中 释放 的 电子 而 被 还 原 。 

周 质 间 隙 ”Periplasmic space 革 兰 氏 阴 性 菌 细胞 质 膜 与 细胞 壁 之 间 的 区 域 ， 含 有 某 些 
与 营养 相关 的 酶 。 

400 


Mp Phage 以 细菌 细胞 为 天 然 宿 主 的 病毒 。 

‘32 Ait Physical map DNA 上 可 识别 的 界 标 位 置 图 谱 ( 如 : 限制 酶 的 切割 位 点 、 基 
因 ) ， 不 考虑 遗传 行为 ， 用 碱 基 对 测定 距离 。 人 类 基因 组 最 低 分 辨 率 的 物理 图 谱 是 24 条 染色 
体 上 的 带 状 化 模式 ; 最 高 分 辨 率 的 物理 图 谱 应 是 染色 体 的 全 部 核 昔 酸 序列 。 

质粒 Plamid 可 以 自主 复制 的 染色 体外 的 环 状 DNA 分 子 ， 不 同 于 通常 细菌 的 基因 
组 ， 而 且 在 非 选择 性 条 件 下 对 细胞 的 生存 是 非 必需 的 。 一 些 质 粒 可 以 整合 到 宿主 的 基因 组 
中 ， 一 些 人 工 构 建 的 质粒 可 以 作为 克隆 载体 。 

多 顺 反 子 标 mRNA PolycistronicmRNA 由 数 个 串 连 排列 的 基因 转录 而 产生 的 单一 
mRNA 分 子 ; 具有 代表 性 的 是 由 操纵 子 转录 的 mRNA。 

HAMA Polymerase chain reaction (PCR) 使 用 热 稳 定 聚 合 酶 ， 以 两 条 短 的 
单 链 DNA 为 引物 在 体外 扩 增 DNA 的 方法 。 一 条 引物 要 与 待 扩 增 序 列 的 正 链 的 3 端 互补 ， 
另 一 条 引物 则 与 待 扩 增 序列 的 负 链 的 3 ` 端 互补 。 由 于 新 合成 的 DNA 链 在 后 续 反应 中 可 作为 
引物 的 追加 模板 ， 连 续 多 轮 的 引物 退火 、 链 的 延伸 和 变性 使 目的 序列 得 以 快速 和 高 度 特异 性 
的 扩 增 。PCR 也 可 用 于 检定 DNA 样品 中 特定 序列 的 存在 。 

多 肽 Polypeptide ”由 肽 键 连接 到 一 起 的 几 个 氨基 酸 。 

引物 “Primer 聚合 酶 链 式 反应 开始 前 已 存在 的 多 核 尊 酸 短 链 ，DNA 聚合 酶 可 将 新 的 
脱氧 核糖 核 苷 酸 加 到 该 短 链 上 。 

探 针 “Probe 免疫 或 者 放射 标记 的 具有 特定 碱 基 序 列 的 单 链 DNA 或 RNA 分 子 ， 用 于 
杂交 以 检测 互补 的 碱 基 序列 。 

原核 生物 “Prokaryotes 一 类 生物 体 ， 即 细菌 和 蓝 细菌 (以 前 称 作 蓝 - 绿 党 ) ， 其 特征 为 
具有 一 条 或 偶尔 两 条 简单 、 裸 露 、 通 常 为 环 状 DNA 的 染色 体 ， 没 有 核 膜 并 只 具有 少数 种 类 
的 细胞 器 (通常 只 有 质 膜 和 核糖 体 ) 。 

启动 子 Promoter DNA 的 一 个 区 段 ， 在 启动 DNA 转录 为 RNA 之 前 ，RNA 聚合 酶 
结合 到 该 区 段 上 。 转 录 起 始 的 核 音 酸 的 位 置 被 定 为 +1， 从 这 个 位 置 开 始 对 核 苷 酸 进 行 编号 : 
这 个 位 置 的 上 游 为 负 ， 下 游 为 正 。 大 多 数 细 菌 启动 子 上 有 两 个 聚合 酶 结合 所 必须 的 共有 序 
列 。 第 一 个 是 位 于 --10 位 置 的 普 里 布 诺 框 ， 含 共有 序列 $ -TATAAT-3“。 第 二 个 是 以 -35 
为 中 心 的 负 35 序列 ， 含 共有 序列 $ -TTGACA-3“。 调 节 基 因 转 录 的 大 部 分 因子 都 是 通过 与 
启动 子 或 与 启动 子 相 邻 位 点 的 结合 来 影响 转录 的 起 始 。 真 核 生 物 的 启动 子 知道 得 很 少 ; 三 种 
RNA 聚合 酶 中 的 每 一 种 作用 于 不 同 的 启动 子 。RNA RSS HF) rRNA 前 体 物 转录 的 单 
一 启动 子 。 转 录 编 码 多 肽 的 所 有 基因 的 RNA 聚合 酶 开 识 别 成 千 上 万 个 启动 子 。 这 些 启 动 子 
中 的 大 部 分 具有 蕊 德 堡 - 堆 格 内 斯 框 或 TATA 框 ， 它 们 集中 在 -25 位 置 并 具有 共有 序列 S- 
TATAAAA-3 ， 而 有 些 启动 子 在 -90 附近 有 共有 序列 为 $ -GGCCAATCT-3 的 CAAT 框 。 
越 来 越 多 的 证 据 显示 ， 所 有 “持家 ”基因 的 启动 子 都 具有 多 拷贝 的 、 含 $-GGGCGG-3“ 序 列 
的 GC 丰富 单元 。 聚 合 酶 开 的 转录 也 受 更 远 端的 称 为 增强 子 的 元 件 的 影响 。RNA 聚合 酶 焉 
合成 SS HBR RNA, 4368 tRNA 和 一 些小 的 RNA。RNA 聚合 酶 陡 的 启动 子 既 可 以 像 在 编 
码 SSRNA 的 基因 上 那样 以 单一 序列 存在 ， 又 可 以 像 在 所 有 的 tRNA 基因 上 那样 以 两 个 区 段 
存在 。 

蛋白 质 Protein 由 一 条 或 多 条 具有 特定 顺序 的 氨基 酸 链 组 成 的 大 分 子 物 质 ， 它 由 编 
码 蛋 白质 的 基因 中 核 苷 酸 的 碱 基 序 列 所 决定 。 生 物体 的 细胞 、 组 织 和 器 官 的 结构 、 功 能 和 调 
控 都 需要 蛋白 质 ， 而 且 每 种 蛋白 质 有 独特 的 功能 。 激 素 、 酶 及 抗体 都 是 蛋白 质 的 例子 。 

407 


质子 动力 “Proton-motive force (PMF) 通过 电子 传递 链 的 作用 由 质子 释放 而 产生 的 
AR 64) BK AE AK 2S 

RY Purine 一 种 含 氨 的 双环 碱 性 化 合 物 ， 存 在 于 核酸 中 。DNA f RNA PORE 
REY Fo LEK, 

喀 啶 ”Pyrimidine 一 种 含 氨 的 单 环 碱 性 化 合 物 ， 其 存在 于 核酸 中 。DNA PHBE 
RO Oe Fo RRB, RNA 中 的 喀 喧 是 胞 喀 喧 和 尿 喀 啶 。 

重组 克隆 Recombinant clones 含有 重组 DNA 分 子 的 克隆 。 见 重组 DNA 技术 。 

重组 DNA 分 子 “Recombinant DNA molecules ”用 重组 DNA 技术 连接 起 来 的 不 同 来 源 
的 DNA 分 子 的 组 合 。 

重组 DNA 技术 ”Recombinant DNA technologies 在 无 细胞 体系 中 (细胞 或 生物 体 以 外 
的 环境 ) 将 DNA 片断 连接 起 来 的 过 程 。 在 适当 的 条 件 下 ， 重 组 DNA 分 子 能 够 进入 细胞 ， 在 
细胞 内 或 进行 自主 复制 或 整合 到 细胞 的 染色 体 上 去 进行 复制 。 

重组 Recombination 子 代 获得 不 同 于 亲 代 基因 的 基因 组 合 过 程 。 在 高 等 生物 中 ， 这 
可 通过 遗传 物质 的 交换 来 进行 。 

调控 Regulation 控制 蛋白 质 合成 速率 的 过 程 ， 诱 导 和 阻 过 均 属于 调控 的 例子 。 

调节 区 域 或 序列 Regulatory regions or sequences ”控制 基因 表达 的 一 段 DNA MK 
序列 。 

调节 子 Regulon 两 个 或 两 个 以 上 的 空间 上 分 开 的 、 由 共同 的 调节 物 分 子 以 协调 的 方 
式 调 控 的 基因 。 

阻 遏 蛋白 Repressor protein 一 种 结合 于 操纵 基因 上 阻止 基因 转录 的 蛋白 质 。 阻 过 有 蛋 
白 与 操纵 基因 结合 的 亲和力 可 受 其 它 分 子 的 影响 。 诱 导 物 与 阻 过 蛋白 结合 削弱 它们 与 操纵 基 
因 的 结合 能 力 ， 而 辅 阻 过 物 增加 这 种 结合 能 力 。 阻 过 蛋白 的 典型 范例 是 乳糖 阻 过 蛋白 ， 它 作 
用 于 诱导 物 为 B- 半 乳糖 苷 (例如 乳糖 ) 的 lac 操纵 子 。 它 是 一 个 由 360 个 氨基 酸 组 成 的 多 肽 ， 
四 聚 体 是 它 有 活性 的 形式 。 

限制 性 酶 切 位 点 Restriction enzyme cutting site DNA 中 一 段 特 定 的 可 以 被 限制 性 内 
切 酶 切割 的 核 音 酸 序列 。 有 些 切 割 点 在 DNA 上 频繁 出 现 ( 如 ， 每 几 百 个 碱 基 对 就 出 现 一 
次 )， 有 些 切 割 点 出 现 的 频率 则 很 低 (例如 ， 每 一 万 个 碱 基 对 才 出 现 一 次 )。 

限制 性 内 切 酶 “Restriction enzyme, endonuclease ”一 种 识别 特定 的 、 短 的 核 苷 酸 序列 
并 在 这 些 位 点 切 审 DNA 的 蛋白 质 。 细 菌 含 400 多 种 这 样 的 酶 ， 可 识别 和 切割 100 种 以 上 的 
不 同 的 DNA 序列 。 见 限制 性 酶 切 位 点 。 

核糖 核酸 “Ribonucleic acid (RNA) 存在 于 细胞 核 和 细胞 质 中 的 一 种 化 学 物质 ， 在 有 蛋 
白质 合成 和 细胞 的 其 它 化 学 活动 中 起 重要 作用 。RNA 的 结构 类 似 于 DNA 的 结构 。RNA 分 
子 有 几 类 ， 包 括 信 使 RNA、 转 移 RNA、 核 糖 体 RNA 和 其 它 小 分 子 RNA， 每 一 种 都 用 于 
不 同 的 目的 。 

核糖 体 RNA Ribosomal RNA(rRNA) 在 细胞 的 核糖 体 中 发 现 的 一 类 RNA。 

核糖 体 Ribosome W rRNA 和 核 蛋 白 亚 基 组 成 的 异 二 聚 体 多 亚 基 酶 。 核 糖 体 与 
mRNA 和 和 氢 酰 tRNA 相互 作用 ， 翻 译 信 使 RNA 上 编码 蛋白 质 的 序列 。 在 所 有 的 生物 体 中 ， 
包括 叶绿体 及 线粒体 中 发 现 的 核糖 体 很 相似 ， 都 是 由 大 、 小 两 个 亚 基 组 成 ， 然 而 原核 生物 和 
真 核 生 物 核 糖 体 的 差异 是 显而易见 的 。 

SD 序列 “Shine-Dalgarno sequence 在 原核 (生物 ) 的 mRNA 分 子 翻 译 起 始 位 点 上 游 的 

408 


一 段 短 的 核 苦 酸 序列 ， 其 作用 是 结合 核糖 体 RNA 并 将 核糖 体 带 到 MRNA 上 的 起 始 密码 子 。 

8 因子 Sigma factor 转录 起 始 因子 (86kDa)， 结 合 于 大 肠 杆 菌 ， 依 赖 于 DNA 的 
RNA 聚合 酶 ， 促 进 聚 合 酶 附着 于 DNA 上 特异 的 转录 起 始 位 点 。 聚 合 酶 附着 于 DNA LE, 
8 因子 被 释放 。 

信号 序列 (信和 号 肽 ) Signal sequence (signal peptide) 有 蛋白 质 始 端的 一 段 短 氨 基 酸 链 ， 
典型 的 是 富 含 朴 水 氨基 酸 的 短 扰 ， 它 协助 完整 多 肽 的 跨 膜 转运 。 

SOS 系统 SOSsystem DNA 修复 系统 ， 也 称 作 易 错 修复 。 在 该 系统 中 , 损伤 DNA 分 
子 通过 迭 入 一 个 碱 基 而 被 修复 。 该 碱 基 可 以 是 一 个 错误 碱 基 ， 但 它 容 许 DNA 复制 。 这 类 修 
复 需 要 recA 蛋白 。SOS 基因 在 原核 和 真 核 生 物 细胞 周期 调控 中 起 作用 。 

DNA 印迹 法 (Southern 印迹 法 ) Southern blotting 通过 吸收 将 凝 胶 上 经 电泳 分 离 的 
DNA 片段 转移 到 滤 膜 上 ， 用 放射 性 标记 的 互补 探 针 检测 特定 的 碱 基 序 列 。 

孢子 Spore 由 许多 原核 生物 和 真菌 形成 的 抗 性 休眠 结构 的 总 称 。 

底 物 水 平 磷酸 化 ”Substrate-level phosphorylation ”通过 无 机 磷 与 活化 的 有 机 底 物 的 反 
应 进行 高 能 磷酸 键 的 合成 。 

it Termination (1)mRNA 合成 ( 即 转录 ) 在 终止 子 位 点 的 停止 ; (2) 蛋 和 白质 合成 
( 即 翻 译 ) 在 终止 密码 子 位 点 的 停止 。 

胸腺 喀 院 ”Thymine (T) “一 种 含 氢 的 碱 基 ， 在 DNA 双 螺 旋 结 构 中 与 腺 嗓 叭 配对 
(A-T)。 

转录 transcription vA DNA 为 模板 在 RNA 聚合 酶 作用 下 进行 RNA 的 合成 。 

转录 控制 Transcriptional control 通过 控制 一 段 DNA 区 段 RNA 转录 物 的 数量 进行 
基因 表达 的 控制 ， 是 原核 生物 和 真 核 生 物 差异 控制 蛋白 质 合成 的 一 个 主要 调控 机 制 。 

转移 RNA Transfer RNA (tRNA) 具有 三 联 核 茜 酸 序列 结构 的 一 类 RNA， 与 
mRNA 的 三 联 核 苷 酸 编码 序列 是 互补 的 。tRNA 在 蛋白 质 合成 中 的 作用 是 与 氨基 酸 结合 并 把 
它们 转移 到 核糖 体 上 。 依 据 mRNA 所 携带 的 遗传 密码 ， 蛋 白质 在 核糖 体 上 组 装 。 

644 Transformation 使 细胞 携带 的 遗传 物质 由 于 外 源 DNA 迭 入 其 基因 组 而 发 生 改 
变 的 过 程 。 

翻译 Translation ”在 核糖 体 上 进行 的 ， 由 mRNA 所 携带 的 信息 来 指定 一 条 多 肽 链 中 
RAR It, 

翻译 控制 Translational control 通过 对 翻译 步骤 的 调控 进行 蛋白 质 合成 的 控制 。 例 
如， 通过 有 选择 的 使 用 已 合成 的 mRNA 或 利用 mRNA 的 不 稳定 性 来 进行 控制 。 

尿 喀 了 啶 ”Uracil (U) 一 种 通常 只 存在 于 RNA 中 而 不 存在 于 DNA 中 的 含 氨 的 碱 基 ， 
尿 喀 啶 能 够 与 腺 嗓 叭 形 成 碱 基 对 。 

病毒 Virus 一 种 仅 能 够 在 宿主 细胞 内 繁殖 的 非 细 胞 生物 体 。 病 毒 由 蛋白 质 包 衷 的 核 
酸 组 成 ; 一 些 动 物 病 毒 还 由 膜 所 包围 。 在 被 感染 的 细胞 中 ， 病 毒 利 用 宿主 的 合成 能 力 生产 子 
代 病 毒 。 


409 


氨 
emi, 244 
在 赖 氨 酸 生物 合成 中 ，176 一 179 
被 动 扩散 ，15 一 16 
氨基 
tE AG 确定 中 ，377 一 378 
氨基 酸 
芳香 氨基 酸 生物 合成 
独立 途径 ，326 一 328 
模型 ，322 一 326 
生物 合成 ，33 一 35 
分 解 代谢 ，32 一 33 
在 AG Re, 377~378 
从 代谢 途径 操作 
AAR, 123 
对 于 氨基 酸 生 产 ，121 一 122 
异 亮 氨 酸 ，125 一 126 
HAM, 123~125 
AB, 122~123 
He AMAR, 242 
理论 得 率 ，245 一 250 
氨基 糖 聚 合作 用 ，38 一 41 


B 


胞 内 代谢 物 
在 细胞 反应 中 ，48 
被 动 运输 
化 合 物 ，15 一 16 
自由 扩散 ，15 
aA AR 
在 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 中 ，323 
苯 - 甲 茶 - 对 -二 甲苯 混合 物 
利用 pPWW0 降解 ，154 一 155 
作为 污染 物 ，154 一 155 
同时 生物 降解 ，155 一 156 
葵 甲 酸 
对 酵母 菌 呼吸 的 影响 ，16 一 17 
葵 氧 乙酸 
410 


索 


5| 


fee, 16~17 
标记 ， 见 同位 素 标记 分 析 
标准 态 
习惯 ，369 
标准 自由 能 
葡萄 糖 氧 化 ，389 一 390 
在 EMP 途径 中 的 己 糖 激酶 反应 ，385 
术语 ，369 
氧化 磷酸 化 ，389 一 390 
反应 ，369 一 370 
表 观 方程 
非 平衡 热力 学 ，385 一 386 
别 构 酶 
Hil 方 程 的 应 用 ，97 一 98 
协同 结合 ，96 一 97 
协同 性 ，95 一 96 
非 协同 位 点 ，96 
AAR 
代谢 途径 合成 算法 ，175 一 176 
运动 发 酵 单 胞 菌 〈Zymomzoxzas mobilis ) 中 的 合 
成 ，123 
1,3- 丙 二 醇 合成 ，127 一 128 
两 二 酸 对 质子 动力 的 影响 ，297 
两 三 酸 作为 竞争 性 抑制 剂 ，91 
丙酮 
工业 发 醇 ，126 一 127 
丙酮 酸 
羧 化 作用 
在 PPC 补偿 中 的 作用 ，258 一 259 
完全 氧化 ，28 一 29 
转化 为 乳酸 ，26 一 27 
在 ED 途径 中 ，24 
在 EMP 途径 中 ，22 
TCA 循环 同位 素 标 记 代 谢 物 中 标记 的 丙酮 酸 的 
分 布 ，216 一 221 
PYR-PEP 分 支点 处 的 通 量 扰 动 ，255 一 257 
在 乙酸 积累 中 的 作用 ，149 一 151 
在 哺乳 动物 中 的 应 用 ，227 一 230 
丙酮 酸 脱 氧 酶 复合 物 
在 丙酮 酸 氧化 中 的 作用 ，28 一 29 
丙酮 酸 脱羧 酶 


用 于 乙醇 的 生产 ，118 一 119 KA F 


柄 状 毕 赤 酵 母 (Pichia stipitis), 118 和 组 装 反 应 ，12 
哺乳 动物 丙酮 酸 利用 ，227 一 230 聚合 ，38 一 41 
不 定 系统 转换 ，42 
线性 规划 ，201 大 偏差 理论 
不 可 逆 抑 制 基础 ，300 一 301 
生物 合成 网 络 控制 ，94 一 95 在 FCC 确定 中 ，302 
SF, 93 营养 物 浓 度 在 通 量变 化 中 的 作用 ，307 
C 代谢 
乙酰 -辅酶 A 
草 栈 乙酸 标记 分 布 ，212 一 214 
在 赖 氨 酸 生物 合成 中 的 作用 ，179 内 源 代谢 
在 TCA 循环 中 ，28 一 32 在 细胞 反应 中 ，59 一 60 
产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum ) KBE (Escherichia coli) 化 学 计量 学 ，202 一 
生长 速率 ，60 一 61 204 
代谢 模型 ，61 异型 发 酵 
青霉素 生产 ，241 乳酸 菌 ，194 一 196 
质子 梯度 ，16 一 17 氮 源 改变 ，148 
P= LWBIR (Cephalosporium acremonium ) 过 量 代谢 防止 ，149 一 151 
抗生素 生产 ，135 一 136 在 反应 途径 分 析 中 ，2 
超 定 系 统 代谢 产物 
分 析 ，75 在 黑箱 模型 中 ，68 一 69 
代谢 通 量 分 析 ，196 一 201 在 细胞 反应 中 ，48 一 49 
成 本 代谢 工程 
乙醇 生产 ，117 一 119 在 细胞 代谢 分 析 中 ，6 
促进 扩散 在 途径 分 析 中 ，5 一 6 
aR | 
饱和 动力 学 ，18 一 19 在 通 量 控制 分 析 中 ，4 一 5 
D 用 于 乙醇 生产 的 戊 糖 代 谢 ，128 
源 于 石油 的 热塑性 塑料 生产 ，6 一 7 
KH (Escherichia coli ) 在 途径 表征 中 的 反 向 代谢 工程 ，1 
乙酸 盐 的 利用 ，230 一 232 作用 
酶 活性 的 调节 ，86 一 87 在 生物 催化 剂 生产 中 ，7 
在 乙醇 生产 中 ，120 一 121 区 
发 酵 途 径 ，26 一 27 在 手 性 药物 生产 中 ，7 
4, 242 通 量 和 途径 ，3 一 4 
靛蓝 的 生产 ，145 一 146 在 体内 组 织 和 器 官 代 谢 中 ，7 一 8 
代谢 的 化 学 计量 学 ，202 一 204 代谢 控制 分 析 
BARA 在 通 量 控制 分 析 中 ，3 一 5 
速率 ，50 一 52 热 动力 学 的 应 用 ，396 一 398 
比 速率 ，54 基本 假设 ，270 一 271 
过 量 代 谢 的 防止 ，149 一 151 与 生物 反应 器 控制 同等 重要 性 ，4 
Pho 调节 子 ，106 一 107 分 支 途径 
启动 子 转录 起 始 ，98 一 99 应 用 ，291 一 295 
1,3- 丙 二 醇 的 合成 ，127 一 128 糖 原 异 生 作 用 ，295 一 297 
色 氨 酸 的 合成 ，122 一 123 糖 酵 解 ，295 一 297 


411 


BERL, 297~299 
A, 299 
EH, 274~276 
控制 系数 ，272 一 274 
7X, 316 
弹性 系数 ，274 一 276 
Delgado-Liao 方法 的 扩展 ，398 
组 控制 同等 重要 性 ，4 
中 间 代 谢 物 反 应 组 
BATA A PH BBA, 352~354 
扰动 常数 ，352 
线性 途径 ，286 一 291 
青霉素 的 生物 合成 ，398 一 400 
生物 化 学 的 作用 ，4 一 5 
遗传 学 的 作用 ，4 一 5 
加 和 定理 ，272 一 274 
理论 一 般 化 ，276 一 277 
代谢 模型 
方程 ，49 一 50 
产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum), 61 
代谢 通 量 
在 大 肠 杆 菌 〈Escherichia coli) 中 的 乙酸 利用 ， 
230 吉 232 
在 赖 氨 酸 生物 合成 中 的 旁 路 途径 ，209 一 212 
一 致 性 检验 ，359 一 360 
应 用 于 预 葵 酸 分 支点 ，363 一 364 
发 展 ，360 一 363 
控制 系数 
确定 ，277 一 279 
非 线 性 函数 推导 ，278 
EL, 2 
误差 测量 影响 ，364 一 365 
实验 证 实 ，359 一 360 
由 代谢 通 量 求 组 控制 系数 ，341 
代谢 通 量 与 同位 素 稳 态 实验 ，209 
优化 
算法 ，355S 三 357 
应 用 于 酿酒 酵母 (Saccharomzyces cerevisiae ) ， 
357~—359 
磷酸 果糖 激酶 扩 增 ，355 
哺乳 动物 中 丙酮 酸 利用 ，227 一 230 
与 物质 结构 特性 的 关系 ，8 
作用 
在 细胞 生理 学 中 ，2 一 3 
在 代谢 工程 中 ，3 一 4 
营养 物 浓 度 ，307 
412 


来 自 瞬 时 强度 测量 ，208 一 209 


代谢 通 量 分 析 


替代 生物 化 学 途径 ，182 一 183 

对 于 细胞 培养 基 设 计 的 应 用 ，268 

分 支点 的 控制 ，182 

柠檬 酸 发 酵 ，188 一 192 

谷 氨 酸 棒 杆 菌 (Corynebacterium glutamicum ) 


的 缺失 突变 ，257 一 258 


转氨酶 发 现 ，259 一 261 

二 3 
途径 代谢 物 的 稀释 影响 ，184 一 185 
KG (Escherichia coli) 代谢 ，202 一 204 
胞 外 通 量 ，182 一 183 
乳酸 菌 的 异型 发 酵 代 谢 ，194 一 196 
线性 相关 反应 化 学 计量 式 ，192 一 194 
赖 氨 酸 生物 合成 ，186 一 188 

描述 ，250 一 251 

在 Glc6P 分 支点 的 扰动 ，252 一 255 
在 PEP- 丙 酮 酸 分 支点 的 扰动 ，255 一 257 
主 节点 识别 ，251 一 2S2 
哺乳 动物 细胞 培养 

描述 ，261 

胞 内 通 量 ，261 一 265 

同位 素 标 记 研 究 ，265 一 268 
最 大 理论 得 率 ，183 
FA NMR, 8 
He AR, 196~201 
敏感 性 分 析 ，204 一 205 
理论 ，184 
不 定 系统 ，201 一 202 


代谢 通 量 控制 


经 由 代谢 工程 的 分 析 ，3 一 5 
过 量 呼吸 ，298 一 299 

在 单一 分 支点 ，313 一 316 
途径 的 结构 ，6 


代谢 图 定义 ，5 
代谢 途径 合成 


算法 ，167 一 173 
丙 氨 酸 合成 ，175 一 176 
分 析 ，180 一 181 
赖 氨 酸 生物 合成 ，176 一 179 
替代 物 ，179 
最 大 得 率 限 制 ，179 一 180 
草 酰 乙酸 的 作用 ，179 
概述 ，173 
丝氨酸 合成 ，174 一 175 


定义 ，166 一 167 靛蓝 的 生产 ，145 一 146 


代谢 网 络 通过 和 抢 阵 代数 确定 核心 矩阵 ，320 一 321 
代谢 网 络 分 析 与 代谢 工程 ，5 一 6 操作 
抗生素 生产 ，135 一 136 对 于 氨基 酸 的 生产 
芳香 族 氨基 酸 生物 合成 ，323 一 329 AAR, 123 


生物 聚合 物 生 产 ，140 一 141 商业 用 途 ，121 一 122 


生物 素 生 产 ，139 异 亮 氨 酸 ，125 一 126 
分 支 的 苏 氨 酸 ，123 一 125 
分 支点 ，304 一 305 ARM, 122~123 
CCC 和 浓度 变化 ，307 在 微生物 中 ，1 
通 量变 化 预测 305~306 对 于 溶剂 生产 
分 支点 位 置 工业 发 酵 ，126 
ATP; 329-333 1,3-A—B, 127 
分 均 酸 , 335~336 营养 物 浓 度 和 通 量变 化 ，306 一 307 


1 ,6- 二 磷酸 果糖 334~335 
6- 磷 酸 葡萄 糖 ，333 一 334 


扰动 的 可 观测 性 ，344 
植物 聚 羟基 链 烷 酸 酯 [poly (hydroxyalkanoate) J, 


3- 磷 酸 甘油 醛 ，334 一 335 143 一 144 

连接 代谢 物 和 组 通 量 ，328 一 329 聚 羟基 链 烷 酸 酯 Lpoly (hydroxyalkanoate)] 的 生 
MAR, 336~338 y=, 141~142 : 

5-BERA RARE, 335~336 调节 


复杂 代谢 网 络 的 定义 ，311 
控制 系数 ，339 一 341 
共聚 物 生 产 ，142 一 143 
乙醇 生产 
作为 生物 燃料 117 
HAE (Escherichia coli), 120~121 
通过 发 酵 代 谢 ，118 一 119 
由 pdc 和 adhAn 基因 ，120 
4EF=, 117~119 
Hy PS el A ie «1:19 


FA BR YS BEEE ( Saccharomyces cerevisiae), 118 


通 量 控制 结构 ，6 

RRB HAT, 144 

组 CCC (gCCC), 344 

组 控制 系数 ，339 一 341 
ATP 分 支点 ，346 一 347 
FDP/GAP 的 分 支点 ，348 
从 通 量 测量 ，341 
6- 磷 酸 葡萄 糖分 支点 ，347 一 348 
PPH 分 支点 ，349 一 350 
XSP+ CHR 分 支点 ，349 

组 FCC (gFCC)，317 一 322 
从 已 表征 的 扰动 ，343 一 344 
实验 确定 ，350 一 352 
从 3 个 扰动 ，341 一 343 

独立 途径 的 识别 ，317 一 322 


FRADE, 110~111 
在 真 核 细 胞 中 ，108 一 109 
途径 ，107 一 110 
在 原核 细胞 中 ，108 一 109 
在 代谢 工程 中 的 作用 ，3 一 4 
总 体 流通 代谢 物 的 作用 ，112 一 113 
SIMS 矩阵 分 析 ，318 一 319 
底 物 范围 扩展 
纤维 素 - 半 纤 维 素 的 解 聚 ，132 
用 于 乙醇 ，129 一 132 
利用 乳糖 和 乳 清 ，132 一 134 
戊 糖 用 于 乙醇 生产 ，128 
酵母 ，129 
淀粉 降解 微生物 ，134 一 135 
利用 蔗糖 ，134 
未 分 支 的 
大 偏差 理论 的 基础 ，300 一 301 
FCC 估计 ，301 一 302 
基于 大 偏差 理论 的 FCC，302 
通 量变 化 
由 酶 的 改变 ，303 
预测 ，302 一 303 
通 量 通过 ，299 
维生素 A 生产 ，140 
维生素 C 生产 ，139 
黄 原 胶 生 产 ，144 一 145 


413 


异 生物 的 降解 ，152 一 153 

得 率 和 生产 能 力 ，116 

代谢 物 

在 生物 化 学 途径 中 ，173 

NMR 分 析 代谢 物 碳 原子 ，222 一 227 


在 代谢 网 络 中 总 体 流 通 代谢 物 的 作用 ，111 一 113 


中 间 连 接 代谢 物 
组 FCCs (gFCCs), 354~355 
在 细胞 反应 中 的 胞 内 代谢 物 ，48 
同位 素 标记 物 
完全 列举 ，214 一 216 
直接 碳 原子 平衡 ，232 一 237 
TCA 循环 中 的 分 布 
从 标记 的 乙酸 ，221 一 222 
从 标记 的 丙酮 酸 ，216 一 221 
连接 
#1 CCC (gCCC), 344 
WH, 328~329 
中 间 连 接 代 谢 物 
组 FCCs 的 (gFCCs), 354~355 
途径 
代谢 物 的 稀释 影响 ，184 一 185 
前 体 物 代 谢 物 
在 生物 合成 反应 中 ，12 
在 FCC 中 测量 瞬时 代谢 物 ，284 一 286 
代谢 因子 
在 生物 合成 反应 中 ，12 
ABER CF 
在 糖 酵 解 中 ，21 
单 细 胞 蛋白 生产 ，148 
胆固醇 合成 与 消除 ，102 
蛋白 质 
聚合 作用 ，38 一 41 
A 
替代 的 氮 代 谢 ，148 
倒数 关系 
非 平衡 热力 学 ，388 
得 率 系数 ，68 一 69 
在 黑箱 模型 中 ， 
| 
细胞 反应 ，5$9 一 61 
滴定 
在 FCC 中 用 纯化 酶 滴定 ，280 一 281 


在 FCC 中 用 特异 性 抑制 剂 滴定 ，281 一 282 


底 物 
在 细胞 反应 中 ，48 


414 


在 动态 质量 平衡 中 ，56 一 57 
底 物 抑制 
竞争 性 抑制 ，90 一 91 
非 竞 争 性 抑制 ，91 一 92 
快速 平衡 ，88 一 89 
作为 简单 可 逆 抑 制 系统 ，90 
稳 态 方法 ，89 
反 竞 争 性 抑制 ，93 
电解 
在 氢 生 产 中 ，146 
电势 梯度 及 维持 ，42 
电子 传递 
从 NADH 到 氧 ，29 一 30 
淀粉 
微生物 降解 ，134 一 135 
靛蓝 生产 ，145 一 146 
丁 醇 
工业 发 酵 ，126 一 127 
动力 学 模型 
动态 质量 平衡 ，57 一 58 
弹性 系数 计算 284 
酶 ，87 一 88 
用 于 FCC，286 


酿酒 酵母 ( Saccharomyces cerevisiae), 350 ~ 


352 


促进 扩散 的 饱和 动力 学 模型 ，18 一 19 


动态 质量 平衡 
在 细胞 反应 中 ，54 一 55 
推导 ，55 一 59 
菌 体 组 成 ，57 
底 物 ，56 一 57 
对 -二 甲苯 - 葵 - 甲 茶 混 合 物 
利用 pWW0 降解 ，154 一 155 
作为 污染 物 ，154 一 155 
同时 生物 降解 ，155 一 156 
多 氯 化 联 茶 
代谢 工程 ，152 一 154 
多 糖 
在 芳香 族 氮 基 酸 生物 合成 中 ，323 


E 


EBA «(Pseudomonas putida ) 
pWWO 用 于 污染 物 的 降解 ，154 一 155 
1,3- 二 磷酸 甘油 酸 
在 EMP 途径 中 ，22 
1,6- 二 磷酸 果糖 


在 芳香 氨基 酸 生物 合成 中 ，323 

在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，334 一 235，348 
二 氧化 碳 

被 动 扩散 ，15 一 16 

在 PP 途径 中 ，22 一 24 

二 异 两 基础 酸 氟 化 物 

作为 不 可 逆 抑 制剂 ，93 


F 


发 酵 
乙醇 ，27 一 28 
柠檬 酸 发 酵 的 代谢 通 量 分析 ，188 一 192 
在 氢 的 生产 中 ，146 
工业 溶剂 ，126 一 127 
TEX (Escherichia coli) 中 混合 酸 发 酵 ， 
速率 ，5$0 一 52 
比 速率 ，54 
RH, HED, 118 
丙酮 酸 转化 为 乳酸 ，26 一 27 
翻译 
酶 控制 ，101 一 102 
反 竞 争 性 抑制 特性 ，93 
反馈 
在 天 冬 氨 酸 途 径 中 的 控制 ，94 一 95 
抑制 和 激活 模式 ，87 
反应 
通过 代谢 和 细胞 生理 学 分 析 ，2 
在 细胞 代谢 中 的 组 装 反应 ，12 
在 细胞 代谢 中 的 生物 合成 反应 ，12 一 13 
细胞 的 反应 ， 见 细胞 途径 
化 学 反应 
乙醇 脱 氨 酶 催化 的 化 学 反应 的 AG®’, 383 ~ 
384 
吉 布 斯 自由 能 的 算法 ，372 一 374 
在 吉 布 斯 自由 能 确定 中 的 基 团 贡献 ，377 一 381 
热力 学 可 行 性 ，371 一 372 
整体 流通 代谢 物 在 耦合 反应 中 的 作用 ，111 一 113 
供 能 反应 
在 细胞 代谢 中 ，12 
目的 ，21 
糖 酵 解 反应 的 自由 能 ，370 一 371 
组 FCC (gFCC)，316 一 317 
分 组 ，316 
独立 途径 识别 ，317 一 322 
Michaelis-Menten 反应 饱和 动力 学 ，18 一 19 
在 细胞 代谢 中 的 聚合 反应 ，12 


SIMS 矩阵 分 析 ，317 一 319 

标准 自由 能 ，369 一 370 
反应 速率 

在 黑箱 模型 中 ，68 一 69 
在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 中 的 混合 酸 发 酵 
的 比 速率 ，54 
反应 组 中 间 代 谢 物 的 控制 分 析 

在 多 分 支点 中 的 重 亚 组 ，352 一 354 
扰动 常数 ，352 
方差 - 协 方差 矩阵 计算 误差 ，81 
方程 

Hill 方程 应 用 于 别 构 酶 ，97 一 98 
细胞 反应 的 线性 速率 方程 ，59 一 61 
非 平衡 热力 学 的 表 观 方程 ，385 一 386 
BA 

作为 聚 酮 化 合 物 来 源 ，136 一 137 
放 线 菌 紫 素 

生产 ，135 一 136 
非 竞争 性 抑制 特性 ，91 一 92 
非 平衡 热力 学 

细胞 生长 ，393 一 394 

细胞 系统 ，384 

定义 ，384 

耗 散 函数 ，385 

效率 ，389 

能 量 转 导 ，384 

流 - 力 关系 ，387 一 388 

力 比 ，387 一 389 

目标 ，396 

EMP 途径 中 己 糖 激酶 反应 ，385 
独立 反应 ，365 一 366 

水 平流 ，387 一 389 

线性 力 关 系 ，394 一 396 

Onsager 的 倒数 关系 ，386 

操作 计量 系数 ，387 一 389 

氧化 磷酸 化 ，389 一 393 

表 观 方程 ，385 一 386 

表 观 计量 系数 ，387 一 389 

质子 动力 ，390 

倒数 关系 〈 可 逆 性 ， 相 关 性 )，387 一 389 
静 头 ，388 一 389 
非 线 性 函数 推导 ，278 
分 解 代 谢 

脂肪 酸 、 有 机 酸 和 氮 基 酸 ，32 一 33 
分 支点 

在 ATP 处 组 控制 系数 ，346 一 347 


415 


FERN 2 PAPE, 110~111 
在 细胞 途径 中 的 控制 ，182 
#£ FDP/GAP 处 的 组 控制 系数 ，348 一 349 
在 Glc6P 处 的 代谢 通 量 扰动 ，252 一 255 
在 GOP 处 的 组 控制 系数 ，347 一 348 
代谢 控制 分 析 
应 用 ，291 一 295 
糖 原 异 生 作 用 ，295 一 297 
糖 酵 解 ，295 一 297 
氧化 磷酸 化 ，297 一 299 
在 代谢 网 络 中 ，304 一 305 
ATP, 329~333 
Ay RIB, 335~336 
1,6- 二 磷酸 果糖 ，334 
6- 磷 酸 葡 萄 糖 ，333 一 334 
3- 磷 酸 甘油 醛 ，334 一 335 
连接 代谢 物 和 组 通 量 ，328 一 329 
预 葵 酸 ，336 一 338 
5- 磷 酸 木 酮 糖 ，335 一 336 
多 个 、 重 有 到 着 的 反应 组 ，352 一 354 
PEP- 丙 酮 酸 处 的 通 量 扰动 ，255 一 257 
PPH 处 的 组 控制 系数 ，349 一 350 
预 葵 酸 处 组 FCC (gFCC) 一 致 性 检验 的 应 用 ， 
363 一 364 
单一 分 支点 处 的 通 量 分 布 的 控制 ，313 一 316 
X5P + CHR 处 的 组 控制 系数 ，349 
分 支 酸 
在 芳香 族 氨基 酸 生 物 合成 中 ，323 
在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，335 一 336，350 
辅酶 
在 生物 合成 反应 中 ，12 一 13 


G 


甘油 

在 芳香 族 氢 基 酸 生物 合成 中 ，323 

肝脏 细胞 

老鼠 肝脏 细胞 中 糖 原 异 生 作用 和 糖 酵 解 ，295 一 
297 


供 能 反应 
在 细胞 代谢 中 ，12 
目的 ，21 
共聚 物 生 产 ，142 一 143 
AR 


生成 的 吉 布 斯 自由 能 ，381 一 382 
ARE A (Corynebacterium glutamicum ) 
在 氨基 酸 生 产 中 ，121 一 122 


410 


缺失 突变 菌 的 代谢 通 量 分 析 ，257 一 258 
转氨酶 的 发 现 ，259 一 261 
异 亮 氨 酸 合成 ，125 一 126 
赖 氨 酸 生物 合成 合成 代谢 通 量 分 析 ， 
描述 ，250 一 251 
在 Glc6P 分 支点 处 的 扰动 ，252 一 255 
在 PEP- 丙 酮 酸 分 支点 处 的 扰动 ，255 一 257 
£7 ARS, 251~252 
赖 氨 酸 生产 ，24 
丙酮 酸 羧 化 ， 由 PPC 补偿 ，258 一 259 
苏 氨 酸 合 成 ，123 一 125 
谷 氨 酸 脱 氢 酶 
产生 ，148 
谷 氨 酸 细菌 
氨基 酸 生 产 ，242，245 一 250 
生物 化 学 和 调节 ，242 一 245 
GEER 
用 于 弹性 系数 的 确定 ，298 
HERE (Pachysolen tannophilus), 118 
FRR BEAT, 144 


果糖 磷酸 化 ，21 一 22 
H 

耗 散 函数 

在 非 平 衔 热 力学 中 ，384 一 385 
核磁 共振 分 析 

代谢 数据 ，222 一 227 

核 苷 酸 生 物 合成 ，36 
核心 矩阵 


通过 和 矩阵 代数 确定 ，320 一 321 
黑 曲 霉 (Aspergillus niger ) 
在 抗生素 生产 中 ，135 一 136 
黑箱 模型 
细胞 生物 质 ，67 一 68 
简单 的 
碳 平衡 ，70 
描述 ，68 
元 素平 衡 ，70 一 71 
一 般 化 还 原 度 平 衡 ，71 一 72 
代谢 的 ，49 一 50，61 
变量 ，68 一 69 
红 霉 素 
由 红色 糖 多 孢 菌 〈Sacchnarozpolyzpora erythrea ) 
生产 ，137 一 139 
红色 糖 多 孢 菌 〈Saccharopolyszpora erythrea ) 


《 
. 


ABR AT, 137~139 
呼吸 
过 量 呼吸 通 量 控制 ，298 
安息 香 酸 对 酵母 呼吸 的 影响 ，16 一 17 
胡 葛 卜 软 腐 欧文 氏 菌 〈Erwzmia carotovora ) 
用 于 纤维 素 - 半 纤维 素 的 解 聚 ，132 
化 石 燃料 
乙醇 作为 生物 燃料 取代 ，117 
化 学 反应 
乙醇 脱 氢 酶 催化 的 反应 AG®”,, 383 ~384 
吉 布 斯 自由 能 算法 ，372 一 374 
在 吉 布 斯 自由 能 确定 中 的 基 团 贡献 ，377 一 381 
热力 学 可 行 性 ，371 一 372 
化 学 工程 
在 代谢 工程 中 的 作用 ，5 一 6 
化 学 计量 学 
细胞 反应 
菌 体 组 分 ，48 
胞 内 代谢 物 ，48 
代谢 产物 ，48 
底 物 ，48 
TEX GE (Escherichia coli) 代谢 中 ，202 一 
204 
在 非 平 衡 热 力学 中 操作 的 化 学 计量 学 ，386 一 389 
在 非 平 衔 热 力学 中 表 观 的 化 学 计量 学 ，386 
代谢 通 量 分 析 中 线性 相关 反应 的 化 学 计量 学 ， 
192 一 194 


黄 原 胶 生产 ，144 
回 补 途径 
TCA 循 环 ，30 一 31 
RAR 
EXER (Escherichia coli) PRE 
速率 ; 50 一 52 
比 速率 ，54 
混合 物 
葵 - 甲 茶 - 对 二 甲 葵 


利用 pWWO 降解 ，154 一 155 

作为 污染 物 ，154 一 155 

同时 生物 降解 ，155 一 156 
酵母 生长 中 的 葡萄 糖 -乙醇 混合 物 ，242 


J 
基 团 贡献 方法 
在 吉 布 斯 自由 能 确定 中 ，377 一 381 
基 团 转 位 


在 主动 运输 中 ，19 一 20 


基因 
酶 的 改变 ，279 一 280 
血红 蛋白 基因 的 克隆 ，149 
在 乙醇 生产 中 的 PDC 和 ADH 基因 ，120 
对 于 乙醇 生产 的 成 糖 代谢 ，128 
稳定 性 维持 ，152 
基因 工程 
在 代谢 途径 操作 中 ，1 
基因 调节 网 络 
胆固醇 的 合成 和 排除 ，101 一 102 
激烈 火球 菌 (Pyrococcus furisous ) 
在 氨 生 产 中 ，146 一 147 
吉 布 斯 自由 能 
乙醇 脱 氢 酶 催化 的 反应 ，383 一 384 
ATP 生成 ，382 一 383 
确定 ，366 一 368 
谷 氮 酸 的 生成 ，381 一 382 
由 基 团 贡献 ，377 一 381 
在 生长 能 学 中 ，41 
反应 的 吉 布 斯 自由 能 的 算法 ，372 一 374 
与 热力 学 可 行 性 的 关系 ，371 一 372 
在 底 物 中 ，73 
己 糖 激酶 
在 EMP 途径 中 的 反应 ，385 
计算 机 程序 
MATLAB、MATHCAD 和 MATHEMATICA， 
78 
加 和 定理 
在 代谢 控制 分 析 中 ，272 一 274 
假 丝 酵 母 (Candida shehatae) 用 于 戊 糖 发 酵 ，118 
简单 黑箱 模型 
碳 平衡 ，70 
描述 ，68 
TER ¥  , 70~71 
一 般 化 还 原 度 平 衡 ，71 一 72 
代谢 
方程 ，49 一 50 
产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum), 61 
降解 
生物 降解 BTX 混和 物 ，154 
异 生 素 降解 , 152 
酵母 
培养 
没有 乙醇 形成 的 好 氧 培养 ，78 一 80，81 一 82 
厌 氧 培养 的 数据 一 致 性 ，73 
在 测量 中 的 误差 诊断 ，82 一 83 
417 


用 于 乙醇 生产 ，129 


热量 产生 ，73 一 74 
木 糖 醇 生 产 ，147 
解 聚 


纤维 素 - 半 纤 维 素 ，132 
RAG IR LL BEBE (Candida lipolytic) 柠檬 酸 发 酵 的 
代谢 通 量 分 析 ，188 一 192 
竞争 性 抑制 特性 ，90 一 91 
静 头 
在 非 平 衡 热力 学 中 ，388 一 389 
酒精 
发 酵 途径 ，26 一 28 
被 动 扩 散 ，15 一 17 
酒精 脱 氢 酶 
催化 反应 的 AG" ，383 一 384 
菊 欧 文 氏 菌 (Erwinia chrysanthemi ) 
用 于 纤维 素 - 半 纤维 素 的 解 聚 ，132 
和 矩阵 
在 同位 素 分 布 模型 中 的 原子 作 图 矩阵 ，237 一 240 
在 超 定 系统 中 缩减 的 宛 余 矩阵 196 
SIMS 
对 芳香 族 氢 基 酸 的 生物 合成 ，326 一 328 
对 独立 途径 识别 ，318 一 319 
在 核心 矩阵 确定 中 ，320 一 321 
方差 - 协 方差 矩阵 计算 误差 ，70 一 71 
和 矩阵 代数 
在 核心 矩阵 确定 中 ，320 一 321 
矩阵 运算 
基本 矩阵 运算 ，76 一 77 
i ER, 77~78 
和 矩阵 转 置 ，77 
方差 - 协 方差 矩阵 计算 误差 ，70 一 71 
聚合 作用 
在 细胞 代谢 中 ，12 
纤维 素 - 半 纤 维 素 的 解 聚 ，132 
大 分 子 ，38 一 41 
聚 (3-2 TR) MH (3- 羟 基 戊 酸 ) 生产 ，142 一 
144 
聚 〈3- 羟 基 丁 酸 ) 生产 ，142 一 144 
聚 羟 基 链 烷 酸 酯 [poly (hydroxyalkanoate) ] 
植物 中 生产 ，143 一 144 
生产 ，141 一 142 
聚 酮 化 合 物 
来 源 ，136 
系统 形成 ，138 一 139 
418 


K 


抗生素 
通过 代谢 途径 生产 ，135 一 136 
控制 同等 重要 性 ， 在 代谢 控制 分 析 中 
生物 反应 器 控制 同等 重要 性 ，4 
组 控制 同等 重要 性 ，4 
控制 系数 
组 ， 见 组 控制 系数 
在 代谢 网 络 中 ，339 一 341 
用 于 酿酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 通 量 
i46; 357~359 
枯草 芽孢 杆菌 (B. subtilis ) 
乙酰 乳酸 合成 酶 ，150 一 151 
扩散 
促进 扩散 
ao, 17 
饱和 动力 学 ，18 一 19 
自由 扩散 
在 被 动 运输 中 ，15 


fi AR 
生物 合成 
替代 物 ，179 一 180 
旁 路 途径 通 量 ，209 一 212 
由 葡萄 糖 和 氮 ，176 一 179 
#4 FCC (gFCC), 343 
最 大 得 率 限制 ，179 一 180 
代谢 通 量 ，186 一 188 
代谢 通 量 分 析 
描述 ，250 一 251 
在 Glc6P 分 支点 处 的 扰动 ，252 一 255 
在 PEP- 丙 酮 酸 分 支点 的 扰动 ，255 一 257 
ER ARWH, 251~252 
草 酰 乙酸 的 作用 ，179 
生成 途径 ，244 
MAR 
在 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 中 ，323 一 325 
Att 
在 非 平衡 热力 学 中 ，387 
连接 代谢 物 
#8 CCC (gFCC), 344 
识别 ，328 一 329 
中 间 代 谢 物 连接 的 组 FCCs (gFCCs), 354~355 
连接 定理 


在 代谢 控制 分 析 中 ，274 一 276 
链 霉 菌 属 Streptomyces coelicitor 
在 抗生素 生产 中 ，136 一 137 
链 霉菌 属 Streptomyces erythreus 
在 抗生素 生产 中 ，136 一 137 
链 霉 素 生 产 ，136 一 137 
量 热 计 
用 于 测量 热 ，74 
列举 
完全 的 同位 素 标记 代谢 物 ，215 一 217 
4-B BR as BEE 
在 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 中 ，323 一 324 
3- 磷 酸 甘 油 醛 
在 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 中 ，323 一 324 
在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，324 一 325，348 一 
349 
在 ED 途径 中 ，23 一 24 
在 EMP 途径 中 ，22 
3- 磷 酸 甘油 醛 脱 氢 酶 
弹性 系数 ，296 
Be RH Th RAE fir BS 
弹性 系数 ，296 
3- 磷 酸 甘油 酸 激酶 
弹性 系数 ，296 
6- 磷 酸 果 糖 
在 EMP 途径 中 ，22 
在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
磷酸 果糖 激酶 
通 量 扩 增 ，355 
5- 磷 酸 核 酮 糖 
在 PP 途径 中 ，21 一 24 
在 芳香 氨基 酸 生物 合成 中 ，323 
在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，335 一 336，349 
磷酸 化 〈 作 用 ) 
氧化 磷酸 化 
在 线粒体 中 的 控制 ，297 一 299 
非 平 衡 热 力学 ，389 一 393 
和 TCA 循环 ，28 一 30 
在 信号 转 导 中 ，105 一 107 
磷酸 己 糖 异 构 酶 
在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
6- 磷 酸 葡 糖 酸 
在 ED 途径 中 ，24 
在 PP 途径 中 ，23 一 24 
6- 磷 酸 葡 糖 酸 脱水 酶 
在 ED 途径 中 ，24 


1- 磷 酸 葡萄 糖 

在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
6- 磷 酸 葡萄 粮 

在 芳香 族 氨基 酸 生 物 合成 中 ，323 

分 支点 的 代谢 通 量 扰动 ，252 一 255 

在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，333 一 334，347 一 
348 


在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
在 PP 途径 中 ，22 一 24 
磷酸 戊 糖 途 径 

回 补 功能 ，23 


在 Aspergillus nidulans (SHH) 中 ，24 
控制 点 ，24 一 25 

在 糖 酵 解 中 ，21 

氧化 功能 ，23 

反应 ，22 一 23 
磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 

在 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 中 ，323 

在 基 团 转 位 中 ，19 一 20 

在 PEP- 丙 酮 酸 分 支点 的 通 量 扰动 ，255 一 257 
磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 羧 化 酶 
作为 回 补 反应 ，244 

补偿 ，258 一 259 
磷酸 转移 酶 

葡萄 糖 吸收 ，48 一 49 

在 基 团 转 位 中 ，19 一 20 
流 - 力 关系 

在 非 平衡 热力 学 中 ，387 一 388 
绿 藻 (Chlamaydomonas reinhardtii ) 

在 氢 生 产 中 ，147 


M 


脉 孢 菌 (Neurospora crassa ) 
在 抗生素 生产 中 ，136 
梅 德 霉 素 生产 ，136 
酶 
TEX (Escherichia coli) 中 的 活性 与 调节 ， 
86 一 87 


别 构 酶 

Hill 方程 的 应 用 ，97 一 98 
协同 结合 96 一 97 
协同 性 ，95 一 96 

非 协 同性 位 点 ，96 
变化 


在 通 量变 化 确定 中 ，303 
生物 合成 网 络 的 控制 ，94 一 95 


419 


遗传 改变 ，279 一 282 
在 氨 生 产 中 ，146 
动力 学 ，87 一 88 
纯化 酶 在 FCC 滴定 中 ，280 一 281 
转录 控制 ，98 一 101 
翻译 控制 ，101 一 102 
ae 
在 主动 运输 中 ，19 一 20 
ae II 
在 主动 运输 中 ，19 一 20 
敏感 性 分 析 和 代谢 通 量 分析 ，204 一 205 
模型 
芳香 族 氨基 酸 生 物 合成 ，322 一 326 
黑箱 
细胞 菌 体 ，67 一 68 
变量 ，68 一 69 
复杂 系统 
利用 生化 系统 理论 ，270 一 271 
同位 素 分 布 
利用 原子 作 图 矩阵 ，237 一 240 
动力 学 
动态 质量 平衡 ，57 一 58 
弹性 系数 计算 ，284 
酶 ，87 一 88 
用 于 FCC，286 
酿酒 酵母 ( Saccharomyces cerevisiae), 350 一 
352 
促进 扩散 的 饱和 动力 学 ，18 一 19 
非 平衡 热力 学 黑箱 模型 ，394 
简单 黑箱 模型 
碳 平衡 ，70 
描述 ，68 
元 素平 街 ，70 一 71 
一 般 化 还 原 度 平衡 ，71 一 72 
木 糖 
用 于 乙醇 生产 ”129 一 131 
木 糖 醇 生 产 ，147 
木质 纤维 素 
在 乙醇 生产 中 ，117 


能 

自由 能 ， 见 自由 能 
产生 与 解 爆 ，16 一 17 
能 量 转 导 的 定义 ，384 
能 学 


420 


酿酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae), 64~66 
酿酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae ) 
RAK, 241~242 
芳香 族 氨基 酸 生物 合成 模型 ，322 一 326 
培养 中 测量 的 误差 诊断 ，82 一 83 
数据 一 致 性 ，73 
能 学 ，64 一 66 
乙醇 生产 ，118 一 119 
通 量 优化 ，357 一 359 
葡萄 糖 
转化 为 乙醇 ，27 一 28 
促进 扩散 ，17 
在 葡萄 糖 -乙醇 混合 物 中 生长 ，241 一 243 
热量 产生 元 373 之 74 
动力 学 模型 ，350 一 352 
预 葵 酸 分 支点 
组 FCC (gFCC) 一 致 性 检验 的 应 用 ，363 一 
364 
安息 香 酸 对 呼吸 的 影响 16 ~ 17 
简单 黑箱 模型 ，68 
淀粉 降解 ，134 一 135 
糖 的 磷酸 化 〈 作 用 )，21 一 22 
柠檬 酸 
fe TCA 循环 中 ，28 一 29 
柠檬 酸 发 酵 的 代谢 通 量 分 析 ，188 一 192 
柠檬 酸 合成 酶 
在 TCA 循环 中 ，28 一 29 
浓度 
用 CCC 预测 变化 ，306 
营养 在 通 量 改变 中 的 作用 ，306 一 307 
浓度 控制 系数 
组 浓度 控制 系数 
确定 ，344 
由 通 量 测定 ，341 
在 代谢 网 络 中 ，339 一 341 
在 浓度 变化 的 预测 中 ，306 
浓度 梯度 维持 ，42 


培养 基 

通 量 分 析 在 细胞 培养 设计 中 的 应 用 ，268 
偏差 理论 (大 偏差 理论 ) 

基础 ，300 一 301 

在 FCC 测定 中 ，302 

营养 物 浓 度 在 通 量 改变 中 的 作用 ，306 一 307 
平衡 


在 底 物 抑制 中 的 快速 平衡 ，88 一 89 
葡萄 糖 

转化 为 乙醇 ，26 一 28 

酵母 生长 中 的 葡萄 糖 -乙醇 混合 物 ，241 一 242 

促进 扩散 ，17 

在 赖 氨 酸 生物 合成 中 ，176 一 179 

氧化 标准 自由 能 ，393 

磷酸 化 ，21 一 22 

运输 ，244 

通过 磷酸 转移 酶 系统 来 吸收 ，48 一 49 
葡萄 糖 磷酸 变 位 酶 

在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
葡萄 糖 脱 氢 酶 

在 氢 生 成 中 ，146 一 147 


Q 
启动 子 
细菌 转录 起 始 ，98 一 99 
器 官 
代谢 工程 在 整个 器 官 的 体内 代谢 中 的 作用 ，7 一 8 
ARB (Streptomyces lividans ) 
在 抗生素 生产 中 ，136 
强度 
在 代谢 通 量 确定 中 的 瞬时 强度 ，208 一 209 
3- 羟 基 丁 酸 
在 共聚 物 生产 中 ，142 一 143 
3- 羟 基 戊 酸 
FELLER DET, 142~143 
青霉素 
生物 合成 
运用 热 动 力学 的 代谢 控制 分 析 的 应 用 ，398 一 
400 
代谢 控制 分 析 ，288 一 291 
生产 ,，135S$ 一 136，241 


Et 
产生 ，146 一 147 
氢化 酶 
在 氢 生 成 中 ，146 一 147 
R 
扰动 


来 自己 表征 扰动 的 组 FCC (gFCC), 343~344 
用 于 组 FCC (gFCC), 344, 354~355 

在 一 致 性 检验 开发 中 的 多 个 扰动 ，360 一 363 
在 组 FCC (gFCC) 测定 中 的 3 个 扰动 ，341 一 
343 


扰动 常数 

在 中 间 代 谢 物 反应 组 的 代谢 控制 分 析 中 ，352 
热 
平衡 ，73 

在 厌 氧 和 好 氧 生长 时 的 热量 产生 ，73 一 74 
热 动力 学 

对 代谢 控制 分 析 的 应 用 ，396 一 398 
Delagdo-Liao 方法 的 扩展 ，398 

在 青霉素 生物 合成 的 代谢 控制 分 析 中 ，398 一 400 
热力 学 

第 一 定律 366 

非 平衡 ， 见 非 平衡 热力 学 

第 二 定律 366 

热力 学 第 二 定律 定义 ，366 

热力 学 第 一 定律 定义 ，336 


”热力 学 可 行 性 ， 


算法 ，372 一 374 

化 学 反应 ，371 一 372 

EMP 途径 ，374 一 377 

来 自 基 团 贡 献 的 吉 布 斯 自由 能 ，377 一 381 
运输 过 程 ，371 一 372 
热塑性 塑料 

源 于 石油 的 热塑性 塑料 的 代谢 工程 ，6 一 7 
溶剂 

工业 发 酵 ，126 一 127 
TEAR FE 

FE AB FE AR GE P Sa at A TCA I, 197~ 198 
乳 清 

利用 ，132 一 134 
乳酸 

细菌 异型 发 酵 代谢 的 代谢 通 量 分析 ，194 一 196 
由 丙酮 酸 ，26 一 27 
乳酸 脱 氢 酶 ， 丙 酮 酸 转化 到 乳酸 ，26 一 27 
乳糖 ， 利 用 ，132 一 134 


fi AR 
酿酒 酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) 中 通 量 的 
释放 ，357 一 359 
KG tf (Escherichia coli) 中 的 合成 ，121 一 
122 
色素 
生物 色素 的 生产 ，145 一 146 
生化 系统 理论 ， 模 拟 复杂 系统 ，271 
生物 催化 剂 生 产 ，6 一 7 
生物 反应 器 


421 


分 批 式 ，55 
连续 式 ，55 
BA, 54~55 
流 加 式 ，55 
生物 反应 器 控制 当量 
在 代谢 控制 分 析 中 ，4 
生物 合成 反应 
氨基 酸 ，33 一 35 
芳香 氨基 酸 
独立 途径 ，327 一 328 
模型 ，322 一 326 
在 细胞 代谢 中 ，12，33 
通过 酶 活性 控制 ，94 一 95 
脱氧 核糖 核 苷 酸 ，36 
脂肪 酸 ，36 一 37 
脂 类 ，36 一 37 
MAR 
(KM, 179 
旁 路 途径 通 量 ，209 一 212 
来 源 于 葡萄 糖 和 氨 ，176 一 179 
组 FCC (gFCC), 343 
最 大 得 率 限 制 ，179 一 180 
代谢 通 量 ，186 一 188 
代谢 通 量 分 析 
描述 ，250 
在 Glc6P 分 支点 处 的 扰动 ，252 一 255 
在 PEP- 丙 酮 酸 分 支点 处 的 扰动 ，255 一 257 
主 节点 的 识别 ，251 一 252 
草 酰 乙酸 的 作用 ，179 
BHR, 36 
青霉素 
运用 热 动 力学 的 代谢 控制 分 析 的 应 用 ，398 一 
400 
代谢 控制 分 析 ，289 一 292 
贮藏 糖 类 ，37 
生物 化 学 
谷 氨 酸 菌 ，242 一 245 
在 代谢 控制 分 析 中 作用 ，4 一 5 
生物 化 学 途径 
识别 ，182 一 183 
代谢 物 参与 ，173 一 174 


生物 降解 

BTX 混合 物 ，154 一 155 
生物 聚合 物 

由 生物 体 生 产 ，140 一 141 
生物 燃料 


422 


ZH, 117~121 
生物 素 
生产 ，139 一 140 
生物 质 
细胞 
在 黑箱 模型 中 ，67 一 68 
是 12 二 13 
组 分 
在 细胞 反应 中 ，48 
在 动态 质量 平衡 中 ，57 
生长 
细胞 
有 机 酸 的 影响 ，149 
非 平衡 热力 学 描述 ，393 一 394 
能 学 
定义 ，41 
KHER (Escherichia coli), 242 
产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum), #*, 
60 一 61 
酿酒 酵母 〈Saccharomzyces cerevisiae ) 
厌 氧 生长 ，242 
在 葡萄 糖 -乙醇 混合 物 中 ，242 
酵母 ， 热 量 产生 
好 氧 生长 ，73 一 74 
厌 氧 生长 ，73 一 74 
嗜 酸 热 原 体 ( Thermoplasma acidophilum ) 
在 所 的 生产 中 ，146 一 147 
数据 一 致 性 
在 厌 氧 酵母 培养 中 ，73 
水 平流 
在 非 平 衡 热 力学 中 ，389 
丝氨酸 代谢 途径 合成 算法 ，174 一 175 
四 氧 吡啶 三 羧 酸 转 化 ，209 一 211 
松弛 时 间 
在 细胞 代谢 中 的 松弛 时 间 ，14 一 15 
Tp AR 
在 谷 氮 酸 棒 杆 菌 (Corynebacterium glutami- 
cum) 中 国 合成 ，123 一 125 
速率 
对 于 别 构 酶 简化 了 的 速率 ，97 一 98 
速率 方程 
细胞 反应 线性 速率 方程 ，5$9 一 61 
算法 
反应 的 吉 布 斯 自由 能 变化 ，372 一 374 
代谢 通 量 优化 ，355 一 357 
代谢 途径 合 


ee 


>to Saar 


两 氨 酸 合成 ，175 一 176 

分 析 ，180 一 181 

实施 ，167 一 172 

赖 氨 酸 生物 合成 ，176 一 179 
替代 ，179 一 180 
最 大 得 率 限 制 ，179 一 180 
草 酰 乙酸 的 作用 ，179 


概述 ，173 一 176 
丝氨酸 合成 ，174 一 175 
羧 化 作用 
丙酮 酸 对 PPC 的 补偿 ，258 一 259 
RM 


在 AG9 确定 中 ，378 
T 


弹性 系数 
由 动力 学 模型 计算 ，284 
糖 原 异 生 作 用 ，295 一 296 
Be 
在 简单 黑箱 模型 中 的 平衡 ，70 
直接 平衡 ，232 一 237 
在 TAC 循环 中 ，28 一 29 
痰 基 氰 化 物 对 -三 氟 - 甲 氧 基 葵 有 
对 质子 动力 的 影响 ，298 
糖 
AG, 38~41 
聚合 作用 ，38 一 41 
贮藏 和 合成 ，37 一 38 
世界 范围 的 生产 ，6 一 7 
糖 酵 解 
MX, 21 
自由 能 ，370 一 371 
Leloir 途径 ，21 一 22 
老鼠 肝脏 细胞 ，295 一 297 
糖 ,，21 二 22 
糖 原 异 生 作用 
老鼠 肝脏 细胞 ，295 一 297 
梯度 
用 于 维持 的 浓度 梯度 ，42 
在 产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum) 中 的 质 
F HE, 16~17 
KAR 
途径 及 反馈 控制 ，94 一 95 
条 件数 计算 205 
通 量 控制 系数 
变化 预测 ，302 一 303，305 一 306 


确定 ，277 一 279 

双 调 节 法 ，282 一 283 

弹性 系数 ，284 

由 酶 的 改变 ，303 
用 于 估计 的 表达 式 ，302 

已 表达 酶 的 基因 变化 ，279 一 280 
组 通 量 控制 系数 

定义 ，311 一 313，316 一 317 

经 由 和 矩阵 代数 的 核心 矩阵 确定 ，320 一 321 
SIMS 矩阵 分 析 ，318 一 319 


动力 学 模型 ，286 
从 大 偏差 而 来 ，303 
矩阵 ，291 


在 代谢 控制 分 析 中 ，272 一 274 

非 线 性 函数 的 确定 ，278 

单调 节 ，283 

用 纯化 酶 的 滴定 ，280 一 281 

用 特异 抑制 剂 的 滴定 ，281 一 282 

自 上 而 下 法 ，283 一 284 

瞬 态 代谢 物 测量 ，284 一 286 
通 透 酶 

在 主动 运输 中 的 作用 ，19 
同位 素 标记 代谢 物 

完全 列举 ，214 一 216 

直接 碳 原子 平衡 ，232 一 237 

TCA 循环 中 同位 素 标记 代谢 物 的 分 布 

来 自 标记 的 乙酸 ，221 一 222 

来 自 标记 的 丙酮 酸 ，216 一 222 
同位 素 标记 分 析 

乙酸 盐 ，221 一 222 

在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 中 的 乙酸 盐 利 用 ， 
230 一 232 

乙酰 -辅酶 A 代谢 ，212 一 214 

在 同位 素 标记 代谢 物 的 完全 列举 中 ，214 一 216 
用 原子 作 图 矩阵 模拟 同位 素 分 布 ，237 一 240 
在 哺乳 动物 细胞 培养 中 的 通 量 ，265 一 268 
细菌 的 乙 醛 酸 支 路 途径 ，232 

代谢 物 碳 原子 NMR 分 析 ，222 一 227 
丙酮 酸 ，216 一 221 

在 哺乳 动物 中 的 丙酮 酸 利用 ，227 一 230 

稳 态 试验 ，209 

细菌 的 TCA 循环 ，232 
2- 酮 -L- 葡 萄 糖 酸 

商业 生产 ，139 
2- 酮 -3- 脱 氧 -6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 

在 ED 途径 中 ，23 一 24 

423 


2- 酮 -3- 脱 氧 -6- 磷 酸 葡萄 糖 酸 醛 缩 酶 弹性 


在 ED 途径 中 ，23 一 24 由 动力 学 模型 计算 ，284 
x- 酮 成 二 酸 糖 原 异 生 作 用 ，295 一 297 
在 TCA 循环 中 ，30 一 32 在 代谢 控制 分 析 中 ，274 一 276 
a- 酮 成 二 酸 脱氧 酶 通 量 控制 ， 见 通 量 控制 系数 
在 TCA 循环 中 ，28 一 29 对 于 代谢 控制 分 析 ，299 
KAR C 的 生产 ，135 一 136 得 率 
透明 菌 属 ( Vitreoscilla ) 在 黑箱 模型 中 ，68 一 69 
血红 蛋白 基因 克隆 ，149 We, 71 
突变 体 细胞 反应 ，59 一 61 
谷 氮 酸 棒 杆菌 (Corynebacterium glutamicum ) 细胞 
缺失 突变 体 的 代谢 通 量 分 析 ，257 一 261 老鼠 肝脏 中 糖 原 异 生 和 糖 酵 解 ，295 一 297 
图 完整 细胞 总 体 调控 
代谢 图 的 定义 ，5 定义 ，102 一 105 
3- 脱 氧 -D- 阿 拉 伯 型 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 通过 磷酸 化 作用 的 信号 转 导 ，105 一 107 
在 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 中 ，323 细胞 代谢 
脱氧 核糖 核 苷 酸 生物 合成 ，36 用 代谢 工程 分 析 ，6 
脱氧 核糖 核酸 组 装 反应 ，12 
聚合 ，38 一 41 生物 合成 反应 ，12 
重组 于 细胞 重生 物质 ，12 
在 代谢 途径 操作 中 ，1 供 能 反应 ，12 
Ww 途径 集成 ，13 
聚合 反应 ，12 
微生物 松弛 时 间 ，14 一 15 
在 代谢 途径 操作 中 ，1，134 一 135 NADH 和 NADPH 的 作用 ，24 一 25 
维生素 A 生产 ，140 细胞 工程 
维生素 C 生产 ，139 对 于 细胞 性 质 ，148 
污染 物 遗传 稳定 性 的 维持 ，149 一 151 
转化 为 非 污染 物 ，154 氮 代 谢 改变 ，148 
SHE ERB BIL, 149~151 
用 于 乙醇 的 生产 对 于 氧 的 利用 ，148 一 149 
代谢 工程 ，128 底 物 利用 改变 ,151 一 152 
利用 酵母 ，129 细胞 合成 
微生物 的 成 糖 发 酵 ，118 生物 合成 反应 ，33 
ARE, 147 细胞 培养 
误差 哺乳 动物 的 代谢 通 量 
在 酵母 培养 测量 中 的 诊断 ，82 一 83 描述 ，261 
在 过 失 测量 中 ，75 胞 内 通 量 ，261 一 265 
在 代谢 通 量 测 定 中 ，364 一 365 同位 素 标记 研究 265~268 
在 方差 - 协 方差 矩阵 计算 中 ，81 在 代谢 通 量 分 析 中 ， 培 养 基 设计 的 应 用 ，268 
细胞 生理 学 
在 反应 途径 分 析 中 ，2 
炳 醇化 酶 弹性 系数 ，296 代谢 通 量 的 作用 ，3 | 
系数 细胞 生物 质 | 
MEE Hl, 306 在 黑箱 模型 中 ，67 一 68 
控制 ，339 一 341，357 一 359 干细胞 重生 物质 ，12 


424 


细胞 生长 
有 机 酸 的 影响 ，149 一 150 
非 平衡 热力 学 描 i 述 ，393 一 394 
细胞 途径 
分 支点 控制 ，182 
动态 质量 平衡 ，$4 一 55 
线性 速率 方程 ，59 一 61 
代谢 模型 ，49 一 50 
代谢 物 
稀释 影响 ，184 一 186 
大 肠 杆 菌 〈Escherichia coli) 的 混合 酸 发 酵 
速率 ，52 一 53 
比 速率 ，S4 
非 平衡 的 热力 学 ，384 
化 学 计量 学 
菌 体 组 成 ，48 
胞 内 代谢 物 ，48 
代谢 产物 ，48 
底 物 ，48 
得 率 系数 ，59 一 61 
细菌 
SAR 
氨基 酸 生 产 ，242，245 一 250 
生物 化 学 和 调节 ，242 一 245 
乙 醋酸 支 路 ，232 
乳酸 异型 发 酵 代 谢 的 代谢 通 量 分析 ，194 一 196 
TCA 循环 ，232 
纤维 素 - 半 纤 维 素 的 解 聚 ，132 
线粒体 
内 膜 ，29 一 30 
氧化 磷酸 化 控制 ，297 一 299 
线性 规 化 
不 定 系统 ，200 一 202 
线性 力 关 联 
在 非 平衡 热力 学 中 ，394 一 396 
线性 速率 方程 
细胞 反应 ，59 一 61 
效应 物 扩 增 因子 
在 营养 物 浓度 计算 中 ，307 
信和 号 转 导 
通过 磷酸 化 作用 ，105 一 107 
血红 蛋白 基因 克隆 ，149 


bf 


BAT WH, 15 


FIFA, 148~149 
氧化 
丙酮 酸 ，28 一 29 
氧化 磷酸 化 
在 线粒体 中 的 控制 ，297 一 299 
非 平 衡 热力 学 ，389 一 393 
与 TCA 循环 ，28 一 30 
药物 
通过 代谢 工程 生产 手 性 药物 ，7 
一 致 性 检验 ， 用 于 组 FCCs (gFCCs) 
对 预 苯 酸 分 支点 的 应 用 ，363 一 364 
特性 ，359 一 360 
发 展 ，360 一 363 
遗传 学 
在 代谢 控制 分 析 中 的 作用 ，4 一 5 
乙醇 
好 氧 酵母 培养 中 不 生成 ，78 一 80，81 一 82 
作为 生物 燃料 ，117 
来 自发 酵 代 谢 ，118 一 119 
来 自 葡 萄 糖 的 转化 ，27 一 28 
在 酵母 生长 中 的 乙醇 -葡萄 糖 混合 物 ，241 一 242 
工业 发 酵 ，126 一 127 
生产 ，117 一 118 
HHA (Escherichia coli), 118~ 120 
HH PDC 和 ADH 基因 ，120 
成 糖 代谢 ，128 
由 丙酮 酸 脱羧 酶 ，119 
由 酿酒 酵母 (Sacchnaromzyces cerevisiae), 118 
由 酵母 ，129 
由 运动 单 胞 菌 (Zymomonas mobilis ), 129 ~ 
131 
真 核 细胞 代谢 网 络 调节 ，108 一 109 
aT Ws 
乙酸 盐 ，149 一 150 
乙 醛 酸 
在 细菌 中 的 支 路 途径 ，232 
乙 醛 脱 氢 酶 
在 酒精 发 酵 中 ，26 
乙酸 
Sy, 149~151 
同位 素 标 记 的 TCA 循环 代谢 物 ，221 一 222 
TEXT A (CE. coli) 中 的 利用 ，230 一 232 
乙酰 辅酶 A 
生成 ，28 一 30 
代谢 ， 标 记 物 分 布 ，212 一 215 
乙酰 乳酸 合成 酶 


425 


在 枯草 芽孢 杆菌 〈B. subtilis) 中 ，150 一 151 
异 亮 氢 酸 
EE AREA (Corynebacterium glutam- 
icum) 中 的 合成 ，125 一 126 
抑制 系统 
竞争 性 抑制 系统 的 特征 ，90 一 91 
不 可 逆 抑 制 系统 
生物 合成 网 络 控制 ，94 一 95 
分 子 ，93 
非 竞争 性 抑制 系统 的 特性 ，91 一 92 
简单 可 逆 底 物 抑 制 系统 ，90 
底 物 
竞争 性 抑制 ，90 一 91 
非 竞争 性 抑制 ，91 一 92 
快速 平衡 ，88 一 89 
作为 简单 可 逆 抑 制 系统 ，90 
稳 态 方法 ，89 
反 竞 争 性 抑制 ，93 
滴定 ,在 FCC 中 ，281 
反 竞 争 性 滴定 在 FCC 中 的 特性 ，93 
营养 物 
在 通 量变 化 中 的 作用 ，307 
吸收 ，151 一 152 
AR 
分 解 代 谢 ，32 一 33 
Xt ATP 的 影响 ， 16 一 17 
对 细胞 生长 的 影响 ，149 一 1S0 
MAR 
在 芳香 族 氨 基 酸 生物 合成 中 ，323 一 324 
分 支点 
组 FCC (gFCC) 一 致 性 检验 中 的 应 用 ，363 一 
364 
在 代谢 网 络 中 ，336 一 338 
元 素平 衡 
一 般 化 还 原 度 平 衡 ，71 一 72 
在 简单 黑箱 模型 中 ，70 一 71 
原核 细胞 
代谢 网 络 调节 ，108 一 109 
原子 作 图 矩阵 
在 同位 素 分 布 模型 模拟 中 ，237 一 239 
运动 发 酵 单 胞 菌 〈2QZyrzomzomzas mobilis ) 
丙 氨 酸 合成 ，123 
用 于 乙醇 生产 ，129 一 131 
运输 
主动 运输 
ATP 消耗 ，19 一 21 
426 


基 团 转 位 ，19 一 20 

通 透 酶 的 作用 ，19 

通过 ATP 酶 ，19 一 20 
从 NADH 到 氧 的 电子 转移 ，29 一 30 
葡萄 糖 244 
机 制 15 
被 动 运输 

化 合 物 ，15 一 16 

自由 扩散 ，15 
热力 学 可 行 性 ，371 一 372 


Z 


载体 - 底 物 复合 物 

在 Michaelis-Menten 反应 中 ，18 一 19 
蔗糖 利用 ，134 

整个 细胞 全 局 控制 

ve &X, 102 

通过 磷酸 化 的 信号 转 导 ，105 
脂肪 分 解 代 谢 ，32 一 33 
脂肪 酸 

生物 合成 ，36 一 37 
被 动 运输 ，15 一 16 
脂 类 

生物 合成 ，36 一 38 


质粒 pWWO 用 于 污染 物 降 解 ，154 一 155 
质子 梯度 
在 产 黄 青 老 【Penicizlivuzre chrysogenum) #, 16~ 
17 
质子 -动力 
线粒体 的 质子 -动力 分 析 ，296 
在 氧化 磷酸 化 作用 中 ，390 
中 间 代 谢 物 连接 
组 FCC (gFCC), 354~355 
主动 运输 
ATP 消耗 ，19 一 21 
基 团 转 运 ，19 一 20 
通 透 酶 的 作用 ，19 
经 由 ATP 酶 ，19 一 20 
贮藏 糖 类 
UDP- 葡 萄 糖 在 合成 贮藏 糖 类 中 的 作用 ，37 一 38 
Ste AEB F ( Methylophilus methylotrophus ) 
单 细 胞 蛋白 生产 ，148 
转录 控制 
细菌 启动 子 ，98 一 99 


乳糖 (lac) BMAF, 99~100 
转氨酶 发 现 ，259 一 261 
转 位 
在 主动 运输 中 的 基 团 转 位 ，19 一 20 
自 上 而 下 法 
组 FCC (gFCC) 的 实验 确定 ，350 一 352 
由 通 量 测量 而 来 的 组 控制 系数 ，341 
需要 ，316 
代谢 网 络 中 的 控制 系数 ，339 一 341 
对 于 组 控制 系数 的 确定 
ATP 分 支点 ，346 一 347 
FDP/GAP 分 支点 ，348 一 349 
G6P 分 支点 ，347 一 348 
PPH 分 支点 ，349 一 350 
X5P+CHR 分 支点 ，349 
自由 能 
吉 布 斯 ， 见 吉 布 斯 自由 能 
糖 酵 解 反应 ，370 一 371 
标准 自由 能 
葡萄 糖 氧 化 ，393 
在 EMP 途径 中 的 己 糖 激酶 反应 ，385 
术语 ，369 
氧化 磷酸 化 ，389 一 392 
反应 ，369 一 370 
总 体 控 制 ， 在 整个 细胞 水 平 上 
定义 ，102 一 105 
通过 磷酸 化 作用 的 信号 转 导 ，105 一 107 
组 氢 酸 蛋白 
在 主动 运输 中 ，19 一 20 
组 控制 同等 重要 性 
在 代谢 控制 分 析 中 ，4 
组 控制 系数 ， 代 谢 网 络 模型 
ATPR ，346 一 3347 . 
FDP/GAP 分 支点 ，348 一 349 
6- 磷 酸 葡 萄 糖分 支点 ，347 一 348 
PPH 分 支点 ，349 一 350 
X5P+CHR 分 支点 ，349 
组 浓度 控制 系数 
确定 ，344 
由 通 量 测 量 ，341 
在 代谢 网 络 中 ，339 一 341 
组 通 量 控制 系数 
从 已 表征 的 扰动 ，343 一 344 
一 致 性 检验 与 实验 证 实 ，359 一 360 
实验 确定 ，350 一 352 
图 形 表示 ，361 一 362 


中 间 代 谢 物 连接 ，354 一 355 

对 于 赖 氨 酸 的 生物 合成 ，343 

测量 误差 影响 ，364 一 365 

由 3 个 扰动 ，341 一 343 
组 织 

代谢 工程 在 体内 组 织 代谢 中 的 作用 ，7 
组 装 反应 

在 细胞 代谢 中 ，12 一 13 


其 他 


Aspergillus nidulans (nidulans 曲霉 ， 梨 曲霉 ) 
PP 途径 ，24 
ATP 
在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，329 一 333，346 一 
347 
用 于 主动 运输 中 的 消耗 ，19 一 20 
用 于 维持 消耗 ，42 
有 机 酸 的 影响 ，16 一 17 
TEX (E. coli) 代谢 中 ，202 一 204 
生成 反应 的 吉 布 斯 自由 能 ，382 一 383 
在 途径 集成 中 ，13 
生产 和 消耗 的 平衡 ，60 一 61 
ATP 酶 
作为 主动 运输 系统 ，19 
FoFi-， 质 子 输出 ，20 
BTX 混合 物 ， 见 茶 - 甲 茶 - 二 甲苯 混合 物 
CCC， 见 浓度 控制 系数 
CHR ， 见 分 支 酸 
C-mole 基准 及 得 率 计 算 ，71 
Delgado-Liao 方法 扩展 ，398 
DNA， 见 脱氧 核糖 核酸 
ED 途径 ， 见 Enter-Doudoroff 途径 
Embden-Meyerhof-Parnas 途径 
控制 点 ，24 一 25 
在 糖 酵 解 中 ，21 
己 糖 激酶 反应 的 非 平衡 热力 学 ，385 
中 间 物 ，23 一 25 
反应 ，22 
热力 学 可 行 性 分 析 ，374 一 377 
EMP 途径 ， 见 Embden-Meyerhof-Parnas 途径 
Enter-Doudoroff 途径 
在 糖 酵 解 中 ，21 
反应 ，22 
FCC， 见 通 量 控制 系数 
FDP， 见 1,6 二 磷酸 果糖 
GAP, Ji 3- 磷 酸 甘油 醛 
427 


Glc6P, JL 6- 磷 酸 葡萄 糖 
Hill 方程 

对 别 构 酶 的 应 用 ，97 一 98 

lac 操纵 子 转录 控制 ，99 一 101 
Leloir 途径 

在 糖 酵 解 中 ，21 一 22 
MATHCAD 程序 用 于 矩阵 运算 ，78 


MATHEMATICA 程序 用 于 矩阵 运算 ，78 


MATLAB 程序 用 于 矩阵 运算 ，78 
MCA， 见 代谢 控制 系数 
MEFA， 见 代谢 通 量 分 析 
Michaelis-Menten 反应 


饱和 动力 学 ，18 一 19 
NAD* 

HH NADH 氧化 ，390 一 391 
NADH 


线粒体 内 膜 通 透 性 ，29 一 30 

氧化 为 NAD- 390~391 

在 途径 集成 中 ，12 一 13 

在 细胞 代谢 中 的 作用 ，24 一 25 
NADPH 

在 途径 集成 中 ，12 一 13 

在 细胞 代谢 中 的 作用 ，24 一 25 
NMR ， 见 核磁 共振 分 析 
Onsager 的 倒数 关系 

应 用 于 细胞 生长 393 

在 非 平 衡 热力 学 中 ，386 
PEP, We BR in BE A Bel a 


PEP 羧 化 酶 ， 见 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 羧 化 酶 


428 


Pho 调节 子 
在 大 肠 杆 菌 〈Escherichia coli) 中 ，106 一 107 
PP 途径 ， 见 磷酸 戊 糖 途径 
PPC， 见 磷酸 烦 醇 丙酮 酸 羧 化 酶 
PPH 
在 代谢 网 络 模型 中 作为 分 支点 ，349 一 350 
RNA，153 
反 义 RNA 的 功能 
聚合 ，38 一 41 
RNA RA 
转录 控制 ，98 一 101 
Schwanniomyces occidentalis 
淀粉 降解 ，134 一 135 
SIMS 和 矩阵 
对 于 芳香 族 氨基 酸 生 物 合成 ，326 一 328 
对 于 独立 途径 识别 ，318 一 319 
在 核心 矩阵 确定 中 ，320 一 321 
TCA 循环 
回 补 途 径 ，30 一 32 
在 细菌 中 ，232 
同位 素 标记 代谢 物 分 布 
从 标记 的 乙酸 ，221 一 222 
从 标记 的 丙酮 酸 ，216 一 221 
NADH 和 FADH2 生成 ，61 一 64 
和 和 氧化 磷酸 化 作用 ，28 一 30 
调节 位 点 ，28 一 29 
UDP- 葡 萄 糖 
在 贮藏 糖 类 合成 中 的 UDP- 葡萄糖，37 一 38 
X5P， 见 5- 磷 酸 核 酮 糖 


内 & 提 要 


代谢 工程 是 一 个 新 出 现 的 多 学 科 交叉 领域 ， 是 应 用 于 化 学 品 、 燃 料 、 材 料 、 医 药 及 环境 
等 领域 中 菌 种 改进 的 一 种 平台 技术 。 最 近 的 发 展 表明 ， 它 在 植物 、 动 物 代谢 工程 乃至 人 体 组 
织 细 胞 的 基因 治疗 及 代谢 分 析 方 面 有 重要 应 用 。 该 领域 的 新 颖 性 在 于 分 子 生 物 技术 与 数学 分 
析 工 具 的 集成 ， 这 有 助 于 阐明 基因 修饰 的 代谢 通 量 控制 及 靶 标 的 合理 选择 。 通 过 提供 对 细胞 
生物 学 的 准确 严密 的 描述 ， 代 谢 工程 也 可 大 大 促进 功能 基因 组 学 研究 的 深入 发 展 。 代 谢 工程 
的 主要 目标 是 识别 特定 的 遗传 操作 和 环境 条 件 的 控制 ， 以 增强 生物 技术 过 程 的 产 率 及 生产 能 
力 ， 或 对 细胞 性 质 进行 总 体 改 进 。 

本 书 最 主要 的 内 容 包括 途径 集成 和 把 代谢 通 量 作为 细胞 生理 学 的 基本 决定 因素 来 考虑 的 
重要 性 。 代 谢 工程 把 数学 的 复杂 性 减 到 最 小 ， 并 同时 提供 一 些 必 要 的 补充 说 明 作 为 不 同 数学 
运算 的 背景 材料 。 书 中 描述 了 途径 分 析 的 计算 工具 ， 书 后 还 附 有 专业 术语 词汇 ， 这 些 都 有 利 
于 生物 化 学 、 分 子 生物 学 、 微 生物 学 、 生 物化 学 工程 、 生 物 医 学 工程 等 方面 的 科学 研究 人 
员 、 教 师 、 研 究 生 及 高 年 级 本 科 生 使 用 本 书 。 

本 书 有 如 下 主要 特点 : 

@ 用 途径 分 析 的 大 量 实例 证 明示 范 代谢 工程 正在 起 着 日 益 重 要 的 作用 ; 

@ 包 括 识别 代谢 网 络 中 关键 酶 的 方法 ; 

@ 提 供 了 代谢 生物 化 学 的 全 面 综述 ; 

@ 在 基因 、 酶 、 操 纵 子 和 细胞 水 平 讨论 代谢 调控 ; 

@ 清 楚 解释 代谢 途径 化 学 计量 学 、 动 力学 和 热力 学 的 基本 概念 ; 

@ 使 数学 复杂 性 减 小 到 最 小 ; 

@@ 可 通过 网 络 交流 更 新 有 关 代 谢 工 程 的 软件 及 讨论 课 后 作业 。 


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