Full text of "Folia microbiologica"

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FOLIA MICROBIOLOGICA.

HOLLÄNDISCHE BEITRÄGE ZUR
GESAMTEN MIKROBIOLOGIE.

HERAUSGEGEBEN VON:

M. W. BEIJERINCK, Delft-
A. KLEIN, Groningen.
J. POELS, Rotterdam.
J. G. SLEESWIJK, Delft.

unter MITWIRKUNG VON:

C. W. BROERS, Utrecht — R. P. VAN CALCAR, Leiden —
L. POLAK DANIELS, Haag - C. EIJKMAN, Utrecht —
H. J. HAMBURGER, Groningen - H. C. JACOBSEN,
Delft — D. A. DE JONG, Leiden — R. DE JOSSELIN DE
JONG, Rotterdam — J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam —
L. LOURENS, Rotterdam - H. MARKUS, Utrecht —
C A. PEKELHARING, Utrecht — H. E. REESER,
Rotterdam — N. L. SÖHNGEN, Delft - C H. H. SPRONCK,
Utrecht - C S. STOKVIS, Amsterdam.

III. JAHRGANG.
: 1914. :

UBRAÄ's;

tJEW YOT&

ADMINISTRATION UND VERLAG DER

FOLIA MICROBIOLOGICA:
PHOENIXSTRAAT 18 DELFT.

v. 3,

BOTANICAL

AUTORENREGISTER.

Seite

Beijerinck. M. W 91

Broers, C. W • • i99

Hekman, J 126

Idzerda, J 227

Jacobsen, H. C i55

Jong, D. A. de i

Loghem, J. J. van 212

Markus, H 141

Misson, L, 49

Raaff, A 89

Reeser, H. E 15

Schornagel, H 220

Scheuten, S. L 114

Söhngen, N. L 15 ^

Steenhuis, T. S 76

Wisselingh, C. van 165

SACHREGISTER.

Aorte (sclérose de 1') 76

Anindologenes (bacterium Proteus) 212

Artbildung (physiologische) 91

Bakterienharpune 89

Bakterienmenge (in Fäzes) 227

Bacterium Proteus anindologenes 212

Bétail européen (en Brésil) 49

Dematium pullulans de Bary 114

Diphtherie 126, 199

Essigbakterien 151

Fäzes (Bakterien menschlicher) 227

Immunisation artificielle (contre la Piroplasmose) 49

Konglutinationsmethode 15

Mammifères (tuberculose aviaire chez les) i

Nitratferment 91

Oxydation (durch Bakterien) 155

Phycomyces Agardh 114

Phytomikrochemische Untersuchung 165

Seite

Piroplasmose (du bétail européen) 49

Putréfaction intestinale 'j^

Réinoculation (de la tuberculose porcine de l'homme au veau) 141

Schwefelwasserstoff (Oxydation von) 155

Serological research (in tuberculosis) 126

Tuberculose aviaire i

Tuberculose porcine 141

Tuberkulinprobe (nach van Es und Schalk) 220

FOLIA MlCROBlOLOölCA.

HOLLÄNDISCHE BEITRAGE ZUR
GESAMTEN MIKROBIOLOGIE.

HERAUSGEGEBEN VON:

M. W. BEIJERINCK, Delft.

Ä. KLEIN, GRONINGEN.
J. P O E L S, ROTTERDAM.

J. G. SLEÉSWIJK, DELFT
III. JAHRG A N G, H E FT 1.

AUSGEGEBEN AM 27. JUNI 1914.

(FÜR INHALT UND VERZEICHNIS DER MITAR*
BEITER, SIEHE INNENSEITE DES UMSCHLAGES).

ADMINISTRATION UND VERLAG DER

FOLIA MICROBIOLOGICA :
PHOENIXSTRAAT 18, DELFT. (Holland.)

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NAAMLOOZE VENNOOTSCHAP

: VOORHEEN :

: J. C TH. MARI US :

GANZENMARKT 440, UTRECHT

SPECIALITEIT;
INRICHTING EN COMPLETEERÏNG VAN
WETENSCHAPPELIJKE LÄBORATORI A

MICROSCOPEN EN NEVENAPP ARATEN

VAN CARL ZEISS TE JENA en
R. WINKEL TE GÖTTINGEN

MICRO. PHOTOGRAPHISCHE EN
MICRO. PROJECTIE APPARATEN

OP AANVRAGE WORDEN GATALOGI TOEGEZONDEN

INHALT.

Stit«

D. A. DE JONG. Sur le bacille de la tuberculose
aviaire chez les mammifères ^ 1

H. E. REESER. Die Konglutinationsmethode ... 15

L. MISSON. Immunisation artificielle contre la piro*
plasmose du bétail européen importé au Brésil.
(Avec 3 planches) 49

T. S. STEENHUIS. La putréfaction intestinale et la
sclérose de Taorte. (Avec 1 planche) 76

A. RAAFF. Eine praktische Bakterienharpune. (Mit
2 Tafehi) 89

[Laboratoire de Pathologie Comparée de
l'Université de Leyde].

SUR LE BACILLE DE LA TUBERCULOSE
AVIAIRE CHEZ LES MAMMIFÈRES,

PAR

Le professeur Dr. D. A. DE JONG.

Il est bien universellement connu qu'on a voulu modifier
l'opinion émise par ROBERT KOCH en 1882 (i) et 1884 (2), à
savoir que le bacille de la tuberculose serait la cause unique
de la tuberculose humaine et animale. Déjà en 1889 (3) on
réussit à démontrer que le bacille isolé des oiseaux ne possédait
pas précisément les mêmes caractères que celui des mammifères.
KoCH (4) lui-même et Maffucci (5) l'ont confirmé en 1890,
et notamment StrauS et Gamaleia (6) ont étudié au fond,
par voie expérimentale, les différences qui peuvent exister
entre les bacilles tuberculeux des oiseaux et des mammifères.

Après ce temps, surtout en Allemagne, on ne s'occupait que
très peu de la question ; beaucoup plus en France oij la plupart
des pathologistes continuait à croire qu'ils n'existaient point de
différences principielles entre les bacilles des oiseaux et ceux
des mammifères tandis que les superficielles seraient les con-
séquences des milieux d'existence si différents.

La situation restait la même jusqu'à 1901. A ce moment, il
était de nouveau ROBERT KoCH (7) qui abordait la matière en
déclarant, se basant sur les expériences exécutées par lui en
collaboration avec SCHÜTZ, que les bacilles tuberculeux humain
et bovin offrent des différences permanentes ; que d'un point
de vue pratique l'infection de l'homme ne serait pas causée
par la tuberculose du bœuf et enfin, qu'il serait assez facile
de différencier les deux bacilles par la culture et par l'expérience.

De divers côtés on s'est opposé contre ce verdict et quant
à la partie principielle de la question, le plus grand obstacle
contre la doctrine de KOCH restait sans doute le fait que les
différences, proclamées par lui, ne se montraient pas constantes,
ni permanentes.

Plus tard on s'est adressé de nouveau à la tuberculose
aviaire, instituant d'autres recherches expérimentales. Non
seulement fut-il prouvé que les bacilles aviaires se trouvent
assez fréquemment dans les corps de mammifères, mais aussi
qu'il est bien imprudent de croire à l'invariabilité des caractères des
bacilles, isolés des mammifères ou des oiseaux. Il est notamment
à Arloing (8) qu'on doit des expériences remarquables à ce
sujet ; il réussit à cultiver les bacilles tuberculeux des mammi-
fères dans des cultures homogènes, où ils obtiennent plusieurs
des qualités connues du bacille aviaire.

Les différences principales entre les bacilles des mammifères
et des oiseaux, laissant à part celles d'une moindre importance,
seraient les suivantes :

i^ Les bacilles des mammifères donnent une culture sèche
et verruqueuse, ceux des oiseaux une couche humide et visqueuse,
tout en employant des milieux solides ;

2" Les bacilles des mammifères sont très virulents pour le
cobaye et y causent la mort en peu de temps par une tuber-
culose type ViLLEMiN (c'est-a-dire avec des tubercules visibles);
au contraire les bacilles aviaires ne sont que très peu pathogènes
pour le cobaye, y donnent un abcès au lieu d'inoculation avec
gonflement du ganglion lymphatique régionnair ou, si vraiment
l'animal meurt, le cadavre ne montre pas des lésions tuber-
culeuses visibles et point de tubercules (tuberculose type Yersin);

3^ Les gallinacés (et d'autres oiseaux) ne sont qu'exception-
nellement à infecter par les bacilles des mammifères, au contraire
assez facile par celui des oiseaux.

Quant aux difïérences qu'on veut créer entre les bacilles
tuberculeux de Xhomme et du hœuf on accuse notamment
les suivantes :

i^ Les bacilles de l'homme sont généralement un peu plus
longs que celui du bœuf, et en cultures ils poussent un peu
plus vite.

2^ Le bacille de l'homme n'est que très peu virulent pour

le lapin, tandis que celui du bœuf est doué d'une grande virulence
envers cet animal.

3^ Le bacille de l'homme inoculé par voie sous-cutanée chez
le veau ne causerait qu'une tuberculose locale peu grave et
non-progressive, tandis que celui du bœuf y causerait une tuber-
culose grave et souvent mortelle.

J'y tiens à accentuer que j'ai mentionné seulement les diffé-
rences principales dont on veut se servir. Dans la littérature
on en peut trouver encore d'autres moins prononcées. Pourtant,
selon mon opinion, on n'a jamais réussi à démontrer que dans
ces sortes de différences on devrait voir les preuves d'une
différenciation permanente, les T^r&n\ç.s à' nwe dißerence d'espèce ;
au contraire, précisém.ent la littérature nous apprend qu'on
veut admettre toutes sortes d'exceptions aux règles, tandis que
les recherches expérimentales ont prouvé qu'on n'a pas affaire
à des différences constantes.

D'ailleurs on comprendra que la solution de telles questions
ne se laisse pas obtenir en peu de temps., justement aussi à
cause de celui que prend l'isolation des bacilles, et l'exécution
des expériences chez des animaux. Ensuite, qu'on n'arrivera
pas au but en étudiant seulement des bacilles isolés d'hommes,
de bœufs et d'oiseaux, et en oubliant les autres animaux qui
peuvent souffrir de la tuberculose. A coté de l'homme, du
bœuf et des oiseaux ce sont le porc, le cheval, le mouton, la
chèvre, le chien, le chat, le singe, le lapin, la souris, les
animaux à sang froid, etc. qui peuvent fournir des cultures
du bacille tuberculeux !

Il va sans dire que celui qui veut proclamer la séparation
des bacilles mentionnés, ayant pour conséquence naturelle la
séparation des maladies, doit apporter les preuves de l'existance
de différences permanentes. Il ne peut pas admettre des
passages, des formes intermédiaires, des variations ou des
mutations spontanées ou artificielles, ou même des exceptions
à la règle. Eh bien, la réalité s'oppose contre de telles con-
clusions des communications de KOCH. Vraiment, on pourra le
trouver assez commode de parler d'un typus humanus, bovinus
ou gallinaceus du bacille tuberculeux pour annoncer que les
bacilles isolés de l'homme, du bœuf ou des oiseaux montrent

souvent leur origine par des caractères quelconques, mais on a
seulement le droit d'accepter des différences principielles du
moment, où l'on donne la preuve d'une barrière permanente et
insurmontable. Jusqu'à maintenant, on n'a prouvé rien de la sorte.

Toujours en rapport au sujet que je veux traiter je dois
signaler les conclusions erronées, aussi en ce qui concerne la
biologie des microbes pathogènes et la pathologie expérimentale,
dérivées de l'opinion de KOCH.

Après avoir observé le fait qu'un bacille tuberculeux isolé
de l'homme, et un autre isolé du bœuf, montraient ordinaire-
ment les différences envisagées plus haut, KoCH et ses colla-
borateurs signalaient tout bacille qui présentait l'une ou l'autre des
groupes de caractères soit comme bacille humain ou bien comme
bacille bovin. Il n'y avait plus de place pour les bacilles avec
des caractères divergents, variants ou intermédiaires. La même
manière de voir est suivie pour les bacilles aviaires. De cette
façon, comme il s'entend, il leur est bien facile d'indiquer
l'origine de tout bacille tuberculeux — cependant, ils n'inter-
prètent point les formes intermédiaires et ne s'occupent non
plus de la variation de caractères, soit naturelle ou bien
artificielle. Or, cette manière de voir n'est pas admissible, ni
pratiquement ni théorétiquement ! Car les bacilles avec des
qualités déviantes et intermédiares existent, et les cas de
variation naturelle et artificielle sont des faits ! Pour cette
raison l'opinion des savants allemands est inacceptable. Il est
impossible de diviser les bacilles tuberculeux chez les animaux
à sang chaud dans trois classes avec des caractères bien
limités, ne comptant pas à ce moment les autres microorganismes
qui s'en approchent.

Bientôt l'application pratique de la nouvelle doctrine de
KoCH se montrait peu recommandable. Il avait supposé que
la tuberculose du bœuf ne présenterait pas un danger envers
l'homme. Les expériences ultérieures, inspirées par lui-même,
faisaient voir, que des bacilles avec les qualités que lui et son
école avaient proclamées pour ceux des bacilles bovins, se
rencontraient sur l'homme beaucoup plus fréquemment qu'on
ne l'avait pensé. Et parce que le critérium créé par lui, ne

pouvait pas faire découvrir tous ces cas, parce que les bacilles
bovins ne possèdent point des caractères mathématiquement
limités, il s'entend qu'on n'est pas informé sur les cas de
tuberculose bovine sur l'homme où le bacille possède des
propriétés moins nettes. Et en tout cas la tuberculose bovine
reste dangereuse pour V homme l

Comment en est-il avec la tuberculose aviaire ?

Il me semble bien difficile de nier qu'aussi les différences
entre les bacilles aviaires et ceux des mammifères, quoique
souvent bien marquées, ne soient pas si constantes et si
caractéristiques, qu'elles donnent le droit de parler de différences
permanentes. Aussi dans ce cas on voit que celui-ci qui étend
ses recherches pendant plusieurs années et montre un peu de
patience, découvre des faits prouvant qu'il n'y a pas lieu de
parler de différences principielles d^ espèce ; on rencontre des
formes de variation naturelle ou artificielle, et les caractères
qu'on veut proclamer comme typiques montrent peu de
constance. Donc aussi dans ce cas la conclusion que, vraiment
en plusieurs cas, on pourra présumer l'origine du bacille, sans
en obtenir la certitude. Toujours l'origine pourra être une auter
que celle suggérée par les qualités soi-disant typiques.

De tout ce qu'on sait des caractères de culture et de virulence
des bacilles humains, bovins ou aviaires il en résulte, qu'ils ne
sont pas assez précises pour en pouvoir dériver un moyen de
diagnostie certain dans tous les cas. Il est précisément la
constance qui manque parmi les qualités. Et serait il possible,
en effet, que ces bacilles, séjournant dans un corps étranger,
pourraient changer leurs propriétés, soit-il très lentement, mais
en accord avec le nouveau milieu, il en résulterait, qu'il est
extrêmement imprudent de créer des espèces, ou des types avec
les qualités d^espèce, du bacille tuberculeux.

Se basant sur les données acquises il ne sera pas donc
certain qu'un bacille tuberculeux quelconque isolé d'une certaine
espèce d'animal, montrant les caractères qu'on voit d'ordinaire
chez le bacille humain, bovin ou aviaire, soit nécessairement
d'une telle origine. On pourra proclamer la vraisemblance,
mais devra s'arrêter là.

Néanmoins de tels cas preuvent sans doute, qu'un certain
bacille tuberculeux qui dans une espèce animale quelconque

montre souvent des qualités assez bien définies, n'' est pas
absolument lié à cette dernière espèce, ce qui d'un point de
vue pratique veut dire que le bacille en question peut infecter
aussi d'autres. Mais il n'est pas permis de taxer la fréquence de
ces infections d'après le nombre des cas où l'on trouve le bacille
avec les caractères divergents, justement à cause de la non-
constance des différences que peuvent montrer les bacilles.
Il est possible qu'on taxe beaucotip trop bas. Et quand on
serait incliné a taxer les cas de tuberculose aviaire chez les
mammifères d'après les cas où l'on trouve des bacilles avec
les propriétés ordinaires du bacille aviaire, on risque de
commettre la même faute que celui qui veut dériver les cas
d'infection de l'homme par la tuberculose du bœuf d'après les
cas dans lesquels on peut isoler de l'homme un bacille avec
les qualités soi-disant typiques du bacille bovin. Probablement
on taxe trop bas parce que la variation des bacilles peut faire
naître des formes intermédiaires ou de passage !

Quoi qu'il en soit, le problème de la possibilité de l'infection mutu-
elle, et l'hygiène à cause de la fréquence de la tuberculose aviaire,
sont intéressées à la question si vraiment, chez des mammifères,
n'importe quels, on a pu trouver des bacilles tuberculeux avec
les propriétés pathogènes et de culture qu'on observe ordinaire-
ment chez les bacilles isolés des oiseaux. Ce sont donc notam-
ment les caractères signalés plus hauts. La question est d'une
valeur pratique réelle. Malgré les recherches de Koch on admet
partout la possibilité de l'infection de l'homme par la tuberculose
du bœuf. Existent-ils des faits qui démontrent le même danger
du côté de la tuberculose aviaire?

Il est bien évident que pour résoudre la question il ne faut
pas s'arrêter exclusivement aux cas d'infection de l'homme. Si
d'après l'opinion des séparatistes, la tuberculose des oiseaux
possède son bacille pour elle, la présence de ce bacille chez un
mammifère, n'importe l'espèce, sera un fait bien important,
parce qu'il prouve que ce bacille n'est pas nécessairement
associé aux attributs du corps aviaire, dont notamment la
température diffère considérablement de celle du corps des
mammifères. Et, si l'on réussit a trouver un cas d'infection, il

est vraisemblable que des autres suivront. Vraiment, les récherches
des dernières années semblent vouloir prouver, qu'il est bien ainsi.

On pourrait diviser les observations en anciennes et modernes.

Peut-être les anciennes n'ont pas été élaborées toutes en
détails. Néanmoins, elles ont attiré l'attention des cercles
scientifiques et ont causé qu'on n'a pas oublié l'importance de
la question. Elles sont datées de peu de temps après 1890 et
1891, c'est-a-dire peu de temps après les recherches mentionnées
de Maffucci, de KOCH et de StrauS et GamaLEIA. Kruse (g)
réussit à isoler quatre bacilles tuberculeux, trois de l'homme
et un du bœuf, qui dans la culture et par leur action
pathogène se montraient comme des bacilles aviaires. FlSCHEL(io)
à cultivé du corps d'un singe un bacille avec les caractères
d'un bacille aviaire. Pansini (ii) encore réussit à obtenir des
bacilles aviaires des matières provenant de l'homme et du bœuf.
NOCARD (12) avait inoculé des cobayes avec des crachats
humains ; les cultures obtenues dans ce cas étaient celles de
bacilles aviaires. Et plus tôt déjà le même auteur pensait avoir
démontré (13) que la tuberculose abdominale du cheval est
d'origine aviaire, opinion qui d'ailleurs n'a pas été confirmée
encore. Puissent toutes ces observations ne pas posséder une
valeur absolue, il est néanmoins bien justifié d'en conclure que
des bacilles tuberculeux avec les propriétés du bacille aviaire
se trouveront chez des mammifères et parmi eux chez l'homme.

Les observations modernes sont faites dans l'époque des
recherches récentes sur la tuberculose, c'est-à-dire après le
Congrès de Londres en igoi. Il s'agit aussi de cas où l'on a
trouvé comme cause de la tuberculose chez des mammifères
des bacilles possédant les caractères de ceux qu'on peut isoler
ordinairement dans les cas de tuberculose spontanée des
oiseaux, notamment les gallinacés, et que j'indiquerai dorénavant
comme des bacilles aviaires.

La série est ouverte, peut-être, par une observation de moi-
même, concernant des cas de tuberculose spontanée chez des
souris blanches, examinés en 1903, et causés par des bacilles
aviaires (14). Les caractères des bacilles isolés furent examinés
avec soin aussi en ce qui concerne l'action sur de grands

mammifères, le tout en rapport avec des recherches antérieures
sur l'action des bacilles provenant de la poule chez la chèvre (15).

Aussi en 1903, WlENER {16) publia un travail sur la possi-
bilité de transformer des bacilles de cheval en bacilles aviaires,
en les cultivant en sacs de collodion dans la cavité abdominale
des poules ; c'était une imitation des expériences antérieures
de NOCARD (12). WlENER inocula aussi des poules avec ces
bacilles de cheval ; les animaux succombèrent après quelque
temps et il en isola un bacille aviaire. Il est possible que ce fait
forme un appui à une publication antérieure de NoCARD (13)
concernant la nature aviaire de la tuberculose abdominale
du cheval. Dans un autre travail j'ai analysé déjà (17) les
recherches de WlENER. En tout cas il est bien curieux que
jusqu'à maintenant on n'a pas réussi à isoler le bacille aviaire
du corps de cheval ; de même des recherches exécutées par
moi-même dans cette direction ont échoué (voir 18).

Bientôt, en 1904, RabinowitsCH confirma mes observations
concernant les souris, et isola même des bacilles aviaires du
corps du rat (19) et dans la même année Weber et BOFINGER (20)
pouvaient cultiver un bacille aviaire d'un ganglion mésentérique
casifié du porc.

Ensuite Lydia Rabinowitsch (21) publia en 1906 un cas
bien intéressant de tuberculose aviaire de V homme; il fut
découvert par l'examen d'un nombre de cas de tuberculose de
l'homme avec le but de vérifier l'opinion de KOCH. La possi-
bilité de l'infection de l'homme par des bacilles aviaires était
ainsi démontrée de nouveau. Et encore en 1906 la même
savante pouvait écrire (22) que parmi un assez grand nombre
de singes tuberculeux on en avait trouvé un qui était infecté
par le bacille aviaire, tandis que dans un autre cas on avait
isolé un bacille intermédiaire entre Vaviaire et V humain !

Après ce temps les communications se sont succédées régu-
lièrement et on a ajouté aux souris, rat, porc, homme et singe
d'autres mammifères. En 1909 StuURMAN (23) a nourri un
lapin avec les ganglions mésentériques d'une vache souffrant
d'entérite paratuberculeuse ; le bacille isolé du lapin était un
bacille aviaire. Il en dérivait la nature aviaire de cette entérite.
A ce moment on sait que l'entérite indiquée possède son propre

bacille, et l'expérience de STUURMAN peut prouver seulement
que le lapin peut avoir une tuberculose aviaire. Aussi en
1909 O. Bang (24) l'a confirmé par la description d'un cas de
tuberculose aviaire spontanée chez le lapin.

Dans l'intervalle, en 1908, j'avais publié un cas de tuberculose
congénitale du veau (25) où l'inoculation des cobayes, révélait
les altérations ordinaires de la tuberculose des mammifères
tandis que le bacille isolé fut un bacille aviaire. Ce cas bien
intéressant, montrant une contradiction entre les résultats de
l'inoculation et les propriétés de la culture, m'a donné le
conviction qu'il est impossible de séparer bien nettement le
bacille aviaire de celui des mammifères.

Quoi qu'il en soit, les cas mentionnés avaient prouvé que
bien probablement aussi le (5^?// pourrait soufïrir d'une tuberculose
causée par le bacille aviaire. D'ailleurs StuURMAN (26), toujours
en expérimentant sur l'entérite chronique, l'avait prouvé encore
par l'inoculation d'un cobaye avec de la matière provenant de
l'intestin d'une vache malade ; le cobaye obtenait un processus
localisé qui faisait isoler un bacille aviaire. Bien certainement
dans ce cas le bacille provenait du bœuf!

Il me semblait justifié d'accorder une assez grande importance
à une trouvaille faite par moi avec Keyzer en 1909 (27).
Tandis que Weber et BOFINGER avaient démontré que le
bacille aviaire peut causer chez le porc une affection tuberculose
localisée, ce qui d'ailleurs était en parfaite concordance avec
des expériences exécutées par moi chez des porcs avec des
bacilles aviaires (28), nous avons réussi à prouver par l'examen
d'un porc saisi à V abattoir de Leyde à cause de tuberculose
généralisée, que cette dernière tuberculose bien étendue fut
causée par des bacilles aviaires. Précisément l'extension con-
sidérable de la maladie permettait de démontrer d'une façon
bien nette le danger que présente la tuberculose aviaire, tandis que
les caractères de culture et l'examen expérimental ont appris,
que sans aucune doute on avait affaire à un bacille aviaire.

Dans la même année MOHLER et Washburn (29) ont relaté
que la tuberculose aviaire peut acquérir une fréquence bien
dangereuse parmi les porcs, comme l'avaient fait présumer
plusieurs cas observés en Amérique ; le fait fut confirmé par
des expériences d'ingestion. Et plus récemment encore le

danger qu'offre la tuberculose aviaire pour le porc a été
démontré par une publication de O. BANG et de RaSMUSSEN (30),
qui viennent de prouver qu'en Danemarc la tuberculose aviaire
du porc présente en effet un danger économique, parce qu'un
grand nombre d'animaux dans les mêmes élevages peuvent
être affectés, soit-il que la maladie n'est pas tellement généralisée
comme dans le cas décrit par nous.

Aussi la Commission anglaise nous a fourni des contributions
à l'étude de la tuberculose aviaire du porc (31). Parmi 26 cas
de tuberculose localisée du porc, 6 furent causés par des
bacilles aviaires. La commission estime qu'en Angleterre 10
pour 100 de la totalité des cas de tuberculose du porc est
causé par le bacille aviaire.

Dernièrement des recherches nouvelles ont confirmé la
fréquence de la tuberculose aviaire du porc. JUNACK réussit à
isoler des bacilles aviaires dans plusieurs cas de tuberculose
localisée du porc (32) et plus tard il a étudié les caractères
des cultures de quelques-uns de ces bacilles (33).

Christiansen (34) eut l'occassion d'examiner plusieurs cas
de tuberculose du porc, ordinairement de tuberculose ganglion-
naire localisée, mais aussi quelques cas de tuberculose plus
étendue. En tout, de 118 porcs, il a isolé 86 bacilles aviaires,
28 du type dit bovin, et dans les 4 cas restants des bacilles
de caractères moins typiques, cependant s'approchant du
bacille aviaire. Et aussi, chez nous en Hollande, il semble que
les cas se multiplieront comme le nouveau de M. Stuurman, à
publier bientôt, le prouvera.

L'expérience acquise en ce qui concerne la tuberculose aviaire
du porc, faisait de nouveau poser la question si vraiment aussi
chez le bœuf la tuberculose, causée par le bacille aviaire, ne
serait pas plus fréquente et plus nette qu'il ne fut le cas dans
ceux mentionnés plus haut. La réponse a été donnée par une
observation récente faite par moi avec le Dr. StuURMaN. Il
s'agit d'une vache abattue à l'abattoir de Leyde en igii et
saisie à cause d'une tuberculose générale. L'examen expérimental,
poursuivi aussi en 19 12 et 1913, comme les recherches bactério-
logiques, ont démontré nettement qu'il existait une tuberculose
aviaire. Des inoculations pratiquées chez des oiseaux, des

cobayes, des lapins, des chèvres et des veaux ne laissent
aucun doute à cet égard. Une description détaillée sera
donnée ailleurs i) ; cependant ce qui mérite bien l'attention
dans ce cas, c'est le fait que le bacille aviaire isolé du
bœuf se cultivait un peu plus sèche, un peu moins visqueuse
que les bacilles aviaires ordinaires et que sa virulence envers
la chèvre et le veau n'était pas si grande que celle des bacilles
employés dans mes expériences antérieures. Ce fait-ci me
semble avoir un intérêt spécial justement par ce qu'il est de
nouveau en contradiction avec les idées de stabilité, défendues
par d'autres auteurs, et plus spécialement par ce qu'il s'agit
d'un bacille aviaire du bœuf.

Aussi le bœuf peut souffrir d'une tuberculose grave, causée
par des bacilles aviaires, et surtout les cas de tuberculose
aviaire chez le porc et chez le bœuf nous imposent le devoir
de penser aux conséquences pratiques des infections d'une
telle sorte chez les mammifères, c'est-à-dire aussi chez V homme.

La littérature récente nous porte la preuve de cette opinion.

Déjà en 1905, avant la publication du cas de Rabinowitsch
(1906), LOEWENSTEIN a fait savoir que dans un cas de tuber-
culose sur l'homme, dont il donne une description détaillée, il
avait isolé un bacille intermédiaire entre celui des mammifères
et des oiseaux (35).

En 1910 Jancso et Elfer (36), réussirent à cultiver un bacille
aviaire d'un ganglion mésentérique d'un enfant qui avait souffert
d'une tuberculose généralisée chronique compliquée par une
méningite tuberculeuse aiguë. 11 était probable que les autres
altérations tuberculeuses que celles du ganglion furent de même
causées par des bacilles aviaires.

Mais dernièrement LOEWENSTEIN vient de donner une des-
cription de trois nouveaux cas de tuberculose aviaire chez
Vhomme\ l'examen est fait dans le laboratoire de PaltaUF (37).
Il nous rappelle le cas observé par lui autrefois, et ceux de
Rabinowitsch et de Jancso et Elfer. Sur les cas nouveaux
il dit que dans deux d'entre eux les bacilles isolés possédaient
tous les caractères du bacille aviaire ; dans le troisième la

1) J'ai donné un aperçue des différentes expériences dans la séance de la société
vétérinaire néerlandaise en Septembre 1913.

culture âtait sèche comme chez le bacille des mammifères et la
virulence du bacille différait un peu de celle du bacille aviaire.
Dans les deux premiers cas il s'agissait d'une tuberculose rénale,
dans le dernier d'altérations ulcéreuses de la peau, du tissu
conjonctif, des cavités nasales et buccales et de la muqueuse
intestinale. LOEWENSTEIN soupçonne comme cause la digestion
d'œufs provenant de poules tuberculeuses.

La série assez longue de mammifères, et parmi eux X homme,
qui peuvent souffrir d'une tuberculose causée par le bacille
aviaire preuve nettement que les bacilles de cette origine ne
se trouvent pas exclusivement chez les oiseaux. Les lésions
étendues, observées sur le porc et le bœuf, mais de même chez
l'homme, démontrent la gravité de la nature de ces infections.
Je ne veux pas m'arrêter de nouveau chez le fait que ceux qui
acceptent des différences constantes entre les bacilles des
oiseaux et des mammifères maintiennent une opinion bien res-
treinte et pratiquement bien dangereuse, tandis que pour eux
qui n'acceptent pas ces différences permanentes les cas d'in-
fection doivent être plus fréquents qu'il ne soit prouvé par les
cas où le bacille aviaire vient d'être isolé. Tout cela est nullement
nécessaire pour démontrer que les propriétés biologiques du
bacille aviaire le rendent dangereux pour Vhomme et pour les
autres mammifères; les cas mentionnés plus haut en donnent
la preuve irréfutible et l'hygiène doit en tenir compte.

Leyde, le lo décembre 1913.

LITTERATURE,

1. KocH. Die Aetiologie der Tuberkulose, Berliner Klinische Wochen-

schrift, 1882.

2. Koch. Die Aetiologie der Tuberkulose. Mitt. a. d. Kaiserlichen

Gesundheidsamte, 1884.

3. RivoLTA. Sulla tuberculosi degli Uccelli, Giorn. di Anat. e. Fisiol.,

Pisa, 1889.

4. Koch. Ueber bakteriologische Forschung. Verh. des X. Intern, med.

Congresses, 1890,

5. Maffucci. Beitrag zur Aetiologie der Tuberkulose (Hühnertuber-

kulose). Centralbl. für Allg. Path, und Path. Anat., 1890.

6. Straus et Gamaleia. Recherches expérimentales sur la tuberculose.

La tuberculose humaine, sa distinction de la tuberculose des
oiseaux. Arch, de méd, exp., 1891.

7. KocH. The combating of Tuberculosis in the Light of the Ex-

perience that has been gained in the succesful combating of
other infection diseases. British Congress on tuberculosis, 1 901 .

8. Arloing. Voir la littérature chez : D. A. de Jong. Sur la fréquence

du bacille tuberculeux du bœuf chez l'homme et sur l'incon-
stance des types du bacille de la tuberculose. Comptes rendus
du Congrès de Pathologie Comparée, Paris. 191 2, et: Revue
générale de Medicine vétérinaire, 19 13.

9. Kruse. Ueber das Vorkommen der sogenannten Hühnertuber-

kulose beim Menschen und bei Säugetieren, Ziegler's Bieträge,
Bd. XIL
IG. FiscHEL. Zur Morphologie und Biologie des Tuberkelbazillus
Berl. Klin. Wochenschrift, 1893.

11. Pansini. Einige neue Fälle von Geflügeltuberkulose bei Menschen

und bei Säugetieren. D. Med. Woch., 1894.

12. Nocard. Sur les relations qui existent entre la tuberculose

humaine et la tuberculose aviaire. Congrès de la tuberculose,
Paris, 1898.

13. Nocard. Le type abdominal de la tuberculose du cheval est

d'origine aviaire. Recueil de médecine vétérinaire, 1896.

14. De Jong. La tuberculose spontanée des souris. Rapport pour le

congrès d'hygiène et de démographie à Bruxelles, 1903. — La
tuberculose aviaire, dans : Rapports entre la tuberculose de
l'homme, du gros bétail, de la volaille et d'autres animaux
domestiques (notamment du chien). Ville Congrès de médecine
vétérinaire, Budapest, 1905.

15. De Jong. Intraveneuze injectie van vogeltuberkelbacillen bij gelten.

Herinneringsbundel, Rozenstein, Leiden, 1902.

16. Wiener. Beitrag zur Uebertragbarkeit der Tuberkulose auf ver-

schiedene Tierarten. Wiener klinische Wochenschrift, 1903,

17. De Jong. Het verband tusschen vogel- en zoogdiertuberculose .

Vétérinaire Pathologie en Hygiene, 4'^^ reeks, Leiden, 1908.

18. De Jong. Beiträge zur Klinik und zur Pathologie der Tuberkulose

des Pferdes. Vétérinaire Pathologie en Hygiene, 4*^^ reeks,
Leiden, 1908.

1 9- Rabinowitsch. Die Geflügeltuberkulose und ihre Beziehungen
zur Säugetiertuberculose, D. Med. Woch., 1904.

20. Weber et Bofinger. Die Hühnertuberkulose. Tuberkulose-Ar-

beiten aus dem Kaiserlichen Gesundheitsamte, 1904.

21. Rabinowitsch. Untersuchungen über die Beziehungen zwischen

der Tuberculose des Menschen und der Tiere (Arbeiten aus
dem Pathologischen Institut zu Berlin), 1906.

22. Rabinowitsch. lieber spontane Affentuberkulose, D. Med.

Wochenschrift, 1906.

23. Stuurman. Die spezifische hypertrophische Darmentzündung des

Rindes. Travaux du TXe Congrès international de Medicine
vétérinaire à La Haye, 1909.

24. Bang. (O.) Die Tuberkulose des Geflügels in ihren Beziehungen

zu der Tuberkulose der Säugetiere. Travaux du Congrès à
La Haye, 1909.

25. Voir: 17.

26. Voir: 23.

27. De Jong. Rapport entre la tuberculose aviaire et celle des mam-

mifères. Annales de l'Institut Pasteur, 19 10.

28. De Jong. Comptes rendus du Congrès de Budapest, 1905 (voir: 14).

29. Mohler and Washburn. The transmission of Avian tuberculosis

to Mammals. Travaux du Congrès de La Haye, 1909.

30. Bang (O.). Tuberkulöses Geflügel als Ursache von Tuberkulose

bei Schweinen. Zeitschr. f. Inf. Kr., paras. Kr. und Hygiene
der Haustiere, 191 3.

31. Royal Commission on Tuberculosis, Final Report, Part. I,

London, 1911.

32. Junack. Ueber das Vorkommen von Geflügeltuberkelbazillen

beim Schweine. Zeitschrift für Fleisch- und Milchhygiene,
15 Juni, 1913.

33. JuNACK. Idem, II Mitteilung. Le même journal, 15 März 1914.

34. Christiansen. Ueber die Bedeutung der Geflügeltuberkulose für

das Schwein. Zeitschr. für Inf. Kr., parasitaire Kr. und Hygiene
der Haust., 1913, Bd. 14.

35. Loewenstein. Ueber Septikämie bei Tuberkulose. Zeitschr. für

Tuberkulose und Heilstättenw., Bd. 7, 1905.

36. Jancso und Elfer. Vergleichende Untersuchungen mit den

praktisch wichtigeren säurefesten Bazillen. Beiträge zur Klinik
der Tuberkulose, 19 10.

37. Loewenstein. Ueber das Vorkommen von Geflügeltuberkulose

beim Menschen, Wiener klinische Wochenschrift, 19 13.

Aus dem Immunitätslaboratorium des Reichs-
saruminstituts in Rotterdam.

DIE KONGLUTINATIONSMETHODE

VON

Dr. H. E. REESER.

Die Konglutinationsreaktion verdankt ihre Entstehung dem
EHRLICH-SACHSschen Experiment (i), welches aufgestellt worden
war in der Absicht zu beweisen, dass die Hämolyse beruht auf
der Wirkung bestimmter Sensibilisatoren, welche sich sowohl
mit den Blutkörperchen als mit dem Komplement banden und
wobei diese beiden Forscher sich von 3 Faktoren bedienten,
nämlich Meerschweinchenblutkörperchen, inaktives Rinderserum
und frisches Pferdeserum. Sie konstatierten, dass die Meer-
schweinchenblutkörperchen intakt blieben in dem frischen
Pferdeserum, aber schnell hämolysierten in einer Mischung
dieses Serums mit inaktivem Rinderserum, was die Voraus-
setzung rechtfertigte, dass in dem Rinderserum ein Sensibilisator
anwesend sein würde, welcher die roten Blutkörperchen band
an das Komplement des Pferdes, wodurch die Blutkörperchen
hämolysierten. Bis soweit nichts besonders. Aber EHRLICH und
Sachs sahen auch, dass, wenn die Blutkörperchen erst mit
inaktivem Rinderserum in Kontakt gebracht wurden und darauf
das Letzte durch Zentrifugation entfernt wurde, die Hämolyse
zurückblieb, wenn die dermaszen vorbehandelten Blutkörperchen

mit frischem Pferdeserum in Berührung kamen, aus welchem
Umstand sie den Schlusz zogen, dass die cytophile Gruppe
des Rindersensibilisators nur dann in Tätigkeit treten könnte,
wenn die komplementophile des Sensibilisators voraus mit dem
Alexin verbunden war. Bei ihrem Studium über denselben
Gegenstand gelangten BORDET und Parker Gay (2) aber zu
einer ganz andern Meinung. Ihrer Behauptung nach besteht
in dem Rinderserum noch ein besonderer Stoff, welcher weder
Sensibilisator, noch Agglutinin, noch Alexin sein sollte und
welcher von allen andern bekannten Immunkörpern abweichen
sollte; er sollte das Vermögen haben die mit Sensibilisator
und Alexin geladenen Blutkörperchen zu präzipitieren, welche
Präzipitation die Hämolyse begünstigen sollte. Dieser spezielle
Stofï des Rinderserums ertragt eine Erhitzung auf 56° C. und
w^urde von B. und G. ,, colloïde de bœuf" genannt. Er präzipitiert
nur Zellen, welche voraus mit Sensibilisator und Alexin geladen
sind und diese Adsorption des ,, colloïde de bœuf", durch die
sensibilisierten und alexinierten Blutkörperchen äuszert sich
nun unter deutlich sichtbaren Erscheinungen ; die Zellen agglu-
tinieren stark zu voluminösen Klumpen und hämolysieren dann
leichter (ausgenommen in einigen Fällen). Beim Ehrlich-
SACHSschen Experiment gelang es ihnen also 4 wirksame Stoffe
nachzuweisen und zwar in dem aktiven Pferdeserum : ein
thermolabiles Komplement und einen starken gleichfalls thermo-
labilen Sensibilisator (Ambozeptor) ; in dem inaktiven Rinder-
serum : einen thermostabilen Sensibilisator und einen Stoff
albuminoider und kolloider Natur, »Colloïde de bœuf«.

Fügt man also Meerschweinchenblutkörperchen, inaktives
Rinderserum und aktives Pferdeserum zusammen, dann ver-
binden sich, nach BORDET und GAY, die Blutkörperchen mit
dem Normalsensibilisator (gleichviel ob er der thermostabile
Rindersensibilisator oder der thermolabile Pferdesensibilisator
ist) ; dieser neue Komplex zieht das Alexin an (aus dem frischen
Pferdeserum) und durch diese Bindung bekommen die Blut-
körperchen das Vermögen das »Colloïde de bœuf« anzuziehen,
welcher Stoff dann seine agglutinierende und hämolytische
Wirkung entfaltet.

Dieser letzte Stoff, von dem die Wirkung sich äuszerst in
der Agglutination der Blutkörperchen zu voluminösen Flocken,

darf nicht verwechselt werden mit den gewöhnlichen Aggluti-
ninen ; aus diesem Grunde gaben BORDET und STRENG (3)
diesem speziellen Stoffe des Rinderserums den Namen »Kon-
glutinin«, während Sie die Agglutination, welche er bewerk-
stelligte, mit dem Namen »Konglutination« bezeichneten.

Ein der Hauptargumente, welche SACHS und BAUER (4)
gegen diese Theorie von BORDET und Gay anführten, war,
dass es ihnen unwahrscheinlich vorkam, dass in dem Rinder-
serum ein spezieller Stoff anwesend war, welcher man niemals
in anderen Sera hatte nachweisen können.

In einer späteren Arbeit untersuchte STRENG (5) aber eine
grosse Anzahl andere Tier- und auch Menschensera auf ihre
konglutinierenden Eigenschaften, Ausser Ziegen- und Schafserum
kontrollierte er auch Sera von exotischen Wiederkäuern (Alpakka,
Kamel, Zebu und Antilope) und weiter Sera von Hund, Schwein,
Kaninchen, Meerschweinchen, Pferd, Katze und Taube. Es
stellte sich heraus, dass konglutinierende Substanzen nicht nur
in Rinderseris vorkommen, sondern ziemlich verbreitet sind bei den
Wiederkäuern.

Nur mit Ziegenserum bekam er keine Konglutination, was er
zurückführte auf den Umstand, dass die von ihm benutzten
Ziegen zu jung waren (Auch bei Kälbern sind die Konglutinine
weit schwächer als bei erwachsenen Rindern).

Das Antilopenserum hatte auf sensibilisierte und alexinierte
Blutkörperchen eine noch stärkere zusammenballende Eigen-
schaft als das Rinderserum und würde vielleicht noch besser als
dieses zu Konglutinationsversuchen dienen können. Hunde-,
Tauben- und Katzensera riefen keine Zusammenballung der
Blutkörperchen hervor und scheinen also keine Konglutinine zu
enthalten. Kaninchen-, Hühner-, Schweine- und Menschensera
gaben zweifelhafte Resultate^ während Pferdeserum oft ein
variables Verhalten zeigte.

Von welchem Tier das Alexin stammt ist gleichgültig, weil
man bei Verwendung von frischem Pferde-, Kaninchen- Meer-
schweinchen-, Menschen- und selbst Rinderserum dasselbe
Resultat bekommt; im letzten Falle verwendet man, an Stelle
des inaktiven Rinderserums, frisches Rinderserum allein.

Auch die Herkunft der Blutkörperchen ist belanglos. STRENG
verwendete nicht nur Meerschweinchen- und Rinderblutkörper-

chen, sondern auch Ziegen- und Pferdeblutkörperchen. Gewöhn-
lich wird, wie schon mitgeteilt wurde, nach der Konglutination
der Blutkörperchen Hämolyse wahrgenommen.

Eine Eigentümlichkeit in dieser Hinsicht zeigten Ziegen- und
Hammelblutkörperchen, welche zwar stark zusammenballen,
aber nicht hämolysiert werden, was BORDET und STRENG
zurückführen auf den Umstand, dass Rind, Schaf und Ziege
mit einander verwandt sind. So hämolysiert auch Rinder-
komplement nicht oder nur äuszerst schwach die Blutkörperchen
von Schaf und Ziege, wenn diese Blutkörperchen geladen sind
mit einem spezifischen, hämolytischen Immumserum.

In seinem Studium über das Verhalten des Rinderserums
den Mikroben gegenüber (Versuch einer neuen serodiagnosti-
schen Methode) forschte STRENG (6) nach, welche Wirkung
inaktives Rinderserum und aktives Pferdeserum auf Bakte-
rien ausübten, mit andern Worten, ob sensibilisierte und
alexinierte Mikroben von Rinderserum ausgeflockt wurden. Auch
die Mikroben nehmen, wie bekannt, das Alexin unter der
Bedingung auf, dass sie erst mit einem entsprechenden, Sensi-
bilisatoren enthaltenden Serum, sensibilisiert worden sind. Die
Alexinabnahme kann in Vitro nicht direkt makroskopisch
gesehen werden ; nur indirect, durch die Komplementbindungs-
methode, ist es mögUch gewesen, in Vitro, die Alexinaufname
der Mikroben nachzuweisen.

Wenn man zeigen könnte, dass Rinderserum nur solche
Mikroben, welche mit entsprechenden ImmunsensibiUsatoren
und mit Alexin vorbehandelt sind, ausflockt, ganz wie die
Blutkörperchen, so würde man im Rinderserum ein Reagens
haben, mit Hilfe dessen man, mit bekannten Mikroben, die
Diagnose eines unbekannten Immunserums direkt in Vitro
makroskopisch stellen könnte und womit andererseits mit be-
kanntem Serum unbekannte Mikroben identifiziert werden könnten.

In diesem Fall würde die Konglutinationsreaktion einen
praktischen Wert haben, weil sie der Serodiagnostik dienstbar
gemacht werden könnte.

Streng experimentierte unter andern mit Typhusbazillen und
Colibazillen und konnte mit dieser Reaktion sehr gut einen
Unterschied zwischen diesen beiden verwandten Bakterien
nachweisen.

Fügte er zusammen Typhusbazillen a (siehe Fig.) mit inaktivem
Typhusimmunserum b und Alexin c (z.B. eines Meerschweinchens)
so wurden die Bazillen sensibilisiert und alexiniert und zogen
das Konglutinin d aus
dem inaktiven Rinder-
serum an, was makros-
kopisch sichtbar wurde
durch die Zusammenbal-
lung, das Konglutinieren «
der Typhusbazillen. Liesz /
er einen der genannten «
Faktoren weg oder er- ♦ ^'

setzte er das Typhus- ^ • ^ . « - '^ '
immumserum durch Coli-
immunserum, so blieb die Konglutination zurück.

Er gelangte dann auch zu der Überzeugung, dass die Kon-
glutination, ebenso wie die Agglutination, eine spezifische
Reaktion war und zu diagnostischen ZAvecken sehr gut benutzt
werden könnte.

Diese Zusammenballung der Mikroben ist nicht mit der
Agglutination zu verwechseln ; die Konglutinine lassen sich
unter anderm, durch Dialyse von den Agglutininen trennen ;
Agglutinine des Rinderserums bleiben nach 24 stündiger Dialyse
noch gelöst in dem Serum, während die bei der Dialyse zurück-
bleibenden Stoffe, die Konglutinine enthalten. Auch zeigte sich,
dass die Gegenwart von Alexin, welche für das Entstehen der
Zusammenballung der Mikroben eine conditio sine qua non
war, auf die Agglutinationserscheinung hindernd wirkt.

Die Konglutination ist also nicht als ein Ausdruck für die,
durch Sensibilisierung und Alexinaufnahme vergrösserte Emp-
findlichkeit der Mikroben, gegen die Agglutinine des Rinder-
serums, zu verstehen.

Konnte STRENG, wie oben mitgeteilt wurde, mit dieser
Reaktion Typhus- und Colibazillen von einander unterscheiden,
es gelang ihm auch, obgleich die Anzahl der diesbezüglichen
Versuche gering war, nachzuweizen, dass diese Reaktion bei
der Typhusdiagnose der GRÜBER-WiDALschen Reaktion ähnlich
war. Zwischen normalem und tuberkulösem Rinderserum konnte
er keine Differenz nachweisen ; ebenso wenig gelang ihm dies

zwischen normalem und tuberkulösem Menschenserum. Die
weiter von ihm untersuchten Mikroben (B. tuberculosis, B.
diptheriae, V. cholerae und Staphylococcus pyogenes) gaben
alle mit Immunsensibilisatoren, Alexin und normalem Rinder-
serum ein positives Resultat. Ob er zu diesen Versuchen
lebende oder abgetötete Bakterien verwendete änderte nichts
an dem Befund.

Nach Streng wurde diese Reaktion von mehreren andern
Forschern zu diagnostischen und andern Zwecken benutzt.

So untersuchte COHEN (7) mit Hilfe dieser Methode den
Unterschied zwischen dem Influenzabazillus von PFEIFFER und
drei morphologisch und kulturell ähnlichen Bazillen, welche er
kultivierte bei der septichaemischen Form von Cerebrospinal-
meningitis. Er erzielte befriedigende Resultate. GAY und LUCAS (8)
gebrauchten die Reaktion für die Dysenteriediagnose, SwiFT
und ThrO (9) um Streptotokken nachzuweisen, LUGER (10)
um Typhus- und Paratyphusbazillen, Dysenteriebazillen und
Choleravibrionen zu determinieren, während SaULI (11) mit Hilfe
dieser Methode, welche in vielen Fällen zuverlässiger war als
die Präzipitation, das Eiweiss mehrerer Planzenarten zu differen-
zieren wusste (Versuche mit Erbsen, Bohnen, Rüben, Klee).

Zur Syphilisdiagnose wurde die Reaktion von STRENG (12)
angegeben, in seinem Vortrag für die Finnländische Akademie
der Wissenschaften (1909 und 19 10) und am ersten ausgear-
beitet von KarvonEN (13). Ein Organextrakt (alkoholischer
Rinderherzextrakt) wurde mit dem zu untersuchenden Serum
und Pferdekomplement zusammengebracht. Nach einiger Zeit
wurden Rinderserum und Meerschweinchenblutkörperchen hin-
zugegeben. Tritt keine Konglutination ein, so ist Komplement
in der ersten Phase absorbiert worden, d. h. das Serum
reagiert positiv.

Aus Grund seiner Untersuchung mit 552 Sera meint Kar-
VONEN diese Reaktion als eine komplettierende Nebenmethode
der Komplementbindung bezeichnen zu können.

SiEBERT und Mironesen (14) haben es unternommen, diese
Reaktion bei Syphilis an einer Anzahl von Seris (100) nachzu-
prüfen. Hiervon waren 15 normale Sera, die in Uebereinstimmung
mit der Wa. R. immer ein negatives Resultat gaben. Die
übrigen 85 Fälle stammten von luetischen Patienten und von

diesen ergaben lo Fälle mit Wa. R. Differenzen ; acht Patienten
hatten hiervon sichere Luesanamnese. Die genannten Forscher
gaben darum die Syphilisreaktion nach Karvonen an neben
der Original-Wa. R.

Auch Hecht (15) forschte den Wert dieser neuen Methode
bei der Syphylisreaktion nach und kontrollierte dieselbe ebenso
mit der Komplementbindungsreaktion; er erzielte mit 150 Seris
ungefähr ähnliche Resultate, aber konnte auch die Reaktion
der Wa-R. nicht vorziehen, weil das Ablesen der Resultate
bei der Konglutination weit schwerer war als bei der Komple-
mentbindung.

Zu ähnlichem Resultat gelangte JaCOBAEUS (16), der statt
Meerschweinchenblutkörperchen Schaf blutkörperchen gebrauchte.
Ueber das Ergebnis weiterer und sehr ausgedehnter Unter-
suchungen hat Streng (17) zusammenfassend berichtet. Er
untersuchte mehr als 1000 Sera und hat dabei die Resultate
in 80 — 95% mit denen der WASSERMANschen Reaktion über-
einstimmend gefunden.

Zur Diagnose der Rotzkrankheit wurde diese Methode am
ersten von PFEILER und WEBER (18, ig, 20) angegeben.

In ihrer ersten Publikation teilen sie ihre Erfahrung mit der
neuen serodiagnostischen Methode mit bei 8 Pferden, wobei
sie die Methode kontrollierten mit der Agglutination und der
Komplementbindung. Das Resultat war vortrefflich. In der
zweiten Mitteilung ist die Rede von Bazillenkonglutination bei
Malleus, welche Reaktion von ihnen nicht so zuverlässig ge-
funden wurde als die Blutkörperchenkonglutination. Die dritte
Arbeit der genannten Forscher betrift wieder die Verwendung
dieser letzten Reaktion.

Bei 45 rotzfreien Pferden (erste Gruppe) fiel die Reaktion
negativ aus, ebenso wie die Agglutination und die Komplement-
bindung.

In der zweiten Gruppe handelte es sich um 45 Sera von
Pferden, die auf Grund der Ergebnisse der Agglutinations- und
Komplementbindungsmethode als rotzverdächtig bezeichnet
werden mussten und die sich, bei der auf Grund davon
vorgenommenen Tötung, auch als sicher rotzig erwiesen
hatten. Diese 45 Sera gaben alle mit der Konglutination und
der Komplementbindung positive Resultate ; mit der Agglutina-

tion erzielte man nur in 500/0 der Fälle ein positives Resultat.

Die dritte Gruppe enthielt die Pferde, von denen das Serum
mit der Agglutination und der Komplementbindung unsichere
Resultate gegeben hatte und gerade in diesen Fällen, die
schw^ersten für die Beurteilung, ergab die Konglutination, in
Zusammenhang mit der Sektion, sicherere Resultate als die
Komplementbindung.

Zugleich stellte sich heraus, dass durch Malleïnisation bei
gesunden Pferden Anti-Konglutinine entstanden, weil die
Reaktion nach der Malleïnprobe positiv ausfiel.

Auch Stranigg (21), der die Konglutination bei Malleus
noch feiner ausarbeitete, erzielte sehr schöne Resultate mit 82
Seris, aber konnte die Reaktion der Komplementbindung nicht
vorziehen.

Ehe ich mit der Schilderung meiner Versuche mit dieser
Reaktion anfange, will ich erst noch die Technik der Konglu-
tinationsmethode behandeln, d.h. die erforderlichen Stoffe und
deren Prüfung. Die Technik der Konglutinationsmethode ist
der Komplementbindungsreaktion sehr ähnlich ; der Unterschied
zwischen diesen beiden Reaktionen ist hauptsächlich, dass als
Index bei der hier genannten Reaktion, statt der Hämolyse,
die Zusammenballung der roten Blutkörperchen gebraucht wird.
Zur Ausführung sind die folgenden Flüssigkeiten nötig:
i) Komplement, wozu bei dieser Methode frisches Pferde-
serum gebraucht wird, das noch an demselben Tage entnommen
wurde.

2) Das zu untersuchende Serum, welches erst durch Erhitzung
in einem Wasserbad (V2 Stunde auf 56° C.) seines Komplements
beraubt werden muss.

3) Ein mit dem zu untersuchenden Serum korrespondierender
Bazillenextrakt.

4) Inaktives Rinderserum (V2 Stunde auf 56° C.) als kon-
glutininhaltender Stoff.

5) Blutkörperchenaufschwemmung. Dazu gebrauchte ich,
ebenso wie bei der Komplementbindung, defibriniertes und
darauf dreimal gewaschenes Schafblut.

Um Irrtümmern vorzubeugen empfiehlt es sich bei jedem
Versuch als Kontrolle ein sicher positives und ein sicher

negatives Serum zu gebrauchen. Ebenso wie bei der Komple-
mentbindung der Fall ist, müssen auch hier die verschiedenen
Flüssigkeiten, ehe der eigentliche Versuch angesetzt wird,
titriert werden. Auch diese Reaktion ist streng quantitativ;
wenn man eine zu grosse oder zu kleine Dosis nimmt, verliert
die Reaktion ganz und gar ihren Wert.

I. Titrierung des Komplements.

Um die kleinste Dosis des frischen Pferdeserums (Komple-
ment) zu bestimmen, fügt man einer sicher genügenden
Quantität inaktiven Rinderserums abnehmende Quantitäten
des Komplements zu, füllt mit physiologischer Kochsalzlösung
an zu bleichen Volumina und füoj't, nachdem die Röhrchen i
Stunde bei 37° C gestanden haben, 3 Tropfen 5% Hammel-
blutkörperchenaufschwemmung zu. Nachdem die Röhrchen 4
Stunden bei 37° C. gestanden haben, liest man die Reaktion ab.

Zur Kontrolle nimmt man ein Röhrchen (No. 8), in dem sich
nur eine ziemlich grosse Quantität Komplement befindet und
kein inaktives Rinderserum, um zu demonstrieren, dass das
Pferdeserum allein nicht konglutinierend wirkt; ein Röhrchen

TABELLE L

No.

Inaktives
Rinderserum.

Komplement.

Physiol.
Na Cl lösunjj.

5 % Hammel-
blutaufschw.

Befund.

0 . I cM'^.

0 . 1 cTvI^.

3 Tropfen.

0.08 »

0.06 »

0
S
_2

4
5

»
»

0 . 04 »
0.02 »

S
0
ja
0

»
»

+
-±i

O.Ol »

■53

'So

0.005 »

—

0. 06 »

c
<1

—

0 . 1 cM^.

—

(No. g) um nachzuweisen, dasz inaktives Rinderserum allein ebenso
wenig konglutinierend wirkt, während Röhrchen No. lo den
Beweis liefert, dass auch die Hammelblutkörperchen nicht von
selbst konglutinieren.

Aus hervorgehender Tabelle I geht solches hervor.

Eine schöne Konglutination wurde beobachtet in den Röhr-
chen 1, 2, 3 und 4; in 5 und 6 war die Reaktion zweifelhaft,
während in No. 7, ebenso wie in den 3 Kontrolleröhrchen, die
Reaktion negativ ausfiel. Die minimale Quantität Komplement
lag hier bei 0.04 cM^. Bei dem zweiten Vorversuch und dem
eigentlichen Versuch wurde nun gearbeitet mit ein wenig grös-
serer Quantität, (in diesem Fall 0.06 cM^). Nimmt man zweimal
die minimale Dosis, so bekommt man, ebenso wie bei der
Komplementbindung (Siehe meine Abhandlung in der Folia
Microbiologica, 1 Jahrgang, Heft 3) einen Überschusz von
Komplement und demzufolge ändern die schwach positiven
Fälle sich in negative.

Nimmt man die richtig minimale Quantität, so läuft man
bei dem eigentlichen Versuch Gefahr, dass "diese Dosis zu klein
ist, denn das zu untersuchende Serum und der Extrakt binden
oft selber ein weinig Komplement, während man auch den
Umstand berücksichtigen muss, dass der Titer des Komplements,
in den Stunden, welche noch verlaufen, ehe man mit dem
eigentlichen Versuch anfängt, ein wenig zurückgehen.

II. Titerstelliing des inaktiven Rinderserums.

Wenn man bei der ersten Titrierung die minimale Quantität
des Komplements bestimmt hat, so muss bei dem zweiten
Vorversuch die minimale Quantität des inaktiven Rinderserums
festgestellt werden, welche mit der bestimmten Quantität des
Komplements noch gerade Konglutination gibt.

Diese Titrierung, mit der erforderlichen Kontrolle, wird im
Tabelle II angegeben.

Die Zufügung der verschiedenen Flüssigkeiten und das Hin-
stellen in den Brutschrank bei 370 C, geschah in derselben
Weise als in Tabelle I mitgeteilt worden ist.

TABELLE II

No.

Inaktives
Rinderserum.

Komplement.

Physiol,
NaCl lösung.

5 % Hammel-
blutauf:^chw.

Befund,

0.05 cM*.

0 . 1 c]\I^

3 Tropfen.

0 . 08 »

0.06 »

0 . 04 »

5
6

»
»

0.02 »
0 . 0 1 »

>
S

»
»

0.005 »

±:

8
9

»
»

0.003 *

»
»

—

0.06 cM.

—

0.04 cM.

0 . 1 cM3.

Die minimale Quantität inaktiven Rinderserums, welche mit
der bestimmten Quantität des Komplements noch eine positive
Konglutination gibt, ist hier 0.02 cM^. Der Umstand, dass die
zu verwendende Dosis möglichst dicht bei der minimalen liegen
muss, was für das Komplement ein Haupterfordernis ist, hat
hier gar nicht so viel Gewicht, Ein Überschusz von Rinderserum
hat bei weitem nicht solche nachteilige Erfolge als ein Über-
schusz von Komplement. Zu dem eigentlichen Versuch benutzte
ich denn auch immer die doppelte minimale Quantität, hier
also 0,04 cM.3.

Obgleich man die Komplementdosis für jeden Versuch aufs
neue bestimmen muss, so ist bei dem inaktiven Rinderserum
die bestimmte Dosis mehr konstant; wie mitgeteilt wird, ist
diese Dosis nach einigen Wochen noch zu gebrauchen. Dennoch
geht, wie ich zeigen werde, die Konglutinindosis zurück.

III. Titrierung des Extraktes.
Da es eine bekannte Tatsache ist, dass die grösseren Dosen

der verschiedenen Extrakte allein schon Komplement binden
und also die Konglutination hemmen können, so ist est not-
wendig voraus die Quantität des Extraktes zu bestimmen, welche
allein nicht mehr hemmend wirkt. Gewöhnlich wird bei der
Komplementbindung die Hälfte dieser Dosis als Titer verwendet ;
darum gebrauchte ich bei der Konglutination ebenso diese
Quantität.

IV. Titrierung der Blutkörperchenanfschtvemmung.

Dieser Vorversuch, welcher bei der Komplementbindung aus-
bleiben kann, ist hier viel wichtiger. Man arbeitet hier nämlich
mit weit kleineren Dosen, sodass die Unterschiede in der Zahl
der roten Blutkörperchen pro c.M^. schärfer hervorkommen.

Es ist darum notwendig, wenn man eine neue 50/0 Blutauf-
schwemmung gemacht hat, diese zu titrieren, hinsichtlich der
bestimmten Quantität des inaktiven Serums.

Zu diesem Zweck bringt man zusammen, auszer der Titer-
dosis des Konglutinins, Komplement (des Pferdes) und abnehmen-
de Quantitäten einer 50/^ Hammelblutkörperchenaufschwemmung.

Das erste Röhrchen, dass eine vollständige Konglutination
zeigt, enthält den Titer der Blutkörperchenaufschwemmung.

Verfügt man aber über ein Schaf, dem man wöchentlich nur
ein wenig Blut entnimmt, in welcher günstigen Lage ich mich
am Reichsseruminstitut befand, so kann man, ohne schädliche
Erfolge, immer mit derselben Blutkörperchen-Quantität arbeiten.
Die Dosis, welche ich für meine Versuche gebrauchte, war 3
Tropfen einer 50/^ Aufschwemmung.

Weiss man, auf obenerwähnte Weise, über die S^'ärke der
verschiedenen Flüssigkeiten, Bescheid, so kann man mit dem
eigentlichen Versuch anfangen, der, wie schon mitgeteilt wurde,
der Komplementbindung sehr ähnlich ist. Auch hier ist das
Komplement der Index ; aber die Hämolyse wird bei der
Konglutination durch die Zusammenballung der roten Blutkör-
perchen ersetzt.

Ich habe diese Reaktion verwendet bei Malleus, Abortus der
Rinder und Syphilis. In den beiden ersteren Fällen kontrol-
lierte ich dieselbe mit der Komplementbindung und der Agglu-
tination, in dem letzten Falle nur mit der Komplementbinding.

A. Konglufination bei Malleus.

Zur Untersuchung auf Malleus konnten, wegen des spora-
dischen Auftretens dieser Krankheit in unsrem Lande, nur
7 Sera bekommen werden.

Drei dieser Sera stammten von Pferden des Furhrherrn L. in
Rotterdam ; diese Pferde reagierten auf die subkutane Mallein-
injektion und auf die Ophtalmoreaktion in sehr typischer Weise.
Ein wenig Blut dieser Pferde wurde genommen und auf Agglu-
tination und Komplementbindung untersucht. Beide Reaktionen
waren schön positiv. (Serum II am stärksten und Serum III am
schwächsten).

Wie verhielten die Sera I, II und III sich nun zu der Kon-
glutinationsreaktion ?

Bei dem ersten Vorversuch, der Einstellung des Komplements,
ergab sich, dass die minimale Quantität des Komplements,
welche nötig war um 3 Tropfen einer 5 % Aufschwimmung von
Hammelblutkörperchen, mit einer gewissen Dosis konglutinierenden
Serums zu konglutinieren, 0.04 cM^. war.

Bei dem zweiten Vorversuch und dem eigentlichen Versuch
arbeitete ich mit 0.06 cM^.

Die Titrierung des inaktiven Rinderserums (2er Vorversuch)
gab als minimale Dosis o.oi cMs. an; gearbeitet wurde mit
0.02 cM^.

Der eigentliche Versuch.

Als Rotzbazillenextrakt gebrauchte ich Malleine brute und
weil dieser Stoff in grösseren Dosen schon von selbst bindend
wirkt, so musste voraus die Quantität bestimmt werden, welche
nicht mehr hemmend wirkte. Es stellte sich heraus, dass diese
Quantität o.ooi cM^. war; die Hälfte dieser Dosis (0.0005 cM^.)
wurde als Titer verwendet.

Nun fügte ich der bestimmten Titerdosis des Extraktes
abnehmende Quantitäten der zu untersuchenden Sera zu, nebst
der bei dem ersten Vorversuch bestimmten Quantität Komple-
ment, füllte mit physiologischer Kochsalzlösung an zu gleichen
Volumina und stellte die Röhrchen i^ Stunde bei 37 0 C.

Es versteht sich, dass bei diesem Versuch die benötigte Kon-

Malleus-

Zu unter-

Physiolo-

S^/oHammel-

No.

Komplement

extrakt

suchende

gische Na Cl

blutauf-

Inaktives
Rinderserum

Befund.

(Mallein)

inaktive Sera

lösung

schwemm.

0.06 cM.3

0.0005 ^^^-^

0,1 cM.3l

3 Tropfen

0,02 cM.3

keine Kongluünation

0,08 » »

» »

0,06 » »

» »

0,04 » »

» »

0,02 » »

teilweise »

0,01 » »

Konglutination

0,005 » »

0, 1 » II

keine Konglutination

0,08 » »

» »

0,06 » »

» »

0,04 » »

» »

0,02 » »

» »

0,01 » »

» »

0,005 * *

teilweise »

0,1 » m

keine Konglutination

0,08 » »

» »

0,06 » »

» »

0,04 » »

teilweise »

0,02 » »

» »

20
21

»
»

0,01 » »
0,005 * >>

»
»

Konglutination
»

0,002 »

—

keine Konglutination

0,001 »

—

0
>

Konglutination

0,0005 »

—

0, 1 » I

— •

0,04 » »

—

0,1 » II

—

0,04 » »

—

0,1 »m

—

0,04 » »

—

0,001 cM.3

0,1 I

keine Konglutination

—

0,0005 »

0,1 I

» »

—

0,001 »

0,1 II

» »

—

0,0005 »

0,1 II

» »

—

0,001 »

0,1 III

» »

—

0,0005 »

0,1 III

» »

—

» »

0,06 C]\1.3

—

Konglutination

0,06 »

Inaktives

Normal

Serum-Pferd.

keine Konglutination

0,0005 cM.3

0,1 cM.3

0,02 cM.'

Konglutination

o;o8 »

0,06 »

0,04 »

0,02 »

0,0 1 »

0,005 »

—

0,1 »

—

0,04 »

—

q,ooi cM.3

0,1 »

keine Konglutination

0,0005 »

0,1 »

» »

—

0,001 »

—

» »

—

0,0005 »

—

» »

—

0,1 »

» »

trolle aufgenomme wurde, hinsichtlich welcher Kontrolle auf
hervorstehende Tabelle verwiesen werden kann.

Nachdem die verschiedenen Flüssigkeiten in den Röhrchen
1I/2 Stunde bei 37 » C. auf einander eingewirkt hatten, wurde
jedem der Röhrchen 3 Tropfen einer 5 % Hammelblutkörperchen-
aufschwemmung und die Titerdosis des Rinderserums {0.02 cM 3.)
zugefügt, die Röhrchen gut geschüttelt und wieder bei 37 0 C.
gestellt, aber nun während 4 — 6 Stunden. Nachdem die Röhrchen
8 Stunden bei Zimmertemperatur verweilt hatten, wurde das
Resultat abgelesen.

Es wird mit abnehmenden Quantitäten der zu untersuchenden
Sera gearbeitet, weil Pferdeserum oft schon spontan hemmende
Stoffe enthält. Um diese nicht spezifischen Stoffe auszuschalten
(1/2 Stunde erhitzen auf 56° C. genügt nicht) muss man die-
jenige Quantitäten der Sera gebrauchen, welche nicht mehr
von selbst hemmend wirken. Aus diesem Grunde verwendet
man die abnehmende Dosis der zu untersuchenden Sera, wo-
durch eine vorhergehende Titrierung unnötig ist.

Gewöhnlich aber beobachtet man die nicht spezifische
Hemmung der Sera erst in Dosen über 0,2 cM^.

Aus hervorstehender Tabelle geht hervor, dass alle 3 zu unter-
suchende Sera mit Malleusextrakt Komplement binden und
man also mit Malleusseris zu tun hat. Ein ganz analoges
Resultat also als mit Komplementbindung und Agglutination
erzielt wurde.

Serum II, das bei der Komplementbindung und Agglutination
am stärksten positiv war, war dies auch bei der Konglutination,
während Serum III, das bei der Komplementbindung und
Agglutination am schwächsten war, hier ein Resultat in gleichem
Sinne gab.

Normalserum gab mit Malleusextrakt gar keine Hemmung
der Konglutination (Kontrolle 40 — 47). Die übrigen Kontroll-
proben sprechen genügend für sich selbst ; es stellte sich heraus,
dass das Malleusextrakt in der Dosis von 0,002 cM^. schon von
selbst hemmend wirkte (Kontrolle 22) ; unter dieser Dosis aber
nicht mehr (Kontrolle 23 und 24) ; die benutzten Sera wirkten
ohne Extrakt nicht hemmend (Kontrolle 25 — 31). Kontrolle 39
gibt an, dass frisches Pferdekomplement (0,06 cM^.) ohne
Rinderserum, nicht konglutinierend wirkt auf Hammelblut-

körperchen, ; dennoch soll Pferdeserum (STRENG (5) teilt es mit)
ebenso wie Rinderserum, neben Agglutinine auch Konglutine
für Meerschweinchenblutkörperchen enthalten , sodass auch
frisches Pferdeserum allein vielleicht Hammelblutkörperchen
zusammenballen könnte. Am Ende meines Artikels komme ich
hierauf in einem besonderen Abschnitt, über die Wirkung
mehrerer Sera auf verschiedene Blutarten, zurück.

Ausser diesen 3 Seris von Pferden von einem Fuhrherrn,
wurden noch an verschiedenen Zeiten 4 Sera auf Malleus
untersucht und zwar von 4 verschiedenen Fällen. Zwei dieser
Sera (I und III) gaben mit der Komplementbindungsreaktion
und mit der Agglutination ein positives Resultat ; die beiden
anderen (II und IV) waren mit beiden Reaktionen negativ. Die
Konglutinationsreaktion mit diesen 4 Seris fand ganz in der
obenerwähnten Weise statt. Auch jetzt wurde als Malleus-
extrakt Malleïn brute gebraucht, von dem die Quantität bei
Titrierung wieder auf 0,005 cM^. bestimmt wurde. Die zu ver-
wendende Dosis des Komplements und die Quantität inaktiven
Rinderserums wurden für jeden Versuch besonders festgestellt.
Hinsichtlich des weiteren Verlaufs des Versuchs kann auf die
erste Tabelle verwiesen werden. Die mit der Konglutinations-
reaktion erzielten Resultate, waren auch mit diesen 4 Seris
ganz dieselben als mit der Komplementbindung und der
Agglutination; I und III waren positiv; II und IV negativ.

Normalserum gab in keinem der 4 Fälle ein positives Resultat.

Obgleich ich also nur eine ziemlich geringe Zahl von Malleus-
fällen mit der Konglutinationsreaktion untersucht habe, so wage
ich es dennoch, mit Rücksicht auf die analogen Resultate mit
den beiden andern Methoden, diese neue Reaktion in geeigneten
Fällen (bei Malleus) neben den beiden andern, zu empfehlen.

B. Konglutination bei Syphilis.

Meine Untersuchungen mit dieser Reaktion bei Syphilis
beziehen sich auf 25 Fälle. Die zu diesen Versuchen erforder-
lichen Sera wurden mir wohlwollend verschafft von Dr. J. F. Maas,
Hautarzt in Rotterdam, der mir auch von jedem Serum das
Resultat der Komplementbindungsreaktion mitteilte.

Als Syphilisextrakt benutzte ich das bekannte alkoholische
Meerschweinchenherzextrakt, von dem ich zuvor die hemmende
Wirkung bestimmte; 0,2 cM^ war die kleinste Dosis, welche
Eigenhemmung zeigte ; bei den Versuchen gebrauchte ich daher
die Hälfte dieser Dosis. Das zu untersuchende Serum fügte ich
in abnehmenden Quantitäten hinzu. Bei dem Vorversuch stellte
ich heraus, dass die erforderliche Quantität des Komplements
(frisches Pferdeserum) 0,05 cM.^ war. Nachdem die verschie-
denen Röhrchen 1 1/2 Stunde bei 37° C. gestanden hatten,
wurden die voraus bestimmte Dosis inaktiven Rinderserums
(0,02 cM.'^) und 3 Tropfen einer 50/0 Hammelblutaufschwemmung
(dreimal gewaschen) hinzugefügt ; darauf wurden die Röhrchen
5 Stunden bei 37° C. hingestellt und nach 10 Stunden oder
eher das Resultat abgelesen.

Aus untenstehender Tabelle geht der Versuch mit der nötigen
Kontrolle deutlich hervor.

Das zu unter-

5*/oHammel-

Inaktives
Rinder-
serum.

No.

Komple-
ment

Syphilis-
extrakt

suchende

inaktives

Serum

Phys. Na Cl

biut-Auf-

schwem-

mung.

Befund

0,05 cM.3

0,1 cM.3

3 Tropfen

0,02 cM.3

keine Konglutination

0,09 »

» »

0,08 »

» »

0.07 »

» »

0,06 »

» »

0,05 »

» »

0,04 »

» »

0,03 »

» »

0,02 »

teilweise »

0,01 »

Konglutination

0,2

—

keine Konglutination

0,15

—

Konglutination

o.i

—

0,1 »

.-.

—

0,08 »

—

0.06 »

»7

—

0,04 »

—

0,02 »

Ï9

—

0,01 »

—

0,2

—

::3

keine Konglutination

0,15

—

V.I

» »

0,1

—

C
<

» »

—

0,1 »

» »

—

0,08 »

» »

—

0,06 »

» »

0,2

0.1 »

» »

0,2

0,08 »

» »

No.

Komple-
ment

Syphilis-
extrakt

Normales

inaktives

Menschen-

serura

Phys. Na CI

S^/oHammel-

blut-Auf-

schwem-

mung

Inaktives
Rinder-
serum

Befund

0,05 cM.3

0,1 cM.3

0, 1 cM.3

3 Tropfen

0,02 cM.3

nglutination

0,09 »

0,08 »

0,07 »

0,06 »

0,05 »

0,04 »

0,03 »

0,02 »

0,0 1 »

—

0,1 »

—

0,08 »

0
>

—

0,06 »

—

0,04 »

—

0,02 »

—

0,01 »

—

0,1 »

keine

Konglutination

—

0,08 »

—

0,06 »

—

0,2

0,1 »

—

0,2

0,08 »

Zu unter-
suchendes
Serum

0,05 cM.3

0,1 cM.3

0. 1 cM.3

S
<

—

0,06 »

—

0,02 »

Normal-
serum

»
»
»
»

0,1 cM.3

—

0,06 »

—

0,02 »

—

Das zu untersuchende Serum, das von einem Patienten mit
secundärer Syphilis stammte, hatte, wie Dr. MAAS mir mitteilte,
mit der Komplementbindungsreaktion ein stark positives Resultat
gegeben. Auch bei der Konglutinationsreaktion wurde ein stark
positives Resultat erzielt. Es stellte sich ja heraus, das dieses
Serum, bis in der Menge von 0,02 cM^,, noch imstande war
den Eintritt der Konglutination zu hemmen (No. I — X). Mit
normalem Menschenserum tratt eine schöne Konglutination ein
(No. 29—39).

Ohne Komplement (21 — 2g und 45 — 50) und ohne inaktives
Rinderserum (51 — 56) blieb Konglutination aus. Auch die
übrigen Kontrollversuche fielen gut aus.

Hier wurde also ein analoges Resultat erzielt sowohl mit der
Konglutinations- als mit der Komplementbindungsreaktion. Dies
war aber nicht der Fall mit allen untersuchten Seris.

Um kurz zu sein und zu gleicher Zeit eine deutliche Über-
sicht der Versuche zu geben, scheint es mir erwünscht diese,
die Diagnose und die Resultate, in einer Tabelle zusammen-
zufassen und hier unten anzugeben. Die Untersuchung bezog
sich, wie schon mitgeteilt wurde, auf 25 verschiedene Sera.

Resultat der

Serum.

Diagnose.

Komplementbindungs-

Konglutinations-

reaktion.

Syphilis.

keine »

—

III

» »

—

» »

—

Syphilis.

schwach -f

schwach -(-

—

VII

VIII

zweifelhaft.

schwach -|-

schwach +

keine Syphilis.

—

Syphilis.

schwach +

—

XII

keine »

XIII

» »

—

XIV

Syphilis.

XVI

keine »

— ,

XVII

zweifelhaft.

sehr schwach -f

—

XVIII

Syphilis.

XIX

XXI

XXII

schwach -|-

schwach +

XXIII

—

XXIV

keine Syphilis.

—

XXV

» »

—

Mit + Konglutinationsreaktion wird gemeint, dass das zu
untersuchende Serum positiv war, sodass in den betreffenden
Röhrchen keine Zusammenballung der Blutkörperchen zu beob-
achten war; umgekehrt, also wenn das Serum negativ ist, so
wird wohl Konglutination beobachtet.

Wenn die Resultate der Komplementbindung und der Kon-
glutination mit einander verglichen werden, so stellt sich heraus,

dass mit den 25 untersuchten Seris in 20 Fällen, ein gleich-
lautendes Resultat erzielt wurde. In 5 Fällen wichen die mit
beiden Reaktionen bekommenen Resultate von einander ab ;
die Sera 6, 9 und 23 gaben, der Diagnose gemäss, mit der
Komplementbindung ein positives Resultat, aber mit der Kon-
glutination ein negatives.

Um ganz sicher zu sein untersuchte ich nun selbst diese
drei Sera mit der Komplementbindungsreaktion, hinsichtlich
desselben Extraktes, das ich für die Konglutination gebrauchte.
Auch ich erzielte bei diesen 3 Seris mit der Komplementbindung
ein positives Resultat. Die beiden andern Abweichungen in den
Reaktionen sind von weniger Wichtigkeit.

Serum X gab ein schwach positives Resultat mit der Kom-
plementbindung, indem die Konglutinationsreaktion deutlich
positiv war (Diagnose Syphilis) ; Serum XVII, das von einem
Patienten stammte, von dem die Diagnose nicht mit Gewissheit
zu stellen war, gab mit der Konglutinationsreaktion ein nega-
tives und mit der Komplementbindung ein sehr schwach positives
Resultat.

Wenn wir von diesen beiden letzten Fällen Abstand nehmen,
so stellt sich heraus, dass von den 25 untersuchten Seris 3 ein
abweichendes Resultat gaben, abweichend sowohl von der
Diagnose als von der Komplementbindung, was total 12 %
Abweichungen sein würde, um das Wort Fehler noch nicht zu
gebrauchen.

In Bezug hierauf scheint es mir nicht angewiesen die Kon-
glutinationsreaktion bei Syphilis neben die Komplementbindung
zu stellen, darüber in keinem Fall, denn die letztere ergab sich
zuverlässiger, während mit der ersteren noch mehrere Be-
schwerden verbunden sind (worauf ich später zurückkomme),
welche bei der Komplementbindungsreaktion nicht anwesend sind.

C. Konglutination beim seuchenhaften Verwerfen des Rindes.

Für die Diagnose des seuchenhaften Verwerfens bei Rindern
sind in den letzten Jahren besonders 2 Reaktionen von sehr
grosser Wichtigkeit geworden, namentlich die Agglutination und
die Komplementbindung. Das Serum von Rindern, welche
verwerfen werden oder welche schon vor sreräumen Zeit ver-

worfen haben, gibt eine schöne Komplementbindung mit einem
Extrakt des Abortusbazillus nach BaNG ; auch enthält ein
derartiges Serum Agglutinine gegen diese Bazillen, sei es, dass
der Titer der Agglutination oft nicht höher ist als i : too.
Beide Reaktionen sind denn auch für die gewisse Diagnose
des seuchenhaften Verwerfens unentbehrlich geworden.

Bedürfnis an eine dritte Reaktion, die Konglutinationsreaktion,
besteht hier nicht, aber von einem wissenschaftlichen Stand-
punkt betrachtet, darf es für wichtig gehalten werden nachzu-
forschen, welche Resultate diese neue Reaktion beim Abortus
der Rinder liefert.

Ich fange an die Aufmerksamkeit darauf zu lenken, dass es
bei dieser Reaktion eine Schwierigkeit ist, dass für die Unter-
suchung von Rinderserum, es keinen Zweck hat voraus die
Dosis des konglutinierenden Serums zu bestimmen, weil man
für das zu untersuchende Serum ebenso Rinderserum gebraucht
und zwar in grosser Quantität (0,1 cM^. — 0,05 cM^.); dazu
kommt noch, dass das zu untersuchende Serum schon beim
Anfang des Versuchs mit dem Komplement und dem Extrakt
anwesend ist und also nicht 1% Stunde nach der Bindung als
konglutinierendes Serum hinzugefügt wird. Um diesen Schwierig-
keiten so viel wie möglich vorzubeugen, habe ich von dem zu
untersuchenden Serum niemals Dosen über 0.05 cM^. genommen
und dann abnehmende Quantitäten, wobei man aber wieder
Gefahr läuft schwach positive Sera in negative zu verwandeln.
Der Titer des konglutinierenden Serums bestimmte ich für
jedem Versuch ins besondere und fügte es 1 1/2 Stunde nach
der Bindung hinzu.

Als Abortusextrakt wurden eine Serumbouillonkultur von
Abortusbazillen, welcher Kultur 1/2 ^!q Karbol zugefügt war,
und ein klares Extrakt von Abortusbazillen gebraucht. Die
minimale, noch von selbst hemmende Wirkung der Serum-
bouillonkultur lag bei 0,2 cM.^, aus welchem Grunde ich bei
den Versuchen die Hälfte dieser Dosis verwendete. Von dem
Extrakt der Abortusbazillen, dass ich durch Erhitzung, schütteln,
zentrifugieren und zerreiben der Bazillen bekam, {Folia Micro-
biologica I Jahrgang Heft 3) konnte immer eine Quantität von
0,2 0,1 und 0,05 cM.3 gebraucht werden. Sowohl für die Kom-
plementbindung als für die Konglutination benutzte ich bei

jedem Versuch, beide Extrakte ; in keinem einzigen Fall sah
ich, zwischen den beiden Stoffen, irgend eine Abweichung.
Auszer dem Titer des konglutinierenden Serums wurde, ehe ich
einen Versuch anstellte, selbstverständlich, der Titer des Komple-
ments, wozu wieder frisches Pferdeserum diente, bestimmt.

Im Ganzen untersuchte ich mit diesen 3 Reaktionen 38 Sera
auf seuchenhaftes Verwerfen. Die erzielten Resultate werden,
ebenso wie bei Syphilis, in unterstehender Tabelle verzeichnet.

Serum.

Resultat der
Agglutination.

Resultat der

No.

Komplementbindungs-
reaktion.

Konglutinations
reaktion.

—

III

—

VII

VIII

—

XII

—

XIII

—

XIV

XVI

+ (schwach)

XVII

XVIII

XIX

—

XXI

XXII

—

XXIII

XXIV

—

XXV

—

XXVI

XXVII

+ (schwach)

-f (schwach)

XXVIII

—

XXIX

+ (schwach)

XXX

XXXI

XXXII

+ (schwach)

XXXIII

—

XXXIV

—

-f (schwach)

XXXV

XXXVI

XXXVII

XXXVIII

—

Ebenso wie bei Syphilis mitgeteilt worden ist, wird auch
hier unter + Konglutinationsreaktion verstanden, dass das un-
tersuchte Serum positiv war.

In den betreffenden Röhrchen war also keine Zusammen-
ballung der Blutkörperchen zu beobachten. Wenn wir hier die
mit den drei verschiedenen Reaktionen erzielten Resultate
genauer betrachten, so bemerken wir sofort, dass sie noch weit
weniger schön sind als bei Syphilis. Von den 38 untersuchten
Seris gaben nur 25 mit den 3 Reaktionen dasselbe Resultat.
Die grosse Ähnlichkeit in Resultat, zwischen der Agglutination
und der Komplementbindung fällt aber sofort auf ; nur in
zwei Fällen (Sera XXXIX und XXXII) war die Agglutination
schwach und die Komplementbindung deutlich positiv, während
in einem Fall (Serum XXXIV) eine negative Agglutination
neben einer schwach positiven Komplementbindung zu beob-
achten war.

Um so mehr fiel darum der grosse Unterschied zwischen
diesen beiden Reaktionen einerseits und der Konglutination
anderseits auf. Von den 38 Seris gaben 13 ein abweichendes
Resultat. Wenn wir dabei die negativen Resultate, welche die
drei Reaktionen gemein haben, auszer Acht lassen und betrachten
wir die 25 positiven Fälle, welche mit der Komplementbindung
erreicht wurden, so sehen wir, dass von diesen 25 Fällen nur
1 1 mit der Konglutinationsreaktion positiv waren. Bei positiven
Seris würde man also in 560/0 der Fälle, mit der Konglutina-
tionsreaktion ein negatives Resultat erzielen.

Sei es, dass die neue Reaktion bei Malleus und auch noch
wohl bei Syphilis zu gebrauchen ist, (meiner Meinung nach
ist im Laboratorium kein Bedürfnis daran), für die Diagnose
von Abortus ist sie unbrauchbar.

Aller Wahrscheinlichkeit nach spielt hier die Tatsache, dass
das zu untersuchende Serum ein konglutinierendes Serum ist,
die Hauptrolle.

Ehe ich zu dem letzten Abschnitt »die Wirkung verschiedener
Blutsera auf verschiedene Blutarten« übergehe, will ich noch
die Aufmerksamkeit darauf lenken, dass an der Konglutinations-
methode sei es dass sie in der Zukunft noch in bestimmter
Weise zu vervollständigen wäre, noch Fehler kleben, welche
wir bei der Komplementbindungsreaktion nicht kennen. Fügt

man hier noch hinzu, dass die Übergänge von Konglutination
und nicht-Konglutination, also die zweifelhaften Fälle, nicht so
deutlich zu beobachten sind (obgleich ich gestehe, dass mit
Übung hier viel zu erreichen ist) so habe ich meiner Meinung
nach, die wichtigsten Bedenken gegen diese neue Reaktion
erhoben.

Der Vorteil über die Komplementbindung besteht nur darin,
dass nicht nötig ist für jeden Versuch ein Meerschweinchen
zu töten. Die Bereitung von hämolytischem Serum is zu einfach
um sie als ein Bedenken gegen die Komplementbindung zu nennen.

Die Wirkung verschiedener Sera auf verschiedene
Blutarten.

A. Rinderserum.

Um die Wirkung frischen Rinderserums auf verschiedene
Blutarten nachzuforschen, bereitete ich von den letzteren jedes-
mal eine 5 0/0 Aufschwemmung, brachte davon 3 Tropfen in
Röhrchen, welche abnehmende Quantitäten frischen Rinder-
serums enthielten, füllte dieselben mit physiologischer Koch-
salzlösung an zu gleichem Volumen und stellte die Röhrchen
dann 4 Stunden bei 37° C, wonach das Resultat abgelesen wurde.

Pferdeblutkörperchen verhalten sich verschieden hinsichtlich
frischen Rinderserums. In einigen Fällen beobachtet man Kon-
glutination, in andern wieder nicht. Als Regel kann man sagen,
dass grössere Quantitäten frischen Rinderserums (0,1 cM^. und
höher) Pferdeblutkörperchen (3 Tropfen einer 5 % Aufschwem-
mung) hämolysieren.

Quantitäten frischen Rinderserums von 0,05 cM^. und weniger
wirken bald konglutinierend, bald nimmt man keine Zusammen-
ballung wahr.

Hammelblutkörperchen werden mittels frisschen Rinderserums
konglutiniert. Gewöhnlich beobachtet man noch Konglutination
mit einer Quantität von 0,05 und 0,1 cM3. Mit kleineren
Quantitäten bleibt Konglutination meistens aus. Dass bei den
kleineren Quantitäten die Rede ist von Erschöpfung des Kom-
plements (nicht der Konglutinine) geht aus dem Umstand hervor,
dass, wenn man frisches Pferdeserum hinzufügt, (von dem man

voraus bestimmt hat, dass es keine Konglutinine enthält) auch
mit noch kleineren Quantitäten frischen Rinderserums (bis 0,0 1
cM3.) Konglutination erhalten wird. Dasselbe gilt für alle andre
Blutkörperchen, die mit frischem Rinderserum konglutinieren.

Ziegenhlutkörperchen zeigen viel Ähnlichkeit mit Hammel-
blutkörperchen. Mit sehr grossen Quantitäten frischen Rinder-
serums (über 0,04 cM^.) beobachtet man Hämolyse ; mit kleineren
Quantitäten, bis einer Menge von ungefähr 0,1 cM^., nimmt man
Konglutination wahr, während Dosen kleiner als 0,1 cM^. gewöhn-
lich keine Zusammenballung der Blutkörperchen veranlassen.

Scfnveinebbitkörpcrchen werden konglutiniert mittels frischen
Rinderserums bis einer Quantität von 0,2 cM^. und 0,1 cM^.
Mit kleineren Quantitäten ist keine Konglutination zu beobachten.

Meerschwcinchenblutkörpcrchen werden mittels frischen Rinder-
serums viel schneller hämolysiert als die andern Blutkörperchen.
Oft beachtet man noch mit Quantitäten von 0,03 cM^. totale
Hämolyse. Selbstverständlich werden Rinderblutkörperchen mittels
Rinderserum nicht konglutiniert. Auch mit andern ähnUchen
Seris und Blutkörperchen ist dies der Fall.

B. Pferdeserum.

Die roten Blutkörperchen des Rindes, Schafes und der Ziege
werden auch mittels grösseren Quantitäten frischen Pferdeserums
nicht konglutiniert. Auch wirkt eine Dosis von 0,3 cM-"^. noch
nicht hämolytisch auf diese Blutkörperchen. Ebenso wenig
beobachtet man Konglutination, wenn man frisches Pferdeserum
auf die Schweine- und Meerschweinchenblutkörperchen ein-
wirken lässt. Diese beiden letzten Arten von Blutkörperchen
werden aber ein wenig leichter hämolysiert ; eine Dosis von
0,2 cM^. wirkt gewöhnlich hämolytisch.

C. Schaf serum.

Pferdeblutkörperchen werden mittels grösserer Quantitäten
frischen Schafserums (bis ungefähr 0,2 cM^.) hämolysiert. Unter
dieser Quantität beobachtet man Konglutination ; oft aber kann
diese schwach sein.

Rinderblutkörperchen zeigen mit frischem Schafserum gewöhn-
lich keine Konglutination. Bisweilen aber wirken wohl gros-

sere Dosen dieses Serums (über o,i cM^.) konglutinierend.

Ziegenblutkörperchen werden nicht konglutiniert mittels frischen
Schafserums.

Schweinehliitkörperchen werden gewöhnlich nicht kongluti-
niert ; bisweilen ist mit grösseren Dosen frischen Schafserums
(über 0,2 cM^.) eine schwache Konglutination zu beobachten.

Meerschweinschenbhttkörperchen werden mittels Schafserums
(ebenso wie dies mit Rinderserum der Fall ist) leichter hämo-
lysiert als andere rote Blutkörperchen. Mit kleineren Quanti-
täten (unter 0,05 cM^) tritt keine Konglutination ein.

D. Ziegenserum.

Pferdehlutkörperchen werden mittels grösserer Quantitäten
frischen Ziegenserums (über 0,1 cM.^) hämolysiert. Unter dieser
Quantität nimmt man gewöhnlich keine, bisweilen aber eine
deutliche Konglutination war.

Rinder- und H aniynelblutk'àrperchen werden nicht konglu-
tiniert.

Schiüeineblutkörpcrchcn werden bald nicht, bald wohl kon-
glutiniert ; im letzteren Fall durch grössere Dosen Serum (über
0,2 cM3).

Meerschweinchenblutkörperchen werden auch mittels frischen
Ziegenserums leichter hämolysiert als die andern. Quantitäten
von 0,03 cM,^ und darüber wirken gewöhnlich hämolysierend.
Unter dieser Dosis tritt keine Konglutination ein.

E. Schweineserum.

Pferdeblutkörperchen werden hämolysiert mittels grösserer
Quantitäten frischen Schweineserums; in einigen Fällen kann
die Dosis, wobei noch vollständige Hämolyse dieser Blutkör-
perchen eintritt, sehr niedrig liegen (bei 0,03 cM.'^). Mit klei-
neren Quantitäten tritt bald Konglutination ein, bald bleibt sie aus,

Rinderblutkörperchen werden ziemlich leicht hämolysiert
mittels Schweineserums. Mit kleineren Quantitäten (Grenzdosis
ungefähr 0,05 cM.^) tritt keine Konglutination ein.

Schafeblutkörperchen werden noch leichter hämolysiert
mittels frischen Rinderserums. Gewöhnlich wirkt eine Dosis

von 0,03 cM.^ noch hämolytisch. Kongkitination tritt nicht ein.
Ziegenblutkörperchen und Meerschweinschenblutkörperchen
verhalten sich, hinsichtlich frischen Schweineserums, ganz wie
die des Schafes.

F. Meerschweinchenserum.

Frisches Meerschweinchenserum wirkt auf keine einzige der
5 von mir gebrauchten Blutarten konglutinierend. In grösseren
Quantitäten (über 0,20 cM.^) ist bei allen Hämolyse zu beob-
achten ; bei Rinderblutkörperchen ist diese am schwächsten.

Der oben gegeben kurzen Beschreibung der angestellten
Versuche mit verschiedenen Scris und Blutarten, will ich sofort
zufügen, dass es sehr gut möglich ist, dasz bei Wiederholung
der Versuche, kleine Abweichungen, nicht nur hinsichtlich der
genannten Quantitäten, sondern auch betreffs des hier und
dort Auftretens der Konglutination gefunden werden.

Aus vorstehendem Résumé geht genügend hervor, welches
Resultat man zu erwarten hat.

Wenn man kurz das Resultat dieser Versuche zusammenfasst,
stellt es sich heraus, dass man nicht berechtigt ist im allgemeinen
zu sprechen von einem Serum, das konglutinierend wirkt. Dies
darf man nur tun, wenn man dazu die Art oder Arten der
Blutkörperchen in Bezug auf welche es konglutinierend wirken
sollte, nennt. Wenn man ja die erzielten Resultate nachliest,
so wird es jedesmal klar sein, dass in Bezug auf ein bestimmtes
Serum verschiedene Blutarten sich ganz verschieden betragen
können. Sogar Rinderserum, das konglutinierende Serum im
höchsten Grade, ist oft nicht imstande Pferdeblutkörperchen zu
konglutinieren.

Es ergibt sich, dass die meisten Sera, in grösseren Quanti-
täten, genügende Normalhämolysine enthalten um mehrere
Blutkörperchenarten zu lösen ; ins besondere scheint es, dass
Meerschweinchenblutkörperchen leicht hämolysiert werden.
Schweineserum scheint die grösste Zahl von Normalhämolysinen
zu enthalten.

Vorstehende Versuche beziehen sich auf frische, eben ge-
wonnene Blutsera ; die unten verzeichneten aber sind angestellt

worden um nachzuforschen, welche Wirkung inaktives Rinder-
serum (1/2 Stunde 58° C.) auf die verschiedenen Blutarten ausübt.
Da ich bei diesen Versuchen auf eine eigentümliche Erscheinung
gestossen habe, so will ich, um diese Erscheinung deutlich
hervorzuheben, die Versuche ganz in Tabellen wiedergeben.
Diese Versuche beziehen sich auf 2 verschiedene Rinderseris
(R. S. I. & II.), welche ich nach Inaktivierung auf mehrere
Blutarten des Pferdes, Schafes, der Ziege, des Schweines und
des Meerschweinchens einwirken Hess.

Zur Kontrolle wurde jede Reaktion wiederholt, aber nun
unter Hinzufügung von Komplement (frisches Pferdeserum P.S.)
Die Einwirkung der verschiedenen Flüssigkeiten auf einander
geschah bei 37° C. während 4 Stunden, Wieder 4 Stunden
später wurden die Resultate abgelesen, nachdem die Röhrchen
erst vorsichtig auf dem Finger umgekehrt waren.

No.

Inaktives

Pferdeblut

Phys.

Frisches

Resultat.

R. S

5 %■

Na Cl

P. S.

0,4

cM.3

3 Tropfen

0,1 cM3.

Konglutination \ gelbl. klareFlüssig-

0,3

» V keit mit kleinen,

0,2

V ] roten Flöckchen.

0,1

» (teilweise).

0,05

» (teilweise).

0.03

keine Konglutination.

9,01

» »

0,005

» »

0,4

—

Konglutination \ vollkommen was-

0,3

—

» y serhelle Flüssig-

0,2

—

» ( keit, in dem sich

0,1

—

» ( einige schöne,

0,05

—

» \ grosse, dunkelrote

0,03

—

» / Flocken befinden.

0,01

"Sj

—

» (teilweise).

0,005

Schafeblut
5 %

» (teilweise).

0,4

3 Tropfen

0,1 cM.3

Konglutination.

0,3

0,2

o>i

0,05

0,03

O.Ol

0,005

keine Konglutination.

0,4

—

teilweise Konglutination.

No.

Inakti

ves

Schafeblut

Phys.

Frisches

Resultat.

R. S.

5 %■

Na Cl

P. S.

0,3

:M.3

3 Tropfen

teilweise Konglutiiiation.

0,2

—

sehr geringe »

0,1

—

keine Konglutination.

0,05

—

» »

0,03

—

» »

0,01

—

» »

0,005

Ziegenblul
5 %•

» »

0,4

3 Tropfen

0,1 cM.3

Konglutination.

0,3

0,2

0,1

0,05

0,03

0,01

teilweise Konglutination.

0,005

keine »

0,4

—

» »

0,3

—

» »

0,2

—

» »

0,1

—

» »

0,05

—

» »

0.03

jü

—

» »

0,01

—

» »

0,005

Schweine-
blut 5 %.

» »

0,4

3 Tropfen

0,1 cM.2

Konglutination.

0,3

0,2

:=i

0,1

0.05

0,03

■>>

0,01

0,005

teilweise »

0,4

—

Konglutination.

0,3

—

teilweise »

0,2

—

keine »

0,1

—

» »

0,05

—

» »

0,03

—

» »

0,01

—

» »

0,005

Meerschvv.-
blut 5 %.

» »

0,4

3 Tropfen

0,1 cM.^

Konglutination.

0,3

0,2

No.

68
69
70

73
74
75
76

77
7S
79
80

81
82
83
84

85
86

87
88
89
90

93
94
95
96

Inaktives
R. S. I.

Meerschw.
blut 5%.

0,1 cM.'

0,05 »

0,03 »

0,01 »

0,005 >^

0,4 »

0,3 »

0,2 »

0,1 »

0,05 »

0,03 »

0,01 »

0,005 *

Inaktives

R. S. II.

0,4

o>3

0.2

0,1

0,05

0,03

0,01

0,005

0,4

0,3

0,2

0,1

0,05

0,03

0,01

0,005

cM.

0,4

0,3

0,2

100

0,1

lOI

0,05

102

0,03

103

9,01

104

0,005

105

0,4

106

0,3

107

0,2

108

0,1

109

0,05

0,03

III

0,01

112

0,005

3 Tropfen

Phys.
Na CI

Pferdeblut

5 %•
3 Tropfen

Schafeblul

5 %■
3 Tropfen

Frisches
P. S.

0,1 cM.3

Resultat.

0,1 cM.s

Konçlutination.

teilweise Konglutination.

keine Konglutination.

Konglutination ^ ym^igkeit ist

* ( hellrot gefärbt.

» )

teilweise Konglutination.
keine Konglutination.

— Konglutination

Die Flüssigkeit in

den Röhrchen isf

wasserhell.

teilweise Konglutination.

Konglutination.

teilweise »

» »

K(jnglutitiation.
teilweise Konglutination.

» »

keine »

No.

Inaktives Ziegenblut
R. S. II. 5 %

Phys.
NaCl

Frisches
P. S,

Resultat.

113

0,4 cM^.

3 Tropfen

0,1 cM.3

Konglutination.

114
"5

0,3 »
0,2 »

»
»

116

0,1 »

117

0,05 »

118

0,03 »

119

0,01 »

120
121

0,005 »
0,4 »

»
»

teilweise
keine

»
»

122

Ol 3 »

—

123

0,2 »

—

124

0,1 »

—

125
126

0,05 »
0,03 »

»
»

127

0,01 »

128

0,005 »

»
Schweine-

129

0,4 »

blut 5 %.
3 Tropfen

0,1 cM.^

Konglutination.

130

131
132

0)3 »
0,2 »
0,1 »

»
»

0
>

»
»
»

133
134
13s
136

0,05 »
0,03 »
0,01 »
0.005 »

»
»
»
»

»
»
»

137
138
139

0,4 »

0,3 »
0,2 »

»
»

—

teilweise
keine

Konglutination.

140

0,1 »

—

141

0,05 »

—

142

143

144

145

0,03 »
0,01 »
0,005 »

0,4 »

»
Meerschw.;
blut 5 %.
3 Tropfen

C
<

0,1 cIVI.3

»
»
»

Konglutination.

146

147

0,3 »
0,2 »

»
»

148

0,1 »

149
150

0,05 »
0,03 »

»
»

151

152

0,01 »
0,005 »

»
»

teilweise

153
154
155

0,4 »

o>3 »
0,2 »

»
»
»

—

keine

»
»

15Ö

0,1 »

—

157
158

159

0,05 »
0,03 »
0,01 »

»
»
»

—

»
»
»

»
»

160

0,005 »

—

Wenn wir aus vorstehenden Tabellen erst die Resultate be-
trachten, erzielt durch die Einwirkung inaktiven Rinderserums
auf die verschiedenen Blutarten, unter Hinzufügung frischen
Pferdeserums und wir vergleichen diese mit den Resultaten,
erzielt durch Einwirkung frischen Rinderserums auf die Blut-
arten, so fallen dabei zwei Besonderheiten auf.

1. Durch inaktives Rinderserum + eine konstante Quantität
frischen Pferdeserums, ist mit weit kleineren Dosen Konglutina-
tion wahrzunehmen, als wenn man nur frisches Rinderserum
gebraucht, was zweifellos seine Ursache darin findet, dass bei
den kleineren Dosen frischen Rinderserums die Komplement-
menge zu gering wird.

2. Das Hämolysieren der verschiedenen Blutkörperchenarten
durch die Normalhämolysine aus dem frischen Rinderserum
verschwindet fast ganz, wenn man inaktives Rinderserum und
frisches Pferdeserum gebraucht. Es scheint, dass die Normal-
hämolysine durch das Inaktivieren zum grössten Teil vernichtet
werden und dasz frisches Pferdeserum wenig oder keine Normal-
hämolysine für die verschiedenen Blutkörperchen enthält.

Die wichtigste Besonderheit in vorstehenden Tabellen nimmt
man aber wahr, wenn man die Resultate betrachtet, welche erzielt
worden sind durch die Einwirkung inaktiven Rinder serums auf
die verschiedenen Blutarten, ohne Zufügung von Komplement.

Dann fällt sofort auf, dass grössere Dosen inaktiven Rinder-
serums die verschiedenen Blutkörperchen (ausgenommen die der
Ziege) auch ohne Komplement, konglutinieren können, aber
vor allem, dass Pferdeblutkörperchen durch inaktives Rinder-
serum, ohne Zufügung von Komplement, noch schöner konglu-
tiniert werden als durch inaktives Rinderserum + frissches
Pferdeserum.

Vergleicht man No. i — 8 mit 9 — 16 so ergibt sich, dass
inaktives Rinderserum + frisches Pferdeserum Pferdeblutkör-
perchen schon bei einer Dosis von 0,1 cM^. teilweise zu
konglutinieren anfängt, während bei 0,03 cM3. gar keine Kon-
glutination mehr eintritt.

Wenn man nur inaktives Rinderserum gebraucht, ohne frisches
Pferdeserum, so beobachtet man erst bei 0,01 cM^. teilweise
Konglutination, sodass also das Komplement gerade die Kon-
glutination hintertreibt. Auch die Farbe der Flüssigkeit ist

anders; obgleich die Flüssigkeit bei No. i — 4 schwachrot gefärbt
ist, was verursacht wird durch eine schwache Hämolyse der
Blutkörperchen mittels der Normalhämolysine, welche durch die
Inaktivierung noch nicht ganz vernichtet sind, bei No. g — 14
ist die Flüssigkeit wie klares Wasser. Die noch anwesenden
Normalhämolysine finden hier kein Komplement um die Blut-
körperchen zu hämolysieren, sodass man also gelangt zu der
wichtigsten Tatsache: »ohne Komplement keine Hämolyse;
ohne Komplement wohl Konglutination«.

Wenn man in den Tabellen No. 81 — 88 mit No. 8g — g6,
wobei ein andres, inaktives Rinderserum gebraucht wurde, ver-
gleicht, so gelangt man zu demselben Resultat ; auch geht die
Konglutination eben so gut weiter ohne Komplement als mit
Komplement. Auch die Art der Flocken ist anders.

Wenn Komplement anwesend ist, so teilen die niedergeschla-
genen Blutkörperchen sich, nach schwachem Umschütteln, in
feine Flöckchen ; ist kein Komplement anwesend, so beobachtet
man in einer wasserhellen Flüssigkeit nur i à 2 schwere Flocken.

Bei allen andern Blutarten (ausgenommen die der Ziege) ist
auch diese Konglutination wahrzunehmen, aber nur, wenn
grössere Quantitäten inaktiven Rinderserums gebraucht werden.

Diese Versuche mit Pferdeblutkörperchen und inaktivem
Rinderserum habe ich wiederholt mit 20 verschiedenen inaktiven
Rinderseris und verschiedenen Arten von Pferdeblutkörperchen.

Bei allen diesen Versuchen stiess ich nur einmal auf ein
inaktives Rinderserum, das ohne Komplement Pferdeblutkörper-
chen nicht zu konglutinieren vermochte ; bei allen andern trat
ohne Hinzufügung von Komplement eine schöne Konglutination
ein, welche Konglutination in allen Fällen auch wieder schöner
war, als wenn Komplement hinzugefügt worden war.

Auf diese wichtige Erscheinung: »Ohne Komplement doch
Konglutination«, was nicht passt in der Theorie von BORDET
und Gay über das Wesen der Konglutination, hoffe ich später
zurückzukommen.

Das Einzige was man anführen könnte ist, dass man es in
den Fällen wo Konglutination auftritt ohne Komplement, nicht
zu tun hat mit Konglutination im vollsten Sinne des Wortes,
sondern mit Agglutination.

LITERATUR.

1. Ehrlich und Sachs. Berl. Klin. Wochenschr. 1902. S. 492.

2. BoRDET et Parker Gay. Annal, de l'Inst. Past. Bd. 20, S. 467.

3. Bürdet et Streng. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 49, S. 260.

4. Sachs und Bauer, Arb. a. d. Königl. Inst. f. experiment. Therapie

zu Frankfort am Main. 1907.

5. Streng. Zeitschr. f. Imm. forsch. Orig. Bd. 2, S. 415.

6. Idem. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 50, S. 47.

7. Cohen. Annal, de l'Inst. Past. Bd. 23, S. 273.

8. Gay and Lucas. Proc. of the Society f. exp. Biol. and Med. 1910.

9. Swift and Thro. Arch. Intern, med. 19 11.
IG. Luger. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 65, S. 390.

11. Sauli. Zeitschr. f. Imm. forschr. orig. Bd. 9. S. 359.

12. Streng. Finska läkares ällskapets handlingar. 19 10.

13. Karvonen. Arch. f. Dermat. u. Syphilis. Bd. 108. Heft 3.

14. Siebert und MiRONESCU. Deutsche med. Wochenschr. 191 1. S. 2084.

15. Hecht. Berl. Klin. Wochenschr. Bd. 1912. S. 58.

16. Jacobäus. Zeitschr. f. Imm. forsch, orig. Bd. 8, S. 445.

17. Streng. Zieglers Beiträge zur path. Anatomie. Bd. 51, S. 279.

18. Pfeiler und Weber. Berl. tierärztl.Wochenschr. i9i2.No.43,S.785.

19. Idem. » » » » » 47, » 873.

20. Idem. Zeitschr. f. Inf. Kr.heiten der Haustieren.

Bd. 12, S. 397.

21. Stranigg. Zeitschr. f. Inf. Kr.heiten der Haustiere. Bd. 14,

S. 166, S. 297.

IMMUNISATION ARTIFICIELLE CONTRE LA
PIROPLASMOSE DU BÉTAIL EUROPÉEN IMPORTÉ

AU BRÉSIL

PAR

L. MISSON.

Directeur de r Industrie Animale de V Etat de Sao Paulo.

Dans un article publié précédemment dans le numéro du
1er Août 1912, des Annales de Gembloux, en même temps que
je justifiais l'importation au Brésil des meilleures races de bétail
européen, dans le but de les croiser avec les races indigènes,
j'indiquais les insuccès qui avaient marqué les premières impor-
tations et la raison principale de ces échecs.

Je veux parler de la piroplasmose bovine, connue dans presque
toute l'Amérique du Sud sous le nom de tristeza.

Pour la clarté de cet article, je reverrai rapidement tout ce
que j'ai déjà dit au sujet de cette maladie, la découverte, par
NUTTAL et Hadwen, des effets du bleu de trypan sur le
protozoaire qui en est la cause et enfin les expériences aux-
quelles se sont livrés Stockman à Londres et le Dr. Theiler
dans l'Afrique du Sud.

Avec mon collègue et ami le Dr. RaQUET, qui à ce moment
était chargé de l'organisation du Poste Zootechnique de Sao
Paulo, nous pûmes déjà, en 1907, avec les animaux importés
à cette époque, arriver à la conclusion que la maladie, jusqu'
alors non déterminée, qui décimait le bétail importé, n'était
autre que la piroplasmose bovine, produite par le piroplasma
bigeminum, transmis aux animaux par les tiques et constater,
d'accord avec les indications de SMITH et KiLBORNE, que ce
piroplasma produisait une maladie très grave, contre laquelle
les animaux étaient généralement immunisés après une première
attaque assez forte.

Il nous fut possible aussi de constater que les pertes étaient
beaucoup moindres lorsque l'on avait soin de prendre les pré-
cautions suivantes :

i". de n'importer que des animaux jeunes, âgés de 12 à 14
mois, qui, toujours se sont montrés beaucoup plus résistants
que les animaux ayant atteint leur complet développement;

2'^. de s'abestenir d'importer des génisses pleines, qui toujours
avortent quand elles sont atteintes de la maladie et souvent y
succombent ;

3^. de ne faire l'importation au Brésil que pendant la saison
d'hiver, d'Avril à fin Septembre, afin que les ^animaux souffrent
moins du changement de climat ;

40. afin de pratiquer le plus tôt possible l'immunisation
naturelle par l'application de tiques virulents en quantité limitée,
ou l'immunisation artificielle par l'injection sous-cutanée, aux
animaux importés, de sang virulent d'un animal rétabli depuis
peu d'une attaque de piroplasmose.

Lors des importations qui furent faites les années suivantes,
il fut tenu compte des conseils énumérés plus haut et les pertes,
qui autrefois étaient de go 0/0 et plus, diminuèrent rapidement ;
elles furent réduites à 33 0/0 c" 1908, à 13 0/0 en 1909 et
tombèrent à 7 0/0 en 19 10. En 191 1, elles furent un peu plus
élevées.

En présence de cette importante diminution de la mortalité,
les importations augmentèrent rapidement et pendant les 4
dernières années, j'ai acheté en Europe, tant pour le Gouver-
nement que pour les particuliers dont l'Etat subventionnait les
achats, de 51 bovidés en 1909, de 115 en 1910, de 115 en
191 1 et de 138 en 191 2, soit un total de 419 en 4 ans.

Par les études réalisées à Sao Paulo, tant par le Dr. CariNI,
Directeur de l'Institut PASTEUR, que par notre service vétéri-
naire et spécialement par le Dr. LuiZ PiCOLLO, qui pendant
longtemps fut le seul vétérinaire de la Direction de l'Industrie
animale, nous avons pu nous convaincre que la piroplasmose
existe pour ainsi dire dans toutes les fermes de l'Etat de Sao
Paulo, où tous les animaux bovins qui y sont nés et qui y ont
été élevés ont eu la maladie et conservent dans le sang le
piroplasme virulent.

La meilleure preuve de ce que j'avance réside dans le fait

PLANCHE I.

Folia Microbiologica III.

(Misson).

Tiques avec leurs œufs, chaque division correspond à un milimètre carré.

PLANCHE II.

Folia Microbiologica III.
(Misson).

Jeunes tiques sur un pieux d'enclos.

5î

que de 721 vaches et génisses qui ont été envoyées au Poste
Zootechnique Central depuis sa fondation, de tous les coins de
l'Etat, pour les reproducteurs du Gouvernement, une seule, a
été atteinte de tristeza. Il s'agissait d'une génisse née et élevée
dans un étable de la ville, qui n'avait jamais été piquée par
les tiques, et qui, par conséquent, n'avait jamais pu avoir la
maladie ni être immunisée.

Aucune des autres, provenant des fermes d'élevage de l'inté-
rieur du pays, n'a présenté le moindre signe de maladie, ce
qui prouve que toute étaient déjà immunisées et que, par con-
séquent, la tristeza existait dans les fermes d'où elles venaient.

Il est donc indispensable, que tous les reproducteurs bovins
importés soient eux-mêmes immunisés de suite, si nous voulons
que plus tard, quand ils auront acquis un plus grand dévelop-
pement et que, pour cette même raison, ils seront plus sen-
sibles, ils ne succombent pas à la maladie.

Les recherches effectuées par le Dr. CarINI lui ont permis
de constater que nous possédons aussi, à S~'o Paulo, V anaplasma
marginale, découvert par le Dr. ARNOLD Theiler au Transvaal
en 1910, et que les animaux importés sont très souvent atteints
des deux maladies, la seconde, l'anaplasmose étant généralement
plus grave encore que la première.

Immunisation.

En 1909, le professeur NUTTALL, de Cambridge, en colla-
boration avec Hadwen, montrait l'efficacité de l'application du
bleu de trypan dans la piroplasmose du chien et cette efficacité
fut confirmée, quelque temps après par des expériences de
Mr. JOWETT, de Capetown, et du Dr. K. F. Meyer, de
l'Institut bactériologique d'Onderstepoort.

Peu après, NUTTALL et Hadwen entreprirent de nouvelles
expériences ayant pour but d'étudier les effets de ce même
médicament sur les animaux souffrant de la piroplasmose bovine,
et ils conclurent que le bleu de trypan serait probablement un
remède efficace pour le traitement de la piroplasmose. Ils
prouvèrent de plus que ce médicament n'avait aucun effet nui-
sible sur la santé des animaux.

La même année, Mr. Stockman, chef du service vétérinaire

du Gouvernement anglais, de Londres, entreprit une série d'ex-
périences qui corroberèrent pleinement les résultats obtenus par
NUTTALL. Enfin, le Dr. Theiler, de Pretoria, confirma abso-
lument les observations précédentes dans un article très complet
qu'il publia en Novembre 1911 dans »1' Agricultural Journal of
South Africa«, en conseillant franchement son emploi dans les
cas d'infection artificielle.

Jugeant cette découverte comme étant d'une importance
capitale pour les éleveurs de SSo Paulo, je fis la traduction
complète de cet article et le publiai dans le »Criador Paulista«
de Décembre 191 1.

Peu de temps après, le 18 Février 1912, j'eus l'occasion
d'appliquer le bleu de trypan sur un taureau BoUed Angus,
importé d'Argentine, qui était bien attaqué de piroplasmose
contractée naturellement. Il était déjà atteint d'hématurie et
l'examen microscopique démontra la présence de nombreux
piroplasmes dans le sang. Je dois ajouter que cet animal était
déjà d'un certain âge, ce qui, ajouté au fait que l'immunisation
était naturelle, rendait la guérison plus difficile.

Il lui fût appliqué 200 cent, cubes de solution de bleu de
trypan, et l'effet de cette injection sous cutanée ne se fit pas
attendre. Les parasites, très nombreux dans les préparations
faites avant l'injection, avaient disparu complètement dans celles
qui furent préparées avec le sang prélevé le lendemain ; l'urine
rouge avait cessé et le taureau, fort triste la veille mangeait
et ruminait comme un animal absolument sain.

Le 5 et le 12 Mars, deux nouvelles injections de bleu de
trypan furent faites, absolument dans les mêmes conditions, sur
deux génisses de même race, toutes deux se rétablissant par-
faitement en quelques jours.

Je dois faire remarquer que ces résultats, tous obtenus dans
des cas d'infection naturelle^ sont d'autant plus remarquables,
que 3 autres animaux, (i taureau et 2 génisses), de même race,
de même âge et de même origine, qui ne furent pas traités
lorsqu'ls tombèrent malades, (parce que à ce moment le remède
n'était pas encore connu ici), moururent tous trois, rapidement,
peu de temps après l'apparation de la maladie.

D'autres applications de bleu de trypan furent faites plus tard
par le service vétérinaire de la Direction de l'Industrie animale :

1°. le I e»" Mars, sur une génisse Hereford importée d'Argentine
et atteinte d'anaplasmose, confirmée par l'examen microscopique.
Elle mourut subitement, le même jour ;

2^. le 14 Mars, sur une génisse Schwyz née au Poste Zoo-
technique Central, atteinte de anaplasmose? et qui était guérie
le 20 du même mois ;

3". le 15 Avril, sur une autre vache Hereford importé d'Ar-
gentine, infectée naturellement de piroplasmose, et qui de même,
guérit rapidement.

Tous ces animaux, traités par le bleu de trypan, depuis 10
mois, ont, à diverses reprises, été attaqués et infectés par les
tiques, au Poste Zootechnique Central ou dans les fermes de
l'intérieur où ils ont été envoyés et où quelques uns vivent en
pleine liberté dans la campagne. Aucun d'eux, jusqu'à présent,
n'a présenté le moindre signe de nouvelle atteinte de la maladie.

Non seulement ils ont été guéris, mais ils sont donc par-
faitement immusisés.

Nous pouvons en déduire :

Que dans certains cas, c'est à dire lorsque l'injection sous
cutanée de la solution de bleu de trypan est faite au moment
opportun, ce remède peut être efficace dans les cas de piroplas-
mose contractée naturellement, mais, comme le dit très bien le
Dr. Theiler dans son article, il ne faut pas généraliser, car souvent
l'intervention dans ces cas naturels peut arriver trop tard.

C'est surtout dans l'immunisation artificielle contre la piro-
plasmose que ce remède est utile, car il permet d'en contenir
et d'en réduire le danger. Il a soin d'ajouter que cette immu-
nisation artificielle doit être faite par des personnes compétentes,
disposant en même temps du matériel nécessaire.

Immunisation artificielle.

En vue des heureux résultats obtenus par StOCKMAN à
Londres et surtout par Theiler au Transval, j'avais demandé,
en Janvier dernier à la Secretaria d'Etat, à ce que tous les
reproducteurs d'espèce bovine que je devais acquérir cette
année en Europe, tant pour le Gouvernement que pour les
fermiers de l'Etat, fussent immunisés artificiellement, aussitôt
leur arrivée au Brésil.

Par suite de circonstances spéciales, lors de mon retour au
Brésil, le Novembre dernier, je retrouvai tous ces animaux,
(arrivées depuis le 23 Août à Sao Paulo), conservés dans les
étables et baignés périodiquement dans une solution de sarnol,
pour les empêcher d'être piqués par les tiques et infectés de
Piroplasmose.

A un moment donné cependent, vers le commencement de
Septembre, quelques uns d'entre eux, (28 de différentes races),
avaient été lâchés dans la prairie, mais comme 6 d'entre eux
étaient morts, à la suite d'une infection naturelle de Piroplas-
mose, on les avait ensuite rentré tous et protégés contre une
nouvelle infection.

Vu le péril qu'il pouvait y avoir à laisser l'infection se pro-
duire naturellement et la nécessité de ne vendre, à la hausse
publique annuelle, aux èlevours de l'Etat, que des animaux dûment
immunisés, je m'empressai de solliciter de Mr. le Dr. PAULO
DE MORAES, Secrétaire de l'Agriculture, l'autorisation de pratiquer,
sur tous les animaux, importés par le Gouvernement, l'immuni-
sation artificielle contre le piroplasmose, que je demandais à
pouvoir appliquer, depuis plusieurs années, en employant en
même temps le bleu de trypan, c'est à dire le procédé découvert
par NUTTALL et Hadwen et recommandé par Stockman et
Theiler.

Le Dr. PAULO DE MORAES. très compétent en la matière,
discuta longuement avec moi cette question, qui l'intéressait
vivement, non seulement parce que médecin distingué, mais
encore comme Secrétaire de l'Agriculture soucieux des intérêts
de son département, et s'empressa de m'accorder l'autorisation
demandée. Je dois ajouter que pendant les deux mois que
durèrent ces immunisations, ce me fût un réel plaisir et un
grand stimulant que de voir l'intérêt qu'il montrait aux ren-
seignements que je lui donnais chaque semaine sur la marche
des immunisations.

L'autorisation n'ayant été accordée le 17 Novembre, je choisis,
le lendemain, comme sujets de la première expérience, parmi
les animaux importés cette année d'Europe, 8 bovins qui, d'après
les notes du service vétérinaire, n'avaient présenté aucun signe
de maladie depuis 3 mois qu'ils étaient arrivés. Nous choisîmes
ensuite, avec Mr. M. ROUSSEAU, le chef du service vétérinaire,

TLANCHE III.

Folia Microbiologica III.
(Misson),

Taureau llamand >Jan II«, malade de Piroplasmose sous forme naturelle
(Rétabli par la suite».

2 jeunes taureaux de race flamande, tous deux de la même
importation que les autres, mais qui avaient eu la piroplasmose,
bien caractérisée, au commencement d'Octobre et chez lesquels
il y avait presque certitude de trouver du sang virulent en
même temps que la probabilité de ne pas rencontrer d'ana-
plasmose dans ce sang.

Je fis prendre, pour cette première expérience, du sang de
2 animaux différents, afin de déterminer, si possible, pour les
expériences suivantes, le degré de virulence du sang de chacun
d'eux et d'obtenir ainsi, pour les infections futures, un animal
dont le sang pût s'employer avec certitude de transmettre la
piroplasmose à des animaux jusqu'alors indemnes.

Le premier essai nous montra que tous deux possédaient un
sang virulent et par la suite, nous fûmes à même de constater
que ce sang était libre d'anaplasmes.

Lors de la première expérience, une partie des injections
furent faites avec du sang pur, les autres avec le même sang
défibriné, sans que les résultats fussent différents quant à
l'infection.

Pratique de l'immunisation par Theiler.

La pratique de l'immunisation est assez simple.

Les animaux importés étant un peu remis de leur voyage,
on fait à chacun d'eux, au moyen d'une seringue, une injection
sous-cutané de 5 c. cubes de sang virulent pris à la jugulaire
d'un animal remis depuis peu de temps de la piroplasmose.

Vers le 5ème ou le 6ème jour, la fièvre se déclare et la
température augmente sensiblement; vers le yème jour, parfois
un peu plus tôt, les piroplasmes commencent à apparaître dans
le sang, tandis que le jour suivant, les lamelles microscopiques
décèlent la présence d'un nombre beaucoup plus considérable
de parasites et que, parfois, apparait en même temps l'urine rouge.

A ce moment, c'est à dire lorsque les piroplasmes sont nom-
breux, en pratique une injection sous-cutanée de 100 à 200
c. cubes, (200 ce. pour des animaux de 600 kgs. de poids
vif), d'une solution de bleu de trypan à la dose de 1 gramme
de cristaux de bleu de trypan pour 100 c. cubes d'eau bouillie
et refroidie.

Après l'injection de bleu de trypan, on note presque toujours
une augmentation presque immédiate de la température ; elle
est probablement due à la destruction des parasites et à la
mise en liberté rapide des toxines dans le plasma du sang.

Après 24 ou 48 heures, elle redevient presque toujours normale.

Parfois, les parasites, qui semblent complètement éliminés
immédiatement après l'injection, réapparaissent dans le sang
après quelques jours mais toujours en petite quantité, ce qui
indique bien que la préparation ne détruit pas tous les parasites.
Jamais cependant, ces piroplasnies qui restent ne produisent
de rechute de la maladie.

Le bleu de trypan ne tuant pas tous les parasites dans le
sang, la conséquence doit être une immunité durable.

Je ne veux pas étudier séparément les différentes expériences
faites dernièrement ; je préfère donner tout d'abord le tableau
des temperatures constatées chez tous les animaux infectés
artificiellement et traités par le trypanbleu d'abord avec les
indications ci-dessus et indiquer ensuite les observations les
plus intéressantes qu'il nous a été donné de faire.

Dans les expériences faites ici, on voit donc que sur 72
animaux qui ont été infectés artificiellement, avec du sang
virulent d'un animal ayant eu la piroplasmose par suite d'une
infection naturelle, 62 ont réagi, c'est à dire qu'ils ont eux-
mêmes eu la piroplasmose, parfaitement caractérisée par
l'examen microscopique du sang.

La réaction, c'est à dire la présence de nombreux piroplasnies
dans le sang, sur les lamelles préparées, a été constatée :
dans 2 cas, le 5ème jour après l'infection,

cas,

6ème

cas.

aème

cas,

gème

cas,

çème

cas.

loème

cas.

I^ème

\Jurine rouge a été notée dans 4 cas seulement.

Uinjection sous-cutanée de la solution de bleu de trypan,
faite chaque fois par moitié à Vendrait même de Vinfection,
par moitié du coté opposé toujours derrière l'épaule, presque

Folia Microbiologica III.
(Misson).

'&, "^

rt «

'^ bn

C-

■*-•

(I)

fc:

bX)

C-

l-l

chaque fois, été suivie d'une augmentation rapide et assez
sensible de la température, mais, chez presque tous les animaux,
celle-ci s'est normaUsée rapidement et la plupart d'entre eux
étaient déjà remis complètement le iième jour après l'infection,
comme on peut le voir parfait;ement par le diagramme ci-joint,
des temperatures journalières de la génisse flamande Blés qui
est typique.

Mr. DescazeaUX, vétérinaire de la Direction, a fait l'injection
de trypan à l'encolure à quelques taureaux et a pu constater
que la chute de la température a été beaucoup moins rapide
après cette injection, ce qui dans son opinion, est dû à ce que,
au point d'infection, il doit se produire un foyer plus actif,
qui serait détruit plus rapidement par l'injection de bleu de
trypan lorsque cette injection est faite au même endroit.

Dans certains cas, les températures accusées quelques heures
après l'injection ont été très élevées, et dans deux cas nous
avons pu constater à ce moment, 42°2 et 42°4 chez deux
génisses flamandes.

De la comparaison de tous les maximas constatés, on ne
peut cependant tirer aucune conclusion en ce qui concerne la
plus ou moins grande résistance à l'infection des animaux des
diverses races.

On ne peut non plus le faire en comparant le nombre des
animaux des différentes races qui ont réagi.

Sur 26 taureaux Hollandais infectés, 25 ont réagi ;
» 15 génisses Hollandaises infectées, 14 » >
» 15 taureaux Schwyz infectés, 7 » »

» 10 génisses Schwyz infectées, 10 » »

» 6 » flamandes infectées, 6 » >'

soit un total de 62 réactions sur 72 infections artificielles.

10 de ces animaux n'ont pas présenté de réaction, ce sont:

8 taureaux Schwyz, i taureau Hollandais et i génisse Hollan-
daise, mais on ne peut cependant en déduire que les taureaux
Schwyz aient été plus résistants. Cette apparence de plus forte
résistance provient de ce que ces animaux, qui comme tous les
autres, étaient ici depuis le 23 Août, c'est à dire depuis 4 mois,
avaient été lâchés dans la prairie peu de temps après leur
arrivée, au commencement de Septembre, avaient étépiqués par
les tiques et, par la suite, avaient eu la piroplasmose. Chez

quelques uns d'entre eux, elle fut parfaitement constatée, chez
d'autres, au contraire, elle était passée inaperçue. Tous cepen-
dant avaient acquis une immunité suffisante pour résister à une
nouvelle infection, puisqu'aucun d'entre eux n'a présenté de
température abnormale pendant toute la période d'observation
qui suivit l'infection artificielle et que, toujours, l'examen
microscopique des lamelles préparées avec leur sang a été négatif.

Huit jeunes taureaux flamands qui faisaient partie de la même
importation ont été malades, la plupart atteints de piroplasmose
comme suite à une infection naturelle, fin Septembre ou commen-
cement d'Octobre, mais tous se sont rétablis assez rapidement,
sans qu'il fut nécessaire de leux appliquer le bleu de trypan.

Ce fait, qui semblerait montrer que l'infection qui se produit
à cette époque, c'est à dire vers la fin de l'hiver ou le
commencement du printemps, serait moins grave que celle qui
se déclare, (ici au Poste) de Décembre à Février, ou que les
tiques sont à ce moment moins nombreux ou moins virulents,
confirme par conséquent ce que j'ai toujours dit de l'avantage
qu'il y a à importer les animaux en hiver, (fin Mai à fin Août
au Brésil), et à les immuniser le plus tôt possible après leur
arrivée.

Dans les nombreuses expériences faites ici, nous avons seu-
lement eu 4 cas dans lesquels l'urine rouge a été constatée,
sans que cependant les animaux sur lesquels elle fut observée
présentissent des symptômes plus graves que les autres et sans
que leur guérison fut plus lente.

Lors de la troisième expérience, en plus des infections pra-
tiquées avec le sang des taurillons flamands qui donnèrent
toujours des infections bien caractérisées, il en fut fait trois
autres, à deux taureaux Schwyz et à un taureau Hollandais, avec
5 ce. de sang d'un taureau No. 3, qui avait été atteint de
piroplasmose le 25 Septembre, à la suite d'une infection naturelle.

Aucun d'entre eux ne présent de réaction, les deux Schwyz,
pendant les 12 jours qu'ils restèrent en observation accusant
des températures toujours comprises entre 38° et 39°, la tem-
pérature du Hollandais, pendant la même période, oscillant
entre 38°4' et 39°8'. A aucun moment il ne fut possible de
constater la présence de piroplasmes dans le sang d'aucun
d'entre eux.

A la suite de ce résultat négatif, qui pouvait s'attribuer à la
non virulence du sang employé ou bien à ce que les 3 autres
taureaux avaient déjà acquis l'immunité, je résolue de les sou-
mettre tous à une nouvelle infection, cette fois avec du sang
du taurillon flamand, dont la virulence était bien connue. Je
fis en même temps infecter, avec le même sang, le taureau
Schwyz No. 3 dont le sang n'avait pas produit de réaction
sur les 3 autres.

Des recherches faites dans les notes du service vétérinaire,
j'avais pu voir que ce taureau, lorsqu'il avait été malade en
Septembre, avait reçu une injection de bleu de trypan.

Tous quatre réagirent cette fois-ci parfaitement, comme on peut
le voir par le diagramme ci- joint des températures enregistrés
chez le taureau Schwyz Medor No. 3 et par celui du taureau
Hollandais »Concurrent« No. 342.

Tandis que l'injection de bleu de trypan était faite en temps
voulu aux trois premiers, c'est à dire lorsque leur sang accusa,
au microscope, le présence de nombreux piroplasmes, je m'ab-
stins d'appliquer ce remède au taureau No. 3 lorsque, le yème
jour, sa température atteignit 40°2' et lorsque son sang ren-
fermait de nombreux piroplasmes.

Je voulais voir si l'infection naturelle qu'il avait subie précé-
demment lui avait conféré l'immunité.

Comme il est facile de le voir par le diagramme, sa tempé-
rature descendait dès le lendemain à 39°8' et, 10 heures plus
tard, elle était retombée à 38°4' à la normale. Quant aux piro-
plasmes, ils étaient déjà beaucoup moins nombreux le Sème jour.

On peut donc en conclure que le taureau était déjà immu-
nisé et que la présence du bleu de trypan injecté 3 mois plus
tôt empêchait encore l'évolution des piroplasmes qui lui furent
injectés lors de l'infection avec le sang virulent. On peut aussi
en déduire que, probablement à cause de l'injection de bleu
de trypan faite 3 mois et 6 jours auparavant, son sang avait
perdu sa virulence.

C'est là un point important, parce qu'il nous indique que le
sang d'un animal traité par le bleu de trypan perd sa virulence
pendant un temps plus ou moins long et qu'il faut s'abstenir
de l'employer pour les infections artificielles peu de temps après
l'application de ce remède.

Une déduction plus importante encore, c'est que son emploi
nous sera d'un grand appoint dans la lutte contre la Piroplas-
mose. En effet, il est bien probable que tous les tiques qui
auront, pendant îine période de j mois au moins, attaqué un
animal traité par le bleu de trypan, dont le sang, comme nous
venons de le voir, ne sera pas virulent, ne s'infecteront pas
eux-mêmes et ne donneront pas naissance à des tiques virulents.
La Piroplasmose se transmettra donc moins et tendra par
conséquent à disparaître.

Dans la Piroplasmose contractée par suite d'une infection natu-
relle, Vavortement est une conséquence presque inévitable de
la maladie.

Lors des essais que nous avons faits ici, plusieurs génisses
étaient en état de gestation plus ou moins avancée, mais
aucune d'elles n'a avorté, toutes ont parfaitement supporté la
maladie produite artificiellement.

Pendant tout le temps que les animaux ont été en observation,
ils se sont conservées dans d'excellentes conditions, presque
toujours ils ont mangé et ruminé parfaitement; c'est à peine
si quelques uns d'entre eux, et ils sont peu nombreux, ont
montré un peu d'inapétence après l'injection de la solution du
bleu de trypan, c'est à dire au moment ou la fièvre était la
plus forte.

Jamais cependant nous n'avons du intervenir et aucun des
animaux en traitement, pendant toute la période d'observation,
n'a reçu le moindre médicament ou même le moindre stimulant.

Les premières expériences m'avaient fait voir parfaitement
la différence entre la piroplasmose naturelle et la piroplasmose
artificielle avec emploi du bleu de trypan quant à l'état de
santé des animaux avant et après la maladie.

Dans la piroplasmose contractée naturellement, les animaux
souffrent en effet un temps plus ou moins long et leur conva-
lescence est souvent lente. Après la maladie ils sont toujours
très affaiblis, manquent presque complètement d'appétit et
généralement maigrissent a vue d'oeil. Leur convalescence est
presque toujours fort longue.

Dans l'infection artificielle, au contraire, ils souffrent géné-
ralement très peu ; la maladie en effet évolue rapidement et
est presqu' instantanément arrêtée par l'injection de bleu de

Folia Microbiologlca III.

(Misson).

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trypan ; les animaux ne cessent pour ainsi dire pas de s'alimenter
parfaitement.

La conséquence est qu'il est presque impossible à une per-
sonne non prévenue de noter que les animaux sont malades.

Dans les expériences ultérieures, afin de m'assurer de l'avantage
de l'infection artificielle, j'ai pesé les animaux avant l'infection
et à leur sortie de l'infirmerie mais les différences n'étaient
pas bien fortes. Je dois faire remarquer que nulle modification
n'a été apportée dans la nourriture de ces animaux pendant
tout le temps qu'ils ont été traités et sont restés en obser-
vation ; leur alimentation est toujours restée la même depuis
qu'ils étaient ici.

Nous pouvons tirer une autre preuve de l'avantage de cette
méthode du fait intéressant qu'une génisse flamande, celle qui
justement a accusé la température la plus haute, (42°4)', a
présenté des signes de chaleur et a été fécondée 14 jours après
avoir montré cette fièvre si forte ainsi que de l'hémoglobinurie
et qu'une autre génisse Schwyz, dans le sang de laquelle on
avait trouvé de nombreux piroplasmes le 14 Décembre, se
trouvait dans le même cas 8 jours plus tard.

Ces manifestations physiologiques spéciales montrent bien que
les animaux se rétablissent rapidement de l'infection artificielle
combinée avec l'application du bleu de trypan.

Pour les animaux qui ont déjà été infectés, l'infection artifi-
cielle par injection de sang virulent ne présente aucun danger,
à la condition naturellement, que cette injection soit faite avec
les précautions antiseptiques indispensables.

Comme il est facile de le voir par le tableau de toutes les
températures constatées chez tous les animaux immunisés,
plusieurs d'entre eux n'ont présenté aucune modification dans la
courbe des températures pendant toute la période d'observation.

L'infection avec du sang virulent constitue dans ce cas un
véritable réactif négatif et permet de s'assurer si certains
animaux qui sont douteux ont été réellement immunisés, ou
si, au contraire, ils sont encore sensibles.

Les principaux avantages de cette méthode résident dans le
fait qu'elle est rapide, pratique et économique.

Elle est pratique, parce qu'elle permet, par l'examen des
températures constatées, de suivre le développement de l'in-

fection pour ainsi dire heure par heure et, lorsque cette tem-
pérature monte brusquement, de faire l'examen microscopique
du sang, qui, presque chaque fois, à ce moment, décèle la
présence des piroplasmes en plus ou moins grande quantité.
A plusieurs reprises, pendant les expériences dont nous nous
occupons, un seul examen du sang a suffi et très rarement il
fut nécessaire de répéter cet examen plus de deux fois pour
acquérir la certitude que les piroplasmes étaient nombreux et
qu'il était nécessaire de pratiquer l'injection de bleu de trypan.

L'examen microscopique du sang est cependant absolument
nécessaire lorsque cette immunisation doit être faite méthodique-
ment, car il arrive que, pendant les premiers jours après
l'infection, l'augmentation de la température ne correspond pas
toujours avec l'apparition des piroplasmes en nombre plus ou
moins considérable.

Ce système est infiniment plus méthodique et par conséquent
plus sûr que l'infection naturelle, dans laquelle la période
d'incubation est plus lente et dans laquelle le moment où il
est nécessaire d'intervenir est plus difficile à déterminer.

// est rapide, car dans la grande majorité des cas que nous
avons traités, il n'a pas fallu plus de lo à ii jours pour que
les animaux infectés fussent guéris parfaitement rétablis.

Dans l'immunisation artificielle, la période qui s'écoule entre
le moment où l'animal est infecté par les tiques et celui où
l'infection se déclare parfaitement est toujours plus longue,
l'animal souffre et s'affaiblit beaucoup plus, de sorte que, même
si l'on intervient à temps avec le bleu de trypan, il s'écoule
un temps beaucoup plus long avant qu'il ne soit parfaitement
rétabli.

// est économique, parce qu'il est plus rapide.

Si nous prenons comme exemple les animaux que nous avons
immunisés dernièrement au Poste Zootechnique Central, il est
facile de calculer l'économie qui aurait été réalisée par le
Gouvernement si cette immunisation artificielle avait été pratiquée
sur les 72 animaux peu de temps après leur arrivée.

Ces animaux sont arrivés le 23 Août et conservés ici pour
être immunisées jusqu'au 1er Février, c'est à dire pendant
160 jours.

Je dois ajouter que malgré cela beaucoup d'entre eux n'avaient

pas eu la tristeza et que le but que l'on se proposait n'avait
par conséquent pas encore été atteint.

Si nous calculons, ce qui est loin d'être exagéré, qu'ils coûtent
par jour, pour le nourriture et les soins, 2 francs par tête, nous
aurons, comme dépense totale pour les 72 animaux, pendant
ce laps de temps, une somme de 2 X 72 X 160 ou 23,040 frs.

Si l'immunisation de ces reproducteurs avait été commencée
une quinzaine de jours après leur arrivée, c'est à dire aussitôt
qu'ils auraient été remis des fatigues du voyage par mer, il ont
été parfaitement possible, en immunisant la moitié chaque fois,
de tout terminer vers la fin du mois de Septembre. Ces animaux,
dans ces conditions, auraient coûté à l'Etat, qui se charge de
leur nourriture et de leur entretien pendant la période d'accli-
matation, (réduite dans ce cas à 40 jours environ), une som
me de 2 X 72 X 40 ou 5.760 frs.

On aurait donc, de cette façon, réalisé une économie de
17.280 frs.

Il convient d'ajouter que le temps pendant lequel tout ces
animaux ont été conservés ici pour être acclimatés, correspond
exactement à la saison de monte, torminée maintenant, et que
l'Etat ou les particuliers qui les ont importés, et qui ne pourront
plus guère les employer avant le printemps prochain dans leurs
troupeaux, ont perdu les produits de toute une saison.

Si l'on estime seulement à 10 le nombre de veaux que chacun
pouvait produire cette année et que l'on compte que ces produits,
pour le moins de demi-sang, aient seulement une valeur de
80 frs. par tête, on arrive à constater pour l'élevage une porte
de 57.600 frs.

Comme je l'ai dit plus haut, en résumant le tableau des
températures constatées, 10 animaux, sur les 72 immunisés,
n'ont pas réagi à la suite de l'infection artificielle parce qu'ils
avaient acquis l'immunité par suite d'une infection naturelle.
7 taureaux flamands, un taureau Schwyz et un taureau Hollandais
étaient dans le même cas.

Cette immunisation naturelle de 19 animaux, pour quelques
uns desquels on a employé le bleu de trypan, n'a pas été obtenue
qu'avec une porte de 5 autres, morts en Septembre ou commen-
cement d'Octobre, de piroplasmose parfaitement caractérisée,
soit de près de 21 %.

Il est donc probable que si les 62 animaux qui ont réagi à
l'immunisation artificielle et qui par conséquent étaient encore
sensibles, avaient été immunisés naturellement, nous aurions eu,
parmi eux, une perte d'au moins 21 ^/^ soit de 15 animaux,
dont il conviendrait encore d'ajouter la valeur aux deux sommes
indiquées plus haut pour évaluer l'économie totale que le Gouver-
nement aurait réalisée si l'immunisation artificielle, avec emploi
de bleu de trypan, avait été pratiquée de suite après l'arrivée
des animaux.

Chez certains des animaux, chez lesquels l'injection de la
solution de bleu de trypan, appliquée lorsque les piroplasmes
étaient nombreux et la fièvre assez forte, a provoqué cependant
un abaissement assez rapide de la température, on constate
assez souvent, après quelque temps, (du iième au i5ème jour),
une nouvelle poussée de fièvre avec une température parfois
aussi élevée que celle notée au moment de la première.

Le cas s'est présenté chez plusieurs des animaux qui ont
été traités ici, comme on peut le voir par le diagramme du
taureau »Concurrent«, mais, quoique on ne soit jamais intervenu,
il ne s'est jamais produit de rechute de la maladie, et après
quelques jours, la température revenait à la normale et l'animal
recouvrait tout son appétit, qui avait un peu diminué pendant
2 ou 3 jours.

Cette fièvre secondaire correspond probablement à la
réapparition dans le sang, de piroplasmes qui paraissaient avoir
disparu complètement de suite après l'injection de bleu de try-
pan, et elle vient confirmer l'affirmation de NUTTALL que le
remède ne tue pas tous les protozoaires.

Preuves de Vimjnunisation. Le bleu de trypan ne tuant
pas tous les piroplasmes, la conséquence doit être une immunité
durable. Ceux qui restent produisent en effet une nouvelle
infection, peu grave en elle même, mais suffisante cependant
pour garantir les animaux contre une infection naturelle
subséquente.

De très nombreuses expériences, faites aux Etats Unis et en
Australie, (sur plus de 9.000 animaux), montrent que les
bovidés immunisés artificiellement, sans emploi de bleu de
trypan, ont parfaitement résisté par la suite à la tristeza,
lorsqu'ils étaient exposés aux piqûres des tiques.

Folîa Microbiologica III.

(Misson).

Le Dr. STOCKMAN, de Londres, a immunisé, en Angleterre,
en employant le bleu de trypan, de nombreux animaux exportés
par la suite au Transvaal dans l'Afrique du Sud, et le Dr.
ThEILER n'a pu constater, aucune rechute sur 200 animaux
qui, peu de temps après leur arrivée, avaient été lâchés en
plein champs, et y avaient été conservés pendant un an.

Ici même, comme je le dis plus haut, nous avons pu nous
assurer parfaitement qu'un taureau immunisé naturellement et
traité par le trypan ne présentait aucune réaction lors de
l'infection artificielle avec du sang dont la virulence avait été
absolument démontrée dans de nombreux cas.

Afin d'obtenir, par la pratique, quelques preuves de plus,
j'avais donné ordre que les 5 génisses flamandes et les 6 gé-
nisses Schwyz immunisées artificiellement et traitées par le bleu
de trypan le 18 Novembre et le 5 Décembre derniers fussent
lâchées journellement dans un champs dans lequel je savais
qu'il y avait de nombreuses tiques, que l'on prit soin de ne pas
les baigner et de s'enlever que les tiques mûres, sur le point
de se détacher d'elles mêmes.

Jusqu'à ce jour, c'est à dire après plus de 2 mois, aucune
d'elles n'a eu de rechute de piroplasmose et comme elles ont,
à certains moments, été absolument couvertes de tiques, je crois
pouvoir dire qu'elles sont tout à fait immunisées contre la tristeza.

Anaplasmose. Lors des recherches auxquelles il s'était livrées
au Transvaal, il y a un peu plus d'un an, pour prouver la
dualité des deux maladies, la piroplasmose et l'anaplasmose, le
Dr. Theiler avait découvert, dans le sang d'animaux provenant
de la région du Karoo, un anaplasme spécial, qu'il avait appelé
l'anaplasma marginale, var. centrale.

Il avait constaté que la maladie produite chez un animal par
cet anaplasme spécial était généralement bénigne, mais cependant
suffisante pour lui conférer l'immunité contre l'anaplasmose commune
et il conseillait, pour les injections, l'emploi du sang d'un animal
ayant été atteint simultanément de piroplasmose et d'anaplas-
mose centrale pour immuniser contre les deux maladies les
animaux importés.

La piroplasmose, qui se déclarait la première, était traitée,
au moment opportun par le bleu de trypan, quant à l'anaplas-
mose, qui ne survenait que plus tard, il n'était pas nécessaire

de la traiter spécialement, il suffisait de bien soigner l'alimentation
des animaux pendant cette période.

Le Dr. StOCKMAN, que j'avais consulté sur ce point lors de
mon dernier voyage en Angleterre, n'a pu me confirmer l'effi-
cacité du procède, il ma conseille d'attendre encore avant de
considérer comme définitifs les résultats obtenus par le Dr.
Theiler et de me limiter, en attendant de nouvelles expé-
riences, à pratiquer seulement l'immunisation artificielle contre
la Piroplasmose.

Je n'aurais du reste pas pu procéder en même temps aux
deux immunisations, parce que nous ne possédons pas encore,
ici au Brésil, de données bien certaines quant à l'existence,
dans un endroit déterminé, de l'anaplasma marginale var.
centrale.

Le Dr. Torres Cotrim, a cependant constaté, que dans sa
propriété de Campo Bello, certains animaux résistaient parfai-
tement à l'anaplasmose, tandis que d'autres, faisant partie de
la même importation, y succombaient rapidement et les recherches
qui ont été faites par les bactériologistes de l'Institut de Man-
guinhos, paraissent montrer que le sang des premiers renfer-
maient des anaplasmes de le variété centrale.

Le fait n'est pas encore confirmé d'une façon bien précise,
mais comme les recherches continuent, il est probable que nous
serons fixés avant peu sur ce point.

Dans les nombreuses importations qui ont été faites en Afrique
du Sud, la pratique a montré que les animaux qui avaient été
immunisés artificiellement contre la piroplasmose et chez lesquels
la maladie avait été arrêtée par le bleu de trypan, étaient,
comme le dit le Dr. StOCKMAN, considérablement plus résistants
que les autres à l'anaplasmose.

Les cas que nous avons pu étudier ici dernièrement semblent
le confirmer.

Un taureau de race flamande qui, en Septembre dernier,
avait été atteint de piroplasmose sous forme naturelle et auquel
il ne fut pas fait (V application de bleu de trypan, est tombé
malade, d'anaplasmose bien caractérisée par l'examen micros-
copique, le 19 Décembre dernier.

Les températures successives, depuis le moment ou la maladie
a été nettement constatée, ont été les suivantes:

Folia Microbiologica III.
(Misson),

s) .-< ^

— <U

m .s .=

Matin. Soir,

le ig Décembre 40^8 40*^3

» 20 » 40O5 3909

» 21 » 39*'6 39^7

» 22 » 36*^6 36*'6

et la mort est survenue le même jour.

Une application de bleu de trypan qui lui fut faite le 19
après midi ne produisit aucun effet et l'examen microscopique
du sang fait le lendemain de cela la présence d'anaplasmes aussi
nombreux que ceux qui avaient été constatés la veille.

Nous avons eu par la suite 4 nouveaux cas, bien caractérisés
aussi d'anaplasmose sur 2 génisses flamandes et 2 génisses
Schwyz, immunisées artificiellement fin Novembre ou commence-
ment Décembre, avec application de bleu de trypan.

Au moment où la maladie a été constatée, les génisses pré-
sentaient des températures variant de 41O1 à 41^7, toutes
étaient fort abattues, avec respiration haletante et inapétence,
mais dans tous les cas, sans emploi d'aucun remède, la tem-
pérature a diminué assez rapidement et elles ont été rétablies
en quelques jours, comme on peut le voir par le diagramme
des températures de la génisse Schwyz 1179.

L'une d'elles a avorté 3 jours après l'apparition de la maladie
et a souffert plus que les autres, mais elle est parfaitement
remise maintenant.

Une est morte, une génisse flamande, mais l'autopsie a montré
que le décès, survenu lorsque le thermomètre accusait une
température de 38^5, était dû à une congestion intestinale.

Dans les conditions actulées, il paraitrait donc que le système
d'immunisation le plus pratique est celui qui consiste à trans-
mettre aux animaux, artificiellement, le piroplasmose pure, ce
qui, dans un établissement comme le Poste Zootechnique Central,
avec le matériel et les précautions nécessaires, n'est pas chose
difficile.

J'y suis du reste parfaitement arrivé, car tous les animaux
qui ont eu l'anaplasmose, Vont contractée naturellement.

Si la maladie qui a été constatée avait été injectée avec le
sang qui a servi pour l'infection de piroplasmose, elle serait
apparue beaucoup plus tôt, (de 14 à 40 jours après l'infection),

ce qui n'est pas le cas ici, puisqu'elle n'a pas été constatée
qu'au moins 56 jours après l'infection artificielle.

Si le trypan bleu confère une résistance plus considérable à
l'anaplasmose, je ne crois pas qu'il soit indispensable de faire
en même temps l'immunisation artificielle contre cette seconde
maladie, non seulement parce que les animaux immunisés contre
la Piroplasmose y résistent mieux, mais encore parce qu'elle
est plus rare que la tristeza et n'attaque qu'une proportion peu
élevée des animaux importés.

Je dois ajouter qu'afin de la faire disparaître, je prends soin
de faire baigner tous les animaux atteints d'anaplasmose, afin
que de détruire le plus possible les tiques qui pourraient être
infectées et, par le suite pourraient la transmettre.

Je crois aussi qu'il n'est pas nécessaire d'immuniser les animaux
contre cette maladie parce qu'il me parait qu'elle est localisée
dans certains endroits ou elle a été importée par des animaux
importés de pays où elle existe et que beaucoup d'autres régions
sont encore indemnes.

Comme je l'ai montré plus haut, l'immunisation artificielle est
pratique, rapide et économique et j'ai indiqué, pour une partie
de l'importation faite par l'Etat de Sao Paulo, l'économie
qu'elle comporterait pour lui si elle était faite de suite après
l'arrivée des animaux.

Les portes éprouvées par les éleveurs sont plus considérables
encore et il serait difficile d'estimer la valeur de tous les repro-
ducteurs importés par eux depuis un certain nombre d'années,
qui sont morts peu de temps après leur arrivée dans le pays.
Je pourrais citer de très nombreux cas ou les portes éprouvées
ont été de plus de go 0/0 ^t, très récemment encore, un impor-
tateur de Rio a eu à enregistrer la porte de 150 génisses
Hereford, tandis qu'un éleveur voyait mourir, en peu de jours, 58
animaux sur un lot de 80 dont il avait fait l'acquisition à l'étranger.

Dans l'Etat de Rio Grande do Sul, beaucoup d'importations
faites tant d'Europe que d'Argentine ont été désastreuses, et je
possède, entre autres des lettres de Mr. Octavio Lemos, grand
éleveur à Santa Maria, dans lesquelles il m.e dit avoir perdu
plus go 7o des animaux qu'il a importés à diverses reprises.

Dans l'Etat de Minas Geraes, il y a eu aussi énormément
d'insuccès lors des importations d'Europe.

Folia Microbiologica III.
(Misson).

B h

Pour le Gouvernement fédéral, qui accorde chaque année
d'importants subsides en vue de favoriser l'importation de repro-
ducteurs de races améliorées, les pertes ont aussi été très
fortes. En effet, la plus grande partie des animaux qui ont été
amenés dans le pays n'ont pu résister à l'acclimatation et ont
péri, de sorte que les subsides, (de 500000 par tête), qui sont
accordés aux éleveurs ont été, pour la plupart, absolument
perdus. On peut dire, sans crainte d'être taxé d'exagération,
que, des 480,000 frs. qui figuraient au budget du Ministère de
l'Agriculture et qui ont été dépensés dans le but de favoriser
l'importation, les deux tiers, c'est à dire 320,000 frs. ont été
dépensés en pure perte parce que les éleveurs qui ont joui de
ces subsides ont perdu ces animaux de tristeza.

Si l'on pouvait faire une statistique complète de tous les
bovidés de races améliorées débarqués sur le territoire brésilien,
obtenir les renseignements exacts quant au nombre d'entre eux
qui ont succombé à la tristeza et calculer leur valeur, (prix d'achat
augmenté des frais de transport), je suis certain que l'on arri-
verait à un total de plus d'un million de francs annuellement.

Le gouvernement de l'Etat de Sào Paulo, qui a été le premier
à créer un Poste Zootechnique destiné à venir en aide aux
éleveurs, non seulement en étudiant toutes les questions qui se
rattachent à l'élevage mais encore en leur permettant d'y accli-
mater les reproducteurs importés à leurs fermes d'élevage, est
outillé maintenant, grâce aux expériences concluentes faites
dernièrement, pour immuniser artificiellement tous les bovidés
importés et assures ainsi, avec un minimum de frais, un emploi
judicieux des subsides accordés, tant par lui-même que par le
Gouvernement fédéral et une utilisation aussi complète que
possible des sommes dépensées par les éleveurs pour l'achat
des réproducteurs.

Malheureusement, le Poste Zootechnique Central de Sao
Paulo a un rayon d'action limité, et, dans les conditions actuelles,
ne peut guère s'occuper que de l'immunisation des bovidés
importés par les éleveurs de l'Etat. Son action sur l'amélioration
des races nationales a cependant été efficace, surtout au point
de vue des croisements, parce que son intervention dans
l'acclimatement du bétail a rendu aux éleveurs la confiance que
de nombreux insuccès leur avait fait perdre.

Grâce à l'application méthodique de l'immunisation artificielle,
qui, désormais sera de pratique courante pour tous les ré-
producteurs importés pour lui même ou avec son concours et
à l'énorme diminution de la mortalité qui en sera la conséquence,
il est certain que les importations augmenteront encore et que
les progrès réalisés par l'élevage seront beaucoup plus rapides.

En ce qui concerne les importations faites pour les autres
Etats, le Ministère de l'Agriculture de Rio Janeiro devrait
intervenir.

Il devrait créer, à Rio de Janeiro et à Porto Alegre par
exemple des postes d'acclimatation où tous les animaux de
race bovine importés avec son autorisation et avec son concours
financier devraient être immunisés artificiellement contre la
pirosplasmose avant d'être remis à leurs propriétaires et où,
en même temps, il serait permisaux éleveurs qui achèteraient
directement de faire immuniser le bétail qu'ils destinent à leurs
fermes d'élevage et qui viennent de l'étranger.

De cette façon, non seulement le Gouvernement fédéral
réaliserait, pour lui-même et pour les éleveurs, une économie
considérable, en sauvant bien des animaux, qui sans cette
immunisation artificielle, auraient péri en peu de temps, mais
encore, en garantissant en quelque sorte les reproducteurs, il
favoriserait énormément leur importation et par là même, con-
tribuerait à augmenter, par le croisement, la valeur du cheptel
national.

Cette immunisation du bétail de race qui permettrait son
acclimatation facile et rapide, tendrait aussi à faire heureuse-
ment diminuer l'introduction du zébu, estiné dans certaines
zones par suite de sa plus grande résistance aux tiques et à
la Piroplasmose.

Avec l'immunisation artificielle, il n'y aurait plus de raisons
de conseiller son importation.

Sao Paulo, 22. 2. 19 13.

LA PUTRÉFACTION INTESTINALE ET LA
SCLÉROSE DE L'AORTE.

PAR

le Dr. T. S. STEENHUIS,

Assistanl-Prosecteur de l'Institut d'Anatomie pathologique de l'Université
de Groningue.

Depuis les publications de NUTTALL et Thierfelder i) et
celles de SCHOTTELIUS 2) qui se sont occupés de la possibilité
de la vie animale sans l'intervention des microbes, la question
de la signification de la flore microbienne intestinale est restée
un des points fixes du programme de travail des laboratoires
de biologie.

Ce chapitre a surtout été étudié dans l'Institut PASTEUR de
Paris par le Prof. El. Metchnikoff s) et ses collaborateurs.

Au cours de ces dernières années, METCHNIKOFF a fait publier et
a publié lui-même une série de recherches sur la sénilité, faites
dans l'intention de dénoncer la cause des altérations seniles et
de faire connaître les changements anatomiques qui caractérisent
le senium.

Dans la théorie de METCHNIKOFF les leucocytes ont une
très grande importance. Les globules blanches mononucléaires
du sang attaquent des cellules fixes du corps et les abolissent.
Quand le ravage a lieu à un haut degré dans les parties nobles
du corps, la mort est inévitable ; une démolition modérée cause
les symptômes du senium, et est le stigma anatomique de la sénilité.

Metchnikoff et ses élèves *) ont trouvé alors dans les

^) Zeitschrift für physiologische Chemie. Bd. 21.

2) Archiv fLir Hygiene. Bd. 34.

3) Etudes sur la nature humaine.

*') Salimbéni et GÉRY. Annales de l'Institut Pasteur 1912.

organes et les tissus des personnes très âgées, hors l'atrophie
et les dégénérescences communes des cellules parenchymateuses,
des infiltrations mono-nucléoleucocytaires ; les infiltrations sont
suivies de la sclérose des tissus, si la mort n'interrompt pas le
processus. Mais MetCHNIKOFF et ses élèves sont restés seuls à
constater les altérations sus-dites. Nulle part dans la littéra-
ture ancienne traitant de la sénilité l'infiltration mononucléaire
est nommée parmi les signes anatomiques et histologiques de la
vieillesse; et MÜHLMANN i), un des spécialistes dans ce domaine
de la pathologie, qui dans ce but a examiné avec beaucoup
de soin les organes d'un vieillard de 90 ans, mort d'une maladie
intercurrente, n'a trouvé aucune trace de ces infiltrations.

MetCHNIKOFF suppose que les cellules des infiltrations ont
dévoré le parenchym, et ensuite il émet un eseconde hypothèse.
METCHNIKOFF suppose que par une action chémoctatique par
exemple, les leucocytes se rendent aux tissus qui ont subi une
intoxication par les produits toxiques d'origine intestinale de
provenance microbienne ; enfin il regarde les infiltrations comme
une preuve de cette intoxication.

La flore microbienne de l'intestin est donc l'itinéraire pour
les phagocytes, les macrophages, qui consomment les organes
de l'individu, intoxiqués par les produits de putréfaction de
l'intestin, surtout le gros intestin de l'homme.

Parmi ces produits de putréfaction apparaît régulièrement
l'indol, qui est formé sans cesse sous l'influence de différents
microbes, surtout du Bacterium coli commune.

L'indol est absorbé et transformé dans le foie en indoxyl-
sulfate et en indoxylglucuronate ; sous ces formes, il circule
dans le corps. Dans son cours à travers le corps, l'indol
affaiblit les cellules des organes, surtout de ceux, qui sont
nécessaires à la vie comme le cerveau, le foie, les reins, les
capsules surrénales, les vaisseaux (les artères) ; les cellules affai-
blies sont en proie aux macrophages.

Pour contrôler sa théorie et pour mieux la fonder, METCHNI-
KOFF a fait faire différents travaux, d'une part pour étudier la
capacité des microbes quant à la production de l'indol 2)^ d'autre

^) Centralblatt für allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie. 191 3.
2) Annales de l'Institut Pasteur, 19 10. Dobrowolsky.

part pour apprendre l'influence de l'indol, du phenol, du para-
cresol sur les animaux.

Parce que l'athérome est une des altérations les plus carac-
téristiques du senium, on a surtout étudié l'influence des matières
nommées sur le système vasculaire.

Metchnikoff 1) ne réussit pas dans ses tentatives de créer
l'athérome de l'aorte des cobayes, à l'aide du parakrésol ; son
élève Okkoubo 2) réussissait avec succès à voir paraître une
sclérose de l'aorte des lapins qu'il avait nourris avec de l'indol ;
et de plus il observait des infiltrations mononucléaires dans
les espaces portes du foie des lapins et des cobayes indoles.

S'appuyant sur ces études de METCHNIKOFF et d'OKHOUBO,
Dratchinsky 3) à l'institut Pasteur de Paris s'est occupé
d'une manière plus étendue de la question, si l'indol est vraiment
d'importance dans l'étiologie de la sclérose des artères.

Tout d'abord, il étudia la structure normale de l'aorte des
cobayes et il constata que l'aorte des cobayes de nos labora-
toires est bien fréquemment altérée en forme d'athérome, ce
qui était bien étonnant, parce que WEINBERG *) à l'institut
Pasteur également, n'avait trouvé qu'un cas d'athérome spon-
tané sur 236 cobayes, ainsi que celui-ci avait conclu, que les
cobayes n'ont pas d'athérome spontané. Et à l'examen macros-
copique Dratchinsky n'a pas trouvé non plus de plaques
athéromateuses, ni d'autres anomalies des parois des vaisseaux.

L'examen microscopique néanmoins de la partie ascendante
de l'aorte, coupée en série révéla des foyers cartilagineux dans
la paroi, surtout dans la tunique moyenne, à forme ronde ou
ovale, très souvent dans la conjonctive, qui rattache les valvules
sémilunaires à la paroi de l'aorte ; les parties cartilagineuses se
trouvent tantôt dans une, ou deux de ces attaches, tantôt
simultanément dans toutes les trois.

Dratchinsky a trouvé ces foyers durs dans 50 0/0 de ses
cobayes examinés, et quand il ne compte que les animaux
ayant un poids de 250 grammes et plus^ ce nombre se monte
à 67.5 p. 100.

^) Annales de l'Institut Pasteur. 1910.

2) Ibid.

*) Annales de l'Institut Pasteur. 191 2.

*) Comptes rendus de la Société de Biologie. 1908.

Dratchinsky conclut, que nous avons là un processus
pathologique: une sclérose de l'aorte »sui generis«, se mani-
festant par un processus de cartilagination. Il la nomme »sui
generis« parce que la cartilagination chez certains autres
animaux, qui ont aussi des parties cartilagineuses dans le
système cardio-vasculaire, ne se présente pas avec la même
constance que chez les cobayes.

Deux des cobayes examinées montrèrent un dépôt de sels
calcaires dans les espaces intercellulaires des foyers cartilagi-
neux ; dans un cas seulement fut annoté un léger épaississement
de la tunique intérieure de la paroi.

Quant à l'étiologie de cette sclérose, on peut éliminer les
différents facteurs de l'artériosclérose chez l'homme, comme
l'empoisonnement par le plomb, par la nicotine, l'alcooHsme, la
syphilis et autres processus infectieux. Il faut donc chercher le
moment étiologique d'après les idées de Metchnikoff dans
l'autointoxication intestinale de provenance microbienne ; c'est le
processus de putréfaction dans l'intestin, et surtout l'indol qui
cause l'athérome.

Alors Dratchinsky a ingéré par voie buccale à une série
de cobayes, une petite quantité d'indol dans une solution d'huile
d'olives ; il pratiqua cette petite opération tous les jours et
ingéra 0,040 grammes d'indol par jour, de sorte que la réaction
de l'urine au point de vue de l'indican restait nettement positive.

De plus la même expérience était faite avec un singe
(Macacus Rhesus).

L'introduction de l'indol chez les cobayes était suivie souvent
d'une dégénérescence hyaline en forme de foyers allongés dans
la tunique moyenne de l'aorte ascendante ; beaucoup de ces
foyers étaient imprégnés de sels calcaires. Dans les dépots
calcaires on pouvait quelquefois constater des restes de cellules
à aspect cartilagineux.

Deux jeunes cobayes ont présenté une forte cartilagination
de la paroi de l'aorte dans la région des valvules.

La dégénérescence calcaire n'entraîna jamais le moindre
épaississement de l'intima.

Autour des vasa vasorum il y avait des infiltrations de petites
cellules rondes mononucléaires. Par endroits le tissu conjonctif
était si fort, qu'il couvrait absolument les fibres élastiques.

Les reins présentaient des foyers d'infiltration autour des
glomérules et des vaisseaux, avec prolifération consécutive du
tissu conjonctif dans la plupart des cas. Dans les tubes urinifères
il y avait des dépôts calcaires.

Le foie présentait sous forme d'une infiltration de petites
cellules autour des vaisseaux biliaires et sanguins la première
phase de cirrhose.

DratCHINSKY conclut donc, que chez les cobayes l'indol
cause une sclérose : une athérome de l'aorte se manifestant
par la dégénérescence hyaline et comme nous l'avons vu, la
cartilagination de la paroi ; la sclérose typique des reins ; la
cirrhose du foie.

Le singe qui avait été traité avec de l'indol présenta des
infiltrations mononucléaires autour des vasa vasorum de la
base de l'aorte, dans le cœur, autour des canaux biliaires et
des vaisseaux sanguins du foie ; une néphrite interstitielle ; des
foyers calcaires dans les capsules surrénales.

Quand nous comparons les altérations de la paroi de l'aorte
de l'homme, connues sous les noms de l'athérome, de l'artérios-
clérose, de l'athérosclérose avec celle que MetchNIKOFF et
DRATCHINSKY ont décrite sous le titre de 1 athérome chez
le singe et les cobayes, nous remarquons une différence
énorme.

Dans l'aorte du singe, DRATCHINSKY observa des infiltrations
de cellules rondes autour des vasa vasorum ; en admettant
l'hypothèse de METCHNIKOFF sur le rôle de ces cellules mono-
nucléaires comme un fait, il peut prétendre que ces foyers
d'infiltration forment la première phase de la sclérose de
l'aorte, mais cela reste à prouver. Chez l'homme on ne connait
pas ces infiltrations initiatives, et la dégénérescence et l'hyper-
plasie de l'intima qui sont si caractéristiques pour la sclérose
de l'homme manquent tout à fait dans la description bien
exacte de DRATCHINSKY.

Chez les cobayes, DRATCHINSKY remarqua des foyers carti-
lagineux et la dégénérescence hyaline avec dépôt de sels
calcaires ; ces foyers se trouvent dans la tunique moyenne,
et adventitielle de la paroi de l'aorte dans une partie nettement
circonscrite, sans qu'il y ait aucune trace d'altérations de la
tunique intérieure à ces endroits.

Or il y a quelqe temps je me suis occupé en collaboration
avec le Prof. Reddingius des recherches sur l'influence des
troubles nutritifs sur la paroi des vaisseaux, surtout de l'aorte
des lapins et du cobaye.

Dans ce but je détachais une partie de l'aorte abdominale
sur une longueur de 3 cM. chez le lapin, de i cM. et ^ chez la
cobaye, sans troubler la circulation dans l'aorte et sans faire
de contusions, en prenant garde de ne pas toucher l'aorte. Pour
empêcher une réunion précoce j'ai couvert la partie détachée
de cofferdam. L'injection d'indigo-carmin prouve, que l'affluence
de sang dans la paroi de la partie détachée est diminuée con-
sidérablement.

A ces troubles nutritifs, qui causent une dégénérescence de
la couche musculo-élastique, l'intima répond par une hyperplasie
consécutive très nette.

Il est bien remarquable, que dans les expériences de Drat-
CHINsKY, où il suppose la dégénérescence de la tunique moyenne
par l'intoxication, qui est aussi un trouble nutritif, il n'y a point
d'altérations de l'intima, ni dégénératives, ni hyperplastiques.

Ces résultats contradictoires m'ont fait répéter les expériences
du Dr. Dratchinsky.

Comme DratCHINSKY je me suis procuré de l'indol pur de
la Badische Anilin- und Sodafabrik à Wilhelmshafen et j'ingérais
tous les jours à mes 20 cobayes o gr., 040 dans 0.5 ou 1 cM^
d'huile d'olives. La solution était ingérée dans l'oesophage des
animaux à l'aide d'une seringue d'injection à laquelle j'avais
appliqué un bout de tube de caoutchouc de 4 cM. de
longueur.

Durant les expériences, douze cobayes sont morts^ les autres
je les ai tués par le chloroforme. Mes matériaux consistaient
donc en 20 aortes, provenant de cobayes qui avaient reçu de
l'indol pendant :

17, 27, 28, 30, 31, 34, 40, 46, 5T, 56 jours, 3 mois (2 cobayes)
3 mois ^/'2 (4 cobayes), 6 mois (2 cobayes), 8 mois (2 cobayes).

La durée de l'intoxication de la première dizaine a été trop
courte, pour faire usage de ces animaux pour les conclusions ;
il ne nous reste que les derniers dix cobayes, qui ont été
empoisonnés de 5 mois à 8 mois.

L'aorte ascendante de tous les animaux fut coupée transver-

salement en série après l'imprégnation à celloidine ou à paraffine.
En règle, j'ai coloré l'aorte en bloc avec le carmin. Des parties,
qui avaient des foyers cartilagineux, ou se trouvaient à la
hauteur, où d'autres animaux en avaient présenté, j'ai coloré
quelques coupes d'après VaN Gieson et d'après WEIGERT afin
d'étudier l'état du tissu conjonctif et des fibres élastiques.

Hors de ces aortes »pathologiques«, j'avais la disposition des
aortes de lo cobayes non traités avec de l'indol; ces cobayes
étaient tous adultes ; nous les avions sacrifiés, saignés à blanc
pour nous fournir du sang pour la réaction de WASSERMANN.

Enfin j'ai fait l'examen de l'aorte de quatre foetus. Pour être
sur que le foetus n'avait pas subi l'influence d'agents morbides,
les produits d'avortement n'étaient pas propres à mes recherches.
Pour cela j'ai fait la section césaréenne d'un cobaye presqu'à
terme, et je lui ai enlevé un des trois foetus qu'il portait.
Quatre jours après les deux autres sont nés, à terme, et ils se
sont très bien développés. Et ce foetus, exstirpé de l'utérus,
tout à fait sain, présenta dans la paroi de son aorte, près de
l'insertion des valvules sémilunaires un petit foyer de cellules
rondes avec des capsules, des cellules différentes des autres
cellules, musculaires et fibreuses, imponant comme des cellules
cartilagineuses.

Chez les autres foetus je n'ai pas trouvé de cellules pareilles,
ni dans cet endroit, ni dans des parties voisines.

Les dix cobayes adultes non traités présentaient sans exception
des foyers cartilagineux autour de l'orifice de l'aorte, difïérents
de grandeur, se trouvant presque toujours dans la couche moyenne.
L'apparence de ces foyers cartilagineux n'était pas accompagnée
d'altérations de l'intima. Les parties de l'aorte thoracique et
abdominale examinées n'ont pas présenté de foyers cartilagineux.

La structure microscopique des foyers cartilagineux correspond
parfaitement à la description exacte de DratchinSKY. Surtout
dans les coupes colorées d'après WEIGERT et Van Gieson,
ainsi que les fibres élastiques sont colorés spécifiquement aussi
bien que le tissu conjonctif, on peut observer que dans quelques
endroits il se trouve des cellules arrondies, au lieu des cellules
fusiformes communes, entre les fibres élastiques qu'ils font
écarter ; au centre de ces foyers les cellules deviennent plus
grandes, le réseau élastique devient très lâche et rentre au

second plan en vue des cellules cartilagineuses entourées d'une
capsule nette, qu'il contient dans ses mailles.

Les foyers cartilagineux se trouvent toujours dans une région
fibreuse ; or l'anneau d'attachement des valvules est toujours,
aussi hors des foyers cartilagineux moins élastique, plus fibreux
que le reste de la paroi de l'aorte.

Chez, les animaux à qui j'avais ingéré de l'indol, j'ai trouvé les
mêmes foyers cartilagineux que je décrivais ci-dessus. Excepté
un cobaye, qui avait été traité pendant 46 jours et qui avait
des foyers cartilagineux très étendus, les foyers des animaux
indoles n'étaient pas plus grands que ceux de ses pareils normals.
La dégénérescence hyaline et l'imprégnation de sels calcaires
n'ont jamais paru. Deux cobayes montraient des infiltrations
lymphocytaires du tissu graisseux péri aortique ; autour des vasa
vasorum je n'ai pas remarqué ces infiltrations.

En me bornant à l'étude de l'aorte, j'ai obtenu le résultat suivant :

Tous les animaux adultes présentaient des foyers cartilagi-
neux de la paroi de l'aorte d'une étendue différente, principale-
ment à la base des valvules sémilunaires, dans le tissu conjonctif
qui rattache ces valvules à la paroi, correspondant à une, deux
ou tous les trois valvules; quelquefois ils se trouvaient dans la
paroi des sinus Valsalvae.

Les cobayes traités avec de l'indol n'ont pas montré de différence
avec les animaux non traités ; il y a le fait curieux que deux
cobayes indoles n'avaient pas de foyers cartilagineux ; ces
deux animaux avaient reçu de l'indol pendant 3 mois et
pesaient 310 et 325 grammes quand je les tuai.

Un foetus presqu'à terme avait un conglomérat de cellules
rondes, capsulées, qui ne peuvent être que des cellules carti-
lagineuses, je crois.

Je dois stipuler que je n'ai jamais remarqué de dégénérescences
ou de l'hyperplasie de l'intima des cobayes normaux ou traitées,
ni à côté des foyers cartilagineux, ni autre part.

Par conséquent, est ce que les faits autorisent DrATCHINSKY
1°. de concluer que les foyers cartilagineux, la dégénérescence
hyaline subséquente et le dépôt de sels calcaires forment une
sclérose sui generis, et de contribuer cette sclérose à l'influence
de l'indol,

et 2° est ce qu'il a le droit d'expliquer la sclérose humaine
comme la suite d'une intoxication de provenance intestinale,
par l'indol?

Quant à la première question : les foyers cartilagineux ne se
trouvent qu'autour de l'orifice de l'aorte, donc dans une région
où l'on trouve des foyers cartilagineux ou osseux chez différents
animaux comme le cheval, le porc, beaucoup de carnivores i)
qui sont aussi susceptibles d'une sclérose, rappelant l'athéro-
sclérose de l'homme ; pour le cheval, tout au moins, Faber 2)
vient de le démontrer. Selon mon opinion c'est un argument
contre la supposition de Dratchinsky, et cela me fait accepter
plutôt que les foyers indiqués qu'on trouve toujours, forment
une partie physiologique de l'aorte, soit qu'ils ne soient pas
placés tout à fait régulièrement.

Il n'est donc plus nécessaire de chercher le moment étiologique
de ces foyers cartilagineux qui ne sont pas causés par l'alcool,
le syphilis, etc. dans l'auto-intoxication chronique par l'indol.
Surtout le petit foyer dans l'aorte d'un foetus, qui indiquerait
une intoxication placentaire sans autres troubles, ne plaide pas
en faveur de l'hypothèse de DRATCHINSKY.

Or il n'est pas vraisemblable du tout, que la cartilagination
est la sclérose kat' exochen des cobayes, On a pu causer chez
les cobayes des formes d'athérome, qui ressemblent beaucoup
plus à l'athérosclérose de l'homme. Tout d'abord je rappelle
nos recherches sus-dites par le détachement de l'aorte. Mais
ce n'est pas encore l'athérosclérose sensu striction.

Le premier qui a réussi à créer chez des animaux une dégé-
nérescence de la paroi de l'aorte ressemblante, même identique
à l'athérosclérose humaine, c'était SaltyKOW 3), qui y parvint
par des injections répétées de staphylocokkes chez le lapin.
Sur la demande du Prof. Reddingius j'ai pratiqué aussi les
injections coccaires et jamais je n'ai obtenu l'athérosclérose
de mes lapins. Cela prouve bien qu'il faut être très prudent
sur l'interprétation des épreuves experimentelles. SaltykOW
lui-même a supposé tout de suite que nos résultats différents

1) Dratchinsky, le.

2) Arne Faber. Die Arteriosklerose, Jena 1912.

3) Verhandlungen der deutschen pathologischen Gesellschaft, Xlle Tagung 1908.

s'expliqueraient par la nourriture: il nourrissait ses lapins avec
du lait, nous avec de l'avoine et de l'herbe.

Des recherches russes ont alors rendu très probable la
supposition de Saltykow.

Anitschow 1), Chalatow 2), Wesselkin 3) et encore d'autres
ont crée des altérations de paroi des vaisseaux, identiques à
celles que SaLTYKOW avait décrites et à l'athérome humaine,
chez des animaux en les nourrissant avec des jaunes d'œuf,
avec des cervelles, avec de la Cholesterine.

Quand Saltykow 4) examinait maintenant l'effet de la
nourriture au lait, toute seule, il a vu les mêmes altérations qu'il
avait trouvés après l'injection des staphylocokkes, combinée avec
l'ingestion du lait. L'examen chimique a démontré alors qu'avec
cette nourriture on ingère une quantité de Cholesterine aussi
grande que dans les experiments d'ANITSCHOW,

Du reste ClIALATOW ^) a montré, que les cobayes réagissent
à l'ingestion de jaunes d'œuf de la même manière que les
lapins, par une athérosclérose.

Je ne veux pas insister ici sur les recherches de CHAUFFARD s)
e. a. 7) qui nous ont démontré la richesse de Cholesterine du
sang des malades sclérotiques, qui sont d'une grande importance
en rapport aux recherches experimentelles nommées ci-dessus.

Il restait encore la possibilité, quoique peu vraisemblable que
l'ingestion de jaunes d'œuf fut cause d'une augmentation des
processus de putréfaction intestinale, de sorte qu'elle créait la
sclérose par l'intermédiaire de l'intoxication par l'indol.

J'ai contrôlé l'urine des lapins et des cobayes (et à la
clinique médicale on a bien voulu vérifier mes résultats)
auxquels j'avais donné un jaune d'œuf par jour pendant
quatre semaines. Nous n'avons pas obtenu la réaction positive
de l'indican.

M'appuyant sur ces faits, mon opinion est qu'on n'a pas le

ij Ziegler's Beiträge, Bd. 56.

2) Centralblatt für Allgem. Path, und Path. Anatomie, 191 3.

3) ViRCHOw's Archiv, Bd. 212.
*) ViRCHOw's Archiv. Bd. 213.
E) 1. c.

ö) Revue de Medicine, 191 1.

'') p. e. Henes, Deulches Archiv, für Klinische Medizin, Bd. iii.

droit de dire que l'indol crée une sclérose sui generis de
l'aorte des cobayes et qu'il est très probable que l'indol ne
joue aucun rôle dans l'origine de l'athérosclérose animale, qui
ressemble à l'athérome humaine.

En ce qui concerne la deuxième question :

MetCHNIKOFF et son école ne bornent pas là la théorie de
l'origine intestinale de la sclérose aux cobayes et aux lapins
qui étaient sujets des experiments à ce chapitre, ils étendent
la doctrine sur l'athérome de l'homme.

Les matériaux humains positifs qui pourraient fonder leurs
réflexions théoriques sont toujours très peu nombreux.

Il me semble que des cas, dans lesquels des malades ont
souffert d'une putréfaction intestinale de longue durée et de
grande intensité, où il y avait de résorption de l'indol pendant
plusieurs années sont indispensables pour nous former une opinion
sur la signification de cette putréfaction et de l'indol pour
l'origine de l'athérome humaine.

Le sort m'a favorisé en me procurant un cas de cette sorte.

Il s'agit d'une femme, âgée de 59 ans qui avait été atteinte
et était morte d'un vice congénital de l'intestin, de la maladie
de Hirschsprung.

L'anamnèse montre que dès sa septième année elle avait des
symptômes graves du mal ; de la dix-septième à la trente-
deuxième année les dérangements n'étaient pas forts, mais alors
ils sont redevenus intenses pendant une grossesse et ils n'ont
pas diminués jusqu'à la mort.

Tous les quatre ou six semaines le gros intestin était évacué
à un certain degré à l'aide de drastiques et de lavements ; par
ces procédés une grande quantité de matières fécales à l'odeur
abominable était mise à jour.

Dans les derniers temps la femme se fit soigner quelquefois
dans la clinique chirurgicale à Groningue pour un nettoyage de
l'intestin à fond. La dernière fois l'entassement et l'inspissation
des selles étaient si énormes que le chirurgien fut forcé de recourir
aux instruments obstétricaux, de tâcher de diminuer la grosseur
des matières par le perforatoire, et de faire l'extraction
forcipale.

Malheureusement la paroi postérieure du colon sigmoideén fut

PLANCHE IV.

Folia Microbiologica III.

(Steenhuis.)

Situs viscerum de !a femme atteinte de maladie de Hirschsprung (pag .87.) (Le colon
sigmoidéen énorme occupe presque toute la cavité abdominale. On voit la dilatation
de l'aperture thoracique inférieure par le S. Romanum, qui se perd dans le bassin").

perforée par ces manipulations, une collapse suivit et la femme
mourut en quelques heures.

l'Autopsie fournit la diagnose :

Megacolon congenitum HIRSCHSPRUNG ; perforatio colonis sig-
noidei, parietis posterioris ; peritonitis diffusa stercoralis incipiens ;
meteorismus abdominalis ; atrophia renum et cordis gradus
levions ; atherosclerosis aortae ramorumque gradus levioris.

La reproduction d'une photographie prise pendant l'autopsie et
quelques chifïres suivants montreront que l'ectasie du colon sig-
moidéen, le dépôt de matières fécales en putréfaction était énorme :

La circonférence la plus grande du colon mesure 42 cM.
(d'après Cruveilhier 14 cM. en état normal.)

L'épaisseur de la paroi mesure 5 mM., dont 3 mM. V2 comp-
tent pour la couche musculaire (en état normal l'épaisseur est
de 1,8 mM.).

La longueur de la flexure mesurée à l'attachement du mésocolon
est 70 cM., selon une ligne opposée au mésentère 105 cM.(VlERORDT
note comme valeurs normales des chifïres de 15,7 à 3g cM.)

La contenance de cette partie de l'intestin se montait donc
à plusieurs litres, ainsi qu'il avait de place pour une quantité
respectable de selles en putréfaction, une source de produits
aromatiques. Il est probable que le corps à puisé de cette
source pendant la vie. A son séjour dans la clinique la femme
avait l'urine donnant la réaction de l'indican positive.

Quant aux organes, nous n'avons pas beaucoup à ajouter
à la diagnose sus-dite.

Le cœur est flasque, les valvules ne sont pas épaissies, pas
rigides; l'examen microscopique ne révèle point d'infiltrations
périvasculaires.

Le foie, de forme et de grandeur normale, consiste de lobules,
régulièrement rangées ; le tissu conjonctif n'a pas augmenté; point de
cirrhose ; le tissu periportale n'a pas d'infiltrations mononucléaires.

Les reins, un peu atrophiés, ont la surface lisse sans rétrac-
tions distinctes ; la capsule se détache aisément. A l'examen
microscopique les artères arciformes montrent la paroi épaissie ;
quelques glomérules sont dégénérées en hyaline ; l'écorce contient
de petits foyers d'infiltration.

Les capsules surrénales ne montrent pas d'altérations à
l'examen microscopique ; point de dépôts de sels calcaires.

L'aorte ascendante a la paroi mince, qui est de bonne élasticité,
l'intima montre quelques petits foyers épaissis de couleur grise,
moins transparents. Le reste de l'aorte thoracique est très peu
athéromateux ; la dégénérescence est limitée à un épaissement
léger de l'intima autour de l'origine des artères intercostales.
L'aorte abdominale n'est pas dilatée ; tout près de la bifurcation
la couche intérieure est épaissie et peu transparente, jaunâtre;
de plus il y a un petit foyer calcifié qui ne montre pas d'usure.

L'examen microscopique a affirmé la diagnose macroscopique.

Dans les coupes transversales de la paroi de l'aorte abdomi-
nale on peut distinguer une couche élastico-musculeuse (Thoma)
d'épaisseur moyenne, bornée par des lamelles élastiques nettes.
A la surface intérieure de cette couche il s'est formée de place
en place une couche de tissu conjonctif contenant peu de
fibres élastiques et un peu de lipoid colorable par le Sudan III.

C'est donc une aorte, qui a passé sa période de croissance
et montre à un certain degré les altérations de la période de
la vieillesse (AsciiOFF) i).

Récapitulons maintenant les résultats de l'examen.

Nous voyons une femme de 59 ans, qui a souffert d'une
constipation grave, avec putréfaction des matières fécales
stagnantes, pendant au moins 40 ans, constipation qui à été
accompagnée de la résorption de l'indol. Elle ne présentait
que des altérations scléreuses de l'aorte et des petits vaisseaux
très peu prononcées, pas plus, qu'on les trouve en règle chez
les personnes de son âge. Le foie ne montre pas de signes
de cirrhose, les reins présentent une sclérose de quelques artères
et la dégénérescence de quelques glomérules, aussi très modérées,
et pas trop graves pour une femme de presque 60 ans.

Il me semble que ce cas indique, que la putréfaction intesti-
nale, et l'indol, soit qu'ils peuvent être d'une importance pour
l'origine des maladies du système vasculaire des rongeurs, ce
que je doute après les recherches, décrites ci-dessus, au point
de vue de la sclérose humaine en général et de l'artériosclérose
en particulier n'ont point l'intérêt que MeTCHNIKOFF et son
école tendent à leur donner.

^) L. AscHOFF. Über Atherosklerose und andere Sklerosen des Gefässsystems.
Beihefte zur Mediz. Klinik, 1908, Heft i.

[Aus dem Bakteriologischen Laboratorium der
Molkereigesellschaft »Plancius« in Amster-
dam].

EINE PRAKTISCHE BAKTERIENHARPUNE.

VON
Dr. Jur. A. RAAFF,

Direktor der Molkereigesellschaft.

Für die Abimpf ung sehr kleiner Plattenkolonien unter fort-
währender mikroskopischer Beobachtung habe ich eine Modifi-
kation der UNNA-ZElSSschen Bakterienharpune herstellen lassen.

Der Apparat (Tafel V.) besteht aus zwei Teilen : der eigent-
lichen Impfnadel und dem Nadelführer.

Die Impfnadel ist von Stahl statt von Platin angefertigt,
damit die Nadel eine gewisse Starrheit besitze. Diese Nadel
kann auch zweiteilig gemacht werden, aus der Nadel und
einem Schiebehülschen, worin die Nadel festgeschraubt werden
kann, zusammengesetzt ; man kann auf diese Weise je nach
dem beabsichtigten Zweck verschiedene Nadeln einschrauben.

Der Nadelführer dient dazu die Nadel derart zu fixieren,
dass ihre Spitze bis unter dem Objektiv des Mikroskops hin-
reicht und dort sichtbar ist. Er besteht aus einer Hülse, einem
Stiel und einer federnden Klemme. Die Hülse umschliesst den
Tubus des Mikroskops und der Stiel ist mittelst eines Kugel-
gelenkes einerseits mit der Hülse, andrerseits mit der federnden
Klemme verbunden. Die federnde Klemme ist derart konstruiert,
dass die Nadel seitlich entfernt werden kann.

Die Nadelspitze wird etwas über die Bildfläche des Mikroskops
(gewöhnlich benutze ich Okular 5, Objektiv A, ZeiSS) ein-
gestellt, sodass ihr Bild mehr weniger diffus wahrgenommen

9Ö

wird. Die Impfnadel wird ausgeglüht und wieder in die federnde
Klemme festgesetzt. Man stellt jetzt die abzuimpfende Kolonie
scharf ein und bringt sie mittelst des beweglichen Objektisches
genau unter dem diffusen Bild der Nadelspitze. Mit der groben
Einstellung wird nun die Nadelspitze in die Kolonie getrieben ;
dieser Handlung kann man durch das Mikroskop ganz folgen.
Der Tubus wird wieder gehoben, die Nadel seitlich entfernt
und das Impfmaterial in den Nährboden übertragen.

Nach einiger Uebung kann man vorher genau die Stelle
bestimmen, wo die Nadelspitze die Kolonie tangieren wird.

Nachstehende Photogramme (Tafel VI.) (die isolierte Abim-
pfung einer sehr kleinen Kolonie, in der unmittelbaren Nähe
einer viel grösseren Kolonie liegend) demonstrieren die Wirkung
der Harpune :

Photogr. I . Zeigt das diffuse Bild der Nadelspitze.
■» 2. Die Kolonie ist scharf eingestellt.

» 3. Die Kolonie ist unter der Nadelspitze gebracht.

» 4. Der Tubus ist wieder gehoben, die abgeimpfte

Kolonie unter der Nadelspitze hinweggeschoben
und wieder scharf eingestellt.

TAFEL V.

l''olia Microbioligia III.
(Raaff.)

TAFEL VI.

Folia Microbiologia III.
(Raafl^)

STANDIGE MITARBEITER DER FOLIA MICROBIOLOGICA:

C. W, BROERS, Utrecht - R. P. VAN CALCAR, Leiden -
L.. POLAK DANIELS, Haag - C. EIJKMAN, Utrecht -
H. J. HAMBURGER, Groningen - H. C. JACOBSEN,
Delft - D. A. DE JONG, Leiden - R. DE JOSSELIN DE
JONG, Rotterdam - J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam -
L. LOURENS, Rotterdam - H. MARKUS, Utrecht -
C. A. PEKELHARING, Utrecht - H. E. REESER,
Rotterdam - N. L. SÖHNGEN, Delft - C. H. H. SPRONCK,
Utrecht - C. S. STOKVIS, Amsterdam.

Die Zeitschrift „F olia Microbiologic a"
veröffentlicht Originalarbeiten, an erster Stelle von
i, holländischen Mikrobiologen; weiter zusammens«
fassende Uebersichte und event. Biichbesprechun*
gen, aber keine gewöhnliche Referate. Die Mitarbeit
von Ausländern ist nicht ausgeschlossen.

Die Arbeiten erscheinen in der deutschen, fran*
zösischen oder englischen Sprache. Die Zeitschrift
veröffentlicht u. A. die Verhandlungen der Nieder««
ländischen Vereinigung fiir Mikrobiologie.

Autoren erhalten 50 Abdrücke ihrer Artikel
kosten&ei.

Die Zeitschrift erscheint in zwanglosen Heften
3—4 Mal jährlich. Der Jahrgang von ± 20 Bogen
mit Abbildungen und Register kostet (fiir nicht
gewöhnliche Mitglieder der Niederländischen Ver««
einigung für Mikrobiologie) fl. 12.—, 20 Mark,
fré24.— , £ 1,1 5 (erhöht mit Portokosten).

Arbeiten zur Aufnahme in die „F o 1 i a M i c r o*
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BUITEN MEDEDINGING, LID DER JURY

FOLIA MICROBIOLOÖICA

HOLLANDISCHE BEITRAGE ZUR
GESAMTEN MIKROBIOLOGIE.

HERAUSGEGEBEN VON:

M, W. BEÏJERINGK. delft

A. KLEIN, GRONINGEN.

J. POE LS, Rotterdam.
J. G. SLEESWÏJK, DELFT.

m JAHRG A N G, HE F T 2.

AUSGEGEBEN AM 21. DEZEMBER 1914.

(FÜR INHALT UND VERZEICHNIS DER MTAR«
BEITER, SIEHE INNENSEITE DES ÜMCHLAGES).

ADMINISTRATION UND VERLAG DER

FOLIA MICROBIOLOGICA:
PHOENIXSTRAAT 18, DELFT. (Holland.)

NAAMLOOZÉ VENNOOTSCHAP

: VOORHEEN :

: J. C TH. MARI US :

GANZENMARKT 440, UTRECHT

SPECIALITEIT:
INRICHTING EN COMPLETEERING VAN
WETENSCHAPPELIJKE LABORATORIA

MICROSCOPEN EN NEVENAPPARATEN

VAN CARL ZEISS TE JENA en
R. WINKEL TE GÖTTINGEN

MICRO^PHOTOGRAPHISCHE EN
MICRO^PROJECTIE APPARATEN

OP AANVRAGE WORDEN CATALOGI TOEGEZONDEN

INHALT

S«itt

M. W, BEIJERINCK. Ueber das Kitratferment und
über physiologische Artbildung. (Mit 1 Tafel) ... 91

S. L. SCHOUTEN. Eine sprosslose Form von Dematium
pullulans de^ Bary und eine sterile Zwergform von
Phycomycis Agardh. (Mit 5 Tafeln) 114

J. HEKMAN. A new method of serological research,
for the first time applied to sufferers from tuberculosis 126

H, MARKUS. Transmission de la tuberculose porcine
à Vhomme; réinoculation au veau. (Avec 3 Planches) 141

N. L. SOHNGEN. Ueber reduzierende Eigenschaften i
der Essigbakterien 151

H. C. JACOBSEN. Die Oxydation von Schwefelwas-
serstoff durch Bakterien 155

BUCHBESPRECHUNG .163

UEBER DAS NITRATFERMENT UND UEBER
PHYSIOLOGISCHE ARTBILDUNG

VON

M. W. BEIJERINCK.

I. Allgemeine Bemerkungen.

Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass sowohl im Boden,
wie in Kulturflüssigkeiten, worin sehr viele Individuen des
Nitratfermentes vorkommen, relativ grosse Mengen organischer
Körper gegenwärtig sein können, ohne die Nitratation, dass ist
die Oxydation von Nitriten, zu stören, i)

Anderseits bemerkt man bei denjenigen Nitratationsversuchen,
wobei das Nitratferment nur in einer geringen Anzahl von
Individuen vorkommt, und also um eine deutliche Wirkung aus-
zuüben zunächst wachsen und sich vermehren muss, dass
schon sehr geringe Quantitäten der verschiedenartigsten orga-
nischen Stoffe die Versuche zum Misslingen bringen und alles
Nitrit unverändert im Kulturmedium verbleibt.

Zur Erklärung dieser Erscheinungen wird angenommen, dass
das Nitratferment nur dann wachsen und sich vermehren kann,
wenn im Nährmedium wasserlösliche organische Stoffe völlig
oder beinahe völlig fehlen, während es, einmal ausgebildet, von
einer relativ grossen Menge organischer Substanz wenig beein-
flusst wird und die Nitratation fortsetzt.

Eigene Untersuchungen haben mich zu einer ganz anderen
Auffassung gebracht, nämlich diese, dass das Nitratferment
eben mit grosser Leichtigkeit von allerlei organischen Körpern

^) Im Folgenden setze ich voraus, dass der Leser mit Winogradsky's
Untersuchungen über die Nitrifikation (Handbuch der Technischen Mykologie,
Bd. 3. Pag. 132, Jena 1904, wo man auch die Literatur findet) bekannt ist.
Doch muss ich einige von ihm schon berührte Fragen, von meinem Standpunkte
aus aufs neue behandelen.

leben und sich vermehren kann, dabei jedoch, dass ist beim
Wachstum auf Kosten organischer Nahrung, das Vermögen
Nitrite zu Nitraten zu oxydieren sehr bald völlig verliert, wobei
es sich in eine scheinbar gewöhnliche saprophytische Bakterie
umwandelt.

Diese bei der Assimilation der organischen Substanz statt-
findende Umwandlung kann physiologische Artbildung, die
beiden Formen, worin das Nitratferment demzufolge vorkommt,
können als oligotrophen und polytrophen Zustand desselben
bezeichnet werden.

Ferner hat sich herausgestellt, dass dem polytrophen Zustand
in den Laboratoriumsversuchen, wobei diese Form, bei Abwesen-
heit organischer Stoffe, mit einer verdünnten Nitritlösung in
Berührung bleibt, das Vermögen Nitrite zu oxydieren nicht zurück-
gegeben werden kann, selbst nicht in zehn Jahren.

Wird also in Flüssigkeiten, worin viel assimilirbare organische
Substanz vorkommt, dennoch Nitratation beobachtet, so muss
diese Substanz vorher auf irgend eine Weise verbraucht sein.

Bezüglich des Nitratationsvorganges im Ackerboden muss
daraus Folgendes geschlossen werden.

Bei Gegenwart von viel organischer Substanz im Boden,
wird diese nicht allein von anderen Mikrobenarten oxydiert
werden müssen um die Arbeit der Nitratkeime zu ermöglichen,
jedoch wird diese Vernichtung auch stattfinden können durch
einen Teil der Nitratfermente selbst, welche dabei allerdings
als solche verloren gehen, weil sie sich in die polytrophe Form
umwandelen, aber im Boden werden immer Stellen vorkommen,
wo keine oder nur Spuren von gelösten organischen Substanzen
vorkommen und unveränderte, oligotrophe Nitratkeime sich
vermehren und ihre Umgebung, nach Vernichtung des Orga-
nischen, wieder mit einer neuen nitratierenden Flora bevölkeren
können.

Wachstum und Nitratation sind getrennte Funktionen : erst,
wenn das Wachstum beendet, setzt die Nitratation ein. Eigent-
lich ergiebt sich schon daraus, dass beim Nitratferment keine
Chemosynthese stattfindet. Denn wäre dieses wohl der Fall, so
müsste eben die Nitritoxydation Ernährung und Wachstum
ermöglichen, was jedoch nicht zutrifft. Immer bemerkt man,
dass zunächst ziemlich rasch eine Bakterienvermehrung stattfindet,

und, dass es die neu gebildeten Bakterien sind, welche, ohne
sich zu vermehren, das Nitrit in Nitrat umwandelen.

Es steht denn auch fest, dass das Nitratferment, auch in
Reinkultur, Spuren von gelösten organischen Stoffen verarbeiten
kann ohne das Vermögen zur Nitratation zu verlieren. Concen-
trationen von Vioo> ja von 1/20 Prozent Pepton siccum oder
Natriumazetat können unter Umständen vertragen werden ;
gewöhnlich sind solche geringe Menge jedoch schon verderblich.
Der Zustand der Keime ist also nicht gleichgültig ; worin dieser
Zustand aber besteht ist nicht bekannt. In einzelnen Fällen
habe ich gute Nitratationen erhalten bei der Aussaat von auf
Fleischbouillongelatine erhaltenen, gemischten Kolonien, welche
sich entwickelt hatten aus darauf ausgesäten Nitratationen. Viel-
leicht handelte es sich dabei um Keime, welche infolge ihrer
zufälligen Lage nicht ernährt und nicht gewachsen waren, denn
die Regel : „ohne Wachstum keine Veränderung", dürfte auch
hier gelten.

Die Reinkultur des Nitratfermentes im nitratierenden Zustand
ist mühsam und erfordert imganzen einige Wochen. Zunächst
wird auf bekannte Weise, und in Uebereinstimmung mit
WinOGRADSKY'S schönem Versuche, eine Rohnitratation ange-
fertigt. Dazu wird in ein ERLENMEYER-kolben, mit einer
dünnen Schicht einer Lösung von: Leitungswasser 100, Natri-
umnitrit 0,05 à 0,1 und Bikaliumfosfat 0,01, infiziert mit
Garten- oder Ackererde, kultiviert bei 30". Nach 10 bis 14 Tagen
ist das Nitrit völlig verschwunden und das Nitratferment der-
weise angehäuft, dass eine Ueberimpfung weniger Tropfen in
eine neue Nährlösung bei übrigens gleichen Bedingungen,
jedoch in klarer Lösung, schon nach ungefähr einer Woche
das Nitrit zum Verschwinden bringen kann. Bei Versuchen im
Laboratorium entsteht nun ebenfalls die für die Rohnitrata-
tionen so eigentümliche ,, Kahmhaut", welche aus ein paar Bak-
terienarten besteht, worauf wir noch zurückkommen. In Kolben,
welche im Freien aufgestellt sind, entsteht diese Kahmhaut
zwar ebenfalls, jedoch in viel schwächerer Ausbildung und wird
erst bei genauem Zusehen bemerkt.

Einen Einblick in die Mikrobenbevölkerung der nitratierenden
Lösungen, bekommt man am besten durch Aussaat auf Kiesel-
oder Agarplatten. Das Agar muss vorher ausgelaugt werden um

daraus die löslichen organischen Körper zu entfernen, und es
soll nicht mehr wie ^'^ Proz. Natriumnitrit zugesetzt werden,
weil anders das Verschwinden dieses Salzes zu spät zur Beobach-
tung kommt.

Die Anfertigung der Kieselplatten habe ich schon in den
Jahren 1896 und 1903 beschrieben. 1) Gegenwärtig verwende
ich das getrocknete und pulverisierte Natriumsilikat des Handels,
welches in 8-prozentiger, wässeriger Lösung, gekocht und filtriert
wird. Eine solche Lösung ist beinahe halb-normal; 100 cc.
werden also durch 50 cc. Normalsalzsäure neutralisiert. Die
Erstarrung findet bei dieser Verdünnng noch langsam genug
statt, um die Silikatlösung und die Säure vollständig zu ver-
mischen und ruhig auszugiessen in die Glasdose. Hat die
Vermischung nur unvollständig stattgefunden, so bilden sich
während der Erstarrung Schlieren, welche die Beobachtung
der Kolonien auf der Oberfläche erschweren. Die erstarrte
Platte wird durch Auslaugen mit destilliertem Wasser von
Kochsalz befreit, mit der Nitrit haltigen Nährlösung übergössen
und, wenn die Salze hineindiffundiert sind so lange , .getrock-
net", bis die äusserlich anhängende Flüssigkeit entfernt ist, und
schliesslich flambiert. Humatzusatz zum Wasserglas, welcher
natürlich vor dem Vermischen mit der Salzsäure stattfinden muss,
begünstigt einigermassen das Bakterienwachstum, jedoch nicht
den Nitrifikationsvorgang in den Platten. Obschon die Humus-
säure durch die zugesetzte Salzsäure unlöslich wird, bleibt
dieselbe, sehr gleichmässig kolloidal in der Kieselplatte verteilt,
kann jedoch wegen ihrer Unlöslichkeit in Wasser, nicht hinaus
diffundieren.

Durch viele spezielle Versuche wurde in meinem Laboratorium
nachgewiesen, dass die günstige Wirkung der Humate, sowohl
bei den Nitrifikation, wie beim Azofobac^erwa-chsium, jedenfalls
der Hauptsache nach auf die katalytische Tätigkeit der gelösten
kolloidalen Kieselsäure beruht, während eine günstige Wirkung
des kolloidalen Eisenhydroxyds in viel geringerem Maasse nach-

^) Centralblatt für Bakteriologie Bd. 19, S. 259. 1896, und Centralblatt für

Bakteriologie, 2e Abt. Bd. 10, S. 38, 1903. Wie geeignet solche Platten sind

für die Kultur der Diatomeen, habe ich ebenfalls daselbst nachgewiesen. Auch
Grün- und Blaualgen wachsen darauf vorzüglich.

weisbar war, obschon in der Literatur eben dem letztgenannten
Körper eine besondes günstige Wirkung bei der Nitratation
zugeschrieben wird.

Es war darum denn auch zu erwarten, dass Humatzusatz zu
den Kieselplatten sich nur wenig bemerkbar machen würde.

Bei guter Vermischung des Wasserglases und der Salzsäure
erhalt man Platten, welche nach der Sättigung mit der Nähr-
salzlösung und nach dem ,, Abtrocknen", eine gleichmässig
spiegelnde Oberfläche besitzen, worauf selbst die kleinsten und
durchsichtigsten Bakterienkolonien erkennbar sind. Die Platten
sind sehr wasserreich und enthalten 3 bis 4 Proz. Kieselsäure als
Trockensubstanz. Unterhalb 3 Proz. werden sie so weich, dass sie
bei der leisesten Berührung mit dem Platinfaden geschädigt
werden. Gut gefertigte Kieselplatten sind fest und elastisch und
geben beim Anschlag der Glasdose mit dem Finger, einen eigen-
tümlichen Ton. Vorgreifend muss ich jedoch bemerken, dass
solche Kieselplatten zwar sehr geeignet sind um eine Trennung
des Nitratfermentes von den gröberen Verunreinigungen vorzu-
nehmen, weil die Nitrifikation darin leicht stattfindet, allein dass
es ausserordentlich schwierig ist wirklich reine Kolonien des
Nitratfermentes von den Kieselplatten zu bekommen : beinahe
jede Kolonie ergiebt sich nämlich als eine Mischkolonie, sodass
man wohl annehmen muss, dass die Einzelkeime des Nitrat-
fermentes viel schwieriger zur Entwicklung kommen, wie die
mit anderen Keimen verklebten. Welche diese Symbionten sind
werden wir bald sehen. Die Reinkultur geschieht viel leichter
durch die Verwendung von Nitritagarplatten, obschon man
darin die Nitrifikation erst später beobachtet. Offenbar sind
die im Agar gegenwärtigen Spuren von löslichen organischen
Substanzen für die erste Entwicklung des Nitratfermentes günstig.

Für die Untersuchung der Nitritfermente, welche die Ammon-
salze oxydieren, und die noch viel empfindlicher sind für gelöste
organische Stoffe, wie das Nitratferment, können richtig ange-
fertigte Kieselplatten sehr nützlich werden, und bei einer anderen
Gelegenheit hoffe ich darauf noch zurückzukommen.

2. Flora der Rohnitratationen.

Ebenso wie in der Natur sind die Rohnitrifikationen in den
Laboratoriumsflüssigkeiten essentiell symbiotische Vorgänge.

Die Reinkulturen geben in keiner Beziehung bessere Erfolge-
wie die Rohanhäufungeni können denselben jedoch, bei guter
Ausführung gleich kommen. Vergleicht man diesen Umstand
mit den wundervollen Resultaten, welche man mit Reinkulturen
z.B. von Leucht- und Pigmentbakterien erhalten kann, deren
Rohkulturen wertlos sind, so sieht man, dass der Unterschied
von prinzipieller Bedeutung ist.

Obschon die äusserlich sichtbaren Eigenschaften, sowohl der
Rohnitrifikationen von Ammonsalzen, wie die der rohen nitra-
tierenden Kulturen, ungemein charakteristisch sind, habe ich
davon nirgend eine Beschreibung gefunden, was um so auf-
fälliger ist, als es sich dabei handelt um eine Frage, welche
von der grössten praktischen Bedeutung ist für die Landwirt-
schaft, und von nicht geringerer theoretischen Wichtigkeit
durch die damit in Verbindung stehenden Probleme der Chemo-
synthese und der physiologischen Artbildung.

Wenn auch die für Nitratation bestimmten Nährsalzlösungen
frei oder nahezu frei von loslichen organischen Körpern sein
müssen, so sind doch die in verwesenen Bodenproben gegen-
wärtigen organischen Stoffe der Nitratation nicht ungünstig, Und
wenn auch kräftig nitratierende Flüssigkeiten gänzlich klar und
durchsichtig sein, und unter Umstanden, z.B. bei der Verwendung
von Reinkulturen auch bleiben können, so braucht dieses bei den
Rohnitratationen (so wie bei den Rohnitrifikationen aus Ammon-
salzen) jedoch gar nicht der Fall zu sein : dieselben überdecken
sich im Laboratorium schnell, im Grünhause und im Freien
langsamer, mit der durchaus eigentümlichen, äusserlich wie
,, Bierkahm" aussehenden Haut, welche ich schon im Jahre
1903 beschrieben habe, ohne damals das Nitratferment selbst
noch genügend zu kennen. 1) Seitdem sind meine Kenntnisse der
hierbei waltenden Wachstumsvorgänge und Bedingungen viel
verbessert.

Die treibende Haut enthält gewöhnlich zahlreiche Keime des
Nitratfermentes und kann dann, mit einigem Rechte, als ,, Nitrat-
mutter" bezeichnet werden. Der Hauptsache nach besteht dieselbe

*) Farblose Bakterien deren Kohlenstoff aus der atmosphärischen Luft herrührt,
Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. 10, Pag. 38, 1903. In dieser Abhande-
lung steht : paucitrophus^ lies : patilotr opinis .

jedoch aus zwei nicht nitrifizierenden Arten, welche ich damals
Bacillus oligocarbophilus und Actinomyces (Strephtothrix)
paulotrophus genannt habe, ohne ihre Verwandschaft richtig
zu verstehen. Seitdem erkannte ich aber, dass B. oligocarbophilus
ein echter Actinomycet ist, und der von NEUMANN und LEHMANN
aufgestellten Gattung Mycobacterium zwar nahe steht, davon
jedoch generisch getrennt werden muss. *) Ich schlage darum
vor diese wichtige Art als Actinobacillus oligocarbophilus zu
bezeichnen, und bringe auch die zweite genannte Form zu der-
selben Gattung als Actinobacillus paulotrophus. 2)

Echte Actinomyces-?ixtç.VL^ wie besonders A. ?'ö(5/^r Krainsky 3)
und A. griseus Kry, finden sich in der treibenden Haut ebenfalls,
jedoch in viel geringerer Anzahl, und nur dann, wenn die Kulturen
lange aufbewahrt werden. A. diastaticus Kry und A. cellulosae
Kry, wurden bisweilen auch aufgefunden, jedoch in noch gerin-
gerer Anzahl. Diese Actinomyces-a.rten gehören nicht zu der
Normalflora der Rohnitrifikationen, obschon sie dem Vorgang
nicht ungünstig sind.

Wie ich das früher (1. c.) gezeigt habe, leben alle diese Haut-
bewohnende Mikroben von den organischen Stoffen, welche sich
in merklichen Menge in der Laboratoriumsluft und gewiss auch
in der Bodenluft vorfinden. Diese Stoffe sind in der freien
Aussenluft, sowie in den Grünhäusern, wie ich durch viele spezielle
Versuche festgestellt habe, nur in einer sehr viel geringeren Menge
gegenwärtig, obschon sie auch darin niemals gänzlich fehlen.

Versucht man die verschiedenen Haut-bewohnenden Arten auf
bessere Kulturböden, z. B. auf Bouillongelatine, zu kultivieren so
stöstman dabei auf Schwierigkeiten. Actinobacillus oligocarbophilus
wird dabei zunächts unkenntlich, indem die Kolonien das „Kahm-
merkmal" verlieren, was sie auf einem armen Kulturboden jedoch
wieder zurückbekommen. Actinobacillus paulotrophus konnte
ich auf bessere Kulturböden überhaupt nicht kultivieren. Die
echten Actinojnyces-a.rten wachsen auf solche Böden, wenn

1) Bakteriologische Diagnostik, le Aufl. 1899, 5e Aufl. Pag. 582, 1912.

2) Vor kurzem (Folia Microbiologica, Bd. 2. Pag. 196, 1914) habe ich noch
eine weitere Actinomycetengattung aufgestellt, nämlich Actinococcus, welche
bis dahin zu Micrococcus gerechnet war.

^) A. Krainsky, Die Aktinomyceten und ihre Bedeutung in der Natur. Cen-
tralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. 41, Pag. 649, 19 14.

einmal in Reinkultur, nicht schlecht, viel besser jedoch auf feste
Böden mit verdünnter Nahrung, wofür übrigens die verschie-
densten organischen Stoffe geeignet sind.

Wenn in den nitratierenden Nährlösungen das Nitrit völlig
in Nitrat umgewandelt ist, hört das Wachstum der Actino-
bacillus-hsiut nicht auf, sondern geht ungestört fort. Offenbar
steht die Nitritoxydation nicht in direkter Beziehung zu diesem
Wachstum, i)

Auch in den vollständigen Nitrifikationen mit Ammonsalzen,
kann die Hautbildung auf die gleiche Weise stattfinden, wie in
den Nitratationen. Dabei beobachtet man aber die folgende
wichtige Erscheinung: beim Ueberimpfen der Nitritphase, ehe
darin Nitratbildung stattfindet, ist schon bei ein oder zwei
Wiederholungen die Hautbildung vollständig beseitigt, sodass
weder AcL oligocarbophilus noch Act. paulotrophns aus solchen
stark Nitrit erzeugenden Lösungen überhaupt mehr zur Ent-
wicklung zu bringen sind. Dieses ist desshalb so bemerkenswert,
weil das Verschwinden der genannten Arten aus den Kulturen,
begleitet ist von dem Verschwinden des Nitratfermentes selbst.
Die Gegenwart selbst vereinzelter Keime des Nitratfermentes lässt
sich leicht nachweisen durch Aussaat auf Agarplatten worin -^-^
Proz. Pepton. Das Ferment erscheint darauf in der polytrophen,
sehr charakteristischen Form. Die Beseitigung des Nitratfermentes
aus den Rohnitrifikationen z. B. von Ammonsulfat, geschieht
am schnellsten, wenn man der Lösung keine Kreide oder
Magsesiumcarbonat zusetzt. Es ist also leicht zwei Arten von
Rohnitrifikationen der Ammonsalze beim ersten Blicke zu
unterschieden, nämlich, erstens, Nitrifikationen, welche kein
Nitrat bilden und an ihre Oberfläche klar bleiben,, und zweitens
vollständige Nitrifikationen, welche neben Nitritferment auch
Nitratferment enthalten und sich an ihrer Oberfläche gewöhnlich
(aber nicht notwendig) mit der beschriebenen Kahmhaut be-
decken. Die Erklärung dieses Umstandes beruht auf zwei Eigen-
schaften des Nitratfermentes, welche ebenfalls bei den Actino-

^) Ob das Nitratferment selbst auch noch wachsen und sich vermehren kann
nachdem die Nitrite völlig oxydiert sind, ohne dabei dieses Oxydationsvermögen
zu verlieren, konnte ich trotz vieler Versuche noch nicht einwandsfrei feststellen.
Weil die Frage offenbar eine interessante ist, hoffe ich später die definitive Antwort
geben zu können.

bacillen gefunden werden, nämlich, ihre Empfindlichkeit für freie
Säure, und ihre, wenn auch geringere Empfindlichkeit für Ammon-
salze, wovon besonders die erstere ausschlaggebend ist.

Anderseits stellt sich heraus, dass die in den Nitritationen
herrschende sauere Reaktion dem Nitritfermente viel weniger
schädlich, ist wie dem Nitratferment. Wenn also in den Rohnitri-
fikationen der Ammonsalze Calciumcarbonat und andere Basen
in ungenügender Menge vorkommen um alle Säure zu binden,
führt dieses zum Verschwinden der Nitratflora. Verwendet man
Ammonsulfat, oder besser noch Ammonmagnesiumfosfat, ohne
weiteren Zusatz von Carbonaten, so kann eine weitgehende
Nitritation stattfinden und wegen der sich langsam anhäufenden
Säure, wird die Nitratflora dabei von Anfang an unterdrückt,
um schliesslich vollständig zu verschwinden.

Weil die Hautbildung auf den nitrifizierenden Flüssigkeiten
in der Aussenluft, sowie im Grünhause, nur schwach ist, muss
man um die beschriebenen Verhältnissse unter diesen Umstän-
den zu beobachten, schärfer zusehen als wenn der Versuch in
der Laboratoriumsluft stattfindet. Niemals habe ich aber voll-
ständige Rohnitrifikationen gesehen, wo die Haut der Actino-
bacillen gänzlich fehlte, solche lassen sich im allgemeinen nui
durch partielle Reinkultur vermittelst der Plattenmethode erhalten,
obschon sie natürlich auch zufällig, bei den gewöhnlichen
Rohkulturversuchen müssen entstehen können.

Hat man Reinkulturen des Nitratfermentes angefertigt, so
bleiben die damit stattfindenden weiteren Kulturen durchsichtig
und wasserklar. Hautbildung findet darauf niemal statt, nur an
der Glaswand der Gefässer ist eine sehr dünne Schleimschicht
-bemerkbar, welche aus den kleinen Nitrobakterien besteht.

Wie zu erwarten war entwickelen sich in den Rohnitri-
fikationen massenhaft Amoeben, welche auch auf den Platten
wachsen und sich dabei oft derweise vermehren, dass sie die
Erzielung reiner Bakterienkolonien unmöglich machen, weil sie
beim Herumkriechen die an ihrem Körper haftenden fremden
Keime überall auf die Platte bringen. Ausser der früher
beschriebenen Amoeba nitrophila, i) ist es besonders eine sehr

*) Kulturversuche mit Amoeben auf festem Substrate, Centralbl. f. Bakterio-
logie Bd. 19, S. 258, 1896.

lOO

kleine und weit verbreitete Art, welche ich Amoeba nana nenne,
die sich in den Nitrifikationen ansiedelt und sich daselbst massen-
haft vermehrt, auf Kosten des Nitratfermentes selbst.

Auf Kieselplatten habe ich mehrfach kleine Acarinen gefunden,
welche sich ebenfalls mit den Nitratfermenten ernährten.

Eine merkwürdige Eigentümlichkeit, speziell der Rohnitrationen,
viel weniger der Rohnitritationen, ist ihre Fähigkeit sich mit
Pigmentbakterien zu bevölkern, welche zu der Familie der
Actinomyceten und wahrscheinlich zur Gattung Actinohacülus
und nicht zu Mycobacterium gehören, weil sie sich durchaus
nicht verzweigen. Dieselben sind ausgezeichnet durch braune oder
rein rote Pigmente, welche am Bakterienkörper gebunden sind,
sodass diese Bakterien als »chromatophore« bezeichnet werden
müssen. Das rote Pigment ist sicher Carotin, denn die roten
Kolonien färben sich in concentrierter Schwefelsäure schön
indigoblau. Auch kann das Pigment leicht mit Chloroform extra-
hiert werden ; nach Verdunstung bleibt dann das Carotin zurück,
das sich mit starker Schwefelsäure wieder indigoblau färbt.

Weil diese Pigmentbakterien sich auf den Nitritagarplatten
auf eine ähnliche Weise ernähren, wie die Actinobacillen, und
aus atmosferischen Kohlenstoffverbindungen ihre Körpersubstanz
aufbauen, lässt sich verstehen, dass ihre Kolonien denjenigen
des Nitratfermentes überwuchern und, dass es schwierig ist die-
selben von dem Letzteren zu reinigen. Man kann dadurch leicht
in den Irrtum verfallen, dass sie imstande sind zu nitratieren,
doch ergiebt die genauere Untersuchung, dass diese Auffassung
unrichtig ist. Solche mit Nitratferment infizierte Kolonien dieser
eigentümlichen Pigmentbakterien sind aber für Nitratations-
versuche, besonders auf Platten, sehr geeignet. Dabei kann es vor-
kommen, dass durch unbekannte Ursachen, die Pigmenterzeugung
gänzlich ausbleibt, sodass diese Bakterien veränderlich sind.

Dagegen ist sowohl das rote wie das braune Pigment selbst
ausserordentlich stabil, sowohl in Dunkeln wie im Lichte. Platten
mit diesen Pigmentkolonien habe ich im feuchten Zustande zwei
Jahre lang aufbewahrt, ohne die geringste Farbänderung zu
bemerken.

Wünscht man Reinkulturen des Nitratfermentes anzufertigen,
so ist es geeignet zunächst durch das Plattenverfahren eine
vorläufige Trennung auszuführen, wobei bei der Impfung in

loi

die zu nitratierenden Lösungen eine partielle Rohkultur erhalten
wird, die dann später, auf dieselbe Weise, weiter zerlegt wird.
Die grösste Schwierigkeit, welche man dabei begegnet ist die
Trennung des Nitratfermentes von Bacillus nitroxus, worauf
wir weiter werden zurückkommen.

3. Reinkultur.

Die mechanische Schwierigkeit der Erkennung des Nitrat-
fermentes auf den Platten hängt damit zusammen, dass der
Nachweis, ob eine Bakterienkolonie, auf einer Kulturplatte
wachsend, Nitrite in Nitrate überführt, nicht direkt möglich ist.

Dieses ist besonders augenfällig beim Vergleich dieser Um-
wandelung mit der Nitritbildung auf Platten mit Ammonsalzen,
wobei jede einzelne Salpeterigesäure erzeugende Kolonie
sofort daran zu erkennen ist, dass sie, z. B. beim Wachstum
auf einer Kieselplatte, worin fein verteiltes Ammonmagnesium-
fosfat suspendiert ist, Mittelpunkt eines hellen Diffusionsfeldes
in der trüben Platte wird, welches Feld dann noch überdies
die so empfindlichen Farbereaktionen der Nitrite geben kann.i)

Vergebens habe ich versucht diesen Umstand zu beseitigen
durch die Verwendung unlöslicher Nitritsalze, deren Umwande-
lung in Nitrate zu löslichen Verbindungen führt, nämlich das
schön gelbe Kalium-Cobalt-Nitrit, Co(No2)3.3KN03.i|H20, und
das weisse Kalium-Iridium-Nitrit. Diese Salze sind aber für
das Nitratferment giftig und werden nicht merklich nitratiert.

Weil nun die Nitratkolonien auf den Nitritplatten morfologisch
wenig charakteristisch sind, ist man genötigt die Einzelkolonien
gesondert zu untersuchen. Bisher musste dieses durch den
Nitratationsvorgang selbst geschehen, was sehr viel Zeit be-
ansprucht. Es hat sich nun aber herausgestellt, dass die Um-
wandelung bei besserer Ernährung des Nitratfermentes in die
polytrophe Art, diese Erkennung sehr vereinfacht.

Für die Reinkultur des Nitratfermentes sind Agarkulturplatten

^) Die Verwendung von Ammonmagnesiumfosfat beim Plattenverfaliren, hat
mehrere Vorzüge vor derjenigen von Ammonsulfat mit Kreide oder Magnesium-
carbonat. Ich bringe das Ammonmagnesiumfosfat auf die Oberfläche der schon
fertigen Kiesel- oder Agarplatte, durch Aufgiessen einer neuen, papierdünnen
Schicht Kiesel- oder Agarlösung, worin das Salz suspendiert ist.

I02

viel geeigneter wie Kieselplatten. Es muss jedoch durch
Auslaugen mit destilliertem Wasser aus dem Agar das Lösliche
vorher entfernt werden, damit das Nitratationsvermögen in den
Kolonien erhalten bleiben soll. Jedenfalls steht fest, dass in
den Nitritagarplatten, welche nicht vollständig ausgelaugt sind,
wenn sich darauf relativ grosse Nitratfermentkolonien entwickelen,
diese gar nicht mehr nitratieren, und, wenn sie klein bleiben,
erst dann zu deutlicher Nitratbildung veranlassen, wenn man
keine Vergrösserung derselben mehr bemerken kann. Letztere
Beobachtung ist in Uebereinstimmung mit der Auffassung, dass
Wachstum und Nitratation nicht zugleich zustande kommen, und
erst die erwachsenen, sich nicht mehr vermehrenden Bakterien,
die Nitratation bewirken.

Weil das Nitratferment, sowie die übrigen in den Rohnitri-
fikationen vorkommenden Mikroben das Agar nicht angreifen,
muss, für die Entwicklung ihrer Kolonien auf der Platte, ein
geringer Gehalt an lösliche organische Substanz vorhanden
sein, welche Substanz den Nitratationsvorgang überhaupt erst
ermöglicht, i)

Die Nitratkolonien bilden bei dichter Aussaat auf den Agar-
platten (Tafel VII Fig. i) kleine Kolonien von | à i m.M. Mittel-
linie, welche als glasartig durchsichtige Plättchen, selbst mit
der Lupe etwas schwierig sichtbar, unter dem Mikroskop bei
20 bis 50-maliger Vergrösserung jedoch sehr charakteristisch
sind. Bei weniger dichter Aussaat und in Impfstrichen können
sie, durch seitliche Ausbreitung, viel grössere Dimensionen
annehmen, bleiben aber immer sehr dünn. Ist der Wassergehalt
des Agars relativ gering, so können die Kolonien rund bleiben ;
auf wasserreicheren Agar bilden sie dagegen leicht Ausläufer,
was zu medusenartiger oder dendritischer Verzweigung der
Kolonien veranlasst. Diese Verzweigungen können ausseror-

^) Die Agar verflüssigenden und daraus Zucker erzeugenden Gelasebakterien,
können in Grabenmoder vorkommen ; auf dem Laade fand ich dieselben nicht.
Bei deren Gegenwart kann die direkte Isolierung des Nitratfermentes im nitra-
tierenden Zustande auf Agarplatten Schwierigkeiten bieten. Bei Anhäufung und
Ueberimpfung in Nitritlösung verschwinden die Gelasebakterien jedoch bald. Im
Schlamme des Schififahrtkanales zu Delft sind besonders sporenbildende Gelase-
bakterien häufig, während die nicht sporenbildenden Arten besonders in der
Nordsee vorkommen. Doch kommen auch im Kanalschlamme nicht sporen-
bildende Arten dieser Gruppe vor.

T03

dentlich fein werden und zugleich zu einer grossen seitlichen
Ausdehnung führen, wodurch dann Kolonien von mehreren
Millimetern Durchschnitt entstehen. Solche stark verzweigte
Nitratkolonien wachsen leicht in die Kolonien anderer Arten
hinein, was man erst bei mikroskopischer Beobachtung bemerkt
(siehe die Tafel). Für die Reinkultur müssen die Kolonien
auf der Oberfläche gut abgetrockneter Agarplatten liegen, und in
so grosser Entfernung von ihren Nachbarn, dass man über ihre
Randbegrenzung nicht im Zweifel ist.

Obschon in gut zubereiteten Kieselplatten die Nitratation
leichter stattfindet, wie in Agarplatten, ist dennoch die Erhaltung
von Reinkulturen von den Ersteren schwieriger wie von Agar.
Es stellt sich nämlich heraus, dass bei weitem die meisten
auf Kieselplatten entwickelten Nitratkolonien, obschon sie gänz-
lich homogen aussehen, Mischkolonien sind und zwar seltener
mit Act. oligocarbophilus, viel öfter dagegen mit dem höchst
eigentümlichen, und hier sicher nicht erwarteten sporenbil-
denden und denitrifizierenden Bacillus nitroxus. i)

Diese letztere Art ist bei allen meinen Versuchen, — welche
jedoch nur mit Gartenerde aus Delft angestellt wurden, — in
den Rohnitratationen ausnahmslos in ungefähr gleicher Indivi-
duenzahl gefunden, wie das Nitratferment selbst, und hat auch
bei der Verwendung von Agarplatten erhebliche Schwierigkeiten
bei der Trennung gegeben. Während langer Zeit meinte ich
nämlich, dass eben B. nitroxus nitratieren konnte, was jedoch
durchaus nicht der Fall ist.

Uebrigens kann ich gegenwärtig, nun ich den Tatbestand
gut übersehe, angeben, wie man verfahren muss um in der
kürzesten Zeit das Nitratferment und B. nitroxus neben ein
ander zu erkennen. Dabei muss man Verwendung machen
von der schon mehrfach genannten Eigenschaft des Nitrat-
fermentes, bei besserer organischer Nahrung, sich in eine
gewöhnliche saprophytische Bakterie umzuwandelen, welche leicht
kenntliche Eigenschaften besitzt. Weil dabei das Vermögen zur
Nitratation völlig verloren geht, und eine rückläufige Verwande-

^) Näheres über diese schwierige Art in: Bildung und Verbrauch von
Stickoxydul durch Bakterien. Centralbl. f. Bakteriol. 2te Abt. Bd. 25, Pag.
45. 1910-

104

lung bisher nicht gelungen ist, muss man vorher durch Versuche
sich von der Richtigkeit dieser Angabe überzeugt haben. Etwas
Aehnliches gilt bei der Virulenzbeurteilung gewisser pathogener
Mikroben, wobei jedoch von einer so grundsätzlichen Verände-
rung, wie beim Nitratferment, niemals Rede ist.

Bevor wir auf diese Unterscheidung von B. nitroxus noch etwas
näher eingehen, muss die zuletzt genannte sehr wichtige Eigen-
schaft des Nitratfermentes genauer betrachtet werden.

4. Oligotropher und polytropher Zustand
des Nitratfermentes: Physiologische Artbildung.

Das Hauptresultat der gegenwärtigen Untersuchung ist die
Erkenntniss der beiden hier genannten Zustände des Nitrat-
fermentes.

Die Umwandelung der nitratierenden oligotrophen, in die
nicht nitratierende polytrophe Form, findet, wie wir schon
gesehen haben, statt bei besserer Ernährung, nicht nur bei der
Impfung auf Platten, sondern auch in Nährlösungen. Impft
man z. B. die reine nitratierende Form in Bouillon, so erhält
man schon den zweiten oder dritten Tag bei 30 0 C. eine sich
ziemlich lebhaft entwickelnde Kultur von dünnen Stäbchen und
Fäden, wovon sich viele bewegen. Sie verzweigen sich niemals
und ihre Beweglichkeit beweist, dass das Nitratferment unmöglich
zur Familie der Actinomyceten gehören kann, welche typisch
unbeweglich sind. Ich hebe dieses deshalb besonders hervor,
weil der nitratierende Zustand des Fermentes niemals Bewegungs-
erscheinungen zeigt, und unter den gleichen, so eigentümlichen
Ernährungsbedingungen lebt, welche für die Actinomyceten
Actinobacillus oligocarhophilus und A. paiilotrophus so charak-
teristisch sind.

Wie man sieht ist die in den Handbüchern vorkommende
Angabe, dass das Nitratferment in Bouillon nicht wachsen kann,
durchaus unrichtig: es wächst darin vorzüglich, nur geht dabei
das Nitratations ver mögen verloren.

Auf Bouillonagar oder auf Peptonagarplatten entwickelt das
Ferment sich ebenfalls ausgezeichnet. Bouillongelatine wird
anfangs nicht, später stark verflüssigt, wobei viel Amnion
entsteht. Bei Gegenwart von Pepton entwickelt sich ein schwacher

Î05

Fäulnissgeruch ; Pigmente oder fluorescierende Körper werden
nicht erzeugt.

Auf reine Gelatinplatten, das heisst Gelatin gelöst in Wasser,
mit oder ohne Salzen, findet kein Wachstum und keine deut-
liche Verflüssigung statt, obschon dabei das Nitratationsvermögen
verloren geht.

Diastase, Tyrosinase und Glukosidenzyme werden durch das
Nitratferment nicht erzeugt ; ebensowenig werden dadurch Kohle-
hydrate unter Gasbildung vergoren ; auch Denitrifikation findet
nicht statt, was allerdings zu erwarten war, weil die Stickstoff-
bildung aus wässeriger Salpetrigesäure ein endothermischer Vor-
gang ist, wobei 308 Kai. absorbiert werden. 1)

Weil die jungen Nitratkolonien auf Bouillongelatine, (Tafel VII
Fig. 2 c, d), so lange sie diese nicht verflüssigen, sowie auf
Peptonagarplatten sehr charakteristisch sind, und sich von allen
anderen Arten unterscheiden durch die ,, trockene", und rauhe
Oberfläche und ihre flache Ausbreitung, muss es möglich sein,
dieselben in Erdproben durch das gewöhnliche Plattenverfahren,
bei oberflächlicher Aussaat, zu erkennen, was mir in einigen
Fällen auch wirklich gelungen ist. Natürlich fehlt dabei jedoch
die Contrôle der Nitratation, weil nur der polytrophe, nicht
nitratierende Zustand erhalten wird, sodass man für die Erken-
nung Uebung haben muss. Der Versuch wird am besten aus-
geführt durch Aussaat der Bodenproben auf Agarplatten, welche
-^^ Proz. Pepton siccum und weiter nichts enthalten, und vor
dem Gebrauch bei einer Temperatur unterhalb 40» abgetrocknet
sind, so dass kriechende Bakterienarten, besonders der Subtilh-
gruppe, welche in Kulturerde allgemein sind, sich nicht allzusehr
ausbreiten können.

Die Conzentration löslicher organischer Stoffe, welche die
Nitratationsfunktion zum Verschwinden bringt, kann sehr gering
sein. Mengen von 1/20 Proz. Glukose, Rohrzucker, Stärke, Man-
nit, Natrium- und Calciumazetat, Pepton, Tyrosin, Asparagin

*) Ostwald giebt die Formel :

HNOg (aq) = H + N + 2 O + Aq — 308 Kai.
Dagegen soll die Zerlegung des Anhydrids exothermisch sein und stattfinden nach :

N2O3 aq = 2 N + 3 O + aq + 68 Kai.
(W. Ostwald, AUg. Chemie, 2te Aufl. Bd. 2, Th. i, Pag. 143, 1893). Hier
findet sich bei Ostwald ein Druckfehler.

io6

veranlassen mehr oder weniger starkes Wachstum und Verlust
des Nitratationsvermögens.

Ist die Conzentration der gelösten organischen Substanzen
noch viel geringer, verwendet man z.B. nicht ausgelaugten Agar,
übrigens ohne jeden weiteren Zusatz, so kann bei dichter Aussaat
das Nitratferment anfangs wachsen und später dennoch nitra-
tieren, welcher letzterer Vorgang, wie wir gesehen, erst anfangt,
wenn die für das Wachstum verbrauchten gelösten organischen
Substanzen verschwunden sind. Das kann aber Monate dauern
und manche Versuche misslingen gänzlich.

Ich schliesse noch aus folgendem Umstände, dass das Nitra-
tieren auch bei den Reinkulturen erst dann beginnt, wenn
die löslichen organischen Stoffe völlig verschwunden sind.
Die kürzeste Zeit, worin ich 0,1 Proz. Nitriumnitrit oxydieren
konnte war drei bis vier Tage. Dazu musste aber eine sehr
grosse von einer Kulturplatte herkünftigen Bakterienmenge
in eine sehr kleine Menge der Nitritlösung gebracht wer-
den, und die dazu verwendeten Bakterien müssen auf der
Platte, wovon sie hergenommen werden, völlig aktiv sein.
Es stellte sich nun heraus, dass so lange die Kolonien oder
Impfstriche auf der Platte noch im Wachstum begriffen waren,
das davon genommene Material erst nach viel längerer Zeit,
z.B. nachdem es zwei bis drei Wochen in der Lösung verweilt
hatte, das Nitrit völlig oxydierte, woraus hervorgeht, dass die
noch in den Bakterienleibern angehäuften Nährsubstanzen zuerst
aufgebraucht werden müssen, ehe Nitratation möglich ist. Nitrata-
tion und Wachstum scheinen also unter allen Umständen Funk-
tionen zu sein, welche einander ausschliessen. Dieser Fall steht
im Mikrobenleben nicht vereinzelt, doch wird auch bei anderen
Oxydationsvorgängen beobachtet, z. B. bei der Melaninbildung
aus Tyrosin durch Actinomyces tyrosinaticus, welcher Vorgang
nur dann kräftig stattfindet, wenn das Wachstum der Kolonien
vollständig aufhört.

Wie lange eine solche Oxydation dauern kann, der offenbar
stattfinden muss ohne Vernichtung, oder vielleicht richtiger, ohne
Regeneration lebender Substanz, ist unbekannt. Nach Analogie
mit den enzymatischen Vorgängen wird diese Zeit nicht lange
sein und also auch das Nitratferment unter diesen Bedingungen
seine Funktion nicht lange fortzetzen können. Es muss aber als

Î07

möglich betrachtet werden, dass in der Natur, in ein und demselben
Bakterienkörper, lokalisiert an verschiedenen Stellen, Regeneration
der bei den Oxydation verschwindenden lebenden Substanz, und,
die durch andere Molekülgruppen dieser Substanz bewirkten
Oxydation neben einander zustande kommen können.

Volständig umgewandelter Dünger bringt das Nitratations-
vermögen nicht zum Verschwinden. Dagegen führen aus Pflanzen,
gepresste Säfte, selbst bei starker Verdünnung, die oligotrophe
in die polytrophe Form über, was unter gewissen Bedingungen
auch im Boden muss vorkommen können.

Natriumhumat, selbst in grosser Conzentration in Platten
oder Nitritlösungen gebracht, beeinträchtigt die Nitratation nicht.

Auch Paraffinöl wird gut vertragen, obschon dadurch der
Eintritt des Vorganges verzögert wird, vielleicht durch im
Parafiinöl vorhandene Verunreinigungen.

5. Unterscheidung des Nitratfermentes von
Bacillus nitroxus und Actinobacillus.

Auf bessere Nährböden wachsen das Nitratferment und Bacillus
nitroxus gleich gut und geben darauf, bei 250 à 30» C. in
2 Tagen deutliche Kolonien. Verwendet man als Kulturboden
Agar in Leitungswasser mit 1/20 Proz. Pepton siccum und eine
Spur Kaliumfosfat (oder auch gewöhnlichen Bouillonagar, welcher
jedoch kein deutlicheres Resultat giebt), so erkennt man das
Nitratferment leicht an die anfangs trockenen, wie Kahmpilz
aussehenden Kolonien, welche erst nach mehreren Tagen glänzend
feucht werden. Vom Anfang an ist der Rand dieser Kolonien
mehr oder weniger unregelmässig ausgeschnitten oder gelappt,
während ihre Oberfläche anfangs glatt, später, beim Feucht-
werden, sich mit radialen Leisten oder Rippen bedeckt. Bis zum
Ende bleiben die Kolonien flach und dünn und können eine
sehr beträchtliche Ausdehnung erlangen. Auf Bouillongelatine
sind dieselben ebenfalls sehr charakteristisch durch ihre anfangs
gekörnte, rohe und ,, trockene" Oberfläche. Später verändert
sich dieses Bild, weil dann eine starke Verflüssigung der Nähr-
gelatine stattfindet.

Die Nitroxus-\i.o\on\en sind unter diesen Bedingungen sofort
daran kenntlich, dass sie vom Anfange an, als kleine, feuchte,
runde, wenig abgeflächte Massen auf den Platten vorkommen.

io8

Sie bleiben viel kleiner wie die Nitratkolonien, und, wenn mit
letzteren in Berührung, werden sie von diesen überwachsen und
bedeckt, gleich wie der Nährboden selbst. Beim längeren
Aufbewahren entstehen Sporen, was beim Nitratferment nicht
stattfindet. Uebrigens ist das mikroskopische Bild der beiden,
so weit verschiedenen Arten, sehr ähnlich : äusserst kleine
meistens unbewegliche Stäbchen, welchen jedoch die Fäigkeit
Schwärmer zu bilden nicht völlig fehlt. Auch Nitroxus verflüssigt
schliesslich die Kulturgelatine sehr kräftig. Einzelne Nitroxus-
stamme besitzen das Vermögen zu denitrifizieren, welche Eigen-
schaft bei der Ueberimpfung aber verloren gehen kann. Bei
der Aussaat auf für Nitratation geeignete Böden, arm an
organische Nahrung, entwickelt Nitroxus sich zwar wenig, jedoch
auf ähnliche Weise, wie bei besserer Ernährung und ist dann
zwischen und in den sich seitlich viel stärker ausbreitenden
Nitratkolonien leicht zu erkennen. In diesem Falle können auch
die früher genannten, in den Rohnitratationen so häufigen
Actinohacillus oligocarhophilus und A. paulotr opinis zwx'^n'v^'icV-
lung gelangen; dieselben sind jedoch sofort durch die schmmel-
artig, schneeweisse Farbe ihrer Kolonien kenntlich und leicht
von den glasartig durchsichtigen Nitratkolonien zu unterscheiden.
Bei besserer Ernährung ist A. oligocarhophilus eine nur
langsam, zu kleinen feuchten Kolonien sich entwickelnde Art,
■welche durchaus nicht mehr an den Kahmpilzartigen oligotrophen
Zustand erinnert. A. paulotrophus habe ich auf keinen einzigen
guten Nährboden zur Entwicklung bringen können.

Bisher erkannte ich nur eine einzige nitratierende Art. Das
mag jedoch Folge des Umstandes sein, dass ich nur mit Böden
aus dem Laboratoriumsgarten zu Delft Versuche anstellte. Weil
ich aber mit gesonderten Beeten von Ton, Gartenerde, Sand
und Moor arbeitete, welche erfahfungsgemäss sehr verschiedene
Mikrobenfloren enthalten, und mit allen das gleiche Resultat
erhielt, dürfte das Nitratferment sehr gleichmässig sein und
auch anderswo in derselben Form vorkommen wie hier.

Die hierbeigegebenen Bilder (Fig. i und 2 Taf. VII) sollen
die Unterscheidung von B. nitroxus und dem Nitratferment
erleichteren. Die übrigen für die Rohnitratationen charakteris-
tischen Arten sind so leicht kenntlich, dass es nicht nötig erschien
dieselben abzubilden.

I09

Es scheint mir aber nicht überflüssig an dieser Stelle eine
Recapitulation zu geben von den, in den Rohnitratationen
hier in Delft stets vorkommenden Bewohnern, welche auch
nach wiederholten Ueberimpfungen standhalten und desshalb,
im Gegensatz zu der accidentellen (wozu z.B. die so merk-
würdigen roten und braunen Pigmentbakterien gehören), als
„Haupt-Flora" bezeichnet werden können. Dazu gehören :

Erstens, Nitrohacter oUgotrophum >• Nitrobacter poly-

trophmn, das Nitratferment selbst, i) Im nitratierenden, meist
unbeweglichen Zustand als A''. oUgotrophum, im saprophytischen
oft beweglichen nicht nitratierenden Zustand, aXs N. polytrophum,
zu bezeichnen. Die beiden Formen müssen als physiologische
Arten bezeichnet werden und verhalten sich zu einander als
Modifikationen und nicht als Mutationen. Der Uebergang findet,
wie der Pfeil andeutet, nur in eine Richtung statt.

Zweitens, Bacillus nitroxus. Sehr kleine sporenerzeugende
meist unbewegliche Stäbchen, welche nicht nitratieren, übrigens in
ihren Lebensbedingungen dem Nitratferment ähnlich und davon
schwer zu trennen sind. Einige Varietäten zeigen Denitrifikation.

Drittens, die Gattung Actinohacillus, welche zu der Familie
der Actinomyceten gehört und desshalb typisch unbeweglich
ist. Unterscheidet sich von der von NEUMANN und LEHMANN
aufgestellten Gattung Mycobacterium durch das vollständige
Fehlen der Verzweigung, sodass man nur Stäbchen oder Fäden
findet. Erzeugt die charakteristische treibende , .Kahmhaut"
auf der Oberfläche der nitrifizirenden Flüssigkeiten. Darin finden
sich zwei Arten nämlich :

a. Actinohacillus oligocarbophilus, welche sich ernähren kann
von den Kohlenstoffverbindungen der atmosferischen Luft und
dann das ,, Kahmpilzmerkmal" zeigt; anderseits auf den ver-
schiedensten organischen Nährböden wächst ohne das „Kahm-
pilzmerkmal". Letzterer Zustand auf Kieselplatten zurückgeimpft
zeigt das ,,Kahmpilzmerkmar' wieder. 2) Doch kann das Merkmal

1) In meiner Mitteilung in der Akademie der Wissenschaften zu Amsterdam,
Bd. 23, Pag, 1163, 28 März (10 April) 1914, habe ich das Nitratferment, wegen
seiner Beweglichkeit Nitribacillus genannt. Doch scheint es mir gegenwärtig,
dass der von Winogradsky eingeführte Name Nitrobacter bleiben kann.

2) Diesen Tatbestand habe ich in meiner, in voriger Note, genannten Mitteilung
etwas anders und nicht ganz richtig vorgestellt.

IIÖ

verloren gehen durch lange fortgesetzte saprophytische Lebens-
weise. Verflüssigt Nährgelatine nicht.

b. Actinobacülus paulotr opinis. Erzeugt auf den nitratierenden
Platten schimmelartige Kolonien mit ,,Lufthyphen" ; besteht jedoch
mikroskopisch anscheinend aus gleichartigen Stäbchen und Fäden.
Wächst durchaus nicht bei Gegenwart organischer Substanz.

Viertens, die Gattung Actinomyces, wovon verschiedene Arten,
in geringer Anzahl in den „Kahmhäuten" von Aciinobacillus
vorkommen können, daraus jedoch bei den Ueberimpfungen
bisweilen gänzlich verschwinden.

6. Kann das Nitratferment
Kohlensäure reduzieren?

Die höchst auffallende Tatsache, dass das Nitratferment nur
dann funktioniert, wenn gelöste organische Stoffe so vollständig
wie möglich fehlen, führt, wie von selbst zur Hypothese, dass die
bei der Nitritoxydation freikommende, nicht unbeträchtliche
Energiemenge, nämlich 184 Kalorien nach der Formel

HNO2 aq + O — > HNO3 + 184 K 1)

vielleicht für die Reduktion atmosferischer Kohlensäure, also
zur Chemosynthese dienen könnte. Beweise dafür habe ich
bisher jedoch nicht finden können

Kultiviert man das Ferment in Nährlösungen, so bleiben diese
gänzlich klar, nur mit dem Mikroskop findet man, besonders an
der mit einer äusserst, dünnen Schleimlage bekleideten Glaswand
viele sehr kleine Bakterien. Die Masse dieser letzteren ist so
gering, dass ein einzelnes Sonnenstäubchen, z.B. ein Fädchen
Wolle oder Baumwolle in die Kulturflüssigkeit gefallen, eine
Million derselben repräsentieren kann.

Auf Kieselplatten, gesättigt mit Lösungen von 0,1 Proz. à
0,05 Proz. Natriumnitrit und 0,01 Bikaliumfosfat, bildet das
Nitratferment erst mit der Lupe deutlich sichtbare, jedoch sehr
aktive Kolonien, desto kleiner, aber nicht weniger aktiv, je
vollständiger man gelöste organische Körper aus der Platte
fernhält. Dass für das geringe Kohlenstofïbedurfniss, welches

*) W. Ostwald, Allg. Chemie, 2^ Aufl. Bd. 2, Th. i, Pag. 145, 1893.

hierbei in Betracht kommt, eine genügende Menge organisches
Material als Verunreinigung in den Platten gegenwärtig ist,
erscheint durchaus nicht unmöglich.

Sollten die organischen Verunreinigungen der Platte dazu
nicht ausreichen, so zeigt das kräftige Wachstum der Oligocar-
bophilushäute auf der Oberfläche der nitratierenden Flüssig-
keiten, sowie der Rohnitrifikationen im allgemeinen, dass die
Atmosfere, wenigstens für deren Wachstum, genügend gebun-
denen Kohlenstofï lieferen kann.

Werden solche Rohkulturen auf Kieselplatten ausgesät, welche,
so vollständig möglich von löslichen organischen Körpern befreit
sind, so wachsen, neben den immer sehr klein bleibenden
Kolonien des Nitratfermentes, diejenigen der genannten Arten
als schneeweisse, trockene Platten (A. oligocarbophilus), oder als
kleine, schimmelartige, sehr zarte Và\?,ttxc}L^ç.xi[A. pauloirophus),
welche nach einigen Wochen, wenigstens was A. oUgocarho-
philus betrifft, hundert oder tausendmal grösser werden können,
wie die daneben liegenden Kolonien des Nitratfermentes. Da es
nun feststeht, dass weder A. oligocarbophilus noch A.paulotrophus
imstande sind Nitrite zu oxydieren und deshalb keine Chemo-
synthese ausüben können, müssen diese Arten in ihrer Umgebung
organisch gebundenen Kohlenstoff in genügender Menge vorfinden
um damit ihrem, nicht so besonders kleinem Bedürfnis an dieses
Element Genüge leisten zu können. Hieraus folgt jedoch mit
Notwendigkeit, dass das so viel weniger bedürftige Nitratferment
bei diesen Bedingungen dann doch auch sehr wohl eine genügende
Nahrung an organisch gebundenen Kohlenstoff in der atmos-
ferischen Luft muss finden können. Allerdings ist es noch
unsicher von welcher Natur die hier in Betracht kommenden
Substanzen sind. Vielleicht handelt es sich dabei um Kohlen-
wasserstoffe, deren Gegenwart in geringer Menge in der Luft
festgestellt ist. Die in meiner oben genannten Abhandelung i)
zitierte Ansicht von Henriet, dass es sich dabei um Alkyla-
minen handelen sollte, dürfte aber wenig wahrscheinlich sein.
Jedenfalls konnte ich mit Formamid nichts erreichen ; ebenso-
wenig mit Ammonformiat und Hexamethylentetramin.

Anderseits muss es auch als möglich betrachtet werden, dass

^) Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. lo, Pag. 38, 1903.

112

flüchtige Stoffwechselprodukte anderer Mikroben dem Nitrat-
ferment zur Ernährung dienen können.

Ueberblicken wir das Vorgehende noch einmal, so ergiebt sich,
dass wenn wir das Nitratferment, welches nur erblich stabil ist bei
Gegenwart von Spuren von löslichen organischen Nährsubstan-
zen mit den Namen Nitrobacter oligotrophum bezeichnen, daraus,
bei besserer Ernährung, z.B. mit Bouillon, eine scheinbar ge-
wöhnliche, schwach bewegliche, stark wachsende saprophytische
Bakterie hervorgeht, mit sehr charakteristischen Eigenschaften
welche Nitrobacter polytrophum genannt werden kann. Dieser
Vorgang ist nicht umkehrbar, das heisst, bei Laboratoriums-
versuchen gelingt es nicht die Umwandelung

N.p > N.o

zu stände zu bringen.

Wie man sieht handelt es sich dabei um physiologische Art-
bildung, und wenn man sich abfragt, wo diese in das System
der Biologie unterzubringen ist, so kommt man zu folgendem
Schlüsse.

Ein Beispiel von Mutation, so wie ich diese für viele Mikroben,
beschrieben habe, i) kann est nicht sein, denn die erblich mehr oder
weniger stabilen Produkte des Mutationsprocesses entstehen
neben der Hauptform und bestehen neben dieser, unter den
verschiedensten Ernährungsbedingungen weiter fort.

Allein es handelt sich dabei um ein neues und besonders
auffallendes Beispiel erblich stabiler Modifikation, nur durch
die Deuthchkeit verschieden von dem Virulenzverlust bei
vielen pathogenen Mikroben ; vergleichbar mit der essentiell
einseitig stattfindenden, nicht umkehrbaren Ontogenese der
höheren Pflanzen und Tiere, deren Folge wür kennen in der
Zellendifferenzierung. Die verschiedenen, bei der Ontogenese
entstehenden Zellenformen, woraus schliesslich die erwachsenen
Pflanzen und Tiere aufgebaut sind, müssen als Modifikationen
der ursprünglichen embryonalen Zelle aufgefasst werden ; dass
auch sie unter Umständen mehr oder weniger erblich stabil
sind, lässt sich in vielen Fällen zeigen. Ich erinnere in dieser

^) Folia Microbiologica, Bd. i, Pag. i, 191 2.

TAFEL VII.

P'olia Microbiologica III
(Beijerinck).

I*'»- Ï (37j- J^'ilralfernieiit und B. Nitii>.\iis auf
Nhritaçar,

Fig. 2 (37). Nilratferment (i\ d) und B nifro.xits (a. b)
auf Fleischbouillontjelatine.

Beziehung an die Wachstumsverhältnisse der Epidermiszellen
der Tiere und der Korkzellen der Pflanzen, welche sich fortwährend
aus ihren Mutterzellen regenerieren. Künstlich sind embryonale
Bindegewebezellen und Muskelzellen des embryonalen Herzens,
während einer Reihe von Generationen in Blutplasma, ohne sich
zu änderen, reproduziert bei den Versuchen von Carrel.

Es muss allerdings anerkannt werden, dass es sehr schwierig,
wenn nicht unmöglich ist, Mutation und erblich stabile Modi-
fikation in allen Fällen scharf von einander zu unterscheiden.
Diese beide Vorgänge fliessen derweise zusammen, dass man
manchmal in Zweifel verkehrt, wie ein Entwicklungsprozess,
wobei eine neue Entwicklungsrichtung eingeschlagen wird,
bezeichnet werden muss.

Ich meine aber, dass, im Falle des Nitratfermentes die
Verhältnisse deuthch sind, und niemand bestreiten wird, dass
der Uebergang ,,oligotroph" zu ,,polytroph" wirklich als Modi-
fikation zu betrachten ist. Es muss aber bemerkt werden, dass
der Modifikationsbegriff zwei verschiedene Begriffe umfasst,
welche bisher nicht durch bestimmte Worte angegeben werden,
nämlich umkehrbare und nicht umkehrbare Modifikation. Damit
parallel im Mutationsbegriff wären Mutation mit und ohne
Atavismus. Es ist aus dem Vorgehenden klar, dass beim Nitrat-
ferment nur nicht umkehrbare Modifikation stattfindet. Hierin
liegt auch eine Verschiedenheit dieses Vorganges mit der
Pleomorphic vieler Pilze, welche übrigens an die physiologische
Artbildung beim Nitratferment erinnert.

FIGURENERKLÄRUNG ZU TAFEL VIL

Fig. I (37). Kolonien des oligotropen Nitratfermentes, Nitrobacter
oligotrophum, und von Bacillus nitroxus auf Nitritagar. Die grossen,
dendritisch verzweigten Kolonien sind das Nitratferment, die runden,
kleinen B. nitroxus.

Fig. 2 (37). Kolonien des umgewandelten, polytrophen Nitratfermentes,
Nitrobacter polytrophum, und Bacillus nitroxus auf Bouillongelatine. Die
grossen, körnigen Kolonien (c, d] sind das Nitratferment, zwei davon
(c, cj fangen an die Gelatine zu verflüssigen ; die kleinen, runden Kolo-
nien (a, b) sind B. nitroxus, im noch nicht verflüssigenden Zustande.

EINE SPROSSLOSE FORM VON DEMATIUM

PULLULANS DE Bary UND EINE STERILE

ZWERQFORM VON PHYCOMYCES

NITENS Aqardh.

VON
Dr. S. L. SCHOUTEN — Utrecht i).

In einer Petrischale mit Glucose-Pepton-Agar folgender
Zusammenstellung: Glucose techn. 5 0/0, Pepton Witte 1/2 Vo»
Monokaliumfosfat 1/10 %5 Magnesiumsulfat V20 "/o» welche ich
zum Auffangen von Luftkeimen aufgestellt hatte (und der ich
I 0/00 Kupferazetat zu einem bestimmten Zweck, der mit der
folgenden Untersuchung nichts zu machen hat, beigefügt hatte),
entwickelten sich verschiedene Kolonien, welche aus gegliederten
Hyphen und Hefezellen bestanden. Aus einer davon impfte
ich nach einigen Tagen auf gewöhnlichen Glucose-Pepton-Agar
(d. h. ohne Kupferazetat) über. Aus der darauf entstandenen
Kultur isolierte ich unter dem Mikroskop eine Zelle. Die daraus
entstandene Kolonie (also bestimmt eine Einzell-Kultur) ist der
Ausgangspunkt der hier folgenden Untersuchung.

Indem ich für eine weitläufigere Beschreibung nach früheren
Publikationen verweise 2)^ will ich hier jedoch mit wenigen

^) Nach einem in der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie am 8
Juli 1912 gehaltenen Vortrage.

^) Siehe u. A. : »Reinkulturen aus einer unter dem Mikroskop isolierten Zelle«
in »Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für mikroskopische Technik.
Bd. 22 (1905) S. 10 ff. Verbesserungen dieser Methode findet man in den
Sitzungs-Berichten der Königl. Akademie der Wissenschaften zu Amsterdam ;
Naturw. Abteilung, 24 Dec. 1910.

Worten sagen, dass für das Isolieren einer einzigen Zelle
(Bakterie, Hefezelle, u. s. vv.) unter dem Mikroskop, das Material
In einen hängenden Tropfen an der Unterseite eines Deck-
gläschens gebracht wird, während diesem Tropfen gegenüber
sterile Tropfen, worin die Reinkultur entstehen soll, angebracht
sind. Mit Hilfe einer feinen, am Ende in ein Auge umge-
bogenen Glasnadel, welche durch einen einfachen Mechanismus
verstellt wird, kann man jetzt eine einzige Zelle, unter Kon-
trolierung der stärksten Vergrösserung, aus diesem Tropfen
isolieren und in einen der sterilen Tropfen hinüberbringen.

Uebergeführt in ein gewöhnliches Kulturröhrchen mit Glucose-
Pepton-Agar, hatte obengenannte Kultur nach 4 Tagen das
Aussehen einer Hefekultur, gelbweiss von Farbe (Fig. 1).
Mikroskopisch untersucht, sah ich, dass sie bestand aus Hefe-
zellen, umsäumt durch einen Rand von Hyphen (Fig. 2). Einige
Zeit später zeigten sich darin braune Flecke, und bisweilen
ein brauner Rand (Fig. 3 und 4), und nach 3 Monaten hatte
die Kultur die Gestalt von Fig. 5: ein flacher Teil, schmutzig
rosa gefärbt, aus losen Hefezellen bestehend, und dicke schwarze
Krusten, gebildet durch dunkelbraune Zellen, die Fetttropfen
enthielten (auch etwa wie in Fig. 4). Die Vermutung, dass ich
hier Dematium puUulans vor mir hatte, war hierdurch ein Gewiss-
heit geworden.

Ueber diesen Pilz, mit dem schon viele Untersucher sich be-
schäftigt haben, besteht keine Uebereinstimmung, weder über
den Platz, der ihm im System zukommt, noch was sein Verhalten
bei verschiedenen Kulturbedingungen betrifft. Brefeld 1) teilt
ihn bei Sphaerulina intermixta ein, eine Auffassung, die von
Anderen bezweifelt wird. Für eine Verwandtschaft mit Hefe sind
noch keine stichhaltigen Gründe angebracht. SEILER 2) behauptet
sogar, dass man die Hefezellen mehrere Decennien hindurch
kultiviert haben müsste, ohne dass sich Myzelium gezeigt hätte,
und sich wohl Endosporen gebildet hätten, um das Recht zu
haben, eine solche Verwandtschafft als sicher anzunehmen.

*) »Untersuchungen aus dem Gesamtgebiet der Mykologie«, 1891, Heft 10.
2) »Studien über die Abstammung der Saccharomyceten« im »Centralblatt für
Bakteriologie«. II Abt. 1896. S. 321.

ii6

Nach LOEUW i) entwickelt sich eine weisse Konidie (so werden
wir die Hefezellen nennen) unter günstigen Bedingungen immer
zuerst zu einer Hyphe mit Seitenzweigen, welche Konidien
hervorbringen, während die Konidien der zweiten Generation
sich dann allein durch Sprossung vermehren.

Ich selbst fand meistens das gleiche, aber doch auch wohl,
dass eine Konidie sich unter denselben günstigen Umständen
zu einer einfachen oder einer doppelten Riesenzelle (Fig. 6)
entwickeln kann, welche dann wieder Konidien abschnürt,
während bisweilen selbst das Aufschwellen zu einer Riesenzelle
unterbleibt. Die braunen Zellen in älteren Kulturen weichen
in dem von mir untersuchten Stamm in so fern ab von dem
was andere Untersucher bei Dematium puUulans aufgeben, dass
die runde Gemmen meistens vereinzelt, und beziehungsweise
wenig in Ketten vorkamen. Die braunen Zellen können, nach
früheren Untersuchern, zu Hyphen entkeimen, welche dann
Konidien abschnüren, oder auch gleich Konidien erzeugen 2).
Das Erstere solle dann geschehen bei guter, das Letztere bei
geringer Nahrung. Ich fand auch Beides, aber unabhängig von
der Nahrung. Abweichungen dürften hier auch übrigens nicht
befremden. Mit Recht sagt ZoPF 3) — und das gilt auch noch
jetzt — : „Wahrscheinlich sind unter dem, was man gewöhnlich
D. p. nennt, mehrere Spezies versteckt".

Ich stellte mir folgende Fragen :

1 . Was passiert, wenn man in der gewöhnlichen Weise aus
dem flachen, schmutzig rosa gefärbtem Teil überimpft? Man
bekommt dann eine Kultur, welche nach 6 Tagen noch weiss
aussieht und aus Konidien und wenigen Hyphen besteht, aber
nach 1 oder 2 Wochen schon schwarze Flecken zeigt — also
die schon besprochene Kultur von Fig. i, 3 und 5.

2. Was passiert, wenn man in der gewöhnlichen Weise aus
einer schwarzen Kruste überimpft ? Dasselbe ; die schwarzen
Flecken werden aber später zahlreicher wie im vorherigen Falle,

3. Was passiert, wenn man eine Konidie aus dem rosa Teil
isoliert? Ich brachte isolierte Zellen über in Tropfen flüssiger

1) »Ueber Dematium pullulans de Rary« in »Jahrbücher für Wissenschaftliche
Botanik«. VI. S. 468—471.

2) Lafar, »Handbuch der technischen Mykologie« IV S. 277.

3) »Die Pilze« S. 480.

Glucose-Pepton, und Hess die Entwickelung bei 250 C. statt-
finden. Man bekommt dann, wie ich sagte, Konidien von sehr
verschiedener Grösse und Gestalt (Fig. 6), oder ein Myzelium.
Wenn man nun hieraus wieder entweder Hyphe-Fragmente
oder grössere und gewöhnliche Konidien isoliert, so bekommt
man immer eine Kultur wie sub i, eine Kultur also, die
Konidien erzeugt.

4. Was passiert, wenn man eine dunkele Zelle aus einer
schwarzen Kruste isoliert? Nach dem was ich hieroben mitteilte,
würden sich dann auch immer Konidien entwickeln, entweder
aus einem zuerst gebildeten Myzelium oder unmittelbar.
Wenigstens, keiner der Untersucher, welche sich mit Dematium
puUulans beschäftigt haben, haben je etwas anderes beobachtet.
Wenn ich aber Zellen einer bestimmten Gestalt auswählte,
und diese isolierte, fand ich eine merkwürdige Abweichung.
Einige braune Zellen, unter volkommen normalen Bedingungen
kultiviert, lieferten eine makroskopisch völlig abweichende,
konidienlose Myzeliumform, die, unter welchen Bedingungen
auch kultiviert, nie Konidien abschnürt, und sich jetzt während
3 1/2 Jahre als constant erwiesen hat.

Um diese braune Zellen zu isolieren, muss man von der Ober-
fläche vorsichtig ein wenig Material abkratzen und dieses in
einen Tropfen steriler physiologischer Kochsalz-Lösung bringen.
Es wird danach mit einem flambierten Glasstäbchen gerieben.
Selbst nach längerem Drücken mit dem Stäbchen findet man
noch wenige lose Zellen, welche isoliert werden können um
die Myzeliumform zu liefern.

Ich fing an mit einer Einzell-Kultur, die 3-| Monat alt war,
zu arbeiten, und isolierte daraus (Fig. 7) 8 Zellen, jede Zelle
in einen Tropfen Glucose-Pepton, und zwar No. i — 4 auf
einem Gläschen, No. 5 — 8 auf einem andern. Die Gläschen
wurden auf feuchte Kammern gelegt, welche bei 250 C. gesetzt
wurden. Nach 24 Stunden zeigte sich die merkwürdige Erschei-
nung, dass 4 Zellen (Fig. 7, No. t. 3, 5 und 8) zu einem
kleinen Myzelium entkeimt waren, welches aber angefangen
hatte Konidien abzuschnüren, während aus 3 Zellen (Fig. 7,
No. 2, 4 und 7) ein Myzelium entstanden war, das keine
Konidien abschnürte (Fig. 8). Eine Zelle — eine Seltenheit
bei diesem Material — war nicht entkeimt. Nach 42 Stunden

ii8

waren diese letzten 3 Myzelien so stark gewachsen, dass sie
schon aus dem Tropfen herauswuchsen. Darauf wurde aus
allen Tropfen in Röhrchen mit Glucose-Pepton-Agar geimpft.
Schon nach 2 Tagen stellte sich heraus, dass i, 3, 5 und 8
sich wie eine gewöhnliche Dematiumkultur entwickelten, während
2, 4 und 7 sich als ein dicker Myzeliumpfropfen mit aufrecht
stehenden kurzen Hyphenbündeln entwickelten. Nach 6 Tagen
war es eine Scheibe, fast so hart wie Knorpel (Fig. 9), welche
nur aus Hyphen bestand, die am Rande etwas länger ausliefen
und im Zentrum kurz und gekrümmt [waren. Wenige Tage
später beginnt die Kultur zu verschrumpfen (Fig. 10). Nach
einigen Monaten ist sie schwarz (Fig. 11), an der Oberfläche
grobkörnig, und ganz verschrumpft ; sie besteht dann aus
braunen und weissen Hyphen von grilliger Form (Fig. 12).

Später zeigt sich auf einer alten Kultur bisweilen noch eine
weisse oder graue sehr dünne watte-ähnliche Schicht, aus weissen
Hyphen von Zellen mit grossen Vacuolen geformt. Das Myzelium
produziert Oel.

Wenn man diese Kultur auf festem Boden in eine Lösung
von Glucose-Pepton überbringt, entweder in Röhrchen, oder
in Kolben, bleibt das Myzelium sprosslos ; ebenfalls wenn
man gleich die entkeimende Zelle in Flüssigkeit überbringt.
Immer sinkt das Myzelium teilweise auf den Boden, während
ein anderer Teil eine Decke formt. Später wird alles
schwarz, wie bei Kulturen auf festem Substrat. Gelatine wird
verflüssigt.

Auch auf anderen Nährböden bleibt diese Form sprosslos,
wie sich aus Kulturen auf Sabouraud-Agar (Glucose 40/^ Pepton
2 0/0) Malzagar, Hefeextract 200/0 + Glucose 7V2V0, Brot,
Kokosnuss, Banane, Agar i V2% ^^f Leitungswasser, erwiesen hat.

Diese Versuche wurden, wie gesagt, genommen mit einer
Kultur, welche aus einer einzigen unter dem Mikroskop isolier-
ten Zelle entstanden war. Später wurden sie mit einer 4
Monate alten Kultur desselben Stammes wiederholt. Es wurden
die Zellen von Fig. 13 isoliert. Davon lieferten No. i — 3 die
Konidienform, No. 4 — 6 die Myzeliumform.

Wenn man die Form und die Masze der Zellen welche die
Myzeliumform geben, nachgeht, wird man bemerken, dass sie
fast alle dem mehr länglichen Typus angehören. Wenn man

Tig

diejenige Zellen länglich nennt, deren Länge wenigstens 2 1/2
mal grösser ist wie die Breite, sieht man, dass von 7 Zellen,
welche die Konidienform liefern, 6 nicht länglich sind und i
länglich, indem von den 6 Zellen welche die Myzeliumform
liefern, 5 länglich sind und i nicht länglich. Diese Tatsache
brachte mich zu der Frage, weil längliche Zellen hier meistens
aus Hyphen herstammen, ob es nicht die Zellen der braunen
Hyphen sein könnten, welche die Myzeliumform geben, indem
die braunen Zellen, welche vom Anfang ab lose in der Kultur
vorkommen, oder vor dem Braunwerden als Konidien an den
Hyphen entstanden sind, und die meistens einen mehr isodia-
metrischen Form haben, die Konidienform geben könnten.

Es ist mir nicht gelungen dem Zusammenhang dieser
Zellen während des Wachsens der Kultur zu folgen. In einem
mikroskopischen Praeparat, verfertigt aus einer ausgewachsenen,
einige Monate alten Kultur ist dies selbstverständlich noch
weniger zu entscheiden. Da liegen alle Zellen mehr oder
weniger verwirrt durch einander. Aber doch hat diese Annahme
wohl eine gewisse Wahrscheinlichkeit bekommen durch die
folgenden Isolierversuche. Aus einer 25 Wochen alten Kultur
isolierte ich 4 Zellen, und aus derselben, nur 2 Wochen
älteren Kultur, wiederum 4 Zellen, welche alle zu dem mehr
isodiametrischen Typus gehörten und jedenfalls den Eindruck
machten, dass sie nicht aus Hyphen entsprossen waren. Sie
lieferten alle die Konidienform. Aus einer andern, 19 Wochen
alten Kultur isolierte ich 3 ganze Hyphen, und Stücke, wovon
es einigermaszen zweifelhaft sein konnte, ob sie von Hyphen
herstammten, welche alle die Myzeliumform gaben, und weiter
eine zusammenklebende Masse Konidien und eine einzelne
Konidie, welche beide die Konidienform gaben.

Obgleich bei gewissenhafter Arbeit die Möglichkeit der
Luftinfektion ausserordentlich klein ist, hat man damit doch
immer zu rechnen. Ich meinte deshalb, dass ich diese Versuche
nicht alle mit einer einzigen Kultur machen dürfte. Darum nahm
ich für die letztbeschriebene Probe eine ganz neue Kultur,
welche ich wiederum aus einer einzigen, unter dem Mikroskop
isolierten, Konidie hatte entstehen lassen.

Ich habe auch nachgeforscht, ob die obenbeschriebene Abspal-
tung einer Myzeliumform bei jedem Dematiumstamm möglich

Î20

ist. Dazu wurden einige an verschiedenen Stellen aus der Luft
aufgefangen, und eine davon erwählt, wovon die braunen Zellen
in den schwarzen Flecken ziemlich übereinstimmten mit den
Zellen des bis jetzt benutzten Stammes. Obgleich ich in derselben
Weise arbeitete wie mit dem vorigen Stamm, habe ich daraus
aber in keiner Weise eine Myzeliumform erzeugen können.

Einige wenige Worte will ich noch sagen über eine Erscheinung,
worauf ich oben schon hingewiesen habe und die gewiss nicht
allein bei Dematium vorkommt: die starken individuellen Unter-
schiede was das Entkeimen der Konidien, sowohl weisse als
braune, betrifft. Man kann, wenn man den hier beschriebenen
Fall der sprosslosen Myzeliumform ausschliesst, 4 Typen
unterscheiden :

A. Es entwickelt sich aus der Konidie eine Hyphe, welche
sich einigermaszen verzweigt und sehr bald (nämlich innerhalb
24 Stunden) zum Abschnüren von Konidien übergeht.

B. Es entwickelt sich aus der Konidie eine Art Riesenzelle,
welche gleich Konidien abschnürt.

Diese 2 Arten der Entkeimung kommen am meisten vor ; viel
seltener sind die folgenden Arten.

C. Es entwickelt sich ein Myzelium, das erst spät, d.h. nach
I oder 2 Tagen, Konidien abschnürt.

D. Die Konidie schnürt gleich Töchterzellen ab.

Von einigen Untersuchern, u. A. DE Bary, wird angenommen,
dass alles dieses unter Einfluss verschiedener Kulturbedingungen
stattfindet. Je besser diese sind, desto mehr Möglichkeit für
Entwickelung von Myzelium wäre vorhanden. Dem kann ich
aber nicht beistimmen. In meinen Tropfenkulturen sah ich nämlich
alle diese Formen unter gleichen Bedingungen durch einander
entstehen. In einem Tropfen z.B., worin man 20 Zellen ent-
keimen lässt, können sich kurze und lange Hyphen entwickeln.
Bringt man 4 Tropfen Glucose-Pepton auf ein Deckgläschen,
und in jeden davon eine Konidie derselben Herkunft, dann kann
der eine Tropfen ein sehr kräftiges Myzelium liefern, das
Konidien erzeugt, ein anderer aber eine kurze Hyphe, woran
Konidien entstehen, während in dem dritten gleich Zellen,
abgeschnürt werden.

Der Gedanke kam mir, ob hier vielleicht Erblichkeit bestehen
könne, welche bei Ueberimpfung tausender Zellen zugleich

Î2Î

selbstverständlich unbemerkt bleibt, aber erst zu Tage kommt
wenn man eine einzige Zelle isoliert. Um hier Sicherheit zu
bekommen, wurde eine Anzahl Zellen in einen Tropfen gebracht,
und, sobald sich eine zeigte, die nach dem Typus C. oder D.
entkeimte,' wurde diese isoliert. Es war aber keine Spur von
ErbUchkeit zu sehen. Die Nachkommenschaft einer Zelle von
Typus C. zeigte bei der Entkeimung eben so gut die 4 Typen
wie die von Typus D.

Mit einer Kultur, abstammend von einem sehr stark ent-
wickelten MyzeUum, dass erst spät Konidien abschnürte (Fig. 14)
— man könnte sagen : ein Mutant mit Neigung zu Spross-
losigkeit — habe ich noch probiert eine sprosslose Form zu
bekommen, wie bei meinem ersten Stamm. Alle Bemühungen,
u. A. das Abschneiden allerlei Teile des Myzeliums unter dem
Mikroskop, und das Isolieren und weiter Kultivieren der abge-
schnittenen Stücke, mislangen ; immer kamen wieder Konidien,
bisweilen nachdem die isolierte Hyphe erst Chlamydosporen
geformt hatte.

Man könnte zum Schluss fragen, ob diese Untersuchung auch
nicht mögUch gewesen wäre mit der Methode der Plattenkultur.
Darauf antworte ich, dass hier für das Erlangen der sprosslosen
Form immer längliche braune Zellen isoliert wurden, welche selten,
selbst nach langem und intensem Reiben, lose vorkommen, sondern
meistens mit andern braunen und weissen Zellen verbunden
bleiben. Jetzt, wo es einmal bekannt ist, dass solch eine sprosslose
Form erhalten werden kann, und die Form der jungen Kultur, also
der Kolonie, bekannt ist, würde man sie vielleicht isolieren
können wenn man sehr viele dünn besähte Platten gösse.
Für das Entdecken einer solchen Form, wenn man ihre Existenz
nicht weiss oder selbst nicht vermutet, scheint mir die Platten-
kultur-Methode jedoch nicht die gewünschteste.

Die Frage, ob die sprosslose Form selbstständig in der Natur
vorkommt, ist schwer zu entscheiden. Vielleicht ist das so ;
vielleicht wird sie in dem einen oder anderen Laboratorium rein
gezüchtet, ohne dass man etwas von Zussammenhang mit
Dematium vermutet. Vielleicht auch wird sie immer von der
Konidienform, worin sie also mehr oder weniger verborgen ist,
überwuchert.

122
II

Aus einer Reinkultur von Phycomyces nitens -f- und — , welche
Herr Prof. Went, Director des hiesigen botanischen Instituts mir
in liebenswürdiger Weise zur Verfügung stellte, isolierte ich Sporen
zur Erlangung von Einzellkulturen. Fast alle Sporen zeigten
die normale elliptische, einige aber eine bizarre Form. (Fig. 15).
Ich isolierte auch einige von diesen letzteren, um zu untersuchen
ob sie vielleicht eine abweichende Kultur geben würden. Dies
schien mir nicht der Fall zu sein, nur mit einer Ausnahme.
Eine Spore, aus einer — Kultur herstammend, und abgebildet
in Fig. 15 No. 2 wurde, zugleich mit 3 normalen Sporen, auf
demselben Deckgläschen isoliert; nach 24 Stunden war sie
gekeimt ; nach 48 Stunden wurde das sehr kleine Myzelium,
und auch das Myzelium aus einer der gekeimten normalen
Sporen, auf Röhrchen mit flüssiger Glucose-Pepton übertragen.
Nachdem die Myzelien sich hierin in zwei Tagen gut entwickelt
hatten, wurde auf festem Nährboden, auf Glucose-Pepton-Agar
übergeimpft. Im Anfang wuchsen beide Myzelien darauf gleich
schnell ; danach produzierten beide niedrige Sporangien. Während
diesen aber beim Myzelium der normalen Sporen lange, in den
Wattepfropfen des Röhrchens wachsenden Sporangirn folgten,
war dies nicht der Fall mit dem Myzelium der abnormalen
Spore ; dieses brachte somit nur niedrige Sporangien hervor.
Der Unterschied blieb beim L'eberimpfen bestehen ; viel grösser
war er aber auf Brot, das für Phycomyces ein weit besserer
Nährboden ist als Glucose-Pepton-Agar. Um die Sporangien
in eine Lage su bringen worin sie sich so hoch wie möglich
entwickeln konnten, wurden zwei Bechergläser des höchsten
Modelles mittels eines geeigneten, rinnenförmigen Verbindungs-
stückes umgekehrt auf einander gesetzt. 1) Dadurch wurde ein
steriler Raum von ^i 13 cm. Durchmesser und 60 cm. Höhe
gewonnen. Der Apparat wurde dann in eine an der Innenseite
geschwärzte Schachtel gestellt, so dass das Licht nur von oben
her einfallen konnte. Hierin erreichten, auf Brot als Nährboden,

*) Ich denke von diesem Apparat, der sich vorzügUch zum steril Züchten
von — und Experimentieren mit hochaufwachsenden Pilzen und höheren Pflanzen
eignet, später eine spezielle Beschreibung zu geben.

123

die Sporangienträger der normalen Stammform eine maximale
Höhe von 37 cm, und die der Zwergrasse eine von 15 cm.
(Fig. 17). Ist dies schon ein auffallender Unterschied, noch
merkwürdiger ist es mit den Sporangien gestellt Das Sporan-
gium der Zwergform ist meistens von einer feuchten Hülle umgeben,
und enthält keine Sporen, sondern einen grobkörnigen, Fett-
tropfen führenden Inhalt (Fig. 16). Auch auf Brot bleibt dieser
Unterschied beim Ueberimpfen bestehen. Ich habe darum die
Zwergform Phycomyces nitens var. nana steriHs genannt.

Da 6 oder 7 Wochen sich wohl ungefähr als die Maximal-
lebensdauer des Myzeliums erwiesen hat, tut man gut, alle 4
oder 5 Wochen überzuimpfen. Dazu werden — da dennoch
mehrmals Partieen des Myzeliums abgestorben schienen —
mehrere Stückchen aus verschiedenen Teilen des alten Nähr-
bodens herausgenommen. Als die Zwergform so mehr als ein
Jahr gezüchtet war, zeigten sich zwischen den sterilen
Sporangien, einige normale. Darüber wird man sich nicht
wundern, wenn man bedenkt, dass die Sporen von Phycomyces
mehrkernig sind. Von 6 — 10 Kernen in der Spore, welche die
sterile Zwergform lieferte, kann sehr gut einer noch die
Eigenschaften der Stammform gehabt haben. Man vergleiche
die Untersuchungen von BURGEFF 1), der aus einer Kultur von
Phycomyces ein Myzelium bekam mit abnormal verdickten
Sporangienträgern, das aber am Schluss der Vegetation wieder
einige echte lange Nitens-Träger erzeugte, eine Erscheinung welche
von BURGEFF auch mit Recht Heterocaryose zugeschrieben wird.

Es ist jetzt zwei Jahr her, dass ich in meiner Zwergrasse
zum ersten Mal einige normale Sporangien konstatierte ;
seitdem hat sich die Erscheinung sporadisch wiederholt, aber
ohne das die normalen Sporangien verhältnissmässig zahlreicher
wurden ; mehrmals hatte ich Kulturen, worin ich sie gar nicht
fand. Es scheint somit der Teil des Myzeliums mit den Nana-
sterilis-Kernen leicht die Ueberhand zu behalten.

^) H. Burgeff: Ueber Sexualität, Variabilität und Vererbung bei Phycomyces
nitens. Vorläufige Mitteilung. Ber. der deutschen bot. Ges. 191 2 Bd. 30, p. 679.

FIGUREN-ERKLÄRUNG.

Fig.

1-14

Fig.

1—5-

Fig.

Fig- 3

Fig. 4

Fig. 5

Fig- 6

Fig. 7.

Fig. 8.
Fig. 9—12.

Fig. 9-

Fig. 10.

Fig. II.

Fig. 12.

Fig. 13.

Dematium pullulans.

Normale Form von Dem. pull. Kultur auf Glucose-
Pepton.Agar.

4 Tage alt.

Mikr. Bild aus Fig. i. 500 fach. Weisse Hyphen und
Konidien.

II Tage alt.

Mikr. Bild aus Fig. 3. 500 fach. Weisse und braune
Zellen und Zellenketten.

13 Wochen alt.

Keimung von weissen Konidien. In i und 2 ist eine
einfache, in 3 und 4 eine doppelte Riesenzelle geformt,
In 5 hat die Konidie erst einen Myzelschlauch getrieben.
500 fach.

Isolierte braune Zellen, von denen No. i, 3, 5 und 8
ein Konidien-abschnürendes Myzelium, No. 2, 4, und 7
ein sprossloses Myzelium lieferten.

Skizze dieser beiden Keimungsarten.

Sprosslose Form von Dem. pull. Kultur auf Glucose-

Pepton-Agar.

6 Tage alt.

II Tage alt.

13 Wochen alt.

Mikr. Bild aus Fig. 11. 500 fach. Braune und weisse
Hyphen von grilliger Form. Keine Konidien.

Isolierte braune Zellen, von denen No. i — 3 ein Konidien-
abschnürendes Myzelium, No. 4 — 6 ein sprossloses
Myzelium lieferten. 500 fach.

TAFEL VIII.

Folia Microbiologica III

(Schouten).

TAFEI, IX.

Folia Microbiologica III
(Schouïen).

^^^^tF^ni^

,-1» .^.l.a \J d.i'j

TAFEL X.

Folia Microbiologica III
(Schouten).

10.

12.

13.

TAFEL XI.

11.

Folia Microbiologica III

(Schoutkn).

Î4

àÂ

^>> I".

15.

16.

TAFEL XII.

17. N°. 1.

Folia Microbiologica III

(Schouten).

17. N«. 2.

125

Fig, 14. Myzelium das erst spät Konidien abschnürt. Schwache

Vergr.

Fig. 15 — 17. Phycomyces nitens.

Fig. 15. Sporen von Phyc. nitens. 500 fach. No. i normal,

No. 2 — 4 abnormal.

Fig. 16. Teil eines unter dem Deckglas zerquetschten Sporan-

giums von Phyc. nana sterilis. 500 fach.

a. Sporangiumträger. bb. Wand des Sporangiums, geöff-
net, c. Inhalt, aus fetthaltendem Protoplasma bestehend.

Fig. 17. No. I. Phyc. nitens normal auf Brot. 37 cM. hoch.

No. 2. Phyc. nitens var. nana sterilis auf Brot. 15 cM. hoch.

[From the Municipal Hospital, Bergweg,
Rotterdam].

A NEW METHOD OF SEROLOGICAL RESEARCH,

FOR THE FIRST TIME APPLIED

TO SUFFERERS FROM TUBERCULOSIS

BY
Dr. J. HERMAN,

First medical attendant at the above mentioned hospital.

Introduction.

For some time I have been engaged upon the analysis of
the effect of tuberculine. In an earlier publication concerning
this subject i) I already illustrated, that tuberculine, though as
good as nonpoisonous to non-tuberculous individuals, may be
made poisonous to them too by allowing the serum of a sufferer
from tuberculosis to act upon tuberculine for a short time.
I illustrated this in the following manner.

Allow such a bloodserum to act upon a solution of old-
tuberculine for about lo minutes in a living-room-temperature
(the tuberculine-solution should be so strong, that, after the
dilution with serum it is from 4 to 5 %) ; bring a few drops
of this mixture into the connective tissue of the eye of a
healthy, non-tuberculous cobaya.

Very soon afterwards such an irritation of the connective
tissue arises, that a thin secretion, sometimes even, a thick
secretion containing much mucus, appears.

The instillation of the serum alone, or of the 5 o/q tuberculine-
solution alone can not cause such a reaction.

^) Dr. Herman. Bijdrage tot de Analyse der Tuberkuline-werking. Nederl.
Tijdschr. v. Geneesk. 191 3 H, No 24..

127

If blood serum obtained from a non-tuberculous individual is
used for the action upon tuberculine, this reaction does not arise.

So it already appeared from these experiments that in the
bloodserum of sufferers from tuberculosis a substance occurs,
which can transform tuberculine in such a way, that from non-
poisonous it may be made poisonous also to non-tuberculous
individuals.

I further proved this by injecting a mixture of such blood-
serum and tuberculine into the abdomen, into the veins and
beneath the skin of healthy cobayas.

In this way I could poison the experimental animals to a
high degree. After injections into the veins of rabbits I could
even cause important rises of temperature, which did not appear
when I injected either only bloodserum or only tuberculine-
solution. Neither did I see this, when I took bloodserum of
healthy persons. It seems to me, that by means of these series
of experiments I have supplied further proofs for the correctness
of the theory, composed by WOLFF-ElSNER i) in order to
explain the peculiarity of the tuberculine-action. A theory, also
treated of in detail and defended by Sahli 2) in his well known
booklet.

After the finishing above mentioned experiments, I began to
analyze the peculiar reaction of tuberculous tissues following an
injection of tuberculine, administered to a tuberculous individual.
Such a strong reaction of the tuberculous tissue has often been
known to take place, that necrosis and decline may often be the
result. I have made an endeavour to imitate these phenomena
artificially. In the first place I asked myself, which factors
co-operate in this reaction. It is probable that chiefly the tuber-
culous tissue, white corpuscles, blood or tissue-fluid and the
injected tuberculine must bring about the reaction together.
"How" I now tried to unravel.

In a test-tube I brought together the following substances : a
tissue (for which I took fibrine obtained from horse-blood), white
corpuscles (also extracted from horse-blood), tuberculine (Alt-
Tuberkuline, KoCH, HÖCHST) and bloodserum, obtained from a

Ï) WoLFF-ElSNER. Früh-Diagnose u. Tuberk. Immunilät. Berlin 1909.
2) Sahli. Tuberkulin-Behandlung u. Tuberk. Immunität. 1913.

128

sufferer of tuberculosis. In the first experiments I coloured the
fibrine with methylic-blue and in the following with eosine.
The mixtures obtained in this way, were placed in an incubator,
for the time of 16 hours in a temperature of 37° C. If after
i6 hours the fibrine had been consumed, the liquid became blue
(resp. pink). If there was no consumption, the above-mentioned
liquid remained colourless.

As tissue I took fibrine, an indifferent substance, in order to
be able to trace the influence of the nature of the tissue on
the reaction. For, by replacing fibrine by tuberculous tissue I
could trace, what influence the nature of the tissue had on the
result of the reaction.

I had expected, that I should see the most intense consump-
tion of the fibrine, if I brought blood-serum, tuberculine and
white corpuscles together. According to my train of thought,
the leucocytes would be killed by the poisons, coming free by
the action of serum on tuberculine. Out of the killed leucocytes
would come free peptically working ferments and these would
again especially transform the fibrine. But the result of the
experiments was quite different. Comsumption of the fibrine
did always arise, when I added it to blood-serum ; but was always
less intense, when I moreover added either tuberculine, or white
corpuscles or both. This greatly astonished me. Therefore I
submitted the checking influence exercised by tuberculine and
leucocytes on the transformation of coloured fibrine by means
of human-serum, to a closer research. From this a new method
of serological research has proceeded. Before setting forth this
method I have first to treat of the preparatory researches first
to be held.

Preparatory researches.

So I found as the result of the above-mentioned experiments
that serum, obtained from tuberculous people can transform
coloured horse-fibrine to a rather high degree. Immediately the
two following questions present themselves :

1. Does the serum of every man possess the property of
being able to transform fibrine ; or does this property specially
belong to serum, obtained from tuberculous persons?

129

2. Can human serum also dissolve other albumina besides
fibrine?

ad. I. It is well-known, that in human serum different
ferments occur, which partially occur in the serum itself, partially-
come free with the falling asunder of the leucocytes. Besides
fibrine-ferment, peptic-, amylolytic-, and lipolytic- ferments are
known.

To my knowledge, in the clinic no use has as yet been
made, towards diagnostic purposes, of the fact that serum
possesses one of these ferments in a more or les high degree.

The anti-tryptic property of serum has indeed often been a
point of research. If we remember e, g. the many researches,
made after the method of JOCHMANN & MÜLLER, wich comes
to this, that the anti-tryptic action is traced by mixing the
serum on a smooth LÖFFLER-serumplate with tryptically acting
liquid.

The anti-tryptic property of serum especially seems to have
increased, when abnormally much human albumen is lost (cancer,
tuberculosi«;, pregnancy a. o.)

Of late many researches by ABDERHALDEN i) and his pupils
have appeared about the property of human serum being able
to destroy certain organs under certain circumstances.

In pregnancy specific ferments were said to occur in the
blood, which can destroy placenta.

With sufferers of cancer specific ferments were said to occur
which can corrode cancer-tissue.

Abderhalden used different methods. First he followed
the dialysing method. To i gram of organ (e. g. placenta)
in a dialyser, 1.5 cM^ serum is added. When this has been
left undisturbed for 16 hours in a temperature of 37 <* C. we
try to indicate the products formed from the placenta in the
dialysiswater (15 c.M^ distilled water) by means of the biuret
— (or better) the ninhydrin — reaction. This method is still
universal and more used than the so called optic method. For
this method we want a small and sensitive polarimeter; by
means of this instrument we determine the refractive index,
changed because of the formed transformation products. After-

^) Abderhalden. 4te Auflage der »Abwehrfermente« 1914.

130

wards the microkjeldahl method i) is used in order to be
able to determine the quantity of nitrogen in the dialysis-
liquid. Later still he makes use of an analogical method, the
same as I have followed 2) ; viz. tissue (placenta) is coloured
with carmine and from the colour coming free, the intensity
of the consuming-process is judged.

It would ask too much space, if I here entered in detail
upon the researches made after these different methods. Let
the short information suffice, that the results are very different.
While Abderhalden and his school maintain that the ferments
occurring e. g. in pregnancy in the serum of women, are
specific and consequently can alone destroy placenta-tissue,
there are on the other hand a great many other investigators,
who cannot agree to this. According to the last, the serum of
pregnant women destroys placenta offener and in a larger
quantity than serum of not-pregnant women, but certainly it
occurs not seldom that the serum of not-pregnant women can
destroy placenta. Even the serum of men is said to be able to
do this ! At all rates the Abderhalden-reaction has as yet not
conquered a place of its own as a diagnostic expedient. Elabo-
rate researches and a list of literature are to be found in the
dissertations of GOUDSMIT 3) and BiJLEVELD 4).

In searching the different tables given in the researches meant
here, I have made it my particular study to find an indication
of the solution of the problem on which we are now engaged,
whether the serum of tuberculous individuals possessed a stronger
peptic property than the serum of non-tuberculous persons. I
consequently investigated, if perhaps the serum of the former,
bjit not pregnant, destroyed placenta oftener than that of others,
non-tuberculous and also not pregnant. For other states, of
disease (cancer, lunacy etc.) I searched this in an analogical way.

From the published tables I could not at all conclude that
the bloodserum of tuberculous individuals regularly differred
from the serum of non tuberculous persons. My own researches

') Munch, Mediz-Woche7ischrift, 7 April 19 14, No. 14.
2) Munch, Mediz- Wochenschrift, 21 April 1914, No. 16.

^) M. E. GoUDSMiT. De biologische Zwangerschapsreactie volgens Abderhalden.
Diss. Amsterdam 1913.

*) J.W. BiJLEVELD. De zwangerschapsreactie van Abderhalden. Diss. Leiden 1913.

also taught me, that there zvas a great individual dißerence,
while I did not find that, in general, blood serum of tuberculous
persons possessed a stronger peptic power than that of non-
tuberculous persons. As albumen, in regard to which I deter-
mined the peptic power, I chose (as mentioned) horse-fibrine.
This was coloured at first with methylic blue, afterwards with
eosine. The fibrine freed from blood and blood-colour by means
of washing, was put in a watery solution of methylic-blue or
eosine for 24 hours. The fibrine absorbed much colour. The
superfluous colour was removed by boiling the fibrine with
constantly renewed water, until the water remained quite colour-
less. This is indeed a work taking up much time, but in this
way we can prepare coloured fibrine, which, when brought into
the controlling-tube, filled with water or Na.-Cl. solution, does
no longer let loose any colour. Afterwards I coloured the
fibrine with eosine instead of methylic blue, because I found that
the digestibility of this albumen suffered more by the colouring-
process when I used methylic-blue than when I used eosine. It
is desirable always to take fresh fibrine, for this digestibility
of the fibrine also decreased during the time it was kept.

The mixtures of serum and fibrine were always put in test-
tubes of the same width and thickness, which were closed with
a cork. The solutions were placed in an incubator for about
16 hours in a temperature of sy'^C. Great care was also taken
to add equal pieces of fibrine to the different mixtures. This
was necessary from the point of view of comparison, as the
experiments taught that the intensity of the consuming process
was greater when the surface of the albumen increased.

The peptic property of human serum in regard to coloured
horse-fibrine 1 determined in 2 ways :

a. To equal quantities of undiluted or very little diluted
serum I added equally big, equally fresh and equally coloured
pieces of fibrine. From the stronger or weaker colour of the
liquid the intensity of the consuming-process was judged.

b. Each serum was so far diluted with 0.9 % Na. CI. solution,
till consuming of fibrine no longer took place. The stronger the
fibrolytic power of a serum, the more it had to be diluted in
order to find this decisive point. Here is an example of an
experiment.

T32

Of 6 persons, respectively suffering from tabes dorsalis,
chlorosis, tubercul. pulm. II, tubercul. pulm. I, lues and liver-
cancer the sera are investigated in regard to their fibrolytic
power. If each serum was diluted 5 times, the dilutions, made
from the sera, obtained from persons suffering from tabes dorsalis
and chlorosis both proved to be coloured equally strong and
strongest of all. Then followed: tubercul. pulm. II, tubercul,
pulm. I, lues and liver-cancer.

The final dilution of each serum, by which fibrine was no
longer transformed, was of tabes i : goo ; chlorosis i : 800 ;
tubercul. pulm. II i : 600; tuberc. pulm I i : 500; lues
I : 450 ; cancer i : 350. Consequently there was a rather satis-
fying harmony in the results obtained in both ways. From
this series of experiments also appeared already the great indi-
vidual variety of the fibrolytic power of the investigated sera.
I found this confirmed in all my experiments.

From these experiments I consequently obtained the following
result: The fibrolytic power of human serum is not constant,
hut individually shows great variety. I did not succeed at all
in finding any fixed rules ; in no state of disease did I find the
fibrolytic power constantly increased or decreased. With older
people this power mostly seems to be stronger than with youn-
ger people.

ad. 2. In order to be able to answer the question, whether
human serum can also transform other albumina instead of
fibrine, I used for further consuniing experiments, hen's albumen,
lung- and kidney-tissue ; these two last substances, obtained
both from a man and a rabbit. (Healthy lungs and kidneys
were used). These tissues I again coloured with eosine. Lung-
and kidney-tissue, cut into small slices and then put in the
colour, absorb much colour, but also lose a great deal of it
again through the boiling. Moreover I found that even though
the water was quite colourless, the coloured pieces of lung and
kidney repeatedly let loose colour when in the controlling-tubes,
if they remained in the incubator for i6 hours in a temperature
of 37» C.

The result of the consuming-experiments was, that every
human serum that I have searched, corrodes hen^s albumen as
well as kidney-tissue.

Ï33

Whether these substances can be transformed to as high a
degree as fibrine I cannot state with absolute certainty, as I
was not quite sure that the quantity of colour occurring in all
3 substances was the same per unit of surface and capacity.
Probably this was not the case, as hen's albumen was weaker
coloured than fibrine. Also I again found (the same as I found
for fibrine) that the consuming poiver of the ser inn with regard
to hen's albunieti, lung and kidneytissue again individually
shozved great variety. Mostly hen's albumen was still consumed
in loo times diluted serum. Lung- and kidney-tissue in still
stronger diluted serum. Serum, obtained from a sufferer
from chronic disease of the kidneys-however, corroded kidney-
tissîte to a niucJi higher degree than that of non-sufferers.
And it makes little or no difference whether lung- and
kidneytissue of a man or of a rabbit is taken for this
purpose.

In general however human serum could be further diluted
still to be able to obtain transformation of fibrine, than to
reach the same purpose for the other mentioned albumina.
Therefore I think it probable that, with a reservation as to the
just made restriction, human serum, speaking in general, can
transform fibrine more strongly than hen's albumen, lung- or
kidney-tissue. If, however, I investigated the consuming power of
serum, obtained from a sufferer from chronic disease of the
kidneys, both in respect to horse-fibrine and coloured kidney-
tissue, the kidney-tissue was also repeatedly corroded in a still
stronger dilution of the serum.

This result, viz. that each serum can corrode organic albumen
contradicts, what has been pretended bij ABDERHALDEN and
his school (page 4 ). If A. however coloured the placenta with
carmine, he also found that nearly every serum transformed
placenta-tissue (sec note 4, page 5). Moreover BiJLEVELD (5)
found that in dialysis continued for more than 16 hours every
human serum corroded placenta-tissue in such a way, that
this could be indicated by the ninhydrin-reaction. Apparently
there is a harmony between these results and mine. The indica-
tion of consumption of the organic tissue by means of colour,
is, however, a much more sensitive method than the dialysis-
method. Hence that every human serum can corrode organic

134

albumen while in using the dialysis method this cannot be
proved in all cases.

What kind of ferment may this be, which exercises such a
consuming power in the serum ? If the serum is heated for half
an hour to 56° C, the fibrolytic power has been weakened but
not destroyed. Consequently it is not the complement. Nor
does it only proceed from leucocytes, which have fallen asunder,
for the activity of the serum is almost the same, when imme-
diately after the coagulation the serum is centrifugated from
the blood, as when this is not done till after some hours.
Most probably in the last serum a rather greater number of
leucocytes have fallen asunder than in the first; still the fibro-
lytic power is almost the same.

How is it to be explained that tuberculine checks the trans-
formation of coloured fibrine by serum ? The solution of this
problem is not so difficult, for from further experiment it soon
appeared that this checking power belongs not only to tuber-
culine, but to many other uncoloured albumina. If for instance,
besides coloured fibrine, hen's albumen is added, the transfor-
mation of fibrine is also impeded. The fibrine-transformation
may even be absolutely checked, when the serum is sufficiently
diluted (100 times or still further). The same thing takes place
when, instead of hen's albumen, uncoloured kidney-tissue is
taken. And when besides fibrine, coloured by eosine, fibrine
coloured by methylic blue is added to serum, the transformation
of the eosine-fibrine predominates.

All the mentioned albumina check the fibrine transformation,
because the digestibility of the fibrine has decreased because
of the colouring ; the other albumina are now easier transformed
and are now more corroded than fibrine. And, as methylic-blue
fibrine is again less easy to digest than eosine-fibrine (pag. 6)
in a mixture of both fibrine-kinds and serum, eosine-fibrine is
most corroded.

In order to explain this checking, we should also remember
that in the serum now occur two instead of one albumen ; and
that consequently the ferment now corrodes two substances
instead of one, but by this the absolute checking cannot be
explained. For by all the mentioned albumina the fibrine-trans-

135

formation can be absolutely checked and that in a much weaker
solution of the serum than that in which (without addition of
one of the mentioned albumina) fibrine alone is no longer
transformed.

Moreover I took care in my experiments that the surface of
the uncoloured albumen was no larger than that of the fibrine.
With an increasing digestion-surface the intensity of the diges-
tion-process also increases. With this factor we must however
reckon in order to explain the checking action of fibrine. For
tuberculine contains a dissoluted albumen, viz. of the character
of an albuminoid.

As albuminoid is again easier to digest than ordinary albumen
(e.g. hen's albumen) and the surface of tuberculine is so large
because of its dissoluted state, the checking influence of this
substance upon the transformation of coloured fibrine is therefore
so great. And especially greater than that of hen's albumen.

By a simple experiment may be indicated that each serum
easily transforms tuberculine. For if we allow any serum to
act upon tuberculine for 3 hours in a temperature of 37° C,
and if we only then add the fibrine, no or nearly no fibrine,
is transformed. If we place serum in the incubator for 3 hours
in a temperature of 37*^ C, this has nearly no influence on
the transformation of fibrine, then added. Probably this simple
experiment also sufficiently explains why every man finally
reacts upon an injection of a very large dose of tuberculine
(more than 10 mG.) The quantity of tuberculine is so great
that only by the action of the peptic ferment occurring in every
human serum enough transformation-products can be formed
to cause temperature rises, etc.

A new method of serological research.

All these preparatory researches were necessary clearly to
understand the now to be treated new serological method.

For soon it appeared to me that tuberculine, added to the
blood-serum obtained from a sufferer from tuberculosis less
checked the fibrine-transformation than when added to non-
tuberculous serum. This I found repeatedly confirmed. Conse-
quently : If the fihrolytic power of 2 sera, the one obtained

1^6

from a süßerer from tuberculosis, the other from a non-
sufferer, is equal, absolute checking of fibrine-transformation
by tuberculine appears with the first serum in a weaker
dilution than with the second. If the fibrolytic power of the
2 sera is not equal, but e.g. that of the second much stronger
than that of the first, the dilution for the absolute checking of
the fibrine transformation need not be weaker for the first
serum than for the second.

I will illustrate this by some experiments.

Serum A is obtained from a female sufferer from phthisis in
the first stage with a temperature up to 38° C. Serum B
originates from a female sufferer from ulcus ventriculi. Both
sera are respecteivly diluted 50, 100, 200 and 400 times with
Na. CI. solution. To all dilutions of both sera pieces of fibrine
of the same size, the same date and the same colour-strength
are added. The fibrine is fresh, 2 days old.

The following mixtures are prepared :

1. 2 cM^. NaCl. + 0,5 M^. Serum A (10 X diluted) + fibrine.

2. 2 » » » + 0,5 » » » (20 X * ) + »

3. 2 » » » 4- 0,5 » » » (40 X » ) + »

4. 2 » » » + 0,5 » » » (80 X >> ) + »

5. 2 » » » + 0,5 » Na CI. -|- fibrine (to be contrôle!)
6, 7, 8, 9 and 10 are to be prepared in the same way from serum B.

II. 1,5 cM». NaCl. + 0,5 cM'. Serum A (10 X diluted) + 0,5 cM^. 10O/0T+ fibrine.

1,5 » » » +0,5 » » » (20 X » ) + 0,5 » » + »

1,5 » » » + 0,5 » » » (40 X » ) + Oi5 » » + »

1,5 » » » + 0,5 » » » (80 X » ) + o,S » » + »

1,5 » » » +0,5 » NaCl. + 0,5 cM3. io°/o T + fibrine (contrôle!)

12
13

'4
15
16, 17, 18, 19 and 20 are to be prepared in the same way from serum B.

For the preparation of the different mixtures, the dilutions
are first prepared, then the tuberculine-solution is added. Then
the mixtures serum-tuberculine are placed in the incubator for
15 minutes in a temperature of ßj^'C. Finally the pieces of
fibrine are added. For experience teaches that when serum is
first allowed to act upon tuberculine, the tuberculosis-serum is
still less checked in its fibrolytic power by tuberculine than
non-tuberculous serum.,

As we see, all sera are diluted 50, 100, 200 and 400 times.
To the second series a 10 °/o tuberculine solution is added,
but, as this is 5 times diluted, the T solution is 2 0/0. From

137

a practical point of view this has experimentally proved the
most suitable solution, as a stronger T solution is too deeply
brown-coloured and a weaker one checks too little.

The controlling tubes 15 and 20 too, were prepared in order
to be able to determine more easily, in comparison with a
tuberculine-solution, in which dilution of the serum the fibrine
was absolutely no longer corroded ; so where the absolute
checking of the fibrine-transformation by tuberculine commenced.
These mixtures were placed in the incubator for 16 hours in
a temperature of 37 0 C. and then the result was examined.
In comparing the tubes of the first series it appeared that the
fibrine-transformation in serum B., obtained from a non tuber-
culosis, is somewhat stronger than in serum A. In the 400
times diluted solution of both sera fibrine had still been
transformed ; in serum B. however not much less than in serum
A. Still almost absolute checking of the fibrine transformation
of the 2 7o tuberculine-solution had already begun in the 100
times diluted solution of serum B. ; in the 200 times diluted
solution no more eosine had been let loose at all. In the
dilution of serum A it was quite different, however. In the 300
times diluted solution of this serum no absolute checking by the
T solution had even as yet arisen. So quite a difference!

This experiment beautifully illustrates the first part of the
above-mentioned rule. If on the contrary, the fibrolytic power
of the sera to be compared mutually, is not the same, but if
that of non-tuberculous sera is much stronger than that of
tuberculous sera, quite another result will be seen. For instance:
From 2 patients, one healthy, the other suffering from abdominal
tuberculosis the sera are examined. The decisive point of the
fibrine-transformation of serum A. is reached when the serum is
1200 times diluted. With Serum B. this decisive point is already
reached with the 400 th dilution. Absolute checking by a 2 0/0
tuberculinesolution in serum A. with a solution of i : 350 ; in
serum B. with a solution of i : 250. Serum obtained from
the non-tuberculous person must now be further diluted than
that of the tuberculous individual. If we consider the results
of our preparatory researches however, this is not difficult to
understand. The stronger the primary peptic power of the
serum is, the more tuberculine will have to be added, or the

138

further the serum will have to be diluted in order to obtain
absolute checking of the same.

Does the serum of every tuberculosis-sufferer possess this
property? I cannot answer to this with absolute certainty, as
we have only been able to indicate this peculiarity in the
tuberculosis-serum, by comparing sera obtained from tubercu-
lous and non-tuberculous individuals.

Still I already have at my disposal more than loo obser-
vations which all gave me a confirmation of this fact.

Also I have already found that the checking influence of
tuberculine is not the same in every tuberculosis-serum, even
if the fibrolytic power is the same. With acute, active tubercu-
losis the checking action of tuberculine is much weaker than
with tuberculosis on the way to recovery. Only a short time
ago I was able to indicate with miliair-tuberculosis how the
checking action of T in the serum decreased the longer the
illness lasted. And on the reverse we find that T in the
serum checks more than before, when the illness passes into
recovery, or is cured. In a period of 2 months we could often
already perceive obvious differences. An increase of the checking
action of tuberculine in tuberculosis serum I consider as a
prognostic favourable sympton, except however zvith cachectic
sufferers. There we often find very low numbers, and this
sympton does not hold good.

In order to increase the practical value of this reaction, I
am now engaged in determining the checking-index of each
serum. By this term I understand what follows: Determine the
decisive dilution of the serum, in which fibrine is no longer
transformed, exactly down to i : 50 * parts (consequently i : 700,
or 1 : 750 etc.). Also investigate with which dilution of the serum
a 2 0/(j tuberculine-solution absolutely checks the fibrine-trans-
formation also exactly down to i : 50. The quotient of the first
mimber, divided by the second, I propose to call checking-index.

We need not demonstrate that this index is smaller in
tuberculosis-serum than in other sera. Suppose e. g. that the
decisive point of the fibrine-transformation of 2 sera A. (tuberculous)
and B. (non-tuberculous) is for both in a dilution of i : 500. The
decisive point of the absolute checking by tuberculine is of A 1 :
300 ; of B. I : 100. Checking-index of A. %%% = if ; of B \%% = 5.

139

It is necessary to determine the normal index from a great
number of observations. I am engaged upon this and will
soon publish it.

How is it to be explained that tuberculine checks the ßbrine
transformation to a lower degree'^ The following explanation
seems to me the most reasonable. Before this (page 2) I could
indicate, that in such serum a substance occurs, which can
transform tuberculine in such a way as to make it poisonous
to every individual. If the action of the serum on tuberculine
lasts too long, the tuberculine is perfectly neutralised, so that
it is then even no longer poisonous to a tuberculous
individual. In the here-meant fibrolitic system-substance
(bacteriolysine ?) also destroys the tuberculine, if tuberculine-
serum is used. By this the checking influence of tuberculine
will decrease.

In normal serum that substance of the character of a
bacteriolysine does not occur. The peptic ferment will now
corrode both fibrine and tuberculine, while the tuberculine in
the tuberculosis-serum (besides by the pectic ferment) is also
destroyed by the specific ferment. Consequently the peptic
ferment will be less weakened in the last serum through the
co-existence of the specific ferment, and will be able to
transform to a higher degree.

If we heat tuberculosis-serum for half an hour to 56° C, the
fibrolytic power has decreased (see page 9), but then the
tuberculine proportionally more checks the fibrine-transformation
than before the heating. Probably the specific ferment is conse-
quently more weakened by the heating than the peptic ferment.

1 will also try to apply this principle of serological research
in another department. If it is true that with different states
of disease different defensive ferments circulate in the blood,
by bringing together coloured fibrine (which is corroded by
each serum), the albumen, in regard to which the specific
ferment occurs in the blood, and the specific serum, it must
be possible to indicate a smaller transformation of the fibrine,
than when serum is used in which the here-meant specific
ferment does not accur. It seems to me that especially in the
department of the serological cancer-diagnostic important results
may be obtained here.

t4o
Synopsis.

1. In the blood-serum of every man a substance occurs,
which can transform coloured horse-fibrine to a rather important
degree. Hen 's albumen, lung and kidney-tissue, coloured with
eosine, can also be transformed by human serum. With other
albumina no experiments have been made.

2. In general the peptic power of the serum individually shows
great variety ; fibrine is generally transformed to a higher degree
than hen 's albumen, lung- and kidney-tissue, except that the
serum of sufferers from a kidney-disease corrodes kidney-tissue
to a higher degree.

3. These outcomes, differing from the results of the well-
known researches of ABDERHALDEN and his school, may
probably be brought in concord with these through the fact,
that the method of research followed by me (colouring of
tissues) is much more sensitive than the methods used by
Abderhalden (dialysis, optic and other methods).

BiJLEVELD. (Dissertation Leiden 191 3) too found, that by an
action of serum on placenta continued for more than 16 hours
it may be proved by the dialysis-method, that every human
serum corrodes such a tissue. This result beautifully harmonizes
with my results.

4. The transformation of coloured horse-fibrine may be
absolutely checked by the addition of other uncoloured albumina :
tuberculine, hen 's albumen, kidney-tissue.

5. As tuberculine checks the transformation of fibrine in
tuberculosis serum to a lower degree than in non-tuberculous
serum, from this a new principle of serological research for
sufferers from tuberculosis has arisen.

6. The proposition is made to call the very last dilution of
serum, the first in which fibrine is no longer transformed,
divided by that dilution, in which a 2 0/0 tuberculine-solution
just succeeds in quite checking the fibrine-transformation, the
check ing-in dex .

7. This checking-index is smaller in tuberculous-serum than
in non-tuberculous serum. The normal number of this index
has still to be determined more exactly.

[Institut de Pathologie de l'Ecole Vété-
rinaire d'Utrecht].

TRANSMISSION DE LA TUBERCULOSE PORCINE
À L'HOMME; RÉINOCULATION AU VEAU.

PAR
le Dr. H. MARKUS, i)

Directeur de V Institut.

Au printemps de igo8 le vétérinaire X. 2)^ âgé de 24 ans,
était à plusieurs reprises incommodé par de petites gerçures
ou déchirures de la face interne du pouce de la main droite.
Ces gerçures se manifestaient dans une callosité de la peau à
cet endroit. Malgré le peu d'importance de ces petites plaies,
X. croit après coup que ce sont elles, qui ont dû constituer la
porte d'entrée du virus.

Cette supposition est d'autant plus fondée que X., en se
servant de ce pouce blessé, a examiné un grand nombre
de porcs tuberculeux. Il est vrai qu'il avait d'abord couvert
une déchirure d'un morceau de taffetas gommé, mais pendant
l'examen en question, ce morceau s'était facilement perdu.

Quelques jours après cet examen, X. avait traité manuellement
quelques vaches qui souffraient de la rétention des secondines.

Peu après X. commença à soufïrir de douleurs du thenar
du pouce droit. Les douleurs devinrent à la fin si violentes,
que X. invoqua l'aide d'un médecin. Ce dernier appliqua
d'abord pendant une journée un pansement-PRIESSNiTZ et
incisa ensuite la partie la plus élevée du thenar ; un peu de

^) Conférence, faite à Delft le i^r juillet 19 14, à l'Association Néerlandaise
de Microbiologie.

^) Mr. X. avait la bienveillance de me communiquer les détails suivants
concernant le cours de sa maladie.

142

pus se dégagea. La petite plaie guérissait vite et les douleurs
avaient disparu.

Peu à peu cependant se développait sur le dos du pouce un
bouton, entouré d'une zone hyperémique, qui s'étendait jus-
qu'à l'endroit du thenar où l'abcès s'était trouvé caché. Après
ces symptômes X. commençait à croire que son état était plus
ou moins grave. Et il ne le croyait pas à tort. La preuve en
est qu'au bout de quelques jours il pouvait constater des dou-
leurs dans l'aisselle droite et le gonflement du ganglion lym-
phatique axillaire, qui était devenu gros comme une bille.

X. alla chez un autre médecin et lui mit au courant de son
indisposition. Le thenar du pouce fut incisé une seconde fois
assez profondément et dans la peau du bouton on fit une grande
incision. Ensuite X. porta la main pendant plusieurs jours
dans un bandage de sublimé. Le ganglion axillaire gonflé
subissait d'abord un traitement d'onguent de mercure, puis un
traitement de solution de BüROW.

La plaie du thenar du pouce guérissait encore assez rapide-
ment, mais le bouton se changeait en un petit ulcère. Sur cet
ulcère se formait toujours une croûte, au dessous de laquelle
était sécrété un pus liquide et gris, qui la soulevait. La
tincture de iode, la pierre infernale ou l'onguent de zinc étaient
impuissants à amener la guérison.

Le gonflement du ganglion axillaire grossissait d'ailleurs
toujours, malgré le traitement mentionné, sans que cependant
les douleurs augmentent dans la même mesure.

Sur ces entrefaites, plusieurs mois s'étaient écoulés et X.
résolut d'aller consulter un spécialiste (chirurgien). On discutait
longuement la nature de l'infection; X. attachait le plus d'im-
portance à la possibilité d'une infection par les vaches souf-
frant de la rétention des secondines. 11 ne pensait pas alors
à l'examen des porcs tuberculeux.

Le chirurgien traitait X. à l'aide de bandages élastiques et
de ventouses, afin de causer de l'hyperémie veineuse. C'est
que les vaisseaux lymphatiques du bras droit s'étaient enflam-
més ; raccourcis qu'ils étaient par l'inflammation, on pouvait les
palper facilement à la tension du bras.

Pendant l'examen qui avait lieu régulièrement et pendant
lequel les autres ganglions lymphatiques étaient contrôlés tou-

143

jours, on découvrit quelques petits nodules le long d'un des
vaisseaux lymphatiques à la face interne du bras. C'est cette
découverte qui immédiatement faisait supposer qu'on avait
affaire à la tuberculose. Pour en être convaincu une partie
du vaisseau lymphatique avec des nodules fut extirpé et exa-
miné au microscope. Il parut alors que les petits nodules
étaient des tubercules typiques, dans lesquels se trouvaient une
très grande quantité de bacilles de KOCH.

On résolut d'extirper le ganglion lymphatique axillaire et
l'endroit ulcéré du pouce. On avait d'abord l'intention d'extir-
per également les vaisseaux lymphatiques enflammés, mais on
y renonça. Les plaies provenant de l'extirpation du ganglion
lymphatique et du morceau de la peau guérissaient rapidement.

Les vaisseaux lymphatiques atteints, dans lesquels on pouvait
d'abord palper facilement les tubercules, furent traités à l'hyper-
émie veineuse. A la suite de ce traitement le raccourcisse-
ment de ces vaisseaux et les tubercules disparaissaient peu à
peu. X. portait le bras en écharpe et le tenait en repos autant
que possible. Plusieurs mois s'écoulaient avant que la guérison
fût complète.

Durant la maladie, l'état de santé de X. était du reste assez
bon ; la température ne s'élevait pas sensiblement ; le malade
prenait une nourriture substantielle et vivait d'une façon très
hygiénique.

Par l'intermédiaire du malade, je recevais dans une petite
bouteille stérilisée une partie (à peu près la moitié) du gan-
glion axillaire tuméfié, pour en faire l'examen.

En coupant le ganglion on avait ouvert un foyer mou et
caséeux, ayant environ la grandeur d'une noisette. Ce foyer
était entouré d'une façon irrégulière par une zone de tissu
lymphatique gonflé et hyperémié, large environ de 5 m. m.,
évidemment tuberculeux déjà. Dans les préparations, faites de
la substance caséeuse, molle et jaune clair et colorées selon
la méthode de KoCH-EhrliCH et avec la liqueur de ZiEHL,
se trouvaient de rares bacilles, plus ou moins granuleux et
relativement fins.

L'examen histologique du tissu ganglionnaire faisait découvrir
une tuberculose diffuse de l'organe avec une multitude de
foyers caséeux. Le tissu tuberculeux abondait de cellules

épithéloides et de cellules géantes. Ces dernières étaient de
grandes dimensions et renfermaient le plus souvent un grand
nombre de noyaux, qui n'étaient pas toujours situés à la péri-
phérie comme dans les cellules du type Langhans. Dans
plusieurs cellules géantes ces noyaux étaient dispersés sans
ordre dans le cytoplasme et y formaient parfois de grands
amas. (PI. XIII).

Il se trouva que dans les coupes aussi le nombre de bacilles
était assez petit.

Le lendemain deux cobayes furent inoculés sous la peau de la
face interne de la cuisse gauche. L'injection se composait d'une
emulsion de la substance caséeuse du ganglion dans de l'eau
stérilisée. Cette emulsion avait été acquise en triturant la dite
substance dans un pilon en porcelaine, qui avait été stérilisé
par l'ébuUition pendant une demi-heure. La seringue-RECORD
aussi était stérilisée de la même manière avant et après l'usage,
La désinfection de la peau des animaux d'expérience avant
l'injection se fait de la manière suivante. Après avoir éloigné
les poils soit avec des ciseaux, soit (chez les grands animaux)
par de la poudre à raser, on lave bien la peau à l'alcool
savonneux, ensuite à l'alcool-jo o/o, puis au sublimé- i*>/„q.

Le premier des cobayes, inoculés le 8 juillet 1908, succomba
le 31 octobre de cette année, c'est à dire au bout de 114 jours;
tandis que le second fut tué le ler novembre 1908, c'est à dire
115 jours après l'injection. Le premier cobaye pesait le jour
de l'inoculation 427 grammes ; le poids montait malgré la tuber-
culose expérimentale à 525 grammes le 9 septembre, pour baisser
ensuite à 418 grammes le jour de la mort.

Le second cobaye qui le jour de l'inoculation pesait 382
grammes, atteignait son maximum de 480 grammes également
vers le 9 septembre et baissait ensuite jusqu' à 422 grammes
le jour de la mort.

A l'autopsie on trouvait chez les deux animaux de la tuber-
culose généralisée ; pour un cas de tuberculose humaine expéri-
mentale chez le cobaye, la maladie était très lente, ce qui
pourrait indiquer un bacille peu virulent ou une grande rési-
stance individuelle de ces cobayes.

Des pommes de terre glycérinées et du serum glycérine, ense-
mencés de pulpe de rate de ces deux cobayes, restaient stériles.

145

Le 2 novembre igo8 un autre cobaye fut inoculé de la
façon susmentionnée avec la pulpe de rate tuberculeuse du
cobaye, tué le i^i novembre; l'inoculation fut pratiquée en
même temps plus ou moins intra-musculaire.

Le poids de l'animal, qui au début de Texpérience était de
470 grammes, baissa rapidement; le 15 novembre l'animal
pesait 410 grammes. Le poids diminuait toujours, de sorte
que le 11 décembre il était de 370 grammes; le ganglion pré-
crural gauche était un peu tuméfié et les muscles au lieu
d'injection étaient fortement gonflés. C'est pourquoi je résolus
de tuer ce cobaye le lendemain, afin d'acquérir une matière
aussi pure que possible pour les expériences de culture.

Le 12 décembre 1908, donc 40 jours après l'infection, ce
cobaye fut tué par effusion sanguine et immédiatement après
l'autopsie fut pratiquée. La désinfection de la peau fut effec-
tuée de la façon susdite ; les pincettes, les scalpels, les ciseaux
avaient été stérilisés auparavant dans de l'alcool savonneux et
après avoir été lavés dans de ralcool-70 0/0, ils étaient déposés
dans une solution aqueuse stérilisée d'acide borique, où ils se
trouvaient prêts à l'usage.

Après l'ouverture de la cavité abdominale ce fut d'abord la
rate qu'on extirpa à l'aide d'instruments stérilisés et qu'on mit
dans une boîte de PÉTRI stérile. Dans la rate se trouvaient
un grand nombre de tubercules miliaires, souvent conflues et
caséeux. Dans les préparations (ZiEHL) il se trouva que ces
tubercules renfermaient beaucoup de bacilles de KOCH, ßns et
colorés d'une façon homogène. Dans les muscles au lieu d'ino-
culation se trouvait un abcès, ayant la grandeur environ d'une
bille et qui renfermait une substance caséeuse et molle. Les
préparations de cette substance montraient beaucoup de bacil-
les de KocH, fins pour la plupart et réunis en petits tas ; ces
bacilles étaient ou très granuleux ou colorés d'une façon
homogène.

Le ganglion précrural gauche n'était que médiocrement gon-
flé, mais déjà en partie caséeux ; il renfermait beaucoup de
bacilles de KoCH fins et souvent granuleux ou pâles.

Dans le foie et les poumons on trouvait un grand nombre
de tubercules miliaires, renfermant au centre souvent un petit
foyer caséeux; dans le foie les tubercules étaient fortement conflues.

146

Le ganglion précrural droit, le ganglion iliaque gauche, les
ganglions du foie et les ganglions cervicales et axillaires étaient
tous plus ou moins considérablement agrandis et déjà caséeux
en partie.

De la tuberculose généralisée s'était donc développée chez ce
cobaye en 40 jours.

J'essayais de cultiver le bacille de KOCH en question, provenant
de la rate tuberculeuse du cobaye, sur des milieux artificiels.
C'est pourquoi une partie de l'organe fut coupée dans des
morceaux aussi petits que possible dans une boîte de PÉTRI
stérile avec des ciseaux stériles. La pulpe ainsi acquise fut
ensemencée par un fil de platine en forme de spatule sur
plusieurs tubes de sérum glycérine et de pommes de terre
glycérinées, lesquels tubes furent placés à l'étuve à 38° C.

Pendant les premières semaines suivantes il n'y avait pas de
changement à remarquer. Peu à peu cependant de petits tas de
cultures grises se montraient, de sorte que le 8 mars 1909,
donc au bout de 85 jours, s'était déclarée sur le sérum une
culture peu abondante, sèche, jaunâtre, verruqueuse ; sur chacune
des pommes de terre s'étaient déclarées quelques protubérances
globuleuses, blanches ou grises.

A cette date les cultures sur sérum furent transplantées sur
le même milieu. Le développement était un peu plus abondant
maintenant, de façon que le ii juin 1909, donc 99 jours après,
on se trouvait en présence d'une culture bien développée ; elle
était moins sèche que la précédente, un peu graisseuse d'aspect
et d'une consistance assez solide. En en prenant un peu de
matière pour une préparation microscopique, la culture manifes-
tait une cohésion assez grande ; il était plus facile de la détacher
du fond, que d'en séparer une particule. Dans des prépara-
tions de ZiEHL des cultures sur sérum, je trouvais des bacilles
très longs, fins, colorés d'une façon homogène. Le 8 mars
1909, les cultures sur pommes de terre furent transplantées sur
le même milieu et sur du sérum glycérine.

Quant à ces dernières transplantations, il est à remarquer,
que lorsque le bacille de KoCH avait été cultivé d'abord sur
des pommes de terre, le développement sur du sérum glycérine
était bien moindre, que lorsqu'il avait été emprunté à une
culture sur sérum. Le sérum ensemencé de la pomme de terre

147

montrait ou uniquement un développement du bacille en forme
de voile à la surface du liquide qui baigne le fond du tube ou
en outre un développement peu abondant sur le milieu lui-même.

Parmi les cultures sur pommes de terre, c'est la culture
avec sa série, que j'indiquerai comme a, qui pour le moment
est surtout importante. Cette culture a ayant été ensemencée
comme culture primaire le 12 décembre igo8, montra le 8 mars
igog un développement sous la forme de quelques petites protu-
bérances blanches. A cette date elle fut transplantée sur des
pommes de terre et elle montra le 11 juin 1909, donc au
bout de 99 jours, une culture secondaire presque entièrement
analogue à la culture primaire. A cette date la culture secon-
daire fut transportée sur des pommes de terre et le 30 juillet
190g, donc en 49 jours, elle s'était bien développée sous la
forme d'une quantité de granules sèches et blanches qu'on
pouvait facilement détacher du milieu.

Dans des préparations de ZiEHL faites de cette culttire
tertiaire je trouvais des bacilles de KOCH ayant la forme de
baguettes courtes et lourdes, souvent piriformes, colorés d'une façon
homogène en rouge, ou étant plus clairs avec des endroits foncés.
Après que cette culture tertiaire était transplantée le ler et le
30 juillet sur des pommes de terre, je résolus de me servir
d'elle pour l'inoculation d'un veau, afin de découvrir quelle était
la virulence de ce bacille de KoCH pour l'organisme bovin.

Pour cette expérience nous avions à notre disposition une
génisse vigoureuse et saine, âgée de 16 semaines. Le 15 juillet
on l'avait tuberculinée avec un résultat négatif; (0,300 gramme
de tuberculine bovine, préparée à l'institut).

Le 30 juillet la culture tertiaire de la série a, suspendue
dans de l'eau stérile, fut inoculée à ce veau sous la peau de la
face droite du cou, dix centimètres environ avant l'articulation
scapulaire. Le poids de la quantité injectée de bacilles humides
(c. à. d. tels qu'ils sortaient de la pomme de terre) était de
0.061 gramme.

Le lendemain, le 31 juillet, je constatai au lieu d'inoculation
un gonflement ayant la grosseur d'un œuf de poule. Le 2
août ce gonflement était moindre, mais le ganglion lymphatique
préscapulaire était un peu agrandi. Le 4 août le gonflement

148

au lieu d'inoculation était réduit à un endroit dur, grossi et
douloureux dans la peau et au dessous ; le ganglion préscapu-
laire était encore tuméfié davantage. Le 6 août le lieu d'inocu-
lation était toujours douloureux ; l'enflure augmentait encore.

La température du veau, qui avant l'injection ne dépassait
pas les 39, 5*^ C. ne s'était pas élevée sensiblement jusqu'ici. La
température la plus élevée qui avait été notée était de 39,7" C, (la
température normale est selon Marek de 38,5 à 40 0 C).

Peu à peu cependant la température s'élevait ; le 1 1 août à
midi elle était de 40'' C, à 6 heures du soir de 40,3 " C, et
à partir de cette date les températures notées s'élevaient con-
tinuellement au dessus de 40", que ce fût à 8 heures du
matin, à midi ou à 6 heures du soir. La température la plus
élevée était de 40,70 C. le 14 août à 6 heures du soir.

Le 1 1 août je constatai au lieu d'inoculation une tuméfaction
ayant un diamètre de ='= 8 cm. et qui vers le bas se terminait
en pointe ; le ganglion lymphatique préscapulaire avait main-
tenant la grandeur d'un œuf de poule.

Le 16 août le foyer au lieu d'inoculation était considérablement
gonflé et se continuait vers le bas dans un ganglion lympha-
tique prépectoral, ayant la grandeur d'une pomme de terre.
Le ganglion préscapulaire était très grand et très douloureux.

Le 23 août l'épaississement disciforme au lieu d'inoculation
avait 13 cm. de long et 6 cm. de large; le ganglion pré-
scapulaire avait maintenant 11 cm. de long.

Le 7 septembre à 4 heures de l'après-midi la température
était de 39, 8** C, la fréquence de la respiration était de 60 et
celle du pouls très faible était de 82 par minute.

A partir du 12 septembre la température restait au dessous
de 400. Le 20 septembre la température la plus élevée était de
39, 40; la fréquence de la respiration était alors de 123 par minute.

Dans l'après-midi du 21 septembre, donc 5J jours après
V inoculation, le veau succombait.

L'autopsie fut pratiquée dans la soirée du même jour.

La peau au lieu d'inoculation était unie au foyer au des-
sous par un tissu très fibreux. Ce foyer était disciforme ; il avait
un diamètre de ± 10 cm. et + i cm. d'épaisseur. Il se
composait d'une substance caséeuse solide, se trouvant dans le
pcaucier cervical et au dessous.

149

Le ganglion lymphatique prêscapulaire droit était enveloppé
d'un tissu conjonctif œdémateux et il était très agrandi. Il
avait une longueur de lo^ cm. et une largeur de ^\ cm. A
l'examen interne il se trouva, qu'il était presque entièrement
caséeux d'une façon diffuse et avec de petites hémorragies.
(PI. XIV).

Les poumons étaient parsemés d'une façon diffuse et très
dense de foyers miliaires, souvent confluents. (PI. XV).

Les ganglions lymphatiques bronchiques et mêdiastinaux
postérieurs étaient très agrandis et entièrement caséeux.

Le foie montrait sous la capsule quelques tubercules miliaires ;
les ganglions lymphatiques du hile étaient devenus plus volu-
mineux et ils étaient caséeux, surtout à la périphérie.

Dans la rate se trouvaient des tubercules miliaires.

Dans le rein gauche se trouvait un seul foyer miliaire ;
dans les capsules surrénales se trouvaient quelques foyers
miliaires ; les ganglions lymphatiques rénales aussi étaient
tuberculeux.

La muqueuse de V intestin grêle était fortement hyperémiée
et portait plusieurs petits foyers tuberculeux et caséeux de la
grandeur environ d'un chènevis ; quelques-uns de ces foyers
allaient percer vers l'intérieur de l'intestin.

Les ganglions mésentériques étaient oedémateux, gonflés; de
petits foyers caséeux et de petites hémorragies se trouvaient à
la périphérie.

Dans les tonsilles se trouvaient de petits foyers tuberculeux
caséeux ; on en trouvait encore dans la partie postérieure de
la muqueuse du nez.

Les ganglions lymphatiques suivants étaient encore tuberculeux.

Les ganglions brachiaux ; le ganglion prêscapulaire gauche ;
les ganglions prêcruraux ; les ganglions supermami7iaires ] les
ganglions lombo-aortiques \ les ganglions ilio-pelviens ; les
ganglions poplitês, les ganglions maxillaires ; les ganglions
prêpectoraux.

Le feuillet viscéral du péricarde séreux était oedémateux
et portait sur le paroi du ventricule droit et sur la pointe du
cœur quelques petits foyers tuberculeux.

Sur les plèvres diaphragmât ique et costale tt sur le péricarde
je trouvais des flocons hémorragiques.

T50

Les autres organes étaient normaux.

Les préparations (ZiEHL) montraient ce qui suit :

Le foyer au lieu d'inoculation : de très rares bacilles fins,
très granuleux, de longueur moyenne.

Le ganglion préscapulaire droit : de très rares bacilles longs,
très granuleux.

Les poumons: Une assez grande quantité de bacilles fins,
point ou très peu granuleux ; ceux qui sont longs prédominent,
mais il y en a aussi de très courts!

Les ganglions bronchiques et mésentériques : peu de bacilles
granuleux de longueur moyenne.

Dans le mucus bronchial il ne se trouvait pas de bacilles.

A l'examen histologique des différents organes se montrait
l'image caractéristique du tissu tuberculeux.

Il s'est donc trouvé que le bacille de KOCH, cultivé à tra-
vers le cobaye, et provenant du ganglion lymphatique axillaire
du vétérinaire X., est pour le veau d'un degré de virulence,
qu'à l'ordinaire on trouve chez des bacilles d'origine bovine.

Le développement lent et peu abondant sur les milieux
artificiels indique également des qualités bovines.

Ce résultat, en rapport avec la clinique, donne la certitude
presque absolue, que X. a été infecté en examinant les porcs
tuberculeux.

La tuberculose des porcs est presque toujours de provenance
bovine ; aussi n'est il pas étonnant qu'à l'examen expérimental
du cas en question, le caractère bovine du bacille se manifestait
clairement.

Vétude de ce cas de tuberculose chez Vhomme a démontré
que le bacille de KoCH, provenant du porc tuberculeux^ peut
avoir également des qualités pathogènes pour V organisme humain.

Quant à l'état de X. après l'extirpation du ganglion axillaire
tuberculeux, il faut mentionner ce qui suit:

X. ne s'est plus ressenti des suites de l'infection. Les
cicatrices au pouce et dans l'aisselle ne montrent rien de
particulier et pour le reste le bras est normal aussi. A des
examens réitérés nul symptôme suspect n'a été trouvé.

Octobre 191 4.

PLANCHE XIII.

Folia Microbiologica IXT.

(Markus).

-,.'-^

-ti^

■yt^

Gançlion a.riUairc de f luvnmc.
Coupe, montrant des cellules géantes et épithéloides, un
centre caséeu\ et des lymphocythes (Jbj. A Ai. oc. 3 (Zeiss).

PLANCHE XIV.

Folia Microbiologica III.
(Markus).

Ganglion prcscapidaire droit du veau.
Totalement caséeux et avec de petites hémorragies. (^/^ grandeur naturelle).

PLANCHE XV.

Folia Microbiologica III.

(Markus).

roumoii gauche dit veau.
Parsemé de tubercules miliaires (//, grandeur naturelle).

[Aus dem Institut für Mikrobiologie der
Technischen Hochschule in Delft].

UEBER REDUZIERENDE EIGENSCHAFTEN DER
ESSIQBAKTERIEN i)

VON

N. L. SÖHNGEN.

Von den biochemischen Umwandlungen durch Essigbakterien
sind bis heute diejenige mehr speziell erläutert worden, welche
eine Folge der oxydierenden Eigenschaften dieser Mikroben
sind. Diese Tatsache darf wohl daran zugeschrieben werden,
dass diese Eigenschaften im allgemeinen und besonders das Ver-
mögen Alkohol zu Essigsäure oxydieren zu können, für diese
Bakteriengruppe von gröszter Bedeutung ist, während der tech-
nische Wert des letztgenannten Prozesses sofort die Interesse
für weitere Untersuchungen zufolge hatte.

Zugleicherzeit aber, dass in Essigbakterienkulturen organische
Substanzen oxydiert werden, entstehen reduzierte Verbindungen,
welche aus den ursprünglich in der Kulturflüssigkeit anwesenden
Substanzen wahrscheinlich durch hydrolytische Spaltung, Wasser-
stoffaddition und Sauerstoffentziehung entstehen. Die Reduktions-
erscheinungen mit anorganischen und einfachen organischen
Verbindungen weisen darauf hin. Merkwürdig ist es, dass auf
diesen Weg aus verschiedenen organischen Verbindungen wie
Zuckerarten, organischen Säuren und Salzen sogar aus Essigsäure
neben andern Produkten auch Alkohol gebildet wird.

Der für die Essigbakterien kennzeichnende Prozess der Alkohol-
oxydation zu Essigsäure kann also, sei es auch in geringem

^) Mitgeteilt in der Sitzung der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie
am I Juni 19 14 in Delft.

i52

Masse und unter Hinzufügung von Energie der Oxydations-
prozesse, in umgekehrtem Sinne stattfinden.

O2 + C2 H5 OH :^=:± CH3 COO H + H^O.

Die Wasserstoffadition und Sauerstoffentziehung an anorga-
schen Verbindungen läszt sich leicht mittels der BEljERINCKschen
Methoden 1) nachweisen. So werden Schwefel, Sulfite, Thio-
sulfate und Sulfate in Essigbakterienkulturen zu Schwefelwasser-
stoff reduziert. In Agar oder Gelatine-kulturen kann das Auf-
treten von Schwefelwasserstoff mittels darin verteilten Bleicar-
bonats sehr empfndlich angezeigt werden, indem Impfstriche
von Essigbakterien sich auf solchen Böden durch Bildung von
Bleisulfid schwarz färben.

In flüssigen Kulturen wird die Schwefelwasserstoffbildung
mittels darüber gehängtes Bleipapiers festgestellt. Auf dieselbe
Weise werden auch Selen- und Tellurverbindungen zum elemen-
taren Zustande und weiter zu den höchst übelriechenden Was-
serstoffverbindungen reduziert. Ebenso entsteht durch Schwefel-
wasserstoff aus Mangandioxyd Mangansulfid, dass an der Luft zu
Mangansulfat oxydiert wird; doch muss bei diesem Versuch
darauf geachtet werden, dass die Essigbakterien verschiedene
Zuckerarten zu Oxysäuren oxydieren, welche mit Mangansuper-
oxyd Manganosalze bilden. Ein Verschwinden des hinzugefügten
Mangansuperoxyds in solchen Kulturen deutet also nicht nur
auf Schwefelwasserstoffentwickling hin. Die folgenden Unter-
suchungen über die Reduktion organischer Verbindungen durch
Essigbakterien, wobei vornehmlich die Bildung von Alkohol und
Fehlingsche Lösung reduzierenden Körpern nachgegangen wurde,
geschahen in Erlenmeyerschen Kolben von 450 c. c. Inhalt, ver-
sehen mit einem etwa 2 c. m. dicken Kulturflüssigkeitsschicht,
während zwischen 28*' und 30° kultiviert wurde. Die Kultur
fand also unter aeroben Verhältnissen statt.

Als Kulturflüssigkeit diente meistens eine Lösung der orga-
nischen Verbindungen in Hefenextrakt, das zuvor durch aus-
kochen vom Alkohol volkommen befreit war. Es wurden aber
auch einige Versuche mit Würze und eiweissfreien Kulturflüssig-
keiten genommen. Wird an eine gut wachsende Essigbakterien-

^) Phénomènes de réduction produits par les microbes, Archives Néerlandaises
des Sciences Exactes ec Naturelles. Serie II, Tome IX p. 131.

153

kultur, z. B. eine Xylinum-oder Pasteurianum-kultur in Malzex-
trakt, Methylenblau hinzugefügt, so wird der Farbstoff bald in
die Leukoverbindung umgewandelt und entsteht daraus wieder
durch Schütteln der Kultur mit Luft. Unter der Oberfläche ist
ein anaerober Zustand vorhanden und nur die Oberfläche,
besonders an der Glaswand bleibt blaugefärbt. In diesem anae-
roben Teil der Kultur werden die folgenden Reduktionsprozesse
von organischen Verbindungen stattfinden. Glucose wird durch
Essigbakterien zu Gluconsäure oxydiert, aber zugleicherzeit
entsteht in den Kulturen Alkohol und Essigsäure. Sehr befrie-
digend ist die Alkoholbildung unter Xylinum-und Pasteurianum-
häuten, besonders wenn die Glucosekonzentration 20 0/0 bis
30 0/0 beträgt. Neben viel Gluconsäure enthält dann die Flüssig-
keit nach 14 Tage Kultur bis zu i 0/0 Alkohol. Die ebenfalls
gefundene Essigsäure kann durch Oxydation von Alkohol,
vielleicht auch durch intramolekulare Atmung entstanden sein
nach der Formel:

Ce H12O6 = 3 C2H4O2.

Aldehyde oder Ketone konnten in der Kulturflüssigkeit nicht
nachgewiesen werden.

Diese Prozesse finden also unter reichlichem Luftzutritt zur
Kultur statt. Während der kräftigen Oxydation in der Ober-
fläche enstehen die reduzierten Verbindungen, welche sich im
anaeroben Teil der Kultur unter der Oberfläche anhäufen
können.

Unter anaeroben Umständen wird Glucose aber auch, sei es
in sehr geringen Mengen, zu Kohlensäure und Alkohol zerlegt,
wie dies aus Versuchen mit Xylinum-häuten in einer 5 ^/o-igen
Glucoselösung in Leitungswasser in geschlossenen Stöpfel-
flaschen hervorging. Essigsäure war nun aber nicht in der
Lösung gebildet, sodass diese beim obengenannten Versuch sehr
wahrscheinlich durch Oxydation des Alkohols entstanden war.
Organische Säuren und Salze werden aber durch Acetobakter
xylinum, so weit ich nachgehen konnte, unter anaeroben
Umständen nicht zersetzt.

Wird nun weiter aus Glucose gebildete Gluconsäure oder
Calcium-gluconat in Hefenentrakt gelöst, den Essigbakterien
unter aeroben Bedingungen als Nahrung geboten, so bilden sie

154

auch hieraus neben Dioxyaceton, Kohlensäure und Wasser
wieder Alkohol, der nach 20 Tagen Kultur bei 28» C in einer
15 Vo'ig^'^ Calciumgluconatlösung in Hefenextrakt zu einem
Betrage von fast 0,4 0/^ vorhanden war. Als Impfmaterial
dienten bei diesen Versuchen Acetob. xylinum — Pasteurianum
oder — rancens. Kulturen mit Gluconsäure als Kohlenstoffquelle
enthielten nur Spuren Alkohol.

Ich möchte hier beiläufig mitteilen, dass die Bereitung von
Gluconsaurem Calcium aus Glucose zu einer Ausbeute von etwa
60 0/0 gelingt, wenn Hefenextrakt mit 50 o/q Glucose und
einem Ueberschusz von Kreide in Erlenmeyerschen Kolben in 2
bis 3 Zentimeter dicker Schicht mit Acetob. Pasteurianum oder
— rancens infiziert wird und die Kultur bei 280 bis 30" ge-
trieben wird. Auf diese Weise lässt sich das sehr teuere Salz,
und daraus Gluconsäure, billig herstellen.

In ganz ähnlicher Weise wie mit Calciumgluconat wurden
Versuche angestellt mit Milchsäure, Aepfelsäure, Brenztrauben-
säure, Essigsäure und deren Calciumsalze, welche zum Resultat
führten, dass auch aus diesen Verbindungen durch Essigbakterien
kleine Mengen Alkohol gebildet werden. Eine Pasteurianum-
kultur in Hefenextrakt mit 10 o/q Calciumlactat z. B. enthielt
nach 10 Tagen Kultur bei 280 C o, 3% Alkohol. Die Essig-
bakterien sind also imstande aus Milchsäure Alkohol und wie
OSTERWALDER 1) beschrieb ebenfalss aus Alkohol Milchsäure
zu bilden. OSTERWALDER kultivierte aber in Flaschen in hoher
Flüssigkeitsschicht, während bei meinen Versuchen in Erlen-
meyerschen Kolben bei gutem Luftzutritte kultiviert wurde. Die
Versuche mit Essigsäure und Calciumacetat als Kohlenstoffnahrung,
woraus die Essigbakterien auch Alkohol bilden, stellten die schon
im Anfang dieser Mitteilung genannten Umkehrbarkeit des
Prozesses der Alkoholoxydation zu Essigsäure fest.

1) Milchsäurebildung durch Essigbakterien, Centralbl. f. Bakt. Abt. 2. Bd. 37,
1913- S. 3";3.

[Aus dem Institut für Mikrobiologie der
Technischen Hochschule in Delft].

DIE OXYDATION VON SCHWEFELWASSERSTOFF
DURCH BAKTERIEN i)

VON

H. C. JACOBSEN.

Bekanntlich liefert die Natur fortwährend verhältnismässig
grosse Quantitäten Schwefelwasserstoff. Nicht nur in den natür-
lichen Schwefelwasserstoff-haltigen Quellen, welche die Fundorte
der Schwefelbakterien WinogradSKY's 2) waren, sondern auch
überall in den Kanälen und Gräben, also den Schmutzwässern,
findet sich dieses Gas. Besonders der schwarze Meeresschlamm
der Küsten ist an Schwefelwasserstoff sehr reich.

Die Ursache für die Anwesenheit dieser Schwefelverbindung
findet sich hauptsächlich in dem bekannten Prozess der Sul-
fatreduktion durch Bakterien, welcher überall wo der atmos-
phärische Sauerstoff schwer durchdringen kann und sonstige
Bedingungen vorhanden sind, intensiv stattfindet.

Dennoch ist das Ungemach, welches durch das fortwährende
Entstehen eines so übelriechenden Gases verursacht wird, nicht
im Verhältnis mit der gebildeten Quantität. Zufolge der Unbe-
ständigkeit des Schwefelwasserstoffs, der in wässeriger Lösung
leicht zu H2O und S oxydiert werden kann, gelangt meistens
nicht eine Spur in die Atmosphäre.

Nicht nur auf rein chemischen Weg verschwindet der Schwefel-
wasserstoff, sondern auch und vermutlich wohl in erster Linie
durch die Tätigkeit von Mikroorganismen.

WiNOGRADSKY hat dies für eine bestimmte Gruppe von

1) Mitgeteilt in der Sitzung der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie
am I Juli 1914 in Delft.

2) WINOGRADSKY, S. Bot. Ztg. 1887. Bd 45 S. 489-

156

Bakterien festgestellt. Innerhalb der Körper der von ihm
»Schwefelbakterien« genannten Organismen scheidet der durch
Oxydation entstandene Schwefel in feinsten Tröpfchen sich ab.
Diese Schwefeltröpfchen werden, wie WiNOGRADSKY nach-
wies, weiter oxydiert sodass, wenn Schwefelwasserstoffmangel
eintritt, die anfangs mit Schwefel überfüllten Zellen schliess-
lich ganz leer erscheinen. Der Schwefel wird zu Schwefel-
säure oxydiert.

Schon WiNOGRADSKY erkannte diesen Vorgang als ein an die
Stelle der bei den meisten andern Organismen vorkommenden
Atmung tredender Prozess, mit dem Unterschied, dass hier statt der
Kohlenstoffverbindung der Schwefel als Energiequelle fungiert.
Er studierte hauptsächlich ein Paar Vertreter der Gattung
Beggiatoa, welche ihm als ein fast reines Material in einem
an organischen Substanzen und Bakterien sehr armen Brunnen-
wasser zur Verfügung stand. Die Frage nach dem Ursprung des
Kohlenstoffs, welchen seine Beggiatoafäden zum Aufbau ihrer
Zellsubstanz notwendig bedürften, meinte er auf die Anwesen-
heit geringer Spuren humusartiger Verbindungen zurückführen
zu müssen. Einen Beweis dafür hat er aber nicht erbracht.

Später hat Keil i) für Beggiatoa und Thiothrix, die er
in Reinkultur gezüchtet hatte, festgestellt, dass diese Bakterien
die Kohlensäure zu reduzieren imstande sind und also zu den
autotrophen Organismen zu rechnen sind.

Mögen vielleicht andere Vertreter dieser Gruppe, ähnlich wie
die von MOLISCH 2) beschriebenen nahe verwandten „Purpur-
bakterien", ihren Kohlenstoff organischen Verbindungen ent-
nehmen können (worüber bisjetzt noch nichts Sicheres bekannt
ist) so kann man für Beggiatoa und Thiothrix wohl anneh-
men, dass sie durch Chemosynthese sich ernähren.

Nicht weniger belangreich als die Schwefelbakterien für das
Verschwinden des Schwefelwasserstoffs sind die kleinen stäbchen-
förmigen y> Thiobakterien" . Diese von Nathansohn 3) im Meer-
wasser, später von Beijerinck 1) im Süsswasser als die Erreger

^) Keil, F. Beiträge zur Physiologie der farblosen Schwefelbakterien. Beitr.
z. Biol. d. Pflanzen 1912. Bd. 11 S. 335 — 372.

2) Molisch, H. Die Purpurbakterien nach neuen Untersuchungen. Jena, 1907.

^) Nathansohn, A. Ueber eine neue Gruppe von Schwefelbakterien und ihren
Stoffwechsel. Mitth. aus der Zoolog. Station zu Neapel. 1902, Bd. 15, Heft 4, S.655.

T57

der Thiosulfatoxydation entdeckten und neuerdings von mir 2) als
schwefeloxydierende Organismen beschriebenen Bakterien, oxy-
diren den Schwefelwasserstoff in einer mit den »Schwefel-
bakterien" analogen Weise.

Auch bei der Schwefelwasserstoffoxydation durch die Thio-
bakterien kann man zwei Phasen deutlich unterscheiden ; erstens
diejenige, worin der H2S zu S und HgO, und eine zweite,
worin der abgeschiedene Schwefel zu H2SO4 oxydiert wird.

Durch nachstehende Versuchsanordnung lässt sich die H2S-
Oxydation durch Bakterien leicht demonstrieren. Den Gebrauch
der hierneben abgebildeten Glasapparate kann ich hierbei emp-
fehlen. Sie ermöglichen den ganzen Vorgang, sowohl mikros-
kopisch als auch quantativ zu verfolgen, ohne dass dabei der
Geruch des Schwefelwasserstoffs hinderlich zu sein braucht.

App. I. App. 2.

Der Apparat i eignet sich mehr für die Rohkulturen. Er
besteht aus einem Erlenmeyerkolben von etwa 300 — 400 cc.
Inhalt, welcher mittels eines mit Trichter und gebogene Glas-
röhre versehenen Gummistöpsels, verschlossen ist.

^) Beijerinck, M. W. Ueber die Bakterien, welche sich im Dunkeln mit
Kohlensäure als Kohlenstoffquelle ernähren können.

Centralbl. f. Bakt. 2. Abt. 1904, Bd. 11.

^) Jacobsen, H. C. Die Oxydation von elementarem Schwefel durch Bakterien.
Folia Mikrobiologica 1912, Bd. i, Heft 4, S. 485.

158

Man bringt loo ce. einer mit Graben schlämm, Gartenerde
oder Meeresschlamm beimpften Kulturlösung :

HoO — loo gramm

K2HPO4 — 0,05

NH4CI — 0,05

Mg CI3 — 0,02 »

CaCOg (MgCOg) 2

(NaCl — 3 »)

Fe CI3 — Spur,
in den Kolben und lässt nach dem Aufsetzen des Stöpsels aus
dem graduierten mit Hahn und Stöpsel versehenen Trichter,
welcher mit HgS-Wasser gefüllt wird, anfangs eine sehr kleine
Quantität hinzufliessen.

Der Gehalt des HgS-Wassers wird zuvor durch Titrieren mit
Jodlösung bestimmt. Zu diesem Zwecke lässt man eine bestimmte
Quantität in eine abgemessene überschüssige zehntelnormal Jod-
lösung fliessen, worin der H2S zu HJ und S oxydiert wird.
Das unverbrauchte Jod wird mit zehntelnormal Thiosulfatlösung
zurücktitriert,

Weil Schwefelwasserstoff ein starkes Bakteriengift ist, auch
für die Thiobakterien, von denen die Süsswasserformen am
empfindlichsten sind, füge man im Anfang nicht mehr als
1 — 2 Mgr. HgS pro 100 cc. der Flüssigkeit hinzu. Eine Kon-
zentration von 50 Mgr. pro Liter tötet die meisten der Thio-
bakterien innerhalb 24 Stunden, während kräftige Bakterien-
arten wie Bac. coli, Bac. ßuorescens und Bac. prodigiosus darin
noch lebendig geblieben sind.

Die Anwesenheit der anfänglich zugegebene Menge des HgS
(i — 2 Mgr.) ist an dem Geruch deutlich bemerkbar und nachdem
man den Kolben ein bis zwei Tage im Brutschrank bei 30» C.
kultiviert hat, kann man nach Abheben des Kautschukverschlusses
feststellen, dass dieser Geruch verschwunden, der HgS also voll-
ständig oxydiert worden ist. Mann kann nun aufs neue eine
kleine Menge HgS zusetzen und nach dessen Verschwinden
dasselbe wiederhohlen.

Nach kurzer Zeit sieht man eine dünne Bakterienhaut an
der Oberfläche der Flüssigkeit sich bilden. Man findet darin
beim Mikroskopieren eine Unmenge kleiner Bakterien, welche
teilweise stark beweglich sind oder auch in unbeweglichem

«59

Zustande im Bakterienschleim sich vorfinden. Zugleicherzeit
nimmt man eine grössere Anzahl kleiner stark lichtbrechender
Schwefeltröpfchen wahr.

Bemerkenswert ist es, dass man, auch bei sorgfältigster
Beobachtung, niemals diese Schwefeltröpfchen in den Bakterien-
körpern zu finden vermag. Wenigstens habe ich bei vielen
Beobachtungen niemals den Eindruck bekommen, dass das erste
Produkt der Oxydation, der elementare Schwefel, wie es bei
den grösseren Schwefelbakterien WiNOGRADSKY's der Fall ist,
in den Zellen sich absetzt ; im Gegenteil fand ich sie aus-
schliesslich ausserhalb.

In wiefern der Schwefel in gelöster bezw. kolloidal-gelöster
Form in den kleinen Thiobakterien vorkommen kann, muss
natürlich unentschieden bleiben. Der weitere Verlauf des
Prozesses hat mich überdies in der Meinung gestärkt, dass die
Schwefelabscheidung in den betreffenden Kulturen in der Tat
»extrazellular« stattfindet.

Sobald die Bakterienhaut sich gebildet hat, kann man die
Mengen des Hg S — Wassers, welche man hinzufügt, steigern
ohne dass dadurch die Bakterien wie im Anfang geschadet und
der Prozess dadurch gehemmt wird.

Ja, man kann bei den älteren Kulturen 20 — 30 Mgr. HgS
zu gleicher Zeit zugeben ; eine Quantität, welche sonst sicher
tötend wirkt. Man bemerkt alsdann, dass eine solche schleimige
Haut, welche nach vollständiger Oxydation des Schwefels, nicht
mehr weisslich trübe, sondern durchscheinend aussieht, inner-
halb kurzer Zeit (eine halbe Stunde) nach Hinzufügung des
H2S wieder stark getrübt ist durch ausgeschiedenen Schwefel.
Diese Oxydation vollzieht sich sehr schnell und in wirksamen
Kulturen kann nach etwa zwei Stunden der H2S schon gänzlich
verschwunden sein. Die weitere darauffolgende Verbrennung
des Schwefels in der Bakterienhaut beansprucht eine bedeutend
längere Zeit. Während nämlich die erste Stufe der Oxydation
zu S und H2O schon nach wenigen Stunden zuende geführt
ist, dauert es 2 bis 3 Tage bevor die zweite Phase, die
vollständige Verbrennung zu H2SO4, beendigt ist.

Es stimmt dies mit meinen früheren Beobachtungen, wobei
unter günstigen Bedingungen in drei Wochen maximal 180 Mgr.
präzipitierter Schwefel oxydiert wurden, gut überein. Im Ver-

i6o

gleich mit andern bakteriellen Vorgängen gehören diese auf der
Reduktion der Kohlensäure sich gründenden Prozesse, zu den
langsamen. Auf Grund der Tatsache, dass die erste Phase in
diesem Vorgang so schnell sich vollzieht, muss man wohl zum
Schluss kommen, dass man es hier bei der Oxydation von HgS
zu H2O und S nicht mit einer auf die hierbei freiwerdende Wärm-
eenergie beruhenden chemo-synthetischen Ernährung zu tun hat.
Nur kann man sagen, dass die an der Oberfläche der
Flüssigkeit sich befindenden Thiobakterien auf den giftigen
Schwefelwasserstoff eine spezifische oxydierende Wirkung ausüben
und denselben in kurzer Zeit unschädlich machen. Offenbar
erfüllt diese Bakterienhaut die Stelle eines Sauerstoff Übertragers.
Diese Schlussfolgerung ist ganz im Einklang mit der miskros-
kopischen Wahrnehmung, dass die Schwefeltröpfchen nur
ausserhalb der Bakterien zu finden sind. Von welcher Natur die
hier beschriebene oxydierende Wirkung der Thiobakterien ist,
konnte ich bisjetzt noch nicht feststellen, beabsichtige aber
diese Frage näher zu untersuchen.

Sowie bei den Versuchen über die Oxydation des elementaren
Schwefels, stellte es sich auch hier heraus, dass die Oxydation
in den salzhaltigen mit Meeresschlamm infizierten Kulturen be-
teutend schneller verlief wie in den Süss wasserproben. Auch
konnte hierbei mit Vorteil statt des Calciumcarbonats das mehr
alkalische Magnesiumcarbonat zur Bindung der Säure verwendet
werden.

Wie gross die maximale Quantität des H2S ist, welche in
diesen Kulturen in einem bestimmten Volum verarbeitet werden
kann, ist schwer zu sagen, weil dieser Stoff nicht in Übermass
vorhanden sein kann und man ihn von Zeit zu Zeit in abge-
messenen Dosen hinzufügen muss.

Über die in den Rohkulturen auf den Vordergrund tretenden
Bakterien sei hier hervorgehoben, dass sie zu der von Beijerinck
Thiohacilliis thioparns genannten Art zurückzubringen sind.
Die Erkennung und Reinkultur gelingt ziemlich leicht auf Agar-
platten, welche ausser den gewöhnlichen Nährsalzen noch 0,5
Proz. NagSgOg 5 aq. und ein wenig CaCOa enthalten. Die
Kolonien der Thiobakterien unterscheiden sich hierauf von den
andern sich vorfindenden Bakterien, durch die Einlagerung von
Schwefeltröpfchen und die Auflösung des CaCOg durch Säure-

i6i

bildung. Mit den Reinkulturen können die Versuche über die
HaS-Oxydation ebensogut wie mit den Rohkulturen ausgeführt
werden ; der Verlauf ist ganz derselbe.

Alle die aus den H2S-Oxydationen isolierten Stämme waren
imstande sowohl den elementaren Schwefel als das Thiosulfat
zu oxydieren. Für die quantitative Bestimmung der aus dem
Schwefelwasserstoff gebildeten Produkte fand der Apparat 2
Anwendung.

Dieser Glasapparat, welcher sterilisiert werden kann, besteht
aus einem Kulturgefäss (a) in der Gestalt eines Erlenmeyer-
kolbens und einem Behälter (b) für H2S — Wasser. Diese zwei
Teile stehen, wie es die Figur angibt, durch eine mit einem
Glashahn d versehene gebogene Röhre mit einander in Verbindung
und können durch die Hähne c und e geschlossen werden.

Der Behälter b wird vorher evakuiert und man lässt dann
eine genau gemessene HgS — Lösung von bekannter Konzen-
tration aus einer Bürette, welche einerseits mit einem Reservoir
mit HgS — Wasser in Verbindung steht und daraus gefüllt wird,
anderseits mit einem kurzen Kautschukschlauch mit dem Hahn
c verbunden ist, hineinfliessen. Darauf wird b mit Wasser-
stoffgas ganz gefüllt. Durch Öffnen des Hahnes d ist man in
der Lage eine behebige Menge des H2S — Wassers in den
geimpften mit Nährlösung beschickten Kulturkolben hineinzu-
lassen. Anfangs genügt hierzu der bei höherer Temperatur in
dem Gefäss b auftretender Druck, später wird der Hahn c mit
einem Wasserstoffapparat in Verbindung gebracht und also
durch Öffnen der Hähne das H2S — Wasser übergepresst.

Der Sauerstoff der Luft, der in dem Kulturgefäss verdrängt
und durch die Bakterien verbraucht wird, kann wenn nötig
durch Aussaugen eines Teiles des restierenden Gasgemisches
und Einfüllen von reinem Sauerstoff oder durch Luft ersetzt werden.
Nach Beendigung der Kultur, wenn der Vorrat des H2S-
Wassers grösstenteils verbraucht ist, wird die übriggebliebene
Quantität mit Jodlösung titriert und das gebildete Sulfat und
der eventuell noch vorhandene freie Schwefel bestimmt. Die
Kulturfîussigkeit wird dazu abfiltriert ; im Filtrat das Sulfat auf
übliche Weise und der auf dem Filter zurückgebliebene Schwefel
nach Oxydation mit Brom und Kalilauge ebenfalls als Ba SO4
bestimmt.

l62

Es ergab sich, dass der verbrauchte Schwefelwasserstoff quan-
titativ zu Schwefelsäure oxydiert wurde.

Durch diese Versuchsanordnung konnte leicht nachgewiesen
werden, dass auch bei der Oxydation von als Schwefelwasser-
stoff den Bakterien dargebotenem Schwefel, das Bakterien-
material durch Reduktion der Kohlensäure gebildet wird. Lässt
man nämlich in dem ganz von der Luft abgeschlossenen
Apparat 2 in der Kulturflüssigkeit absichtlich das Carbonat
fort, so gelingt es nicht die Bildung von Schwefelsäure und
Wachstum der Bakterien zu erzielen. In diesem Falle wurde
statt des Magnesiumcarbonats, für die Neutralisierung" möglicher-
weise sich bildender Säure, stark geglühtes Mg O zugefügt^
welches bei Anwesenheit von freier Kohlensäure, die Ent-
wicklung ermöglicht. Wie gesagt blieb dieselbe vollständig aus.

Dass bei Vorhandensein des Carbonats als Kohlensäurequelle
in der anfangs an organischen Substanzen sehr armen Kultur-
lösung bei der Oxydation des H2S eine Zunahme dieser
Verbindungen tatsächlich stattfindet, wurde durch Analyse
festgestellt.

Der Inhalt des Kulturkolbens wird zu diesem Zwecke nach
Zusatz von verdünnter Schwefelsäure zur Zerstörung des
unzersetzten Carbonats auf dem Wasserbade bis etwa 30 cc.
eingedampft. Darauf kann die organische Substanz darin nach
der Methode Desgrez 1) als Kohlensäure bestimmt werden.

In der ursprünglichen Kulturflüssigkeit wurde ebenfalls den
Gehalt an organischen \'erbindungcn, welche nur sehr gering
war, bestimmt. Auf diese Weise konnte eine ansehnliche
Steigerung der organischen Subtanz nachgewiesen werden.

Die genauen Zahlen der bei diesen Analysen erhaltenen
Resultate hoffe ich später zu veröffentlichen.

Durch die hier beschriebenen Versuche glaube ich bewiesen
zu haben, dass die Thiobakterien bei der Oxydation des Schwefel-
wasserstoffs in der zweiten Phase (die Verbrennung des abge-
schiedenen Schwefels zu Schwefelsäure) autotroph sich ernähren.
Es ist dies dann auch mit den bei dem Studium der Oxydation
des freien Schwefels erhaltenen Resultaten in Übereinstimmung.

^) C.\LMETTE, A. Recherches sur l'épuration biol. et chim. des eaux d'égout.
Analyse des eaux d'égout. i^r Supplément. 1908. p. 42.

BUCHBESPRECHUNG.

Tijdschrift voor vergelijkende geneeskunde, gezond-
heidsleer en parasitaire en infectieuse dierziekten, onder
redactie van Prof. Dr. D. A. de Jong, te Leiden.
Deel I, Aflevering i, Leiden S. C. van Doesburgh.

(Zeitschrift für vergleichende Medizin, Hygiene,
parasitäre und infektiöse Tierkrankheiten. Heraus-
gegeben van Prof. Dr. D. A. de Jong, Leiden. Band I,
Heft I, Leiden, S. C. van Doesburgh.)

Mitten im Europäischen Kriegsgewoge erscheint auf unsrem neutralen
Boden, wo man glücklicherweise noch wissenschaftlich arbeiten kann,
diese neue Zeitschrift, welche wohl von keinem Berufeneren als de
Jong geleitet werden könnte. Die Arbeiten dieses Heftes sind alle
in holländischer Sprache publiziert, obwohl unter den Mitarbeitern
auch einzelne Ausländer genannt sind.

Die Publikation dieses neuen Organs erscheint wohl berechtigt ; der
Prospekt sagt darüber ungefähr Folgendes. Menschliche und Tiermedizin
sind sehr eng mit einander verknüpft. Das zeigt sich bei verschiedenen,
infektiösen sowie parasitären Tierkrankheiten, welche auf den Menschen
übergreifen können. Auch können Tiere die Entwicklungsstadien mensch-
licher Parasiten beherbergen. So bringt der Gebrauch tierischer Pro-
dukte im menschlichen Haushalt vielerlei Gefahren mit sich. Es gibt
also in dieser Richtung nicht nur rein wissenschaftliche, sondern auch
wichtige praktisch-hygienische Fragen. Schliesslich deckt sich die
experimentelle Pathologie, und i. Bes. die moderne Mikrobiologie mit
dem Arbeitsgebiet der neuen Zeitschrift.

Das erste Heft enthält die folgenden Arbeiten :

D. G. Ubbels, Trichinenkrankheii in Holland. — Der Autor w-eist
darauf hin, dass wir nocht nicht genau bekannt sind mit der Frequenz
von Trichinosis bei Schweinen aus alle7i Teilen Hollands. Diese
Kenntnis brauchen wir aber mit Rücksicht auf die Einführung eines
Reichskontrollgesetz für Fleisch.

i64

E. A. R. F. Baudet behandelt die Parasiten der Krätze und gibt
an der Hand von instruktiven Mikrophotogrammen die differentialdiag-
nostische Merkmale zwischen Sarcoptes, Psoroptes und Chorioptes.

E. QuADEKKER empfehlt für die Diagnose von Milzbrand in Kada-
vern Färbungsmethoden welche Kapselsubstanz und Stäbchen differen-
zieren. Dazu kann man wählen zwischen den Methoden von Foth oder

GlEMSA.

J. R. F. Rassers behandelt drei Fälle von Milzbrand bei Menschen.
Zwei davon waren atypisch, heilten leicht, während die bakteriologische
Untersuchung eine Begleitinfektion mit Proteus, und mit Coli und
Paratyphus (als Antagonisten) anzeigte. Ein dritter Fall von reiner
Milzbrandinfektion dagegen verlief tötlich, und trotzte jeder Behandlung,

D. A. DE JoNG publiziert die Arbeit über Vogeltuberkelbazillen bei
Säugetieren, welche schon in dieser Zeitschrift (B. III, H. i.) erschienen ist.

J. Rogs weist darauf hin, dass die Bakterien der paratyphus-enteritis-
Gruppe die Saccharose nicht vergären dürfen. Hat man die Pepton-
Kochsalzlösung mit Natriumkarbonat neutralisiert, so kann durch die
Säurebildung Kohlensäure frei werden. Man soll darum, wenn über-
haupt, den Nährboden nur mit NaOH alkalisieren.

W. C. De Graaff bestätigt dass die Bakterien der paratyphus-enteritis-
hogcholera-Gruppe die Saccharose nicht vergären. Einige (9) genau
bestimmten Coli-Stämme verhielten sich in dieser Hinsicht verschieden :
einzelne vergärten die Saccharose, andere nicht. Saccharose-haltige
Nährböden sind also in diagnostischer Hinsicht für die coli-typhus-
paratyphus-Gruppe ohne Wert.

T. Van Heelsbergen beschreibt eine Entensterbe, verursacht durch
eine Mischinfektion von Staphylokokken und Colibazillen. Nur die
Kombination war töllich bei den Fütterungsversuchen, nicht jeder
Stamm für sich.

J. G. S.

STÄNDIGE MITARBEItER DER FOLIA MICROBIOLOGICA:

C. W. BROERS, Utrecht - R. P. VAN CALCAR, Leiden -
L. POLAK DANIELS. Haag - C. EIJKMAN, Utrecht -
H. J. HAMBURGER, Groningen - H C. JAÇOBSEN,
Delft - D. A. DE JONG, Leiden - R. DE JOSSELJN DE
JONG, Rotterdam - J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam -
L. LOURENS, Rotterdam - H. M ARKUS.f, Utrecht -
C A. PEKELHARING, Utrecht - HE. REESER,
Rotterdam - N. L. SÖHNGEN, Delft - C H H SPRONCK,
Utrecht - C. S. STOK VIS, Amsterdam.

Die Zeitschrift „F o lia Mi er p biologie a*'
veröfFentlickt Originalarbeiten, an erster Stelle von
holländischen Mikitobiologen ; weitet zusammen«
fassende üebersichte und event. Buchbesprechung
gen, aber keine gewöhnliche Referate. Die Mitarbeit
von Ausländern ist nicht ausgeschlossen.

Die Arbeiten erscheinen in der deutschen, fran«
zÖsischen oder englischen Sprache. Die Zeitschrift
veröffentlicht u. Ä. die Verhandlungen der Nieder«
ländischen Vereinigung für Mikrobiologie.

Autoren erhalten 50 Abdrücke ihrer Artikel
kostenfrei.

Die Zeitschrift erscheint in zwanglosen Heften
3—4 Mal jährlich. Der Jahrgang vpn ± 20 Bogen
mit Abbildungen und Register kostet (für nicht
gewöhnliche Mitglieder der Niederländischen Ver^
einigung für Mikrobiologie) fl. 12.—, 20 Mark,
fr. 24.— , £ 1,1; 5 (erhöht mit Portokosten).

Arbeiten zur Aufnahme in die „Folia Micro»
biologica** sind bei einem der Herren Heraus^*
geber einzusenden.

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HOLLÄNDISCHE BEITRAGE ZUR
GESAMTEN MIKROBIOLOGIE.

HERAUSGEGEBEN VON:

M. W. BEIJERINCK, Delft.

A. KLEIN, GRONINGEN.
J. POELS, ROTTERDAM.

J. G. SLEESWIJK, DELFT.

IIL J AHRG A N G, H E FT 3.

AUSGEGEBEN AM 20. MAI 1915.
SCHLUSSHEFT DES III. BANDES.

(FÜR INHALT UND VERZEICHNIS DER MITAR«
BEITER, SIEHE INNENSEITE DES UMSCHLAGES).

ADMINISTRATION UND VERLAG DER

FOLIA MICROBIOLOGICA:
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MICRO. PROJECTIE APPARATEN

OP AANVRAGE WORDEN CATALOGI TOEGEZONDEN

INHALT.

Saite

C. VAN WISSELINGH. Ueber die Anwendung der
in der organischen Chemie gebräuchlichen Reaktionen
bei der Phytomikrochemischen Untersuchung. (Mit
1 Tafel) 165

C. W. BROERS, The bacteriological diagnosis of
Diphtheria 199

J. J. VAN LOGHEM. Bacterium (Proteus) anindolo-
genes n. sp. 212

H. SCHORNAGEL. Beitrag zur Wertbestimmung der
Tuberkulinprobe beim Huhn nach van Es und Schalk
(Mit 1 Tafel) 220

J. IDZERDA. Ueber die kultivierbare Bakterienmenge

menschlicher Fäzes 227

VEKEEITIGIîTG Voor MIKHOSTOLOGIE

Hst, Be^tuur bsricht aan de leden^ dat in
het begin van Juli de ja.arlijkschs zomervergadering zal wor-
den gshovidan» Zijj die eene voordracht of madcdoeling ten
beste wenschen te ,:;even, worden uit^,enoodiôd, daarvan ten
spoediti'^te aan onder,';et.eelcende mededeeling te doen,-

Namens het Bestuur^

ift, Mei 1915. J".G»81eeswijk,

SeoretaTis

ÜBER DIE ANWENDUNG DER IN DER
ORGANISCHEN CHEMIE GEBRÄUCHLICHEN

REAKTIONEN BEI DER
PHYTOMIKROCHEMISCHEN UNTERSUCHUNG.

VON

C. VAN WISSELINGH.

Professor- dir Pharmazie an der Universität in Groningen.

Einleitung.

Besonders während der letzten zehn oder zwanzig Jahre hat
es sich gezeigt, welche grosse Bedeutung die Chemie für das
Studium der Botanik hat. Im Jahre 1905 erschien das Hand-
buch von F. Czapek »Die Biochemie der Pflanzen«. Wie sehr
diese grosze wertvolle Arbeit einem groszen Bedürfnis entsprach,
geht daraus hervor, dasz schon im Jahre 1913 eine zweite,
ganz umgearbeitete Auflage herausgegeben wurde. Auch das
Studium der Mikrochemie der Pflanzen erregt während der
letzten Zeit mehr das Interesse und demselben wird jetzt mehr
Wert beigelegt als es früher der Fall war. Über diesen Teil
der Phytochemie erschienen auch im Jahre 1913 ungefähr
gleichzeitig zwei Handbücher, die »Pflanzenmikrochemie« von
O. Tunmann und die »Mikrochemie der Pflanze« von H.
MOLISCII, welche einem von mehreren Forschern gefühlten
Bedürfnis entsprachen. TUNMANN sah mit Recht ein, dasz
man für diesen Teil der Phytochemie einen Namen benötigte
und gewisz werden die Namen Pflanzenmikrochemie und Phyto-
mikrochemie Eingang finden.

i66

Wenn man die Frage stellt, ob man nicht nur der makro-
chemischen Untersuchung der Pflanzen, sondern auch der
Phytomikrochemie groszen Wert beilegen darf, so meine ich,
dasz man diese Frage sehr bestimmt bejahen musz. Vorteile
der phytomikrochemischen Untersuchung sind die geringe Quan-
tität des Materials, welche erforderlich ist, die einfachen Hilfs-
mittel, welche für die Untersuchung genügen und die relativ-
kurze Zeit, welche sie beansprucht. Bei der makrochemischen
Untersuchung musz man sich oft auf einige besonders dafür ge-
eignete Objekte beschränken, weil man in vielen Fällen das
Material nicht in hinreichender Quantität bekommen kann und
die erforderliche Zeit fehlt. Sich stützend auf die Resultate
der makrochemischen Untersuchung, kann man in solchen Fällen
durch mikrochemische Versuche die Kenntnis der Chemie der
Pflanzen oft bedeutend erweitern. Mit ein paar Beispielen will
ich dieses erläutern.

Als GiLSüN 1) und Winterstein 2) durch ihre bahnbrechende
Untersuchungen über die Chemie der Pilzmembranen in einigen
Fällen nachgewiesen hatten, dasz sie keine Zellulose sondern
Chitin enthielten, wurde bald darauf eine mikrochemische Methode
für den Chitinnachweis ausfindig gemacht 3). Dadurch konnte
leicht die chemische Untersuchung der Pilzmembranen über
einhundert Objekte ausgedehnt werden, wobei es sich zeigte,
dasz mit wenigen Ausnahmen das Chitin bei Fungi allgemein
vorkam *).

1) E. GiLSON, Recherches chimiq. sur la membr. cell, des champignons. Extr.
de la Revue »La Cellule« t. XI, i^ fasc. (1894). — Bull, de la Soc. chimiq. de
Paris, No. 23 (1894). — Das Chitin und die Membranen der Pilzzellen. Ber. d.
D. ehem. Ges., Jahrg. XXVIII (l895\ Heft 7, p. 821. — De la présence de la
Chitine dans la membr. cell, des champignons. Extr. des Compt. rend. d. séance
de l'Acad. d. scienc, mai 1S95.

2) E. WiNTERSTEi.x, Zur Kenntnis der Pilzzellulose. Ber. d. D. bot. Ges. Bd.
XI (1893), P- 441- — Über Pilzzell. ebenda Bd. XIII (1895), p. 65. — Zur
Kenntn. der in den Membranen der Pilze enthaltenen Bestandteile. Zeitschr. f.
physiol. Chemie. Bd. XIX (1893), p. 521 u. Bd. XXI (189Ç), p. 134- — Über
ein Stickstoffhaltiges Spaltungsproduct der Pilzzell. Ber. d. D. ehem. Ges. Bd.
XXVII (1894), p. 31 13. — Über die .Spaltungsprodukte der Pilzzellulose, ebenda
Bd. XXVIII (1895), P- 167.

3) C. VAN WlssELiNGH, Jahrb. f. wlss. Bot. Bd. XXXI (1898;, p. 637.
*■) 1. c. p. 684.

167

Von den gelben, orangenen und roten Farbstoffen, welche
man unter dem Namen Carotinoide 1) zusammenfasst, sind bis
jetzt nur einige makrochemisch untersucht worden. Hunderte
von Kilogrammen Material müssen manchmal verarbeitet werden,
um nur wenige Gramme reinen Farbstoffs zu erhalten. Eine
einfache mikrochemische Untersuchung setzt uns instand in
vielen Fällen wichtige Tatsachen betreffs der Anwesenheit dieser
Körper in den Pflanzen festzustellen 2). Diesen beiden Beispielen
können leicht noch andere hinzugefügt werden.

Noch mehr fällt die Bedeutung der mikrochemischen Unter-
suchung auf, wenn man berücksichtigt, dasz auf mikrochemischem
Wege Resultate erzielt sind, welche anfangs nicht mit denen
der makrochemischen Untersuchung übereinstimmten, aber
später gerade durch solche Untersuchung bestätigt wurden. Als
Beispiel nenne ich die Untersuchungen über die Korkzellwand.
Ein Teil dieser Wand, nämlich die Korklamelle besteht aus
eigentümlichem Zellstoff, dem sogenannten Korkstoff oder
Suberin. Vor ungefähr 25 Jahren hatten die Forscher ver-
schiedene Meinungen über die chemische Natur dieses Zell-
stoffes. Auf Grund makrochemischer Untersuchungen betrachtete
KÜGLER 3) das Suberin als ein Gemisch von echten Fetten.
GiLSON 4) war mit dieser Ansicht nicht einverstanden, weil
die Korklamelle beim Erwärmen bis auf ungefähr 300° C nicht
schmilzt und weil sie in Alkohol, Aether und Chloroform unlös-
lich ist. Er betrachtete das Suberin, gleichfalls auf Grund
makrochemischer Untersuchungen, als ein Gemisch von zusam-
mengesetzten Aethern, die wenig schmelzbar und unlösUch in
Alkohol, Aether, Chloroform u.s.w. waren oder als ein Produkt
von Kombination, Kondensation oder Polymerisation von Säuren
oder ihren Derivaten.

^) Siehe besonders R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über
Chlorophyll usw. (1913), p. 231.

^j C. V.\N WiSSELiNGH, On the demonstration of Carotinoids in plants. Koninkl.
Akad. van Wetensch. at Amsterdam, Proceeding 1912, p. 51 1, 686 u. 693. — Über
die Nachweisung und das Vorkommen von Carotinoiden in der Pflanze. Flora,
N. F. 7. Bd. Heft 4, (1915) p. 371.

*) K. KÜGLER, Über den Kork von Quercus Suber. Archiv der Pharmacie 22.
Bd., 6. Heft, p. 217.

*) E. GiLSON, La subérine et les cellules du liège. La Cellule t. VI, i'' fasc.
Sep. Abdruck p, 44.

i68

Die von mir i) auf mikrochemischem Wege erzielten Resultate
hielten die Mitte zwischen den Ansichten der beiden obengfe-
nannten Forscher. Nach mir kommen in der Korklamelle bei
ziemlich niederer Temperatur schmelzbare und nicht schmelz-
bare Stoffe vor, wie aus der folgenden 1892 gegebenen
Zusammenfassung meiner Resultate hervorgeht: Ich halte es
für erwiesen, dasz schmelzbare und in Chloroform lösliche
Stoffe eine wichtige Rolle bei der Zusammensetzung der ver-
schiedenen Korklamellen spielen, dasz man diese Stoffe ver-
seifen und aus denselben Säuren absondern kann. Wenn ich
hierbei die Absonderung von Glyzerin aus dem Kork von
Quercus Suber berücksichtige, so bin ich geneigt das Suberin
in seinen verschiedenen Modifikationen als ein Produkt zu be-
trachten, das aus Fetten oder mit diesen ähnlichen Stoffen, aus
Glycerylestern oder anderen zusammengesetzten Aethern, und
aus einem oder mehreren in Chloroform unlöslichen, nicht
schmelzbaren Stoffen zusammengesetzt ist, welche alle durch
Kalilauge auf eine mehr oder weniger ähnliche Weise zersetzt
werden 2).

Nach den späteren makrochemischen Untersuchungen von
VON Schmidt 3) besteht der Korkstoff teils aus unlöslichen
Anhydriden und Polymerisationsprodukten fester und flüssiger
Fettsäuren und teils aus Glyzerinestern von Fettsäuren, zum
Teil deshalb auch aus schmelzbaren und löslichen Stoffen. Die
Resultate, die ich vor mehr als zwanzig Jahren auf mikroche-
mischem Wege erhielt, sind also in Übereinstimmung mit denen
der letzten makrochemischen Untersuchungen.

Aus obigem geht hervor, dasz die mikrochemische Unter-
suchung Fragen beleuchten kann, deren Lösung auf makro-
chemischem Wege mit groszen Schwierigkeiten verbunden ist.

Grosze Bedeutung hat die phytomikrochemische Untersuch-
ung für das Studium der Lokalisation der chemischen Körper
in den Geweben, den Zellwänden und dem Zellinhalt. Mit

*) C. VAN WissELiNGH, Sur la lamelle subéreuse et la subérine. Arch. Néerl.
T. XXVI, p. 305.

2) 1. c. p. 347.

') M. VON Schmidt, Zur Kenntnis der Korksubstanz, II. Mitteilung, Sitzungsb.
d. kais. Akad. d. Wiss. Wien, CXII. Bd. Abt. II b, Jahrg, 1903, p. 1134 und
III. Mitteilung, 1. c, CXIX. Bd. Abt. II. b, Jahrg. 1910, p. 241.

log

groszer Genauigkeit kann man bestimmen, welche Zellvvände
oder Teile von Zelhvänden Zellulose und Chitin enthalten, aus
suberinartigen Stoffen bestehen, kutikularisiert und verholzt sind.
Für viele Bestandteile des Zellinhalts ist das Vorkommen im
Cytoplasma, in den Chromatophoren, in dem Kern oder im
Zellsaft festgestellt.

Für das Studium des Wachstums der Zellwand halte ich es
von groszer Bedeutung, dasz die chemischen Modifikationen,
welche die Zelhvand während ihrer Entwicklung erleidet, fest-
gestellt werden. Ungefähr vor einem Vierteljahrhundert wid-
meten Forscher ersten Ranges dem Studium des Zellwach-
stums ihre besten Kräfte. Es scheint, dasz jetzt dieses Studium
durch andere Plobleme zurückgedrängt ist, obschon das eben-
falls sehr interessante Problem des Zellwachstums bei weitem
noch nicht in einer befriedigenden Weise gelöst ist. Gröszten-
teils führe ich dieses auf die geringe Aufmerksamkeit zurück,
welche man beim Studium des Zellwachstums den chemischen
Modifikationen gewidmet hat. Dasz man beim Studium dieser
Modifikationen besonders mikrochemische Arbeit leisten musz,
liegt auf der Hand.

Für das Studium vieler physiologischen Probleme ist die
Feststellung der chemischen Änderungen in dem Zellinhalt von
groszer Bedeutung. Sowohl von makrochemischen als von
mikrochemischen Untersuchungen darf man auf diesem Gebiet
wichtige Resultate erwarten. Wenn man aber die Änderungen
des Zellinhalts beim lebenden Objekt studieren will, sind makro-
chemische Untersuchungen ausgeschlossen, während man mikro-
chemische Methoden manchmal mit Erfolg anwenden kann.
Als Beispiel nenne ich die Antipyrin- und Caffein-Methode,
welche ich bei der Untersuchung nach der physiologischen
Bedeutung des Gerbstoffes anwendete i).

Obschon ich, wie aus obigem ersichtlich, der phytomikro-
chemischen Untersuchung groszen Wert beilege, kann ich nicht
leugnen, dass diese Untersuchung mit besonderen Schwierigkeiten

^) C. VAN WissELiNGH, On the tests for tannin in the living plant and on
the physiological significance of tannin. Koninkl. Akad. van Wetensch. te
Amsterdam, Proceedings 1910, p. 685. — Cber den Nachweis des Gerbstoffes in
der Pflanze und über seine physiologische Bedeutung. Beihefte z. Bot. Centralbl.
Bd. XXXII (1914), Abt. I, p. 155.

und Gefahren verbunden ist. Das erste Erfordernis bei makro-
chemischen Untersuchungen ist Absonderung des Stoffes, den man
untersuchen will, in hinreichender Menge und reinem Zustande.
Der Forscher, der phytomikrochemische Versuche anstellt, wendet
Reaktionen auf Stoffe an, welche in relativ geringer Quantität
in der Zellwand oder in dem Zellinhalt anwesend sind und zwar
oft neben anderen Stoffen, deren Anwesenheit Verwechselung
und Modifikationen der Reaktionen veranlassen kann. Wenn
man Schlüsse zieht, musz man deshalb allen Nebenumständen
Rechnung tragen und möglichst vorsichtig sein. Beim Studium
der Lokalisation der chemischen Körper musz man auszerdem
die Tatsache berücksichtigen, dasz nach dem Tode des Proto-
plasmas eine Wanderung von im Zellsaft gelösten Stoffen
stattfinden kann.

Die Unterschätzung und das Nichterkennen der Schwierig-
keiten, welche mit der mikrochemischen Untersuchung verbunden
sind, haben oft Veranlassung gegeben zur Verwechselung che-
misch sehr verschiedener Körper. Mit einigen Beispielen will
ich dieses erläutern. Bei den mikrochemischen Untersuchungen
der Korkzellwand hat man die Violettfärbung, welche die Kork-
lamelle nach Behandlung mit Kalilauge mit Chlorzinkjod infolge
der Anwesenheit der Phellonsäure zeigt, für eine Zellulosereak-
tion gehalten and Verseifungsprodukte, welche aus Kalium-
phellonat bestanden, als Zellulosemembranen gedeutet i).

Von den Fungi hat men lange Zeit allgemein behauptet, dasz
ihre Membranen aus Zellulose mit fremden Beimischungen be-
stehen, während später festgestellt wurde, dasz sie mit wenigen
Ausnahmen keine Zellulose sondern Chitin enthalten. Die
Violettfärbung, welche Chitosan, ein Zersetzungsprodukt des
Chitins, mit Jod und verdünnter Schwefelsäure zeigt, hat man
mit einer Zellulosereaktion verwechselt 2).

Reaktionen mit Haematoxylin, Methylenblau und anderen
Farbstoffen, hat man als Zellulosereaktionen beschrieben,
während es sich später zeigte, dasz die Farben, welche die

^) C. VAN WISSELINGH, Sur la paroi des cellules subéreuses, Arch. Néerl.
T. XXII, Sep. Abdruck p. 8. — La lamelle subéreuse el. la subérine 1. c.
T. XXVI, p. 340.

2) C. VAN WissELiNGH, Mikrochemische Untersuchungen über die Zell wände
der Fungi. Jahrb. f. wiss. Bot. Bd. XXXI (1898), p. 657.

Zellwände erhielten, die Folge der Anwesenheit von Pektin-
stoffen waren i).

Carotin hat man verwechselt mit Chlorophyllan, einem Zer-
setzungsprodukt des Chlorophylls 2). Gerbstoffniederschläge
sind als Eiweiszniederschläge gedeutet worden 3).

Manchmal hat man Körper, die zwar zu derselben Gruppe
gehören, aber chemisch doch verschieden sind, für identisch
erklärt. Man glaubte mit eben demselben Körper zu tun zu
haben. So hat man z. B. gemeint, dasz in allen Korkzell-
wänden und kutikularisierten Wänden als wesentlicher Bestand-
teil ein bestimmter chemischer Körper, Korkstoff oder Suberin,
vorkam, während es sich später gezeigt nat, dasz diese Zell-
wände verschiedene Stoffe enthalten, welchen sie ihre eigen-
tümliche Eigenschaften verdanken, und dasz sie sich chemisch
oft bedeutend von einander unterscheiden *).

Auch hat man gemeint, dasz alle carotinähnliche Farbstoffe
oder Carotinoide, wie Carotin, Lycopin, die verschiedenen Xan-
thophylle usw. ein und derselbe Körper, Carotin, wären, während
spätere sorgfältige chemische Untersuchungen festgesteltt haben,
dasz einige dieser Körper Sauerstoff enthalten und andere nicht
und sie deshalb unter einander sehr verschieden sind ^).

Oft fühlt man bei der phytomikrochemischen Untersuchung
sehr den Mangel an zuverlässigen Reaktionen. Zwar klaget
man bisweilen darüber mit Unrecht, aber es ist gewisz, dasz
in vielen Fällen die bekannten makrochemischen Reaktionen
für die mikrochemische Untersuchung untauglich sind, weil sie
zu wenig empfindlich sind oder wegen anderer Ursachen. Der
Botaniker hat in solchen Fällen oft zu Farbstoffen Zuflucht
genommen. Hiermit kann man wohl sehr schöne Praeparate

1) L. Maxgin, Sur les composés pectiques. Journal de botanique, T. VI.
(1892) p. 238.

2) C. VAN WisSELiNGH, On the demonstration of Carotinoids in plants. Koninkl.
Akad. van Wetensch. at Amsterdam, Proceedings 191 2, p. 9.

^) C. v.\N WissELiNGH, On intravital precipitates. Koninkl. Akad, van Wetensch.
at Amsterdam, Proceedings 191 3, p. 1329, Recueil des Travaux bot. Néerl. vol.
XI. Livr. I, 1 9 14 p. 14

*) C. VAN WissELiNGH, Sur la paroi des cell, suber. 1. c. p. 43. Sur la lamelle
subéreuse et la suberine, 1. c. p. 344.

^) Siehe besonders R. Wilstätter und A. Stole. Untersuchungen über
Chlorophyll usw. p. 231.

172

erzielen, aber weil oft sehr verschiedene chemische Körper die-
selben Farbstoffe speichern und festhalten können, kann man auf
Grund der erhaltenen Resultate gewöhnlich keine sichere Schlüsse
ziehen. Farbstoffe sind denn auch mehr geeignet, um bei Erhal-
tung negativer Resultate die Abwesenheit von Körpern, die leicht
Farbstoff speichern, festzustellen, als um beim positiven Befund
damit die Anwesenheit bestimmter Körper zu beweisen 1).

Da ich oft bei phytomikrochemischen Untersuchungen Mangel
an zuverlässigen Reaktionen empfunden habe, so habe ich mir
jetzt die Frage gestellt, ob man diesem Mangel durch Anwen-
dung der in der organischen Chemie gebräuchlichen Reaktionen
abhelfen könnte.

Wenn man berücksichtigt, wie die Botaniker im allgemeinen
zu ihren mikrochemischen Reaktionen gekommen sind, so musz
man gestehen, dasz man sie zufälligerweise entdeckt hat oder
dasz man sie erst bei makrochemischer Untersuchung gefunden
und später bei der mikrochemischen Untersuchung angewendet
hat. Von einer systematischen Forschung nach mikrochemischen
Reaktionen, die sich gründet auf der chemischen Struktur
der Körper und den Umsetzungen, welche man im Zusammen-
hang mit der Anwesenheit bestimmter Atomgruppen erwarten
kann, habe ich in der botanischen Literatur nichts entdecken
können. In den beiden vor kurzem erschienenen, vorzüglichen
Lehrbüchern über Pflanzenmikrochemie von TuNMANN und
Molisch habe ich vergebens nach einer Behandlung" dieses
Gegenstandes gesucht.

Die vorliegende Arbeit musz man als einen Versuch betrachten,
um in der angegebenen Richting etwas zu leisten. Der Körper,
von dem ich dabei ausgegangen bin, ist das Chitin, welches im
Tierreich bei Arthropoden, Vermes und Mollusken, im Pflanzen-
reich bei Fungi vorkommt. Für den mikrochemischen Nachweis
dieses Körpers habe ich früher schon eine Methode, welche
sich auf die Umsetzung des Chitins in Chitosan und die sehr
empfindliche Reaktion des letzteren mit Jod und verdünnter
Schwefelsäure gründet, in Einzelheiten beschrieben 2). Auf

^) C. VAN WissELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zellwände der Fungi,
1, c. p. 644.

') C. VAN WisSELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zellwände der Fungi,
1. c. p. 637.

173

Grund dieser Tatsache würde man behaupten können, dass es
nicht nötig sei, neue mikrochemische Reaktionen für das
Chitin zu finden. Ich bemerke dazu, dasz für die Prüfung einer
neuen Arbeitsmethode es erwünscht ist, die erhaltenen Resul-
tate mit Hilfe einer schon bewährten Methode kontrollieren
zu können.

Weiter bemerke ich, dasz einige Forscher, zwar noch ohne
hinreichende Gründe, von mehreren chitinartigen Körpern reden i).
Es ist deshalb erwünscht, dasz man bei der Untersuchung mit
neuen Reagenzien der Möglichkeit Rechnung trägt, dasz Chitin
verschiedener Herkunft verschieden sei. Zuletzt mache ich noch
darauf aufmerksam., dasz die Botaniker, was das Vorkommen
des Chitins betrifft, noch uneinig sind. Einige behaupten
nämlich, dass die Wand der Bakterien Chitin enthält, während
andere in derselben diesen Körper nicht entdecken konnten 2).

Im Zusammenhang mit dem Obenerwähnten glaube ich, dasz
einige neue Methoden zum mikrochemischen Nachweis des
Chitins den Forschern, die darüber Untersuchungen angestellt
haben oder anzustellen wünschen, willkommen sein werden.
Der Hauptzweck der vorliegenden Arbeit ist aber die Aufmerk-
samheit auf die Tatsache zu richten, dasz man bei phytomi-
krochemischen Untersuchungen von den in der organischen
Chemie gebräuchlichen Reaktionen mit Erfolg mehr Gebrauch
machen kann, als bis jetzt der Fall gewesen ist.

Über die Chemie des Chitins.

Das Chitin ist, wie man von einem Zellwandstoff wohl er-
warten kann, ein in Wasser unlöslicher Körper. Auch ist es
unlöslich in anderen einfachen Lösungsmitteln. Konzentrierte
Säuren und starke Alkalilaugen zersetzen es beim Erwärmen.
Im allgemeinen wird es aber durch Reagenzien nicht oder nur
wenig angegriffen. Auch widersteht es ziemlich hoher Temperatur.

*) N. P. Krwvkow, Uebev verschiedenartige Chitine. Zeilschr. f. Biologie,
XXIX, Bd. 1S92, p. 177. — E. Zander, Vergl. und kril. Untersuchungen zum
Verständnisse der Jodreaktion des Chitins. Archiv für die gesammte Physiologie
des Menschen und der Tiere. 66. Bd. 1897, p. 545.

2) Siehe F. Czapek, Biochemie der Pflanzen, i. Bd. 191 3, p. 630.

Ï74

Wie Zellulose, kann man es bis auf 300" C in Glyzerin er-
wärmen ohne, dasz es sich zersetzt 1). Die Methoden, welche
man zur Reindarstellung des Chitins anwendet, gründen sich
auf seiner Widerstandsfähigkeit Reagenzien gegenüber.

In konzentrierter Salzsäure (37 ^/o), Salpetersäure (25 und
50 0/0) und in einigermaszen verdünnter Schwefelsäure (66 0/0)
scheint Chitin, ohne sich dabei ganz zu zersetzen, löslich zu sein.
Am besten geHngt solche Auflösung unter Abkühlung. Wenn
man nicht zu lange wartet, kann man durch Verdünnen mit
Wasser das Chitin teils noch unverändert niederschlagen. Man
bekommt es dann wieder im amorphen Zustand 2). Wenn
konzentrierte Säuren längere Zeit oder unter Erwärmung ein-
wirken, wird das Chitin zersetzt. Ledderhose 3) erhielt durch
Chitin mit konzentrierter Salzsäure zu kochen, am besten unter
Hinzufügung von Zinn, einen schönen kristallinischen, in Wasser
löslichen Körper, das salzsaure Glycosamin, Cg H13 NO5. HCl.
Die Base, das d-Glucosamin, haben E. FISCHER und LeuCHS *)
synthetisch bereitet und besonders durch ihre Untersuchungen
ist die Frage nach seiner Struktur und Konfiguration in den
wesentlichen Punkten gelöst. Man hat es zu betrachen als ein
Derivat des Traubenzuckers oder der d-Mannose, in welcher
das in der of-Stellung befindliche Hydroxyl durch Amid ersetzt
ist. Fischer und LeuCHS geben ihm die folgende Konfigura-
tionsformel :

H H OH

CH2OH.C— C— C.CH(NH2).C0H

OH OH H

1) C. VAN WISSELINGH, Mikrocliem. Unters, über die Zelhvände der Fungi,
1. c, p. 643.

2) D. H. Wester, vStudien über das Chitin, Inaugural-Dissertation (1909), p. 28.
') G. Ledderhose, Über salzsaures Glykosamin. Ber. d. D. ehem. Ges. zu

Berlin. 9. Jahrg. (1876;, p. 1200. — Über Chitin und seine Spaltungsprodukten.
Zeitschr. f. physiol. Chem. 2. Bd. (1878;, p. 213. — Über Glykosamin. Ebenda
4. Bd. (1880), p. 139.

*) Emil Fischer und Hermann Leuchs, Synthese des Serins, der 1-Glukosa-
minsäure und anderer Oxyaminosäuren. Ber. d. D. chem. Ges. 35. Jahrg. (1902),
P- 3787- — Synthese des d-Glukosamins, Ber. d. D. Chem. Ges. 36. Jahrg.
(1903), P- 24-

175

Sic bemerken dabei, dasz nur die sterische Anordnung der
Aminogruppe an dem «-Kohlenstoff noch unbestimmt ist und
dasz für die Annahme der Aldehydgruppe der gleiche Vorbe-
halt wie bei den Zuckern gilt. Bei der viel gröszerer Ver-
breitung des Traubenzuckers in der Natur wird man selbst-
verständlich der Annahme, dasz das Glucosamin sich von ihm
ableite, die gröszere Wahrscheinlichkeit zumessen, aber der
direkte Beweis dafür fehlt augenblicklich noch.

Der Name Glucosamin ist von einigen Autoren in Chitosamin
abgeändert worden. FISCHER und LeuchS sagen aber, dasz
der alte von LedderhoSE gewählte Name Glucosamin in jeder
Beziehung verdient rehabilitiert zu werden.

SUNDWIK 1) und von FÜRTH und SCHOLL 2) erhielten durch
Behandlung mit rauchender Salpetersäure salpetersaure Aether,
sogenannte Nitrochitine und FräNKEL und KELLY s) durch
Behandlung mit Schwefelsäure von 70 bis 72 0/0 Monoacetyl-
chitosamin und Acetyldichitosamin.

Wenn man Chitin bis auf 180° mit Kalilauge erhitzt, wird
es unter Abspaltung von Essigsäure in Chitosan *) (Mykosin
GilSON) verwandelt. Dieses Spaltungsprodukt ist, wie das
Chitin, unlöslich in Wasser und in gewöhnlichen Lösungs-
mitteln. Es besitzt basische Eigenschaften und bildet mit
Säuren meist in Wasser lösliche Salze. Demzufolge löst es
sich in vielen verdünnten Säuren, z. B. in 2 o/^iger Essig-
säure und 2 1/2 Voig^'' Salzsäure. In konzentrierter Salzsäure
ist es bei der gewöhnlichen Temperatur unlöslich. Verdünnte
Schwefelsäure löst Chitosan auch nicht und schlägt es aus
Lösungen anderer verdünnter Säuren als Chitosansulfat nieder.

Nach LÖWY 5) präzipitieren auch Phosphowolframsäure,

') E. E. SuNDWiK, Zur Constitution des Chitins, Zeitschr. f. physiol. Chem.
5. Bd. (1881), p. 387.

2) O. VON FÜRTH und E.MiL Scholl, Über Nitrochitine. Beilr. zur chem.
Physiologie und Pathologie, X. Bd. (1907), p. 188.

5) S. FräNKEL und A. Kelly, Beiträge zur Constitution des Chitins. Sit-
zungsber. d. kais. Akad. d. Wiss. CX. Bd. 1901, Abt. II b, p. I147.

*) F. Hoppe-Seyler, Über Chitin und Cellulose. Ben d. D. chem. Ges. 27.
Jahrg. 1894, p. 3329. — E. Gilson, Recherches chimiques sur la membrane
cellulaire des champignons, 1. c. p. 11.

^j E. LÖWY, Über krystaUinisches Chitosansulfat, Bloch. Zeitschr. 23. Bd.
1910, p. 47.

Phosphomolybdäiisäure, Jodquecksilberkalium, Jodwisinutkalium,
Pikrinsäure und Tannin das Chitosan und man erhält beim
Schütteln mit Benzoyl-, Benzosulfo- und Naphtalinsulfochlorid
sehr schwer lösliche Additionsprodukte. Jodjodkaliumlösung
färbt Chitosan einigermaszen schmutzig braunviolett, aber sehr
verdünnte Schwefelsäure genügt um diese Farbe in einem sehr
schönen, dunkelen, rotvioletten umzuwandeln. Chlorzinkjod färbt
Chitosan blau i) und Brom scharlachrot 2).

Hoppe-Seyler 3) und Ch. Fischer haben Chitosan durch
Erhitzen mit Essigsäureanhydrid in einen Körper umgewandelt,
der Chitin sehr ähnlich war. Als die genannten Forscher diesen
Körper näher untersuchten, zeigte es sich aber, dasz derselbe
doch kein Chitin war. Nach Ch. FiSCHER erhielt er nämlich
drei Acetylgruppen, gegen das Chitin zwei. Mit Propion-
säureanhydrid und Benzoesäureanhydrid bereiteten HOPPE-
Seyler und Ch. Fischer ähnliche Chitosanderivate.

Araki ^), LÖWY 6) und andere haben nachgewiesen, dasz
durch Kochen mit Salzsäure Chitosan, wie Chitin, in Gluco-
samin umgewandelt wird. Nebst salzsaurem Glucosamin ent-
stehen dabei Essigsäure und Ameisensäure.

Während die Struktur und Konfiguration des Glucosamins
der Hauptsache nach bekannt sind, sind diese von dem Chitin
und dem interessanten Spaltungsprodukt, dem Chitosan, noch
lange nicht aufgeklärt.

Nach Ledderhose e) ist die Formel des Chitins wahrschein-
lich Ci5 H26 N2 Ojo und die Spaltung in Glucosamin und Essig-
säure, Avelche sie durch Kochen mit Salzsäure erfährt, sollte
der folgenden Gleichung entsprechen :

C,5 H26 N2 Oio + 3 H2 O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 C2 H4 O2
Chitin Glucosamin Essigsäure

*) C. VAN WissELiNGii, Mikiochem. Unters, über die Zellwände der Fungi,
1. c. p. 642.

2) O. VON Fürth und M. Russo, Über kristallinische Chitosanverbindungen
aus Sepienschulpen. Beiträge zur ehem. Physiol, und Pathol. 8. Bd. (1906), p. 163.

3) F. Hoppe-Seyler, Ueber Chitin und Cellulose, 1. c. — Ueber Umwandl-
ungen des Chitins. Ber. d. D. ehem. Ges. 28. Jahrg. (1895), P- 82.

*) F. Araki, Über das Chitosan, Zeitschr. f. physiol, Chemie, 20. Bd. (1895),
p. 498-
5) 1. c.
®; G. Ledderuose, Über Chitin und seine Spaltungsprodukte, 1. c.

177

Schmiedeberg ») bemerkt, dasz diese Gleichung nicht richtig
sein kann, dasz wahrscheinlich ein Druckfehler oder Irrtum sich
eingeschlichen hat und dasz sie vielmehr lauten muss :

Ci8 H30 N2 O12 + 4 H, O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 Co H4 O2.

SUNDWIK 2) betrachtet das Chitin als ein reines Aminderivat
eines Kohlenhydrats der allgemeinen Formel n (C13 Hoq 0^) und
findet es sehr wahrscheinlich, dasz seine Formel Cßo Hjos Ng Ogg.
n H.O ist.

Araki 3) gibt dem Chitin die Formel Cis H30 Ng O12 unJ
dem Chitosan die Formel C14 H26 Ng O^). Für die Umwandl-
ungen, welche das Chitin durch Kochen mit konzentrierter
Salzsäure und durch Erhitzen mit Kalilauge erfährt, stellt er
die beiden folgenden Gleichungen auf:

C,8 H30 Na O12 + 4 Ho O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 C2 H4 O,
Chitin Glucosamin Essigsäure

C,8 H30 N2 O12 + 2 H2 O = Cx4 H26 N2 0,0 + 2 Ca H4 O2
Chitin Chitosan Essigsäure

Für die Zersetzung, welche Chitosan durch Kochen mit kon-
zentrierter Salzsäure erfährt, gelangt er zu der folgenden
Gleichung :

Ci4 Hoe N2 Oio + 2 H2 O = 2 Ce Hi3 NO5 + C2 H4 O2
Chitosan Glucosamin Essigsäure

FräNKEL und Kelly *) kommen auf Grund ihrer Unter-
suchungen zu dem Resultat, dasz die Grundlage des Chitins
Acetyl-n-Chitosamin ist und dasz das Chitin und das Chitosan
keineswegs die angenommene einfache Zusammensetzung besit-
zen, sondern vielmehr höher zusammengesetzte stickstoffhaltige
am Stickstoff acetylierte, respektive mit Acetylacetessigsäure
verbundene Polysaccharide sind.

Nach Offer b) is das Chitin als ein polymères Monoacetyldi-
glucosamin aufzufassen. Die Acetylgruppe ist am Stickstoff
gebunden und die Bindung der beiden Glucosaminreste beruht
einerseits auf der Reaktion zwischen Aldehyd und Amin,
andererseits ist der zweite Glucosaminrest in äthylenoxydartiger
BindunsT vorhanden.

1) O. Schmiedeberg, Über die chemische Zusammensetzung des Knorpels.
Arch. f. exp. Pathol, und Pharmak. 28, Bd. (1891), p. 355.

2) 1. c. 3) 1. c. *) 1. c.

5; Th. R. Offer, Über Chitin, Biochem. Zeitschr. 7. Bd. (1908), s. 117.

178

Irvine 1) glaubt, dasz das Chitinmolekül C30 H50 N^ O^g ist
und aus einem Molekül Aminoglucose und drei Molekülen
Acetylaminoglucose zusammengesetzt ist, welche unter Elimina-
tion von vier Molekülen Wasser kondensiert sind.

Rothera 2) behauptet, dasz seine Resultate betreffs der
Stickstoffbindung im Chitin nicht ohne weiteres mit der Ansicht
in Einklang zu bringen sind, dasz das Chitin nur ein acetyliertes
Glycosamin darstellt.

Hugo Brach 3) ist zu dem Resultate gelangt, dasz aus Mono-
acetylglucosaminen bestehende Viererkomplexe die kleinsten
Bausteine des Chitins sind. Auf je ein Stickstoffatom kommt
im Chitin ein Essigsäurerest und ein Glucosamin vor. Der Abbau
des Chitins zu Monoacetylkomplexen resp. Glucosamin und
Essigsäure vollzieht sich nach BRACH nach der Gleichung:

(C32 H54 N4 Ooi) X + 3 (HoO) X = 4 (Ca Hi5 NOe) X bzw.
(C32 H54 N, O2,) X + 7 (H.O) X = 4 (Ce Hia NO,) x + 4 (CH3
COOH) X und der Übergang des Chitins in Chitosan bei der
Kalischmelze erfolgt unter Absprengung der Hälfte der in Chitin
vorhandenen Essigsäuregruppen nach der Gleichung:

(C32 H54 N4 O21 ) X + 2 (HoO) X = (C28 H30 N4 Ol«) X + 2 (CH3
COOH) X. Nach Brach kann von einer Bindung der Essigsäure
im Chitin in Form von Acetessigsäure nicht gesprochen werden,
hingegen ist anzunehmen, dasz die Essigsäure in säureamid-
artiger Form am Stickstoff gebunden ist und zwar an je einem
Stickstoffe eine Essigsäure. Die Gesammtmenge des im Chitin
vorhandenen Stickstofïes ist bei geeigneter Hydrolyse in Form
von Glycosamin nachweisbar und daneben treten keine anderen
reduzierenden Kohlehydrate auf. Durch die Einwirkung der
salpetrigen Säure wird der Stickstoff aus dem Chitosansulfat
quantitativ abgespalten, wie auch WeSTER *) gefunden hat.
Nach Brach spricht dieses Verhalten aber nicht gegen die
Bindung von Acetylkomplexen an primären Aminogruppen im

^) J. C. Irvine, A Polarimetrie Method of Identifying Chitin. Joura. of the
Chemical Society (1909) XCV. I. p. 564.

^) C. H. Rothera, Zur Kenntnis der Stickstoffbindung im Eiweisz. Beiträge
zur ehem. Physiol, und Pathol. 5. Bd. (1904), p. 442.

^) Hugo Brach, Untersuchungen über den chemischen Aufbau des Chitins,
Bioehem. Zeitschr. 38. Bd. (1912), p. 468.

*) 1. c. p. 27.

179

Chitosan, bzw. Chitininolekül. Dagegen spricht diese Tatsache
gegen die MögUchkeit, dasz etwa Stickstoffe untereinander
oder mit anderen Teilen des Moleküls durch intramolekulare
Bindung verkettet sind. Daraus, sowie aus dem Umstände,
dasz im Chitinmolekül keine von Stickstoff und Acetyl freien
Kohlehydrate vorhanden sind, ergibt sich, dasz die von OFFER
für das Chitin aufgestellte Formel und die Annahme einer
Amin-Aldehyd-Verkettung der substituierten Zucker den Tat-
sachen nicht entspricht. Gröszere Wahrscheinlichkeit besitzt die
Annahme von Monocarbonylbindungen nach Art der von Emil
Fischer z. B. für Maltose aufgestellten Hypothese.

Betreffs des Chitosans erhielten VON FÜRTH und Russo i)
die folgenden Resultate : In Abweichung der von Araki aufge-
stellten Chitosanformel fanden sie, dasz das Chitosan, je zwei
N-Atomen entsprechend, etwa 13 C- Atomen, 26 H-Atome und
14 O- Atome enthalten dürfte und dasz das Molekül mindestens
zweimal, vielleicht aber um ein Vielfaches gröszer ist, als der
Gröszenordnung der ARAKI-schen Formel entspricht. Nach VON
Fürth und Russo entspricht einem N-Atom annähernd i Molekül
Essigsäure und 3/4 Molekül Glykosamin. Das Chitosan vermag
je einem N-Atom entsprechend ein Molekül HCl zu binden.
Sein Stickstoff trägt den Charakter eines secundären Amins.
Bei Benzoylierungsversuchen nimmt es, je einem N-Atom
entsprechend, nur eine Benzoylgruppe auf. Alle im Chitosan-
molekül vorhandenen Glykosaminkomplexe scheinen acetyliert
zu sein. Daneben dürfte aber noch eine kohlenstoffärmere
acetylierte Stickstoffverbindung im Molekül vorkommen. Ein
erheblicher Teil seines Sauerstoffs dürfte im Molekül in anderer
als in Hydroxy Iform enthalten sein. Es enthält keine Aldehyd-
und Carbonylgruppen. VON FÜRTH und RusSO bemerken, dasz
das freie Chitosan sich leicht unter Sauerstoffabgabe verändert.

Nach LüWY 2) ist das Chitosan tatsächlich als ein polymères
Monoacetyldiglucosamin anzusehen. Für die Molekulargrösze
besitzt man vorläufig keine Anhaltspunkte, doch ergitbt sich aus
dem Schwefelsäurebindungsvermögen [2 C14 Hge Ng Oxo +
3H2SO4 = C28 H50 N4 Ol« (H2S04)3 + Hob], dasz min-
destens zwei Monoacetyldiglucosamine im Chitosan verbunden

^) 1. c. S) 1. c.

i8o

sein müssen. Die Zusammensetzung des Chitosans entspricht
also der Formel (Cgs H50 N4 O19) x und die hydrolytische
Spaltung in Glucosamin und Essigsäure erfolgt nach der Gleichung :
(C28 H50 N4 O,,) X + 5 X H2 O = 4 X (Ce H,3 NO5) 4- 2 X
(CH3COOH). Das Chitosan vermag je einem Monoacetyldi-
glucosaminkomplex entsprechend je ein Jod- oder Bromatom
aufzunehmen.

KOTAKE und Sera 1) kommen im Zusammenhang mit Unter-
suchungen über neue Glukosaminverbindungen («- und (i-Lyko-
perdin) zu der Meinung dasz im Chitin vier Glukosaminmoleküle,
von welchen jedes an einer Aminogruppe acetyliert ist, mit
einander verbunden sind und zwar auf die folgende Weise :

CHgOH
I
CH OH

I
CH

CHOH
I
CH NH CO CH

Aus dem Obenerwähnten geht hervor, dasz die Ansichten der
Chemiker, was die Zusammensetzung des Chitins und des Chito-
sans betrifft, noch lange nicht übereinstimmen. Sowohl für das
Chitin wie für das Chitosan sind die aufgestellten Formeln ver-
schieden. Die Ansichten über die Zahl der Acetylgruppen im
Chitin gehen auseinander. Während LedderhoSE, Schmiede-
BERG und Araki im Chitin auf zwei N drei Acetyle, Irvine
auf vier N drei Acetyle, OFFER auf zwei N ein Acetyl anneh-
men, glaubt Brach, dass im Chitin auf vier N vier Acetylen
vorkommen. Die Ansichten über die Bindung der Stick-
stoffe und der Acetyl- und Glucosamingruppen im Chitin und
Chitosan sind sehr verschieden. Auch die Frage, warum beim
Erwärmen des Chitins in konzentrierter Kalilauge bis auf

^) Yashiro Kotake und Yoshita Sera, Über eine neue Glukosaminverbindung,
zugleich ein Beitrag zur Konstitutionsfrage des Chitins. Zeitschr. für physiol.
Chemie, S8. Bd. (1913), p. 56.

i8i

1 80° nur ein Teil der Acetylgruppe abgespalten wird, ist noch
ungelöst.

Die mikrochemische Untersuchung.

Obschon es noch viele Lücken in unserer chemischen Kenntnis
des Chitins gibt, hat die makrochemische Untersuchung doch
schon viel geleistet, das für die mikrochemische Untersuchung
Bedeutung hat. Schon verfügen wir über eine sehr empfindliche
mikrochemische Methode zum Nachweis des Chitosans, des
unlöslichen Zersetzungsprodukts des Chitins, aber wie es sich
unten zeigen wird, brauchen wir uns nicht auf diese Methode
zu beschränken. Neue mikrochemische Methoden sind unten
beschrieben.

Die mikrochemische Untersuchung fand bei den folgenden
Objekten statt, nämlich bei 10 pflanzlichen Objekten (Fungi):

Agaricus campestris L.

Polyporus versicolor L.

Aspergillus giganteus Wehmer,

Plasmodiophora Brassicae Woron.

Peltigera canina Hoffm.

Sphaerotheca Mors Uvae (Schw.) Berk, et Curt.

Aecidium nymphoides DC.

Roestelia cancellata Rebentisch [Gymnosporangium Sabi-
nae (Dicks) Winter].

Telephora terrestris Ehrh.

Scolecotrichum (auf Gurke)
und bei zwei tierischen Objekten :

Crangon vulgaris.

Sepia officinalis (Sepia-Schale).
Besonders habe ich von den pflanzlichen Objekten die fünf
erstgenannten benutzt. Wie die tierischen Objekte, waren diese
wegen des beträchtlichen Chitingehalts für das Studium der
neuen mikrochemischen Methoden sehr geeignet.

Bei phytomikrochemischen Untersuchungen musz man, im
Gegensatz zu dem, was bei makrochemischen Untersuchungen
stattfindet, einer Auflösung vorbeugen. Dementsprechend richten
wir bei der mikrochemischen Nachweisung des Chitins unsere
Aufmerksamkeit auf das Cliitosan, sein unlösliches Zersetzungs-

-l82

produkt, das im Gegensatz zu Chitin mit vielen Stoffen reagiert.

Reaction zirm Nachzveis des Chitosans mit Jod und Säuren.
(Fig. 1.) In 1898 habe ich 1) die Forscher auf die schöne
Violettfärbung, welche das Chitosan mit Jod und verdünnter
Schwefelsäure zeigt, aufmerksam gemacht. Diese Reaktion
hatte GiLSON 2) bei der makrochemischen Untersuchung pflanz-
licher Objekte beobachtet. Ich habe sie für die mikrochemische
Untersuchung anwendbar gemacht. Die angewandte Methode
ist von mir und später von anderen beschrieben worden. Im
Zusammenhang hiermit erlaube ich mir einige Bemerkungen :
Wie schon früher erwähnt, werden die Präparate in zuge-
schmolzenen Glasröhrchen bis auf 1600 C (unkorr.) in kon-
zentrierter oder 500/Qiger Kalilauge erhitzt, darauf mit absolu-
tem oder 950/oigem Alkohol ausgewaschen und in destilliertes
Wasser gebracht und schlieszlich mit Jodjodkaliumlösung und
sehr verdünnter Schwefelsäure behandelt. Die Erwärmung der
Röhrchen kann natürlich auf verschiedene Weise stattfinden^
z. B. in einem Ölbade, in einem Trockenschrank oder in einem
Schränkchen von Asbestpappe. Bei Anwendung eines Ölbades
hing ich die Röhrchen in Hüllen von Metalltuch möglichst
nahe beim Reservoir des Thermometers. Überflüssig und
unpraktisch ist ein Deckel mit Löchern auf dem Ölbade,
wie einige Autoren abgebildet haben. Wenn man die Röhr-
chen aus dem Ölbade herausnimmt, hindert ein derartiger
Deckel nur.

Die Anwendung zugeschmolzener Röhrchen und besonders
das Auswaschen mit Alkohol dient dazu die Präparate intakt
zu erhalten. Nach Umwandlung des Chitins in Chitosan haben
die Präparate viel von ihrer Festigkeit eingebüszt und die
direkte Übertragung aus der konzentrierten Kalilauge ins Wasser
können sie nicht mehr ertragen. Die Anwendung des Alkohols
leistet ausgezeichnete Dienste, aber bei der Übertragung aus
dem Alkohol ins Wasser zeigt es sich noch manchmal, dasz
die Präparate weniger fest sind als vorher. Die Behandlung

1) C. VAN WissELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zelhvünde der Fungi,

1. c. p. 639.

^) E. Gn.soN, Recliercheb cliimiques sur la membr. cell, des champignons,

1. c. p. II.

i83

mit verschiedenen Reagenzien, unter anderen mit Jodjodkalium-
lösung oder mit verdünnter Schwefelsäure, macht sie wieder fester.
Anstatt erst Jodjodkaliumlösung und nachher verdünnte
Schwefelsäure kann man auch erst verdünnte Schwefelsäure
und dann Jodjodkaliumlösung hinzufügen. Statt verdünnter
Schwefelsäure kann man auch andere verdünnte Säuren oder
ein saures Salz anwenden, z. B. verdünnte Phosphorsäure,
verdünnte Selensäure oder Kaliumbisulfat. Bei vielen Säuren
ist es nicht einerlei, ob man erst die Jodjodkaliumlösung
und nachher die Säure zuflieszen lässt oder umgekehrt. Dieses
ist nämlich der P'all mit verdünnter Salzsäure (2 1/2 ^/o), verdünnter
Essigsäure (2 %), Weinsteinsäure, Zitronensäure und Benzoesäure.
In den verdünnten Lösungen dieser Säuren löst sich das Chitosan.
Bringt man die Präparate auf den Objektträger in ein kleines
Quantum der Lösung einer dieser Säuren, so findet Lösung des
Chitosans statt. Fügt man darauf JodjodkaUumlösung hinzu, so
bildet sich ein körniges, rotviolettes Präzipitat. Behandelt man die
Präparate erst mit JodjodkaUumlösung und nachher mit der
verdünnten Lösung einer der genannten Säuren, so bleiben die
Präparate intakt und zeigen nur die schöne Violettfärbung.

Die Farbe, welche Jod in Kombination mit sauer reagieren-
den Stoffen hervorbringt, ist meist rotviolett (Kl. et V. 556^ bei
Plasmodiophora Brassicae mit Jod und Schwefelsäure). Verschie-
dene Ursachen scheinen die Nuance mehr oder weniger modi-
fizieren zu können. JodjodkaUumlösung und Kaliumbisulfatlösung
rief sogar eine blauviolette Färbung hervor.

Wenn man die Chitosanpräparate mit JodjodkaUumlösung und
sehr verdünnter Schwefelsäure, z, B. i o/oiger, violett gefärbt
hat und darauf 661/2- oder 76 "/oige Schwefelsäure hinzufügt,
so verschwindet die Violettfärbung. Falls die Präparate zellulose-
haltige Membrane enthalten, so tritt dann bei diesen Blaufär-
bung auf (Fig. 2).

Wie oben erwähnt, zeigt Chitosan einen basischen Charakter
und enthält gewisze Atomgruppen ; es geht demzufolge mit
vielen Stoffen Verbindingen ein. Einige dieser Verbindungen
sind in Wasser löslich, andere dagegen nicht. Aus den wässerigen
Lösungen der löslichen Chitosansalzen kann das Chitosan durch
viele Stoffe präzipitiert werden. Zu diesen Stoffen gehören auch

i84

die, welche für die Präzipitation der Alkaloide benutzt werden.
Ich bereitete mit 2%iger Essigsäure eine iVoig^ Lösung
von Chitosan, das aus Chitin von Crangon vulgaris dargestellt
war und das durch Präzipitation gereinigt war. Diese Lösung
gab mit den folgenden Lösungen Präzipitate : verdünnte
Schwefelsäure (Präzipitat, das aus losen Körnern besteht),
Jodjodkaliumlösung (Jod 5, Jodkalium 10, Wasser bis 100,
violettes Präzipitat), Pikrinsäure (1 : too, häutiges Präzi-
pitat), Picrolonsäure (gesättigte Lösung), Trinitrokresol, Kali-
umquecksilberjodidlösung (Mayer's Reagens, HgCl2 i, KJ 4,
Wasser 95), Quecksilberchloridlösung (1 : 20), Goldchloridlösung
(i : 20), Platinchloridlösung (i : 10), Palladiumchlorürlösung (i :
100), Kaliumwismutjodidlösung, Kaliumcadmiumjodidlösung,
Phosphomolybdänsäurelösung (häutiges Präzipatat), Phospho-
wolframlösung (häutiges Präzipitat), Ferrocyankaliumlösung (1 : lo,
häutiges Präzipitat), FerricyankaUumlösung (i : 10, häutiges
Präzipitat), Kaliumbichromatlösung, Kaliumchromatlösung, sehr
verdünnte Chromsäurelösung und Lösung von i, 2-naphtochinon-
4-sulfosaurem Natrium (häutiges, orangefarbenes Präzipitat). Mit
10 Voiger Tanninlösung erhielt ich kein Präzipitat. Als ich aber
eine konzentriertere Chitosanlösung benutzte, entstand mit
10 '^/oigev Tanninlösung ein häutiges Präzipitat im Überflusz,

Wenn man anstatt Chitosanlösungen tierische und pflanzliche
Präparate benutzt, in welchen auf die angegebene Weise das
Chitin in Chitosan umgewandelt ist, so entstehen durch Behandl-
ung mit Präzipitiermitteln dieselbe Verbindungen, welche sich
sonst bei der Präzipitation bilden. Man kann dabei konstatieren,
dasz die Chitosanpräparate, die weniger fest sind als die
ursprüngliche Chitinpräparate, wieder fester werden.

Falls die Chitosanverbindungen eine intensive Farbe besitzen,
kann man nach Behandlung mit Reagenzien die Skeletteilen der
Tiere und die Zellwände der Fungi, die ursprünglich aus Chitin
bestanden oder chitinhaltig waren, an der erhaltenen Farbe
erkennen. Falls die gebildete Chitosanverbindung farblos ist, so
kann man versuchen, den Stoff, der durch das Chitosan festge-
legt ist, in eine gefärbte Verbindung umzuwandeln. Wenn
solches gelingt, so kann man die ursprünglich chitinhaltigen Skelet-
teile und Zellwände an der hervorgerufenen Farbe unterscheiden.

Pikrinsäure (Fig. 4), Picrolonsäure, Trinitronaplitol, Trini-

i85

trokresol. Wie ein wollener oder seidener Faden durch eine
Pikrinsäurelösungbleibendgelbgefärbtvvird.im Gegensatz zu einem
baunjwollenen, welche durch Auswaschen mit Wasser die gelbe
Farbe bald verliert, so werden auch tierische und pflanzliche
Chitosanpräparate bleibend gelb gefärbt, während zellulose-
haltige Zellwände den gelben Farbstoff nicht festhalten. Anstatt
einer Pikrinsäurelösung kann man auch Lösungen von Picrolon-
säure, Trinitronaphtol und Trinitrokresol benutzen. Die Farbe
ist intensiver je nachdem der Chitosan- oder der ursprüng-
liche Chitingehalt gröszer ist. Die untersuchten tierischen
Präparate färbten sich intensiv gelb und von den pflanzlichen
Objekten zeigten die folgenden intensive Gelbfärbung: Agaricus
campestris, Polyporus versicolor, Peltigera canina, Aspergillus
giganteus und Plasmodiophora Brassicae. Bei dem letzten Objekt
bilden die gelb gefärbten Sporen einen Kontrast mit den farblos
bleibenden Zellulosewänden von Brassica. Die gelbe Farbe, welche
ich bei Agaricus campestris mit Pikrinsäure, Picrolonsäure, Trini-
trokresol und Trinitronaphtol erhielt, stimmte resp. mit Nr. 226, 201,
211 und 176 der Code des Couleurs sow Klincksieck tX Valette
überein. Wenn man Chitosanpräparate durch einen der vier oben-
genannten Stoffe gelb färbt und nachher mit Jodjodkaliumlösung
und verdünnter Schwefelsäure behandelt, so wird die gelbe Farbe
durch die bekannte violette ersetzt. Chitin wird durch die vier
obengenannten Stoffe nicht gelb gefärbt.

Ferrocyanwasser Stoff säure. (Fig. 3). Ferrocyanwasserstoff-
säure bildet mit Chitosan eine unlösliche Verbindung. Auch
wenn man Chitosanpräparate in eine Lösung von Ferrocyan-
kalium, der man etwas verdünnte Schwefelsäure zugefügt hat,
oder erst in verdünnte Schwefelsäure und später in i "/oige
Ferrocyankaliumlösung bringt, entsteht die Verbindung. Man
kann die Präparate mit Wasser auswaschen und auskochen,
ohne dasz sie zersetzt wird. Wenn man, nachdem man auf
diese Weise das Ferrocyankalium und die nicht gebundene
Ferrocyanwasserstoffsäure sorgfältig entfernt hat, die Präparate
mit einer Lösung eines Ferrisalzes, z. B. des Ammoniumferri-
sulfats, behandelt, so wird Berlinerblau gebildet. Diese unlös-
liche Verbindung entsteht in äuszerst feiner Verteilung in den
Skeletteilen oder Zellwänden, so dasz diese sehr gleichmäszig
blau gefärbt werden (Kl. et V. 401, 402 und 406). Die blaue

i86

Farbe ist stärker, je nachdem der Chitosan- resp. Chitingehalt
gröszer ist. Die untersuchten tierischen Chitosanpräparate
werden dunkelblau gefärbt und das ist auch mit den Chitosan-
präparaten von Agaricus campestris, Polyporus versicolor, Pel-
tigera canina, Aspergillus giganteus und Plasmodiophora Bras-
sicae der Fall. Bei dem letzten Objekt beobachtet man die
blaugefärbten Sporen inmitten des farblos gebliebenen Parenchyms.

Die Verbindung der Ferrocyanwasserstoffsäure mit dem Chi-
tosan wird durch Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefel-
säure nicht zersetzt. Die mit Ferrocyanwasserstoffsäure behan-
delten Chitosanpräparate werden dadurch nicht violett gefärbt.
Wenn man Chitinpräparate auf die obenbeschriebene Weise
mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem Ferrisalz behandelt,
tritt keine Blaufärbung auf.

Feryicyanwasserstoffsäiire. (Fig. 3). Anstatt sukzessiver
Behandlung mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem Ferrisalz
kann man auch sukzessive Behandlung mit Ferricyanwasserstoff-
säure und einem Ferrosalz anwenden. Man verfährt, wie oben
angegeben ist, aber benutzt statt Ferrocyankalium Ferricyan-
kalium und statt Ammoniumferrisulfat ein Ferrosalz, z. B.
Ammoniumferrosulfat. Anstatt Berlinerblau entsteht Turnbull 's
Blau. Die Methode führt zu ähnlichen Resultaten wie die vorige
und die Empfindlichkeit beider ist auch ungefähr dieselbe.
Zellulose und Chitin werden nicht gefärbt.

Phosphomolybdänsäure. (Fig. 3). Mit Phosphomolybdänsäure
bildet Chitosan eine unlösliche Verbindung, die auch entsteht,
wenn man Chitosanpräparate in eine lO/^ige Lösung von
Phosphomolybdänsäure bringt. Wenn man die Präparate später
mit Wasser auswäscht oder auskocht, um nicht gebundene
Phosphomolybdänsäure zu entfernen, und darauf in sehr ver-
dünnte Zinnchlorürlösung bringt, so färben alle Skeletteile oder
Zellwände, die aus Chitosan bestehen oder chitosanhaltig sind,
sich blau (Kl. et V. 401, 402, 403, 406, 432, 437). Die blaue
Farbe ist dunkler, je nachdem der Chitosangehalt, resp. der
Chitingehalt, gröszer ist. Dunkel ist die Farbe bei den unter-
suchten tierischen Produkten und bei Agaricus campestris,
Polyporus versicolor, Peltigera canina, Aspergillus giganteus
und Plasmodiophora Brassicae. Die Zellulosewände bleiben
vollkommen farblos. Wenn diese sich neben chitosanhaltigen

i87

befinden, wie bei der Untersuchung von Plasmodiophora Brassicae
der Fall ist, so kann man beide sehr deutlich von einander
unterscheiden. Chitin wird nicht blau gefärbt.

Anstatt der Phosphomolybdänsäurelösung kann man auch
eine Natriumphosphomolybdänatlösung und verdünnte Schwefel-
säure anwenden. Man legt die Präparate erst in verdünnte
Schwefelsäure und behandelt sie darauf mit i Vo^g^r Natrium-
phosphomolybdänatlösung.

Anstatt der Zinnchlorürlösung kann man auch andere
reduzierende Stoffe benutzen, um Blaufärbung hervorzurufen,
z. B. Ferrosulfat oder Wasserstoff in statu nascenti. Zinnchlorür-
lösung verdient aber den Vorzug. Ihre Anv/endung ist bequem
und führt schnell zum Ziel.

Phosphowolframsäure. Mit Phosphowolframsäure kann man
bei Chitosanpräparaten eine ähnliche Reaktion hervorrufen, wie
mit Phosphomolybdänsäure. Nach Behandlung mit einer i o/^-
igen Phosphowolframsäurelösung, nach Auswaschen mit Wasser
und nach langem Erwärmen mit verdünnter Zinnchlorürlösung
bekommt man Blaufärbung (Kl. et V. 437). Diese Reaktion
ist weniger empfelungswert als die mit Phosphomolybdänsäure,
mittels welcher man die Färbung schnell und ohne Erwärmen erzielt.

Goldchlorid, H Au CI4, 4 H2 O (3 Hg O). Mit Goldchlorid
geht Chitosan eine unlösliche Verbindung ein, die auch entsteht,
wenn man tierische oder pflanzliche Chitosanpräparate in Gold-
chloridlösung bringt. Wie bekannt, erzeugt Oxalsäure beim
Erwärmen in stark verdünnter Goldchloridlösung zunächst eine
blaue Färbung, welche allmählich in einen rotbraunen Nieder-
schlag von metallischem Gold übergeht. Eine gleiche Reaktion
bewirkt Eisenvitriol- oder Eisenchlorürlösung schon in der
Kälte. Zinnchlorürlösung verursacht in sehr verdünnter Gold-
chloridlösung eine purpurrote bis rotbraune Färbung. In kon-
zentrierteren Goldchloridlösungen bewirkt dieses Reagens einen
dunkelpurperroten, bisweilen rotbraunen Niederschlag eines
Gemisches, welches als Cassiusschtv Goldpurpur oder als
Mineralpurpur bezeichnet wird. Dasselbe besteht nach ZsiGMONDY
aus zinnoxydhaltigem, fein verteiltem, kolloidalem Gold, bzw. aus
einem Gemenge von kolloidaler Zinnsäure mit kolloidalem Gold.

Wenn man Chitosanpräparate mit Goldchlorid behandelt und
mit Wasser sorgfältig auswäscht oder auskocht, um das nicht

gebundene Goldchlorid zu entfernen, und nachher mit Oxal-
säure-, Ferrosulfat- oder Zinnchlorürlösung behandelt, so kann
man bei denselben ähnliche Färbungen wahrnehmen, wie
obenerwähnt, nämlich nach schwachem Erwärmen mit Oxal-
säure blauviolett oder rotviolett (Kl. et V. 487 — 587), mit Fer-
rosulfat meist blau (407) und mit verdünnter Zinnchlorürlösung
violett (502), rotviolett, orangerot oder orange (127 — 128). Die
Färbungen, die Goldchlorid in Kombination mit reduzierenden
Stoffen bei Chitosanpräparaten hervorruft, sind im allgemeinen
sehr dunkel. Ich bemerke, dasz oft auch bei dem Zellinhalt
Färbung eintritt, was die Untersuchung erschwert. Verholzte
Zellwände werden durch Goldchlorid violett gefärbt. Chitin
und Zellulose werden nicht gefärbt.

Tannin. Tannin geht mit Chitosan eine Verbindung ein.
Demzufolge bemerkt man, dasz Chitosanpräparate in lo/oiger
Tanninlösung ein ganz anderes Aussehen bekommen. Wenn
man die mit Tanninlösung behandelten Präparate wiederholt
sorgfältig mit Wasser auswäscht und später mit Ferriacetat-
lösung behandelt, färben sie sich schwärzlichblau, während
man mit Kaliumbichromat- und Uranacetatlösungen braune
Färbungen erhält.

Für den Nachweis des Chitosans, resp. des Chitins, kann
ich aus verschiedenen Ursachen Tannin nicht empfehlen. Die
Färbungen, welche -Tannin in Kombination mit Gerbstoffrea-
genzien den Chitosanpräparaten erteilt, sind verhältnismäszig
schwach. Aus den nicht chitosanhaltigen Zell wänden kann
man das Tannin nicht leicht entfernen, so dasz manchmal auch
diese mit Ferriacetatlösung eine schwärzlichblaue Farbe zeigen.
Wenn man die Präparate mit Wasser auskocht, wird die
Tanninreaktion bei den chitosanhaltigen Wänden schwächer.
Das Tannin wird dem Chitosan entzogen. Das Chitosan scheint
also mit dem Tannin nur eine lose Verbindung einzugehen.
Chitosanpräparate, die man mit Tanninlösung behandelt hat,
färben sich mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefel-
säure violett. Das Eintreten dieser Reaktion wird deshalb durch
das Tannin nicht verhindert.

Salpetrige Säure. BRACH 1) hat betont, das obschon man

») 1. c.

i89

annehmen musz, das im Chitosanmolekül Acetylgruppen an
primairen Aminogruppen gebunden sind, der Stickstoff durch
die Einwirkung der salpetrigen Säure doch quantitativ abgespalten
wird. In Übereinstimmung hiermit findet, wenn man ein Chitos-
anpräparat in Kaliumnitritlösung legt und verdünnte Schwefel-
säure zufügt, Gasentwicklung und Lösung des Präparates statt.
Diese Lösung ist vollständig, wenn das Präparat ganz aus
Chitosan besteht, während, wenn solches nicht der Fall ist, ein
unlöslicher Rest zurückbleiben kann. Chitin zeigt in Kalium-
nitritlösung und verdünnter Schwefelsäure keine Änderung.

1,2 - Naphtochinon - 4 - siilfosaurcs Natrium 1). (Fig 5). Wie
bekannt, ist 1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurcs Natrium zur
Identifizierung von Aminoverbindungen empfohlen worden. Eine
schwach saure Lösung von Anilin in Essigsäure z. R. gibt mit
einer Lösung von 1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurem Natrium
ein orangerotes kristallinisches Präzipitat.

O 00

;0 / \/ \:0 /\/\.OH

+ CeIl5NHa->S03HNa +

SOgNa NH. CgHp N.CgHg

Obschon die meisten Chemiker annehmen, dasz der Stick-
stofï im Chitosan secundair gebunden ist, habe ich doch
untersucht, ob genanntes Reagens für den mikrochemischen
Nachweis des Chitosans dienen konnte. Eine schwach saure
Lösung von Chitosan in Essigsäure gibt mit einer Lösung von
1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurem Natrium ein zimtfarbenes
Präzipitat. Wenn man tierische oder pflanzliche Chitosanprä-
parate in eine derartige Lösung bringt, so nehmen sie allmäh-
lich eine zimtbraune Farbe an (Kl. et V. orange 102, 103, 106,
107, 126), die intensiver ist, je nachdem die Objekte, mehr
Chitosan enthalten. Zu den Objekten, bei welchen die Farbe
sehr intensiv wird, gehören die beiden tierischen Objekte und
von den pflanzlichen Objekten Agaricus campestris, Polyporus
versicolor, Peltigera canina, Aspergillus giganteus und Plas-
modiophora Brassicae. SchAvaches Erwärmen beschleunigt die

*) Th. Weyl, Die Methoden der Organischen Chemie, 2. Bd. (Bes. Teil), 2.
Abt. (191 0. P- 1305-

Reaktion. Bei der Untersuchung von Plasmodiophora Brassicae
fallen die orangefarbenen Sporen inmitten des farblosen Paren-
chyms sehr auf. Die gewöhnlichen Zellulosewände färben sich
nicht. Auch bleibt Chitin in einer Lösung von 1,2 - naphto-
chinon - 4 - sulfosaurem Natrium farblos.

Wenn man die orange gefärbten Präparate mit verdünnter
Salzsäure oder Schwefelsäure behandelt, so wird die Farbe
wenig modifiziert. Bringt man sie aber in verdünnte Kalilauge
oder Salmiakgeist, so wird die Orangefarbe in Olivengrün um-
gewandelt (Kl. et V. gelb 202, 203, 207). Durch Jodjodkalium-
lösung und verdünnte Schwefelsäure werden die orangefarbenen
Präparate nicht violett gefärbt.

ScJiJvefelkohlenstoff. Schwefelkohlenstoff reagiert mit primären
und sekundären Aminen. Mit primären und secundären Aminen
der alipathischen Reihe bildet er alkylierte resp. dialkylierte
Dithiokarbaminsäure :

2C2H5.NH2 + CS2 -> C0H5.NH.CSSH, H2N.C2H5

Athylamin äthyldithiokarbaminsaures Äthylamin.

2(C2H5)2NH + CS3 -^ (CoH.5)2N.CSSH, HN(C2H5)2

Diäthylamin. di.Hthyldithiokarbaminsaures Diälhylamin.

Es lag deshalb auf der Hand zu untersuchen, ob Schwefel-
kohlenstoff auch mit Chitosan reagiert. Es zeigte sich, dasz
das der Fall war. Weil das Reaktionsprodukt unlöslich ist,
behalten die Präparate vollkommen ihre Struktur. Wenn man
Chitosanpräparate aus absolutem Alkohol in Schwefelkohlenstoff
überträgt und lange hiermit in einem Wasserbade erwärmt, so
zeigt CS sich, dasz das Verhalten Reagenzien gegenüber sich
ganz geändert hat. Mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter
Schwefelsäure bekommt man keine Violettfärbung mehr; die
Präparate färben sich gelb bis braun ; in verdünnter Essigsäure,
verdünnter Salzsäure und in salpetriger Säure (Kaliumnitrit mit
verdünnter Schwefelsäure) findet keine Auflösung mehr statt.

Alkylierung. Jodmethyl lagert sich in der Mehrzahl der
Fällen an primäre, sekundäre und tertiäre Basen an. Primäre
und sekundäre Basen liefern Jodhydrate der methylierten Basen,
aus welchen Verbindungen durch Alkali die freien methylierten
Amine ausgeschieden werden :

R.NHa 4-»JCH3 -> ^^^ > NII.JII (|- KOH) ^> ^^ > NH
RjNH + JCH3 -> R > N.JII (+ KOII) -> R > N

CH3 ^Hg

Tertiäre Basen liefern durch Alkali nicht zerlegbaren substi-
tuierten Ammoniumjodide :

R > N + JCH3 — >- R > N < ?"»

Nimmt man bei der Methylierung eines primären Amins den
entstehenden Jodwasserstoff durch Alkali fort, so gelangt man
durch weitere Einwirkung von Jodmethyl und Alkali stufen-
weise bis zum Jodid der quaternären Base.

Es lag auf der Hand zu untersuchen, welche Änderungen das
Chitosan erfährt, wenn man es abwechslungsweise einige Male
mit Jodmethyl und mit Alkali behandelt. Die Chitosanpräparate
wurden aus absolutem Alkohol in das Jodmethyl übertragen und
lange mit diesem und darauf mit alkoholischer Kalilauge er-
wärmt. Dreimal wurde solches wiederholt. Das Resultat dieser
Versuche war, dasz in allen Fällen sowohl bei tierischen als
pflanzlichen Objekten das Chitosan in ein Produkt umgewan-
delt wurde, das auch unlöslich war, so dasz die Präparate bei
zweckmäsziger Behandlung intakt blieben, aber das Reagenzien
gegenüber sich auf ganz andere Weise als Chitosan verhielt.
Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefelsäure rief keine
Violettfärbung mehr hervor; die Präparate färbten sich orange.

Weil das Übertragen ins Wasser den Präparaten manchmal
schadet, ist es erwünscht sie mit Alkohol und Wasser auszuwaschen
und darauf mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure
zu behandeln.

Acylieyting. Wie schon erwähnt, kommt im Chitosan primär
oder secundär gebundener Stickstoff vor. Auch ist es möglich,
dasz wie im Glucosamin auch im Chitosan Hydroxylgruppen an-
wesend sind. Man kann deshalb erwarten, dasz Chitosan mit
Säurechloriden und Säureanhydriden neue Verbindungen bilden
wird, nämlich zusammengesetzten Äther oder Aminosäuren.
Einige Chemiker haben schon durch Acylierung mit Essig-
säureanhydrid und Propionsäureanhydrid Derivate von Chitosan
erhalten. Es lag deshalb auf der Hand auch den Wert der

192

Acylierung für die mikrochemische Untersuchung zu studieren.

Mit verschiedenen Stoffen habe ich Acylierungsversuche ange-
stellt, nämlich mit Chloriden von Säureradikalen : Acethylchlorid
und Benzoylchlorid und mit Anhydriden von Säuren : Essigsäure-,
Bernsteinsäure-, Benzoesäure- und Phtalsäureanhydrid. Die
Chloride der Säureradikale liesz ich bei der gewöhnlichen
Temperatur auf die Chitosanpräparate einwirken und die
Säureanhydride unter Erwärmen im Wasserbade. Die Säurechloride
liesz ich als solche einwirken. Das flüssige Essigsäureanhydrid
benutzte ich auch meist als solches, aber auch in alkoholischer
Lösung. Die festen Säureanhydride wendete ich in Lösung an.
Für Lösungsmittel dienten absoluter Alkohol, Benzol und Toluol.
Die Lösungen enthielten gewöhnlich 5 0/0 Anhydrid. Freilich
bilden sich beim Gebrauch vom absoluten Alkohol als Lösungs-
mittel allmählich zusammengesetzte Äther und deshalb scheint
seine Anwendung weniger rationell. Die Acylierung wird aber
durch den Alkohol nicht verhindert.

Bei den obenerwähnten Versuchen musz man darauf achtgeben,
dasz die Flüssigkeit aus welcher man ein Präparat nimmt,
mischbar ist mit der, in welche man es überträgt. Man musz
z. B. kein Präparat direkt aus Wasser in Benzol oder Toluol bringen,
sondern man musz es erst mit absolutem Alkohol auswaschen.

Die Acylierung führte im allgemeinen zum Resultate, dasz
das Chitosan in eine in Wasser unlösliche Verbindung umge-
wandelt wurde, während die Zelhvände vollkommen intakt
blieben. Die neuen Körper, welche man bei den Acylierungs-
versuchen erhält, verhalten sich Reagenzien gegenüber anders
als das Chitosan, während sie untereinander auch verschieden
sind, was mit den eingeführten Säureresten zusammenhängt.
Deshalb werde ich erst die Resultate, welche das Acetylieren
lieferte, erwähnen.

Nach dem Acetylieren verhalten sich die Präparate verschie-
denen Reagenzien gegenüber, als ob sie aus Chitin beständen
oder chitinhaltig wären. Hierbei musz ich aber bemerken, dasz man
doch nicht annehmen darf, dasz man Chitin wiederbekommen hätte-

Wenn man die acetylierten Präparate mit Jodjodkaliumlösung
behandelt, so färben sie sich gelb oder orange ; nach Hinzufügung
von verdünnter Schwefelsäure geht die Farbe aber nicht in
violett über. Wie Chitin, widerstehen die Präparate eine

^93

Erwärmung bis auf 300 0 C in Glyzerin, während Chitosan-
präparate dadurch zersetzt und gelöst werden. Verschiedene
Reaktionen, welche Chitosan zeigt, kann man bei den Präparaten
nicht mehr hervorrufen. Wenn man sie z. R. hintereinander mit
Ferrocyanwasserstoffsäure (Ferrocyankaliumlösung und verdünnte
Schwefelsäure) und mit einer Lösung eines Ferrisalzes oder
mit Phosphomolybdänsäure und sehr verdünnter Zinnchlorürlösung
behandelt, so färben sie sich nicht mehr blau. In salpetriger
Säure (Kaliumnitritlösung und verdünnte Schwefelsäure) lösen
sich die Präparate nicht mehr. Auch in verdünnter Essigsaure
und verdünnter Salzsäure sind sie unlöslich geworden.

Wenn man die Präparate wieder mit konzentrierter oder
500/oiger Kalilauge erwärmt, entsteht wieder Chitosan. Wenn
man sie darauf mit absolutem Alkohol auswäscht und mit
Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure behandelt,
so zeigen sie wieder die schöne Violettfärbung der Chitosans.
Auch die anderen Reaktionen, welche dem Chitosan zukommen,
wie die Blaufärbung mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem
Ferrisalz und mit Phosphomolybdänsäure und Zinnchlorür, kann
man wieder bei den Präparaten hervorrufen. Verdünnte Essig-
säure und verdünnte Salzsäure lösen die Präparate wieder
ganz oder teilweise auf.

Das Benzoylieren führt zu ähnlichen Resultaten wie das
Acetylieren. Nach dem Benzoylieren ist das Chitosan in eine
Verbindung umgewandelt, die sich mit Jodjodkaliumlösung
gelb oder braun färbt, welche Farbe durch Hinzufügung ver-
dünnter Schwefelsäure nicht in violett übergeht. Die benzoylierten
Präparate werden durch Ferrocyanwasserstoffsäure und ein
Ferrisalz, durch Ferricyanwasserstoffsäure und ein Ferrosalz
und durch Phosphomolybdänsäure und Zinnchlorür nicht blau
gefärbt. In verdünnter Essigsäure und verdünnter Salzsäure
sind sie unlöslich. Wenn man sie mit konzentrierter Kalilauge
erwärmt hat, so verhalten sie sich wieder wie Chitosanpräparate ;
Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefelsäure z. B. rufen
wieder Violettfärbung hervor.

Die mit i,2-naphtochinon-4-sulfosaurem Natrium behandelten
Chitosanpräparate lösen sich unter Gasentwicklung in salpetriger
Säure. Wenn man sie durch Erwärmen mit Essigsäureanhydrid
oder mit einer alkoholischen Benzoesäureanhydridlösung acety-

194

liert oder benzoyliert, so zeigen sie keine Änderung ; nach der
Acylierung haben sie auch ihre Orangefarbe behalten, aber sie
widerstehen dann der Einwirkung der salpetrigen Säure.

Mit Dikarbonsäureanhydriden erhielt ich zum Teil andere
Resultate als mit Monokarbonsäureanhydriden. Phtalsäureanhy-
drid reagiert mit Aminen und mit Alkoholen. Es bildet z. R.
mit AniUn Phtalanilsäure COOH. Cg H4. CO. NH. Cg H5 und
mit primären und sekundären Alkoholen in Sodalösung lös-
liche Ester :

Ce H4<(^^>0 + R. CH, O H --> Q H,<^^OCH, R

Beim Acylieren von Chitosanpräparaten mit Phtalsäurean-
hydrid erhielt ich die folgenden Resultate: Nach Erwärmen
mit einer Lösung von Phtalsäureanhydrid färben die Präparate
sich mit Jodjodkaliumlösung gelb oder orange, welche Farbe durch
verdünnte Schwefelsäure nicht in violett übergeht. Durch Ferro-
cyanwasserstofïsaure und ein Ferrisalz, durch Ferricyanwasser-
stoffsäure und ein Ferrosalz und durch Phosphomolybdänsäure
und Zinnchlorür werden sie nicht blau gefärbt. In verdünnter
Essigsäure (2 "/o) und in verdünnter Salzsäure sind die Präpa-
rate unlöslich. Auch in salpetriger Säure lösen sie sich nicht.
Sie sind aber löslich in verdünnter Kalilauge (4 X N) und in
Sodalösung. Die Auflösung ist vollständig oder ein unlöslicher
Rest bleibt zurück (Plasmodiophora Brassicae). Die Löslichkeit
in verdünnten Alkalien und kohlensauren Alkalien bildet einen
Unterschied mit den Resultaten der Acetylierung und Ben-
zoylierung.

Beim Erwärmen der Chitosanpräparate mit einer Lösung von
Bernsteinsäurennhydrld bekommt man ähnliche Resultate wie
mit Phtalsäureanhydrid. Nach der Behandlung werden die
Präparate durch Jodjodkaliumlösung gelb oder orange gefärbt
und diese Farbe geht durch Hinzufügung von verdünnter
Schwefelsäure nicht in violett über. In verdünnter Essigsäure
und verdünnter Salzsäure findet keine Lösung statt, aber wohl
ist das Reaktionsprodukt löslich in verdünnter Kalilauge und
Sodalösung.

Die folgende Methode kann man zur Kontrolle der oben-
beschriebenen Versuche anwenden. Man behandelt die Chito-

195

sanpräparate mit einem Lösungsmittel, z. B. mit verdünnter
Essigsäure und fügt darauf die Reagenzien hinzu. Man legt
die Chitosanpräparate auf den Objektträger in ein Tröpfchen
2 Vo^o^^ Essigsäure. Hierin löst sich das Chitosan. Darauf
läszt man unter dem Deckglase ein der Reagenzien
zuflieszen, nämlich Ferrocyanwasserstoffsäure, Ferricyanwasser-
stoffsäure, Phosphomolybdänsäure, naphtochinonsulfosaures Na-
trium, Pikrinsäure oder Picrolonsäure. Genannte Reagenzien
verursachen häutige oder körnige Niederschläge. Die, welche
Ferrocyanwasserstoffsäure, Ferricyan wasserstoffsäure und Phos-
[ihomolybdänsäure hervorrufen, ffirben sich resp. mit Ferrisalz,
Ferrosalz und Zinnchlorür blau.

In einer früheren Abhandlung über die Mikrochemie der
Pilzzellwände habe ich i) erwähnt, dasz man chitinhaltige Zell-
wände bis auf 300° C in Glyzerin erhitzen kann, ohne dasz das
Chitin sich dabei zersetzt und ohne dasz das Gewebe destruiert
wird, während viele andere Zellwandstoffe zersetzt und aufgelöst
werden. Die chitinhaltigen Wände erfahren gleichsam eine
Reinigung. Diese Methode kann man mit allen obenerwähnten
Methoden kombinieren. Erst erhitzt man die Präparate bis auf
300° in Glyzerin, durch Erwärmen in konzentrierter Kalilauge
verwandelt man das Chitin in Chitosan und darauf wendet
man die verschiedenen Reaktionen an, welche B'ärbung und
Auflösung hervorbringen. Die vorhergehende Erwärmung in
Glyzerin dient zur Kontrolle und zur Verschärfung der Methode.

Ohne Erhitzen in Glyzerin gelingt es z. B. nicht in den
Sporenschläuchen von Peltigera canina Chitin nachzuweisen.
Die Hyphen und Paraphysen zeigen nach Erwärmen bis auf
160° C in konzentrierter Kalilauge sehr deutlich die Violett-
färbung mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure.
Bei den Sporenschläuchen wird diese Reaktion durch das
Lichenin (nach Berg 2) Isolichenin) maskiert, das in beträcht-
licher Quantität anwesend ist und mit Jodreagenzien sich intensiv
blau färbt. Mit anderen Reagenzien kann man bei den Hyphen
und Paraphysen auch leicht Chitosan nachweisen, aber bei den
Sporenschläuchen ist die Quantität dafür zu gering. Durch

1) 1. c. p. 643.

1) Berg, Jahresber. f. Chemie (1873), p. 849.

Erhitzen bis auf 300° in Glyzerin wird das Lichenin (Isolichenin)
aus der Zellwand entfernt und danach findet mit Jod keine
Blaufärbung mehr statt. Wenn man nach dem Erhitzen in
Glyzerin die Präparate bis auf 160° in konzentrierter
Kalilauge erwärmt und mit absolutem Alkohol auswäscht, so
färben auch die Sporenschläuche sich mit Jodjodkaliumlösung und
verdünnter Schwefelsäure violett. Die Farbe ist deutlich aber
hell. Der Rest der Sporenschläuche ist zum Teil löslich in ver-
dünnter Essigsäure ; er besteht deshalb nicht ganz aus Chitosan.
Neben Lichenin (Isolichenin) und verschiedenen anderen Stoffen
enthalten die Sporenschläuche offenbar auch etwas Chitin.

Zusammenfassung.

Chitin und Chitosan verhalten sich Reagenzien gegenüber
sehr verschieden. Chitin ist ein verhältnismäszig indifferenter
Körper. Es wird nur durch kräftige Reagenzien, wie starke
Mineralsäuren, Ätzkalien und kräftige Oxydationsmittel ange-
griffen. Chitosan dagegen reagiert mit einer Menge verschie-
dener Stoffe. Was wir von der chemischen Struktur dieser
beiden Körper wissen, reicht noch lange nicht aus, um das
verschiedene Verhalteq Reagenzien gegenüber zu erklären.
Unsere Kenntnis von der chemischen Struktur des Chitins ist
noch sehr unvollständig und ungewisz. Die chemische Struktur
des Chitosans ist zwar auch noch nicht vollständig bekannt,
aber durch die Untersuchungen der Chemiker ist doch soviel
ans Licht gekommen, dasz ich met Erfolg nach neuen mikro-
chemischen Methoden suchen konnte zum Nachweis dieses
Zersetzungsproduktes des Chitins.

Aus dieser Publikation geht hervor, dasz man Chitosan nicht
nur mittels Jod und einer Säure (verdünnte Schwefelsäure),
sondern noch auf verschiedene andere Weisen mikrochemisch
in den Zellwänden und Geweben nachweisen kann. Von den
neuen Methoden erwähne ich zunächst einige, wobei die Zell-
wand gefärbt wird, als die Nachweisung des Chitosans mittels
Ferrocyanwasserstoffsäure (Ferrocyankalium und verdünnte
Schwefelsäure) und eines Ferrisalzes (Ammoniumferrisulfat),
mittels Ferricyanwasserstoffsäure (Ferricyankalium und verdünnte
Schwefelsäure) und eines Fcrrosalzes (Ammoniumferrosulfat),

197

mittels Phosphomolybdänsäure und sehr verdünnter Zinnchlorür-
lösung, mittels i,2-naphtochinon-4-sulfosaures Natriums, Pikrin-
säure u. s. w. Bei Anwendung der drei ersten Methoden färben
sich die Zellvvände und Gewebe, die ursprünglich Chitin ent-
hielten, blau, mit naphtochinonsulfosaurem Natrium orange und
mit Pikrinsäure gelb. Die Präparate bleiben bei zweckmäsziger
und sorgfältiger Behandlung volkommen intakt.

Die gfenannten neuen Methoden zum mikrochemischen Nach-
weis des Chitins sind im allgemeinen sehr empfindlich und
stehen der auszerordentlich empfindlichen Reaktion mit Jodjod-
kaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure nur wenig nach.
Im Fall die Präparate viel Chitosan enthalten, ist die Färbung
sehr intensiv.

Auszer den genannten Methoden kann man noch andere
anwenden, als Acylieren mit Essigsäureanhydrid, Phtalsäure-
anhydrid, Bernsteinsäureanhydrid u.s.w. und Methylieren. Auch
können verschiedene Methoden kombiniert werden.

Zur näheren Kontrolle kann man noch die folgende Methode
anwenden. Man legt die Chitosanpräparate auf den Objektträger
in ein Tröpfchen verdünnter Essigsäure, in welcher das Chitosan
sich löst ; darauf läszt man unter dem Deckglase Reagenzien
zufliessen, die das Chitosan präzipitieren. Men erhält dann
körnige oder häutige, manchmal gefärbte Präparate.

Alle Methoden können durch vorhergehendes Erwärnen bis
auf 3000 in Glyzerin empfindlicher gemacht werden. Hierdurch
werden viele Zellstoffe zersetzt und aus der Wand entfernt, z. B,
das Lichenin (Isolichenin), das durch Jod intensiv blau gefärbt
wird und demzufolge die Chitosanreaktion mit Jod und ver-
dünnter Schwefelsäure maskiert. Chitin wird durch die Erhitzung
nicht angegriffen.

Da sich in der Natur verschiedene Zellwandstoffe finden, die
durch Jod blau oder violett gefärbt werden und auch Zellulose
nach Behandlung mit konzentrierter Kalilauge Blau- oder Violett-
färbung mit Jod zeigen kann, sind wiederholt Verwechslungen
vom Chitin mit anderen Stoffen vorgekommen. Die neuen
Methoden können jetzt zur Kontrolle angewendet werden.

Bei allen 10 untersuchten Fungi und bei den beiden unter-
suchten tierischen Objekten habe ich nach Erwärmung in kon-
zentrierter Kalilauge bis auf 1600 sowohl mit Jod und verdünnter

Schwefelsäure als mittels der neuen Methoden Chitosan resp,
Chitin nachgewiesen.

Schlieszlich bemerke ich, dass meine Beobachtungen nicht zu
Resultaten geführt haben, auf deren Grund man annehmen
könnte, dasz in der Natur nicht ein einziges Chitin, sondern
mehrere chemisch verschiedene chitinartige Körper vorkämen.

FIGURENERKLÄRUNG.

Die fünf Figuren stellen Präparate von Plasmodiophora Brassicae
vor. Durch Erhitzen mit 50°/oiger Kalilauge bis auf i6o<' in zuge-
schmolzenen gläsernen Röhrchen ist das Chitin in Chitosan umgewandelt.
Darauf sind die Präparate mit absolutem oder g^'^/o'igem Alkohol
ausgewaschen, in Wasser übertragen und, wie unten angegeben ist,
mit verschiedenen Reagenzien behandelt worden.

Fig. I, Mit verdünnter Jodjodkaliumlösung und lyoiger Schwefel-
säure, wodurch Violettfärbung der chitosanhaltigen Membranen
eintritt.
Fig. 2. Nach der Behandlung mit Jodjodkaliumlösung und i^/oiger
Schwefelsäure hat Einwirkung 66 '/2- oder yö^/oiger Schwefel-
säure stattgefunden, wodurch die Violettfärbung der chitosan-
haltigen Membranen verschwindet und die zellulosehaltigen
sich blau färben.
Fig. 3. Nach Behandlung mit Ferrocyan Wasserstoff säure (Ferrocyan-
kalium und verdünnte Schwefelsäure), sorgfältigem Auswaschen
oder Auskochen mit Wasser und Hinzufügung einer Ferrisalz-
lösung (Ammoniumferrisulfat), wodurch die chitosanhaltigen
Membranen infolge der Bildung von Berlinerblau sich blau
färben.

Wenn man anstatt Ferrocyankalium Ferricyankalium und
anstatt eines Ferrisalzes ein Ferrosalz (Ammoniumferrosulfat)
anwendet, färben sich die chitosanhaltigen Membranen infolge
der Bildung von TurnbuU's Blau auf ähnliche Weise.

Blaufärbung der chitosanhaltigen Membranen bekommt

man auch, wenn man auf ähnliche Weise wie die oben-

. genannten Reagenzien Phosphomolybdänsäurelösung und

sehr verdünnte Zinnchlorürlösung anwendet.

Fig. 4. Die chitosanhaltigen Membranen sind durch Pikrinsäurelösung

gelb gefärbt.
Fig. 5. Die chitosanhaltigen Membranen sind durch eine Lösung von
i,2-naphtochinon-4-sulfosaurem Natrium orange gefärbt.

EL XVI.

Folia Microbiologica III.

(v. WlSSEHNGH).

THE BACTERIOLOGICAL DIAGNOSIS
OF DIPHTHERIA i)

Dr. C. W. BROERS.

Director of the Central Laboratory of Public Health at Utrecht.

Since more and more attention is being paid to the rôle,
played by bacilli-carriers in the epidemiology of diphtheria,
the importance of the bacteriological diagnosis of diphtheria has
increased, but at the same time, the difficulties attached to it,
have become better known. This is the chief reason why the
bacteriology of diphtheria has enjoyed universal attention,
specially of late. It therefore seemed to me a good idea, to
make this subject a point of discussion in the Microbiological
Society.

The first question, that presents itself, of course is, what
is a diphtheria bacillus? The answer may be very short, namely,
that it is a coryne-bacterium which may cause diphtheria
in man.

The first part of this definition refers to a characteristic
namely the appearance of club-shaped, rounded ends, which
is typical for a large group of bacteria, to which the diphtheria
bacillus also belongs. The second part is not open to experi-
mental research. So in making a diagnosis the abovementioned
definition does not hold good.

The diphtheria bacillus has met with the same fate as so
many other pathogenic microorganisms ; at first it was thought
that the shape only would be enough to classify the microorga-
nism, but very soon it got known, that the same morpho-
logical characters belonged to many other, also non-pathogenic

^) Introductory to the discussion of this subject at the meeting of the
Microbiological Society held on I5ch of January 1915 (translated by Jeanne S.mit).

200

bacteria and from that moment onward, other differentiating
characters have been looked for.

It would be no use to sum up everything, that has become
known of late years to characterize the diphtheria bacillus.
I should - only like to mention the most inportant. Beside shape
and non motility, it is in the first place its reaction on diffe-
rent stains, namely the irregular staining of the protoplasm
by anilin dyes. The well-known staining method of Neisser,
which makes the metachromatic bodies of Babes-Ernst clearly
visible, is based on this characteristic of the diphtheria bacillus.

In the second place its reaction on Gram's staining should
be mentioned. Another character is found in the way in which
it grows on different culture media, specially the rapidity and
abundance of growth on LöFFLER'S serum (ox or horse serum
mixed to a proportion of 3:1 with glucose broth) and the
nature of colonies formed on it.

As is the case with so many other bacteria, it has also been
tried with the diphtheria bacillus, to find typical characteristics
in its reaction on several carbohydrates ; especially the production
of acid in glucose containing media plays an important part
as a diagnosticum and special attention is paid to the amount
of acid produced.

Is it possible now to make out with the help of these details,
which may be got in the way I suggested above and
which belong all of them to morphological or cultural proper-
ties, if a pure culture we are working on is one of true diphtheria
bacilli? In many cases, it is no doubt likely to be so, but we
dont get certainty, we only approach the truth and the more
we extend our investigation this way, the nearer we get to it.

Fortunately there are other characters which may help us
somehow one way or the other. These are derived from the
immuno-reactions and the experiments on animals. Analogical
to what was taught by other pathogenic microorganisms, several
serological reactions were tried for diphtheria too. In the first
place I should like to mention the agglutination.

If we follow the working-method, used for example in typhoid,
we dont get any satisfactory result. But other methods have been
worked out, for instance about 5 years ago in the laboratory
of Prof. SprONCK in Utrecht, which gave very useful results.

, 201

Very good too seems to be the method, which Miss Van
RiEMSDIJK pubhshed some time ago in the »Centralblatt für
Bakteriologie.«

With a strong agglutinable serum we certainly obtain again
and again very marked differences between diphtheria bacilli
und bacteria, which are more or less allied to them. It is my
experience though and, as the bacteriological literature teaches,
that of most experimentors, who have occupied themselves with
diphtheria agglutination, that most unexpected surprises are
obtained. Thus one culture possessing every possible character
of a diphtheria bacillus, virulence included, is not agglutinated,
as another strain which was thought to be one of pseudo-
diphtheria agglutinates very well indeed. This must of course
be due to the imcomplete working-method and we may expect
that the difficulties, that have presented themselves so far
will disappear.

The precipitation reaction has not yet been able to find a
place in the examination of diphtheria either. We tried to
get something suitable out of the application of the thermo-
precipitation, with which Ascoli had such splendid results with
anthrax, but have failed so far. The complement fixation test
does not give any result equal to the very complicated techi-
nical difficulties of this method.

It is much safer all round, to call in the assistance of the
experiment on animals. The diphteria bacillus is a toxin-producer
and this toxin is not only harmful to man, but may also be
very dangerous to a great many animals. In the guinea-pig
we find an animal which specially suits our purposes. If a
guinea-pig is injected subcutaneously with a sufficient dose of
a toxincontaining medium, it will die in a few days and on
obduction we will find the typical symptoms. If we bring only
a small quantity of the toxin under the skin, in the way RÖMER
suggested several years ago or after the method in which miss
VAN RiEMSDIJK made some technical improvements, we get a
very circumscript characteristic process on the skin.

Although we shall find in this way a very excellent method
of identifying a culture of diphteria, still more important are the
results, that will be obtained by making use at the same time of
the property of the toxin of being neutralised by its antitoxin.

202

If a second guinea-pig is injected with toxin and diphtheria
antitoxin at the same time and if it is found that this guinea-
pig remains without any symptoms, as another, being injected
with taxin only, dies or gets some local reaction, it is proved
with centainty, that the culture which produced the toxin is
one of true diphtheria bacilli.

So we find in this a method to make out with certainty if
a given culture consists of real diphteria bacilli, but to my mind
we must not conclude from the absence of a toxin harmful to
guinea-pigs that the culture is not one of diphtheria.

I have now given you an outline of the principal methods
which may be used by the examination of diphtheria ; to wind up
with I should like to mention the following : Give a culture to
an experimenter trained in this part of bacteriology, put at
his disposal a well-equipped laboratory and above all sufficient
time, he will in most cases be able, though it may be after
many weeks, to tell you with great probability if the culture
you gave him was diphtheria or not.

But if we face the practical side of the question another
problem crops up, as one of the provisions made, namely that
of having plenty of time, fails here completely. A result
obtained after weeks or months is hardly ever of any use to
the answering of questions that face us in practice. What we
want here is to know in the shortest time possible, if a person
has diphtheria bacilli in his throat, nose or other part of his body.

In most cases the answer to this question cannot be given
with absolute centainty in a short time, therefore we try to
get as near to the truth as possible and all sorts of experiments
are made to improve the working-methods.

In the Central Laboratory we have organised the diphtheria
examination as follows : The medical man receives a wooden
box containing two testtubes, in one of which there is a
sterile swab of cottonwool ; the other is a sloped tube of
LOEFFLER 'S serum . The practitioner rubs the mucous membrane
of the patient with the swab and after that he rubs it over
the serum. As soon as possible all this is sent to the Central
Laboratory and on arriving there the swab is brushed over the
surface of a Petri dish containing LOEFFLER 'S serum. Both
culture media, testtube and plate, are now incubated at 37" C.

203

After a certain time, varying from i8 to 24 hours, both media
are examined. If there are separate colonies, which look very
much like diphtheria colonies, microscopical preparations are made
of them. If this is not the case and such colonies are not clearly
visible we make a preparation of material taken from different
parts of the plate. These films are stained by the new method
of Neisser with the modification of GiNS. If trained assistants
find bacilli which have the typical shape of diphtheria bacilli
and contain the bodies of BabeS-Ernst, then the diagnosis
diphtheria is made.

By proceeding in this way we make use of the property of
diphtheria bacilli to grow rapidly and abundantly on Loeffler's
serum at body temperature in the shape of characteristic colonies
and to exhibit within 24 hours by NeiSSER's stain very typically
the metachromatic bodies.

May we be perfectly sure now by working in this way that our
diagnosis is the right one and that no diphtheria bacillus escapes
our attention? I should be the last to be positive as to that.
As mentioned before we only get near the truth and I am
convinced that in proceeding like this, a mistake is made
occasionally in one direction or the other.

Being convinced of this it is easy to understand that people
will try by all means to extend and improve upon the working
methods. But at the same time the question arises whether the
improvement achieved is proportional to the possibly longer
duration of the examination. The solving of this problem will
be the subject of the following lines.

In the first place let us pay attention to these modifications
or extensions of the technical part which do not lead to prolong
the examination. Over and over again it has been tried to find
a culture medium able to stimulate the growth of diphtheria
bacilli and to inhibit at the same time the growth of other
microorganisms, specially those who are nearly related to
diphtheria bacilli. Of the methods, which have been published
recently, I should like to mention those of RaNKIN and of
Conradi-Troch. None of these culture media however came
up to the expectation and up to the present the best results
have been obtained with Loeffler's serum.

When the staining method of Neisser is used it is considered

204

a drawback, that the shape of the bacteria is not always
clearly visible ; therefore a methyleneblue preparation Avas often
made at the same time. But since GiNS taught us how to avoid
this difficulty, the double-stained preparation will do.

In some laboratories a second film is made and stained after
Gram, thus making use of the property of the diphteria bacillus
of being Gram-positive. Wanting to know if the addition of
this manipulation, which would not delay the diagnosis but only
cause a great extension of the routine work, would be a benefit.
Miss Smit has made pure cultures of a great many cases in
which diphtheria bacilli were diagnosed by us and investigated
their behaviour towards Gram's stain. Only one of them was
not immediately stained after Gram. According to these
investigations I cannot find sufïicient reason for extending our
working-method in this way.

So the shape and the relations to different stains not being
able to procure any new information, let us now have a look
at the other characteristics mentioned above. Before proceeding
in this direction we must bear in mind that a pure culture of
the microorganism we want to examine, is absolutely necessary
and also that for investigating these characteristics we want
some time, for the bacilli must grow in their new medium in
order to show their characteristics.

In many a case and especially in those of a doubtful nature
the diphtheria bacilli or what looks like them, are overgrown
by other microorganisms to such an extent, that no distinct
separate colonies are formed on the medium. If we want
to get a pure culture it is necessary to make a new culture
on an other plate of the most suspected places and we have
got a separate colony then in at least 20 hours. But this
may not always be possible, not seldom we have to repeat
this operation and every one, who does this work regularly,
knows by experience that the isolation often fails altogether.

It will be clear now, that there are some cases in which an
almost pure culture, suitable for further investigations is obtained at
once, but there are a great many cases in which we only
succeed in 1 or 2 or more days. Now the question has to be
raised as to whether a delay of 24 hours at least, but as a rule
of two or more days, gives so much more certainty, that the

205

drawback of the delay is exceeded by the benefit of the greater
correctness.

The characteristics which have to be considered, are those
of the acid-production out of carbohydrates, the behaviour
toward serological reactions and the power of producing toxin
(virulence).

As long as there has been difference of opinion as regards
the identity of the diphtheria bacillus the production of acid
has played its part. Now ordinary broth was used, then again
different carbohydrates were added, in most cases glucose-broth
was employed. Some thought the acidproduction to be of
difïerential-diagnostical value, others looked upon the amount
of acid produced as a thing of great importance.

Of late little attention has been paid to the results obtained
by this method, only recently Miss VAN RiEMSDIJK in the
»Centrallblatt für Bakteriologie« brought the acidproduction out of
glucose into prominence again. For this examination she made
a good simplification of the culture-medium by using a pepton-
solution and adding glucose and litmus. She looks upon this
qualititive reaction as an important diagnosticum for the diffe-
rentiating of diphtheria and pseudo-diphtheria.

It seemed very important to me, to investigate if by this
method it would be easy to sort out our practical material. I
expected that all diphtheria bacilli we diagnosed would produce
acid in this medium. Miss Smit was so kind as to examine
one hundred pure cultures, isolated by her without making any
choice whatever. Under these lOO strains only one did not
produce acid and this was a bacillus, which looked suspicious
by the the routine examination too.

For the working out of our practical material the acid-pro-
duction does not give information of practical importance, so
that I have not been able to find a reason why to extend our
daily examination in this way. Against the drawback of the
decision being delayed for one, or as a rule for more days, there
is to my mind no sufficient advantage.

In the second place I mentioned the serological reactions,
which might be useful to the extension of the working-methods.
From what has been said above it may be concluded, that in
my opinion none of these reactions give sufficiently reliable

206

information to be used in the daily routine work of a practical
laboratory. It is probable however that the agglutination-test
may prove to be of great value for the diphtheria diagnosis.

Much longer I should like to dwell on what was mentioned in
the third place, namely the estimation of the virulence. For this
purpose guinea-pigs are generally employed. A certain quantity
of a toxin-containing medium is injected subcutaneously or a
small portion of the culture is inoculated cutaneously. In the
first case we try to give such a quantity of toxin that the
animal is killed within a few days and on obduction the
charteracistic symptoms of diphtheria-death are looked for, namely
subcutaneous oedema at the seat of the inoculation, a serous
exsudate in the pleural cavity and pericardium and enlargement
with strong hyperaemia of the suprarenal glands. By the cutané
inoculation we intend to get a local reaction, which presents itself
at first as an infiltration, afterwards as a necrosis of the skin.

As I noticed before the simultaneous inoculation of a control
guinea-pig, having recieved a dose of antitoxin, may greatly
increase the importance of a positive result.

Let me now give an outline of the course which is followed
by the method of such a virulence-estimation. Of a small portion
of the mucous membrane of throat or nose a little of the
secretion-product is taken, this is rubbed over the surface of
a culture-medium, hoping that every bacterium present will
form a separate colony and if necessary, culturing is repeated
on a new medium till we reach our end. Thus we go out
for our further investigations if possible from one or otherwise
from a few bacilli. Of the descendents of this bacillus we want
to make sure whether any toxin is formed or not.

It is kwown however, that the toxinproduction is dependent
on various circumstances, e. g. the composition of the medium,
the length of growth, the temperature etc. By the estimation
of the pathogenicity, as far as the practical side is concerned,
no attention can be paid to these matters without making the
experiment too extensive. In all cases one fixed scheme has to
be followed. This takes place either by inoculation directly
from a serum-culture as soon as a pure culture is obtained,
or by inoculating after the bacteria have grown for a certain
time, fixed for all cases, in some liquid medium. Now we al-

207

ways inject the animal with the same quantity of material and
read of the result after a certain time, fixed in advance.

If the virulence-estimation has a positive result we will
probably not be far from the truth if we infer that the microorga-
nism is a diphtheria bacillus, wich may produce a toxin also
harmful to man. The same cannot be said of a negative result.

As we have selected one or a few bacilli among millions
and millions from one part of the mucous membrane of the
throat, as we have cultivated it after à fixed schema and inocu-
lated it on a guinea-pig, and as we now find that after a
certain time the animal shows no signs of disease, we conclude,
that in the throat of the person examined no diphtheria bacilli
are to be found, which may produce by growth on a human
mucous membrane a toxin, which may be harmful to man.

This conclusion rests after all on too weak a basis even for
praxis. What if we had altered the scheme a little? It we had
swabbed another part of the throat, or selected another bacte-
rium for further cultivation or if we had given it another
medium for the toxinproduction and prolonged the time of the
growth a little or injected a larger quantity and observed the
guinea-pig a little longer? Might not the result have been
different? And above all we have to bear in mind, that a
guinea-pig cannot be compared in every way to man. .\ bacillus,
which may be quite harmless to a cavia, may surely be patho-
genic to man ; the following experience may illustrate this.

In October 1914 a few soldiers in the south of our country
got angina with membrane-formation and a few days slight
raise of temperature. The medical man thought it diphtheria
and material was sent to us. We found bacteria in it, which
were positively diagnosed by us as real diphtheria bacilli.

A small epidemic of angina arose among these soldiers ;
persons in the same lodgings, or who came in some other way
in closer contact, infected each other and in all 15 had to be
taken to the infirmary with throataffections. Some of them
were scarcely ill, others had distinct membranes in their throat
and with the great majority diphtheria bacilli could be diagnosed.
Of a great many we isolated a pure culture and it was tried
in every way to get a toxin harmful to guinea-pigs. We were
not successful however, neither by subcutaneous nor by

208

cutaneous inoculation Our cultures proved non -pathogenic for
guinea-pigs.

Now we had to do here with a small epidemic of throataffections,
which resemble diphtheria clinically ; the infection passes from
one person to another, but the virus is not very virulent to
man. In most cases bacilli are isolated from the throat, be-
having in every way like diphtheria bacilli, also as regards the
acid-production, but non-virulent to guinea-pigs. Now what had
we got here? I should like to say a diphtheria bacillus slightly
pathogenic to man and non-pathogenic to guinea-pigs. To
diagnose here that it were no diphtheria bacilli because the
guinea-pigs remained healthy seems to me too theoretical.

It will be undertood now, that the absence of virulence for
guinea-pigs is not always easy to demonstrate and that a
negative result does not always prove a valuable help to iden-
tify the bacteria found. And above all if we think, that we obtain
these results only after several days, it will be clear that not
too much attention should be paid to the estimation of the
virulence for the practical diphtheria-diagnosis.

On reading all this one may get the impression, that the
bacteriological diagnosis of diphtheria seems to be rather a
desperate thing. But as a rule this is not the case, as may
appear from the following lines.

We shall have to draw a sharp line as to what is intended
at with the examination. There is namely a great difference
whether we get material for examination from diseased persons,
convalescents or healthy individuals.

If a person is attacked by an affection of some mucous
membrane, which makes the general practitioner think of diph-
theria and if the doctor sends material for examination, the
diagnosis hardly ever affords many difficulties. If the method,
used in this laboratory is applied and if within 24 hours bacilli
are found, which are considered to be diphtheria bacilli and if
on account of this state of affairs and of the clinical observations
diphtheria is diagnosed, the chance of making a mistake is
exceedingly small.

The same cannot be said of a negative result of the bacterio-
logical examination ; here we must bear in mind the possibility
of the material not being taken from the right place or desin-

209

fectants being present in the throat or also of course the
possibillity of diphtheria bacilli being overlooked by the
laboratorium-examination. A repetition of the examination is
desirable in such cases and as a rule will make the continued
clinical observation correspond with the bacteriological exami-
nation. The great difficulties of the bacteriological diphtheria
diagnosis must not be looked for here.

Secondly the question is raised daily, if in the throat or
nose of a person, who has suffered from diphtheria, diphtheria
bacilli are still present. This may be the case a long time,
but it would not be right to think that it is the rule. In the
larger majority of cases the bacilli are not to be found any
more soon after the clinical recovery.

Then we get rather a large group of individuals, with whom
one or two weeks after the recovery diphtheria bacilli can still
be demonstrated, and there only remains a small minority,
with which after the time mentioned diphtheria bacilli can
still be diagnosed.

If an individual had a clinically and bacteriologically diagnosed
diphtheria and if a short time after his clinical recovery bacteria
are still found, which according to our examination have to
be identified as diphtheria bacilli, we may diagnose without
making too great a mistake, that they are in reality diphtheria
bacilli. Here also the diphtheria-examiner is not running too
great a risk.

If the time during which the bacilli are still found, gets
extraordinarly long and the difficulties caused by the measures
which have to be taken, gets greater, the time has come to
consider if the diagnosis of diphtheria is perhaps wrongly made
and so we get here a material, exceedingly fit for elaboration
in the smallest details of the methods of the bacteriological
diphtheria diagnosis. In this case there is no reason for special
hurry, because it does not matter very much, if the examination
takes a few days longer.

We perform these continued examinations repeatedly, mostly
at the request of an impatient doctor'. We mostly find then
that the bacilli present answered to the greatest demands,
which we may put to a diphtheria bacillus and mostly they
are also virulent to guinea-pigs. As so many others we have

2IO

been able to isolate from the throat of recovered diphtheria
patients bacilli, which were very virulent to guinea-pigs even
after many months.

So at the control-examination of convalescents the necessity
of extension of the routine work is only felt as an exception.

Now I have come to the most difficult part of the diphtheria
examination, namely the searching for diphtheria bacilli in nose
or throat of healthy individuals.

In recent years a material extending over many thousand
persons had to be examined in our laboratory in order te
to discover diphtheria-carriers. It is my experience that the
presence of bacilli in throat or nose, which we must consider
as diphtheria bacilli, does not occur to so alarming a degree as
some wanted to make us believe. It is not exceptional that we
find at a school-examination, extending over many a hundred
of children, only a few diphtheria-carriers.

The search for diphtheria-carriers may often be very useful
and very well practicable. For instance this was the case with
an examination made last summer in a holiday-home (»Vacan-
tie-kolonie«). A case of clinically and bacteriologically true
diphtheria occurred there, while some other children had slight
alïections of the throat. Now here the search for carriers seemed
to be in the right place ; it only concerned a small number —
40 à 50 — the isolation of those individuals by whom the
result was positive, was easily practicable and the danger of
spreading the infection was very great.

Now by this examination a number of slightly affected and
perfectly normal bacilli-carriers were actually found, that is to
say that they were diagnosed as positive by the quick method
used by us for the discovery of diphteria bacilli. Here also
the examination had to be made quickly, a too scrupulous
weighing again and again of the diagnosis would have rendered
the useful result very problematic and therefore we used in this
also case the ordinary investigation methods. In some cases
arbitrary chosen we finished the examination to the end and by
this was shown, that the isolated microorganisms were really
typical diphtheria bacilli virulent to guinea-pigs.

Let us contrast to this example of a useful examination for
diphtheria-carriers an unuseful one. In a village there is much

211

diphtheria and consequently also among the schoolchildren. The
schools are closed and now by the reopening of the schools
no children are admitted unless they are free from diphtheria
bacilli; therefore all the schoolchildren have to be examined
and if possible all looo together and if not then 250 daily.
It is rightly observed, that if it is not finished at once, there
may be a chance of the child being infected afterwards and
therefore the examination would be of no use ; but the impos-
sibility of doing such a huge investigation with due accuracy is
not thought of. There are too many sources of mistakes on
the long way between the throat of the person examined and
the microscope of the bacteriologist.

In the searching for diphtheria-carriers we miss the impor-
tant help of the clinicus for making our diagnosis ; only in
these cases, where a close contact has existed between the
persons examined and a diphtheria-patient we get an indication
which may be of some use to us. In other cases we are
referred to the bacteriological examination only. Moreover this
examination has to be done as soon as possible, for only by
quick decision some succès of the measures taken may be
expected. Therefore we are exposed at such examinations to
far greater mistakes than at those of patients or convalescents.

Only under special circumstances we may get any results
valuable for the practical hygiene. As such favourable circum-
stances may be mentioned : a small number of persons living
in close contact with each other, provided that sufficient isola-
tion of the individuals, diagnosed as carriers, is possible.
Further it will be a great benefit to the result, if the regulation
of the examination on the spot and the laboratory-work are
in one hand or take place in mutual consultation.

Under these favourable circumstances the examination of the
childeren of one or two classes of a school may sometimes give
useful results. The examination on a large scale of a whole
school-population or of every schoolchild in a small town, is
■ not practicable in such a way, that the results can serve a? a
foundation for practical hygienic measures. The trouble, which
is caused and the work that has to be done, are certainly not
in accordance to the results obtained.

BACTERIUM (PROTEUS) ANINDOLOQENES N. SP.

PAR

J. J. VAN LOGHEM, — Amsterdam.

En étudiant les urines d'un malade pneumaturique j'isolai i)
— il y a dix ans — un bacille qui montre une forte ressemblance
avec le bacille de Hauser (Bacterium vulgare Hauser): un
bâtonnet mobile, liquéfiant rapidement la gélatine, faisant fer-
menter des sucres, etc., et donnant une coloration rouge-vineux
dans les cultures peptoniseés, aux quelles on a ajouté de l'acide
sulfurique pur et de la nitrite de potassium (réaction de l'indol
de Salkowski).

Steensma 2) démontra que cette matière colorée n'était
nullement identique au nitrosindol ; alors qu'on peut distiller
l'indol, la substance-mère de la matière rouge de notre bacille
ne quitte pas le milieu peptonisé, soumis à la distillation.

Cette différence entre le bacterium (Proteus) vulgare et notre
bacille s'est montrée d'une constance absolue. Les cultures de
ce dernier en solution de peptone WiTTE donnent jusqu'aujourdhui
une réaction forte de SalKOWSKI, tandis que les autres réactions
de l'indol restent négatives. Notre nouveau bacille-Proteus est
alors incapable de séparer l'indol de la peptone, par conséquent
j'ai proposé de le considérer comme une espèce nouvelle sous
le nom Bacterium (Proteus) anindologenes.

Depuis on a rencontré plusieurs représentants de notre nou-
velle espèce.

J'ai pu isoler une deuxième culture du B. anindologenes du
pus d'un abcès de la paroi abdominale d'un malade, soigné
en 190G dans la clinique du Professeur RuiTINGA ; cet abcès
provenait probablement de l'intestin.

Aucune difïérence n'a pu être constatée entre le bacille du
pus et celui de l'urine du malade pneumaturique ; ses cultures
en milieu peptonisé donnaient la même pseudoréaction de

213

SalkowSKI et, ce qui était important : un sérum de lapin
immunisé contre le bacille de l' urine agglutinait aussi le bacille
du pus.

Pendant notre séjour à Sumatra, ma femme et moi avons
fait des recherches spéciales sur la fréquence du bacterium
anindologenes 3). Sur 30 »bacilles-Proteus«, isolés du contenu
de l'intestin humain, 27 donnaient les réactions de l'indol, et
3 la pseudoréaction de SalkowSKI.

Ces trois derniers nous les avons examinés aussi au point
de vue sérologique et comparés avec le bacille pneumaturique
et des proteus indologènes. Nous avons immunisé des lapins
contre nos bacilles »anindologenes«, et d'autres lapins contre
les vrais Proteus Hauseri et nous avons examiné le pouvoir
agglutinant des serums de tous ces lapins vis-à-vis des différents
bacilles.

Les résultats de ces expériences n'étaient pas douteux ; les
»serums anindologenes« agglutinaient tous les quatre représen-
tants de notre nouvelle espèce sans aucune influence spécifique
sur des bacilles indologènes, tandis que toute action spécifique
des > serums indologènes« vis-à-vis des bacilles anindologenes
était absente (v. table !).

Récemment M. BAUDET 4) a publié un mémoire sur les
réactions de l'indol dans lequel il annonce avoir isolé à Leyde
de nouveau trois bacilles proteus anindologenes, donnant la
pseudoréaction de SalKOWSKI.

Une des cultures provenait du pus d'un empyème, les deux
autres furent isolés des urines. M. BAUDET a eu la bienveil-
lance de mettre ces cultures à notre disposition.

Au point de vue morphologique et biochimique (v. table II)
les trois cultures isolées à Leyde se montrent identiques aux
bacilles isolés autrefois à Amsterdam et aux Indes Néerlan-
daises ; cependant, je n'ai pas réussi à démontrer directement
leur identité mutuelle par les méthodes sérologiques.

Des serums agglutinants, préparés avec un des bacilles de

214

M. Baudet, donnaient des réactions spécifiques avec les deux
autres, isolés par ce bactériologiste ; leur identité mutuelle est
donc hors de doute. Ces serums n'ont en général pas d'action
agglutinante sur le bacille isolé autrefois par moi dans le cas
de Pneumaturie (v. table III).

Pas contre, un sérum préparé avec le bacille »pneumaturique«
est négatif vis à vis les trois bacilles de Leyde (v. table IV).

Seulement en certaines expériences avec des serums de lapins
qui ont été injectés plusieurs fois on peut coyistater de la
coagglutination (v. table V).

Les mêmes expériences ont été répétées selon la méthode
Bordet-Gengou.

Un sérum, préparé vis à vis un des bacilles de Leyde, et
laissé en contact avec des suspensions de ces bacilles, dévie le
complément de cobaye, tandis que le complément n'est pas
dévié si ce sérum est mélangé avec le bacille pneumaturique.

Le même résultat négatif était obtenu en mélangeant un
sérum pneumaturique avec les bacilles de Leyde.

En résumant nous pouvons conclure que parmi les différentes
espèces du groupe- »Proteus« il y a au moins une espèce qui
se distingue des autres par l'impuissance de produire de l'indol
en milieu peptonisé. Dans le milieu peptonisé on constate la
présence d'une matière qui donne une coloration rouge-vineux
(un peu plus rouge que le nitrosindol) avec l'acide nitrique et
la nitrite de potassium (Steensma).

Jusqu'ici des bacilles »anindologènes« ont été isolés huit fois :

I. (Jrines d'un malade pneumaturique (Amsterdam).
II. Pus d'un abcès de la paroi abdominale (Amsterdam).

III. \

IV. > Contenu de l'intestin humain (Sumatra).
V.)

VI. /
,,j. > Urines de deux malades (Leyde).

VIII. Pus d'un empyème (Leyde).

I, II, III, IV et V se sont montrés identiques par la méthode
de l'agglutination.

215

L'identité de VI, VII et VIII a été prouvée de la même
manière et par la méthode Bordet-Gengou.

La preuve sérologique de l'identité mutuelle de tous ces
bacilles anindologènes n'est pas donnée ; en certaines expérien-
ces seulement nous avons constaté de la coagglutination.

Il me semble que ces résultats plutôt négatifs ne justifient
pas encore la séparation des deux groupes de bacilles, isolés
à Amsterdam-Sumatra et à Leyde. Ils existent dans la micro-
biologie plusieurs faits qui prouvent que la sérologie n'est pas
toujours capable de déterminer à quelle espèce un microbe
quelconque appartient. Nous savons seulement que deux bacilles
qui sont influencés de la même manière par le même sérum
sont apparentés, souvent identiques; le résultat négatif de
l'expérience sérologique ne justifie pas des conclusions si
décisives.

Il est nécessaire que nous disposions d'un grand nombre
de »Proteus anindologènes« avant de pouvoir formuler une
opinion plus précise sur l'identité des bacilles décrits ci-dessus.
Provisoirement je propose de les considérer tous comme des
représentants de la même espèce : Bacterium (Proteus) anin-
dologènes.

Tout récemment Berthelot 5) a publié la première partie
de ses recherches sur un grand nombre de bacilles-proteus,
qui preuvent que des bacilles »non-indologènes« isolés par cet
auteur sont capables de produire de l'indol dans un milieu
contenant du tryptophane.

M. Berthelot n'a pas expérimenté avec les bacilles non indo-
logènes isolés par nous, de sorte que nous ne savons pas si les bacilles
examinés par lui sont identiques aux nôtres. C'est inutile alors
de répondre en détail aux amples considérations de cet auteur
qui l'amènent à la conclusion que »l'espèce Proteus anindologènes
VAN Loghem n'a aucune raison d'être«.

Les recherches de M. BERTHELOT ne changent rien au fait
que notre bacille diffère du vrai Bacterium (Proteus) vulgare
par l'impuissance de produire de l'indol en milieu peptonisé et
qu'il y forme une substance qui donne une coloration rouge avec
de l'acide sulfurique et de la nitrite.

2l6

Cette double propriété est tellement caractéristique et constante
qu'il est impossible de l'ignorer; il ne peut être question qu'il
s'agit ici de la variation d'une propriété biochimique comme M.
BerthelOT le prétend.

Au point de vue biologique nous considérons l'impuissance
constante de notre bacille anindologène de séparer de l'indol
de cet »édifice moléculaire très complexe« : la peptone, comme
beaucoup plus importante que le fait qu'on peut trouver de
temps en temps de l'indol dans des cultures qui contenaient
d'avance déjà le tryptophane ou d'autres substances peu
complexes i).

Mars 1915.

BIBLIOGRAPHIE.

1. J. J. VAN LoGHEM, Centralbl. f. Bakteriologie. Abt. I. Orig.
Bnd. 38, 1905. S. 425.

2. F. A. Steensma, Centralbl. f. Bakteriologie. Abt. I. Orig.
Bnd. 41, 1906. S. 295.

3. J. J. VAN LOGHEM Und J. C. W. VAN LoGHEM-Pouw, ibid.
Bnd. 66., 1912. S. 19,

4. E. A. R. F. Baudet, Folia microbiologica. T. II, 1913 p. 261

5. A. Berthelot, Annales de l'Institut Pasteur, 1914, sept.-octobre.

^) Ce dernier point sera examiné de plus près par M. Steensma ; c'est donc
a sa prochaine publication que je renvoie le lecteur.

217

TABLE I.

Pouvoir agglutinant d'un sérum anindologène vis à vis

des bacilles anindologènes et indologènes.

Contrôle

Dilutions.

lOO

250

1000

B. proteus anindologènes V.C. l6

—

clar.

(clar.)

» »

» V.C. 8

—

+ + +

+ +

» »

» L.D. 2

—

clar.

+ + +

» »

» Pneumaturie.

—

clar.

+ + +

B. proteus

indologènes V.C. 2

» »

» V.C. 4

—

» »

» V.C. 6

—

» »

» V.C. 12

—

» »

» V.C. 13

—

» »

» V.C. 14

—

i »

> V.C. 23

—

» »

» Pol.

—

— , réaction négative. -f i réaction très faible.

+ + +, ++ réaction plus au moins forte, sans clarification complète.

clar. (clar.) clarification complète on presque complète.

TABLE n.
Morphologie et biochimie du Bacterium anindologènes.

Cas de
pneu-

Abcès paioi
abdom.

Sumatra
intestin humain.

Leydc (Baudet).

urines I. urines II. empyème

Bâtonnet

mobilité

Gram

aérob. facult . . . ,
liquéf. gélatine . ,
indol (distill.) . . ,

pseudoindol

(Salkowski)

glycose

lactose

saccharose

mannite

Petruschky

pomme de terre..
Hémolysines . . , .

+ gaz

+ 2)

brunâtre

+
+

+ gaz

+
+

+
+ gaz

+ gaz , + gaz

+
+

+ gaz

brunâtre

+
+

+ gaz

+ ^)
brunâtre

+
+

+
+
+ gaz

brunâtre
+

^) Dans les cultures très jeunes on peut observer des bacilles qui prennent plus ou moins le Gram.
2) D'abord rouge, après quelques jours bleu.

2l8

TABLE III.

Pouvoir agglutinant d'un sérum ') anindologène (Leyde Urines I)

vis à vis les trois bacilles anindologènes de Leyde, le

bacille Pneumaturie et un Proteus indologène.

Con-
trôle.

Dilutions.

100 500

1000

B. proteiis anindologènes, Leyde Urines I.
» » » » » II.
» » » » Empyeme.
» » » Pneumaturie.
» » indologenes (Hauser).

—

(clar.)
+ + + + +
+ + + + +

(clar.)

+ + + +
+ + +

+ + +
+ + + +
+ + + +

+ +
+ +
+ +

') Le lapin a été injecté deux fois.

TABLE IV.

Pouvoir agglutinant d'un sérum ^) anindologène (Pneumaturie) vis

à vis le bacille Pneumaturie, les trois b. anindologènes

de Leyde et un Proteus indologène.

Con-
trôle.

Dilutions.

100 j 500

B. proteus anindologènes Pneumaturie.
» » » Leyde Urines I.
» » » » » II.
» » » » Empyeme.
» » indologenes (Hauser.

—

+ + + + +

+ + +

^) Le lapin a été injecté deux fois.

TABLE V.
Sérum du même lapin de l'expérience Table IV, après 4 injections.

Con-
trôle.

500

1000

B. proteus anindologènes Pneumaturie.
» Leyde Urines I.
» » » II.

» » Empyeme,

indologenes (Hauser).

(clar.)

+ + +

(clar.)
+ + +

+ + + + +
+ + +

+ +

219

TABLE VI.

Déviation du complément dans les mélanges d'un sérum anindologène Leyde

(Urines 11), d'un sérum anindologène pneumaturique et d'un sérum

normal, avec le bacille Proteus pneumaturique, les bacilles

anlndologènes de Leyde et un proteus indologène (Häuser).

*/^ c. c. sérum anindologène

(Leyde Urines II)

avec ICC suspension

pendant i heure à 37" C.

'^1^ c c sérum anindologène
(Pneumaturie)
avec ICC suspension
pendant i heure à 37° C.

^j^ C C sérum normal

avec ICC suspension
pendant i heure à 37° C,

B. auijjdologenes Urines I.
» » » II.

» » Empyeme.

» » Pneumaturie.

» indologenes (Hauser).

B. anindologenes Urines I.
» » » II.

» » Empyeme.

» » Pneumaturie,

» indologenes (Hauser).

B. anindologenes Urines I.
» II.
Empyeme.
Pneumaturie.
» indologenes (Hauser).

Quantité du complément (sérum
de cobaye i : 12).

/a ce

i c c

+
+

(+)

+
+
+

(D)

+
( + )

+
+
+
+

D = déviation du complément = pas d'hémolyse après avoir ajouté le système hémolytique
(chèvre-lapin).

-f = pas de déviation (hémolyse). Il suffit de placer les tubes pendant une ^/g heure dans
l'étuve, et après dans la glacière, pous éviter l'action hémolytique des bacilles.

[Aus dem pathologischen Institut der
Reichstierarzneischule zu Utrecht.
Direktor: Dr. H. Markus].

BEITRAG ZUR WERTBESTIMMUNG DER

TUBERKULINPROBE BEIM HUHN NACH

VAN ES UND SCHALK

VON

Dr. H. SCHORNAGEL,

Prosektor am Institut.

Die Vogeltuberkulose ist bekanntlich eine sehr verbreitete
Krankheit, welche speziell unter den Hühnern grosse Verluste
verursachen kann. Zur Bekämpfung dieser Krankheit ist es in
erster Linie notwendig, dieselbe möglichst früh zu erkennen.
Es ist eine ziemlich leichte Aufgabe das Vorkommen chronischer
Tuberkulose in einem Hühnerbestand zu diagnostisieren. Wenn
die Tiere nach längerem Siechtum, unter Abmagerung das Eine
nach dem Anderen sterben, kann man mit grosser Gewissheit
die Diagnose Tuberkulose stellen ; besonders sei auch hinge-
wiesen auf die Vergrösserung der Lymphknoten am kaudalen
Ende des Halses, welche beim lebenden Tiere deutlich wahrnehm-
bar ist. Die Sektion der gestorbenen Tiere bestätigt die Diagnose.
Auch kann man, bei der geringen Wert des Einzeltieres ein
verdächtiges Huhn töten und obduzieren.

Ist die Tuberkulose also leicht zu erkennen bei schwerkranken
und toten Tieren, unmöglich war dies bis vor kurzem bei
Hühnern mit geringen Läsionen. Bei Versuchen zur Ausrottung
der Krankheit kann man alle Tiere töten und Ställe und Hof
desinfizieren, und dann wieder neue gesunde Tiere ankaufen,
oder man tötet nur die kranken Tiere und lässt die übrigen,
anscheinend gesunden Hühner in den desinfizierten Ställen.
Sollen diese Massregeln Erfolg haben, so muss man ganz
bestimmt sicher davon sein, dass unter den neuangekauften oder
den am Leben gelassenen Tieren kein einziges, auch nur im

221

geringsten Grade, an Tuberkulose leidet ; ist dies doch der Fall,
so kann man nach kurzer Zeit wieder aufs Neue anfangen.

Es ist selbstverständlich, dass kurz nach der Einführung des
Tuberkulins als Diagnostikum, ihre diagnostische Wert auch bei
Vögeln geprüft worden ist. Mehrere Untersucher haben das
Tuberkulin, bereitet von Tuberkelbazillenkulturen verschiedener
Herkunft, auf den bekannten Weisen angewandt, subkutan,
kutan und konjunktival, die Versuche schlugen alle fehl. Aus diesem
Grunde schrieb Klimmer i) im Jahre igii : »Ist Tuberculose
»in einen Geflügelbestand eingeschleppt, so bleibt zur sicheren
»Tilgung, da eine exakte Erkennung der bereits Erkrankten
»von den Gesunden nicht möglich und somit eine erfolgreiche
»Absonderung ausgeschlossen ist, nichts anderes übrig, als den
»ganzen verseuchten Bestand abzuschlachten und die Ställe,
»Gerätschaften, und den Geflügelhof zu reinigen und zu
»desinfizieren«.

Im April 19 14 erschien ein »Bulletin of the North Dakota
Agricultural Experiment Station« von L. VAN Es und A. F.
Schalk über »Vogeltuberkulose« 2). In dieser Arbeit beschrei-
ben die Autoren ihre Versuche über die Anwendung von aus
V o g e Ituberkelbazillenkulturen bereitetes Tuberkulin bei Vögeln.
Bekannt mit den Misserfolgen der obengenannten Methoden
haben v. E. und S. die intrakutane Methode von MOUSSU und
Mantoux 3) angewandt, und mit sehr guten Resultaten. Als
Injektionsstellen sind Kehllappen und Kamm gewählt, weil die
Haut an diesen Stellen nicht so äusserst dünn ist, als die
befiederte Haut.

Die Resultate von den Versuchen von v. E. und S. waren
folgende :

Anzahl der Tuberkulinproben 601.

» der sezierten Hühner 227.

» der sezierten Hühner mit Tuberkulose 125.

Tuberkulöse Hühner mit positiver Reaktion 88 (97.77 "/o)
Gesunde Hühner » » » 2 ( 2.23 o/o)

Gesunde Hühner mit negativer Reaktion 120 (91.53 % )
Tuberkulöse Hühner » » » 10 ( 8.47 %)

222

Gesunde Hühner mit zweifelhafter Reaktion 30 (52.64 0 0)
Tuberkulöse Hühner » » y> 2-] (47.36 o/^)

Als im August 19 14 eines der Versuchshühner dieses Insti-
tutes an spontaner Tuberkulose starb, Avar dies für mich An lass
die Methode von v. E. und S. bei den 10 übrigen, scheinbar
gesunden Tieren anzuwenden. Von diesen Tieren zeigten die
Nummer 5, 6 und 7 eine positive und No. 8 eine zweifelhafte
Reaktion 1). Da diese Versuche gerade in den Ferien statt-
fanden habe ich die vier reagierenden Tiere nicht getötet,
sondern isoliert und die Probe nach einigen Monaten wiederholt.
Ich gebe hier die Beschreibung der zweiten Versuchsreihe ; ich
habe hierbei den Angaben von v. E. und S. gefolgt.

Beim ersten Versuch habe ich einige Tiere im Kehllappen,
andere im Kamme injiziert, die letzte Stelle gefiel mir gar nicht ;
erstens ist die Ausführung technisch viel schwerer, zweitens
ist die Beurteilung, besonders bei platten Kämmen mit ihrer
unregelmässigen Form, nicht so leicht. Die Injektion an einen Kehl-
lappen hat noch den Vorteil, dass man den Verlauf der Reaktion
vergleichen kann mit dem anderen, nicht injizierten Lappen.

Statt 50 0/0 Vogeltuberkulin benutzte ich Roh-Tuberkulin.
Das Tuberkulin stammte, weil momentan kein im hiesigen
Institute bereitetes Vogeltuberkulin vorhanden war, in beiden
Versuchsreihen vom Reichsseruminstitut zu Rotterdam.

Zur Injektion benutze man eine kleine Rekordspritze und
möglichst feine Hohlnadeln. Die Epidermis der Vogelhaut ist
durchwegs dünn, zart und schichtenarm ; die Dicke der Ober-
haut steht im umgekehrten Verhältniss zur Dichtigkeit der
Befiederung. Man unterscheidet ein Stratum profundum und
ein Stratum corneum. Ich fand das Stratum profundum der
Brusthaut eines Huhnes nur 2 — 3 Zellschichten dick (kleine runde
Zellen), das Stratum corneum war ungefähr zweimal so dick.
Beim selben Huhn war das Str. profundum am Kamm und
Kehllappen bis zu g Schichten dick, das Str. corneum dagegen nur
sehr dünn. Es versteht sich das eine intrakutane Injektion in
der nur 2 — 3 Zellschichten dicke Epidermis der befiederten Haut
technisch unmögHch ist. Doch kostet es dem Anfänger auch
viel Mühe die Nadel in der dickeren, aber doch noch sehr

») Siehe die Tabelle.

223

dünne Oberhaut vom Kehllappen und Kamm so einzustecken,
dass die Flüssigkeit gerade in die untersten Schichten der Epider-
mis gelangt ; der Umstand dass die Oberhaut der Vögel sehr
bröcklig ist, erschwert die Injektion erheblich. Man muss die
dünne Nadel fast parallel an der Hautoberfläche einstecken ;
empfindet man nun bei der Injektion einen Widerstand und
wird die Haut in der Umgebung blass, so ist der Einstich
gelungen. Geht die Injektion leicht von Statten, so beweist dies,
dass die Flüssigkeit ins Corium oder die Subkutis gelangt und ist
der Versuch misslungen ; dies ist ebenfalls der Fall wenn eine
Blase entsteht, diese berstet und das Tuberkulin fliesst ab. Es
schadet nichts, die Injektion an eine naheliegende Stelle zu wieder-
hohlen, der grosse Kehllappen bietet dazu auch Raum genug.
Es scheint mir angemessen die Haut vorher mit Alkohol zu
desinfizieren. Als Injektionsstelle wähle man die Mitte der
äusseren Fläche des linken Kehllappens, weil dies für die Aus-
führung die bequemste Stelle ist. Die Menge der injizierten
Flüssigkeit ist sehr gering, weniger als ein Tropfen.

Die Hühner werden am 2. November 1914, vormittags 11 Uhr
injiziert.

Huhn

Tuberkulin-
probe im
August '14.

Tuberkulinprobe am 2. November 1914, vormittags 11 Uhr.

No.

5 St.
nach

Injekt.

24 St. 48 St. 72 St.

nach nach nach

Injekt. Injekt. Injekt.

96 St. 120 St.

nach nach

Injekt. Injekt.

Sektionsbefund.

zt.

_ 1
1

Tubeikulosefrei.

— —

—

— —

—

+ +

+
+

+ + +

+ + +
getötet

getötet

»
Tuberkulös.

+ +

+ + +

+ + +
getötet

7
8

+ +
±

+ +
+ +

+
+

±:
getötet

»
»

—

Tuberkulosefrei.

—

Tuberkulös.

— Keine Anschwellung. ± Sehr geringe Anschwellung. + Massige Anschwellung.
+ -f Starke Anschwellung. + + + Sehr starke Anschwellung.

224

5 Stunden nach der Injektion zeigen die Nummer i, 2 und 3
eine geringe örtliche Anschwellung an der Impfstelle ; die Nummer
4) 5» 6, 7 und 8 eine ödematöse Anschwellung des ganzen
Kehllappens und die Nummer 9 und 10 gar keine Reaktion.

24 Stunden nach der Injektion ist die Anschwellung der
Nummer 1, 2, 3 und 4 kaum merkbar mehr; die Nummer 5, 6,
7 und 8 zeigen eine sehr starke, ödematöse Anschwellung ; der
Kehllappen ist sehr viel dicker und länger als der Kontroll-Lappen,
dabei ein wenig blässer, die Temperatur des Lappens ist nicht
erhöht, das Ganze macht den Eindruck einer mit Flüssigkeit
gefüllten Tasche. Die Nummer 9 und 10 zeigen keine Reaktion.

Nach 48 Stunden ist die Anschwellung der Nummer 5 und 6
noch eben so stark als am vorigen Tage ; die Anschwellung der
Nummer 7 und 8 ist geringer. Behufs mikroskopischer Unter-
suchung werden die Nummer 5 und 6 nach 48 Stunden getötet.
No. 8 zeigt nach 72 Stunden eine kaum merkbare Anschwellung
und wird dann getötet. Die Anschwellung der No. 7 ist nach
96 Stunden verschwunden ; das Tier wird nach 9 Tagen
getötet.

Die Nummer i, 2, 3 und 4 welche nach 5 Stunden eine
geringe, örtliche Anschwellung zeigten, aber nach 24 Stunden
und später gar keine, werden resp. 30, 9, 17 und 3 Tage nach
der Injektion getötet ; sie sind alle völlig frei von Tuberkulose.

No. 9 und 10 haben gar keine Anschwellung gehabt, sie
werden resp. nach 35 und 30 Tagen getötet. No. 9 ist tuber-
kulosefrei ; No. 10 hat in der Leber zwei stecknadelkopfgrosse,
hyaline Knötchen w^elche Tuberkelbazillen enthalten.

No. 5 positive Reaktion ; getötet nach 48 Stunden. Sektions-
bild : Zwei verkäste Herdchen in den Lungen, viel Tuberkel-
bazillen ; ein hyalines Knötchen in der Leber, keine Tuberkel-
bazillen ; Halslymphknoten speckig geschwollen, sehr viel Bazillen.

No. 6 positive Reaktion; getötet nach 48 Stunden. Sektions-
bild: In der nicht vergrösserten Milz ein stecknadelkopfgrosses,
verkästes Herdchen mit Tuberkelbazillen ; Halslymphknoten nicht
vergrössert, wenig Tuberkelbazillen. (Reaktion: siehe die Photo).

No. 7, positive Reaktion ; getötet nach 9 Tagen. Sektionsbild :
Sehr vermagert, chronische Tuberkulose von Milz, Leber und
Halslymphknoten, zahlreiche Tuberkelbazillen.

No. 8 positive Reaktion ; getötet nach 3 Tagen. Sektionsbild :

225

Ein wenig vermagert ; chronische Tuberkulose von Milz, Leber
und Halslymphknoten, sehr viel Bazillen.

Von allen Hühnern wurden die Organe auf genaueste unter-
sucht, und wurden Deckglaspreparate angefertigt nicht nur von
verdächtigen Knötchen, sondern auch von Leber, Milz und Nieren,
Halslymphknoten und Darmschleim, auch von den gesunden
Tieren.

Wenn man die sehr geringe Anschwellung einigen Stunden
nach der Injektion nicht als eine Reaktion betrachtet, sondern
nur die starke Vergrösserung des ganzen Kehllappens welche
nach 24 Stunden und später anwesend war, dann haben wir
folgende Resultate :

Untersuchte Hühner 10

Tuberkulöse Hühner mit positiver Reaktion 4

» » » negativer » i

Tuberkulosefreie » » » * 5

» » » positiver » o

Von den tuberkulösen, reagierenden Tieren war nur eines sicht-
bar krank (no. 7) die anderen waren klinisch vollkommen gesund.

Auf 10 Fällen haben wir also i Misserfolg. Das betreffende
Tier, ein sehr kräftiger, wohlernährter Hahn, ist erst 30 Tage
nach der Tuberkulinprobe getötet worden ; die Tuberkulose
war noch sehr jung und geringgradig, sodass die Möglichkeit,
ja selbst eine grosse Wahrscheinlichket besteht, dass das Tier
nach dem Versuch infiziert worden ist.

Aus obigen Versuchen geht hervor, dass die von Van Es
und Schalk angegebene Methode ein vorzügliches Diagnostikum
und ein kräftiges Hilfsmittel zur Tilgung der Hühnertuberkulose
ist ; besonders auch weil die Methode, nach einiger Übung,
technisch nicht schwer ist, und die Beobachtung vom Verlauf
der Reaktion leicht und schnell geschehen kann. Auch ist die
Methode vorzüglich um Versuchshühner auf Tuberkulose zu
prüfen ; wo die Spontantuberkulose bei dieser Tierart so häufig
vorkommt, ist es natürlich vom grössten Wert ein Mittel zu
besitzen die scheinbar gesunden Tieren auf dieser Krankheit
untersuchen zu können. Zwar kommen Misserfolge vor, wenn
aber von einer Sendung Hühner eines oder mehrere reagieren,
sind alle anderen doch verdächtig und jedenfalls für Tuberkulose-

226

versuche nicht zu benutzen. — Auch scheint mir in Fällen wo
ein oder mehrere Tiere reagieren eine Wiederhohlung des
Versuches nach einiger Zeit sehr empfehlenswert, da die fehler-
hafte, negative Reaktion auch durch technische Fehler verursacht
sein kann.

Mikroskopisch zeigen die geschwollenen Kehllappen ein starkes
Ödem, das Bindegewebe ist aufgelockert und zwischen den
Fasern findet sich eine teils homogene, teils körnige Masse ;
w'eiter sieht man eine starke leukozytäre Infiltration, wobei
besonders die eosinophilen Zellen in den Vordergrund treten.
Die Blutgefässe zeigen keine Veränderungen ; nur enthalten sie
relativ mehr weisse Blutkörperchen als normal.

Im Februar 1915.

LITERATUR.

1. Handbuch der Serumtherapie und Serumdiagnostik in der Veterinär-
Medizin ; herausgegeben von Klimmer und Wolff — Eisner, 1911. S. 169.

2. L. VAN Es und A. F. Schalk, Avian Tuberculosis. Bulletin
no. 108 of the North Dakota Agricultural Experiment Station, April
1914. — Ausgebreitete Literatur-verzeichnis. — Eine kürzere Arbeit
über denselben Gegenstand von van Es erschien in »Zeitschrift f.
Infektionskrankheiten, parasitäre Krankheiten und Hygiene der Haus-
tiere, Bnd. XIV, 1913. S. 271«.

3. Bulletin de la Soc. centrale de médecine vétérinaire, T. 85.
1908. pag. 500.

TAFEL XVII.

Folia Microbiologica III.
(.Schornagel.)

Positive Real^tion; starke Anschwellung des
linken Kehllappens 48 Stunden nach der Injektion.
(Huhn n«. 6).

[Aus dem Institut für Bakteriologie und
Hygiène der Universität Groningen]

UEBER DIE KULTIVIERBARE BAKTERIENMENQE
MENSCHLICHER FÄZES

VON

J. IDZERDA

Assistenten am Institut.

Die Anwendung der mikroskopischen Zählungsmethode von
A. Klein i) bei der bakteriologischen Untersuchung der Fäzes
normaler, erwachsener Menschen mit gemischter Kost hat
ergeben, dass in diesen Fäzes eine weit grössere Bakterienzahl
vorhanden ist, als man auf Grund der bisher ausschliesslich
benutzten Kulturmethoden annehmen zu dürfen meinte. Andere
Untersucher 2)^ die gleichfalls die mikroskopische Zählungs-
methode anwendeten, haben diese wichtige Tatsache vollends
bestätigt. Auf Grund der angestellten Untersuchungen darf
angenommen werden, dass die mittleren Bakterienzahlen, welche
man mittels der Kulturmethode gefunden hat, zwischen 100.000
und 800.000, die, welche man mittels der mikroskopischen
Zählungsmethode gefunden hat, zwischen 58 Millionen und 375
MilHonen, per mg frische Fäzes schwanken ^).

Dieser ungeheure Überschuss mikroskopisch zählbarer Bak-
terien kann auf verschiedene Weisen erklärt werden :

lo Dieser Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien
besteht aus abgestorbenen Individuen ;

20 Diese Bakterien sind in lebendem Zustande in den
Fäzes vorhanden, aber sie sind, wenigstens nach den für die

1) A, Klein, Zentralblatt f. Bakt. und Parasitenkunde, Abt. I, Bd. 27.

2) Siehe u. a. jNIacn'eal, Latzer und Kerr. The Journaal of Infectious
Disaeses, Vol. 6.

ä) A, Klein und F. Visser. Diese Folia, Bd. 2

228

kwantitative Bestimmung gebräuchlichen Methoden nicht kul-
tivierbar.

Eine dritte Möglichkeit: diese Bakterien sind wohl lebend,
und unter gewöhnlichen Umständen auch wohl auf unseren
gebräuchlichen Nährböden kultivierbar, aber in den Fäzes in
derartig geschwächtem Zustande vorhanden, dass sie sich nicht
mehr vermehren können, auch wenn sie unter die allergün-
stigsten Lebensbedingungen gebracht werden, kann ausser
Betracht bleiben. Bakterien, die sich nicht vermehren können
und nur ein latentes Leben führen, können weder in den
Fäzes, noch im Darmkanal irgend welche Rolle spielen ; der-
gleichen geschwächte Bakterien sind praktisch den abgestor-
benen Bakterien gleichzustellen.

Die Frage, ob alle oder ein grosser Teil der mikroskopisch
zählbaren Bakterien in lebendem Zustande anwesend sind, ist
von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung des Sterili-
tätsindex der Fäzes, d. i. der Sterbezahl der in den Fäzes
befindlichen Bakterienbevölkerung; diese Sterbezahl ist die
Resultante der bakteriziden Prozesse, welche sich im Darm-
kanal abspielen.

Im voraus ist es schon schwer anzunehmen, dass dieser
Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien sich wohl in
den menschlichen Fäzes, nicht aber in unseren künstlichen Nähr-
böden vermehren könnten.

Ferner hat sich ergeben, dass durchschnittlich ungefähr
50 o/jj der mikroskopisch zählbaren Bakterien, was die Form
betrifft, zu der Koligruppe gehört; von diesen 50 0/0 kommt
nur eine äusserst kleine P>aktion auf den Platten zur Entwick-
lung. Die Bakterien von der Koligruppe sind auf den meisten
unserer künstlichen Nährböden sehr leicht kultivierbar, und es
liegt also kein einziger Grund vor, dass dieser grosse Über-
schuss mikroskopisch wahrnehmbarer koliforme Bakterien keine
Kolonien auf unseren Nährböden erzeugen würden, wenn sie
lebend wären.

Weiter deuten die sogenannten Kadaverformen 1) der Bak-
terien, welche zumal in grosser Zahl in den Kaninchenfäzes
vorhanden sind (in den menschlichen Fäzes in kleinerer Anzahl)

^) A. Klein, Archiv für Hygiene. Bd. 45.

229

darauf hin, dass wenigstens ein Teil der mikroskopisch zähl-
baren Bakterien abgestorben ist. Eine vollständige Ueberein-
stimmung zwischen der Anzahl Kadaverformen und der Anzahl
mikroskopisch zählbarer Bakterien, auch wenn diese grössten-
teils abgestorben sind, kann nicht erwartet werden. Sogleich nach
dem Tode der Bakterien wird das Bakterienprotoplasma noch
schön gleichmässig tingiert. Erst längere Zeit nach dem Tode
trennt sich die chromatische von der achromatischen Substanz
des Bakterienprotoplasmas : erstere ist in der Form von einem
oder mehreren Körnern angehäuft sichtbar, während dazwischen
der Rest des Protoplasmas keinen oder nur wenig von dem
Anilijifarbstoff aufnimmt. Noch später haben auch diese Körner
das Vermögen verloren, den Farbstoff aufzunehmen, und ist die
Bakterie nur noch als ein äusserst leicht gefärbter »Schatten"
wahrnehmbar. Diese Kadaverformen sind so fragil, dass sie
beim Färben der Präparate nach der KoCHschen Methode (vor-
hergehende Trocknung der Präparate) grösstenteils auseinander-
fallen und nicht mehr wahrgenommen werden ; bei der An-
wendung der mehr schonenden Färbungsmethode nach A, KLEIN i)
bleiben sie bestehen.

Und schliesslich hat A. Klein 2) auf experimentellem Wege
den Beweis geliefert, dass dieser Überschuss mikroskopisch
zählbarer Fäzesbakterien auch in den Fäzes selber sich nicht
mehr vermehren können. Zu diesem Zwecke wurden die
menschlichen Fäzes mit physiologischer Salzlösung verdünnt,
um eventuell vorhandene bakterizide Einflüsse zu verringeren,
respektive aufzuheben, und bei 37° C. aufgestellt; nach einigen
Tagen stimmte die Zunahme der Anzahl mikroskopisch zähl-
barer Bakterien genau überein mit der während dieser Zeit
erfolgten Zunahme der kultivierbaren Bakterien.

Auf der anderen Seite ist es wohl völlig ausgeschlossen,
dass es möglich wäre derartigen Lebensbedingungen bei der
Kultur auszuwählen, dass alle lebende Bakterien der Fäzes
ausnahmslos auf den Platten zur Entwicklung kommen würden.
Zahlreiche Bakterienarten sind uns bekannt, welche sich auf
unseren gewöhnUchen Nährböden nur schwer oder gar nicht

1) A. Klein, Zentralblatl für Bakt. und Parasitenkunde, Abt. I, Bd. 25.

2) A. Klein, 1. c

230

züchten lassen. Es ist aber hier die Frage, ob die Zahl solcher
zwar lebenden, aber nicht züchtbaren Bakterien, welche even-
tuell in den menschlichen Fäzes vorhanden sind, so gross sein
kann, dass diese Anzahl eine mehr oder weniger wichtige
Fraktion der mikroskopisch zählbaren Bakterien bildet und
also auf die aus dem gegenseitigen Verhältnis zwischen kulti-
vierbaren und mikroskopisch zählbaren Bakterien zu ziehenden
Schlüsse von merkbarem Einfluss sein könnte. Zu einem der-
artigen Einfluss müsste bei dem ungeheuren Überschuss mi-
kroskopisch zählbarer Bakterien, welche in den menschlichen
Fäzes vorhanden sind, die Zahl solcher lebenden, aber nicht
züchtbaren Bakterien wirklich noch sehr gross sein. Zahlreiche
Untersucher haben die Kulturverhältnisse für die Bakterien der
menschlichen Fäzes auf verschiedene Weisen variiert, um so
eine möglichst grosse Anzahl lebende Bakterien hervortreten zu
lassen. Es gelang eben nicht aus den Fäzes eine Anzahl Bak-
terien zu kultivieren, die mit der mikroskopischen Zahl auch
nur einigermassen zu vergleichen wäre. Wohl wurden Difïerenzen
angetroffen ; es waren aber im allgemeinen nur Differenzen,
wie sie auch bei Kulturplatten gefunden werden, welche unter
vollkommen denselben Verhältnissen gezüchtet werden. Nur
zwei Untersuchter bilden hiervon eine Ausnahme. MATSUSHITA i)
fand in der Regel eine weit grössere Anzahl kultivierbare Bak-
terien (in einem Falle sogar i8 Millionen per mgr Fäzes) wenn
er einen besonderen Nährboden verwendete, welcher aus Leber
oder Leber und Galle (Leber-Agar und Leber-Galle-Agar) ange-
fertigt war, wenn er bei 37° C. züchtete, und wenn er unter
anaeroben Verhältnissen kultivierte. COHENDY 2) versuchte
gleichfalls einen Nährboden herzustellen, welcher möglichst mit
dem natürlichen Milieu, worin die Fäzesbakterien leben, über-
einstimmte. Er machte eine Bouillon aus der Darmwand,
Magenwand und angrenzenden Organen (Leber, Pankreas, u.s.w.)
von Hunden, Schafen, Schweinen und Hühnern. Aus einer
derartigen Bouillon machte er, nach Zusatz von 0,9 0/0 Glykose,
einen Nähragar für die bakteriologische Untersuchung der
menschlichen Fäzes. Bei Verwendung dieses Agars bekam er

^) Matsushita, Arichv für Hygiene, Bd. 41.

^) Cohendy, C. r. de la Soc. de Biol., T. 60 et 63.

231

aus menschlichen Fäzes ungefähr 70 Mal mehr Bakterien als
auf gewöhnlichem Agar; unter anaeroben Bedingungen fand er
58 — 77 % der Gezamtzahl kultivierbarer Bakterien.

Ich habe dieses Problem, der Kontroversen wegen, nochmals
eingehend untersucht.

Für die Untersuchung wurden gebraucht die frischen Fäzes
erwachsener Menschen mit gemischter Kost. Eine gewisse
Menge dieser Fäzes (immer mindestens einige Gramme) wurde
genau abgewogen und in einem sterilisierten Mörser unter
allmählicher Hinzufügung der 20-fachen Menge sterilisierter,
physiologischer Kochsalzlösung zu einer Emulsion verrieben.
Von dieser Emulsion wurde mittels einer sterilisierten Pipette
loccm in einen sterilisierten Kolben mit sterilisierten Porzellan-
kügelchen gebracht, und dieser Kolben, nach Hinzufügung von
go ccm sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung, während
längerer Zeit tüchtig geschüttelt. Von dieser letzteren Emulsion
wurden mit einer Platinöse von bekannter Kapazität (3.37 mgr)
die Platten gegossen. Für die Herstellung der Agarplatten
wurde stets der Inhalt der Platinöse zuerst in ein sterilisiertes
Reagenzröhrchen mit 1,5 ccm sterilisierter Salzlösung hinüber
gebracht, die Flüssigkeiten gut gemischt, in das Röhrchen der
flüssige Agar gegossen, gut geschüttelt, und schliesslich der
Inhalt des Röhrchens zu einer Platte ausgegossen.

Kultiviert wurde :

1. Auf gewöhnlichem Nähragav bei 37° C. unter aeroben Bedingungen

2. Auf gewöhnlicher Nährgelatine bei 20° C. » » »

3. Auf I %"^§^'^ Glykoseagar bei 37° C. » » »

4. Auf I %-igem » bei 37° C. » anaeroben »

5. Aut I %-iger Glyl^osegelatine bei 20° C. » » »

6. Auf Leber-Galle-Agar( nach Matsushita) bei 37° C. » aeroben »

7. Auf Leberagar ( » » ) bei 37° C. » » »

8. Auf » ( » » ) bei 37° C. » anaeroben »

Von den Fäzes wurde zugleich der Gehalt an festem Stoff
bestimmt. Die Ergebnisse sind dargestellt in Tabelle I. Die
Zahlen beziehen sich stets auf die aus zwei Platten berechnete
Durchschnittszahl.

Unter aeroben Bedingungen sind die Differenzen zwischen
den auf den verwendeten Nährböden gefundenen Bakterienzahlen
untereinander nicht grösser als die, welche man auf einem
und demselben Nährboden zwischen mehreren von einer Rein-

232

TABELLE L
Bakterienzahl durch Kultur gefunden und berechnet auf j mgr. frischen Fäzes.

Nr. der

Prozent-
gehalt fes-
ten Stoffes
der Fäzes.

Kultiviert aerob bei 37' C.

auf

Kultiviert anaerob
bei 37" C. auf

Kultiviert
aerob bei
20O C. auf
Gelatine.

Kultiviert
anaerob

Unter-
suchung.

Nähr-
Agar.

Glykose-
Agar.

Leber-
Galle-
Agar.

Leber-
Agar.

bei 2o0 C.

Glykose-
Agar.

Leber-
Agar.

auf
Glykose-
gelatine.

25 %

3813

4.216

3.906

4.619

2.294

29 %

4-154

5-363

2.251

—

588

—

620

III

31 %

2-542

6.541

2.852

—

2.418

—

2.604

18 %

12.245

12.679

17-503

—

4.712

—

9-548

9-579

28 %

216.154

255-750

196.536

—

177-134

—

155.208

28.489

34 %

23.498

11.346

20.770

—

26.412

—

22.894

3.007

VII

26 %

7.192

8.940

5-518

—

4.092

—

8.122

S-878

VIII

30 %

245.830

254.758

213.931

—

24.614

—

302.589

123.504

27 %

159.216

179. 118

166.20S

—

102.455

—

184.078

153-225

35 %

3-565

4.185

2.988

—

2.729

1.147

27 %

2.666

4-154

5-394

—

415

—

2.976

818

XII

28 %

18.592

17-233

18.011

—

7-533

—

39-494

13.206

XIII

34 %

99-956

125.887

108.438

—

85.560

—

115-413

64.558

XIV

24 %

30-791

31.620

30.318

33-728

—

28.210

28.334

32 %

5.580

5-404

4.278

5-456

5-332

4-774

3-346

1.480

XVI

25 %

13-392

16.120

21.390

23.312

2.666

5-356

26.102

341

XVII

30 5o

3.286

2.852

1.406

8.184

961

1.054

1.922

806

XVIII

27 %

16.430

II. 136

14.260

559

2-853

15.292

1.985

XIX

28 %

42.222

39.680

30.814

34.131

28.489

24.025

31.682

30.020

29 %

525-413

508.496

507.501

447.005

31-930

28.703

527-403

394.059

XXI

26 %

2.052

2.133

1.767

2.076

837

775

I.Ol 6

279

kultur von Bakterien hergestellter Platten, antreffen kann i) ;
die Nährmedien von MATSUSHITA bieten keinen einzigen Vorteil
über den gewöhnlichen Nähragar und den Glykoseagar. Das
Kultivieren bei 20° C. (Gelatine) weist ebensowenig einen be-
deutenden Unterschied auf gegen das Züchten bei 37° C. Nur
beim Kultivieren unter anaeroben Verhältnissen ist die Bakterien-
zahl in der Regel kleiner, in vielen Fällen sogar ganz erheblich
kleiner, als beim Züchten unter aeroben Bedingungen ; auch hier
wies der Leberagar keinen einzigen Vorteil auf über den
I %-igen Glykoseagar. Auf i 0/0-iger Glykosegelatine bei 20° C.
war die Anzahl unter anaeroben Verhältnissen kultivierter Bak-

^) Hehewerth, Die mikroskopische Zählungsmethode der Bakterien von A.
Klein und einige Anwendungen derselben. Inaag. Diss. Amsterdam, 1900 und
Archiv für Hygiene, Bd. 39.

233

terien bald grösser, bald kleiner als die, welche gezüchtet war
unter anaeroben Bedingungen auf i o/o-igem Glykoseagar bei
37° C. ; aber auch auf der Gelatine unter anaeroben Verhält-
nissen blieb die Zahl der Kolonien regelmässig zurück, oft sehr
viel zurück, hinter der Kolonienzahl, welche unter aeroben
Bedingungen erzielt war, sowohl bei 37° C. wie auf Gelatine
bei 20° C.

Noch deutlicher treten diese Verhältnisse hervor, wenn man
die Durchschnittszahlen von allen verrichteten Bestimmungen
betrachtet.

TABELLE II.
Durchschnittszahlen berechnet aus Tabelle I.

Zahl der

untersuchten

Fäzes.

Nährböden.

Aerob bei
37* C.

Anaerob
bei 37" C.

Aerob bei
200 C.

Anaerob
bei 20 0 0.

Nähragar

68.599
71-567

65-415
71.016

25.568
9.649

77.928

21
20

Glykoseagar

Leber-Galle-Agar

Leber-Agar

19
20

Leber-Agar

Gelatine

Glykosegelatiiie

43-361

Die mittleren Bakterienzahlen, welche sowohl bei 37° C als
bei 20" C. auf den verschiedenen Nährböden gefunden sind,
zeigen eine sehr schöne Übereinstimmung ; nur die Kultur unter
anaeroben Verhältnissen bietet weniger günstige Bedingungen
für die Entwicklung der Fäzesbakterien.

Man hat nicht das Recht die Anzahlen unter aeroben und
anaeroben Verhältnissen kultivierter Bakterien zusammenzufügen,
und diese Zahl als die Gesamtzahl der aus den Fäzes gezüchteten
Bakterien anzugeben, so lange nicht der Nachweis geführt ist, dass
die unter anaeroben Bedingungen kultivierten Platten andere Bak-
terienarten gewähren als die unter aeroben Verhältnissen kulti-
vierten. COHENDY >) berechnet, dass durchschnittlich 58 — 76 ^j^
der aus den menschlichen Fäzes kultivierbaren Bakterien aus
anaeroben Bakterien bestehen ; der Rest wird von fakultativ

1) COHENDY, 1. C. 2j INIaTSUSHITA, 1. C.

234

anaeroben Bakterien gebildet. Ganz willkürlich nimmt COHENDY
hierbei an, dass die unter anaeroben Bedingungen kultivierten
Bakterien auch obligat anaerobe Bakterien sind, welche auf den
aeroben Platten nicht wachsen.

Die Sache verhält sich aber ganz anders. Auf den unter
anaeroben Verhältnissen kultivierten Platten wachsen gleichfalls
die fakultativ anaeroben Bakterien, welche auch auf den aeroben
Platten mitgezählt werden. Um mich hiervon zu überzeugen,
habe ich von einigen, unter anaeroben Bedingungen entwickelten
Platten, eine grosse Anzahl verschiedene Kolonien abgeimpft,
und untersucht zu welcher Gruppe von Bakterien sie gerechnet
werden mussten. Ohne Ausnahme gediehen die isolierten Bakterien-
arten, obgleich sie von anaeroben Platten herstammten, weit
besser unter aeroben Verhältnissen als unter anaeroben ; bei
näherer Untersuchung zeigte sich, dass alle isolierten Kolonien
Koli- oder koliforme Bakterien w^aren. Die unter anaeroben
Verhältnissen kultivierten Bakterien bestehen mithin zum weitaus
grössten Teil aus fakultativ anaeroben Kolibakterien, welche
also auch auf den aeroben Platten gefunden werden. In die-
sem Zusammenhang erklärt es sich auch, dass MATSUSHITA,
obgleich er in der Regel auf seinen anaeroben Platten weit
mehr Kolonien zählen konnte als auf seinen aeroben, unter den
44 verschiedenen Bakterienarten, welche er bei seinen Unter-
suchungen aus den menschlichen Fäzes isoliert hat, keine einzige
obligat anaerobe Art erwähnt.

Hiermit ist aber durchaus nicht gesagt, dass in den Fäzes
normaler, erwachsener Menschen mit gemischter Nahrung obligat
anaerobe Bakterien gänzlich fehlen würden ; im Gegenteil, durch
bestimmtes Anreicherungsverfahren gelingt es regelmässig die-
selben in den Fäzes nachzuweisen. Die Plattenkultur unter
anaeroben Verhältnissen wird aber nur selten zu der Isolierung
obligat anaerober Bakterien führen können, weil die Anzahl dieser
Bakterien in den menschlichen Fäzes so ausserordentlich gering
ist; die kleine Zahl dieser Bakterien kann der Anzahl unter
aeroben Bedingungen kultivierter Bakterien gegenüber, völlig
vernachlässigt werden.

Von den untersuchten Fäzes habe ich überdies noch die
Anzahl unter anaeroben und aeroben Verhältnissen kultivierbare
Dauerformen der Bakterien bestimmt. Zu diesem Zweck wurde

235

ein Teil der zweiten Fäzesverdünnung während lo Min. bei
80° C. erwärmt und jedesmal mit 2 ccm dieser erwärmten
Verdünnung Platten gegossen. Die Sporen wurden kultiviert auf :

i". I %-igem Glykoseagar bei 37° C. unter anaerobeu Bedingungen.

2°. I %-iger Glykosegelatine » 20° C. » » »

3". Gewöhnlichem Nähragar » 37° C. » aeroben »

4". Gewöhnlicher Nährgelatine » 20° C. » » »

Die Resultate dieser Bestimmungen sind dargetan in Ta-
belle III ; die Sporenzahlen sind angegeben per 1000 mgr
frische Fäzes.

TABELLE III.
Zahl der kultivierten Bakteriensporen in 1000 mg frischen Fäzes.

Nr. der

Kultiviert

aerob auf

Kultiviert

anaerob auf

Untersuchung.

Nähragar
bei 37° C.

Gelatine bei
20° C.

Glykoseagar
bei 37° C.

Glykosegela-
tine bei 20° C.

10.200

3.200

III

600

100

1.700

100

400

100

200

1.800

400

550

600

400

15050

77.000

VII

200

1.600

100

VIII

350

100

—

400

—

1.800

850

600

400

700

ISO

15.000

14.800

I.IOO

850

XII

600

—

3.100

—

XIII

6.900

150

9.500

—

XIV

1.400

900

3.600

350

1.800

200

500

—

XVI

4.400

400

I.IOO

300

XVII

1.700

1.500

300

500

XVIII

I.OOO

600

2.300

300

XIX

6.200

600

5.900

300

25.800

500

36.450

550

XXI

600

500

550

Die Zahl der kultivierbaren Dauerformen ergiebt sich als
äusserst gering und beträgt für beide Gruppen, sowohl aerobe
wie anaerobe, durchschnittlich 4 Sporen per mg frische Fäzes.
Die Anzahl unter anaeroben Verhältnissen kultivierbarer Sporen
beträgt also nur 0.057 Voo; tier Durchschnittszahl (± 70.000 per

236

mg frische Fäzes) der aus denselben Fäzes kultivierten, vege-
tativen Bakterienformen gegenüber.

Da weitaus die Mehrzahl der obligat anaeroben Bakterien
zu den Sporenbildnern gehören, beweist auch dieses Ergebnis
von neuem, welch eine geringe Anzahl obligat anaerober
Bakterien in den Fäzes erwachsener Menschen anwesend sind.

Wenn ich voraussetze, dass die unter aeroben und anaeroben
Verhaltnissen kultivierten Sporen zu verschiedenen Bakterienarten
gehören, finde ich im ganzen vorhanden 0.114 o/^^j kultivierbare
Sporen, gegenüber der Gesamtzahl der aus den Fäzes kultivier-
baren Bakterien; dem ungeheuren Überschuss der in diesen
Fäzes vorhandenen mikroskopisch zählbaren Bakterien gegenüber,
wird diese pro-Mille-Zahl natürlich noch viel kleiner. Aus den
Untersuchungen von A. KLEIN und F. ViSSER 1) ist weiter
hervorgegangen, dass die Anzahl mikroskopisch zählbarer Sporen
in menschlichen Fäzes, als Durchschnittszahl aus einer grossen
Reihe von Bestimmungen, 4V2 Voo ^^r Gesamtzahl vorhan-
dener, mikroskopisch zählbarer Bakterien beträgt. Hieraus geht
also hervor, dass in den Fäzes erwachsener Menschen, ebenso
wie dies sich schon erwiesen hatte für die vegetativen Bakte-
rienformen, nur eine äusserst kleine Fraktion der vorhandenen
Sporen auf den Platten zur Entwicklung zu bringen ist ; weit-
aus die Mehrzahl der mikroskopisch wahrnehmbaren Sporen in
den menschlichen Fäzes ist wahrscheinlich abgestorben.

Zusammenfassung.

1. Weder auf besonderen Nährböden, noch auch unter anaeroben
Bedingungen oder bei 37° C. lässt sich eine bedeutend grössere
Bakterienmenge aus den Fäzes normaler, erwachsener Menschen
kultivieren.

2. Die Zahl der obligat anaeroben Bakterien in den Fäzes Erwachsener
ist sehr gering.

3. Der ungeheuere Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien in
den Fäzes Erwachsener ist als abgestorben zu betrachten.

4. Die Zahl der Dauerformen in den Fäzes Erwachsener ist sehr
gering ; die übergrosse Mehrheit dieser Dauerformen ist ebenfalls
als abgestorben zu betrachten.

^) A. Klein und F. Visser, 1. c.

STÄNDIGE IVUTARBEITER DER FOLIA MICROBIOLOGICA:

C. W. BROERS, Utrecht - R. P. VAN CALCAR. Leiden -
L. POLAK DANIELS, Haag - C. EIJKMAN, Utrecht -
H. J. HAMBURGER, Groningen - H. C. JACOBSEN,
Delft - D. A. DE JONG, Leiden - R. DE JOSSELIN DE
JONG, Rotterdam - J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam -
L. LOURENS, Rotterdam - H. MARKUS, Utrecht -
C. A. PEKELH ARING, Utrecht - H. E. REESER,
Rotterdam - N. L. SÔHNGEN, Delft - C. H. H. SPRONCK,
Utrecht - C. S. STOKVIS, Amsterdam.

Die Zeitschrift „Folia Microbiologica"
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