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Full text of "sheng wu hua xue zhi bei ji shu"

I 



生 物化学 实验技 术丛书 

生物 化学制 备技术 

苏拔 贤主编 




I 



内 容简介 

生化制 备技术 涉及面 很广, 包括材 料处理 、提取 、各 种分离 手段的 使用, 
以至 浓縮、 结晶、 纯度 测定和 保存等 内容。 由于 生化物 质种类 繁多, 制备方 
法多种 多样, 不 可能有 一个统 一操作 规程, 因此, 本书 着重介 绍实验 的设计 
思路、 有关分 离技术 的原理 和实验 条件的 选择, 并列举 各种例 子加以 说明。 
书 末并附 有各类 生化物 质制备 的参考 文献。 

本书可 供生物 化学、 生 物学、 医药、 食品工 业技术 人员及 有关大 专院校 
师生 参考。 



生 物化学 实验技 术丛书 
生物 化学制 备技术 

苏拔 贤主编 
责 任编辑 赵甘泉 

4^ « «k A i*" 出版 

北京 朝阳门 内大街 137 y- 

+ 《f£ef i^Jjr 印刷 

新华 书店北 京发行 所发行 各地 新华书 店经售 
* 

1986 年 1 月第 一 版 开本: 787 X 1092 l/l« 
1986 年 1 月 !《— 次印刷 印 张 : 20 \/2 
印教 0001— 4,200 字教: 467,000 

统一 书号 : 13031 • 3053 
本 itt 书 5> : 4062 • 13—10 

定价: 4.80 元 



编 者 的 话 

在二 十世纪 有了惊 人发展 的生物 学中, 生 物化学 是最活 跃的分 支学科 之一。 促使生 
物 化学迅 速发展 的重要 因素之 一是新 技术的 开发。 

过去一 、二十 年间生 物化学 的实验 方法日 趋专门 化和复 杂化, 牵 涉到生 化实验 工作的 
领域 也越来 越多。 今天, 农业、 工业、 医学、 环境 以及生 命科学 等的研 究都涉 及生物 化学研 
究, 生 化实验 已成为 常规的 实验操 作了。 因此, 对于开 始进行 生化研 究的工 作者, 或者要 
开拓 自身专 业领域 以外生 化研究 领域的 工作者 来讲, 都 希望能 有一本 合适的 实验指 导书。 

有鉴 于此, 科学出 版社于 1977 年 夏委托 中山大 学在广 州召开 了由国 内从事 生化工 作的部 
分 研究所 (中 国科 学院上 海生物 化学研 究所、 中国 科学院 微生物 研究所 )、 大学 (中 山大 
学、 北京 大学、 武汉 大学、 南开 大学、 南京 大学、 复旦大 学)、 工厂 (江门 甘蔗化 工厂、 生物 
化 学研究 所东风 生化试 剂厂) 参加座 谈会, 拟定了 编写一 套切实 可行, 供有 关工作 者随时 
查阅 参考的 《生 物化 学实验 技术丛 书》。 

本 《丛 书》 各 册编写 的内容 是建国 以来国 内已经 应用、 开 展或正 在开展 的生化 技术。 
随着 我国生 化研究 工作的 进展, 国外新 技术的 引进, 国 内独创 技术的 开展, 将不断 补充新 
的 内容。 

本 《丛 书》 着重 在实验 技术, 各册内 容力求 做到: 

(1) 理论部 分简洁 明了, 实验 部分力 求重复 性高; 

(2) 直接 触及实 验设计 的各项 要领; 

(3) 指出 实验操 作中应 注意的 地方; 

(4) 尽 可能多 的举例 说明。 

本 《丛 书》 的 编写, 虽经大 家共同 努力, 但缺点 错误在 所难免 ,热情 希望读 者批评 指正。 
如果本 《丛 书》 的出版 ,能推 动生物 化学的 进展, 为实 现科学 技术现 代化作 出一些 贡献, 编 
者将感 到十分 高兴。 



前 言 



《生 物化 学制备 技术》 分册, 内容包 括生物 化学制 备技术 特点、 实 验设计 原理, 有关生 
化制备 一些常 用方法 如提取 、沉淀 、过滤 与超滤 、结晶 、浓縮 与干燥 、样品 保存, 以及 在分离 
纯化时 使用较 多的色 谱法、 超 离心技 术等。 与制备 有关的 分析鉴 定方法 ,则 分别由 其他分 
册予以 介绍, 使 本分册 篇幅与 其他分 册大致 相同。 

尽管 如此, 生化 制备技 术所涉 及的面 还是很 宽的, 任何一 类生化 物质的 制备方 法或制 
备方法 中某一 技术都 可以写 成一本 专著。 在实 际工作 中我们 还体会 到各类 生化物 质制备 
的 方法、 手段是 很不相 同的, 即使同 一种生 化物质 也有多 种制备 方法, 就是同 一生化 物质, 
采用同 一制备 方法, 也 因材料 差异、 设备和 条件的 不同、 工作 人员的 习惯经 验等彼 此工艺 
流 程并不 一样。 所 以本分 册编写 的指导 思想, 一方面 是作为 《生物 化学实 验技术 丛书》 整 
体的一 部分, 内容选 择上与 其他分 册互相 呼应、 互相 补充; 另方面 希望通 过本书 的介绍 ,使 
读者对 生化制 备技术 有一比 较系统 认识。 因此, 在内 容方面 我们尽 可能把 有关技 术原理 
讲清楚 ,并适 当多举 一些例 子加以 说明, 企 图使理 论与实 例结合 起来, 起到 触类旁 通的作 
用。 同时 在本书 末尾, 附 上各类 生化物 质制备 及测定 的参考 资料, 以 便读者 查阅。 

参加本 书编写 的有: 苏拔贤 、程 明哲、 卓肇文 、劳 子谦。 附录 部分由 粟舜英 编译。 编写 
过 程中, 上 海生物 化学研 究所东 风生化 试剂厂 顾涵英 同志、 香港中 文大学 生化系 江润祥 
教授等 均先后 赠送了 大量珍 贵图书 资料。 本书 初稿完 成后, 得 到北京 大学王 镜岩副 教授、 
中山 大学曾 淑云副 教授、 陈俊 民副教 授等在 百忙中 给予审 阅并提 出了许 多宝贵 意见。 全书 
编 写得以 完成, 还由 于江门 甘蔗化 工厂、 中国科 学院微 生物研 究所、 上海生 化制药 厂和中 
山大学 生化教 研室同 志们具 体帮助 和积极 支持的 结果, 在此 仅向这 些同志 致以最 衷心的 

感谢! 

由于我 们水平 所限, 实 践经验 很少, 书中 肯定存 在不少 错误和 缺点, 垦 请读者 批评指 

正。 

苏 拔 贤 
1983.8. 



目 录 



第一章 生物 化学制 备技术 特点及 实验设 计原理 1 

第一节 生物体 组成及 生物分 子间的 作用力 1 

―、 生 物体组 成成分 1 

二、 生物分 子间的 作用力 2 
第二节 生化分 离制备 方法特 点及基 本原理 6 

一、 生 化分离 制备方 法特点 6 

二、 生化分 离制备 方法基 本原理 7 

第三节 生 化分离 制备实 验的设 计及实 验方法 的选择 8 

一、 生化 分离制 备实验 的设计 8 

二、 分离纯 化各阶 段对实 验技术 的选择 16 

参 考文献 22 

第二章 提取 及溶剂 分离法 23 

第一节 引言 23 

第二节 选 用的溶 剂与物 质溶解 度的一 般规律 23 
第三节 影响物 质溶解 度的几 个主要 因素… 26 

一、 离 子强度 26 

二、 PH 值 26 

三、 ®g 27 

四、 去垢剂 27 

第四节 固 一液萃 取中扩 散作用 的应用 27 

第五节 液 一液萃 取时分 配定律 的应用 28 

第六节 提取 时对具 有生理 活性物 质的保 护措施 29 
第七节 各类物 质的提 取分离 30 

一、 蛋 白质和 藤的提 取分离 30 

二、 核 酸的提 取分离 37 

三、 脂 类化合 物的提 取分离 44 

四、 其他 脂溶性 生化物 质的提 取分离 45 

五、 糖、 氧基酸 及其他 水溶性 生化物 质的提 取分离 - 47 

六、 植 物次生 物质的 提取及 溶剂系 统分离 的选择 - 48 
0^^m 49 

第三章 沉淀及 沉淀剂 51 

第一节 引言 • 51 

第二节 盐析法 51 

―、 基 本原理 51 

二、 影响盐 析的若 干因素 53 



三、 一般常 用的中 性盐盐 析方法 56 

第三节 有 机溶剂 沉淀法 61 

一、 基 本原理 61 

二、 有机溶 剂的选 择及浓 度计算 62 

三、 有 机溶剂 沉淀的 影响因 素及注 意事项 64 

四、 有机溶 剂沉淀 法实例 65 

第四节 等电点 沉淀法 68 

第五节 生 成盐类 复合物 沉淀法 68 

第六节 选择 性变性 沉淀法 72 

第七节 非离子 多聚物 沉淀法 • 73 

- 一、 基 本原理 • 73 

二、 应 用方法 和范围 74 

三、 应 用实例 76 
第八节 其他 沉淀剂 78 

一、 氨 基酸类 78 

二、 大分子 核酸类 78 

三、 粘 多糖类 

参 考文献 79 
第四章 生物小 分孑常 用色谱 分离法 80 

第一节 吸附 色谱法 • 81 

一、 吸 附过程 的本质 81 

二、 常用 吸附剂 的特性 和应用 , 82 

三、 吸 附柱色 谱的实 验技术 86 
第二节 离 子交换 色谱法 • 88 

一、 离子 交换剂 的类型 88 

二、 离子交 换树脂 的性质 91 

三、 离子 交换的 动力学 93 

四、 离子 交换剂 的选择 94 

五、 离 子交换 色谱法 的应用 97 

第三节 高 效液相 色谱法 99 

一、 弓 m 99 

二、 高效液 相色谱 仪概述 100 

三、 高效液 相色谱 的固定 相填料 103 

四、 色 谱方法 的选择 104 

五、 分离度 的调整 104 

六、 具体操 作及注 意事项 …… 10& 

参 考文献 111 

第五章 生物 大分孑 的色谱 分离法 : 112 
第一节 多糖 基离子 交换剂 色谱法 112 

一、 多糖 基离子 交换剂 的分类 112 

二、 实验操 作技术 •••• 114 

• i V • 



第二节 分子 筛色谱 • 119 

一、 分 子筛色 谱的基 本原理 119 

二、 常 用凝胶 的结构 和性质 121 

三、 分 子蹄色 谱的实 验技术 127 

四、 分子 旆色谱 的应用 129 
第三节 亲 和色谱 135 

一、 基 本原理 135 

二、 载体 的选择 '- 136 

三、 琼脂 糖的活 化及其 衍生物 的制备 138 

四、 亲和色 谱条件 的选择 140 

五、 亲和 色谱应 用举例 : 141 
第四节 色 谱聚焦 145 

―、 色 谱聚焦 的原理 146 

二、 多 缓冲剂 147 

三、 多缓? * 交换剂 148 

四、 操 作步骤 149 

五、 应 用实例 152 

参 考文献 …… 153 

第六章 制备离 心技术 155 

第一节 引言 155 

第二节 一般制 备离心 156 

一、 过滤式 离心机 156 

二、 沉降式 离心机 157 

三、 分离式 离心机 158 

四、 一 般制备 离心机 的选择 158 

第三节 制备超 离心… 159 

―、 原理 和计算 160 

二、 制备超 离心的 方法及 其选择 163 

三、 转子、 离 心管及 其选择 168 

四、 梯度、 梯度 介质及 其选择 173 

五、 制备 超离心 的操作 177 

六、 制 备超离 心实例 184 

参 考文献 187 

第七章 过滤 与膜分 离技术 189 

第一节 过滤 189 

一、 过滤 ii 度 189 

二、 提高滤 速的主 要措施 189 

三、 生化 工业常 用的过 滤装置 194 

第二节 膜分 离技术 197 

一、 透析 198 



三、 电渗析 和离子 交换膜 电渗析 218 
参 考文献 220 
第八章 结 晶方法 222 
第一节 结晶与 晶体一 般性质 222 
第二节 生化 物质形 成结晶 的条件 223 

一、 样 品纯度 223 

二、 溶液的 饱和度 ' 224 

三、 溶剂 的选择 225 
第三节 晶核 形成及 晶体生 长的影 响因素 226 

一、 晶 核的形 成及诱 导方法 226 

二、 影响结 晶生成 的因素 226 
第四节 结晶衍 生物及 重结晶 228 

一、 结晶 衍生物 228 

二、 重结晶 228 

第五节 结 晶的一 般方法 229 

第六节 有关蛋 白质结 晶的几 项技术 • 231 

一、 抽提结 晶技术 23-1 

二、 蛋白质 微量结 晶技术 233 

参 考文献 ' 237 

第九章 浓縮 与干燥 239 

第一节 浓缩 239 

―、 « 239 

二、 吸收 252 

三、 膜浓缩 253 

■ 四、 冰 冻融化 255 

五、 其他 256 

第二节 干燥 256 

一、 影 响干燥 的因素 256 

二、 常压吸 收千燥 257 

三、 真 空干燥 259 

四、 冷 冻干燥 260 

五、 喷 雾干燥 264 

六、 滚 筒干燥 • 266 

参 考文献 267 

第十章 样品 的保存 269 

第一节 样 品的保 存与环 境条件 的关系 269 

第二节 样品保 存的一 般方法 270 

第三节 各类生 化物质 的保存 273 

―、 蛋白质 的保存 273 

二、 核酸 的保存 276 

• vi • 



三、 油脂 的保存 276 

四、 细 胞及生 物制剂 的保存 277 

五、 小 分子生 化物质 的保存 281 
参 考文献 282 

附录一 各 类生化 物质制 备及测 定的参 考资料 284 
附录二 部 分国际 单位换 算及缓 冲液配 制方法 305 



第一章 生物 化学制 备技术 特点及 实验设 计原理 

苏拔贤 

第一节 生物体 组成及 生物分 子间的 作用力 

一、 生物体 组成成 份 [ 1, 2] 

现知地 球上约 有一百 八十多 万种动 、植物 (包 括微 生物) 从最 简单的 病毒、 细 菌直至 
最复杂 的人类 ,不论 它们之 间形态 上多么 不同, 但它们 最基本 组成成 份都含 核酸和 蛋白质 
两类 物质。 核酸是 遗传信 息的携 带者, 在生 物体内 指导着 各种蛋 白质的 合成, 决定 着每一 
生物 个体和 种族的 差异。 蛋 白质则 担负着 机体的 生长、 发育、 感觉、 运动、 保护、 运 输营养 
物质和 氧气, 消灭外 来疾病 因素等 多种重 要生理 功能。 进化 比较高 级的生 物体, 其 组成成 
份除了 核酸和 蛋白质 (包 括酶) 两 大类物 质外, 还含有 糖类、 维生素 、脂类 、激 素以及 多种多 
样的 代谢中 间产物 和次生 物质。 

一个生 物体内 含有多 少生物 分子? 以及 这些生 物分子 结构、 形状、 大小 如何? 都是通 
过亿 万年进 化而确 定的, 每 一种生 物分子 结构与 功能不 仅十分 协调, 而且每 个分子 在空间 
排列 也很有 次序, 相互 契合, 并通过 细胞的 形式共 同组织 起来, 执行着 各种复 杂生理 功能, 
体现 出生命 的高级 活动。 

单细胞 生物一 个细胞 就是一 个完整 的生命 体系。 多细胞 生物逐 渐出现 高度分 化的器 
官 组织, 细胞内 不同的 细胞器 的化学 组成也 有明显 区别。 一 个细胞 究竟由 多少生 物分子 
组 成呢? 现以大 肠杆菌 为例, 说明一 个简单 的细胞 的分子 组成。 见表 1-1。 

表 1-1 可 以代表 细菌这 一类细 胞的组 成成份 的基本 情况, 当然不 同类型 的生物 、不同 



表 1-1 大肠杆 菌细胞 中主要 的分子 组成' 



组 分 


总量的 百分率 


分 子种类 的概数 


水 


70 


1 


蛋白质 


15 


3,000 


核酸 






DNA 


1 


1 


RNA 


6 


1,000 


糖类 




50 


脂类 


2 


^0 


基本 单位分 子与中 间产物 


2 


5liO 


无 机离子 


1 


12 



类型的 细胞其 组成分 子种类 和概数 是不相 同的, 有的差 异很大 ,有 的差异 较小。 但 在同一 

个细胞 内各类 的分子 分布大 致有一 个规律 ,在 真核细 胞中, 脱氧核 糖核酸 (DNA) 大部分 
存在 于细胞 核内, 只有 极少量 存在于 线粒体 或叶绿 体中。 而核 糖核酸 (RNA) 则 主要存 
在 于细胞 质中。 电子 传递系 统组成 物质, 包括黄 素蛋白 ,细 胞色素 c、 ci、 a、 a3 以 及糖类 

分解, 脂肪酸 合成和 氧化, 氧化磯 酸化等 有关醒 系大部 分存在 于线拉 体中, 关于 蛋白质 (包 

括醸) 和核酸 两大类 大分子 在细胞 内分布 情况, 现以 肝细胞 为例介 绍于表 1-2 【3 1 



表 1-2 蛋 白质、 II 及核酸 在肝细 胞内分 布情况 



细胞 器名称 


主要 蛋白质 及歸类 


核酸类 


细胞核 


精蛋白 、组 蛋白、 核酸合 成薛等 


RNA 占总量 10% 左右 
DNA 几 乎全部 


线粒体 


电子 传递、 氧化磯 酸化、 三接酸 循环、 脂肪酸 氧化、 

氨基酸 氧化、 脲合成 等酶系 


RNA 占总量 5% 左右 
DNA 微量 


内质网 (微 拉体) 


蛋白 质合成 海系、 经 化醒类 


RNA 占总量 50% 左右 


溶薛体 


水 解薛系 (包括 RNA 酶、 DNA 酸、 碟酸 脂薛、 硫 
酸酯酸 、脂酵 、组 织蛋白 61、 糖昔 翁等) 




高尔 基氏体 


糖苷转 移薛、 粘多 糖及类 固醇合 成酷系 




细胞膜 


载体 与受体 蛋白、 抗原 ATP 薛、 环化腺 苷醒、 
5'- 核苷酸 醒以及 多种脂 蛋白及 糖蛋白 




细胞汁 


咤 和嗪呤 代谢物 、氨基 酸合成 翁系、 各种 可溶性 

蛋白 


RNA (主 要是 tRNA) 占总量 30% 



由 上两表 可见, 一个细 胞包含 着成千 成万种 分子, 每种 分子每 时每刻 都在变 化运动 
中, 就像 一座小 小的" 化工厂 "一样 ,分 成许多 车间, 有着各 种各样 的机器 ,不 断消耗 着各种 
原料, 产生 出各种 产品; 这处产 品运到 别处又 变成了 原料, 重新合 成或分 解成另 一产品 ,直 

到最后 变成最 简单的 C02、 尿素、 H2O 或一些 "低值 "废 物排出 体外。 生 化分离 制备的 

目的, 就好 像是把 这一" 工厂" 里某一 机器的 "部 件" 或 "产 品" 巧妙地 、毫无 损伤地 分离出 
来。 研究其 结构, 了解其 功能或 作为一 种药物 和原料 满足人 类社会 生产和 生活需 要的一 
种 手段。 

二、 生物分 子间的 作用力 [4 , 5] 

存在 于地壳 上的元 素巳知 有九十 多种, 而组成 生物体 的元素 不过二 十多种 ,其 中最重 
要 的元素 是碳。 以碳为 主链连 结氮、 氧、 氢、 碟、 硫等 元素, 通过共 价结合 ,组 成各种 原始生 
物小 分子的 骨架, 如氧 基酸、 核 苷酸、 单糖、 甘油、 脂肪 酸等。 我们 把这些 原始生 物分子 
看成是 生命组 成的基 本结构 单位。 然后 这些小 分子通 过共价 缩合而 成各种 各样生 物大分 
子, 如蛋 白质、 藤、 核酸、 多 糖等。 大分 子与大 分子, 或 大分子 与小分 子之间 又常常 相互结 
合形 成更大 的复合 分子, 如脂 蛋白、 糖蛋白 、核蛋 白等。 蛋白质 、核酸 等生物 大分子 除了一 
级结 构外, 还有二 、三、 四级 结构。 生物大 分子还 可以再 聚合成 生物超 分子复 合物, 如核糖 
体便 是一个 超分子 结构复 合物。 每 个核糖 体含有 一个大 亚基, 一个小 亚基, 每个亚 基约含 

有 65f。RNA、 35fc 蛋 白质。 各种 细胞器 实际上 是由超 分子复 合物所 组成, 最后 再由不 
同 结构的 细胞器 建造成 细胞。 因此, 我们欲 把细胞 中各种 生物分 子相互 间的结 合拆开 ,就 



需要了 解这些 分子结 合的力 (或 称化 学键) 的有关 性质, 然后 才能使 用相应 的措施 把它们 
彼 此分离 出来, 这 就是我 们生化 制备实 验设计 的主要 对象及 目的。 现在简 单地就 一些主 
要生物 大分子 内及分 子之间 的作用 力讨论 如下: 



(― ) 共价键 

这是 组成各 种生物 分子元 素及基 团之间 "连 结" 主要化 学键。 共价键 又称原 子键, 是 
指由 两个原 子通过 共用电 子对而 产生的 一种化 学键。 若电子 对是由 两个原 子平均 共有称 
为非 极性共 价键。 如电子 对偏于 某原子 一侧使 整个分 子产生 极性, 称 极性共 价键。 极性 
键的 极性渐 增至电 子对脱 离一个 原子而 为另一 原子所 单独占 有时, 即变为 离子键 (如图 
1-1 所示 )。 因此, 离子型 化合物 是一种 极性最 强的化 合物。 

上面所 述是由 二个原 子共同 提供电 子对所 形成共 价键, 如果两 个原子 之间, 由 某一原 
子单方 面提供 共用电 子对所 形成的 共价键 称为" 配位 键"。 许 多含有 金属离 子的蛋 白质分 
子, 金属离 子与蛋 白质的 连接大 都是配 位键。 

蛋白 质分子 内每一 个氨基 酸的氨 基与另 一氨基 酸的接 基之间 脱水縮 合形成 肽键, 核 
酸分 子内每 一个核 苷酸的 碟酸基 团与相 邻的另 一个核 苷酸的 戊糖上 的轻基 脱水缩 合形成 
碟酸二 酯键。 多 糖分子 内前后 单糖上 轻基脱 水缩合 形成的 糖苷键 都是共 价键。 现 以蛋白 

质 为例, 介绍一 些共价 键的键 长及键 能如表 1-3。 



3 晚性键 



性分子 



H 



H CZ3 
CEE3 



CUD 
CEIZZ) 



Na 



离子键 



离子 型分子 



Na 



表 1-3 蛋白质 中共价 键键长 及键能 



共价键 


键长 (A) 


键能 (KJ/ 克 分子) 


C 一 H 


1 


08 


-378.7 


C— C 


1 


53 


276.9 


C— N 


1 


47 


232.2 


C=N 


1 


30 


1^68.6 


C-N (状键 ) 


1 


32 




C— S 


1 


81 


246.8 


c=o 


1 


24 


665.2 


— H 





96 


462.7 


N— H 


1 


01 


352.7 


S— N 


1 


33 


366.9 


S— S 




08 


266.9 


P— 


1 


66 


1 



图 1-1 由非 极性分 子过渡 到离子 型分子 示意图 1 卡 (cal) = 4.1868 焦耳 (J) 

从表 1-3 中可以 看到, 共价键 的键能 一般在 230 至 660 千焦 (KJ) 之间, 其 中肽键 
(一 C 一 N —) 与 二硫键 (一 S—S —) 都具 有双键 性质, 肽键不 能沿着 一 C 一 N — 轴 自由转 
动, 二硫 键不能 沿着一 S — S —轴 自由 转动。 肽键 是蛋白 质一级 结构中 主要共 价键, 二硫键 
是维系 蛋白质 空间结 构最强 有力的 桥键。 而碗 酸酯键 则是核 酸一级 结构的 主要共 价键。 



(二) 非共价 键或非 共价键 作用力 

生物体 内的生 物大分 子如蛋 白质、 酶、 核酸、 多 糖等的 空间结 构和分 子之间 的作用 力,. 



Bx xcx 



H H H H 

键的 极性依 次增强 



主要 是通过 非共价 的静电 引力、 氢键和 范德瓦 耳斯力 (Van der Waals') 等联系 而成。 其 
中 除离子 键的键 能与共 价键相 近外, 其它 键的键 能一般 都小于 4 千焦 (KJ), 而 键长则 
长达 3 — 5 A 左右。 组 成生物 分子共 价键的 强度、 方向或 其它性 质受环 境影响 较少, 而非 
共价 键的性 质受环 境影响 较大。 下面我 们分别 介绍一 些非共 价键作 用力的 性质: 

1. 离孑键 (或称 离子时 ,有 时称为 盐键或 盐桥) 离子键 指相反 电荷的 静电作 用力, 
这 一作用 力与两 个带电 基团带 电量的 乘积成 正比, 与两个 基团距 离平方 成反比 ,称 为库伦 
定律, 可 用下式 表示: 

F = -9i3i, 

q.q2 表 示二个 带电基 团的带 电量。 D 是介电 常数, 即介 质对有 相反电 荷微粒 之间静 
电引力 影响的 数值, 常定义 为在真 空中与 在介质 中这种 带电微 粒之间 的电位 差比。 y 为二 
个 基团的 距离。 

生 物大分 子能形 成离子 键的带 电基团 很多, 如蛋 白质分 子中的 带正电 基团有 胍基、 
e- 氨基, N- 末端的 氨基、 咪 基等, 带 负电的 基团有 C- 端 接基, 天 门冬氨 酸的^ 接基, 谷 

氨酸的 羧基等 ,都可 以相互 形成离 子键。 但离 子键在 水中, 因水的 介电常 数很高 ,带电 
基团受 屏蔽, 从而使 正负电 荷相吸 引的能 力大大 减弱。 所以 分布在 蛋白质 分子表 面的带 
电基团 ,实际 形成离 子键的 机会并 不多, 主要 是把水 分子吸 引在自 己周围 形成水 合层, 使 
蛋 白质具 有亲水 性质。 

在核酸 分子中 的确酸 基团有 时候也 与蛋白 质分子 中碱性 基团以 离子键 相结合 (如组 
蛋白、 核蛋白 ), 另某 些酶, 如胆碱 脂藤、 酶分子 和底物 胆碱的 结合, 也 是通过 离子静 电引力 
相互作 用的。 

2. 氢键 在化 合物分 子中, 凡是 和负电 性较大 的原子 相连的 氢原子 (如 — H, 
N — H, F-H) 都可 以和同 一分子 或别的 分子上 另一负 电性较 大的原 子形成 氢键。 水、 
乙醇、 醋酸等 分子的 缔合现 象和蛋 白质、 核酸分 子立体 结构的 维系都 和氢键 有关。 氢键的 
键距 比普通 的化学 键长, 约为 2. 6 3 至 3.10 A。 键 能比普 通化学 键弱, 一 般只有 12 — 34 千 
焦 / 克 分子。 氧键还 具有方 向性, 当氢键 供体与 受体上 N、 H、 0、 C 等原 子在一 直线上 
时, 键 的强度 最大。 约为 33 千焦。 在水溶 液中, 氢键 的产生 和交换 都以很 高速度 进行。 
这对生 物分子 表现其 生理活 动有着 重要的 作用, 也是 生物大 分子形 成立体 构型的 主要推 
动力 之一。 

3. 范德瓦 耳斯力 (Van der Waals') 范 德瓦耳 斯力主 要包括 三种弱 的静电 引力: 

(1) 非 极性分 子内部 电子运 动的不 对称, 产生瞬 时极性 现象, 以 及由于 这一现 象所引 
起周围 电子分 布的变 化所产 生的作 用力, 也 称色散 效应或 London 分 散力。 

(2) 极 性基团 之间偶 极与偶 极相互 吸引力 (也称 定向效 应)。 

(3) 非极性 分子与 极性分 子接近 ,在 分子内 造成的 偶极诱 导作用 (也称 诱导效 应)。 
范 德瓦耳 斯力总 的表现 趋势是 偶极之 间互相 吸引, 但当 两个基 团距离 很近时 排斥作 

用又 占主导 地位。 范德 瓦耳斯 力的键 距约为 3 — 4 A, 其能量 比氢键 还弱, 在水中 或一些 
极性介 质中单 独起作 用不大 ,但分 子中存 在许多 偶极, 这些偶 极相互 作用所 得的范 德瓦耳 
斯力 则是很 大的。 范德 瓦耳斯 力还具 有某些 特点, 如 它一方 面可以 使分子 之间具 有吸引 
能力, 同时这 种引力 又必需 使二个 分子保 持一定 距离。 这种 特殊作 用力对 于酶和 底物, 抗 



原和 抗体的 结合和 解离有 着重大 意义。 

4. 疏 水基相 互作用 疏水 基相互 作用, 以往常 称为" 疏水 键"。 虽 "疏 水键" 这一词 

不确, 因习惯 了现姑 用之。 t 对于 维持蛋 白质、 酶、 核酸 等大分 子立体 结构起 着重大 作用。 
这 些大分 子通常 都有亲 水区域 和疏水 区域, 疏 水区域 一般位 于分子 内部, 也常是 酶与底 
物, 抗 原与抗 体相互 结合的 地方。 

蛋白质 和核酸 分子的 疏水键 主要是 蛋白质 分子中 缬氨酸 、亮 氨酸、 苯丙 氨酸、 色氨酸 
等一 些疏水 性基团 及核酸 分子中 嘌吟、 嘧 啶碱基 之间的 非极性 侧链粘 结在一 起而形 成的。 
这些 非极性 疏水基 团相互 粘合在 一起, 可以解 释为非 极性基 团为了 避开水 而被迫 相聚的 
自然 趋势。 在疏水 区域, 极性基 团一般 很难离 子化, 并 造成与 自由水 溶液十 分不同 的化学 
环境。 有机 溶剂能 降低溶 液介电 常数, 故可 导致疏 水键的 破坏, 反之, 盐类可 使非极 性基. 
团在水 中溶解 度减少 ,可使 疏水键 增强。 

(H) 水在 各种非 共价作 用力中 的作用 

没 有水, 生命便 不可能 形成。 在生物 化学反 应中, 水不仅 是一种 良好的 溶剂, 也是在 
各种生 化反应 中提供 H+ 和 OH- 的主要 源泉。 同时, 水还 是生物 分子表 现生理 活性的 
唯 一天然 环境。 水 的结构 特点及 对于生 物分子 作用力 的影响 可归纳 如下: 

(1) 水分子 由一个 氧原子 和两个 氧原子 组成, 由于分 子不对 称的空 间构型 ,其 中氧原 
子具 有负极 作用, 而相邻 的二个 氢原子 则合成 偶极分 子中的 正极。 二个氢 原子核 与氧原 
子 核连线 之间形 成的夹 角约为 105°, 是一个 高度极 化的极 性分子 ,具 有很高 的介电 常数, 
图 1-2 是 水分子 结构示 意图。 

(2) 由 于偶极 分子中 场力的 作用, 水 分子彼 
此吸引 而缔合 ,很 少单独 存在。 每 个水分 子通过 
氢键 可与另 外四个 水分子 配价, 形成 四面体 "冰 
格" 的结构 ,随 着周围 条件的 变化, 结构中 的氧键 
不 断破坏 又不断 形成, 水分 子间这 种独特 结构使 
水有极 高的内 聚力。 . 

(3) 水溶 液中的 水分子 因自身 形成氢 键的趋 

势 极强, 故水分 子的存 在可使 其它分 子形成 键 k 

负电 性部份 

能力 减弱, 水分 子还可 以减弱 离子键 的相互 作用, ― 
而增强 非极性 疏水键 的相互 作用。 图 1—2 水分 子结构 示意图 

(4) 通 过氢键 的缔合 作用, 许多生 物分子 如多糖 、淀粉 、蛋 白质、 核酸等 分子中 的轻基 
或氧、 氮 等原子 都可以 通过氧 键与水 结合, 从而具 有巨大 的水合 或称" 水化" 能力。 

上述 关于一 些生物 分子中 的结合 力及分 子间的 作用力 的简单 介绍, 可 以看到 生物体 
系 中分子 结构及 分子之 间联系 的作用 力十分 复杂。 作为一 个生物 分子, 其 基本骨 架各原 
子 及基团 之间都 是共价 结合, 整个分 子一级 结构是 比较稳 定的。 但 分子与 分子间 的连结 
主要 通过一 些非共 价键如 氢键、 盐键、 金 属键、 范德 瓦耳斯 引力所 维系, 其键能 较弱, 而且 
键的性 质差别 较大, 故 可采取 不同方 法使之 分离, 而不损 伤其分 子基本 结构。 但须 注意的 
是许 多生物 大分子 的二、 三 级立体 结构也 是一些 非共价 结合, 因此 分离时 就必须 十分小 
心, 使其 立体结 构不受 破坏。 故常常 保持在 十分温 和的条 件下, 以避 免由于 强烈的 外界因 




〇 氧原子 
• 氢原子 



一 
正电 性部分 




子 而丧失 其生理 活性。 这 就是生 化分离 制备技 术与有 机化学 分离制 备技术 最重要 区别之 
处。 

第二节 生化分 离制备 方法特 点及基 本原理 

一、 生 化分离 制备方 法特点 

混合 物中各 组分的 分离是 化学科 学中一 个重要 内容, 但 某些经 典的化 学分离 方法如 
蒸溜、 熔 炼等, 对具 有特殊 生理活 性物质 的分离 是不适 合的。 许多 生理活 性物质 如蛋白 
质、 酶、 核 酸等的 分离已 给经典 的化学 分离方 法带来 了新的 课题, 并 有力地 推动了 化学分 

离技 术向另 一分支 —— 生 化分离 技术的 发展。 生化分 离技术 由实验 目的的 不同, 可分为 
生化分 离分析 和生化 分离制 备二个 方面。 前 者主要 对生物 内各组 份加以 分离后 进行定 
性, 定量 鉴定, 它不一 定要把 某组份 从混合 物中分 离提取 出来。 而后 者则主 要是为 了获得 
生物 体内某 一单纯 组份。 生化 制备技 术与一 般化学 分离制 备技术 比较, 其 特点有 下列几 
点: 

第一, 生物 材料组 成非常 复杂。 一个生 物材料 常包括 数百种 甚至数 千种化 合物, 各种 
化 合物的 形状、 大小、 分子 量和理 化性质 都各不 相同, 其中有 不少化 合物迄 今还是 未知物 
质, 而且这 些化合 物在分 离时仍 不断在 代谢变 化中。 

第二, 有些 化合物 在材料 中含量 极微。 只 达万分 之一, 几十万 分之一 甚至百 万分之 
一。 如 从脑垂 体组织 提取某 些激素 的释放 因子, 从蚕体 中提取 某些信 息素, 和从竹 笋中提 
取竹笋 素等, 都是 用几吨 或几十 吨的原 料才提 取到. 几个毫 克的目 的物。 

第三, 许 多具有 生物活 性的化 合物一 旦离开 了生物 体内的 环境, 很易 变性、 破坏。 因 
此, 在分离 过程中 要十分 小心保 护这些 化合物 的生理 活性, 这 是生化 制备最 困难的 地方, 
许多 生物大 分子在 分离过 程中, 过酸、 过碱、 重金属 离子、 高温、 剧烈 的机械 作用、 强 烈的辐 
射 和机体 内自身 酶的作 用均可 破坏这 些分子 的生理 活性。 故 分离具 有生物 活性的 生物分 
子, 特别一 些生物 大分子 ,常 选择十 分温和 条件, 并尽可 能在较 低温度 和洁静 环境下 进行。 

第四, 生化分 离方法 几乎都 在溶液 中进行 ,各 种参数 (温 度、 PH 值、 离子强 度等) 对溶 
液中 各种组 成综合 影响常 常无法 固定, 以致许 多实验 的设计 理论性 不强, 实 验结果 常常有 
很 大经验 成份。 因此, 一个实 验的重 复性的 建立, 从材料 到方法 直至各 种环境 条件, 使用 
的试 剂药品 等都必 须严格 地加以 规定。 

第五, 为 了保护 所提取 物质的 生理活 性及结 构上的 完整, 生化分 离方法 多采取 温和的 
"多 阶式" 进行, 也就是 我们常 说的" 逐层 剥皮" 方法, 一 个生物 分子的 分离制 备常常 少至几 
个步骤 ,多至 十几个 歩骤, 并不断 变换各 种分离 方法, 才达 到纯化 目的。 "多 阶式" 的分离 
制 备方法 操作时 间长, 手续 繁琐, 常常会 给制备 工作带 来许多 影响。 近年 来出现 所谓" 钩 
鱼 法", 利用某 些分子 特有的 专一亲 和力, 将某一 化合物 从极复 杂的体 系中一 次钩出 ,这一 
方法目 前虽只 用于某 些大分 子如酶 、抗体 和核酸 等的分 离提纯 工作, 但比起 任何经 典化学 
方法都 具有很 大的优 越性。 

第六, 生化分 离方法 最后均 一性的 证明与 化学上 纯度的 概念并 不完全 相同。 这里由 
于生物 分子对 环境反 应十分 敏感, 结构与 功能关 系比较 复杂, 故对其 均一性 的评定 常常是 



有条 件的, 或者只 能通过 不同角 度测定 ,最 后才能 给出相 对的" 均 一性" 结论。 只凭一 种方. 
法所得 纯度的 结论往 往是片 面的, 甚 至是错 误的。 



、 生化分 离制备 方法基 本原理 



生化 分离方 法与一 般化学 分离方 法虽然 有着许 多不同 特点, 但 生化分 离方法 与一般 
化学分 离方法 原理上 又有许 多是相 同的或 者说是 相通的 地方, 这充 分说明 反映了 近世纪 
来生 物化学 的发展 与经典 化学及 物理学 的密切 关系。 用于 生物化 学分离 的制备 技术, 大 
都根 据混合 物中的 不同组 份分配 率的差 别把它 们分配 于可用 机械方 法分离 的两个 或几个 
物相中 (如有 机溶剂 抽提、 盐析、 结晶等 )。 或者 
将 混合物 置于某 一物相 (大 多数是 液相) 中, 外 
加 一定作 用力, 使各组 份分配 于不同 区域, 从而 
达到分 离目的 (如 电泳、 超离心 、超滤 等)。 除了 
一些小 分子如 氨基酸 、脂 肪酸、 某 些维生 素及固 
醇 类外, 几 乎所有 机体中 大分子 物质都 不能融 
化, 也不能 蒸发, 只 限于分 配在固 相和液 相中, 



F'A. 



-(B)- 



图 1- 



运 动方向 

分 离吋, 溶质分 子所受 的不同 作用力 示意图 



表 1-4 生 化分离 方法分 类表' 



分 离方法 


推动力 


阻 滞 力 F2 


占 优势的 
作用力 


分离主 要依据 


―、 色谱 










(a) 吸附 


流 体动力 


表 面能, 范 德瓦耳 斯力位 阻效应 


F, 


极性、 位 阻因素 


(b) 离 子交换 


流 体动力 


静电吸 引力, 极化 度分子 筛效应 


Fj 


离子性 质及分 子大小 


(C) 分配 


流 体动力 


渗透 (扩散 ), 偶极 作用, 缔 合和解 离效应 




极 性因素 


(d) 分子简 


流 体动力 


渗 透作用 


Fj 


分 子大小 


二、 逆流分 S 己 


机 械作用 


渗透, 缔 合和解 离效应 


F, 


极 性因素 


三、 电场力 










(a) 在自由 溶液中 


静 电引力 


分子摩 擦力, 极 化度动 电作用 


F, 


离 子性质 


(b) 在 多孔支 持物中 


静 电引力 


分子摩 擦力, 极化 度动电 作用, 表面能 


F, 


离 子性质 


(C) 在 凝胶支 持物中 


静 电引力 


分子 筛效应 


F. 和 F, 


离子性 质和分 子大小 


(d) 等 电聚焦 


静 电引力 




平 衡作用 


离 子性质 


(0 对 流电泳 


静 电引力 


分子摩 擦效应 


F, 


离 子性质 


(Electrophoresis- 


电动力 








convection) 


(Electrokixielic) 








(f) 电渗析 


静 电引力 


分子 旆效应 


F, 和 F, 


分子大 小和离 子性质 


四、 扩 散方法 


电动力 


电动力 






(a) 透析 


渗透力 


分子 筛效应 


F, 


分 子大小 


(b) 超滤 


流' 体动力 


分子筛 效应, 表面能 (吸附 ) 




分 子大小 


(0 在 溶液中 热扩散 


温 度梯度 


分子摩 擦效应 


F, 


分 子大小 




重 力 








五、 结晶 


结晶 格子能 


扩散 


F, 


分 子大小 及形状 


六、 沉降 










(a) 动 力学的 


重力、 离心力 


分子庫 擦效应 


F, 


分 子大小 


(b) 等 密度的 


离 心 力 




平 衡作用 


分子大 小及介 质密度 



. 并在这 两相之 间相互 交替进 行分离 纯化。 

摩里斯 (Morris) 认 为许多 生化分 离制备 方法都 可以看 作是各 种溶质 分子在 溶液中 
沿 着一条 狭窄路 线移动 的结果 ["。 例如溶 质分子 (A) 在一定 时间内 只有一 个运动 方向, 
它受二 个不同 方向力 的作用 (如图 1-3)。 

Fi 表示与 溶质分 子运动 方向相 同的推 动力, 表示 与溶 质分子 运动方 向相反 的阻滞 
力。 作为推 动力可 能是流 体动力 (如色 谱)、 电场力 (如电 泳)、 重力、 离心力 (如 沉降) 及其 
他作 用力如 扩散, 渗 透中的 分子运 动等。 许多分 离方法 常常不 止一种 推动力 ,而是 几种推 
动力 联合起 作用。 阻滞 力一般 包括: , 

(1) 在均 一溶液 中分子 的摩擦 效应; 

(2) 极 化分子 的静电 作用, 尤其是 生物大 分子溶 质与溶 液中其 他溶质 分子的 静电引 
力, 往往 造成这 些大分 子溶质 流动时 遇到的 主要阻 碍力。 

(3) 在两相 体系中 ,溶 质在两 相中的 分配系 数及分 子旆效 应等。 

(4) 吸附 作用, 渗透 作用及 其他因 素所引 起的阻 滞力。 

因此, 图 1-3 中溶 质分子 A 的移 动速度 取决于 — F,^ = AF\ 而溶 质分子 B 的移 
动速度 取决于 — F2B = AFB。 溶 质分子 A 与溶 质分子 B 的分离 效果将 取决于 AFA/ 
AF«= AF 的 比值。 所以, 在分离 混合物 的各组 份中, 必 须尽量 设法扩 大各组 份之间 AF 
的差别 ,以其 达到各 组份彼 此之间 的完全 分离。 

史特朗 (Strain) 和他 的同事 根据物 质分离 各种力 的作用 把许多 分离方 法作了 一些归 
纳 及评论 [ 7] 。 摩 尔里斯 (Morris) 等在 史特朗 等基础 上进一 歩把各 种分离 方法中 Fi、F2 及 
分 离时主 要依据 —— 物理、 化学因 素作了 小结, 如表 1-4 所示。 

表 1-4 中所列 各种生 化分离 方法, 在制备 中使用 较多的 有吸附 色谱、 离 子交换 色谱、 
分子筛 色谱、 逆流 分配、 凝胶 电泳、 电渗析 、透析 、超滤 、结晶 、沉 降等, 其中大 部分方 法将在 
以后各 章中分 别予以 介绍。 

第三节 生 化分离 制备实 验的设 计及实 验方法 的选择 

一、 生化 分离制 备实验 的设计 

生化分 离制备 实验的 设计, 首先面 临的是 所要求 分离的 物质的 化学结 构及性 质存在 
着" 已知" 与" 未知" 两种 情况。 已知 结构性 质物质 的分离 制备, 前人肯 定已做 过一些 研究, 
在继 续进行 这类实 验时, 常 常是为 了取得 更纯、 更多的 产物或 者希望 找出更 简便、 效率更 
高 的实验 方法。 因此, 这类 物质分 离制备 方法的 改迸, 主要依 赖于对 所分离 物质的 理化性 
质的 了解和 参照前 人已用 过的各 种实验 方案, 通过 自己具 体实验 条件加 以比较 优选, 或者 
是参考 其他类 似物质 最新分 离方法 加以引 进试用 ,从而 求得最 佳的实 验方法 或工艺 流程。 
经较小 的制备 规模过 渡到中 间规模 试验, 最 后到较 大规模 的工业 生产。 但 任何技 术方法 
都 有时间 性和受 到具体 条件的 限制, 一个认 为比较 理想的 分离制 备方法 ,并 不是永 远都是 
最 好的, 随着时 间的推 移和新 的技术 、实 验仪器 和实验 器材的 出现, 总 得不断 革新, 完善; 
否 则便将 逐歩地 被新的 方法所 代替。 所以, 熟练掌 握实验 原理, 根据 自己实 验具体 条件, 
及时了 解国内 外有关 先进技 术发展 动态, 不断 改进自 己实验 方法, 才 能适应 日新月 异的技 



术 发展的 要求。 

对于 一个未 知化学 结构、 性质 的物质 的分离 制备, 情况 则比较 复杂, 由 于所分 禽制备 
物质还 是一个 "未知 数", 没 有什么 经验和 固定方 法可以 遵循, 开始 设计实 验时, 只 能根据 
该物质 某一生 物学或 生物化 学的性 质或现 象来指 导每一 分离制 备歩骤 (这里 ,往往 也需要 
参照前 人有关 工作, 并不是 凭空想 出)。 有时在 摸索过 程中, 往往认 为自己 设计的 方法很 
理想完 善了, 但最后 得不到 什么结 果或得 到很小 的结果 ,这 是常有 的事。 只 有经过 多次反 
复 实践, 不断总 结失败 原因, 修 改原有 的实践 方案, 才有 可能取 得最后 成功。 当实 验一旦 
获得目 的制备 物后, 就可以 根据产 品比较 详细准 确理化 性质, 改进 巳有制 备方法 条件, 逐 
步提高 产品的 质量和 产量。 

生物体 内某一 组份, 特别是 未知结 构的组 份的分 离制备 设计, 大 致可分 为五个 基本阶 

段: 

(1) 确 定制备 物研究 目的及 建立相 应的分 析鉴定 方法。 

(2) 制备物 物理化 学性质 稳定性 的预备 试验。 

(3) 材 料处理 及抽提 方法的 选择。 、 

(4) 分 离纯化 方法的 摸索。 

(5) 获得 制备物 以后, 均 一性的 测定。 

现就 以上五 个基本 阶段所 涉及的 实验设 计原理 及实验 程序简 要介绍 和讨论 如下: 

(― ) 制备物 研究的 目的及 分析鉴 定方法 的建立 

前已 提到, 分离 制备某 一生物 组份的 目的, 如果不 是为了 在原有 的实验 方法上 加以改 
进, 以求 得更多 更纯的 产品, 就是 为了获 得新的 物质。 这里 主要涉 及的问 题是后 一种情 
况。 在生 物化学 研究工 作中, 新 组份的 分离常 常是科 研工作 主要的 内容。 机体内 一个新 
的 物质的 发现, 对了 解有机 体的生 理功能 具有很 重要的 意义。 如核 酸的发 现对揭 开生物 
体 遗传变 异规律 之谜, 环化腺 一磯的 发现对 进一歩 了解激 素和代 谢调节 的关系 ,反 向转录 
薛的 发现对 于了解 RNA 控 制蛋白 质的合 成等。 可以说 生物体 内每一 种新的 物质的 发现, 

都不同 程度地 推动着 生物化 学甚至 整个分 子生物 学前进 一歩。 通过 科学工 作者的 长期劳 
动, 现 在我们 虽然知 道了很 多机体 内组成 成份及 分泌的 物质, 但也许 我们尚 未知道 的东西 
比已知 的东西 数量还 要多。 从 生物不 断变异 的观点 来看, 人 们对机 体内组 成的物 质的认 
识是 没有尽 头的。 

从机体 内分离 制备一 种未知 物质的 企图, 通 常是由 于二种 情况引 起的。 一种 是无意 
识的, 例如, 在 进行某 种有目 的的实 验时, 偶然出 现了某 些异常 现象, 引起了 研究人 员的注 
意和 兴趣, 从而 进一步 去追踪 研究。 属于 这类情 况往往 在研究 者获得 了这种 制备物 质后, 
开 始并不 了解这 种物质 的生理 意义或 实际上 有什么 用处。 只 有经过 一定时 间后才 被人们 
所 认识。 这种 开始并 没有固 定目的 的实验 工作, 对于 应用研 究部门 往往容 易疏忽 或缺乏 
深人 探索的 兴趣。 基 础理论 研究部 门则常 视为一 种新的 发现, 而 比较重 视加以 研究。 第 
二 种情况 是有目 的的, 人 们在一 定自然 条件或 人工条 件观察 到某种 异常的 生物学 或生物 
化学 现象, 从而有 意识地 追踪研 究引起 这种现 象发生 的物质 基础。 这种例 子在科 研工作 
中是很 多的。 如根 据细菌 生长被 抑制的 情况有 目的分 离某种 新的抗 菌素, 根 据某些 物质对 
动、 植物 的代谢 调节所 引起的 作用探 求新的 激素, 根据 昆虫某 些特殊 生理反 应研究 它们所 



分泌 的通讯 物质, 以及从 机体内 某种代 谢中间 产物的 积累寻 找催化 这一反 应的酶 等等。 
属 于这类 有既定 目的而 设计的 分离制 备实验 方案, 效果一 般比较 显著。 建 立相应 的分析 
鉴定方 法也比 较容易 ,获 得制备 物后对 其生理 意义及 实用价 值事前 也巳有 一定的 认识。 

生化 分离制 备实验 目的性 尽管有 不同, 当一旦 着手进 行实验 工作时 ,都 必须首 先建立 
对制备 物的分 析鉴定 方法, 才能保 证分离 制备工 作顺利 进行, 指导生 化物质 分离制 备工作 
的分 析鉴定 方法大 致可分 为三种 类型: 

1. 生物测 定方法 对一个 未知结 构的新 物质, 生物测 定方法 常常比 一般物 理化学 
方法具 有更大 优越性 ,且 是实验 取得成 功必不 可少的 一歩, 生 物测定 方法全 面涉及 生物学 
各科 的实验 内容, 如微生 物学、 细胞学 、生 理学、 组织解 剖学、 药理学 及动植 物形态 分类学 

等。 一个生 物测定 方法的 建立, 必须选 择适当 的生物 对象, 继而决 定测试 的生物 反应类 
型, 如细菌 的生长 或抑制 ,肌肉 的舒张 或收缩 ,某种 器官呈 现抑制 或兴奋 反应, 血压 的升高 
或 降低, 受到 试验物 质刺激 后某种 组织分 泌物增 加或减 少等。 然后 在这些 定性反 应基础 
上 进一歩 建立生 物反应 的定量 标准。 生物测 定方法 很多, 而 且每一 测定方 法具体 规定标 

准及条 件各不 相同, 其详细 内容的 介绍可 参看有 关专著 及资料 [ 3' 8 1。 

2. 理化測 定方法 这 是最常 用最方 便的分 析测定 方法, 生物 测定方 法虽有 很高特 

异性, 但手续 繁琐, 对于 指导分 离制备 实验的 进行, 时间 上太受 限制。 因此, 对于一 个未知 
化学 结构的 物质, 如生 物反应 测定确 定其存 在后, 应立 即着手 建立理 化测定 方法。 理化测 
定方法 的建立 一般是 先进行 预试, 初歩肯 定该物 质属于 那一类 有机物 ,然后 按各类 有机物 
质的特 殊物理 化学性 质建立 定性、 定量鉴 定方法 ,这 类方法 常有: 

(1) 呈 色法: 包括染 色和比 色法。 

(2) 色 谱法: 包括纸 上色谱 、薄层 色谱、 气 相色谱 和高效 液相色 谱等。 

(3) 光 谱法: 包括紫 外光谱 、红外 光谱、 荧光光 谱等。 

(4) 电 泳法: 包括纸 电泳, 凝胶电 泳等。 

(5) 核磁 共振波 谱法。 

(6) 其他: 如电子 显微镜 观察。 

理化测 定方法 的最大 优点是 实验操 作简便 快速, 能及时 指导分 离制备 工作。 

3. 理化 方法与 生物学 方法结 合測定 对 于某些 生物体 内含量 较低, 或所建 立的理 
化 测定方 法的特 异性和 灵敏度 不足以 反映该 物质定 性与定 量的要 求时, 常 需要结 合生物 
学测定 方法才 能全面 地准确 地反映 该物质 的存在 情况。 例如 Kaslson 和 Schmialak 根据 
生 物反应 知道虾 也存在 蜕皮激 素并借 用昆虫 中提取 蜕皮酮 的方法 企图从 奸提取 这种物 
质, 由 于使用 的理化 分析方 法不够 灵敏和 分离流 程的不 合理, 用了三 千公斤 虾为实 验材料 
而毫无 所获。 后来 Hampshire 和 Horn 以丽蝇 (CalHphora) 的生物 测定为 指导, 并结合 
理化分 析方法 ,改 进了实 验分离 流程, 才由 一千公 斤奸的 废液中 成功地 分离了 2mg 非结 
晶的 蜕皮酮 激素; 又如从 家蚕中 提取家 蚕醇, 使 用气相 层析方 法和蚕 蛾兴奋 反应相 结合, 
使分 离制备 流程效 果大大 提高。 

理化分 析方法 与生物 学测定 方法相 结合, 用于 各类抗 菌素、 信息素 、激素 、维生 素和各 
种具 有生理 活性的 生化药 物的定 性及定 量相当 普遍。 

不论是 生物学 方法或 物理化 学方法 或是二 者结合 使用, 一个好 的分析 鉴定方 法必须 
满 足以下 要求: 

* 10 • 



1. 特异性 或专一 性强; 

2. 重现 性好; 

3. 准确 度大; , 

4. 灵敏 度高; 

5. 手续 简便; 

分析方 法的特 异性或 专一性 ,对于 整个分 离纯化 实验的 成功与 否非常 重要。 一 个特异 
性 高的分 析方法 的建立 是分离 一个未 知结构 的化合 物的指 南针, 如 果分析 方法特 异性不 
高, 分离 工作前 进方向 不明, 必 然造成 错误的 结果。 一 个分析 方法的 特异性 除了方 法本身 
因 素外, 与环境 因子关 系十分 密切。 特别在 分离纯 化初始 阶段, 各种 干扰物 质大量 存在情 
况下, 一个 专一性 高的分 析方法 更显得 重要, 但 除了极 个别情 况外, 很少有 绝对专 一的分 
析 方法。 所以为 了提高 分析方 法的特 异性, 常 常需要 把起始 材料中 干扰成 份减少 到最低 
量, 或 尽量选 择适当 条件使 干扰物 质不起 作用。 选用制 备物质 含量较 丰富的 材料, 也可大 
大提高 分析方 法的特 异性。 

重现性 或称重 复性, 是指 分析结 果能经 受起时 间的考 验重复 测出的 程度。 重 现性的 
获得 主要是 认真规 定每次 的实验 条件, 包括分 析仪器 装置, 试剂药 品的标 准度, 样 品的浓 
度, 操作 方法及 材料的 来源、 保 存和处 理等。 如果把 样品、 测试 仪器、 试剂等 因素固 定后, 
分析方 法的重 现性, 主要 和实验 人员主 观因素 有关。 

分析方 法的准 确度主 要反映 在定量 测定上 的误差 范围。 在一般 情况下 对分析 方法要 
求的准 确度当 然越高 越好, 但. 在生化 制备过 程中, 制备 物由一 个混杂 体系逐 歩向一 个纯粹 
单一 的物质 过渡, 开始时 杂质的 干扰是 不可避 免的, 因此, 分离提 纯每一 阶段, 定量 上存在 
的误 差只要 不影响 分离提 纯工作 沿着正 确方向 进行, 即可满 足测定 要求。 有的分 析的精 
确 度甚至 可以粗 略到用 正反应 (+) 或 负反应 (-) 表示, 也能 获得很 好分离 效果。 所以在 
分离 制备过 程中, 分 析工作 的特异 性和重 现性在 某种意 义上比 要求精 确度更 为重要 一些。 

灵敏度 是指制 备物在 某一体 系中含 量的可 测度。 换句 话说, 即 我们使 用的分 析方法 
对制 备物所 能测出 的最低 含量是 多少。 在分离 纯化开 始阶段 或所用 原料含 制备物 的量较 
低时, 高灵 敏度的 分析方 法显得 比较重 要些。 此外, 高 敏度的 分析方 法在多 歩骤的 分离提 
纯工艺 流程中 ,可以 帮助收 回一部 分产品 ,达到 节省原 料消耗 ,增加 产量的 目的。 

最 后谈谈 分析工 作操作 手续的 繁简与 指导分 离纯化 实验的 关系, 人们 往往存 在这样 
一个 倾向, 即盲 目追求 某一分 析方法 的特异 性或灵 敏度等 指标, 而忽 视操作 手续简 便的重 
要性, 这 对于一 些代谢 速度较 快或者 容易失 去生理 活性的 物质的 制备, 将 是一严 重的错 
误。 生 化分子 一般都 是一些 具有生 理活性 的物质 或代谢 的中间 产物, 因此, 简便快 速的分 
析测定 方法有 着重要 意义。 人们 在提取 一个代 谢速度 较快的 中间产 物时, 往往宁 愿要一 
个快速 简便而 精确度 较差的 方法, 而不 要一个 繁琐费 时而高 精确的 方法, 这 似乎是 一个普 
通的 原则。 

(二) 制备物 的物理 化学性 质及稳 定性的 预备试 验 [6 '" 

制备 物的理 化性质 及稳定 性的预 试验是 对一个 未知物 质分离 制备实 验设计 的 基础。 
许多 生化物 质在有 机体特 定环境 中比较 稳定, 一旦离 开机体 后容易 受外界 条件影 响而失 
活。 因此, 在各 个阶段 的分离 纯化步 骤中, 都必须 在制备 物的稳 定条件 范围内 进行, 以保 

• 11 • 



证被 分离物 质不受 破坏。 设计 一个未 知结构 的生化 物质的 分离纯 化实验 方案, 通 常所涉 

及 的预备 试验项 目如表 1-5 所示: 



表 1-S 分离 制备物 质的预 备试验 项目表 



A; 


溶 解性能 




1. 在 水或各 种稀盐 溶液中 的溶解 性能; 




2. 在弱 极性溶 剂中溶 解性能 (如 甲醇、 乙醇、 丙觸等 ); 




3. 在各 种非极 性溶剂 中的溶 解性能 (如氯 仿和各 种经类 等)。 


B: 


溶液 稳定性 




l.pH 稳定 范围; 




2. 温度 效应; 




3. 各 种缓冲 溶液的 影响; 




4. 有 机溶剂 (如 乙醇、 丙爾) 的 影响。 


C: 


固态吋 稳定性 




1. 温度 影响; 




2. 水份 含量的 影响; 




3. 低 压冻干 效应。 


D: 


物 理性质 • 




1. 透 过不同 大小孔 径膜的 能力; 








3. 在电场 中每一 pH 变 化的迁 移值; 




4. 在 超离心 力场中 的沉降 作用。 


E; 


化学 性质: 




1. 对姨 蛋白薛 及其他 蛋白水 解酶作 用的稳 定性; 




2. 对 DNase 和 RNase 作 用的稳 定性; 




3. 对 糖类分 解薛作 用的稳 定性; 




4. 在 温和条 件下乙 酷化作 用的稳 定性; - 




5. 对亚 硝酸作 用的稳 定性; 




6. 在 温和条 件下酷 化作用 的稳定 性-. 



表中所 列项目 较繁多 ,不 必在实 验一开 始便全 部进行 试验, 先选择 某些预 试项目 ,其 
结果能 说明一 个未知 物的主 要物理 、化学 性质就 够了。 例如未 知物是 极性还 是非极 性化合 

物, 是电 解质还 是非电 解质, 是 大分子 还是小 分子及 pH 值、 温度、 稳定范 围等。 至 于其他 
一些 细目, 往往 需要结 合分离 制备过 程出现 的具体 情况, 有必 要时, 才进一 歩加以 测试。 

在上表 所列到 各预测 项目中 ,溶解 性能的 测定是 指导制 备物的 提取、 沉淀、 结 晶的基 
础。 必 须最先 完成, 然后 在此基 础上, 求出 pH 值、 温度、 离 子强度 对制备 物溶解 度及稳 
定性的 影响, 以便在 溶液中 找出最 适提纯 条件。 对于绝 大多数 生化物 质来说 ,只有 在一定 
pH 值、 温度 及离子 强度下 进行分 离纯化 才能保 证其活 性不受 损失, 这方面 内容在 本书以 
后几章 中还详 细讨论 ,在 这里需 要指出 的是制 备物在 分离过 程中, 随 着其他 成份不 断被除 
去, 原来 B 项试验 有关的 化学性 质将有 所改变 ,这 点应随 时予以 注意。 

物理 性质的 试验主 要了解 制备物 的分子 大小、 形状 及带电 性质。 在电 场中可 逆移动 
的方向 及进行 离子交 换树脂 或离子 交换纤 维素的 试验, 可判 断此未 知物是 否属于 两性电 
解质及 其带电 荷性质 与数量 情况。 其 次进行 某些吸 附试验 (如活 性碳、 硅胶、 氧 化铝、 磷 
酸钙等 的吸附 试验) 可以帮 助分离 初期制 备物在 选择方 法上的 设计。 吸附 作用可 起到浓 
缩收集 作用, 但注意 活性碳 和硅胶 的吸附 作用不 适宜蛋 白质及 核酸衍 生物, 因为活 性碳和 
硅胶对 这些物 质的吸 附常常 是不可 逆的, 不仅洗 脱困难 ,而 且容易 造成变 性失活 a 膜透过 



性、 分子 筛层析 及超离 心沉降 作用的 试验, 主 要是为 了获得 制备物 分子大 小及形 状的证 
据, 在 制备中 后期的 提纯是 十分有 用的。 但这 种试验 只待分 离工作 到了一 定程度 后才按 
需要 进行。 到 了分离 纯化的 后期, 半成 品和成 品保存 的温度 及水份 含量对 其稳定 性的影 
响也很 重要, 大多数 生化物 质固相 保存都 要低温 、干燥 (但 也不 是温度 越低、 含水量 越少越 
好) 还有些 生化物 质除了 对温度 含水量 敏感外 ,对 光线、 气体及 某些微 量金属 也十分 敏感。 
分离 后期的 产品如 以液态 保存, 影响 其稳定 性因素 更多, 更不 可有所 忽视, 否则辛 苦制得 
的 样品最 后受到 破坏或 损失是 令人痛 心的。 各 种样品 的保存 方法在 本书最 后一章 还将详 
细 讨论。 

分离 制备物 如果是 一复合 成份, 或 某制备 物的生 理活性 与分子 内某一 基团或 分子外 
某一辅 基有关 ,则其 他一些 预备试 验便不 能获得 正确的 结果。 此时常 将复合 物拆离 ,决定 
其中那 一组份 是所要 制备的 部分。 有些 蛋白质 和酶, 其生 理活性 与分子 上某一 氨基、 羧 
基 或经基 有关, 在温 和条件 下进行 硝化, 乙酰化 及酯化 试验, 便 可推测 这些分 子大致 
化学 性质。 还有 些酶, 其 生理活 性与金 属离子 和小分 子辅基 有关, 常用 透析或 超离心 
沉降 方法, 观察其 失活及 重组后 复活的 过程, 便从中 了解到 整个复 合分子 中各组 份的关 
系。 

总之, 在 整个实 验的设 计时, 对制备 物各项 稳定性 及一些 理化性 质的预 试验是 整个研 
究工 作最费 精力及 时间的 部分, 但也 是不可 缺少的 部分。 

(H) 材料处 理及提 取方法 的选择 

选 择材料 主要根 据实验 的目的 而定, 同一 种物质 由于进 化的关 系通常 在不同 种类的 
生物体 中都有 存在。 从工业 生产角 度上来 考虑, 首先是 材料来 源丰富 ,含 量高、 成本低 。有 
时 材料来 源丰富 但含量 不高, 或者材 料来源 ,含 量都很 理想, 而材料 中杂质 太多, 分 离纯化 
手续十 分繁琐 ,以 致影响 质量和 收率, 反不如 含量低 些但易 于操作 获得纯 品者。 因此, 必 
须根 据具体 情况, 抓住主 要矛盾 而决定 取舍。 伹为 了科学 实验某 种特殊 需要, 例如 对某种 
材 料或某 一生物 品种中 寻找某 种未知 物质, 选材时 则无需 全面考 虑上述 问题, 只能 达到实 
验目的 即可。 

与 无机物 不同, 生 物体内 某种成 份不是 一成不 变的。 如 植物材 料所含 各种成 份常随 
季节 和生长 时期而 变化, 动 物材料 中的各 种组份 处于不 同生理 状态也 有很大 差别。 微生 
物材料 中的各 种组份 的变化 受环境 因子影 响尤为 显著, 培 养基的 成份、 PH、 温度 的影响 
外; 诱 导物、 抑制剂 的添加 都可以 大大增 加所需 物质的 含量。 菌种的 筛选、 诱变巳 是人们 
所熟悉 的提高 微生物 体内某 种物质 含量最 常用的 方法。 此外, 近年 来使用 转导、 核 酸重组 
即遗传 工程等 新方法 已使细 菌中一 些原来 含量很 少的物 质大量 增加, 原来 没有的 物质成 
份, 也可以 通过遗 传工程 方法, 使之 产生。 当 然后者 不属于 材料选 择讨论 范围, 但 这些都 
说明 生物材 料所含 的组分 并不是 一成不 变的, 必须因 时因地 和根据 实验的 目的要 求而具 
体 解决。 一个 材料选 择是否 合理, 不仅关 系到实 验进行 的难易 ,而且 常常是 导致实 验的成 
败的 原因。 

实验 材料选 定后, 常常需 要进行 预处理 ,如 动物材 料要除 去一些 与实验 无关甚 至有防 
碍 的结缔 组织, 脂肪组 织和血 污等, 植物种 子需要 除壳, 微生 物材料 需将菌 体和发 酵液分 
开等。 材料处 理及洗 净以后 ,下 一步就 是选用 适当方 法将组 织细胞 破碎, 进行 抽提。 材料 

• 13 . 



中被制 备物质 的存在 形式及 部位与 组织破 碎及抽 提方法 有直接 关系, 必须 在实验 前有所 
了解。 如属 体液、 血 液中的 游离物 质或生 物体分 泌到体 外的分 泌物, 则不必 进行组 织细胞 
的 破碎。 但细胞 内含物 不论存 在于哪 些部位 (如在 膜上, 核中 或细胞 装内) 均需采 取不同 
方法进 行细胞 破碎。 

组织细 胞的破 碎方法 很多, 有机械 方法, 物理 方法, 化学 及生物 化学方 法等。 不同实 
验 规模, 不同实 验材料 和实验 要求, 使用 的破碎 方法和 条件也 不同。 例如一 些坚初 组织如 
肌肉, 植物 的根、 茎等, 则常 需强烈 的绞碎 或研磨 作用, 才能 把其组 织细胞 破坏。 而 比较柔 
软 的组织 如肝、 脑等, 用普 通的玻 璃匀楽 器即可 达到完 全破坏 细胞的 目的。 同样 一种实 
验 材料, 但制备 大分子 量的核 酸和制 备小分 子的核 苷酸, 对细 胞破碎 的方法 和条件 也不相 
同, 后者 可以采 用强烈 手段, 而 前者则 必须保 持十分 温和的 条件, 才 不致于 损坏其 分子的 
完 整性。 组 织细胞 破碎常 用方法 有如下 几种: 

1. 机械法 主 要通过 机械切 力的作 用使组 织细胞 破碎的 方法, 常用 的器械 有组织 
德 碎机, 勾浆器 ,研钵 和研磨 、压榨 器等。 

(1) 组织擒 碎机: 一般用 于动物 组织, 植物肉 质种子 ,柔嫩 的叶, 芽等 材料的 破碎。 

国产的 擒碎机 最高转 速可达 每分钟 1 一 2 万转。 由于 旋转刀 片的机 械切力 很大, 制 备一些 
较 大分子 如核酸 则很少 使用。 

(2) 勾 装器: 勾装 器的研 杵磨球 和玻璃 管内壁 之间间 隙常保 持在十 分之几 毫米距 
离。 破碎细 胞的程 度比组 织搗碎 机高。 制作句 浆器的 材料, 除玻 璃外, 还 可以用 硬质塑 
料, 不诱钢 、人 造荧光 树脂等 制成。 ' 

(3) 研磨: 多用于 细菌或 其他坚 硬植物 材料, 研磨时 常加人 少量石 英砂, 玻 璃粉或 
其他研 磨剂, 以提 高研磨 效果。 细菌 磨是一 种改良 了的研 磨器, 比一 般研钵 具有更 大的研 
磨面积 ,而且 底部有 出口。 操 作时先 把细菌 和研磨 粉调成 糊状, 每 次加入 磨内一 小勺, 研 
磨 20 — 30 秒钟 即可将 细菌细 胞完全 破碎。 

(4) 其 他大型 细胞破 碎器: 如 French 压搾器 Manton- gauhn 勾浆 器等, 主要 是高压 
下使 细胞通 过小孔 隙而被 挤碎, 每 小时可 处理数 十升至 数千升 样品, 适用于 微生物 发酵工 
业 生产。 

2. 物理法 主要通 过各种 物理因 素使组 织细胞 破碎的 方法。 在生化 制备中 常用的 

有: 

(1) 反复冻 融法: 先 将样品 深冷至 一 15°C 至 一 20°C 使之 冻固, 再 缓慢地 融化, 反 
复多次 可将大 部分细 胞破碎 ,此法 多用于 动物性 材料。 

(2) 急热骤 冷法: 将样品 材料投 人沸水 ,维持 85 — 90°C 数分 钟后, 置 冰浴中 急速冷 
却, 使细 胞壁结 构受到 破坏。 此 法可用 于细菌 及病毒 材料, 伹制备 对热敏 感的物 质时慎 
用。 

(3) 超声波 处理: 此法 多用于 微生物 材料, 频率一 般选在 10KC 至 200KC ,功率 
200-500 瓦 范围, 对 于不同 细菌, 应视具 体情况 而定。 处理 时间有 数分钟 至数十 分钟不 
等。 处理 效果和 样品浓 度及使 用功率 有关。 在处理 过程中 如溶液 温度升 高时, 注意 冷却。 

3. 化学 及生物 化学法 主要有 自溶法 ,酶解 法和表 面活性 剂处理 法等。 

(1) 自 溶法: 自溶 法是在 一定的 PH 和适 当的温 度下, 利用组 织细胞 内自身 的酶系 
统 将细胞 破碎的 方法。 自 溶法所 需时间 较长, 常添加 少量防 腐剂如 甲苯、 氯 仿等防 止细菌 
• 14 • 



的 污染。 

(2) 酶 解法: 利用各 种水解 酸如溶 菌酶, 纤维 素酶、 蜗牛酶 、半纤 维素酶 、壳 糖酶、 脂 
醜 等专一 性地将 细胞壁 分解, 使细 胞内含 物释放 出来。 适用 于制备 大分子 核酸材 料的破 
壁。 有些细 菌对溶 菌酶不 敏感, 加人少 量琉基 试剂或 8M 脲素处 理后, 使转 为对溶 菌酶敏 
感而 融溶。 - 

(3) 表面 活性剂 处理: 如十二 院基碟 酸钠、 氯化十 二院基 吡啶, 去氧胆 酸钠等 均对细 
胞 膜有一 定破坏 作用。 

此外, 使用真 空干燥 及冷丙 酮处理 制成" 丙酮粉 "均可 以改变 细胞的 透性, 不同 程度地 
破坏 细胞膜 结构, 以利于 提取。 

有时 为了防 止其他 细胞组 份中的 物质对 制备物 干扰或 污染, 或 由于对 细胞组 分上某 
一物质 进行特 殊研究 的需要 ,常将 各种细 胞器先 行分离 ,然后 在某一 细胞器 中提纯 某一物 
质。 细胞 组份的 分离, 一 般使用 差速离 心法, 即 将破碎 后的细 胞在适 当介质 中进行 离心。 
常用 的介质 有生理 盐水, 蔗糖或 葡萄糖 -聚乙 二醇等 高分子 溶液。 各种细 胞组份 按照质 
量、 大小 不同, 经过 不同速 度的离 心后, 便沉降 于离心 管不同 部位, 经过多 次分步 离心分 
离, 即 可获得 所需要 组份。 

组织细 胞破碎 过程中 ,大量 胞内酶 及细胞 内含物 被释放 出来, 须 立即选 择适当 条件进 
行提取 分离, 避免因 长久放 置造成 制备物 的分解 破坏。 

提取是 分离纯 化的第 一歩, 它将制 备物从 复杂的 生物体 系中转 移到特 定的人 工液相 
体系中 (通常 是水、 缓冲液 ,稀盐 溶液或 有机溶 剂)。 抽 提所用 溶剂的 选择标 准首先 对被制 
备物具 有最大 溶解度 ,并在 提取中 应尽可 能减少 一些不 必要的 成份。 为了更 好地达 到以上 
两个 目的, 常用 的手段 是调整 溶剂的 PH 值、 离子 强度、 溶 剂成份 配比和 温度范 围等。 关 
于提 取方法 本书第 二章另 有详细 介绍, 这 里不再 赘述。 



表 1-6 供选 择分离 某些生 物分子 的方法 时参考 







技 




术 




化合物 


分 配 

纸色谱 


吸附薄 
层色谱 


吸附柱 
色 谱 


通 透色谱 


气-液 
色谱 


逆 流分溶 


离 子交换 


亲 和色谱 


电泳 


超 速离心 


氨基酸 


+ 


++ 






++ 


++ 


++ + 




++ 




多肽 


+ 


++ 




+ 




++ 


++ 


+ 


++ 




蛋白质 








+++ 




+ 


+ 


+++') 


+++ 


+++ 


嘌呤 /!^ 啶 


+ 


十 T 








+ 


-H- + 




++ 




核酸 




十 




++ 




++ 


十 


+++" 


十 


+++ 


单糖 和二糖 


++ 


•1 "十 


+ 




++ 




+ 




+ 




寡 聚糖和 多聚塘 






十 


++ + 












++ 


脂肪酸 


+ 


++ 


+ 




++ 












mm 


+ 


++ 


+ 
















萜类、 胡 萝卜索 
叶绿素 


+ 


+++ 


+++ 




十 


十 






+ 




面酵和 类固醇 




++ 


++ 




++ + 


+++ 











I) 可以使 用的情 况下, 十,— 表示选 择适宜 程度。 (十) 示 适宜、 (++) 较 适宜、 (+++) 最 适宜; (一) 示不 适宜。 



. 15 . 



(四) 分离纯 化方法 的摸索 

分 离纯化 是整个 生化制 备过程 的核心 部分。 生物 体的组 成成份 千千万 万种, 分离纯 
. 化的实 验方案 也千变 万化。 没有一 种分离 纯化方 法可适 用于所 有物质 的分离 纯化, 一种 
物质 也不可 能只有 一种分 离纯化 方法。 所 以对于 某一种 物质, 究竟 选用什 么分离 纯化方 
法最 理想, 主 要是根 据该物 质的物 理化学 性质和 具体实 验条件 而定。 认真 参考借 鉴前人 
经验可 以避免 许多盲 目性, 节省实 验摸索 时间。 即使 是分离 一个新 的未知 组份, 根 据分析 
和 预试验 的初步 结果, 参考别 人对类 似物质 分离纯 化经验 ,也可 以帮助 少走些 弯路。 威廉 

斯 (Wmiams) 和 威尔逊 (Wilson) 等根 据一般 规律性 对各种 分离纯 化方法 适用于 什么物 
质的 作用, 提出了 很好的 意见, (详 见表 1-6) [ 1° ] 摩 尔里斯 (Morris) 等对于 各种分 离方法 
中所 依据溶 质的物 理化学 性质, 作 了一个 分类表 (见表 1- 7)" ] 均可 供读者 参考。 



表 1-7 以溶 质物理 性质为 基础的 各种分 离方法 



方 法 


分 子大小 


分 子电荷 


分子相 


互作用 


氣 键结合 


疏水 键结合 


色谱 










吸附 


十 


N + 


+++ 


+++ 


分配 


+ 


++ 


+++ 


+++ 


离子交 换树脂 


+++ 


+++ 




+ 


多聚糖 


土 


+ (■+ 


+ 




分子 




+ 


+ 


士 


气相 


十 


++ 


+++ 


+++ 


逆 流分配 


+ 


++ 


+++ 


+++ 


电泳 










自 由溶液 


++ 


+++ 






聚乙 烯介质 


++ 


+++ 






纤维素 


++ 


+++ 


+ 




凝胶 


+++ 


+++ 




土 


等 电聚焦 


土 


+++ 






沉降 


+++ 


+ 




土 


膜穿透 (透析 ) 和扩散 


+++ 


++ 




士 


溶解度 


+ 


+4- 


+++ 


+++ 



二、 分离纯 化各阶 段对实 验技术 的选择 

这 是一个 十分灵 活掌握 而且难 以统一 规定的 问题, 但是也 不是说 没有一 点规律 可循。 
现根据 文献介 绍的经 验和一 般原则 ,对分 离纯化 各阶段 对各种 方法的 选择作 简单的 讨论: 

(― ) 分离 纯化的 早期使 用方法 的选择 

分离 纯化的 早期, 由于 提取液 中的物 质十分 复杂, 制备物 质浓度 较稀、 在理化 性质上 
与被 制备物 相似的 杂质, 数量 较多。 因 此在这 一阶段 选用一 些分辨 能力较 高的分 离纯化 
方法 一般认 为不大 合适。 原 因是一 种高分 辨率的 分离纯 化方法 在大量 杂质存 在下, 不论 
是 根据物 质分子 大小或 物质带 电性质 而进行 分离, 都 不可能 使被分 离的物 质集中 于一个 

• 16 • 



区域。 只可能 在预定 区域中 得到一 些理化 性质相 近的同 类物, 而把 真正要 分离的 成份漏 
掉。 出现这 种现象 的主要 原因, 是高分 辨率的 分离方 法在杂 质多的 情况下 位置效 应比较 
严重, 大批 理化性 质相近 的分子 在相同 分离条 件下, 彼 此在电 场中或 力场中 相竞占 据某一 
位置。 这样, 被 目的物 占据的 机会就 很少, 或 者分散 在一个 很长区 域中而 无法集 中于一 
点。 高 分辨效 力的分 离方法 大部分 是根据 物质二 个以上 理化因 素而建 立的, 如区 带电泳 
和凝胶 电泳是 根据分 子大小 及带电 数量而 进行分 离的, 一次 分离物 质的量 不大, 即 负荷能 
力都比 较小。 如电泳 法虽有 较高分 离能力 ,但如 果早期 使用电 泳法, 不仅得 不到理 想效果 
而且 渗杂着 大量类 似物, 给以 后纯化 工作带 来更大 困难。 

早期分 离纯化 用萃取 、沉淀 、吸附 等一些 分辨力 低的方 法比较 有利。 这 些方法 不仅负 
荷能 力大, 一次 分离的 量多, 同时可 以除去 大部分 理化性 质相差 较大的 杂质。 萃取、 沉淀、 
吸附 分离方 法既起 着分离 提纯的 作用, 又起 着浓缩 的作用 ,可 为以后 进一歩 分离纯 化创造 
良好的 基础。 , 

离子交 换树脂 分离有 时也用 于早期 纯化, 如搅拌 交换或 短胖柱 交换方 法用于 发酵液 
中 分离浓 缩抗菌 素比较 常见。 纤维 素离子 交换色 谱也常 直接用 于粗抽 提液中 进行多 种蛋' 

白质的 制备, 没有出 现明显 的同位 效应, 且具 有较高 的负荷 能力。 其中的 DEAE- 纤维素 
特别适 于从中 性或碱 性蛋白 质中分 离纯化 酸性蛋 白质。 实验时 ,先 将上柱 液调到 pH 4.0〜 
4.5。 通过 DEAE- 纤维素 柱时, 酸性蛋 白质被 吸附, 其他杂 质及非 酸性蛋 白质不 被吸附 ,从 

下面 流出。 然 后进行 洗脱和 浓縮, 这样一 步分离 后得到 的酸性 蛋白质 纯度可 提高许 多倍。 
据 A. Atkinson 报道, 早 期使用 DEAE- 纤 维素、 羟基确 灰石, 从 B. Stearothermophilus 菌 
体细 胞提取 液中, 同 时分离 了十多 种酶, 已达到 了工业 生产规 模水平 [ 11 ] 。 

亲合 色谱法 由于具 有极高 生物特 异性, 分 离目的 物受到 理化性 质相似 的杂质 干扰极 
少, 能从 比较复 杂的组 织抽提 液或细 菌发酵 液中一 步提取 分离出 所需的 物质, 提纯 倍数可 
达 一百倍 以上。 如从大 肠杆菌 粗抽提 液中一 歩提纯 ^半乳 糖苷藤 ,即达 电泳纯 [12]。 亲合 
色谱是 一种既 优越又 简便的 方法。 用于 早期分 离一些 含量少 而又不 稳定的 生物大 分子是 
一 个值得 推广的 方法。 

总的 来说, 早 期分离 提纯的 方法, 选择的 原则一 般是从 低分辨 能力到 高分辨 能力, 而 
且 负荷量 较大为 合适。 但随着 许多新 技术的 建立, 一个特 异性方 法其分 辨能力 越高, 便意 
味着提 纯步骤 的简化 ,提纯 步骤的 减少, 回 收率便 越高, 具有 生理活 性物质 变性的 危险性 
就 越少, 这 是所有 生化制 备研究 工作人 员所希 望的。 如上述 亲和层 析和纤 维素离 子交换 
色 谱就是 很好的 例子。 其他方 法如连 续流动 电泳, 连 续流动 等电聚 焦等, 在 一定条 件下, 
用于 早期从 粗抽提 液中分 离制备 小量物 质也具 有许多 优点, 但 目前仍 处于探 索发展 阶段, 
不 如前两 者已达 到比较 成熟的 程度。 当 然所谓 低分辨 能力的 分离纯 化方法 如有机 溶剂沉 
淀、 盐析、 有 机溶剂 萃取等 也不限 于分离 的早期 使用, 在整个 分离制 备过程 中经常 反复应 
用, 而每 次应用 其分离 的能力 和效果 也是不 同的。 

(二) 各 种分离 纯化方 法的使 用程序 

生物体 内各种 物质的 分离都 是在液 相中进 行的。 故分离 方法常 根据这 些物质 的分配 
系数、 分子量 大小、 离子 电荷性 质及数 量和外 加环境 条件的 差别等 因素构 成不同 分离方 
法的 基础。 而 每一种 分离方 法又都 在特定 条件下 发挥作 用的。 因此, 在相 同或相 似的条 

、 • 17 • 



件 下连续 作用同 一种分 离方法 就不大 适宜。 例如纯 化某一 两性物 质时, 前一步 已利用 it 
物质阴 离子的 性质, 使用了 阴离子 交换色 谱分离 方法, 那么下 一歩提 纯时应 用阳离 子交换 
色 谱或作 为一个 阳离子 应用电 泳方法 分离, 则 比再用 其阴离 子性质 作色谱 或电泳 具有更 
好 的分离 效果。 各种分 离方法 的交叉 使用对 于除去 大量理 化性质 相近的 杂质也 较为有 
效。 某些 杂质在 各种条 件下带 电性质 可能与 制备物 相似, 但分 子大小 与形状 与制备 物相差 
较大; 而另一 些杂质 的分子 大小形 状可能 与制备 物相似 ,但在 某种条 件下与 制备物 带电性 
质 不同。 在 '这样 的情 况下, 先用分 子旆、 超速离 心沉降 或膜过 滤方法 除去分 子量相 差较大 

的 杂质, 然后 在一定 PH 值和 离子强 度范围 下使制 备物变 成有利 的离子 状态, 便能 有效地 
进 行色谱 分离。 当然, 这两种 歩骤的 先后秩 序反过 来应用 也会得 到同样 效果。 

纯化方 法顺序 先后的 安排, 还考虑 到有利 于减少 工序, 提高 效率。 如在 盐析法 后采取 
吸附法 ,必 然因为 盐离子 过多影 响吸附 效果。 中间 增加透 析脱盐 一歩, 则使 操作大 大复杂 
化。 如倒 过来先 吸附, 后 盐析, 吸附 洗脱时 的含盐 洗脱液 即可直 接进行 盐析, 则可 达到操 
作 简化节 省原料 时间的 目的。 此外, 分 离体积 过大时 使用盐 析法和 有机溶 剂沉淀 法都能 
达到浓 縮效果 ,但 使用盐 析法成 本就低 得多。 

对于 一未知 物通过 各种方 法的交 叉分离 纯化, 还可以 进一歩 了解到 制备物 的性质 ,以 
补 充预试 验时所 获得的 知识片 面性。 但不论 是巳知 物或未 知物, 当条件 改变时 ,连 续使用 
同一分 离是允 许的, 如 分级盐 析和分 级有机 溶剂沉 淀等。 分离纯 化中期 ,有 时由于 某种原 
因 (如样 品含盐 太多, 或样品 过大等 ), 一个 方法一 次分离 效果不 理想, 可以连 续使用 二次, 
这 种情况 在凝胶 过滤, DEAE- 纤维 素色谱 等比较 常见。 当 分离纯 化工作 巳进行 至后期 
时, 大 部分杂 质巳经 除去, 欲制备 的物质 已十分 集中, 重复 应用先 几歩所 应用的 方法, 对进 
一步 肯定所 制备的 物质在 分离过 程中其 理化性 质有无 变化和 验证所 得的制 备物是 否属于 
矫作 物又有 着新的 意义。 

(三) 分离纯 化后期 的保护 性措施 

各 种活性 物质在 生物体 内的含 量一般 都是很 少的。 有的 本来含 量已经 是十分 微量, 
再由于 多歩骤 的纯化 过程的 流失, 到了分 离制备 后期可 获的产 品已经 是十分 微量了 ,有的 
量只有 原材料 的千分 之几。 有的只 有万分 之几, 或几 十万分 之几。 如果所 制备的 物质是 
未知 物质, 分离 纯化方 法还属 于探索 性质, 分离过 程中损 失更为 严重。 现在 数学上 作一简 
单 推算: 假设某 材料含 A 物质 为万分 之一。 纯化 后回收 率只有 20%, 即在分 离过程 中损. 
失 了百分 之八十 (这是 常有的 ), 如开 始投料 为一千 公斤, 应得 产品是 20 克, 到了 分离后 
期, 损失 了一克 产品, 就等 于损失 了五十 公斤的 原料。 因此, 到了分 离工作 后期, 必需注 
意避免 产品的 损失。 后期 产品的 损失主 要途径 有玻璃 器皿的 吸附。 操作过 程样品 液体的 
残留, 空气的 氧化和 某些事 先无法 了解的 因素, 当然 后者是 很难避 免的。 所 以对于 一些探 
索性 的制备 实验, 为 了取得 一定量 (那怕 是很少 也好) 的 产品, 提供分 析鉴定 之用, 常常需 
要 加大原 材料的 用量, 并在后 期纯化 工序中 注意保 持样品 溶液较 高浓度 ,以 防止制 备物在 
稀 溶液的 变性, 有时常 加入一 些电解 质以保 护生化 物质的 活性, 减少 样品溶 液在器 皿中的 
残留 量等, 这 些都是 十分重 要的。 

(四: ) 对分 离纯化 每一步 骤方法 的优劣 进行综 合评价 



• 18 • 



每一个 分离纯 化步骤 方法的 好坏, 除了从 分辨本 领和重 现性二 方面考 虑外, 还注 意方— 
法本 身的回 收率的 高低, 特别是 制备某 些含量 很少的 物质时 ,回收 率的高 低十分 重要。 表 

18 是分 离制备 的几种 常用方 法中有 关分辨 本领、 重现 性及回 收率的 一些初 步评价 (参考 
Morris 并有所 删减) [ 6] 。按现 生化制 备中应 用的分 离纯化 方法, 一个制 备的原 始活力 经过五 
至六 歩的提 纯后, 一 般都可 以达到 V^lo 以 上的回 收率。 当然, 不同 物质由 于其稳 定性的 
不同及 分离的 难易, 所 得回收 率是不 同的。 



表 1 — 8 — 些常用 的分离 纯化方 法的几 项特性 



方 法 


分 辨本领 


重现性 


回收率 


色 谱法: 一 

吸附 

分配 

离 子交换 
分子篩 


+++ 
++ 

+++ 

+ 




+ 

++ 
+++ 


逆流 分配法 


++ 


++ 


++ 


电 泳法: 一 
自 由溶& 
聚乙稀 支持物 
纤维 支持物 
凝胶 ' 
等 电聚焦 




•H- 

+++ 
+++ 


+ ++ 

f++ 

++ 

+ 

+++ 


沉降法 


十 


++ 


-f-H- 


膜 透析及 扩散法 


++ 


+++ 


-r-H- 


溶 解度法 


+ 


++ 


++ 



生化物 质在分 级分离 中对每 一步骤 方法的 优劣的 记录, 常体现 在所得 产品重 量及活 
性 平衡关 系上。 这一 关系, 可通 过每一 步骤的 分析鉴 定即可 求出。 例如酶 的分离 纯化每 
一 步骤产 物重量 与活性 关系, 通过测 定酶的 比活力 及溶液 中蛋白 质浓度 的比例 ,其 他活性 
物质 也可通 过测定 总活性 的变化 与样品 浓度或 体积作 比较而 求出。 最后根 据各步 骤所得 
样 品重量 或体积 和测出 的活力 列表进 行对比 分析, 算出 每歩的 提纯倍 数及回 收率。 现以 

从 长春花 (iCathasanthus roseus) 中提纯 Strictosidine 合成 酶的实 验为例 , 将各歩 骤提纯 
倍 数及回 收率总 结于表 1-9。 



表 1-9 长 春花中 Stricto»idine 合成 K 的提纯 



步 骤 


总蛋白 
(毫克 ) 


比活性 * 
nKat/ 毫 克蛋白 


总活 力单位 
(nKat) 


产 率 
% 


提 纯倍数 


(I) 粗 抽提液 


654 


0.008 




100 


1 


(11) 硫酸 铵沉淀 


466 


0.011 


5.1 


98 


1.3 


(III) DEAE- 纤 维素柱 


38.7 


0.10 


3.9 


75 


12.5 


(IV) 经基碟 灰石柱 


5.9 


0.64 


3.8 


73 


80 


(V) Sephadcx G 75 


0.72 


2.8 


2.0 


38 


350 


(VI) 等 电焦点 


0.08 


5.9 


0.5 


10 


737.5 



* 比活 性项中 nKat 的换 算方法 见下。 



• 19 . 



按 国际酶 学会议 规定: 一分 钟转化 一个微 克分子 底物为 一个国 际单位 薛量, 而一个 

国际单 位酶量 = 16.67nKat. 原酶 量单位 "Katal" 定 义为每 秒钟转 化一个 克分子 底物的 
藤量, 因所 需醸量 太大, 现一 般很少 应用。 

上面 表中: 比活力 —— 总活 力除以 总蛋白 质含量 (或蛋 白氮) 的 比值。 

回收率 —— 为本歩 骤所得 的总活 力与第 一步骤 所得总 活力之 比值, 以百 
分比 表示, 开始时 回收率 假定为 100%。 

提 纯倍数 —— 为本歩 骤所得 之比活 力与第 一歩骤 所得之 比活力 之 比 值, 
开 始时假 定提纯 倍数为 1 。 

从表 1-9 的 内容中 可以看 到提纯 倍数为 737.5, 但回收 率只有 10%, 即 90fc 损失于 
操 作中。 总蛋 白量由 654 毫克 减少至 0.08 毫克, 共减 少了八 千倍, 而酶 损失仅 10 倍, 因 
而 获得了 纯化。 从每一 纯化歩 骤看, 比活力 越高, 酶的提 纯倍数 越大, 一个 好的分 离提纯 
方法 应该是 提纯倍 数和回 收率都 同时有 较大的 提高。 但必须 指出, 整个分 离提纯 歩骤是 
连续进 行的, 前一歩 骤虽然 提纯程 度和回 收率都 不高, 但 它是必 需的, 前一 步主要 为后一 
步提供 更有利 的分离 纯化的 基础。 

(五) 对 制备物 均一性 的鉴定 

对制备 物均一 性的鉴 定是分 离制备 过程最 后一个 工序, 一个新 分离的 物质是 否纯, 常 
用" 均 一性" 表示, 均 一性即 指所获 得的制 备物只 具有一 种完全 相同的 成份。 均一 性的评 

价常 须经过 数种方 法的验 证才能 肯定。 有时 
某一 种测定 方法认 为该物 质是均 一的, 但另 
一 种测定 方法却 可把它 分成二 个甚至 更多的 
组份, 这 就说明 前一种 鉴定方 法所得 的结果 
是片 面的。 如果某 一物质 所具有 的物理 、化 
学 各方面 性质经 过几种 高灵敏 度方法 的鉴定 
都是均 一的, 那么 大致可 以认为 它是均 一的。 
当然, 随着新 的鉴定 方法的 出现, 还可 以发现 
它 不是均 一的。 绝对的 标准只 有是把 制备的 
全 部结构 弄清楚 并经过 人工全 合成证 明具有 
相同 的生理 活性, 才能 肯定所 分离的 物质是 绝对纯 净的。 但通 过这样 严格的 核对, 小分子 
物质还 是容易 办到的 ,大 分子物 质如蛋 白质、 酶、 核酸 或某些 多糖则 是一件 十分困 难的事 
了。 就目 前水平 来说, 除了极 少数成 功的例 子外, 生物 大分子 的结构 全面分 析及人 工全合 
成工 作还处 于早期 发展的 阶段。 

现以 蛋白质 为例, 说明 均一性 试验常 用的一 些物理 一化学 方法。 蛋白 质均一 性的经 
典试验 主要基 于它的 溶解度 、电泳 和沉降 行为。 近年来 增加了 末端氨 基酸残 基测定 方法, 
即一个 纯的蛋 白质含 有一定 量末端 氨基酸 残基, 而且 这些残 基成整 数比例 地存在 于蛋白 
质分 子中, 如有 其他末 端氨基 酸残基 和不成 整数比 例存在 于蛋白 质分子 则表示 该蛋白 
质 不纯。 另 还有生 物特殊 功能测 定法, 具 有某些 特殊功 能的蛋 白质, 如酶、 激素 蛋白、 氧 
载体、 抗体等 ,都可 以通过 其特有 的催化 效率、 生理活 性和免 疫反应 等加以 测定, 这 种测定 

方 法常可 以检出 非常低 的杂质 含量, 在 某种意 义上比 物理和 化学鉴 定更为 优越。 现就蛋 
• 20 . 




加入的 固体蛋 白质量 

图 1-4 蛋白质 的溶解 度曲线 



白 质均一 性常用 的几种 鉴定方 法介绍 如下: 

1. 溶 解度法 这主 要根据 Gibb 相 律理论 而建立 的一种 经典测 出物质 纯度的 方法。 

它不仅 用于蛋 白质, 也可 用于其 他物质 的纯度 测定。 Gibb 相 律理论 认为, 一个单 一成份 
的物质 在一定 条件下 其溶解 度是一 定的, 因此, 当某 一物质 在溶剂 中的溶 解度达 到饱和 
时, 其 溶解曲 线有着 非常明 显的转 折点。 溶解 度测定 法操作 简单, 方 法也很 灵敏。 例如用 
此法测 定酶的 纯度时 ,将 一系列 不同量 的酸制 剂分别 加人等 容积的 溶剂中 (水或 盐溶液 )。 
搅拝溶 解后, 过滤除 去固体 部分。 然后分 别测定 各管滤 液中蛋 白质含 量或醜 的活力 ,当固 
体酶蛋 白溶解 后未达 到饱和 度时, 加入 的酷量 和滤液 中的蛋 白质量 或酶活 力是按 比例上 
升的。 加入 酶量至 一定程 度即达 到饱和 度时, 固体 酶蛋白 则不能 溶解, 滤液 中的蛋 白质含 
量或 酶活力 也不再 提高。 于是, 在 溶解度 曲线上 在饱和 度时出 现一个 转折。 如固 体醒制 
剂中含 有少量 不纯物 质时, 就不 会出现 一个明 显的饱 和度转 折点。 、如图 1-4 所示" "。 

在图 1-4 中, 曲线 1 只出 现一个 明显转 折点, 表示只 有一种 蛋白质 组份。 曲线 2 含有 
二种 组份的 混合蛋 白质, 故出现 二个转 折点。 一般 来说, 混合 蛋白质 中有多 少组份 便出现 
多少个 转折点 ,但 实际上 组份太 多时, 溶解度 曲折点 便不明 显了。 曲线 1 在 转折点 以前直 
线的斜 率应为 1, 转折 点以后 直线与 横座标 平行, 斜率 为零。 曲线 2 在二个 转折点 之间直 
线 的斜率 (图 中虚线 部分) 表示不 纯成份 在混合 蛋白质 中所占 比例。 

溶解度 法测定 物质均 一性的 试验, 在 实际应 用时常 选择几 个不同 PH 和离子 强度的 
条件 进行, 使 所得结 果更加 准确。 溶解度 法的测 试工作 因需要 大量的 样品, 现在已 很少应 
用。 

2. 电泳均 一性的 测定法 近二十 年来电 泳法有 了很大 发展。 早期在 自由溶 液中, 

建立 在不同 pH 及离 子强度 条件下 测定带 电物质 电泳迁 移率, 以表示 电泳的 均一性 ,在理 
论上 是很理 想的, 但在 实际操 作中常 存在许 多影响 因素, 难以达 到理想 程度。 前沿 电泳法 
则 主要由 于分辨 率较低 及使用 的仪器 和操作 都比较 复杂, 所以使 用的人 不多。 此外, 以上 
两种方 法样品 用量也 比较多 ,故 巳渐渐 被凝胶 电泳所 代替。 凝 胶电泳 不仅具 有电泳 作用, 
同时 还具有 分子筛 作用。 因此 有极高 的分辨 能力。 如聚丙 晞酰胺 凝胶电 泳可以 检测出 
10-' 至 10—" 克 样品的 含量, 含量 10 — 15 微克分 子的蛋 白质或 5 — 10 微克 左右的 核酸在 
一定的 pH 下能 做出很 漂亮的 均一性 试验的 结果。 凝 胶电泳 在测定 样品均 一性的 同时, 
还可 以分析 鉴定样 品分子 大小和 形状。 是目前 许多生 物大分 子普遍 采用的 均一性 鉴定的 
方法。 凝胶 电泳也 适用于 小分子 电解质 的纯度 测定。 

用凝 胶电泳 (包 括聚 丙稀酰 胺凝胶 电泳) 进行蛋 白质均 一性测 定时, 一 般都要 变换二 
至三种 pH 值进行 实验, 才 能对所 得结果 是否均 一加以 评定。 蛋白 质可以 作为阴 离子或 
阳离子 进行电 泳试验 ,核酸 只能作 为阴离 子进行 试验。 近年来 ,还发 展了各 种免疫 电泳和 
最 近流行 专门检 验糖蛋 白使用 的亲和 电泳。 它们都 是由凝 胶电泳 衍生出 来的, 具 有更专 
一, 操作更 简便的 优点。 

3. 高 速离心 沉降法 对于 蛋白质 及其他 生物大 分子均 一性的 测定也 是一个 经典方 
法, 在 理论上 这一方 法是完 善的。 主要问 题是离 心设备 本身的 缺陷, 以至每 个组份 在离心 
管中所 能移动 的距离 很短。 如果每 个组份 的分子 大小、 形状、 带电性 质差别 不大时 ,由于 
影 响分子 移动的 各种因 素综合 平衡的 结果, 往往使 各组份 所受的 力场作 用相等 ,于 是就很 
难 区分。 所以使 用高速 离心沉 降方法 测定物 质的均 一性, 其精 确度的 提高受 到一定 限制。 

' • 21 • 



但由于 其具有 测定时 间短, 样品用 量少等 优点, 现 仍是经 常使用 的方法 之一。 

以 上仅就 蛋白质 均一性 测定作 一简略 讨论, 对于其 他小分 子物质 纯度的 测定, 供使 

用分 析方法 更多, 如制 备物获 得一定 量的结 晶后, 可进行 核磁共 振波谱 、质谱 ,紫外 光谱, 

红 外光谱 测定, 或作高 效液相 色谱、 气相 色谱、 旋光和 熔点等 试验, 经过 综合分 析后, 便可 

以对 被鉴定 物作出 纯度的 结论。 

有 关各类 生化物 质的分 析鉴定 方法, 本 丛书各 分册均 已详细 介绍。 这 里不再 赞述。 

参 考文献 

[I] 沈同、 王 镜岩、 赵邦悌 主编: 生物 化学, 人 民教育 出版社 (1980) 

[ 2 ] Lehninger, Albet L., Biochemistry The moleculas basis of cell structlre and function, Worth 

Publishers Inc., 2nd ed. (1975) [中 译版, 上册, 科学 出版社 (1981)] 

[3] 中山 大学生 化微生 物教研 室编: 生 化技术 导论, 人 民教育 出版社 (1979) 
[4] 阿 南功一 等著: 基 础生化 实验法 [2], 日本 丸善株 式会社 (1974) 
[5] W. 费迪南 德著: 隨分子 (中译 本), 科学 出版社 (1980) 

[ 6 ] Morris, C. J. O. R. and Morris, P., Separation Methods in Biochemistry, 2nd Ed., p. 5 一 8, Pi- 
tman publishing, Canada (1976) 
[ 7 ] Strain, H. H., Sato, T. R., and Engelke, J. Andyt. Chem., 26, 90(1954) 
[ 8 ] Finney, D. J., Statistical Methods in Biological Assay, Critfin, London (1952) 
[9] T. G. 库 珀著: 生物化 学工具 (中译 本), 人 民卫生 出版社 (1980) 
[10] B. L. 威 廉斯, K. 威尔 逊编: 实用 生化化 学原理 和技术 (中译 本), 科学 出版社 (1979) 

[II] Atkison, A., Process Btochem., 8(8): 9(1973) 

[12] Steers, E" Cuatrecasas, P. and Pollard, H. B., J. Biol. Chem., 246: 196 (1971) 
[13] Mizukami, H., Nordlov, H., Lee, S. L. and Scott, A. ;., Biochemistry, 18:, 3760 (1979) 
[14] Neilands, J. B. and Stumpt, P. K., Outlines of Enzyme Chemistry, 2nd Ed, John Wiley and Sons 
Inc., N. Y. (1958) 



• 22 • 



第二章 提取 及溶剂 分离法 

苏拔贤 
第一节 引 言 

提 取常指 制备物 与细胞 固体成 份或其 他结合 成份的 分离, 由固 相转人 液相或 从细胞 
内 生理状 态转入 外界特 定溶液 环境的 过程。 如 果被提 取物质 在细胞 内呈固 相或与 固体结 
合存在 ,提取 时由固 相转人 液相, 常称为 固一液 萃取。 如被提 取物质 原来已 呈液相 存在, 
提 取时由 一液相 转入另 一互不 相溶的 液相, 这 种提取 方法称 液一液 萃取, 或称 抽提。 提 

取、 萃取和 抽提英 文都是 Extraction, 其含义 基本上 相同。 习 惯上, 提取多 指分离 纯化前 
期, 被提 取物质 从破碎 的细胞 中释放 出来的 过程, 而抽 提则贯 穿在分 离纯化 整个过 程中。 
如核酸 制备中 用氯仿 或苯船 反复振 荡抽提 除去蛋 白质, 分离 DNA 和 RNA, 或用 有机溶 
剂从细 胞膜上 抽提一 些可溶 性蛋白 质等。 所 以提取 应是分 离纯化 工作的 开始, 提 取的效 
果, 主要 取决于 被提取 物在溶 剂中溶 解度的 大小, 由固相 扩散到 液相的 难易, 同时, 选择提 
取的条 件对制 备物稳 定性的 影响, 是否 有利于 以后的 提纯步 骤等因 素均应 顾及。 

第二 1? 选 用的溶 剂与物 质溶解 度的一 般规律 

溶解 度因素 用于分 离提纯 有两个 主要的 目的, 一 是选择 一个对 制备物 溶解度 大而对 
杂质溶 解度小 的溶剂 ,使制 备物从 混合组 份中有 选择地 被孤离 出来; 另一是 选择一 个对制 
备物溶 解度小 而对杂 质溶解 度大的 溶剂, 使制备 物沉淀 或结晶 析出。 但不 论是使 溶质有 
选择地 溶解或 有选择 地沉淀 都是为 了达到 与杂质 分离的 目 的。 

一 个物质 溶解度 的大小 与溶质 和溶剂 性质都 有关。 即溶质 一溶质 ,溶质 一溶剂 ,溶剂 
一溶剂 三个相 互作用 力综合 平衡的 结果, 这 种相互 作用可 用下图 表示: 

. 溶质 溶剂 

A J[ 、 、 J[ B 

溶质 e 溶剂 

过程 A 是溶质 分子相 互作用 ,过程 B 是溶剂 分子相 互作用 ,过程 C 是溶 质与溶 剂相互 
作用。 这三 种相互 作用过 程中, 如果溶 质一溶 剂相互 作用占 优势, 则溶质 的溶解 度大。 反 
之如 溶质一 溶质或 溶剂一 溶剂其 中一个 系统相 互作用 很强, 或者两 个系统 两个系 统相互 
作用都 很强, 则溶 质在该 溶剂中 的溶解 度小。 

溶质一 溶质, 溶剂一 溶剂, 溶 质一溶 剂之间 相互作 用力主 要有: . 

<1> 偶 极一偶 极相互 作用; 

<2> 偶 极一诱 导偶极 作用; 

<3> 弥 散力; 

• 23 . 



<4> 氧键; 

<5> 离子 基团的 静电作 用等。 

当然, 要定量 测定毎 一种作 用力是 十分困 难的, 影响因 素也很 复杂。 所以对 于一' 卜有 
机分 子或生 物分子 来说, 其在某 一溶剂 中的溶 解度, 往 往只能 根据实 际表现 而加以 描述。 
如属已 知物质 ,可查 阅有关 资料或 手册。 对于一 个未知 物质, 只能根 据物质 溶解的 一般规 
律进行 预试验 ,最后 确定其 溶解度 性质。 物 质溶解 性质的 一般规 律可归 纳如下 几点: 

1. 极 性物质 易溶于 极性溶 剂中, 非极性 物质易 溶于非 极性溶 剂中。 能 溶于水 的物质 
一般都 是极性 分子或 离子化 合物, 有些 化合物 虽然是 非极性 物质, 但 分子内 有较多 极性基 
团, 也易溶 于水, 如 糖类。 

2. 碱性物 质易溶 于酸性 溶剂中 ,酸 性物质 易溶于 碱性溶 剂中。 

3. 在极性 溶液中 ,溶剂 的介电 常数的 减少, 溶质的 溶解度 也随之 减少。 

上述 规律也 可以用 所谓相 似物溶 解于相 似物的 原则进 行解释 [ 1 〕 。 所谓 相似, 一方面 
表示 溶质、 溶剂 分子结 构上的 相似, 另 一方面 是指溶 剂与溶 质二者 分子间 作用力 大小相 
似。 前 者如石 油等经 类溶剂 是经类 化合物 的优良 溶剂。 后 者例子 如具有 OH、 COOH、 

NH2、 SO4 等基团 之物质 都易溶 于水, 因 这些基 团周围 有与水 分子周 围同样 大小的 

引 力场, 含有这 些基团 的分子 能均句 地分布 于水分 子之间 ,并 通过一 定的配 价键而 相互结 
合。 己烷 不溶于 水而溶 于苯, 由于 己院与 苯分子 间吸引 力大致 相同, 而己烧 与水分 子间吸 
引力 很小, 水 分子自 身吸引 力较大 之故。 相似物 溶于相 似物的 结论一 般地符 合实际 情况。 

一些 常用溶 剂按其 极性的 大小, 可依 顺序大 致排列 如下: 饱和经 类<全1^ 代经类 < 



表 2-1 Hecker 的溶剂 分类法 



类 别 




b 




d 




形 成氢键 的能力 


3 个 或更多 


2 个 


1 


1 





(个数 ) 


A 和 D 


A 和 D 


A 


D 




H— 0— H 


AlK— OH 


R— CHO 


CHCI3 


ecu 




1 1 


R — C— OH 


Rj=CO 


CHCIj— 


经类 




— C— C — 

1 1 


Rj=0 


CHCI2 




溶 


OH OH 


R =NOH 








剂 


1 1 
— C C — 


— CHj— CN 


R — C = 






1 1 

C = OH 


— CHj— NOj 


OR 






功 


OH 

1 1 


Ar— OH 
R— NHj 








能 


— c c— 

1 1 

c=o c=o 


R,=NH 








团 


1 1 

OH OH 

― c— c — 

1 1 

OH NH, 











0=质 子供体 人=质 子受体 



• 24 • 



不饱 和烃类 < 釀类 < 未全 代经类 〜脂类 < 芳胺类 < 酚类 < 酮类 < 醇类。 

希克卡 (Heclcer) 认为 溶剂按 极性进 行分类 带有较 多经验 成份, 而按形 成氢键 能力分 
类科 学性更 强些。 他 提出非 电解质 溶于极 性或非 极性溶 剂时, 根据形 成氢键 能力的 大小, 
可把 溶剂分 为五类 【2] : 

(1) 能形成 二个以 上氢键 的溶剂 分子, 在溶液 中这些 分子有 三维空 间网状 结构。 水 
就是这 类溶剂 的典型 例子, 水的二 个氢原 子和一 个氧原 子都可 以形成 氧键。 (2) 能形成 



表 2- 2 —些常 用溶剂 的性质 



溶 剂名称 


r/v 点 


介 电常数 


溶解度 


(20 — 25 0) 


A、 "ill -A-* -Jy r4-i /■ rrf 、 

溶剂 在水中 (%) 


水在 溶剂中 (9 &) 


石油魅 


36— 65^C 


1.80 


几乎不 j§ 


几 乎不溶 


己 烧 


96°C 


1.88 


0.00095% 


0.0111% 


环己焼 


81。c 


2.02 


0.010% 


0.0055% 


二 氧陆环 


101°C 


2.21 


任 意混溶 


任 意混溶 


四 氯化碳 


77°C 


2.24 


0.077% 


0.010% 


苯 


80°C 


2.29 


0.1780% 


0.063% 


甲 苯 


110。C 


2.37 


0.1515% 


0.033-4% 


间 二甲苯 


139°C 


2.38 


0.0196% 


0.0-102% 


二 硫化碳 


46°C 


2.46 


'0.294% 


<0.005% 


乙 雠 


35 °c 


4.34 


6.04% 


1.468% 


醋 酸戊醋 


H9°C 


4.75 


0.17% 


1.15% 


氯 仿 


61 。C 


4.80 


0.815% 


0.072% 


醋 酸乙酷 


77°C 


6.02 


8.08% 


2.94% 


醋 酸 


118°c 


6.15 


任 意混溶 


任 意混溶 


苯 胺 


184°C 


6.89 


3.38% 


1、 


四 氢呋喃 


66 °C 


7.58 


任 意混溶 


任 意混溶 


苯 gj} 


182°C 


9.78(60'C) 


8.66% 


28.72% 


吡 啶 


115"C 


12.4 


任 意混溶 


任 意混溶 


叔丁醇 


82 °C 


12.47 


任 意混溶 


任 意混溶 


正戊醇 


138°C 


13.9 


2.19% 


7.41% 


^ fX M 


isrc 


14.7 


2.67% 


9.61% 


仲丁醇 


100°C 


16.56 


12.5% 


44.1% 


正丁醇 


118。c 


17.5 


7.45% 


20.5% 


甲乙酮 


80°C 


18.5 


24.0% 


10.0% 


异丙醇 


82 °C 


19.92 


任 意混溶 


任 意混溶 


正丙醇 


97°C 


20.3 


任 意混溶 


任 意混溶 


醋 肝 


140°C 


20.7 


微 溶 


微 溶 


丙 爾 


56°C 


20.7 


任 意混溶 


任 意混溶 


乙 醇 


78°c 


24.6 


任 意混溶 


.任 意混溶 


甲 醇 


65 。c 


32.7 


任 意混溶 


任 意混溶 


二甲基 甲酷胺 


153。c 


36.7 


任 意混溶 


任 意混溶 


乙 腈 


82°C 


37.5 


任 意混溶 


任 意混溶 


乙二醇 


197°C 


37.7 


任 怠混溶 


任 意混溶 


二 甲亚讽 


189°C 


46.68 


25.3% 


25.3% 


甲 酸 


lorc 


58.5 


任; S 混溶 


任 意混溶 


'水 


100°C 


81 






甲醜胺 


211°c 


11! 


任; &混溶 


任 怠混溶 



. 25 - 



二个氢 键的溶 剂分子 ,即 既是氢 供体又 是氢的 受体, 例如脂 肪族的 醇类。 (3) 只作 质子受 
汰的溶 剂分子 ,如脂 肪族的 醚类。 (4) 只作质 子供体 的溶剂 分子, 如 氯仿。 (5) 不 能形成 
氢键的 经类, 如四氯 化碳。 

以 上分类 法见表 2-1 所示。 

按照表 2-1 的溶剂 分类, a、l> 二 类溶剂 宜用于 极性化 合物的 提取, c、d 二类 溶剂宜 
于对 溶液中 弱极性 或非极 性化合 物进行 抽提。 在抽提 中如加 人质子 供体溶 剂酷或 质子受 
体溶 剂胺, 均 可增加 质子受 体溶质 或质子 供体溶 质的溶 解度。 

以上仅 对物质 溶解一 般规律 在理论 上简单 介绍, 实际应 用时, 各 类物质 的溶解 有关数 
据 均可在 手册或 文献中 查到。 现将一 些常用 溶剂的 沸点、 介电 常数及 溶解度 列于表 2-2。 

第三节 影响 物质溶 解度的 几个主 要因素 

一、 离 子强度 



离 子强度 是影响 物质溶 解度主 要因素 之一。 有 些物质 在高离 子强度 下溶解 度增加 
(如 DNA- 蛋白 ), 另一 些物质 (如 RNA- 蛋白) 在低离 子强度 下溶解 度增加 ,而 在高离 
子强度 下溶解 度反而 减少。 绝 大多数 球蛋白 和酶, 在 低离子 强度的 溶液中 都有较 大的溶 
解度, 如 在纯水 中加人 少量中 性盐, 蛋 白质溶 解度比 在纯水 时大大 增加。 称为" 盐溶" 现 

象。 但中 性盐的 浓度增 加至一 定时, 蛋 白质的 
溶解度 又逐渐 下降, 直 至沉淀 析出。 则称为 "盐 
析" 现象。 溶液离 子强度 与蛋白 质溶解 度的关 
系见图 2-1。 盐溶 现象的 产生主 要是少 量离子 
的 活动, 减 少了偶 极溶质 分子之 间极性 基团静 
电吸 引力, 增加了 溶质和 溶剂相 互作用 力的结 
果。 盐溶现 象不仅 在水溶 液中, 而且在 低介电 
常数 溶剂如 乙醇中 也同样 发生, 低离子 强度溶 
液除 了增加 许多生 化物质 的溶解 度外, 还对一 
些 物质生 理活性 有稳定 作用, 所 以稀盐 溶液常 




一盐溶 ♦ 



盐析 



离 子强度 



图 2-1 溶 液离子 强度与 蛋白质 溶解度 的关系 
用 于大多 数生化 物质的 提取。 



二、 pH 值 

许多有 机分子 或生物 分子都 同时具 有酸性 或緘性 基团, 这 些基团 在不同 PH 下有着 
不同 的解离 状态, 在水 中或有 机溶剂 中便有 不同溶 解度。 当两性 物质分 子上酸 、碱 性基团 
解离 情况相 等时, 整 个分子 所带电 荷总和 为零, 此时 溶液的 pH 值称 为该分 子的等 电点。 
在等电 点时, 两性溶 质分子 易相互 聚集, 溶解度 最低, 而远离 等电点 两侧的 pH 值 时溶解 
度 增大。 对于一 些酸性 或碱性 小分子 物质, 当 pH 很 低时, 酸 性物质 大部分 呈非解 离分子 
状态, 而碱性 物质大 部分呈 阳离子 状态。 如 pH 很 高时, 酸性 物质大 部分呈 阴离子 状态存 
在, 而碱性 物质则 呈非解 离分子 状态。 离子 状态的 物质, 不论 是阳离 子或阴 离子都 易溶于 



26 



水, 非离 解的分 子状态 则易溶 于有机 溶剂。 所 以当酸 性物质 处于低 pH 值, 碱性物 质处于 
高 pH 值时, 都可 以转溶 于有机 溶剂。 但有些 两性物 质如氨 基酸, 在等 电点以 外任何 pH 
值时, 均呈离 子状态 存在, 所以氨 基酸一 般不用 有机溶 剂提取 (稀的 乙醇例 外)。 

酸 性或碱 性物质 在不同 pH 下 的溶解 性质的 差异, 和它 们的酸 性与碱 性的强 弱程度 
有关。 如非常 弱的酸 ,则 需要高 pH 值的溶 剂内, 才能使 这种酸 解离。 

以上从 pH 值与 物质溶 解度之 间的关 系作一 简单的 讨论。 对蛋 白质、 酶、 核 酸等生 
物 大分子 来说, 提取溶 液选择 pH 值首 先要保 证这些 生物大 分子活 性不受 破坏为 前提, 过 
酸、 过碱 均尽量 避免, 一般 控制在 pH6 — 8 范围, 常 选接近 中性的 pH 比较 稳定。 如单纯 
从溶解 度方面 考虑, 等电点 在酸性 范围的 蛋白质 或酶, 可选 用偏碱 性溶液 提取, 等 电点在 
碱性范 围时, 则选 用偏酸 性溶液 提取, 酸 性条件 还可以 解离一 些蛋白 质与其 他组分 的离子 
键 结合。 并有 利于细 胞壁的 溶解。 

三、 温 度 

温度的 升高可 增加物 质的溶 解度, 减少 溶液的 粘度, 这是 大家熟 知的。 所以, 略为提 
高温 度对提 取是有 利的, 这 叫热提 取法。 热提 取法多 用于一 些植物 成份和 某些小 分子生 
化 物质, 提取 温度常 控制在 5()〜7()°C 左右。 热提取 法虽然 提取效 率高, 但 所得提 取液含 
杂质 较多, 不 如冷提 法含杂 质少, 这是热 提法的 缺点, 对于绝 大多数 生物大 分子, 除 了某些 
特殊例 子外, 一般 提取温 度选择 0〜10力 范围 , 选择温 度范围 不但使 溶质有 较好溶 解度, 
更主要 是防止 生物大 分子的 变性。 

四、 去垢 剂 

去垢剂 是一类 既具有 亲水基 又具有 i^L 水基的 物质。 可分阴 离子、 阳离 子和中 性去塘 
剂 等多种 类型, 去垢剂 一般具 有乳化 、分散 和增溶 作用, 其中 中性去 垢剂对 蛋白质 的变性 
作 用影响 较少, 宜于蛋 白质或 酶提取 之用。 一 般市售 中性去 垢剂有 Tween 20、 40、 60、 
85、 Triton X-100 420; Lubrol W 等多种 规格。 中性 去垢剂 使用后 可通过 Sephadex LH- 
50 柱除去 [3] ,欲 直接用 DEAE-Sephadex 柱层析 ,不必 先分离 除去去 垢剂" ] , 洗脱所 得蛋白 
质 溶液, 接着可 用盐或 有机溶 剂分部 沉淀。 

某些 阴离子 去垢剂 如十二 院基橫 酸钠, 它可以 促进核 蛋白的 解体, 将核 酸释放 出来, 
并 对核酸 酶有一 定抑制 作用, 常用于 核酸的 提取。 

第四节 固一 液萃 取中扩 散作用 的应用 

当 提取物 是由固 相转为 液相, 或由细 胞内转 到细胞 外时, 提取的 效率与 物质的 扩散作 
用 有关。 扩散作 用中各 项因素 关系可 用下式 表示: 

G = DF — t 
厶 X 

式中: G 为巳扩 散的物 质量。 

• 27 • 



D 为扩散 系数。 物质 分子量 越大, 扩散系 数越小 ,温度 升高, 扩散系 数增大 ,溶 液粘度 
增加, 扩 散系数 减少。 
F 为扩散 面积。 

AC 为两相 界面溶 质的浓 度差, AC 越大, 扩散 越快。 
Ax 为溶质 扩散的 距离, Ax 越大, 物质 扩散到 溶剂中 的速度 越慢。 
t 为扩散 时间, 时间 越长, 扩 散的量 越多。 

从上式 各因素 的关系 可知, 为了 增加扩 散物质 的量, 也 就是提 高提取 速度, 常 采取如 
下 措施: 

〈1〉 提高材 料的破 碎程度 ,以增 加扩散 面积, 减 少扩散 距离。 

〈2〉 进行 搅拌, 使已扩 散的溶 质迅速 与溶剂 混匀, 以保持 两相界 面最大 浓度差 ,或分 
次提取 ,不断 更换新 鲜溶剂 ,以提 高扩散 速度。 

<3> 延 长提取 时间, 提高提 取温度 (但对 一些不 耐热的 物质, 温度不 宜过高 ), 以及减 
少溶 液粘度 (如 属大分 子核酸 干扰, 加 入少量 鱼精蛋 白或硫 酸链霉 素沉淀 去除) 等。 

固 一液提 取常见 于动物 骨骼、 肌肉组 织及中 草药等 材料, 往往由 于这些 材料的 组织细 
胞破 碎比较 困难, 提取效 果受扩 散作用 的影响 较大。 

实 际上从 破碎后 的固体 细胞提 取所需 组分, 当细胞 破碎程 度及提 取温度 受到限 制时, 
采用 少量多 次提取 方法较 为有利 [5〕 。 

设 K 为所 制备 的溶质 (A) 在固相 和液相 中分配 系数, X0 为 固相中 原有的 (A) 的重 

量, x„ 为提取 n 次后 固相 中所剩 (A) 的 重量。 W 为 
被 抽提固 体材料 体积, L 为每 次抽提 剂所用 溶剂的 
体积。 可 得如下 公式: 

KW 




Xn 



.KW + L 

从上 式可看 出用同 样体积 的溶剂 抽提, 分二次 

抽提比 一次抽 提收率 高得多 ,抽提 次数与 in 比可用 

Xo 

― 图 2-2 表示: 



提 取次数 

图 2-2 提取 次数与 提取率 的关系 



第五节 液一液 萃取时 
分 配定律 的应用 



液一 液萃取 选用的 溶剂必 须与被 抽提的 溶液互 
不 混和, 且对被 抽提的 溶质有 选择性 的溶解 能力。 萃 取的过 程是溶 质在两 相中经 充分振 
荡平衡 后按一 定比例 分配的 过程。 溶质在 两相中 达到平 衡后分 配比例 受分配 定律的 支配, 
分配定 律可表 示为在 恒温、 恒压 及比较 稀的浓 度下, 溶 液在两 相中的 浓度分 配比是 一个常 
数, 即: 

\ 7 恒 S, 恒压下 

式中 Ci —— 表 示分配 达到平 衡后, 在上层 液相中 溶质的 浓度。 - 

C, 一- 表 示分配 达到平 衡后, 在下层 液相中 溶质的 浓度。 



2S 



K —— 为分配 常数。 

不同 溶质在 不同溶 剂中有 不同的 K 值。 K 值 愈大, 表示 该溶质 在上层 液相中 溶解度 
愈大, K 值 愈小, 表示 该溶质 在下层 液相中 溶解度 愈大。 当 混合各 组分的 K 值很接 近时, 
须 通过不 断更新 溶剂进 行多次 抽提才 能彼此 分开。 分 配系数 与物质 在二相 系统中 的溶解 
度 有关, 但分配 系数不 等于溶 质在二 个相溶 剂中溶 解度的 比例, 因溶 解度是 指饱和 状态而 
言, 而 一般萃 取常限 于稀的 溶液。 

如溶 质分子 在提取 的溶剂 有缔合 现象, 则分 配定律 公式改 写为: 



n 为溶质 缔合后 分子量 变化的 数目。 其数 值等于 在上层 相中的 分子量 (Ml) 和下层 
液相中 分子量 (M2) 之比。 例如, 醋酸分 子量为 60, 在 水和乙 醚之间 分配, 因没 有缔合 
现象 发生, 故, M, = 60, M, = 60 

60 1 
n = — =1 

60 

如醋酸 在水和 苯之间 分配, 固醋 酸在苯 中形成 (CHiCOOH), 缔合 分子, 故 M2= 120, 

此时 

n — Ml — 60 = 1 
M2 120 ― 2 

所以醋 酸在水 一苯体 系中, 分 配系数 K 应为: 

K ― Ci 
iv — 

cf 

液一液 萃取在 生化制 备中应 用十分 普遍, 最常用 的二相 溶剂: 水, 水 一醇为 一相, 另 
一相为 与水不 相混和 的各种 碳氢化 合物, 如低 级瞇, 酯、 苯 酷等。 液 一液萃 取有简 单一次 
提取 和多次 提取, 提 取时可 用普通 分液漏 斗人工 操作, 也可以 用自动 转液的 逆流分 配仪。 
逆 流分配 仪是一 种多次 液一液 萃取的 装置, 可 以自动 进行数 十次甚 至数百 次连续 的转液 

抽提, 最后将 一系列 K 值十分 相似的 组份, 经 过多次 二相系 统不断 抽提和 重新分 配后, 达 
到彼此 分离的 目的。 逆流分 配仪已 广泛用 于多肽 如垂体 激素、 加 压素、 催 产素、 短 杆菌肽 
和 tRNA 的 分离。 

第六节 提取 时对具 有生理 活性物 质的保 护措施 

对于 一些具 有生理 活性的 物质的 提取, 除 了考虑 所选用 的溶剂 对被提 取物有 较大的 
溶 解度, 对杂质 有较少 的溶解 度外, 还应 综合考 虑提取 所用的 溶剂中 各种成 份的组 合及其 
他 因素, 使这些 活性物 质在提 取时处 于稳定 状态, 对于 一些生 物大分 子如蛋 白质、 酶和核 
酸来说 ,主要 措施常 有如下 几点: 

1. 采 用缓冲 系统。 防止 提取过 程中某 些酸碱 基团的 解离, 造成 溶液中 PH 值 变化幅 
度 过大, 导致某 些活性 物质的 变性, 或由于 pH 影响 提取的 效果。 在 生化制 备中, 提取用 
的缓 冲系统 常有磷 酸盐缓 冲液, 柠檬 酸盐缓 冲液, Tris 缓冲液 ,醋 酸盐缓 冲液, 碳 酸盐缓 

♦ 29 • 



冲液 和巴比 妥缓冲 液等。 缓冲 液听使 用的浓 度均比 较低, 以 利于增 加溶质 的溶解 性能。 

2. 加入保 护剂。 防止某 些生理 活性物 质的活 性基团 及酷的 活性中 心受到 破坏。 如最 
常见的 琉基, 是许 多活性 物质和 藤催化 的活性 基团, 它 极易被 氧化, 故提取 时常加 入一些 
还原剂 如半胱 氨酸, 《 -琉基 乙醇, 二琉 基赤藓 糖醇, 还 原型谷 胱甘肽 等以防 止它的 氧化。 
其 他的措 施如撐 取某些 酶常加 入一些 底物。 一 些易受 重金属 离子抑 制生理 活性的 物质, 
加入某 些金属 螯合剂 ,把有 害金属 离子螯 合掉, 而 保持被 提取的 活性物 质的稳 定性。 

3. 抑制水 解酶的 破坏。 是 提取生 化物质 中最重 要保护 性措施 之一。 可 根据不 同水解 
酶的 性质采 用不同 方法, 如 需要金 属离子 激活的 水解酶 (如 DNase), 常加入 EDTA 或 
用柠 檬酸缓 冲液除 去溶液 中的某 些金属 离子, 使 酶的活 动受到 抑制。 对热 不稳定 的水解 
酶, 可 用热提 取法使 之失去 作用, 或根据 水解酶 的溶解 性质的 不同, 采 用不同 pH 值提取 
以减 少水解 酶释放 到提取 液中的 机会; 或选用 pH 范围使 酶活力 最低。 但 最有效 方法还 
是针对 性地加 人某些 抑制剂 ,以 抑制水 解酶的 活性。 核 糖核酸 酶是制 备完整 RNA 分子 
的最大 障碍, 在 长期研 究中已 发展了 许多特 殊抑制 剂对付 此醃。 例 如阴离 子去垢 剂十二 
院基橫 酸钠, 脱氧胆 酸纳, 萘 -1,5- 二磺 酸钠, 三异丙 基萘横 酸钠, 4- 氨基 水杨酸 纳等, 均 
已 被广泛 应用于 核酸的 提取。 另最近 还使用 了帛土 (Bmtonke, Al^CV ASiCVH/D), 肝素 
(Heparin), DEP (Diethyl-pyrocarbesate, 二乙基 焦碳酸 盐), 蛋白酶 K (该 酶最适 pH 7.5 〜 
12, 对热 稳定, 在很高 浓度的 SDS 和 尿素溶 液中仍 有很高 活性) 等多 种核酸 酶的抑 制剂, 
使 具有活 性的核 酸提取 纯化工 作获得 了很大 进歩。 

此外 提取各 种具有 活性的 蛋白质 或酶分 子时, 常 加人某 些蛋白 酶抑制 剂如苯 甲基磺 
酷 氟化物 (PMSF), 二 异丙基 氟磷酸 (DIFP 或 DFP), 碘乙 酸等。 但这 些抑制 剂在抑 
制 蛋白水 解酶的 同时, 也常抑 制其他 蛋白质 和酶的 活性, 使 用时必 须小心 选择。 一 般说, 
提 取蛋白 质时, 加 人蛋白 水解酶 的抑制 剂没有 象使用 核酸酶 抑制剂 在核酸 提取时 那样普 
遍和 迫切。 

4. 其他 一些特 殊要求 的保护 措施, 除前面 已提及 过种种 引起生 物大分 子变性 因素, 如 
紫 外光、 强烈 搅伴、 过酸 过碱、 高温、 冻结 等均避 免外。 某些 生物大 分子提 取时的 特殊要 
求, 如固氮 酶钼一 铁蛋白 ,提取 分离时 严格要 求无氧 条件下 进行, 以 及某些 对冷或 热敏感 
的 蛋白要 求一定 的温度 下操作 等均应 根据不 同具体 对象予 以不同 处理。 

第七节 各类物 质的提 取分离 

^ 一、 蛋 白质和 酶的提 取分离 

(一) 不同 结构的 蛋白质 及其溶 解性质 

蛋白 质按其 功能可 分为活 性蛋白 和非活 性蛋白 二类, 按 结构又 可分为 简单蛋 白和结 
合蛋白 二类; 再一种 分类法 是根据 蛋白质 的溶解 度差别 而分为 水溶性 蛋白, 醇溶 性蛋白 
等, 还有一 类硬蛋 白不溶 于水, 稀酸, 稀碱 和有机 溶剂, 遇强酸 、强碱 水解。 各类蛋 白质的 
溶解性 质见表 2 - 3。 

根据表 2-3 所 列各类 蛋白质 的溶解 性质, 可以看 出大部 份蛋白 质可溶 于水、 稀盐、 稀 
碱或稀 酸溶液 ,少数 与脂类 结合的 蛋白质 则溶于 乙醇、 丙酮、 丁醇 等有机 溶剂。 蛋 白质在 
• 30 . 



表 2-3 不同 结构的 蛋白质 及其溶 解性质 



蛋白 质类别 


溶 解性质 


间毕 ffi tJ / 贝 






干 7k 稀社, 稀秘, 稀? [^您 液* "^被 50% l^^faPt'S^St^^tfT.'-H 

ti& J /J\ /X, Tip Hl 5 Tip KSc ? Tip WW i-U" nX 5 *"M tPC /o l-gj th CX. Wll tlit T>C t/| LU o 


2. 球蛋白 




真 球蛋白 


一般 在等电 点不溶 于水, 但加 入少量 的盐、 酸、 碱则可 溶解。 


拟 球蛋白 


溶 于水, 可为 50% 饱和度 硫酸按 析出。 


么醉 溶蛋臼 


>v .3=1 *7 n fine/ 7 rh /□ -r* 工 -J/ TZ, ^ -,1/ 

溶卞 /U ― oU^ 醉中, 小 (^卞 Tic 反; t:7jC 乙醉 


4 <0 

L 分适曰 


任寺电 > ^小浴 卞 7K,tE 小浴丁 怖 欣, 合: T 怖阪, 怖嫩? ^欣。 


e A* JH 

,-精 


rn: -J/ as. 曰 -fv ^ -,u rh .W ; 
溶 t 水和 怖酸, ig/ 在怖 ® 水中饥 


6. 组蛋白 


溶 于水和 稀酸, 易在稀 氨水中 沉淀。 


硬 蛋白质 


不溶 于水, 盐, 稀酸, 稀緘 


结合 蛋白质 


此 类蛋白 质溶解 度性质 随蛋白 质与非 蛋白结 合部份 的不同 而异, 除 


(包括 碟蛋白 ,粘 蛋白, 糖蛋白 ,核 


脂蛋 白外, 一般 可溶于 稀酸, 稀碱 及盐溶 液中, 脂 蛋白如 脂质部 分露于 


蛋白, 脂蛋白 ,血红 蛋白, 金属 蛋白, 


夕卜, 则脂 溶性占 优势, 如脂 质部份 被包围 于分子 之中, 则水 溶性占 优势。 


黄素蛋 白等) 





不同溶 剂中的 溶解度 差别, 主要 取决于 蛋白质 分子中 极性基 团与非 极性基 团的比 例和这 
些 基团的 排列位 置及偶 极距, 因 此采用 不同溶 剂和调 整影响 蛋白质 溶解度 的外界 因素如 

温度、 PH 、离子 强度等 ,即 可把所 需的蛋 白质和 酶从细 胞内复 杂的组 份中提 取分离 出来。 

(二) 蛋白质 及酶的 一般提 取方法 

1. 水溶 液提取 凡能溶 于水、 稀盐、 稀酸或 稀碱的 蛋白质 或酶, 一般 都可用 稀盐溶 
液或 缓冲溶 液进行 提取。 稀盐溶 液和缓 冲溶液 有利于 稳定蛋 白质结 构和增 加蛋白 质溶解 
度。 加入 的提取 液的量 要适当 ,加入 量太少 提取不 完全, 加的 量太多 , 则不利 于浓缩 ,一般 
用量为 原材料 3 — 6 倍体积 左右, 可一 次提取 或分次 提取。 提取时 常缓慢 搅伴, 以 提高提 
取 效率。 以盐 溶液或 缓冲液 提取蛋 白质和 酶时, 常 综合考 虑下列 因素: 

(0 盐 浓度: 提 取蛋白 质的盐 浓度, 一般在 0.02 — 0.2M 的范 围内。 常用稀 盐溶液 
和缓 冲液有 0.02 — O.OSM 磷酸缓 冲液, 碳酸缓 冲液, ().09〜(U5M 氯化钠 溶液。 在 某些情 
况下, 也 用到较 高的盐 浓度, 如提取 脱氧核 糖核蛋 白及膜 蛋白。 有 时为了 螯合某 些金属 
离 子和解 离酶分 子与其 他分子 的静电 结合, 选 用柠檬 酸缓冲 液和焦 磷酸钠 缓冲液 可获得 
较好 效果。 故稀盐 溶液和 缓冲溶 液的浓 度及缓 冲液的 组份的 选择, 应根据 不同对 象及具 
体情况 而定。 有 时为了 破坏蛋 白质与 其他物 质的离 子键或 复键的 结合, 加 入少量 多价阴 
离子 也有助 于对这 些蛋白 质提取 分离。 总的 来说, 能 溶于水 溶液而 与细胞 颗粒结 合较松 
的 蛋白质 或醜, 在细 胞破碎 以后, 只要 选择适 当的盐 浓度和 pH 值, 一般是 不难提 取的。 

(2) pH: 蛋白 质和酶 所用的 提取液 pH 值 一般选 择在被 提取的 蛋白质 等电点 两侧的 
稳定 区内。 如细 胞色素 丙是一 碱性蛋 白质, 常 用稀酸 提取。 肌肉 甘油醒 -3- 碟酸脱 氢酶是 
—酸 性蛋 白质, 则用稀 碱提取 C 植物 组织中 的一些 酸性或 碱性蛋 白质常 分别用 0.1% — 
0.2% 的氢氧 化钾水 溶液或 1% 碳酸 钠溶液 提取。 在某些 情况下 ,为 了破坏 所分离 的蛋白 
质与其 他杂质 的静电 结合, 选 择偏酸 (pH3 — 6) 或偏碱 (pH 10—11) 提取, 可以 使离子 

. 31 « 



键破 坏而获 得单一 的蛋白 成份。 

(3) 温度: 蛋白质 和酶一 般都不 耐热, 所以 提取时 通常要 求低温 操作。 只有 对某些 
耐高温 的蛋白 质或歸 (如胃 蛋白醸 、酵母 醇脱氢 酶及某 些多肽 激素) 才在比 较高的 温度下 
提取, 使更有 利于和 其他不 耐热蛋 白质的 分离。 

2. 有机溶 剂提取 一些和 脂质结 合比较 牢固或 分子中 非极性 侧链较 多的蛋 白质和 
酶, 难溶 于水, 稀盐, 稀酸和 稀滅, 常用有 机溶剂 提取。 如丙酮 、异 丙醇、 乙醇、 正丁 醇等, 均 
可溶 于水或 部份溶 于水, 这 些溶剂 都同时 有亲脂 性和亲 水性。 其中 正丁醇 有较强 的亲脂 
性, 也有 一定亲 水性, 在 01 时于 水中有 10.5% 的溶 解度。 它在水 和脂分 子间起 着类似 
去污剂 的桥梁 作用, 在取代 蛋白质 与脂质 的结合 位置后 ,由于 丁醇与 蛋白质 极性基 团结合 
的竞争 力比脂 质大, 能阻止 脱落了 的脂质 重新与 蛋白质 结合。 使原 来蛋白 质在水 中溶解 
度大大 增加。 丁 醇在水 溶液及 各种生 物材料 中解离 脂蛋白 的能力 极强, 是 其他有 机溶剂 
所不 及的。 我国 生化工 作者曾 用此法 成功地 提取了 琥珀酸 脱氧酶 [ 6] , 对于 碱性磷 酸酯藤 
的提取 效果也 十分显 著^。 

有 些蛋白 质和酶 既溶于 稀酸、 稀碱, 又能 溶于一 定比例 的有机 溶剂。 在这样 的情况 
下, 采用 稀的有 机溶剂 提取常 常是为 防止水 解酶的 破坏, 并兼 有除杂 和提高 纯化效 果的作 
用。 现举 例说明 如下: 

如胰岛 素可溶 于稀酸 、稀碱 和稀醇 溶液, 但 针对组 织中共 存的糜 蛋白酶 对胰岛 素有极 
高的水 解活性 ,采用 68% 酒 精溶液 并用草 酸调至 pH2.5〜3.(), 这样 便能在 三方面 抑制了 
糜蛋 白酶的 活性: (1) 68% 酒精 可以使 糜蛋白 酶暂时 失活; (2) 草酸可 以除去 激活糜 
蛋白 酶的金 属离子 Ca++;(3) 选用 pH2.5〜3.() 是糜 蛋白酶 不适宜 作用的 pH 值。 而以 
上条件 对胰岛 素的溶 解度和 稳定性 并没有 影响, 并可 以除去 一部份 在稀醇 及酸性 溶液中 
不溶 解的杂 蛋白。 当然 胰岛素 的提取 现巳有 了新的 进展, 但上 面的设 计仍是 十分合 理的。 

又如 提取垂 体前叶 ACTH 常采 用酸性 70f 。丙 酮, 其设计 原理是 酸性可 以促进 ACTH 
的溶解 ,而 70% 浓度 丙酮对 ACTH 的溶解 度没有 影响, 却可 大幅度 地抑制 其他杂 蛋白的 
溶出, 对提高 分离纯 化的效 果极为 显著。 

3. 从细胞 膜上提 取水溶 性的蛋 白质和 酶方法 〔8] 膜上 的蛋白 质或酶 一般有 二种存 
在状态 ,一是 在膜表 面上, 与 膜成份 联系比 较松; 第二是 膜的内 在成份 之一, 或与膜 成份结 
合 较紧。 蛋白质 与膜成 份的结 合可通 过脂质 形成复 合物, 也 可以通 过金属 离子与 膜成份 
结合, 或与 膜其他 蛋白质 形成复 合物。 与膜成 份结合 较松的 蛋白质 或酶, 经 过充分 破碎细 
胞, 在一定 pH 范围 用稀盐 溶液即 可提取 分离。 如 线粒体 上的细 胞色素 C, 是与细 胞器结 
合较 松的一 个酶, 用 PH4.0 的酸 或等渗 KC1 溶液破 坏其与 膜成份 的静电 引力, 线粒体 
上的细 胞色素 C 即 解离转 到提取 液中。 但一 些与膜 成份结 合较牢 或属于 膜组成 的蛋白 
质, 提取 则比较 困难, 须用超 声波, 去污剂 或其他 比较强 烈的化 学处理 ,才能 从膜上 分离出 
来。 一般常 用方法 有如下 几种: 

(1) 浓盐 或尿素 等溶液 提取: 如 Naa04、 尿素、 胍 盐酸盐 等溶液 均有人 应用于 提取膜 
蛋白, 当以上 溶液浓 度达到 2M 时, 可抽去 27fe 以上的 膜蛋白 ,但 使用这 样条件 易引起 
蛋白质 和酶的 变性。 

(2) 碱溶液 提取: 碱性条 件也可 以解离 与膜上 成份结 合的蛋 白质。 在 pH8 — 11 范 
围内, 某 些膜蛋 白随着 pH 值 的提高 而溶解 度大大 增加, 至 pHll 时, 约有 40〜50fc 的 

. 32 . 



膜蛋白 被抽出 ,但 碱提取 法也容 易引起 蛋白质 和酶的 失活, 应用上 不广。 

(3) 加入 金属螯 合剂: 蛋白 质通过 金属离 子与膜 成份结 合时, 加人 金属螯 合剂如 
EDTA 可 使蛋白 质释放 出来。 用此法 曾成功 地提取 了膜上 ATP 酶的偶 联因子 I。 EDTA 
与超声 波联合 处理抽 提膜上 鱗酰转 移酶, 据报导 效果更 好 [9] 。 

(4) 有机溶 剂抽提 使用 乙醇、 吡啶、 叔 戊醇、 正丁醇 等溶剂 抽提及 用冷丙 酮做成 
丙 酮粉, 是提取 膜上与 脂质结 合的脂 蛋白或 膜内脂 蛋白组 份最常 用也较 有效的 方法, 其中 
叔 戊醇及 正丁醇 用于膜 内脂蛋 白效果 尤佳。 前已提 到正丁 醇可在 广泛的 PH 值 (pH 3 — 
10) 和温度 范围内 (一 2— + 40°C) 使用。 用 有机溶 剂结合 其他方 法已成 功地提 取了多 
种膜上 蛋白质 和酶, 如 NPDH 脱 氣酶, 琥珀酸 脱氢酶 ,细胞 色素氧 化酶, 碱 性磷酸 酯酶, 
胆碱脂 酶等。 

(5) 去垢剂 处理: 去 垢剂处 理是目 前广泛 应用于 提取膜 上水溶 性蛋白 和脂蛋 白的方 
法, 常用 的去垢 剂有弱 离子型 去垢剂 脱氧胆 酸盐, 胆 酸盐, 强 离子型 去垢剂 十二院 基磺酸 
钠 (SDS), 和非 离子型 去垢剂 Triton X-100 和 Tween、 Lubrol 和 Brij 等。 去垢剂 处理膜 
蛋白时 的浓度 通常为 1 左右, 用 此法提 取的膜 蛋白和 酶有细 胞色素 b5、 胆碱 脂酶、 细胞 
色素氧 化酶、 DPNH 氧 化酶、 ADP/ATP 载体蛋 白等。 Klingenberg 认为用 去:^ 剂分离 
膜蛋 白时, 选 择去垢 剂首先 考虑: (1) 去垢剂 的溶解 能力; (2) 去话 剂的温 和性。 强离 
子 型去: ^ 剂 (如 SDS) —般 具有很 好溶解 能力, 但温和 情况不 理想, 容易 引起蛋 白质变 
性。 |1 离子型 或非离 子型去 剂对蛋 白质变 性影响 较小, 而 溶解能 力差。 去垢剂 的溶解 
能力与 溶液的 离子强 度大小 有关。 一般 来说, 离 子强度 增加, 去垢剂 的溶解 能力也 随之增 
大。 所以 使用去 垢剂溶 解膜蛋 白时, 须考 虑各种 条件。 根据 Klingenberg 等的 经验, 分离 
线 粒体膜 ADP/ATP 载体 蛋白, 选用 Triton X100 比用 Lubrol, Brij 和 Aminoxide 等去 
泪 剂效果 较好, 所得 ADP/ATP 载体 蛋白具 有较高 的天然 活性。 但主要 缺点是 Triton 
xlOO 在 280nrn 处有强 的紫外 吸收, 干扰 用紫外 法测定 蛋白质 的含量 [ ii ] 。 

脱氧 胆酸盐 和胆酸 盐也常 用提取 细胞色 素系统 的酶和 线粒体 膜上的 ATP 醯" 3 ], 最 
近 我国尤 美莲等 比较了 Triton XlOO- 胆酸和 脱氧胆 酸-胆 酸对猪 心线粒 体内膜 H+- ATP 
酶复合 体的分 离效果 ,结 果表明 Triton XlOO- 胆酸 盐法, 操作 简便产 率高, 重复 性好, 而脱 
氧胆酸 -胆酸 盐法, 操作较 繁琐, 脱氧胆 酸对酶 活性影 响较大 "2 ] 。 

另有报 导使用 去招剂 ,再加 上温和 条件的 超声波 处理使 细胞结 构松散 开来, 可 提高膜 
蛋 白的提 取率。 

(6) 加人酯 酶或鱗 酸酯酶 水解蛋 白质- 脂质复 合物, 也 是一个 有用的 方法: 其 中蛇毒 
中提 取的碑 酸脂酶 A 主要 作用于 磷脂, 最适 pH 为 6 — 8。 从胰 脏中提 取的酯 酶作用 于单、 
二、 三甘 油酯, 酶作 用最适 pH 为 7 — 8。 酯 酶和碟 酸酯酶 均需要 Ca2+ 所 激活。 用酶 
法 处理提 取的膜 蛋白及 酶有细 胞色素 C, « -磯酸 甘油脱 氢酶, TPNH- 细 胞色素 C 还原酶 

等。 

(三) 蛋白 质和酶 提取后 的进一 步纯化 

蛋白质 和酶从 细胞内 提取出 来后, 仍处于 十分混 杂的体 系中, 必须 进一步 纯化。 但经 
过提取 除去了 大量与 制备物 理化性 质差别 较大的 杂质, 只剩 余与制 备物理 化性质 大致相 
近或 类似的 物质。 因此, 经过 有选择 性的提 取这一 歩骤, 对以 后纯化 工作创 造十分 有利条 

• 33 . 



血型 专一性 




+ 


u 

•J, 














< 












D- 半乳糖 


D- 半乳糖 
D-GalNAC 


Gal/3(1 -* 3) - gal NAC 

D- 半乳糖 


D- 葡萄糖 
D- 甘露糖 


D- 半乳糖 


甲 壳寡糖 »GlcNAC 


甲 壳寡糖 


D-GalNAC 




< <: 

z z 
a 

QQ 


D- 甘露糖 
D - 葡萄糖 


D- 甘露糖 

D -葡 萄糖 




NeuNAC, NeuNAC - Ga, 
D- 葡 糖酸酸 -L- 艾 杜糖^ 
酸 (2:1) 聚合体 


亚基数 








卞 














iia 
•inn 

tH^ 


CM 






屮 


有毒 65,000 
无毒 120,000 


000*82 


OOO'OII 


g 
CD 

s 


000*031 


29,000 (凝胶 过滤) 
20,000(PAGE) 




CD 
CD 





000*6/ 


CD 








OOD'OOi^ 


m 
被 


NaCl 溶 液抽提 (NH4)2SC^ 沉淀, Sepharose 亲 和层析 


NaCl 溶液 抽提, DEAE- 纤 维素, Sephadex G-100, 碟 酸纤维 素色谱 


NaCI 溶 液抽提 (NH》2SO, 沉淀, Sepharose-ff 氣基 乙醜- /3- 半 乳糖胺 
亲和 层析, 半乳 糖洗脱 


NaCl 溶 液抽提 沉淀, Sephadex G-50 亲和 层析, 葡萄糖 
或低 pH 缓冲 液洗脱 


Sepharose 亲和 层析, 乳 糖洗脱 


含苏 糖醇的 冰冷的 PBS 抽提, (NH,)2SO, 沉淀, Sepharose- 甲 壳三糖 
亲和 层析, O.lAf 乙 酸洗脱 


PBS 抽提, 丙 酮分级 沉淀, Sepharose- 胎蛋白 亲和层 析,' GlcNAC 洗脱 


乙醇 沉淀, 或 聚亮氨 銑-猪 A+H 血型 物质亲 和层析 


水 抽提, (NHO^SO, 沉淀, 对乙醇 透析, 碟酸 柱和 DEAE- 纤维 素柱色 
1 谱或 NaCl 溶液 抽提, (NH,),SC^ 沉淀, Sepharose- 半乳 糖亲和 层析半 

乳 糖洗脱 - 


NaCl 溶液 抽提, 聚亮氨 酰-猪 A + H 血型物 质亲和 层析, GalNAC 洗脱 


(NHO.SO, 分级 沉淀, DEAE- 纤 维素, CM- 纤维素 柱层析 


Sephadex G-100 亲 和层析 DEAE- 纤维 素层析 


NaCl 溶液 抽提, DF.AE- 纤 维素柱 层析, Sephadex 亲和 层析, 葡萄糖 
洗脱 


超 离心, 淀 粉区带 电泳, Sephadex G-200 过滤, Ultragel A-4- 牛 颌下腺 

粘 蛋白亲 和层析 


凝集 素名称 及来源 


相 思豆素 
(^Abrtis pecatorius') 




花生 PNA 
(^Arachis hypo%aea) 


刀豆 ConA 
(^Coneanavalta ensifomis') 


菽麻麻 (也 称印 度麻) 




曼陀罗 
{Datura stramoniurn) 


双 花扁豆 DHL 
(^Dolichos /'ijlostis') 


大豆 SBA 
(^Glycine max') 


蜗牛 HP 
(Helix pomatia') 


卿 R 
"S 
-J 


草 香豌豆 
(^Lathyrtis sativiis') 


扁豆 LCA 
(^Lens cidinaris') 


dl 冪 



X 






U 


< 












H + V 




X 


< 


Z 




L- 岩藻糖 


(GlcNAC) ! 


1)- 半乳塘 


D-GIcNAC 


< 

z 
c 

Q 


O 

z 
o 

Q 


D- 甘露糖 
D- 葡萄塘 


D- 半乳塘 

D-GalNAC> 半乳糖 


具有 D- 半乳 糖末和 a "露 
糖内核 的寡糖 


z z 
o o 

QQ 


D- 半乳糖 
D-GalNAC 


D-Glc Nc, NANA 


UEA. L- 岩藻糖 
UF.A,, 甲 壳二糖 


< 

Z 

U 

1 

Q 


N- 型红血 球的主 要糖蛋 
白, 酷 蛋白, 糖肽, 额 下腺蛋 
白 


D-Gal NAC 甲 壳二糖 


•T CVI 




CM 




























OOO'ZII -D 
000*85 'H 

ooo'ozi -v 


84,000 或 63,000 


o 

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o o 

ro r、 

X s 


I'BS 抽提, Sepharose- 岩 藻亲和 层析, 岩藻 糖洗脱 


汁 +(NH02SO, 沉淀, 胰醉处 理的人 B 型血球 吸附, GlcNAC 寡糖解 
My Scphadex G-200 层析, 或 聚亮氨 銑-猪 A + H 血型物 质亲和 层析. 


PBS 抽提, (NH,),SO, 沉淀, Sepharose 4B 亲和 层析, 0.2A/ 半乳糖 

洗脱 


(NHOaSO,, 沉淀, Sepharose 化-卵 粘蛋白 层析, CM- 纤维 索层析 


NaCl 溶液 抽提, (NH4)2S04 沉淀, 聚 亮氛銑 -A 血型物 质亲和 层析、 
D-GalNAC 洗脱 


SF.-Sephadex 层析, Sephadex G-150 凝胶 过滤, 碑酸 纤维素 层析或 
Sepharose- 甲状 腺球蛋 白亲和 层析, 甘氨酸 -HCl 洗脱 


(NH,),SO, 沉淀, Scphadex G-150 亲和 层析, 甘氛酸 -HCl 洗脱, 或葡 

萄糖 或甘露 糖洗脱 


(^^H,).SO, 沉淀, 琼脂 糖亲和 g 析, 半乳糖 或乳糖 洗脱, Sephadex G- 
2UU 或 G-150 凝胶 过滤, 分为 RCAi 和 RCAii 


PBS 抽提, (NHU),SC^ 沉淀, DEAF.- 纤 维素和 CM- 纤维 素层析 


NaAc 缓冲液 抽提, (NH,),SO, 沉淀, DF.AE- 纤 维素, CM- 纤 维素层 
析, Sephadcx G-lOO 过滤, SP-Sephadex 层析 


PBS 抽提, 乙醇 沉淀, 聚亮氨 酰-猪 胃粘蛋 白亲和 层析, 半乳 糖洗脱 


卵粘蛋 白亲和 层析, O.lWHCl 洗脱, 或 甲壳聚 糖亲和 层析, 0.05WHC1 

洗脱等 


NaCl 溶液 抽提, (NHJiSO, 沉淀, UEA,, CM- 纤维素 Sephadex G- 
200, Biogel P- 200 层析, 淀粉 凝胶, 岩藻 糖亲和 层析, 甘氨酸 -HC1 洗脱, 
UHA,,, DEAE- 纤维素 层析、 电泳, Uiogel P-200 层 析淀粉 凝胶— 甲壳三 
糖亲和 层析, 甘氨酸 - HC1 洗脱 


NaCl-Tris 抽提, NaAC 沉淀去 杂质, Sephadex G-lOO 层析, 或 
Sepharose-A 血型 物质亲 和层析 


碟酸 缓冲液 抽提, (NH,)2SO_^ 沉淀, DEAE- 纤维素 层析, Sephadex 
G-150 凝 胶过滤 


NaCl 溶液 抽提, (NHOaSO, 沉淀, SE-Sephadex 层析, Sepharose 6 13 

过滤 






v> .2 

1^ 

1 


米胚 RGL 


利马 S PL A 
(^Phasroltis It men sis 
或 P. lunattis^ 


菜 SPHA (亦称 植物血 凝素) 
(_Phaseohis vulgaris^ 


碗豆 PSL 
(Pi sum sativiini) 


苗麻 RCA 
(^Riciniis communis') 


刺 槐 
hlock. loeiist) 


马铃薯 
(_Solantim tuberosum) 


m 


麦胚 WGA 
(Triticum vulgaris^ 


vjn 麵 


草 藤 
(yicia cracca') 


(^I'icia '^raniinea') 


多 花紫藤 WFH QWiftarta 
jlribunda var. macrohotrys) 



件。 蛋白质 和酶溶 剂提取 后进一 步分离 纯化常 用方法 有如下 几种: 

(1) 选 择性变 性除去 杂质; 

(2) 分段盐 析及有 机溶剂 沉淀; 

(3) 吸 附色谱 分离; 

(4) 多糖基 离子交 换色谱 分离; ' 

(5) 凝 胶过滤 分离; 

(6) 亲 和色谱 分离; 

(7) 制备 超离心 分离; 

(8) 其他方 法分离 纯化以 及后期 结晶纯 化等。 

由于各 类蛋白 质和酶 从细胞 中提取 分离后 进一歩 纯化的 方法选 择及操 作步骤 繁简都 
不相同 ,很难 作统一 规程。 但对 于同一 类的蛋 白质, 在提 取分离 上仍有 许多共 同点。 例如 
病毒的 提取分 离常分 为三歩 [ 1 3 '" ] 。 

1. 病毒 的提取 病毒寄 主细胞 经过物 理或机 械方法 破碎后 ,常用 中性缓 冲液在 4^ 
左右 提取, 大 多数病 毒在这 一条件 下比较 稳定, pH 7.0, O.IM 磯酸缓 冲液, 0.5M, PH6.5 
柠檬 酸缓冲 液使用 较多。 在提取 中为了 消除对 病毒某 些有害 物质, 还常加 入一些 还原剂 
(亚硫 酸钠, 巯基乙 醇等) 以 抑制多 酚氧化 酶活力 或加入 一定量 EDTA 除去 CU++ 使多 
酚氧化 酶不起 作用。 另加人 EDTA 除去 Ca++ 和 Mg++ 还 可以使 混在提 取液中 的核糖 
体降解 以便于 除去。 

2. 净化 提取液 粗提取 液中, 除 含有病 毒外, 还包 括有大 量细胞 碎片, 每种 各样的 
大分 子和颗 粒必须 除去。 常用方 法有: 3000 — 10,0()()g 低速 离心, 除去一 些细胞 碎片, 细 
胞核、 线 粒体、 叶绿体 等大的 颗粒, 加入 皂土、 活 性炭 吸附除 去色素 及一些 非病毒 蛋白组 
份, 用有机 溶剂如 氯仿、 丁醇、 乙醇等 使寄主 蛋白质 变性, 但对 含脂质 外膜的 病毒应 避免使 
用, 将提取 液反复 冻融或 50 — 60°C 加热 5 — 10 分钟, 使杂蛋 白质变 性或凝 聚再通 过低速 
离心 除去。 

3. 从净化 后提取 液中进 一步纯 化病毒 除去了 大部份 色素和 寄主蛋 白质、 细胞碎 

片以后 ,常选 择如下 一些方 法进一 步纯化 病毒: 

(1) 聚 乙二醇 (PEG 6000、 12000) 或 硫酸按 沉淀: 植物病 毒一般 使用硫 酸铁为 
1/3 饱 和度, 如使用 PEG 6000 其 浓度为 6% 左右 (另加 3f 。的 NaCl)。 

(2) 差速离 心和超 离心: 差 速离心 先除去 一些与 病毒颗 粒质量 悬殊的 组份, 然后在 
40,000-100,000g 下离心 1 一 2 小时, 把病毒 沉下, 如 此反复 数次, 即得到 较纯的 病毒。 

(3) 色谱 分离: Sepharose 2B, Sephadex G 200, DEAE 纤 维素, CM 纤 维素, 磷酸钙 
凝 胶等均 可用于 病毒的 纯化, 上柱与 洗脱与 一般蛋 白质分 离基本 相同。 

又例如 凝集素 (lectin) 是一类 能使红 细胞凝 集的蛋 白质, 广泛 分布于 植物及 部分低 
等 动物、 哺乳动 物和病 毒中, 现已 查明凝 集素近 千种, 绝 大多数 与糖分 子共价 结合。 这 
上千种 不同凝 集素分 离一般 都是生 理盐水 或缓冲 液提取 (脂质 多的材 料需事 先脱脂 ), 提 
取后比 较老的 工艺流 程是硫 酸铁分 级沉淀 (或乙 醇分级 沉淀) ,离 子交换 色谱, 分子 筛凝狡 
过滤 , 超离 心等。 目 前新的 工艺主 要是采 用亲合 色谱法 , 提取 后含凝 集素的 混合液 直接上 
Sepharose 或 Sephadex 柱, 或者 通过固 定化配 体的亲 合柱而 纯化, 配体 包括糖 蛋白、 糖肽、 
单糖、 双糖 及其衍 生物。 一 些凝集 素的提 取分离 纯化方 法见表 2 - 4。 
• 36 • 



二、 核 酸的提 取分离 



(一) 不 同种类 的核酸 及其溶 解性质 

核 酸分为 DNA 和 RNA 两 大类。 DNA 主要存 在于细 胞核内 ,核内 DNA 占整个 
细胞 DNA 量的 90% 以上, 核外的 DNA 主要有 线粒体 DNA (或 植物 叶绿体 DNA) 
和质粒 DNA。 RNA 主 要存在 于细胞 装中, 其中微 粒体中 RNA 约 占细胞 RNA 总量 
50%, 细 胞液中 RNA 约 占总量 30f 。,其 余便在 核仁, 线粒 体及其 他细胞 器中。 核酸是 
两性化 合物, 有 一定等 电点, 能与金 属结合 成盐, 又能与 碱性物 质结合 形成复 合物。 在核 
酸大分 子中, 由于磯 酸基的 酸性和 嘌呤、 嘧啶基 的碱性 比较, 酸性占 优势, 故 其水溶 液呈酸 
性。 不论 DNA 或 RNA 都能溶 于水, 而不溶 于乙醇 等有机 溶剂。 

DNA 和 RNA 在细 胞中常 与蛋白 质结合 存在。 这种蛋 白质- 核 酸复合 物是细 胞结构 
的 组成部 份之一 C 根 据蛋白 质与核 酸结合 的不同 可分为 三种类 型的核 蛋白: (1) 核精蛋 
白 —— 核酸 与精蛋 白结合 而成, 最初 发现于 动物精 子中; (2) 核 组蛋白 —— 核酸 与组蛋 
白结合 而成, 常存在 于细胞 核中; (3) —般核 蛋白。 在这 类核蛋 白中, 核 酸结合 的蛋白 
质大 部份是 非碱性 蛋白, 还有些 细胞装 中的核 蛋白是 核酸与 脂蛋白 结合在 一起。 因此, 细 
胞破 碎后提 取分离 核酸, 首先 遇到的 问题是 如何把 核蛋白 与其他 蛋白质 分幵, 然后 才进一 
步把 核酸和 蛋白质 拆离。 故最早 提取分 离核酸 方法是 在以蛋 白质提 取分离 原理为 基础上 
进 行的。 人 们根据 DNA- 核 蛋白和 RNA_ 核蛋白 溶解度 的研究 发现, 在 氯化钠 浓度为 
0.14M 时, 脱氧 核糖核 酸蛋白 的溶解 度仅为 水中的 1/100, 当 氯化钠 浓度增 加时, 脱氧核 
糖核蛋 白的溶 解度逐 渐增加 ,氯 化钠浓 度增至 lA^, 时, 脱氧核 糖核蛋 白溶解 度比水 中大二 
倍。 而 核糖核 蛋白在 0.14M 氯化钠 浓度时 仍有相 当大溶 解度。 而当 氯化钠 浓度增 大时, 
溶解度 又相对 减少。 因此早 期常用 0.14M 氯化 钠提取 核糖核 蛋白, 此时 脱氧核 糖核蛋 
白溶解 度极少 ,从而 与核糖 核蛋白 分开。 反之提 取脱氧 核糖核 蛋白时 ,则用 1M 浓 度氯化 
钠 溶液。 由于各 类核酸 在细胞 内分布 不同, 有时可 事先将 各部份 细胞器 分开, 然后 在不同 
细胞 器提取 所需的 DNA- 蛋白或 RNA- 蛋白, 再进 一步把 核酸与 蛋白质 分离。 这常 称为二 
步法。 近年来 ,由于 分子生 物学的 发展, 核酸 制备技 术突飞 猛进, 二 歩法提 取核酸 由于操 
作时间 过长, 核酸降 解比较 严重, 现多 采取一 歩法, 即细胞 破碎后 ,用 苯酷一 歩提取 核酸并 
同时 除去蛋 白质, 中间 不用把 核蛋白 分离。 当然 近年来 核酸提 取工作 最大的 进步, 还在于 
克 服核酸 的降解 作用以 及采取 了比较 高效而 又十分 温和的 方法除 去所结 合的蛋 白质。 因 
而所获 得的核 酸分子 较大, 活性 较高。 这里为 了叙述 上方便 和系统 起见, 仍 按核蛋 白及核 
酸的 提取分 别予以 介绍: 

(二) 提 取方法 

1. 脱 氧核糖 核蛋白 的提取 [ " ] 提 取完整 的脱氧 核糖核 蛋白常 用方法 有低离 子强度 

盐溶液 提取和 高盐浓 度溶液 提取, 对于细 菌的脱 氧核糖 核蛋白 则多用 缓冲液 提取。 低离 
子 强度溶 液提取 的优点 是避免 核蛋白 暴露于 高盐浓 度中, 引起蛋 白质和 核酸的 分解, 但低 
离子 强度溶 液不能 抑制核 酸酶的 作用, 常 需加入 酶的抑 制剂。 低盐 溶液提 取法, 大 致过程 
如下: 

• 37 • 



组织与 O.IM NaCI 和 0.05A/ 佇檬 酸纳在 pH 7 匀拔, 破碎细 胞后, 2000Xg 离心。 
然后用 蒸溜水 洗涤沉 淀三次 (用 0.004A/ NaHC03 调 pH 至 7 ), 除 去电解 质后所 得粘稠 
沉淀与 蒸溜水 混合摇 动提取 ,并放 置过夜 ,次日 离心后 ,取上 清液, 用 0.l4MNaCl 沉淀即 
得脱氧 核糖核 蛋白。 

高盐 浓度溶 液提取 法则在 第一步 0.14M NaCl 和 0.05M 柠檬酸 钠破碎 细胞, 所得 
沉淀离 心后, 沉淀用 5 的 NaCl 抽提, 抽 提液再 加水至 0.15M 的 NaCl 浓度, 使脱氧 
核糖 核蛋白 沉淀。 

2. 核糖 核蛋白 的提取 核 糖核蛋 白的提 取最常 用的方 法是以 0.14A^ 氯化钠 抽提, 

此 时核糖 核蛋白 是可溶 性的, 而脱氧 核糖核 蛋白留 于细胞 固体组 份或沉 淀中。 离心后 ,上 
清液用 乙酸调 pH 至 4 一 5 之间, 核糖 核蛋白 被沉淀 下来, 即 得包括 tRNA 蛋白在 内的各 
种核糖 核蛋白 沉淀。 此外, 提取细 胞质中 的核糖 核蛋白 及植物 病毒中 核糖核 蛋白, 有时也 
采用分 歩差速 离心法 和硫酸 铁分歩 盐析法 ,其 原理与 操作与 一般盐 析法及 离心法 相同。 

3. DNA —般提 取方法 从 DNA- 蛋 白中提 取分离 DNA ,是 解离 DNA 与蛋白 
质结合 ,使 DNA 释出的 过程, 饱和 氯化钠 溶液、 高浓 度高氯 酸盐、 氯仿、 阴 离子去 污剂、 
苯酚等 均可使 DNA 与 蛋白质 解离。 饱和氯 化钠法 由于提 取时间 很长及 蛋白质 沉淀不 
完全, 实际 上应用 很少。 用 5M NaC104 解离 DNA- 蛋白, 然后在 30% 蔗 糖中超 离心分 
离 DNA 与蛋 白质, 在提 取某些 噬菌体 DNA 是成功 的""。 但 应用最 广泛的 还是氯 仿法、 
去污剂 法和苯 酚法。 现分 别介绍 如下: 

(1) 氯 仿法: 氯仿法 提取核 酸最早 的是由 Sevag 等人于 1938 年首 先提出 [ 18 】 , 其方 
法主 要过程 如下: 

培养 18 小时的 Streptococcus, p. 的菌 体悬? 享液, 经 超声波 破碎细 胞后, 离心, 取上清 
液, 用 (UN HC1 沉淀 上清液 中的核 蛋白, 再离心 取沉淀 ,溶于 水中, 调节 pH7.() 离心。 
上 清液用 等体积 95% 乙醇 处理, 离心 除去不 溶物。 加入 0.1N HC1 至核蛋 白沉淀 ,再离 
心, 沉淀以 95% 乙 醇洗漆 二次, 后将沉 淀溶于 水中, 调 pH7.() 滤除不 溶物。 然 后添加 
0.5%Na3CO5, 于 50 — 55°C 水浴 加热, 1 一 2 小时。 冷 却离心 取上清 液并调 pH 7.0, 加 
人 0.25 体积 氯仿和 0.1 体积 戊醇, 振荡 60 分钟。 离心后 ,上层 为水层 (含核 酸), 下 层为蛋 
白 质胶状 物和氯 仿层。 

Sevag 的氯仿 法提取 的核酸 ,含有 DNA 和 RNA 二种 成份, 加热和 HC1 都能 
使 核酸产 生降解 现象, 但其 优点是 除蛋白 质比较 完全, 故 一直为 人们所 重视。 1946 年 
Mccarty 和 Arery 对此法 进行了 改良" ",主 要用 0.1M NaCl 和 O.lM 柠檬 酸钠和 去氧胆 
酸钠破 碎细菌 细胞, 从而 抑制了 核酸酶 活性。 另外 还加入 RNase 消化 RNA, 用 Ca++ 
除多糖 ,使 氯仿法 逐渐趋 成熟。 以后又 经多人 改进, 直至 1961 年, Marmur 总结 了用氣 
仿 法提取 50 多 种细菌 核酸的 经验, 此法才 逐渐被 广泛应 用 【 2«。 Marmur 法 主要步 骤包括 
用含有 EDTA 溶液洗 漆细菌 ~ > 用十二 院基横 酸纳和 溶菌酶 破碎细 胞一— 加人 过氯酸 
钠至 1M 浓 度分离 蛋白质 和核酸 一" > 以等 体积氯 仿一戊 醇振荡 30 分钟 一" ^吸取 水层加 
两 倍体积 乙醇沉 淀核酸 一" > 沉淀再 溶于柠 檬酸盐 溶液中 ,反 复以氣 仿一戊 醇振荡 提取, 直 
至除净 蛋白质 一" ^加 人核 糖核酸 酶消化 RNA "~ ^最 后在含 有柠檬 酸盐和 EDTA 的溶液 
中, 滴加 0.54 体积的 异丙醇 或乙醇 以沉淀 DNA。 目前 氯仿法 除应用 于细菌 DNA 提取 
外, 植物 和动物 组织也 常应用 此法。 当然 许多具 体细节 上巳有 了改进 [ 1 7 ,21 ] , 但基本 原理及 
• 38 • 



过程和 marmur 报 告大致 上是相 同的。 

(2) 去污 剂法: 去污 剂法早 在三十 年代已 经有人 提出, 但直到 1951 年 以前此 法并无 
太大 进展。 1952 年, Key 等人对 此法作 了详细 的介绍 [ 22 ], 才 逐渐被 人们所 重视。 1957 年 
Zamenhof 报 道在动 物组织 中制备 DNA 时, 使用 0.1A/ 柠 檬酸纳 (或 0.1M EDTA) 充 
分洗 漆组织 及破碎 细胞, 然后以 1M NaCl 抽提, 乙醇沉 淀后, 所得 的核蛋 白在标 准缓冲 
液 (0.14Af NaCl + O.OIM 拧檬 酸钠) 中加入 乙醇- 十二 院基礎 酸钠混 合液, 搅 拌使核 
蛋白 解聚。 在解 聚后的 DNA 和蛋 白质溶 液中加 入固体 NaCl, 使最终 浓度为 5 % ,沉淀 
蛋白 质及去 污剂, 离心 后的上 清液, 再以乙 醇沉淀 DNA, 反 复在标 准缓冲 液中以 去污剂 
去 蛋白, 最后得 到具有 活性的 DNA 产品, 以上方 法已应 用于小 牛胸腺 、脾脏 、鸡 的红血 
球等 材料的 DNA 提取分 离 [ 231。 许多去 污剂都 具有溶 解细胞 ,使 蛋白质 和核酸 解离, 抑制 
核 酸酶的 活性, 调节 各类核 酸在酚 相及水 相的溶 解度等 作用。 常用 的去污 剂有十 二烧基 
橫酸钠 (SDS), 十 二院基 硫酸锂 (LDS), 脱氧胆 酸钠, 4- 氨基水 杨酸, 三异 丙基磺 酸钠, 萘- 
1,5 二横 酸钠, 二甲 苯横酸 钠等。 实 际上, 目前 单独使 用去污 剂法提 取分离 核酸, 除超离 
心法外 [如 提取 噬菌体 (G) DNA —— 以 5 % 浓度 SDS— O.IM EDTA 提取, 于 CsCl 中 
超离 心分离 DNA]。 一般 多和苯 酚法、 氯 仿法或 其他方 法结合 使用。 如用 苯船抽 提核酸 
时, 水相为 RNA 和 多糖, DNA 和蛋白 质留在 酚层或 两相交 界处, 但在 1 %SDS 或 6 % 
的对 氨基水 杨酸存 在下, 可将 DNA 和 RNA 同时提 到水相 (0.1 f。 的 SDS 只能将 RNA 
提到水 相)。 萘 -1,5 二 僙酸钠 与紛法 结合使 用时, 可将 tRNA、 rRNA 提到 水相, 而把 
DNA 和 mRNA 留在 酚层。 

(3) 苯!^ 法: 苯 法是近 年来较 流行的 一种提 取核酸 方法。 早期由 Westphal 等人 
(1952) 用紛 和水混 合液处 理细菌 分离多 糖时, 发现多 糖和核 酸留于 水相, 而蛋白 质溶于 ®} 
相。 1956 年 Kirby 用此法 提取了 RNA[2"。 接着 1957 年, Kirby 又将 此法作 了改进 [ 2 5〕 。 
方 法是: 鼠肝与 6 对氨 基水杨 酸做成 勾装, 然后用 90% 酚水 混合液 抽提, 使 DNA 与 
RNA 同时进 人水相 ,再用 2- 乙 氧基乙 醇沉淀 DNA。 DNA 与 RNA 的分 离采用 加人核 
糖核 酸酶降 解法。 多 糖的除 去采用 在浓磷 酸盐存 在下的 2- 甲氧 基乙醇 抽提法 (多 糖溶 
于下面 水相, DNA 溶于上 面有机 相)。 以后, Kirby 又对 法作了 多次改 进 [ 2 6 '2", 为 法 
提取 DNA 奠定了 基础。 苯酹法 可用于 RNA 和 DNA 的提取 ,由 于其溶 解蛋白 质能力 
强, 对 核酸酶 具有一 定抑制 作用, 并可 以不经 分离核 蛋白直 接从细 胞勾装 中提取 分离核 
酸, 抽提后 留在水 相残余 的酚很 易被乙 醚洗漆 除去, 以 及所获 得的核 酸分子 也较完 整等, 
故在 核酸提 取中是 一种比 较受人 欢迎的 方法。 

(4) DNA 提取 实例: DNA 提取分 离方法 文献资 料很多 ,很难 一一 介绍。 现 就上述 
几类主 要方法 ,现举 例说明 如下: 

例一, 豆胚芽 DNA 的提 取分离 [ 2": 豆 胚芽收 集后, 用蒸溜 水充分 洗净, 500 个豆胚 
轴加入 2 毫升 pH7. 5 的 0.5M NaCl (内含 0.1A/EDTA) 再加入 4 毫克 链丝菌 蛋白酶 
及 5 克 蔗糖。 研磨 破壁, 勾 楽溶于 50 毫升 ().5A/ NaCl — O.IM EDTA 溶液 (内含 5 毫升 
20%SDS) 中, 37t 保温 4 小时。 后加 入等量 氯仿- 异戊醇 ( 4 ():1) 混合 液振荡 30 分钟, 
10,000 转 / 分 下离心 10 分钟, 上清液 两次用 等量氯 仿-苯 §^(1:1) 混合液 振荡, 离心 取上面 
水相。 加人 等量乙 醇沉淀 DNA。 用玻棒 搅集后 再溶于 10 毫升 ().15MNaCl — O.OISM 柠 
檬酸三 钠溶液 (PH7.()) 中, 同时按 每毫升 2 微克及 0.006 微 克的量 分别加 人核糖 核酸酶 

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A 和 噬菌体 Ti 核糖核 酸酶, 37 力保温 60 分钟。 接着用 50 微克 / 毫升的 链丝菌 蛋白酶 
37°c 处理二 小时。 此 混合物 溶液再 用氯仿 一苯盼 (1:1) 反复 抽提, 除去 RNA 及蛋 白质, 
最 后用乙 醇沉淀 DNA。 

例二, 短小 芽孢杆 菌抗药 性质粒 PCJ 3 的分离 [29] : 3 7°C 振荡培 养的细 菌至对 数期。 收 
集菌体 ,以溶 菌酶及 SDS 先后 处理, 将破壁 裂解后 的粘稿 物加人 5MNaCl 至 浓度为 lA/, 
以沉淀 染色体 DNA。 置冰箱 过夜, 取出于 — 3°C 离心 (17,000 — 20,000g) — 小时, 取上 
清 液加入 lOA^g/ml 核 糖核酸 酷消除 RNA。 继加入 固体聚 乙二醇 (MW 6,000) 至 10% 
浓度 (W/V) 沉 淀质粒 DNA。 0— 3°C 放置 2 小时 以上, 离心 (eOOg) 2 分钟得 沉淀。 
将沉淀 悬浮于 40%(NH4)2SO4— 0.05M Tris-HCl (pH 8.0)— 0.05M NaCl— 5mM EDTA 
中, 离心 (3500 转 / 分 ) 10 分 钟除去 液面的 悬浮物 及聚乙 二醇和 下面的 蛋白质 沉淀。 将 
溶液以 50mM Tris— HC1 (pH 7.5)— 5mM EDTA— 5mM NaCl 低 温透析 过夜。 透析液 
用 酚抽提 三次后 再用氯 仿抽提 三次。 最后以 50mM Tris-HCl(pH 7.5)-20mM NaCl— 
lOmM MgCl3 透析 一次。 取 出用紫 外分光 光度计 测定含 量后置 4 °C 保存。 

所得 的质粒 DNA 经电镜 观察, 并依电 镜照片 用图形 数字转 换器测 定质粒 DNA 分 
子的 长度, 除以 放大倍 数得到 各个分 子实际 长度, 然 后从平 均长度 计算出 PCJ3 的 分子量 
4.33 X 106。 

[注] 本文 质粒分 离的主 要根据 下列文 献的方 法略加 修改: 

(1) Guerry, D. J. et al.: J. Bacteriol. 116: 1064, 1973 

(2) Hynipherys, G. O. et al.: Biochem. Biophys. Acta, 383: 457, 1975 

(3) Johnson, J. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm., 75: 13, 1977 

例三, 酵母 线粒体 DNA 的提 取分离 [3 °j: 酵 母原生 质体在 0.15M NaCl-2.5% SDS 
(pH7.0) 中 60t 保温 搅拝一 小时, 溶解后 加人氯 化钠至 1M 浓度, 在 冰浴中 过夜。 次日 
离心 后取上 清液, 加一 倍体积 95fc 乙醇 沉淀。 离心 分离, 沉淀再 溶解于 1M NaCl 溶液 
中, 如此反 复处理 数次。 然后用 15%SDS 和氯仿 处理去 除蛋白 ,再按 Bermardi 法 [3 1 ] , 上 
轻磷 灰石柱 (HA 柱) 进行 吸附, 洗脱后 可得两 个峰。 第一个 峰为核 DNA, 第二 个峰为 
线粒体 DNA。 

4. RNA 的 一般提 取方法 RNA 的提 取方法 一般有 酚法, 去污剂 法和盐 酸胍法 

等, 这些 方法都 可以用 来提取 具有生 物活性 的核糖 核酸。 此外, 工业 上还常 用稀碱 法和浓 
盐法提 取酵母 RNA [32] 。 用 稀緘法 和浓盐 法所提 取的核 酸均为 变性的 RNA, 主 要用作 
制备核 苷酸的 原料, 其工 艺比较 简单。 稀碱 法使用 1 % 氢氧化 钠使酵 母细胞 裂解, 使核酸 
稀放 出来。 然后 用盐酸 中和, 除去 菌体, 水溶 液中的 RNA 用酸调 PH2.5, 即沉 淀得核 
糖核酸 粗品。 浓盐 法是在 10f。 氯化 钠溶液 90°C 提取 3 — 4 小时, 然 后提取 液经离 心后以 
乙 醇沉淀 RNA。 下面 主要介 绍提取 具有生 物活性 RNA 的几种 方法: 

(1) 盐酸胍 法 [33] 用盐 酸胍提 取分离 RNA 是五十 年代提 出的, 早 期由于 各实验 
使用 盐酸胍 的浓度 不同, 所得到 RNA 分 子量大 小差别 较大, 后 来证明 4 M 盐酸 胍不仅 
可以使 蛋白质 变性而 与核酸 分离, 而且还 有效地 抑制了 核糖核 酸酶。 但 2 M 浓度 的盐酸 
胍则不 能很好 地抑制 RNase, 故所得 RNA 分子量 较低。 如 使用其 他抑制 剂配合 2 M 盐 
酸胍提 取分离 ,也可 以获得 较高分 子量的 RNA。 如 1959 年 Rdchmami 和 Stace-Smith 曾 
成 功地用 2.5M 盐 酸胍加 0.005M EDTA 提 取了土 豆病毒 X 中 具有感 染性的 RNA [ " ] 。 
盐酸 胍法也 可用于 DNA 的提取 ,如 Widndl 和 Tata 曾用 6M 盐 酸胍提 取大鼠 细胞核 

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中 DNA, 但具 体例子 不多。 总的 来说, 盐酸 胍是提 取分离 RNA 的一种 方法, 但 不如酚 

法 和去污 剂法效 果好, 故应用 不广。 

(2) 去垢 剂法: 去 垢剂不 仅广泛 应用于 DNA 的提取 ,也 普遍应 用于提 取各种 RNA。 

其中使 用最多 的是十 二烧基 横酸纳 (SDS) ,使 用浓度 范围为 0.5 — 2%, 早期 单独使 用此法 
提 取动物 组织的 RNA 和植物 病毒的 RNA 取得一 定成功 ,但 除去蛋 白质不 完全。 近年 
来多与 法、 氯仿法 、超 离心法 结合提 取不同 材料的 tRNA、 rRNA、 mRNA 获得 十分良 
好的 效果。 其中尤 以去污 剂-苯 法最受 欢迎, 其例 子将在 酷法中 介绍。 这 里简要 地提一 
提 Key 和 Dounce 【35] 以及 Fraenkel-Conm [36] 单 独使用 去污剂 提取动 物和植 物病毒 RNA 

的大致 过程: 

从动 物肝脏 中提取 RNA 的主 要过程 如下: 动物杀 死后, 尽快将 组织在 冰浴中 冷却, 
并在 0.9% NaCl (内含 0.01M 柠檬 酸钠) 溶液 中做成 勾装。 离心后 ,上 清液以 W HC1 
调 pH4.5, 离心 取沉淀 再溶于 0.9foNaCl 中。 加人 2 %SDS 溶液去 蛋白质 ,以 lOfoNaOH 
调 PH7.0 搅伴 3 小时。 后加人 NaCl 至 1A/ 浓度 抽提, 离心 后取上 清液, 用 2 倍 乙醇沉 
淀 RNA。 用 SDS 去蛋白 可反复 进行, 直至 RNA 达 到所需 纯度。 

从 烟草花 叶病毒 (TMV) 中提取 RNA 的主 要过程 如下: 将 4 体积 1 %TMV (内 
含 l(r 4 EDTA) 在 50=^} 及 pH8.5 下, 加入 SDS 使最终 浓度为 1 %。 搅拌 5 分钟, 冷却 
后, 以 33fc 饱和度 硫酸按 沉淀蛋 白质, 离心 后的上 清液于 冰箱中 过夜使 RNA 沉淀, 第二 
天离 心后, 再将沉 淀溶于 水中, 加 入几滴 pH5.(), 3M 醋酸缓 冲液, 并以二 倍体积 乙醇沉 
淀 RNA。 最后将 沉淀溶 于水中 ,用超 离心法 除去病 毒及凝 集物, 即得 RNA 水 溶液。 

(3) 苯 酷法: 苯 船法用 于提纯 RNA 先于 DNA, 现 仍是分 离提取 RNA 最 好的方 
法, 此 法可以 单独使 用或与 其他方 法结合 使用, 广泛用 于各种 RNA 的 提取。 根 据其使 
用条 件及与 其他方 法结合 情况可 分为冷 酚法、 热酚法 ,阜土 -酚法 、去垢 剂-酚 法等, 其中热 
酚法多 用于植 物组织 及病毒 RNA 的 提取, 主要由 于这些 材料细 胞壁及 外壳比 较坚硬 ,脂 
质较多 ,必须 升高酹 的提取 温度, 才能使 RNA 释放 出来。 阜土- 酚法和 去垢剂 -酚法 ,有 
利 于抑制 RNase 的作用 及解离 蛋白质 与核酸 的结合 ,使 蛋白质 变性而 除去。 各种 方法的 
综合使 用是目 前提取 核酸最 常用和 最有效 手段, 其原理 通常是 相互取 长补短 ,以便 获得更 
纯更完 整的核 酸分子 ,满足 分子生 物学对 核酸分 子结构 和功能 方面研 究越来 越高的 要求。 
由于 RI^A 般法提 取的应 用十分 广泛, 资料 甚多, 下面 简单地 介绍几 种以说 明此法 应用的 
大致 过程: 

(4) 酚 法提取 RNA 实例 

例一、 植 物组织 RNA 的提 取分离 [3": 新鲜植 物组织 在溶液 A (1 克 SDS 溶于 100 毫 
升 0.1M Tris 缓冲 液内含 5 X EDTA 和约 1 克阜 土并调 pH 7.4) 中。 加砂 (酸 

处 理过) 研磨 成勾莱 (不同 组织有 时须变 动破碎 细胞方 法)。 将 一倍体 积的酚 先预热 60 力, 
. 再倒 进组织 勾装, 维持 此温度 3 分 钟并不 断振荡 (某些 难提取 的植物 组织需 提高至 70<^ 
并延长 提取时 间)。 然 后迅速 冷却和 离心, 使悬浮 液分成 二相。 取出上 面水相 ,再 加人溶 
液 A 反复 抽提 酷层。 合并水 相后, 用 乙醚洗 数次, 除去水 相残余 的紛。 然 后以二 倍体积 
预冷的 95% 乙 醇沉淀 RNA。 

例二、 大肠 杆菌中 tRNA 的 提取: tRNA 分子 量小, 在 105,000g 离心 后常存 在于上 
清液 中而与 微粒体 的核蛋 白很易 分开, 故提取 方法早 在六十 年代已 解决, 现 已能十 分简便 



地 大规模 制备, 下 面主要 以大肠 杆菌中 tRNA 的提取 为例, 说明目 前常用 酷法的 基本过 

程。 

• 对数生 长期的 大肠杆 菌菌体 一" >破 壁船处 理去蛋 白质, 水 相以乙 醇沉淀 RNA 并除 
去低分 子量物 质和酚 一" ^沉 淀用 1A/ NaCl 抽提使 tRNA 和 大分子 RNA 分离 一" > 进一 
步提 纯用异 丙醇沉 淀或上 DEAE- 纤维素 进行吸 附分离 " 8] 。 每公 斤大肠 杆菌细 胞可得 
2 〜 2.5 克 tRNA。 

例三、 大 鼠肉瘤 -180 腹水 细胞肌 动蛋白 mRNA 的提 取分离 [ 3": 收 集感染 6—8 天 
后的大 鼠肉瘤 -180 腹水 细胞, 在完全 培养液 中培育 1 小时后 ,用 Trkonx-100 在低 离子强 
度 下破碎 细胞, 并以镇 盐沉淀 法从原 生质体 中分离 得聚核 糖体" ° ] 。 聚 核糖体 悬浮于 50mM 
KC1, ImM MgClj 和 50mM Tris-HCl (pH 7.6) 缓冲 液中, 于液 氮或一 85°C 处存 放后, 
按 Brawerman 法 [ " ] 在碱性 pH 下用 提 取分离 RNA。 酚 层再用 0.1M Tris-HCl (pH 
9.0) 抽提。 合并 水相, 再 用酚一 氯仿一 异戊醇 (1:1:0.1) 反复 抽提, 使二相 界面无 蛋白质 
为止, 取出 水相加 NaCl 至 O.U/ 及 2.5 倍体积 的乙醇 ,4°C 过夜。 次日离 心收集 沉淀, 
以 66f。 乙醇及 0.1A/ NaCl 洗漆。 用 乙醚除 乙醇, 再溶于 水中, 吹风除 乙醚, 所得 的聚核 
糖体 RNA 存 放于一 20°C 下, 待进一 步分离 mRNA。 

将上面 所得聚 核糖体 RNA 和 digo (dT)- 纤维素 在室温 中混合 (加人 500mM NaCl, 
5mM MgCU, 50mM Tris-HCl, pH 7.6 和 0.1%SDS), 吸附 30 分钟后 离心。 并用 上述缓 
冲 液洗漆 二次, 每次离 心后的 上清液 合并。 用 0.1M NaCl 和 2.5 倍乙 醇沉淀 Poly(A:r 
RNA。 然 后用水 连续地 洗下被 digo (dT) 所 吸附的 Poly(A)+RNA, 收集 后用上 述乙醇 
一盐 沉淀。 

Poly(A)-RNA 的 进一步 纯化, 可以用 3—30% 蔗糖 密度梯 度离心 (介 质中含 lOmA/ 
NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.1% SDS), 使用 Sw-27 Spinco 转子, 在 23,500 转 / 分 
下离心 17 小时, Pdy (A)-RNA 在 18S 处被 纯化。 

例四、 感染 的大肠 杆菌中 RNA 的提取 [ " ] : 

T4 感染 的细胞 4 毫升按 Hagon 和 Young 法加人 0.5 毫升 SDS 提取 缓冲液 (内含 
0.5M Tris, pH6.8 0.02M EDTA, 10% SDS) 在沸水 中加热 2 分钟, 破碎 细胞。 然后在 
提取液 中加入 醋酸钠 (PH5.2) 至最 后浓度 0.2M, 接着 用酚和 氯仿混 合溶剂 抽提, 离心 
后 取上层 水相, 以乙醇 沉淀。 离 心后收 集沉淀 再溶于 Tris- Mg++ (各为 ().01M,pH 7.0) 
缓冲 液中, 加入 DNase (用前 经碘代 乙酸盐 处理) 至最后 浓度为 每毫升 10 微克。 在 37t 
保温半 小时, 加人醋 酸钠至 0.2M, 再用 氯仿抽 提除去 DNase, 上层水 相用乙 醇沉淀 
RNAo 

(5) 其 他提取 具有生 物活性 RNA 方法: 除上述 几种外 ,还 有热处 理法, 曾用 于制备 
具有感 染性的 TMV-RNA [ " ] 。 氟碳化 合物法 ,曾 用于制 备某些 肿瘤细 胞中的 RNA 【 " 】 。因 
目 前应用 不广, 这里就 不再详 细举例 说明。 

核酸 的提取 分离、 纯化, 其技术 方法进 展极快 ,日新 月异, 不胜 枚举。 仅 就提取 或溶剂 
分离方 法来说 ,近 年来发 展特点 主要有 如下几 方面: 

第一、 分 离提取 方法更 趋简便 快速。 例如 1978 年 Dirnoboin 和 Doly 介绍一 种快速 
滅抽 提法分 离质粒 DNA, — 天之内 可提取 100 多个质 粒样品 ,只要 一个人 操作。 方法十 
分简单 ,将 培养的 大肠杆 菌用溶 菌酶破 壁后, 以 SDS- NaOH 处理 菌液使 pH 达 12〜12.5, 

• 42 • 



此时 染色体 DNA 变性 而质粒 DNA 不 变性, 再用高 浓度酸 性醋酸 钾一醋 酸中和 菌液, 
已变性 染色体 DNA、 大分子 RNA 和蛋 白质- SDS 复合物 均沉淀 下来, 离 心后上 清液用 
无 水乙醇 沉淀即 可获得 纯度很 高质粒 DNA, 有少量 RNA 可用 RNase 除去。 又 如分离 
噬菌体 DNA 时, 在离 心管底 层放置 5A^ NaClO,, 上层小 心铺盖 30% 蔗糖, 并加 入巳破 
碎 菌体。 由于 30% 庶糖层 只让噬 菌体通 过到达 管底, 遇到 5MNaC104 后, 噬 菌体内 DNA 
即释放 出来, 再经低 速离心 除去一 些杂质 碎片, 所得 DNA 失活少 且产率 很高。 此法只 
要有 超离心 设备, 几 分钟即 可把噬 菌体中 DNA 提取 出来。 

第二、 提取高 活性大 分子核 酸时, 条件要 求更加 温和, 实验设 计更加 合理。 在 操作上 
强调 温和, 对提 取大分 子核酸 (特 别是 DNA) 也是 近年来 技术改 革一个 方向。 例如, 为 
了避 免切力 作用, 尽量 不用吸 管和滴 管或改 用大口 吸管; 改 用缓冲 液而不 用酸碱 进行中 
和; 破 碎细胞 时要求 低温、 短时, 使用 高剂量 溶菌酶 等等, 都直 接关系 到所提 取的大 分子核 
酸 的活性 大小。 在 使用各 种溶剂 提取核 酸时, 条件 也越来 越具体 细致, 包括 各种缓 冲液、 
变性剂 、去 污剂和 核酸酶 的抑制 剂如何 搭配, 谁先 加谁后 加均极 讲究。 以其 中酷试 剂提取 
核酸 为例, 不同 PH 值, 不 同缓冲 液或试 剂饱和 ffi} 以及不 同摇荡 次数, 对各 种核酸 的提取 
其效 果差别 很大, 如 O.lfoSDS- 酷 提取, 只能将 RNA 提到 水相, 1%SDS- 酪提 取时, 可将 
DNA、 RNA 同时提 到水相 ;中 性酚无 法将含 有多聚 A 的 tnRNA 提到 水相, 但 pH 8.5 以 
上或 加人少 量氯仿 的盼, 即可把 mRNA 提到 水相; 用 Tris- HC1 饱和酚 提取细 菌质粒 
DNA, 剧 烈振摇 20 次以 上和轻 轻的上 下把试 管颠倒 三次, 被提取 的内含 物差别 很大, 前 
者包括 染色体 DNA、 质粒 DNA、RNA 和 蛋白质 全部被 提出, 后者只 有质粒 DNA 和少 
量小 分子内 含物被 提取。 

最后, 分离 提取阶 段防止 核酸酶 (主 要是 RNase) 的作用 仍是一 个棘手 问题。 由于 
RNase 很难 失活, 使制备 完整的 RNA 分子遇 到很大 困难, 如提取 大分子 rRNA 和 mRNA, 
常 常未纯 化就被 RNase 降解。 使用 过的抑 制剂如 SDS、 皇土、 肝素、 精胺、 核苷- 钒复合 
物、 蛋白酶 K、 Macaloid (一种 复合硅 酸盐) 和 二乙基 焦碳酸 (DEP) 等, 均未能 完全抑 
制 RNase 的 活力。 新的更 有效的 方法还 不断研 究中。 

以上主 要指核 酸的提 取方法 而言, 至 于核酸 提取后 的纯化 包括沉 淀法、 超离 心法、 各 
种色 谱法、 电泳法 、免疫 法和分 子杂交 法等, 其种类 之多、 内容 之广, 要 讨论其 发展方 [^及 
每一方 法具体 内容, 已超出 本书篇 幅范围 ,读者 可参阅 有关核 酸研究 文献。 但核酸 —— 作 
为生 化物质 中的一 大类, 此处从 历史到 现状把 不同类 型的核 酸提取 方法作 一简单 介绍, 并 
列 举一些 例子, 其目的 是使读 者了解 一些主 要核酸 提取方 法原理 ,并 不意味 着这些 例子是 

最 新的和 完满的 方法。 当然其 中不少 是很有 价值的 现在仍 有普遍 应用的 意义。 

5. 核酸提 取时注 意事项 及提取 后进一 步纯化 这里主 要指提 取具有 生物活 性的核 
酸 (包括 DNA 和 RNA) 都必须 注意如 下几个 问题: 

(1) 选用 的材料 必须要 新鲜, 材 料的预 处理不 要时间 太长。 

(2) 整个提 取分离 过程, 除 注明在 某一温 度下进 行外, 一般 均维持 — 4°C 中 进行操 
作。 但不同 材料和 不同方 法对温 度要求 的严格 程度也 不等。 

(3) pH 要适当 ,除特 别注明 在某步 骤需要 比较高 或低的 pH 值外, 一 般在中 性附近 
进行。 

(4) 避免强 烈的理 化因素 作用。 如局 部过酸 过碱、 过热, 以及强 烈机械 切力, 及剧烈 

• 43 . 



搅 拌等。 特别 对大分 子量的 DNA 或 mRNA 等的提 取尤须 注意。 

(5) 防止核 酸酶的 作用, 是十分 重要的 问题, 从 材料预 处理, 细 胞破碎 直至提 取分离 
纯 均注意 抑制核 酸酶的 作用。 

核酸 提取后 的纯化 工作, 由于各 类核酸 性质的 不同, 牵 涉的讨 论面比 较广。 除 和核酸 
相结 合的蛋 白质和 性质相 似的多 糖的分 离方法 大致相 同外, 不同种 类及不 同大小 的核酸 
的分离 仍是一 个十分 复杂的 问题, 如闭 合环状 DNA (质粒 DNA) 与 染色体 DNA 的分 

离, 主要根 据二者 变性的 难易。 采取 CsCl-EB (菲 啶溴红 种核酸 染料) 密 度梯度 

离 心法、 硝酸 纤维膜 吸附法 或聚乙 二醇沉 淀法、 聚乙 二醇一 葡萄糖 二相分 配法而 分离。 
mRNA 与其他 RNA 的分离 主要根 据真核 细胞中 mRNA 末 端常含 PolyA 顺序, 利 用这一 
特点, 而采取 Oligo(ciT) 纤 维素或 PolyU- 琼脂 糖特异 性吸附 mRNA 与其他 RNA 分子 分离, 
这是 一个十 分简便 和有效 方法。 但末 端没有 PolyA 顺序的 许多原 核組胞 mRNA 的 纯化, 
则不能 采取上 述方法 ,只能 用一般 比较繁 琐的分 子杂交 方法。 tRNA 由于 分子量 较小, 与 
其他 大分子 DNA、 RNA 的分离 ,方法 则比较 简单, 如用 1"0 甲 氧甲酚 (Cresol), 0.54 体积 
的异 丙醇, IMNaCl 或 43% 饱 和度硫 酸按均 可以沉 淀除去 DNA 及 RNA, 上清液 中回收 
tRNA。 除了 以上所 述一些 特殊方 法外, 许多带 有共性 的核酸 纯化方 法如梯 度超离 心法, 
分子杂 交法, 柱层 析法, 琼 脂糖凝 胶电泳 法等。 均可 根据不 同对象 采取不 同条件 进行实 
验。 以上 共性分 离纯化 方法, 在 Cantoni 和 Grossman 等人所 编著的 核酸研 究方法 手册中 
已有 详尽的 介绍, 读 者有兴 趣时, 请参阅 [45, 46]。 

三、 脂 类化合 物的提 取分离 

用热 乙醇或 乙醚抽 提生物 组织可 得到油 状物, 它包括 脂肪、 蜡、 磷脂、 糖脂、 固 醇及它 
们的水 解产物 (如高 级脂肪 酸), 这些物 质虽结 构功能 不同, 但都 属于油 脂类化 合物, 都能 
溶于脂 溶性溶 剂中。 脂 类化合 物可分 为中性 脂肪和 类脂二 大类。 中 性脂肪 的比重 都小于 
1.0, 不 与水相 混溶, 但都溶 于乙醚 、氯仿 、丙酮 、苯、 二硫 化碳、 热酒精 及其他 脂肪溶 剂中。 
类脂 主要有 磯脂、 脑苷脂 、固醇 及蜡等 。碟 脂也是 一种甘 油脂, 但不 同于中 性脂, 主要 是甘油 
上的 三个轻 基其中 有一个 不是与 脂肪酸 结合, 而是 与碟酸 胆碱等 相连, 不同 的碟脂 具有不 
同 的溶解 性质, 如脑碟 脂不溶 于丙酮 而溶于 氯仿及 乙醚, 卵碟 脂不溶 于冷乙 醇而溶 于热乙 
醇, 神经 碗脂则 不溶于 乙醚。 这些 溶解性 质的差 别常作 为提取 分离隣 脂类化 合物的 依据。 
固醇 类化合 物都不 溶于水 (仅 在水中 溶胀或 形成乳 胶状物 ), 而溶 于有机 溶剂。 固 醇类化 
合物 中因无 脂链的 存在, 故 在碱性 条件下 不能发 生皇化 反应, 可用阜 化法使 固醇与 脂肪分 
开, 又 因固醇 类化合 物都比 较容易 结晶, 故从生 物材料 中提取 制备并 不十分 困难。 

油 脂化合 物的提 取分离 方法常 有下面 几种: 

1. 机械 压榜法 主 要通过 各种压 搾机在 10 — 100 公斤 / 厘米 2 的压 力下, 将 流动性 

较大的 油从材 料破碎 的细胞 中挤压 出来, 这种 纯属于 物理的 方法常 用于一 些油料 作物种 
子的 制油, 如花 生油, 棉子 油的生 产等。 

2. 水代法 这是 我国劳 动人民 几千年 前制造 的一种 简便取 油法, 其 原理是 以水代 
油。 因油 料细胞 中蛋白 质亲水 性强, 而油 的疏水 性强, 在 热的条 件下加 入大量 的水, 剧烈 
搅拌, 水 进入细 胞与蛋 白质结 合而将 油顶替 出来。 此 法设备 简便, 成本 低廉, 生产 安全而 

• 44 • 



出油 率高。 驰名中 外的小 磨麻油 就是用 此法提 取的。 

3. 患化法 甘油酯 易与碱 (如氢 氧化钾 或氧氧 化钠) 作 用而水 解生成 能溶于 水的脂 
肪酸 纳或钾 (即 肥皇) 和甘油 ,此过 程称为 皂化。 阜化液 再经酸 化处理 ,即分 离析出 高级脂 
肪酸。 不被阜 化部份 如固醇 等通过 皂化反 应后与 甘油酯 分开, 再进 一步用 有机溶 剂提取 
纯化。 

4, 有 机溶剂 萃取法 是 实验室 常用的 一种比 较精细 的分离 方法, 它 主要根 据不同 

油脂化 合物, 在不同 溶剂和 不同条 件下溶 解性质 的差别 而进行 分离。 有机 溶剂萃 取的实 
验仪 器及操 作方法 都比较 简单, 在各 种有机 化学实 验指导 中都有 描述, 这里 不再作 介绍, 
而各 种脂类 化合物 的溶剂 系统分 离法可 参考图 2- 3"", 图 2- 4" 8】 。 图 2-3 是 一般生 物材枓 
在不 同溶剂 中系统 分离; 图 2-4 是一种 抗酸菌 的菌体 内不同 脂类化 合物在 不同溶 剂的系 
统分离 情况。 



总 抽提液 

j 减 压浓缩 
氯仿 一甲醇 (2:1 — 1:2) 



可 溶部份 


不 溶部份 (脂 蛋白) 


1 少量 氯仿及 10 倍容积 的丙酮 




放严 




沉淀 


丙酮可 溶部份 (胆 S 醇, 脂 肪酸, 中性 脂肪, 类胡萝 卜 素〉 


j 少量 氯仿及 10 倍容积 的乙链 




放置 (4°C, 过夜) 




i 

沉淀 , 

i 1 


1 

+ 乙醚可 溶部份 (卵 碑脂, 脑磷脂 ,其 他甘油 脂类) 


同以上 乙醚反 复抽提 3 — 4 次 
1 




沉淀 (白色 ) 




i 热 聢熔解 




放置 (4°C, 过夜) 




\ 

同以 上用吡 P£ 溶解 并抽提 3 — 4 次 


吡啶可 溶部份 (糖 脂类) 


沉淀 (神 经磷 脂类) . 




图 2-3 


脂类化 合物有 机溶剂 系统提 取分离 示意图 



四、 其他 脂溶性 生化物 质的提 取分离 

除 上面所 说的脂 类化合 物外, 生物 体内还 有许多 非脂类 物质, 它 们不溶 或难溶 于水, 
而易溶 于有机 溶剂。 如植物 组织中 的不含 紛轻基 的醌类 、内 酯类、 皇 甙类和 大部份 生物碱 
都属于 脂溶性 物质。 常用 氯仿、 乙醚、 热乙醇 、甲醇 、甲苯 、乙酸 乙脂等 有机溶 剂分别 提取。 

• 45 . 



抗酸 菌菌体 

I 乙醇: 乙继 (1:1) 



可 溶部份 



I 

水; 1 



残渣 



水加 脂质浓 缩后, 
用乙 鲢抽提 



氯 仿抽提 



可 溶部份 



不 溶部份 



乙辭层 



加少量 氯仿后 

2 倍丙 酮沉淀 



乙醇一 乙醚一 
1%HC1 抽提 



浓缩 

丙 酮沉淀 



可 溶部份 
(脂质 B) 



沉淀 



可 溶部份 


沉淀 


(中性 脂肪) 




热丙嗣 

抽提 



可 溶部份 
(结合 脂质) 



残遼 



热丙酮 

抽提 



可 溶部份 

(脂质 C) 



不 溶部份 

(脂质 D〉 



不 溶部份 
(碟 脂类) 



可 溶部份 
(脂质 A) 



图 2-4 抗酸菌 菌体脂 质的系 统分离 示意图 

样 品 



80% 甲醇浸 提过滤 



残遼 (弃去 ) 



甲 醇滤液 

减少 浓缩至 水相, 过滤。 



水相 残渣 (弃去 ) 

pH8.6 (IN NaOH) 乙酸乙 酷萃取 



乙酸 乙酯相 

蒸干, 溶解在 80% 
甲 醇中, 减 压浓缩 
至 水相, pH2.8, 

乙酸乙 脂萃取 



水相 



pH2.8 (1NHC1) 
乙酸乙 脂萃取 



乙笼 乙脂相 
含 (U) 



水相 



乙酸 乙脂相 
含 (I) 



水相 
(弃去 ) 



pH5.5, 用 水饱和 

正丁 醇萃取 



正 丁醇相 
含 (III) 



水相 
(弃去 ) 



图 2-5 植物样 品几种 植物激 素的提 取分离 示意图 
图中 (I) 含 IAA、 ABA、 GA, (II) 含 中性生 长素, (III) 含细胞 分裂索 

由于这 些化合 物种类 繁多, 本章只 能扼要 地提及 ,详细 介绍他 们的分 离方法 请参阅 有关植 

物成份 化学的 专著。 

此外, 许 多植物 激素如 P 引噪 乙酸 (IAA)、 赤霉素 (GA)、 脱落酸 (ABA) 及细 胞分. 

裂素等 ,这些 物质均 具有极 高的生 理活性 ,对 植物的 生长、 开花、 结实 等均有 明显的 影响, 
在农 业生产 上应用 较广, 这些 物质, 其分子 都具有 非极性 基团, 可溶于 甲醇、 乙醇及 乙醚等 



. 46 • 



有机溶 剂中。 但分子 中也有 某些极 性基团 ,因此 又可溶 于一定 PH 的水溶 液中。 根据它 
们的溶 解度的 共性, 一 般先用 五倍于 材料的 80% 甲醇提 取后, 再通 过改变 pH 条 件及改 
用不 同溶剂 抽提使 各组份 分开。 其 系统分 离见图 2-5""。 

以上几 种植物 激素提 取初步 分离后 ,进 一步纯 化时, 常用 离子交 换树脂 柱色谱 (包括 
使 用强酸 性树脂 Dovvex 50 或强碱 性树脂 Amberlite IRA-AOO) 或用 DEAE 纤维素 分离。 

五、 糖、 氨基酸 及其他 水溶性 生化物 质的提 取分离 

游离单 糖及小 分子寡 糖易溶 于水, 材 料破碎 以后, 用 水或在 中性条 件下以 50f。 稀乙 
醇进 行搅拝 提取, 提取液 以醋酸 铅除去 蛋白质 及其他 杂质, 铅离子 可通过 H2S 而除 去。 然 
后浓缩 至干, 再用沸 甲醇或 热乙醇 抽提, 冷却 后单糖 便结晶 析出。 单 糖或小 分子寡 糖也可 
在提 取后, 用 吸附柱 色谱或 离子交 换法而 纯化。 

大分 子的多 聚糖或 杂多聚 糖情况 则比较 复杂, 应 依照不 同种类 的多糖 的具体 溶解性 
质而决 定提取 方法。 如昆布 多糖、 果聚糖 、糖原 、易溶 于水。 壳多 糖纤维 素溶于 浓酸。 直 
链淀粉 易溶于 稀碱。 许多具 有医药 价值的 酸性粘 多糖常 含有氨 基己糖 、己糖 酸酸, 以及硫 
酸等多 种成份 ,其结 构种类 复杂, 并常与 蛋白质 结合在 一起, 提取分 离时, 先 用蛋白 酶破坏 
蛋白质 与糖的 结合后 ,再将 水提取 液减压 浓缩, 以乙醇 或十六 院基三 甲基溴 化按沉 淀酸性 
粘 多糖, 最后用 离子交 换树脂 柱色谱 进一歩 纯化。 Danishefsky 和 Bell 等曾 用不同 浓度的 
稀氯 化钠, 从人的 肚跻带 提取了 几种含 有透明 质酸和 软骨素 的酸性 粘多糖 [5 *"。 其 方法如 
图 2-6。 

SA 经 Dovvex I 分 离所得 SAA、 SAB、 SAD 三个组 份均含 有葡萄 糖胺、 糖醒酸 ,但所 
含 硫酸基 及蛋白 质差别 较大。 SB、 SC 所含葡 萄糖胺 较微量 ,其中 SB 含半 乳糖胺 及硫酸 
基 较多。 P-I, P-n 部份也 以半乳 糖胺为 主要氨 基己糖 组份。 

500 克 组织用 0.2%NaCl 在 — 匀浆 5 分 钟并用 0.2%NaCl 提取 (5°c)— 天 

1 离心 



I 

上清液 



上清液 残渣 

i 加 十六垸 基氯化 •% 啶至 1% 浓度 1 蛋白飽 水解, 醋 酸耗及 18% 乙 醇沉淀 



i i 1 

沉淀 沉淀 上清液 

\ 0.4M NaCl 提取 (P—I) I 35% 乙 醇沉淀 



残澄 
I 1.2M 
1 NaCl 提取 



抽提液 
(SA) 
1.6 克 



沉淀 
(P-II) 



上清液 



残渣 




2.1A/ 




NaCl 提取 



i 

残澄 



抽提液 

(SB) 
0.5 克 



抽提液 
(SC) 
0.04 克 

图 2-6 从 人肚脐 带提取 几种酸 性粘多 糖图解 



• 47 • 



肝素也 是一类 酸性粘 多糖, 水 解后生 成葡萄 糖錢、 氨基葡 萄糖及 硫酸, 临床上 用于各 
种血栓 栓塞。 肝 素易溶 于水, 不溶于 乙醇, 丙酮 等有机 溶剂, 在水 溶液中 带强负 电荷, 故用 
水提 取后, 能用 各种阴 离子交 换树脂 吸着, 目前 国内制 备方法 多用离 子交换 树脂分 离或在 

酸 性条件 下以溴 化十五 院吡啶 (简 写为 PPB) 选择 性沉淀 而获得 纯品。 

此外, 某些水 溶性的 小分子 物质如 氨基酸 、核苷 酸及其 衍生物 ,大部 份都溶 于水, 不溶 
于乙醇 、乙醚 等有机 溶剂, 当材 料经破 碎后, 用水 或一定 PH 范 围的水 溶液提 取后, 滤去残 
澄即可 用离子 交换树 脂进行 分离, 最后 以乙醇 或调整 pH 至 等电点 沉淀。 如需要 较纯产 
品, 可 通过反 复结晶 方法而 获得。 

六、 植物次 生物质 的提取 及溶剂 系统分 离的选 择 [5 1, 52 3 

植物 次生物 质种类 繁多, 包括 各种生 物碱、 帖类、 苷类、 黄酮类 和有机 酸等, 其 中大部 
分在工 业上医 学上有 着广泛 用途。 如挥 发油, 蜡、 油漆、 橡胶、 鞣质等 都是一 些重要 工业原 
料, 这些 物质的 工业提 炼方法 不属本 书讨论 范围。 但 其中某 些对人 类或动 物具有 极强生 
理 作用的 药物, 它 们的提 取分离 纯化方 法和其 他生化 物质的 提取分 离纯化 方法有 着许多 
共同 之处。 这里 主要根 据广州 医药工 业研究 所丘晨 波经验 总结作 一简要 介绍: 

作为 药用的 植物次 生代谢 产物, 不论干 或鲜的 材料, 粉碎 后一般 可分为 水提取 和醇提 
取二 部分。 醇提 部分, 使用 最多的 溶剂是 甲醇, 有 时也用 60% 或 95f。 乙醇 代替。 如样品 
中含 挥发油 较多, 并 着重研 究这些 成份, 可用 石油醚 提取。 各类药 用成份 提取选 用的溶 
剂, 主要依 据被提 取物的 极性大 小而定 ,欲 作系统 分离, 其溶剂 选择可 参考表 2-5, 由于植 
物 药用成 份种类 繁多, 系统分 离时很 难一次 完成。 先粗分 后细分 ,多次 完成。 如仅 研究其 
某一 成份, 如 生物碱 可选择 氯仿为 主要溶 剂进行 抽提控 制不同 pH, 然 后加入 细分。 关于 
药用植 物成份 的分离 系统, 丘 晨波提 出了如 下模式 (图 2-7)。 



表 2- 5 植物药 用成份 及其适 用的提 取溶剂 



极 性大小 


植物成 份类型 


适用提 取溶剂 


提取 溶剂介 电常数 


亲脂 性最强 


精油、 脂肪油 、措、 叶绿素 


石油链 


1.80 


(极 性小) 


g 类、 某 些甙元 


乙 烧 


1.87 


亲 脂性强 


S 萜类、 甙元、 生物碱 (游离 型)、 酸、 酮、 醇、 醌、 某些 


乙 M 


4.3 




试类 


m 仿 


5.2 


中 等极性 (小) 


某 些甙类 (如强 心甙) 


氯仿: 乙醇 (2:1) 




(中) 


某 些试类 (如黄 酮或) 


乙 酸乙脂 


6.1 




某 些甙类 (如 %甙 、蒽醌 甙等) 


正丁醇 


19 


亲 水性强 


极性大 的甙类 、糖 类和氛 基酸等 


丙 酮 


21 






乙 醇 


26 






甲 醇 


31 


亲水 性最强 


蛋白质 、粘 液质、 果胶、 










水 


81 


(极 性大) 


糖类、 氨 基酸等 







• 48 • 



药用植 物材料 

\ 甲 醇温浸 (90%, 60% 各浸 二次) 
醇提 浓缩液 

丄 热水浸 ,搅伴 悬浮, 石油魅 (或苯 ) 抽 提五次 



i 



水层 (及悬 浮物) 

氯仿 (或 乙醚) 抽提 



石 油链层 



水层 (及悬 浮物) 

乙 酸乙脂 (或 氯仿: 乙醇 =2:1) 
抽 提五次 



氯仿层 (或乙 链层) 
(极 性大小 部份) 



水, 层 

' 正丁醇 (水 饱和) 
(或乙 酸乙脂 :乙酸 =2:1) 

, 抽提 



乙酸 乙脂层 
(极 性中小 部份) 



水层 

I 滤 清蒸浓 
(极 性大 部份) 



正丁酵 (或 乙酸 乙酷〜 乙酸) 层 

I 水洗、 减 压浓缩 
(极 性中大 部份) 
图 2-7 植 物成份 分离系 统简图 



参 考文献 

[1 ] West, E. S., 生 物物理 化学, 中 译本, 科学出 版社, 78 页 (I960)- 

[ 2 ] Hecker, E., Chimia, S, 229 (1954). 

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[11] 程 秋探: 生物化 学与生 物物理 进展, 5 期, 76 页 (1981) 

[12] 尤美 莲等: 生物化 学与生 物物理 进展, 6 期, 60 页 (1982) 
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[14] 陈 作义, 朱 本明: 生物化 学与生 物物理 进展, 4 期, 68 页 (1981) 

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. 50 • 



第三章 沉 淀 及 沉 淀 剂 

苏拔贤 

第一节 引 言 

沉 淀是溶 液中的 溶质由 液相变 成固相 析出的 过程。 在生物 化学、 有机 化学和 无机化 
学制备 工艺中 ,沉 淀都是 一种最 常用的 方法。 在制 备过程 中采取 沉淀的 手段, 主要 是为了 
通过沉 淀达到 浓缩的 目的, 或者通 过沉淀 固液分 相后, 除去留 在液相 (如 果目 的物是 固相) 
或 沉积在 固体中 (目的 物留在 液相) 的 非必要 成份; 其次, 沉淀 可以将 巳纯化 的产品 由液态 
变成固 态加以 保存或 进一歩 处理。 沉淀 方法用 于分离 纯化是 有选择 性的, 即有选 择地沉 
淀杂质 或有选 择地沉 淀所需 成份。 对于生 物活性 物质的 沉淀, 情况更 为复杂 ,不仅 在于沉 
淀作 用能否 发生, 还要注 意所用 沉淀剂 或沉淀 的条件 对生物 活性物 质结构 是否有 破坏作 
用, 沉 淀剂是 否容易 除去; 用于 食品、 医 药的沉 淀剂还 应考虑 对人体 是否有 害等。 在生化 
制备中 常有下 列几种 沉淀方 法和沉 淀剂: 

1. 盐 析法。 多 用于各 种蛋白 质和酶 的分离 纯化。 

2. 有机 溶剂沉 淀法。 多用于 生物小 分子、 多糖 及核酸 类产品 的分离 纯化, 有时 也用于 
蛋白质 沉淀。 

3. 等 电点沉 淀法。 用于氨 基酸、 蛋白 质及其 他两性 物质的 沉淀, 但此 法单独 应用较 
少, 多与 其他方 法结合 使用。 

4. 非 离子多 聚体沉 淀法。 最近使 用于分 离生物 大分子 的例子 很多, 是 发展很 快的一 
种 方法。 

5. 生成盐 复合物 沉淀。 用于 多种化 合物, 特别 是一些 小分子 物质的 沉淀。 

6. 热变性 及酸碱 变性沉 淀法。 这一 类方法 也常称 为选择 性变性 沉淀。 在分 离制备 
中, 常有选 择地用 于除去 某些不 耐热及 在一定 PH 值 下易变 性的杂 蛋白。 但应以 在实验 
条 件下所 分离物 质的活 性不受 影响为 前提。 

7. 其他。 除以 上所述 沉淀方 法外, 只对某 一种或 某一类 物质产 生沉淀 的沉淀 方法及 
沉 淀剂。 

下面介 绍几种 主要沉 淀方法 的原理 ,操作 及应用 实例: 

第二节 盐 析 法 
一、 基 本原理 

—般 地说, 所有固 体溶质 都可以 在溶液 中加入 中性盐 而沉淀 析出, 这一过 程称为 "盐 
析"。 在生化 制备中 ,许多 物质都 可以用 盐析法 进行沉 淀分离 ,如蛋 白质、 多肽、 多糖、 核酸 

• 51 - 



等。 2 — 40% 饱和 度的硫 酸按可 以使许 多病毒 沉淀, 使用 43% 饱 和度的 硫酸铁 也可以 
使 DNA 和 rRNA 沉淀, 而 tRNA 保留 在上清 液中。 但盐 析法应 用最广 的还是 在蛋白 
质领 域内。 用盐析 法分离 提纯蛋 白质巳 有八十 多年的 历史, 特别是 粗提纯 阶段, 盐析 法是、 
—种十 分常用 的纯化 手段。 当然 在生化 制备技 术高度 发展的 今天, 盐 析法由 于共沉 作用, 
不是 一个高 分辨的 方法, 但和 其他方 法交替 使用, 盐析 法仍具 有许多 突出的 优点: 

1. 成本低 ,不 需要什 么特别 昂贵的 设备。 

2. 操作 简单, 安全。 

3. 对 许多生 物活性 物质具 有稳定 作用。 
关于盐 析原理 ,现以 蛋白质 为例讨 论如下 [ 1 ] : 

蛋白 质在高 盐浓度 下发生 盐析, 在低 盐浓度 下发生 盐溶。 盐溶 现象在 第二章 中已作 
过 介绍, 主要是 中性盐 离子对 蛋白质 分子表 面极性 基团及 水活度 的影响 ,增 加了蛋 白质分 
子与溶 剂分子 相互作 用力, 从 而使蛋 白质的 溶解度 增大。 但 中性盐 的浓度 渐增至 一定程 
度时, 水分子 在中性 盐的作 用下活 度大大 减少, 蛋 白质表 面电荷 大量被 中和, 最后 破坏了 
蛋白质 分子外 表的水 化膜, 使 蛋白质 分子之 间相互 聚集而 沉淀。 蛋 白质盐 析时与 溶液中 
中 性盐的 离子强 度有如 下定量 关系: 

Log A Ks - I (3-1) 

So 

这里 s 是指 在离子 强度为 I 时蛋白 质的溶 解度, So 是在 纯溶剂 (即 I = 0) 时 蛋白质 
的溶 解度。 Ks 是一个 常数, 也 称盐析 常数。 离 子强度 I 决定于 下式: 

1 = 丄 Zmz2 (3-2) 
2 

2mz2 是所 有离子 总数的 电荷, 其中 m 为溶液 中各种 离子的 克分子 浓度, Z 为 各种离 
子的 价数, 3-1 式 中当溶 剂的温 度为一 定时, S 。对 于某一 溶质也 是一个 常数, 即 

LogSo = /?, 

所以 3-1 式 可以改 写为: 

Logs = /? - Ks • I (3-3) 

P 值的大 小取决 于溶质 的性质 ,不可 能直接 测定, 是 假定溶 解度在 1 = 时, 用外推 
法 求出。 故/? 值带有 经验性 性质。 

盐 析常数 Ks 值, 主要决 定于加 人盐的 性质, Ks 大 小与各 种离子 价数成 正比, 与离子 
半径 及溶液 的介电 常数成 正比。 而离子 价数对 Ks 影 响比较 主要。 由于蛋 白质表 面有很 
多亲水 基团, 是一 个偶极 离子, 它需要 较高的 I 值 才能从 溶液中 析出, 所以蛋 白质的 Ks 常 
数 很高, 常比一 般小分 子高出 10 — 20 倍。 Ks 和蛋 白质性 质关系 不大, 但受到 溶液的 pH 
值和 温度的 影响。 表 3-1 列举 了一些 蛋白质 的盐析 常数。 

在表 中可以 看出多 价阴离 子如硫 酸根和 磯酸根 有很高 Ks, 但高 价阳离 子如镁 (或 f§) 
的 存在反 而降低 Ks 值。 表中 还可以 看到, 蛋白质 性质对 Ks 值 也有一 定影响 (虽然 不是主 
要的 ), 如在一 种盐浓 度中, 大 而不规 则分子 如纤维 素原, Ks 最大, ^乳 球蛋白 Ks 最小, 
但 目前还 设有适 当理论 i 羊细说 明溶质 的分子 性质与 Ks 的 关系。 

等式 3-3 中的 是溶质 的特征 常数, 对于 蛋白质 来说, 值大小 主要决 定于不 同蛋白 
质的 性质。 

关于 蛋白质 的盐析 条件的 研究, 四十 年代至 六十年 代已做 了大量 工作。 Czok 和 Bucher, 
. 52 . 



表 3-1 —些 蛋白质 的盐析 常数' 



蛋白质 


NaCl 


MgS04 


(NH,)jSO, 


NajSO« 


碟酸盐 


柠 樣酸纳 


|8- 乳 球蛋白 








0.63 






马血 红蛋白 




0.33 


0.71 


0.76 


1.00 


0.69 


人血 红蛋白 










2.00 




马肌 红蛋白 






0.94 








卵 清蛋白 






1.22 








纤维 蛋白原 


1.07 




1.46 









Dixon 和 Webb 对利用 盐析方 法进行 蛋白质 分离纯 化作了 系统总 结 [3 '4 ] , 并 在等式 3-3 基 
础上将 盐析方 法分为 两类: 

(1) 在 一定的 PH 和 温度下 改变离 子强度 (盐 浓度) 叫 Ks 分段盐 析法。 

(2) 在 一定离 子强度 下改变 pH 和 温度叫 "纩 分段盐 析法。 

Czok 和 Bucher 认 为第一 组适于 早期粗 抽提液 的分歩 分离, 而 第二组 则适于 后期进 
一 歩分离 纯化和 结晶时 使用。 Czok 和 Bucher 应用 "Ks" 分 段盐析 法曾成 功地从 肌肉抽 
提 液中分 离了多 种醒。 Jakoby 发现蛋 白质在 硫酸按 溶液中 的溶解 度随着 温度升 高而降 
低, 从而提 出了在 0°C 用逐歩 降低浓 度的硫 酸按溶 液抽提 蛋白质 沉淀, 然后 在室温 进行结 
晶。 此 法曾成 功地分 离了许 多醒。 (详细 介绍见 本书结 晶一章 )。 

下面, 我们以 蛋白质 为主要 对象讨 论应用 盐析法 的几个 问题。 

二、 影响盐 析的若 干因素 

(一) 蛋白质 的浓度 与盐祈 的关系 

利用盐 析方法 分歩分 离蛋白 质各组 份和溶 液中蛋 白质实 际浓度 有很大 关系。 例如一 
种蛋白 质在溶 液中的 浓度为 Ci, 加人中 性盐, 浓 度直至 离子强 度等于 Ii 时, 蛋白质 开始沉 
淀并从 溶液中 析出。 此 时等式 3-3 可 写作: 

LogCi = /?- K2I1 (3-4) 

这里的 Ii 是蛋白 质开始 沉淀时 的离子 强度。 但 如果这 种蛋白 质在溶 液中含 量较低 

(设其 浓度为 CO, 则需要 加入较 多的中 性盐, 蛋白质 才开始 沉淀。 (设此 时离子 强度为 12) 

应 写作: 

LogC, = /? - Ksl, (3-5) 

3-4 式减 3-5 式得: 

Log = Ks(I, - 10 (3-6) 

Dixon 和 Webb 用 硫酸按 测定羧 基肌红 蛋白, (Carboxymyoglobin) 当接 基肌红 蛋白浓 
度为 30 克 / 升, 硫 酸铁饱 和度为 58% 时开 始出现 沉淀。 而幾 基肌红 蛋白的 浓度为 3 克 / 
升, 加至 58% 饱 和度硫 酸按不 会出现 沉淀, 直至到 66% 饱和度 时才开 始产生 沉淀。 但在 
较浓的 蛋白质 溶液中 (30 克 / 升) 当硫酸 铁达到 66% 饱和度 时巳有 90 蛋 白质度 沉淀析 
出 C 根据上 述实验 结果, Dixon 等 计算出 Cx = 10C, 时, 应增 加大约 7% 的 硫酸按 饱和度 

• 53 • 



才 可以把 低浓度 (CO 的蛋白 质沉淀 下来。 

所 以在不 同浓度 的蛋白 质溶液 中进行 盐析, 使 用硫酸 按的饱 和度范 围是不 同的。 高 

浓 度蛋白 质溶液 可以节 约盐的 用量, 但许 多蛋白 质由于 "纩 和 "Ks" 常 数十分 相近, 若蛋 
白 质浓度 太高, 会发 生严重 的共沉 作用。 但在 低浓度 蛋白质 溶液中 盐析, 所用的 盐量较 
多, 而共沉 作用比 较少, 因此需 要在二 者之间 进行适 当选择 。用 于分歩 分离提 纯时, 宁可选 
择稀 一些的 蛋白质 溶液, 多加 一点中 性盐, 使共沉 作用减 至最低 限度, 当然浓 度不能 太稀, 
一 般认为 2.5 — 3.0% 的蛋 白质浓 度比较 适中, 如 果蛋白 质浓度 太稀, 消耗大 量的中 性盐, 
对蛋白 质的回 收也有 一定的 影响。 

(二) 离子强 度和离 子类型 对盐析 的影响 

上面介 绍过, 在低 离子强 度下, 许 多蛋白 质比在 纯水中 的溶解 度大大 增加, 但 当溶液 
中离 子强度 不断增 加时, 各离 子之间 及离子 与溶质 分子之 间相互 竞争水 分子, 结果 导致溶 
质的溶 解度渐 渐减少 ,产 生盐析 现象。 一般 来说离 子强度 越大, 蛋 白质的 溶解度 越低。 但 
蛋白 质的盐 析现象 比一般 有机分 子复杂 一些, 蛋白质 分子大 ,而 且有许 多表面 电荷, 这^ 



发生盐 析时所 需求的 离子强 度是不 同的。 所以 用不同 离子强 度分步 盐析的 方法, 就可以 
分离 混合物 中各种 组份。 在进行 分离的 时候, 一般从 低离子 强度到 高离子 强度, 顺次进 
行。 每一 组份被 盐析出 来后, 经 过固- 液分离 (冰 冻离心 或过滤 ), 再 在溶液 中逐渐 提高中 
性 盐的饱 和度, 使另 一种蛋 白质组 份盐析 出来。 离子 强度的 大小对 蛋白质 的溶解 度起着 
决 定性的 影响。 但在 同样的 离子强 度下, 离子种 类的不 同对蛋 白质溶 解度的 影响也 不同。 
图 3-2 所示是 七种不 同电解 质下, 一 氧化碳 血红蛋 白溶解 度曲线 B ] 。 图中不 同离子 种类对 
蛋 白质溶 解度的 影响, 可以从 Hofmeister 系 列理论 中获得 解释: 即 离子半 径小而 很高电 
荷的 离子在 盐析方 面影响 较强, 离子半 径大而 低电荷 的离子 的影响 较弱。 单 价盐如 Ka, 
NaCl 的盐 析效果 一般比 较差。 图 3- 3 表示不 同盐类 对同一 蛋白质 的盐析 效应具 有不同 
的" Ks" 值 [ 6] , Ks 值可 由各种 盐的盐 析曲线 的斜率 表示。 它们的 减少顺 序是: 碟 酸钾〉 硫 
酸纳〉 硫 酸按〉 柠檬 酸钠〉 硫 酸镇。 按照 Hofoneister 系列, 镇离子 比按离 子小, 但实际 
上硫酸 按的盐 析效应 比硫酸 镁好, 主要 是镇离 子在高 离子强 度下产 生了一 层颇大 的离子 
雾, 从而减 少了它 的盐析 效应。 




表 面所带 电荷常 随着周 围离子 和溶剂 分子排 
列 秩序的 影响而 不断变 化着, 蛋白质 分子内 
还有许 多相互 作用的 基团, 这 都造成 了许多 
经 典理论 不能十 分完美 地解释 蛋白质 盐析的 
原因。 



图 3-1 几 种蛋白 质析出 吋所需 硫酸铵 的离子 的强度 
—— 纤维蛋 白原, 2 —— 血红 蛋白, 3 — 拟球 蛋白, 
4 —— 血清清 蛋白, 5 —— 肌 红蛋白 



离 子强度 ( I ) 



几种 蛋白质 在不同 离子强 度下的 盐析效 
应见图 3-1"、 从图 中可以 看出, 当硫 酸按饱 
和 度达到 20% 时, 纤维蛋 白原首 先析出 ,饱 
和 度增至 28 — 33% 时, 血 红蛋白 析出, 饱和 
度 再增至 33 — 35fo 时, 拟 球蛋白 析出, 饱和 
度至 50% 以上, 清蛋白 析出, 饱和度 最后& 
到 80fc 时, 肌 红蛋白 析出。 可 见不同 蛋白质 



1.0 



0<>^:^-^ """" « 



-1.0 



NaCl xn 杆據酸 
KCl 
MgSOt 

o K,SO 




Na,SO 



10 20 
离 子强度 



30 



图 3-2 25°C — 氧 化碳血 紅蛋白 在不同 电解质 下溶解 度曲线 




离 子强度 



图 3-3 25ec pH 6.6 吋一氧 化碳血 红蛋白 在不同 电解质 中的盐 析效应 
• Na,SO, □ (NH 力, SO" ▲ MgSO^ A 泞樣酸 三纳, KH,PO, + K^HPO* 

( 三) pH 对盐祈 的影响 

一般 地说, 蛋白 质所带 净电荷 越多, 它的 溶解度 越大; 如 果所带 的电荷 减少至 接近于 
零时 溶解度 最少, 我们称 此时的 pH 值 为该蛋 白质的 等电点 (pl)。 改变 pH 或特 异地加 
入与 蛋白质 极性基 团结合 的离子 (叫反 离子) 即 可改变 蛋白质 的带电 性质, 也就是 改变了 
蛋白 质的溶 解度。 图 3- 4 是 在不同 pH 的 浓碟酸 盐缓冲 液下血 红蛋白 (Haemoglobin) 的 
溶解 度曲线 [7] 。 从图 中曲线 可见, 蛋 白质在 不同的 pH 下有 着不同 的溶解 度,' 远离 等电点 
处蛋 白质的 溶解度 最大, 等 电点处 溶解度 最小。 因此 在盐析 时常选 择溶液 pH 值 在该蛋 
白质 等电点 附近。 但必须 注意在 水中或 稀盐溶 液中测 得的蛋 白质等 电点与 高盐浓 度下所 
测的结 果是不 同的。 需根据 实际情 况调整 pH 值至蛋 白质溶 解度最 低处, 才能使 盐析获 
得更好 效果。 





6.0 6.5 7.0 
pH 
(b) 

图 3-4 不同 pH 下, 在浓磯 酸缓冲 液中血 红蛋白 的溶解 度曲线 
(图 b 是由图 a 所衍 生的) 

(四) 温度 对盐析 的影响 

温度 是影响 溶解度 的重要 因素, 对于许 多无机 盐和小 分子的 有机化 合物, 温度 升高, 

溶解度 也相应 增大。 但对于 蛋白质 、酶、 多肽等 生物大 
分子在 高离子 强度溶 液中, 温度的 升高, 它们的 溶解度 
有时 不但不 升高, 反而 减少。 许 多蛋白 质在高 离子强 
度 溶液中 25°C 时的溶 解度比 4°C 时溶 解度明 显地减 
少。 如图 3- 5 所示 [6] 。 但 必须指 出这种 温度升 高溶解 
度的 下降现 象只有 在高离 子强度 下才能 发生。 在低离 
子强 度或纯 水中, 蛋白质 溶解度 大多数 在一定 范围内 
是随着 温度增 加而增 加的。 

在一般 情况下 ,蛋白 质的盐 析温度 要求不 严格, 可 
以在 室温下 进行, 只有 某些对 温度比 较敏感 的酶, 要求 
缓冲 液中的 溶解度 在低温 — 4°C 下 操作, 以避免 活力的 丧失。 



2.0/ 



1.0 




COHb 0。 



COHb 2o 



2.0 



4.0 



3.0 

离 子强度 

图 3-5 不同温 度下、 血红 蛋白在 浓碟酸 



三、 一般常 用的中 性盐盐 析方法 

一般常 用的中 性盐有 硫酸按 、硫 酸钠、 硫酸镁 、磷 酸钠、 磯酸钾 、氯 化纳、 氯 化钾、 醋酸 
钠和 硫氰化 钾等, 其中用 于蛋白 质盐析 的以硫 酸按、 硫 酸钠最 广泛。 在表 3-1 中虽 然碟酸 
盐的盐 析效果 强于硫 酸按, 但 后者的 溶解度 比较大 (在 0°C 时饱 和度为 5.35Ai ,在 25t 时 
为 5.82M) 而且受 温度影 响较少 。关 于不同 温度下 硫酸铵 在饱和 水溶液 的性质 详见表 3-2。 

由 于有上 述的优 点在蛋 白质盐 析时, 硫 酸铵乃 是最受 欢迎的 盐类。 但 硫酸按 也有不 
足的 地方, 如缓冲 能力比 较弱, 此外, 因 含有氣 原子, 对蛋白 质的分 析会带 来一定 影响。 硫 
酸钠 也较常 用于蛋 白质的 盐析, 它的优 点是不 含氮, 不影响 蛋白质 的定量 测定。 缺 点是在 
30°C 以下 溶解度 太低。 在 30°C 以上操 作效果 较好。 511 酸盐、 柠檬 酸钠、 硫 氰化钟 等有时 



56 



表 3-2 不同里 度下硫 酸按在 饱和水 溶液的 性质' 



温 度 



温 



(义:) 



性 质^" 





10 


20 


25 


30 


摩尔 /1000 克水 


5.35 


5.53 


5.73 


5.82 


5.91 


克 /1000 克水 


706.96 




757.16 


769.05 


780.95 


重量 % 


"•42 


42.22 


■13.09 


43.47 


■43.85 


比 重 


1.2428 


1.2436 


1.24-17 


1.2449 


1.2450 


克 /1000 毫 升溶液 


514.72 


535.05 


536.34 


5-11.24 


545.88 


摩尔 /1000 毫 升溶液 


3.90 


3.97 


4.06 


•1.10 




克 /10G0 毫升水 


706.86 


730.53 


755.82 


766.80 


777.55 



也 用于蛋 白质的 盐析。 但由 于溶解 度低, 易与 其它金 属产生 沉淀, 或 因酸性 过强, 都不如 
硫 酸按应 用那样 广泛。 

(― ) 硫酸按 盐祈法 

1. 硫酸 按使 用前的 预处理 一般 生化工 业制备 用的硫 酸按。 选择三 级纯度 即可, 

但 对于实 验定沉 淀蛋白 质或酶 用的硫 酸按, 常 需要纯 度较高 或进行 重结晶 后才能 使用。 

硫 酸按中 含有少 量重金 属离子 对蛋白 质的琉 基十分 敏感, 使用时 必须用 H2S 进行 处理。 处 
理方法 是先将 硫酸按 配成浓 溶液, 然 后通入 H2S 至饱和 ,放置 过夜, 用滤纸 过滤除 去重金 
属离 子后, 滤 液在瓷 蒸发皿 中浓缩 结晶, 在 100°C 下烘 干后即 可使用 [ 8], 另 高浓度 的硫酸 
铵溶 液一般 呈酸性 (PH5.() 左右) ,使 用前也 需要用 氨水或 硫酸调 至所需 pH 值。 

2. 硫酸 按的饱 和度及 调整法 盐析 时硫酸 按的浓 度常用 饱和度 表示, 达到 饱和状 
态时的 硫酸铁 饱和度 (P) 为 lOOfcc 当盐析 要求不 同的硫 酸铵饱 和度时 可用下 面三种 
方法 调整: 

(1) 加 入固体 盐法: 这当 盐析要 求饱和 度较高 而又不 增大溶 液的体 积时, 多用 此法。 
操 作时先 将硫酸 铵磨碎 成均句 细粒, 在搅 拌下缓 慢分批 加入。 各种 不同的 饱和度 应加人 
硫酸铵 的量可 以从表 3-3, 3-4 中 查得。 

(2) 加入 饱和溶 液法: 饱和硫 酸按的 配制, 一般方 法是取 过量硫 酸按加 热溶解 ,再在 
0°C 或室温 放置, 直至固 体硫酸 铵析出 为度。 

实例: 取 800 — 850 克 化学纯 度的硫 酸按加 入蒸溜 水至总 体积为 1 升, 加热至 501, 
保温 10 分钟, 待大部 分固体 溶解后 ,趁热 滤去不 溶物, 放置 过夜, 第 二天如 有少量 硫酸铵 
晶体 析出, 即达 100% 的饱 和度。 

盐析 时要求 的饱和 度所需 加入饱 和硫酸 按溶液 的体积 计算如 下式: 

V = V。(S2 — Si)/(l - SO 

V = 是 所需加 人饱和 硫酸铁 溶液的 体积。 

Vo = 原来 待盐析 溶液的 体积。 

51 = 原来溶 液的硫 酸铁饱 和度。 

52 = 所 需达到 的硫酸 按的饱 和度。 



57 



加入 饱和溶 液法适 于要求 硫酸按 饱和度 不高, 而且 原来溶 液体积 不大时 使用。 二种 

不同 浓度的 硫酸按 溶液混 合时, 体积 的变化 的计算 误差在 2% 左右, 在一般 实验工 作及工 
业生 产上影 响是不 大的。 但如加 人饱和 溶液后 体积增 加甚大 ,选 用固体 加人法 较好。 饱 
和 硫酸铵 溶液加 人法, 操作时 也需注 意少量 分批在 揽拌下 缓慢地 倾入。 以 免造成 局部过 
浓, 影响 分离的 效果。 

表 3-3 室温 25'C 破酸按 水溶液 由原来 的饱和 度达到 所需要 的饱和 度时, 

每升 琉酸技 水溶液 应加入 a 体硫 酸铵 的克数 







需 


要 


达 


到 


的 


硫 




按 


的 饱和度 (%) 








10 


20 


25 


30 


33 


35 


40 


45 


50 




60 


65 


70 


75 


80 


90 


100 





56 


114 


144 


176 


196 


209 


243 


277 


313 


351 


390 


430 


472 


516 


561 


662 


767 


10 




57 


86 


118 


137 


150 


183 


216 


251 


288 


326 


365 


406 


449 


494 


592 


694 






























20 






29 


59 


78 


91 


123 


155 


189 


225 


262 


300 


340 


382 


424 


520 


619 


25 








30 


49 


61 


93 


125 


158 


193 


230 


267 


307 


348 


390 


485 


583 


30 










19 


30 


62 


94 


127 


162 


198 


235 




314 


356 


449 


546 


33 












12. 


43 


74 


107 


142 


177 


214 


252 


292 


333 


426 


522 


35 














31 


63 


94 


129 


164 


200 


238 


278 


319 


411 


506 


40 
















31 


63 


97 


132 


168 


205 


245 


285 


375 


•496 


45 


















32 


65 


99 


134 


171 


210 


250 


339 


431 


50 




















33 


66 


101 


137 


176 


214 


302 


392 


55 






















33 


67 


103 


141 


179 


264 


3^3 


60 
























34 


69 


105 


143 


227 


314 


65 


























34 


70 


107 


190 




70 




























35 




153 


237 
































36 


115 


198 


80 


































157 


90 


































79 



硫 

酸 

按 
原 
来 
的 
饱 
和 
度 

% 



在 25*^3 下, 硫 酸铵溶 液由初 浓度调 到终浓 度吋, 每升 溶液所 加固体 硫酸按 的克数 

(3) 透析平 衡法: 先将待 盐析的 样品装 于透析 袋内, 然 后浸人 饱和硫 酸按溶 液中进 
行透析 ,外部 的硫酸 铵由于 扩散作 用不断 通过半 透膜进 入透析 袋内, 逐歩达 到所需 要的盐 
析饱 和度, 蛋白质 便产生 沉淀, 此时 即停止 透析。 透析 法的优 点是硫 酸按浓 度变化 有连续 
性, 盐析效 果较好 ,但 透析法 计算饱 和度的 测定工 作手续 烦琐。 除 了结晶 时多使 用外, 一 
般 盐析沉 淀比较 少用。 

3. 使用硫 酸按进 行盐析 必需注 意的几 个问题 

(1) 加固 体硫酸 按时, 必须 看清楚 表上所 规定的 温度, 一般有 0°C 或室温 (20° — 25^) 
两种, 加人固 体盐后 体积的 变化已 考虑在 表中。 例如在 室温时 Si==0, 要 求达到 S2 为 100% 
饱 和度, 每升 溶液加 固体硫 酸铵为 767 克。 欲使 S2 为 50% 饱和度 时应加 313 克 而不是 
767/2 = 383.5 克。 



58 



表 3-4 O C 下由 S, 提 J6 到 S/ 时每 100 毫升 加固体 琉酸按 的克数 



饱 和 度 


在 o°c 吋所 达到的 硫酸按 饱和度 (%) 


20 


25 


30 


35 


40 


45 


50 


55 


60 


65 


70 




80 


85 


90 


95 


100 


在 100 毫 升中欲 加固体 硫酸按 的克数 





10.6 


13.4 


16.4 


19.4 


22.6 


25.8 


29.1 


32.6 


36.1 


39.8 


■13.6 


47.6 


51.6 


55.9 


60.3 


65.0 


69.7 


5 


7.9 


10.8 


13.7 


16.6 


19.7 


22.9 


26.2 


29.6 


33.1 


36.8 


40.5 


44.4 


-18.4 


52.6 


57.0 


61.5 


66.2 


10 


5.3 


8.1 


10.9 


13.9 


16.9 


20.0 


23.3 


26.6 


30.1 


33.7 


37.-1 


41.2 


45.2 


-19.3 


53.6 


58.1 


62.7 


15 


2.6 


5.4 


8,2 


11.1 


14.1 


17.2 


20.4 


23.7 


27.1 


30.6 


34.3 


38.1 


42.0 


46.0 


50.3 


54.7 


59.2 


20 





2.7 


5.5 


8.3 


11.3 


H.3 


17.5 


20.7 


24.1 


27.6 


31.2 


34.9 


00 

、1 


42.7 


46.9 


51.2 


55.7 
52.2 
48.8 
45.3 
41.8 


25 







2.7 


5.6 


8.4 


11.5 


14.6 


17.9 


21.1 


24.5 


28.0 


31.7 


35.5 


39.5 


43.6 


47.8 


30 









2.S 


5.6 


8.6 


11.7 


14.8 


18.1 


21.4 


24.9 


28.5 


32.2 


36.2 


40.2 


44.5 


35 











2.8 


5.7 


8.7 


11.8 


15.1 


18.4 


21.8 


25.4 


29.1 


32.9 


36.9 


■H.0 


40 













2.9 


5.8 


8.9 


12.0 


15.3 


18.7 


22.2 


25.8 


29.6 


33.5 


37.6 


45 















2.9 


5.9 


9.0 


12.3 


15.6 


19.0 


22.6 


26.3 


30.2 


34.2 


38.3 
34.8 


50 

















3.0 


6.0 


9.2 


12.5 


15.9 


19.4 


23.0 


26.8 


30.8 


55 



















3.0 


6.1 


9.3 


12.7 


16.1 


19.7 


23.5 


27.3 


31.3 
27.9 


60 





















3.1 


6.2 


9.5 


12.9 


16.4 


20.1 


23.1 


65 























3.1 


6.3 


9.7 


13.2 


16.8 
13.4 


20.5 


24.4 


70 

























3.2 


6.5 


9.9 


17.1 


20.9 


75 



























3.2 


6.6 


10.1 
6.7 


13.7 
10.3 


17.4 
13.9 
10.5 
7.0 




80 



























3.3 


85 































3.4 




6.8 
3.4 




90 




























95 






















100 





























(2) 分段盐 析时, 要考虑 到每次 分段后 蛋白质 浓度的 变化, 蛋白 质浓度 的不同 要求盐 
析的饱 和度也 不同。 一种蛋 白质如 经二次 盐析, 第一次 盐析分 离范围 比较宽 ,第二 次分离 
范围 较窄。 如胆 碱酯酶 第一次 硫酸按 盐析的 饱和度 范围为 35% 至 60%, 第 二次为 40fo 
至 60%。 脱 氧核糖 核酸酶 第一次 硫酸铵 盐析的 饱和度 范围为 20% 至 40%, 第二 次则为 
30% 至 40%。 

(3) 为了 获得实 验的重 复性, 盐析的 条件如 pH 值温度 和硫酸 铵的纯 度都必 须严加 
控制。 

盐析后 一般需 放置半 小时至 1 小时, 待沉淀 完全后 才过滤 离心, 过早的 分离将 影响收 
率, 低浓度 的硫酸 铵溶液 盐析后 固液分 离常采 用离心 方法, 高 浓度硫 酸铵溶 液则常 用过滤 
方法。 因高浓 度硫酸 铵的密 度太大 ,蛋白 质要在 悬浮液 中沉降 出来, 需要较 高离心 速度和 
长时间 的离心 操作, 故 采取过 滤法较 合适。 

• 59 • 



4. 硫酸 铵盐析 的实例 

例 (1) 血 清中各 主要蛋 白质组 份的盐 析分离 

100 毫 升血清 + 100 毫升 PBS** • • 

1 滴加 200 亳 升饱和 硫酸铵 (pH 7.2) 



I i 

上^ 液 沉淀 再溶于 PBS 中, 使 体积达 100 毫升 

含 清蛋白 (Ab) I 滴加 25 毫升饱 和硫酸 铵约达 20% 饱和度 

\ i 

上清液 沉淀 含纤维 蛋白质 (很 少量) 

1 滴加 18 — 25 毫升饱 和硫酸 按使达 30 — 33% 饱和度 



\ 

上清液 沉淀 主要含 > "- 球蛋白 和少量 |8- 球蛋白 

滴加 35 — "10 毫升饱 和硫酸 1 

按约达 45% 饱和度 溶于 pb\ 中使体 积达到 100 毫升 



上 清液为 《- 球蛋 沉淀 主要为 球蛋白 
白 及小量 清蛋白 (混 杂少量 "及 r- 球 蛋白) 
和 P 球蛋白 I 



滴加 43 — 50 毫升饱 和硫酸 
按约达 30 — 33% 饱和度 



i 上 清液为 沉淀为 r- 球蛋白 重复上 ;去 

溶于 PBS 中 使体积 |3- 球蛋白 1 一 2 次得 r- 球蛋白 更;: 电 

达 10Q 毫升 

滴加 43 — 5Q 毫 升饱和 硫酸铰 
约达 30 — 33% 饱和度 



上清液 沉淀 为少量 r- 球蛋白 



滴加 30 — 40 毫 升饱和 硫酸铵 
约达 45% 饱和度 



Jt 清 液少量 《 -球 沉淀为 /3- 球蛋白 
蛋白及 清蛋白 

** PBS 为 碟酸缓 冲液, 0.2A/, pH 7.2 并 加入氯 化纳至 0.15M。 
例 (2) 高活 性组织 蛋白薛 C (二肽 酷氨基 肽醒) 的 分段盐 析制备 [ s ] 
^^脾5 公斤(除去脂肪肋膜) 

-15-C 冻硬, 绞碎、 室温 融化, 再在 ― 15°c 冻硬, 反 复冻融 四次。 然 后加入 10 升冷蒸 1S 水 
— 4°C 浸泡 半天, 盐酸 (重蒸 ) 酸化至 pH4.0, 1 小吋后 过滤。 

液 (SQOO 毫升) 

\ 加固 体硫酸 按粉末 560 克, 沉淀, 0°C 过滤, 沉淀, 离心 压紧。 

沉淀 ' 

溶于二 倍体积 PH4.0, 0.1M 柠樣 酸缓冲 液中。 离心得 抽提液 720 毫升, 加饱 和硫酸 按溶液 
(pH4.0) 至 50% 饱 和度, (TC 过滤。 

滤液 (850 毫升) 

\ 加入 硫酸按 粉末至 7.0% 饱 和度, 放置 2 小吋后 0°C 离心, 沉淀为 50—70% 饱和度 硫酸铁 部分。 
沉淀 ' 

I 溶 于少量 3% 氯 化钠中 (少量 分批, 每次 不超过 5 毫升) 放 在锥形 瓶中, 60°C 水 浴加热 20 分钟, 
I 加热 后立即 用冰水 冷却, 0°C 离心, 得 上清液 44 毫升 

上清液 

i 加硫酸 按粉末 至沉淀 完全, 然后对 pH 5.6, 0.02Af 磯酸纳 缓冲液 0°C 透析 过夜。 
透 析液上 DEAE- 葡聚 糖凝胶 A-5 (C1-) 柱 (先用 pH 5.6 0.02M 碑酸纳 缓冲液 平銜) 
|pH 5.6 0.02M 碟酸 钠缓冲 液洗脱 

收集第 一峰活 性部分 

加入 硫酸按 使蛋白 质全部 沉淀, 然后对 PH4.0, 0.005Af 柠檬酸 纳缓冲 液透析 最后得 透析液 4 

毫升。 



• 60 • 



透 析液在 0°C 上 Sephadex G200 柱 

(6 克 Sephadex G200 置于 pH 4.0, 0.005M 柠樣 纳缓冲 液中, 冰 箱存放 待完全 胀开) 
j 以 pH4.0, 0.005M 柠椽 酸缓冲 液展开 

收 集第一 峰活性 部分, 共得 20 毫升 (含 蛋白质 30 毫克, 比活为 214 单位 / 毫克) 

jo°c 下 对蒸馄 水透析 

透析 液再上 Sephadex G200 柱 
I 0=C 用蒸溜 水展开 

收集第 一峰活 性部分 ' 
(比 活为 310 单位 / 毫克) 

(二) 硫酸 盐析法 

在很 早以前 巳有人 用硫酸 钠来分 离血清 中的蛋 白质, 但由 于其盐 析效果 不如硫 酸按, 
因而 应用范 围也不 及硫酸 按盐析 广泛。 其操 作方法 如硫酸 铵盐析 一样, 这 里不另 赞述。 
硫酸钠 在不同 温度下 的溶解 度见表 3-5。 



表 3-S 不 同温度 下硫酸 钠的溶 解度' 



温度 Cc) 





10 


20 




30 


32 


溶解度 (克 / 升) 


13.8 


18.4 


24.8 


28.2 


32.6 


34.0 



硫酸钠 应用于 蛋白质 分段盐 析举例 如下: 

«: 使用硫 酸纳提 取较纯 IgG (免 疫球 蛋白) 

100 毫 升血清 十 100 毫升 PBS (0.2M, pH 8.0) 



加 36 克 硫酸纳 使最后 浓度达 18% 
i 

离心 取沉淀 再将沉 淀溶于 80 毫升 PBS 中 

离心 取上清 液加入 9.6 克 硫酸钠 使最后 浓度达 12% 
I 

离 心取沉 淀溶于 40 毫升 PBS 中 
i 

离 心取上 清液, 加入 4.8 克 硫酸纳 使最后 浓度达 12% 
i 

离心得 沉淀为 IgG (免 疫球 蛋白) 透析 脱盐得 较纯的 IgG 

(H) 其它 中性盐 应用于 蛋白质 的盐析 

例如: 用低浓 度氯化 钠沉淀 DNA 核蛋 白质, 用低浓 度硫氰 化钾沉 淀人脐 干扰素 
等 [ 11 】 。 但 没有硫 酸铉应 用那样 广泛。 

第三节 有 机溶剂 沉淀法 、 

一、 基 本原理 

有机溶 剂对许 多能溶 于水的 小分子 生化物 质以及 核酸、 多糖、 蛋 白质等 生物大 分子都 



能发 生沉淀 作用。 有机 溶剂的 沉淀作 用主要 是降低 水溶液 的介电 常数, 如 20°C 时 水的介 
电 常数为 80, 而 82 乙 醇溶液 的介电 常数为 40。 溶液 的介电 常数减 少就意 味着溶 质分子 
异性 电荷库 仑引力 的增加 从而使 溶解度 减少。 这一点 可以从 静电学 的库仑 定律中 得到阐 
明。 在库仑 定律的 公式中 带电离 子基团 之间作 用力随 着介电 常数的 减少而 增大, 离子之 
间不断 接近, 两带 电基团 的距离 也随之 减少, 因此 带电溶 质便互 相吸引 凝集。 对于 具有表 
面水层 的生物 大分子 来说, 有机溶 剂与水 的作用 不断使 这些分 子表面 水层厚 度压縮 ,最后 
使 这些大 分子脱 水而相 互聚集 析出。 不 同溶质 的沉淀 要求不 同浓度 的有机 溶剂, 是有机 
溶剂分 歩沉淀 的理论 基础。 

有机溶 剂沉淀 法的优 点是: (1) 分 辨能力 比盐析 法高, 即一种 蛋白质 或其他 溶质只 
有在 一个比 较窄的 有机溶 剂浓度 范围内 沉淀。 (2) 沉淀不 用脱盐 ,过 滤比较 容易。 (3) 在 
生化 制备中 应用比 盐析法 广泛。 其缺点 是对某 些具有 生物活 性的大 分子, 如酶, 容 易引起 
变性 失活, 操作 常需在 低温下 进行。 

二、 有机溶 剂的选 择及浓 度计算 . 

用 于生化 制备沉 淀的有 机溶剂 的选择 首先是 能和水 混溶。 使用 较多的 有机溶 剂是乙 
醇、 甲醇、 丙酮。 还有二 甲基甲 酰胺、 二甲基 亚砜、 乙腈和 2- 甲基 -2, 4- 戊二醇 (MPD) 
等。 作为 核酸、 糖类、 氨 基酸和 核苷酸 等物质 的沉淀 剂最常 用的是 乙醇, 对 于蛋白 质和酶 
的 沉淀, 乙醇、 甲醇 和丙酮 都可以 使用, 但甲醇 和丙酮 对人体 有一定 毒性。 总的来 说蛋白 
质的 有机溶 剂沉淀 法不如 盐析法 普遍。 核 酸的有 机溶剂 沉淀, 除了乙 醇外, 异 丙醇和 《-二 
氧 基乙醇 也常被 采用。 . 

其他一 些有机 溶剂如 二甲酰 甲醜胺 、二甲 基亚砜 、乙 腈以及 氯仿、 乙醚等 ,作为 沉淀剂 
其 应用的 对象及 条件, 则必须 根据不 同具体 情况而 选择。 

进行有 机溶剂 沉淀时 ,欲使 原溶液 达到一 定的有 机溶剂 浓度, 需 加入的 有机溶 剂的浓 
度及体 积可按 下公式 计算: 

、 V = V。(S2 — Si)/(100— S2) 

式中 : 

V = 需加人 100% 浓度有 机溶剂 的体积 C 
Vo = 原溶液 体积。 

51 = 原溶液 中有机 溶剂的 浓度。 

52 = 所 要求达 到有机 溶剂的 浓度。 ' 



种 组份 的浓度 



原 来浓度 



要求 的浓度 



i 需要混 合的量 



96% . 



750/0- 



^^^^^ = 5 份 
80% 96- 80= 16 份 



一 种组份 的浓度 


需要混 
合的量 


原 来浓度 


要求 的浓度 




40?^ 96 -40 = 56 份 



• 62 . 



图 3-6 —种 组份溶 剂的比 例图解 计算法 



表 3-6 制备 较低浓 度乙酵 1 升所需 较高浓 度乙酵 及水的 用量表 (毫 升, 20°C) 



得混 合液的 

t % (V/V) 


95 


90 


85 


80 


75 


70 


65 


50 


55 


50 


45 




35 


30 


25 


20 


15 


10 


50 
953 


100 


水 


950 
62 


900 
119 


850 
174 


228 


750 
282 


700 
334 


650 
385 


600 
436 


550 
■187 


500 
537 


■150 
585 


-! 00 
633 


350 
681 


300 
727 


250 
772 


200 
S17 


150 
862 


100 
908 


95 


水 




947 
61 


895 
119 


842 
176 


789 
233 


737 
288 


684 
344 


632 
397 


579 
451 


526 
504 


556 


•121 
608 


368 
658 


316 
708 


263 
756 


211 
805 


158 
852 


105 
901 


53 
950 


90 


醇 
水 






994 
62 


889 
122 


833 
182 


778 
241 


722 
299 


667 
357 


611 
■114 


556 
471 


500 
526 


580 


389 
635 


333 
687 


27S 
739 


222 
791 


167 
842 


111 

894 


56 
947 

59 
943 

63 

939 


85 


水 








9-11 
65 


882 
128 


824 
190 


765 
252 


706 
313 


647 
374 


588 
434 


529 
493 


471 

552 


-112 
609 


353 
665 


294 
721 


235 
776 


176 
832 


118 

887 


80 


水 










938 
67 


875 
134 


813 
200 


750 
265 


688 
330 


625 


563 


500 
520 


438 
581 


375 
6" 


313 
701 


250 
760 


188 
819 


125 

879 


75 


m 

水 












933 
71 


867 
HI 


800 
211 


733 
280 


667 
349 


600 
417 


533 
483 


467 
550 


400 
614 


333 
678 


267 
742 


200 
806 


133 
870 


76 
929 

77 
929 


70 


m 

水 














929 
76 


857 
150 


786 
225 


714 
298 


643 
371 


571 
443 


500 
514 


429 
584 


357 
653 


286 
722 


214 
790 


143 
860 


65 


水 
















923 
81 


846 
160 


769 
240 


692 
319 


615 
396 


538 
473 


462 
548 


385 
624 


308 
698 


231 
773 


154 

848 


77 

923 

83 
917 


60 


m 

\3tf- 
水 


















917 
87 


833 
173 


750 
258 


667 
343 


583 
426 


500 
509 


417 
591 


333 
672 


250 
753 


167 
835 


55 


m 

水 




















909 
94 


817 
187 


727 
279 


636 
370 


545 
461 


455 
551 


364 
640 


273 
730 


182 
819 


91 
909 


50 


艇 

水 






















900 
103 


800 
204 


700 
305 


600 
405 


500 
504 


400 
603 


300 
701 


200 
800 


100 

900 

111 

889 


45 


水 
























889 
113 


778 
225 


667 
336 


556 
447 


444 
557 


333 
667 


222 
778 


40 


水 


























875 
126 


750 
252 


625 
376 


500 
500 


375 
625 


250 
750 


125 
875 


35 


疏 

水 




























857 
144 


714 
286 


571 
429 


429 
571 


286 
714 


143 
857 


30 


水 






























833 
167 


667 
333 


500 
500 


333 
667 


167 

S33 

200 

800 

250 
750 

333 
667 


25 


醇 

水 
































soo 


600 
400 


400 
600 


20 


醇 
水 
































750 
250 


500 
500 


15 


醇 
水 




































667 
333 


10. 


醇 
水 






































500 
500 



- 63 - 



100 指加 入的有 机溶剂 浓度为 100%, 如 所加入 的有机 溶剂的 浓度为 95%, 上式 
(lOO-SO 项 应改为 (95-S2)。 

上式的 计算由 于未考 虑混溶 后体积 的变化 和溶剂 的挥发 情况, 实际上 存在一 定的误 
差。 如有机 溶剂浓 度不要 求太精 确时, 可用 简单的 图解方 法求出 "2] (见图 3-6)。 有时为 
了 获得沉 淀而不 是进行 分离, 可用溶 液体积 倍数如 一倍、 二倍、 三 倍等来 表示。 

表 3-6 是制 备不同 浓度乙 醇溶液 所需较 高浓度 乙醇及 水的用 量表" 3] 。 



多数 蛋白质 在乙醇 一水混 合液中 的溶解 度随着 温度的 降低而 降低, 对 于其他 物质也 



(一) 样 品浓度 

样品 浓度对 有机溶 剂的影 响与盐 析情况 相似, 低 浓度样 品使用 有机溶 剂的量 大但共 
沉作 用小, 利于提 高分离 的效果 ;但 低浓度 样品损 失较大 (即回 收率小 ), 具 有生理 活性的 
样 品易产 生稀释 变性。 反 之高浓 度样品 可以节 省有机 溶剂, 减 少变性 危险, 但共 沉作用 
大, 分 离效果 较差。 一般认 为蛋白 质最初 浓度为 5 — 20 毫克 / 毫升, 粘多糖 1 一 2% 范围较 
为合适 ,再加 上选择 适当的 PH 值, 进行分 段沉淀 ,即 可获得 较好的 结果。 

(三) pH 值 

在 样品结 构稳定 范围下 选择溶 解度最 低处的 pH 值, 有 利于提 高沉淀 效果。 另外, 适 
宜的 pH 值也可 大大提 高分离 的分辨 能力。 例 如上海 生化制 药厂用 乙醇分 段沉淀 糖蛋白 
绒 膜激素 (HCG) 时, 蛋白质 浓度为 1%, 乙醇 浓度为 55fc, —部分 HCG 产生 沉淀, 但 
不 完全。 加入一 定醋酸 铁后, 乙醇浓 度增至 66% ,但没 有产生 沉淀, 再结 合调整 pH 至 5.7 
附近, HCG 则在 非常狭 窄的乙 醇浓度 下沉淀 下来。 

(四) 金 属离子 的影响 

一些 多价阳 离子如 Zn2+ 和 Ca2+ 在一定 pH 值 下能与 呈阴离 子状态 的蛋白 质形成 



三、 有 机溶剂 沉淀的 影响因 素及注 意事项 



(一) 温度 




图 3-7 低 温有机 溶剂沉 淀装置 



大致 如此。 值得 注意的 是大多 数生物 分子如 
蛋 白质、 薛和核 酸在有 机溶剂 中对温 度反应 
特别 敏感, 温 度稍高 即发生 变性。 因此, 加入 
的 有机溶 剂都必 须预冷 至较低 温度, 操作要 
在 冰浴中 进行, 同时加 入有机 溶剂必 须缓慢 
而且不 断搅拌 以免溶 剂局部 过浓。 一 种低温 

下 使用有 机溶剂 沉淀装 置如图 3-7 所示 [ " 】 。 

有 机溶剂 沉淀一 些小分 子物质 (如核 苷酸、 氨 
基酸、 生物碱 及糖类 等), 其温 度要求 没有生 
物大分 子那样 苛刻。 这 是因为 小分子 物质结 
构比较 稳定, 不易 破坏。 但低 温对于 提高沉 
淀效果 仍是有 利的。 



复 合物, 这种复 合物在 水中或 有机溶 剂中的 溶解度 都大大 降低, 而不 影响蛋 白质的 生物活 

性。 如使用 0.005A/ 至 0.02M 的 Zn2+ 可 以使原 来沉淀 蛋白质 的有机 溶剂用 量减少 

- 至 • ^,这 在工 业上很 有实用 价值。 但使用 此一方 法时, 需事 先加有 机溶剂 除去杂 蛋白, 
3 2 

同时 在沉淀 后尽可 能避免 这些离 子残存 于蛋白 质中。 如使用 Zn2+ 时, 蛋 白质溶 液中则 
不能 含有碟 酸盐, 以免产 生碟酸 锋沉淀 不易与 蛋白质 分开。 

钙与锌 离子的 存在, 也可 提高粘 多糖乙 醇分歩 沉淀的 效果, 二价钡 离子也 有同样 作用。 

(五) 离 子强度 的影响 

离 子强度 是影响 溶质在 有机溶 剂及水 混合液 中溶解 度的一 个重要 因素, 盐的 浓度太 
小或 太大都 对分离 有不利 影响, 对于蛋 白质和 多糖, 在 有机溶 剂中盐 的浓度 不超过 5fc 比 

较 合适, 使用的 乙醇量 也以不 超过二 倍体积 为宜。 

有 机溶剂 沉淀所 应用的 对象是 比较广 泛的。 许 多种类 的生化 物质, 只 有选用 合适的 
有机 溶剂, 注意调 整样品 浓度、 温度、 PH 值 和离子 强度, 使 这些因 子综合 地发挥 作用, 都 
可以获 得较好 的实验 结果。 有机 溶剂沉 淀所得 的固态 样品, 如果不 是立即 溶解进 行第二 
步分离 ,则应 尽可能 抽干, 减 少沉淀 中有机 溶剂的 含量, 以免影 响样品 的生物 活性。 

四、 有机溶 剂沉淀 法实例 

例 (一) : 血浆一 乙醇 分步沉 淀法" 5] [Cohn 方法 6] 

血 浆 
I 

乙醇 8%, pH7.2, 温度一 3°C, ― 
离 子强度 0.14, 蛋白 质浓度 5.1% 



上清液 I 沉淀 I(PI) 



乙醇 25%, PH6.9, 温度 一 5°C, 
离 子强度 0.09, 蛋白 质浓度 3.0% 



上清液 II + III 沉淀 II + ni(pii + III) 



乙醇 18%, pH5.2, 温度 - 5>t: 
离 子强度 0.09, 蛋白 质浓度 1.6% 



上清液 IV-1 沉淀 IV-1 (FIV-1) 



乙醇 40%, PH5.8, 温度 一 5°C 
离 子强度 0.09, 蛋白 质浓度 1.0% 



上清液 IV-4 沉淀 IV-4(PIV-0 



. 65 . 



乙醇 40%, pH4.8, 温度一 5°C 
离 子强度 0. 11, 蛋白 质浓度 0. 8% 



1 

沉淀 V(PV) 

i 

乙醇 10%, pH4.5, 温度 一 3力 
离 子强度 0.1, 蛋白 质浓度 3% 

i 1 

上清液 不纯物 

乙醇 40%, PH5.2, 温度一 5°C 
离 子强度 0.01, 蛋白 质浓度 2.5% 

I 

i \ 

上清液 清蛋白 (Jfe 度 95%) 

附: [方法 6] 乙 醇分歩 沉淀有 关条件 及组份 的分析 



1. [方法 6] 分离 的条件 及各阶 段蛋白 质浓度 的測定 



""^"^"^^条 件 

、\\ 


pH 


离 子强度 


温 度 

[。c] 


乙 醇浓度 
[%] 


蛋白 质浓度 
[克 /100 毫升] 


原血装 


7.4 


0.16 






6.03 


PI 


7.2 


0.16 




8 


5. 11 


PII + III 


6.8 


0.09 




25 


3.00 


PIV-1 




0.09 




18 


1.58 


PlV-4 


5.8 


0.09 




40 


1.01 


PV 


4.8 


0.11 




40 


0.75 


SV 


4.8 


0.11 


—5 


40 


0.2 











2. [方法 6] 各分 离阶段 蛋白质 组份电 泳分析 





Alb 




/3 


4> 


r 


收量 [%] 
















原血漿 


56 


13 


16 


3.8 


11 


100 


PI 


5.8 


S.8 


15 


62 


S.3 




I'll + III 


4.5 


5.8 


4S 


53 




29 


PIV-1 





88 


9.8 









MV-4 


15 


47 


38 








8.8 


PV 


95 


4.1 


0.9 








48 


SV 


40 


20 


40 


n 





1.5 



上清液 vO) 



• 66 • 



3. [方法 6] 各分 爽阶段 分离条 件图解 (图 3-8) 



M (二) 小牛胸 腺核组 蛋白, 全组蛋 白和组 蛋白各 组份的 分离" SI 

小牛 8^ 腺 (100 克) 

0.9% NaCl 0.05M NaHSO, (pH3.5) 洗涤 匕次 



y 

核 组蛋白 



0.25A' HCI 抽提 



上清液 



10% GuCl 的 25% 乙 醇抽提 



乙醇 - 1.25A/ HC1 抽提 



上清液 



8 倍体积 

丙 詷沉淀 



全 组蛋白 
(1,700 毫克) 



上漳液 

对乙 醇透析 



I 

沉淀 



浓 HC1,1.75 

体 积丙酮 



0.25iV HC1 
抽提 



上清液 沉淀 ^ I 

I F3 上清液 残 澄弃去 

300 毫克 
3 倍体积 3 倍体积 

丙銅 



丙銅 



上清液 沉淀 F„i 
丙酮 50 毫克 

, 沉淀 

345 毫克 



Fj,i 
600 毫克 



i 1 

上清液 沉淀 F,50() 毫克 



\ 2 倍体 积丙爾 

520 毫克 

注: Fi、 F„i、 F,a,、 F,b 和 F3 为 Johns 和 Butler 对组蛋 白的分 类系统 [见 Prog. Biophys. 
Mol. Biol, 18, 209 (196S)] 



例 (三) 多糖类 的分离 

多糖 类的水 溶液加 人等量 或倍量 的乙醇 (或用 丙酮和 甲醇代 替), 可以 破坏多 糖颗粒 
的水化 膜及降 低溶液 的电解 常数, 使多糖 沉淀而 析出。 含有 糖酸酸 或硫酸 基团的 多糖, 可 
以在其 盐类溶 液中直 接加入 乙醇, 则多 糖以盐 的形式 沉淀。 如在其 醋酸或 盐酸溶 液中加 
人 乙醇, 则多糖 以游离 酸形式 沉淀。 乙醇分 歩沉淀 右旋糖 軒例子 如下: 



67 



PV(O.ll) 


? PN-4 

Pn— ni(o.o9) 


1 

7 


\PI(0.14) 
\(0.16) 



4.8 5.2 5,8 6.8 7.2 



pH 

图 3-8 各分 离阶段 分离条 件图解 



〔%〕 «5«*r2 



12% 右 旋糖酐 

37. 5 — 38. 5% 乙醇 



上清液 沉淀 

38.5 — 42. 5% 乙醇 分子量 18 万以 上的右 旋糖軒 



上清液 

I 45% 乙醇 



沉淀 

分子量 4. 5 — 7 万的右 旋糖肝 



上清液 

60% 乙醇 



上清液 



沉淀 

分子量 2. 5 — 4.5 万的右 旋糖肝 



沉淀 - 
分 子量为 1 一 2. 5 万的右 旋糖軒 



第四节 等电点 沉淀法 

等电 点沉淀 法主要 利用两 性电解 质分子 上的电 中性时 溶解度 最低, 而 各种两 性电解 
质 具有不 同等电 点而进 行分离 的一种 方法。 氨 基酸、 核苷酸 和许多 同时具 有酸性 及誠性 
基团的 生物小 分子, 以及蛋 白质、 酶、 核酸等 生物大 分子都 是一些 两性电 介质。 在 处于等 
电 点时的 pH 值, 再 加上其 他沉淀 因素, 则很 易沉淀 析出。 如 不加其 他沉淀 因素, 带有水 
膜的大 分子如 蛋白质 等仍有 一定溶 解度, 不 易沉淀 析出。 另 许多蛋 白质的 等电点 十分接 
近, 单独使 用此法 效果不 理想, 分辨率 也差。 一般 用于提 取液中 除去杂 蛋白, 如在 工业上 
生产胰 岛素时 ,在粗 提取液 中先调 PHS.O 去碱性 蛋白质 ,再调 pHS.O 去酸 性蛋白 (以上 
均常 加人一 定有机 溶剂以 提高沉 淀效果 )。 利 用等电 点除杂 蛋白方 法须事 先了解 所制备 
的物 质对酸 碱的稳 定性, 不然, 盲 目使用 是很危 险的。 不少 蛋白质 与金属 离子结 合后, 等 
电点 会发生 偏移, 如胰 岛素等 电点为 5.3, 与 Zn2+ 结合后 ,形成 膀岛素 锋盐, 其等 电点度 
为 6.2, 故加 人金属 离子后 选择等 电点沉 淀时, 必须注 意调整 pH 偟。 等 电点法 常和盐 
析法、 有机 溶剂法 或和其 他沉淀 剂一起 使用, 以提高 其沉淀 能力。 



第五节 生 成盐类 复合物 沉淀法 

生物大 分子和 小分子 都可以 生成盐 类复合 物沉淀 ,此法 一般可 以分为 (1) 与 酸性功 
能团 作用的 金属复 合盐法 (如 铜盐、 银盐、 锋盐、 铅盐、 锂盐、 f5 盐等 ), (2) 与滅性 功能团 
作用的 有机复 合盐法 (如苦 味酸盐 、苦酮 酸盐、 丹宁 酸盐等 ), (3) 无机复 合盐法 (如碗 
酸盐、 磯钼 酸盐等 )。 以上 盐类复 合物都 具有很 低的溶 解度, 极容 易沉淀 析出, 若沉 淀为金 
属复 合盐, 可通以 H2S 使金属 变成硫 化物而 除去, 若为 有机盐 酸盐、 磯^ 酸盐, 则 加入无 
机酸并 用乙醚 萃取, 把有 机酸, 碟^ 酸等移 入乙醚 中除去 ;或 用离子 交换法 除去。 但值得 
注意 的是, 重 金属、 某些 有机酸 与无机 酸和蛋 白质形 成复合 盐后, 常 使蛋白 质发生 不可逆 
的沉淀 ,应用 时必须 谨慎。 

. 68 • 



(― ) 金属复 合盐法 

许多有 机物包 括蛋白 质在内 ,在碱 性溶液 中带负 电荷, 都能与 金属离 子形成 沉淀。 所 

用 的金属 离子, 根据 它们与 有机物 作用的 机制可 分为三 大类。 第一 |1 包括 Mn2+、 Fe 2 +、 
Co 2 +、 Ni 2 +、 Cu 2 +、 Zn 2 + 和 Cd 2 +, 它 们主要 作用于 羧酸、 胺及 杂环等 含氮化 合物。 第二 
类包括 Ca2+、 Ba2+、 Mg2+ 和 Pb2+, 这些金 属离子 也能和 羧酸起 作用, 但 对含氮 物质的 
配基 没有亲 和力。 第 三类金 属包括 Hg2+、 Ag+ 和 Pb2+, 这 类金属 离子对 含硫氢 基的化 
合 物具有 特殊亲 和力。 蛋 白质和 醒分子 中含有 羧基、 氨基、 咪吨基 和硫氧 基等, 均 可以和 
上述金 属离子 作用形 成盐复 合物。 但复 合物的 形式和 种类则 依照各 类金属 离子和 蛋白质 
的 性质, 溶 液离子 强度和 配基的 位置等 而有所 不同。 关于蛋 白质一 金属复 合物形 成的机 
理, Gurd 和 Wilcox 等曾作 过全面 论述" ",读 者有兴 趣时, 可 进一步 査阅。 

蛋 白质一 金属复 合物的 重要性 质是它 们的溶 解度对 介质的 介电常 数非常 敏感, 调整 
水溶 液的介 电常数 (如加 入有机 溶剂) ,用 Zn2+, Ba2+ 等金属 离子可 以把许 多蛋白 质沉淀 
下来, 而所 用金属 离子浓 度约为 0.02M 左右 即可。 金属离 子复合 物沉淀 也适用 于核酸 

^ 或其他 小分子 ,例如 0.01A/ 的 Ca 2 + 或 Mg 2 + 在 室温下 可以完 全沉淀 PolyA 和 PolyU 

^ 金属离 子沉淀 氨基酸 ,多肽 及有机 酸等。 详见 实例。 

(二) 有 机盐法 

含氣有 机酸如 苦味酸 、苦 酮酸、 鞣酸 等都能 与有机 分子的 碱性功 能团形 成复合 物而沉 
淀 析出。 但这 些有机 酸与蛋 白质形 成盐复 合物沉 淀时, 常常发 生不可 逆的沉 淀反应 ,工业 
上应用 此法制 备蛋白 质时, 需 采取较 温和的 条件, 有时还 加入一 定的稳 定剂, 以防 止蛋白 
质 变性。 

近 年来应 用一种 P 丫 U 定染料 雷凡诺 (2- 乙氧基 - 6,9- 二氨基 P 丫啶乳 酸盐, 2- ethoxy- 6, 9- 
diaminoacidine lactate), 虽然 其沉淀 机理比 一般有 机酸盐 复杂, 但其 与蛋白 质作用 也主要 

是通过 形成盐 的复合 物而沉 淀的。 此种染 料据报 导时提 纯血浆 中 > ^-球 蛋白有 较好效 

果"" 。 实际应 用时以 0.4% 的雷凡 诺溶液 加到血 楽中, 调 pH 7.6— 7.8, 除 球蛋 白外, 
可将血 浆中其 他蛋白 质沉淀 下来。 然后以 5f。 浓度 NaCl 将雷凡 诺沉淀 (或 通过 活性炭 
柱或马 铃薯淀 粉柱吸 咐除去 )o 溶 液中的 0^- 球蛋 白可用 151。 乙醇 或加等 体积饱 和硫酸 
铵溶 液沉淀 回收。 使用 雷凡诺 沉淀蛋 白质, 不影响 蛋白质 活性, 并可通 过调整 pH 值, 分 
段沉淀 一系列 蛋白质 组份。 但蛋白 质的等 电点在 PH3.5 以下或 pH9.() 以上, 不 被雷凡 
诺 沉淀。 核 酸大分 子也可 在较低 pH 值时 (PH2.4 左右) ,被 雷凡诺 沉淀。 

(H) 无 机盐法 

一般 用于小 分子如 氧基酸 的分离 制备, 大分子 蛋白质 、酶 和核酸 则很少 使用。 
(四) 实例 

关于各 类生化 物质盐 类复合 物沉淀 法举例 如下: . 
实例一 雷凡 诺提取 免疫球 蛋白" ] 



• 69 • 



100 毫 升血清 + 69 毫升 蒸溜水 + 65 毫升雷 凡诺液 (3%, pH 7.5) + 1 滴辛酸 
\ 离心 



沉淀 (弃去 ) 上清液 

(十 11. 7 克氯 化纳使 浓度达 5%) 

1 离心 



雷凡 诺沉淀 上清液 

(+ 等体 积饱和 硫酸按 溶液) 

1 离心 



1 



沉淀 上清液 (弃去 ) 

(溶于 50 毫升水 中再加 入等体 积饱和 硫酸按 溶液) 

I 离心 

沉淀为 IgG (免 疫球 蛋白) 

实例二 鞣酸沉 淀法制 备菠萝 蛋白酶 * 

25 公斤 疲萝下 脚料, 经 压棒, 10%NaCI 抽提 二次, 共 得清液 12 升, 用柠 樣後调 pH4.5* 

i 

加入 0. 06% 二氧 化硫, 0. 02% 抗坏 血酸作 稳定剂 
i 

在搅 伴下缓 慢加入 0. 5% 鞣酸 至沉淀 完全。 
I 离心 

沉淀用 PH4.5, 0.02% 抗坏 血酸溶 液洗漆 数次, 除去 沉淀中 的鞣酸 (每次 洗涤后 离心) 
沉 淀干燥 后得菠 萝蛋白 酷成品 

• 选 自广西 南宁罐 头厂生 产工艺 

实例三 铜盐 沉淀法 制备谷 胱甘肽 

100 公 斤面包 酵母, 轧碎 后加入 硫酸, 乙醇 -乙链 混合液 10,000 毫升 * 
降温 30°C 以下, 搅 样抽提 30 分钟。 

I 抽滤 

滤液以 浓硫酸 调节到 0.5 当量 酸度' 
I 

约得 8 升 滤液在 40°C 保 温中, 边 搅拌, 边 加入约 4 克氧化 亚铜, 静置 20 分钟。 

j 过滤 - 
沉淀用 0.5W H,SO, 洗漆, 再 加蒸溜 水洗漆 数次, 直到 滤出液 与氯化 钡不产 生白色 沉淀。 

i 

刮下 无硫酸 根的谷 胱甘肽 铜盐, 加入 2 — 3 倍体积 的水, 使 溶解。 

通入 HzS 三 小吋, 抽滤, 得饱 和的硫 化氣谷 胱甘肽 滤液。 ' 
I 

通人 氮气, 除净滤 液中的 H,S 
I 布氏漏 斗抽滤 
滤 液加入 10 倍 左右的 丙酮, 冷 库放置 1 一 2 天 

i 

沉 淀物用 两倍冷 丙酮洗 几次, 千燥 后得谷 胱甘肽 产品约 100 克。 
* , 硫酸, 乙醇- 乙链混 合液的 配制: 在 耐酸缸 中加入 86% 乙醇 5000 毫升 (在 冰浴中 ), 逐 渐加入 浓硫酸 1000 毫升 
(使 温度 不超过 3(nO, 硫酸加 完后, 待液 温降至 10°C 以 下吋, 加 入乙链 4000 毫升。 
引自上 海酵母 厂的生 产工艺 
上 法用有 机溶剂 较多, 现多使 用热水 抽提, 上离 子交换 树脂柱 纯化, 产率 较高。 举此 



• 70 • 



例只 说明金 属盐沉 淀方法 而已。 

实例四 铜盐 法制备 L- 异白氨 酸 [2 " 

纯齿棒 状杆菌 CCorynel>acteri"m crenatum^ ASl.998 发酵液 1 升 (约含 】%L- 异白 氨酸) 
离心 (3500 转 / 分 ) 30 分钟 
上清液 

I 加 0.5 克 CuC03、 3H,0, 升温 溶解、 冷后过 

滤液 

j 加 6. 5 克 CuC03、 3H,0 溶解后 浓縮至 150 亳 升离心 
沉淀 

1 加水 煮沸。 溶 解后缓 慢冷却 
铜 盐溶液 

I 通入 气体、 过滤。 
滤液 

I 浓缩至 100 毫升, 调节 pH 至 6.0, 加二 倍体积 95% 乙醇, 静置 过夜, 离心。 
沉淀 

I 加水 250 毫升, 用 HCl 调节 pH 至 4.0, 加 活性炭 2 克, 煮沸 20 分钟, 过滤。 
滤液 

j 浓縮至 100 毫升, 用氣 水调节 pH 至 6.0, 加二 倍体积 95% 乙醇, 放置 过夜, 离心。 
■ 沉淀 

丄 70t; 烘干 
半成品 (6.5 克) 

I 加 170 亳 升水, 用 HC! 调节 pH 4.0, 加 活性炭 1 克煮沸 20 分钟, 过滤。 

滤液 ' 

i 浓缩至 100 亳升, 用氨 水调节 pH 至 6.0, 加二 倍体积 95% 乙醇, 静置 过夜。 离心。 
沉淀 

j7(ric 烘干 

精制品 (5 克) 



实例五 盐类 复合物 沉淀制 备酸性 及碱性 氨基酸 f2il 

蛋白 质盐酸 水解液 

去 除盐酸 及酸性 胡敏酸 



硫醇 盐沉淀 (胱 氨酸) 



低 氧化正 铜处理 

硫醇 盐溶液 
硫化 氣处理 



硫化铜 



I 

滤液 



酷氨 酸分离 



i 

酷氨酸 



i 

滤液 

丄第一 次石灰 ,乙 醇处理 



第一次 将酸性 氨基酸 f§ 予以 脱^, 
分离出 谷氨酸 、天门 冬氨酸 



将 滤液及 母液予 以脱^ 
及去乙 醇处理 



71 



第一 次碟钩 酸处理 

1 



第一 次将碱 性氨基 酸分离 



去除滤 液中沉 淀试剂 
分离难 溶的一 氣基酸 
生 成铜盐 
以 甲醇抽 提铜盐 



用 醇溶解 部份, 脱铜, 以乙 醇提取 

1 一―不 溶于乙 醇的一 氨基酸 
苦味 酸处理 提取液 

分离脯 氨酸苦 味酸盐 



簡 氧酸苦 味酸盐 



甲 醇不溶 解部份 

1 

冷水 提取, 脱铜 



溶 解于冷 水部份 不 溶于冷 水部份 



从滤液 中去除 苦味酸 



脱铜 



第二次 石灰, 乙 醇处理 



脱铜 



析出一 氨基酸 



第二次 从酸性 氨基酸 中分离 
出谷 氨酸, 天门 冬氨酸 



将滤 液脱^ 与去 除乙醇 
第二次 以碟锡 酸处理 



第 二次沉 淀碱性 氨基酸 



分离 出碱性 氨基酸 



去除 滤液中 的试剂 

i 

分离一 氨基酸 
干 滔母液 



第六 1? 选择 性变性 沉淀法 

这一 特殊方 法主要 是破坏 杂质, 保存目 的物。 其原 理是^ Ij 用蛋 白质、 酶 和核酸 等生物 
大 分子对 某些物 理或化 学因素 敏感性 不同, 而有选 择地使 之变性 沉淀, 使达 到分离 提纯的 
目的。 此 方法可 分为: 

(1) 利用 表面活 性剂或 有机溶 剂引起 变性。 如 制备核 酸时, 加人含 水酷、 氯仿、 十二 
院 基磺酸 钠等有 选择地 使蛋白 质变性 与核酸 分离。 

(2) 利用 对热的 稳定性 不同, 加热破 坏某些 组份, 而保存 另一些 组份。 如脱氧 核糖核 
酸酶对 热稳定 性比核 糖核酸 酶差, 加热 处理可 使混杂 在核糖 核酸酶 中的脱 氧核糖 核酸酶 
变性 沉淀。 又如由 黑曲霉 发酵制 备脂肪 酶时, 常 混杂有 大量淀 粉酶, 当把 混合粗 酶液在 



72 



水浴中 保温二 小时半 (pH 3 . 4 ), 90% 以上的 淀粉酶 将受热 变性而 除去。 热 变性方 
法简单 易行, 在制备 一些对 热稳定 的小分 子物质 过程中 ,除去 一些大 分子蛋 白质和 核酸特 
别 有用。 

(3) 选择性 的酸碱 变性。 在本章 第三节 中已述 及调节 PH 值 除去杂 蛋白的 方法。 利 
用酸、 碱变 性有选 择地除 杂蛋白 在生化 制备中 的例子 很多, 如用 2 .5fc 浓度 的三氯 醋酸处 
理胰蛋 白酶, 抑肽 藤或细 胞色素 C 粗提 取液, 均 可除去 大量杂 蛋白, 而对所 提取的 酶活性 
没有 影响。 有时还 把酸碱 变性与 热变性 结合起 来使用 ,效 果更为 显著。 但应 用前, 必须对 
制备物 的热稳 定性及 酸碱稳 定性有 足够的 了解, 切 勿盲目 使用。 例 如胰蛋 白酶在 pH 2.0 
的 酸性溶 液中可 耐极高 温度, 而且 热变性 后所产 生的沉 淀是可 逆的。 冷却 后沉淀 溶解即 
可恢 复原来 活性。 还 有些酶 与底物 或者竞 争性抑 制剂结 合后, 对 pH 值或 热的稳 定性显 
著增加 ,则可 以采用 较强烈 的酸碱 变性和 热方法 除去杂 蛋白。 

第七节 非离子 多聚物 沉淀法 

. 一、 基本原 理 [24,27] 

非离子 多聚物 是六十 年代发 展起来 的一类 重要沉 淀剂, 最早应 用于提 纯免疫 球蛋白 

(igG) 和沉 淀一些 细菌与 病毒, 近年来 逐渐广 泛应用 于核酸 和酶的 分离纯 化 [ 22'2 3] 。 这类 

非离 子多聚 物包括 各种不 同分子 量的聚 乙二醇 (Polyethylene Glycol 简写为 PEG), 壬苯 
乙 嫌化氧 (简 写为 NPEO), 葡 聚糖, 右旋糖 酐硫酸 纳等。 其中应 用最多 的是聚 乙二醇 ,其 
结构式 如下: 

CHj- (CHj— CH,— 0),— CH, 
OH OH 

根据 X 射线衍 射和红 外光谱 分析, 证明聚 乙二醇 具有螺 旋状的 结构。 聚乙二 醇亲水 
性强, 有 很广范 围的分 子量, 在生化 制备中 用得较 多的是 PEG 2000 — 6000, 分子 量超过 
20,000 以上 的聚乙 二醇, 则具有 很高的 粘性。 操作十 分不便 ,平 时很少 使用。 聚乙 二醇及 
其 他非离 子多聚 物应用 于生物 大分子 微粒病 毒和细 菌的沉 淀时, 其 效果与 沉淀剂 本身浓 
度有 关外, 还受 到离子 强度、 pH 和 温度等 因素的 影响, 例如, 用 PEG 沉淀蛋 白质, 使用 
PEG 的浓度 与溶液 中盐的 浓度常 呈反比 关系, 在固定 pH 值下, 盐浓度 越高, 所需的 PEG 
浓度 越低。 溶液 pH 值越 接近微 粒的等 电点, 沉淀微 粒所需 PEG 的浓度 越低。 其次, 使 
用 PEG 的分子 量大小 也与沉 淀效果 有直接 关系。 在一定 范围内 ,高分 子量的 PEG 沉淀 
的效力 较高。 此外, 如 使用的 PEG 分子量 和浓度 相同、 沉淀 效果与 被沉淀 微粒的 分子大 
小、 形状 有关。 以 上这些 现象, 到目前 为止, 仍 未找到 很合适 的理论 解释。 曾提出 的假设 
有如下 几种: (1) 认为沉 淀作用 是多聚 物与大 分子发 生共沉 作用。 (2) 多 聚物使 大分子 
在多聚 物与水 之间发 生分配 ,使 大分子 脱水而 沉淀。 (3) 多 聚物与 大分子 之间以 氢键相 
互作用 形成复 合物; 或由于 大分子 被多聚 物包埋 形成复 合物, 在重 力作用 下沉淀 析出。 但 
以上 假设都 没有充 分根据 支持。 最近 罗兰梯 (Laurent) 等基 于多聚 物的沉 淀作用 主要依 
赖于多 聚物的 浓度和 被沉淀 物的分 子大小 的众多 事实。 提出 PEG 的沉淀 机理主 要是通 

• 73 • 



过空 间位置 排斥, 使 液体中 的微粒 (包括 生物大 分子、 病 毒和细 菌等) 被迫挤 聚在一 起而引 

起沉淀 的发生 [25 '2 6] 。 根据上 述排斥 理论, 被 排斥的 体积、 其数 值应是 多聚物 的浓度 函数。 
如多聚 物的浓 度固定 以后, 微 粒的沉 淀则主 要和微 粒分子 大小、 形状、 带 电情况 有关。 而 

溶液的 温度、 pH 值和离 子强度 正是通 过影响 微粒分 子性质 而起作 用的。 对排斥 理论, 目 

前虽 有某些 异义, 但得 到较多 的实验 支持。 

水溶性 非离子 多聚物 的沉淀 方法, 近年来 在生化 制备应 用发展 迅速, 其主要 优点在 

于: 操作条 件温和 ,不 易引起 生物大 分子的 变性。 同时具 有极高 的沉淀 效能。 很 少量的 
非离子 多聚物 则可以 沉淀相 当多的 生物大 分子。 沉 淀后的 多聚物 也容易 除去。 因 此广泛 
应用于 细菌、 病毒、 核酸、 蛋 白质和 酶等多 种微粒 的沉淀 分离。 ' 

二、 应 用方法 和范围 

用非离 子多聚 物沉淀 生物大 分子和 微粒, 一般 有两种 方法: 一 是选用 二种水 溶性非 
离子多 聚物组 成液一 液两相 系统, 使 生物大 分子或 微粒在 两相系 统中, 不等量 分配, 而造 
成 分离。 这一方 法主要 基于不 同生物 分子和 微粒表 面结构 不同, 有不 同分配 系数。 并外 

加离子 强度, pH 值和 温度等 因素的 影响, 从 而扩大 分离的 效果。 二 是选用 一种水 溶性非 
离子多 聚物, 使 生物大 分子或 微粒在 同一液 相中, 由于被 排斥相 互凝集 而沉淀 析出。 对后 

一种 方法, 操作时 先离心 除去粗 大悬浮 颗粒, 调 整溶液 pH 值和 

温度至 适度, 然后 加入中 性盐和 多聚物 至一定 浓度, 冷处 n —段 
时间, 即形成 沉淀。 

非 离子多 聚物沉 淀法的 应用, 主要在 下列三 方面: 

(-) 细 菌和病 毒方面 的应用 

六十年 代初, 艾伯森 (Albemon) 等人 用此法 分离多 种细菌 
和 病毒, 他们以 葡聚糖 和聚乙 二醇作 为二相 系统, 经过逆 流分配 
操作 先后分 离了不 同株的 大肠杆 菌和烟 草花叶 病毒, 脊 髓灰白 
质炎 病毒, 牛痘 病毒和 echo 病毒等 [28] 以后, 国外 用聚乙 二醇沉 
淀分离 病毒和 噬菌体 研究的 报导越 来越多 [2 9 '3»'31 ] , 七十年 代我国 
科 学院有 关研究 所也先 后使用 此法分 离病毒 成功。 关于各 种病毒 和噬菌 体使用 PEG 沉 
淀所选 用的条 件见表 3-6。 沉淀 后所得 的含有 病毒沉 淀物, 可用 透析法 或逆向 PEG 梯度 
离心法 将病毒 分离, 制备性 的逆向 PEG 梯度组 成见图 3-9。 含 病毒的 PEG 沉淀 经离心 
后, 病毒在 适当的 PEG 浓 度下, 则被分 配在一 狭窄区 带内。 




图 3-9 制备 性逆向 PEG 
梯 度组成 



(二) 核 酸方面 的应用 

用 葡聚糖 和聚乙 二醇作 为二相 系统分 离单链 DNA、 双链 DNA 和多种 RNA 制剂, 
在六 十年代 也有过 报导。 近 十多年 来发展 很快, 特别 是用聚 乙二醇 沉淀分 离质粒 DNA, 
已相 当普遍 [32] 。 一般在 0.01A/ 碘酸缓 冲液中 加聚乙 二醇达 10% 浓度, 即可将 DNA 沉 
淀 下来。 在遗 传工程 中所用 的质粒 DNA 的 分子量 一般在 10 6 范围, 故 选用的 PEG 分 
子量 也常在 6000 ( 即 PEG 6000) 因它 易与分 子量在 10 6 范围的 DNA 结合而 沉淀。 



74 



§^ OS » 度 



I 




G 度 

^浓 



表 3- 7 用 PEG 和氣 化钠沉 淀各种 病毒的 条件' 



病 毒名称 


浓 


度 




PEG 分子量 


沉 淀作用 的条件 


氯化纳 (W) 


PEG (%) 


― 动 物病毒 














Echo 29 


0.15 


15 





15 


000 


pH 7.4,7.6 


爱浚斯 坦氏- 巴尔 氏病毒 


0.-15 


8 


• 


6 


000 




口蹄疫 病病毒 


0.15 


6 





20 


000 


0.02 A/ Tris 缓冲液 (pH 7.6) 


流 感病毒 


0.9 










盐水 (PH7.4) 






3 


•7 


6 


000 




麻 疹病毒 


0.4 


8 





6 


000 




多 瘤病毒 


0.5 


10 





6 


000 




劳斯 氏肉癍 


0.4 







6 


000 




. 风 疹病毒 


0.9 










盐水 (pH 7.^) 


猿 猴病毒 40 


0.5 


10 





6 


000 




二 植 物病毒 














苜啻花 叶病毒 


0.2 


8 





20 


000 


叶 匀浆在 0.2M 碟酸缓 冲液中 (pH 6.5) 
0.5mM 


苹 果绿叶 斑病毒 


― 


6 


5 


6 


000 


氯化镇 


菜 豆荚斑 驳病毒 


0.2 


8 





6 


000 




狼 把草斑 驳病毒 


- 


8 





6 


000 


0.5M 碟酸 缓冲液 (pH 7.5), 0.5%NaSO3, 
IM 尿素, 8% "- 丁醇 


雀 麦草花 叶病毒 


0.08 




^ 


6 


000 


pH 5.0 , 


a 豆花 叶病毒 


0.2 


-1 





6, 


000 


叶勾浆 22ec 


a 豆 褪绿斑 驳病毒 


0.24 


6 




6, 


000 


pH 5.0 


胡椒斑 驳病毒 


― 


8. 





6, 


000 


0.5M 磯酸 缓冲液 (pH 7.5), 0.5%NaSO,» 














IM 尿素 8%"- 丁醇 


马铃薯 Y 病毒 


― 


8. 





6,000 


同上 


11 草 ti 纹病毒 


― 


8. 





6,000 


pH 7.0 


菸草花 叶病毒 


0. 1 


4. 





6,000 


66mM 碟酸 缓冲液 (pH 7.0) 














5mA/ 琉 基乙醇 


菸草花 叶病毒 


0.3 







6 


000 




资草环 斑病毒 


0.3 


8. 





6 


000 




宪 菁黄花 叶病毒 


0.47 


6. 


7 


6 


000 


醋酸 缓冲液 (pH 6.0) 


白花 叶病毒 


― 


- 





6 


000 


0.1M 碑酸 缓冲液 (pH 7.5) 


三 分 枝杆菌 噬菌体 














丁酸分 枝杆菌 


0.5 


9 





6 


000 




草分 枝杆菌 


0.5 


6 





6, 


000 




路氏分 枝杆菌 (V72) 


0.5 


8. 





6, 


000 




P«H, 噬菌体 


0.5 







6, 


000 




Rn 噬菌体 


0.5 


6. 





6 


000 




T, 菌体 


0.2 


8. 




6 


000 




T, 噬菌休 


0.5 


6. 





6 


000 




0X17^ 1^ 菌体 


0.5 


10. 





6 


000 




; 1 噻菌体 


0.5 


10. 





6 


000 





(依照 VakU 所制 表格, 删 去部份 无关的 内容) 




(三) 蛋 白质和 酶方面 的应用 

Poison 等人 [33] 早在196 4 年已 开始使 用聚乙 二醇分 离纯化 免疫球 蛋白, 以后 关于这 



方面报 导逐渐 增多。 使用聚 乙二醇 的分子 量多为 2000 — 6000, 多数 认为使 PEG 6,000 沉 
淀蛋白 质较好 ,但 是近有 报导认 为低分 子量的 PEG 也获得 较好的 结果。 用 聚乙二 醇进行 
酶的沉 淀分离 ,有人 认为容 易引起 变性, 早 期应用 较少, 仅有 少数例 子如黄 素蛋白 乙醇氧 
化酶, 葡萄糖 -6- 磯酸 脱氢酶 等的分 离纯化 [2"。 最近又 有新的 发展, 如国内 从大肠 杆菌中 
制备 L- 天门 冬銑胺 酶和从 小牛肾 上腺中 制备葡 萄糖- 6- 碟酸脱 氢酶, 使用 了聚乙 二醇沉 
淀法, 获得 了很好 的效果 [ 3 6] 。 

三、 应 用实例 

关于 聚乙二 醇沉淀 分离方 法举例 如下: . 
实例一 水稻 普遍矮 缩病毒 的分离 



低温冰 冻病叶 300 克 



加 900 毫升, pH7.0,0.lM 碟 酸缓冲 液绞肉 机绞碎 J 
纱布 过滤, 70Q0 转 / 分离心 20 分钟。 



上清 沉淀 

加 2{)<~<25% (体 积比) 的 氯仿, 冰浴 搅拌或 分液漏 斗振动 5 分钟 3 
弃 去底部 白色糊 状物, 7000 转 / 分离心 2Q 分钟。 



上清 



上清 



加聚 乙二醇 (分 子量为 12, 000 或 6, 000) 到 6%, NaCl 
到 3%, 冰箱 过夜, 7000 转 / 分, 离心 20 分钟 



沉淀 



加 60 毫升 0.lA/, PH7.0 碟酸 缓冲液 
抽提 2QC0 转 / 分, 离心 20 分钟 



上清 
(三次 合并) 



沉淀 



重 复二次 



40,000 转 / 分 离心 60 分钟 



上清 



沉淀 



加少量 pH7.0,0.lA/ 碟 酸缓冲 液抽提 

lO'OOO 转 / 分 (离心 15 分钟) 



上清 



沉淀 



重 复二次 



上清 



沉淀 



病 毒制剂 
(约 1 毫升) 



76 



加聚 乙二醇 (§) 重 复一次 



实例二 小麦丛 矮病毒 抗原的 制备" 5】 

小 麦病苗 (鲜重 300 克) 



加 900 毫升 0.3A/ 甘氨酸 (G. 13) 内含 O.OliW MgCl, pH 8.0 缓冲液 (内 
加 NaN3 约 0.01%) 用绞肉 机或髙 速组织 拽碎机 绞碎, 双 重纱布 过滤。 

汁液 

3000-5000 转 / 分离心 10 — 15 分钟 



沉淀 



上清 



加 20% (体 积比) 氯 仿在分 液漏斗 中震摇 2 分钟, 弃去底 部白色 
糊 状物, 4000 转 / 分离心 20 分钟。 



沉淀 



上清 



加聚 乙二醇 (分 子量为 12, 000) 到 6%, NaCl 到 3%,攛 
伴均勾 置冰箱 过夜, 7000 转 / 分, 离心 20 分钟。 



上清 



沉淀 

加 0.1A/ 甘氨酸 MgCl 



约 3 倍体积 抽提, 



上清 
(三次 合并) 



沉淀 



40,000 转 / 分 
离心 60 分钟 



缓冲液 (pH 7.0) 
7000 转 / 分离心 20 分钟。 



重 复二次 



上清 



沉淀 



加少量 pH7.0 O.IM G. B 抽提 7000 转' 分 
离心 15 分钟 ' 



上清 
(三次 合并) 



沉淀 



重 复二次 



上清 

抗 原制剂 (1 勺 1 毫升) 



沉淀 



实例三 肾上腺 葡萄糖 -6- 确酸脱 氧酶的 分步沉 淀 [36] 

小牛肾 上腺体 在含有 琉基 乙醇, EDTA, 甘油 的碟酸 缓冲液 (pH 8.0) 中, 
勾装, 提取, 离心。 上清液 加入等 量含有 15% 乙醇的 醋酸缓 冲液中 (pH 4.5) 
进行 沉淀, 沉 淀所得 的醒, 再溶于 上述提 取用的 碟酸缓 冲液中 ,为 已提纯 10 倍比 
活力 = 3.0 的悬 浮液, 作为聚 乙二醇 沉淀的 起点。 

加入聚 乙二醇 (PEG-6000) 使 浓度达 9%, 
停留 5 分钟, 35,000Xg 离心 30 分钟。 



沉淀 
(比 活力 0.03) 



沉淀 
(比 活力 0.80) 



上清 

加入 PEG-6000, 使 浓度达 23%, 停 
留 5 分钟, 35,000 Xg 离心 30 分钟。 



上清 



加入 PEG-6000, 使 浓度达 33%, 留 
5 分钟, 35,000Xg, 离心 30 分钟。 



沉淀 

(比 活力 2.00) 



上清 

加入 PEG-6000, 使 浓度达 41%。 



沉淀 
(比 活力 5. 60) 



停 



沉淀 
(比 活力 6. 30) 



留 5 分钟, 35,000Xg 离心 30 分钟 C 
上清 

加入 PEG- 6000 使 浓度达 50%, 停 
留 5 分钟, 35, 000Xg 离心 30 分钟 



上清 



沉淀 
(比 活力 1.40) 



加入 PEG-6000, 使 浓度达 70%。 停 
留 5 分钟, 35,000xg 离心 30 分钟。 



上清 

(比 活力 ^0. 01) 



以上操 作均在 4°C 下搅伴 进行, 从图 解可见 酷活力 主要在 41<~50% 浓度的 
PEG 沉淀 部份。 沉 淀后的 PEG 可 以通过 DEAE- 纤 维素以 除去。 



第八节 其他 沉淀剂 

除上述 各节应 用较普 遍的沉 淀剂和 沉淀方 法外, 还有一 些沉淀 剂和沉 淀方法 只用于 
某 些物质 的沉剂 作用。 

一、 氨 基酸类 

例如 使用苯 偶氮苯 磺酸选 择性地 沉淀丙 氨酸和 丝 氨酸, 2, 4- 二硝 基萘酹 -7- 碟酸选 
择性地 沉淀精 氨酸, 二氨合 硫氰化 铬铁选 择性地 沉淀脯 氨酸和 经脯氨 酸等。 

二、 大分子 核酸类 

多价 阳离子 鱼精蛋 白和硫 酸链霉 素对带 有大量 负电荷 的核酸 分子, 也 是两种 十分有 
效的沉 淀剂。 但由于 沉淀后 分离比 较困难 ,成本 也高, 较少 使用于 核酸的 制备, 主 要用于 
制备酶 时选择 性地沉 淀除去 核酸。 

三、 粘 多糖类 



一 些粘多 糖的沉 淀剂, 除了 较多地 使用乙 醇外, 十六 院基三 甲基季 胺盐的 溴化物 (简 
称为 CTAB), 十六 浣基氯 化吡啶 (简 称为 CPC) 等 阳离子 表面活 性剂也 是用于 分离粘 
多糖 的有效 沉淀剂 [ ",3 8] 。 CTAB 具 有下列 结构: 

CHj— (CHOm— CH2— N+(CH3)3— Br" 

季胺 基上的 阳离子 与粘多 糖分子 上的阴 离子可 以形成 季胺络 合物。 此 络合物 在低离 
子强度 的水溶 液中不 溶解, 但 当溶液 离子强 度增加 至一定 范围, 络合物 则逐渐 解离, 最后 
溶解。 除了 离子强 度的影 响外, CTAB 对各种 粘多糖 的分级 沉淀效 果与各 种粘多 糖硫酸 
化程度 和溶液 pH 值 有关。 由于 CTAB 的沉 淀效力 极强, 能从 很稀的 溶液中 (如 万分之 
一 浓度) 通 过选择 性沉淀 回收粘 多糖。 
• 78 • 



参 考文献 



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- 79 • 



第四章 生物小 分子常 用色谱 分离法 

程明哲 苏拔贤 

- 我们所 需的生 物体组 成成份 ,经过 溶剂提 取初步 分离, 常 选用沉 淀方法 进行粗 分及浓 
缩, 接着上 柱色谱 分离, 或 者不经 沉淀分 离直接 上柱进 行色谱 纯化。 在现代 生化制 备技术 
中, 色谱 分离占 有核心 地位。 色谱 方法按 分离机 制的不 同可分 为吸附 色谱、 分配 色谱、 离 
子交换 色谱、 凝 胶过滤 (或分 子筛) 色谱和 亲和色 谱等。 用于 制备量 色谱要 求一次 进样量 
大并容 易回收 ,故常 用柱型 色谱, 板状薄 层色谱 也常用 于小量 样品的 制备, 且有 快速, 操作 
简便的 优点。 

应 用色谱 分离方 法制备 的生物 体组成 成份, 包括各 种初级 代谢产 物如氨 基酸、 核音 
酸、 单糖类 、有 机酸、 脂肪酸 ;次级 代谢产 物如生 物碱、 萜类、 糖苷、 精油、 色素 和鞣质 类以及 
各种组 成生物 体的大 分子如 蛋白质 、多肽 、酶、 核酸、 多 糖等。 这些物 质使用 色谱分 离制备 
时, 常根 据它们 之间分 子结构 和化学 特性, 分子 量大小 以及在 色谱分 离过程 中生理 活性的 
稳定 情况, 选择不 同色谱 方法。 蛋白质 、酶、 核酸 等生物 大分子 由于它 们分子 量大, 容易在 
操 作中失 去生理 活性, 同 时这些 大分子 常常具 有与其 结构相 对应的 专一分 子可逆 地结合 
的特性 (或 称生物 亲和性 ), 较多地 选用多 糖基离 子交换 色谱、 分子篩 色谱和 亲和色 谱法, 
这几 种色谱 方法, 将 在本书 第五章 介绍。 而一些 代谢产 物即各 种类型 的生物 小分子 ,由于 
它们分 子量小 ,结 构和性 质比较 稳定, 操作 条件要 求不太 苛刻, 采用 吸附, 分 配柱色 谱和离 
子交换 柱色谱 进行分 离较为 适宜。 其中氨 基酸、 核苷酸 、有机 酸等一 些离子 化合物 的制备 
多 用离子 交换色 谱法, 而生物 碱、: ffi 类、 昔类、 色 素等次 生代谢 小分子 则多采 用吸附 色谱法 
或反 相分配 色谱法 分离。 现根 据一些 发表的 资料, 统 计近年 来植物 化学成 份应用 色谱分 
离技 术的情 况如下 [1]: 



分 离手段 


应 用色谱 技术占 总的分 离方法 百分数 


硅胶 柱色谱 


49.4% 


制 备量薄 层色谱 


16.4% 


氧化铝 柱色谱 


10.1% 


' 溶剂法 


7.3% 


聚酰胺 柱色谱 


4.5% 


离 子交换 柱色谱 


3.8% 


纤维素 柱色谱 


1.9% 


制 备量气 相色谱 


1.3% 


其 他方法 


5.3% 



由上 列百分 比可以 看出, 经典色 谱方法 在天然 药物的 分离制 备中仍 占很大 比例, 尤以 
硅胶 柱色谱 方法使 用情况 最多, 其次是 各种制 备薄层 色谱。 

色谱 技术近 年发展 很快, 各 种固定 相填料 (或 称支 持剂) 型 号日益 增多, 分离 性能越 
来 越好, 各种色 谱附加 的检验 系统如 紫外和 可见光 吸收分 光计, 折 光计, 芡 光计等 装置曰 

• 80 - 



趋完善 ,特 别是高 效液相 色谱系 统装置 的出现 (包括 分配与 吸附, 离子 交换, 凝胶过 滤等高 
效液相 色谱) ,不 论在柱 分离效 率上, 仪器自 动化程 度上, 或者 在应用 广泛性 上都远 远超过 
了 其他经 典色谱 方法。 已成 为当前 生化分 离制备 最有效 的手段 之一。 本章 将结合 生物小 
分子的 分离制 备介绍 吸附色 谱法、 离 子交换 色谱法 和高压 液相色 谱法。 

但应 该指出 的是: 根 据分子 大小和 某些化 学性质 分别选 择使用 不同色 谱法, 并不 
意 味着某 一色谱 方法只 适用于 某一类 物质, 只能说 某类物 质较多 地使用 某一色 谱法。 例 
如, 高效液 相色谱 最初只 应用于 小分子 物质, 最近出 现使用 了凝胶 固相及 改进了 仪器结 
构, 应用 于生物 大分子 的分离 已越来 越多。 又如 吸附色 谱法, 较多 用于小 分子的 分离, 但 

其 中确酸 f5 凝胶 吸附柱 色谱却 十分适 用于蛋 白质的 分离, 迄 今还是 工业上 和实验 室大量 
制备 酶的常 用方法 之一, 亲 和色谱 方法绝 大多数 情况用 于生物 大分子 的分离 制备, 但反过 
来以大 分子酶 作配基 ,相 对应地 吸附一 些小分 子辅基 或酶的 底物, 也是可 以的, 只 是使用 
机 会较少 而已。 

第一 1? 吸附 色谱法 

吸附色 谱法是 指混合 物随流 动相通 过吸附 剂时, 由于吸 附剂对 不同物 质有不 同的吸 
附 力而使 混合物 分离的 方法。 

吸 附色谱 法是最 早期的 一种色 谱分离 技术。 1903 年 俄国植 物学家 LbeT 用菊 根粉柱 
研究 植物色 素的提 取物, 以石油 醚冲洗 ,得到 分离的 黄色、 绿色 区带, 故称为 色谱分 离法。 
1931 年又 有人用 氧化铝 柱分离 了胡萝 卜素 的两种 同分异 构体, 显示 了本法 具有较 高的分 
辨率, 同时, 吸附 色谱法 操作较 简单, 不 需特殊 的实验 装置, 分离 物质的 量小至 毫克, 大至 

上 百克, 主要应 用于某 些分子 量不大 的物质 的分离 提纯。 个别的 (如 轻基碟 灰石) 也适用 
于生物 大分子 的分离 提纯, 应用 范围比 较广。 本法虽 然比较 古老, 但 目前仍 有其实 用的意 
义。 特别 是一些 新的改 良的吸 附剂的 出现, 结合快 速的分 离和监 测器, 如高 效液相 吸附色 
谱法的 发展, 赋予吸 附色谱 技术更 新的生 命力。 

一、 吸 附过程 的本质 

吸附是 表面的 一个重 要性质 之一。 任 何两个 相都可 以形成 表面, 其中 一个相 的物质 
或溶解 在其中 的溶质 在此表 面上的 密集现 象称为 吸附。 在固体 与气体 之间, 固体 与液体 
之间, 吸附 液体与 气体之 间的表 面上, 都 可以发 生吸附 现象。 

凡能 够将其 他物质 聚集到 自己表 面上的 物质, 都称为 吸附剂 ,聚 集于吸 附剂表 面的物 
质就 称为吸 附物。 既然 吸附是 发生在 表面上 的表面 现象, 因 此要了 解固体 吸附剂 的吸附 
作用的 本质, 就要了 解固体 的表面 特性。 

为 什么分 子能在 固体表 面停留 一定时 间呢? 这是因 为固体 表面上 的分子 (离 子或原 
子) 和固 体内部 分子所 受的吸 引力不 相等。 在内部 的分子 ,分 子之间 相互作 用的力 的对称 
的, 其力 场互相 抵消, 而处 于固体 表面的 分子所 受的力 是不对 称的, 向内的 一面受 到固体 
内 部分子 的作用 力大, 而表面 层所受 的作用 力小, 因而 气体或 溶质分 子在运 动中碰 到固体 
表面 时受到 这种剩 余力的 影响, 就会 被吸引 而停留 下来。 



在不同 条件下 ,吸附 剂与被 吸附物 之间的 作用, 既有 物理作 用的性 质又有 化学作 用的' 
特征。 物理作 用又称 范德华 吸附, 是分子 间相互 作用的 范德华 力所引 起的, 其特点 是无选 
择性, 吸附速 度快, 吸 附的过 程是可 逆的, 伴随放 出的能 量较小 ,吸附 不牢, 吸附的 分子是 
单 层或多 层的。 化学吸 附主要 是由原 子价力 (化 学键) 的作用 引起的 ,如电 子的转 移或分 
子与 表面共 用电子 对等。 其特点 是有选 择性, 吸 附速度 较慢, 不易 解吸, 放 能大, 一般 
吸 附的分 子是单 层的。 物 理吸附 和化学 吸附可 以同时 发生, 在一定 条件下 也可以 互相转 
化。 

由于 吸附过 程是可 逆的, 因 此被吸 附物在 一定条 件下可 以解吸 出来。 在单位 时间内 
被吸 附于吸 附剂的 某一表 面积上 的分子 和同一 单位时 间内离 开此表 面的分 子之间 可以建 
立动态 平衡, 称 为吸附 平衡。 吸附色 谱法过 程就是 不断地 产生平 衡与不 平衡, 吸附与 解吸. 
的矛盾 统一的 过程。 



二、 常用 吸附剂 的特性 和应用 

(一) 珪胶 

是应用 最广泛 的一种 极性吸 附剂, 它的主 要优点 是化学 惰性, 具较 大的吸 附量, 易制 

备不同 类型、 孔径、 表 面积的 多孔性 硅胶, 一般以 Si02«xH20 通式 表示。 

硅胶 制备是 将硅酸 钠溶液 酸化, 产生硅 溶胶, 同时发 生絮凝 作用, 放置一 定时间 (陈化 ) 

后, 收集 沉淀, 充 分洗去 可溶性 杂质, 干燥 磨碎。 用 前要在 150~20()C 加热 活化。 絮凝 
作用 的速率 取决于 PH。 在 pH3 — 4 时, 絮 凝作用 缓慢, 产 生了大 的表面 积硅胶 (SOO 
米 2/ 克); 而在 pH6 时, 絮 凝作用 很快, 产 生的硅 胶结实 致密, 其比 表面积 〈 400 米 2/ 
克。 

硅胶 的吸附 活性取 决其含 水量, 吸附色 
谱法一 般采用 含水量 10〜12% 的硅胶 ,当含 
水 量小于 1% 时活性 最高, 而大于 20% 时, 
吸 附活性 最低。 用加 热脱水 法可使 硅胶活 
化。 图 4-1 表示 加热活 化温度 与吸附 活性之 
间的 关系。 

当 加热到 1501 时, 吸附 剂失去 物理结 
合的水 ,活性 上升, 在 150〜250°C 时, 吸附活 
性几乎 恒定, 而当 加热到 250〜400°C 时, 失 
去硅院 醇基上 的水, 这是 化学结 合水, 从而使 
吸附活 性下降 ,加热 400°C 以上时 ,由 于部份 

相邻 的硅烷 醇基的 脱水, 形成 了硅氧 院桥, 另 
外部 份硅胶 颗粒的 熔结, 而使 吸附活 性迅速 

下降, 而且 部份不 可逆, 至 iooo°c 时, 成为无 

水 Si02, 失去 活性, 因 此硅胶 的热活 化通常 在小于 250°C 下 进行。 

降 低活性 的硅胶 (纯化 ) 能 显著改 善分离 性能, 增加样 品的负 载量。 Scott 等" 】 认为硅 
胶是由 三层小 分子覆 盖在表 面上, 如 下图式 所示: 



0£ 




图 4-1 吸 附活性 (R°) 随活 化温度 的变化 

戊 院对蔡 的洗脱 
在 N, 中活化 15 分钟, 
• 在空气 中活化 16 小吋 



82 



\ 

第三 层弱吸 附的小 分子, 7(nc 加热 或用干 燥的溶 剂就能 除去。 



<~第 二层弱 吸附水 分子, 120°C 加热 或用干 燥的溶 剂就能 除去。 

\ 

H 

—第 一层强 吸附小 分子, 需 200<><650«10 加 热才能 除去, 为氣键 结合的 小分子 

\ 

在 450。~1100°C 加热 可使挂 嫁醇基 脱水成 6* 基, 为 不可逆 反应。 
活 性硅胶 是指在 150〜195t 加热活 化后覆 盖有第 一层小 分子的 硅胶, 对样品 溶质分 

子有较 强的吸 附作用 ,其 缺点是 活性部 位非均 勾性, 样品的 线性容 量明显 地小, 甚 至产生 

催化 反应或 不可逆 吸附。 采 用加水 纯化的 办法可 解决, 一般 100 米 2/ 克比 表面积 的吸附 
剂, 加水 1 一 2% 相 当覆盖 30〜60% 的 吸附剂 表面, 能提高 5 〜10() 倍 样品负 载量。 

实验 表明, 加入 4 〜20f。 水的 硅胶, 能提高 柱效。 这是 因为加 水后, 表 面活性 部位纯 
化, 加快了 样品溶 质在吸 附剂上 的吸附 和解吸 过程, 另外, 由于 硅胶上 的细孔 被水" 堵 住", 
也改善 了传质 作用。 

硅胶 的吸附 活性测 定可用 偶氮染 料法, 含 水量与 吸附活 性的关 系见表 4-lB 】 。 
硅胶的 再生: 用过的 硅胶用 5 — 10 倍量的 1 % NaOH 水溶 液迴流 30 分钟, 热 过滤, 
然 后用蒸 馏水洗 三次, 再用 3 — 6 倍量的 5 % 醋 酸迴流 30 分钟, 过滤, 用 蒸溜水 洗至中 
性, 再用甲 醇洗、 水洗 二次, 然后在 120°C 供 干活化 12 小时, 即 可重新 使用。 

(二) 氧化结 

以氧化 铝作为 吸附剂 的色谱 法适用 于亲脂 性成分 的分离 制备。 氧化铝 具较高 的吸附 
容量, 价格 低廉, 分离效 果好, 因 此应用 也较为 广泛。 

氧化 铝的吸 附原理 一般认 为是物 质与氧 化铝表 面上的 经基形 成氢键 (如下 式), 铝原 

1 H I H 

I / 1 \ I / 

I N 
I ! 

/\|/\/\!/\ 

A1 AI A1 A1 A1 

子提供 亲电子 中心, 从 而吸引 电子供 体基团 (如 一 OH, -NH)o 

影 响氧化 铝吸附 色谱法 的因素 很多, 操作 时要注 意选择 具适当 活性及 适当的 酸碱度 
的氧 化铝。 

用于吸 附色谱 法的氧 化铝通 常可按 制备方 法的不 同而分 为以下 三种: 
1. 城性 氧化铝 直接 由氢氧 化铝高 温脱水 而得, 柱 色谱法 一般用 100〜15() 目。 一 
般水洗 脱液的 PH 为 9 〜1(), 经活化 后即可 使用。 碱 性氧化 铝主要 应用于 碳氧化 合物的 
分离, 以碳氢 化合物 中除去 含氧化 合物以 及某些 中性、 碱性 物质的 分离。 

- 83 . 



HIO —— HIO —— H — —— Hlol.^lo 

H 



2. 中性 氧化钜 用碱性 氧化铝 加人蒸 榴水, 在不 断搅伴 下煮沸 10 分钟, 倾 去上清 
液。 反复处 理至水 洗液的 PH 为 7.5 左右, 滤 干活化 后即可 使用。 中 性氧化 铝使用 范围最 
广, 适用 于醛、 酮、 醌、 某些 苷类及 在酸碱 溶液中 不稳定 的酯、 内 酯等化 合物的 分离。 

3. 酸性 氧化结 氧化铝 用水调 成糊状 ,加人 22V 盐酸, 使混合 物对刚 果红呈 酸性反 
应。 倾去上 清液, 用热水 洗至溶 液对刚 果红呈 弱紫色 ,滤 干活化 备用。 酸性 氧化招 适用于 
天然 和合成 的酸性 色素以 及醒、 酸的 分离。 水洗液 pH 为 4 一 4.5。 

氧化 铝的吸 附活性 与含水 量关系 很大, 在一定 的温度 下除去 水分可 使氧化 铝活化 ,加 
入一 定量的 水又可 使氧化 铝活性 改变。 活性 与含水 量的关 系见表 4-1。 



表 4-1 S 化铭、 挂胶、 挂酸镇 的活性 与含水 量关系 



活 性 


氧化锡 
(水 %) 


硅 胶 
(水 %) 


硅酸镇 
(水 %) 


I 级 











n 级 


3 






晴 


6 


15 


15 


IV 级 


10 


25 


25 


V 级 


15 


35 


35 



氧化 铝活性 的测定 可采用 薄层色 谱法, 按表 4-2, 所列的 Rf 值确 定活性 级别。 



表 4-2 測定 S 化错 活性的 Rf 值 



按 Brockmann 和 Schockler 划分 活性' 



偶 氮染料 


II 


III- 


IV 


V 


偶氮苯 


0.59 


0.74 


0.85 





95 


对 -甲氧 偶氮苯 


0.16 


0.49 


0.65 


0. 


89 


苏丹黄 


0.01 


0.25 


0.57 





78 


苏丹红 (ra) 


0.00 


0.10 


0.33 





56 


对 -氨基 偶氮苯 


0.00 


0.03 


0.08 





19 



CH) 活性炭 

活性炭 的来源 可分为 动物炭 ,植 物炭和 矿物炭 (煤) 三种, 分别用 动物的 骨头、 木屑、 煤 
屑高 温炭化 而成。 市售活 性炭大 多数以 木屑为 原料, 加氯 化锋在 700〜800t 高温 炭化并 
活化, 经适 当处理 除杂质 而成。 

根据其 粗细程 度活性 炭可分 为以下 三种: (1) 粉末活 性炭: 颗粒 极细, 呈粉 末状, 比 
表面 积大, 吸附量 及吸附 力大, 但因颗 粒太细 ,流 速慢, 故一 般柱色 谱法极 少用。 (2) 颗粒 
活 性炭: 颗粒 较大, 其比 面积及 吸附力 都较粉 末活性 炭小, 但易控 制流速 ,便 于装柱 使用, 
故在柱 色谱法 中应用 较广。 (3) 锦 论一活 性炭: 以锦纶 为粘合 剂将粉 末活性 炭制成 颗粒, 
比表 面积介 于粉末 活性炭 和颗粒 活性炭 之间, 吸附能 力较两 者弱。 一般用 于前两 种因吸 
附 力太强 而不易 洗脱的 物质。 

活性炭 的吸附 作用, 在水 溶液中 吸附力 最强, 在有机 溶剂中 吸附力 较弱。 在一 定条件 
下, 对不同 的物质 的吸附 力不同 ,一般 说对极 性基团 (如 COOH、 一 NH2、 一 OH 等) 多的 
化 合物的 吸附力 大于极 性基团 少的化 合物。 在酸性 溶液中 活性炭 的吸附 力大, 在 PH6.8 
• 84 • 



以上 ,吸 附能力 较差。 活性炭 在水溶 液中对 同系列 有机化 合物的 吸附量 ,随 吸附物 的分子 
量 增大而 增大。 活性 炭对化 合物的 吸附力 一般认 为主要 为范德 华力。 

活性炭 用前需 活化, 一般在 150°C 加热 4 一 5 小时, 将吸附 的大部 分气体 除去, 对于锦 
纶活 性炭, 因 易受热 变形, 活 化时常 不超过 1001。 

(四) 聚銑胺 

聚 酰胺是 一类化 学纤维 原料, 国外名 称尼" 龙", 我国 名称" 锦 论"。 由己 二酸与 己二胺 
聚合 而成的 叫锦论 66。 由 己内酰 胺聚合 而成的 叫锦论 6。 因 为这两 类分子 都含有 大量的 
酰胺 基团, 故 统称聚 酰胺。 

聚 酰胺柱 色谱特 别适用 于低分 子量化 合物的 分离。 如 对酧、 接酸、 DNP- 氨 基酸、 醌 
及 芬香族 硝基化 合物的 分离是 一个良 好的吸 附剂。 它 们的吸 附等温 线在较 广浓度 范围内 
是成线 性的。 

聚酰胺 具有特 异的色 谱分辨 能力, 它 对极性 化合物 的吸附 作用, 是由于 聚酰胺 与被分 
离物之 间形成 氧键, 如 酚类和 酸类是 与其轻 基与酰 胺键的 親基的 氧形成 氢键。 被 分离物 
质形 成氢键 能力的 强弱, 决 定了吸 附力的 大小。 在色谱 过程中 ,洗脱 剂与被 分离物 质在聚 
酰胺 粒子表 面上竞 争形成 氢键, 可 选择适 当的洗 脱剂, 使被分 离物质 在洗脱 剂与聚 酰胺表 
面之 间的分 配系数 有最大 差异。 经 过吸附 与解吸 的色谱 过程, 就可 使化合 物与杂 质分离 
开来。 

聚酰胺 与化合 物形成 氢键的 能力也 与所用 的溶剂 有关, 一般在 水中形 成氢键 能力最 
强, 而 在有机 溶剂中 形成氢 键能力 较弱。 在碱性 溶剂中 形成氢 键能力 最弱。 
聚酰胺 的吸附 活性可 用其对 萘酚橙 的吸附 力大小 表示。 

(五) 聚 苯乙嫌 吸附剂 

Amberlite XAD 是 一个合 成的非 极性吸 附剂, 它由苯 乙稀和 二乙稀 苯共聚 合而成 。它 
的比表 面积达 300 米 2/ 克, 孔径约 90A, 虽然 它是多 孔的, 但 溶解物 质穿透 进孔内 的能力 
很弱, 吸 附作用 主要发 生在吸 附剂表 面上。 聚 苯乙婦 对化合 物的吸 附作用 是基于 化合物 
的疏水 基与非 极性吸 附剂之 间的范 德华力 作用。 

聚苯 乙稀吸 附剂已 成功地 应用于 肉香味 前体的 水溶液 分离; 除 去过量 的蛋白 质沉淀 
剂苦 味酸; 硝基和 氯酚的 分离, Amberlite XAD-2 也用 于高效 液相色 谱的固 定相" ] 。 

(六) 磯酸!^ 

在无 机吸附 剂中, 碟 酸锊是 唯一的 适用于 生物活 性高分 子物质 (如蛋 白质, 核酸) 的分 
离的吸 附剂。 

Swingle 等用 蔗糖钙 的水溶 液加人 磷酸, 得到 磯酸钙 沉淀, 用于 蛋白质 的色谱 分离, 但 
为 了获得 适当的 流速, 需 渗加硅 藻土。 后来, Tiselius 用 0.5A^ CaCl, 加 0.5M 碟酸二 钠盐, 
在 室温下 反应, 得到满 意的流 速的磯 酸钙。 CaHPO^ • 2H,0 在 pH 7 以上, 慢慢变 为羟基 
碗灰石 ,即 Ca5(P04);OH 放出 H^PO^c Levin 等叙 述了轻 基磷灰 石的制 备方法 [7] 。 

轻 基磯灰 石主要 适用于 蛋白质 的色谱 分离, 也适用 于较小 分子的 核酸, 如转移 RNA 
的 分离。 

• 85 • 



Bernardi 等用 几个合 成的多 聚氨基 酸在轻 基碟灰 石上进 行色谱 分离, 以 碟酸盐 梯度洗 
脱, 研 究其对 蛋白质 的吸附 机制, 又研究 几种蛋 白质在 8 M 尿 素存在 下或无 尿素下 的色谱 
分区 性质, 最后 指出, 酸 钙对蛋 白质吸 附的机 制是溶 质的酸 性基团 与在洗 脱液中 的磯酸 
根离子 对吸附 剂的阳 离子^ 的 竞争性 作用。 对核酸 分子的 吸附机 制也与 蛋白质 类似, 多 
核苷酸 的负电 性碟酸 基与轻 基碟灰 石结晶 表面上 的阳离 子锊之 间的相 互作用 , 糖 和碱基 
没 有直接 影响。 例如, 嘌吟和 嘧啶碱 及其相 应的核 苷在经 基磯灰 石柱上 没有阻 留作用 (用 
O.OOlAf 磯酸缓 冲液平 衡)。 而单 核苷酸 则稍有 阻滞, 对二和 三磯酸 酯则需 较高碟 酸盐浓 
度才 能洗脱 下来。 多聚核 苷酸从 轻基磯 灰石上 的洗脱 是由于 缓冲液 的无机 磷离子 和溶质 
的碟 残基之 间对吸 附剂上 钙离子 的竞争 作用。 

经基碟 灰石对 于分辨 有次序 和无次 序的生 物大分 子结构 (包 括蛋 白质和 核酸) 是很有 
用的 一个吸 附剂。 生物大 分子从 有序到 混乱的 螺旋变 性结构 过程中 常常伴 随着电 荷密度 
的降低 ,这可 能是由 于破坏 了高级 结构, 离子基 团间的 静电排 斥的结 果所引 起的。 

三、 吸 附柱色 谱的实 验技术 

(一) 吸附剂 的选择 及处理 

吸附剂 的选择 是吸附 色谱法 中的关 键问题 ,选择 不当, 达不 到要求 的分离 效果。 因为 
作 为吸附 色谱中 的吸附 剂种类 很多, 无机吸 附剂有 硅胶、 氧化铝 、活 性炭、 硅酸镇 、氧 化镇、 
碳酸钙 、确酸 钙等。 还 有一些 人工合 成的硅 铝酸盐 (如人 造沸石 ); 有 机吸附 剂有纤 维素、 
淀粉、 蔗糖、 聚酰 胺等。 而 对吸附 剂的选 择尚. 无固定 的法则 ,一 般需通 过小样 实验来 确定, 
但要 注意, 同一 种吸附 剂因制 备及处 理方法 不同, 吸 附性能 有很大 差别。 例如, 活 性炭在 
5001 活化后 吸附酸 而不吸 附滅, 但在 80()°C 活化 者却易 吸附碱 而不吸 附酸; 硅胶, 碗酸 
锊 凝胶的 吸附能 力与陈 化程度 有关。 

一般 来说, 所选 吸附剂 应有最 大的比 表面积 和足够 的吸附 能力, 它对欲 分离的 不同物 
质应 有不同 的吸附 能力, 即有足 够的分 辨力; 与洗 脱剂、 溶剂 及样品 组分不 会发生 化学反 
应, 还要 求所选 的吸附 剂颗粒 均勾。 在 操作过 程不会 破裂。 吸附 的强弱 可概括 如下: 吸 
附 现象是 与两相 间界面 张力的 降低成 正比, 某 物质自 溶液中 被吸附 程度与 其在溶 剂中的 
溶解度 成反比 ,极 性吸附 剂易吸 附极性 物质, 非极性 吸附剂 易吸附 非极性 物质, 同 族化合 
物的吸 附程度 有一定 的变化 方向, 例如, 同系 物极性 递减, 因 而被非 极性表 面吸附 的能力 
将 递增。 ' 

许 多吸附 剂一般 先经过 旆取得 较均匀 的颗粒 (100 — 200 目), 对 含有杂 质的吸 附剂, 
可 用有机 溶剂如 甲醇、 乙醇、 乙酸乙 酯等浸 泡处理 或提取 除去, 有些 吸附剂 可用沸 水洗去 
酸碱使 呈中性 ,有些 需经加 热处理 活化。 

(二) 溶剂与 洗脱剂 

溶 剂与洗 脱剂实 用上常 为同一 组分, 但用途 不同。 习惯 上把用 于溶解 样品的 溶液称 
溶剂。 把 用于洗 脱吸附 柱的溶 液称洗 脱剂。 原 则上所 选的溶 剂和洗 脱剂要 求纯度 合格, 
与样 品和吸 附剂不 起化学 反应, 对样品 的溶解 度大, 粘 度小, 易 流动, 易与 洗脱的 组分分 
开。 常用的 溶剂与 洗脱剂 有饱和 碳氢化 合物、 醇、 酚、 酮、 继、 齒化院 、有机 酸等。 选 择溶剂 

• 86 . 



与洗脱 剂时, 可根据 样品组 分的溶 解度、 吸附剂 的性质 、溶剂 极性等 方面来 考虑, 极 性大的 
洗脱能 力大, 因 此可先 用极性 小的作 溶剂, 使组 分易被 吸附, 然后换 用极性 大的溶 剂作洗 
脱剂, 使组分 易从吸 附柱中 洗出。 

表 4-3 按介电 常数反 映的极 性递增 顺序列 出了各 种常用 溶剂。 



表 4- 3 溶 剂的脱 附系列 (按 极性递 if 排列) 



溶 剂 


介 电常数 (25°C) 


溶 剂 


介 电常数 (25^0) 


己院 


1.89 


冰乙酸 


6.15 


庚浣 


1.92 


四 氢呋哺 


7.58 


环己浣 


2.02 


二 氯甲浣 


9.14 


1,4- 二 氧六环 


2.21 


a- 甲 基丙醇 (2) 


10.9 


四 氯化碳 


2.24 


吡淀 


12.3 


苯 


2.28 


丁醇 


15.8 


甲苯 


2.38 


«- 甲基 丙醇 (1) 


17.7 


乙腈 


3.88 


丁醇 


17.8 


乙链 


4.34 


丙醇 (2) 


18.3 


三 氯甲院 


4.87 


丙醇 (1) 


20.1 


甲酸 


5.0 


丙酮 


20.7 


« -甲 基丁醇 


5.82 


乙醇 


24.3 


乙 酸乙酯 


6.02 


甲醇 


33.6 



(三) 柱 的装填 和样品 的加入 

吸附 色谱法 通常采 用柱型 装置, 色谱 柱一般 为玻璃 或有机 玻璃管 制成, 柱下端 装上一 

块 2 — 4 号 烧结玻 璃或塾 一层玻 璃丝以 支持吸 附剂。 柱 高与直 径比根 据实验 的要求 而定。 
管 内装吸 附剂。 管顶可 与样品 溶液或 洗脱液 贮液瓶 连接, 下 端可用 活塞或 用胶管 连接排 
出管, 并 在胶管 上装置 螺旋夹 以控制 流速。 有 条件可 附加压 或减压 装置, 使流速 保持恒 
定, 色谱柱 外也可 配恒温 管套。 

装柱 的方法 通常是 将一种 在适当 溶剂中 的吸附 剂调成 糊状, 慢 慢地倒 人关闭 了出水 
口的 柱中, 同时不 断搅伴 上层糊 状物, 赶去 气泡, 并使装 填物均 勾地自 然下降 ,装置 所需要 
的高 度后, 打开出 水口, 让溶剂 流出。 注意柱 的任何 部分不 能流干 ,即 是说, 在柱的 表面始 
终 就保持 着一层 溶剂。 

小 心地用 移液管 把样品 液沿绕 柱内壁 小心地 加人, 不要冲 击着吸 附剂的 表面。 加样 
的另 一个办 法是用 一个注 射器或 蠕动泵 把样品 直接送 到柱表 面上。 

(四) 洗脱 

在整个 洗脱过 程中, 要使 洗脱液 通过柱 时保持 恒定的 流速, 可以用 调节" 操作压 "来控 
制 (操作 压相当 于在柱 上部的 贮液瓶 中溶剂 的水平 和柱出 水口位 置的水 平之差 )。 另一个 
办法是 使用蠕 动泵。 

洗 脱过程 中柱内 不断发 生溶解 (解吸 ), 吸附, 再 溶解, 再 吸附。 被吸附 的物质 被溶剂 
解吸, 随着溶 剂向下 移动, 又 遇到新 的吸附 剂又把 该物质 自溶剂 中吸附 出来, 后来 流下的 

• 87 • 



新溶 剂又再 使该物 质溶解 而向下 移动。 如 此反复 解吸, 吸附, 经 一段时 间后, 该物 质向下 
移动 至一定 距离, 此距离 的长短 与吸附 剂对该 物质的 吸附力 及溶剂 对该物 质的溶 解能力 
有关, 分子 结构不 同的物 质溶解 度和吸 附能力 不同, 移动 距离也 不同, 吸附 较弱的 就较易 
溶解, 移 动距离 较大。 经过 适当时 间后, 各物质 就形成 了各种 区带, 每一区 带可能 是一种 
纯的 物质, 如果被 分离物 质是有 色的, 就可 以清楚 地看到 色层。 随 着洗脱 剂向下 移动, 最 
后各组 分按吸 附力的 不同顺 序流出 色谱柱 ,以流 出体积 对浓度 作图, 可得由 一系列 峰组成 
的曲线 ,每 一峰可 能相当 于一个 组分。 

如果 样品中 含组分 较多, 某 些组分 吸附力 相近, 易 形成两 峰重叠 间界限 不清, 可采用 
梯度洗 脱法。 

第二节 离 子交换 色谱法 

离子交 换作用 是指一 个溶液 中的某 一种离 子与一 个固体 中的另 一种具 有相同 电荷的 
离子互 相调换 位置, 即溶 液中的 离子跑 到固体 上去, 把固体 上的离 子替换 下来。 这里, 溶 
液称流 动相, 而固 体称固 定相。 

自从人 类远古 的时代 ,就知 道利用 这种离 子交换 现象, 例如用 砂粒来 净水。 但 真正了 

解这种 离子交 换现象 的机制 以及在 实验上 的广泛 应用则 要到十 九世纪 以后。 1950 — 1955 
年期 间出现 了以聚 丙乙炼 为母体 的阳离 子和阴 离子交 换剂, 使离子 交换层 析技术 得到迅 
速 发展。 目前, 离子交 换剂巳 发展到 数百种 ,各 种离子 交换色 谱法巳 成为最 广泛应 用的色 
谱方法 之一。 

、 一、 离子 交换剂 的类型 

(一) 聚苯乙 嫌阳离 孑和阴 离子交 换树脂 

这是最 重要的 一类离 子交换 树脂, 由苯乙 稀和二 乙燥苯 的共聚 物作为 骨架, 再 引入所 
需要 的酸性 基或碱 性基。 例如聚 苯乙晞 横化型 阳离子 交换树 脂是由 苯乙稀 (母体 ) 与二乙 
條苯 (交 联剂) 共聚后 再横化 引人横 酸基而 成的。 其中 苯乙炼 是主要 成分, 形 成网的 直链, 
其上带 有可解 离的橫 酸基, 而二乙 炼苯把 直链交 联起来 形成网 状结构 ,所得 的产物 有像海 
绵似的 结构, 磺酸根 连在树 脂上, 氢 离子与 磺酸根 的负电 荷互相 平衡, 颗 粒内部 就像一 
个苯磺 酸的浓 溶液, 只是负 性根不 能自由 移动, 只 有氧离 子才能 与外来 的离子 相互交 
换。 



CH=CH, 

i 

(苯 乙炼) 



CH=CH, 

I 



CH=CHj 
二乙 煤苯) 



CH— CHj— CH— CHj— CH- 



合 



I I 

—— CH— CHj— CH— CHj—CH -— 

I I 



• 88 • 



CH— CH,— CH— CH,— CH- 

01 化 



s'07H+ SOJH^ 

^ CH— CH— CH— CH,— CH 

i I 

sorH+ S07H+ 

调 节加人 不同的 悬浮液 稳定剂 和控制 介质的 温度、 粘度 及机械 搅拌速 度可得 到不同 
大 小规格 的树脂 (直 径从 1 微米至 2 毫米 ), 而 改变二 乙稀苯 的量则 可得到 不同交 联度的 
树脂。 

根 据引人 的可离 解基团 的性质 又可分 为下列 两类离 子交换 树脂。 

1. 聚苯 乙嫌阳 离子交 换树脂 这 类交换 剂可再 分为强 酸型、 中强酸 型及弱 酸型三 

种, 各含有 以下的 可解离 基团。 

. 磺酸基 一 SOI"H+ (强 酸型) 

碑酸根 一 P〈 、 
O 

. 亚磷 酸根一 p〈 u 中强 酸型) 

O 

/OH 
碟 酸基一 o—p〈 

II \0H 
O 

羧基 一 COOH (弱 酸型) 

这些 交换剂 在交换 时氢离 子为外 来的阳 离子所 取代, 如下式 所示: 

R— SOjH + Na+^=^R— SOjNa + H+ 

/OH /OH 

R—P〈 +Na+^=^R—P〈 + H+ 

II \0H II \ONa 

O O 

R— COOH + Na+^=^R — COONa + H+ 

2. 聚苯 乙嫌阴 离子交 换树脂 也可再 分为强 碱性、 中强 碱性及 弱碱性 三类, 这三类 

都 是含有 胺基, 碱性的 强弱按 胺基碱 性强弱 而分。 如含 季胺盐 [一 N+(CH3)J 为强 碱性、 
叔胺 [― N(CH3)2]、 仲胺 [—NHCH3]、 伯胺 [一 NH2] 类 都属弱 碱性、 既含 强碱性 基团又 
含弱碱 性基团 即为中 强碱性 ,交换 时反应 如下: 

R— N+(CH3)40H + Cr =^ R— N+(CHj)4Cr + OH— - 

R— N(CH3)2 + HCl — R— N(CH3)2 . HCl 

R— N(CH3)2 + H2O ^ R— N( CH3)2H ,OH" 

R— N+(CH3)H, OH + CI- — R — N+(CH3)2H,C1 + OH" 

• 89 • 



(二) 聚丙 嫌酸阳 离子交 换树脂 

— C— CH,— C 一 CH2— CH—CHz 一 C — 

I I 1 I 

CH3 CH=CH, COOH COOH | COOH 

I I 

C=CH, + II 
I I II — > I II 

COOH I 11 

CH3 CH3 I CHa 

CH=CHj 一 C — CHj ― C — CH,— CH--CH,— C ― 

COOH COOH COOH ' 

是由 甲基丙 稀酸和 二乙稀 苯聚合 而成。 这类树 脂具高 度的交 换量, 每 克干重 树脂可 

交换 10 毫 克当量 物质。 在 PH 8 以下, 这类 树脂中 的幾基 不完全 解离, 因此要 在高的 PH 
值 下树脂 才有完 全的交 换量, 由于相 邻幾基 距离较 短而产 生的缔 合作用 ,故 有很高 的表观 
pK 值, 在低 离子树 脂强度 下特别 明显。 这种高 度缔合 的非离 子化接 基使树 脂的表 面形成 
一个亲 水层, 对极性 分子能 起一种 很有效 的吸附 作用。 

由丙稀 酸或甲 基丙炼 酸在季 胺型阳 离子交 换树脂 (如 Dowexl) 中聚 合而成 的一类 
树脂称 "蛇笼 树脂" (Snake-Cage resins) 结构 如下: - 



— CHj— N+ (CHj), — O— CO — CH 



CHj— N+ (01-13)3 — O— CO— CH 



由于 树脂中 的接基 (一COO_) 和 季胺基 [— N+(CH3)3] 是等当 量的, 放 树脂在 反应上 
的中 性的。 这类树 脂可用 于生物 化学上 的脱盐 ,例 如一个 NaCl 溶 液通过 这类树 脂柱, 则 
Na+ 为树 脂中的 一 COCr 除去, 而 C1- 则为 季胺基 除去, 故脱盐 后的溶 液没有 明显的 pH 
改变, 随后用 水洗柱 即可回 收盐。 这类 树脂也 可用来 从电解 质中分 离非电 解质, 因 为非电 
解 质直接 通过柱 流出。 另 外也用 于从大 分子的 等电点 两性电 解质中 分离电 解质, 因为前 
者不能 进人树 脂的网 孔中。 

(三) 其 他离子 交换剂 

例如选 择性离 子交换 剂是利 用某些 特殊的 有机试 剂可与 某些金 属离子 起选择 性反应 
的原 理而制 备的。 

螯 形树脂 是利用 金属离 子与有 机试剂 生成螯 形化合 物的性 质而制 备的。 如用 含求的 
树脂 分离含 琉華的 化合物 (辅酶 A, 半胱 氨酸、 谷胱 甘肽等 )。 

吸附树 脂是一 类有很 大的表 面积, 吸附能 力强, 但 离子交 换的能 力很小 的树脂 主要用 
于脱 色和除 去蛋白 质等, 也 称为" 脱色树 脂"。 

电 子交换 树脂, 这类 树脂使 交换的 不是离 子而是 电子, 交 换反应 一个氧 化还原 反应, 
也称" 氧化 还原树 脂"。 可 用于氧 化剂或 还原剂 再生, 由于上 述几种 离子交 换剂与 生化物 

• 90 . 




质的 分离制 备关系 不大, 这里 不作详 细介绍 



^ 二、 离子交 换树脂 的性质 

(-) 一 般离孑 交换剂 的特性 

1. 多孔性 树 脂为疏 松的, 多孔 的网状 物质, 而 活性基 团一般 都处于 树脂网 孔内, 

外来离 子必需 进人到 网孔内 才能进 行离子 交换。 

2. 不溶性 树脂在 水中及 稀酸、 稀碱和 一般有 机溶剂 中都不 溶解, 经 常维持 其立体 
网状 结构。 

3. 稳定性 离子 交换树 脂具有 强稳定 的化学 性质, 母体 本身不 与酸、 碱起 作用。 例 
如强 酸型阳 离子交 换树脂 (Dowex50, 国产 732 树 脂等) 很稳定 ,可 使用几 百次, 其 交换当 
量改变 不大, 又可 长时间 浸泡于 5 % NaOH, 0.1% KMn04, H^O^, O.lA/HNOs 中, 耐热性 
较好, 可在 100°C 左右 处理。 一些强 碱性阴 离子交 换树脂 (如 Dowex 1, 国产 717»树 脂等) 
对酸 碱及有 机溶剂 稳定, 但在浓 HN03 中不 稳定。 一般 游离型 (即一 OH 型) 树脂, 其耐热 
性较差 (不 超过 45°C) 而制 成盐型 (C1 型) 则耐热 性大大 提高, 可耐受 100°C 处理。 

4. 离子 交换性 离子 交换树 脂必需 具备相 当数量 的可交 换离子 或带电 基团, 这些 
离子 或基团 的类型 决定了 离子交 换剂的 类型, 而基团 的总数 和它们 的亲和 性决定 树脂的 
交换 容量。 

(二) 总 交换量 

总交 换量是 指交换 剂中可 交换离 子数, 一 般用单 位重量 (干 树脂) 或单 位容积 (湿树 
脂) 交换剂 所能交 换的毫 克当量 离子来 表示, 即毫 克当量 / 克或毫 克当量 / 毫升。 总 交换量 
为离 子交换 树脂的 特性, 与操 作条件 无关。 这两种 表示法 之间的 关系式 如下: 



Qv 和 Qw 各为体 积和重 量表示 的总交 换量; V, 为总床 体积; V。 为外水 体积; W 是树 
脂含水 量的百 分数; P 是树 脂的湿 密度。 

以上 的方法 仅适用 于一些 能穿透 树脂网 孔进入 树脂内 部的小 离子, 而 对于一 些大分 
子的 多电解 质则有 很大的 区别, 取决于 它们穿 透进人 树脂的 能力。 

在实 验条件 下所得 到实际 交换量 称为" 有 效交换 量", 其 大小取 决于活 性基团 的亲和 
力, 洗脱剂 的浓度 ,离子 强度, 反离子 性质及 活性基 团的选 择性。 

(H) 交联度 

合成 树脂时 所用的 交联剂 (如 二乙; If 苯) 在 原料总 重量中 所占的 百分比 叫做树 脂的交 
联度。 交联度 也是离 子交换 剂的一 个重要 参数, 交联 度的大 小与树 脂的膨 胀性及 交换量 
均有 关系, 交联度 越大, 树脂 的网孔 越小, 膨胀 性小, 故 交换量 也少; 反之, 交联度 越小, 网 
孔越大 ,孔内 活性基 团越多 ,故交 换量也 越大, 但 膨胀性 增大, 从而易 引起树 脂的机 械变形 
破损。 

交 联度的 表示方 法是在 树脂型 号后面 标明共 聚物中 所加交 联剂的 比例, 如 Dowex 1 

• 91 • 



A 



B 



X2 表明为 Dowex 阴 离子交 换树脂 1 号, 其交 换度为 2%, Amberlke IR-120 (lOfc) 表明 
其交 换度为 10%。 而 国产树 脂的编 号规定 如下: 

强酸: 1—100 弱酸: 101—200 

强磯: 200—300 弱緘: 301—400 

磯酸: 401 — 500 

如 201 X 7 表明为 强碱性 阴树脂 ,交 联度为 7 %。 有些单 位仍沿 用原有 名称, 如 732 
(1X7) 其中 1 为强酸 编号, 7 为交 联度。 

(四) 离子交 换剂中 活性基 的性质 

所 用离子 交换剂 的性质 决定于 它们功 能基的 性质。 阳离 子交换 剂的活 性基有 强酸基 

(-SO3-) 或 弱酸基 (一 COO- ) 及中 强酸基 
(•P04H=), 而阴 离子交 换剂的 活性基 团有强 
碱基 ('N+Rs) 或 弱碱基 ('N+HRz) 等, 它 
们的 滴定曲 线见图 4-2。 

图 4- 2a 中曲线 A 是聚 苯乙炼 磺 酸型阳 
离子交 换树脂 的滴定 曲线。 在 PH2 以上, 横 
酸 基完全 离解, 树脂有 最大的 交换量 ,曲线 B 
为 强滅型 聚苯乙 稀阴离 子交换 树脂的 滴定曲 
线, 带有 季胺交 换基, 在 pH 10 以下 碱性基 

解离, 树 脂有最 大的交 换量。 

图 4-2 中曲线 C 。和 Ci 表 示一个 弱酸性 
接基阳 离子交 换树脂 的滴定 曲线, 与 强酸或 
强碱性 的树脂 相反, 曲 线的形 状明显 地受介 
质 的离子 强度所 影响。 曲线 C 。是在 水中, Ci 
是在 0.1 M NaCi 中。 从曲 线中可 看到, 交换 
量随 pH 的变化 而改变 很大, 曲线 D 为弱碱 
性阴 离子交 换树脂 的滴定 曲线, 在 PH5 以下 
完全 离解。 




图 4-2 



6 
pH 
(b) 

离子 交换树 脂的滴 定曲线 



10 12 



(五) 离 子交换 树脂对 离子的 亲和力 

溶液中 某一离 子能否 与交联 剂上的 离子进 行交换 主要取 决于离 子的相 对浓度 (质量 
作用) 与交换 树脂对 离子的 相对亲 和力。 一般 说来, 电性 越强, 越易 交换, 对于阳 离子树 
脂, 在常温 常压的 低浓度 溶液中 ,交换 量随交 换离子 的电价 增大而 增大, 如 Na+ <Ca++< 
A1+++ < Ti++++。 如原 子价数 相同, 则交换 量随交 换离子 的原子 序数的 增加而 增大, 
Li+ < Na+ < K+<Pb+Ss+。 阴离 子也有 一定的 规律, 在常温 常压下 低浓度 溶液中 ,强 碱性 
交 换树脂 的各负 电性基 团的离 子亲和 力次序 如下: CH^COO- <F- < OH— < HCOO_< 
Cr < SCN— < Br— < CrOf < NO3- < I— < C^Or < SOf < 柠檬 酸根。 

弱碱 性阴离 子交换 树脂对 OH— 有极高 亲和力 ,对各 负性基 的亲和 力次序 如下: 

F— < cr < Br— = I— = CH3COO- < MoOr < < AsOf < NO^ < 酒 石酸根 < 



92 



柠 檬酸根 < cror < sor < OH- 



三、 离子 交换的 动力学 

在溶液 中的盐 (B+S_) 中的 阳离子 B+ 与一 个完全 解离的 树脂盐 (A+R_) 上的 阳离子 
A+ 发生 交换的 过程可 分为以 下五个 阶段: 

(1) 离子 B+ 扩散 到交换 树脂的 表面。 

(2) 离子 B+ 通过 树脂孔 中的液 体扩散 到颗粒 网孔内 可能交 换的位 置上。 

(3) 离子 B+ 与 A+ 进行离 子交换 ,这 个过程 是一个 平衡的 过程。 

(4) 离子 A+ 通过 树脂孔 的液体 扩散到 树脂的 表面。 

(5) 离子 A+ 最后 扩散到 外部溶 液中。 

以上 1 、 2 、 4 、 5 阶 段的动 力是渗 透作用 , 它 们服从 Fick 的扩散 定律。 阶段 3 为树 
脂盐 (A+R— ) 和 (B+R_) 之间 的化学 电位的 差别所 决定。 

Boyd 等 对 整个交 换过程 作了理 论上的 分析, 假 定离子 B+ 进人树 脂的量 很小, 故离 
子 A- 的浓度 不变, 可以 用放射 性示 踪离子 B+ 来进行 实验。 Rekhenberg [8] 更进 一歩 扩充了 
这个 理论, 假定有 相当量 的离子 B+ 进 入树脂 相中。 Boyd 及 后来的 研究者 都认为 对于 
小的无 机离子 ,交 换过程 3 不是决 定交换 速率的 阶段, 因 为假如 B+ 与 A+ 的 交换是 决定整 
个交换 过程的 速率, 那么 A+ 应与树 脂的颗 粒大小 无关, 但事 实上在 所有的 动力学 研究中 
都表 明并非 如此。 

Boyd 等把交 换过程 1 和 5 称为外 扩散或 膜扩散 ,过程 2 和 4 称 颗粒扩 散或外 扩散。 并 
推导 出膜扩 散或颗 粒扩散 的交换 动力学 公式, 指出 其交换 速率的 控制过 程可以 从时间 
— 百分交 换量的 曲线形 状推导 出来。 

了 = . 丄.^ 

— 3 Z)m 丁 . 

和 Dm 是溶 质在内 和外液 相中的 扩散系 数," 是分配 系数, r 是颗粒 半径, 5 是在 
离子 交换树 脂周围 固定相 液膜的 厚度。 

T 值比 1 小时 说明颗 粒扩散 为交换 过程速 率的主 要控制 过程, 而 T 值比 1 大 则表示 
膜扩散 过程占 主要。 

从上 式中也 明显地 看到, 在 Ds 值 (高交 联度、 紧密的 交联剂 结构) ,低 《 值 (低交 换量) 
和低 8 (低 流速, 因 8 与线性 流速成 反比) 如有利 于颗粒 扩散, 相反对 于松散 的交换 剂结构 
高《值 、低 流速、 颗粒小 (这 些条 件通常 认为有 助于提 高色谱 效率) 的情 况下, 则有 利于膜 
扩散。 

虽然 在离子 交换树 脂中, 扩 散系数 DjDm 的 比率通 常较小 (0.01 — 0.1), 但交 换速率 
仍 为颗粒 扩散所 控制, 用多糖 离子交 换剂色 谱时, Ds/Dm 较大 (0.1 — 1.0), 所以通 常用于 
高分 辨率的 色谱, 其交, 速率主 要为膜 扩散所 控制。 

膜扩散 控制的 交换过 程的速 率通常 比颗粒 扩散慢 10〜10() 倍, 大分子 溶质在 两相的 
扩散 系数都 较小, 例如在 多糖离 子交换 剂上的 大分子 色谱, 其 离子交 换速率 较慢, 这一点 
也 支持了 膜扩散 控制的 主张。 



• 93 • 



四、 离子 交换剂 的选择 



(一) 选 择交换 剂时要 考虑下 列的一 些因素 

被分 离物质 带何种 电荷; 分子的 大小; 被分 离物质 所处的 环境, 环境中 是否有 其他离 
子的 存在; 这些 离子的 电性, 数量 如何; 被分离 物的物 理化学 性质, 是否 耐酸、 碱、 高温等 J 
被分离 物质的 大概数 量等。 

在阳 离子交 换剂中 以磺酸 型应用 最广, 它在 酸及中 性溶液 中均可 使用, 简单及 复杂的 
无机及 有机离 子都可 交换, 但带 正电荷 的胶体 和高分 子的阳 离子则 不能被 交换或 交换很 
少。 对 于一些 两性化 合物, 如 分子较 小的氨 基酸也 可进行 交换。 含 有苯酚 的磺酸 型树脂 
不宜 在滅性 溶液中 应用。 接酸型 的阳离 子交换 剂较有 选择性 ,可用 于强碱 与弱碱 分离, 也 
可用于 碱性氨 基酸与 其他氨 基酸的 分离, 此类 交换剂 对氢离 子有特 大的亲 和力, 少 量的酸 
就可 把碱置 换掉, 故再 生手续 简便。 

阴离子 交换剂 与阳离 子交换 剂相似 ,强碱 型树脂 应用范 围广, 在 酸性溶 液中强 碱型与 
弱碱 型均可 使用, 但弱酸 与碳酸 、硼酸 、硅酸 等不能 与弱碱 型树脂 产生交 换作用 ,必 需用强 
碱型树 脂才可 除去。 在 中性溶 液中, 以用强 碱型或 中强碱 型树脂 为宜, 而在 碱性溶 液中则 
只有 强碱型 树脂才 适用。 

(二) 交换剂 的处理 及转型 

商品的 树脂是 干树脂 ,使用 前要用 水浸透 使之充 分吸水 膨胀, 又 因含有 一些水 不溶性 

的杂质 ,故要 用酸、 碱处理 除去。 歩骤 如下: 干 树脂用 水浸泡 2 小时后 减压抽 去气泡 ,倾 
去水, 用 无离子 水洗至 澄清, 倾去水 后加人 4 倍树 脂量的 IN HC1, 搅伴四 小时, 除去酸 
液, 水洗至 中性, 再加 4 倍量 2 iV NaOH, 搅拌 4 小时, 除去 碱液, 水洗 至中性 备用。 

根据 需要用 适当的 试剂, 使树 脂成为 所需要 的型式 (称 为转型 ), 阳离 子交换 树脂用 
HC1 处理 则转为 H+ 型, 用 NaOH 处 理则为 Na+ 型, 用 NH^OH 处理为 NHj 型; 阴 离子交 
换 树脂用 HCl 处理 则转为 C1- 型, 用 NaOH 或 NH^OH 处理为 一 OH— 型, 用甲酸 按处理 
为甲 酸型。 

树脂 长期使 用后, 如杂 质含量 太高, 则可 在酸碱 处理前 用沸水 处理, 或 用热酸 与热碱 
处理, 甚 至用有 机溶剂 (如 乙醇、 丙 酮等) 处理, 再 用水洗 干净。 

树脂保 存时以 盐型较 稳定。 用过的 树脂一 定要洗 干净, 防止 发霉。 如短期 存放, 可保 
存于 1 N NaOH (阳 树脂) 或 1 N HC1 (阴 树脂) 中。 

(三) 装柱 及加样 

实 验室的 离子交 换柱一 般用玻 璃或有 机玻璃 制成, 下部有 缩口, 管底部 烧接上 3 号砂 
芯滤 板或垫 上玻璃 纤维, 下口 带有调 节活塞 (如图 4-3)。 柱的大 小视需 要而定 ,可 根据被 
交换 物质的 数量和 交换剂 的总交 换量来 决定。 工厂 也有用 离子交 换罐的 (如图 4-4)。 一 
般用塑 料或不 绣钢为 材料, 在罐中 有分布 液体用 的交换 器及支 持树脂 的筛板 ,为了 便于反 
冲, 罐的上 部需留 有足够 空间, 为防止 酸碱的 腐蚀, 罐用涂 料保护 的钢板 ,或 用耐酸 誠的塑 
料 制成。 
• 94 • 



图 4- 3 离子 交换色 谱装置 



图 4- 4 离子 交换纖 



离子交 换剂的 装柱与 一般柱 色谱法 相同, 主 要是防 止出现 气泡和 分层, 装填要 均勾。 
防止产 生气泡 和分层 的方法 是装柱 时柱内 先保持 一定高 度的水 (一 般为 柱高的 1/3), 加 
入 树脂时 使树脂 借水的 浮力慢 慢自然 沉降。 

装柱完 毕后, 用水或 缓冲液 平衡到 所需的 条件, 如 特定的 PH 值、 离子强 度等, 即可上 
样 品液。 上柱中 的一个 重要问 题是控 制流速 的加压 或减压 装置, 尤 其是采 用细长 柱或细 
目的交 换剂。 外加 可用减 压法, 也可用 
加 压法, 前者是 在柱的 排出口 增设抽 
气装置 (工业 生产上 多用此 法); 后者 
是用 打气入 柱的方 法进行 加压的 (见 
图 4- 5), 这是最 简单的 装置, 用 一个装 



样品液 




打气管 




图 4-5 简便加 压装置 



图 4- 6 自动加 压装置 



95 





维 

纤 

玻 



有样品 液的分 液漏斗 与柱用 橡皮塞 连接, 分液 漏斗上 端串有 压力计 并经缓 冲瓶与 打气管 

相连, 当 达到所 需压力 时就将 打气管 夹紧, 假如 树脂为 100 目, 柱高 7.2 厘米, 柱内径 1.2 
厘米 时采用 30 厘 米承柱 压力就 可达到 2 毫升 / 分的 流速。 

国内 有的实 验室采 用自己 设计制 造的自 动加压 装置, 如图 4-6 所示, 操 作时首 先移动 
压力计 左侧的 白金丝 ,使它 的尖端 处于所 需要的 压力位 置上, 插入 电源, 马达即 起动, 压缩 
空 气很快 进入色 谱柱, 同时压 迫压力 计中水 银柱, 使压 力计左 侧水银 上升, 当水银 受压上 
升接 触到白 金丝尖 端时, 因 白金丝 与继电 器相连 而使空 气压缩 机马达 断路。 经过 一定时 
间后, 因色 谱柱中 液体的 流动, 外 压逐渐 下降, 压力计 中水银 柱也随 之下降 而与白 金丝脱 
离, 此 时继电 器恢复 原状, 马达又 起动。 由 此周而 复始, 保持色 谱柱中 稳定的 压力, 即得到 
恒定的 流速。 

(四) 洗脱 

对分离 不同的 物质所 用的洗 脱液也 不同, 原则是 用一种 更活拨 的离子 把交换 上的物 
质 再交换 出来。 常用的 洗脱剂 为酸类 、碱类 或盐类 的溶液 ,改 变整个 系统的 酸碱度 和离子 

强度, 以使交 换物质 的交换 性能发 生变化 ,巳 交换上 去的物 质就逐 渐洗脱 下来。 为 了提高 
分辨率 ,常采 用梯度 洗脱法 ,装 置上有 如下三 种设计 (图 4-7)。 



(a) 



A 

DC 

B 

E 



Ca 
A 



(b) 



c 









Ca 
A 




Cb 
B 

E 



D 



(c) 



门 




图 4-7 梯度洗 脱装置 
(a) 凸形梯 度装置 (b) 线性梯 度装置 (C) 非 线性梯 度装置 (d) 浓度梯 度曲线 

图 4-7 (a) 包 括一个 洗脱液 储存器 A 和 混合室 B 相连, 混合室 又与柱 连接, 混 合室中 
装入 色谱分 离开始 使用的 溶剂, 储存器 A 包括的 洗脱液 用以增 加流动 相的洗 脱能力 ,液流 
从 B 流入 柱中, 而洗 脱液将 以同样 流速从 A 到 B, 所以在 B 中液 体体积 不变。 洗脱 液和溶 

剂的 混合设 置有电 磁搅伴 E 以使 混合 均勾。 - 
这种装 置产生 一个凸 形指数 梯度, 以下式 表示: 



• 96 • 



25 50 75 100 125 150 175.200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 25 50 75 100 125 
L _ 150cm 长柱, pH3.25, 小 150cm 长柱, pH4.25 _J 

r o.zNnmmm T .0.2A' 柠 橡酸纳 , ro.ssyv 佇 檬酸纳 飞 

图 4-8 氣基酸 自动色 谱仪对 各种氨 基酸分 离结果 



Cv = Ca — (Ca ― Cb) . e~vi 

Cv 是体积 V 后洗 脱液的 浓度, Ca 是 储存器 A 中的 浓度, Cb 是 开始在 混合室 B 中洗 
脱液的 浓度, Vb 是在 B 中液体 体积。 
这种 装置现 已很少 应用。 

图 4-7 (b) 包 括两个 同一横 截面积 的容器 A 和 B, 连接在 一起, 故两 者的液 面保持 
一致, 在 B 室中有 电磁搅 拌以保 证混合 均句, 管 F 把 层析柱 C 和 B 室连接 起来。 在 流出体 
积 V 后 B 室中 洗脱液 的浓度 Cv 可 由下式 计算: 

' Cv = Cb + (Ca + Cb) • ― 

Vtot 

Ca 和 Cb 各 为容器 A 和 B 中 溶液的 浓度。 
V.ot 为开始 在两个 容器中 液体总 体积。 

图 4-7 (c) 表 示容器 A 和 B 不需要 相同的 横截面 ,洗 出体积 V 后洗 脱液 的浓度 计算如 

下: 

Cv = Ca — (C、 - Cb) fl ― -^W 
Aa 和 Ab 各 为容器 a 和 B 的横截 面积, 其 他符号 同上。 

图 4-7 (d) 表示浓 度梯度 曲线, 当 Aa = Ab 时 为线性 梯度, Aa > Ab 时 为凸形 梯度, 
Aa< Ab 时 为凹形 梯度。 

- 五、 离 子交换 色谱法 的应用 

(― ) 氧基酸 - 

离子 交换树 脂用于 氨基酸 的系统 分离研 究工作 已有几 十年的 历史, 但 早期的 工作效 
果不大 满意, 特别是 对碱性 氨基酸 回收率 很差。 自从 Moore 和 Stein 【 i« 引进 了两根 层析柱 
分离 氨基酸 的方法 之后, 在氨基 酸系统 分离方 面有了 很大的 发展。 方 法是在 Dowex50X8 
的 100 厘米 层析柱 上分离 酸性和 中性氨 基酸, 开始洗 脱液为 PH 3.41 的柠 檬酸钠 (37.51), 



苯丙 If 



精氨酸 

组氨 酸- 

i 酸 

i ^ 




苯丙氣 酸 

酪氨酸 



亮 靈|= 

异亮 氨酸, 



甲 硫氨酸 

蟹酸 



别异 亮氨酸 



J 



丙氨酸 

I 酸 I 




复酸 

丝氨酸 I 

苏氨酸 

甲硫 氣酸讽 

天门 冬氨酸 




甲硫 酸亚! W 



• 97 • 



最后洗 脱液为 pH 4 .25 的柠 檬酸钠 (50<1C); 用 15 厘米的 Dowex 50 X 8 层 析柱, 以磯酸 
和 柠檬酸 缓冲液 (PH 6.8 和 6.5) 洗脱分 离色氨 酸和碱 性氨基 酸及游 离氨。 

到 1958 年, 以 上的手 工分离 方法被 氨基酸 自动色 谱仪所 代替, Moore 等"" 用粉状 树 
脂 AmberlkeIR-120 ( 4 00 — 600 目), 150 X 0.9 厘米 层析柱 以分离 中性和 酸性氨 基酸, 整 
个操作 过程在 501 下进行 ,仅用 一种缓 冲液, 从 0.2 柠 檬酸纳 (PH3.25) 到 0.2 M 柠檬 
酸纳 (.pH 4.25), 而碱 性氨基 酸的分 离则在 15 X 0.9 厘米 的短柱 上用同 样树脂 进行, 以 
0.3 M 泞檬酸 缓冲液 (pH 5.28) 在 50^ 下洗脱 ,其 分离结 果如图 4-8。 

(二) 糖 

离子交 换色谱 法也可 用于中 性不带 电荷的 糖类的 分离。 主要原 理是利 用糖和 硼酸盐 
生成 的糖- 硼酸盐 复合物 有离子 性质, 从而 可用离 子交换 层析法 分离。 某些 多轻基 化合物 
包 括糖) 在碱 性溶液 中和硼 酸盐离 子反应 生成稳 定的复 合物, 可 包括以 下三种 形式: 



一 C — 0\ 

一 C 一 oZ 

[1] 



BOH 



一 C — o、 
— C — O' 



Ndh 



[II] 



H+ 



■C — 0\ /O— c 
I >B< 1 

c— \o — c- 
[111] 



H+ 



[I] 型 实际上 是非离 子化的 形式, 而 [n] 和 [m] 型在碱 性溶液 中是完 全离子 化的, 
为中 等强度 的酸。 这些化 合物的 形成为 以下的 因素所 决定: 糖 的绝对 浓度, 硼酸 盐的离 
子 浓度, 两者的 比率。 在低糖 浓度和 低的糖 / 硼酸 盐的比 率下, 主 要产生 [n] 型复 合物。 

Khym 和 Zm [ i23 用强 碱型阴 离子交 换树脂 Dowex-1 层 析分离 果糖、 半乳糖 和葡萄 
糖的混 合物, 用 0.016M K2B4O7 洗脱果 糖和半 乳糖, 以 0.3 M K2B4O7 洗脱葡 萄糖。 这个 
方法也 可用于 寡糖和 六元醇 的分离 如山梨 糖醇、 半乳 糖醇和 甘露糖 醇可在 Dowex - 1 
硼酸 柱上用 K2B4O7 溶液 洗脱, 其中甘 露醇由 于它的 一对顺 式二炼 基而在 柱上产 生强烈 
的 滞留。 

对单糖 和低聚 糖的分 离如采 用硼酸 盐复合 物阴离 子交换 体系, 虽然具 有较高 的分辨 
力, 但由于 流速慢 ,溶质 要暴露 在碱性 条件中 的缺点 ,不如 采用分 配层析 为佳。 




10x3 20x3 30x3 40x3 50x3 
V=NOx3 立升 
图 4-9 阳离 子交换 柱分离 四种单 核苷酸 曲线及 pH 值变 化曲线 



• 98 • 



(=) 四种 5'- 单核苷 酸的分 离 [ ": 

在 pHl.5 时, AMP、 CMP、 GMP 上 的氨基 离解, 带正电 荷可被 阳离子 交换树 脂所吸 
附。 UMP 没有 氨基, 不带正 电荷, 大部分 直接流 下来。 当用无 离子水 洗脱时 ,随着 PH 值 
的 变化, GMP, CMP, AMP 上的氨 基解离 度降低 的程度 不同, 而先后 失去阳 离子交 换树脂 
上的吸 着能力 ,按 GMP、 CMP、 AMP 的 顺序依 次洗脱 下来。 结 果如图 4 -9。 

树脂: 聚苯 乙炼- 二乙' 烯苯磺 酸型, 200〜300 目, 1X8。 柱: 10X58 厘米。 上 
柱量: 占 树脂全 交换量 1.7% 



(四) Dowex- 1 甲廏 型树脂 柱分离 腺苷, AMP、 ADP 和 ATP 

分 离条件 如下: 树脂: Dowex- 1 甲 酸盐。 柱: 1 X 30 厘米。 样品: 
AMP、 ADP 和 ATP 各 10 毫克, 调 pH 至 7.9。 

以 D-5iV 甲酸 线性梯 度洗脱 



每毫升 含腺苷 



1.2 



AMP 



ATP 



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 

组分 X 10-1 

图 4-1Q 在 Dowex- 1 甲 酸盐树 脂柱上 腺苷、 AMP、 ADP 和 ATP 的分 离图谱 

(五) 图 4-11 为人 血红蛋 白的氨 乙酰化 链的 胰蛋白 酶水解 物的色 谱分离 as 

实 验条件 如下: 柱 0.9X 18 厘米。 树脂: 横化阳 离子交 换树脂 Spinco 15A ,在 50t 
下以 线性梯 度洗脱 (混 合室: 250 毫升 0.2 吡 啶醋酸 缓冲液 pH 3.1; JJt 存室: 250 毫升 
2.()M 吡啶 醋酸缓 冲液, pH 5) 流速: 300 毫升 / 小时。 

第三节 高 效液相 色谱法 

一、 引 言 

高效液 相色谱 (简称 HPLC) 是最近 十多年 兴起来 的一门 新技术 ,它最 主要的 特点是 
流动相 在高压 泵作用 下高速 地能准 确控制 流量地 通过色 谱柱。 使样 品中各 组分在 流动相 
和固 定相之 间迅速 地达到 平衡; 其次采 用了封 闭的能 重复使 用的柱 子并特 殊制作 了各种 
类型固 定相, 这 些固定 相不仅 具备体 积小、 均勾而 且有耐 压和传 质快等 特点, 使色 谱分离 
效 率大大 提高, 一般 定量分 析可达 ± If 。准 确度。 用于制 备色谱 时又可 以连续 操作。 每 
次制 备样品 量最高 可达克 量级。 高效液 相色谱 不同于 气相色 谱是对 分离的 样品类 型具有 

- 99 • 




昔 

腺- 



非常 广泛适 应性, 样品 还可以 回收。 从各种 无机化 合物、 
有机化 合物到 具有生 理活性 的各种 生物大 分子; 极性的 
和非极 性的都 适用, 此 外整个 仪器装 置自动 化程度 很高, 
附 加的各 种检测 器种类 繁多, 因此, 高效 液相色 谱已成 
为现 代化学 和生物 化学分 析和制 备最有 力武器 之一。 在 
生化领 域中广 泛应用 于下列 产物的 分离和 鉴定: (1) 氨 

基酸 及其衍 生物; (2) 有 机酸; (3) S 体化 合物; (4) 生物 
碱; (5) 抗 菌素; ( 6 ) 糖类; (7) 卟琳; (8) 核酸及 其降解 
产物; (9) 蛋白质 、酶和 多肽; (10) 脂 类等。 

高 效液相 色谱的 分离原 理与经 典色谱 相同, 主要是 
各种 溶质在 色谱柱 中差速 迁移的 结果。 这 种差速 迁移现 
象, 是样品 在固定 相和流 动相之 间分配 不同所 引起的 ,所 
以 按照固 定相对 样品的 保留作 用机理 不同, 高效 液相色 
谱常分 离以下 几类: 

1. 液 一液分 配色谱 又可分 为正相 色谱和 反相色 
谱。 正相 色谱以 极性较 强的填 料作固 定相, 而以 极性较 
小的 溶剂作 流动相 , 极性较 强的化 合物被 保留, 极 性弱的 
化 合物先 被洗脱 下来。 反相色 谱则固 定相极 性小, 流动 
相极 性大, 用于 分离非 极性或 弱极性 物质。 

2. 液 一固吸 附色谱 

3. 离子交 换色谱 

4. 凝 胶色谱 

此 外最近 正出现 高效聚 焦色谱 和蛋白 质快速 液相色 
谱 (FPLC) 等 主要是 高效离 子交换 剂和琼 脂糖凝 胶等色 
谱用于 蛋白质 、多肽 、酶的 发展。 

二、 高效液 相色谱 仪概述 



高效 液相色 谱仪主 要由高 压泵、 色谱柱 、检测 器三大 

syUdd d 部分 组成。 附件 可增设 自动记 录仪、 洗脱 液自动 部分收 

集器、 r: 液 器及梯 度混合 装置、 进样阔 或注射 器等。 色谱 
柱是获 得良好 分离率 的核心 部件, 但好的 色谱柱 必须配 备优良 的整机 装置, 才能获 得满意 
的 结果。 图 4-1 是高效 液相色 谱仪器 装置示 意图。 现按仪 器各个 部分作 一简单 介绍: 

1. 溶剂糟 (或称 流动相 ft 罐) 商品贮 罐是用 不诱钢 制成, 常附 加脱气 设备如 搅拌、 
加热、 抽真 空和吹 氮等。 自制简 单溶剂 糟可用 玻璃瓶 代替。 

2. 溶 剂程序 控制器 主要用 于梯度 洗脱, 梯度 的形成 可分常 压混合 和高压 混合两 
类。 前者 是在常 压下将 溶剂混 合再用 单泵输 送给色 谱柱。 后 者是不 同溶剂 用双泵 在高压 
条件下 混合, 目动 化程序 较高, 可在较 大范围 的流速 (600 毫升一 3 升 / 小时) 和较 长时间 



IS 



范围内 (15 分钟至 16 天) 获得 梯度, 



100 



溶剂糟 



溶 剂程序 控制器 



过滤器 



高压泵 1 

„ < 样品注 射器或 进样阔 



管道 过滤器 







脉 冲阻尼 限制器 1 


预 


柱 



色谱柱 



_J_ 

检测器 



部分 收集器 



r 、― 记录器 



r~\ 



数据处 理系统 



图 4-12 高效液 相色谱 仪装置 示意图 

3. 高压泵 是高 效液相 色谱主 要部件 之一, 可 用优质 不绣钢 或陶瓷 制成。 有较强 
抗化学 侵蚀性 和抗机 械破损 性能。 输 出压力 最高达 350 至 400 巴 (约为 5 — 6 千碌 / 英寸 2 )o 
常 分机械 泵和气 动泵两 大类, 使用时 各有优 缺点, 对于制 备色谱 来说, 一般 要求泵 压没有 
分析色 谱高。 但希望 有较大 流量。 一 个好的 泵应该 是工作 压力范 围大, 没 有输液 脉冲或 
者很 小的输 液脉冲 (脉冲 对荧光 、紫外 检测影 响较小 ,对 化学检 测影响 较大, 有时需 加脉冲 
阻尼限 制器以 减弱之 )。 

4. 进 样装置 最简单 的方法 是使用 注射器 ,注射 器进样 隔膜的 设计应 能承受 高压, 
多用硅 酮弹性 体或氯 丁橡胶 制成。 另一 种是进 样阔, 能在高 压下操 作而无 扰流, 宜 于大体 
积 样品的 注人, 注射器 和进样 阔见图 4-13。 

5. 检測器 检测器 是高效 液相色 谱仪的 眼睛, 必 须具有 足够灵 敏度, 而且要 求适应 
条件范 围比较 广些, 最常用 的检测 器有: 

(1) 紫外 吸收光 度计: 凡是 有紫外 吸收的 化合物 都可以 使用。 使用 最多的 波长有 
280 毫 微米, 260 毫微米 (蛋 白质类 ), 254 (核酸 类), 210, 206 毫微 米等。 有 一个以 上的双 
键生 色团的 化合物 都能产 生紫外 吸收。 有些蛋 白质如 r- 球 蛋白在 206 毫微 米比在 280 毫 
微 米的吸 收度大 40 倍。 故选 择波长 范围时 还需依 不同化 合物具 体情况 而定。 

(2) 示差折 光计: 也 是应用 较广的 检测器 之一。 多 应用于 脂质、 糖类 物质渗 色的测 
定。 在适 当的条 件下能 检测到 3 微克 / 毫升的 样品量 ,缺点 是对温 度比较 敏感。 



101 




图 4-13 注射器 和进样 阔简图 



表 4-4 各种 检瀏器 性能一 览表' 



参 数 


紫 夕卜 
(吸 收值) 


折光 
(折 光指 
数 单位) 


溶 质迁移 * 
(安培 ) 


放射性 


极谱 
(微安 ) 


红外 
(吸 收值) 


荧光 


电导 (微欧 ) 




选择性 


普通 


普通 


选择性 


选择性 


选择性 


选择性 


选择性 


用于梯 度洗脱 


可 


不可 


可 


可 


未定 


可 


可 


不可 


线性 动态范 围上限 


2.56 


10-3 


10-* 


无现 成数据 


2X10-, 


1.5 


无现 成数据 


1000 


线 性范围 


5X10* 


10* 


-105 


大 


10* 






2X10* 


在土 1% 噪 音下满 


0.05 


10-' 


10-" 


无现 成数据 


2X10-° 


0.01 


0.005 


0.05 


刻度 灵敏度 


















对合 适样品 灵敏度 


5X10-10 


5X10' 


10-' 克 / 秒 


50 居里 / 


10-10 


10-' 


10 ―'〜 10-'。 


10-' 




克 / 亳升 


克 / 毫升 


(约 5X10-' 

克 / 毫升) 


毫升 


克 / 毫升 


克 / 毫升 


克 / 毫升 


克 / 毫升 


对流速 敏感性 


无 


无 


有 


无 


有 


无 


% 


有 


对温度 敏感性 


低 


10—"c 


可忽略 


可忽略 


1.5%/°C 


低 


低 


2%I。C 



* 也 称火焰 离子化 检测器 



(3) 放 射性检 测器: 主要利 用色谱 柱中流 出含有 放射性 标记的 溶质与 检测器 中闪烁 
体 接触时 产生脉 冲而被 检出。 多用于 代谢途 径中间 产物的 分离。 

(4) 荧光检 测器: 也是一 种受干 扰小, 灵敏 度很高 的测验 方法。 只要 能在紫 外光激 
发下 能发射 出荧光 的溶质 都可以 使用。 灵敏 度可达 10- 9 — 10-1° 克 / 毫升。 适用于 各种氨 
基酸、 胺类维 生素、 ^醇化 合物的 测定。 

此外, 还有 溶质迁 移检测 器或称 火焰离 子化检 测器, 极谱检 测器, 电 导检测 器等。 溶 
质迁移 检测器 对样品 有一定 破坏性 ,制 备分离 中比较 少用, 由 于制备 色谱、 溶质的 浓度一 
般都比 较大, 对检测 器灵敏 度的要 求没有 分析色 谱那样 严格, 在高效 液相色 谱中, 一些常 

• 102 . 



用 的检测 器有关 规格性 能见表 4-4。 

三、 高效液 相色谱 的固定 相填料 

经典 液相色 谱所用 的多孔 物质如 硅胶、 氧化铝 、离 子交换 珠等, 由于粒 度大, 传 质慢而 
不 均勾, 造成谱 带扩散 严重, 影 响了柱 的分离 效率。 针 对上述 缺点, 高效液 相色谱 所用的 
固定 相填料 大部分 具有实 心圆核 外裹多 孔薄层 构成, 使溶 质在多 孔薄层 中易于 出入。 另 
一 种是形 状规则 的全多 孔微粒 (直径 一般在 5 — 10 左右 ), 这样小 的颗粒 ,溶质 在孔中 
移动的 距离是 很短的 ,以上 结构都 使溶质 易于在 二相之 间达到 平衡, 加快分 离速度 和提高 
分离 效率。 形状 规则的 填料及 均勾装 填都使 样品分 离获得 良好重 现性。 现 代高效 液相色 
谱使 用的固 定相填 料常有 下列几 大类: 

1. 按形状 可分为 球形和 无定形 两类, 圆球 形填料 有利于 分离效 率和重 现性。 

2. 按硬 度可分 为硬质 填料、 半硬 质填料 凝胶及 一些如 琼脂糖 的生物 软胶。 

3. 按结构 可分为 表面多 孔薄层 填料与 完全多 孔填料 两类: 

现根 据不同 色谱的 要求, 介绍一 些常用 固定相 填料的 名称及 其主要 结构的 性质。 

(-) 液一液 分配色 谱常用 的固定 相填料 

液一 液分配 色谱的 固定相 一般多 选表面 积小, 孔径较 大的为 填料, 全多 孔和表 层多孔 
填料都 能用于 制备液 一液分 配色谱 ,主 要有: 

1. 全多孔 硅珠: 如 商品名 Porail 或 Spherosil。 

2. 表 层多孔 硅胶: 如 商品名 Zipax 和 Corasilo 

3. 化学键 合相: 是 在表面 多孔或 全多孔 的小球 上经过 化学反 应结合 上一层 固 定相。 
有的在 多孔硅 珠上用 醇类脂 化生成 脂化硅 质填料 (刷型 ) 如 商品名 Durapak, 或经 硅院化 
生 成聚硅 氧烧型 (涂 层型) 填料如 商品名 Permaphase, 以 上化合 键合相 固定相 都比较 稳定, 
不易在 使用中 脱落。 

(二) 液一固 吸附色 谱常用 的固定 相填料 

与 经典吸 附色谱 相似, 需 要选择 良好表 面吸附 性能的 物质, 其中 极性吸 附剂有 硅胶、 
氧化铝 、氧 化镇、 硅酸镁 (Florisil) 等。 非极 性吸附 剂有活 性炭。 如 按结构 和性质 不同又 
可 分为: 

1. 全多 孔高效 吸附剂 如全多 孔硅胶 (商品 Porasil A-F), 全多孔 氧化铝 (商品 
Bio- Red AG) 等。 

2. 全多 孔低效 吸附剂 如多 孔硅胶 (商品 Divason Code 800)。 

3. 表 面多孔 吸附剂 如薄壳 型硅胶 (商品 Corasil II) 及用于 制备高 容量薄 壳型氧 
化铝 (商品 Pellumina HC)。 

(=) 离 子交换 色谱常 用固定 相填料 

主要有 离子交 换树脂 制成的 微网或 大网状 结构的 全多孔 颗粒, 或在固 体惰性 核上涂 
渍一 层多孔 离子交 换剂而 成薄壳 结构。 离子 交换剂 的骨架 有聚苯 乙炼, 葡 萄糖和 纤维素 

• 103 • 



等。 它们都 可以带 上大量 可交换 基团。 一些以 糖基为 骨架的 离子交 换剂适 用于分 离各种 
生物 大分子 物质, 使 用较多 的有: 

弱滅性 DEAE Sephadex A25, A50。 
强滅性 QAE Sephadex A25, A50。 
弱酸性 CM Sephadex C25, C50。 
强酸性 SP Sephadex C25, C50。 

(四) 凝胶 色谱常 用固定 相填料 

用于 凝胶色 谱的凝 胶有: 

1. 软 胶和半 硬胶, 如葡聚 糖凝胶 (Sephadex) 交联聚 丙炼酷 胺凝胶 (Bk)-gel-P) 和琼 
脂糖 (Sepharose) 等, 这些 凝胶多 使用水 或缓冲 液作流 动相, 凝胶承 受压力 较低, 一般在 
7-14 巴 之间, 过去由 于高效 液相色 谱高压 泵的设 计未能 满足这 一技术 要求, 在生 化中实 
际应用 很少。 近年 来由于 制出了 流速低 而稳定 的低压 泵及各 种防止 缓冲液 中金属 的腐蚀 
的 装置, 生物凝 胶类填 料才广 泛用于 HPLC。 

2. 刚性和 半刚性 凝胶, 包 括刚性 多孔玻 璃和多 孔硅胶 (商品 Bio-glas, Porasil 和 Merck- 
O-gel-Si 等); 半刚 性聚苯 乙炼珠 (商品 Poragel, Styragel, Bio-Bead-S) 乙炼乙 酸脂珠 (商 
品 Merck-0-gel-OR), 以 上刚性 和半刚 性凝胶 一般均 可承受 60— 70 巴以上 压力, 并能在 
有机 溶剂中 使用。 

四、 色 谱方法 的选择 • ' 

待分离 样品对 色谱法 的选择 主要基 于样品 的物理 化学特 性及溶 解度。 对于一 个未知 
样品, 首先 要大概 了解它 的分子 大小, 然 后进一 步试验 其溶解 性能。 根据分 子大小 和溶解 
性能便 又粗略 地选定 一种色 谱柱进 行初分 。一般 来说, 吸附 色谱多 适用于 非极性 样品, 它的 
柱容量 主要决 定于吸 附剂表 面积的 大小。 离子 交换色 谱和液 一液分 配色谱 多用于 水溶性 
样品, 柱容量 分别决 定于离 子交换 量和固 定相中 固定液 的体积 ,凝胶 过滤色 谱可根 据填料 
的性能 不同分 别用于 亲水和 亲脂性 样品, 但以上 选择也 不能绝 对化, 如吸附 色谱的 填料经 
过特 殊处理 后也可 以吸附 极性很 强的水 溶性化 合物, 液一液 分配色 谱的正 相和反 相就可 
分别用 于分离 极性和 非极性 化合物 。关于 对色谱 方法的 选择, 可参考 L.R. 斯奈德 (Snyder) 
和 J. J. 柯克兰 (Kirkland) 合著的 "现 代液相 色谱法 导论" 一书中 所提出 的图解 (见图 4- 
14)。 另 LKB 和 Beckman 公司 根据他 们生产 的产品 也提出 了类似 选择色 谱方法 的图解 
(见图 4-15, 图 4-16), 均可结 合我们 具体情 况参考 选择。 

注: 离子 对分配 色谱, 是 可离子 化或离 子型的 化合物 (在 水的介 质中) 用一个 适当的 
反离子 (如 四院基 铁化物 / 苦 味酸) 与离 子或可 离子化 的溶质 生成离 子对, 该 离子对 便在二 
相中 产生新 的分配 系数, 大大提 高柱分 离率和 选择性 ,此 法用途 很广。 

五、 分离度 的调整 
液相 色谱的 分离度 (或 称分 辨率) 常以下 面公式 表示: 

• 104 . 



分子 
量 

范围 



-高于 2000- 



- 非水溶 
液系统 



水 溶液. 
- 系统 



-低于 2 000 



'水 溶液 

系统 



非水溶 
一液 系统- 



凝胶渗 
透色谱 






凝胶过 
滤色谱 





Slyragel 
-多 孔玻璃 
_Porasil 

"Sephadex 
-Biogcl-P 
—多 孔玻璃 



凝胶过 滤色谱 一 Sephadex (小孔 ) 



离子交 
换色谱 



—酸性 
化合 物' 

滅性 

一 化合物 



阴离子 
交换剂 

, 阳离子 
交换剂 



-匚 



-树脂 Aminex-A 25 

-薄膜 (Pellionex-SAX) 
树脂 (Durruni Type DCIA) 



分 紀色谱 



薄膜 (Zipax SCA) 
水 / 异辛院 / 乙醇 一三元 (含 水固 定相) 



凝胶渗 




― Poragel 


透色谱 




Biobeads-5 



(按 分子 大小显 著差异 分离) 



一 异构体 分离及 
稳定 化合物 



型 



吸附色 




谱 





― Zorbox-Sil 
― Peilumina-HS 



分 


配 


色 


谱 



■ 极性化 

合物 - 
(常规 分配) 



非极性 
. 化合物 
(反相 分配) 



一 0,/3'- 氧 二丙腈 / 己垸 

-ETH-PeriTiaphasc/$f 
戊院— 异丙醇 
_三 乙二醇 / 庚院 

一 角鲨烷 / 水- 甲醇 

— ODS-Permaphase/ 
水- 异丙醇 

—聚, 烃 / 水- 乙腈 



=— 



图 4-14 液相 色谱方 法选择 



4 \ a / \1 + K;/ 

(1) Rs 表示分 离度, 也即 是在色 谱图中 二个相 邻的峰 分离的 程度。 Rs 值 越大, 表示 
二峰 尖分隔 愈远, 二峰 的峰宽 越窄。 分离度 也可以 在色谱 图计算 而得, 下面 是一个 双组分 
的色 谱图: 

R ― a(tR, —― tRi) 

Wl W, 表示相 邻二个 峰的宽 窄度, tKi, 为相邻 二个峰 的保留 时间。 

(2) N 表示 理论塔 板数。 N 与柱长 (L) 成 正比, 与 每个理 论塔板 的高度 (H) 成反 

比。 即 N-:^ H 也是一 个色谱 柱单位 长度的 效率的 量度, 小的 H 意味着 得到高 的柱效 
H 

率, 它受各 种因素 的影响 ,如 小的填 料颗粒 直径, 低的溶 剂流速 和粘度 ,以及 提高分 离温度 

均 可获得 较小的 H 值。 



类物 物定物 

同合 系稳合 

不化 同不化 

I , 



• 105 • 



样品 

分 子大小 



色谱法 



LKB 产品 的选择 HPLC- CAT-EOL P.5 



大分子 
(蛋 白质) 
核酸 
多糖 



碎片 
(多肽 ) 
寡 核苷酸 

寡糖 



离 



子 



交 



换 



色 



小分子 化合物 
(氣 基酸) 
核苷酸 



凝胶过 滤色谱 

2150 HPLC 泵一 流速 可控制 10pl~5ml/min 之内 
2154 注射器 
2210 记录仪 
2158 紫外 检测器 

制备 色谱柱 2135 LKB Ultropac TSK G2,000, 3,000 或 4,000 SW 
21.5mm><60rnm(2135 蓝 色柱) 如 特异吸 附少, 回收 率高, 每次 
可分 离样品 最高达 100 毫克, 此柱可 在缓冲 液和有 机溶剂 使用, 
能 经受变 性剂及 各种去 污剂的 侵蚀。 . 

离子交 换色谱 
2150 HPLC 泵 
2154 注射器 

2210 记录器 2158 紫外 检测器 
11300 Ultrograd 梯度 混合器 
制备色 谱柱: LKB 535/545 CM/DEAE 柱: 
柱) 



21.5Xl50mm (2133 蓝色 



反 相液一 液色谱 
2150 HPLC 泵 . 
2154 注射器 
2210 记录器 

2158 紫外捡 测器或 2151 UV/VIS 检测器 
2134—210 Lichrosorb RP-18 2134-220 Lichrosorb RP-8 
2134—230 Lichrosorb RP-2 

图 4-15 LKB 产品色 谱方法 的选择 

(3) a 为选择 因子也 称分离 因子, 是二种 物质容 量因子 之比。 

k; 

选 择因子 (《) 可 以通过 变更流 动相和 固定相 的组成 性质而 改变。 

(4) K' 为容量 因子, 一般可 以看作 溶质在 固定相 中的总 摩尔数 与在流 动相中 总摩尔 
之比。 对于 一定的 柱子、 溶剂、 分离 温度和 样品浓 度足够 小时, K' 是一个 常数, 容 量因子 

与 分配常 数关系 如下: 

固 定相中 溶质量 _ 固定 相中溶 质浓度 X 固 定 相体积 
流 动相中 溶质量 流动 相中溶 质浓度 流动 相体积 , 

= 分 配常数 X mil 
流动 相体积 

以上影 响分离 度的三 个因子 《、 N、 K' 基本 上是独 立的, 可 以调整 好其中 一项, 然后 
再调 整另外 两项, 不 一定三 项同时 改变。 a、N、K' 三个 因子对 Rs 的 影响情 况比较 复杂, 
每一 因子的 作用都 可以作 专门的 论述。 对 于二个 组份的 色谱峰 来说, 变 动选择 因子" 
时, 《 使其中 一个谱 峰发生 位移, 而峰高 不变。 增 大理论 塔板数 N 时, 可以 使二个 谱峰同 
时变窄 ,峰尖 增高。 而变动 K' 时, 对分离 度影响 较大, 减少 K' 时, 又使谱 峰提前 呈现, 伹 
分离度 减少, 增加 K' 可以 提高分 离度, 但延 长分离 时间, 谱带 变宽。 图 4 - 18 表示 《、 N、 



K' 



- 106 • 









is 

M 


X 
















W 


o 








TTT 


5 













CO 




■gel- 




O 













ng 



样 品分子 
tt 小于 - 

2000 




ng 




0003 

















•"5 "i* 




D 3 



饑 #i 











效 









Vdl -Houw 



~HN I!i 一 n 



Veil -xovs. 



$0 



i 



o~H/N、。v 

VfU ^ VSH 



xu-xv nils 



Sao 

f.!^ 屮撖一 



HSA 或 TBA 1 


缓冲液 


0!H/H03W 












1 离 子对分 配色谱 1 





c 

5 







o'h/ndv 








反相 (控 制离 子化) 

Ultrasphere-ODS 
Ultrasphere-Octyl 

(c«i) 



1 o'h/hcpw 




o'h/ndv 1 










Ultrasphere-ODS 





开 始用乙 院添加 1 




MeOH. I PA 1 












Ultrasphere Si 



zu< -Hops 



—suanclssjjfj 



OMH/NUV 



PS 



翻屮被 



s 被 k 



翻屮被 # 



效 



107 



K' 三个因 素对色 谱图的 影响。 

在制 备色谱 图中, 常常在 混合组 份中要 求分离 其中一 个组份 ,此组 份如在 谱图中 是- 

个较大 的峰时 ,可 先提高 分离度 (改 变流动 

相 成份) 使成为 单峰, 再使样 品的负 载增至 

最大, 然后 收集谱 峰中心 部分。 如 所要求 5f 

情况 

组 份在谱 图中是 一个较 小的峰 (表 示样品 




图 4-17 — 个双组 份色谱 图计算 Rs 的方法 
保留吋 —— tR 分辨率 —— R, 峰宽 —— W 



改变 K' 



增大 N 



增大: 




减少 K' 



I 




增加 K' 






图 4-18 改变 《、 K'、 N 

对样 品色谱 图影响 



中含 所要求 组份的 量很少 ), 便经 过多次 分离将 此组份 收集浓 集后再 上柱, 按第一 种情况 
处理, 先提高 分离度 ,使成 单峰, 然后在 超负荷 下收集 纯品。 

六、 具体操 作及注 意事项 

<-) 进 样前准 备工作 

首先 使用的 溶剂, 即 流动相 要求具 有较高 纯度。 有 机溶剂 事前须 重蒸; 用水要 经过混 
合离 子交换 树脂处 理和活 性炭处 理后, 重 蒸除去 各种杂 质才能 使用。 盐类 常须经 过重结 
晶。 

各种溶 剂一般 要求新 鲜配制 ,使 用前经 过脱气 处理。 

挥发性 有机溶 剂脱气 较常用 方法是 超声波 振荡。 水和缓 冲液先 通过微 孔薄膜 滤去固 
体微 粒后, 缓慢加 热搅伴 (在电 磁搅伴 器上) 抽真空 去气。 

样品加 入前, 必须 用流动 相充分 洗柱, 待流出 液经过 检测器 的基线 校正, 证明 柱内残 
留杂质 确已全 部除净 ,才能 进样。 

进 样时, 样品用 与流动 相相同 的或互 溶的溶 剂完全 溶解, 如有 悬浮状 颗粒, 需 过滤除 

去, 然后 通过注 射器或 进样阔 进样。 进 样量的 多少, 视 不同的 柱容量 而定, 一般制 备性往 

每次最 大上柱 量可达 10 — 100 毫克。 

(二) 洗脱 

进样 后洗脱 的条件 常按事 先计划 好的溶 剂程序 进行, 内 容一般 包括: 
(1) 每次 色谱计 划所需 时间。 



108 



(2) 洗脱液 (即流 动相) 的组份 (单 元或 多元) 及 对形成 梯度的 要求。 如 样品各 组份与 
固 定相之 间的亲 和能力 差别较 大时, 采用 梯度洗 脱方法 (包括 极性, PH 和 离子强 度的改 
变), 可获 得较好 的分离 效果。 

(3) 流 动相的 流速, 是恒速 或变速 或每分 段时内 要求流 动相的 流速。 

实 际上, 样品展 层以后 所得色 谱图一 次很难 获良好 的分离 效果, 需要根 据色谱 图各组 
峰 形状、 位置进 行综合 分析, 并按自 己所需 制备的 组份的 谱峰分 离情? 5^, 调 整流动 相的板 
性 (或 离子 强度) 梯度 组合、 流速及 展层时 间等。 以上这 些因素 一般现 '代高 效液相 色谱仪 
都有 自动控 制程序 装置, 再加 上检查 温度和 pH 对 分离的 影响, 直至 选择到 最好的 分离条 
件后, 便开始 大规模 分离, 收集 所需的 组份。 

各类 色谱柱 加进样 品后如 何选择 适应的 洗脱液 (即流 动相) 其基 本原理 与经典 色谱洗 
脱 法大致 相同。 例如 液一液 分配色 谱的正 相与反 相色谱 的操作 原则大 致如表 4-5。 



表 4-5 正相 与反相 色谱操 作原则 





正 相 


反 相 


固定 相极性 


强 


弱 


溶剂 的扱性 


弱至中 


中至强 


样品洗 脱程序 ' 


弱极 性组份 先流出 


强极 性组份 先流出 


增加溶 剂极性 的影响 


减少洗 脱吋间 


增加洗 脱吋间 



当然高 效液相 制备色 谱对流 动相的 要求, 需照顾 到与检 测器相 匹配, 同 时还要 尽可能 
获得较 大的分 离度, 因此, 使用有 机溶剂 时要求 粘度要 低并有 一定挥 发度。 其中最 常用的 
有机 溶剂有 乙腈、 甲醇、 二氯 甲院、 己院、 硝基丙 酮等。 有些工 厂生产 的色谱 柱还限 定不准 
使用某 种溶剂 ,则 应注意 遵守。 

(H) 色谱柱 的清洗 及保存 

色谱 分离完 毕后, 应用溶 剂彻底 清洗色 谱柱, 或色 谱柱用 后存放 时间过 久也应 定期清 
洗。 硅胶柱 先用甲 醇和乙 腈冲洗 (乙 腈价格 较贵, 可少用 ,多用 甲醇) 再用干 燥的二 氯甲院 
清洗后 保存, 烷基 键合相 色谱柱 可用甲 醇一氯 仿一甲 醇一水 顺次交 叉冲洗 除去有 脂溶性 
及 水溶性 杂质。 离子交 换柱可 按一般 经典方 法经过 酸碱缓 冲液平 衡后, 再 以水和 甲醇洗 
净。 凝 胶柱则 以根据 其使用 流动相 的不同 分别以 甲苯、 四氧 呋喃、 氯仿或 水大量 冲洗至 
净。 但 亲水性 凝胶及 其他亲 水性色 谱柱保 存时, 常加 入少量 甲苯或 氯仿以 防止微 生物污 
染。 

(四) 一些 生化样 品分离 色谱图 的举例 

■ 高效液 相色谱 的使用 ,除 了认真 了解仪 器的设 i"1 原理和 各种色 谱柱的 性质、 应 用范围 
外, 要真 正掌握 好这门 技术, 还要通 过大量 实践才 能得心 应手。 目前 国外内 高效液 相色谱 
仪和色 谱柱型 号繁多 ,每个 厂家对 于自己 产品都 有比较 详细说 明和应 用举例 ,只要 遵守操 
作规 则及结 合有关 色谱的 原理加 以具体 运用, 在短期 内掌握 仪器操 作开展 实验工 作是不 
困 难的。 下 面试举 几个生 物样品 分离色 谱图的 例子, 供读者 参考。 

1. 标准核 苷酸混 合液的 分离: 使用 一种大 孔径多 孔硅胶 高效阴 离子交 换剂, 分 

• 109 • 




图 4-21 人血 清蛋白 质分离 色谱图 
样品: 未 稀释的 人血清 1.5 毫升 色 谱柱: LKB Ultropac, TSK G-4000 SWG 2135 蓝色柱 
21.5X600mm; 流速: 70 微升 / 分 检测器 UV 280nm 

清, 回收 率可达 90fc 以 上,. 色谱条 件及结 果见图 4-21。 

4. 长春 花培养 细胞中 P 引 噪生物 域的分 离"" 使用 Water ^ Bondapak C18 (十 八烧 
基 硅烧) 反相色 谱柱, 按 Perkin-Elmer 3B 编序, 溶剂系 统分配 如下: 



离各种 5'- 核苷碑 酸盐, 在 室温下 进行, 每 次色谱 时间约 35 分钟。 色谱条 件及结 果见图 
4-19。 

2. 数 种单糖 及双糖 的分离 [ " 】 使用 一种极 性键合 相微粒 硅胶, 作正 相液一 液分配 
色谱, 洗 脱剂是 乙腈: 水 (80:20) 出 峰顺序 与样品 的极性 相同, 极性强 最后被 洗脱, 色谱 
条 件及结 果见图 4-20。 

3. 人血 清蛋白 的分离 使用的 是一种 KLB 

出品的 凝胶制 备柱, 每次可 进样品 1.5 毫升血 




20 

. 分钟 

图 4-19 标准 核苷酸 混合液 的分离 
样品: 12 种 5' 核苷酸 混合液 
色 谱柱: Poiyomion Si 阴离子 交换柱 
洗 脱液: 碟酸盐 缓冲液 0.01 摩尔至 1 摩尔 pH 
流速: 0.4 毫升 / 分 
检测: 紫外 254nni 



12 18 

(分) 

图 4-20 几 种单糖 及双糖 的分离 
样品: 1. 溶剂, 2. 木糖, 3. 果糖, 4. 葡 萄糖, 
5. 庶糖, 6. 乳糖 
色 谱柱: Partisil 1025-PAC 柱 (10/1) 4.6 X 250 mm 
洗 脱液: 乙腈: 水 (80:20) PH5.0 (H3POJ, 流速: 
1.3 毫升 / 分 检测: 折光计 



-厂 



i082。o 




dav. 

10- 



. 110 . 





平衡 


丁 1 










A 乙腈 


35 


40 


55 


85 


90 


90 


B. lOmM 碟酸 缓冲液 (pH7.5) 




55 


45 


15 


10 


10 


时间 (分) 





10 


10 


25 


5 




曲线 






1 


4 




1 



色谱结 果如图 4-22- 



[1 
[2 

[3 

[4 

[5 

[6 

[7 

[8 

[9 

110 

[11 

[12 

[13 

[14 

[15 

[16 

[17 



样品: 粗 生物碱 

液 (PH7.5) 梯 度洗脱 



时间 (分) 

图 4-22 长春花 培养细 胞中吲 生物滅 的分离 
色 谱柱: P Bondapak C18 十 八院基 硅烧柱 洗脱液 



检 2 



乙腈 /10mA/ 磷 酸缓冲 
器: 紫外, 254nm 



献 



流速: 1 毫升 / 分 

参考文 

姚 广元, 古 德珍: 中 草药, 第 五期, 41 页 (1982) 

Morris, C. J. O. R and Morris, P., Separation Methods in Biochemistry (1976) 

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苏拔贤 、胡 昌序、 李 兆良: 未发 表的工 




csszcro 



. Ill . 



第五章 生物 大分子 的色谱 分离法 

程明哲 

生物 大分子 的色谱 分离法 是六十 年代以 后发展 起来的 一类新 技术。 包 括多糖 基离子 
交换色 谱法、 分子筛 色谱法 、亲 和色谱 法和色 谱聚焦 法等。 这类 方法的 建立, 其原理 虽然不 
完全 相同, 如分 子蹄色 谱分离 主要建 立在分 子大小 形状差 别的基 础上, 亲和 色谱则 根据分 
子生 物功能 团对载 体上的 配基的 特殊亲 和力而 建立。 伹在总 体上都 属于色 谱分离 范畴, 
即生 物大分 子与其 他组份 的分离 主要依 赖于溶 质彼此 间理化 性质的 差别在 固相载 体和流 
动相之 间分布 和流动 速度不 同而达 到分离 目的。 

生物大 分子色 谱分离 与生物 小分子 色谱分 离在固 相载体 性质和 色谱条 件上要 求稍有 
不同。 

第 一生物 大分子 要求固 相载体 具有亲 水性, 并 具有一 定三维 空间结 构及疏 散度。 使 
生物 大分子 易于接 近和出 入固相 部分, 通过表 面吸附 或筛眼 作用达 到分子 之间的 分离, 此 
外, 要 求固相 载体对 生物大 分子生 理活性 有稳定 作用, 按上述 要求, 各种来 源于生 物材料 
的凝胶 及其衍 生物是 比较理 想的固 相载体 ,凝胶 的使用 ,是生 物大分 子色谱 分离近 年来得 
以 迅速发 展最主 要原因 之一。 

第二, 与生物 小分子 比较, 生物 大分子 色谱分 离条件 (包括 上柱、 洗脱 等工序 ), 要求比 
较 温和。 一切 强酸、 强碱、 高压、 高 温都不 适用。 

生物 大分子 色谱分 离在近 代生化 制备技 术中, 在细分 阶段使 用较多 ,效 果也远 比其他 
方 法好。 因 每一种 色谱原 理和方 法所涉 及的知 识面都 很广, 在 本丛书 中其他 分册中 已另. 
有详细 介绍, 这里为 了对生 化制备 技术有 一系统 认识, 只结合 制备有 关方面 作一简 要补充 
介绍。 , 

第一节 多糖 基离子 交换剂 色谱法 

这类交 换剂中 应用最 广泛的 有离子 交换纤 维素和 离子交 换交联 葡聚糖 两类, 另外, 还 
有离子 交换琼 脂糖, 但应用 不广。 其中离 子交换 剂特别 适用于 生物大 分子活 性物质 (如蛋 
白质、 核酸 及其衍 生物) 的 分离。 因为 这类交 换剂的 多糖骨 架来源 于生物 材料, 具亲 水性、 

对生物 活性物 质是一 个十分 温和的 环境。 它们的 色谱原 理与离 子交换 树脂基 本相同 [ 1'2' 3〕 。 

一、 多糖 基离子 交换剂 的分类 

(一) 离 孑交换 纤维素 

离子 交换纤 维素是 开放性 的长链 骨架, 大分子 物质也 能自由 地进人 和迅速 地扩散 ,它 
也有 较大的 表面, 故对 生物大 分子的 吸附容 量比离 子交换 树脂大 得多。 另外, 由于 离子交 
换纤 维素上 所含的 离子交 换基团 较少, 排列 疏散, 所以对 大分子 的吸附 也不太 牢固, 用较 

. 112 . 



趟翻 



©1 



^ ^ ii*^ 



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HN 

- 

"sf +ZI ~H3LH3—o — 



I ~H3—"H3—ol 



-0-6丄.8 



ro—ro 

8-0 

8-0 

s-o—ro 



CINfl 

VICSJLOW 



~HN,H~3i"(HN,H~:)), 



^"(HO-H~0)+N—~HOI*H3—〇. 



si?-v,I03.1。3 



」H3—9 



§0 



. 113 . 



温和 的条件 就能将 其洗脱 下来, 再加上 纤维素 的亲水 性质, 这就 使生物 大分子 在吸附 和洗. 
脱 过程中 不致因 变性而 失活。 

根据它 们联结 在纤维 骨架上 的交换 基团, 可分阳 离子交 换纤维 素和阴 离子交 换纤维 
素 两类。 阳离子 交换纤 维素又 可分为 强酸型 、中强 酸型、 弱酸型 三种; 阴离 子交换 纤维素 

也可 分为强 碱型、 中强 碱型、 弱碱型 三种, 常 用的离 子交换 纤维素 及其特 性如表 5-1 所示。 
根据 离子交 换纤维 素存在 的物理 状态, 又可 分为纤 维型和 微粒型 两类。 微粒 型纤维 
素颗 粒细, 溶涨 性小, 能装成 紧密而 分离效 率高的 吸附柱 ,适用 于分析 ,而纤 维较长 的纤维 
型 纤维素 适用于 制备。 

(二) 离子交 换交联 葡聚糖 

离 子交换 交联葡 聚糖是 将离子 交换基 团连结 于交联 葡聚糖 上制成 各种交 换剂, 由于 
交 联葡聚 糖具有 三度空 间网状 结构, 因此, 离子交 换交联 葡聚糖 既有离 子交换 作用, 又有 
分子旆 作用。 



表 5-2 常 用的离 子交换 if 聚糖和 琼脂糖 (meq/g) 



商品名 


化学名 


类型 


活性 基结构 


反离子 


对 小离子 
吸 附容量 

(meq/g) 


对血红 
蛋白吸 
附容量 
g/e 


稳定 
pH 


CM-Sephadex G-25 


按甲基 


弱酸 阳离子 


— CHj — COO" 


Na+ 


4.5±0.5 


0.4 


6-10 


CM-Sephadex G-50 


梭甲基 


弱酸 阳离子 


— CH,— COO" 


Na+ 




9 




DEAE-Sephadex A25 


二 乙基氣 基乙基 


中强滅 阴离子 


— (CHO2— NH+CCjH,)^ 


CI— 


3.5±0.5 


0.5 


9-2 


DEAF-Sephadex A50 


二 乙基氨 基乙基 


中强碱 阴离子 


一 (CH2) 厂 N+(C2H,)2 


cr 








OAE-Sephadex A25 


季 胺乙基 


强滅 阴离子 


-(CH,),-N+-(C,H,). 

1 

C«2CH(OH)CHj 


cr 


3.0±0.4 


0.3 


10—2 


OAE-Sephadex A50 


季 胺乙基 


强滅 阴离子 


-(CH,),-N+-(C,H,), 

CHjCH(OH)CH3 


ci- 




6 




SE-Sephadex C25 


横乙基 


强酸 阳离子 


一 (C'H,), — SO3— 


Na+ 


2. 3 士 0.3 


0.2 


2—10 


SE-Sephadex C50 


磺乙基 


强酸 阳离子 


j 

1 

p 


Na+ 








SP-Sephadex C25 


磺丙基 


强酸 阳离子 




Na+ 


2.3±0.3 


0.2 


10—2 


SP-Sephadex C50 


磺丙基 


强酸 阳离子 


— (CH,)3— SO3- 


Na+ 








CM-Sepharose CL-6B 


梭甲基 


弱酸 阳离子 


— CHjCOO- 


Na+ 


13±2 


10.0 


3—10 


DEAE-Sepharose CL-6B 


二 乙基氨 基乙基 


中强减 阴离子 


— (CHj)2— NH+(CiH,)j 


cr 


12±2 


10.0 


3-10 



离子 交换交 联葡聚 糖有很 高电荷 密度, 故比离 子交换 纤维素 有更大 的总交 换量, 但当 

洗脱 介质的 pH 或离子 强度变 化时, 会引 起凝胶 体积的 很大的 变化, 由此 而影响 流速, 这 
是它 的一个 缺点。 

常用 的离子 交换交 联葡聚 糖及其 某些特 性见表 5-2。 



二、 实验操 作技术 

(一) 多糖基 离子交 换剂的 选择" ' 5] 

与 离子交 换树脂 的选择 相似, 一般情 况下, 带正 电的物 质用阳 离子交 换剂; 带 负电物 
质用阴 离子交 换剂。 物质的 带电性 质可用 电泳法 确定。 对 于已知 等电点 的两性 物质, 可 

• 114 . 



根 据其等 电点及 介质的 PH 确定其 带电状 ^,同 时考虑 该物质 的稳定 性和溶 解度, 选择合 
适的 pH 范围。 

实验室 中最常 用的为 DEAE- 纤 维素, CM- 纤 维素或 DEAE-Sephadex, CM- Sephadex。 
如 需在低 pH 下操 作时, 可用 P- 纤 维素, SE- 纤 维素或 SE-Sephadex, 而需在 pH 10 以上操 
作 的可用 GE- 纤 维素。 对于大 分子两 性物质 (如蛋 白质) ,其 选择情 况见图 5-1。 




(a) 



QAE-S 




图 5-1 蛋白 质色谱 的离子 交换剂 的选择 
(a) 酸性 蛋白, (b) 碱 性蛋白 

图 5-1 (a) 表示酸 性蛋白 (等电 点约为 5) 的解离 曲线和 DEAE- 纤 维素及 CM- 纤维素 
的解离 曲线。 蛋白 质作为 一个阴 离子在 DEAE- 纤维 素柱色 谱可在 pH 5.5-9.0 范 围内进 
行, 在这个 pH 范围内 ,蛋 白质和 交换剂 都是解 离的, 带 相反的 电荷。 在 CM- 纤维 素上色 
谱则严 格限于 较窄的 pH 范围内 (pH 3.5-4.5) 进行。 

图 5-1 (b) 表 示碱性 蛋白质 (pi = 8) 和接 甲基纤 维素, DEAE- 纤维素 及强碱 阳离子 
交换剂 QAE-Sephadex 的解离 曲线。 蛋 白质作 为一个 阳离子 在羧甲 基纤维 素上色 谱可在 
pH 3.5-7.5 之间 进行, 如 作为阴 离子在 DEAE- 纤 维素上 色谱则 仅限于 pH8.5 — 9.5 的范 
围内 进行, 用 QAE- Sephadex 则在 pH 8.5 — 11.0 之间 进行。 

(二) 缓冲液 的选择 

对 缓冲液 pH 的 选择, 决 定于被 分离物 质的等 电点、 稳定 性和溶 解度。 也就 是说, 要 
选择 这样的 缓冲液 条件, 保证 被分离 的组份 有足够 大的溶 解度, 并且不 会变性 失活。 选择 
pH 时, 也 要考虑 离子交 换剂的 pK 值, 用阴离 子交换 剂时, pH 要小于 pK, 用阳离 子交换 
剂时 pH 要大于 pK。 

起始缓 冲液的 浓度要 尽可能 的低些 (如 0.001 — 0.01 M), 使色谱 柱上能 吸附更 多的被 

• 115 • 



分离 物质。 为了获 得足够 的缓冲 容量, 选用的 缓冲液 离子, 其 pK 值 要尽量 接近起 始缓冲 
液的 PH 值 (最 好在 0.5 个 pH 单位之 内)。 

在进行 梯度洗 脱时, 多采用 离子浓 度梯度 ,尽可 能不用 pH 梯度, 因为 pH 过高 或过低 
可能引 起一些 蛋白质 的变性 失活, 而且 pH 偏离 pK 值过远 ,会降 低溶液 的缓冲 能力, 而提 
高离 子浓度 不仅增 加洗脱 能力, 还可增 加溶液 的缓冲 能力。 

为了在 不提高 缓冲离 子的浓 度情况 下增加 洗脱能 力, 常在 缓冲液 中加入 适当的 
NaCU KC1 LiCl 等非缓 冲盐。 

(H) 多糖基 离子交 换剂的 处理: 

1. 离子 交换 纤维素 的处理 将离 子交换 纤维素 悬浮于 大体积 的水中 让其自 然沉 

降, 用 倾倒法 除去细 颗粒。 然后采 用碱一 酸一碱 的顺序 反复洗 ,除 去杂质 及活化 交换基 
团。 即先用 0.5iVNaOH 浸泡 1 小时, 然后蒸 溜水洗 至中性 ,再用 0.5 AT HC1 浸泡, 水洗 p 
中性, 用 0.5iVNaOH 洗, 最后充 分用水 漂洗。 再把其 调节到 起始缓 冲液的 pH 即可 
用。 

2. 离子交 换交联 葡聚糖 的处理 将离 子交换 交联葡 聚糖在 水中使 凝胶充 分 溶涨, 
然后浮 洗除去 细颗粒 ,用 0.5WNaOH 浸泡 1 小时, 水洗至 中性, 用 0.1— 0.5 A^HCr 浸泡, 
水洗至 中性, 再以 0.5 N NaOH 洗, 最后用 水充分 漂洗, 除去 空气后 备用。 

(四) 装柱 

装柱 方法有 重力沉 降法和 加压法 两种。 重 力沉降 法与离 子交换 树脂& ^装柱 法相似 
(见 第四章 )。 加 压法: 在 色谱柱 顶上连 接一个 耐压的 厚壁梨 型瓶, 其中贮 放离子 交换剂 
的悬浮 溶液。 梨型瓶 直接与 加压装 置连接 (氮气 钢瓶或 压縮空 气钢瓶 ), 将 柱按十 等分划 
线, 幵始加 0.3 个犬 气压, 沉积 床每升 高一个 刻度, 增加 0.07 个大 气压, 最后 达到一 个大气 
压立刻 减压。 装柱时 要不时 振荡梨 型瓶使 悬浮液 均匀, 另外, 用提高 贮液器 高度的 办法进 
行 加压, 也能得 到好的 效果。 . 

(五) 加样 

加样量 的多少 和体积 主要取 决于待 分离组 份的浓 度及其 对交换 剂的亲 和力。 也要考 
虑实验 的目的 要求, 假如待 分离组 份含量 很低, 被吸 附又很 牢固, 则 加样的 量和体 积可以 
相 当高。 如 果要求 高分辨 率时, 加 样量不 得使紧 密吸附 的区带 超过床 体积的 10%。 

样品 上柱前 要以起 始缓冲 液充分 平衡, 常 用的方 法为: (1) 样品在 4 °C 下对 20 倍体 
积 的起始 缓冲液 透析。 (2) 凝胶过 滤法: 用 Sephadex G-25 或 G-5() 装柱, 先用 起始缓 
冲液 平衡, 然后 加样, 再 用起始 缓冲液 洗脱。 蛋 白质在 一个外 水体积 (Vo) 流出。 

加样 方法与 一般柱 色谱法 相似。 

(六) 洗脱 

加样后 ,用 足够量 的起始 缓冲液 洗柱, 除去未 吸附的 物质, 再进行 洗脱。 

洗脱 的办法 可采用 (1) 改变缓 冲液的 pH, 使 大分子 的电荷 减少, 从吸 附状态 变为解 

吸。 (2) 增加 缓冲液 的离子 强度, 使 离子的 竞争力 加大, 将大分 子从交 换剂上 置换下 

来。 

• 116 • 



通常 使用的 洗脱方 式为阶 段洗脱 或梯度 洗脱。 

三、 应 用实例 

(一) DEAE- 纤 维素柱 色谱分 离人血 清蛋白 (图 5-2) 

DEAE- 纤 维素用 Tris- 磯酸 缓冲液 (0.005 M, pH 8.6) 平衡, 以 0.5 M Tris- 碑 酸缓冲 

液 洗脱。 从图中 看出, IgG 型的 
免疫球 蛋白最 先出现 (即 组份 1 — 
6), 峰 8 是 铁传递 蛋白, 在组份 
10 和 11 中 发现脂 蛋白, 接着是 
结 合球蛋 白和血 红蛋白 (光 吸收 
在 405 nm), 从 11 一 14 的 大峰主 
要为 血清白 蛋白, 从 15 起 是一个 
复 合物, 包括" 和/? 球 蛋白, 16 
和 17 发现 IgM 巨球 蛋白; 组份 20 
为含 铜的血 桨铜蓝 蛋白。 凝血酶 
和 《 -酸性 糖蛋白 也存在 色谱区 
内。 随后又 发现一 些其他 蛋白质 
存在, 如 类风湿 因子和 维生素 Bi2 



3.0- 








2.5 




— 




2.0- 






…- 、、 


1.5- 




11 


j\l2 


1.0- 
0.5- 


3 


4 


\13 


. 




10 


20 30 



pH 
» 
6 

•4 



升数 ' 

图 5-2 在 DEAE- 纤维 素上人 血清蛋 白的色 谱图" 1 



结合 蛋白, 



8.5q :-lO.O 10.0 
i ♦ I ♦ 



(二) 在 幾甲基 纤维素 柱色谱 分离卵 清蛋白 

约 2 克混合 的卵清 蛋白, 色谱柱 14X2 厘米, 用醋 酸铉- Na^COs 缓 冲液, pH 4.4-1.0 
逐步 洗脱, 一个 典型的 洗出液 
曲 线如图 5 - 3。 

图峰 A 包括 卵粘蛋 白和黄 
素蛋白 ,峰 C、D 和 E 各为 卵清 
蛋白 Ai、 A2 和 A3, 峰 G 和 H 
含伴清 蛋白, 而峰 L 和 N 各为 
抗生 物素蛋 白和溶 菌酶。 其中 
卵 清蛋白 还可在 pH 3.7 下重 

复色 谱与黄 素蛋白 分离。 

(H) 大肠 杆菌的 30S 核蛋白 
体亚 单位的 蛋白色 谱分级 

分离 图 5-3 在 CM- 纤 维素上 卵白蛋 白的分 级分离 [ 7 ] 

以確酸 纤维素 (交 换量 0.9 — 1.1 毫 克当量 / 克) 为固 定相, — 0.6MNaCl (在 尿 
素 -0.05 A/NaH2PCV0.012A^ 甲胺, pH、6.5, 每升含 50 ^*12- 琉基 乙醇) 的线 性梯度 溶液洗 
脱, 一个 典型的 洗脱曲 线如图 5-4。 




• 117 • 



500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 
洗脱 液体积 (ml) 

图 5- 4 在 磷酸纤 维素上 30 S 核蛋白 体亚单 位蛋白 的色谱 图" ] 

有 二十多 个峰, 其中 10 — 11 相当 于单一 成份, 在 大峰中 的混合 物可在 pH5.5 的同样 体系中 
(或 Sephadex G-100) 重复色 谱分离 



(四) ECTHAM- 纤维 素柱色 谱分离 哺乳动 物肝抽 提液的 线粒体 上清液 的组份 

用 0.005 M Tris- HCl, pH7.5( 含 0.005 MHgCl2) 平衡, 在抽提 液中大 部分可 溶性蛋 
白和 糖原无 阻留地 通过色 谱柱。 加进 0.9fc 的非 离子型 去垢剂 (Trkon X-100) 以除 去微粒 
体脂 蛋白。 核蛋 白体用 0— 2 M NaCl (或 KCl) 和 O.OO 5 — 0.0 2 M MgCl, 的梯 度溶液 洗脱, 
结 果如图 5-5。 峰 I 包括 可溶性 蛋白, 峰 11 为 Trkon X-lOO 洗 脱物, 而双峰 包括核 糖体, 
第一 组分为 RNPI, 在 0.04MNaCl 洗脱, 主要含 83S 核蛋 白粒, 而第 11 组分 RNP II 在 
O.HMNaCl 洗脱, 主要含 77S 核 蛋白。 




0.4 0.6 0.8 

洗 脱体积 (糖) 
图 5-5 在 ECTHAM- 纤维素 色谱柱 上分离 核糖' 

RNPI 和 RNPII 在核 酸含量 上也有 差别, RNPI 在重复 色谱时 不可逆 地转为 RNP 




ios V 



• 118 



(五) CM-Sephadex G 25 柱 色谱分 离眼镜 王蛇蛇 毒组份 

分 离条件 如下: CM- Sephadex G25 用 0.05 M 醋酸钠 缓冲液 (pH 5.8) 浸泡上 柱并平 
衡。 柱 2.5X60 厘米。 广西产 眼镜王 蛇蛇毒 1 克溶于 9 毫升 上述缓 冲液中 上柱。 洗脱分 
三步: (1) 用平衡 缓冲液 洗脱; (2) 0-0.43 M NaCl 梯度 洗脱; (3) 0.43-0.64 M NaCl 梯 
度 洗脱。 每管 6 毫升, 每小时 24 毫升, 得 17 个 蛋白质 峰如图 5-6。 



OD280 




50 100 150 200 250 300 350 

ml 

- 图 5-6 眼镜 王蛇蛇 毒柱色 谱图谱 



第二节 分子 筛色谱 

分子 筛色谱 又称凝 胶色谱 或凝胶 过滤, 它 是六十 年代发 展起来 的一种 快速简 便的生 
物 化学分 离分析 方法, 目前已 在生物 化学、 分子生 物学、 生物 工程学 以及医 药学等 有关领 

域 中得到 广泛的 应用。 

分子筛 色谱是 指混合 物随流 动相经 固定相 (凝胶 ) 的色谱 柱时, 混合物 中各组 份按其 
分子 大小不 同而被 分离的 技术。 固定相 (凝胶 ) 是一种 不带电 荷的具 有三维 空间的 多孔网 
状 结构的 物质, 凝 胶的每 个颗粒 的细微 结构就 如一个 筛子, 小 的分子 可以进 人凝胶 网孔, 
而 大的分 子则排 阻于凝 胶颗粒 之外, 因 而具分 子筛的 性质。 又因整 个色谱 过程一 般不变 
换洗 脱液, 好像过 滤一样 ,故也 称凝胶 过滤。 

一、 分 子筛色 谱的基 本原理 

当含 有大小 分子的 混合物 样品加 入到色 谱柱中 , 这些 物质随 洗脱液 的流动 而 移动。 
大 小分子 (指分 子量) 流 速不同 , 分 子量大 的物质 (阻 滞作 用小) 沿凝 胶粒子 间的孔 隙随洗 

• 119 • 



脱液 移动, 流 程短, 移动速 度快, 先洗出 色谱柱 ;而分 子量小 的物质 (阻 滞作 用大) 可 通过凝 
胶 网孔进 人粒子 内部, 然后 再扩散 

小 分子、 



(1) 



(2) 



(3) 



、辨' 
大 分子、 ^ 



凝 胶- 



出来, 故流 程长, 移动速 度慢, 最后 
流出 色谱柱 (见图 5-7)。 也 就是, 

分子篩 色谱的 基本原 理是按 溶质分 
子量的 大小, 分 别先后 流出色 谱柱, 
大 分子先 流出, 小 分子后 流出。 当 
两种以 上不同 分子量 的分子 均能进 
入凝胶 粒子内 部时, 则由于 它们被 
排 阻和扩 散程度 不同, 在色 谱柱内 
所经 过的时 间和路 程长短 不同, 从 
而 也得到 分离。 

分子 筛色谱 柱的总 床体积 (Vt) 
可分 为三个 组分, 即: Vt = V。 + 
Vi + Vm。 式中, V 。为 凝胶颗 粒之间 
液体 的体积 (即外 水体积 ), Vi 为凝 
胶颗 粒内所 含的液 体体积 (即内 水体积 ), V 



、■§ 



〇 

00 
〇〇 
〇〇〇 
〇〇〇 
〇〇〇 
〇〇〇 





OC 
OC 
OC 




(4) 



图 5-7 分 子蹄色 谱分离 示意图 

(1) 样品 (其中 含有大 、小 不同的 分子) 溶 淡加在 色谱柱 顶端; 

(2) 样 品溶液 流经色 谱柱, 小分 子通过 扩散作 用进入 凝胶颗 
粒的微 孔中, 而大 分子则 被排阻 于颗拉 之外。 大、 小 分子因 
向下移 动的速 度发生 差异而 将大、 小分 子分离 开来; (3) 向色 
谱柱顶 加人洗 脱液, 大、 小分 子分开 的距离 增大; (4) 大分子 

已 经流出 色谱柱 

为凝 胶颗粒 本身的 体积。 

每 个溶质 分子在 流动相 和固定 
相 之间有 一个特 定的分 配系数 (称 
Kd)。 所以, 它的洗 脱体积 (VJ 为: 
Ve = Vo + KdVi 

K — Ve — Vo 
d ― V. 

当 Kd = 时, Ve = V。, 即溶 

质分子 (高 分子) 完 全不能 进人凝 
胶颗 粒内, 完 全被排 阻于凝 胶颗粒 

微孔之 外而最 先洗脱 下来, 当 Kd = 

图 5-8 分子 筛色谱 的区带 轮廓图 1 时, 艮卩 Ve = V。 + Vi, 说明 这种溶 

质分子 (小 分子) 完全 向凝胶 颗粒内 扩散, 在洗 脱过程 中将最 后流出 柱外, 通常 0<Kd<:l, 
意味着 溶质分 子以某 种程度 向凝胶 颗粒内 扩散, Kd 愈大, 进入凝 胶颗粒 内的程 度愈大 ,在 
中间情 况下, 例如 Kd = 0.5 时, 其洗 脱体积 = V。 + 0.5Vi (见图 5-8)。 

因此 V。<Ve《(V。 + Vi), 相应为 0<Kd<l。 实 际上, Kd 很难达 到大于 0.8—0.9。 




上 式中总 床体积 Vt, 可 由圆柱 形色谱 柱的体 积计算 (V 



^D^h , 而外 水体积 



(Vo) 的 测定, 可采 用一个 分子量 远超过 凝胶排 阻极限 的有色 大分子 的溶液 通过色 谱床, 
其洗 脱体积 就等于 V。, 最常用 的参照 物为蓝 葡萄糖 2000。 Vi 的测定 则可选 用一个 自由扩 
散的 小分子 (如 中性 盐类) 通过色 谱床, 此时, Kd = 1, 则 Vi = — V。。 表 5-3,5-4 列举 
了某些 凝胶的 性质。 

分 配系数 (Kd) 是分 子筛色 谱的一 个特征 常数, 即 溶质在 流动相 和固定 相之间 分配的 



〇〇〇〇〇©〇 

〇〇〇〇〇©© 

〇〇〇〇〇Q>o^ii 



o〇©l〇p 

OO0 ©QQP . 

〇〇©©©〇一:o「 




• 120 • 



表 S-3 Sephadex 分子 蹄物质 的性质 



型 号 

G-X 


得水值 
(克 > 克干胶 ) 


床体积 V, 
(毫升 /;^ 干胶) 


外 水体积 V。 
(毫并 /;^ 干胶) 


内 水体积 Vi 
(毫升 7 吉干胶 ) 

、 -^3 , 1 / 乂 U 1 ALA* J 


湿密度 
(克 / 毫升) 


G-10 


1.0±0.1 


2 


0.8 


1.0 


1.24 




1.5 + 0.2 




1 . 1 


1.5 


1.19 


G-25 


2.5±0.2 




2.0 




1.13 


G-50 


5.0±0.3 


10 


4 




1.07 


G-75 


7.5±0.5 


13 






1.05 


G-100 


10.0±1.0 


17 


6 


10 


1.04 


G-15 


15.0±1.5 


24 


8 


15 


1.03 


G-200 


20.0±2.0 


30 


9 


20 


1.02 



表 S- 4 Bio-Gel 分 子蹄色 谱物质 的性质 



型号 P-X 


得水值 (克 / 克) 


床体积 V, (毫升 / 克) 


P-2 


1.5 


3.8 


P-4 


2.4 


5.8 


P-6 


3.7 


8.8 


P-10 


4.5 


12.4 


P-30 




14.8 ' 


. P-60 


7.2 


19.0 


P-100 


7.5 


19.0 


P-150 


9.2 


24.0 


P-200 


14.7 


34.0 


P-300 


18.0 


40.0 



比例。 

由 于式中 Vi 不 易正确 测定, 而 Vm 所 造成的 偏差又 不大, 故若 把整个 凝胶都 作为固 
定相, 则分配 系数以 Kav 表示 (文 献中 Kd 及 Kav 均有使 用)。 



二、 常 用凝胶 的结构 和性质 

(一) 交 联葡聚 糖凝胶 

1959 年 Porath 和 Flodin 首先合 成了交 联葡聚 糖凝胶 因其 具有良 好的化 学稳定 
性等 优点, 目前在 分子旆 色谱中 巳成为 最常用 的凝胶 ,商 品名为 Sephadex。 

交联 葡聚糖 的基本 骨架是 葡聚糖 (dextranX 它是 一种以 右旋葡 萄糖为 残基的 多糖, 
分子间 主要是 《- 1, 6 糖昔键 (约占 95%), 分枝为 M 糖苷键 (约占 5fO, 以 3- 氯 -1,2- 环氧 
氯丙烧 (C1 一 CH2 — CH — CH2) 为交 联剂, 将链 状结构 连接成 为三维 空间的 网状结 构的高 

分子化 合物, 其网 孔大小 可通过 调节交 联剂和 葡聚糖 的配比 及反应 条件来 控制, 交 联度越 
大, 网孔 结构越 紧密; 交联度 越小, 网孔 结构越 疏松。 交联葡 聚糖的 结构如 下页。 

表 5-5 列出 8 种 Sephadex 对蛋白 质和多 糖的平 均分级 范围。 从表中 可看出 它们对 
这两类 不同化 合物的 分级范 围各不 相同, 这意 味着这 两类化 合物在 溶液中 有不同 的物理 

. 121 • 













} ― o 、 










/ H 

\ OH H 



o 



H 



OH 



O CH, 



H OH 



H 

OH H 



CHOH 
O 



-o- 



OH 



H OH 



-CH, 



H I— 0、 H 

Z H 

OH H 



H 



OH 



图 5-9 交 联葡聚 糖的化 学结构 



结构。 蛋白 质为紧 密的椭 圆形的 结构, 而多 糖主要 是无规 则线团 的链状 结构, 其旋 转半径 
可 能比相 同分子 量的蛋 白质分 子大。 同 样的情 况也出 现在核 酸中, 因为核 酸在溶 液中有 
一种 类棒状 结构, 它们的 聚集状 态受洗 脱液的 组成, 特 别是某 些离子 (如 Mg++) 的 浓度影 
响 很大。 

表 5-5 Sephadex 的分 级范围 



型 



能 分级的 分子量 



球伏 蛋白质 



葡 聚 



糖 



G-10 

G-15 

G-25 

G-50 

G-75 

G-100 

G-150 

G-200 



<700 

<1500 

1000-5000 

1500-30,000 

3000—70,000 

4000-150,000 

5000-400,000 

5000—800,000 



<700 

<1500 

100—5000 

500 — 10,000 

1000-50,000 

1000—100,000 

1000—150,000 

1000—200,000 





CHOH 













葡聚 糖凝胶 是一种 化学性 质比较 稳定的 物质, 不溶 于水、 弱酸、 碱和盐 溶液, 也 不溶于 
, 122 • 



一般 有机溶 剂中。 但在强 酸中, 凝 胶的糖 昔键易 水解, 一般在 0.022VHC1 低 温下能 保持半 
年, 在碱性 环境下 却十分 稳定, 如 Sephadex G-25 在 0.25 W NaOH 中 , 60^: 经两 个月仍 
不改变 其色谱 性质, 故常用 0.5 N NaOH (含 0.5 N NaOH) 来 除去残 留在凝 胶上的 变性蛋 
白质 及其他 杂质。 此外, Sephadex 结构上 的经基 在过强 的碱性 下对氧 敏感, 易氧化 成酸。 
凝胶对 热稳定 ,湿态 凝胶在 llOt 高 压灭菌 40 分钟, 性质 不变, 干 态凝胶 可耐受 12Q°C 左 
右。 

由于 Sephadex 中含 有许多 亲水性 轻基, 故干 胶有很 强的吸 水性, 吸水 性主要 取决于 
网孔 大小, 不同 型号的 Sephadex 用 G 表示, 在 G 后面 的阿拉 伯数字 为凝胶 得水值 再乘以 
10, G 值愈大 ,则 得水值 愈大。 

表 5-6 列举 某些常 用物质 的葡聚 糖凝胶 分子筛 色谱的 Kd 值: 



表 5-6 某 些常用 物质的 Sephadex 分子筛 色谱的 值 





Kd 值 


Jlf jtk HAn 


G-25 


G-50 


G-75 


G-lOO 


G-200 














纤维 蛋白原 , 

















r- 球蛋白 (19S) 

















r- 球蛋白 (7S) 














0.2 


铁传 递蛋白 











0.1 


0.3 


血清 清蛋白 











0.2 


0.4 


血 红蛋白 








0.1 


0.3 


0.5 


藻 红蛋白 

















藻 蛋白 














0.2 


卵 清蛋白 











0.2 




胰 蛋白臨 








0.3 


0.5 


0.7 


糜 蛋白飽 








0.3 


0.5 


0.7 


胃蛋白 薛 








0.3 






细 胞色素 C 








0.4 


0.7 




溶菌 SI 










0.7 




核糖 核酸鵡 








0.4 






甘氨酸 


0.9 




0.1 






苯 丙氨酸 


1.2 


1.0 








酷氛酸 


1.4 


1.1 








色氨酸 


2.2 


1.6 


1.2 






KC1 


1.0 


1.0 










0.9 











(二) 聚 丙烯酰 胺凝胶 

聚丙炼 酰胺凝 胶也是 一种人 工合成 凝胶, 其商品 名为生 物凝胶 -P (Bio- Gel- P), 和交 
联葡聚 糖一样 ,为 颗粒状 干粉, 在溶剂 中能自 动吸水 溶涨成 凝胶。 其 组成单 位是丙 炼銑胺 
(CH, = CH-CONH0, (称为 单体) 和 交联剂 (甲叉 双丙炼 酷胺, 简称 Bis) 通过自 由基引 
发 聚合反 应形成 聚丙炼 酰胺, 经干燥 粉碎加 压成形 处理即 成为生 物凝胶 ,只 要控制 单体用 
量和 交联剂 的比例 就能得 到不同 型号的 凝胶。 

. 123 . 







o 


o 


OS 

o 


1—4 

o 


o 


CD 






m 
o 


ro 


CM 

O 


r、 

◦ 




o 








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◦ 


GO 
◦ 


o 


o 


OO 

o 


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o 


o 


◦ 




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ro 

O 




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o 
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o 


r、 
o 


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二 

o 


o 


o 






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O 


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o 


OO 

o 


CD 


s 




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1 




' 


GO 

r-4 








O 










o 






















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GC 

o 


o 
o 


m 

o 












O 


vo 
o 


CD 

o 




CD 


o 


◦ 
o 




O 

o 


r〜 
O 


o 

◦ 


GC 

o 


O 


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O j C3 
o 1 <=> 




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O 


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O 


rn 
O 


r、 
o 








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c 


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o 


o 


S 




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o 


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O 


o 


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o 






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o 


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O 


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o 




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CD 








O 








CD 


s 


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o 


ro 

o 


OO 

o 


OO 

o 






o 


r、 

,11 


r-H 
vo 


in 


Cs 






rn 






o 


o 


◦ 










stokes 

半径 


s 






CD 
CO 

r-j 




1 八 

so 




s 士"^ 




ir\ 


o 


o 
m 




O 


ITS 


•m 

hjnf 


■m 


大豆 姨蛋白 
飽 抑制剂 


(翁耶 li^Y) 


■ra 

FOT 

链 

EC 
XZS\ 


血 红蛋白 (人) 


牛血 淸蛋白 
(单体 ) 


血^铜 蓝蛋白 
(人) 



E3£^K*smffiw^^^i««E»s s (1) ¥^*-掛叵± i-s 



• 124 . 



— CH,— CH— CH,— 
CO 
NH, 

— CH,— NH 
CO 

— CH,— CH— CH,— CH— CHj— CH— CH,— CH— 
' 图 5-10 聚 丙煤銑 胺凝胶 的结构 

在聚丙 炼酰胺 凝胶的 合成过 程中, 单 体和交 联剂的 配比可 以任意 改变。 Hjerten"" 最 
早提出 的表示 记号方 法已普 遍采用 ,以 (T) 代表 100 毫升凝 胶溶液 中含有 的单体 和交联 
剂总 克数, 称 为凝胶 浓度, 而其中 交联剂 占单体 加交联 剂总量 的百分 比称交 联度, 以 (C) 
表示。 如 8X25 的凝 胶的制 备是每 100 毫升溶 液中含 6 克丙稀 酰胺和 2 克 Bis.。 应用于 
分子 筛色谱 中的单 体浓度 (T) 在 5 — 25 之间, T 在 5 之下 的凝胶 太软易 碎裂, T 在 25 以 
上 的凝胶 使小分 子蛋白 质也几 乎不能 穿透。 实际 上应用 C 值为 1 一 25f 。之 间。 

聚丙炼 酰胺凝 胶的稳 定性不 如交联 葡聚糖 凝胶, 在 酸性条 件下酰 胺键易 水解为 接基, 
使凝胶 带有一 定的离 子交换 基团, 一 般应在 pH2 — 11 之间。 

表 5-7 提供 了一些 典型的 蛋白质 (分 子量 12,000 — 160,000) 在 聚丙炼 醜胺凝 胶色谱 
上的 值。 . 

表 5- 8 列 举了各 种型号 Bio- Gd p 的分级 范围。 



表 S-8 Bio-Gel P 的分 级范围 (球形 分子) 



型 




分 级范围 (分 子量) 


Bio-Gel 


P-2 


170—2600 


Bio-Gel 


P-4 


600—3500 


Bio-Gel 


P-6 


1000—5000 


Bio-Gel 


P-10 




Bio-Gel 


P-30 


o 


Bio-Gel 


P-60 


5000—65,000 


Bio-Gel 


P-100 


5000—100,000 


Bio-Gel 


P- 150 


o 
o 


Bio-Gel 


P- 200 


40,000—250,(100 


Bio-Gel 


P-300 


CD 

g 



(三) 琼脂 糖凝胶 

琼 脂是一 种天然 存在的 多糖混 合物, 它来源 于几种 海藻。 Araki [ "l 认为, 琼脂 主要由 
两部分 组成, 一为中 性链状 多糖, 称 琼脂糖 (agarose), 其结 构是由 /?-D- 吡 喃型半 乳糖和 
3,6- 脱水 -L- 吡喃半 乳糖相 间结合 的链状 多糖; 另一 为带负 电荷的 琼脂糖 (agaropectin), 
含有横 酸基和 接基, 可采 用氯代 十六院 吡啶, 聚乙稀 醇等把 琼脂胶 沉淀而 除去。 

琼 脂糖凝 胶的商 品名因 生产厂 家不同 而异, 目前有 Sepharose (瑞典 ); Sagavac (英国 ) 
Bio-Gel A (美国 ); Gelarose (丹麦 ); Super Ago-Gel (美国 )。 

表 5- 9、5- 10 列举了 某些蛋 白质在 Sagavac 和 Sepharose 凝 胶上的 值: 

• 125 • 



;«— CHj— CH— 

D CO 

I 

H, NH 
CH, 

H, NH 



D 



CO 



lolN 



H o m w o 



表 S-9 几种蛋 白质在 4 一 10% Sagavac 琼 脂糖凝 胶上的 值 



蛋白质 


分子& 

Jj 丁 里 


stokes 
半径 
厘米 X10 - S 






琼 


脂 糖 






10 


8 


6 




4 


肌 红蛋白 


17 . 


20.0 


0.60 





70 









88 


过氧 化物酷 (辣根 ) 


40 ' 


30.0 


0.33 





50 









82 


酵 母醇脱 


150 


45.5 


0.11 





23 




0.50 





70 


谷氨酸 脱氢薛 


258 


60.0 


0.02 





08 


0.02 


0.37 





58 


甲状腺 球蛋白 


670 


83.0 










0.20 





42 


芜 菁黄花 叶病毒 


3500 


—20.0 










0.07 





19 



表 5-10 几种蛋 白质在 Sephadex G-200 Sspharose 4B 和 6B 上的 值 



蛋白质 


分子量 X103 


stokes 半径 


Sepharose 


Sephadex 


厘米 X10- 8 


4B 


6B 


G-200 


核糖 核酸藤 


13.7 


19.2 


0.86 




0.78 


0.75 


卵 清蛋白 


45 


27.3 


0.72 




0.62 


0.53 


铁传 递蛋白 


71 


36.1 


0.68 




0.53 


0.40 


葡萄糖 氧化飽 


186 




0.60 




0.42 


0.27 


甲状腺 球蛋白 


670 


82.5 


0.45 




0.27 


0.00 


«- 结晶 蛋白 


1000 




0.38 




0.22 


0.00 



(四) 交联 葡聚糖 LH- 20 (Sephadex LH-20) 

交联 葡聚糖 LH-2() 是 亲脂性 Sephadex 的衍 生物, 能 在有机 溶剂中 溶涨, 溶 涨的性 
质决定 于原凝 胶的交 联度, 轻基 取代的 程度, 溶 剂的性 质等。 

Sephadex LH-20 是交 联葡聚 糖的轻 基被经 丙酰基 [HO(CH2)2 — CH,0 - ] 所 取代, 

已成为 商品, 可用于 分离脂 溶性的 物质。 

Sephadex LH-20 在 各种有 机溶剂 中的性 质见表 5-1 1。 



表 5- U 交联 葡聚糖 LH-20 的性质 



溶 剂 


得溶剂 值毫升 / 克干胶 


床体 积毫升 / 克干胶 


二 甲基甲 胺 




4.0-4.5 


水 


2.1 


o 


甲醇 


1.9 


4.0—4.5 


乙醇 


1.8 


3.5-4.5 


氯仿 (用 1% 乙醇 稳定) 


1.8 


3.5-4.5 


氯仿 


1.6 


I 八 
O 


正丁醇 


1.6 - 


o 


二氧杂 环己焼 


1.4 


3.0-3.5 


四 氢呋喃 • 


1.4 


vn 


丙酮 


0.8 




乙 酸乙醋 


0.4 




甲苯 


0.2 





. 126 . 



三、 分 子筛色 谱的实 验技术 



(一) 凝胶 的选择 及处理 

交联葡 聚糖、 琼 脂糖和 交联聚 丙炼酰 胺凝胶 都是三 维空间 网状结 构的高 分子聚 合物。 
混 合物的 分离程 度主要 决定于 凝胶颗 粒内部 微孔的 孔径和 混合物 分子量 的分布 范围。 微 

孔孔径 O) 的 大小与 凝胶物 质在凝 胶相中 的浓度 (C) 的平 方根成 反比, 而 与凝胶 聚合物 
分 子的平 均直径 00 成正比 ,它们 之间的 关系可 近似地 以下式 表示" 5] : 



实验 证明, 琼脂 凝胶的 浓度以 8.9f。 为宜。 

和凝胶 孔径大 小有直 接关系 的是凝 晈的交 联度, 凝胶的 交联度 越高, 孔径 越小。 交联 
度决定 了被排 阻物质 分子量 的下限 ,移动 缓慢的 小分子 物质, 在低交 联度的 凝胶上 不易分 
离, 大分子 物质同 小分子 物质的 分离宜 用高交 联度的 凝胶。 

凝胶的 颗粒粗 细与分 离效果 有直接 关系, 颗 粒细的 分离效 果好。 但流 速慢, 而 粗粒子 
流速 过快会 使区带 扩散, 使洗脱 峰变平 和宽, 因此, 要根 据工作 需要, 适当选 择颗粒 大小及 
调整 流速。 为使凝 胶颗粒 均勾, 并 除去影 响流速 的过细 颗粒, 一般采 用自然 沉降, 再用倾 
倒法 除去悬 浮的过 细凝胶 颗粒。 Kawata 等介 绍了一 种在干 燥乙醚 中的沉 降法, 从 过细的 
Sephadex 中制备 适当流 速的凝 胶部份 ""。 

交 联葡聚 糖和聚 丙炼酰 胺凝胶 通常的 商品为 干燥的 颗粒, 使用前 必须充 分溶涨 ,而这 
个水 洗过程 在室温 下进行 缓慢, 可 用加热 10()°C (沸 水浴) 方法 加速溶 涨平衡 (见表 5- 
12)。 在装 柱前, 凝胶的 溶涨必 需彻底 ,否则 由于继 继溶涨 过程, 会逐 渐降低 流速, 影响色 
谱的均 一性, 甚至会 使色谱 柱涨裂 



表 S-12 Sephadex 和 B=o- Gel 的 水合作 用和平 衡时间 (小时 ) 



物 




质 


室 


温 


100 G 水浴 


Sephade 


K G 


-10 G- 15 






1 


Sephade 


K G 


-25 G-50 


6 




2 


Sephade 


( G- 


-75 


24 




3 


Sephade 


( G- 


-100 


48 






Sephade 


s G- 


-150 


72 






Sephade 


t G- 


200 


72 






Bio-Gel 


P-2 


-P-10 


2—4 






Bio-Gel 


P- 30, P-60 


10—12 






Bio-Gel 


P-100, p-150 


24 






Bio-Gel 


P-200, P-300 


48 







(二) 柱 的选择 及装填 

色谱 柱一般 用玻璃 * 或有机 玻璃管 制成, 管底 部放置 玻璃纤 维或砂 芯滤板 (2 号或 3 
号), 上面 再装上 2 厘 米厚的 玻璃球 (球 径约 0.5 厘米) ,柱顶 部联接 一个长 颈漏斗 ,长约 100 
厘米, 直 径约为 柱径的 一半, 漏斗中 安装搅 伴器。 然后在 玻璃柱 和漏斗 中加满 水或洗 脱剂, 

. 127 • 



在搅 梓下缓 缓加入 凝胶悬 浮液, 毛细 管出口 的流速 维持在 5 — iO 毫升 / 分。 凝胶粒 沉积管 
底后 关紧毛 细管, 使 其自然 沉积达 1 一 2 厘米时 再打开 毛细管 ,直至 达到所 需高度 为止。 拆 
除 漏斗, 用较小 的滤纸 片盖住 凝胶床 表面, 再用大 量的水 或洗脱 剂洗漆 过夜。 

色 谱柱的 大小规 格的选 择也很 重要, 通常对 于高分 辨率的 柱则采 用高的 (L/Z) 即长 
度 / 直径) 比率。 例如, Killander 发 现分离 血清蛋 白的柱 L/Z) 为 23 : 1 时, 效果 最佳。 为 
了提高 分辨率 有人甚 至采用 100:1 (L/D) 的 比率。 增 高柱长 虽然提 高了分 辨率, 但影响 
流 速和增 加了样 品的稀 释度, 所以在 实际操 作中应 通过系 统实验 来确定 色谱柱 的大小 、规 
格。 

色谱分 离效果 和装填 起来的 色谱床 是否均 匀有大 关系, 因此使 用前必 需检查 装柱的 
质量, 最简 单的方 法是用 肉眼观 察色谱 床是否 均勾, 有没有 "纹路 "和 气泡, 或用一 种有色 
的物质 的溶液 (如铁 蛋白液 ,印 度墨水 或带色 的多糖 溶液等 ), 当有 色溶液 流过色 谱柱床 
后, 观察 色带的 移动, 如色带 狭窄, 均勾 平整, 说明性 能良好 ,色 带出现 歪曲, 散乱 变宽, 则 
必 需重新 装柱。 

(H) 加样 及洗脱 

分子 筛色谱 中由于 其洗脱 曲线是 分配等 温线, 溶质 的浓度 与分配 等温线 无关, 故对比 
许多其 他的色 谱法, 溶质可 采用较 高的起 始浓度 ,但 也不要 太高, 浓度太 高粘度 太大, 一般 
溶质的 粘度不 能超过 溶剂的 两倍。 

对于高 分辨率 的分子 筛色谱 ,开 始溶液 的体积 主要为 内体积 (P^O 所 决定, 故 高得水 

值凝胶 (如 Sephadex G-200), 每 « 升总 床体积 (F,) 可加 0.3 — 0.5 毫克 溶质, 使用 体积约 
为 0.02 F„ 而 低得水 值凝胶 (如 Sephadex G-75) 每毫升 总体积 (P^) 加 溶质量 0.2 毫克, 
样品 体积为 0.01 v,o 

样 品上柱 也是分 子筛色 谱的一 项重要 操作, 要求尽 可能保 持色谱 床表面 的稳定 ,可用 
人工 方法, 当色谱 柱经平 衡后, 吸 去上层 液体, 待平 衡液流 至床表 面以下 1 一 2 毫 米时, 关 
闭 出口, 以最小 体积样 品用滴 管慢慢 加人, 打开 出口, 调整 流速, 使 样品慢 慢渗入 色谱床 
内, 当样 品加完 流至快 干时, 小 心加入 洗脱液 洗脱。 加样品 的体积 越小, 分离效 果越好 ,上 
样 体积不 得超过 ViOa — K'"。 ' 

非水溶 性物质 的洗脱 都采用 有机溶 (如苯 和丙酮 等), 水溶性 物质的 洗脱一 般采用 
水或 具有不 同离子 强度和 PH 值的缓 冲液, pH 的 影响与 被分离 物质的 酸碱度 有关, 在酸 
性 pH 值时, 碱性物 质易于 洗脱, 在碱性 pH 值时, 酸性 物质易 洗脱。 多糖类 物质的 洗脱以 
水为 最佳。 有时为 了使样 品增加 溶解度 而使用 含盐洗 脱剂, 盐类的 另一个 作用是 抑制交 
联 葡聚糖 和琼脂 糖凝胶 的吸附 性质。 

某些 物质洗 脱剂的 选择实 例见表 5-13。 

(四) 凝胶柱 的保养 

交联葡 聚糖和 琼脂糖 是多糖 类物质 ,极易 染菌, 由微生 物分泌 的酶能 水解多 糖的糖 
苷键, 聚丙條 酖胺凝 胶虽不 是微生 物的生 长介质 ,但其 溶涨的 悬浮液 内也常 染菌而 改变色 
谱 特性。 为了 抑制微 生物的 生长, 碑 酸离子 fp 所 有底物 必需在 凝胶床 保存之 前完全 除去, 
将柱真 空保存 或低温 保存, 但温 度不可 过低, 介质的 离子强 度要高 一些, 以防 冻结。 

• 128 . 



表 S- 13 某些物 质的洗 K 剂 





喊 oX, 


9^1 m ±\ 

VU lUL JPi 


多状, 氨基酸 


Sephadex G-25 


乙酸: 吡咬: 水 =65:15:25 


血红 蛋白, 血清 白蛋白 


7% 琼脂 


0.07 A/ 碟酸盐 缓冲液 pH 7.2 ■ 


球 蛋白类 


Sephadex G-25 


0.15M 确酸盐 缓冲液 pHS.O 


藻青 蛋白, 藻 红蛋白 


Sephadex G-75 


0.1 M 柠豫 酸盐- 碟酸盐 缓冲液 pH7.0 


蛋 白质类 


9% 琼脂 


0.04M 碟酸钟 -0.12 A/ KCI 缓冲液 pH7.0 


染料结 合蛋白 


S6phadex G-25 


0.1A/ 磷酸盐 缓冲液 pH7.0 


虫漆 痴, 碳 酸肝薛 


交 眹聚丙 稀銑胺 


0.05A/ 碟酸盐 缓冲液 pH8.0 


胃蛋白 SS 


Sephadex G- 50 


0.2M 乙酸纳 pH4.9 


酸性 酸酯 SI 


Sephadex G-75 


1A/ 乙酸 


葡聚糖 


9% 琼脂 


水 


m 4-A 7^ ^ ^£ 
中状芳 腺激素 


Sephadex O-jU 


乙酸- 乙酸按 缓冲液 pH4. /Z 


維 性激素 


Sephadex-G- 25 


0.1 A/ NHpH 


烟草花 叶病毒 


8% 琼脂 


0:2A/ NaHjPO,-0.3A/.VaCI pH6.8 


维生素 


Sephadex G-25 


水 


牛乳 中的锞 


Sephadex G-50 


0.5 A/ 磯酸 缓冲液 pH7.4 


聚 苯乙炼 


硅酸 


苯 


Hif ,牧守 


聚丁二^^苯 


丙酮, 乙酸, 乙酯 



常用的 方法是 在凝胶 中加入 一些抑 菌剂, 如 叠氮钠 (0.02%); 三 氯丁醇 (0.01 — 
0.02%); 乙基隶 硫代水 杨酸钠 (0.005 — 0.01 %); 苯基 求代盐 (包 括苯基 汞代乙 酸盐、 硝酸 
盐、 硼 酸盐) (0.001 — 0.01 %)o 

(五) 凝胶 的再生 和干燥 

凝 胶色谱 的载体 不会与 溶质发 生任何 作用, 因此 色谱分 离后稍 加平衡 即可进 行下一 
次 色谱。 但 在实际 操作中 常有一 些污染 凝胶或 色谱床 表面, 必需 作适当 处理。 交 联葡聚 
糖凝胶 柱可用 (i.2N NaOH 和 0.5 ATNaCl 的混合 液处理 ,聚丙 嫌酰胺 凝胶和 琼脂糖 凝胶由 
于遇 酸碱不 稳定, 常用 0.5 W NaOH 处理。 

经常使 用的凝 胶以湿 态保存 为主, 只要在 其中加 入适当 的抑菌 剂就可 放置几 个月至 
一年, 不需要 干燥, 尤其是 琼脂糖 凝晈, 干燥操 作比较 麻烦, 干燥后 又不易 溶涨, 一 般都以 
湿法 保存。 如需进 行干燥 时应先 将凝胶 按一般 再生处 理彻底 浮选, 除去碎 颗粒, 以 大量水 
洗漆除 杂质, 然后用 逐歩提 高乙醇 浓度的 方法使 之脱水 IS 缩, 方法 是先用 70% 乙醇, 接着 
是 90% 乙醇, 最后为 95% 乙 醇逐步 脱水, 然后在 60 — 80力 下干燥 或用乙 醚洗漆 干燥。 

四、 分子 筛色谱 的应用 

(― ) 脱盐 

生 物大分 子物质 (如蛋 白质、 核酸、 酶、 多 糖等) 在 分离提 纯时, 常用 盐溶液 洗脱, 故洗 
脱液 含有无 机盐, 一 般采用 透析法 除盐, 费时又 繁琐, 如 果采用 分子筛 层析法 除盐, 时间 
短、 也不影 响生物 大分子 的生物 特性。 葡聚 糖凝胶 G-25 因其 流动阻 力小, 交联度 适宜, 故 
常用于 蛋白质 溶液的 脱盐, 一 般要达 到完全 脱盐, 溶 液的体 积应在 0.8 V, 以下, 如 果样品 
粘度 不大, 0.751^可达到完全脱盐,但在一 般情况下, 采用 0.3 左右体 积即可 【 " 】 。 

• 129 • 



进行 蛋白质 样品的 脱盐应 注意蛋 白质溶 液在去 除电解 质后因 溶解度 显著下 降而沉 
淀, 以致被 吸附在 柱上不 能洗脱 下来, 解 决的方 法是先 使用含 有挥发 性盐类 (如甲 酸铁、 醋 
酸 按等缓 冲液) 使色谱 柱平衡 ,然 后加人 样品, 并 用同种 缓冲液 洗脱, 洗脱液 再用冷 冻干燥 
法除去 挥发性 盐类。 

(二) 分子量 的測定 

用 一系列 巳知分 子量的 标准样 品放入 同一凝 胶色谱 柱内, 令其 在同一 条件下 进行凝 
胶色谱 分离, 记下每 一种成 分的洗 脱体积 ,并 以洗脱 体积对 分子量 的对数 作图, 在 一定分 

子量 范围内 可得一 直线, 这就 是分子 量的标 

准曲线 (图 5-11) [ 1 8 '1 9] 。 测定未 知物的 分子量 
时, 可将 样品加 在测定 了标准 曲线的 凝胶柱 
内, 洗脱 后根据 此物质 的洗脱 体积, 可 在标准 
曲线 上查出 它的分 子量。 用本 法测定 高分子 
物质的 分子量 时不需 要复杂 的仪器 设备, 操 
作 简便, 样品用 量少, 有一定 的实用 价值, 但 
本法也 会产生 一定的 偏差, 如 对一些 纤维状 
蛋白质 ,糖蛋 白等, 因 此要作 精确的 测定, 要 
和 其他方 法结合 比较。 

, (H) 用于物 质的分 离提纯 

——0—0——, 交联 葡聚糖 G- 75 ; 1. 糖 John 等 [2 °】 用微孔 聚丙嫌 酰胺凝 

胶 P-2 分离 葡萄糖 寡聚糖 (n==ll), 采用 色谱柱 127X1.5 厘米, 凝 胶小于 40G 目, 在 
65^ 用水 洗脱, 流速 28 毫升 / 小时, 得到良 好的分 离结果 (图 5-12)。 

Laurent & Granath [ 2i] 研 究了在 Sephaclex G-200 上 可溶性 葡聚糖 的一系 列色谱 特性。 





3.5 



4,0 



5.5 



6.0 



4.5 5.0 

分子 量对数 

图 5-11 溶质的 洗脱特 征和分 子量之 间的相 互关系 
一 A-A —— ,交联 葡聚糖 G-200; 

-, 交联 葡聚糖 G-100; 



' 3 4 5 6 

时间 (小时 ) 

图 5-12 在 Bio-Gd P-2 上葡 萄糖寡 聚糖的 分离图 





• 130 . 



800 



1000 



1200 1400 
流出液 (ml) 



1600 



1800 



V, 



图 5-13 在 Sephadex G-200 上可 溶性葡 聚糖的 分离图 

葡聚 搪的分 子量从 13,600 (组份0-6)到59,000 (组份 D-1) 用 9 2 X 5.1 厘米凝 胶床, 以 
0.2 M NaCl 洗脱, 流速 1.5 毫升 / 小时 • 厘米 2。 分离结 果如图 5-13。 

2. 核 酸及其 衍生物 用分 子筛色 谱法研 究核酸 及其衍 生物的 分级分 离首要 问题是 
选择 一个适 当的固 定相。 在 Sephadex G-100 或 G- 200 或相 应的聚 丙稀酰 胺凝胶 上都可 
满 意地分 离转移 RNA (4S. 分 子量约 25,000 — 28,000) 和 5S 核糖体 RNA, 但 对于核 
糖体 16S 和 23S 及信使 RNA 的 分离, 则需要 较大孔 的基质 (如 琼脂糖 )。 这可能 是由于 
核酸和 具相同 分子量 的球蛋 白比较 有较大 的分子 体积, 例如: Hayes & Mitchdlt 22】 发 现一 
个合 成的寡 聚脱氧 核苷酸 (分 子量为 25,000) 在 琼脂糖 柱上其 VelVo 值为 1.29, 而 在同样 
柱上对 糜 蛋白酶 (分 子量 22,50()), 其 F,/F。 值为 2.29, 这 个区别 意味着 寡聚脱 氧核昔 
酸有 比蛋白 质大的 斯托克 (stoke) 半径, 这是因 为核酸 链中相 邻的离 子化确 酸基之 间的静 
电排斥 结果。 增 加洗脱 液的离 子强度 可以降 低静电 效应, 使分子 更紧密 ,从 而降低 这种排 




图 5-14 在 Sephadex G-lOO 上大 肠杆菌 细胞的 RNA 的分 级分离 



o 



EU092V 



• 131 • 



斥力。 

Reynier 等 【2 3] 用 Sephadex G- 100 分离大 肠杆菌 细胞抽 提液的 RNA, 色谱柱 187X3 
厘米,以0.05^1^ Naa洗脱, 得 色谱图 5-14。 显 示有四 个峰, 第一峰 出现在 色谱柱 的外水 
体积中 ,含 核糖体 16 S 和 23 SRNA, II 峰 含一些 中等分 子量的 代谢上 稳定的 RNA 的混 
合物, 峰 m 是 5S 核糖体 RNA ,而峰 IV 为转移 RNA。 ' 

对 于分子 量超过 500,000 的 溶质的 分离, 特别是 对那些 有展开 结构的 分子, 需 要大孔 
隙的 固定相 (如琼 脂糖珠 )。 Oberg 和 philison [ 2" 测定 了细胞 和病毒 的核酸 在几种 不同的 
琼脂糖 浓度上 的色谱 行为, 如图 5-15 所 示为细 胞的核 酸和脊 髓灰质 炎病毒 RNA 的合 
成混 合物在 60X2.1 厘 米柱的 1% 琼 脂糖珠 上分离 结果。 峰 I 仅含 DNA, 峰 n 含病毒 
RNA; 峰 m 和 IV 各为核 糖体和 tRNA, 图 5-15 表 示分离 过程中 琼脂糖 浓度变 化的影 
响, DNA 在所用 的琼脂 糖浓度 下都被 排阻, 而 tRNA 在 4% 琼脂糖 浓度的 值为 0.6, 
在 1% 琼 脂糖浓 度中则 上升到 1.0, 洗脱液 pH 在 5 — 8 范 围内变 化对分 离影响 很小, NaCl 
浓度从 0.01 到 1.0 M 的变化 不影响 DNA 或 tRNA 的色谱 行为。 由 此看出 DNA 完全 
为固 定相所 排阻, 而 tRNA 有一个 紧密的 构型, 核糖体 (16 S 和 23 S) 和 腺病毒 RNA 由于 
NaCl 浓度 的增加 而降低 了静电 排斥, 从而 形成更 紧密的 构型, 故在 柱上有 更大的 阻留。 图 
5-15(0 表示腺 病毒型 5DNA (分 子量 20X1() 6 ), 脊 髓灰质 炎病毒 RNA (分 子量 370,000) 
和随体 烟草坏 疽病毒 RNA (分 子量 370,000) 在 lf。 琼脂 糖珠上 的分离 结果, 色 谱柱长 60 
厘米。 



n A 



\ 



0.4 
0.3 
0.2 
0.1 



J. 



乂, 



30 



床 体积的 百分数 
(a) 



50 
(b) 



70 



^269 



90 

床 体积的 百分数 
a ~~ D 数目 / 分 10 一 2 



】、 



\\2 
8 



30 40 50 60 70 80 

(C) 

« ~~ X 数目 / 分 10-» 



图 5-15 高分子 量核酸 在琼脂 糖珠上 的分离 
(a) 脊 髓灰质 炎病毒 RNA 与细 胞核酸 分离; (b) 琼 脂糖浓 度对核 酸洗脱 体积的 影响, *一* DNA, 
-0 rRNA, D — □ 脊 髓灰质 炎病毒 RNA, X — X tRNA; (c) 病毒 核酸的 分离, X — X 腺病毒 
RNA, □— □ 脊 髓灰质 炎病毒 RNA, • — • 随体 烟草坏 疽病毒 RNA 

3. 蛋白质 分子 筛色谱 早期重 要的应 用是血 清蛋白 的分级 分离。 按 分子大 小可分 

为 二组。 第一组 (A) 包括约 50 总血清 蛋白, 其中 主要为 白蛋白 (分 子量 70,000), 较 
少量的 P-1 前 白蛋白 (分 子量 61,000), 血清 粘蛋白 (分 子量 5 4 ,00()), 铁传 递蛋白 (分 子量 
60,000); 第二组 (G) 包括 免疫球 蛋白, 主要为 IgG 及较 少量的 IgA、 IgD 和 IgE (分 子量 
15,000-170,000), 少量的 血浆铜 蓝蛋白 (分 子量 151,000)、 结合 珠蛋白 (分 子量 200,000) 
和 .tf-2A 球 蛋白; 第三组 (M) 包括 免疫巨 球蛋白 (IgM) 和 "及 P 脂蛋白 (分 子量约 
2,000,000 — 3,000,000)0 

图 5-16(a)、(b)、(cy" ] 表示在 Sephadex G-100.G-150 及 G- 2 00 上 这些组 别的分 
离 图谱。 分 离结果 最好为 G-2()(), 在 聚丙炼 酰胺球 上则以 6X5 的孔径 上分辨 率最佳 [图 



00 % 



. 132 - 



o 







(!) 

§ OST 





• 133 • 



5-16 (d)、 (e)、 (f)] ,但巨 球蛋白 组份的 分辨率 最好为 5X5 的 凝胶。 蛋 白质的 分子量 在- 
200,000 之下 的在琼 脂糖凝 胶上分 离效果 不好, 但 10% 的琼 脂糖浓 度可以 用来分 离巨球 
蛋白 [5-16(G)、(H)、(I)], 而 6fc 凝胶 仅用于 分离如 病毒的 颗粒, 分 子量在 SOO'OOO 以 
上的 物质。 

对于分 析分离 的实验 最好在 柱直径 1 厘米长 200 厘米下 进行, 床体积 80 — 300 毫升, 
最大 加样量 5 — 50 毫克, 这对 于大分 子溶质 的混合 物的分 离有良 好的分 辨力。 假如适 
当选 择操作 条件, 在制 备范围 上可获 得高分 辨力, Mauritzen 等 [ 2 6] 在 300X7.6 厘米的 
Sephadex G-100 色谱 柱上对 0.5 克 小牛胸 腺组蛋 白的富 有精氨 酸组份 的分级 分离, 以 
O.OIMHCI 洗脱, 流速 67—90 毫升 / 小时。 分离结 果如图 5— 17 得五 个峰, 按 9 个组分 
收集, 蛋白 质回收 率达到 85%, 组蛋 白在峰 III, 而峰 IV 和 V 在聚丙 晞酰胺 凝胶电 泳上实 
际 上均一 组份。 假如 应用特 别的双 头柱, L/D 比率 (40:1) 控 制适当 流速, 1.5—2 毫升 / 
小时 • 厘米 2。 较低 加样量 (少于 0.04 毫克 / 毫升 床体积 ), 可得 良好分 辨力。 




40 45 



50 55 60 65 70 75 
小时 



80 85 



90 



图 5-18 人血装 铜蓝蛋 白的循 环分子 蹄色谱 
以上 的色谱 操作多 采用长 的柱, 故柱的 装填及 操作较 繁琐, 但在 许多情 况下, 可 用- 



134 




.120 160 200 
外 水弃去 (3245 毫升) 



240 280 



图 5-17 在 Sephadex G-100 上富有 精氨酸 -组蛋 白的分 级分离 




I 5 

L 1 



2 4 6 00 




根 短柱, 以循环 色谱法 代替。 例如 Porath 和 Bennich [ " 】 报导 的人血 装铜蓝 蛋白的 分级分 
离 (图 5-18)。 用粗 血浆铜 蓝蛋白 156 毫克, 93 X 2.2 厘米色 谱柱, Sephadex G-100, 以 
Tris-HCl 缓冲液 (PH8.0) 循环 上柱, 流速 20 毫升 / 小时。 在三 次循环 后得到 A 和 B 成分 
的不完 全分离 ,进一 步的循 环色谱 可除去 B 峰的尾 随物质 (阴 影部分 ); 至第四 循环时 A 部 
分 已与任 何残余 B 部分 分开; 至第 六和第 八循环 之间, 某些尾 随物质 已除去 ;到第 八循环 
可得纯 A 组分。 



第三 15 亲 和色谱 

一、 基 本原理 > 

生物体 中许多 高分子 化合物 具有和 某些相 对应的 专一分 子可逆 结合的 特性, 例如酶 
蛋白和 辅酶、 抗原和 抗体、 激素及 其受体 、核 糖核酸 与其互 补的脱 氧核糖 核酸等 体系, 都具 
有这种 特性。 生物分 子间的 这种结 合能力 称为亲 和力, 根据 生物分 子间亲 和吸附 和解离 
的 原理, 而建立 的色谱 法称为 亲和色 谱法。 

亲和色 谱的基 本过程 如下: 把欲 分离的 可亲和 的一对 分子的 一方作 为配基 (ligand), 
在不伤 害其生 物功能 情况下 与不溶 性载体 结合使 固定化 ,装入 色谱柱 (称 亲和柱 ), 然后把 
含有 欲分离 物质的 混合液 作为流 动相, 在有利 于配基 固定相 和欲分 离物质 之间形 成络合 
物的 条件下 进入亲 和柱。 这时, 混合物 中只有 能与配 基形成 络合物 的物质 分子被 吸附, 不 
能形成 络合物 的杂质 则直接 流出。 变换 通过亲 和柱的 溶液, 促使配 基与其 亲和物 解离, 从 
而释 放出亲 和物来 (如图 5-19)。 
载体 

""" 亲 和层析 



mmm 

亲和物 dib 
杂质^ A 

再生 



CFD 十国 i 



洗漆 



凸 

图 5-19 亲和 色谱基 本过程 示意图 

亲 和色谱 中最常 用的生 物体系 如下: 
酶: 基质类 似物, 抑 制剂, 辅酶。 
抗体: 抗原, 病毒, 细胞。 

外源凝 集素: 多糖, 糖蛋白 ,细 胞表面 受体, 细胞。 
核酸: 互补碱 基序列 ,组 蛋白, 核酸聚 合酶, 结合 蛋白。 
激 素及维 生素: 受体, 载体 蛋白。 
细胞: 细胞表 面特异 蛋白、 外源凝 集素。 

亲和色 谱的优 点是在 温和条 件下操 作简单 ,效 率高, 特别 对分离 含量极 少而又 不稳定 
的活性 物质最 有效。 甚至 从粗抽 提液中 经亲和 色谱一 步就能 撐纯几 百至几 千倍。 例如分 
离胰 岛素受 体时, 把胰岛 素作为 配基, 偶 眹于琼 脂糖载 体上, 经亲和 色谱, 从 肝细胞 抽提液 



135 



中 纯化达 8000 倍。 

亲和色 谱的局 限性在 于不是 任何生 物高分 子都有 特定的 配基, 针对某 一分离 对象就 
需要 制备专 一的配 基和选 择特定 的色谱 条件。 

由 于琼脂 糖这一 理想载 体的出 现以及 固定化 技术的 改进, 使亲 和色谱 技术得 到越来 
越广泛 的应用 ,发 展十分 迅速, 目前巳 有几百 成功的 例子, 也 有了作 为亲和 色谱载 体的商 
品 供应。 因此, 亲和色 谱技术 已成为 生物化 学中分 离提纯 生物活 性物质 的重要 方法之 

一 [28,29] 

二、 载体 的选择 

亲和 色谱的 理想载 体应具 备下列 特性: (1) 不 溶性; (2) 渗 透性: 疏松网 状结构 ,容 
许大分 子自由 通过; (3) 高硬 度及适 当的颗 粒形式 (最好 为均一 的珠状 ); (4) 最低 的吸附 
力; (5) 较好的 化学稳 定性; ( 6 ) 抗 微生物 和醒的 侵蚀; (7) 亲 水性; (8) 具 大量的 供反应 
的化学 基团可 供活化 ,能与 大量配 基共价 连接。 . 

(一) 纤维素 

亲水 性纤维 素衍生 物已用 于抗体 和酶的 纯化。 Lemian 最早用 于酪氨 酸酶的 分离, 将 
酪氨 酸的抑 制剂对 苯重氮 粉连接 于纤维 素上, 用来提 纯蘑薙 中的酪 氨酸酶 [3 ° ] ;黄素 衍生物 
偶联 于羧甲 基纤维 素上, 能特 异吸附 肝黄素 激酶, 使酶纯 化几百 倍 [ 31 ] 。 纤维 素衍生 物用于 
核苷 酸化学 上特别 有效, 例如, 用于纯 化核酸 的互补 链转移 RNA 和核 苷酸。 

虽然 纤维素 衍生物 有价廉 及来源 充足的 优点, 但 由于它 的纤维 性和非 均一性 限制了 
大分子的掺人 [32 ^^ 而 且非专 一吸附 作用较 严重, 因而限 制了其 广泛的 应用。 

(二) 葡聚 糖凝胶 

葡聚糖 凝胶是 由葡聚 糖经环 氧氯丙 院交联 而成的 产物, 它有良 好的化 学及物 理稳定 
性, 但多 孔性则 较琼脂 糖凝胶 为低, 并 且经过 偶联配 基的操 作后, 凝 胶的膨 胀度将 进一歩 
缩减, 因 而在亲 和色谱 中的应 用也受 到一定 限制。 

(H) 聚 丙嫌酰 胺凝胶 

聚丙 炼酰胺 凝胶的 物理化 学性质 也十分 稳定, 抗微生 物侵蚀 的能力 比琼脂 糖强, 有更 
多 的可供 化学反 应的酰 胺基, 提高了 配基的 浓度, 故特 别适用 于配基 和亲和 物之间 亲和力 
比 较弱的 系统。 用 Biogel 制得配 基高度 取代的 衍生物 ,就能 增强物 质间的 相互作 用而成 
功地进 行亲和 色谱。 从聚 丙嫌酰 胺凝胶 为载体 可制得 各种衍 生物。 

1. 叠氮 衍生物 通过聚 丙稀酰 胺的酰 胺基经 水合肼 处理后 形成酰 肼基, 再 由亚硝 
酸处 理而成 叠氮衍 生物。 它 可以和 具有脂 族或芳 香族氨 基的配 基偶合 (以 i 表示 聚丙炼 
酰胺 )。 



;— C— NHj- 一 C 一 NH . NH, — C— — — C— NH— 配基 



• 136 • 



2. 氧基 衍生物 带 有酰胺 基的聚 丙稀酰 胺衍生 物可与 脂族二 胺反应 制得氨 基衍生 
物。 它 可以和 带接基 的配基 偶合。 利用脂 族二胺 中的经 长度可 以控制 "手臂 "的 长短。 

I I 

{ y H,N (CH,)nNH, \ / 

< -C— NH . NH, H 一 C • NH(CH,)。NH, 



HOOC— 



配基 



o 



;— C— NH(CH,)n . N— C — 



i 己基 



紫 二亚胺 

3. K 氨酖 衍生物 - 聚丙炼 酰胺叠 氮衍生 物进一 步和甘 氨酰酪 氨酸反 应可制 得酷氨 

酷衍 生物, 它可 以和带 有氨基 的配基 经重氣 化后相 偶眹。 



[ 

y 甘 ,甘' 酷 ^ 

-C-N3 ^ — C 一甘 '甘' 酷- 



S— OH 



N 三 N- 



配基 



C 一甘. 甘. 酷一 〈 



-OH 



— \ 



N = N— ( 



配基 



(四) 多 孔玻璃 

多孔玻 璃的优 点在于 不受微 生物的 侵烛, 经受得 起有机 溶剂和 缓冲液 组成的 改变。 但 
是玻璃 表面由 于含有 轻基, 因而在 水溶液 中显示 轻微负 性的表 面电荷 ,对于 大多数 酸性蛋 
白质、 病毒、 多糖或 核酸, 洗 脱时没 有任何 阻挡或 吸附, 而对所 有强碱 性蛋白 质和一 些中性 
蛋白 质及病 毒都可 吸附。 多 孔玻璃 表面对 蛋白质 这种非 专一性 吸附, 也影 响了其 广泛应 
用。 

院 基胺取 代的多 孔玻璃 (商 品名 Bio- Glass) 共 价连接 甘氨酰 -D- 苯丙 氨酸, 制 得接肽 
薛 A 的亲和 吸附剂 [33] , NAD+ 偶联于 Bio-Glass 制得水 不溶辅 酶 [34】 。 

(五) 琼脂糖 

琼 脂糖是 D- 半 乳糖和 3,6- 脱水 -L- 半 乳糖交 替结合 的链状 多糖。 




商品中 相应于 2, 4 和 6f。 的琼脂 糖浓度 的珠状 凝胶, 分 别称为 Sepharose 2B、 4B 和 
6Bo 凝胶浓 度越低 ,其结 构也越 疏松, 即 多孔性 越高, 其机 械强度 则随浓 度的降 低而减 
少。 

• 137 . 



琼脂糖 易溶于 沸水中 ,在 40t 以 下即形 成不溶 性凝胶 (甚 至浓 度低于 0.4%)。 与葡 
聚糖 和聚丙 晞酰胺 相反, 其多聚 链是由 氢键连 接一起 的而不 是由共 价键连 接的, 这 就使琼 
脂糖凝 胶在化 学上的 稳定性 比葡聚 糖和聚 丙痛酰 胺差, 要 避免在 PH 低于 4 高于 9 下操 
作。 破 坏氢键 的试剂 能降低 凝胶的 机械稳 定性。 但 通常用 0.1 M NaOH 或 1 M HCl 处理 
2 — 3 小时 不致引 起凝胶 颗粒的 变化。 琼脂 糖凝胶 不为有 机溶剂 (如 乙醇、 丙酮) 所 破坏, 

而葡聚 糖和聚 丙炼酰 胺用丙 酮处理 则完全 收缩。 经 6M 盐 酸胍或 m 尿 素长期 处理, 只 

引起凝 胶略微 缩小, 而不影 响吸附 性能, 这种 稳定性 保证了 吸附剂 可反复 使用, 并 可采用 
蛋白变 性剂作 为洗脱 大分子 及彻底 洗漆吸 附剂的 手段。 

由于琼 脂糖凝 胶是一 种热可 逆凝胶 ,凝胶 受热即 失去稳 定性, 最后 溶解。 因此, 凝胶 
必需保 存在低 温下, 但不能 冻结, 因为冻 结也破 坏可逆 结构。 凝胶不 能加热 消毒, 宜湿态 
储存, 表 5-14 总结 了琼脂 糖对一 些溶剂 和介质 的耐受 条件。 

表 5-14 琼脂 糖耐受 的溶剂 和介质 的条件 



溶 剂 


条 件 


溶剂 


条 件 


溶 剂 


条 件 


0.1M NaOH 
IM HCl 

(>M 盐酸胍 
7A/ 尿素 


2 — 3 小吋 (室温 ) 
2 — 3 小时 (室温 ) 
2 — 3 小吋 (室温 ) 
2 — 3 小吋 (室温 ) 


乙醇 
甲醇 
丁醇 
丙酮 


2-3 小吋 (室温 ) 
2-3 小吋 (室温 ) 
2-3 小吋 (室温 ) 
2-3 小吋 (室温 ) 


有水 >%啶 8Q% V/V 
有水 二甲基 甲銑胺 50%V/V 
乙二醇 50% V/V 
无水二 氧六环 


2 — 3 小吋 (室温 ) 
2 — 3 小吋 (室温 ) 
2 — 3 小吋 (室温 ) 
6 个月 



三、 琼脂 糖的活 化及其 衍生物 的制备 

琼 脂糖使 用前需 活化, 通常是 在碱性 条件下 用溴化 氰处理 引人" 亚氨 基碳酸 盐", 再在 
弱碱的 条件下 直接偶 联含有 游离的 脂族或 芳香族 氨基的 配基, 形成 氨基碳 酸盐和 异脲衍 
生物。 



-OH CNBr 
-OH 



活化 



— On 



— O' 



H,N- 



.C=NH 



配基 ;一 O — f—NH_ 配基 
NH 



偶联 



-O— C— NH- 

n 

o 

OH 



配基 



由于 亲和色 谱中常 用一些 小分子 化合物 作为配 基制备 亲和吸 附剂, 但 小分子 的配基 
直接连 接于琼 脂糖上 常产生 无效吸 附剂, 其原因 是由于 载体的 空间位 阻关系 ,使大 分子化 

合物 (亲 和物) 不能直 接接触 到配基 (如图 5-20)。 解 决的办 法是在 载体和 配基之 间引入 
适当长 度的" 手臂" 减 少载体 的空间 位阻, 增加配 基的活 动度。 作为" 手臂" 的经链 可以先 
连接于 载体, 再通 过它连 接于配 基上。 

图 5- 21 表 示纯化 /?- 半乳糖 苷酶的 几种琼 脂糖吸 附剂。 E. coli /?- 半乳 糖苷酶 的竞争 
性 抑制剂 对氨基 苯-釺 D- 琉 基吡喃 半乳糖 是相当 弱的抑 制剂, 直接 连于琼 脂糖上 的衍生 
物不能 用来纯 化/? -半乳 糖苷酶 (图 5-21 A), 而在抑 制剂和 载体之 间引人 "手 臂", 在溴乙 
酰氨 乙基琼 脂糖上 (图 5-21B) 和號珀 酰化的 3,3'_ 二氨基 二丙胺 琼脂糖 (图 5- 21C) 上连 



138 



图 5-20 亲和 色谱中 引入" 手臂" 原因 示意图 



Agarose 




图 5-21 纯化 /3- 半乳 糖苷酸 的几种 琼脂糖 吸附剂 

接抑 制剂, 发现 B 衍生物 (手臂 长度〜 1()A°) 与 衍生物 A 有本 质上的 差别, /?- 半乳 糖昔酶 
的洗脱 峰在柱 色谱图 上比杂 蛋白峰 的迁移 稍迟缓 ,而 衍生物 C (手臂 长度约 21A°) 则对 
半 乳糖苷 酶有很 强的亲 和力。 

图 5-22 表示 几种激 酶和脱 氢酶与 琼脂糖 衍生物 (含 有不 同长度 的次甲 基手臂 连接的 
ATP 和 NAD+) 的相互 作用。 在同 一实验 条件下 研究它 们之间 亲和力 的大小 关系, 从而 
得出以 下重要 结论。 当伸 长手臂 含有四 个次甲 基时, 核苷酸 与载体 骨架很 接近, (0 — 5A°) 
酶和 亲和吸 附剂的 结合力 很弱, 接近 于零, 而当 伸长" 手臂" 达到 5 — 10A 。(即 次甲 基增加 
到 8 个) 时, 其结 合力有 很大的 增加, 故需 较高的 盐浓度 才能把 结合的 酶从柱 上洗脱 下来, 
但 当载体 和配基 之间的 "手臂 "含有 8 个 以上的 次甲基 (长 度〉 10A°) 时, 酶 和亲和 吸附剂 
之间 的结合 力反而 下降, 这 可能是 由于" 手臂" 过长易 弯曲, 使配基 过于接 近载体 骨架, 从 
而 减弱了 与酶的 作用。 

. 139 • 



500 
400 
p 300 
200 



(a) 


(b) 










^^^^ 





6 9 
在伸长 



12 3 6 
L 臂" 中次 甲基数 



12 



图 5-22 某些脱 氢飽和 激酶与 固定化 核苷酸 结合吋 伸长手 臂长度 的影响 

(a) □ 兔骨髓 肌乳酸 脱氢酷 • 猪心 肌乳酸 脱氢海 苹 果酸脱 氢腺; 
■ 葡萄糖 6- 碟酸脱 氢醒; 固 定化的 NAD+。 
(b) □ 己糖激 醉; ■ 3- 碑酸 甘油激 H; 甘油 激醒; 固定化 ATP, /3 代 表酶和 固定化 的核苷 

酸之 间相互 作用的 强度值 及洗脱 11 所需的 KC1 浓度 (mA/) 

在所有 的琼脂 糖衍生 物中, 最 重要是 CO- 氣 烧基琼 脂糖。 

琼 脂糖经 溴化氰 活化后 和甲叉 二胺或 乙叉二 胺的一 个氨基 偶联。 这些 脂族二 胺分子 
的 经链的 长短, 可以控 制插人 "手臂 "的 长短, 其 W- 氨 基可与 带接基 的配基 在羧二 亚胺的 
作用 下脱水 连接。 



籠 I HjN(CHj)„NHj |— NH(CHj)„NHj HOOC— 



配基 



-NH(CHOnNH • CO— 



配基 



CNBr 



幾 二亚胺 



to- 氨院基 琼脂糖 可用来 进一步 制备一 系列的 琼脂糖 衍生物 (如图 5-23)c 



四、 亲和色 谱条件 的选择 



亲 和色谱 一般采 用柱色 谱法。 亲 和柱的 平衡缓 冲液的 组成、 PH 和离 子强度 应选择 
亲 和物双 方作用 最强、 最 有利于 形成络 合物的 条件。 一 般用接 近中性 pH 为亲和 吸附条 
件, 上 柱的样 品液应 和亲和 柱平衡 缓冲液 一致。 为了有 利于络 合物的 形成, 亲和吸 附可在 
4°C 下 进行, 以防止 生物大 分子的 失活, 上柱流 速尽可 能慢。 

样品通 过亲和 柱后, 用 大量平 衡缓冲 液洗去 杂质, 也常用 不同的 缓冲液 洗漆, 进一步 
除去非 专一吸 附的杂 蛋白, 尽可能 使亲和 柱上只 留下有 专一吸 附的亲 和物, 然后再 用洗脱 
液 洗脱亲 和物, 洗脱液 所选取 的条件 正好与 吸附条 件相反 ,应 能减弱 配基与 亲和物 之间的 
亲 和力, 使络合 物完全 解离。 

由 于亲和 色谱中 亲和对 象差异 很大, 很难有 统一的 标准, 表 5- 15 中列 举了一 些亲和 
吸附 和洗脱 条件, 以供 参考。 

洗脱结 束后, 亲 和柱需 继续用 洗脱剂 洗涤至 无亲和 物存在 为止, 再用平 衡缓冲 液使亲 
和柱充 分平衡 ,存放 于冷室 (4°C 左右 )。 

• 140 . 



(2) NajSjO^ 

(连 二硫 酸纳) 

(3) HNO, 
(亚 硝酸) 



I 一 NH(CH2)6NHCO—〈 



O u o 

(琥珀 酸肝) 



N+=N 
图 5-23 琼 脂糖的 衍生物 



五、 亲和 色谱应 用举例 

(一) 醇脱 氧酷及 磷酸果 糖激酶 的纯化 [38】 

在 N6- 氨己基 -5'- AMP- 琼脂 糖柱上 以部分 提纯的 酶液可 纯化醇 脱氢酶 及磷酸 果糖激 
酶。 结 果如图 5-24 (A) 0.5 毫升酶 抽提液 (每 毫升含 40.5 单 位的确 酸果糖 激酶, 10 单位 
或 9.9 毫克 的醇脱 氢酶) 对 10 磷酸盐 (PH6.8, 含 0.2Af KCl) 充分 透析, 然 后吸附 
在 AMP- 琼脂糖 柱上, 用 以下溶 液顺序 洗漆。 (a) 平衡 缓冲液 (10 mM 磷 酸盐, pH 6.8) 
24 毫升; (b) 5mM NADH 5 毫升 (同上 缓冲液 ); (c) 缓冲液 5 毫升; (d) 5mM ATP, 5mM 
Mg++ (在 5 毫升缓 冲液中 ), 流速 0.4 毫升 / 分。 (B)KCl 梯度 处理: 与 (A) 同样条 件处理 
后 吸附, 以 lOmA^ 碟酸盐 (pH 6.8 , 含 0.2M KC1) 20 毫升 洗漆, 再以 0.2 — 0.8 M KC1 的 
线 性梯度 (40 毫升) 洗脱。 (C) pH 梯度 处理: 样品对 10 mM- N-2- 轻乙基 呱嗅- N'- 乙基 



141 



卜 NH(CH,)「COOH 蔑 二亚胺 I 

(CH-Sepharose 4B) ;― ^ — NH(CfI,),CONHR 

I NH,(CH,),COOH . 

CNBr 活化的 SepharosMB ^ |— NHR 

NH,(CH,).NH, 

紫 二亚胺 $ 
卜 NH(CH,)6NHCOR 



(― NH(C«,)6 NH, 
1 (AH— Sepharose 4B) 



(l)OjN— < 



)— C 



o 

歹 



(对 硝基 苯甲醜 桑氮) 



NH, 

J— NH (CH,)6 NHCOCH(CH,)2SH 



CHj — S 
CH, 

NH,— CH— CO 

(同 型半眈 氨酸硫 内酯) 



I — NH(CHj)6NHCOCHj Br 



BrCH, 



O 



(O- 漠乙銑 -N- 经基 琉拍銑 亚胺) 

— NH(CH06NHCO(CH,),COOH 




o 

olc 



表 5-15 亲和色 谱中配 基的选 择和洗 脱条件 【 : 



辛和对 #^ 

V^jN '|>1 /^J 巧、 


配 基 


洗 fltf 液 

tTU lUit UA. 


乙酰 胆滅酷 SI 


对氨 基苯- 三甲基 氯化铵 


IM NaCI 


酸縮酸 


醒缩醒 亚单位 


6Af 尿素 


天冬 銑胺酸 


D- 天 冬銑胺 


D- 天 冬醜胺 


碳 酸肝酷 


礎胺 


乙銑偶 氮醜胺 


羧狀薛 A 


L- 酷氨醜 -D- 色氨酸 


O.IA/ 醋酸 


按肽酸 B 


D- 丙氨銑 -L- 精氨酸 


0.05A/NaCl, Tris-HCl, pH 7.9 


枝酸 变位飽 


L- 色氧酸 


O.OOIA/ L- 色氧酸 


« -糜 蛋白薛 


D -色氨 酸甲酯 


0.1 M 醋酸 


胶原酶 


胶原 (豚鼠 皮肤) 


IWNaCl, 0.05Af Tris-HCl 






pH 7.5 0.005M CaCl, 


3 -脱氧 -D- 阿拉 伯糖- 庚酮 糖酸- 7- 


L- 酷氨酸 


Q.2M 碟 酸盐, pH 6.5 


• 碟酸 合成薛 




0.001 M CuSO, 


脱 氧核糖 核酸醒 抑制剂 


核糖 核酸酷 


0.7Af 盐酸胍 






(在 0. 5 A/ 醋酸纳 - 3 0% 甘^ 中) 


二 氢叶酸 还原酶 


2,4- 二氨- 10- 甲基蝶 - 


5 - 甲銑四 氣叶酸 




銑- L- 谷氨酸 




半乳 糖苷海 


对 氨基苯 -/3-D- 琉 


NaB, pH 10 




基 吡喃半 乳糖昔 




3- 磷 酸甘油 脱氢海 


3 -碟 酸甘油 


0.5Af 3- 碑 酸甘油 


■ 脂 g 白酯醒 


肝素 


0,16— 1.5M NaCl 梯度 


- 神 经氨糖 酸苷藤 


N -(对 氨基苯 )- 草氧酸 


0.1 M NaHCOj pH9.1 


核酸酸 (葡萄 球菌) 


对-氨 基苯- 磯銑- 脱氧 






胸苷- 5'- 碟酸 


O.IA/ 醋酸 


• 糜蛋 白醒卵 抑制剂 


糜蛋白 §1 


0.2M KCl— HCl pH2 


木瓜 蛋白薛 


甘氨 酰-甘 氨銑- (邻 苯甲跌 -L- 


水 




酷氨銑 -L- 精氧酸 




■ 木瓜 蛋白薛 


对氨 基苯- 醋酸汞 


0.0005 U MgCI, 


胃蛋 白薛, 胃蛋 白薛原 


聚 赖氣酸 


0.15— IM NaCl 梯度, 






(在 醋酸 纳中) pH 5.2 


血纤 维蛋白 溶隨原 


L- 赖氨酸 


0.2M E- 氨 基己酸 


蛋白酷 (小麦 ) 


血 红蛋白 


O.IM 醋酸 


核德 核酸薛 A (胰腺 ) 


对 氨基苯 -碑銑 -尿苷 2'3'- 碟酸 


0.2A/ 醋酸 


核糖 核酸晦 -S- 肽 


核 糖核酸 SI-S- 蛋白质 


50% 醋酸 


凝血酶 


对 氯苯胺 


1M 苯胺- HC1 (在碟 酸纳, pH7 中) 


转氨酶 


吡!^ 胺- 5'- 磯酸 


0.25Af 谷 氨酸, 1A/ 碟 酸盐, pH4.5 


«和/3 姨 蛋白酷 


卵 粘蛋白 


O.IM 甲酸- 0.5MKC1 






pH4.5-2.75 梯度 


酪氣酸 经化酷 


3- P5I 哚 酪氨酸 


0.001 M KOH 


白蛋白 (人) 


抗血清 白蛋白 


0.5MNaCl, 甘氨酸 -HCl, pH2.8 


绒毛 膜促性 腺激素 (人) ' 


绒毛 膜促性 腺激素 (人) 


6M 盐 酸胍, pH3 


DNP- 蛋白质 


DNP 卵 清蛋白 


0.1A/ 醋酸 


/3- 半乳 糖苷酸 


(3 一半乳 糖苷藤 


O.lAf NaCl, 0.05M 






Tris-HCl, pH7.4, O.OlMMgCl, 


免疫 球蛋白 IgE 


IgE 


0.15 WNaCl, O.IA/ 甘氨 酸- 






HC:, pH 3.5 


IgG 


IgG 


5M 盐酸胍 . 




IgM 


5M 盐酸胍 


胰岛素 


胰岛素 


1 0.1 M 醋酸, pH 2.8 



m 表 



■Vr- Xr-t -vt 

亲 和对象 


K, -tf- 
面己 虽 


A4- DAX 
洗脱液 


淋 巴细胞 (鼠) 


抗淋巴 细胞, 球蛋白 偶联于 


0.2Af 醋酸 




Sepharose 2B 上 




催 乳激素 (人) 


人 胎盘催 乳激素 


4Af KSCN 


转移 RNA 


转移 RNA 


O.HMNaCI, 0.01 M 碟 酸盐 pH7.4 


补体 (组分 Ci) 


IgG 


0.2 A/ 二氨 基丁院 pH 1 1 . 


皮质 醇-结 合蛋白 (人) 


皮质醇 


0.08 W 皮 质醇, 在 0.05 M 磷 酸盐: 






pH6.8 中 


视黄 醇-结 合蛋白 (人) 


前 白蛋白 


水, pH8 (NH.OH) 


酷氨酸 -结合 球蛋白 


L- 酪氣酸 


0.002 M KOH,pH 9.3 


抗生物 素蛋白 


E-N- 生物素 gSfc-L- 赖氧酸 


6^f 盐酸胍 


姨岛素 


抗胰 岛素, IgG 


6'W 盐酸呱 








-11 - 




^ c 


y -10 






9 






-8 






-7 



20 



-.10 



60 



20 40 
洗 脱体积 (毫升 ) 

图 5-24 以 N6- 氨己基 -5'-ATP- 琼 脂糖亲 和柱上 专一洗 脱醇脱 氢酷及 酸果 糖激酶 
• 蛋 白质; 3- 碟 酸-甘 油酸脱 氢醒; ▲ 醇脱 氢薛; ■ 碟酸果 糖激海 

磺酸盐 (pH 6.8) 平衡, 其他 条件同 (A), 然后 吸附在 柱上, 以 缓冲液 20 毫升 洗漆, pH 梯 
度 (10 mM 经乙基 呱嚷- 乙基横 酸盐, 5 mM 甘 氨酰甘 氨酸, pH 10.4) 40 毫升 洗脱。 

(二) a- 抗胰蛋 白醜的 分离纯 化 [3 " 

在 伴刀豆 球蛋白 A- 琼脂糖 (ConA- Sepharose) 柱上从 人血清 中可分 离纯化 cr- 抗胰蛋 
白醸。 



143 




m) SIOM 




ufw/w 慚) sms 



(=) rRNA 的分离 

用赖 氨酸- 琼脂糖 4B 可把 几种 rRNA 按 分子大 小分开 (如图 5- 26)。 

色谱柱 1.6X7.5 厘米 (床 体积 15 毫升 ), 流速 15 毫升 / 小时, 温度 22t ,洗 脱液: 

0.02 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.5) 含 0.01 M MgCl? 以 0.05— 0.30 NaCl 线性梯 度洗脱 。 

样 品液: E. coli rRNA (在缓 冲液中 )。 

( 四) 还原 型辅酶 A (CoA) 的分 离纯化 [ " 】 

由于 发现藤 黄八叠 球菌透 析的抽 提液中 的蛋白 质绝大 部份为 CoA 亲和 蛋白, 故可直 
接将此 透析抽 提液与 CNBr 活化的 Sepharose 6B 反应, 制 得固相 CoA 亲和 蛋白柱 (IX 



分部 收集, 流速 15 毫升 / 小时。 



1.6 




一 




1.2 






1 , 

1 1 

. \ 


0.8 






\ 


0.4 






i\ 










10 20 30 40 50 60 
分部数 (2. 5ml/ 管) 



图 5-25 • 人血清 《 -抗 胰蛋白 酷在固 
定化- 伴刀豆 球蛋白 A 上的亲 和色谱 



当 部分纯 化的人 血清制 剂通过 ConA- Sepharose 柱时, 蛋白 质出现 在外体 积中, 其中包 
含大量 血清白 蛋白, 随后用 0.1 M 甲基 a-D- 葡萄 糖苷洗 脱可得 75 — 80% 的抗胰 蛋白酶 
活性, 其中也 包含有 少量的 蛋白质 (见图 5-25)。 

ConA-Sepharose 柱 1.5 X 10 厘米, 以 0.05M 磯酸盐 缓冲液 (pH7.6) 平衡, 无 吸附的 
蛋 白质被 洗下。 从 箭头所 指起用 0.1M 甲基- «-D- 葡萄糖 吡喃苷 (在同 上缓冲 液中) 洗脱, 



图 5-27 固相 CoA 亲和蛋 白柱的 吸附专 一性 

; 离子 强度, A: AMP, B: 氧化型 CoA' C: ADP, D: 还原型 CoA, 

£: ATP, F: 脱磷 CoA, G: 还原型 CoA 



5 0.6 

|0.2 

L_ 



分部数 (人为 单位) 



0.30 




100 200 300 楊 

洗 脱体积 (毫升 ) 

图 5-26 在賴 氨酸- 琼脂糖 4B 
上 rRNA 的色谱 



0.08 
0.06 
0.04 

40.02 





D 



A B、 




S 5 o 5 

1 7 5 2 o 



• 144 • 



5 厘米 ), 以 醋酸钠 (pH 6.0, 离 子强度 0.01) 缓冲液 平衡。 还原型 CoA 可 吸附在 柱上, 增 
加 NaCl 的 离子强 度可把 CoA 洗脱 下来, 如图 5- 26, 还原型 CoA 有 两个洗 脱峰, 洗脱的 
离子强 度各为 0.025 和 0.06, 这说 明在吸 附剂中 至少存 在两类 CoA 亲 和蛋白 , 对 CoA 有 
不 同的亲 和力。 氧化型 CoA ,脱磯 CoA, ATP 和 ADP 也被 吸附, 但 AMP 不 吸附。 收集的 
还原型 CoA 纯度达 92 — 94 f。。 

图 5-27 中表 示固相 CoA 亲和蛋 白柱的 吸附专 一性。 洗 脱的化 合物在 260 nm 测光吸 
收, 第一峰 为平衡 的缓冲 液洗下 ,其他 峰则以 NaCl 线 性梯度 洗脱。 

(五) 绒毛膜 生长激 素的提 纯 [ "1 

在抗 HCS- 琼脂糖 柱上, 以 正常人 血清提 纯人绒 毛膜生 长激素 (HCS)。 以放 射免疫 
测定法 测定, 发现 在非阻 留组分 中没有 激素, 99% 的 激素在 胍洗脱 液中, 几 乎定量 回收, 
结 果如图 5-28。 



图 5-28 

第四节 色 谱聚焦 

色谱 聚焦是 (chromatofocusing) —种高 分辨率 的新型 的蛋白 质纯化 技未。 Sluyterman 
等首 先发展 了这一 技术" 气 它是 根据蛋 白质等 电点, 结合离 子交换 技术的 大容量 色谱, 
能分离 几百毫 克蛋白 质样品 ,洗脱 峰被聚 焦效应 浓缩, 峰宽 度可达 0.04 — 0.05 pH 单位, 分 
辨率 很高, 操作 简单, 不 需特殊 的实验 装置。 

本法适 用任何 水溶性 的两性 分子, 如蛋白 、酶、 多肽、 核 酸等。 

• 145 • 



I -0 



J 







6A/ 盐酸胍 
0.05%HSA 
pHs.l 



琼 脂糖抗 HCS 

HCS300 毫克 
(在 正常血 清中) 



0.15A/ NaCl 
0.01/V/S? 酸钠 
i pH7.4 



、。、 

25 50 




8=V 



10 



洗 脱体积 (毫升 ) 



^ 9 g - ^ 



一、 色 谱聚焦 的原理 [45,46] 

(一) pH 梯度 的形成 ' 

一般 的离子 交换色 谱中, pH 梯度的 产生, 通 常是利 用一个 梯度混 合器, 例如 要得到 
一个 下降的 pH 梯度, 混 合容器 中盛高 pH 的 起始缓 冲液, 另 一个容 器装低 pH 的 限制缓 
冲液 (limit buffer)。 当溶 液离开 混合容 器进到 柱时, 低 pH 限制缓 冲液进 入混合 容器, 使 
流入 柱上的 pH 逐 渐降低 (图 5-29)。 



A 限制 起始 B 限制 

缓冲液 缓冲液 缓冲液 




图 5-29 梯度形 成图解 
A: 离 子交换 色谱; B: 色 谱聚焦 



色 谱聚焦 是利用 离子交 换剂本 身的带 电基团 的缓冲 作用, 当洗 脱缓冲 液滴到 离子交 
换剂上 ,自 动形成 pH 梯度。 

例如 要形成 pH 9 — 6 的下降 梯度, 色谱 柱内的 pH 比洗脱 液高。 可选 择一个 具有碱 
性 缓冲基 团的阴 离子交 换剂, 如商 品名为 PBE 94 的 阴离子 交换剂 装填在 柱上, 首先平 
衡到 pH 9, 洗 脱液的 pH (相 应为 限制缓 冲液) 选定为 pH 6, 其 中含商 品名为 多 缓冲剂 
Cpolybuffer) 的物质 (如 polybuffer 96). 当洗脱 液从顶 部滴人 PBE 94 色谱柱 ,大 部份酸 
性成份 与阴离 子交换 剂的碱 性基团 结合, 最初 从柱上 流出的 溶液的 pH 接 近于起 始缓冲 
液 (图 5-30), 洗脱过 程中在 柱上每 一点的 pH 随 着更多 的缓冲 剂加入 而逐渐 下降, 最后 
几乎整 个色谱 柱被洗 脱液所 平衡, 最后流 出液的 pH 等于洗 脱液的 pH (即 pH6)。 
abed 




图 5-30 PBE 94 柱用多 缓冲剂 洗脱吋 图 5-31 蛋白 质分子 在色谱 聚焦吋 的行为 

pH 梯度 (pH9—6) 的形成 假定 蛋白质 1 等 电点为 7, 蛋白质 2 等 

a、 b、 c、 d 代表不 同的洗 脱阶段 电点为 8 



• 146 ♦ 



(二) 蛋白质 的行为 

蛋白质 所带的 电荷取 决于它 们的等 电点和 介质的 PH, 当 介质的 pH 低 于它的 等电点 
时, 蛋白 质带正 电荷, 它不与 阴离子 交换剂 结合, 随洗脱 液向下 移动, 然而, 在蛋白 质从柱 
顶向下 移的过 程中, 其 周围的 pH 逐 步增高 (图 5-31) 当它移 动到某 一点, 其 环境的 pH 高 
于蛋白 质等电 点时, 蛋白质 由带正 电荷变 为带负 电荷, 而 与离子 交换剂 结合。 随着 洗脱过 
程的 进行, 所 形成的 pH 梯度 也不断 下降, 当 pH 下降至 蛋白质 的等电 点时, 蛋白质 又重新 
脱离交 换剂而 下移, 移至 pH 大 于其等 电点时 又重新 结合, 这 样不断 重复, 直至蛋 白质从 
柱下 流出。 不同 的蛋白 质有不 同的等 电点, 在 它们被 离子交 换剂结 合以前 将移动 不同的 
距离, 按等 电点顺 序流出 (图 5-31)。 

(三) 聚 焦效应 

当一种 蛋白质 在柱上 随洗脱 液下移 至等电 点处, 此时其 移动速 度明显 减慢。 如果此 
时加上 相同的 第二个 样品, 它将 以洗脱 液移动 的速度 下移, 直 至追上 正在慢 移的第 一个样 
品处 (聚焦 )。 然后这 两个样 品一起 下移, 从 柱下一 起洗脱 出来。 但 是所有 样品必 须在第 



一个样 品峰尚 未被洗 脱之前 加人, 否则就 
不能 聚焦。 如 果加入 的第二 个样品 的等电 
点比第 一个样 品高, 它可以 越过第 一个样 
品 区而先 被洗出 (图 5- 32 )。 

llllllllllllliflHIIHiafflHi^ 




3-L —— . , , . 

0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 

meq NaOH 

图 5-32 色谱聚 焦的聚 焦效应 图 5- 33 2 毫 升多缓 冲剂用 0.1 A' NaOH 滴 定曲发 

二、 多缓冲 剂 

多缓 冲剂是 一种两 性电解 质性缓 冲剂, 性质与 两性载 体电解 质相似 ,是 分子量 大小不 
同的 多种组 分的多 接基多 氨基化 合物, 瑞典的 Pharmacia 公司专 门设计 生产的 Polybuffer 
96 和 Polybuffer 74, 它 们分别 适用于 pH 9 — 6 和 pH 7_4 范围 的色谱 聚焦。 这二 种多缓 
冲 剂相匹 配的多 缓冲交 换剂是 PBE 94。 对于 pH 9 以 上的色 谱聚焦 则选用 pH8 — 10.5 的 
两 性载体 电解质 (Pharmalyte) 配以 相应的 PBE 118。 

在所 使用的 pH 范围内 ,多 缓冲剂 96 和 7 4 有 很均衡 的缓冲 容量, 当 色谱聚 焦时, 能 
提供一 个平滑 的线性 pH 梯度, 它们的 滴定曲 线见图 5-33。 

多缓 冲剂在 280 nm 的吸收 很低, 但在 250 nm 有 较大的 吸收, 故洗脱 液的监 测应在 
280nm (图 5-34)。 

• 147 • 



^〇〇〇「 

=©©〇{ 



p( 



OD OD 




200 300 400 200 300 400 

波长 (mm) 波长 (mm) 

图 5-34 多缓 冲剂的 紫外吸 收光谱 

多 缓冲剂 通常以 无菌的 液体形 式提供 (0.075 毫摩尔 pH 单位 / 毫升 ), 用前 稀释。 于 

3— 8°c 暗处 r: 存。 

三、 多缓冲 交换剂 

PBE 118 和 94 是 以交联 琼脂糖 6B (Sepharose 6B) 为 载体, 并在 糖上通 过醚键 偶合上 
配基而 成的。 它们在 pH 3-12 的范围 内对水 、盐、 有 机溶剂 都是稳 定的。 它们 也能在 8M 
脲中 使用。 多缓冲 剂的交 联性质 使它有 很好的 物理稳 定性和 流速, 并防 止了由 于不同 pH 
值静电 相互作 用所引 起的床 体积的 变化, 它的 盐型在 pH 7 能耐受 110 — 120°C 的 高压灭 

菌 处理。 

偶联剂 Sepharose 6B 上 的配基 经特别 选择, 确保在 很宽的 pH 范围内 有均衡 的缓冲 



表 5^16 多缓冲 交换剂 PBE 96 和 PBE 118 的 缓冲容 量资料 



多缓冲 






总容量 11 


eq/100 毫 升不同 pH 间 隔凝胶 






交换剂 


3—4 


4—5 


5—6 


6—7 


7—8 


8-9 


9-10 


10—11 


PBE 94 




3.3 


3.1 


3.0 


3.5 


3.9 


3.1 


2.1 


PBE 118 


0.6 


0.3 


0.9 


1.7 


2.8 


3.7 


4.6 


4.9 




1.0 2.0 3.0 

meg NaOH 



图 5-35 10 毫升 PBE 118 和 PBE 94 在 1M KCl 中的滴 定曲线 



« 148 . 



容量。 这两种 多缓冲 交换剂 的缓冲 容量数 据见表 5-16, 它们的 滴定曲 线见图 5-35。 它们 
的商品 是以悬 浮液形 式提供 (含 24% 乙醇 )。 

四、 操作步 骤 [46 , 47 3 

iPiSi 定 样品的 等电点 

选 择适当 的多缓 冲剂和 PBE 

I 

调节起 始缓冲 用起 始缓冲 液平衡 凝胶, 装入 适当的 
液到梯 度上哏 柱中 

i 

装 a 仪器 

, . * 泵 ' 

* 紫外 监测器 

* pH 计 

* 记录仪 

* 部分 收集^ 

i 

调节多 缓冲剂 pH 让 5 — 10 毫升多 缓冲剂 
到梯 度下限 流过柱 
I 

假如需 要平衡 样品一 —加样 

用 多缓冲 剂洗脱 用 起始缓 冲液重 新平衡 

I 

凝 胶再生 
1 

分析和 改进分 离条件 < 

(一) 凝胶和 缓冲剂 的选择 

每次 使用的 多缓冲 剂和多 缓冲交 换剂的 pH 间隔 为三个 单位。 为了 提高分 辨率, 选 
择 的实验 pH 范围应 包含要 分离样 品的等 电点, 并 使其有 2/3 — 1/2 的柱长 的吸附 解吸时 
间。 不同 pH 范围 色谱聚 焦缓冲 剂和凝 胶的选 择见表 5-17。 

(二) 凝胶柱 的准备 

色谱聚 焦需要 的凝胶 量取决 于样品 的量、 样品的 性质、 杂 质的情 况以及 实验分 辨率要 
求。 大 多数情 况下, 20 — 30 毫 升床体 积已足 够分离 1—200 毫克 蛋白质 /pH 单位。 

装柱 之前, 凝胶必 须用起 始缓冲 液平衡 ,每种 pH 相 应的起 始缓冲 液见表 5-17。 交换 
剂的反 离子是 Cr, 除 Cr 以外的 单价阴 离子也 可作为 反离子 ,但 这些阴 离子的 pKa 必须 
比梯 度选择 的最低 点至少 低二个 pH 单位。 碳酸氧 盐离子 (HC03— ) 会引起 pH 梯 度的变 
化, 所 以所有 的缓冲 液使用 前必须 除气。 大 气中的 C02 在 pH 5.5-6.5 条件 下会使 梯度变 
平坦, 用 醋酸根 作反离 子可防 止这一 情况, 但对多 缓冲剂 74 则 不能用 醋酸根 作为反 离子。 

柱装 填的好 坏直接 影响分 辨率, 如果操 作得当 , 可达 0.02 pH 带宽 的分离 效果。 通常 
装 柱过程 如下: 

• 149 • 



表 5-17 不同 pH 范 围色谱 S 焦所用 »K 和缓冲 « 



凝胶的 pH 范围 


起始 缓冲液 


洗脱液 


稀 释倍数 


所用 溶液近 似体积 
(以柱 体积为 1 计算) 


ftp qrr 
始前 


梯 度体积 


总体积 


]0.5— 9' PBE 118 


pH 11 


pH 8.0 










10.5—8 PBE 118 


0.025 M 
三乙胺 - HC1 
pH 11 


pharinalyte 
pH8-l0.5 • HCI 
pH7 


1:45 


1.5 


11.5 


13.0 


10.5—7 PBE 118 


0.025 M 
三乙胺 -HCI 


pharinalyte 
pH 8-10.5 HCI 


IH5 


2.0 


11.5 


13.5 


9—8' PBE 94 


pH 9.4 0.025A/ 
乙醇胺 -HCI 


pH 8.0 
pharinalyte 


1:45 


1.5 


10.5 


12.0 


9—7 PBE94 


pH 9.4 
0.025 M 
乙醇胺 -HCI 


pH8-l0.5 • HCI 
pH7.0 

polybuffer 96-HCI - 


1:10 


2.0 


12.0 


14.0 


9—6 PBE94 


pH 9.4 0. 025A/ 
乙醇胺 CH3COOH 


pH 6.0 

polybaffer 96-CH3COOH 


1:10 


1.5 


10.5 


12.0 


8—7 PBE94 


pH 8.3 

0.025Af Tris. HCI 
pH 8.3 


pH 7.0 

polybuffer 96- HCI 
pH 6.0 


1:13 


1.5 


9.0 


10.5 


8—6 PBE 94 


0.025 M 

Tris • CH3COOH 

pH 8.3 


polybuffer 96 
CH3COOH 
pH 5.0 


1:13 


3.0 


9.0 


12.0 


8—5' PBE 94 


0.025JW 

Tris • CH3COOH 


polybuffer 96 
(30%) + polybuffer 
74 (70%)— CH3COOH 


1:10 


2.0 


8.5 


10.5 




pH 7. 4 


pH 6.0 










7—6 PBE94 


0.025M 咪哩 
CHjCOOH 


polybuffer 96- 
CH3COOH 


1:13 


3.0 


7.0 


10.0 


7—5 PBE94 


pH7.4 0.025 W 
咪挫- HCI 


pH 5.0 polybuffer 
74. HCI 


1:8 


2.5 


11.5 


14.0 


7—4 PBE94 


pH7.4 0.025Af 
咪唑- HCI 


pH 4.0 

polybuffer 74 - HCI 


1:8 


2.5 


11.5 


14.0 


6—5 PBE94 


pH6.2 0.025M 
组氨酸 -HCI 


pH 5.0 

polybuffer 74 • HCI 


1:10 


2.0 


8.0 


10.0 


6—4 PBE94 


pH6.2 0.025M 
组氛酸 -HCI 


pH 4.0 

polybuffer 74 • HCI 


1:8 


2.0 


7.0 


9.0 




pH5.5 


pH 4.0 










5—4 PBE 94 


0.025 M 
呱噪 • HCI 


polybuffer 74 • HCI 


.1:10 


3.0 


9.0 


12.0 



(1) 凝胶按 1:1 (V/V) 悬浮于 起始缓 冲液中 ,除去 气泡。 

(2) 将柱调 垂直并 除尽底 部尼龙 网下的 气泡, 关闭 柱下端 出口。 

(3) 在 柱中放 2 — 3 毫升 起始缓 冲液, 在搅拌 下将凝 胶倒入 柱中。 

(4) 打开 柱底部 开关, 待凝 胶沉降 后仔细 将柱顶 部接头 装好, 排 除所有 气泡。 
• 150 . 



(5) 用 10 — 15 个 床体积 起始缓 冲液平 衡至流 出液的 pH 和电导 系数与 起始缓 冲液相 

同 C 

色谱柱 的装填 好坏可 用有色 的牛细 胞色素 C 检查, 因其等 电点为 10.5, 不被柱 吸附, 
很快 穿过柱 流出。 

(三) 样品 的准备 

上样 量取决 于每个 区带中 蛋白质 的量, 通常每 10 毫 升床体 积可加 100 毫克蛋 白质样 

品, 由于 有聚焦 效应, 因 此样品 的体积 是不重 要的, 只 要在欲 分离的 物质从 柱上流 下之前 

加人 样品, 对 分离结 果均无 影响, 样品体 积最好 不超过 0.5 个床 体积, 样品 不能含 过量盐 
(L<0.05)。 

上样前 样品要 对洗脱 液或起 始缓冲 液透析 平衡, 如果 样品体 积小于 10 毫升, 最好先 
通 过一个 Sephadex G-25 柱, 用起始 或洗脱 缓冲液 洗脱, 以达 到最好 的平衡 效果。 如果缓 
冲 液浓度 很低, 样品 pH 也不 重要。 

(四) 上样 和洗脱 

上样最 好是通 过一个 加样器 ,为了 确保样 品均勾 平整地 加到床 面上, 可 在床顶 部小心 
铺一层 1 一 2 厘 米厚的 Sephadex G-25。 上样前 应先加 5 毫升 洗脱液 以避免 样品处 于极端 
(过碱 ) 的 PH。 

上 样后, 首先 用洗脱 缓冲液 淋洗, pH 梯 度自动 形成。 梯度的 pH 上限 由起始 缓冲液 
确定, 其 下限由 淋洗缓 冲液的 pH 决定。 

推荐 使用的 缓冲液 组成及 所用洗 脱液体 积见表 5-17。 pH 梯度 的斜率 (或 梯度 体积) 
是由用 于洗脱 的多缓 冲剂的 浓度决 定的。 浓 度高, 所需的 梯度体 积小, pH 梯度斜 率陆, 
洗脱 峰窄, 但 分辨率 下降, 反之, pH 梯度斜 率小, 洗脱 峰宽, 但分辨 率高。 采用通 常推荐 
的多 缓冲剂 浓度, 总洗脱 体积需 12 — 13 个床 体积, 洗 脱时的 流速一 般选择 30 — 4()cm*h_i。 

(五) 从分 离的蛋 白质中 除去多 缓冲剂 的方法 

1. 沉淀法 加入 固体硫 酸铵到 80 — 100% 饱和度 ,放置 1 一 2 小时, 使 蛋白质 沉淀。 

因 为处在 等电点 pH 的 蛋白质 很容易 沉淀。 离心收 集沉淀 ,用 饱和硫 酸按洗 两次, 然后透 
析除硫 酸按。 

2. 凝胶 过滤 用 Sephadex G-75 可以 将分子 量大于 25,000 的 蛋白质 和多缓 冲剂分 

开。 

3. 亲和 色谱法 应 用一个 亲和色 谱柱, 分离的 蛋白质 通过柱 为柱中 的吸附 剂所吸 
附, 而多 缓冲剂 没阻留 地流出 柱外, 再将 蛋白质 洗下。 

4. 疏水相 互作用 色谱法 利 用载体 与蛋白 质样品 的疏水 基团间 的相互 作用。 在水 

相中 提高中 性盐的 浓度或 降低乙 二醇的 浓度增 强体系 的疏水 性可增 强疏水 基团的 相互作 
用。 

疏水 色谱柱 中装填 苯基或 酚基- 琼脂糖 CL-4B, 用 80fc 饱和度 硫酸铵 平衡, 对 10 毫 
克蛋 白质需 1 毫升 凝胶, 用 2 — 3 个床 体积的 80% 硫 酸铵洗 凝胶。 蛋白质 样品通 过柱产 
生疏水 作用的 结合, 然后用 低离子 强度的 缓冲液 洗脱。 

• 151 • 



(六) 多缓 冲离子 交换剂 的再生 

多 缓冲离 子交换 剂的再 生可以 在柱上 进行。 凝胶用 2 — 3 个床 体积的 1 M NaCl 洗, 
以除去 结合的 物质。 用 0.1 A^HCl 洗则 可除去 结合牢 固的蛋 白质。 假 如使用 HCj ,一当 
洗完 凝胶就 要尽快 平衡到 较高的 pH。 



1. 蛋白 质的一 个模式 混合物 的分离 结 果见图 5-36。 
从图 中显示 了高分 辨率和 窄的分 离峰。 

分 离条件 如下: 在 pH 7 — 4 范 围内, 柱 C 10/20 床高 15 厘米, 样品 4 毫升洗 脱缓冲 
液含 有马肌 红蛋白 (12 毫克) ,碳 酸酐酶 (8 毫克) 和 白蛋白 (12 毫克) ,洗脱 条件: 起始缓 
冲液 0.0 2 5M 咪挫 HC1, pH7. 4 , 洗脱 缓冲液 0.075 mM/pH 单位 / 毫升多 缓冲剂 74, pH4, 
流速 12.5 厘米 / 小时。 



2. 粗卵蛋 白的分 级分离 图 5-37 为粗卵 蛋白在 pH 7 — 4 梯度上 的分级 分离。 卵 
白过滤 ,用多 缓冲剂 74 稀释, 然后 3000g 离心 10 分钟, 上 PBE 94 柱, 以 0.025 M 咪唑 HC1 
(pH 7.2) 平衡, 用 1 : 10 多 缓冲剂 74 (pH4) 洗脱, 分辨率 良好。 

分 离条件 如下: 柱 SR 10/50, 床高 30 厘米, 样品 5 毫升, 洗脱缓 冲液含 0.5 毫升卵 
白。 洗脱 条件: 起始 缓冲液 0.025 A/ 咪!^ -HC1, pH7.5, 流速 40 厘米 / 小时。 

3. 糜鹿 肌肉提 取水溶 性蛋白 的分离 图 5-38 表 明在高 pH 下 也有良 好的分 辨率。 
10 克 糜鹿肌 肉用等 体积水 勾装, 3000g 离心 10 分钟, 上清液 用洗脱 液平衡 ,上 PBE94 柱, 
以多 缓冲剂 96 洗脱。 

分 离条件 如下: 柱 C 10/40, 床高 45 厘米, 样品: 5 毫升糜 鹿肌肉 勾浆上 清液; 洗脱 
条件: 起始缓 冲液, 0.025 M 乙 酸按一 HCl,pH 9.4, 洗脱缓 冲液, 0.0075 mM/pH 单位 / 



五、 应用实 例 [46] 




OD280 
0.51 



图 5- 36 蛋白 质的一 个模式 混合物 的分离 



图 5- 37 卵 白的分 级分离 



• 152 . 



毫升, 多 缓冲剂 96, pH6 流速 20 厘米 / 小时 < 




100 150 
体积 (ml) 

- 图 5-38 从糜 鹿肌肉 提取的 水溶性 蛋白质 的分离 

4.Trichoderma reesei 细胞的 蛋白质 的分离 图 5-39 表明 色谱聚 焦具高 容量分 

离的 优点。 Trichoderma reesei 是 产生大 量胞外 纤维素 酶的微 生物, 这些酶 可用在 PBE94 
上 色谱聚 焦制备 分离。 

分 离条件 如下: 柱 SR 10/50, 床高 30 厘米, 样品: 5 毫升, 洗脱缓 冲液含 460 毫克冷 
冻 干燥的 培养上 清液。 洗脱 条件: 起始 缓冲液 0.025 咪 B^-HCl,pH7.4, 洗脱 缓冲液 
0.0075 mM/pH 单位 / 毫升, 多 缓冲剂 74, pH4, 流速 30 厘米 / 小时。 
1.0- 

r7 



X 




200 300 
体积 (ml) 

图 5-39 Trichoderma reesei 胞外 蛋白质 的分离 



400 



500 



参考文 



献 



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• 154 • 



第六章 制备离 心技术 

劳予谦 



第一节 引 言 

离心机 是借离 心力分 离液相 非均一 体系的 设备。 离 心的形 式有: (1) 离心 过滤, (2) 
离 心沉降 (或澄 清), (3) 离心 分离。 其目 的是达 到固一 液或液 一液的 分离。 离心 是利用 
1^ 转运 动的离 心力, 以及物 质的沉 降系数 或浮力 密度的 差别进 行分离 、浓缩 和提纯 的一项 
操作。 

在有孔 转鼓的 离心机 中通过 过滤介 质分离 悬浮液 的过程 为离心 过滤; 利用固 液两相 
比重 的差异 在离心 机无孔 转鼓或 管子中 进行悬 浮液沉 降分离 者为离 心沉降 (如用 于净制 
含少量 固体的 液体时 也称离 心澄清 ); 利用 不同溶 质颗粒 在液体 各部分 分布的 差异, 分离 
不同比 重液体 的过程 为离心 分离。 离心 过滤、 离心沉 降同属 固一液 分离, 离 心分离 则属液 
一液 分离。 

离心 机可以 按以下 几个方 面进行 分类: (1) 转速: 低、 高、 超速; (2) 用途: 工 业或实 
验用, 分析或 制备; (3) 离心 形式: 过滤、 沉降或 分离; (4) 操作 方式: 连续、 半 连续、 间 
歇; (5) 结构 特点: 如 依转动 部分的 形状可 分转鼓 (有孔 或无孔 )、 长 管式的 转筒、 角式和 
外摆式 转于、 分析型 转子和 区带转 子等。 依驱动 方式有 手摇式 、油涡 轮式、 气 动式、 磁悬式 
和电动 式等。 依旋 转轴位 置有直 立式、 水平式 、倾斜 式等; (6) 卸 料法: 人工、 重力、 离心 
力、 刮刀、 螺旋、 活塞、 震动、 喷嘴、 蠕动 泵等; (7) 使用 温度: 冷 冻和无 冷冻; (8) 工作 性质: 
通用 型或专 用型, 小 型或大 型等。 

—般分 类如下 : 

. 离心机 



工业用 



实验用 



低速 离心机 

(<(M 万 rpm) 



高速 离心机 
(0.4— 1.5 万 rpm) 



超速 离心机 
(1.5—5 万 rpm 或 
更高) 



制备 



普通 离心机 



I 

冰冻 离厶机 



分析 
I 

分 析超速 离心机 



台式 (或地 面式) 
普通 离心机 
(0.3-0.6 万 rpm) 



台 式高、 
超 速离心 
机 (0.6 — 
l6 万 rpm 
以上) 



大 容量冰 髙 速冰冻 超 速离心 

冻 离心机 离心机 机 (2. 5 — 

(<0.6 (0.6 — 8 万 rpm 

万 rpm) 2.5 万 或 更高) 
rpm) 



由于离 心机的 结构、 性能 和用途 等差别 很大, 分类法 也各不 相同, 特别在 转速范 围上, 
有关 文献、 教科 书记载 的出人 较大。 同时, 随 着离心 技术的 发展, 离 心机现 已趋向 于多效 
能。 如制备 超速离 心机也 配备分 析型转 子和光 学检测 系统, 可作 某些分 析研究 工作; 而分 



• 155 



析 型离心 机有些 也附有 制备用 转子。 又 如某些 附有大 容量区 带转子 或连续 流动式 转子的 
超速离 心机, 能用 于工业 生产, 也远远 超越了 实验室 的应用 范围。 



第二节 一般制 备离心 [1-3] 

一般制 备离心 是指在 分离、 浓缩、 提纯样 品中, 不 必制备 密度梯 度的一 次完成 的离心 
操作。 使用的 机种包 括所有 工业离 心机和 实验室 用低、 高速离 心机。 下面 介绍几 类离心 
机 的简单 结构、 原理和 使用。 、 

一、 过滤式 离心机 - 

这 种离心 机转速 一般为 450 — 3,500 rpm, 按操 作方式 和卸料 方式可 分为: 间歇式 (人 
工或 刮刀自 动卸料 ); 连续式 (自动 、震动 、活 塞或螺 旋卸料 )。 




图 6-1 三足式 离心机 的结构 
1.^ 转鼓, 2 主轴, 3. 机座, 4. 拉杆, 5. 支柱, 6. 缓冲 弹簧, 7. 电动机 

目 前最常 用的过 滤式离 心机是 三足式 (下 动式) 离 心机。 ^主 要部 件有: (0 外壳: 
上方 开口。 有安 全保护 和收集 滤液的 作用; (2) 多孔 转鼓: 位于外 壳内, 固 定在转 轴上, 
转 鼓内表 面复以 滤布; (3) 制动 装置; ( 4 ) 电动 机传动 装置; (5) 支架。 其结 构如图 6-1。 

离 心时, 转鼓滤 布内装 入待过 滤的悬 浮液, 当转 速逐渐 加快而 高速运 转时, 鼓 内悬浮 
液受 离心力 作用, 液 体穿过 滤布被 鬼出转 鼓外。 滤 液经外 壳下部 排出, 固 体则留 在布袋 
内, 从而 达到固 液分离 目的。 

这 类采用 间歇式 人工卸 料的离 心机结 构及操 作均较 简单, 性能 良好。 其缺点 是取出 
滤饼 费力、 耗时, 而且由 于驱动 和制动 装置设 在转鼓 下面, 容 易引起 液体渗 漏腐蚀 及带来 
维修 保养的 不便。 为了克 服以上 缺点, 人们设 计了上 悬式离 心机, 这 种离心 机的传 动系统 
安装 在转鼓 上方, 具有 稳定、 卸料 较快、 固 体颗粒 破碎少 和不受 液体腐 饨的 优点。 

在生化 、微 生物工 业中, 过滤式 离心机 已用于 味精、 柠檬酸 、抗菌 素及某 些生化 药物和 
酷制 剂等结 晶或较 大固体 颗粒的 过滤, 脱 水效率 很高。 

• 156 • 




二、 沉降式 离心机 



这 类离心 机品种 较多, 根据其 结构又 可分为 管式、 钵式、 碟片 式和倾 析式。 它 们的卸 
料 方式也 很多, 如人工 、离 心力、 刮刀、 螺旋、 喷嘴、 自动卸 料等。 

1. 台式 或地面 式普通 离心机 这是一 类结构 最简单 的实验 室常用 的低、 中 速离心 

机, 转速在 3,()0() — 6,000 rpm。 其转子 一般用 角式或 外摆式 ,多 用交流 整流子 电动机 驱动, 
但 电动机 的碳刷 易磨损 而导致 离心机 损坏; 转速是 用电压 调节器 调节, 起动电 流大, 速度 
升 降不够 均勾。 操作 一般在 室温下 进行, 但 个别机 种也配 有冷却 装置, 如 贝克曼 公司的 
TJ-6R 台式 离心机 的可调 温度为 — 20<^。 

2. 高 速冰冻 离心机 这类 实验室 常用的 离心机 最高转 速可达 18,000 — 25,00()rpm, 
因此需 有冷却 离心腔 的致冷 设备, 并 用热电 偶监测 腔内的 温度, 一 般温度 控制在 — 4 力。 
其转 动部分 是各种 角式或 外摆式 转子, 有 的还配 备区带 转子、 连续 流动式 转子或 其它转 
子。 速度控 制比台 式离心 机精密 准确。 操作方 式除间 歇式外 也有连 续式。 其应 用见表 
6—1。 




3. 管 式高速 或超速 离心机 这是 一类工 业用离 心机, 转 速约在 8,000 — 45,0()0 rpm, 
用于固 一液分 离时为 间歇式 操作, 也可用 于液一 液连续 分离。 主要由 五部分 组成: (1) 转 
筒; (2) 主轴; (3) 电动机 及传动 装置; ( 4 ) 制 动器; (5) 外壳和 机座。 管式 超速离 心机的 
结 构如图 6-2。 

离心沉 降时, 先把 转筒上 部的重 液出口 堵塞, 后将悬 浮液在 静止、 慢速 或全速 下从转 

• 157 • 





(a) (b). 



图 6-2 管 式超速 离心机 结构图 
1. 转鼓, 2. 悬 浮液加 入管, 3. 折 转板, 4. 十字形 挡板, 5. 转 鼓头, 6. 烧 性袖, 7. 机座, 
8. 重液排 出管, 9. 轻液排 出管, 10. 传 动装置 




进料管 
重轻 液分隔 
碟片 



筒底部 加液管 送人。 悬浮液 向转筒 上部移 动时, 颗粒受 离心力 作用而 沉降到 转筒内 壁上, 

形成沉 澄层, 留 在内层 的清液 或轻液 (含 细颗 
粒) 则从 上方轻 液出口 流出。 离心完 后取出 
转筒, 人 工清除 滤渣。 如用于 液一液 离心分 
离时, 液体即 按不同 比重从 转筒上 部的轻 、重 
液出 口分别 排出, 工作原 理与离 心沉降 相同。 
管式离 心机结 构简单 、紧凑 、、转 速高、 密 
封 性好, 有良好 的沉降 效果, 主 要用来 从培养 

液 (5 — 500 升) 中回 收菌体 及用于 化工、 食品 
等 部门。 其缺点 是卸料 麻烦, 容量 有限。 

4. 碟片式 离心机 碟片 式离心 机是在 
管式离 心机的 基础上 发展起 来的, 转速为 
4,500-7,500 rpm。 根 据卸料 方法的 不同可 
分 为喷嘴 型碟片 式离心 机和自 动间歇 卸料型 
碟 片式离 心机。 其主 要工作 部分是 转鼓, 在 
转鼓 中加入 了许多 重迭的 碟片, 每 个碟片 间距约 1 毫米, 縮短 了颗粒 的沉降 距离, 大大提 
高 了分离 效果。 这种 离心机 可用于 固一液 和液一 液两相 分离, 也可 用于液 一液一 固三相 
分离。 其 工作原 理如图 6-3。 两相分 离的碟 片无孔 ;三 相分离 的碟片 有孔, 液体由 各碟片 
孔道 最后移 动到转 鼓上方 出口, 并根 据两部 分液体 比重不 同各自 从轻、 重 液出口 排出。 

这 种离心 机结构 简单、 沉降距 离短、 沉降面 积大, 能连续 生产、 分离效 率高, 已 广泛用 
于发酵 工业, 作菌 体的收 集及抗 菌素、 疫苗的 分离, 也用于 化工、 医药、 食品等 部门。 




图 6-3 碟片 式离心 机的工 作原理 

左侧: 液一固 分离; 

右侧: 液一 液或液 一液一 固分离 



三、 分离式 离心机 

主要 指上述 用于液 一液分 离的碟 片式离 心机, 以及分 离式管 型高、 超速离 心机。 离心 
时各组 分在离 心力作 用下, 按比 重大小 的不同 将液相 分成若 干层, 比重 大的在 外层, 比重 
小的在 内层, 分别 从转鼓 (管) 的不 同出口 排出。 

四、 一 般制备 离心机 的选择 

通常是 根据离 心物料 的性质 选择离 心机。 凡固相 颗粒比 重小于 或等于 液相、 颗粒直 
径在 0.01 — 1 毫米 (或 以上) 的 物料可 选用过 滤式离 心机。 固相 颗粒的 比重大 于液相 (相 

H 左右) 颗粒直 径小于 10 微米以 及具有 压缩性 (纤 维状或 胶状) 的物料 则应选 用沉降 

式离 心机。 如颗粒 直径为 10 微米 左右宜 用普通 沉降离 心机, 用过滤 式则滤 饼薄、 损 失大。 

直 径小于 1 微米 的颗粒 须用管 式高、 超速 或钵式 高速, 以及碟 片式离 心机, 但管式 离心机 
仅在 悬浮液 颗粒浓 度小于 1% 才适用 ,浓 度太大 要用连 续式离 心机, 以免 卸料、 拆 装频繁 

而损坏 机件。 0.01 — 0.1 毫米 (或 以上) 的 颗粒可 用沉降 式或过 滤式, 如 固体浓 度高达 1 一 
50%, 固 液相比 重差较 大的悬 浮液, 最好 用倾析 式螺旋 卸料的 沉降离 心机。 压 力较高 (10 
个 大气压 以下) 或有毒 、易燃 、易 爆物料 须用倾 析式螺 旋卸料 和碟片 式等密 闭型离 心机, 或 



158 



用管 式高、 超速离 心机。 固液分 离时, 有 时还要 结合考 虑离心 液的澄 清度或 固形物 的含水 
量, 过滤 式比沉 降式的 沉渣湿 度大。 分 离式离 心机只 适用于 乳浊液 分离或 含固体 很少的 
悬 浮液的 增浓。 

第三 , 制备 超离心 

制 备超离 心技术 就是在 强大的 离心力 场下, 依 据物质 的沉降 系数、 质量 和形状 不同, 
将混合 物样品 中各组 分分离 ,提纯 的一项 技术。 在生物 化学、 分子生 物学以 及细胞 生物学 
的发 展中, 制 备超离 心技术 起着很 重要的 作用。 迄今, 这项技 术已广 泛用于 各种细 胞器、 
病毒以 及生物 大分子 的分离 ,成了 生物学 、医学 和化学 等领域 中现代 实验室 不可缺 少的制 
备 和分析 手段。 

- 制备 超离心 不同于 分析超 离心, 它 的主要 目的是 最大限 度地从 样品中 分离高 纯度的 
所需 组分。 在离 心技术 的发展 史上, 制备超 离心是 制备离 心发展 的最高 形式, 它与 其它低 

级离心 形式的 不同之 处如表 6-1。 



表 6-1 三 种不同 级别的 制备离 心机 的比较 



类 型 


普通 离心机 


高速 离心机 


超速 离心机 


最 大转速 

(rpm) 


6,000 


25,000 


75,000 以上 


最大 相对离 
心力 (g) 


6,000 


89,000 


510,000 以上 


容量 


几 十毫升 到几升 


一般 1.5 升左右 (有 大容 量连续 
流 动式) 


几十 到几百 毫升, 最 大达到 1.7 
升以上 (如 用连续 流动式 则一次 
分离 可达几 升至几 十升) 


分 离形式 


固液沉 降分离 


固液沉 降分离 


密度 梯度区 带分离 或差速 沉降分 

离。 


离心 管平衡 
允 许误差 


0.25 克 




0.1 克 


转子 


角式 和外摆 式转子 


角式、 外摆 式转子 (有 些还 配备区 
带转子 或其它 转子) 


角式、 外摆 式和区 带转子 (有 些还 

配备 分析和 连续式 转子) 


仪器 结构性 
能 和特点 


速度不 能严格 控制, 
多数 室温下 操作. 


有消 除空气 和转子 间摩擦 热的致 
冷 装置, 速度和 温度控 制较准 
确、 严格。 


备有消 除转子 与空气 摩擦热 的真空 
和冷却 系统, 有 更为精 确的温 度和速 
度控制 、监测 系统, 有保 证转子 正常运 
转的 传动和 制动装 置等。 


应用 


收集易 沉降的 大颗拉 
(如红 血球、 酵 母细胞 
等)。 


收集微 生物、 细胞 碎片、 大细 胞器、 
硫酸按 沉淀物 和免疫 沉淀物 
等。 但 不能有 效沉淀 病毒、 小 
细胞器 (如 核糖体 )、 蛋 白质等 

大 分子。 


主要 分离细 胞器、 病毒、 核酸、 蛋白 
质、 多 糖等, 甚至 能分开 分子大 小相近 
的 同位素 标记物 I'N-DNA 和 未标记 
的 DNAo 



由 于许多 具有生 物活性 的生物 大分子 和细胞 器很不 稳定, 在分离 时要求 温度低 ,操作 
条件 缓和, 不能应 用一般 '的 化学分 离法。 制备超 离心机 具有冷 却和真 空系统 ,分离 制备上 
有明 显的优 越性。 

• 159 • 



一、 原理 和计算 [4,6,7,1G3 



制 备超离 心机的 设计原 理是: 利 用转子 高速旋 转时所 产生的 强大离 心力, 加 快颗粒 
的沉降 速度, 把样 品中不 同沉降 系数或 浮力密 度差的 物质分 离开。 制备超 离心实 验的关 
键 是如何 根据颗 粒和介 质的性 质以及 转子的 某些参 数来确 定转速 和离心 时间。 颗粒 (细 

胞、 细胞 器及大 分子的 统称) 在 离心力 场下的 沉降情 况都与 沉降速 度和沉 降时间 相关, :k 

降的 时间和 速度取 决于: (1) 离 心力; ( 2 ) 颗粒的 大小、 形状和 密度; (3) 沉降介 质的密 
度和 粘度。 

1. 离心力 制备 离心是 根据物 质在离 心场中 发生的 变化来 分离物 质的。 当 离心机 
转子以 一定的 角速度 《 (弧度 / 秒) 旋转, 颗粒 的旋转 半径为 r (厘米 ) 时, 任 何颗粒 均经受 
一个向 外的离 心力, 此离 心力为 : 

F = co^r • (1) 

F 通常以 地心引 力表示 ,称 为相对 离心力 (RCF)。 相对离 心力是 指在离 心场中 ,作用 
于颗粒 的离心 力相当 于地球 重力的 倍数, 单位 是重力 加速度 g (980 厘米 / 秒 2)。 这时 RCF 
可 用方程 式规定 如下: 

RCF = — . (2) 
980 

实 用上, 这一关 系式常 用每分 钟转数 n (或 rpm), 以 更通用 的表达 方式来 表示。 由于 



60 ' i 



RCF 仏 2! 



3600 X 980 
简 化得: 

RCF = 1.119 X 10- Vr (3) 

一般情 况下, 低 速离心 时常以 rpm 来 表示, 高速离 心则以 g 表示。 计 算颗粒 的相对 
离心 力时, 应注意 离心管 与旋转 轴中心 的距离 r. 沉 降颗粒 在离心 管中所 处位置 不同, 所 
受离 心力也 不同。 

因此, 报告超 离心条 件时, 通常总 是用地 心引力 的倍数 (Xg) 代 替每分 钟转数 
(rpm), 因为它 可以真 实反映 颗粒在 离心管 不同位 置的离 心力及 其动态 变化。 科 技文献 
中, 离心力 的数据 常指其 平均值 (RCF^i^s), 即离 心管中 点的离 心力。 

为了 便于进 行转速 和相对 离心力 之间的 换算, 人 们在式 (3) 的 基础上 制作了 三者关 
系 的列线 计算图 (如图 6-4)。 图示法 比公式 法计算 方便, 由图中 两者数 值的点 的延线 ,即 
得与第 三者的 交点, 此即 为所求 第三者 数值。 

2. 离 心时间 离心 时间是 由实验 要求所 决定。 为 了避免 不稳定 颗粒的 凝聚、 挤压 
损伤 或变性 失活, 并使 扩散所 导致的 区带加 宽现象 减弱, 在 保证分 离的前 提下, 应 尽可能 
缩 短离心 时间。 相反, 分离 某些沉 降较快 的大颗 粒时, 为了达 到预期 的分离 效果, 往往使 
用粘度 较大的 梯度, 以阻 止颗粒 的过度 沉降, 并延 长离心 时间。 离心所 用方法 不同, 离心 
时 间也不 相同。 

• 160 • 



半径 (s 米) 

30-- 
25- 



20. 

19- 

18. 

17- 

16. 

15' 

14- 

13. 

12. 

11 

ID- 
S' 
8- 

7- 
6- 

5- 



相对 离心力 (g) 



转速 (rpra) 



3-»- 



7.000- 
6,000- 
5.000- 
4.000- 
3.000- 

2.000- 
1,500. 

1,000- 

800- 
700 
600' 
500' 
400 ■ 



300 --30. 000 



200- 
150 • 

100 
80 
70 
60 
50 
40 



700.000 
600.000 
500.000 
400,000 
300.000 

200.000 
150.000 

100.000 
•80.000 

70.000 
•60.000 
•50,000 
•40.000 



20.000 
•15.000 

10.000 
8.000 
7.000 
6.000 
5,000 
•4.000 



30- -3,000 



•2.000 
1.500 



10-4-1.000 



图 6-4 离心机 转速与 离心力 的列线 计算图 



5,000": 
' : 


-SO 000 


4.500-: 


1-45.000 


4,000-i 


—40.000 


3.500— 


r 35. 000 


1 AAA*- 


一 OU. \i\J\J 


2.500: 


三 25, 000 


2,000- 

- 


- 20, 000 


1 500*- 




1 , 4UU 一 


14, UUU 


1,300- 


-13,000 


1,200- 


-12.000 


1.100- 


-11.000 


1.000- 


-10,000 




900- 


-9.000 


800- 


-8.000 


700- 


-7.000 






600- 


-6,000 


500- 


-5.000 



(1) 颗 粒沉降 时间的 计算: 

颗 粒的沉 降时间 可用下 面公式 计算: 



S 



lnr2 ― Inri 



(4) 

S 为颗 粒沉降 
(5) 



(6) 



式中, t 为样 品颗粒 完全沉 降到离 心管底 的时间 (秒 ), 也 叫澄清 时间; 
系数; r^.r, 分别 为旋转 轴中心 到离心 管底部 及样品 液液面 的距离 (厘米 )。 
括 号内的 部分可 用常数 K 表示。 此时, 

K = St 

若 t 的 单位用 小时, S 以 Svedberg (S) 表示, 由于 IS == 10- 秒, 可得 

K = Inr; — Inri • 10" 
3600 

K 是转 芋的效 率因子 (通常 K 值为 10 — 1,000 或更大 ), 与转 子大小 和速度 有关。 S、 
ri、r2 不变时 ,由 上述公 式可以 得出: (1)K 值 越低, 颗粒沉 降时间 越短, 转 子使用 效率越 

高; (2) C0\t, = colt,; (3) K 值 与转速 平方成 反比, CofKi = C022K2。 转子 出厂时 都已标 上最大 

转 速时的 K 值, 由此可 求得低 速时的 K 值。 有了 K 值就 可估 计具有 一定沉 降系数 的某种 
颗粒 的沉降 时间。 伹文 献或厂 家所给 K 值均 从离 心管腔 顶部而 不是从 液面计 算的, 故实 
际 K 值比 理论 K 值小。 

如 果颗粒 接近圆 球状, 但不知 其沉降 系数, 也可 借助其 它有关 参数, 用 下式估 算颗粒 



161 



表 6-2 某些盐 的密度 梯度比 例常数 P。 



£4? ^ 




13" X 10—' 
阴离子 


(25。C, g/cm') 


阳离子 


C]~ 


Br" 


I- 


S07 


1 .20 




2.04 


1.46 


1.17 


1.06 


1,30 




1.55 


1.06 


0.81 


0.76 


1.40 




1.33 


0.89 


0.65 


0.67 


1.50 


Cs+ 


1.22 


0.80 


0.55 


0.64 


1.60 


1.17 


0.73 




0.66 


1.70 




、 1,14 






0.69 


1.80 




1.12 






0.74 


1.90 




1.12 








1.20 




3.42 


2.15 


1 .58 




1.30 




2.76 


1.56 






1.40 


Rb+ 


2.25 


1.34 


0.99 




1.50 






1 .22 


0.90 




1.60 








0.83 




1.05 




28.7 


12.8 


8.7 




1.10 




18.7 


,-, 


5.1 




1.15 




15.8 


5.9 


3.80 




i.20 


Na+ 


14.3 


5.2 


3.19 




1.25 






4.5 


2.86 




1.30 








2.82 




1.35 








2.95 




1.05 




22.1 


11.3 


7.9 




1.10 




13.1 


6.2 


4.28 




1.15 




10.1 


4.6 


3.44 




1.20 


K+ 




3.80 


2.55 




1.25 






3.36 


2.21 




1.30 






3.05 


1.96 




1.35 








1.73 




1.30 




42.3 


8.9 






1.40 






9.1 






1.50 
1.60 


Li+ 




10.5 
11.4 






1.70 






11.4 






1.80 






10.0 







的沉 降时间 (秒) : 

t = ^ In (7) 

(p ― po) ri 

式中, d 为 颗粒平 均直径 (厘米 ); V 为介 质粘度 (泊 ); p、 PO 分 别为颗 粒和介 质密度 
(克 / 厘米 3 )。 

经验 表明, 角式 转子离 心管内 悬浮颗 粒沉降 到管底 的时间 比外摆 式转子 稍短, 但较易 
产 生对流 干扰。 

(2) 颗 粒平衡 时间的 计算: 上述离 心时间 的计算 仅适用 于沉降 分离, 在密度 梯度区 
• 162 . 



带离 心中, 颗粒到 达平衡 点所需 时间的 计算则 要复杂 得多。 如在离 子介质 中进行 平衡等 
密度 离心, 计 算样品 中颗粒 在盐梯 度中的 平衡时 间时, 其方法 如下: 

(a) 样品和 盐介质 一起离 心时, 

t 一 1.13 X 10" X /g。 X (p— 1) (8) 
nVS2o,w 

式中, t 为时间 (小时 为特 定溶剂 (水) 中盐梯 度的比 例常数 (见表 6-2); P 为颗 
粒的浮 力密度 (克 / 厘米 0; S,o.w 为 20°C 时 颗粒在 水中的 标准沉 降系数 (S); n 为转 子转速 
(rpm); r 为平 衡颗粒 至旋转 轴中心 的距离 (厘米 )。 

因为样 品颗粒 在盐梯 度中的 平衡区 带是位 于梯度 的中间 部分, 故 r 值可用 等浓点 (与 
起 始均匀 盐介质 密度相 同的梯 度中某 一点) 公式 计算: 

- (d + r,r, + rO f (外 摆式转 子用) (9) 



L 3 



或 fe 



丄 (r? + rOT (区 带转 子用) (10) 
L 2 」 



公式 (9) 也可用 于角式 转子。 必须 注意, 等 浓点公 式中的 ri 是指梯 度液面 而言, 如果 
管子未 充满梯 度液, 则应经 适当换 算求出 ri (以 缩短离 心时间 )。 

此法计 算的时 间是颗 粒平衡 的时间 (也 即总离 心时间 ), 形成盐 梯度所 需的平 衡时间 
则要少 得多。 

(b) 用预形 成的非 平衡梯 度时, 

t— 2.53 X 10" X (p- l)[log(r,-rOMH-4.61] (卩) 

式中, dp/dr 为 线性密 度梯度 的斜率 (克 / 厘米 3 / 厘米 ); ri、 r, 分 别为梯 度顶部 和平衡 
底部 与旋转 轴中心 的距离 (厘米 ); 其余符 号与式 (8) 相同。 

公式 (11) 和 (8) 仅适 用于相 对粘度 约等于 1 的 梯度液 (如 CsCl), 在 粘度较 大的溶 
液中, 应对颗 粒的沉 降系数 作适当 校正。 

此法虽 用预先 形成的 梯度, 但离 心时仍 存在梯 度重新 平衡、 再分布 问题, 故也 与平衡 
或稳 定梯度 所需的 离心时 间有关 (总 离心 时间比 (a) 少)。 

二、 制备超 离心的 方法及 其选择 [4 , 5 , 6 , 8] 

制备 超离心 法可分 为二大 类型: (1) 差速离 心法; (2) 密 度梯度 区带离 心法。 现分 
别介绍 如下: 

(一) 差速 离心法 

采用 逐渐增 加离心 速度或 低速和 高速交 替进行 离心, 使沉 降速度 不同的 颗粒, 在不同 
离心 速度及 不同离 心时间 下分批 分离的 方法, 称为 差速离 心法。 差 速离心 一般用 于分离 
沉降系 数相差 较大的 颗粒。 

进行 差速离 心时, 首先要 选择好 颗粒沉 降所需 的离心 力和离 心时间 。离 心力过 大或离 
心时间 过长, 容易 导致大 部分或 全部颗 粒沉降 及颗粒 被挤压 损伤。 当 以一定 离心力 在一定 

• 163 • 



的离心 时间内 进行离 心时, 在禽心 管底部 就会得 到最大 和最重 颗粒的 "沉 淀", 分出的 "上 
清液' '在加 大转速 下再进 行离心 ,又 得到第 二部分 较大、 较重 颗粒的 "沉 淀" 及含小 和轻颗 
粒的" 上清 液"。 如此多 次离心 处理, 即能把 液体中 的不同 颗粒较 好地分 离开。 此 法所得 

沉淀 是不均 一的, 仍杂 有其它 成分, 需经再 悬浮和 再离心 (2 — 3 次), 才能得 到较纯 颗粒。 

差速离 心法主 要用于 分离细 胞器和 病毒。 其优 点是: 操作 简易; 离心后 用倾倒 法即可 
将上清 液与沉 淀分开 ;并可 使用容 量较大 的角式 转子。 缺 点是: (1) 分离效 果差, 不能一 
次 得到纯 颗粒。 (2) 壁效应 严重。 特别 当颗粒 很大或 浓度很 高时, 在离心 管壁一 侧会出 
现 沉淀。 (3) 颗粒被 挤压, 离心力 过大、 离 心时间 过长会 使颗粒 变形、 聚集而 失活。 / 

(二) 密度梯 度区带 离心法 (或 简称 区带离 心法) 

这是 1940 年发 展起来 的一种 方法。 区带 离心法 是样品 在一惰 性梯度 介质中 进行离 
心沉降 或沉降 平衡, 在一定 离心力 下把颗 粒分配 到梯度 中某些 特定位 置上, 形成不 同区带 
的分离 方法。 此 法的优 点是: (1) 分离效 果好, 可 一次获 得较纯 颗粒; (2) 适应范 围广。 
能 象差速 离心法 一样分 离具有 沉降系 数差的 颗粒, 又 能分离 有一定 浮力密 度差的 颗粒; 
(3) 颗粒不 会挤压 变形, 能保 持颗粒 活性, 并 防止已 形成的 区带由 于对流 而引起 混合。 缺 
点是 :(0 离 心时间 较长; (2) 需 要制备 梯度; (3) 操作 严格, 不易 掌握。 区 带离心 法又可 
分为 差速- 区带 离心法 (动 态法或 沉降速 度法) 和 等密度 离心法 (平衡 法或沉 降平衡 法)。 

1. 差速 -区带 离心法 当 不同的 颗粒间 存在沉 降速度 差时, 在 一定离 心力作 用下, 
颗粒各 自以一 定速度 沉降, 在密 度梯度 的不同 区域上 形成区 带的方 法称差 速-区 带离心 
法。 差速- 区带离 心仅用 于分离 有一定 沉降系 数差的 颗粒, 与 其密度 无关。 大小 相同, 密 
度不同 的颗粒 (如线 粒体、 溶 酶体和 过氧物 酶体) 不能 用此法 分离。 

离 心时, 由于离 心力的 作用, 颗粒离 开原样 品层, 按 不同沉 降速度 沿管底 沉降。 离心 
一定时 间后, 沉 降的颗 粒逐渐 分开, 最后形 成一系 列界面 清楚的 不连续 区带。 沉降 系数越 
大, 往下 沉降得 越快, 所 呈现的 区带也 越低。 沉 降系数 较小的 颗粒, 则在较 上部分 依次出 
现。 从颗 粒的沉 降情况 来看, 离心必 须在沉 降最快 的颗粒 (大 颗粒) 到达管 底前或 刚到达 
管底时 结束, 使颗 粒处于 不完全 的沉降 状态, 而出现 在某一 特定区 带内。 此时, 离 心管梯 
度液面 上的样 品层, 由于颗 粒沉降 而变成 了仅有 溶剂分 子的上 清液。 若样 品液中 含有大 
量 沉降系 数不同 的颗粒 (即 浓度 很大) 时, 也 可能得 到一条 不同颗 粒连续 分布的 区带。 

在离心 过程中 ,区带 的位置 和形状 (或 宽度) 随 时间而 改变。 因此, 区带 的宽度 不仅取 
决 于样品 组分的 数量、 梯度的 斜率、 颗粒的 扩散作 用和均 一性, 也与离 心吋间 有关。 时间 
越长, 区带 越宽。 适当增 加离心 力可缩 短离心 时间, 并可减 少扩散 所导致 的区带 加宽现 
象, 增加 区带界 面的稳 定性, 特别是 较小的 颗粒, 沉 降慢, 易扩散 ,需 用高速 离心。 

差速 -区带 离心的 分辨率 (不 同区 带相互 间分开 的清晰 程度) 比差速 离心高 ,分 辨率高 
低受 颗粒沉 降速度 和扩散 系数、 实验设 计的离 心条件 (样 品带的 宽度和 浓度、 离心 力和离 
心时间 ,梯度 斜率和 长度、 梯度介 质的性 质等) 、离 心操作 的熟练 程度所 影响。 梯度 介质的 
摩 擦阻力 (或 粘度) 越大、 颗粒 沉降速 度和扩 散系数 越少。 沉降 速度的 大小还 与颗粒 的表面 
积、 形状 有关, 大的、 球形的 颗粒比 小的、 长形的 颗粒沉 降得快 ;与颗 粒和周 围介质 间的密 
度差 及梯度 上某一 点的离 心力成 正比。 若颗 粒沉降 速度差 值小, 就会 影响分 辨率, 颗 粒的扩 
散系 数可改 变区带 宽度, 也 影响分 辨率。 操作中 应尽量 避免在 装样、 离心及 取出梯 度时扰 

• 164 . 



乱 梯度。 离心条 件对分 辨率的 影响, 将在有 关部分 叙述。 

2. 等密度 离心法 文献中 有多种 叫法, 但均离 不开" 平衡" 这二 个字的 含义, 故也称 

平 衡法。 当不 同颗粒 存在浮 力密度 差时, 在离心 力场下 ,颗粒 或向下 沉降, 或向上 浮起, 一 
直沿 梯度移 动到与 它们密 度恰好 相等的 位置上 (即 等密 度点) 形成 区带, 此 即为等 密度离 
心法。 处于等 密度点 上的颗 粒没有 重量, 区带的 形状、 位 置均不 受离心 时间所 影响, 体系 
处 于动态 平衡。 等 密度离 心的离 心过程 与差速 离心、 差速- 区带离 心的比 较如图 6-5。 



(a) 



(b) 



(c) 



(d) 



(a) 



(b) 



(c) 



(d) 



(a) 



(b) 



(c) 



(d) 



絲 

微 



差 速离心 



www 
'时间 从左— 右增加 

差 速一区 带离心 

图 6-5 颗 粒沉降 过程的 示意图 



④ 



W W w w 



等密 度离心 



等 密度离 心的有 效分离 取决于 颗粒的 浮力密 度差, 密度差 越大, 分 离效果 越好, 与大 
小 和形状 无关, 但后二 者决定 着达到 平衡的 速度、 时间和 区带的 宽度。 颗粒 的浮力 密度不 
是恒定 不变的 ,还与 其原来 密度、 水化程 度及梯 度溶质 的通透 性或溶 质与颗 粒的结 合等因 
素 有关。 例 如某些 颗粒容 易发生 水化, 使密度 降低; 亲 水梯度 材料可 能渗入 颗粒, 取代结 
构内 的水化 水而增 加表观 密度, 分离时 就要考 虑这些 因素的 影响。 

等密 度离心 的分辨 率受颗 粒性质 (密度 、均 一性、 含量) 、梯 度性质 (形状 、斜率 、粘度 )、 
转子 类型、 离心 速度和 时间的 影响。 颗粒区 带宽度 与梯度 斜率、 离 心力、 颗 粒分子 量成反 
比。 低速 离心虽 可使颗 粒稳定 沉降, 但不 易建立 平衡, 需延时 离心, 有时要 达数天 之久。 这 
会 增加某 些分子 的扩散 速度, 使区带 加宽, 分辨率 降低。 所 以等密 度离心 的转速 一般较 

高 

根据梯 度产生 的方式 可分为 预形成 梯度和 离心形 成梯度 的等密 度禽心 (后者 又称平 
衡等密 度离心 )。 前 者需要 事先制 备密度 梯度, 常用的 梯度介 质主要 是非离 子型的 化合物 

(如 庶糖, Ficoll)。 离 心时把 样品铺 放到梯 度的液 面上, 或 导入离 心管的 底部。 平 衡等密 
度离心 常用的 梯度介 质有离 子型的 盐类、 三碘 化苯衍 生物, 还有 Ludox 等 (后者 扩散慢 ,最 
好用梯 度产生 器制备 )。 离 心时是 把密度 均一的 介质液 和样品 混合后 装入离 心管, 通过离 
心形成 梯度, 让 颗粒在 梯度中 进行再 分配。 离心达 平衡后 ,不 同密度 的颗粒 各自分 配到其 
等密度 点的特 定梯度 位置上 ,形成 不同的 区带。 颗粒到 达等密 度点需 要一定 的离心 时间, 
转速不 够高, 可以 用延长 时间来 弥补, 而 提高转 速可缩 短平衡 时间。 大颗粒 的平衡 时间可 
能 比梯度 本身的 平衡时 间短, 而小 颗粒则 较长。 因此, 离心 所需时 间应以 最小颗 粒到达 
平 衡点的 时间为 基准。 如果 采用" 松弛技 术", 即先 高速离 心建立 梯度, 后 降至原 定速度 
维持 6 — 8 小时, 可大大 縮短平 衡等密 度离心 时间。 

当巳 知某种 颗粒的 浮力密 度时, 也可不 用梯度 而进行 等密度 离心。 方 法是先 在适当 




速度下 沉降, 除 去较重 颗粒, 然 后把待 分离颗 粒的样 品悬浮 在与其 浮力密 度相同 的介质 
中, 离心 直至所 需颗粒 沉降到 管底。 此法适 于分离 特定巳 知颗粒 ,用 于多种 颗粒的 分离则 
很 费事。 

(三) 离 心方法 的选择 

如上 所述, 差速 离心、 差速- 区 带离心 的分离 是依据 颗粒的 沉降速 度差, 等密度 离心分 
离 则依据 颗粒的 浮力密 度差, 二 者互为 补充。 差速离 心的关 键在于 选择离 心力和 离心时 

间, 而区 带离心 关键是 选择梯 度及其 范围。 可参照 6-3 来选 择合适 的分离 方法。 



表 6-3 超 离心分 离方法 的选择 





颗粒沉 降系数 


颗粒浮 力密度 


离 心特点 


分 离效果 


适 用范围 


差 
速 
离 
心 


相差大 (1- 几个 
数 量级) 




短 吋间、 多次采 
用不 同速度 和离心 
吋 间进行 分段离 
心。 


粗 分离, 纯度和 
收率 不高。 


分子量 (或 大小〕 相 差大、 
不稳定 、易 变性、 易受 梯度介 
质 损伤的 颗粒。 常用 于从组 
织勾装 液中分 离细胞 器及分 

离 病毒。 


差 

带 
离 
心 


相 差较少 (20% 
或更少 )。 或分子 
量相差 3 倍 的蛋白 
质。 




短吋间 ,低 速度, 
样品 不完全 沉降。 


可分出 较纯颗 
拉。 


大 小不同 而密度 相似、 受 
差速离 心挤压 变形、 受低浓 
度梯 度介质 损伤较 少的颗 
粒。 一次 分离量 较少, 宜作 
分析 分离。 可分离 核酸、 蛋白 
质、 核 糖体亚 基及其 它成分 
(如整 细胞、 脂蛋白 )。 


等 
密 
度 
离 
心 




有 差异。 如相差 
0.005 克 / 厘米 3 的 
DNA, 相差 0.01 — 
0.02 克 / 厘米 3 的亚 
细 胞器。 


长吋 I'sl 、高 速度, 
颗拉 完全沉 降到平 
衡 位置。 其 中平衡 
等密 度离心 多用较 
低转速 (3 — 4 万 
rpm)、 较 长吋间 
(2-3 天)。 


可分出 较纯颗 
拉。 


大 小相同 而密度 不同、 稳 
定、 不 受高浓 度介质 损伤的 
颗粒。 一次分 离样品 量大, 
用 于制备 及分析 分离。 可分 
离核酸 、亚细 胞器、 整 细胞, 
也 可分离 复合蛋 白质, 但简 
单蛋 白质不 适用。 



选择分 离方法 必须注 意以下 几点: 

(1) 区带 法分离 颗粒的 能力由 大小或 密度所 决定。 沉降 系数和 浮力密 度都相 同的颗 
粒, 经处 理后也 可用超 离心法 分开。 常用方 法是改 变梯度 的组成 (如 加入少 量无机 盐或另 
一种梯 度材料 以改变 渗透性 、促进 颗粒的 结合作 用等) 及有选 择损伤 某种颗 粒从而 影响颗 
粒的浮 力密度 和沉降 系数。 

(2) 颗粒 在一定 溶剂或 介质中 都有其 特征的 沉降系 数和浮 力密度 (如图 6-6), 可以 
从 文献或 手册中 查得。 已知分 子量的 某些大 分子, 可用 经验公 式计算 (如表 6-4)。 哺乳 
动物细 胞主成 分的沉 降系数 (S) 近 似为: 可 溶蛋白 1— 25,RNA 4-30,DNA 20-100, 
核糖 体亚基 30 — 60, 核糖体 70 — 80, 聚 核糖体 100—400, 微粒体 100 — 1.5X10% 质膜 
100X10% 溶酶体 1 X 104—2x104, 线粒体 2X10^—7X104, 细胞核 4 X 106—107。 必 要时, 

也可 参考同 类颗粒 或经反 复试验 求出。 然后 由所得 数据列 表或作 S — P 图, 从中确 定分离 

的最佳 方法和 条件。 

- 166 . 



1.0 

1.1 

1.2 
1.3 

1.4 
1.5 
1.6 
1 

1.8 
1.9 



平滑 

内质 线粒体 D 
溶 SI 体 * 

粗糖 网② 线粒体 3 

内 质 洛報体 a 

网 * 



蛋 白质① 许多 

病毒 3 
(聚) 核糖^ 

DNA® 

糖 

KNA ③ (聚) 核搪体 a 



细胞核 $ 
质膜 a 
质体 ® 
细胞核 S 



DNA* 



RNA® 



RNA* 



10' 



102 



105 



10^ 



107 



103 10^ 

沉 降系数 (s〉 

图 6-6 某些 细胞成 分和大 分子的 S—P 图 
(1) 在水或 0.25 M i=: 糖中; (2) 在庶糖 液中; (3) 在 Cs,S04 中; (4) 在 CsCl 中。 

(3) 制备 超离心 分离颗 粒的分 子量为 10 6 以上 (或 直径 20 微米以 上), 小于 10 6 的颗 

粒分 离效果 不好, 小分子 核酸、 蛋白质 、多肽 等在目 前实验 室所用 离心力 下还无 法分离 ,还 
须寻求 其它分 离技术 (化学 处理、 分子筛 、超滤 、聚焦 电泳等 )。 

(4) 高密 度的颗 粒可用 盐介质 进行平 衡等密 度离心 分离。 含脂 颗粒可 利用其 沉降速 

度 差进行 差速- 区带离 心分离 (样品 铺放在 梯度顶 上), 或用 浮力密 度差进 行等密 度分离 
(样品 分布在 梯度底 部)。 

(5) 同种颗 粒由于 其不均 一性, 沉降系 数或浮 力密度 可能变 动很大 ,分 离时容 易出现 
相当宽 的区带 或发生 不同颗 粒区带 的交错 重叠。 核酸、 核蛋白 、蛋白 质均存 在分子 的不均 
一性, 如哺 乳动物 DNA 在 CsCl 中 的浮力 密度为 1.68— 1.72 克 / 厘米 3。 细胞和 细胞器 
的非 均一性 更甚。 

(6) 分离 方法的 灵敏度 与操作 有关。 熟练 的操作 者用差 速-区 带法可 分离沉 降系数 
相差 5% 的 颗粒, 而初学 者往往 只能分 离相差 20 — 30% 的 颗粒。 

表 6-4 某些生 物大分 子沉降 系数的 经验计 算公式 



公 式 


分 子类型 


分子姓 范围 




= 0.00242m''-'" 


蛋白质 


1.7X10^— 4. 9X10" 




= 2.8 + 0.00834MO-4" 


双 链线性 DNA 


10'— 10« 




= 0.0528m°-* 


单 链碱性 DNA 


1.5X106 — 7X10' 




= 0.0105MO-," 


单 链中性 DNA 


1.5X10'— 7X10' 


s° = 


2.7 + 0.1759MO'", 


双 链环状 DNA 


3X10'— 3X10' 


so = 


7.44 + O.OOZ^SM"-" 


双链超 旋 DNA 


10' — 3X10' 



• 167 • 



三、 转子、 离心管 及其选 择 [4 , 5 ,11 ] 



制 备超离 心机的 结构装 置比较 复杂, 一般由 四个主 要部分 组成: (1) 转子; (2) 传动 
和速 度控制 系统; (3) 温 度控制 系统; (4) 真空 系统。 其 结构特 点是: 有完 善的冷 却和真 
空 系统, 以消除 摩擦热 (转 速大于 20,000 rpm 时, 摩擦生 热很严 重), 保 护转子 和离心 样品; 
有精确 、严格 的传动 系统, 以及 速度、 温 度监测 和控制 系统, 此 外还有 防过速 装置、 润滑油 
自 动循环 系统、 电子控 制装置 和操纵 板等, 以保 证操作 安全, 自动化 和获得 最好的 离心效 
果。 

与制备 超离心 使用密 切有关 的是转 子和离 心管, 现将其 结构、 性 能及用 途介绍 如下。 

(一) 转子 和转子 的选择 

离心 转子是 当代离 心机发 展的重 要内容 之一, 自 50 年 代起至 今已有 近百种 转子出 
现。 制 备用转 子主要 分为角 式转子 (fixed angle rotor), 外摆 式转子 (Swinging-bucket 
rotor) 和区 带转子 (zonal rotor) 等 三类, 现介绍 如下: 

1. 角 式转子 角 式转子 是指离 心管腔 与转轴 成一定 倾角的 转子。 角 式转子 的型号 
因管子 的倾角 、数目 、容 量以及 转子的 材料、 半径、 转速 而异。 管子的 倾角对 离心沉 降有很 
大影响 ,角度 愈大, 沉降愈 结实, 分 离效果 愈好。 角度小 ,颗粒 沉降距 离短, 沉降速 度快, 但 
不 结实, 分离效 果差。 角式转 子的重 心低, 运转 平衡, 寿命也 较长。 

颗粒在 角式转 子中沉 降时, 先沿离 心力方 向撞向 离心管 (如图 6-7), 然 后再沿 管壁滑 
向 管底。 因此管 的一侧 就会出 现颗粒 (尤 其大 颗粒) 沉积, 此现 象称" 壁效 应"。 "壁 效应" 
容易使 沉降颗 粒受突 然变速 所产生 的对流 扰乱, 影响分 离效果 ,尤其 在分离 沉降特 征相似 
的颗粒 时更为 显著。 用于 区带离 心时, 颗粒区 带在减 速后需 要重新 定向, 定 向后管 下部区 
带变窄 ,上 部区带 变宽。 

2. 外摆 式转子 转子活 动管套 内的离 心管, 旋转 时随着 转子的 运动, 从垂直 悬吊上 
升到水 平位置 (约 200 — SOOrpm 下), 这种转 子称为 外摆式 转子。 外 摆式转 子的结 构较复 
杂, 也有 管数、 容量、 材料、 半径、 转 速等的 差别。 

颗粒 在外摆 式转子 中的沉 降情况 与角式 转子的 不同, 是' 沿管子 方向沉 降的。 梯度离 




A. 角 式转子 



C Z 




^ F 










B. 夕 式转子 

图 6-7 颗 粒在不 同转子 中的沉 降情况 
(S 样 品带; C 旋转 中心; F 离 心力) 



C. 区 带转子 



• 168 • 



心中 颗粒沉 降区带 横过离 心管, 离心后 区带不 必重新 定位。 由于颗 粒在离 心力场 中沼离 

心 力方向 散射地 运动, 而不是 按平行 线沉降 (图 6-7B), 只有 处于样 品区带 中心的 颗粒才 
直接 向管底 沉降, 其它颗 粒则撞 向管的 两侧, 产生类 似角式 转子的 "壁 效应" 现象。 颗粒也 
受振动 和变速 扰乱, 但 对流现 象要小 得多。 

3. 区 带转子 区 带转子 主要由 一个转 子桶和 可移动 的顶盖 组成。 桶 中心位 于转子 
的旋转 轴上, 转子桶 中装有 叶片状 (或 隔板) 装置, 把 转子内 部分隔 成四个 或多个 扇形小 
室。 叶 片上有 导管, 梯度 液或样 品液从 转子中 央液管 泵入, 通过这 些导管 分布到 转子四 
周。 转子内 的叶片 装置可 防止样 品或梯 度受突 然变速 时产生 祸流, 有改善 分离效 果的作 
用。 这种转 子的缺 点是: 样品和 介质直 接接触 转子, 耐腐 蚀要求 较高, 操作较 复杂。 

区带转 子的型 号很多 ,自 1964 年 至今已 发展到 40 种以上 ,但制 备上广 泛应用 的仅几 
.种 (如 B-XIV、 B-XV 等)。 一般按其结构和应用特点可分为八、8.3、1<:***;按操作方式 
分为 分批式 (又 有动态 和静态 装放料 之分) 和连 续式; 按转速 可分高 速和低 速等。 有些区 
带 转子还 可和光 学系统 连用, 用于离 心监测 和扫描 记录。 各种 转子的 结构、 性能和 用途可 
从有 关专著 或转子 手册中 査得。 

颗 粒在区 带转子 中的沉 降情况 不同于 角式和 外摆式 转子, 在径 向的散 射离心 力作用 
下, 颗粒的 沉降距 离不变 (如图 6-7C) 。因此 区带转 子的" 壁效应 "极小 ,可避 免低速 晃动所 

造成 的区带 或沉降 颗粒的 扰乱, 分离效 果好。 而且 还有转 速高、 容量大 ,回收 梯度容 易和不 
影响分 辨率的 优点, 使超离 心用于 制备和 工业生 产成为 可能。 

区带转 子除了 在沉降 特点、 "壁 效应" 上与以 上二类 转子有 明显差 异外, 还有如 下不同 
之处 (表 6-5)。 



表 6-S 三 类转子 结构上 的比较 





管 数 


管 子容量 


管子 与转轴 的角度 


角 式转子 


4一12( 多达 几十. 上百) 个 


0.2 — 500 毫升 


14 一 45° 


外摆 式转子 


3—6 个 


5 — 25 ( 多至 70) 毫升 


静止吋 °, 离心吋 90° 


区 带转子 


有一转 子桶, 无离 心管。 


转 捅容量 300 — 1700 毫 
升 (多至 8 升, 连续式 
可 分离几 十升) 


桶中心 位于转 轴上。 



4. 转子的 最大允 许速度 任 何转子 都有一 定的使 用速度 和使用 限度, 随着 使用时 

间和 次数的 增加, 转子 长期疲 劳必然 引起运 转速度 下降。 所以 使用转 子时, 必须 设立档 
案, 记 录每次 的使用 时间。 一定时 间或次 数后, 应 重新估 算其最 大允许 速度, 以保 障使用 
安全。 各制造 厂生产 的转子 均已标 明其保 证使用 期限。 如 Beckman 转子 可保证 在最大 
转速 下使用 1,000 次或 2,5()0 小时或 5 年, 此后转 速降低 10f。 后又 能再用 1,000 次或 
2,500 小时。 但转子 的使用 保证仅 适用于 完好的 转子。 

由 于最大 额定转 速是以 装载好 的离心 管的重 量为依 据的, 影响 离心管 重量还 有管子 
及管帽 材料和 样品或 梯度液 重量等 因素, 所以 为了便 于安全 操作, 必 须估算 某一特 定重量 
离 管的最 大允许 转速。 上述 因素和 转子最 大允许 转速间 有如下 关系: 

N' = N (12) 

• 169 • 



式中, N' 为最 大允许 转速; N 为最 大额定 转速; Wa 为注满 了平均 密度为 1.2 克 / 厘 
米 3 溶液 的塑料 离心管 加硬铝 帽的总 重量; Wb 为操作 时所用 离心管 加管帽 及溶液 后的总 
重量。 

如果离 心管、 帽不变 ,但 样品液 和梯度 液的平 均密度 P 大于 1.2 时, 应降速 运转, 其最 



S. 转子 的选择 制备用 超离心 机附有 各种转 子以供 选择。 例 如贝克 曼公司 生产的 
L8 系列 超速离 心机就 配备有 角式、 垂直、 外 摆式、 区带和 连续流 动式等 43 种 转子。 在超 
离心制 备中, 转子 的选择 可结合 分离的 目的、 要求和 方法, 从转速 、容 量和形 状等三 方面考 
虑。 

(1) 转速: 转子通 常可用 钛合金 (钛 铝合金 )、 铝合金 (铝镍 合金) 或塑料 做成。 低速 
运转 用塑料 转子, 中速运 转可用 铝合金 转子, 而高、 超速 须选用 钛合金 转子。 

塑 料转子 (如聚 氧苯、 有机 玻璃, 聚四氟 乙烯) 的 固有弱 点是强 度低, 使 用速度 仅限于 
6,000 rpm 以下。 铝合 金具有 轻便、 价廉、 易 加工、 有一 定强度 和抗爆 性能等 优点; 但不能 
加热 消毒、 易 氧化、 抗 化学腐 蚀性差 (易为 酸碱及 CsCl 等盐类 腐蚀, 仅 在中性 或生理 pH 
6.5-7.5 下使用 )。 此外, 抗 金属疲 劳损伤 的性能 也差。 高速运 转时, 铝转 子会出 现金属 
疲劳, 易受应 力影响 而损伤 其晶体 结构, 导致水 进人微 晶界面 ,加 重裂缝 的扩展 (这 种现象 
称应力 腐烛或 应变损 伤)。 化学和 应力腐 蚀均会 造成运 转失衡 ,酿成 事故。 

钛合金 转子虽 然价格 昂贵、 加工 困难, 内含的 铜会抑 制一些 酶活, 也比较 笨重; 但它强 
度大、 耐用, 能经受 冷冻及 高温消 毒处理 ,抗化 学腐蚀 (如 CsCl、 PH3.5-11 的酸 碱液) 和 
应变侵 蚀的性 能强, 是 当前最 理想的 转子。 由于钛 转子的 强度大 ,同 样大小 转子的 抗离心 
力的能 力要比 铝转子 大二倍 左右, 并至少 可增加 最大允 许转速 20%。 

转子的 型号、 来源 不同, 转速也 不同。 久用 的转子 受化学 或应力 腐蚀, 须重新 估算最 
大允许 转速。 任何转 子都不 允许在 满额或 超额定 转速下 运转。 有人 建议使 用转速 为最大 
额 定转速 (或最 大允许 转速) 的 75%, 以保证 安全, 延 长使用 寿命。 角式转 子的转 速除受 
转子材 料强度 限制外 ,也 受离心 管的塑 料强度 限制。 

(2) 形状: 转子的 形状可 直接影 响颗粒 的分离 效果。 区 带转子 具有与 外摆式 转子相 
同或稍 好的分 辨率; 既能进 行区带 离心, 也能进 行差速 沉降。 但颗粒 沉降区 带随半 径增大 
而 被径向 稀释, 故一般 不用于 浓缩, 仅适 于分离 纯化。 区带 转子的 分辨率 与转子 的高度 / 
直 径之比 呈反比 关系。 

外摆 式转子 主要用 于区带 分离。 等密度 离心选 用粗短 离心管 ;而 差速- 区带离 心选用 
细长离 心管的 外摆式 转子。 

角式 转子不 能用于 差速- 区带 分离; 加减 速期间 样品或 颗粒区 带易被 扰乱, 通 常在差 
速离 心中作 组分的 粗分。 但 在差速 分离有 显著沉 降系数 差的样 品时, 效果却 很好。 用在 
等密度 离心, 尤其在 平衡等 密度离 心时, 由于 沉降距 离短, 梯度和 颗粒容 易建立 平衡。 伹 
所用 的梯度 密度范 围小, 多用 于分离 DNA —类 颗粒, 分离效 果比外 摆式转 子好。 而且在 
CsCl 中, RNA 沉 积于管 外壁, 不妨碍 用穿刺 法取出 DNA 区带。 

还 有一类 垂直管 转子, 它是角 式转子 的特殊 形式, 主 要用作 等密度 离心。 其优 点是颗 
粒 移动距 离短, 梯度离 心时, 约 比外摆 式和角 式转子 各节省 4/5 — 2/3 及 1/2 — 2/3 的吋 




间。 但转子 须承受 很大的 与管子 成垂直 作用的 离心力 ,速度 的剧变 容易产 生对流 扰乱。 

0) 容量: 转 子的容 量依次 是区带 转子〉 角式 转子〉 外摆式 转子, 每 一类型 的转子 

也 有大小 之分。 区 带转子 不仅容 量大, 有些还 有连续 流动装 置或光 学监测 系统, 很 适于大 
规 模分离 制备。 角式 转子用 于差速 离心分 离时, 由 于每次 处理样 品多, 离心时 间短, 可增 
加样品 的处理 次数和 体积。 

(二) 离 心管及 其选择 

离心管 通常由 玻璃、 塑料 和金属 (如不 锈钢、 铝 合金) 制成。 玻璃管 虽质硬 ,但 很脆, 不 
能耐 受超速 离心的 应力。 超离 心所用 离心管 主要用 塑料和 不锈钢 制成。 

塑料 离心管 常用的 材料有 聚乙炼 (PE) 、醋酸 -丁酸 纤维素 (CAB) 、聚 碳酸酯 (PC)、 聚 
丙炼 (PP) 、硝酸 纤维素 (NC) 等。 塑料 管的最 大优点 是透明 (或 半透明 ), 硬 度小, 可用穿 
刺 法取出 梯度。 某些管 子还具 有良好 的物理 性能, 如抗 张力、 耐高 (或低 ) 温等, 可 经受高 
温消毒 、冷冻 、超 速离心 等不同 处理。 其 主要缺 点是易 变形, 抗腐蚀 性差, 使用寿 命短。 

不诱钢 离心管 强度大 ,不 变形、 能 抗热、 抗冻、 抗化学 腐蚀。 但使 用时也 应避免 接触强 
腐烛性 的化学 药品, 如 HCU H,SO,, HF 等。 在某些 特殊场 合下, 也可使 用塑料 衬里的 
不锈 钢管。 

离心管 的选择 主要从 容量、 强度、 抗温变 、抗化 学腐蚀 等方面 考虑。 此外, 高速 离心的 
应力还 会加剧 介质对 管子的 腐蚀。 因此, 必 须根据 制备离 心的不 同要求 (体积 、转速 、介质 
等) 选择相 应的离 心管。 选择 管子的 最好办 法是查 阅有关 管子的 资料或 产品说 明书, 并在 
离心 前测试 梯度介 质或样 品对离 心管稳 定性的 影响。 制备 超离心 普遍采 用不镜 钢管; 塑 
料管则 主要用 于区带 离心。 选用塑 料离心 管时, 管子的 大小须 与梯度 液或样 品液相 适应。 
未充 满液体 的管子 (甚 至拉 力强度 较大的 PC 管) 应降速 使用; 在角式 转子中 高速离 心时, 
管壁 受压不 勾将引 起管子 变形或 崩裂。 上下密 度差较 大的梯 度管, 也容易 发生类 似的离 
心变形 ,使转 子不平 衡而造 成严重 事故。 有 些管子 (如 NC 管、 PP 管) 即使充 满液体 ,也不 
能在 5 万 rpm 以上 转速下 离心。 超速离 心宜选 用不绣 钢管、 厚壁塑 料管、 polyallomer(PA, 
丙烯和 乙稀单 体的共 聚物) 管。 严禁使 用显著 变形、 损 伤或老 化的离 心管。 另外, 还应了 
解管子 的容量 、最高 转速、 使用 次数、 保存方 法等, 以 便合理 使用。 薄 壁管在 6.5 万 rpm 的 
高速 下仅用 一次, 4-6 万 rpm 下可用 3 — 5 次。 厚壁 管使用 次数可 多些。 

此外, 还要考 虑介质 对管子 (如 前述) 或管子 对分离 颗粒的 影响, 例 如某些 塑料管 (如 
硝 酸纤维 素管) 的表面 会吸附 核酸, 管子的 长短' 、大 小等也 要适当 注意。 如 外摆式 转子用 
细长管 作差速 -区带 离心可 获得较 高的分 辨率; 薄壁管 仅用于 外摆式 转子; 角式转 子及垂 
直转 子用的 管子承 受的压 力大, 须 用厚壁 离心管 等等。 

(H) 离 心管帽 

超速离 心机的 离心管 常附有 管帽。 离心前 管子必 须戴好 管帽。 管帽 有三种 作用: 

(I) 防 止样品 外泄。 用于生 物危险 、放射 性或腐 蚀性的 样品时 ,这 点尤其 重要。 (2) 防止 
样品 挥发。 样品暴 露于真 空时, 很容易 挥发, 使 转子失 衡运转 而发生 事故。 (3) 支 持离心 
管, 防 止离心 变形。 

管帽 一般由 塑料、 电镀铝 合金或 不锈钢 制成, 内衬橡 胶密封 塾圈。 

• 171 • 



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四、 梯度、 梯度 介质及 其选择 [4 , 5 ,1 5] 

(-) 梯 度介质 

常用梯 度介质 可分为 五类, 各 类介质 的优缺 点如表 6-6。 

市售的 梯度材 料均含 有杂质 ,影响 分离或 测定, 用前必 须进行 精制, 除去 杂质。 例如 
重金 属可用 EDTA (1 — 10 mM) 或 Dowex 螯 合树脂 (1/20 — 1/10 体积) 除去; 紫外 吸收物 
质可 用酸处 理过的 活性炭 (1/40 — 1/20 重量) 煮沸一 段时间 后吸附 除去; 核 酸醒可 用活性 
炭 或焦碳 酸二乙 酯进行 处理; 高分子 介质所 含低分 子杂质 可透析 除去。 

(二) 梯 度介质 的选择 

理 想密度 梯度材 料的条 件是: (1) 溶度足 够大, 能形成 颗粒分 离所需 的有效 密度。 常 
见梯度 介质的 最大密 度见表 6-7; (2) 溶液 稳定、 惰性、 渗透作 用小、 粘度和 离子强 度低, 
不损伤 待分离 组分; (3) 不干 扰组分 分析; (4) 具有某 些特性 (如折 射率) 以 便于测 定其浓 
度或 密度。 此外, 还应考 虑纯度 、价格 、毒性 、腐蚀 性和水 化作用 ,能否 除去或 回收, 能否加 
热 消毒等 因素。 



表 6- 7 常 见梯度 介质的 S 大密度 (20°C) 



材 料 


密度 (克 / 厘米 3) 


材 料 


密度 (克 / 厘米 3 ) 


蔗糖 


1.33 


乙酸铯 


2.00 


甘油 


1.26 


RbCl 


1.49 


葡聚糖 


1.13 


RbBr 


1.68 


Ficoll 


1.16—1.45 


Rbl 


1.95 


牛血清 白蛋白 


1.12 


甲酸细 


1.85 


三 氯乙醒 水合物 


1.91 


NaBr 


1.53 


重水 


1.105 


Nal 


1.90 


Ludox 


1.219 


甲酸纳 


1.32 


Metrizamide 


1.46 


KBr 


1.37 


Urografin 


1.45 


KI ' 


1.72 


Renograf in 


1.45 


甲酸辨 


1.57 


CsCl 


1.91 


乙酸拥 


1.411 


CsjSO^ 


2.01 


酒 石酸钾 


1.485 


CsBr 


1.72 


柠 樣酸禅 


1.485 


Csl 


1.65 


LiBr 


1.83 


甲酸绝 


2.10 


Ludox- 葡聚糖 


1.25 



注: 用 重水代 替水作 溶剂, 通常最 大密度 可增加 0.Q6 — 0.08, 并可 使粘度 下降。 低温 影响溶 解度, 密度也 相应降 



低。 

实际 上不存 在适用 于所有 颗粒分 离的理 想梯度 材料, 常用材 料都有 一定的 局限性 。几 
类 梯度材 料的应 用见表 6-8。 下 面简单 介绍梯 度介质 材料的 性质和 应用。 

1. 滅 金属盐 盐梯 度介质 主要用 于平衡 等密度 离心, 分离 RNA、 DNA 或核 
酸 占优势 的病毒 颗粒。 由于 核酸的 浮力密 度大, 不 能选用 蔗糖、 Ficoll 等梯度 材料, 须用溶 
度大、 能形 成高密 度液的 盐类。 RNA 的 分离几 乎全用 Cs,SO<, 理 由是: (1) RNA 不溶于 
浓 CsCl, 离 心时在 管外壁 沉淀; (2) Cs,SO, 溶 解度比 CsCl 大, 形成 梯度的 斜率比 CsCl 大 



• 173 • 



表 6-8 几类 梯度材 料的主 要应用 



梯 度材料 


大分子 




亚细胞 §S 


细 胞 


病 毒 


单糖 或双糖 






+ 




+ 


多糖 






+ 




+ 


三 碘化苯 衍生物 


十 


+ 


+ 


+ 


+ 


胶态 SiO, (Ludox) 






十 


+ 


+ 


CsCl 


+ 


— itfc 






+ 



"+" 表示 可用, "一" 表示 不用。 



二倍, 适 于浮力 密度很 宽的不 同核酸 分子的 分离; (3) 核酸在 Cs2SO< 中的 水化程 度比在 
CsCl 中大, 使浮力 密度大 为降低 ,也即 降低了 所用梯 度的盐 浓度; (4)CsCl 在水中 的密度 
低温 下约为 1.7 克 / 厘米 3 , 已 接近溶 解度的 极限, 不能 产生足 够密度 以分离 RNA。 虽然 
CS2SO, 对某 些单链 RNA 分子有 聚合、 沉 淀作用 ,但 仍可 用于其 它单链 RNA、 双链 RNA 和 
RNA-DNA 杂交 分子的 分离。 

DNA 的浮 力密度 较小, 普遍用 CsCl 来 分离。 CS2SO4 离心 形成的 梯度斜 率大, 分辨率 
比 CsCl 差, 而且 SOr 能与 闪烁剂 沉淀, 妨 碍同' 位素标 记物的 测定, 故一般 不宜作 DNA 分 
离 的梯度 介质。 CsCl 分离 DNA 的优点 是分辨 率好; DNA 在浓 CsC1(7AO 中也 溶解; 
天然 DNA 在中性 CsCl 中的浮 力密度 还与其 GC 含量呈 现出近 似线性 的关系 (p=« 
0.098 X GC% + 1.660), 而用 CsaCC^ 则 观察不 到这种 关系。 

核酸在 CsaCO^ 和 CsCl 中的浮 力密度 依次为 RNA >> RNA-DNA ①〉 变性 DNA > 
RNA-DNA®〉 天然 DNA (杂交 分子的 浮力密 度随组 成而改 变)。 核 酸的浮 力密度 会受到 
某些 因素的 影响。 DNA 的 浮力密 度与以 下因素 有关: (1) 在盐 介质中 的水化 程度。 已利 
用水化 程度的 不同而 分离单 、双链 DNA。 (2) 螺 旋度。 利用在 CsCl 或 CS2SO4 中加人 
溴 化乙锭 而影响 DNA 的浮力 密度。 螺旋度 大的, 结合染 料少, 浮力 密度降 低就不 明显。 
(3) 磁基 组成。 天然 DNA 的 GC 含量、 碱基的 修饰、 同位 素标记 等对密 度均有 影响。 

铯盐介 质也用 于病毒 及某些 复合蛋 白 (如血 清脂蛋 白 、 mRNA 蛋白、 核 RNA 蛋 白等) 
或经 特殊处 理的核 蛋白的 分离, 但盐介 质所产 生的高 渗透压 和高离 子强度 对少数 病毒及 
多数复 合蛋白 的稳定 性不利 ,可能 会导致 结构改 变而丧 失感染 活性。 

分离 核酸类 物质也 用其它 盐类, 但缺陷 更多, 仅 在特殊 情况下 使用。 如 某些动 物病毒 
在酒石 酸钾梯 度中相 当稳定 ,分离 效果比 CsCl 好。 Nal 可用 于分离 核酸, NaBr 则专用 
于分 离脂蛋 白等。 

2. 小分子 有机物 单、 双 糖梯度 主要用 于差速 -区带 离心。 最常 用的是 蔗糖, 梯度 
范围是 5 — 20f。 (大分 子及小 颗粒) 或 15 — 30fc (具 膜颗粒 )。 蔗糖 有对多 数病毒 安全, 无 
损伤、 浮力 密度低 (在 CsCl 中浮力 密度为 1.38 的. 病毒, 在蔗 糖中为 1.20) 等 优点。 除少数 
病毒外 (如 f2 噬菌 体, 80S), 多数 病毒的 沉降系 * 为 120 — 1,000 5 。使用 蔗糖梯 度时, 通常 
在 90,000—420,000 g 下离心 0.5 — 3 小时 即可。 

庶糖 也常用 于亚细 胞器、 某些 RNA、 DNA 和核 蛋白的 分离, 但分离 亚细胞 器时, 颗 
粒 完整性 可能受 到一些 影响。 

如果 待分离 样品液 含有蔗 糖酶或 蔗糖干 扰某些 酶的测 定时, 可用甘 油代替 蔗糖。 甘 
油在性 质上类 似蔗糖 ,但 可保护 酶活, 能高压 消毒, 易蒸发 除去。 

• 174 • 



3. 有机 高分子 多糖、 白蛋白 等渗透 压低, 适于 具膜颗 粒的差 区 带和等 密度离 

心 分离。 许多动 植物、 微 生物的 细胞、 亚细胞 器和病 毒已成 功地用 多糖介 质进行 分离, 颗 
粒经分 离后, 一般损 伤极小 ,但高 浓度下 多糖的 渗透性 增加, 易 使细胞 失活, 故不常 用于活 
细胞的 等密度 分离。 差速- 区 带离心 却可获 得相同 或更为 有效的 结果, 而且时 间短, 转速 
低, 其中最 为广泛 使用的 是聚蔗 糖和牛 血清白 蛋白。 生 物颗粒 在多糖 中高度 水化, 其浮力 
密度比 在庶糖 中低。 

高浓度 的大分 子梯度 介质, 对 颗粒拫 伤比蔗 糖小, 但成本 较高、 溶度 较小, 而 且粘度 
高, 需要延 长离心 时间, 不宜 用于小 颗粒的 分离, 应 用上并 不优于 蔗糖。 

4. 三镇 化苯 衍生物 复合 蛋白质 对高离 子强度 敏感, 容易引 起结合 键的断 裂或亚 
基 解离。 分离 这类复 合物须 选用非 离子型 的梯度 介质。 最常 用的三 碘化苯 衍生物 是非离 
子型的 Metrizamide, 有 时也用 蔗糖。 Metrizamide 不 解离核 蛋白, 但 其它三 碘化苯 衍生物 

均为弱 离子型 ,会影 响核蛋 白组成 ,应 用上受 到一定 限制。 

三碘苯 衍生物 也能用 于分离 核酸、 蛋白质 、病毒 、亚细 胞器和 细胞等 ,许 多成功 的例子 
已显 示出它 的潜在 作用。 

颗粒 在三碘 苯衍生 物中的 浮力密 度与介 质本身 有关。 DNA 在 Metrizamide 中的浮 
力 密度为 1.12 克 / 厘米 3 , 接近 完全水 化时的 密度; 而 在离子 型三碘 苯衍生 物中, 密 度还稍 
大些。 改变 Metrizamkk 的离子 强度或 pH 也 能改变 DNA 的浮力 密度。 多数 三碘苯 
衍 生物能 与蛋白 质牢固 结合, 使浮 力密度 增大达 1.30 克 / 厘米 3 以上。 采用 重水作 溶剂或 
搭样 品分层 到梯度 顶上, 或 用较低 浓度的 Metrizamide (弱结 合)、 Urografin (不 结合) 可 
减弱或 排除这 种结合 作用。 蛋 白质、 复合蛋 白质在 Metrizamide 中的 浮力密 度约为 1.27 和 
1.22 克 / 厘米 3。 , 

三碘苯 衍生物 几乎可 用于任 何颗粒 的分离 ,是很 有前途 的一类 介质。 

5. 胶态 SiO, (Ludox) 具膜 颗粒对 渗透压 敏感, 不能 用高渗 透性的 盐类、 蔗糖或 
高 粘性的 FicoIl、 Metrizamide 来 分离。 粘度高 ,沉 降慢, 离心 时间长 也易引 起不稳 定颗粒 
的 破坏或 变性。 Ludox 的渗 透压和 粘度均 很低, 是分 离不稳 定颗粒 的理想 介质。 但 Ludox 
在 pH4 — 7.5 不稳定 ,对细 胞有低 毒性, 须与 多聚体 (如葡 聚糖、 聚乙 二醇) 配 成混合 梯度介 
质后才 适用, 或 采用新 型号的 Ludox (如 MCS 的 I、II 型)。 Ludox MCS 不 仅保留 了胶态 
SiO, 的 优点, 而且避 免了加 多聚体 所带来 的弊病 ,在渗 透性、 pH、 离 子强度 上接近 细胞的 

生理 条件, 是一种 很有前 途的材 料 [2 "3。 

颗粒在 Ludox 中的浮 力密度 较低, 大部 分细胞 器小于 1.10 克 / 厘米 3 (在 蔗糖 中则达 
1.15-1.2 克 / 厘米 3), 细胞器 分离常 用介质 是溶于 0.25 M 蔗糖的 Ludox。 

选择 梯度介 质还要 考虑介 质的稳 定性。 Ludox 在高速 下( 〉 100,000g) 会出现 SiOa 
颗粒 沉淀, 只能分 离沉降 速度比 Si02 颗粒快 的较大 颗粒, 不 宜分离 大分子 或大分 子复合 
物 (如 染色体 )。 大量 制备还 要考虑 材料的 成本, 来 源及回 收等。 

如一 时找不 到合适 的材料 作梯度 介质, 或 颗粒不 稳定, 不 能用高 粘度介 质时, 也可用 
混合 材料作 介质。 混 合材料 的梯度 在等密 度离心 中已得 到广泛 应用, 如 40% Ludox 和多 
糖的梯 度常用 于完整 细胞的 分离。 



• 175 • 



CH) 梯度 的选择 

梯度 的作用 是使颗 粒沉降 稳定或 稳定颗 粒区带 界面, 防 止因局 部温度 变化或 机械震 
动 产生的 对流扰 乱而影 响分离 效果。 在 区带离 心中, 梯 度的有 效密度 范围、 梯度的 斜率、 
形状 和容量 的选择 是颗粒 分离的 关键。 

1. 梯度 的形状 梯度 可按其 形状分 为五种 类型: 直线形 (或线 性)、 凸形 (或 指数 
型)、 凹形 (或 对数型 )、 阶梯形 和复杂 梯度。 . 

超离心 制备常 用线性 梯度。 差速- 区带离 心一般 用预形 成线性 梯度; 等密度 离心则 
可 用预形 成或离 心形成 的线性 梯度。 预 形成梯 度一般 用于: (1) 不 稳定的 颗粒; (2) 扩散 
慢, 不易离 心形成 梯度的 介质; (3) 沉 降快的 大颗粒 (细 胞、 细胞器 等)。 当 颗粒在 高速下 
离心 18 小时 (或 18 小时 以下) 后, 能清楚 分成区 带时, 可 用预形 成线性 梯度, 因离 心形成 
的 梯度, 梯度介 质经长 时离心 后重新 分配, 梯 度形状 会发生 改变。 

有时 为了某 种分离 需要, 也 采用某 些特殊 形状的 梯度。 阶梯梯 度用于 颗粒区 带很靠 
近、 连续 梯度难 分开的 场合, 最适 于亚细 胞器、 整 细胞、 某 些病毒 分离, 具有梯 度容量 
大, 分离 迅速、 效 果好的 优点。 主 要用于 等密虔 分离, 有 时也用 于差速 -区带 离心。 使用 
阶 梯梯度 须有线 性梯度 的分离 数据作 依据。 凹形梯 度常用 于低密 度颗粒 (如脂 蛋白) 的上 
浮等密 度分离 ;凸 形梯度 则用于 较高密 度颗粒 的沉降 等密度 分离。 通 常都采 用长离 心管, 
以提 高较低 密度区 (回形 ) 或较高 密度区 (凸形 ) 的分 辨率。 复 杂梯度 可同时 用混合 物中颗 
粒的沉 降系数 差和密 度差。 这种 混合物 一般需 依次经 颗粒密 度差及 沉降系 数差二 步离心 
分离 (或反 之), 采用复 杂梯度 ,一次 即可得 较彻底 的分离 ,简化 了分离 步骤。 沉降系 数或密 
度范 围很宽 (即同 种颗粒 大小不 均一) 的颗粒 ,用 复杂梯 度往往 也能与 其它颗 粒很好 分开。 

线性 梯度的 缺点是 离心力 随管长 (或 半径) 增加, 无法抵 消粘度 增加对 沉降速 度的影 
响, 使颗粒 的沉降 变慢, 影 响了梯 度下部 分的分 辨率。 为了 使粘度 与离心 力的增 加相平 
衡, 让颗粒 作恒速 运动, 有 人在外 摆式和 区带转 子的差 速-区 带离心 中使用 了等动 力学和 
等体积 梯度, 但制 备上除 常用的 5 — 20% 蔗糖梯 度外, 其余实 用价值 不大。 

2. 梯 度的密 度范围 线 性梯度 上下密 度比为 1/4 最好。 差速- 区带离 心所用 梯度的 
密度范 围小, 其最 大密度 (即 底部 密度) 小于 样品液 中所有 颗粒的 密度。 这 种梯度 的作用 
既可 以使大 小不同 的颗粒 在离心 力场下 往管底 沉降, 又能防 止对流 ,维 持沉降 稳定, 使颗 
粒 不致很 快降到 管底, 从而有 足够时 间形成 区带。 还能避 免某些 颗粒形 成等密 度区带 ,而 
与其 它颗粒 的沉降 区带相 混渚。 等密 度离心 所用梯 度的密 度范围 较大, 包 括样品 液中所 
有颗粒 的密度 在内。 梯度的 最大密 度要大 于样品 中所有 颗粒的 密度, 防止 某些颗 粒在没 
有等密 度点稳 定的情 况下, 继续往 下沉降 ,造 成与其 它等密 度区带 重叠, 影 响分离 效果。 

选择梯 度的最 小密度 (即 梯度 顶部的 密度) 的依 据是, 它 必须能 支持样 品液, 并在未 
离心 前尽可 能减少 颗粒的 沉降, 又 必须具 有分离 所要求 的最小 密度和 粘度, 以使 离心迅 
速。 因此, 梯 度顶部 的密度 必须比 样品液 的大。 在 分离具 膜颗粒 (细 胞或细 胞器) 时, 为 
了避免 溶涨, 一般 将样品 悬浮于 等渗介 质中。 如用 0.25M 的 等渗蔗 糖液, 蔗糖梯 度的最 
小 密度为 0.3 M 或 0.35 — ().40M。 分离 大分子 或核蛋 白体亚 基时, 因 颗粒不 必悬浮 于等渗 
介 质中, 梯度的 最小密 度可用 0.15 M。 此时, 由 于粘度 下降, 分离时 间大为 缩短。 

如 果用盐 介质进 行平衡 等密度 离心, 形成梯 度的密 度范围 与梯度 介质的 性质、 离心 
• 176 • 



力、 梯 度顶部 和底部 与转轴 的距离 及梯度 液的起 始密度 有关。 可用公 式表示 如下: 

- = 去 ("一 (13) 

由公式 可见, 离心 力大, 梯度的 密度差 也大。 通 常起始 密度均 应稍高 于样品 中颗粒 的最大 
浮 力密度 (大于 0.01-0.02 克 / 厘米 3 ), 以避 免梯度 形成之 前出现 颗粒的 沉淀, 并让 所有颗 
粒都能 在平衡 梯度中 分成稳 定区带 ,出现 在梯度 的较上 部分。 

3. 梯度 (线性 ) 的斜率 颗 粒的沉 降系数 或浮力 密度差 较大, 可选用 较大的 梯度斜 
率及较 短的离 心管, 但这会 导致颗 粒区带 变窄, 降低区 带容量 (指稳 定区带 所容纳 颗粒的 
最 大量, 它与区 带宽度 平方成 正比, 与斜率 成反比 )。 梯度 的斜率 越大, 区带 越窄, 靠得越 
近, 回收 区带时 就易产 生交叉 污染; 梯度的 斜率小 ,虽然 区带容 量大, 但 由于粘 度小, 扩散 
严重, 使区 带宽度 增加, 并 可能导 致区带 重叠而 降低分 辨率。 超离心 分离一 般采用 斜率较 
小 的线性 梯度, 但需达 到一定 的梯度 斜率, 以阻止 对流的 影响, 维持 颗粒区 带的稳 定性。 差 
速-区 带离心 所用梯 度斜率 一般比 等密度 离心小 ,但在 高速离 心并使 用低样 品浓度 和相对 
宽的 样品区 带时, 用斜率 较大的 线性梯 度也能 得到很 好的分 辨率。 

平衡等 密度离 心的梯 度斜率 与转速 、梯度 底部与 转轴的 距离、 介质 性质或 ^ 值、 浓度 
(成正 比)、 温度 (成反 比)、 转 子类型 (角式 大于外 摆式) 有关, 可用公 式表示 如下: 



由公式 可知, 低速斜 率小, 二个 区带的 中点离 得远, 但区 带宽。 梯度 斜率随 介质种 类而不 
同, 已知 Cs2SO/〉CsCl〉NaI, 与盐的 /?° 值 相反。 一 般的分 离最好 用斜率 稍大的 盐梯度 
(太大 也影响 分辨率 ), 斜率 太小的 梯度仅 作纯化 使用。 

平衡 等密度 离心所 产生的 梯度斜 率一般 较小, 如事先 使用阶 梯梯度 或线性 梯度, 可使 
梯度斜 率增加 ,但此 梯度不 稳定, 离 心时将 重新分 配为斜 率小的 梯度。 

4. 梯度 的容量 梯度容 量取决 于样品 体积和 浓度、 梯度 体积和 斜率、 所要求 的分辨 
率、 所用的 回收方 法和转 子的效 率等。 已 发现梯 度的实 际容量 低于理 论值, 为 后者的 
90f 。。梯 度的容 量带有 很大的 经验性 ,如 差速- 区带离 心为每 毫升梯 度体积 1—1000 微克, 
一般在 100 微克 以下; 外摆式 转子的 离心管 (直径 2.5cm), 每 厘米直 径所容 许的样 品量约 
为 0.15 — 0.8 毫升 (随直 径而变 化)。 梯度 斜率相 同时, 角式 转子的 梯度容 量比外 摆式转 
子大, DNA 容量为 后者的 10 倍 左右。 角式 转子如 用于分 离二种 DNA (密 度差 0.005 克 / 
厘米 时, 梯度 容量为 50—150 微克 DNA ,如 用于 制备总 DNA, 容量 可大至 5 毫克。 

五、 制备 超离心 的操作 [6 、 8 、 9 、"] 

(一) 梯度的 制备: 

梯 度可用 机械法 或手工 操作法 制备, 也可用 离心法 形成。 常见 梯度的 制备方 法介绍 
如下: 

1. 不 连续密 度梯度 (或 阶梯 梯度) 的制备 密度随 管长或 半径阶 梯式增 加梯度 ,为 

不连续 梯度。 其制备 方法最 为简单 ,通 常先配 好一系 列不同 密度的 溶液, 然 后用移 液管将 
梯度介 质从浓 到稀沿 管壁小 心加入 ,或用 一加细 管的注 射器针 头插到 管底, 从稀到 浓一层 
层地铺 到离心 管中, 即可产 生一个 不连续 的密度 梯度。 这 梯度不 稳定, 放 置一段 时间或 

• 177 . 



用金属 丝轻轻 搅拌, 或轻 敲离心 管后, 由 于分子 的扩散 作用, 就会 慢慢变 为连续 的线性 
梯度。 

2. 连续密 度梯度 的制备 密度随 管长或 半径逐 渐增加 的梯度 为连续 梯度。 连续梯 
度又可 分为: (1) 线性 梯度; (2) 回形 或凸形 梯度; (3) 复杂 梯度. 制备超 离心常 用线性 
梯度, 其制备 方法有 三种: 

(1) 阶 梯梯度 自动扩 散法: 由上 述方法 以相同 体积和 等差浓 度制得 阶梯梯 度后, 将 
梯度 自然放 置一段 时间, 即能形 成所需 的线性 梯度。 此 法仅适 用于低 分子梯 度介质 (分子 
量 《1,000), 每层梯 度液以 1 一 2 厘米 为宜。 阶梯 梯度应 在无振 动下自 动扩散 形成, 形成时 
的 温度最 好与离 心时的 相同. 扩 散形成 线性梯 度所需 的时间 与梯度 材料的 分子量 和扩散 
系数, 梯度的 温度、 浓度和 粘度, 以及每 层液的 厚度、 密 度差等 有关, 通常需 8 — 24 小时以 
上。 温 度高, 时间可 略短。 例如蔗 糖梯度 不易离 心形成 ,制备 5 — 50f。 蔗糖 线性梯 度时, 是 
让 50%、 45% …… 5f。 浓度的 庶糖液 及水各 0.9 毫升 的阶梯 梯度, 在 4 °C 下放 置过夜 (或 
室温下 2 — 3 小时) 自 动扩散 而成。 如用 1 毫米直 径的细 铁丝轻 轻敲击 ,可大 大缩短 时间。 
多 糖需数 天才能 扩散 成线性 梯度。 

(2) 梯 度产生 器法: 此法最 通用. 其装置 又可分 为手动 式和自 动式, 实验室 自制的 
简易梯 度产生 器即属 前者。 梯度 产生器 系由玻 璃或有 机玻璃 等材料 制成的 大小相 同的内 
外两室 所组成 ,通常 把外室 称为储 存室, 内室 称为混 合室。 小 室高度 与直径 之比为 2.5 — 
3:1。 二个 圆柱形 小室间 有一连 接管, 管中间 配备有 作开关 用的活 塞或螺 旋夹。 混 合室底 
部沿连 接管的 水平方 向上还 装有一 塑料导 液管, 以螺 旋夹控 制梯度 液流人 离心管 的速度 
混合室 中附有 搅伴器 ,使 用时一 般控制 转速为 60 rpm 左右。 

' 现以蔗 糖作梯 度材料 为例, 制备 5 — 30f 。的线 性蔗糖 梯度。 先关闭 两室的 活塞, 然后 
向 外室和 内室分 别加人 10 毫升 5f 。和 30% 的蔗 糖液。 装液时 必须先 装外室 ,在蔗 糖液快 
满过连 接管时 轻轻打 开中间 活塞, 使蔗糖 液充满 连接管 到活塞 间的通 道后立 即关闭 活塞。 
手工操 作中这 是一个 重要的 步骤; 不排除 管内的 空气, 将 会影响 梯度的 形状。 内室充 液时, 
可将 导液管 流出端 提起, 使之 高出液 体的水 平面, 以阻 止液体 流出。 两室中 的溶液 应调节 
在同 一水平 面上, 使两室 连通时 线性梯 度不致 为相互 产生的 对流所 扰乱。 两 室都加 完蔗糖 
液后, 用固定 支架将 导液管 紧贴离 心管壁 ,使 梯度液 沿管壁 流下, 以避 免扰乱 梯度。 开动 
电磁搅 样器, 并打 开两室 连接管 活塞。 当梯 度液自 内室流 出时, 不允 许再移 动固定 于支架 
上的 离心管 混合 时流速 要慢, 控制在 1 毫升 / 分 左右。 制备好 梯度后 ,将离 心管小 心移到 
冷室 中放置 备用, 梯度在 几小时 内是稳 定的。 也 可把稀 液加人 内室, 浓 液加入 外室, 但此 
时梯 度液导 液管必 须直插 到离心 管底, 让 浓溶液 将稀溶 液顶浮 起来, 最后仔 细地将 导液管 
取出。 此法适 用于疏 水的、 在管 壁不形 成水流 的塑料 离心管 (如 聚碳酸 酯管和 polyallomer 
管), 流速 可相对 大些, 一 般可达 2 毫升 / 分. 

手动式 梯度产 生器虽 简单, 容易 操作, 但不能 同时制 备几个 梯度。 近 年来, 各 种自动 
梯度 产生器 已相继 出现, 这些 装置尽 管在产 生梯度 的体积 (几 毫升, 多至 100 毫升 以上) 或 
形状 上各不 相同, 但都 由一蠕 动泵所 操纵。 例如 日 立公司 55 P-2 型超离 心机的 DGF-U 型 
密度梯 度产生 器可同 时制备 6 支梯 度管, 又 能在离 心后自 动分层 取出梯 度中各 区带。 

改变内 室或外 室的横 截面积 也可得 到某些 特殊的 非线性 梯度. 如图 6-8 所示, 当 
A < B 时 为凸形 梯度, A 〉 B 时 为凹形 梯度。 

• 178 • 



V 




图 6-8 几种 不同梯 度形状 的梯度 产生器 示意图 
B 为外室 (储存 室), 用浓 溶液; A 为内室 (混合 室), 用稀 溶液。 Cb、 Ca、 Vb、 Va 分别 为回收 梯度的 

浓度和 体积, Vr 为残 留体积 

梯 度产生 器制备 梯度虽 有许多 优点, 但也有 其不足 之处。 如: 小室中 有残留 液体, 使 
梯度达 不到最 大密度 ;机械 搅祥增 加内室 压力, 使梯度 变形; 小室间 连接管 太小不 易迅速 
建立 平衡; 高粘液 难以用 泵控制 恒定流 速等。 

(3) 平衡梯 度法: 盐介 质的线 性梯度 须用平 衡法, 通过 长时间 高速离 心均勾 盐溶液 
和 样品液 (有 时还含 Tris- HC1, 碟酸 盐等缓 冲液) 达 平衡而 产生。 盐 介质离 心足够 长的时 
间, 当盐分 子的沉 降速度 等于其 反方向 的扩散 速度时 ,即 形成盐 的平衡 梯度。 样品 中的颗 
粒也 由于受 离心力 影响而 沉降或 上浮到 梯度内 相应的 等密度 点上, 建立 另一种 平衡。 将 
所需梯 度的最 大和最 小密度 液分成 二层, 让盐 分子静 置扩散 12 小时, 然后进 行离心 ,可縮 
短平 衡梯度 形成的 时间。 外 摆式转 子离心 形成的 梯度线 性比角 式转子 的好。 

此 法的关 键是选 择介质 的起始 密度, 并 通过折 射计进 行准确 校对。 起 始密度 所需盐 
的重量 (以 CsCl 为例 ), 可从表 6-9 求得。 

也 可用下 面公式 求出: 

x(% ,W/W) = ~ -- ~ = 137.48 - 138-11 . (15) 
1 + y p25 

式中, y 为 1 毫升 DNA 样液中 加入的 CsCl 克数, 为需要 制备的 CsCl 密度 (25^) 

此外, 有人 介绍一 种制备 大体积 1^-: 糖梯度 的简单 方法, 此 法是将 20% 庶糖液 通过反 
复在 一 20°C —一 40°C 冰冻, 然后在 4t 或室 温融解 (2 — 3 次), 可获 得近似 线性的 10 — 
30% 蔗 糖梯度 ["1。 

• 179 • 



表 3-9 CsCl 的起 始密度 与重重 及最^ 体积间 的关系 



起 始密度 (克 / 厘米 3 ) 


1.66 


1.67 


1.68 


1.69 


1.70 


1.71 


1.72 


1.73 


1.74 


1.75 


1.76 


重量 (克) 


1.17 


1.19 


1.22 


1.24 


1.26 


1.29 


1.31 


1.33 


1.35 


1.36 


1.37 


最 后体积 (毫升 ) 


1.30 


1.30 


1.31 


1.31 


1.32 


1.32 


1.33 


1.34 


1.34 


1.34 


1.35 



(二) 样品的 装入和 离心: 

样品在 超离心 之前, 应作适 当的预 处理。 许多 大分子 (或 颗粒) 在 溶液中 都带有 电荷, 
离心沉 降时, 沉降快 的分子 可被沉 降慢的 带相反 电荷的 分子所 吸引, 减慢 沉降的 速度。 分 

离这类 样品前 ,应 加人适 量的低 分子电 介质, 以排 除沉降 时电荷 的相反 影响。 如在 lOfc 
蛋 白质溶 液中, 加人 0.2AfNaa 或 KC1 可使 静电吸 力对沉 降速度 的影响 减少到 1 以 
下。 样品中 如有容 易沉淀 的凝聚 物或其 它不溶 物时, 也 应预先 滤除。 还 要注意 样品的 
稳 定性, 有时须 加人缓 冲剂、 稳定剂 (硫 醇、 EDTA 、酶的 底物, Mg++) 等。 样 品液的 
密 度应小 于梯度 的最小 密度。 必要 时也可 将样品 用介质 做成倒 梯度, 使 高分子 样品的 
颗粒向 梯度方 向的扩 散与高 浓度小 分子梯 度介质 向低浓 度样品 带的扩 散速度 相等, 以减 
少因离 心前颗 粒局部 沉降所 造成的 分辨率 下降。 

样品 在梯度 中所处 位置有 四种, 即 顶部、 底部、 中间及 混合。 一 般样品 是以薄 层铺放 
在梯度 顶上。 样品的 用量对 分辨率 有很大 影响。 当颗 粒沉降 系数或 浮力密 度差较 小时, 
常 采用窄 样品带 (梯 度总 体积的 5 f 。以下 )。 样品 浓度不 要太高 (为 梯度介 质最低 浓度的 

10%)。 操作时 用吸管 吸取, 然 后沿管 壁小心 放人。 吸管 的尖端 绝不允 许接触 梯度的 液面, 
一般 要离开 0.5 毫米, 紧贴 管壁, 避 免自由 滴落。 离 心管最 好事先 放入转 子内, 以 免管子 
装入时 扰乱梯 度和样 品层。 外 摆式转 子加样 后的液 面与管 口相距 2 — 3 毫米。 如果 用角式 
转子 离心, 最好将 管子部 分充满 ,以防 止梯度 重新定 向时, 管帽分 裂梯度 ,还 可避免 梯度介 
质 对金属 管帽的 腐浊。 盛 放溶液 的多少 与管子 角度、 材料 强度、 厚薄 有关, 一般装 量约为 
1/3 — 1/2。 塑料离 心管要 加满, 一般梯 度介质 及样品 加完后 须用密 度小于 水的、 与 水不相 
溶的惰 性液体 —— 矿物油 (如 轻石 蜡油) 填满 (差速 离心可 全用样 品液充 满)。 有时 样品也 
可通过 一根长 金属导 管导人 管底。 此法 对分离 密度较 小的颗 粒特别 有用, 已用于 分离细 
胞、 核蛋 白等。 使用时 须注意 不能让 气泡进 入梯度 ,样 品密度 需用固 体介质 调到大 于梯度 
底部的 密度。 

样品装 好后, 将离 心管盖 拧紧, 小心放 入松紧 恰好的 离心管 腔内, 按照 事先设 计的离 
心条件 及转子 、离心 机的使 用说明 书进行 超离心 操作。 因为 生物颗 粒均不 稳定, 离 心一般 
均在 低温下 进行, 管子、 梯 度液、 转 子也最 好预冷 至一定 温度后 再装入 样品。 但低 温会增 
加梯度 的粘度 ,使离 心时间 延长, 不利 颗粒的 分离。 开始 离心时 应缓缓 加速, 离心 达所需 
时间后 ,须让 转子自 由地慢 慢停下 (不许 制动! )。 尤其在 5 '000 rpm 的低 速下, 速 度的剧 
变 很容易 扰乱梯 度液和 样品层 或梯度 中颗粒 区带, 当用粘 度小的 梯度如 (CsCl) 及 直径大 
的管 子时, 这种扰 乱更为 严重。 进行 平衡等 密度离 心时, 转 速不能 过高, 以 免盐梯 度的平 
均密 度超过 1.2, 管 底盐浓 度过高 而出现 结晶。 高 密度的 盐结晶 (如 CsCl 结 晶可达 4 克 / 
厘米 3 ) 受很 大的离 心应力 作用, 此应 力超出 了转子 的设计 限度, 会造成 事故。 

180 • 



区带转 子的离 心操作 不同。 以 动态装 放料区 带转子 为例。 梯度 液是在 转速约 3 '000 
Tpm 的 低速下 泵人. 首先 泵入的 是低密 度液, 通 过导管 分布于 转子的 四周。 由于 离心力 
的 作用, 在转子 内壁成 均勾的 一层。 随着 梯度液 的不断 加人, 较浓 梯度液 将把较 稀液不 
断推向 转子的 中心。 梯度液 加完后 ,再用 一种最 浓的液 体作" 塾 层", 将转子 整个密 闭空间 
充满, 以防止 颗粒在 转子壁 积累。 然后 通过转 子的中 心导管 缓慢地 (5 毫升 / 分) 加 人样品 
(样 品层 一般为 10 — 200 毫升) ,最 后再加 人一种 更低密 度的液 体作" 覆盖 层", 同时 有等体 
积的 "垫 层" 从转 子四周 被取代 出来。 上 述梯度 液及样 品加完 后移去 转子上 的加液 装置, 
将转 子加速 到预定 速度, 经过 一定时 间后, 就 能得一 系列分 级分离 区带. 然后转 子减速 
到 3.000 rpm ,以回 收颗粒 区带。 此时, 通过进 一步把 "塾层 "液加 到转子 周围, 可 逐渐置 
换出密 度较小 一端的 梯度液 ,并进 行分部 收集、 测定。 用 区带转 子可大 量制备 样品, 一次 
可高达 100 毫克 以上。 

(三) 取出 梯度: 

从 离心机 提出转 子和从 转子取 出离心 管并进 行回收 梯度区 带的操 作时, 应十分 小心, 
避 免管子 震动。 操作的 温度最 好与离 心时的 一致, 以 防温度 变化引 起的热 对流扰 乱区带 C 

否则 的话, 最 好的分 离也往 往由于 回收方 法的不 当或回 收操作 的错误 而招致 失败。 在处 
理粘度 小或斜 率小的 梯度时 ,更 应特别 小心, 以免使 分辨率 降低。 
梯度 区带的 分部回 收有如 下三种 方法: 

1. 底部 收集法 (穿 剌法) 这 是一种 简易的 手工操 作法。 采用针 穿刺离 心管底 部, 

使梯 度靠重 力自由 滴出, 然后依 次作分 部收集 (如图 6-9A)。 此法 适用于 薄壁塑 料管, 
操 作时先 将管固 定在支 架上, 然后用 一根针 将管底 刺穿, 使 梯度液 从小孔 滴出。 也 可事先 
在管底 贴一块 胶布, 防止 穿刺后 液体的 渗漏, 后用 22 号注 射针头 (鋸去 针尾) 小心 地经胶 
布剌人 管底, 让液 体缓慢 沿针头 滴下。 流 出液分 部收集 于小试 管中, 经分析 后决定 取舍或 
合并。 液滴 的大小 (或 流速) 可 通过将 梯度管 塞上橡 皮塞, 塞 子上插 人一根 连着橡 皮管和 
螺旋夹 的玻管 ,或通 过与一 测压计 连接, 维持 恒定的 压力来 控制。 也 可将离 心管与 一储液 
容器 连接, 以油 或稀溶 液补偿 滴下的 液体, 保 持流速 不变。 流 速一般 控制在 0.5 — 1 毫升 / 
分, 特别 是粘度 较大的 梯度, 缓 慢的流 速可减 少区带 沿管壁 的拖尾 现象。 

此法对 梯度扰 动小, 但离心 管不能 再用, 而 且不适 合回收 管底有 沉淀或 粘度大 的梯度 
(易导 人空气 ), 也不适 于不绣 钢管或 厚壁塑 料管。 

2. 顶部 收集法 顶部 收集法 又可分 为取代 法和虹 吸法。 

(1) 取 代法: 是 回收梯 度中最 常使用 的一种 方法, 分为向 上及向 下取代 二种。 向上 
取代可 用人工 操作, 方法是 通过用 针头穿 剌管底 或由插 入管底 的细管 注人浓 梯度液 ,将梯 
度液 从稀到 浓经顶 盖另一 出口管 排出。 如用一 It 液器 代替注 射器进 行穿刺 取代, 控 制流速 
的 效果会 更好。 使用梯 度回收 仪时, 从管 顶盖将 一根细 导管小 心插至 管底, 然后用 蠕动泵 
由导管 注人高 浓液体 (其 密度比 梯度大 ), 迫使 梯度中 的分离 区带依 次从盖 上另一 出口管 
流出, 以小 试管分 部收集 (图 6-9B)。 操作 时应先 排除导 管内的 空气。 用 作取代 液的溶 
质应是 惰性的 ,溶 度要足 够大, 能形 成高浓 溶液。 常 用的取 代液有 蔗糖、 盐 以及某 些与水 
不相混 合的浓 溶液, 如四 漠甲院 (密 度可达 2.96 克 / 厘米 3 ) 等。 取代液 如是水 溶液, 则最 
好与 梯度介 质组分 相同, 以免 产生扩 散混合 现象。 

• 181 • 



02 ― 



OT ― 



- 液体石 緒贮器 



= 通活塞 




1 毫升 注射器 



梯度 



乂乂 



梯 度分部 



取代液 



离心管 帽- 
石 蜡- 



梯度 一 1 



取代液 




收 集区带 



离 心管帽 
水 或空气 



分部 



(B) 




水 或空气 



螨动泵 



(C) 



夹具 



夹具 



图 6-9 回 收梯度 的方法 
CA; 底 部穿刺 收集法 (B) 向上 取代法 (C) 向下 取代法 

向 梯度顶 部充入 空气或 轻液体 (水 ), 也可 从插人 底部的 导管由 浓到稀 地从顶 盖取代 

出梯 度液。 这种取 代法称 为向下 取代法 (图 6-9C) 但效果 较差, 较少 使用。 

除穿刺 取代法 以外, 其它取 代方法 多用于 不绣钢 管和厚 壁管, 使 用取代 法时流 速应缓 
慢, 以 免管壁 滞留液 体而造 成梯度 混合。 这种混 合现象 可通过 使用疏 水的窄 、短梯 度管而 
减少。 取代前 梯度顶 部如有 悬浮不 溶物, 须事先 除去。 流出管 应尽可 能短, 以减少 管内混 
合, 而导致 分辨率 下降。 此法优 点是不 破坏离 心管, 管子 能反复 使用, 能用 于较粘 梯度, 是 



182 



回收梯 度最好 的一种 方法。 缺点是 开始取 代操作 时易引 起扰乱 ,操作 需要特 别小心 ,而且 
不适 合粘度 更大的 梯度。 取 代法可 借光学 (或放 射性) 系统进 行流出 液跟踪 ,简 化分析 化验. 
工作。 

(2) 虹 吸法: 此法 是用一 根聚乙 炼小管 插到管 底部, 用虹吸 法吸出 梯度。 它 也不损 
伤离 心管, 尤其适 用于不 锈钢管 中物质 的分级 分离。 但虹 吸时易 引起分 离区带 扰乱, 最好 
使用 专门的 装置。 例如 DGF-U 型密 度梯度 自动产 生器, 就 是一部 用蠕动 泵逆向 运转而 
以 虹吸收 集梯度 区带的 分部收 集器。 

除以上 取代法 和虹吸 法外, 有时从 管上部 直接仔 细地用 注射器 或吸管 定量移 出梯度 
液, 也 可收到 较好的 效果。 如 果已知 某颗粒 区带的 位置, 也可 用注射 针头刺 人管壁 抽取, 
伹效 果差。 

(3) 切 割法: 极粘 的梯度 宜用切 割法。 所 谓切割 法就是 用离心 管切割 器将冻 结的塑 
料 管子切 成薄片 的一种 方法。 此法仅 适用于 赛瑯络 管或硝 酸纤维 素管。 操 作时把 离心管 
插在操 纵台的 孔中, 后 用一锐 利的切 刀切割 管子。 切下 的部分 留在刀 刃上, 然后用 注射器 
或吸管 吸取这 部分梯 度液, 如此 即能逐 一将梯 度分部 收集。 操作中 应注意 夹紧各 可动部 
分, 减少切 口周围 的渗漏 现象。 

切割器 的型号 很多, 如日 立公司 55P-2 型超离 心机的 TSU-2 型离 心管切 割器。 较新 
的切割 法是在 梯度中 加人丙 炼酰胺 、核黄 素和交 联剂, 离心 后将梯 度曝光 聚合, 然 后再进 
行切 片操作 [ 18 ] 。 

(四) 梯度 的分析 

在制 备梯度 和样品 液或需 了解离 心后颗 粒区带 在梯度 中的位 置时, 应进 行密度 测定。 
测定密 度的最 简单方 法是用 折射计 ,此法 迅速, 用量少 ,如 阿贝折 射计仅 需样品 25 微升左 
右。 由于折 射率与 密度有 正比的 关系, 通过折 射率即 能换算 出被测 梯度液 的密度 (如表 
6-10)。 但折射 率与温 度等因 素有关 ,须考 虑这些 因素的 影响。 梯度 的密度 也可用 比重瓶 
直接 测定, 但样 品用量 较大, 通常需 0.1 — 0.3 毫升。 

梯度 通过适 当方法 分部收 集后, 应进 行分析 化验, 以便分 类合并 或作后 处理。 分析梯 
度中的 回收物 质常用 紫外吸 收法、 酶活力 测定法 、放 射标记 法等。 蛋 白质, 核酸或 某些含 
蛋白质 、核 酸占优 势的细 胞器, 病 毒等可 用紫外 吸收法 测定。 细胞器 一般可 测定标 志酶活 
性, 通常每 一组分 至少选 二种标 志酶。 如一时 找不到 更好的 测定目 的物, 也 可测光 吸收来 
推断 分部的 组分。 对于同 位素标 记物, 最好 是测定 其放射 活性。 此外, 某些 情况下 也可用 
免 疫法、 电泳 法或在 500 — 600 nm 下用光 散射法 测定物 质在梯 度中的 分布。 亚细 胞成分 
可 用电镜 或光学 显微镜 (如 相差显 微镜) 观察 分析各 分部的 组分和 分布。 最 后根据 分析结 
果 绘图。 

梯度介 质对梯 度分析 的影响 很大。 如 糖介质 (尤 其庶糖 )、 metrizamide 能抑制 酶活, 
测 定时每 次介质 浓度应 一致。 有 时适当 的稀释 也能有 效地解 除这种 影响。 又如碘 化物、 
三 碘苯衍 生物、 Ludox 等有强 烈紫外 吸收, 能干扰 核酸、 蛋白 质紫外 测定。 三 碘苯衍 生物, 
蔗 糖等也 干扰放 射活性 测定。 

凡对分 析有干 扰的梯 度介质 ,均 应设法 避免。 如单 双糖、 多糖或 metrizamide 都干扰 
核酸、 蛋 白质和 糖原的 分析。 单 双糖、 metrizamide 可透析 或超滤 除去, 或 用酸、 乙 醇使核 

• 】83 . 



表 6- 10 各 种梯度 介质的 折射率 17 与密度 P 的换 算公式 



介 质 


公 式 


庶糖 


Po。 = 2.732977,0° 一 2.6425 


Ficoll. 葡聚糖 


II 


牛血清 白蛋白 


11 

oo 

CO 


M C t r 1 Zci 1)1 ici c 


11 

1 

11 
1 

t— ' 


Ludox 


p = 8.204;7 一 9.936 


CsCl 


p,o° = 9. 9688^7,0° 一 12.292 (适用 于密度 1.00 — 1.29, 折射率 1.333 — 1.360) 
/020° = 10.92767,00 一 13.593 (适用 于密度 1.22 — 1.90, 折射率 1.355 — 1.418) 
Pw。 = 10.24027?„o ― 12.6483 (适用 于密度 1.00—1.38, 折射率 1 .333 — 1 .370) 
(0„o = 10.860l77„o 一 13.4974 (适用 于密度 1.25 — 1.90, 折射率 1 .357 — 1 .418) 


CsjSO^ 


p„o = 12.120>7"° — 15. 1662 (适用 于密度 1.10 — 1.40, 折射率 1.342 — 1.366) 
Pr,o = 13.6986;7»° 一 17.3233 (适用 于密度 1.40—1.80, 折射率 1.366 — 1.396) 



注: (1) 水在 2(PC 的折 射率为 1.3330。 (2) 上 述公式 仅适用 蒸馏水 配制的 介质, 未考 虑其它 成分。 如介 质中还 
包含缓 冲剂、 其 它盐、 EDTA 等 成分, 应作 折射率 修正。 



酸、 蛋白质 沉淀而 分开; 多糖则 用稀释 或离心 解除。 被测物 质的浓 度也影 响分析 准确度 ,紫 
外 分析蛋 白质浓 度应为 0.2 — 39^0, 核酸浓 度最低 限度为 0.004fc。 

进行 梯度分 部的分 析时, 对颗粒 的分布 必须心 中有数 ,才 能有目 的地选 择测定 方法。 

(五) 操作注 意事项 

超速 离心机 是生化 制备和 生化研 究的重 要精密 设备, 又 因其转 速高, 产生的 离心力 
大, 使用不 当或缺 乏定期 的检修 保养, 都可 能发生 事故。 

离心 机故障 大多由 转子的 不平衡 引起。 离心管 的称量 误差; 长 期使用 造成转 子表面 
的腐蚀 、损伤 ;离心 管放错 位置; 管 子重力 中心的 不平衡 (重量 相同的 梯度管 和非梯 度管不 
能一 起离心 ); 塑料离 心管的 变形、 破 裂等是 引起转 子失衡 的主要 因素。 失 衡的严 重后果 
是导致 驱动杆 弯曲, 甚 至使转 子抛离 转轴。 在 离心过 程中, 转子必 须垂直 放下或 提起, 避 
免碰撞 转轴, 一旦发 生转轴 弯曲或 断裂, 应更换 后才能 使用。 

为了保 障使用 安全, 初 学者除 严格按 说明书 规定的 程序使 用外, 还要熟 悉和掌 握所用 
离 心机和 转子的 性能, 以及维 修保养 事项。 遇有 疑问, 或 操作中 发生故 障时, 应请 专人处 
理。 转子、 离心管 用后须 用温水 或中性 去污剂 清洗、 干燥后 保存。 塑 料管最 好在低 温避光 

处 保存。 区带转 子必须 拆下各 部件, 依 次用自 来水、 蒸馏水 (有 时还用 70f。 乙醇) 洗漆, 除 
去 痕量残 存的梯 度液, 以防结 晶堵塞 液管。 铝转子 应定期 上蜡, 防止水 分进入 裂缝。 

六、 制 备超离 心实例 

(一) 用 CsCl 平衡等 密度离 心法制 备质粒 DNA"^ 

此法是 利用添 加溴化 乙锭影 响线形 DNA、 双螺 旋环状 DNA、 或超螺 旋环状 DNA 
等的 浮力密 度而达 分离。 

(1) 在大 肠杆菌 培养液 1.6 升 (E650 约 0. 6 ) 中 加入约 0. 2 fc (V/V) 的 氯仿, 摇动 10 

• 184 . 



分钟 以杀死 菌体, 然后除 去不溶 氯仿。 

(2) 在 4t、8,00()g 下, 离心 15 分 钟收集 菌体。 然后 悬浮在 1'200 毫升 PH8.0 的 50 
mM Tris— HC1 中, 再在 4t 8,000 g 下离心 15 分钟, 收 集沉降 细胞。 

(3) 将 大肠杆 菌细胞 沉积物 悬浮在 4 t 的 130 毫升會 25% (W/W) 蔗糖的 5 rnM 
Tris-HCl (pH8.0) 中, 并加人 13 毫 升溶菌 酶溶液 (10 毫克 / 毫升, 溶于 pH 8.0 的 5 mM 
Tris— HC1 中), 5 分 钟后, 再加人 26 毫升 0.5 M EDTA (pH 8.2), 混匀后 301 保温 15 
分钟。 

(4) 加人 120 毫升 3.6% (V/V) 的 Triton X-100, 使最后 浓度为 1.5% (V/V), 并 
在 20<<: 保温 10 分钟, 使原 生质体 胞溶。 

(5) 混 合液于 4t、 65,000g 下离心 1 小时。 

(6) 倾析 除去上 清液, 在约 200 毫升 残留物 中加入 其体积 1/9 的 5M NaCl 和 最终浓 
度达 10f。 (W/V) 的聚 乙二醇 (分 子量 6'000)。 

(7) 混 合液在 20°C 下搅伴 ,使聚 乙二醇 溶解, 然后在 4力 下放置 过夜。 

(8) 于 4C、 8,000 g 下离心 15 分钟, 再将沉 淀溶于 10.8 毫升 0.1XSSC (15 mM 
NaCl、 1.5 mM 柠檬 酸钠, pH7.0) 中, 然后 再加人 11.7 克 CsCl 和 1.2 毫 升溴化 乙锭液 (2 
毫克 / 毫升 )。 

(9) 剧烈 搅伴使 CsCl 溶解, 再 用水或 CsCl 将溶液 的折射 率调到 1.3880 — 1.3890。 

(10) 在 MSE10X 10 钛角 式转子 的二个 聚碳酸 酯管中 各加人 7.5 毫升上 述液, 然后 
用 石蟮油 将管子 加满。 20。C、 40,000 rpm 下离心 64 小时。 

(11) 用 顶部收 集法回 收质粒 DNA 的 区带。 

(12) 用 CsCl 所饱和 的异戊 醇或异 丙醇反 复抽提 ,或 将收集 的梯度 液通过 Dowex 50 
树 脂而除 去有机 杂质。 然后在 4^ 下对 0.1 XSSC 透析 3 天, 可得基 本没有 非质粒 DNA 
的活 性超螺 旋质粒 DNA。 

此 法所得 的质粒 DNA 较多, 每 管可达 500 微克。 

(二) 用 RbCl 梯 度纯化 多瘤病 毒"" 

(1) 用小 白鼠胚 细胞在 培养基 (Eagle 氏培 养基加 10% 牛 血清) 中, 以少于 或等于 1 
转 / 分 的旋转 速度进 行摇瓶 培养, 使细 胞生长 汇合。 每瓶 含汇合 细胞约 10 8 , 需 100 — 200 
毫升培 养基。 

(2) 培养 物用多 瘤病毒 毒株以 1 pfu/ 细 胞进行 侵染, 在 n 叱 下保温 一周后 收获。 

(3) 将每瓶 细胞和 培养基 转入离 心管, 加 5f。 体积的 0.4 U 碟酸 缓冲液 (pH5.6), 并 
冷却到 4<t:。 低 pH 和低温 可保证 大多数 病毒吸 附到细 胞上, 培养 基中仅 留下极 少病毒 
(10 2 HAU/ 毫升 或更低 )。 2,000 g 下低 速离心 15 分钟, 弃去上 清液。 

(4) 以每 10 8 个 细胞重 悬浮于 2.5 毫升 Tris 盐水中 ,4°C 下 存放, 并检 查有无 细菌污 
染。 若无 污染则 将样品 4 份 合并转 入烧瓶 (每瓶 4 X10 8 个 细胞, 10 毫升 Tris 盐水) 中冻、 
融 三次。 

(5) 每 10 毫升 悬浮液 中加人 2.5 毫升霍 乱弧菌 的受体 破坏酶 (RDE), 37t 保温 24 
小时 以破坏 受体。 悬 浮液经 RDE 处理 后加人 5% 体积的 1A/ NaHCOj 使呈 碱性, 加热至 
37<t:o 2,000 g 下离心 15 分 钟以除 去细胞 碎片, 然后用 10 毫升热 Tris 盐水洗 漆沉淀 ,并 

• 185 • 



悬浮于 10 毫升 THs 盐 水中。 此步 处理须 从各分 部取样 0.1 毫升, 用 确酸缓 冲的盐 水稀释 
100 — 10,000 倍, 保温 30 分钟, 再用血 球凝集 测定法 估算解 离出的 病毒。 经一次 
RDE 提 取后, 如仍有 10 — 20fc 以上病 毒留在 细胞碎 片上, 应重复 处理, 或增加 RDE 用量 
(但 应避 免过量 RDE 进入 病毒液 )。 

(6) 将 较稀的 病毒悬 浮液在 80,()()0 g 下离心 2 小时, 使病毒 浓缩, 并重悬 在少量 Tris 
盐 水中。 

(7) 5 克 RbCl 溶于 7.6 毫升 0.05 Tris 缓冲液 (pH 8.0) 中, 以每管 3 毫 升量分 
装三个 塑料离 心管。 每 管加人 1 毫升 病毒悬 浮液并 掼伴到 上半个 梯度。 在 10±5^ 下, 
30,000 rpm 离心 24 小时。 用穿刺 法分部 收集。 

(三) 用 CsCl 等密 度离心 提纯染 色质蛋 白质" ] 

(1) 将染 色质在 缓冲液 (含 5M 脲、 ImM 二 硫赤藓 糖醇、 0.1 xnM EDTA 和 ZAfNaCl 
的 10rnM、 pH7.5Tris— HC1) 中 勾化, 然后在 12,000 g 下离心 10 分钟。 倾出上 清液, 沉 
淀在同 一缓冲 液中再 勾化, 使染 色质在 高离子 强度的 盐介质 中充分 解离为 核酸和 蛋白质 
组分, 再在 12,000 g 下离心 10 分钟。 合并 二次上 清液, 用蒸 馏水稀 释染色 质的蛋 白质至 
浓度为 1 毫克 / 毫升 (或更 少), 然后加 人等体 积的含 0.1 mM 苯 甲基橫 酰氟的 55% (W/ 
W) CsCl 溶液 (5.5 AO, 混勾。 

(2) 在 MSE 10 X 10 钛角式 转子的 离心管 中放入 5 毫升 上述混 合液, 再用液 体石蜡 
装满, 并在 4°C, 50,000 rpm 下离心 68 小时。 

(3) 离心 后用向 上取代 法取出 梯度, 5 毫 升梯度 的上面 1.5 毫 升部分 均含蛋 白质, 可 
分部 收集。 

(4) 通过透 析或凝 胶过滤 脱盐, 得纯染 色质蛋 白质。 

(四) 用 NaBr 等密度 离心分 离血装 脂蛋白 W 

(1) 用稀 NaBr 液 (11.4 克 NaCl 和 0.1 克 EDTA, 以 蒸馏水 定容至 1 升, pH 7.8) 
和浓 NaBr 液 (263 克 NaBr、 11.4 克 NaCl 和 0.1 克 EDTA, 以 蒸熠水 定容至 1 升, 调 pH 
7.8) 通过 梯度产 生器, 在 MSE3 X 25 外摆式 转子的 离心管 中制备 20 毫升 密度为 1.003 
— 1.2 克 / 厘米 S 的 NaBr 线性 梯度。 

(2) 每 毫升血 清样品 中加入 0.32 克 NaBr, 将密 度调到 1.22 克 / 厘米 3。 

(3) 将 0.5 — 1 毫升样 品分层 到梯度 的底部 ,样品 层下面 再铺放 1.5 — 2.0 毫升浓 NaBr 
液 (0.582 克 / 毫升 )。 导入样 品层应 注意排 除气泡 ,以 免扰乱 梯度。 

(4) 在 4 力, 30,000 rpm 下离心 2 小时。 从 静止到 5,000 rpm 要上 得慢, 一般达 I'OOO 
rpm 应为 3 分钟 左右, 1,000 — 5,000 rpm 为 2 分钟, 后 按正常 加速。 

(5) 离心后 通过向 上取代 法取出 梯度。 通常最 低密度 脂蛋白 在梯度 顶部, 较 低密度 
脂蛋 白在顶 部以下 10 — 15 毫升 之间; 而高密 度脂蛋 白与其 它血清 蛋白一 起在原 样品位 
置。 

(五) 用线性 或阶梯 蔗糖梯 度制备 线粒体 【 7] 

(1) 500 克蓖 麻籽, 在室 温下用 水浸泡 过夜, 浸泡 过的蓖 麻籽在 3()°C, 湿润条 件下萌 

• 186 . 



发 5 天。 

(2) 除去 萌芽蓖 麻籽的 胚芽和 子叶, 将胚乳 组织用 蒸馏水 洗漆后 置冰中 冷却。 

(3) 制备 500 毫 升由下 列成分 组成的 混合液 (研磨 介质) : 0.4M 蔗糖, 0.165 MpH7.5 
麦黄酮 (trkine) 缓 冲液, 0.01 M KC1, 0.01 M MgCl^, pH 7.5 0.01 M EDTA, O.OIM 二硫 

苏 糖醇。 

(4) 在 60 克胚 乳组织 中加入 90 毫升 上述混 合液, 并 用擒碎 机捣碎 6 分钟。 

(5) 将粗糊 状物在 冰浴中 研磨成 细糊。 

(6) 用棉布 粗滤, 滤液在 270g 下离心 10 分钟, 除去 细胞和 大细胞 碎片。 上清 液倾入 
冷却离 心管, 10,800 g 下离心 30 分钟。 所得细 胞器沉 淀物再 悬浮于 4 一 6 毫升研 磨介质 
中。 

(7) 用 pH 7.5、 0.01 M EDTA 溶解适 量蔗糖 ,配成 60、 57、 50、 44 和 33% 的蔗 糖液, 

然后 按顺序 加人以 建立蔗 糖阶梯 梯度。 也 可先加 16 毫升 60fc 庶 糖液, 然 后仔细 地在上 
面建立 33 — 60% 的蔗 糖线性 梯度。 

(8) 在梯度 上仔细 地铺入 1 一 2 毫 升细胞 器悬浮 液的样 品层。 

(9) 用 SW 25.2 外摆式 转子于 23,000 rpm 下离心 5 小时。 

(10) 离心 后用底 部收集 法回收 分离线 粒体。 测 定各分 部柠檬 酸合成 晦和苹 果酸脱 
氢酶 活性。 



(六) 用差速 离心法 分离大 白鼠肝 脏中各 种亚细 胞成分 

鼠肝 脏组织 

1 0.25 M 蔗 糖磯酸 缓冲液 

肝勾浆 (10% W/V) 

! l,000g, 10' 平均 8 厘米) 



C6J 



I 

沉淀 
(细 胞核) 



4- i 
沉淀 上清液 1 

® 0.25 A/ 鹿 糖洗 三次。 
② l,000g,10'(r 平均 8 厘米) 

h 清液 J 

1 3,300 g, 10' (r 平均 8 厘米) 



i 

沉淀 



® 0.25 M 廉糖 洗三次 

© 3,300g,10' (r 平均 8 厘米) 



沉淀 (溶 飽体) 



上清液 



> 上清液 

丄 100, 000g, 3 0' ( r 平均 6 厘米) 



沉淀 

(微 粒体) 



上清液 



參 考文献 



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. 137 • 



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[201 Catsimpoolas, N., Methods of Cell Separation, Vol. 1 (1977) 



• 188 



第七章 过滤 与膜分 离技术 

苏拔贤 卓筆文 

第一节 过 滤 [ 1一4 ] 

过滤 是利用 多孔介 质阻留 固体而 让液体 通过, 使固体 和液体 分离的 方法。 在 生化制 
备中, 从 原材料 处理到 产品的 提取分 离精制 都可能 涉及到 过滤。 过 滤的目 的一是 除去不 
溶性杂 质得到 所需的 清液以 便进一 步提纯 ,二 是收集 固体中 间产物 或结晶 成品。 

一、 过 滤速度 

一般以 单位时 间内单 位过滤 面积流 出的滤 液体积 计算。 常用下 式表示 

U _ n7rd'*APo 
128^L 

U = 过滤 速度; 

n = 过滤 面积上 的滤饼 毛细孔 道数; 

APo = 毛细 管孔道 两端的 压强降 (千克 / 米 2 ) 

P= 滤液 的粘度 (千克 *秒/ 米 2) 

L = 滤 饼厚度 (米 ); 

« = 毛细 管孔道 弯曲程 度校正 系数; 
d = 毛 细管孔 道直径 (米) . 

实际 上滤饼 毛细管 孔道的 情况很 复杂, n、 a, d 难 于准确 测定。 故上式 只能反 映各因 
子的 相互关 系及各 因子所 起作用 的综合 结果。 从上式 可知, 影响滤 速的因 素有: 

(1) 液体的 粘滞度 越大, 滤速 越慢; 粘滞度 随温度 升高而 降低, 故升温 可增加 滤速。 

(2) 滤材 (如 滤纸、 滤布、 玻璃 纤维、 石 棉板, 多孔 陶质滤 板等) 的 毛细管 愈长, 管径愈 
小 或数目 愈少, 则滤速 愈慢。 

(3) 压差 愈大, 滤速 愈快。 

(4) 滤澄层 越厚, 滤速 越慢。 

(5) 沉 淀中有 胶状物 或其它 可压缩 的物质 (如 细菌或 发酵液 中的悬 浮物等 ), 均易堵 
塞滤孔 ,使滤 速大大 减慢。 

二、 提高滤 速的主 要措施 

选 择适当 的过滤 介质, 添加助 滤剂, 增 加过滤 推动力 及加大 过滤面 积等, 均可 增加滤 
速, 现分述 如下: 

' • 189 • 



(一) 选择适 当的过 滤介质 

1. 选择过 滤介质 应考虑 的因素 

0) 孔径 大小适 于截留 被分离 的固体 微粒, 孔径 过大, 则滤液 不清, 太小则 滤速过 

慢。 

(2) 孔的数 量多, 孔道短 且不很 弯曲, 则滤 速快, 否则滤 速慢。 

(3) 耐酸碱 ,化 学稳定 性好。 

(4) 有一 定机械 强度, 易于 回收。 

(5) 工业上 要求再 生方便 ,使用 寿命长 ,成 本低。 

2. 过滤介 质简介 

(1) 通常棉 、麻、 丝织 品适用 于沉淀 颗粒较 粗或较 粘稠的 中性、 弱 酸性或 弱碱性 物料, 

但不 耐强酸 强碱。 

(2) 实验室 中最常 用的是 滤纸。 滤 纸分工 业用和 分析用 两类。 按其材 质和滤 速的差 
别又分 慢速、 中速 和快速 三种。 一般德 纸不耐 强酸、 强碱。 近来国 外濾纸 的型号 规格很 
多, 分别 适于过 滤各种 物质。 离子交 换滤纸 在过滤 时还兼 有分离 作用。 日本 TOYO 出 
品的离 子交换 滤纸有 DEAE, ECTEOLA 阴离 子交换 滤纸和 CM 阳离 子交换 滤纸。 此 
外还有 供特殊 试验用 的活性 炭滤纸 、采 血用的 滤纸、 玻璃 纤维滤 纸等。 过滤 时滤纸 折叠形 
状对 滤速有 影响, 有平折 法与多 折法, 见图 7-1。 多 折法滤 速一般 比平折 法高。 




多折法 

图 7-1 滤纸的 各种折 叠方法 



(3) 过滤 介质还 有玻璃 纤维, 垂溶 玻璃、 石棉 或烧瓷 滤板, 漆 论等。 
玻 璃纤维 或垂熔 玻璃滤 器可耐 强酸, 但不耐 强碱。 石棉 或烧瓷 滤板, 漆论等 可耐强 
酸、 强碱。 食品、 医药及 发酵工 业中因 过滤面 积大, 并 考虑到 成本、 再生及 耐用等 因素, 多 
用漆纶 、卡 普论、 尼龙 66、 维 尼纶等 作过滤 介质。 它们 不仅抗 酸碱, 耐用, 而且不 沾料, 易 

• 190 . 



再生。 漆论 有多种 规格, 其粗密 孔径各 不相同 ,可 根据需 要选用 



(二) 加 助滤剂 

过滤时 滤饼的 形成对 滤速影 响很大 ,如 组成滤 饼的颗 粒很小 而粘度 较大, 则增 加压力 
不但不 能增加 滤速, 而且 滤饼中 毛细孔 变形缩 小还会 使滤速 减慢。 这时 需加助 媳剂, 以增 
加 滤饼疏 松度, 防止堵 塞过滤 介质的 孔道。 常用助 滤剂有 硅藻土 ,活 性炭, 纸粕, 细 砂等。 
加助滤 剂的方 法是在 过滤前 把助滤 剂先均 匀铺在 过滤介 质表面 ,或与 滤液混 合一起 过滤, 
滤毕再 回收助 滤剂。 最好选 用易与 样品分 离的助 滤剂。 

(H) 增 加过滤 推动力 

通常 推动力 愈大, 滤速 愈快。 根据产 生过滤 推动力 的条件 不同, 分为 常压、 加 压和减 
压过滤 三种。 

1. 常 压过滤 主要由 滤液位 差产生 推动力 引起过 

滤。 因此滤 速慢, 操作时 间长, 很少用 于分离 大量样 品或不 
稳定 物质。 工业 上的吊 滤及实 验室中 常规过 滤属于 此类, 
简单装 置如图 7-2 及图 7_3 (a)。 此 法补充 加样时 间难掌 
握, 如改 为连续 过滤, 则较 方便, 简单装 置如图 7-3(b)。 

2. 加 压过滤 用 压縮气 体加大 液体所 受的压 力或用 
泵把样 液输送 至过滤 装置时 产生液 压作为 过滤的 推 动力。 
加压过 滤时压 力愈大 ,滤速 愈快, 直至 滤饼的 厚度和 粘结度 
增 加至一 定限度 时增压 才失去 作用。 加压过 滤适用 于粘度 
较大, 沉 淀颗粒 较细的 溶液。 如工 业用的 板框过 滤机, 加压 
叶 片过滤 机属于 此类。 实 验室常 用加压 过滤装 置如图 7- 
4o 它 的特点 是装样 漏斗或 过滤器 需用坚 固材料 (如 金属) 
制成且 密封。 并 注意在 用前做 好安全 检查。 

3. 减 压过滤 和加 压过滤 相反, 是在过 滤介质 下方抽 真空, 以 增加过 滤介质 上下的 
压差, 推动 溶剂通 过过滤 介质。 实 验室常 用的和 特殊的 减压装 置如图 7-5 及 7-6。 工业 




(a) (b) (c) 



图 7-3(a) 实验 室几种 常压过 滤装置 

• 191 . 





图 7- 3(b) 连 续过滤 的仪器 ' 
a — 具虹 吸瓶的 装置; b —— 具分液 漏斗的 装置; C —— 具 倒置锥 形烧瓶 的装置 




金属 制石棉 过滤加 压装宣 金 属制膜 过滤加 压装置 



图 7-4 实验室 中常用 加压过 滤装置 

装置有 陶瓷抽 滤缸, 转鼓真 空过滤 机等。 

加 压过滤 与减压 过滤的 共同点 是过滤 介质下 面必须 有支持 滤板, 或过滤 介质。 都是 
一些强 度较大 的烧瓷 滤板等 物质。 

此外, 还有 离心过 滤法, 实 验室装 置如图 7- 7 所示。 利用 离心机 产生的 离心力 促使滤 
液通 过过滤 介质, 分 离效果 更好。 但过 滤液体 积小, 多用于 分离临 床的小 量组织 样品。 

(四) 提高 过滤时 的温度 

升温使 溶液粘 度减少 ,溶质 溶解度 增大, 对 提高滤 速显然 有利。 但此法 不适用 于热敏 

• 192 • 




垂 焰玻璃 
过滤板 (蹄板 > 



磁 过滤扳 
(蹄板 ) 



蹄 板漏斗 




图 7-6 实 验室用 的特殊 减压过 據装置 



物料。 实验 室加热 过滤装 置如图 7 - 8 。 



(五) 其他 

增加过 滤面积 ,减 少滤饼 厚度等 均可提 高滤速 



图 7-7 离心过 滤装置 




热逸 

图 7-8 实验室 加温过 滤装置 



三、 生化 工业常 用的过 滤装置 

(-) 板框 压滤机 

它是 一种加 压过滤 装置。 结 构如图 7-9。 主要部 分由交 替排列 的滤板 (1) 和滤框 (2) 
组成, 其中 滤板又 分为过 滤滤板 和洗漆 滤板。 滤 板和滤 框由机 座两旁 两条平 行横梁 支撑。 
机座 (3) 上有固 定端板 (4) 和借 滚轮移 动的可 动端板 (5)。 滤板和 滤框之 间夹着 滤布, 滤布 
上 开有与 滤板孔 洞相通 的孔。 当端板 (4) (5) 将 板框压 紧时, 相邻的 每两个 滤板与 其所夹 
住的 滤框组 成独立 的过滤 小室。 板框 上缘有 三个孔 (有的 只在上 缘两角 各开一 孔)。 中间 
孔为过 滤液进 口通道 ,旁边 两孔为 洗漆液 通道。 图 7-10 为滤 板与滤 框的放 大图。 

使用时 按过滤 滤板、 滤框、 洗 漆滤板 的顺序 安装, 压紧。 在加入 待滤液 以前, 先 从过滤 
液进口 通道压 入清水 试漏, 除滤清 液开关 以外, 它处 均无水 喷出。 即证 明滤机 可用。 随后 
通入 压缩空 气驱去 机内试 漏水, 再用泵 压入待 滤液。 图 7-ll(a) 为 板框压 滤机的 工作简 
图。 待滤液 流经滤 液进口 通道后 ,由 滤板暗 孔进入 滤框。 滤液 通过滤 板上的 滤布, 沿板上 
沟渠自 下方旋 塞开关 排出。 

• 194 • 





锥形 过滤為 




胎 盘组织 
纱布 

金属 固定片 
'80 目支持 M 



普通玻 璃离心 心 ^ 



滤出液 




滤出液 



SW0 



71 -一-一 | _|^??3.^||三 -- |二: 一 

离心力 




架 

支 



离心力 



1. 據板, 2. 滤框, 



图 7- 9 压滤机 

;. 机座, 4. 固定 端板, 5. 可动 端板, 6. 水 压机, 7. 悬 浮液, 洗涤 水及压 

缩空 气的进 口管, 8. 滤液 及洗涤 水的排 放旋塞 




(a) 




图 7-10 滤板 (a) 和據框 (b) 放大图 
(a) 滤 板上为 滤布; (b) 滤 框中空 

洗漆滤 渣时, 关闭待 滤液进 口通道 ,洗漆 液由洗 涤液进 口通道 压人, 经 洗漆滤 板上的 
暗孔进 人滤框 ,如图 7-ll(b) 所示, 关闭过 滤滤板 下的滤 液排出 旋塞, 洗涤 液透过 两层滤 

布和 全部滤 澄层后 排出。 

板框 压滤机 的操作 压强由 待滤物 的性质 决定, 一般 为表压 2 一 3 个大 气压。 过 滤中性 

或碱性 物料多 用铸铁 板框。 过滤酸 性物料 常用木 
板框。 此外 还可用 祷钢, 玻璃钢 ,硬 聚氯乙 稀等制 
成 板框。 它们 各具有 优点, 使用滤 板和滤 框的数 
量 一般为 10 至 6 0, 如过 滤少量 物料, 不需 通过全 
部板框 ,可取 无孔隔 板插入 机中, 使 隔板后 面的板 
框不起 作用。 

板框 压滤机 因结构 简单, 操作 方便, 造价较 
低, 过滤效 果好, 现 仍广泛 应用, 近 年又不 断向机 
械化、 自动 化方向 发展。 



(二) 转 筒真空 过滤机 

是 一种减 压过滤 装置, 也是生 化工业 中常用 
的过滤 设备。 它包括 转筒分 配头, 料槽, 真空系 
统、 压缩空 气系统 及离心 泵等。 

当物料 进入料 槽后, 需 搅伴使 固体不 致沉降 

料槽中 置刮刀 式转筒 ,见图 7-12。 转筒内 每个扇 
形室, 有 网或栅 便于铺 滤布。 已 铺滤布 的转筒 转动时 (转 速为 0.1 — 2.6 转 / 分), 各 室经转 
筒 的空轴 枢内的 通道与 固定的 分配头 相连。 通过分 配头可 吸气或 压气, 使区 I 各 室产生 




(b) 洗洚水 
图 7-11 



195 




真空, 将 滤液吸 入转筒 各室, 而固 体则被 阻留于 筒面。 转筒旋 转时, 滤渣 随之上 升到区 11 

的 位置, 滤渣中 剩余液 体即被 吸去。 区 m 为空 白区。 到区 IV 时由 供水管 7 喷 水洗漆 
滤渣, 又称洗 漆区。 区 V 又是空 白区。 到区 VI 时通 过分配 头压缩 空气将 转筒上 已洗净 
吸干 的滤澄 吹松。 转筒继 续旋转 ,滤渣 被刮刀 刮下, 最 后转筒 上的滤 布在区 vm 经蒸汽 
洗净重 新循环 使用。 

-仏 






5、 6. 



图 7- 12 转筒真 空过滤 机操作 简图: 
1. 转筒, 2. 分 配头, 3.、 4. 与 减压相 接的管 J 

与 压縮空 气相接 的管, 7. 喷水管 
I. 吸气过 滤区, n. 滤瓶吸 干区, III. V. IX. 空白 
区, IV. 洗漆滤 饼区, VI. 吹松滤 饼区, vn. 卸滤 

饼区, VIII. 滤饼 清洗区 



图 7-13 转筒 真空过 滤机分 配头: 

1. 转 动盘, 2. 固 定盘, 3. 与减压 管相通 的缝隙 , 4. 与 
洗涤 It 槽 相通的 缝隙, 5.、 6. 与压缩 空气相 通的缝 
隙, 7. 转动盘 上的孔 



分配头 是真空 过滤机 的重要 部件, 各 区的工 作由它 分配。 分配头 包括转 动圆盘 1 和 
不 动圆盘 2, 见图 7-13。 当转动 圆盘上 的孔与 不动圆 盘上的 大缝隙 3 相对 应时, 扇形室 
即与 真空泵 相连。 滤出液 由滤液 槽转人 滤液承 受缸。 转筒转 过一定 角度, 可 顺次与 4 和 
5 对应而 与洗液 r: 槽 相连。 最 后经孔 6 和 7 使 转筒室 与压缩 空气管 相连, 以便吹 干滤饼 
和清洁 滤布。 空白区 是用于 防止作 用不同 的相邻 的两区 相互串 联而设 下的缓 冲区。 

转筒 真空过 滤机适 用于中 等细度 和粘度 不大的 物料。 其式样 较多, 转 筒直径 可小至 
30 厘米, 大到 4.5 米, 长度由 30 厘米到 6 米, 适 用范围 很广。 卸料方 法有: 

1. 刮刀法 用于剥 离较厚 (8 — 10 毫米) 的 滤渣, 过滤 困难的 胶质滤 澄时, 每转一 
周阻 留滤渣 厚度在 5 — 10 毫米之 间或更 少时, 为 避免用 刮刀卸 料损及 滤布, 可用 其他卸 
料方法 ,见图 7-14。 

2. 环 行索法 (滤 渣层厚 2 — 4 毫米) 过滤 时预先 将绳索 嵌在滤 渣内。 卸 料时, 滤 
饼 随绳索 移动而 脱落。 见图 7- 14(b) 

3. 橡皮 圆裙法 薄滤澄 和粘滞 滤澄被 紧压在 转筒表 面上旋 转的橡 皮圆棍 所 卸下, 



绳索 



滤带 




刮刀 



图 7-14 各种剥 落滤澄 的方法 
用刮刀 b. 用 环行索 C. 用橡 皮圆棍 d. 用环 行滤带 



• 196 . 



在圆 辐上的 滤渣再 用一较 小直径 的圆辊 除去, 见图 7-14(0。 

4. 环行 滤带法 滤 渣区特 别薄时 (小于 2 毫米) 可用 此法, 滤带通 过一系 列圆辊 ,然 
后 被刮刀 卸除, 滤带再 经洗涤 回到转 筒上。 其原 理见图 7-14(d) 

转筒真 空过滤 机的全 部过滤 、洗 漆和干 燥过程 都在一 圆面上 进行, 滤澄 不能进 行细致 
的 洗漆和 干燥。 所 得滤饼 含水量 一般为 10〜3()%, 若 要得到 较干的 滤饼, 可将转 筒的一 
部份 罩住, 通 人热空 气使之 干燥。 

(H) 加压叶 片连续 过滤机 

它的特 点是主 轴每转 一周, 依 次完成 过滤、 水洗、 干燥、 卸 料四个 工序, 结 构见图 
7-15。 它的效 率高, 密封 性好, 适应 性强。 多用于 过滤粘 度大、 颗 粒细、 有毒、 易挥发 物料。 
过滤 面积为 5 米 2 的叶片 过滤机 的生产 能力, 相当于 六台过 滤面积 36 米 2 的板框 过滤机 ,而 
占地面 积缩小 2/3, 设备投 资减少 50fc, 每年 所用滤 布量为 板框压 滤机用 布量的 1/160。 



插 




图 7-15 加 压过滤 机简图 



(四) 其他 

如叶片 真空吸 滤机、 金 属圆片 压力过 滤机、 圆形 板框压 滤机、 陶 瓷抽滤 缸等分 别用于 
生产谷 氨酸钠 、柠 檬酸、 抗菌 素及其 他生化 药物。 

第二节 膜分 离技术 

早在 1861 年 Thomas Graham 就已 介绍用 膜分离 法可从 大分子 (多糖 、蛋 白质) 溶液 
中 除去一 些小分 子的无 机盐类 E 5〕 。 那时 用的膜 还只是 来源于 动物, 不及现 用的透 析膜那 
样 精致和 高效。 但分离 的原理 还是相 同的。 

膜 分离的 原理, 主要是 利用溶 液中溶 质分子 的大小 、形状 、性 质等的 差别, 对于 各种薄 
膜 表现出 不同的 可透性 而达到 分离的 目的。 选择 薄膜在 膜分离 法中很 重要。 薄膜 的作用 
是有选 择地让 小分子 通过, 而 把较大 的分子 挡住。 分子透 过膜, 可 由简单 的扩散 作用引 
起, 或 由膜两 边外加 的流体 静压差 或电场 作用所 推动。 由上 述原理 衍生出 的分离 法有透 
析、 超滤、 电 渗析、 反渗 透等。 它 们还可 根据装 置的不 同或所 用膜性 能上的 区别再 细分。 
如超滤 装置有 静止无 搅伴式 、搅 伴式、 浅 道式和 中空纤 维式等 类型。 

• 197 • 



膜分 离技术 的发展 和制膜 工艺水 平直接 有关。 早期 用的动 物膜, 不论 在材料 来源、 再 

生 能力及 分离效 果上都 有许多 缺点。 三十 年代初 Elford 制成硝 化纤维 薄膜, 可用 于测定 
某些病 毒颗粒 的大小 ,但用 这种薄 膜时, 流速 甚慢, 操作 烦琐, 因而未 能广泛 应用。 后来 
Graig 等对 玻璃纸 (赛 職玢) 做的透 析管进 行了细 致研究 ,用各 种理化 方法改 变玻璃 纸孔径 

大小, 克服 再生能 力低, 流速慢 等缺点 ,并 改进了 装置使 透析技 术前进 了一步 

制 膜工艺 的革新 高潮是 在近十 多年出 现的。 工 业废水 处理、 海 水淡化 试验及 制盐工 

业的 发展, 医学上 "人工 肾脏" 的研 究等, 使人 们对薄 膜的研 究的兴 趣大为 增加。 因 此新的 

薄 膜及装 置应运 而生, 其中 最重要 的是各 向异性 的不对 称薄膜 或称" 表层 膜"。 它 不仅提 

高 了膜的 选择性 和机械 强度, 而且 滤速也 比玻璃 纸的滤 速增加 数十倍 甚至成 百倍。 其次 

是 出现了 多种新 装置。 

目前, 迅速发 展的膜 分离法 已成为 物理化 学分离 法中重 要组成 部份。 它在生 化制备 

中用于 浓缩及 脱盐已 占压倒 优势, 用于 分离提 纯的事 例逐年 增加。 下面分 别介绍 常用的 

几 种膜分 离法。 

一 、透析 

" 透析 法的特 点是半 透膜两 边都是 液相, 一 边是试 验液, 另一 边是纯 净溶剂 (水 或缓冲 
液)。 试验液 中不可 透析的 大分子 被截留 于膜内 ,可透 析的小 分子经 扩散作 用不断 透出膜 
外, 直到 两边浓 度达到 平衡。 以前透 析膜两 边的液 相用的 名称较 混乱, 未 透出的 溶液, 称 
"不 可扩 散的物 质", 或称" 透 析残留 液", 而透析 后的溶 液称" 已透析 液"、 "透析 液"。 Craig 
和 King 建议 使用的 "保 留液 (retentate)" 和" 渗出液 (diffusate)" 分别 代表透 析后膜 
内外的 液相, 已 被广泛 承认。 透 析法多 用于制 备及提 纯生物 大分子 时除去 或更换 小分子 
物质、 脱 盐和改 变溶剂 成份。 近来, 透析法 有很大 发展, 透 析膜和 透析装 置更有 新的进 
步。 

(-) 透祈膜 

除动物 膜外, 羊皮纸 、火 棉胶和 玻璃纸 及最近 使用的 Visking 赛 職玢透 析膜, 都是纤 
维或纤 维素衍 生物制 成的。 纤维素 材料来 源丰富 ,价格 便宜, 但用于 制作透 析膜的 高聚物 
还应 有如下 特点: 

1. 在溶剂 中能膨 胀形成 分子篩 状多孔 薄膜。 只允 许小分 子溶质 和溶剂 通过, 而阻止 
大分子 (如蛋 白质) 通过。 

2. 具 有化学 惰性, 不具有 可以和 溶质起 作用的 基团, 在水、 盐溶液 、稀碱 或稀酸 中不溶 

解。 

3. 有一 定的机 械强度 和良好 的再生 性能。 

透析膜 可自制 (如火 棉胶) 或 购买, 国外的 透析膜 常有以 下几种 ,见表 7-1。 
商品 透析膜 大多为 管状, 各公司 采用的 大小规 格又不 相同, 曾引起 混乱。 购 买时需 
注意, 如 Visking 公 司最初 的透析 管大小 以装满 水时管 内膨胀 直径为 多少吋 表示, 以分数 
1/32 为」 个 单位。 因此, 8/32 透 析管的 膨胀直 径约为 0.25 吋 (约合 0.62 厘米 )。 Visking 
并入 Union Carbide 公 司后, 仍用 "32" 为分母 基数, 但 商标上 常略去 "32'^ 而代以 透析管 

• 198 . 



I 



表 7-1 几 种商品 透析膜 



巧 


相当于 Visking 
公 司型号 


扁 平宽度 
(厘米 ) 


膜 壁厚度 
(厘米 ) 




8/32 


0.390 


2X10"' 


20 


20/32 


0.984 


8X10- 


27 


27/32 


1.312 


10—3 


36 


36/32 


1.734 


10-' 


1 丄 SS 
1 8 


1 -Z-SS 
8 


2.88-3.14 


1.6X10 - 3 


3 — SS 
4 


3 丄 SS 
4 


4.65—5.10 


3.5x10-3 


表 7- 2 Union Carbide 各种型 号透析 管的渗 透范围 


型 号 


近似膨 胀直径 (湿) 
(厘米 ) 


可 透过的 分子量 


不能 透过的 

分子量 


8 透析管 


0.62 


5,732 


20,000 


18 透析管 


1.40 


3,300 


5, '32 


20 透析管 


1.55 


30,000 


45,000 


27 透析管 


2.10 


5,732 


20,000 


36 透析管 


2.80 


20,000 




1 Y 透析管 


4.70 


1 不详, 但与 8 号管大 致相同 . 


3-^ 透析管 


8.13 



长度, 如 36/100 即表示 36/32 号 管每卷 100 英 尺长。 另外, 管的 膨胀直 径改为 公制, 以厘 
米 表示。 Union Carbide 公司 的几种 透析管 渗透范 围见表 7-2。 

透 析管孔 径大小 可经机 械作用 和理化 处理而 改变。 例 如乙酰 化作用 可缩小 膜的孔 
径, 直至能 阻滞甲 醇分子 通过, 而用 64%ZnCl2 溶液浸 泡时, 膜的孔 径可增 大到能 使分子 
量为 135,()()() 的大分 子通过 。机械 法对管 膜孔径 的影响 可因作 用方向 而异。 线形膨 胀可使 
孔径 减小至 50f 。,而 放 射形膨 胀作用 由于管 内液体 静压力 加大, 可使 管膜孔 径增加 1 一 2 
倍以上 ,表 7-3 是 Union Carbide 的三 种透析 管径不 同处理 后孔径 的变化 [8] 。 

此外, 某 些小分 子溶质 的渗透 性也因 溶液中 存在某 些微量 表面活 性剂而 增加, 可能是 
由于它 们吸附 在膜的 "活性 位置" 上, 改 变了膜 的理化 特性。 

各种 纤维素 透析膜 片孔径 度一般 不如管 状膜那 样易受 控制, 透 析的有 效面积 也小于 
管 状膜。 实验 中样品 量少, 用透 析管较 方便, 而工 业上大 量溶液 透析脱 盐时, 用透 析膜片 
有利。 

商品透 析管膜 常涂甘 油以防 破裂, 并含 有极其 微量硫 化物、 重金 属和一 些具有 紫外吸 
收的 杂质。 它 们对蛋 白质 和其它 生物活 性物质 有害, 用 前必须 除去。 McPhie 建 议先用 50f- 
乙 醇慢慢 煮沸一 小时, 再 分别用 50fc 乙醇, O.OIM 碳 酸氧钠 溶液, 0.001M EDTA 溶液 

• 199 • 



表 7- 3 不 同处理 方法对 Union Carbide 透析管 孔径度 的影响 



透 析管型 号及处 理方法 


分子 量范围 


18 DC 线形 膨胀和 乙醜化 

18 DC 线 形膨胀 

18 DC 未 经处理 

20 DC 未 经处理 

20 DC 加 压放射 形膨胀 

20 DC ZnC!2 处理 


O 

o o o o o o 
CNi vo r^i cz> m 



依次 洗漆, 最后 用蒸溜 水浸洗 三次, 基本可除杂质^^ 实验 证明, 50% 乙醇 处理对 除去具 
有紫外 吸收杂 质特别 有效。 已处理 好的管 膜如果 不用, 可 贮存于 4 t 蒸馏 水中。 如需长 
期 Jt 存, 可加少 量叠氮 化钠、 氯仿以 防细菌 侵烛。 再 用时需 用蒸馏 水充分 漂洗, 再 以透析 
时用 的溶剂 漂洗, 然后灌 人溶剂 ,仔细 检查, 不漏即 可用。 

(二) 透 析方法 及装置 

透析 方法较 简单, 可将已 处理及 检查过 的透析 袋用绒 线或尼 龙丝扎 紧底端 ,然 后将待 
透析液 (1 一 100 毫升) 从管 口倒人 袋内。 但不能 装满, 常 留一半 左右的 空间, 以防 膜外溶 

剂大量 透人袋 内时将 袋胀裂 ,或因 透析袋 膨胀, 而引起 膜的孔 径大小 改变。 装透析 液后, 

即紧扎 袋口, 悬 于装有 大量纯 净溶剂 (水 或缓 冲液) 的大 容器内 (量 筒或玻 璃缸) 如图 7- 
16, 7-17 所示" W 进行 透析。 小分子 (水 或盐) 可从透 析膜内 透出, 直 到膜内 外浓度 相等。 
如用透 析膜片 ,实验 室中简 易装置 也可装 配如图 7-18 [ 11 ] : 在 二个刚 好可以 互相套 叠的有 



- 玻璃棒 





透析袋 



- 透析袋 

水或 
缓冲液 

玻瑛虹 



图 7-16 透析袋 透析简 单装置 



图 7-17 另一种 透析袋 透析简 单装置 

机 玻璃圆 筒中间 夹人透 析膜, 箍紧, 使透析 膜表面 平坦, 然后平 放于漏 斗中。 漏斗 架在烧 
杯上, 漏斗口 径应比 烧杯大 4 一 6 公分, 烧杯 高度应 能容纳 漏斗, 使 其末端 不接触 烧杯底 
部。 在烧杯 中放入 水或缓 冲液。 液面 高度以 刚触及 透析膜 为好, 用玻璃 皿盖住 漏斗, 以免 
杂物 污染。 如需 冷却, 可在 冰箱内 进行。 此法 简单, 安全, 适 用于少 量样品 脱盐。 实验室 
小型透 析装置 常加上 搅拌以 及定期 (或 连续) 换上新 鲜溶剂 ,这 样均可 大大提 高透析 效杲。 
近来, 国 外设计 透析装 置多是 如此。 现举例 如下: 

1. 旋转 透析器 在透 析容器 下安装 电磁搅 拌器。 但这 只能消 除膜外 溶剂的 浓度梯 
度, 而不 能消除 膜内溶 剂的浓 度差。 Feinstdn 介绍 的透析 装置, 可使 膜内外 两侧液 体同时 



200 




图 7-18 用透 析膜片 透析简 单装置 图 7-19 旋 转透析 器简图 

C —— 盛水或 缓冲液 容器; A、 B —— 木轮; D —— 横 
轴; S, S, —— 透 析袋; Fi F, —— 玻璃珠 

流动, 使 透析速 度大大 增加, Feinstein 的旋 转透析 器如图 7-19 所示" 2 ] 。 

图中, C 为 装有大 量水或 缓冲液 的容器 (可用 玻璃或 塑料制 成), D 为横 轴连接 二个木 
轮 A、B ,横 轴末端 为滑轮 E, 它通过 传动带 与马达 相连, 转速约 4 转 / 分。 透析袋 Si、S» 
成 对角线 拴紧在 A、 B 木轮的 两端。 当 D 转动 时, Si、 S2 即绕 着横轴 作圆周 运动。 由 
于透 析袋安 装成交 叉状, 与横轴 不平行 ,因此 D 轴转 动时 透析袋 中液体 即上下 流动。 必要 
时还可 在袋中 放几颗 玻璃珠 (Fi、F2)。 增加 袋内液 体搅拌 速度。 轴 D 及轮 A、B 的 转动, 
也 对透析 膜外溶 液起搅 伴作用 C 这种 简单装 置可放 8 — 10 个透 析袋, 透析速 度比图 7- 
16, 7-17 示 意的装 置约快 2 — 3 倍。 

按上述 原理尚 有多种 设计。 有 的仪器 将许多 透析袋 悬挂在 环状圆 筒上, 圆筒 放入盛 
有溶剂 且装置 搅拌器 的大容 器中, 由马 达带动 旋转。 这种 装置一 次可放 8 个透 析袋, 每袋 
装样液 24 毫升。 较大的 装置一 次可放 16 个透 析袋, 每袋 装样液 220 毫升。 这种 装置国 
外已有 生产。 有的仪 器除了 由鼓轮 引起旋 转外, 还用一 凸转轴 使透析 袋产生 10 — 30° 角 
的 振动。 这种振 动透析 器透析 O.IA^ 氯化 钠仅需 2 — 3 小时 即达到 平衡。 

2. 平面 透析器 圆筒 形透析 管虽然 使用较 方便, 孔径易 控制, 但透 析面积 较小。 
Katz 等介绍 了平面 透析器 装置, 见图 7- 20 [ " ] 。 将透 析管装 在长方 形塑料 框内, 利 用塑料 
框把 透析管 张开, 成为 很薄的 平面透 析器。 然后把 它的两 端连接 到转动 装置上 ,通 过电磁 
转 动器使 它缓慢 转动。 透 析器外 面是盛 有溶剂 的玻璃 缸或塑 料箱, 这种透 析器一 次即可 
装样液 0.5 — 20 毫升。 效率 比管状 旋转透 析又有 提高。 , 




图 7-20 平 面透析 器简图 
S- ^ 透 析袋; B _ 方形塑 料框; E, E, — 透 析袋两 端接旋 转装置 

3. 连续循 环透析 器 上述 各种装 置在膜 内外可 透析物 质达到 平衡后 必须更 换新鲜 
溶剂, 才能 使可透 析物质 继续通 过透析 膜向外 扩散, 通常 要更换 3 — 4 次 溶剂, 这 比较麻 

• 201 • 



斗 S 玻筒 

漏 套机掘 



烦。 Hospethom 介绍的 简单装 置如图 7- 21""。 用一根 很长的 粗棉线 缠绕在 两端扎 紧的长 
透析 管上, 棉线 缠绕的 螺距应 适当, 以保证 透析液 有一定 流速。 溶剂 可沿棉 线自上 而下流 
动把透 析管中 扩散出 的小分 子不断 移去。 用这种 装置, 可使 50 毫升 0.9 M 硫酸 铁溶液 
在 18/32 透析 管内对 蒸溜水 透析, 7 小时 后除去 99% 的盐, 见图 7-21。 连续 循环透 析器如 
用 水透析 可在冷 室敞开 进行。 如用 缓冲液 透析, 则需密 封以防 缓冲液 蒸发而 使浓度 改变, 
装 置见图 7- 21(b)。 ' 




图 7-21 连 续循环 透析器 
(a) 开 放式; (b) 密封式 



连 续透析 装置有 多种, 其原理 都是使 溶剂更 新以加 大膜内 外的浓 度差, 提高 透析速 
度。 此 种装置 除用于 分离浓 缩外, 还可 用于酶 促连续 反应。 我国轻 工业部 食品发 酵工业 
研 究所试 验天门 冬氨酸 酶促合 成时, 用 连续透 析法使 酶和底 物溶液 分别缓 慢流入 用半透 
膜隔开 的压滤 机形式 的连续 透析器 中进行 反应, 可 提高酶 的利用 率和避 免渗入 杂质。 天 

门冬 氨酸转 化率达 99fc 以上 [ 1 5] 。 较 复杂的 透析装 置有: 空心 纤维透 析器、 线流连 续透析 



图 7-22 色谱 用微量 透析器 



202 



器、 簿膜 反流连 续透析 器等, 其 透析效 率远大 于简单 装置。 

4. 层析用 的微量 透析器 有时 柱层析 收集的 各组小 量样品 必须分 别进行 层析。 用 
透析 袋在同 一条件 下同时 透析小 量样品 是很困 难的。 Reitz, A. H. 和 Rilet, W. H. 介 
绍的 方法是 [ " 】 : 在 一块平 滑的娃 化橡胶 上挖许 多小洞 (如图 7-22), 每 个洞可 放样品 
0.025-0.5 毫升, 另在 一块对 应的有 洞硅化 橡胶的 洞中放 溶剂, 用平 面膜把 样品和 溶剂隔 
开, 进行 透析。 如需 移去透 析物, 即在 溶剂一 侧开一 浅沟, 使透析 液连续 流出。 安 装时将 
二 块橡胶 (中 间夹 着膜) 用夹 子紧固 即可。 

5. 反流 透析器 它使样 液和溶 剂在膜 两侧反 向缓慢 流动, 既有较 大的透 析面积 ,又 
能使 膜内外 溶液浓 度差达 到最大 限度, 透 析效率 极高, 透 析的样 液体积 很大。 Craig 和 
Stewart 设计很 简单的 反流透 析器" ", 见图 7-23。 样 液由输 人泵注 人后, 通 过内管 从膜的 
底端 上升。 而溶剂 从膜另 一侧上 端往下 流动。 使膜 两侧分 别形成 不同流 向的薄 液层。 膜 
外 液层因 马达带 动外管 转动而 流动, 可进 一歩提 高透析 效率。 调节 输人泵 和输出 泵的流 
速 可以控 制透析 速度。 Craig 和 Stewart 用六种 溶液测 定透析 效率, 结 果见表 7-4。 

6. 减 压透析 其原理 是在渗 出液外 抽真空 使膜两 边形成 压差, 加速 膜内物 质透出 




»-15nim-» 



图 7-23 薄 层反流 透析器 
I. 透析 溶液; 2. 溶液输 入泵; 3. 聚 四氟乙 煤管; 4. 支 持夹; 5. 支 持夹; 6. 溶 印!; 
7 虹 吸管; S 透析后 保留液 出口; 9. 马达; 10. 皮带; 11. 轴承; 12. 内管 (中 
空); 13. 透 析膜; 14. 外管 (旋转 ); 15 支 持夹; 16. 聚 四氣乙 管; 17. 透析后 
渗出液 ;输 出泵; 18 透析后 渗出液 ;出口 

• 203 • 



表 7-4 两种不 同膜在 25:'c 进 行薄层 反流透 析的比 较结果 〔慢泵 速) 





No. 


18 Visking 膜 


No. 20 Visking 膜 


溶 质品称 


出 口流速 
(毫升 / 分) 


滤除 百分率 


出 口流速 
(毫升 / 分) 


滤除 百分率 




保留; & 


渗出液 


(%) 


保留液 


渗出液 


(%) 


色氣酸 (2. 46x10-3 A/) 

If 糖 (1%) 
杆菌肽 (1.92X10—3AO 
1 颜 aCl 

3% 硫酸铵 
50% 硫酸按 


0.36 
0.43 
0.37 
0.44 
0.43 
0.73 


1.00 
1.16 
0.97 
1.00 
1.00 
0.98 


94.2 
86.1 
64.0 
99.7 
97.9 
94.3 


0.39 
0.33 
0.48 
0.40 


1.25 
1.18 
1.20 
1. 18 


70.5 
99.7 
98.7 
93.1 



其装 置见图 7-2 4 , 图中 D 为一个 15— 60 厘 米长的 Union Carbide 8 号透 析管, 下 端用线 

扎紧, 放 人真空 抽滤瓶 (F) 内。 透析 管上端 套塑料 
管 (T), 再通过 橡皮塞 (S) 中 央小孔 ,与 分液 
漏斗 (R). 的管 口直接 相通, 控制 分液漏 斗活塞 
开关, 把 样液加 入透析 管内。 抽真 空后, 将抽滤 
瓶抽 滤嘴处 橡皮管 夹紧, 即 可减压 透析。 必要时 
可将装 置放人 冰箱内 透析至 平衡。 操 作时, 要预 
先估计 透出液 体积, 加 上原有 溶剂, 使抽滤 瓶内最 
高 界面不 得超过 (L) 处。 如 选用其 它透析 膜管, 
应测 试其耐 受压力 (不得 低于一 个大气 压)。 在 4 
°C, 700-750 托 (Torr) 时, 滤速为 0.6—0.7 毫升 
水 / 厘米管 / 小时。 此装 置使用 方便。 效果 很好。 

7. 浅流 透祈器 它是 近年发 展的新 型透析 
装置, 国 外巳有 商品。 它可 兼用于 透析和 超滤。 
样液经 小沟由 中心沿 螺旋浅 流流向 外周, 沟底为 
图 7 - 24 减压透 析装置 平 面膜, 样液边 流动边 透析。 当样 液流至 末端, 透 

^ 透 f 管膜 Jm^— ;" 分? 漏斗 2:^7" 豫 析即告 完成。 关于浅 流透析 的效率 及各种 因子的 

皮塞, T 塑料 管套, C 夹子, F~ ~ 

真空 抽滤瓶 影响, Zdnch, R. A. 等人 曾作详 细评论 [ ia 】 。 有 

关 装置及 原理请 参看本 章超滤 部份。 




二、 超 滤 

超滤是 加压膜 分离技 术之一 ,操作 简便, 成本 低廉, 分离效 率髙, 且 不引起 温度、 离子 
状态 及相的 变化。 近来 广泛用 于生物 制品、 食品 和制药 工业、 三 废处理 及其它 浓缩、 脱盐 
及分 级分离 工序。 至今, 国内 外巳有 很多关 于超滤 原理及 应用的 专著、 评论及 文献" 9 _ 23] o 

超滤原 理和一 般过滤 一样, 主要 依赖于 被分离 物质分 子量的 大小、 形状 和性质 不同, 
在一 定的 压力差 (外源 N2 或真空 泵压) 下, 使小 分子能 够通过 具有一 定孔径 的特制 薄膜, 

限额以 上的大 分子被 膜阻留 ,使 不同大 小的分 子得以 分离。 要在 膜的两 边产生 压差, 可在 
样 液一边 加正压 或在超 滤液一 边产生 负压。 前 者应用 较多, 因为抽 真空产 生的负 压差不 



204 



超过 一个大 气压, 超滤 效果差 c 所以 超滤通 常是指 外源加 压的膜 分离。 根 据所加 的操作 

压和所 用膜平 均孔径 的不同 ,可分 为微孔 过滤、 超滤和 反渗透 三种。 

微孔 过滤所 用操作 压在每 平方吋 5 碌以下 ,膜 的平均 孔径为 500 埃至 14 微米, 用于 
分 离较大 颗粒。 

加 压超滤 所用操 作压为 5 — 100 榜 / 吋 2, 膜 的平均 孔径为 10 — 100 埃, 用于分 离大分 

子 溶质。 

反渗 透作用 操作压 比超滤 更大, 常达 500 — 2000 碌 / 吋 2, 膜的平 均孔径 最小, 一般为 
10 埃以下 ,用 于分离 小分子 溶质。 

超 滤与反 渗透及 微孔过 滤的比 较见图 7-25, 7- 26" 9] 。 



鲁 




(A) 




(B) *^ 

图 7-25 超滤 (A) 与 反渗透 
(B) 的比较 (示 意图) 



溶液 




大分子 



小分子 

"表 层" 
超滤膜 



• 溶液- 



压力 







'。二 咬々 

C <:£)<' C 

O o O … Q 



〇 



6 



op 



o 



多微 孔滤膜 



(B) 

图 7-26 超滤 (A) 与微 孔过滤 
(B) 的比较 (示 意图) 



(一) 超 滤过程 及装置 

超滤在 密封的 容器中 进行, 外 源压力 迫使溶 质通过 薄膜。 开始 时溶质 分子在 溶液中 
均勾 分布, 后 来由于 小分子 溶质通 过膜, 而大分 子溶质 被截留 于膜面 ,渐形 成浓度 梯度, 称 
为浓 度极化 现象。 大分子 溶质在 膜上的 堆积层 (或称 浓缩层 ), 就好 似超滤 膜上附 加的次 
级膜, 因此, 溶质 滤过时 必须首 先通过 这层次 级膜。 见图 2-27。 随 着大分 子溶质 堆积层 
的 加厚, 膜的选 择分离 能力愈 来愈低 ,流速 也越来 越慢。 如用 各向同 性微孔 薄膜, 经常会 
堵塞, 而 完全丧 失过滤 能力。 为此, 设计 超滤装 置时, 都 力求克 服浓度 极化, 增加 流速, 提 
高选 择分离 效率。 现 有装置 一般可 分四种 类型。 

1. 封闭 系统 无搜梓 式装置 它比较 简单, 没有搅 拌装置 ,浓度 极化较 严重。 而且膜 
的 使用面 积小, 滤速慢 ,常 需较大 压力。 因 此只适 于浓缩 小量稀 溶液。 早期装 置如图 7- 



205 




超滤液 

图 7-27 超滤 过程的 浓度极 化现象 示意图 图 7-28 封闭系 统无搅 拌式超 滤装置 示意图 

28。 目 前已不 常用。 

2. 封 闭系统 有搜拌 式装置 超滤 室内溶 液中放 铁芯搅 拌棒, 室外底 部的电 磁搅拌 

器通电 后可带 动搅拌 棒缓慢 转动。 搅祥作 用减少 了溶液 浓度极 化现象 ,使滤 速大大 提高, 
见图 7-29。 北 京植物 研究所 设计的 搅拌式 超滤器 的剖视 图见图 7-30【2", 超滤器 由盖、 筒身、 

筒底 三部份 组成。 盖 用金属 制成, 盖上有 加样器 和连接 压缩气 钢瓶的 进气口 ,以螺 旋结构 
和橡咬 塾圈使 盖和筒 身保持 密封。 筒身和 筒底用 有机玻 璃制成 ,筒 身管壁 厚度为 4 毫米。 



压力 调节器 



加压口 





磁力 投样棒 
膜 

〜滤 液出口 
-磁力 拔伴器 



图 7-29 封闭系 统有搅 伴式超 滤装置 




图 7- 30 搅拌式 超滤器 剖视图 
1. 进气口 2. 加 样口盖 3. 加样口 4. 盖 5. 有机玻 璃底筒 
6. 超滤膜 7. 尼龙布 8. 支持板 9. 橡 胶垡圈 10. 塑料杯 
11. 磁 检 棒 12. 有机玻 璃筒身 13. 橡 胶塾圈 



筒身 底部装 有硬塑 料环, 密 封在玻 璃管中 的铁棒 (磁 搅棒) 位于此 环上。 滤膜、 尼 龙布、 支 
持板装 在筒身 与筒底 之间, 筒身 和筒底 以螺旋 结构和 橡胶塾 圈保持 密封, 支 持板是 有小? L 



206 



圈 板 



的 塑料板 或不锈 钢板。 超滤 器操作 压力是 由压缩 气钢瓶 经减压 器从进 气口供 给的。 压力 
受 减压器 控制。 超滤器 装在磁 力搅拌 器上, 由磁力 搅伴器 带动超 滤器内 的磁搅 棒转动 ,滤 
出 液收集 在结晶 皿内。 所用的 二醋酸 纤维超 '德膜 ,也是 植物研 究所自 制的, 超 '德 时 膜的有 

效 面积为 6 厘米 2 ; 压力为 3 公斤 / 厘米 2 , 8 小时 内可将 100 毫升的 Mo- Fe 蛋白 浓缩至 10 
毫升, 蛋白质 浓度由 3 毫克 / 毫 升增至 30 毫克 / 毫升, 这 种超滤 器结构 简单, 使用 方便, 国 
内已有 不少商 品供应 ,用 于生化 实验。 

3. 浅道 系统超 滤装置 这类装 置使液 体通过 螺旋形 浅道, 向与 膜平行 的方向 流动。 
浅 道底部 有膜, 由于液 体在膜 面高速 流动, 浓度 极化不 显著。 而且液 体与膜 接触的 面积也 
大于一 般搅拌 型装置 ,故 有很高 滤速。 浅道系 统见图 7- 31(a), 装 置见图 7- 3l(b)。 超滤 
后被截 留的大 分子溶 液从浅 道末端 流出, 通过 蠕动泵 再循环 超滤, 见图 7-31 (b), 最后浓 
度可达 40%。 该装置 适用于 大分子 混合液 的分级 分离, 生物 制备中 细菌、 病毒、 热原的 
滤除 及生物 大分子 溶液的 浓缩、 脱 盐等。 

4. 中 空纤维 系统超 滤装置 它由很 多根空 心纤维 丝成束 地装配 组成。 每根 纤维丝 




® 大溶质 分子 ' — 

• /hm 质分子 

溶剂 

图 7-32 空 心纤维 膜超滤 示意图 图 7-33 PM- 空 心纤维 膜横切 面扫描 电镜图 (放大 400 倍) 




- 207 • 



艇计 




二二 i?L 胰 7^ 



-w"^ L- 丄 -Q」 
— 浓缩液 
— 超滤液 

图 7- 34 中空纤 维系统 超滤装 置简图 
表 7-5 各 种超滤 系统滤 出液流 量比较 * 



系 统 


膜面积 
(平方 厘米) 


操作压 

(碌 / 吋 2) 


流 量 
(毫升 / 分) 


标 准流量 
(毫升 /分* 厘米' *砖 吋) 


非 搅摔型 


3.4 


70 


0.05 


0.002 


搅拌型 


39 


50 


2.7 


0.0014 


浅道型 


40 


25 


8.0 


◦ 


中 空纤维 


900 


7** 


50.00 


0.007 



* 超滤 材料为 1% 牛 血清白 蛋白, 用 分子量 规格为 10,000 的膜 截留。 

** 平均 的透膜 压力。 

以上几 种实验 室超滤 装置的 规格、 用 途及滤 出液流 量的比 较见表 7-5 及表 7-6""。 

(二) 超滤膜 的选择 及使用 

商品膜 的型号 甚多。 在选 择时, 一 般应注 意以下 指标。 

1. 额定截 留水平 表示每 种超滤 膜所规 定截留 溶质分 子量的 范围。 在这个 范围内 

绝大 多数溶 质分子 能被膜 截留。 截留 分子量 愈大, 膜的表 观孔径 愈大, 反 之表观 孔径愈 
小。 一般 选用额 定截留 水平稍 低于所 分离、 浓缩的 溶质分 子量。 由 于额定 截留水 平常以 
球状溶 质分子 所得的 测定结 果表示 , 故 纤维状 或不规 则的溶 质分子 还应根 据实际 情况在 



208 



即 成为一 个微细 管型膜 (相当 于一个 超滤单 位), 如图 7-32。 纤维丝 横切面 内壁的 "表 层'' 
细密, 向外逐 渐疏松 ,形 成各向 异性微 孔膜管 结构。 图 7- 33 为 PM- 空心纤 维膜横 切面的 
扫描电 镜图。 空心 纤维管 的内径 一般为 0.2 毫米, 有效 面积约 1 厘米 2 , 表面 积与体 积的比 
率极大 ,所 以滤速 很高。 例如 DC- 30 型中 ,空纤 维系统 超滤装 置共有 三根装 有许多 中空纤 
维膜管 的套筒 ,膜表 面积达 2.7 米 2 , 在 3 个大 气压下 滤液流 量可达 1 升 / 分。 中空 纤维用 
于透析 、脱盐 ,不到 1 小时即 可从溶 液除去 99% 的盐。 装 置见图 7-34。 



超滤 液出口 



束 

心维管 

空纤套 





表 7-6 几 种实验 室超滤 装置的 规格及 其用途 



过滤 


商 品型号 


处 理容量 
(毫升 ) 


处理浓 度% 


滤 膜规格 


用 途 


备 注 


最低 


最高 


最初 
最低 


最终 

最高 


直径 
(微米 ) 


面积 
(平方 厘米) 


搅伴型 


12 型 

52 型 
202 型 
402 型 

2000 型 


1.0 

5.0 
10.0 
60. 


10 
65 
200 
400 
2000 


0.05 




25 

62 
76 
150 


CO t、 o\ cvi 


适用于 溶质大 分子的 浓缩及 
脱盐, 如 处理蛋 白质、 多肽、 多 
糖或血 液组份 、脊 髓液、 尿及其 
他体液 处理。 


使用 搅伴 
f?, 滤室用 化学药 
剂 灭菌, 有 的滤室 
可高压 灭菌, 低温 
操作 


浅道 

系统 


TCF.o 


10.0 


600 


0.05 




90 


40 


适用于 溶质大 分子混 合液的 
分级 分离, 如处理 生物制 品细胞 
悬浮液 、血清 、糖 « 等, 回 收发酵 
液中 的代谢 产物, 滤除 细菌、 病 
毒、 热源。 


用化学 药剂灭 
菌, 低 温操作 


TCE 


300.0 


1950 


40 


150 


1 

GO 


适 用于处 理血液 组份、 疫苗、 
类 毒素, 浓縮 或除去 病毒、 细菌, 
聚合物 、培养 基的澄 清等。 


滤室可 高压灭 
菌, 低温 操作。 














化 学药剂 灭菌, 
低 温操作 




CEC, 




无限 






90 


43 


色谱 柱线性 洗脱液 的浓缩 






















中空 
纤维 


DC, 


1000 


2000 








900 


适用于 浓缩及 脱盐, 如 处理蛋 
白质、 醒、 病毒、 类 毒素、 浸出液 

胶体 产物等 


同 上 


CH3 


500 


无限 


0.4 


20 




900 


同 上 










适用高 效透析 浓缩, 快 速处理 
大分子 溶液, 如血液 组份、 病毒、 
疫苗、 醒等 




DC30 


5000 


无限 








28X10' 




无愤 

拌型 


lOPA 


0.2 


14 




1 


25 


3.6 


适用于 浓缩小 量稀的 活性物 
质溶液 (低于 1% 的大溶 质分子 
溶液) 以及 快速研 究或分 析临床 
样品 


低 温操作 



额 定截留 水平上 限加以 选用。 国外 常见商 品超滤 膜的型 号及性 质见表 7- 7[231。 Amicon 厂 
所 生产的 Diaflo 型号的 十种超 滤膜对 20 种 不同溶 质的阻 留率及 11 种空 心纤维 对八种 
不 同溶质 的阻留 率分别 测定结 果见表 7-8(a)、 7-8 (b)o 

2. 流率 可 用在一 定压力 下每分 钟通过 单位面 积膜的 液体量 来表示 (一般 用无离 
子水进 行测定 )。 实 验中常 用毫升 / 厘米 2/ 分表 示流率 单位。 工 业上测 定流率 (通 常加仑 / 
n 犬 2/ 分表 示简称 GFD) 时, 需 注明条 件才能 比较。 如 UM、 PM、 XM50、 DM 膜流率 
的测 定规定 时间为 5 分钟, 压力为 55 砖 / 吋 2 , 而 XM300, XM100A 膜流率 测定规 定时间 
也是 5 分钟, 但 压力为 10 碌 / 吋 2。 流率大 小不仅 和膜的 表观孔 径大小 有关, 而且 和膜的 
结 构类别 有关。 例如早 年的各 向同性 的微孔 超滤膜 [见图 7-35 (a)] 和近年 发展的 各向异 
性 不对称 超滤膜 [见图 7- 35(b)、 (c)、 (d)] 作比较 ,虽 然膜的 表面孔 径大小 一致, 但各向 
异 性不对 称超滤 膜的流 率却大 得多。 它是 由很薄 的表层 (0.1 微米或 以下) 和较厚 的多孔 
基层 (200 — 250 微米) 粘合 而成。 表层非 常薄, 有 圆锥形 (或喇 叭形) 的 孔道, 因此溶 剂通透 
性极好 ,流 量大, 不易 被溶质 阻塞。 多孔 基层厚 度大, 可以 增加膜 的机械 强度。 而且, 表层 
膜选择 性高, 商品规 格多, 合 成膜时 各种性 质易于 控制, 质量指 标较有 保证。 因此, 这种超 

• 209 • 



表 7-7 — 些常见 商品超 S 及透 析膜 的性质 



型 号 


制 造单位 


组 成材料 


水 透过性 
毫升 / 厘米' / 分 

(lUO 磅 / 吋" 


分子量 截留值 
(保留 80—100%) 


PEM 膜 


Gelinan 


均质 纤维素 


0.02 


60,000 (白 蛋白) 


Diaflo UM-0.5 


Amicon 


高分 子电解 质络合 

物 C 离于父 换膜〕 


0.05 


340 (If 糖) 


Diaflo UM-2 


Amicon 


高分子 电解质 络合物 


0.1 


600 (棉 子糖) 


Diaflo UM-10 


Amicon 


高分子 电解质 络合物 


0.3 


10,000 ( 葡聚糖 10) 


Diaflo PM-10 


Amicon 


芳香族 多聚物 


C.5 


10,000 (细 胞色素 C) 


Diaflo PM-30 


Amicon 


芳香族 多聚物 


0.7 


30,000 (卵白 蛋白) 


Diaflo XM-50 


A micon 


煤 类物质 


0.7 


50,000 (白 蛋白) 


Diaflo XM-IOOA 


Amicon 


煤 类物质 


0.9 


100,000 (7S 球 蛋白) 


Diaflo XM-300 


Amicon 


炼 类物质 


1.1 


300,000 (硫铁 蛋白) 


HFA-100 


Abcor Inc 


非均质 纤维素 


0.07 


10,000 (葡 聚糖 10) 


HFA-200 


Abcor Inc 


非均质 纤维素 


0.4 


20,000 (葡 聚糖 29) 


HFA-300 


Abcor Inc 


非均质 纤维素 


1.4 


70,000 (白 蛋白) 


PSAC 


Millipore 
Corp 


非均质 纤维素 


0.33 


750-1250 (漠甲 80 绿) 










PSF.D 


Millipore 
Corp 


非均质 纤维素 


0.75 


25,000 («- 姨凝 乳蛋白 酸) 


PSDM 


Millipore 
Corp 


非均质 纤维素 


1.00 


40,000 (卵白 蛋白) 



滤膜对 克服以 往超滤 速率和 选择性 都不高 的缺陷 ,起了 极重要 作用。 

3. 其他 除考 虑额定 截留水 平和流 率外, 还应 了解各 种超滤 膜的使 用条件 和注意 
事项。 例如: 

(1) 操作 温度: UM、 XM、 HX、 OM 型膜耐 受温度 不超过 50^, 而 PM、 HP 膜 
耐 受温度 可高达 120V,。 

(2) 膜 的无菌 措施: 一 般可用 5% 甲醇、 70% 乙醇、 环 氧乙院 (浓度 不超过 20fO。 
有的 超滤器 (如 H1P8、 H1P10、 HIPIOO 和 10P100、 H10P8 等 型号) 可高压 灭菌, 有的 
超滤器 (如 H1P5 和 H10P5 等 型号) 则不 能高压 灭菌。 

(3) 可用的 溶剂与 禁用的 溶剂和 药物: 不 同型号 的膜也 不完全 相同。 需先查 明膜的 
配 伍性。 例如, DM 型膜禁 用强滅 、氨水 、肼、 二 甲基甲 酰胺、 二甲基 亚讽、 二甲基 乙酰胺 

• 210 . 



s 八 
X 一 



^ 二 



>5 



(SI) s^^^$^.^ss OHdia s 



(3X ssss'^^M^f§^..rr-BS^^^^M^0^'s§ 



86< 

09 

OS 



01 

01 



86< 

06 -. 



St 

ST 



86< 

86< 

86< 

01 

06< 



S8 

0£ 



86< 

86< 

? 6< 

66< 

06< 

08 

SI- 



86 八 

86< 

S6A, 



56 

£6<. 



06 

09 



86< 

86< 

86< 

66< 

S6< 

66< 

66< 

S6< 

06 















86< 

86< 

66< 

66< 

86< 

66< 

66< 

66< 

08 

06 

06 

09 

OS 

OS 









86< 

86< 

86< 

66< 

66 < 

66< 

66< 

66< 

66< 

86< 

S6< 

06 

08 

09 

OS 









86< 

86< 

86< 

66< 

66< 

86< 

66< 

66< 

66< 

S6< 

£6< 

S6< 



06 

08 

08 

06 

08 



000096 

000081- 

000091 

OOOOII 

000Z9 

擊 9 

00081 

00091 

00s 

00001 

is 

OOH 

S9I 

68 



on i« 

Oil 000 

激滅 K 淋- la 



• 211 • 



表 7-8(b) Diaflo 空 心纤维 腹的港 质分子 阻留率 



溶 质分子 
名 称 


分子量 




阻 


留 率 (%)* 








H,P,o 
H,P,o 
H,oPio 


H,X50 
H,oX50 


H,P,oo 
10X100 


棉于糖 


594 













多聚 -DL- 丙氨酸 


1,000-5,000 


65 


一 






一 


胰岛素 


5,000 




15 











PVP K,5 


10,000 


80 


70 


50 








肌 红蛋白 


17,000 


>98 


' 95 


90 


30 





PVP 


40,000 


>98 


85 


70 


50 


15 


白蛋白 


67,000 


>?8 


>98 


>98 


90 


20 


PVP K60 


160,000 


>98 


>98 


>98 




70 

















* 测定 条件: lOpsi (0.7 公斤 / 厘米 2)。 

PVP = Polyvinylpyrrolidone 聚乙 炼吡咯 院酮。 




图 7- 35 不同 类型超 滤膜的 纵切面 模式图 
a. 各向 同性微 孔膜, b. 各向 异性扩 散膜, C. 各 向异性 微孔膜 d. N.icleopore UF 膜的显 微照相 

和 m-Pyrol; XM、 HX 型膜禁 用丙酮 、乙腈 、糠酸 、硝基 乙浣、 硝基 甲院、 环酮、 胺 类和二 
甲 基甲酰 胺等; UM 型膜 禁用强 离子表 面活性 剂和去 污剂。 可用的 溶剂不 能超过 一定浓 

度, 如碟酸 缓冲液 浓度不 能大于 0.05M,HC1 和 HN03 溶液 浓度不 能超过 lOfc ,酚 浓度 
不 能超过 0.5%, 碱的 pH 值不 能大于 12; PM 和 HP 型膜 禁用芳 香经、 氯化经 、酮类 、芳 
香族经 化物、 脂肪族 酯类、 二 甲基甲 酰胺、 二甲基 亚砜、 m- Pyrol 和 浓度〉 10% 的确酸 
等', 

此外, 由 于各种 膜的化 学组成 不同, 对各 种溶质 分子的 吸附情 况也不 相同。 使用膜 
时, 应选择 尽量少 吸附溶 质的。 某 些缓冲 液如会 改变膜 对溶质 的吸附 能力, 就应 改用其 
它缓 冲液。 例如磷 酸盐缓 冲液常 增加膜 的吸附 作用, 改用 三轻基 甲基氨 基甲垸 (Tris) 
缓冲 液或琥 珀酸缓 冲液, 则可 减少溶 质的损 失和保 证超滤 时溶剂 的正常 流速。 
. 2 12 • 



4. 保存 超滤膜 较稳定 ,如使 用适当 ,能 连续用 1 一 2 年。 暂时 不用, 可在 Ifc 甲醛 
溶液或 5% 甘油 溶液中 保存, 避 免细菌 侵蚀及 干燥。 

(=) 各向异 性醋酸 纤维素 超滤膜 的制备 

国外超 滤膜类 型很多 ,我国 北京、 上海等 地近年 来也开 始研制 各种超 滤膜。 并 已有少 
量 商品供 应市场 。 

超滤 膜可由 二乙基 纤维素 或硝基 纤维素 (Collodion), 或二 者混合 制成, 称为 纤维性 
膜。 另一种 是为适 应医药 、食品 工业上 灭菌的 需要而 研制的 非纤维 性膜, 主 要用聚 偏二氟 
乙稀、 各种芳 香族多 聚物, 尼龙 等材料 制成。 实验室 中需要 的各向 异性表 层超滤 膜可按 
照 Van Oss 的方 法制备 ^^。 中国科 学院植 物研究 所制备 CA^o 各 向异性 醋酸纤 维素表 
层膜的 方法如 下 [ 2": 

1. 制 膜材料 

成 膜剂: 二醋酸 纤维素 (结 合酸 54.5 — 56%, 粘度 500 厘泊, 上海生 产)。 
溶剂: 丙酮 (影响 制膜液 的粘度 )。 
添 加剂: 甲酰胺 (影响 膜的性 能)。 

2. 制膜液 的配制 

将 25 克 醋酸纤 维素、 100 毫升 丙酮、 80 毫 升甲銑 胺加入 密闭容 器内, 间歇搅 拌使其 
溶解 (防止 丙酮过 量挥发 )。 待醋酸 纤维素 全溶后 ,用 二层粗 棉布、 一层尼 龙布在 3 公斤 / 
厘米 2 压力下 过滤, 得淡 黄色清 亮粘稠 滤液, 室 温静置 12 小时, 待滤 液中小 气泡完 全消失 
后, 立 即制膜 (时间 过长膜 液变性 ,呈掠 红色, 影响膜 的质量 )。 

3. 制 膜方法 

工具: 表面 平滑的 玻璃板 或特制 的抛光 玻璃板 数块, 刮膜 刀可用 表面平 直的玻 璃管、 
玻璃板 或金属 板制成 ,刀 面平滑 而窄, 两 端缠绕 细铜丝 (直径 0.27 毫米) 以 控制膜 的厚度 
(经 蒸发和 浸水后 实际厚 度约为 0.14 — 0.17 毫米 )。 

制膜 条件: 最好 在恒温 (20±1^)、 恒湿 (相 对湿度 75 — 80%) 下 进行, 成膜 时冷浸 
水温度 控制在 4 一 5 1。 

刮膜: 将制膜 液倒在 玻璃板 一端, 用刮 刀均勾 刮膜, 刮 13X25 厘米的 膜约需 5 秒 
钟 C 刮膜 后蒸发 5 秒钟, 立即 把带膜 的玻璃 板浸人 冰水, 一小 时后, 从玻 璃板上 取膜。 贴 
着玻 璃板的 膜面为 反面, 取膜 后应做 上识别 标记。 用 膜时需 将正面 向着被 超滤的 溶液。 
制成的 膜贮于 0.02 f 。的叠 氣化钠 (NaN3) 的水 溶液中 备用。 

膜刮好 后在空 气中停 留时间 (蒸发 时间) 越长, 膜孔径 越小。 粘 稠溶液 表面的 溶剂蒸 
发最快 ,醋酸 纤维素 分子会 浓缩形 成微密 表层, 妨碍底 层溶剂 蒸发。 冷浸时 溶剂和 添加剂 
逐渐 被漂洗 出来, 醋酸 纤维素 分子形 成凝胶 而沉积 下来, 由于 表层沉 积作用 最强, 故结构 
更 严密。 而底层 沉积作 用弱, 结构较 疏松, 形成 较大的 孔径。 这样就 形成了 表层和 底层结 
构不同 的各向 异性超 滤膜。 

Edberg, Bronsen 和 Van Oss 指出 [ 2 6 '2" , 在一 定条件 (室温 、湿度 、蒸发 时间、 冷浸 温度和 

时间) 下, 改变甲 酰胺与 醋酸纤 维素、 丙酮的 配比, 可 制备不 同孔径 的膜。 如 甲酰胺 和丙酮 
之比为 50/65 (V/V) 时, 可获 得截留 分子量 35,000 的孔径 ;甲 酷胺与 丙酮之 比如为 35/65 
(V/V), 即可获 得截留 分子量 23,000 的 孔径。 随甲酰 胺量的 增加, 膜 的孔径 增大。 

• 2 13 • 



(四) 影响流 率的几 个因素 

除了 上述膜 的结构 性质起 重要作 用外, 流率 还受以 下因素 影响: 

1. 溶 质的分 子性质 包括溶 质分子 大小、 形状 和带电 性质。 一般 来说, 比重 大的纤 
维状分 子扩散 性差, 对流 率影响 较大。 在一定 压力下 浓缩至 一定程 度时, 大 溶质分 子很容 
易在膜 的表面 达到极 限浓度 而形成 半固体 状的凝 胶层, 使 流率达 到极限 水平。 而且, 随着 
凝胶层 的不断 增厚, 原先 能透过 膜的小 分子溶 质和溶 剂也受 阻碍, 流 率越来 越慢, 最后降 
到最 低点。 反之, 比重 较小的 球形分 子较易 扩散, 在一定 压力下 虽也形 成浓度 梯度, 但不 
易形成 凝胶层 ,随着 压力的 增加, 流率也 有相应 提高。 

2. 溶 质浓度 溶液 浓度对 流率有 影响是 很易理 解的。 在 一定压 力下, 稀溶液 比浓溶 

液的 流率高 得多, 故一般 稀溶液 浓縮至 一定浓 度时流 率逐渐 下降。 用补充 溶液来 稀释的 
办法, 可以减 少浓度 极化, 增高 流率, 但 却延长 了过滤 时间。 如用于 大分子 脱盐, 可 在超滤 
器和压 力源之 间加贮 存瓶, 内装的 新的洗 漆液不 断补充 到超' 虚器内 (流 率与 超滤器 流率相 
等), 于 是超滤 器内大 分子溶 质浓度 不变, 而小分 子溶质 和盐类 不断被 洗漆液 洗出, 最后可 
将小分 子溶质 和盐类 脱尽。 此法已 称透滤 或加压 透析, 如图 7-36。 用 此法脱 盐十分 有效。 



(a) 





进样 
t 保留液 



, db , 



N2 或泵 



溶剂! e 存瓶 



<b) 



超滤液 
进样 



|XM 一 50 
N2 或泵 溶剂! t 存瓶 



UM— 10 



1 



高分子 



中分子 



UM-2 



X X 



^小分 子 



丁 

超滤液 

图 7-36 透 滤装置 示意图 

3. 压力 对于具 有高度 扩散性 的溶质 分子和 较稀的 溶液, 增压 能增加 流率。 但增 
压也常 加速浓 度极化 ,故 开始增 压时流 率增加 较快, 当压 力增至 一定程 度时, 流率 增加便 
减慢, 二者 并不成 比例。 对于 易生成 凝胶的 溶质, 一旦 形成凝 胶层, 增压对 流率就 不再起 
作用。 因此, 对不同 溶质, 应选 择不同 的操作 压力。 

4. 按拌 搅伴 可以破 坏溶质 在膜表 面形成 的浓度 梯度, 即加 快溶质 分子的 扩散, 减 
少浓度 极化, 从 而提高 流率。 如同时 增压, 可大 大提高 流率。 对于易 形成凝 胶层的 溶质, 
效果更 显著。 对搅伴 产生的 切力较 敏感的 大分子 (如酶 和核酸 ), 必须 注意控 制搅拌 速度, 
以 免破坏 它们的 活性。 采用 单程传 送的浅 道系统 的超滤 方法, 有 时能避 免这种 不良影 



214 



碘。 

5. 温度 通常 升高温 度可以 降低溶 液粘度 及减少 凝胶的 形成。 温度 升高, 溶质溶 
解度 通常也 增加。 故升温 可提高 流率, 但温度 过高易 使活性 大分子 变性。 所以考 虑升温 
提高流 率时, 对不同 的溶质 需严格 地区别 对待。 

6. 其它 溶液 pH、 离子 强度及 溶剂性 质等因 素对流 率均有 影响。 可以 认为, 凡 
能增 加溶质 溶解度 或减少 溶质形 成凝胶 倾向的 因素都 能增加 超滤的 流率。 

(五) 超滤 的应用 

1. 乳清 的回收 乳 清是用 牛奶生 产干酪 和酪蛋 白过程 中路蛋 白凝固 收获后 留下的 

残液。 它含有 牛奶中 70% 左 右的营 养成份 (包括 20% 蛋 白质, 极为 丰富的 乳糖、 维生 
素及矿 物质) ,过去 往往作 为废水 弃去。 七十年 代初, 全 世界每 年约产 生乳清 500 亿碌。 
因此, 乳清的 回收不 仅有重 大经济 意义, 而且涉 及环保 问题。 采 用超滤 法后, 乳清 处理有 
很大 改进。 如图 3-37 所示, 采用 一级超 滤一级 反渗透 装置, 每天可 处理乳 清二千 加伦, 分 
别 将蛋白 质及乳 糖浓缩 回收, 除去约 90f。 水份 [28 ,2 9] 。 



乳清" ~~ 



超滤器 






水 









蛋白质 浓縮液 



反 渗透器 



乳糖 浓縮液 



BOD: 生物 耗氧值 



-37 



低 BOD 物质 及水份 



乳清 处理膜 分离法 示意图 

2. 生 物大分 子浓縮 和脱盐 酶、 蛋 白质、 核酸、 多糖等 用超滤 法浓縮 的报道 日益增 
加, 【3 °_ 32 ], 其中较 多用于 酶类。 酶的 回收率 可高达 90f。 [ 3 3] 。 同 时可除 去盐和 低分子 杂质, 
比活力 有较大 提高, 是简单 、高效 、经济 、快 速的浓 缩法。 Wang, D. I. C. 等人在 1970 年 
报告 了使用 UM- 10 膜浓缩 及回收 几种醒 的情况 见表 7-9。 

表 7- 9 几种 K UM-10 膜超 as 浓缩及 回收率 



酷 的名称 



开 始体积 
(毫升 ) 



最 后体积 
(毫升 ) 



体 积浓缩 
倍数 



醒浓度 (单位 / 毫升) 



原样品 



浓縮液 



滤 液 



回收率 ( 



青 霉素醒 

/3- 半 乳糖苷 H 

膀蛋白 酷(3) 

姨 蛋白酵 



1800 
1000 
1400 
1320 



150 
33 
310 

290 



12.3 
30.3 
4.52 
4.56 



100 
0.75 
4.5 
4.3 



950 
5.44 
18.7 
14.9 



29.3 
24") 
91.3 
76.6 



(1) 回 收率: 



浓缩液 总酶活 



X 100 



原样品 总醮活 

(2) 对照 样品中 47% 半乳 糖苷酶 活性因 放置过 久受到 损失, 故 此值不 准确, 

(3) 此酶在 lit 下 过滤, 其它三 种醇在 25 — 过滤。 



215 



图 7-38 牛乳乳 清用二 种超滤 装置分 级分离 示意图 
表 7-10 二种 串联超 滤装置 对牛乳 乳淸分 离的产 量比较 



额 定膜间 隔分子 量范围 


蛋白 质产量 


实 际产量 (%) 


理 论产量 (%) 


揽 拌系统 730,000 


50.3 


17.6 




1 

o 
o 
o 


2.4 


38.1 


o 




4.1 


<2,000 


41.5 


40.1 


浅 道系统 〉30,000 


24.7 


13.2 


o 


32.8 


41.5 








<10,000 


•42.5 


■15.2 



Blatt, W. F. 比较了 二种超 滤串联 装置对 牛乳乳 清分离 的理论 和实际 产量, 见表 7- 

lOo 

从上表 可看出 ,搅伴 系统超 滤中各 级分离 所得实 际产量 与理论 值相差 较大, 而 在浅道 



• 216 • 




此外, 也有人 用超滤 法浓缩 病毒、 多糖, 从 尿中回 收蛋白 质激素 [23," 〕 。 用超滤 法浓缩 

地衣芽 抱杆菌 2709 碱 性蛋白 酶时, 酶活力 损失少 (<5%), 浓缩倍 数高, 节约 能源, 设备简 
单, 还能 同时除 去低分 子杂质 和部份 色素" D ] 。 

3. 大 分+溶 质的分 级分离 与提纯 蛋 白质、 酶 等大分 子用一 次超滤 法很难 达到分 

离纯化 的目的 ,需用 2 — 3 级超滤 装置, 才能 收效。 串 联超滤 装置是 根据截 留不同 大小的 
分 子来区 分的。 第一级 装置选 用的膜 分子量 截留值 大于第 二级, 第 二级用 的膜分 子量截 
留值 大于第 三级, 其 余依此 类推。 然后 用色谱 分析法 测定各 级超滤 装置的 滤出液 及保留 
液中的 成份, 即可知 各级的 分离效 果及组 份的纯 度 [36 ," ] 。 图 7-38 是 牛乳乳 清通过 二种不 
同 超滤串 联装置 (搅伴 型和浅 道型) 分级分 离的色 谱分析 示意图 [ 3"。 

浅道型 



膜分 离模式 



Sephadex C ― 100 



膜分 离模式 



1-2 



1000 



:后 超滤液 



乳清 



N'2 




PM— 30l 30. 000 
翁 



PM — 10 



10,000 



最后 超滤液 




082 




清 







系统中 ,所 得数据 都比较 接近理 论值。 采用浅 道系统 型串联 装置分 部分离 的效果 较好。 

4. 超滤分 离与躕 反应器 (或 发酵) 联用 把超滤 分离与 酶反应 器联用 多见于 酶促分 

解 反应。 将大分 子底物 变成小 分子产 物后, 被超滤 除去, 保留 下来的 酶分子 和底物 返回反 
应器再 行反应 ,连 续除去 底物。 反 复进行 反应, 结果大 大提高 底物利 用率, 减少酶 用量和 
增加 酶反应 速度。 超滤 分离与 酶反应 器联用 装置见 示意图 7- 39 [ " ] 。 这类 装置已 广泛用 
于纤维 素糖化 、蛋白 酶对蛋 白质的 水解、 淀粉酶 对淀粉 的水解 以 及大豆 薛解产 物的分 
离 等"" 。 



同理, 超滤 与发酵 联用, 见图 7-40, 可以 使超滤 回收的 营养物 继续供 给细菌 利用, 而 
产物 及有毒 物不断 滤去, 以减 少对微 生物的 抑制。 微 生物分 泌至胞 外的大 分子产 物在超 
滤时 被截留 还是透 过膜, 主要 决定于 对膜的 选择。 如果 超滤时 营养物 的损失 过多, 还需适 
当补充 ,以 维持微 生物正 常生长 环境。 

Sonoyma 和 Wang [34 '" ] 利用超 滤与发 酵联用 装置连 续培养 溶组织 梭菌, 使蛋白 酶分泌 
至 胞外, 然后用 Abcor 的 HFA- 300 膜分离 ,除去 有毒代 谢物, 结果 酶和菌 体的产 量都高 
于常规 方法。 

此外, 用吸附 、交联 、共 价键合 等方法 可将各 种酶做 成单酶 膜或多 酶膜, 已大量 用于生 
化分 析及食 品医药 工业" 3] n 



浓缩的 飽 及底物 




含 有产物 的滤液 



图 7-39 超滤分 离与酶 反应器 联用装 置简图 




'~ ^粗 产物 

图 7-40 超滤 分离与 发酵罐 联用装 置简图 



三、 电渗析 和离子 交换膜 电渗析 [4 G ] 



(一) 电渗析 

是 在半透 膜二侧 加电极 使可透 过膜的 带电物 质彼此 分开的 方法。 可用 于大分 子溶液 
脱盐 纯化。 此法常 因电流 作用产 生大量 的热, 需 要附加 冷却装 置才能 保证透 析正常 进行。 
此外, 通电 时产生 电渗流 (即外 加电场 使带电 粒子与 介质作 相对移 动), 也常 对膜分 离带来 
不良 影响。 因此, 电渗析 在生化 分离制 备上不 如超滤 那样受 欢迎。 

电渗析 基本装 置如图 7- 41 [ 1 ] , 容器中 有二块 半透膜 隔成三 个室, 中 心室放 试液, 两侧 



渗 析法分 离质粒 DNA —例 于后" s ] : 

E. coli 8021 (pBR322) 加氯霉 素扩大 培养后 ,离 心收集 菌体。 用终 浓度为 2% 重结 

晶 SDS 使菌体 裂解。 加等体 积苯酷 (水饱 和并用 THs 调至 PH8.0) 及"^ 体积氯 仿-异 

2 

戊醇 (24:1) 提取 两次, 再用 等体积 氯仿- 异戊醇 (24:1) 提取 两次。 在水相 中加入 ^ 体 

积 NaAc (2M, pH 5.0) 及二 倍体积 预冷的 无水乙 醇沉淀 DNA。 使用 直径为 1.4 厘米 
的电 泳管进 行制备 电泳, 每管 上样量 200 微克 DNA, 以溴 乙锭为 DNA 定'! 位指 示剂。 
电泳后 切取发 荧光的 含质粒 DNA 的凝胶 薄片, 放 人透析 袋中, 在 冰浴中 电渗析 3 小时, 
电流 0.07 安培, 在电 场作用 下质粒 DNA 与凝胶 分开, 进入 透析袋 内的溶 液中, 吸出含 
pBR322 DNA 的溶 液即为 成品。 

(二) 离子 交换膜 电渗析 

离子 交换膜 电渗析 器主要 由离子 交换膜 隔板, 电极 及电渗 析池和 外接直 流电源 组成。 
其中离 子交换 膜最为 重要, 它 可以选 择透过 或阻留 不同的 离子。 离 子交换 膜的选 择透性 
一方面 决定于 膜表面 的孔隙 度大小 ,只让 小于膜 上孔隙 的物质 通过, 大于膜 上的孔 隙的物 
质被 阻留。 另"^ 方面, 也决定 于组成 膜的离 子基团 ,它 们在强 电场作 用下对 某种离 子所起 
的吸附 或排斥 作用, 能够达 到选择 分离的 目的。 如带磺 酸基团 的阳膜 ,在电 场中电 离为带 

负电的 R- sor, 它吸 引和让 阳离子 通过, 而对阴 离子则 起排斥 作用。 同样, 带有 季胺基 

团的 阴膜, 在电场 中电离 为带正 电荷的 R-N+(NH3)3, 它只吸 引和让 阴离子 通过, 而对限 




水 或其他 

缓冲液 



水 或其他 
搅拌器 iS 冲液 



室 内装纯 净溶剂 (一 般为水 ), 并分别 插入正 
负 电极。 通电后 ,中心 室内试 液的阳 离子透 
过膜 移向阴 极槽, 阴 离子则 移向阳 极槽。 透 
析开 始时, 因中 心室内 离子浓 度大, 可 用较低 
电压, 当中心 室离子 浓度很 低时, 可适 当升高 
电压, 以缩 短透析 时间。 实验 室电渗 析常用 
电压为 200 — 300 伏, 电流为 50 毫安 左右。 



图 7-41 电渗 析基本 装置图 



用电 渗析法 也可分 离一些 带有电 荷的生 
物大 分子, 如蛋白 质和核 酸等。 但具 体操作 
时, 需经凝 胶电泳 将样品 初步分 开后, 再通过 
电 渗析方 法使所 需组份 与凝胶 分离。 现举电 



表 7-11 国外 离子交 换胰电 渗析应 用简况 



类 另 IJ 


试验中 


工业化 


脱 
盐 


高纯水 
蛋白 质精制 
糖 类脱盐 
液 晶脱盐 
人 工肾膜 


海 (咸) 水淡化 
放 射性废 液处理 
血清脱 硫酸铰 
牛乳乳 清脱盐 
氨基 酸脱盐 
干酷 素制造 


缩 


同位 素分离 
铼、^ 、金、 锆分离 

电镀 液回收 
显 影剂废 液回收 

造纸废 液回收 ' 
氢氟 酸分离 


海 水浓縮 
纸装黑 液处理 

由铺 r^i?^i±i Mi 5Rn H so. fniiKr 

人造丝 粘性废 液回收 
酸 的回收 


换 


磷 酸纯化 


里' >4 "日 W 敌? <r*t 

无机和 有机药 品制备 


电解 

氧化 
还原 


醋酸 纳电解 
硫酸 纳电解 

脂 肪族氧 化生成 单浣基 酸和魅 
甲 基丙煤 酸聚合 
铝 渔回收 


食 盐电解 
丙 炼腈电 解还原 

Za-Ni 合 金电镀 
Fe 还原 


水解 


酸 滅制备 




复 
分 
解 


2NaCl + Ca(OH), 
= 2NaOH + CaCU 

2NaCl + (NHO^COj 
= NajCOj + NH.Cl 




电泳 


同价离 子分离 


电 泳涂漆 



离子 起排斥 作用。 现以 淡化海 水时氯 化钠的 电渗析 为例, 说明 电渗析 原理: 如图 7-42 所 
示, 许多 阴膜和 阳膜交 替排列 组成多 槽电渗 析池, 在直流 电场作 用下, Na+ 趋向 阴极并 
与 阳膜上 H+ 交换而 选择性 地透过 阳膜, 但 被阴膜 所阻而 留于有 * 符号 的浓缩 室中; C1 - 
趋向阳 极并与 阴膜上 OH— 交换而 选择性 地透过 阴膜, 但被 阳膜阻 留于有 * 符号 的浓缩 
室中。 于 是在有 A 符号 的淡化 室中, 由于 溶液中 NaCl 含量 减少而 变淡, 而 浓缩室 中海水 
因 NaCl 含量 增加而 变为浓 盐水。 各室中 淡水, 浓盐水 分别由 不同管 道排出 ,就达 到咸水 
淡化 和浓盐 水用于 制盐的 目的。 实际操 作时还 应附加 预处理 设备, 淡水再 除盐装 置及浓 
盐水再 循环处 理等。 

离子 交换膜 电渗析 主要用 于海水 淡化与 制盐, 工业 上脱盐 浓缩。 在生 化方面 也常用 
于蔗糖 、柠檬 酸和抗 菌素等 的分离 提纯, 注射 用水的 制备, 蛋白 质与氨 基酸的 脱盐等 [ ","j。 

六十年 代后, 离 子交换 膜电渗 析用的 膜及各 种电渗 析器装 置日新 月异。 如日 本德山 
曹达公 司生产 的离子 交换膜 就将近 十四种 ,美国 AMF 公司、 杜邦 公司、 英国的 Permutit 
公司 等也生 产多种 型号的 离子交 换膜。 目 前离子 交换膜 的品种 繁多, 根据 膜上所 带活性 
基团可 分为阳 膜和阴 膜二大 类型。 近来 按照不 同的分 离目的 还发展 了许多 不同性 能的离 

• 219 • 



正极 



浓 出水口 



A+ 阳膜 

C -阴膜 
R+ 阳离子 
X - 阴离子 



0: 



淡 出水口 



阴 



阳 



i 极 



A 



■C1- 

_1_ 



阴 



阳 



阳极水 



Na+ 



•Ci- 

A 



阴 



阳 



Na+ 



ci- 

-i- 



c- 



负极 



—X- 7 
-H2O — 



阴 



阳 



_ is. 



A 



a- 
_* _ 



■H, 



f 

负极 



浓 室进口 

:淡 室进口 



阴极水 



图 7-42 海水淡 化离子 交换膜 电渗析 示意图 



子交 换膜, 如磯酸 -接酸 螯合 型膜, 吡啶 季胺- 幾酸两 性膜, 用 于压渗 (是 一种 渗析和 反渗析 
相结 合的新 技术) 的镶嵌 型膜, 以及 无机离 子交换 膜等。 

离子交 换膜电 渗析在 国外的 应用情 况见表 7- 11" 6] , 近 年来, 国 内离子 交换膜 的研制 
及电 渗析的 应用, 也发展 较快, 如上海 化工行 业已生 产多种 异相膜 、半均 相膜及 均相膜 ,用 
于海水 淡化, 污水 处理, 综合 回收等 试验。 .在 生化分 离制备 方面, 上 海酵母 厂用电 渗析法 
从柠檬 酸发酵 液分离 提纯柠 檬酸, 1977 年经鉴 定认为 可以投 产"" 。 



考 文 



献 



[1 

[2 
[3 
[4 
15 
[6 
[7 
[8 

[9 

[10 
[11 
[12 

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. 221 . 



第八章 结 晶 方 法 

苏拔贤 

第一节 结晶与 晶体一 般性质 

结 晶是物 质从液 态或气 态形成 晶体的 过程, 但在生 物化学 领域中 ,绝大 多数的 物质的 
结晶, 都是 从液态 通过一 定条件 形成晶 态的。 结 晶是物 质分离 纯化的 一个古 老而目 前还十 
分常用 的手段 ,它 普遍应 用于各 种化学 制备工 艺中, 制 备结晶 物也常 作为结 构分析 之用。 

按 照一般 结晶化 学原理 [ 1 ] ,一个 结 晶应是 具有一 定形状 的固态 物质, 这 种固态 物质由 
许多性 质相同 的粒子 (包括 原子、 离子和 分子) 有规律 地排列 而成。 但某些 物质如 玻璃和 
树脂, 外观很 像晶态 固体, 实际 上是熔 体过冷 而成的 无定形 物质, 只因 粘性很 大不易 变形。 
某些液 体乍看 起来不 像晶体 ,但内 部结构 明显地 具有晶 体空间 排列规 律性, 如某些 棒状大 
分子 晶体受 热转为 液体, 或 生物大 分子中 所结合 的水层 都具有 此种规 律性, 这种液 体称为 
液 态晶体 或简称 液晶。 液晶是 物质一 种特殊 状态, 即在一 定温度 内既具 有液体 的特性 ,同 
时又具 有晶体 特性的 物质。 

物质 属于晶 态或非 晶态, 主要 区别是 晶态物 质的许 多性质 (如 电学和 光学等 性质) 都 
具有方 向性, 即 一个晶 体在同 一方向 上具有 相同的 性质, 在不同 方向上 具相异 性质, 称为 
晶体 各向相 异性, 非 晶体则 不具此 性质。 其次是 晶态物 质具有 一定对 称性。 晶体 外形对 
称性也 是晶体 内部规 律性的 反映。 晶 体外形 结构的 几何规 律性可 以归纳 成许多 对称类 
型。 晶体上 述这些 特性都 是由于 组成晶 体的粒 子排列 具有空 间点阵 的周期 性所引 起的。 
所谓空 间点阵 学说, 简单 地说, 就是把 构成晶 体内部 粒子的 排列, 形 象地比 喻为一 盘摆在 
三维 空间排 列的" 围棋 子", 而点阵 中每一 个点子 (也 称结点 ), 便代 表着一 个粒子 或粒子 
集团的 重心, 而 整个晶 体结构 即由每 个结点 沿着空 间不同 方向, 并 按一定 距离周 期性地 




平移 而成。 每一 平移距 离称为 周期, 不 同方向 周期不 
同, 而 每个结 点周围 环境条 件是相 同的。 空间 点阵学 
说的 建立, 使 晶体许 多性质 得到了 合理的 解释。 因此, 
晶体的 现代定 义是: 许多 性质相 同的粒 子在三 维空间 
有 规律地 排列成 格子状 固体, 称为 晶体。 围绕 晶体的 
天然平 面称为 晶面, 二个晶 面的交 线称为 晶接。 而晶 

体中 每个格 子称为 晶胞。 图 8-1 是尿素 晶体中 一个晶 
胞, 它含 有九个 分子。 一个晶 体内的 晶胞之 大小, 所含 



图 8-1 尿 素晶胞 示意图 原子 或分子 数目及 其分布 规律, 可通过 X 射线 衍射方 

法测定 并计算 求出。 

晶体 内部有 规律的 结构, 规定 了晶体 的形成 必须是 相同的 离子或 分子, 才可能 按一定 
距 离周期 性地定 向排列 而成。 所 以能形 成晶体 的物质 是比较 纯的。 在生化 制备中 ,许多 
• 222 - 



小分子 物质如 各种有 机酸、 单糖、 核苷酸 、氨 基酸、 维 生素、 辅 酶等, 由 于其结 构比较 简单, 
分离至 一定纯 度后, 绝大部 分都可 以定向 聚合形 成分子 型或离 子型的 晶体。 至于如 多糖、 
蛋白质 、酶和 核酸等 生物大 分子, 由于分 子量大 ,结构 复杂, 不 易定向 聚集, 获得结 晶就相 
对困难 得多。 但生物 大分子 都是由 相同或 相似的 小分子 "单 体" 缩合 而成, 如蛋白 质和藤 
由 二十种 a- 氨 基酸通 过肽键 组成, 多 糖类由 一种或 数种单 糖通过 糖昔键 组成, 两 大类核 
酸 由四种 核苷酸 通过磯 酸二酯 键连接 而成。 因此, 生物 大分子 也具有 形成晶 体的能 力-. 但 
这 种能力 和大分 子结构 和外形 有很大 关系。 一般 来说, 分子支 链较少 、对称 的比支 链多、 
不对 称的分 子容易 结晶, 分子量 越大越 难结晶 ,分子 量小, 易 结晶。 例如大 多数球 蛋白和 
薛 蛋白比 较容易 结晶, 一 些大小 均勾的 病毒特 别是植 物球状 病毒, 也 比较容 易得到 结晶, 
高度不 对称的 核酸大 分子, 与蛋白 质相比 则较难 结晶。 (在 一定条 件下, 小心 操作, 也可以 
获得一 定结晶 度的固 体。) 还有一 些结构 复杂, 不 对称的 核酸、 蛋白 质和多 糖类, 迄 今仍未 
能获得 晶体。 

大 多数物 质结晶 都是在 溶液中 进行, 故 晶格中 常含有 一定结 晶水。 无 机化合 物所含 

结 晶水的 量常在 分子式 后予以 标明, 如蓝 矾写作 CuS04*5H20, 为硫酸 铜的五 水化合 
物。 有机化 合物及 生物大 分子的 晶体也 含有结 晶水, 如许多 蛋白质 和酶的 结晶水 含量常 
达 10 — 50%。 /?- 乳球 蛋白、 麻仁 蛋白、 溶菌酶 的晶体 水份分 别占晶 体重量 46%, 39.2fo 
和 48%, 而原 肌球蛋 白的长 角片晶 中水竟 占总重 90fo, 可见 水在蛋 白质晶 体中占 的比重 
相 当大。 晶体的 水含量 与晶体 蒸汽压 强有关 ,当晶 体蒸汽 压强高 于大气 蒸汽压 强时, 则风 
化 失去结 晶水, 当晶 体蒸汽 压强低 于周围 大气压 强时, 则晶体 吸收空 气中的 水分而 潮解。 
所 以一定 的水份 对维持 晶体的 结构是 十分重 要的。 

鉴定物 质的晶 态与非 晶态, 通常在 光学显 微镜或 偏光显 微镜下 观察其 形状、 大 小和消 
光 现象; 或者进 一步用 X 射 线衍射 方法加 以分析 鉴定。 

第二节 生化 物质形 成结晶 的条件 [2 , 3 , 4 ] 

物质能 不能结 晶主要 决定于 物质的 本性, 但具有 一定结 晶能力 的物质 进行结 晶时还 
必 须在一 定的条 件下才 能形成 结晶, 各种生 化物质 形成结 晶时, 往 往要求 一定样 品的纯 
度, 溶液 的饱和 度和溶 剂的性 质等三 个主要 条件, 其 中纯度 和溶液 饱和度 是决定 因素。 

一、 样 品纯度 

所 谓纯度 是指所 需要的 组分与 不需要 的杂质 所占的 比例。 杂质 占比例 越低, 则所制 
备物质 的纯度 越高。 物质 欲在溶 液中析 出结晶 不论是 小分子 或大分 子均需 达到一 定纯度 
才能 发生。 但究竟 纯化到 什么程 度才能 结晶, 则依各 种物质 而异, 没有 一定的 标准。 有些 
样 品虽然 纯度很 不高, 欲条件 合适, 也可 以从混 合液中 单独析 出结晶 (如毛 发水解 液中结 
晶胱氨 酸)。 对于大 多数的 蛋白质 来说, 一般要 求纯度 常常达 50fc 以上 才进行 结晶。 样品 
的纯 度对结 晶的影 响是由 于结晶 过程具 有高度 选择的 缘故。 杂质的 存在, 有的影 响待结 
晶溶质 在晶面 上的定 向排列 ,使结 晶无法 进行或 进行得 很慢, 阻碍 晶核的 形成, 有 些杂质 
还能 与结晶 溶质化 合或结 合成络 合物。 所以在 结晶前 总是设 法通过 各种分 离纯化 手段, 

. 223 . 



使 样品达 到一定 纯度后 才进行 结晶。 - 

有时候 某些杂 质吸附 在晶体 表面, 只影 响晶体 色泽, 而 不防碍 晶体的 形成, 这 时可加 

少量 (一 般为 1 一 2fe) 的活 性炭、 硅 藻土、 活性白 土等, 利用有 色杂质 一般具 有较多 双键与 
发色 基团, 容易 被这些 脱色剂 吸附的 特点, 进行 有选择 地吸附 再通过 离心过 滤方法 除去杂 
质 后仍可 以获得 良好的 结晶。 但 使用以 上吸附 剂时必 须防止 这些吸 附剂同 时对样 品的吸 
附。 



结晶形 成的条 件最主 要的是 建立在 溶解度 改变的 基础上 ,因此 找到了 合适的 浓度, 结 
晶物的 分子或 离子便 有足够 的相碰 机会, 并按一 定速率 作定向 排列聚 集而形 成晶体 。浓度 
太高达 过饱和 状态时 ,结晶 物的分 子在溶 液中聚 集析出 的速度 太快, 超过这 些分子 形成晶 
核的 速率, 便得不 到晶体 ,只 获得一 些无定 形固体 微粒, 或虽得 到一些 结晶, 但 共沉物 (或 
杂质) 含量 很高。 相 反浓度 太低, 样品溶 液处于 不饱和 状态, 结晶形 成的速 率远低 于晶体 
溶解的 速率, 也不 能得到 结晶。 因 此只有 在稍稍 过饱和 的状态 (或 称低 过饱和 状态) 下, 即 
形成 结晶速 率稍大 于结晶 溶解速 率的情 况下才 能获得 晶体。 结晶 的大小 和均勾 度和结 1| 
的饱 和度有 很大的 关系, 获 得良好 的结晶 一般常 控制在 饱和区 以上、 过饱和 区以下 的稳定 
区 范围内 (见图 8-2)。 此时, 晶体 附近的 溶液浓 度接近 于饱和 状态, 而较外 层的溶 液为过 
饱和 状态, 利用这 种浓度 差使外 层待结 晶的溶 质向晶 体周围 扩散, 最 后定向 地沉积 于晶体 
表面上 ,使结 晶逐渐 长大。 所以, 结晶开 始时, 应使溶 液处于 稍稍过 饱和状 态以利 于晶粒 
形成; 然后控 制在稳 定区范 围内, 这时 形成新 的晶核 较少, 主要使 巳形成 的结晶 长大, 便可 
获得较 大的和 均匀的 结晶。 

在过饱 和区是 新晶核 大量形 成的浓 集区, 晶核形 成以后 没有一 个稳定 的使晶 体长大 
的所谓 "养晶 区", 于 是只得 到一些 颗粒很 小又不 均勾的 晶体。 过饱 和度的 大小与 晶核生 
成的 速度关 系见图 8-3, 在图 中可以 看到, 过饱和 越大, 晶核生 成速度 越快, 形成结 晶的颗 
粒 愈小。 晶粒 过小不 仅影响 分离过 滤上的 困难, 而且 造成结 晶产率 和质量 下降。 如在味 
精 (谷氨 酸钠) 的 结晶过 程中, 常保持 溶液在 64〜65°C 左右, 浓度 在波美 31.5〜32 度, 结 
晶 成长刚 好在稳 定区。 浓度过 高时, 结 晶液发 生混浊 现象, 表示 新的晶 核大量 形成, 此时 



、 溶液的 饱和度 




m 




温度 —— - 

图 8- 2 晶 体形成 的浓度 区域图 

• 224 . 



过 饱和度 一~ - 

图 8- 3 晶 核形成 速度和 过饱和 度关系 示意图 



必须 用热的 蒸溜水 调节, 消除混 '洩 现象, 保持溶 液在稳 定区的 浓度, 方能获 得较大 整齐的 

结晶。 

在 晶核形 成时, 如何控 制结晶 液刚好 在低过 饱和度 状态? 在工业 大规模 生产时 ,常将 
结晶溶 液浓缩 至一定 程度, 或加 人各种 沉淀剂 (盐或 有机溶 剂), 至溶液 出现乳 白色混 '浊, 
即认 为低过 饱和度 巳到, 而放置 结晶。 这种粗 略估计 方法, 对 于制备 一般试 剂药品 用的生 

化分子 的结晶 ,已 可满足 要求, 但对 于制备 一些供 X 射线 结构分 析用的 大结晶 (须 大于 0.1 
mm 直径 )。 按常规 方程, 当样品 发生混 浊时, 实 际已超 过最低 的过饱 和度, 此时很 难取得 

较大的 晶体, 必 须小心 地测出 样品的 溶解度 曲线, 然后从 中求出 最低的 过饱和 度;' 5j 或者 
通过十 分缓慢 的蒸发 和扩散 作用, 使 结晶液 达到低 过饱和 度后, 并保 持溶液 的稳定 浓度, 
才可 获得较 大的单 晶体。 关于以 蛋白质 为对象 的一些 微量结 晶方法 本章后 面还将 进一歩 
讨论。 

三、 溶 剂的选 择 

溶剂 对于晶 体能否 形成和 晶体质 量的影 响十分 显著, 故 找出合 适的溶 剂是结 晶实验 
首先 考虑的 问题, 一个物 质的结 晶究竟 选用什 么溶剂 合适? 需要对 此物质 某些性 质如溶 
解度、 稳 定性及 温度系 数等进 行预试 验才能 确定。 对于大 多数生 化小分 子来说 ,水、 乙醇、 

甲醇、 丙酮、 氯仿、 乙酸 乙酯、 异 丙醇、 丁醇、 乙醚、 N- 甲 基甲酰 胺等溶 剂使用 较多。 尤其是 
乙醇, 既具亲 水性, 又具亲 脂性, 而且价 格便宜 、安全 无毒, 所以 应用得 最广。 至于蛋 白质、 
酶和 核酸等 大分子 使用较 多的是 硫酸铵 溶液、 氯化钠 溶液、 磯酸缓 冲液、 Tris 缓冲 液和丙 
酮、 乙醇等 。有时 某单一 溶剂不 能促使 样品进 行结晶 ,则 需考虑 使用混 合溶剂 (但这 两种溶 
剂应能 相互混 合)。 操作时 先将样 品用溶 解度较 大的溶 剂溶解 ,再缓 慢地分 次少量 加人对 
样 品溶解 度小的 溶剂, 直至产 生混浊 为止, 然后 放置或 冷却即 可获得 结晶。 也可选 用在低 
沸点溶 剂中易 溶解, 在 高沸点 溶剂中 难溶解 的高低 沸点二 种混合 溶剂。 当 结晶液 放置一 
段时间 ,低 沸点溶 剂由于 慢慢蒸 发掉而 使结晶 形成。 许多生 物小分 子结晶 使用的 混合溶 
剂 有水一 乙醇, 醇一醚 ,水一 丙酮, 石油 醚一丙 酮等。 
选 择结晶 溶剂常 注意如 下几个 条件: 

(1) 所用 溶剂不 能和结 晶物质 发生任 何化学 反应。 

(2) 选用 的溶剂 应对结 晶物质 有较高 的温度 系数, 以便 利用温 度的变 化达到 结晶的 
目的。 

(3) 选用 的溶剂 应对杂 质有较 大的溶 解度, 或在 不同的 温度下 结晶物 质与杂 质在溶 
剂中 应有溶 解度的 差别。 

(4) 所用溶 剂如为 易挥发 的有机 溶剂时 ,应考 虑操作 方便, 安全。 工业 生产上 还考虑 
及成本 高低, 是否 容易回 收等。 

当然以 上条件 并不是 对每一 种物质 都是符 合的。 事物的 矛盾总 有主次 之分, 对于未 
知物的 结晶, 溶剂的 选择主 要为了 能获得 结晶, 重结 晶时才 考虑溶 剂其他 方面的 性能。 对 
于具 有生理 活性的 生物大 分子, 溶 剂对分 子活性 的影响 (即生 物大分 子的稳 定性) 常是最 
先考虑 的问题 ,一 般选用 温和的 条件下 缓慢地 结晶以 及反复 多次地 进行重 结晶, 而 不宜使 
用 强烈的 条件。 

. 225 . 



第三节 晶核 形成及 晶体生 长的影 响因素 

一、 晶 核的形 成及诱 导方法 

晶核的 形成一 般方法 是将饱 和溶剂 冷却、 蒸发 除去部 分溶剂 或者加 入沉淀 剂等, 使溶 
液达到 过饱和 状态, 则 其中过 饱和部 分的溶 质便渐 渐析出 晶核。 如 只由溶 质分子 (或离 
子) 自身定 向聚集 形成的 晶核, 叫作" 同相结 晶化" ,这在 低过饱 和的样 品溶液 中很难 发生, 
需要 较高过 饱和度 或放置 较长时 间才能 产生结 晶核, 故在工 业生产 及实验 常规结 晶时, 通 
常待 溶液达 到稍过 饱和状 态后, 加入同 种晶核 ,或 某些异 种固体 微粒, 使形 成二相 交界面 
诱导 晶核的 形成, 这叫作 "异 相结晶 化"。 在异相 结晶化 中加晶 种诱导 结晶方 法是最 常用的 
方法, 此法 如掌握 适当, 不仅缩 短结晶 时间, 而 且所得 的晶体 较大而 且均勾 整齐。 

添加晶 种诱导 晶核形 成的常 用方法 大致如 下 [ ": 

(1) 如有现 成晶体 ,可取 少量研 碎后, 加入少 量溶剂 ,离心 除去大 的颗粒 ,再稀 释至一 
定浓度 (稍稍 过饱和 ), 使悬 浮液中 具有很 多小的 晶核, 然后倒 进待结 晶的溶 液中, 用玻棒 
轻轻 搅摔, 放置 一段时 间后即 有结晶 析出。 

(2) 如 果没有 现成的 晶体, 可取 1 一 2 滴待 结晶溶 液置表 面玻璃 皿上, 缓慢蒸 发除去 
溶剂, 可获 得少量 晶体。 或者 取少量 待结晶 溶液置 于一试 管中, 旋转 试管使 溶液在 管壁上 
形成 薄膜, 使溶剂 蒸发至 一定程 度后, 冷却 试管, 管壁上 即可形 成一层 结晶。 在玻 璃皿或 
试管 壁上的 结晶, 用玻棒 刮下沾 取少量 接种到 待结晶 溶液中 ,轻轻 搅拌, 并放 置一定 时间, 
即有 结晶的 形成。 

对以光 学异构 体进行 诱导结 晶时, 加入 的晶种 须根据 分离晶 体性质 而定。 如 加人光 
学性质 相同的 晶体, 便 优先诱 导形成 同种异 构物的 结晶。 

此外, 有些 蛋白质 和酶结 晶时, 常要求 加人某 种金属 离子才 能形成 晶核。 如转 胰岛素 
和镉铁 蛋白的 结晶。 它们结 合的金 属离子 便是形 成晶核 时必不 可少的 成份。 

实验室 结晶操 作时, 人 们较喜 欢使用 玻璃棒 轻轻刮 擦玻璃 容器的 内壁, 刮擦 时产生 
玻 璃微粒 可作为 异种的 晶核。 另玻 璃棒沾 有溶液 后暴露 于空气 部分, 很易 蒸发形 成一层 
薄薄的 结晶, 再浸 人溶液 中便成 为同种 晶核。 同时用 玻璃边 刮擦边 缓慢地 搅动也 可以帮 
助溶 质分子 在晶核 上定向 排列, 促成 晶体的 生长。 

最后应 该指出 ,对加 人固体 微粒诱 导形成 晶核的 方法, 需 看结晶 物质的 用途而 有选择 
地 使用。 如要求 纯度很 高或用 X 射线衍 射结构 分析的 晶体, 结晶 时异种 晶体、 玻璃 微粒、 
尘埃、 气泡、 变性 生物大 分子均 应尽量 除去。 制得 的晶体 的纯度 才合乎 要求。 

二、 影响结 晶生成 的因素 

结晶 的生成 除与溶 液饱和 度和溶 剂性质 等因素 直接有 关外, 还 受下列 因素的 影响: 
(-) 温度 

温度 对溶解 度的影 响是人 们所熟 知的, 许多 物质在 温度升 高时, 溶解度 升高, 温度降 
• 226 • 



低时, 溶解度 也随之 减少, 但也有 例外。 故 许多耐 热小分 子物质 一般采 用高温 溶解, 缓慢 
冷却 结晶的 方法。 冷却 的速度 及冷却 的温度 直接影 响结晶 效果, 冷 却太快 引起溶 液突然 
过 饱和, 易形成 大量结 晶微粒 ,甚 至形成 无定形 沉淀。 冷却 的温度 太低, 溶 液粘度 增加, 也 
会 干扰分 子定向 排列, 不利于 结晶的 形成。 温度不 同,. 同一物 质其结 晶形态 及结晶 大小, 
质量也 有很大 差别。 

利 用温度 差方法 对生物 大分子 进行结 晶时, 更需注 意掌握 结晶的 条件, 各种蛋 白质的 
结晶 对温度 要求有 很大的 不同, 如触珠 蛋白在 高盐浓 度下常 需要比 室温稍 高的温 度才能 

结晶, 而血清 清蛋白 则需较 低温度 下长期 存放才 能结晶 [ a ] 。 所以很 多生化 大分子 结晶时 
利用温 度变化 的方法 ,很难 在理论 上划定 标准, 只能根 据实践 而定, 不同于 一些有 机小分 
子 物质。 生物 大分子 整个分 离纯化 过程, 包括结 晶在内 ,通常 要求在 低温或 不太高 温度下 
进行。 低温有 利于保 护生物 活性, 尤其是 使用有 机溶剂 进行结 晶时, 要 求温度 更低。 否则 
由于 有机溶 剂作用 引起蛋 白质变 性就无 法形成 结晶。 

(二) PH 

pH 值的 变化, 可以 改变溶 质分子 的带电 性质, 是 影响溶 质分子 溶解度 的一个 重要因 
素。 在一般 情况下 ,结晶 溶液所 选用的 pH 值与沉 淀大致 相同。 蛋 白质、 酶等大 分子结 
晶的 pH 多 选在该 分子的 等电点 附近。 如果 结晶时 间较长 并希望 得到较 大的结 晶时, 
pH 值可选 择离等 电点远 一些, 但必 须保证 这些分 子的生 物活性 不受到 损害。 高野 常広、 
森 本英树 等对细 胞色素 C (氧 化型) 的结晶 条件做 了一系 列研究 [ "。 细 胞色素 C 浓度从 
0.17% 至 5.0f。 结晶 溶液所 选用的 pH 从 5.0、 6.0、 6.6、 7.0、 7.6 至 8.0, 硫酸铁 饱和度 
(%) 从 67% 至 85fc 范围, 实验结 果表明 ,细 胞色素 C (氧 化型) 结晶时 最佳条 件为: 样品 
浓度为 lfc, PH6.0 左 右生成 的结晶 最佳。 细 胞色素 C (氧 化型) 对 pH 值范 围要求 很窄, 
超过 PH6.6 或不到 5.0, 虽然 增大细 胞色素 C 的浓 度, 也 得不到 结晶。 当 然对不 同蛋白 
质及生 化物质 结晶时 所要求 pH 范 围宽窄 不一, 当视具 体情况 而定。 

<H) 结晶 的时间 

晶核形 成后, 在晶核 表面即 密集着 大量待 结晶的 溶质, 这 些待结 晶溶质 先铺满 一层晶 
面后才 开始铺 第二层 晶面, 最 后得到 内部十 分整齐 排列的 晶体。 

结 晶的速 度以单 位时间 内在单 位晶体 表面上 所结晶 的量来 表示。 当结 晶速度 为一定 
时, 单位 时间内 总结晶 量与结 晶总表 面积成 正比。 一定重 量的结 晶所含 晶体数 目愈多 ,则 
总面积 愈大, 单位 时间内 总的结 晶量也 愈大。 也 就是说 生成晶 体数量 很多, 但颗粒 较小。 
所以结 晶速度 太快, 不仅结 晶粒小 ,而 且常常 含杂质 量多。 因为在 重量相 同的条 件下, 小晶 
体的巨 大的总 表面积 对杂质 吸附的 机会要 比大晶 体多。 故大 的晶体 总比小 的晶体 纯净。 

蛋白质 、酶等 生物大 分子结 晶时, 由于分 子内有 着许多 功能团 和活性 部位, 其 结晶的 
形 成过程 也复杂 得多。 简 单的无 机或有 机分子 形成晶 核时需 要几十 个甚至 几百个 离子或 
分子 组成。 但蛋白 质分子 形成晶 核时, 只有 很少几 个分子 即可。 不 过这几 个分子 整齐排 
列成晶 核时, 比几 十个几 百个小 分子、 离子 所费时 间要多 得多。 所以蛋 白质、 酶、 核 酸等生 
物大分 子形成 结晶常 需要较 长时间 ,如 Bernal 和 Crowfoot 在 1934 年制 备用于 X 射 线衍射 
的 胃蛋白 酶结晶 花了几 个月才 完成。 现在, 由于 方法的 进步, 结晶一 个生物 大分子 时间比 

. 227 • 



以往少 得多了 ,如最 近梁栋 材等用 微量静 置法, 在柠檬 酸缓冲 液中, 培养 出可供 X 射线结 
构分 析用的 B 链 NH2 端 L- 蛋 氨酸牛 胰岛素 单晶, 晶体大 小可达 l.OXl.OXl.Omm 3 , 外 
形为正 棱十二 面体, 只 用了四 周时间 t 8] , 当然不 同物质 或不同 实验要 求所需 要的结 晶时间 
长短 不同。 但欲得 到纯净 ,整齐 的大结 晶体都 必需一 定结晶 时间。 

(四) 愤伴 

搅 拌主要 使晶体 与母液 均勾地 接触, 搅拌的 快慢, 对晶体 大小和 均勾度 有一定 影响, 
搅太剧 烈会损 坏晶体 并影响 晶体的 生长。 搅 伴速度 太慢, 不 能保持 整个结 晶器中 低过饱 
和度的 恒定, 甚 至使大 部分晶 体颗粒 都积沉 在容器 底部, 晶体 生长不 均勾, 一般工 业大生 
产所设 计的搅 拌结晶 装置, 各种搅 拌器的 搅伴转 数多以 5 — 15 转 / 分 为宜。 

第四节 结晶衍 生物及 重结晶 [2 , 6 ,93 

一、 结 晶 衍生物 . 

生物体 内某些 组份, 其游离 状态很 难形成 结晶, 可考虑 先制成 结晶衍 生物, 然 后用其 
他方法 复原。 例如有 机酸类 与钙、 钾、 钠 成盐, 某些生 物碱及 具有碱 性基团 的胺类 与有机 
酸或 无机酸 成盐, 均可获 得很好 结晶衍 生物, 然 后通过 适当方 法使之 复原。 有些生 物大分 
子的 结晶, 也可以 先通过 形成无 活性的 结晶衍 生物, 如 酵母炼 醇化酶 和木瓜 蛋白酶 与汞结 
合, 生成无 活性的 求炼醇 化醒和 汞木瓜 蛋白酶 结晶衍 生物, 再经 透析除 去汞, 便可 获得活 
性 的炼醇 化酶和 木瓜蛋 白酶。 

二、 重结晶 

重结晶 是生化 制备最 后阶段 常用的 一种精 制方法 ,当粗 结晶获 得后, 再 结晶则 可得到 
更纯的 产物。 重结 晶时宜 选用对 制备物 比较难 溶而对 杂质较 易溶解 的溶剂 条件, 有时还 
需要用 二种不 同溶剂 分别除 去一些 彼此性 质相近 的杂质 和共沉 组份。 并尽 可能利 用温度 
差及其 他改变 溶解度 的因素 ,使通 过重结 晶获得 较纯的 晶体。 

如粗结 晶中含 有两种 以上的 成份, 它 们在溶 剂条件 下溶解 度存在 差别, 常用分 步结晶 
法使之 分离。 分歩结 晶时, 一般 将粗晶 中含量 最多的 成份, 通 过溶剂 选择及 温度差 方法, 
使之首 先分离 出来, 然后再 把留在 母液中 其他成 份逐个 地处理 分开。 分步 结晶的 方法如 

图 8-4 所示: 

粗结晶 

(+ 溶剂) 
/ \ 
结晶 1 母液 1 

(+ 溶剂) / \ 

结晶 1A 母液 1A + 结晶 2 母液 2 

(十 溶剂) \ / \ 

/ \ 母液 2A + 结晶 3 母液 3 

结晶 IB 母液 1B + 结晶 2B 

图 8-4 三角 形分歩 重结晶 示意图 

. 228 . 



实验操 作时, 先 将粗结 晶溶于 少量选 好的溶 剂中, 并经 一定操 作后, 使 达稍过 饱和状 
态, 放置后 得结晶 1 。 离心或 过滤后 与母液 1 分开, 结晶 1 再在新 鲜的溶 剂中重 结晶, 得 

结晶 1A 和母液 1A。 再 把上一 歩得到 的母液 1 浓缩 使之析 出结晶 2 和母液 2 , 然 后再使 
结晶 2 与母液 1 合并再 结晶, 得结晶 2A 与母液 2A。 如 此交互 进行再 结晶, 在某 一溶剂 
系统 中溶解 度低的 一方得 近似单 一成份 的结晶 物质, 而在另 一方的 母液中 含有溶 解度高 
的物质 ,最 后通过 鉴定可 分别获 得不同 组份的 晶体。 

物质经 过结晶 与重结 晶后, 所 得的晶 体虽然 纯度有 很大的 提高, 但还不 能说已 经达到 
十分 纯的程 度了。 有 时须经 多次重 结晶, 直至恒 定状态 ,并通 过各种 方法的 鉴定才 能判断 
晶体 的纯度 情况。 鉴 定晶体 纯度和 鉴定固 态或液 态生化 物质纯 度的方 法基本 相同, 但结 
晶体常 可从外 形观察 晶形是 否一致 及色泽 是否均 勾加以 判断, 另外 还可以 从下面 几方面 
鉴定其 纯度: 

1. 熔 点及熔 距测定 是否符 合规定 范围。 

2. 层析、 电 泳的均 一性的 鉴定。 

3. 光学活 性的物 质的旋 光测定 及其它 光谱法 鉴定。 

4. 生物 大分子 晶体物 质的纯 度除参 考上述 2, 3 二点 测定方 法外, 还可 进行生 物活性 
测定。 

以上分 析工作 均以标 准品为 对照, 以判断 其相对 "纯 度"。 

第五节 结 晶的一 般方法 

在工 业上, 结 晶的方 法在原 理上常 分为两 大类, 第一类 是除去 一部分 溶剂, 如 蒸发浓 
缩使 溶液产 生过饱 和状态 而析出 结晶。 第 二类是 不除去 溶剂, 而用 直接加 人沉淀 剂及降 
低 温度等 方法, 使溶液 达到饱 和状态 而析出 结晶。 实际 上常是 两者结 合使用 较多。 在实 
验室 进行一 些生化 组份结 晶可细 分为下 列几种 方法: (1) 盐 析法: 主要用 于大分 子如蛋 
白质、 酶、 多肽等 物质的 结晶。 因为 这些大 分子不 耐热, 对 PH 变化 及许多 有机溶 剂的使 
用 均十分 敏感, 而使用 中性盐 作为沉 淀剂, 降 低这些 物质的 溶解度 而产生 结晶, 不 仅安全 
而操作 简便。 盐 析结晶 法和本 书第三 章所讨 论的盐 析沉淀 法原理 相同, 并 按照加 盐的方 
式不同 而分为 加固体 盐法, 加饱 和盐溶 液法和 透析扩 散法。 (2) 有机 溶剂结 晶法: 此 法较常 
用于一 些小分 子物质 的结晶 ,如氨 基酸、 核苷酸 类等。 固醇类 在有机 溶剂中 也很易 获得结 
晶。 如用一 些低极 性溶剂 提取固 醇类时 ,酯类 常被皇 化生成 水溶性 酯肪酸 钠盐和 甘油, 固 
醇 类存在 于中性 不阜化 部分。 此时再 用有机 溶剂把 固醇抽 提于甲 醇或丙 酮中, 浓 缩后很 
快 形成白 色鳞片 状结晶 析出。 某些蛋 白质也 可以在 稀的有 机溶剂 中进行 结晶, 但 常保持 
比 较低的 温度以 防止蛋 白质的 变性。 (3) 等 电点结 晶法: 多 用于一 些两性 物质。 (4) 其 
它: 如利 用温度 差法, 加人金 属离子 法等。 现以上 海东风 生化试 剂厂所 提供资 料为主 
并结合 国内一 些生产 单位近 年来在 生产及 实验中 应用的 一些结 晶方法 ,举例 如下: 

(一) 盐 祈法: 

1. 加固 体盐法 

例: 酵 母醇脱 氧酶的 结晶: 

• 229 • 



100 克干面 包酵母 经碟酸 缓冲液 提取, 热变 性除杂 蛋白, 用各种 方法纯 化至一 定程^ 
后, 用 冷丙酮 沉淀, 得酵母 醇脱氢 粗酶, 沉淀 悬浮于 50 毫升含 0.01 % 螯 合剂和 0.001M 半 
胱氨酸 溶液中 cy 对 3 升 0.001M 磯酸 缓冲液 (pH7.5) 透析 3 小时, 离 心除去 沉淀。 在每 
100 毫升上 清液中 缓慢加 入粉末 硫酸按 36 克, 边加边 搅伴, 在 0°C 下放置 30 分 钟后离 
心。 沉 淀溶于 20 毫 升蒸馏 水中, 再加入 4 克 硫酸按 粉末, 离心。 上清 液加入 4 克硫 酸铵粉 
末 (缓慢 地在几 个钟头 内加完 )。 此时溶 液呈微 混洩状 ,冰箱 放置直 至结晶 完全。 

2. 加饱和 盐溶液 的方法 

例 1: 牛 胰核糖 核酸酶 的结晶 * 

经 纯化后 的牛胰 核糖核 酸酶, 用 70f。 饱 和硫酸 铵沉淀 所得的 牛胰核 糖核酸 酶滤饼 1 
克, 溶于 1 毫升 水中, 稀释至 2 毫升。 逐 滴加人 饱和硫 酸铁至 微浑, 然后加 W NaOH, 使 
PH 至 4.6, 20< ^放置 待析出 结晶。 若硫 酸铵浓 度过高 时出现 沉淀, 这 种沉淀 有时在 3 — 4 
天后能 转化成 晶体。 若沉淀 过多, 并不变 成晶体 ,可 逐滴加 入水促 使转成 结晶, 3 — 4 天后 
结晶 完全, 得针状 晶体。 

例 2: 溶菌, 的结晶 . 

初步纯 化后的 400 毫克 溶菌酶 溶解在 5 毫升 0.04M pH 4.7 的醋 酸缓冲 液中, 缓慢搅 
拌 5 分钟 (避 免出现 泡沫) 使完全 溶解。 后 慢加人 5 毫升 10fc(W/V) 氯化钠 溶液, 边加 
边搅样 , 5 分钟内 加完, 过滤。 滤液转 到一个 塑料容 器中, 室温 下放置 2 天 后结晶 析出。 

3. 透析法 

例: 羊 胰蛋白 酶结晶 

盐 析法获 得羊胰 蛋白酶 粗品, 溶于 0.4M、pH9 硼 酸缓冲 液中, 过滤。 滤液加 入等量 
"结晶 透析液 "(0.4M 硼酸 缓冲液 与等体 积饱和 硫酸镇 混合, 以 饱和碳 酸钾调 PH8.0), 装 
入透析 袋内, 于 0〜5 力对上 述结晶 透析液 透析, 每天 换结晶 透析液 一次, 3 — 4 天 后出现 
结晶, 7 天 内结晶 完全。 

(二) 用有 机溶剂 结晶法 

1. 直接加 有机溶 剂结晶 的方法 

例 1: 丙氨酸 的结晶 * • 

从层 析柱上 收集巳 达低层 析纯的 丙氨酸 溶液, 合并 后减压 浓縮至 体积, 趁 热缓慢 

地加入 两倍体 积热的 95% 乙醇, 结晶逐 渐析出 3 冷 却放置 过夜, 使结晶 完全。 
例 2: 麦芽糖 的结晶 * 

1: 台糖用 80% 乙醇搅 伴抽提 ,上 清液浓 縮除去 大部分 乙醇, 后用水 稀释, 依次上 阳离子 
和 阴离子 交换树 脂柱。 从交 换柱下 来的糖 液浓縮 至比重 1.35 左右。 趁热倒 人缸内 ,稍冷 
后加 入等体 积的浓 乙醇, 边加边 搅伴, 并加 入少量 晶种。 放置 半个月 以上, 结晶 完全。 

糖液浓 缩时, 必 须控制 合适的 浓度, 太浓不 易结晶 ;即使 结晶, 晶体 质量也 很差。 过稀 
时, 结晶不 完全。 

例 3: 赤霉素 的结晶 

5 克 粗的赤 霉素加 500 毫升 乙酸乙 酯加热 回流半 小时, 大 部分溶 解后, 脱色, 过滤 c> 
滤液慢 慢加入 1250 毫升石 油醚, 即生成 赤霉素 结晶。 

• 230 . 



2. 利 用挥发 性溶剂 蒸发结 晶方法 * 

例 1: 1- 二甲胺 -5- 萘 横銑氯 的结晶 * 

1- 二甲胺 -5- 萘磺 酸和五 氯化磷 混研, 后 滴人冰 水中。 油状 物用乙 酸乙酯 抽提。 抽提 
液 用水洗 3 — 4 次, 用无 水氯化 f§ 干燥 1 一 2 天, 过滤。 滤液于 40°C 水 浴中减 压浓缩 至干, 
得 1- 二甲胺 -5- 萘磺 酰氯粗 结晶。 粗 结晶用 石油继 溶解, 过滤。 滤液在 水浴 减压浓 
縮 至干, 得橙色 1- 二甲胺 -5- 萘 横酰氯 结晶。 

例 2: 麦角 固醇的 结晶及 重结晶 

干酵 母粉以 82 — 84 % 乙醇搅 拌抽提 18 — 24 小时。 蒸汽 加热到 70 — 751 保温 3 小 
时, 冷至 30<t: 以下 过滤。 滤 渣复提 3 次, 过滤。 滤液合 并减压 浓缩得 膏状物 ,加 5 — 10% 
的水 溶解, 再加 3 — 5 倍 体积的 乙酸, 剧 烈搅伴 2-3 小时, 静置 16 — 20 小时, 吸出 上清液 
于一 5^ 冰 箱中放 置一天 后析出 结晶。 粗 结晶滤 集后加 10 倍量的 醚酮混 合液, 在 50 — 
54t 隔 层水浴 中保温 30 — 40 分钟 (间断 搅伴) 静置, 后吸 出上清 液于一 5 °C 下放置 过夜, 
得白 色针状 结晶。 

(三) 等电点 结晶法 

例: 乙酰 -DL- 色 氨酸的 重结晶 * 

2.5 公斤 粗乙酰 -DL- 色 氨酸加 1.2 — 1.3 立升 5iV 氢 氧化钠 溶解, 40 克活 性炭脱 色 后 
过滤。 滤液在 lot 以 下用冰 醋酸调 pH3, 缓慢 搅伴即 逐渐出 现大量 结晶。 

(四) 利用 温度差 结晶法 

例: 葡萄糖 -1- 磷酸 钡盐的 重结晶 * 

葡萄糖 -1- 碗 酸钡盐 的粗结 晶溶于 20 倍 体积的 盐酸中 , 过滤 除去不 溶物。 清 
液在 8(nc 水浴中 加热到 60 — 651, 后用 氢氧 化钠调 pH7.0, 乘热过 滤除去 无机盐 
沉淀。 清液在 4 C 冰箱 中放置 24 小时, 得葡 萄糖- 1- 确 酸钡盐 的片状 结晶。 

(五) 加金 属离子 结晶法 

例: 铁 蛋白的 结晶法 * 

狗肝的 水抽提 液加硫 酸按至 50% 饱 和度, 沉 淀后将 沉淀再 溶于少 量蒸馏 水中。 每 
100 毫升 溶液缓 慢加入 5 克 固体硫 酸镉, 冰 箱放置 过夜, 得 红褐色 菱形含 镉的铁 蛋白结 

晶。 

(以上 标明有 * 号者为 上海东 风生化 试剂厂 内部总 结资料 ,没有 * 者摘 自上海 生化制 
药厂, 上海酵 母厂, 武汉生 化制药 厂的生 产工艺 规程。 ) 

第六节 有关蛋 白质结 晶的几 项技术 

一、 抽提结 晶技术 

这是 Jakoby 介绍的 一个比 较成功 的蛋白 质用不 同浓度 硫酸铵 抽提结 晶的方 法"" 。当 

. 231 . 



蛋白质 被提纯 至一定 纯度, 经浓缩 至每毫 升含蛋 白质量 1 一 2 毫 克后, 加入 足量固 体硫酸 
按使 蛋白质 沉淀。 然后 用硫酸 按由高 到低的 浓度在 0°C 附 近进行 抽提, 按 照蛋白 质在硫 
酸按中 低温溶 解度大 ,温 度逐渐 升高, 溶解 度反而 减少的 规律, 将低 温抽提 的蛋白 质溶液 
置室 温中即 可析出 结晶。 

在分歩 抽提中 ,溶解 在高浓 度硫酸 铵中的 蛋白质 首先被 抽提, 然 后按各 种蛋白 质在不 
同盐 浓度下 的溶解 度差别 而彼此 分离。 

具体实 验时, 先选 好已提 纯蛋白 质或驗 的硫酸 按盐析 范围。 如 某一酶 蛋白的 硫酸按 
盐 析沉淀 范围在 45 — 60% 饱和度 之间, 选用 硫酸按 抽提的 饱和度 依次为 65、 61、 58 和 
5 2 %。 如果盐 析沉淀 范围为 25 — 35% 饱和度 之间, 则选用 硫酸按 抽提的 饱和度 依次为 
38、 36、 34 和 32fc。 如 在实验 中发现 所用硫 酸按浓 度梯度 太高或 太低, 可 按实际 情况加 
以 调整, 直至增 减到所 需提纯 组份产 生结晶 为止。 一般 来说, 低温 抽提液 转至室 温后, 几 
小时 或几天 以后即 可出现 结晶。 表 8-1 是 一些蛋 白质抽 提盐浓 度及结 晶情况 [ 12 】 。 

Jakoby 法已 十分成 功地抽 提结晶 了一百 多种酶 蛋白, 晶 体轴长 一般为 1 一 4 微米, 最 
大可达 50 微米, 可供 X 射 线分析 使用。 另外, 此法对 分离纯 化蛋白 质也是 十分有 用的技 
术。 现以微 生物研 究所用 此法抽 提结晶 红曲霉 葡萄糖 淀粉酶 为例, 県体介 绍如下 " 3] : 

红曲霉 As3, 978 的 变异株 As 3.2199 菌 株生产 的葡萄 糖淀粉 醏经过 抽提, 硫酸按 
(70% 饱 和度) 盐析 沉淀, Sephadex G25 凝胶 柱过滤 脱盐, 后上 DEAE- 纤维 素柱。 所得 
薛浓缩 液对蒸 馏水透 析除盐 ,在冰 浴中慢 慢加人 预先磨 细的分 析纯硫 酸按达 饱和, 放冰箱 
中 过夜。 然后 0°C 下 离心, 弃去上 清液。 根据 预先所 作硫酸 按从低 至高浓 度的分 步抽提 
试验 结果, 选用饱 和度为 60、 56、 52、 50% 的硫 酸按; 由高 到低浓 度地依 次进行 抽提。 每 
次抽 提后, 将抽提 液放人 冰浴中 20 — 30 分钟。 然后在 °C 离心 (12,000 转 / 分) 20 分钟, 



表 8-1 —些蛋 白质抽 提结晶 的条件 



蛋白质 


分子量 


缓 冲溶液 (m.\/) 


pH 


添加物 


盐浓度 
(% 饱和度 ) 


i± 曰 
回收率 (%) 


甲状腺 球蛋白 


660,000 






1% NaCl 


42,39,37 


70 


醇 脱氧酶 


200,000 


磯酸 缓冲液 
(50mM) 


7.0 


25% 甘油+ 
50m.W2,3 二经 
基 丙硫醇 


55,51,47,43 


<30 


轻 基丙二 酸半酸 还原薛 




Tris 缓冲液 
(40iiiA/) 


7.4 


50mM 琉 
基乙醇 


55,45,40,35 


50 


轻 基丙二 酸半醒 还原酶 


104,000 


碟酸 缓冲液 
(lOOmM) 


7.0 


30mA/ 巯 

基乙醇 


55,45,40,35 


75 


苹果酸 脱氢海 


43,000 


磯酸 缓冲液 
(30miW) 






60, 55 


35 


酒石 酸脱氣 SI 










55, -15, 40, 35 


• 40 












65,50,45,36 


90 


轻 丙酮酸 还原海 


76,000 


磯酸 缓冲液 
(30 mW) 




3 mA/ 

琉 基乙醇 


50,45,40,35 


70 



- 232 • 



立即将 上清液 倒入带 塞玻璃 试管中 ,放入 4 t 冰箱。 后每隔 10 — 12 小时交 替放入 7 t 和 
4 化的 冰箱中 (而不 是室温 中), 过 5 天即出 现大量 沉淀。 继续在 7t 长时间 放置, 每隔 
1 一 2 周用偏 光显微 镜检查 ,数 周后出 现针状 结晶及 晶族。 随着 时间的 延长, 晶簇增 多并长 
大, (50 — 100 微米) ,由麦 捆状变 成放射 状以至 球状。 摇动 试管可 以见到 明显的 丝光。 三 
批 结晶试 验的结 果如表 8-2 所示。 



表 8-2 用 Jackoby 法进 行葡萄 糖淀粉 K 结晶 情况 



实 验批号 




硫酸按 抽提液 


吋间 (小吋 ) 


适 amaioL 

量 (目测 ) 


有 5!) J 口通 
的吋间 (天) 


起 始样品 


饱和度 % 


毫升 




部分 II 
30 亳升 含蛋白 


60 
56 
54 


2 
2 


72 
1.5 


++++ 
+++ 十 


60 
45 




质 65 毫克 


52 
50 


2 
2 


20 


'++ 十 


胶冻状 




^分 II 


56* 




>72 


+ 




2 


30 毫升 含蛋白 


54 


2 


1 


+十 ++ 


50 




质 1Q0 毫克 


52 


2 


1 


++++ 


40 




部分 II 


60 










3 


30 毫升 含蛋白 


56 




>"2 


+ 




质 130 毫克 


54 




24 


+++ 


42 






52 




24 


+++ 十 


25 



* 实验 操作有 失误。 



二、 蛋白质 微量结 晶技术 

(一) 热 盒技术 —— 溶解 度温度 梯度法 【3] 

热盒 技术适 合于某 些对温 度比较 稳定、 而 在高温 中比在 室温下 有较大 溶解度 的蛋白 

质。 其 原理和 利用温 度差进 行结晶 相同, 设计也 很简单 ,如图 8- 5 所示。 

操作时 ,先 将蛋白 质在较 高温度 下溶于 结晶介 质中, 并 装人一 带塞试 管内, 试 管悬挂 
于 一内装 有热水 的热水 瓶里。 管口露 出水面 ,以 免热水 浸人试 管造成 污染。 然后 把热水 
瓶垂 直放置 在一木 盒内, 盒内四 周用聚 苯乙炼 填满, 使热水 瓶固定 不动。 上 面加上 木盖盖 
紧, 让热 盒缓慢 冷却, 当试管 内的蛋 白质溶 液到达 一定温 度即开 始析出 结晶。 

图 8-5 是 用来结 晶胰岛 素的一 个热盒 装置。 热 盒及蛋 白质溶 液最初 均处在 50<t: 的 
高温下 ,渐渐 冷却至 25<t: 时, 大 的胰岛 素结晶 即开始 形成。 如 冷却温 度低于 20 力, 溶液 
过 饱和度 太大, 反而形 成晶体 较小。 此法曾 成功制 备了胰 高血糖 素和胰 岛素的 结晶。 这 
二种蛋 白质在 50^ 低 离子强 度缓冲 液中都 比较稳 定和有 较高溶 解度。 



. 233 . 



(二) 平衡透 析技术 

平衡 透析技 术早在 1932 年已由 Theorell 介 绍并于 1947 年由 Boycs — Watson 等人用 

于结晶 血红蛋 白 [ " ] 。 其原 理是通 过一个 半透膜 
把 蛋白质 溶液与 外界结 晶介质 隔开, 膜 只允许 
小分子 和溶剂 透过, 而 阻止蛋 白质的 透过。 半 
透 膜可用 玻璃纸 或其它 一些赛 職珞衍 生物制 
成, 膜内 蛋白质 溶液的 PH 值及 离子强 度可通 
过 膜外介 质的扩 散进行 调节, 直 至到达 蛋白质 
形 成结晶 时最适 的条件 为止。 此 法的优 点是, 
结晶 条件的 变化可 通过控 制扩散 作用, 缓慢地 
到达 结晶核 化点。 使 晶体的 生长颗 粒大, 整齐 
均勾。 如蛋 白质在 某种条 件下出 现无定 形沉淀 
和小 晶体, 可 以人为 地改变 膜外部 溶液的 条件, 
使沉淀 溶解, 再调整 到形成 较大而 均勾的 晶体。 
平衡 透析结 晶法, 可 在不同 pH 和不同 溶剂条 
件下 进行。 此法也 适用于 某些需 要金属 离子的 
蛋白质 结晶。 操作 和一般 透析法 相同。 方法并 不难, 只是需 要耐心 摸出结 晶的适 合条件 
便 可获得 结晶, 有时在 结晶形 成后还 需进一 歩改变 外部缓 冲液的 浓度及 pH 值, 结晶才 
能 完成。 平衡透 析方法 巳成功 地用于 制备多 种蛋白 质的大 结晶。 可作 为常量 结晶, 也可 
以进 行微量 结晶。 如 Zeppezauer 设计的 各种微 量毛细 管及穴 洞透析 扩散器 ,小的 只有几 
微升, 大的也 不过几 十微升 ,也就 是说, 只要 一滴那 么多的 蛋白质 溶液便 可进行 实验。 其 
装置 形状举 例如图 8-6, 8-7 [ 15," ] 。 

图 8-6 是 一种毛 细管式 扩散透 析结晶 装置。 图 8- 6(a) 毛 细管上 的膜用 有三个 "脚" 
的 PVC 环固定 ,使 膜稍离 开容器 底部, 以免损 坏膜。 操 作时, 把装 有蛋白 质溶液 的毛细 
管垂 直置于 结晶介 质中, 通过 改变结 晶介质 的条件 促使毛 细管中 蛋白质 结晶的 形成。 图 
8 - 6(b) 是毛 细管的 一端放 大图。 各种毛 细管扩 散透析 器一般 内径为 0.5 — 1 微米, 长为 
20-50 微米, 能装 10 — 30 微升 蛋白质 溶液, 这对于 样品是 十分节 约的。 

图 8-7 为洞穴 式扩散 透析结 晶器, 其小室 完全使 用光学 处理过 的玻璃 制成, 不 用取出 
结 晶即可 直接用 显微镜 观察。 因此它 比毛细 管扩散 透析装 置更易 控制晶 体生长 时间。 

(H) 蒸发扩 散技术 

待结 晶溶液 通过蒸 发作用 使浓度 增加, 最后 达到过 饱和度 而析出 结晶, 这是小 分子传 
统结晶 方法。 但简单 的蒸发 作用很 难控制 饱和度 并容易 造成盐 类在母 液中形 成晶体 ,故过 
去 较少用 于制备 高纯度 蛋白质 结晶。 近 年来, 通过浓 盐溶液 与结晶 溶液蒸 发扩散 的平衡 
作用, 使此 技术具 有了更 大的灵 敏度, 用于蛋 白质和 tRNA 的 结晶逐 渐增多 "7- 2«。 其方 
法原 理是: 先 将蛋白 质溶于 一个适 当浓度 (低 于沉 淀所需 浓度的 lO/o 左右) 的盐溶 液中, 
并使蛋 白质含 量约为 1 毫克 / 毫升。 另在 一大容 器中盛 放高浓 度的盐 溶液, 二者同 时置于 
一密 封干燥 器中。 于是蛋 白质溶 液中的 溶剂, 通 过蒸发 逐渐转 到较浓 的盐溶 液中, 直至到 

• 234 • 




图 8-5 姨岛素 热盒结 晶方法 示意图 



石緒纸 




, 盐溶液 

-烧杯 
、透 析膜 



-aH 化 
(b) 



(a) 



.氣 乙稀管 1 - 30 — 30rmn <^ - 约 0.5nim a《3inm (玻璃 ); 
<1.2mm (高 分子) b 磨 圆管口 边缘。 



图 8-6 毛 细管扩 散透析 结晶器 
00 毛细 管扩散 透析结 晶装置 (b) 毛细管 磨圆的 管口边 (以免 磨破透 析膜) C 



蛋白 结晶^ 液 



透析膜 

」■ 



3mm 

1 J "O" 环 

c> ^固定 

膜用 



-10mm- 
侧面图 




(a) 



lOmnr- 
正面图 



X (mm) 


小 室容量 
(nl) 


1.4 




2.0 


10 


3.0 


20 


4.0 


40 


4.5 


50 



L 



膜、 



蛋白结 品溶液 



-4- 



丄/ - 
2,「 



-10 ~ - 



〕- 



-32mm- 



14 (b) 

二 



H 

图 8- 7 穴 洞式扩 散透析 结晶器 
(a) 透析器 侧面及 正面图 (b) 透 析器全 套装置 示意图 

达平衡 为止。 当 蛋白质 溶液中 的溶剂 蒸发到 一定程 度后, 蛋 白质便 从溶液 中结晶 析出。 
如 果结晶 的介质 不是盐 溶液, 而是易 挥发的 与水混 合的有 机溶剂 ,则 不需要 在蛋白 质溶液 

中先 加人有 机溶剂 (加 人一定 缓冲液 及调整 PH 值仍是 必要的 ), 通 过有机 溶剂的 蒸发, 

. 235 • 



很 快便扩 散到蛋 白质溶 液中。 如 所用有 机溶剂 挥发性 不强, 也可事 先加入 适量有 机溶剂 
到待 结晶蛋 白质溶 液中, 这样可 避免平 衡时间 过长。 当蛋白 质溶液 中的有 机溶剂 到适量 

时便开 始形成 结晶。 图 8-8 是二种 简单的 微量蒸 发扩散 结晶装 置的示 意图。 

图 8-8(0 为碟 式蒸发 扩散结 晶器。 用一 塑料盒 (或培 养皿) 将底 部隔开 二半, 一半放 
置浓盐 液或有 机溶^ ,另 一半放 待结晶 蛋白质 溶液, 一次 可结晶 16 个 样品。 操作时 ,先将 
盛放蛋 白质溶 液的玻 片硅化 以防止 蛋白质 溶液的 散开。 整个 装置密 封后放 置在一 定温度 
下, 当蛋 白质中 溶剂蒸 发或吸 收有机 溶剂至 一定浓 度后, 即开始 结晶。 图 8-8(b) 为悬滴 
式蒸发 扩散结 晶器, 容器 底部为 浓盐液 或有机 溶剂, 上 面用一 玻片, 其中央 加一滴 蛋白质 
溶液。 反过 来盖住 容器, 密封后 即可进 行蒸发 结晶。 此法比 较简易 ,容易 操作。 下 面以毕 
汝昌、 雷克 健等人 用微量 气相扩 散法对 猪和牛 [Trp]Bi 胰 岛素进 行结晶 为例: 
猪和牛 [Trp]Bi 胰岛 素结晶 —— 微量气 相扩散 法 【 21 ] 

晶 体生长 甲液为 0.02A/HC1, 1 % 蛋白质 溶液; 晶体 生长乙 液为含 0.07f。 氯化锌 ,30% 
丙酮, 0.2Ai 柠檬 酸钠。 对生长 猪和牛 [Trp]Bi 胰岛素 晶体, 乙液的 pH 分 别调至 6^9 和 7.7。 
生 长晶体 时将甲 乙二液 等体积 混合, 按每滴 5 — 100 微升分 开滴在 预先硅 化的康 维皿内 



表 8-3 X 射线 衍射研 究用的 


一些 生物高 g 物的结 晶方法 


生物 高聚物 


结 晶方法 和条件 


酸缩薛 (rabbit muscle) 

禾 1、:] 冬 銑胺驗 
QErwinia carotovora) 

细 菌叶绿 素蛋白 
(J^hloropseiidomonas ethylicutn) 

本琼 氏蛋白 (human L-type) 

细 胞色素 C 过氧 化物酷 
(Yeast) 


高 离子强 度分步 结晶法 
在低 离子强 度下加 入乙醇 

缓慢 地平衡 到高离 子强度 
低离子 强度, 微细 管平衡 透析法 
低离子 强度, 微细 管平衡 透析法 


人 血浆铜 蓝蛋白 

细 胞色素 b5 (calf liver) 
(rabbit liver) 

抗原结 合片断 (human myeloma 
protein IgGl) 

黄^ 氧化 还原蛋 ^ 
{Clostridium pasteurianitrn) 

谷 氨銑胺 合成酷 (E. colO 

聚肌 红蛋白 (sperm whale) 

肌 红蛋白 (tuna) 


低离子 强度; 等电 点附近 缓慢蒸 发结晶 

高离 子强度 分歩结 晶法, 或平衡 透析法 

高离子 强度; 平衡 透析法 

pH6.4— 6.8, 高离子 强度, 微细 管平衡 透析法 

高 离子强 度分歩 结晶法 
高 pH 值和高 离子强 度分步 结晶法 

高 离子强 度分歩 结晶法 


, # 白一 
(Penicillium lanthincllutn^ 


高离子 强度, 缓 慢蒸发 结晶法 


蛋白 ss _ 

(^SorangiufJi s^.Myxobactcr 405) 


高离子 强度, 微细 管平衡 透析法 


蛋白薛 

(Strain of Arthrobacter') 
原肌 球蛋白 (rabbit musc'e) 
甲状腺 球蛋白 
转移 RNA 
转移 RNA 
硫氧 化蛋白 (E. coli-) 
番茄丛 缩病毒 


高离子 强度, 微细 管平衡 透析法 

中度的 高离子 强度, 平衡 透析法 
高离子 强度, 温 度梯度 结晶法 (Jackoby 法) 
溶 剂平衡 或等温 蒸溜, 再助 以温度 梯度法 
分歩 结晶法 
在 等电点 附近, 微细 管平衡 透析法 
高离子 强度, 分歩 结晶法 



(注: 本表中 所列作 者文献 从略) 



• 236 • 



K: 存浓 盐溶液 




娃化 
载玻片 



一滴蛋 
白溶液 



一滴 20lJ 蛋白质 
'溶液 晶 介质中 



真 空油密 i 寸 



浓 盐溶液 



图 8-8 微 量蒸发 扩散结 晶装置 示意器 



室, 再将 10 毫升 的乙液 置于康 维皿外 室中, 然后 盖上玻 璃片, 加真 空油脂 封密, 于 培养箱 
放置 1 至 数周, 即形成 晶体, 大小为 0.5 至 0.7 毫米的 单晶, 外形为 菱形六 面体, 可供 X 射 
线结 构分析 之用。 

微 量结晶 方法还 有多种 装置, 由于篇 幅限制 ,这 里就不 一一 介 绍了。 微 量结晶 法的优 
点是使 用样品 较少, 所得 的蛋白 质结晶 较大, 可用使 X 射线 衍射的 分析。 关 于专供 X 射线 
衍射 用的一 些生物 大分子 的结晶 方法和 条件可 参考表 8-3。 



参考文 



献 



[2 
[3 

[4 
[5 
[6 
[7 
[8 
[9 
[10 

[11 
[12 
[13 
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[15 
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- ? 38 • 



第九章 浓縮 与干燥 



卓筆文 

第一节 浓 縮 [19,111 

浓缩是 从低浓 度的溶 液除去 水或溶 剂使之 变为高 浓度的 溶液。 生化制 备中往 往在提 
取后 和结晶 前进行 浓缩。 加热和 减压蒸 发是最 常用的 方法。 一些分 离提纯 方法也 能起浓 
缩 作用。 例如, 吸收法 用亲水 凝胶很 容易吸 收稀溶 液中的 水分而 得到浓 溶液。 超 滤法利 
用半透 膜能够 截留大 分子的 性质, 很适 于浓缩 生物大 分子。 离子交 换法与 吸附法 使稀溶 
液通过 离子交 换柱或 吸附柱 ,溶质 被吸附 以后, 再用少 量液体 洗脱、 分部收 集能够 使所需 
物质的 浓度提 高几倍 以至几 十倍。 此外, 冷冻 融化、 加沉 淀剂、 溶剂 萃取、 亲和层 析等方 
法 也能达 到浓缩 目的。 有些 方法已 在各章 中分别 介绍, 本节 只着重 于蒸发 浓缩和 吸收浓 
缩。 

一、 蒸 发 

蒸 发是溶 液表面 的水或 溶剂分 子获得 的动能 超过溶 液内分 子间的 吸引力 以后, 脱离 
液 面进入 空间的 过程。 可以 借助蒸 发从溶 液中除 去水或 溶剂使 溶液被 浓缩。 
影响蒸 发速度 的因素 如下: 

1. 首先是 温度。 溶液受 热后, 分子动 能增加 ,蒸发 加快。 

2. 其次是 蒸发面 积和溶 剂的蒸 气压。 恒 温时蒸 发情况 可以表 示为: 



P 

m 为 单位时 间的蒸 发量, . 

S 为液体 的蒸发 面积, 

P 为液面 所受的 压力, 

F 为某一 温度时 溶剂的 饱和蒸 气压, 

{ 为某一 温度时 溶剂的 实际蒸 气压。 

由上式 可见: 

(1) 当气 压与蒸 发面积 恒定, 而液面 的溶剂 蒸气压 达到饱 和时, F = f, 压差为 0, 
蒸发 停止。 要加大 F 与 f 之差, 就 应该不 断地移 去液面 蒸气。 采用 气流吹 散或使 蒸气? ^ 
凝的方 法都很 有效。 ' 

(2) 加大蒸 发面积 (例 如采 用薄膜 蒸发) 可以 增加蒸 发量。 液体 沸腾也 能加大 蒸发面 
积。 这 时气化 不限于 液面; 液内的 气泡表 面也能 气化。 

(3) 压 力与蒸 发量成 反比。 减压蒸 发是比 较理想 的浓缩 方法。 因为减 压能够 在温度 



不高的 条件下 使蒸发 量增加 ,从 而减小 加热对 物质的 损害。 

总之, 实验室 和生产 单位在 设计蒸 发装置 时要考 虑适当 加热、 增 大液体 面积、 减压与 
加 速空气 流动等 因素。 

(一) 实 验室蒸 发浓縮 的方法 

1. 常 压蒸发 即在常 压下加 热使溶 剂蒸发 ,最后 溶液被 浓缩。 方法 简单, 但 仅适于 

浓缩耐 热物质 及回收 溶剂。 

(1) 装置 

(a) 浓 缩而不 需回收 溶剂, 可用蒸 发皿。 

(b) 在浓 缩的同 时回收 溶剂, 则应 在装液 容器与 接受器 之间安 装冷凝 管使溶 剂的蒸 
气 冷凝。 

(2) 操作注 意事项 

(a) 需用 圆底蒸 榴瓶。 装液 量应不 超过蒸 溜瓶的 1/2 容积。 以 免沸腾 时溶液 雾滴被 
蒸 气带走 或溶液 冲出蒸 塯瓶。 

(b) 加热前 需加少 量沸石 (或碎 磁片、 小的 磨砂玻 璃珠、 一端封 闭的毛 细管等 )、 使溶 
液 不致因 过热而 暴沸。 暴沸易 使液体 冲出, 或使 蒸馏瓶 压力陡 增而致 破裂。 蒸发 过程中 
如沸石 因空气 去尽而 失效, 需停止 加热待 溶液冷 却后, 补加 或更换 沸石, 因沸 石中有 空气, 
加入 热液也 能引起 暴沸。 

(C) 操 作时先 接通冷 却水。 冷却 水的流 速容易 受水压 变化的 影响, 要及时 调节。 



0- 



100 



图 9-1 压力 -温度 直线图 



在 P 毫米 汞柱时 

观 察到的 沸点, -c 

•C "F 
400 ■ 



-r 700 



300 



200 



: r 600 



-「500 



100 



400 



-r 300 



200 



常压沸 点,' C (校 正到 760 
毫米汞 柱时的 沸点〉 



•C 。F 
70" 

60 

50C 

400 

300 

200 
100 



压力, P 
毫 米汞拄 




V 



1 1 1 9 8 7 6 5 ^ ^ 



?- - -- - -1---- 一- 



• 240 - 



Cd) 选用 适当的 热浴, 避免直 接火焰 加热。 液体沸 点低于 85< ^可 用水 浴或蒸 气洛, 
高于 85t 常用 油浴。 蒸溜瓶 浸人热 浴应使 内外液 面大致 接近。 瓶 底与热 浴底保 持一定 
距离, 以免 碰碎。 

(e) 热 洛温度 较溶剂 沸点高 20 — 为宜, 温度过 高使蒸 发速度 太快, 蒸溜 瓶内的 
蒸气 压超过 大气压 以后易 将瓶塞 冲开, 逸 出大量 蒸气, 甚至使 蒸溜瓶 炸裂。 处理低 沸点易 
燃或 有毒物 时更应 注意。 否则 引起燃 烧或爆 炸将造 成严重 事故。 此外, 过 热还容 易使被 
浓缩物 分解或 变性。 

(f) 如果出 现大量 气泡, 可 以考虑 加人少 许醇类 (例如 辛醇) 或 其它消 泡剂。 

2. 减 压蒸发 与常 压蒸发 相比, 此法 所需温 度低而 蒸发速 度快, 适于 浓缩不 耐热的 
物质。 其原理 是使液 面压力 降低。 而压力 降低, 沸点也 就降低 ,于 是蒸发 加快。 
从 压力- 温度直 线图可 以了解 溶剂沸 点与真 空度的 关系。 

使用图 9-1 时, 可用小 尺通过 表中二 条直线 上的各 一个数 据点连 成直线 ,并且 使它延 
长与第 三条线 相交, 就能 得到第 三个数 据点。 

从已知 真空度 可求得 在该真 空度下 溶剂的 沸点。 例如某 液体在 常压下 沸点为 loot, 

要 求得在 减压至 压力为 50 毫米求 柱时的 沸点。 用小 尺通过 B 线的 100^ 点和 C 线的 50 
毫米求 柱点, 可以看 到小尺 与直线 A 相交 的点为 201。 由此 得知, 该 液体在 50 毫 米汞柱 
压力下 沸点为 20t。 

要求溶 剂沸点 不得超 过某一 规定温 度时, 也可 求出所 需的真 空度。 例 如某溶 剂在常 
压下 沸点为 1001, 希望在 20°C 蒸出, 同 样可在 C 线上 得知 真空度 应达到 50 毫米 求柱。 
(1) 装置: 

(a) 普 通减压 加温蒸 发器: 示意装 置见图 9-2。 加热容 器需用 圆形或 圆锥形 烧瓶, 
先将液 体加入 容器, 接通冷 却水, 再 打开水 泵或真 空泵, 开始时 减压要 缓慢, 加热至 一定温 
度后, 溶剂 即大量 蒸发。 如气泡 过多, 应立 即打开 阔门, 降低真 空度, 或加人 适当的 消泡剂 
防 止泡沫 溢出。 

(b) 旋转 减压蒸 发器: 原理 同上。 改 进部分 为装液 容器采 用旋转 烧瓶。 旋转 烧瓶由 
马达带 动缓慢 旋转, 液 体在瓶 壁展开 成膜, 溶剂得 以迅速 蒸发。 烧瓶 旋转还 能防止 溶液暴 
沸。 用于浓 缩产品 与回收 溶剂时 ,效率 很高, 是实 验室中 比较理 想的蒸 发器, 示意 图为图 
9-3。 




真空泵 



图 9-2 减压 加温蒸 发装置 

旋转蒸 发器应 用日益 广泛。 现 以上海 玻璃仪 器二厂 生产的 ZFQ81-I、 n 型 旋转蒸 
发器为 例对旋 转蒸发 器的使 用说明 如下: 



• 241 • 




干冰一 



温水 



图 9-3 旋转蒸 发装置 示意图 

几种溶 剂的蒸 发速度 

(采用 1 升 蒸发瓶 转速为 100 转 / 分) 



溶剂 


沸 点 


洛温 


真空度 


400 毫升 
蒸 发吋间 


冷 却水温 


溶剂 回收量 




(°c) 


(。c) 


(毫米 汞柱) 


(分钟 ) 


(°c) 


(毫升 ) 


% 


水 


100 


50 


45 


69 




390 


97.6 


水 


100 


40 


5 


45 


7 


370 


92.6 


丙酮 


56 


40 


65 


13 




360 


90.0 


乙醇 


78 


40 


98 


30 




390 


97.6 


苯 


80 


40 


76 


22 




390 


97.6 



装 配示意 图见图 9-4、 9-5、 9-6。 

支架的 安装: 将座 杆套上 塾套, 用弹簧 塾圈、 螺母 与底座 固定。 把升降 座杠杆 、固定 
套、 联接支 架套入 座杆, 支 架安装 完毕。 

传动 部分的 安装: 支架装 好后, 将 传动部 分的套 管套入 联接支 架的主 轴上, 旋紧旋 
钮, 使传 动部分 固定。 

夹头 部分的 组合: 先将 夹头套 在夹头 杆上, 然后 再将夹 头杆, 插人传 动部分 的盖子 
上, 并用夹 头杆调 整旋钮 旋紧。 
机 架部分 的使用 

传 动部分 的升降 移动: 将升 降调节 杆手柄 逆时针 旋转, 使 它与杠 杆的螺 纹联接 放松, 
按动 手柄, 使 传动部 分随杠 杆的作 用而上 下升降 运动, 到 达预定 位置, 顺时 针拧紧 升降调 



242 



- 图 9-4 

I. 座杆, 2. 传动部 份固定 旋钮, 3. 联接 支架, 4. 夹头 杆调正 旋钮, 5. 传动 部份, 6. 传动 
部份 角度调 节旋钮 7. 水 平旋转 旋钮, 8. 调速 旋钮, 9. 联轴节 螺母, 10. 升 降固定 旋钮, 

II. 升 降调节 手柄, 12. 传动 部份电 源线, 13. 手柄水 平旋转 旋钮, 14. 底座, 15. 电 源线, 

16. 变压 器罩, 17. 升降 杠杆, 18. 夹头杆 19. 夹头 

节杆 与杠杆 的螺纹 联接, 再 用固定 套使联 接支架 的位置 固定。 

升降 调节杆 的水平 旋转: 放松手 柄的水 平旋转 旋钮, 手柄便 可左右 偏转。 到 达所需 

位置时 ,把旋 钮拧紧 即可。 

传 动部分 的水平 旋转: 放松 水平旋 转旋钮 就可使 传动部 分左右 移动。 

传 动部分 的角度 调节: 放松角 度调节 旋钮, 传动部 分即可 在垂直 平面内 偏转, 选定位 

置 后拧紧 旋钮。 

夹 头部分 的安装 使用: 松 开夹头 杆调整 旋钮, 可以调 节夹头 杆与传 动部分 的角度 ,使 
之适 于夹固 不同角 度的冷 凝器。 用于 81-1 型时, 松开 夹头顶 部的螺 丝可以 变化夹 头在夹 

头 杆上的 位置, 若用于 81- n 型时, 松开 夹头, 并将 它旋转 90°。 

旋转 速度的 调节: 将传动 部分电 源线的 插头, 插入 变压器 罩上的 电源插 座中, 再把电 
源 线的插 头插人 220V 电源, 旋转调 速旋钮 即可任 意变速 (10 — 190 r.p.m)。 

衬垫的 使用: 把玻 璃旋转 轴插入 传动部 分的锥 套内, 如图 9-5 所示方 向依次 装上油 
封、 聚 四氟乙 條迹片 和玻璃 法兰。 

• 243 • 



图 9-5 ZFQ81-I 型旋 转蒸发 装置固 定部件 示意图 
1. 座杆, 3. 联接 支架, 5. 传动 部份, 10. 固 定套, 11. 升降调 节杆, 14. 底座, 
17. 杠杆, 18. 夹 头杆, 19. 夹头, 20.^ 套, 21. 弹簧 塾圈, 22. 螺母 

玻 璃部件 的安装 - 

装拆 玻璃旋 转轴: 将玻 璃旋转 轴从传 动部分 的背面 插人锥 套内, 当轴 套外口 的卡环 
卡 住玻璃 旋转轴 的轴肩 即可。 在拆卸 玻璃旋 转轴时 ,左手 抓住传 动部分 ,少 许用力 往后拉 
即可 拔出。 若玻璃 轴与锥 套结合 较紧, 可卸下 冷凝管 ,右手 握住玻 璃轴, 用 左手掌 心轻轻 
拍击玻 璃轴的 端部, 就能 取出。 

冷 却器的 安装: 玻璃 轴装人 传动部 分后, 在其 前端依 次套人 油封、 聚 四氣乙 炼片。 再 
将冷凝 管的法 兰套上 螺母, 并从 螺母侧 孔插入 弹簧, 然后旋 紧螺母 ,联接 冷凝管 ,使 之不漏 
气。 

旋 转烧瓶 与圆底 烧瓶的 固定与 拆卸: 烧瓶的 接头口 均为标 准口, 并配专 用接头 联接。 
使用之 前要用 酒精擦 净各个 接头口 ,然后 涂真空 油脂, 以 免产生 伤痕和 漏气。 减 压解除 
- 244 • 



图 9-6 ZFQ81-I 型冷凝 器安装 示意图 
23. 圆底 烧瓶; 24. 菊形 烧瓶; 25. 玻璃旋 转轴; 26. 双 迴流冷 凝管; 27. 加 料管; 31. 塑料 活接头 



后, 将接 头旋松 分开, 即 可取下 烧瓶。 

(2) 关于真 空度: 通常 把压力 低于常 压的空 间称为 真空, 可 分为: 粗 真空, 中度真 
空, 高度 真空。 

(a) 粗真空 (气压 760 — 10 毫米 汞柱) 可 用水泵 达到。 水 泵的最 大真空 度受水 蒸气压 
哏制。 而水蒸 气压又 与水温 有关。 水温 愈高, 蒸气压 愈大。 例如 水温从 1°C 升至 301, 
蒸 汽压从 4.9 上升到 31.6 毫米 求柱。 而 且水温 愈高, 水蒸气 压上升 愈快。 例如 水温由 
it: 升至 2 时, 压力 只上升 0.4 毫米 汞柱, 而 水温由 29t 升至 30^ 时压力 就上升 1.6 毫 
米 承柱。 水泵装 置如图 9-7, 用时应 在水泵 前装安 全瓶, 以防水 压陡降 时水倒 流进入 样液, 
停止使 用时应 先打开 安全瓶 活塞, 放人 空气, 再关 水泵。 为了保 持水泵 的工作 效率, 需经 
常进 行清洁 并定期 拆洗。 



0>) 中 度真空 (气压 10 — 10_ 3 毫米汞 柱): 可选用 油泵, 真空 度可达 10- 3 毫米 汞柱。 
油泵装 置如图 9-8, 常在安 全瓶与 蒸馏系 统之间 加冷阱 ,不让 低沸点 物或易 分解物 被抽入 
泵内, 真空压 力计平 时不宜 与系统 接通, 只在 读数时 与系统 接通, 读数 后立即 关闭。 停机 
前, 先关 闭真空 容器, 再旋开 安全瓶 活塞, 放人空 气后才 停电, 以 免泵油 倒流。 

(C) 高 度真空 (10—3 — 10_ 8 毫米汞 柱): 应用扩 散泵。 借 助于求 或桂油 等特殊 液体的 
蒸发与 冷凝, 使空气 被吸附 在冷凝 时形成 的液滴 表面, 由 前级泵 抽出, 因此 扩散亲 必需与 
前级泵 联用。 前 级泵的 作用是 抽去被 冷凝吸 附的气 体分子 和造成 真空, 使 扩散泵 内液体 
的沸点 降低、 易于 沸腾。 其 最大真 空度主 要决定 于所用 的特殊 液体的 性质。 




图 9- 7 水 泵装置 



图 9-8 油 泵装置 
1. 接压 力表; 2. 干燥 系统; 3. 油泵 



高 效油泵 可按图 9-9 装置。 用时应 该注意 各个系 统及连 接处的 密封, 及时换 冷肼, 并 
根据溶 剂沸点 ,选 用合适 的制冷 方法。 

(3) 减压 装置的 选择: 先 根据溶 剂的性 质确定 所需真 空度, 从 而选用 合适的 减压装 
置。 真空度 愈高, 设备愈 复杂, 操 作也愈 困难。 所以用 水泵如 能达到 要求, 就 不要用 油泵; 
用普通 油泵如 能达到 要求, 就不 要用扩 散泵。 否 则不但 麻烦, 而且可 能损失 产品, 甚至因 
抽人低 沸点物 质而损 坏真空 设备。 




图 9-9 高效油 泵装置 ' 
1. 接 油泵; 2. 小船及 P2O, 干 燥剂; 3. 接 转动式 麦氏真 空表; 
4. 备 用口; 5. 接蒸溜 装置; 6. 放 气孔; 7. 冷凝阱 

(4) 真空度 的测量 —— 真 空表的 使用: 

(a) 缩 短的真 空表和 开口的 U 形管真 空表: 用它们 (见图 9-10) 测量 真空度 各有优 
缺点: 前一 种使用 方便, 但装 汞和使 用时易 有少量 空气进 入乘柱 顶端, 导致 测量不 准确而 
需 重装。 后 一种装 汞方便 但管长 应超过 760 毫米, 还要 与大气 相通才 能进行 比较; 用汞较 
多且开 口处汞 蒸气容 易逸出 ,较不 安全。 常在 汞柱顶 端加少 量液体 石蜡。 这类真 空计能 
够 测出的 最高真 空度为 1 一 2 毫米 求柱。 




2 

图 9-10 普通 真空表 



8 76 5 413-2 1-0 1 < 



si 3-4 5 6-7 

一 二 一 r :l l l 一一 hmli … 一 11 二 



• 246 • 



图 9-11 充 汞装置 



图 9-12 汞纯化 



充汞法 如下: 先将 清洁汞 放在小 圆底烧 瓶内, 然后用 高效油 泵抽至 10_' 毫米 隶柱以 
下, 轻 拍小烧 瓶使汞 内气泡 逸出, 用电吹 风加热 玻管使 附在管 壁的气 体易被 抽去。 将汞灌 
入 U 形管后 ,即 可停止 抽气, 放人 空气。 充汞装 置见图 9-11。 

如使用 的汞不 洁净, 还需 要按图 9-12 装 置进行 净化。 净化 时可用 25%HN03 溶液灌 
入管内 ,使汞 分成细 滴逐层 滴下, 必 要时可 重复洗 数次、 再用蒸 馏水、 乙醇、 乙醚依 次洗净 
千燥。 

(b) 麦氏真 空表: 能够同 时测量 粗真空 和高度 真空。 它 根据波 义耳定 律比较 开管和 
闭 管的压 力差。 一 种为直 立式。 见图 9-13 ( 甲) 读数前 应慢慢 旋开连 接系统 的活塞 4 和 
连接 机械泵 的三通 活塞, 接通管 2, 使麦氏 真空表 系统与 贮汞瓶 1 之 间的压 力达到 平衡。 
再转 动三通 活塞, 接通管 3 使它 与大气 相通, 慢慢放 人空气 ,加压 汞面, 迫 使汞柱 上升, 直 





图 9-13 麦氏 真空表 
甲. 直 立式; 乙. 转动式 













. 247 • 



至比较 毛细管 5 中求面 与测定 毛细管 6 的顶端 相平, 读出 毛细管 6 隶面 对应的 刻度, 即为 
系 统的真 空度。 读数后 转动三 通活塞 连通管 2 , 把上升 的求柱 抽下, 恢复 原状。 

另一 种为常 用的转 动式, 见图 9-13 ( 乙), 易于 使用。 但应 注意: 读数前 ,先旋 开真空 
系统 活塞, 再将 表慢慢 转至直 立状。 使比 较毛细 管内的 汞柱准 确升至 零点。 读数 后立即 
将表慢 慢恢复 横卧状 ,然后 关闭真 空系统 活塞。 

(5) 减 压操作 的注意 事项: 

(a) 使 用的厚 壁橡皮 管先在 20f。NaOH 溶液 中煮沸 1 小时, 煮时应 使管内 碱液流 
动, 煮 后用蒸 馏水洗 数次以 除去滑 石粉, 硫横等 杂质。 

(b) 常检 查橡皮 塞是否 漏气, 如已变 质应该 更换。 橡皮 塞在蒸 馏瓶上 的露出 部分不 
得少于 1/3。 

(C) 防漏与 涂脂: 如发现 真空系 统漏气 ,可 用等量 的蜂蜡 与松香 混熔后 涂封。 如真 
空 度低于 1 毫米汞 柱可涂 凡士林 ,高于 1 毫 米汞柱 应涂高 真空活 塞油。 涂脂 要注意 均勾。 

(d) 冷却 系统: 要在冷 阱周围 造成低 温条件 ,可 用冷冻 机制冷 或加冷 却剂。 常用的 
冷却 剂有: 液氣: 无色 液体, 大气 压下沸 点为一 195.8°C ,可 冷至一 210°C。 

干冰 (固体 CCO: 升华温 度为一 78.5°C, 用时, 加适 量溶剂 (如 丙酮、 乙醇、 乙 醚等) 
则冷却 均勾。 可冷至 一 70 —一 80°C 左右。 

结 晶氯化 f5 与碎冰 : 能达 到的低 温随结 晶氯化 f5 与碎冰 的比例 而变, 最低 可冷至 
一 54.9°C (143 克 结晶氯 化钙与 100 克碎冰 )。 

食盐与 碎冰: 能达 到的低 温随组 分比例 而变, 最低 可达一 21.3°C(33 克 食盐与 100 
克碎冰 )。 

使用冷 阱时, 应先接 好蒸馏 系统, 然后再 加冷却 剂以免 空气中 水分大 量进入 冷阱, 降 
低 冷阱的 效率。 

(e) 干燥 系统: 油 泵前用 固体氧 氧化钾 (钠) 、氯 化钙、 活性炭 、碱石 灰等, 也可 以用五 

氧化 二隣。 活性 炭应该 放在近 油泵的 一端。 

(0 抗 暴沸: 常用 毛细管 (应该 先检查 是否通 气)。 蒸馏或 浓缩容 易氧化 的物质 ,应 

由毛细 管通人 氮气。 浓缩过 程中如 有固体 析出, 可 将毛细 管倒插 (粗 端朝下 ), 以免 堵塞。 

浓縮 小量液 体时, 可用抗 暴沸管 (取 4 毫米直 径的玻 璃管, 在 下端约 i> 毫米 处封闭 )。 
(g) 停止 浓缩, 应该 先移去 热源。 稍冷, 再关真 空泵, 以 免浓缩 物升温 分解。 

00 高真空 操作, 需戴防 护镜。 

3. 薄 膜蒸发 又 称薄膜 浓缩。 

(1) 原理: 薄 膜蒸发 是使液 体形成 薄膜, 增加气 化表面 、加速 蒸发。 薄 膜蒸发 器内有 
直立 的加热 (蒸发 ) 管, 传热面 较大。 液体在 减压下 进入加 热管, 把未 蒸发液 体拉成 薄膜迅 
速通 过管的 内壁, 连续 蒸发。 

(2) 薄膜蒸 发的优 点是: 

(a) 液膜表 面很大 ,传 热快而 均勾。 液体 在蒸发 管内停 留的时 间很短 (仅 数秒 或不足 
一秒 )。 这样即 使温度 略高, 物枓 也不易 破坏。 可用于 制备对 热较稳 定的酶 、蛋白 质和小 
分子 物质。 

(b) 蒸发管 较长, 液体沸 腾产生 的泡沫 容易在 管壁上 部受热 破裂。 加 热室上 部安装 
泡沫分 离器, 所 以也适 于浓缩 易产生 泡沫的 物料。 

• 248 . 



(3) 薄膜 蒸发的 缺点是 操作温 度较高 (浓 缩液温 度可达 60 — 80«t), 且 液体被 拉成膜 
状, 因此不 适于浓 缩对热 敏感的 或易受 薄膜切 力破坏 立体结 构的醃 与核酸 等生物 大分子 
的 溶液。 蒸发 管难于 清洗和 更换, 不适于 浓缩粘 度很大 、容 易析出 结晶的 物料。 因 为它们 
不易 成膜, 而 且容易 堵塞蒸 发管。 

(4) 使用 薄膜蒸 发时, 应 该控制 进料速 度使泡 沫在气 液分离 器中能 够全部 破裂。 如 
速度 过快, 液体受 热不足 ,蒸 发与分 离受到 妨碍。 速度 过慢, 则气 液难于 分离, 而易 于在蒸 
发管中 干枯, 导致产 品分解 。此外 气液分 离器的 直径不 宜过小 ,以免 浓缩液 冲入冷 凝管。 

(5) 小 型薄膜 浓缩装 置见图 9-14。 用时 先夹紧 14、 13、 12 的螺 旋夹, 以水通 人冷凝 
管 5 的 入口处 6 ,然 后开真 空泵, 待气 压降至 500 毫 米求柱 以下, 打 开蒸汽 阔并适 当放出 
冷 凝水。 调节 螺旋夹 14 使 溶液缓 缓沿管 上升至 A 管的 1/2 高 度处。 减压使 A 管液 体迅 
速蒸发 ,蒸 汽充满 A 管并 将部分 液体拉 成薄膜 沿管壁 上升。 液 膜迅速 蒸发, 大量蒸 汽和少 
量液 体的混 合物通 过气液 分离器 3。 液膜 破裂, 液体 逐滴流 下进入 2 中 即为浓 缩液。 绝 
大部 分气体 被抽人 冷凝器 5 中 转变为 冷凝液 4。 浓缩 液贮瓶 1 装 满后, 抽 出液体 检查浓 
度。 如浓度 不够可 以反复 浓縮。 结束时 先关蒸 汽阔, 拔 掉抽气 泵接头 8 ,再关 真空泵 ,最后 
关冷凝 水阔。 

薄膜浓 缩效率 很高, 例 如用长 1 米, 内径 2 厘米的 A 管装 成小型 薄膜浓 缩器, 每小时 
可浓缩 稀溶液 1 一 2 升 (根据 所需浓 度而定 )。 还 可按图 9-15 装置 使提取 与浓缩 连续进 
行。 




图 9-14 薄膜 蒸发器 

1. 待浓 缩液; 2. 浓 缩液; 3. 气- 液体分 离器; 4. 冷 凝液; 
5. 冷 凝管; 6. 冷水 进口; 7. 冷水 出口; 8. 抽气泵 接头; 
9. 温 度计; 10. 浓 縮液吸 出管; 11. 冷 凝液吸 出管; 12、 
13、 H. 螺旋夹 




图 9-15 薄膜 浓縮与 提取连 续装置 
1. 连抽 气泵; 2. 溶剂; 3. 提取 物料; 4. 浓 缩液; 
5. 蒸 汽导入 



膜蒸 发装置 




提取装 E 



• 249 • 



(二) 工业 上用的 蒸发浓 缩设备 



原理 与实验 室装置 相同, 特 点为容 量大, 附属设 备多, 结构较 复杂, 由 于生化 物质在 

60-^ 以上 一般容 易丧失 或降低 活性, 常用 以下减 压浓缩 装置: 

1. 减压 蒸发器 见图 9-16, 用时 先开真 空泵, 抽出 内部空 气后, 再 由入口 4 吸人 

待浓 缩液。 继续 抽气至 一定真 空度, 由蒸 汽入口 5 慢 慢通入 蒸汽、 加热 蒸发, 同时 打开废 
气出口 8。 蒸 汽经隔 沫装置 9 分出液 滴后, 进入 冷凝器 11, 冷凝 液流入 接受器 14。 从观 
察窗 3 可 见蒸发 情况, 如果液 体沸腾 过猛, 应该稍 稍打开 放气阔 2 调节真 空度。 温 度由温 
度计 1 显示, 调节蒸 汽入口 5 , 可控 制蒸发 速度。 停止 蒸发时 先关闭 蒸汽人 口及抽 气泵, 
再打开 放气阔 2, 使蒸发 锅的压 力恢复 正常。 浓缩液 由出口 6 放出。 

2. 循 环减压 蒸发器 装 置见图 9-17。 

蒸 发速度 很快。 例如 容积为 150 升的 加热蒸 发器, 每小时 可蒸发 100 升浸 出液。 它 
由外 加热室 1 和 分离室 2 组成。 加热室 中蒸汽 在管外 加热, 溶剂蒸 汽由上 部横管 经分离 
室 上部及 附设的 隔沫装 置迸入 冷凝器 冷凝后 排出。 液体沿 循环管 4 回到加 热室再 蒸发, 
如 此循环 直至达 到所需 浓度。 加热 室的管 子很长 (可达 7 米), 沸腾管 长度如 果增加 ,循环 
管中 液体和 沸腾管 中气液 混合物 的重量 之差也 增加。 分离室 内液体 温度低 、比 重大, 所以 
不 断流入 蒸发器 (加热 室), 因 此产生 搅伴作 用加速 蒸发。 



二 次蒸汽 




图 9-16 减压 蒸发器 

1. 温 度计; 2. 放 气阔; 3. 观 察窗; 4. 液体 入口; 5. 蒸 
汽 人口; 6. 浓缩液 出口; 7. 冷水 出口; 8. 废气 出口; 
9. 隔沫 装置; 10. 热水 出口; 11. 冷 凝器; 12 冷水入 

口; 13 连抽 气机; 14. 接受器 




浓溶液 



图 9-17 循 环减压 蒸发器 
(蒸 发器加 热室在 外面) 
1. 加热室 5 2. 分 离室; 3. 气液 混合管 5 4. 循环管 



循环减 压蒸发 器适于 浓缩易 结晶、 多 泡沫的 溶液。 其优点 是生产 能力大 ,容易 维护。 
3. 管 式薄膜 蒸发器 液膜在 蒸发器 的管壁 受热, 溶剂 迅速蒸 发使溶 液达到 所需浓 
度。 按 管长可 以分为 长管式 (管长 6 — 8 米)、 短管式 (管长 3 — 4 米)。 按液 体流向 可以分 



- 250 • 



为升 膜式、 降膜式 c 它们 的构造 简单, 便于 操作, 传热效 率高, 蒸发 速度快 (仅 数秒 至数卜 

秒), 适用 于对热 敏感、 易 发泡的 物料。 

(1) 升膜式 蒸发器 :见图 9-18, 在真空 下操作 ,蒸发 管内压 力小, 蒸汽流 速快, 如进料 
量适当 ,沸腾 液被蒸 汽流急 速携带 向上, 沿管 壁形成 薄膜, 故 称为升 膜式。 如进料 过多, 加 
热蒸汽 不足, 管的下 部积液 过多, 则 液柱虽 然上升 但不能 成膜。 进料 过少易 造成物 料在管 
中 干涸而 分解。 

(2) 降 膜式: 结构 与升膜 式基本 相同。 但液膜 和蒸汽 的流动 方向与 升膜式 相反; 见 
图 9-19。 料液由 顶部人 ;通过 料液分 配器被 均勾地 分配到 每根加 热管中 受热而 蒸发, 因重 
力的 影响增 加了蒸 汽的抽 拉作用 和液膜 的流动 速度, 所以在 同样条 件下降 膜蒸发 器的液 
膜比升 膜蒸发 器的液 膜要薄 一些。 而且 液流的 加速方 向与重 力方向 一致使 得降膜 式比升 
膜式 有更多 优点, 目前已 被广泛 采用。 




图 9-18 升膜式 蒸发器 图 9- 19 降 膜蒸发 器结构 

1. 料液分 配器; 2. 加热 列管; 3. 蒸 i'^t 挡板; 4. 分 离器; 5. 冷凝 
水液 位计; a. 料液 进口; b. 加 热蒸汽 进口; C. 不 凝性气 体排出 
口; (1. 冷凝水 出口; e. 浓縮液 出口; f. 二次蒸 汽出口 

4. 真空离 心薄膜 蒸发器 利用锥 形盘高 速旋转 产生的 离心力 把料液 鬼到锥 形盘的 

传热 面上, 分散为 一层极 薄的圪 匀液膜 (仅 0.1 毫米 )。 由于离 心力的 作用, 液膜在 蒸发面 
仅停留 1 秒钟。 操 作是在 700 毫 米承柱 的真空 度下进 行的。 适于连 续浓缩 中度或 高度热 
敏性及 高粘度 物料。 



• 251 • 



真空 离心薄 膜蒸发 器在国 外已广 泛用于 浓缩胰 岛素、 葡萄糖 、蛋 白质、 酵母等 物料。 例 

如胰 岛素在 401 浓缩就 会损失 效价, 而采 用真空 离心薄 膜蒸发 器仅在 1 秒 钟内就 能使物 
料达到 一定的 浓度, 故 可避免 效价的 损失。 我国 福建厦 门已有 生产, 型号为 LZ- XJ26 型, 
加热 面积为 2.6 米 2 , 蒸发 能力为 800 — 900 公斤水 / 小时, 浓 縮比为 5 — 10, 物料蒸 发温度 
为 45<t;。 



S. 大型 薄膜 蒸发器 为 了提高 薄膜蒸 发器的 效率, 近 年来多 采用一 种改良 装置是 

在 蒸发器 处安装 多条加 热管图 9-20 所示。 




图 9- 20 离心薄 膜蒸发 器结构 示意图 图 9-21 大 型薄膜 蒸发器 

1. 待浓 縮液; 2. 流 量计; 3. 预 热器; 4. 蒸 发器; 5. 气液分 离器; 
6. 冷 凝器; 7. 浓 縮液接 受器; 8. 热 水槽; 9. 废气 出口; 10. 蒸汽 
管; 11. 稳 压箱; 12. 检 验罩; 13. 岡门; 14. 温 度计; 
15. 冷水管 



二、 吸收 • 

吸 收浓缩 是加入 吸收剂 从溶液 中吸收 水或溶 剂使溶 液达到 浓缩的 方法。 吸收 剂应具 
有不与 溶液起 反应、 不吸附 溶质、 容易 和溶液 分离、 除去溶 剂后还 能重新 使用等 特性。 常 
用的 吸收剂 有各种 凝胶、 聚乙 二醇、 聚 乙婦吡 酮 和葡聚 糖等。 吸收 方法有 用凝胶 直接吸 
收和在 半透膜 外吸收 两种。 

(一) 用 凝胶直 接吸收 

凝胶 (例如 葡聚糖 凝胶和 聚丙炼 酰胺凝 胶等) 由多聚 物组成 ,具 有一定 孔径的 微孔, 能 
• 252 . 



够 吸水。 孔径小 的凝胶 吸水能 力弱, 但速 度快。 孔径大 的凝胶 吸水能 力强, 但速 度慢。 选 
用适当 孔径的 干凝胶 投入大 分子溶 液后, 大分子 不能进 人凝胶 网孔, 仍然 留在溶 液中。 溶 
剂 分子及 其它小 分子则 进人凝 胶内, 除 去凝胶 即得浓 溶液。 用凝 胶浓缩 有两种 方式: 动 
态浓缩 (使稀 溶液通 过凝胶 柱), 静 态浓缩 (将干 凝胶投 人稀溶 液)。 

1. 使用凝 胶直接 吸收可 用葡聚 糖凝胶 Sephackx G-25、 G- 50, 还有近 年来制 出的吸 
水性强 、容 易分离 的聚丙 嫌酰胺 干凝胶 (Lyphogel)。 

(1) 使用以 前应先 测定干 凝胶吸 水率, 方法 如下: 在 65t 加热 4 小时 得到干 覷胶。 
然后把 一定重 量的干 凝胶吸 水至恒 重后测 定重量 ,可 用下式 计算吸 水率: 



S 为吸 水率; 
W, 为干燥 凝胶的 重量; 

W2 为干 凝胶吸 水至恒 重后的 重量。 

根据干 凝胶吸 水率计 算出需 要加人 的干凝 胶量。 例如 1 克 Lyphogel 吸水达 到平衡 
时 能吸收 5 克水, 则 10 毫升溶 液浓缩 5 倍需加 1.6 克 凝胶。 如使用 Sephadex G- 25, 其 
吸 水率为 2.5 毫升 / 克干 凝胶, 则 3 毫升 蛋白质 稀溶液 中加入 1 克干 凝胶后 蛋白质 溶液可 
浓縮 6 倍。 

将 一定量 的凝胶 投入溶 液后, 凝胶开 始浮于 液面, 不久即 下沉, 应放置 待吸水 达到平 
衡以后 ,再离 心分出 上层浓 溶液。 下层巳 吸水膨 胀的凝 胶经回 收处理 后可以 再用。 

(2) 直接 加吸收 剂的优 点是: 使用 方便, 吸 收剂用 量与吸 水量成 正比。 浓縮 时溶液 
中盐 类和水 分同样 进人吸 收剂, 浓缩前 后溶液 PH 及离子 强度无 变化。 有 的吸收 剂甚至 
在 高压灭 菌后性 能也不 改变, 可以对 溶液进 行无菌 浓缩。 

缺 点是吸 收剂表 面有时 粘附一 部分溶 液造成 损失。 

(二) 在 半透膜 外吸收 

即高渗 透析。 半透 膜能使 小分子 或离子 透过而 蛋白质 等大分 子不能 透过。 半 透膜袋 
的外面 如果有 浓度很 高的、 能够吸 水的高 聚物, 膜外 渗透压 就高于 膜内。 膜 内溶液 中的水 
向膜外 扩散, 立 即被高 聚物吸 收直至 平衡。 反复操 作就能 得到所 需的浓 溶液。 常 用的吸 
水高 聚物有 聚乙稀 吡咯酮 (polyvinyl pyrrolidone, 简称 PVP, 分子量 12 ,000) , 聚 乙二醇 
(polyethylene, 简称 PEG, 分子量 5000 — 10, 000 适于 浓缩, 6000 最好) 及葡聚 糖等。 使 
用前 常需加 碱中和 PEG 中 的酸。 用过的 PVP、 葡 聚糖等 经过加 热或吹 风去水 后可以 
再用。 但是 PEG 不能加 热干燥 ,因 为加热 使它转 变为无 用的蜡 状物。 

此 法的缺 点是: 吸收剂 中如果 含有分 子量较 低的聚 合物或 杂质, 就有可 能透入 袋内; 
有些物 质如聚 乙嫌吡 咯酮对 280 毫微米 波长有 吸收, 因而对 测定蛋 白质有 干扰。 蛋白质 
不能全 部回收 ,因为 半透膜 有吸附 作用。 

三、 膜浓缩 



膜 分离方 法在本 书巳有 介绍。 这 里简单 介绍实 验室用 的浓缩 装置。 

• 253 • 




BS 蛋白 质溶液 
袋 支持器 
"^- ~~ 胶塞 
f 吸滤瓶 

娃管 

火 棉胶袋 
水或糊 精溶液 



样品液 
(通大 气压: ) 



(一) 减 压透析 

1. 基本原 理是利 用浓縮 装置内 外的压 力差, 将样 品中的 溶剂挤 压出去 > 使样 品得到 
浓缩。 例 如在图 9-22 所示的 装置中 ,火棉 胶袋的 容量为 8 毫升, 透水 速度为 7 — 15 毫升 / 
小时, 可以反 复用十 几次。 火棉 胶袋装 液后, 置 于吸滤 瓶内进 行真空 吸滤, 直至袋 内高分 

子溶液 达到所 需浓度 为止。 如无 低温工 作室又 不愿连 
续使用 水泵, 可以 在室温 减压后 关闭吸 滤瓶出 口 ,置于 
冷处。 吸滤压 力不宜 过大, 否则引 起滤孔 堵塞, 反而延 
长时间 。取出 浓縮液 时为了 不损伤 膜和减 少样品 损失, 
可 以用细 胶管套 在吸管 (或注 射器) 上轻 轻擦吸 膜面。 
为了防 止透析 袋干燥 或长霉 ,可 保存于 25fc 乙 醇中。 

2. 微量蛋 白质减 压透析 浓缩器 ,见图 9-23。 操作 
时 透析液 处于大 气压下 C 利用膜 面的压 力差能 够有效 
图 9- 22 减 压透析 地进行 浓縮。 透析 液内有 垂直的 管状透 析膜。 膜内的 

杆 有三种 作用: 

(1) 增 加单位 体积样 液的膜 面积。 

(2) 透析 时使分 子移动 的距离 减少至 1.5 厘米 左右, 基本上 是薄层 透析; (3) 能够精 
确地预 定浓縮 的最终 体积。 

微量 蛋白质 浓缩器 用水泵 (或真 空泵) 抽真 
空后, 用夹子 夹住, 停止 抽气, 可 以在一 定的温 
度条件 下进行 浓缩。 加样 液后透 析浓缩 立即开 

始, 样液 弯月面 下降直 至样液 r: 存室的 尖端。 
这 时样液 与蛋白 质透析 膜脱离 接触, 透 析液的 

浓縮 就自动 停止。 因此 样液不 会浓缩 至干。 可 

以自动 使样液 体积最 终定量 地小至 25 微升。 

透析 膜如不 垂直, 重 力使被 截留的 蛋白质 
分子 沉淀在 膜上。 膜的 吸附作 用使蛋 白质变 
性、 活力受 损失, 而且产 生浓差 极化。 搅 伴虽然 
可以使 蛋白质 分子离 开膜, 但又 产生有 害的切 
变 作用。 该装置 中透析 膜是垂 直的, 能 消除上 
述 有害作 用而保 留重力 的有效 作用。 浓 缩时被 

截留 的分子 直接沉 淀到透 析膜底 部已经 硅酮化 
的样液 It 存 器中。 这些改 进使回 收率平 均达到 
90%, 而 且不损 害蛋白 质的酶 活性或 生物活 
性。 

国 外有多 种这类 装置。 它们 还能与 高压消 毒装置 连用。 浓 縮达到 的预定 体积为 15 
微升至 1000 微升。 

(二) 离 心超滤 

含 生物大 分子的 少量样 液可在 离心管 内借助 于离心 力进行 超滤, 如图 9-24, 用小圆 




图 9-23 微量 浓縮器 



254 



筒插 人离心 管上的 活塞, 使 圆锥形 亲水凝 胶膜固 定在圆 锥形支 架上。 膜内装 有样液 ,离心 

2-30 分钟, 部分 溶剂和 小分子 杂质透 过膜, 成为 
超 滤液。 含 有大分 子的样 液得到 浓缩。 

(=) 加压 膜浓缩 

包括加 压超滤 装置、 空心 纤维浓 縮器、 微孔膜 
过滤 器及反 渗透膜 过滤装 置等, 已 大量用 于分离 
与浓 缩生化 产品。 加压膜 浓縮不 仅效率 极高, 还 
有以下 优点: 

(1) 条件 温和: 与 蒸发、 冻干、 沉淀等 方法比 
较, 此法没 有相的 变化, 保持 原来的 PH 和离子 
强度, 可以 在低温 操作, 能较 好地保 持生物 大分子 
的 活性, 因此广 泛用于 浓縮生 物大分 子的稀 溶液, 
特 别适于 浓缩不 稳定的 酶液。 

(2) 不需要 添加化 学试剂 ,设备 简单、 费用较 
低, 操作方 便且能 较快地 处理大 量的稀 溶液。 

(3) 蛋 白质和 酶的溶 液可以 浓缩到 10 — 50% 浓度, 回收 率高达 90fc, 

(4) 有纯化 作用, 可以 同时脱 盐及除 去其它 小分子 杂质。 
缺点是 不能直 接得到 干品。 膜的吸 附作用 会造成 一定的 损失。 




图 9-24 离 心超滤 



四、 冰 冻 融 化 

冰 冻融化 是浓缩 生物大 分子及 其它物 质的一 种有效 方法, 能 用于浓 缩大量 溶液。 样 
液在 缓慢冻 结时, 水不 断形成 冰晶而 析出, 盐类 及大分 子留在 液相, 从而 得到浓 溶液。 其 
装 置如图 9-25 所示, 浓缩 室的中 央有浮 动式搅 样器。 溶液中 的水在 浓缩室 的周围 逐渐结 
冰, 溶质浓 度不断 增大, 集 中到浓 缩室的 中部。 可 以使溶 液浓缩 4 一 30 倍。 




图 9-25 冰冻 浓缩机 

也 可以利 用溶剂 与溶质 融点的 不同, 先将溶 液冻成 固体, 然 后缓慢 融化。 用此 法浓縮 
蛋白 质和酶 的盐溶 液时, 不 含蛋白 质和酶 的冰块 浮在液 面上, 而蛋白 质和齒 则集中 于下层 
溶液。 移去上 层冰块 ,可以 得到蛋 白质和 酶的浓 溶液。 



255 




五、 其 他 



离子 交换, 吸附 剂吸附 和亲和 层析方 法都同 时具有 分离和 浓缩的 作用。 

(一) 离 子交换 

例如: 水解 RNA 可以得 到四种 单核苷 酸的混 合液。 经 阳离子 交换树 脂分离 AMP 
组 份后, 再经阴 离子交 换树脂 分离能 够得到 GMP、 UMP 及 CMP 组分。 经阳柱 得到的 
AMP 组 分所含 的杂质 很少, 可以进 行减压 浓缩。 而 CMP、 GMP、 UMP 组 分中存 在较多 
色素, 减 压浓縮 将使产 品颜色 加深, 故宜再 用阴柱 浓缩。 其过程 如下: 

CMP 组分用 NaOH 调 pH 8.0— 8.5, UMP 组分调 pH9.0— 9.5, GMP 组分调 
pH7.0 上柱 (聚 苯乙 琉-二 乙條苯 季胺型 树脂, 100 — 200 目, 交联度 1X8)。 100 毫 升树脂 
可上柱 10 克 核苷酸 (吸 附越 饱和, 浓縮效 果越好 )。 上 柱后用 O.liVHCKpHl.O), 3% 
NaCl 溶液 加热至 50力 洗脱, 分部 收集, 用 10 倍量的 95% 乙醇 沉淀核 苷酸。 可浓缩 50 — 
100 倍, 收率在 80% 以上。 

(二) 吸附 剂吸附 

常用 的吸附 剂有活 性炭、 碗酸 f§、 氧化 铝与硅 胶等。 溶剂 的极性 和溶解 性对吸 附作用 
有 很大的 影响, 所以 考虑吸 附作用 时应注 意两个 方面: 被 吸附物 的极性 和溶剂 的溶解 
性。 

亲 和层析 与有选 择地加 沉淀剂 常用于 分离, 但同 时也起 到极好 的浓缩 作用。 其原理 
及操 作前已 介绍, 这 里不再 赘述。 

第二节 干 燥 [1-5, 11- IS] 

千燥是 将潮湿 的固体 、膏 状物、 浓缩液 及液体 中的水 或溶剂 除尽的 过程。 

生化 制备中 干燥往 往是最 后一道 工序。 生化产 品含水 容易引 起分解 变性、 影响质 

量。 

干燥的 目的是 提高产 品的稳 定性, 使它符 合规定 的标准 ,便于 分析、 研究、 应 用和保 

存。 

物料 含水量 与空气 湿度之 间存在 着动态 平衡。 未经 密封的 物料不 能保持 干燥, 因为 
空 气中就 含有水 蒸气。 要使 物料干 燥或含 水量低 于空气 湿度, 就应 放入密 封容器 内进行 
干燥。 

一、 影 响干燥 的因素 

(一) 蒸 发面积 

干燥过 程中, 水或溶 剂从物 料表面 蒸发。 干 燥效率 与蒸发 面积成 正比, 蒸发面 积大, 
有利于 干燥。 如果物 料厚度 增加, 蒸发面 积减小 ,不 仅难于 干燥。 还 可能因 温度升 高而引 

• 256 • 



起物 料部分 溶解、 结块, 甚至 变质。 
(二) 干 燥速度 

干燥 过程先 是表面 蒸发, 然后 内部的 水分子 扩散至 表面, 继续 蒸发。 如 果干燥 速度过 
快, 表面水 份很快 蒸发, 就使得 表面形 成的固 体微粒 互相紧 密粘结 ,甚至 成壳, 妨碍 内部水 
份 扩散至 表面。 所以应 根据表 面蒸发 的情况 对干燥 速度进 行适当 控制。 

C=) 物 料所处 的状态 

静态时 蒸发面 积最小 ,蒸 发效率 很低, 需 要有充 分的时 间使内 部水份 扩散到 表面, 才 
能完全 干燥。 如 用气流 连续吹 过含水 的固体 物料使 之分散 跳动, 可以提 高干燥 效率。 

(四) 温度 

升温 能使蒸 发速度 加快, 蒸发量 加大, 空间相 对湿度 降低, 从而 有利于 干燥。 但很多 
生化 物质不 耐热, 所以 干燥的 温度不 能高。 对于 需在低 温下进 行干燥 的样品 说来, 冷冻干 
燥较为 适宜。 

(五) 湿度 

物料 所处空 间的相 对湿度 越低, 越 有利于 干燥。 相对 湿度如 果达到 饱和, 则 蒸发停 
止, 也就无 法进行 干燥。 降低相 对湿度 的办法 如下: 

1. 可以在 干燥器 内放人 干燥剂 吸水。 

2. 使气 体流动 更新, 如采用 鼓风干 燥箱和 烘房, 利用 气流降 低相对 湿度。 而在 喷雾干 
燥时, 相对 湿度决 定于高 压气流 的相对 湿度。 如果 降低气 流的相 对湿度 (例 如用干 燥剂先 
吸去 气流中 的水份 ), 干燥效 果更为 理想。 

(六) 压力 

蒸发 速度与 压力成 反比, 减压能 够有效 地加快 蒸发的 速度。 还能降 低干燥 的温度 ,并 
使产 品变得 疏松。 

了解 上述因 素将有 助于选 择和改 进干燥 方法。 

二、 常压吸 收干燥 

常 压干燥 是在密 闭空间 内用干 燥剂吸 收水或 溶剂。 此 法的关 键是选 用合适 的干燥 
剂。. ' 
1. 干燥 剂分类 按 照脱水 方式可 以分为 三类: 

(1) 能够 与水可 逆地结 合为水 合物。 例如 无水氯 化钙、 无水硫 酸钠、 无水硫 酸钙、 固 
体氢 氧化钾 (或钠 ) 等。 这 类干燥 剂不能 完全除 去水, 因为它 们与被 干燥物 之间存 在着水 
分的 平衡。 

(2) 能够 与水作 用生成 新的化 合物, 例如 五氧化 二磷、 氧化 f5 等。 

(3) 能够吸 去微量 的水及 溶剂, 例如分 子篩。 

, 257 • 



2. 选用干 燥剂除 考虑效 率外, 还 有以下 的要求 (1) 不与被 干燥物 发生化 学反应 

(例如 水解、 酸碱中 和或生 成分子 化合物 等); (2) 不溶 于被干 燥物; (3) 对被 干燥物 没有催 
化 作用; (4) 干燥速 度快, 吸水 量大, 价格 合适。 

3. 常 用的干 燥剂及 其性能 (1) 无水 硫酸钠 (Na^SCO, 中性、 价廉、 吸水 量大, 但 
作 用慢、 效 力差。 NaaSO^ 在 32.4^ 以 下吸水 后形成 NazSCVlO H2O, 但 超过该 温度以 
后, 这 种水合 物即不 稳定。 

(2) 无水 硫酸镇 (MgSOO, 中性, 效力 中等、 作 用快、 吸水量 也大, 吸水 后形成 
MgS04-7H,0, 与 有机物 不发生 反应。 

(3) 无水 硫酸锊 (CaSOO, 作用快 、效 率高。 与有机 物不发 生反应 ,而 且不溶 于有机 
溶剂。 与 水形成 稳定的 水合物 (2CaSCVH20), 25°C 时蒸 气压为 0.004 毫米 求柱。 缺点 
是吸 水量小 (仅 为其 重量的 6.6f。)。 可用 于进一 步干燥 (在 无水硫 酸钠、 无 水硫酸 镇吸水 
后使用 )。 

(4) 固体氢 氧化钾 (或钠 ), 可吸 收水、 氨和 胺类。 氢氧 化钾吸 水能力 比氢氧 化钠大 
60—80 倍 

(5) 五氧 化二磷 (P2O5), 吸水、 效力 最高、 作用非 常快, 但 是价格 较贵。 

(6) 氧化 15 (CaO), 即生 石灰, 碱性, 吸 水后成 为不溶 的氢氧 化物、 价廉。 . 

(7) 分 子筛: 常 用的是 沸石分 子筛。 它们是 含铝硅 酸盐的 结晶, 有以下 几种: 

(a) A 型, 又可 分为: 

3A 型: K9Na3[(Al02)i2(Si02)i2] '271120 
4A 型: Nai2[(Al02)i2(Si02)u] '271120 
5A 型: Ca45Na3[( Al02)i2(Si02)i2] • SOH^O 

(b) X 型 

13 X 型: NaM[(A102)M(Si02)i。6]';tH20 

分 子筛有 高度的 选择吸 附能力 , 可 依据它 们的孔 径不同 而筛分 不同大 小分子 的混合 
物。 分 子筛用 前应在 550±10°C 活化 脱水, 温 度过低 影响吸 附量。 温 度超过 600<\3 则使 
晶体结 构遭到 破坏, 导致降 低或丧 失吸附 能力。 分子 筛活化 后冷至 200Sc, 应立即 取出存 



表 9-1 分子 蹄的吸 附性能 



类 型 


孔 径 


吸 附情况 


(埃) 


能吸附 


不 能吸附 


3A 


3.2—3.3 


0,、 H2、 HjO 


CO,,NH, 及 更大的 

分子 


4A 


4.2—4.7 


CHjOH^C^HsOH^ CHjCN 
CHjNH,^ CHjCU COh CS, 
CO、 NH3、 CH<、 CjHs 
以 及能被 3A 吸附 的物质 




5A 


4.9-5.5 


(Ca-C.O 正 构垸径 C,H,C1 
(CH3)jNH, C,H,C1、 CH3CI 
以 及能被 3A、 4A 吸附 的物质 


w(C4H,),NH 
及更大 的分子 


13X 


9—10 


小于 : 10 埃的各 种分子 





• 258 • 



放干 燥器内 备用。 分 子旆用 后活性 降低, 需用水 蒸汽或 惰性气 体把吸 附的物 质置换 出来, 
再进 行活化 脱水。 

分子筛 适于吸 除微量 水份, 如 果样品 水分过 多应先 用其它 干燥剂 吸水, 再用分 子筛进 

行 干燥。 几种分 子筛的 吸附性 能如表 9-1。 

三、 真 空干燥 

(一) 原理 

真空干 燥即减 压干燥 ,与 减压浓 缩原理 相同。 

(二) 装置 

包括 真空干 燥器、 冷凝 管及真 空泵。 干燥 器顶部 经活塞 接通冷 凝管。 冷凝管 的另- 
端顺序 连接吸 滤瓶、 干燥 塔和真 空泵。 蒸气 在冷凝 管中凝 聚后滴 入吸滤 瓶中。 干 燥器内 
放有干 燥剂可 以干燥 和保存 样品。 

实验 室中常 用的装 置有: 

1. 真空 干燥器 

(1) 使用 时真空 度不宜 过高, 抽气 至盖子 推不动 即可, 以免干 燥器被 压碎。 新 的干燥 
器 一般需 经耐压 试验。 处理 危险或 有毒物 品时, 干 燥器外 还应罩 铁丝网 或用布 包扎。 打 
开干燥 器取样 时放人 空气不 宜太快 ,应缓 缓旋开 活塞。 在通气 口放一 小片清 洁滤纸 ,也能 
减缓 气流, 避 免冲散 样品。 

(2) 选用合 适的干 燥剂: 常用的 干燥剂 及其作 用见表 9-2。 



表 9-2 常用干 燥剂及 其作用 



干 燥 


剂 


吸收的 溶剂或 其它杂 W 


无水 Na,SOo MgS04、 


CaSO" 硅胶 


水 


CaO 




水、 乙酸、 氯化氧 


KOH、 NaOH 




水、 乙酸、 氯化氢 、船、 薛 


无水 CaCl,、 P,0, 




水、 醇 


石 错刨片 




醇、 链、 石油 Si 、苯、 甲苯、 氯仿、 四 氣化碳 



(3) 待干燥 物所含 溶剂如 不止一 种时, 可在 干燥器 内同时 放两种 干燥剂 (例如 无水氯 
化钙和 硅胶, 氧化^ 与 五氧化 二确、 石蜡 与氧氧 化钠等 )。 不 应同时 放两种 效率相 差很大 
而又吸 收相同 溶剂的 干燥剂 (如 五氧化 二碟和 氯化钙 )。 因为 这时低 效的氯 化钙不 能起作 
用。 必 要时可 以分两 次进行 干燥, 即先 用低效 的氯化 吸除 大部分 水再用 高效的 五氧化 

二 磷将水 除尽。 

2. 真空 干燥箱 可 以调控 温度。 用 时需连 接冷凝 器和真 空泵。 它能 处理较 大量的 
样品, 但是 被干燥 物的加 量应该 适当, 以免 液体起 泡溢出 容器, 造成 损失和 污染真 空干燥 
箱。 

• 259 • 



四、 冷 冻 干 燥 



(一) 概述 

冷 冻干燥 (Lyophilization), 是先将 溶液或 混悬液 冷冻成 固态, 然后在 低温和 高真空 



使冻结 的溶液 逐渐脱 水而留 下溶质 干粉。 

因为冰 冻干燥 是在低 温高真 空度下 进行的 ,所以 样品不 起泡、 不暴沸 。干物 不粘壁 、易 
取出, 而 且成为 疏松的 粉块, 极易溶 于水。 由于冰 冻干燥 有上述 优点, 所以 广泛用 于科研 
和生产 ,适 于对热 敏感、 易吸湿 、易 氧化及 溶剂蒸 发时易 产生泡 沫而引 起变性 的制品 (蛋白 
质、 酶、 核酸、 抗菌素 、激素 等)。 但 并非所 有的生 化物质 都能在 冻干时 稳定。 应该 先用小 
量做 试验, 确证冻 干对该 种物质 无害以 后再进 行大量 处理。 



核心部 件是具 有足够 抽气容 量的真 空泵。 为了保 持泵的 效率, 防止蒸 气进入 泵内, 在 

泵前应 该有吸 收蒸气 的装置 ,内装 干燥剂 (如 P2O5 和 KOH) 用以 吸水。 冷阱也 是整个 
装置 的主要 部件。 冷 阱外围 可用化 学制冷 或机械 制冷。 真空 测量装 置可用 水银真 空表或 
麦氏真 空表。 

1. 实 验室制 备冻干 品的简 易方法 

(1) 将物 料置培 养皿内 (厚度 不超过 1 厘米) ,在冰 箱内冻 成硬块 (有些 物料需 在深度 
低温 下迅速 冻硬) C 准备 真空干 燥器, 内置两 个培养 皿分别 放固体 KOH (或 NaOH) 及 



m 




温度 

图 9- 26 三相 点相图 



度 下使冰 升华, 留下 干物。 冷冻 干燥的 原理可 用溶剂 
的三相 点相图 来说明 ,见图 9-26。 图中 OA 是 固液曲 
线, 0B 是汽液 曲线, OC 是固汽 曲线, 为三 相点。 
当 温度在 三相点 以下 时将压 力降至 OC 线以下 ,溶 

剂就可 以由固 相直接 升华为 汽相。 例如, 冰的 蒸气压 
在一 40^ 时为 0.1 毫米 汞柱, 在一 60力 时为 0.01 毫米 
汞柱, 如将 一 40^ 冰 上的气 压降到 0.01 毫米 汞柱, 固 
态 的冰就 吸收大 量的热 (1 克 0°C 的冰 变成 0°C 的蒸 
汽 需吸热 580 千卡) 直接升 华为水 蒸气。 故升 华可以 



(二) 装置 




图 9-27 实 验室冻 干装置 (1) 

♦ 260 . 



图 9-28 实 验室冻 干装置 (2) 



P205, 迅速取 出冻块 放人干 燥器, 干 燥器通 过装有 P205 的干 燥管与 真空泵 相连, 管 中要有 

足量的 P205, 两端塞 棉花, 注意 切勿使 P2O5 和 水进入 油泵。 抽真 空后, 经过 5 — 10 小时 
可得冻 干品, 见图 9-27。 

(2) 物料置 圆底烧 瓶中, 将瓶 浸入干 冰-乙 醇混合 物内, 使瓶 内物迅 速冻成 硬块, 然后 
连接 高真空 度的真 空泵, 见图 9-28。 连接泵 的管道 口径不 宜太小 ,否则 降低冻 干效率 ,减 
压时 加温可 以加速 蒸发。 但以 不使试 料解冻 为限, 烧瓶外 面通常 蒙霜。 如 果霜层 开始融 
化、 冻块起 泡应即 停止。 检查和 排除故 障后将 试料重 新冻结 ,继续 冻干。 如 果霜层 全部融 
化, 用手 接触烧 瓶不感 觉冷, 就 表明升 华已经 停止。 但可 能还有 冰残存 于物料 内部, 因此 
需 适当升 温或延 长抽真 空时间 以彻底 脱水。 

(3) 半微量 冻干: 简便 易行, 效率 较高。 冻干 30 毫升以 下水溶 液仅需 2 — 3 小时。 
其装 置见图 9-29。 它由 A 与 B 两部分 组成, A 用 于冷却 与贮存 抽出的 溶剂, 支管 C 与 A 
相切 连接。 D 为真空 活塞。 E 为盛放 样液的 容器。 F 为盛 放制冷 剂的保 温瓶, 其 中放干 
冰-丙 酮混合 物或冰 盐混合 物或液 氣等冷 却剂。 

使用 时先将 溶液置 E 中, 用冰- 盐浴 或丙酮 -干冰 浴冷至 固态。 E 经活塞 D 与真 空泵 
联接。 开动 真空泵 (可 以用 2X-1 型旋 片式真 
空泵) 以后, 旋开活 塞0。 E 中冻 块内的 溶剂升 
华, 由支管 C 切向 进入并 沿螺旋 线通过 A,F 的 
冷 却作用 使溶剂 蒸气沿 A 的周壁 凝聚。 15 分 
钟 后关闭 D, 数 小时后 E 中溶 剂全部 升华至 A, 
旋开 D 、放人 空气或 氮气, E 中 留下冻 干品。 

几点 说明: 

(a) 如 果装置 密闭, 待真空 度恒定 以后就 
可关 闭活塞 D, 再停真 空泵。 冷浴 F 需维 持低 
温 (一 80°C — — 20<^), 以保 证继续 冻干。 此时 
系统内 真空度 等于该 种冷浴 的温度 条件下 E 中 
溶剂的 饱和蒸 气压。 

(b) 待 冻干物 中如果 混有少 量低凝 点溶剂 
(丙酮 、甲醇 、乙酸 乙酯等 ), 则需重 复以下 操作: 
先冷却 E 使内容 物冻固 ,然 后打开 D 抽真 空, 待 真空度 恒定以 后关闭 D 使 E 升到 室温, 再 
冷却 E, 反 复操作 2 — 3 次, 可除去 混杂的 溶剂, 否则样 品不易 冻干。 

(C) 冻 干速度 与冷阱 A 的温度 有关。 A 与 E 的温差 越大, 冻 干效率 越高。 例 如要将 
20 毫升某 物质的 水溶液 冻干, F 处用干 冰-丙 酮混合 物制冷 (约 一 60t) 只需 2 — 3 小时; 
如用冰 盐混合 物制冷 (约 一 15°C), 则需 8 小时。 

(d) 各种 溶液冻 干效率 还受该 溶剂的 汽化热 等因素 影响。 汽化热 越小, 冻干 效率越 
高。 例如, 20 毫 升某物 质的苯 溶液, 用干冰 -丙酮 制冷, 1 小时 即冻干 (苯 的汽化 热比水 
小)。 

2. 旋 转冷冻 离心式 冻干机 (Spin- Freeze Centrifugal Freeze Dryer) 用这种 装置可 

以 冻干小 量的样 品而无 需制冷 设备。 该 装置与 真空泵 相连, 高速 旋转中 的样品 上面的 E 
力 降低导 致迅速 蒸发。 利用蒸 发的冷 却作用 可以使 样品降 温直至 冻结。 在常用 的冻干 

• 261 • 




图 9- 29 半 微量冷 冻干燥 装置结 构简图 



机中, 如果使 样品上 面的压 力降低 就会引 起沸腾 和起泡 ,导 致损失 样品。 然 而旋转 冷冻装 
置 利用离 心力可 以防止 起泡而 使样品 的损失 最少。 

旋转 产生的 离心力 (大 于重 力五倍 以上) 还 有一个 好处就 是能够 迫使部 分样品 沿管壁 
升高, 从 而减少 样品的 厚度、 增加表 面积。 并不 需要在 整个冻 干过程 中连续 旋转。 冻干装 
置中的 定时器 可以控 制旋转 时间, 样 品冻结 后转子 停止旋 转而冻 干过程 仍继续 进行。 

3. 高效 能多用 途的实 验室多 用冰冻 干燥机 LG-3 型 实验室 多用冰 冻干燥 机采用 

自动控 制技术 ,操作 方便。 它是在 小型半 导体内 冷式冻 干器的 基础上 改进设 计的, 用于冰 
冻 干燥的 最大试 样量可 以达到 500 毫升 (12 — 18 小时内 干燥, 用 13A 型分子 筛干燥 剂,. 
可以 再生) 此 外还能 用于: (1) 室 温真空 干燥; (2) 升温真 空干燥 (在 一 30° — +50 力 范围 
内无 极可调 );(3) 低 温冷藏 (容积 50 升, 最低 一 25°C); (4) 真 空低温 r: 存; (5) 充氮低 温贮 
存。 

4. 大型冻 干装置 示意 图见图 9-30。 




图 9-30 大型冻 干装置 示意图 
1. 装待干 燥物; 2. 真空干 燥箱; 3. 冷 凝器; 4. 增 压泵; 5. 前 级泵; 6. 隔离阔 



一般 由制冷 系统、 真空 系统、 加 热系统 和电器 仪表控 制系统 组成。 主 要部件 为干燥 
箱、 凝结器 、冷冻 机组、 真空 泵组和 加热装 置等。 制 品的冻 干在干 燥箱中 进行。 箱 内搁板 
可用 铸铝板 制成, 冷 管及热 管绕注 其中, 分别用 于冷却 或加热 制品。 凝结器 内装螺 旋状冷 
气盘管 ,使其 工作温 度低于 干燥箱 内制品 的温度 (可达 60°C)。 机械泵 (旋 片式真 空泵) 与 
增压泵 (罗 茨真 空泵) 串接, 用以抽 空真空 系统。 制冷系 统的冷 冻机并 联使用 ,根据 负荷情 
况可以 只开一 台也可 同时开 二台或 三台。 加热 装置由 油泵、 油箱、 电 加热器 等组成 循环管 
路。 控 制台控 制全机 的电动 仪表。 利用 铂热电 阻与动 圈式温 度指示 仪对干 燥箱中 各层的 
板温、 制品 温度、 油 温及凝 结器温 度进行 遥测。 电阻真 空计能 够测量 气体的 全压, 并具有 
反应时 间快和 适于遥 测等优 点已在 冻干机 中广泛 应用。 例 如我国 LZG-4() 型冷冻 干燥. 
机就是 采用电 阻真空 计的。 

(三) 冻干注 意事项 

1. 样品) 容液 

(1) 样品 最好溶 于水, 不含有 机溶剂 ,因为 有机溶 剂降低 冰点, 使冻块 易融。 蛋白质 
和醒 溶液的 冻块融 化后再 经减压 则引起 大量泡 沫导致 变性。 而 且低沸 点溶剂 (乙 醇或丙 
酮) 的蒸 气压相 当高, 不易 凝结; 大部分 蒸气将 经过冷 阱进入 泵内, 冷 凝于泵 油中, 使泵油 

• 262 - 



稀释将 损害真 空泵。 如果冻 块仅含 少量有 机溶剂 可按前 述操作 除去。 

(2) 盐 浓度的 影响: 盐浓 度高, 冻块也 易融化 ,影响 样品活 性及延 长干燥 时间。 解决 
方法是 先将样 品溶液 脱盐, 或 使用挥 发性盐 (碳 酸铵 或碳酸 氢按) 缓 冲液。 

(3) pH 值的 影响: 缓冲液 冻结时 pH 可能 有很大 改变, 例如 pH7.() 的满酸 缓冲液 
冷 冻时, 磯酸 氢二钠 比确酸 二氢钠 先结晶 析出。 溶液 pH 在完 全冻结 前接近 3.5。 使用 
PH7.0 的碑酸 钾缓冲 液时结 果恰恰 相反, 因 为磷酸 二氢钾 比磷酸 氢二钾 的溶解 度小, 溶液 
pH 最终可 以达到 7.5 — 8.0。 溶 液冻结 愈快, pH 变动 愈少。 挥 发性盐 (碳 酸按或 碳酸氣 
铵) 缓 冲液冻 干时, pH 同 样可能 改变。 因此某 些物质 (如 接基 肽酶、 过氧化 氢酶、 脂蛋白 
等) 因 pH 改变 或低温 影响可 能变性 失活, 需加人 适当的 稳定剂 (如 糖类、 Ca2+ 等)。 

(4) 溶液的 浓度应 该适当 ,蛋 白质浓 度最好 不低于 1.5%。 同批 冻干的 溶液浓 度相差 
也不应 过大。 

2. 装 样容器 

(1) 在高 度真空 条件下 应该能 够耐受 外压并 且传热 良好。 常用圆 底烧瓶 、玻 璃安瓿 
和青霉 素瓶。 加液 量不应 超过容 器有效 体积的 1/5。 样品 过多, 将使冷 阱积存 厚冰, 影响 
传热, 并延 长冻干 时间。 

(2) 冻干 稀溶液 通常得 到很轻 的绒毛 状物, 容易 飞散, 被蒸 气带人 冷阱。 在装 样容器 
上面扎 一层细 的尼龙 网能够 截留冻 干物, 而 且不影 响冻干 速度。 

(3) 用皿或 盘盛放 样品使 之形成 薄层, 较易 冻干。 

3. 溶 液冷冻 

(0 骤 冷冻结 (温 度低于 一 20t) 可以 使晶粒 细小、 冻块 均匀。 实验室 内通常 采用静 
冻法, 干 冰-乙 醇冷浴 的液面 应该高 于样品 液面。 样 液冻成 白色不 透明时 即可。 如 果用小 
管或 安飯, 预冻后 可以用 多接头 管连接 冷阱, 见图 9-31。 

(2) 旋 冻法可 以加速 冻干。 在圆底 瓶中放 人少量 样液, 将瓶倾 斜浸在 冷却剂 (干 冰- 
乙醇混 合物) 中。 边冻 边旋转 直至形 成薄层 硬块。 




冷阱浸 于含有 干冰的 丙飼中 



图 9-31 冷讲浸 于含有 干冰的 丙嗣中 实验室 规模的 冻干器 



• 263 - 



4. 冻干 条件及 操作注 意事项 

(1) 在冰 全部升 华以前 不要扰 动样液 冻块。 在除 去瓶壁 冰壳或 移动容 器时, 应避免 
水 蒸气流 量突然 增加导 致冲散 样品。 

(2) 达到一 定真空 度后, 冻块 中水分 升华、 温度 降低, 可 使冻块 自然保 持冻结 状态。 
这时 容器外 面无需 冷却、 甚至还 需适当 加温以 补充升 华时被 消耗的 热量。 

(3) 冻干过 程中, 容器外 壁通常 结霜, 这 表明系 统运转 良好。 将近结 束时, 外 壁的霜 
渐渐 消失。 为了除 尽水份 ,应适 当延长 时间。 

(4) 结 束时, 缓慢放 入空气 ,避 免急速 的气流 冲散冻 干品。 系统 内部的 压力升 至大气 
压后, 取 出装样 容器, 关闭真 空泵。 最后 关冷冻 机或移 去冷阱 (上述 次序不 能颠倒 )。 如果 
在放人 空气以 前停真 空泵, 泵油将 倒流至 冷阱, 甚 至可能 进入干 燥器, 污染 样品。 为了预 
防水蒸 气进入 真空泵 ,要在 停真空 泵以后 才停止 冷却。 

(5) 冻干品 可以移 人小瓶 ,用蜡 密封, 如果是 安瓿, 可用扁 平火焰 熔封, 保存 于冰箱 

内。 

(6) 真空泵 是冻干 装置的 主件。 应注意 维护, 经常 换油。 常用 的泵至 少每月 换一次 
油。 如果发 现水、 有机 溶剂或 酸进入 泵内, 即需 换油。 . 

五、 喷雾干 燥 

喷雾 干燥是 将料液 (含水 50% 以上的 溶液、 悬浮液 、浆状 液等) 喷成雾 滴分散 于热气 
流中, 使水分 迅速蒸 发而成 为粉粒 状干燥 制品。 

喷雾干 燥的效 果决定 于雾滴 大小。 雾滴 直径为 10 微米左 右时, 每升液 体形成 的液滴 
数可 以达到 1.92 X 10", 总 面积可 以达到 600 米 2, 通 常雾滴 直径在 10 — 50 微米 之间, 表 
面极大 ,蒸发 极快、 干燥时 间很短 (数秒 至数十 秒)。 水 份蒸发 带走热 量还能 使液滴 与周围 
的气 温迅速 降低。 因此可 以在常 压下干 燥热敏 物料。 改变操 作条件 还可以 调控产 品的粒 
度及含 水量, 并且 可以制 成空心 微球状 产品, 易于 溶解。 因 而广泛 用于制 备粗酶 制剂、 抗 
菌素及 活性干 酵母。 

伹这种 方法的 干燥能 力小、 占地面 积大, 而且 成品密 度低、 粒度小 ,在收 集和除 尘方面 
要求 较高。 物 料需经 雾化, 不适用 于对切 力及对 热敏感 的具有 生物活 性的大 分子。 

1. 雾化器 的类型 按液滴 雾化的 方式可 以分为 三种: 

(1) 机械 喷雾: 用高压 (50 — 200 大 气压) 泵将物 料送进 喷嘴, 由喷嘴 高速喷 出均勾 
雾滴。 喷距约 1 米。 喷嘴 直径约 0.5 — 1.5 毫米, 不适 用于悬 浮液。 

(2) 气流 喷雾: 利 用压强 1.5 — 5 公斤 / 厘米 2 (表压 ) 的 压缩空 气经气 流喷雾 器使液 
体喷成 雾滴, 适用 于各种 料液。 

(3) 离心 喷雾: 将料液 注于急 速的水 平旋转 的喷洒 盘上, 借离 心力使 料液沿 喷洒盘 
的沟 道散布 到盘的 边缘, 分散成 雾滴, 离心 喷洒盘 转速为 4000 — 20,000 转 / 分, 周速达 
100-160 米 / 秒, 喷距 直径为 2 — 3 米。 此法适 用于各 种料液 ,但功 率消耗 较大。 

2. 喷雾干 燥装置 的类型 按气流 与雾滴 运动的 方向可 以分为 并流、 逆 流与混 合流。 
并流使 雾滴运 动的方 向与气 流运动 的方向 一致, 产品不 致过热 ,应用 较广, 见图 9-32。 

3. 喷雾干 燥装置 包括: (1) 喷雾室 ,(2) 液 体喷洒 装置, (3) 加热空 气并且 将它送 

• 264 • 




水 平并流 



垂直下 降并流 



图 9— 32 并流干 燥装置 






图 9-33 各种 喷嘴及 喷洒盘 

3L 




图 9- 34 喷雾干 燥装置 
1. 空气过 滤器; 2. 鼓 风机; 3. 空气预 热器; 4. 喷头; 5. 干 燥室; 6. 收 集器; 7. 袋滤 
器; 8. 排 风口; 9. 贮 料缸; 10. 压缩 空气; 11. 风压表 

入喷 雾室的 设备, (4) 从湿 热空气 中分离 细粉的 装置。 

使液体 成雾的 主要部 件是喷 嘴或喷 洒盘。 见图 9-33。 其中 a 是喷 洒盘, 其余 为喷嘴 
喷雾 干燥装 置见图 9-34。 




• 26 5 • 



空气 经滤框 1 过滤, 由 鼓风机 1 送 人空气 加热室 3。 加热室 内加热 管的气 压维持 8.5 
公斤 / 厘米 2 , 热空 气温度 130^:。 物 料由空 气压縮 机或高 压泵以 70 公斤 / 厘米 2 的 压力喷 
成 细雾, 在喷雾 室内与 热空气 相遇立 即蒸发 干燥, 得到 极细的 成品。 干燥的 细粉大 部分落 
在喷 雾室的 底部, 小 部分被 热空气 带走的 干燥细 粉则被 收集在 袋滤器 7 中, 废气经 离心式 
排风 鼓风机 8 排放到 室外。 




图 9-35 离心 喷雾干 燥设备 流程图 
1. 发酵液 贮槽; 2. 高 位槽; 3. 观察玻 璃管; 4. 离心喷 雾盘; 5. 出风 管口; 6. 旋 
风分 离器; 7. 受 粉器; 8. 沉 降室; 9. 双 闹门卸 料器; 10. 进风鼓 风机; 11. 空 
气加 热器; 12.排 风机; 13. 排风温 度计; 14. 百页窗 式进风 分配器 

离心 喷雾干 燥装置 包括干 燥室、 空气加 热器、 喷 雾器、 干燥成 品收集 器等, 见图 9 - 

35o 

已除去 水份、 温度不 高的热 空气用 于降温 喷雾, 可 使喷雾 干燥技 术更适 用于热 敏物料 
(例 如氨^ 基青霉 素纳盐 等)。 

降温喷 雾干燥 的原理 是利用 吸湿剂 (氯 化锊、 氯化锂 等的水 溶液或 硅胶) 在加 热前使 
空气 脱水。 降 低空气 湿度, 可以进 一步降 低喷雾 干燥的 温度, 从而提 高喷雾 干燥产 品的质 
量。 

六、 滚 筒干燥 

(一) 原理 

滚 筒干燥 是将已 经蒸发 至相当 稻度的 液体在 加热面 展成薄 层进行 干燥, 蒸发 面与受 
热面显 著增大 有利于 干燥, 能大 大縮短 时间, 减少 受热的 影响, 也 可以进 行连续 生产。 滚 
筒干燥 器能在 常压或 减压下 工作。 滚筒转 速可根 据物料 干燥情 况加以 调节。 如 转速固 
定, 则 可控制 浓度。 滚 筒干燥 器分单 滚筒及 双滚筒 两种。 此法缺 点是干 燥温度 较高, 产品 
质量不 及喷雾 干燥, 而且是 片状, 需粉碎 ,设备 构造较 复杂。 

(二) 装置 

1. 单滚筒 干燥器 用 于浓缩 抽提液 或使稠 厚物料 干燥, 兼有蒸 发和干 燥作用 ,装置 
• 266 • 



图 9-36 单滚筒 干燥器 图 9-37 减压双 滚筒式 干燥器 

1. 槽: 2. 转滚: 3. 外壳; 4. 刮刀: 5. 螺旋运 输机: 1. 滚筒; 2. 加 料槽: 3. 刮刀: 4. 斜壁; 5. 收 集罩: 

6. 贮 料槽; 7. 泵; 8. 干 燥成品 6. 观察孔 

細 9-36。 

滚筒 2 中空, 由 铜或铝 制成。 液 状易流 动的物 料呈均 勾薄层 沿回槽 1 的全部 宽度流 
下, 涂布 在滚筒 2 的 表面。 滚筒 由齿轮 传动, 以 2 — 8 转 / 分的速 度缓慢 转动。 随着 滚筒的 
转动, 从蒸气 管进入 筒内的 蒸气供 热使薄 层物料 中的水 分迅速 蒸发。 转 到刮刀 4 时, 物料 
薄层巳 干燥, 被刮刀 4 从滚筒 表面刮 下落到 干燥产 品接受 器中。 

如果将 干燥装 置放在 密闭外 壳中, 吹入空 气或抽 真空都 可以提 高干燥 能力。 
2. 双滚 筒减压 干燥器 干 燥能力 成倍高 于单滚 筒式。 流动的 物料经 加料室 2 呈薄 
层洒在 滚筒上 ,滚 筒每转 一周, 涂布于 滚筒表 面的料 液立即 干燥, 被紧贴 于筒上 的刮刀 3 
刮下, 落 于接受 器中。 干燥 器中蒸 发的溶 剂蒸气 通过捕 尘器进 人表面 冷凝器 冷凝。 抽气 
泵接在 冷凝器 后面。 从 观察孔 可以了 解干燥 及冷凝 情况, 见图 9-37。 这种 干燥器 的蒸发 
效率 很高, 水分蒸 发量可 以达到 70 公斤 / 米 V 小时。 

参 考文献 

C 1 ] 《有 机化 学实验 技术: >编 写组: 有机化 学实验 技术, 科学 出版社 (1978) 
[2] 南京 药学院 主编: 药剂学 ,人 民卫生 出版社 (1978) 

[3] 中山大 学生物 系生化 微生物 学教研 室编: 生 化技术 导论, 人 民教育 出版社 (1978)。 
[ 4 ] 阿 南功一 等编: 基础 生化学 实验法 [2], 抽出 • 分离 • 精制, 丸善株 式会社 (1974) 
[5] 王世中 主编: 免 疫化学 技术, 科学 出版社 (1980) 
[6] 樊汝恭 ,刘 尔翔: 生物化 学与生 物物理 进展, 1 , 71(1980) 

[7] 中国科 学院北 京植物 研究所 七室生 化组修 理组: 生物化 学与生 物物理 进展, 2 , 22(1975) 
[8] 中国 科学院 上海生 物化学 研究所 三室: 生物化 学与生 物物理 学进展 ,36(1975) 

[9] Biomedical Products, Vol. 5, No. 2, p. 58(1980) 

[10] Freifelder, D. M., Physical Biochemistry Application to Biochemistry and Molecular Biology, W. H. 

Freeman and Company (1976) 
[11] 《微生 物工程 * 编写组 : 微生 物工程 (下册 ), 上海科 学技术 出版社 (1982) 

[12] 苏 盛恵: 医药 工业, 1 ,44—45(1979) 

[13] 上海轻 工业设 计院、 上海 医药工 业研究 院编: 干 燥技术 进展, 笫一 分册, 综述; 第四 分册, 喷 雾干燥 (1977). 

IHj Jakoby.W. B. (Ed.), Methods in Enzymology, Vol. XXII, Academic Press (1971) 



• 267 • 



ri5] Webb, F. C., Biociiemical Engineering, D. Van Nostrand Company Ltd. London (1964) 
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[17] 商业 部脏器 生化制 药情报 中心站 编著: 动物 生化制 药学, 人 民卫生 出版社 (1981) 
[Ul] Freeze Dry Apparatus, Labconco p. 24(1978) 



. 268 . 



第十章 样 品 的保存 

' 劳子谦 

第一 15 样 品的保 存与环 境条件 的关系 

生化药 物或生 物制剂 的正确 保存, 在 生物化 学以及 医药科 学领域 中都有 重要的 意义, 
不适 当的保 存不仅 造成经 济上的 损失, 而且也 给生化 研究和 应用带 来很大 影响。 特别是 
一些用 于大分 子结构 和功能 研究的 制剂或 药品, 以及分 析用标 准生化 样品, 要求更 为严格 
的保存 条件, 防止 失活、 失效或 变质。 要 保存好 样品, 首先就 要对样 品变质 的一般 规律以 
及样品 的理化 性质有 足够的 了解, 才 能确定 某种样 品的最 适保存 条件。 

影响 生化药 物或制 剂质量 的因素 很多, 主要有 空气、 温度、 水分、 光线、 酸 碱度、 样品的 
状态、 微生物 活动、 保存时 间和容 器等。 这些 因素可 单独起 作用, 但更 多情况 是协同 作用, 
互相 影响, 从而加 速样品 的变质 破坏。 每种生 化药物 或制剂 的理化 性质和 对上述 因素的 
稳定 性都不 相同, 必须结 合具体 情况, 抓 住主要 矛盾, 选择 适当的 r: 存 环境和 条件。 现将 
影响样 品质量 的几个 主要因 素分述 如下: 

1. 空气 空气 的影响 主要和 潮解、 微生 物污染 和自动 氧化等 有关。 空气中 的微生 
物 污染可 以使样 品腐败 变质, 吸 湿后的 样品除 引起潮 解变性 外也造 成微生 物活动 的有利 
环境。 某些具 有较强 还原性 的样品 ,露置 于空气 中不久 便氧化 变质。 如 维生素 C 的失 效、 
油脂的 酸败、 琉基 酶的失 活等。 某 些样品 (特 别是 液体样 品或半 成品) 在空 气中的 氧化是 
一种自 动氧化 过程, 是由 空气中 的氧自 发引起 的游离 基链式 反应。 自动氧 化的机 理很复 

杂, 包括 氧化、 还原、 聚合、 水 解等。 氧 浓度、 水、 PH、 温度、 紫外线 等对自 动氧化 均有影 

响。 

2. 温度 每种样 品均有 其稳定 的温度 范围, 温 度升高 有利于 许多物 理和化 学变化 
(如温 度升高 10°C, 氧 化反应 约加快 数倍, 酶 促反应 约增加 1 一 3 倍。 50°C 以上蛋 白质容 
易变 性等等 ), 不利于 物质的 稳定。 同时, 适宜 的温度 (如 室温) 又是 微生物 感染的 重要条 
件。 而低 温却可 以抑制 氧化、 水解 等化学 反应和 微生物 生长, 使微生 物处于 生命迟 缓和隐 
蔽 状态。 故大多 数生化 样品选 择低温 保存, 稳定性 可大大 增加。 

3. 水份 水份也 是影响 样品质 量的主 要因素 之一。 这里 所指的 水份, 可能 来自样 
品 本身, 也可能 是样品 吸湿的 结果。 水份除 直接参 与水解 、酶解 、水 合和加 合等反 应外, 还 
能加速 氧化、 聚合、 离解和 霉坏。 蛋白质 、核 酸等大 分子含 水量太 高时, 会导 致高级 结构松 
散, 稳定 性下降 而易于 失活。 因此, 为 避开或 削弱水 分子的 影响, 保存固 态样品 要密闭 ,液 
态样品 须冻结 或加稳 定剂。 

4. 光线 某些 分子可 吸收一 定波长 的光, 反射或 透过其 它光波 的光。 样品 吸收光 
后, 使分子 活化, 内能 增加, 不利 于样品 保存。 日光 中的紫 外线能 量大, 对生 化药物 或制剂 
的影响 最大。 在 不同条 件下, 样品对 光的敏 感性各 不相同 ,受 光作用 而发生 变化的 程度也 

• 269 • 



不同。 

样品受 光催促 的反应 有变色 、氧 化和分 解等, 通 称光化 作用, 其 中重要 的是在 有氧参 
与 下的自 动氧化 作用。 光化作 用比较 复杂, 如 肾上腺 素在空 气中受 光催化 进行自 动氧化 
时, 可能涉 及复杂 的氧化 、聚合 过程, 颜色由 淡黄— 淡红— 褐色— 棕黑 色。 



光 



o= 



HO— >— CHOH [O] O 
HO— LI CHj 
HNCHj 

肾 上腺素 

一 I 



光 



'^― CHOH [O] O 

I 

j 

HNCHj 
脱氣肾 上腺素 



-OH 



7、/ 



CHj 
肾上 腺素红 



聚合, 

IT 



tOH 



肾上 腺素黑 

维生素 C 的光化 作用也 涉及一 系列的 氧化、 水解 等反应 < 







c=o —一 

I 

HO— C 
II 

HO— C 

HC - 

] 

HO— CH 

CHjOH 

维生素 C 

COOH 



光 



光 



COOH 



草酸 



o=c- 
o=c 
o=c 

HC 

I 

HO -CH 

CHjOH 
脱氢抗 坏血酸 
COOH 

HC— OH 
HO— CH 

COOH 

L- 丁糖酸 



0=C-OH 

,o=c 
o=c 

I 

HC- OH 

I 

HO- CH 

CHjOH 
二酮古 乐糖酸 



因此, 保存光 敏感的 样品时 ,必 须注意 避光。 

5. 酸滅度 酸 碱度对 液态样 品的保 存影响 较大。 不 同样品 的稳定 pH 不同, 可由 
实 验求得 或从文 献资料 查得。 液体 样品保 存时, 控制 pH 常用缓 冲剂, 但 选择缓 冲剂不 
能只考 虑缓冲 容量的 大小, 还要 注意缓 冲剂的 种类和 浓度对 样品稳 定性的 影响。 如" ""定 
浓 度的氯 霉素液 用磷酸 盐和醋 酸盐缓 冲剂调 PH5.95 时, 半衰期 分别为 6.3 和 10.9 小时, 
差别 很大。 青霉 素用柠 檬酸盐 而不用 砩酸盐 和醋酸 盐作缓 冲剂, 因 前者催 化水解 的速度 
小得多 "' 2 ]。 某些以 无机磷 或有机 磯作底 物或反 应产物 的酶, 不宜 用确酸 和焦确 酸缓冲 
液。 

6. 时间 按 照现代 技术, 生物或 生化样 品的永 久存活 仍无法 办到, 不 同样品 均有其 

不 同的有 效期。 因此, 保 存的样 品需要 作定期 检查、 处理或 更换。 



第二节 样品保 存的一 般方法 



1. 密 闭保存 凡露 置在空 气中受 水分、 空气的 影响易 发生吸 水水解 (如含 RCO — 

<- 270 . 



HN<、 RSO2— 等 基团的 样品) 或潮解 (如 含有 Br -、 C1- 、S07、 SCN -、 NO3— 、 一 COOH、 
-SO3H, -OH 等基团 的易溶 于水的 有机物 )、 氧化 (如含 一SH 、一 CHO 、一 NO、 〉S203、 

〉S03 基团的 样品) 或聚合 (如含 一 CHO、 〉C = C<、一 CeC— 基团的 样品) 、吸收 CO2 

而 碳酸化 (含 OH ―、 — N+—OH 的样品 )、 易风化 (含 结晶水 的样品 )、 挥 发或霉 坏的, 
以至几 乎所有 的样品 ,都 可用密 闭保存 方法, 以防止 空气及 水份的 侵入。 玻 璃瓶、 安瓿是 
密闭 保存最 理想的 容器, 固体、 液 体均可 采用。 有 些极易 氧化的 样品, 瓶装时 应尽量 装满, 
少留 空隙, 以减少 瓶内氧 气的相 对含量 ,加塞 (或盖 ) 后蜡封 保存。 如 果样品 量少, 或为了 
取样 方便及 避免取 样时样 品吸水 污染, 可 用安瓿 或小瓶 分装。 有 时需充 N2 或抽真 空后再 
保存。 易吸 湿发霉 (如 胃蛋白 酶、 胰蛋 白 醜、 淀 粉酶及 一般含 糖和蛋 白质 的不纯 制剂) 或吸 
湿 后易分 解失效 (如青 霉素、 NAD 等) 的样品 ,应 放入内 盛无水 Caa2、 硅胶、 PaOs 等干 
燥剂的 干燥器 中密闭 保存。 某些 样品吸 湿后, 经检 查如不 变质, 或 未被其 他杂质 污染, 千 
燥后仍 可再用 (如糖 类)。 

2. 低 温保存 生化 药物或 制剂一 般对热 敏感, 特别是 生物大 分子, 性 质很不 稳定, 
容 易受温 度等环 境因素 的影响 而变性 失活。 对 热敏感 的生物 活性物 质及易 水解、 氧化的 
物质的 保存, 一 般是温 度愈低 愈好。 低温 保存是 多数样 品保存 的必要 手段, 但由于 不同样 
品具有 不同理 化性质 ,耐热 性不全 相同, 必须根 据样品 的具体 特性选 择保存 温度。 例如木 
瓜 蛋白醒 粉能耐 100<^ 干热 3 小时, 甚 至在溶 液中对 热也极 稳定。 抗 菌素、 抗血清 和胎盘 
球 蛋白等 血清类 制剂, 在低温 冰冻下 保存最 稳定。 但一些 对低温 敏感的 样品, 保存 温度不 
能 太低。 此外还 要注意 ,用玻 璃瓶或 安瓿低 温保存 液体时 ,不 能装满 容器, 以防液 体冻结 
时 膨胀, 使瓶子 破裂。 

3. 固态千 燥保存 液体样 品的保 存虽然 可省去 较费时 的干燥 处理, 但由于 水的存 

在, 使样 品稳定 性大大 下降。 加稳 定剂可 延长保 存期, 又给使 用带来 许多的 不便。 因此, 
样品通 常都制 成结晶 ,或经 干燥以 至冰冻 干燥成 固体后 再干燥 保存。 

固态 干燥保 存排除 了水导 致的不 稳定, 创造了 不利于 微生物 生存的 条件。 一 些在水 
溶液 中容易 变性或 水解、 氧化的 样品, 在干燥 或低温 干燥下 都比较 稳定。 如 干燥青 霉素在 
完全无 水条件 下可以 长期保 持效价 不变, 但 吸湿或 含水在 10% 以上时 即分解 失效" '21。 因 
此, 干 燥后的 固态样 品须瓶 装并放 人干燥 器内, 必 要时置 冰箱内 保存。 干 燥保存 是最古 
老, 最普遍 采用的 方法, 在生 化药物 和制剂 的保存 中占有 重要的 地位。 

4. 避 光保存 凡见 光引起 分解、 氧化或 变色的 样品, 均 应置棕 色玻璃 瓶或安 瓿内避 
光 保存。 掠色玻 璃能阻 碍某些 波长的 光线, 特 别是紫 外线的 透过。 如 没有掠 色瓶, 也可用 
黑 色纸包 裹或暗 处避光 保存, 以减 弱光化 作用。 对光 特别敏 感者需 用掠色 瓶再外 包一层 
黑纸 保存。 如上 述肾上 腺素、 维生素 C 等都是 对光极 敏感的 物质。 维生素 B2 干 品较稳 
定, 但液 态遇光 也极易 变质, 在 碱性下 生成光 黄素, 中性或 酸性下 生成光 色素。 蛋白质 
(如葡 萄糖氧 化酶) 在 有氧存 在下也 受光的 影响。 这些 物质需 用綜色 瓶密封 后置冷 处避光 
保存, 同 时还要 设法减 少参与 光化反 应的其 它因素 (如 Oh H,0, 温度、 pH) 的 影响。 

5. 添加 稳定剂 液态保 存常需 根据不 同样品 的要求 添加某 些辅助 成份, 如防 腐剂、 
抗氧剂 、酸 碱调节 剂等。 这些物 质对样 品起一 定稳定 作用, 故通 称为稳 定剂。 

• 271 . 



(1) 防 腐剂: 用于抑 制微生 物生长 、繁殖 的防腐 剂有: 乙醇、 酚类和 氯酚类 (如 苯酚、 
氯甲盼 )、 有机汞 化合物 (如硫 柳汞、 硝酸 苯承、 醋酸苯 汞)、 对轻 基苯甲 酸酯类 (如对 轻基苯 
甲酸的 甲酯、 乙酯、 节酯) 等。 选择 防腐剂 应以防 腐能力 和对样 品有无 影响为 依据。 例如 
驗 的保存 不能用 汞和其 它重金 属化合 物作防 腐剂, 因它 们对酶 有毒害 作用。 酶和 一般蛋 

白质 的防腐 剂常用 甲苯、 NaN3、 氯仿、 百里 般等。 

(2) 抗 氧剂: 抗氧剂 本身是 较强的 还原剂 ,容易 氧化。 有氧存 在时, 其 自身首 先被氧 

化, 从而 保护并 延缓了 样品的 氧化。 能强烈 地与样 品争夺 02 的 物质, 或能固 定或螯 合金属 
离 子的物 质都可 以作抗 氧剂。 抗 氧剂选 择的原 则是: 它不 应与样 品的主 要成分 作用, 如 
本身 是还原 剂时, 它的 标准还 原电位 要比样 品低, 而且 低浓度 下也应 有抗氧 能力。 常用的 

水溶 性抗氧 剂有: Na2S03、 NaHS03. 焦亚硫 酸钠、 硫代硫 酸钠、 半胱 氨酸、 维生素 C、 硫 
脲、 甲硫氨 酸等。 常用 的脂溶 性抗氧 剂有: 没食子 酸丙酯 、对苯 二酷、 邻苯 二酷、 生 育酚、 
二叔丁 基对甲 苯般、 焦 性没食 子酸、 去甲二 氢愈疮 酸等。 例 如巯基 酶用半 胱氨酸 作抗氧 
剂, 维生素 A、 D、 油 脂等可 用没食 子酸丙 酯或对 轻叔丁 茴香醚 等作抗 氧剂。 

样品中 微量金 属杂质 (如 Cu++、 Fe+++) 是自动 氧化或 水解作 用的催 化剂, 起 促进分 
解的 作用, 通常 可加入 某些金 属螯合 剂或沉 淀剂来 防止。 例如 维生素 C 在极 微量的 Cu++、 
Fe+++、 Mn++ 存在下 便能被 氧化和 水解, 但如 加人碗 酸三钠 与金属 离子作 用即能 抑制分 
解。 最 常用于 结合金 属的抗 氧剂是 EDTA 钠盐 (1 一 3 X 1()_4]\^),在广范的 pH 范 围内它 
都 能与样 品液中 许多金 属离子 螯合, 生成稳 定的水 溶性螯 合物。 EDTA 已广泛 用作酶 、抗 
坏血酸 、肾上 腺素、 青霉素 等的抗 氧剂, 有 效地防 止或延 缓了氧 化分解 作用。 

(3) 惰气填 充剂: 充 填惰气 是稳定 样品, 防止氧 化的有 效方法 之一。 少量易 氧化固 
体样 品可用 安瓿充 填惰气 保存。 如果 是液体 样品, 也可 用惰气 驱除液 中残存 的氧, 然后再 
充气 保存, 此时不 加任何 抗氧剂 ,效 果也很 理想。 样品充 气保存 的例子 很多, 如细 胞色^ 
C 的充 保存, 维生素 C 的充 C02 保 存等。 但不是 所有样 品都能 充惰气 保存, 如维 i 
素 K 充惰气 后反使 分解速 度加快 ,使 用时必 须加以 注意。 

6. 制 成高稳 定性的 盐类或 衍生物 许 多样品 由于水 解或氧 化会使 稳定性 下降, 伹 
制成盐 类或对 其结构 进行化 学修饰 改造后 ,效力 不降, 稳 定性却 得到了 很大的 改善。 如青 
霉素 G 经制 成钾、 钠盐, 维生素 C 经修 饰为 维生素 C 苯甲酸 酯后, 效价 不变, 但稳 定性大 

大提 高了。 

样品 的保存 除了正 确选择 上述方 法外, 常须注 意以下 事项: 

(1) 保存的 样品一 律要贴 标签, 标明 样品的 名称、 制造 单位、 含量 (浓 度、 效 价或活 
性)、 添加 成份、 曰期、 有效 期或使 用期, 以 及必要 的附加 说明。 

(2) 定期 检查, 如有变 质者, 应立 即查找 原因, 并 作及时 处理。 凡 保存期 过长的 样品, 
均应慎 用或经 检验、 处理后 再用。 变质样 品一般 可用眼 、口、 鼻从 外观上 (如 发霉、 变色、 沉 
淀、 挥发、 酸败、 气味、 潮解、 粘 结等) 判断, 但也 有的外 观不变 而已失 效者, 切勿 大意。 

(3) 不 同样品 应按性 质分类 保存。 如干 燥样品 和液态 样品不 宜一起 存放, 易 挥发样 
品 应与其 它样品 分开保 存等。 



- 272 • 



第三 1? 各类生 化物质 的保存 

一、 蛋白质 的保存 

蛋白质 失活受 多种理 化因素 的影响 ,保 存时必 须根据 其不同 特性, 采 用不同 措施, 以 
防止 变性或 降解。 蛋白 质的保 存方法 如下: 

(一) 液 态保存 

1. 在低温 下保存 蛋白 质对热 敏感, 温度 越高, 稳定性 越差。 因此, 低温保 存蛋白 

质 溶液在 绝大多 数情况 下是有 利的。 一般 蛋白质 越纯, 其 稳定性 越差。 特别是 纯酶溶 

液, 对热甚 不稳定 (少 数酶 例外, 如核糖 核酸酶 能短期 煮沸, 胰 蛋白酶 能在稀 HC1 中耐 
90$, 及某些 高温细 菌产生 的耐热 性酶等 ), 多数在 35 — 40°C 以 上就会 失活, 难以 长期保 
存, 在普通 冰箱中 通常也 只能保 存一周 左右。 因此, 液态 蛋白质 样品常 常在一 5 —一 10°C 
以至 一201 以 下冰冻 保存比 较理想 ,有时 经数月 或数年 仍保留 大部份 活性" ] 。 

但是, 各种蛋 白质的 耐热性 不同, 并 非温度 越低, 保存越 稳定。 例如鸟 肝丙酮 酸接化 
酶对冷 敏感, 25^ 左右 稳定, 低温反 而容易 失活。 而南北 极中某 些鱼类 的抗冻 蛋白, 在极 
低温 度下仍 保留其 活性。 羧 肽酶、 脂蛋白 和某些 抗体经 冰冻再 融解后 ,即完 全变性 破坏。 
但某些 酶如酿 酶液经 冻融后 ,活 性反而 增加, 这可能 是由于 酶颗粒 发生了 散解, 表 面积增 
大, 暴 露出更 多活性 基团的 缘故。 反复冰 冻和融 化一般 会导致 蛋白质 变性, 必须 尽量避 
免"' 53。 为了 防止冻 p4 损伤, 冰冻保 存要求 样品浓 度大、 体积小 、表面 积大、 含 盐低、 冻结迅 
速、 一 7()°C 以下 保存、 用时 迅速融 化等。 

2. 在稳定 pH 下保存 多数蛋 白质只 有在很 狭窄的 pH 范 围内才 稳定, 超出此 
范围 即迅速 变性。 如 鯨肌红 蛋白在 等电点 PH6.8 附近时 稳定, 卵类 粘蛋白 在中、 酸性条 
件下对 热稳定 〔6〕 。 蛋 白质较 稳定的 pH — 般在等 电点。 因此, 酸性、 中性和 碱性蛋 白酶的 
稳定 pH 分别为 pH2 — 6、 pH6 — 9 和 pH5 — 10.5 [7] 。 但也有 例外, 如血漿 蛋白质 的等电 
点 PH4.6, 而 其稳定 pH 为 6.8, 稳定 pH 与 其等电 点并不 相同。 酶的 最稳定 pH 也并 
非是 酶反应 的最适 pH, 二 者有时 可相差 1 至数个 pH 单位。 所以 保存液 态蛋白 质样品 
时, 应小 心调到 其稳定 pH 范 围内。 

3. 在高 浓度 下保存 液态 蛋白质 易受水 化作用 影响, 保存时 浓度不 能太稀 (如 1 
亳克 / 毫升以 下), 否则将 可能引 起亚基 解离、 表 面变性 或器壁 吸附。 一般蛋 白质在 浓溶液 
中比较 稳定, 中间样 品的保 存可采 用湿的 沉淀。 需要保 存醒溶 液时, 其蛋白 质浓度 也应大 
于 1%。 保存较 长时, 还需 加入防 腐剂、 蛋 白酶抑 制剂或 其它稳 定剂。 如免 疫球蛋 白可加 
NaN5 至 0.04%, —20°C 下进 行冰冻 a 】 。蛋白 酶抑 制剂的 选择: 中 性蛋白 酶常用 EDTA; 
碱 性蛋白 酶用二 异丙基 氟碟酸 (DFP)、 苯甲基 横酰氟 (PMSF); 酸 性蛋白 酶用十 二院基 
磺 酸钠、 N- 溴 琥珀酰 亚胺。 活性中 心为丝 氨酸的 蛋白酷 加二异 丙基氟 碟酸; 活性 中心为 
琉基 的蛋白 酶加对 氯承苯 甲酸等 [7 , 9] 。 但某些 抑制剂 (如 DFP、 PMSF) 不仅 抑制蛋 白酶, 
对其它 酶可能 也有抑 制作用 ,使 用时应 慎重。 

4. 在保护 剂存在 下保存 很早就 有人观 察到, 在 无菌条 件下, 室温保 存了四 十五年 

• 273 • 



的血液 ,血红 蛋白仅 有少量 改变, 许多酷 仍保留 部分活 性 [ 1"。 另一方 面又观 察到, 有些纯 
驗液 即使在 冷却下 也甚不 稳定, 保存期 仅为几 小时至 几天。 这是由 于血液 中含有 某些蛋 
白 质稳定 因素, 而纯酶 则恰好 相反, 缺乏这 些稳定 因素。 为了较 长期保 存蛋白 质溶液 (特 
别是敏 感的纯 酶或稀 蛋白溶 液), 常常 加入某 些稳定 剂进行 保护。 现 将几类 蛋白质 的稳定 
剂介绍 如下: 

(1) 惰 性生化 或有机 物质: 多数蛋 白质要 求较为 疏水的 环境才 能长期 保存。 加人某 
些物 质降低 溶液的 极性, 可 保护蛋 白质以 免变性 失活。 这类蛋 白质的 稳定剂 有糖类 (单、 
双糖、 或多糖 )。 脂肪类 (包括 脂肪酸 )、 蛋 白质类 (如牛 血清白 蛋白、 明胶 )、 氨基酸 (如 谷氨 
酸钠、 甘氨酸 、半胱 氛酸) 等生化 物质, 以及 多元醇 (如 甘油、 丙二醇 )、 二甲 亚讽、 有机 溶剂、 
轻接酸 (如柠 檬酸钠 )。 多聚 阴离子 (如多 磯酸盐 )、 表面 活性剂 等普通 有机化 合物, 可根据 
需要 而加以 选择。 

如消 化性蛋 白酶在 甘油液 中十分 稳定, 浓 酶液加 等体积 甘油于 一 下可较 长期地 
保存, 但稀释 时活性 会下降 [ iD'" ] 。 二甲 基亚砜 也是蛋 白类物 质低温 保存的 常用保 护剂。 
在某些 情况下 ,加 人有机 溶剂使 酶处于 稳定的 非极性 环境, 对酶也 呈现稳 '定 作用。 如小田 
假单孢 菌的间 苯二酚 酶在含 10% 丙酮的 50mA/ 碑酸 缓冲液 (pH7.5) 中 稳定, 假单孢 
菌 属的苯 甲醇脱 氢酶用 20% 丙酮 或乙醇 几乎能 保存全 部活性 [ 12 ] . 

许 多蛋白 质可用 糖类来 保存。 如酵母 转化酶 的活性 与糖类 有关, 用皇 土除去 多糖后 
稳 定性即 下降。 血装 r- 球蛋 白也可 用糖类 (甘 油也 可以) 来 稳定, 但不为 脂肪酸 稳定" D ] 。 
用蛋 白质保 存蛋白 质也是 一种常 见保存 方法, 如溶菌 酶用白 蛋白、 鱼精 蛋白、 聚赖 氨酸, 木 
瓜蛋白 酶用骨 胶元的 部分水 解产物 来保护 [ iD'" ] 。 一 些蛋白 质也用 脂肪酸 保存, 如 结晶的 
人或 牛血清 蛋白需 要少量 脂肪酸 保护, 除去后 变得不 稳定。 

(2) 中 性盐: 相当部 份的蛋 白质要 求高离 子强度 (1-4M 或饱和 盐液) 的极性 环境才 
能 保持其 活性, 加人 中性盐 可稳定 这类蛋 白质。 例如胰 蛋白酶 在饱和 MgSO, 中 冰箱放 
置可 较长期 保存。 木瓜蛋 白酶悬 浮在浓 NaCl 中, 4°C 下可保 持许多 个月不 失活。 蛋白 
质用 硫酸铵 沉淀或 用硫酸 按反透 析浓缩 成糊状 (硫酸 铵糊) 是一 种很好 的保存 方法, 用前 
再 透析或 用分子 筛脱盐 B' 4 '" 】 。 

(3) 巯基 试剂: 一 些蛋白 质表面 或内部 含有半 胱氨酸 琉基, 易 被空气 中的氧 缓慢氧 
化为 次磺酸 或二硫 化物, 使蛋 白质的 电荷或 (和) 形状发 生改变 而失活 。保存 时可加 人琉基 
试 剂半胱 氨酸、 2- 琉基 乙醇、 二琉基 苏糖醇 、二琉 基赤藓 糖醇等 (浓度 10-4—5 XI (r 3 M), 
保护蛋 白质处 于还原 状态, 然后 在隔绝 空气下 (甚 至真 空或惰 气中) 密闭 保存。 

琉 基酶除 氧化外 还常与 重金属 (如 Fe、 Mn、 Cu 等) 结合而 失活, 这时加 入微量 
EDTA、 Na,S 等可以 解除。 在保存 中应注 意容器 、试剂 和水的 质量, 尽可能 避免重 金属污 
染。 

(4) 酶反应 因子: 某些 酶可为 底物、 辅酶、 竞争性 抑制剂 、活化 离子、 反 应产物 等所稳 
定。 例如酵 母己糖 激酷、 顺乌头 酸酶、 N- 甲基 谷氨酸 合成酶 等只有 分别与 底物葡 萄糖、 柠 
檬酸、 L- 谷氨酸 共存; D- 磯酸 甘油醋 脱氢酶 (兔肌 ) 只有与 其辅酶 NAD 共 存才能 稳定。 
一旦 这些底 物或辅 酶被除 去或不 存在, 酶 的稳定 性大大 下降。 又如淀 粉对淀 粉酶有 稳定作 
用, 故往 往将醸 吸附在 淀粉上 保存。 D- 氨 基酸氧 化酶与 其底物 D- 氨基酸 的竞争 性抑制 
剂 安息香 酸钠或 其辅醸 FAD 结 合时, 抗热变 性的能 力大增 [12 〕 。 有人 认为, 底物、 辅酶、 抑 

• 274 . 



制剂 促使酶 稳定的 可能原 因是降 低了活 性中心 的能量 水平, 使 酶趋于 稳定。 

添加 活化无 机离子 也能增 加某些 酶的稳 定性。 例如 当动物 和微生 物淀粉 酶存在 

Ca++, 溶 菌酶和 精氨酸 酶存在 Mn++ 及透 明质酸 酶存在 C1- 或 Br_ 时, 稳定性 可大大 
增强 [12'1 5〕 。 青 霉属的 核糖核 酸酶和 脱氧; i 糖核 酸酶 当存在 1 X 10'-1 X lO-iM 的 
时, 耐热性 则大大 提高" 6] 。 因此, 某^ 含金 属离子 的纯酶 (如淀 粉酶、 蛋白酶 、脂 肪酶) 变 
成 另一特 定活化 金属离 子的结 晶时, 即能大 大提高 酶活, 并增 加酶稳 定性。 如结晶 Ca 式 
淀粉 酶和胃 蛋白酶 的酶活 力甚至 比一般 结晶酶 活力高 2.8—3.6 倍" 7] 。 

但是, 同一类 保护剂 对一种 蛋白质 或一种 保护剂 对同一 类蛋白 质的保 护作用 往往相 
差 很大。 例如 5'- AMP 能 激活确 酸化酶 a 并对 热失活 有保护 作用, 而 3'-AMP 则对 酶无激 
活 作用且 能加速 酶失活 1" 】 。 0.2MKC1 可使 KB 细胞 DNA 聚合酶 Ni 稳 定并使 活性增 
加 13%, 而对 KB 细胞的 DNA 聚合酶 C 却有 抑制 作用, 使酶活 下降到 11%"", 使用时 
不能 大意。 
(二) 固 态保存 

1. 制 成干粉 或结晶 固态 蛋白质 比液态 稳定。 一 般蛋白 质含水 量超过 10% 时, 无 
论在室 温或低 温均容 易失活 ;含 水量若 降低至 5f。 时, 在室温 或冰箱 中均比 较稳定 ,但在 
37<^ 活性 则明显 下降。 低 含水量 对微生 物和化 学活性 不利, 一般 认为, 微 生物活 性在含 
水量 10% 以下、 化学 活性在 3fe 以下即 被抑制 [ 2"。 

长期保 存蛋白 质的最 好办法 是把它 们制成 结晶或 干粉。 干粉 的制备 有很多 方法, 冰 
冻干 燥是酶 保存普 遍采用 的方法 之一。 由于冰 冻干燥 蛋白质 分子内 脱水比 冻融更 完全, 为 
了防 止冻干 过程中 蛋白质 的部分 变性, 除 干燥时 间须迅 速外, 有时可 选择加 入某些 稳定剂 
或 缓冲剂 (如挥 发性的 碳酸盐 和醋酸 盐缓冲 液)。 所用稳 定剂与 前述冻 结保存 相同, 最低 
有效 浓度为 0.03M 即可 达保存 大部分 活性的 目的。 冻 干失活 也与温 度和离 子强度 有关。 
如 谷氨酸 脱氢酶 对冻融 稳定, 但冻干 也引起 失活。 离子 强度为 0.1 时, 一 30°C 、一 80°C、 
-196^ 冻干 使此醸 活性由 100/。 下降为 51%、 42f。 和 38fc; 离子 强度为 0.01 时, 活性 
又分 别降为 45%、 42% 和 30% [ " 〕 。 

结晶和 冻干品 均具有 增强抗 热性、 稳定 蛋白质 的良好 效果, 而且易 于保存 ,便于 运输。 
多数固 态蛋白 质和酶 在盛有 干燥剂 的干燥 器中, 低温下 (0 — 4°C 或 更低) 可 相当长 期地保 
存。 如 干态葡 萄糖氧 化酶在 ()°C 下可保 存二年 ,一15°C 下 可保存 八年。 有 些甚至 在室温 
下也能 保存数 月或经 年之久 [ 11 ] 。 

2. 制成水 不溶酶 除物 理吸附 法制成 的不溶 酶热稳 定性下 降外, 在多数 情况下 ,酶 
经固定 化后, 其对 酸碱、 蛋白酶 、温度 等稳定 性普遍 提高, 并 更易于 保存。 如氨基 酸酰化 
酶用 离子结 合法与 DEAE-Sephadex 制成不 溶酶后 ,经在 70^ 加热 15 分钟进 行比较 ,天然 
m 与 DEAE-Sephadex- 酶的残 留酶活 分别为 10% 和 80%。 上述酶 在一定 条件下 用胰蛋 
白酷处 理后, 残 留酶活 分别为 23% 和 87% 【22] 。 不溶 酶的耐 热性及 抗蛋白 酶能力 均比天 
然酶 大大提 高了。 因此, 酶 和载体 结合普 遍增加 酶的保 存期。 如脲驗 4°C 保存 15 天失活 
60%, 二个 月失活 80%, 而固定 化脲酶 4°C 保存 50 — 80 天 不失活 [23 ] 。 乳酸 脱氢酶 

30 天全 失活, 而 用载体 交联法 (多 孔玻 璃加戊 二醛) 固 定的不 溶酶则 仍保留 1Q0% 活 
性 [ 22 ] 。固 定的 3- 核糖核 酸酶低 温冰箱 保存一 年活性 仍无明 显变化 【 " ] 。 

3. 制成酶 衍生物 这 也能提 高某些 酶的稳 定性。 如淀 粉酶可 制成氯 化烧二 甲基苯 

• 275 . 



胺或聚 碳酸^ 化 物的衍 生物, 细菌蛋 白酶、 核糖核 酸酷、 葡萄 糖氧化 酷和酰 化醒等 都可用 
某种 高分子 化合物 作成衍 生物。 天 然酶经 上述处 理后, 耐热性 均得到 提高。 如木 瓜蛋白 
酶经制 成结晶 汞衍生 物后, 稳定性 增加, 可数 月保持 不失活 [ 11 】 。 

总的 来说, 蛋白 的保存 主要还 是从稳 定构型 、保 护活性 中心、 避免辅 助因子 丧失等 
方面 考虑, 以防止 变性、 解聚或 降解。 由 于温度 和水份 对蛋白 质结构 的稳定 性影响 最大, 
故 蛋白质 最好是 低温、 冰冻或 冰冻干 燥后低 温干燥 保存。 一 些酶的 保存方 法和稳 定性见 

表 10-1。 

二、 核酸 的保存 

核酸保 存的条 件与蛋 白质和 酶大致 相同, 凡影响 核酸变 性和降 解的因 素在样 品保存 
中均应 避免。 一般保 存方法 如下: 

1. 浓盐液 由 于水、 稀电解 质都可 以断裂 核酸的 氢键, 破坏其 双螺旋 结构, 使核酸 
变性。 因此, 保存核 酸时, 必须注 意水的 影响, 防 止稀释 变性。 一 般保存 可用浓 盐液、 

NaCl- 柠檬酸 缓冲液 (pH7) 或 0.1 M 醋酸缓 冲液。 DNA 的液态 保存, 所 用盐浓 度常为 
1M 或 0.01 — IMNaCl, 浓度不 应低于 10— 3 — 10— -"。 用 盐溶液 保存核 酸时, 须配 合低温 
(0^ 以上) 及加 防腐剂 (氯 仿或 lmMNaN3)、 核酸酶 抑制剂 等措施 ^。 如 DNA 可在 0.15 
MNaCl 和 G.015M 柠 檬酸钠 溶液中 (1 毫克 / 毫升 ), 加 几滴氯 仿后于 4°C 保存, 几 个月仍 
稳 定不变 [2 6 1。 低 分子量 RNA (如 tRNA) 可干态 保存, 但高 分子量 RNA 应在含 .2^。 
NaAc 的 -Mo 乙醇中 4°C 下以浆 状保存 [25 〕 。 液态质 粒可加 甘油后 r: 存在 一 10°C, 也可 
在 lOmM Tris-HCl(pH7.8)、 lOmMNaCU ImM EDTA-Na; 溶 液中于 4°C 下保存 [27】。 

2. 稳定 pH 核酸溶 液的保 存也受 pH 的影响 ,过酸 过碱均 会导致 碱基上 形成氧 
键 基团的 解离, 使 氢键稳 定性下 降以至 断裂。 对 DNA 来说, 分 子上的 碱基在 pH4_ll 
范围较 稳定, 超出 此范围 DNA 易 变性或 降解。 低温、 酸性 或稀碱 下保存 DNA 及低温 
酸性 下保存 RNA 均较 稳定。 

3. 低温 核酸变 性温度 一般为 70 — 85°C,DNA 的 变性温 度还与 GC 含量 有关, 
GC 含量 愈大, 变 性温度 愈高。 通 常固态 核酸在 0°C 以上低 温下干 燥保存 即可。 小分子 
核酸保 存温度 还可更 低些, 如固态 tRNA 可在一 10°C 下保存 [ 2 8 J。 液 态核酸 室温下 容易变 
性, 短期最 好低温 (4°C) 保存, 但不宜 冻结, 否 则将破 坏大分 子结构 [25 ] 。 也有报 道牛肝 
RNA 溶于 50mM NaCl 后一 35 力低 温冰冻 保存, 二个 月内不 变性或 降解, 但应避 免重复 
冻融 [ 2 9] 。 电 解质的 存在对 核酸冰 冻有一 定保护 作用。 如将含 0.15MNaCl 和 0.015M 柠檬 
酸钠的 DNA 在一 70°C 快速 冷冻, 后于一 20°C 保存, 可长达 一年之 久不变 [ 2 6] 。 

核酸 的保存 也与使 用目的 有关, 用于 制备单 核苷酸 和用于 结构、 功能 研究的 样品, 所 
要求的 保存条 件各不 相同。 

三、 油脂 的保存 

脂肪 和油保 存不当 会发生 酸败, 酸败是 由水解 和氧化 作用所 引起。 酸 败的油 脂比重 
减小、 碘值 降低、 酸值 增高, 可 作为油 脂保存 中质量 检查的 指标。 根 据油脂 酸败时 化学变 

• 276 • 



化的 特点, 可 把酸败 分为两 大类, 其特点 及保存 方法如 下 [ 3°'31 ] : 

1. 水 解酸畋 水解酸 败是由 于油脂 杂有脂 肪酶, 在 水及其 它适宜 条件下 (如 25 — 
35°C、pH4.5 — 5), 催 化油脂 的不饱 和双键 水解, 产生 游离脂 肪酸。 含水油 脂容易 长霉菌 
和酵 母菌, 产生脂 肪隨和 脂肪氧 化酶, 因此 即使在 o°c 以下 保存, 也会 发生酶 水解。 所以, 
长期保 存油脂 的关键 是除去 水分, 在无水 状态下 保存。 通常把 油脂加 热灭菌 处理, 即可达 
破坏 脂肪酶 和除去 水分的 目的。 

2. 氧 化酸败 氧化酸 败比水 解酸败 更常见 ,在油 脂保存 上也更 重要。 油脂 一般都 
含有不 饱和脂 肪酸, 不饱 和程度 愈高, 也即 含双键 愈多, 愈易 发生氧 化酸败 (如 亚油酸 )。 
某 些金属 (如 Co、 Mn、 Cu、 Fe 等)、 光、 水 和热等 都能加 速油脂 的氧化 变质, 使不饱 和双键 

加氧生 成过氧 化物, 后 者进一 步聚合 或分解 为具有 特殊臭 味和味 道的低 分子游 离酸、 

酮等, 可借 感官来 判断。 

由于油 脂氧化 酸败是 由多因 素引起 ,长 期保存 必须消 除不利 因素的 影响。 因此, 油脂 
—般都 应避光 、低温 、密闭 保存, 尽 量充满 容器, 除尽 水分和 灭菌。 必要时 也可加 入抗氧 
剂, 阻 止或延 缓氧化 进行。 粗 制油脂 一般含 有天然 抗氧剂 (如 维生素 E 、棉 酚、 芝麻 紛或麦 
胚 等) 但精制 后含量 降低, 故精 制油脂 (尤其 是油) 较不 稳定, 容 易氧化 酸败。 因此, 精制 
油必 须加入 抗氧剂 (如邻 苯二酷 ), 但非 天然抗 氧剂多 为侵蚀 性物质 (紛、 胺等 ), 较 理想的 
抗氧 剂目前 还很难 找到。 常用的 抗氧剂 有五倍 子酸的 酯类、 二 丁基甲 、维 生素 E 等, 也 
可加 增效剂 (如脑 磯脂、 维生素 C 及其 酯类) 增 强抗氧 效果。 抗 氧剂、 增效 剂的选 择标准 
是: (1) 能较 长期抗 酸败; (2) 能溶解 油脂; (3) 无不良 气味和 味道; (4) 无 毒性。 

此外, 某些含 不饱和 双键的 固醇类 (如麦 角固醇 )、 磯脂类 (如卵 磷脂) 也容易 氧化变 
质。 如 麦角固 醇经一 系列光 化反应 可变为 维生素 D2, 后者 继续氧 化为无 活性或 有毒的 
化 合物。 所以这 类物质 也要避 光低温 下密闭 保存。 

高级不 饱和脂 肪酸、 油 脂或碗 脂类也 可根据 需要固 化后在 P2O5 中 保存, 或用 低极性 
溶剂溶 解为高 浓溶液 ,后 者在避 光低温 (一 2()°C) 下 ,密 闭保存 1 一 2 年不分 解 [ 321。 . 

四、 细 胞及生 物制剂 的保存 

动植 物培养 (或 分离) 细胞、 以 至器官 和组织 都可加 人低温 保护剂 (常用 5 — 10% 甘 
油和 二甲基 亚砜) 后, 于低温 冰冻下 保存。 保存 细胞的 存活率 与冰冻 方法、 保存温 度和时 
间、 融化 温度、 保 护剂、 细胞的 种属和 性状等 有关。 不 同细胞 对保存 条件的 要求往 往相差 
很大。 植 物培养 细胞保 存的主 要环节 如下: 预 培养— 加等体 积低温 保护剂 混句— 冰冻 
(慢 冻, 1 一 51/ 分; 预冻, 一 20 —一 70°C; 快冻, 直接浸 入液氮 )— _40 —一 100°C— 在营养 
条 件下低 温保存 (一 100 —一 196t)— 迅 速解冻 (34 — 40°C)— 再 培养。 动 物细胞 的冰冻 
保 存大致 相同, 但动物 细胞与 植物细 胞的保 存期和 存活率 各有差 别 [ "一" 1。 

病毒 和噬菌 体常在 lOmM Tris- HCl(pH7.6)、 10mMNaCl、 ImM EDTA-Naa 溶液中 
4^ 下保存 [ " ] 。 纯化病 毒悬浮 液也可 加少量 防腐剂 (NaN3、 甲苯、 氯 仿等) 或等体 积甘油 
保存于 一 4°c 低 温中。 冻干保 存时, 一 般加入 5 — 10% 蛋白胨 和葡萄 糖作稳 定剂, 以防 
冰冻时 丧失感 染活性 【3 "。 

生 物制剂 (如 菌苗、 疫苗、 类毒素 、抗毒 素等) 的稳定 性差别 较大, 需根据 不同情 况选择 

• 277 • 



表 一些餘 保存的 条件和 稳定性 一'' 1 





名 称 


保 存条件 


稳定性 




睦架 f^5^ 


(1) 液态 pH3 冰 箱保存 (加 CaW 保护 
更好 );(2) 固态 5"C 保存 


(1) 数 周内不 失活。 如 PH2.3 — 3 室温下 

易 自溶; (2) 可稳 定几个 月不变 




胃 蛋白薛 


冻干品 4 。C 干燥 下保存 


失活 




淀粉酷 


(1) 干粉 一 20。c 保存; (2)«- 淀粉薛 结晶在 
NaCl-CaCl, 或 2 — 3A/ 硫 酸按中 4°C 冰 箱保存 


活加 Ca+^• 和调 PH4.8— 10.6, 可增 加稳定 

性、 冻干易 失活。 




糜 蛋白酷 


(1) 干粉 4°C 保存; (2) 酷液 pH2 — 6,37。c 
保存; (3) 酶液 pH3 冰 箱保存 


(1) 一至 几年内 稳定; (2)4 小 吋失活 20%; 
(3) 几天 内稳定 




脱氧 核糖核 
酸薛 I 


冻干品 5 °c 下保存 


2 — 5 年 内稳定 




RNA 醒 A 


干粉 4°C 下干 燥保存 


最稳定 




脲 IS 


(1) 在 50% 甘油中 2°C 下 保存; (2) 干粉 

rc 保存 


(1) 可 稳定几 个月; (2) 可稳定 一年 




接肽隨 Y 


(1) 在 饱和硫 酸铵中 一 2(rc 下 保存; (2) 酸 
液 (1%, pH7) 在 一 2(rc 冰 冻保存 


(1) 可长期 保存; (2) 二 年内不 失活, 但稀释 
至 O.lmg/ml 则迅速 失活, 反 复冻融 引起失 
活。 其水液 25\:pH5.5 — 8.0 下 8 小吋 内稳定 




羧肽藤 A 


飽结晶 水溶液 4°C 保存 


较稳定 


水 


接肤 SIB 


a^^SMi^f ifc-T^ Bt/ nVjJ S Trie Zfit >rfl 

中) 一 10°C 冰 冻保存 


一年 内稳定 


解 


氨肽飽 (胞装 ) 


f 1 ^ 平大 f) —— 4。r" Z?-?*? .,7、 县 -M? 不 K?^ 

、丄夕 IjEn u t L. l^fi 仔八 Z 人 子丁 iM tPjJ 

酸铵中 (含 0.1 'V/pH8 Tris— HCl 和 5mA/ 
MgCl04-G 保存 


(1) 可 稳定几 个月; (2) 可保存 4 个月。 其 
水液 pH7 — 9 最 稳定, 可保存 2 天 


m 


脂肪 SI 


(1) 歸 液在巴 比妥缓 冲液和 牛胆酸 纳液中 
(pH3-7)4-C 保存; (2) 干粉一 2U C 保存 


(1) 可 保存一 个月; (2) 可保 存二年 




弹性 蛋白酷 


干品 S^C 下保存 (一 10°C 更好) 


可保存 6— 12 个月。 液态 pH4-10.5 于 
2°C 下较 稳定, pH<6 稳 定性有 所增加 




果胶酶 


干粉 4°C 保存 


可保存 半年。 其溶液 5(rc 稳定, 62°C30' 全 

失活 




木瓜 蛋白酷 


(1) 干粉 4°C 保存; (2) 悬 浮于浓 NaCl 中 

4°C 保存 


(1) 可稳定 6 个月; (2) 可保 存许多 个月。 




—葡: ^據 
苷齒 


K^J /<%卞 。口〕 L 休仔八 愁/ 條 毀孩甲 
5°C 保存 


(1) 1—2 年内 稳定; (2) 6 个月 失活约 10% 




P WJ^W 

酸 SI 


、U 你卞 n 口 1 L 沐仔八 你卞 B 口 "^U C 保 

存 


(1) 可保存 半年; (2) 可保存 2 年以上 






(1) 冻干品 保存; (2)15 液 4=C 保存 


(1) 可稳 定一年 以上; (2) 可稳定 2 周。 稀 
«»y/& pTfm ~lof„ ? it/ 5<% EpI+i^fAKf Bp 2% 

(fx J y/JU U • 厶 /o \i . J JO pHj IJ/. IPJ/LX-ivCj 

明胶 保护。 用 PH6 的缓冲 液可增 加稳定 性《> 




溶菌酸 


(1) 干粉 4°C 保存 


一年 以上不 失活。 SI 液酸性 条件下 (pH4 — 

5) 最稳定 




氨 基銑化 SI 


干粉 一 2(rc 保存 


可保存 二年。 酷 液中性 pH、 70°C 可放 1 
小吋, pH<5 立 即失活 




|8- 半乳糖 

苷飽 


4°C 保存 


4 一 6 个月 内稳定 



. 278 . 



续 表 





名 称 


保 存 


条 件 


稳定性 


水 

解 


精氨. 酸 K - 


(1) 干粉 41 保存; (2) 飽液 于中性 pH、 rc 

F 保存 


(1) 可稳定 半年; (2) 很稳定 


纤 维素翁 


干粉 4 保存 


可保存 一年。 薛液 PH4 — 6 最稳定 


减性 磯酸醋 H 


(1) 粗 痴 冻干品 一 20°C 保存; (2) 纯 醒干粉 
— 2(PC 保存 


(1) 能保存 二年; (2) 可保存 半年。 最适稳 
定 PH9-10 (^肠 ), 血中 滅性碟 酸酷酶 25^: 
校稳定 


接性 磯酸酯 SI 


冻干品 一 2(rc 保存 


可保存 二年。 酷液在 pH<6.5 或 酷液加 

入 柠樣, 和醋酸 ,降低 pH 可增 加稳定 


gl 酸 二酷齒 I 


干粉 存 


6 个 月失活 15%。 醒液 pH<5、pH〉10 不 
稳定, 冻干 会失活 


m 


瞎苷 酸脱氨 SI 


在 lAf KCl-lmA/2 琉基乙 醇中冰 箱保存 


20 — 25 天 内稳定 


激狀 释放驗 


(1) 干粉 一 2(PC 或 一 50°C 保存; (2) 纯飽 
在 pH8 缓冲 液中冰 冻保存 


(1) 几个 月内不 失活; (2) 相 当长吋 间不失 

活 












乙醜胆 滅酷晦 


(1) 干粉 4 :C 保存; (2) 薛液在 50mA/、 
pH7.2 碟酸缓 冲液中 4'C 保存 


(1) 半年不 失活, (2) 可稳 定数天 


早 IT 困 
水解歸 


干粉 保存 


一 年内不 失活。 薛液 pH6 — 10 最稳定 




乳酸 脱氢飽 

TTj i=lX. Il/Li F#y> 


(1) 浓 SS 液 3 — 15。C 下 保存; (2) 结晶 于 
0.5 饱和度 硫酸铵 中低温 保存; (3) 对 0.1W 
pH7 jg^&i 缓冲 液透析 后冰冻 保存; (4) 薛结晶 
在 3.2M, pH7 硫 酸按中 •TG 保存 


(1) 可 稳定几 个月。 高度稀 释极不 稳定; (3) 

一小日 任" h:X2£p. f4^ ^tS^rf 1 — n ££ 
一 1 jtca la JJ^ji. J 、iy BJ.tS 疋 i >lj 千 o 

纯 SI 水液 不稳定 


L- 氣 基酸氧 


(1) 干粉 4 c; 保存; (2) 结晶薛 悬浮于 


(1) 几个月 内活力 不变; (2) 可保 存一年 




化薛 


pH6 硫 酸按中 4 C 保存 


D- 氨 基酸氧 

化 SI 


(1) 固态 4=G 保存; (2) 在 1.8A/ 硫 酸按中 
PH6.25 下 4°C 保存 


(1) 12 个月内 稳定; (2) 几 个月内 稳定, 但 

Ml^f^Mi^r^^im-^ 1 >:10"*A/ FAD pTrifeB^ 
itp 勿穴 Itij y >u (3 丄 A 1 u iyi 1 八!^ liFKr^ 








氧 
化 
还 
原 


过 氧化氢 


(1) 5"C 保存; (2) 干粉 4°C 避光干 燥保存 


(1) 所 有制剂 6 — 12 个月均 稳定, 但冰; 东或 
冻干会 失活; (2) —年内 稳定。 液态 pH7 较稳 


过氧 化物飽 


干粉 "TC 避光干 燥保存 


一年内 稳定。 液态 pH<3.5、 pH>12 不 
稳定 


醇脱 SSI 


冻 干品 一 2(rc 保存 




可稳定 一年。 干品加 塘, 液 态藤加 0.1% 




牛 ifi 清 白蛋白 可增加 定性 


异 柠檬酸 

脱氢 


在 50% 甘油中 4°C 下保存 


可稳定 几个月 










6 -碟 酸葡萄 
糖脱氢 海 


(1) 冻干品 4 'C 保存; (2) 酸结晶 悬浮于 
3.2AI 硫酸按 (pH6) 中 保存 


(1) 3—6 个月内 稳定; (2) 几个月 内稳定 


苹果 酸脱氢 £ 嘀 


(1) 冻干品 保存; (2)11 结晶 悬浮于 70% 
饱和硫 酸按中 51 保存 


(1) 一 年内不 失活; (2) 二年不 失活。 稀溶 

液加 白蛋白 可增加 稳定性 


a- 轻 丁酸脱 
氢齒 


(1) 纯薛液 保存; (2) 藤液冰 冻保存 


(1) 保存过 夜失活 10% 左右; C2)6 个月活 

力不卑 


葡萄 糖氧化 P 


(1) 冻干品 4°C 保存; (2) 醒液调 pH4_6.5 
'并 加葡 萄糖后 "TC 保存 


(1) 半年至 一年内 稳定; (2) 飽液 pH>8 温 

度大于 5(rc 不 稳定。 加葡萄 糖有保 护作用 


尿酸齒 


干品 一 20°C 干 燥保存 


可至 少稳定 二年。 液态 pH6.5—10.5 较 

稳定 



. 279 . 



续 表 





名 称 


保 存 


条 件 


稳定性 


氧 
化 
还 
原 


胺 氧化酶 


冻干品 一 20°C 保存 


较 稳定。 液态 pH7.2—7.6 最稳定 


黄@吟 氧化酶 


冻干品 保存 


6 个月基 本稳定 • 


单胺 氧化酸 
(牛肝 ) 


在 0.5—1.0% Triton X-100 中 4°C 保存 


3 — 4 天 内稳定 


山梨糖 脱氢歸 


. 冻干品 保存 


相 当稳定 




脱氢酶 


悬浮在 2.5JW 硫 酸铵中 — 4°C 保存 


可稳定 半年。 酶液在 PH<6 不稳定 


转 
换 
m 


銑化酶 I 


干品 5°C 密 闭保存 




― A 日&十 工口 2"7or"hn«WL7qp"H6" 
1 /j Ta yj^3k.o 口口 l JJUm ^ TCBXi 

液态 pH7 在 碟酸缓 冲液中 6(rc 加热 1 小吋 

活力 不变, 但 PH5 以下 易失活 


肌 酸激酷 


冻干品 4°C 或一 20°C 保存。 


下 6—12 个 月活力 不变。 一 20°C 可保 
存一年 。其液 PH7 — 9 最稳定 


丙酮 酸激酸 


冻干品 4°C 保存; 悬浮于 3M 硫 酸铵中 4°C 
保存 


至 少可保 存一年 


谷 丙转氨 SI 


(1) 干粉一 2(rc 保存, (2) 结 晶酶在 
硫 酸按中 (pH6)4=x: 保存 


(1) 可稳定 2 年, (2) 可稳定 3—6 个月 


谷草 转氨酶 


(1) 冻干品 4°C 保存, (2) 在 3.2A/ 硫 酸续中 
(pH6)4t: 保存 


(1) 6— 12 个月 内稳定 (2) 可稳定 几个月 


己 糖激醒 


0) 冻干品 保存; (2) 悬浮于 硫酸 
铵 液中或 50% 甘油中 — 4t] 保存 


(1) 可保存 一年, (2) 可保 存一年 




酸缩醒 


悬浮在 3.2A/ 硫 酸铁中 (pH7.6)4°C 保存 


6 个月内 稳定。 pH<4.5 醒不可 逆变性 


碳 酸軒臨 


(1) 干粉一 2(PC 保存; (2) 浓酸液 (pH5— 

10)5°C 保存 


(1) 至少 可稳定 二年; (2) 可保 存一年 


柠檬酸 合成酷 


干粉 4°C 保存 




酶液 PH5.5 — 10.0 较稳定 ,离子 强度为 
0.2 时很稳^^ 




T4 DNA 聚 

合藤 


纯 醒液中 (0.86mg/ml) 含有 200mA/ 碑 
酸钾 缓冲液 (pH6.5)、 lOniA/2- 琉基 乙醇, 
50% 甘油, 保存在 — 20°C 


10 个 月内活 力不变 


RNA 

或 
DNA 

聚 
合 
雜 


小 牛胸腺 

DNA 
聚"^ 酷 a 


纯醒在 50mA/ 磷酸钟 缓冲液 (pH7.0)、 
IniM 2- 巯基 乙醇、 50% 甘 油中, 保存在 
-20°C 




大 肠杆菌 






DNA 

jlg-A-Sa I 

yi<. 口 fPS- * 


同 上 




RNA 聚合酶 


在 琉基 乙醇、 10 mMMgCl2、 100 
mA/KCl, 0. 1mA/ KDTA、 50% 甘油、 lOmM 
Tris-HCI (pH7.9) 中 安瓿充 后于一 2(rc 

保存 


2—3 个 flrSfiT^^ 


哺乳动 物细胞 

低分子 14 
DNA ^-A-iS 


在 20 mM Tris-HCl(pH8)、 200mA/ NaCl、 
ImM 巯基 乙醇、 O.lmjV/ EDTA、 50% 甘油 


6 个 月内维 持稳定 




中 一 20°C 保存 




RNA 

或 
DNA 

修 
饰 


ECoRl 限制 

性 内切酶 


海 液分装 于安瓿 4°C 或 一 20°C 保存 


— 20=C 可 保存一 年以上 


限制性 内切醜 


50% 甘油中 一 2(rc 保存 


长 期保存 不失活 


噬菌体 
'1,RNA 


纯飽在 液氣或 一 20°C 保存 


不 怕冻, 液氣 中至少 6 个月内 稳定。 含较多 

蛋白 质的不 纯制剂 在液露 中至少 一年半 内稳定 




连接 ^ 





• 280 . 



续 表 





名 称 


保 存条件 


稳定性 




噬菌体 
T"1DNA 

连接酶 


(1) 在 50% 甘油中 一 15 c 保存; (2) 在 
10mA/ 碟酸钾 缓冲液 (pH7.6)、lmM 二硫苏 
糖醇、 50inAyKCl、 50% 甘油中 一 2(rc 保存 
在湿 冰内; (3) 在 10mA/ Tris-HCl(pH7.6)、 
lOmM 0- 巯基 乙酵、 50% 甘 油中一 5 C 保存。 


(1) 6 个 月内活 力损失 不大于 10%; (2) 
4 个 月内不 失活。 




细 菌滅性 
酸醋 SS 


在 lOmM Tris-HCl (pHS.O)、 120mA/ 
NaCU 50% 甘油中 —20ec 保存, 浸于 湿冰中 


对热 较稳定 


RNA 


核酸薛 


在 20miVf Tris-HCl (pH7.5)、 50mAf 
NaCK O.lmM ZnCI,, 50% 甘'; ^中— 20。C 
保存, 浸于 湿冰中 


数月内 仍稳定 


或 
DNA 
修 
饰 


超螺旋 DNA 

松环 SI 


在 lOmM Tris-HCl (; pH7.8)、 ImM 
MgCl,、 5mAf /3- 琉基乙 fe、 50% 甘油中 

一 2(rc 保存, 浸于湿 冰中。 




酶 


核 酸外切 

薛 III 


在 66 mAf KCU 25mA/ Tris-HCl (pH8)、 
ImAf 二硫苏 糖醇、 50% 甘油中 —20°C 保存, 浸 

于 湿冰中 






T4 聚核苷 
酸激齒 


在 50mAf Tris-HCl (pH7.6)、 30mAf KCU 
5mM 二硫苏 糖醇、 5mA/ MgClj, O.l^M 
ATP, 50% 甘 油甲一 20 'C 保存, 浸于 湿冰甲 






基质 结合的 
细菌 喊性磯 
酸薛 


在 lOmAf Tris-HCl (pH8)、 0.02% NaN, 
中 保存 






末端 脱氧核 
苷 酸转换 海 


在 50mAf 碟酸钾 缓冲液 (pH7.2)、 500 
mMNaCU IniM |8- 琉基 乙醇、 50% 甘油中 
一 2(rc 保存, 浸于湿 冰中。 






烟草酸 性焦碟 
酸齒 (TAP) 


在 lOmM Tris-HCl (pH7.5)、 120mM 
NaCU 10 mAf |8- 琉基 乙醇、 . 01% Triton 
X- 100、 50% 甘油中 一 20」C 保存, 浸于 湿冰中 





保存 方法。 菌苗、 疫苗或 抗原、 抗体类 可直接 冻干。 有 些制剂 需加人 稳定剂 (如 蔗糖、 明 

胶) 或杀 菌剂, 然 后冷冻 (2 — 10°C 或 更低) 保存。 如抗血 清加硫 柳求或 NaNs 分别达 
0.01% 和 0.1 ,在 无菌安 瓿分装 后冰冻 保存, 则可维 持二年 以上不 变 [3 8】。 

五、 小 分子生 化物质 的保存 

1. 辅酶 生化 中的辅 酶约有 10 多种, 多数都 对环境 敏感, 故 辅酶类 样品应 做成干 
粉, 在阴凉 处或冰 箱内密 闭避光 保存。 有些 辅酶如 ATP 也 可加入 稳定剂 L- 精氨 酸后进 
行 冻干, 保存期 可大大 延长。 液态保 存时, 对酸碱 敏感的 FMN、 FAD、 ATP、 NAD 等 
应调节 到稳定 pH 范围。 例如 ATP、 CoA、 NAD、 NADP 在碱 性下易 分解, 应在中 、酸 
性 条件下 保存; NADH2、 NADPH, 对酸不 稳定, 保存 pH 应大于 7.5[3V"»j。 

2. 维生素 固态下 维生素 一般很 稳定, 在干 燥器内 可长时 保存, 如 维生素 C 密 
闭 保存数 年也无 影响。 但液态 时受环 境因素 的影响 ,稳定 性大为 下降。 对光、 02 敏感, 需 
要密 闭避光 的有: 维生素 A、 Bi、 B2、 B6、 Bi2、 C、 D2、 E、 K、 叶酸和 类胡萝 卜素等 ,其 
中 维生素 C、 A、 D, 等 还对热 敏感, 液 态应低 温避光 保存。 还 有些维 生素对 pH 敏感 
(如 Bi、 B, 对碱 敏感, D2、 叶酸对 酸敏感 ), 应调 pH 保存。 易 分解的 维生素 (如 C、 

• 281 . 



D2、 D3) 常 以固态 保存。 

3. 抗菌素 [ 1— 3 1 青 霉素不 稳定, 固 态也应 4 力才 能稳定 保存, 液态更 易分解 失效。 
自然界 存在有 /种 青霉素 形式, 每 一种青 霉素之 间或其 盐的稳 定性都 不完全 相同。 结晶 
青霉素 盐对热 较稳定 ,但易 吸湿, 应密闭 保存。 而液态 青霉素 盐则易 分解, 应调 pH6""6 8 
后 保存。 

链霉素 受光、 空气影 响小, 但易 吸湿, 故 干品可 以室温 下密闭 保存, 一年 内效价 不变, 
数年内 也影响 不大。 液态链 霉素也 较稳定 ,加 入防腐 剂冰箱 保存可 数月不 失效。 

四环类 抗菌素 (金 霉素、 土 霉素、 四环素 及其衍 生物) 固态 下都较 稳定。 如 金霉素 
20°C 下 3 — 5 年内效 价不变 ,一般 密闭干 燥保存 即可。 液 态受环 境因素 影响, 稳定 性差异 
较大, 须结合 其性质 采取相 应保存 措施。 

4. 激素 激 素一般 对环境 较敏感 (尤其 在液态 下), 除 蛋白质 激素按 蛋白质 要求保 
存外, 其它 固醇类 激素需 在干燥 器内于 阴凉处 (或冰 箱内) 密 闭避光 保存。 液态保 存时, 应 
选择最 适稳定 条件。 例 如促肾 上腺皮 质激素 液态酸 性下较 稳定, 碱性下 则容易 失活。 胰 
岛素 水溶液 易受环 境因素 (PH、 温度、 离子 强度) 影响而 聚合成 解离, 故液 态应调 弱酸性 

或在中 性缓冲 液中冰 箱保存 [ 4°j。 

5. 其他 如核苷 、核 苷酸、 氨基酸 、糖类 等对环 境要求 不高, 固 态一般 只要室 温下密 
闭干燥 保存, 则可稳 定相当 长时间 不变。 保存中 要注意 防潮, 以免造 成霉坏 (如糖 类)。 有 
些物质 (如色 氨酸、 半胱 氨酸、 蛋氨酸 、肝 素等) 要 求避光 保存。 它们的 水溶液 稳定性 差异较 
大, 如核 昔酸酸 性下不 稳定, 易破坏 ,需在 中碱性 条件下 保存, 而嘧 P 定和 嘌呤 碱则对 酸碱均 
稳定, 应视 不同情 况具体 处置。 

参 考文献 

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[3] 张 紫洞: 药物贮 藏法, 人民 卫生出 版社, 第 42、 104、 119、 137 页 (1958) 

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[213 Hanafiisa, N., Freezing and drying of enzyme protein, in "Freeze-drying of biological materials". 
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• 282 • 



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[24] 中 国科学 院上海 生物化 学研究 所固相 酷组: 生物化 学与生 物物理 学报, 9(2), 187 (1977) 

[251 ParisH, J. H" Principles and practice of experiments with nucleic acids, pp. 106, Longman Group 

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[26] 蔡 妙英: 微生物 通报, 10(1), 24(1983) 

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[29] 蔡良 婉等: 生物化 学与生 物物理 学报, 4(5), 508 (1964) 

[30] 武汉 大学生 物系: 油 脂化学 及苗麻 油的综 合利用 (内部 交流教 材), 11 一 22 页 (1971) 

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[32] 阿南功 一等: 基础 生化学 实验法 (? ), 抽出、 分离、 精制, 丸善株 式会社 ,第 344 页 (1974) 

[33] Reinert, J. & Bajaj, Y. P. S., Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue, and Organ 

Culture, Springer-Verlag (1977) 
[34] G. D. 华斯 莱著, 何申 等译: 动物组 织培养 技术, 科学 出版社 (1982) 
[35] 罗 士韦, 唐惕: 细 胞生物 学杂志 5(1),1(19S3) 

[36] Withers, L. A. & Street, H. E., in "Plant Tissue Culture and Its Bio-technological Application", pp, 

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[37] Reynolds, J. F. & Murashige, T., Cel! culture, in "Methods in Enzymoiogy", Vol. 58, pp. 29, Eds. 

Jakoby, W. B, & Pastan, I. H., Academic Press, New York (1979) 
[38] 史 春森, 王 小风: 微生物 学通报 ,7(6), 277 (1980) 

[39] Guibault, G. G., Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, Marcel Dekkcr, New York and Basel 
(1976) 

[^0] 商业部 蛀器生 化制药 情报中 心站: 动物 生化制 药学, 人民 卫生出 版社, 125 — 187 页 (1981) 
[^1] 蒋传 类等: 工具醜 的活力 测定, 上 海科技 出版社 (1982) 



• 283 • 



附录一 各类 生化物 质制备 
及测 定的参 考资料 

根据 R. M. C. Dawson, Daphne C. Elliott, W. H. Elliott and K. M. Jones 等编的 "DATA 
for BIOCHEMICAL RESEARCH" (Second Edition, Oxford University press, 1969.) 译出, 
并 在内容 上作了 删减。 

溶解 度縮写 符号: 

V, S. Very soluble 
SI. S Slightly soluble 
Sp. S. Sparingly soluble 

i. insoluble , 

文献及 著作: 

J. A. C. S. Journal of the American chemical Society, 

P. S. E. B. M. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 

Ber. Chemise he Berichte (Prior to 1947 Berichte der deutschen Chemischen Gesf llschaft). 

C. A. Chemical Abstracts, 

Biochem. Preps. Biochemical preparations (Wiley & Sons Inc., N. Y.). 
J. B. C. Journal of Biological Chemistry, 
B. J. Bio c he mical journal. 

Arch. B. B. Archives of Biochemistry and Biophysics, 
Arch. B. Archives of Biochemistry, 

Z. P. C, HoppC'Seyler* s Zcitschrift fiir Physiologische Chemie. 
B. Z. Biochemiiche Zeitschrift, 

Meth. Enzymol. Methods of Enzymology, ed. S. P. Coiowick and N. O. Kaplan (Academic Press). 
Meth. Biochem. Anal. Methods of Biochemical Analysts, ed. D. Giick (Wilcy-Interscience Inc., N. Y.). 
Org. Synth. Coll. Collective Volumes of Organic Syntheses. 
J. C, S. Journal of the Chemical Society. 
B- B. A. Biochimica et Biophysica Acta. 

B. B. R. C. Biochemical and Biophysical Research Co mm tin ic ation s, 

F. J. Bates et al" Polarimetry, Saccarimetry and the sugars, U. S. Department of Commerce, National Bur- 
eau of Standards, Washington, D. C. (1942). 縮写: "Bates et ai." 
P. A. Levenc and L. W. Bass, Nucleic Acids, Chemical Catalog Co" N. Y. (1931). 缩写: "Levene and Bass'"' 
Modern Methods: Modern Methods of Plant Analysis, eds. K. Paech and M. V. Tracey, Vol. 4, Springer- 
Verlag, Berlin (1955). 

M. Freed (ed.) for the Association of Official Vitamin Chemists, Methods of Vitamin Assay, 3rd ed., Ini- 
erscience (1966). 

P. Gyorgy and W. N. Pearson (eds.), The Vitamins, Vols. 6 and 7, Academic (1967). 

Vitamins and Hormones, Academic Press, a review serial published annually. Vol. 1(1943), Vol. 26 (1968) 
The Nucleic Acids, eds. E, Chargaft and J. N. Davidson, Vol. 1, Academic Press, N. Y. (1955). 



• 284 • 



1. 糖类 及有关 化合物 的制备 













名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


D- 阿 拉伯糖 


150. 1 


S. 水 


J. A. C. S. 72, 454()(1950) 


戊 糖分析 测定一 般方法 






SI. s. 乙醇 


Org. Synth. Coll. 3, 101 (1955) 


见" F 述参 考文献 


(D-Arabinose) 




i. 乙魅 






D- 来苏糖 


150. 1 


s. 水 


J. A. C. S. 72, 4546(1950) 


Meth. Hiochcni. Anal. 






2. 乙醇 


Bates et al., p. 469 


2, 313(1955) 










J. B. C. 167, 369 (1947) 


L- 来 苏糖酸 


166. 1 


s. 水 


J. B. C. 235, 2518(1960) 


J. B. C. 194, 261 (1952) 


(L-Lyxonic acid) 


















J. B. C. 204, 1011 (1953) 


核糖醇 


152. 1 


S. 7k, 7 ®J 

" • /J、 , prr 


J. A. C. S. 73, 4691(1951) 


J. B. C. 205,661 (1953) 


(Ribitol) 






J. c. S. 1949, S44 




D- 核糖 


150. 1 


s. 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 6, 135 


B. J. 58, 288 (1954) 






SI. s. 乙醇 


C195n 
乂 * 乂乂 1 乂 










Bates et al., p. 476 




2- 脱 氧核糖 


134. 1 


S. 7X 


Cheruy Ind. 1955, 92 


The Nucleic Acids, eds. 


(2-Deoxy-D- 




Si S 酷 


Biochem. Preps. 5, 75(1957) 


Charga££ and Dav id son. 


Ribose) 








Vol. 1, p. 285 


D- 核酮糖 


150.1 




Helv.Chim. Acta. 18, 80(1935) 


J. B. C. 204, 1011 (1953) 


(D-Ribulose) 








J. B. C. 201, 71 (1953) 


D- 木酮糖 


150.1 


s. 水 


J. A. C. S. 60, 1201 (1938) 


J. A. C. S. 76, 5889 (1954) 


(D-Xylulose) 






J. B C. 115, 731 (1936) 


B.J. 63, 542 (1956) 


L- 木酮糖 


150. 1 


s. 水 


J. B. C.215. 677 (1955) 


[Hi D- 太 £111 疲 


(L-Xylulose) 






Ber. 68, 118 (1935) 




D- 岩藻糖 


164.2 


s 7k 


J. c.S. 1945, 746 


i;i 下 为分; ffi^ 田甚 爐一 船卞 


(D-Fucose) 




i. 乙继 




法参 考文献 






SI. s. 乙醇 




J. B. C. 175, 595 (1948) 


毛地黄 毒素糖 


148.1 


s. 乙醇, 水 


Meth. Carb. Chem. Vol. 1, 


J. B. C. 192, 579 (1951) 


(Digitoxose) 




i. 乙链 


p. 240 (1962) 


Analyst, 80, 268(1955) 


L- 鼠李糖 


164.2 


s. 水, 甲醇, 乙醇 


J. A. C. S. 43, 127 (1921) 




(L-Rhamnoic) 




i. 苯, 乙继 


Bates et al.. p. 475 





己 糖分析 测定一 般参考 文献: J. B. C. 220, 583 (1956) 
B. J. 58, 288 (1954) 
J. Physiol. 132, 289 (1956) 
J. B. C. 195, 19 (1952) 
(酮糖 ): J- B. C. 192, 583 (1951) 

P. S. E. B. M. 74, 117 (1950) 
B. J. 63, 543 (1956) 



(己糖 酸酸) : Analyt. Chem. 28, 1098 (1956) 



N- 乙 銑-半 乳糖胺 


221.2 


s. 水 


J. A. C. S. 76, 301 (1954) 


J. B. C. 217, 959 (1955) 


(N- Acetyl D- 








B. J. 51, 379 (1952) 


galactosamine} 










N- 乙銑- D- 神经 


309.2 


s. 水, 甲醇 


Biochem. Preps. 7, 1 (1960) 


见 上述一 般文献 


氣 (糖) 酸 




SI. s. 乙醇 


B. B. A. 39, 161 (1^60) 




CN- Acetyl-neura- 




i. 乙链, 丙酮, 






minic acid) 




氣仿 







• 285 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


D- 果糖 


180.2 


375" 水 


\dv. Carbohyd. Chem. 


J. B. C. 127, 601 (1939) 


(D-Fructose) 




S. 甲醇, 乙醇 


7, 53 (1952) 


J. B. C. 192, 583 (1951) 


D -半 乳糖胺 盐酸盐 


215.6 


S. 水 


J. A. C. S. 76, 301 (1954) . 


\nalyt. Chem. 28, 1743 


(D-Galactosa-minc 






A.dv. Carbohyd. chem. 7, 


(1956) 


hci; 






247 (1952) 




D- 半乳糖 


180.2 


10°, 68" 水 


Bates et al., p. 462 


Analyt. Chem. 27, 857 


(D-Galactose) 




5.45" 吡啶 




(1955) 






S1. S. 甲醇 






D- 氨基 葡萄糖 


179.2 


V. S 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 7, 


Analyt.Chem. 28, 1743(1956) 


(D- Glucosamine) 




S. 热甲醇 


247 (1952) 


B. J. 61, 586 (1955) 






S1. S. 乙醇 




y/Ieth. Biochem. Anal. 






i. 乙链, 氯仿 




6, 289 (1958) 


L- 古洛糖 


180.2 


S. 水 


J. A. C. S. 67, 1713 (1945) 




(L-Gulose) 




S1. S. 乙醇 






D- 甘 露糖胺 


179,2 


S. 水, 甲醇 


J. A. C. S. 81. 2403 (1959) 




(D-M an nos amine) 










D- 甘露糖 


180.2 


248" 水 


Bates et al., p. 471 




a 
Q 




i. 乙醚 






L- 山梨糖 


180.2 


55" 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 7, 




(L- Sorbose) 




Sp. S. 热乙醇 


99 (1952) 








甲醇 


Bates et al., p. 479 








-般 分析 测定方 法参考 文献: J. B. C. 204. 983 (1953) 








J. B. C. 205, 661 (1953) 


D-«- 葡庚糖 


210.2 


9. 5. 水 






(D-a-GIucoheptose) 




S1. S. 乙醇 


J. C. S. 1931, 2864 




D -甘露 庚酮糖 


210.2 


S. 水 


J. A. C. S. 61, 1654 (1939) 




(D-manno-Hep- 




Sp. S. 乙醇 






tulose) 










景天 庚酮糖 


210.2 


S. 水 


J. A. C. S. 78, 4717 (1956) 




(Sedoheptulose) 




Sp. S. 乙醇 














二糖一 


般分析 测定方 法参考 文献: 


B. J. 58, 288 (1954) 




纤 维二糖 


342.3 


S. 水 


Org. Synth. Coll. 2, 122 (1943) 








i. 乙 醇乙链 


Bates et al., p. 459 




异 麦芽糖 


342.3 


S. 水, 甲醇 


B. J. 67, 49 (1957) 




E 






J. A. C. S. 75,5911 (1953) 










J. B. C. 196, 265 (1952) 




pH ~ "fa 


342.3 


S. 水 


Nature, Lond. 182, 1303 
(1958); 189, 753 (1961); 




(Kojibiose) 






191, 278 (1961) 




乳 糖 


342.3 


21,6" 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 16, 




(Lactose) 




S1. S. 冰醋酸 


159 (1961) 








i. 甲醇 










乙醇, 乙链 






昆 布二糖 


342.3 


S. 水, 甲醇 


J. C. S. 1952, 1243 




(Laminaribiosc) 






J. C. S. 1958, 724, 729 





• 286 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


麦芽糖 


342.3 


108,0 水 


Bates et al., p. 470 




(Maltose) 




S1. S. 乙醇 










1. 乙链 






密二糖 


342.3 


S. 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 9, 




(Melibiose) 




S1. S. 乙醇 


165 (1954) 










Bates et al., p. 473 




松二糖 


342.3 


S. 水 


Avd. Carbohyd. Chem. 2, 




(Turanose) 




S1.S. 甲醉 


1 (1946) 










J. A. C. S. 52, 2522 (1930) 




纤 维三糖 


504.4 


S. 水 


J. A. C. S. 74, 5331 




(Cellotriose) 




S1.S. 甲醇 


(1952) 








j. 乙醇 






庶 果三糖 


504.4 


S. 水 


Meth. Carb. Chem., 




(Kestose) 






Vol. 1, p. 360 (1962) 




昆 布三糖 


504.4 


S. 水 


J. C. S. 1958, 724 




(Laminaritriose) 










麦 芽二糖 


504.4 


S. 水 






(Maltoriose) 






J. B. C. 205, 75 (1953) 










J. A. C. S. 74, 3612 










(1952) 




6- a- 葡糖基 


504.4 


S. 水 


J. A. C. S. 73, 2547 


Analyt. Chem. 25, 231 


麦芽糖 






(1951) 


(1953) 


(Panose) 










密三糖 


504.4 


14.3" 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 


Meth. Biochem. Anal. 


(Raffinose) 




9.8 甲醇 


9, 167 (1954) 


1, 308 (1954) 






V. S. 吡啶 


Bates et al., p. 475 








i. 乙醇 






水 苏四糖 


666.6 


S. 水 


Chemy Ind. 1961, 475 




(Stachyose) 






Adv. Carbohyd. Chem. 










9, 149 (1954) 






828.8 


S. 水 


Adv. Carbohyd. Chem. 




(Verbascose) 






9, 149 (1954) 




2. 脂类 及长链 脂肪酸 化合物 的制备 


名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


花生酸 


312.5 


0.45" 乙醇 


J. Soc. Chem. Ind., Lond. 


Meth. Biochem. 


(Arachidic acid) 




S. 氯仿, 苯, 乙 68 


44, 219 (1925) 


Anal. 8. 1 (1960) 








J. B. C. 59, 905 (1924) 


T. P. Hiklitch and 








Ber. 64, 2504 (1964) 


P. N. Williams, The 










Chemical Constitution 










of Natural Fats, 4th 










cd., p. 678, Chapman 










and Hall (1964) 


花生 四炼酸 


304.5 


S. 乙链 


J. B.C. 80, 455 (1928) 




(Arachidonic acid: 




i- 水 


B. J. 34, 879 (1940) 










J. B. C. 142, 672 (1942) 





. 287 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 




(508.3) 








(Cardioli P in) 


n /ja/i/j r« 


'- >■ r3 filD ? 1/7 3 


B. J. 70, 409 (1958) 


B. B. A. 84, 109 (1964) 








R 1 78 44 ng^in 

D. J* f O ) 1 1 \^ i. 7 U 1. J 




脑磯脂 


(296. 2) 








(Cephalin) 


丁 a 日/ yjK^ 


激 to , ^ 


B T 60 353 riQSS'i 






残基 


,• 丙酮 


Biochem. Preps. S, 5 (1957) 

U» J • OV J J J 1 、量 ^^Ui 乂 


(1951) 
{ 1 g4 40 7 (\Qfi7\ 


脑 苷脂类 


(488. 6) 






T H C 141 S4=5 

J • U* I"* 1 , J I J 




十 脂肪酸 


SI. s. 乙醇 


J. B. C. 169, 77 (1947) 


(1941) 




残基 


s. 吡 1!^, 


J. B. C. 219, 977 (1956) 


J. B. C. 219, 977 






删," 敞, 


Biochem. PrepSw 7, 31 (I960) 










J. Lipid Res. 2, 228 (1961) 


Vleth , Biochem, A n al « 
6, 178 (1958) 


胆甾醇 


386.6 


。• CjHEE 


Z. P. c. 192, 77 (1930) 


VI eth» Bioche m • «A n a 1 - 


(Choleslerol) 




剥 yj , 今 , ^yt , 
执 7 M 


Z. P. C. 241, 81 (1936) 


10, 263 (1962) 
J. Lipid Res, 3, 283 


冀甾醇 


388.6 




Z P p 223 249 riQ34^* 


R. P Cook Cholesterol 


(Coprosterol) 




109 不 


225 1 Q7 riQ14^ 


pp. 117, 481, 






SI. s. 甲醇 


J. Lipid Res, 4, 337 


Academic Press (1958) 








(1963) 




二氢 (神经 ) 銷氨醇 


301.5 


S 7 隨 


J. B. C. 170, 269 (1947) 


J. Lipid res" 1, 40 


Q 






J, Neurochem. 6, 112 (1969) 


、 乂 


gosine) 






T R p 2^fi 1 Q12 n Q 6 1、 




桐 酸 


278.4 


c 7" M 拔? 7^ 

。• c_* Bee ? ^^5! t/N 


T A P S 5fi 8QR n934、 


B. J. 59, 309 (1955) 


(Elaeostearic acid) 




醋酸 
i 7k 




Meth. Biochem, Anal. 
8, 1 (1960) 


芥子酸 


338,6 


S 7 酸 ,7^ 絲 


J. A. C.S. 48, 968 (1926) 


J. A. C. S. 48, 968 


(Erucic acid) 




(顺式 ) 


(顺式 ) 


(1926) 






SI. s. 水, 乙醇 


J. B. C. 200, 287 (1953) 


Meth. Biochem. Anal. 






s. 乙 链 


(反式 ) 


8, 1 (1960) 


半乳糖 甘油脂 




(反式 ) 
(i) S. 甲醇 


J. A. C. S. 78, 3735 (1956) 
J. Lipid Res. 2, 215, 


B. B. A. 44, 49 (1960) 






(Galacto-glycerides] 




(ii) s. 水 


223 (1961) 




神经 节昔脂 






Z. P. c. 278, 1 (1943) 


B. J. 82, 527 (1962) 


(Gangliosides) 






J. Biochem., Tokyo, 43, 

B. B. A. S3, 422 (1961) 
B. B. A. 60,350 (1962) 
Z. P. C. 327, 249 (1962) 


J. Lipid Res. 3, 269 
(1962) 


«- 单油酸 甘油酯 


356.5 


i. 水 


Chem, Zent BI. 1, 2971 


B. J. 62, 455 (1956) 


(a-Monolein) 




s. 乙醇, 氯仿 
乙醚 


(1935) 


J. Am. Oil Chem. Soc. 
37, 7(1960) 


«- 单棕 榈酸 甘油脂 


330.4 


i. 水 


J. B. C. 128, 475 (1939) 


见 单油酸 甘油脂 


(a-Monopalmitin) 




s. 乙醇 

2.75" 乙醚 







• 288 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


/8- 单 踪榈酸 甘油酯 


330.4 


i. 水 


J. A. C. S. 56, 1724 


见 单油酸 甘油脂 


(/3-MonopaImitin) 




S. 乙醇 


(1934) 




«- 单硬 脂酸 甘油脂 


358.5 


分散 于水中 


J. B. C. 128, 475 (1939) 


同 上 


(a-Monostearin) 




S1. S. 乙醇 










S. 热 乙醇, 热 










乙继, 氯仿 






/5- 单 硬脂酸 甘油脂 


358.5 


S. 热乙醇 


J. A. C. S. 56, 1724 (1934) 


同 上 


(/3-Monostearin) 




热乙醚 






三 月桂酸 甘油脂 


639.0 


i. 水 


J. A. C. S. 51, 866 (1929) 


Chem, Rev. 29, 333 


(Trilaurin) 




S1. S. 乙醇 




(1941) 






S. 氯仿, 乙瞇, 苯 






DL-2- 经基 硬脂酸 


300.4 


i. 水 


J. C. S. 1954, 177. 


Aust. J. Chem. 13, 


(DL-2-Hydro- 




V. S. 热苯 


B. B. A. 45, 102 (1960) 


80 (1960) 


xystearic acid) 




S. 乙醇, 乙 Si 


J. B. C. 236, 1912 (1961) 




羊毛 S 醇 


426.7 


i. 水 


H.:Iv. Chim Acta. 27, 


见类 |g 醇 


(Lanosteroi) 




S. 脂 肪溶剂 


472 (1944); 28, 759 










(1945); 29, 204 (1946) 




月桂酸 


200.3 


V. S. 乙 继, 


J. Soc. Chem. Ind., Lond, 


B. J. 63, H4 (1956) 


(Laurie acid) 




冰 醋酸, 甲醇, 


49, 138T (1930) 








Y mm 

CjH? 守 


J. c. S. 1936, 283. 








0.0055 水 






卵碟脂 


(329.3) 


I- 丙酮 


J. B. C. 188,471 (1950) 


J. B. C. 169, 137 (1917) 


(Lecithin) 


十 脂肪酸 


S. 乙醇, 乙 H 


Biochem. Preps. 4, 12 


B. J. 84, 497 (1962) 




残基 


氯仿, 四氯化 


(1955) 








碳, 苯 


B. J. 60, 353 (1955) 










B. J. 88, 414 (1963) 




亚油酸 


280.4 


i. 水 


Biochem. Preps. 4, 86 


B. J. 59, 309 (1955) 


(Linoleic acid) 




V. S. 乙醇, 乙醚 


(1955) 




溶血 卵碟脂 




i. 乙醚 


J. B. C. 129, 619 (1939) 


J. B. C. 206, 443; 647 


(Lysolecithin (^)) 




S. 乙醇, 冰 


J. B. C. 211, 321 (1954) 


(1954) 






酷酸, 氯仿 


J. B. C. 206, 431 (1954) 


J. Lipid Res. 3, 1; 467 






Sp. 丙酮 


B. B. A. 30, 187 (1958) 


(1962) 






在水 中乳化 






油 酸 


282.5 


i. 水 


J. A. C. S. 56, 1563 (1934) 


Analyt. Chem. 22, 1261 


(Oleic acid) 




S. 乙醇, 苯, 


J. C. S. 1939, 974. 


(1950) 






氯仿, 乙魅, 


J. B. C. 154, 437 (1944) 


B. J. 59, 309 (1954) 






甲醇, 丙酮 


Biochem. Preps. 2, 100 










(1952); 9, 113 (1962) 




棕榈酸 


256.4 


i- 水 


Ber. 21, 2265 (1888) 


B. J. 63, 144 (1956) 


(Palmitic acitl) 




乙醉 、本, 










氯仿, 乙醚, 


J. C. S. 1931, 802. 








甲醇, 丙酮 


Org. Synth, Coll. 3, 










607 (1955) 




碟脂酸 


226.1 


i. 水, 乙醇 


B. B. A. 41, 45 (1960) 


B. J. 84, 497 (1962) 


Phosphatitlic acid 




S. 丙酮, 乙继, 


Can. 】. Biochem. physiol. 








氯仿 


33, 575 (1955) 





• 289 • 



续 表 



仲 


> ^羊畺 

77 丁里 


mJvftx. 


制么卞 Jfc 
刷 贪刀 


7T VT 力 tU 


碟脂 酰甘油 


300.1 


在水 中乳化 


B. B. A. 27, 189 (1958) 


B. J. 84, 497 (1962) 


(Phosphatidyl- 




S. 乙醇, 乙鲢, 


B. J. 88, 42p (1963) 




glycerol) 




氯仿, 丙酮, 苯> 


B. B. A. 84, 35 (1964) 








甲醇 






碟脂醜 丝氨酸 


313.2 


在水 中乳化 


B. J. 85, 251 (1962) 


J. B. C. 192, 465 (1951) 


(Phosphalidyl- 




i. 乙醇, 


B. B. A. 30, 41 (1958) 


B. J. 84, 497 (1962) 






甲酷, Wffi 


Nature, Lond. 200, 887 (1963) 


J. Lipid Res. 3, 467 






S. ffi 仿, 乙 H 

" ' •Svi i/j p ( ' rax 


B. B. A. 135, 624 (1967) 


("1962) 


缩路 脂 


0)267.2 




(a) B. J. 70, 409 (1958) 


J. B. C. 219, 39 (1956) 


(Plasmalogens) 


十 脂肪酸 


Sl.s. 乙醇, 


J. B. C. 237, 329 (1962) 


J. B. C. 217, 199 (1955) 




和 脂肪醇 


乙鰱, 丙酮苯 


J. Neiirochem. 10, 941 (1963) 


B. B. A. 38, 340 (1960) 




残基 


s. 热甲醇 ,热 


(b) J. B. C. 225, 859 (1957) 


B. J. 84, 497 (1962) 




(b)240.2 


乙醇, 氯仿 


B. J. 75, 251 (1960) 


Prog. Chem. Fats 6, 1 




十 脂肪醇 






(1963) 




残基 








谷甾醇 


(«) 


(«) S. 氯仿 


(a) J. A. C. S. 58, 2446 




(Sitosterols) 


412.7 


乙继 


(1936) 






(^) 


(^3) S. 氯仿 


((3) Ber. 64,2167 (1931) 






414.7 




J. A. C. S. 66, 489 (1944) 




神经 鞘磯脂 


(509.6) 


i. 乙醚, 丙 


J. B. C. 166, 677 (1946) 


B. J. 56, 621 (1954) 


(Sphingomyelin) 


十 脂肪酸 


酮, 水 


J. B. C. 232, 63 (1958) 


B. J. 84, 497 (1962) 




残基 


S. 苯, 氯仿 


Biochem. Preps. 8, 121 (1961) 


J. Lipid Res. 3, 467 






热乙醇 




(1962) 


鲨 烯 


410.7 


S. 乙鲢, 氯仿 


J. C. S. 1926, 1631. 


J. A. C. S. 74, 4321 


(Squalene) 




Sp. S. 乙醇, 


J. A. C. S. 74, 4321 (1952) 


(1952) 






冰醋酸 






硬脂酸 


284.4 


i- 水 


Ber. 17, 1627 (1884) 


B. J. 63. 144 (1956) 


(Stearic acid) 




S. 乙链, 氯 


J. Soc. Chem. Ind., 








仿, 笨, 乙醇 


Lond. 43, 346T (1924) 










J. A. C. S. 62, 230 (1940) 










J. C.S. 1931, .802. 










Biochem. Preps. 7, 84 










(1960) 




11 -十八 (碳) 炼酸 


282.4 


S. 氯仿 


J. A. C. S. 70, 1102 (1948) 


J. B. C. 169, 227 (1947) 


(Vaccenic acid) 




丙酮 


J. C. S. 1950, 3484. 









3. 


维 生素及 辅隨类 的制备 




名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


乙酷辅 IS A 
Acetylcoenzyme A 

抗 坏血酸 

(维 生素 c) 

Ascorbic Acid 


― oo 
On \d 
1— 0\ 


s. 水 

33.3 水; 

2 乙醇 
i- 乙 6i, 氯仿 


Meth. Enzyniol. 3, 931 (1957) 
J. A. C. S. 74, 3205 (1952) 
Biochem. Preps. 5, 

27 (1957) 
B. J. 27, 279 (1933) 
J. B. C. 97, 325 (1932) 


Meth. Enzymol. 3, 
935, 938 (1957) 
B. B. R. C. 10, 333(1963) 

Methods of Vitamin 
Assay, 3rd ed., 
p. 287 (1966) 



. 290 • 



续 表 













名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 




767.6 








辅驗 A 


s, 水 


VIeth. Enzymol. 3, 


Meth, biochem - 


Coenzyme A 




i. 丙酮, 乙謎 


907 (1957) 


Anal. 2, lo9 ^y^j) 








J. A. C. S. 83, 663 


Meth. Enzymol. 3. 








(1961) 




氣 钴胺素 


1355. 4 


1.2 7jC; 


Science 107, 396 


Meth. biochem. 


(维 生素 Bi》 




s. 乙醇, Sih 


(1948) 


Anal. 2, 189 (1955) 


Cyanocobalamin 




脂 肪酸, 


Proc. R. Soc. B136 


The Vitamins. 2nd 








o 


ed. Vol, 7, p. Ill Ciyo7J 


辅酸 B" 




厶 水 


Biochem. Preps. 10, 


J. B. C. Zab, Lt>^i , 


Coenzyme B12 




s. 乙醇, 粉 


27 (1963), 12, 124, (1968) 


pci Qiyoi ) 


DMBC 辅 S5 




>• 丙酮, 乙继 


Arch. B. B. 92, 381 (1961) 










J. C. S. 1963, 4146 










J. B. C. 236, 2119 (1961) 




多萜醇 


1382.4 


s. 乙醚 


Nature, Lond. 186, 470 


B. J. 82, 454 C196Z) 


Dolichol 




SI. s. 乙醇 


(1960) 








" 水 


B. J. 88, 470 (1963) 




L-i— * rrj 
麦 角固醇 


2n< 7 

iyo. / 


热 S<C5, 本, 


J. A.C. S. 67, 609 (1945) 


Analyst /o, DUy, 


Ergosterol 




SI. s. 甲醇, 


Analyst 78, 509 (1953) 


514, 519, 5" Qly^i^ 






乙醇, 乙趟 7 










j- 水 






Uk*. XiU x& * 

- 脂 St 辅醒 A 


lUUo 


nt-r 0+* XUt- 

脂肪 酸链愈 


十六醜 -辅酶 A: 


Meth. Enzymol. i, 


Fatty acyl 


(十 八醜) 


IX »- — 1— _t, ,1、 

长, 溶于 水愈少 


Biochem Preps. 7, 


(1957) 


coenzyme A 






80 (1960) 


J. B. C. 5ly 


黄 素腺嘌 I^— 核晋酸 


70c < 

/ 05 . 


V. S. tIc; 


Meth. Enzymol. 3, 950 


Meth. biochem. Anal. 


(FAD) 




S. 吡 咤船; 


(1957) 


10, 319 (1962) 


Flavin adenine 




I- 乙醇, 乙继, 


Biochem. Prep. 7, 51 


Meth, Enzymol. J, y^J, 


Dinucleotide 




丙酮, 氯仿 


(1960) 


r\r r\ Zinc T\ 

960 (1957) 










J. B. C. 223, 559 


-44-, ^ -++- 

黄素单 核苷酸 


456. 4 


i. 丙酮, 


Meth. Enzymol. 3, 957 


Meth, Enzymol. 


FMN 




乙继, 氯仿; 


(1957) 


(1957) 


Fiavin Mono- 




水, 冰醋 


J. C. S. 1950, 3295 


Meth. biochem. Anal. 


nucleotide 




酸; > 吡!! 




10, 319 ( IvoZ ) 


肌 m 




14" 水', 


J. B. C. 139, 29 (1941) 


Meth. biochem. AnaU 


Inositol 




SI. s. 乙醇 




7, 115 (1959) 










B. J. 67, 5zi Qiy?/^ 


硫辛酸 


206.3 


V. S. 苯, 乙 


Science 114, 93 (1951) 


Meth. biochem. Anal. 3, 


Lipoic acid 




醇, 甲醇; 


J. A. C. S. 76, 1828 (1954) 


T 5 /■ I nff /C、 

23 Ql95o^ 






SI. s. 石 油魅; 


J. A. C. S. 77, 416, 5144 


Meth. hnzymol. 






i- 水 


(1955) 


(1957) 


r~1 XU. DrJSi 
尼 克酰胺 


122. 1 


100 7jc; 




The Vitamins, 2nd ed., 


(^56 生茶 1"^; 




SI. s. 本 ,乙 K 




vol. /, p. 丄 <5/ 


Nicotinamide 










尼克 銑胺腺 嘌呤二 


663.4 


s. 水 


Biochem. Prep. 3, 20 (1953) 


Meth. Enzymol. 3, 890 


核苷酸 (辅薛 1) 






J. B. C. 239, pc3598 (1964) 


(1957) 


Nicotinamide adeni- 






Biochem. Prep. 11, 84 (1966) 


Meth. Enzymol. 6, 792 


ne dinuclcotidcNAD; 






Meth. Enzymol. 3, 876 (1957) 


(1963) 


DPN. coenzymel 











• 291 . 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 












尼克 銑胺腺 嘌呤二 


743.4 


S- 水 


Biochem. Preps. 3, 24 (1953) 


Meth. Enzymol. 3, 890 


核苷 酸碟酸 






Meth. Enzymol. 3, 879 (1957) 


(1957) 


(辅醒 U) 






Biochem. Preps. 11, 87 (1966) 


Meth. Enzymol. 6, 792 


Coenzyme II 








(1963) 


NADP 










蝶醜谷 氨酸; 


441.4 


S1.S. 冰 醋酸; 


J. A, C, S, 70, 3 (1948) 


.J B. C. 205, 361 (1953) 


叶酸, 维生素 Be 




i. 许 多有机 


J. A. C. S. 77, 6365 (1955) 


The Vitamins, 2nd 


Pteroylglutamic 




溶剂; 




ed., vol. 7, p. 243 (1967) 


acid 




0.05"" 水 






N', N'o- 甲基四 g 


457.4 




Meth. Enzymol. 6, 806 (1963) 


Meth. Enzymol.e, 809 


叶酸 






J. B. C. 238, 1498 (1963) 


(1963) 


N', N"-Methenyl- 






J. A. C. S. 82, 4921 (1960) 




tetrahydropteroyl- 










glutamic acid 










N'- 甲基四 氢叶酸 


459.5 


S, 水 


Biochem. Preps. 10, 103 (1963) 


J. B. C. 237, 1298 


(N'- 甲基四 氢喋酰 






B. J. lOS, 633 (1967) 


(1962) 


谷 氨酸) 








J. B. C. 238, 1746 


N'-Melhyltetra- 








(1963) 


hydropter- 










Oylglutamic acid 










吡!^ 醇 盐酸盐 


205.7 


22 水; 


J. A. C. S. 61, 1245 (1939) 


Meth. biochem. 


(维 生素 B6) 




S1.S 丙酮; 




Anal. 12, 183 (1964) 


Pyridoxol hydroc- 




i. 乙醚 






hloride 










碟酸 吡咳醛 


247.1 


S. 水 


Biochem. Preps. 3, 34 (1953) 


Meth. biochem. Anal. 


Pyridoxal phosphate 




S1.S. 甲醇 


Meth. Enzymol. 3, 965 (1957) 


12, 183 (1964) 






i. 氯仿, 丙 




Analyt. Biochem. 7, 






酮, 苯 




335 (1964) 


核黄素 


376.4 


0.01" 水; 


Ber. 66, 315 (1933) 


The Vitamins. 2nd 


(维 生素 B2) 




V.S. 冰 醋酸; 




ed., vol. 7, p. 99 


Riboflavin 




i. 乙魅, 氯 




(1967) 






仿, 苯 






琥珀銑 -辅驗 A 


867.6 


S. 水 


J. A. C. S. 75, 2520 (1953) 




Succinyl 






Biochem. Preps. 5, 30 (1957) 




coenzyme A 










硫胺素 盐酸盐 


337.3 


100 水; 


J. A. C. S. 59, 1052 (1937) 


Meth. biochem. Anal. 


(维 生素 Bi 盐 酸盐) 




0.35 乙醇; 


J. C. S. 1937, 364 


6, 191 (1958) 


Thiamin 




S. 甲醇 




The Vitamins, 2nd 


chloride 




i. 乙醚, 氯仿 




ed., vol. 7, p. 53 (1967) 


硫胺素 焦碟酸 ,辅 


460.8 


S. 水 


Helv. chim. Acta 29, 


B. J. 62, 601 (1956) 


羧酶 (TPP) 


(cl-) 




ivoy (.iy4o_) 


D. B. A. 0*,la {^lyOL ) 


Thiamin 






Helv. chim. Acta 32 




pyrophosphate 






1478 (1949) 




生育酣 


430.7 


S. 丙酮, 乙 


J. B. C. 113, 319 (1936) 


Vhanis. Horm. 20. 407 


a-Tocopherol 




醇, 氯仿, 乙醚; 


B. J. 32, 1953 (1938) 


(1962) 






i. 水 


J. A. C. S. 65, 918 (1943) 


The Vitamins, 2nd 








Ivitams Horni. 20, 389 (1962) 


ed., vol. 6, p. 291 (1967, 



. 292 . 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


泛 醌 


863.4 


s. 乙醇, 乙链, 


Biochem. Preps., 9, 30 




(辅海 Qio) 




轻质石 油链; 


(1962) 




Ubiquinone - 10 




i. 水 


J. B. C. 234, 2169 (1959) 










B. B. A. 32, 73 (1959) 










J. A. C. S. 82, 1647 (1960) 




维生素 Ai 


286.5 


S. 乙醇, 甲醇, 


The Vitamins. 2nd ed., 


The Vitamins, 2nd 


(全 反型) 




氯仿, 乙 61; 


vol. 1, p. 1 (1967) 


ed" vol. 6, p. 139 (1967) 


Vitamin Aj 




i- 水 


Vitams Horm. 18, 295 


Meth. biochem. Anal. 








(1960) 


4, 43 (1957); 15, 1(1967) 


维生素 A, 


284.4 


S. 乙醇, 氯仿, 


B. J. 52, 535 (1952) 


The Vitamins, 2nd 


(全 反型) 




乙链, 环 己浣; 


J. C. S. 1952, 2657, 


ed., vol. 6, p. 139 


Vitamin A, 




i. 水 


1955. 2763 


Meth. biochem. Anal. 








Vitams Horm. 18, 295 


4, 43 (1957); 15, 1 








(1960) 


(1967) 


维生素 


396.7 


28" 乙醇; 


B. J. 49, 45 (1951) 


The Vitamins, 2nd 


Vitamin 




25" 丙酮; 


J. A. C. S. 67, 609 (1945) 


ed., vol. 6, p. 211 






S. 乙继; 




(1967) - 






i- 水 




B. J. 49, 36, 45, 54, 










232, 243 (1951) 


维生素 




i>- 乙醇, 内 


J- A. C o. O/, 0\jy {^lyj^) 


The Vitamins, 2nd 


Vita min D3 




酮, 氯仿; 




ed., vol. 6, p. 211 






i. 水 




(1967) 


维生素 Ki 


450.7 


S. 乙醇, 丙 


Helv. chim. Acta. 22, 


Meth. biochem. Anal. 


Vitamin K, 




酮, 苯, 乙链; 


310,945, 1464 (1939) 


11, 279 (1963) 






i- 水 


J. A. C. S. 76, 4592 (1954) 


The Vitamins, 2nd ed 










vol. 6, p. 245 (1967) 




4. 核苷、 核苷 酸及其 衍生物 的制备 




名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


腺噤呤 


135.1 


0.09", 


*Levene and Bass, p. 114 


Meth. biochem. Anal. 


Adenine 




2.5'。。 水; 


8- "C. Biochem. Preps. 


3, 97 (1956) 






SI.S. 乙醇, 


5, 62 (1957) 


Meth. biochem. Anal. 






i. 乙链, 氯仿 




6,79 (1958) 


腺嘿 吟核苷 


267.2 


S. 水; 


J. B. C. 237, 2283 (1962) 


J. B. C. 167, 445 (1947) 


Adenosine 




S1.S. 乙醇 


J. A. C. S. 73, 1650 (1951) 


Arch. B. 25, 347 (1950) 








Levene and Bass, p. 163 




腺苷 -3、 5'- 碟酸 


329.2 


S. 水 


J. B. C. 232, 1065, 1077 (1958) 


Analyt. Biochem. 13 


(c'AMP) 






J. B. C. 224, 463 (1957) 


71 (1965) 


Adenosine - 3', 






J. A. C. S. 79, 3608 (1957) 




5'-cycIicphos-phate 






J. A. C. S, 83, 698 (1961) 










J. Org. Chem. 31, 3247 (1966) 




腺苷- 5'- 二磯酸 


427.2 




Biochem. Preps. 1, 1 (1949) 


Meth. biochem. Anal. 


(ADP) 






B. B. A. 91, 1 (1964) 


1, 341 (1954) 


Adenosine - 






Bcr. 95, 1664 (1962) 




5'-diphosphalc 






Ber. 98, 1045 (1965) 





. 293 • 



续 表 



名 称 


分子量 


A.7J nV 

溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


腺普 S6 酸 


347.2 


S. 热水 


Vteth. Enzymol. 6, 645 (1963) 


J. B. C. 167, 445 (1947) 


Adenos nc- 






Biochem. Preps. 9, 5 (1962) 


Meth. Enzymol. 10, 474 


5' - phosphate 






B. J. 58, 503 (1954) 

B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


(1967) 


腺脊 -5'- 二 SS 酸 


507.2 




Biochem. Preps. 1, 5 (1949) 


Analyt. Biochem. 14, 261 


(ATP) 






Arch. B. B. 62, 253 (1956) 


17, 456 (1966) 


Adenosine - 






B. B. A. 91, 1 (1964) 


Meth. Knzyniol. 10, 474 


5 — triphosphate 






J. A. C. S. 87, 2265 (1965) 
B. B. R. C. 9, 556 (1962) 
Meth. Enzymol. 10, 702, 
773 (1967) 




胞 喷核苷 


243.2 


S. 水 


Levene and Bass, p. 164 




Cytidine 




Sl.s. 乙醇 


J. B. C. 237, 2283 (1962) 
J. C. S. 1950, 2084 




胞苷 -5'- 二磯酸 


403.2 




Arch. B. B. 35, 465 (1952) 




CCDP') 






J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 




Cytidine-5 ― 






J, A. C. S. 83, 649 (1961) 




diphosphate 










胞昔- 5' -碟酸 


323.2 


Arch. B. B 


Arch. B. B. 35, 465 (1952) 


The Nucleic Acids, 


Cytidine-5'- 




B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


Vol. 1, p. 211 (1955) 


phosphate 










胞苷 二磷酸 


483.2 




J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 




(CTP) 






B. B. A. 91, 1 (1964) 




Cytidine - 5' - 






Biochem. Preps. 9, 120 (1962) 




triphosphate 






J. A. \jm o. At , "0〕 、丄 yo〕j 




鸟嘿 呤核苷 


283.2 


0.08", 3.0"" 


Levene and Bass, p. 163 


J. B. C. 167, 429 (1947〉 


Ouanosinc 




/J、 5 

s. 稀 酸滅, 


Ber. 74, 694 (1941) 

J. B. C. 237, 2283 (1963) 








A*? t'J>' HX 

i- 乙链, 乙 


J. C. S. 1958, 1593 
















醇, 氯仿, 苯 






鸟苷 -5'- 二碟酸 


443.2 




J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 


J. B. C. 218, 505 (1956) 


(5'-GDP) 






J. B. C. 218. 521 (1956) 




Guanosine-5 - 






Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 




diphos-phate 






Ber. 98, 1045 (1965) 
B. B. A. 91, 1(1964) 




鸟苷 -5'- 碟酸 


363.2 




J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 




< 






Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 




Guanosinc-5'- 






B. B. R. C. 24, 872 (1966) 




phosphate 










鸟苷 -5'- 三碟酸 


523.2 




J. B. C. 209, 23, 41 (1934) 


J. B. C. 209, 41(1954) 


(GTP) 






J. B. C. 218, 521 (1956) 




Giianosine-5- 






B. B. A. 91, 1 (1964) 




triphos-phate 






Biochem. Preps. 9, 120 
(1962) 

J. A. C. S. 87, 2265 (1965) 





- 2y4 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


次黄 嘌呤核 


268.2 


1.6" 水 


Ber, 42, 336 (1909) 


J. B. C. 167, 429, 477 


苷 (肌苷 ) 




V. S1. S. 


B. B. R. C. 13, 394 (1963) 


(1947) 


Inosine 




乙醇 


J. B. C. 167, 477 (1947) 




次黄 嘌呤核 


3-18.2 


S. 水 


B. J. 36,729 (1942) 




苷酸 (肌 苷酸) 




甲酸 


J. B. C. 190, 611 (1951) 




Inosine - 5 - 




V. S1. S. 


B. J. 58, 503 (1954) 




phosphate 




乙醇, 乙链 


Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 










B. B. R. C. 24, 872 (1966) 




乳清 酸核苷 -5'- 


368.2 




J. A. C. S.76, 2844 (1954) 


J. A. C. S. 76, 2844 


碟酸 






Biochem. preps. 9, 5 


(1954) 


Orotidine-5'- 






(1962) 




phosphate 






J. A. C. S. 85, 1118 (1963) 




胸 腺嘧啶 


126.1 


0.4" 水 


Levene and Bass, p. 57 


J. B. C. 197, 227 (1952) 


Thymine 




S. 热水; 


B. J. 70, 642 (1958) 


Analyt. Biochem. 1, 






S1. S. 乙醇 


Nature, Lond. 181, 254 (1958) 


249 (1960) 








R R A 61 141 /"iQfi?^ 




尿 啶核昔 


244.2 


S. 水 


Levene and Bass, p. 165 




Uridine 




Sp.s. 乙醇 


J. B. C. 237, 2283 (1962) 




尿苷 -5'- 二碟酸 


404.2 




J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 




UDP 






J. A. C. S. 81, 3032 (1959) 




Uridine- 5 _ 






R H A 1 n QM、 




diphosphate 






Ber. 98, 1045 (1965) 




尿苷 -5'- 碟酸 


324.2 




J. B. C. 203, 319 (1953) 


J. B. C. 209, 41 (1954) 


5' - UMP 






Biochem. Preps. 9, 5 (1962) 




Uridine- 5'- 






B. B. A. 61, 29 (1962) 




Phosphate 






B. B. R. C. 24, 872 (1966) 




尿甚 -5'- 二 /36 敌 


484.2 




J. A. C. S. 75, 5449 (1953) 


J. B. C. 209, 41 (1954) 


UTP 






J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 




Uridine- 5' - 






Biochem. Preps. 9, 120 (1962) 




triphosphate 






J. A. C. S. 87, 2265 (1965) 




脱 氧尿苷 -5'- 碟酸 


308.2 




B. B. R. C. 10, 289 (1963) 




Uracil deoxyribose 










- 5' - phosphate 










脱 氧尿苷 


228.2 


S. 甲醇, 水 


Nature, Lond. 166, 557 (1950) 




Jracil deoxyriboside 






J. C. S. 1952, 2721 










J. C. S. 1958, 3035 




脱氧 胸苷- 5'- 三 


482.2 




B. B. A. 39, 82 (1960) 




碟酸 






Biochem, Preps. 9, 120 




Thymine deoxyr- 






(1962) 




ibose - 5' - 






J. B. C. 233, 263 (1958) 




triphosphate 






B. J. 86, 562 (1963) 




脱 氧胸苷 


242.2 




J. C. S. 1950, 1990 


Arch. B. B. 73, 180 


Thymine 






J. C. S. 1952, 2721 


(1958) 


deoxyriboside 






H. J. 35, 855 (1941) 





. 295 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


胸腺! ^啶 


126.1 


0.404" 水 


J. A. C. S. 68, 912 (1946) 


J. B. C. 197, 227 (1952) 


Thymine 




s. 热水 


Levene and Bass, p. 67 


J. Bact. 84, 17 (1962) 






SI. s. 乙醇 






5- 甲 基胞嘧 PS 


125.1 


4.5" 水 


B. J. 48, 581 (1951) 


B. J.48, 581 (1951) 


5-MethyIcytosine 






Levene and Bass, p. 73 










J. A. C. S. 81, 178 (1959) 




6- 甲基氨 基嘌呤 


149.2 


0.12^% 2.0'M 水 


B. J. 68, 627 (1958) 


Meth. biochem. Anal. 


6-Methylamino- 






J. A. C. S. 74, 411 (1952) 


6, 79 (1958) 


purine 










脱 氧胞昔 -5'- 三碟酸 


467.2 




B. B. A. 39, 82 (1960) 




Cytosine deoxy- 






Biochem. Preps. 9, 120 




ribose- 5'- 






(1962) 




triphosphate 






B. J. 86, 562 (1963) 




脱 氧腺苷 -5'- 三碟酸 


491.3 




B. B. A. 39, 82 (1960) 




Adenine deoxy- 






Biochem. Preps. 9, 120 




ribose-5'- 






(1962) 




triphosphate 






B. J. 86, 562 (1963) 




腺苷- 5'- 二碟 酸- 


589.3 


s. 水 


Arch B. B. 106, 371 (1964) 


J. B. C. 237, 3577 


D- 葡萄糖 




i. 甲醇, 


J. B. C. 237, 3577 (1962) 


(1962) 


Adenosine-5*- 




丙酮, 乙醅 


B. B. A. 91, 1 (1964) 




diphosphate D- 










glucose (ADPG) 










胞苷 -5'- 二碟酸 


506.3 


S. 水 


J. A. C. S. 77, 250 (1955) 


B. B. A. 40, 425 (1960) 


胆碱 






J. B. C. 222, 185 (1956) 


J. B. C. 235, 37 (1960) 


u 








B. J. 78, 209 (1961) 


phosphate choline 










胞苷- 5'- 二碟酸 


565.3 




B. B. R. C. 7, 1 (1962) 




D- 葡萄糖 










CDPG 










鸟苷- 5'- 二确酸 


605.3 




B. J. 75, 428 (1960) 




D- 葡萄糖 






J. B. C. 237, 1260 (1962) 




Guanosine 






B. B. A. 91, 1 (1964) 




5' - diphosphate 






J. C. S. 1961, 2574 




D - glucose 










胸腺- 5'- 二磯酸 


564.4 


S. 水 


J. B. C. 263, 1791 (1961) 


J. B. C. 237, 3041 (1962) 


D- 葡萄糖 




i. 甲醇, 


J. B. C. 237, 3014 (1962) 




Thymidine 




丙酮, 乙链 






5'-diphosphate 










D-glucose 










尿苷 -5'- 二碟酸 


607.4 




B. B. A. 46, 595 (1961) 


J. B. C. 203, 1055 (1953) 


N- 乙醜葡 萄糖胺 






Meth. Enzymol. 6, 777 (1963); 




Uridine 5'- 






8, 147 (1966) 




diphosphate 






Meth. biochem. Anal. 




N-acetylglucos- 
3 mine 






10, 107 (1962) 




UDPAGal 











• 296 . 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


尿苷- 5'- 二 酸 


566.4 


s. 水; 甲醇; 


Arch. B. B. 33, 186 (1951) 




D- 半乳糖 




i. 丙嗣 


J. B. C. 223, 977 (1956) 




Uridine 5 






J. A. C. S. S3. 659 (1961) 




diphosphate 






Meth. biochcni. Anal. 10, 




D- galactose 






107 (1962) 




尿苷- 5'- 二碟酸 


580.3 




B. B. A. 53, 589 (1961) 




D- 半乳 糖酸酸 






Arch. B. B. 78, 401 (1958) 




Uridine 5' - 






J. B. C. 235, 910 (1960) 




diphosphate 










D-galacturonic acid 










尿苷- 5'- 二碟酸 


566.4 


s. 水, 甲醇 


B. J. 51, 426 (1952) 


Meth. biochem. Anal. 


D- 葡萄糖 




«• 丙酮, 


J. B. C. 223, 977 (1956) 


10, 107 (1962) 


Uridine 




乙 


B. B. A. 26, 146 (1957) 


Meth. Enzymol. 2, 676 


5-diphosphatc 






Meth. Enzymol. 6, 777 (1963) 


(1955); 3, 968, 974 


D-glucose 






J. A. C. S. 83, 659 (1961) 


(1957) 


尿苷 -5'- 二碟酸 


580.3 


S. 水 


B. J. 59, 279 (1955) 




D- 葡萄 糖酸酸 




»• 甲醇 J 丙嗣 


J. A. C. S. 79, 2342 (1957) 




Uridine 5 -di- 






J. B. C. 228, 357 (1957) 




phosphate 






J. Biochem., Tokyo 51, 




D-glucuronic acid 






277 (1962) 
Biochemistry 1, 1171 (1962) 




尿苷 -5'- 二磷酸 


550.3 




B. B. A.33, 276 (1959) 




L- 鼠李糖 






B. B. R. C. 8, 204 (1962) 




Uridine 5' - di- 






Arch. B. B. 103, 276 




phosphate 






、丄 vco J 




L-rhaninose 










尿苷 -5'- 二磯酸 


536.3 




J. B. C. 223, 977 (1956) 




D- 木糖 






Meth. Enzymol. 6, 782 




Uridine 5' - di- 






(1963) 




phosphate 










D- xylose 











5. 碟酸醋 类物质 



名 称 


分子量 


制 备方法 


分 析方法 


碟酸 精氨酸 


254.2 


B. J. 62, 358 (1956) 


B. J. 63, 153 (1956) 


Argininc 




B. J. 92, 429 (1964) 




phosphate 








脱 氧核糖 -5- 碟酸 


214.1 


J. B. C. 215, 389 (1955) 


Biochem. Preps. 9, 35 (1962) 


Deoxyribosc-5- 




J. B. C. 198,885 (1952) 




phosphate 




Biochem. Preps. 9, 35 (1962) 
J. B. C. 235, 1292 (1960) 




D -果糖 -1, 6- 二碟酸 


340.1 


J. A. C. S. 64, 2722 (1942) 


J. B. C. 208, 55 (195-1) 


D-Fructose-l , 




Arch. B. B. 3, 33 (1944) 


、' 
1 — ■ 

Cm 


6 - diphosphate 




Biochem. Preps, 2, 52 (1952) 
Meth. Fnzymol. 3, 240 (1957) 
B. Z. 161, 240 (1925) 


Arch. B. B. 74, 326 (1958) 



• 297 • 



续 表 



名 称 


分子量 


制 备方法 


分 析方法 


D- 果糖- 1- 磯酸 


260. 


1 


J. B. C. 201, 645 (1953) 


Meth. Enzymol.3, 171 (1957) 


D-Fructose-1- 






Meth. EnzymoJ, 3, 169 (1957) 




phosphatc 






Biochein. Preps. 7, 58 (1960) 




D- 果糖 -6- 磯酸 


260. 


1 


Arch. B. 3, 33 (1944) 


Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


D - Fructose - 6- 






Meth. Enzymol. 3, 167 (1957) 




phosphate 










«-D- 葡萄糖 - 1- 


260 


1 


J. A. C. S. 66, 560 (1944) 


B. J. 53, 157 (1953) 


碑酸 






Biochem. preps. 4, 63 


J. B. C. 208, 55 (1954) 


a-D-Glucose-1- 






(1955) 




phosphate 






B. J. 59, 203 (1955) 




D- 葡萄糖 -6- 碟酸 


260 


1 


Biochem. Preps. 2, 39 (1952) 


J. B. C. 208, 55 (1954) 


D-Glucose-6- 






Biochem. Preps. 3, 71 (1953) 


Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


phosphate 






B. J. 59, 13 (1955) 




D-1, 3- 二 碑酸甘 


266 





B. Z. 301, 135 (1939) 


B. Z. 303, 132 (1939) 


油酸 










D - Glyceric acid 










1,3 - diphosphate 










D- ( — ) -3- 碟酸 甘油酸 


186 


1 


Arch. B. 3, 105 (1944) 


B. Z. 297, 60 (1938) 


— )Glyceric acid-3-phosphate 






J. B. C. 226, 777 (1957) 




L-a- 甘油碟 銑胆喊 


275 


2 


B. J.62, 689 (1956) 


J. B. C. 197, 601 (1952) 


L-a-GIyceryl-phosphoryl- 






J. B. C. 161, 523 (1945) 


J. B. C. 212, 887 (1955) 


choline 






Biochem. Preps. 6, 16 (1958) 
J. B. C. 220, 1 (1956) 


B. J. 62, 693 (1956) 


L- a- 甘 油碟醜 乙醇胺 


215 


2 


J. A. C. S. 75, 4510 (1953) 


J. B. C. 212, 887 (1955) 


L-a-Glycerylphosphoryl- 






B. J. 50, 449 (1952) 




ethanolamine 










甘油碟 酰肌醇 


334 


2 


B. J. 71, 195 (1959) 


B. J. 71, 195 (1959) 


Glyceryiphos- 






J. A. C. S. 81, 2591 (1959) 




phorylinositol 






J. B. C. 236, 1907 (1961) 




甘 油碟銑 丝氨酸 


259 




J. A. C. S. 81, 2167 


J. B. C. 212, 887 (1955) 


Glycerylphos- 






(1959) 




phorylserine 






B. J. 71, 195 (1959) 




磯 酸烯醇 丙酮酸 


168 





B. Z. 273, 60 (1934) 


B. Z. 273, 60 (1934) 


Phosphoenolpyruvic acid 






J. B. C. 180, 145 (1949) 
J. B. C. 190, 21 (1951) 










B. B. A. 78, 732 (1963) 










Biochem. preps. 11, 101 (1966) 




核糖 -1- 碟酸 


230 


1 


J. B. C. 167, 477 (1947) 


J. B. C. 162, 421 (1946) 


Ribose - 1 -phosphate 






J. B. C. 193, 497 (1951) 
J. A. C. S. 79, 441 (1957) 




D- 核糖 -5- 碟酸 


230.1 


Arch. B. b. lyjy (^丄 251 J 


J. rS. l^. ID/, JO? 、丄 "/J 


D-Ribose-5 -phosphate 






J. A. C. S. 75, 1153 (1953) 
J. A. C. S. 76, 5523 (1954) 
B. J. 58, 503 (1954) 


Arch. B. B. 74, 306 

(1958) 


D- 核爾糖 -5- 碟酸 


230. 


1 


Meth. Enzymol. 9, 41, 46 (1966) 


Arch. B. B.74, 306 (1958) 


D-Ribu lose - 5- phosphate 






Arch. B. B. 74, 295 (1958) 
J. B. C. 236, 2975 (1951) 


J. B. C. 196, 135 (1952) 



• 298 ♦ 



续 表 



名 称 


分子量 


制 备方法 


分 析方法 


1> 木爾糖 -5- R 酸 


230.1 


J. B. C. 223, 993 (1956) 


Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


D-XyluIose-5- 




Meth. Enzyinol.9, 41 (1966) 




phosphatc 









6. 固酵 类物质 的制备 



々 14: 


TTjM. 




^1 & -fr it 
制含力 74: 


yTvT/} fK 


可的松 


360.4 


S. 甲醇乙 


J. B. C. 114, 613 (1936) 


J. clin. Endocr. Metab. 


Cortisone 




醇, 丙 m 


J. A. C. S. 74, 4223 (1952) 


12, 519 (1952) 






SI. s. 乙链, 




B. J. 54, 523 (1953) 






苯, 氯仿 






氢化 可的松 


362.4 


S1.S. 水 


J. B. C. 124, 459 (1938) 


J. clin Endocr. Metab. 


Hydrocortisone 




S. 冰 醋酸, 


J. B. C. 175, 451 (1948) 


21, 1146 (1961) 






氯仿, 甲醇 






17/3- 雎 (留) 二醇 


272.4 


i. 水 


J. B. C. 115, 435 (1936) 


J. Endocr. 16, 49 (1957) 


OestradioI-17/3 




S. 乙醇, 


J. B. C. 134, 391 (1940) 








丙銅 及滅液 


B. J. 34, 1293 (1940) 










Ber. 74, 1914 (1941) 




雌 (甾) 三醇 


288.4 


Sp.s. 水 


B. J. 24, 435, 1021 (1930) 


J. Endocr. 16, 49 (1957) 


Ocstriol 




S. 乙醇, 


Nature, Lond.131, 766 (1933) 








m 仿, 乙 链 


J. B. C. 91, 641, 655 (1931) 




雜 

m 


270.4 


S. 稀滅 


Am. J. Physiol. 90, 329 (1929) 


J. Endocr. 16, 49 (1957) 


Oestrone 




i. 水 


B. J. 34, 1293 (1940) 








4.0 乙醇 






脱氢 可的松 


358.5 


Sp- S. 水 


Science 121, 176 (1955) 




Prednisone 




0.67 乙醇 


J. A. C. S. 77, 4781 (1955) 




孕 (甾) 二醇 


320.5 


Sp.s. 有 机溶剂 


J. B. C. 143, 716 (1942) 




Pregnanediol 






J. A. C. S. 60, 2931 (1938) 




孕 (a) 煤醇 S 


316.5 


Sp.s. 水 


Ber. 67, 1611 (1934) 




Pregnenolone 




17 氯仿 


J. A. C. S. 71, 1840 (1949) 








2 乙醇 


J. B. C. 174, 925 (1948) 




睾 (甾) 鬭 


288.4 


i. 水 


Z. B. C. 233, 281 (1935) 




Testosterone 




S. 乙醇, 乙链 


Z. P. C. 237, 89 (1935) 








有 机溶剂 


Ber. 71, 2278 (1938) 




氟经脱 S 皮质 甾醇 


394.4 


S. 丙 爾、 


J. A. C. S. 78, 5693 (1956) 




Triamcinolone 




乙醇, 氯仿 


81, 1689 (1959) 




脱氛皮 (^) 醇 


360.5 


SI.S. 水 


Science 121, 176 (1955) 




Prednisolone 




3.3 乙醇 


J. A. C. S. 77, 4781 (1955) 








0.55 氯仿 






雄固酵 炼二嗣 


288.4 


S. 乙 链 ,本 


Ber. 68, 2097 (1935) 




Androstanedione 






J. B. C. 172. 263 (1948) 




皮质 (^) 銅 


346.4 


S. 乙醇 


J. B. C. 114, 613 (1936) 


J. clin. Endocr. Metab. 


Corticosterone 




有 机溶剂 




21, 1146 (1961) 






i. 水 







• 299 • 



7. 胺, ft 胺, £ 基酸, 多 肽及其 衍生物 的制备 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 




226. 1 






IVlClll* 1X1 CU- IVCda 1 l^J 


Acetylcholine 


乂" 1 J 


i. 乙链 5 苯 


J. gen- Cheni, U. S. S. R. 28, 


0960 








3040 /^i QS8^ 






1832 


。• kNhh^j 


Am T PVivcinl 4S7 


LVlCLIla IllCvi* IxCd* «r 9 1 iaJ 


A M n Q 1 1 n ^ 
\J i\\XV C J Id E lUC 




W 敗 3 脚 




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DCl • *f 9y i \j\J U \^l.y£m\j J 








7 賠 










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£>• J ■ 、丄 7J 丄乂 


/iHd J y L> ^iiciii* A u / J7 


r - Amino - butyric acid 






Arch R R 4fi 74(1 








薛 ^ 
醉, 不 


g» oy ni.n» v>oii* 厶 _J 7 t j ^ 




T At!; Rn 


ZiU . 3 


\7 C -, U 

V- i>. 7JC 


J* Biochem*, Tokyo 54, 


J. JD. l^. 厶 J9, 丄 >?,0 )' 


L 一 Anserine 




CI c 田媳 

s. 干 a?5 


^4Q ^fi^ 


R T 81 Qfi /'I Qfil A 

D* J ■ Oi> -' O ^ I 7 U 1 》 








T Orcr PKpm M 1 Q(s9, C\QM'\ 

J • V_/l g> \_/ItClIl* 丄 V 1 7 U T J 






290.3 


V. o. ^ 


1 R p 204 QS 

J • ij» V-** y J 乂 X: y J J 


1 R p 204 1 IS 

J • D* v>» 、L y -J J 


L— ArgininO'Succinic 




i 7 敏 




KT-,f,l T r»nH 1Q2 








B. 1 77 135 /']960^ 


n96n 

VI 7Ui 乂 


厂 妝 


102.2 




IPS 782 


Matiirr T onfi 197 290 


Cadav erinc 






Rpr Qfl 1 9^1 








腿 






内 


161.2 






ArrVi R R 75 24 ri958> 


Carnitine 






Arch R B fifi 1 n (\ QS7^ 


Analvt Phpm 32 870 






0Ir]> 并内醉 


7 p p ^Ifi 1 9Q ,1QM、 


0/1 ^>丄 J 












h- 肌讽 


226 2 


。厶 iK 


U1UV.UCI11* X 1 CLJda ,j -J u 


L B. C. 235, 1398 (I960) 


L - Csirnosinc 








B. J, 81, 98 (1961) 








Del - Z>/UO 、丄; 丄乂 






























\ i PKtJ J y , J,7 y_ 1 J7 U J y 




L- 瓜氣酸 




s, 水 


Diocneni. i reps- 3^ i uu, 


J • £3* V_y. £iU9, IT-? 、丄 乂 


L-Citrulline 




i. 甲醇 


104 riQ'^?^ 
丄 u" \i.y J -J J 
















4556 


V s 7k" 


J. B. C. 213, 171 (1955) 


Acta Endocr. 29, 70 (1958> 


ACTH 




SI s T 酸 


Science 124, 934 (1954) 


Endocrinology 71, 13 


Kj%JI IILULI U 1 J 1 L 1 11 




" i< r3 f31。J 


J. A. C. S. 78, 5051 (1956) 


0962;) 








M'itiirf> T nnH 199 1 72 










、丄 yco^ 




T 0/2 A ― ¥义 

L-p-C^? 4 -一径 






Biochcit). Preps. 1, 25 


cpr 90 1687 n957、 


基苯) 丙氣酸 




s. 酸或碱 


(1949) 




L-^-(3, 4-Dihydr- 




i. 乙醇, 乙 






oxyphenyl) 




m 






alanine (DOPA) 










3, 5- 二碘 酷氧酸 


433.0 


s. 碱液 


B. J. 39, 157 (1945) 


Meth. Enzymol.4, 856 (1957) 


3,5-Diiodotyro3inc 






Biochem. Preps. 10, 171(1963) 


Meth. biochem. Anal. 12, 








Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) 


143 (1964) 



• 300 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


L- 谷 胱甘状 (氧 


612.6 


s. 水 


J. B. C. 90, 409 (1931) 


Bergmeycr. Methods of 


化型) 




i. 乙醇, 乙 K 


J. B. C. 194, 119 (1952) 


Enzymatic Analysis, 


L - Glutathione 






Biochcm. Preps, 9, 52 (1962) 


p, 363, Academic press 


oxidized GSSG 








(1963) 


L- 谷 胱甘狀 


307.1 


s. 水 


Biochem. Preps. 2, 87 


Arch. B. B. 82, 70 (1959) 


(还 原型) 




i. 乙醇, 乙继 


(1952) 


Analyt. Biochem. 8, 217 


L-Glutathione 






J. C. S. 1957, 880 


(1964) 


reduced GSH 






Ber. 97, 2434 (1964) 










Meth. Enzymol. 3, 603 (1957) 




5- 经色胺 


176.2 


2",10'。o 水 


J. gen. Chem. U. S. S. R. 


Meth. Enzymol. 6, 598 


5-Hydroxytrypt- 




S. 冰醋酸 


34, 1605 (1964) 


(1963) 


araioe 




S1. S. 甲醇, 


J. C. S. 1961, 2919 


Meth. biochem. Anal. 






95% 乙醇 


J. Org. Chem. 24, 894 


6. 95 (1958) 






«• 丙酮 > 乙链, 


(1959) 


Analyt. biochem. 6, 393 






苯 


J. C. S. 1958, 3493 


(1963) 


P3l»Sg 乙酸 


175.2 


0.16 水; 


tier. 85, 323 (1952) 


Analyt. Biochem. 4, 42S 


Indolacetic 




V.S. 乙醇; 


J. A. C. S. 75, 3589 (1953) 


(1962) 






S- 丙酮, 乙链; 


Ber. 91, 1141 (1958) 








SI. s. 


J. Org. Chem. 28, 589, 








i. 氯仿 


1246 (1963) 




3- 碘 酩氨酸 


307.1 


6.7 


B. J. 38, 320 (1944) 


Meth. biochem. Anal. 


3-Iodotyrosinc 




SI. s. 


Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) 


12, 143 (1964) 








Nature, Lond. 197, 180 (1963) 




犬 尿氨酸 


208.2 


s. 水 


Biochem. Preps 3, 108 (1953) 


B. J. S3, 379 (1953) 


Kynureninc 






J. A. C. S. 76, 1708 (1954) 


J. B. C. 219, 985 (1956) 








C. A. 47, I2489d (1953) 




去 甲基肾 上腺素 


169.2 


s. 矿酸, 滅 


J. A. C. S. 75, 1757 (1953) 


Arch. B. B. 85, 345 (1959> 


Noradrenaline 




SI.s. 水, 


J. A. C. S. 77, 2896 (1955) 


Meth. med. Res. 9, 125 






甲醇, 乙链 




(1961) 


鸟氨酸 


132.2 


V. s. 水 


Biochem. Preps. 3, 97 (1953) 


B. J. 39, 46 (1945) 


L - Ornithine 




SI.S. 乙链 


Ber. 91, 2418 (1958) 


1、 

ON 
— < 

> 








C. A. S3, 19904i (1959) 




催产素 


1007 


s. 水 


J. A. C. S. 81, 2504 (1959) 


Endocrinology, 71, 


Oxytocin 




SI.S. 丙銅 


J. B. C. 233, 116 (1958) 


196 (1962) 


肌氨酸 


89.1 


4.81" 水 


J. A. C. S. 76, 3213 (1954) 


J. B. a 200, 803 (1953) 


Sarcosinc 




SI.s. 乙醇 


1 r~* c 10 2 1 1 QOA 




L- 甲 状腺素 


776.9 


S. 璩 


J. C. S. 1949, 3424 ' 


Meth. Enzymol.4, 856 


L- thyroxine 




S1.S. 水 


Ber. 96, 1 (1963) 


(1957) 






i. 乙醇, 乙 


Biochem. Preps. 10、 171, 


Meth. biochem. Anal. 






m 


176 (1963) 


12, 143 (1964) 








Meln. ^nzyinoi* o DO 










(1957) 




3, 5, 3'- 三确 -L- 


651.0 


S. 搣 


B. J. 53, 645 (1953) 


同 L- 甲 状腺素 


甲 状腺素 




S1. S. 水 


Ber. 96, 1 (1963) 




3j5,3',-Triodo-L- 






Meth. Enzymol. 4, 856 




thyroxine 






(1957) 





• 301 . 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备方法 


分 析方法 


色 胺 


160.2 


V.S. 乙醇, 


Ber. 85, 324 (1952) 


Meth. med. Res. 9, 169, 


Tryptamine 




丙酮 


J. Org. Che in. 23, 146 


175 (1961) 






SI.S. 水, 


(1958) 


Analyt. Chem. 32, 666 






乙 魅 


J. A. C. S. 82, 2386 (1960) 


(1960) 


后叶 加压素 


1084 


S. 水 


J. B. C. 222, 951 (1956) 


Methods in Hormone 


(抗 利尿 激素) 




»• 丙嗣 


J. B. C. 233, 116 (1958) 


Research, vol. 2, p. 495, 


Vasopressin 






J. A. C. S. 82, 3195 (i960) 


Academic Press (1962) 



8. 某 些生物 大分子 的制备 



名 称 


分子量 


溶解度 


' 制 备及测 定方法 


清蛋白 (卵) 


45,000—46,000 


s. 水 


B- J. 30, Z17 (1936} 


Albumin 






The Proteins, cds. Neurath and Bailey, 








vol. 2A, p, 443, Academic Press, New York 








(1954) 


支 链淀粉 


o 


s* 水, 甲 


Modern Methods of Planl Analysis, 


Amylopectin 




酷 胺 


vol. 2, p. 166, Springer, Berlin (1955) 


直 链淀粉 


O 

o 


s. 稀滅, 


Modern Methods of Plant Analysis, 


Aniylose 




m xrt- p*t» 
甲 K 胺 


vol. Z, p. loo, Springer. Berlin (19)5) 


抗生物 素蛋白 


o 
o 


s. 水 


Arch. B. B. 39, 80(1952) 


Avidin 






B. J. 89, 591 (19o3_) 








B. J. 92, 16c (1964") 


酷蛋白 


75,000—100,000 


s. 稀碱, 


J. A. C. S. 66, 1725 (1944) 


Casein 




矿 酸 


The Proteins, eds. Neurath and Bailey, 






1. 乙醇, 乙魅 


vol. 2A, p. 397, Academic Press, New York 








(1954) 








Analyt. Biochem. 9, 423 (1964) 








J. A. C. S. 84, 4929 (1962) 


纤维素 (包括 DEAE, 


600,000 


i. 水, 乙醇, 


Methods in Carbohydrate Chemistry, vol. 


CM 和碟酸 




乙链, 氯仿 


3 (1963) 


化衍 生物) 




S. 浓 硫酸, 


Modern Methods of Plant Analysis, vol. 


Cellulose 




发烟 盐酸, 浓 


2, p. 197, Springer, Berlin (1955) 






碟酸, 氣氧化 


DEAE, CM 及碟酸 化衍生 物见: 






铜的氨 溶液, 


Biochem. Preps. 8, 39, 45, 47 (1961) 


几 丁质, 壳多糖 




S. 浓酸 


Adv. Carbohyd. Chem. 15, 371 (1960) 


Chitn 




i. 水 


测定方 法见透 明质酸 


硫酸 软骨素 


25,000—30,000 


S. 水 


J. B. C. 211, 605 (1954) 


Chondroitin 








硫酸 软骨素 A 和 C 


o 


S. 水 


硫酸 软骨素 A 与 C 在与 其他酸 性多糖 分离提 取吋, 二者 


Chondroitin sulphates 






常混在 一起, 因需进 一歩用 色谱法 纯化。 


A and C 






B. B. A. 21, 506 (1956) 








硫酸 软骨素 A, Meth. Enzymol. 3, 20 (1957) 








硫酸 软骨素 C, J. B. C. 215, 685 (1955) 


硫酸 软骨素 B 


1 

CD 


S. 水 


J. B. C. 233, 541 (1958) 


Chondroitin B 






B. B. A. 21, 506 (1956) 








硫酸 软骨索 A. B. C. 的测 定见透 明质酸 的方法 



• 302 • 



续 表 



名 称 


分子量 


f§ ^ g 


制备及 测 定方法 


葡聚糖 




s. 水, 


Adv. Carbohyd. Chcni. 15, 341 (1960) 


右 旋糖軒 




甲酰胺 




Dextran 








脱氧核 糖核酸 


6—120 


S1.S. Tjc; 


J. molcc. Biol. 3, 208 (1961) 


Deoxyribonucleic 


百万 


S.1— 3W 盐 


Nature, Lond. 191, 1375 (1961) 


acid DNA 




成 胶液, 稀碱; 


Prog. Nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) 






i. 有 机溶剂 


测定方 法见: 








B. J. 62, 315 (1956) 








J. B. C. 213, 107 (1955) 








Meth. Biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958) 








14, 113 (1966) 


糖 原 


1—10 


V.S. 水; 


Adv. Carbohyd, Chem. 12, 262 (1957) 


(动物 淀粉) 


百万 


S. 热 乙醇; 


J. A. C. S. 64. 2349 (1942) 


Glycogen 




i. 冷乙醇 


J. B. C. 199, 97 (1952) 








测定方 法见: 








J. B. C. 220, 583 (1956) 


血 红蛋白 


67,000 


S. 水 


J. B. C. 127, 123 (1939) 


Haemoglobin 






Arch. B. 21, 224 (1949) 








J. B. C. 185, 231 (1950) 








J. Lib. Clin. Med. 46, 255 (1955) 








测定方 法见: 








Nature, Lond. 175, 903 (1955) 


硫酸乙 醜肝素 


CD 
O 


S. 水 


J. B. C. 235, 3283 (1960) 


Heparan sulphate 






B. B.A. 29, 443 (1958) 








测定方 法见透 明质酸 


组蛋白 


oo 
o 

g 


S. 水, 稀酸; 


Phillips, Prog. Biophys. Chem. 12, 21 (1961) 


Histones 




'- 氣水 




透 明质酸 


0.1—10 


S. 水 


B. B. A. 69, 574 (1963) 


Hyaluronic acid 


百万 




J. B. C. 239, 726 (1964) 








B. J. 92, 34p (1964) 








测定方 法见: 








Meth. biochem. Anal. 2, 313 (1955) 








Meth. Enzymol. 3, 73 (1957) 








Meth. biochem. Anal. 8, 145 (960) 


菊 粉 


3000—5000 


Sp.s. 水, 


Modern Methods of Plant Analysis, vol. 


Inulin 




乙 醇 


2, p. 189, Springer, Berlin (1955) 








J. B. C. 51, 275 (1922) 








P. S. E. B. M. 74, 117 (1950) 


硫酸 角质素 


o 
o 

o 


S. 水 


J. B, C. 205, 611 (1953) 


Keratan sulphate 






Acta chem. scand. 11, 668 (1957) 


/3- 乳 球蛋白 


35,000—42,000 


S. 水 


B. J. 58, 332 (1954) 


/3-Lactoglobulin 






Biochem. Preps. 4, 23 (1955) 








Acta Chem. scand. 16, 2067 (1962) 


昆 布多糖 




S. 水 


Modern Methods of Plant Analysis, vol. 


Laminarin 






2, p. 178, Springer, Berlin (1955) 


果聚糖 (左 聚糖) 




S. 水 


J. B. C. 140, 105 (1941) 


Levan 









• 303 • 



续 表 



名 称 


分子量 


溶解度 


制 备及测 定方法 


肌 红蛋白 


18,500—18,800 


S. 水 


Arch. B. B. 91, 319 (1960) 


Myoglobin 






J. B. C. 236, 2238 (1961) 








Arch. B. B. 91, 310 (1960) 








Nature, Lond. 198, 1201 (1963) 


果胶酸 


60,000—80,000 


S. 稀酸 


B. J. 47, 437 (1950) 


Pectic acid 








鱼 精蛋白 


8000 


S. 水, 稀 


J. Gen. Physiol. 30, 101 (1946") 


Protamine 


鲑 精蛋白 


酸, 氨水 


B. B. A. 91, 416 (1964) 








Adv. Protein Chem. 15, 1 (1960) 


核 糖核酸 


10,000— 


S1. S. 水; 


B. J. 96, 266 (1965) 


Ribonucleic acid 


2,000,000 




B. J. 93, 5c (1964) 


(RNA) 




i. 有 机溶剂 


B. N. R. C. 13, 61 (1963) 








Progr. nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) 








J. B. C. 198, 297 (1952); 221, 635 (1956) 








Meth. biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958)? 








14, 113 (1966) 


烟草花 叶病毒 


40X10' 


S. 水, 生理 


Biochem. Preps. 9, 132 (1962) 


Tobocco mosaic 




盐 水 












转运核 糖核酸 


24,000—30,000 


S. 水 


Prog. Nucl. Acid Res. 2, 259 (1963) 


Transfer-RNA 






J. B. C. 236, 200 (1961) 


(tRNA) 






J. B. C.236, 1726, 1741 (1961) 








J. Molec. Biol. 4. 347 (1962) 








B, B. A. 80, 574 (1964) 








Meth. Enzymol. 12B, 166, 169, 173 (1968) 



• 304 • 



附录二 部 分国际 单位换 算及缓 冲液配 制方法 

A. 部分 国际单 位及换 算方法 

1. 长 度单位 

米 (m) = 10 分米 (dm) = 100 厘米 (cm) = 10' 毫米 (mm) = 10' 微米 (juxn) = 10' 纳米 (nm) 

= 10"' 埃 a) 

1 英寸 =2. 539998 厘米 

2. 体 积单位 

升 (1) = 10 分升 (dl) = 100 厘升 (cl) = 10' 亳升 (ml) = 10' 微升 (fxl) 

3. 重 量单位 

公斤 (kg) = 10' 克 (g) = 10^ 分克 (dg) = 10' 厘克 (eg) 
= 10' 毫克 (mg) = 10' 微克 (jug) 
1 克 (g) = 毫克 (mg) = 10' 微克 (;^ g) 
1 市斤 = 500 克 
1 榜 -453. 59237 克 

*■ 浓 度单位 

1 克分 子浓度 = Imol/L = 10»mol/m' (mole 译为 中文: 摩尔) 



5. SI 单位 制所用 的词头 



因 数 


词 头 


符 号 


因 数 


词 头 


符 号 


10 


十 


deca (da) 


10-2 


厘 


centi (c) 


10: 


百 


hecto (h) 


10—3 


毫 


E 
E 


10' 


千 


kilo (k) 


10— « 


微 


micro (ju) 


10' 


兆 




10-' 


纳 (诺) 




10, 


吉 (咖) 


giga (G) 


10-" 


皮 (可) 


pico (p) 


10" 


太 (拉) 


tera (T) 


10—', 


飞 (母托 ) 


femlo (f) 


10-' 


分 


deci (d) 


10-" 


阿 (托) 


atto (a) 



6. SI 单 位制导 出单位 的名称 及符号 





SI 


SI 


SI 


SI 


量 的名称 












单 位名称 


单 位符号 


单 位定义 


单位 相当量 


能量 


焦 (耳) 


J 


m'kgs— 2 


N • m 


力 


牛 (顿) 


N 


mkgs~* 


kg • m/s' 


压力 


帕 (斯卡 ) 


Pa 


m~'kgs~* 




功率 


瓦 (特) 


W 


in*kgs~' 


Js-» 


电荷 


库 (仑) 


C 


As 


JV-' 


电位; 电压 


伏 (特) 


V 


m'kgs"'A"' 


WA—i 


电阻 


欧 (姆) 


Q 




VA— ' 


电导 


西 (门子 ) 


S 


in"'kg"'s'A' 


AV-» 


电容 


法 (拉) 


F 


< 

's 


CV-' 


光通量 


流 (明) 


Im 


cd • sr 





• 305 • 



续 表 





SI 


SI 


SI 


SI 


量 的名称 












单 位名称 


单 位符号 


单 位定义 


单位 相当量 


光照度 


勒 (克斯 ) 


Ix 


m"^cclsr 


Imm— 2 


频率 


赫 (兹) 


Hz 


s 一 1 





7. SI 单位制 (米 一千克 一秒) 基本物 理量数 及符号 



物 理量数 


SI 单位 制名称 


符号 


基 本单位 






长度 


米 


m 


质量 


千克 (公斤 ) 


kg 


吋间 


秒 


s 


电流 


安 (培) 


A 


热力 学温度 


开 (尔文 ) 


K 


发 光强度 


坎 (德拉 ) 


cd 


物 质的量 


摩 (尔) 


mol 


补 充单位 






平面角 


弧 度 


rad 


立体角 


球面度 


sr 



8. 一些 常用的 "C.G.S" 制 单位与 SI 单 位制换 算举侧 

(1) 压力; 每平方 英寸上 1 碌 = 6894.76Pa 
每 1 毫 米汞柱 (托) =133.322Pa 

1 大气压 = l(U325Pa 
1 毫巴 = 100Pa 
1 巴 = 10,Pa 

(2) 能: 1 尔格 = 10— 'J 

1 升!" 大气压 -101.328J 
1 卡 (热 化学) 

1 卡 (国 际表) (Cal) - 4.1868J 
1 卡 15°C (Call 5) = 4. 1855J 
电子伏 (特) (eV) = 1.6021 X 10-"J 

(3) 温度: 0°c=273. 15K 

CF = 459.67k: 

(4) 放 射性: 1 居里 (ci)-3.7 X lO'Os- ' (贝可 ) 

(5) 照明: 1 英尺 -烛光 = 10.76931x (勒 克斯) 

1 平方 英尺- 流明 =10.7639bc 
1 平方米 -流明 (光 通量) =llx 

B. 生化分 离制备 一些常 用缓冲 液的配 制方法 



1. 挥发性 缓冲液 (pHl. 9—8.9) 



pH 范围 


组 份 


1.9 


87 毫升冰 醋酸, 25 奄升 88% 甲 酸用水 稀释至 1 升 


2.1 


25 毫升 88% 甲酸, 用水 稀释至 1 升 


3.1 


5 毫升 吡啶, 100 毫升冰 醋酸, 用水 稀释至 1 升 



. 306 . 



续 表 



PH 范围 


组 份 




5 毫升吡 淀, 50 亳升冰 醋酸, 用水 稀释至 1 升 


4.7 


25 毫升 % 淀, 25 毫升冰 醋酸, 用水 稀释至 1 升 


6.5 


100 毫升 吡啶, 4 毫升冰 醋酸, 用水 稀释至 1 升 


7.9 


0.03M NH.HCOj 


8.9 


(NHO2CO3 (20 克 / 升) 溶液 



["Data for Biochemical Research" 2nd Fdition P. 505— 506 (1969)] 



2. 挥发性 缓冲液 (高 压电 泳用) 


pH 范 围 


系 统 


接近 1 




醋酸 一甲酸 


2.3-3.5 




•ftl® —甲酸 







吡淀 一醋酸 


3.0-6.0 




* 三甲胺 一甲酸 (或 醋酸) 


5.5-7.0 




三甲基 "% 咬 一醋酸 


7.0-12.0 




* 三甲 胺一二 氧化碳 


6.0— 1C.0 




氨水 一甲酸 (或 醋酸) 






单 (或三 ) 乙醇胺 一盐酸 


8.0—9.5 




碳 酸氢按 一氨水 


* 三甲 胺缓冲 液的使 用参考 Porath, Nature, Lond. 17 


5,478 (1955) 


3. 氣化押 -a 酸 S 冲液 (pH 1.0-2.2) 






25 毫升 0.2 U KCl (14.919 克 / 升), 加 r 毫升 0.2M HC1, 用 蒸馏水 稀释至 100 毫升 


pH, 25 °C 


毫升 0.2AfHCl' 


1.00 




67.0 


1.10 




52.8 


1.20 




42.5 


1.30 




33.6 


1.40 




26.6 


1.50 




20.7 


1.60 




16.2 


1.70 




13.0 


1.80 




10.2 


1.90 




8.1 


2.00 




6.5 


2.10 




5.1 


2.20 




3.9 



[Bower and Bates, ]. Res. natn. Stand. 55, 197 (1955)] 



4. 甘 SK- IkK 缓冲液 (pH2.2— 3.6) 
甘 氛酸分 子量: 75.07 

25毫升0.2«甘氨酸(15.01 克 / 升), 加 * 亳升 0.2WHC1, 用 蒸溜水 稀释至 100 毫升。 



• 307 • 



pH, 25 。C 


Jr 毫升 0.2WHC1 




22 


2.4 


16.2 


2.6 


12.1 


2.8 


8.4 


3.0 


5.7 


3.2 


4.1 


3.4 


3.2 


3.6 


2.5 



[S0rensen, B. Z. 21, 131 (1909); Gomori, Meth. hnzymol. 1. 141 (1955)] 



5. 柠 « 酸 -碟酸 SI 二钠 缓冲液 (pH 2.6-7.6) 

0. lAf 柠 檬酸: 含 柠檬酸 • H2O (分 子量 210. 14) 21.01 克 / 升。 

0.2Af 确酸氢 二纳: 含 Na,HPO< (分 子量 141. 98) 28. 40 克 / 升; 或含 Na,HPCV2H20 (分 子量 178. 05)35. 61 



克 / 升。 

* 毫升 0.1M 柠 樣酸和 y 毫升 0.2Af 碟酸 氢二纳 混合。 



pH 


r 毫升 O.lAf 柠檬酸 


y 毫升 确酸 氢二纳 


2.6 


89.10 


10.90 


2.8 


84 


15 


15 


85 


3.0 


79 


45 


20 


55 


3.2 


75 


30 


24 


70 


3.4 


71 


50 


28 


50 


3.6 


67 


80 


32 


20 


3.8 


64 


50 


35 


50 


4.0 


61 


45 


38 


55 


4.2 


58 


60 


41 


40 


4.4 


55 


90 


44. 


10 


4.6 


53 


25 


46 


75 


4.8 


50 


70 


49 


30 


5.0 


48 


50 


51 


50 


5.2 


46 


40 


53 


60 


' 5.4 


44 


25 


55. 


75 


5.6 


42 


00 


58. 


00 


5.8 


39. 


55 


60.45 


6.0 


36. 


85 


63. 


15 


6.2 


33. 


90 


66. 


10 


6.4 


30.75 


69. 


25 


6.6 


27. 


25 


72. 


75 


6.8 


22. 


75 


77. 


25 


7.0 


17. 


65 


82. 


35 


7.2 


13. 


05 


86. 


95 


7.4 


9. IS 




7.6 


6. 


35 


93. 


65 



[Mcllvaine, J. B. C. 49, 183 (1921)] 



6. 广泛 3 冲液 (pH2.6 — 12.0) 

每升 混合液 内含: 柠橡酸 6.008 克, 8? 酸 二氧押 3.893 克, 硼酸 1.769 克, 巴比妥 5.266 克。 
• 308 . 



每 100 毫 升混合 液滴加 * 毫升 0.2;VNaOH 至 所需要 pH 值 (18。(:) 



pH 


"亳升 0. 


22VNaOH 


pH 


r 毫升 0.2A/NaOH 


pH 


; « "毫升 0.2iVNaOH 


2.6 


2 





5 


8 


36 


5 


9.0 


72 


7 


2.8 


4 


3 


6 





38 


9 


9.2 


74 





3.0 


6 


4 


6 


2 


41 


2 


9.4 


75 


9 


3.2 


8 


3 


6 


4 


43 


5 


9.6 


77 


6 


3.4 


10 


1 


6 


6 


16 





9.8 


79 


3 


3.6 


11 


8 


6 


8 


48 


3 


10.0 


80 


8 


3.8 


13 


7 


7 





50 


6 


10.2 


82 





4.0 


15 


5 


7 


2 


52 


9 


10.4 


82 


9 


4.2 


17 


6 




4 


55 


8 


10.6 


83 


9 


4.4 


19 


9 




6 


58 


6 


10.8 


84 


9 


4.6 


22 


4 




8 


61 




11.0 


86 





4.8 


24 


8 


8 





63 




11.2 


87 


7 


5.0 


27 


1 


8 


2 


65 


6 


11.4 


89 




5.2 


29 




8 


4 


67 




11.6 


92 





5.4 


31 


.8 


8 


6 


69 




11.8 


95 





5.6 


34 




8 


8 


71 





12.0 


99 


6 



[Johnson and Lindsey, Analyst 64, 490 (1939)] 



7. 拧 《 酸-杆 據酸钠 3 冲液 (pH3.0—6.2) 

O.IM 柠 樣酸: 含 柠檬酸 'HiO (分 子量 210. 14) 21. 01 克 / 升。 

0.1M 柠樣 酸纳: 含柠樣 酸三钠 • 2H2O (分 子量 294. 12) 29. 41 克 / 升, 



pH 


X 毫升 O.lAf 柠橡酸 


y 毫升 O.lAf 柠檬 酸三纳 


3.0 


82 


.0 


18 


.0 




77 




22 


.5 


3.4 


73 


.0 


27 


.0 


3.6 


68 


.5 


31 




3.8 


63 




36 


5 


4.0 


59 





41 





4.2 


54 





46 





4.4 


49 




50 


5 


4.6 


44 


5 


55 




4.8 


40 





60 





5.0 


35 





65 





5.2 


30 




69 


5 


5.4 


25 


5 


74 




5.6 


21 





79 





5.8 


16 





84 





6.0 


11 




88 




6.2 


8 





92 






[N. Hcniinpton and R. M. C. Dawson] 



8. 乙酸- 乙酸纳 缓冲液 (pH3.7_5.8) 

0.2M 乙 酸纳: 含 NaAc'3H,0 (分 子量 136. 09) 27. 22 克 / 升 
0.2M 乙酸: 含 冰乙酸 11. 7 毫升 / 升 



• 309 . 



pH, 18。C 


; r 直? !• 0.2M 
















10 





90 







12 





88 





4 n 


18 





82 





4 9 


26 


5 


73 




44 


37 





63 





45 


49 





51 





4.8 


59 





41 





5.0 


70 





30 





5.2 


79 





21 





5.4 


86 





14 





5.6 


91 





9 





5.8 


94 





• 6 






[Walpole, J. C. S. 105, 2501 (1914)] 



9. 碟酸氧 二钠- 磷酸 二氫钠 缓冲液 (pH5.8 — 8.0) 

Na2HPO,.2H,0 分子量 = 178. 05, 0.2M 溶液含 35. 61 克 / 升 

NajHP0,-12H,0 分子量 = 358. 22, 0.2M 溶液含 71.64 克 / 升 

NaH,PO,-H,0 分子量 138.01, 0. 2M 溶液含 27. 6 克 / 升 

NaH,P0,.2H,0 分子量 156. 03, 0.2M 溶液含 31.21 克 / 升 

* 毫升 0.2似碑 酸氢 二纳加 y 毫升 0.2Af 磯酸二 氢钠, 用 蒸溜水 稀释至 100 毫升。 



pH, 25 °C 


; f 亳升 0.2Af 碟酸 g 二纳 


y 毫升 0.2Af SI 酸 二氢纳 


5.8 


4 





46 





6.0 


6 


15 


43 


85 


6.2 


9 


25 


40 


75 


6.4 


13 


25 


36 


75 


6.6 


18 


75 


31 


25 


6.8 


24 




25 




7.0 


30 


5 


19 






36 





14 





7.4 


40 


5 


9 


5 


7.6 


43 




6 




7.8 


45 


75 


4 


25 


8.0 


47 


.35 




65 



[Gomori, Meth. Enzymol. 1, 143 (1955)] 



10. KHjPO,-NaOH 缓冲液 (0.05Af, pH5.8— 8.0) 

AT 毫升 0.2 WKH,PO« + y 毫升 0.2WNaOH 加水 稀释至 20 毫升 



pH(20。C) 




y 

(毫升 ) 


pH(20°C) 


(毫升 ) 


y 

(亳升 ) 




(毫升 ) 




5.8 




0.372 


7.0 




2.963 


6.0 




0.570 


7.2 




g 


6.2 




0.860 


7.4 




3.950 


6.4 




1.260 


7.6 




"80 



• 310 . 



续 表 







y 






y 


pH(20lC) 






pH(20"\:) 


(毫升 ) 


(S 升) 


升) 


(亳升 ) 




6.6 




1.780 


7.8 




4.520 


6.8 


5 


2.365 


8.0 




4.680 



[潘家 秀等, 蛋 白质化 学研究 技术, 科学 出版社 (1962)] 



11. 巴比妥 缓冲液 (pH6.8_9.6) 





0.04M 巴比 妥钠盐 


0.2iVHCI 




0.04M 巴比 妥纳盐 


0.2A/HC1 


pH(18°C) 




pH(l8。c) 






(毫升 ) 


(亳升 ) 




(毫升 ) 


(亳升 ) 


6.8 


100 


18.4 


8.4 


100 


5.21 


7.0 


100 


17.8 


8.6 


100 


3.82 




100 


16.7 


8.8 


100 


2.52 


7.4 


100 


15.3 


9.0 


100 


1.65 


7.6 


100 


13.4 


9.2 


100 


1.13 


7.8 


100 


11.47 


9.4 


100 


0.70 


8.0 


100 


9.39 


9.6 


100 


0.35 


8.2 


100 


7.21 









巴比 妥钠盐 分子量 = 206. 2,0. 04Af 溶液含 8.25 克 / 升 
[Britton and Robinson, J. Chem. Society 1931, 1456] 



12. 缓冲液 (0.2iVf 硼 酸盐, pH7.4 — 9.0) 





0.05Af 硼砂 

(毫升 ) 


0.2M 硼酸 

(亳升 ) 






0.2Af 硼酸 
(毫升 ) 


PH 


pH 


0.05M 硼砂 
(毫升 ) 


7.4 


1.0 


9.0 


8.2 


3.5 


6.5 


7.6 


1.5 


8.5 


8.4 


4.5 




7.8 


2.0 


8.0 


8.7 


6.0 


4.0 


8.0 


3.0 


7.0 


9.0 


8.0 


2.0 



硼砂 Na2B,O,.10H,O, 分子量 = 381. 43, 0.05 W 溶液 ( = 0.2M 硼砂) 含 19.07 克 / 升, 硼酸 分子量 = 61. 84: 

0.2W 溶液含 12.37 克 / 升 
硼砂易 失去结 晶水, 必须 放带塞 的瓶中 保存, 硼砂溶 液也可 以用半 中和的 硼酸溶 液代替 
[Holmes, Anat. Record, 86, 157 (1943)] 



13. 甘 S 酸- NaOH 缓冲液 (0.05A/, pH8.6— 10.6) 

r 亳升 0.2A/ 甘氨酸 +y 毫升 0.2N NaOH 加水 稀释至 200 毫升 



pH 




y 


pH 




y 


8.6 


50 


4 





9.6 


50 


22 


4 


8.8 


50 


6 





9.8 


50 


27 


2 


9.0 


50 


8 


8 


10.0 


50 


32 


6 


9.2 


50 


12 





10.4 


50 


38 


6 


9.4 


50 


16 


8 


10.6 


50 


45 





甘氧酸 分子量 = 75. 07, 0.2M 溶液含 15.01 克 / 升 
[Goniori, Meth. EnzymoL 1, 145 (1955)] 



• 311 . 



14. Tri»- 缓冲液 (0.05A/, pH7 — 9) 

; c 毫升 0.2A/ 三经基 甲基氨 基甲烧 + y 毫升 0.1WHC1 加水 稀释至 100 毫升 



PH 


0.2M Tris 


O.lA'HCl 


pH 


O.IM Tris 


O.lNHCl 


23°C 


37°C 


23。c 


37V. 


9.10 


8.95 


25 


5 


8.05 


7.90 


25 


27.5 


8.92 


8.78 


25 




7.96 


7.82 


25 


30.0 


8.74 


8.60 


25 


10.0 


7.87 


7.73 


25 


32.5 


8.62 


8.48 


25 


12.5 


7.77 


7.63 


25 


35.0 


8.50 


8.37 


25 


15.0 


7.66 


7.52 


25 


37.5 


8.40 


8.27 


25 


17.5 


7.54 


7.40 


25 


40.0 


8.32 


8.18 


25 


20.5 


7.36 


7.22 


25 


42.5 


8.23 


■ 8.10 


25 


22.5 


7.20 


7.05 


25 


45.0 


8.14 


8.00 


25 


25.0 











三经 甲基氧 基甲院 ( >C< ) 分子量 =121. 14, 0.2A/ 溶液含 24.23 克 / 升 

^HOCH/ \NH, ' 

[潘家 秀等, 蛋 白质化 学研究 技术, 科学 出版社 (1962)] 



15. W 砂- NaOH 缓冲液 (0.05M 硼 酸根) 

; r 毫升 0.05Af 硼砂 +y 毫升 0.2WNaOH 加水 稀释至 200 毫升 



pH 




y 


pH 




y 


9.3 


50 


0.0 


9.8 


50 


34 





9.4 


50 


11.0 


10.0 


50 


43 





9.6 


50 


23.0 


10.1 


50 


46 






[潘家 秀等, 蛋白质 化学研 究技术 ,科学 出版社 (1962)] 



16. « 酸纳- 珠酸 tl 纳 缓冲液 (0.1M) Ca++, Mg++ 存 在吋不 得使用 



pH 


O.lMNajCOj 

(毫升 ) 


O.IA/ 
NaHCOj 

(毫升 ) 


pH 


O.IM 
NajCOj 

(毫升 ) 


O.IA/ 
NaHCOj 
(毫升 ) 


20。C 


37°c 


20°C 


37°C 


9.16 




8.77 




9 


10.14 


9.90 


6 


4 


9.40 




9.12 


2 


8 


10.28 


10.08 


7 




9.51 




9.40 






10.53 


10.28 


8 


2 


9.78 




9.50 


4 


6 


10.83 


10.57 


9 


1 


9.90 




9.72 















NajCOa - 10H,O 分子量 = 286.2, 0. 1 A/ 溶液含 28.62% 克 / 升; Na^HCOs 分子量 = 84.0, O.lAf 溶液含 8.40 
克 / 升 

[潘家 秀等, 蛋 白质化 学研究 技术, 科学 出版社 (1962)] 



17. 確酸象 二钠- 氣氣 化钠 缓冲液 (pH 11.0-11.9) 

50 亳升 0.5 A/Na,HPO, (7. 10 克 / 升), 加 * 毫升 0. 1 WNaOH, 用 蒸溜水 稀释至 100 毫升 
• 312 . 



pH, 25°C 


•r 毫升 0.1 應 aOH 


pH, 25°C 


; r 毫升 O.lWNaOH 


11.00 


4.1 


11.5 


11.1 


11.10 


5.1 


11.6 


13.5 


11.20 


6.3 


11.7 


16.2 


11.30 


7.6 


11.8 


19.4 


11.40 


9.1 


11.9 


23.0 



[Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] 



18 氣化押 -ft 氧化纳 缓冲液 (pHl2.0 — 13.0) 

25 亳升 0.2MKC1 加; r 毫升 0.2WNaOH, 用水 稀释至 100 毫升 



pH, 25°C 


A "毫升 O.ZNNaOH 


pH, 25°C 


* 毫升 0.22VNaOH 


12.00 


6.0 


12.60 


25.6 


12.10 


8.0 


12.70 


32.2 


12.20 


10.2 


12.80 


41.2 


12.30 


12.2 


12.90 


53.0 


12.40 


16.8 


13.00 


66.0 


12.50 


20.4 







[Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] 



c. 常用 酸械溶 液的比 重及浓 度配制 

1. 硝 酸溶液 的比重 和浓度 



比 重 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 

硝酸 的克数 


比 重 

di, 


溶 液的当 量浓度 




100 克 溶液含 

确酸 的克数 






oo ir\ o\ fNj rv) r-i 


t、 1、 t、 — iTv 


o o o o o o 

m GO o — r^j 








00 oo in ON o t、 


2. 盆 酸溶液 的比重 和浓度 






比 重 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 

盐酸 的克数 


比 重 
dr 


溶 液的当 量浓度 




100 克 溶液含 

盐酸 的克数 


1.100 
1.110 
1.120 
1.130 
1.H0 
1.150 


r--* »、 — QO r、 

VO r、 OO On 






vo oo o\ o 

f—^ «— * i"H f— 4 r—K 






— in t、 



. 313 . 



3. 疏 酸溶液 的比重 和浓度 



比 重 

di, 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 
硫酸 的克数 


比 重 
di, 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 

硫酸 的克数 


1.100 


3.219 


14.35 


1.840 


35 


87 


95.6 


1.200 


6.685 


27.32 


1.8405 




QQ 


95.95 


1.300 


10.39 


39.19 


1.8410 


36 


17 


96.38 


1.400 


14.31 


50.11 


1.8415 


36 


54 


- 97.35 


1.500 


18.26 


59.70 


1.8410 


36 


87 


98.20 


1.600 


22.41 


68.70 


1.8405 


. 36 


99 


98.52 


1.700 


26.75 


77.17 


1.8400 


37 


03 


98.72 


1.800 


31.89 


86.92 


1.8395 


37 


05 


98.77 


1.810 


32.59 


88.30 


1.8390 


37 


18 


99.12 


1.820 


33.42 


90.05 


1.8385 


37 


23 


99.31 


1.830 


34.39 


92.10 


1.837 


37 


66 


100.00 



4. 氢氧化 按溶液 的比重 和浓度 



比 重 
di, 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 
氨 的克数 


比 重 


.溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 
氨 的克数 


0.960 
0.950 




.58 
.10 


9 

12 


91 
74 




o o 


13 
14 


35 
97 


24.99 
28,33 



d CD C3 


ro 00 ir\ 
»0 — 1、 

» — « i~H 


15 
18 
21 


63 
64 
75 


0.890 
0.880 


16 
18 


59 
10 


31.75 
34.95 


5. 奇性 钾溶液 的比重 和浓度 


比 重 
di' 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 


比 重 


溶 液的当 量浓度 


100 克 溶液含 


苛性钾 的克数 


苛性钟 的克数 


1.100 


2. 


13 


10 


85 


1.34 


8 


26 


34.60 


1.120 


2. 


59 


12 


95 


1.36 


8 


84 


36.47 


1.140 


3. 


05 


14 


99 


1.38 


9 


42 


38.25 


1.160 


3. 


53 


17 


08 


1.40 


10 


00 


40.09 


1.180 


4. 


02 


19 


13 


1.420 


10 


60 


41.88 


1.200 


4. 


52 


21 


15 


1.440 


11 


20 


43.64 


1.220 




03 


23 


13 


1.460 


11 


81 


45.38 


1.240 




55 


25 


11 


1.480 


12 


42 


47.09 


1.260 


6. 


08 


27 


05 


1.500 


13 


04 


48.79 


1.280 


6. 


61 


28 


97 


1.520 


13 


68 


50.48 


】.300 




15 


30 


87 


1.540 


14 


31 


52.15 


1.320 




70 


32 


74 











. 314 . 



6. 苛性 钠溶液 的比重 和浓度 



比 重 
dj' 


溶 液的当 量浓度 


100 克溶 液含苛 
性纳 的克数 


比 重 
di, 


Y*" di'n ^ S- y* Pft* 


100 克溶 液含苛 
性纳 的克数 


1 


100 


2 


47 


8 


99 


1.320 


9.54 


28.92 


1 


120 




02 


10 


79 


1.340 


10.31 


30.78 


1 


140 


3 


59 


12 


59 


1.360 


11.13 


32.74 


1 


160 


4 


17 


14 


39 


1.380 


11.96 


34.66 




180 


4 


78 


16 


19 


1.400 


12.81 


36.60 


1 


200 




40 


17 


99 


1.420 


13.70 


38.58 


1 


220 


6 


04 


19 


80 


1.440 


14.61 


40.58 


1 


240 


6 


70 


21 


60 


1.460 


15.56 


42.62 


1 


260 


7 


37 


23 


42 


1.480 


16.54 


44.70 


1 


280 


8 


68 


25 


25 


1.500 


17.55 


46.80 


1 


300 


8 


79 


27 


07 


1.520 


18.58 


48.90 



315 - 



S0017423 



*到 期 






来 源 


Sj> . - 




书 价 




单据号 


S 1 'J , 


I- 


开票 





总 

号 


13325 


书 
号 


261 


书 
名 


兮化 《*^'J| 拔十二 


著 


者 i 






出版处 



者 借书 it 号还书 日期、 



统一 书号: 13031- 
定 价: 4.80 

本社 书号: 4 62 '1 
科技新 书目: 109