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Full text of "dan bai zhi hua xue yu dan bai zhi zu xue"

Digitized by the Internet Archive 
in 2011 with funding from 
Institute of Botany, CAS and Internet Archive 



http://www.archive.org/details/danbaizhihuaxueyOOxiaq 



现代 生物枝 术前沿 



:其昌 曾嵘 • 等编著 



白 质化学 

蛋 白质组 



. 2212a 

# 镅&糸 ii 

北 京 



内 容简介 



本书系 统论述 了蛋白 质化学 基础理 论和实 验技巧 ,也反 映了蛋 白质组 
学研究 的最新 成果。 内容 包括: 蛋 白质的 表征, 蛋白质 的组成 分析和 序列测 
定, 与此相 关的实 验方法 ,包 括各种 色谱、 电泳、 质谱技 术等, 以及应 用在蛋 
白质表 征研究 和基因 工程产 品的质 检方面 的实际 范例。 在蛋 白质组 学领域 
介绍 了基本 概念、 样品 制备、 双向 凝胶电 泳的图 像分析 和定量 分析、 质谱等 
常规 方法, 并 介绍了 国际上 最新的 多维技 术在研 究中的 应用; 同时充 分体现 
了 生物信 息学在 蛋白质 组研究 中的重 要性。 

本书可 作为生 物学、 医学、 化学 专业大 学生, 研究 生和教 学人员 的参考 
书, 也是从 事生物 化学、 分子生 物学、 医 学等领 域中分 离分析 工作人 员的参 
考书。 



图书在 版编目 (CIP) 数据 

蛋白 质化学 与蛋白 质组学 /X 其昌, 曾嵘等 编著. 一 北京: 科学出 版社, 

2004.4 

(现 代生 物技术 前沿) 
ISBN 7-03-012401 -4 

I. 蛋… n.® 夏… ②曾… m. 蛋白质 -研究 IV.Q51 
中 国版本 图书馆 CIP 数 据核字 (2003) 第 100086 号 

责任 编辑: 莫结胜 杨兆弘 谢灵玲 / 责任 校对: 宋玲玲 
责任 印制: 安春生 / 封面 设计: 王 浩陈敬 



4* « * /^L 出版 

北京东 城根北 ttjif)!"} 

http : // www . sciencep . com 

科 学出版 社发行 各地 新华书 店经销 

2004 年 4 月第 一 版 开本: 787x1092 1/16 
2004 年 4 月第一 次印刷 印张: 36 1/4 
印数 :1 一 4 000 字数: 828 000 

定价 :75.00 元 
(如 有印 装质量 问题, 我社负 责调换 〈新 欣〉) 



《蛋 白质 化学与 蛋白质 组学》 编写人 员名录 



(按姓 氏音序 排序) - 

曹兴军 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

车发云 Department of Molecular Pharmacology , Albert Einstein College of 

Medicine, New York, NY, USA 
陈益强 中国科 学院计 算技术 研究所 北京 100080 

丁士健 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

付 岩 中国科 学院计 算技术 研究所 北京 100080 

龚幕蓁 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

上海 200031 

江晓胜 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋白质 组研 究分 析中心 上海 20003 1 

斩文海 中国 科学院 大连化 学物理 研究所 国家色 语中心 大连 116023 
李 辰 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

李荣霞 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

中国 科学院 上海生 命科学 研究院 生物信 息中心 上海 200031 
中国 科学院 上海生 命科学 研究院 生物信 息中心 上海 200031 
Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, 
Seattle, WA, USA 
马丹军 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

阮宏强 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

邵晓霞 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

沈海芳 中 国科学 院上海 生命科 学研究 院药物 研究所 上海 201203 

史 律 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

宋金芳 中国 科学院 上海生 命科' 学研^ 院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 



君学襟 

素 亦 

李李刘 



唐柳娅 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白 质组研 究分析 中心 上海 200031 

屠成剑 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

屠红炅 Biocenter and Department of Medical Biochemistry & Molecular 

Biology, University of Oulu, Oulu, Finland 
吴家赛 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

上海 200031 

夏其昌 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

徐来根 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

薛卫华 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

杨一鸣 中 国科学 院上海 生命科 学研究 院药物 研究所 上海 201203 

命利 荣 Laboratory of Prot comics and Analytical Technologies SAIC- Frederick , 

Inc. Natinal Cancer Institute at Frederick , MD, USA 
曾 碌 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

张 雷 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 20003 1 

张丽华 Medical Information Technology Inc. , Boston, USA 
周 虎 中国科 学院上 海生命 科学研 究院生 物化学 与细胞 生物学 研究所 

蛋 白质组 研究分 析中心 上海 200031 

邹汉法 中国 科学院 大连化 学物理 研究所 国家色 语中心 大连 116023 - 



—I— 

刖 m 

我曾在 1997 年 10 月 出版了 《蛋 白质化 学研究 技术与 进展》 一书。 此书 后来又 重印了 
一次, 这 反映有 一定的 需求, 但目前 已完成 其历史 任务。 因为, 这几 年中, 蛋 白质领 域发生 
了翻天 覆地的 变化, 进入了 蛋白质 组学的 时代。 在中国 科学院 ,上海 生命科 学研究 院和生 
物 化学与 细胞生 物学研 究所于 2000 年共建 了蛋白 质组研 究分析 中心。 近年来 ,更 多的研 
究单位 和大专 院校建 立了蛋 白质组 学中心 或蛋白 质组学 重点实 验室。 

蛋白 质化学 的研究 是从细 胞中成 千上万 种蛋白 质中分 离纯化 到一种 蛋白质 来研究 
它; 而在 蛋白质 组学研 究中, 是欲将 细胞中 全部的 蛋白质 系统地 分离和 鉴定, 在整 体水平 
上 研究其 结构和 功能。 有人说 ,早期 蛋白质 研究是 个体作 坊式的 ,而 目前的 蛋白质 组研究 
是 在团队 水平上 进行。 由于工 作量之 大和高 通量、 高难度 ,不 是少数 几个人 所能胜 任的, 
这 也要求 研究者 是团队 式的。 

30 多年前 ,很 多医学 家已经 考虑到 疾病不 是单因 素而是 多种因 素综合 作用的 结果, 
他们发 展了现 代双向 电泳技 术来研 究这些 复杂的 因素, 看到了 可喜的 前景。 当时 犹如看 
天上 众多的 星星, 但 理不出 头绪。 后来 发展的 电泳图 像分析 和质谱 技术, 才 解决了 这些疑 
难 问题。 

我近年 常用" 从蛋白 质化学 到蛋白 质组学 "这 一题目 讲课, 这也反 映一种 历程。 国际 
上一些 科学家 用疑惑 的眼光 询问, 也 有很多 人表示 赞同。 事实上 ,不 少蛋白 质组学 专家, 
过去 也是蛋 白质化 学家。 当然, 也有 不少蛋 白质组 学专家 来自医 学界。 

1997 年, 我 应邀参 加在澳 大利亚 举行的 Lome 蛋白质 结构和 功能讨 论会, 当时 
Williams 的报告 "The Establishment Phase for the Australian Proteome Analysis Facility" 
(即 著名的 APAF) 使我很 受启发 ,次年 我访问 美国一 些实验 室时, 特别注 意有关 内容, 并 
请顺访 上海的 蛋白质 化学专 家潘裕 敬博士 作了蛋 白质组 的报告 ,重点 在双向 电泳。 当时, 
我 们已有 CE、Mimi-IEF、FFE 等多 种电泳 技术, 但没有 建立双 向电泳 的要求 ,也不 太明白 
为何在 国际有 名的电 泳杂志 上总有 一半论 文涉及 2-DE。 当对蛋 白质组 学有所 了解后 ,也 
就明 白了。 

金善 纬教授 多次建 议我: 做 蛋白质 研究一 定要有 质谱! 在 后来工 作中, 还得到 质谱专 
家杨 一鸣进 一步的 指点和 帮助。 

我步 入蛋白 质化学 这一领 域首先 是在复 旦大学 的课堂 上听郞 承鲁、 钮 经义先 生和曹 
天饮先 生的精 彩讲课 ,当 时很多 名教授 为大学 生讲系 列的基 础课。 进入中 国科学 院上海 
生物化 学研究 所后, 得益 于王应 睐先生 和戚德 芳先生 的直接 教诲。 值 得指出 的是: 在著名 
的生化 所这样 的研究 氛围中 ,我受 到国内 一批享 有盛名 的研究 蛋白质 的前辈 熏陶; 同时也 
获益 于同事 们有益 的交流 讨论, 他 们在当 时生活 和研究 条件极 其艰难 的情况 下开展 工作。 

蛋白质 组学这 一新的 热点学 科在国 内外都 有不同 程度的 理解。 可以作 为大学 科来组 
织, 也可 以作为 一种研 究方法 在小范 围内对 所感兴 趣的课 题进行 研究。 但 有一点 是肯定 
的, 即大家 都对蛋 白质组 学寄予 厚望, 并在 不同水 平和不 同范畴 上进行 工作, 这是 值得庆 




贺的。 如今 已有全 球性的 蛋白质 组机构 —— 人类 蛋白质 组组织 (Human Proteome Orga- 
nization, HUPO) ,蛋白 质组学 的专业 性刊物 也不断 涌现, 一派欣 欣向荣 景象。 

我们在 《蛋 白质化 学研究 技术与 进展》 的基 础上, 结 合当前 的研究 进展, 写作了 本书, 
如果本 书能在 我国蛋 白质组 学的发 展中, 引起人 们更多 的兴趣 ,起到 普及和 引导入 门的作 
用, 我 们将感 到非常 欣慰。 

夏其昌 
2003 年 4 月 21 日 
中国 科学院 上海生 命科学 研究院 
生 物化学 与细胞 生物学 研究所 
蛋 白质组 研究分 析中心 
http: //www. proteomics. ac. cn 



目 录 



前言 

上篇 蛋白 质化学 



第一章 蛋白质 的表征 3 
第一节 蛋 白质结 构的基 本概念 3 
第二节 蛋白质 的纯度 6 
第三节 蛋白质 的定量 7 

一、 光 吸收法 8 

二、 双 缩脲法 8 

三、 福林- 船法 8 

四、 考马 斯亮蓝 G-250 法 9 

五、 氨基酸 分析法 9 
第四节 蛋白质 的脱盐 (除去 盐和非 共价结 合的小 分子) 9 
第五节 蛋 白质的 分子质 量测定 10 
第六节 蛋白质 的等电 点测定 11 
第七节 氣 基酸定 量分析 12 

第八节 肽 谱 • 14 

第九节 质 谱 16 

第十节 蛋 白质及 多肽的 序列测 定和末 端分析 18 

一、 N 端分析 19 

二、 C 端 的测定 19 

第 十一节 蛋白质 的二硫 键分析 19 

一、 不同 同位素 标记法 20 

二、 4- 乙 稀吡啶 标记法 20 

三、 直接 色谱法 21 

四、 质谱法 21 

第 十二节 突变点 的分析 22 

第 十三节 原位分 析和快 速分析 24 

―、 原 位分析 24 

二、 快 速分析 24 

第 十四节 蛋白 质翻译 后修饰 的分析 25 

##Jt«t 25 

第二章 蛋 白质结 构分析 27 

第一节 蛋白 质样品 的准备 27 



r 



一、 SDSPAGE 纯化 的样品 27 

二、 HPLC 纯化 的样品 27 

三、 蛋 白质样 品中的 二硫键 和巯基 (一 SH) 27 

第二节 蛋白 质的化 学裂解 28 

一、 裂 解于甲 硫氣酸 (Met) 28 

二、 裂 解于半 胱氨酸 (Cys) 29 

三、 裂解于 色氣酸 (Trp) 30 

四、 部分 酸水解 30 

五、 选择 性及限 制性化 学裂解 30 

第三节 蛋 白水解 薛聽 解 31 

―、 常 用蛋白 水解薛 31 

二、 酷 解操 作条件 31 

三、 讨论 32 

第四节 蛋 白质中 存在着 封闭的 N 端 33 

一、 除去蛋 白质中 封闭的 iv- 乙醜丝 氨酸和 N- 乙酰 苏氣酸 33 

二、 除去 iV- 甲酷甲 硫氣酸 33 

三、 除去 N 端的 焦谷氨 酸残基 (pyroglutamate) 33 

四、 除去 其他的 A/- 乙酰 氨基酸 34 

五、 选择 性纯化 N 端封 闭的肽 34 

第五节 蛋白 质中的 C 端残基 的测定 34 

一、 羧 肽酶法 34 

二、 化学 降解法 35 

第六节 蛋 白质中 一些特 殊肽段 的检出 35 

一、 含巯基 肽的分 离纯化 和分析 35 

二、 含 芳香族 氨基酸 肽的分 离纯化 和鉴定 … 37 

三、 含 Lys^ 肽的分 离纯化 和鉴定 40 

0^Xm 42 

附录一 微量蛋 白质实 验室注 意事项 44 

附录二 常用试 剂处理 44 

第三章 氨 基酸组 成分析 46 

第一节 氨 基酸组 成分析 的目的 46 

第二节 蛋白 质的水 解方法 46 

第三节 特殊 氨基酸 的保护 和定量 48 

第四节 氨基酸 组成原 位分析 50 

第五节 衍 生方法 及原理 50 

第六节 测定氨 基酸组 成的实 验步骤 52 

一、 OPA 法 52 

二、 PTOAAj£ 53 

三、 茚 三酮法 54 

• iv • 



四、 氨基 酸直接 分析法 55 

第七节 结 语 • 55 

##讀 56 

第四章 蛋白 质和多 肽的氨 基酸序 列测定 57 

第一节 N 端分 析原理 57 

一、 繊 57 

二、 藝 57 
三靴 58 
四、 PTH- 氨基酸 的鉴定 58 

第二节 N 端 蛋白质 序列仪 58 

一、 液相 旋转杯 序列仪 58 

二、 固 相序列 分析仪 59 

三、 气相 序列仪 59 

第三节 影响 N 端 Edman 反应 裂解率 的因素 60 

第四节 测 序前样 品处理 62 

一、 纯 度鉴定 62 

二、 艇 62 

三、 巯基修 饰方法 62 

四、 去除 N 端封闭 的基团 的方法 63 

第五节 手工 N 端测序 64 

第六节 C 端序 列分析 67 

一、 C 端分 析原理 67 

二、 C 端 蛋白质 序列仪 69 

三、 C 端测序 的样品 前处理 69 

四、 影响 C 端测 序反 应产率 的因素 72 

五、 结语 和展望 72 

##讀 73 

第五章 薄层等 电聚焦 74 

第一节 原理 74 

第二节 薄层 IEF 75 

一、 雌 75 

二、 试剂 和储存 液配制 75 

三、 制 胶模具 的准备 75 

四、 凝胶 的制备 76 

五、 加样 76 

六、 电泳 76 

七、 染色 和脱色 76 

八、 凝 胶保存 77 

第三节 等 电聚焦 中的注 意事项 77 



第四节 lEF 的 优缺点 77 

第五节 实例 78 

79 

第六章 SDS- 聚丙條 酰胺凝 胶电泳 80 

第一节 概况 80 

第二节 材料 80 

一、 设备 和材料 80 

二、 翻 81 

第三节 基本操 作步骤 81 

一、 聚胶 前准备 81 

二、 不 连续系 统下层 分离胶 的聚合 81 

三、 不 连续系 统中的 上层浓 縮胶和 连续系 统凝胶 的聚合 82 

四、 加样 82 

五、 电泳 82 

六、 染色 和脱色 82 

七、 干胶 84 

第四节 几种 不同凝 胶电泳 系统及 其应用 84 

一、 Leammli 系统 84 

二、 大孔 胶系统 86 

三、 Tris~Tricine 系统 87 

第五节 注 意事项 , 88 

一、 形成 凝胶的 试剂要 有足够 的纯度 : 88 

二、 激活剂 的用量 89 

三、 温度 的影响 90 

四、 氧气 的影响 … 90 

五、 凝胶 添加剂 90 

六、 聚 胶时间 90 

七、 单体 的浓度 %T,%C 90 

八、 操作 注意点 90 

^^Xm 91 

第七章 液 相电泳 92 

第一节 毛细 管电泳 92 

—、匿 92 

二、 漏 95 

三、 基本操 作步骤 96 

四、 毛细管 电泳分 离模式 及应用 97 

五、 注 意事项 104 

六、 结束语 104 

第二节 连 续自由 流电泳 1()5 



—、籠 105 

二、 材料 109 

三、 自由流 电泳操 作步骤 110 

四、 分 离模式 111 

五、 自由 流电泳 的应用 113 

六、 自 由流电 泳在微 重力下 的特点 115 

七、 展望 ; 116 

第三节 液相等 电聚焦 117 

—、旋 转式等 电聚焦 117 

二、 循 环式等 电聚焦 119 

三、 制 备型连 续流等 电聚焦 122 
参 考文献 123 

第八章 高效液 相色谱 127 

第一节 高效 液相色 谱的类 型及分 离原理 127 

第二节 高效液 相色谱 的装置 131 

一、 输 液系统 131 

二、 进 样系统 132 

三、 分 离系统 132 

四、 检 测系统 136 
第三节 各类高 效液相 色谱应 用实例 137 

一、 反相 高效液 相色谱 137 

二、 高效 离子交 换色谱 • 138 

三、 高效 疏水作 用色谱 138 

四、 高效排 阻色谱 138 

五、 高效亲 和色谱 139 

第四节 讨论 140 

参 考文献 142 

第九章 质谱 144 

第一节 引言 …… 144 

第二节 四极 和离子 讲质谱 144 

― 、 四极 质谱仪 (quadrupole mass spectrometry) 144 

二、 四 极离子 讲质谱 (quadrupole ion trap mass spectrometry) 147 
第三节 飞行时 间质谱 154 

第四节 傅里 叶转换 回旋共 振质谱 160 

—、基 本原理 160 

二、 质量分 辨率、 质量精 度和质 量范围 163 

参 考文献 165 

第十章 毛细管 电泳- 质 谱联用 167 

第一节 介绍 167 

• vii • 



—、籠 167 

二、 CEWS 联用 的接口 169 

三、 其他联 用方式 172 

四、 CE/MS 的限制 性因素 及其改 进方法 173 

五、 应用 177 
第二节 材料 179 

一、 试剂 和溶剂 …'- , 179 

二、 多肽和 蛋白质 180 

三、 稱 180 

四、 仪器 181 

第三节 方法 181 

一、 胰蛋白 雜酸解 181 

二、 血 红蛋白 的脱盐 和纯化 181 

三、 蛋白憐 酸藤去 磷酸化 181 

四、 蛋白 质二硫 键的接 酰胺甲 基化及 产物的 HPLC 纯化 和蛋白 酶酷解 182 

五、 糖苷 SSF 解解 182 

六、 a- 甘 露糖苷 酵薛解 182 

七、 正 离子非 共价涂 层毛细 管电泳 182 

八、 毛细管 电泳- 质 谱联用 182 

九、 蛋 白质序 列数据 库搜索 • 183 

十、 特殊肽 段的选 择性离 子监测 184 

十一、 毛细管 等电聚 焦-质 谱联用 184 

第四节 结果 185 

一、 多肽和 蛋白质 的分析 与鉴定 - 185 

二、 蛋白质 点突变 的鉴定 190 

三、 蛋白质 磯酸化 的鉴定 193 

四、 蛋白质 N- 糖基化 和氧化 的鉴定 194 

五、 蛋白质 混合物 的毛细 管等电 聚焦- 质谱联 用分析 199 

第五节 展望 203 

参 考文献 203 

第 十一章 毛 细管电 泳在蛋 白质磯 酸化和 糖基化 分析中 的应用 208 

第一节 毛 细管电 泳分析 多肽和 蛋白质 磷酸化 208 

―、 简介 208 

二、 材料 209 

三、 im 209 

四、 结果 和讨论 210 

第二节 毛细管 电泳分 析单糖 和寡糖 212 

―、 Wi^ 212 

二、 材料 : 216 

• viii • 



三、 方法 216 

四、 结果 和讨论 217 

第三节 毛细管 电泳分 析糖蛋 白微不 均一性 221 

—、敵 221 

二、 材料 223 

三、 方法 223 

四、 结果 和讨论 223 

第四节 结语 和展望 225 

参 考文献 226 

下篇 蛋白 质组学 

第 十二章 导论 233 

一、 蛋 白质组 学研究 的历史 和背景 233 

二、 蛋白 质组学 的特点 与难点 234 

三、 蛋白质 组学发 展趋势 239 
参 考文献 240 

第 十三章 样 品的全 息制备 242 

第一节 双 向凝胶 电泳常 规样品 制备及 其改进 242 

一、 概述 242 

二、 样品裂 解液中 各种成 分分析 243 

三、 双向凝 胶电泳 常规样 品制备 245 

四、 蛋白 质顺序 提取法 245 

五、 注 意事项 246 

第二节 培养细 胞蛋白 质样品 的制备 246 

一、 细胞破 碎的处 理方法 246 

二、 培养 细胞总 蛋白质 的提取 247 

第三节 组织样 品制备 249 

一、 概述 249 

二、 动物组 织样品 的制备 249 

三、 植物组 织样品 的制备 260 

四、 注 意事项 261 

第四节 分 泌蛋白 质样品 的制备 261 

一、 真核 细胞的 分泌蛋 白质样 品制备 262 

二、 细菌 分泌蛋 白质样 品制备 263 

第五节 体 液蛋白 质样品 的制备 263 

一、 血 清蛋白 质样品 的制备 263 

二、 脑脊 液蛋白 质样品 的制备 264 

三、 总结 265 

参 考文献 265 

• ix • 



第 十四章 双向凝 胶电泳 269 

第一节 介绍 269 

一、 双向 凝胶电 泳简介 269 

二、 1PODALT 双向凝 胶电泳 270 

第二节 试剂、 设 备和溶 液配制 275 

一、 试剂 275 

二、 仪器 275 

三、 溶 液配制 • 276 

第三节 实 验操作 277 

—、样 品制备 277 

二、 蛋白 质定量 278 

三、 双向凝 胶电泳 279 
第四节 胶上 蛋白质 的检测 280 

―、 介绍 280 

二、 染 色方法 283 

参 考文献 286 

第 十五章 电泳图 谱的图 像分析 290 

第一节 介绍 • 290 

第二节 PDQuest 软 件简介 290 

第三节 PDQuest 软件 的使用 • 291 

―、 腿 291 

二、 方法 292 

第四节 双 向凝胶 电泳软 件的实 际应用 299 

一、 双 向凝胶 电泳的 重复性 和定量 定性差 异分析 299 

二、 双向凝 胶电泳 矢量图 304 

第五节 双向 凝胶电 泳数据 库和网 上比较 305 

―、 双 向凝胶 电泳网 络数据 库资源 305 

二、 双向凝 胶电泳 数据库 的构建 308 

三、 双向 电泳凝 胶的网 上比较 309 

参 考文献 310 

第 十六章 生物质 谱技术 和蛋白 质鉴定 311 

第一节 生 物质谱 基本原 理和工 作模式 311 

第二节 质 谱法分 析完整 蛋白质 和多肽 316 

第三节 质谱 法对蛋 白质和 多肽一 级结构 的分析 及鉴定 317 

一、 质谱 分析多 肽序列 的原理 317 

二、 质谱法 结合数 据库检 索对多 肽和蛋 白质进 行鉴定 318 

三、 多肽从 头测序 325 

第四节 质谱 前蛋白 质或多 肽样品 制备方 法和关 键步骤 328 

参 考文献 335 

' X • 



第 十七章 蛋白质 组研究 中的定 量方法 340 

第一节 介绍 340 

—裏 340 

二、 化学 标记定 量方法 341 
第二节 材料 346 

一、 试剂 和溶剂 346 

二、 多肽、 蛋白质 和细胞 347 

三、 仪器 347 

第三节 方法 347 

第四节 结果 和讨论 349 

第五节 展望 356 

参 考文献 356 

第 十八章 蛋白质 组研究 中的翻 译后修 饰分析 358 

第一节 磯酸化 蛋白质 组研究 358 

―、 ift-m 358 

二、 材料 369 

三、 法 370 

四、 结果 371 

五、 展望 372 

第二节 糖基化 蛋白质 组研究 374 

—、魏 374 

二、 材料 383 

三、 方法 383 

四、 结果 和讨论 384 

五、 展望 388 

参 考文献 389 

第 十九章 亚细 胞蛋白 质组学 394 

第一节 概论 394 

一、 亚 细胞蛋 白质组 学内涵 394 

二、 亚细 胞蛋白 质组学 的意义 395 

三、 亚 细胞蛋 白质组 学的技 术基础 396 

四、 亚细胞 蛋白质 组学研 究进展 404 

五、 总结 405 

第二节 细 胞膜的 蛋白质 组学研 究进展 406 

一、 细胞膜 的结构 与功能 406 

二、 膜 蛋白质 的特点 406 

三、 膜蛋白 质的双 向凝胶 电泳技 术研究 407 

四、 膜 蛋白质 的非双 向凝胶 电泳技 术研究 408 

五、 总结 408 

• xi ' 



第三节 高 尔基体 蛋白质 组学研 究进展 408 

一、 高 尔基体 的结构 和功能 408 

二、 高尔基 体的蛋 白质组 学研究 409 

三、 蛋白质 组学研 究发现 新的高 尔基体 蛋白质 410 

四、 不同 功能状 态高尔 基体的 比较蛋 白质组 学研究 410 

五、 总结 411 

第四节 核孔 复合体 蛋白质 组学研 究进展 411 

一、 核孔 复合体 的结构 和功能 411 

二、 酵母 核孔复 合体蛋 白质组 学研究 412 

三、 哺 乳动物 核孔复 合体蛋 白质组 学研究 413 

四、 总结 413 

第五节 核仁 蛋白质 组学研 究进展 414 

―、 核仁 的结构 与功能 414 

二、 核仁的 蛋白质 组学研 究进展 415 

三、 , &g 415 

第六节 线 粒体蛋 白质组 学研究 415 

一、 线粒体 蛋白质 组学研 究进展 416 

二、 材料 420 

滅 421 

m. 422 

第七节 展望 422 

参 考文献 -- 424 

第 二十章 蛋 白质组 研究中 的非凝 胶技术 432 

第一节 概况 432 

第二节 非 凝胶色 谱技术 一• 433 

—、一 维色谱 及其与 质谱联 用技术 433 

二、 多 维色谱 及其与 质谱联 用技术 435 

. 第三节 非凝 胶电泳 •• 439 

一、 液相等 电聚焦 439 

二、 毛细 管电泳 444 

第四节 毛 细管电 色谱及 其在蛋 白质组 学研究 中的初 步应用 444 

一、 毛细 管电色 谱简介 444 

二、 毛 细管电 色谱在 蛋白质 和多肽 分离中 的应用 448 

第五节 展望 449 

参 考文献 450 

第二十 一章 蛋 白质相 互作用 和蛋白 质芯片 456 

第一节 蛋 白质相 互作用 456 

―、 概 456 

二、 蛋白 质相互 作用研 究策略 和方法 457 

• xii • 



b. 



三、 结语 467 

第二节 蛋白 质芯片 467 
―、 蛋白 质芯片 的分类 468 

二、 蛋 白质芯 片的检 测方法 471 

三、 蛋白质 芯片技 术的应 用及发 展前景 472 
参 考文献 473 

第二 十二章 蛋白质 组生物 信息学 477 

一、 大规模 蛋白质 组学实 验信息 的产生 477 

二、 将实 验信息 处理成 具有生 物学意 义的实 验结果 477 

三、 对实 验结果 的分析 491 

四、 实验室 信息管 理系统 506 

五、 总结 507 

参 考文献 507 

第二 十三章 蛋白质 组学在 各领域 的应用 511 

第一节 蛋白质 组学在 微生物 研究中 的应用 511 

一、 概述 511 

二、 蛋白 质组学 在模式 微生物 研究中 的应用 512 

三、 蛋白 质组学 在病原 微生物 研究中 的应用 515 

四、 展望 521 

第二节 蛋白 质组学 在肿瘤 研究中 的应用 521 

第三节 蛋 白质组 学在神 经系统 研究中 的应用 528 

—、胸 528 

二、 应 用举例 529 

第四节 蛋白 质组学 在体液 研究中 的应用 534 

―、, 534 

二、 体液的 蛋白质 组学研 究现状 536 

三、 展望 544 

第五节 蛋 白质组 学在其 他领域 的应用 545 

一、 蛋白 质组学 在植物 研究中 的应用 545 

二、 蛋白质 组学在 药物开 发方面 的研究 547 

三、 结语 548 

参 考文献 548 

后记 559 



• xiii • 



I 



第一章 蛋白质 的表征 

第一节 蛋 白质结 构的基 本概念 

蛋白质 是一类 重要的 生物高 分子, 英文为 "Protein" ,该词 从希腊 文转化 而来, 意思是 

"最 原始 的", 可见当 时人们 对蛋白 质的认 识已有 相当的 基础。 

蛋白质 有成千 上万种 ,不 同的蛋 白质具 有不同 的生物 功能。 蛋 白质是 20 种 a- 氨基 

酸通过 醜胺键 (肽键 ) 联成 的长链 分子, 这种 长链即 所谓的 肽链。 许 多蛋白 质还包 含有非 
肽链结 构的其 他组成 成分, 这种成 分称为 配基或 辅基。 

作 为蛋白 质组成 成分的 氨基酸 一共有 20 种, 它们 的名称 和结构 列在表 1.1 中。 为了 

表达蛋 白质和 肽结构 的需要 , 每个 氣基酸 都有相 应的符 号表示 , 常用符 号通常 由 氣 基酸英 

文 名的三 个字母 组成。 一个 蛋白质 由上百 个甚至 上千个 氨基酸 组成, 为了 表达的 方便, 又 

设计 出单字 符号。 



表 1.1 存在 于蛋白 质中的 20 种常见 氨基酸 



氣基酸 


英文名 


三字 母符号 


单字 母符号 


tn 构 


残 ffi 分 f 质 M/l>a 


等电点 


丙氨酸 


alanine 


Ala 


A 


— NI+ (、H^ CX>- 
(、K、 

-NH— CH -('Q- 


71.08 


6.00 


精氨酸 


argnine 


Arg 


R 


(CH,),, 

NH 

1 

NH.— C=NH 
— NH— CH-CO- 

! 


156. ly 


10.76 


天 冬醜胺 


asparagiiie 


A.sn 


N 


CONH2 
— NH— CH— C^O— 


114.10 




天 冬氨酸 


aspartic acid 


Asp 


D 


CH2 
COOH 


115.09 


2.77 


天冬 酷胺或 

天 冬氧酸 




Asx 


B 








半 胱氨酸 


cysteine 


Cys 


C 


— NFi-CH— CXJ— 

CH2SH 

— NI^CH -CO— 
1 


103.14 


5.07 


谷氣酸 


glutamic acid 


Glu 


E 


CH, 
1 一 

CH.— ax)H 


129.12 


3.22 



3 



续表 



氨基酸 英文名 三字 母符号 单字 母符号 结 构 残基分 子质量 /Da 等电点 



谷氣 酷 胺 glutamine Gin Q 
谷 i [酸或 

谷 氨跣胺 Z 

甘氨酸 glycine Gly G 

组筻酸 histidine His H 

异 亮氧酸 isoleucine lie I 

亮氨酸 leucine Leu L 

赖氨酸 lysine Lys K 

甲 硫氨酸 methionine Met M 

苯 丙氨酸 phenylalanine Phe F 

脯氧酸 proline Pro P 

丝氨酸 serine Ser S 

苏氨酸 threonine Thr T 

色氨酸 tryptophan Trp W 



128.13 

57.05 5.97 
137.14 

113.16 6.02 

113.16 5.98 

128.17 9.74 
131.19 5.74 

147.18 5.48 

97.12 6.30 

87.08 5.68 

101.11 6.16 

186.21 5.89 



-NH— CFf-CO— 
I 

CHz 

CH2— CONH2 

-Nf^CH2— CO— 
-NH— CH— CO— 
CH, 



-N 



-NP^CH— CO— 
I 

CH— CH3 
CH2— CH3 
-NH— CH— CO— 
CH2 

CH— CH3 

I 

CH3 

-NF^CH— CO— 

I 

JCH2)4 

NH2 

-NH— CH— CO— 
I 

(CH2), 

S— CHj 
-NH— CH— CQ- 



CH2 



■N-CH— CO- 



-NH— CH— CC>- 
CHOH 
CH3 

-NH— CH— CO- 

I 

nrCH2 

N 



rs2 



续表 



氨基酸 英文名 三字 母符号 单字 母符号 结 构 残基分 子质量 /Da 等电点 



酷氨酸 tyrosine Tyr Y 



缬 il 酸 valine Val V 



163.18 5.66 



99.13 5.96 



除了表 1.1 列出的 20 种基 本氨基 酸外, 实 际上还 有几百 种不常 见的氨 基酸参 与某些 

蛋白质 的组分 ,可称 为稀有 氨基酸 ;另一 些氨基 酸出现 频率要 高些, 如经脯 氨酸、 甲 基组氨 

酸和 甲基赖 氨酸、 7- 羧基谷 氨酸等 ,但 它们是 在蛋白 质生物 合成后 转变而 来的, 因 此不计 
人基本 氨基酸 之列。 

蛋白 质的化 学结构 如下: 

H H H H 



NH,—— C——C 



R, 



N——C— C 



H Ro 



N— C— C, N— C— COOH 



H R, 



H R. 



N 端 



舦键 



残基 



C 端 



这是一 个链状 的结构 ,经水 解后, 将肽键 断裂, 转变 成一系 列的氨 基酸。 链中 相当于 
氨 基酸的 单元结 构称为 残基。 而上述 链称为 肽链。 肽链的 氨基一 端称为 N 端或氨 基端, 
羧基一 端称为 C 端或羧 基端。 习 惯上将 N 端列在 左边, C 端列在 右边。 

从氨基 酸的结 构看, 半胱 氨酸的 侧链上 有琉基 (一 SH)。 巯基的 稳定性 较差, 在碱性 
pH 下易氧 化成硫 一硫键 (或称 二硫键 )。 如果 一条肽 链上的 两个半 胱氨酸 的琉基 形成二 
硫键, 肽 链形成 链内二 硫键。 假如两 条肽链 间形成 二硫键 ,就 出现由 两条肽 链组成 的蛋白 
质 (如 胰岛素 )。 蛋白质 分子有 两对以 上的二 硫键, 或 者是蛋 白质分 子有一 对二硫 键和一 
个半胱 氨酸, 二硫 键可能 有不同 的连接 方式, 于是出 现了异 构体。 异 构体的 数目因 半胱氨 
酸含 量不同 而异, 但是 在天然 的蛋白 质分子 中没有 这种异 构体, 只有一 种连接 方式。 而在 
重 组蛋白 质的复 性中, 可能出 现二硫 键的错 配对。 

肽链由 许多氨 基酸通 过肽键 (相邻 两个氨 基酸脱 去一分 子水) 连接 而成。 20 种氨基 
酸 前后沿 一定的 排列次 序形成 特定的 结构。 当 氨基酸 组成及 它们的 排列次 序和长 短不同 
时, 就形 成了不 同的蛋 白质; 或者, 不同的 蛋白质 有特定 的氨基 酸序列 ,这种 序列是 蛋白质 
化学结 构的最 重要的 内容。 

蛋白 质分子 中还有 非肽链 结构的 部分, 有些也 通过共 价连接 (糖 基化、 磯酸化 等), 有 
一些 是通过 非共价 结合的 (辅基 或配基 )。 

根据 蛋白质 结构有 不同的 层次, 可分别 称之为 蛋白质 的一级 结构、 二级 结构、 三级结 
构 及四级 结构。 





一级结 构是指 肽链中 的氧基 酸排列 序列, 二硫键 的定位 也是一 级结构 的重要 内容。 

下 面是猪 胰岛素 A 链的 一级结 构的两 种表示 形式: 

GIVEQCCASVC SLYQLENYCN 

蛋白 质的二 级结构 也可称 为构象 单元, 因 为它们 是蛋白 质复杂 的空间 构象的 基础。 
常见的 构象单 元有: a- 螺旋; [3- 折叠; (3- 转角; 无规则 卷曲。 一些构 象单元 的结构 不是不 
可改 变的, pH 、温度 、溶 剂极性 等环境 因素可 以影响 单元的 变化。 

具有二 级结构 的肽链 在空间 走向, 形成具 有空间 三级结 构的蛋 白质, 如所谓 球蛋白 
类, 它们 几乎都 有生物 功能和 活性, 其中 有些还 能进一 步相互 作用, 形成更 高层次 的结构 C 
蛋白质 之所以 有功能 ,是 因为分 子表面 有可以 进一步 作用的 基团, 不 同的蛋 白质由 于分子 
表面结 构不同 ,可作 用的基 团分布 和组合 也不同 ,这种 特定的 结构就 是各种 蛋白质 具有不 
同 的功能 和活性 的分子 基础。 

四级结 构可以 认为是 一些特 定三级 结构的 折叠肽 链通过 非共价 键而形 成的大 分子体 
系, 也可称 为亚基 的装配 (assembly)。 装 配是一 个非常 复杂的 过程, 它能使 各亚基 间相互 
调节, 使 蛋白质 分子的 功能更 完善。 

蛋白质 的分离 纯化是 研究蛋 白质的 基础和 起点。 蛋白 质的来 源是多 样的, 主 要来自 
动物、 植物的 各种组 织和微 生物, 取材要 采用含 量丰富 的器官 ,这 有时还 和季节 有关; 近年 
来, 还来 自基因 工程的 方法。 、 

抽提蛋 白质的 第一步 是将组 织粉碎 ,破坏 细胞, 以 便于抽 提出蛋 白质; 抽提液 的选择 
也因 蛋白质 而异。 一般 用低浓 度的缓 冲液, 有时 在从肌 肉抽提 时也用 稀碱, 因肌肉 中含有 
乳酸, 最后抽 提液的 pH 却是中 性的。 在提 取膜蛋 白或包 含体内 的蛋白 质时, 还加入 (非 
离 子型) 表 面活性 剂或变 性剂以 增加溶 解度。 各种 细胞中 普遍存 在各种 蛋白水 解酶, 会导 
致蛋 白质的 降解, 低 温操作 和加一 些相应 蛋白酶 抑制剂 (如 DFP、PCMB、PMSF 等)、 螯合 
剂 (EDTA 等) 是有 益的。 

将蛋白 质抽提 出来后 ,就要 进一步 纯化。 纯化不 外乎两 方面: 一 是将大 体积变 成小体 
积; 二是 把多组 分蛋白 质只留 下单一 种的蛋 白质。 前 者有吸 附法、 超滤法 [ 1 ] 、冻 干等。 后 
者有 根据蛋 白质的 分子形 状和分 子质量 大小、 电离 性质、 溶解 度和疏 水性、 生物功 能专一 
性等, 常用 有各种 盐析法 [ 2 3、 超离心 沉降、 结晶 [3] 、电泳 、凝胶 过滤, 离 子交换 色谱、 亲和色 
谱等。 近年来 发展的 FPLC 和 HPLC 大大促 进了许 多蛋白 质在毫 克级的 纯化, 其 量足够 
用于 蛋白质 的化学 研究。 一些新 型无载 体的液 相电泳 的发展 [4 , 5] ,能在 数十毫 克到数 
克水平 上制备 蛋白质 ,并 开拓了 一个新 领域。 精制蛋 白质的 技术将 在本书 有关章 节中阐 
述。 

第二节 蛋白质 的纯度 

蛋白质 的纯度 是一个 重要的 指标, 尤其 在重组 蛋白的 质量控 制中。 但 它也是 一个相 
对的 指标, 而纯 度要求 95% 、99% 或 99.9% 需根 据实际 要求而 制定。 正如 化学试 剂有化 
学纯、 分析纯 、光谱 纯等, 蛋 白质的 纯度一 般指是 否含有 其他杂 蛋白, 而不包 括盐、 缓冲液 
离子、 十 二烧基 硫酸钠 (SDS) 等 小分子 在内。 一 些蛋白 质在硫 酸铵糊 中相当 稳定, 一些酶 



在甘 油中保 存则很 稳定。 而 在遗传 工程产 品中, 却要考 虑这些 小分子 的存在 与否。 
蛋白质 纯度如 用百分 数表示 ,有时 还和检 测方法 、定量 方法、 所选 用仪器 的参数 有关。 

例如在 HPLC 分析蛋 白质纯 度时, 一般 要求以 280nm 检测, 这是 蛋白质 的吸收 高峰, 而很 
可能 不是非 蛋白质 杂质的 紫外吸 收峰, 甚至 小分子 物质在 280nm 处没有 吸收, 因 此都以 
280nm 的光吸 收来定 量处理 ,检测 不到非 蛋白质 杂质和 小分子 物质的 存在, 表明 所得的 
蛋白质 纯度会 偏高。 

在 色谱中 普遍采 用积分 面积的 方法, 这也不 是很妥 当的。 而 且在用 计算机 或积分 
仪在线 检出时 ,仪器 的参数 设置与 所得的 报告很 有关系 ,设 置不妥 往往导 致结果 不够准 
确。 

目 前常用 的鉴定 蛋白质 纯度方 法有: ①聚丙 浠酰胺 凝胶电 泳和十 二焼基 硫酸钠 -聚丙 
'烯 酰胺凝 胶电泳 (SDS-PAGE); ②毛细 管电泳 (CE); ③等 电聚焦 (IEF); ④ 高效液 相色谱 
(HPLC) ,包 括凝胶 过滤、 各种反 相色谱 、离子 色谱、 疏水色 谱等; © 质谱 (MS) 。 

一些新 的有效 方法也 在引入 分析蛋 白质的 纯度, 如质 谱等。 由 于它测 定分子 质量的 
精确度 可达万 分之一 ,因此 丢失一 个氨基 酸残基 (平 均分子 质量约 llODa) 就可以 检出; 如 
有氨基 酸的取 代形成 突变株 (可能 分子质 量有几 十道尔 顿的差 异), 也非常 容易被 发现。 

此外, 还有 一些化 学法, 例 如观察 末端或 C 端是否 均一, 也是相 当有效 的方法 ,有时 
甚至比 常用的 HPLC 更 有效。 比如 有一个 产品在 HPLC 中已是 一对称 的峰, 该生 产单位 
认为是 100% 纯, 但在蛋 白质的 N 端分 析中指 出纯度 还不到 90% , 有一定 量的其 他蛋白 
质 存在。 

用末端 分析法 检査蛋 白质的 纯度, 在国内 目前还 没有引 起重视 ,其 实在测 N 端序列 
的同时 ,应该 也给出 N 端均 一性 (蛋 白质的 纯度百 分数) 的 数据。 

在遗传 工程产 品的鉴 定中, 又常 常发现 N 端是不 均一的 ,存 在着微 观不均 一性。 例 
如新型 白细胞 介素- 2( IL-2 , Ser-125 ) 的 N 端, 部分是 Ala-ProThr- Ser-Ser -… , 部 分携有 
Met ,故其 序列是 Met-Ala-ProThr-Ser …… 但一般 不影响 其生物 活性, 仍认 为是均 一的。 
但美国 Hoffmann-La Roche 同类产 品均为 Met-Ala-ProThr-Ser …… 

按照 严格的 要求, 用 电泳法 证明蛋 白质的 纯度, 在一种 pH 下电 泳说明 该蛋白 质是纯 
的, 这是 不够充 分的。 应该 取两种 pH 缓 冲液, 它们分 布在蛋 白质等 电点的 两侧, 在这两 
种 pH 下电 泳都证 明此蛋 白质是 纯的, 这样才 可靠。 

应该 指出, 只用一 种方法 鉴定蛋 白质纯 度是不 够的, 至少应 该用两 种以上 的方法 ,而 
且 是两种 不同的 分离机 理的方 法来判 断蛋白 质纯度 才比较 可靠。 因 为常常 发现某 一样品 
在凝胶 过滤中 是纯的 ,而 在离子 色谱中 却分辨 为两个 组分, 反之 亦然。 

又如, 一种 样品用 凝胶过 滤法和 SDS-PAGE 电泳 证明是 纯的, 但这仍 不充分 ,因为 
这两 种方法 的 机制 是相 同的。 

第三节 蛋白质 的定量 

测定蛋 白质的 量是研 究蛋白 质的最 基本的 一步, 而 对蛋白 质定量 方法的 原理、 适用范 
围、 灵 敏度和 可靠性 程度有 一些了 解是必 要的。 

往往 一些单 位在送 蛋白质 / 多肽 样品进 行氨基 酸组成 分析或 进行其 序列分 析时, 样品 



实 际浓度 和所报 (预期 ) 的浓度 有很大 的差异 ,甚 至有数 量级的 差异, 以致上 样品量 太少而 
无法 分析, 造 成人力 、时间 、费 用上的 浪费。 

更有 甚者, 根据一 些片面 数据, 没有测 定蛋白 质浓度 ,进 行光谱 和定量 氨基酸 分析, 就 
断言所 得的样 品是蛋 白质。 因此, 蛋白质 的定量 看来是 "小事 "一桩 ,但却 是最基 本的要 
事, 如不 重视, 会在根 本上出 问题。 

溶液中 蛋白质 的浓度 测定方 法很多 ,最早 的经典 方法是 克氏定 氮法, 因 为每一 种蛋白 

质 都有其 恒定的 含氮量 (14%〜16%)。 其方法 是将一 定量的 蛋白质 用浓硫 酸消化 分解, 
使 其中的 氮变成 铵盐, 再与浓 NaOH 作用, 使氨气 放出而 被吸收 于标准 酸液中 ,用 反滴定 
法滴 定残余 的酸, 或用 硼酸吸 收后, 再 用标准 酸直接 滴定, 求得该 蛋白质 样品中 的含氮 

M[6,7] 
C 

此法 虽有普 遍性, 但操作 繁琐, 目 前应用 较少。 稍 后应用 较广泛 的方法 是双縮 脲法、 
福林- 酚法和 紫外吸 收法, 近年来 大多数 人用考 马斯亮 蓝法。 

选择 哪一种 方法, 一般 考虑的 原则是 准确、 操作 方便、 影响因 素少。 

一、 光 吸收法 

蛋 白质在 280nm 左右 有吸收 高峰, 这主 要是由 于蛋白 质中的 芳香族 氨基酸 (Trp 和 
Tyr) 的缘故 ,因此 可以用 280nm 光吸收 值来定 量溶液 中的蛋 白质。 但是每 种蛋白 质中的 
芳 香族氨 基酸含 量是不 同的, 而且有 较大的 差别。 最简单 的方法 是采用 280nm 光 吸收为 
1 时等于 Img/ml 来 计算。 这样简 单的处 理在准 确性上 有不足 之处, 但其 测定时 间短, 用 
量极少 ,而且 不消耗 样品, 故 被广泛 采用。 

考虑 到蛋白 质样品 中可能 含有少 量核酸 类杂质 ,因 此采用 280nm 和 260nm 光 吸收以 
下式 计算。 

蛋白质浓度(1113/1111) = 1.45卢280"111 - 0.74 A 260 nm - 

最准确 的方法 是用蛋 白质的 摩尔消 光系数 计算。 在蛋 白质纯 化后, 将 此纯的 蛋白质 
对 水充分 透析, 然后冻 干或在 真空干 燥器中 干燥, 继而在 105€ 下恒重 ,精 确称量 1〜 
lOmg ,再 定量溶 于一定 体积中 (通 常为 Img/ml) ,测量 280nm 下的光 吸收, 从而得 出该蛋 
白 质的摩 尔消光 系数。 这种方 法最为 方便、 准确, 适 于微量 测定。 

二、 双 缩脲法 

此法是 基于蛋 白质之 肽键一 CO~NH —有 双缩脲 反应, 在 碱性溶 液中与 Cu 2 + 络合显 
蓝色 [ s ] 。 该法受 蛋白质 之特异 性影响 较小, 适用于 较大量 蛋白质 (毫 克级) 的 测定。 

二、 福林- St 法 

此法灵 敏度和 准确性 都较高 ,但 操作较 繁琐, 此外, 影 响因素 (譬 如去^ 剂干扰 这一方 

法) 也较多 [9]。 

- 8 • 



Smith[iD ] 提出一 种新的 BCA 测定蛋 白质的 方法, 灵敏度 和重复 性均佳 ,受干 扰少, 
Pierce 公司 有商品 供应。 

四、 考马 斯亮蓝 G-250 法 

此 法适合 于定量 10〜10(Vg ,操作 简单, 应用 广泛。 考马 斯亮蓝 O250 又叫" home^ 
made" 试剂 [11] 每个实 验室可 以方便 地自行 配制。 

五、 氨基酸 分析法 

此法很 准确, 最接近 真实值 ,因 为其他 方法都 用一个 已知的 纯蛋白 (大 多数情 况下采 
用牛 血清白 蛋白, BSA) 作一标 准曲线 ,将 待测蛋 白与之 相比, 实际上 两种蛋 白质的 芳香族 
氨 基酸含 量不完 全一样 , 所 以会产 生系统 误差。 而用氨 基酸分 析来计 算是测 得该蛋 白 真 
实值, 但稍偏 低一点 ,因为 蛋白质 在酸水 解时, Trp 被 破坏, Cys 也遭 受很大 破坏, Ser 和 
Thr 回 收也在 90% 左右。 

上述方 法的操 作细节 可参见 《蛋 白质化 学研究 技术》 [7] 和 《蛋 白质 和酶学 研究方 
法》 [12]。 

第四节 蛋白质 的脱盐 (除去 盐和非 共价结 合的小 分子) 

蛋白 质溶液 中的大 多数盐 和低分 子质量 的物质 可以对 O.lmol 几 NaCl 透析而 除去, 
然 后再对 水充分 透析。 如果用 过甲酸 处理过 的样品 ,由于 缺少^ 原子, 所以 先用其 他盐或 
缓冲液 透析, 如挥发 性的乙 酸铵、 稀的乙 酸或碳 酸氛铵 ,然 后再对 水透析 或直接 冻干。 

用凝胶 过滤法 (Sephadex G-25 或 类似的 介质) 和 HPLC 的 凝胶柱 脱盐。 应用 这类技 
术时 首先要 考虑蛋 白质的 回收, 特别对 少量蛋 白质, 尤其是 碱性蛋 白质, 则 常常因 载体对 
蛋白质 的吸附 作用而 导致回 收差。 此时的 流动相 一般不 能用水 ,而 推荐用 O.lmol/L 醋 
酸或 O.lmol/L 碳酸 复铵, 因为 可以在 冻干过 程中除 去这些 挥发性 的盐。 

在蛋白 质纯化 的最后 阶段, 常 用挥发 性溶剂 (例 0.196TFA/ACN)的反相HPLC,则 
可得到 无盐的 蛋白质 样品, 在我们 实验室 常用此 法于蛋 白质序 列分析 中净化 样品。 如果 
对某 些蛋白 质的回 收低, 建议 用短柱 (例 PE-ABD 公司的 RP-300 柱 , 30mm x 2 . 1mm) 较 
为 理想。 

比 HPLC 更简 单的方 法是用 C-18 的 Sek-Pak ,或用 Millipore 公司的 超滤离 心过滤 
管, 但耗费 较大。 

如 果蛋白 质是用 SDS-PAGE 纯化的 ,则 非共价 结合的 分子往 往可以 有效地 除去, 但 
又 引人了 SDS 和 其他一 些分子 (Tris,Glycine 等)。 从 SDS- PAGE 电 泳的凝 胶中回 收蛋白 
质的方 法很多 ,但 不尽如 人意。 如 采用电 印迹, 往往很 有效。 因为 PVDF 膜结合 蛋白质 
的亲和 力大大 高于盐 、去^ 剂等 小分子 物质, 从而达 到蛋白 质脱盐 的目的 [ 1 3 ,1 4] 。 

Stone 推荐用 TCA 沉淀蛋 白质而 脱盐, 蛋白 质浓度 >10(Vg/ml (如果 蛋白质 浓度太 
低, 得不到 沉淀, 这时可 用真空 离心浓 缩蛋白 质的方 法), 加 总体积 1/9 的 100%TCA, 

• 9 • 



TCA 最后 浓度为 10%, 在冰 浴放置 30min 后离心 收集沉 淀物, 用 lOO^d 冷丙酮 洗两次 ,气 

流干燥 [1 5] 。 

Stone 还 建议用 丙酮 沉淀法 , 1 ml 以 下的蛋 白质对 . 05 % SDS,5mmol/L NH4HCO3 充 
分透析 ,然后 转移到 1.5ml Eppendorf 管中真 空离心 干燥; 加 50/^1 水; 再加 450^d Immol/L 
HCl 的酸性 丙酮, 在 -20t: 放置 3h ,离 心收集 沉淀, 用 10(^1 冷丙酮 洗沉淀 两次, 气流干 

極 [15] 

注意: 如果 SDS 的 量大于 0.05% , 则 SDS 易与 蛋白质 形成共 沉淀。 

金属离 子或辅 酶往往 和蛋白 质紧密 结合, 这 可将蛋 白质变 性后用 透析法 除去。 

第五节 蛋 白质的 分子质 量测定 

蛋白质 分子质 量的测 定早期 采用超 离心分 析和光 散射法 ,这需 要较高 级的专 用仪器 
和较多 量的蛋 白质的 样品, 目 前应用 很少。 

二十 多年前 采用凝 胶过滤 法测定 蛋白质 的分子 质量' 6 3, 应 用最广 泛的是 Sephadex 
列 (O75.O100) 等。 近年来 由于解 决了分 离介质 的刚性 问题, 有了 HPLC 的凝胶 过滤系 
统 (例如 Waters 的 1-60、 1-125、 1-250 和 Beckman 或 Toyo Soda 的 TSK2000SW , 3000SW , 
4000SW) ,这 样测定 分子质 量只需 Ih 即可。 

但在一 般实验 室应用 的常规 方法是 SDS-PAGE [ i 7] ,原理 是在 SDS 存在条 件下, 蛋白 
质表面 都携带 了大量 负电荷 ,呈杆 状分子 ,在此 情况下 ,不是 根据蛋 白质的 电荷而 是根据 
其分 子形状 和大小 来进行 分离。 用量为0.1〜1^^8,这种方法误差为596〜10%,但极为简 
便。 

凝胶 过滤是 测定完 整蛋白 质分子 的分子 质量, 而 SDS-PAGE 是 测定蛋 白质亚 基的分 
子质量 ,同时 用这两 种方法 测定同 一蛋白 质分子 质量, 可以方 便地判 断样品 蛋白质 是否寡 
聚蛋 白质。 

较新 方法是 用毛细 管电泳 (凝 胶筛分 或无胶 筛分) 测定 蛋白质 的分子 质量, 仅 需纳克 
量, 而且还 可用积 分仪或 电脑联 机精确 定量。 同时此 法对蛋 白质的 分辨率 和准确 性优于 
SDS-PAGE 方法。 在 某一批 IL-3 产品 的分子 质量测 定中, 用 SDS-PAGE 得到均 一的区 
带, 但在毛 细管筛 分电泳 中为两 个毗邻 的峰。 两个 峰的分 子质量 也有约 1 OOODa 的 差异, 
我 们进一 步用质 谱验证 了这一 结果。 

最新 的方法 是用质 谱测定 蛋白质 的分子 质量。 20 世纪 80 年代 初期, 质谱用 于测定 
分 子质量 的有快 原子轰 击质谱 (fast-atom bombardment mass spectrometry, FABMS) 和等 
离子 体解吸 飞行时 间质谱 (plasma desorption time-of- flight mass spectrometry) o 

近年来 ,高分 辨率的 磁质谱 可精确 测定分 子质量 2 OOODa 以下的 多肽。 到 90 年代, 
由 于电喷 雾质谱 (ESI) 有了 长足的 发展, 可以 用于测 定分子 质量约 5 万 Da 的蛋 白质, 而 
且只需 皮摩尔 (pmol) 量的蛋 白质, 且其精 度可达 0.01%。 而 MALDI-TOF 则可测 定蛋白 
质分子 质量高 达二三 十万道 尔顿。 图 1.1 所示为 ESI 质谱 测定细 胞色素 C 的分子 质量, 
右角是 其电荷 分布图 ,据 此计算 出分子 质量。 细 节可参 见相关 章节。 



10 



4 



I I— i> »,, M''',v,Vi], t ^VTT'r > Vffi^^ > |r,V , Yf!"!li;\V i *fTrrfrfyfM 



6000 



8000 



10000 



16000 



12000 14000 
分 子质量 /Da 

图 1 . 1 电喷雾 质谱法 测定细 胞色素 C 分 子质量 



18000 



20000 



第六节 蛋白质 的等电 点测定 



等电 聚焦法 可以测 定蛋白 质的等 电点, 同时又 能鉴定 蛋白质 的纯度 ,是 一种一 举两得 
的 方法。 严格讲 ,一 种蛋白 质只有 一个等 电点, 不同研 究小组 报道同 一种蛋 白质的 等电点 
有所 差别, 可能和 所用的 具体方 法不同 有关。 如我 们实验 室测定 重组人 表皮生 长因子 



天花 粉蛋白 

17.91 





一 r/min 

碳酸 RfiS 

il 核 糖核酸 》 A 37.00 
21.42 



P P 



m § 
《 s 
§5 d 



两性 屯解成 

'NaOH f 扰 



/3- 乳球 a 白 A 

, 40.12 

fltl« 收缩肽 

50.29 



1*4 j\ ^. 



o 



,/mm 




图 1.2 CIEF 测定 天花粉 蛋白的 等电点 

天花粉 蛋白的 等电点 测定; b. 标准蛋 白质的 等电点 测定; C. 左 侧二图 实验值 的作图 



12359.0 



8250 



+ 12 
1030 S 



+ 1( 

I 5|2' 



o oooooooooo 

o 9876543 ^-1 



11 



(rhEGF) 时, 用 Bio-Rad Mini-IEF 在聚 丙烯酰 胺凝胶 上测得 它的等 电点为 4.6[i 8 ], 而用全 
液 相的毛 细管等 电聚焦 (CIEF) 测 得其等 电点是 5.0[1 9 ]。 

人们常 常遇到 某一产 品用一 些方法 证明是 纯的, 但在等 电聚焦 分析时 出现较 多的条 
带, 对此众 说纷^ ,尚无 公认的 解释。 有 的专家 认为可 能是空 间构象 不同而 引起, 但还有 
待 实验来 验证。 

CIEF 测定 蛋白质 等电点 的另一 个优点 是能测 定偏碱 性的蛋 白质等 电点, 比如 天花粉 
蛋 白的等 电点被 测定为 10.10 [5 3。 

最近, 我 们实验 室发展 了毛细 管等电 聚焦电 泳-电 喷雾质 谱技术 (CIEF-MS), 这种技 
术 的等电 点分辨 率极高 (能分 辨的等 电点差 异小于 0.04pH 单位 )。 一些标 准样品 用这种 
方法分 析可发 现亚型 (分 子质 量完全 一样, 等电点 不同) 的 存在, 其中细 胞色素 C 两种 亚型 
的 等电点 分别为 9.60 和 9. 55, 差 异只有 0.05, 一般 的方法 根本无 法分辨 (图 1.3)。 



100 
90^ 
80 

70 

m 60 i 

^ 40 
30 
201 
10 




6.50 



细 胞色素 cl 

细 胞色素 c2 
Z 
J7.41 



肌 红蛋白 1 球蛋白 A1 

、.29 61.14 



肌红 
蛋白 2 




^乳 球蛋白 A2 
1^ 



10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 
t/m'm 



图 1.3 CIEF/ESI-MS 联用 分析标 准蛋白 混合物 

(使用 Pharmalyte3.5 — 10) 



第七节 氨 基酸定 量分析 - 

自从 SpackmaruStein 和 Moore 建立 氨基酸 自动分 析方法 以来, 无论在 方法学 、仪器 
自 动化或 高灵敏 度方面 都有了 很大的 发展。 氨 基酸分 析可以 分为柱 后反应 法和柱 前衍生 
法两 大类。 前一种 方法是 将游离 氨基酸 经过色 谱柱分 离后, 氨基 酸再与 显色剂 (茚 三酮、 
荧 光胺、 邻苯二 甲醛) 作用, 仪器需 用专门 的氨基 酸分析 仪或用 HPLC 加 上柱后 衍生装 
置。 这 种方法 比 较稳定 ,因为 一些可 能有影 响的" 杂质" 在柱 分离过 程中已 与氨基 酸分开 , 
然后再 各自与 显色剂 作用。 后一 种方法 是将各 种氨基 酸和荧 光试剂 先作用 生成氨 基酸的 
衍生物 ,然 后再用 柱把各 衍生物 分离, 直接 检测衍 生物的 荧光, 这种 方法的 特点是 灵敏度 
高, 检出极 限已达 1 prriol ,且可 以利用 HPLC 进行 氨基酸 分析, 譬如 OPA 技术。 缺 点是荧 
光强度 依赖时 间变化 ,稳定 性欠佳 ,要 求控制 很严格 [2 G ] 。 近年来 报道的 PITC 是 一种很 
有效的 柱前衍 生技术 , 并且可 以在 254nm 下检测 ,操作 简便, 作者也 作了一 些尝试 [ 2 i ] 。 

氨 基酸的 水解方 法通常 采用在 5.7mol/L HC1 真空 状况下 1101C 水解 24h ,也 有在 
150t: 下快 速水解 4h。 不同条 件下, 各种氨 基酸的 回收率 会有所 不同, 而且 色氨酸 会受到 
破坏, 通 常采用 3mol/L 巯基乙 磺酸或 4mol/L 甲 横酸来 防止色 氨酸被 破坏。 一种 新的方 
• 12 • 



法是在 水解样 品中加 入保护 剂十二 烧硫醇 (dodecanethiol) 和 EDTA ,据 称色 氨酸的 回收率 
可达 800/0。 

Stein 实验 室引人 气相水 解法, 操作 方便, 样品损 失少, 回收率 也高。 目 前已有 把蛋白 
质水解 、 自 动进样 、氨 基酸分 析和定 量报告 联成一 个系统 的氨基 酸分析 仪商品 出售。 

在酸水 解条件 下半胱 氨酸的 定量很 不准确 ,偏低 严重。 通常在 酸水解 蛋白质 前用过 
甲 酸氧化 成横基 丙氨酸 (cysteie acid) ; 或先 还原蛋 白质, 用碘 代乙酸 处理把 半胱氨 酸转变 
成羧甲 基半胱 氨酸。 一 种较新 的方法 是把蛋 白质用 DTT 还 原后, 加入乙 條吡啶 
(4-vinylpyridine), 然后分 析其衍 生物。 也有 报道用 DTDPA(3, 3'-Dithiodipropionic acid) 
与半 胱氨酸 和胱氨 酸形成 Cys-MPA ,此 衍生 物能在 HPLC 中 和其他 氨基酸 衍生物 分离, 
故 可用于 准确定 量半胱 氨酸。 

如 果采用 电泳法 (例如 SDS-PAGE) 分离到 样品, 则很难 从凝胶 中洗脱 下来, 可 采用点 
印迹法 把样品 转移到 PVDF 膜上, 然后在 PVDF 膜上 直接进 行盐酸 水解和 氨基酸 分析称 
之为原 位分析 ( m situ ) , 在 膜上分 析氨基 酸的误 差要高 于常规 方法。 

人们在 氨基酸 分析时 重视精 确性和 重复性 ,而常 常忽略 了其准 确性。 为了较 好地评 
价氨 基酸分 析的准 确性, 过 去作者 用胰岛 素为标 准样品 来判断 分析方 法的可 靠性。 近年 
来采用 "测 试肽" 的方法 , 即将 20 种常 见的氨 基酸人 工合成 为一个 20 肽。 然后用 酸水解 , 
每 种氨基 酸残基 出现频 率都是 1, 易 于校正 回收。 

氨基 酸分析 在基因 工程产 品分析 中是一 项重要 的辅助 指标。 往 往有人 将产品 做了氨 
基酸 分析, 见到有 氨基酸 的存在 ,就断 言此产 品为蛋 白质, 这是 很不充 分的。 在此 要强调 
氨基酸 的定量 分析, 究 竟取多 少样品 量去水 解和做 氨基酸 分析? 如果取 lO^tg 样 品去分 
析, 最 后各种 氨基酸 总和才 l/^g, 那么尽 管该样 品有生 物活性 或疗效 (如果 确有的 话), 要 
考虑 可能该 活性不 一定是 来自蛋 白质, 因为 在该产 品中, 蛋白 质只占 10%, 算是 一种" 杂 

质 "0 

进行 重组蛋 白质的 氨基酸 分析, 可以 和标样 比较, 以确认 重组蛋 白质的 氨基酸 组成是 
否 和天然 蛋白质 的氨基 酸组成 一样。 如果 是某种 未知蛋 白质, 可以到 蛋白质 数据库 (Pro- 
tein Data Bank) 去查阅 ,看看 和哪一 种已知 蛋白质 的组分 相似, 再作 进一步 确认, 或者此 
样品就 是一种 新的蛋 白质。 

对 某单位 生产的 y 干扰 素进行 分析, 用 BrCN 裂解后 找不到 C 端肽, 同 时观察 到氨基 
酸分 析中精 氨酸明 显缺少 (y 干 扰素的 133 个氨基 酸中精 氨酸占 8 个, 其中 5 个集 中在近 
C 端), 提示 C 端可能 是不完 整的。 由于 氨基酸 分析提 供重要 信息, 从 而让工 作深人 下去, 
最 后证明 C 端有所 缺失, 少了约 13 个氨基 酸的肽 ,但没 有危及 生物活 性 [22] 。 当时 如有质 
谱技术 , 解 决此类 问 题会 简单得 多 。 

在基因 工程的 重组蛋 白质中 ,分 子质量 一般在 10 000〜20 OOODa 之间, 氨基 酸分析 
的准 确性有 多大? 实际 意义有 多少? 这 个问题 上是有 不同看 法的。 有些产 品上报 的氨基 
酸 组成和 理论值 完全相 同 , 反而 是不太 合理的 , 因 为一 些经基 氨基酸 (丝 氨酸 , 苏氨 酸酸水 
解时有 所破坏 ; 又因为 各种肽 键在酸 水解时 , 有些肽 键水解 不完全 , 有些 肽键受 到破坏 , 因 
此和理 论值总 有些差 异却是 正常的 现象。 一 般讲, 目 前很少 有人在 科学研 究论文 中将蛋 
白质的 氨基酸 组成作 为一项 数据来 发表, 因为 往往和 最后的 蛋白质 序列有 较大的 差异, 还 
不如等 待序列 的数据 为好。 

• 13 • 



氨基 酸分析 在肽谱 和点突 变肽的 分析中 是很重 要的, 同时 也可以 是很精 确的。 因为 

这 种肽通 常是含 5~20 个氨基 酸残基 的肽, 又 常常是 以特定 的某一 个酸性 或碱性 氨基酸 
为 C 端。 从氨 基酸定 量分析 而言, 分析 20〜30 个氨 基酸残 基肽的 精确性 要比含 100〜 
200 个氨基 酸残基 的蛋白 质的精 确性大 得多。 其次, 酶 解肽段 (最常 用胰蛋 白酶) 可用一 
个碱性 氨基酸 作基准 1 来 计算, 这样准 确性又 可有所 提高。 在新型 IL-2 的制备 工作中 
(Cys-125 被 Ser 或 Ala 所取代 ), 利用二 阶微分 光谱法 [23] 可以方 便地判 别点突 变的肽 ,然 
后用 氨基酸 分析或 质谱, 或序列 测定来 进一步 确认。 

第八节 肽 谱 • 

肽谱 技术是 指蛋白 质被酶 解或化 学降解 后肽段 的分离 分析或 制备。 
肽谱分 析最早 称之为 fingerprinting (指纹 术), 用在血 红蛋白 A(Hb A) 和血 红蛋白 S 
(Hb S) 的分 子病研 究中, 即将 Hb A 和 Hb S 分 别用胰 蛋白酶 酶解, 然后将 它们的 肽分别 
进行纸 电泳, 再转动 90° 进行纸 层析。 Ingram 用此法 观察到 Hb A 和 Hb S 之间有 一个肽 
斑 点上的 差别, 进一步 的肽顺 序分析 指出仅 仅是一 个氨基 酸残基 (一 个净 电荷) 的差别 ,正 
常的 Hb A 中是 Glu(P- 6) , 异常的 Hb S 中为 Val((3-6)。 该技术 发展到 现阶段 ,肽谱 (pep- 
tide-mapping) 用 HPLC[ 22 ' 23 ] 和 CE[ 24 ] 来做, HPLC 主 要是用 RP-HPLC 根 据肽的 长短和 
疏水 性质来 分离, 如果肽 的亲水 性强, 则柱 不能滞 留住这 些亲水 性强的 肽段, 达不 到分辨 
开 的效果 , 如果 某些肽 的疏水 性很强 , 往 往会粘 在柱上 洗脱不 下来, 而 CE 有时可 以避免 

这 些弊端 C 

早期 对遗传 工程产 品的肽 谱分析 指定用 SDS-PAGE 这一 方法。 用 SDS-PAGE 来进 
行" 肽谱" 的分析 ,有 方便的 一面, 但也 有其局 限性, 譬如用 溴化氰 化学裂 解蛋白 质时, 生成 
的肽 段较大 (文 献上常 称为" fragment" ,而不 称为" peptide"), 由于肽 段少, SDS-PAGE 可 
以根 据它们 的分子 质量不 同而分 辨开, 但对于 小分子 的肽, 往 往无法 分辨或 在染色 脱色过 
程中 丢失。 我们 用溴化 氰裂解 肌红蛋 白时, 它 的小肽 (分 子质量 2 512Da) 在 SDS-PAGE 
和电 印迹后 回收仅 10% 左右 (基于 氨基酸 序列分 析), 再小的 肽则更 难操作 ,故此 法有其 
局 限性。 同理, 更不 适用于 酶解后 肽谱的 分析, 因 为酶解 的小肽 段往往 更多。 

在用 BrCN 化 学裂解 IL-2 后, 再用 SDS-PAGE 进 行肽谱 分析, 由 于 IL-2 中有 4 个 
Met ,理论 上应有 5 个 肽段, 实际上 SDS-PAGE 肽谱上 仅见到 3 个 肽段的 区带, 因为有 2 
个肽段 分子质 量小, 在染色 和脱色 过程中 丢失。 在 这种情 况下, 最好用 HPLC 分析 肽谱。 

如果 Met 在蛋白 之中分 布较匀 ,得到 的肽段 大小差 不多, 都能在 SDS"PAGE 中检出 ,看 
来" 功德 圆满" 了, 但 SDS"PAGE 测分 子质量 不是很 精确, 最好是 将此肽 谱印迹 (blotting) 到 
PVDF 或 ProBlot 膜上, 再 置于蛋 白质序 列仪上 做几个 N 端序列 , 以确认 是哪一 段肽。 

我们在 IL-3 的肽谱 工作中 ,采用 TPCK- 胰 蛋白酶 酶解, HPLC 进行肽 谱分析 和收集 
各个 肽峰, 对 每一峰 作了氨 基酸组 成分析 和质谱 分析, IL-3 在酶解 后理当 得到的 肽都在 
肽谱 中得到 验证, 这 样的结 果是比 较有说 服力的 (图 1.4, 表 1.2)。 

在没有 条件验 证的情 况下, 报批的 三批样 品肽谱 相同, 这不够 充分, 最 好有标 准样品 
作对照 ,三批 报批样 品的肽 谱和标 样的肽 谱一样 ,这样 安全系 数就大 多了, 以防万 一由于 
某种 原因, 三 次有误 而且能 重复, 得出不 恰当的 结论。 
• 14 • 



图 1.4 IL-3 的胰蛋 白酶嗨 解肽谱 



表 1.2 IL-3 的胰蛋 白酶酶 解肽段 的氨基 酸分析 





Tl 


T2 


T3 


T4 


T5 


T6 


T7 


T8 


T9 


TIO* 


Asp 








2.5 


1.6 




1.1 


1.3 


7.0 


4.1 


Thr 






2.7 






0.9 




2.8 




3.6 


Ser 














2.9 


1.5 




2.0 


Glu 






1.3 


1.0 


1.0 




2.2 


3.7 


4.4 


1.4 


Pro 




1.0 


2.0 




0.8 








2.3 


1.8 


Gly 








1.0 










1.4 




Ala 


0.9 




1.2 




10 




2.0 


3.0 




2.9 


Cys 






















Val 


0.7 


















0.8 


Met 






i.O 












1.0 


1.0 


lie 




1.8 










2.0 


1.1 


0.8 


2.1 


Leu 






1.3 




1.0 


1.9 


2.1 


3.2 


6.3 


5.0 


Tyr 












0.9 










Phe 










1.1 


1.0 




0.9 


1.2 




His 




1.8 




1.0 












1.2 


Lys 


1.4 


1.2 


1.3 






1.1 


1.1 






1.0 


Arg 


0.95 






1.0 


0.8 








1.3 


1.2 


Trp 






















No. 


64〜66 


95 〜 100 


1-10 
N 端肽 


101-108 


56-63 


111-116 


67-79 


117-133 

C 端肽 


29-54 


11~28& 
80-94 



* 肽 10 是 两段肽 , 因为 薛 解前 没有用 DTT 还原 二硫键 , 所 以这 两段肽 由;: 硫 键连接 在一起 , 反之 也证明 IL-3 中 
二硫 键的配 对是正 确的。 



近年来 ,随着 LC-MS 和 CE-MS 的普遍 应用, 使收 集到的 肽峰立 刻得到 精确分 子质量 
的测定 ,这样 使肽谱 的可靠 性大大 增加。 

此外, "肽质 量指纹 "(peptide-mass fingerprinting, PMF) 的出现 ,即用 MOLDI - TOF 

• 15 • 




质 谱直接 分析蛋 白质 的酶解 产物, 多肽出 现 先后是 按分子 质量大 小排列 , 这 对于已 知序列 
的 重组蛋 白质样 品的分 析更加 有利。 



第九节 质 谱 



在分 子质量 测定一 节中, 我 们已初 步涉及 到质谱 (MS) 测定分 子质量 的精确 程度; 在 
图 1.5 中, 我们 见到人 胰岛素 (B-30 Thr,Mr 119) 和猪 胰岛素 (B-30 Ala, Mr 89) 的 差别仅 
在一个 氨基酸 残基, 分子质 量净差 30Da ,质 谱能准 确无误 地分辨 它们。 因此, 质谱 用在重 
组蛋白 质的质 控中是 相当有 效的, 如果在 表达过 程中丢 失一个 氨基酸 残基, 至少在 分子质 
量 上会少 75Da (最 小是 Gly) ,肯定 能鉴别 出来。 



SU 1 RT: 1 .00 AV 
T: + P Full ms 
猪 胰岛素 
95 ; 聰十算 好质量 5777.52 

90 1 实測分 子质量 5777.00 
85 

80 

75 

70 

65 

60 
■ft! 55^ 
•W-50 
气 45 
.40 ^ 

35] 

30 

25 

20 



SM:11G NL:5.90E6 
5777.0 




5807.0 



人 胰岛素 

理新算 好质量 5807.52 
实测分 子质量 5807.00 



5500 

分 子质量 /Da - 
图 1.5 人 胰岛素 和猪胰 岛素的 质谱图 

质谱在 90 年代的 发展, 特别 是两种 软电离 技术的 发展, 使生物 质谱在 质谱界 成为主 
要 角色。 蛋 白质组 学又为 生物质 谱提供 了一个 发挥才 华的大 舞台。 它 们中首 选的是 
MALDI-TOF ,它的 大容量 分析、 单电 荷为主 的测定 分子质 量高达 30 万 Da 、干 扰因 素少, 
适合蛋 白质组 的大规 模分析 之需。 其次 ESI 为主的 LC-MS 联机, 适于 精细的 研究。 

目前, 质谱广 泛用于 蛋白质 的纯度 鉴定、 分子质 量测定 、序列 测定、 肽 (质) 谱分析 、二 
硫键、 乙酰化 、糖 基化、 磯酰化 ,以及 非共价 结合等 研究中 ,成 为研究 蛋白质 不可缺 少的技 
术, 具 有广阔 的发展 前景。 以往的 美国质 谱年会 ,参加 者约千 余人, 近年来 为三四 千人, 其 
中很多 是生化 学家, 这和 ESI 和 TOF 在 生物学 中的广 泛应用 是分不 开的。 质谱年 会上生 
物学和 医学方 面的论 文也由 10% 上 升到近 40%。 

对于蛋 白质, 质 谱发展 还有一 个重要 的功能 是肽的 测序, 这是一 个被认 为很有 前途的 
测序 方法, 称为串 联质谱 (Tandem-MS) ,即 在第一 级质谱 得到肽 的分子 离子, 选取 目标肽 
的离子 作为母 离子, 与惰 性气体 碰撞, 使肽链 中的肽 键断裂 ,形成 一系列 子离子 ,即 N 端 
碎片离 子系列 (b 系列) 和 C 端碎 片离 子系列 (y 系列 ), 将这些 碎片离 子综合 分析, 可得出 



16 



肽段的 氨基酸 序列。 在以四 级杆为 质量分 析器的 质谱, 通常 是将三 个四级 杆串联 起来, 实 

现二级 质谱, 即 MS/MS ,这 就是所 谓三级 四级杆 质谱。 在以 离子阱 为质量 分析器 的质谱 
中, 采用离 子讲可 多次捕 捉母离 子和子 离子, 因此可 实现多 级质谱 ,即 MSn ,一般 可达五 
级以上 ,对 于分子 结构分 析很有 用处。 目前的 测序方 法基本 上是在 ESI 质 谱上发 展起来 
的, MALDI-TOF-MS 最近 发展了 PSD(post source decay) 技术, 在一 定程度 上可进 行序列 
分析, 但不如 ESI-MS 测 序应用 广泛。 

图 1.6 是我 们实验 室对一 类新药 TPO 用质 谱进行 的全序 测定。 




5 10 15 20 25 30 35 
r/min 

图 1.6 TPO 的质 谱测序 
TPO 的氨基 酸序列 

1 10 20 30 40 

S-P-A-P-P-A-C-D-L-R-V-S-L-K-L-L-R-D-S-H-V-L-H-S-R-L-S-Q-C-P-E-V-H-P-L-P-T-P-V-L 

41 50 60 70 80 

L-P-A-V-D-F-S-L-G-E-W-K-T-Q-M-E-E-T-K-A-Q-D-I-L-G-A-V-T-L-L-L-E-G-V-M-A-A-R-G-Q- 

1 I T6 I I -" T7 — — I I 

81 90 100 110 120 

L-G-P-T-C-L-S-S-L-L-G-Q-L-S-G-Q-V-R-L-L-L-G-A-L-Q-S-L-L-G-T-Q-L-P-P-Q-G-R-T-T-A- 

T8 1 I I 卜 一- T10— 

121 130 140 150 160 

H-K-D-P-N-A-I-F-L-S-F-Q-H-L-L-R-G-K-V-R-F-L-M-L-V-G-G-S-T-L-C-V-R-R-A-P-P-T-T-A- 

161 170 180 190 200 

V-P-S-R-T-S-L-V-L-T-L-N-E-L-P-N-R-T-S-G-L-L-E-T-N-F-T-A-S-A-R-T-T-G-S-G-L-L-K-W- 

—一 ― —I I T16 I 卜 T17 I I T18 I I ― 

201 210 220 230 240 

Q-Q-G-F-R-A-K-I-P-G-L-L-N-Q-T-S-R-S-L-D-Q-I-P-G-Y-L-N-R-I-H-E-L-L-N-G-T-R-G-L-F- 

-T19 —— I T20 I T21 1 I T22 1 | T23 1 | 

241 250 260 270 280 

P-G-P-S-R-R-T-L-G-A-P-D-I-S-S-G-T-S-D-T-G-S-L-P-P-N-L-Q-P-G-Y-S-P-S-P-T-H-P-P-T- 

„^ Y24 I I T25 

281 290 300 310 320 

G-Q-Y-T-L-F-P-L-P-P-T-L-P-T-P-V-V-Q-L-H-P-L-L-P-D-P-S-A-P-T-P-T-P-T-S-P-L-L-N-T- 

'P25 

321 330 
S-Y-T-H-S-Q-N-L-S-Q-E-G 



17 



还有采 用氨肽 醉 或羧肽 酸与质 谱结合 而形成 的梯带 测序法 (ladder sequencing) ,但由 
于酶解 是一个 动态演 泽过程 ,不同 氨基酸 残基的 酶解速 度不一 ,故 这个方 法有一 定局限 
性。 

因此, ESI-MS 可较好 地与现 有的蛋 白质分 析方法 (如 HPLCXE) 蛋白 质测序 技术相 
匹配。 在 蛋白质 翻译后 修饰研 究中, 由 于 ESI-MS 强大的 MS/MS 乃至 MSn 功能 ,可 以解 
析蛋白 质的各 种修饰 的位点 , 如 糖基化 、碟 酸化等 , 以及复 杂的糖 链结构 。 

值得注 意的是 , 质 谱技术 目 前的 发展非 常迅猛 , 无论是 ESI ,还是 MALDI-TOF, 都在 
不断 改进, 以期 完善。 ESI 着力 于提高 灵敏度 (如 采用 nanospray, capillary LC) ,以 及降低 
盐和去 剂的 影响; MALDI-TOF 则着重 于提高 精确度 ,如 在离子 进入分 析器前 稍微停 
留, 去除 杂质, 即延 迟抽提 (delay extraction) 和加 强测序 功能。 

最近 Q-TOF 质谱 的发展 —— MALDI-TOF 由于 其仪器 的固有 性能, 决 定其在 高分子 
质 量区域 (m/z〉3 000) 的质 量精度 下降, 一般认 为在高 分子质 量区域 ,质 量偏差 应不超 
过 100 ppm ,否则 在肽谱 检索时 得不到 准确的 结果。 这种现 象已被 我们实 验室的 经验所 
证实。 Q-TOF 型仪器 ,由于 其四极 杆和飞 行时间 质谱是 以相互 垂直方 向几何 型组成 ,当 
离子通 过四极 杆后, 同样 的质量 而具有 不同动 能的离 子在垂 直方向 上受到 飞行时 间质谱 
的推出 电压作 用时, 通过离 子的水 平方向 动能差 异不会 对飞行 时间质 谱分辨 率产生 影响, 
因而其 分辨率 比普通 MALDI-TOF 要高, 灵敏度 也提高 ,显 然它的 质量精 度亦有 显著提 
高, 其偏差 <5ppm。 这 样在蛋 白质肽 谱的检 索中可 提高准 确度。 

目前, Q- TOF 质谱 不但有 ESI 源, 也 配备了 MALDI 源, 这无疑 是如虎 添翼, 具有极 
高 的分辨 率和灵 敏度。 

第十节 蛋 白质及 多肽的 序列测 定和末 端分析 

目前测 定蛋白 这一级 结构的 主要方 法有: 蛋 白质化 学方法 (主 要是 Edman 降 解法测 
N 端和 用浚肽 酶或化 学法从 C 端测起 ) 和从 cDNA 来 演泽的 方法。 其他方 法有质 谱法和 

二维 核磁共 振法。 

利用 cDNA 法测定 的最长 蛋白质 是脱脂 脂蛋白 B-100(4 532 个氨基 酸残基 ), 用经典 
的蛋 白质化 学分析 法测得 的最大 的蛋白 质是人 凝血体 系中的 Von Willebrand 因子 (2 050 
个氨基 酸残基 )。 从蛋白 质数据 库来看 ,约一 半来自 cDNA, —半来 自蛋白 质化学 方法。 
虽然 cDNA 技术发 展很快 , 也方便 , 但 目 前 还不能 取代经 典的蛋 白 质化 学方法 , 例 如部分 
顺序测 定对识 别蛋白 质的功 能结构 域或蛋 白质活 性部位 以及化 学修饰 部位, 还是 离不开 
经典 的蛋白 质化学 方法。 

蛋白质 的末端 氨基酸 与在肽 键中间 的氨基 酸不同 ,蛋白 质的一 端是以 a- 自由 基存在 
的, 称之为 N 端, 习惯 上列在 左侧; 在另一 端是以 自由羧 基存在 ,则 称之为 C 端, 习 惯在右 
侧。 1954 年 Sanger 首先把 二硝基 氟苯应 用于胰 岛素的 N 端 测定, 为研究 蛋白质 的精细 
化 学结构 开辟了 一个新 的领域 [ 25 ] ,继后 Eclman、Wetman-Libet、Chang 等人 相继作 了很多 
贝献。 

特别应 该强调 指出, 末端的 鉴别能 力较之 一般的 物理化 学方法 (色谱 、电 泳等) 毫不逊 
色, 有时甚 至更为 灵敏, 所以 也是鉴 别蛋白 质样品 纯度的 一种好 方法。 
• 18 • 



一、 N 端分析 



在 N 端测 定上, 目前 最经典 的是异 硫氰酸 苯酯法 [ 26 ]。 自 1950 年代建 立后, 在 1970 
年 代发展 成一种 全自动 的测定 方法。 目前 微量液 相脉冲 蛋白质 / 多肽自 动顺序 分析仪 ,灵 
敏度约 Ipmol ,检出 极限为 20fmol ,加上 进行计 算机数 据处理 和分析 ,既 灵敏又 方便。 但 
机器 有时会 出现读 / 写 错误, 还是需 要有经 验的工 作者加 以最后 判断才 是最可 靠的。 

Wittmann-Liebold 发 展的双 标记法 (DABITC/PITC) ,用 薄层分 析鉴定 的微量 序列测 
定法不 需昂贵 仪器, 可成为 一般实 验室普 遍采用 的技术 [ 27 ' 28 3, 但需 要很熟 练的技 术才能 
掌 握好。 

N 端 15 个序列 的测定 ,很大 程度上 排除了 蛋白质 混淆的 可能, 即不太 可能有 两种不 
同的蛋 白质在 N 端 15 个序 列是一 样的。 这已是 相当常 规和公 认的。 

如 果测定 蛋白质 的几个 C 端序列 ,从蛋 白质的 两端来 验证, 可 靠性又 增加了 许多。 
再 加上用 MS 精确测 定蛋白 质的分 子质量 ,基本 上是不 会出差 错的。 如 果有肽 谱或肽 
(质) 谱, 则是相 当完整 的鉴定 工作。 

二、 C 端 的测定 

C 端 测定最 早是肼 解法。 我国蛋 白质化 学前辈 纽经义 先生在 1955 年 就应用 此技术 
测定了 烟草花 叶病毒 蛋白的 (:端 [29] 。 

经典 的是用 羧肽酶 (Cp) 的方法 ,近年 来虽用 Cp YXp P ,但基 本方法 仍是一 样的, 基 
于不同 时间的 C 端氨 基酸的 释放, 是一 个动态 过程的 演泽。 先是用 CpA、CpB ,近 来用 
CpY、CpP ,但都 不尽如 人意, 因 为这种 方法是 在加入 Cp 后每 隔一定 时间间 隔取一 部分反 
应液, 停止 反应, 用氨基 酸分析 测定释 放出来 的游离 氨基酸 , 以释 放氨基 酸的量 为纵轴 , 作 
用时 间为横 轴得一 曲线, 这 样来分 析释放 顺序, 一般约 几个, 且先后 顺序的 区别也 不是很 
容 易的。 

梁宋 平教授 实验室 采用羧 肽酶和 MALDI- TOF 联用 测定蛋 白质的 C 端序列 [ ^。 
作者 指出用 C 端序列 仪分析 重组蛋 白质的 C 端很有 意义, 但也 有不少 问题, 例如 C 
端如是 Pro ,则完 全不能 进行, 对 Cys、Thr、Ser 的 分析很 困难, 其他氨 基酸的 C 端分 析则 
较 顺利。 在作 者实验 室中, 最好 的结果 可测定 10 个 C 端氨 基酸 序列。 此 法的主 要困难 
在产率 、重 复效率 等不够 理想, 尚有 待进一 步完善 [ 3 卜 33 3 。 

第 十一节 蛋白质 的二硫 键分析 

. 二硫 键和巯 基与蛋 白质活 性有着 密切的 关系, 早 期测定 巯基用 对氯汞 苯甲酸 
(PMCB) 法, 后来用 5,5'- 二硫- 双 (2 -硝基 苯甲酸 )[5,5'-dithio bis(2-nitro benzoic acid), 
DTNB] 和 乙基 顺丁' 席二 酰亚胺 (NEMI) ,可以 研究巯 基分布 以及与 活性的 关系。 

遗传 工程产 品的二 硫键是 否正确 配对, 是一个 重要的 问题, 在 IL-2 中, 如果形 成错配 
对, 不但 生物活 性只有 原来的 1/400, 而 且在医 用后会 引起不 必要的 麻烦。 因此分 析二硫 

• 19 • 



键 正确配 对是一 项必不 可少的 程序。 目前 有几种 方法可 以借鉴 



一、 不同 同位素 标记法 

人 IL-2 有三个 Cys ,由 天然 IL-2 的 结构分 析得知 Cys58 和 Cysl05 形成二 硫键, 而 
Cysl25 以 游离巯 基形式 存在。 为了阐 明重组 IL-2 的二 硫键是 否以正 确形式 配对, 在 
pH 8 . 5 下用 3 H -碘代 乙 酸处理 IL-2 , 在这种 情况下 , 仅游离 的琉基 才能与 3 H -碘代 乙 酸作 
用 形成相 应的衍 生物。 然 后再还 原和用 "C- 碘 代乙酸 焼化。 因此 3 H 标记 仅在肽 11 上 
(Cysl25), 而肽 11 上基本 上无' 4 C 的放 射性, 而 "C 的 放射性 全在肽 12 和肽 14 上, 因此, 
说明 rIL-2 的二硫 键结构 和天然 IL-2 是 一致的 [ 34] 。 

二、 4 -乙 烯吡呢 标记法 

超 氧化物 歧化藤 (SOD) 也 有三个 Cys ,由 一级 结构分 析指出 Cys6 为游离 巯基, Cys55 
和 Cysl44 形成二 硫键。 通常可 用同位 素标记 方法来 判别二 硫键的 位置, 如上述 方法一 
样, 但应 用同位 素在国 内有其 不方便 之处, 我们采 用化学 修饰法 来判断 ,用 4- 乙稀 吡徒与 
天然的 SOD 作用, 此时仅 Cys6 和化学 修饰剂 形成衍 生物, 此衍 生物在 254nm 有 特殊吸 
收, 因此 在胰蛋 白藤酶 解后, 在 254nm 下只 有一个 肽峰, 而 还原型 SOD 经同样 处理, 则有 
三个 肽峰, 经 Edman 法测三 个肽的 序列, 得知肽 1 含 Cys6, 肽 2 含 Cys55, 肽 3 含 
Cysl44[35] (图 1.7)。 




8 12 16 20 24 28 8 12 16 20 24 28 

//min //min 



图 1.7 毛细 管电泳 分析识 别二硫 键和含 半胱氨 酸的肽 
电泳 条件: 样品 浓度: Ifxg. 乍 1, 进样 3.5~7.0nl; 缓冲液 :100mmol/L 碟酸缓 冲液- lOmmol/L 
NaCl,pH2.5; 毛细 管直径 50 fmi,72cm(50cm 至检测 器); 电压 :20kV ,电流 :42 fzA; 
检测: 200nm (上图 ) 或 254nm (下图 ); 左图是 还原型 SOD ,右 图是 氧化型 SOD 



• 20 • 



三、 直接 色谱法 



直接分 析二硫 键的异 构物。 IL-2 在 碱性条 件下可 以形成 二硫键 异构体 (Cys58 与 
Cysl25 或 Cysl05 和 Cysl2 形成 二硫键 ) ; 在反相 色谱中 ,它们 的疏水 性弱些 ,较早 被洗脱 
出柱 [^。 

四、 质 谱 法 



近年来 ,质 谱定位 二硫键 已成为 有效的 方法。 最近, 我们以 天花粉 凝集素 为材料 ,用 
质 谱法测 定此凝 集素有 4 对分 子内二 硫键, 2 对分 子间二 硫键。 图 1.8 显示 N 端肽 的分 
析 , Asn-5 用 PNGase F 酶 解除去 糖链后 转化成 Asp ,图 1 . 8a 是没 有还原 时肽的 质谱图 , 其 
双 电荷图 m/z 为 1 637.0, 指出 是分子 间的二 聚体。 图 1.8b 是此 肽还原 后的串 联质谱 
图, 说明 Cys3 和 Cysl4 之间有 分子内 二硫键 ,且 Cys2 之 间的分 子间二 硫键被 NEM 处理 
还原 「37]。 



100, 
90 
80 

70— 
60^ 

40 

2(H 
10 




1637.0 [M+2H]" 

SCCTNDSLPMCY 
SCCTNDSLPMCY 



1 

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 



吶毕 ,' 砵 』'| 4 与"||' 一 



100 
903 
80 

60 

30 
20— 
10— 




1762.1 [M+Hf 



NEM 

SCCTNDSLPMCY 



881.7 [M+2H]2+ 



800 



1000 1200 1400 1600 1800 2000 

miz 



图 1.8 用 质谱法 定位蛋 白质的 二硫键 



• 21 



第 十二节 . 突变点 的分析 

天然 人白细 胞介素 -2(IL-2) 由 133 个氨基 酸组成 ,其中 有一个 游离半 胱氨酸 (Cys ,位 
于第 125 位), 第 58 位和第 105 位的半 胱氨酸 形成二 硫键, 此二 硫键为 活性所 必需, 而二 
硫 键的错 配对, 可降低 其生物 活性和 形成抗 原性。 用蛋白 质工程 方法将 IL-2 的 125 位 
Cys 改为 丝氨酸 (Ser) 或 丙氨酸 (Ala) ,其热 稳定性 等方面 都有较 明显的 改善。 

为了鉴 定新型 IL-2 的生物 工程突 变点, 
我们将 IL-2 用 N -对甲 苯横酰 苯丙氨 酰氯甲 
酮-胰 蛋白酶 (TPCK- 胰蛋 白酶) 水解后 ,进行 
了 RP-HPLC 分析 分离。 为了 搜寻点 突变所 
在肽段 ,可 以用下 述方法 进行。 ①天然 IL-2 
和新型 IL-2 的酶解 图谱比 较法, 寻找 有差别 
的肽进 行顺序 分析。 ②荧 光标记 Cys 残基, 比 
较 标记前 后新型 IL-2 酶解 图谱的 差别, 从而 
鉴别出 点突变 的肽。 ③用同 位素标 记法。 
④由于 IL-2 只有一 个色氨 酸残基 ,而 蛋白质 
的 280nm 紫外 吸收主 要是色 氨酸, 其 次是酪 
氨酸 和苯丙 氨酸的 贡献。 所以, 我们采 用酶解 
后 分别于 214nm 和 280nm 处检测 肽谱, 在 
280nm 肽谱中 ,光 吸收特 高的峰 就应该 是含有 
色氨酸 (Trp) 的肽段 (残基 121~133), 可以简 
便地作 出判断 (图 1.9)。 
图 I. 9 IL- 2 (Serl 25 ) 的胰蛋 白酶酶 解肽谱 分离 到的肽 段再经 过毛细 管电泳 (CE) 鉴 

定确定 为均一 ,最 后进行 了该肽 的氨基 酸序列 分析, 证 实为: ― 

121 125 130 133 

Trp-Ile-Thr-Phr-Ser-Gln-Ser-Ile-Ile-Ser-Thr-Leu-Thr 



从而 由蛋白 质化学 分析方 法直接 证明了 在新型 IL-2 中 Serl25 确 实取代 了天然 IL-2 中的 
Cys[24] (表 1.3, 图 1.10)。 

表 1.3 毛细管 电泳- 质谱联 用分析 S-125 突变的 IL-2 胰 蛋白繭 解肽段 



肽段 


位置 


序列 


保 留时间 /mi 


n 理论分 子质量 /Da 实测分 子质量 /Da 


T1 


-卜 8 


MAPTSSSTK 


19.48 


909.0 


908.5 


T2 


9-35 


KTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPK 


14.71 


3192.7 


3192.4 




36-38 


LTR 




388.5 




T3 


39-43 


MLTFK 


15.88 


638.8 


638.4 


T4 


44〜48 


FYMPK 


16.37 


684.8 


684.5 


T5 


49-54 


KATELK 


10.37 


688.8 


688.5 


T6 


55〜76 


HLQC" LEEELKPLEEVLNLAQSK 


17.55 


2621.0 


2621.4 


11 


77〜83 


NFHLRPR 


7.97 


939.1 


939.2 


T8 


84-97 


DLISNINVIVLELK 


17.97 


1582.9 


1581.8 


T9 


98-120 


GSETTFMC" EYADETATIVEFLNR 


31.97 


2684.9 


2684.2 


T10 


121-133 


WITFS'QSIISTLT 


39.73 


1496.7 


1496.8 




22 



进一步 ,我 们受到 HPLC- 二阶微 分光谱 分析的 启发, 也 建立了 这种技 术并用 于重组 
蛋 白质的 C 端分析 [23] 。 

最近, 我们 建立了 CE- MS 联用 技术用 于蛋白 质突变 点的分 析中, 将整 个分析 水平又 

提高 到一个 新阶段 [38] 。 



T3,T4 




5 10 15 20 25 
//min 

图 1 . 10 毛细管 电泳- 质谱联 用测定 IL-2 突变 

液 -质联 用已普 遍用在 重组蛋 白的鉴 定中。 TNF-a 突 变株在 N 端和 C 端都有 改变, 
早期 我们分 别采用 N 端和 C 端分析 Edman 降解 法分别 测定。 近来用 液-质 联用, 分析水 
平又上 了一个 层次。 TNF-a 用胰 蛋白酶 酶解, 然 后进行 液-质 分析, 肽的分 子质量 与理论 
值 一致, 均为正 常肽; 如与理 论值不 一致, 则可能 是突变 点所在 的肽。 TNF-1 理论 分子质 
量是 17 522. 6Da ,突变 株分子 质量为 16 864. 3Da, 实验测 得分子 质量为 16 864.8Da。 肽 
谱中 有两段 肽与理 论值不 一致, 经 MS/MS 测得的 肽序列 ,证 实确为 N 端和 C 端突 变肽 
(图 1.11)。 

MRRRKPVA HWANPQAE 
VRSSSRTPSDKPVA HWANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR 
DNQLWPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA 
VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF 
QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYPGI IAL 

SGQVYFGI IAQ 



MRKRKPVAHVVANPQAE 

N 端 肤 

. SGQVYFGIIAO 




//min 



图 1.11 TNF-a 的突变 点分析 



0000000000 

0987654321 



23 



第 十三节 原位分 析和快 速分析 
一、 原 位分析 

原 位分析 是指蛋 白质在 SDS-PAGE 后 , 电 印迹至 PVDF 或 ProBlot 膜上 , 然后 将此膜 
直接 置于蛋 白质序 列仪上 进行序 列分析 [1 3 '1 4] 。 

在遗传 工程产 品的研 究中, 原位 分析具 有非常 重要的 作用。 当重组 蛋白质 表达后 ,需 
确认 是否有 预定的 表达产 品及其 数量的 多少。 如果没 有原位 分析法 ,则需 将粗的 表达产 
物 进行工 作量很 大的分 离纯化 工作, 然后对 大量不 同的积 分进行 分析才 能得出 结论。 

目前, 人们常 在分离 之前, 进行 SDS-PAGE 分析, 根据电 泳谱上 的条带 和分子 质量来 
估计有 否预定 的产品 和产量 ,这只 是一种 粗略的 估算。 进一 步的验 证需将 相应分 子质量 
的条带 电印迹 到疏水 膜上, 再置此 膜到蛋 白质序 列仪上 分析, 如果这 一序列 和预定 表达的 
蛋白 质序列 一致, 就 能得出 肯定的 结论。 可以认 为这是 非常简 便而又 有效的 方法。 

在肯定 了有表 达产物 和一定 的量后 ,必须 进行分 离纯化 的工作 ,在分 离纯化 的每一 
步 , 常用 SDS-PAGE 来 判断和 评价每 一程序 的效果 , 提 纯倍数 , 活性得 率和蛋 白质 回收如 
何, 等等。 



二、 快 速分析 

文献上 报道了 两种快 速的色 谱方法 :无孔 径载体 色谱柱 (non-porous resin column, 
NPR) 和灌 注色谱 (perfusion chromatography) [39] 。 

我们 就无孔 径载体 色谱柱 (NPR) 在 蛋白质 和多肽 等遗传 工程产 品中的 快速分 析作了 
报道 (图 1.12)。 通常用 经典的 HPLC 柱 做一次 样品分 析约需 30min ,而用 无孔径 载体柱 
只需 2〜5min ,这 种快 速高效 的方法 对遗传 工程产 品的分 离过程 跟踪尤 为有利 「 4 G ] 。 





140 
130 

120 
110 
100 




//min 



//min 



图 1.12 标 准蛋白 质和遗 传工程 产品在 NPR-18 柱 上的快 速分离 
左 图样品 :1. 核 糖核酸 薛;2. 胰 岛素; 3. 细 胞色素 c;4. 溶 菌酷; 

5. 牛血清 白蛋白 (各 lfig);NPR-18 柱 :35mmX4.6mm I. D; 检出: 220nm。 
右 图样品 :1. rhEGF;2. "HFN; 流速 :1.5ml/min; 梯度: TFA-ACN 



nvE 





o 

2 

nvE 



24 



第 十四节 蛋白 质翻译 后修饰 的分析 

蛋 白质翻 译后修 饰包括 磯酸化 、糖 基化等 。 蛋 白 质一 级结构 可以从 基因序 列演泽 , 但 
翻译后 修饰的 信息几 乎无法 仅从基 因序列 得到。 而众 所周知 的是, 这些翻 译后修 饰特别 
是磯 酸化、 糖基化 对于蛋 白质的 功能乃 至细胞 的功能 都十分 重要。 因此, 这 些修饰 的鉴定 

对于重 组蛋白 质控, 蛋白质 组特别 是功能 蛋白质 组的研 究意义 重大。 Edman 降解 法对于 
这些修 饰的鉴 定无能 为力, 而采用 质谱法 可通过 特征离 子监测 的方法 很快确 定磯酸 化肽, 
通过串 联质谱 确定碟 酸化位 点 [4 1 ] 。 在糖蛋 白 分析 方面, 质谱 更显示 了独特 的优势 , 不仅 
可以通 过质谱 、蛋白 酶解和 糖昔酶 酶解相 结合的 方法寻 找糖肽 ,鉴定 糖基化 位点, 还可依 
靠 MS/MS 和 MSn 分 析糖链 组成、 结构甚 至分支 情况。 我 们采用 质谱方 法鉴定 了一种 
C 凝 集素的 N 糖链结 构和位 点 [42 3; 质谱 也用于 鉴定蛋 白质的 憐酸化 位点; 用质谱 法我们 
还发现 了一种 新型的 唾液酸 [43] 。 此外, 还用毛 细管电 泳建立 了糖蛋 白的糖 型分析 [44 ' 45] 。 
这些将 在有关 章节中 讨论。 

(夏 其昌) 

参 考文献 

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• 25 • 



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trophoresis. J Chromatogrphy A, 1999,849:599〜608 



26 



第二章 蛋 白质结 构分析 

第一节 蛋白 质样品 的准备 

进行结 构分析 的蛋白 质样品 ,一 般要 求纯度 〉95% 。 这样的 样品, 通常 是用色 谱和电 
泳精制 过的。 

- 、 SDS-PAGE 纯化 的样品 

从 SDS-PAGE 上分离 的蛋白 质必需 经过特 殊处理 ,使 SDS 浓 度低于 0.0005% , 否则 
SDS 会影响 到胰蛋 白酶的 酶解, 也会大 大降低 HPLC 分肽时 的分辨 率 [ 1 ] 。 

有报道 指出, 在 2mol/L 尿素存 在下, 用胰蛋 白酶消 化蛋白 质时, 如果 SDS 浓度〉 
0.05% , 则完 全阻止 了胰蛋 白酶和 内肽酶 Lys-C 的 作用。 

虽然有 报道用 HPLC 或用盐 酸胍沉 淀除去 SDS ,但不 易掌握 ,尤 其是共 价结合 到蛋白 
质分 子上的 SDS 分 子更难 除去。 

在 SDS-PAGE 后, 采用 电印迹 ( blotting ) 到 PVDF 膜上, 也是常 用的方 法 [2 ], 因为 
PVDF 膜结合 蛋白质 能力的 专一性 远远超 过其结 合盐、 氨基 酸和去 垢剂, 因此, 蛋 白质能 
和这些 "污 染物" 分开。 经 过这样 处理后 , 能用于 BrCN 化 学裂解 或酶解 [3] 。 

二 、 HPLC 纯化 的样品 

如果 样品是 用反相 HPLC 纯 化的, 因为流 动相是 挥发性 溶剂, 它们在 真空离 心干燥 
或冻干 样品时 除去; 如果 蛋白质 是用离 子交换 HPLC 或疏水 HPLC 或凝 胶过滤 HPLC 精 
制的, 则样品 要进行 脱盐。 

脱 盐或稀 蛋白溶 液的浓 縮可用 O.lQ/o 三 氟乙酸 (TFA)- 乙腈 (ACN) 系 统的短 柱反相 
HPLC; 也可 采用一 次性的 Sek-Pak ,因为 蛋白质 是水溶 性的, 所以先 用能与 水互溶 的甲醇 
或乙腈 (2ml) 润之, 再用 5ml 纯水 洗涤; 然后 样品液 体通过 Sep-Pak 柱时, 蛋 白质保 留在柱 
上 , 小 分子的 盐类流 过柱体 ,用 水溶 液充分 洗涤后 , 最后用 甲醇 或乙腈 抽提蛋 白质。 

小的 超滤装 置对浓 縮蛋白 质也是 有效的 [4] 。 此外, 有机 溶剂或 TCA 沉淀 也可以 考虑。 

三、 蛋 白质样 品中的 二硫键 和疏基 (一 SH) 

当蛋白 质样品 纯度达 到要求 ,盐和 小分子 也除得 比较" 干净" , 在进行 酶解前 , 还要转 
变半胱 氨酸残 基成其 他的稳 定的衍 生物。 因 为半胱 氨酸的 巯基在 分肽过 程中易 自 动氧化 
成各种 产物, 包括 形成无 序的二 硫键, 因 此需要 将半胱 氨酸残 基先转 变成稳 定的衍 生物。 
常用有 碘代乙 酸烧化 ,因为 这个反 应是快 速和专 一的; 同 时这类 试剂保 存在暗 处是很 

• 27 • 



稳 定的。 而且, 这类 试剂的 矫作物 (artifact) 容易 得到放 射性标 记物。 蛋白 质或肽 在导入 
带电荷 基团后 也增加 了其在 水溶液 中的溶 解度。 
胱 氨酸也 可在还 原后再 修饰。 

1. 还 原和羧 甲基化 

将 l〜20mg 蛋 白质溶 解在含 6 mol/L 盐 酸胍的 0. Imol/L Tris-lmmol/L EDTA 的缓 
冲 液中, pH8.3, 加 DTT 至 2 mmol/L 或再 多一些 (过量 于存在 于蛋白 质中的 二硫键 ) , 通 
氮气 , 然后迅 速封闭 , 37t: 反应 Ih , 再加人 50mmol/L 的碘 代乙酸 (已用 NaOH 中和) ,其 
量为 1.1 倍 (分 子比) 过 量于溶 液中的 巯基数 (蛋 白质 中的一 SH 和 DTT 中的一 SH 总 
和), 典型为 4.5〜5 mmol/L, 再次充 氮气, 于暗处 371: 保温 lh。 加 2 -巯基 乙醇至 最后浓 
度 1%( 结束 反应, 然后对 50 mmol/L NH4HCQ3 , 含 0.01 % 硫 二甘醇 (thiodiglycol) 

充分 透析, 冻干。 

注意: 碘代 乙酸必 须是无 色的, 如果有 碘存在 ,呈淡 黄色, 会引起 巯基迅 速氧化 ,阻碍 
了烧 化反应 , 而且可 能有副 反应, 使 色氨酸 修饰。 

碘代 乙酰胺 (iodoacetamide) 也常 代替碘 代乙酸 用于半 胱氨酸 残基的 烷化。 这 常用于 
避免半 胱氨酸 被导入 负电荷 ,而用 中性的 碘代乙 酰胺。 另一种 情况是 变性剂 不用盐 酸胍, 
而用 SDS ,这 时如果 用碘代 乙酸, 反 应往往 进行得 很慢, 而且不 完全, 这是因 为碘代 乙酸的 
负电 荷和蛋 白质- SDS 胶束 (微团 ) 上 的负电 荷相互 排斥。 

2. 还原 和吡啶 乙炼化 

用 4 -乙' 烯吡淀 (4-vinylpyridine) 处理 同上, 通氮气 保温过 夜 [5] 。 

第二节 蛋白质 的化学 裂解' - 

一、 裂 解于甲 硫氨酸 (Met) 

溴化氰 (BrCN) 是首选 的化学 试剂, 专一 裂解在 甲硫氨 酸的羧 基端, 对 多数蛋 白质裂 
解 效率为 90 % 以上 [6] 。 BrCN 在酸性 条件下 , 裂解在 甲 硫 氨酸的 C 端 肽键上 , 将 甲 硫氨酸 
转化成 高丝氨 酸( n )(homoserine) 和高丝 氨酸内 酯( I ) (homoserinelactone) 的混 合物, 它 
们之间 也能相 互转化 ,如图 2.1 所示。 

对 Met-Thr、Met-Ser 键, 则常常 是低产 率的, 可能是 (3 经基产 生下面 的一系 列反应 
(m 和 IV) ,最 后形成 高丝氨 酸残基 (V) ,而未 裂解此 肽键, 如图 2.2 所示。 Met-Cys 键也 
不易 裂解。 

典型 的反应 常常在 201: 、70% 甲酸 ( WVO 中进行 24h ,副 反应 是部分 Asp-Pro 键会 
断裂 , 一些 酖胺基 团会部 分丢失 , 部分 Asn-Gly 会产 生重排 或环化 ,有时 Trp 会氧化 。 

操作: 蛋白 质先用 596 巯基 乙醇在 pH 8.0 室温 下处理 24h ,加 色胺 (tryptamine) 或色 
氨酸 (以 每分 子甲硫 氨酸加 5 分子 色胺或 色氨酸 计算) 以防止 色氨酸 氧化。 

蛋 白质以 l〜5mg/ml 浓度 溶解在 70% 甲酸中 ,加入 50 倍过量 ,小 体积的 BiCN/7096 甲 
酸, 通氮 并置于 暗处, 室 温放置 16〜24h ,结 束后加 15 倍体积 的水, 冻干, 重 复加水 冻干。 
• 28 • 



NH— CH— C— NH — CH— CO— 
CH, 



-N — CH— CO— 



O 

I 

CHj Br 
S: C 
CH3 N 



— NH— CH— C 
CH 



// 



CH;\ /0 



R 

-CH— CO- 



-NH— CH— C^v +Br- 

Nth, 

CH,— S—CN 



' ' " — NH— CH— C + *NH— CH— CO- 



CH— S— CN 



CH2\ 



CH, 



(I) 



HAOH" 
— NH— CH— COOH 

CHj— CH2OH 
(H) 

图 2.1 溴 化氰裂 解甲硫 氣酸的 C 端肽键 



H— 0、 



CH — CH, 



— NH— CH — C— NH— CH— CO — NH — 

\" 
CH, 

CH3— S—CN 

+ B「(in) 

~~ - — NH— CH— C— NH— CH — CO— NH — +HBr + CH,— SCN 



CH2 O 

\ch/ 



(IV) 



HO— CH — CH, 



— NH— CH— C— NH— CH — CO — NH— 
/ \ 
CH2 O 



CH2OH 



(V) 



图 2.2 溴化 氰裂解 Met-Thr、Met-Ser 键 



二、 裂 解于半 胱氨酸 (Cys) 

半胱氨 酸能和 5, 5'- 二硫- 双 (2 -硝基 苯甲酸 )(miNB)(I) 在 pH 8.0 下形成 
S~cyanocystein 战基, 过量 试剂和 副产物 在酸性 条件下 用凝胶 过滤法 除去, 而 S^cyanylted 的蛋 
白质 (n) 在 pH 9.0 下保温 使肽键 断开, 由 S"Cyanocysteine 形 成氧端 iminothiozolidine4-arboxyl 
残基 (IE) 和 释放前 一残基 的羧端 (IV) ,由于 (IE) 己环化 ,不 能再用 PITC 法自动 降解, 但可进 

• 29 • 



-步分 肽和做 氨基酸 分析, 或用 稀酸水 解在天 冬氨酸 上再进 行分析 [7] ,如图 2.3 所示 ( 



II II /=\ 

— C— NH- -CH— C— NH— + N=C— S— d>— NOj 
CH2— SH COJ 

(I) 




(ffl) 

图 2.3 裂 解于半 胱氨酸 

三、 裂解于 色氨酸 (Trp) 

常用 试剂有 BNPS-Skatole ,效 率为 150/。 〜 60% , 副反 应是酪 氨酸, 组氨酸 也能作 
用 [ 8 ' 9 ]。 还有 报道用 ◦- 亚 碘酰基 苯甲酸 (0-iodosobenzoicadd)[iG] 和 DMSO/Ha/HBr。 

四、 部分 酸水解 

用 0.03mol/L HC1 于 1051: 反应 6 〜: I8h ,裂 解在 Asp 的 羧端。 0.0125mol/L HCKpH 
2) 真空 108"C 反应 2h,60% Asp-X 键裂解 「11、 
温和酸 水解, 肽 键断在 Asp-Pro。 

五、 选择性 S 限制 性化 学裂解 

选 择性化 学裂解 如轻胺 裂解在 Asn-Gly 键上 [ i 2 ] 。 

表 2.1 常用的 薛 解和化 学裂解 的试剂 和方法 



裂 解试剂 


专一性 


文献 


裂 解试剂 


专一性 


文献 


内肽 SlLyS"C 


Lys-X 


[13] 


胰凝 乳蛋白 SI 


Trp-X.Tyr-X 




Achromobacter 蛋白 酵 I 


Lys-X 


[14] 




Phe-X,Leu-X 




内肤酶 Arg-C 


Arg-X 


[15] 




Met-X 




内肽解 Asi>N 


X-Asp 




溴化氢 (BiCN) 


Met-X 


[20] 




x-cysteic acid 


[16] 


BNPS-Skatole" 


Trp-X 


[21] 


Asn 内肤 醉 


Asn-X 


[17] 


lodosobenzoic acid 


Trf^X 


[22,23] 


V8 蛋白 SS 


Glu-X 




N- 氯 代號珀 酰亚胺 


Trp-X 


[24] 




Asp-X 


[18] 


2 -硝基 -5- 硫氧基 苯甲酸 


Cys-X 




胰 蛋白解 


Lys-X 
Arg-X 


[19] 









2 -(2 -确 基苯亚 磺酰胺 )- 3 - 甲基- 3 -溴 代假! >引1*。 



30 



德国 Stahl 用 BrCN 和蛋白 质作用 ,在不 同的时 间间隔 取样, 得 到一系 列裂解 在蛋白 
质不同 部位的 甲硫氨 酸产物 ,并进 行质谱 分析, 这有 助于蛋 白质全 序列的 演泽。 表 2.1 提 
供 了常见 的酶解 和化学 裂解的 试剂和 方法。 

第三节 蛋 白水解 酶酶解 

一、 常 用蛋白 水解酶 

(1) 跌 蛋白酶 (trypsin) 

专一 作用在 Arg 和 Lys (碱 性氨 基酸) 的羧 基端, 但对 Arg-Pro 和 Lys- Pro 键没 作用。 
我 们常将 胰蛋白 酶配成 Img/ml ,贮 存在 Immol/L HCl 中, -201: 保 存数月 ,而未 观察到 
酶 的活性 损失。 如果样 品溶解 度差, 可适量 加入尿 素增加 溶解度 ,因 为胰蛋 白酶在 
2mol/L 尿素 中 , 仍具有 充分的 活性。 

(2) 跌凝孚 L 蛋白 酵 (a-chymotrypsin) 

专 一作用 在芳香 族氨基 酸的羧 基端。 

(3) 内狀醉 Lys-C (endoproteinase Lys-c) 
专一 作用在 Lys 的羧 基端。 

(4) V8 蛋白醉 ( staphylococcal protease) 

专一 作用在 Asp 和 Glu (酸 性氨 基酸) 的羧 基端。 pH 8.0 的磯 酸缓冲 液时, 作用在 
Glu-X 和 Asp-X;pH 4.0 的乙 酸缓冲 液时, 仅 作用于 Glu-x 键。 

(5) 梭菌 蛋白酶 (clostripain) 
专一 作用在 Arg 的 羧基端 [253。 

(6) 凝血醉 (thrombin) 

专一 裂解在 Arg- Gly 键上 [26] ,在纤 维蛋 白原工 作中, 很 大程度 上还依 赖于邻 近氨基 
酸 序列。 近来 还常用 作融合 蛋白的 裂解点 [27] 。 

(7) 其他 

还有 专一性 较广的 胃蛋白 酶 ( pepsin) 、枯草 杆菌蛋 白 酶 ( subtUisin) 、木 瓜蛋 白酶 ( pa- 
pain) 、嗜热 菌蛋白 酶 ( thermolysin) 等 。 

应该指 出 胰蛋白 酶、 胰 凝乳蛋 白 酶均从 胰脏制 备 , 常常 不易完 全分开 , 而是你 中 有我, 
我中 有你, 专一性 不佳, 易造成 混乱。 应采购 TPCK- 胰 蛋白酶 (抑 制了胰 凝乳蛋 白酶活 
性 ) 和 TLCK -胰 凝乳蛋 白酶 (抑制 了胰蛋 白酶活 性), 才能保 证酶的 专一性 。 

二、 酶解操 作条件 

将 3(Vl(10(Vg) 蛋 白质, lOOmmol/L NH^HCOj.pH 8 . 5 , 5mmol/L DTT,50t: 作用 
15min ,在 冷至室 温后, 加 5;/1 lOOmmol/L 碘代 乙酸, 室温 15min ,加 6(^1 水,最后加酶 
[蛋白 样品: 酶 =25:1 (质 量比 )],37t: 保温 20~24h ,冻干 样品或 直接注 射样品 (用稀 
TFA 酸 化至约 91^2.5)到反相 HPLC 柱中 分析。 



31 



三、 讨 论 

(1) 蛋白 质的量 和浓度 

酶解不 能正常 进行的 主要原 因之一 是蛋白 质的量 不足。 精确定 量蛋白 质是必 需的, 
一般用 氨基酸 分析来 定量微 量的蛋 白质。 

蛋白质 浓度通 常要求 50(Vg/ml ,最 少不 得低于 10(Vg/ml ,否则 酶的消 化难以 进行, 
体积在 50 〜 10(^1。 

(2) 緩沖液 、盐和 去垢剂 

酶作用 可以被 缓冲液 中的各 种因子 所抑制 或完全 阻止。 在 标准的 2mol/L 尿素, 
. Imol/L NH4HCO3 系 统中, SDS 含量为 . 0005 % 时 ,就 会影 响酶的 消化。 . 005 % SDS 
会 减少许 多酶解 肽段的 产量。 类 似的, 染料考 马斯兰 和两性 电介质 也会阻 止酶的 消化。 
高浓 度的盐 (Imol/L NaCl) 也 会影响 蛋白水 解酶的 活性; 2mol/L 以 上浓度 的尿素 会影响 
羧甲基 化和蛋 白酶的 消化。 

(3) 羧 甲基化 

Stone 等报道 ,转铁 蛋白用 酶解时 ,羧甲 基化的 转铁蛋 白酶解 很好, 而没 有羧甲 基化的 
转铁 蛋白, 酶 解程度 很差。 

(4) 蛋白 酶的量 

酶 和蛋白 质的质 量比为 1:25, 如果 分子质 量大的 蛋白质 (>6 万 Da) , 则比例 要减低 
至 1:50。 胰 蛋白酶 要用序 列级的 商品。 

(5) 原 位酶解 

将 SDS-PAGE 上的蛋 白质样 品从凝 胶上解 析下来 是很困 难的, 文献 报道有 很多方 
法, 但实用 性差。 目前流 行的方 法是将 蛋白质 电印迹 (blotting) 至 PVDF 类的 膜上, 直接 
进 行序列 分析或 直接在 膜上进 行酶解 , 后者 称为原 位分析 ( in situ ) 。 

操作 如下: 膜 片剪成 1mm 细条, 放在 Eppendrof 管中, 力卩 1.2ml 0.5%(m/V) PVP- 
40/O.lmol/L HAc,37t: 保温 30min,PVP-40 的作用 是阻止 在酶解 时蛋白 酶吸附 到硝酸 
纤维素 膜上, 除去 PVP-40 后, 用水充 分洗洚 膜至少 5 次 以洗净 残留的 PVP-40( 因为 
PVP-40 有很强 的紫外 吸收, 在 RP-HPLC 中, PVP-40 于 30% 〜40% 有机 溶剂浓 度时洗 
下来, 它在 215~220nm 有很高 的吸收 ,在 260〜289nm 吸收很 小), 所以在 HPLC 前需完 
全 除去。 膜片 再用酶 解时的 缓冲液 漂洗, 然 后进行 酶解, 一般蛋 白酶在 lOOmmol/L 
NH4HCO3 : ACN = 95:5,pH8.2,37r 酶 解过夜 ,对 V8 蛋白 酶则在 lOOmmol/L 磯 酸钠: 
ACN = 95:5,pH7.8, 室温 过夜。 酶 与底物 之比为 1 : 10 至 1 :20( 质量比 ) ; 对亚微 克级样 
品, 酶与 底物之 比高达 2:1。 酶解后 -201C 保存或 立刻用 数微升 lOo/oTFA 酸化, 上样到 
HPLC 柱上 分析。 

(6) 限制 性醉解 

有助于 蛋白质 测序时 的序列 演泽。 最著名 的例子 是核糖 核酸酶 (RNase) ,它 被枯草 
杆菌 蛋白水 解酶在 pH 8.0 下作用 ,活 性没有 变化, 但 出现一 个新的 N 端丝 氨酸。 用 Am- 
berlite IRC-50 离子交 换柱, 0.2mol/L pH6.25 的 碟酸钠 缓冲液 可分离 到一个 大片段 
(S 蛋白) 和一个 小片段 (S 肽)。 也 可用三 氯乙酸 (TCA) 沉淀法 ,沉淀 部分是 S 蛋白, 上层 
• 32 • 



^ 



液 部分是 5肽 [28] 。 同法 亦可用 在糖原 磯酸化 酶等的 研究中 



第四节 蛋 白质中 存在着 封闭的 N 端 

有些蛋 白质的 N 端是封 闭的, 尤其在 Ehrlich Ascites 腹水细 胞中, 80% 的蛋 白质的 N 
端 是乙酖 化的, 因此用 Edman 法不 能直接 测定其 序列, 要用 一系列 的化学 或酶处 

理 [29, 30]。 

如果在 蛋白质 / 肽序列 仪上测 定不到 序列, 蛋白质 的量肯 定又是 足够的 ,则可 在仪器 

上 进一步 用含水 TFA (三氟 乙酸) 处理 样品, 使蛋 白质酸 水解成 许多肽 段后再 测序, 这时 
会 有很多 PTH- 氨基酸 出现, 以此反 证此蛋 白质的 N 端是封 闭着的 ,再用 下述方 法除去 
封 闭着的 N 端。 

首先, 用 温和的 酸处理 可以除 去甲酰 化的甲 硫氨酸 (f-Met) ,也可 能引起 丝氨酸 、苏氨 
酸的 乙酰化 N — 重排 反应。 如 果酸处 理后还 是测不 到序列 , 则进 一步用 焦谷氨 酸氨肽 
薛 除去 蛋白质 N 端上 的焦谷 酰基; 假设 这一方 法仍不 见效, 再用较 强的酸 处理或 其他酶 
处理。 虽然 有乙酰 氨基酸 释放酶 (acylamino acid- releasing enzyme, AARE) , 但它不 能作用 
长度在 20 个氨基 酸残基 以上的 蛋白质 或肽。 因此, 封闭 的蛋白 质首先 裂解成 小肽, 再用 
AARE 处 理除去 N 端上的 乙酰化 氨基酸 转变成 n-1 肽, 然后 n-1 肽的序 列再用 Edman 法 
测定。 

一、 除去蛋 白质中 封闭的 A/ - 乙酰丝 氨酸和 A/ -乙酷 苏氨酸 

样 品置于 1.5ml 的 聚丙' 烯离心 管中, 加无水 TFA, 密闭, 40t: 保温 Ih ,然 后打开 管盖, 
让 TFA 挥发 , 干燥 , 再进 行序列 分析。 

二、 除去 A/ - 甲酷甲 硫氨酸 

样 品置于 1.5ml 聚丙 條离心 管中, 加 3(V1 0.6mol/L HCl ,密 闭, 251: 水解 24h ,打开 
管盖, 真 空除去 HCl ,然 后进 行序列 分析。 

以上 两种温 和酸水 解除去 甲醜或 乙酰氨 基酸, 这与 时间、 温度、 酶浓度 有很大 关系, 过 
分的酸 水解会 引起蛋 白质中 肽键的 断裂, 如 对酸不 稳定的 Asp-Pro 键; 相反, 条件 不够, 则 
封闭的 N 端基团 水解不 完全, 导致测 序的起 始点不 均一。 

三、 除去 N 端的 焦谷氨 酸残基 (pyroglutamate) 

样 品在序 列仪上 测不出 N 端, 则将载 有样品 的膜片 转移至 1.5ml 聚丙' 烯微量 离心管 
中, 用 0.5%PVP-40 洗膜片 (见上 节原位 醇解部 分), 再加 lOO/Ltl 焦 谷氨酸 氨肽酶 (5ptg 于 
50mmol/L 碟酸钠 pH7 . , 含 lOmmol/L DTT) 371: 酶解 5 〜 lOh ,用 水洗膜 , 干燥 ,放 回序 
列仪 分析。 



四、 除去 其他的 A/ -乙酷 氨基酸 [3 1 ] 
五、 选择 性纯化 N 端封 闭的肽 

蛋白 质用胃 蛋白酶 (pepsin) 或 嗜热菌 蛋白醉 (thermolysin) 作用后 (但 不能用 胰蛋白 
酶! ), 酸化到 pH 2, 上 强酸性 阳离子 交换柱 (例 Dowex 50mmX2mm,H+ 型)。 所 有含游 
离 氨基或 其他碱 性基团 的肽都 结合至 柱上, 仅缺少 碱性基 团的肽 通过柱 泄出。 如果 N 端 
是封 闭着的 (没有 游离的 N 端氨基 ), 同时 因用专 一性很 广的酶 作用, 肽较 小又不 含组氨 
酸、 赖氨酸 、精 氨酸, 则可在 排出液 中发现 N 端封闭 的肽。 

此技术 的局限 性是: 大肽 (甚 至含 有碱性 基团) 可能不 结合到 树脂上 ,因 为它们 不渗人 
树脂孔 径内; 相反, 一些疏 水的肽 ,特 别含有 色氨酸 残基, 即是它 们缺少 游离的 N 端氨 基, 
也可能 结合到 柱上。 此外, 如果存 在碱性 基团非 常靠近 N 端, 胃蛋 白酶作 用不能 除去, 则 
该技 术也不 见效。 

应该 指出, N 端 为谷氨 酸的肽 在极端 pH 下会 环化而 转变成 封闭, 需加以 小心。 
近年来 , 由 于质谱 ( MS) 在 生物样 品检测 中有 了长足 的发展 , 可用 MS 精确测 定分子 
质量 的方法 来判断 封闭的 N 端为何 种基团 [ 32 3。 

第五节 蛋白 质中的 C 端残基 的测定 

一、 接 肽酶法 

羧肽 酶是最 常用的 方法, 对一 些小肽 而言, C 端有时 最容易 测定的 ,如 胰蛋白 酶酶解 
肽段时 总是以 Lys 或 Arg 为 C 端; BrCN 裂解 的肽总 是以高 丝氨酸 ( homoserine) 为 C 端; 
V8 蛋白薛 酶解的 肽总以 Glu 或 Asp 为 C 端。 虽 然有非 专一的 情况, 但毕竟 出现的 概率很 

少。 

羧 肽酶酶 解是从 C 端开 始, 一个一 个地从 C 端释放 出氨基 酸残基 ,这 是个动 态的释 
放 过程。 有的氨 基酸释 放快些 ,有 的氨基 酸释放 慢些。 对 小肽的 C 端序 列测定 问题不 
大, 但 对长肽 的序列 测定, 由于对 不同氨 基酸残 基释放 的速度 不同, 对后面 一些氨 基酸的 
序列 判断, 可能 会出现 错误。 在这方 面不如 化学降 解法。 

C 端序 列分析 是在酶 解的不 同时间 间隔, 取出一 定量的 反应物 停止反 应后, 用 氨基酸 
分析定 量氨基 酸来排 列出其 序列, 近来 用质谱 法测定 C 端序 列。 参 见有关 章节。 
(1) 羧肽醉 A (Cp A) 

此酶 释放非 极性氨 基酸速 度快, 释放 His 、Thr、 homoserine 也很快 ,释放 Asp、Ser、Met 
sulphone 则缓慢 ,释放 Lys 也 较慢, 但在高 pH 下则 速度加 快点; 酸 性氨基 酸的释 放也较 
慢, 对 Pro 和 Arg 基本 上不起 作用。 倒数 第二个 氨基酸 残基影 响水解 速度, 但对这 一现象 
作一 归纳 或解释 是很困 难的。 

此外, 如 何保证 Cp A 不污染 有内肽 酶也是 一个很 重要的 问题, 通常用 二异丙 基憐酰 
氟 (Diisopropylfluorophosphate,DFP) 处理以 抑制丝 氣酸蛋 白醉的 活性。 
• 34 • 



Cp A 在低离 子强度 下是不 溶性的 ,通 常以悬 液形式 存放于 4t: 。 使用 前将酶 悬浮在 
水中, 离心 除去上 层液, 上层液 中可能 含有游 离的氨 基酸, 而沉淀 部分溶 于少量 2mol/L 
NH4HCO3 中, 此 Cp A 加到 变性的 底物蛋 白质中 (10〜 100nmol,pH 8.5,0.2mol/L 
N-ethylnorpholine HAc) , 酶和底 物的分 子比为 1 : 100, 如果 底物在 此缓冲 液中不 溶解, 则 
可在 10/6SDS(m/V) 或 6mol/L 尿素中 进行。 有 时加正 亮氨酸 (norleucine, Imol/mol 蛋白 
质) 为 内标。 溶液在 25t: 保温, 隔 0.5,l,4,16h ,取 一定量 反应液 (l〜5nmol) ,加 等体积 
Imol/L HAc 停止 酶作用 , 离心 除去蛋 白 质 , 上 层液真 空干燥 , 然后残 余物溶 在氨基 酸样品 
缓冲液 中进行 氨基酸 分析。 以正亮 氨酸作 校正, 同 时有相 同程序 的空白 对照。 

如果在 酶作用 短时间 后就释 放出大 量的氨 基酸, 则改 用低的 Cp A 浓 度和作 用短时 
间 (5,10,20,6001»1)取样;相反,如果只有少量氨基酸释放,则可加大酶/底物的比例,或 
371C 作用 更长的 时间。 

(2) 羧肽酵 B (Cp B) 

从 蛋白质 / 肽的 C 端释放 Lys 和 Arg,CpB 存放在 - 20t: 时, 非常 稳定。 

(3) 羧狀酵 Y (Cp Y) 

目前 Cp Y 有更广 泛的专 一性和 通用性 ,一般 讲它作 用底物 C 端的疏 水性氨 基酸快 
些, 作 用于带 电荷的 氨基酸 慢些。 此酶很 稳定, 某些金 属离子 (例如 Cu 2 +,Hg2+) 抑制酶 
活性。 CpY 制 剂中可 能污染 有酵母 蛋白嗨 A ,这时 可加胃 蛋白酶 抑制剂 (pepstatin) 抑 
制 , 也可用 EDTA 抑制。 Cp Y 用量 一般为 底物的 1 /50 〜 1 /100 , 在 251: 作用, 于不同 时间 
取 反应液 酸化后 分析游 离的氨 基酸。 

(4) 羧舦醉 P (Cp P) 

CpP 是种 酸性羧 肽酶, 它 r: 存在 pH 5.5 的 50mmol/L 吡!^^醋酸缓冲液中,于 
-20X: ,6 个月 内非常 稳定。 其 作用于 pH2.5 的 lOOmmol/L 吡啶甲 酸缓冲 液中。 

二、 化学 降解法 

早年 的化学 降解法 只能测 定一个 C 端氨 基酸, 远远不 能满足 需求。 而 羧肽酶 法虽能 
测到 3〜5 个序列 ,但 这是一 个动态 演泽的 方法, 有可能 错判。 十多 年前, 蛋 白质化 学家就 
开始 用类似 Edman 降 解法从 C 端 逐个测 定氨基 酸序列 ,每 次国 际蛋白 质 会议都 有报道 , 
直到 1995 年 才有商 品仪器 供应。 目前 C 端序 列仪 一般只 能测定 5 个氨 基酸残 基左右 (这 
和蛋白 质的性 质有关 ,有些 可测到 10 个左右 ) , 在 nmol 水平上 ;这与 N 端 序列还 有很大 
的差距 ( 目前 N 端序 列仪灵 敏度在 lOpmol, 可测到 50 个 循环) 

第六节 蛋白 质中一 k 特殊 肽段 的检出 

一、 含琉基 肽的分 离纯化 和分析 

巯基在 蛋白质 性质、 结 构和功 能中具 有重要 作用, 因此含 巯基肽 段的鉴 定是蛋 白质化 
学不可 缺少的 部分。 文 献上含 Cys 的肽 常用同 位素标 记的碘 代乙酸 处理, 羧甲 基化, 然后 
在 HPLC 肽谱 分析时 跟踪有 标记的 肽段。 鉴于 用同位 素在国 内不很 方便, 我们用 4- 乙' 烯 

• 35 • 



吡淀 标记蛋 白质中 的半胱 氣酸, 酶解后 的肽谱 ,除用 214nm 检出外 ,同 时还用 254nm 检 
出 , 只有被 4 - 乙烯吡 淀修饰 的肽在 254nm 才有 吸收, 所以 能方便 地检出 【33] 。 

Steinman^^' 35 ] 等 用碘代 乙酸修 饰牛红 细胞超 氧化物 歧化酶 (SOD) ,测 定了其 一级结 
构和二 硫键的 定位, 确定 此酷含 有一对 二硫键 和一个 游离的 琉基, 因此 SOD 可以 成为研 
究 巯基修 饰的良 好材料 C 碘代乙 酸修饰 的蛋白 质在进 行氨基 酸序列 分析时 ,X 甲 基半胱 
氨酸的 PTH- 衍生物 (PTH-CMC) 和 PTH-Glu 较难 分开, 影响序 列测定 ,同 时需用 同位素 
标记才 能分离 到含有 巯基的 肽段。 我 们现用 4- 巯基 吡淀修 饰半胱 氨酸, 可以 在分析 
PTH- 氨 基酸时 清楚地 定位乙 基吡淀 化半胱 氨酸的 PTH- 衍生物 (PTH-PEC) ,同 时利用 
4 -乙' 烯 吡啶标 记后在 254nm 处有特 殊吸收 这一性 质 [33] ,分别 标记 还原的 SOD 和 天然的 
SOD ,从而 制备含 有巯基 的肽和 定位二 硫键。 

(-) 试剂 和仪器 

牛红 细胞超 氧化物 歧化醜 : Sigma 公 司产品 。 

巯基 乙醇, HPLC 级: Fluka 公司 产品。 

4 - 乙 稀吡捉 : Serva 公 司产品 , 重蒸并 充氮气 , - 201: 保存。 

盐酸胍 : Schwarz/Mann Biotech 公 司产品 。 

TPCK- 胰蛋 白酶: 本 实验室 自制。 

270A 毛细 管电泳 : Applied Biosystems 公司 产品。 

150 HPLC 和 RP-300 柱 ( Aquapore, 30mm x 4.6mm I. D. C-8), Spheri-5 ( 50mm x 
1.0mm I.D. ,C- 18): Applied Biosystems 公司 产品。 

477A/120A 蛋 白质序 列仪: Applied Biosystems 公 司产品 。 

(二) 方 法 , - 

(1) 总銃 基修饰 (还 原型 SOD) 

30(VgSOD 溶于 10(^1 6mol/L 盐 酸胍- 0.25mol/L Tris-HCl-lmmol/L EDTA, pH 
8.5 缓冲 液中, 充人 氮气, 加入 5^tl 10% 巯基 乙醇水 溶液, 室温避 光反应 2h ,然 后加人 4^^1 
4 -乙' 烯吡啶 , 室温避 光反应 1 . 5h。 立即 用反相 HPLC RP-300 柱脱 盐分离 , 收集样 品后抽 
干。 

(2) 游离銃 基修饰 (天然 SOD) 

30(VgSOD 溶于同 上的胍 -Tris-EDTA 缓冲 液中, 充入 氮气, 加入 15/^1 4 - 乙' 烯 吡淀, 
室温 避光反 映反应 3h ,立 即经 HPLC RP-300 柱脱盐 分离, 收 集样品 并浓縮 抽干。 

(3) 胰蛋白 晦水解 , 

修饰 后的样 品溶于 30(Va O.lmol/L NH4HCO3 溶液中 ,加入 3/^gTPCK- 胰 蛋白酶 (底 
物与 酸质量 比约为 100:1),371:,避光醜解411,再追加同量的酶,反应过夜。 10%TFA 调 
至 pH 3.0, 终止 反应。 

(4) 含 疏基被 修饰肽 段的氨 基酸序 列分析 

调节序 列仪中 120AHPLC 分离 PTH 氨基酸 洗脱液 A(5% 四氣 呋喃) 中 HAc-NaAc 
的离 子强度 , 使 PTH-Ala 和 PTH-HLs 保 留时间 间隔为 . 5 〜 1 . Omin ,便于 PTH-PEC 的分 
离。 
• 36 • 



(三) 结 果 



① 参见图 1 .7, 还原型 SOD (左图 ) 与天然 SOD (右图 ) 的 肽谱, 上图是 220nm 检测, 下 
图是 254nm 检测 , 仅显示 含巯基 的肽。 

② 含巯基 肽的序 列分析 

按 HPLC 图谱 洗脱次 序依次 命名肽 1 、 肽 2、 肽 3。 

肽 1:AVCVLK (4〜9); 

肽 2 : LACGVIGI AK( 53 〜 62 ) ; 

肽 3: GDTVWTGSITGLTEGDHGFHVHQFGDNTQGCTSAGPHFNPLSK (113 - 
156); 

由此 得出: 肽 1 中 Cys-6 是游 离的一 琉基, 而肽 2 中的 Cys-55 和肽 3 中的 Cys-144 形 
成二 硫键。 

(四) 提 示 

① 修 饰天然 SOD 所需 的乙烯 吡啶量 大大多 于修饰 还原型 SOD 所需 的量, 可 能原因 
是 SOD 在 还原过 程中蛋 白质结 构趋于 松散, 半胱氨 酸相对 稳定, 易于乙 烯吡啶 结合。 

② 调节序 列仪中 120A HPLC 分离 PTH 氨基酸 洗脱液 A(5% 四氢 呋喃) 中 HAc- 
NaAc 的离子 强度, 使 PTH-Ala 和 PTH-His 保 留时间 间隔为 0.5 〜: I .Omin ,便于 PTH- 
PEC 的 分离。 

二、 含 芳香族 氨基酸 肽的分 离纯化 和鉴定 

(一) 弓 I 言 

蛋 白质在 280nm 有特征 性的高 吸收, 这 主要是 芳香族 氨基酸 (色 氨酸、 酪氨酸 和苯丙 
氨酸) 的 贡献。 蛋白质 在酶解 后的肽 谱中, 检测波 长不用 280nm ,而 采用 214〜220nm ,这 
是由于 肽键的 强吸收 缘故。 肽谱 中不含 芳香族 氨基酸 的肽, 在 280nm 下, 基本上 没有吸 
收峰, 但含有 色氨酸 或酪氨 酸的肽 ,则在 280nm 下却 表现出 强的吸 收峰。 据此, 我 们可以 
辨别含 芳香族 氨基酸 的肽。 

此外, 含 芳香族 氨基酸 肽的二 阶微分 光谱也 和一般 肽的二 阶微分 光谱有 明显的 差别。 
有报道 在碱性 条件下 (pH 12.5),Tyr 离子 化的二 阶微分 光谱与 Trp 的二阶 微分光 谱完全 
不同, 特别在 260nm [36] 。 但 这样的 条件对 酸性的 HPLC 反相 柱显然 是不合 适的。 我们用 
不含 Trp 和 Tyr 的 19 肽 (从血 红蛋白 酶解物 中分离 纯化) ,含有 Trp 的 5 肽胃 泌素, 含有 
Tyr 的合成 7 肽和同 时含有 Trp 与 Tyr 的 LH - RH 作为模 型肽, 进行了 HPLC 分 析和在 
线二阶 微分光 谱分析 ,结 果见图 2.4 [37] 。 

由图谱 可见, 不含 Tip 和 Tyr 残基 的肽, 二阶微 分光谱 为一无 序图谱 ,没有 Trp 和 
Tyr 的特 征峰形 (图 2. 4a); 含 Trp 的 肽的二 阶微分 光谱在 290nm 处有 特征峰 (图 2.4b) ; 
含 Tyr 肽的二 阶微分 光谱在 283nm 处有 特征峰 (图 2.4c) ; 同 时含有 Trp 和 Tyr 的 肽的二 
阶微分 光谱在 290nm 和 283nm 处都有 特征峰 (图 2.4,d)。 据此也 可以辨 别含不 同芳香 
族氨基 酸的肽 [ 36] 。 

• 37 • 



图 2.4 模型 肽的在 线二阶 微分光 谱分析 
a. 19 肽; b. 5 肽胃 泌素; C. 合成 7 肽; d.LH-RH。 

(二) 不同波 长测定 IS 出 含芳香 族氨基 酸的肽 

由于芳 香族氨 基酸在 280nm 附 近有强 吸收, 但它们 的强度 差别也 很大, 一般是 Trp;» 
Tyr》Phe。 基于此 ,我们 可以比 较同一 肽图在 214nm 和 280nm 下的 吸收, 可以方 便地判 
断 哪一个 肽可能 含有芳 香族氨 基酸。 

1. 材料 

新 型白细 胞介素 - 2(Ser-125) : 上海医 药工业 研究院 中试组 提供。 

2. 方法 ' 

① 酶解: TPCK- 胰蛋白 酶为本 实验室 自制。 IL-2:TPCK- Trypsin = 50:l( ,碳 
酸 氢铵缓 冲液, pH 8.0,37t: 酶解 4h, 加 TFA 至 pH 2~3 停止 反应。 

② HPLC:Beckmam System Gold 系统, 250mm X4.6min I.D. RP-18 柱。 梯 度洗脱 
条件为 . 1 o/o TFA/H2O -0.085 % TFA/CAN , 60min。 

③ 蛋白质 / 多 肽序列 分析: ABI 477A 序列仪 ,常规 分析。 

3. 结果 

参见图 1.9, 这是 白细胞 介素- 2 的酶解 肽谱, 上图是 214nm 检测, 下图是 280nm 检 
测。 由此可 方便地 判定下 图中的 高吸收 峰含有 芳香族 氨基酸 [ 38] 。 

(三) 二阶 微分光 谱检出 含芳香 族氨基 酸的肽 

1. 材料 

19 肽: 由血 红蛋白 (3 链酶 解后从 HPLC 制备, No.41〜59。 

Phe-Phe-Glu-Ser-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Thr-Prc^Asp-Ala-Val-Met-Gly-Asn-ProLys 
5 肽胃 泌素: 上 海丽珠 东风生 物技术 有限公 司产品 。 
- 38 • 




A/nm 



-0.10 
-0.20 



0.30 
0.05 
- 0.45 
-0.95 

A/nm 



0.12 
^ 0.02 
E -0.08 
cS^ -0.18 
-0.28 



Tyr 

250 260 270 280 290 300 310 

A/nm 



250 260 270 280 290 300 310 
A/nm 



nvEAC? 




Boc-P-Ala-Trp-Thr-Pro-Phe-NH2 
合成 7 肽: 崔大 敷教授 合成并 赠送。 

Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr 
LH-RH : p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 
重组人 表皮生 长因子 (hEGF) : 甘人 宝教授 赠送。 
新型 人白细 胞介素 -2(Ser-15) : 天 元生物 技术有 限公司 提供。 

2. 方法 和仪器 

① HPLC:HP 公司 HPLC 1090M Series 11, 具有 DAD 检测 器和相 应化学 工作站 软件, 
可 在线对 图谱各 峰进行 二阶微 分光谱 分析。 HP-C18 柱 (100mmX2.1mm I.D.);TEA- 
ACN 梯度 (均为 HPLC 级产品 ) ;mAU 为 毫吸收 单位。 

② 酶解 条件: TPCK- 胰蛋白 酶为本 实验室 自制。 HEGF: 胰 蛋白酶 = 50:1(W/W), 
. Imol/L 碳 酸氢铵 缓冲液 , pH 8 . 3 , 371: 酶解 18h 后, 用稀 TFA 调节至 pH 2 . 左 右上柱 
分析。 

③ 氨基 酸分析 :适 量肽于 not: 下, 恒沸点 HC1 水解 22h( Waters 水解工 作站) 后, 于 
Beckman 6300 氨基酸 组成分 析仪上 分析。 

④ 蛋 白 质序 列分析 : ABI 477A/120A 蛋 白 质序 列仪上 , 按 常规方 法进行 。 

3. 结果 

( 1 ) hEGF 的 肽 语及含 Trp 肽 的分析 

图 2.5a 图是 hEGF 的酶解 产物的 肽谱; 对肽谱 中每个 峰进行 二阶微 分光谱 分析, 只 
有标星 号的肽 ,在 290nm 处有一 明显的 负峰, 是 Trp 肽的 特征二 阶微分 光谱。 见图 2.5b。 



根据 EGF 的一级 结构, 它仅在 C 端肽中 有两个 Trp 残基。 收集 星号肽 进行氨 基酸分 
析, 仅 Glu、Leu、Arg ,其比 值近于 1 , Trp 在酸 水解时 被破坏 •。 对肽 的序列 分析结 果为: 
-Tri>Tri>au-Leu-Arg。 由 此判定 此肽是 EGF 的 C 端肽。 
(2) 新型 IL-2 的肽语 及其相 关分析 

新型 IL-2 是重组 蛋白, 其突 变点是 原来的 Cys-125 改变成 Ser-125。 将新型 IL-2 用 
TPCK- 胰蛋 白酶酶 解后, 进行了 RP- HPLC 分离 分析。 因为 IL-2 中只 有一个 Trp 残基位 
于 121 位。 

肽 谱的二 阶微分 光谱扫 描判定 仅星号 肽具有 Trp 肽 的特征 光谱, 即此肽 是含有 Trp 
的 C 端肽 (No. 121〜133) (图 2.6)。 




图 2.5 hEGF 的胰 蛋白酶 聽 解肽谱 (a) 及其峰 2 的 二阶微 分分析 (b) 



39 




10 20 30 40 50 

//min 



图 2.6 IL-2 的薛解 肽谱及 其二阶 微分光 谱分析 

收 集此肽 进行序 列测定 , 结果是 : 

121 125 130 133 

Trp-Ile-Thr-Phe-Ser-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser-Thr-Leu-Thr 
更证 实了二 阶微分 光谱结 果的可 靠性。 
(3) 讨论 

二阶微 分光谱 分析具 有简便 、快速 的优点 , 不 必增添 任何试 剂处理 并能在 线检测 。 但 
此法 也有一 定的局 限性, Trp 和 Tyr 的 二阶微 分光谱 都有次 峰谷, Trp 除在 290nm 有特征 
峰外 , 在 282nm 有 次峰谷 ; Tyr 在 282nm 有特 征峰外 , 在 276nm 有次 峰谷。 它们 且有重 
叠现象 ,所 以判别 Trp 肽 中含有 Tyr 的 存在是 件困难 的事, 特别当 Trp:Tyr= 1 : 1 时, 因 
为 Trp 的 光吸收 系数比 Tyr 大 得多。 . 

三、 含 Lys- 肽的分 离纯化 和鉴定 

赖 氨酸的 e- 氨 基可以 和磯酸 吡哆醛 (PLP) 形成 Schiff 碱, 该衍 生物在 325nm 有特殊 
的吸收 ,利用 这一性 质可找 出含有 Lys 残基 的肽段 [ 39 、 

• (-) 引 言 

蛋 白质中 的赖氨 酸残基 常常与 生物活 性密切 有关。 例如 酸缩酶 (ALD) 中的 Lys-227 
和同 位素标 记的憐 酸二轻 丙酮反 应后, 经 NaBH4 还原可 以形成 Schiff 碱。 此时酶 分子上 
可 测定到 等克分 子数的 放射性 , 同 时酶的 催化活 性丧失 。 

用同位 素标记 肽比较 麻烦, Shapiro[ 4 G ] 则 发现醛 缩酶中 Lys-117 和磷酸 吡哆酸 (PLP) 
反应, 并经 NaBH4 还 原也可 以形成 Schiff 碱, 酶 活性受 抑制, 但修饰 后的酸 缩酶仍 可和底 
物 结合。 由 此推论 Lys-107 是一次 要活性 部位。 

用 PLP 作 用的优 点是避 免用同 位素, PLP 修饰在 Lys 残基 上形成 的肽, 在 325nm 有 
• 40 • 




一特 殊吸收 [ 4 G]。 因此, 这 种技术 对制备 和分离 Lys- 肽 具有普 遍意义 



(二) 材料 与试剂 

酲缩酶 :本 实验室 制备。 
PLP:Sigma 公司 产品。 
NaBH4:Aldrich 公司 产品。 
ACN:Fluka 公司 产品。 
TFA:Merck 公司 产品。 

(三) 方 法 

① PLP 修饰 :2mg ALD(12.5nmol) 和 8/^1 lOmmol/L PLP 在 2ml lOmmol/L, pH7.5 
Tris-HCl 缓 冲液中 室温避 光反应 30min,pH 调至 6.5 后加入 2(^1 0.5mol/L NaBHi 
(l(Vmol),OlC 反应 10min。 对 重蒸水 透析。 在分 光光度 计上全 波扫描 来计算 PLP 的结 
合量 , 以 e280nm 二 1 . 46 X lO^L/mol 定量 ALD 蛋白 含量, 以 e325nm = 1 . 015 X 10 4 L/mol 定量 
PLP 衍 生物的 含量。 

② TPCK- 胰蛋白 酶水解 :lmg/ml ALD 在 lOOmmol/L pH8.0 NH4HCO3 中, 371: 反 
应 过夜。 底物 与酶重 量比为 50:1。 

③ 酶解 产物的 分离: 酶解 产物经 ABI150A HPLC 分离 系统, 柱为 Spheri-5 ( C1 8 , 
50mmx 1.0mm I.D. )。 流动相 A 为 0.1%TFA; 流动相 B 为 0.085%TFA- 7096CAN。 
洗脱 条件: 0% 〜 250/6B 20min;25% 〜75%B 60min;75% 〜 100%B 10min。 流速为 
0. Iml/mino 

④ 肽纯 度鉴定 :在 ABI 270A 型 毛细管 电泳上 分析。 毛 细管长 75cm (至 检测 器距离 
50cm) , 内径 5(Vm。 电泳 条件为 20mmol/L pH2.5 柠檬酸 缓冲液 , 电压 20kV, 电流 15/LtA。 

⑤ 氨基 酸序列 分析: 在 ABI 477A/120A 蛋白质 / 多肽 序列仪 上常规 进行。 但在 120A 
PTH 分析系 统中改 变了乙 酸盐的 浓度, 使 PTH-Ala 与 PTH-His 洗 脱时间 相差约 1 .5min, 
这 样可将 PTH-Ala 与 PTO- Lys* (经 PLP 修饰) 能分 离开。 

(四) 结 果 

(1) PLP 结合位 点肽段 的分析 

图 2.7 为 ALD 经 PLP 修饰后 的胰蛋 白酶酶 解图, 其中图 2.7a 在 220nm 波长 检测, 
图 2 . 7b 在 325nm 波 长检测 。 

分别 收集图 2.7 b 中的峰 1,2,3, 经毛 细管电 泳鉴定 纯度, 如纯度 不够, 则在 HPLC 上 
稍加改 变洗脱 梯度再 纯化。 

(2) 含 Lys- 肽的 序列分 析结果 

101 107 110 

肽 1 :OOV-V-G"I-K* -V-D-K 

28 41 42 

肽 1 : G-I-L-A-A-D-E-S-T-G-S-I-A-K * -R 




20 40 60 80 20 40 60 80 

t/m'm 



图 2.7 PLP- 修 饰的醛 縮醇经 胰蛋白 醒水解 产物的 HPLC 图谱 

87 91 98 

肽 3: A-I>r>G"R* -P-F-P-Q-V-I-K 

(夏 其昌) 

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43 



附录一 微量蛋 白质实 验室注 意事项 

(1) 环境 

由于是 微克级 的操作 ,实验 室内的 温度、 灰尘、 纤维、 皮 肤和头 皮屑都 会影响 结果。 

(2) 吸附 

玻璃容 器的表 面吸附 ,由于 量少, 会 使大部 分物质 被吸在 壁上. 在溶 液中的 量趋于 

零。 

用透 析袋, 少量 蛋白质 (lOOpg) 会因 吸附作 用而导 致严重 损失。 建议 用微量 透析仪 
器 , 或用 小的凝 胶过滤 柱脱盐 , 甚至 用挥发 性溶剂 , 避 免脱盐 。 

推荐储 存少量 肽( < lOnmol) 在小的 玻璃管 (5mm X 50mm) 中 , 避免转 移和表 面吸附 
引起的 损失。 

冻干样 品时, 如果 用大的 器皿, 则用 硅烧化 处理; 有时候 ,宁可 存放样 品在聚 丙條管 

中。 

(3) 样 品加样 和转移 

小量 样品采 用称量 是不精 确的, 因为有 的样品 含盐易 吸湿。 蛋白质 / 肽 溶在适 合的小 
量溶剂 中 ( 例 5(^1) ,用 5 〜 1(^1 进 行分析 , 而且 建议用 玻璃的 微量注 射针筒 , 这 比 用微量 
可 调加样 器精确 得多。 - 

吡淀- 乙酸- 水是相 当好的 蛋白质 / 肽的 溶剂, 但 吡淀在 280nm 有很 高的光 吸收, 影响 
到紫外 定量和 HPLC 的 检出。 此时, 较大的 酸性肽 可溶在 NH40H,NH4HC03, 有 些蛋白 
质 / 肽在此 溶剂中 不溶解 ,则 可用酸 (70% 甲酸, 或 TFA) ,并 尽快在 真空干 燥后于 -20t: 
保存。 为防 止在过 程中空 气泡的 喷出而 使样品 丢失, 开始可 用水^ 抽 lOmin ,直至 溶解在 
水 中的空 气泡逸 出后, 再用油 泵真空 干燥。 

(4) 反应 

小体积 的溶液 ,先 用微量 离心机 使样品 集中在 底部, 加人 试剂后 迅速密 闭防止 小体积 
溶剂的 挥发, 然后 祸旋, 样 品和转 移均用 微量注 射器。 

附录二 常用试 剂处理 

(1) 水 

在我 们实验 室采用 Mini- Q 水。 必须 指出: 即使用 Mini Q 水也要 新鲜, 长期 存放的 
Mini Q 水, 在 HPLC 空白时 ,也 会有峰 出现。 

(2) 淡化氩 (cyanogen bromide, BrCN) 

应新鲜 配制, 完全 无色才 能用。 平 时密闭 保存在 -20t:。 

(3) 盐酸胍 (Guanidium chloride, Gu. HCl) 

推荐用 Schwarz/Mann Biotech 公司的 超纯级 产品。 纯化 方法见 Nozaki, Y. , Methods 
Enzymol. , 1972 ;26 :43〜50 

(4) 6mol/L 盐酸 

浓盐酸 加等体 积水, 重蒸 三次, 去 除前后 馏分。 此产 品通常 认为是 6mol/L 
• 44 • 



(或 5.7mol/L) 的 HC1。 
(5) 尿素 

尿素溶 液在放 置时, 特别 在碱性 pH 下, 会有 氰化胺 (ammonium cyanatc) 积累, 故应用 
新鲜配 制尿素 溶液。 

氰化胺 除去的 方法: 溶液通 过一混 合离子 树脂的 小柱, lL8mol/L 尿素 溶液需 lOg 树 
脂, 开 始流出 柱的两 个柱体 积的尿 素丢弃 不用。 



45 



第三章 氨 基酸组 成分析 

氨基酸 是一种 小分子 的两性 化合物 ,分子 质量在 75〜200Da 之间, 其化学 通式为 
R-CH-aX)H ,在 生物体 内出现 的氨基 酸都是 L 型, 仅 在少数 微生物 来源的 多肽中 

NH. 

出现 D 型氣 基酸: 常见的 20 # 氨基 酸结构 式见表 1.1。 

無基酸 分析技 术的发 展始于 1820 年, 由 Braconnm 最早 将甘氨 酸从白 明胶水 解物中 
分离 出来, 到 21 世纪初 ,用化 学方法 或微生 物方法 测定氣 基酸, 仍是一 项持续 数周或 
数月的 繁琐的 工作。 

色谱 技术的 引入为 氨基酸 分析打 开了一 扇新的 大门。 1941 年, Martin 等运用 色层法 
分析 氨基酸 , 主 要采用 乙酰化 氨基酸 在娃胶 柱上或 滤纸上 半定量 ; 随后 , Moore.Stein 应用 
离子交 换柱直 接分离 游离的 氨基酸 ,在 1958 年, Spackman、Stein、Moore [ i ] 制造了 自动化 
的氨 基酸分 析仪, 使気基 酸定量 分析进 人了一 个崭新 的阶段 ,至 今仍是 经典的 方法。 

第一节 氨基 酸组成 分析的 目 的 

氣基酸 是维持 生物体 正常机 能的必 需物质 ,氨基 酸分析 在生命 科学、 制药、 食品、 饲料 
和临床 检验等 领域具 有非常 重要的 意义。 现 代分离 提纯技 术的发 展使蛋 白质操 作微量 
化, 但也 给定量 带来了 困难, 一 般很难 通过常 规的称 量或测 蛋白质 溶液在 280nm 的光吸 
收值 来准确 定量蛋 白质。 所以, 如 果在蛋 白质酶 解或测 序前, 取蛋白 质样品 的一部 分进行 
i [基 酸组成 分析, 根据结 果便可 以推算 出蛋白 量的可 靠值。 另外, 在 蛋白质 测序中 有时遇 
到 测不出 结果的 情况, 一种可 能是蛋 白质的 N 端封闭 ,另一 种可能 则是样 品本身 不是蛋 
白质或 绝大部 分是非 蛋白质 物质, 解决 这个问 题的很 好途径 便是做 氣基酸 组成分 析以确 
定 样品的 成分。 ' 

除了 蛋白质 研究和 重组蛋 白需要 测定氨 基酸组 成外, 医 学上也 需要测 定血液 或各种 
体 液中的 游离氨 基酸。 

第二节 蛋白 质的水 解方法 

氨基 酸分析 的第一 步是将 蛋白质 或多肽 水解, 常 规方法 是采用 5. 7mol/L 盐 酸在真 
空状 况下于 UOt: 水解 24h ,也 有在 1501: 下快 速水解 90min[ 2 ]。 Woodword[ 3] 等人 提议用 
微波 福射法 (20~25mm,15(VC) 来 水解蛋 白质和 多肽。 如果 是测定 生理样 品中的 游离氨 
基酸, 在样品 预处理 时主要 是通过 强酸、 有机 溶剂、 盐析、 加热、 超滤 和预柱 等方法 将大分 
子蛋白 质除去 ,评 价除去 蛋白质 方法的 有效性 应从去 除蛋白 质效果 和待分 析样品 的回收 
两 方面来 评价。 

• 46 • ■ 



我们 实验室 目前采 用的是 气相水 解法, 操作 简便, 样品的 损失小 ,回 收高。 Stein[~^j 在 
1987 年提出 气相水 解法, 而后 Waters 公司 有商品 化仪器 (水 解工 作台) 出售 (图 3.1a)。 
将 100〜500pmol 的蛋 白质或 肽转移 到水解 指管中 (图 3. lb) 冷冻 抽干, 在 水解反 应器中 
(图 3.113)加入5.70101/1^盐酸20()^11,含2%苯酚(;"/\0,将指管置于反应器中,抽真空并 
充 氮气反 复三次 (图 3.1c ,真 空控制 也是实 验重复 性的一 项重要 因素) UOt: 保温 22h。 其 
中, 苯酚是 作为一 种抗氧 化剂来 防止半 胱氣酸 (Cys) 和甲 硫氨酸 (Met) 的 氧化。 如 果遇到 
一些不 易裂解 的肽键 ,如 Val — Val,Ile~Leu 等, 水 解时间 可适当 延长至 72h ,但长 时间水 
解 会部分 破坏含 经基的 氨基酸 [丝 氣酸 (Ser), 苏氨酸 (Thr), 酪氨酸 (Tyr)]。 




图 3.1 氨基 酸水解 工作台 
a. 水解台 :高温 水解室 (1); 温 度指示 (2); 真空表 (3); 真空操 
作部位 (4); 开关 (5); 冷颈 (6)。 b. 水 解指管 (7) 和水 解反应 
器 (8)。 C. 真空操 作部位 :通氣 (9); 真空 (10)。 d. 水 解室可 
容纳 4 个水解 反应器 

影响氨 基酸分 析结果 的三大 因素是 : 水解 、衍 生、 色谱。 水解是 第一步 , 水解的 完全与 
否对结 果影响 很大。 在我们 实验中 采用一 些标准 蛋白质 ,如细 胞色素 c(Cyt C) 、核 糖核酸 

• 47 • 



酶 (RNase) 或 胰岛素 (insulin) 为标 样进行 水解、 衍生和 色谱分 析来计 算回收 ,从而 考验蛋 
白 质分析 的可靠 程度和 评价方 法的适 用性。 

表 3.i —些标 准蛋白 质的氨 基酸组 成分析 



S 基酸 


胰岛素 


马心细 胞色素 C 


理论值 




实验值 


理论值 


实验值 


Asp 


3 




2.8 


8 


8.3 


Thr 


1 




1 .0 


10 


7.9 


Ser 






2.8 






C;iu 


, 




7.0 


12 


13.5 


I'm 


1 




1.2 


4 


3.8 


(; ly 


4 




4.1 


12 


10.7 


Ala 






3.0 


6 


5.9 


Cys" 


6 




2.3 






Val 






4.0 


3 


4.0 


Met 










2.4 


lie 


1 




0.7 


6 


6.2 


Leu 


6 




5.8 


6 


6.2 


Tyr 


4 




3.8 


4 


3.3 


Phe 


3 




3.0 


4 


3.6 


His 






2.0 


3 


3.4 


Lys 


1 




1.2 


19 


20.1 




1 




1 .3 







* 来作任 何处理 



伹 由于各 种蛋白 质含有 的氨基 酸多少 不同, 并且每 一种氨 基酸的 量也不 一样, 有的氨 

基酸含 iii 可 多到十 几个, 有的氨 基酸含 量只有 1~2 个, 这影 响到氨 基酸的 回收。 生物应 

用公司 曾设计 过一种 "测试 肽", 即人 工合成 18 种不 同氨基 酸的肽 (除 Gln、Asn 外), 这样 
每种鐵 基酸出 现的频 率都是 1, 用此肽 来校正 回收, 看 来机会 均等, 是一种 可以采 纳的方 
法。 我们也 对合成 此肽作 了尝试 ,但在 实际样 品中, 不 太可能 出现这 种理想 情况。 
测 试肽的 结构: 

H-Cys- Pro~Asp4)he- (; ly- His-Ile-Ala-Met-(;lu-Leu-Scr- Val-Arg- The-Trp-Lys-Tyr-OH 

第三节 特殊 氨基酸 的保护 和定量 

不同条 件下, 各 种氣基 酸的回 收有所 不同, 但色氨 酸均遭 破坏, 通常解 决方法 有以下 
5 种。 

1. 水解 酸中加 添加剂 

这些 添加剂 包括巯 基乙酸 [4 ] 和 巯 基乙醇 W ,我 们通过 实验认 为液相 水解时 加入巯 
基乙 醇对色 氨酸保 护效果 较好, 色氨 酸的回 收可达 80%。 有报道 Perkin- Elmer 公 司针对 
其产品 ABI 420A 的特点 ,推 出试剂 十二烧 基硫醇 [ 6 ], 专门 保护色 氨酸, 据称回 收率达 
97%, 但由于 其试剂 ^滴 在加样 孔的砂 芯玻璃 上使其 在水解 时造成 一种还 原环境 来保护 
色氨 酸的, 只适 用在该 公司特 定的仪 器上, 不能 在其他 仪器上 推广。 
• 48 • 



2. 有机酸 

3mol/L 巯基乙 横酸 ( mcrcaptoethanesulfonic acid ) [?] 或 4mol/L 甲礎酸 ( mcthane-sul- 
fonic add)[«] 在水 解时对 色氨酸 有一定 的保护 作用。 

3. 喊 

用氢 氧化钠 [ 9 ] 和氣 氧化钡 代替酸 水解, 可保 护色氨 酸不被 破坏。 

4. 酶 

蛋 白 酶 水解法 有时也 有应用 , 其优 点是条 件温和 , 对天冬 酰胺和 谷氨酰 胺及色 氨酸均 
无破坏 作用, 但酶 水解法 往往不 完全, 必 须用酸 水解法 校正。 

5. 光谱法 

分光 光度法 和二 阶微分 光谱法 [I 2 ] 可测定 色氨酸 ,前 者应用 较早, 在蛋白 质分子 
中, 如不含 胱氨酸 和其他 有干扰 的发色 基团的 氨基酸 ,根 据其在 6mol/L 盐 酸胍的 中性溶 
液中 的紫外 吸收, 测 定色氨 酸和酪 氣酸的 含量, 此经验 公式只 适用于 色氨酸 对酪氨 酸的比 
值为 0.2〜1 时的 情况。 后者常 被用来 确定蛋 白质中 芳香族 氨基酸 的含量 ,计算 公式复 
杂。 Hewlett Packard 公司 推出的 DAD 检测 器配合 其化学 工作站 软件, 能 较方便 地在线 
检 测并定 量肽段 中的色 氨酸。 

虽然 蛋白质 和多肽 的氣基 酸分析 法对大 多数氨 基酸是 快速、 准确和 灵敏的 ,但 在半胱 
氨酸定 量时仍 遇到很 大困难 ,解 决这个 问题的 途径有 两种, 一种是 还原烧 化法, 另 一种是 
氧 化法。 

(1) 还原 坑化法 [ 8 ] 

产生能 抗水解 的半胱 氨酸衍 生物。 烧化试 剂包括 4- 乙 條吡淀 和碘代 乙酸。 但 这些方 
法有 缺点, 为了 确保试 剂接近 巯基, 还原 和氧化 通常在 变性剂 存在下 进行, 多 余试剂 和变性 
剂要用 HPLC 、沉淀 法或透 析去除 ,每一 步都可 能造成 样品的 损失, 特 别是对 于小肽 和微量 
样品, 而 且烷化 反应如 果不仔 细控制 条件, 可能导 致半胱 氨酸以 外其他 残基的 衍生。 

(2) 氧化法 

氧化反 应被用 来转化 半胱氣 酸和胱 氣酸成 为半胱 横酸, 过甲酸 [ 1 3] 氧化 反应的 缺点是 
它会 影响其 他氨基 酸特别 是甲硫 氨酸会 转变成 甲硫氨 酸砜, 酪 氨酸会 降解。 为克 服这一 
缺点, 必 须准备 能分析 两次的 样品量 , 一 次提供 半胱氨 酸数据 , 另一 次则提 供其他 氨基酸 
的组成 数据。 

Barkholt 和 】6118611 [ ' 4] 提 出使用 二巯基 化合物 (如 DrroPA.DTDBA) 作为酸 水解步 骤中的 
保护剂 ,他们 发现半 胱氣酸 和这些 化合物 形成稳 定的衍 生物, 是 一种双 巯基混 合物, 衍生的 
半胱氨 酸残基 能通过 离子交 换层析 与其他 氨基酸 分离, 并用 柱后衍 生法检 测到。 二 巯基试 
剂对 其他氨 基酸无 影响, 样品只 须稍加 处理, 通常取 溶解于 0.2mol/L 氣氧化 钠中的 196 
DrroPA20pJ ,与 l〜5nmDl 蛋白质 反应, 再用 20^x1 异丙 醇淋洗 管壁, 抽干后 水解。 

但 以上两 种试剂 在分析 PTC-AA 时 常会干 扰层析 谱图。 Hoogerheide [ i 5] 等通 过改变 
二 巯基二 酸的链 长度而 改变衍 生物在 层析谱 图中的 位置, 发现了 另一种 半胱氨 酸保护 

• 49 • 



剂 —— DTDGA ,同 时他们 认为, 无论 是气相 水解还 是液相 水解, 二琉 基二酸 必须直 接接触 
样品, 否则衍 生物产 率下降 ,导致 半胱氨 酸定量 不准。 

第四节 氨基酸 组成原 位分析 

如果蛋 白质样 品采用 电泳法 (如 SDS-PAGE) 分离, 则很难 从凝胶 中洗脱 下来, 可采用 
电 印迹法 把样品 转移到 PVDF 膜上, 然后在 PVDF 膜上直 接进行 盐酸水 解和氨 基酸分 
析, 称之 为原位 5 /化) 分析。 因为通 常所用 聚丙' 烯 酰胺凝 胶分离 系统中 含大量 甘氨酸 
和 Tris 盐, 易干 扰氨基 酸原位 分析, 故改用 CAPS 缓 冲系统 以减少 影响。 另外, 在 膜上做 
氨基酸 组成分 析时可 以做一 个空白 对照, 具体操 作时将 含蛋白 条带的 PVDF 膜割下 ,另 
取一条 相同面 积的转 移膜作 为空白 ,分 别置于 水解指 管中, 加人 7(^1 含 7% ( m /V) 巯基 
乙酸的 6mol/L 盐酸 以防止 抽真空 时膜片 的漂出 ,将水 解指管 放人水 解反应 器中, 在反应 
器底 部加人 200^11 含 7% 巯基 乙酸的 6mol/L 盐酸, llOt: 真 空水解 24h ,水 解结 束后用 
20(V1 含 30 % 甲醇的 . Imol/L 盐酸 反复三 次将氨 基酸从 PVDF 膜中抽 提出来 , 以 便进行 
下 一步的 分析。 

第五节 衍 生方法 及原理 

从 衍生角 度看, 氨基酸 分析可 以分为 柱后反 应法和 柱前衍 生法两 大类。 前一 种方法 
是将游 离氨基 酸经过 色谱柱 分离后 ,各 种氨基 酸再与 显色剂 (茚 三酮、 荧光胺 、邻 苯二甲 
酸) 作用, 这种方 法比较 稳定, 对样品 预处理 要求低 ,容易 定量和 自动化 操作, 不足 之处在 
于检 测灵敏 度不高 (lOOpmol 以上) ,分析 时间长 (蛋 白质水 解液需 IhM 某 些生理 样品则 
需 4h 以上 )。 另一种 方法是 将氨基 酸和化 学耦联 试剂先 反应生 成氨基 酸的衍 生物, 然后 
再用 色谱柱 将各种 衍生物 分离, 直接 检测衍 生物的 光吸收 或荧光 发射, 此法 可检测 
OPA -、 PTC -、 PTH -、 DABS -、 Dansyl- 和 DABTH- 氨基酸 ,分 析灵敏 度高, 可利用 HPLC 进行 
氨基酸 分析, 缺点是 有的衍 生物不 稳定, 衍生 试剂可 能干扰 氨基酸 检测。 

以 下是几 种常见 的氨基 酸分析 方法。 
(1) 節 三酮法 

McCaldin 曾 详细研 究了茚 三酮与 氨基酸 反应的 机理, Spackman 等人最 早将茚 三酮试 
剂 运用到 氨基酸 组成分 析上。 离子 交换层 析后, 各种 氨基酸 与茚三 酮反应 形成紫 色化合 
物, 最大光 吸收在 570nm ,摩 尔消 光系数 2X10 4 , 茚 三酮和 二级胺 (脯 氨酸 和经脯 氨酸) 形 
成黄色 产物, 在 440nm 检出, 摩尔消 光系数 3 X 10 3 。 








茚三酮 氨基酸 紫蓝色 衍生物 

(Aniax=570mm) 



50 



目 前此法 的灵敏 度可达 lOOpmol, 但茚三 酮试剂 易氧化 ,必须 隔绝空 气避光 保存, 试 
剂本身 點性大 ,需要 有个柱 后混合 器才能 与氨基 酸充分 反应, 对仪 器要求 较高。 
(2) 柱后荧 光胺法 

20 世纪 70 年代合 成了荧 光胺, 它能 在室温 下迅速 和一级 胺发生 反应, 其荧光 产物的 
激 发波长 Ex390nm ,发 射波长 Em475nm。 次级胺 可以用 N-Chlorosuccinimide (NCS) 氧化 
生 成相应 的初级 胺后再 与荧光 胺反应 而检出 [1 6 ^。 



+ RNH, 





一级胺 



荧 光产物 



(3) 邻笨 二甲趁 (OPA) 法 

OPA 最早 是被作 为柱后 衍生试 剂而引 进的, 后来 也逐渐 应用于 柱前反 应中。 OPA 能 
在还原 剂巯基 乙醇存 在下和 一级胺 产生具 有很强 荧光的 异吲噪 衍生物 , 反 应迅速 , 在室温 
下 Imin 即可 完成, 反应络 合物的 Ex340 〜 360nm, Em455nm ,灵 敏度 比 茚三酮 法高, 在 
OPA 中加入 SDS 或表面 活性剂 Brij-35, 不但能 提高赖 氨酸和 轻赖氨 酸的稳 定性, 而且能 
提高它 们的荧 光度。 缺点是 不能检 测次级 氨基酸 ,但可 用稀的 Na-hypochlorite[i 7 ] 在碱性 
条件下 氧化成 相应的 一级胺 ,然 后再与 OPA 反应。 

CHO 

+ NH, — CH— R + HS— (CH.X— 0H 

I 

COOH 

OPA 氨基酸 巯 基乙醇 

S — (CH2)2— OH 

R +2H2O 
COOH 

异 D3I 哚 衍生物 

OPA/FMOC 作为柱 前衍生 剂能同 时与一 级胺和 二级胺 反应, 室温下 只需几 分钟, 
Hewlett Packard 公司 改用巯 基丙酸 (3-MPA)[l 8] 代 替巯基 乙醇。 由于 3- MPA 的加入 ,异 
吲噪 衍生物 疏水性 降低, 使出 峰时间 提前, 过量的 FMOC 及 其分解 产物的 出峰时 间在最 
后 , 被洗脱 出的次 级氨基 酸之后 ,不干 扰分析 结果。 

(4) PTOAA 分析法 

属柱前 衍生法 ,源于 Edman 降解 法测定 蛋白质 的一级 结构。 异硫氰 酸苯醋 (PITC) 
能在 碱性条 件下和 氨基酸 反应, 生成 PTC-AA ,此 法分 析灵敏 度和荧 光胺、 OPA 的 荧光法 
相同, 优点 是能同 时检出 初级和 次级氨 # 酸 ,在 254nm 检出, 缺点 是操作 繁琐, 水 和盐的 
副反应 敏感, 要 求较高 的操作 技术。 ' 




51 



异硫氡 酸苯醋 

20 Hi 试剂 



NHj— CH— COO' 
氨基酸 



S R 

II I 

C— NH— CH— COO' 



PTC-AA 



(5) Dansyl-Cl 法 

能与 所有氨 基酸柱 前反应 形成高 稳定性 的荧光 产物, 但反应 耗时。 




+ NH, 




Dansyl-Cl 



COOH 

荧 光产物 



(6) Dabsyl-Cl 法 

灵 敏度是 Dansyl-Cr 法 1/5, 但由于 反应产 生有色 衍生物 ,能方 便地在 254nm 和 
425nm 处 用紫外 检测。 有 报道用 DABITC 代替 Dabsyl- C1 ,反 应产生 DABTH-AA ,在 酸性 
环境中 显红色 ,易在 254nm,269nm 和 436nm 检测。 

第六节 测定氨 基酸组 成的实 验步骤 

目 前各大 公司如 Beckman, Hewlett Packard , Perkin Elmer, Waters 等 都有各 自 的将 自 
动 进样、 氨基酸 分析和 定量报 告联为 一体的 商品化 氨基酸 自 动 分析仪 出售, 下面介 绍几种 
我 们实验 室测定 氨基酸 组成的 方法。 

― 、 OPA 法 

称取 5.0mgOPA 溶于 O.lml 甲醇中 ,加入 50/^1 巯基 乙醇, 用 0.2mol/L pH 9.5 的硼 
酸 缓冲液 稀释至 1.0ml。 通氮气并避光保存,每隔2(1加人5^^1巯基乙醇以维持其强度,此 
OPA 反应试 剂能用 2〜3 周, 取 10^ 标准 氨基酸 混合液 (50〜100pmol) 或样品 水解液 ,加 
lOfil pH9.5 的硼酸 缓冲液 (内含 2%SDS 和 lOOpmola- 氨基丁 酸), 然 后加入 1(^1 OPA 试 
• 52 • 



剂, 混合 均勾, 反应 Imin 后 再加人 2(V1 O.lmol/L 的 KH2PO4 中止 反应, 并 立即取 20ptl 注 
入 RP-HPLC 柱进行 分析。 

仪器为 Beckman 344 HPLC 仪, 反相柱 RP- 18(250mmX4,6mm) , 荧光检 测器。 

流 动相: A:50mmol/L 乙酸 缓冲液 pH6.8: 甲醇: THF = 80:19:1 
B:50mmol/L 乙酸 缓冲液 pH6.8: 甲醇 = 20:80 

梯度 条件是 :5min,10o/oB;10min,15%B;20min,10%B;25min,15O/6B;35min,50O/()B; 
50mm , 90 % B ; 55min , 100 96 B。 

我们实 验室曾 报道过 用乙醇 代替剧 毒的乙 腈或甲 醇作为 有机相 来定量 分析氨 基酸, 
灵敏 度可达 10pmoP 9 ]。 

100 



80 



60 



40 



20 




15 30 45 

Mtiin 



60 



图 3.2 OPA 法柱 前衍生 法分析 氣基酸 
各 种氨基 酸衍生 物均为 40 pmol 

二 、 PTC-AA 法 



氨 基酸或 样品在 Eppendorf 管 中真空 干燥后 溶解在 5(^1 耦 联试剂 (乙醇 : 三乙胺 :水 
=7: 1 : 1) 中。 此 溶液在 旋转真 空干燥 后再次 溶解于 5(^1 耦联试 剂中, 然 后加入 2/^1 
PITC ,反 应混 合物在 25t: 下保温 15min ,再 次旋 转真空 干燥, 真空度 (1.3〜13Pa)。 如此 
生成的 PTC-AA 溶解 在适量 流动相 A 中, 取一部 分上柱 定量分 析 [2 ° ] 。 

仪器为 Beckman Gold System HPLC 仪 ,反 相柱 RP-18(250mm X 4 . 6mm) 或 PTH- 柱 , 
254nm 检测。 

流 动相: A:50mmol/L 乙 酸钠, pH 6.8 

• 53 • 



vfflv 



J3 



B:50mmol/L 乙 酸钠 , pH6 . 8 : 乙腈 = 50 : 50 
HPLC 柱 采用水 浴夹套 401: 恒温, 并用 5% 流动相 B 平衡。 梯度条 件是: Omin,5%B; 
5mm , 5 96 〜 1 5 96 B ; 1 Omin , 1 5 o/b B ; 30min , 1 5 96 〜 60 O/G B ; 35min , 60 o/o B ; 40min ,60% ~ 5 % 
B。 流速是 lml/min。 



• 图 3.3 PTC- 氨基 酸图谱 
各种 PTC-AA 100 pmole,254nm 检出, 0.010 AUFS 

三、 茚三 S 法 



水解 后氨基 酸样品 溶解于 Na- S 样品稀 释液中 ,取 lOO/il 上样 分析, 实际 进样量 50^d 
( lOOpmol 〜 5nmol , 均 呈线性 ) 。 

仪器: Beckman 6300 氨 基酸分 析仪。 



温度 :0.00min 48t: 
ll.Smin 65 1: 
32.5min 77*C 
50.0min 48t: 



流 动相: Na-EO.OOmin 

Na-D 27.80min 

Na-F 39.00min 

Na-R 76.00min 

Na-E 77.00-90. OOmin 
流速: 缓冲液 14ml/h 

茚三酮 7ml/h 

图 3.4 中除 常见的 18 种 氨基酸 (Asn 和 Gin 转变成 相应的 Asp 和 Glu) 外, 还 有碘代 
乙 酸还原 Cys 形 成的羧 甲基半 胱氨酸 (CM — Cys) ,过甲 酸氧化 Cys 形成 的磺基 丙氨酸 
(cysteic acid,CA)o 在此系 统中, 我们 观察到 Thi^PCb , Se「P03 , Ty「P03 在溶 剂前沿 
出现, 难以 分离。 这 是由于 亲水性 太强的 关系, 用毛细 管电泳 则可将 这三种 磯酸化 的氨基 
酸分开 (参见 第十一 章)。 
• 54 • 



<<j!jndiu! 15SB3y -0 



SI- 



SI 1 




dsv ^ 



试剂 反 应时间 灵敏度 !^: =, 备注 

稳定性 酸检测 



500 pmol 



四、 氨基 酸直接 分析法 

最 近美国 公司推 出的氨 基酸直 接分析 法是基 于阴离 子交换 分离, 积分脉 冲安培 检测。 
流 动相由 氣氧化 钠和乙 酸钠溶 液组成 [ 2 1 ] 。 

第七节 结 语 

影响氨 基酸分 析准确 性和重 复性的 因素有 三个: 一是 样品的 水解。 水解 时间、 水解温 
度、 真空度 、样品 是否被 氧化等 ,都影 响实验 的结果 ;二是 氨基酸 的有效 的衍生 情况; 三是 

氨 基酸色 层分离 好坏。 不同 样品采 用不同 的分析 方法, 生理样 品含有 30〜50 种氨 基酸, 
用离 子交换 色谱柱 后衍生 法比较 合适, 天然氨 基酸、 合 成多肽 样品的 氨基酸 测定多 采用反 
相色谱 柱前衍 生分析 方法。 食 品和饲 料中氨 基酸分 析采用 上述两 种方法 均可。 因 为反相 



表 3.2 —些分 析方法 的比较 



茚三酮 


1 ~2min 


> lOOpmol 


荧光胺 


少于 Is 


lOOpmoKFLD) 


OPA 


Imin 


ISOfmoKFLD) 


PITC 


5min 


5 pmol 


Dansy 卜 C1 


60min 


SpmoKFLD) 


Dabsyl-Cl 


60min 


2 5 pmol 



经典的 氨基酸 分析法 

适 用于肽 类分析 

反应 迅速, 灵 敏度高 

需要 样品比 较纯净 

与喊性 氨基酸 反应产 生多种 衍生物 

与氣 反应会 干扰甲 硫氣酸 的分析 



图 3.4 茚三 酮柱后 法分析 氨基酸 



能 



定 定 

定定稳 稳定定 

稳稳不 较稳稳 




• 55 



色谱柱 前衍生 法具有 快速和 灵敏的 特点, 在药 物和手 性氨基 酸的分 析中同 样也获 得广泛 

的 应用。 几种氨 基酸分 析法各 有利弊 (表 3. 2), 实验 者应根 据自己 的实际 情况, 如精确 
性、 方便性 、经 济性等 来选择 合适的 方法。 



(邵 晓霞 张 丽华) 

参 考文献 

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dithiodiglycolic acid and phenylisothiocyanate derivatization. Anal Biochem, 1992,201 : 146 ~ 151 

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19 夏其昌 ,徐 松琴, 蔡嘉 坤等. 应 用乙醇 系统的 高效液 相色层 (HPLC) 可在 10 微微克 分子水 平定量 分析氣 基酸. 生 

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• 56 • 



第四章 蛋白质 和多肽 的氨基 酸序列 II 定 



蛋白 质和多 肽是由 20 种氨基 酸按照 一定的 顺序通 过肽键 连接成 一长链 ,然后 通过链 
内、 链 间的离 子键、 疏水作 用等多 种作用 力进行 折叠、 卷曲形 成一定 的构象 并发挥 其独特 
作用。 氨基 酸的排 列顺序 即蛋白 质的一 级结构 决定了 蛋白质 的高级 结构及 功能。 因此, 
测定 蛋白质 的氨基 酸序列 是进行 蛋白质 结构功 能研究 中不可 缺少的 部分。 另外, 蛋白质 
一级结 构的信 息也有 助于对 其基因 结构的 研究。 

目 前, 进行蛋 白 质序列 测定有 两个关 键步骤 , 即 : ①氨基 酸残基 一个一 个依次 从蛋白 
质和多 肽的末 端切割 下来; ②正确 鉴定每 次切割 下来的 氨基酸 残基。 其中 第一步 可采用 
化学 法或薛 法进行 裂解。 由 于化学 法较之 酶法具 有裂解 率高、 易于自 动化 、耗 费少 等诸多 
优点, 被蛋 白质化 学实验 室普遍 采用, 可 以从蛋 白质和 多肽的 N 端进行 裂解, 也 可以从 C 
端进行 分析。 第二 步通常 是在氨 基酸残 基上衍 生了一 个生色 基团, 通过高 效液相 色谱进 
行分离 分析。 

本章 将就蛋 白质和 多肽的 N 端、 C 端氨基 酸序列 分析的 原理和 方法、 进行序 列分析 
前蛋 白质和 多肽样 品的准 备作一 介绍。 

第一节 N 端分 析原理 
一、 稱 联 

蛋白质 和多肽 的自由 a- 氨 基经与 异硫氰 酸苯酯 (PITC) 试剂耦 联后, 与其紧 邻的第 
二 个残基 的键合 力大大 减弱, 很容易 断裂。 




在 无水条 件下酸 裂解, 仅仅切 下反应 的那个 残基。 紧挨 的第二 个氣基 酸残基 暴露出 
自由的 a - 氨基, 又可与 PITC 进 行耦联 反应。 



57 




无水二 氣乙酸 



HN 



ATZ- 氨基酸 



、R, 




三、 转 



化 



ATZ- 氨基酸 不稳定 ,在三 氟乙酸 水溶液 (25%) 中可 转化成 稳定的 PTH- 氨基酸 < 



HN 



H,0 





一 H,0 




PTH- 氨基酸 



、 PTH- 氨基酸 的鉴定 



可以通 过薄层 层析、 气相 色谱、 高 效液相 色谱及 质谱等 各种手 段进行 分析。 近年 来由于 
高效液 相色谱 技术具 有分析 速度快 、灵敏 度高、 定性定 量准确 等诸多 优点, 并 且仪器 自身结 

构 也日臻 完善, 被广泛 应用于 PTH- 氨 基酸的 鉴定。 通 常选用 C- 18 反相 柱进行 分离。 



节 N 端蛋 



自 20 世纪 70 年代初 自动序 列仪诞 生以来 ,经过 了一系 列更新 换代, 仪 器日趋 灵敏、 
快速, 下面就 其中几 种代表 性的仪 器作一 简介。 

一、 液相 旋转杯 序列仪 



这是 最初的 自动化 仪器。 整个仪 器的" 核心" 部分是 一个反 应杯, 它由 一个马 达带动 
并 有调速 控制。 蛋白质 或多肽 样品经 溶解后 ,通 过一根 导管注 入反应 杯中, 样品随 着旋转 
的离 心力被 均勾地 涂在杯 壁上, 形成一 层薄膜 ,其 厚薄可 由转速 控制。 反应 的试剂 和溶剂 
分别通 过导管 进入反 应杯, 与 杯内薄 层上的 样品的 N 端自 由氨 基进行 Edman 反应; 降解 
下来的 ATZ 氨基酸 衍生物 通过另 一导管 引出并 收集, 再将 ATZ 氨基酸 转换成 PTH 氨基 
酸后进 行鉴定 ,依 次循环 分析。 此 仪器由 于消耗 的样品 量多, 目前在 蛋白质 化学实 验室已 
很少 使用。 
- 58 • 



二、 固 相序列 分析仪 



由于一 些小肽 或疏水 性多肽 ,不易 吸附在 一般支 持物上 (如旋 转杯) ,只得 将它们 共价固 

定在惰 性载体 后进行 Edman 化 学降解 反应。 固相测 序的优 点是样 品共价 结合后 ,不 会在有 
机溶剂 洗漆、 抽提等 过程中 丢失, 因而 可以增 加循环 次数。 其缺 点是共 价结合 不外乎 通过氨 
基或羧 基与载 体上的 活性基 团作用 ,蛋白 质和多 肽中的 谷氨酸 、天冬 氨酸、 赖 氨酸等 含有除 
a - 氨基或 a -羧基 以外氨 基或羧 基的氨 基酸残 基将结 合在载 体上, 不 能正确 鉴定。 

三、 气相 序列仪 



自动 化蛋白 质序列 仪刚问 世时, 需要样 品量为 l~2mg。 1978 年 Tarr 等将一 种四级 
铵盐聚 合物" polybrene" 引人了 蛋白质 、多肽 的序列 测定, 它 能和肽 链中的 极性基 团作用 
(非 共价 键合) 而将 蛋白质 和多肽 有效地 固定在 玻璃纤 维支持 膜上, 防止了 萃取时 样品的 
损失。 为了适 应分子 生物学 对蛋白 质微量 分析的 要求, 20 世纪 80 年 代初, Hewick 及 
Hunkpillar 等人改 进了自 动化蛋 白质序 列仪中 的仪器 结构, 它 用弹筒 型玻璃 反应室 (内部 
体积约 0.05ml) 代替了 液相序 列仪中 的旋转 玻璃杯 ,用 polybrene 固定 样品, Edamn 降解 
反应中 有的试 剂如三 甲胺以 气体方 式输送 ,其他 试剂以 流动或 液相脉 冲方式 输送。 此仪 
器 较之以 前几种 序列仪 具有以 下明显 优点: 

① 灵敏 度高, 耗 费样品 量少, 通 常仅需 50〜100pmol; 

② 试剂 和溶剂 消耗少 , 大约是 液相序 列仪的 1 /10 , 降低 了费用 ; 

③ 缩短 了每步 降解循 环时间 ,提高 了分析 效率。 

20 世纪 80 年代末 又对气 相序列 仪进行 了部分 改进, 即 将原来 三氟乙 酸以气 体方式 
输送 改为液 相脉冲 方式, 称为脉 冲液相 序列仪 ,以 适应不 同样品 的分析 需要。 另外, 由于 
载 有活性 基团的 功能性 PVDF 膜的 问世, 蛋白质 和多肽 可以共 价固定 在此类 膜上, 直接 
在上述 两种序 列仪上 进行固 相序列 分析。 

在这两 种序列 仪中, Edman 降 解后的 PTH- 氨基 酸衍生 物可及 时直接 从转化 腔中自 




图 4.1 序列 仪结构 示意图 



59 



动 输人高 效液相 色谱仪 中进行 PTH- 氨基酸 衍生物 的定性 及定量 分析, 这 样不仅 快速可 
靠, 而且 防止了 样品的 损失。 这两台 仪器统 一用电 脑控制 ,包 括化学 反应和 分析鉴 定以及 
数 据的自 动记录 和处理 (图 4.1)。 图 4.2 为标准 PTH- 氣 基酸的 色谱分 离图。 由图可 
见 , 欲在 20min 内将各 组分较 好分离 , 需 选择合 适的色 谱条件 ,表 4 . 1 列出 了各种 条件的 
改变 导致个 别组分 位置的 迁移及 图谱的 改善。 



0.00 
-1.00 



-2.00 

3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 



图 4.2 PTH- 氛基酸 色谱图 
表 4.1 PTH- 氨 基酸分 离条件 的调整 



改变下 列条件 




结果 


改变下 列条件 




结果 




增 加起始 B 液百 分比 






增加 A 缓冲 液浓度 










E 


DMPTU 




H 


R 


PE-Cys 








降低 A 缓冲 液浓度 










Q 


T 




H 


R 


PE-Cys 


降 低起始 B 液百 分比 






降低 A 液 pH 值 










S 


Q 




D 


E 










增加 A 液 pH 值 










DTT 


D 




D 


E 




柱 温降低 3t: 






需更换 A 液 (因 THF 浓度 










DTT 


D 


降低) 


Q 


T 




柱 温升高 3t: 
















M 


V 




P 


M 




降 低最终 B 液百 分比 






用 酸洗泵 




可使基 线平坦 




I 


K 


1LA 液中加 0.5rW 12.5%TM\ 




H 和 R 峰尖锐 


增 加最终 B 液百 分比 






(可 能需用 A 液稀释 来调节 










K 


L 


H 和 R 的位置 ) 


H 


R 


PE-Cys 



注 :一 、— 为色谱 峰迁移 方向。 



第三节 影响 N 端 Edman 反应 裂解率 的因素 

在测 序中往 往可以 发现, 即使 N 端很 均一的 蛋白质 (第 一个循 环出现 单个氨 基酸残 
基), 经 过十几 个循环 后背景 明显不 及第一 个残基 清晰。 这 是由于 Edman 反应是 一个化 
学过程 ,在其 耦联、 裂解、 转化 等步骤 都有可 能发生 一些副 反应, 从而 影响最 终裂解 效率。 
目 前最佳 产率为 95%〜98%。 因此, 经过 50 次循 环后, PTH- 氨基 酸分析 谱中将 出现较 
• 60 • 




DTT 



D N 

Q. 








低 



多杂峰 ,影 响正确 辨认, 也就 是说对 于一般 蛋白质 最多能 分析至 N 端第 50 个氨 基酸左 
右, 欲知全 顺序, 则需将 蛋白质 降解成 一系列 肽段分 析后再 拼接。 

对于有 些蛋白 质由于 含有较 多的对 Edman 反应 敏感的 残基或 肽键, 裂解效 率将更 
表 4.2 列出 了在蛋 白质和 多肽中 容易发 生断裂 的一些 肽键。 

S R HOHjC 

(f^ II I II I II 

^^^;i^NH ~ C— NH— CH— C— NH— CH— C— NH— 

CFjCOOhI 

CF3CO— O— CH2 O 



表 4.2 容易发 生断裂 的肚键 





肽键 


断裂 百分比 / 循环 








X- 


—Set ~ X 


0.1-0.15 








X- 


-Sei ~ Thr 


0.35 








X- 


-Thi— X 


0.25-0.5 




1 




X- 


-Asp— X 


<0.02 



AYZ-aa 



HfN— CH — C— NH- 



图 4.3 



O HOH2C o 

II I II 

CF3— C— NH— CH— C— NH— 

HOH2C O 

I II 
NH2— CH— C— NH— 

三 氟乙酸 造成的 Ser 和 Thr 的 N 端封闭 



有时 循环至 Ser 和 Thr 时产 率突然 降低, 这是因 为在进 行这两 个氨基 酸残基 分析前 
一个循 环中, 三氟乙 酸除起 裂解作 用外, 可能与 Ser 和 Thr 上 的经基 反应, 继而部 分封闭 
Ser 和 Thr 的 N 端 a- 氨基, 见图 4.3。 

另外, 丝 赚和苏 氨酸的 PTH 衍生物 也織彌 他产物 ,造 #率 的降低 ,见图 4.4。 



CH2— OH 

CH— NH H2O 



c=s- 



o=c 



、N' 

s 



CH3 

CHOH 

CH— NH H2O 
7 . 



CH, 
II 

C— NH 



RSH 



C = S- 



AS 

II 

C— NH 

/ \ 

o==c c=s 



RSH 



0=C C = S 



CH,— SR 
*l 

CH— NH 
/ \ 

o=c c=s 

S' 



CH3 

*CHSR 

*CH— NH 

/ \ 

o=c c=s 



H\ /CH3 



C— NH 



o=c C=S 

AT 



T' 



图 4 .4 PTH-Ser 和 PTH-Thr 转化成 副产物 



61 



耦 联试剂 PITC 本身也 将发生 下列副 反应, 形成 一些" 杂 质"。 

测序完 成后, 电 脑将每 个循环 的产率 处理, 得出起 始产率 (initial yield) 和重 复产率 
(repetitive yield) , 其中通 过起始 产率可 以估计 蛋白质 的真实 含量, 有时可 以推测 N 端是 
否封闭 (和氨 基酸组 成分析 测得的 含量相 差甚远 ), 而重 复产率 则表明 机器是 否正常 运转。 
但是对 于纯度 不够的 样品, 上 面两项 均不具 备实际 意义。 另外, 如果 蛋白质 或多肽 中含有 
过多的 Ser、Thr、Glu、Trp 等氨基 酸残基 ,也 将降低 这两个 数值。 

第四节 测 序前样 品处理 

一、 纯 度鉴定 

宜采 用多种 互补有 效的手 段鉴定 样品的 纯度, 如 SDS-PAGE 、反相 HPLC 、毛 细管电 
泳、 阴离 子或阳 离子的 FPLC 等。 

、 脱 盐 

可采用 多种有 效的脱 盐方法 如反相 HPLC 、凝胶 过滤、 透析、 超滤等 ,但 需注意 在进行 
脱盐 过程中 除需考 虑是否 除盐完 全外, 所用 试剂、 仪器 乃至操 作规范 也必须 是测序 级的, 
应尽量 避免引 人新的 杂质。 下面介 绍一种 简便的 ProSpin 装置, 尤 其适合 于普通 实验室 
对 蛋白含 量少的 样品进 行序列 分析前 脱盐。 

图 4.5 为 ProSpin 示意图 ,其中 在插管 的底部 
點附了 ProBlott PVDF 膜 (有关 ProBlott 膜 见电泳 
一章) ,插管 插人套 管后, 此 膜与分 子质量 3 OOODa 
截留 过滤膜 接触, 再在 套管的 底部连 接一离 心管, 
通过 离心除 去样品 中的缓 冲盐、 去垢 剂及其 他小分 
子杂质 ,也可 以在套 管下放 一海绵 (接触 滤膜) ,将 
上述小 分子物 质随水 分一起 吸去。 然后将 插管倒 

\ 置, 用切割 器取下 吸附有 蛋白质 的膜片 (ProSpin 和 
_ \ 切 割器由 Perkin-Elmer 公司 提供, 并 附详细 操作步 
骤)。 对 于特别 稀少的 样品可 将切下 的膜片 分割成 
几部分 ,分 别进行 测序、 氨基 酸组成 分析、 肽 谱分析 
. 等工作 ,其 中每部 分约需 50pmol。 



PVDF 膜 

分子质 M 
3 000 Da 截留 
过滤股 




一 切割器 



图 4.5 ProSpin 示意图 



1. 丙炼酰 胺修饰 [ " ] 



三、 魏基修 饰方法 



第 1 步: 还原: 蛋白质 溶解于 10〜15^tl0.2mol/LTris,pH8.4,内含 lOOmmol/L DTT 
缓冲 液中, 加人 SDS 至最终 浓度为 1 % , 将样 品 于 70t: 水浴 中保温 20 〜 30min ,然 后用 4 
倍 体积的 重蒸水 稀释。 



62 



第 2 步: 烷基化 :加人 6mol/L 丙 稀酰胺 浓溶液 至最终 浓度为 2mol/L ,通 人氩气 (或高 
纯 氮气) 后于 371: 避 光保温 30〜60min。 

第 3 步: 脱盐: 加 人甲醇 至最终 浓度为 10%, 再用 Perkin- Elmer 公司的 ProSpin 管进 
行 脱盐。 

具体 操作: 先将 1(V1 甲 醇润湿 ProSpin 上的 ProBlott 膜, 然后加 入反应 溶液离 心至膜 
上面无 液体, 再加人 5(^1 2096 甲醇, 同 上进行 离心, 将膜片 切割下 后放人 1.5ml 离心管 
中, 用 0.1%TFA 清洗后 ,再用 水漂洗 ,待 其自然 晾干后 (或用 氮气吹 干), 即 可进行 序列分 
析。 

注意: 第 3 步也 可采用 其他有 效的脱 盐法。 但上述 方法相 对比较 简便。 
2. 4- 乙炼吡 腚修饰 [2] 

第 1 步: 还原: 蛋白 质溶于 4(^1 lOOmmol/L Tris,pH 8.4, 内含 6mol/L 盐酸胍 缓冲液 
中, 加人 Imol/L DTT 浓溶液 到最终 浓度为 20mmol/L ,充 人氩气 后于室 温放置 l〜2h。 
第 2 步: 烧基化 : 加入 2/^1 4 -乙 烯吡 啶后充 分混合 , 同 上保温 1 〜 2h。 
第 3 步: 脱盐: 加人 重蒸水 1 : 1 稀释蛋 白质溶 液后, 同 前述用 ProSpin( 或其 他方法 ) 脱 

盐。 

四、 去除 N 端封闭 的基团 的方法 

如果 怀疑蛋 白质或 多肽的 N 端被 封闭, 可 按下述 方法去 除一些 N 端封闭 的基团 [ 3 ]。 

1. 去除 乙酰丝 氨酸和 〜- 乙 酰苏氨 酸残基 

第 1 步: 蛋白质 吸附在 PVDF 膜上, 经 蛋白质 N 端 序列分 析几个 循环后 , 未 能检测 出 
N 端氨基 酸残基 , 将膜 条置于 1 . 5ml 的塑 料离心 管中。 

第 2 步: 加入 5(^1 三 氟乙酸 液体后 密封管 口 并在 40t: 保温 lh。 
第 3 步: 打开 管盖, 在通风 橱中使 TFA 挥发 完全。 
第 4 步: 将 此膜条 再放回 序列仪 中进行 分析。 

2. 去除 N 端甲酰 甲硫氨 酸中的 甲酷基 

第 1 步: 将吸 附了蛋 白质的 PVDF 膜 条置于 1.5ml 塑 料离心 管中。 
第 2 步: 加入 30^a 0.6mol/L HCl 后 密封管 口并于 25t: 保温 24h。 
第 3 步: 打开 管盖, 吸去 HC1 溶液, 再将 膜条真 空干燥 或氮气 吹干。 
第 4 步: 将膜 条放回 序列仪 中继续 分析。 

3. 去除 N 端的焦 谷氨酸 

第 1 步: 将吸 附了蛋 白质的 PVDF 膜 条置于 1.5ml 的塑 料离心 管中, 加入 1.2ml 
0.5%(m/\OPVP-40 封闭 膜条, 使其 不再吸 附其他 蛋白质 (PVP-40 溶于 lOOmmol/L 冰 
醋酸中 ) , 于 37t: 保温 30min, 然后用 超纯水 清洗膜 条至少 5 遍 , 接 着再用 . 5ml 酶解缓 冲 
液 (下 一步 将用) 漂洗 一遍。 

• 63 • 



第 2 步: 加入 10(^1 左右焦 谷氨酸 水解酶 (5|Lig 酶溶于 10(V1 50mmol/L,pH7.0 磯酸 
钠及 lOmmol/L DTT 缓冲液 中), 371: 保温 5 〜 10h。 

第 3 步: 用超纯 水漂洗 膜条, 自然吹 干后放 回序列 仪中。 

4. 去除 N -乙酰 基封闭 的氨基 酸残基 

第 1 步: 将吸 附了蛋 白质的 PVDF 膜 条置于 1.5ml 的塑 料离心 管中。 

第 2 步: 用 0.5% PVP-40( 溶于 lOOmmol/L 冰 醋酸) 封闭 PVDF 膜以防 吸附蛋 白藤。 

第 3 步: 将膜 用超纯 水充分 清洗后 ,加人 5 ~ lOptg 胰 蛋白雜 (溶于 100/^1 . Imol/L 碳 

酸 氢铵, pH8.0, 内含 10% 乙腈) ,于 37t: 酶解 24h。 

第 4 步: 将离 心管中 的溶液 移至另 一干净 的离心 管中, 用 10(^1 超纯水 清洗膜 条后将 

此清洗 溶液与 酶解后 的溶液 合并, 然后将 此含有 酶解多 肽的溶 液冷冻 干燥。 

第 5 步: 加入 10(^1 5096 吡啶及 1(^1 异硫氰 酸苯酯 (PITC) ,通 人氮气 20s ,然 后于 

60t: 保温 lh。 此 步骤中 PITC 可 以和酶 解后各 多肽的 N 端 a -氨 基反应 (除 N 端 被乙酰 

基封闭 的多肽 )。 

第 6 步: 加入 苯 / 乙 酸乙酯 (1 : 1 的体 积比) 混合 溶剂, 充分振 荡后以 3 OOOg 离心 
Imiric 

第 7 步: 吸去上 层溶液 (内 含第 6 步中的 过量试 剂及反 应副产 物)。 再按第 6 步对下 
层溶 液抽提 3 次, 然 后真空 抽干下 层液。 

第 8 步: 加人 loopti 过甲酸 (9 份 甲酸与 1 份 过氧化 氢混合 后在室 温放置 ih) , 于 or: 

保温 Ih ,以 封闭 经过上 述几步 反应的 多肽的 N 端。 

第 9 步: 真 空抽干 , 再用 水溶解 , 然后再 将样品 抽干。 

第 10 步: 将 多肽用 100/al 0.2mmol/L,pH 7.2 磯酸 缓冲液 (内含 Immol/L DTT) 溶 
解, 加人 0.05 单位的 N -乙酰 氨基酸 去除酶 (AARE) , 于 371: 保温 12h。 

第 11 步: 将反应 混合物 加样至 已预处 理过的 测序用 玻璃纤 维支持 膜上, 并放 入序列 
仪中 分析。 

第五节 手工 N 端测序 
虽然自 动化测 序方便 、快速 ,但并 不能完 全排除 手工测 序的实 用性, 尤 其对于 一些实 

验室 尚不具 备测序 条件, 而且 样品量 足够, 只 需知道 N 端个别 残基以 确定是 否均一 ,手工 
测序不 失为一 种简便 有效的 方法, 下面 简单介 绍一种 手工测 序方法 —— DABITC/PITC 
双耦合 法^。 

DABITC/PITC 双耦 合微量 顺序测 定法, 采用有 色试剂 DABITC 与多 肽或蛋 白质的 
氨基作 第一次 耦合, 因 该耦合 反应产 率只有 20%〜500/。, 余下 没有与 DABITC 耦 合的氨 
基再用 PITC 作第二 次耦合 ,由于 PITC 与多肽 或蛋白 质的稱 合反应 几乎是 定量的 ,这样 
就保 证了每 个残基 都反应 完全, 然后再 裂解、 转化、 鉴定 有色的 DABTH- 氨 基酸。 失去 
一个残 基后的 肽或蛋 白质再 耦合、 裂解、 转化, 依次循 环测定 多肽和 蛋白质 序列, 其 反应原 
理 如下: 



64 



■N=N- 



Ri R, 

1 I I 

一 N=C=S + NHj— CH— C— NH— CH— C — NH— CH— C- 



1) DABITC 

2) PITC* 



o 

OH— pH8~9,40~50X: 通 N2 



o 



o 




R-i ^2 ^3 

NH— C— NH — CH— C— NH— CH— C— NH— CH— C- 



O 

H+ 无水 TFA ,通 N2 



o 



o 



NH3——CH— C—NH— CH— C 

II II 
■R, O O 

H+ 40%~50% TFA, 通 N2 
稀酸 



DABITC:4-iV,iV - 二甲 胺基偶 氮苯- 4'- 异硫 氰酸酯 (4-iV, N-dimethylaminoazobenzene^4'-isothiocyanate) 
DABTC:4-N,iV -二甲 胺基偶 氮苯- 4'- 硫代氣 甲酷基 (4-N, iV-dimethylaminoazoben2ene"4'-thiocarbamoyl) 
DABTZ-aa:4-N,iV- 二甲 胺基偶 氮苯- 4'- 樓挫 琳酮- 氨基酸 (4-iV,/V-dimethylaminoazobenzene«4'-thiozolinone"aa) 
DABTH-aa : 4-iV , /V - 二 甲胺基 偶氮苯 - 4 '- 乙内酰 硫脲- 氣基酸 

(4-N , N-dimethylaminoazobenzene-4'-thiohydantoin-aa) 

PITC 耦合, 裂解, 转化 产生的 PTH -氨 基酸不 作鉴定 

(1) 材料 

DABITaFluka 公司出 品或自 己合成 ), 用沸 丙酮重 结晶。 n- 正庚院 、乙酸 乙酯、 
n -乙酸 丁酯都 按顺序 级要求 处理。 吡 徒先用 K〇H(10g/L) 回流, 蒸出, 再用 茚三酮 (Ig/ 
L) 回流, 蒸出, 最 后再用 KOH(10g/L) 回流, 再 蒸出。 异硫氰 酸苯酯 (PITC) 在减压 下通氮 
气 重蒸。 三氟 乙酸用 CtOj 处理重 蒸再用 CaS04 干燥 重蒸。 超 滤水。 

聚 酰胺薄 膜层析 溶剂: A. I 相 33% 乙酸; n 相 甲苯: n- 乙院: 乙酸 (2:1:1, 体积比 )。 
B. 鉴定 116丄60,膜7.5(:01乂4(:01,100/0甲酸:乙醇(10:9,体积比)。 

高效 硅胶板 (HPTLCMerck) 鉴定 He, Leu ,氯仿 :甲醇 (50:2, 体积比 )。 

(2) 辆合 

将 2〜5nmol 样品放 在尖底 带塞小 试管中 (Edman 管), 加 80;xl 50% 吡淀 溶液, 加 40/11 
DABITC 吡 啶溶液 (0.6mg/26(Vl) ,通 高纯氮 (99.99%),盖好塞子,在501:加热4511110,然 
后再加 1(^1 异硫氰 酸苯酯 ,通 氮气 ,用混 合仪使 PITC 与反应 溶液很 好混合 , 在 501: 加热 
30min ,反 应混 合物用 4 X 200^tl n - 正庚烷 :乙 酸乙酯 (2 : 1 ) ( 如疏水 性肽用 3 : 1 ) 提取, 除去 
有 机层, 水层在 真空干 燥器中 干燥。 

• 65 • 



(3) 裂解 

干燥 后水层 产物加 50^11三氣乙酸,通人氮气温和搅摔混合后,在501: 加热 15min; 真 
空 干燥。 如是 Pro — Pro;Pro- -Ile;Pro — Val;Ile — He; 或是 Val — Val 则 需要重 复裂解 1〜2 
次, 裂解干 燥后的 产物加 30/ul 双蒸水 ,用 2X5(^1 乙酸丁 酯提取 DABTZ- 氨 基酸, 并干燥 
之。 水层 真空干 燥后, 作下 一步循 环用。 

(4) 转化 

将 干燥后 的乙酸 丁酯提 取物加 30/^1 40%〜50%三氟乙酸水溶液,通氮气,在5(^0 加 
热 50min ,真 空干燥 后可作 鉴定。 

(5) 鉴定 

干 燥物加 10〜20/il 乙醇 溶解, 取 l/2;il 点到 3cmX3cm 聚酰胺 薄膜上 ,然 后再加 
1/2^1 标记化 合物, 按上面 A 溶剂 系统 展开, 其标准 层析图 谱见图 4.6。 如鉴定 Ile、Leu ,则 
可 用溶剂 B 系统 或娃胶 板溶剂 系统。 

(6) 标记 化合物 的制备 

500/il 50% 吡喊 中加人 3(^1 二 乙胺, 乙 醇胺及 330/堪 DABITCd OOOnmol) ,在 
55t: 加热 Ih ,真空 干燥, 用时 取少量 溶于乙 醇中。 




图 4.6 DABTH- 氨 基酸在 聚酰胺 图 4.7 四种 Ser 产物在 聚酰胺 

薄膜 上的层 析图谱 薄膜 上的层 析图谱 

注意 

① 所用 试剂药 品都要 按顺序 级要求 处理。 DABITC 在吡 啶中不 稳定, 必 须新鲜 配制。 

② 疏水性 肽在用 2:1 或 3:1 的庚 烧和乙 酸乙酯 (体 积比) 提取时 易产生 沉淀或 薄膜, 
悬浮在 有机相 和水相 中间, 切勿 吸去。 

③ Gln、Asn 可能有 8% 〜 15% 水解成 Glu、Asp ,因此 在鉴定 Gln、Asn 时有时 也出现 
很淡的 Glu、Asp 斑点。 

④ 层析溶 剂均应 新鲜, 保证层 析的重 复性。 

⑤ Lys 可 出现三 个不同 颜色的 衍生物 , a-DABTH-£-DABTOLys (紫色 ) ; a-e-DABTO 
Lys (蓝色 ) 和 a- DABTH-e-PTOLys (红色 )。 

® Ser 和 Thr 副反 应较多 , 一般可 以有 3 〜 4 个产物 : DABTH-Ser ; DABTH-Ser^ ( 失 
水产物 );DABTH-SerG (失水 后再聚 合产物 );DABTH-Ser 口 (失水 后再加 水产物 )。 
• 66 • 



第六节 c 端序 列分析 



虽然 建立在 Edman 化学法 上的自 动化 N 端测 序技术 日 趋 成熟, 但仍有 不少问 题需借 
助 C 端序列 分析来 解决。 C 端测 序尤其 适合于 基因重 组蛋白 是否正 确表达 的鉴定 和大规 
模 生产时 的质量 控制、 N 端封 闭蛋 白的分 析以及 DNA 探针的 设计。 

由于选 择性对 C 端羧 基进行 稱联修 饰并从 C 端逐一 将氨基 酸残基 切下较 N 端测序 
困难, 在过 去的近 20 年里, 虽 然为数 不少的 蛋白质 化学家 致力于 C 端测 序研究 [ 5] ,但目 
前仍 不能和 N 端测 序技 术程度 媲美。 蛋 白质化 学工作 者曾利 用羧肽 酶分析 C 端氨 基酸 
残基 [ 6 ' 7 3, 但是 由于不 同的羧 肽酶对 个别氨 基酸残 基有选 择性, 使 用时仍 有一定 困难。 另 
有报道 [8 3 将 C 端选择 性标记 ,分 离出 C 端 肽段后 , 再用 Edman 法分析 ,我 们 实验室 [9] 曾 
根据 一些蛋 白接近 C 端的 个别 氨基酸 (如 Trp,Tyr) 有 特殊的 紫外光 谱或二 级微分 光谱, 
分离 出含有 C 端氨基 酸的酶 解肽段 ,进行 N 端序列 分析, 以此 鉴定蛋 白质的 C 端是 否有 
缺失 残基。 

最近, 由于 对化学 法测定 C 端技术 进行了 一系列 改进, 已有了 自动化 C 端序 列仪问 
世 [ 10 ] 。 下面介 绍一种 自动化 C 端测 序方法 的原理 及应用 [ 11 ] 。 



基于与 N 端 Edman 降解 类似的 原理, C 端分 析采用 化学试 剂与蛋 白质和 多肽的 
a- 羧基 反应, 反 应后的 C 端衍生 物被切 割下来 ,通过 HPLC 系统进 行分离 分析。 一个完 
整的 C 端序 列分析 包括以 下几个 步骤。 



蛋白质 和多肽 C 端的 自由 羧基与 乙酸軒 反应生 成混合 酸軒, 并 进一步 环化成 、挫 
酮, 而 侧链上 的羧基 形成的 混合酸 軒难以 成环。 C 端的噃 挫酮在 硫氰四 丁铵的 作用下 ,转 
化为 乙 内 酰硫脲 ( thiohydantoin , TH) 。 



一、 C 端分 析原理 



(1) 活化 




C— 0— C— CH3 




C— 0— C— CH3 



67 



(2) 酰胺化 保护侧 链羧基 

侧链 羧基形 成混合 酸酐后 , 与硫 氰哌淀 进一步 作用形 成酰胺 , 以保 护侧链 。 

0H 

I 

CH2 R, H 




«y^o 





CH II 1 T 

C— O— C — CH3 

II II 

o o 

(3) 坑基化 

由于 C 端环化 形成的 TH 衍 生物较 为稳定 而不易 被切割 , 因 此产率 不高。 用 溴甲基 
萘选 择性地 院基化 修饰硫 原子, 形成 Alkylated-TH (ATH) 衍生物 ,裂 解产率 将大大 提高。 
0H 0H 

C— N、/N ^^^^' ^^^― C— 
CH2 S CH2 S— Alkyl 

II U II ^ 

o o 

(4) 修饰 Thr 和 Ser 的幾基 

蛋白质 和多肽 中的经 基会干 扰测序 ,因 此需要 修饰。 在活化 过程中 ,乙 酸酐也 会与经 
基反应 将其乙 酰化, 但反应 不完全 ,在 iV- 甲 基咪挫 (NMI) 和乙 酸軒的 共同作 用下, Thr 
和 Ser 上的 经基基 本被乙 酰化。 

0H OAc 

C— N 丫 M 

S— Alkyl 



溴 甲基荼 





蛋白质 -COOH 
ji 次 

蛋 白质 -TH 



、蛋 白质 -ATH 



(5) 裂解 和衍生 

C 端的 ATH 衍 生物在 酸性条 件下与 [NCS 广反 应而被 
裂 解生成 ATH - 氨基酸 ,新的 C 端自 动形成 TH ,而不 必重新 
活化。 

因此, 整 个测序 过程只 需在开 始时对 C 端进 行一 次性活 
化, 并修饰 Asp 和 Glu 侧链羧 基以及 The 和 Ser 的 经基。 实 
释放 ATH-AA 际上, 循环反 应的只 有烧基 化和裂 解两步 ,其 全过程 图解如 

左图。 



^ 裂解 / 

环化 



68 



二、 c 端 蛋白质 序列仪 

近 年来, 已有商 品化的 C 端序 列仪 问世。 C 端 序列仪 一般由 N 端序列 仪改装 而成, 
其基 本结构 与后者 相似, 两者的 不同之 处主要 在于: 

① 反 应所用 的试剂 不同, 因此 两者不 可兼容 , 否则 极易堵 塞管道 ; 

② 在 C 端序列 仪中, 所有的 化学反 应均在 弹筒型 反应室 中进行 ,切割 下来的 ATH- 
AA 仅在转 化腔内 干燥和 溶解后 即进人 HPLC 系统分 离分析 ;而在 N 端测序 仪中, ATZ- 
AA 需在转 化腔中 转化为 PTH-AA。 参见图 4.8。 




12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 30.0 33.0 
r/min 



图 4.8 ATH- 氣基酸 色谱图 

三、 C 端测序 的样品 前处理 

C 端测序 样品的 纯度鉴 定和巯 基修饰 方法与 N 端测 序基本 相同, 可参照 前述。 
下 面介绍 C 端测 序样品 的脱盐 和游离 氨基的 衍生。 
(1) 脱盐 的方法 

目前 使用最 普遍的 C 端脱 盐方法 是采用 ProSorb 装置。 ProSorb 的结 构和使 用方法 
与 ProSpin 大致 相同, 不同 的是用 过滤器 代替了 ProSpin 中的离 心管, 过滤 器可将 样品中 
的小 分子物 质随水 分一起 吸收, 以达 到脱盐 和浓缩 样品的 目的。 具体操 作步骤 如下。 

第一步 : 将插管 插入套 管上部 , 过滤 器插人 套管下 部并接 触插管 底部的 PVDF 膜 。 

第二步 :用 15|^11甲醇润湿?\^0?膜。 

第三步 :在 插管中 加入出 5(^1 0. 1%TFA ,待过 滤器将 其完全 吸干。 
第四步 :将样 品溶液 加入, 体积 不少于 10(^1 ,吸 干。 
第五步 :用 TF A 洗膜 1 〜 2 次, 吸干。 

• 69 • 



i nmol 马肌 红蛋白 ISi 








3 Residue 1 






G 


G, 




I f 














120 150 
1 nmol »^ 肌红 蛋白原 


180 


210 24 


27 


300 330 

4 Residue 2 


Residue 2 


Q 






八 . 


广 




12.0 15 
1 nmol 马肌红 蛋白原 


180 


210 24.0 


27,0 


30.0 33.0 

5: Residue 3 


Residue 3 

A_A^ 


^ 一 








F 








/V 






120 15,0 
1 nmol 砀肌红 蛋白原 


180 


21.0 24 


27,0 


300 33 

6 Residue 4 


Residue 4 

/V/v 




G 




八 






12,0 150 
1 nmol 马肌红 蛋白原 


18 


210 24.0 


270 


30.0 330 

7 Residue 5 


Residue 5 










L 


JU_ 




八 


















120 15 180 21 240 27 
I nmol 3 肌红 蛋白原 


30 33,0 

8 Residue 6 




图 4.9 马肌红 蛋白原 



1 nmol 马肌红 肇白原 



9 Residue 7 



y\ 



nmol 马肌红 蛋白原 



• Residue 8 








―-八 i\ 八 k 










V r 
















马肌红 蛋白原 



- Residue 10 

'- —— ^ 


1 A 

-IV A /N 

















I nmol ? i 肌红 蛋白原 



A 

7V_ 



_yv_ 



的 C 端测 序图谱 



第六步 :取出 插管, 置于 恒温加 热块上 , 55 〜 60t: 加 热至少 10min。 
(2) £-# ^基的 衍生 

为了使 Lys-ATH 衍生物 获得更 好的分 离效果 ,需 先将蛋 白质或 多肽中 Lys 的 e -氨 
基与 Phenylisocyanate (PhNCO) 反 应成衍 生物。 具体操 作步骤 如下。 
第一步 :脱 盐后, 从恒温 加热块 上取出 插管。 
第二步 :用: VI 二异丙 基乙胺 (DIEA) 润湿 PVDF 膜。 
第三步 :在 膜上加 3pd PhNCO。 
第四步 :加热 5 〜; I0min。 
第 五步: 将第二 至第四 步重复 两次。 

四、 影响 C 端测 序反 应产率 的因素 

C 端测序 副反应 较多, 最高 初始产 率仅为 20%, 而对于 Glu,Asp,Ser,Thr 等氨 基酸, 
其 产率将 更低。 如 C 端富 含上述 几种氨 基酸, 测序 将十分 困难。 另外, 一 旦遇到 Pro ,由 
于吡咯 环的存 在而不 能与乙 酸軒反 应成环 ,整 个测序 过程将 终止。 

到目前 为止, C 端测 序可测 1〜10 个 残基, 一次测 序需要 的量比 N 端测 序要大 得多, 
至少需 lnmol。 此外, 因为不 同的氨 基酸反 应产率 不同, 所以, 对图 谱的分 析也比 N 端测 
序复杂 ,需要 较多的 经验。 目前 C 端测 序结 果最好 的一个 样品是 马肌红 蛋白原 (图 4.9), 
可测 C 端 10 个以上 残基, 通常 将其作 为标准 样品来 判断仪 器的稳 定性。 我们对 TNF 的 
C 端 测定结 果得到 C 端 8 个序 列为一 VYFGIIAL — COOH。 由于需 要对样 品进行 PIC 预 
处理和 侧链的 修饰, 有些氨 基酸的 ATH 衍生物 上会出 现修饰 基团。 如: Asp,au 将生成 
侧链酰 胺化的 ATH 衍 生物; Ser,Thr 通过 (3 -消除 分别生 成脱氨 Ala-ATH 和脱水 Thr- 
ATH 的 衍生物 ; Lys 的 反应终 产物为 PIC>Lys-ATH。 ' 

另外, 由于副 反应的 存在, 有的氨 基酸将 生成不 止一种 ATH 衍 生物。 如: Arg 的 
ATH 衍 生物可 能被乙 酰化或 院化; Tyr-ATH 可被乙 酰化; Cys 被修饰 后将形 成丙' 烯酰胺 
化的 Cys-ATH 以 及脱氧 Ala-ATH; 脱水 Thr-ATH 将产生 两个非 对映异 构体。 

五、 结语 和展望 

目前, C 端序列 测序技 术已初 步成熟 ,并开 始发挥 作用。 

但其 反应的 效率与 N 端 Edman 降解测 序法有 一定的 差距。 因此, 目前 的主要 问题是 
如何提 高反应 的产率 ,特 别是如 何改善 T,S,D,E 几种氨 基酸的 测定, 以及如 何解决 P 终 
止 测序的 问题。 如果在 上述几 方面取 得进展 ,将使 C 端可 测残基 数大大 增加, 并 减少样 
品所 需量。 另外, 近年来 发现, 很 多活性 多肽的 C 端是 酰胺 化的, 如果能 检测酰 胺化的 C 
端残基 ,将 对活性 多肽的 研究有 很大的 帮助。 

C 端测序 技术仍 处于研 究和发 展阶段 ,虽然 该技术 还不尽 完善, 但对于 确认表 达蛋白 
的 C 端是 否正确 , 以 及判断 在表达 、纯 化过 程中是 否发生 了不必 要的加 工大有 帮助。 

(徐 来根 屠红旻 曾 碌) 

• 72 • 



参 考文献 



1 Brune D C. Alkylation of cysteine with acrylamide for protein sequence analysis. Anal Bkx:hem,1992,207:285〜290 , 

2 Fullmer C S. Identification of cysteine-containing peptides in protein digests by high- performance liquid chromatography - 
Anal Biochem, 1984 , 142 : 336 〜 339 

3 LeGendre N et ai . Purification of proteins and peptides by SDS-PAGE. In: Matsudaira P. ed. A pratical guide to pro- 
tein and peptide purification for microsequencing , 2nd ed. USA: Academic Press, 1993 

4 Wittmann- Liebold B, Kimura M. Microsequencing of peptide and proteins with 4-N, N-dimethylamino-azo-benzene-4'- ' 
isothiocyanate . In: Walker J M ed. Methods in molecular biology. Vol.1. Proteins, The Humana Press Inc, 1984,221 〜 

241 

5 屠红受 ,夏 其昌. 蛋白质 和多肽 C 端氨 基酸序 列研究 进展. 生物化 学与生 物物理 进展, 1993,20:181〜185 '' 

6 Ambler R P. Enzymatic hydrolysis with carboxypeptidases. Methods Enzymol, 1972,143 |' 

7 Hayashi R, Moore S, Stein WH. Carboxypeptidase from yeast . Large scale preparation and the application to COOH-ter- ' 
minal analysis of peptides and proteins. J Biol Chem, 1973, 248(7) : 2296 〜 2302 

8 Hawke D H, et al . Studies on C- terminal analysis. In: Hugli T C ed. Techniques in protein chemistry San Diago : Aca- jlj 
demic Press, Inc. ,1989,59~70 ;: 

9 张丽 华等. HPLC 在线二 阶微分 光谱法 检测基 因工程 产品的 C- 端肽. 科学 通报, 1995,40(14):1314〜1317 

10 Perkin Elmer. Biosystems Reporter, Issue No. 24, p. 4 〜 5 , Feb. 1995. cf. Martiner, A et al . Biochem J , 1995 , 306 : ; 1 
589 〜 597 'j 

1 1 Boyd VL , Bozzini M , Zon G et al Sequencing of peptides and proteins from the carboxy terminus . Anal Biochem , 1 992 , | 
206(2): 344 〜 352 ,! 



1 



3 

7 



第五章 薄层等 电聚焦 

第一节 原 理 

蛋 白质等 电聚焦 (isoelectric focusing, IEF) 技术在 20 世纪 60 年 代后才 得到迅 速发展 
和推广 应用, 现已 成为一 种被广 泛采用 的蛋白 质分析 和制备 技术。 与常规 电泳不 同之处 
是在 IEF 时, 蛋白 质分子 是在含 有载体 两性电 解质形 成的一 个连续 而稳定 的线性 pH 梯 

度 中进行 电泳。 通 常使用 的载体 两性电 解质是 脂肪族 多氨基 多幾酸 (或横 酸型, 或 羧酸磺 
酸混合 型), 其在 电泳中 形成的 pH 范围有 3〜10、4〜6、5~7、6〜8、7〜9 和 8〜10 等可应 
用于 大多数 蛋白质 等电点 (p/) 的范围 [ 卜 3] 。 由 于蛋白 质是由 不同的 L-a 氨基酸 以不同 
数量和 比例按 一定顺 序排列 组成的 ,而 氨基酸 分子中 的氨基 和羧基 都是可 解离的 基团, 因 
此 氨基酸 可以形 成两性 离子: 

NH2 顯3+ 

I I 

H— C— COOH H— C— COO" 
I I 
R R 

在不同 pH 条件时 带电荷 状态会 有不同 : 

NH3 . NH3 NH2 

I — H+ I I 

H— C— COOH ^ H— C— COO— ^ H— C— COO— 

I +H+ I +H+ I 

R R R 

pH 1 时的主 要形式 pH 7 时的主 要形式 pH 1 1 时的主 要形式 

其中, R 为 侧链, R 不同决 定所带 的正、 负 电荷和 氨基酸 的酸碱 性质。 蛋白质 所带的 
净电荷 是其组 成各氨 基酸残 基上所 有正负 电荷的 总和, 所以 蛋白质 等电点 是一个 常数。 

IEF 电泳时 ,形成 正极为 酸性、 负极为 碱性的 pH 梯度。 当 将某种 蛋白质 (或 多种蛋 
白质) 样品置 于负极 端时, 因 pH>pJ ,蛋白 质分子 带负电 ,电泳 时向正 极移动 ;在 移动过 
程中, 由于 pH 逐渐 下降, 蛋白 质分子 所带的 负电荷 量逐渐 减少, 蛋 白质分 子移动 速度也 
随之 变慢; 当 移动到 pH = pJ 时, 蛋白质 所带的 净电荷 为零, 蛋白质 即停止 移动。 当蛋白 
质样品 置于阳 极端时 ,也 会得到 同样的 结果。 因此, 在进行 IEF 时 可以将 样品置 于任何 
位置。 各种不 同氨基 酸的蛋 白质在 IEF 电泳结 束后, 会分别 聚集于 相应的 等电点 位置, 
形 成很窄 的一个 区带。 IEF 不仅能 获得不 同种类 蛋白质 的分离 和纯化 效果, 同时 也能得 
到 蛋白质 的浓縮 效果。 在 IEF 中蛋白 质区带 的位置 ,是 由电泳 pH 梯度的 分布和 蛋白质 
的 所决 定的, 而 与蛋白 质分子 的大小 和形状 无关。 一 般蛋白 质等电 点分辨 率可达 
O.OlpH 单位。 



74 



第二节 薄层 lEF 

聚丙烯 酰胺水 平薄层 平板等 电聚焦 (horizontal thin layer polyacrylamideslafs) 分析技 
术操作 简便, 样品用 量少, 可在一 块板的 相同条 件下, 同时 分析多 个样品 并进行 比较, 电泳 
时间短 ,分辨 率高, 凝胶板 易制成 永久保 存的干 胶板。 

制备 型等电 聚焦、 毛 细管等 电聚焦 将分别 在有关 章节中 讨论。 

一、 仪 器 

实 验使用 BioRad 的等电 聚焦仪 (Model 111 Mini lEF Cell) ,包 括制胶 模具、 电源 
(PowerPac 1000 Power Supply) (图 5 . 1 ) 。 




图 5.1 薄层 等电聚 焦仪和 制胶框 



二、 试剂 和储存 液配制 

① 10%(7w/\O 过硫 酸铵: lOOmg 过 硫酸铵 加水至 lml。 当 天新鲜 配制。 

② 24.25%(m/V) 丙條 酰胺和 0.75% (r« AON'- 甲叉 双丙' 烯 酰胺储 存液, 过滤后 
4t: 保存, 不 超过一 个月。 

③ 25 % ( m /V) 甘油: 称 25g 甘 油加重 蒸水至 100ml。 

④ TEMED。 

© 两性 电解质 (根 据需 要选择 pH 范围 )。 

三、 制 胶模具 的准备 

取一片 玻璃片 (65rnmXl25mm) 表 面滴上 1 〜2 滴重 蒸水; 再取一 片塑料 薄膜, 疏水 
面盖 在玻璃 片带水 面上, 使 玻璃片 与塑料 膜贴紧 并压去 气泡。 在凝 胶制作 的模具 盒两侧 
各有 10mm 宽、 0.5mm 厚的塑 料条。 将玻璃 片上的 塑料膜 亲水面 向下, 紧 靠模具 盒一端 
两侧塑 料条上 贴紧, 形成 玻璃板 在模具 盒内三 面贴着 盒壁, 只 有一面 敞开。 



75 



四、 凝胶 的制备 



将以下 溶液置 于抽气 瓶内: 



重蒸水 5.5ml 

丙梯 醜胺/ Bis 储存液 2.0ml 

25% 甘油 2.0ml 

40% 两性 电解质 0.5ml 
抽气 lOmin 后加入 激活剂 

10% 过 硫酸铵 40fJ 

TEMED lO^tl 



轻轻混 匀后用 10ml 移液 管将凝 胶液一 次吸人 管内; 管口 放在上 述模具 盒中玻 璃板敞 
开面的 边上, 慢 慢地将 凝胶液 灌注入 盒内。 液流 需连续 不断, 以 免形成 气泡。 当凝 胶灌注 
至 充满整 个玻璃 板框时 停止。 水 平放置 Ih ,待凝 胶充分 聚合。 聚合 后玻璃 板塑料 膜和凝 
胶 已连在 一起。 从模 具盒中 取出即 可进行 加蛋白 样品和 IEF 电泳, 或用 保鲜膜 包封闭 
4t: 冰 箱保存 备用。 

五、 加 样 

将模 具中制 备好的 聚丙' 烯酰胺 凝胶面 朝上, 凝胶表 面覆盖 上带有 加样孔 的塑料 薄膜, 

使薄膜 与凝胶 贴紧, 每 孔蛋白 质样品 (溶于 50% 甘 油中) 可 以加人 0.5〜2/^1, 样品 量超过 
2^1 可将样 品滴在 滤纸。 加 样后需 5〜10min ,待 样品 进人胶 后小心 揭去. 带加样 孔的膜 (如 
滤 纸可在 IEF 结束后 再揭去 )。 ' 

A 、电 泳 

将电泳 盒内的 石墨电 极清洗 干净, 用水 将电极 润湿, 将加有 样品的 凝胶面 向下, 直接 
将凝 胶的两 端放在 石墨电 极上, 盖好电 泳槽盖 ,即 可开始 电泳。 

在稳压 条件下 ,开始 聚焦在 100V,15min 后增加 电压至 200V; 聚焦 15min 后 再增加 
电压至 450V;60min 便可 以结束 电泳。 

七、 染色 和脱色 

① 固定液 : 12. 5% 三氣 乙酸, 30% 乙醇。 

② 染色液 :0. 04% 考马 斯亮蓝 R250(Coomassic brilliant blue R250);10%冰醋酸;270X) 

乙醇。 

③ 脱色液 :25% 乙醇; 796 冰 醋酸。 

IEF 结 束后可 用微量 表面电 极测定 pj。 如 凝胶需 染色, 可将凝 胶连同 塑料薄 膜一起 
从玻 璃板上 取下。 
• 76 • 



八、 凝 胶保存 



脱色完 毕后, 轻 轻地从 玻璃上 取下支 持膜, 室温下 干燥。 此 胶可永 久保存 (图 5.2)。 

第三节 等 电聚焦 中的注 意事项 

① pH 梯度的 选择: 可 先在宽 pH 范围内 (pH3.5〜10 或 pH2.5〜ll) 的 载体两 性电解 
质中进 行分析 IEF。 当 了解到 目的蛋 白质的 pi 值后, 再用窄 pH 范围 (pH3~5 或 pH5〜 
7) 的载体 两性电 解质进 行分析 或制备 IEF。 在窄 pH 范 围进行 IEF 不仅 可以提 高分辨 
率, 而且可 以增加 需分离 蛋白质 的负载 容量。 

② IEF 如在宽 pH 范围载 体两性 电解质 内进行 ,为 了克服 在中性 区域形 成纯水 区带, 
可适当 添加中 性载体 两性电 解质。 

③ 为防 止电泳 过程中 pH 梯度的 衰变, 一般在 电流降 低达最 小而恒 定时尽 快结束 

lEFo 

④ pH 梯度 (pJ) 测定。 

凝胶 IEF 后, 可分 段切割 凝胶, 用 3~^5 倍体 积的蒸 馏水或 lOmmol/L KC1 浸 泡该凝 
胶, 从凝胶 浸出液 中测定 pH 值; 或 用微电 极直接 测定凝 胶表面 pH 值。 

薄层 等电聚 焦后, 可用 微电极 检测凝 胶表面 pH 值; 根据 蛋白质 分布的 pH 值 即能确 
定该蛋 白质的 pJc 

©IEF 聚焦过 程中由 于蛋白 质泳动 到某一 区段, 而该区 段刚好 是该蛋 白质的 pJ ,会 
造成蛋 白质的 沉淀。 为了 解决此 问题, 可在样 品中添 加脲、 TritonX-100、NP-40 或 其他一 
些非 离子型 表面活 性剂。 

©IEF 样品 应不含 盐类。 因盐浓 度高在 高压电 泳时电 流大, 发热 量大; 但在无 盐时, 
一些 蛋白质 的溶解 度低, 可通过 在样品 中加入 适量两 性电解 质或甘 氨酸来 解决。 

⑦所 用试剂 要求高 纯度。 

第四节 IEF 的 优缺点 

(1) 与 常规电 泳比较 IEF 有以 下优点 

① 具有 很高的 分辨率 ,可把 pJ 相差 O.OlpH 单位的 蛋白组 分相互 分开。 

② 样 品体积 和加样 位置不 受严格 限制, 样品可 混入胶 中或放 在任何 位置。 

③ 在 IEF 电泳一 结束, 即可以 测定其 蛋白质 pJ。 

④ 分离 蛋白质 快速, 一 般分析 型薄层 IEF 可在 2h 完成。 

⑤ 由于 载体两 性电解 质分子 质量小 , 不会 与蛋白 质反 应并使 之变性 , 因 此只需 硫酸铵 
沉淀, 通过透 析和分 子筛、 电泳 等方法 很易与 蛋白质 分开。 

©IEF 分 离获得 的蛋白 质基本 上可保 持原有 的生物 活性。 

(2) IEF 的 缺点: 

① 许多蛋 白质在 p/ 附近 会产生 沉淀, 因而影 响分离 效果。 可 在凝胶 介质中 或制备 

• 77 • 



电泳 无介质 的样品 溶液中 加豚或 非离子 去坂剂 解决。 

② 样品 中 最好不 含盐。 如高 盐浓度 在高压 电泳时 ,电 流大, 发热 量大; 但在 无盐时 , 一 
些蛋白 质溶解 不好; 这可 通过在 样品中 适当多 加些两 性电解 质或甘 氨酸等 两性物 质来解 
决。 

③ 由于 两性电 解质可 与蛋白 质间的 静电作 用而紧 密结合 ,形成 的复合 物可能 导致它 

与抗体 反应降 低或使 醜活性 降低。 可通 过高离 子浓度 (O.lmol/L 或更高 ,达 0.5mol/L)、 
pH7 左 右的挥 发性缓 冲液破 坏它们 的静电 作用。 

表 5.1 提供了 部分蛋 白质的 等电点 和分子 质量。 



表 5.1 部分 蛋白质 的等电 点和分 子质量 



蛋白 质名称 


分子 质量/ Da 


等电点 (P/) 


蛋白颜 


碳酸 51: 解 


38 000 


4.5 




人胎 盘喊性 碟酸化 薛 


116 000 


4.6 




藻 青蛋白 


232 000 


4.63 


蓝色 


P- 乳 球蛋白 


18 400 


5.1 




大 肠杆菌 L- 天 冬酰胺 合成薛 


80 000 






人血清 白蛋白 


69 000 


5.85 




牛碳 酸酐解 


31 000 


6.0 




大肠 杆菌' L - 高 丝氣酸 脱氢薛 


360 000 


6.1 




人碳 酸肝酵 


28 000 


6.5 




马肌 红蛋白 (二 条带) 


175 000 


6.8,7.0 


綜色 


人血 红蛋白 A 


64 500 


7.1 


红色 


猪红 细胞碳 酸肝酵 


30 375 


7.3 




人血 红蛋白 (' 


64 500 




红色 


扁豆 凝集素 (三 条带) 


49 000 


7.8.8.0,8.2 




豚鼠胰 a 淀粉薛 


52 000 


8.4 




细 胞色素 C 


12 200 


9.6 - - 


红色 


鼠 肝醇脱 复薛 


68 000 


9.7 




菠萝 蛋白醉 


22 000 


9.7 





第五节 实 例 

①用 IEF 来鉴定 蛋白质 不同纯 化过程 所得到 的样品 (图 5.2)。 




STD Pr.l Pr.2 Pr.3 Pr.l Pr.2 Pr.3 STD 



78 



图 5.2 不同 蛋白质 样品的 薄层等 电聚焦 



用此法 可以来 鉴定不 同纯化 方法所 得到的 蛋白质 的性能 ,根据 需要以 此来选 择最佳 
的纯化 方法。 

②用 Rotofor 分离纯 化样品 (可参 见第七 章第三 节), 用 Mini-IEF 来鉴定 (图 5 . 3) 。 



Rgo|r 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 摩職 (STD) 

图 5.3 细 胞色素 C 和白 蛋白 的制备 
IEF 分离 (BioRad Rotofor), 然后用 Mini-IEF 鉴定 

自由 流等电 聚焦后 样品, 也可 通过薄 层等电 聚焦来 鉴定分 离纯化 效果。 

(邵 晓霞 龚 蓁蓁) 

参 考文献 

1 Vesterberg O.Svensson H. Isoelectric fractionation , analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. 
IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chem Scand. 1966, 
20(3):820~834 

2 Vesterberg O. Buffering capacity and conductance of isoionic ampholytes. Acta Chem Scand , 1 969 , 23 : 2653 

3 Vesterberg O. Physicochemical properties of the carrier ampholytes and some biochemical applications. Acta Chem 
Scand ,1973,27:2415- 2420 



雪奉 . I Mmmm • 

一 



79 



第六章 SDS — 聚丙炼 酰 胺凝 胶电泳 

第一节 概 况 

聚丙' 烯 酰胺凝 胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 具有较 高的分 辨率和 
灵 活性, 因而被 广泛应 用于蛋 白质的 分离和 分析。 然而, 凝胶 电泳目 前仍是 一项手 工操作 
较多的 技术, 操作 者如能 对电泳 原理、 聚 胶过程 及影响 电泳的 一些因 素多加 了解, 将有助 
于顺利 完成有 关实验 ,获得 分离效 果及重 复性好 的电泳 结果。 

聚丙' 烯 酰胺凝 胶是由 丙條酷 胺和甲 叉双丙 條酰胺 (bis) 经 共聚合 形成。 此聚 合过程 
是由 四甲基 乙二胺 (tetramethylethylenediamine,TEMED) 和过硫 酸铵激 发的, 即过 硫酸铰 
在 水溶液 中形成 一个过 硫酸自 由基, 然后此 自由基 再激活 TEMED ,随后 TEMED 作为一 
个电 子载体 提供一 个未配 对电子 将丙' 烯酰胺 单体转 化成一 个自由 基从而 激活了 后者。 被 
激活的 单体和 未被激 活的单 体反应 开始了 多聚链 的延伸 ,正 在延伸 的多聚 链也可 以随机 
地通过 bis 的 作用进 行交叉 互联成 为网状 结构, 最终多 聚物聚 合成凝 胶状, 而其孔 径大小 
等 特征由 聚合条 件及单 体浓度 决定。 凝 胶的孔 径可以 在一较 宽范围 内变化 以迎合 不同的 
分离 需要, 改变凝 胶或缓 冲液的 某些组 成成分 ,就可 以按照 不同的 分离机 制进行 分离, 如 
分别 根据蛋 白质的 电荷、 大小或 荷质比 特性进 行等电 聚焦、 SDS-PAGE 及酸 性或碱 性凝胶 
电 泳等。 

核黄素 也可以 作为产 生自由 基的起 始物, 有时也 将它和 过硫酸 铵混合 在一起 使用, 核 
黄素 激活聚 合反应 需要光 和氧气 存在, 因 此称为 光化学 聚合。 

在聚丙 '烯 醜胺凝 胶电泳 中最常 用的是 SDS-PAGE (十二 烷基硫 酸钠- PAGE) ,简称 
SDS 电泳。 SDS 是一种 阴离子 去污剂 ,能断 裂分子 内和分 子间的 氢键, 它与 蛋白质 的疏水 
部分相 结合, 破坏 其折叠 结构, 并 使其稳 定地存 在于均 一的溶 液中。 SDS 蛋 白质络 合物的 
长度与 其分子 质量成 正比。 由于 在样品 介质和 聚丙條 酰胺凝 胶中加 入了离 子去污 剂和强 
还原剂 (如巯 基乙醇 和二硫 苏糖醇 ), 使 各合 物所带 的负电 荷大大 超过了 
>g^f 1^、有的电荷量,消除了不同分子£1^^¥^)百荷^^,其电泳迁移率主要取决于5- 
^¥ 质量的 大小。 当 蛋白质 的分子 质量为 15 000〜200 000Da 时, 电泳 迁移率 与分子 
iSi 的对数 呈线性 关系。 因此, 它 被广泛 应用于 蛋白质 纯度鉴 定和分 子质量 测定, 且因所 
需设备 简单, 操作 简便, 重复 性好, 使它 成为许 多研究 领域中 一种重 要的分 析和微 量制备 
技术。 

第二节 材 料 

一、 设备 和材料 

①电泳 装置为 BioRad Mini-Protean II 型电 泳仪。 
• 80 • 



② 电源 (Bio^Rad Model 3000xi)。 

③ 水 浴锅。 

④ Eppendorf 管 。 

⑤ 移液 器 ( lOOOjuL , 200/^L , 20^iL) , Tip。 

⑥ 摇床。 
(D 水泵。 

⑧ 干胶仪 (BioRad Model 583 Gel Dryer) 。 

⑨ 玻 璃纸, Whatman 3MM 滤纸。 
@pH 计。 

⑪离 心机。 

二、 试 剂 

① 丙 稀酰胺 (电泳 级)。 

② iV,N'- 甲 叉双丙 烯酰胺 (bis)。 

③ SDS。 

④ TEMED。 
©Trisc 

⑥ 过硫 酸铰。 

⑦ a - 巯基 乙醇。 

⑧ 甘油。 

⑨ 甘 氨酸。 
@漠 酚蓝。 
⑪ 盐酸。 

第三节 基本操 作步骤 
一、 聚胶 前准备 

① 配制 储存液 ,单 体储存 液需经 MilUpore 膜 过滤后 使用。 

② 配制 10% 过硫酸 按溶液 (需 每天新 鲜配制 )。 

③ 将 单体储 存液、 缓冲液 、水 按照一 定比 例配制 成凝胶 溶液。 

④ 将灌胶 装置准 备好。 

⑤ 待 凝胶溶 液平衡 至室温 (23~25t: ) 后, 真 空脱气 15min。 

二、 不 连续系 统下层 分离胶 的聚合 

在 10ml 凝 晈溶液 中加入 109() 过 硫酸铵 50fil (最终 浓度为 0.05% ),TEMED 原液 5^tl 
(最终 浓度为 0.05%)。 轻 缓地摇 动溶液 (8〜10 下), 使激活 剂混合 均勾。 

• 81 • 



将 凝胶溶 液平稳 地注人 两层玻 璃板中 (注意 要以连 续平稳 的液流 从中间 位置注 人), 

再 在液面 上小心 注入一 层水或 正丁醇 (2~3mm 高), 以 阻止氧 气进人 凝胶溶 液中, 然后静 
置至少 90mine 

三、 不 连续系 统中的 上层浓 缩胶和 连续系 统凝胶 的聚合 

连续 系统只 含一种 凝胶, 它和不 连续系 统中的 浓缩胶 具有相 同之处 ,即 在其液 面处与 
空气相 接触, 因此激 活剂的 含量应 相应地 增加, 在 10ml 凝 胶溶液 中加入 1096 过 硫酸铵 
5(VK 最 终浓度 0.05% ) ,TEMED 原液 lO/utl (最 终浓度 0.1%)。 

同前 将激活 剂混合 均勾, 但摇动 溶液时 不要摇 得过于 剧烈以 免引人 过多的 氧气。 

吸去不 连续系 统中下 层分离 胶上的 水分, 以连续 平稳的 液流注 人凝胶 溶液, 然 后小心 
插入 梳子并 注意不 得在齿 尖留有 气泡。 

静置 90niin 以 上以保 证完全 聚合。 

如果在 聚胶过 程中发 现一道 道纹线 ,即 凝胶不 均匀, 可能 是聚合 速度太 快或激 活剂未 
充 分混合 导致局 部浓度 过高。 

凝胶聚 合的速 度可以 通过紫 外吸收 检测, 由于丙 '烯酰 胺中的 双键在 260nm 有 吸收, 
聚合 后双键 消失, 光吸收 减低。 将凝 胶溶液 倒入石 英比色 杯中, 可 观察到 20〜30min 后光 
吸收读 数开始 下降, 至 80min 以后趋 于稳定 ,说 明聚合 完成。 . 

将聚合 好的凝 胶板安 置于电 泳槽中 ,加入 上下槽 电泳缓 冲液后 ,小 心拔去 梳子, 以缓 
冲液冲 洗加样 槽后, 依次 加人标 准品和 待分析 样品。 注意 加样时 间要尽 量短, 以免 样品扩 

散。 

五、 电 泳 

加样 完毕, 盖好 电泳槽 盖子并 选择适 当的电 压进行 电泳。 通常, 在不 连续系 统中, 上 
层浓缩 胶的电 泳电压 要低于 分离胶 的电泳 电压, 使样 品更好 地进入 凝胶。 当指示 剂即将 
走 出凝胶 说明电 泳基本 结束。 

A 、染色 和脱色 

电泳 完毕需 通过染 色和脱 色评定 其结果 的优劣 。 此外 , 根据不 同 的研究 目 的 , 也可将 
凝 胶直接 进行放 射自显 影及电 印迹。 以 下介绍 最常用 的染色 和脱色 方法。 

1. 考 马斯亮 蓝染色 

染 色液为 0.1% 考马 斯亮蓝 R-250,40O/6 甲醇 (或 乙醇) 和 lOo/o 冰醋酸 ,染色 0.5〜lh。 
脱 色液为 10% 甲醇 (或 乙醇) 和 10% 冰醋酸 ,需 l~3h ,其 间更换 2〜3 次脱色 液至背 
• 82 • 



景 清楚。 

此方法 检测灵 敏度为 0. 1 〜 1 .(VgW 。 

2. 银染法 

根据 Morrisey[ 2 ] 方法 并稍加 改进, 具 体步骤 如下: 

第一步 :电泳 结束后 凝胶在 50% 甲醇和 10% 冰醋酸 中浸泡 30min ,然 后换至 5% 甲醇 
和 7% 冰 醋酸中 30min。 

第二步 : 10% 戊二 酵固定 30minc 

第 三步: 重蒸水 中漂洗 过夜或 2h (中间 更换三 次水) ,这 一步根 据电泳 结束的 时间选 

择。 

第四步 :在 硫 苏糖醇 (DTT) 溶液 中浸泡 30min。 
第五步 :在 . 1 % AgNCb ( 定 影液) 中浸泡 30min。 
第六步 :在水 中迅速 漂洗几 秒钟。 

第七步 :用 显影液 (100ml 3%N&CQ3 中含 5(^1 37% 甲酸, 经 MiUipore 膜 过滤) 漂洗 两次。 
第 八步: 在显影 液中浸 泡至蛋 白条带 显现。 

第九步 :在 50ml 显影液 中加人 5ml 2.3mol/L 的柠 檬酸终 止显影 过程。 凝胶 需在此 
终止 液中至 少浸泡 10min。 

第十步 :重蒸 水漂洗 三遍, 共 30min。 

第十 一步: 凝胶在 0.03%Na2CQ3 溶液 中浸泡 lOmin ,使凝 胶处于 微碱性 环境中 ,蛋白 
质条 带不易 褪色。 

第十 二步: 凝胶在 3% 甘油 中浸泡 30mm 以 增加柔 软性, 然后用 干胶机 或简单 地夹在 
2 张事先 润湿的 透气玻 璃纸中 (中间 不得留 有气泡 ), 用 固定夹 封住制 成凝胶 干片。 
需注意 以上每 一步凝 胶在溶 液中都 要在水 平摇床 上轻轻 摇动。 



1 2 3 4 5 6 7 8 



TME 



ME 



图 6.1 OCSF 纯 度鉴定 (银染 ) 
1,2,3 为不 同批号 的重组 OCSF 用琉 基乙醇 处理后 
的电泳 条带; 6,7,8 为不 同批号 的重组 OCSF 未经 
琉基乙 醇处理 的电泳 条带; 4, 5 为标准 蛋白质 



图 6.2 GM-CSF 纯 度鉴定 (银染 ) 
1,2,3 为不 同浓度 GM-CSF 用巯 基乙醇 处理后 
的电泳 条带; 4,5,6 为不 同浓度 GM-CSF 未经 
巯基 乙醇处 理的电 泳条带 



83 



此方 法检测 灵敏度 高于考 马斯亮 蓝法, 为 2〜10ng [3] ,常 可用 于鉴定 蛋白质 的纯度 
(见图 6.1, 图 6. 2), 但是 由于不 同蛋白 质结合 银离子 的能力 不同, 而 且在上 述第八 步中显 
影时间 的长短 将明显 改变蛋 白条带 的色度 ,所以 ,应用 银染法 时根据 蛋白质 条带深 浅确定 
其浓 度不易 准确。 

3. 铜、 锋等金 属离子 染色法 

电泳结 束后凝 胶在水 中漂洗 几秒钟 ,然后 浸泡在 0.3mol/L 的 Cua2( 或 ZnCl2 等) 溶 
液中, 并 在室温 下轻摇 5min ,这时 若在凝 胶背面 衬以暗 色背景 ,即可 观察到 近乎透 明的蛋 
白质 条带的 显现, 用 水冲洗 2〜3mm 除去过 量的染 色剂后 ,可保 存在重 蒸水中 [4 ' 5] 。 

七、 干胶 

将 一张经 润湿的 玻璃纸 (或 Whatman 3MM 滤纸) 平整地 铺于干 胶仪桌 面上, 凝胶置 
于玻璃 纸上, 以蒸馏 水作润 滑剂, 再将 另一张 同样经 润湿的 玻璃纸 覆盖在 凝胶的 表面, 小 
心去 除所有 的气泡 , 盖上密 封塾膜 , 打 开真空 开关 使密封 塾膜的 四周密 封于干 胶仪上 , 加 
盖 后开启 电源进 行程序 干胶。 

凝胶也 可在室 温和常 压下, 置于玻 璃纸内 ,四 周以封 条密封 (不能 留有气 泡以免 破裂) 
后进 行自然 干胶。 

第四节 几种 不同凝 胶电泳 系统及 其应用 

在 聚丙燦 銑胺凝 胶电泳 中最常 用的是 SDS-PAGE ,它被 广泛应 用于蛋 白质纯 度鉴定 
和分 子质量 测定, 下面介 绍适用 于不同 范围蛋 白质分 离的实 验方、 法。 

― 、 Laemmli 系 统 

r: 存液 由以下 几部分 组成。 

① C: 备胶 (30%T,2.67%C): 称取 29. 2g 丙' 烯 酰胺和 0.8g bis ,用水 溶解并 定容至 
100ml,Millipore 膜过 滤后在 41: 避光 保存。 

② 1.5mol/LTris-HCl,pH8.8: 称取 18. 15g Tris ,用 60ml 重蒸水 溶解, 再用 Imol/L 
盐酸 调节至 pH8.8, 然后 定容至 100ml,4t: 保存。 

③ 0.5mol/L Tris-HCl,pH 6. 8: 称取 6g Tris ,用 60ml 重蒸水 溶解, 再用 Imol/L 的盐 
酸 调节至 pH6.8, 然后 定容至 100ml,4t: 保存。 

④ 10%SDS: 将 lOg SDS 溶于 80ml 重蒸水 中并轻 缓搅拌 (室 温低时 需水浴 加热溶 
解), 再 定容至 100ml ,室温 存放。 

© 样品缓 冲液: 分别取 重蒸水 4.0ml,0.5mol/LTris-HCl,pH6.8 缓冲液 l.OmI ,甘油 
0.80ml,10%(m/V)SDS 1.6ml ,巯 基乙醇 0.4ml,0.1%(m/V) 溴酚蓝 0.2ml ,总 体积为 
8ml ,加样 前样品 与此缓 冲液以 1 :4 混 合后在 沸水浴 中加热 4min。 

⑥浓 缩电泳 缓冲液 (5 X ): 称取 l5g Tris,72g 甘 氨酸, 5g SDS ,用水 溶解至 1 000ml, 
• 84 • 



pH8.3, 不必 调节。 用 时稀释 5 倍。 

电泳前 首先根 据样品 分子质 量大小 选择适 宜的凝 胶浓度 ,当分 析一个 未知样 品时, 常 
先用 7. 5% 的 标准凝 胶或用 4% "^10% 的凝胶 梯度来 测试, 然 后选出 适宜的 浓度。 



蛋白质 分子质 量范围 /U) 3 Da 


适 宜的凝 胶浓度 /%T 




<10 




15〜20 




10-50 




15 




15-60 




12.5 




15-100 




10 




30-120 








30-200 








>200 








分离 胶配方 




15%T 12%T 


10%T 


7.5%T 


重蒸水 


2.35ml 3.35ml 


4.02ml 


4.85ml 


1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8 


2.50ml 2.50ml 


2.50ml 


2.50nil 


30% 丙稀 銑胺/ bis 


5.0ml 4.0ml 


3.33ml 


2.50ml 




室 温脱气 15min 






10%SDS 


lOOfil 100^1 


lOOfxl 


lOOfxl 


10% 过 硫酸铵 (新鲜 配制) 


50fx\ 50fxl 


50fil 


50fxl(0.05%) 


TEMED 




5ixl 


5fxl(0.05%) 


总体积 


10ml 10ml 


10ml 


10ml 


浓缩胶配方(4.0%T,0.125mol/LTris,pH6•8) 


重蒸水 




3.05ml 




O.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 




1.25ml 




30% 丙 錄銑胺 




0.65ml 






室 温脱气 15min 






10%SDS 




50{x\ 




10% 过 硫酸按 




25"K0.05%) 




TEMED 




5fil (0.1%) 




总体积 




5ml 





在 Laemmli 系统 中蛋白 质分子 质量的 对数值 和其相 对迁移 距离呈 良 好的线 性关系 , 
因此适 合测定 蛋白质 的分子 质量。 根据 一系列 已知分 子质量 蛋白质 的相对 迁移距 离制得 
标准 曲线, 将未 知蛋白 质的相 对迁移 值对照 标准曲 线即可 获得其 分子质 量数据 (图 6.3)。 

另外, 将标准 曲线向 Y 轴 (log 分子 质量) 延 伸可得 Y 轴截距 ,即 相对泳 动为零 时的分 
子质 量值, 也 就是说 当蛋白 质的分 子质量 大于此 值时将 不能进 入分离 胶中, Y 轴截 距的数 

• 85 • 



0.2 0.4 0.6 0.8 
相 对迁移 

图 6.3 标准 蛋白质 及重组 IL- 3 产 品鉴定 (考马 斯亮蓝 染色) 
1-5 为不 同批号 的重组 白细胞 介素- 3;6 为标准 蛋白质 



值大 小可体 现聚胶 完全程 度以及 电泳结 果的重 复性。 

表 6.1 列出了 商品化 的标准 蛋白质 及它们 的分子 质量。 

表 6.1 标准 蛋白质 及其分 子质量 



蛋白质 


分 子质量 

/lO^Da 


蛋白质 


分 子质量 
/lO^Da 


姨岛素 A 链、 B 链 (insulin A chain & B chain) 


2,3 


内切 糖昔薛 HCendoglycosidase H) 


29 


牛 胰蛋白 SI 抑制 剂标准 蛋白质 及其分 子质量 


6.2 


乳糖 脱氢酶 (lactate dehydrc^enase) 


36 


(bovine pancreatic trypsin inhibitor) 


3- 磷酸 甘油醒 脱复醉 


36 


HIV 蛋白酶 (HIV protease) 


10 


( glyceraldehyde- 3 - phosphate dehydrogenase ) 


细 胞色素 c( cytochrome C) 


13 


卵 白蛋白 (ovalbumin) 


45 


a - 乳白蛋 白 ( a-lactalbumin) 


14.2 


•y- 球蛋 白重链 (y-globulin heavy chain) 


50 


溶菌薛 (Lysozyme) 


14.3 


过氧 化氢酶 ( catalalse ) 


57 


核糖 核酸酶 A(ribonucIease A) 


14 


牛血清 白蛋白 (bovine serum albumin) 


66 


抹 香録肌 红蛋白 (sperm whale myoglobin) 


17.2 


转 铁蛋白 (transferrin) 


75 


(3 -乳 球蛋白 ((3~lactoglobulin) 


18.4 


伴 白蛋白 ( conalbumin) 


77 


大豆胰 蛋白薛 抑制剂 (soybean trypsin Inhibitor) 


20.1 


憐酸化 Si bCphosphorylase b) 


97.4 


球蛋 白轻链 (7-8101)111;11 light chain) 


25 


3 -半 乳糖音 SI(p"galactosidase) 


116 


胰蛋 白 酶原 ( trypsinogen ) 


24 


a2 -巨 球蛋白 (a2-macrc^lobulin) 


180 


a -胰 凝乳蛋 白 酶原 (a-chymotrypsinogen) 


25.5 


肌 球蛋白 (myosin) 


205 


碳 酸酐酷 (carbonic anhydrase) 


29 







二、 大孔 胶系统 

在上述 Laemmli 系 统中, 交联度 0%为3%(3%为1315 的质量 / 单体的 总质量 ) , 但是 
有时 样品中 的蛋白 质较复 杂时, 在一 块单一 浓度凝 胶上很 难将所 有蛋白 分离, 比如 单体浓 
• 86 • 





8 6 4 2 

Mo- 



度 T 为 12% 的凝 胶就不 能分离 lOOkDa 以 上的蛋 白质。 虽然 梯度凝 胶可以 拓宽分 子质量 
分离 范围, 但操作 繁琐。 以下介 绍一种 大孔径 凝胶, 它可以 在一块 凝胶上 分离分 子质量 
10 X 10 3 〜450x 10 3 Da 的蛋 白质, 比如 细胞内 总蛋白 分析。 这种凝 胶还可 以允许 上样量 
高达 200/^1, 并仍 能得到 尖窄的 条带。 另外, 这种凝 胶中的 蛋白质 更容易 转移至 膜上。 但 
是 由于大 孔胶系 统中蛋 白质分 子质量 的对数 值和其 相对迁 移距离 的关系 的线性 程度不 
佳, 用它 测定蛋 白质分 子质量 的准确 度不及 常规的 Laemmli 系统。 
大 孔胶的 配方: 

分离 胶中含 1096 丙' 烯 酰胺, 0.1% bis, 0.4% SDS, 5% 甘油, 200mmol/L Tris, 
lOOmmol/L 甘氨酸 (不 必调节 pH), 最终为 pH9.0。 聚胶 时加人 0. 1% 过硫 酸铵和 0.05% 
TEMEDo 

浓縮 胶中含 4% 丙烯 酰胺, 0.04% bis, 0. 4% SDS, 4mmol/LEDTA, 5% 甘油, 
70mmol/L Tris-HCl,pH 6.7。 聚胶 时加人 0. 1 % 过硫 酸铵和 0.05%TEMED。 

上槽 (负极 ) 电泳缓 冲液为 lOOmmol/L Tris , 150mmol/L 甘氨酸 , . 1 % SDS , pH8 . 45 
(不 必调 pH)。 下槽 (正极 ) 电泳缓 冲液为 上槽电 泳缓冲 液稀释 一倍。 电泳 时选择 恒电压 
60V。 

样 品缓冲 液中含 8mol/L 尿素, 3 96 SDS , lOOmmol/L DTT ,0.005 % 溴酷蓝 , 70mmol/L 
Tris-HCl,pH6.7。 上 样前于 沸水浴 中加热 4min。 

三 、 Tris-Tricine 系 统 

此系统 适合小 分子蛋 白和多 肽分离 , 分 子质量 可低至 3 OOODa( 图 6 . 4 ) 。 

Ins. 

STD 多肽 (60aa) A-B 链 





图 6.4 小分子 蛋白质 和多肽 的分离 
(用 Tri^Tricine 系统) 

电 泳前准 备下列 溶液: 

①正极 (下槽 ) 缓冲液 ( 10 X , 2 . Omol/L Tris-HCl , pH8 . 9 ) : 将 12 1 . 9g Tris 溶 于 400ml 
重蒸 水中, 用 Imol/L HCl 调至 pH8.9, 再 定容至 500ml。 

• 87 • 



② 负极 (上槽 ) 缓冲液 (10X,1. Omol /L Tris , 1 . Omol/L Tricine , 1.0%SDS, pH8.25) : 
将 60.55g Tris,89.58g Tricine 及 5g SDS 溶于 400ml 重蒸 水中, 用 Imol/L HCl 滴定至 
pH8. 45, 加水 至最终 体积为 500nil。 

③ 丙烯酰 胺溶液 (49.5%T,3%C): 将 48g 丙烯 酰胺和 1.5g bis 溶于 100ml 重蒸水 

中。 

④ 凝胶 缓冲液 (3 X ) : 将 181 .5g Tris, 1.5g SDS 溶于 400ml 重蒸 水中, 用 Imol/L HCl 
滴定至 pH 8. 45, 再加水 稀释至 50()ml。 

©50% ( m /VO 甘油: 称取 250g 甘油 加重蒸 水混合 均匀并 定容至 500ml。 
以上溶 液需经 Millipore 膜 过滤。 

⑥样品 缓冲液 :将 1ml 甘油, 0.5ml 巯基 乙醇、 0.4g SDS, 1ml 0.5mol/L Tris-HCl, 
pH6.8 及少许 溴酌蓝 (至溶 液呈棕 红色) 混合后 再加人 重蒸水 定容至 5ml。 上样前 将样品 
与相同 体积的 样品缓 冲液混 合后, 沸水 浴加热 2〜4rnin。 

凝胶 的配方 





10% 分离胶 


4% 浓缩胶 


单 体溶液 (49.5%T,3%C) 


3.0ml 


0.5ml 


50% 甘油 


4.0ml 




凝胶 缓冲液 (3 X) 


3.0ml 


2.5ml 


重蒸水 


3.92ml 


4.46ml 




脱气 15min 




10% 过 硫酸铵 


75fxl 


■ 37.5^1 


TEMED 


7.5^tl 


3.8;il 


总体积 


14mJ 


7.5ml 



Tris-Trcine 系统 电泳条 件根据 不同仪 器可在 100〜200V 之间 选择。 



第五节 注 意事项 

一、 形成 凝胶的 试剂要 有足够 的纯度 

丙烯酰 胺是形 成凝胶 溶液中 的最主 要成分 ,其纯 度的好 坏将直 接影响 凝胶的 质量, 丙 
稀 酰胺可 能混有 的影响 凝胶形 成的杂 质有: 丙條酸 、线性 多聚丙 '烯 酰胺、 金属离 子等。 

丙烯 酸是丙 稀酰胺 的脱氨 产物, 它也能 和丙條 酰胺及 bis 发生共 聚合, 从而导 致凝胶 
中部分 区域的 pH 发生 改变, 最终 电泳结 果产生 偏差, 如表 现为: 迁移位 置发生 改变、 蛋白 
条带弯 曲不平 整等。 除了固 体丙' 烯醜胺 中可能 含有丙 稀酸外 ,单体 储存时 间过长 (4t: ,一 
个月 以上) ,也 将有部 分丙稀 酰胺水 解成丙 烯酸。 

线性 聚丙' 烯酰胺 是丙稀 酖胺在 生产、 加工 或储存 时污染 了具有 催化作 用的杂 质引起 
"自聚 合", 凝胶溶 液中混 有这种 丙條酰 胺的聚 合物后 将造成 聚胶不 均勾并 改变凝 胶的孔 
径, 从而 影响电 泳的重 复性。 

金属离 子的含 量超过 一定浓 度后有 时会抑 制凝胶 的聚合 ,有 时则改 变一些 蛋白质 (尤 
其是金 属结合 蛋白) 的泳 动力。 
- 88 • 



上述杂 质虽然 可以通 过一些 物理、 化 学方法 检测, 但通常 都是根 据聚胶 及电泳 结果推 
测的。 在实验 室中可 以通过 重结晶 的方法 纯化丙 '烯 酰胺, 但 由于丙 烯酰胺 单体具 有神经 
毒性, 一般应 尽量避 免上述 工作。 最简单 的方法 是选择 质量好 、达 到电泳 纯级的 产品。 另 
外, 需注 意不能 随便倾 倒单体 溶液, 应加 入过量 的催化 剂使其 完全聚 合成无 毒性的 聚丙條 
酰 胺后再 弃置。 

甲叉双 丙稀酰 胺相对 于丙' 烯酰 胺在单 体溶液 中含量 甚少, 但也 可能混 有上述 几种杂 
质, 造成 同样的 结果。 

TEMED 中混有 氧化试 剂后其 自身极 易被氧 化而失 去催化 能力, 另外 TEMED 的氧 
化 产物呈 黄色, 以此可 以鉴定 TEMED 的 质量。 如果 无法获 得无色 透明的 TEMED ,只能 
适当 增加用 量以保 证聚胶 速度。 

过硫 酸铵容 易吸潮 , 由 于它 溶解于 水后很 快降解 失去催 化能力 , 因此潮 解后的 过硫酸 
铵会渐 渐失去 活性。 保存 固体过 硫酸铵 应密闭 干燥。 过硫 酸铵溶 液宜制 胶当天 配制。 另 
外在配 制凝胶 溶液时 过硫酸 铵不易 过量, 否 则会使 蛋白质 在电泳 过程中 被氧化 (主 要指天 
然无变 性剂凝 胶)。 

凝胶 溶液中 的其他 成分如 Tns 、甘 氨酸、 SDS 、尿素 等也应 选择纯 度较高 的产品 (分析 
纯以上 ) , 以避免 混有抑 制凝胶 聚合的 杂质。 

二、 激活剂 的用量 

激活剂 的浓度 适当与 否不仅 可以决 定凝胶 聚合的 速度, 也 将影响 凝胶的 质量。 增加 
过硫 酸铵或 TEMED 的用量 ,将使 丙條酰 胺聚合 链长度 缩短, 凝胶会 变得脆 弱而失 去应有 
的 柔性。 二者多 至一定 程度时 ,聚合 链长度 过短, 将不会 形成肉 眼可见 的凝胶 ,这 些短链 
多聚 物呈溶 液状, 只 是其點 度较聚 合前高 一些。 过量 的过硫 酸铵或 核黄素 还将氧 化蛋白 
质尤其 是含有 巯基的 蛋白质 ,使它 们的泳 动力发 生改变 ;而 过量的 TEMED 不但可 以与蛋 
白质反 应使其 电泳条 带位置 偏移, 还将 升高缓 冲液的 pHc 

激 活剂过 少则聚 胶速度 过慢, 氧气越 来越多 地进入 单体溶 液中抑 制聚合 过程, 最终凝 
胶孔径 扩大, 支 撑力弱 而易于 变形。 另外, 未聚合 的丙條 酰胺和 bis 单体还 可以和 蛋白质 
中的 a- 氨基、 巯基、 酚经基 等反应 ,造成 蛋白质 泳动力 改变, 条带拖 尾或停 滞在加 样孔。 

由此 可见, 可以 通过激 活剂的 用量控 制聚胶 速度, 保证聚 胶完全 并提供 理想的 凝胶质 

地。 

对于 非连续 系统中 的下层 分离胶 最佳聚 合速度 是从加 人过硫 酸铵和 TEMED 起至开 
始出现 凝胶的 时间为 15〜20min (并 不是此 时已凝 聚完全 )。 对于浓 縮胶及 不含浓 缩胶的 
连续 系统, 最 佳聚合 速度为 8〜10min 开 始可见 聚合。 这种情 况凝胶 与大气 接触, 需要增 
加激活 剂的浓 度并加 快聚合 速度。 总之, 要掌 握一个 原则, 即 用尽量 少的催 化剂并 在最佳 
时间 聚合。 

使用核 黄素的 优点是 只需要 很少量 (5〜l(Vg/L) 就有催 化活性 ,尤其 适合于 缓冲能 
力较弱 的凝胶 系统, 如只 含有两 性电解 质的等 电聚焦 凝胶。 另外, 核黄素 具有抗 氧化能 
力, 通常 用它作 为激活 剂时, 聚 合物在 30〜60min 后 开始呈 凝胶。 



. 89 



三、 温度 的影响 



聚胶 的最佳 温度为 23〜25t: ,需要 注意灌 胶前单 体溶液 (通 常置于 4t: 冰箱) 及玻璃 
板或管 (有时 从烘箱 取出) 也要平 衡至此 温度。 由于 溶液在 抽真空 时仍维 持较低 温度, 需 
待其 升至室 温后再 脱气。 另外, 升 温后脱 去氧气 的速度 较低温 时快。 

四、 氧气 的影响 

氧气会 与被激 活的单 体自由 基作用 抑制聚 合过程 ,因此 需在加 激活剂 前对单 体溶液 
脱气。 如果省 去这一 步骤, 凝胶仍 能聚合 但需更 多的激 活剂, 并且 不能保 证很好 的重复 
性, 充 分去除 氧气可 以用尽 量少的 激活剂 得到最 佳聚合 效果。 通常在 较好的 真空度 
«125torr, ltorr= lmmHg= 1 .33322 x 102pa) 脱 气至少 15min。 

使用 核黄素 作为激 活剂时 (核 黄素/ TEMED 系统或 核黄素 /TEMED/ 过硫酸 铵), 由 
于核 黄素由 无催化 活性状 态转化 成具有 催化作 用的形 式时需 要少量 氧气, 脱气不 能太完 
全, 一般不 得超过 5min。 

五、 凝胶 添加剂 

凝 胶中常 常加人 SDS 、尿 素、 Triton X-100 等添 加剂。 SDS 加入 后不会 对凝胶 的聚合 
产生 影响, 但尿素 会使凝 胶孔径 变小, 这 一特性 可用来 分离小 分子蛋 白质或 多肽。 

穴、 聚 胶时间 

虽然应 用过硫 酸铵/ TEMED 催化 后灌胶 15〜20min 即可 观察到 凝胶的 形成, 但至少 
需 90min 才 能保证 95% 以 上的单 链聚合 成长链 以及具 有合适 的孔径 大小。 采用 核黄素 
时聚 胶时间 更长, 但它 一般用 于等电 聚焦即 根据蛋 白质的 电荷性 质进行 分离, 对孔 径大小 
要求 不高, 因此不 必等很 长时间 (完全 聚合需 8h)。 

七、 单体 的浓度 %T,%C 

所谓单 体浓度 %丁是 指单体 总质量 (丙' 烯酰胺 + 双丙' 烯 酰胺) 在溶 液中的 百分比 

,可 选择的 范围为 3%〜30%。 单体浓 度增加 后聚合 速度将 加快, 因此可 适当减 
少催 化剂的 用量。 

%C 是指双 丙烯酰 胺与单 体总质 量的比 值( m/m)o 

八、 操 作注意 点 

①未聚 合的丙 條酰胺 具神经 毒性, 操 作时应 戴手套 防护。 
• 90 • 



② 梳子 插入浓 縮胶时 ,应确 保没有 气泡, 可 将梳子 稍微倾 斜插入 以减少 气泡的 产生, 
梳子拔 出时亦 应小心 , 不要 破坏加 样孔。 

③ 电 泳槽内 加人电 泳缓冲 液后, 清除黏 附在凝 胶底部 的气泡 ,以 保证电 泳过程 中电流 
的 畅通。 

④ 加样 前可先 用电泳 缓冲液 冲洗加 样孔, 这样 可去除 未聚合 的丙' 烯酰 胺。 

⑤ 加 样前样 品应先 离心, 尤其是 长时间 放置的 样品, 以减 小蛋白 质条带 的拖尾 现象。 

⑥ 为避 免边缘 效应, 可 在未加 样的孔 中加入 等量的 样品缓 冲液。 

⑦ 样品 缓冲液 中煮沸 的样品 可在- 201: 保存 几周, 但 反复冻 融会使 蛋白质 降解。 

⑧ 上 样时, 小 心不要 使样品 溢出而 污染相 邻的加 样孔。 

⑨ 电 泳时, 应采用 恒压的 模式, 这样蛋 白质才 可以保 持恒定 的电泳 迁移率 [9] 。 低电 
压可使 电泳过 程中产 热减小 ,迁移 减慢, 同时 分辨率 会稍有 下降。 

⑩ 为减 小蛋白 质条带 的扩散 ,上样 后应尽 快进行 电泳, 电 泳结束 后也应 直接进 行固定 
或 染色。 

⑪考马 斯亮蓝 染色液 应过滤 后使用 , 以免 未溶解 的染料 沉积于 胶上。 

©干 胶前可 将凝胶 浸泡于 5% 的甘油 中过夜 ,这样 可减小 干胶过 程中出 现胶破 

裂 [10]。 

(宋 金芳 屠 红旻) 

参 考文献 

1 Smith I.Cromie R, Stainsby K. Seeing Gel Wells Well. Anal Biochem, 1988 , 169 : 370 - 371 

2 Morrissey, JH. Silver stain for protein in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivity. 
Anal Biochem, 1981, 117: 307 -310 

3 Giulian GG,Moss RL, Greaser M. Improved methodolc^ for analysis and quantition of proteins on one- dimensional sil- 
ver-stained slab gels. Anal Biochem , 1983 , 129: 277 ― 287 

4 Dzaudu JF, Johnson JF, Wise GE. Sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis : staining of polypeptides using heavy metal 
salts. Anal Biochem, 1988, 174: 157 -167 

5 Lee C. Copper staining: a five- minute protein stain for sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Anal Biochem , 1987, 
166:308-312 

6 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970,227: 
680-683 

7 Doucet JP, Trifaro JM. A discontinuous and highly porous sodium dodecyl sulfate polyacrylamide slab gel system of high 
resolution. Anal Biochem , 1988 , 168 : 265 - 271 

8 Schagger H, Van Jagoe G. Tricine- sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for separation of proteins in 
the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 1987, 166: 368 〜 373 

9 Hames HD, Rickwood D. Gel electrophoresis of proteins. In: A practical approach. Oxford and Washington D. C: IRL 
Press. 1981 

10 Walker JM. Methods in molecular biology. Volume : Proteins. New Jersey: Humana Press, 1984 



91 



第 1: 章 液 相电泳 

电 泳被定 义为荷 电物质 (离子 ) 在电 场中因 受吸引 或排斥 而引起 的差速 运动。 1925 
年瑞典 Tiselius 继承前 人在电 泳方面 的工作 ,在 30 年代 成功地 将一个 无色、 移动 的蛋白 

质界 面的折 光率变 化定量 地记录 下来, 从而把 液相界 面移动 电泳建 立成一 个分析 方法, 并 
于 1948 年获 得了诺 贝尔化 学奖。 随后, 许多科 学家在 此基础 上发展 了有支 撑介质 的区带 
电泳, 例如纸 电泳、 琼脂 电泳、 淀粉 凝胶电 泳等, 直 到现在 应用最 广泛的 SDS-PAGE。 区带 
电泳 的优点 是设备 简单、 价廉, 分 析量在 微克水 平上, 但也牺 牲了液 相界面 电泳的 一些优 
点。 80 年代后 科学家 们又考 虑到液 相电泳 的若干 特点, 相继发 展了超 微量、 高分 辨率的 
毛细 管电泳 和制备 级的连 续自由 流电泳 以及液 相等电 聚焦。 我们实 验室近 年来相 继建立 
和发展 了这几 种电泳 技术, 并统称 之为" 第二 代液相 电泳" [1 ] ,下 面分 节逐一 介绍。 

第一节 毛细 管电泳 

1. 发展史 

在像 Tiselius 所用的 自由溶 液中的 电泳方 式下, 分离效 率受热 扩散和 对流的 限制。 
因此, 随 后发展 的各种 电泳都 在抗对 流介质 (如纸 电泳、 凝胶 电泳) 中 进行。 尽管凝 胶电泳 
是应 用最广 泛的分 离技术 之一, 但分析 时间长 、效 率低及 检测和 自 动化 困难等 依然是 自 身 
的缺陷 。 由 于细径 毛细管 自 身具 有抗对 流作用 , 可 以替代 原来起 此作用 的凝 胶介质 , 因此 
近 年来细 孔管或 毛细管 被用于 电泳。 20 世纪 80 年代初 , 很多 科学家 致力于 发展微 量的、 
没有 支撑介 质的液 相毛细 管电泳 [ 2 〜 5 ], 并揭示 了毛细 管电泳 作为一 种分析 技术所 具有的 
潜力。 中 国科学 院化学 所竺安 教授也 很早从 事此项 研究。 自 1989 年有商 品化仪 器供应 
后, 毛细管 电泳的 应用研 究更是 日 新月 异 f 6 , 7] ,开始 主 要用于 蛋白质 和多肽 方面, 以后应 
用 在核酸 [«' 9 ]、 糖 、维 生素、 药品 检验、 无机 离子、 环保 等各种 领域, 和 HPLC —起成 
为分析 方法中 互补的 技术。 

我们从 1990 年开始 引用这 项技术 [1 2 ~1 4] ,继后 发展用 在酶活 性测定 [IS] 、 磷 酸化分 
析 [ 1 6] 、糖 研究 [1 7 ~ 2 1 ] 中 ,并成 功地将 毛细管 电泳与 质谱技 术联用 [22 ~^ 5 ]。 本 章仅就 毛细管 
电 泳概念 和我们 在应用 中的体 会作一 介绍。 

2. 基 本原理 

(1) 毛细 管电泳 

所谓毛 细管电 泳是在 内径为 25〜10(Vm 的弹 性石英 毛细管 中进行 电泳, 毛细 管中填 
充了缓 冲液或 凝胶。 与平板 凝胶电 泳相比 ,毛 细管电 泳可以 减少焦 耳热的 产生, 这 主要是 
• 92 • 



由于毛 细管内 径细, 因此 表面积 与体积 比大, 易 于扩散 热量。 另外, 电泳时 毛细管 的高电 

阻限制 了电流 的产生 和管内 发热, 选用 高电压 (10~30kV) 产 生高电 场强度 (100〜500V/ 
cm) ,但仍 可维持 较小的 电流。 毛细管 电泳通 常在高 电场下 进行, 可 以缩短 分析时 间并且 
提高分 辨率, 其 理论塔 板系数 可高达 10 6 。 电 泳所需 样品体 积很小 (l〜50nl 的 进样体 
积) ,且 多种分 离模式 能改变 选择性 , 扩 大应用 范围。 
(2) 毛细管 电泳仪 

目前生 产毛细 管电泳 仪的厂 商不下 数十家 ,其基 本结构 都是由 毛细管 、高压 电源、 电 
极及电 极液、 在线检 测器、 恒温 装置、 样品盘 、数 据收集 和处理 系统等 组成, 如图 7.1 所示。 



电源 




缓冲液 自动 进样器 



图 7.1 毛细管 电泳仪 结构图 

毛细管 是由溶 融石英 (fused silica) 制成的 ,内径 通常为 25〜75/xm ,外 径为 350 〜 
40(Vm ,在其 外壁涂 有一层 聚亚胺 (polyimide) 保 护层, 使得毛 细管有 一定柔 性不易 折断。 
在检测 窗口需 将这层 保护材 料去除 (可 用小火 灼烧几 毫米, 再用乙 醇将黑 灰抹去 )。 去除 
了保护 层的毛 细管非 常脆弱 ,容易 折断, 操作时 要格外 小心。 

毛细 管电泳 仪的高 压装置 一般可 允许电 压高至 30kV ,最大 电流为 200〜300mA ,并 
且可改 变其正 、负极 方向。 - 

在电泳 过程中 ,毛细 管两端 及电极 插至电 极液中 ,此电 极液通 常与管 中的缓 冲液一 
致。 正、 负 两电极 连接至 高电压 装置。 进样时 样品盘 移动, 使 毛细管 的进样 端及此 端的电 
极 (通 常是 正极) 准确插 入样品 管中, 给予 一定电 场或压 力后, 样品被 吸入毛 细管内 ,然后 
再 将毛细 管移至 电极液 中开始 电泳。 

常用 的检测 方式是 紫外- 可见光 吸收。 检 测器位 于距样 品盘约 毛细管 总长的 2/3 至 
4/5 处 , 对毛 细管壁 内部分 进行光 聚焦。 此外 , 荧光 、激 光诱导 荧光、 质谱等 检测方 法也被 
应用于 毛细管 电泳。 

虽然 毛细管 的内径 很细, 有助于 散热, 但 是由于 It: 的 温度变 化会引 起缓冲 液點度 
2% 〜3% 的差异 ,因此 仍需借 助有效 的散热 装置, 如简 单的风 扇以及 含有致 冷液体 的冷却 
系统。 理论上 ,液 体冷却 的效果 更好, 但如 果空气 流动速 度达到 lOm/s 时, 也足以 能够将 
电 泳产生 的热量 散去, 使毛细 管周围 的温度 调节至 ±0. It: 的范 围内。 
(3) 电渗流 

毛细管 电泳操 作中一 个必需 考虑的 因素是 电渗流 (EOF)。 电渗 流是毛 细管内 壁表面 

• 93 • 



-Si + o 



—Si— OH + H 



-Si — Oe+2H《 



电荷所 引起的 管内液 体的整 体流动 ,来 源于外 
加电场 对管壁 溶液双 电层的 作用, 它通 过对溶 
质 淌度叠 加一个 体相流 速来控 制溶质 在毛细 
管内 停留的 时间。 

在水 溶液中 大多数 固体表 面都带 有多余 
(额外 ) 的负 电荷, 这是由 于酸- 碱平衡 造成的 
离 子化和 (或) 固体表 面吸附 了离子 基团。 构 
SiOH) 组成, 它在 水溶液 中以一 SiO— —形 式存在 (一 SiOH 



高 pH 



Veo- 



■Vep 



Veo- 



低 pH 



+Vep 

图 7.2 电渗流 示意图 
其中 Veo 为 电渗流 方向, Vep 为样品 
分子泳 动方向 



成毛细 管的熔 融石英 由硅醇 ( 

的 解离常 数约为 pH 1.5)0 

为了维 持电荷 平衡, 溶液 中的正 离子吸 附至石 
英 表面形 成双电 子层, 当在毛 细管两 端施加 了电压 
后, 这一层 正离子 趋向负 极移动 ,并 带动毛 细管中 
的溶液 以液流 (bulk solution) 的 形式移 向负极 (图 
7.2), 这一 现象称 为电渗 ( electroosmosis ) 或电渗 流 
(electroendosmotic flow, EOF) 。 由于 毛细管 的表面 
积与 体积之 比大, 且电 泳时使 用了高 电压, 电渗流 
在 毛细管 电泳中 常常起 着不可 忽视的 作用。 

电 渗流的 大小可 以下面 两个公 式表示 : 
Veof = (《/7)E 
FEOF = 7 

式中 VEOF为电渗流速率;^tEOF为电渗流泳动力;f 为电势能;£ 为 双电子 常数; 7 为 溶液的 
點度。 , ' 

S 势能 是由毛 细管壁 的表面 电荷决 定的, 而表 面电荷 依赖于 溶液的 pH ,因此 电渗流 

和 电泳缓 冲液的 pH 密切 相关。 在高 pH 环境 中硅醇 基团易 于去质 子化, 电渗流 大于低 
pH 溶液。 

C 势能和 缓冲液 的离子 强度也 有关, 增大溶 液的离 子强度 即减少 C 势能, 也就 降低了 
电渗 作用。 

电渗作 用特点 之一是 液体沿 着毛细 管壁均 勾流动 ,因 而其前 沿是平 头的, 不同 于高效 
液相色 谱中泵 推动的 液体流 动呈圆 弧状。 

另一 特点是 电渗使 得携带 不同电 荷的分 子朝一 个方向 移动, 不 带电荷 的中性 分子也 
能随 着电渗 流一起 移动。 一般情 况下, 电渗 流的方 向是由 正极到 负极。 

电渗 的上述 两个优 点在毛 细管电 泳分离 中起着 有益的 作用, 但 是在实 验中有 时能够 

发现选 择过高 pH 缓冲液 进行电 泳时电 渗流太 快以至 不能将 被分析 物分开 ;而选 择过低 
pH 缓冲 液时, 毛细 管内壁 的负电 荷也能 吸附被 分析物 中带正 电荷的 分子。 

测定电 渗流的 大小可 采用中 性标准 物质, 如二甲 基亚砜 (DMSO) 、氧化 甲基硅 
(mesityloxide) 以及 丙酮。 

3. 影 响因素 

在毛 细管电 泳中, 分离效 率的好 坏取决 于区带 的分散 情况, 而引 起区带 分散的 因素很 
• 94 • 



多, 最重要 的有焦 耳热引 起的温 度梯度 、进样 长度、 溶质与 毛细管 壁的相 互作用 、样 品和缓 
冲液电 导不匹 配等。 

(1) 焦耳热 

在毛 细管内 进行电 泳的一 个主要 的好处 是减小 了曾限 制传统 电泳技 术的热 效应。 热 
效 应可导 致不均 勾的温 度梯度 和局部 的點度 变化, 从而引 起区带 变宽。 尽 管在毛 细管电 
泳中高 电场强 度提供 高分离 效率, 但它 所带来 的收获 最终将 受到焦 耳热的 限制。 

电流作 用下, 温度 的上升 与产生 的功率 有关, 并由 毛细管 尺寸、 溶液的 电导和 外加电 
压所 决定。 因此, 降低电 场强度 ,减小 毛细管 内径, 降低缓 冲液浓 度和离 子强度 ,主 动控温 
等方法 都可有 效地减 小温度 梯度, 但同时 可能损 失一定 的分离 效率。 

(2) 进 样长度 

在 进样过 程中, 减小样 品长度 (进 样量) 非常 重要, 如其长 度超过 因扩散 造成的 区带分 
散, 分离效 率将受 影响。 在 实际操 作中, 对进样 长度的 限制是 低于毛 细管总 长度的 1%~ 
2%。 对于 70cm 长的毛 细管, 1% 的长度 相当于 7mm (或 14nl,5(Vm 内径 )。 

(3) 溶质与 毛细管 壁的相 互作用 

溶质 与毛细 管壁之 间的相 互作用 可能会 出现拖 尾峰甚 至发生 对溶质 的完全 吸附, 引 
起吸附 的主要 原因是 阳离子 溶质与 负电表 面之间 的离子 相互作 用和疏 水相互 作用, 对多 
肽和蛋 白质来 说这种 吸附作 用特别 严重。 

可 以采取 多种方 法来减 小溶质 与管壁 的相互 作用。 如增 加缓冲 液浓度 可以降 低有效 
表面电 荷来减 小溶质 与管壁 的相互 作用; 选择高 离子强 度溶液 ,尤 其是两 性离子 缓冲体 
系。 限 制吸附 的另一 尝试是 在极端 pH 下进行 分离。 在低 pH 下 (pH2〜3), 电渗 流接近 
于零, 但因蛋 白质可 以质子 化而带 正电荷 ,它 们仍可 向负极 迁移; 正高 pH 下 (pH 为 9〜 
10), 毛细管 壁和溶 质都将 解离而 带负电 ,溶质 与管壁 的相互 作用则 因电荷 之间的 排斥受 
到 限制 。 对 毛细管 进行涂 层处理 , 通过 降低相 互作用 的自由 能 来抑制 吸附 , 也是一 种有效 
的 方法。 

(4) 电分 散作用 

样品和 缓冲液 电导不 匹配时 会引起 各区带 中电场 强度的 变化, 从 而导致 了峰形 畸变, 
这种 现象为 电分散 作用。 当样 品电导 高于缓 冲液电 导时, 样 品的前 沿将会 扩散而 后沿尖 
锐; 相反, 当样 品电导 高于缓 冲液电 导时, 前 沿尖锐 而后沿 扩散; 当两者 电导相 同时, 峰形 
对称。 峰形畸 变这种 现象只 能通过 缓冲液 和样品 电导之 间的匹 配才能 消除, 但在 分离度 
不受 影响情 况下是 可以忽 略的。 

二、 材 料 

(1) 设备 和材料 

①毛 细管电 泳仪; ②毛 细管; ③脱 气装置 (水泵 );® 移 液器; ©Eppendorf 管, Tip;© 离 
心机 ; ⑦ pH 计 ; ⑧ 过滤器 ; ⑨ 微孔膜 ( . 22/mn) ; ⑩针筒 ( 10ml) 。 

(2) 试剂 

①氣 氧化钠 ; ②盐酸 ; ③憐酸 氢二钠 ; ④磯酸 二氢钠 ; © 氯化钠 ; ©乙 酸钠。 

• 95 • 



(3) 蛋白质 和多肽 

①多肽 Kemptide; ②蛋 白激酶 A; ③巨 噬细胞 集落刺 激因子 (GM-CSF); ④核 糖核酸 
酶 T1 ; ⑤ a -乳 清蛋白 ; ⑥胰 凝乳蛋 白 酶原 A; ⑦ 溶菌酶 ;⑧ a - 乳白 蛋白; ⑨碳 酸酐酶 ; ® 卵 
白蛋白 ;©牛 血清白 蛋白; ©碳 酸酐酶 b '鄭 - 半乳糖 苷酶; ⑭肌球 蛋白; © 肠促胰 酶肽片 
段。 t 

三、 基本操 作歩骤 

毛细管 电泳的 基本步 骤包括 清洗毛 细管、 更换 电泳缓 冲液、 进样、 电泳 并同时 在线检 

(1) 清洗 毛细管 

对于一 根新的 或久未 使用的 毛细管 ,需用 Imol/L 的 NaOH 溶液、 O.lmol/L NaOH 溶 
液、 超纯 水依次 清洗。 在某些 情况下 还需用 O.lmol/L HCl 、甲醇 或去: ^剂 清洗。 强碱溶 
液可 以清除 吸附在 毛细管 内壁的 油脂、 蛋白 质等, 强 酸溶液 可以清 除一些 金属或 金属离 
子, 甲醇、 去塘 剂可去 除疏水 性强的 杂质。 

每 次在进 行分析 前可用 相当于 毛细管 总体积 2 ~3 倍的 O.lmol/L 的 NaOH 溶液清 
洗 一遍, 一般为 2〜3min ,而 后注入 电泳缓 冲液, 以保证 分析结 果的重 复性。 

(2) 更 换电泳 緩冲液 

清 洗液、 电极液 (电泳 缓冲液 )、 样品 均置于 可旋转 的进样 盘中。 按照 设定的 指令, 毛 
细管 电泳仪 可自动 转动进 样盘, 将一端 (通 常是正 极端) 的毛 细管和 电极插 入电泳 缓冲液 
中, 并 将缓冲 液吸人 或推进 至毛细 管中。 上一 步清洗 过程结 束后, 毛 细管和 电极从 清洗液 
中移 至电泳 缓冲液 , 不可避 免地将 强碱或 强酸等 溶液带 至其中 。 吸取 # 品后 , 毛细 管外壁 
點 附的样 品液也 会污染 电泳缓 冲液。 缓 冲液本 身置于 样品盘 中也会 因挥发 而改变 其离子 
强度。 因此, 对 于精确 分析, 每分析 5 次 后需更 换一次 样品盘 中的缓 冲液。 一般分 析时, 
半天更 换一次 即可。 

有些 品牌的 毛细管 电泳仪 具有自 动更换 电泳缓 冲液的 功能, 即 将进样 盘中已 用过的 

缓冲液 排人废 液瓶中 ,并从 r: 存瓶 中引人 新鲜的 溶液。 

(3) 进样 

有 4 种进样 方式。 

第 1 种 在毛细 管进样 端施加 一定压 力推人 样品。 

第 2 种 将出口 端连接 真空装 置吸取 样品。 这 两种进 样方式 称为流 体静力 (hydrody- 
namic) 方式, 其优 点是进 样体积 和样品 浓度、 样品溶 液离子 强度等 基本无 影响。 

第 3 种方式 为电动 (electrokinetic) 进样, 即在一 定的电 场下, 样 品通过 电渗流 及自身 
的泳 动力进 入毛细 管中。 这种 方式的 上样量 受电渗 、样 品浓度 、样品 分子的 泳动力 以及样 
品溶液 中无机 离子的 多少及 种类等 多种因 素影响 ,因此 其进样 的重复 性不如 前者。 但是, 
当毛 细管中 填充了 點性较 大的介 质或凝 胶时, 只能 选择电 动进样 方式。 

第 4 种为 虹吸, 即依靠 毛细管 进样口 端与出 口端位 置的高 低吸入 样品。 

无论 采用何 种进样 方式, 毛细管 插入样 品溶液 的深度 一般要 低于毛 细管总 长度的 
196 或 2%。 以尽 量减少 样品溶 液经毛 细吸附 进入毛 细管, 从而影 响进样 量的精 确性; 样 
• 96 • 



品管 中溶液 最少需 5^11,进样体积为 l~50nl。 因此, 每 次分析 所耗的 样品量 只及其 
1/1000。 样品 可多次 分析, 或经 毛细管 电泳后 再进行 HPLC 分离、 序列 测定等 工作。 

为防 止样品 挥发造 成浓度 改变, 可对样 品管加 橡皮盖 ,盖 子中间 留有一 缝隙, 毛细管 
和 电极可 以自由 出入。 将样品 盘连接 至外围 的冷却 装置也 可减少 样品的 挥发, 并 且还可 
保持蛋 白质的 活性。 

虽 然绝大 多数仪 器进样 时间可 精确至 0.1s ,但是 由于毛 细管在 插人样 品管时 不可避 
免 地会黏 附一些 溶液, 进样时 间过短 会影响 分析结 果的重 复性。 通常进 样时间 可选择 
0.5~ls, 此时點 附的样 品量相 对于应 吸人的 体积可 以忽略 不计。 

受毛细 管内总 体积的 制约, 对于浓 度很稀 的样品 ,毛细 管电泳 不能像 HPLC 那样可 
以加大 进样量 来提高 检测灵 敏度, 但是可 以采取 一些措 施得以 改善。 

首 先可以 通过样 品缓冲 液和电 泳缓冲 液离子 强度的 不同来 实现。 当样 品缓冲 液的电 
导明 显低于 (100 倍 以上) 电泳缓 冲液的 电导时 ,一 旦在毛 细管两 端通上 电压, 可在 样品区 
带前形 成一个 更大的 电场, 使得样 品溶液 中的分 子迁移 更快。 当这 些分子 趋向于 到达电 
泳缓 冲液边 界时, 这个附 加产生 的电场 减弱, 这些分 子迁移 减慢, 直 至样品 移至电 泳缓冲 
液边界 ,样 品区带 内电场 均一。 样品区 带由宽 变窄, 样品 中各成 分得以 浓缩。 

假如样 品缓冲 液和电 极缓冲 液的电 导相同 ,而样 品浓度 较稀, 不适 合再作 稀释, 可以 
在 进样前 先吸入 一些水 , 也 能达到 浓缩的 目 的 。 无 论采取 何种进 样方式 , 上述方 法都可 以 
使 样品自 动堆积 浓缩。 

必 须注意 的是, 采取这 种浓缩 堆积方 法时, 由于在 堆积区 带电势 陡降, 会导致 此区带 
温度 升高。 

另外, 有报道 将若干 根毛细 管平行 排列成 毛细管 束进行 电泳以 提高分 析灵敏 度 [26] , 
不过此 法需在 改进的 仪器上 进行。 

(4) 电泳 和检测 - 

石英毛 细管可 以透过 190〜700nm 范围内 的光, 在实验 时应尽 量选用 低波长 检测以 
提高灵 敏度。 与此 相应, 电泳 缓冲液 必需在 低紫外 波长下 的吸收 值低, 否则 会增加 基线噪 
声并降 低检测 信号。 憐酸盐 、硼酸 盐等无 机盐缓 冲液符 合上述 条件, 因而 被广泛 使用。 选 
用生物 实验中 常见的 HEPES、CAPS、Tris 等 缓冲液 时检测 波长不 得低于 215nm。 

采用 荧光或 激光诱 导荧光 检测, 非常 灵敏, 质量检 测限最 高可达 l(r 2 Gmd ,但 常常需 
要 样品衍 生化。 

在 分析稀 浓度样 品时, 也可以 通过扩 展检测 光程来 提高灵 敏度。 具体 方法是 安装在 
检测 窗口处 呈球泡 状的毛 细管, 或在 此处加 工成" Z" 字形 结构。 

与检 测器相 连的记 录系统 (记 录仪、 积分仪 、电脑 等), 除可显 示分离 图谱外 ,还 可以根 
据 峰面积 积分进 行定量 分析。 但是, 和 HPLC 不同, 不同的 分子在 毛细管 电泳中 的泳动 
速率不 一致导 致泳动 慢的分 子积分 面积大 ,这 时可以 将峰面 积除以 迁移时 间进行 校正。 

四、 毛细管 电泳分 离模式 S 应用 

与 HPLC 相似, 毛细管 电泳根 据不同 的分离 机制, 有多 种分离 模式, 其 中在蛋 白质化 
学 研究中 经常应 用的模 式见表 7.1。 

• 97 • 



表 7.1 毛细管 电泳分 离模式 



模式 



分 离机制 



毛 细管区 带电泳 (CZE) 
微团电 动毛细 管色谱 (MECC) 
毛 细管蹄 分电泳 (CSE) 
毛 细管等 电聚焦 (CIEF) 



荷质 比差异 

与微团 的疏水 子交联 

大小 与电荷 

等电点 



下面分 别就上 述模式 的特点 及其应 用进行 介绍。 

1. 毛细管 区带电 泳( capillary zone electrophoresis , CZE ) 或称 自由溶 液毛细 管电泳 
(free solution capillary electrophoresis , FSCE) 

毛细 管中充 满了电 泳缓冲 液后, 由于 电渗的 作用, 分析物 中带正 、负电 荷及中 性的分 
子均 能向一 个方向 移动, 但是不 同的中 性分子 没有自 身的泳 动力, 都和电 渗流共 迁移, 它 
们之 间不能 分开。 

由于 CZE 具有 与反相 HPLC 不同 的分离 机理, 且其 理论塔 板系数 不亚于 后者, 可成 
为后 者的一 项互补 技术, 尤 其对于 亲水多 肽的分 离分析 具有一 定的优 越性。 在某 种程度 
CZE 较 HPLC 更方便 ,有更 多的选 择性, 只需改 变电泳 缓冲液 的条件 ,(如 pH 、离 子强度 
等), 不必 更换毛 细管。 在合适 的电泳 条件下 ,毛 细管电 泳可以 分辨多 肽的细 微结构 差异, 
如 C 端的 酰胺化 与去酰 胺化, 单个 氨基酸 残基的 替换, 氨基 酸组成 相同而 序列不 同的多 
肽也能 区别开 ,甚至 表面电 荷不同 而一级 结构相 同的多 肽也有 可能分 离开。 还有 报道用 
FSCE 帮助 确定多 肽内是 否存在 二硫键 [3] 。 

图 7.3 为多肽 kemptide 经蛋 白激酶 A 作用后 的磯酸 化产物 与底物 的分离 图谱。 由 
于毛 细管电 泳分析 快速, 我 们以此 建立了 测定蛋 白激酶 A 活性的 '方法 ,其灵 敏度、 精确性 
和线性 范围均 不亚于 经典的 同位素 法 [ 1 5] 。 




I 10 15 20 25 30 
L- ^~ " ,/min 

图 7.3 多肽 kemptide 与其憐 酸化产 物的分 离图谱 
S 为底物 kemptide, P 为磔酸 化产物 

在运用 CZE 这一模 式进行 分析时 首先要 考虑的 是如何 选择缓 冲液, 一 般掌握 的原则 
是: ①在所 选择的 pH 范围内 有很强 的缓冲 能力; ②在 所选择 的检测 波长缓 冲液本 底吸收 
低; ③溶 液中的 离子泳 动力低 (即结 构大、 带电荷 少), 从而可 以减少 电流。 

表 7.2 为在 CZE 中常用 的缓冲 液及其 pKa 值, 可供 参考。 



98 



表 7.2 常 用缓冲 液及其 pK, 值 





2.12(pK.i) 


MOPS 


7.20 


佇 槺酸盐 

1 J ^B^. wx. jm. 


3.06(pKai) 


磯酸盐 


7.21(pKa2) 




3.75 


TES 


7.50 


號 flS 酸盐 ( succinate ) 


4.19(pK„,) 


HEPES 


7.55 


泞 樣酸盐 


4.74(pKa2) 


HEPPS 


8.00 


乙酸盐 


4.75 


Tricine 


8.15 




5.40(pKa3) 


甘氨 St 甘氨酸 


8.25 


琥 拍酸盐 


5.57(pK»2) 


Tiis 


8.30 


MES 


6. 15 


Bicinc 


8.35 


ADA 


6.60 


Morpholine 


8.49 


BIS-TRIS 丙院 


6.80 


硼酸盐 


9.24 


PIPES 


6.80 


CHES 


9.50 


ACES 


6.90 


CHAPSO 


9.60 


MOPSO 


6.90 


CAPS 


10.40 


Imidazole 


7.00 


碟酸盐 


12.32(pK,3) 



图 7.4 为 用不同 pH 的缓 冲液鉴 定遗传 工程重 组蛋白 GM-CSF 的 纯度。 可以 发现在 
PH7.0 的 磯酸缓 冲液中 样品的 不均一 性更加 明显。 由此 建议, 用毛 细管电 泳鉴定 遗传工 
程产 品时, 宜 选择多 种缓冲 液进行 分析。 一 般选在 蛋白质 pJ 的 两侧。 

选择 合适的 温度也 是应用 CZE 时应该 注意的 ,这 不仅是 因为温 度的高 低可以 改变缓 
冲液的 點度、 电渗以 及分析 时间, 而且 温度将 影响蛋 白质的 构象、 蛋白 质与辅 基的交 联等。 

30°C 



图 7.4 用 CE 鉴定 GM-CSF 的纯度 
a 为 20mmol/L 碟酸缓 冲液, pH7 . ; 
b 为 50mnral/L 磷酸缓 冲液 + 5mmol/L NaCl , pH2 . 5。 
电 压均为 30kV ,进样 0.5s ,检 测波长 214nm ,毛 细管 
长度 72cm (至检 测处有 效长度 50cm) , 内径 50fmi 



35t 



40X: 



sot 



60*0 



//min 

图 7.5 核糖 核酸酶 Ti 在不同 

温度 下的毛 细管电 泳结果 
电泳 条件: 25mmol/L 磷 酸钠缓 冲液, pH7 . ; 
电压 15kV ,毛 细管长 72cm, 有 效长度 
50cm, 内径 50/im, 检 测波长 200nm 



图 7.5 显示不 同温度 对核糖 核酸酶 Ti 在 毛细管 中电泳 行为的 影响。 随着 温度的 升高, 

核糖 核酸酶 n 在毛细 管中泳 动速度 加大, 但在 40t: 此 蛋白发 生了构 象变化 (或称 热变性 )。 
对于等 电点偏 碱性的 蛋白质 (例 如细 胞色素 c), 在一般 的电泳 缓冲液 中带有 较多的 

正电荷 ,容易 被毛细 管内壁 吸附。 解决 这一问 题的方 法之一 是对毛 细管内 壁进行 涂层以 

• 99 • 



改 变电荷 极性或 使毛细 管内壁 电荷趋 于零。 目 前有商 品化的 内壁经 过共价 水久修 饰的毛 

细管, 这类毛 细管的 内壁几 乎不带 电荷, 如 J&W 公司 提供的 DB-1 毛 细管。 此外, Supelco 
公司 有不同 程度亲 水性质 (PI 系列) 和疏水 性质的 (H、H1、H2 系列, 分别为 C1、C8、C18) 
的 毛细管 供应。 它们的 优点是 :可以 减少样 品与毛 细管壁 的相互 作用; 减小电 渗流; 增加 
重复 性和选 择性。 另外也 可在实 验室对 毛细管 进行动 态可逆 修饰, 比如 Perkin-Elmer 公 
司 的产品 MicroCoat 试剂 盒即可 对普通 的石英 毛细管 进行涂 层使内 壁带正 电荷, 如不需 
要涂层 ,用 Imol/L 的 NaOH 溶液 即可将 此涂层 除去。 

图 7.6 为 我实验 室进行 的三种 蛋白质 涂层前 后毛细 管电泳 图谱的 比较。 



乳 清蛋白 



胰 凝乳蛋 白海原 A 



溶菌雜 



涂层前 



涂层后 



图 7.6 毛细管 涂层前 后分离 蛋白质 的比较 . 
电 泳条件 :40mmol/L 乙 酸钠, pH4.0, 真 空进样 2s, ' 
200nm 检测 涂层前 25kV, 涂层后 - 25kV 

2. 微团电 动毛细 管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography , MECC) 

MECC 在某种 程度很 像反相 HPLC ,通常 在电泳 缓冲液 中添加 一定浓 度的表 面活性 
剂, 这类分 子一端 为亲水 基团, 其 余部分 为疏水 结构。 当表面 活性剂 的浓度 高于其 临界微 
团浓度 (critical micelle concentration, CMC) 时, 表面 活性剂 分子就 会发生 聚集, 形 成微团 

或胶束 (miceUe)。 其中 疏水部 分在内 
部, 亲水 基团在 表面, 被 称为假 固相。 
在毛细 管内, 样品 中的各 种分子 除了电 
泳外, 还与 这些微 团存在 程度不 同的吸 
附。 根据 在假固 相和溶 液相中 的分配 
不同 各种分 子得到 分离。 前面 提及的 
在 FSCE 中不能 分开的 中性分 子可以 
经 MECC 分析。 

表 7.3 列出了 常用的 表面活 性剂, 
其 中最常 用的是 SDS。 



表 7.3 常用 的表面 活性剂 


类型 


名称 


浓度 /(mmol/L) 


聚 合数目 


阴离子 


SDS 


8.2 


62 


阳离子 


DTAB 


14 


50 




CTAB 


1.3 


78 


非离子 


Triton X-100 


0.24 


140 


两 性离子 


CHAPS 


8 


10 




CHAPSO 


8 


11 


胆汁盐 


cholic acid 


14 


2-4 




deoxycholic acid 




4-10 




taurocholic acid 


10-15 


4 



100 



采用 SDS 构成假 固相时 ,微团 带有大 量的负 电荷, 其泳 动方向 与电渗 相反, 但 是如果 
选择 pH 偏碱的 缓冲液 可维持 电渗流 速率大 于微团 的泳动 速率, 因 此微团 的最终 泳动方 
向仍与 电渗流 一致。 样品 中的中 性分子 疏水性 越强, 与 微团的 结合越 紧密, 迁移时 间也就 
越长。 其他带 电荷分 子除了 与微团 形成疏 水吸附 ,还 有离子 交联等 作用, 最 终泳动 速率取 
决于 其疏水 程度、 带电 荷多少 等各种 特性。 

在应用 MECC 模式时 常可加 入有机 修饰剂 ,如 甲醇、 乙腈、 异丙 醇等。 这些有 机溶剂 
可以降 低溶质 和微团 间的疏 水吸附 ,也可 减小形 成微团 的疏水 作用。 

由于 MECC 可以同 时分离 带电荷 与不带 电荷的 分子, 目 前被较 多地应 用于氨 基酸衍 
生物、 肽 谱分析 以及合 成多肽 纯度鉴 定等。 

3. 毛 细管篩 分电泳 (capillary sieving electrophoresis , CSE ) 

此种电 泳模式 的特点 是毛细 管内填 充了多 聚物作 为分离 介质, 对分子 的泳动 起着阻 
碍 作用。 分离介 质可以 如平板 电泳一 样呈凝 胶状, 也可以 是甲基 纤维素 溶液, 后者 便于清 
洗, 可实 现毛细 管一管 多用。 溶液中 的甲基 纤维素 分子在 电子显 微镜中 呈现缠 绕状, 其作 
用机 理类似 于凝胶 的旆网 作用, 大分 子较小 分子所 受的阻 碍大, 泳 动速度 减慢。 这 种分离 
模式尤 其适合 于荷质 比差异 很小而 大小不 同分子 的分离 (如 DNA 分子、 SDS- 饱 和的蛋 
白质分 子)。 这类分 子应用 FSCE 无 法进行 分析。 

CSE 在 DNA 研究 中有着 广泛的 应用, 在蛋白 质研究 中主要 用来代 替传统 的平板 
SDS- 聚 丙稀酰 胺凝胶 电泳。 其优点 在于: 第一, 缩短分 析时间 ,通 常凝胶 电泳至 少需要 
45min 左右, 而 CSE 只需 15min 即可达 到同样 的分离 效果; 第二, 在 毛细管 电泳中 可以在 
线 检测并 进行更 精确的 定量; 第三, 毛细管 电泳仪 自动化 程度高 ,可以 省却手 工灌胶 、聚 
胶、 上样、 染色、 脱色 等操作 步骤。 但是 CSE 每 次电泳 只能分 析一个 样品, 不能像 平板凝 
胶 电泳那 样具有 多个进 样孔可 以同步 电泳。 另外, 目前 CSE 只 能用于 相对分 子质量 1 万 
至 20 万范 围内蛋 白质的 分离, 尚不 可进行 多肽的 分析。 

图 7.7 为 7 种 相对分 子质量 不同的 标准蛋 白质经 CSE 的分离 图谱。 

应用 毛细管 SDS 凝 胶电泳 可以比 较方便 地分析 糖蛋白 的分子 质量。 由于多 糖基团 
不结合 SDS ,糖蛋 白的荷 质比相 对于同 样大小 的蛋白 质低, 用 经典的 SDS- 聚丙婦 酰胺凝 
胶电泳 估计的 分子质 量偏大 ,通常 必需在 不同浓 度的凝 胶上进 行分析 ,得到 糖蛋白 迁移率 
对 数值相 对于凝 胶浓度 的线性 关系图 (Ferguson 图), 该直线 的斜率 称为此 蛋白的 排阻系 
数 Kr。 和蛋 白质的 半径的 平方成 正比, 而 蛋白质 半径与 其分子 质量的 对数成 线性。 
因此, 得到 标准蛋 白分子 质量的 对数值 相对于 平 方根的 线性关 系图, 测得糖 蛋白的 
值即 可推测 其分子 质量。 运用传 统的平 板凝胶 电泳需 多次灌 胶多次 电泳, 而毛 细管凝 
胶电 泳应用 溶液状 的分离 介质只 需对浓 的含甲 基纤维 素的分 离溶液 进行一 系列的 稀释, 
按照设 定的程 序自动 分析即 可得到 Ferguson 图。 

图 7 . 8a 为 用常规 方法测 定糖蛋 白 的分 子质量 ,可 发现 根据相 对迁移 率推测 的糖蛋 白 
分 子质量 将与实 际数值 有较大 差异。 

图 7.8b 为用 Ferguson 分析方 法测定 糖蛋白 的分子 质量, 图中 显示糖 蛋白与 标准蛋 
白基本 上位于 一条直 线上, 也就是 说根据 Kr 的平方 根值, 可 以较准 确地确 定糖蛋 白的分 
子 质量。 

. 101 . 




3.0 I .... I … , , , I 1 000 

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 
相 对迁移 

图 7.7 标准蛋 白质的 CSE 分析 ' 




316000 
200 000 

100 000 

58 000 Q 

14000 ^ 
10000 屮 

3 000 



5.4- 
5.2- 



b 

5.4 - 
5.2 - 



4.4- 
4.2- 



4.8 
4.6 
4.4 
4.2 







65 



0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 



图 7.8 糖 蛋白的 分子质 量分析 
a. 一种凝 胶浓度 测得的 相对迁 移率; 
b. 用几种 凝胶浓 度进行 Ferguson 分析 

4. 毛 细管等 电聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 

与普通 的凝胶 等电聚 焦一样 ,毛细 管内的 pH 梯 度也是 由两性 电解质 形成。 在 实验中 
需选用 内壁中 性共价 涂层的 毛细管 ,阳 极端至 检测器 有效分 离部分 (离 检测窗 口差几 厘米) 
充 满两性 电解质 溶液, 样品溶 液夹在 其中以 避免直 接接触 阳极液 (H3P04)。 毛细管 其余部 
分 (检 测器至 阴极) 为 阴极液 (NaOH 溶液 )。 毛细 管两端 分别插 人阳极 和阴极 液中, 其中毛 
- 102 • 





细 管中的 溶液和 H3P04 溶 液中均 含一定 浓度的 可溶性 甲基纤 维素作 为支持 介质。 两性电 
解质 载体和 样品在 电场中 聚焦至 电流趋 于零。 此 时可采 用真空 抽吸、 压力推 动或者 在电极 

液 中加人 盐以改 变已经 形成的 pH 梯度等 方式驱 使蛋白 质条带 移动并 逐一经 过检测 窗口。 
需要注 意的是 ,毛细 管等电 聚焦必 须选用 内壁经 过共价 涂层消 除了电 渗的毛 细管。 

与前面 介绍的 CSE —样, CIEF 不 仅可以 取代常 规的凝 胶等电 聚焦, 还具有 前述的 诸多优 

点。 另外, 由 于是直 接在线 检测, CIEF 可以 分析多 肽的等 电点, 而在 传统凝 胶等电 聚焦中 

的 固定、 染色、 脱色等 步骤中 小分子 多肽易 丢失。 

整个 分析过 程可自 动化, 通 常仅需 45min 左右。 图 7.9 说 明毛细 管等电 聚焦的 过程。 
检测器 ― 



液体流 动方向 



氧 氧化钠 



氢 氧化钠 



氣 氧化钠 



检测器 



检测器 



检测器 



液体流 动方向 



液体流 动方向 



液体流 动方向 



氣 氧化钠 1" 



iiiilllliililiiliniilHlSKinhiisHillilllilliil III 



检测器 



氢 氧化钠 



复 氧化钠 I 



检测器 



电场 



液体流 动方向 

电场 



氣 氧化钠 注入 阴极液 
两性 电解质 注 入两性 电解质 
样品 进样 



两性 电解质 再注 入两性 电解质 
以保 护样品 



麵 聚焦 



碰 移动聚 焦条带 



图 7.9 CIEF 程序 



图 7.10 为我 们实验 室应用 CIEF 测定 重组人 表皮生 长因子 (rhEGF) 的等 电点, 经分 
析其 为 5.0 [27] 。 



移 动起始 



阴 极界面 




rhEGF 
肠促胰 81 肽片段 p/=2.75 

一 阳 极界面 



图 7.10 CIEF 分析 rhEGF 的 等电点 



由于等 电点与 聚焦位 置距离 检测窗 口的长 度呈良 好的线 性关系 ,用 CIEF 可 以测到 
以往 用凝胶 IEF 较 难测准 的接近 pH 梯度极 端值的 等电点 ,如 pI9.0 以上或 pI3.0 以下的 

蛋白质 [28 ^。 

另外, CIEF 具有较 高的分 辨率, 可 分辨至 pi 相差 0.5 个 单位, 因而它 可用于 分离差 
异较 小的异 构体。 

CIEF 还具 备其他 毛细管 电泳分 离模式 没有的 优点, 即对于 较稀蛋 白溶液 (低至 
0.001/^g/Vl) 可将 它们和 两性电 解质混 合后一 起注入 毛细管 中进行 分析。 

五、 注 意事项 

① 毛细 管的清 洗和平 衡条件 应保持 一致, 尤其在 做多样 品定量 分析时 是保证 高重现 
性 的重要 因素。 

② 用 于毛细 管电泳 的缓冲 液应尽 量新鲜 配制, 使用的 试剂为 电泳纯 ,水 的质量 要求也 
很高, 以 Milli-Q 水为佳 ,使用 前还应 脱气和 膜过滤 处理。 

③ 正 负极两 端的缓 冲液必 须是相 同的, 如不同 ,会使 吸光值 增减, 电流 变化以 及电渗 
流 改变。 两端 的缓冲 液池要 等高, 这样 对于分 离效率 和迁移 时间重 现性都 是很重 要的。 

④ 缓 冲液的 更新是 获得高 重现性 的一个 环节。 溶液的 电解会 改变缓 冲液的 pH 值, 
电 渗流也 会随之 改变。 电 解的程 度决定 于电流 的大小 和分析 时间的 长短, pH 值变 化的程 
度决定 于缓冲 液的缓 冲容量 ,两 端池体 积等。 

⑤ 用于 毛细管 电泳的 样品应 均勾地 呈溶液 状态, 上样前 应离心 取上清 分析。 

©如 果没有 灵敏度 的限制 ,应 该用尽 可能短 的进样 长度, 但是受 到仪器 的限制 ,进样 
时 间短会 使进样 重现性 减小。 、 

⑦ 为防 止样品 蒸发, 必须盖 紧样品 管盖或 冷却样 品盘。 ' 

⑧ 为防 止样品 沾带引 起额外 的进样 ,毛细 管端口 要平正 光滑, 并 除去毛 细管端 口的聚 
酰 亚胺。 另外, 进 样后要 及时将 毛细管 浸人缓 冲液或 水中。 

® 毛细 管电泳 结束后 , 如有 一段时 间不用 , 应将毛 细管作 清洗后 ,以 氮气吹 干管内 留 
有的 液体后 保存。 

六、 结束语 

毛 细管电 泳是基 于电泳 的高分 辨机制 和色谱 的仪器 自 动化概 念而诞 生的, 因 而兼具 
二者的 优越性 ,即分 辨率高 、分析 速度快 、消耗 样品少 、灵敏 度高、 操作 简便、 分离 模式多 
样、 不使 用毒性 强的有 机溶剂 等诸多 优点。 表 7.4 显 示毛细 管电泳 与其他 分析方 法的比 
较 结果。 毛细管 电泳技 术发展 迅速, 具 有很好 的应用 前景。 但是, 它只能 局限于 分析水 
平, 尚不能 作为分 离制备 的手段 ,即 使用多 次分离 得到的 样品, 仅能 进行如 N 端序列 、质 
谱等微 量分析 ,而 且它还 不能分 析难溶 于水的 样品, 因 此不能 完全替 代气相 色谱、 液相色 
谱 及传统 的凝胶 电泳。 



104 



表 7.4 毛细管 电泳与 其他分 析方法 的比较 



项 目 


毛细 管电泳 


凝 胶电泳 


HPLC 


分 离机制 


电荷、 疏水 性分子 大小等 


大小 与电荷 


极性/ 极性 ; 分 配大小 ;离 子交换 


常规分 析时间 


lO-aOmin 


2h 〜几天 


10~120min 


分辨相 近分子 的能力 


优秀 


优秀 


良好 


样品 需要量 


< 1^1 


1 ~ lOO/il 


10~50^tl 


灵敏度 (一 般常规 分析) 


皮克 至纳克 


纳克 至微克 


纳克 至微克 


定量 准确性 


好 


较差 


好 


检 測方式 


在线检 测可见 -紫外 吸收荧 


染色, 放射 自显影 


在线检 测可见 -紫 外吸收 荧光, 激 




光, 激光 




光, 电 化学等 


仪 器价格 


较高 


较低 


较高 


实 验消耗 


低 


较髙 


较低 


手 工操作 


少 


多 


少 


自动 化程度 


离 


低 


髙 


制 备能力 


无 


有 


髙 


部 分收集 


困难 


困难 


容易 



第二节 连 续自由 流电泳 

一、 概 况 

1. 概述 

Philpot 在 20 世纪 30 年代 后期首 先考虑 到连续 电泳的 优点, 至 10 年后 Svenson 和 
Brattsten,Grassmann 以及 Hannig 便报道 了在这 方面所 做的首 次实验 ,他们 研究了 被电解 
液流所 带动的 颗粒在 经过垂 直于流 动方向 的电场 作用后 其区带 的迁移 原理。 然而, 因系 
统本 身的复 杂性, 以及 对一些 基本现 象缺乏 认识和 仪器条 件的限 制而未 被广泛 应用。 直 
至 80 年代后 ,科 学家们 又考虑 到液相 电泳的 特点, 相 继发展 了毛细 管电泳 和制备 级的连 
续自由 流电泳 、液 相等电 聚焦, 后两 者使电 泳的大 规模制 备型分 离得以 可能。 

连 续自由 流电泳 (continuous free flow electrophoresis, CFFE) 可 理解为 在无固 相支持 
介质的 薄的矩 形分离 腔中, 以缓 冲液作 为分离 介质进 行生物 大分子 或不溶 性颗粒 及细胞 
等物质 的电泳 分离纯 化技术 ,它可 采用多 种类型 的仪器 系统。 也 被称为 Hannig 型 自由流 
电泳, 简称 自由流 电泳。 曾有 不少学 者对自 由流电 泳进行 过全面 的综述 [29 ~ 33] 。 

自由流 电泳是 基于区 带电泳 的原理 —— 当带 电样品 以细带 进入系 统后, 在电 场的作 
用下根 据它们 的电泳 迁移率 在一定 pH 介质 中得以 分离。 从理论 上看, 这 种过程 较等电 
聚焦更 灵活, 因 为等电 点相似 的样品 在另一 pH 介质 中能有 相当不 同的迁 移率。 然而, 区 
带电泳 不可避 免的次 现象如 分子扩 散等使 样品带 变宽因 而导致 分辨率 下降。 所以, 最有 
利 的是提 供短而 快速的 分离, 而自由 流电泳 正是满 足了在 电场中 滞留时 间短的 要求。 另 
外, 更引 人注目 的是, 它除了 能分离 离子和 大分子 物质如 蛋白质 等外, 还能 分离大 颗粒甚 
至 活细胞 , 这是其 他过程 所不具 备的。 

对比 其他分 离技术 而言, 自 由流电 泳的主 要优点 在于它 是一个 连续的 而不是 分批进 

. 105 . 



p: 蛋白质 

A,B: 杂质 



行的分 离过程 ,同时 ,由 于它一 般不使 用有机 溶剂、 高盐溶 液及硅 胶或凝 胶等支 持介质 ,其 

分离条 件相当 温和, 对有活 性的生 物材料 的分离 纯化提 供了十 分合适 的分离 环境。 然而 

因自由 流电泳 是完全 无载体 的液相 电泳, 因 此除了 电泳本 身所固 有的影 响因素 (焦 耳热, 

电 动力学 变形) 外, 还 有层流 (流 体力学 变形) 以及 一些综 合因素 的影响 (电 流体力 学变形 

等), 且这些 因素常 常相互 关联, 使整个 过程变 得极为 复杂。 也 许正因 为此, 自由流 电泳在 

很长时 间内被 忽视。 然而, 尽管 众多因 素会引 起样品 流的扰 动而降 低自由 流电泳 的分辨 

率, 使其应 用受到 限制, 但 在大规 模分离 的可能 性以及 多种生 物样品 (如 离子、 大分子 、颗 

粒、 完整 细胞、 细胞碎 片等) 分离的 可行性 上显示 了独特 的优点 ,再 加之近 20 年 来空间 自 

由流 电泳的 开展, 使这 种被忽 视的局 面得以 改善, 并 推动了 该领域 研究的 发展。 

我们 实验室 首先选 择两种 有色的 等电点 差异较 大的标 准蛋白 质作为 分离样 
品 [34 ~ 38] ,旨在 认识和 研究自 由流电 泳的各 种现象 ,之后 进行了 一些地 面应用 研究, 主要 

为 药用蛋 白质和 细胞的 分离。 天 花粉蛋 白是一 种核糖 体失活 蛋白, 对其粗 产品的 自由流 

电泳 分离, 得 到经多 种分析 技术鉴 定为纯 度很高 (大于 99%) 的产品 [39] ;还 进行了 一些基 
因 工程粗 产品如 干扰素 、人 表皮生 长因子 的分离 尝试。 对细 胞的分 离是在 人和兔 红细胞 
成功 分离的 基础上 [ 34 ], 又 分离了 小鼠脾 脏淋巴 B 细胞和 T 细胞 [ 4 G ] 、传代 培养 的肝癌 
7414 细胞 和鼻咽 癌细胞 CNE-2, 基本 建立了 细胞的 自 由流电 泳分离 体系。 

2. 基 本原理 

自 由 流电泳 的原理 图见图 7.11。 在 CFFE 中, 分 离介质 在两块 平行的 矩形板 组成的 
分离腔 内形成 层流, 两板 之间的 距离通 常介于 0.5〜3.0mm (地基 分离腔 通常为 0.5〜 

1.0mm 之间) ,分 离腔的 两侧为 正负电 极室。 被分离 
样品 由一口 径很小 (约 为分离 腔厚度 1/3) 的 输入口 
进入 分离介 质中, 形成一 细带, 在垂直 于液流 方向上 
加上均 勾的电 场后, 样品 中的各 组分由 于各自 电泳迁 
移 率的差 异而各 自向与 所带电 荷符号 相反的 电极以 
不同 的角度 迁移, 相同电 泳迁移 率的物 质则迁 移为一 
窄带, 在 到达分 离腔出 口处 由级分 收集器 收集。 

3. 主要影 响因素 

自由流 电泳在 20 世纪 50 年 代被提 出后, 并没有 
受到 重视, 主要 的原因 是其过 程相当 复杂, 且 为动态 
过程 , 导致 稳定性 、分辨 率都不 易控制 ,使 其在 很长一 
段时间 内都没 有一个 可操作 的模式 ,所 以不像 SDS- 
PAGEJEF 等电 泳技术 几乎普 及于所 有的生 化实验 
室。 CFFE 过程 中所涉 及的因 素不仅 种类繁 多而且 
常常相 互关联 ,如热 对流、 流体力 学变形 、电动 力学变 
形、 电 流体动 力学变 形等。 若把 所有的 影响因 素都考 



电极液 




电极液 



待纯 化样品 



图 7.U 自由 流电泳 原理图 



虑在内 ,那 么列出 的方程 组用现 有的数 学方法 将无法 解出。 




106 



(1) 热 力学不 稳定性 (thermal instabilitiy) 

当电流 通过导 电体后 ,由 于焦耳 热的产 生会使 导电体 的温度 升高。 在 CFFE 中, 当使 
用很薄 (0.5〜1. 0mm) 的分离 腔时, 电 泳中产 生的热 量可以 随着分 离介质 的高速 流动被 
迅速 带走; 而当 分离腔 厚度增 加时, 处于分 离腔中 心部位 溶液的 热量不 能有效 地散发 ,从 
而导 致温度 升高。 

焦耳热 的产生 直接导 致温度 梯度的 形成, 后 者又导 致密度 梯度的 形成。 在 重力加 
速度存 在下, 必然造 成热对 流现象 ,从 而严重 影响电 泳分离 效果, 所以控 制热对 流现象 
极为 重要。 在工 程上以 相关无 因次数 (dimensionless number)Grashof 数 (Gr) 来描 述这一 
现象: 

Gr = (g ' ^ ' AT ■ ?)/ 

式中, g 为重 力加速 度,/ ?是介 质的体 积膨胀 系数, AT 是 介质流 经分离 腔后的 温差, r 是 
分 离腔的 半厚度 , V 是介质 的點度 常数。 

Gr 超过一 定值后 ,液 流的不 稳定性 增加, 并可导 致已分 离组分 的再混 合而使 分辨率 
降低, 因 此减小 Gr 是设 计自由 流电泳 仪和实 验的中 心技术 问题。 通常, 增 加冷却 功率、 
减小 分离腔 厚度、 增加介 质點度 均可使 Gr 大为降 低从而 保证液 流的稳 定性。 另外, 减小 
重力 加速度 也不失 为一条 途径, 也正因 为此, 人们 尝试在 空间进 行自由 流电泳 分离。 

(2) 流体力 学变形 ( hydrodynamic distortion ) 
流体力 学变形 是自由 流电泳 的另一 个固有 现象。 

当流体 在两块 平行板 之间流 过时其 速率分 布会形 成一种 抛物线 型模式 ,在中 心部位 
的流 体流速 最大, 而靠近 分离腔 壁的流 体速度 较小, 在腔壁 上流速 为零。 这就是 所谓的 
Posseuil 层流 型速率 分布。 在横跨 分离腔 厚度方 向上, 液 流存在 着速率 梯度。 速率 梯度造 
成的停 留时间 梯度使 得各物 质受电 场作用 的时间 不同, 即物 质在电 场方向 的迁移 时间不 
同, 最终 导致样 品带的 变宽, 而且, 样 品带的 形状将 不再是 笔直的 而呈新 月状。 

为了解 决这个 问题, 首先可 以减小 样品输 人口的 口径, 这 样样品 流由于 保持在 一个距 
离分离 腔壁较 远的位 置上, 其中 各物质 的速度 梯度将 较小, 从而具 有比较 均一的 迁移时 
间, 但会 使电泳 的物料 流通量 减小。 另一个 办法就 是增加 分离腔 的厚度 ,但 这同时 会带来 
由于 散热效 果差而 造成的 热对流 问题。 

(3) 电动力 学变形 ( electrodynamic distortion) 

因电 泳池材 料和介 质中阳 离子引 起的双 电层导 致的电 渗流在 所有液 相电泳 中都存 
在。 在 CFFE 中, 电渗 流会把 样品流 变形为 新月状 —— 在靠 近分离 腔壁区 域的离 子被拖 
向阴极 ,而 处于分 离腔中 部的离 子则基 本不受 影响。 电渗流 可在一 定程度 上被控 制和利 
用。 当电渗 流方向 与物质 在电场 中的迁 移方向 相反时 ,能 使分离 的分辨 率提高 [29] ;当电 
渗流的 速度与 物质在 电场中 的迁移 速度大 小相等 、方向 相反时 ,由流 体力学 变形和 电动力 
学变 形所带 来的影 响可完 全相互 抵消。 这就意 味着必 须尽量 使分离 腔壁上 的毛电 势和待 
分离 物质的 毛电势 一致。 用具有 高亲和 力且其 S 电势 与待分 离物质 相近的 可溶性 材料来 
覆盖分 离腔壁 是一种 有效而 简单的 方法, 如在 细胞分 离时, 分离 腔壁用 2% 〜3% 的牛血 
清白 蛋白处 理后可 减小条 带扩散 [4 1 ] 。 

(4) 电动流 体力 学变形 ( electrohydrodynamic distortion ) 

样品流 由于蛋 白质的 存在常 常具有 与分离 介质不 同的离 子组成 ,使它 们之间 存在电 

. 107 . 



导差异 ,进而 导致溶 液中电 场的变 形并在 溶液中 产生剪 切应力 ,这种 变形被 称为电 动流体 
力学 变形, 其造 成的结 果是样 品带的 变宽。 当样品 流比介 质电导 低时, 发生 朝向分 离腔壁 
的变宽 现象; 当样品 流的电 导比介 质高时 ,则 产生平 行于分 离腔壁 的条带 变宽, 后者 常见。 
这种 变形在 自 由 流电 泳分离 过程中 占有 很重要 的地位 , 而且 , 即使在 微重力 环境下 这种变 
形效应 仍可能 存在。 

解决 这问题 的简单 方法是 仔细地 调整样 品流与 介质的 电导, 使它们 大致相 同 [4 1 ] ,但 
在蛋白 质样品 浓度高 时很难 做到。 

(5) 电动 学效应 (electrokinetic/Kohlrausch effects) 

一般讨 论时都 假设蛋 白质的 电泳迁 移是不 受周围 环境影 响的。 但实际 上在电 解质溶 
液中加 上直流 电场后 ,溶 液中的 所有离 子都将 发生电 迁移。 但溶液 中不同 离子的 迁移必 
须同时 满足其 周围的 电中性 和化学 平衡的 条件, 这就 意味着 蛋白质 样品流 附近的 离子浓 
度常常 会发生 不定的 变化, 从而产 生所谓 的电动 学变形 效应。 

(6) 他 豫效应 (relaxation effect) 

在电 解质溶 液中, 带 电颗粒 和分子 都被电 子云所 包围。 颗粒 的半径 a 与电子 云的伸 
展量 1//C 的比率 ,即 /c*a ,是 一个可 测量。 当电场 加上后 ,电 子云的 形状将 发生变 形而产 
生偶极 移动。 这种效 应在电 子云具 有极大 或极小 的伸展 量时都 可忽略 不计。 而 在高的 S 
电 势下, 电子云 具有中 等的伸 展量时 即可达 到最大 的偶极 移动。 这 将产生 一种与 电场力 
方向 相反的 迟滞力 ,这就 是弛豫 现象。 所以, 在 1< /C • a < 100 时, 带 电颗粒 的分离 依据将 
不但有 $ 电势而 且还有 颗粒的 大小。 这个范 围内的 值 可在极 低浓度 的电解 质溶液 
中 达到。 

可以 看到, 这 种弛豫 现象也 给大型 制备级 分离开 辟了一 条新的 道路。 在极低 浓度的 
电解质 溶液中 ,物 质以比 在常规 的较高 离子强 度分离 介质中 高得多 的速率 进行电 迁移, 所 
以可 以应用 比较高 的流速 而增加 物料流 通量。 而且, 由 于所通 过的电 流强度 很低, 电泳过 
程产生 的焦耳 热也将 减小, 从而 可以减 轻冷却 功耗。 在这种 低浓度 电解质 溶液中 进行电 
泳, 惟一 可能的 限制性 因素就 是某些 样品的 稳定性 问题。 

(7) 浮力 g 区动 的扰 动效应 (buoyancy-driven flow) 

分离缓 冲液与 样品流 之间以 及分离 缓冲液 自身之 中的密 度差异 可以引 起自然 对流现 
象。 样品流 和分离 介质之 间有不 可忽略 的速率 差异, 而且会 沿着分 离腔的 垂直方 向随缓 
冲液中 离子和 蛋白质 的不同 迁移而 变化, 于是, 蛋白质 在电场 中的迁 移轨迹 将不会 像预测 
的那 样是笔 直的。 同时, 缓冲液 自身也 存在密 度不均 一性, 这 是因为 缓冲液 中的离 子迁移 
受到分 离腔与 电极室 之间分 隔膜的 影响, 同时 溶液中 的离子 迁移还 受到由 电流通 过而产 
生 的焦耳 热在溶 液中的 扩散所 带来的 影响。 由 膜所产 生的浓 度极化 效应还 可在缓 冲液内 
形 成温度 梯度, 进而导 致缓冲 液的密 度不均 一性。 

(8) 电极膜 的影响 

用于分 隔电极 室和分 离室的 电极膜 ,一方 面可防 止电极 所产生 的气泡 进人分 离腔, 另 
一方 面还可 防止高 浓度电 极液在 高速循 环时对 分离腔 内的流 场造成 破坏。 但是, 电极膜 
会产生 浓度极 化现象 ,即 在分离 腔一侧 产生一 个离子 积聚区 而在另 一侧产 生一个 离子耗 
竭区, 这时, 离子 粍竭区 由于其 电导较 低将比 其他区 域的介 质温度 低而形 成温度 梯度, 进 
而 导致介 质的密 度梯度 ,引 起自 然 对流。 
. 108 . 



为避免 膜引起 的影响 因素, 可考 虑三种 方法: ①为 克服由 经过膜 的扩散 性转移 引起的 
耗竭 现象, 可使 用薄的 膜和大 的电极 液-分 离液浓 度差。 ②使 用具相 反极性 的膜, 并使用 
可在 分离区 域内产 生两个 积聚区 的电流 方向。 合适的 设置方 式为: 阴离子 交换膜 置于阴 

极侧, 而 CEA 膜、 PES 膜 或其他 阳离子 交换膜 置于阳 极侧。 ③为控 制随膜 设置而 变的浓 
度变化 情况, 可使 用具有 高浓度 的边界 溶液。 这样, 积 聚区和 耗竭区 对分离 中心区 域的影 
响都将 很小, 该区 域的电 场强度 可保持 均一而 稳定。 
(9) 气泡 

由于水 水解在 电极产 生气泡 ,在负 极积累 H2, 在正 极积累 Oz, 影 响了分 辨率。 采用 
把电极 或铂黑 电极, 可减 小这个 影响, 但不能 消除它 ,特别 在高电 流时。 在 微重力 下气泡 
更不 会自动 逸出, 因此 采用电 极液循 环流动 去除。 在 分离室 和电极 之间用 半透膜 是一种 
有效的 方法, 此外 还可在 循环回 路上加 上相分 离器。 

另外, 非常重 要的是 ,在地 基自由 流电泳 实验中 ,重 力加速 度是一 个不可 忽视的 影响因 
素。 它与 许多影 响因素 有关, 如热 对流、 流 体力学 变形、 分子沉 降等。 这些效 应在进 行自由 
流 电泳的 放大实 验时显 得尤为 严重。 因此, 要进一 步提高 自由流 电泳的 分辨率 和产率 ,必须 
在微 重力条 件下进 行电泳 操作。 不少 国家已 经开展 了空间 自 由 流电泳 的研究 工作并 取得了 
长足 的进展 , 对此 Snyder 和 Rhodes^ 42 ] , 以及 Morrison 都作了 很全面 的总结 [ 43 3 。 

4. 自由流 电泳仪 

自从 Tiselius 的 U 型管 电泳装 置问世 以来, 对电 泳仪器 的研究 已经走 过了很 长一段 
历程。 可以克 服对流 及样品 流变形 等问题 的方法 已经得 到发展 ,许 多不同 类型的 仪器也 
已商 品化。 人们朝 着使蛋 白产率 最大化 、蛋白 分离最 佳化、 自 由对流 不稳定 性最小 化以及 
蛋 白区带 扩散最 小化等 目标对 自由流 电泳分 离装置 的设计 进行了 研究和 探索。 

一台典 型的自 由流电 泳仪包 括四个 部分: 泵驱动 系统、 电源、 级分 收集器 和分离 单元。 
泵驱 动系统 通常采 用的是 一个或 多个蠕 动泵。 输送分 离介质 的泵可 放在分 离介质 入口的 
前面, 也 可放在 出口的 后面。 分离 介质泵 和电极 液泵可 合用同 一泵, 也可独 立使用 ,样品 
泵通常 独立于 介质泵 和电极 液泵。 

分离单 元包括 分离介 质和样 品的输 人口、 分离 腔和电 极室。 分离 腔通常 由两块 玻璃或 
聚碳酸 酯等材 料制成 的平行 的矩形 板构成 , 电极 室设在 分离腔 的两侧 ,其 中的 电极由 不易在 
电 场中氧 化的金 属如铂 制成, 电极室 与分离 腔由电 极膜如 离子交 换膜、 醋酸纤 维膜等 隔开。 

电源 要能提 供达到 300V/cm 以上 的直流 电压, 最大电 流达到 200mA 以上。 

级分收 集器用 来收集 分离腔 出口处 的已分 开的样 品和分 离介质 ,通常 由很多 输出管 
道和接 收小管 或小瓶 组成, 也有仪 器在输 出管路 中或管 路前设 置在线 检测的 元件。 

二、 材 料 

(1) 设备 和材料 

① 自由流 电泳仪 (Octopus 仪, 德国 Weber GmbH 生产) ;②酸 度计; ③电 导仪; ④离心 
机; ⑤磁 力搅 拌器; ⑥分光 光度仪 ; ⑦ 移液器 , Tip , Eppendorf 管 。 



109 



(2) 试剂 

①三乙 醇胺; ② 乙酸; ③甘油 ;④葡 萄糖; ⑤甘氨 酸; ⑥蔗糖 ;⑦乙 酸钾; ⑧氢氧 化钠; ® 
磯酸; ⑩两性 电解质 (ampholine)。 

(3) 样品 

①牛血 红蛋白 ;②牛 血清白 蛋白; ③细 胞色素 C; ④天花 粉蛋白 (丙 酮沉淀 粗提物 );© 
人和 兔的红 细胞。 

三、 自由流 电泳操 作步骤 

自由流 电泳的 基本操 作包括 安装和 清洗分 离腔, 缓 冲液和 样品的 加注, 电泳, 收集和 
检测等 步骤。 . • 

(1) 安装 和清洗 分离腔 

久未 使用的 分离腔 的前后 腔壁应 以酒精 或异丙 醇湿润 的棉花 球仔细 擦洗。 根 据分离 
模式 选择所 需的电 极膜, 并仔 细洗去 电极膜 上的存 储液, 以重 蒸水润 湿后与 相同长 度的滤 
纸条一 起封住 分离腔 前壁的 电极室 ,安装 间隔条 后将分 离腔的 前后壁 合拢, 并以两 侧的弹 
簧夹 固定, 注意一 定要用 力均勾 ,否则 腔后壁 的玻璃 (镜子 ) 易 破碎。 

根据 分离模 式连接 好管路 及泵的 设置, 然 后进行 管路的 清洗。 需用 O.lmol/L 
NaOH 、超 纯水、 O.lmol/LHCl 、超纯 水依次 清洗。 如管路 特别脏 ,可 以异丙 醇或去 街剂清 
洗。 在最 后超纯 水清洗 过程中 还需对 分离腔 内和管 路内的 气泡进 行彻底 清除。 在 缓冲液 
注人前 , 超 纯水应 以 低速不 断地注 人分离 腔内。 

(2) 緩沖液 和祥品 的加注 

开启冷 却至所 需温度 ,然 后加注 分离缓 冲液和 样品。 选 择合适 的缓冲 液流速 和上样 
速 率是自 由流电 泳分离 的关键 之一。 一般 样品速 率与层 流厚度 的比值 越小, 样品 带的扩 
散 越小。 样 品带的 扩散还 与样品 速率与 缓冲液 流速的 比值成 正比。 

在加电 压之前 ,还需 对收集 管进行 仔细地 抽气, 保证每 管畅通 并流速 均勾。 

(3) 电泳 

电压是 自由流 电泳另 一个比 较重要 的操作 参数。 为了得 到最佳 的分离 效率, 必需在 
物料流 通量和 分辨率 之间进 行折中 ,这 主要通 过调节 缓冲液 流速和 分离电 压的大 小来实 
现。 

整个分 离过程 仅约几 分钟, 但作 为制备 电泳, 其电 泳时间 通常为 Ih 左右, 在实 际操作 
中 根据样 品量和 收集液 的量来 决定。 

电泳 过程中 如出现 气泡, 应停止 电泳。 

(4) 收集 和检测 

电泳结 束后, 取出收 集管, 并对 每管进 行光密 度值的 检测。 根据光 密度值 ,画 出分离 
曲线。 对 出现的 峰可进 行进一 步分离 或分析 鉴定。 

电泳 结束后 的分离 腔应以 超纯水 清洗, 如长期 不用, 可用含 0.0196 的 叠氮钠 进行防 
腐处理 ,并 取出电 极膜、 间 隔条等 作适当 保存。 



110 



四、 分 离模式 



自由流 电泳有 4 种 最基本 的分离 模式, 它们分 别为区 带电泳 (zone electrophoresis, 
ZE) 、等 速电泳 (isotachophoresis, ITP) 、等 电聚集 (isoelectric focusing, lEF) 和电场 梯度电 
泳 (field step electrophoresis, FSE)o 可以说 ,这 4 种模 式各有 千秋, 若能针 对不同 样品适 
当地 选择不 同的分 离模式 或利用 一些联 合型模 式来进 行分离 纯化, 往往可 使整个 工作收 
到事半 功倍的 效果。 

(1) 区 带电泳 (ZE) 

在区带 电泳中 ,均一 的分离 介质从 一个输 入口连 续泵人 分离腔 并在腔 内形成 薄层液 
流, 待分离 样品则 在其稍 下游处 进入分 离腔, 根 据样品 中各组 分的电 荷-质 量比的 差异进 
行分离 ,其中 所使用 的分离 介质的 pH 和电导 都是均 一的。 这是 一种最 常用、 最简 单方便 
的分离 模式。 在这种 模式中 ,选 择合适 的分离 pH 值是 整个分 离成功 与否的 关键, 介质电 
导通 常偏向 低值。 

区带 电泳最 具吸弓 I 力的 优点是 其分辨 率很高 , 回 收 率也高 , 且其设 置简单 , 易 于操作 , 
适合于 从复杂 的混合 物中分 离纯化 某一种 物质, 同 时纯化 几种物 质也有 报道。 其 缺点是 
产 率不高 , 而且 有条带 扩散现 象和稀 释效应 。 

图 7.12 为 标准蛋 白质的 ZE 分离 图谱。 分 离缓冲 
液 和电极 液均为 pH6.5,10mmol/L 三乙 醇胺, 含 10% 

甘油。 样品 浓度为 10/0。 

(2) 等 速电泳 (ITP) 
在等速 电泳中 ,被分 离样品 作为一 条与先 导离子 

(具 有最大 电泳迁 移率的 离子) 和尾 随离子 (具有 最小电 
泳迁 移率的 离子) 溶液平 行的条 带同时 进人分 离腔, 在 
电场的 作用下 ,各种 离子根 据它们 的电泳 迁移率 差异重 
新按序 排队, 具有较 大迁移 率的离 子则靠 近先导 离子, 
具有较 小迁移 率的离 子则落 在近尾 随离子 一侧, 从而达 
到 分离。 当达到 稳定状 态后, 所有 各自分 开的离 子都将 
以相同 的速率 移动, 这样, 所有离 子将依 它们的 种类分 
为相 应数量 的彼此 毗邻的 条带。 为收集 方便, 还 必须加 
人合适 的间隔 物质, 使各 物质之 间具有 明显的 界限。 

等 速电泳 是代替 层析的 电泳对 应物。 其分 离过程 
达到 稳态的 时间与 所加的 电压的 大小成 反比; 与 混合物 
中各组 分的电 泳迁移 率差异 的大小 成反比 ;与样 品的浓 
度大 小则成 正比。 已经分 开的样 品中各 组分的 条带宽 
度和 浓度依 赖于各 自 迁移率 的大小 , 而 且被先 导离子 的浓度 和迁移 率大小 所控制 : 当先导 
离子 的浓度 和迁移 率均增 大时, 各组分 的条带 宽度将 减小而 浓度则 增加。 

ITP 的分辨 率适中 ,样品 带的扩 散效应 较小, 适于 分离成 分不复 杂的, 而且其 中的几 
个 组分需 同时纯 化的混 合物。 其缺 点是系 统设置 和操作 都比较 复杂, 需要 一定的 经验来 

. 111 . 




4 7 10 13 16 19 22 25 28 



-0.21 管号 

图 7.12 自由流 区带电 泳分离 

血红 蛋白和 BSA 
分离腔 : 205mm x 60mm x . 8mm, 
缓冲 液流速 : 2 . Oml/mip , 样品 流速 : 
1 .Oml/h ,电压 :300V, 电流 32mA 



建立 合适的 体系。 所以, 等速电 泳在蛋 白分离 纯化方 面的应 用远没 有其他 几种工 作模式 
那样 广泛。 

(3) 等 电聚焦 (IEF) 

等 电聚焦 是将样 品置于 pH 梯度中 移动直 至净电 荷为零 时停滞 不动而 聚焦, 使含不 
同等电 点的组 分得到 分离的 过程。 不同 于其他 IEF 的是, 在 连续流 等电聚 焦中, pH 梯度 
的 形成可 有多种 方式。 常用 的是直 接将含 有一定 pH 范围的 两性电 解质和 分离介 质泵入 
分离腔 ,在电 场的作 用下, 形成一 天然的 连续的 pH 梯度, 待稳 定梯度 (大于 30min) 形成后 
再进样 作进一 步的聚 焦分离 ,整个 过程需 2h 以上。 还 有一种 是在不 同的输 人口以 平行的 
方式 同时泵 入不同 pH 的 几种介 质使形 成一人 工的不 连续的 pH 梯度, 通 常仅需 5〜 
lOmin 就能达 到稳定 梯度, 样品也 可与介 质同时 输入, 但这种 方法样 品的聚 焦程度 不如前 
者。 Weber [44] 认为, 利用多 种不同 pH 值 的缓冲 液所形 成的这 种人工 pH 梯 度具有 足够强 
的条 带聚焦 效应, 可以 抵消部 分样品 带的流 体变形 效应, 从而 提高自 由流电 泳的分 辨率。 

等电 聚焦过 程本身 是一样 品聚焦 和浓縮 的过程 , 因此 其条带 扩散现 象较小 , 常 可用来 
进一 步纯化 样品。 但其产 率较低 ,聚焦 所需时 间长; 蛋白 质在等 电点附 近溶解 度小, 易沉 
淀析 出而导 致分离 失败。 另外, 商品 化的两 性电解 质混合 物比较 昂贵, 并会 与某些 蛋白发 
生相互 作用, 同时, 收集 的样品 中的两 性电解 质的去 除也是 问题, 且 不适合 用来分 离活性 
细胞。 

图 7.13 为 标准蛋 白质的 等电聚 焦分离 图谱。 分离 
介质为 0.50/0 两性电 解质, 含 30/0 甘油; 阳极电 极液为 
lOOmmol/L 磯酸, 阴极电 极液为 50mmol/L 氣氧 化钠。 
样品浓 度各为 10/0。 
(4) 电场梯 度电泳 (FSE) , ' 

在这种 模式中 ,将两 种缓冲 组分相 同但浓 度相差 10 
倍以 上的分 离介质 (pH 值 相同) 平行 泵人分 离腔, 通常 
在靠 近电极 处为电 导高的 介质, 而 腔中心 区域为 电导低 
的介质 ,样 品在低 电导介 质区域 内连续 泵入分 离腔, 并 
利用 腔内形 成的不 连续的 电导梯 度进行 分离。 当样品 
进入电 场后, 由于低 电导区 域的场 强大大 高于高 电导区 
域的 场强, 欲 分离物 质根据 其电荷 迅速向 相应的 电极侧 
迁移 , 当 迁移至 电导交 界处时 , 由 于 场强的 骤降, 迁移速 
率 迅速变 小而在 界面附 近浓集 起来。 

电场梯 度电泳 的一个 显著特 点就是 其物料 流通量 
很高, 这主要 是因为 它所需 的停留 时间一 般都比 较短, 一 般小于 5min 即可。 另一 个特点 
是在 不同电 导区的 边界处 有很强 的浓缩 效应。 在高 电压、 短停留 时间的 操作条 件下, 提高 
进 样速率 以及增 加进样 宽度都 可增加 物料流 通量从 而提高 产率。 尽 管增加 进样宽 度将导 
致样品 峰的拖 尾现象 ,降 低浓缩 效应, 但对产 率的提 高影响 不大。 在 电场梯 度电泳 中虽然 
其浓縮 效应可 使样品 带的扩 散受到 限制, 但其分 辨率仍 显著低 于区带 电泳。 

在这种 分离模 式中, 分 离结果 的好坏 与样品 的处理 相关。 样品 要求具 有较低 的电导 
值, 因为样 品的电 导增加 少许即 可使浓 缩效应 降低, 物质的 迁移速 率同时 降低。 另外, 由 
. 112 • 




图 



管号 

13 自由流 等电聚 焦分离 



BSA ,血 红蛋 白和细 胞色素 C 
缓冲液 流速: llOml/h, 样品 流速: lml/h, 
电压 : 600 ~ 1 200 V ,电流 : 1 5mA 



于其 浓缩效 应剧烈 时会引 起沉淀 现象, 因此对 样品的 
起始浓 度亦有 一定的 限制。 

除上述 4 种模 式外, 还可将 不同分 离模式 联合起 
来使用 ,最 常见的 是联合 的电场 梯度区 带电泳 (com- 
bined field step- zone electrophoresis, FSE/ZE) 。 在这 
种联合 模式中 ,介 质的设 置和分 离原理 均与电 场梯度 
电泳 类似, 惟一 不同的 是以区 带电泳 的细带 进样, 而 
不是 电场梯 度电泳 的宽带 进样。 这种 模式的 分辨率 
比电场 梯度电 泳高, 同时 其条带 扩散现 象比区 带电泳 
有明显 改善, 且其产 率适中 ,因 此适合 于分离 成分不 
太复 杂的混 合物。 

图 7.14 为天 花粉蛋 白的最 终纯化 图谱。 分离体 
系 pH 为 7. 9, 分离缓 冲液为 lOmmol/L 三乙 醇胺, 含 
5% 甘油; 电 极液为 lOOmmol/L 三乙 醇胺; 稳 定介质 
为 lOOmmol/L 三乙 醇胺, 含 5% 甘油; 反向 介质为 
5% 甘油。 样 品蛋白 浓度为 4.2mg/rnl。 



0.10 



0.08 



0.06 



0.04 



0.02 



0.00 




管号 

图 7.14 自由 流电泳 FSE/ZE 模式 

纯 化天花 粉蛋白 

缓冲液 流速: 500ml/h , 样 品流速 : 2 . 3ml/h , 
电压: 1600V ,电流 :75mA 



五、 自由 流电泳 的应用 



自 由流电 泳由于 其连续 和温和 的分离 条件, 适合于 多种生 物活性 物质的 分离, 从小分 

子、 蛋 白质、 DNA 、脂 质体、 膜物质 、细 胞器到 完整细 胞等, 涉及到 生物学 、生物 化学、 细胞 
学等多 个学科 领域。 

(1) 小分子 

生 物样品 中 的一 些大分 子物质 可通过 透析、 超离心 、凝 胶色谱 等方法 除去, 但 一些小 
分子的 去除反 而比较 困难, 而自 由流电 泳则为 其分离 提供了 可能, 并 且经过 CFFE 分离的 
样品可 直接用 于红外 、核磁 共振和 质谱的 分析。 

ITP 模式 适合于 分离小 分子。 Hirokawa 用 a- 经 丁酸或 酒石酸 为介质 从核燃 料废弃 
物中以 ITP 模式 分离铂 分子, 之后以 颗 粒诱导 的 X 射线 方法测 得其 中主要 的阳离 子的回 
收率为 100%; 还 以醋酸 分离体 系分离 带负电 的克菜 红染料 和荧光 染料。 FSE 模 式成功 
地 应用于 经离子 对色谱 分离后 组分中 混有的 离子对 试剂的 分离。 

(2) 多肽和 蛋白质 

不管在 地面还 是空间 ,蛋 白质、 酶或 一些酶 解产物 已成为 CFFE 广泛 应用的 对象, 尤 
其是蛋 白质, 还 经常被 作为模 型样品 来研究 CFFE 所包 含的现 象以及 现象的 消除, 并用来 
试验 分离装 置的可 行性。 

Hoffstetter-Kuhn 和 Wagner [45] 把从 酵母蛋 白粗提 物中纯 化乙醇 脱氧酶 (ADH) 作为 
模型, 深入地 研究了 放大型 CFFE 电泳在 工业领 域进行 酶的纯 化方面 的潜力 和限制 因素, 
指出 FSE/ZE 在蛋 白质纯 化上的 潜力。 他们对 介质的 pH 、电导 、停留 时间、 分离电 压以及 
样品进 样速率 、浓度 等进行 了探讨 ,经 条件优 化后, 以三 个进样 口同时 进样, 可得到 2.7 
g/h 的物料 流通量 ,样 品提纯 4.7 倍, 总产 率达到 90% 以上 的分离 结果。 

. 113 • 



8&1111等 [46 ] 人对 t-PA 进行 了分离 纯化, 使用 5mmol/L 的 醋酸- 醋酸铵 介质, 同时在 
分 离介质 中加人 0.05% 的吐温 80 以减 小吸附 现象, 得到 80% 以上 纯度的 样品, 并 可直接 
用于 糖基化 研究和 N 端测 序。 

10)8673等 [47] 人, 纯化了 几种蛋 白质和 多肽: 蜜蜂 毒液、 肿 瘤坏死 因子、 白 细胞介 

素、: /干 扰素和 超氧化 物歧化 酶等。 应用 CFFE 分离蛋 白质的 例子还 很多, 如鸡和 鹅的红 
细 胞中组 蛋白的 分离、 HeLa 细胞中 NADH 氧 化酶的 抗癌性 橫酰尿 抑制剂 和抗性 形式的 
分离、 扁豆凝 集素的 制备、 干扰素 的纯化 、天花 粉蛋白 的纯化 : 39 ] 等。 

空间 电泳分 离的蛋 白质, 目前 以模式 蛋白质 为多, 如血红 蛋白、 血清 蛋白、 白蛋白 、细 
胞色素 C 、血红 细胞生 成素、 胰蛋白 酶抑制 剂等, 也 有分离 培养基 质中的 目标蛋 白的。 

(3) DNA 

DNA 片段的 电泳分 离已很 成熟, 主要 是凝胶 电泳。 以 CFFE 分离 DNA 并不多 ,但自 
Bier 等 [48] 人 将几种 成纤细 胞株中 分离的 中期染 色体以 CFFE 研究其 电泳迁 移率, 并以细 
胞 遗传学 方法和 流式细 胞术都 证明了 CFFE 分 离对染 色体的 形态和 稳定性 均无影 响后, 
人们开 始注意 DNA 的 CFFE 分离。 最近, 日本 在空间 成功地 分离了 C.degam DNA [49] , 
取 得令人 兴奋的 结果。 

(4) 膜物质 、生物 颗粒、 细胞 

几乎 没有一 种更合 适的分 离方法 可替代 CFFE 来分离 膜物质 、生物 颗粒和 细胞。 不 
同于其 他分离 对象, 为了保 持样品 的生物 活性, 在 分离过 程中的 pH 必须保 持在其 生理容 
忍范 围内, 同时 为了提 供等渗 环境, 有时还 需在介 质中加 人一定 的蔗糖 、葡萄 糖等。 

膜 物质的 CFFE 分离 引起了 很多生 物化学 家和生 物学家 的广泛 注意, 许多膜 物质已 
用 CFFE 得到 分离, 其中人 们研究 较多的 有内体 、高尔 基体、 质膜、 液泡、 线 粒体和 溶菌酶 
以及一 些特殊 的膜物 质如披 网格蛋 白小泡 、胰岛 素响应 的葡萄 糖转运 活性小 泡等。 

以 ITP 模式 可对生 物颗粒 和细胞 器进行 分离。 Volkl [5 G ] 将小鼠 肝内细 胞器被 分离成 
过 氧化物 臃 蛋白 质和微 粒体的 蛋白包 含体; Lackner 等将胆 固醇、 甘油 三酯、 卵磯酯 、神经 
鞘 隣脂和 转脂蛋 白等主 要颗粒 群体进 行了分 离纯化 及功能 研究; 5?3&^等 [5 1 ] 人纯 化了猪 
胰酶原 颗粒。 还有人 从云杉 中分离 出完整 的叶绿 体等。 

Hymer等 [52] 应用 CFFE 在 微重力 下从培 养的小 鼠脑垂 体前体 中分离 纯化了 含有生 
长激 素的胞 质分泌 颗粒, 并与地 面结果 相比, 发 现在轨 细胞有 更高的 电泳迁 移率, 表明暴 
露 于微重 力下的 细胞表 面静电 荷密度 会发生 改变。 

对于 细胞的 分离由 于其所 要求的 生理环 境很苛 刻及不 易保持 其生物 活性, 使 一些常 
规的分 离方法 显得无 能为力 ,然而 不同的 细胞其 表面积 的负电 荷密度 一般都 有差异 ,因此 
可用 CFFE 来进行 分离, 同时因 CFFE 的独 特性, 使 其备受 细胞学 家和生 化学家 们的青 
睐。 人们 已开展 地基和 空间的 细胞分 离研究 工作, 并有数 百种细 胞应用 CFFE 得到 分离。 

早在 60 年代, Hannig 和 Zeiller 等人 就已开 始进行 免疫系 统中各 种细胞 的分离 工作, 
在 分离分 化和激 活不同 时期的 B、T 淋 巴细胞 的过程 中证明 了 CFFE 是一 种强有 力的研 
究 方法。 Bauer 和 Weber 在细胞 生存力 和电泳 分离条 件的关 系上作 了大量 的研究 ,并提 
出 介质中 氯化钠 浓度至 少达到 35mmol 以上, 才可能 满足分 离后细 胞的生 存力的 要求; 同 
时, 他们 还发展 了三种 很好的 细胞分 离缓冲 液系统 [53 ]。 现在, B 和 T 淋巴 细胞已 经可以 
通过自 由流电 泳大量 地进行 制备。 
. 114 . 



精子 是一种 特殊的 细胞, 它本 身就具 有移动 能力。 但由 于带有 X 染色 体的精 子与带 
有 Y 染色体 的精子 具有不 同的表 面电荷 密度, 所以同 样可用 自由流 电泳对 其进行 分离。 
Kaneko 等 [ 54 3 人和 Engelmann 等 [ 55] 人用 自 由流 电泳均 得到了 lOOo/o 纯 化的含 X 染 色体和 
80% 纯 化的含 Y 染色 体的人 精子。 

自 由流电 泳还可 用于临 床上的 血液细 胞快速 
检测, 以监 测身体 的病变 情况。 Valet 等 [ 56] 人通过 
对绵 羊红细 胞群体 动力学 的研究 发现, 在幼 羊的血 
液中存 在三种 红细胞 群体, 其 电泳图 谱表现 为在幼 
年动物 中有两 个峰, 而 在成年 动物中 只有一 种红细 
胞。 将每天 的电泳 图谱依 次排列 起来, 可清 楚地看 
到整 个变化 过程。 

图 7. 15 为 我们实 验室对 人和兔 红细胞 的分离 
图。 分离缓 冲液为 15mmol/L 三乙 醇胺, 4mmol/L 
醋 酸钾, lOmmol/L 葡 萄糖, 240mmol/L 甘 氨酸, 
30mmol/L 庶糖, pH7.2。 

为 了能对 那些电 荷密度 差异不 大的细 胞进行 
分离, 人 们还发 展了抗 原特异 性电泳 细胞分 离法和 
以后 的免疫 自由流 电泳, 使细胞 的电泳 分离更 
广泛。 

在空 间进行 过的细 胞电泳 对象, 以不同 种类的 红细胞 为多, 也有肾 细胞、 脾细胞 、淋巴 
细胞 和骨髓 细胞。 




1 7 19 25 3137 43 49 55 6167 73 
管号 

图 7.15 自 由流电 泳分离 人和兔 红细胞 
缓冲 液流速 : 2 . 7ml/min ,样 品流速 : 1 . 38ml/h, 
电压: 400V ,电流 :63mA 



穴、 自 由流电 泳在微 重力下 的特点 



颗粒 沉降、 小滴沉 降和热 对流是 影响自 由流电 泳的三 种重力 现象, 在微 重力条 件下这 

些现象 几乎完 全消失 ,这使 CFFE 的放 大在空 间有可 能得到 实现, 而 且也只 有空间 条件才 
是消除 重力依 赖的影 响因素 的惟一 机会。 

在地基 条件下 ,为了 减小热 对流, 分离 腔的厚 度必须 保持在 0.5〜0. 8mm 内, 并且还 
必需 有十分 有效的 冷却。 另外, 样品 流的直 径约为 分离腔 厚度的 1/3 时, 样 品在介 质流的 
Posseuil 流影 响下可 达到最 大速度 迁移。 上述 所有条 件都限 制了样 品的上 样量。 微重力 
条件下 ,分离 腔内的 热对流 几乎完 全消失 ,因此 ,从理 论上讲 可大大 增加分 离腔的 间隙, 以 
提高 样品上 样量。 然而, 仍有两 个对立 的因素 限制了 CFFE 在空间 的无限 放大, 使 放大终 
究有 一定的 限度。 因为: 其一, 在 冷却玻 璃板和 分离腔 一半厚 之间仍 存在由 焦耳热 引起的 
温度 梯度, 所以 在空间 条件下 也应控 制分离 介质的 温度, 使其 在蛋白 质等活 性材料 的变性 
温度 以下。 其二, 冷 却能力 限制了 分离腔 厚度的 上限。 通常, 腔厚度 增加将 明显降 低腔内 
液流 的散热 效果, 加大腔 内温度 变化; 而温 度增加 It: , 会使电 泳迁移 率增加 3% , 从而降 
低了过 程的分 辨率。 考虑到 这些, 介质流 的厚度 实际上 最大为 3〜5mm。 然而, 即使这 
样, 在分辨 率保持 基本不 变的情 况下, 物料流 通量仍 能增加 约一个 数量级 ,甚至 更高。 

与地 基条件 相比, 在微重 力下由 于沉降 现象的 消失可 使用更 高浓度 的样品 上样, 使物 

. 115 . 



料流通 量进一 步提高 5〜10 倍 (依赖 于被分 离的生 物材料 )。 这种提 高可以 认为是 由于在 
微重 力下避 免了微 滴的形 成而实 现的。 

许多学 者以理 论模型 预言在 微重力 下将能 使用更 大的分 离腔、 更高的 场强、 得 到更好 
的分辨 率以及 更大的 样品流 通量。 在过去 20 年的 空间电 泳中, 对蛋 白质和 生物大 分子的 
分离, 证实了 微重力 条件主 要提高 了流通 量和分 辨率, 如 美国的 CFES 实验 指出空 间流通 
量 将提高 718 倍; 对颗 粒的空 间分离 证明了 运用高 场强和 大分离 腔的可 能性, 同时 也证实 
了对 流和沉 降消失 后对分 离有利 的理论 分析。 此外, 在空间 对细胞 的分离 也证实 了在空 
间可 有更宽 的操作 条件; 这些都 至少证 明了微 重力的 确为自 由流电 泳提供 了相当 优越的 
环境。 

七、 展望 

自由流 电泳的 发展经 历了较 长一段 时间, 逐 渐向人 们展示 了它的 潜力, 一些其 他分离 
方法, 尤其在 制备级 上无法 比拟的 潜力。 同时, 它还是 一个合 适的开 展电泳 理论研 究的对 
象, 如探讨 热对流 、各种 动力学 变形、 微重 力等对 电泳的 影响。 而空 间电泳 在分辨 率和流 
通量上 的提高 ,更 吸引了 众多的 生化学 家的注 意力。 但由于 空间电 泳的高 成本, 决 定了候 
选样 品是那 些在地 面不可 能在纯 度和量 上达到 要求的 样品, 或是那 些具有 极高商 业价值 
的样品 ,如其 年产量 价值至 少达到 1000 万美 元以上 的目标 产品。 

在未 来空间 站上, 生物样 品的纯 化不只 是一个 简单的 过程, 它可 组合不 同的生 物分离 
技术通 过一系 列的生 物过程 最终得 到设计 的目标 产物。 在此 之中, 细胞电 泳可用 于分离 
空间 电融合 所产生 的杂交 瘤细胞 或其他 细胞, 纯化的 细胞再 作为空 间生物 反应器 中的种 
子细胞 , 在培 养基质 条件下 , 使之 产生大 量细胞 , 然 后维持 细胞在 有利于 产生分 泌激素 、抗 
体等产 品的条 件下使 之富集 ,最后 将富集 的目标 产品以 空间电 泳一步 纯化。 在此方 案中, 
将 这些生 物技术 组合在 一起对 空间筛 选新样 品是相 当有潜 力的。 微 重力研 究也早 已证明 
了其中 每一过 程的优 越性, 其中空 间电泳 、空间 电融合 和空间 生物反 应器已 在空间 分别得 
到 飞试, 而流式 细胞仪 也已为 空间站 的使用 在不断 发展。 

自由 流电泳 用于蛋 白质组 研究已 有报道 [57] 。 蛋 白质组 的研究 实质上 是在细 胞水平 
上对蛋 白质进 行分离 和分析 ,从 技术方 法上, 目 前主要 以双向 凝胶电 泳分离 和质谱 分析为 

支 撑技术 (见有 关章节 )。 传统的 双向凝 胶电泳 由第一 向等电 聚焦和 第二向 SDS-PAGE 
组成, 虽然 其一次 能分离 到上千 个蛋白 质点, 但有其 固有的 缺陷, 如 严格限 制样品 的上样 
量 (通常 5(Vg〜lmg) ,第一 向到第 二向存 在低转 移效率 ,样 品在样 品缓冲 液中的 低溶解 
度, 许 多蛋白 尤其是 膜相关 蛋白和 低拷贝 数的蛋 白得不 到检测 等等。 因此 Simpson 等 [57] 
人 以自由 流电泳 的等电 聚焦模 式结合 SDS-PAGE 对 结肠癌 细胞系 LIM 1215 进行 了分离 
和质谱 分析, 鉴定到 36 个蛋 白点。 此法 一方面 可提高 样品的 上样量 (连 续进样 ), 另一方 
面可 提高样 品的回 收率, 自 由流 电泳收 集的样 品仅有 1% 用于 SDS-PAGE ,剩 余的 99% 可 
用来 研究目 标蛋白 质的性 质及其 进一步 的结构 特性, 研 究细胞 信号传 导的复 杂性, 作进一 
步的细 胞作图 的蛋白 质组学 研究。 另外, 以自 由流电 泳取代 传统的 凝胶等 电聚焦 进行的 
二向 电泳, 还 可用来 分离细 胞器。 我们 实验室 利用自 由流电 泳的区 带模式 结合混 和酶解 
及质谱 分析, 也得到 一定的 结果。 
• 116 • 



我们 相信, 随着电 泳仪和 操作条 件的不 断完善 ,以及 将来空 间站所 提供的 便利, 自由 
流电泳 必将发 挥越来 越大的 作用。 

第三节 液相等 电聚焦 

蛋白 质的分 离方法 可依赖 于蛋白 质的各 种不同 性质来 区别, 如质量 、形状 、电荷 ,疏水 
性、 亲和 性等, 或 者结合 这些因 素中的 几项。 大 多数工 作者在 聚丙烯 酰胺凝 胶或琼 脂糖凝 

胶上 电泳, 其 目的是 分析, 如等电 聚焦、 SDS- PAGE 、双向 电泳, 都有很 好的分 辨率, 广泛用 
于 生物学 研究和 质量控 制中。 而用这 些技术 进行制 备量是 非常困 难的, 因 为上样 量通常 
为 0.1〜2/^g ,而且 很难从 凝胶上 回收蛋 白质。 与分 析电泳 相比, 制备 电泳的 分辨率 较差, 
还存 在不少 困难, 譬如由 电场产 生的焦 耳热, 是正比 于电泳 体积; 尽 管可以 采取冷 却的方 
法, 但冷却 的效果 又反比 于其表 面积, 往往难 以抵消 产生的 热量。 等 电聚焦 作为纯 化蛋白 
质的 方法, 不仅具 有高分 辨率、 样品 高浓缩 效果, 以及可 以获得 高的回 收率, 而且可 以不改 
变 样品的 物理化 学性质 和生物 活性。 因此 成为蛋 白质分 离纯化 的手段 之一。 

目前, 用于蛋 白质制 备目的 的等电 聚焦有 多种, 根据 IEF 时所 用的支 持介质 的种类 
不同, 基本上 可以分 两类: 一类 是在液 体介质 中的制 备等电 聚焦, 是本节 的主要 内容; 另一 
类是在 凝胶介 质中的 制备等 电聚焦 ,这 里不作 介绍。 

制备 型液相 等电聚 焦的特 点是无 载体。 采用 无载体 系统, 仅在液 相中进 行等电 聚焦, 
就 不存在 从载体 上回收 样品的 问题。 此外, 上样量 可从几 微克到 克级, 满足 了制备 级的要 
求。 在无 载体情 况下, 要 解决样 品溶液 和分离 液体介 质的扩 散和电 泳时产 生热量 而引起 
的热 对流。 否则, 犹如牛 奶滴到 水中, 样品反 而稀释 ,更谈 不上等 电聚焦 纯化样 品了。 

我们实 验室应 用了旋 转式等 电聚焦 (rotofor) 、循 环式等 电聚焦 (recycling isoelectrofo- 
cusing,RIEF) 、连续 液相等 电聚焦 (continuous IEF, CIEF) 电泳 技术。 本节 将几种 类型的 
液 相等电 聚焦作 一简单 介绍。 

一、 旋 转式等 电聚焦 

(-) 概 况 

1983 年 Bier 报道 一种水 平式聚 焦柱, 它由 20~30 个平行 而有连 续的部 分组成 ,电极 
在两端 ,它们 之间管 道是相 通的。 整个聚 焦室周 围有一 陶瓷冷 却管, 聚焦室 围着中 央冷却 
棒旋转 (lr/min)[ 58 、 阻止了 热对流 和地心 引力对 蛋白质 分子的 影响, 这 种想法 最早在 
1967 年由 Hjerten 提出: 重力 影响可 以用电 泳柱围 着它的 水平轴 旋转而 减小。 

Rotofor 装置是 BioRad 公 司生产 的制备 IEF 仪, 是根 据区带 对流等 电聚焦 仪改进 
的, 是一种 制备级 的无载 体等电 聚焦仪 ,为蛋 白质的 纯化提 供了新 的选择 对象。 其 优点是 
在 反复的 聚焦过 程中, 使蛋白 质纯度 增加。 举例 来说, 如果某 种有意 义的蛋 白质经 第一次 
分离后 (两性 电介质 pH3〜9), 发现分 布在二 个或三 个收集 管内, 可对 此样品 采用相 应的更 
窄 pH 的两性 电介质 (pH4〜6) 进行 第二次 聚焦, 使纯度 增加。 该仪 器的特 点如下 所述。 

①等电 聚焦可 直接在 溶液中 进行, 不需 加稳定 介质。 聚焦 室含有 19 个 平行的 聚酯膜 
隔板, 使 聚焦室 分隔成 20 个 不连续 的间隔 部分。 等电 聚焦过 程中可 控制蛋 白质的 扩散。 

• 117 • 



② 在聚 焦室的 中心有 一指形 的陶瓷 冷却管 ,它 与聚酯 膜隔板 的膜芯 相联, 可阻 止电泳 
过程 中的热 对流。 

③ 在 IEF 过程 中聚焦 室可以 转动, 而 使地心 引力被 消除。 

④ 等电 聚焦结 束后, 可 将含有 20 个 针管的 收集装 置与聚 焦室内 20 个间隔 室相连 ,通 
过真 空吸引 能在几 秒钟内 收集到 20 个间 隔室内 已通过 IEF 分开的 蛋白质 而不被 混合, 
保持 pH 梯 度和等 电点蛋 白质。 

由于以 上一些 特点使 Rotofor IEF 制备电 泳仪分 离蛋白 质获高 分辨率 成为可 能 [59] 。 

(二) Rotofor 制备电 泳仪操 作步骤 

(1) 组装 

根据 Rotofor 制备 电泳使 用说明 书组装 好仪器 (图 7.16)。 




图 7. 16 Rotofor 制 备电泳 仪和取 样装置 



(2) 加样 

加样 品于聚 焦室内 (注 意不 要带人 气泡; 样品最 小体积 30ml ,最 大体积 55ml), 蛋白质 

样品 制备: 根据 蛋白质 的性质 可用以 下几种 溶液。 

溶液 1 : 样 品溶于 20/。 两性电 解质中 (pH 范围 根据需 要选用 )。 

溶液 2: 样 品溶于 3mol/L 脲和 2% 两性电 解质中 (pH 范围 根据需 要选用 )。 

溶液 3: 样 品溶于 911101/1^脲,2.5011 (3 -巯基 乙醇, lOmmol/L Naa,2% 两性 电解质 

(pH3〜10),l%两性电解质(pH5〜7)(pH根据需要选用)。 

每次 IEF 负载 量大约 1.5g 蛋白 质。 脲和非 离子去 剂可以 保证蛋 白质的 溶解。 

(3) 电 泳条件 

负极 电极液 O.lmol/L NaOH; 正极 电极液 O.lmol/L HsPQic 

样品加 入聚焦 室后, 盖上 盖子。 聚焦 室旋转 4t: 预冷 10〜15min 后, 加稳定 电压至 

300V ,检査 功率。 最后以 12W 恒定功 率进行 电泳。 电泳过 程中, 电 压会不 断上升 (最大 

电压 2 000V) , 电 流不断 下降并 恒定, 4h 完成电 聚焦。 

注意: 如 果起始 电压过 高可在 样品液 中增加 NaCl 浓度, 使电压 降低。 功率最 高只能 

保持 12W(41C), 过热会 损坏聚 焦仪。 
. 118 . 



(4) 取样 

电泳结 束后, 停止 仪器的 转动; 聚焦 室带有 取样孔 的一面 朝下, 将取样 装置连 接到减 
压水泵 ,盖上 取样室 盖子, 盖上的 20 支针 头同时 刺破聚 焦室取 样孔的 膜而伸 人聚焦 室内; 
通过 真空吸 引可在 几秒钟 内收集 20 个样品 于取样 室内的 20 支试 管中。 

(5) 电泳检 查电聚 焦样品 

20 个 IEF 后 的样品 可直接 测定每 一管的 pH。 取 小量可 分别进 行薄层 IEF (或 盘状 
IEF 和 SDS-PAGE 电泳 检查蛋 白质分 子质量 的检査 )。 如果 目的蛋 白质在 某一管 或分散 
在 几管中 样品用 水稀释 后可再 次进行 Rotofor IEF —次, 直至 纯的蛋 白质的 获得。 

(6) 等 电聚焦 后的栽 体两性 电解质 的去除 

① 由于 两性电 解质的 分子质 量较小 ,因此 透析的 方法可 以去除 它们。 

② 蛋 白质装 于透析 袋内, 通过 电泳, 使两性 电解质 泳出透 析袋。 

③ 如 等电点 沉淀出 的蛋白 质可用 离心法 收集, 用等电 点溶液 洗去电 解质。 

④ 用 60% 〜 100% 硫酸铵 ,在对 蛋白质 稳定的 pH 条件下 沉淀出 蛋白质 ,然后 用同浓 
度 的硫酸 铵再洗 3 次, 去除 两性电 解质。 

⑤ 可用 Sephedex 025 凝胶过 滤法, 去除 两性电 解质。 

⑥ 超滤 技术的 应用。 

我们研 制类似 的简化 仪器用 于分离 蛋白质 ,基本 结构和 Rotofor 相似, 但聚 焦柱由 12 
个 动片和 12 个定 片间隔 组成。 在电 聚焦结 束后, 动片转 动一个 角度, 便将 原来相 通的聚 
焦池分 成互不 相通的 12 个 独立的 小室, 然后分 别取出 样品。 图 7.17 是我 们用自 制的仪 
器制备 卵白蛋 白和细 胞色素 C ,在 收集 后再用 Mini- IEF 鉴定 [6 G ] 。 




6 7 8 9 10 II 12 IEF 
STD 



17 卵白蛋 白和细 胞色素 c 的 IEF 分离 
样品各 lOmg, 两性 电解质 pH3〜10, 
电压 230V ,持续 24h (无 冷却 系统) 



二、 循 环式等 电聚焦 

1. 原理及 其组成 

后来 Bier[ 58 3 又设 计了一 种循环 式等电 聚焦, 它 的原理 图如图 7. 18 所示。 
以 RF3 为代表 的循环 式等电 聚焦仪 主要由 5 部分 组成。 



119 




图 7.18 RF3 原理图 和装置 

(1) 聚焦 分离室 

聚焦室 是循环 自由流 等电聚 焦仪的 核心, 左右两 侧分别 为正极 和负极 小室, 离 子交换 
膜既 使其与 中间的 聚焦室 分开, 又通过 膜仍可 相通, 这 样电极 上产生 的气泡 就不会 干扰中 

央聚焦 室已分 离好的 介面。 电极室 的酸碱 也以高 速循环 流动, 可将 气泡赶 走而不 致影响 
电场。 中央 分离室 循环流 动的两 性电解 质由下 而上, 在正负 电极所 提供的 电场中 形成从 
正极 到负极 逐渐升 高的近 线性的 pH 梯度, 具 有不同 等电点 (pO 的蛋 白质" 对号入 座", 从 
而各自 分离。 ― 

聚焦 室是矩 形的, 两平行 的板之 间厚度 0.75mm ,液体 在其间 为一极 薄的幕 状流, 在 
蠕动 泵作用 下以较 快速度 从底部 30 孔进人 聚焦室 ,然后 由顶部 相应的 30 孔 流出, 再经外 
部管 道流过 冷却系 统得到 降温, 如 此反复 循环直 至聚焦 完成, 此时转 动三相 阔门, 分离聚 
焦好的 样品则 进人收 集器。 

(2) 热 交换器 

等电聚 焦过程 中不断 产生和 积累的 焦耳热 是影响 电泳效 果的不 利因素 之一, 大电流 
影响尤 为严重 ,同时 产生的 焦耳热 正比于 装置的 体积, 而冷却 效果只 正比于 它的表 面积。 
循环自 由流等 电聚焦 引进外 部冷却 系统, 聚焦过 程可以 控制在 合适的 温度下 进行, 避免了 
温度过 高而可 能对样 品生物 活性造 成不利 影响, 有效保 证了聚 焦后样 品生物 活性的 回收。 
控制温 度的作 用还在 于显著 地减小 对流, 防止 扩散, 使 聚焦达 到最佳 效果。 

(3) 端动泵 

蠕动泵 是液体 循环流 动的动 力来源 ,有两 种泵, 一种为 双向可 调速, 用 于驱动 两性电 
解质载 体和样 品的循 环流动 ,改变 泵的转 动方向 和速度 可以进 行进样 、驱赶 系统中 气泡、 
收集 样品等 目的。 另外一 组泵驱 动聚焦 池两侧 电极室 中电解 液的循 环流动 ,电解 过程中 
可 能产生 的气泡 在循环 流动过 程中及 时得到 排放。 

(4) 排气 泡装置 

排气 泡装置 在循环 流动过 程中的 主要作 用是排 除系统 在聚焦 过程中 可能产 生的气 
. 120 . 



泡, 还可. 以 在样品 体积较 小时在 此进行 加样。 

(5) 收集器 

聚焦后 的两性 电解质 pH 从第 1 管到第 30 管呈线 性分布 ,样品 则按其 等电点 分配于 
相应 的管道 中循环 流动, 循环 自由流 等电聚 焦采用 30 只收 集管组 成的收 集器, 在 蠕动泵 
的 作用下 分别对 应收集 , 避免了 聚焦后 目 标样品 的再 混合。 

2. RF3 的操 作步骤 

① 将 配制好 的阴极 (O.lmol/L 氢氧 化钠) 和阳极 (O.lmol/L 憐酸) 电极 液加注 到电极 
储杯内 ,将两 性电解 质溶液 (1% 两性电 解质, 10% 甘油, 105ml) 以针筒 注入分 离腔内 ,并 
注 意将腔 内的气 泡敲击 赶出。 

② 预 聚焦: 将电参 数设置 到最大 (150W,400mA,l 500V) 进行 预聚焦 30〜45min。 

③ 加样 : 待 电流下 降并稳 定于某 一值后 , 以 针筒注 人欲分 离样品 (5 〜 10ml) 。 
® 聚焦: 调低 电压至 1 000V ,聚焦 Ih; 之后 500V ,聚焦 0.5h。 

⑤ 取样 : 聚 焦结束 , 同 时关泵 和高压 , 并 将聚焦 好的溶 液赶至 30 管收集 管内。 

⑥ 检测: 收集的 样品作 pH 值和光 密度值 测定, 并 可做进 一步的 分离, 如将每 一管继 
续做 SDS-PAGE 电泳 分离, 或 将其中 的一管 或几管 重新进 行不同 pH 范围 的等电 聚焦以 
获得 更纯的 样品。 

⑦ 仪器 的清洗 :聚焦 结束后 的分离 腔应及 时进行 清洗, 保 证以后 的正常 使用。 依次以 
500 〜1 000ml 水, 300 〜 400ml 0. Imol/L 氢氧 化钠, 1 000〜 1 500ml 水, 200ml 10% 酒精冲 
洗 分离腔 , 排空电 极槽并 以水 冲洗 , 最后放 松泵。 

3. RIEF 的应用 

① 用于 酶的精 制纯化 [6 1 ] ,从米 曲霉 中初步 提纯的 DNA 核酸酶 ,经 RIEF 分离, 酶活 
性集 中在第 14 管, 活 性回收 82%。 

② 除去干 扰素中 的热源 [ 62] ,a - 干 扰素- 2 制 剂中含 有热源 , 影 响其临 床应用 , Nagab- 
hushan 等 人先用 pH3〜10 的两性 电解质 分离, 发 现样品 集中的 5〜8 管中有 抗病毒 活性, 
但仍 含有一 定量的 热源, 根据这 几管的 pH 在 5〜7 之间, 采用 pH4〜7 的两 性电解 质第二 
次聚焦 ,可将 干扰素 和热源 分开。 

我们实 验室以 标准蛋 白进行 RIEF 的分离 ,结 果见图 7.19。 
分 离样品 : 1 % 细 胞色素 C 、 1 % Hb 、 1 % BSA。 
(样 品需 经色谱 柱脱盐 或含低 盐浓度 ,用 . 45)um 微孔滤 膜过滤 ) 
电极缓 冲液: 负极 : . Imol/L 氢 氧化钠 正极 : . Imol/L 磯酸。 
分离室 缓冲液 及电泳 条件: 配成 1% 两性 电解质 (军事 医学科 学院产 品), 含 10% 甘 
油 , 共 105ml 注入 分离腔 , 进行 预聚焦 30 〜 45min, 电压 1 000V。 然后加 样再进 行聚焦 , 每 
隔 10〜15min 记录 电流和 功率, 直至电 流衡定 ,调 节电压 1 200V ,继 续聚焦 10〜15min ,最 
后 收集。 

样品 量大于 10ml ,可不 进行预 聚焦, 加去离 子水至 102. 5mK 含 10% 甘油) ,再加 4096 
两性 电解质 2 . 5ml , 直接进 行聚焦 。 

. 121 . 



" Cyto.C 




管号 

图 7.19 BSA 、血红 蛋白, 细 胞色素 c 的分 离纯化 

4. 讨论 

等电 聚焦早 期用单 个氨基 酸时, pH 范 围窄, 缓冲能 力差。 目前 大多用 两性电 解质, 这 
是一种 多氨基 多羧酸 , 具 有趋于 连续改 变的氨 基羧基 比 , pH 值连续 , 能 得到较 平滑的 pH 

梯度。 

两性 电解质 对某些 酶活性 有影响 [63 3, 限止 了它的 应用。 因此也 有用几 种氨基 酸衍生 
物 代替两 性电解 质建立 阶梯式 pH 梯度 的探讨 [64] ,Righetti 则采用 一种膜 建立固 定化的 
梯度 (immobilized gradients) 以代替 液相两 性电解 质 [65] ,最近 Hoefer 公司已 有此类 商品化 
的仪器 供应。 

两性电 解质的 质量对 结果有 影响, 有些 国产两 性电解 质的紫 外吸收 很高, 干扰 了蛋白 
质的 定量, 因为在 聚焦后 观察蛋 白质的 分布, 以测 280nm 的光 吸收最 方便, 又不 损失样 
品。 如两 性电解 质的紫 外吸收 很高, 以致无 法测到 280nm 的光 吸收。 有些 国产的 两性电 
解 质可能 含有盐 ,因 为在同 样实验 条件下 , 电流明 显偏大 , 这也 有影响 。 

关于如 何去除 IEF 纯化 的蛋白 质中的 Ampholine,Nilsson 等 [ 66 ] 人报道 ,用 i 4 C-Am- 
pholine 实验, 用 Sephadex 分 Ampholine 和 蛋白质 有两个 弊端, 一是回 收低, 二是样 品在此 
过程中 被稀释 ,作者 采用硫 酸铵沉 淀法, 原来 0.5mg/ml 的 crHaemolysin 和 5mg/ml BSA, 
Lysozyme 中放 射性为 (2〜5) X 10 6 cpm/ml ,在重 复沉淀 3 次后, 再把 蛋白质 溶解在 
O.lmol/L 憐酸 缓冲液 (pH7.0) 中, 完全测 不到放 射性。 

三、 制 备型连 续流等 电聚焦 

Weber 设计 了连续 自由流 等电聚 焦仪, 并 使之商 品化。 结构 和连续 流电泳 相同, 模式 
如图 7.20。 

0.5% 两性电 解质由 底部连 续进入 分离室 (1 道, 最多 5 道), 其 设计可 保证形 成稳定 
的 平流。 流经 分离室 时在电 场作用 下形成 pH 梯度。 

样品 由进样 口连续 进人, 在 pH 梯度下 ,蛋 白质根 据不同 等电点 (pJO 聚集, 分 离过程 
于 5 〜 lOmin 即 可达到 平衡。 由 于设计 是连续 性的, 在达平 衡后连 续进样 , 连 续收集 , 因此 
. 122 . 




1. 正极稳 流介质 

2. 负极稳 流介质 

3. 两性 电解质 

4. 反向稳 流介质 

5. 样品 



OCTOPUS 等 电聚焦 




1.1 反向稳 流介质 
1.2 正极稳 流介质 
1.3 两性 电解质 
1.4 负 g 稳流 介质 
1.5 样品 





2.1 介质泵 
2.2 样品泵 



3.1 分离腔 
3.2 收 集部分 



图 7.20 连 续流等 电聚焦 原理图 和仪器 结构图 



从理论 上讲, 制 备量应 是很可 观的。 

Weber 设计的 仪器长 500mm ,宽度 100mm ,厚度 0.5mm ,在分 离室的 后面有 冷却系 
统, 在 100mm 宽 度上有 96 收 集管。 

我们 以标准 蛋白质 进行了 CIEF 分离, 结 果见图 7.13( 本章 第二节 )。 



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126 



第八章 高效液 



相色谱 



对于 经典的 液相色 谱法, 流动相 在常压 下输送 ,所 用的固 定相柱 效低, 分析周 期长。 

20 世纪 60 年代末 ,引入 了气相 色谱法 的理论 ,在 技术上 采用了 高压输 液泵、 高效 固定相 
和高灵 敏度的 检测器 ,克服 了经典 液相色 谱法的 缺点, 具有 分析速 度快、 分离效 率高、 检出 
极 限低的 特点。 因此被 称为高 压或高 效液相 色谱法 (high performance liquid chromato- 
graphy, HPLOo 

第一节 高效 液相色 谱的类 型及分 离原理 

高效 液相色 谱的固 定相可 以是吸 附剂、 化 学键合 固定相 (或 在惰 性载体 表面涂 上一层 
液膜) 、离 子交换 树脂或 多孔性 凝胶; 流动相 是各种 溶剂。 高 效液相 色谱法 按组分 在两相 
间的 分离机 理分类 , 主要 可分为 : 

I 液 -固吸 附色谱 



1. 液 -固吸 附色谱 

液-固 吸附色 谱是以 液体为 流动相 ,以 固体吸 附剂如 硅胶、 活性炭 、氧化 铝等作 为固定 
相。 其基 本原理 是一些 物质在 同一吸 附剂上 的吸附 能力的 不同。 这 种吸附 作用的 本质, 
很 可能是 基质和 样品间 的非专 一的偶 极与偶 极间的 作用。 在样 品进人 色谱柱 以后, 经展 
开 , 吸附能 力差的 物质迁 移得快 , 吸附 性强的 物质移 动得慢 , 从而一 个混合 物中几 种物质 
就 可按其 吸附性 被彼此 分开。 分离 过程是 吸附与 解吸附 的平衡 过程, 也是 溶剂分 子与样 
品中溶 质分子 在吸附 剂表面 竞争的 结果。 这种 竞争吸 附同时 表现在 不同溶 质分子 的不同 
官 能团对 吸附剂 表面吸 附-解 吸附作 用的强 弱上。 

2. 液 -液分 配色谱 

液-液 分配色 谱的流 动相为 液体, 固 定相是 将固定 液涂渍 或键合 在惰性 载体表 面上。 
分 配色谱 是基于 样品中 各组分 在固定 相和流 动相之 间的分 配系数 不同而 进行分 离的。 可 
分为正 相分配 色谱和 反相分 配色谱 两种。 固定相 的极性 大于流 动相的 极性, 称为 正相色 
谱 , 这种色 谱通常 用于分 离极性 较强的 化合物 , 如酚类 、胺类 、经基 化合物 、氨 基酸等 , 分离 
顺序是 极性较 弱的组 分保留 值小, 先 流出色 谱柱; 固定相 的极性 小于流 动相的 极性, 称为 
反 相色谱 (reversed phase chromatography) ,它 是目前 高效液 相色谱 法中应 用最多 和最有 



高效液 相色谱 



液 -液分 配色谱 < 
离子交 换色谱 
凝 胶色谱 (排阻 色谱) 
亲 和色谱 



正相分 配色谱 
反相分 配色谱 



效的 方法, 常用于 分离非 极性化 合物, 分离 顺序是 极性较 强的组 分保留 值小, 先流 出色谱 
柱。 

反相色 谱固定 相有硅 胶键合 相填料 、多 孔碳固 定相、 苯乙 稀型共 聚微球 填料、 氧化铝 
或氧化 锆等作 为基质 的涂层 填料。 其中 娃胶键 合相填 料最为 常用, 大量的 是各种 院基硅 

焼的化 学键合 硅胶。 院 基链长 可以是 C2、C4、C8、Ci6、Ci8、C22 等, 但最常 用的是 Ci8, 又称 

ODS, 即十八 烷基硅 焼键合 硅胶。 

用反 相色谱 分离纯 化蛋白 质时流 动相的 选择应 满足: 在 210〜280nm 的紫外 吸收要 
小、 溶剂易 除去、 价格低 、毒 性小、 选择 性好等 条件。 常用 的有机 溶剂有 甲醇、 乙腈、 丙醇 
等。 常 用的离 子对试 剂有三 氟乙酸 (TFA)、 磷酸、 甲酸。 常用的 流动相 组成: A 液: H2(> 
0.1%TFA;B 液: H2OX- 0.1%TFA (X 为甲醇 、乙腈 、丙醇 、异丙 醇等, 按此 顺序流 动相的 
洗脱 能力依 次增强 )。 

3. 离子交 换色谱 

离子交 换色谱 (ion exchange chromatowraphy, lEC) 是目 前蛋白 质化学 中应用 最广的 
方法 之一。 其原 理是利 用物质 的带电 部分与 具有相 反电荷 的离子 交换剂 的相互 作用不 
同, 进而达 到分离 纯化的 目的。 因为 几乎所 有的生 物大分 子都有 极性, 都带 电荷, 所以离 
子交换 色谱广 泛应用 于生物 大分子 的分离 纯化; 又由于 离子交 换色谱 处理样 品量大 ,容易 
操作, 它已成 为生物 大分子 分离纯 化的重 要方法 ,在生 物大分 子的分 离纯化 中约有 75% 
的 工作采 用离子 交换色 谱法。 而 且由于 价廉和 纯化后 的蛋白 质多保 持原有 活性, 是生物 
大分 子分离 和纯化 中应用 广泛的 通用型 色谱。 

离子交 换色谱 固定相 的基质 有娃胶 基质和 有机聚 合物两 大类。 根据离 子交换 剂所带 
电荷 性质, 这 类色谱 又可以 分为阳 离子交 换色谱 和阴离 子交换 色谱, 其中当 离子交 换剂带 
阳离子 基团时 即可吸 附阴离 子样品 ,称 为阴离 子交换 色谱; 反之, 当 离子交 换剂带 阴离子 
基团时 ,可吸 附阳离 子样品 ,称 为阳离 子交换 色谱。 根据可 电离基 团的解 离度, 它 们又可 
分为 强的和 弱的离 子交换 色谱。 常见 的离子 交换基 团有, 弱阴: 一 NH2、 一 NHR — NRR'; 
弱阳: 一 COOH; 强阴: 一 NR3+ 、一 N + 三; 强阳: 一SOjHc 

离子 交换色 谱中所 用的流 动相为 盐的水 溶液。 依据 pH 和盐 浓度的 变化与 使用固 
定相的 种类, 可用 pH 梯 度或盐 浓度梯 度洗脱 (盐 浓度 一般由 O.01〜1.0mol/L)。 在绝 
大多数 情况下 , 以 IEC 法进 行分离 和纯化 的蛋白 质均保 持原有 的活性 , 但 是某些 特殊情 
况例外 ,如: 当蛋 白质的 活性部 位位于 可解离 的基团 上时, 用 IEC 分 离可能 失活。 考虑 
到蛋白 质的活 性时往 往较多 用弱的 离子交 换色谱 ,一些 较小和 较稳定 的分子 ,如 氨基酸 
和 小肽等 仍可用 强的离 子交换 色谱。 当然, 在测定 结构时 ,不 必考虑 活性, 只要 能达到 
分离的 目的, 可任意 选用。 

在离子 交换中 ,蛋 白在交 换剂上 的吸附 要置换 出在交 换剂上 的配衡 离子, 使流 动相中 
的 H+ 离子浓 度增大 或减小 ,从 而会影 响蛋白 的电荷 大小及 其在固 定相同 流动相 之间的 
分配 平衡。 为 维持流 动相中 pH 恒定, 应 用缓冲 溶液。 一般 推荐的 适合的 缓冲容 量应为 
lOmmol/L ,还要 注意缓 冲液不 应干扰 蛋白质 的交换 过程, 同时注 意温度 的影响 ,以 避免因 
此 影响蛋 白质的 分离和 纯化。 



128 



4. 尺寸排 阻色谱 

尺寸排 阻色谱 (size exclusion chromatography) 又 称为凝 胶过滤 (gel filtration) 、凝 胶色 
谱 (gel chromatography) 、分子 蹄色谱 (molecular sieve chromatography ) 。 这 类色谱 和吸附 
或交换 无关, 基本原 理是生 物大分 子进入 凝胶填 料后, 分子 大的不 能进人 凝胶的 小的孔 
穴 , 而分子 小的可 以进人 小的凝 胶孔穴 ,所 以, 分 子质量 大的先 通过凝 胶填料 , 而分 子质量 
小 的后通 过凝胶 填料, 从而达 到分离 纯化的 目的。 

排阻色 谱固定 相的基 质有硅 胶 [ 1] 和聚合 物 [2 , 3] 两种 基质。 硅 胶基质 的典型 代表是 
TSK-SW 系列, 是在 娃胶基 质上负 载亲水 性聚合 物层形 成的。 对于 聚合物 基质的 SEC 填 
料 , 经典的 有葡聚 糖凝胶 、琼脂 糖凝胶 和聚丙 '烯酰 胺凝胶 ,但它 们都是 软凝胶 , 不能 耐受高 
压, 难以实 现高效 分离。 现在常 用的聚 合物刚 性凝胶 有两种 :①高 交联度 (〉40%) 苯乙 
烯- 二乙' 烯基苯 共聚物 微球, 粒 度约为 lOptm ,孔径 分布范 围很大 ,为 10〜100nm ,耐 压达 
40MPa ,最高 使用温 度低于 1501C; ②经 基化聚 醚多孔 微球, 粒 度约为 l(Vm ,孔径 5〜 
200nm ,耐压 20〜30MPa ,使 用温度 10〜40t: 。 

在用排 阻色谱 分离蛋 白质时 ,一 般用等 度方式 洗脱, 通 常采用 盐离子 浓度在 0.05〜 
0.5mol/L 之间 的缓冲 溶液。 有时 为了增 加蛋白 质的溶 解度, 也会加 入有机 溶剂、 職或盐 
酸胍等 试剂。 

目前 所用的 凝胶过 滤的载 体可以 根据它 们的孔 径分为 很多种 不同的 规格。 每 种规格 
都有 其特定 的分级 范围, 一旦超 出分级 范围, 不论 是其上 限还是 下限, 即使 分子质 量有大 
有小, 但 载体的 排阻情 况基本 相同, 就无法 分离。 为此, 在使用 这种色 谱时, 要根据 所要纯 
化 的样品 的分子 质量选 择所用 的凝胶 过滤的 基质。 凝胶过 滤除了 可对混 合物进 行分离 
外, 还能 提供样 品分子 质量的 信息。 要较精 确地定 出样品 的分子 质量, 可以 用一系 列分子 
质 量不同 的标准 样品。 先分 别用大 于所用 载体上 限分子 (常 用的是 蓝色葡 聚糖, 分 子质量 
约 200 万) 和小 于下限 的分子 (可以 用有紫 外吸收 的氨基 酸或其 衍生物 ,也 可用有 色的盐 
类, 例如 Nia2), 测得它 们的洗 脱体积 ,用 以标定 凝胶过 滤柱的 \ ^。和 V,。 然后再 测定一 
系列已 知分子 质量的 标准样 品在柱 上的洗 脱体积 ,所 得的 一系列 (V^e - 。- 
V,) 和 标准样 品的分 子质量 的对数 成线性 关系。 测 得了待 测分子 质量的 样品的 Ve, 

再由 (Ve- Vi)/(\^。- V^,) 从标 准曲线 上可以 求得未 知样品 的分子 质量。 更为简 单的方 
法是以 log m 对 作图, 所得 的直线 也能作 为测未 知样品 的标准 曲线。 

也可 用此法 达到脱 盐和浓 缩大分 子质量 物质的 目 的, 但 是所用 的量均 不大。 

5. 亲 和色谱 

亲 和色谱 (affinity chromatography) 是一 种以样 品的生 物活性 为依据 的分离 分析方 
法。 生 物分子 的特点 是有其 专一的 活性。 例如: 酶分子 和底物 或抑制 剂的专 一结合 ;抗原 
和 抗体的 结合; 激素和 其受体 的结合 ;一 些维生 素和血 紫中的 运载蛋 白质的 结合; 凝集素 
和 糖类的 结合; 核酸和 有关的 结合蛋 白等。 如 果能将 上述的 例子中 的诸多 相互作 用体系 
中的 一方连 接到基 质上, 使之固 定化, 就有 可能分 离纯化 专一作 用的另 一方。 

亲和色 谱的固 定相由 基质、 空间臂 和配体 三部分 组成。 基质有 陶瓷、 聚苯 乙稀、 娃胶 
等。 空 间臂的 存在是 因为基 质的几 何位阻 常常限 制了分 离物与 配体的 结合, 所以, 为了使 

• 129 . 



配体能 与分离 物的作 用位点 起作用 ,在配 体和基 质间加 入一定 长度的 有机基 团即空 间臂。 
配体通 常是酶 、抗原 、抗体 、激 素、 核酸等 生物大 分子。 

亲和色 谱的流 动相主 要是一 些缓冲 溶液, 常 用的有 碟酸盐 (PBS) 、硼 酸盐、 乙酸盐 、柠 
檬 酸盐、 Tris-HCl 等缓冲 体系。 

为了能 有效地 进行分 离分析 ,在将 配体和 基质连 接时, 一 定要保 留配基 的生物 活性, 
即使用 的连接 方法不 能过分 剧烈。 同样 道理, 在样品 被亲和 在固定 化配基 以后, 所 用的解 
吸条 件也应 是尽可 能温和 , 以 免样 品 , 或固定 化配体 , 或这两 者失活 。 

亲和 色谱的 最大特 点是其 高效和 简便。 一旦 制备固 定化配 体后, 操作使 用非常 方便, 
通常 情况只 要在上 样后, 洗去 杂质, 就可将 所需的 物质解 吸下来 ,而 且所得 的物质 已有较 
高的 纯度。 这样的 方法可 以从含 量极低 的原料 中经一 次亲和 色谱就 能分得 所要的 物质, 
得率也 较高。 以血 装中的 维生素 B- 12 结合蛋 白为例 [4] ,这种 结合蛋 白在血 莱中的 含量仅 
5/1 000 万, 如 果应用 常规的 分离纯 化方法 (盐 析和离 子交换 色谱或 电泳等 ), 即使能 得到, 
得率也 很低, 采用固 定化的 维生素 B-12, 能很方 便地纯 化得这 一结合 蛋白。 亲和 色谱的 
过程也 是高度 浓缩的 过程。 亲和色 谱还有 两个另 外优点 ,是 其他的 分离纯 化方法 所不能 
比 拟的。 一是可 以从样 品中除 去大量 的杂质 ,产 率较高 的得到 少量的 物质; 二是可 以在活 
性物 质中除 去理化 性质几 乎完全 相同的 但已失 活了的 那些" 杂 质", 这一点 对提高 酶或其 
他分 子的比 活特别 有用。 

在 亲和色 谱中还 有三种 通用性 较强的 技术, 免疫亲 和色谱 [ 5 , 6 ]、 凝集素 亲和色 谱 [7 , 8] 
和染料 亲合色 谱 [9 ,1<"。 用蛋白 质抗体 耦联到 载体所 形成的 免疫亲 和柱可 用于作 为抗原 
蛋白的 分离和 纯化。 凝集 素是一 大类能 专一地 与糖类 及糖复 合物结 合的蛋 白质, 固定化 
的凝 集素则 可用于 糖蛋白 的分离 纯化。 . 

6. 疏水作 用色谱 

疏水作 用色谱 (hydrophobic interaction chromatography) 是利 用在高 的盐浓 度时, 蛋白 
质会吸 附在疏 水色谱 填料上 ,当降 低洗脱 液的盐 浓度时 ,它们 会按疏 水性的 强弱先 后被洗 
脱。 因疏水 作用色 谱有很 高的分 辨率, 所以是 生物大 分子分 离纯化 最有效 的分离 手段之 
一。 因其廉 价和纯 化后的 蛋白具 有生物 活性而 成为一 种较新 的发展 前途广 阔的专 门用于 
分离生 物大分 子的色 谱方法 ,并且 是一种 通用型 的分离 和纯化 蛋白的 工具。 

疏水 作用色 谱的原 理与反 相色谱 相同, 区 别在于 疏水色 谱固定 相表面 的疏水 性没有 
反相色 谱强, 所用 基质分 为有机 聚合物 (交联 琼脂糖 Superose 12 、TSK-PW 、乙稀 聚合物 
等) 和大 孔硅胶 键合相 两类。 疏水 配基有 苯基、 戊基、 丁基、 丙基、 经丙基 、乙基 、甲 基以及 
硅胶表 面键合 聚乙二 醇等。 

流动相 一般为 pH6〜8 的盐水 体系, (NH4)2S04、NH4Ac、NaCl 和磯酸 盐等都 是常用 
的盐, 其中 (NH4)2S04 应 用最为 广泛。 洗脱方 式采用 梯度洗 脱逐渐 减少流 动相中 盐的浓 
度, 使 蛋白质 与填料 间的疏 水作用 减弱而 使蛋白 质得到 洗脱。 和普通 反相色 谱相比 ,疏水 
作用色 谱的疏 水性小 ,且 流动相 中不采 用有机 溶剂, 蛋白质 变性的 可能性 较小, 有 利于蛋 
白 质保持 固有的 活性。 



130 



第二节 高效液 相色谱 的装置 



图 8.1 是高效 液相色 谱仪的 结构示 意图。 主 
要包 括输液 系统、 进样 系统、 分 离系统 和检测 系统。 

工作时 ,高 压泵将 r: 液 池中的 流动相 输入色 谱柱, 
然后 从检测 器出口 流出。 待测 组分注 人进样 器后, 
被 流经其 中的流 动相带 入色谱 柱进行 分离。 分离 
后 的各组 分依次 进入检 测器, 检测器 的响应 信号由 
记录仪 (或 装有色 谱工作 软件的 电脑) 记录 下来即 
得到 液相色 谱图。 



! r: 液池 



进样巧 



色消柱 



-试样 



数据处 
理系统 







检测器 



图 8.1 高效液 相色谱 仪结构 示意图 



液系统 



泵 是输送 流动相 液体的 动力, 人们希 望能得 到稳态 的连续 流动的 液体, 低流速 时的噪 
声尽 量小, 所以对 泵一般 有以下 要求。 ①流量 稳定。 这一 点非常 重要, 因为 流量的 稳定性 
直接 与保留 时间的 准确性 相关。 对于 4〜5mm 的 常规色 谱柱, 最常用 的流量 范围是 0.5〜 
2.0ml/min ,误 差应 不大于 1%。 ②耐 高压。 ③耐 腐蚀。 ④操作 和检修 方便, 特别 是流量 
调节、 高压密 封和单 向阔的 清洗和 更换等 ,要 求简便 易行。 

早期在 HPLC 中大量 采用的 是往复 式的活 塞泵, 有 的公司 采用低 扩散泵 , Isco 和 ABI 
公司 则采用 注射泵 (syringe pump) ,像 针筒一 样一次 推进, 这样没 有脉冲 (图 8.2)。 如果 
一 个泵是 20ml ,二个 泵形成 梯度, 总体 积就有 40ml。 

0.2ml/min,3 OOOpsi 



2ml/inin,l 500psi 



TTTTTTTT 



注射泵 

单活塞 
往复泵 

双活塞 (补偿 ) 
往复泵 

双活塞 (平行 ) 
往复泵 




注射泵 

单活塞 
往复泵 

双活塞 (补偿 ) 

往复泵 



双活塞 (平行 ) 
往复泵 



图 8.2 不同 泵造成 的脉冲 



2. 梯 度洗脱 

当样 品混合 物的容 量因子 /^' 范围 很宽, 当等度 (isocratic) 洗脱时 不仅耗 费时间 长而且 
后面的 峰太扁 平不便 检测, 这 时就需 要梯度 (gradient) 洗脱。 梯度 方式可 以是连 续的, 也 

. 131 • 



可以 是分段 式的。 梯度 洗脱可 以使分 析时间 缩短, 使所 有峰都 处于最 佳分离 状态, 而且峰 
形比较 尖锐。 

梯度洗 脱时溶 剂系统 可以是 二元、 三元, 甚至四 元的, 但 最常用 的是二 元溶剂 体系。 
所用设 备也有 好几种 ,大致 可分为 两类: 一 类是高 压梯度 (或称 内梯度 ), 即 按预先 设计的 
程序 分别用 两台高 压泵把 两种溶 剂打入 一个混 合器, 混合均 勾后再 进入色 谱柱, 此 法需两 
台泵 工作, 价格 较高, 但有流 量精度 高和梯 度洗脱 曲线重 现性好 的特点 ;另 一类是 低压梯 
度 (或称 外梯度 ), 即两种 溶剂按 一定程 序混合 ,随后 由一台 高压泵 打入色 谱柱, 此 法仅需 
一台泵 ,价格 便宜。 

二、 进 样系统 

HPLC 中 的进 样方式 有注射 器进样 、停 流进样 、 阀进样 、 自 动进 样器进 样等。 

(1) 注射 器进样 

即像 气相色 谱那样 , 用 微量进 样器针 头穿过 橡皮隔 膜进样 , 这是 最简便 的一种 进样方 
式。 而且由 于可以 把样品 直接送 到柱头 中心, 死体 积几乎 为零, 所以 往往可 获得最 好的柱 
效。 

(2) 停 流进样 

为了避 免高压 下操作 ,当使 用注射 器隔膜 进样时 可以停 泵断流 ,泄压 后注入 样品, 即 
停 流进样 , 随后再 开泵进 行色谱 分离。 

(3) 岡进样 

虽然由 于阔接 头和连 接管死 体积的 存在, 柱效 稍低于 注射器 进样, 但因耐 高压、 重复 
性好、 操 作方便 而深受 色谱工 作者的 欢迎, 其中六 通进样 闽最为 常用。 

(4) 自 动进样 器进样 

自 动进样 器多用 于洗脱 条件相 同且样 品量较 多时或 无人看 管的色 谱仪。 使用 微处理 
机 或电脑 来控制 六通闽 的采样 、进 样和 清洗等 动作。 

三、 分 离系统 

作为分 离系统 的色谱 柱一般 为不锈 钢管, 柱 内壁要 求精细 的抛光 加工。 分析 柱内径 
为 2〜6mm ,排 阻色谱 柱内径 粗些。 柱长 一般为 10〜50cm。 色谱 柱的装 填常用 两种方 
法。 对于直 径大于 2(Vm 的填料 ,一 般采用 干式装 柱法, 即将 填料通 过漏斗 加入到 垂直放 
置的柱 管中, 同 时敲打 或振动 柱管, 以得到 填充紧 密而均 勾的色 谱柱。 另一 种是勾 装法, 
此法用于直径小于20^aTl的填料,将填料用溶剂配制成勾装,然后用加压介质(己院或甲 
醇等) 在 高压下 将匀紫 压入柱 管中。 

有人 形容, 柱是 HPLC 的" 心 脏", 可见在 HPLC 工作 中选择 柱的重 要性。 因 为用不 
同的柱 ,因 其分离 机理也 不同, 得到的 效果也 不同。 通常 有反相 HPLC 、疏水 HPLC 、凝胶 
过滤 HPLC 、各 种离 子交换 HPLC 、亲和 HPLC 等。 

1. 柱性能 的判别 

对色谱 工作者 来讲, 柱效 是不离 口 的。 而 对一般 HPLC 用户 来讲, 对 此并无 概念。 
. 132 • 



在生 化界, 人们 在进行 SDS-PAGE 分析时 ,常 加已知 分子质 量的标 准蛋白 质在一 侧为对 
照, 已是一 种常规 程序; 而 在进行 HPLC 时, 很 少有人 先去检 查柱的 分辨率 和计算 柱效, 
因此在 出了问 题或感 到有问 题时非 常迷惑 ,不 知如何 着手检 査原因 和排除 故障。 

新柱到 货后, 厂方 都应有 检査柱 效的结 果报告 附上, 用户 可以据 此检査 验收, 但由于 
试剂、 水质、 仪器型 号等方 面的差 异和运 输过程 的影响 ,按 常规, 柱效 允许有 10% 的 差别。 

柱的分 辨率和 柱效的 测定, 一般采 用几种 化合物 为标准 在特定 的条件 下进行 分离, 并 
据此 结果计 算柱效 [ 11 ] 。 参见图 8.3 和表 8.1 以 Beckman 公司的 反相柱 为例, 采用 一些小 
分子化 合物, 配伍 如下: 乙酰苯 33mg ,硝 基苯 59mg ,苯 2g ,甲苯 3g ,溶于 3L 甲醇中 备用。 
进样 5/utl,254nm 检测 [iij。 



38 r 




4.4 4.6 
log 分 子质量 



图 8.3 柱 效测定 和对称 性测定 
柱 : LiChrosorb RP-8 , 250mm x 4 . 6 讓; 
洗 脱液: ACN/H2O 75/25 
进样 : 1(V ,纸速 : 2 . Omm/s , 压力 : 23 . Obar , 
检出: 254nm,0.25AU lOOmV FS 



图 8.4 



TSK 3000PW 的 凝胶过 滤测定 蛋白质 

分 子质量 

样品: 细 胞色素 C ,肌红 蛋白, 卵清 蛋白和 BSA; 
流动相 :20mmol/L PBS,0.3mol/L NaCl,pH7.0; 
流速 : . 2ml/min , 检测 : 280nm , 40V 



在鉴定 Phenyl 5PW 柱 时用丙 酮为标 准品, 水作流 动相; 在鉴定 CAA-HIC 柱时用 a- 胰 
蛋白 醉原为 标准品 (5mg/ml ,进样 5W),3.0mol/L(NH4)2SO4/0.5mol/L NHiAc,pH6.0 和 
0.5mol/L NH4OAc,pH6.0,20min 内线 性梯度 洗脱; 在鉴定 DEAE 柱和 CM 柱时, 分 别用尿 
酸 (0. Img/ml) 和色胺 (0. Img/ml) 作标 准品; 在鉴定 G2000SW 或 G3000SW 时 分别用 葡聚糖 
(500 000D&),PEG(7 500D& 和 PEG 3 000D&) 或已 知分子 质量的 蛋白质 为标准 (图 8. 4, 本实 
验室结 果)。 此 外还有 Cyano、IP、Si 等柱, 都可 在厂商 的资料 中査阅 到有关 信息。 

表 8.1 柱效和 对称性 等测定 



组成 /lOOml 


苯 


萘 




1,2- 苯并蒽 


40.00 


3.70 


0.19 


0.95mg 


保 留时间 /s 


223.9 


268.7 


348.1 


445.4 


容 量因子 


0.8 


1.1 


1.8 


2.6 


峰 对称性 


1.2 


1.2 


1.2 


1.2 


HETP/^im 


28.6 


27.9 


29.3 


31.1 


理论 塔板数 /m 


35020.5 


35879.1 


34147.4 


32128.0 



133 



以 应用生 命系统 (applied biosystem) 的 微柱为 
代表, 直接采 用一些 标准蛋 白质来 鉴定反 相柱、 离 
子交 换柱、 疏水柱 的分离 效果, 这对 生物化 学工作 
者来讲 ,更加 直观。 图 8.5 为本 实验室 结果。 




这 5 种蛋 白质依 次是: 细 胞色素 C 、胰 岛素、 乳 
白蛋白 、碳酸 酐醃、 卵白 蛋白。 有时 也用核 糖核酸 
酶、 溶 菌酶、 胰凝乳 蛋白酶 原等。 (3- 乳球蛋 白的胰 
蛋 白 酶 酶解液 ( 多肽) 也用 作鉴定 柱效。 



2. 柱的 新进展 



图 8.5 5 种标 准蛋白 质的分 离图谱 
ABI RP-300(C8 柱) 30mmX2.1mm 




30、100、150、150mm 等。 微 柱的优 点如下 所述。 
分辨率 至少和 经典柱 一样, 长的 柱效果 更好。 
回收 率高。 因为 柱的载 体少, 非专 一性吸 附少。 

灵敏 度高。 由于 流速仅 100〜200/ul/min (经 典柱 Iml/min) ,样 品的峰 尖窄, 所 以检出 
灵敏度 提高。 

溶剂消 耗少, 节 省运转 费用。 以流速 lOCVl/min ,一 个流程 Ih 计算, 分 析一个 样品只 
需 6ml 洗脱液 ,约 仅消耗 3ml 乙腈。 - 



这种载体颗粒度为3〜5^011,表面无孔径,因此被分析的物质不会进入载体内部,而 
只在 载体表 面进行 吸附、 疏水结 合或交 换等, 故 可用于 蛋白质 和多肽 的快速 分析, 一般流 
速 1.5ml/min ,只 需几 分钟即 可完成 [1 3] 。 当应用 经典的 柱分离 生物大 分子时 ,通 常使用 
较慢的 流速, 因为 大分子 进出柱 介质孔 径结构 的速度 较慢, 如 果为縮 短时间 而采用 较快的 
流速, 则 分辨率 下降。 无 孔径载 体柱的 发展克 服了因 蛋白质 大分子 进入载 体颗粒 内部而 
引起的 局限性 ,解 决了高 流速时 样品峰 太宽及 拖尾等 问题。 



其载 体颗粒 结构中 含有两 类孔径 (6 000~80 000 人 的贯 穿孔和 800~ 1 500 人扩散 
孔), 克服了 传统填 料的传 质瓶颈 ,大 大提高 了传质 效率, 使 分离线 速度从 传统的 50〜 
360cm/h 提高到 1 000〜7000cm/h。 它比 常规的 HPLC 柱载体 的分离 速度快 10 倍, 30s~ 
3min 即可完 成高分 辨率、 高 载量的 分离, 是大量 制备蛋 白质类 产品很 有潜力 的方法 (图 
8.6)。 

(4) 毛细管 HPLC[i5] 

从 1986 年发展 了微柱 HPLC 分离蛋 白质和 多肽, 将 HPLC 流动相 流速从 经典柱 
(250mm X 4.6mm I.D. ) 的 Iml/min 降低到 SO/ul/min (用 两个 10ml 的注射 泵产生 梯度, 
这类泵 的优点 是没有 脉冲, 产生的 梯度平 稳)。 1995 年 Yamada 发展了 毛细管 HPLC ,用 
2.5ml 的注 射泵, 流速仅 5|Ltl/min; 样品 上样量 5〜25/^1; 柱为 150mmX0.5mm I.D. ;梯度 





图 8.6 灌注色 谱与经 典色谱 的比较 示意图 



时变 化小于 10nl/min。 收集 系统改 为毛细 管直接 点涂在 PVDF 膜上, 极其 方便地 定位峰 
和收 集样品 (图 8.7)。 如此 收集在 膜上的 样品, 可用刀 片割成 l〜2mm ,然 后放在 蛋白质 
序列仪 的反应 器上进 行序列 分析, Hsi 等用于 t- PA 的研究 工作中 ,分 析量在 300fmol〜 
lOpmol 之间。 




图 8.7 毛细管 HPLC 示意图 



从经 典的柱 (内径 4.6mm) 到微柱 (内 径约 2mm) , 再从微 柱到毛 细管柱 (内径 < 
0.5mm)o 一般讲 ,内 径小了 一半, 灵敏度 可提高 4 倍 (如从 经典柱 到微柱 )。 因此, 毛细管 
HPLC 的 灵敏度 比经典 柱有了 很大的 提高。 此外, 由于用 小内径 的柱, 流速 也相应 降低, 
又 使灵敏 度进一 步提高 (表 8.2)。 



表 8.2 柱 内径、 流速和 灵敏度 的关系 



柱 /mm 


流速 /(f<il/min) 


峰体积 //^a 


名义上 的浓度 


100X4.6 


1000 


360 


1.0 


100x2.1 


250 


75 


4.8 


100X1.0 


50 


17 


21.2 


100x0.32 


5 


1.7 


206.6 



实际上 ,近年 来已有 十多家 厂商生 产毛细 管柱, 一般 内径是 0.32mm ,长度 150 〜 
250mm ,颗 粒度 3~5/i ,品 种有 正相, 反相有 CKSAS) 、C4(Butyl-) 、C8(MOS) 、C18(ODS) 
等。 图 8.8 是 肽图分 析图。 



135 



8 16 24 32 40 48 56 

图 8.8 肌红 蛋白的 胰蛋白 SISI 解肽谱 
柱 : Selectosil C18 , 5fz 300A, 250mm x . 32mm , 
流 动相: A: 2 % ACN/98 % H2O/0 . 1 % TFA, B: 90 % ACN/10% HjOA) . 09 % TFA 
流速: lOfxl/min ,检出 :214nm ,进样 :5f_a,5pmol/)Lil 

四、 检 测系统 

用于 HPLC 的检 测器, 除应该 具有灵 敏度高 、噪 声低、 线性范 围宽、 响应快 、死 体积小 
等特 点外, 还 应该对 温度和 流速的 变化不 敏感。 

高效液 相色谱 常用的 检测器 有紫外 检测器 、示差 折光检 测器、 荧光检 测器和 电导检 测器。 

1. 紫外 检测器 - 

该检 测器适 用于对 紫外光 (或可 见光) 有吸 收性能 样品的 检测。 特点是 :使 用面广 (如 
蛋白质 、核酸 、氨 基酸、 核昔酸 、多肽 、激素 等均可 使用) ;灵 敏度高 (检测 下限为 10 — 'Gg/ 
ml); 线性范 围宽; 对温度 和流速 变化不 敏感; 可 检测梯 度溶液 洗脱的 样品。 

蛋白 质中有 一些芳 香族氨 基酸, 它们在 近紫外 有吸收 光谱, 常用 的检测 波长是 280nm 
和 254nm; 在远 紫外区 肽键有 吸收, 如 210nm ,甚至 190nm ,在该 区域中 灵敏度 很高, 但选 
择性 较差, 因为糖 类等其 他物质 在远紫 外也有 吸收。 在一些 复合蛋 白中, 一 些蛋白 质以外 
的其他 组分也 可作为 蛋白质 检测的 依据, 例如血 红蛋白 中的血 色素, 以及转 铁蛋白 配位结 
合的铁 离子。 

另外, 紫外光 电二极 管阵列 检测器 也已研 制出来 ,它 的基本 特点是 一次色 谱操作 中可同 
时获得 吸光度 、时 间和 各组分 UV 光谱 图一起 的三维 谱图, 便于 得到最 佳检测 波长、 色谱图 、 
光谱 图等; 并且在 一张三 维谱上 , 同时 可以得 到定性 、定量 及色谱 峰是否 是单一 组分的 信息。 

2. 示 差折光 检测器 

凡具有 与流动 相折光 率不同 的样品 组分, 均可 使用示 差折光 检测器 检测。 目前, 糖类 
化 合物的 检测大 多使用 此检测 系统。 这一系 统通用 性强、 操作 简单, 但灵 敏度低 (检 测下 
限为 10 — 7 g/ml) ,流 动相的 变化会 引起折 光率的 变化, 因此, 它既 不适用 于痕量 分析, 也不 
适用于 梯度洗 脱样品 的检测 。 
. 136 . 



3. 荧光 检测器 

凡具有 荧光的 物质, 在一定 条件下 ,其 发射光 的荧光 强度与 物质的 浓度成 正比。 因 
此, 这 一检测 器只适 用于具 有焚光 的有机 化合物 (如多 环芳烃 、氨 基酸、 胺类、 维生 素和某 

些蛋白 质等) 的 测定, 其灵敏 度很高 (检测 下限为 i(ri 2 〜i(ri 4 g/mi) ,痕量 分析和 梯度洗 
脱样 品的检 测均可 采用。 

4. 电导 检测器 

电导检 测器是 离子色 谱中使 用最广 泛的检 测器。 其作用 原理是 用两个 相对电 极测量 
水 溶液中 离子型 溶质的 电导, 由电导 的变化 确定淋 洗液中 溶质的 浓度。 此 检测器 死体积 

小, 灵敏 度可达 10 — 9 g/ml。 

第三节 各类高 效液相 色谱应 用实例 

HPLC 用于 蛋白质 的分离 出现在 19 世纪 70 年代 末期, 二十多 年来, HPLC 已 成为分 
离 纯化蛋 白质非 常有效 的方法 之一。 采用的 HPLC 法有反 相色谱 、离 子交换 色谱、 疏水 
作用 色谱、 排阻 色谱、 亲和色 谱等。 

用于 蛋白质 分离的 HPLC 系统应 具有梯 度洗脱 功能, 采 用紫外 或荧光 检测, 常用的 
紫 外检测 波长为 280nm、254nm 或 215nm; 荧 光检测 要求多 数蛋白 质应在 检测之 前进行 
衍生化 反应。 



Alan[i 6 ] 等使用 反相高 效液相 色谱对 鲁米那 肠促胰 酶肽释 放因子 (luminal cholecys- 
tokinin-releasing factor, LCRF) 进行 纯化。 首先 将样品 以 1 : 5 的 比例用 . 1 % 的三 氟醋酸 
(TFA) 稀释, 接 着上样 至已用 0.1% 的 TFA 平衡好 的反相 C18 柱 (Vydac) 上, 梯度 洗脱。 
如图 8.9 所示, 为检测 波长为 220nm 时的色 谱峰。 



一、 反相 高效液 相色谱 




50 

t/m'm 



图 8.9 反 相高效 液相色 谱纯化 LCRF 的 色谱图 
色 谱柱: C18 柱 (Vydac);流动相:A:0.1%TFA, 
B:0.1%TFA+ 乙腈; 
梯度: lOOmin 由 100%A~*50%B ,检 測波长 220nm 



137 



、 高效 离子交 换色谱 



Laurence 和 Rashmi[i 7] 将大 肠杆菌 发酵所 得到的 MP(movement protein) 蛋白 的包涵 
体, 使用阴 离子交 换色谱 纯化。 将用 8mol/L 尿素溶 解的包 涵体先 用色谱 缓冲液 

( lOmmol/L Tris,pH 9.0, 8mol/L 尿素 , 5mmol/L ED- 
TA, 150mmol/L NaCl , Immol/L 2 -疏基 乙醇) 透析, 转 




100 



200 



速为 15 OOOg 离心 30min, 弃 沉淀, 取 上清, 上样至 
HQ/M 阴 离子交 换色谱 (PerSeptive Biosystems, Fram- 
―, ingham,MA)o 流动相 A 为上述 色谱缓 冲液, 流动相 B 
为 A + 3mol/L NaClo 线性梯 度从第 50 〜 250s, NaCl 
浓度由 0.15mol/L 增大到 1.15mol/L。 
图 8 .10 高效离 子交换 色谱纯 色谱 图如图 8.10 所示。 峰 1 为不保 留峰, 2、3 为 

itMP^^mm 当 NaCl 浓度增 大时洗 脱的峰 ,经 检测, 峰 2 和峰 3 为 

高度 纯化的 MP 峰, 二 者构象 上略有 差异。 



t/s 



三、 高效 疏水作 用色谱 

图 8. 11 是 高效疏 水色谱 法分离 7 种 标准蛋 
白的 色谱图 [ 1 8] 。 色 谱柱为 100mm X 4mm 不锈 
钢管, 用勾 装法装 填西北 大学现 代分离 科学研 
究所 合成的 LHIC-3 疏水 填料。 使 用的是 LC- 
10A 高 效液相 色谱仪 (Shimadzu) ,包括 主控器 
( SCL-10AVP ) 、 检测器 ( SPD-10AVP ) 、 泵 ( LC- 
10ATVP) 、 恒 温柱箱 ( CTO10ASVP ) 、 Class 
VP5.03 色谱工 作站。 

7 种标准 蛋白分 别是: 细 胞色素 c(Cyt-c)、 
肌红蛋 白 ( Myoglobin) 、 核糖核 酸酶- A(RNase- 
A) 、溶菌 酶 ( Lysozyme ) 、 a - 糜蛋白 酶 ( a-Chy- 
motrypsin) 、a -淀粉 酶 ( a-Amylose) 、胰 岛素 ( In- 
sulin) 

疏水色 谱还被 用来分 离纯化 E.coli 表达的 
rhIFN-7[i 9 、rhIFN-y 的盐 酸胍提 取液在 40min 内只 经一次 色谱过 程就可 以使纯 度达到 
85% , 活 性回收 率为稀 释法的 2〜3 倍。 

四、 高效排 阻色谱 

排阻 色谱除 了被广 泛应用 于蛋白 质的分 离外, 还用于 未知蛋 白分子 质量的 测定。 图 
8. 12 为 TSK 3 OOOPW 的排阻 色谱测 定蛋白 质分子 质量。 
• 138 • 




10 20 30 

//min 



图 8.11 高效 疏水色 谱柱分 离标准 蛋白的 
色谱图 

a. Cyt-c; b. Myo; c. RNase-A; d. Lys; e. o-Chy; 

f . a- Amy; g. Ins 
流动相 A 液为 2.5mol/L(NH4)2S04 + O.05mol/L 
KH2PO4(pH7.0),B 液为 O.05mol/L KH2PO4 ( pH 
7.0),25min 线 性梯度 (0%B~ 100%B) 洗脱, 流 
速 Iml/min ,检 测波长 280nm 



38 r 




4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 

log 分? 质量 

图 8. 12 TSK3 OOOPW 的排 阻色谱 测定蛋 白质分 子质量 
样品: 细 胞色素 C ,肌红 蛋白, 卵清 蛋白, BSA 
流动相 :20mol/L PBS.0.3mol/L NaCl,pH7.0, 
流速 : . 2ml/min , 检测 : 280nm , 40t: 



五、 高效亲 和色谱 



粒细胞 集落刺 激因子 (granulocyte colony stimulating factors, G-CSF) 是 能够在 体内外 
特异地 作用于 中性粒 细胞系 ,促进 其增殖 、分化 并能维 持功能 和存活 的一种 糖蛋白 类生长 
因子 [2 G ] 。 OCSF 在临床 上有非 常广泛 的用途 ,其毒 副作用 很低, 目前主 要用于 防治化 
疗 [2 1 ] 及放疗 后引起 的骨髓 抑制。 此外还 用于自 身骨髓 移植、 某些类 型的白 血病、 艾滋病 
引起的 白细胞 减少和 再生障 碍性贫 血等, 均 有显著 疗效。 免疫亲 和色谱 可用于 OCSF 的 
分离 和测定 , 衍 生后荧 光检测 。 如 采用免 疫亲和 色谱法 测定化 疗诱导 的中性 白 细 胞减少 
症的 G"CSF[22]。 

① 免疫亲 和柱的 制备: Ig 经酸洗 的玻璃 小球, 用 10% 3- 氨基- 丙基三 乙氧基 硅焼回 
流 16h ,将 碳基 二咪挫 接于硅 烧化的 玻璃球 表面。 用二氧 环己烧 清洗, 通气 干燥。 将玻璃 
小球 Ig 置于 50mmol/L pH9.0 含 Img 抗生 蛋白链 菌素的 pH7.0 磯酸盐 缓冲液 (PBS) 
10ml 中, 4€ 振荡 18h , PBS 清 洗数次 , 4t: 保存。 之后 加入鼠 单抗液 , 4t: 过夜, PBS 清洗小 
球 5 次, 加入到 50mm x 4.6mm 生物 兼容柱 
(PEEK) 中。 

② 流动相 :0.1mol/L 盐酸甘 氨酸、 O.Olmol/ 
LPBS 溶液, pH7.0。 梯度: 柱 子先用 O.Olmol/L 
PH7.0PBS 溶 液平衡 5min ,使 OCSF 结 合到固 
定 相表面 , 之后 5mm pH 作线 性变化 7 . 〜 1 . 5 , PH ^ 
保持 2miii。 

③ 样品衍 生化。 衍生化 试剂为 OPA ,取 衍生 
液 进样。 

色谱 图如图 8.13 所示, 其中 a 即为 OCSF 
色 谱峰, 为 7min。 




图 8.13 OCSF 的免 疫亲和 色谱图 
流速 :0.5ml/min; 温度 :4t: ; 
检测 : 荧光 340nm/450nm 



139 



第四节 讨 论 

1. 对蛋白 质活性 的考虑 

所要 研究的 样品, 还要通 过活性 的检测 或其他 特性的 鉴定, 才能 从诸多 的蛋白 质中鉴 
别分离 得到。 尽管这 一点是 显而易 见的, 但是 也常常 被从事 蛋白质 研究不 久的生 化工作 
者 忽视。 为此, 不论 用何种 分法, 其中包 括色谱 技术, 分离 纯化蛋 白质样 品前, 原则 上说, 
首先 建立所 要研究 的蛋白 质的活 性检测 方法。 活性检 测方法 不仅可 以从分 离所得 到的诸 
多的蛋 白质组 分中, 鉴别 到所要 研究的 样品, 而 且还能 对所用 的分离 纯化方 法的优 劣作出 
评估。 如果在 分离纯 化后, 研 究对象 的比活 (即 单位重 量的蛋 白质所 表现的 活性) 没有提 
高, 则说明 研究的 对象和 其他的 杂质蛋 白在所 用的这 种分离 过程中 没有能 分开。 如果在 
分离 纯化后 , 尽 管所需 的样品 比活有 所提高 , 但是总 的活性 回 收率 却很低 , 这提示 在整个 
分离 纯化过 程中, 所研究 的样品 或是有 损失, 或是 有失活 现象。 总之, 比活 提高不 明显, 或 
是总活 性回收 率不高 ,都说 明了所 用的分 离纯化 方法不 理想, 应该更 换其他 的分离 方法。 
旨在测 定蛋白 质一级 结构时 ,可以 不考虑 所得样 品的生 物活性 ,只要 能得到 某些特 定结构 
或性 质的蛋 白质, 即能用 于结构 测定。 例如 可以用 专一的 抗血清 检测, 收集 具有免 疫反应 

的级分 ,或是 用通过 SDS-PAGE 测定所 得蛋白 质组分 的分子 质量, 收集所 需分子 质量的 
部分。 

2. 评 价与文 献结果 的差异 

经常 有人在 重复文 献时, 得不到 相同的 结果, 甚至 差别很 ;^。 可能有 下述因 素要考 

虑 

① 柱效 如何。 可按第 二节的 办法去 检查。 如果柱 效很低 ,再花 很多精 力在其 他条件 
探讨 上也是 白搭。 

② 柱的 型号、 孔径、 颗粒度 等是否 与文献 一样。 如反 相柱, 有 C- 18,C-8,C- 4,C-2 等亚 
型。 分离氨 基酸。 肽等 则常用 C-18 的柱, 孔径 100〜300 人; 分离 蛋白质 则常用 C-4,C-8 
的柱, 孔径 300〜1 000 人 为好。 

另外, 生产厂 商也很 有关系 , 由 于生产 工艺不 同 [ 11 ] , 同一 厂商的 不同批 号之间 差别不 
大, 而 不同厂 商的同 型号柱 (如 C-18) 会 有较大 差别。 

③ 采 用不同 公司的 HPLC 仪器, 由于产 生梯度 的方式 不完全 一样, 管 道的长 短和死 
体积不 一样, 因此 设定的 梯度和 实际的 梯度会 不同。 即看来 两个实 验室表 面上的 条件相 
同, 事实 上可能 不同。 这要求 参考文 献的试 验条件 ,在具 体条件 上作一 些调整 ,才 能得到 
满意的 结果。 盲目相 信文献 ,不 如没有 文献。 • 

3. 蛋 白质和 多肽的 HPLC 中的注 意事项 

(1) 流动相 

对反相 HPLC 而言, 最常 用的流 动相是 0.1%TFA/ACN 系统, 它有低 的紫外 吸收、 
低點度 、好 的稳定 性和分 辨率。 在 A 液中的 TFA 浓度 稍高于 B 液中的 TFA 浓度 
(0.0890, 这 样保持 基线的 平整, 不致基 线斜度 太大。 如基线 斜率不 理想时 ,可在 A 液中 
- 140 - 



加 50〜15(V1 的 20%TFA 来调整 基线; 如基线 下降, 则可将 20%TFA 加到 B 液中。 

一般讲 ,肽 峰出现 的快慢 和肽的 大小和 疏水性 有关, 如果大 肽或肽 的疏水 性强, 则用 
丙醇或 异丙醇 代替乙 腈作流 动相。 

(2) 反相柱 

一般讲 ,长的 柱和内 径细的 柱的分 辨率和 灵敏度 好些, 常规 的柱是 250mmX4.6mni 
I.D. ,我 们实 验室常 用柱是 30mm X 2. lmm, 100mm X 2.1mm I.D. 和 50mm x 1mm 
I.D. ,颗 粒度 5〜7pm ,孔径 300 人。 对 肽的分 离常用 C-18 柱, 分辨率 较高; 对纯化 重组蛋 
白质 (分子 质量在 10 000〜20 OOODa 之间) ,我 们常用 C-8 和 C-4 柱, 孔径也 大一些 为好。 

(3) 流速 

在 常规的 250mm X 4.6mm I.D. 柱上 流速为 Iml/min; 在无 孔径柱 中流速 一般是 
1.5ml/min; 而在 2.1mm 内径的 柱上, 流速是 200^tl/min(50〜20(Vl/min) ; 1 .0mm 内径柱 
流速 100^d/min。 

以微 柱而言 , 流 速小时 , 分 辨率高 , 灵敏度 也好些 ,肽 的保 留时间 ( retention time) 也相 
应会 增大。 

(4) 肽的 重演性 

不同 厂商的 C-18 柱性 能有所 差异, 这 是工艺 不同引 起的。 同一 种柱在 不同的 HPLC 
仪器上 的图谱 也会有 些不同 ,这也 是正常 的现象 ,因为 不同仪 器的管 道长短 、流动 相的混 
合器、 死 体积不 尽相同 等所引 起的。 此外, 每次实 验中柱 的平衡 时间没 有严格 控制, 也会 
使 肽谱的 重复性 不好。 如果柱 没有衡 温装置 ,周 围环境 的温度 变化, 也会影 响肽谱 的重复 
性。 

(5) 检出的 可靠性 

目前 很多人 用紫外 检出的 积分面 积作为 定量的 依据, 一般 也是可 以的, 但我们 要了解 
这 种定量 的不充 足性。 因为 通常用 280nm 或 216nm 来分别 检出蛋 白质或 多肽, 但 不同蛋 
白质的 摩尔吸 光系数 不同, 因此根 据积分 面积来 定量, 就可 能引进 很大的 误差。 其次, 有 
些杂质 可能在 280nm 或 216nm 处没有 吸收, 或者不 是杂质 的吸收 高峰, 这 种情况 时单用 
积分 面积作 为定量 的标准 , 也会产 生很大 的偏差 。 

4. 多维色 谱在蛋 白质组 学及蛋 白质分 离纯化 研究中 的应用 

最 传统的 蛋白组 学研究 方法是 双向凝 胶电泳 (2-D SDS-PAGE) 和 图像分 析法。 蛋白 
质在第 一向根 据等电 点的差 异分离 ,在 第二向 根据分 子质量 的不同 分离。 2-D 胶 方法已 
可与 MS 联用, 较好 地识别 胶上各 个斑点 中的蛋 白质。 从胶上 切下斑 点后, 蛋白质 被消解 
成肽 碎片, 然 后再用 MS 分析, 所得 的肽质 量用于 检索蛋 白质数 据库以 识别蛋 白质。 

尽管双 向电泳 是蛋白 组学研 究的主 要方法 ,但 存在耗 时多、 劳动强 度大的 缺点。 为 
此, 许多科 学家正 试图简 化这一 步骤。 解决的 方法是 用多维 色谱法 ,如 Michigan 大学的 
化 学教授 Lubman[ 23] 在分离 人乳腺 癌全细 胞裂解 液时, 使用 一个商 品化的 蛋白纯 化系统 
先根据 等电点 的差异 来分离 蛋白质 (chromatofocusing) ,该 装置有 20 个通道 ,由膜 隔离, 
加 电场后 使组分 分离。 收集 溜分, 再使用 非多孔 反相色 谱进一 步分离 纯化, 最后上 电喷雾 
TOF-MS 分析 以获得 细胞中 蛋白质 含量。 而 丫&163[ 24] 等 则使用 多维液 相色谱 、串联 质谱、 
数据库 搜索等 方法对 Saccharomyces cerevisiae strain BJ5460 的蛋白 质组进 行研究 ,并称 

• 141 • 



此 方法为 MudPIT( multidimensional protein identification technology) 法, 得 到了目 前为止 
最 大量的 蛋白质 组分析 数据. 分析并 检测了 1 484 种蛋 白质, 其中包 括很多 低丰度 的蛋白 
质, 如转录 因子和 蛋白质 激酶。 

在使用 多维色 谱纯化 系统时 要仔细 考虑柱 子的使 用顺序 ,这样 可以缩 短操作 步骤, 从 
而提 高总回 收率。 比如, 从 离子交 换或疏 水色谱 流出的 样品可 直接上 排阻, 之后可 直接上 
反 相柱。 此方 法被用 来纯化 小鼠唾 液腺的 上皮生 长因子 (EGF)[ 25 、 牛脑中 的一种 GT- 
Pase-activating protein[ 26 ] 以 及从结 肠癌细 胞系中 得到的 A33 抗原 [27] 。 Opiteck 等 使用正 
交 的色谱 模式: 排阻- 反相或 阳离子 交换- 反相 来分离 复杂的 蛋白质 混合物 [ 28 ' 29] 。 

5. 联 用技术 

(1) LC-MS 联用 

目前与 LC 联用的 MS 有: 快原 子轰击 FAB-MS 、电喷 雾电离 ESI-MS 、基 质辅 助激光 
解 吸电离 MALDI- MS 等, 其中 LC-FAB 多 用于小 的多肽 分子的 检测, Zang [ W 等采用 LC/ 
ESI-MS 联用 技术, 测定 了小鼠 血莱和 尿液中 ALA 及其代 谢产物 CDEPA 和 DEA 的含 
量。 MALDI-MS 是目前 灵敏度 最高的 质谱法 之一, Ackermann[ 3 i3 等用 LC-MALDI 联用 
测定 抗生素 混合组 分时, 可 在样品 用量极 小的情 况下, 灵敏、 准确地 得到各 组分的 分子质 
量。 

(2) LONMR 联用 

对 于生物 大分子 ,较常 用的是 LC 与二维 NMR 联用 ; 对 更复杂 的分子 ,有 更先 进的三 
维和四 维异核 NMR ,可提 供样品 的氨基 酸组成 、蛋白 质的局 部构象 和整体 三维构 象的信 
息。 Feng [32] 等以 HPLC-NMR 联用, 测定了 SCH 56592 的 4 种主 要降解 产物的 结构。 

(薛 卫华 夏 其昌) 

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143 



第九章 质 



谱 



第一节 引 言 

有机 质谱仪 自诞生 以来, 一 直是有 机小分 子结构 分析的 重要工 具之一 , 但它一 直不能 
成为 生物学 家用以 分析生 物大分 子如蛋 白质、 多肽、 核酸等 的有力 武器, 这 是由于 有机质 
谱仪有 限的质 量范围 和电离 技术不 适合热 不稳定 、挥发 性差的 生物大 分子的 测定。 长期 
以来, 质谱 研究工 作者和 生物学 家双方 都在不 断的探 索和企 盼有朝 一日能 使有机 质谱在 

生物大 分子的 分析中 有用武 之地。 在 20 世纪 80 年 代末, Karas [ i] 和 Fenn[ 2] 等先 后发明 
了基质 辅助激 光电离 和电喷 雾电离 技术, 这两个 新的电 离技术 研究的 突破性 进展, 启动了 
有机 质谱在 生物领 域中的 应用, 尤其是 在蛋白 质的结 构分析 中获得 了蓬勃 的发展 并取得 
了令人 满意的 结果, 他们不 仅用质 谱法分 析蛋白 质的一 级结构 ,即 氨基酸 的序列 分析, 而 
且对蛋 白质的 高级结 构的研 究和应 用也逐 渐广泛 起来, 如蛋白 质非共 价复合 物的测 
定 [3 , 4] 、H/D 交 换法研 究蛋白 质的高 级结构 的性质 [ 5] 、一定 长度的 交联剂 (cross-link- 
er) [6 ' 7] 研究酵 母核孔 复合体 (yeast nuclear pore complex) 等, 这些研 究成果 都表明 质谱技 
术在目 前已经 成为生 物大分 子结构 分析中 必不可 少的工 具之一 ,有 着非常 广阔的 前景。 
在开展 生物大 分子的 研究中 所应用 的质谱 仪也是 多种多 样的, 如电 喷雾- 三级四 极质谱 
仪 [8 ' 9] 、电喷 雾- 四极 离子讲 质谱仪 (ESI-quadrupole ion trap MS) [ ig'ii] 、 基 质辅助 激光电 
离-飞 行时间 质谱仪 (MALDI-TOF MS) [ i、 基质辅 助激光 电离- 离子讲 质谱仪 (MALDI- 
lon Trap MS) [ i 2 'u ] 、傅里 叶回 旋共振 质谱仪 (FTMS) [ i 4 'i 5] 、电喷 雾- 四极- 飞行时 间质谱 
仪 (Q-TOFMS)[i 6 ~i 8 ] 肄。 为了 使生物 学家能 够更有 效地应 用这些 仪器开 展研究 工作, 本 
章就四 极杆、 四极离 子阱、 飞行 时间、 傅 里叶回 旋共振 质谱的 基本原 理作一 些简单 介绍。 

第二节 四极 和离子 胖质谱 

一、 四极 质谱仪 (quadrupole mass spectrometry) 



四极 质谱仪 结构很 简单, 它 是由两 对相互 平行的 横截面 为双曲 面或圆 形的极 杆所组 

成, 见图 9.1。 在此极 杆上加 上两对 极性相 反的电 位±</>() 形成 
四 极场。 当 离子沿 Z 轴进 人四极 场后将 受到此 电场的 作用, 在 
四极 场中无 空间电 荷即理 想场情 况下, 在 场中任 何一点 (■r'jN 
:0 的 电位可 用下式 表示: 




<?。 r§ 
•>^=U -一' ^&0是加在极杆上的电位, 
图 9.1 四极 质谱仪 示意图 = — Vcos/^f 

. 144 . 



(9-2-1) 



(9-2-2) 



其中 1/ 是直流 电位, \^cosr2? 是射 频电位 (RF)。 1^ 是射频 电位的 幅值, r2 为角 频率, /3 = 

27r/; A , a , y 分别为 T , _y , Z 方向 上的权 重常数 ( weighting constant ) 。 因为 场内无 空间电 
荷 , 电场梯 度是均 一的, 所 以满足 Laplace 方程 ▽ = , 即 



从 (9- 2-1) 式可得 



dx dy dz 



▽ 2》 = -^(2A +2a + 2y) 



(9-2-3) 



(9-2-4) 



要满足 (9-2-3)式,则义+ (7+7 = 0,或 ^^ = 0,这些条件在四极场中必须得到满足。 在 
四极杆质谱中,久= — ^T = l,y = 0。 在离子 阱中, A 二 a = l,y= —2。 
在 此场内 离子在 ■r ,3Nz 方向 上的运 动方程 (F= ma) 分 别由下 式表示 

(fx d<t> 



F- = 



dx 

3<}> 
ay 



(U _ VcosOt) 



以 T 方向上 离子的 运动方 程为例 ,对 (9 - 2 - 1) 式 微分得 

― 2 Ax 

把此 式代入 (9 -2 - 5) 式得: 

d X 2Xex 



Ft = 



(U - VcosOt) 



重新整 理方程 (9- 2 -9) 可得 



dt' 



+ VcosOt) = 

鮮 



令 $ = f ,则 



将 (9 



两边同 乘- 



生 
dt 

11) 式代入 (9 



dld_ _ nd_ _ 
dt 2 d^' dr 

2 -9) 式 可得: 
mO} d^x ― 2\ex 



dt d^\dt 



4 



4 



(U - VcosOt) 



d J 



^XexU + 8AexVcos26 



令" 工= 



8XeU 



4AeV 



并代人 (9-2 -13) 式可得 



(9-2-5) 
(9-2-6) 
(9-2-7) 

(9-2-8) 
(9-2-9) 
(9-2-10) 



- U - —— ; (9-2-11) 



(9-2-12) 



(9-2-13) 



145 



+ (a J. - 2gj-cos2$) 丄 二 



(9-2-14) 



同样, 对 四极场 中任何 一个方 向的运 动方程 也可用 (9- 2 -14) 式的 形式来 表示。 



+ (a„ - 2q'„cos2$) u ― 



其中, 



式中 U 代表 



8eU 



4eV 



(9-2-15) 



(9-2-16) 



Qt 



jc ,y,z 



坐标, 6 是 无量纲 参数, 6 = f 。 (9 - 2 - 15) 式, 即是著 名的马 绍方程 

(Mathieu equation), 它是描 述离子 在四极 场中运 动规律 的基本 方程。 我们 所关心 的并不 
是如何 解马绍 方程, 而是 离子在 场中沿 2 方向 注入后 能否依 次通过 四极杆 得到分 离并检 
测, 即离子 在场中 的运动 轨道是 否稳定 ,它在 •r, 3; 方 向上的 振幅是 否小于 极杆之 间的间 
距 (2ro), 亦即由 U,V,m, r。,r3 这些 参数所 决定的 a„,g„ 值能否 使马绍 方程有 稳定的 
解。 通常 马绍方 程是否 有稳定 的解由 a„,g„ 为坐 标的稳 定图来 表示。 图 9. 2(a) 中的阴 
影 部分为 离子在 •r 方向 上的稳 定区, 图 9. 2(b) 中 的阴影 部分为 离子在 3; 方向上 的稳定 
区, 因为 离子只 有在: c,3; 方向 上同时 稳定才 能使离 子顺利 通过四 极杆。 所以, 只有 •r, 3^ 
方向 上稳定 区的重 叠部分 即如图 9. 2(c) 所 示的重 叠区域 A,B,C,D 才是离 子在场 中运动 
的稳定 区域。 在四极 杆质谱 中采用 接近于 原点的 A 区, 一般称 此区为 稳定三 角形, 其放 
大 图见图 9.2(d)。 



(a) 




图 9.2 马 绍方程 稳定图 

(a)i 方向 稳定; (b)j 方向 稳定; (c)_r,3> 方向 稳定重 叠区; (d)A 区 放大图 

图中 a/q 比值为 常数并 通过原 点的直 线称为 扫描线 ,此 扫描线 和稳定 三角形 边界分 

别 相交于 (ai, 91) («2, 92), 显然, 位 于此二 交点之 间线上 的离子 都是稳 定的。 从方程 

U 



2 - 16) 可见 a/<? = 常数, 即 ^ = 常数。 若 设定一 个起始 \^ 值则 U 值同时 被设定 ,运 



(9 

用 (9- 2- 16) 式 即可算 出不同 质量的 离子它 们此时 各自相 对应的 a 、g 值。 从图 9.2(d) 

中可 见只有 ^/72,("?1>^2>^3)离子落在稳定区内它可以通过四极场而 /",、/7Z3 离子将 
. 146 • 



与 极杆相 碰撞而 消去。 若提高 \^值并保持^7/^=常数,即起始扫描时,^771、^2将离开 

稳定区 而质量 较大的 m3 将进 人稳 定区。 从以 上分析 可见, 只 要保持 常数, 连续 
提高射 频电位 的幅值 V 时, 离子将 按照其 质量的 大小, 由小 到大依 次通过 四极杆 达到检 

测器, 在这种 模式操 作下, 四 极场具 有质量 分离的 作用。 通常 四极质 谱仪的 质量测 量上限 

范围为 2 000~4 000Da ,分辨 率为单 位质量 分辨, 属于 低分辨 仪器。 目前在 生物大 分子, 

尤 其是蛋 白质、 多肽的 结构鉴 定中, 因要求 仪器具 有质谱 / 质谱 (MS/MS) 功能, 一 般采用 

三 级四极 质谱仪 (triple quadrupole mass spectrometer) ,其结 构如图 9.3 所示。 

Q1 02 03 

四极杆 I 1 四极杆 检测器 

… … 



离子源 
加热 毛细符 

— ryii 

八极杆 



I 薩 I 
I 瞧 I 



I 瞧 I 
I 麵 I 



八极杆 碰撞宰 



图 9.3 三 级四极 质谱仪 示意图 

图中 Q1、Q3 为四 极杆, 它们分 别可单 独用作 为一个 四极质 谱仪, Q2 为八 极杆, 作为 
碰撞 活化室 , 此八 极杆上 仅加上 幅值较 小的射 频电位 (即 au = 0) , 在此 条件下 , 所有 质量不 
同 的离子 均因它 们具有 较小的 q 值 而能保 持在四 极场内 稳定的 振荡, 这表明 所有由 Q1 
选择的 离子都 能通过 Q2。 一 旦当选 择的离 子进入 Q2 后将与 Q2 内 充人的 惰性气 体分子 
相 碰撞, 其碰撞 能量的 一部分 转换成 离子内 能并使 
其发生 裂解, 裂 解后的 碎片由 Q3 作进一 步测定 ,实 
现了 MS/MS 功能。 上述的 三级四 极质谱 Ql、Q2、y W 
Q3 成线形 排列。 目 前商品 仪器中 亦有成 90° 垂直排 乂^ 1^,,1^~^", 
列的, 如图 9.4 所示。 这种排 列不仅 縮小了 仪器的 QSii'S^S^fcS 
尺寸, 由于 Q2 成 90° 形状, 中性 碎片不 能随着 离子流 图 9.4 垂直 排列三 级四极 质谱仪 
一 起转弯 到达检 测器, 所以提 高了信 噪比。 ' 




-Q3 



罔 子 阱质谱 ( quadrupole ion trap mass spectrometry) 



离 子讲质 谱结构 与四极 杆质谱 相似, 由一个 环电极 (ring) 和 两个端 盖电极 (endcap) 所 
组成, 它们的 横截面 均为双 曲面, 见图 9.5。 环电 极上的 电位为 ^^。,端盖电极接地,对于理 
想 的四极 场其电 极尺寸 r"g = 24,在此条件下,场中任何一点(:^,3^:0上的电位仍可用 

h 



(9- 2-1)式表示^^ 



(Ax^ + cry + yz^) 




接地 

射 频电位 (RF) 



接地 



图 9.5 四极 离子讲 示意图 



147 



如前 所述, 为满足 Laplace 方程的 条件, A =(7 = 1, y= _ 2, 所以 四极离 子讲电 场的表 



达为 



^0 



(9-2-17) 



因为离 子阱以 Z 轴为对 称轴, 所以 通常用 r,z 两个 方向来 表达。 

令工二 rcos^,3'= rsin^,2 = z 并代入 (9 - 2 - 17) 式, 则 (9 - 2 - 17) 式可 变换成 



n 厂 



(9-2-18) 



考 虑四极 离子阱 电极上 的电位 : 即环电极( = 0,r= H)) 上 的电位 <!> 二 h 及端 盖电极 ( r = 
0,z = zo) 上的 电位为 <!> = 0, 所以 方程式 (9 -2- 18) 按上 述边界 条件可 修正为 : 



h , 2 , 2、 ^0 



(9-2-19) 



2ri' - 2 

参照四 极质谱 中离子 运动方 程推导 过程, 亦 可得到 描述离 子阱中 离子运 动的马 绍方程 

d fji 



+ (a„ - 2q'„cos2$) u ― 0,/^{r,z) 



式中 



4eU 
― SeU 



4eV 



Qr = 



Qz 



2r>2 



mroO 
4eV 



(9-2-20) 



(9-2-21) 



与 四极质 谱一样 ,由 a- , 所 决定的 方程是 否有稳 定的解 , 也用 稳定图 来表示 , 如图 
9.6 所示。 如上所 述离子 阱在正 常操作 条件下 ,端 盖电极 接地, 环电 极上只 有射频 电位即 
17 = 0, 即 az = 0, 可见离 子的" 运动" 均在 轴上 进行。 设想 离子阱 在起始 时环电 极加上 
射 频电位 幅值为 ,从 方程 (9-2-21) 可计算 出不同 质量的 离子的 值, 凡是其 q: 值 
在 0〜0. 908 之间离 子均被 稳定地 陷在离 子阱中 ,由于 q^m 成反比 ,所 以质量 大的离 
子 小, 相反 亦然。 当射频 电位的 幅值从 逐渐升 高时, 不同 质量的 离子的 值也随 




图 9.6 四极 离子阱 稳定图 



148 



之逐渐 增大, 也 就是说 它们按 其质量 从小到 大的次 序沿着 q: 轴向右 移动, 当 离子的 q,、 值 
大于 0.908 时, 离子在 Z 向的振 幅变大 ,运动 变成不 稳定并 通过端 盖电极 上的小 孔打到 
倍增 器上被 检测, 以 此得到 一张完 整的质 谱图。 这种 操作模 式称为 选择质 量不稳 定模式 
(mass-selective instability) ,是离 子阱通 常使用 的操作 模式。 

离子 阱技术 从早期 离子讲 检测器 ITD(ion trap detector) 发展到 离子阱 质谱, (ion trap 
mass spectrometry) 它 的主要 技术性 能如分 辨率、 质量测 量范围 和质谱 -质谱 功能都 得到了 
发展和 提高, 这 也是采 取了以 下一系 列技术 措施的 结果。 

1. 缓冲气 (buffer gas) 

离 子阱充 人一定 量的惰 性气体 如氦气 (10 — 3 torr) 后, 离子和 氦原子 将发生 碰撞, 使离 
子的动 能得到 一定程 度的" 冷 却", 从而使 离子在 r,;^ 方向上的位移趋向于离子阱的中 
心, 如图 9.7 所示。 当这些 离子达 到轨道 不稳定 的临界 状态时 ,它们 几乎在 离子阱 内同样 
的位置 开始向 外运动 ,由 于离子 不仅成 群结队 地向外 运动而 且它们 都紧紧 地沿着 Z 轴方 
向上 聚焦, 所 以提高 了仪器 的分辨 率和灵 敏度。 



2 . 自 动增 益控制 ( auto gain control , AGC) 

当样 品在离 子阱中 的浓度 发生变 化时, 不论是 否有缓 冲气的 存在, 谱 形仍会 发生变 
化, 致使 定量分 析无法 进行, 谱库检 索无法 实现。 这是 由于高 浓度的 样品分 子如果 在离子 
阱中陷 人较长 时间将 会发生 分子离 子反应 ,从而 改变了 离子的 特征, 如分子 离子变 成了准 
分子 离子, 造成定 量分析 困难。 另外, 离子讲 中离子 密度的 增加也 会引起 空间电 荷效应 
(space-charge) ,由 于它改 变了" 纯" 四极场 的性质 ,其结 果将造 成稳定 图边界 位置的 改变, 
从而使 离子质 量发生 偏离。 为了克 服上述 缺点, 采用了 自动增 益控制 技术, 即在扫 描过程 
中设 有两个 电离时 间段, 第一 电离阶 段的时 间为固 定的, 如 0.2ms, 电离后 赶出全 部从背 
景气 中形成 的离子 (如 m/z 为 44 以下) ,并测 定保留 在讲内 的离子 的总离 子流, 以此作 
为依据 计算第 二阶段 电离所 需的最 佳时间 ,这 样可以 避免因 阱内离 子太多 而引起 的空间 
电荷 效应。 当然在 每一次 扫描过 程中都 同时伴 有这两 个时间 段的电 离过程 ,其电 离时间 
与谱 的强度 亦同时 被记录 , 以 便实现 数据的 归一化 处理。 由于自 动 增益控 制技术 的应用 , 
离子 阱质谱 也可实 现定量 分析。 

3. 轴 向调制 (axial modulation) 

当 离子讲 中的射 频电位 幅值扫 描时, 低质量 离子首 先被" 扫出" 离子阱 而较高 质量离 




图 9.7 离 子阱中 离子在 有无缓 冲气时 的运动 状态图 



子仍 旧陷在 阱中, 由 此引起 的空间 电荷效 应将会 造成即 将被扫 出的离 子峰的 加宽。 为丫 

改变这 种状况 ,在 端盖电 极上加 上一个 附加振 荡电场 (oscillation field) ,它的 峰值为 
6\^(p_p) ,其 频率约 为环电 极上射 频电位 频率的 一半。 当离 子随着 射频电 位幅值 的增加 
而 达到稳 定三角 形边界 (g、~ =0.908) 即将被 扫出时 ,在附 加振荡 电位的 作用下 ,这 些离子 
将产生 共振, 并使它 们紧密 地聚集 在一起 ,同时 排出离 子阱, 所以分 辨率随 之得到 提高, 如 
图 9.8 所示。 



400 




300 




200 




100 




薪 




屮 3000 


F b 


被 2500 




2000 




1500 




1000 




500 






50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 
miz 



图 9.8 轴 向调制 效果图 
a. 无轴向 调制; b. 有轴 向调制 



4. 质 量范围 的扩展 

离 子讲质 谱最初 设计的 质量范 围仅为 650Da, 显然不 适合于 生物大 分子的 分析。 从 
AV 



方程 m/e 



中 可见, 减少电 极尺寸 ro 或 降低射 频电位 的频率 f2, 均 可扩展 质量范 



0.2 
0.1 
0.0 
-0.1 
-0.2 
-0.3 
-0.4 
-0.5 
-0.6 



围, 然 而最有 效的办 法是采 用共振 排斥法 (resonance 
ejection) 如图 9.9 所示。 在 轴 上设定 一个点 作为离 
子共振 排斥点 ,它 相当于 四极离 子阱正 常工作 时在稳 
定图的 q: 轴上开 了一个 小孔, 让 离子在 此孔的 位置上 
发 生共振 排斥。 其 具体操 作过程 如下: 当射频 电位幅 
值扫 描时, 即在 q: 扫描时 在端盖 电极上 加上一 个频率 
较低的 附加交 流电位 ,它 的频率 由质量 范围扩 大的倍 
数 决定。 阱内 离子随 着射频 电位的 幅值的 增大其 (?, 
也增大 并达到 设定的 共振排 斥点所 相应的 9- 值时, 离 
子 依次产 生共振 并排出 离子讲 到达检 测器。 由于 m/z 

值与 成 反比, 所以共 振排斥 点 的 q:- 薦 可 用下式 表示: 9,.new = <?z-eject-old ( m /z^.^.^/ 

^ / 2;iim-old 









^ 正常 


二 不稳定 


、、、、 \ 排斥点 







0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 



图 9.9 共振 排斥法 示意图 



1.4 



m 厶 Um-new) , 当 欲扩大 的质量 范围即 



m / z\ 



确定后 9,.-new 即可由 上式计 算得到 ,通过 



q: 与/? 2 的 关系式 (见后 即离子 讲端盖 电极上 的附加 交流电 位的频 率也可 决定, 如需 

扩大质 量范围 为 10 倍, 则 g^.new = . 908/10 二 . 0908 ,相 应的 二 . 064 , 此 时在端 盖电极 
上 应附加 的交流 电位的 频率为 35.2kH2。 



150 






5. 狭扫描 (narrow scan or zoom scan) 

通常 离子讲 的扫描 速度为 5 555Da/s, 当质量 范围为 650Da 时, 此扫 描速度 相当于 
180Ms/Da。 在这种 扫描速 度下, 以质 量选择 不稳定 模式工 作时, 对 单电荷 离子其 分辨率 
(半 峰宽 定义) 理论 上可达 3 xm。 离子 阱的分 辨率除 了由它 本身的 性能决 定外, 还 取决于 
控制射 频电位 变化的 电子线 路中数 字模拟 转换器 (DAC) 的速度 ,在 仪器设 计中一 般将此 
DAC 所 需的时 间间隔 等同于 离子流 信号采 集时模 拟数字 转换器 (ADC) 的时间 间隔, 以 12 
位 (bit) 的 DAC 和 ADC 为例, 此时间 间隔为 28;is, 
由 此可得 每一个 质量中 的采样 次数为 18(Vs/28^ts, 
即约 6.3 次; 若 采用上 述的质 量扩展 技术, 使质量 
范围 扩展至 4 lOODa ,则 每一 个质量 中的采 样点将 
小于 1。 从信息 学理论 可知, 一个峰 中采样 数至少 
6 次才能 较完整 地表达 一个峰 的原来 面貌。 如图 
9 . 10 所示 , 如果 采样次 数太少 , 峰形 将发生 变化, 使 
原来两 个能相 互分离 的峰合 并成一 个峰。 

为了克 服由于 电子线 路上的 技术问 题所造 成对仪 器实际 分辨率 的影响 ,一种 称为补 
偿 DAC 技术已 被广泛 应用于 离子讲 质谱, 其 工作原 理见图 9.11。 射频电 位扫描 是由一 
个 0~10V 的数 字模拟 转换信 号来控 制的, 这个电 压在其 扫描过 程中任 何时刻 均可由 
TTL 控制脉 冲经电 压分配 器将它 衰减, 如 图中被 衰减为 0〜1V ,但其 扫描速 度保持 不变。 
这个衰 减的电 压经运 算放大 器与补 偿电压 (6V) 相加后 成为射 频电位 的控制 信号, 如图中 
为 6V〜7V ,这 个控制 信号经 射频电 位发生 器最终 得到射 频电位 的扫描 电压。 由此 可见, 
射频 电位经 此补偿 DAC 修正后 扫描速 度不变 但幅值 扫描范 围变窄 , 扫描范 围仅从 4 850V 
到 5 870V ,这就 意味着 在同样 的扫描 时间内 ,扫描 质量范 围变窄 ,这 样就能 保证在 一个峰 
中有足 够的采 样次数 ,使 仪器的 分辨率 得以真 正体现 出来。 商品仪 器在采 用此技 术后其 
分辨率 将大于 10 000( 半峰 宽定义 )。 在蛋 白质、 多肽样 品的分 析中, 仪器的 高分辨 能力是 
至关重 要的, 因为只 有高分 辨才能 使准分 子离子 与其同 位素峰 相分离 ,图 9.12 为 血管紧 



图 9. 10 采样 次数对 分辨率 的影响 



射频电 位扫描 电压 衰减后 射频电 位扫描 
分配器 






IV 





一 1_ 



补 偿电压 



运箅 放大器 




0V 



4850Vp 



5870Vp 



射频 发生器 



6V 













最终 射频电 位幅值 最终 射频控 制信号 

图 9.11 DAC 补 偿技术 原理图 



151 



502.7 



500.6 ,501.5 501.- 



502.6 



502.6 



502. 




504.2 - 



505.1 505.2 



501 



502 



504 



505 



图 9.12 血管紧 张素肽 段的狭 扫描图 

张素中 某肽段 的狭扫 描图, 图中 可见峰 间的质 量差为 0.3 个质量 单位, 这表明 m/ 义 
502.7 是 一个带 有三个 电荷的 离子。 离子 所带电 荷数的 判断, 可通 过观察 谱中一 个质量 
单位 内所含 有的同 位素的 峰数来 推测, 此峰数 即为此 离子所 带的电 荷数, 从 离子的 电荷数 
与质 量即可 计算出 肽段或 蛋白质 的分子 质量。 

6. 质谱 / 质谱 (MS","》10) 

在生物 大分子 分析中 ,特 别是蛋 白质、 多肽分 析中, 质谱 / 质谱功 能是必 不可少 的技术 
手段。 因为 肽段的 MS /MS 所 提供的 各级子 离子信 息包含 了极为 丰富的 N 端和 C 端离 
子结 构信息 (即 6,3/ 系列离 子), 它不 仅为实 现计算 机数据 库检索 创造了 良好的 条件, 也 
为 多肽的 de novo^'' ] 序列 分析提 供了所 必需的 信息。 

在 离子阱 中实现 MS/MS 的 关键在 于如何 提取先 驱离子 (precusor ion) , 即把 质量大 
于 或小于 此离子 的离子 赶出离 子讲。 实现 提取单 一离子 的方法 很多, 下面仅 作简单 介绍。 

( 1 ) 顶 点提取 法 ( apex isolation) 
此 方法是 采取射 频电位 和直流 电位相 结合的 

方法, 如图 9.13 所示。 首先 使提取 离子从 A 点移 
^ 到三 角形的 顶点在 9- 轴上的 投影点 B ,然后 在环电 
极上 加上一 个负的 适当大 小的直 流电压 ( - L/) ,使 
该 离子的 g->0 ,并恰 好到达 在三角 形顶点 之下的 
C 点。 在此条 件下, 质 量比提 取离子 大或小 的离子 
分 别越过 = , ^ == 1 边界线 ,由 于 它们在 3; 和 Z 
向不稳 定而被 消去。 

(2) 共 振排斥 (resonance ejection) 
共振排 斥法原 理如前 所述这 里不再 重复。 运 

用共振 排斥法 实施离 子提取 时端盖 电极上 的附加 
电场 的频率 不是固 定的, 而是 以提取 离子质 量的不 




图 9.13 顶 点提取 法原理 



152 



同而 改变。 通 常此频 率设定 在相当 于提取 离子质 

量数加 一的水 平上。 其 工作过 程如图 9.14 所示, C 

基础射 频电压 A , 

当离子 形成后 (A) ,射 频电压 立即起 始扫描 (B) ,同 ~^\B 




时端盖 电极加 上附加 电场, 此 时小于 提取离 子质量 图 9. 14 共振 排斥法 MS/MS 操作 示意图 
的离子 随着射 频电位 幅值的 增加在 = 1 边 界上, A. 电离和 储存质 量范围 确定; B. 附加 电场开 
由于 Z 向不稳 定而被 排出离 子讲, 大 于提取 离子质 (Mffi^^^fM+lhC'MM^f- 

曰_^*^+7丄 ^~^>/^4^ ^ ^.^ A^,^^^a:.^-u.^^t=^^ D. 附加电 场关; E. 碰撞 诱导 解离; F. 射频电 

m^^^^^^mM^m^mm^^^mmm 位幅 值扫描 得到子 离子谱 
被排出 离子阱 ,只有 提取离 子能留 在离子 阱中。 

(3) 过滤噪 声场法 (filtered noise field) 

运用此 方法时 先在环 电压上 加上射 频电位 ,使一 定质量 范围内 的离子 均陷于 阱中, 其 
中包括 欲提取 的离子 , 与此同 时在端 盖电极 上加上 附加振 荡电位 , 其 频率覆 盖上述 质量范 
围内 所有离 子的在 Z 向 的振荡 频率而 独缺一 个相应 于提取 离子的 频率。 因此, 大 于或小 
于提取 离子质 量的所 有离子 均因共 振而被 排出离 子讲, 惟有提 取离子 被留在 阱内。 

' 在离子 提取技 术的发 展和应 用上, Cooks [2 G, 2 i ] ,KeUey [22 ' 23] ,Mclucky [24] 等作 出了很 
大的 贡献, 他们分 别采用 逆向傅 里叶转 换的尖 脉冲, 陷波滤 波技术 ,以 及反向 -正向 扫描等 
方法, 达到了 有效提 取单一 离子并 实现了 质谱- 质谱测 试功能 ,有关 这些技 术的详 细内容 
在此不 一一 赞述。 

用以上 这些方 法得到 的离子 ,在拼 内经共 振激发 与背景 气体发 生相互 碰撞并 发生单 
分子裂 解反应 ,然 后以通 常射频 电位幅 值的扫 描得到 子离子 图谱。 重复 上述的 过程, 即可 
在离 子讲质 谱中实 现多级 MS/MS 功能。 目前 商品仪 器中最 多可达 10〜11 级。 

在 以上讨 论离子 阱的性 能改进 过程中 , 共 振排斥 、轴向 调制技 术被广 泛应用 , 这些技 
术的 基本原 理均是 在端盖 电极上 加上一 个附加 的振荡 电位, 使其与 不同离 子发生 共振, 所 
以, 离 子的基 本频率 是离子 阱中一 个重要 参数, 它是由 下式决 定的: 

1 



aV„ =- (" + 全/? "卜 - oo<"《。 

u(r . z) 



(9-2-22) 



当 ^2 =0 时,称此为离子的基本频率,0;",0 = ^)9„/3。 

由此 可见, 凡是 /? 相同的 离子其 基本频 率是相 同的, 这就是 稳定图 中的等 /? 线。 P 值 
是由 a ,g 值来决 定的, /3 值可 用下式 计算: 

131 = + ― 2 

(/?„ + 2)2 -a,- 2 

(一 _"" 、 + 6)2\ ―… 

+ —— ― 2 (9-2-23) 

- 2)2 -a,- ^ 2 

. 153 . 



从 (9- 2- 23) 式 可见, 为计算 /9 值, 应采用 数值逼 近法, 即逐一 代入/ ?值, 然 后比较 + i 
和 /?„ 的差值 , 直 至此差 值小至 忽略不 计为止 , 在得到 值后, 显然 值也随 之而定 , 但在 
离子阱 质谱中 为提高 分辨率 、灵 敏度, 实现质 量扩展 ,提取 单一离 子所采 取的一 系列" 共 
振" 技 术中, 如共振 排斥、 轴向调 制等其 在端盖 电极上 附加振 荡电位 的时间 以及幅 值是各 
不相 同的, 如轴向 调制中 其频率 约为环 电极射 频电位 频率的 一半, 而幅 值大于 6V(M); 而 
在共振 激发中 (resonance excitation) ,其频 率为保 留在讲 中的提 取离子 所相应 的频率 ,而 
其幅 值不能 过大, 以 能达到 提高碰 撞效率 即可, 避免提 取离子 排出离 子讲。 通常其 幅值小 
于 1.5V (一 

第三节 飞行时 间质谱 



Wiley 和 Mckren 于 1955 [25] 年发表 了他们 设计的 飞行时 间质谱 (time-of-flight mass 
spectrometry ,TOFMS)。 早期以 飞行时 间质谱 配以激 光脉冲 电离技 术应用 于同位 素比、 
元素分 析等, 直到 1974 年由 Macfarlane [26] 实现 了等离 子体解 析电离 (plasma desorption) 
与飞 行时间 质谱相 匹配后 才得以 在生物 大分子 的分析 中得到 应用, 尤其是 Karas 和 Hil- 
lenkamp 于 1988 年引入 了基质 辅助激 光电离 (MALDI) 成功地 测试了 分子质 量超过 300 
xl0 3 Da 的蛋白 质后飞 行时间 质谱才 获得了 新生, 随 着飞行 时间质 谱性能 (质 量分 辨率、 
灵敏 度等) 的不断 改进, 基 质辅助 激光电 离-飞 行时间 质谱已 成为生 物大分 子尤其 是蛋白 
质、 多 肽分析 中有效 的工具 之一。 下面对 TOFMS 作一 介绍。 



加 
速 
电 

压 



离子源 引#极 漂移管 D 



© 



图 9.15 



检测器 



飞行时 间质谱 示意图 



TOFMS 由 离子源 (S) 引 出极、 漂移区 (D) 和检 
测器所 组成。 如图 9. 15 所, 示。 当离 子在离 子源内 
引 成后在 离子源 内电场 E 的作 用下 进入无 场漂移 
区。 在理想 状态下 ,所 有进人 漂移区 的离子 具有相 
同 的动能 (KE)。 

KE = qEs 



式中 g = Ze 为离 子的总 电荷, £, 为加速 电压。 



qEs = ― 



式中 m 为 离子的 质量, z; 为离子 飞行的 速度。 
离 子在漂 移区内 所需的 时间为 

t 二 D/v 

以 (9 - 3 - 2) 式中的 t; 代入 (9 - 3 - 3) 式可得 



1/2 



IZeEs 



D 



整理 (9- 3-4) 式为 



2eEs ― 

Id 



(9-3-1) 



(9-3-2) 



(9-3-3) 



(9-3-4) 



(9-3-5) 



Z 

或者 m= A 一, 式中 A 为常 数。 所以, 测定离 子在漂 移区内 的飞行 时间即 可计算 出它的 
质 荷比, 亦即离 子的飞 行时间 谱可转 换成质 谱图。 
. 154 . 



早 期 TOFMS 都 是线性 飞行时 间 质 谱 ( linear (a)A/„^o 
TOFMS) ,分辨 率较低 ,这与 离子在 离子源 内形成 及加速 
过程 中的离 子形成 的时间 U) 、离 子的初 始动能 (Uo) 、离 
子在离 子源中 的位置 (So) 及运 动方向 有关。 如图 9.16 
所示, 图 9. 16(a) 是两 个质量 相同、 初 始动能 相同的 离子, 
但 是由于 它们在 源内形 成时间 的不同 (A《7^0), 所 以当它 
们 以相同 速度飞 向检测 器时, 一直保 持着它 们的时 间差。 
对方程 (9- 3- 5) 微 分可得 



(1> 



(c) Atyo=^o 



(i> - 



dm 



= 2 At. 



dm 



2 &, 所以 ^ 



2 



(d) v,=-v. 



(l>i 



(±>- 



©r 



图 9. 16 离子 源内离 子不同 
状态 示意图 



(9-3-6) 

显 然只要 峰宽保 持不变 (Af 为常数 ), 延长 飞行时 
间, 降低加 速电压 ,可 提高分 辨率。 图 9. 16(b) 是 两个质 
量相同 、初 始动能 相同, 但在 源内的 不同位 置形成 的离子 
(As^O)。 由于 左边的 离子比 右边的 离子受 到更强 的电场 作用, 飞行速 度较快 ,相 对较早 
地到达 检测器 ,其结 果造成 峰宽的 加宽。 图 9. 16(c) 是两 个质量 相同、 在同 一位置 形成, 
但具有 不同初 始动能 的离子 (A(7。^0), 动能 高的离 子飞得 较快。 如果飞 行管的 长度加 
长, 则 这两个 离子的 飞行时 间差也 加大, 显然不 利于分 辨率的 改善。 提高加 速电压 可减少 
这种 影响。 图 9. 16(d) 是两 个质量 相同、 初始动 能相同 ,但起 始飞行 方向相 反的离 子的运 
动 的情况 (Vi= - V2)。 显然, 初始运 动方向 与飞行 方向相 反的离 子需要 更长时 间到达 
检 测器。 提高 加速电 压可缩 短由此 产生的 飞行时 间差。 

综合以 上两个 质量相 同的离 子在离 子源形 成过程 中的状 态及加 速过程 中的各 种因素 
的影响 ,离 子在加 速电压 £5 的作 用下飞 越长为 D 的 漂移管 所需的 时间可 用下式 表示: 



= {2m) 



1/2 



[(t/o + e£5o)^^/.l7o'^] (2m)i々D 



+ ^0 (9 



7) 



式中 to 为离 子形成 时间, 50 为离子 在离子 源中的 位置, U, 为离子 的初始 动能。 

上式中 第一项 为离子 在电离 / 加 速区内 所需的 时间。 其中(1/。 + ^£.;。)1^为离子飞出 
离 子源的 速度, ± l/o 反映了 离子初 始速度 方向的 影响。 第 二项为 离子在 漂移区 内所需 
的时间 ,它 反映了 离子初 始动能 和离子 位置的 影响。 第三项 为离子 形成的 时间。 如果样 
品分 子是从 一个表 面上经 解析电 离进入 气相的 情况, 如在 MALDI 条件下 ,则 e£5。 为常 
数, e£5() = e\^( \/ 为加 速电压 ), 在漂移 管的尺 寸比离 子源大 得多的 条件下 (D》5), 
(9-3- 7) 式可 简化成 



'1々 



2{Uo + eVy 

我们 比较两 个动能 分别为 和 L/d 的离子 ,它们 到达检 测器的 时间差 

1々 「 1 1 



△《 



^12 



X 



(9-3-8) 



(9-3-9) 



从 (9 



3 - 9) 式 可见, 离子初 始动能 的分布 (kinetic energy distribution) 是影响 飞行时 

. 155 . 



间质谱 分辨率 的主要 因素。 把 (9 -3-6) 式代人 (9- 



A 772 OO 2 



1 + 



eV 



1 



9) 式, 则分 辨率可 用下式 表示: 

m eV 



或者更 简化为 



(9-3-10) 



从 (9 - 3 - 10) 式可 见如果 提高加 速电压 或减少 初始动 能分布 将有利 于分辨 率的提 
高。 为此, Mamyrin^ 27 ] 和 他的同 事们于 1973 年在飞 行时间 质谱中 引进了 反射器 (reflec- 
tron) ,以补 偿离子 初始能 量分布 的影响 ,提高 仪器分 辨率, 其结 构见图 9.17。 反射 器处于 



(a) 

离子源 



反射器 



\\\ 



中 性碎片 
检测器 



©■^ (Sy* <Sy* 




图 9.17 反射 器结构 示意图 ' 
漂移区 的后面 ,里 面装有 一系列 电极, 电极 上的电 压逐极 增加, 并在 最后电 极上达 到比加 

速电压 略高水 平上即 (V+a)。 离子穿 进反射 器后, 当 它的能 量达到 后, 随即反 相加速 
出反 射器, 其 能量与 进入时 相同, 只是速 度方向 相反。 假定反 射器的 电场为 £ ,离子 电荷 

K 



为 g ,离 子的 动能为 K ,则 它能够 穿越的 深度为 



因离子 穿进反 射器的 速度是 



从 ",:^ 至 0, 所以 其平均 速度为 在 反射器 中飞行 长度为 工 所需 时间为 ^0 = —^, 
离 子在反 射器中 穿入及 返回的 距离为 2:r。 所 需的总 时间为 r = 2" = ^ = &。 对于 



./2 



两个质 量相同 的离子 ,若它 们具有 的动能 不同, 分别为 K 和 iT ,且 



1< 



"2。 因 K 



,所 以它 们的飞 行速度 分别为 = (2K/m y 々; V'^ = (2KVm ) = 



2 2 

(2Ka 2 /m)i々 = a(2K/m)i々 = «V^,.r。 以 这样的 速度, 两个离 子在漂 移区内 飞行的 时间为 
; =0/卩^,^ = 1)/\^',:^ = 0/«卩^卜=^/«,而在反射器中飞行 2_r 与 2:r' 所需 的时间 
= 4:r/Vu,《V = 4:r7V'u。 由于这 两个离 子的能 量不同 ,所 以在反 射器内 穿越的 深度也 
不同, 其值 分别为 •r = Ky(g£), x'^KV(qE) = a~K/(qE), 二 a?:!: ; 由 此可得 "二 
4:r/V,.r,《'r = 4a 2 :r/«V,.r 二 4ar/Vu ,二 a《r。 从 以上分 析可知 这两个 离子在 飞行时 间质谱 
. 156 . 



的漂移 区和反 射器中 飞行时 间的和 分别为 tf^ 、二 t + tr,t、 = t/<x + ,从式 中可见 ,如 a 

〉1, 即具有 较高能 量的离 子在无 场区飞 行时间 较短, 而 在反射 器中飞 行时间 较长; 相反, 
若《<1, 则具有 较低能 量的离 子在无 场区飞 行时间 较长, 而 在反射 器中飞 行时间 较短。 
所以这 两个相 同质量 ,初始 动能不 同的离 子在反 射器的 作用下 ,飞行 时间相 互补偿 ,最终 
使这两 个离子 几乎同 时到达 检测器 ,提 高了仪 器的分 辨率。 反射型 飞行质 谱不仅 提高了 

仪 器的分 辨率, 而且能 够测定 源后衰 变离子 (post source decay, PSD) ,这些 离子所 包含的 
信息 是结构 解析中 的重要 依据。 PSD 的 基本原 理如图 9.18 所示。 当离子 被加速 出离子 
源时, 离 子门开 (on) 时, 离子 m/z 1281. 7 被 消去, 只剩下 m/ 义 1 270.7( 见图 9. 19)。 选 



100 
75 
50 
25 



[M+H]+ 



I iT^?>i 1, " 



80 85 90 95 100 105 110 115 ml: 



低质量 
PSD 离子 

检测器 



延 迟提取 

IP 离子门 



彘 





1 质量 PSD 离子 

















先 驱离子 




加 速电压 Up 



第 一无场 漂移区 



图 9.18 PSD 原理图 



离 子门关 (off) 



1270.7 



I 1281.7 



miz 1250 1260 1270 1280 1290 1300 



离 子门开 (on) 



1270.7 




ml: 1250 1260 1270 1280 1290 1300 

图 9.19 离子 门的作 用原理 



157 



择的 离子在 进入无 场漂移 区后它 从离子 源内解 析电离 过程中 获得的 内能, 在无场 漂移区 

内 飞行过 程中通 过发生 断裂而 释放其 能量。 这 个过程 称为源 后衰变 (post source decay, 
PSD) ,由 此而得 到的碎 片离子 由于它 与其先 驱离子 具有相 同的飞 行速度 但能量 不同, 所 
以, 在反 射器内 穿越的 深度不 一可被 反射器 按其质 量大小 (即 能量 大小) 从 小到大 依次反 
射, 并到达 检测器 检测。 在上述 分析过 程中, 反射器 的电场 是一个 固定的 电压, 实 际上那 
些能量 小的碎 片离子 (即低 质量的 离子) 不能穿 人反射 器而无 法得到 检测, 一般能 量大于 
5096 先 驱离子 能量的 离子才 能被检 测到, 为此, 在反射 型飞行 时间质 谱中反 射器上 的电位 
是 逐级降 低的, 这样在 每一级 电位下 可得到 与其相 应的较 低能量 的碎片 离子。 全 部碎片 
离 子即可 采用若 干级降 低电位 的方法 得到。 如 在某些 商品仪 器中, 其加速 电压为 
28 . 5kV ,反 射器最 后透镜 电压为 30kV。 在实施 PSD 离子 检测时 , 第一 级采用 30kV ,接着 
为 28. 5,27. 08,23.29, 19. 90 …… 3.66kV ,共分 13 级, 由此而 得到的 14 张 质谱图 可经计 
算机软 件处理 后成为 一张完 整的质 谱图。 在数据 处理中 ,以 相邻两 张质谱 图中同 时出现 
的离 子的峰 强作归 一化, 所以 全谱具 有相同 的强度 标尺。 在飞行 时间质 谱中, 另一 个重要 
的技 术措施 称为延 迟引出 (delay extraction) 。 它 是基于 Wiley 和 Mclaren 提 出的时 间延迟 
聚焦 (time lag energy focusing) 概 念的基 础上由 Brown 和 1^61111011 [28] 等 首先实 现的。 如在 
基质辅 助激光 电离中 ,当激 光束照 射样品 和基质 的共晶 体时, 样品分 子获得 了能量 进行电 
离并溢 出表面 ,此时 不立即 加上加 速电压 将离子 推进漂 移区, 而是在 经过一 段时间 的延迟 
后 (几百 纳秒) 再加速 出去, 在延迟 时间内 离子处 在推斥 极及引 出极之 间的无 场区内 ,由于 
样 品分子 电离后 经延迟 再加速 所以称 为延迟 引出。 这 种技术 的应用 可以补 偿离子 初始动 
能分 布对分 辨率的 影响, 也就 是说, 初始 动能不 一样但 质荷比 相同的 离子能 同时到 达检测 
器, 从而 提高分 辨率。 延迟 时间的 长短与 测试样 品性质 和应用 的基质 有关, Karas [ & ] 用芥 
子酸 (sinapinic acid) 和 二经基 苯甲酸 (DHB) 作为基 质对碳 酸酐酶 (carbonic anhydrase, 分 
子 质量为 29024 .6Da) 进行 测定, 发现 以芥子 酸作基 质时, 最 佳延迟 时间为 300ns, 要比用 
DHB(250ns) 作基质 要长。 即使 如此, 前者分 辨率为 700 ( FWHM) ,而后 者可达 900 
(FWHM) ,如图 9.20 所示。 

总之, 在使用 基质辅 助激光 电离- 飞行时 间质谱 仪进行 生物大 分子测 试时, 除 了仪器 
本身性 能之外 ,还 要考虑 样品的 性质、 基质的 选用、 样品 制备的 方法、 激光强 度等因 素对测 
试时的 分辨率 、灵 敏度的 影响。 

从以上 介绍的 飞行时 间质谱 工作原 理可知 ,飞 行时间 质谱工 作过程 是脉冲 式的。 即 
样 品分子 在离子 源内电 离成为 离子并 滞留一 段时间 后由加 速电压 把它们 引入无 场漂移 
区, 按它 们的质 量大小 不同, 由小到 大逐个 到达检 测器而 被检测 ,所 以飞行 时间质 谱与脉 
冲式 的电离 技术, 如激 光电离 (laser desorption, LD) 、 等离子 体电离 ( plasma desorption, 
PD) 、基质 辅助激 光电离 (matrix assistant laser desorption, MALDI) 能 很好地 匹配。 为了 
实现飞 行时间 质谱与 连续电 离源如 电子喷 雾电离 相连接 ,在 离子引 人飞行 时间质 谱的方 
法上相 应发展 了许多 相关的 技术, 如 在线门 (in-line gate) 、垂直 加速器 和离子 阱储存 (ion 
trap storage) 等离 子引入 技术, 以 下对垂 直加速 器方法 作简单 介绍。 垂直加 速器的 结构如 
图 9.21 所示, 低能离 子束从 离子源 出来经 静电透 镜聚焦 后送入 加速区 ,加 速区的 宽度约 
为漂 移区的 5% ~10%, 当离子 充满加 速区后 ,漂 移区内 的电极 (一个 或多个 电极) 上加上 
脉冲 电压, 建立 一个脉 冲的引 出场, 此场 与连续 离子流 成绝对 垂直, 离子在 引出场 的作用 
. 158 . 




28400 28600 28800 29000 29200 29400 29600 29800 

ml: 





检 iW 器 

图 9.21 垂直 加速器 -TOF 示意图 

下获 得能量 并飞进 无场漂 移区。 当第一 批离子 离开引 出场后 ,关闭 引出场 电压, 使 离子束 
再次 充满加 速区, 如此反 复循环 ,可 实现连 续离子 源与飞 行时间 质谱相 结合。 由于 连续离 
子流 的初始 速度方 向和引 出场相 垂直还 带来了 另一个 优点即 离子在 漂移区 方向上 的速度 
分量 极小, 因此 可以提 高飞行 时间质 谱的分 辨率。 目前 采用垂 直加速 器离子 引人技 术后, 
其分辨 率可达 5 000(FWHM) ,仪 器已商 品化。 在解 决了连 续离子 流和飞 行时间 质谱相 

. 159 . 



28400 28600 28800 29000 29200 29400 29600 29800 
miz 

图 9.20 不同 的基质 和延迟 时间对 分辨率 的影响 
a. 芥 子酸为 基质; b. 二经基 苯甲酸 为基质 



离子源 

V 



漂移区 



排 斥脉冲 

- OV 

W I 总 离了流 

—— , V- 

1 0V 




8 6 4 



2 



J2 13 



数数数 

栅栅栅 



匹配的 问题后 ,为 了在 TOF 仪器 上实现 MS/MS 功能, Morris 于 1996 [ 1 5] 年 发表了 他设计 
的 四极- 垂直飞 行时间 质谱串 联装置 (quadrupole- oa time of flight mass spectrometer, Q- 
TOF), 具体结 构如图 9.22 所示, 第一 级质谱 采用四 极杆, 第 二级质 谱为反 射式飞 行时间 
质谱 , 此 两级质 谱成垂 直配置 , 其间还 有碰撞 活化室 以实现 碰撞诱 导解离 ( CID) 。 进行质 
m~ 质谱实 验时, 第 一级四 极杆质 谱用于 选取单 一离子 并将它 送入碰 撞活化 室与惰 性气体 
发生碰 撞并使 母离子 发生诱 导裂解 。 碰撞 活化室 由 六级 杆组成 , 在 工作状 态下极 杆上仅 
有射 频电位 (RF-only) , 因而所 有离子 均能通 过碰撞 活化室 , 到达第 二级垂 直飞行 时间质 
谱 的加速 器中, 在推斥 极的 作用下 ,离 子进人 TOFMS 进行质 量分离 。 由 于此 仪器配 以 电 
子喷雾 电离源 (ESI) 和基 质辅助 激光电 离源, 可分别 实现与 高效液 相色谱 联用或 直接进 
样。 目前已 成为蛋 白质组 研究工 作中的 重要手 段之一 ,在商 品仪器 中已可 见采用 多级反 
射器 (W 型) 的 飞行时 间质谱 作为第 二级质 谱仪。 由于多 级反射 ,其 分辨率 更高, 可达 
20 OOO(FWHM) 左右。 



推斥极 TOF 检 « 器 




图 9.22 ChTOF 结构 示意图 



第四节 傅里 叶转换 回旋共 振质谱 

傅里叶 转换回 旋共振 质谱仪 (Fourier transform- ion cyclotron resonance mass spectrom- 
etry,FTMS) 由于 其超高 分辨率 及质量 测量的 准确度 而备受 关注。 第一台 FTMS 是由 
Comisarow 和 Marshall[ 3 G ] 于 1974 年研 制的, 但 是它在 蛋白质 和多肽 分析中 的应用 还是在 
电子喷 雾电离 (ESI) 和基质 辅助激 光电离 (MALDI) 的引入 后才逐 渐广泛 起来。 FTMS 主 
要 有四大 部分所 组成, gp : 超 导磁场 (其磁 场强度 可高达 3 〜 9T) , 分析池 ( analyzer cell ) ,超 
高 真空系 统和计 算机数 据处理 系统。 

一、 基 本原理 

FTMS 的工作 原理是 基于离 子在均 勾磁场 中的回 旋共振 运动。 当离子 在进入 分析池 
后即被 "陷入 "池中 ,由于 分析池 置于均 勾的强 磁场中 (B), 此离子 将受到 洛仑兹 力的作 
用, Fi^ = ez;£ ,式中 e 为 离子的 电荷, 为 离子的 速度, £ 为磁场 强度。 由于 离子在 磁场中 
受力方 向始终 保持与 速度方 向垂直 ,所以 离子在 磁场中 将作圆 周运动 ,此时 离子受 到的洛 
. 160 . 



仑兹 力和离 心力相 平衡, 见图 9.23。 Fl^Fz ,即 



evB 二 

r 

式中 m 为离子 质量, r 为离 子回旋 半径, 因为 z;/r 二 CO 二 27r/ ,所以 

eB = mat) = 2mTzf 
式中 CO 为角 速度, / 为回旋 的频率 (Hz) ,由 此可得 

f 二 eB/2izm 

evX B=mv-lr 



(9-4-1) 

(9-4-2) 
(9-4-3) 






图 9.23 离 子在磁 场中的 受力图 



图 9.24 不 同质荷 比离子 的回旋 频率图 



可见 离子的 回旋频 率与离 子的质 荷比成 反比, 而 与磁场 强度成 正比。 图 9.24 显示 了两个 
不同 质量的 离子在 磁场中 回旋共 振时的 情况, 离子 A 由于质 荷比比 B 小, 所以其 回旋的 
频率比 B 高。 从 (9-4 -2) 式又可 见对于 一个给 定质量 的离子 ,若 置于较 高的磁 场强度 
内, 其回旋 频率亦 较高。 由于 在高频 信号测 量中, 较高的 频率可 得到较 好的信 噪比, 所以 
采 用高磁 场能得 到较好 的测量 结果。 另外, 从 (9 - 4 - 2) 式也可 推论, 离子 的回旋 频率与 
它的初 始速度 无关, 所 以离子 的动能 分布不 会影响 FTMS 的 性能, 这就是 FTMS 可以得 
到 超高分 辨的基 本原因 之一。 分 析池是 FTMS 中的关 键部件 ,其结 构见图 9. 25, 它是一 
个立 方体, 它的六 个面构 成了相 互绝缘 的三组 极板, 上下一 组称为 接受极 (receiver plate), 
用于接 受离子 产生的 信号。 左右 一组为 传送极 (transmitter plate) , 用于传 送激发 脉冲信 
号。 前后一 对为" 陷电极 "(trapping plate) ,它与 磁场相 垂直, 为了阻 止离子 沿磁场 方向从 
池中 逸出, 通常 在此组 极板加 上一个 正或负 1〜2V 的电压 ,当 离子进 人分析 池后, 即使质 
量相同 的离子 ,由于 其初速 度不同 ,在磁 场中做 回旋运 动时, 其 回旋频 率相同 而半径 不同。 



接受极 



FT 




时 域信号 



陷电极 

图 9.25 分析池 示意图 



质谱 





图 9.26 不同 初速度 的离子 的回旋 状态图 



图 9.26a 显示 了这些 离子在 不同的 半径上 作回旋 运动的 情况, 如果此 时在传 送极加 
上一个 频率与 这些离 子回旋 频率相 同的激 发脉冲 ,这些 离子将 与其产 生共振 ,离子 在获得 
了能量 后回旋 半径逐 渐增大 ,最 后趋向 一致。 所以, 这 些离子 在激发 后回旋 在相同 的半径 
轨道上 并聚集 在一起 。 如图 9 . 26b 所示 , 轨 道半径 由下 式表示 r = Arf X ^ ,式中 Arf 是 

• 161 . 



激发 脉冲的 大小, f 为激发 脉冲的 时间。 从上式 可见, 轨道半 径与激 发脉冲 的大小 、时间 

成正 比 , 与 磁场强 度成反 比。 FTMS 中离子 信号的 接受是 在接受 极板上 完成的 , 其 基本原 
理见图 9.27, 当正 离子在 池中做 回旋运 动并接 近接受 极时, 它吸引 了与接 受极相 连的外 
电路中 的电子 ,感 应出" 像电流 "(image current )o 所以, 在离子 的激发 过程中 ,若 在传送 
极上 加上很 快的射 频扫描 (RF chirp), 其频率 范围能 覆盖欲 测定的 质量范 围所相 应的频 
率, 池中 的所有 离子将 同时被 激发, 并在 接受极 上获得 与其相 应的像 电流, 如图 9.28 所 



激 发脉冲 I 

Time 




图 9.27 像电 流产生 示意图 图 9.28 FTMS 转换 流程图 



示 C 这种图 谱称为 时域谱 (time- domain spectrum) ,为 了从时 域谱中 得到每 一个质 荷比的 
离子 的频率 成分, 通常用 傅里叶 转换方 法来进 行计算 ,经 过这种 转换的 谱称为 频域谱 (fre- 
quency-domain spectrum) 若以参 比化合 物建立 了频率 和质量 关系, 频域 谱即可 转化为 
质谱。 为了实 现连续 测试, 池 中剩余 离子必 须在每 次测试 后从池 内清除 (qunch), 它是通 
过分别 加在一 对陷阱 极上的 正负电 压来实 现的。 使 正离子 (负 离子) 与负极 (正极 ) 相碰 
撞, 这 样剩余 的离子 即可被 消去。 综上 所述, FTMS 的操 作是通 过四个 步骤, 即清除 、电 
离、 激发和 检测程 序来完 成的。 如图 9.29a 所示, 首先清 除池内 的剩余 离子, 接着 用各种 
离子引 入技术 如四极 杆或静 电透镜 组将电 离后的 离子引 入分析 池中, 然后 以频扫 (RF 
3 清除 电离 激发 检測 

反 应时间 



清除 单离了 -提取 碰 撞诱导 激发 频 



离子化 过 度激发 



162 



图 9.29 FTMS 脉冲 序列图 



chirp) 、脉 冲激发 ( impulse excitation )、 储存 波形逆 向傅里 叶转换 ( storage wave inverse 
Fourier transform) 等方法 同时激 发不同 质荷比 的离子 ,最后 同时记 录所有 不同回 旋频率 
的 信号。 



(1) 质量 分辨率 

在 FTMS 中质量 分辨率 可用下 式表示 = i /T ,式中 / 为回旋 频率, T 为采 集信号 

持续 时间, 从上式 可见, FTMS 的质量 分辨率 是与磁 场强度 (£) 和 信号持 续时间 (T) 成正 
比, 而与 离子的 m/z 成 反比。 为了 达到高 分辨, 在磁场 强度确 定后, 分辨 率就取 决于信 
号持 续时间 (T) 的长短 ,虽然 FTMS 的分 析池是 处于高 真空状 态下, 但是 离子和 池中的 
中性 分子发 生碰撞 仍旧是 不可避 免的, 这种碰 撞会减 低离子 的速度 以至于 逐渐减 少离子 
回 旋的半 径甚至 使信号 消失, 所以在 FTMS 仪器中 ,保持 超高真 空是必 需的, 通常 其真空 
度 应优于 10 — 9 torr ,这 样才能 保证较 长信号 时间, 以得到 高分辨 数据。 同时 我们也 应看到 



基于 FTMS 原理, 它的分 辨率会 随着所 测的分 子质量 的增大 而降低 /=;^。 Mclaffe- 



ty [3 i ] 曾 以细 胞色素 C 为 标样对 FTMS 性 能进行 测试, 其结 果见图 9 . 30 , 图中 显示, 随着质 
量测量 范围的 增大, 分辨率 呈下降 趋势。 尽管 如此, FTMS 的 分辨率 还比其 他类型 的质谱 

高。 



(2) 质量 准确度 

FTMS 的高分 辨性能 为质量 测定的 准确度 提供了 前提, 但并不 意味着 分辨率 越高, 质 
量 测量准 确度也 越高。 在良 好的质 量标尺 校正情 况下, 即 使测量 离子的 m/2>1 000, 
FTMS 的质量 测量准 确度仍 可达到 l〜10ppm。 这对于 肽谱检 索的准 确度是 非常重 要的。 

(3) 质量 范围和 灵敏度 

对于 生物大 分子的 分析, 质 谱仪的 质量测 定范围 亦是选 用质谱 仪的主 要指标 之一, 
FTMS 理论 可测质 量的上 限与磁 场强度 (J3) 和陷 阱板上 的电位 (VtO 有关, 磁场 强度越 
高, 可 测的质 量范围 越大, 但是陷 阱极上 的电位 所形成 的径向 电场会 引起离 子从径 向排出 
池外, 故而陷 讲电位 应尽可 能低, 如图 9.31 所示, 在 ^7^ = IV 时, 磁场 强度为 7. 5T 的可 
测 极限为 280 000(7/2厶) ,而 3.0T 只 能达到 50 000( m /z) ; 同样, 对某一 强度的 磁场如 



、 质量分 辨率、 质量精 度和质 量范围 





图 9.30 质 量分辨 率与质 量范围 关系图 



10 000 000- 



I 000 000 - 




图 9.31 质 量范围 与陷阱 电极上 

电位 Vt 的关系 



7.5T 随着 Vt 的增 加其可 测定质 量范围 呈下降 
趋势 , 大 体上它 们成线 性关系 , FTMS 的 灵敏度 
随着磁 场强度 的增强 而增高 ,基 本上也 呈线性 
关系, 同时 延长采 集数据 时间并 叠加采 样信号 
均对 提高灵 敏度和 信噪比 有益。 
(4) 多级质 语-质 傳功能 

实现 质谱- 质谱是 FTMS 的重 要功能 之一。 
在常 规测试 的脉冲 序中, 插人 3 个 脉冲, 即单离 
子提取 ,过渡 激发, 碰撞 活化, 即可 实现, 如图 
9.2% 所示。 在清除 电离脉 冲后, 以一定 形式的 
激发 脉冲, 消去除 选择的 先驱离 子以外 的所有 
离子, 然后以 过渡激 发脉冲 激发先 驱离子 使其回 旋半径 增大并 聚集在 一起, 接着向 池内注 
入一 定量的 气体, 使离子 与气体 分子发 生碰撞 并发生 裂解, 最 后再激 发所有 的碎片 离子并 
接受其 信号, 反复整 个上述 过程, 即可实 现多级 MS/MS 功能, 此功能 只有在 FTMS 和离 
子 阱质谱 中才能 实现。 另外, 由 于电喷 雾电离 形成的 蛋白质 多电荷 离子因 其电荷 间的相 
互排斥 作用, 故而 在碰撞 诱导解 离过程 中比单 电荷离 子更容 易发生 裂解并 再生成 不同电 
荷 状态的 离子。 这些 离子的 准分子 离子与 其同位 素峰在 FTMS 实 验中由 于它的 超高分 
辨能 力很容 易得到 分离, 我们只 需观察 在一个 质量单 位内所 能包含 的峰数 即为离 子所带 
的电 荷数。 图 9.32 所 示为某 一带有 14 个电 荷的肽 段的质 谱图。 可见峰 间质量 差仅为 
0.07。 由于 FTMS 的 超高分 辨性能 和多极 MS/MS 功能, 并实 现了与 MALDI 电 离源和 
ESI 电 离源相 连接, 所以它 在蛋白 质结构 分析中 逐渐地 被广泛 应用, 惟一的 缺点就 是价格 

B 虫 

卬 jn 



13+ 





»+ 


1: 


1 


1+ 

10+ 









800.0 1 000.0 1 200.0 

\0-2>/ 



14+ 



7+ 

iL 



4+ 



5+ 890.0 891.0 



_ I 1 p 

800.0 1 000.0 1 200.0 



14+ 




802.5 803.0 



-n 1 1 r 

800.0 1 000.0 1 200.0 



图 9.32 带 14 个 电荷的 离子的 同位素 分布图 



(杨 一鸣 孙 海芳) 



. 164 . 



参 考文献 



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• 165 • 



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166 



第十章 毛细 管电泳 _质 谱联用 

第一节 介 绍 

20 世纪 90 年代 以来, 随着基 因组计 划的实 施和快 速发展 ,迄今 为止已 有流感 嗜血杆 
菌、 大肠 杆菌、 酿酒酵 母等几 十种微 生物的 全序列 被测定 ;对 cDNA 和表达 序列标 记的大 
规模测 序也取 得显著 进展, 这 将为生 物学家 们提供 前所未 有和极 其丰富 的遗传 信息。 但 
同时人 们也越 来越清 楚地认 识到, 要单 单从基 因的序 列推断 出基因 产物的 行为和 功能是 
十分困 难甚至 是不可 能的。 因为即 使基因 被转录 ,它 的表达 还可能 在翻译 水平上 受到调 
控, 并且 其蛋白 质表达 产物还 将通过 翻译后 修饰、 改变 半衰期 和装配 到蛋白 质复合 物中等 
方式进 一步受 到调控 [1]。 为了 对生物 系统的 功能和 调控有 深人的 了解, 对 组成和 调控这 
样一 个系统 的蛋白 质的分 析就显 得十分 重要。 但是, 现在还 没有一 种常规 的方法 可以把 
代表 某一过 程中特 殊状态 形式的 蛋白质 或代表 某一特 定蛋白 质修饰 形式的 蛋白质 进行扩 
增。 与 DNA 可 以通过 PCR 方法方 便地进 行扩增 所不同 的是 , 在对蛋 白 质 进行分 析之前 
必须 把它们 从其生 物来源 中分离 出来。 由 于许多 蛋白质 (尤其 是特殊 的调控 蛋白) 常常是 
丰度极 低的, 所以蛋 白质分 析技术 的高度 灵敏性 就极为 重要。 

在常用 的蛋白 质和多 肽分离 技术中 ,毛细 管电泳 (capillary electrophoresis, CE) 具有 
最 高的灵 敏度。 经 过适当 标记的 蛋白质 甚至可 以通过 激光诱 导荧光 检测方 法在单 分子水 
平上得 到检测 [2 3。 有两个 因素对 CE 的广 泛应用 形成了 限制: CE 通 常所用 的检测 器都只 
是检测 到被分 析物的 存在, 而 不能区 分所分 离物质 各自的 性质; CE 只能 容许几 十纳升 
(nanoliter, nL, l(r 9 L, ) 的进样 体积, 所 以其浓 度检测 极限与 层析方 法相比 并没有 显著的 
优 越性。 但是, 后来发 展的在 线预浓 缩方法 能够显 著提高 浓度检 测极限 ,而 且质谱 (mass 
spectrometry, MS) 及串 联质谱 (tandem mass spectrometry, MS/MS) 的 引入使 得在低 fmol 
(femtomole, 10— i 5 mol) 甚至 amol(attomole, l(ri 8 mol) 水平 上对经 CE 分离 的多肽 进行鉴 
定成 为可能 [3 ' 4] 。 正是 由于毛 细管电 泳-质 谱联用 (CE/MS) 技术的 这些显 著优点 ,使得 
它越 来越受 到生物 学家的 关注, 并被广 泛地用 于蛋白 质和蛋 白质组 的研究 之中。 

一、 概 况 

在 20 世纪 80 年 代早期 ,Jorgenson 和 Lukacs 指出 ,CE 可 以产生 快速和 高分辨 率的分 
离, 带电物 质根据 它们电 泳迁移 率的不 同而得 到分离 [5] 。 CE 的样 品操作 和进样 自动化 
更加 容易; 可以直 接采用 紫外吸 收及荧 光发射 检测器 进行在 线检测 ;进样 量和消 耗溶剂 
少。 另外, 对比液 相层析 而言, 由于 不存在 纵向分 子扩散 和质量 转移, CE 的峰型 比较尖 
锐, 而且质 量灵敏 度也常 常要高 得多。 正 是由于 CE 的这 些引人 注目的 优点, 自 80 年代 
后期 第一台 商品化 CE 仪 器出现 以来, CE 在技术 上和应 用上得 到了" 爆炸" 式的 发展。 CE 
在进样 方法、 检测器 灵敏度 、毛细 管表面 衍生、 涂层技 术和引 入新的 电泳缓 冲液系 统等方 

. 167 . 



面 的发展 进一步 推动了 CE 在多 个学科 领域的 应用。 CE 能 处理和 分析极 小体积 样品的 
能力 为使用 CE 来 挑战极 端的分 析任务 (如 对单个 细胞的 分析) 提供了 基础。 另外, CE 具 
有多 种电泳 形式, 如区 带电泳 (capillary zone electrophoresis, CZE) 、等 电聚焦 (capillary iso- 
electric focusing , CIEF) 、 等速 电 泳 ( capillary isotachophoresis , CITP ) 、 电动层 析 ( capillary 
electrokinetic chromatography, CEC) 、 胶束电 动层析 (micellar capillary electrokinetic chro- 
matography, MEKC) 和凝 胶电泳 (capillary polyacrylamide gel electrophoresis, CGE) 等, 还 
具有 多种控 制进样 条件和 分离特 异性的 方法。 因此, 使用 CE 来进 行样品 分析灵 活性极 
大, 它被广 泛地用 于复杂 混合物 的分析 ,如蛋 白质酶 解产物 、药 物的底 物和代 谢物、 DNA 
加合物 ,以 及生物 工程产 品等。 不少 文章对 CE 的最 新研究 和应用 情况作 了综述 [6 ' 7] 。 

尽管 CE 的多功 能性、 高分辨 率和高 速度使 它在多 个领域 得到了 广泛的 应用, 当时其 
检测方 法的局 限性限 制了它 在这些 领域研 究中的 进一步 深人。 最近 10 年来, 随着 质谱技 
术 的飞速 发展, 电喷雾 离子化 (electrospray ionization, ESI) 质谱 [8] 和基 质辅 助激光 解吸离 
子化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 质谱 [9] 已经 成为生 物大分 子研究 
中必 不可少 的支撑 技术。 把 MS 作为 CE 的检 测器受 到越来 越多的 关注。 MS 可能是 CE 
最强有 力的检 测器。 因为 MS 可以提 供多达 几千个 的离散 性和选 择性的 "检 测器" 等价物 
(每一 个质荷 比值都 可以看 作是一 个单独 的检测 器), 它们并 行地工 作并能 提供完 整的" 分 
子离子 "的分 子质量 信息和 母离子 在质谱 仪中解 离而产 生的结 构相关 信息。 从某 个角度 
来看, CE 和 MS 的 联用简 直可以 说是理 想化的 —— CE 的分 离基于 溶液中 离子的 不同迁 
移率, 而 MS 则 根据离 子在气 相中的 质荷比 (mass-tocharge ratio, m/z) 来分 析离子 —— 
这 两种高 度正交 化的分 析方法 分别利 用了在 两种截 然不同 的环境 中的离 子迁移 运动。 
CE 分 离中常 常遇到 的迁移 时间变 化等问 题可由 MS 检测的 选择性 和特异 性得到 补偿。 
把分离 技术与 质谱联 用还可 以显著 提高检 测极限 并且简 化对分 析结果 的解析 过程。 

Jorgenson 等人的 早期工 作已经 清楚地 揭示出 CE 的潜力 ,但 是要把 CE 与 MS 联接 
起来 还需要 解决几 个概念 上和实 践上的 问题。 首先, CE/MS 必 须同时 建立起 CE 的电场 
梯度和 ESI 的 高压。 其次, CE/MS 的接口 必须与 CE 的 低流速 (通常 《l;il/min) 相容。 
第三, 要避 免任何 可能由 毛细管 两端压 力差造 成层流 而引起 的峰型 变宽, 或 者与检 测密切 
相 关的死 体积。 另外, CE/MS 要有实 际应用 价值, 其检 测灵敏 度还必 须在亚 pmoKpico- 
mole, l(ri 2 mol) 水平 之上。 80 年代 早期就 有了为 LC/MS 设计的 热喷雾 (thermospray) 接 
口, 但这 种接口 并不适 合用于 CE/MS ,因 为它 的流速 要求在 10(Vl/min 以上, 而且 也不够 
灵敏。 1984 年, Fenn 等人 首次将 ESI 离 子源与 MS 连接 ,其中 液 体从毛 细管的 一端以 
l~10^tl/min之间的速度流出并在高压电场中被雾化而进人MS。 这个 结果使 Smith 等 
人 深受鼓 舞并致 力于发 展基于 ESI 的 CE/MS 在 线联用 技术。 1987 年, Smith 等 [ 11 ] 人发 
表 了有关 CE/MS 联用的 第一篇 论文, 对 CE/MS 的研 究情况 作了综 述并客 观地评 估其潜 
力 和限制 因素。 此外, Moseley 等 [ 1 2] 人还发 展了基 于连续 流快原 子轰击 (continuous-flow 
fast atom bombardment, CF-FAB) 离子化 方法的 CE/MS 接口。 近年来 ,将 CE 与 MS 联 
用的技 术已经 达到了 一个相 当成熟 的程度 ,这 当然是 与各种 CE/MS 接口 的不断 完善密 
不可 分的。 

CE 已经 与多种 不同类 型的质 谱质量 分析器 联用, 其中包 括三级 四极杆 (triple 
quadrupole, TQ) 质谱、 傅里 叶转换 离子回 旋共振 (Fourier transform ion cyclotron reso- 
. 168 . 



nance, FTICR) 质谱、 离子阱 (ion trap, IT) 质 谱和飞 行时间 (time- of- flight, TOF) 质谱。 
尽 管在将 CE 与 CF-FAB 和 MALDI 联用 方面作 了不少 努力, ESI 还是人 们在将 CE 与 
MS 联用时 的首选 方法。 这主要 是因为 ESI 将 分子从 液相直 接转移 到气相 之中, CE 与它 
的 整合比 较容易 实现。 而且, ESI 条件下 ,大分 子物质 是带多 电荷的 ,这使 得分子 质量较 
高 的物质 可在大 多数质 谱仪有 限的质 量范围 内被检 测到。 

对 MS 仪器 的改进 使它的 灵敏度 、速度 , 以 及由这 种强有 力的检 测器获 得的分 子结构 
信 息的细 节进一 步得到 提高。 MS/MS 和多 级质谱 (MSn) 方 面的研 究进展 更为我 们展示 
了能提 供更高 选择性 和结构 信息的 未来质 谱仪器 的美好 前景。 尽管 MS 仍是 CE 最复杂 
和最 昂贵的 检测器 之一, 但其费 用正在 降低, "用户 亲切性 "正在 增加, 而且 从这种 联用中 
可以得 到的不 断增加 的丰富 信息还 将持续 地减轻 我们对 这些" 缺点" 的 顾虑。 典型的 
CE/MS 系统 示意图 可用图 10.1 来 表示。 对 CE/MS 的发展 和应用 已有不 少综述 [ 1 3 ~1 7 ]。 



CE HV 



UV 





Interface ^ 



MS 



I 




1 






Time ni/z 



图 10 . 1 CE/MS 仪 器设置 示意图 



二 、 CE/MS 联用 的接口 

从 MS 的角度 来看, CE 和 MS 的联 用要依 赖于接 口才能 在不牺 牲毛细 管电泳 分辨率 
的前提 下在线 地把分 析物从 电泳毛 细管中 的液相 中高效 地转移 到气相 中进行 MS 分析。 
CE 本身 非常适 合于分 离容易 在溶液 中形成 离子的 极性化 合物, 但是 这些类 型的化 合物对 
常规的 离子化 方法, 如电子 和化学 离子化 ,却 是一个 挑战, 而 且不挥 发性或 热不稳 定性化 
合物在 此条件 下容易 产生热 分解。 直到 ESI、MALDI 和 FAB 等" 软 电离" 方法发 展起来 
后, 这 种矛盾 才得以 解决。 CF-FAB 和 ESI 以及气 动辅助 ESI 等离 子化方 法都已 成功地 
与 CE 进行了 联用; 而等离 子解吸 (plasma desorption, PD) 和 MALDI 等解 吸附离 子化方 
法与 CE 的联用 基本上 还处于 非在线 阶段。 由 于前述 ESI 方法 的诸多 优点, CE 与 MS 的 
联用 多采用 ESI 方 法来离 子化。 

最佳的 CE/MS 接口 应该能 提供最 高的离 子转移 效率, 最好的 电导通 性和喷 雾稳定 
性, 同 时只引 入最少 的物理 和化学 问题。 现在用 来进行 CE/ESI-MS 联用的 接口有 三种: 
同轴鞘 流 液 ( coaxial sheath-flow ) 接口、 液- 液连接 ( liquid-junction ) 接 口和无 鞘流液 
(sheathless) 接口 (图 10.2)。 



169 




t 

销流气 



图 10.2 CE/MS 接口 示意图 

a. 鞘流液 接口; b. 液- 液连接 接口; C. 无鞘流 液接口 
(-) 鞘流 液接口 

鞘流 液接口 (图 10. 2a) 首先由 Smith等 [ l 8] 人提出 ,它是 一种最 常用的 CE/MS 接口, 
因为 它可以 很容易 且重复 地建立 起来。 这种接 口使用 了一种 同轴的 层层包 裹结构 ,分离 
毛细管 的出口 端既是 CE 的出口 端也是 ESI 的发 射口, 其外部 有鞘流 液流通 ,以 建立起 
CE 分离和 ESI 发 生所必 需的电 连接。 分离毛 细管出 口端突 出在鞘 流液针 管尖端 之外约 
lmm,CE 的 流出物 质与鞘 流液在 这里混 合并被 喷雾。 鞘流 液通常 是一定 比例挥 发性酸 
与挥发 性醇的 水溶液 (鞘 流液可 以综合 考虑表 面张力 、pH 值及 添加剂 等因素 以优化 ESI 
条件) ,它可 以稀释 CE 的电泳 缓冲液 ,也 就减轻 了可能 存在的 电泳缓 冲液与 ESI 不相容 
的程度 ,但是 在使用 前必须 将鞘流 液脱气 以防止 ESI 时 气泡的 产生。 当液 体的流 速较大 
时, 还可以 在鞘流 液的外 部再使 用鞘气 来辅助 喷雾。 这种接 口由于 鞘流液 的引入 可以增 
加 在选择 CE 缓 冲液方 面的灵 活性。 在 分离毛 细管内 壁用中 性化合 物涂层 后电渗 流几乎 
为零的 情况下 , 常常 要使用 这种类 型的接 口 。 

鞘流液 中不可 避免地 含有离 子化或 中性的 物质, 它们在 ESI 的 过程中 会竞争 本来就 
有限的 电荷, 从而降 低了分 析物的 离子化 效率。 使用 鞘流液 还引入 了另一 些化学 背景, 它 
们可能 会对分 析物的 检测造 成干扰 而且增 加检测 极限, 还可 能改变 分析物 的带电 荷分布 
形态。 同样值 得一提 的是, 由于 毛细管 中电场 梯度的 存在, 鞘 流液和 电泳缓 冲液中 的阴离 
子都 朝阳极 移动。 当这两 种溶液 中的阴 离子不 同时, 就会在 CE 毛 细管的 内部形 成一个 
移动 的离子 边界。 由于 这个移 动边界 内部的 pH 可能会 不同, 当分 析物进 入到这 个边界 
时, 电渗流 的速度 、分析 物的有 效电荷 以及它 们的迁 移率都 会发生 改变。 这 种现象 的发生 
将不仅 影响分 析物的 迁移时 间和迁 移顺序 ,而 且会引 起分离 效率的 损失。 将 CE 的入口 
端抬高 以提供 除电泳 流动以 外的流 体力学 流动, 可以 将这种 分离效 率的损 失保持 在最小 
的 水平。 

(二) 液- 液连 接接口 

液 -液连 接接口 (图 10. 2b) 首先由 Lee 等 [1 9] 人发展 起来。 这种 类型的 接口使 用了一 
. 170 • 



个 T 型结 构, CE 分离毛 细管和 ESI 发 射毛细 管之间 的电连 接通过 由另一 入口引 人的缓 
冲液 (也 称构 成液, make-up liquid) 来 建立。 CE 毛 细管和 ESI 发射 毛细管 之间的 缝隙只 
有 10〜20/^m。 构成 液的传 送速度 可以通 过可控 流速的 方式来 控制, 液-液 连接处 还可以 
方 便地进 行精确 定位。 

Severs 等 [ 2 G3 人利用 透析膜 建立电 连接还 发展了 一种透 析液- 液连接 (dialysis junc- 
tion) 接口。 Yang 等 [ 2 1] 人 通过这 种接口 进行了 CIEF/ESI-MS 实验。 与常 规的鞘 流液接 
口 相比, 这种接 口 的灵 敏度要 高一个 数量级 , 而且离 子强度 和信噪 比也高 许多。 这种接 口 
设计可 以获得 很高的 分辨率 ,而且 接口处 的透析 液-液 连接所 提供的 柱后酸 化过程 可产生 
更加有 效的变 性作用 而使蛋 白质带 上更多 的电荷 ,从而 提高其 离子化 效率。 

由 于液- 液连接 接口中 CE 毛 细管与 ESI 发射毛 细管是 断开的 ,所以 ESI 发射 毛细管 
可以很 容易地 被更换 ,与 之相关 的问题 也就与 CE 分离毛 细管隔 离开来 ,从 而延长 了其使 
用 寿命。 另外, 这种接 口可以 适应多 种不同 的流速 条件, 而且 在柱后 引入缓 冲液使 得在选 
择 缓冲液 的适当 pH 值、 组成 和流速 以优化 ESI 效 果方面 具有很 大的自 由度。 但是, CE 
分离毛 细管和 ESI 发射毛 细管之 间的不 良安装 将直接 导致峰 型变宽 和分离 效率的 损失。 
液- 液连接 处的溶 液混合 或流速 过低可 能造成 的峰型 变宽和 背景噪 声也是 这种接 口的缺 
点 所在。 

(三) 无鞘流 液接口 

鞘 流液接 口 和 液-液 连接接 口 的一 个共同 缺点是 : 它们的 工作都 依赖于 含有带 电荷物 
质 的额外 液流的 存在, 从而不 可避免 地在不 同程度 上对检 测灵敏 度造成 影响。 这 促使人 
们致力 于发展 一种更 加灵活 、可 靠而且 不再需 要额外 液流的 CE/MS 接口。 

无鞘流 液接口 (图 10.2c) 由 0117&^3等 [ 11 ] 人首先 提出。 早期的 无鞘流 液接口 在电泳 
毛细管 的外部 套有一 根不锈 钢针管 ,在 毛细管 的末端 和不锈 钢针管 上都有 一层银 的沉积 
层。 因为 获得稳 定的电 喷雾所 需的起 始电压 随着喷 雾尖端 外径的 减小而 降低, 所 以使用 
较 小内径 的毛细 管可以 在产生 电暈放 电现象 之前使 水溶液 喷雾。 这种 概念被 Gale 和 
Smith 用来 改造早 期的接 口 。 他们 不再使 用不锈 钢针, 而是 使用末 端被氣 氟酸蚀 刻并打 
磨成 尖端的 小内径 (5〜l(Vm) 熔融 石英毛 细管, 毛细 管尖端 的外部 用金涂 层以建 立电连 
接, 并用 SF6 作为 鞘流气 以抑制 喷雾尖 端处电 晕放电 现象的 产生。 

ESI 发 射口尖 端的涂 层技术 决定了 其性能 和使用 寿命。 Kelly 等 [22] 人 的方法 最为成 
功, 他 们将毛 细管尖 端先进 行金的 喷溅, 然后再 通过电 镀来加 强金的 涂层。 Chang 等 [23] 
人报 道了一 种简单 的方法 来制备 碳涂层 的毛细 管尖端 用于无 鞘流液 接口。 制备而 成的毛 
细管 尖端可 以在比 较极端 的酸碱 条件下 使用, 而且 性能与 金涂层 的毛细 管尖端 相当。 

无鞘 流液接 口可以 说是把 CE 与纳升 电喷雾 (nanospray, 0£51)或微升电喷雾(1^;- 
crospray,/zESI) 质谱 联用的 最简单 的一种 接口, 而且它 与这些 微量喷 雾技术 较低的 流速非 
常 相容。 这种接 口 喷雾电 压更低 ,喷 雾口与 MS 人 口之 间距离 更短, 这些特 点使得 它的质 
量转移 (mass transfer) 效 率和液 体微珠 的去溶 剂化效 率大为 提高。 因此, 使 用这种 接口可 
以获得 很高的 离子化 效率和 较低的 质量检 测极限 ,它是 最灵敏 的一种 CE/ESI-MS 接口。 
另 外 , 与鞘 流液接 口 相比, 没有 额外的 化学物 质被引 入 。 

使用 这种接 口 时 , 毛 细管尖 端的内 径大小 应该仔 细考虑 , 以保持 合理的 离子迁 移时间 

. 171 . 



和 ESI 的稳 定性。 例如, 若是毛 细管尖 端的内 径太小 ,将使 得分析 时间大 大加长 而且容 
易造成 堵塞; 毛细 管尖端 的内径 太大, 虽然可 以产生 更大的 电渗流 ,却 会牺牲 ESI 的稳定 
性。 另外, 由于 毛细管 经过了 好几步 的处理 步骤, 如牵拉 出尖端 、在 毛细管 尖端上 进行金 
涂层、 在毛细 管内壁 上进行 化学涂 层等, 它的 使用寿 命是有 限的。 假 如这些 处理步 骤的其 
中一步 没有处 理得当 (如堵 塞了毛 细管尖 端), 那 就不得 不抛弃 整根毛 细管。 对此, 有人提 
出了 另一种 设计: 将 CE 和 ESI 的电路 整合到 一个环 路中, 这样 就可以 直接在 CE 的毛细 
管人口 端加上 高压, 而无需 再在毛 细管出 口端进 行金涂 层了。 值得注 意的是 ,无鞘 流液接 
口要 求分离 毛细管 内部的 液体流 动比较 稳定, 这样 也就把 使用中 性涂层 毛细管 (其 中几乎 
没有电 渗流, 用 以减小 毛细管 内壁对 分析物 的吸附 作用) 的可能 性排除 在外, 从而 限制了 
它 在某些 方面的 应用。 

三、 其他联 用方式 

人们在 将各种 CE 技术与 不同的 MS 技术进 行联用 方面作 了许多 努力, 可以 说各种 
可能的 联用方 式都已 经有了 相关的 报道。 CZE、aTP、aEF、CEC、CGE 等 CE 技 术常常 
与 ESI 和 MALDI 类型的 MS 技术 联用。 以下对 CE 与 MALDI 的联用 和模仿 CE 原理的 
微型预 制设备 (microfabricated device, MFD) 与 MS 的 联用情 况作一 介绍。 

(一) CE 与 MALDI- TOF-MS 的联用 

MALDI-TOF-MS 在生 物大分 子的分 析中应 用极为 广泛, 尤其 适合于 分析分 子质量 
较大 的分子 和杂质 较多的 样品, 其特点 是一般 只产生 带单电 荷或双 电荷的 离子, 图 谱的解 
析比 较方便 直观。 由于 MALDI 是将离 子从固 相中转 移到气 相的一 个过程 ,而 CE 则是一 
个液 相分离 过程, 这个矛 盾使得 CE 与 MALDI-TOF-MS 的 联用基 本上还 处于非 在线状 
态。 通常, 通过 CE 分离 后的物 质在它 们流出 毛细管 时被收 集在装 有溶剂 的小型 收集管 
中。 然后, 再将这 些收集 的级分 (fraction) 与基质 混合并 点样在 探测器 (probe) 上, 用 
MALDI-TOF-MS 检测。 为了简 化样品 的处理 过程, 也可通 过吸附 作用直 接将样 品沉积 
到膜上 或探测 器上。 此时, 这些 支撑物 (膜 或探 测器) 都 预先用 基质处 理过, 样品在 CE 分 
离 完成后 无需进 一步处 理而直 接引人 MALDI-TOF- MS 进行 检测。 

Foret 等 [24] 人设计 了一种 巧妙的 自动化 CE 级 分收集 接口, 可以在 不中断 CIEF 的情 
况下将 样品收 集在一 根根短 的毛细 管中, 然后 将毛细 管中的 级分与 基质混 合后点 样到探 
测器 上进行 MALDI-TOF-MS 分析。 这种 接口在 CE 毛细管 出口处 利用鞘 流液将 样品条 
带转 移到收 集毛细 管中。 鞘流液 可以在 用压力 移动条 带的同 时维持 电场的 存在, 从而避 
免了 条带的 扩散。 在非 常接近 接口的 地方还 有一个 UV 检测 器可以 监测样 品条带 的流出 
情况。 

CE 缓冲液 中的电 解质与 MALDI 的相 容性需 要引起 特别的 重视。 许多 CE 中 常用的 
电解质 (特别 是憐酸 钠盐) 会抑制 MALDI 信号。 Walker 等 [ 25 ] 人发现 ,在将 CE 级 分直接 
点样到 探测器 上时, 含 有高浓 度酸的 基质更 能耐受 常常那 些导致 信号抑 制的电 解质。 对 
经 CE 分 离的多 肽进行 MALDI-TOF-MS 非在线 检测所 达到的 最高灵 敏度是 Zhang 等 [26] 
人 通过膜 上沉积 技术获 得的。 用 这种方 法可以 检测到 amol 水平的 神经加 压素。 起始量 
- 172 - 



只有 3 fmol 的脱 辅基肌 红蛋白 的胰蛋 白酶酶 解产物 也通过 这种方 法得到 鉴定。 其中 CE 
分离 中所用 的样品 浓度在 pmol/pd 水平。 

这种 联用技 术具有 接近分 析和鉴 定低丰 度蛋白 质所必 需的灵 敏度。 但是, 其 pmol/^a 
水平 的浓度 检测极 限使得 其应用 还仅限 于分析 丰度较 高的蛋 白质。 所以, CE 的在 线预浓 
缩 技术与 CE/MALDI-TOF-MS 联用 技术的 结合将 进一步 拓宽这 种联用 技术的 应用范 
围。 

(二) MFD 与 MS 的联用 

高灵敏 度鉴定 蛋白质 工作中 的一个 主要挑 战就是 发展能 够相当 或超过 最灵敏 分析仪 
器灵敏 度的样 品处理 程序。 因为 现在这 种工作 中最常 见的一 类问题 就是: 由于吸 附到塑 
料管内 壁或其 他表面 而造成 的样品 损失; 由于 多步的 样品处 理步骤 所造成 的样品 损失; 微 
量的样 品中污 染有实 验室常 见的蛋 白质或 化合物 (如人 的角蛋 白), 等等。 有人 提出, 建造 
微型 预制整 合型的 分析模 块可能 是解决 这类问 题的一 种有效 方式。 而且, 把这种 微型预 
制设备 与质谱 仪实现 在线联 用是一 种极具 吸引力 的设置 方式, 因为 MFD 对分析 步骤的 
自 动化十 分关键 而且可 以节约 费用。 MFD 的研究 虽然起 步较晚 (1997 年), 但发 展十分 
迅速, 迄 今已有 许多关 于多种 MFD 的研究 进展及 其应用 的报道 [27 〜 3 G ] 。 这些 MFD 的共 
同点是 :贮液 池和管 道都蚀 刻在一 块玻璃 板上, 另一块 玻璃盖 板點接 在设备 的顶端 ,盖板 
上有与 每一个 r: 液池 相应的 小孔。 不同 MFD 的 差异点 在于: 它们与 ESI-MS 的 连接方 
式、 实验 的目的 以及溶 剂加入 到这些 设备中 和从这 些设备 中移走 溶剂的 方式。 最近, Wen 
等 [28 ] 人建 立了一 种微型 CIEF 设 备可与 ESI-MS 直接联 用分析 复杂蛋 白质混 合物。 Xi- 
8118等 [29] 人 发展的 MFD 还 可以通 过其双 透析功 能净化 样品。 Li 等 [3 ] 人将他 们的" CE 
芯片" 与 nESI-MS 联用。 由于使 用了管 道的表 面涂层 技术、 低死体 积的连 接方法 和金涂 
层的 nESI 尖端, 这 种系统 在以选 择性离 子监测 (selected ion monitoring, SIM) 模式 检测时 
可以获 得高达 3.2nmol/L 的浓 度检测 极限。 与 原来的 nESI-MS 不 能进行 任何预 分离相 
比, 它 可以使 得多组 分样品 在进行 nESI 的 同时预 先得到 部分的 分离。 这 种系统 的另一 
个特点 是它的 样品分 离所需 要的时 间极短 ,一 般小于 1.5min ,单 个峰 宽只有 2s 左右, 需 
要 与速度 较快的 TOF-MS 联用。 

尽管将 MFD 用做 ESI-MS 的 前端设 备的研 究还处 于起步 阶段, 但是, 将几步 按顺序 
进 行的操 作整合 到微型 设备中 , 以及 实现无 需人的 干预而 自 动进行 多步骤 分析的 可能性 
很 明显是 非常诱 人的。 这种技 术必将 在未来 的蛋白 质生化 分析中 扮演越 来越重 要的角 
色。 

四 、 CE/MS 的限制 性因素 及其改 进方法 

(-) 限 制因素 

CE 的一个 主要限 制性因 素是: 在不 降低分 离效率 的前提 下它所 能分析 的样品 体积极 
为 有限。 所以, CE 的 浓度检 测极限 常常要 比层析 方法高 几个数 量级。 要想使 CE/MS 成 
为微量 生物分 析的主 流技术 ,就 必须使 它能够 与分析 物的生 物来源 有效而 相容性 地结合 
起来。 现在生 物学中 绝大多 数的样 品制备 技术都 是通过 手工操 作的, 而且 很难产 生体积 

. 173 . 



在微升 以下的 样品。 所以, 通常微 量的样 品仅以 较低的 浓度存 在于较 大的体 积中。 能够 

在不 影响分 离的条 件下被 CE 分 析的样 品通常 在样品 总量的 Io/q 以下。 即使 在通过 MS 
获得 相对较 高的检 测灵敏 度的情 况下, 对这种 样品进 行成功 的分析 也还要 求其浓 度在中 
等 fmol/^a 或 pmol/fil 水平。 这就意 味着若 是没有 样品的 预浓缩 过程, CE/MS 只 能用于 
分 析生物 样品中 那些主 要的蛋 白质。 

CE/MS 的 另一个 缺点是 它的迁 移时间 容易随 着环境 温度的 变化而 波动。 尽 管许多 
CE 仪器 都有温 度控制 设备, 但还 是有一 大部分 CE 毛细管 伸出在 CE 和 MS 仪器 之间而 
得不到 温控。 对于那 些标定 类型的 工作或 其中含 有未知 成分的 混合物 的分析 ,适 当地加 
入 一些内 标可能 会有所 帮助。 CE 分离 毛细管 的内壁 化学条 件也对 CE 的 分离有 重要影 
响。 

像 LC/MS —样, 在 CEMS 中也要 避免使 用非挥 发性的 缓冲液 成分。 所以在 CEMS 
中常常 要在选 择合适 的操作 条件之 间作出 妥协。 由于 使用非 挥发性 盐所造 成的灵 敏度限 
制 和离子 源堵塞 现象阻 碍了把 CE 分 离条件 向在线 CE/MS 联用 的直接 转移。 非 挥发性 
的添 加物, 如环糊 精等, 在进行 性质相 近的物 质甚至 光学异 构体的 分离时 常常被 用到。 但 
是, 这些 添加物 的浓度 却常常 受到应 用上的 限制。 另外, 含有 表面活 性剂的 离子流 进入到 
MS 离子源 的时候 ,会严 重影响 MS 的灵 敏度。 

(二) 分 析方法 的改进 ' 

1. 通过 OTP 进 行在线 预浓縮 

有多种 技术已 经被用 来提高 CE 的浓度 检测灵 敏度。 其中, 通过 CITP 的在线 样品预 
浓 縮技术 受到了 最多的 关注。 与 CZE 具有很 高的分 离效率 而其浓 度检测 灵敏度 却不高 
相比, CITP 能够提 供很好 的浓度 检测灵 敏度, 但对 鉴定复 杂混合 物却缺 乏足够 的分辨 
率。 将 CZE 和 CITP 结合 起来就 可以克 服它们 的缺点 而保留 各自的 优点。 有两 种基本 
的方法 可以将 它们有 效地结 合起来 :柱上 短暂等 速电泳 联合区 带电泳 (transient isota- 
chophoretic CZE, tITP- CZE) [3 i3 和等速 电泳与 区带电 泳联用 (aTP-CZE) [32] 。 

CITP-CZE 系统利 用了两 根分离 毛细管 ,进行 CITP 预浓缩 的毛细 管在前 ,聚 焦好的 
样 品条带 进而被 转移到 后面的 另一根 毛细管 中进行 CZE 分离。 两 根毛细 管之间 的连接 
是将 CZE 分离 毛细管 通过隔 膜插人 CITP 毛细 管中来 完成。 tITP-CZE 的 方法是 在同一 
根毛 细管上 先进行 ITP ,然后 再进行 CZE 分离。 这 种方法 在易用 性和与 MS 连接 方面显 
得效率 更高, 它 可以用 于任何 CE/MS 系 统中而 无需做 任何仪 器上的 改动。 尽管 所有的 
在线 CITP 预浓 缩方法 都会降 低分离 效率, 但是这 种方法 的综合 效率还 是要比 常规的 LC 
方法高 得多。 

类 似的还 有利用 CZE 中的 电场放 大作用 (field amplification)[ 33] 的样 品堆栈 技术。 

2. 通 过层析 方法进 行在线 预浓縮 

CE 样品 在线预 浓缩的 层析方 法是在 CZE 毛细管 中插入 一个样 品抽提 装置, 也称为 
膜 预浓缩 (membrane preconcentration, mPC) 装置, 它们 通常由 C18 材料充 填的微 型柱床 
或含有 C18 材 料的膜 制成。 样品用 压力推 人该系 统中, 其中 的分析 物被抽 提出来 并且聚 
集在 微型装 置上, 然后再 把它们 洗出到 CZE 毛细 管中, 其体积 只有几 纳升。 由于 样品在 
. 174 . 



抽提过 程中相 当于被 "固 定化" 在抽提 装置上 ,所以 ,其 中的分 析物可 以被有 效地清 洗以去 

除盐分 和杂质 或进行 缓冲液 更换。 用这种 方法可 以达到 amol//il 的浓 度检测 极限。 

关于这 种在线 样品预 浓缩技 术的重 要性在 许多对 痕量生 物样品 的分析 中都有 报道。 
Naylor 等 [ 34] 人 进一步 将这种 mPOCE/^tESI-MS 系统与 tITP 方 法结合 起来。 样 品从抽 
提装 置中洗 脱后, 夹在先 导缓冲 液和终 结缓冲 液之间 先进行 tITP 聚焦。 浓 缩好的 样品随 
即在 同一根 毛细管 中进行 CZE/^SI-MS/MS 分析。 与 普通的 mPOCE/ESI-MS 系统相 
比, 这种方 法可将 灵敏度 再提高 100 倍。 Figeys 等 [ 35] 人用由 C18 微 珠充填 的微型 装置通 
过固相 微抽提 (solid-phase microextraction, SPM) 浓縮 作用对 经过高 分辨率 双向凝 胶电泳 
(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE) 分离 的酵母 蛋白质 进行了 分析。 在 凝胶中 
fmol 水平 的蛋白 质也可 以得到 成功的 鉴定, 使得 SPM-CZE/^^ESI-MS成为通过 MS/MS 
来进 行蛋白 质鉴定 和序列 分析的 最灵敏 的系统 之一。 

3. 使 用内径 较小的 毛细管 

Wahl 等 [ 36 ] 人报道 ,使用 小内径 毛细管 来进行 CE 可以 获得更 高的灵 敏度。 一般来 
说, ESI/MS 的最佳 灵敏度 应该在 CE 电流大 致等于 或小于 ESI 电流时 获得, 此时 CE 往 
ESr 源输送 带电物 质的速 率最小 ,离子 化效率 最高, ESI-MS 将以一 种质量 敏感的 检测器 
系统起 作用。 

在涂 层的毛 细管中 进行蛋 白质混 合物分 离时, 使用 5^011 内径的 毛细管 检测灵 敏度要 
比使用 5(Vm 的毛 细管高 25〜50 倍。 绝 对检出 量达到 600 amol 水平。 但 在使用 小内径 
毛细 管时, 样品 和缓冲 液的制 备和处 理都需 要采用 改良的 程序, 以 防止毛 细管的 堵塞。 

4. 使用减 小流出 速度进 行检测 的方法 

MSA1S 仪器的 工作周 期限制 了其检 测的动 态范围 (即 对含有 不同丰 度多肽 的复杂 
混合物 的分析 和覆盖 范围) 。 通常 , MS/MS 仪 器都被 设计为 按照强 度降低 的顺序 来分离 
出 多肽离 子进行 碰撞诱 导解析 (collision induced dissociation, CID)。 在用 MS/MS 进行蛋 
白质鉴 定时, 由于每 一个分 析周期 包括多 肽质量 分析、 多 肽离子 选择、 CID ,以 及获 取所选 
择 离子所 产生的 MS/MS 质 谱图, 整个过 程需要 l〜3s。 所以, 在一 个典型 的层析 或电泳 
峰中 , 只有 少数几 个强度 最高的 离子被 分析到 , 而强 度较低 的离子 则被忽 略了。 

在 CE/MS 中," 降低流 出速度 ( reduced elution speed , RES ) 检测" 的概念 首先由 
Goodlett 等人 提出, 它可 以增加 MS 分析多 肽的数 目 。 最近, 这种 方法又 被应用 到增加 
MS/MS 分 析多肽 的动态 范围。 这种 被称为 峰停留 (peak parking) 的 方法通 过降低 从多肽 
分离 系统向 MS 的样 品流速 来延长 对特殊 分析物 的分析 时间。 在第 一个要 分析的 物质进 
入到 Esr 源之前 ,电 泳电压 降低, 于是溶 液的流 出速度 也随之 降低。 这样, 在单位 时间内 
进入 Esr 源 的溶液 量超过 它的离 子化能 力时, 可以有 更多的 扫描图 谱被记 录下来 而不会 
有明 显的离 子强度 损失。 总 的结果 就是可 以使得 更多的 分析物 离子被 MS 分析。 这种将 
分析 物进入 MS 的时 间延长 的方法 可以用 于以下 方面: ①增加 扫描的 m/z 范围; ②增加 
某一 特定离 子在其 迁移过 程中被 MS 扫描 记录的 数目; ③增强 对特定 离子的 检测灵 敏度。 
这都 对增加 MS/MS 仪器 的动态 范围有 直接的 贡献。 另外, 这种方 法并不 需要增 加样品 
的消 耗量而 且几乎 不会造 成离子 强度的 损失, 后 者对于 MS/MS 仪 器的多 肽测序 能力来 

. 175 • 



说极为 重要。 

Figeys 等 [ 37 ] 人进一 步发展 了这种 技术, 他 们的数 据依赖 调节型 SPM-CZE4£SI- 
MS/MS 系统 可以自 动在各 组分从 CE 系 统流出 时降低 CZE 的分离 电压, 从而实 现自动 
化的峰 停留。 应用这 种技术 来分析 内皮一 氧化氮 合成酶 (eNOS) 的 体内憐 酸化位 点的结 
果表明 ,这 种系统 对复杂 样品中 数量较 少的多 肽进行 MS/MS 分析 的功能 很强。 

(三) 仪器 的发展 

1. 涂层 毛细管 

涂层的 毛细管 常常被 用来分 析生物 样品, 如碱 性多肽 和蛋白 质等, 因为 它可以 减小由 
于这些 物质与 毛细管 内壁发 生吸附 作用而 引起的 条带变 宽和峰 的拖尾 现象。 CE 的毛细 
管 涂层有 多种。 氨 丙基甲 娃烷化 (aminopropyl silyl, APS) 的熔融 石英毛 细管是 CE/MS 
联 用中使 用最多 的一种 涂层毛 细管。 因为经 过这种 处理的 毛细管 内壁带 上了正 电荷, 这 
对多 使用酸 性挥发 性缓冲 液进行 蛋白质 和多肽 分析的 CE/MS 来 说非常 合适。 线 性聚丙 
錄酰胺 (linear polyacrylamide, LPA) 和聚乙 '烯 基乙醇 (polyvinyl alcohol, PVA) 涂层 的毛细 
管 被广泛 地用在 CIEF 实 验中。 经过 这种方 法涂层 后的毛 细管表 面是中 性的, 其 中的电 
渗 流几乎 为零。 另 一种经 过亲水 性衍生 的毛细 管也常 常用于 CE/MS 联用 之中, 用这种 
经过表 面疏水 性改变 的毛细 管进行 分离常 常可以 获得意 想不到 的效率 提升。 另外, 使用 
动态非 共价涂 层的毛 细管可 用于多 种物质 的分离 ,用 这种方 法进行 涂层非 常方便 而且重 
复性 较好。 最近, 还有许 多新型 的涂层 方法和 试剂已 经研制 出来, 比 较有代 表性的 有采用 
陆续的 多层涂 层方法 ,以 及采用 新型的 多聚物 进行毛 细管的 涂层。 

2. 捕集 离子型 质谱仪 

提高 CE/MS 灵 敏度的 另一个 途径就 是发展 能提供 更高灵 敏度的 MS 仪器。 现在的 
MS 中, 从 大气压 ESI 源到 MS 检 测器的 离子转 移效率 很低。 因此, 使用捕 集离子 型质谱 
仪, 包括 FTICR-MS 和 IT-MS ,可 能会 对提高 灵敏度 有益。 

IT-MS 能 比柱型 (beam-type)MS 提供 高得多 的传输 效率, 它的 离子捕 集能力 使得它 
在进行 MSn 分 析时有 独特的 优势。 已有 报道一 些商品 化仪器 (如 Finnigan LCQ 等) 进行 
了 MSiG 的 实验。 最近 有不少 CE/IT-MS 联 用的研 究报道 [ 38 3。 

FTICR-MS 具 有别的 MS 仪器所 不能比 拟的高 灵敏度 、高 精确度 (ppm 水平 )、 超高的 
分辨率 (>10 6 ) 和进 行串联 质谱分 析的强 大潜力 (FTICR-MS 的非解 构性检 测方法 使得它 
可以反 复地对 某一捕 集的离 子群进 行解离 和分析 其解离 产物, 从而 可从有 限的样 品中得 
到更丰 富的结 构信息 )。 近年来 FTICR-MS 发展很 迅速, 它在与 其他离 子源的 接口、 离子 
捕集 室中的 离子操 作技术 以及数 据处理 方法等 方面都 取得了 很大的 进展。 Bebv 等 [39] 人 
报道 ESI- FTICR-MS 对蛋 白质的 检测灵 敏度已 经达到 zeptomoledO — 2 imol) 水平。 Ramjit 
等 [ 40 ] 人用 FTICR-MS 通过 分辨单 一同位 素峰和 同位 素峰成 功地对 一个有 19 个成分 
的十 二肽库 进行了 鉴定。 正 是由于 FTICR-MS 的这种 超高分 辨率, 使得他 们在进 行这项 
对别的 MS 仪 器来说 可能是 难以想 像的工 作时显 得游刃 有余。 Smith 的研 究小组 在发展 
ESI-FTICR-MS 以及 将它与 CE 联用 方面有 极大的 贡献。 Hofstadler 等 [4 1 ] 人首 次利用 
. 176 • 



ESI 接口将 FTICR-MS 与 CE 实现了 联用。 Severs 等 [ 42 ] 人还 利用该 系统对 CZE、aTP 
及 CIEF 与 FTICR 仪 器的联 用作了 研究。 在用 CIEF/FTICR-MS 来分析 红细胞 裂解产 
物中 的蛋白 质时, 尽管其 中血红 蛋白的 量比碳 酸酐酶 要高出 100 倍 以上, 这两种 pJ 值差 
异只有 0.27 的 蛋白质 还是得 到了完 全而且 高效的 分离。 Hofstadler等 [43] 人甚 至使用 
CE/ESI-FTICR-MS 技 术和显 微进样 的方法 鉴定了 单个红 细胞中 的血红 蛋白。 

3. 飞 行时间 质谱仪 

TOF-MS 仪器的 最大特 点是极 高的扫 描速度 及其高 工作周 期所提 供的高 灵敏度 , 它 
可以从 单个的 进样脉 冲中记 录下全 m/z 范 围的质 谱图, 这对于 检测一 般峰宽 较小的 CE 
流出物 质十分 有利。 而且, TOF 检测器 还可以 通过反 射器式 (reflectron) 的 设置来 进一步 
提高分 辨率。 同时, 这种检 测器相 对较简 单而且 更便宜 ,对许 多实验 室来说 极具吸 引力。 

TOF 检测器 尤其适 合与那 些脉冲 式离子 化的离 子源配 合使用 ,但 它在与 容易和 CE 
实 现在线 联用的 ESI 离子源 联合使 用也同 样极具 潜力。 为 了达到 ESI-TOF-MS 分析的 
最佳灵 敏度, 最好使 ESI 的离子 流以正 交的方 式进入 MS 仪器。 Lubman 的小组 在实现 
CE/ESI-TOF-MS 联用 方面做 了许多 尝试, 他 们发展 了一种 离子阱 存 / 反射型 (ion trap 
storage/reflectron, ITSR)TOF-MS 仪器。 这 种系统 利用一 个离子 阱作为 TOF 分 析前的 

前 端离子 r: 存设备 ,它把 连续的 离子流 转换成 脉冲离 子流。 而且, 可以 以相对 较低的 

pulse-out 频 率使离 子阱获 得高工 作周期 而不会 损失灵 敏度和 质量分 辨率。 Wu 等 [ 44 ] 人利 
用 ITSR-TOF-MS 与 CZE 联用来 鉴定蛋 白质, 这种 MS 仪器 还可以 和密封 式和开 放式的 
CEC 方法 联用来 分析蛋 白质和 多肽混 合物。 最近, 】111等 [45] 人使用 ITSR-TOF-MS 仪器 
结合 SWIFT 技术对 CE4£SI-TOF-MS/MS 作了进 一步的 研究, 取得了 极好的 结果。 

五、 应 用 

(一) 蛋白质 

CE/MS 在蛋白 质研究 中的重 要方面 就是被 用来对 溶液或 凝胶中 的蛋白 质进行 鉴定。 
利用 MS 肽质谱 (peptide mass mapping) 所产生 的各个 酶解肽 段的质 量数信 息集合 或通过 
CID 获得 的酶解 肽段的 MS/MS 图谱, 就可以 分别利 用不同 的算法 来进行 蛋白质 序列库 
的搜索 ,从而 得到蛋 白质的 鉴定结 果 [46] 。 其 
中, CID 质谱图 包含有 肽段的 全部或 部分序 
列 信息。 因为在 不同的 CID 条 件下, 肽段会 
在肽键 及侧链 处发生 断裂, 从 而产生 一系列 
的序 列特异 性离子 (图 10.3)。 

CE/MS 系 统用于 蛋白质 鉴定最 大的优 
点 就是其 高灵敏 度和比 LCA1S 更短 的分析 图 10' 3 多肤』 iCj^t 成的碎 片离子 

_L Air 的^^名万法 

B^|lil。 Figeys ^ XMit^ CZE/^ESI- n 端 带有电 荷的不 同碎片 离子分 别称作 3„、1^或 〔„离 

MS/MS 系统进 行蛋白 质鉴定 作了比 较深入 子; C 端 带有电 荷的不 同碎片 离子分 别称作 x。、y 。或 3„离 

的 研究。 该系统 在使用 20^tm 内径的 毛细管 子。 在低 能量条 件下主 要生成 b 和 y 类型 的碎 片离子 
及 无鞘流 液接口 进行成 功的蛋 白质鉴 定只需 

. 177 . 




50 fmol 的酶 解样品 [ 3 ]。 后来, 他们将 SPM 技 术用于 CZEZ/LtESI-MS/IVlS 系 统后, 灵敏度 
进一 步得到 提高, 进行 MS/MS 分析 的浓度 检测极 限达到 300 amol 々山 所消 耗样品 量小于 
10 fmolo 他们 用这种 方法对 2-DE 凝胶内 的酵母 蛋白质 进行了 鉴定, 充分 显示了 这种系 
统在大 规模蛋 白质鉴 定方面 的巨大 潜力。 另外, Valaskovic 等 [4] 人通过 使用内 径仅有 
5^ 的毛细 管进行 CZE/nESI-FTICR-MS 并首次 报道检 测到了 9amol 的碳酸 肝藤, 分辨 
率达到 60 000 以上。 Katayama 等 [47] 人最 近对有 机溶剂 辅助的 CE/nESI-MS/MS 技术用 
于高灵 敏度蛋 白质鉴 定作了 介绍。 

对蛋 白质鉴 定最大 胆的一 种设想 可以说 就是同 时鉴定 复杂混 合物中 的所有 蛋白质 
了, 因为这 对分离 系统的 分辨率 和检测 系统的 灵敏度 、精 确度和 动态范 围要求 极高, 简直 
可以 说是" Mission impossible"。 但是, 如 此纷繁 复杂的 分析鉴 定任务 也可以 通过" 复杂" 
的 CE/MS/MS 系 统得以 解决。 Tong 等 [48] 人 通过一 种设计 巧妙的 SPM/ 多步 洗脱- 
CE/MSMS 系统 对含有 75 个酵母 核糖体 蛋白质 的复杂 混合物 进行了 分析。 结果 表明, 
高达 90% 的蛋 白质可 以通过 使用实 验中所 获得的 CID 图谱进 行数据 库搜索 而得到 鉴定。 
SPM 系统实 际上还 通过使 用有机 相的分 步洗脱 梯度增 加了除 CE 之 外的额 外分离 效果, 
所 以使得 66 种蛋 白质能 被同时 鉴定。 

蛋 白质分 析的另 一个主 要方面 —— 蛋白质 修饰的 分析将 为揭示 其结构 与功能 的关系 
提供 很大的 帮助。 我 们通过 CZE/ESI-IT-MS/MS 联用对 酪蛋白 中的丝 氨酸磷 酸化进 
行了分 析 [38] 。 通过 SIM 模式, 可以很 方便地 找到磷 酸化肽 ,并且 利用其 CID 图谱 对磯酸 
化 肽的结 构作进 一步的 确认。 Cao 等 [49 ] 人则 利用固 定化金 属亲和 层析与 CE/ESI-MSn 的 
在线 联用来 确定蛋 白质的 磯酸化 位点。 对糖 蛋白的 研究也 有许多 CE/MS 的成功 应用。 
Yeung 等 [ 5 G ] 人发 展了一 种利用 CE/TQ-MS 直 接对含 高甘露 糖型的 糖蛋白 进行分 析的方 
法, 不但可 以分辨 不同的 糖蛋白 糖型, 还 可以通 过对完 整蛋白 质的源 内裂解 以产生 特征性 
报 告离子 来观察 糖链的 存在。 另外, Boss 等 [5 1 ] 人 还通过 HPLC 和 CE/MS 对重组 人红细 
胞生成 素进行 了结构 分析。 糖基化 位点、 糖链结 构都可 以得到 确认; 位点特 异性的 微观不 
均一 性也可 以直接 估定; 糖 基化位 点的占 用率还 可以进 行定量 测定。 用这 种方法 可以获 
得 98。/。 以上的 序列覆 盖率。 

蛋白质 的高级 结构变 化如蛋 白质的 还原和 氧化态 结构差 异 [52] 、蛋白 质的 重折叠 [53] 
等都可 以利用 不同的 CE/MS 联 用形式 来进行 研究。 

另外, CIEF/MS 联 用还提 供了除 2-DE 以 外进行 高分辨 率蛋白 质组研 究的另 一种有 
力 手段。 Lee 和 Smith 的小组 在这方 面作了 很出色 的工作 [54 ~ 57] 。 尤其值 得一提 的是, 
Smith 小组 通过其 CIEF//^ESI-FTICR-MS 系 统的高 灵敏度 和高精 确度并 结合选 择性同 
位素 标记的 方法, 还可 以对蛋 白质的 表达水 平作出 评估, 从而 实现了 真正意 义上的 
CIEF/MS 蛋白质 组研究 [ 57 ' 58 、 

(二) 多 肽 

CEMS 对多肽 的研究 主要集 中在对 被修饰 多肽和 生物活 性肽进 行鉴定 这两个 方面。 
对比 LC/MS 而言, CE/MS 不会 丢失那 些极性 很强的 寡肽。 通常对 多肽的 分析都 是利用 
CZE/MS 联用模 式来进 行的, 但最近 Shen 等 [59] 人发展 的高效 CIEF 也可 成功地 用于多 
肽 混合物 分析。 另外, Barroso 等 [ 6 G3 人还 发展了 一种无 鞘流液 预浓缩 CZE/MS 方 法用于 
. 178 • 



多肽 分析。 

对 于磯酸 化肽的 分析, 固 定化金 属亲和 层析与 CE/MS 在线 联用是 一种很 好的方 
法 [6 1 ] , 可进 行数据 依赖性 自 动电压 微调的 SPE-CE/VESI-MS/MS 系 统还可 检测到 复杂多 
肽混合 物中的 微量磯 酸化肽 [ 37] 。 Soudan 等 「 62] 人将 CZE 与 MALDI-MS 结 合对一 个苏氨 
酸 / 丝氨 酸含量 丰富的 MUC5AC 十六肽 的体外 0- 糖 基化情 况进行 监测, 取得了 很好的 
结果。 另外, Forest 等 [ 63 3 人 还通过 CEAIS 确定了 一种海 银莲花 毒素的 C 末端氨 基酸为 
游 离羧基 结构。 

将 CE/MS/MS 用于天 然多肽 的分析 不但可 以确定 其组分 的多少 ,还 可以得 到各组 
分的结 构信息 ,是一 种方便 快捷的 方法。 Perkins 等 [ 64] 人用 CE/MSMS 结合 SIM 的方 
法 从黑树 眼镜蛇 (black mamba) 的 毒液中 确定了 70 多种 多肽的 存在, 它们 的分子 质量范 
围在 6 000〜9 000 之中。 Ensing 等 [65 3 人通过 CE/MS 将 神经肽 Y 与 它的两 个片段 分离。 
而且, 神经肽 Y 的分 解产物 由于只 有一个 氨基酸 残基的 差别而 不能被 CE-UV 检 测所区 
分, 但 CE/MS 却可 以把这 些分解 产物分 别鉴定 出来。 CE 和 MALDI 的非 在线联 用同样 
在多肽 分析中 起着很 重要的 作用: Zhang 等 [66] 人使 用这种 技术对 E 肽在大 脑内的 代谢过 
程 进行了 监测; Ivanov等 [67] 人 则鉴定 了多肽 中的异 常氨基 酸残基 (修饰 化的和 非编码 
的)。 值 得一提 的是, 1^711611等 [68] 人还 发展了 一种用 万古霉 素结合 ACE/MS 的方 法来分 
析 寡肽混 合物。 . 

(三) 非共价 复合物 ' 

CE/MS 是研 究生物 分子间 非共价 相互作 用的一 种极具 价值的 技术, 因 为它集 分离、 
鉴定 和定量 分析于 一体, 而 且快速 准确。 最 近有许 多利用 CE/MS 技术研 究非共 价复合 
物的 报道。 Lyubarsakya等 [69 U 利用 ACE/MS 方法 来进行 内啡肽 线性抗 原决定 簇的定 
位。 他们 首先用 分析内 啡肽的 胰蛋白 酶酶解 产物, 然后再 将这种 酶解产 物与抗 
内啡 肽的单 抗混合 进样进 行相同 条件的 CE/MS 分析。 这样, 与单 抗结合 的肽段 就会从 
它原 来出现 的地方 消失。 把这个 肽段分 离后用 ACEA1S 进 行分析 可以确 认其中 抗原决 
定簇的 存在。 最 后通过 ACE/MS 对该 肽段的 一系列 按顺序 截短产 物进行 分析就 可以精 
确 地确定 线性的 抗原决 定簇的 位置。 这种方 法每次 分析所 消耗的 抗体和 酶解产 物都在 
fmol 水平, 而且 快速, 容易 实现自 动化。 另外, 他 们还用 CIEF/MS 方法 进行了 Srr SH2 
结构域 的高亲 和性配 体的篩 选 [7 ] 。 1\1££31等 [7 1 ] 人用 CZE/MS 方法 研究了 分枝杆 菌的甲 
基 葡萄糖 脂多糖 与棕榈 醜辅酶 A 形成的 非共价 复合物 ,发现 它们在 复合物 中的化 学计量 
为 1:1。 另外, Gysler 等 [ 72 ] 人还 利用这 种联用 技术对 白介素 6 的 二聚体 化过程 进行了 监测。 

第二节 材 料 

一、 试剂 和溶剂 

① 所有缓 冲液均 用经过 Mmipore( Bedford, MA, USA) 系 统处理 过的水 配制。 

② 甲酸 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

③ 冰醋酸 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

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④ 氨水 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑤ 碳酸 氣铵: 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑥ 二硫 苏糖醇 (DTT): 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑦ 碘代 乙酰胺 (lAA): 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑧ 巯基 乙醇: 购自 Merck(Schuchardt, Germany) 公司。 

⑨ 乙腈 (ACN): 购自 Fisher(Fair Lawn, NJ, USA) 公司。 

⑩ 甲醇 (MeOH): 购自 FisheK Fair Lawn, NJ, USA) 公司。 
⑪三 氟乙酸 (TFA): 购自 Merck(Schuchardt, Germany) 公司。 

© 1,5- 二甲基 -1,5- 二氮 十一亚 甲基聚 溴化物 (polybrene): 购自 Sigma(St. Louis, 
MO, USA) 公司。 

© 表面 活性剂 Brif 35 和 SM-2 吸附 小珠: 购自 BioRad( Hercules, CA, USA) 公司。 
⑭ 两性 电解质 pharmalyte pH3.5 〜; 10 和 pH5~8: 购自 Amersham Pharmacia Biotech 
(Uppsala, Sweden) 公司。 

二、 多肽和 蛋白质 

① Met- 脑啡肽 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

② Leu- 脑啡肽 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

③ 人工 合成鲑 鱼降^ 素 (s-CT): 生化所 崔大敷 研究员 惠赠。 

④ i 25 Ser 突变 的重组 人白细 胞介素 2(S125-IL-2): 上海 医药工 业研究 院提供 的基因 
工程 产品。 ' 

© 血 红蛋白 A(HbA): 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑥ 镰状红 细胞血 红蛋白 (HbS): 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑦ 牛 酪蛋白 (P-casein): 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑧ 牛胰 RNaseB: 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

® 竹叶 青蛇毒 C- 型 凝集素 (TSL): 基本 参照梁 雪莲等 [ 73] 人 的方法 获得。 

® 细 胞色素 C: 购自 Pierce(Rockford, IL, USA) 公司。 

® 马肌红 蛋白: 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

(© 牛 13- 乳 球蛋白 A: 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

® 牛碳 酸野酶 n :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

三、 酶 

① TPCK -胰蛋 白 酶 :本 实验室 自 制 。 

② 蛋白 憐酸酶 1 催 化亚基 (PP1): 购自 Roche(Mannheim, Germany) 公司。 

③ Lys-C 蛋白酶 :购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

④ Glu-C 蛋白酶 :购自 Pierce(Rockford, IL, USA) 公司。 

⑤ ct- 甘露糖 苷酶: 购自 Sigma(St. Louis, MO, USA) 公司。 

⑥ iV- 糖苷酶 F: 购自 Roche( Mannheim, Germany) 公司。 
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四、 仪 器 



熔融石 英毛细 管和毛 细管卡 座购自 Beckman(FuUerton, CA, USA) 公司。 线性聚 丙烯酰 
胺 (linear polyacrylamide, LPA) 涂 层的毛 细管为 BioRad(Hercules, CA, USA) 公司 产品。 快速 
脱 盐柱为 Amereham Phamiacia Biotech( Uppsala, Sweden) 公 司产品 PD40 预 装柱。 

毛 细管区 带电泳 (CZE) 和毛 细管等 电聚焦 (CIEF) 在 Beckman P/ACE Station 5500 型 
毛 细管电 泳仪上 进行。 '熔 融石 英毛细 管全长 80cm ,入 口端到 UV 检 测器的 距离为 20cm, 
内径为 5(Vm ,外 径为 36(Vm。 质谱 检测在 Finnigan MAT(San Jose, CA, USA) 公 司的离 
子阱 质谱仪 LCQ 上 进行, 数据采 集使用 LCQ Navigator 1.2 软 件包, 数据解 析使用 LCQ 
BioExplore 1.1 软 件包。 

第三节 方 法 

―、 胰蛋白 酶酶解 

10(Vg 蛋白 质溶于 30;ilNH4HCO3(100mmol/L, pH7.8) 缓冲 液中。 先用 DTT (终浓 
度为 5mmol/L) 在 501: 条件 下还原 15min ,冷 却至室 温后, 加入 IAA (终 浓度为 lOmmol/L) 
在 室温下 再反应 15min (避光 )。 用 NH^HCOs 缓冲液 稀释到 lOO/il ,加人 浓度为 Ig/L 的胰 
蛋白酶溶液2.5/^d,37t:保温4h。 补加酶 2.5pd 后, 371: 继 续保温 18h。 偶 尔取出 轻摇。 
酶解完 成后取 出置于 -201: 保存。 

二、 血 红蛋白 的脱盐 和纯化 

由于 商品化 的血红 蛋白含 有碳酸 复铵及 50 0/0 左右的 非离子 稳定剂 ,所 以在进 行蛋白 
质酶解 之前, 首先需 要进行 纯化。 快速 脱盐柱 PD-10 先用 0.6% HAc 溶液平 衡至少 10 
倍 柱体积 (25ml)。 HbA 和 HbS 均溶于 2.5ml 水中, 浓 度约为 10 g/L。 待 柱内液 面正好 
没入 柱中填 料时, 将 2.5ml 样 品全部 加入。 待液面 再次没 入柱中 填料时 ,用 0.6% HAc 
溶液进 行连续 的洗脱 , 收集前 3 . 5ml 洗 脱物。 冷 冻干燥 后将样 品置于 - 20t: 保存。 

三、 蛋白磯 酸酶去 憐酸化 

P -酪 蛋白 Ig 溶解于 1ml 去磯酸 化溶液 [25mmol/L 三 乙醇胺 (TEA) , 200mmol/L 
NaCl, O.lmmol/L EGTA, 0.5mmol/L MnC^ , 0.1% (3 - 巯 基乙醇 ( m /V ) , 0.03% 

Brij® 35(77z/V), 用 HCl 调节 pH 至 7.5] 中。 加人 5mU/|^l 的 PPl (溶于 50 % 甘油 
( V/V) ,25mmol/L TEA-HCl, 200mmol/L NaCl, 0. Immol/L EGTA, 0.1% 巯 基乙醇 
{m/V), 0.03% Brif 35(m/V), pH 7.5) 溶液 5;il,37t: 保温 4h。 反 应完成 后冷至 室温。 

20mg SM-2 吸附小 珠先用 50ml 甲醇洗 lOmin ,重复 2 次。 加入 50ml 水洗 lOmin ,重 
复 3 次。 把水 吸去, 加入 1ml 已反 应完的 溶液, 室温 下摇动 2h。 吸取 上清, 加入另 一份已 

. 181 • 



经 用同样 方法处 理过的 SM-2 吸附 小珠, 室 温处理 2h。 

将反 应液用 0.6% HAc 溶液 稀释到 2. 5ml ,用 PI>10 预装柱 脱盐。 收集的 3.5ml 液 
体冷冻 干燥后 , 置于 - 2010 保存。 

四、 蛋白 质二硫 键的梭 酰胺甲 基化及 产物的 

HPLC 纯化 和蛋白 酶酶解 

. 2mg RNaseB 溶 于 8(^1 30mmol/L NH4 HCO3 缓冲液 ( pH7 . 8 ) 中, 加人 50mmol/L 
DTT 10^d,50t: 反应 15min ,再 加入 lOOmmol/L IAA 10/^1 在 37t: 反应 15min。 

. 2mg TSL 溶于 80jul 30mmol/L NH4HCO3 缓冲液 ( pH7 . 8 ) 中, 加入 . 5mol/L DTT 
l(Vl,50t: 反应 Ih ,再 加人 Imol/L IAA 10/Ltl 在 371: 反应 30min。 

HPLC 为 HP-llOO 型, 使用 C8 反相柱 (RP- 300, 5^xm, 30mmX2.1mm I.D. , ABI 公 
司产品 );A 液 :0.01% TFA-H2〇;B 液 :0.01% TFA-ACN; 流速: 20(Vl/min; 洗脱 梯度: 
0min〜2min, 0% A 液, 2min〜15min,0 〜: 100% B 液。 

lOO/xg 经纯 化的羧 酰胺甲 基化蛋 白质直 接溶于 10(^1 30mmol/L 的 NH4HCQ3 缓冲液 
(pH7.8, 胰蛋 白酶或 Lys-C 蛋白酶 酶解) 或 IOOjlJ 30mmol/L 的 NH^Ac 缓冲液 (pH4.0, 
Glu-C 蛋白酶 酶解) 中。 加人 浓度为 1 g/L 的蛋白 酶溶液 2.5|ul,37t: 保温 4h。 补加酶 
2.5/Lil 后, 371: 继 续保温 18h。 偶 尔取出 轻摇。 反 应完成 后置于 -201: 保存。 

五、/ V - 糖昔酶 F 酶解 、 

9(^1 蛋白 质的蛋 白酶酶 解产物 中加入 1 U/pl 的 N -糖 昔酶 F 水溶液 1(V1,371C 保温 
4h。 反应 完成后 置于- 20t: 保存。 

穴、 (X -甘 露糖昔 醜酶解 

9(^1 蛋白 质的蛋 白酶酶 解产物 中加入 0.1 U/fA 的 a- 甘 露糖苷 酶溶液 (3.0mol/L 
( NH4 )2S04 , . Imol/L ZnS04 , pH7 . 5 ) 10/^1 , 371: 保温 6h。 反 应完成 后置于 - 201: 保存 。 

七、 正 离子非 共价涂 层毛细 管电泳 

正离 子非共 价涂层 方法基 本参照 Kelly[ 74 ] 和 Wiktorowicz 等 [ 75] 人的方 法进行 ,简要 
概述 如下: 毛 细管用 Imol/L NaOH 溶 液冲洗 15min, 再依次 用水、 0. Imol/L HCl 溶液和 
水 各冲洗 5min。 然后用 涂层液 [含有 5% ( m /V)polybrene 和 296 ( 乙二醇 的水溶 

液] 冲 5min。 最后用 2mol/L 甲酸 溶液冲 5min。 电泳缓 冲液为 2mol/L 甲酸 溶液, 分离电 
压为 -30kV ,在 200nm 波长下 检测。 在每次 实验结 束后需 要用同 样的方 法重新 涂层。 

八、 毛 细管电 泳-质 谱联用 

新鲜毛 细管内 壁的硅 醇基团 通过以 下方法 来激活 : Imol/L 的 HC1 冲洗 15min ,水冲 
. 182 . 



洗 15min ,再用 Imol/L 的 Na〇H 继 续冲洗 15min ,最后 用水冲 15min。 在不 同的电 泳过程 
之间, 毛 细管用 . Imol/L 的 NaOH 再生 5min , 再用 水冲洗 5min , 最 后用电 泳缓冲 液平衡 
5mino 

CE/MS 接 口采用 鞘流液 接口。 毛细管 出口端 不导电 的高聚 物涂层 被烧去 2〜3mm, 
裸露出 石英毛 细管, 以利 于鞘流 液接口 处的电 接触。 毛 细管的 人口端 置于缓 冲液储 瓶中。 
为了 将由于 重力作 用引起 的液体 流动带 来的影 响降到 最低, 整个毛 细管电 泳仪器 被放在 
一辆可 以精细 调节高 度的小 车上, 并仔 细调节 仪器的 高度以 使毛细 管入口 端缓冲 液储瓶 
与毛细 管出口 端所在 的质谱 仪离子 源喷雾 口处于 同一水 平上。 鞘流液 (60% 乙醇, 1% 甲 
酸, 39% 水) 用 500^tl 的 Unimetrics 注射 针筒, 由质谱 仪上的 注射泵 推动通 过离子 源上套 
在毛 细管外 部的一 根不锈 钢细管 引人, 流速为 2.0(Vl/min。 由于 CE/MS 中毛细 管的流 
量很低 ,一般 <l/^l/rnin ,所 以不使 用流量 较大的 LC/MS 中所 必需的 销流气 (sheath gas) 
和 辅助气 (auxiliary gas)。 这样, 毛细管 末端突 出在不 锈钢细 管外部 分的长 短对喷 雾的效 
果好坏 就极为 关键。 在 Finnigan 公司的 CE/MS 接口上 ,可 以通过 一个千 分尺移 动头来 
作毛 细管末 端位置 的精细 调节, 一般 突出长 度约为 lmm。 CE/MS 接口处 的不锈 钢细管 
上加上 4. 25kV (对 比质 谱仪毛 细管入 口处) 的正 向喷雾 电压。 毛细 管电泳 分离通 过在毛 
细 管进样 口 端 加上正 向 高压来 进行。 

质谱 仪在联 机状态 下先用 血管紧 张肽做 校正, 以 使仪器 对毛细 管电泳 的出口 情况做 
出相应 的参数 调整以 获得最 佳的检 测灵敏 度和分 辨率; 然 后再用 Finnigan 的 Ultramark 
做 Calibration 来 调节质 谱仪的 精确度 及在不 同扫描 方式下 的参数 以得到 最佳的 操作性 
能。 其他主 要操作 参数为 :质 谱仪入 口处加 热毛细 管的温 度设为 1801: ,其 加速电 压设为 
13V;Tube lens offset 为 55V; 正离 子模式 检测。 在 MS/MS 实验 中设置 CID 碰撞 能量为 
45%, 所要 求的最 小信号 计数为 10 5 。 所有 实验均 采用自 动控制 (auto gain control, AGC) 
模式 进行, 即在质 谱仪的 扫描设 置中包 含三个 阶段: 首 先是质 谱仪在 m/z400〜2 000 的 
范 围内作 全扫描 (full scan) ,检测 所有经 过加热 毛细管 进人质 谱仪的 离子; 随后再 对信号 
计 数超过 10 5 ( 可另行 设置) 的丰度 最大的 离子, 在 m/z 很小 的范围 内进行 精度很 高的放 
大扫描 (zoom scan) ,可用 于确定 离子的 带电荷 情况; 最后质 谱仪对 已做过 放大扫 描的离 
子 在离子 阱中做 MS/MS ,并 将生成 的所有 碎片离 子记录 下来。 随 后质谱 仪又回 到全扫 
描状态 ,依 次循环 下去。 若 质谱信 号未超 过所设 定的最 小信号 计数, 则质谱 仪将一 直保持 
在 全扫描 状态。 这 三个阶 段可在 Is 之内 完成, 从 而能够 保证获 得足够 的质谱 信息。 

九、 蛋 白质序 列数据 库捜索 

蛋 白质序 列数据 库的搜 寻通过 SEQUEST 软件 进行。 对 于经过 MS/MS 分析 的质谱 
图, SEQUEST 将给 出一个 表格, 其中包 含从数 据库中 抽出的 最可能 的肽段 ,以及 它们的 
Xcorr 相关 系数和 DelCn 相关 因子。 Xcorr 相关系 数表示 ,将 实验中 获得的 MS/MS 质谱 
图 与数据 库中相 应肽序 列的预 测的碰 撞诱导 解离质 谱图所 作比较 (match) 的 质量; DelCn 
相 关因子 表示, 最匹配 的肽段 与其次 的肽段 之间的 差异。 一般 Xcorr 相关 系数在 2 以上 
即表明 ,从 数据库 中检索 得到的 肽段与 实验中 获得的 质谱图 得到了 很好的 匹配; DelCn 相 
关 因子在 0.1 以上则 表明, 搜 寻所得 的最佳 肽段与 其次的 肽段有 显著的 区别。 

. 183 . 



对一个 蛋白质 酶解产 物进行 分析所 得到的 MS/MS 质谱图 ,可 以不加 以任何 分析就 
直接对 整个质 谱图用 SEQUEST 软件进 行检索 ; 同样, 也可以 先经过 一定的 分析后 , 再选 
取感 兴趣的 肽段的 MS/MS 质谱图 进行单 独检索 ,这 样可以 大大缩 减数据 库检索 所需的 
时间。 对于检 索出的 来自同 一个蛋 白质的 肽段, SEQUEST 将把它 们归为 一类, 并 把所检 
索出的 蛋白质 按其总 加权值 由高到 低对它 们进行 排序。 在此, SEQUEST 采取了 一个简 
单的算 法来作 为判断 的指标 ,即在 所有从 数据库 中检索 出来的 肽段中 ,被认 为是与 该蛋白 
质的理 论酶解 肽段匹 配最佳 的肽段 分值为 10, 处于第 二位的 分值为 8, 依次 类推, 第三位 
的为 6, 第四 位的为 4, 第五 位的为 2。 最后通 过各个 蛋白质 所获得 的总加 权值的 高低, 来 
判断 所分析 的蛋白 质最可 能是哪 一种。 

数据 库搜索 的参数 设置为 : 蛋 白 质酶切 特异性 为胰蛋 白 酶或 Lys- C 蛋白酶 ,或 Glu-C 
蛋 白酶; 选择单 同位素 b 离子和 y 离子; 母离 子质量 范围为 300〜4 000; 差 异性修 饰设为 
Cys 羧酰胺 甲基化 (质量 数增加 57.0),Met 氧化 (质量 数增加 16.0) , 静态 修饰设 为无; 搜 
索所 用的数 据库为 SwissProt3.9 版及 从中单 独抽取 出来的 部分数 据库。 

十、 特殊肽 段的选 择性离 子监测 

为了进 一步确 定蛋白 质中的 点突变 情况, 需 要找到 带有突 变位点 的特殊 肽段。 通过 
选 择性离 子监测 (extracted ion monitoring, EIM) 方法 可以对 分子质 量已知 的目标 肽段进 
行整个 质谱图 范围内 的搜索 以查找 该肽段 的出峰 时间, 然后即 可根据 所找到 肽段的 CID 
质谱图 进一步 确定其 中突变 位点的 情况。 在 BioExplore 数据 分析软 件中输 人目标 肽段的 
可 能质荷 比数值 即可实 现选择 性离子 监测。 

十一、 毛细管 等电聚 焦-质 谱联用 

内壁经 LPA 涂 层的毛 细管长 80cm, 内径 50jLxm ,外径 360^tm。 聚焦 阳极电 解质为 1 % 
乙酸 溶液, 聚焦 阴极电 解质为 196 氨水 溶液; 移动 阳极电 解质为 0.5% 乙酸 溶液, 移 动阴极 
电解 质为含 有有机 相的乙 酸溶液 (0.25/75/25, HAc/MeOH/HzO, V/V/V)o 蛋 白质直 
接溶解 于含有 1 0/0 ( /V0 两 性电解 质的水 溶液中 , 浓 度约为 0. lmg/ml。 

毛细管 电泳仪 置于一 个可以 上下移 动的平 台上。 在等电 聚焦开 始前, 先仔细 将毛细 
管人 口端的 位置调 节至与 ESI 喷雾口 处于同 一水平 位置。 用聚焦 阴极电 解质作 为鞘流 
液 , 流 速始终 保持在 2/^l/min, 同 时打开 鞘流气 ,流 速为 20 个相 对单位 , 以防 止鞘流 液在针 
管口的 聚集。 在将 整根毛 细管充 满样品 和两性 电解质 的混合 物后, 小心将 毛细管 的出口 
端 縮人到 鞘流液 针管的 内侧约 1.5mm 处, 这样 就在鞘 流液针 管的末 端形成 了一个 微型的 
聚 焦阴极 电解质 溶液的 r: 池。 继续让 鞘流液 冲洗约 5rnin 以 去除可 能残余 在毛细 管末端 
的样品 和两性 电解质 ,然后 将鞘流 气流速 减小到 7 个相对 单位, 使得 鞘流液 可以恰 好在针 
管的末 端稳定 地形成 球面型 液滴。 毛细管 的入口 端浸没 于聚焦 阳极电 解质中 ,而 出口端 
则位于 以鞘流 液方式 引入的 聚焦阴 极电解 质中。 这 时加上 30kV 的 电压开 始聚集 (毛细 
管 中的电 位差为 375V/cm)。 聚焦约 40min 后, 电 流不再 下降, 表示聚 焦已经 完成。 此时 
. 184 . 



关 闭聚集 电源, 迅速将 毛细管 位置重 新调整 到突出 于鞘流 液针管 外部约 1mm 处, 再迅速 
将鞘 流液换 成移动 阴极电 解质, 人 口端电 解质换 为移动 阳极电 解质。 再迅 速将整 个毛细 
管电 泳仪的 位置向 上移动 8cm (这 是为 了将重 力引起 的移动 与由于 移动阳 极电解 质替换 
引起 的条带 移动结 合起来 , 以加快 聚焦条 带移动 的速度 ) , 在毛细 管的两 端加上 + 30kV 的 
电压, ESI 离 子源的 喷雾电 压设为 + 4.25kV (此时 毛细管 中的电 位差为 322V/cm) ,随即 
开始对 样品条 带移动 情况的 MS 在 线检测 过程。 这 种实现 CIEF/ESI-MS 联用的 方法称 
为" 活 动式毛 细管位 置调整 法"。 

质谱 检测条 件为: 加热毛 细管的 温度为 1801C ,加速 电压为 24V;Tube lens offset 为 
-5V; 光电倍 增管在 _ 950V 条件下 检测; Full scan 范围为 m/z 1 100〜2 000; 以 正离子 
模式 检测。 

第四节 结 果 
一、 多肽和 蛋白质 的分析 与鉴定 



首先用 CZE/^S/MS 对 Met -脑 啡肽和 Leu -脑 啡肽的 混合物 进行了 分析, 它 们的浓 
度 分别为 133.3/imol/L 和 66.7/Ltmol/L。 缓 冲液为 1% 醋酸, pH3.4; 在 138kPa 压 力下进 
样 3s; 电压为 30kV。 图 10.4 表示了 质谱仪 检出的 基峰图 (代 表在 该峰中 丰度最 高的离 
子)。 这两 种带单 个正电 荷的多 肽离子 在经过 MS/MS 后得到 了较好 的碎片 离子, 能明确 
地解析 出每种 多肽的 氨基酸 序列。 可以 清楚地 看到这 两种五 肽在一 级结构 上的区 别仅仅 
在于 C 端的一 个氨基 酸残基 (图 10.5)。 



lOOn 
90-: 
80 

70 

ISJ 60- 
^ 504 
40 
30 
20 
10 三 




Met- 脑啡肽 



Leu- 脑啡肽 



13.66 



14.31 



2 4 6 8 10 12 14 

//min 

图 10.4 用 CZE/MS 方 法分析 Met- 脑啡肽 (1.4pmol) 和 
Leu - 脑啡肽 (0.7pmol) 的 混合物 

为 了验证 CZE/MS/MS 系 统是否 适合于 通过检 测蛋白 酶酶解 产生的 肽段来 鉴定多 
肽, 我们对 S-CT 的胰 蛋白酶 酶解产 物作了 分析。 同 样使用 1% 醋酸 (PH3.4) 作为 电泳缓 
冲液, S-CT 的酶 解产物 未经任 何处理 直接在 138kPa 压力 下进样 5s。 图 10.6 是对 s-CT 
酶解产 物的基 峰图, 每个肽 段的出 峰时间 很短, 均低于 0.4min。 所 有的理 论酶解 肽段都 

• 185 . 



图 10.5 Met- 脑啡肽 (a) 和 Leu- 脑啡肽 (b) 的 MS/MS 质谱图 

可由 CZE/MS 分离 并得到 鉴定。 自动化 数据库 检索结 果表明 该多肽 最可能 来源于 Calci- 
tonin 1 Precursor。 其中 已经被 鉴定的 肽段有 T1 、T2 和 T3,T4 由于 在人工 合成的 产品中 
C 端为酰 胺化而 未能得 到鉴定 ,但 仍然可 以从其 CID 图谱验 证它的 氨基酸 序列。 

1(2* SNLSTC * VLGK ^ LSQELHK ^ LQTYPR ^ TNTGSGT^P-NHz 

图 10.7 是对细 胞色素 C 胰蛋 白酶 酶解产 物的基 峰图, 毛细管 电泳在 1% 乙酸 (pH 
2. 3) 缓冲液 中进行 ,实 际分离 电压为 10.75kV。 几乎 所有的 理论酶 解肽段 都可由 CZE/ 
MS 分离 并检测 (表 10.1)。 另外, 尽管一 些肽段 (如 T7 和 T18,T5 和 T14, 以及 T9 和 
T10) 并未完 全分开 ,扫 描速度 极快的 CZE/MS/MS 还是 能够分 别对它 们进行 鉴定。 仔细 
观察 发现, 尽 管肽段 T5 和 T6、T8 和 T9、T10 和 T11、T12 和 T13, 以及 T15 和 T16 的氨 
基酸序 列都只 有一个 Lys 的区别 ,但 它们的 电泳迁 移率却 发生了 很大的 变化, 在 CZE/MS 
条件 下被很 好地分 辨开来 并分别 得到了 鉴定。 最 长的一 段肽段 T11 得到了 很好的 CID 
图谱 (图 10.8)。 

. 186 . 



b3 

278.0 



bl 

164.3 



b2 
221. 



50 



200 



261.9 
250 



y2 

297.1 
I, . 
300 



397.0 



164 221 -\278 ,425 、 

Tyr -VGly VGIv V-Phe V- Met 



380. 



a4 



M 
424.9 



350 
miz 



400 



450 



480.1 528.1 
丄 

500 



[M-H2O]* 
555.9 

550 



397.0 



164^221 、278 ,425 、 

Tyr -\-Gly V-Gly V-Phe V- Leu 



b3 
277.9 



1.1 261.9 



y4 

392.8 

y2 y3 380. 1\ 
一 279.0 336.1 I \ 

■i ' ', I A 1 1. I' I A 1' 



a4 



b4 
424.9 



493 
465.0 



r 510.1 [M-H,0]- 
-1 1 538.1 
1 J i 556.6 



150 



200 



250 



300 



350 
mIz 



400 



450 



500 550 



0987654 321 

i 3 



) - - - - - ------------ --------- 

(0987654 3 




lOOq 
90-1 
80」 



T3 



T2 



12 3 4 



f/min 



10.6 用 CZE/MS 方 法分析 5.2pmol 的 s-CT 胰蛋 白酶酶 解产物 (1% HAc,pH3.4) 



100 
90: 
80; 



T4 



T2 



20 
//min 



25 



30 



35 



40 



7 用 CZE/MS 方 法分析 5.8pmol 的细 胞色素 c 的胰 蛋白薛 SI 解产物 



1020.3 



y7 

891.3 



y5 y6 

615.2 728.2 



y4 

486.3 



680.6 



y3 

372.2 



Lvl6】-' 
[yl4p 9 
877.0 



[yi3p 

812 



y8 



b9 
^1058. 



m/z : 737.6, + 3 ion 
GITWKEE TLMEYLENPKK 



v9 blO 
1151 5ii90.4r 



bll 
1318.' 



yll 1483.6 bl3 
1366.5 I 1596.7 1837.3 



00 



400 



600 



800 



I 000 
miz 



1200 1400 1600 1800 2000 




O. 2000000000 

1 2987654321 




f . M 




图 10 . 8 肽段 Tl 1 的 MS/MS 质谱图 



187 



表 10.1 用 CEA1S 方 法对细 胞色素 C 的胰蛋 白酶酶 解产物 进行肽 谱分析 



肽段 位置 序列 保 留时间 /min 理论分 子质量 /Da 观测分 子质量 /Da 





1 - 


~5 


GDVEK 




546.6 






5- 


一 8 


GKK 




331.4 




Tl 


9~ 


-13 


IFVQK 


24.85 


633.8 


633.4 


12 


9~ 


-22 


FFVOKCAOCHTVEK 


18.55 


1 633.9 


1 633.2 




23- 


^25 


GGK 




260.3 




T3 


26- 


~38 


HKTGPNLHGLPGR 


14.23 


1 433 . 6 


1 433.5 


T4 


28- 


-38 




21.71 


1 168.3 


1 168.2 


T5 


39- 


-53 


KTGQAPGFTYTDANK 


26.32 


1 598.7 


1 598.7 


T6 


40' 


- 53 


TGQAPGFTYTDANK 


40.17 


1 470.6 


1 470.2 




54- 


-55 


NK 




260.3 




T7 


56- 


-60 


GITWK 


23.33 


603.7 


603.4 


T8 


61- 


-72 


EETLMEYLENPK 


41.38 


1 495.7 


1 495.0 


T9 


61- 


-73 


EETLMEYLENPKK 


28.52 


1 623.8 


1 623.3 


TIO 


56- 


-72 


GI 1 WKhL 1 LJVLbYLh-NrK 


29. 10 


2 081 .4 


2 080.9 


Til 


56- 


-73 


GITWKEETLMEYLENPKK 


22.65 


2 209.5 


2 209.3 


T12 


73- 


-79 


KYIPGTK 


17.56 


806.0 


805.6 


T13 


74- 


-79 


YIPGTK 


25.64 


677.8 


677.3 


T14 


80- 


- 86 


MIFAGIK 


26.72 


779.0 


778.4 


T15 


88- 


-99 


KTEREDLIAYLK 


20.11 


1 478.7 


1 478.4 


T16 


88- 


100 


KTEREDLIAYLKK 


16.06 


1 606.9 


1 607.1 


T17 


92- 


-99 


EDLIAYLK 


35.03 


964.1 


963.5 


T18 


100- 


- 104 


KATNE 


23.75 


561.6 


561.4 



CZE/MS/MS —共 生成了 29 个 不同的 CID 质 谱图。 用 SEQUEST 软 件对事 先未加 
以 任何解 析的酶 解产物 MS/MS 质谱图 ,先 进行马 蛋白质 序列数 据库的 检索。 结果 如下: 
A 

1. CYC — HORSE 180(18,0,0,0,0) 1 4 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 23 

25 26 27 1 



2 


.CPT7 - 


_ HORSE 


60(4,1, 


,2, 


,0, 


,0)1 3 21 24 28 


3. 


.TRFL. 


- HORSE 


50(0,3. 




,0, 


.4)1 [ 


4. 


.ETBR_ 


— HORSE 


46(1,2, 






,1)1 29 I 


5, 


• GELS. 


- HORSE 


44(0,2, 


,4, 




,0)1 1 



共有 18 个 CID 质谱图 与马细 胞色素 c 的某些 序列相 匹配, 它们的 Xcorr 相关 系数和 
DelCn 相关因 子都比 较高, 显 示出很 高质量 的检索 结果。 尤其是 DelCn 相关因 子大于 
0.4, 这表示 通过检 索所得 到的肽 段具有 比较明 显的特 殊性, 与马细 胞色素 C 的胰 蛋白酶 
酶 解产物 中的某 些肽段 对应关 系极为 显著。 而且, 检 索得到 的序列 较长的 肽段均 具有较 
高的 Xcorr 相 关系数 (如最 长的两 段肽段 T10 和 T11 的该项 值分别 达到了 5.7017 和 
5. 1797), 说明数 据库中 对这些 肽段所 预测的 CID 质 谱图与 CZE/MS/MS 实验所 获得的 
CID 质 谱图能 很好地 吻合。 点击 相应肽 段的因 特网链 接还可 以观看 该肽段 的理论 CID 
. 188 . 



图谱, 以 供与手 工解析 结果相 对照。 马细 胞色素 C 的总 加权值 最高, 为 180, 有 18 个 CID 
质谱图 与之显 著相关 (列为 最佳匹 配肽段 ), 而其 他几个 蛋白质 的总加 权值都 不高。 仔细 
观察检 索结果 发现, 蛋白质 CPT7 HORSE 的 4 个 最佳肽 段均来 自 于 在不同 的时间 分别出 
现 4 次的一 个质量 数约为 452.2 的 离子, 而这极 有可能 就是来 自 系 统内部 的杂质 离子。 
这说 明利用 CZE/MS/MS 所 产生的 CID 质谱 图检索 蛋白质 序列数 据库来 鉴定蛋 白质, 可 
以得 到快捷 而可靠 的结果 [76] 。 
B 





CYC — 


EQUAS 


50(5 





,0 


,0 


0) 


1 10 12 18 


2 


CYC — 


HELAS 


30(0 









0) 




3 


CYC2 


_ MOUSE 


20(2 











0) 


1 9 17 ! 


4 


CYC — 


HORSE 


20(2 











0) 


) 16 26 } 




CIN6 


— HUMAN 


20(0 




2 





0) 




6 


CYC — 


APIME 


20(0 





2 


2 


0) 




7 


CYC — 


ASTRU 


20(0 




2 





0) 




8 


AFAC 


― ECOLI 


20(1 







1 


0) 


1 29 ( 


9 


CYC — 


ANAPL 


20(2 











0) 


4 11 t 


10 


CYC — 


APTPA 


20(2 











0) 


4 11 1 



如果 所鉴定 蛋白质 的来源 未知, 则可将 CZE/MS/MS 产生的 CID 质谱 图先在 复杂非 
冗余库 ( 如 SwissProt .OWL) 中进 行检索 , 这 样一般 可确定 蛋白质 的种类 , 然 后再结 合该蛋 
白质 的分子 质量进 行比较 精细的 检索, 就可 确定蛋 白质的 种属。 我们 将马细 胞色素 C 的 
酶解 产物的 CID 质 谱图在 SwissProt 3.9 版数据 库进行 检索后 ,结果 排在前 10 位 的蛋白 
质中有 8 种是细 胞色素 c, 只 是来源 不一样 (见 B)。 这 主要是 因为细 胞色素 C 是一 种很保 
守的蛋 白质, 来自 不同种 属的细 胞色素 C 在经过 胰蛋白 醉 酶解 后可 能会存 在许多 序列相 
同的 肽段。 进 一步结 合所测 得的分 子质量 12 359.0Da (图 10.9) , 即 可判断 该蛋白 质是马 
细 胞色素 C (理 论分子 质量为 12 360.0Da)o 



图 10.9 马细 胞色素 C 的分 子质量 (插 图表示 它的电 荷分布 情况) 



12359.0 



i.>>>tiW<|ifcii<«H(<»ii^wM]ii<>|Cn)T>i 

6000 8000 



10000 12000 14000 16000 18000 20000 
分 子质量 



8 650 




+12 
10309 



1374. 1 , 
1 +8 +7 
1545.6 1766.2 



§ 000000000 

1987654321 



w^oooooooon 

OQ'87654321 



189 



二、 蛋白质 点突变 的鉴定 



图 10.10 用 CZE/MS/MS 方 法分析 4.6pmol 的 S125-IL-2 的胰蛋 白酶酶 解产物 

为了找 到带有 突变位 点的特 殊肽段 ,可 以利用 EIM 方 法快速 地进行 目标肽 段的搜 

索。 T10(WITFSi 25 'QSnSTLT) 的理 论分子 质量为 1 496. 7Da ,所以 可以选 择它的 + 1 价 
离子0/z = 1 497.7)进行EIM搜索,结果如图 10.11 所示。 可见该 肽段在 39.7min 时 



100- 






80- 


base peak 










40 f 






20- 






0: 






100- 






80: 


m/z: 1497.7 




60: 






40: 






20: 






二 


^ ., wi'i^k '、卞 '1,,'— 气、 f"i'» r r*H r^7/^p"fTiiV»i 





10 15 20 25 30 35 40 45 
//min 



图 10.11 对质 荷比为 1 497.7 的离 子的选 择性离 子监测 



S125-IL-2 醇解 产物在 138kPa 压力 下进样 20s。 净分离 电压为 10.75kV; 使用 的电泳 
缓 冲液为 1% HAc 溶液 (pH2.3)。 图 10.10是S125-IL-2酶解产物的basepeak,一共找到 
了 10 个胰 蛋白酶 的酶切 肽段, 整个 蛋白质 序列的 回收率 达到了 97. 89()。 由于 S125-IL- 2 
是 基因工 程重组 产品, 所以其 N 端含 有一个 Met 残基, 而 在天然 IL-2 中是没 有这个 N 端 
Met 残 基的。 所以 在肽段 Tl(MAPTSSSTK) 中, 将 Met 残基 定位为 - 1 , 以与 天然的 IL-2 
蛋白质 序列相 对应。 



100 q 

90 
80 - 
70 : 



T3,T4 




T9 



T10 



20 

//min 



25 



30 



35 



40 



- : 一 二 



o o o o o o 

6 5 4 3 2 1 



190 



出峰。 然 后再在 该时段 的质谱 图中找 到它的 CID 质 谱图, 即可实 现对突 变位点 的鉴定 
(图 10.12)。 从 T10 的 CID 质 谱图中 可以看 到一个 有趣的 现象: T10 在经过 MS/MS 过 
程后 生成了 一系列 b 离子的 连续脱 水产物 及肽段 本身的 分子连 续脱水 产物。 这可 能是因 
为 T10 肽段中 含有较 多容易 脱水的 Ser 和 Thr 残基的 缘故。 



40: 
35: 
30: 
25: 
20- 
15 



[bl2-H 



TIO 

WITFS*QSIISTLT 



[bl2-2H20r 



[bll-HjOr 
1246.4 



b6 【b7-^ 




(b9-H20r 
1058.2 

b9 
^1076.: 



1264.4 



4 



_1377.: 
bl2 



fM-HjOr 
1478.3 



[M-2H2Cj]* 

1460.3 



400 500 600 700 800 



900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 

miz 



图 10.12 肽段 T10(WITFSi25' QSIISTLT) 的 MS/MS 质谱图 

用同样 的方法 可以对 HbS 的 突变位 点进行 鉴定。 10(^1 HbS 的 胰蛋白 酶酶解 产物经 
冷冻干 燥后, 用 20^11 1% HAc(pH2.6)溶解,60 000 r/min 离心 lOmin 后, 在 138kPa 压力 
下进样 20s ,进样 量约为 11.5pmol。 毛细管 电泳在 1% HAc 缓 冲液中 进行, 净分离 电压为 
10.75kV。 由于 Hb 是一种 寡聚蛋 白质, 分子 中含有 2 个 a 链和 2 个 (3 链, 所以它 的酶解 
产物 中肽段 很多, 难以实 现对每 个肽段 的完全 分离。 尽管 如此, 由于 质谱检 测的特 异性、 
高速度 和高灵 敏度, 利用 CZE/MS/MS 方法还 是可以 单独对 绝大部 分的肽 段进行 检测和 
鉴定。 从 HbS 的基峰 (图 10. 13) 可以 看到, 绝大部 分肽段 被找到 ,而 且出峰 时间的 重现性 



100-1 



Ta6 



90-; 




8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 

//min 



图 10.13 用 CZE/MS/MS 方 法分析 11. 5pmol 的 HbS 



191 



较好。 对质谱 图的手 工解析 找到了 Hb 的 a 链的 9 个理论 酶解肽 段中的 7 个, 以及 P 链的 
11 个理论 酶解肽 段中的 9 个, 具有 良好的 氨基酸 序列覆 盖率。 



Base Peak 



补 




图 10. 14 对肽段 TbSl 的选 择性离 子监测 

为了进 一步鉴 定肽段 Tbl 中的突 变位点 ,可 以利用 EIM 方法来 快速地 找到它 的出峰 
位置。 TbSl 的理 论分子 质量为 923. lDa, 所以相 应地可 以对其 461. 9 2 + 离子进 行监测 (图 
10.14)。 从 TbSl 的 CID 质谱图 (图 10. 15) 可以 看到, TbSl 确实 发生了 (3^Glu— (3H^al 点 



100 
90 
80^ 
70 
60-. 
50i 
40 
30 
20— 
104 




686.4 



y5 

573.2 



b2 



y2-H20 
257.6 b3 



y72+ 

412.2 



238.2 



163.8 



351J 



y4 529.2 
472.2 I 



b6 
648.2 



■y6 



b7 

777.3 



796.4 



200 300 400 500 

b 101.1 238.3 351.4 452.5 

V H L T 

923.1 824.0 686.8 573.7 



600 700 800 
549.7 648.8 777.9 906.1 



900 



P 

472., 



y E 

375.4 276.3 



K 

147.2 



图 10. 15 肽段 TbSl 的 MS/MS 质谱图 

值得一 提的是 ,发生 了点突 变的蛋 白质同 样可以 用自动 化的数 据库检 索来进 行鉴定 < 
不过 含有突 变位点 的肽段 将不能 被正确 鉴定, 但 这对整 个蛋白 质的鉴 定影响 甚微。 



. 192 • 



三、 蛋白质 磷酸化 的鉴定 



(3 -酪蛋 白及去 碟酸化 (3- 酪 蛋白的 酶解样 品均在 138kPa 压力 下进样 20s ,相 应的进 
样 量约为 12.0pmol。 净分离 电压为 10.75kV; 使用的 电泳缓 冲液为 1% HAc 溶液 
(pH2.6)o 

酪蛋 白的胰 蛋白酶 酶解产 物中应 该含有 两段存 在憐酸 化位点 的肽段 (RiELEEL- 
NVPGEIVESPLSPsPsPEESITR25 和 F33qsPEEQQQTEDELQDK48) , 但 是由于 RiELEEL- 
NVPGEIVESPLSPsPsPEESITR 25 含有 4 个磯酸 化位点 ,整 个肽段 由于这 4 个额外 的负电 
荷而 难以在 酸性条 件下离 子化, 因而很 难在正 离子检 测模式 下被质 谱仪检 测到, 这 与文献 
报道是 一致的 [77] 。 利用 EIM 方法 可以快 速地进 行目标 肽段的 搜索。 在 酪蛋 白中, 由 
于含有 一个天 然磯酸 化位点 的肽段 T2(F 33 QSf'EEQQQTEDELQDK 48 ) 的 理论分 子质量 
为 2 061. 2, 所以 可以选 择它的 + 2 价离子 (m/z = l 031. 6) 进行 EIM 搜索, 结 果如图 
10. 16 所示, 可见该 肽段在 39. 6min 时 出峰。 根据该 时段的 MS/MS 图谱, 即可实 现对该 
肽段 的鉴定 (图 10.17)。 其中最 高的信 号对应 于该磷 酸化肽 段分子 的去磯 酸化双 电荷离 
子; b 离 子找到 4 个, 而 y 离子则 找到了 比较完 整的一 个系列 (y3〜yl5)。 这是 因为, 在本 
实验 设置的 MS/MS 碰撞 能量下 , 尽管 肽键之 间的断 裂情况 比较好 , 但造 成憐酸 化修饰 的 
共价键 却也容 易发生 断裂; 而 且磯酸 化位点 Ser^ 5 处于整 个肽段 分子的 N 端一侧 ,所以 y 
离子 较多而 b 离子 较少。 




图 10 . 16 肽段 T2(F 33 QSPEEQQQTEDELQDKM ) 的选 择性离 子监测 

同样用 EIM 方 法可以 容易地 找到去 瞵酸化 酪 蛋白酶 解产物 中的对 应肽段 T2' 
(F 33 QSEEQQQTEDELQDK 48 , 理论质 量数为 1 982.0, 搜索 其双电 荷离子 m/z 为 992.0)。 
图 10 . 18 是 T2' 的 MS/MS 质谱图 , 可 见其与 T2 的 CID 图 谱有很 明显的 差别。 另 一段含 
有 4 个天然 憐酸化 位点的 肽段的 去磯酸 化产物 RiELEELNVPGEIVESLSSSEESITR 25 仍 
然未 能得到 鉴定。 这可能 是因为 这几个 磯酸化 位点彼 此相距 太近, 影响了 磯酸酯 酶作用 
的效果 ,导 致不能 或不完 全去磯 酸化, 所以该 肽段还 是难以 在正离 子条件 下得到 检测。 



• 193 • 



90 
80^ 

70 i 

60i 
50 

30 i 
20」 
10 




982.7 



[M-H2PO4]' 



y8 

977.4—1 



7^7.3 



FQSPEEQQQTEDELQDK 



y9 

1106.3 yio 
1/ 1233,4 y" 



1 , v5 b5 b6 832 |/ 1233,4 X"' yl2 ,^ 



400 



600 



800 



1000 



1200 
miz 



1400 



1600 



1800 



2000 



图 10 . 17 肽段 T2(F33QSPEEQQQTEDELQDIC^) 的 MS/MS 质谱图 



100 
90-3 
80 

70 T 
60 
50t 
40i 

30 
20: 





y9 

1 106.6 



1217.2 



855. 



368.2 y3 



539.6 



3—90.1 -"" y6 
yll^ 747.3 

682.3 
632. 



y8 

978.6 



y7 

876.9 



1045.3 



b8 



f"oseeoqqtedelqdk^ 



yi2 

1491.3 



ylO 
-1234.6 



1327.5 1575.^ 

1447.3 
bll 



yU 
1619.4 



yl4 
1707.9 



400 



600 



800 



1000 



1200 
ml: 



1400 



1600 



1800 



图 10. 18 去憐酸 化肽段 T2'(F 33 QSEEQQQTEDELQDK 48 ) 的 MS/MS 质谱图 



四、 蛋白质 A/ - 糖基化 和氧化 的鉴定 

(一) 蛋白 质糖型 的分辨 . 

通常情 况下, HPLC 等 分离方 法对于 蛋白质 糖型的 分辨是 无能为 力的; 但用毛 细管电 
泳方法 ,选择 适当的 分离缓 冲液和 (或) 涂层方 法却可 以分辨 许多糖 蛋白的 糖型。 在未涂 
层的毛 细管内 壁带负 电荷, 其中 的电渗 流朝向 阴极; 而 经过正 离子高 聚物涂 层的毛 细管内 
壁是 带正电 荷的, 其中 的电渗 流方向 是朝向 阳极的 (电荷 反转, charge reversal) 所以, 在 
普通 的极性 安排下 (毛 细管进 样端为 阳极, 检测端 为阴极 ), 未 涂层毛 细管中 的电渗 流与电 
泳迁移 力方向 相同, 造成样 品条带 的扩散 ;在涂 层毛细 管中, 电渗流 的方向 与电泳 迁移力 
的方 向是相 反的, 样品条 带的移 动速度 减慢, 因 而分辨 率得到 提高。 但此时 样品条 带的移 
动要靠 电渗流 的推动 ,所以 ,要将 毛细管 的进样 端设为 阴极, 检测 端设为 阳极, 这样 样品条 



194 



带才能 通过检 测器得 到检测 ,因为 此时电 渗流的 方向是 朝向阳 极的。 另外, 通过使 用强酸 
性的 缓冲液 可以将 电渗流 降低, 从 而使样 品条带 的移动 进一步 减慢, 分辨率 得到进 一步提 

高。 在 2mol/L 甲酸 溶中利 用正离 子非共 价涂层 方法对 RNase B 的糖型 分析情 况如图 
10. 19 所示。 



(二) 蛋白 质高甘 露糖型 N -糖基 化和氧 化情况 的分析 

对于蛋 白质的 iV - 糖基化 ,可以 考虑分 为两个 步骤: 首先分 析糖基 化位点 ;然 后再分 
析糖链 结构。 而对于 高甘露 糖型的 iv- 糖基化 ,可以 很方便 地通过 比较性 肽质谱 方法来 
进行。 N -糖 昔酶 F 可以 完全切 断与肽 链相连 的糖链 , 其适宜 pH 值在 8 左右, 正 好可与 
胰蛋 白酶或 Lys-C 蛋白 酵联合 使用; 这 二者的 联合使 用可以 鉴定蛋 白质的 糖基化 位点。 
a -甘 露糖苷 薛切断 的是以 a- 糖昔键 连接的 糖基团 (在 高甘露 糖型的 糖链中 除了与 Glc- 
NAc 相连的 一个甘 露糖外 ,其余 的甘露 糖均以 a- 糖苷键 彼此相 连), 其 适宜的 pH 值在 4 
左右, 正 好可与 Glu-C 蛋白 酶联合 使用; 这二者 的联合 使用可 以确定 糖链的 结构。 

1. 糖 基化位 点和氧 化情况 的分析 

TSL 是在 竹叶青 蛇毒中 发现的 C 型 凝集素 , 它本身 就具有 结合半 乳糖的 活性。 天然 
状态 下表现 为通过 链间二 硫键形 成的多 聚体。 通过 LC/MS 方 法对其 还原态 TSL 及进一 
步用 N - 糖苷酶 F 处 理后的 TSL 进行的 分子质 量测定 发现, 还原态 TSL 中 有分子 质量不 
均一 现象, 且彼此 之间相 差约为 162, 含 量最高 的一种 还原态 TSL 与用 N - 糖苷酶 F 处理 
后的 TSL 之 间的分 子质量 差距为 1 703, 正 好符合 GlcNAcsHexg 的糖链 结构。 所以, 还原 
态 TSL 中 的糖型 分布被 归结为 GlcNAc2Hex5~8 [78] 。 对比经 N - 糖苷薛 F 处理前 后的肽 
质谱图 (未 显示) 发现, 在别 的酶解 肽段出 峰位置 都基本 保持不 变的情 况下, T1 肽 段经糖 
昔 薛 去除 糖链后 产生的 Tl' 肽 段的出 峰位置 与之发 生了较 大程度 的改变 (Tl:1.3min; 
Tr:4.5min) ,这说 明糖链 的存在 对该肽 段的电 泳迁移 率影响 很大。 从 TSL 的氨 基酸序 
列中 可见, 只有 N 端的 T1 肽段 中含有 符合特 殊识别 序列子 的一个 糖基化 位点: Asn 5 - 
Asp-Ser。 另外 一个有 趣的现 象是, 在存在 糖基化 修饰的 T1 肽 段中由 于含有 2 个 Met 残 
基, 所 以还同 时检测 到了其 中不同 程度的 Met 残 基氧化 现象; 在另一 个含有 Met 残基的 
肽段 T3 中也同 样检测 到了它 的氧化 形式。 经 N - 糖昔酶 F 处理后 的肽段 Tl' 中 同样也 




Man ■ 

Man 8 
Man 9/1 




图 10 . 19 用极 性反转 方法对 RNaseB 的糖 型进行 CE-UV 分析 



检 测到与 T1 中 类似的 Met 残 基氧化 现象。 

图 10.20a 显示 了糖肽 T1 的糖 型分布 情况; 图 10.20b 显示了 Tl-GlcNAczMang 型糖 
肽 的氧化 情况。 由于在 Tl-GlcNAc2Man8 型糖肽 (S1CCTNGdSLPM1GNGM1 3 CYK1 6 ) 中含 
有 MetiG 和 Meti 3 两个 Met 残基 , 所 以 它产生 了两 种不同 的氧化 形式, 即一个 Met 残基被 
氧化 的形式 (T1- GlcNAc2Man8-0) 和两个 Met 残 基同时 被氧化 的形式 (Tl-GlcNAcaMang- 
20)0 



100 

90 
803 

70 
60 
50 
403 
30 
20^ 
10 




1214.6 



3+ 
Man? 
1160.3 



3+ 
3+ Man6 
Man5 '106.5 

1053?4 



、 3+ 
Man 8 



Tl-GlcNAc^-Man„ 



2+ 
Man8 
1821.1 



1311.7 



Man5 
1577.8 



2+ 
Man? 

2+ 、, 2+ 1740.1 
Man6 

1659.5 



" 'p 'r li'i' t 'i'*^ 



1929.4 



900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 
m/z 



1226.2 
\ 



Tl-Man8-20,3 



Tl-Man,-0,2+ 
1830.2 

Tl-Mang-20,2+ 
1837.4 




2000 



图 10.20 肽段 Tl (a) 及其氧 化产物 Tl-GlcNAc2Man8(b) 的糖 型分布 质谱图 

用 N - 糖昔酶 F 对 TSL 的 酶解产 物进行 处理后 , 糖肽 T1 的糖 链被移 去而转 化为肽 
段 Tl' ,原 来的 Asn 5 残基 转化为 Asp 5 残基。 尽管 Tl' 及 其两种 氧化形 式并没 有被分 离开, 
但 CE/MS/MS 还 是分别 捕捉到 了它们 各自的 CID 质 谱图。 值得一 提的是 ,通过 Tl'- 
(SiCCTiyDSLPMiGNGMi 3 CYKi 6 ) 的 CID 质谱 图可以 清楚地 看到, 发生 氧化的 Met 残基 
是 Meti 3 残基 而不是 MetiG 残基 (图 10.21)。 同样 发生了 Met 残基氧 化的还 有肽段 T3 
(T23wEDAEM29fCR32)。 



2. 糖链结 构和氧 化情况 的分析 



为 了进一 步验证 TSL 中糖链 的高甘 露糖型 结构, 需要用 a- 甘 露糖昔 酶对它 进行处 
196 • 



lOOq 
90-i 
80^ 
70-i 
60-i 
50-f 
40-i 
30 
203 
10 




1017.3 



b3 b4-H20 



■ J> <l>|.l,)|l,»|>iH、 M l n ,,ln<*l,,)ii|' 人) r ijun^ 



y5 \ y6 
674.3\ 789. 



bS-H^O 
921.2 



、y8 



400 



y9 yio 
1130.4 1217.3 yll 
I r 1332 5 



yi3 

1548 6 



600 



800 



1000 
miz 



1200 1400 



1600 



1800 



249.2 409J 5104 624. S 



S C C T Z)DS LPM 

1955.0 1867 9 1707.8 1547.7 1446.6 1332.5 1217.4 1130.4 1017.2 920.1 



739.6 826.7 939.9 1037.0 1168.2 1282.3 1339.4 1486.6 1646.7 1809.9 1938 1 

3/ C Y K 



N 

788.9 



G 

674.8 



图 10.21 肽段 Tl'-O 的 MS/MS 质谱图 



100 q 
90-; 
80-1 
70 



60^ 



m 50 

40 
30 
20 
10 







GlcNAc2,3+ 
GlcNAc,3+ \ 13263 

Ml, 3、+ 1^72.2 
121 



1096.8 



M6,3+ 
1488.4 

M4,3+ 

1379.9 M5,3+ 
M3,3+ 



I', 屮 M ' I 

1000 1100 1200 1300 1400 



M7,3+ 
1542 6 



GlcNAC2,2+ 
1746.2 



1500 
mIz 



2 3 j\ 1805,8 ,„" 

i|ii j 、 , , ,,「J ,. , il,i ,MW#) ,'j、ii,i 



1600 1700 1800 1900 2000 



lOOn 
904 
80^ 
70. 
60 
50; 
40— 
30 
20 
10 







M2.3+ 
1277.4 
GlcNAc2,3+ \ M3,3+ 
GlcNAc,3+ II 69.7 I l"l 7 
、 Ml, 3+ I 

1102.5 1223.2 



M4.3+ 

1385.5 . - 
M6,3+ 
M5,3+ I 

1439 7 / M7,3+ 
\ 1493.8 1547.9 



1500 

mil 



GlcNAc,2+ 



GlcNAo,.2+ 
1754.0 



1000 1100 1200 1300 1400 



1600 1700 1800 1900 2000 



b 



图 10.22 肽段 Gl-GlcNAc2Man8(a) 和 Gl-GlcNAczMang - 0(b) 的 MS/MS 质谱图 



理。 经过 6h 的 a- 甘露糖 昔酶处 理后, 糖肽 Gl 的糖链 结构由 GlcNAc2Man8 转化为 Glc- 
NAc2Man3 结构, 并且 出峰位 置由原 来的比 G5 先出峰 变为后 来的比 G5 后出峰 (图 谱未显 

示)。 

TSL 的 Met 残基的 氧化现 象同样 也在其 Glu-C 酶解 产物中 存在。 肽段 Gl(SiCCTN 5 
dslpmiongm13cykifdepktwe25) 和 G4(m29fCRKYKPGCHLASFHRLAE48) 中均存 

在不同 程度的 Met 残基氧 化现象 ,由于 这些肽 段的氧 化形式 与它们 本身的 电泳迁 移率差 
别很小 ,所以 它们混 和在一 起出峰 ,造成 相应峰 的拖尾 现象。 

以 G1 为 例来分 析其分 子中的 糖基化 和氧化 情况。 在未经 a- 甘露糖 苷酵处 理前, 糖 
肽 G1 的主要 的糖链 结构为 GlcNAc2Man8( 糖肽 表现为 1597. 3 +)。 图 10.22 显示了 G1- 
GlcNAc2Man« 和 Gl-GlcNAczMang-O 的 CID 质 谱图。 可见这 两种糖 肽的断 裂都主 要发生 
在各种 糖基团 之间, 因而得 到了从 Gl-GlcNAc2Man7〜Gl-GlcNAci 之间一 系列的 完整的 
碎片 离子, 但糖链 与肽链 之间的 共价键 Gl^GlcNAc 不发生 断裂。 这充分 说明了 糖链是 
iV- 连接 的高甘 露糖型 结构, 而且这 两种糖 肽之间 的差别 仅仅在 于其中 一个糖 肽中的 Met 
残基 发生了 氧化。 



100 
90^ 
80^ 
70^ 
60 
50 
40-. 
30i 

loi 

10 




GlcNAc2Man3-IO,3+ 

GlcNAc2Man3.3+ 
1326.0" 



GlcNAc2Man2-20,3+ 
GlcNAcjMan,- 1 0,3+ \. 1282.9 
1277.9 

GlcNAc2Man2>3+ "- ' 

12712 
GIcNAc2Man,-10,3+ 
1223.6 



GlcNAc2Man3-20,3H 




1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 

ml: 



100: 
90^ 
80 

70 i 
60 ^ 
50 
40 
30 
20 
10-3 



GlcNAC2,3+ 



GlcNAc,3+ 




GlcNAc2,2+ 



1000 1100 1200 



1300 1400 1500 
miz 



1996.2 



1600 1700 1800 1900 2000 



图 10.23 Gl'- GlcNAc2Man 卜 3 及 其氧化 产物的 质谱图 a 及 
Gl '-GlcNAc2Mans-20 的 MS/MS 质谱图 b 



§ . 一+ 



198 



在经过 6h 的 a- 甘露糖 昔酶处 理后, 糖肽 G1 转化 为糖肽 Gl' (其中 的糖链 结构由 
GlcNAc2Man« 转化为 GlcNAc2Man 卜 3)。 这 也是高 甘露糖 型结构 的一个 佐证。 图 10.23 
中分 别表示 了糖肽 Gl' 的 带电荷 情况和 Gr-20 的 MS/MS 情况。 

五、 蛋白质 混合物 的毛细 管等电 聚焦- 质谱联 用分析 

(-) 标准 蛋白混 合物的 CIEF /MS 分析 

首 先用细 胞色素 C 、肌红 蛋白和 (3 -乳 球蛋白 A 的 混合物 试验了 CIEF/MS 系 统的性 
能。 样品为 两性 电解质 pH3.5〜10, 细 胞色素 C 0.125mg/ml ,肌 红蛋白 
0.03mg/ml,(3- 乳 球蛋白 A0.15mg/ml。 聚焦 电流开 始时为 4. 5/^ ,聚 焦完成 时变为 
1.2;xA。 图 10.24 为 CIEF/MS 的 base peak 图谱。 由图 谱可以 看到, 这三 种蛋白 质的聚 
焦效果 极好, 出 峰时间 均仅在 Imin 左右, 这也 是对等 电点非 常接近 的混合 物中的 各种物 
质进行 分辨的 基础。 另外, 非常有 趣的是 ,这三 种蛋白 质均被 各自分 辨出两 种亚型 (电荷 
分布和 分子质 量几乎 完全一 样), 且它们 之间的 等电点 差异都 很小。 细 胞色素 C 和 肌红蛋 
白在等 电聚焦 条件下 可以被 分辨出 两种亚 型是有 报道的 , 而 (3 -乳 球蛋白 A 的 亚型则 
未见 报道。 

细 胞色素 C 的 已知等 电点为 9. 6 [2 1、 肌 红蛋白 的两个 已知等 电点为 7.2 和 6.8 [2 1 ] , 
|3 -乳 球蛋白 A 的已 知等 电点为 5.1 [79] 。 用它们 各自的 出峰时 间对其 等电点 作线性 回归, 
即 可获得 CIEF/MS 的工作 曲线。 因为 实验中 所采用 的条带 移动方 法是阳 极电解 质替换 
结合重 力移动 的方法 ,这种 方法本 身的移 动速度 并不是 线性的 ,但 在小的 pH 范围 内可以 
保 持良好 的线性 关系。 根据在 pH5〜7 和 pH6.5〜10 范围 的工作 曲线, 可 以方便 地得出 
细 胞色素 C 的两种 亚型的 等电点 分别为 9.60 和 9. 55; 肌红蛋 白的两 种亚型 的等电 点分别 
为 7.20 和 6.79;p- 乳 球蛋白 A 的两种 亚型的 等电点 分别为 5.10 和 4.51。 对这 些亚型 
的分析 情况总 结在表 10.2 中。 





细 胞色素 c2 




10 15 20 25 30 35 40 45 
t/m'm 



图 10.24 用 CIEF/ESI.MS 方法 分析细 胞色素 c 、肌红 蛋白和 
P- 乳 球蛋白 A 的混 合物 (Pharmalyte 3.5~10) 



199 



表 10.2 用 CEEF-ESI-MS 方法 分析细 胞色素 c 、肌红 蛋白和 P- 乳 球蛋白 A 的混 合物 



蛋白质 


保 留时间 /min 


理论分 子质量 /Da 


观测分 子质量 /Da 


等电点 


相 对含量 /% 


细 胞色素 cl 


6.50 


12359.3 


12362.0 


9.60 


75.7 


细 胞色素 c2 


7.41 


12359.3 


12363.0 


9.55 


24.3 


肌 红蛋白 1 


48.29 


16951.5 


16952.0 


7.20 


80.7 


肌 红蛋白 2 


50.80 


16951.5 


16953.0 


6.79 


19.3 


P -乳 球蛋白 A1 


61.14 


18367.3 


18364.0 


5.10 


90.2 


P- 乳 球蛋白 A2 


64.76 


18367.3 


18364.0 


4.51 


9.8 



用 同样的 方法分 析了细 胞色素 C ,肌 红蛋 白和碳 酸肝酶 n (pJ 二 5. 9) 的 混合物 (图 
10.25)。 根据 pH5.5〜7. 5 范围内 的工作 曲线, 可 以得出 来自碳 酸軒酶 n 中的两 种小分 
子杂质 Ml 和 M2 的 等电点 分别为 6.15 和 5.55。 另外, 碳 酸肝酶 n 在实 验中的 
CIEF/ESI-MS^ 件下离 子化非 常好, 在 m/z 1 100〜2 000 范围 内找到 了它的 + 15〜 + 26 

离子。 有趣 的是, 碳 酸肝酶 n 并没 有亚型 存在。 



100, 



49.29 



肌 红蛋白 1 



细 胞色素 cl 

6.56^ 

细 胞色素 c2 
一 7.34 

XZ 



肌 红蛋白 2 



碳 酸軒薄 n 




iTrrrri 



10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 
//min 



图 10.25 用 CIEF/MS 方法 分析细 胞色素 C 、肌 红蛋 白和碳 酸酐酶 n 的 混合物 

(Ml 和 M2 是来 自碳 酸酐酶 n 中的 杂质) 



(二) 血 红蛋白 变种的 CIEF /MS 分析 

图 10 . 26 中 显示了 分别用 pH 3 . 5 〜 10 和 pH 5 ~ 8 的 两性电 解质对 HbS 和 HbA 混合 
物的 CIEF/MS 结果。 尽管 仅仅从 base peak 图谱看 起来它 们的分 离度并 不好, 但 是通过 
EIM 方法对 HbS 和 HbA 进 行分别 的监测 (选择 HbA 的 (3 链的 + 12 离子, m/z = 
1 323. 4; 对于 HbS ,则 选择其 (3 链的 + 12 离子, m/z= 1 320. 9) 时则可 发现, 这主要 是因为 
它 们各自 还有三 种彼此 之间等 电点非 常接近 的亚型 的缘故 (图 10.26a) ,各 种亚型 之间的 
分离 度是很 好的。 在用 pH 梯度 更窄的 两性电 解质进 行等电 聚焦时 (图 10.26b), 各种亚 
型之间 的分离 度还可 以得到 提高。 进 一步对 每一种 亚型进 行分析 发现, HbS 的三 种亚型 
的 电荷分 布情况 和分子 质量几 乎完全 一样; HbA 的三 种亚型 的电荷 分布情 况和分 子质量 
. 200 . 



也几乎 完全一 样< 



.—39.24 



Base Peak 




100-1 




100 



j HbS 


— 3〜 


mlz=\ 320.9 




36.09 






^ 1 38.9. 


》\ 


: HbA 


HbA2 1 


Hb A3 




HbAl 35.70j 


mlz=\ 323.4 




32.95 f\ 





20 



25 



30 



35 40 
f/min 



45 



50 



图 10 . 26 用 CIEF/MS 方 法分析 HbS 和 HbA 的 混合物 
a . Pharmalyte 3 . 5 ~ 10 ; b . Pharmalyte 5 〜 8 

为了 确定这 些血红 蛋白变 种的亚 型的等 电点, 需 要加人 标准蛋 白与之 共同进 行等电 
聚焦, 然后从 工作曲 线得出 它们对 应的等 电点。 图 10.27 是血红 蛋白变 种与细 胞色素 C 
及 肌红蛋 白的混 合物的 CIEF/MS 图谱, 图 10.28 是经 线性回 归得出 的工作 曲线。 表 
10.3 总结 了这些 血红蛋 白变种 的亚型 的等电 点及它 们各自 的相对 含量。 对于这 些血红 
蛋白的 亚型的 分辨还 未见任 何文献 报道。 

本节 的研究 中采用 LPA 涂层的 毛细管 来消除 电渗流 带来的 影响; 用移 动阳极 电解质 
替换结 合重力 影响的 方法来 进行样 品条带 的移动 ;用 活动式 毛细管 位置调 整的方 法来实 
现 CIEF 与 ESI-MS 的在线 联用; 用较长 的毛细 管来进 行等电 聚焦。 所有这 些技术 和材料 
的使用 所带来 的结果 就是: 超 高的等 电点分 辨率。 对 于其他 的一般 方法所 无法分 辨的等 
电点微 小差异 (如 ApJ<0.05), 可 以比较 容易地 区分。 如尽管 HbA2 和 HbA3 亚 型之间 
的等 电点差 异只有 0.04, 还是可 以通过 CIEF/MS 得 到近乎 基线的 分辨。 



201 



100, 



肌 红蛋白 1 

49.78 



细 胞色素 cl 

7 ); 2 细 胞色素 c2 
丄7." 



49.1 7-, 
47.98 
46.64 



'.17 



Base Peak 

肌 红蛋白 2 

L 52.38 
L. 



100, 



lOOn 



48.86 







HbS3 


HbS 


Hb S2 






HbSl 


/w/z= 1320.9 






46.57 J 






图 10.27 用 CIEF/MS 方 法分析 HbS、HbA 、细 胞色素 c 和肌红 蛋白的 混合物 (Pharmalyte3.5~10) 



"S. 



10.0, 
9.5- 
9.0- 
8.5- 
8.0- 
7.5- 
7.0- 
6.5 



/ =0.9967 







10 



20 30 
//min 



40 



50 



60 



图 10.28 pH6.5~10 范围 中的线 性回归 
表 10.3 用 CIEF-ESI-MS 方 法分析 HbS 和 Hb A 的 混合物 (PhaiTnalyTe3.5~10) 



蛋白质 



保 留时间 
/min 



理论分 子质量 /Da 



观测分 子质量 /Da 



a 链 



P 链 



a 链 



P 链 



等电点 



相 对含量 
/% 



HbSl 


46 


57 


15126.4 


15837.2 


15127.0 


15838.0 




26 


10 


70 


HbS2 


47 


92 


15126.4 


15837.2 


15128.0 


15837.0 




18 


42 


17 


HbS3 


48 


86 


15126.4 


15837.2 


15128.0 


15838.0 




13 


47 


13 


Hb Al 


48 


20 


15126.4 


15867.2 


15128.0 


15868.0 




17 


16 


39 


Hb A2 


49 


12 


15126.4 


15867.2 


15128.0 


15867.0 




11 


50 


36 


Hb A3 


49 


88 


15126.4 


15867.2 


15128.0 


15868.0 




07 


33 


25 



用于 CIEF/MS 分 析的样 品的制 备比较 简单, 只需要 将蛋白 质溶于 的两性 电解质 
水 溶液中 即可。 当然, 盐 分较多 的样品 (如 生理 样品) 必 须经过 脱盐的 步骤, 否则分 辨率将 
有不同 程度的 下降。 另外, 蛋白 质的浓 度不能 太大, 一般宜 <0.2mg/ml ,因为 CIEF 方法 
. 202 . 



本身 就有条 带浓缩 的效果 ,太多 的样品 不仅对 分辨率 有很大 的影响 , 而且还 非常容 易造成 
毛 细管的 堵塞。 

在超高 分辨率 条件下 ,采用 CIEF/MS 对 蛋白质 混合物 进行分 析还发 现了另 外一个 
非常 有趣的 现象, 即 多种蛋 白质在 CIEF/MS 分析中 都发现 有不同 的亚型 存在。 对于这 
种电 荷分布 情况和 分子质 量完全 相同的 亚型的 存在, 目 前还没 有一种 确切的 解释。 

. 第五节 展 望 

CE/MS 联用 技术从 1987 年问世 以来, 虽然时 间不长 ,但 无论在 技术上 还是应 用上都 
已经 获得了 长足的 进步。 样品 处理、 CE 分离、 接口、 MS 检测 等环节 的每一 次技术 发展和 
创新, 都会给 生物学 家和生 化学家 们带来 惊喜, 同时也 进一步 拓宽和 加深了 CE/MS 在这 
些领 域中的 应用; 而人们 在应用 CE/MS 作各 种研究 的时候 所发现 的问题 和提出 的改进 
设想又 可能对 CE/MS 技 术本身 的发展 产生不 可估量 的推动 作用。 

CE 是目 前为止 分辨率 最高的 一维分 离技术 ,而 MS 则是目 前 最灵敏 的检测 技术, 而 
且 MS 还能提 供丰富 而精确 的结构 信息, 这二者 的结合 所产生 的巨大 能量是 可以想 像的。 
在 线预浓 缩方法 的产生 解决了 CE 上样 量小的 问题; 各种高 效率接 口的研 制和应 用极大 
程度地 提高了 CE 向 MS 的离 子转移 效率; 多种 CE 分 离形式 为不同 物质的 分析提 供了极 
大的自 由度; 各 种新型 MS 仪 器的不 断发展 解决了 CE 的" 后顾之 忧"。 所 有的这 一切令 
我 们不难 相信, CE/MS 将成 为高精 度和微 量分析 中不可 或缺的 技术。 

质谱仪 器的发 展还将 进一步 朝着高 灵敏度 、高精 确度、 高 分析速 度和更 强的多 级质谱 
能力 等方向 发展。 今后小 型化的 IT-MS 将成 为一般 生物学 实验室 的常用 仪器, 因 为其简 
单及 操作易 用性可 以广为 生物学 家们所 接受; 而 FTICR-MS 及 Q-TOF-MS 等高端 质谱仪 
器将 在更加 艰难和 复杂的 分析任 务中显 示它们 的不凡 实力。 另外, ACE/MS 技术 还具有 
很大的 潜力, 若 能结合 MFD 设备作 进一步 的发展 ,利用 多功能 "CE 芯片" 与 MS 联用进 
行高通 量大规 模自动 化临床 和药物 分析将 不再是 梦想。 而 最近出 现的高 分辨率 
CIEF4£SI-FTICR-MSS 术 使我们 看到了 CE/MS 方 法在蛋 白质组 分析方 面的巨 大潜力 
和优势 ,若 相应的 数据处 理技术 和数据 库搜索 的计算 机算法 能得到 更快的 发展, 它 必将受 
到蛋 白质组 研究者 的更加 广泛的 关注和 应用。 不妨 让我们 作一个 大胆的 设想: 若干 年后, 
完全 自 动化的 整合型 CE/MS 仪器 将出现 在普通 的生物 学实验 室里。 

(刘 

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207 



第 十一章 毛细管 电泳在 蛋白质 磷酸化 
和 糖基化 分析中 的应用 

蛋白质 翻译后 修饰是 影响蛋 白质结 构和功 能的重 要因素 ,在生 物化学 途径的 调控中 
起关键 作用。 而蛋白 质磷酸 化和糖 基化为 最常见 的两种 翻译后 修饰, 分析 鉴定蛋 白质磯 
酸 化和糖 基化是 阐明他 们如何 调控生 命活动 的重要 环节。 目 前已有 许多方 法手段 分析鉴 

定 这两种 蛋白质 修饰。 在本章 ,我 们只讨 论毛细 管电泳 (CE) 方法, 并且重 点介绍 我们实 

验室 的一些 工作。 

、 第一节 毛 细管电 泳分析 多肽和 蛋白质 磷酸化 

一、 简 介 

蛋白 质可逆 磯酸化 是最普 遍最重 要的一 种蛋白 质翻译 后修饰 (PTM)。 在哺 乳细胞 
中 大约有 1/3 的蛋 白质被 认为是 磯酸化 修饰的 [ 1 ] 。 蛋 白质可 逆憐酸 化在胞 外信息 传递到 
核内, 细胞 生长、 分裂、 分化、 代谢 和癌症 的产生 等生命 活动过 程中起 着关键 的作用 [ 卜 3] , 
对众多 蛋白质 生物化 学功能 担负开 / 关调控 责任, 它是一 种普遍 的调控 机制。 当调 控蛋白 
质或 酶被特 定的蛋 白激酶 在特定 位点上 磯酸化 , 该蛋 白质 或酶就 被激活 , 或 被抑制 , 或被 
标记上 了其他 调节因 子作用 的靶记 号 [4] 。 估 计细胞 内大约 90% 的 碟酸化 出现在 丝氨酸 
残基, 9. 9% 出现在 苏氨酸 残基, 0. 10/。 在酪氨 酸残基 [5 ' 6] 。 然而, 目 前仅有 有限的 憐酸化 
蛋白是 已知的 ,而且 许多涉 及蛋白 磯酸化 激酶和 憐酸酯 酶的专 一性, 亦即它 们的蛋 白质底 
物仍不 清楚。 其主 要原因 之一是 蛋白质 磯酸化 分析一 直是一 个技术 挑战。 虽然 Edman 
降 解氨基 酸序列 自 动分 析技术 目 前已十 分成熟 , 但由 于抽提 氨基酸 PTH 衍 生物的 有机溶 
剂不能 有效抽 提亲水 的磯酸 氨基酸 PTH 衍生物 ,因此 采用当 前的蛋 白质测 序标准 步骤不 
能 分析憐 酸氨基 酸及其 位点。 而且, 至 今没有 一个改 进的自 动测序 方法对 3 种主 要的憐 
酸氨 基酸, 即憐酸 丝氨酸 (pSer) 、磯酸 苏氨酸 (pThr) 和磯酸 酪氨酸 (pTyr) (图 11.1) 鉴定 
都 通用。 传 统的方 法是在 体外用 纯化的 蛋白激 酶标记 放射性 32 P 于 所研究 的蛋白 质或在 
体内作 32 P 代谢标 记细胞 ,然后 酶解标 记的蛋 白质, 分 离磯酸 化肽, 最后结 合磯酸 氨基酸 
分析 和手工 Edman 降解氨 基酸序 列分析 ,在每 一测序 循环检 测放射 性丢失 ,鉴定 憐酸氨 
基酸 残基和 位点。 Meyer 等用 气相蛋 白质顺 序仪固 相非放 射法分 析磯酸 酪氨酸 [7] 。 但是 
由 于憐酸 酪氨酸 PTH 衍生物 在反相 HPLC 柱上出 峰很宽 ,且峰 只比基 线稍高 一些, 难以 
得到 肯定的 鉴定。 为此, 他们用 毛细管 电泳进 一步验 证序列 仪反相 柱流出 液中是 否存在 
磯酸 酪氨酸 PTH 衍 生物。 我们 报道了 一种有 效的毛 细管电 泳方法 [8] , 可 以在低 pmol 范 
围同 时非放 射分析 3 种常见 PTH- 碟酸氨 基酸, 进而 可分析 蛋白质 或多肽 中的磔 酸氨基 
酸。 还可用 此方法 侦测碟 酸化蛋 白酶解 产物中 碟酸化 肽段。 



35 



H 



HzC— O— PC^- 

3N+ — C 一 OOO— 
I 

H 



HjC— C— O— PC^- 

H3N+— c— cocr 

H 

phosphothreonine ( pThr) 



phosphoserine( pSer) 

H2C- 

I 

H3N+ — C— COO— 
H 

phosphotyrosine( pTyr) 

图 11.1 常见 3 种磔 酸氨基 酸结构 



二、 材 料 

®L - 磷酸丝 氨酸丄 -憐 酸苏 氨酸、 L -憐酸 酪氨酸 、牛 (3- 酪蛋白 、卵 黄高憐 蛋白。 顺 
序级 苯异硫 氰酸酯 (PITC) 、乙腈 、三 氟乙酸 和乙酸 乙酯为 ABKApplied Biosystems) 公司 
的 产品。 

② 七肽 Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly ( Kemptide) 、 六 肽 Lys-Arg-Thr-Leu-Arg-Arg 
(hexapeptide) 、蛋 白激酶 A 催化亚 基和蛋 白激酶 C 均为 Sigma 公司 产品。 含磯酸 酪氨酸 
残基的 合成肽 ( phosphorylated hendecapeptide ) Glu- Asp- Asn-Glu- Tyr ( PO3 H ) -Thr-Ala-Arg- 
Gln-Gly-Ala 由 意大利 Lorenzo A. Pinna 教授 赠送。 

③ 丝 氨酸憐 酸化肽 Leu-Arg- Arg- Ala-Ser(P03H)-Leu-Gly(kemptide-P) 和苏氨 酸碟酸 
化肽 Lys-Arg-Thr(P03H)-Leu-Arg-Arg(hexapeptide- P) 为本实 验室分 别用蛋 白激酶 A 催 
化亚 基和蛋 白激酶 C 催化 憐酸化 相应底 物肽, 然后用 HPLC 纯化 而得。 

三、 方 法 

(1) 部分 酸水解 

水 解和衍 生均在 Waters Pico. Tag Work Station 上 进行。 蛋 白或多 肽样品 先吸入 
5mmX50mm 硼硅酸 玻璃管 底部, 然后 将玻璃 管放入 水解反 应瓶, 真空 抽干。 吸 250/^1 
5.7mol/L 恒 沸盐酸 (含 1% 重蒸 苯酷) 于 反应瓶 底部。 小心抽 气至盐 酸溶液 开始冒 气泡, 

关闭真 空阔, 打开 高纯氮 气闽充 氮气。 如此 重复两 次后, 密封反 应瓶, 放入 uot: 反应签 

中, 水解 1.5h。 取出冷 至室温 ,高 真空下 抽干。 

(2) PTH 衍 生反应 

磯酸 氨基酸 PTH 衍生 反应基 本按照 Meyer 方法 [7 3 。 

条 件溶液 1: 以 体积比 2:2:1 混合 乙醇、 三乙胺 和水; 

条 件溶液 2: 以 体积比 8: 1 : 1 混合 乙醇、 三乙胺 和水; 

衍 生溶液 :以 体积比 7 : 1 : 1 : 1 混合 乙醇、 三乙胺 、水和 PITC。 

衍生 步骤: 

①加 10^1 条 件溶液 1 于部 分酸水 解后抽 干的样 品管, 稍后 高真空 下抽干 (真 空度小 

. 209 . 



于 0.04mbar)。 重复 此步骤 一次。 

② 加 1(V1 条 件溶液 2 ,充高 纯氮。 密封反 应瓶后 ,室 温放置 5min。 

③ 加 1(V1 衍生 溶液, 充高 纯氮, 50t: 下保温 5mm。 高真空 下抽干 (真空 度小于 
0.04mbar)o 

④ 加 5(^1 乙酸 乙酯, 轻轻 旋转样 品管, 然后倒 出乙酸 乙酷。 稍微抽 干后, 重复 该洗漆 步骤。 
©加50;^20% 三氟 乙酸, 充高 纯氮。 密 封反应 瓶后, 501: 下保温 30min。 高 真空下 抽干。 

(3) 毛 细管电 泳分析 PTH-^ 酸 氣基酸 

将 PTH 衍生 物溶于 20 96 乙腈, O.io/o 三氟 乙酸, 25mmol/LNaa 样品溶 液中。 毛细 
管为 熔融石 英管, 总长 72cm ,有 效长度 (进 样端至 检测器 )50cm ,内径 5(Vm; 电 泳缓冲 
液 : 25mmol/L NaHsKVHsPOd , pH2 . 5 , 15mmol/L NaCl ;电压 : - 22kV; 电 压极性 :负; 检 
测波长 :261nm; 毛 细管恒 温温度 : (30 ± .2)1: 。 



四、 结果 和讨论 
1. 毛 细管电 泳分离 PTH- 憐酸 氨基酸 



在 pH2. 5 的电泳 缓冲溶 液中, 所有这 



+ 



^©PTH-pSer 
斧 ©PTH-pThr 
-^©PTH-pTyr 



PTH-AA® + PTH-AA®-»> 
PTH-AA®-^ 
PTH-AA ①+ 



EOF 



t 



uv 



图 11.2 毛 细管电 泳分析 
PTH- 憐酸 氨基酸 示意图 

磯酸 氨基酸 (pSer、 pThr 和 pTyr) 的 PTH 衍生物 毛细管 电泳分 离图。 



I 种 PTH- 磯酸 氨基酸 都带负 电荷, 而其他 
PTH- 氨 基酸带 正电荷 或不带 电荷。 当施加 
一负相 电压时 ,只有 PTH -磯酸 氨基酸 逆电渗 
流方向 迁移, 通 过检测 器而被 检测, 而其他 
PTH- 氨基酸 顺电渗 流方向 迁移, 不 会通过 
检测器 (图 11.2)。 因此, 这种 磯酸氨 基酸分 
析 方法的 选择性 较高。 图 11.3 为三 种常见 



PTH-TYR-P 



PTH-THR-P 



PTH-SER-P 




10 



15 20 
//min 



25 



30 



10 



15 

r/min 



20 



25 



图 11.3 毛 细管电 泳分离 PTH- 磯酸 氨基酸 
磷酸丝 氣酸、 酸苏 氨酸和 碟酸酪 氨酸各 2nmol 混合, 
用 PITC 衍生。 衍生 物溶于 20pl 样 品溶解 液中, 真空进 
样 2s (约 7nl) 。 条件 : 培 融石英 毛细管 , 总长 72cm, 有效 
长 度 50cm, 内 径 5(Vm; 电泳缓 冲液: 25nimol/L 
NaH2P04-H3P04 , 15mmol/L NaCl, pH2.5; 电泳 电压: 
- 22kV; 检测 波长: 261nm 



图 11.4 间 隙进样 技术同 时分析 
不 同浓度 PTH- 憐酸 酪氣酸 
碟酸 酪氧酸 1, 2, 3, 4 和 5nnxJ, 分别用 PITC 衍生。 衍 
生物分 别溶于 40jJ 样 品溶解 液中。 每一 样品真 空进样 
2so 进样 方法: 进样 第一号 样品一 电泳 2min— 停止电 
泳— 进样 第二号 样品— 电泳 2min~^ 停止 电泳— …… 一进 
样 第五号 样品一 电泳并 记录电 泳图。 其余条 件同图 11.3 



210 



2. 定量 分析磷 酸氨基 酸的线 性关系 

利 用毛细 管电泳 间隙进 样技术 可以一 次同时 电泳同 一种磷 酸氨基 酸但不 同浓度 
的 PTH 衍生物 ,这 样既快 速又准 确地获 得定量 关系。 图 11.4 是采 用该间 隙进样 技术, 同 
时电泳 5 个浓度 的磯酸 酪氨酸 PTH 衍生物 的电泳 图谱。 上述 3 种磯酸 氨基酸 的浓度 
(25〜250;imol/L 范围) 与其 PTH 衍生 物毛细 管电泳 UV 吸 收峰高 一次线 性回归 曲线的 
线性相 关系数 均大于 0.992U=6)。 磯酸酪 氨酸、 憐 酸苏氨 酸和憐 酸丝氨 酸的质 量检测 
限 分别为 170fmol、 350fmol 和 700fmoK 指吸人 毛细管 的绝对 量)。 

3. 多 肽及蛋 白质中 憐酸化 氨基酸 的分析 

当 2nmol Kemptide-P 经 1 . 5h 酸水解 , 用 PITC 衍生后 , CE 分 析证实 Kemptide- P 为 
丝 氨酸碟 酸化肽 (图 11.5a)。 图 11.5b 和图 11.5c 

分别 是对憐 酸化肽 hexapeptide-P 和 憐酸化 十一肽 二, 比 ,,., ,、 - ], ., 

分析 结果, 证实 他们分 别含磯 酸苏氨 酸残基 和憐酸 ••'',''," • ' ' " 
酷氨酸 残基。 牛 P -酪蛋 白是 天然的 磯酸化 蛋白, ^M^tM I^^MI n iiV'ifUrill/'M'j'iV' 
有 209 个 氨基酸 残基, 其中有 5 个丝 氨酸残 基被磯 C I 
酸化。 约 Inmol 牛 (3- 酪蛋白 直接经 酸水解 1.5h 衍 【u. ',",f"' ,'tjr,' \\ j.ft ' r" 
生。 毛 细管电 泳分析 证实它 是丝氨 酸磯酸 化蛋白 d 1 
(图 11.5d)。 鸡卵 黄高憐 蛋白有 271 个氨 基酸残 ', if^.i /Jv^HPfrt'^.--^ 
基, 是 磯酸化 程度最 高的天 然憐酸 化蛋白 之一, e 
10% 的残 基被碟 酸化。 毛细 管电泳 分析显 示它含 » ^ ,' 1, I f'i ' V 
磯 酸丝氨 酸残基 (图 11.5e)。 f 

水 解条件 是分析 憐酸化 肽和磷 酸化蛋 白的最 -. 

关 键,。 截# ^德據 T,l 翻 M 雄 ^^^^" ^" '1 '"— " " 納 

的水解 回收率 对于不 同的肽 或蛋白 质是不 同的。 g 
磯酸丝 氨酸的 回收率 尤其依 赖于肽 的序列 而 
且 磯酸丝 氨酸对 强酸的 敏感性 (指 发生 (3- 消除或 

磷酸酯 水解) 高于 磯酸苏 氨酸和 磷酸酪 氨酸, 这使 'fl|h'0'.^"|.yii. ,||f^ , fUkl^Hi *h、i , 

得 对其分 析尤为 困难。 对大 多数憐 酸化肽 来说, 通 e — ; — ro ~~ ^5 ~~ 7o S ~~ 

常水解 l〜3h 可 得到较 好的碟 酸化氨 基酸回 收率。 "min 

对 于特定 的憐酸 化蛋白 或磯酸 化肽, 欲获得 最大的 图 II. 5 CE 分析肽 或蛋白 质中! ^酸 氨基酸 

憐酸氨 基酸回 收率, 需要 优化水 解条件 (温度 、时间 《geM#5^as?7jciM'5h„ ^mj-^m 

, 、化 二-上 , 1^ PITC 衍生。 PTH 衍生物 溶解于 5m1 样 品溶解 
和酸浓 度)。 分析蛋 白质中 g 酸氨 基酸, 也 可先用 液中 (除图 11.5E 外)。 a.2nmol 含 Kenpude- 
测序级 的高纯 度蛋白 水解酶 将待分 析的蛋 白质降 p, 进样 5s; b.2nmol hexapeptide^P ,进样 4s; 
解成肽 ,然 后对肽 混合物 进行酸 水解。 这样 磯酸氨 c.lnmol 含碟酸 酷氨酸 十一肽 ,进样 Is; 
基酸回 收率有 可能高 于直接 酸水解 待分析 的蛋白 d.lnmoip- 酪蛋白 ,进样 2 s;e.0. 5 nmol 卵黄高 

质。 这时, 为排 除蛋白 水解酶 样品含 有的杂 质蛋白 ^^蛋白'衍生物溶于10(¥样品溶解液中,进样 

Br*:i:^^/l TEr^ 且*7/««1_«_11"— 1八 □ A1 -。„_^^^25丄100产1/1^?714-碟酸丝氨酸标准'进样 
i^^fbgfi'ft^MXt 照 $^。 ^ 夕卜, 戶 2s;g. 样品 E 和 lOOpol/LPTH- 憐酸 丝氨酸 
白水解 酶还应 当不含 磯酸酯 酶杂质 蛋白。 标准 各进样 2s。 其余条 件同图 11.3 

. 211 • 



i 

丄 



丄 



第二节 毛细管 电泳分 析单糖 和寡糖 



、 简 介 



治疗疾 病用的 一系列 重组糖 蛋白如 重组促 红细胞 生成素 (rEPO) 、重组 组织纤 溶酶原 
激活物 (rt-PA) 等在临 床的成 功应用 ,以及 其他药 用重组 糖蛋白 的研发 ,日 益激发 人们对 
糖蛋 白中糖 部分的 性质的 关注和 兴趣。 愈来愈 多的证 据表明 这些寡 糖链的 组成和 结构影 
响糖蛋 白的特 性和生 物活性 ,糖基 化在细 胞识别 和免疫 应答中 起重要 作用。 图 11.6 给出 
在糖蛋 白和蛋 白聚糖 中常出 现的单 糖及其 结构。 糖 蛋白中 的寡糖 链就是 这些单 糖通过 



己糖 



己糖胺 



脱氧 己糖 



己 糖醛酸 



唾液酸 




CHjOH 



CH,OH 



HO, 

OH 

£>- 葡萄糖 (Glc) 



HO'— ^ 



OH 




OH 



D- 甘露糖 (Man) 



OH 

D- 半乳糖 (Gal) 



CHjOH 

/oh V- oh 

HoNL-y 

NHCOCH3 
乙酸. -葡 萄糖胺 
(GlcNAc) 




NHCOCH3 
D- 乙酷半 乳糖胺 
(GalNAc) 




OH 

丄- 岩藻糖 (Fuc) 





OH "OH 

HO、 

OH 

£ -艾杜 糖酸酸 (IdoA) 




戊糖 



乙酰甘 露糖胺 丙酮酸 (Neu5 Ac) 
-Q 

OH 




5-N- 轻乙 St 唾液酸 (Neu5Gc) 
HOCH2J 



OH 

O- 木糖 (Xyl) 
(吡喃 糖苷) 




A- 阿 拉伯糖 (Ara) 
(呋喃 糖苷) 



图 11.6 糖蛋白 或蛋白 聚糖中 的常见 单糖及 其结构 



212 



a- 或 糖苷键 以及不 同的支 链形式 连接成 结构复 杂的寡 聚物。 糖链经 iV- 糖苷 键与多 
肽的天 冬酰氨 残基侧 链连接 ,或经 -糖苷 键与多 肽的氨 基酸残 基的经 基连接 ,如 通常与 
丝氨 酸或苏 氨酸残 基侧链 上经基 连接, 有时 与经脯 氨酸或 经赖氨 酸残基 的经基 相连。 
N -糖 基修饰 几乎总 出现在 Asn-X-Ser/Thr 三 肽序列 (这里 X 为除 Pro 或 Asp 外的 任何氨 
基酸 残基) [11]; 相反, 对于 0- 糖基 修饰, 目前 还没鉴 定到类 似的糖 基转移 酶底物 识别序 
列。 一般 连接寡 糖分为 三大类 ,即 高甘露 糖型、 复 杂型、 杂合型 [11]。 图 11.7 对每一 
类 N -连 接寡糖 糖型列 举一个 代表性 例子。 从图 11 .7 可见, 这三类 N -连 接糖型 都有一 
个相同 的保守 的由五 元糖构 成的核 心结构 ,即 Manal— 3(Manal— 6)Man[31— 4GlcNAcpi 
— 4GlcNAc。 不同 iV- 连 接寡糖 链就是 在这五 元糖核 心结构 基础上 进行不 同的分 支和延 
伸而形 成的。 而与 N- 连接 寡糖链 相比, 0- 连接寡 糖链短 ,但 结构多 变化, 没有一 致的核 
心 结构为 0- 连接 寡糖共 同享有 [ 1 2] ,这使 0- 连接寡 糖链结 构的分 析更加 困难。 



糖分子 有两个 特性。 一是缺 乏常规 紫外吸 收基团 和荧光 基团, 只 在低紫 外波长 (如 
195nm) 范围 才有光 吸收; 二是除 酸性糖 (如唾 液酸、 葡萄糖 酸酸、 半 乳糖醛 酸和横 酸化修 
饰 糖等) 外, 糖 分子因 其经基 解离常 数极小 (10 — 11〜10—1 3 ), 是 非常弱 的酸, 只在强 碱条件 
下 (pH>12) 由于经 基的微 弱电离 [I 3 ] 而 带部分 电荷。 另外, 糖分子 能与硼 酸盐形 成带负 
电 荷的复 合物。 基于 第一个 特性, 检 测糖分 子的方 法分衍 生化法 和非衍 生化法 两类。 前 
者包 括紫外 [1 4 ~1 6 \ 荧光和 激光诱 导荧光 检测法 「I 7 , IS]; 后者包 括直接 紫外法 [i 9 , 2 G]、 间接 
紫外法 [ 2 1 ] 、间接 荧光法 [ 22] 、化学 检测法 [23] 和折射 法等。 基于 第二个 特性, 可以用 硼酸盐 
或 高碱性 (如 NaOH) 缓冲 液为毛 细管电 泳液, 使不同 结构的 糖分子 具有不 同的电 迁移率 
而得以 分离。 当然, 若衍 生试剂 本身带 电荷, 那 么衍生 化不仅 为糖分 子提供 紫外吸 收基团 
或荧光 基团, 同时 还提供 电迁移 必要的 电荷, 因 而电泳 缓冲液 不必局 限于硼 酸盐或 强碱性 
(如 NaOH) 溶液。 

目前, 有 三种化 学衍生 方法衍 生糖化 合物。 最常见 的是还 原胺化 法 [ 1 4 ~1 6 ], 以及 1- 
苯基- 3- 甲基- 5- 吡吨酮 (l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP) 缩合法 [24] 和羧基 化糖与 
胺缩合 法 [25] 。 图 11.8 列出了 常用的 糖分子 衍生剂 ,紫 外检测 波长, 激光诱 导荧光 检测的 
激发波 长和发 射波长 以及有 关的部 分参考 文献。 图 11.9 显示 了还原 单糖与 AMAC 还原 
胺化 的反应 历程。 还原糖 的醛基 与衍生 试剂的 氨基反 应形成 Schiff 碱。 Schiff 碱 的形成 




图 11.7 糖 蛋白中 连接寡 糖分类 



是动 力学快 速平衡 反应, 但 热力学 不利。 因 此用硼 氰氣化 钠不断 地还原 平衡反 应产物 

Schiff 碱, 迫使 衍生反 应进行 完全, 形成 稳定的 二级胺 [37]。 还 原反应 可能是 该衍生 反应的 
总限 速步骤 [37]。 为 使反应 完全, 并避免 二级胺 进一步 与酵基 反应, 反应体 系中应 有至少 
5 倍 过量的 衍生试 剂存在 [38]。 

从糖蛋 白 释 放单糖 的常用 方法是 酸水解 。 也可 用一系 列 的针对 某一单 糖残基 及其连 
接于 糖链上 的方式 (如 a- 或 糖 苷键, 1,3 或 1,4 连接, 等等) 专一 的外切 糖昔水 解酶从 

糖 链的非 还原端 逐步切 除单糖 [39' 40、 酸水解 主要用 于糖蛋 白的单 糖组成 分析, 而 外切糖 
昔水 解酶法 主要用 于某一 寡糖的 糖序列 (结构 ) 分析。 释放 完整糖 链的方 法有碱 降解法 

(P- 消除反 应)、 肼解 法和内 切糖苷 水解酶 酶切法 fi2\ 用 N- 糖 苷水解 酶切除 iV- 连接寡 

糖链, 0- 糖 苷水解 酶切除 0- 连接 寡糖链 )。 如畢 选用肼 解法, 需要 对肼解 的产物 重乙酰 
化。 




AP 

(240 nm ) 



NH, 

[27】 

COOH 
p-Aminobenzoic acid 
(285 nm) 



[28】 



4-ABN (4-Aminobenzonitrile) 
(285 nm) 




[29-32] 



ANTS 

325/520nm He-Cd laser 
(223 nm) Ex*/Eni** 257/520nm Ar-ion laser 




■ [16, 33] 



AMAC 
(261nm) 




COOH 



CBQCA 
Ex/Em 457/552 nm Ar-ion laser 



[17, 34] 



•NH, 




[18, 35, 40] 



APTS 

Ex/Em 457/552 nm Ar-ion laser 



(CH3)2N 




[36】 



Ex/Em 543/580 nm He-Ne laser 



图 11.8 常见 糖分子 衍生剂 

Ex = Excitation; * * Em = Emission 



214 




图 11.9 还原 单糖与 AMAC 还原 胺化反 应历程 示意图 
表 11.1 列出分 别从完 整糖蛋 白和纯 化的寡 糖酸水 解释放 单糖的 通常条 件 [35 , 4 1 ] 。 
表 11.1 从 完整糖 蛋白和 纯化的 寡糖酸 水解释 放单糖 的条件 



单糖 完整 糖蛋白 纯化 的寡糖 

唾液酸 O.lmol/LTFA, sot; , 0.5〜lh 0. Imol/L TFA. 80t: . 0.5~lh 

中性糖 2mol/L TFA, lOOt: , 5h 2mol/L TFA, lOOr , l-3h 

氣基糖 4mol/L HCl. lOOr , 3h 4mol/L HCl, lOOtT , Ih 



对于 乙酰氨 基糖的 分析, 酸水 解后, 为了重 新得到 N- 乙酰 氨基葡 萄糖和 iV- 乙酰氨 
基半 乳糖, 也需要 进行重 乙酰化 反应。 进行稍 大规模 (对于 几毫克 到数十 毫克糖 蛋白分 
析) 重乙 酰化反 应及其 反应后 样品脱 盐可参 考本文 和文献 [17]; 而进行 小规模 (对 于几微 

克到数 十微克 糖蛋白 分析) 重乙酰 化反应 时 [ 1 8] ,用 5^d 25mmol/L (pH9.5) 碳酸盐 溶液将 





蛋白质 混合物 






(1) SDS-PAGE/2D-Gel 分离 

(2) 电 转移于 PVDF 膜上 

(3) 膜 上糖蛋 白染色 




糖蛋白 


非 糖蛋白 




(1) 割 下糖蛋 白条带 (点) 

(2) 0.1 mol/L,TFA,80°C,0.5~lh 



液相: 唾 液酸、 部分 岩藻糖 膜 


衍生 




(l)2mol/L TFA.lOOr.Sh 
, (2) 重 乙酷化 


毛 细管电 泳分析 




液相: 中性糖 (含部 分岩藻 糖)、 氧基糖 






, 衍生 




毛 细管电 泳分析 



图 U.10 毛 细管电 泳分析 PVDF 膜 上糖蛋 白中单 糖成分 流程图 

• 215 



酸水解 后单糖 混合物 冻干重 新溶解 , 加 2ptl 无水 乙 酸酐 , 室 温反应 30rnin 后, 冻干, 再经衍 
生反 应后, 直接 用毛细 管电泳 分析, 就可得 到较好 结果。 

如果 需要分 析混合 物中某 一糖蛋 白的糖 组成, 可用 SDS^PAGE 电泳 (对 于更 复杂的 
蛋白质 混合物 ,如 组织或 细胞的 蛋白抽 提物, 用 2-D Gel 电泳) 分离纯 化蛋白 ,电转 移分离 
的蛋 白质于 聚偏二 氟乙' 烯 (PVDF) 膜上, 运用 糖蛋白 染色法 [4 G~ 42] 检测膜 上糖蛋 白条带 

(点 )。 从平 行实验 得到的 另一张 经考马 斯亮蓝 染色的 PVDF 膜上 割下感 兴趣的 糖蛋白 
条带 (点) ,酸 水解释 放糖蛋 白中的 单糖。 最后, 用毛 细管电 泳分析 单糖衍 生物。 实 验流程 
见图 11.10。 

二、 材 料 

① 单糖: iV- 乙 酰氨基 半乳糖 (GalNAc) ,木糖 (Xyl) ,核糖 (Rib),iV- 乙 酰氨基 葡萄糖 
(GlcNAc), 葡萄糖 (Glc), 甘露糖 (Man) ,阿 拉伯糖 (Ara), 岩藻糖 (Fuc), 半乳糖 (Gal) ,葡萄 
糖酲酸 (GlcUA) ,半乳 糖酸酸 (GalUA) 和 5-N -乙 酰氨基 唾液酸 (Neu5Ac)。 

② 聚糖: 葡聚糖 (Dextran, 平均相 对分子 质量为 523 000)。 

③ 衍生剂 :2- 氨基 啶酮 (2- Aminoacridone, AMAC) ,8 - 氨基 萘基- 1,3,6- 三 磺酸盐 
( 8-aminonaphthalene- 1,3, 6-trisulfonate , ANTS) 。 

④ 糖 蛋白: 火鸡卵 白蛋白 (Sigma 产品 A5015) , 核糖 核酸酶 B, a, -酸性 糖蛋白 Ui- 
AGP) , 人尿胰 蛋白酶 抑制剂 ( hu-UTI ) ,重 组人促 红细胞 生成素 ( rhu-EPO) 。 

© 江浙 蝮蛇毒 蛋白: 江浙 蝮蛇毒 粗品经 硫酸铵 反透析 沉淀得 到蛇毒 蛋白混 合物。 
© 其他 试剂: 四 氛呋喃 (THF) ,二 甲亚砜 (DMSO) ,三 氟乙酸 (TFA) ,无水 乙酸軒 ,硼 
氰氢 化钠, 硼酸, 硼砂, 冰 乙酸。 

三、 方 法 

(1) 无水肼 的制备 

30g 80 % 肼, 150 g 甲 苯及 150 g 氧化 I? 在圆 底烧瓶 内混合 , 室温放 置过夜 。 混 合物在 
装 有氣氧 化钠干 燥管的 回流装 置回流 Ih 后, 蒸馏, 收集 93〜94t: 馏份。 甲 苯与无 水肼分 
层 , 收 集下层 无水肼 ,密封 ,置 410 暗 处保存 。 

(2) 糖蛋白 肼解幹 放完整 iV- 连 接寡糖 

将 1 〜2mg 糖蛋白 置于 安瓿瓶 , 加人 1ml 新 制无水 肼溶解 ,充高 纯氮, 封管 , loot 反 
应 8〜10h。 转 移肼解 产物于 1.5ml 的 Eppendorf 管, 离 心冷冻 干燥。 加 400/il 甲苯, 振 
荡, 离 心冷冻 干燥。 - 

(3) 酸 水解寡 糖及重 乙酰化 

转移肼 解后的 样品于 一洁净 安瓿瓶 ,溶于 1ml 2mol/L 三氟 乙酸, 充高 纯氮, 封管, 
loot: 水解 l〜3h。 离心 冷冻干 燥后, 加 1ml 饱和碳 酸氢钠 溶解, 加 KVl 无水乙 酸酐, 混 
匀, 反应 10min。 重复 3 次后, 将反 应物过 BioRad RG- 501-X8(H+ ) 柱, 用 5 倍床 体积的 
Milli-Q 水洗 脱柱。 合并流 出液和 洗脱液 ,离 心冷冻 干燥。 
. 216 . 



(4) 酸 水解释 放糖蛋 白中的 唾液酸 

分别取 Inmol ai-AGP,hu-UTI 和 rhu- EPO 于 3 只 0.5ml Eppendorf 管, 离心 冷冻干 
燥, 各加 10(V10.1mol/LTFA。 在 801C 水浴保 温反应 0.5 至 1 .Oh ,离 心冷冻 干燥。 

(5) 酸水 解释放 PVDF 膜上 糖蛋白 中单糖 

将 SDS^PAGE 分 离并电 转移至 PVDF 膜上 的蛋白 用考马 斯亮蓝 ( 0.1% R-250, 
50% 甲醇) 染色 3min ,然 后用 50% 甲醇, 10% 乙酸溶 液脱色 ,水洗 3〜4 次后, 晾干。 用洁 
净的剪 刀剪下 糖蛋白 条带, 并 将该条 带剪成 2〜3mm 宽, 长 0.5〜0.8cm 小 条带, 放入一 
只 . 5ml Eppendorf 管 , 加 200^tl . Imol/L TFA, 密封 , 置 801: 水 浴反应 40min。 将水解 
液 转移至 另一只 0.5ml Eppendorf 管, 再用 200/^1 水分两 次浸洗 PVDF 膜, 合并水 解液与 
浸洗液 ,离 心冷冻 干燥, 放置 -2010 待衍生 分析唾 液酸。 将 PVDF 膜小条 带转移 至一洁 
净 5cm X 5mm 硼硅酸 盐玻璃 水解管 底部, 加 20(^1 2mol/L TFA。 然 后将水 解管放 入水解 
瓶, 密闭水 解瓶, 置 loot: 反应釜 ,水解 4h。 冷至室 温后, 吸出水 解液入 0.5ml Eppendorf 
管 , 用 20(^1 水分两 次浸洗 PVDF 膜 , 合并水 解液与 浸洗液 , 离心冷 冻干燥 , 放置 - 20t: 待 
衍生 分析中 性糖。 

(6) 单糖 AMAC 衍生 

向已 冻干的 单糖样 品中加 5/^11 50mmol/L AMAC (溶于 HAc/DMSO, 3/17 ) 及 Sjixl 
l.Omol/LNaBHgCN (溶于 THF) ,振荡 ,稍 离心。 唾液酸 的衍生 反应条 件是在 55t: 水浴 
保 温反应 4h , 其他单 糖的衍 生反应 条件是 45t: 水浴保 温反应 5h。 反应 完毕后 , 离 心冷冻 
干燥, 加适 当体积 (50〜40(V1) 的 5096 DMSO/H2〇 溶解, 用毛细 管电泳 分析。 

(7) 寡聚 葡萄糖 混合物 的制备 及寡糖 ANTS 衍生 

置 0.2g 葡聚糖 (Dextran) 于一 安瓿瓶 底部, 加 1 .5ml 0. Imol/L HCl ,充 高纯氮 lmin, 
封管, 在 loot: 恒 温水解 4h。 离 心冷冻 干燥水 解产物 至干。 加 ImlMilU-Q 水, 振荡, 离心 
冷冻 干燥至 干以除 去酸, 得到 寡聚葡 萄糖混 合物。 取其 50mg 于 0.5ml Eppendorf 管, 加 
150/Lil 0.2mol/L ANTS (溶于 HAc/H2〇,3/17) ,200/Ltl l.Omol/L NaEHgCN (溶于 DMSO) , 
振荡, 密封, 置 401: 水 浴反应 15h。 取 5/il 用 Milli-Q 水 稀释至 40(^1 ,用 毛细 管电泳 分析。 

(8) 毛细管 电泳分 析单糖 AMAC 衍生物 

单糖 AMAC 衍生物 分离在 ABI 270A 型毛 细管电 泳仪上 进行。 使用未 涂层溶 融石英 
毛细管 ,总长 度及有 效长度 (进样 端到检 测器处 长度) 见图注 ,内径 5(Vm。 电泳缓 冲液为 
lOOmmol/L NazBj O7 , pHlO . 5 ( 用 NaOH 调 pH 值), 或 300mmol/L H3 BO3 , pHlO . 5 ( 用 
NaOH 调 pH 值)。 电泳 电压见 图注, 毛细管 恒温在 (30±0.2)t:。 检测 波长为 264 或 
260nm。 电泳 图和数 据收集 由惠普 HP3394A 积分仪 完成。 每次 电泳前 分别用 0. Imol/L 
NaOH 和 Milli-Q 水冲洗 毛细管 2min ,再用 电泳缓 冲液冲 洗平衡 5min。 

(9) 毛细管 电泳分 析寡糖 ANTS 衍生物 

分 析寡糖 ANTS 衍生 物时, 电泳缓 冲液为 50mmol/L 憐酸缓 冲液, pH2.5, 电 泳电压 
- 20kV 或使用 100mmol/L,pH9.3 的硼砂 缓冲液 为电泳 缓冲液 ,电 泳电压 15kV。 检测 
波长 214nm。 其 余条件 同方法 7。 

四、 结果 和讨论 

图 11.11 是 9 种还 原单糖 AMAC 衍 生物在 lOOmm/L NazBzO; , pHlO.5 缓冲 液中毛 

. 217 . 



细管电 泳分离 图谱。 各 峰归属 通过混 合单糖 AMAC 衍生 物与每 一单糖 AMAC 衍 生物共 



!2 

1 



AMAC 




图 11 
A. 



5 10 15 20 25 30 35 

//min 

图 11.11 毛 细管电 泳分离 9 种单糖 AMAC 衍生物 
条件: 熔融 石英毛 细管, 内径 5(Vm ,总长 62cm ,有 效长度 40cm; 电泳缓 冲液, 
lOOmmol/L Na2B407-NaOH, pHlO.5; 电泳 电压为 14kV; 检 测波长 264nm; 单糖 AMAC 衍生物 
浓 度均为 2(Vmol/L ,真 空进样 2s (约 6nl)。 各峰归 属:' 1 . iV - 乙酷 氣基半 乳糖; 2. 木糖; 3. 核糖; 
4. N- 乙酰 氨基葡 萄糖; 5. 葡 萄糖; 6. 甘 露糖; 7. 阿拉 伯糖; 8. 岩 藻糖; 9. 半 乳糖; 10. 肉桂酸 (内标 ) 

进样而 确定。 不 同单糖 AMAC 衍生 物在硼 
酸 盐缓冲 液中电 迁移率 的差异 原因, 也是毛 

细管 电泳分 离单糖 AMAC 衍生物 的基础 , 主 

要是 由于不 同化学 结构的 单糖与 硼酸根 

B(OH)4— 形成的 络合物 稳定性 不同。 越稳定 
的 络合物 迁移率 越大, 而稳定 性与单 糖部分 
邻位 强基的 取向、 邻位强 基的个 数有关 3 6] 。 
单糖 浓度在 5〜25/^mol/L 内, 各单糖 AMAC 
衍 生物峰 面积与 迁移时 间之商 关于单 糖浓度 
成良好 的线性 相关, 相 关系数 均大于 0.992, 
表 明该方 法可定 量分析 单糖。 图 11.12A 和图 




.12 毛细管 电泳分 析糖蛋 白中单 糖组成 

火鸡卵 白蛋白 (A5015); B. 核 糖核酸 gSB。 
毛细 管电泳 条件和 各峰归 属同图 11.11 





10- 




8- 






X— 


6- 


《 


4- 




2- 




0- 







'AMAC 




14 



I > 



20 
f/min 



25 



30 



35 



图 11 . 13 毛细 管电泳 分析酸 性单糖 AMAC 衍生物 
条件: 溶融 石英毛 细管, 内径 50^071, 总长 72cm ,有 效长度 50cm; 电泳缓 冲液, 300mmol/L HjBOj-NaOH, 
pHlO.5; 电泳 电压为 20kV; 检 测波长 260nm; 唾液酸 AMAC 衍生物 浓度为 100/xmol/L, 其 余单糖 AMAC 
衍 生物浓 度均为 25Mmol/L, 真 空进样 2s (约 7nl)。 各 峰归属 : 1 .N - 乙酰 氨基半 乳糖; 2. 木糖; 3. 唾液 
酸; 4. 核糖; 5. 乙酷 氨基葡 萄糖; 6. 葡 萄糖; 7. 甘 露糖; 8. 阿拉 伯糖; 9. 岩 藻糖; 10. 半 乳糖; 11. 肉桂 
酸 (内标 );12. 唾 液酸; 13. 葡萄糖 酸酸; 14. 半乳 糖酸酸 



. 218 . 



11.12B 分别 是分析 火鸡卵 白蛋白 (A5015) 和核糖 核酸酶 B 糖 成分的 电泳图 , 显示 这两种 
糖蛋白 糖主要 成分为 GlcNAc 和 Man ,定 量分析 它们的 摩尔比 分别为 2:4. 3 和 2:6.6。 

图 11.13 是在 300mmol/LH3BQ3,pH10.5( 用 NaOH 调 pH) 电 泳缓冲 液中分 离中性 
单 糖和酸 性单糖 AMAC 衍生 物的电 泳图。 需要说 明的是 ,由 于该电 泳条件 是用来 分析酸 
性单糖 (主 要是 分析唾 液酸) : 33] ,所 以, iv- 乙酰 氨基葡 萄糖、 葡 萄糖、 甘露糖 和阿拉 伯糖这 
4 种糖的 AMAC 衍生 物未被 很好分 离并不 重要。 另 外 , 唾液酸 AMAC 衍生物 , 如 5 善乙 
酰氨基 唾液酸 Neu5 Ac- AMAC (图 11.13 中, 峰 12) 在室 温下不 稳定, 易自动 转化成 稳定的 
脱羧基 唾液酸 AMAC 衍生物 , 即 脱羧基 5-N- 乙 酰氨基 唾液酸 AMAC 衍生物 (图 1 1 . 13 
中, 峰 3)。 而在- 20t: 暗 处保存 12h ,基 本观 测不到 唾液酸 AMAC 衍生物 的脱羧 反应。 
在 10~120/Lmiol/L 浓度 范围, 唾液酸 AMAC 衍 生物的 峰面积 与迁移 时间之 商与唾 液酸浓 
度成良 好的线 性关系 ,线 性相关 系数为 0.9978(;z 二 8)。 表明在 所给的 条件下 ,可 以准确 
定量唾 液酸。 图 11.14 A,B 和 C 分别是 分析重 组人促 红细胞 生成素 rhu-EPO ,人 尿胰蛋 
白酶 抑制剂 (hu-UTI) 和 牛酸性 糖蛋白 Ui-AGP) 中唾液 酸的毛 细管电 泳图。 图 11.14 C 
显示牛 ai-AGP 中 除存在 Neu5Ac 外, 还存在 另一酸 性糖。 它的 AMAC 衍生物 (带' 号峰) 
也能发 生脱羧 反应。 用质 谱鉴定 这一酸 性糖为 5-iV- 乙醇 酰氨基 唾液酸 (Neu5Gc) [33 3。 定 
量分析 表明, 每 mol rhu-EPO 和 hu-UTI 分别含 17.59 和 2.55mol Neu5Ac ,而每 mol 牛 
ai-AGP 含 5 . 5mol Neu5Ac 和 5 . 04mol Neu5Gc。 



图 11.14 毛细 管电泳 分析糖 蛋白中 唾液酸 
酸水 解释放 糖蛋白 中的唾 液酸经 AMAC 衍生化 ,衍生 
物溶于 lOOfil 50% DMS0/H20。 A.0.45nmol rhu-EPO. 
真 空进样 2s; B.2.14nmol hu-UTI, 真 空进样 2s; 
C.1.42nmol 牛 ai-AGP, 真 空进样 ls。 其 余条件 和各峰 




归 属同图 11.13 



219 




图 11.15 荧 光检测 SDS 
PAGE 分 离并电 转移于 
PVDF 膜 上蛇毒 糖蛋白 
A.PVDF 膜上 蛋白考 马斯亮 
蓝染色 ^B.PVDF 膜上 糖蛋白 
荧 光染色 



江 浙崚蛇 蛇毒硫 酸铵反 透析沉 淀总蛋 白等分 为二, 分别上 

样于 SDS^PAGE 胶两样 品道, 电泳分 离后, 电 转移蛋 白质至 
PVDF 膜。 从两样 品道中 间剪开 PVDF 膜, 一半 PVDF 膜用糖 
蛋白莢 光染色 法染色 [ 44 ], 另一半 PVDF 膜 用考马 斯亮蓝 染色。 
荧光染 色结果 (图 11. 15) 表 明有若 干蛋白 条带被 染色, 说明蝮 
蛇中 存在较 多的糖 蛋白。 用 CE 对 图中标 示出的 3 条带 的单糖 
成分进 行分析 ,证 实了它 们是糖 蛋白。 图 11.16A 是单糖 AMAC 
衍 生物标 准的毛 细管电 泳分离 图谱。 图 11. 16B 是全程 空白对 
照实验 ,可知 2mol/LTFA 水解液 存在木 糖和葡 糖糖。 图 11.16 
CD 和 E 分别 是分子 质量约 55,32, 14kDa 糖蛋 白的中 性糖分 
析结果 ,表明 它们都 含有甘 露糖、 半乳 糖和岩 藻糖。 由于 我们没 
有对 在水解 产物进 行重乙 酰化, 因 此没有 检测到 iV- 乙 酰氨基 
葡 萄糖和 N- 乙酰 氨基半 乳糖。 唾 液酸分 析结果 (图 谱未 给出) 
表明 没有检 测到唾 液酸。 



;! 2 


56 

il 9 


A 

10 


-I, ■ Jua. 


j6 B 

xL 


111. 

: \ L 


6 C 




6 

U L AJ 


D 

10 


1 , 1 - lL 


,10 c 

7 1 E 

ill! 9/1 



12 17 



23 



28 33 
//min 



37 42 



图 11.16 毛 细管电 泳分析 PVDF 膜上 糖蛋白 的单糖 
条件: 培融 石英毛 细管, 内径 5{Vm, 总长 72cm ,有 效长度 50cm; 电泳缓 冲液, 
lOOmmol/L NazBjCVNaOH, pHlO.5; 电泳 电压为 HkV; 检 测波长 260nm; 
A. 10 种单糖 AMAC 衍生物 标准毛 细管电 泳图。 各 峰归属 :l.iV- 乙銑 氣基半 乳糖; 2. 木糖; 
3. 唾 液酸; 4. 核糖; 5. N- 乙銑 氣基葡 萄糖; 6. 葡 萄糖; 7. 甘 露糖; 8. 阿拉 伯糖; 9. 岩 藻糖; 
10. 半 乳糖; B. 全程空 白对照 实验; C. No.3 糖 蛋白的 单糖; D. No.2 糖 蛋白的 单糖; E. No. 1 糖蛋白 的单糖 

图 11.17A 为在 50mmol/L,pH2.5 的磯酸 缓冲液 中葡聚 糖酸水 解产物 ,即不 同聚合 
度寡 聚葡糖 (图 11. 18) 混 合物的 ANTS 衍 生物电 泳图。 聚 合度从 1〜21 的寡 聚葡糖 
ANTS 衍生 物得到 检测和 近基线 分离。 在 pH2.5 的缓冲 溶液条 件下, 毛细 管内表 面娃焼 
. 220 ' 



醇的氢 解离性 很弱, 电渗流 很弱, 而 ANTS 寡 糖衍生 物带近 3 个负 电荷。 所以这 时电迁 
移速度 远大于 电渗流 速度, 而 且两者 的方向 相反。 因此, 需在阳 极检测 衍生物 ,也 即施加 
负极性 电压, 使 阳极在 检测器 一侧。 出峰 顺序按 聚合度 1,2,3,一21 排列。 这被毛 细管电 
泳-离 子讲质 谱联用 分析糖 ANTS 衍生物 技术证 实 [45 ]。 图 11.17B 是在 lOOmmol/L 
Na2B407,pH9.3 缓冲 液中寡 聚葡糖 ANTS 衍生 物的电 泳图。 在碱 性缓冲 液中, 电 渗流速 
度很快 ,需 要在阴 极检测 ANTS 衍生物 ,而 且出峰 顺序正 好与图 11.17B 的 相反。 很明 
显, 这时 聚合度 越大的 衍生物 之间的 分离度 越小, 这是 因为聚 合度越 大的衍 生物之 间的电 
迁移速 度的差 异比电 渗流速 度越来 越小, 在 衍生物 到达检 测器时 尚未得 到有效 分离。 寡 
糖 ANTS 衍 生物在 PH2.5 碟酸 缓冲液 中的电 迁移率 差异主 要决定 于寡糖 分子的 有效表 
面的 差异。 因此, 可 以通过 比较结 构相似 的寡糖 ANTS 衍生 物之间 的电迁 移率的 差异得 
到寡糖 相对大 小的信 息 [32] 。 



6 




9 
8 

6 



DMSO 



9 






1 




1 






15JI 






1 




稀, 


k 





1 B 



4 8 12 16 20 24 28 
//min 



图 11.17 毛细 管电泳 分离葡 聚寡糖 ANTS 衍生物 
条件: 培融 石英毛 细管, 内径 50fim ,总长 60cm ,有 效长度 40cm; 检 测波长 214nm。 A. 电泳 缓冲液 SOmmol/L NaHzB^ 
-HjPOj.pHZ.S; 电泳电 压为- 20kV;B. 电泳 缓冲液 100mmol/LNa2B4O7,pH9.3; 电泳 电压为 15kV 




SOT V V 、so3- 

图 11.18 葡 聚寡糖 ANTS 衍生 物结构 
("二1, 2, 3, •••) 

第三节 毛细管 电泳分 析糖蛋 白微不 均一性 
一、 简 介 



糖蛋白 一个特 点就是 它趋于 "微 不均一 性"。 某一 种糖蛋 白实际 上是一 类具有 相同的 
多肽链 ,而共 价连接 于肽链 上的寡 糖的结 构不同 (包 括单 糖成分 和连接 方式) 的蛋白 群体。 
不同结 构的寡 糖链, 即不同 糖型使 糖蛋白 表现出 微不均 一性。 



221 



毛细 管电泳 (CE) 的高 分离能 力使分 离糖蛋 白的糖 型成为 可能。 它为 回答诸 如糖蛋 
白糖 基部分 的生物 功能; 与自 身的非 糖基化 蛋白相 比较, 不同 的糖型 是否具 有不同 的生物 
或生理 活性; 某些 糖蛋白 的糖型 的变化 是否与 某一疾 病有相 关性等 问题提 供了一 种有效 
的技术 支持。 同时 也为生 物医药 工业重 组糖蛋 白的质 量控制 提供了 一种快 速分析 手段。 

目前, 已有 很多文 献报道 CE 分析 糖蛋白 微不均 一性。 几 种分离 模式, 如毛细 管区带 
电泳 (CZE) 、毛 细管等 电聚焦 (CIEF) 和 微团电 动毛细 管色谱 (MEKC) [46 ] 等 都被应 用来研 

究糖蛋 白微不 均一性 。 

最 早报道 CE 分析糖 蛋白微 不均一 性的是 Kilar 和 Hjerten [47] 。 他们用 CZE 方式分 
离人血 清转铁 蛋白的 糖型, 得到 5 个组 分峰, 分别 代表含 2,3,4,5 和 6 个唾 液酸残 基的转 
铁 蛋白。 在用 唾液酸 水解酶 处理转 铁蛋白 不同时 间后, 用 CE 可以 观测这 5 个糖 型峰高 
发生 规律的 变化, 表明唾 液酸逐 渐被水 解掉。 处理 20h 后, 基本只 有一个 新的峰 存在。 用 
CIEF 鉴定 该峰是 去唾液 酸化的 转铁蛋 白 。 

医药 用的重 组人促 红细胞 生成素 (rhEPO) 的糖 部分结 构相当 复杂, 有 4 位点 被糖基 
化修饰 ,既有 iV- 连接 糖链, 也有 ◦- 连接 糖链, 其 唾液酸 的含量 也很高 [ 33 ]。 利用 CE 研 
究 rhEPO 的微不 均一性 的报道 较多。 在 pH4.0,100mmol/L 醋 酸钠- 醋酸缓 冲液中 CE 
分析 rhEPO 仅得一 个峰, 而在 pH4.0,100mmol/L 醋 酸钠- 碟酸缓 冲液中 电泳分 离得到 5 
个组分 峰 [48] 。 其原因 可能是 磯酸与 毛细管 内壁硅 醇形成 复合物 ,使 毛细管 对蛋白 质的吸 
附 降低。 表明缓 冲液组 成成分 在糖蛋 白糖型 的分析 中所起 的重要 作用。 在 lOmmol/L 
Tricine, lOmmol/L Naa,pH6.2 缓冲 液中, 添加 2.5mmol/L 1 ,4 - 二 氨基丁 烧后, 使原来 
仅一 个峰的 rhEPO 分离成 4 个峰 [49 ]。 再添加 7mol/L 尿 素于电 泳缓冲 液中, rhEPO 被分 
离成 6 个峰, 并且分 离度明 显提高 很多。 1, 4- 二氨 基丁烧 作用是 降低电 渗流, 尿 素可能 
抑制或 降低了 毛细管 内壁对 rhEPO 的 吸附。 另外, 需注意 ,在 7mol/L 尿素存 在下, 蛋白 
质处 于变性 状态。 而应用 CIEF 分析 rhEPO 糖型 [SG] ,在 7mol/L 尿素 和两性 电解质 
(pH3〜10两性电解质与pH2.5~5 的 两性电 解质以 体积比 1:2 混合) 中等电 聚焦, 得到 
最佳 分离。 在表观 等电点 3.78〜4.69 范围内 ,可 观测到 7 个 糖型。 

用 CE 分析 鸡卵白 蛋白的 糖型的 报道也 较多。 在 lOOmmol/L 硼 酸盐, pH8.5 的缓冲 
液中用 CZE 方式分 离鸡卵 白蛋白 ,仅观 测到几 个峰。 而当 缓冲液 中存在 Immol/L 1,4- 
二氨基 丁烧时 ,可 观察到 20 多个 大小不 同的峰 [5 1 ] 。 用键合 交联聚 丙條酰 胺涂层 的毛细 
管, 在 0.4mol/L 硼酸, 2mol/L Tris,2mmol/L EDTA,pH7.8 缓冲液 中分离 鸡卵白 蛋白, 
也 可得到 20 多个峰 [ 52] 。 毛细管 内壁中 性涂层 同样是 为了降 低电渗 流并抑 制蛋白 质与毛 
细管内 壁相互 作用, 以 达到高 分辨的 目的。 总之, 可从如 何降低 电渗流 ,如 何降低 毛细管 
内壁对 糖蛋白 的吸附 ,以 及从缓 冲液的 pH 值、 组成 和浓度 等方面 考虑和 尝试, 选 择糖型 
分析的 条件。 修饰 毛细管 内表面 以降低 电渗流 和降低 表面对 蛋白质 的吸附 的方法 分为动 
态涂 层和静 态涂层 两类。 动态 涂层是 在电泳 缓冲液 中加多 聚物、 离 子或非 离子有 机去垢 
剂、 二 胺或多 胺等。 这些 添加剂 基于吸 附原理 涂附于 毛细管 内壁, 因此涂 层方便 并易再 
生, 而且 电泳分 离重现 性高。 静态 涂层是 将毛细 管内壁 经共价 反应" 永久" 键合涂 敷一层 
中性 亲水多 聚物或 带电荷 亲水多 聚物或 疏水多 聚物。 静态 涂层通 常稳定 (但 在强 酸或强 
碱中稳 定性下 降), 对抑 制和降 低毛细 管电渗 流和表 面对蛋 白质的 吸附更 有效; 但 制备耗 
时。 若欲了 解有关 动态或 静态涂 层详细 信息, 可参阅 相关文 献综述 [53〜55]。 最近, 动态 
- 222 - 



涂层 (电泳 缓冲液 lOOmmol/L 硼酸 盐中加 3mmol/L 二氨基 丁烷) 和静 态涂层 (碳 氟化 合物涂 
层) 毛细管 电泳都 被运用 来直接 分析人 血清中 转铁蛋 白唾液 酸糖型 [ 56 ' 57] ,并 观测到 嗜酒和 
非嗜酒 病人血 清中转 铁蛋白 唾液酸 糖型的 差异。 两种 方法得 到可比 较的糖 型分离 结果。 

需 要指出 的是, 由于糖 蛋白结 构极其 复杂, 不同糖 蛋白间 的差异 ,包括 多肽链 一级结 
构和空 间结构 (包 括二 硫键) 的差异 、糖基 化位点 的多少 、糖 含量的 多少、 寡 糖链结 构的差 
异、 有 无唾液 酸和唾 液酸的 含量多 少等, 目前 很难有 1 或 2 种 固定的 分离模 式或分 离条件 
对所 有或大 多数糖 蛋白都 得到满 意的糖 型分离 结果。 因而, 还必需 根据待 分析糖 蛋白的 
特性, 寻找最 佳的、 可重 现的、 且 易操作 的分离 条件。 例如, 无 论是用 涂层或 是未涂 层的毛 
细管, 在硼 酸缓冲 液中, 即使有 二氨基 丁烷存 在于缓 冲液, 也 不能将 重组人 组织纤 溶酶原 
激活物 (rh-tPA) 糖型分 离 [58] ,表明 唾液 酸化程 度高的 糖蛋白 不能有 效地与 硼酸根 形成复 
合物, 并且糖 型间的 电迁移 率差异 甚小, 因而难 以得到 分离。 唾液酸 含量不 同的糖 型由于 
其等电 点不同 ,可用 CIEF 将它们 分离。 如用 pH3〜10 和 pH5〜8 两性 电解质 混合物 (体 
积比 1:1 ) 为等 电聚焦 电泳液 (其 中还含 4mol/L 尿素) ,可将 rh-tPA 分离成 10 个峰 [59] 。 
使用尿 素的目 的是增 加蛋白 质的溶 解性, 因 为蛋白 质在其 等电点 处可能 沉淀。 而 对于只 
有一个 位点被 糖基化 并且糖 链是高 甘露糖 型的重 组人骨 形态形 成蛋白 2(rhBMP- 2), 使 
用简单 的电泳 缓冲液 0. lmol/L,pH2.5 磯酸 缓冲液 及中性 涂层毛 细管, 就 可将其 9 个糖 
型 分离: W 卜。 

下 面介绍 我们用 CZE 比 较分析 3 种卵白 蛋白糖 型分布 的方法 和结果 [6 ij。 

二、 材 料 

两种 火鸡卵 白蛋白 (Sigma 产品 A5015,A7269) 和鸡卵 白蛋白 (A2512),l,4- 二氨基 
丁焼 , 异亚丙 基丙酮 (mesityloxide) 。 

三、 方 法 

糖型 分析在 ABI 270A 型毛 细管电 泳仪上 进行。 使 用总长 72cm ,有 效分 离长度 
50cm ,内径 50|Lmr 熔 融石英 毛细管 (ABI 产品 )。 检测 波长为 200nm。 毛细 管温度 控制在 
(30±0.2)t:。 进样前 分别用 O.lmol/L NaOH 和 水冲洗 2min ,再用 电泳缓 冲液冲 洗平衡 
4min。 使用的 电泳缓 冲液为 : (l)50mmol/L NaH2 PO4-H3 PO4 , pH2 . 5 ; ( 2 ) lOOmmol/L 
HaBOs-NaOH , pH8 . 6 ; ( 3 ) lOOmmol/L Na2B4O7,40〜100mmol/L KH2PO4, pH8. 2-9.0; 
(4)100mmol/L HgBCb-NaOH, pH8.6, 1 .8mmol/L 1 ,4 - 二氨基 丁焼。 电 泳电压 随缓冲 
液而 调整。 用电中 性物质 异亚丙 基丙酮 测定毛 细管电 渗流。 

四、 结果 和讨论 

商品化 的两种 火鸡卵 白蛋白 (A5015,A7269) 和鸡卵 白蛋白 (A2512) 经反相 HPLC 进 
一步 纯化。 在 50mmol/L 憐酸, pH2.5 缓冲 溶液中 分析这 3 种卵白 蛋白, 仅 微弱显 示它们 
均存在 微不均 一性。 在 lOOmmol/L H3B03-NaOH,pH8.6 缓冲液 中分离 A5015 效 果有所 

. 223 . 



4- 



3- 



1- 



4- 



1- 






24 



29 



34 39 
//min 



44 



增加, 可以 观察到 5 个峰。 然 而由于 在碱性 
缓 冲液中 毛细管 的电渗 流变得 较大, 蛋白在 
电 渗流的 负载下 较快地 通过检 测器而 没有得 
到充分 的电泳 分离。 基于电 渗流的 性质, 通 
常有 3 种方法 消除或 抑制电 渗流: 一 是使用 
中性 涂层毛 细管; 二是 使用高 离子强 度的缓 
冲液 ;第 三种方 法是使 用化学 添加剂 , 如有机 
溶剂或 有机阳 离子试 剂于电 泳缓冲 液中。 

图 11.19 是 3 种卵 白蛋白 在较高 离子强 
度硼砂 缓冲液 中的毛 细管电 泳图。 这 时电渗 
流降低 ,糖型 分离度 进一步 提高。 A5015 和 
A7269 已被 分离成 5 组峰, A2512 被 分离成 
两 组峰。 但是, 继续提 高硼砂 或磯酸 二氣钾 
的浓度 ,并不 能继续 提高糖 型的分 离度。 另 
外 , 如继续 增加电 压( > 150V/cm) , 会 降低那 
些 相邻的 峰的分 辨率。 这可归 结于高 离子强 
度和高 电压, 导 致大量 的焦尔 热产生 而引起 
峰 严重变 宽甚至 坍陷。 因此, 当使用 高离子 
强 度缓冲 液时, 施加在 毛细管 两端的 电压被 
^ 限制在 某一值 以下, 最 终阻碍 了分离 度进一 
步 提高。 分别在 含不同 浓度的 1,4- 二氨基 
丁烧 (0〜2.0mmol/L) 的 lOOmmol/L H3BO3- 
NaOH, pH8.6 缓冲 液中, 进 行分离 A5015 糖 
型的 一系列 实验, 发现当 1,4- 二氨基 丁烷浓 



图 11.19 高离子 强度硼 酸盐缓 冲液中 
分离 卵白蛋 白糖型 
条件: 馆融 石英毛 细管, 内径 50/im ,总长 72cm ,有 效长 
度 50cm; 检 测波长 200nm。 A. 火鸡卵 白蛋白 A5015。 
电泳缓 冲液, lOOmmol/L Naz B4 O7, lOOmmol/L 度为 1 • 8mmol/L 时, A5015 糖 型得到 最佳分 
KH2P04,pH8.2; 电泳 电压为 8kV。 B. 火鸡卵 白蛋白 离。 图 1 1 . 20A, B 分别 是在 最适分 离条件 
A7269。 电泳缓 冲液, lOOmmol/L Na2B4O7,40mmol/L ( lOOmmol/L H3 BOj-NaOH, pH8.6, 

KH 2 PO 4 ,pH9.0; 电泳 电压为 8 kv。 c. 鸡卵 白蛋白 i.8mmol/L 1,4 -二 氨基 丁院, 20kV) 下, 

A2 5 l 2 。 电泳缓 冲液, lOOmmol/L Na^B^O^, 60mmol/L A5015 和 A7269 的糖型 分离图 ,多于 13 个峰 
1<^2?03,?148.8;电泳电压为101{丫 . . A~rwv~v〖7/、 十 /v,,,A v^zai , 

在 35min 内可 被较好 分离。 对 A7269 连续 6 
次电 泳得到 的各糖 型峰的 相对迁 移时间 (相 对于 EOF) 变异系 数均在 2. 7% 以下, 表明分 
离的可 重复性 较高。 有趣 的是, A5015 和 A7269 的糖型 花样极 其相似 ,每 一对相 对应的 
峰 的相对 迁移时 间几乎 相同。 将 A5015 和 A7269 按 1 : 1 混合, 电泳 发现它 们的每 一对相 
对应 的峰完 全重叠 (图 11.200。 这表明 A5015 和 A7269 具有完 全相同 的糖型 花样。 它 
们之 间的不 同主要 在于峰 8,9,12,13 的相 对含量 不同。 与 A7269 相比, A5015 中糖型 8, 
9,12,13 的 相对含 量明显 降低。 图 11. 20D 为在上 述分离 火鸡卵 白蛋白 最适条 件下, 分离 
鸡卵 白蛋白 A2512 糖型电 泳图。 比较 火鸡卵 白蛋白 和鸡卵 白蛋白 糖型电 泳图, 可 预知其 
寡糖 链结构 不同。 



224 



8 13 18 23 28 33 38 
t/mm 



10 15 20 25 30 35 40 45 
//min 



图 11.20 含 1,4- 二氨 基丁烷 硼酸盐 缓冲液 中分离 卵白蛋 白糖型 
条件: 熔融 石英毛 细管, 内径 5(Vm, 总长 72cm, 有 效长度 50cm; 检 测波长 200nm。 电泳缓 冲液, lOOmmol/L 
H3B05-NaOH,pH8.6, 1 .8mmDl/L 1,4 - 二氣基 丁烷。 电泳 电压为 20kV。 蛋白 浓度, lmg/L, 真 空进样 ls。 A. 火鸡卵 
白蛋白 A5015;B. 火鸡卵 白蛋白 A7269;C. 火鸡卵 白蛋白 A5015 和 A7269 混合物 (1 : 1) ; D. 鸡卵 白蛋白 A2512 

第四节 结语 和展望 

目前, 由于质 谱技术 的迅速 发展, 蛋白 质憐酸 化分析 多用质 谱完成 [62~""]。 但在 pSer 
或 pThr 残 基相邻 有多个 Ser 或 Thr 残基 存在情 况下, 用质谱 确定是 丝氨酸 或苏氨 酸磯酸 
化通 常比较 困难。 结合已 知的蛋 白激酶 底物识 别序列 (recognition motifs) 推测磔 酸化位 
点, 有时得 到错误 结论。 因为 至今有 许多蛋 白激酶 还没被 发现, 其底 物识别 序列更 是未知 
的。 而用 CE 分 析憐酸 氨基酸 方法容 易区分 磯酸丝 氨酸和 憐酸苏 氨酸。 当使 用荧光 [65] 
或激 光诱导 荧光检 测器, CE 分析憐 酸氨基 酸方法 的灵敏 度会得 到较大 提高。 对于 CE 分 
析糖 分子, 已有若 干糖衍 生法和 衍生试 剂相继 被开发 出来, 而目前 最常用 的是还 原胺化 
法。 最近, 又有 一种糖 衍生法 被报道 [ 66 ]。 衍生 第一步 是还原 糖与甲 基胺还 原胺化 反应生 
成 N -甲 基糖胺 ( iV-methylglycamine) ; 第二步 中, iV - 甲 基 糖胺与 4-nitro-2 , 1 , 3-benzoxa- 
diazole 7-fluoride(NBD-F) 反 应生成 NBD 标记的 N -甲 基糖胺 (NBD- tagged N-methylgly- 
camine)o 衍生 反应在 pH4.5, 40t: 进行 30min 定量 完成。 另一 方面, 各种 检测方 法得到 
运用, 灵 敏度以 激光诱 导荧光 (LIF) 检测 最高, 但 目前价 格贵。 另外, 由于 激光发 生器产 
生的激 光波长 有限, 应 用受到 一定的 限制。 紫外检 测法较 常用, 检测 波长范 围宽, 是灵敏 
度 与价格 的折衷 选择。 CE 蛋白糖 基化修 饰分析 涉及糖 蛋白单 糖组成 分析、 寡糖 分析、 寡 
糖序 列分析 、糖肽 分析、 糖蛋 白糖型 分析等 方面。 

过去 12 年里, 毛细 管电泳 技术得 到快速 发展, 在生命 科学中 发挥了 巨大的 作用。 人 
类基 因组计 划进展 迅猛, 几近 完成, 可以 说得益 于高通 量毛细 管电泳 DNA 测序技 术的运 

. 225 • 



用。 而. 近 6〜7 年也是 全微分 析系统 (micrototal analysis systems, jli-TAS) 或称" 芯 片实验 
室" ("lab-on-achip" ) [67] 研究真 正兴起 和发展 时期。 这种 /i-TAS 将 完成分 离和检 测的所 
有部 件整合 在一个 微小化 平台装 置内。 目前毛 细管电 泳的微 小化是 最成功 的微芯 片应用 
之一 [68] 。 在微 芯片长 方形管 道中的 毛细管 电泳分 离情况 与在开 管毛细 管电泳 是相同 
的 [69] 。 几种毛 细管电 泳分离 模式如 CZE,CGE (毛细 管凝胶 电泳) 和 MEKC 都已 在微芯 
片电泳 中得到 应用。 最近, 文献 [70] 报道微 芯片电 泳快速 分析氨 基糖。 氨基糖 (氨 基葡萄 
糖和 氨基半 乳糖) 及它们 的还原 形式经 NBI>F 衍生, 衍生物 在微制 作芯片 33mm 长的分 
离管道 内电泳 分离, 用 LIF 检测。 这 4 种衍 生物在 Imin 内得 到很好 分离。 低至 0.5fmol 
的氨基 糖可被 检测到 (信 噪比 S/N 二 3)。 微芯片 毛细管 电泳可 望发展 成高度 自动化 、大规 
模、 高通量 、快 速的分 离分析 方法, 除可配 以光或 电化学 或拉曼 光谱等 检测器 夕卜, 还 可以质 
谱为 检测器 [ 7 1 ' 72 ] ,增 强其 分离分 析能力 , 获 得更多 的被分 析物质 的信息 。 可 以相信 , 这种 
整合 方式可 能更有 助于后 基因组 时代, 进行 大规模 高通量 蛋白质 翻译后 修饰, 特别 是憐酸 
化 和糖基 化修饰 的分析 鉴定以 及临床 诊断。 

(车 发云) 

参 考文献 

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229 



I 
( 



第 十二章 导 论 



2001 年人类 基因组 框架图 的发表 使大众 对科学 家将揭 示人类 的遗传 奥秘充 满了幻 
想和 信心。 但是, 真 实的图 景远不 像普通 人想像 的那样 简单。 正如 国际人 类基因 组计划 
(human genome project ,HGP) 主要 负责人 Francis Collins 在 2001 年 6 月 一 次会上 所强调 
的: 真正 的竞赛 才刚刚 开始。 竞赛的 一个核 心内容 ,就 是要研 究基因 的产物 —— 蛋 白质。 
在 Nature 杂志 2001 年 2 月发布 人类基 因组框 架图的 消息的 同一版 面上, 编辑也 同时登 
载了 一条关 于人类 蛋白质 组组织 (human proteome organization, HUPO) 成立的 消息, 标题 
就叫" 现在是 蛋白质 组了" [ 1 ] 。 2001 年的 Science 杂 志把蛋 白质组 学列为 2002 年 六大研 
究热点 之一, 其" 热度" 仅次 于干细 胞研究 [ 2] 。 2003 年 3 月 Nature 杂 志上的 一系列 蛋白质 
组学的 综述文 章更是 把蛋白 质组学 研究推 到了令 人瞩目 的地位 [3 ~ 9] 。 蛋 白质组 学的受 
关注 程度如 今已令 人刮目 相看。 

一、 蛋 白质组 学研究 的历史 和背景 

随着人 类基因 组计划 的实施 和推进 ,生命 科学研 究已进 入了后 基因组 时代。 在这个 
时代, 生命科 学的主 要研究 对象是 功能基 因组学 ,包 括结构 基因组 研究和 蛋白质 组研究 
等。 尽管现 在已有 多个物 种的基 因组被 测序, 但在这 些基因 组中通 常有一 半以上 基因的 
功 能是未 知的。 目前功 能基因 组中所 采用的 策略, 如基因 芯片、 基因 表达序 列分析 (serial 
analysis of gene expression, SAGE) 等, 都是从 细胞中 mRNA 的角 度来考 虑的, 其前 提是细 
胞中 mRNA 的水平 反映了 蛋白质 表达的 水平。 但事实 并不完 全如此 ,从 mRNA 角度考 
虑, 实际 上仅包 括了转 录水平 调控, 并不能 全面代 表蛋白 质表达 水平。 蛋白 质复杂 的翻译 
后修饰 、蛋 白质的 亚细胞 定位或 迁移、 蛋白质 和蛋白 质相互 作用等 则几乎 无法从 mRNA 
水平来 判断。 毋庸 置疑, 蛋 白质是 生理功 能的执 行者, 是生命 现象的 直接体 现者, 对蛋白 
质 结构和 功能的 研究将 直接阐 明生命 在生理 或病理 条件下 的变化 机制。 蛋 白质本 身的存 
在形式 和活动 规律, 如翻译 后修饰 、蛋 白质间 相互作 用以及 蛋白质 构象等 问题, 仍 依赖于 
直 接对蛋 白质的 研究来 解决。 虽 然蛋白 质的可 变性和 多样性 等特殊 性质导 致了蛋 白质研 
究技术 远比核 酸技术 要复杂 和困难 得多, 但正 是这些 特性参 与和影 响着整 个生命 过程。 

传 统的对 单个蛋 白质进 行研究 的方式 已无法 满足后 基因组 时代的 要求。 这是 因为: 
①生命 现象的 发生往 往是多 因素影 响的, 必然 涉及到 多个蛋 白质; ② 多个蛋 白质的 参与是 
交织成 网络的 ,或平 行发生 ,或 呈级联 因果; ③在 执行生 理功能 时蛋白 质的表 现是多 样的、 
动 态的, 并不像 基因组 那样基 本固定 不变。 因此, 要对 生命的 复杂活 动有全 面和深 入的认 
识, 必 然要在 整体、 动态、 网络的 水平上 对蛋白 质进行 研究。 因此, 在 20 世纪 90 年代中 
期, 国际上 产生了 一门新 兴学科 —— 蛋白 质组学 (proteomics) ,它是 以细胞 内全部 蛋白质 
的存在 及其活 动方式 为研究 对象。 可以 说蛋白 质组研 究的开 展不仅 是生命 科学研 究进入 
后基 因组时 代的里 程碑, 也 是后基 因组时 代生命 科学研 究的核 心内容 之一。 

• 233 . 



虽然第 一次提 出蛋白 质组概 念是在 1994 年, 但 相关研 究可以 追溯到 20 世纪 90 年代 
中 期甚至 更早, 尤其是 80 年代初 ,在基 因组计 划提出 之前, 就 有人提 出过类 似的蛋 白质组 
计划, 当 时称为 Human Protein Index 计划, 旨在 分析细 胞内的 所有蛋 白质。 但由 于种种 
原因 , 这 一计划 被搁浅 。 20 世纪 90 年 代初期 , 各 种技术 已 比 较成熟 , 在 这样的 背景下 , 经 
过各国 科学家 的讨论 ,才提 出蛋白 质组这 一概念 。 

国 际上蛋 白 质组 研究的 进展十 分迅速 , 不论基 础理论 还是技 术方法 , 都 在不断 进步和 
完善。 多种 细胞的 蛋白质 组数据 库已经 建立, 相应的 国际互 联网站 也层出 不穷。 1996 
年, 澳大利 亚建立 了世界 上第一 个蛋白 质组研 究中心 ,即 Australia Proteome Analysis Fa- 
cility ( APAF )。 丹麦、 加拿大 、日本 也先后 成立了 蛋白质 组研究 中心。 在美国 ,各 大药厂 
和 公司在 巨大财 力的支 持下, 也纷纷 加人蛋 白质组 的研究 阵容。 在瑞士 成立的 QeneProt 
公司, 是由 以蛋白 质组数 据库" SWISSPROT" 著称的 蛋白质 组研究 人员成 立的, 以 应用蛋 
白 质组技 术开发 新药物 靶标为 目的, 建立了 配备有 上百台 质谱仪 的高通 量技术 平台。 而 
当 年提出 Human Protein Index 的美国 科学家 Norman G. Anderson 也成立 了类似 的蛋白 
质组学 公司, 继续其 多年未 实现的 梦想。 2001 年 4 月 ,在美 国成立 了国际 人类蛋 白质组 
组织 (Human Proteome Organization, HUPO) , 随 后欧洲 、亚 太地区 都成立 了 区域 性蛋白 
质组研 究组织 ,试 图通过 合作的 方式, 融合各 方面的 力量, 完 成人类 蛋白质 组计划 ( Human 
Proteome Project) ,并在 2002 年和 2003 年陆 续启动 了人类 血装、 肝 和脑的 蛋白质 组研究 
国际合 作计划 (参见 www.hupo.org)。 

二、 蛋白 质组学 的特点 与难点 

根据对 国际生 命科学 文献数 据库" Medline" 的 检索, 基因组 的研究 论文从 1990~2001 
年的时 间里, 头 6 年基 本保持 不变, 只是在 1996 年以 后才以 大约每 年翻一 番的速 度开始 
增长。 而冠有 "蛋白 质组" 的研究 文献, 1997 年是 1 篇, 到 2003 年 已迅速 发展至 2 700 多 
篇。 这一结 果表明 ,蛋白 质组学 迅速为 科学界 所接受 并受到 重视。 下面笔 者将从 基因组 
与 蛋白质 组比较 的角度 来谈谈 为什么 要研究 蛋白质 组以及 蛋白质 组学的 特点和 难点。 

(-) 同 一性与 多样性 

基因组 作为遗 传信息 的载体 ,其 最主要 的特征 就是同 一性。 对于单 细胞生 物而言 ,不 
论在什 么样的 生长条 件下, 其基 因组始 终是不 变的。 对 于多细 胞生物 来说, 同一个 个体的 
基因 组不论 是在不 同的发 育阶段 或不同 种类的 细胞里 都是同 样的。 知道了 个体内 某一细 
胞内的 基因组 就等于 知道了 该个体 所有细 胞的基 因组。 然而, 对于蛋 白质组 而言, 由于蛋 
白质 是生命 活动的 主要执 行者, 因此, 对 于不同 类型的 细胞或 同一个 细胞在 不同的 活动状 
态下, 蛋 白质组 的构成 是不一 样的。 

蛋 白质组 的这种 多样性 使得我 们对蛋 白质组 的定义 出现了 问题。 目前 蛋白质 组比较 
公认的 定义是 ,一 个基因 组所有 基因所 表达的 全部蛋 白质。 这 种定义 在文字 上可以 理解, 
但在 实际中 却难以 运用。 任何 一种基 因组, 都 是由不 编码蛋 白质的 核昔酸 序列和 编码蛋 
白质 的核昔 酸序列 —— 基因所 组成。 然而, 除了已 经知道 有蛋白 质产物 的基因 以外, 其余 
的" 基因" 只不过 是根据 "起始 密码" 和" 终止 密码" 序列所 确定的 "可 读框" (open reading 
• 234 - 



frame,ORF)o 一般 说来, 一个基 因组内 的基因 数目通 常是指 ORF 的 数目。 基因 组研究 
的实 践告诉 我们, 要 想准确 无误的 肯定一 个基因 组内的 ORF 数目, 并 不是一 件容易 的事。 
虽然 生物信 息学已 经有了 长足的 进步, 但是 直接从 基因组 的序列 进行基 因注释 (annota- 
tion) 还 是很困 难的。 不久 前人们 发现, 对一 个简单 的细菌 (M^rop/asma gf^m'taZz'Mm) 基因 
组的 340 个 基因的 注释, 其错注 的比率 至少是 8%[iG]。 对 于那些 高等生 物复杂 的基因 
组 , 尤其 是存在 RNA 剪切 的 基因组 , 要想 确定其 ORF 的数 目 就 更成问 题了。 

显然, 最 能确定 ORF 的数量 应该是 通过研 究蛋白 质组来 进行。 据最新 统计, 人类基 
因 组拥有 的基因 数目为 3 万〜 4 万个。 如果我 们能够 把人的 252 种 细胞内 的全部 蛋白质 
都鉴定 出来, 那么就 有可能 真正知 道人类 基因组 的所有 基因。 但是这 样一来 ,基因 组和蛋 
白质组 进入了 "循环 定义" 之中: 蛋 白质组 是以基 因组拥 有的所 有基因 的表达 产物来 构成, 
而所 有基因 的确定 又必须 通过蛋 白质组 来给予 肯定。 当然, 蛋 白质是 最终的 尺度。 确定 
了一个 蛋白质 就肯定 了一个 基因, 但确定 了一个 ORF 却并不 能肯定 它会有 对应的 蛋白质 
产物。 

即 使基因 注释或 ORF 数目的 问题我 们能够 解决, 这些 ORF 是否 与蛋白 质存在 一一 
对应关 系也仍 是一个 问题。 一方面 , 人们已 经发现 有许多 "拟 基因" ( pseudogene) 的存在 , 
这 些拟基 因有和 真基因 相同的 ORF ,但 却从不 表达。 另一 方面, 由 于存在 RNA 水 平上遗 
传信息 的加工 —— mRNA 编辑 (RNA editing) 和蛋 白质水 平上遗 传信息 的加工 —— 蛋白 
质剪切 (protein splicing) ,许多 蛋白质 很难找 到直接 对应的 ORF。 所以, 要 想找出 一个生 
物体基 因组的 全部基 因和相 应的全 部蛋白 质是一 个非常 困难的 任务。 

(二) 有限 与无限 

对于基 因组研 究而言 ,核 心任务 是测定 所有的 DNA 碱基 序列。 例如, 芽殖酵 母基因 
组有 1 200 万碱 基对, 人类 基因组 的最新 统计为 32 亿个碱 基对。 要 测定的 基因组 不论大 
小, 其核苷 酸的数 量是明 确的。 然而, 对蛋 白质组 来说, 蛋白 质的种 类究竟 有多少 就很难 
说了。 上面 说过, 蛋白质 组可以 被定义 为基因 组基因 表达的 所有蛋 白质, 但 这一定 义没有 
考虑蛋 白质的 修饰。 细胞 内的大 部分蛋 白质通 常都被 进行过 翻译后 修饰, 主 要有磯 酸化、 
糖基化 、酰基 化等。 修饰 过的蛋 白质具 有其特 定的物 理化学 性质和 生物学 功能。 对蛋白 
质修饰 的研究 已构成 了蛋白 质组研 究的一 个重要 部分, 由此 还形成 了蛋白 质组学 的一个 
分支: 修饰蛋 白质组 学 [ 11 ] 。 如果把 一个修 饰蛋白 视为一 种新的 蛋白质 ,那 么蛋白 质组的 
蛋 白质数 量将远 远大于 相应的 基因组 的基因 数量。 在 这个意 义上, 人们估 计人类 蛋白质 
组的蛋 白质的 种类为 20 万〜 200 万 [1 2 3。 显而 易见, 对蛋白 质组的 蛋白质 数量的 估计是 
非常模 糊的。 

从蛋白 质修饰 的角度 来看, 不 仅仅是 蛋白质 组的蛋 白质种 类大大 增加, 更重要 的是, 
由于不 存在度 量蛋白 质修饰 的尺度 ,人 们也许 永远不 能像确 定基因 组核苷 酸序列 那样肯 
定 地把握 生物体 内蛋白 质组的 蛋白质 数量。 如 果说表 达的蛋 白质的 种类可 以根据 基因的 
数目来 确定, 那么 修饰形 成的蛋 白质种 类只有 依靠对 蛋白质 的直接 研究来 决定, 而 这种研 
究是 没有止 境的, 因 为蛋白 质的修 饰和生 命的活 动密切 相关。 从这种 意义上 来说, 对基因 
组核苷 酸序列 的测定 是一种 "有限 "的 工作, 而 对蛋白 质组的 蛋白质 种类的 确定则 是一种 
"无限 "的 工作。 

. 235 • 



(三) 静态 与动态 

一个 个体的 基因组 自 个 体诞生 到死亡 , 始 终保持 不变。 而作为 新陈代 谢的主 要执行 
者的蛋 白质组 ,在个 体的生 命活动 中却总 是变动 不停。 人们 可以通 过确定 变化的 蛋白质 
来 理解其 功能。 因此, 蛋白质 组研究 的一个 重要任 务是, 找出 蛋白质 组里发 生了变 化的蛋 
白质。 生命活 动中的 蛋白质 可以大 致分为 两类: 一类是 比较稳 定的, 如负责 细胞各 种结构 
组 成的蛋 白质。 另一 类则是 随细胞 的活动 和状态 发生量 或质变 化的蛋 白质, 如负 责信号 
转导 或细胞 活动调 控的蛋 白质。 在这种 意义上 ,人们 把以研 究蛋白 质变化 为主的 蛋白质 

组学 称为功 能蛋白 质组学 (functional proteomics)。 它 主要是 比较在 不同生 长状态 下或病 
理情 况下的 同一种 细胞或 组织的 蛋白质 组内的 差异蛋 白质。 与此相 对应, 测定一 个细胞 
或组 织含有 的全部 蛋白质 种类的 研究就 是通常 所说的 蛋白质 组学。 例如 "Large Scale 
Proteomics" 公司 正在从 事的" 人类 蛋白质 索引" (Human Protein Index, HPI) 项目, 就是 
要建 立一个 人类所 有蛋白 质的数 据库; 据说目 前已从 157 种不同 的组织 中得到 11.5 万种 
蛋白质 [ 1 3] 。 

这种对 蛋白质 动态的 研究又 引出了 蛋白质 组学的 另一个 问题, 即怎样 区分差 异蛋白 
质是 属于生 物学意 义上的 还是实 验意义 上的。 因为 蛋白质 的稳定 性要比 核酸差 得多, 在 
制备 的过程 中可能 会发生 降解或 丢失。 此外, 差异蛋 白质的 区分通 常是通 过蛋白 质双向 
凝胶 电泳来 检测, 而双向 电泳由 于自身 分辨率 的限制 ,难 以测定 微量的 蛋白质 变化。 有实 
验表明 ,目前 的双向 电泳技 术对酵 母细胞 中低于 1 000 个 拷贝量 的蛋白 质是检 测不到 
的 [ 1 4] 。 还有 一个问 题是, 对于大 多数差 异蛋白 质而言 ,有或 无这类 质的变 化的差 异蛋白 
质 较少, 而在量 的增减 方面的 差异蛋 白质则 较多。 由于 双向电 泳技术 的不稳 定性, 所以要 
准确 测定蛋 白质量 的差异 是一个 困难的 任务。 因此, 从动态 的角度 来研究 蛋白质 组是当 
前蛋白 质组学 的一个 挑战。 

尽管 测定差 异蛋白 质的技 术难度 较大, 但 功能蛋 白质组 学在今 后一段 时间将 仍然是 
蛋白 质组研 究领域 的主要 方向。 首先, 蛋白 质的差 异和变 化是生 命活动 的重要 方式; 发现 
在正常 和病理 状态下 出 现差异 的蛋 白 质常常 是认识 和防治 疾病的 关键。 因 此大多 数研究 
者仅 仅关心 寻找蛋 白质的 差异表 达谱。 其次, 鉴定出 一个细 胞或组 织中的 所有蛋 白质是 
一项费 时费钱 的工作 ,需要 大量的 人力和 物力。 相比 之下, 测 定差异 蛋白质 的任务 需要的 
投 人就小 得多。 

(四) 时间 与空间 

DNA 通常位 于细胞 核内, 且保持 稳定, 因此 测定基 因组的 DNA 序列是 不受时 空的影 
响。 对于 转录的 mRNA 来说, 时间 是主要 的参考 因素, 在发 育的不 同阶段 或细胞 的不同 
活动 时期, mRNA 的表达 是不一 样的。 因此, 在研究 转录组 或基因 芯片时 必须考 虑到时 
间, 但通 常不需 要考虑 空间的 影响。 而在 蛋白质 组的研 究中, 不仅 要考虑 时间的 因素, 更 
要考虑 空间的 影响。 首先, 不同的 的蛋白 质分布 在细胞 的不同 部位。 它们 的功能 与其空 
间定 位密切 相关。 要想真 正了解 蛋白质 的功能 ,必 须要知 道蛋白 质所处 的空间 位置。 其 
次, 许多 蛋白质 在细胞 里不是 静止不 动的, 它们 在细胞 里常常 通过在 不同的 亚细胞 环境里 
的运 动发挥 作用。 例如, 在细胞 周期的 调控过 程中, 磯 酸酯酶 Cdc25 在细胞 核内对 蛋白激 
. 236 . 



m Cdc2 进行去 磯酸化 , 从 而激活 Cdc2 , 使细 胞进人 分裂期 。 如果 DNA 损 伤发生 , Cdc25 
会 被一种 14-3-3 蛋白 从细胞 核内转 运到胞 质内, 导致 核内的 Cdc2 保持磯 酸化和 失活状 
态, 使细胞 停滞在 G2 期 [ 1 5] 。 细 胞的信 号传导 和转录 调控也 常依赖 于蛋白 质在空 间位置 
的 变化和 运动。 因此, 蛋 白质组 学中又 派生了 一个与 空间紧 密相关 的新研 究领域 —— 亚 
细胞蛋 白质组 学 [ 1 6] ,这种 亚细胞 蛋白质 组可能 是细胞 器蛋白 质组, 如高 尔基体 蛋白质 
组 [ 1 7] ;也可 能是比 细胞器 还要小 的组分 —— 如核膜 [1 8 ]。 对 亚细胞 蛋白质 组的研 究将有 
助于对 亚细胞 结构和 功能的 理解。 此外, 值得一 提的是 ,分级 分离技 术对于 研究细 胞的整 
体蛋白 质组也 是很有 用的。 目前双 向电泳 技术能 分离的 蛋白质 数量最 多是几 千种, 而一 
个细胞 内的蛋 白质数 量通常 会超过 万种, 尤其是 高等真 核生物 的细胞 ,可能 有数万 种蛋白 
质。 因此, 用双 向电泳 技术分 离全细 胞的蛋 白质组 分的效 果很不 理想。 如 果利用 细胞的 
分级分 离技术 , 人们 可以把 细胞不 同组分 的蛋白 质谱 分别进 行鉴定 , 然后再 进行" 组装" , 
从而 得到细 胞完整 的蛋白 质谱。 

对 于亚细 胞蛋白 质组学 来说, 关键技 术是对 细胞进 行恰当 的分级 分离。 由此, 蛋白质 
组 研究又 面临着 一个新 的挑战 : 如 何获得 完整的 亚细胞 成分。 在 这种分 级分离 过程中 , 既 
要避免 待研究 的亚细 胞组成 蛋白质 的丢失 ,又要 避免非 组成蛋 白质的 "污 染"。 另外, 如何 
区别 亚细胞 组成蛋 白质和 由于生 理作用 而在细 胞不同 区域进 行运动 的蛋白 质也是 亚细胞 
蛋白质 组的一 个技术 难点。 例如, 负责转 运蛋白 质的高 尔基体 ,既有 组成蛋 白质, 也有待 
输送的 蛋白质 ,在 研究高 尔基体 蛋白质 组时应 该加以 区分。 

(五) 孤立行 为与相 互作用 

基因 组的基 因表达 的各种 mRNA 是彼此 孤立的 ,互不 干扰。 但是 mRNA 的产物 
—— 蛋白 质正好 相反, 它们彼 此间有 着广泛 的相互 作用。 也许可 以说, 不存 在不与 其他蛋 
白质 发生作 用的" 孤 立蛋白 质"。 蛋白质 的功能 的实现 离不开 蛋白质 与蛋白 质或蛋 白质与 
其他生 物大分 子之间 的相互 作用。 所以, 蛋白 质组研 究的一 个主要 内容是 研究大 规模的 

蛋白质 的相互 作用。 科 学家为 此专门 发明了 一个新 的名词 —— "相互作用组"(11^6^0 

tome)[i9]。 

相互 作用组 研究可 以分为 两类。 第一 类是研 究蛋白 质相互 作用的 网络。 细胞 内的许 
多活 动如信 号转导 等都是 通过一 个复杂 而广泛 的蛋白 质相互 作用网 络来实 现的。 不久 
前, 科学家 通过大 规模双 杂交的 手段, 利用 27 种蛋 白质对 线虫的 基因组 进行了 筛选, 得到 
了参 与线虫 生殖器 发育的 124 种发生 相互作 用的蛋 白质, 其中 大约有 100 种是未 知功能 
的蛋白 质 [2 ° ] 。 对这 一类型 的研究 来说, 除了大 规模双 杂交技 术外, 人们还 使用了 噬菌体 
显 示技术 (phage-display) 和蛋 白质芯 片技术 [22] 。 对于 大规模 蛋白质 相互作 用分析 而言, 
最突 出 的 技术问 题是虚 假信号 比较多 , 如双 杂交技 术容易 出 现 假阳性 , 而噬 菌体显 示技术 
则容易 产生假 阴性。 显然, 如果把 不同技 术结合 起来, 可以把 结果进 行互补 ,从而 更准确 
地描绘 出蛋白 质的相 互作用 网络。 

相互作 用组的 另一类 研究是 蛋白质 复合体 组成的 分析。 蛋白质 复合体 通常可 以分为 
两种。 一种 是结构 型的蛋 白质复 合体, 如核孔 复合体 ;这 一类通 常比较 稳定。 另一 种则是 
功能型 蛋白质 复合体 ,例如 ,负 责转录 的转录 蛋白复 合体或 者负责 DNA 复 制的复 制蛋白 
复合体 ;这类 复合体 只有在 执行功 能时才 聚合在 一起, 因 此很不 稳定。 对于 结构型 蛋白质 

. 237 . 



复合体 , 通常采 用分级 分离的 方法进 行富集 , 然 后再用 经典的 蛋白质 组研究 方法如 电泳和 
质 谱进行 研究。 但 对于功 能型蛋 白质复 合体, 现有的 方法就 很难胜 任了。 最近, 研 究者发 
明了 一种新 的分离 方法, 可能有 助于对 这类蛋 白质复 合体的 研究。 首先是 构造能 够表达 

含有 特定标 签肽段 (tag) 的 复合蛋 白质的 质粒, 这些质 粒表达 的蛋白 质在正 常生理 状态下 
与细胞 内能够 与其发 生相互 作用的 其他种 类蛋白 质形成 复合物 ;然 后通过 对标签 肽段有 
专一亲 和性的 亲和分 离柱进 行提取 ,最 后再通 过电泳 和质谱 对这些 蛋白质 复合物 的组分 
进行分 析 [23 ' 24] 。 发 展对蛋 白质复 合体的 研究技 术将是 今后蛋 白质组 学的一 项重要 任务。 

(六) 单一手 段与多 种技术 

对于 研究核 酸和蛋 白质这 类生物 大分子 来说, 测定 其序列 是首要 任务。 在 20 世纪 
50 年代 分子生 物学刚 刚诞生 之际, 科学 家就发 明了测 定蛋白 质氨基 酸序列 的方法 〔25] 。 
在 70 年代 研究者 又发明 了测定 DNA 核昔酸 序列的 化学法 和酶法 [26 ' 27] 。 随 后人们 发现, 
测定 DNA 的 核苷酸 序列要 远比测 定蛋白 质的氨 基酸序 列容易 得多。 因此, 在 80 年代和 
90 年代, 测定 DNA 序列成 为分子 生物学 研究的 一个主 要手段 ,而蛋 白质序 列的测 定则很 
少人 问津。 即使需 要知道 某种蛋 白质的 序列, 研究者 也尽可 能试图 先得到 其编码 的基因 
或 cDNA ,测定 其核苷 酸序列 ,最后 再推出 对应的 蛋白质 序列。 但是, 对于 蛋白质 组研究 
而言, 测序 工作不 再是一 个可以 绕开的 问题。 生 物质谱 技术的 出现, 为蛋白 质序列 测定提 
供了 一个最 主要的 手段。 这也就 是为什 么质谱 技术现 已成为 蛋白质 组研究 的核心 技术的 
原因。 

前面已 讨论过 ,基 因组既 无量的 变化, 也没 有质的 变化。 在基 因组研 究中, DNA 测序 
技 术是一 个最基 本和最 主要的 工具。 这 是因为 基因组 的均一 性和简 单性使 得一种 单一的 
技术 就能胜 任基因 组研究 任务。 但是, 在蛋白 质组研 究中, 需 要的研 究技术 就远远 不止一 
种, 并且 技术的 难度也 远远大 于基因 组研究 技术。 

蛋 白质组 研究技 术可以 简单地 分为两 大类。 第一 类是蛋 白质组 的分离 技术。 前面所 
说过的 双向电 泳技术 、细胞 分级分 离技术 、亲和 层析技 术都是 蛋白质 组常用 的分离 技术。 
蛋白 质组分 离有这 样几个 难点。 首先 是量的 问题, 不 同的蛋 白质数 量在细 胞内可 以有很 
大的 差别。 例如, 在 酵母细 胞里, 有些细 胞周期 调控蛋 白不到 100 个 分子, 而糖基 酶可能 
有 200 万个分 子 [ 2« ] 。 估计 蛋白质 量的动 态差别 可达到 10 6 数 量级。 其次 是质的 问题, 蛋 
白 质是由 20 种化学 性质各 异的氨 基酸所 组成, 因此不 同的蛋 白质的 物理化 学性质 差别很 
大。 有些蛋 白质易 溶于极 性溶剂 ,有些 蛋白质 则难溶 于极性 溶剂; 有些蛋 白质较 稳定, 有 
些蛋白 质则易 降解。 目前 膜蛋白 的提取 仍很不 理想。 

第二 类是蛋 白质组 的鉴定 技术, 其核心 是质谱 技术。 蛋白 质芯片 技术、 噬菌体 显示技 
术 和大规 模双杂 交方法 等也属 于鉴定 技术。 现有 鉴定技 术面临 的一个 最大问 题是, 它们 
都依赖 于已知 的蛋白 质或基 因的序 列作为 检测的 基础, 通过比 较来确 定待测 定的蛋 白质。 
对于在 已有数 据库中 没有记 载的全 新蛋白 质进行 "从头 测定" (cfe novo identification) 是一 
个很 困难的 任务, 一般 是利用 经典的 Edman 降解 法进行 N 端序列 测定或 C 端化 学降解 
法测定 C 端序 列。 

简而 言之, 蛋 白质组 研究对 技术的 依赖性 和要求 远远超 过基因 组学。 目前, 蛋 白质组 
学 的研究 技术还 有很多 不完善 之处, 许多新 技术正 在研发 之中。 因此, 蛋白 质组学 的发展 
• 238 . 



是受 技术限 制的, 也是受 技术推 动的。 

' (七) 互补 与互助 

自从 20 世 纪中叶 分子生 物学因 DNA 结构 和蛋白 质结构 的解析 而诞生 以来, 现代生 
命 科学的 主旋律 一直是 围绕着 核酸与 蛋白质 展开。 在后 基因组 时代, 蛋白 质组研 究和基 
因 组研究 依然是 形影相 随的两 个重要 领域。 它们 之间既 为互相 补充又 能互相 帮助。 

当 基因组 测序工 作结束 之后, 下一个 主要任 务是要 进行基 因注释 (annotation) ,找出 
所有 可能的 基因或 ORF。 前面曾 经说过 ,一 般情况 下注释 的出错 率是比 较高的 [ iG ] 。 但 
是, 如果 有蛋白 质组的 数据作 参考, 可 以大大 提高注 释的正 确率。 此外, 由 于高等 真核生 
物个体 的基因 大多是 非连续 性的, 即由 编码氨 基酸的 外显子 和非编 码氨基 酸的内 含子所 
组成, 因 此确定 完整的 ORF 也非 易事。 显然, 利用 蛋白质 的序列 来推测 和确定 ORF 的全 
长也是 很有帮 助的。 

mRNA 是介 于基因 和蛋白 质之间 的中间 产物。 因 为它既 是基因 的直接 产物, 又比蛋 
白质 要容易 分析, 所以, 研究 mRNA 的 表达模 式也是 了解基 因组和 蛋白质 组的一 个重要 
途径。 为此专 门形成 了一个 新的研 究领域 —— 转录组 (transcriptome)。 研 究转录 组的主 
要手 段是基 因芯片 技术, 此外如 SAGE 技术 也可用 于转录 组研究 [29] 。 有报道 认为, 可以 
从 mRNA 的转录 水平去 测定相 应的蛋 白质的 含量。 在酵母 细胞里 ,一个 mRNA 分子大 
约能 翻译出 4 000 个蛋白 质分子 [28] 。 

蛋白质 组的许 多工作 也离不 开对基 因组的 研究。 这一点 在蛋白 质相互 作用的 研究中 
尤为 突出。 双杂交 技术、 噬菌体 显示技 术等就 是以基 因组数 据和技 术为基 础的。 在质谱 
测 定蛋白 质的过 程中, 离不开 对已知 基因组 的基因 数据的 比较。 有 人把蛋 白质组 研究比 
做一 种双向 研究: 经典的 蛋白质 组学是 从蛋白 质组到 转录组 再到基 因组, 而" 反向 蛋白质 
组学" (reverse proteomics) 则是从 基因组 到转录 组再到 蛋白质 组 [3 ] 。 

三、 蛋白质 组学发 展趋势 

蛋 白质组 学一经 出现, 就有两 种研究 策略。 一种可 称为" 竭泽 法", 即采 用高通 量的蛋 
白质组 研究技 术分析 生物体 内尽可 能多乃 至接近 所有的 蛋白质 ,这种 观点从 大规模 、系统 
性的角 度来看 待蛋白 质组学 ,也 更符合 蛋白质 组学的 本质。 但是, 由 于蛋白 质表达 随空间 
和时 间不断 变化, 要分析 生物体 内所有 的蛋白 质是一 个难以 实现的 目标。 另一种 策略可 
称为" 功能 法", 即研究 不同时 期细胞 蛋白质 组成的 变化, 如蛋 白质在 不同环 境下的 差异表 
达, 以发现 有差异 的蛋白 质种类 为主要 目标。 这种观 点更倾 向于把 蛋白质 组学作 为研究 
生命 现象的 手段和 方法。 

早期蛋 白质组 学的研 究范围 主要是 指蛋白 质的表 达模式 (expression profile), 随着学 
科的 发展, 蛋白 质组学 的研究 范围也 在不断 完善和 扩充。 蛋 白质翻 译后修 饰研究 已成为 
蛋 白质组 研究中 的重要 部分。 蛋 白质- 蛋白质 相互作 用的研 究也已 被纳人 蛋白质 组学的 
研究 范畴。 而蛋白 质高级 结构的 解析即 传统的 结构生 物学, 虽也有 人试图 将其纳 人蛋白 
质组 学研究 范围, 但目前 仍独树 一帜。 

在基 础研究 方面, 近两 年来蛋 白质组 研究技 术已被 应用到 各种生 命科学 领域, 如细胞 

. 239 . 



生物学 、神 经生物 学等。 在研究 对象上 ,覆盖 了原核 微生物 、真核 微生物 、植 物和动 物等范 
围 , 涉 及到各 种重要 的生物 学现象 , 如信 号转导 、细胞 分化、 蛋白 质折 叠等。 在未来 的发展 
中, 蛋白 质 组学的 研究领 域将更 加广泛 。 ' 

在应 用研究 方面, 蛋 白质组 学将成 为寻找 疾病分 子标记 和药物 靶标最 有效的 方法之 
一。 在对 癌症、 早 老性痴 呆等人 类重大 疾病的 临床诊 断和治 疗方面 蛋白质 组技术 也有十 
分诱人 的前景 ,目 前国际 上许多 大型药 物公司 正投入 大量的 人力和 物力进 行蛋白 质组学 
方面的 应用性 研究。 

在技 术发展 方面, 蛋白 质组学 的研究 方法将 出现多 种技术 并存、 各有优 势和局 限的局 
面, 而难以 像基因 组研究 一样形 成比较 一致的 方法。 除了发 展新方 法外, 更 强调各 种方法 
间的 整合和 互补, 以适 应不同 蛋白质 的不同 特征。 另外, 蛋白 质组学 与其他 学科的 交叉也 
将日益 显著和 重要, 这种交 叉是新 技术、 新方法 的活水 之源, 更重要 的是, 蛋 白质组 学与其 

他大规 模科学 如基因 组学、 生物信 息学等 领域的 交叉, 所 呈现出 的系统 生物学 (systems 
biobgy) 研究 模式, 将 成为未 来生命 科学最 令人激 动的新 前沿。 

(吴 家睿 曾 碌) 

参 考文献 

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241 



第 十三章 祥品 的全 息制备 

蛋白质 样品制 备是蛋 白质组 研究的 第一步 ,无论 后续采 用怎样 的分离 或鉴定 手段, 样 
品 制备都 是关键 步骤。 从 蛋白质 组大规 模研究 的角度 而言, 要求样 品制备 尽可能 获得所 
有的蛋 白质, 但由于 蛋白质 种类多 、丰 度不一 和物化 特性多 样等, 要 达到真 正的全 息制备 
是有难 度的。 当然, 样品制 备的方 法还必 须与后 续的分 离或鉴 定方法 相匹配 ,如采 用双向 

凝胶 电泳, 需谨 慎使用 SDS 抽提蛋 白质, 如果 以液相 色谱作 为分离 手段, 太 多的去 污剂和 
两性 电解质 不是一 个好的 选择。 更重要 的是, 样 品的来 源千差 万别, 针对不 同来源 的样品 
(如细 胞样品 、动 物组 织样品 、植 物样品 、体液 等), 需要采 取不同 的蛋白 质抽提 方法。 本章 
就 常规样 品的制 备和不 同来源 蛋白质 的样品 制备进 行详细 阐述。 

第一节 双 向凝胶 电泳常 规样品 制备及 其改进 

一、 概 述 

目 前 蛋白质 组研究 技术发 展很快 ,新 的研究 方法和 研究手 段不断 涌现, 如毛细 管等电 
聚焦 [ 1 ] 、多 维色谱 [2] 、分 子扫描 仪和微 流芯片 〔3] 等。 而 双向凝 胶电泳 (twodimensional gel 
electrophoresis) 技术 是蛋白 质组研 究中最 早的支 撑技术 之一, 自 0'Farell [4] 等提出 以来, 
已有近 30 年的 历史。 由于 双向凝 胶电泳 技术具 有高分 辨率、 高重 复性、 微 量分析 和制备 
等 性能, 仍然是 当今蛋 白质组 分析研 究中的 一个强 有力的 工具。 因 而针对 双向凝 胶电泳 
样 品制备 方法的 探索也 是蛋白 质组研 究的一 个重要 方面。 

目前 双向凝 胶电泳 的双向 一般是 指第一 向为等 电聚焦 (IEF), 根据蛋 白质等 电点进 
行分离 ;第 二向为 SDS 凝 胶电泳 (SDS^PAGE) ,根据 蛋白质 的相对 分子质 量进行 分离。 所 
以, 在样品 制备过 程中, 一切影 响等电 聚焦和 凝胶电 泳的因 素都应 该考虑 在内。 样 品制备 
绝对 是一门 艺术, 方法 可以从 简单的 缓冲液 溶解, 到应用 离液剂 、还 原剂及 去污剂 来进行 
复合物 提取, 以及 到更复 杂的顺 序提取 (sequence extracting) [5 ' 6] 和亚 细胞分 级等。 由于 
实验需 求的不 同以及 样品本 身的特 殊性, 没有 一种样 品制备 方法能 够广泛 地适用 于各种 
各样的 样品。 所以, 对于每 一个有 着不同 要求的 样品, 都需要 通过大 量的实 验来摸 索最合 
适 的实验 条件。 有 效的可 重复的 样品制 备方法 是双向 凝胶电 泳成功 的关键 [7 ~iG ] 。 一般 

来说, 一 种理想 的有效 的样品 制备方 法应该 满足以 下几点 要求。 

① 在 合适盐 浓度下 , 可重 复地溶 解所有 的蛋白 质 , 包括疏 水性蛋 白 质 , 并使样 品 中 的 
蛋白质 以分离 的多肽 链形式 存在。 

② 避 免溶解 性低的 蛋白质 (如膜 蛋白) 在 等电聚 焦时由 于溶解 度降低 而沉淀 析出。 

③ 防止 蛋白质 的化学 修饰, 包括 蛋白质 降解、 蛋白 酶或尿 素热分 解后所 引起的 修饰。 

④ 排除 核酸、 多糖、 脂 类和其 他干扰 分子。 

⑤ 获 得的目 标蛋白 质应在 可探测 水平, 有时 需要去 除高丰 度蛋白 质和不 相关蛋 白质。 
- 242 • 



样品裂 解液中 各种成 分分析 



为获 得最佳 的双向 电 泳分离 结果, 样品一 般使用 促溶剂 、去 污剂 、还 原剂 、 IPG 缓冲液 
和两 性电解 质等将 其变性 并充分 溶解。 然而这 些化学 物质应 满足一 些化学 和电学 要求, 
如适合 IPG 胶条的 IEF 技术、 保持蛋 白质最 大的溶 解性和 尽可能 低的离 子强度 (等 电聚 

焦加 以高电 压时, 低离子 强度使 得电流 很低, 保证 了聚焦 的快速 和高效 )。 关于溶 解方法 
更多具 体内容 在许多 相关文 章中均 有讨论 [ 10~1 2] 。 

(-) 离液剂 

尿 素是最 常用的 离液剂 (chaotropic agent) ,它的 主要作 用是改 变或破 坏氣键 等次级 
键的 结构, 使得蛋 白质变 性并使 蛋白酶 失活。 硫 脲和尿 素联合 使用, 可以大 大增加 蛋白质 
的溶 解性, 特别是 膜蛋白 的溶解 性 [ 1 3 ,1 4] 。 尿素和 硫腺有 效地破 坏了疏 水键, 防止 了聚集 
作用 和二级 结构的 形成, 聚集 作用和 二级结 构的形 成会改 变蛋白 质的迁 移性。 然 而硫脲 
在 水中的 溶解性 很差, 需要高 浓度的 尿素来 助溶, 因此在 实际应 用中, 需要高 溶解强 度时, 
一般用 2mol/L 硫脲和 5〜8mol/L 尿 素联合 使用。 

(二) 还原剂 

还原剂 (reducing agent) 主 要是用 来断裂 蛋白质 分子中 Cys 残基 之间形 成的二 硫键, 
增 加蛋白 质的溶 解性。 常 用的还 原剂有 (3- 巯基 乙醇、 DTT 或 DTE(Dithioerythreitol) 和 
三 丁基膦 (TBP) 等。 其中 DTT 是使用 比较 广泛的 还原剂 , 它在 50mmol/L 时能有 效地还 
原大部 分的二 硫键, 但有些 蛋白质 仍不能 完全被 还原。 但是 如果过 分提高 DTT 的 浓度, 
由 于它的 pKa 在 8 左右, 因而会 影响到 pH 梯度。 另外, DTT 在碱性 pH 值 下会发 生去质 
子化, 在等电 聚焦时 ,向阳 极发生 迁移, 使得 阴极的 DTT 损耗 而不足 [IS], 导致二 硫键复 
原, 蛋白质 沉淀。 而非 离子型 还原剂 TBP 则比 DTT 更加 有效, 能大 大增加 蛋白质 的溶解 
性, 在低 摩尔浓 度下就 能使蛋 白质得 以还原 [ 1 6] 。 

(三) 去污剂 

I 去污 剂的作 用主要 是破坏 蛋白质 分子之 间的疏 水相互 作用, 提高蛋 白质的 溶解性 ,防 

止 在等电 聚焦时 析出。 去污 剂有离 子型、 非离 子型和 兼性离 子型等 几类。 经常使 用的去 
污剂有 阴离子 去污剂 SDS ,非 离子 去污剂 TritonX-100 和 NP-40, 两 性离子 去污剂 CHAPS 
^ 等。 原则上 去污剂 应该是 非离子 型或者 是兼性 离子型 ,这样 才不会 影响蛋 白质迁 移到它 
P 们 各自的 等电点 位置。 离 子型去 污剂如 SDS 不利 于等电 聚焦, 然 而由于 SDS 的缓 冲液可 
抑制 蛋白质 被内源 性蛋白 水解酶 降解, 并提 高了蛋 白质的 溶解性 [ 1 7] ,特别 是膜蛋 白的溶 
I 解性, 因此 一般只 用于样 品处理 的初级 阶段。 在 SDS 浓度 不高于 0.3% 时, 对等电 聚焦不 
会产生 太大的 影响。 传统 的非离 子型去 污剂, 如 Triton X-100 和 NP-40, 以 前用得 较多, 
现多 数以兼 性离子 去污剂 CHAPS (3-[( 3-Cholamidopropyl ) -Dimethylammonio ] - 1 -Pro 
Pane Sulfonate) 代替。 CHAPS 比 其他去 污剂溶 解疏水 性氨基 酸残基 的能力 更强, 其使用 
浓度 一般在 1%〜2%。 然而 它在高 浓度脲 中的溶 解度比 较低, 因此 不断有 新的去 污剂涌 

. 243 . 



现出来 ,如 新的兼 性离子 去污剂 ASB44 [ i 8] (amidosulfobetaine 14) ,Molloy 等人 [ i 9] 把有机 
溶剂抽 提的大 肠杆菌 蛋白质 溶于含 ASB^14 的增溶 溶液中 ,发现 蛋白质 的溶解 性比用 SB 
3-10 和 CHAPS 好; 从 13 个被 鉴定的 蛋白质 中发现 8 个是 以前在 双向胶 上没有 发现过 
的, 其中 5 个 都是疏 水性蛋 白质。 

(四) 两 性电解 质载体 - 

在去 污剂存 在的情 况下, 某 些蛋白 质在等 电聚焦 的时候 仍旧容 易沉淀 在它们 的等电 
点上。 为 了防止 这种现 象的出 现需要 向蛋白 质溶液 中加人 某些盐 类以增 加蛋白 质溶解 
度, 但是与 此同时 这些盐 类又会 使聚焦 效果不 理想。 为了解 决这个 问题, 通 常在缓 冲液中 
加入两 性电解 质作为 载体。 两性电 解质能 够促进 蛋白质 的溶解 ,吸 附高浓 度尿素 在溶液 
中形成 的氰酸 盐离子 (cyanate ions) ,离 心时还 有助于 核酸的 沉淀。 此外, 它 还可以 阻止样 
品蛋 白质和 IPG 胶条 中固相 化的两 性电解 质相互 作用。 一 定浓度 的两性 电解质 会提高 
蛋白质 溶解性 ,在 第一向 等电聚 焦时, 提高 极性端 蛋白质 的聚焦 效果, 如图 13.1 所示。 

pi 9.5 I I pi 3.5 pi 9.5 I 

B ^. .. 



+ pi 3.5 



-ft 



严 



-,. 



一 ■■ . Jk-^n—-* ― - — -. - ^一 癧 ,. 

图 13.1 两性电 解质对 2-DE 分辨率 的影响 
样 品取自 培养的 ECV 304 细胞, A 和 B 上样 量均为 lOfxg ,第 一向为 7cm pH3~10 NL IPG 胶条, 第 二向为 11% 的 
PAGE。 A ,两性 电解质 浓度为 0.5%; B, 两性 电解质 浓度为 2% 

以上介 绍的是 常规使 用的各 种裂解 液成分 对样品 蛋白质 的作用 ,保证 蛋白质 达到最 
大的溶 解度并 适合双 向凝胶 电泳。 关于裂 解液的 配方, 由于 不同实 验室有 着不同 的习惯 
和需求 ,配方 也千差 万别。 G5rg[l 5 ] 总结了 三种裂 解液的 配方。 

① 9mol/L 脲, 1% (m/V) DTT, 2o/o〜4o/o (m/V) CHAPS, 2% (V/V) 两 性电解 
质, pH3~10 和 lOmmol/L Pefabloc 蛋 白酶抑 制剂。 

② 7mol/L 脲, 2mol/L 硫脲, lo/o (m/V) DTT, 2Q/o〜4% (m/V) CHAPS, 2% ( V/ 
V) 两性电 解质, pH3〜10 和 lOmmol/L Pefabloc 蛋 白酶抑 制剂。 

③ 热的 SDS 缓冲液 :1% (m/V) SDS, lOOmmol/L Tris-HCl, pH7.0, 该缓冲 液裂解 
样品 后至少 3 倍 稀释于 1 或 2 的裂解 液中。 根 据目标 蛋白质 的特性 和实验 要求, 我们同 
样 可以摸 索出更 合适的 裂解液 配方, 进行有 效重复 的样品 制备。 



244 



三、 双向凝 胶电泳 常规样 品制备 

样 品制备 时要使 用新鲜 的样品 或者将 新鲜样 品速冻 (液 氮或- 701:) 保存; 注意防 
止污染 ,佩戴 乳胶手 套等。 整 个操作 过程在 冷库或 冰浴中 进行, 避免蛋 白质的 降解、 修饰。 
下 面以最 简单的 培养细 胞的样 品制备 为例, 介绍操 作步骤 如下。 

① 常 规细胞 培养, 待长至 80 96 左右密 度时, 在处 理前一 天更换 新鲜培 养液。 

② 吸去培 养液, 用预冷 PBS 清洗 细胞, 重复 3 次。 

③ 按 1 X 10 6 细胞加 50/il 的量 往培养 皿中加 裂解液 (8mol/L Urea, 4% CHAPS, 
40mmol/L Tris,65mmol/L DTT) ,刮刀 收集。 

④ 进行 超声波 处理, 处理 时间为 5s ,间歇 时间为 10s ,功 率为 100~120W ,超声 处理至 
溶液 清澈无 點稱物 为止。 

⑤ 41C 、25 OOOg 离心 lh。 

⑥ 取上 清测蛋 白质浓 度后, 分装后 -70t: 冰箱中 冻存。 

四、 蛋白 质顾序 提取法 

由于在 2-DE 胶中所 能显示 出的蛋 白质的 数量, 依赖 于细胞 中蛋白 质的拷 贝数、 蛋白 
质的上 样量及 电泳后 染色方 法的灵 敏度。 为了能 够富集 低拷贝 蛋白质 ,很 多实验 室采用 
了样品 预分级 的方法 ,如 亚细胞 分级、 亲和 分级、 蛋白 质复合 物分级 和根据 蛋白质 溶解性 
的顺序 提取法 [5 , 6] 等。 另外, 窄 pH 范围的 IPG 胶条 在一定 意义上 也可以 说是富 集了低 
拷贝蛋 白质, 提 高了低 丰度蛋 白质在 2-DE 中的分 辨率。 

这里主 要介绍 蛋白质 顺序提 取法, 它 是根据 蛋白质 溶解性 差异, 用具有 不同溶 解能力 
的溶 解液进 行顺序 提取, 从而 提高了 样品在 2-DE 中的 可检测 范围。 其具 体操作 步骤如 
下 所述。 

① 溶液 A(40mmol/L Tris) 提取: 将细胞 裂解, 振荡 混勾, 12 OOOr/min 离心 8min ,取上 
清, 抽提 出细胞 中的可 溶性蛋 白质。 

② 溶液 B(8mol/L 脲, 49{)CHAPS,25mmolDTT) 提取: 在 上一步 的沉淀 物中加 入溶液 
B ,振荡 混勾, 12 OOOr/min 离心 8min ,取 上清。 

③ 溶液 C(5mol/L 腺, 2mol/L 硫脲, 2%CHAPS,2%SB3-10、2mmol/L TBP) 提取: 上 
一步的 沉淀物 用溶液 A 洗 2 次, 加溶液 C ,振荡 混勾, 12 OOOr/min 离心 8min ,取 上清。 

如有必 要也可 用更强 烈的溶 解液进 行第四 步提取 ,这样 就根据 蛋白质 溶解性 不同, 提 
取出了 不同的 蛋白质 组分, 对疏 水性很 强的蛋 白质如 膜蛋白 和低丰 度的蛋 白质起 了富集 
作用。 顺序提 取法是 目前获 得更多 蛋白质 点的一 种良好 策略。 应用 双向凝 胶电泳 分离手 
段, 一步 提取法 一般只 能获得 1 000〜2 000 个不同 的蛋白 质点; 而 使用分 级顺序 提取方 
法, 对 不同组 分进行 分离, 据报道 能够获 得上万 个不同 的蛋白 质点。 在样品 量充足 的情况 
下 , 先进行 亚细胞 器分级 , 然 后对各 个分级 组分再 进行顺 序提取 ,可 以在一 定程度 上富集 
溶解度 差及低 丰度的 蛋白质 ,尽量 把细胞 中的全 部蛋白 质提取 出来。 



245 



五、 注 意事项 

以上介 绍的是 双向凝 胶电泳 蛋白质 样品制 备的一 些常规 方法。 然而这 些制备 方法并 
不是 十分完 善的, 相信随 着不断 的实验 探索, 会 有更理 想的制 备方法 出现。 另外, 由于每 
一个样 品的特 殊性, 不同 实验中 应根据 自己的 需要对 众多的 样品制 备方法 加以选 择或者 
修改, 但不管 采用什 么方法 ,都 应该注 意以下 问题。 

① 在合适 的盐浓 度下, 应保持 蛋白质 的最大 溶解性 和可重 复性。 因此, 在样品 制备过 
程中可 选择合 适的增 溶试剂 (如脲 、硫脲 等), 以 减少疏 水性蛋 白质的 损失。 

② 选择 合适的 表面活 性剂和 还原剂 ,破 坏所有 |[^ 共价结 合的蛋 白质复 合物和 共价键 
二硫键 , 使 其形成 一个各 自 多肽的 溶液。 

③ 尽 量除去 核酸、 多糖、 脂!^ 等干扰 分子。 

④ 防 止蛋白 质在样 品处理 过程中 的人为 修饰, 制备过 程应在 低温下 进行, 以避 免细胞 
破 碎释放 出的各 种酶类 的修饰 (建议 加入合 适的蛋 白酶抑 制剂) ;含 有脲的 试剂不 要加热 

(温度 不高于 37t:) ,避免 尿素分 解产生 的异硫 氰酸盐 引起氨 基甲酰 化而导 致电荷 的不均 
一性; 佩戴乳 胶手套 ,减 少来自 头发和 皮肤的 角蛋白 污染。 

⑤ 裂解 液新鲜 配置, 分 装后置 - 801: 冰箱中 保存, 注意不 要反复 冻融。 

⑥ 样品 建议分 装成合 适的量 ,然 后冷冻 干燥或 者直接 以液体 状态置 -80t: 冰 箱中保 
存, 但要 注意不 要反复 冻融。 

第二节 培养细 胞蛋白 质样品 的制备 

在蛋白 质组研 究中, 我 们经常 利用细 胞培养 技术, 观察细 胞在不 同生理 条件下 的蛋白 
质动态 变化。 下 面主要 介绍关 于细胞 破碎样 品的几 种制备 方法。 

一、 细胞破 碎的处 理方法 

细胞破 碎主要 包括机 械和化 学方法 两种。 由于在 细胞破 碎时会 释放出 一些蛋 白酶及 
其他引 起蛋白 质修饰 的酶。 为了避 免这种 情况, 样品中 应加蛋 白酶抑 制剂, 同时尽 量将样 
品直接 加入强 变性裂 解液中 ,在低 温及使 用预冷 的溶液 下进行 操作。 根据 裂解程 度的不 
同, 细胞破 碎方法 又可分 为以下 两种。 

(-) 温 和的裂 解方法 

裂解 对象主 要是一 些容易 裂解的 细胞, 如组 织培养 细胞、 血细胞 和微生 物等。 同时温 
和裂解 方法可 用于一 些亚细 胞分级 产物, 如线 粒体、 高尔 基体和 膜等。 有时 在制备 样品的 
时候 需要多 种裂解 方法综 合使用 来获得 目标蛋 白质。 如表 13.1 所 示为温 和裂解 方法的 
应 用对象 和操作 步骤。 



246 



表 13.1 温 和的裂 解方法 



细胞破 碎方法 



应 用对象 



操 作步骤 



渗透 溶胞法 t 2 G ] 

非 常温和 的裂解 方法, 可用于 进一步 进行亚 
细 胞分级 

冻 融裂解 [ 2 卜 23 3 

许多类 型的细 胞可以 通过快 速反复 冻融得 
到裂解 

裂解 液裂解 

含 去污剂 的裂解 液处理 组织、 细胞以 裂解细 
胞膜, 使 细胞内 容物释 放出来 

» 裂解 :24'25] 

有细 胞壁的 细胞可 以通过 藤 解去除 细胞壁 
得以温 和裂解 



血细胞 

组织培 养细胞 

细 菌细胞 
组织培 养细胞 



组织培 养细胞 



植物 细胞、 细 菌细胞 
真 菌细胞 



将细 胞悬浮 于渗透 溶胞溶 液中, 细胞 溶胀而 
释放 出细胞 内容物 

使用 液氣, 快速 反复冻 融至符 合实验 要求为 

止 

将细胞 直接置 裂解液 或样品 液中, 进 行悬浮 
处理 



将 细胞悬 浮于专 一性薛 的等渗 溶液中 



(二) 更强 烈的破 碎方法 

当破 碎不容 易破碎 的细胞 如固体 组织中 的细胞 或有坚 靭细胞 壁的细 胞时, 需 要采用 
更强烈 的破碎 方法对 细胞进 行破碎 裂解。 这些方 法可使 细胞完 全破碎 裂解, 但在 操作过 

程 中应避 免产热 及产生 泡沫。 主 要的方 法如表 13.2 所示。 

表 13.2 更强 烈的破 碎方法 



细胞破 碎方法 



应 用对象 



操 作步骤 



超声 波处理 [ 26 一^ 

超 声波产 生剪切 力使细 胞破碎 悬 浮细胞 

压 力杯法 [ 24 '仏 29 ] 
( French press pressure cell) 用髙 



要进 行间歇 处理, 减轻产 生热和 泡沫, 样品 
处理应 在冰浴 中进行 



压使细 胞穿过 小孔, 产生 剪切力 
从而新 破细胞 

研磨法 : 26 .30 - 32 ] 



微生物 细胞, 如细菌 、霄菌 、酵母 将 细胞悬 浮液置 于预冷 的压力 杯中, 施加压 
细胞 及含有 细胞壁 的细胞 力, 然 后收集 挤出液 



固体 组织细 胞微生 物细胞 



组 织或细 胞预先 用液氮 冷冻, 然后置 瓷研钵 
中 研磨成 粉末。 

加氧 化铝或 砂有助 于研磨 ' 



机械 勾菜法 f-M' 2 l' 33 l 

要防 止细胞 破碎释 放出蛋 白醉, 

引 起蛋白 质修饰 



固 体组织 , 如心脏 、肝脏 、 肾脏组 先 尽量将 组织剪 成小块 , 然后加 有蛋白 藤抑 
织和细 菌悬液 制剂的 冷勾紫 液进行 勾莱, 过 滤或离 心收集 



二、 培养 



总 蛋白质 的提取 



裂解 液裂解 方法是 很多实 验室常 用的裂 解组织 培养细 胞的样 品制备 方法。 下 面就裂 



247 



解液 裂解方 法展开 讨论, 以下的 操作过 程均在 冰浴中 进行。 这 里所涉 及的裂 解液成 分为: 

8mol/L 脲, 65mmol/L DTT, 4% CHAPS, 40mmol/L Triso 



1. 胰雜 繭 解 后裂解 

细胞 培养在 直径为 10cm 的培 养皿中 , 待 培养至 80% 左右 密度时 , 以含 0.02% EDTA 
的 0.05 96 胰 蛋白酶 消化, 细胞经 预冷的 PBS 漂洗 3 次, 离心 收集在 1.5ml 离心 管中, 加 
45(V1 裂解液 ,反复 吹打。 

2. 皿上直 接裂解 

细胞 培养在 直径为 10cm 的培养 皿中, 待 培养至 80% 左右密 度时, 细胞用 预冷的 PBS 
漂洗 3 次, 加 450^d 裂解液 , 细胞刮 刀 收集 ,用 移液器 转移至 1 . 5ml 离 心管中 , 反复 吹打。 

3. 热 SDS 裂解 [34] 

细胞 培养在 直径为 10cm 的培养 皿中, 待 培养至 800/0 左右密 度时, 细胞用 预冷的 PBS 
漂洗 3 次, 加 45(^1 热的 SDS 裂解液 (每 10ml 中, 1096SDS 30(V1, (3 - 巯 基乙醇 10(^1, 
1.5mol/LTris•Ha,pH8.8,300^a,去离子水 9.3ml) ,细 胞刮刀 收集, 用 移液器 转移至 
1.5ml 离心 管中, 反复吹 打后, 把离 心管置 入液氮 中迅速 冷冻。 在不 加热情 况下, 真空离 
心冻干 样品。 用原 来体积 的样品 缓冲液 重新溶 解样品 (100ml 中, 尿素 59.7g, NP-40 4g, 
DTT1.54g, 两性 电解质 pH3 〜: 10 5.5g, 去 离子水 44.9ml) 。 

最终 所有的 样品用 超声细 胞破碎 仪超声 处理, 超声 时间为 5s ,间歇 时间为 10s ,功率 
为 100〜120W ,超 声处理 至溶液 清澈无 點稠物 为止, 处理 过程在 冰浴中 进行。 超 声处理 
后, 41C 、25 OOOg 离心 lh。 取上清 进行蛋 白质浓 度测量 ,按 实验所 需的量 分装后 -801: 冰 
箱 中保存 备用。 如图 13.2 所示, A、B、C 分别 为以上 三种方 法单独 制备的 样品在 相同的 
条件下 得到的 2-DE 图谱。 从图 13.2 可以 看出, 在上 样量相 同的情 况下, 胰酶酶 解后裂 
解 的样品 A 比 B 和 C 的蛋 白质点 要少, 认为在 胰酶酶 解破碎 细胞过 程中有 一小部 分蛋白 
质受到 了损失 ;热 SDS 裂 解制备 的样品 C 在等 电聚 焦方面 比样品 A 和 B 要差, 认 为低浓 

A - B , C 、7 



图 13.2 不 同的细 胞裂解 方法对 2-DE 分辨率 的影响 
样 品取自 培养的 ECV 304 细胞, A 和 B 上样 量均为 lOfig ,第 一向为 7cmpH3- 10 NL IPG 胶条, 第 二向为 11% 的 
PAGE。 A, 胰薛 薛 解后 裂解的 样品的 2-DE 图谱; B ,细胞 培养皿 上直接 裂解的 样品的 2-DE 图谱; C ,热 SDS 裂解制 

备的 样品的 2-DE 图谱 

- 248 • 



度的 SDS 在 一定程 度上同 样影响 了第一 向等电 聚焦; 另外, 由于 SDS 量的 增大, 在 图谱中 
垂直 位置上 出现了 一些新 的点, 可能 是由于 SDS 包被的 情况不 一样所 引起, 如图 13. 2C 
中箭头 所示。 

以上 为贴壁 培养细 胞的样 品制备 方法, 至于悬 浮培养 的细胞 (包括 植物细 胞), 常规的 
处 理方法 就是离 心收集 细胞; 用预冷 PBS 清洗 3 次; 加裂解 液进行 处理; 进行超 声波处 
理; 离 心收集 上清。 注意无 论是如 何处理 细胞, 样品 最终的 蛋白质 浓度不 要低于 O.lmg/ 
ml ,最 合适的 浓度为 l~5mg/ml (— 般来说 1X10 7 个动 物细胞 能得到 Img 蛋白质 )。 因为 
样品浓 度过小 ,会 使相对 盐浓度 增大, 从 而影响 了等电 聚焦。 

第三节 组织样 品制备 

一、 概 述 

以疾病 组织为 实验材 料的蛋 白质组 学研究 ,因 为真实 地反映 机体内 环境的 情况, 既可 
以为疾 病的早 期诊断 提供新 的特异 性的候 选标志 ,又 能够为 疫苗的 研制寻 找新的 特异性 
的候选 抗原, 同时可 以监测 、跟 踪疾病 的发展 及预后 情况, 并为认 识发病 机制、 明确 疾病的 
分型、 分级、 分 期提供 线索。 因此, 疾病 组织的 蛋白质 组学研 究有着 不可替 代的临 床意义 
及应用 前景。 

另外, 由于 水稻和 拟南芥 (Ara6zdo/>5Z5 thalmna ) 这些植 物基因 组序列 测定的 完成, 随 
之而来 的问题 是如何 应用高 通量的 技术去 研究其 复杂的 蛋白质 网络。 因此 植物蛋 白质组 
研 究也越 来越受 到关注 , 对农业 生产必 将会产 生巨大 的影响 , 如现在 的育种 也将从 以前的 
通过 个别基 因的转 移来改 进个别 性能, 发展 到整体 性能的 改善。 植 物蛋白 质组的 研究在 
以 农业为 本的国 家里, 有着更 丰富的 内涵。 然 而由于 动物组 织与植 物组织 虽然同 是组织 
样品, 但 是各有 其物化 特性, 所以制 备方法 也不尽 相同。 有些制 备方法 可以借 鉴通用 ,有 
些 则必须 根据其 特有的 性质和 要求做 相应的 改变。 下 面分别 介绍动 物组织 和植物 组织样 
品 的制备 方法。 

二、 动物组 织 样 品 的制备 

对于取 材于机 体组织 样品的 制备, 不均 一性和 易污染 性一直 是技术 发展的 症结所 
在。 如何从 多细胞 、不均 一的体 系中获 取特定 类型的 细胞、 亚 细胞结 构甚至 特殊的 蛋白质 
复合体 ,同 时又避 免各种 血装蛋 白质、 基 质组分 以及坏 死组织 成分的 污染, 是各类 组织样 
品 制备方 法必须 考虑的 问题。 早期组 织样品 采用藤 解样品 制备法 (enzymatic sample 
preparation, ESP) ,即 薛解、 抽 提细胞 然后以 Percoll 梯 度离心 等方法 分离。 由于酶 解处理 
会导致 蛋白质 图谱的 改变, ESP 已很少 使用。 目前, 动 物组织 样品常 采用非 薛解样 品制备 
法 、纯 化法和 微切割 法进行 制备。 



249 



(一) 非酶 解样品 制备法 (nonenzymatic sample preparation, NESP)^^^^ 

1. 工具、 设备 

针头, 长针头 ,注 射器, 玻璃勾 装器, 解剖刀 ,尼龙 网眼过 滤器, 冷冻离 心机, 冷冻干 
燥机。 

2. 试剂 

R/MINI1640 缓冲液 (游 离谷氨 酰胺; 50/。 胎牛 血清; 0.2mmol/L Phenylmethylsulfonyl 
Fluoridem;lmmol/Lol/LEDTA; 抗生素 :苯挫 青霉素 25 ^18/011,庆大霉素 50|iig/ml ,青霉 
素 lOOU/ml ,链 霉素 lOO^ig/ml ,两 性霉素 B 0.25/^ig/ml, Nistatin 50 U/ml), Percoll/PBS 
溶液 (54.7%, 密度为 1.07g/ml), PBS/PIH 溶液, lOo/o SDS/33 .3o/o Mercapthoethanol , 
DNase I 溶液 (0 . 144mg/ml 20mmol/L Tris-HCl , 2mmol/L CaCh •2H2O, pH8 . 8 ) , RNase 
A 溶液 (0.0718mg/ml Tris), 上样 缓冲液 (0.2mmol/L 苯甲 磺酰氟 PMSF, l.Ommol/L 
EDTA ,0.5% NP-40 , 25mmol/L CHAPS) 

3. 操 作步骤 

(1) 细胞 的提取 

手术切 除的组 织块迅 速置于 冰上, 快速 切成几 个肉眼 可见、 无坏 死区域 的小块 (备份 
的原材 料可用 于平行 的组织 病理学 、细 胞学、 免疫组 化等实 验)。 用 预冷的 R/MINI1640 
缓冲液 洗漆组 织小块 数次, 根据 组织病 理学特 征及组 织块的 大小, 选 择合适 的细胞 提取方 
法 (图 13.3)。 

细胞 不易碎 细 胞易碎 



组 织较软 



组 织较硬 



图 13.3 组织 细胞提 取方法 

① 压挤 (squeezed): 在约 0.5ml 预冷的 R/MINI1640 缓冲 液中, 通过切 、压、 剁 得到微 
小的 碎片, 添加缓 冲液至 l〜2ml。 

② 刮擦 (scraped): 以锋利 的解剖 刀刀锋 轻刮新 鲜切出 的组织 小块的 截面, 所得 细胞置 
于 l〜2ml 预冷的 R/MINI1640 缓冲 液中。 

③ 针 头吸取 (Needle Aspiration) : 用 0.7mmol/L 孔径的 针头, 收集约 1 000 万 个细胞 
于 1 ~2ml 预冷的 R/MINI1640 缓冲 液中。 

(2) 去 除组织 碎片及 红细胞 

① 先以两 层直径 10mm 的 尼龙网 眼过滤 器重悬 细胞。 尼龙网 眼过滤 器上层 孔径为 
25(Vm ,下层 孔径为 10(Vm (可根 据组织 细胞的 实际大 小选择 合适的 上下滤 器孔径 )。 这 
一步 对以刮 擦法或 压挤法 提取的 细胞悬 液尤其 重要, 因为其 中不可 避免地 混有點 连组织 
- 250 • 




和成纤 维细胞 等杂质 成分。 

② 所得的 细胞重 悬液用 1.2mm 的 长针头 (连在 2ml 注射 器上) 转移 至新的 Effendorf 
管 中 , 小 心加入 1 . ~ 1 . 5ml 预冷的 Percoll/PBS 溶液 , 使得 重悬细 胞浸没 其中。 

③ 于 4t: ,在 低加减 速率下 (1 OOOg) 离心 10min。 

(3) 收集 并洗' 涤细胞 

① 用连在 2ml 注 射器上 0.7mm 的 针头挑 取收集 分界面 处的细 胞层, 注意尽 量减少 
Percoll 及 R/MINI1640 缓 冲液的 污染。 根 据细胞 的多少 用适当 体积的 预冷的 Percoll/ 
PBS 溶液 洗漆。 

② 若细 胞层薄 甚至几 乎透明 ,洗 漆后的 细胞收 集在体 积小于 0.4ml 的 PBS/PIH 溶液 
中, 在盛入 1.5ml 预先 称重的 Effendorf 管中, 加满 PBS/PIH 溶 液后, 4t: 、 800g 离心 
3min ,沉 淀物 中的细 胞颗粒 重悬于 PBS 溶 液中。 若细胞 层较厚 ,洗 漆后的 细胞收 集在体 
积小于 1ml 的 PBS/PIH 溶液中 ,然后 转移入 10〜12ml 的玻 璃离心 管中, 加入 5〜6ml 预 
冷的 PBS/PIH 溶 液后, 4t: 、800g 离心 3min ,沉 淀物 中的细 胞颗粒 重悬于 1 〜2 个 盛有预 
冷的 PBS 溶液 并预先 称重的 Effendorf 管中。 

③ 于 4t: 、2 700g 离心 5min ,小 心去除 所有的 上清及 Effendorf 管内外 管壁點 着的液 
滴。 称重并 计算所 得细胞 的净重 (wet weight, WW) 后 -sot: 冻存。 

(4) 细胞裂 解及核 酸降解 

① 按细 胞净重 (mg) :mQ 水 (^tl) = 1 : 1 .89 的比例 ,在 冻存细 胞中加 人相应 体积的 mQ 
水, 冰 上制成 细胞重 悬液。 反 复冻融 4 次 以破碎 细胞。 

注: 细胞 破碎还 可采用 超声法 [37] 、裂 解液法 [38] 等。 其中, 裂解液 法 [38] 用裂解 缓冲液 
(9mol/L 尿素, 4%m/V CHAP,65mmol/L DTE,4% 载 体两性 电解质 Ampholine 9—11 , 
Immol/L EDTA) 将破 细胞和 溶解蛋 白质两 个过程 结合在 一起, 较为 简便, 本实验 室就是 
选择 这种样 品制备 方法进 行肝细 胞癌的 癌与癌 旁组织 的比较 研究。 

② 依 次加入 (0.089 XWW)/^1 10%SDS/33.3% Mercapthoethanol , ( . 329 x WW ) fxl 
DNase I 溶液和 RNase A 溶液 , 冰 上静置 5min。 

③ 冷 冻干燥 降解核 酸后的 样品。 

④ 冻干 的蛋白 质样品 溶解在 (6 X WW ,或 3 X WW 若 WW< 10mg)/il 适当的 上样缓 
冲液中 ,混勾 后静置 3h 使样品 中的蛋 白质充 分溶解 (有 文献报 道只需 5111111 [35] 即 可)。 
4V 12 OOOr/min 离心 15min ,上 清小 心转移 入新的 Effendorf 管中, - 80"C 冻存。 

(二) 纯化法 

由 于方法 所限, NESP 法制备 的组织 样品, 无法完 全去除 血紫蛋 白质、 基质组 分以及 
坏死组 织成分 的污染 ,而 且也不 能排除 机体组 织中其 他类型 细胞的 干扰。 因此, 在用 
NESP 法制备 成细胞 悬液后 ,常常 添加抗 体纯化 、流式 细胞仪 纯化或 选择性 的细胞 培养建 
立不同 的细胞 株系。 但纯化 出单一 类型的 细胞有 可能会 丢失一 些系统 性信息 ,例如 ,细胞 
间基 质与细 胞间、 不 同类型 细胞间 的相互 作用等 信息。 据报道 ,不 经流式 细胞仪 纯化, 仅 
用 NESP 法制备 的组织 样品中 基质信 息仍可 以保留 [4 "] , 因此, 应注 意根据 具体情 况设计 
对照 和并行 实验。 

• 251 . 



1 . 抗体 纯化法 ( antibody purification) [38'39] 

(1) 工具、 设备 

磁珠 浓缩器 (MP01;Deutsche Dynal) ,聚 苯乙' 烯磁珠 (Dynabeads M450 Pan T,Dyn- 
abeads M450 Pan B— DYNAL AS— Oslo, Norway) o 

(2) 试剂 

抗体、 裂 解缓冲 液等。 

(3) 操 作步骤 (以 磁珠法 为例, 仅列出 制备成 细胞悬 液后的 步骤) 

① 依据 悬液中 细胞数 的多少 ,加人 适当的 聚苯乙 烯磁珠 (带有 1、2 或 3 种抗特 定细胞 
表 面特定 抗原的 单抗, 如抗人 T 细 胞表面 CD2 膜抗原 的单抗 ,抗人 B 细 胞表面 CD19 膜 
抗原的 单抗, 抗 人上皮 细胞的 Ber- EP4 抗体 )。 41: 恒温 30rnin。 

② 磁珠 浓缩器 收集挂 满目标 细胞的 聚苯乙 '烯 磁珠。 

③ 洗漆并 收集磁 珠上的 细胞, 加入裂 解缓冲 液等进 行常规 制样。 

注: 作为 对照, l.(3)(C) 中以磁 珠移去 了目标 细胞的 剩余液 ,可 以加入 裂解缓 冲液并 
进行常 规制样 及平行 实验。 

2. 流式 细胞仪 纯化法 [4 G〜 45] 

(1) 工具、 设备 

细胞计 数器, FACS 仪 (如 Epics, Coulter-Immol/Lunotech, Hamburg, Germany), 玻璃 
管 (如 Silicoborated Glass Tube)o ' 

(2) 试剂 

台盼蓝 ,70% 预冷 乙醇, 预冷 PBS 缓冲液 ,荧光 素交联 的抗体 (如 CAM5.2 Perkin- 
Elmer , Norwalk , Connecticut , USA) 。 

(3) 操 作步骤 (仅 列出 制备成 细胞悬 液后的 步骤) 

对 NESP 法所得 的细胞 悬液进 行细胞 计数, 用台盼 蓝测定 细胞存 活能力 (一 般约 
90% 的活细 胞); 于 4t 、70o/q 预 冷乙醇 中振荡 过夜; 用预冷 PBS 缓冲 液洗涤 细胞; 荧光素 
交联 的抗体 (抗 特定细 胞表面 的特定 抗原, 如用 荧光素 交联的 抗细胞 角蛋白 抗体分 离结肠 
癌上皮 细胞) 标记约 45min; 用 FACS 仪定量 选择被 荧光素 标记的 细胞并 收集在 玻璃管 
中; 离心 、裂 解细 胞等常 规制样 操作。 

(4) 备注 (流 式细 胞术的 发展) 

① RCA 技术与 流式细 胞术的 联用: RCA(roUing circle amplification) [4 i' 42] 技术 是基于 
DNA 滚 环复制 的 基本理 论而设 计的一 种新的 信号原 位放大 的方法 , 能够整 合细胞 及组织 
来源 的基因 组和蛋 白质组 信息。 RCA 技术 有以下 优点: a) 线 性放大 (不 同于 PCR 只能进 
行指数 放大) 原 始信号 (约 10 5 倍) ,因 而所 有的扩 增产物 始终连 在原始 目 标物上 , 可有效 
消除假 阳性; b) 可 以对目 标物定 位并分 析生物 结构; C) 能 够同时 分析多 种原始 信号。 目 
前, RCA 技术 已成功 地应用 于免疫 组化、 蛋白质 芯片、 流式细 胞术等 技术, 大大提 高了这 
些已有 技术检 测或分 离的灵 敏性。 RCA 技术与 流式细 胞术联 用的大 致步骤 如下: 
a) RCA 的 准备: 设计寡 核昔酸 序列, 合成两 套引物 (Circles 和 两端联 有荧光 素或生 物素的 
修饰序 列); 准备免 疫共轭 物作为 RCA 引物 与抗体 连接的 中介; b)NESP 法 制备的 细胞重 
- 252 - 



悬液以 PBS 洗漆, 再连 接与荧 光素交 联的特 定单抗 (如抗 CD3 的单抗 clone BMA 031; 
Caltag Labortories, Burlingame,CA) ; c) 连接 免疫共 轭物; d) PBS 洗漆, 离心, 细 胞重悬 
于固 定介质 (Caltag Laboratories), 冰 上固定 15min ,再用 PBS 洗漆 细胞; e) 于 371: 、在含 
200nmol/L 的 RCA 引物的 lOOmmol/L 谷氨酸 钾溶液 中温育 30min; f) RCA 反应 :31t:, 
$29 DNA 复 制酶催 化反应 45min; g)Coulter EPICS/Profile II 流式 细胞仪 检测。 

② 激 光扫描 细胞术 (laser scanning cytometry, LSC)[ 43 '"] : 这是 一种基 于显微 镜可检 
测多 种荧光 嗜铬染 料标记 的细胞 或组织 样品的 固相细 胞术。 既能 极小化 样品的 用量, 又 
能将 荧光信 息与形 态学信 息整合 起来, 因而拥 有流式 细胞术 及图像 细胞术 (image cytome- 
try) 两者的 特征, 应用前 景极为 广阔。 

③ 复 合颗粒 (multiplexed particle-based) 流式 细胞术 [ 45] : 以复合 微球颗 粒( 已有 商业化 
产品, 如 luminex flowmetrix system) 作 为常规 的免疫 分析、 亲和性 分析、 DNA 杂交 分析的 
固相支 持物, 快速 (两小 时内) 、无需 洗漆, 可在 极少量 的同一 样品上 同时得 到多种 不同的 
分析 结果。 

3. 建 立细胞 株系法 

NESP 法制备 成的细 胞悬液 经选择 性的细 胞培养 建立不 同的细 胞株系 ,再进 行破细 
胞、 溶 蛋白质 和去核 酸等常 规制样 步骤。 由于经 历了体 外培养 过程, 其蛋白 质图谱 与直接 
组织来 源样品 的图谱 有一定 差别。 具体方 法请参 阅相关 文献。 

(三) 微 切割法 

1 . 人工微 切割法 (manual microdissection) [46 5。] 

(1) 工具、 设备 

注射器 ,针头 (规格 18〜27, 依实 际组织 细胞类 型而定 ),Pasteur 移液管 (尖 端极 锋利, 
因 已由火 焰烧灼 并小心 拉伸。 另外, 拉 伸后的 尖端點 有少许 568g/L piccolyte.437.5g/L 
xylene 用以點 着靶组 织碎片 ),pipetmantip(P20), 解 剖刀, 光学显 微镜, 低温维 持器。 真 
空干 燥器。 

注 : 人工微 切割工 具可直 接手控 , 或连 接微机 械手臂 (micromanipulator arm) 。 

(2) 试剂 

10% 甲醛 水溶液 (或 80% 乙醇、 3.7% 甲醛 ), 石蜡, O.C.T 复合物 ,二 甲苯, 100O/(> 乙 

醇。 

(3) 操 作步壤 

① 组织 切片的 获得: 10% 甲醛 水溶液 (或 80% 乙醇、 3. 7% 甲酸) 固定, 石蜡 包埋, 切片 
(同 一组织 区域同 时切出 5/^m、10〜25;im 厚的切 片)。 根据组 织病理 学特征 ,选择 合适的 
固定、 包埋、 切片 方法。 例如, 乳 腺癌组 织可用 O.C.T 复合物 包埋、 液 氮冰冻 后进行 切片。 

② 光 学显微 镜下微 切割: 5|^m 厚的组 织切片 (常 规的 H&E Hematoxylin and Eosin 染 
色) 置于 低温维 持器玻 璃平面 上的, 先 以针头 (或 Pasteur 移液管 ,或 Pipetman Tip(P20), 
或解 剖刀) 切去希 望获得 的组织 部分。 其余 10〜25|^m 厚的 未染色 切片整 齐叠放 在这片 
已 镂空的 5^011 厚 H&E 染色切 片下方 ,再 用微切 割工具 获取相 应部分 的组织 微屑。 

• 253 • 



③ 对 人工微 切割三 种工具 (针 头、 Pasteur 移 液管、 Pipetman Tip) 的比较 [ 48] : 针头和 
Pasteur 移液 管都存 在太锋 利而不 能有效 地将刮 取的组 织大小 控制在 l〜2mm 2 (含 500〜 
2 000 个 细胞) 和切 下的组 织碎屑 难于收 集两个 缺点, 另外, Pasteur 移液管 的玻璃 尖端极 
易 折断。 Pipetman Tip(P20) 既可 以有效 地将刮 取的组 织大小 控制在 l〜2mm 2 ,又 可以通 
过 存放在 尖端的 0.75/^1 左右的 矿物油 收集切 下的组 织碎屑 (组 织碎 屑-矿 物油混 合物可 
反复获 得并汇 合在一 起)。 

④ 后 处理: 室温下 , 以二 甲苯洗 漆两次 (每次 80(V1) , 除去 石蜡; 10096 乙醇洗 漆三次 
(每次 80(V1); 真空 干燥去 除乙醇 (估 计净重 ); 加适当 体积的 裂解缓 冲液或 破细胞 后加上 
样缓 冲液; 加核 酸酶去 DNA 及 RNA; 低温高 速离心 去未溶 杂质。 此 步骤亦 可参考 NESP 
方法。 

2. 激光 微切割 (laser microdissection ) [5 i〜 58 ] 

激光 g 卩 light amplification by stimulated emission of radiaton (Laser) ,按 介质大 致分为 
四类: 固体 激光, 如红宝 石激光 ;液体 激光, 如染料 激光; 气体 激光, 如二 氧化碳 激光、 氩激 
光; 半导体 激光, 如 二极体 激光。 1964 年, Tomberg 首先将 单脉冲 激光用 于诱导 细胞损 
伤, 1970 年 Bessis、 1971 年 Hillenkamp、1972 年 Bereiter-Hahn 等人也 用红宝 石激光 (ruby 
laser) 进行了 尝试。 但真 正意义 的激光 微切割 仪器是 Remy 等人在 1975 年发 展的, 使用 
氮激光 (nitrogen laser) 取代了 破坏性 太强的 红宝石 激光。 1976 年 Meier-Ruge 发展 了紫外 
激光仪 , 发射低 损伤的 . 5mW 氦氖 激光束 ( He- Ne laser) 来进行 微切割 。 随后 20 多年, 各 
种 激光和 相应的 仪器蓬 勃发展 起来。 从方法 学上讲 ,激 光微切 割技术 可分为 正选择 靶点、 
负剥离 非目标 区域两 大类。 其中, 最具代 表性的 是两种 正选择 技术: 基于红 外激光 (in- 
frared laser) 的激 光捕获 显微解 剖技术 (laser-capture micro dissection, LCM) 和基于 氮激光 
(nitrogen laser) 的激 光微束 微切害 Ij— 激 光压力 弹送法 (laser microbeam microdissection- laser 
pressure catapulting, LMM-LPC) o 

(1) 激 光捕获 显微解 剖技术 (laser-capture microdissection, LCM) [5 i~ 56] 

① 工具 、设备 

透明 热敏膜 (transparent thermoplastic film, lOO/^m 厚, 材质为 EVA ethylene vinyl ac- 
etate polymer) , PixcelpM Laser capture microdissection system (Arcturus Engineering 公司 
产品) 

② 操 作步骤 

a) 常规组 织切片 或冰冻 切片及 对照用 同源组 织染色 切片按 如下方 法准备 :甲 酸或乙 
醇固定 、石蜡 包埋的 6~8/^m 厚的常 规组织 切片; 新鲜组 织块液 氮冰冻 ,低 温制成 6〜8/um 
厚的冰 冻切片 ;对 照用同 源组织 切片脱 石蜡、 H&E 染色、 3% 甘 油处理 Imin 并风干 5min。 
上述所 有切片 梯度酒 精脱水 ,风干 5rnin。 

b) 要进行 LCM 的常 规组织 切片或 冰冻切 片覆盖 一层热 敏膜, 制成" 膜 一 组织 - 玻 
片" 三明治 (图 13.4) ;PixcellTM laser capture microdissection system 中 选择内 置显微 镜的合 
适 放大倍 数观测 " 膜-组 织-玻 片" 三 明治。 

C) 通过 与冷凝 器光路 共轴的 一块前 表面反 射镜, 在热 敏膜上 表面输 人脉冲 CQ2 激光 
束; CO2 激光 (Apolb Company Model 580 , Los Angeles 或 California Laser Company Model 
. 254 . 



组织 切片〜 z 被选 择的细 胞区域 

玻璃板 I =1 

B 



红 外线光 束聚集 
激活 點和层 



C 



反射镜 棱镜组 




转 移被选 择的细 胞^^ 



图 13.4 "膜- 组织- 玻片" 三明治 



LS 150, San Marcos, CA) 的脉冲 波长及 功率均 可以根 据情况 调节。 

d) ZnSe 棱镜将 CO2 激光束 聚焦在 组织切 片的目 标点上 ,产生 的照射 点直径 可调。 例 
如: 600ms、25〜30mW 的脉 冲激光 束可产 生直径 15(Vm 的照 射点。 

e) 激光束 90O/6 以上的 能量被 10(Vm 热敏 膜吸收 (10.6)um 波长时 ,热 敏膜的 吸收指 
数为 200cm— 1, 仅 少量热 能被膜 下样品 吸收; 因而, 膜 下样品 可以耐 受脉冲 激光束 产生的 
瞬间 90t: 的高温 而无物 质变化 ), 样 品下玻 片的存 在也可 确保热 量沉积 于靶点 处整个 
10(Vm 厚的热 敏膜层 , 导致 膜融化 , 润湿 靶点处 目 标样品 , 迅速 冷却和 再结晶 。 

f) 在靶 点处, 膜与目 标样品 的鈷着 力强于 目标样 品与玻 片间的 點着力 ,可通 过机械 
系统 转移并 收集膜 与目标 样品。 一般 而言, 每 1 000〜3 000 束照 射收集 满一个 塑料帽 
(30min 左右) ,每次 激光照 射平均 可捕获 3〜5 个细胞 ,每次 免疫杂 交需要 20 000 〜 40 000 
个细胞 ,耗时 2〜7h; 每次双 向电泳 需要约 250 000 个 细胞, 耗时约 15h。 

③备注 

LCM 技 术的主 要优势 在于: a) 直接 的可视 显微环 境下, 无污染 而一步 获取目 标物; 
b) 广泛适 用于冰 冻组织 切片、 石蜡包 埋组织 切片、 甲醛 或乙醇 固定后 经染色 (H&E 等方 
法) 或未 经染色 的组织 切片; C) 当前, 脉 冲激光 束可捕 获直径 30〜70(Vm 范围内 的靶细 
胞, 由 于激光 束可以 聚集直 径小到 l(Vm 的单 细胞, 因而, 不久 的将来 LCM 可以实 现更为 
精细 的显微 切割。 

LCM 技术的 缺点: a) 耗时; 瓶颈在 于当前 蛋白质 组学支 撑技术 之一的 双向电 泳技术 
的检测 极限是 Ing (银染 ), 这要 求蛋白 质丰度 范围在 每细胞 50 000〜100 000 个拷贝 ,细 
胞内低 拷贝蛋 白质因 为这个 技术缺 陷难于 检测, 也因此 对制备 样品的 细胞数 目有依 赖性; 
b) 脉冲激 光束产 生直径 30〜70(Vm 的圆 形照射 区域, 对组织 细胞的 形状有 所限制 ,如梭 
形、 多角形 等不规 则形状 的组织 细胞; C) 红外波 长激光 的产热 问题, 虽 然由于 100^011热敏 
膜的 存在而 缓解, 但 不能完 全保证 90t: 的 瞬间高 温对样 品毫无 影响。 

本实验 室已与 上海东 方肝胆 医院合 作开展 ,利用 LCM 技术研 究肝细 胞癌的 工作。 



255 



(2) 激光微 束微切 害'卜 激 光压力 弹送法 (laser microbeam micro dissection- laser pressure cat- 
apulting, LMM-LPC)[57'58] 

① 工具 、设备 

载 玻片, Microbeam-MOMeNT 技术, 1.35/Lzm 厚的 聚乙' 烯箔 (PALM, Wolf ratshausen , 
Genmany ) , Robot-MicroBeam (PALM) 显微切 割仪, 微离心 管帽或 玻璃片 (联在 LPC 收集 
器上, P.A.L.M. GmbH)o 

② 操 作程序 (图 13.5) 



样本 




指甲油 (固 定用) 



膜 



Esi^Vy ,^ 



载玻片 



物镜 



帽、 



组 织样本 



激光 



弹射出 的样本 



图 13.5 LPC 操 作程序 示意图 

a) 组织 切片的 准备: 常规甲 醛固定 、石蜡 包埋的 组织切 片直接 放置在 玻璃载 玻片上 
或间隔 1 .35;im 厚的 聚乙' 烯膜 (PALM, Wolf ratshausen, Genmany) ; 组织切 片进行 脱石蜡 
和 H&E 等染 色处理 ; 建议在 脱石蜡 和染色 处理后 ,将 聚乙' 烯膜和 组织切 片 的上下 位置交 
换, 即聚 乙條膜 覆盖在 组织切 片上, 这样既 可以减 少污染 ,又可 以作为 微切割 之后的 LPC 
的 组织支 持骨架 以保证 所获细 胞的形 态学完 整性; 聚乙稀 支持膜 的安放 可使用 Mi- 
crobeam-MOMeNT 技术, 每块 膜可在 Imin 内 完成; 聚乙' M 膜 覆盖的 未脱石 蜡和染 色处理 
的组织 切片可 保存在 常温。 

b) LMM 和 LPC: 选择 合适的 物镜, 并根据 组织特 性及物 镜传输 效率调 节所需 激光束 
的能量 ;对 LMM 而言, 激 光束能 量需要 调整到 仅切割 组织片 或聚乙 浠膜- 组织片 (根据 
组织切 片是否 是直接 放置在 载玻片 上), 应视组 织与激 光束具 体相互 作用情 况而定 ;对 
LPC 而言, 激光束 能量需 要调整 到能够 弹送并 收集所 选的组 织小片 到微离 心管帽 或玻璃 
片 (联在 LPC 收集 器上, P.A.L.M. GmbH) 上。 一般 来说, LPC 激光束 能量是 LMM 激 
光束 能量的 两倍; 使用的 Robot-MicroBeam (PALM) 显微 切割仪 可以发 射能量 可调的 
337nm 脉 冲氮激 光束并 含内置 显微镜 (Axiovert 135; Carl Zeiss , Oberkochen , Germany ) o 

c) 最终 收集的 所有组 织小片 进行常 规的裂 细胞、 溶蛋 白质、 去 核酸等 处理。 
. 256 ' 




③备注 

LMM-LPC 技 术的主 要优点 在于: a) 与待 切割组 织无直 接的机 械接触 以保持 组织的 
原始 形态; b) 微 切割选 择的部 分与未 被选择 的部分 之间有 l〜l(Vm 的间 隙可避 免污染 
并保 持组织 的原始 形态; C) 在微 切割的 同时用 LPC 技 术将所 获细胞 或细胞 簇传送 到容器 
内; d) 对组 织细胞 形状和 大小无 限制, 梭形、 多 角形等 不规则 形状的 组织细 胞及直 径从一 
到 数百微 米的组 织细胞 都可以 获取; e) 获 取及传 送速度 较快, 单细胞 30s 内完成 ,直径 
lOO^tm 内的细 胞簇在 60s 内完成 ,直径 1 00(Vm 的细 胞簇需 l〜2min; 0337nm 氮 激光不 
需加热 就可以 严格定 位并充 分光解 待剥离 部分。 

(四) 其他 

1. 组 织芯片 (tissue chip)[59〜6i] 

(1) 工具、 设备 

钢制活塞钻孔器(薄壁钢管围成的内径为600^011,自带钢探针),受体石蜡块(点阵状 
排列、 深度 可调的 内径为 60(Vm 的孔穴 ), 點性 带系统 (Instmmedics, Hacken-sack, New 
Jersey) o 



图 13.6 组织 芯片操 作步骤 

(2) 操 作步蝶 [59] (图 13.6) 

① 不同来 源的新 鲜组织 块用乙 醇固定 或甲酸 固定。 

② 准备 各组织 块打洞 截面的 H&E 染色切 片作为 打洞获 取圆柱 状组织 核时的 可视参 

昭 n 

③ 用 钢制活 塞钻孔 器的薄 壁钢管 (无 污染、 锋利) 在供体 组织块 的目标 部位打 洞以截 
取圆 柱状组 织核。 

④ 钢探 针将截 取的圆 柱状组 织核压 出薄壁 钢管, 并 按照其 X-Y 轴坐标 准确定 位于受 
体石 蜡块的 对应孔 穴内。 可以 使用立 体测量 显微镜 (stereotactic microscope) 来保 证组织 
核 放置的 高度有 序性。 

⑤ 清 洗钢制 活塞钻 孔器, 重复③ ④操作 ,直 至受体 石蜡块 的孔穴 内排满 组织核 (来源 




—— 窜 



257 



于相同 供体组 织块和 (或) 不同供 体组织 块)。 一般地 ,每块 表面积 45mm X 20mm 的受体 
石 蜡块上 可排列 1 000 个 组织核 (组织 核间距 10(Vm)。 

© 所得的 组织核 微阵列 块用超 薄切片 机切出 一系列 组织阵 列片, 然后进 行常规 
的裂解 细胞、 溶蛋 白质、 去 核酸等 处理。 

注 意事项 ① 切片时 建议使 用點性 带系统 ( Instmmedics, Hackensack , New Jersey) , 
可以避 免组织 核移位 ;即: 點性带 覆盖在 组织核 微阵列 块上, 使二 者相互 點着, 再切 割紧贴 
點性带 的下方 ,所 得的组 织阵列 片粘于 點性带 表面, 随 后转移 组织阵 列片并 移去點 性带。 
② 平均 每块组 织核微 阵列块 可切出 200 个 组织阵 列片; H&E 染色 能够保 证组织 学图谱 
同源性 的厚度 依组织 类型有 所差别 : 对迁移 后癌组 织而言 , 可保证 3mmol/L 厚 (约 40 个 
S/Ltm 组织 阵列片 ); 对于高 分化癌 组织、 轻微 损伤组 织及正 常组织 而言, 可保证 1〜 
2mmol/L 厚 (约 20 个 S/mhi 组织阵 列片) 。 
(3) 备注 

激光 微切割 等技术 可以和 组织芯 片技术 联用, 例如 LCM 与组 织芯片 的联用 [6 G ] (如图 
13.7)。 

正常上 皮细胞 癌变前 期细胞 浸 润细胞 基 质细胞 



IX 


N 


P 


IN 


s 

o 


1/2X 








o 


1/4X 






o 


o 


1/8X 






o 


o 


空白 













图 13.7 LCM 与组 织芯片 的联用 



I. 质谱 成像术 (imaging mass spectrometry)'^^" 



64] 



基质 辅助激 光解析 电离- 飞行时 间质谱 (MALDI-TOF MS) 的一 大优势 在于能 够在纯 
度不高 的样品 中分析 相对复 杂的复 合物; 电杂交 、接触 杂交等 技术可 以将蛋 白质样 品转移 
到 poly-vinylidene fluoride(PVDF) 、 Nylon 、 polyethylene 或 Teflon 膜上, 然后 直接进 行质谱 
分析。 基于这 两方面 的技术 ,直接 大规模 地分析 生物样 品成为 可能, 使得 能够分 析单细 
胞、 细胞簇 、新鲜 组织或 常规组 织切片 并获取 平面或 空间信 息的质 谱成像 术应运 而生。 同 
其他的 成像技 术相比 ,质谱 成像术 的成像 不局限 在特异 的一种 或几种 蛋白质 分子, 理论上 
可以找 到组织 切片中 的每个 已知或 未知的 蛋白质 分子。 

(1) 工具、 设备 

MALDI-MS( Voyager Elite DE, Applied Biosystems, Framingham , Massachusetts) , 
载 玻片, 聚乙稀 (Polyethylene) 膜, Perseptive DE-STR MALDI-MSo 

(2) 试剂 

自动 吸量管 , 基质 缓冲液 ( Sinapinic Acid: lOmg/ml Acetonitrile/HsO =1:1, V/V) , 
胰蛋白 酶溶液 (终 浓度 2 pmol^tl 溶于 50mmol/L ammonium bicabonate) ,mQ 水。 
• 258 • 



(3) 操 作步糠 

①以冰 冻组织 切片为 例 [64 \ 图 13.8) 





MALDE-TOFMS 



图 13.8 质谱 成像术 

a) 将于液 氮保存 的新鲜 组织, 切割成 连续的 厚冰 冻组织 切片。 

b) 无污 染的目 标钢板 上放置 一片冰 冻组织 切片, 覆盖 基质缓 冲液后 脱水。 

C) MALDI-MS( Voyager Elite DE , Applied Biosystems , Framingham , Massachusetts) 
分析: 样 品表面 的每个 试映图 (raster) 以 连续的 激光点 (直径 25ptm) 照射, 固 定激光 位置, 
移动样 品盘; 每 个激光 照射点 产生照 射部分 的样品 信息。 平均每 50 次激光 照射产 生一个 
fast transient recorder PC board (DP211, Acqiris,Geeva, Switzerland) ,每个 照射点 信息的 
处理 需要约 2. 5s; — 个典型 的信息 点阵根 据成像 质量要 求需要 1 000〜30 000 个照 射点; 
每个 照射点 可产生 500〜80 OOODa 的约 200 种蛋白 质或肽 段峰。 

d) 软件 分析, 生成样 品的质 谱图像 或任意 特定相 对分子 质量蛋 白质或 肽段的 样品定 
位图。 

②以 新鲜组 织为例 (建议 在同一 天内完 成下列 操作) [63] 

a) 于密闭 C02 环境麻 醉实验 动物, 快速活 体解剖 取出目 标组织 并切割 成合适 大小的 
组 织片。 

b) 组 织片置 于载玻 片上, 其新鲜 截面平 整覆盖 上一层 聚乙條 (Polyethylene) 膜, 最大 
限 度减少 水分的 丢失。 

C) 接 触杂交 5min 后移去 组织片 ,揭下 聚乙烯 膜并使 之完全 失水。 

d) 每一 个杂交 区域用 2(^1 mQ 水 润洗, 20/il automatic pipet 除去盐 和组织 碎屑, 脱 

水。 

e) l|Ltl 胰蛋白 酶溶液 (终 浓度 2 pmol/|ul 溶于 50mmol/L ammol/Lonium Bicabonate) 
点在 杂交区 域上, 37t: 酶解 30min, 其间定 时滴加 mQ 水 以保持 湿润。 

f) 聚乙' 烯膜重 新失水 ,在 杂交区 域点上 1/^1 基质 (Sinapinic Acid: lOmg/ml acetoni- 

. 259 . 



trile/HzO- 1:1, ,环境 空气中 晾干。 

g) 用 Perseptive DE-STR MALDI-MS 分析 样品。 

三、 植物组 织样品 的制备 - 

上面提 到的动 物组织 样品的 制备方 法有些 对植物 组织同 样适用 ,但应 根据植 物组织 
的 特点, 在应用 时而做 相应的 改进。 由 于植物 组织含 有坚籾 的细胞 壁和复 杂的细 胞外基 
质等, 所以, 在 样品制 备时要 采用更 强烈的 破碎方 法才能 破碎细 胞获得 样品。 对于 植物材 
料 来说, 标准的 蛋白质 提取方 案是在 TCA/j^ 酮 溶液中 沉淀蛋 白质, 然后用 含去污 剂的裂 
解液 来溶解 沉淀。 这种方 法的优 点是: 克服在 单位质 量的植 物组织 中蛋白 质提取 量低的 
问题; 去除 了植物 次级代 谢产物 带来的 影响; 使植物 体内高 活性的 蛋白酶 失活, 避 免了蛋 
白质 被降解 修饰。 其缺 点在于 由于不 充分地 沉淀和 溶解而 选择性 地丢失 某些蛋 白质。 最 
近 Giavalisco [65] 等 改善了 Klose [66] 新近发 表的对 动物组 织抽提 的方法 ,使之 适用于 植物组 
织 的蛋白 质分级 提取。 下面 分别介 绍这两 种从植 物组织 中抽提 蛋白质 样品的 方法。 

(-) TCA / 丙酮法 

简单 的植物 样品制 备可在 加裂解 液的情 况下, 在 TCA 的 丙酮溶 液中进 行勾装 破碎处 
理, 然 后离心 获得。 下面 以拟南 芥幼叶 (green leave) 为例 介绍, 具体操 作步骤 [67] 。 

① 称 取新鲜 的嫩叶 200mg, 洗净。 

② 使 用液氮 速冻, 进行 研磨, 加含 0.07% 巯基 乙醇, 10%TCA 的丙酮 溶液, 低 温研磨 
45miri。 

(3)35 OOOg 离心 15min ,用 0.07% 巯基 乙醇, Immd/L PMSF 和 2mmol/L EDTA 溶 
液清洗 沉淀, 然后 冻干。 

④每 lOmg 冻干粉 末中加 25(V1 样品 裂解液 (9mol/L 尿素, 2% 两性 电解质 pH3 〜: 10, 
60mmol/L DTT,0 . 5 % Triton X _ 100 和 . 003 % 溴酚蓝 ) 。 

© 搅拌情 况下在 371C 温浴 30min。 

©19 OOOg 离心 15min ,取 上清。 

(二) 植物组 织分级 提取法 

同样以 拟南芥 幼叶为 例 [65] ,介绍 一种从 2-DE/MS 路线 出发的 植物组 织分级 抽提的 
样 品制备 方法。 幼叶取 自从胚 芽算起 生长了 56d 的植株 ,双 蒸水清 洗后用 滤纸去 掉多余 
的 水分。 在进行 蛋白质 抽提前 ,幼叶 用液氮 速冻保 存在- 80t: 冰 箱中。 蛋 白酶抑 制剂复 
合 物分为 三种: 复合物 工 为一片 CompkteTM( Molecular Biochemicals Roche, Mannheim, 
Germany) 溶解在 2ml 含 lOOmmol/L KCl,20o/o 甘油, 50mmol/L Tris,pH7.1 的溶 液中; 复 
合物 n 为 Immol/L 胃酶 抑制剂 A 和 1 .4^tm PMSF 的乙醇 溶液; 复合物 01 为一片 Com- 
plete™ 溶解在 2ml 含 O.2mol/LKC1, 20% 甘油, 0. Imol/L 磯酸, pH7. 1 的溶 液中。 具体的 
操作过 程如下 所述。 

①取冻 存的植 物组织 20〜300mg ,加 1/8 重量的 抑制剂 复合物 I 和 1/20 重量 的抑制 
剂 复合物 II。 
- 260 • 



② 液 氮浴中 勾浆成 碎末。 

③ 在 4t: 下 226 OOOg 离心 30min。 

④ 上清 即为分 离所得 的第一 个组分 ,每 50/^1 加人 54mg m,5fi\ 700mmol/L DTT,5^il 
两性 电解质 复合物 Servalyte2-4。 如 果不是 立即进 行等电 聚焦, 样品在 - 801: 保存。 所 
获 得的蛋 白质主 要是疏 水性蛋 白质。 

⑤ 用 1/8 重量的 抑制剂 复合物 in , 相同 重量的 lOOmmol/L 憐酸缓 冲液含 0.2mol/L 
KC1,20% 甘油, 4% CHAPS 和 2% 的 ASB 14 去溶解 沉淀。 

⑥ 重 复步骤 2, 在 4t: 下搅摔 45min ,加 23% 体积质 量比的 700mmol/L DTT 溶液, 
7mol/L 脲和 2mol/L 硫腺。 

⑦ 常温 下搅伴 45mino 

⑧ 当腺 和硫脲 完全溶 解时, 在 nt: 下 226 OOOg 离心 30min。 

® 上清即 为分离 所得的 第二个 组分, 加 0.05 体积 质量比 的两性 电解质 pH2 - 4, 样品 
可 以直接 进行等 电聚焦 , 或者在 - 801C 保存; 获得 的蛋白 质主 要是疏 水性蛋 白和核 酸结合 
蛋白。 

⑩加含 2mmol/LMgS04 的 50mmol/LTris pH8.0 溶液溶 解沉淀 ,重 复步骤 2。 
⑪加 0.025 体积质 量比的 DNase 搅拌 30min。 

©加0.11 体积质 量比的 700mmol/L DTT 溶液, 7mol/L 腺和 2mol/L 硫脲, 搅拌 
30miri。 

©当 脲和硫 脲完全 溶解时 ,在 nt: 下 226 OOOg 离心 30min。 

⑭上清 即为分 离所得 的第三 个组分 ,加 0.05 体积 质量比 的两性 电解质 pH2-4, 样品 

可以 直接进 行等电 聚焦, 或者在 -sot: 保存; 获 得的蛋 白质主 要是与 核酸结 合紧密 的蛋白 

质。 

由于 植物组 织纤维 素含量 较高, 一般取 植物纤 维素含 量低的 部位制 备样品 ,如 嫩叶、 
k 幼根、 种 子等。 另外, 植物 的亚细 胞和复 合物分 级研究 也开始 兴起, 如细胞 膜蛋白 、线粒 
体、 叶绿体 和磯酸 化蛋白 质复合 物等, 具 体方法 与动物 组织的 亚细胞 和复合 物分级 基本上 
相同。 我们 可以借 鉴动物 组织样 品制备 方法, 对 不同的 植物组 织采用 最适宜 的制备 方法。 

四、 注 意事项 

I 

一般 而言, 无论动 物组织 还是植 物组织 ,在 样品制 备时都 必须注 意以下 几点。 ①尽量 
I 使用新 鲜的组 织制样 ,如需 保存, 则 应该迅 速冷冻 保存在 液氮或 -801: 低温冰 箱中。 ②使 
^ 用预 冷的缓 冲液, 整个操 作过程 应该在 冷库或 者冰浴 中进行 ,以避 免随机 的物质 降解。 ③ 
大部分 的非目 标组织 应先切 成小块 并洗漆 除去。 ④使用 蛋白酶 抑制剂 ,避 免蛋白 质的降 
解和 修饰。 ⑤少量 的核酸 不会引 起蛋白 质聚集 影响等 电聚焦 ,但是 大量的 样品制 备时必 
须用核 酸酶进 行处理 ; 另 外 也要去 除多糖 等干扰 分子。 

第四节 分 泌蛋白 质样品 的制备 



细胞分 泌蛋白 质主要 包括细 胞因子 、生长 因子和 激素等 具有重 要功能 的生物 活性分 

. 261 . 



子。 分泌蛋 白质的 重要性 决不亚 于胞内 蛋白质 或膜上 受体蛋 白质, 如致病 细菌的 分泌蛋 
白质 往往含 有致病 或毒性 因子, 对于疾 病的病 理研究 和抗生 素开发 [68] 等具 有重要 意义; 
真核细 胞的分 泌蛋白 质负责 细胞的 自反馈 调节以 及细胞 间的近 程或远 程的信 号传导 ,在 
研究信 号传导 通路、 癌 细胞生 长转移 和免疫 调节等 方面具 有十分 重要的 作用。 因此, 借鉴 

蛋 白质组 的重要 意义和 手段, 分泌组 (secretome) 这一概 念也应 运而生 [69] ,即 指一 个有机 
体 所有的 分泌蛋 白质。 

一、 真核 细胞的 分泌蛋 白质样 品制备 

培养细 胞的分 泌蛋白 质就在 细胞培 养液中 ,收 集分泌 蛋白质 要注意 两点: 一是 细胞需 
无血清 培养基 培养, 或在血 清培养 基中培 养至一 定密度 后无血 清培养 ,以避 免血清 中的蛋 
白质 混在分 泌蛋白 质中; 二是 脱盐和 浓缩, 由于培 养液中 有大量 的盐, 并且体 积较大 ,分泌 
蛋 白 质 相对浓 度很低 。 通常采 用分子 超滤膜 , 将 脱盐和 浓缩一 次完成 , 具体 操作步 骤如下 
所述。 

① 细 胞在含 血清的 培养基 中培养 (或直 接用无 血清培 养基培 养)。 

② 待细 胞密度 培养至 80% 左右时 ,换无 血清培 养基, 处理 6h。 

③ 收集 培养液 ,离心 去除细 胞碎片 ,取 上清, 加蛋 白酶抑 制剂。 

④ 使用 MUHpore 公司的 15ml 规格的 YM-3 超滤管 进行超 滤浓缩 ,降低 相对盐 浓度。 
© 浓缩样 品经稀 释后, 再超滤 , 降低 绝对盐 浓度。 . 

⑥ 最终浓 缩样品 加常规 裂解液 ,蛋 白质 定量后 ,分装 冻存。 

一般 而言, 200ml 培养液 中只能 提取到 2mg 左 右的蛋 白质。 对' 体积如 此之大 的培养 
液进行 超滤需 要很长 时间。 为 了防止 蛋白质 降解和 修饰, 离心超 滤过程 应该在 4t: 进行。 
图 13.9 为脂 肪细胞 分泌蛋 白质的 2-DE 图谱。 




图 13.9 脂肪 细胞分 泌蛋白 质图谱 
第 一向为 13cmpH3~10 NL IPG 胶条, 第 二向为 12. 5% 的 PAGE 



262 



二、 细菌 分泌蛋 白质样 品制备 

细菌 蛋白质 分泌是 一个复 杂的多 阶段的 过程, 对 细菌的 膜和细 胞壁的 生物合 成以及 

细菌的 存活是 必不可 少的。 Economou [7 G] 把细 菌分泌 途径分 成三个 明显的 阶段, 第一阶 
段为靶 向阶段 ,在 导航因 子的帮 助下, 靶向细 胞膜; 第二阶 段为穿 膜阶段 ;第 三阶段 为成熟 
释放 阶段。 一般意 义上获 得的分 泌蛋白 质为成 熟释放 到培养 液中的 分泌蛋 白质。 下面以 
幽门 螺杆菌 分泌蛋 白质样 品的制 备为例 [7 1 ] ,介绍 细菌分 泌蛋白 质样品 的制备 过程。 

① 细菌 培养到 一定密 度后, 在 4t: 下 20 OOOg 离心 15min。 

② 取 上清, 0.45pm 滤膜 过滤, 去除 残余的 细菌。 

③ 每 380ml 滤液加 120ml 预冷的 浓度为 25% 的 TCA 溶液 沉淀蛋 白质, 冰浴 15min。 

④ 在 4t: 下 10 OOOg 离心 10min。 

⑤ 用 10ml 丙酮重 悬沉淀 ,清洗 2 次。 

⑥ 冻干 沉淀。 

分泌 蛋白质 样品的 制备, 主 要在于 浓縮蛋 白质和 除盐。 由于在 培养液 中分泌 蛋白质 
的量相 对很少 ,因此 在提取 分泌蛋 白质时 ,一要 注意提 取分泌 蛋白质 前要使 用无血 清的培 
养液, 避免 血清中 成分对 分泌蛋 白质的 覆盖; 二 要注意 把细胞 扩增至 一定的 量后再 进行分 
泌蛋白 质提取 ,或者 进行多 次提取 ,确 保获得 的分泌 蛋白质 的量达 到实验 所需。 至 于除盐 
和浓缩 的方法 ,可 以根 据自己 的实验 要求进 行调整 , 为 后续的 分离和 鉴定方 法做好 准备。 

第五节 体 液蛋白 质样品 的制备 

体 液是机 体内所 有物质 交换和 运输的 场所, 包括细 胞内液 和细胞 外液。 一般 意义上 
的体液 是指细 胞外液 ,包括 血液、 脑脊液 、尿液 、唾液 、泪水 、乳汁 、精液 、胆 汁等。 体 液蛋白 
质分 析对于 疾病的 诊断、 疾 病的机 制研究 和疾病 治疗、 疫苗和 药物的 开发等 都有着 重要的 
意义 , 借助于 有着高 通量分 析能力 的蛋白 质组研 究手段 和方法 , 体液蛋 白 质 组学研 究正在 
蓬勃 发展。 下面以 血清和 脑脊液 为例, 介 绍体液 蛋白质 样品的 制备。 

一、 血 清蛋白 质样品 的制备 

血清是 成分十 分复杂 的样品 ,除 了含有 丰富的 蛋白质 (每毫 升血清 中含有 60〜80mg 
的蛋 白质) 外, 还含 有很多 小分子 物质, 如盐类 、脂类 、氨基 酸和糖 类等。 其 中的蛋 白质大 
部分是 白蛋白 、免 疫球蛋 白 、转 铁蛋 白 、结 合珠蛋 白 和脂蛋 白 等少 数种类 的蛋白 质, 如果不 
加处理 ,将 严重影 响对种 类上占 绝大多 数的低 丰度蛋 白质的 检测。 然而由 于血清 中极高 
丰度 的蛋白 质浓度 与低丰 度的蛋 白质浓 度的比 值可达 10 9 倍, 因此 单独去 除高丰 度蛋白 
质并不 能达到 很好的 效果, 还需要 对样品 进行分 级处理 ,把 样品分 成尽可 能多的 组分。 

Joshua [74] 等人先 将血清 样品过 蛋白质 A/G 的亲 和柱, 除 去免疫 球蛋白 这些高 丰度蛋 
白质, 再经 胰蛋白 酶酶解 后用强 阳离子 交换色 谱将样 品分成 120 个组分 ,通 过这些 分离手 
段和后 续的鉴 定方法 ,共 检测了 490 个蛋 白质。 在去除 血清中 高丰度 蛋白质 方面, 许多公 

. 263 . 



司都有 操作方 便的试 剂盒, 下面以 Millipore 公司的 Montage™ Albumin Deplete Kit 为例 
作一 介绍。 图 13.10 是这 个试剂 盒的简 易操作 过程, 图 13.11 显示应 用此试 剂盒, 提高了 
2-DE 的分 辨率, 发 现了更 多的低 丰度蛋 白质。 因此, 我们可 以应用 这些试 剂盒来 去除白 
蛋白, 随后样 品再用 8mol/L 脲, 65mmol/LDTT, 4% CHAPS, 40mmol/L Tris 溶解, 进 
行常 规双向 电泳。 



15-Minwt* Dtbumm OwfttiHon 




平衡 加样 去 白蛋白 清洗 洗脱 



图 13 . 10 Montage™ Albumin Deplete Kit 
的 简易工 作原理 示意图 



A 



顯 



•i. 



• I 命 ' iM H y 秦 



图 13 . 1 1 A 为使用 Montage™ Albumin Deplete Kit 前的 2-DE 图谱; 
B 为使用 Montage™ Albumin Deplete Kit 后的 2-DE 图谱 



二、 脑脊 液蛋白 质样品 的制备 

脑 脊液中 富含多 种盐类 对相对 少量蛋 白质的 分离有 很大的 影响。 ¥11311[ 75] 等 人的工 

作很有 特色, 他们 在采用 常规的 2-DE-MALDI-MS 路线 之前, 加入了 三种不 同的除 盐方法 
制备 脑脊液 蛋白质 样品。 下面 分别介 绍这三 种除盐 方法。 

(-) 丙酮 沉淀法 

① 10(^1 脑脊 液在终 浓度为 80% 的丙酮 溶液中 -20t: 过夜。 

② 蛋白质 沉淀用 80|lJ 浓度为 90% 的丙酮 重悬, 清洗 2 次。 

③ 蛋白质 沉淀用 lOfil 含 5%SDS 和 20/oDTT 的溶液 溶解。 

④ 于 95€ 加热 5min。 

样品 与重泡 胀液混 合后, SDS 的最终 浓度为 0. 14% ,不 会影 响等电 聚焦。 



264 



(二) TCA / 丙酮 沉淀法 

®10(V1 脑 脊液在 TCA/^ 酮 溶液中 4t: 处理 lh,TCA 的终 浓度为 20% , 丙酮 的终浓 
度为 8096。 

② 蛋白质 沉淀用 80^J 丙酮 重悬, 清洗 2 次。 

③ 蛋白质 沉淀用 lO/utl 含 5%SDS 和 2%DTT 的溶液 溶解。 

④ 于 95t: 加热 5min。 

(三) BioSpin 柱 除盐法 

BioSpin 柱为 BioRad 公司的 产品, 每 10(^1 脑脊液 使用分 子质量 6 OOODa cut-off 的 
微型柱 ,在 1 OOOg 下离心 4min。 分子质 量小于 6 000 Da 的蛋 白质、 盐类和 其他干 扰物保 
留在柱 子中, 分子质 量大于 6 000 Da 的蛋白 质被收 集下来 ,制成 样品。 

Yuan 等 通过对 上面三 种方法 的比较 , 发现 BioSpin 柱 预处理 法蛋白 质损失 量最低 , 
且在 2-DE 图谱上 蛋白质 点最多 ,是 一种很 值得推 荐的样 品脱盐 方式。 另外, 要获 得更好 
的分 辨率, 对脑 脊液样 品也可 以进行 分级处 理等。 

其他 体液样 品可用 上述类 似的方 法进行 处理, 主要包 括三方 面内容 :一 是去除 高丰度 
蛋白质 ,提 高对低 丰度蛋 白质的 检测; 二是 降低体 液样品 中的盐 浓度, 提高等 电聚焦 效果; 
三是 尽可能 分成多 个组分 , 富 集低丰 度蛋白 质 , 提高分 辨率。 

― 、 ,t !、 

在" 蛋白质 组学" 一 词诞生 开始, 蛋白质 组学研 究就同 时向两 个方向 发展。 一是走 "竭 
泽法" 的路线 ,即 采用高 通量的 蛋白质 组研究 技术分 析生物 体内尽 可能完 整的蛋 白质。 这 
就要求 在样品 制备中 ,使用 溶解性 最好的 裂解液 配方, 另外, 对样品 进行尽 可能多 的组分 
分级, 以期 获得细 胞中所 有的蛋 白质; 二是走 功能蛋 白质组 学这条 路线, 把 蛋白质 组学作 
为一 种手段 和方法 来研究 生命的 本质。 这时 的样品 制备方 法则必 须根据 需要来 制定, 围 

绕 所研究 的对象 进行。 另外, 由于 蛋白质 鉴定技 术的发 展如" Shotgun" 质 谱检测 技术、 
MALDI-TOF-MS 和微流 芯片等 ,出 现了一 些非常 规的样 品制备 方法。 可见, 蛋白 质组样 
品制 备在某 种意义 上来说 是一种 艺术, 其中 融合了 各种各 样样品 的物化 特性, 各不 相同的 
实验 需求和 不同的 研究手 段和方 法等。 在蛋白 质组研 究蓬勃 发展的 今天, 样品制 备或者 
说样品 的预处 理已经 成为蛋 白质组 学研究 的一个 瓶颈, 对 研究者 提出了 更高的 要求。 

(屠 成剑 李 辰) 

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268 



第 十四章 双向凝 胶电泳 



第一节 介 绍 

由于蛋 白质组 学是从 整体水 平研究 细胞、 组织、 器官 甚至是 有机体 (微 生物) 内 的蛋白 
质表达 变化, 那么首 先需要 一种强 有力的 方法来 分离、 显示 和分析 成千上 万种蛋 白质。 虽 
然目前 蛋白质 组学技 术发展 很快, 如毛 细管等 电聚焦 [ 1 ] 、多 维色谱 [2 j 、微 流芯片 等技术 
均已 建立, 但双向 凝胶电 泳仍然 是目前 蛋白质 组学研 究的主 要分离 方法。 双向凝 胶电泳 
的高分 辨率、 高 重复性 和兼具 微量制 备的性 能是其 他分离 方法所 不能匹 敌的。 

一、 双向 凝胶电 泳简介 

双 向电泳 的思路 最早由 Smithies 和 Poulik [4] 提出, 蛋白 质第一 向电泳 是根据 其自由 
溶液 迁移率 (free^solutionmobility) ,在滤 纸条上 进行; 第二 向电泳 方向与 第一向 垂直, 在 
淀 粉胶上 进行。 随着 聚丙' 烯酰 胺凝胶 的发明 ^ 5 ], 双向 电泳支 持介质 逐渐转 向聚丙 條醜胺 
凝胶 ,即双 向凝胶 电泳。 1969 年, 双向 凝胶电 泳在原 理上有 了新的 发展, 以第一 向为蛋 
白质 等电聚 焦的双 向凝胶 电泳建 立起来 (即 IEF-PAGE)t 7 ' 8 3。 20 世纪 70 年 代初, 第二向 
电 泳中使 用了十 二烷基 硫酸钠 (SDS)[ 9 qi 、使 第二向 电泳基 本上根 据蛋白 质的相 对分子 
质量来 分离, 从 而奠定 了现代 双向凝 胶电泳 的基础 (即 IEF-SDSPAGE)。 1975 年, O'Far- 
rell [ i 2] 、Klosefi 3 3 和 Scheele [ " ] 分别 对双向 凝胶电 泳做进 一步的 优化, 建立了 高分辨 的双向 
凝胶 电泳。 

双 向凝胶 电泳的 基本原 理是: 先将蛋 白质根 据其等 电点在 pH 梯度胶 内进行 等电聚 
焦, 然后 按照它 们的相 对分子 质量大 小进行 SDSPAGE 第二 次电泳 分离。 根据第 一向等 
电聚焦 条件和 方式的 不同, 可将双 向凝胶 电泳分 为三种 系统: ISO-DALT、NEPHGE 和 
IPG-DALT[i 5 ]。 在 ISO-DALT 系 统中, 等电聚 焦在聚 丙稀醜 胺管胶 (tube gel) 中进行 ,载 
体两性 电解质 (carrier ampholyte) 在 外加电 场作用 下形成 pH 梯度。 pH 梯 度在碱 性区不 
稳定 (阴极 漂移) 、重 复性不 易掌握 和上样 量低是 其主要 缺点, 并且一 般不能 分离等 电点大 
于 8.0 的 碱性蛋 白质。 优点是 电泳设 备要求 不高, 电泳溶 液容易 配制, 易 于开展 工作。 各 
种电泳 条件经 优化后 ,可达 到非常 高的分 辨率, 也可获 得好的 重复性 [ 1 6 ,' 7 ], 目前惟 一分辨 
到 10 000 个蛋白 质斑点 的图谱 正是采 用了这 一系统 '' 6] 。 图 14. 1 是我 们利用 ISO-DALT 
分离 鼻咽癌 细胞系 CNE-2 细胞总 蛋白质 的双向 图谱。 NEPHGE 为 非平衡 pH 梯 度电泳 
(nonequilibrium pH gradient electrophoresis) ,是 IPG( immobilized pH gracHcnt) 胶发 明前用 
于分离 碱性蛋 白质的 一种方 法 [ 1 8] ,蛋白 质在等 电聚焦 场中达 到平衡 前结束 电泳, 第一向 
的 pH 也是依 靠载体 两性电 解质和 电场来 建立。 IPG-DALT 的第一 向电泳 是采用 1982 
年 发明的 IPG 胶 [1 9 、 其 pH 梯 度的形 成依赖 于不同 pK 值 的一种 合成的 化合物 immobi- 
line。 该化合 物是丙 '烯酰 胺的衍 生物, 为非 两性的 弱酸和 弱碱, 在凝胶 聚合过 程中, 能与聚 

. 269 . 



丙條酰 胺共价 结合。 因此, IPG 胶的 pH 梯度是 稳定的 ,不依 赖于外 加电场 ,基本 上克服 
了 ISODALT 的主 要缺点 ,无论 在重复 性和上 样量上 均优于 ISaDALT。 



4 

图 14. 1 鼻咽癌 细胞系 CNE-2 的双 向凝胶 电泳银 染图谱 

二 、 IPG-DALT 双向凝 胶电泳 

(-) 样 品制备 - 
要获得 高分辨 和高度 重复的 双向凝 胶电泳 图谱, 蛋白 质样品 制备是 极其关 键的一 

步。 首先, 样品不 能变质 ,要使 用新鲜 的样品 或者将 新鲜样 品速冻 (液 氮或 -70t:) 起来 
也可以 ,样品 需要处 理时要 尽量和 处理前 的保持 一致。 样品 处理过 程中注 意防止 污染, 手 
套 等必须 戴上。 不同类 型的样 品制备 请见上 一章。 为了分 离一种 细胞或 组织的 蛋白质 
组, 要 尽可能 使蛋白 质组中 的各种 蛋白质 成分溶 解在裂 解缓冲 液中, 整个蛋 白质抽 提过程 
要避免 蛋白质 的降解 、修 饰等。 对 于组织 而言, 由于组 织的不 均一性 ,保证 组织细 胞取样 
的重 复性很 重要, 采用激 光捕获 微解剖 (laser capture microdissection) 技术 可获得 特定的 
一类细 胞 [29] ,但该 技术 目前在 蛋白质 组中的 应用也 存在局 限性, 主 要的问 题是每 次所获 
得的 细胞量 太少。 一般 在样品 裂解前 和裂解 中可结 合机械 破碎方 法., 如研磨 、超 声等。 

裂解液 的基本 成分为 尿素、 去: ^ 剂、 还原 剂和两 性电解 质等。 尿 素是一 种优良 的变性 
剂, 通过 断裂氛 键和疏 水键使 蛋白质 变性, 增加其 溶解性 ,而 不影响 蛋白质 所带的 电荷。 
尿素 与硫脲 结合使 用使蛋 白质的 溶解性 更好, 尤 其是疏 水性的 膜蛋白 [ ^, 3 1 ] 。 去:^ 剂有离 
子型、 非离 子型和 兼性离 子型等 几类。 离子型 去:^ 剂, 如 SDS 使蛋白 质带上 负电荷 ,干扰 
第 一向等 电聚焦 而避免 使用。 但 Harder 等人在 加裂解 液抽提 酵母细 胞蛋白 质之前 ,用 
1%SDS 的 缓冲液 破碎细 胞并加 热可抑 制相对 分子质 量较高 的蛋白 质被内 源性蛋 白水解 
醉降解 ,并提 高了相 对分子 质量较 高的蛋 白质的 溶解性 [32] 。 传统的 非离子 型去^ 剂, 如 
Triton X-100 和 NP-40, 以 前用得 较多, 现多数 以兼性 离子去 剂 CHAPS(3-[ (3-cholami- 
- 270 - 




dopropyl) -dimethylammonio ] - 1 -propane sulfonate ) 代替。 CHAPS 的 终浓度 可达到 40/0。 
SB 3-10 ( N-decyl-N , N-dimethyl-3-ammonio-l -propane sulfonate) 溶 解疏水 性氨基 酸残基 
的能力 更好, 但 它在高 浓度的 脲溶液 中溶解 性较差 [ 33] ,终浓 度应尽 量小于 2%。 最近, 有 
一种新的兼性离子去^^剂为 ASB 14 (Amidosulfobetaine 14) , MoUoy 等 [ 34 3 把有机 溶剂抽 
提的大 肠杆菌 蛋白质 溶于含 ASB 14 的增溶 溶液中 ,发现 蛋白质 的溶解 性比用 SB3-10 和 
CHAPS 好; 从 13 个被 鉴定的 蛋白质 中发现 8 个 是以前 在双向 胶上没 有发现 过的, 其中有 
5 个 是新发 现的疏 水性蛋 白质。 还 原剂多 数使用 巯基 乙醇、 DTT 或 DTE(dithioery- 
threitol) ,通 过打断 二硫键 使蛋白 质彻底 变性。 Herbert 等人 [35] 用三 丁基膦 (tributyl phos- 
phine, TBP) 代替 DTT ,在 等电聚 焦中大 大增加 了蛋白 质的溶 解性, 并提高 了蛋白 质从第 
一向到 第二向 转移的 效率。 但 TBP 不溶 于水, 半衰 期短, 等 电聚焦 时可能 并不起 作用。 
Seow[ 36] 等在肝 癌样品 处理时 也发现 TBP 做还原 剂时蛋 白质的 溶解性 较差。 两性 电解质 
能促进 蛋白质 的溶解 ,吸 附高浓 度尿素 在溶液 中形成 的氰酸 盐离子 (cyanate ions), 离心时 
还 有助于 核酸的 沉淀。 此外, 它还可 以阻止 样品蛋 白质和 IPG 胶条 中的固 相化的 两性电 
解 质相互 作用。 样品中 的核酸 大分子 会干扰 等电聚 焦和双 向胶的 银染, 加 入核酸 水解酶 
或采 用超声 等方法 可将其 降解。 为避 免样品 制备过 程中蛋 白质的 降解, 整 个过程 需在低 
温 中进行 (约 4t:), 并 可加入 PMSF 等蛋 白酶抑 制剂。 061"8 [36] 总 结了三 种裂解 液的配 
方: ① 9 mol/LUrea, 1% {m/V) DTT, 2o/o〜4o/o {m/V) CHAPS, 2% (V/V) carrier 
ampholytes, pH3 ― 10 和 10 mmol/L Pefabloc® Protease Inhibitor; ② 7 mol/L Urea, 2 
mol/L Thiourea, 1% (m/V) DTT, 2o/o〜4o/o (m/V) CHAPS, 2% (V/V) Carrier Am- 
pholytes, pH3~10 和 lOmmd/L Pefabloc® Protease Inhibitor; ③热的 SDS 缓冲液 :10/() 
(m/V) SDS,100mmol/L Tris-HCl, pH7.0, 该缓 冲液裂 解样品 后至少 3 倍 稀释于 ①或② 
的裂解 液中。 强变性 作用的 裂解液 中不加 蛋白酶 抑制剂 亦可。 

(二) 第一向 :等 电聚焦 

1. IPG 胶条的 重泡涨 

商品 化的胶 条使用 前是以 干胶条 的形式 和塑料 支撑薄 膜粘在 一起, 加 样前需 要先撕 
去薄膜 在重泡 涨液中 泡涨。 重泡 涨液的 成分为 8 mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L 
DTT, 0.5% IPG Buffer, 痕量 Bromophenol Blue, 和裂 解液成 分基本 相同, 在 10 〜 
lOOmmol/L 浓度范 围内适 当提高 DTT 的浓度 可提高 蛋白质 的检测 灵敏度 [38] 。 重泡涨 
可以在 等电聚 焦盘内 进行, 此时 样品已 经加到 重泡涨 液中, 在加样 杯上样 (cup loading) 方 
式中, 胶 条在专 门的重 泡涨盘 内泡涨 完成后 再转入 等电聚 焦盘内 加样。 对 于非常 碱性的 
窄 pH 范围的 胶条, 如 pH9〜12 或 pH10~12, 重泡涨 液的成 分要根 据样品 做适当 修改。 
如核糖 体蛋白 ,重泡 涨液的 成分为 8mol/L Urea, 10% (V/V) 2-propanol, 10% (V/V) 
Glycerol, 1% (m/V) CHAPS, 20 mmol/L DTT, 0.5% Pharmalyte 3—10, 0.2% 
(m/V) Methycellulose 或 160/() (V/V) 2-propanol, 10% Glycerol, 1% (m/V) CHAPS, 
20mmol/LDTT, 0.5% Pharmalyte。 组 蛋白的 重泡涨 液成分 同上, 但没有 CHAPSe 36 、 
重泡 涨时间 至少要 lOh ,泡 涨不 充分会 影响相 对分子 质量较 高的蛋 白质的 吸收。 重泡涨 
液的 体积和 胶条的 长度相 匹配, 可参照 产品说 明书。 重泡涨 和等电 聚焦过 程中的 温度都 

. 271 • 



稳定在 201:, 温度太 低尿素 会结晶 出来, 温 度不稳 定也会 造成胶 上蛋白 质点位 置的变 
化 [39] 。 重泡涨 时加上 30V 或 50V 的低压 会促进 胶条对 蛋白质 的吸收 ,但 这一点 在制备 
型电泳 时才有 意义。 



样品可 以在重 泡涨时 加入, 称 为胶内 重泡涨 (in-gel rehydration) ,也可 以重泡 涨完成 
后再加 ,如 加样杯 上样。 重泡 后加样 相对不 可靠, 操作 比较困 难而且 蛋白质 容易在 胶和样 
品的界 面产生 沉淀。 然而 在某些 特殊情 况下, 重泡 涨后加 样具有 优势, 如使用 pH6〜ll 
或 pH6〜9 的胶条 分离碱 性蛋白 质时, 在 阳极用 加样杯 加样, 可以得 到更好 的分离 图谱。 
样品的 胶内重 泡涨是 推荐的 方式, 可以 增加蛋 白质上 样量, 也 避免了 在阴极 或阳极 加样的 
方向 问题。 Sabounchi-SchuU[ 4 ''] 报道了 一种新 的加样 方式, 称 其为纸 桥加样 (paper bridge 
loading), 即胶条 重泡涨 好以后 ,用 1.5cmX5. cm 的滤纸 做为纸 桥覆盖 在胶条 的一端 ,将 
样品 加到滤 纸上, 这样可 显著提 高蛋白 质的上 样量, 并 在分辨 率和相 对分子 质量较 高的蛋 
白质的 分离方 面有所 改善, 如图 14.2 所示, 这种加 样方式 可以在 Pharmacia 公司 24cm 的 
等电聚 焦盘上 实现。 分析型 双向凝 胶电泳 上样量 在几十 到几百 微克, 制备 型双向 凝胶电 
泳 上样量 在数百 (银染 ) 到 最大几 十毫克 (考马 斯亮蓝 染色) 之间, 上 样量的 大小和 胶条的 
pH 范 围也有 关系, pH 范围 越窄, 上样量 越大。 由于蛋 白质定 量方法 的重复 性并不 十分可 
靠, 最佳 的上样 量要根 据实验 结果来 优化。 从我们 的结果 来看, 分析型 银染, BioRad 
17cm pH3〜10L 胶条的 最佳上 样量为 60 〜 80/ig, Pharmacia 18cm pH3〜10NL 的 最佳上 
样量为 80〜100/ig; 制备型 银染, pH3〜10 胶 条最大 可加到 400/堪; 制备型 考马斯 亮蓝染 
色, pH3〜K) 胶条 可加到 lmg,pH4〜7 胶条可 以加到 1 .5mg ,在 制备 型电泳 时为保 证图谱 
质量减 少变形 ,样品 最好脱 盐后再 上样。 



3. 等 电聚焦 

重 泡涨结 束后, 在胶条 和电极 的之间 加上润 湿的小 纸片, 它可以 吸收盐 离子和 补充水 
分。 在阴 极加上 20mmol/LDTT 润湿 的纸片 可减少 减性端 的水平 条纹并 且有助 于碱性 
蛋白质 的聚焦 [ 4 1]。 等电聚 焦的电 压上升 分为三 个阶段 ,首 先加上 一个比 较低的 电压, 去 
除胶条 中的过 多的盐 离子。 然后 开始加 高压, 电 压上升 的模式 为缓慢 上升。 最后 是持续 
高压, 电 压上升 的模式 为快速 上升。 BioRad 公司 的第一 向等电 聚焦仪 Protean IEF 最多 
可加到 10 000V 的 高压, Pharmacia 公司 IPGphor 的最高 电压为 8 0()0V。 BioRad 公司胶 
条总 的电压 时 问积为 7cm 胶条 8〜35kVh, 11cm 胶条 15 〜60kVh, 17cm 胶条 25 ~ 
l()()kVh。 一般原 则是, 根据 胶条的 pH 范 围和上 样量的 多少, 总电压 时间积 可以在 一定范 



2. 加样 




图 14.2 纸桥加 样法的 /ri 意图 



表 14. 1 Protean lEF 的 聚焦条 件设置 



胶 条长度 17cm; 温度 2(rC; 最大限 制电流 0.05mA per IPC; strip; 最大限 制电压 10 OOOV 
分 析型等 电聚焦 
重 泡涨: 12h 

开始阶 段的等 电聚焦 设置: 
250V 15min 电压快 速上升 
10 OOOV 5h 电压快 速上升 
稳定阶 段的等 电聚焦 设置: 

pH3~10 胶条 pH4~7 胶条 

10 OOOV -35 000 Vh 电压快 速上升 10 000V~60 000 Vh 电压快 速上升 

制 备型等 电聚焦 

重 泡涨: 12h 

开始阶 段的等 电聚焦 设置: 

250 V 15min Rapid 

1 OOOV Ih Rapid 

4 OOOV Ih Rapid 

稳定阶 段的等 电聚焦 设置: 

pH3~10 胶条 pH4~7 胶条 

10 OOOV -80 000 Vh 电压快 速上升 10 000V〜 100 000 Vh 电压快 速上升 




围内 调整。 上样 量大、 pH 范围窄 则总电 压时间 积高, 分析型 双向凝 胶电泳 限制电 流可以 
放宽到 70 微安, 制备 型双向 凝胶电 泳的限 制电流 最好在 50 微安。 等电聚 焦完成 后的胶 
条若 不能及 时进行 第二向 电泳, 胶 条可于 -20t: 保存。 以 17cm 胶条 为例, 优化的 等电聚 
焦设 置如表 14.1 所示, pH4〜7 胶条的 实验结 果如图 14.3 所示。 

(三) 胶条的 ¥衡 

等电 聚焦完 成后, 胶条必 须经过 平衡才 能走第 二向, 平衡缓 冲液的 组分为 6mol/L 尿 
素, 0.375mol/L Tris pH8.8, 2% SDS, 30% glycerol, 2% (m/V) DTT 或 2.5% 
(m/V) IAA。 平衡液 的体积 随胶条 的长度 而异, 我们的 用量为 17cm/18cm 胶条 3ml, 
llcm/13cm 胶条 2ml ,大大 低于说 明书的 用量。 平衡 液中尿 素和甘 油可增 加溶液 點度, 减 
少电 内渗。 电内 渗作用 是由固 相化的 两性电 解质造 成的, 它 影响蛋 白质从 第一向 到第二 
向的 转移。 SDS 用于 变性蛋 白质, 使蛋白 质带上 负电荷 ,这对 第二向 SD&PAGE 来讲是 
十分重 要的。 DTT 和 IAA 分别 用于打 开和封 闭蛋白 质的二 硫键。 溴酚蓝 用来检 测电泳 
过程。 两次平 衡的时 间均为 15min ,如 果图谱 的竖直 条纹较 多则平 衡时间 可适当 延长到 
20min ,时间 太短则 蛋白质 没有被 SDS 充分 包裹, 容易产 生水平 条纹。 Galvani [42] 发现如 
果平 衡液中 有硫脲 的话, 它会迅 速消耗 IAA 从而 破坏其 院基化 作用, 并指 出丙稀 酰胺单 
体可 以代替 IAA 且不 会受到 硫脲的 干扰。 我 们用相 同浓度 的丙稀 醜胺单 体替代 IAA ,验 
证了这 一点。 DTT 也 可以用 5mmol/LTBP 代替。 Lauber [43] 报道 两次平 衡可以 简化为 
用 62.5mmol/LTris, 2.3% SDS, 5% 琉基 乙醇, pH6.8 的平 衡液一 次平衡 3.5min 即可, 
效果 如何, 我 们没有 试用。 、 

(四) 第二向 SDS-PAGE 

第二向 SDSPAGE 采用 1^60111111「 44] 的不连续缓冲液系统,3丁%的 IPG 胶条 可以看 
作为 压缩胶 , 所 以我们 只使用 分离胶 , 但也有 人用压 缩胶。 IPG 胶条平 衡好后 , 一 般将胶 
条在电 泳缓冲 液里浸 润一下 ,这 样做一 方面可 以清洗 胶条去 除胶条 上的平 衡液, 另 一方面 
润湿的 胶条也 容易沿 着玻璃 板推到 SDS^PAGE 凝胶 上端。 IPG 胶条 转移到 SDS^PAGE 
胶有两 种方式 :一 种方式 是先将 IPG 胶 条放到 SDSPAGE 胶上, 再加人 '熔 化的琼 脂糖溶 
液, 另一种 方式是 先加入 溶化的 琼脂糖 溶液, 再将 IPG 胶 条放到 SDS^PAGE 胶上。 两种 
方 式各有 优劣。 第一种 方式图 谱不易 变形, 但在两 块胶之 间容易 有小气 泡产生 ,第 二种方 
式非 常好地 解决了 胶之间 的气泡 问题, 但琼脂 糖容易 凝固, 插人 IPG 胶条 时有时 会造成 
图谱 变形。 相比 之下, 气泡 对图谱 的影响 较小, 故我 们推荐 第一种 方式。 SDS^PAGE 胶的 
浓度往 往需根 据研究 目的和 样品性 质而定 ,最常 用的是 12% 和 12.5% 的均 一胶。 采用均 
一胶 的好处 是灌胶 方便, 重复 性好。 但相 对分子 质量较 高的蛋 白质斑 点较为 聚集, 分离不 
佳。 采用 9%~16% 的线性 梯度胶 ,相 对分子 质量不 同的蛋 白质点 在整块 凝胶上 分布比 
较均勾 ,如图 14.4 所示, 但灌胶 不易。 电泳过 程中温 度一般 控制在 10~15t:。 



274 



图 14.4 使用 9% ~16%T 梯 度胶的 人肝癌 细胞系 
BEL-7404 的双 向凝胶 电泳银 染图谱 

第二节 试剂、 设 备和溶 液配制 

一、 试 剂 

丙 稀酰胺 (Arc) , 甲 叉双丙 稀酰胺 (Bis) ,三 (经 甲基) 氨 基乙烷 (Tris) , 甘 氨酸, 十二烷 
基 磺酸钠 (SDS), 四甲基 乙二胺 (TEMED) ,过硫 酸铵, 二硫 苏糖醇 (DTT) ,碘代 乙晚胺 
(IAA) , 尿素, 3-[(3 -胆酰 胺丙基 ) - 二 乙铵] - 丙磺酸 (CHAPS) ,矿 物油, 均购 自 BioRad 
公司, 溴 酚蓝为 Amersham Pharmacia 公司 产品。 预制 IPG 胶 条及其 IPG 缓冲液 为以上 
两家公 司相应 产品。 所 有缓冲 液均用 Milli-Q 水 配制。 

二、 仪 器 

超 声细胞 破碎仪 (宁 波新 芝科仪 研究所 JY92- 2D); 本 实验室 有两家 公司的 双向凝 
胶电 泳实验 仪器: Amesham-Pharmacia 公司的 IPGphor 水 平电泳 系统和 Hoefer SE 垂直电 
泳系统 ,如图 14.5 所示。 

Protean lEF^" System 水 平电泳 系统和 Protean 11 XL Cell 垂 直电泳 系统为 BioRad 
公司 产品, 如图 14.6 所示。 




275 



图 14.5 Amesham-Pharmacia 公司的 IPGphor 水平电 泳系统 
和 Hoefer SE 垂直电 泳系统 




6 



图 14.6 BicvRad 公司的 Protean IEF® System 水 平电泳 系统和 PROTEAN II XL Cell 垂直电 泳系统 

三、 溶 液配制 ' 

1. 裂解液 

8mol/L 尿素 (Urea), 4% 3- [(3 - 胆酷胺 丙基) -二 乙铵卜 丙横酸 (CHAPS), 40mn»l/L 三 
(经 甲基) 氨 基乙烷 (Tris), 65mmol/L 二硫 苏糖醇 (DTT) 40ml。 
尿素 19.2 g 

CHAPS 1.60g 
Tris 碱 0.194g 
DTT 0.401g 
分装- 75t: 保存。 

2. 重 泡涨液 

8mol/L 尿素, 2%CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5% IPG 缓冲液 ,痕量 溴酚蓝 (Bro- 
mophenol blue trace) 40ml 。 
尿素 19. 2g 

CHAPS 0.8g 
痕量 溴酚蓝 

分装 - 20"C 保存。 临用 前加人 DTT 和 IPG buffer ,每 25(^1 加 0.7mgmT 和 1 .25 fA 
IPG 缓 冲液。 

. 276 . ' 



3. 平衡 缓冲液 



50mmol/LTris-HCl pH8.8, 6mol/L 尿素, 30 o/o 甘油 (Glycerol) , 2% 十 二烷基 磺酸钠 
(SDS) ,痕量 溴酚蓝 



临用 前加入 DTT 和 IAA ,浓度 分别为 1% 和 2.50/6。 

4. 0.5% 的 琼脂糖 

O.lg 琼脂糖 溶解在 20ml IX 电泳缓 冲液, 加人痕 量溴酚 蓝后, 加热 融化。 于室温 存放。 

5. SDS-PAGES& 存液 和电泳 缓冲液 

(1) 丙 烯酰胺 (Acr)/ 甲 叉双丙 烯酰胺 (Bis)(30o/oT, 2.67%C) 

丙' 烯酰胺 (Acrylamide)(BioRad 161-0107) 146. Og 

甲叉 双丙' 烯酰胺 ( iV , N-Methylene-bisAcrylamide)(Bioradl61-0201 ) 4 . Og 
用 500ml 水溶 解后, 用 . 45^tm 的 微孔滤 膜过滤 , 41: 避 光保存 , 保存期 为 30d。 Arc 、 
Bis 为神经 性毒剂 , 配时请 小心。 

(2) 1. 5mol/L Tris-HCl ,pH8.8 

54.45 g Tris 碱溶于 150 ml 水中, 用 盐酸调 pH 至 8. 8, 然 后加水 定容至 300ml。 4t: 
保存。 

(3) 10% (/n/V) 十 二梡基 磺酸钠 (SDS) 

lOg SDS 溶于 60ml 水中, 轻微 振荡, 然 后加水 定容至 100ml。 SDS 很轻, 称量 时要小 
心, 以免 吸入。 

(4) 10 0/^)过硫酸铵( Ammonium Persulfate)( m/V) 
新鲜 配制。 

(5) 5X 电泳 緩沖液 (IX -25mmol/L Tris, 192mmol/L甘氨酸,0.1O/6SDS,pH8•3) 
Tris 碱 45. Og 

甘氨酸 216. Og 

SDS 15. Og 

溶于 3L 水中, pH8.3 不用 调整。 每次 用时取 800ml ,加水 稀释到 4L。 



Tris-HCl pH8.8(l. 5mol/L) 
尿素 

甘油 (87 0/6, WV) 

溴酚蓝 

水 



72.07g 
69ml 

痕量 
to 200ml 



第三节 实 验操作 



、 样 品制备 



以真 核细胞 为例, 按 2 X10 6 细 胞数加 150^11体积的比例加裂解液。 原 核样品 建议超 

. 277 • 



声 裂解。 真核 生物样 品可不 经超声 或温和 超声。 超声前 预冷至 41:, 超声 时冰浴 保持低 
温, 时间为 2minc 注意 勿产生 泡沫。 于 4t: 25 OOOg ,离心 Ih ,取 上清。 上清 分装于 
-75t: 保存。 

二、 蛋白 质定量 

在电 泳前需 要对样 品的浓 度进行 测定, 一 般采用 Bradford 法。 其他 方法如 BCA 法、 
Biruet 法和 Lowry 法定量 蛋白质 都是建 立在将 Cu+ 还原为 Cu 2 + 的颜色 变化基 础上的 ,而 
双向凝 胶电泳 裂解液 中含有 巯基还 原剂, 会影 响这些 定量方 法的灵 敏度。 Bradford 法是 
根 据考马 斯亮蓝 G-250 和蛋白 质的结 合来定 量蛋白 质的, 但 这种结 合也会 受到裂 解液中 
的碱性 Ampholytes 和 尿素的 影响。 

RamaglP 7 ] 改进了 Bradford 法, 先用 0. Imol/L 的盐 酸中和 样品, 方法 如下。 

1. 染色液 

Bic^Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate 500 - 0006 , 稀释 5 倍使用 。 或者 自 行 
配置 :10 mg 的考马 斯亮蓝 G250 溶解于 5ml 的 95% 乙醇中 ,与 10ml 85 96 碟酸混 合定容 
到 100ml。 4t: 保存, 使 用前用 Whatman No. 1 滤纸 过滤。 

2. 标准 蛋白质 的配置 

标准蛋 白质 使用卵 白蛋白 (ovalbumin) 或 "/ 球蛋白 ( y-globulin) 较好, 牛血清 白蛋白 
(BSA) 做标 准蛋白 质时测 得的样 品浓度 偏高, 但在 定量血 清样品 时比较 准确。 标 准蛋白 
质以 Img/ml 浓度溶 于裂解 液中, 分装于 - 20t: 保存。 

3. 标 准曲线 的绘制 
如表 14.2 所示。 



表 14.2 蛋白质 定量的 标准曲 线绘制 



标准 蛋白质 /f^lg 




10 


15 


20 


25 


30 


40 


50 


体积 /fxl 




10 


15 


20 


25 


30 


35 


40 


裂解液 /fxl 


45 


40 


35 


30 


25 


20 


15 


10 


O.lmol/L HCl/fzl 


10 


10 


10 


10 


10 


10 


10 


10 


HzO/^l 


40 


40 


40 


40 


40 


40 


40 


40 



每管加 3.5 ml 染色 液轻微 摇匀, 5 min 后读取 OD595。 
利用 origin 5.0 软件 绘制的 标准曲 线如图 14.7 所示。 

4. 样 品浓度 的测定 

按比 例稀释 样品后 按标准 曲线的 方法测 定样品 浓度。 



278 




三、 双向凝 胶电泳 

1. 加样 

取出 重泡涨 液解冻 , 以 13cm 胶条 为例, 将 30 〜 lOO^tg 样品 和重泡 涨液充 分混合 , 总 
体积为 250L。 低速离 心后, 加入持 胶槽, 取出胶 条撕去 表面膜 ,胶面 朝下从 一端小 心放人 
持胶槽 , 使重 泡涨液 浸润整 个胶条 , 注 意不要 有气泡 , 胶 条尖端 和持胶 槽尖端 匹配, 用矿物 
油 覆盖。 (考马 斯亮蓝 显色样 品量为 100〜30(Vg ,制 备型样 品量为 l〜10mg。) 

重泡涨 12h; 500V Ih; 1 OOOV lh;8 OOOV 6h。 整个 过程在 20t: 进行, 电流 上限为 
70mA。 结束 后记下 总电压 小时和 电流。 胶 条可在 -201: 中保存 或立即 平衡。 

3. 平衡 

胶条取 出后, 先 用滤纸 吸去附 着的矿 物油, 然后在 1%DTT 的平 衡缓冲 液中, 置于摇 
床 上平衡 15min 后, 然 后转人 2.5%IAA 平衡 缓冲液 中平衡 15min。 2ml 平衡液 完全够 
用, 平衡时 胶条可 以放在 Bio^Rad 或 Amesham-Pharmacia 公司 的重泡 涨盘里 进行。 

4. SDS-PAGE 

(1) 潘胶 

按表 14.3 配制, 抽气 15min 后加入 SDS、10% AP、TEMED。 

凝胶 时为保 证每次 灌出的 胶高度 一致, 最好 用尺量 一下, 一般距 离玻璃 板顶端 
0.5cm ,用 水或水 饱和的 异丁醇 封胶。 凝胶聚 合后用 电泳缓 冲液或 水冲洗 一下胶 上端, 除 
去未 聚合的 单体, 同 时也使 胶条容 易推到 SDSPAGE 胶 上端。 

(2) 第一 向胶条 的转移 

用镊子 夹住一 向胶条 的一端 ,放 到玻璃 板上, 胶面 朝外, 然后用 平头镊 子将小 心地将 
胶条 推到二 向胶的 上端。 两块胶 之间, 经常 会出现 细小的 气泡, 可 以用镊 子调整 一下胶 
条, 尽量除 去气泡 ,然 后加人 融化的 0.5% 的琼脂 糖封胶 ,此时 尽量少 动一向 胶条。 

. 279 . 



表 14.3 SDS"PAGE 的凝 胶配制 



分离胶 

聚 丙錄醜 胺单体 (%T,2.67%C) 

12.5%T X%T 



水 


31.78ml 


V-all the following 


Arc/Bis (30%T, 2.67%C) 


41.67ml 


' X * V/30ml 


1.5mol/LTris-HCl, pH8.8 


25ml 


V/4ml 


10%SDS 


1.0ml 


V/lOOml 


10% 过 硫酸铵 


500^1 


V/200ml 


TEMED 


50^1 


V/2000ml 



总体积 100ml 



(3) 电泳 条件设 置如表 14.4 所示 

表 14.4 第二向 SDS^PAGE 电泳 的设置 



1 • 0mm Spacer 


15mA/gel 走 15min ,然后 30mA/gel 走至溴 B& 蓝离 胶下沿 0.5cm 


1 . 5mm Spacer 


20mA/gel 走 15min ,然后 40mA/gel 走至溴 酹 蓝离 胶下沿 0.5cm 



5. 干胶 

(1) 手 工干胶 

多孔聚 乙烯膜 两张, 剪 成比胶 稍大的 尺寸, 浸泡在 水中。 取出 一张在 玻璃板 (如 灌胶 
用的玻 璃板) 上铺平 ,将凝 胶平铺 其上, 胶上再 覆盖一 层膜, 做成" 三明治 "夹 饼状。 四周用 

有机 玻璃条 压住, 再 用夹子 夹紧。 注 意凝胶 与两层 膜之间 
不得有 气泡, 膜表面 尽量保 持光滑 平整。 于室温 干燥, 一 
般 24〜72h 内即可 干燥, 时间 差不多 时注意 观察, 否则胶 
很容易 干裂。 
(2) 干胶 机干胶 

先将 干胶机 的滤纸 板用水 润湿, 再将膜 和胶放 到滤纸 
板上, 操作和 注意事 项基本 同上。 盖上橡 胶塾, 打 开抽气 
装置后 ,检查 橡胶塾 四周是 否已经 吸牢, 然 后再盖 上干胶 
图 I 4 . 8 BioRad 公司的 干胶机 机盖子 ,一般 80X:ih 即可。 BioRad 的干胶 机如图 14.8 
所示, 抽气 一般用 水泵, 该 公司也 有配套 的抽气 装置。 

第四节 胶上 蛋白质 的检测 

一、 介 绍 

显示双 向凝胶 上的蛋 白质点 的方法 有多种 ,例如 ,考马 斯亮蓝 R-250 (CBB R-250)、 
CBB G-250、 醜胺黑 (Amido Black) 、丽 春红 S(Ponceau S) 、银染 、负染 、荧光 染料染 色以及 





280 



放 射性同 位素标 记等。 放 射性同 位素标 记法显 示蛋白 质的灵 敏度非 常高, 同位素 的掺入 

是以 细胞代 谢为基 础的, 不同 蛋白质 掺人同 位素如 35 s 的量 不同, 因此, 有时 难以反 映蛋白 

质组 中各种 蛋白质 的实际 丰度, 从胶上 切取蛋 白质斑 点的不 便也是 影响它 被广泛 使用的 
一个 因素, 但 用来监 测蛋白 质组表 达变化 时有其 潜力。 银染 和考马 斯亮蓝 染色是 蛋白质 

组研究 中最为 广泛使 用的两 种染色 方法, 银染有 100 多种 不同的 方法, 分为两 大类, 碱性 

银氨染 色法和 酸性硝 酸银染 色法。 酸性硝 酸银染 色法和 碱性银 氨染色 法相比 ,它 对酸性 
蛋白质 的染色 灵敏度 稍高, 但 对碱性 蛋白质 的染色 灵敏度 稍低。 酸 性硝酸 银染色 法的原 
理是一 个照相 的过程 ,凝胶 在酸性 环境下 与硝酸 银温育 ,银离 子附于 蛋白质 表面, 然后在 
碱性环 境中里 用福尔 马林还 原成金 属银。 碱性 银氨染 色法的 原理是 用氨水 来形成 银氨复 

合物, 银氣 复合物 与胶内 SDS- 蛋白质 复合物 结合, 然 后在酸 性条件 下用福 尔马林 将银氨 
还 原成金 属银。 由于氨 的不稳 定性, 酸 性硝酸 银染色 法更适 合于定 量比较 分析。 一般认 
为 银染的 灵敏度 是能染 l〜10ng 的蛋 白质, CBBR-250 的灵 敏度在 lOOng 左右, CBB G- 
250 的 灵敏度 稍高于 CBBR-250 [45 3。 酰 胺黑较 广泛地 用于染 色电转 移到膜 上的蛋 白质, 
其检 测限在 30~50ng[ 45] 。 负染中 的锌染 [ 46] 和铜染 [47] 是近 年来逐 渐受到 重视的 染色方 
法, 染色 后凝胶 背景呈 不透明 的乳白 色或青 绿色, 而蛋白 质斑点 或条带 则是透 明的。 我们 
比较了 银染、 CBBR-250、 锌 染和铜 染对蛋 白质的 染色灵 敏度, 银染能 检测到 8ng 的肌红 
蛋白; CBBR-250 能 检测到 62ng 的肌红 蛋白和 同量的 牛血清 白蛋白 ;铜染 对肌红 蛋白的 
灵敏度 稍高于 CBB R-250, 为 31ng ,但 只能 检测到 125ng 的牛血 清白蛋 白条带 ;锌 染的灵 
敏度 与银染 相当, 8ng 的肌 红蛋白 或牛血 清白蛋 白均能 被检测 出来。 CBBR-250、CBBG- 
250 和锌 染对蛋 白质的 后续分 析有较 好的兼 容性。 由于 金属负 染蛋白 质是可 逆的, 具有 
高灵敏 度的锌 染在蛋 白质组 研究中 会具较 大潜力 ,但对 手工切 胶而言 ,从锌 染的凝 胶上切 
取蛋 白质斑 点要困 难些, 采用自 动切胶 机可解 决这一 问题, 图 14.9 是用光 密度仪 (densit- 
ometer) 扫描锌 染的双 向凝胶 得到的 图谱。 银染由 于其较 高的灵 敏度, 多数 用来作 为图谱 
分析 为目的 的染色 方法, 但通 过染色 方法的 改进, 银染后 的蛋白 质也可 用来分 析鉴定 [48] 。 
Scheler 等人 用不同 的染色 方法, 结合酶 解和质 谱分析 双向凝 胶电泳 分离的 蛋白质 ,结 
果表明 CBBG-250 和锌 染对量 低的蛋 白质斑 点能得 到较好 的识别 鉴定; 与之相 比, CBB 




图 14.9 人肝癌 细胞系 MHCC97 的部 分双向 
凝胶 电泳锌 染图谱 

• 281 • 



R-250 染色 量大的 蛋白质 斑点, 酶 解和质 谱分析 后可达 90% 的 序列覆 盖率, 对量中 等的蛋 

白 质斑点 也可达 80% 的覆 盖率。 染色 方法的 确定一 般要根 据研究 需要和 后续分 析的灵 • 

敏度 而定。 

利用 荧光试 剂显影 凝胶分 离蛋白 质在蛋 白质组 研究中 的应用 越来越 广泛。 传 统的荧 
光标 记往往 需要共 价修饰 蛋白质 的自由 氨基、 羧基 或巯基 [5 G' 5 i ] ,这种 共价 修饰的 荧光标 H 

记法 有许多 缺点: 等电聚 焦前标 记蛋白 质会改 变蛋白 质的等 电点, 从 而引起 蛋白质 的不正 I 

常迁移 [5 G, 5 i ] ;不同 蛋白质 中荧光 基团可 修饰的 功能基 团不同 ,因此 不同蛋 白质对 标记的 ' 

灵敏度 不同; 荧光基 团的共 价修饰 会干扰 蛋白质 的分离 后分析 ,如蛋 白质相 对分子 质量的 
轻 微改变 影响质 谱识别 鉴定蛋 白质。 然而, 非共 价修饰 的荧光 染料如 sypro red 和 sypro 
orange 等则 与前者 不同, 它 有许多 优点。 sypro red 和 sypro orange 对聚丙 條酰胺 凝胶中 
蛋白质 染色非 常灵敏 [45] ,能 检测 l〜10ng 的蛋 白质, 可 与银染 媲美, 且染色 的动态 范围比 
银染大 ,达 3 个数 量级; 染色步 骤简单 ,一步 染色, 无需 脱色; 染色后 的蛋白 质适于 Edman 
降 解测序 和质谱 分析。 但 图像采 集时需 UV 光源或 激光扫 描仪。 一 种新型 的荧光 染色试 
剂 sypro ruby ,其染 色原理 是利用 重金属 铷的螯 合物来 和胶上 蛋白质 结合, 染色 专一性 
好, 灵敏 度高, 而且 不会担 心染色 过度。 Lopez[ 52 j 比较了 sypro mby 荧光染 色和银 染两种 
方法, 前者 的定量 重复性 (相关 系数二 0.9) 要 比后者 (相关 系数二 0.8) 稍好, 银染的 线性动 • 
态 范围为 8〜60ng ,而 sypro ruby 染 色的线 性动态 范围为 l〜2ng 到 1 〜2|Ltg,sypro ruby 的 
线性 动态范 围要比 银染高 700 倍左右 ,而且 sypro ruby 染色 在蛋白 质酶解 的序列 覆盖率 
和质谱 图信噪 比方面 都优于 银染。 图 14.10 是 我们用 sypro ruby 染色得 到的效 果图。 



1 




图 14.10 人肝癌 细胞系 MHCC97 的 sypro 
ruby 染 色图谱 (BioRad 11cm pH3〜10 胶条) 

观 察功能 相关的 蛋白质 表达的 平行性 变化是 差异蛋 白质组 (differential proteome) 研 
究的主 要内容 ,实验 需要多 次重复 ,大 量双向 凝胶图 像需要 用计算 机软件 一张一 张地分 
析、 比较, 使用 改进的 染色方 法或图 谱成像 方式不 仅能简 化图像 分析, 并且 可以减 少实验 
工 作量。 Onlii 等 [531 建 立了一 种称为 差异凝 胶电泳 (differential gel electrophoresis, DICE) 

- 282 - 



I 



的方法 ,实际 上是采 用两种 荧光试 剂分别 标记两 个样品 ,然 后混在 一起进 行双向 凝胶电 

泳。 他们用 两种花 青染料 (cyanine dyes) 丙基- Cy3 和 甲基- Cy5 分别 标记经 IPTG(iso- 
propylthiogalactopyrarioside) 和未经 IPTG 诱导 的大肠 杆菌蛋 白质抽 提物, 两样品 混合后 
在一块 胶上双 向凝胶 电泳, 因两种 染料分 别具有 不同的 激发光 和发射 光波长 ,从一 块凝胶 
上可以 采集到 代表两 种样品 的两张 图像, 经计算 机处理 ,得 到一张 Cy3/Cy5 的 比例图 (ra- 
tio image) (相 当于差 减图) ,可以 很清楚 地看到 GAL4VP16 蛋白被 IPTG 诱导。 图 14.11 
是 模式系 统里用 Cy3/Cy5 染色 得到的 结果。 





图 14.11 以 Cy3 和 Cy5 为染料 的模式 系统的 
双向 -差异 凝胶电 泳图谱 
蓝色为 Cy3 的 颜色, 红色为 Cy5 的 颜色。 (AmershamPharmada 公司 提供) 

由 Bernhardt 等 [54] 建立 的双通 道成像 (dual channel imaging) 是 另一种 在一张 电泳图 
谱 上显示 蛋白质 组表达 变化的 方法。 在 细菌用 L-[ 35 S] 甲硫 氨酸脉 冲标记 5 min 后 裂解, 
提取蛋 白质, 双向 凝胶电 泳后凝 胶经过 银染, 采 集银染 的双向 图谱, 同一块 胶再用 Phos- 
phorlmager 采 集同位 素标记 蛋白质 的双向 图谱。 银染图 谱经软 件转换 为绿色 的图谱 (即 
保留绿 色通道 ), 同位素 图谱转 换为红 色图谱 ,然 后将两 图谱合 成一张 图谱, 可以看 到新合 
成的 蛋白质 为红色 斑点, 细胞 内早已 合成的 蛋白质 为绿色 斑点, 一 直在合 成的为 黄色斑 
点。 这种方 法免去 了凝胶 配比的 麻烦, 但 操作过 程中应 戴干净 的手套 以避免 同位素 污染。 



二、 染 色方法 

(一) 考 马斯亮 蓝染色 

(1) 常规考 马斯亮 蓝染色 

① 滤 纸过滤 染色液 [50% 甲醇, 10% 乙酸, 0. 250/6 (m/V) CBBR350]o 

② 水洗胶 5min。 

. ③ 染色液 中染色 3h。 

④ 50X)(\VV0 乙酸, 10%(VVV) 甲 醇溶液 脱色, 反复更 换脱色 液直至 蛋白质 点在背 
景 上变得 清晰。 

• 283 . 



(2) 胶体考 马斯亮 蓝染色 [55] 

① 120/{) TCA 固定 lh。 

② 0.1O/{) (m/V) CBBG250,2% ( /VO 憐酸, 10% 过硫 酸铵, 20% 甲 醇染色 lOh ,注 
意染 色盒要 密封。 

③ 25% 甲醇 溶液洗 Imin ,重复 2 遍。 胶 可置于 20% 过硫 酸铵中 保存。 

(二) 银染 

(1) 分析 型银染 (不 能用 于质语 鉴定) [56] 

① 水洗胶 5min; 

② 40% 乙醇, 10% 乙 酸固定 lh。 

③ 5% 乙醇, 5% 乙 酸固定 过夜。 

④ 水洗 20min ,重复 2 遍。 
©596 戊二醛 lh。 

⑥ 水洗 30min ,重复 4 遍。 

⑦ 250ml 新鲜 配制的 银氨液 (1ml NaOH 与 5ml 饱和 氨水混 合再加 10ml 20% 
AgNOj)/ 胶 45mino 

⑧ 水洗 3min ,重复 3 遍。 

(9)1. 5ml 1% 柠 檬酸、 125|ul 37% 甲醛 / 胶 显色。 
⑩ 5% 乙 酸停显 10min。 

® 水洗 lOmin ,重复 3 遍。 ■ 

(2) 快 速银染 (和 质语 鉴定相 匹配) [57] 

① 水洗 5min。 

② 40% 乙醇、 lOo/o 乙酸重 复固定 15min ,重复 2 遍。 

③ 30 % 乙醇、 . 2 % 硫代 硫酸钠 、6 . 8 % 乙 酸钠 30min。 

④ 水洗 5min ,重复 3 遍。 

©2. 5% 碳酸钠 ,0.04% 的福 尔马林 (36 0/0 的甲醛 溶液) 显影 至背景 出现。 
©1.46%EDTA 溶 液停显 10min。 
⑦水洗 lOmin ,重复 3 遍。 

(三) 锌染 [46] 

① 水洗 lmin。 

② 0.2mol/L 咪 U^、0.10ASDS 溶液 10min。 

③ 0.2mol/L 氯化锌 Imin 至胶背 景变为 纯白。 

④ 水洗 5s ,重复 3 遍。 

(四) ruby 荧 光染色 [43] 

① 10% 甲醇、 7% 乙 酸固定 lh。 

② 700ml sypro ruby 溶液 / 胶染色 3h。 

③ 10% 甲醇、 7% 乙酸洗 lh。 
• 284 • 



以 下简述 双向凝 胶电泳 的问题 与原因 [ 58 ~ 6 G] , 如表 14.5 至表 14.7 所述。 



表 14.5 第 一向等 电聚焦 的问题 


问题 与现象 


可能原 因和解 决措施 


IPG 胶 条在靠 近电极 附烧焦 


电流限 制太髙 ,最大 电流限 制设为 5(VA 

IPG 胶条没 有完全 重泡涨 ;应检 査重泡 涨液的 体积, 保证 重泡涨 液的体 积足够 
IPG 胶条过 于干燥 ;重 泡涨和 等电聚 焦时加 矿物油 


申 压太低 达 不到最 高电压 


样 品盐浓 度太高 

flJ^ 或稀释 样品, 等 电聚焦 l~2h 后更 换电极 塾片。 盐 浓度不 得超过 

lOOmmol/L ,最好 控制在 lOmmol/L 以内 
等电聚 焦的设 置错误 
检査电 压设置 


电 流为零 或很低 


持胶 槽和电 极接触 不好, 或者电 极和胶 条的接 触不好 
检査以 上接触 情况, 检査 胶条是 否完全 重泡涨 


尿素在 胶条表 面结晶 


温 度太低 

温度控 制设为 20t: ,室 温不 能太低 



表 14.6 第二向 SDS"PAGE (垂直 系统) 的问题 



问题 与现象 


可能原 因和解 决措施 


开 始时没 有电流 


上下 槽是否 有电泳 缓冲液 


电 泳太慢 


检查电 泳缓冲 液是否 配错; 检査分 离胶缓 冲液是 否配错 


溴 S& 蓝 前沿一 边上翘 


阴极电 泳缓冲 液没有 接触胶 的一端 ;保证 电泳缓 冲液覆 盖了胶 的全长 


溴酌蓝 前沿两 边上翘 


冷凝 不好; 检査 冷凝器 是否工 作正常 


溴 S& 蓝前沿 不规则 


受 IPG Buffer 影响, 对最终 结果没 有影响 
胶条太 旧或二 向成品 胶太旧 ;检査 日 期是 否过期 

IPG 胶条 转移到 二向时 下面有 气泡; 保证胶 条和二 向胶顶 部紧密 接触, 无气泡 



表 14.7 染色 的问题 



聚焦时 间太短 (尤其 对于相 对分子 质量较 高的蛋 白质) 或太长 (蛋白 质会分 解); 
优化聚 焦时间 



去柜剂 浓度太 低或使 用了不 合适的 去塘剂 ; 
检 查去^ 剂浓度 ,测 试不 同的去 剂 



尿 素浓度 太低; 

重泡涨 液的尿 素浓度 不低于 8mol/L 



IPG 胶条时 间太短 , 没有 重泡涨 到其原 始厚度 ; 
重泡涨 胶条至 0.5rnm 厚, 时 间大于 6h 或过夜 



裂解液 或重泡 涨液的 DTT 浓度 不够; 

裂 解液的 DTT 浓度为 65mmol/L 或重泡 涨液的 DTT 浓度为 18mmol/L 



单个 蛋白质 的多重 氧化; 

加 足够量 DTT ,等电 聚焦时 加上矿 物油, 矿物油 脱气或 充上惰 性气体 



285 



续表 



水 平条纹 


由 于 D'lT 朝 阳极移 动 喊性端 DTT 消 耗 ; 
在阴 极加上 2()mmol/L DTT 润 湿的电 极塾片 


错 误的样 品加样 区域; 

检査 阳极还 是阴极 加样比 较好, 或者 使用样 品的胶 内重泡 涨方式 加样' 


由 于样品 的内源 性水解 造成的 假象; 

用 TCA 丙酮 法处理 失活蛋 白解, 加 人蛋白 晦抑制 剂或与 SDS —起煮 


空 气中的 C02 干扰; 

等电聚 焦时加 矿物油 ,密封 电泳腔 或在腔 内加上 NaOH 润 湿的纸 片去除 COz 


相 对分子 质量为 68 000 或 55 000 的 条纹, 可能有 角蛋白 或白蛋 白污染 ,或 者由巯 基乙醇 造成; 
过滤所 有溶液 ,用 DTT 取代巯 基乙醇 


蛋白 质加样 处产生 沉淀; 
等 电聚焦 时采用 低电压 


蛋 白 质抽 提时有 不溶物 在样品 中 ; 
高 速离心 40 OOOg Ih 


垂 直条纹 


蛋白 质从一 向转移 到二向 时发生 沉淀; 
提高 平衡的 SDS 浓度, 适当 延长平 衡时间 


蛋白质 上样量 过大; 
降低 上样量 


水不够 纯净, SDSPAGE 胶配 制时没 有过滤 (背 景有 极细的 条纹) 或 者胶条 平衡后 仍带有 额外的 
DTT; 

使用 Millipore 水, 过滤 胶液。 使用 IAA 平衡 IPG 胶条, 去除 额外的 DTT 


成 对的竖 直条纹 遍布于 胶上; 
可能是 由硫脲 引起的 ,原因 尚不明 



(丁 士健) 

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289 



第 十五章 电泳图 谱的图 像分析 

第一节 介 绍 . 

双向凝 胶电泳 根据等 电点和 相对分 子质量 的不同 可一次 分离数 千种蛋 白质, 经染色 
后蛋 白质在 聚丙' 烯酰胺 凝胶上 形成密 度不同 、分布 不均的 复杂点 图谱。 如 何对图 谱上的 
这些蛋 白 质点进 行检测 、定量 、 比较 、分 析和 归类是 双向凝 胶电泳 分析软 件所要 解决的 问题。 

双向凝 胶电泳 图谱分 析一般 包括以 下几个 步骤: 图像 采集、 图像 加工、 点的检 测和定 
量 、凝 胶匹配 、数 据分析 、数据 解释和 构建数 据库。 图 像采集 是通过 扫描仪 或数码 相机将 
凝胶转 换为数 字图像 ,其 参数设 置对于 以后的 蛋白质 点的内 在信息 抽提是 比较重 要的, 因 
为 以后的 整个图 像加工 过程实 质上是 给图谱 上的每 个蛋白 质点进 行精确 的定位 和定量 
(以 面积和 密度作 为指标 )。 图像 加工主 要是指 软件通 过一定 的算法 来去除 图谱上 非蛋白 

质点的 杂质和 染色不 同造成 的不同 深浅的 背景。 点 的检测 主要是 产生每 个点的 X、Y 轴 
坐标, 外形参 数和密 度参数 ,并 对每个 蛋白质 点做数 字模拟 合成。 对 于点的 检测和 定量, 
目前 采用的 算法可 分为高 斯拟合 (Gaussian fitting) 和拉 普拉斯 算子高 斯拟合 (Lapladan of 
Gaussian) 两大类 [卜 4 ]。 除了在 单块胶 上获得 点的信 息外, 在 一系列 不同胶 上监测 某个蛋 
白质 点的变 化是生 物学分 析所感 兴趣的 问题。 不同图 像间的 比较首 先要确 定足够 的坐标 
(landmark) ,即每 块胶上 都存在 的点。 这些坐 标用于 确定图 像之间 几何转 换的多 项式, 然 
后 用于其 他点的 匹配。 表 达量变 化的蛋 白质点 或已经 鉴定的 点可在 软件中 进行数 据归类 
和 解释, 还可以 建立数 据库通 过因特 网来进 行成果 共享。 

双 向图谱 分析软 件的开 发始于 20 世纪 70 年代末 ,至 今经历 了三代 的发展 历程。 最 
初 的程序 是使用 DEC PDP11 家族的 小型计 算机在 VMS 操作 系统上 运行, 如 Elsie, 
LIPS, Gellab 和 Tycho; 第二代 是基于 Unix 的程序 , 盛行于 80 年 代后期 , 如 Gellab- , 
Elsie-4, Kepler, Melanie 和 Quest ; 第三代 是基于 Unix 、 NT 和 Mac 多种计 算机平 台的程 
序, 如 2DBioImage, Melanie- 11 和 Phoretix 2D。 当今, 双 向图谱 分析软 件正向 PC 化发 
展, 而且 界面更 友好, 使用更 方便, 功能更 强大, 以适应 这一工 具进人 普通实 验室, 如 
PDQuest, Melanie- in, Phoretix 2D 和 ImageMaster 2D 等。 近年来 随着蛋 白质组 学的兴 
起, 新的双 向凝胶 电泳分 析软件 在自动 化方面 又有较 大改进 ,如 Z3、Deha 2D 和 Progenesis。 

第二节 PDQuest 软 件简介 

PDQuest 是显示 ( imaging ) 、 分析 ( analyzing ) 双向 凝胶电 泳图谱 和数据 库查询 
(databasing) 的一个 软件包 ,由 BioRad Laboratories 开发, 目前 已经升 级到第 7 版。 它运 
行在 Windows 环境下 ,图形 界面简 单易用 ,有标 准菜单 、工 具条, 并且支 持键盘 操作。 
PDQuest 从 BioRad 的专业 扫描仪 中获取 图像, 用高 级算法 去除图 像背景 噪声、 凝 胶中的 
人 为假象 和水平 垂直的 条纹, 然后用 点细化 (spot segmentation) 的方 法去检 测和定 量蛋白 
- 290 - 



质斑点 ,最后 将结果 显示并 能输出 到其他 的统计 分析用 途中。 它 能同时 分析凝 胶上的 

10 000 个蛋白 质斑点 ,能跟 踪报告 所有蛋 白质形 式和样 品浓度 的变化 ,并给 出合理 的定量 
和定性 数据。 PDQuest 的匹配 (matching) 和数据 (databasing) 分析能 力使它 能同时 分析几 
百块 凝胶, 柱形图 (histograms) 方式能 比较一 组实验 中每块 凝胶上 相同点 的量的 变化。 
使用者 能将相 关的蛋 白质斑 点归为 一类, 再 从实验 胶上产 生的参 考图像 (master image) 上 
做高级 分析和 比较。 扫 描的文 件能被 插入或 输出到 发现组 (discovery series) 中, 文 件格式 
转换为 TIFF 格 式以便 作其他 用途。 图像 匹配的 数据能 输人到 列表中 (spreadsheets) 以便 
做 简单的 分析。 

用 PDQuest 分析 2D 凝胶 包括以 下主要 步骤。 

① 看图和 解释。 看图工 具可对 图像进 行缩放 、翻转 、任 意角度 调整、 切 割和去 除背景 
噪声, 还可 将图像 转换为 数据。 另外, 利 用密度 工具还 可看到 整张图 上点的 OD 值的变 
化。 在点的 检测中 PDQuest 自动标 记哪些 点是过 饱和点 (saturated), 哪些是 模糊点 
(faint) ,这 些点将 不能参 加以后 的分析 过程。 使用者 也可人 工标记 哪些点 不参与 分析过 
程, 还可 将紧挨 在一起 的点综 合成一 个点, 便于 比较和 分析。 

② 点的 检测和 定量。 PDQuest 点 的检测 过程是 自 动进 行的, 但 是使用 者可人 工设定 
参数, 如扫描 过程、 看图 过程、 点检测 的灵敏 度以及 是否纠 正模糊 点等。 PDQuest 还可根 
据所做 的标准 给出凝 胶上每 个点的 相对分 子质量 (A/zr) 和 等电点 (pJ) 信息。 

③ 凝胶 匹配。 根据不 同的目 的做出 不同的 匹配组 (matchset), 然后将 它们整 合成标 
准 (standard)。 选择标 准胶的 要素有 :点的 数目、 代 表胶、 对照胶 和点的 质量。 对 匹配组 
(matchset) 可进 行编辑 操作: 部分 匹配、 手工 匹配、 检査非 稳定点 (erratic spot) 、重新 匹配、 
添加 点等。 匹配过 程中需 要人工 设定- -些 参考点 (landmark)。 

④ 数据 归类。 PDQuest 可将凝 胶上的 点做数 据处理 ,有 6 组 设置可 使用: 定量、 定性、 
任意 (arbitrary) 、布尔 (boolean) 、统计 和解释 (annotation) 。 

© 报告 输出。 匹配组 (matchset) 的数据 可输出 到列表 中进行 分析, 扫 描的图 像可以 
TIFF 的形 式输出 到其他 图像处 理软件 中进行 分析。 

图谱 分析是 一个多 步骤、 有顺序 的过程 ,包括 蛋白质 斑点的 检测、 高 斯拟合 (Gaussian 
fitting) 、定量 、背景 扣除、 图 像定位 (alignment) ,最后 是凝胶 图像的 比较, 蛋 白质斑 点配比 
(matching) 图谱分 析的大 多步骤 是自动 进行的 ,但由 于凝胶 电泳的 质量, 通常有 10% 左 
右的 斑点没 有被正 确检测 , 有小 部分蛋 白 质斑 点可能 会错配 , 需 要人工 校正。 要 提高蛋 白 质 
斑点检 测和配 比的正 确率, 一方 面需要 提高双 向凝胶 电泳的 质量, 另一 方面需 建立更 为精确 
的斑点 检测和 配比的 计算机 算法。 最近, Panek 等 [ 5 ] 提 出了一 种称为 point pattern matching 
的新的 计算机 算法, 检 测蛋白 质斑点 的正确 率大于 9596 ,斑 点配比 的精确 率大于 980/6。 

第三节 PDQuest 软件 的使用 

一、 材 料 

1. 硬件 

最低硬 件配置 要求为 Pentium 166 处理器 ,64M 内存, 3G 硬盘, 17' '显 示器, 1024 X 

• 291 . 



768 分 辨率, 256 色, SCSI 接口。 Windows 95/98/NT 操作 系统。 

我们 实验室 的硬件 配置为 Pentium 11 350 处 理器, 256M 内存, 15G 硬盘。 Windows 
ME 操作 系统。 

2. 软件 

PDQuest 双 向凝胶 图像分 析软件 6.2.0 版, BioRad Laboratories, Hercules, CA。 

二、 方 法 

(一) 图 像采集 

染色完 毕的凝 胶用水 洗净后 ,置于 BioRad GS710 扫描 仪上, 胶 上盖一 块干净 的滤光 
板, 注意 胶和扫 描仪以 及滤光 板之间 不能有 气泡。 

扫描仪 可以从 文件菜 单或者 从快速 向导中 选择。 扫描 仪面板 上的" 选项" 里有 扫描仪 
校准的 设置, 软 件安装 后要根 据扫描 仪随机 附送的 校准表 来重新 设置。 扫 描仪会 根据此 
表 在每次 扫描前 自 动将 机器校 准一遍 。 

扫描 的第一 步是选 择所要 扫描的 介质的 种类, 如 凝胶、 X 射线 片等, 然 后选择 染色方 
法 , 如 银染、 考马斯 亮蓝染 色等。 软件会 根据所 选择的 介质和 染色方 法来改 变发光 方式和 
滤 光片的 设置。 第二步 ,预 扫描, 确 定所要 收集的 数据的 范围。 第三步 ,数据 采集。 此时 
会提 示给扫 描文件 命名。 扫 描仪面 板见图 15.1。 




图 15.1 扫描 仪面板 
(二) 看图 和编辑 

在 View 菜单中 Zoom In.Zoom Out 可以 对图像 的进行 縮放, View Density 工 具可以 
看到胶 上点的 光密度 变化。 Advance View 工具提 供了更 多的看 图方式 ,在 点的检 测和编 
辑 中可以 用到。 Windows 菜 单下的 Tile 可 以平铺 图像, Imitate 用来 使所有 其他胶 的显示 
和所选 胶的显 示相同 ,比如 ,用 Zoom out 观看 一块胶 的某一 放大区 域时, 用 Imitate 可以 
很方 便地看 到其他 胶上此 放大的 区域。 Assign 和 Interchange 工具 在建立 点的检 测以后 
会用到 ,用于 在指定 窗口内 显示同 一块胶 所产生 的不同 文件, 如 2D scan 文件、 Image File 
文件和 Gel Spot 文件。 看图菜 单和它 们的图 标见图 15.2。 
- 292 • 



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图 15.2 看 图菜单 和对应 的图标 

图像 编辑时 要将所 有图像 的大小 、方向 、调整 一致, 同时还 要去除 图像上 的背景 噪声。 
打开图 像后用 Image 菜 单下的 Rotate 或 Flip 工具将 所有图 像的方 向调整 一致, 然后 
用 Filter 工 具去除 图像中 的背景 噪声。 背景噪 声分为 两类, 称为 Pepper 和 Salt。 Salt 的 
光密 度比背 景浅, Pepper 的光密 度比背 景深。 它们 都属于 Outlier 类型的 噪声。 噪 声有三 
种密 度分布 方式, 称为 Gaussian、Uniform、Outlier ,用 View 菜 单下的 View Density 可以判 
断噪声 的分布 方式。 然后选 择过滤 的像素 大小, 像 素越大 过滤的 效果越 明显。 需注意 ,过 
滤对 图像来 说是不 可逆的 操作, 因此, 最好在 保存的 时候选 择备份 (copy and filter) o 过滤 
的提示 框见图 15.3。 



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图 15.3 过滤的 提示框 

去除噪 声后, 用 Image 菜 单下的 Crop 命令可 切除胶 上四周 一些不 需要的 部分。 高级 
的切割 方法是 在所有 图像中 选择一 块胶做 参考胶 ,用 Image 菜 单下的 Advance Crop 工具 
中的 Define crop area 定义切 割区域 ,然 后执行 Place Crosshair 命令 在胶上 选择一 个分离 
得好、 又很清 晰的点 做为十 字准线 (crosshair) 。 Save Crop Setting 保存 此切割 设置。 其他 
胶只要 Load Crop Setting ,找 到十 字准线 后执行 Crop 命令 即可。 这 样能保 证切割 出来的 
胶规格 一致。 

Image 菜 单中的 Transform 可 以随意 调整图 像的亮 度和对 比度, 以便于 看图, 但它并 
不改变 图像内 在的光 密度。 图 像的亮 度和对 比度可 以手工 调整, 也可以 选择自 动方式 
(Auto-Scale) • 

. 293 . 



(三) 点 的检测 和编辑 

PDQuest 6.1 版增 加了点 检测的 参数设 置向导 (Spot Detection Parameter Wizard) o 
打开胶 图像后 , 选择 一块分 离效果 比 较好的 胶作为 标准胶 , 然后在 Spot 菜单 下选择 Spot 
Detection Parameter Wizard ,会弹 出如图 15.4 所示的 界面。 

点 检测时 需要设 定以下 参数: 最模糊 的点、 最小 的点、 最 大的点 和胶的 背景。 Spot 
Dectection Parameter Wizard 面板左 边的一 列图标 是看图 工具, 可以 放大、 縮小、 移动图 
像, 并能 看到胶 上点的 光密度 变化, 这些 工具是 为了便 于找到 最模糊 的点、 最小的 点和最 
大 的点。 最模 糊的点 即是图 中可见 的光密 度最低 的点, 它 确定了 点检测 时的灵 敏度。 最 
小的 点为面 积最小 的点, 它 确定了 点检测 的尺寸 范围。 在大 多数情 况下, 最 模糊的 点即是 
最小 的点, 因 此可以 略去设 定最小 的点这 一步。 最大的 点为面 积最大 的点, 它确定 了去除 
背景时 的背景 抽提转 球和条 纹去除 圆盘的 半径。 胶的 背景设 定应选 择胶上 一块尽 可能大 
的、 没 有点和 条纹的 区域作 为胶的 背景, 胶的背 景确定 了点检 测过程 中的噪 声过滤 方式。 




图 15.4 点 检测的 参数设 置向导 

点的参 数设置 好后, 按 Find Spot Centers 测试 一下点 的检测 效果。 软 件将会 给每个 
检 测得到 的点打 上十字 标记。 如选中 Gaussian Model During Test ,则 检测 到的点 将会减 
少, 因 为聚焦 在一起 的点可 能将被 认为是 一个大 的点。 要获得 满意的 点的检 测效果 ,点的 
检测需 要重复 若干遍 , 直 至找到 最佳的 参数。 

在 Spot Dectection Parameter Wizard 面 板上的 Optional Controls 选项里 ,有 Streaks 、 
Background. Speckles 和 Options 4 栏。 在 点的参 数设置 好后, Background 栏和 Speckles 栏 
一般不 用改动 ,如 果条纹 的去除 不够多 的话, 可将 Streaks 中 的半径 降低一 半再重 新检测 
—遍。 

背景 抽提有 3 种 方法: Floating BalK Roller Ball 和 Bi-disk。 默认的 Floating Ball 方法 
和球半 径是最 佳的。 如果 默认方 法对背 景的抽 提太多 或有图 像假象 的话, 可 以选择 
Roller Ball 方法, 但它通 常会产 生更多 的图像 假象。 Bi- disk 方法比 Floating 和 Roller Ball 
方法稍 快一点 ,对 均勾光 滑的背 景处理 效果比 较好, 对 不均勾 光滑的 背景处 理效果 较差。 
- 294 • 



背景抽 提的方 法见图 15.. 



j Streak« ; Background j ; SprokJes j 1 Options 
Method r^RoatngBatt r Roltef P Bi-Oitk 



Large spot size 1 3S 寘 33 




图 15.5 背 景抽提 的方法 

Speckles 栏 的设置 用于过 滤背景 噪声, Perform Smoothing —般要 选中, 过滤的 类型是 
根据噪 声的种 类来选 择的, 见表 15.1。 

表 15.1 噪声 的种类 



噪 声类型 



过 滤类型 



Pepper, Salt Noise 

Gaussian Noise 
Salt, Gaussian Noise 
Pepper, Gaussian Noise 



Median 
Weighted Mean 
Power Mean 
ContraMean 



rOpborvaiConlrois - ^SSSSSBBB^^^S^H 


j Streaks | jBdckgroundj Speckles | Options h| 


jx] Peffoim smocrthaig 




^^Medan C We^ed Mean 




Fler type 




Power Mean P Contra Mean 


P Adaptive 


Kernel Size <T 3x3 r 5x5 r 7x7 









Kernel Size 的选 择在最 小点和 噪声的 平均像 素大小 之间, 像素 的大小 可用放 大看图 
工具来 观察。 见图 15.6。 

Options 栏的 Fix Faint Spots 是 默认选 中的, Faint Spots 是指一 些光密 度低于 一定值 
(如 0.2 OD) 又高 于背景 的点, Fix Faint Spots 将这 些点的 X、Y Sigma 值赋 为同一 Y 轴座 
标的点 的值。 它解 决了像 素非常 小的点 的定量 问题。 见图 15.7。 



图 15.6 Kernel Size 的选择 



Opbonal Controls — 

Stie^s i .Backgound Speckles 



Options 



Fix faint spots. 

(Use average sigma o( dark neig^tiors-) 




Help 



',讓 • 



图 1 5 . 7 Fix Faint Spots 的选择 



点的 检测参 数设置 好后, 在 Parameter Set 栏按 Save 将 此设置 保存, Load 此设 置可对 
其 他胶进 行点的 检测。 Processing All Gels 可选择 设置参 数检测 多块胶 的点。 

点的检 测完成 后加上 原来的 2D scan 文件, 另 外又生 成两个 文件: Filtered 和 Gaus- 
sian。 同时打 开这三 个文件 , 利用 Spot 菜单的 Add Spot 和 Remove Spot 可 增加或 去除点 , 
在 More Edit Tools 里还 可将几 个重叠 在一起 的点合 并成一 个点, 或 者手工 标记哪 些点是 

. 295 • 



B -I 



饱和点 ,哪 些是模 糊点。 Spot Boudary Tools 是 6.2 版 新增的 功能, 如果一 个点是 形状不 
规则的 饱和点 ,或者 点的质 量很差 ,那 么在点 的检测 过程中 Gaussian Modeling 不 能精确 
合成这 个点, 用 Spot Boundary Tool 可手工 描绘这 些点, 但点 的定量 可能不 很准。 

(四) 建立 和编辑 比较组 (Matchset) 

建 立和编 辑比较 组的菜 单见图 15.8。 

Create/Bdi 1 HatcKset 




Hatch Gel 
Hatch Ml Gels 



Edit Matches 



Show Symfcc'ls 
Show Offsets 
Mark Landmarks 
Show Watch 




Atito"Add Spots to Standard 
Add Spot to Standard 
Mark Added Spots Alt+FS 
Keroav« Added Spot 

图 15.8 建立 和编辑 比较组 的菜单 



点的 检测完 成后, 同一 个胶文 件会自 动生成 3 个 文件: Gel Spot. Gel Image 和 2D 
Scan。 建立比 较组, 命令 如下: Matchset 菜单下 CreatMatchset。 然后 选择要 比较的 文件, 
Gel Spot 和 Gel Image 文件也 应包含 在内, 这 样在建 立比较 组后, 还可以 做点的 编辑。 按 
OK 键之 后会出 现一个 对话框 , 要 选择一 块胶做 标准胶 , 标 准胶最 终会包 含所有 比 较组成 
员 的点, 所以, 标准胶 应选择 一块最 具代表 性的胶 , 比如 实验中 的对照 , 而且 这块胶 要分离 
得好。 标准胶 也可在 比较组 建立后 再选。 比较组 分为两 个水平 :低水 平和高 水平。 低水 
平比较 II 建 立在原 始的扫 描胶文 件上, 而高水 平的比 较组则 产生于 低水平 比较组 的标准 
胶上。 

点 的编辑 最好在 Matchset 建立 之后, 这样可 以同时 编辑多 块胶, 也便 于看到 各块成 
员 胶上的 情况。 

各块 胶之间 比较, 首先要 确定几 个坐标 (Landmark), Landmark 的选 择标准 如下: ① 
所 有胶上 都有; ②分离 得好, 分辨 率高; ③靠近 图像的 四角; ④独立 的没有 其他点 与其重 
叠; ⑤位 于或 靠近点 密集的 地方。 胶的 各个部 分应至 少选择 5 个 点做为 Landmark ,一般 
应 标记约 10% 的 点做为 Landmark。 

Landmark 建立 之后, 软 件会自 动匹配 所有其 他点。 用 Show Symbols 可以看 到匹配 
的结果 ,绿色 表示匹 配的点 ,红色 表示该 点只在 该块胶 上有, 而其 他胶上 没有。 Show Off- 
sets 可以 看到点 匹配的 情况, 如果出 现以下 结果则 表示匹 配可能 有问题 :① Offset 有 交叉; 
. 296 . 



②某 一区域 Offset Line 不平行 ;③ Offset Line 长短 不均; ⑤ 某块区 域只有 极少的 Offset, 
暗示 这个部 分尚未 匹配。 

Erratic Spots 用于显 示在各 个成员 胶上有 量的不 同的点 ,量的 差别可 以自由 设定显 
示。 如输人 3, 则成员 胶上有 3 倍量 的差别 的点, 将 会出现 在标准 胶上, 以黄色 显示。 

Manual Match 用于在 自动匹 配情况 下未匹 配的点 ,用手 工方式 匹配这 些点。 匹配完 
成后, 一些只 在成员 胶上有 而标准 胶上没 有的点 需要加 到标准 胶上。 Add Spot To Stan- 
dard 会完 成这一 任务。 一般情 况下, 从成员 胶上加 到标准 胶上的 点不会 很多。 Colony 
Match 是针 对同一 批样品 而言, 比较只 需要定 义两个 Landmark ,就 可以 快速比 较两块 
胶。 



(五) 比较 组的数 据分析 



Analysis 的菜 单见图 15. 9, 



Spot Review Tool 
Imag« Stacl: Tool 

Scatter Flct Too: 

Replicate Groups 



Analysis S«i& 

AxiTLOtalion Tool 
Aimotatx on Select Tool 
More Arino t Tools 

MrpI Standards 



Spot Fumbers 




图 15.9 Analysis 的菜单 

一般在 建立和 编辑好 比较组 之后, 需 要分析 各个成 员胶上 蛋白质 点差异 表达的 情况。 
Spot Review Tool 可以 看到各 个点的 定量柱 型图, 并且方 便地观 察所有 点在各 块胶上 
的定量 变化。 

Image Stack Tool 将多幅 图像进 行堆栈 ,然 后逐幅 观察, 可方便 地观察 多幅图 像上某 
一 斑点的 有或无 的表达 情况。 

Scatter Plot Tool 可分析 比较成 员胶间 所有点 的相关 系数。 

成员 胶之间 的非差 异表达 的量的 变化可 以通过 Normalize 来 平衡。 非 差异表 达的点 
的量的 变化, 可 能由以 下因素 造成: 

①样品 制备中 所用的 细胞数 目不同 ;②不 同试剂 和实验 方法而 导致样 品制备 的效率 
不同; ③ 制备中 的操作 误差导 致样品 丢失; ④样品 制备过 程中移 液枪的 误差; ©上 样时样 
品 丢失; ⑥两块 胶的染 色时间 不同; ⑦放射 性标记 的效率 不同; ⑧不 同荧光 试剂的 激发/ # 
放效率 不同; ⑨图 像扫描 时的检 测能量 不同; ® 图像 扫描时 胶的暴 露时间 不同。 

Normalize 的选 项如图 15. 10 所示。 

. 297 • 





Matchttf ICVMAP 
^CnM Ntfnolabcn 


r- Total 4Mr«)r mUiciois 










Scats lada [ 


Urte 1 










卜-' '-" -一 1 






[l.CUO ]' 



















图 15 . 10 Normalize 的选项 

Normalize 方法取 决于实 验要求 和卖验 方法, 如仅仅 想鉴定 一些胶 上持家 蛋白质 
( housekeeping protein) ,贝 Ij 应对 Total Spots In Analysis Set 进行 Normalize, 如果已 知了某 
些蛋 白质点 的量的 变化, 则选择 Specified Value ,输 入已知 的变化 因素。 

Normalize 的 公式: Normalized Spot Quantity = (Raw Spot Quantity * Scaling Factor * 
Pippeting Compensation Factor) /Normalize Factor o 

Raw Spot Quantity 是未校 准的点 的量; Scaling Factor 是选 择的中 间值, 一般是 10 6 ; 
Normalize factor 是由 Normalize 的 方法决 定的。 

Normalize 的方 法如下 所述。 

① 对一 套分析 组中总 的点。 如 持家蛋 白质, 即所有 Matchset 成 员都有 的点, 但这首 
先 要求从 Standard 上 做一个 Arbitrary Analysis Set ,其中 包含了 持家蛋 白质, 选择 多个持 
家蛋 白质的 好处是 极个别 的点被 平均掉 了 。 

② 对 Total Of All Valid Spots。 All Valid Spots 是指 所有标 准胶上 的点。 在这 个方法 
中, 成员胶 上每个 点的原 始定量 值除以 该块胶 上所有 被包含 在标准 胶上的 点的定 量值。 
这个方 法假设 实验中 只有极 少点的 变化, 而且这 些点在 胶上是 平均分 布的。 在不 知道样 
品变 化的原 因时, 这种方 法是有 用的。 

③ 对 Total Density In Gel Image。 这个方 法假设 胶与胶 之间的 总密度 (点 的密 度加上 
背景 密度) 不变。 在 不知道 样品变 化的原 因时, 这种方 法是有 用的。 

④ 对特 定值。 如果已 知样品 的变化 ,如实 验中的 上样量 和总细 胞数, 以 及图像 检测时 
的时间 长度, 可以 针对特 定值来 设定。 

⑤ 对 Counts Loaded From Gel Record。 Counts Loaded Into Gel 是 在做校 准时在 Gel 
Record 里设定 的值。 这 种方法 只有在 Matchset 胶 里做了 校准时 才是可 行的。 Counts 
Loaded Into Gels 列在 Normalization Dialog 表的 末尾。 这种 方法假 设实验 中只有 极少的 
点的 变化, 而且这 些点在 胶上是 平均分 布的。 如果 已知样 品量的 变化, 正如 在扫描 时设定 
的, 这种方 法是有 用的。 这种方 法选择 Pippetting Error Compensation ,可以 补偿所 有比较 
组 成员间 的加样 误差。 当这个 窗口被 选中后 ,软件 会试图 纠正微 小的系 统误差 ,如 扫描计 
数、 加 样等的 误差。 校准 是假设 这些误 差对所 有蛋白 质的影 响是均 等的, 同 时假设 实验中 
如果 有影响 时只有 极少数 蛋白质 会发生 变化, 而且它 并不改 变从一 个样品 到下个 样品间 
的随机 分布。 当此 窗口选 中时, 一个 对话框 会显示 每个比 较组成 员的计 算的误 差值。 这 

. 298 . 



些值会 出现在 Normalize Dialog 表的 尾端。 Pippetting Error Compensation 能纠正 由于上 
样量 的不同 而引起 的系统 误差, 但它 存在两 个假设 前提: ① log 点是 正常分 布的; ② 点的变 
化是随 机的, 如果 细胞在 加药状 态下, 那么它 的合成 不是随 机的。 补 偿因子 (compensation 
factor) 用于计 算平均 比率, 如果假 设的第 二点成 立的话 ,此 值应为 1。 

同一 实验条 件下、 一 批胶中 由于染 色等效 果的不 同会造 成部分 点定量 不准。 Repli- 
cate Group 会平均 这些实 验中的 误差。 Replicate Group Quantitation 会显示 平均点 的定量 
信息、 变异 系数和 Replicate Group 中的 胶的数 目 。 

双 向凝胶 电泳可 以用商 品化的 2D standard 做为 内标, 用 来计算 其他胶 上蛋白 质的等 
电 点和相 对分子 质量。 用 pi Standard 工具可 输人一 些标准 蛋白质 的相对 分子质 量和等 
电点。 然后软 件会自 动标出 其他点 的相对 分子质 量和等 电点。 但相 对分子 质量和 等电点 
超过标 准蛋白 质范围 的点, 其相 对分子 质量和 等电点 将无法 显示。 

(六) 点 的计数 和解释 

点的 计数和 显示在 Analysis 菜 单下的 Spot Numbers 里。 每个 匹配的 点都将 分配一 
个标 准点数 SSP(standard spot number )o 除了 SSP 之外, 还有 一个计 数系统 DSN 
(database spot number), DSN 系统的 好处是 它根据 相对分 子质量 、等 电点画 出的格 子暗示 
了每 个点的 定位。 

(1) SSP 

SSP 会在 比较组 建立之 后自动 分配, SSP 由 4 位数 组成, 前两位 数代表 该点所 在部分 
的 X、Y 轴, 后两位 数代表 它在方 框里的 计数。 每个 方框里 的数目 不超过 100 个。 如果超 
过 100, 那 么软件 会从其 他方框 里调用 数目。 

(2) DSN 

DSN 在输人 内标的 等电点 和相对 分子质 量之后 ,从 Database 菜单下 Spot Number 中 
的 Assign DSN Grid ,可 绘出其 他点的 DSN 数 目 。 DSN 也由 4 位数 组成: ABnn, A 代表相 
对分子 质量, B 代表 等电点 , nn 是方框 里的数 目 。 

第四节 双 向凝胶 电泳软 件的实 际应用 

一、 双 向凝胶 电泳的 重复性 和定量 定性差 异分析 

比较组 成员间 的蛋白 质差异 表达分 析和双 向凝胶 电泳的 重复性 分析, 需 要结合 
PDQuest 和 Office 软件 包里的 Excel 来进行 统计学 分析。 

(-) 双向凝 胶电泳 的重复 性分析 

双向凝 胶电泳 的重复 性关系 到不同 实验室 间数据 交换和 利用, 也直接 影响蛋 白质组 
研究的 价值和 应用。 分析 的过程 如下: 不同批 次的胶 建立好 比较组 之后, 在 File 菜 单下的 
Export 里输出 比较组 里所有 匹配点 的信息 (X、Y 轴坐标 ,点 的定量 )。 一 般是随 机挑选 
10% 左右 的点, 在 Excel 里 算出这 些点的 X、Y 轴坐 标的标 准差, 作 为双向 凝胶电 泳的位 
置 重复性 指标。 定 量的重 复性用 这些点 的定量 变异系 数作为 指标。 

• 299 . 



(二) 差^ 表 达分析 

差异表 达可用 Creat Analysis Sets 分析, Creat Analysis Sets 菜 单如图 15. 11 所示。 





图 15 . 1 1 Creat Analysis Sets 菜单 
Set 的选择 类型有 4 种, 见图 15.12。 




图 15.12 选 择类型 



其中 Quantitative 用 于定量 (多 / 少) 差异表 达分析 ,差 异表达 的倍数 可自由 设定。 
Qualitative 用 于定性 (有 / 无) 差 异表达 分析。 Arbitrary 可用 于自由 显示某 些点, 如 某块胶 
特有 的点、 匹配 的点和 自 己设定 的点。 Boolean 用于分 析多重 Set 里点 的或、 与等 分析。 
Statistic 是对 Replicate Group 里 的点做 统计学 分析, 分析有 4 种 Student T-Test(P< 
0.05). Log scaled Student's T-Test. Mann-Whitney Test。 常用 的差异 表达分 析选用 Stu- 
dent T-Testo 

我们对 正常肝 细胞系 L02 和肝癌 细胞系 BEL7404 进行 了双向 凝胶电 泳图谱 的重复 
性分析 [5 ], 结 果见表 15.2。 

表 15.2 双向 凝胶电 泳图谱 的重复 性分析 

位置 重复性 定量 重复性 
参数 

等电聚 焦方向 SDSPAGE 方向 BEL-7404 L-02 

标准差 (騰 ), mean 0.73±0.38 0.44±0.23 

标准差 (mm), range 0.09-1.74 0.08-1.24 

变异系 数(%), mean 
变异系 数(%), range 



19. 2± 10.9 17.6±9.8 
3.7-59.9 1.9-58.8 



300 



定量差 异表达 分析, 在 BEL7404 细胞 系里高 表达的 蛋白质 点如表 15.3 所示。 
表 15.3 在 BEL7404 细胞系 里高表 达的蛋 白质点 的定量 差异表 达分析 



蛋白质 索引" 




分子 


相对 体积' /% 


P 值 


质量 b/kDa 


BEL-7404 


L-02 


154 






0.051 ±0.003 


0.017±0.004 


0.0000 


155 


一 




0. 125 ±0.022 


0.066±0.019 


0.0067 


232 


― 


一 


0.030 ±0.005 


0.016 ±0.003 


0.0042 


436 


5.96 


64.3 


0.064 ±0.012 


0.034 ±0.002 


0.0030 


453 


― 




0.025 ±0.004 


0.013 ±0.005 


0.0081 


464 






0.395 ±0.041 


0.307 ±0.020 


0.0085 


522 


― 




0.127±0.011 


0.105 ±0.005 


0.0091 


591 


6.46 


57. 1 


0.189±0.015 


0.107±0.010 


0.0001 


601 


6.55 


56.8 


0.068 ±0.006 


0.032 ±0.005 


0.0001 


636 


6.11 


57.4 


0.071 ±0.014 


0.038±0.009 


0.0061 


675 






0.082 ±0.007 


0.035 ±0.014 


0.0010 


693 


5.97 


55.7 


0.017 ±0.007 


0.003±0.002 


0.0097 


735 


5.8 


53.7 


0.085±0.012 


0.038±0.002 


0.0002 


750 




― 


0.051 ±0.004 


0.020±0.008 


0.0003 


770 






0.064±0.021 


0.007 ±0.004 


0.0019 


784 






0.034±0.014 


0.005 ±0.002 


0.0057 


812 




一 


0.257 ±0.021 


0.203 ±0.018 


0.0076 


813 




一 


. 259 土 . 008 


0.020±0.015 


0.0000 


817 


― 




0.069 ±0.018 


0.020 ±0.009 


0.0033 


845 


6 


50.2 


0.052±0.010 


0.021 ±0.008 


0.0025 


846 






0.304 ±0.065 


0.074 ±0.040 


0.0010 


852 


6.16 


49.9 


0.164±0.019 


0.123±0.004 


0.0066 


855 






0.401 ±0.135 


0.126±0.009 


0.0066 


858 


5.76 


49.8 


0.049 ±0.010 


0.015±0.003 


0.0006 


916 






0.219±0.014 


0.096±0.014 


0.0000 


1002 


5.4 


44.8 


0.028±0.007 


0.009 ±0.005 


0.0059 


1043 






0.126±0.007 


0.045 ±0.008 





301 



续表 



蛋白 质索引 a 


等电点 b 


分子 


相 对体积 7% 


P 值 


质量 b/kDa 


DtL- /4U4 


L-02 


1098 






0,100 ±0,00*7 


0.057±0.018 


0.0038 


1184 


6.92 


35.0 


0.018 ±0.005 


0.006 ±0.004 


0.0072 


1189 






0. 131 ± - 030 


0.011 ± . 006 


0.0002 


1256 






0.073±0.006 


0.051 ±0,006 


0.0022 


1287 






0.041 ±0,009 


0.015 ± . 007 


0.0037 


1298 






0.054±0.012 


0.016±0.001 


0.0008 


1303 


5.91 


31.6 


0.156±0.024 


(),歸± 0,009 


0.0005 


1325 






0.109±0.016 


0.067 ±0.011 


0.0049 


1347 


5.38 


31.0 


0.044±0.009 


(KG13±(K()()8 


0.0022 


1390 


5.11 


30.1 


0.131 ±0.019 


0.063±0.017 


0.0017 


1397 


5.32 


29.9 




0. 100 ±0.016 


0.0074 


1410 






0.141 ±G,G10 




0.0001 


1425 






0.110±0.012 


0,G*74 ±G,G14 


0.0073 


1446 


6.64 


27.2 


0.041 ±(),0()9 


0,019±0,()0*7 


0.0091 


1480 


5.32 


27.1 


0.481 ±0.058 


0.025 ±0.013 


0.0000 


1521 


6.74 


25.0 


0.099±0.008 


(),G5"7±(K()1() 


0.0006 


1540 


5.23 


24.7 


0.127 ±0.020 


0.075 ±0.003 


0.0025 


1554 


5.38 


23.6 


0. on ±0,002 


0.009 ±0,002 


0.0029 


1566 






0.062 ±0.010 


. 026 ± . 007 


0.0009 


1568 


5.42 


22.2 


0,100 ±0,009 


0.049 ±0.008 


0.0001 


1589 






0.119±0.022 


0.041 ±(),00了 


0.0006 


1606 






0.094±0.023 


0.045±0.008 


0.0074 


1635 






0,233±0.026 


0.123±0.020 


0.0005 


1665 






0.223±0.014 


0.156±0.027 


0.0044 


1732 






0.466±0.091 


0.085±0.069 


0.0005 



a. 参考 胶中的 索引; b." —" 表 示没有 对分子 质量和 等电点 校准; C. 每 个点的 体积以 其占胶 上所有 点的体 积比表 

示。 



在 L02 细胞 系里高 表达的 蛋白质 点如表 15.4 所示。 



302 



表 15.4 在 L02 细胞系 里高表 达的蛋 白质点 的定量 差异表 达分析 



蛋白质 索引' 


等电点 b 


分子 
质量 b/kDa 




相 对体积 e/% 

BEL-7404 L02 




P 值 


648 









,173±0 


.055 





.320 ±0 


.037 


0.0043 


837 









.169±0 


.031 





,247 ±0, 


.022 


0.0065 


866 


6.34 


49.2 





,129±0 


.030 





,240 ±0. 


.022 


0.0010 


892 


5.3 


47.7 





.078±0 


,080 





.252±0 


.044 


0.0089 


894 


5.36 


47.7 





• 010±0 


.008 





.033±0 


,004 


0.0017 


938 


5.63 


48.5 





.067±0 


.006 





.118±0 


.022 


0.0043 


976 


5.52 


47.5 





.012±0 


.005 





.172±0 


.017 


0.0000 


1019 


5.26 


43.9 





.064 ±0, 


.007 





.090±0 


.005 


0.0010 


1025 









.018±0 


.015 





.097±0 


.039 


0.0094 


1032 


5.85 


45.2 





.097±0 


.023 





.148±0, 


.014 


0.0092 


1071 


5.38 


42.2 





.036±0 


.003 





.078±0 


.010 


0.0002 


1072 


6.35 


37.2 





.207±0 


.073 


0, 


.613±0 


. 103 


. 0007 


1090 









,091 ±0 


.019 


0, 


.244±0, 


.061 


0.0031 


1107 


5.38 


41.1 





.220±0, 


.011 


0, 


.290 ±0, 


.017 


0.0005 


1122 


6.34 


36.5 





.033±0, 


.007 


0, 


,107±0, 


.019 


0.0003 


1237 









,090 ±0, 


.007 


0. 


.126±0, 


.002 


0.0001 


1314 









.045 ±0, 


.008 


0, 


.086±0, 


.020 


0.0090 


1317 


5.64 


31.1 


0, 


.100±0, 


,026 


0, 


.223±0, 


.020 


0.0003 


1365 


5.47 


30.7 


0, 


.080±0, 


,010 


0. 


.167±0. 


.022 


0.0004 


1406 


5.98 


29.5 


0. 


.171±0. 


.021 


0. 


.259±0. 


.026 


0.0018 


1505 


5.29 


25.9 


0. 


.243±0. 


.050 


0. 


.361±0. 


.021 


0.0049 


1529 






0, 


.050±0, 


.009 


0. 


,107±0. 


.005 


0.0000 


1647 






0. 


.036±0. 


,002 


0. 


,052 ±0. 


.007 


0.0052 


1688 






0. 


.037±0. 


.011 


0. 


080 ±0. 


010 


0.0012 


1700 






0. 


.065 ±0. 


,013 


0, 


,117±0. 


,021 


0.0056 


1705 






0. 


.855±0. 


.118 


1. 


,600 ±0. 


,178 


0.0004 



a. 参考 胶中的 索引; b." —" 表 示没有 对分子 质量和 等电点 校准; C. 每 个点的 体积以 其占胶 上所有 点的体 积比表 

示。 



关于 定性差 异表达 分析, 只在 BEL7404 或 L02 细 胞系里 表达的 蛋白质 点如表 15.5 • 

所示。 



• 303 - 



表 15.5 在 BEL7404 或 U)2 细胞 系里表 达的蛋 白质点 的定性 差异表 达分析 



BEL-7404 L02 



蛋白 质索引 a 


等电点 


分子质 量'' 
/kDa 


相对 体积' 

/% 


蛋 白质索 引"' 


等电点 b 


分 子质量 
/kDa 




相 对体积 e 
/% 


2530 


6.12 


55.6 


0.025±0.010 


230 


一 







015 ±0.005 


2542 


6.12 


49.1 


0.008 ±0.003 


512 


5.96 


61.2 





172 ±0.037 


2551 


6.09 


47.0 


0.046±0.014 


514 


5.87 


61.3 





014 ±0.006 


2555 


5.57 


46.3 


0.016±0.010 


904 


6.11 


49.8 





010 ±0.006 


2570 


5.40 


37.2 


0.018±0.005 


915 


5.1 


47.3 





068 ±0.027 


2573 


5.18 


36.0 


0.005 ±0.001 


1050 









169 ±0.058 


2584 


5.77 


28.7 


0.005 ±0.006 


1055 









285 ±0.050 










1120 


5.57 


42.1 





057 ±0.014 










1328 


6.59 


30.9 





008 ±0.008 










1359 









041 ±0.015 










1543 









004 ±0.002 










1657 









177 ±0.027 










1673 









145 ±0.044 










1685 









767 ±0.214 



a. 参考 胶中的 索引; b." —" 表 示没有 对分子 质量和 等电点 校准; C. 每 个点的 体积以 其占胶 上所有 点的体 积比表 

示。 , 



以 IPG 胶代替 传统的 基于两 性电解 质的等 电聚焦 ,较大 程度提 高了双 向凝胶 电泳的 
重 复性。 Corbett 等 [ 7 ] 采用 pH4〜8,18cm 长的 IPG 胶, 12%T 的 SDS 均一 浓度胶 双向凝 
胶 电泳, 同一实 验室内 IEF 方向 平均位 置偏差 的最好 结果是 0.62mm, SDS~PAGE 方向 
为 0.44mm; 实 验室间 IEF 方向 偏差为 1 〜; 1 .5mm,SDS"PAGE 方向为 l~2.6mm ,量 的变 
异未做 比较。 Blomberg 等 [8] 也做过 IPG-DALT 双向凝 胶电泳 实验室 间的重 复性, 他们采 
用线性pH4〜7,13%T,18.5cm高的SDS均一胶,一块胶中分辨蛋白质斑点数最多的达l 
561 点, 最少 的只有 1 054 点。 同一实 验室内 IEF 方向位 置偏差 的最好 结果为 0.68%, 
SDSPAGE 方向为 0.50%, 量的 变异为 19. 9%; 实 验室间 IEF 方向 偏差为 2.8mm,SDS 
PAGE 方向为 1.8mm ,量的 变异为 34.5%。 我们的 实验结 果表明 [9] , IEF 方向位 置偏差 
为 0.73mm, SDSPAGE 方向为 0.44mm, 量的 变异为 17.6% 〜 19.2% 。 可见双 向凝胶 
电泳 中蛋白 质斑点 位置的 重复性 较好, 但量 的重复 性不尽 如意, 尤 其是实 验室间 量的比 
较。 

二、 双向凝 胶电泳 矢量图 

蛋 白质组 研究的 一个重 要内容 是蛋白 质各种 翻译后 修饰的 研究。 运 用图像 分析软 
件, 在双向 凝胶电 泳数据 库的参 考图上 ,蛋白 质位置 如果与 该蛋白 质的理 论预测 位置不 
同, 在这两 个位置 之间连 一直线 ,即为 该蛋白 质的" 矢量" ,这 样的图 谱称双 向凝胶 电泳矢 
- 304 • 



量图 ("Vector maps"of the 2-D gels)': i"3。 在矢量 图上, 有的蛋 白质具 有一个 矢量, 有的具 
两个 或多个 矢量, 表明 可能存 在多种 翻译后 修饰。 如 果对不 同翻译 后修饰 与蛋白 质双向 
凝胶电 泳迁移 位置效 应关系 进行大 量研究 , 可能建 立一个 矢量库 ,从 而有助 于蛋白 质翻译 
后修 饰种类 和程度 等预测 , 为 实验研 究提供 信息。 

第五节 双向 凝胶电 泳数据 库和网 上比较 

一、 双 向凝胶 电泳网 络数据 库资源 

蛋白质 组的研 究目前 还正处 于展开 阶段, 双向凝 胶电泳 作为目 前研究 细胞总 蛋白质 
最简单 、最 有效的 手段, 纷纷被 采用, 其 数据库 亦纷纷 建立。 最 著名的 SWISS2DPAGE 
已更 新到第 6 版, 内 容包括 59 条记录 ,人的 23 张 参考图 (脑 脊液, 结 肠上皮 细胞, 结肠腺 
癌 细胞系 DL - 1 , 红白 血病 细胞系 , HepG2 , HepG2 分泌蛋 白, 肝, 肾, 淋 巴瘤, 大噬 菌体样 
细胞系 U937, 血莱, 血小板 ,早幼 粒白血 病细胞 HL60 和红细 胞), 鼠 的样品 (附 睾脂 肪埜, 
腓肠肌肉,肝,胰岛细胞),大肠杆菌(3个pH范围3.5〜10,4〜5,4.5〜5.5),酿酒酵母和 
网柄 菌属的 discoideum。 在 这些图 上一共 鉴定了 2 761 个蛋白 质点, 用 凝胶匹 配的占 
52.3%, 免疫印 迹的占 24.7%, 微 量测序 法的占 17.9%, 氨基酸 组成分 析的占 6.5%, 共 
迁 移的占 3.2%, 质谱占 12.9%。 因为 许多蛋 白质点 采用多 种方法 鉴定, 所 以累加 的百分 
数 要超过 100。 SWISS2DPAGE 数据库 可通过 关键词 (蛋 白质 名称, 副本, 作者, 全文) 或 
图像 点击的 方法来 查询。 我 们也可 将任何 SWISS2DPAGE 数据库 上査出 的蛋白 质序列 
或 使用者 输人的 序列来 将它定 位到任 何一张 SWISS2DPAGE 的参考 图上。 

除 SWISS"2DPAGE 外 其他的 2-DE 数据 库见表 15. 6 〜表 15.12。 



表 15.6 多 物种的 2-DK 数据库 



数据库 


研 究对象 


SIENA-2DPAGE( 2D-PAGE database at Department 


人乳房 导管癌 

衣原体 Trac/io 脚/" ,克氏 病线虫 C. elegam 


of Molecular Biology, University of Siena, Italy) 
hup: / /www. bio-mol. unisi - it/2d/2d. html 


2-DE database at Max Planck Institute for Infection 


人 Jurkat T 细胞 


Biology , Berlin , Germany 


分枝 杆 菌 Bovi.s、 Tuberculotis, 幽 门 螺杆菌 Heli- 


http: //www. mpiib- Berlin . mpg. de/ 


cobacter /)yori. , 疏螺 旋体属 Garinii 


Argonne protein mapping group server 


人乳 房上皮 细胞, 鼠 肝细胞 


http: //www. anl. gov/BIO/PMG/ 


火 球菌属 Furiosus 


Research Institute for Biological Science , Science Uni- 
versity. Tokyo 

http: / /www. rs. noda. sut. ac. jp/〜 kamom/Zde/Zd. 

html 


小鼠: 小脑, 皮层, 海马, 回纹 


拟南芥 的愈合 组织, 叶, 种, 茎 
水 稻叶愈 合组织 ,叶, 茎, 胚, 种子 


Large Scale Biology Corp 


人, 小鼠, 大鼠肝 


http: //www. Isbc. com/ 


玉米, 小麦 



305 



表 15.7 哺乳 动物的 2-DE 数据库 



数据库 


研 究对象 


Human and mouse 2-D PAGE databases - Danish Centre for Hu- 


人角质 化细胞 ,转 变的癌 细胞, 膀胱多 


man Genome Research 


磔细 胞癌, 尿, 纤维 原细胞 


hup: //biobase. dk/cgi-bin/celis 


小鼠 肾细胞 


RAT HFAPT 9nPAriF ( Carman Heart Tnc;tiriitp FWlin) 




http; / /gelmatching. inf. fu-berlin. de/ 〜 pleiss/ 




HSr ? nPAOFC HMTt SfMPnrp rpntre HarpfipldHosnital ) 


人' f 、脏 U'、 房 、室) 内 细 flft 


http: / /www. hare field - nthames. nhs. uk/nhli/protein/ 


鼠、 狗心脏 (心室 ) 


HEART-2DPAGE (German Heart Institute Berlin) 


人 (心房 心窜) 


http: //www. chemie. fu-berlin. deberlin . de/ user/ pleiss/ 




HP-2DPAGE (Heart 2-DE Database, MDC, Berlin) 


人 (心室 ) 


http: / /www. mdc-berlin. de/ emu/heart/ 




FDD Protein Disease Database (NIMH - NCI) 


人血浆 ,脑 脊液, 尿 


http : / / www- lecb . ncifcrf. gov/PDD/ 




PPDB - PhosphoProtein DataBase 


鼠淋 巴细胞 


http: //www-lecb. ncifcrf. gov/ phosphoDB/ 






人的 外淋巴 


Washington University Inner Ear Protein Database 


际鼠 内淋巴 (内 耳膜状 迷路内 的淋巴 


http: //oto. wustl. edu/thc/innerear2d. htm 


液), 皮质、 耳石、 顶盖 膜器官 


PMMA - 2DPAGE at Purkyne Military Medical Academy, Czech 


人 结肠癌 


http: //www. pmma. pmfhk. cz. 




Rflt Scrum Protein Study Group at Istituto di Scicnze Farniaco- 


大 鼠血清 (对照 Sprague-Dawley (CD) 


logiche , Milano , Italy 


鼠, 松节 油鼠) 


http: //users, unimi. it/〜 ratserum/homef ramed - html 




Rat Scrum Protein Ostabdsc at Acbcrsold Protein Laboratory , 


大 鼠血清 (正常 、急 性相) 


University of Washington , Seattle 


http: //weber. u. Washington. edu/〜 ruedilab/info/ ratserum/ rat- 




serum. html 




BALF 2D Database at Department of Biological Chemistry , Uni- 


-/Very JSC ^ 目 OT?Eiflil5tM 


versity of Mons-Hainaut, Belgium 


鼠 的支气 管肺泡 灌洗液 


http: //www. umh. ac. be/〜 biochim/BALF2D. html 




Mito-pick (2-DE gel of mitochondria at CEA, France) 


人 线粒体 


http: //www. dsv. cea. fr/thema/MitoPick /Mito2D . html 






人血莱 ,肝 


Molecular An atomy Laboratory at Indiana University, Columbus 


鼠血架 


http: //iupucbiol . iupui. edu/f rankw /molan - htm 




大鼠肝 ,肾 (皮层 ,髓 ), 脑, 血浆, 睾丸 


Human Colon Carcinoma Protein Database at JPSL, Ludwig Insti- 


人胎盘 ,结肠 细胞系 


tute for Cancer Research, Melbourne, Australia 




http: //www. ludwig. edu. au/jpsl/jpslhome. html 




Cambridge 2D PAGE 


鼠 神经元 


http: //sunspot. bioc. cam. ac. uk/NEURON. html 





306 



表 15.8 果 *| 的 数据库 



Drofophila melanogaster, Drosophila melanogaster at the Karolins- http: //try. cmb.ki.se/ 
ka Institute 



表 IS. 9 酵母的 2-DE 数据库 

YPD Yeast Protein Database ( registration is required ) at Pro- http: //www. proteome. com/ databases/ 

teome, Inc. YPD/ 

YPM - Yeast Protein Map at Instiiut de Biochimie et Genet ique hitp: //www. il^c. u-bordeaux2.fr ATM 
Cellulaires, Bordeaux , France 

LB YPM- 2D Map of The Kronenbourg Breweries Yeast Proteins http: //www. sdv. fr/tepral/Pagel .htm 
at TEPRAL Laboratory , Strasbourg, France 



表 15.10 植物的 2-DE 数据库 



Maize Genome Database at INRA, Gif-sur-Yvette, France 


http: //moulon. moulon. in 


ra. fr/imgd/ 


2-D gels for maritime pine at INRA, Bordeaux , France 


http: //www. pierroton. in 


ra. fr/genetics/2D/ 



Plant Plasma Membrane Database (PPMdb) at Gent University, http: //sphinx, rug. ac. be:8080/ 
Belgium 



表 15.11 细菌和 病毒的 2-DE 数据库 



PHCI-2DPAGE - Parasite host cell interaction 2D-PAGE http : //www. gram. au. dk/ 
database, at Department of Medical Microbioloy and Immunology, 
University of Aarhus, Denmark 



Sub2D - 2D PROTEIN INDEX of Bacillus subtilis, at Department 
of Biosciences, University of Greifswald, Germany 



http: //microbio2 • biologic, uni-greifswald. de: 
8880 /sub2d/pub /sub2d - ask 



Cyano2Dbase - Synechocystis sp. PCC6803, at the Kazuka DNA 
Research Institute, Japan 



http: //www. kazusa. or. j p/ cyano/ cyano2D/ 



2-D PAGE Aberdeen ( Haemophilus influenzae and Neisseria 
meningitidis) , at Department of Medical Microbiology , University of 
Aberdeen, Scotland 



http: //www. abdn. ac. uk/〜 mmb023/ 
2dhome. htm 



SSI -2 DP AGE - Mycobacterium tuberculosis, at Department of 
Tuberculosis Immunology* Stateris Serum Institute, Denmark 



http: //www. ssi. dk /en /forskning / 1 bimmun / 
tbhjemme. himl 



EC02DBASE- NCBI repository 



http: //pcsf. brcf. med. umich. edu/eco2dbase/ 
(new) ftp: //ncbi. nlm. nih. gov/ repository/ 
EC02DBASE/ EC02DBASE (old) 



307 



表 15.12 细 胞系的 2-DE 数据库 



TMIG-2DPAGE - Age-related Proleome Database j 
Metropolitan Institute of Gerontology, Japan 


at Tokyo 


http : / /proleome . tmig. or.jp/2D/ 


Embryonal Stem Cells at University of Edinburgh 




http: //www. ed. ac. uk/〜nh/2DPAGE. html 


UCSF 2D PAGE (A375 cell line) 




hup: //rafael. ucsf. edu/2DPAGEhome - html 


Human leukemia cell lines Lab. de Biochimie et Tech. 
teines, Bobigny 


des Pro- 


htlp: //www-smbh. univ-paris 13 • fr/lbtp/ 
biochemistry /biochimie/bque - htm 



二、 双向凝 胶电泳 数据库 的构建 

双向 凝胶电 泳数据 库可用 Make2ddb 来建立 ,该软 件包在 Solaris 和 Irix 操作 系统中 
运行, 可在 http: //www. expasy. ch/ch2d/make2ddb. html 上下 载到。 它 要求至 少一个 2- 
DE 参考图 (Melanie 解释 的图或 TIFF 图) 和 普通文 本描述 (绘图 过程, 作者, 日期等 ), 
Make2ddb 也允 许管理 和出 版网上 2- DE 数据, 并 且综合 了查询 链接。 

操作过 程如下 所述。 

① 安装 make2cldb ,安装 中必须 指定服 务器的 bin,cgi-bin 和 htdocs 目 录 和存放 有全部 
2-D 数据 文件的 2d 目录。 

② 做参 考胶。 参考胶 上至少 要有一 组登记 号码的 标记。 

③ 做文本 文件。 给出 参考胶 上每一 个鉴定 蛋白质 的记录 —— db.、dat ,并以 SWISS 
2DPAGE 的形式 保存。 

④ 给 db.dat 加上 标题。 每条记 录用〃 分开, 每个文 件加上 三行: DB^NAME Release 
NN , MONTH YEAR ,空 行。 

©做 GIF 图。 用 make2db 的 melch2dtogif 和 mastergif 程序给 每一个 参考胶 做五个 
GIF 图放在 db 目 录下。 

a) melch2dtogif-x-e-ll-z0. 1 Master NULL > Master, gif : 将 Master, gif 放在 目 录 2d/ 
small-gifs/Master 下 。 

b) mastergif-zl .O-U-e Master; mv Master _ id. gif Master _ id_ big. gif. 

c) mastergif-z0.6-ll-e Master. 

d) Melch2dtogif-e-ll-zl .0 Master NULL > Master _ big. gif. 

e) Melch2dtogif-e- 1 1 -zO . 6 Master NULL > Master, gif. 

将 4 个 GIF 图放在 2d/gifs/Master 下, 这 些文件 包含了 参考图 上鉴定 和未鉴 定的蛋 

白 质点。 

©做 existing, map 文件。 建立 2d/current _ release 的子 目泉, 将 包含所 有参考 图名称 
的 existing, map 文件放 在其下 。 

⑦ 修改 主页。 将 make2db 提供 的主页 2d. html 稍 做修改 以适合 自 己 的需要 并放在 
htdocs/2d 目 录下。 

⑧ 给 2d 加个 化名。 编辑 srm. conf 文件给 htdocs/2cl 加个 化名: Alias /2d xxx/2d/ 
- XXX 是去 htdocs 的 目 录, 这将保 证链结 时找到 正确的 地址。 

• 308 • 



⑨运行 Make2ddb。 在 2d/current — release 目录下 为每条 记录建 立独立 的文件 ,为关 
键词 和作者 査询建 立索引 ,在 cgi-bin 目 录下存 放版本 信息。 
@ 通过 互联网 测试双 向电脉 数据库 [ 11 ] 。 

三、 双向 电脉凝 胶的网 上比较 

随着 互联网 上双向 电脉数 据库的 增多, 实验人 员越来 越容易 在网上 找到与 自 己样品 
类似 的双向 电脉数 据库, 从而 将实验 结果与 之进行 比较。 比较时 要用到 Flicker 程序, 这 
是用 Java 语言 编写的 程序, 可在任 何装有 IE3.0 或 Netscape2.0.1 以上版 本的计 算机上 
运行。 该程 序可在 http: //www-lecb. ncifcrf. gov /flicker /flicker, zip 上下载 5!j。 

运行 Flicker 时终端 使用者 和数据 库服务 器的关 系如图 15 . 13 所示。 

1 互联 网 "一 I 1 [ 1 ""- 



终端 浏览器 网络 服务器 数据库 1 数据库 2 数据库 n 

I 运行 Flicker 

I Flicker |Java^g序 整 合的网 h2D 数据库 

I I— 数 据库中 

用户 胶文件 I 的 2D 图像 其 他的网 上图像 数据库 

终端 计箅机 NCI 网络 服务器 

图 15. 13 运行 Flicker 时 终端使 用者和 数据库 服务器 的关系 

用户 登录到 NCI Flicker 网页 http: 〃www-lecb. ncifcrf. gov/flicker 上, Flicker 程序可 
将终 端用户 的双向 电脉凝 胶图像 与远程 数据库 的图像 数据进 行实时 比较, 比较的 结果将 
在第三 个窗口 显示, 使用 者也可 用鼠标 将一个 图像拖 到另一 个图像 上进行 比较。 有三种 
比较 方式。 

1. 图像闪 烁比较 (flickering) 

因为双 向电脉 凝胶图 像有很 多扭曲 变形, 而 且图像 上每个 部分的 变形程 度也不 相同, 
所以两 块胶不 可能一 次性匹 配得非 常好, 这就需 要在凝 胶上不 同的部 位做一 些标记 
( landmark) , 然后进 行多次 比较 , 被形象 地称之 为闪烁 比较 ( flickering) 。 

如果一 个点及 其周围 的区域 和另一 张图都 匹配得 非常好 ,我们 可认为 这个点 与另一 
张图上 已知的 点是相 同的, 如果完 全鉴定 这个点 则还需 要序列 分析、 氨基 酸组成 分析、 质 
谱、 单抗 或其他 方法。 

2. 图像增 强效应 (enhancement) 

为了改 善闪烁 比较的 质量, 在比较 前可做 一些图 形处理 ,如空 间弯曲 —— 在不 改变灰 
度 值的情 况下使 一张图 的某一 区域和 另一张 图的相 应区域 在几何 上完全 对应。 另外, 还 

有一些 处理方 法如图 像尖锐 (image sharpening) 技术 种边 缘增强 效应, 即在 原始灰 

度的图 像上增 加陡蛸 成分或 lapladan 点检测 功能和 增加图 像的对 比度。 



309 



3. 图像力 11 工变开 乡 ( image-processing transform) 



(1) Affine 空间弯 曲变形 
变形后的坐标(u,v)与原始坐标(x,y)的关系如下:u(x,y) = ax+by+c; v(x,y) = dx 

+ ey+f ^ 

a, b, c, d, e, f 是 Flicker 根据 每块胶 上的三 个标记 计算出 的值。 变形 的结果 是使两 
块胶 比较的 区域在 几何上 等同。 

(2) 假 3-D 变形 

假 3- D 变形可 增加重 叠的点 ,变 形后点 的坐标 (x',y') 和原 始坐标 (x,y) 的关系 如下: 
dx 二 width * sin(q) ; x' 二 [dx * (height — y) /height] + x; y' = y - zScale * g(x, y)。 
灰度 值决定 了 z scale 的大小 , q 值在- 45。 - 45。 范围 内 。 

(3) 边缘尖 锐效应 

边 缘尖锐 (sharpening) 效应可 增加模 糊点的 边缘。 处理过 的点的 坐标' (x, y) 与原始 
点的关 系如下 :,g(x, y) = [e scale * edge(x, y) + (100 - e scale) * g(x, y)]/100。 公式 
中 e scale 值用来 衡量增 加的边 缘检测 值 [ 1 2] 。 • 

(丁 士健 命 利荣) 

参 考文献 

1 Anderson NL, Taylor J, Scandora AE et al . The TYCHO system for computer analysis of two-dimensional gel elec- 
trophoresis patterns. Clin Chem, 1981,27: 1807— 1820 

2 Appel RD. Interfacing and intergrating databases. In: Wilkins MR ed. Proteome research: new Frontier in funtional ge- 
nomics. Vol 1, Berlin: Springer- Verlag, 1997, 149 〜 175 

3 Lemkin PF, Lipkin LE. GELLAB : a computer system for two-dimensional gel electrophoresis analysis, ffl . Multiple 
two-dimensional gel analysis. Comput Biomed Res, 1981, 14: 272 〜 297 

4 Lemkin PF, Lipkin LE. GELLAB: a computer system for 2D gel electrophoresis analysis A . Pairing spots. Comput 
Biomed Res, 1981,14: 355〜380 

5 Wu Y, Lemkin PF, Upton K. A fast spot detection algorithm for 2D electrophoresis analysis. Electrophoresis, 1993, 
14: 134 卜 1356 

6 Panek J , Vohradsky J . Point pattern matching in the analysis of two- dimensional gel electropherograms . Elect rc^horesis , 
1999,20: 3483〜3491 

7 PDQuest User Guide for Version 6, BIO-RAD 

8 Corbett JM, Dunn MJ , PoschA et al . Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel 
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Electrophoresis, 1994,15: 1205 〜 1211 

9 Blomberg A, Blomberg L, Norbeck J et al . Interlaboratory reproducibility of yeast protein patterns analyzed by immobi- 
lized pH gradient two dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis, 1995, 16: 1935 〜 1945 

10 俞 利荣, 王楠, 吴高 德等. 人肝癌 细胞系 BEL-7404 和 正常肝 细胞系 L-02 表 达的蛋 白质组 双向凝 胶电泳 分析. 科 
学 通报, 2000,45: 170〜178 

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tocols. In: Link A J , ed. Methods in molecular biolc^. Vol 112, Totowa : Humana Press, 1999, 41 卜 416 

12 Lemin PF. Comparing 2-D electrophoresis gels across internet databases. 2-D Proteome analysis protocols. In: Link AJ 
ed. Methods in molecular biology. Vol 112, Totowa: Humana Press, 1999, 393〜410 

• 310 • 



第 十六章 生 物质镨 技术和 蛋白质 -鉴定 

在蛋白 质组学 研究流 程中, 蛋 白质鉴 定是最 关键的 一环。 如果 说在蛋 白质组 分离技 
术方面 出现各 种方法 并存的 局面, 那么, 蛋白质 鉴定的 主流技 术的确 定已无 可争议 ,那就 
是质谱 技术。 

蛋白质 组学研 究与传 统的蛋 白质研 究最重 要的区 别在于 前者是 大规模 研究, 因此在 
研究策 略上必 然是从 整体出 发的大 视野, 但落 实到蛋 白质组 中的单 个蛋白 质成分 的研究 
技术, 并 没有脱 离蛋白 质研究 的基本 框架。 可以 认为, 蛋白质 组学大 规模技 术的发 展必然 
促进了 对单个 蛋白质 的研究 ,而 很多在 单个蛋 白质研 究中得 以应用 的技术 也很快 应用到 
蛋白质 组学研 究中。 正因为 两者相 辅相成 、密不 可分的 关系, 在本 章中, 作 者并不 打算将 
两 者割裂 ,而 将对 蛋白质 和蛋白 质组 学研究 中 的质谱 方法做 一总述 , 介绍 质谱技 术在蛋 白 
质 分析鉴 定中的 发展和 应用。 

第一节 生 物质谱 基本原 理和工 作模式 

就 技术方 法而言 ,蛋 白质 研究技 术比核 酸研究 技术要 相对复 杂和困 难得多 : 不 仅氨基 
酸残 基种类 远多于 核昔酸 残基, 而且 蛋白质 有着复 杂的翻 译后修 饰如磯 酸化, 糖基 化等, 
这 给分离 分析带 来很多 困难。 由于蛋 白质结 构层次 复杂, 物理化 学特性 多样, 因此 在蛋白 

质结构 功能研 究中, 技术方 法的发 展对研 究的影 响十分 显著。 如 Edman 降 解氨基 酸测序 
使 蛋白质 一级结 构得以 阐明; NMR 的出 现大大 推进了 对蛋白 质溶液 构象的 解释。 

如果说 上述这 些技术 的应用 已成为 蛋白质 研究的 里程碑 ,那么 20 世纪 80 年 代末以 
来, 在生 物大分 子领域 中得以 广泛应 用的质 谱技术 则可以 视为一 个新的 里程碑 [ 卜 5] 。 质 
谱 技术在 20 世纪 初就已 出现, 但一直 仅应用 于有机 小分子 领域, 直到 80 年 代才渐 渐进人 
到生物 大分子 领域。 随着 20 多年来 的发展 和应用 ,质 谱技术 已是蛋 白质研 究中必 不可少 
的 工具, 并成为 蛋白质 组研究 中的主 要支撑 技术。 

对蛋白 质和多 肽而言 ,质谱 技术就 是要确 定一个 蛋白质 或多肽 的分子 质量。 而由此 
所 获得的 信息, 涉及的 领域已 远远超 过了检 测分子 质量这 一简单 应用。 因 为分子 质量是 
一个蛋 白质、 多 肽或氨 基酸最 基本的 特征, 这种特 征是专 一的。 不同的 氨基酸 组成、 不同 
的氨基 酸序列 、不同 的修饰 方式、 不同的 蛋白质 间结合 方式、 不同的 位点差 异都可 以在蛋 
白质 的分子 质量上 体现。 对蛋白 质以及 组成蛋 白质的 多肽, 氨基酸 的分子 质量测 定实际 
上就是 对蛋白 质种类 和性质 的鉴定 ( identification) 。 

质谱技 术的基 本原理 是样品 分子离 子化后 ,根 据不同 离子间 质荷比 (m/z) 的 差异来 
分 离并确 定分子 质量。 一台质 谱仪一 般由进 样装置 、离子 化源、 质量分 析器、 离子 检测器 
和 数据分 析系统 组成。 在这几 部分中 ,离子 化源和 质量分 析器是 两个中 心部件 ,也 是发展 
得最快 的两个 方面, 不同类 型的质 谱仪主 要就是 根据这 两个部 件来命 名的, 如 电喷雾 
(ESI) 、快 原子轰 击质谱 (FAB) 是根据 离子化 源不同 来区分 ,而飞 行时间 质谱、 四极 杆质谱 

- 311 . 



则 是根据 质量分 析器来 划分。 不同离 子源和 质量分 析器相 匹配, 就 基本确 定了质 谱仪的 

工作 方式。 如 ESI 离子源 通常与 四极杆 、离子 阱质量 分析器 相匹配 ,而基 质辅助 的激光 
解析 离子化 源通常 与飞行 时间飞 行器相 结合, 即所谓 MALDI-TOF 质 谱仪。 表 16.1 提 
供质谱 特别是 生物质 谱技术 的发展 历程。 质量 分析器 的原理 在本书 的上篇 已有详 尽的阐 
述, 在此 着重讨 论生物 质谱的 离子化 方式和 相关技 术及其 应用。 



表 16.1 质 谱技术 发展历 史简介 



研究者 


时间 


贡献 


J . J Thompson 


1912 


第一台 质谱仪 


Gohlke and McLafferly 


1956 


气 相质谱 


Biemann , Seibl et al . 


1959 


肽序 列分析 


McLafferty, Jennings et al . 


1967 


串 联质谱 


McLafferty 


1973 


液 相质谱 


&) misarow and Marshall 


1974 


傅里叶 回旋共 振质谱 


Barber, Bordoli et al . 


1981 


快原 子轰击 


Yamashita , Fenn et al . 


1984 


电 喷雾离 子化用 于生物 大分子 


Tanaka , Karas et al . 


1988 


基质辅 助激光 解吸离 子化用 于生物 大分子 



(-) 生 物质谱 的软电 离方式 

早期的 质谱技 术仅应 用于小 分子研 究领域 ,其中 一个重 要的原 因是当 时采用 的电子 

轰击 (electron impact, EI) 电离能 量太强 ,而 生物大 分子结 构复杂 且热不 稳定, EI 不 适于生 
物 大分子 分析。 直到 20 世纪 80 年代, 电喷雾 离子化 和基质 辅助激 光解吸 离子化 的出现 
和应用 , 才使 质谱技 术真正 进人到 生物大 分子分 析领域 , 而这 两种技 术的原 创研究 者也都 
获得了 2002 年的诺 贝尔化 学奖。 . 

1. 电喷雾 离子化 

电喷雾 离子化 (electrospray ionization, ESI) 是一种 "软 电离" 方式, 它是在 "离子 蒸发" 
原理 基础上 发展起 来的一 种离子 化方法 [6 ]。 离子蒸 发是指 离子从 液相发 射到气 相的过 
程。 待测 分子溶 解在溶 剂中, 以液相 方式通 过毛细 管到达 喷口。 在 喷口高 电压作 用下形 
成 带电荷 的微滴 , 随 着微滴 中 的挥 发性溶 剂蒸发 , 微滴 表面的 电荷体 密度随 半径减 少而增 
加, 到达某 一临界 点时, 样品将 以离子 方式从 液滴表 面蒸发 ,进入 气相。 这 一过程 即实现 
了样 品的离 子化, 由于 没有直 接的外 界能量 作用于 分子, 因此对 分子结 构破坏 较少, 是一 
种典 型的" 软 电离" 方式。 电喷 雾离子 化示意 图见图 16.1。 

电喷雾 质谱的 另一大 特点是 可形成 多电荷 离子, 因此, 在 较小的 m/z 范围内 可以检 
测到 大分子 质量的 分子。 采 用电喷 雾质谱 目前可 测定分 子质量 100 OOODa 以下 的蛋白 
质, 最高达 150 000Da。 由于离 子蒸发 使电喷 雾质谱 采用液 相方式 进样, 因 此可与 蛋白质 
化学中 常用的 液相色 谱联用 ,即液 相色谱 -电喷 雾质谱 (LC-MS)。 蛋白 质或多 肽经过 
HPLC 分 离后, 直接进 入质谱 进行分 子质量 测定。 

在常 规电喷 雾中, 喷雾时 形成的 较大液 滴中, 有一 部分样 品还来 不及离 子化, 因而降 
• 312 . 



图 16.1 电喷雾 离子化 示意图 



低 了样品 的利用 率和灵 敏度。 近年发 展的纳 升电喷 雾方法 (nanospray) ,采用 内径为 
左右的 喷针, 样品 注人到 喷针的 喷口, 产生 喷雾, 在喷 口前端 喷雾液 滴体积 是常规 电喷雾 
1/100, 使样品 被充分 利用, 并有效 离子化 [7] 。 纳升 电喷雾 以极低 的流速 (20~40nl/min), 
消 耗极少 的样品 (l〜2^tl), 灵敏 度达低 fmol。 

2. 基质 辅助激 光解吸 离子化 

基质 辅助激 光解吸 离子化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 是将 样品均 
勾包埋 在固体 基质中 ,基质 吸收激 光提供 的能量 而蒸发 ,携 带部分 样品分 子进人 气相, 并将 
一部分 能量传 递给样 品分子 使其离 子化。 

早 期的激 光解吸 离子化 没有基 质辅助 , 激 光能量 直接作 用于被 分析物 , 使分 子碎裂 , 产 
生大量 碎片, 而 不易得 到分子 离子。 1988 年, Tamka 等 首先采 用可吸 收激光 的基质 (如甘 
油) 将被分 析物包 埋其中 ,避 免了激 光能量 对分子 结构的 破坏, 测定 了分子 质量为 35 000D& 
的 蛋白质 [ 8] 。 后来 发现, 采用固 体基质 可以使 样品分 散得更 均勾, 离子化 效果更 好 [9 '1*"。 通 
常 采用的 激光束 波长为 337nm 。 由于 样品的 电离过 程是由 基质介 导的, 因此 基质的 选择对 
分子 离子化 有很大 影响, 继而影 响到分 析的灵 敏度、 分辨 率和精 确度。 合适的 基质应 保证待 
测物的 离子化 ,而且 基质本 身的离 子造成 的背景 较弱。 对于 蛋白质 和多肽 样品, 较为 通用的 
基质有 芥子酸 ( sinapic acid, SA) , a- 氰基 -4- 羟 肉桂酸 ( a-cyano-4-hyclioxycinnamic acid , CHCA) , 
2,5- 经基 苯甲酸 (2,5-dihydroxybenzoicadd,DHB) 。 MALDI 最 大的特 点是离 子电荷 通常为 1 
或 2 个, 而不像 ESI 中为多 电荷, 对分子 质量较 大的样 品而言 ,不会 形成复 杂的多 电荷图 ,因 
而对图 谱的解 析比较 清楚。 图 16.2 为 MALDI 离子 化的示 意图。 

由于 MALDI 的进样 是固相 方式, 不像 ESI 的液相 进样容 易受溶 液性质 的影响 ,因此 
对 杂质的 忍耐性 较好。 通 常在进 行生物 样品制 备时, 往往会 在样品 中引入 一些缓 冲液或 




图 16.2 MALDI 离 子化的 示意图 



313 



去^^剂(如尿素和503)等。 这 时采用 MALDI 会有 较好的 效果。 一般 MALDI 采 用的激 
光是 在紫外 范围, 而近 年来发 现可用 红外激 光分析 生物大 分子, 红外 激光的 能量比 紫外激 
光弱, 产生的 碎片离 子较少 ,比 较合适 分析不 稳定的 样品, 如磯酸 化肽等 [ 11'1 2] 。 也 有人提 
出不使 用基质 ,而将 样品直 接置于 多孔硅 板上进 行激光 解吸离 子化, 从而大 大减少 了基质 
的背 景离子 [ 1 3 ,1 4] 。 

(二) 常用生 物质谱 的类型 和特点 

生物 质谱的 离子化 方法基 本采用 ESI 和 MALDI ,质 量分析 器则有 不同的 选择, 如三 
极四 极杆、 离子阱 、飞行 时间、 傅里叶 回旋共 振等。 不同 的质量 分析器 各有其 优势和 特点, 
也有不 同的应 用范围 ,目前 发展趋 势是将 不同类 型的质 量分析 器串联 起来, 以提高 质谱的 
工 作性能 和适用 范围。 在 此以离 子化方 式为中 心对生 物质谱 仪进行 分类和 描述。 

1. 电喷雾 质谱仪 

目前 常用的 以电喷 雾为离 子化方 式的质 谱有: 电喷 雾-三 级四极 杆质谱 (ESI-TQ- 
MS) 、电 喷雾- 离子 讲质谱 (ESI-IT-MS) 、电 喷雾- 三级四 极杆- 飞行 时间质 i 普 (ESI- Q-TOF- 
MS) 、电 喷雾 -傅里 叶 回 旋共 振质谱 ( ESI-FTICR-MS) 等 。 

2. 基质 辅助激 光解吸 离子化 质谱仪 

目 前已有 基质辅 助激光 解吸离 子化- 飞行时 间质谱 (MALDI-TOF-MS,MALDI-TOF/ 
TOF-MS) 、基 质辅 助激光 解吸离 子化- 三级四 极杆- 飞行时 间质谱 (MALDI- Q-TOF-MS) , 
基质辅 助激光 解吸离 子化- 离子 阱质谱 (MALDHT-MS) 等。 

表 16.2 和表 16.3 为离 子化方 式和各 种质谱 性能的 比较。 

表 16.2 ESI 和 MALDI 的比较 

电喷 雾方式 可在 线联用 的方式 离子电 荷形式 对 杂质容 忍程度 

ESI 液相 多电荷 直 接进样 时差, 与液相 色谱联 用后好 

MALDI 固相 一般为 1 或 2 个电荷 较好 



表 16.3 各种 类型质 谱的性 能比较 



质 谱类型 



MS/MS 功能 速度 分辨率 灵敏度 精确度 



电喷 雾-三 级四极 杆质谱 (ES1-TQ"MS) 

电喷雾 -离子 讲质谱 (ESI-IT-MS) 

电 喷雾- 三级四 极杆- 飞行时 间质谱 (ESI-Q" 
TOF-MS) 

电 喷雾- 傅里叶 回旋共 振质谱 (ESI-FTICR- 
MS) 

基质辅 助激光 解吸离 子化- 飞行时 间质谱 
(MALD 卜 TOF-MS) 



314 



续表 



质 谱类型 MS/MS 功能 速度 分辨率 灵敏度 精确度 

基质辅 助激光 解吸离 子化- 串联 飞行时 间质谱 
( MALDI-TOF/TOF-MS) 

基质 辅助激 光解吸 离子化 -三级 四极杆 -飞行 
时 间质谱 ( MALDI-Q"TOF-MS) 

基质 辅助激 光解吸 离子化 -离子 讲质谱 
(MALDI- IT-MS) 

注 :+ 表示性 能强大 程度。 

(三) 生物 质谱与 其他技 术的联 用方式 

液 相色谱 与电喷 雾质谱 (LC-ESI-MS) 连用, 可对 色谱分 离的成 分直接 用质谱 进行在 
线 (online) 分析, 而不需 要收集 这些成 分 [ 1 5 '1 6] 。 由于蛋 白质传 统分析 中采用 的肽谱 (pep- 
tide mapping) 分析是 在液相 色谱上 进行的 ,因此 LC-ESI-MS 的出现 使肽谱 分析不 再仅仅 
根 据色谱 中的保 留时间 (retention time) 来区分 多肽, 而是采 用多肽 分子质 量来对 其进行 
鉴定, 大大提 高了分 析的效 率和精 确度。 在灵敏 度方面 ,由于 色谱的 灵敏度 与色谱 柱的内 
径相关 ,内径 越小, 灵敏度 越高。 肽谱分 析传统 上采用 内径为 2.1mm 或 1.0mm 的 柱子, 
连接的 电喷雾 喷头内 径较大 ,这是 最初的 LC-ESI-MS 模式, 称为 normal-spray ,灵 敏度在 
低 pmol 水平。 后来采 用的毛 细管液 相色谱 (capillary LC ), 柱内径可在 100~300/^an 之 
间, 流速为 l〜15^d/min [ i 7 ~i 9] 。 相应的 电喷雾 喷头内 径也縮 小了, 称为 microspray ,这种 
cLC-ESI-MS 的灵敏 度可达 fmol。 进 一步又 发展了 10(Vm 以 下柱内 径的纳 升流速 
(nanoflow) 的色谱 ^ 2 "' 2 1 ] ,与纳 升 喷雾头 (nanospray) 联用, 灵敏度 可达低 fmol。 液相 色谱的 
分离 方式也 有多种 选择, 除了分 析肽谱 常使用 的反相 柱外, 还可 采用分 子筛、 亲和柱 、离子 
交换 柱等。 无论 何种液 相色谱 与质谱 联用, 都要 求色谱 洗脱液 挥发性 较好, 以保证 电喷雾 
离 子化的 效率。 

(四) 串联 质谱与 碰撞诱 导解离 

串 联质谱 (tandem MS, MS/MS) 是指 多个质 量分析 器相连 , 分离 母离子 ,进行 碰撞解 
离, 并检测 子离子 [22 ' 23 3。 MS/MS 较早在 四级杆 质谱中 实现方 法是: 将三个 四级杆 串联, 
第 一个四 级杆进 行母离 子分析 , 选 择感兴 趣的离 子进入 第二个 四级杆 , 与惰 性气体 碰撞成 
碎 片后, 进人第 三个四 级杆进 行子离 子分析 (图 16.3)。 离子 阱和傅 里叶转 换离子 回旋共 



电喷雾 

离子束 



^掩^ 



检测器 



图 16.3 串 联质谱 (MS/MS) 示意图 



315 



'振 质谱 (FTICR-MS) 也可 以进行 MS/MS [24 ' 25] 。 选择 的母离 子阱内 与惰性 气体碰 撞而产 
生碎片 离子。 与三 级四极 杆通过 空间分 离方式 获得母 离子和 子离子 不同, 离子讲 和傅里 
叶共 振离子 回旋质 谱采用 的是时 间分离 方式, 因而 可以进 行多级 MS (MSn) ,可达 10 级 
(MSiG)。 FTICR-MS 还出 现双讲 设计, 分别 进行离 子储存 和离子 分析, 更加强 了多级 MS 
功能 [26] 。 与 串联质 谱平行 的一个 概念是 碰撞诱 导解离 (collision induced dissociation, 
CID) [23 , 27] 。 在没 有出现 串联质 谱时, 为获得 分子结 构信息 ,需 要在离 子源内 (in-source) 
对离 子进行 碰撞, 使其 碎裂。 源内 CID 灵敏 度高, 但由于 没有选 择性, 因此 碎片的 专一性 
不强。 串联 质谱出 现后, 逐 渐取代 了源内 CID。 严格 地说, CID 仅指 离子解 离成碎 片的过 
程 , 串联 质谱则 包括了 母离子 选择、 CID 和子 离子分 析三个 过程。 另外 ,在电 喷雾质 谱中, 
离子从 离子源 输送到 质量分 析器过 程中, 要经 过一些 孔道, 如 orifice 或 skimmer ,有 时可 
以通 过改变 这些孔 道上的 电压, 使 离子发 生一定 程度的 解离。 这一 方法可 以用于 分析翻 
译后 修饰蛋 白质和 非共价 结合蛋 白质。 

第二节 质 谱法分 析完整 蛋白质 和多肽 

对完 整蛋白 质或多 肽分子 质量的 确定, 是蛋 白质结 构分析 的重要 部分。 对 于点突 
变的蛋 白质、 不均 一的糖 蛋白、 多 位点修 饰的磯 酸化蛋 白质、 N 端封 闭或 残基被 共价修 
饰的 蛋白质 而言, 质谱法 是快速 、准确 的鉴定 方法。 将测定 的分子 质量与 理论分 子质量 
比较, 可以 验证或 推测蛋 白质被 修饰的 情况, 或是否 有突变 位点; 还可根 据不同 亚型在 
质谱中 的相对 强度, 分析蛋 白质被 修饰的 程度。 对于 溶液内 纯度. 较高的 单个蛋 白质或 
多肽, 若采用 电喷雾 质谱, 由于 形成了 多电荷 离子, 分 子质量 越大, 图谱越 复杂, 一般电 
喷 雾质谱 可测定 的分子 质量范 围低于 70 OOODa ,尤 其以 3 000 Da 以下的 测定结 果较为 
理想, 而 MALDI-TOF-MS 由于主 要形成 单电荷 ,图谱 简单, 可测 定的分 子质量 范围可 
达 100 OOODa ,甚至 1 000 OOODa 以上。 

胶内蛋 白质的 精确分 子质量 是鉴定 蛋白质 的指标 之一。 可将 蛋白质 转移到 PVDF 
膜上, 用 MALD-TOF- MS [28] 分析, 还有人 将整块 双向凝 胶电泳 的胶转 PVDF 膜上, 整 
张膜与 MALD-TOF-MS 的基质 反应, 再进 行紫外 或红外 MALD-TOF-MS 扫描, 分析蛋 
白质的 分子质 量 [29 , 3 " ] 。 甚至 有人用 质谱代 替双向 凝胶电 泳中的 第二向 (SDS-PAGE), 
直接扫 描测定 等电聚 焦后的 凝胶, 测定蛋 白质的 精确分 子质量 ,并称 之为" virtual 2-D 
ger'[ 3 i ] 。 也可 直接将 蛋白质 从胶内 电洗脱 或有机 溶剂洗 脱到液 相后, 用 MALD-TOF- 
MS 和 ESI-MS 测定分 子质量 [32 ~ 34] 。 但 大分子 或疏水 蛋白质 抽提到 液相较 困难。 而 
且, 蛋白 质经过 凝胶分 离后, 某些氨 基酸可 能会被 丙稀酰 胺修饰 ,或被 氧化, 也 可能被 
抽 提的有 机溶剂 所修饰 (如甲 酸), 造成分 子质量 偏移, 或 造成同 种蛋白 质以不 同形式 
存在 [35] 。 就目前 的大多 数质谱 精确度 而言, 根据电 泳所得 到的等 电点和 质谱测 定的分 
子质量 ,仍 不足以 鉴定蛋 白质。 以大 肠杆菌 为例, 等 电点为 5. 5, 分子 质量为 25 OOODa 
的蛋白 质就有 几十种 [36] 。 因此, 还需 要采用 质谱分 析蛋白 质酶解 肽谱的 方法来 鉴定蛋 
白质。 



316 



第三节 质谱 法对蛋 白质和 多肽一 级结构 的分析 及鉴定 
一、 质谱 分析多 肽序列 的原理 

蛋 白质测 序法是 分析蛋 白质和 多肽一 级结构 的传统 方法。 但蛋 白质测 序法只 能鉴定 

末端 (N 端或 C 端), 要获得 蛋白质 所有氨 基酸的 序列, 还需 将蛋白 质进行 酶解, 酶 解肽段 
经色谱 分离收 集后, 分别 测序, 再拼 接成全 序列。 这个过 程十分 繁琐。 而质 谱方法 可以一 
次分 析蛋白 质酶解 的所有 肽段, 解析 序列, 从而获 得蛋白 质完整 的一级 结构。 而对 于分子 
质量 较小的 多肽, 只需根 据分子 质量和 MS/MS 数据, 即 可分析 其一级 结构。 

质谱法 测定多 肽序列 有几种 方式: 首先是 串联质 谱法或 CID 法, 即在 质谱中 获得肽 
段的 碎片' 23 -3 7 、 肽 段在质 谱中的 碎裂有 一定的 规律, 通常最 容易断 裂的是 肽键, 形成的 
是 N 端 离子和 C 端 离子, 分 别命名 为 b 离子和 y 离子, 其他 N 端离 子命名 为 a 离子和 b 
离子, 其他 C 端 离子为 X 离子和 Z 离子, 图 16.4 为肽 链在质 谱中断 裂形成 的主要 离子。 
除了这 些主要 离子外 ,侧链 基团的 断裂也 产生一 些离子 ,如 Thr,Ser 容易 脱水, Arg 易脱 
胍。 此外, 两 个以上 肽键同 时断裂 将产生 一些内 部离子 (internal ions)。 通 常根据 碎片离 
子进行 肽序列 分析, 主要依 据由肽 键断裂 而产生 的离子 ,即 b 离子和 y 离子。 质谱 法测定 
肽序列 ,最擅 长的是 确证已 知序列 和分析 已知序 列中的 翻译后 修饰。 而对 未知序 列的分 
析, 目前还 是一个 难题。 
典型肽 



肽片段 



R, 


O 

II 




R, 

r 


O 
II 




R, 


O 
II 




R4 

r II 


■C- 


-c- 


— N— 


— C— 


-c- 


-N- 


-c- 


— C- 


— N— 


—c—c 


H 




H 


H 




H 


H 




H 


H 






+2H 


z.; 




y, 

'211 






yi 

+211 




R, 




II 








II 






o 

II 




=0 


C- 


-c- 


-N- 


-c- 


-c- 


-N- 


-c- 


-c- 


— N- 


-c— c- 


H 




H 

+2H 


H 




H 

*2H 


H 




H 

+211 


H 



ai bj Ci a—; bj c—; 



3| H:N=CHR, 
R, 

b| H2N— CH— C=0- 
R, O 

I II 
1 H2N— CH— C=NH., 

R, O 



a: H,N— CH— C— NH' 



NH, 



R4— CH=COOH z, 
R4 

H,N — CH— COOH vi 
R4 

O =C— NH— CH— COOH x, 

R, O R4 
I II I 

C=C — Nil — CH— COOH -! -、 
H - 



图 16.4 肽在 CID 中 的断裂 

具有 源后衰 减 ( post source decay , PSD ) 功 能 的 MALDI-TOF-MS 也能 对肽链 测 
序 [38 ' 39 \但 由于在 这一过 程中肽 链断裂 的得率 并不高 ,且产 生的碎 片离子 准确度 不够, 在 



317 



图谱解 析时存 在一定 困难, 因此 使用的 效果不 甚理想 [4 " ] 。 近 两年出 现了将 MALDr 源与 
其他质 量分析 器如离 子畊、 Qq-TOF、TOF-TOF 相连 的模式 [ 4 «~ 42 ], 这些分 析器都 有真正 

的 MS/MS 功能, 因此实 现了将 MALDI 的 高通量 与串联 质谱的 序列分 析功能 的合二 

为一。 

由于 Lys 和 Gin 的分 子质量 很相近 (相差 0.0364Da) ,在 分辨率 很高的 质谱如 FTICR- 
MS 或高分 辨磁质 谱中, 可 以区别 Lys 和 Gin 微小的 质量差 异 [43 ' 44 ] 。 但在 常规的 质谱中 
不易 区分。 可 用多级 MS 断裂 Lys 和 Gin 不同的 侧链来 区分两 者 [45] , 或将 Lys 衍 生为高 
精氨酸 [ 46] 。 而 lie 和 Leu 的分 子质量 相同, 显然 不能仅 凭一级 MS 分辨 , lie 和 Leu 在 CID 
和 CAD 作用下 ,也会 产生不 同的侧 链离子 [ 47] 。 最近 的研究 发现可 将多肽 与游离 铜离子 
形成复 合物, 在进行 CID 时 lie 和 Leu 也会产 生不同 的碎片 [48 ' 49] 。 

另一种 测定肽 序列的 质谱法 方法是 酶法阶 梯式测 序 [5 "' 5 1 ] (13(^6『 sequencing) 一般 
多 应用于 C 端序列 分析, 即用 氨肽酶 或羧肽 酶依次 切除肽 链或蛋 白质的 C 端氨 基酸, 测 
定酶 解前后 的肽分 子质量 , 通 过质谱 差异确 定何种 氨基酸 被切割 , 依此 类推末 端序列 。 这 
一方法 多用于 C 端序列 测定。 但 由于酶 解是一 个动态 过程, 各个氨 基酸酶 解速度 不同, 
并且受 相邻氨 基酸的 影响, 因 此这一 方法的 通用性 不强。 目前阶 梯式测 序一般 可测定 3~ 
10 个氨 基酸。 还有报 道用质 谱法直 接测定 由化学 降解的 氨基酸 ,分析 蛋白质 末端序 

歹 ||[52~54]。 

采用质 谱法分 析蛋白 质的质 量肽谱 ,获 得每一 肽段的 分子质 量和序 列后, 即可 对蛋白 

质进行 鉴定。 这 个方法 可用于 验证由 cDNA 推出的 蛋白质 序列, 而 且特别 适用于 鉴定基 
因工程 重组蛋 白质是 否与预 期的序 列符合 ,是否 均一, 突 变位点 是否准 确等。 

二、 质谱法 结合数 据库检 索对多 肽和蛋 白质进 行鉴定 

, (一) 肽 质量指 纹图谱 法鉴定 蛋白质 

1. 原理 和特点 

这一 方法的 理论基 础是认 为每个 蛋白质 经过酶 解成为 长短不 一的肽 段后, 同 一时间 
获得所 有肽段 分子质 量而形 成一个 肽段分 子质量 图谱, 这一 图谱对 蛋白质 应是专 一而特 
异的, 因此 称为肽 质量指 纹图谱 (peptide mass fingerprinting, PMF) 。 这一 方法不 需对图 
谱进 行人工 解析, 只需 将实验 获得的 PMF 与蛋 白质数 据库中 蛋白质 的理论 PMF 比对, 
就 可以鉴 定该蛋 白质。 因此 比传统 方法速 度快、 通量高 ,是最 早用于 大规模 蛋白质 鉴定的 
质谱 方法, 也是目 前最简 便的蛋 白质鉴 定方法 之一。 近年来 随着蛋 白质数 据库或 由基因 
组数 据库和 EST 库等 衍生的 蛋白质 数据库 的快速 增长和 完善, 使 PMF 方 法的适 用性大 
大 增强。 

2. 影响结 果的关 键因素 

(1) 灵敏度 

无论 如何, 能 否灵敏 地获得 PMF 信 号是任 何后续 分析的 基础。 灵敏 度的欠 缺会造 
成信噪 比高, 一 定程度 上又影 响到精 确度。 另外, 可检测 到的肽 段少, 对数 据库检 索是不 
• 318 . 



利的。 

(2) 精确度 

显而 易见, PMF 方法主 要是靠 对肽段 的分子 质量测 定来获 得准确 的检索 结果, 因此 
分子质 量精确 度是最 重要的 指标。 目前 已有延 迟萃取 和反射 检测的 MALDI-TOF-MS, 
以 及新近 出现的 MALDI-Q-TOF-MS ,分 子质量 精确度 都可达 5ppm 左右, 已经完 全符合 
数据库 检索的 要求。 但是在 实际工 作中, 尤其 是微量 样品, 或从胶 内酶解 获得的 样品, 精 
确度 往往不 够理想 , 在 很大程 度上会 影响检 索结果 , 误 差越大 , 检索 准确性 越低。 

(3) 质 量校正 

鉴于精 确度对 PMF 结果的 决定性 作用, 质量 校正就 是实验 中必不 可少的 一步, 尤其 
对 TOF 质量分 析器, 质 量校正 非常重 要而且 需常规 进行。 质 量校正 有外标 和内标 校正两 
种, 外标校 正是指 在样品 测试前 用已知 精确分 子质量 的标准 品对仪 器进行 校正。 不同的 
分子 质量范 围有不 同的标 准品, 通常做 PMF 时 会采用 5〜 10 个标准 肽的混 合物, 内标校 
正是 指将已 知精确 分子质 量的标 准品掺 入到样 品中, 或将样 品中已 知精确 分子质 量的信 
号为标 准对仪 器进行 校正, 显然内 标校正 比外标 校正要 精确, 不过标 准品掺 人的步 骤较繁 
琐, 标准品 浓度若 太高, 反而 会将样 品信号 抑制, 但如 果控制 得好, 对 PMF 的精确 度还是 
很有帮 助的。 在 对蛋白 质的胰 蛋白酶 酶解产 物进行 PMF 分 析时, 有时会 将胰蛋 白酶的 
自醇解 峰作为 内标; 如 果使用 牛胰蛋 白酶, 一般在 MALDI-TOF-MS 上最明 显的自 酶解峰 
理 论上为 2 163. 057, 可作 为校正 标准, 但仅能 做单点 校正, 仍不够 理想。 

(4) 分辨率 

分辨率 在一定 程度上 与精确 度相关 ,尤 其在肽 段分子 质量在 2 OOODa 以上时 ,在 
MALDI-TOF-MS 中的 分辨率 会有所 下降, 导致 峰变宽 , 精 确度也 下降。 

(5) 数据库 

由于 PMF 鉴 定蛋白 质是依 赖数据 库的, 因此数 据库本 身是否 完善和 准确也 是关键 
因素 之一。 实 际工作 中经常 会出现 PMF 图谱 很好, 但 查不到 结果的 情况。 原因 之一就 
是数据 库不全 ,所 研究的 蛋白质 在数据 库中不 存在, 即 可能是 未知蛋 白质。 目前已 有的蛋 
白质数 据库中 ,以 部分微 生物尤 其是原 核微生 物和酵 母的数 据库最 完善, 在 大部分 真核生 
物中, 即使基 因组序 列已知 ,由 于有内 含子、 翻译 后修饰 等因素 影响, 蛋白质 数据库 仍不完 
善, 是制 约质谱 法鉴定 蛋白质 的一个 瓶颈。 

(6) 样 品制备 

影响 PMF 法鉴定 蛋白质 结果的 人为因 素主要 是样品 制备。 虽然 MALDI 质 谱对杂 
质的 容忍度 较好, 但样品 制备的 好坏会 直接影 响到图 谱的灵 敏度、 精确 度和分 辨率, 具体 
的步 骤和注 意事项 见相关 章节。 

3. 检 索方法 和工具 

(1) 现 有的检 索工具 [55,56] 

如何对 PMF 的实验 结果和 理论图 谱进行 比较和 评价, 是将实 验数据 转换成 具有生 
物学 意义的 结果的 关键。 目前 已发展 了不少 算法和 工具, 这 些软件 都可以 在互联 网上免 

费 使用。 互联网 上的软 件使用 的都是 公用数 据库, 如果 要使用 自主数 据库则 需购买 in- 
house 版。 常用 的软件 及其介 绍如表 16.4。 

. 319 . 



表 16.4 PMF 常用 的软件 


软 件名称 


网 址 


Mascot 


www. matrixscience. com 


Profound 


Prowl . rockefeller, edu 


Peptldeni 


www. expacy: ch /tools 


ProteinPrcxspector 


Prospector, ucsf. edu 


PepSea 


195.41. 108. 38 



(2)Mascot 使 用方法 

图 16.5 为 Ma.scot 查询 页面, 参数 的选择 如下。 

Database: 选择数 据库, 一 般采用 NCBI 的非 冗余库 (NCBInr), 

Taxonom y : 根据样 品 来源 选择物 种名称 (如 Human 数据库 )。 

Enzyme: 选择所 使用的 IK 如 Trypsin)。 

Allow up to : 选 择可能 遗漏的 酶切位 点数。 

Fixed modifications : 选 择固定 修饰。 

Variable modifications : 选择可 变修饰 。 

Protein mass :选 择蛋白 质分子 质量上 限 。 

Peptide tol. ± : 选择肽 分子质 量误差 范围。 

Mass values : 用以 搜索的 数值是 分子离 子质量 或分子 质量。 

Database! 謂 



I 仏 QHfimy 



Enzyme trypsin 



Fixed 
modifications 



AB—oldJCATdO (C) 
AHroldriCATfiS (C) 
Acetyl (K) 
Ace t y I (N- lerm) 
Ami dp (C- temi) 



Protein mass 

1 kDa 

Mass values ^ MH+ 广 M 
Dafa file 

NB Contcnis 

of this field 
arc ignored if 
a data tile 

is specified, 

CHerview 厂 

^^tari Search . . . j 



Allow up to I 

Variable 
modifications 



missed cleavages 



\Ii ohLICATdO (C) 



A( cty 1 



【 t-tyl (N'-term) 
Hide (C- term) 



1 



Peptide tol.±| 
Monoisotopic 



Average 



Report topi 



hits 



m 16.5 Mascot 査 询页而 



320 



Monoisotopic :是单 同位素 分子质 量还是 平均分 子质量 c 

Data file: 选定 文件。 

Query: 贴人用 于査库 的分子 质量。 

图 16.6 为 Mascot 检索 结果的 示例。 

151:、-篇、、、 



25 50 75 

Probability Based Mowse Score 

1. gil6319314 Mass: 69896 Total score: 89 Peptides matched : 1 1 

(NC — 001133) StresS" seventy subfamily A; Ssalp [ Saccharomyces cerevisiae] 

2. gil6323196 Mass: 17433 Total score: 38 Peptides matched: 4 

(NC_ 001144) Homology to rat S27a; Rps31p [Saccharomyces cerevisiae] 
图 16.6 为 Mascot 检 索结果 

图中 的横坐 标为鉴 定的蛋 白质的 可能性 分数, 分数 越高, 代表 结果越 可靠, 第 一位结 
果和 第二位 结果分 数相差 越大, 第一位 结果越 可靠。 

(二) 一 级质谱 (MS) 结合串 联质谱 (MS /MS) 法鉴定 蛋白质 

1. 原理 和特点 

由于 MS/MS 具有结 构分析 功能, 可 以获得 检测到 的每一 肽段的 序列。 因此, 根据一 
级质谱 (MS) 测得 的精确 分子质 量和串 联质谱 (MS/MS) 所得 的序列 信息, 通过蛋 白质数 
据库的 检索, 无疑 大大增 加了蛋 白质鉴 定的准 确性。 这一 方法多 在具有 CID 功能 的质谱 
中 进行, MALDI-TOF-MS 的 PSD 功能虽 然也能 获得一 些序列 信息, 但效率 不高, 操作繁 
琐, 故应用 有限。 

2. 影响结 果的关 键因素 

(1) 灵敏度 、精 确度和 分辨率 

由于有 MS/MS 信息, 对 图谱的 精确度 和分辨 率的要 求不如 PMF 高。 因此, 影响结 
果的最 重要指 标是灵 敏度, 尤其是 在液相 色谱- 质谱联 用的仪 器上。 通常 会采用 纳升喷 
雾 提高检 测的灵 敏度。 

(2) MS/MS 图 婚质量 

MSMS 图谱 的质量 是最影 响检索 结果的 因素, 除了灵 敏度、 精确 度等指 标外, 图谱 
的 峰型分 布也很 重要。 理论上 , 如 果所有 b 离子和 y 离 子都被 检测到 , 并有 同等离 子强度 
时, 检索的 匹配最 理想, 但在实 际的图 谱中, 某些离 子可能 会被遗 漏或强 度很低 ,造 成匹配 
程度不 理想。 




321 



3. 检 索方法 和工具 

(1) 现有的 检索工 具 [57 ' 58 ] 

常 用的串 联质谱 检索工 具如表 16.5 所示, 这些检 索工具 有的可 从网上 获得, 有的绑 
定 在质谱 仪软件 中可供 使用。 我们实 验室常 用的是 SEQUEST 软件, 它与 Finnigan 公司 
的质谱 仪整合 ,因 而可以 直接识 别原始 图谱, 而 在网上 使用的 软件则 需从原 始图谱 中抽取 
峰 信号后 使用。 

表 16.5 常用 的串联 质谱检 索工具 

软 件名称 网 址 

SEQUEST Fields . scripps . edu/ sequest 

Mascot www. matrixscience. com 

PepFrag Prowl, rockefeller, edu 

ProteinProspector Prospector, ucsf. edu 



(2) SEQUEST 使 用方法 

① 先在 Bioworks 软件 中打开 一个原 始图谱 (Raw Data)。 

② 在 Action 栏点击 TurboSEQUEST Search ,即 出现检 索参数 (图 16.7), 




图 16.7 SEQUEST 检 索界面 

③选择 Basic 参数, 见图 16.8。 

Scan limits; 选择 用于检 索的扫 描数。 

丽 Range: 选择用 于检索 的肽分 子质量 范围。 

Threshold: 选择用 于检索 的信号 下限。 

Database: 选择 数据库 〇 

Options: 选择数 据库的 性质。 

Enzyme: 选择使 用的蛋 白酶。 

Number of internal cleavage sites; 选择可 能遗漏 的酶切 位点数 < 
322 • 



Baste |Advw^ad| Modtfications | Charge Slate (ZSA) | SEQUEST Qu 
f FokiM /Directory 



'. \Xcalibur\sequest 



R Perform DTA generdtion 



Scan JmniH: (T"7080 Tracfe 
MWBanoe: |500 00-4000 00 
Ihrmhokl 



Remove ana oxislng " d(a fBes 



P" Pwfoim DT& Ss«rch 



4un^ of 
deavac 





IC \Xcalibut'vdaiAha?e\veasl tas(a 




Options: 


<^ £asta 广 Indesfed 






Erotein 广 tiucleotide 












1 Trypsin 





Remjjve any ews<ing " oul files 



Qefauks 



图 16.8 Basic 参 数选择 

④选择 Advanced 参数 (图 16.9) , 一般可 使用默 认值。 可根据 需要选 择的参 数有: 
Precursor Mass; 母离 子分子 质量差 异在此 范围内 可视为 同一种 离子, 可合 并检索 < 
Minimum Group Count : 合 并检索 组的最 小值。 
Minimum Ion Count: 用于检 索的最 少离子 个数。 
Peptide: 用 于检索 的肽分 子质量 误差。 



Bdsic Advanced | Mo<fificatior>$ | Chage State (ZSA) | SEQUEST Queue | 



TolNance & \jmk& for Ota G deration 
Precxesof 

Qfoup Scan: 

Mnmun Group Count 

Mirwnum {on Count 

Use Charge State: 

Sii>$eguence. 



Totorance & LarAs H» Ota Search 
Eepbde; |i 50 

fragnnent lona. jo 00 

Number results scored: [500 



-3 



Ion Seiies CatciJated tn Dtd Search— 
厂 6 tons P" S Ions [7 ^j^lorw 



-Output Options for Ola Se^ch — 
Numbof QutpU Lnes: po 
Number PrcD^on Lines: 15 

「 Showf Fr^jmmt lon< 

「 Report Qupficate Refefence 



图 16.9 Advanced 参 数选择 

⑤选择 Modification 参数 (图 16. 10) 
Static: 选 择固定 修饰。 
Differential: 选 择可变 修饰。 

在 SEQUEST 软 件中, 通过实 验数据 与理论 数据的 相关性 (cross correlation) 分析就 
可以 鉴定蛋 白质。 表 16.6 为 一个胶 内蛋白 质的部 分数据 库鉴定 结果。 

• 323 • 



BasK I Advanced ModiHcatiofW | Charge Stale (2SA) | SEQU^flSiieul^ 



CjOfmpaphds: |o 0000 
H te"n peptide; |o 0000 
AurwioActd 



AA 


mmmn 




0000 




0000 




0.0000 




0.0000 




□ 0000 




0000 



gtaft Soafch | | pose 




Savg f 



图 16 . 10 Modification 参 数选择 
表 16.6 蛋白质 的部分 数据库 鉴定结 果示例 



Filf 




Massl 


MassA 


Xcorr 


DelCn 


Sp 


RSp 


Ions 


Reference 


Sequence 


2D-14. 0974. 0989 




1543.9 


1543.8 




0044 


0.535 


2032.8 


1 


21/28 


TPIS HUMAN 


( R) KQSLGEUGTLNAAK 


2D-14. 0992. 0995 




1416.1 


1415.6 




3091 


0.261 


553.0 


1 


14/26 


TPIS HUMAN 


( K)QSLGELIGTLNAAK 


2D-14. 1007. 1010 




1516.3 


1513.7 


1 


1531 


0.041 


90.8 


65 


7/24 


SPCA HUMAN 


(R)DGLUVRRDALREK 


2D-14. 1022. 1037.2 


2192.8 


2193.4 




6444 


0.657 


1167.4 


1 


24/38 


TPIS HUMAN 


(K)VPADTEW 






















C» APPTAYIDFAR 


2D-14. 1040. 1049 




1808.7 


1809.1 


6 


1178 


0.609 


3068.3 


1 


27/34 


TPIS HUMAN 


(K)VAHALAEGL 
GVIAC* IGEK 


2D-14. 1055. 1088 




1603.0 


1603.9 


4 


5333 


0.540 


1501.7 


1 


20/28 


TPIS HUMAN 


(K)VVLAYEPVWUGrGK 



1. TPIS HUMAN 

2. HIV2U272007 



. S3%21 



152 (14,0,0,0,0) I 10 13 22 23 27 28 31 34 36 38 39 42 44 48 
22 (1,0,0,0,0) i 12 I 
22 (1,0.0,0,0) I 26 1 



第一 列为文 件名; MassI 和 MassA 分别 为肽段 的实验 分子质 量和理 论分子 质量; 
Xcorr 为相关 性分析 的分数 (Score) 。 分数 越高, 表明实 验数据 和理论 数据越 接近; DelCn 
为 相关性 最高的 两个检 索结果 之间的 Xcorr 差值; Sp 为 MS/MS 丰度 最高的 200 个离子 
与 理论离 子比较 的初步 分数; RSp 为 由初步 分数获 得的序 列的排 列顺序 ; Ions 为实 验所检 
测到 的离子 和理论 应有的 离子; reference 为肽序 列的参 考号; MH+ 为实验 肽段离 子分子 
质量, Sequence 为肽 序列。 表中还 列出了 综合检 索到的 蛋白质 ,及 其排列 顺序和 分数。 

(三) 序列标 S 法鉴定 蛋白质 

Mann 等发展 了根据 序列标 签来搜 寻肽段 的方法 [59 3。 在 MS/MS 或 PSD 对 肽段的 
序列分 析中, 通常 获得的 是部分 序列, 特别 是肽链 中段的 序列, 根据 肽段的 部分序 列和序 
列两 端的肽 质量, 可 以对肽 段进行 鉴定。 可 使用的 软件有 PepSea。 
- 324 - 



(四) 使用^ 索工 具的注 意事顶 

参数的 选择是 重要的 ,会 影响到 蛋白质 鉴定的 结果, 需 要注意 的有下 述几个 方面。 

① 选 择可能 遗漏的 酶切位 点数, 一般为 1〜2 个, 若选择 太多, 将 导致理 论库的 内容增 
多, 降 低了准 确性。 

② 修饰 种类的 选择, 一般半 胱氨酸 会被烷 基化, 属 于固定 修饰。 可变修 饰也不 宜选择 
太多, 因为 会提高 匹配的 难度。 

③ 肽 分子质 量误差 范围, 这是影 响检索 结果的 关键因 素之一 ,而 且与实 验图谱 质量相 
关 , 是不容 易把握 的参数 , 若 实验误 差较大 , 而用 于检索 的误差 范围小 , 就得 不到分 数较高 
的检 索结果 ; 若实验 误差小 ,用于 检索的 误差范 围大, 则匹 配的结 果太多 , 同 样影响 查询结 
果的可 信度。 

④ 用 于査库 的分子 质量, 尤其是 MALDI-TOF-MS 图谱中 的信号 很庞杂 ,肽 信号、 杂 
质、 基质等 混杂后 可能到 达上万 个峰, 而 由于检 索查库 的信号 只有几 个到几 十个, 往往会 
选择 分辨率 和强度 较好的 信号, 作为用 于査库 的分子 质量。 但即便 如此, 仍然有 一些" 假 
峰", 如蛋白 酶自酶 解峰、 角蛋 白污染 后的酶 解峰。 因此, 需要 在查库 时进行 甄别, 消除这 
些 干扰。 

(五) 蛋 白质鉴 定的结 果评价 

通过 上述方 法在数 据库中 可以查 到蛋白 质的全 序列, 以及质 谱检测 肽段的 覆盖率 
( coverage )o 覆盖率 越高表 明检索 结果越 可靠。 一般覆 盖率为 20% 〜 50% 。 在有 
MS/MS 结 果的情 况下, 由于蛋 白质序 列有很 高的专 一性, 若覆盖 率达到 20% 〜50%, 根 
据 分子质 量和肽 序列所 查询结 果将是 相当可 靠的。 查询 到蛋白 质全序 列后, 通常 应根据 
其精确 分子质 量和等 电点, 与蛋 白质在 双向电 泳图谱 中的位 置进行 对比, 进 一步确 证蛋白 
质 的鉴定 结果。 

胶内蛋 白质酹 解后, 并不是 所有的 肽段都 可以检 测到。 至少有 如下因 素会影 响到蛋 
白质的 覆盖率 :一 是蛋白 质晦解 效率和 酶解肽 段的获 得率。 这 由蛋白 质本身 的性质 决定, 
采用藤 解与化 学裂解 (如 CNBr) 共同 作用的 方法, 可提高 覆盖率 [6 G ] ; 二是蛋 白质被 修饰的 
情况。 这类蛋 白质会 出现质 量迁移 ,导 致与数 据库中 的理论 肽谱不 符合, 而未被 确认; 三 
是蛋白 质很微 量或杂 质较多 , 质 谱分析 的信噪 比低 , 有 些分子 离子检 测不到 , 因 而 无法与 
数据库 匹配。 

目前质 谱法检 测的通 常是经 考马斯 亮蓝染 色的蛋 白质, 对分析 银染蛋 白质仍 有一定 
困难。 由于银 染蛋白 质十分 微量, 而且 银染会 导致蛋 白质的 很多位 点被不 可逆地 修饰和 
封闭, 酸 解十分 困难。 

三、 多肽从 头测序 

仅根据 多肽在 质谱中 的碎片 信息解 析未知 序列, 目前 还存在 困难: 一是 因为质 谱仅获 
得碎片 ,无 法分辨 b 离子和 y 离子; 二是由 于除了 b 离子和 y 离子 以外, 其 他离子 的存在 
对序列 解析有 干扰; 三是 由多肽 断裂不 完全, 造成离 子系列 不连续 ,难 以确定 某些氨 基酸。 

• 325 - 



目前 常用的 质谱测 序方法 大多依 赖于蛋 白质数 据库。 测定 未知肽 序列, 称为 de novo 
sequencing ,即 所谓" 从头测 序"。 从头测 序可根 据质谱 碎片图 用软件 推导, 这 一方法 将在生 
物信息 学一章 中详细 阐述。 在此介 绍化学 衍生标 记法, 化学衍 生标记 法有如 下几种 策略。 

1. 质量 偏移法 

将 多肽的 N 端或 C 端标记 ,通过 质量偏 移区分 b 离子和 y 离子。 有人 采用酯 标记肽 
C 端, 通过 质量偏 移区分 b 离子和 y 离子 [6 1 ] 。 Cagney 等人 [ 62] 则采用 0- 甲 基异脲 将胰蛋 
白 酶解肽 段中的 Lys 衍 生成高 精氨酸 (homoarginine) ,与 未衍生 的肽段 1:1 混合后 ,通过 
C 端 Lys 的质量 偏移, 确定 C 端离 子。 还 发展了 稳定同 位素掺 人法, Horiuchl等 [63] 在进 
行蛋白 质胰蛋 白酶酶 解时, 用 1:1 的 H20' 8 /H20i 6 作为 溶剂, 在酶解 肽段的 C 端同 时有 
和 Oi 6 , 在形成 碎片时 ,同 时有这 两种氧 原子的 离子为 C 端离子 (图 16.11)。 




Ser-, 

图 16.11 HzCys 中蛋白 质胰蛋 白酶醉 解过程 

2. 单 向离子 增抑法 

除 了质量 偏移法 以外, 另一种 思路是 在形成 质谱图 时就只 看到单 向离子 (b 离子或 y 
离子 ) , 只需 从一端 便可推 导出肽 序列。 主要的 方法是 将肽的 N 端或 C 端 衍生使 其电荷 
达到 增强或 削弱, 引入 正电荷 和负电 荷均可 [64] 。 在正离 子检测 模式下 ,引 人带正 电荷的 
基团, 可使某 一端的 离子得 到增强 ,如引 入四价 季铵或 辚基团 ;若引 入带负 电荷的 基团, 则 
是某 一端的 离子减 弱甚至 完全被 抑制, 如引 人横酸 基团。 反之, 在负离 子检测 模式下 ,引 
入负 电荷则 增强, 引入 正电荷 就抑制 某一端 离子, 表 16.7 为 目前所 采用的 衍生基 团及其 
原理。 

表 16.7 目前 所采用 的衍生 基团及 其原理 

衍生基 团性质 基 团结构 衍 生部位 引入电 荷性质 文献 

quaternary N 端 正电 [65~70] 

ammonium ― +n — CH2C ^ 

(季铵 ) I 



J II 
— (CH2)5— C— 

i O 

― ^N— CH2CH2S— CHzC— 

/ O 
— (Qn^— {CH2)3— C— 



. 326 . 



续表 



衍生基 团性质 



基 团结构 



衍 生部位 引入电 荷性质 文献 









+仏 cj— 



<0n*— CH2C- 



o 



(CH3)3— N— CH2C- 



o 



(C8Hn)(CH3)2— f^CHsC— 



quaternary 



ammonium 



(季桉 ) 



-NHCHjCHj— 



-OCH2CH2— N— 



C 端 



正电 



[71,72] 



quaternary 
phosphonium 
(錄 基团) 



,OCH, 



CH3O— o 



O 
II 

-P+— CH2C- 



N 端 



正电 [73,74] 



\0CH3 

(<0> 卜 p+— CH2CH2— 



quaternary 
phosphonium 

(雜 基团) 



c 端 



正电 



[74] 



— NHCHjCHj— P^— <^ 

o 



O 

II 

O3S— CH2— c- 



Sulfonic acid group 
(确 酸基) 




C 端 



负电 



[76] 



N 端 负电 75 



Sulfonic acid group 

(横 酸基) 




327 



3. 稳定 同位素 标记的 氨基酸 惨入法 

由于体 外的化 学修饰 有一定 的缺陷 (如 反应效 率问题 ), 普遍有 副反应 而增加 了图谱 
解 析的难 度等。 另外, 一些 研究组 尝试在 细胞培 养时, 就将已 将用同 位素标 记的氨 基酸掺 
人, 因此, 在合成 出的蛋 白质中 ,就 带有同 位素标 记的氨 基酸。 011 [77] 等 人选择 5096 4 个 
D 标记的 Lys(Lys- d4) 掺人, 使所 有蛋白 质中的 Lys 都以 等量的 Lys-dO 和 Lys-d4 形式存 
在, 由于胰 蛋白酶 酶切位 点即在 Lys 的 C 端。 因此, 在 蛋白质 酶切图 谱中, 形成了 C 端被 
差异 标记的 肽段, 从 而达到 了分辨 b 离子和 y 离子的 目的。 这一方 法的最 大缺陷 在于仅 
能用 于培养 细胞, 而不 能用于 组织。 

第四节 质谱 前蛋白 质或多 肽样品 制备方 法和关 键步骤 

( ― ) 概 况 

质谱前 蛋白质 或多肽 样品准 备主要 根据纯 化系统 是凝胶 系统还 是非凝 胶系统 ,分析 
系统是 MALDI-MS 还是 ESI-MS ,其 中又 以凝胶 系统的 MALDI-MS 或 ESI-MS 样 品准备 
技术 要求相 对较高 , 非凝胶 系统的 MALDI-MS 或 ESI-MS, 无论是 完整蛋 白 质分 析还是 
混合 蛋白质 (包 括单 个纯蛋 白质) 酶解后 质谱的 样品准 备技术 要求在 本书其 他章节 将有详 
细 描述。 而 HPLC 与 ESI-MS 的联用 ,样品 的脱盐 、浓缩 也基本 实现在 线和自 动化。 目前 
只有 普遍采 用的从 凝胶到 MALDI- MS 系 统的样 品准备 技术还 多少依 赖人工 操作, 在此重 
点介 绍质谱 分析前 样品准 备的整 体思路 和具体 步骤。 

凝 胶系统 一般为 1-D gel 或 2-D gel ,胶 上分离 的蛋白 质点可 以转移 到膜上 (如 PVDF 
膜) 进行膜 上酶解 ,也可 以胶内 酶解, 虽然二 者同样 有效, 但胶内 酶解更 为方便 ,且 灵敏度 
较高, 有利 于低丰 度蛋白 质的鉴 定以及 后续的 肽段碎 片分析 (如 PSD 或 MS/MS)[ 78] 。 

(二) 质谱前 的样品 纯化、 浓缩 

虽然 MALDI-MS 可以容 忍一定 限度的 盐分、 去污 剂等, 但对样 品结晶 有很大 影响以 
及 在离子 化过程 中形成 加合物 , 将增 加数据 处理的 复杂度 , 也会降 低信噪 比 , 影响 结果的 
可 靠性, Zip Tip 是纯化 、浓缩 蛋白质 和肽段 的理想 工具, 为蛋白 质组学 实验室 所必备 ,关 
于具体 的实验 步骤, 详 见相关 章节。 

当前 关注的 焦点是 MALDI-MS 质 谱前的 样品处 理的自 动化及 怎样提 高整个 样品前 
处理的 效率。 在设备 方面已 有一些 改进, 如 Millipore 公司的 ZipPlate MicroSPE Plate ,蛋 
白质 酶解、 脱盐、 浓缩样 品在同 一盘中 ,无需 样品转 移等繁 琐步骤 ,减少 了损失 ,提 高了蛋 
白 质鉴定 的成功 率和氨 基酸的 序列覆 盖率。 

为了 满足蛋 白质组 学中低 丰度蛋 白质的 检测与 分析, 新的自 动化、 在线 的样品 准备方 
案不 断得到 发展, 瑞典 Lund 大学 MarkoVarga 等人 [? 9 , 8 。] 做了 有益的 尝试, 他们研 制开发 
的 微量纯 化硅芯 片技术 (silicon microextration chip, SMEC) 不 仅减少 了人工 操作的 步骤, 
而且 减少了 层析填 料的使 用量, 并且 可重复 使用, 节约 了实验 费用, SMEC 甚至可 以作为 
固化微 芯片酶 反应器 (immobilized microchip enzyme reaction, IMER) (与蛋 白质纯 化中的 
• 328 - 



柱上 复性有 异曲同 工之妙 ), 同时对 样品洗 脱时产 生的散 逸问题 进行了 研究。 

(三) 染色方 法与质 谱分析 的兼容 性 [8 13 

1. 传 统的染 色方法 

在 蛋白质 组学领 域中广 泛应用 的是考 马斯亮 蓝染色 法和银 染法。 考马 斯亮蓝 染色法 
较为 灵敏, 可以达 到微克 级检测 水平; 具有 线性的 动力学 范围, 非常适 合定量 ,这一 点相当 
重要; 易于 使用并 且与质 谱分析 的兼容 性相当 出色, 这些都 使其成 为常规 染色的 首选。 遗 
憾的是 ,微克 级的检 测水平 使它无 法检测 到相当 多的低 丰度蛋 白质, 日益成 为蛋白 质组学 
的 瓶颈。 

银染法 比考马 斯亮蓝 染色法 灵敏约 100 倍, 检测限 度可达 纳克级 水平, 被广泛 应用于 
各蛋白 质组学 实验室 ,但 是并非 完全符 合线性 动力学 (仅在 100〜150ng 范围内 符合) 导致 
蛋 白质差 异显示 的不准 确性, 给后续 分析及 鉴定带 来一定 的实际 困难, 实验 操作中 使用的 
银离 子及戊 二醇影 响胶内 蛋白质 酶解, 降低 了蛋白 质质谱 分析的 氨基酸 序列覆 盖率。 

我们 实验室 蛋白质 (考马 斯亮蓝 染色) 鉴 定的成 功率为 60% 〜80%, 远高于 蛋白质 
(银染 ) 鉴定的 成功率 (为 30%〜60%)。 鉴于此 ,我 们也在 不断发 展新的 方法, 以 提高银 
染鉴 定的成 功率, 改进的 无戊二 酸银染 法 [82] 和^1202^ 83] 脱色 法将会 降低不 利因素 带来的 
影响。 

2. 荧光 染色法 [«^, 85 ] 

虽然荧 光染色 应用到 蛋白质 组学研 究的时 间不长 ,但其 突出的 优点和 广泛的 应用前 
景冲击 着传统 的染色 方法, 从事 蛋白质 组学实 验的研 究人员 将是最 大的受 益者。 荧光染 
料有 多种, 其中以 Sypro 染料最 为引人 注目, 荧光染 色法与 银染法 同样具 有高灵 敏度, 但 
克服了 银染法 的一些 缺点, 染料与 蛋白质 非共价 结合, 减少了 对酶解 及质谱 分析的 影响, 
极大地 提高了 氣基酸 序列覆 盖率, 同时 具有宽 广的线 性动力 学范围 (2〜2 000ng), 这使得 
低丰 度蛋白 质的检 测和精 确的蛋 白质定 量更为 准确、 简便。 但是由 于荧光 染色法 要求使 
用昂贵 的仪器 和试剂 ,延缓 了其在 蛋白质 组学中 的推广 速度。 

(四) 关 于酶自 解峰和 角蛋白 的活染 

首先, 要尽量 降低自 酶解, 减少角 蛋白的 污染, 因它们 "额外 "的 肽段会 干扰质 谱检测 
得到的 数据的 分析, 主要的 预防措 施如下 所述。 

® 使用 TPCK-Trypsin (测序 级)。 Promega 和 Roche 公司均 有较好 产品。 

② 在 加酶使 胶块吸 胀后, 一 定要去 掉多余 酶液, 不要认 为这样 会影响 酸解的 效率。 

③ BI 解时 间不宜 过长, 不 要超过 24h。 

④ 电 泳的玻 璃板、 染胶的 器皿等 用前应 洗净。 

⑤ 所 用试剂 和溶液 的纯度 要高, 以便达 到质谱 分析的 要求。 

⑥ 尽量使 用干净 的乳胶 手套和 洁净的 EP 管及 Millipore H20。 
© 尽量减 少不必 要的操 作步骤 ,简 化操作 程序。 

⑧ 要有一 个洁净 的操作 环境。 

• 329 . 




尽管 如此, 有时 自酶解 和角蛋 白的污 染还是 难以避 免的, 那么有 必要在 数据存 储时将 

其剔除 ,提 高搜库 的有效 性和准 确性, 同时 它们也 可以作 为内标 准物校 准仪器 (Porcine 
Trypsin:842.5100 和 2211.1046,M+H+) ,相对 外标准 物有更 高的精 确度。 表 16.8 和表 
16 . 9 分别 表示猪 和牛胰 蛋白藤 自 酶解理 论肽谱 ( 中性 , 相对分 子质量 值)。 猪和牛 胰蛋白 
酶 的全序 列参考 http: //biochem. roche. com/pack-insert/1418475a. pdf 以 及文献 [86] 。 

常见 的对质 谱影响 较大的 角蛋白 有以下 4 种: 角蛋白 1( 皮肤 )、 角蛋白 2E (头皮 屑)、 
角蛋白 9( 皮肤 )、 角蛋白 10( 头皮屑 )。 详 情请参 见网址 http://ww.matrixscience.com/ 
Help Topic Index : Protein chemistry 中 autolysis 和 contaminants 选项 。 



表 16.8 猪胰蛋 白酶自 薛解理 论肽谱 



相对分 子质量 


位置 


#MC 


肽序列 


3012.3164 


171- 


-200 





DSCQGDSGGPWCNGQLQGI VSWGYGCAQK 


2282.1729 


70- 


-89 





I ITHPNFNGNTLDNDIMLIK 


2210.0967 


50- 


-69 





LCEHNIDVLEGNEQFINAAK 


2157.0234 


150- 


-170 





SSYPGQITGNM1CVGFLEGGK 


1767.7920 


108- 


-125 





SCAAAGTECLISGWGNTK 


1735.8352 


209- 


- 223 





VCNYVNWIQQTIAAN 


1468.7232 


126- 


-139 





SSGSSYPSLLQCLK 


1044.5564 


90- 


-99 





LSSPATLNSR 


1005.4801 


140- 


149 





APVLSDSSCK 


905.4970 


201- 


-208 





NKPGVYTK 


841.5021 


100 - 


-107 





VATVSLPR 


514.3227 


46- 


-49 





IQVR 


261.1437 


44- 


-45 





SR 


表 16.9 牛胰蛋 白翁自 酶解理 论肽谱 


相对分 子质量 


位置 




肽序列 


2551.2410 


100 ~ 


-125 





VASISLFTSCASAGTQCLIS GWGNTK 


2272.1521 


70- 


'89 





SIVHPSYNSNTLNNDIMLIK 


2192.9870 


150- 


-170 





SAYPGQITSNMFCAGYLEGGK 


2162.0491 


50- 


-69 





LGEDNIWVEGNEQFISASK 


1494.6079 


171- 


-186 





DSCQGDSGGPWCSGK 


1432.7133 


187- 


200 





LQGIVSWGSGCAQK 


1152.5662 


126- 


-136 





SSGTSYPDVLK 


1110.5532 


209- 


-217 





VCNYVSWIK 


1019.4957 


140 〜 


149 





APILSDSSCK 


905.4970 


201- 


208 





NKPGVYTK 


804.4090 


92- 


99 





SAASLNSR 


658.3762 


44- 


49 





SGIQVR 


632.3129 


218- 


•223 





QTIASN 


362.1988 


137- 


139 





CLK 


259.1896 


90- 


91 





LK 



330 



(五) MALDI- MS 基质 的选择 

1. 基质 的作用 及选择 

基质的 使用是 MALDI 这一 软电离 技术的 关键, 各 种基质 都有相 应的应 用范围 (表 
16. 10), 不同的 生物样 品只有 在相应 的基质 辅助下 ,才能 更好地 离子化 ,进人 MALDI 质 



谱 分析。 

表 16.10 基 质的种 类及应 用范围 



基 质 


分子 质量/ Da 


应 用 


。-氛 基- 4 -经基 肉桂酸 ( a-cyano4-hydroxycinnamic 
acid.HCCA) 


189.04 


肽 ( < 5 OOODa) , 脂类 ,碳水 化合物 


3, 5 -二甲 氧基- 4 -轻基 肉桂酸 (sinapinic acid, SA, or 


224.07 


肽和大 蛋白质 (3 000-150 OOODa), 糖 


trans- 3 , 5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) 


蛋白, 膜蛋白 


2,5 - 二羟基 苯甲酸 (gentisic acid , or 2 , 5-dihyclroxy ben- 
zoic acid , DHB) 


154.03 


肽, 蛋 白质, 碳水化 合物, 糖 蛋白, 糖脂, 
聚合物 ,有 机分子 


3 - 经基吡 啶甲酸 ( 3-hydroxypic»linic acid . HPA) 


139.03 


寡 核昔酸 (>3 500Da) 


2,4, 6 - 三经基 苯乙酮 (2, 4, 6- irihydroxyacetophenone , 
THAP) 


168.00 


寡 核昔酸 (<3 500Da) 


2, 6- 二经基 苯乙酮 (2, 6-dihydroxyacetophenone , DHAP) 


152.05 


糖 蛋白, 糖肽, 磯 酸化肽 



2. 基质 的结晶 

在点 样前, 须注意 :配制 饱和基 质溶液 (对于 HCCA,5〜10mg/ml) ,以 吸收足 够的能 
量解 吸附; 基 质与被 分析物 一定要 混勾, 以利于 单分子 解吸。 基质的 结晶状 态可以 用显微 
镜或 摄像头 (仪器 配备) 监控, 各种基 质的结 晶如图 16. 12 〜图 16. 14( 各种 基质的 结晶状 
态因被 分析物 的不同 可能有 所改变 )。 




图 16.12 HCCA 的结晶 图 16.13 SA 的结品 




331 



. (六) 胶内酶 解方法 [87 3 

1. 操 作步骤 

① 用 手术刀 片切 下胶上 目 标条带 (或用 自 制切 点器切 下感兴 趣的点 ) , 置于 EP 管中 
(胶块 切成约 1mm 3 大小 ), 同时切 下空的 胶块作 对照。 

② 加入 200〜40(V1 lOOmmol/L NHiHO^/BOWACN 脱色, 清洗至 透明, 去除 上清, 
冻干 (脱 色液体 积过量 为好, 脱色至 透明, 不必 担心蛋 白质的 损失, 因 为完整 蛋白质 在此条 
件下很 难被洗 脱)。 

(若为 银染) [88] 取 30~50/ua 30mmol/L KsFeCCN)^ : lOOmmol/L NazSzOj - 1 : 1 ( 体积 
比) 加入胶 块内, 洗至 蛋白质 点棕色 消失, 去除 上清, 立刻加 20(^1 水终止 反应, lOmin 后, 
去除 上清, 再加人 10(^1 lOOmmol/L NHtHCCb, 静置 20min ,去除 上清。 

③ (若是 2-D 胶, 则 跳至第 8 步) 每 管加入 90;il lOOmmol/L NH4HCO5, 10/m1 
lOOmmol/L DTT,561C 孵育 30min ,还原 蛋白质 (溶液 体积应 过量, 若 温度为 室温, 反应时 
间相应 延长至 l〜2h)。 

④ 去 上清, 每管加 100/^1 100%ACN,5min 后 吸去。 

⑤ 每 管加人 70/^1 lOOmmol/L NHtHCOs^O/il 200mmol/L lAA (现配 ,避光 保存) ,暗 
处反应 20min。 

⑥ 去上清 ,每 管加入 lOO/Ltl lOOmmol/L NH4HCO3, 室 温反应 15min。 

⑦ 去上清 ,加入 10(^1 100%ACN,5min 后 吸去, 冻干。 

⑧ 冻 干后, 各加入 2.5〜10ng/^tl Trypsin 溶液, 置于 41: 冰箱 30〜60min ,使 胶块 
充 分吸胀 (若 仍有 剩余液 ,吸 出打掉 ) 。 需注意 : 50ng 酶量基 于考染 一块胶 Img 的 上样量 , 
12.5ng 基 于银染 一块胶 10(Vg 的上 样量。 上样 量增加 , 酶量同 比增加 , 酶与被 分析蛋 白 
质质量 比 一般为 1 : 20 〜 1 : 100[89' 。 

⑨ 再加人 20〜30;xl 左右 50mmol/L NH4HCO3 缓冲液 (无 Trypsin),pH 7.8〜8.0 
(Promega)o 缓 冲液体 积视胶 块体积 而定, 一般没 过胶块 20^11左右。 

⑩ 37t: 反应 过夜, 20h 左右。 

® 吸出酶 解液, 转 移至新 EP 管中, 原 管加人 lOOptl 60% ACN/0.1%TFA ,超声 
15rnin ,吸 出溶液 , 并人前 次溶液 ,反 复抽提 3 次, 合并, 冻干。 
© 样品制 备完成 ,可以 复溶, 点样, 进 行质谱 分析。 

2. 注 意事项 

① 若样 品种类 较多, 应将 离心管 编号, 样 品对号 人管。 

② 考 染方案 各注释 均适用 于银染 方案。 

③ 整个 操作过 程应注 意角蛋 白等的 污染。 

④ 释 带一次 性乳胶 手套, 使用洁 净的离 心管及 Millipore H20。 

⑤ ^同公 司的酶 ,最适 pH 范围 不同, 需调节 pH 值。 



332 



(七) 样品 纯化、 浓缩 Zip Tip 方案 

1. Zip Tip 操 作步骤 

① 润湿 Ci8 介质。 

② 平衡 Zip Tip 枪头。 

③ 捆绑肽 段或蛋 白质。 

④ 洗去盐 分和残 留物。 

⑤ 洗 脱被纯 化的肽 段或蛋 白质。 

2. 使用 Zip Tip Ci8 枪头 时要求 的溶液 

润湿液 : 50 96 ACN Milli-Q 级水 配制。 

样品 准备液 :0. 1 % TFA Milli-Q 级水 配制, 样品液 pH<4。 

平衡液 : 0.1% TFAMilli- Q 级水 配制。 

洗杂液 : 0.1% TFA Milli-Q 级水 配制。 

洗脱液 : 0.1 96 TFA/50% ACN。 

3. 不同 介质的 Zip Tip 对不同 分子质 量范围 的肽段 或蛋白 质的捆 绑效率 



I -— I^^^W^MWM ZipTip C|8 
I I ZipTip C4 

― > 分 子质量 /Da 

50 000 100 000 

效 果最佳 
不 太理想 
不推荐 

4. 说明 ' 

有关 ZipTip 使用 的详细 说明, 见网址 www. miUipore.com/zipUp ,一般 前面胶 内酸解 
冻 干的样 品用上 面介绍 的样品 准备液 3/^1 复溶 (若 是多块 胶合并 产物, 适当 增加, 但不易 
过多, 因为 ZipTip 的容 量只有 10^x1; 若冻干 样品不 是胶内 产物, 样品量 较多, 要适当 稀释, 
因^91>有一定的载量,(:18》1.0^18,最大为5.0^18,04>0.5/18,最大为3.3|^8),通过以 
上介绍 的脱盐 方案, 最终 洗脱为 的样 品液进 行质谱 分析。 

因 ZipTip 方案 大部分 是适用 于手工 操作的 实验, 在操作 时应注 意以下 儿点: ①整个 
操作过程润湿体积〉0.6^tl(因填料为0.6^a);②pH值<4;③整个过程绝对不能引入气 
泡 ; ④注 意流速 , 最好速 度均匀 。 

(八) 样 品-基 质的准 备方法 

1 . Dried-Droplet 法 




祥品 -基质 的准备 方法对 MALDI-MS 的 影响非 常大, 在已经 报道的 准备方 法中, 

. 333 . 



Dried-Droplet 法被广 泛应用 (本中 心实验 室也以 此为主 )。 在 这个方 法中, 饱和的 基质溶 
液 与被分 析物溶 液混合 (比例 大约为 5 000:l),0.5;il〜2|La 混合液 被点在 靶体上 (本 中心 
为 BrukerDal tonics Scout 384 ) , 让其 自 然 干燥 。 
下面 是此法 的一个 具体的 例子。 

① 称取 O.OOlgCHCA 基 质装人 洁净的 EP 管中。 

② 在此 EP 管 中加入 200/^1 0.1% TFA/50% ACN 溶液, 混勾, 离心。 

③ 取 1^11饱和基质溶液与 liul 样品液 (参 考浓 度约为 l.Opmol/L) 混合 均勾。 

④ 取 1^11混合液用加样枪点在靶体盘上(注意不要有气泡,枪头也不要接触靶体表 

面)。 

⑤ 在 洁净的 环境中 让其自 然挥发 (在 未结晶 之前不 要晃动 )。 
2. 其他准 备方法 

在 Thin-Layer 法 [9 1 ' 92] 中 , 均一 的基质 层首先 在靶体 上形成 , 然后 样品加 在其上 , 这种 
方法有 很高的 灵敏度 、分辨 率和精 确度。 类似地 ,在 Thick-Layer 方法 [93] 中 ,硝化 纤维被 
用 作基质 辅助物 , 当均一 的硝化 纤维- 基质层 形成后 ,样 品应 用其上 , 这种 准备方 法抑制 了 
碱性加 合物的 形成, 明显提 高了检 测的灵 敏度, 特别是 对胶内 抽提的 蛋白质 和肽。 Sand- 
wich 法 [92] 则是另 一种" 变体" ,按 Thin-Layer 法基质 晶膜形 成后, 再滴加 TFA 、样 品和基 
质。 

上述 的方案 基本都 已经流 程化, 总的 来看, MALDI 质谱对 样品准 备的要 求最高 ,影 
响因素 也最多 ,基质 的选择 、基质 溶液的 组分和 浓度、 基质 溶液的 pH 值以 及样品 基质共 
结晶的 速度等 [94 , 95] 在一 定程度 上影响 MALDI 质谱 分析的 结果, 要 对研究 样品达 到最好 
的分析 效果, 相关 操作人 员不仅 要了解 MALDI 质谱的 原理, 还要对 样品的 准备过 程有深 
人 的理解 并熟练 操作。 操作 人员与 样品提 供者之 间的交 流也是 相当重 要而有 益的。 以下 
信息, 如分子 质量、 等 电点、 样品量 (若 不是冻 干品, 溶剂和 浓度) 和纯度 、样 品的纯 化过程 
和 来源等 都是有 益的。 

(九) 实验 室酶解 标准化 的控制 



为了对 实验过 程进行 有效的 监控, 用 (3~casein(Sigma 公司) 进行 胶内、 溶液内 酵解与 
LCQ( Thermo Finnigan 质 谱仪) 质谱 测试, 结 果如表 16. 11 和表 16. 12。 



表 16 . 11 P-casein 胶 内酷解 LCQ 质谱测 试结果 


品名 时间/ h 


上样量 


匹配 肽段数 (MS/MS) 


査 库结果 


胶 内酶解 18 


4ng/1.3/iil 


3(855.1/1119.2/1849.1) 


p- casein B 






4(729 . 9/723. 9/762. 0/81 1 ■ 9) 


(3- casein A2 Variant 


胶内 BI 解 18 


2/^/1 . 3;il 


4 ( 1 964 . /2 1 68 . 6 /2334 . 4 /2462 . 6 ) 


3-casein precursor 






2(855.1/1119.2) 


P-casein B 






6(729.9/723.9/811.9/854. 1/995.2/2168.6) 


j3- casein A2 V^ant 


胶内 BI 解 18 


500ng/0.5,」 


3(723.9/762.0/811.9) 


P-casein A2- Variant 


胶 内薛解 18 


250ng/0.5/il 


2(762.0/811.9) 


P-casein A2 Variant 



注: 关于 4fig/1.3/J,"/ "之 前代表 SO^PAGE 电泳的 上样总 量," / "之 后代 表胶内 醉 解、 ZipTip 纯化 后质谱 的上样 体积。 
- 334 • 



表 16.12 p^casein 溶 液雜解 LCQ 质 谱测试 结果表 



口 




上 件重/lmol 




:*:fit "^里 

g: 阵 5® 采 


•5^ ^rt tu? 

溶液 SI 解 


12 


50 


3(729.9/723. 9/0II . 9; 


P-casein A2 Variant 


溶 液醉解 


16 


50 


4(729.9/723.9/811.9/2168.6) 


P-casein A2 Variant 


溶 液醉解 


21 


50 


6(611.9/627.8/729.9/723.9/811.9/2168.6) 


(3- casein A2 Variant 








2(1964.0/2168.6) 


(3- casein precursor 


溶 液雜解 


12 


500 


5(729.9/723.9/762.0/811.9/2168.6) 


P-casein A2 Variant 


sfe Aff 

浴液 SI 解 


16 


500 


0(729.9/723. 9/7o2. (J/oll . 9/2043. 4/21oo.o; 


(3-casein A2 Variant 








1(2168.6) 


P-casein precursor 








2(1119.2/1120.4) 


(3-casein B 


溶 液酶解 


21 


500 


7(627.8/729.9/723.9/762.0/811.9/995.2/2168.6) 


p-casein A2 Variant 








2(1964.0/2168.6) 


(3-casein precursor 








1(1119.2) 


(3-casein B 



实 验结果 表明, p-casein 胶内 酶解以 18h、2jLtg 上样量 为好, 结果 6 段肽 MS/MS 匹配 
较好。 (3-casein 溶液 酶解以 21h、500fmol 为好, 且有 7 段肽 MS/MS 匹配 较好。 以 上结果 
经多 次实验 均鉴定 (3- casein (Sigma 公司) 以 ^-casein A2 Variant 为主要 成分。 在实 验过程 
中用标 准品进 行全程 对照, 监 控实验 过程, 以提高 实验结 果的可 靠性。 

(十) 小 结 

质谱前 样品的 制备也 要根据 所用的 仪器和 研究者 的目的 而定, 是 ESI 质 谱还是 
MALDI 质谱, 是鉴 定蛋白 质还是 对蛋白 质的功 能进行 研究。 憐酸 化蛋白 和糖蛋 白的样 
品制备 异于上 述常规 样品制 备方法 ,本 书另有 详述。 

总的 来说, 质谱分 析对蛋 白质的 总体要 求是" 质" 和" 量" 的 概念, 无论是 单个纯 的样品 
还是复 杂的混 合样品 都必须 有品质 的保证 ,尽可 能避免 污染、 提高被 分析物 的纯度 ,减少 
各种非 蛋白质 组分, 例如不 挥发盐 、去污 剂等; 还有绝 对量的 满足, 尽 可能达 到各类 质谱仪 
常 规检测 分析的 下限, 以提高 蛋白质 鉴定的 成功率 和实验 结果分 析的可 靠性。 

(史律 曾峻) 

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• 339 • 



第十 t 章 蛋白质 组研究 中的定 量方泫 

第一节 介 绍 
一、 概 述 

蛋白 质组学 的研究 目的是 以大规 模的尺 度研究 细胞蛋 白质的 功能。 依靠 2-DE 和质 
谱技术 ,蛋白 质组的 研究策 略和方 法在细 胞蛋白 质的鉴 定上已 经比较 成熟。 但是 仅仅进 
行鉴 定并不 能提供 用以阐 明蛋白 质功能 的全部 信息, 监控蛋 白质的 表达水 平对弄 清细胞 
体内存 在的各 种生物 进程是 非常重 要的。 因此, 定量 蛋白质 组学作 为蛋白 质组学 研究的 
重要 组成部 分被提 出来。 通常情 况下, 我们是 对两种 不同状 态细胞 的蛋白 质差异 表达进 
行比较 ,对 蛋白质 的定量 不必是 检测其 在细胞 内表达 的绝对 含量, 而 只需对 相对含 量的变 
化进 行准确 的定量 即可。 但是, 细 胞内各 种蛋白 质的丰 度并不 单单在 转录水 平上被 调控, 
还在翻 译水平 和翻译 后修饰 的水平 被调控 ,这 使得我 们不能 通过对 体内的 mRNA 的丰度 
进行检 测来间 接进行 准确的 蛋白质 定量, 这些 无疑增 加了对 蛋白质 定量的 困难。 

当前, 蛋 白质组 研究中 比较成 熟和可 信的定 量策略 和方法 主要有 两种。 其中 之一是 
传统的 建立在 2-DE 基础 上的染 料染色 方法, 通过比 较蛋白 质在不 同胶上 的染色 强度来 
进 行相对 定量。 对蛋白 质进行 染色已 经不仅 仅是为 了显示 蛋白质 '的 存在, 而且还 提供了 
其表达 水平的 信息。 用这 类方法 准确定 量的关 键是找 到灵敏 度高、 检测动 态线性 范围大 
的 染料。 传统 的考马 斯蓝染 色和银 染已经 不能满 足准确 定量的 需求, 现在 发展了 不少新 
的荧光 染料染 色技术 [ 1 ] 。 例如, 利 用丙基 Cy3 和甲基 Cy5 分 别对两 个来自 不同蛋 白质样 
品进 行荧光 标记, 以此 可在同 一块凝 胶上显 示两个 样品的 差异。 随着最 新开发 出来的 
SYPRO Ruby 等发光 金属螯 合荧光 染料的 应用, 染色 进行差 异定量 表达的 准确性 将越来 
越高。 但是 这类方 法存在 着一些 弊端。 价格不 菲的染 料和显 色设备 的投人 限制了 进一步 
的应用 ;目前 染料染 色的准 确性也 不尽如 人意, 增加 了后续 的操作 步骤, 而 且容易 给后续 
的 质谱检 测带来 干扰。 最关 键的一 点是这 种方法 立足的 2-DE 平台 带来的 弊端。 2-DE 不 
能检测 出具有 极端等 电点的 、分 子质量 太大和 太小的 以及低 丰度的 蛋白质 以及膜 蛋白, 而 
且分离 的效果 不是很 绝对, 许多单 一的蛋 白质点 包含了 一个以 上的蛋 白质, 因此来 定量就 
勉为其 难了。 ' 

在蛋白 质组研 究中, 第二 种定量 策略是 利用质 谱检测 技术。 质 谱仪器 并不能 像荧光 
检测仪 那样, 检测到 的信号 强度对 来自单 一样品 的蛋白 质并不 具有定 量功能 ,因而 不能对 
来 自相同 肽段进 行两次 质谱检 测得到 的信号 强度进 行比较 定量。 但 是如果 我们对 来自不 
同样 品的肽 段标上 一个内 部标准 ( internal standards) , 使 得可以 识别 不同 样品来 源的肽 
段, 同时标 记好的 肽段的 化学性 质基本 上是一 样的, 这 样就可 以确保 同一次 质谱扫 描中两 
者的离 子化效 果是相 同的, 此时肽 质谱峰 信号成 对出现 ,质谱 峰的信 号强度 就可以 作为定 
• 340 • 



量的 依据。 经常用 到的这 个内部 标准就 是稳定 同位素 (如 D、i 3 C 和 i 5 N 等) 标记 的小分 
?, 这 些内标 分子必 须满足 一定的 条件, 例如, 不同样 品来源 的肽段 标记后 化学性 质是相 
同的; 如果与 高效液 相色谱 联用, 标记 后的肽 段的保 留时间 尽可能 相同, 等等。 

二、 化学 标记定 量方法 

以质 谱检测 技术为 基础的 化学标 记定量 方法有 多种, 归纳起 来主要 有两类 ,一 种是体 
内 标记, 另一种 是体外 标记。 . 

(一) 体 内标记 

细胞 在含有 稳定同 位素的 介质中 生长, 稳定同 位素被 结合进 蛋白质 ,从 而充当 了蛋白 
质定量 的内部 标准。 

1. i 5 N 体内代 谢标记 

用富含 i 5 N 的介质 来培养 酵母、 细菌和 哺乳类 等细胞 ,i 5 N 被掺 人合成 的蛋白 质中, 从 
而充 当其定 量的内 部标准 ,这 是一 种普遍 标记的 方法。 Oda 等 人把这 方法用 于了对 
酶表达 和磷酸 化修饰 相对变 化的定 量 [2] 。 Oda 将野生 型酵母 细胞培 养物在 富含轻 氮同位 
素的正 常介质 ("N, 99.6% ,i 5 N,0. 4%) 中生长 ,突变 型酵母 细胞培 养物放 在富含 重氮同 
位 素的相 同介质 (i 5 N>96%) 中 生长。 经 过一个 适当的 生长期 后合并 细胞培 养物, 提取蛋 
白质, 通过高 效液相 色谱和 SDS- PAGE 进行 分离, 胶内酶 切感兴 趣的蛋 白质点 ,然 后进行 
质谱 鉴定和 定量。 每结 合一个 i 5 N ,该 肽将 比正常 "N 结合 的相同 肽大一 个质量 单位, 使 
得不 同细胞 状态来 源的肽 段得到 区分, 肽质 谱峰信 号成对 出现, 从而 根据质 谱峰的 信号强 
度进行 准确的 定量。 但是这 种体内 标记策 略有一 个明显 的缺点 ,就 是由于 相同肽 段的不 
同同位 素标记 形式之 间的质 量变化 依赖于 氮原子 数目, 因此, 对未知 的蛋白 质难以 进行定 
量。 定量的 蛋白质 的序列 事先必 须已知 ,这样 才能知 道稳定 同位素 的结合 增加了 多少质 
量单位 ,才 能在质 谱图上 找到这 样的一 对峰, 所以, 不能在 鉴定蛋 白质之 前进行 定量。 而 
在实际 操作中 ,我们 一般首 先想要 知道的 是定量 结果, 然后才 是对表 达量有 差异的 蛋白质 
进行 鉴定。 因此, 这种体 内稳定 同位素 普遍标 记的方 法并不 能广泛 应用。 

2. 稳定 同位素 标记的 必需氨 基酸体 内标记 (SILAC 法) 

体内标 记定量 蛋白质 表达还 有一种 策略就 是在培 养介质 中加人 稳定同 位素标 记的必 
需氨 基酸, 这主 要用于 高等动 物细胞 中蛋白 质的定 量以及 鉴定。 高 等动物 细胞的 生长中 
需要一 些必需 氨基酸 的摄入 ,如 赖氨酸 (Lys)、 亮氨酸 (Leu) 、苯 丙氨酸 (Phe) 等, 这 些氨基 
酸细胞 自身无 法合成 ,需 要从外 界摄人 补充。 因此, 在 培养细 胞时可 以在培 养介质 中特异 
地加人 用稳定 同位素 标记的 某一种 必需氨 基酸, 在经过 适当的 培养时 间后, 细胞中 合成的 
含有这 类氨基 酸的蛋 白质几 乎都掺 入了标 记的氨 基酸, 收获 不同同 位素标 记的不 同生长 
状态下 的细胞 ,混合 裂解, 再做 质谱, 就 可以从 质谱图 上得到 蛋白质 差异表 达量的 信息。 
Ong 等首先 把这种 蛋白质 定量策 略称为 SILAC(stable isotope labeling by amino acids in 
cell culture ,细胞 培养物 中含有 稳定同 位素的 氨基酸 标记) ,并且 利用这 种策略 通过用 D 

. 341 • 



标记的 Leu 研究 了肌肉 细胞分 化过程 中蛋白 质的差 异表达 [4 ]。 Gu 等也用 D 标记的 Lys 
研究 了人皮 肤成纤 维细胞 在热休 克情况 下蛋白 质表达 的差异 [ 5 ]。 相比较 而言, 用 Lys 来 
标记明 显优于 其他的 必需氣 基酸, 因为 当用胰 蛋白薛 (trypsin) 酶切时 ,保证 了含有 Lys 残 
基的每 个肽段 都只含 有一个 标记物 ,从 而避免 了未知 肽段用 i 5 N 标 记所带 来的质 量变化 
不清 的类似 问题, 而且有 利于蛋 白质做 MS/MS 鉴 定时质 谱图的 解析。 

总的 来说, 体内标 记相对 于体外 标记方 法来说 具有一 定优势 ,它 省去了 标记化 学反应 
和分离 纯化等 步骤, 因而 减少了 样品的 损矢, 有利 于低丰 度蛋白 质的高 灵敏度 检测。 同 
时, 体内标 记也存 在一些 缺点。 首先, 它不 能对组 织来源 的蛋白 质进行 分析。 其次, 培养 
细胞 在富含 稳定同 位素的 介质中 生长, 这些 介质可 能会细 胞的繁 殖和其 他生物 进程, 由此 
改变 蛋白质 的表达 水平。 第三, 这种 方法受 到同位 素材料 成本的 限制, 不可 能对整 个动物 
体进行 标记。 最后, 对于未 知序列 肽段, 大多数 的体内 标记都 无法确 定标记 物与肽 段之间 
量的 关系, 从 而使得 我们难 以确认 同一肽 段在质 谱图上 成对出 现的不 同同位 素标记 形式。 

(二) 体 外 标 记 

近 年来, 定量蛋 白质组 学的发 展主要 集中在 以质谱 检测为 核心的 体外标 记上, 涌现了 
一些新 的蛋白 质定量 方法。 这些方 法消除 了体内 标记定 量带来 的缺憾 ,使 样品来 源不再 
局限于 培养的 细胞, 从而具 有良好 的发展 前景, 虽然由 此增添 了化学 反应和 分离的 步骤导 
致 样品的 损先。 

根据标 记的部 位不同 ,我 们又可 以将体 外标记 分为以 下几种 类型。 
1. 氨基 (一 NH2) 标记 

肽段的 N 端和 Lys 残 基侧链 上是一 NH2 基团, 容 易跟含 有酰氧 基的小 分子如 琥珀酸 
肝、 iV- 乙酰 氧琥珀 酰亚胺 等发玍 銑基化 反应, 从而对 肽段进 行标记 3 例如, Chakraborty 
等人用 正常的 /\^乙酰氧琥珀酰亚胺和稳定同位素标记的 iV- 乙酷氧 -[D3] 琥珀酰 亚胺研 
究了 E. coli 细胞在 ct- 半乳 糖营酶 激活前 后蛋白 质表达 量的定 量变化 [6 3。 

含有 稳定同 位素的 分子特 异标记 N 端不仅 有利于 蛋白质 的定量 ,而且 还充当 了后续 
的质谱 MS/iMS 扫描中 b 系列 离子的 标志, 从而方 便了蛋 白质的 鉴定。 Munchbach 等人 
于 2000 年首次 提出了 N 端稳 定同 位素特 异标记 的方法 [7] (图 17.1)。 他 们先用 2-DE 分 
离得 到不同 条件下 生长的 细胞提 取物的 蛋白质 ,选出 感兴趣 的蛋白 质点后 切下, 
Lys 残基 在弱碱 性条件 下被琥 珀酸肝 酰化, 随后蛋 白质用 Asp/Glu 蛋白酶 酵切。 从状态 1 
得到的 蛋白质 N 端用 H4-Nic-NHS[1-(H4- 烟酰 氧基) 琥珀酰 亚胺] 特异 标记, 来 自状态 2 
的 蛋白质 则用氘 代试剂 C^-Nic-NHS 标记。 MALDI-TOF-MS 分 析单个 肽段的 D4/H4 比 
率进行 蛋白质 的相对 定量。 这套方 法的秉 承了体 内标记 的优点 ,且 能够用 于所有 类型的 
蛋白质 提取物 ,费用 低廉。 虽然 Munchbach 在 应用这 套方法 进行蛋 白质定 量和鉴 定时还 
是 建立在 2- DE 分离蛋 白质的 基础上 ,实 际上它 可以对 1- D 胶条和 2-DE 未 能完全 分离的 
含 多个蛋 白质点 进行 蛋白质 定量, 从而使 我们有 条件去 研究在 i-D£ 上简 单分离 而不能 
在 2-DE 上 运行的 膜蛋白 以及低 丰度蛋 白质。 同时对 N 端 的特异 标记也 简化了 MS/MS 
质谱 图谱的 解释。 

与特 异标记 N 端的一 NH2 基团 相对的 是反应 试剂特 异标记 Lys 残 基上的 e — NH2 基 
. 342 • 



切 下蛋白 质点, 琥珀 St 化, Asp/Glu-C 蛋白 BI 解 




It 解与 MALDI-TOF 分析 相结合 



A1 



B1 A3 
A2 



B2 



质荷比 



通过 MS/MS 分析 蛋白质 B 的肤段 



aa4 aa3 aa2 aal 

通 过相差 4 个质 ^ 
量 单位的 b 系列 g 

离子測 定序列 M I 1 1 II 1 1 1 1 I 

质荷比 

图 17.1 N 端 稳定同 位素特 异标记 的方法 

团。 0- 甲 基异脲 (O-methyHsourea) 可以选 择性地 胍基化 Lys 残 基上的 £ 一 NH2。 Cagney 

等首先 采用了 这种标 记方式 [8] 。 但是 与以往 稳定同 位素标 记不同 的是, 他 们采用 的是一 
种称 之为" 质量标 记的丰 度标签 "(mass-coded abundance tagging, MCAT) 的标 记策略 (如 
图 17.2 所示 )。 他 们的报 道打破 了以前 认为不 能只对 一份样 品进行 化学修 饰标记 来定量 
的 成见, 认为这 样来做 相对定 量是可 能和准 确的。 但是 由于只 对其中 一份样 品进行 标记, 
来自不 同样品 的相同 肽段在 质谱中 的离子 化效率 不一定 相同, 因此, 还需要 进一步 摸索才 
能够判 断这样 的标记 定量方 法是否 可靠和 准确。 

N 端标 记或者 说对一 NH2 的标记 像体内 代谢标 记一样 ,也 属于一 种普遍 标记的 
模式。 由于通 量大的 原因, 这种 模式经 常要借 助于其 他的蛋 白质分 离和显 色技术 来对感 
兴趣 的蛋白 质进行 分析。 如果 用这种 普遍标 记的方 法来大 规模的 鉴定和 定量蛋 白质, 则 
劳动 强度非 常大。 例如, 酵母和 E. coli 是进行 蛋白质 组研究 的模式 生物, 按照一 个基因 
对应 一个蛋 白质的 理论, 酵母 细胞有 6 200 多个蛋 白质, 经过 trypsin 酶切后 将产生 
132 768 个肽段 ,平均 每个蛋 白质有 53 个肽段 [9] 。 但理论 上说, 每个 蛋白质 只要有 一条肽 
段就 可以对 其进行 鉴定和 定量。 因此, 要大规 模对细 胞的整 个蛋白 质表达 量的差 异做一 
个全面 的分析 ,势必 要在尽 量不放 过每个 蛋白质 的基础 上减少 质谱分 析的工 作量。 Wang 
等 人通过 联用针 对特殊 氨基酸 组氨酸 (His) 和半 胱氨酸 (Cys) 残基 的亲和 色谱分 离技术 

. 343 • 



通过 H4/D4 峄高 
比率相 对定量 



Sim 



A 肽 段測序 

Trypsin 

■ » 切 / 



无修饰 



B 蛋白 质定量 



0- 甲基异 脲标记 Lys 
HN,— C=NH 



混 合并去 a 



LC 



WDLVEHVAK 



ESI 



MS/MS 



氨基酸 序列从 头測序 



无修饰 



Trypsin 

II 切 0- 甲基异 HR 标记 Lys 



混合 并去盐 



LC 



ESI 



MS/MS 



定量 

图 17.2 MCAT 蛋 白质鉴 定和定 量策略 
和一 NH2 标 记技术 分析了 E.CO" 中表 达的蛋 白质, 大大降 低了分 析强度 [9] 。 

2. 羧基 (一 COOH) 标记 • 

肽段的 C 端和所 含的天 冬氨酸 (Asp) 和 谷氨酸 (Glu) 残 基侧链 上的一 COOH 羧基也 
可 以进行 标记。 这种标 记方法 主要通 过两条 路线来 完成。 一 条路线 主要是 通过对 这些羧 
基酯 化进行 标记。 Goodlett 等人已 报道用 H 和 D 标记 的甲 醇酯化 标记来 定量研 究蛋白 
质 表达量 的差异 不过 这条路 线有两 个主要 缺点: 其一 是特异 性不是 很好, 在 C 端和 
Asp 和 Glu 残基 上都有 标记, 且效率 不均。 其二是 采用的 标记条 件容易 引起天 冬酰胺 
(Asn) 和谷 氨酰胺 (Gin) 的去 酰胺。 另一 条路线 就是在 H2OI 8 的溶 液中进 行蛋白 酶切, 从 
而 特异性 地只在 C 端弓 I 人稳定 的同位 素标记 。 这种标 记像特 异标记 N 端一样 , 其优 
点是 方便了 MS/MS 扫描测 序时对 y 系列 离子的 识别。 

3. 巯基 (一 SH) 标记 —— ICAT 策略 

在蛋 白质含 有的氨 基酸残 基中, 没有 哪一个 能比半 胱氨酸 (Cys) 残基 上的一 SH 基团 
更具有 标记反 应的特 异性。 院基 化试剂 (如 碘乙 酸等) 能专 一地对 Cys 的 琉基进 行焼基 
化。 如果将 稳定同 位素引 人这些 焼基化 试剂, 那么就 可以通 过比较 质谱图 谱上成 对出现 
的质 谱峰信 号的强 度进行 相对定 量了。 由于 Cys 是一种 特殊的 氨基酸 ,在 蛋白质 酶切产 
生的 多肽片 段不一 定含有 Cys 残基, 因此, 这种 标记方 法并不 是像以 上所述 的各种 方法那 
样 属于一 种普遍 标记的 模式。 如果能 将这些 烷基化 标记的 肽段分 离出来 进行鉴 定和定 
量, 无疑将 大大减 少工作 强度。 据 统计, 和酵 母细胞 中含有 Cys 残 基的蛋 白质分 
别占到 蛋白质 总量的 85. 7% 和 91 . 60/6 , 而在 trypsin 酶切产 生的肽 段中, 含有 Cys 残基的 
多肽 分离仅 占 9 . 4 % 和 9 . 3 96 [9] ,因 此, 这 种标记 定量方 法与上 述标记 方法相 比 , 既 能监察 
到足够 多的蛋 白 质 , 又大大 减少了 工作量 , 更适宜 大规模 操作。 

基于这 种定量 战略, Gygi 等于 1999 年提出 了称为 "同位 素标记 的亲和 标签" (isotope- 
coded affinity tag, ICAT) 定量策 略 [ 1 2] 。 
(1) ICAT 原 理和应 用步骤 

ICAT 方 法建立 在一种 新型的 化学反 应试剂 —— ICAT 试 剂的基 础上, ICAT 试剂结 
- 344 ■ 



构如图 17.3 所示 < 



HN NH 



ICAT 试剂: 




重 试剂: d8-ICAT(X=D ,気) 
轻 试剂: dO-ICAT(X=D ,氘) 



接头 




琉基反 应基团 



图 17.3 ICAT 试剂 的结构 

ICAT 试剂 包括三 部分。 ①反应 基团, 可特异 地与蛋 白质侧 链上的 Cys 残基 的巯基 
(一 SH) 进行 反应, 使试剂 共价结 合在蛋 白质侧 链上。 ②同位 素标记 的接头 ,含有 稳定同 
位素 (H 和 D) 的 标记。 ③亲和 标记的 生物素 ,用于 分离标 记的蛋 白质或 多肽。 

当 ICAT 试剂中 8 个 X 位置被 H 取代时 ,称为 轻试剂 (Db ) ,当 8 个 X 位置被 D 取代 
时, 称为 重试剂 (08)。 因此重 试剂比 轻试剂 的相对 分子质 量要大 8Da ,而且 两种试 剂的化 
学性质 相同, 当分别 用两种 试剂去 标记不 同状态 下的同 一种蛋 白质时 ,不同 标记的 蛋白质 
之 间的分 子质量 就相差 8Da ,体 现在质 谱图上 就是这 对标记 蛋白质 的肽段 离子蜂 质荷比 
(m/2) 相差为 8 或 4( 当为双 电荷肽 段离子 时), 从而 能将来 自不同 样品的 同一种 蛋白质 
分 离开。 - 

ICAT 标 记方法 的步骤 如下, 参见图 17.4。 

(D 将 来自一 种状态 下的细 胞的蛋 白质混 合物还 原后用 Db 试剂 标记蛋 白质侧 链上的 
Cys 残基; 将 来自另 一种状 态下的 同种细 胞的蛋 白质混 合物还 原后用 Dg 试剂 标记。 

② 两 种样品 混合在 一起, 用 trypsin 藤切, 产生多 肽片段 ,包括 标记的 和没标 记的。 

③ 样品经 SCX-HPLC 两维色 谱分离 ,除去 消化酶 、去 坂剂、 还 原剂和 ICAT 试剂。 

④ 混 合物过 抗生物 素亲和 色谱柱 分离, 得到 只含有 同位素 标记的 多肽混 合物。 

⑤ 将分离 得到的 标记多 肽混合 物再用 RP-;ilC-MS 分离和 鉴定。 



用 dOICAT 试 剂标记 



状态 1 

0^ 



状态 2 



用 dSICAT 试 剂标记 



I 混合、 Trypsin, 



+丄+ dO 离 子强度 ^ 
表达率 =d8 离 子强度 I 



|scx 和 hVlc^^^ 



I ICAT 标记的 肚段亲 和纯化 I 




质荷比 
定量 



质荷比 
鉴定 



图 17.4 ICAT 方法操 作步骤 



345 



(2) ICAT 策略 的优点 和应用 

应用 ICAT 策略对 蛋白质 进行鉴 定和定 量有着 许多的 优点, 除了 能准确 进行定 量外, 
还具 有以下 特征。 

① 若一种 蛋白质 酶切产 生至少 有一个 Cys 残基 的肽段 的话, 就可 以对其 鉴别和 定量。 
含有 Cys 残基 的肽段 越多, 结 果对照 得出的 结论越 准确。 

② 鉴定的 肽段中 肯定都 含有至 少一个 Cys, 因此, 在进行 数据库 搜索时 就增加 了一个 
有效 的约束 条件。 

③ 肽段根 据标记 情况有 选择性 地得到 了 富集 , 从 而减少 了下游 质谱分 析的复 杂程度 。 
例如, Gygi 等用 ICAT 处理 酵母蛋 白混合 物时, 从 344 855 个 肽段中 富集了 30 619 个标记 
肽段, 大大 减少了 后期的 工作量 〔1 2] 。 

④ 分 离出来 的标记 多肽可 直接与 后面的 RP-;ilC-MS 分析 系统在 线耦联 操作。 

基 于此, ICAT 策略现 已在蛋 白质组 研究领 域得到 了广泛 应用。 Gygi 等用 ICAT 分 
析方 法首先 比较了 酵母细 胞在不 同碳源 生长条 件下蛋 白质表 达水平 的差异 [ 1 2] ,进 而又分 
析了 碳源的 改变对 细胞内 mRNA 和蛋 白质表 达水平 的影响 [ 1 3] 。 Han^ 4 ] 等用 ICAT 策略 
分 析了用 PMA 处理 细胞后 微粒体 蛋白质 的表达 变化。 ^61^61 [ 1 5] 等 综合了 基因组 和蛋白 
质组 分析的 概念, 描 述了一 套运用 cDNA 微 阵列和 ICAT 策略 这些整 体研究 手段来 建立、 
检验、 改进一 种细胞 生理状 态模型 的策略 ,深化 了人们 对酵母 细胞改 变碳源 后基因 表达的 
认识。 

(3) ICAT 策略 的缺陷 及改进 

ICAT 策略 并非是 十全十 美的, 它本身 也有一 些缺点 ,仍 处在不 断的发 展完善 当中。 
酵母细 胞内有 lOo/o 左右的 蛋白质 上没有 Cys 残基, 得不 到鉴定 [6 ' 9] '。 ICAT 标记的 分子质 
量是 400Da 左右, 对于 较小肽 段的修 饰可能 会影响 数据库 搜索。 Zhou 等采 用了固 相氨基 
酸同 位素标 记试剂 来代替 ICAT 试剂, 降低 了标记 的分子 质量, 提高了 灵敏度 [ 1 6] 。 以 
ICAT 方法 为代表 的稳定 同位素 标记定 量策略 的缺点 是耗时 太长和 数据存 储消耗 在量没 
有改变 的蛋白 质上, 这些蛋 白质可 能与研 究的问 题没有 太大的 关联, 新的解 决方案 是把鉴 
定和定 量分开 ,串 联两套 RP-/JC-MS 分析 系统, 第一次 分析时 进行相 对定量 分析, 只有量 
有变 化的肽 段才被 有选择 地送到 下游, 进行二 次鉴定 ;最近 又采用 新的质 谱系统 MALDI- 
QTOF 来解决 这个问 题 [ 1 7] 。 

Goshe 等 改进了 ICAT 试剂, 发展了 一种" 磯酸 多肽同 位素亲 和标记 标签" (PhlAT) 技 
术 [ 1 8 ]。 PhlAT 试剂 可以标 记蛋白 质上碟 酸化的 丝氨酸 (Ser) 和 苏氨酸 (Thr) 残基, 用来进 
行蛋白 质磯酸 化程度 的定量 检测, 从而 为定量 研究蛋 白质的 翻译后 修饰提 供了新 的思路 
和 途径。 V. 

第二节 材 料 

一、 试剂 和溶剂 

胰 蛋白醇 (typsin) 为 Roche 公司 的序列 级产品 (Sequencing Grade), 乙腈为 Fisher 公 
. 346 . 



司色谱 级产品 (Fisher Scientific), HCCA 为 Sigma 公 司产品 , 其余试 剂均为 Sigma 公司产 
品。 ICAT 试剂盒 为应用 生物系 统公司 的产品 (AppUed Biosystems)o 

细胞 裂解液 (6mol/L 尿素, 1% SDS, lOOmmol/L DTT, 50mmol/L Tris, 5mmol/L 
EDTA, Immol/L PMSF) ,溶液 A (6mol/L 尿素, 0.059^ SDS, 50mmol/L Tris, 5mmol/L 
EDTA), 蛋白质 沉淀液 [丙酮 : 乙醇: 乙酸 = 50:50:0. 1( 体积比 )]。 

二、 多肽、 蛋白质 和细胞 

标准 肽层粘 连蛋白 (laminin) 为 ICAT 试剂盒 中自带 ,标准 蛋白质 a-lactoglokilin 为 
Sigma 公司 产品。 其余 试剂为 国产分 析纯。 钩 端螺旋 体菌由 上海第 二医科 大学郭 晓奎教 
授 提供。 

三、 仪 器 

电喷 雾质谱 (ESI-MS) 为 Thermo Finnigan 公司的 LCQ 离子 阱质谱 系统, 基 质辅助 
激光 解析离 子化- 飞行时 间质谱 (MALDI-TOF- MS) 为 Bruker 公司的 REFLEX DI 系统。 

第三节 方 法 

1 . 标 准肽段 Laminin 的 ICAT 标记 

将 100/^g 标准肽 Laminm 溶于 lOOpti 溶液 A 中, 均等 地分为 两份, 分别加 2|^d Reduc- 
ing Buffer ,沸 水浴 lOmin ,自然 冷却。 分别 将两管 中的溶 液移人 各一个 单位的 Db 和 Dg 试 
剂中, 避光, 室 温反应 lh。 各取 混合, 进行 MALDI- TOF-MS 分析。 

2. 标准蛋 白质的 同位素 标记. 酶解 和特异 性肽段 的纯化 

称取 Img 标准蛋 白质, 溶于 100^1 纯 水中。 吸取 分装于 2 个 Eppendorf 管内 
(control and test) ,各加 90/m1 变性 缓冲液 (denaturing buffer) 和 2|Ltl 还原 缓冲液 (reducing 
buffer) 于这两 管内, 置 于沸水 中水浴 lOmin ,自然 冷却, 低速 离心。 分别将 两管中 的溶液 
移入 各一个 单位的 Db 和 Dg 试剂中 ,避光 ,室 温反应 Ih ,低速 离心。 另 取两个 Eppendorf 
管, 在 其中一 个加入 5(V1 Db 标记 样品和 5(V1 Dg 标记 样品; 在 另一个 管内. 加人 25|ul Db 标 
记 样品和 5(V1D8 标记 样品。 (使之 质量比 分别为 1:1 和 1:2) 用 20(^1 纯水 溶解一 份胰蛋 
白酶 (25/ig) ,在两 种质量 比的样 品中各 加一半 的胰蛋 白醇, 371C 反应, 12〜16h。 组装阳 
离子 交换柱 柱架. 完毕后 ,注射 2ml 阳离 子交换 上样缓 冲液。 将酶 解后的 溶液移 人两个 
5ml 的 Eppendorf 管内, 加人 2ml 阳 离子交 换上样 缓冲液 稀释。 以每 秒一滴 的速度 将稀释 
后的样 品注射 到阳离 子交换 柱中, 收集流 穿液。 注射 iml 阳离 子交换 上样缓 冲液, 清洗 
阳 离子交 换柱。 以 每秒一 滴的速 度注射 500/^1 阳离 子交换 洗脱缓 冲液, 收集 洗脱的 肽段。 
注射 1ml 阳离 子交换 清洗缓 冲液, 洗 去胰蛋 白酶。 (另 一份不 同质量 比的样 品重复 土述离 
子交换 柱层析 过程) 注射 2ml 阳离 子交换 上样缓 冲液, 4t: 保存 过夜, 注射 2ml 阳 离子交 

. 347 . 



换 r: 存液, 4t: 保存 Id 以上 方可再 使用。 

组装 Avidin 亲和柱 ,注射 1ml 亲和 洗脱缓 冲液, 再注射 2ml 亲和 上样缓 冲液。 在阳 
离子交 换柱的 洗脱肽 段样品 中加人 500/^1 亲和 上样缓 冲液。 准备 3 个 5ml 的 Eppendorf 
管, 分别 编号为 a 管、 b 管、 C 管。 以每 秒一滴 的速度 注射中 和后的 样品, 在 a 管中 收集流 
穿物, 注射 50(^1 亲和 上样缓 冲液, 继续在 a 管中 收集流 穿物。 注射 1ml 亲 和清洗 缓冲液 
1, 注射 1ml 亲 和清洗 缓冲液 2, 在 b 管中 收集前 500|ul。 以 每秒一 滴的速 度注射 80(V1 亲 
和 洗脱缓 冲液, 弃去前 50^a ,在 C 管 中收集 余下的 溶液。 注射 1ml 亲和 洗脱缓 冲液。 (另 
一 份不同 质量比 的样品 重复上 述亲和 柱层析 过程) 注射 2ml 亲和 上样缓 冲液, 中 和亲和 
柱。 注射 2ml 亲和 上样缓 冲液, 4t: 保存过 夜后, 注射 2ml 亲和 贮存缓 冲液, 保存 Id 以上 
方可再 使用。 实验中 C 管中 的溶 液用于 下一步 的质谱 分析。 

3. 细胞抽 提总蛋 白质的 ICAT 标记 和酶解 

取钩 端螺旋 体菌体 加入细 胞裂解 液超声 裂解, 410 、15 OOOr/min 离心 lh。 取上清 ,蛋 
白质 定量, 采用 Bradford 法。 

按 5:1( 蛋白质 沉淀液 :细胞 裂解液 = 5:1, 体 积比) 的比 例向定 量后的 细胞裂 解液中 
加人预 冷的沉 淀液, 置于 - 20t:。 半 小时后 取出, 4t:、15 OOOr/min 离心 lh。 去上清 ,加 
入 70% 乙醇 (体积 与第一 步加人 的沉淀 液相等 ), 洗漆 蛋白质 多次。 41C、15 OOOr/min 离 
心 30min ,去除 上清, 将沉淀 冻干。 

使用适 当体积 的溶液 A 溶解 冻干的 蛋白质 ,浓 度至约 lOg /L ,按 所得 蛋白质 浓度, 
蛋白质 分装成 10(Vg —份, - 80t: 保存。 

各取对 照组和 实验组 lOO/xg 蛋白质 ,加人 Denaturing Buffer 至总 体积为 100/^1。 各加 
人 2^x1 Reducing Reagent 。 沸水浴 lOmin ,自然 冷却。 低速 离心。 将 对照组 样品移 入一个 
单位的 Db 试 剂中, 混勾。 将 实验组 样品移 人一个 单位的 试 剂中, 混勾。 避光, 室 温反应 
2 小时。 各加 Iptl Imol/LDTT ,终止 反应, 室温 15min。 低速 离心。 另外在 1 个 Eppen- 
dorf 管 内加人 95^ 标记后 的对照 组蛋白 质和实 验组蛋 白质, 混勾。 取一份 Trypsin 
(25^tg)Jn20(Vl Millipore水溶解加入蛋白质混合物中,37t:(12〜16h)。 酶解后 产物进 
行质谱 分析。 

4. MALDI-TOF-MS 分析 

使用 布鲁克 公司的 REFLEX in MALDI-TOF 质 谱进行 分析。 用 50% 乙腈, 0. 1 0/6 
TFA 溶解 HCCA ,配成 饱和溶 液溶液 ,取 l/il 与 1^1 待 分析的 ICAT 标 记肽段 混合, 混勾后 
取其中 Ifxl 点在加 样板上 , 自 然挥干 , 然 后进行 MS 分析 。 

5. ES1-MS 分析 

一维色 谱质谱 联用在 Finnigan 公司的 LCQ DECA XP 系统上 进行。 其 中反相 
HPLC 使用 Ci8 柱 (150mm length, 0. 18mm I. D. ) 其 洗脱梯 度为: A 液为 纯水, 含有 
0.1%甲酸;8液为乙腈,含有 0.1 96 甲酸。 0〜20min,B 液 296 ,20〜30min,B 液线 性升 
至30%,30〜80111^1,8液线性升至 98%,80〜81min,B 液降至 2%。 泵 流速为 150 
^11/01111,分流后为 2〜3^a/min。 质谱条 件为: 喷 雾电压 3. 5kV ,毛细 管温度 150t:。 
. 348 . 



MS/MS 能量为 35 0/6 。 

二 维色谱 -质谱 联用在 Finnigan 公司 ProteomeX 系统。 第一 相采用 阳离子 交换柱 
(150mm length, 0.32mm I. D. ) ,第 二相采 用反相 Cis 柱 (150mm length, 0. 18mm I.D. )。 
第 一相洗 脱液为 NHjCl, 浓度 梯度为 :0,25mmol/L,50mmol/L,75mmol/L,100mmol/L, 
150mmol/L,200mmol/L,400mmol/L,800mmol/L。 反 相色谱 A 液为 纯水, 含有 0. 1 o/o 甲 
酸; B 液为 乙腈, 含有 0.1% 甲酸。 洗脱梯度为:0〜20111111,8液2%,20〜80111111,8液线性 
升至98%,80〜81111111,8液降至2%。 质谱条 件为: 喷 雾电压 3. 5kV ,毛细 管温度 15010。 
MS/MS 能量为 35%。 

第四节 结果 和讨论 
1 . ICAT 标 记标准 肽段的 MALDI-TOF-MS 结果 

先使用 合成肽 Laminin 测试方 法的可 靠性, 肽 序列为 CDPGYIGSR ,理 论分子 质量为 
967. 07Da ,含有 1 个半胱 氨酸, 标记 上轻链 和重链 ICAT 试剂后 分子质 量应分 别增加 
442.2Da 和 450.2Da。 Db 和 Dg 分 别标记 Laminin 后, 将产物 1 : 1 混合, 用 MALDI-TOF- 
MS 分析。 图 谱见图 17.5。 结果 显示, 重链标 记和轻 链标记 的肽在 质谱中 的信号 强度接 
近 1:1。 说 明标记 和质谱 检测定 量效果 都十分 理想。 



图 17.5 Eb 和 Dfe 试剂分 别标记 Laminin 的 质谱图 
2. ICAT 标记 标准蛋 白质的 ESI-MS 结果 



由于 简单的 合成肽 无复杂 的空间 结构, 标记效 率高。 标记后 也无未 标记肽 干扰, 无须 
纯化。 但对于 蛋白质 ,情况 会复杂 一些。 因此, 我 们进一 步选择 了标准 蛋白质 (3- lac- 
toglobin 进行 分析, 该蛋 白质的 理论氨 基酸序 列是: 




FNPTQLEEQCHI (自 NCBI,GI: 1070647)。 经过 Trypsin 的 SI 解, 理论肽 段如表 17.1 所 
示。 将两 份样品 分别用 Db 试剂和 Ds 试剂标 记后, 按 1:2 比例 混合, 进 行电喷 雾质谱 分析。 



1417.35- 

一 409.25, 



349 



表 17.1 p^lactoglobulin 的 理论酶 解肽段 



分子 质量/ Da 


氣基 酸位置 


肱序列 


2707.3759 


31-56 


VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR 


2647.2023 


118-140 


YLLF€MENSAEPEQSLACQC LVR 


2313.2587 


57-76 


VYVEELKPTPEGDLEILLQK 


2275.2586 


3-24 


CLLLALALTCGAQALIVTQT MK 


1658.7843 


165-178 


LSFNPTQLEEQCHI 


1245.5845 


141-151 


TPEVDDEALEK 


1065.5826 


108-116 


VLVLDTDYK 


1064.4465 


77 — 85 


WENGECAQK 


916.4734 


100-107 


IDALNENK 


837.4763 


158-164 


ALPMHIR 


674.4235 


94-99 


IPAVFK 


673.3879 


25-30 


GLDIQK 


573.3606 


87-91 ' 


1IAEK 



质谱总 离子流 图见图 17. 6, 在对 LCQ 图谱 进行分 析后, 发现 保留时 间约为 46min 时 
出现 一对信 号峰, 质荷比 分别为 1 051. 3 和 1 055. 3( 图 17.7)c 图 17.8 显 示的是 1 051.3 
峰的 Zoomscan 图谱, 在图中 明显可 以看到 Do 和 Dg 标记 肽段 的质荷 比最小 相差是 0.5, 就 
是说两 个肽段 都是双 电荷, 肽的 实验分 子质量 应该是 2 100.6Da 和 2 108.6Da。 与 165〜 
178 位 的肽段 LSFNPTQLEEQCHK 理论分 子质量 1 658.78Da) 被 ICAT 试 剂标记 后的分 
子质量 (理 论分 子质量 2 100.98Da 和 2 108.98Da) 相符。 精 度令人 满意。 




5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 

r/min 



图 17.6 ICAT 试剂标 记后的 p^lactoglobulin 胰 蛋白酶 酶解肽 质谱离 子流图 



TTTT3T 



一 III |一 11111 = 11 1 : 1 一 一 :: 一 11 : 1 : 1 11-111 I m - 一 11111 : 11 一墨 -III 111-11 m 

/76655443322 I 1 



350 



1055. 



1051.3 — 



900.2 



1070.7 



'0^'-^1120.ril33.l 1174.1 1195.6 1250.2 1266.8 



800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 

miz 

图 17 . 7 p-lactoglobulin 中被 ICAT 试剂 标记肽 LSFNPTQLEEQCHI 的 质谱图 
图中 两个峰 分别为 Db 标 记肽和 Ds 标记肤 



1056.4 



1052.4 



1051.9 



1051.9 



1051.1 I 



1052.9 



1055.9 



1053. 




1056.8 



1057.3 



.1058.3 

1059.8 
1 1058.81059.3 1 



1051 



1052 



1053 



1059 



1060 



图 17.8 Db 和 Dfe 试剂 标记肽 LSFNPTQLEEQCHI 的 ZoomScan 显示该 肽段在 质谱中 为双电 荷形式 

从图 17.7 中可 看到, Db 标记的 p-lactoglobulin 和 标记的 13-lactoglobulin 质 量比为 
1:2 的图谱 ,实 验数据 得到的 比例是 1:1. 8, 这 说明了 ICAT 方法定 量的可 靠性。 

• 351 . 



I m - 一 l-lll m l 

^50505050505050505 

W99887766554433221 



一 …-一… 二-… 一 im 一… -1=1 二 im 一一 ml- …一 一… llll-l-mlm 二一: 一一 :|一| …二… |一一|一 

505050505050 5 5 5 

0998877665544 33221 1 



400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 

miz 

图 17 . 9 Di^ 试剂 标记肽 LSFNPTQLEEQCHI 的 MS/MS 图谱 

3. 细胞抽 提总蛋 白质的 ICAT 标记 后的多 维色谱 质谱联 用分析 

由于 多维色 谱强大 的分离 能力, 所以 ICAT 方法在 蛋白质 组研究 中的应 用时, 没有对 
标记后 的肽段 进行亲 和色谱 纯化, 而是直 接进行 分析。 在对 钩端螺 旋体进 行蛋白 质组研 
究中, 使用 ICAT 方法对 不同菌 株的蛋 白质表 达进行 分析。 分析的 两种菌 体分别 为有毒 
株 (V) 和 无毒株 (NV), 其中有 毒株用 Dt) 试剂 标记, 无 毒株用 Ds 试剂 标记。 

图 17 . 10 所 示为分 析的一 种未知 功能蛋 白质 在有毒 株和无 毒株之 间的表 达差异 , 图 
谱为同 一段肽 (LCTHSESVLK) 的两 个标记 形式, 因为 离子带 有两个 电荷, 所以质 荷比相 
差 4。 图 17. 11 所示 为这一 段肽的 Db 标记 形式的 MS/MS 图谱, 图 中显示 碎片峰 中大多 

数 都和该 肽段的 b 离子和 y 离子 一致, 并可以 清楚地 显示出 Cb 标记的 特征峰 m/z 284.1, 
充分 证明鉴 定的准 确性, 且为 ICAT 试 剂标记 的肽。 图 17.8 中的两 种标记 肽段的 离子强 
度 比值为 1 :0. 46, 说明 该蛋白 质在有 毒株中 的表达 高于无 毒株约 2 倍。 这 是一个 未知蛋 
白质, 在 有毒株 中的高 表达意 味着该 蛋白质 可能与 钩端螺 旋体的 致病性 或毒力 有关。 

图 17. 12 所示 为电子 转移黄 素蛋白 a 亚基 (electron transfer flavoprotein alpha-sub- 
• 352 . 



但要对 这一肽 段进行 确认, 还应 该进行 MS/MS 的碎片 分析。 图 17.9 显 示的是 Dg 标 
记的相 对分子 质量为 2 108.6 的 肽段的 MS/MS 碎 片图。 肽 键断裂 后形成 两个系 列的碎 
片, 分别 被称为 b 系列和 y 系列 。 图中标 出了匹 配的碎 片质量 , 丰度 较高的 碎片基 本上都 
被 匹配。 因此, 可以认 为这一 肽段就 是图中 所标的 序列, 也 就是表 17.1 中 所示的 相对分 
子 质量为 1 658.7843 的肽段 LSFNPTQLEEQCHI 在 Dg 试剂 标记后 得到的 产物。 另一 
Db 标记的 肽段的 情况大 致相似 (结果 未显示 )。 



1208 



y6 



y3 

824, 



822.3 



b7 



、70.C 



B: b3 



409^ 
326 8 



b4 



462.6 



410.9 



753. 



555.8 631.9 
613.0 




y7 



1321.9 



1209.4 
132』 

1270.4 



ylO 
1647.7 



^8.7 



bii y9 

/ 550.9 



1432; 
1323.6 



y8 



1431.7 



1— Ws 

1493.5 



y 11(1762.7) 



1822.8 



17$9.6 
1698 



'J.43. 0,96 1.2 



|-- 二 一一- : | 三 - 二 三 一 … -1 三二 …二三 二三二 三二三 -I 一 三 一- 三 |--- 二 一 - 三三 三 一一 一 

U50 5 05050505050 5 050 



110- 
105i 

looi 

951 
9(H 
851 
80 i 
75 i 

65 1 
60 i 
551 
50 i 
45: 
40; 
35 = 
30 i 
25 = 
20: 
15| 
lOi 



780.8 



[LC(Do)THSESVLK+ 2H】2+ 



[LC(D8)THSESVLK+ 2Hf' 
\ 784.4 



^ 



781 



782 



783 



784 



785 



786 



787 



ml: 



图 17 . 10 Db 和 试剂 标记肽 LCTHSESVLK 的 质谱图 




200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 



图 17 . 1 1 Db 试剂 标记肽 LCTHSESVLK 的 MS/MS 图谱 

unit) 在 两个菌 种之间 的表达 差异, 该肽段 中有两 个半胱 氨酸, 离子带 有三个 电荷, 所以质 
荷 比相差 5。 两 者的离 子强度 比值为 1:0.47。 这个差 异与双 向凝胶 电泳所 分析的 结果一 
致 (结果 未显示 )。 图 17.13 和图 17.14 为该肽 段的两 种标记 形式的 MS/MS 图谱, 图中 
显示碎 片峰中 大多数 都和该 肽段的 b 离子和 y 离子 一致, 充分 说明鉴 定的准 确性。 该肽 

. 353 . 



段的 序列为 TVSPNCYIACGISGAIQHLAGMGSSK。 该蛋白 质在有 毒株中 的表达 高于无 
毒株。 目前, 关 于电子 转移黄 素蛋白 a 亚基 与钩端 螺旋体 的致病 性或毒 力相关 还未见 

报 道,, 

ICAT 方法是 近几年 来发展 的蛋白 质组定 量方法 , 实 验证明 在蛋白 质组研 究中有 良 
好的应 用前景 , 其分析 速度快 , 所耗 样品少 , 完全 脱离了 凝胶分 离过程 , 与质 谱技术 兼容性 
好 , 大 大促进 了蛋白 质组研 究大规 模定量 的应用 。 



lOOq 
954 
90-1 
854 
80^ 
754 
70 1 
65 i 
60 1 
554 
50 1 
45 1 
40] 
35-j 
30《 
251 
20 j 
15j 
10^ 



1151.3 



0^ 



^ 1128.8 



1139.9 7 
1135.2 -1 1142.7 

' ,'1 I ' l'l U I I, 



1149.3 



[TVSPNC(Do)YIACGISGAIQHLAGMGSSKN +3H]' 



[TVSPNCCDg )YIACGISGAIQHLAGMGSSKN +2Uf* 



■1152.3 f 
1156.8 



1153.. 



1 1_57; 
'狐 9 



1163.4 1169.2 



1173.4 
I l.i I 



1180.8 
1170 



1130 1135 1140 



1145 1150 1155 
m/z 



t 

1160 1165 1170 1175 1180 



图 17 . 12 Db 和 Ds 试剂 标记肽 TVSPNCYIACGISGAIQHLAGMGSSK 的 质谱图 
肽 段有两 个半胱 氨酸, 在质 谱中带 3 个电荷 

对定 量技术 而言, 准确性 是最重 要的。 影响 准确性 的因素 很多, 实现样 品制备 和总蛋 
白 质定量 的精确 是基本 保证。 另外还 要尽量 保持样 品在还 原和标 记过程 中条件 的一致 

性, 减 少实验 误差。 另外, 目前 使用的 ICAT 方法 本身也 有一些 弱点, 需在 结果分 析时注 
意。 本文 介绍的 是用复 (Db) 和氘 (Dg) 标记的 ICAT 试剂。 标 记上这 种试剂 的肽段 在色谱 
行为上 有一定 的区别 ,出 峰时间 有细微 差异, 通常 Ds 标记的 肽会比 Db 标记 的肽较 早被洗 
脱, 因此, 在液相 色谱质 谱联用 使给质 谱检测 和定量 带来了 一定的 困难。 一般 ICAT 定量 
的 误差在 20% 以内, 但如果 样品成 分复杂 ,定量 误差会 增大, 并往往 需要手 工检查 结果。 
目前, 一种新 型的用 i 3 C 标记的 ICAT 试剂 已经商 品化, 这种 ICAT 试剂标 记的肽 段在保 
留时间 上没有 差异, 定 量将更 为准确 (本实 验室未 发表结 果)。 

ICAT 方法的 另一个 问题是 ,试 剂中的 Biotin 基团相 对于肽 段是相 当大的 ,在 做二级 
质谱 碎片分 析时, 巨 大的修 饰对肽 段碎片 的形成 不利, 在大规 模分析 时会造 成蛋白 质鉴定 
的分数 偏低。 进 一步的 实验中 已经将 Biotin 修 饰部分 在亲和 纯化后 去除, 提高了 肽段碎 
片谱的 质量。 

ICAT 技 术定量 依赖于 ICAT 试剂特 异性地 结合于 半胱氨 酸残基 的游离 巯基上 ,但 
是在细 胞总蛋 白质中 (以酵 母为例 ), 约 8% 的蛋 白质是 不含有 半胱氨 酸的, 就 无法用 
. 354 . 



400 



600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 

miz 



图 17 . 13 Db 试剂 标记肤 TVSPNCYIACGISGAIQHLAGMGSSK 的 MS/MS 图谱 



1001 

95 i 
90 i 
85 
80 i 
75 i 
70 i 
651 
60i 
55 
50 T 
45 i 
40 i 
35-: 

30 i 

25 i 
20-1 
15-1 
10-= 







1089.8 



y23(3+) 

1060.8 



y6 



ylO-HjO 

998.6 



566.3 
485.3 



400 



|673i) 732.4853 3981.3 
i.,,,.,i71..;..i|l.l..)l,i,|iljli,i,nwllMl(li 



y24(3+) 




y23(2+) 

y24(2+) 

1633.7 
j634.6 

1683.6 1817.0 1917.. 



600 



800 



1000 



1200 



1400 



1600 



1 800 2000 



mIz 



图 17 . 14 试剂 标记肽 TVSPNCYIACGISGAIQHLAGMGSSK 的 MS/MS 图谱 

ICAT 定量。 所以, 目前也 有发展 了其他 方法如 标记在 赖氨酸 、精氨 酸的同 位素氨 基酸掺 
入 法等。 但就 标记特 异性和 使用简 便程度 而言, ICAT 技术 的优势 还是明 显的。 就定量 
蛋白质 组学研 究的发 展方向 而言, 以 ICAT 技 术为代 表的稳 定同位 素标记 技术将 发挥越 
来 越大的 作用。 

. 355 . 



1084.9 y24(3+) 



y23{3 +) 
1055.2 



y6 y7 y8 



477 , - 
372.9 I 566.1 7573 887.6 lljl 1 

L |||」丄.¥~7』.11「11 ..... I. 丄 I.JMIll 




1035.9 



yl2 yl3 
1 1-22.3 Z j 

jiifSLii' 丄 1., 




y24 (2 +) 



bll 



1792.6 188"1994j: 



二 I 三 一 

05050505050505050505n 

099887766554433221 1 



第五节 展 望 



蛋白 质组研 究与基 因组研 究相比 最大的 不同和 难点之 一就是 定量, 而 蛋白质 表达量 
的差 异又是 影响生 物功能 的重要 因素。 蛋白质 组定量 技术现 在还处 于起步 阶段, 也面临 
着很多 难题: 首先, 对低丰 度蛋白 质检测 的困难 显然阻 碍了对 这些蛋 白质的 定量。 其次, 

当蛋白 质表达 量差异 很小, 如在 50O/O 以 下时, 精确定 量成为 瓶颈。 另外, 生 物体系 中蛋白 
质 表达的 瞬时变 化的捕 捉是样 品制备 中需要 关注的 问题。 总之, 蛋 白质组 定量技 术的研 
究 和应用 还任重 道远。 

' (曹 兴军 阮宏强 曾 碌) 

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• 356 • 



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357 



第 十八章 蛋白质 组研究 中的翻 译后修 饰分析 

第一节 碟酸化 蛋白质 组研究 

一、 介 绍 

蛋白质 憐酸化 研究是 一项大 事业。 在生命 现象的 许多关 键调节 机制中 ,蛋白 质的磯 

酸 化是最 重要的 翻译后 修饰。 20 世纪 50 年代, 发现憐 酸化酶 a 和憐 酸化酶 b 原 来是同 
一种 臃 的磯酸 化和脱 磯酸化 形式。 从那时 开始, 生物 学家开 始将蛋 白质的 磯酸化 看作是 
一种 动态的 生物调 节过程 「1]。 在原核 生物中 ,碟 酸化位 点主要 位于组 氨酸、 谷氨 酸和天 
冬氨酸 残基, 但 真核生 物中的 磯酸化 主要发 生在丝 氨酸、 苏氨酸 和酪氨 酸残基 [ 2 ]。 自从 
20 世纪 50 年代 以后, 憐酸 化蛋白 质的研 究一直 受到生 物学家 的广泛 重视, 重大的 研究成 
果屡见 不鲜。 但是, 传统 的磯酸 化分析 依赖于 放射性 同位素 标记、 Edman 降解以 及薄层 
层析 等方法 [2] ,这 些方法 冗长, 需要 高超的 实验技 巧和较 多的蛋 白质, 而且 对操作 者存在 
放射 性危险 [3] 。 

20 世纪 80 年代, 蛋白 质分析 领域发 生了一 场重要 的技术 革命。 "电 喷雾" —— 第一 
种可以 运用于 生物大 分子的 质谱电 离方式 诞生了 ,随后 ,基质 辅助激 光解析 电离也 应用于 
蛋白质 的分析 ,质 谱分析 成为蛋 白质分 析领域 的中坚 力量。 当然, 作为 蛋白质 分析" 新宠" 
的质 谱技术 , 也 被大量 用于碟 酸化蛋 白 质 的检测 。 

90 年代后 , 质谱技 术的发 展迎来 了历史 上最好 的阶段 , 世 界各国 投入大 量精力 , 开发 
质谱 技术。 各种类 型的质 谱纷纷 出现: 如 MALDI-TOF、MALDI-QTOF、MALDI-TOF- 
TOF 、 MALDI- ION-TRAP 、 ESI- ION-TRAP 、 ESIQ-TOF 、三 级四极 杆质谱 和即将 成为质 
谱技术 先锋的 FTICR。 本文将 就使用 现代质 谱技术 对真核 生物蛋 白质憐 酸化的 分析检 
测及碟 酸化蛋 白 质 组研究 的 策略进 行综述 。 

(-) 概 况 

蛋 白质憐 酸化在 真核生 物中是 非常重 要而且 是非常 普遍的 现象。 据估计 ,在 任一给 
定时刻 ,细胞 内约有 1/3 的蛋白 质存在 磯酸化 [ 4 3。 在真 核生物 常见的 三种磯 酸化形 式中, 
丝氨酸 磯酸化 最多, 苏氨酸 磯酸化 其次, 而酪氨 酸憐酸 化最少 [5] ,三 者的 比例是 1 800: 
200:1。 磯酸 化对于 蛋白质 而言是 非均一 性的, 大多 数憐酸 化蛋白 质都有 多个碟 酸化位 
点, 但这并 不意味 着某一 蛋白质 分子的 所有潜 在的磯 酸化位 点都是 隣酸化 的 [6] 。 人类的 
基因 组中有 2% 的序 列用来 编码憐 酸化蛋 白质, 主要 是蛋白 质激酶 和磯酸 酯酶, 其 中丝氨 
酸和 苏氨酸 激酶的 数量是 酪氨酸 激酶的 4 倍, 而它们 的磯酸 酯酶的 数量基 本相同 [3] 。 

要 对蛋白 质磯酸 化进行 分析, 首先要 对蛋白 质磯酸 化的化 学有所 了解。 丝氨 酸和苏 
氨酸 磯酸化 是不稳 定的, 在碱性 条件下 ,磯酸 基团会 脱去, 发生 P 消除 (图 18.1)。 酪氨酸 
的碟酸 化由于 磯酸基 团连在 苯环上 ,不 会发生 P 消除, 相对 是较稳 定的。 丝 氨酸和 苏氣酸 
. 358 . 



I 

残基 上隣酸 基团脱 去后的 质量变 化与酪 氨酸是 不同的 (图 18. 2), 酪氨酸 因为无 法进行 (3 
消除 反应。 所以, 在质量 变化上 比丝氨 酸和苏 氨酸少 一步, 减少 的分子 质量是 80Da ,而不 
是 98Da ,这 些细节 的质量 变化是 碟酸化 质谱检 测中所 必须注 意的。 



0、 /OH 



--、 zC^cZ- -H3PO4 ―、 Z \c 严— (R=CH3 orH) 



磯 酸化丝 氣酸和 碟酸氏 苏氨 酸残基 

图 18.2 氨基 酸残基 上的憐 酸基团 脱落时 发生的 结构变 化和质 量变化 

分析蛋 白质憐 酸化是 困难的 ,尽 管现代 质谱技 术的发 展非常 迅猛, 但是 憐酸化 面临的 
难 点仍然 存在。 具 体分析 有以下 几点。 首先, 憐酸化 蛋白质 在细胞 内的蛋 白质中 是相对 
较低丰 度的。 第二, 即使我 们找到 一种憐 酸化蛋 白质, 也不能 排除有 该蛋白 质的其 他磯酸 
化形式 存在, 在体内 碟酸化 与其说 是一座 "山" (静态 ), 不如说 是一条 "河" (动态 )。 第三, 
细胞 内有很 多磯酸 酯酶, 在样品 处理时 ,这些 酶很容 易将碟 酸基团 脱掉。 因此, 在 处理样 
品时, 加入磯 酸酷酶 抑制剂 是非常 必要的 [6] 。 第四, 磯 酸化蛋 白质酶 解后的 憐酸化 肽段, 
因为其 化学性 质的负 电性, 在质谱 技术中 面临着 难以质 子化的 困难。 此外, 磯酸化 肽段在 
质谱图 谱中还 往往受 到非憐 酸化的 肽段信 号的强 烈抑制 ,这 一点在 MALDI 源的 质谱中 
尤 为明显 [7'83。 





II 

HO— P— OH 



R— CH 
H3PO4 " 



— N— C— C— 



Base 

H 6 



图 18.1 丝氣酸 和苏氣 酸碟酸 化的不 稳定性 (R = H、CH3) 
磷酸基 团在喊 性环境 下易于 脱去, 并 伴随着 (3 消除 反应, 再 脱去一 分子水 



0、 /OH 

hqZ \o Z^l^ 

C CH 



HC C 

CH CH, 



--、 叱 C' 

I II 
H O 

磷酸 化酷氨 酸残基 



j-HPOj 
-80Da 



lolmlrH 

R i—H 



Hz 



H 

eye 



. Hz 

— f 



Nl„ 



s 



基 

氨 

酪 



359 



(二) 富集 的策略 

由于磯 酸化蛋 白质的 丰度低 ,而 且磯酸 化肽段 分析检 测存在 困难, 使得 富集在 磯酸化 
蛋白质 组的研 究中显 得十分 重要。 富集的 策略应 用在磯 酸化蛋 白质组 研究中 ,有 两种不 
同的应 用阶段 ,包 括富集 隣酸化 蛋白质 和富集 磯酸化 肽段。 

1. 磯酸化 蛋白质 的富集 

这 一类富 集策略 的目标 是磯酸 化的蛋 白质。 富集 这些蛋 白质的 主要手 段是使 用磯酸 
化 蛋白的 抗体。 憐 酸化蛋 白质的 抗体主 要分成 两种: 一种是 丝氨酸 和苏氨 酸憐酸 化蛋白 
质的 抗体, 另一 种是酪 氨酸磯 酸化蛋 白质的 抗体。 其中, 酪氨 酸磯酸 化抗体 的应用 较早, 
已 有专一 性强、 效率高 的抗体 存在, 因此也 较早用 于免疫 共沉淀 [ 9] 。 最近, 已经有 可用于 

丝氨酸 和苏氨 酸磯酸 化的抗 体面世 ,这 些抗体 不但可 以用于 Western 印迹 检测, 还 可以用 
于免疫 共沉淀 纯化磯 酸化蛋 白质, 将大 大方便 免疫共 沉淀在 磯酸化 蛋白质 的富集 中的应 

用 [6]。 

同样是 富集磯 酸化蛋 白质, 也 有采用 化学方 法进行 修饰, 改变碟 酸基团 的化学 性质, 
然后特 异性分 离纯化 , 并可 以定 量分析 这些磯 酸化蛋 白 质 [ 10~1 2 ] 。 这些方 法无一 例外地 
涉及到 化学修 饰的效 率问题 ,在试 验中蛋 白质的 损失是 难免的 ,这也 间接影 响了此 类方法 
的 应用。 其 中一种 化学修 饰的基 础是利 用磯酸 基团脱 去后的 (3 消除 反应, 通 过加成 反应, 
共 价连接 新的化 学修饰 基团。 (3 消除 反应后 生成的 脱氢氨 基酸直 接由质 谱检测 (MS/ 
MS) ,或用 EDT (ethanedithiol) 作 为亲核 试剂, 提供一 个新的 巯基以 便连接 一个生 物素的 
亲和 标签, 为下 一步的 亲和纯 化和同 位素标 记定量 (ICAT) 提供条 件 [ 11,1 3] 。 肽段 中的半 
胱 氨酸和 甲硫氨 酸会和 EDT 发生副 反应, 因此首 先要对 这两种 残基进 行强烈 氧化, 使其 
丧失 活性。 Goshe 等 人使用 同位素 标记的 EDT ,这提 供了一 个巧妙 的解决 憐酸化 肽段定 
量问题 的方案 [ 1 2] (如图 18.3 所示 )。 这 种化学 方法的 优点是 所有的 反应都 在同一 个反应 
体系内 进行, 没有很 多的反 应步骤 ,反应 的产率 有一定 保证; 其缺点 是对于 酪氨酸 的磯酸 
化是 无能为 力的。 

第二种 化学修 饰是第 一种方 法的合 理补充 ,它 可以应 用于酪 氨酸憐 酸化的 检测。 这 
种方 法在保 护肽段 的氨基 和羧基 端的基 础上, 对憐酸 基团进 行化学 修饰, 然 后用特 异化学 
表面 的微球 纯化, 很明显 ,这一 方法的 化学基 础复杂 ,其 核心是 对磯酸 基团的 修饰, 以便和 
有 特异化 学表面 的玻璃 珠结合 纯化。 这一方 法的缺 点是步 骤太多 ,产 率相对 较低, 这一点 
连作者 本人都 不否认 [10]。 详细 化学过 程见图 18.4。 

2. 隣 酸化肽 段的富 集策略 

磷酸化 蛋白质 组研究 中应用 的抗体 只是对 憐酸化 蛋白质 有效。 对碟酸 化肽段 进行富 
集使 用较多 的是固 定金属 螯合亲 和层析 ( immobilized metal affinity chromatography , 
IMAOo 

憐酸化 酪氨酸 残基由 于结构 的制约 ,不能 像磯酸 化丝氨 酸和苏 氨酸那 样发生 p 消除 
反应, 因此分 子质量 数的变 化只有 80Da ,而一 般磯酸 化丝氨 酸和苏 氨酸的 质量数 变化有 
98Dao 
. 360 . 



i 



加 成反应 



Lj— C 



S 



C—L2 



CH— X 



H、 > 

C 

、?/ 



H 



O 



生 物素化 



注: 1. X=CH3, H 
2. R= 



— CH2 NH CH 



'S- R— I 

L2—C 

>— L2 

s 



Hv > 

c 



CH— X 



\ H 
C— N 



rC CH, 



H 



Z、 



,CH, 



\ /CH2\ /NH\ 

CH, O CH2 C 



、(: H,' 



'CH, 



、、、'■ 



■CH— S 



图 18.3 通过 同位素 标记的 化学修 饰进行 丝氨酸 和苏氣 酸憐酸 化肽段 的富集 和定量 
这项 技术从 20 世纪 90 年代开 始应用 于憐酸 化肽段 的检测 ,在 online 和 offline 两个 
形式上 都得到 了满意 的结果 [ 1 4 〜1 9 ]。 IMAC 技术 是用于 富集磯 酸化的 肽段, 对憐 酸化蛋 
白 质的富 集是无 效的。 IMAC 技术使 用的金 属离子 主要是 Fe 3 + 和 Ga 3 + ,据文 献 [ 1 6 3 报道 
Ga 3 + 的富集 效果比 Fe 3 + 要好, 但是 本实验 室的实 践和后 续的文 献报道 [2 G ] 显示, Fe 3 + 的效 
果是 可以接 受的, 而 且由于 Fe 3 + 的价 格便宜 和易于 操作的 优点, 比 Ga 3 + 的应 用要广 
泛些。 

蛋白质 组学的 开展, 需要有 大规模 、自 动化的 技术。 对 IMAC 技 术的要 求也是 如此, 
尽管有 报道, 在 offline 条件下 的磯酸 化肽段 纯化有 良好的 结果, 但是 从长远 来看, IMAC 
参 与其中 的多维 色谱技 术的发 展是必 须的。 在这一 方面, 已 经显著 进展。 Zarling 等人在 
2000 年 报道使 用内径 10(Vm 的 IMAC 柱, 与两根 反相柱 联用形 成多维 色谱, 取得 了良好 
的试 验效果 [2 13。 之后 不久, 在 Nature Biotechnology 杂志上 ,就 报道了 更出色 的工作 [2 n ] , 
在使 用基本 相同的 技术手 段的情 况下, 在酵 母的全 细胞裂 解液中 检测到 了超过 1 000 个磯 
酸化 肽段, 并分 析了其 中的一 部分。 

, IMAC 柱富集 磯酸化 肽段的 原理, 是利用 磯酸基 团的负 电性与 IMAC 柱上的 带正电 
的金 属离子 结合, 从 而起到 纯化的 作用。 IMAC 技术对 丝氨酸 、苏氨 酸和酪 氨酸磯 酸化都 
有效, 但是 IMAC 柱上的 正电荷 位点同 样会与 肽段中 的天冬 氨酸、 谷氨酸 和组氨 酸残基 
结合, 从而 特异性 和非特 异性肽 段同时 富集。 所以, IMAC 方 法面临 的最主 要的缺 点是特 
异性 不强。 在上述 同一篇 文献中 ,对磯 酸化肽 段中的 酸性残 基进行 了预先 的甲基 酯化, 封 
闭了上 述氨基 酸的酸 性侧链 ,从 而大大 提高了 IMAC 方法的 特异性 [2 G ] 。 这 一方法 弥补了 

. 361 . 



o 

II 

HO — P — OH 

I 

O 

I 

CH2 

I 

HN— ... — C— ... — C — OH 

I I II 

H H O 



HO- 



EDC+ 



NHAH4OH 



tBoc- 



-N — 
H 



HN— C2H4OH 

-p=o 

I 

O 

CH2 

-C— ... — C — NH — C2H4OH 



O 

II 

HN— C2H4S — CHjC— —Beads 

HO— P = O 
I II 
O I— CH2— C Beads 

^ 

tBoc— N— ... — C— ... —C — NH— C2H4OH tBoc— N- 

I I II I 

H H O H 



TFA 



DTT 一 



, EDC+(NH2C2H4S)2 



HN— C2H4SH 
HO— P = 
O 

CH2 

-… — C— C — NH — C2H4 — OH 

I II 
H O 



TFA 



O 



HO— P — OH 
O 

CH2 - 

HN— C— C— NH — C2H4— OH 

I I II 

H H O 

图 18.4 化 学修饰 后进行 磯酸化 蛋白质 的纯化 (碳化 二乙胺 反应) 

IMAC 技术 最大的 缺陷, 为大规 模磯酸 化蛋白 质组学 的开展 展现了 美好的 前景。 

鱗酸化 蛋白质 和肽段 的富集 对于它 们的检 测是重 要的, 进行磯 酸化蛋 白质组 研究, 第 
一 步要做 的就是 富集, 以上介 绍的这 两方面 的富集 策略, 各有优 缺点。 笔者 认为, 以抗体 
为基础 的第一 种策略 有效但 昂贵, 现阶 段酪氨 酸磯酸 化蛋白 质的抗 体比丝 氨酸和 苏氨酸 
的要有 效些, 对于大 多数国 内实验 室来说 ,受 财力所 限使用 时会有 困难; 而 以色谱 方法为 
基础的 IMAC 方法 , 同样是 有效的 ,甚至 于在有 化学修 饰辅助 下是更 有效的 [ 2 G ] ,重要 的是 
其试 验花费 和前者 相比是 微不足 道的, 因 此会有 更好的 应用。 本实 验室的 实践证 明在国 
内现 有的条 件下, 使 用相对 简单的 IMAC 色 谱柱对 磯酸化 肽段的 富集也 能得到 满意的 
结果。 

(三) 隣 酸化肽 段的质 谱检测 

当代质 谱技术 沿着两 条主线 发展, 其一是 离子源 ,其 二是检 测器, 这两 个方向 上几乎 
包括了 所有新 的技术 思路。 就 离子源 而言, 自从 20 世纪八 九十年 代发明 ESI 和 MALDI 
后, 鲜 有质的 突破。 时至 今日, 绝大多 数生物 质谱的 离子化 方式仍 然是这 两种。 而 就质量 
分析器 而言, 种类倒 是颇多 ,有 经典的 三级四 极杆、 离子阱 和飞行 时间检 测器, 也有 稍后的 
. 362 • 



Qq-TOF、TOF-TOF 和即 将成为 热门的 FTICR。 近几 年来, 质谱技 术的发 展主要 集中在 
各种离 子源和 检测器 、检测 器和检 测器的 "杂交 "上, 产 生了多 种新颖 的生物 质谱, 应用于 
生物 学各个 领域。 以下将 从生物 质谱的 这些技 术特征 角度, 分别介 绍应用 于蛋白 质组磯 

酸化 研究的 情况。 

1. 以 MALDI 为 离子源 

以 MALDI 为离 子源的 生物质 谱通过 PMF(peptide mass fingerprinting) 技术, 在鉴定 
蛋白质 的工作 中取得 了很好 的结果 ,但将 MALDI 离 子源的 质谱应 用于蛋 白质组 憐酸化 
研究就 遇到了 问题。 如前 所述, 磯酸化 肽段是 带有负 电性的 ,而生 物质谱 常用正 离子模 
式, 它的 离子化 就显得 不佳。 更糟 糕的是 进行憐 酸化研 究时, 磷酸化 肽段常 常和非 隣酸化 
的肽段 混合在 一起, 在 MALDI 源的情 况下, 磯 酸化肽 段的信 号会被 非磯酸 化肽段 的质谱 
信号 抑制。 在 未经富 集的情 况下, 一个磯 酸化蛋 白质的 磯酸化 肽段在 MALDI 源时, 经常 
会淹 没在其 他非磷 酸化肽 段的信 号中, 连信号 都没有 ,分析 研究碟 酸化的 位置、 数 量和变 
化 就成了 奢望。 此外, 因为以 MALDI 为离 子源的 质谱没 有分离 能力, 所以 蛋白质 必须先 
进行 纯化, 在蛋 白质组 学中, 现在应 用最广 的纯化 方法还 是双向 电泳和 HPLC。 因此, 
MALDI 质谱分 析磯酸 化时, 就会 有些必 要的前 处理。 

首先, 碟酸 酯酶被 应用到 磯酸化 肽段的 检测中 [ 1 8 ' 2 1, 22] 。 磯酸 酯酶处 理蛋白 质的前 
后, 磷酸 化肽段 的质量 数会有 变化, 这为磯 酸化肽 段的检 测提供 了前提 条件; 更重要 的是, 
很 多磯酸 化肽段 在脱去 碟酸基 团后, 质谱信 号会有 很大提 高 [ 1 8] 。 这样 比较前 后图谱 ,寻 
找质量 数变化 80 或 98Da 和 强度增 大的信 号就很 可能是 磯酸化 肽段。 在 磯酸酯 酶反应 
时, 丝氨 酸和苏 氨酸磯 酸化肽 段的质 量变化 可能是 80Da ,也 可能是 98Da, 后者的 发生是 
因 为在磯 酸基团 脱落后 发生了 P 消除 反应, 酪 氨酸碟 酸化肽 段只有 80Da 的 质量数 变化。 
隣酸酷 酶的另 一种应 用方式 是固定 化磯酸 酯酶, 使脱 碟酸作 用发生 在亲和 柱上, 这 提高了 

酶 反应的 效率和 方法的 自 动 化程度 [ 23] C 

其次, 以 MALDI 为离子 源的质 谱检测 磯酸化 肽段时 ,对 憐酸化 肽段的 富集显 得更为 
重要。 这 其中, IMAC 技 术与之 合用较 为多见 [1 4 ~1 6 ,1 8] 。 磯酸化 肽段经 过富集 ,在 MALDI 
质谱上 的检测 信号会 有较大 的提高 ,对于 这一点 ,本实 验室对 (3 酪蛋 白的酶 解产物 进行了 
IMAC 的富集 ,其 磯酸化 肽段的 信号得 到明显 增强。 

MALDI 离子 源质谱 较早使 用的是 TOF 检测器 ,受 其原理 所限, MALDI-TOF 质谱的 
PSD 碎片分 析非常 困难。 为 了克服 MALDI 质谱的 这一重 要缺陷 ,近 年来, 发展了 多种以 
MALDI 为离子 源的" 杂交" 质谱, 如 MALDI-ION-TARP、MALDI-Qq-TOF 和 MALDI- 
TOF-TOF 等等。 这 些技术 的出发 点都是 为了在 MALDI 离子 源的情 况下, 进行肽 段的碎 
片 分析。 MALDI-IONTRAP 质谱是 其中较 早出现 的一种 [ 24 ' 25] ,思路 是将 MALDr 源产生 
的离 子选择 性的用 离子阱 俘获, 并作 CID( collision-induced dissociation) 分析, 得到 肽段碎 
片信息 , 以 便更好 地分析 鉴定蛋 白质。 在 选择作 CID 的离 子时, 主 要选择 有成对 出现的 
质量 数相差 98Da 的质谱 信号。 MALDI-ION-TRAP 技术很 早就被 认为是 有前景 的 [7] 。 
当时此 项质谱 技术还 停留在 实验室 阶段, 而现 在这种 质谱已 经被成 功地商 品化, 并 很快被 
应 用于碟 酸化肽 段的检 测上来 [ 26 j。 Chait 等人 的工作 说明, 在这种 质谱条 件下, 丝 氨酸、 
苏 氨酸和 酪氨酸 憐酸化 肽段在 CID 分 析时, 都会形 成失去 98Da 的碎片 峰 [25] 。 丝 氨酸和 

• 363 • 



苏氨 酸憐酸 化肽段 CID 时 失去的 98Da 的 质量数 一般被 认为是 伴随着 (3 消 除反应 而发生 
的 (也 有人 认为是 ds-l,2-elimination ,而 不是 [3-elimination [27 3 ) , 丝氨 酸和苏 氨酸碟 酸化肽 
段磯酸 基团的 脱落是 常见的 现象, 而 且与肽 段的氨 基酸构 成没有 关系。 而 酪氨酸 憐酸化 
肽段在 CID 时的质 量数变 化也是 98Da, 这很有 意义。 现在 认为这 里发生 了两步 反应, 第 
一是 HP03 的失去 ,第二 是一分 子水的 失去。 同时, 酪 氨酸碟 酸化肽 段的碟 酸基团 较前两 
者不 易脱落 (这 些脱落 与肽段 的氨基 酸组成 有关, 在肽 段中有 碱性氨 基酸赖 氨酸和 精氨酸 
存在时 有利于 磯酸基 团的脱 落), 因此, 在 CID 时能 看到带 有磯酸 的肽段 碎片, 这 一点可 
能对 磯酸化 位点的 判断有 帮助。 MALDI-IONTRAP 也有令 人遗憾 的缺点 ,因为 MALDI 
离子源 情况下 ,产 生的离 子大多 是单电 荷的, 而 单电荷 的离子 在离子 阱内作 CID 时信号 
显得不 太强烈 , 产生 的碎片 峰的强 度也不 太理想 , 这不能 不说是 该项技 术的一 个隐忧 。 

2. 以 ESI 为 离子源 

可以毫 不夸张 地说, ESI (电 喷雾) 离 子源质 谱在磷 酸化肽 段的检 测中, 有着比 MALDI 
离子源 质谱更 广泛的 应用和 更好的 前景。 在大 多数情 况下, ESI 离 子源质 谱都会 配以一 
个 HPLC 系统作 为分离 的工具 ,这使 其可以 分析较 为复杂 的系统 ,而不 像很多 MALDI 离 
子源 质谱只 能分析 相对较 纯的样 品或者 是不太 复杂的 肽段混 合物。 近年来 ,质谱 技术与 
毛细管 HPLC 技术相 结合, 而且 越来越 多的实 验室开 始使用 nanospray 的电喷 雾技术 ,大 
大的 提高了 ESI 技术 的灵敏 度和应 用范围 [28] 。 同时, 也 是由于 ESI 离子源 与色谱 技术的 
良好兼 容性, 多种 现代色 谱技术 参与到 其中, 与 ESI 质谱 联用, 大大 的推动 了质谱 本身的 
发展。 比如, 多 维色谱 技术、 IMAC 技术、 微柱 HPLC 以及填 料技术 等等都 越来越 多的在 
质 谱技术 中发挥 作用。 可以说 ,以 电喷雾 技术为 离子源 的质谱 是蛋白 质组学 研究的 主力, 
同 时也是 碟酸化 蛋白质 组研究 的重要 武器。 这 方面, 憐酸化 肽段的 分析方 法是丰 富多彩 
的 , 其核心 是围绕 着肽段 磯酸化 的检测 。 
(1) 前离 子扫描 ( Precursor ion scan ) 

前体检 测的思 路是, 利用憐 酸基团 的化学 特性, 检 测它在 各种条 件下所 生成的 有特点 
的 离子。 这其 中有带 负电的 PQT ,也 有带 正电的 immonium 离子。 前离子 扫描这 项方法 
的离 子源都 是电喷 雾的, 而质 量分析 器主要 是串联 质谱, 如 三级四 级杆和 Qq-TOF 等。 

前体离 子中较 早被用 来做前 离子扫 描的是 PC^— (rn/z 79)。 POT 是在低 能量的 
CID 时, 从憐酸 化肽段 上脱落 的小分 子离子 ,将 它作为 标识分 子进行 检测, 然后在 串联质 
谱 中对它 的母离 子进行 分析。 在使用 三级四 级杆分 析器时 ,经 典的方 法是, 第一级 四级杆 
分析 器进行 全质量 数范围 扫描, 第二 级四级 杆分析 器进行 CID 碎片 分析, 而第三 级四级 
杆分析 器则专 门扫描 POT (m/z 79) [29] 。 在找到 这个特 征性的 小分子 的时刻 ,质 谱上记 
录下 的肽段 和肽段 CID 的信息 就是磯 酸化肽 段的的 信息。 之所以 能够对 进 行前离 
子扫描 ,作为 磷酸化 肽段的 特征性 标识, 原因是 现代生 物质谱 对这样 的小分 子有着 很高的 
灵敏 度和准 确度。 对 POT 的前离 子扫描 ,在多 项研究 中得到 了应用 [3 0, 3 1], 但是这 里有个 
矛盾的 问题, 如 果没有 HPLC 进行 分离, 前离子 扫描的 分析是 不可想 像的, 但是, HPLC 的 
酸性环 境对质 谱的负 离子模 式的灵 敏度是 非常不 利的。 尽管 有人尝 试使用 多维色 谱来解 
决 所遇到 的困难 [ 32 】 ,但 是这种 努力显 然遇到 了很大 的技术 阻力, 没 有获得 如意的 前景。 

前 体离子 扫描的 发展是 很快的 , 面对 负离子 模式下 一些难 以逾越 的困难 ,另一 些正离 
. 364 . 



子模式 下的前 体离子 扫描方 法被发 展起来 [33 _ 35 ]。 较早一 些的是 扫描酪 氨酸憐 酸化的 im- 
monium(pY) 离子" i/z 216.043) , 最早 Hoffmann R 等 人首先 描述到 immonium 离子是 
酷氨 酸磷酸 化肽段 的特征 性的碎 片离子 [ 36] 。 2001 年, 丹麦 学者将 这种离 子的前 离子扫 
描付 诸实践 [ 35 、 他们 使用的 质量分 析器是 Q-TOF ,之所 以要使 用这种 分析器 ,是 因为其 
精确度 比三级 四极杆 要高, 而 要在一 系列的 质量数 相差很 小的碎 片离子 中准确 的找到 
immonium 离子, 需 要相当 高的精 确性。 他们 的工作 显示, 这 种方法 在标准 品上可 以达到 
1 飞摩尔 的水平 ,而 在胶内 蛋白质 也只要 100 飞摩 尔就足 够了。 这 方法可 以作为 研究酪 
氣 酸憐酸 化时的 不错的 选择。 另一些 正离子 模式的 方法, 涉 及到对 残基上 的憐酸 基团的 
化学修 饰 〕 - 3 ], 在磯酸 基团脱 去发生 P 消除反 应后, 加入合 成的巯 基季铵 (2-dimethy- 
UminoethanethioO, 进行加 成反应 ,然 后在低 能量的 CID 下, 产生特 异性的 小分子 碎片。 
前离 子扫描 技术大 多数情 况下, 使用的 是串联 的质量 分析器 ,如 三级四 极杆、 Q-TOF 等, 
在后一 级分析 器上发 现特征 分子后 ,可 以在同 时的前 一级分 析器上 即时的 分析母 离子, 以 
便获 取肽段 的序列 信息。 在离子 阱分析 器上, 较为常 用的发 现憐酸 化肽段 的方法 则是作 
中性丢 失扫描 (neutral loss scan)。 
(2) 中性丢 失扫描 (neutral loss scan) 

Hunter AP 等 人最早 阐述了 磯酸化 肽段在 CID 前后的 质量数 变化, 在大 多数情 况下, 
憐酸化 肽段的 质量数 变化是 98Da, 以这 一特征 性的质 量变化 为判断 磷酸化 是否存 在的依 
据 [37] 。 中性 丢失扫 描在磯 酸化质 谱检测 的方法 中占有 重要的 地位, 方法主 要的优 点在于 
思路比 较简洁 ,可以 完全在 正离子 模式下 操作, 不会像 前离子 扫描那 样碰到 负离子 模式下 
的灵敏 度下降 的问题 ,此外 ,如前 所说, 此 方法在 离子阱 分析器 中也可 以有很 好的利 

用 [38]。 

中性丢 失扫描 也会遇 到一些 问题。 因为 质谱检 测到的 是质量 电荷比 而不是 质量本 

身, 因此在 核对质 量数的 变化时 ,并 不是只 要核对 98Da 就 可以。 也就 是说, 中性 丢失的 
信号可 能有几 个数值 ,在 单电荷 离子是 98Da ,双电 荷和三 电荷是 49Da 和 32.66Da。 这就 
提出一 个要求 ,要么 知道要 检测的 碟酸化 肽段离 子的电 荷数, 要么 在软件 中设定 多个参 
数, 前者 对于未 知物是 难以了 解的, 而后者 会增加 程序分 析的难 度和准 确性。 更令 人感兴 
趣的是 ,磯酸 化肽段 的电荷 实际上 与磯酸 基团在 CID 中 脱落的 可能性 有关。 中性 丢失另 
一个 不可回 避的问 题是, 憐酸化 肽段质 量数变 化的多 样性。 在 多数情 况下, 数值是 98Da, 
但也 可能是 80Da, 原因是 憐酸化 肽段在 CID 时 发生的 P 消除反 应时气 态反应 ,反 应中有 
可能失 去的是 一个碟 酸分子 (H3P〇4), 也 可能失 去的是 HPO3,80DaL 3] 。 不管是 98Da 还 
是 80Da ,如 果憐 酸化的 残基是 酪氨酸 , 磯酸 基团的 脱落就 不如另 两种磯 酸化残 基容易 。 

从理论 上说, 在质 谱的正 离子模 式下, 使 用中性 丢失扫 描是检 测憐酸 化肽段 的好方 
法, 在方法 学的层 面上, 很早就 有学者 进行了 研究, 并认为 是有效 的 [29 , 37] 。 但是, 在面对 
未知的 蛋白质 样品时 ,就显 得有些 困难。 原因 是多方 面的, 最 大的困 难是在 肽段混 合物没 
有 富集磯 酸化的 情况下 , 憐 酸化肽 段的信 号与非 瞵酸化 肽段的 信号相 比 是较弱 的 , 如果母 
离子 的信号 很弱, 选择作 CID 时就 会相当