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Full text of "sheng wu hua xue zhi bei ji shu"

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生物 化 学 制备 技术 


苏 拔 贤 主编 


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书 未 并 附 有 各 类 生化 物质 制备 的 参考 文献 。 

胡可 供 生 多 化 学 ,生物 党、 医药 fMRI RATE 


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Ma et Fe 生物 化 学 实验 技术 丛书 
生物 化 学 制备 技术 
苏 拔 贤 主编 

责任 编辑 赵 甘 录 
Aeakmath B 
JERPANIA AG 1375 Sai; 
KOQMG He BIS EDM 
新 华 世 店 北京 发 行 所 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 售 
SETS * 
1986 年 1 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 
1986 年 1 月 第 一 次 印刷 印张 : 20 1/2 
印 数 : 0001—4,200 Hk : 467,000 


统一 书号 213031 - 3053 
AHAB S : 4062 + 13-10 


xe ft: 4.80 元 


编 I 的 话 


f= 十 世纪 有 了 惊人 发 展 的 生物 学 中 , 生物 化 学 是 最 活跃 的 分 支 学 科 之 一 。 促使 生 “ 


”物化 学 迅速 发 展 的 重要 因素 之 一 是 新 技术 的 开发 。, 
过 去 一 、 二 十 年 间 生 物化 学 的 实验 方法 日 趋 专门 化 和 复杂 化 ,牵涉 到 生化 实验 工作 的 
领域 也 越 来 越 多 。 今 天 ,农业 \ 工 业 \ 医 学 ,环境 以 及 生命 科学 等 的 研究 都 涉及 生物 化 学 研 
究 ,生化 实验 已 成 为 常规 的 实验 操作 了 。 因 此 , 对 于 开始 进行 生化 研究 的 工作 者 , 或 者 要 
开拓 自身 专业 领域 以 外 生化 研究 领域 的 工作 者 来 讲 , 都 希望 能 有 一 本 合适 的 实验 指导 书 。 
有 鉴于 此 ,科学 出 版 社 于 1977 年 夏 委托 中 山大 学 在 广州 召开 了 由 国内 从 事 生化 工作 的 部 
分 研究 所 〔 中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 、 中 国 科学 院 微生物 研究 所 )、 大 学 (中 山大 
学 、 北 京 大 学 、 武 汉 大 学 、 南 开 大 学 南京 大 学 、 复 旦 大 学 )、 工 厂 ( 江 门 甘蔗 化 工厂 、 生物 
化 学 研究 所 东风 生化 试剂 厂 ) 参 加 座谈 会 ,拟定 了 编写 一 套 切实 可 行 , 供 有 关 工 作者 随时 
查阅 参考 的 《生物 化 学 实验 技术 丛书 ) 

本 《从 书 》 各 册 编 写 的 内 容 是 建国 以 来 国内 已 经 应 用 、 开 展 或 正在 开展 的 生化 技术 。 
随 着 我 国生 化 研究 工作 的 进展 ;国外 新 技术 的 引进 , 国 内 独创 技术 的 开展 , 将 不 断 补 充 新 
的 内 容 。 

本 《丛书 ?着重 在 实验 技术 , 各 册 内 容 力求 做 到 : 

(1) 理论 部 分 简洁 明了 ,实验 部 分 力求 重复 性 高 ; 

Q) 直接 触及 实验 设计 的 各 项 要 领 ; 

(3) 指出 实验 操作 中 应 注意 的 地 方 ; 

(4) 尽 可 能 多 的 举例 说 明 。 

本 《丛书 》 的 编写 , 虽 经 大 家 共同 努力 ,但 缺点 错误 在 所 难免 ,热情 希望 读者 批评 指正 。 
如 果 本 《从 书 》 的 出 版 ,能 推动 生物 化 学 的 进展 , 为 实现 科学 技术 现代 化 作出 一 些 贡献 , 编 
者 将 感到 十 分 高 兴 。 


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《生物 化 学 制备 技术 》 分 册 , 内 容 包括 生物 化 学 制备 技术 特点 、 实 验 设计 原理 , ARE 
化 制备 一 些 常 用 方法 如 提取 沉淀 \. 过滤 与 超 滤 、 结 晶 ` 浓 缩 与 干燥 、 样 品 保存 ,以 及 在 分 离 
纯化 时 使 用 较 多 的 色谱 法 ,` 超 离心 技术 等 。 与 制备 有 关 的 分 析 鉴 定 方法 , 则 分 别 由 其 他 分 
册 了 予以 介绍 ,使 本 分 册 篇 幅 与 其 他 分 册 大 致 相同 。 

尽管 如 此 ,生化 制备 技术 所 涉及 的 面 还 是 很 宽 的 ,任何 一 类 生化 物质 的 制备 方法 或 制 
备 方法 中 某 一 技术 都 可 以 写成 一 本 专著 。 在 实际 工作 中 我 们 还 体会 到 各 类 生化 物质 制备 
的 方法 .手段 是 很 不 相同 的 ,即使 同一 种 生化 物质 也 有 多 种 制备 方法 ,就 是 同一 生化 物质 , 
采用 同一 制备 方法 ,也 因 材 料 差异 、 设备 和 条 件 的 不 同 、 工 作 人 员 的 习惯 经 验 等 彼此 工艺 , 
流 程 并 不 一 样 。 所 以 本 分 册 编 写 的 指导 思想 ,一 方面 是 作为 《生物 化 学 实验 技术 丛书 》 整 
体 的 一 部 分 内容 选择 上 与 其 他 分 册 互 相 呼 应 \ 互 相 补充 ; 另 方面 希望 通过 本 书 的 介绍 ,使 
读者 对 生化 制备 技术 有 一 比较 系统 认识 。 Alt, 在 内 容 方面 我 们 尽 可 能 把 有 关 技 术 原 理 
讲 清楚 ,并 适当 多 举 一 些 例子 加 以 说 明 , 企图 使 理论 与 实例 结合 起 来 , 起 到 触 类 旁 通 的 作 
用 。 同 时 在 本 书 未 尾 , 附 上 各 类 生化 物质 制备 及 测定 的 参考 资料 , 以 便 读 者 查阅 。 

参加 本 书 编写 的 有 : TAR IAG REN IF it PARED aD HH RPE Re a HS 
WE, kKBEMILSRRAMRAEAR) MMAR, SRPMAKSELALBS 
教授 等 均 先 后 赠送 了 大 量 珍贵 图 书 资料 。 本 书 初 稿 完 成 后 ,得 到 北京 大 学 王 镜 岩 副教授 、 
中 山大 学 曾 淑 云 副 教授 、 陈 俊民 副教授 等 在 百 忙 中 给 予 审 阅 并 提出 了 许多 宝贵 意见 。 全 书 
编写 得 以 完成 , 还 由 于 江门 甘蔗 化 工厂 \. 中 国 科 学 院 微 生物 研究 所 、 上 交 生 化 制药 厂 和 中 
山大 学 生化 教研 室 同 志 们 具体 帮助 和 积极 支持 的 结果 , 在 此 仅 向 这 些 同志 致 以 最 衷 尼 的 
感谢 ! 

由 于 我 们 水 平 所 限 , 实践 经 验 很 少 , 书 中 肯定 存在 不 少 错误 和 缺点 , 明 请 读者 批评 指 
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苏 拔 贤 
1983.8. 


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目 有 录 


第 一 章 生物 化 学 制备 技术 特点 及 实验 设计 原理 …………………… eee cece cent eecccssenesaeensece 1 


PFA Hy SER RAE FOE FA cee eee ene cee een cneeeeeeecseeeeeeeeeeeae ees 下 
一 、 生 物体 组 成 成 分 ee 1 
《 二 、 生 物 分 子 间 的 作用 力 ee 2 
第 二 节 生化 分 离 制备 方法 特点 及 基本 原理 Sass c cee snccccomsaae nese citis delesleevsccacacecccse 6 
一 、 生 化 分 离 制备 方法 特 片 ee 6 
二 、 生 化 分 离 制备 方法 基本 原理 pe 7 
第 三 节 生化 分 离 制备 实验 的 设计 及 实验 方法 的 选择 aed ceacescccceccbecuevecccsoscecsens 8 
一 、 生 化 分 离 制备 实验 的 设计 pe 8 
二 、 分 离 纯化 各 阶段 对 实验 技术 的 选择 ee 16 
人 参 落 文献 22 
FAB EB FUG Bcc ccc eter eee ceec ences ec eeeeere nee eeeseeseesseaeeseesseasseeeeaeneneneees 73 
第 一 节 ”引言 pe 73 
BS Fe Fell Sy RR BE RL nee cece eee ee cette cet eee eee eeceneeeeees rt. ee | 
EM AUC 9 a Op ee eas a6". 
一 、 离 子 强度 ee 26 
ca PH 值 desddudeause cvs scmtsvesivigesedenquacednsquyqudgessdeeatqe'coWewdesetcle vais Snepihedcewahyhbevcesecnsenass 26 
=. 温度 sence ec er een acrenceenensnecnssesseeeseseccassees eee ssseeseeeeuscseeneesessssensssnssssceesseessenenees 27 
四 、 支 拍 剂 pp 27 
第 四 节 fe] eZ AY op BE a cece tccwlccrecccccenvctiaccnscesontovececesevasescaccess 27 
第 五 节 “ 液 一 液 荃 取 时 分 配 定 律 的 应 用 .pp rt 28 
第 六 节 提取 时 对 具有 生理 活性 物质 的 保护 措 te HE ee 29 
第 七 节 ”各 类 物质 的 提取 分 离 : 站 pp 30 
一 、 蛋 白质 和 酶 的 提取 分 离 ee ie cS Pa Sav AW oghne cosh vaah aude ees EE 
二 、 核 酸 的 提取 分 离 pep a ecnccccmaccnnentiocsseucceceesss 37 
= HBAS APA HBEAD BY ceeeeceeceeeceeecensnescesensenseeevereesseressens SEMvddeliels dees bane gan kan one 44 
四 、 其 他 脂 溶 性 生化 物质 的 提取 分 离 ep 45 
五 、 糖 、 氨 基 酸 及 其 他 水 溶性 生化 物质 的 提取 分 离 ee + AT 
六 、 植 物 次 生物 质 的 提取 及 溶剂 系统 分 离 的 选择 ce cece eee eeeescceeeeee reece eceeeeeeeeeeeeeaenes 48 
人 参 芳 文献 上 49 
Fj PE Te FA weve eee eee eee cece eee cee eee eee e eee nee ereneeeeeeeeeeeseneneneeseneeaeeens 51 
ie Me] = CEL eee eee 本 eceeeceeeweceeeeesecevereersepenns 51 
第 二 节 盐 析 法 .pp 51 
me) HET caked wasdiese recrencscecovocvocsssecscscvencecsceuedtagelsihiedveN tame nbuetnlaa@ine succes vainves 
FEM ERAT AI FEF pp 53 


SpE AGRE EE ERAT Pe sentence ne eeesseleoscetetscensoreusoedbesntcoacedansvediesee1 ana 


Ee 24/0: 2] eee ee eee 61 
一 、 基 本 原理 pp 61 
Se pe opt: Da) a aa Se eee Gav 3 
= FPLIA FADE OE EBB] ooo ones ncetecceneeccccncnnsnnscesencceceecessnamepeesenns 64 
四 .有 向 资 剂 沅 淀 法 实例 , 65 

BECO AH .等 电 点 沉淀 法 pe 68 
第 五 节 , 生 成 盐 类 复合 物 沉淀 法 -8 
第 六 节选 择 性 变性 沉淀 法 .pe 72 
Ee oa oR |= oe 2 ee fous - Choon 74 
: — EK AF cereccceenscecccnccevceneccssnsccseencncranecnscseecessnesseesessertersstecsecsceesannennensens 73 
Zl, AFA FT REFUIE weveeceecececscccsceccccncesesesscnsessceeoeeeensveascceesecaccsenseseseseesecnenanwane TA 
三 应 局 实例 -re 76 
第 八 节 “其 他 沉淀 让 4 78 
一 、 氮 基 酸 奖 .ee ee eeeseee sense sos 78 
ZL KA FBR co teecessecccseccssecccessnsecnenseeeensveseesseserssssescensseecaeseusnscesscceeseseees 78 
三 、 粘 多 糖 类 -ee 了 
参 芳 文献 7 
SES SS BE Ba Bocce cect ere ere eee ee ene ee tere eeneeeeneeterenanes eeeee 80 
第 一 节 ”吸附 色谱 法 站 81 
==» EMSS PEAY AUT others Seater aioe coe, ae ate on menaee 1 81 
二 、 常 用 吸附 剂 的 特性 和 应 用 eee vee 和 和 了 4 
三 、 吸 附 柱 色谱 的 实验 技术 eerresaree 86 
BES A EFA Hi FE PE PE owe cce cee ccsaeecetieeeccsteanctasestecccccsscccceeceesessueebeenecnanns 88 | 
一 、 离 子 交 换 剂 的 类 型 。………。 wibobeet tetaSpeaaepsetdsas sscsececdecccercy cans sdiecyh heeoa sian 88 
三 、' 离 子 交 换 树 脂 的 人 性质, oeeereeeceeeeeececeeseeseenenceessnseuterseseessasresesessegessesssseasssesvesens 9 
三 、 离 子 交 换 的 动力 学 .ee 93 
四 、 离 子 交 换 剂 的 选择 .ee 人 94 
Fly PEF EHR EEA ILD coceeceeceecceeeeeceneeeenececeeeesanscescaceescecsssacenescesssearesesaasens 97 
第 三 节 高 效 液 相 色 谱 法 :pe 99 
一 、 引 言 -eeeeeeeeeeeeeeeee 人 0 99 
二 、 高 效 液 相 色谱 仪 概述 .ee 100 
三 、 高 效 液 相 色谱 的 固定 相 填 料 we eeedecccecceccccccecceccecesecascevessovecedccavescoccescetcgsaboes M03: 
四 、 色 谱 方法 的 选择 ,.eeeeeeeeee 104 
五 、 分 离 度 的 调整 coeececceececcesccseesnscescesescevsecceeessesancseseeucerseseneseseusenscaeaeceeses 104 
yx 和 具体 操作 及 注意 事项 本 108 
BEES. ---rrverscceecncreccrsrscsccanesccnerccvercassecnasvenssseevsuttunia las slsiesecaealeaesate 111 
第 五 章 “ 生 物 大 分 子 的 色谱 分 离 法 :Re 112 
第 一 节 -多糖 基 离子 交 换 剂 色谱 法 的 lz 
一 多 糖 基 离子 交换 剂 的 分 类 -son 和 no 0 112 
二 、 实 验 操 作 技 术 pp vee an 


三 、 应 用 实例 cv L107 | 
第 三 池 aN ae eee Valine s ate ABSs AM OMMEE NG Opt 有 生生 119 
一 、 -分 子 筛 色谱 的 基本 原理 devccccccveccccceccccccccvecaccacscnceccseseseoesecscoccecsessnasecuusecesd 119. 
二 、 常 用 凝 胶 的 结构 和 性 质 ceeeeeeeeeeteeseeeeeeseeneeeeetneeeees Atri ore cn eee 121 " 

三 、 分 子 筛 色谱 的 实验 技术 ee BY ah 

四 、 分 子 筛 色谱 的 应 用 本 AS 129155 
BE SAG REI FE Pk pp A vteaaviecacasvetasyvessanbtseia dbleetbdgeap ses cae 135 
一 、 基 本 原理 ee 135 
二 、 载 体 的 选择 SN os RR EMA aa eck cmneens 136 
三 、 琼 脂 糖 的 活化 及 其 衍生 物 的 制备 ES 138 
py, 亲 和 色 谱 条 件 的 选择 Se N eae ads VATAAEE AAT dd aeencealebuccace ad dele Wdbusichscsesesnceseschee 140 
五 、 亲 和 色谱 应 用 举例 …………. 0 4 
第 四 节 色谱 聚焦 pp 145 
一 、 色 谱 聚 焦 的 原理 pe 146 
全 147 
Sy SHE THAT HA - cor eccensecressecneverssrceresecscccsccsnsbasseccsaenusenensresseseogesveceeebeacseens 148 
四 、 操 作 步 又 .ee 149 
五 、 应 用 实例 ee 0 152 

人 参 芳 文献 .……- pAatetrsinaiennnn’ beitvenschisas tariinisytenssrinn sare chsh pene Rn gatt rid “aaR or ake 153 
第 六 章 “” 制 备 离 心 技 术 .………… 凡生 半生 本 155 
-第 一 节 引言 站 155 
第 三 节 忆 二 役 制 备 离心 did sn bs SaaS Ges nian sures ons MAGS doe anc 156 
一 、 过 滤 式 离心 机 ee At ee 156 

ZV TURES BIL. ccc eeeceeceeeeeneeceenencceecnenecceeceesenesencssenseeeees 本 二 人 
eee TA Vai dgraauaiddrandvugavavawadatagtisersceech<astbvanscvsbyssesceesi is MMMM sh onas 158 
四 、 一 般 制备 离心 机 的 选择 - 158 
人 159 
一 、 原 理 和 计算 ppp 160 
二 、 制 备 超 离 心 的 方法 及 其 选择 pp 163 
人 这 和 Ts 168 
人 173 
五 、 制 备 超 离心 的 操作 po。 177 
Fry FP VG) pp 184 
总 本 ccwwees unease nd ede Wee sd bed SEUTWUEEL AUST E eUe sede eb oecues coweueene 187 
第 七 章 过 滤 与 膜 分 离 技术 Re Mesidedaaly sp Way seew re rwd dilisie Sea siaicgaad pale 6s an.claaiee ne keer Reeders 189 
SP Rae... 189 
Ay TFT BE ns oreeew cc eveninndeccenveadventsdernestcssctbeneparseecddebsvcdcesterees ipsa nos dhs cer tge 189 
二 \、 据 高 波束 的 主要 措施 oo 189 
Hy. EAC LAW FH FAT RG Be eee ee ececec cence ee gactecceccteegecnsecssdscnceacsencesceteeceassncceces 194 

第 二 节 膜 分 离 技 术 本 二 生生 生生 生生 TEMS Gales a aldale sale 197 
一 、 透析 Oe eee e neces ee ecacecererees cece essen eee eereee eee eeseeeesace ness eeseeseeneescense cesses sescccecesrs 198 


a 超 注 ee 204 


三 、 电 渗析 和 离子 交换 膜 电 渗析 218 
参 若 文献 站 220 
第 八 章 “结晶 方法 和 Ne 779 
第 一 节 结晶 与 晶体 一 般 性 质 « nialein ipnidiane pibinie Gv cluimd uGin'v ne oc Mueuda icy sx deli amir ita At, aaa 222 

第 二 节 生化 物质 形成 结晶 的 条 件 ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosooioooeooovsos 223, 

— | PEGULRE ceeceeeeeceeeeeeeeeeeeeeeneennenteteetenenteeseneeanansaasasesencesnencaecceceesecceserecenass 223 

Bae 9, 419152001) ee enrnnnnnnnnnnnanonnrnnnoninnenosnanorrannnnoooooooon 224 

三 、 深 剂 的 选择 EOE 225 

第 三 节 “ 晶 核 形 成 及 晶体 生长 的 影响 因素 :pe 226. 

一 、 晶 核 的 形成 及 诱导 方法 ee 226 

二 、 影 响 结晶 生成 的 因素 226 

第 四 节 SE TAG Hy a BE Fence e cece eee ete eee eeeeneneensensecseeteeseescneceecseeeeenenes 228 

: 一 、 结 晶 衍生 物 cece eeeeceeeeeceeeeeeneeeneceeeeeceeeesseseneceeesaasenessaeesessasscssaueessneeeecanenes 228 
二 、 重 结晶 cecee eee ceeeceeeeceneeeeaeeceeeesenseeeeecteeseseneessensasessanesereccessssseecaneeneneneeeans 228 

第 五 节 “结晶 的 一 般 方 诸 .ee 229 
ig ie ose Oe Peco, See 生息 esa ia ee miateltete 231 

、 抽 提 结 晶 技 术 0 233 

二 、 蛋 白质 微量 结晶 技术 ee 233 

参 基 文 献 站 pe Pe ee 237 

第 九 章 ”浓缩 与 干燥 站 239 
第 一 节 “浓缩 .ee 239 

| RE .eveoeeieeeeee9eoeie 23% 

TZ LAL wer eereeeceeeeeceeeeeeerececseresecerserceeceesescaecsseesucssssceccecsessesenscassesseacousaneses 252 

三 、 膜 浓缩 eevee cee ececceeter eve 253. 

DO, URURBHAL, sereecesccssseccccseeceseassessececens oe dans cadence Oui 全 255. 

五 、 其 他 eveeioeoieeeeeei vie 256 

第 二 节 于 燥 pp 256 

一 、 影 响 于 燥 的 因 琵 pe 256 

=, FEE WRU CFR oon eecceccccecscccnessscsecesessnstasessiscscccassoosecennsseccessanesssesceranacescos 257 

三 、 真 空 于 爆 ee 259: 

PO, YE TRF .eve ee 9 ee 260 

五 、 了 路 有 雾 干 燥 。 eeeeeeeeeee9eie 9 264 

Fry FREE UB ee 266 

BEE LR cnn eee e cence eeeteeeceeeeeccceeeceeseseeenesensceeessonsesencesssnsensersnssenseneasenes 267 

第 十 章 , 样 品 的 保存 .nn 269 
第 一 下 ”样品 的 保存 与 环境 条 件 的 关系 收 pp 269 

BES A 作品 保存 的 到 月 六 定 有 和 270 
第 三 节 各 类 生化 物质 的 保存 273 

一 、 蛋 白质 的 保存 ee 273 

二 、 核 酸 的 保存 pe 276 


ig yeaa REPS FER Ph neponsavedegtants-anknshitoniys agin s: Ce ans 
Bs, 细胞 及 生物 制剂 的 保存 _ eed + Mai baik «baa ta We kaos teteaae mae Ty ek die ty ig 277 th 


、 小 分 子 生 化 物质 的 保存 ee cee ea ae 


BBhevsssseeeceeecessssneeteecceccennannnsssscsenneeannaesneeececenatsanneiseneseeeneeetaes 282 


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第 一 章 “ 生 物化 学 制备 技术 特点 及 实验 设计 原理 
* kK 


St “生物 体 组 成 及 生物 分 子 间 的 作用 力 
一 、 生 物体 组 成 成 份 吕 名 


现 知 地球 上 约 有 一 百 八 十 多 万 种 动 \ 植 物 ( 包 括 微生物 )。 从 最 简单 的 病毒 、 细 苗 直 至 
最 复杂 的 人 类 ,不 论 它们 之 间 形 态 上 多 么 不 同 ,但 它们 最 基本 组 成 成 份 都 含 核酸 和 和 蛋白 质 
两 类 物质 。 核 酸 是 遗传 信息 的 携带 者 ,在 生物 体内 指导 着 各 种 蛋白 质 的 合成 ,决定 着 每 一 
生物 个 体 和 种 族 的 差异 。 蛋 白质 则 担负 着 机 体 的 生长 ,发 育 ; 感 觉 ` 运 动 、 RP. 运输 营养 
物质 和 和 氧气 ,消灭 外 来 疾病 因素 等 多 种 重要 生理 功能 。 进 化 比较 高 级 的 生物 体 , 其 组 成 成 
份 除了 核酸 和 和 蛋白 质 (包括 酶 ) 两 大 类 物质 外 ,还 含有 糖 类 、 维 生 素 、 脂 类 、 激 素 以 及 多 种 多 
样 的 代谢 中 间 产 物 和 次 生物 质 。 

“一 个 生物 体内 含有 多 少 生物 分 子 ? 以 及 这 些 生物 分 子 结构 形状 `, 大 小 如 何 ? BEB 
过 亿 万 年 进化 而 确定 的 ,每 一 种 生物 分 子 结构 与 功能 不 仅 十 分 协调 ,而 且 每 个 分 子 在 空间 
排列 也 很 有 次 序 , 相 互 契合 ,并 通过 细胞 的 形式 共同 组 织 起 来 ,执行 着 各 种 复杂 生理 功能 , 
“体现 出 生命 的 高 级 活动 。 

单 细 胞 生物 一 个 细胞 就 是 一 个 完整 的 生命 体系 。 多 细胞 生物 逐渐 出 现 高 度 分 化 的 器 
SAA, 细胞 内 不 同 的 细胞 器 的 化 学 组 成 也 有 了 明显 区 别 。 一 个 细胞 究竟 由 多 少 生 物 分 子 
组 成 呢 ? 现 以 大 肠 杆菌 为 例 ,说 明 一 个 简单 的 细胞 的 分 子 组 成 。 见 表 1-1, 

表 1-1 可 以 代表 细菌 这 一 类 细胞 的 组 成 成 份 的 基本 情况 ,当然 不 同类 型 的 生物 、 不 同 


表 1-1 ABFRARPSSHSFAR™ 


fa 

Ba 

基本 单位 分 子 与 中 间 产 物 
无 机 离子 


类 型 的 细胞 其 组 成 分 子 种 类 和 概 数 是 不 相同 的 ,有 的 差异 很 大 ,有 的 差异 较 小 。 但 在 同一 
个 细胞 内 各 类 的 分 子 分 布 大 致 有 一 个 规律 ,在 真 核 细 胞 中 , 脱氧 核糖 核酸 (DNA) 大 部 分 
存在 于 细胞 核 内 , 只 有 极 少 量 存 在 于 线粒体 或 叶绿体 中 。 而 核糖 核酸 (RNA) WERE 
在 于 细胞 质 中 。 电 子 传 递 系统 组 成 物质 ,包括 黄 素 蛋白 ,细胞 色素 cv ay ay a 以 及 糖 类 
分 解 ,脂肪 酸 合成 和 氧化 ,氧化 磷酸 化 等 有 关 酶 系 大 部 分 存在 于 线粒体 中 ,关于 蛋白 质 ( 包 
括 酶 7) 和 核酸 两 大 类 大 分 子 在 细胞 内 分 布 情况 , 现 以 肝 细 胞 为 例 介 绍 于 表 1-2" 


表 1-2 蛋白 质 、 酶 及 核酸 在 肝 细 胞 内 分 布 情况 


细胞 器 名 称 主要 蛋白 质 及 酶 类 核 酸 类 
| RNA SRE 10% EG 
细 胞 Be HEA. AEA. BARBS Dela ee 
ee tk 电子 传递 、 氧 化 磷酸 化 三 羧 酸 循环 \ 脂 肪 酸 氧 化 | RNA 占 总 量 5% 左右 
氨基 二 氧 化 \ 腺 合成 等 酶 条 DNA 微量 
内 质 网 (微粒 体 ) 蛋白 质 合成 酶 系 \ 羟 化 酶 类 RNA 占 总 量 5096 左右 
mB ik 水 解 酶 系 (包括 RNA BE, DNA 酶 、 磷 酸 脂 酶 、 硫 
MORAG GRE BREA Be NES) 
高 尔 基 氏 体 糖 背 转移 酶 . 粘 多 糖 及 类 固 醇 合成 酶 系 
‘a Wa TR 载体 与 受 体 蛋 白 、 抗 原 ATP MS, OCORERE. 
5“- 核 华 酸 酶 以 及 多 种 脂 蛋 白 及 糖 蛋白 


旷 啶 和 呆 叭 代谢 物 、 氨 基 酸 合成 酶 系 ,各 种 可 溶性 | RNA( 主 要 是 tRNA) 占 总 量 3096 
细 胞 t+ 蛋白 1 


由 上 两 表 可 见 , 一 个 细胞 包含 着 成 千 成 万 种 分 子 , 每 种 分 子 每 时 每 刻 都 在 变化 运动 
中 ;就 像 一 座 小 小 的 “化 工厂 "一 样 , 分 成 许多 车 间 , 有 着 各 种 各 样 的 机 器 ,不 断 消 耗 着 各 种 
原料 ,产生 出 各 种 产品 ; 这 处 产品 运 到 别处 又 变 成 了 原料 ,重新 合成 或 分 解 成 另 一 产品 ; 直 
到 最 后 变 成 最 简单 的 CO;、 尿 素 、H;O 或 一 些 “ 低 值 ” 废物 排出 体外 。 生化 分 离 制备 的 
目的 ,就 好 像 是 把 这 一 “工厂 ”里 某 一 机 器 的 “部 件 ” 或 “产品 ”巧妙 地 、 毫 无 损伤 地 分 离 出 
来 。 研究 其 结构 , 了 解 其 功能 或 作为 一 种 药物 和 原料 满足 人 类 社会 生产 和 生活 需要 的 一 
种 手段 。 


二 、 生 物 分 子 间 的 作用 力 545] 


存在 于 地 壳 上 的 元 素 已 知 有 九 十 多 种 ,而 组 成 生物 体 的 元 素 不 过 二 十 多 种 ,其 中 最 重 
要 的 元 素 是 碳 。 以 碳 为 主 链 连 结 氮 、 氧 \, 氨 \ 磷 、 硫 等 元 素 , 通 过 共 价 结合 ,组 成 各 种 原始 生 
物 小 分 子 的 骨架 , MAAR. BAB. 单 糖 、 甘 油 、 脂 肪 酸 等 。 我 们 把 这 些 原始 生物 分 子 
看 成 是 生命 组 成 的 基本 结构 单位 。 然 后 这 些小 分 子 通过 共 价 缩合 而 成 各 种 各 样 生物 大 分 
子 , 如 蛋白 质 \ 酶 核酸、 多 糖 等 。 大 分 子 与 大 分 子 , 或 大 分 子 与 小 分 子 之 间 又 常 涝 相互 结 
合 形成 更 大 的 复合 分 子 , 如 脂 蛋 白 \ 糖 蛋白 、 核 蛋白 等 。 蛋 白质 、 核 酸 等 生物 大 分 子 除了 一 
级 结构 外 ,还 有 二 ,三 \` 四 级 结构 。 生 物 大 分 子 还 可 以 再 聚合 成 生物 超 分 子 复合 物 , 如 核糖 
体 便 是 一 个 超 分 子 结构 复合 物 。 每 个 核糖 体 含 有 一 个 大 亚 基 , 一 个 小 亚 基 , 每 个 亚 基 约 含 
有 65%RNA、35 多 蛋白质。 各 种 细胞 器 实际 上 是 由 超 分 子 复合 物 所 组 成 , 最 后 再 由 不 
同 结构 的 细胞 器 建造 成 细胞 。 因 此 ,我 们 欲 把 细胞 中 各 种 生物 分 子 相互 间 的 结合 拆 开 , 就 


. 2 . 


需要 了 解 这 些 分 子 结合 的 力 (或 称 化 学 键 ) 的 有 关 性 质 , 然 后 才能 使 用 相应 的 措施 把 它们 
彼此 分 离 出 来 ,这 就 是 我 们 生化 制备 实验 设计 的 主要 对 象 及 目的 。 现在 简单 地 就 一 些 主 
要 生物 大 分 子 内 及 分 子 之 间 的 作用 力 讨论 如 下 : 


(—) Hie 


这 是 组 成 各 种 生物 分 子 元 素 及 基 团 之 间 “连结 ”主要 化 学 键 。 共 价 键 又 称 原子 键 , 是 
指 由 两 个 原子 通过 共用 电子 对 而 产生 的 一 种 化 学 键 。 若 电子 对 是 由 两 个 原子 平均 共有 称 
“为 非 极 性 共 价 键 。 如 电子 对 偏 于 某 原子 一 侧 使 整个 分 子 产 生 极 性 , 称 极 性 共 价 键 。 极 性 
键 的 极 性 渐 增 至 电子 对 脱离 一 个 原子 而 为 另 一 原子 所 单独 占有 时 , 即 变 为 离子 键 〈 如 图 


ARR. Bik, 离子 型 化 合 物 是 一 种 极 性 最 强 的 化 合 物 。 


上 面 所 述 是 由 二 个 原子 共同 提供 电子 对 所 形成 共 价 键 , 如 果 两 个 原子 之 间 , 由 某 一 原 
子 单 方面 提供 共用 电子 对 所 形成 的 共 价 键 称 为 “ 配 位 键 ”。 许 多 含有 人 金属 离子 的 蛋白 质 分 © 
子 , 金 属 离子 与 蛋白 质 的 连接 大 都 是 配 位 键 。 

蛋白 质 分 子 内 每 一 个 氨基 酸 的 氨基 与 另 一 氨基 酸 的 羧基 之 间 脱 水 缩合 形成 肽 键 , 核 
酸 分 子 内 每 一 个 核 背 酸 的 磷酸 基 团 与 相 邻 的 另 一 个 核 背 酸 的 成 糖 上 的 羟基 脱水 缩合 形成 
磷酸 二 酯 键 。 多 糖分 子 内 前 后 单 糖 上 羟基 脱水 缩合 形成 的 糖苷 键 都 是 共 价 键 。 现 以 蛋白 
质 为 例 ,介绍 一 些 共 价 键 的 键 长 及 键 能 如 表 1-3, 


” 非 极 性 键 非 极 人性 分 子 
| 8 表 1-3 ”蛋白质 中 共 价 键 键 长 及 键 能 
ee eye sekr Cr) 
2 机 st th it ati CA) | 键 能 (KJ/ 克 分 子 ) 
he + i a c—H 1.08 ~378.7 
性 “ink C 一 C 1.53 fe § Ta 5276.9 
Bee, * Brx C—N 1.47 232.2 
z ae C=N 1.30 468.6 
Hk Clx C—N (ikét) 1.32 
sap ex 1.81 246.8 
H : oe — c=o 1.24 665.2 
xx O—H 0.96 462.7 
xx N—H 1.01 352.7 
Na xP x OF ) S—N 1.33 366.9 
“™ Na S—s 2.08 266.9 
离子 键 离子 型 分 子 P 一 O 1.66 一 335.0 
图 1-1 由 非 极 性 分 子 过 渡 到 离子 型 分 子 示意 图 1 +5 (cal) = 4.1868 焦耳 CJ) 


从 表 1-3 中 可 以 看 到 , 共 价 键 的 键 能 一 般 在 230 至 660 FR (KJ) 之 间 , 其 中 肽 键 
(—C—N—) 与 二 硫 键 (一 S 一 S 一 ) 都 具有 双 键 性 质 , 肽 键 不 能 沿 着 一 C 一 N 一 轴 自 由 转 
动 ;二 硫 键 不 能 沿 着 一 S 一 S 一 轴 自 由 转动 。 肽 键 是 蛋 白 质 一 级 结构 中 主要 共 价 键 , 二 硫 键 
是 维系 蛋白 质 空间 结构 最 强 有 力 的 桥 键 。 而 磷酸 酯 键 则 是 核酸 一 级 结构 的 主要 共 价 键 。 
(=) 非 共 价 键 或 非 共 价 键 作 用 力 

生物 体内 的 生物 大 分 子 如 蛋白 质 \ 酶 \ 核 酸 \ 多糖 等 的 空间 结构 和 分 子 之 间 的 作用 力 , 


e Ze 


主要 是 通过 非 共 价 的 静电 引力 、 氢 键 和 范 德 瓦 耳 斯 力 (Van der Waals’) 等 联系 而 成 。 其 

中 除 离子 键 的 键 能 与 共 价 键 相 近 外 , 其 它 键 的 键 能 一 般 都 小 于 40 TR (KI), MEK 

长 达 3 一 5A 左右 。 组 成 生物 分 子 共 价 键 的 强度 、 方 向 或 其 它 性 质 受 环境 影响 较 少 , 而 非 

共 价 键 的 性 质 受 环境 影响 较 大 。 下 面 我 们 分 别 介绍 一 些 非 共 价 键 作 用 力 的 性 质 : 

1. 离子 键 ( 或 称 离子 时 ,有 时 称 为 盐 键 或 盐 桥 ) 离子 键 指 相反 电荷 的 静电 作用 力 , 
这 一 作用 力 与 两 个 带电 基 团 带电 量 的 乘积 成 正比 ,与 两 个 基 团 距离 平方 成 反比 , 称 为 库伦 

定律 ,可 用 下 式 表示 : 


F = 9192 
Dy? 


qiq 表示 二 个 带电 基 团 的 带电 量 。 了 是 介 电 常 数 , 即 介质 对 有 相反 电荷 微粒 之 间 静 
电 引 力 影 响 的 数值 , 常 定义 为 在 真空 中 与 在 介质 中 这 种 带电 微粒 之 间 的 电位 差 比 o7 为 二 
个 基 团 的 距离 。 

生物 大 分 子 能 形成 离子 键 的 带电 基 团 很 多 , 如 蛋白 质 分 子 中 的 带 正 电 基 团 有 县 基 、 
8- 氮 基 ,N- 末 端的 氨基 咪唑 基 等 , 带 负 电 的 基 团 有 C- 端 羧基 , 天 门 冬 氢 酸 的 PRE, 谷 
氨 酸 的 Y- 羧 基 等 ,都 可 以 相互 形成 离子 键 。 但 离子 键 在 水 中 , 因 水 的 介 电 常数 很 高 ;带电 
, 基 团 受 屏蔽 , 从 而 使 正 负 电荷 相 吸 引 的 能 力 大 大 减弱 。 所 以 分 布 在 蛋白 质 分 子 表面 的 带 
电 基 团 , 实 际 形成 离子 键 的 机 会 并 不 多 ,主要 是 把 水 分 子 吸 引 在 自己 周围 形成 水 合 层 , 使 


蛋白 质 具 有 亲 水 性 质 。 


在 核酸 分 子 中 的 磷酸 基 团 有 时 候 也 与 蛋白 质 分 子 中 碱 性 基 团 以 离子 键 相 结合 《如 组 , 
蛋白 、 核 蛋白 ), 另 某 些 酶 ,如 胆 碱 脂 酶 \ 酶 分 子 和 底 物 胆 碱 的 结合 ,也 是 通过 离子 静电 引力 
相互 作用 的 。 

2. 氧 键 ”在 化 合 物 分 子 中 , 凡 是 和 负电 性 较 大 的 原子 相连 的 所 原子 〈 如 O-H, 
N—-H, F—H) 都 可 以 和 同一 分 子 或 别 的 分 子 上 另 一 负电 性 较 大 的 原子 形成 氢 键 。 水 、 
乙醇 、 醋 酸 等 分 子 的 缔 合 现象 和 和 蛋白质、 核酸 分 子 立 体 结构 的 维系 都 和 氧 键 有 关 。 氢 键 的 
键 距 比 普通 的 化 学 键 长 , 约 为 2.63 至 3.10A。 键 能 比 普通 化 学 键 弱 , 一 般 只 有 12 一 34 千 
焦 / 克 分 子 。 氢 键 还 具有 方向 性 , 当 氧 键 供 体 与 受 体 上 N、H、O、C 等 原子 在 一 直线 上 
时 , 键 的 强度 最 大 。 约 为 33 干 焦 。 在 水 溶液 中 , 氢 键 的 产生 和 交换 都 以 很 高 速度 进行 。 
这 对 生物 分 子 表现 其 生理 活动 有 着 重要 的 作用 , 也 是 生物 大 分 子 形成 立体 构 型 的 主要 推 
动力 之 一 。 

3. 范 德 瓦 耳 斯 力 《Van der Waals’) ,” 范 德 瓦 耳 斯 力主 要 包括 三 种 弱 的 静电 引力 : 

C1) 非 极 性 分 子 内 部 电子 运动 的 不 对 称 , 产 生 瞬 时 极 性 现象 ,以 及 由 于 这 一 现象 所 引 
起 周围 电子 分 布 的 变化 所 产生 的 作用 力 , 也 称 色 散 效应 或 London 分 散 力 。 

《2) 极 性 基 团 之 间 偶 极 与 偶 极 相互 吸引 力 ( 也 称 定向 效应 )e 

(3) 非 极 性 分 子 与 极 性 分 子 接近 ,在 分 子 内 造成 的 偶 极 诱导 作用 (也 称 诱 导 效应 )o 

范 德 瓦 耳 斯 力 总 的 表现 趋势 是 偶 极 之 间 互 相 吸 引 , 但 当 两 个 基 团 距离 很 近 时 排斥 作 
用 又 占 主 导 地 位 。 范 德 瓦 耳 斯 力 的 键 距 约 为 3 一 4 全, 其 能 量 比 氢 键 还 弱 , 在 水 中 或 一 些 
极 性 介质 中 单独 起 作用 不 大 但 分 子 中 存在 许多 偶 极 ,这 些 偶 极 相互 作用 所 得 的 范 德 瓦 卫 
斯 力 则 是 很 大 的 。 范 德 瓦 耳 斯 力 还 具有 菜 些 特点 , 如 它 一 方面 可 以 使 分 子 之 间 具 有 吸引 
能 力 , 同 时 这 种 引力 又 必需 使 二 个 分 子 保持 一 定 距 离 。 这 种 特殊 作用 力 对 于 酶 和 底 物 , 抗 


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原 和 抗体 的 结合 和 解 离 有 着 重大 意义 。 
”4. 朴 水 基 相 互 作 用 “, 蕊 水 基 相 互 作用 ,以 往常 称 为 “ 朴 水 键 "。 虽 “ 蕊 水 键 ” 这 一 词 
不 确 , 因 习惯 了 现 姑 用 之 。 它 对 于 维持 蛋白 质 \ 酶 核酸 等 大 分 子 立体 结构 起 着 重大 作用 。 
这 些 大 分 子 通常 都 有 亲 水 区 域 和 疏 水 区 域 , 朴 水 区 域 一 般 位 于 分 子 内 部 , 也 常 是 酶 与 底 
物 ,抗原 与 抗体 相互 结合 的 地 方 。 

蛋白 质 和 核酸 分 子 的 朴 水 键 主要 是 蛋白 质 分 子 中 妥 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 
等 一 些 下 水 性 基 团 及 核酸 分 子 中 吧 吟 、 喀 喧 碱 基 之 间 的 非 极 性 侧 链 粘 结 在 一 起 而 形成 的 。 
这 些 非 极 性 朴 水 基 团 相互 粘 合 在 一 起 , 可 以 解释 为 非 极 性 基 团 为 了 避 开 水 而 被 迫 相 聚 的 
自然 趋势 。 在 牙 水 区 域 , 极 性 基 团 一 般 很 难 离子 化 ,并 造成 与 自由 水 溶液 十 分 不 同 的 化 学 
环境 。 有 机 溶剂 能 降低 溶液 介 电 常数 , 故 可 导致 了 水 键 的 破坏 , 反之 , 盐 类 可 使 非 极 性 基 
团 在 水 中 溶解 度 减 少 ,可 使 疏水 键 增强 。 


《三 ) 水 在 各 种 非 共 价 作 用 力 中 的 作用 


没有 水 ,生命 便 不 可 能 形成 。 在 生物 化 学 反应 中 , 水 不 仅 是 一 种 良好 的 溶剂 , 也 是 在 
各 种 生化 反应 中 提供 H+ 和 OH- 的 主要 源泉 。 同 时 , 水 还 是 生物 分 子 表现 生理 活性 的 
唯一 天 然 环 境 。 水 的 结构 特点 及 对 于 生物 分 子 作用 力 的 影响 可 归纳 如 下 : 

(1) 水 分 子 由 一 个 氧 原子 和 两 个 氢 原 子 组 成 ,由 于 分 子 不 对 称 的 空间 构 型 ,其 中 氧 原 
子 具 有 负极 作用 , 而 相 邻 的 二 个 所 原子 则 合成 偶 极 分 子 中 的 正极 。 二 个 所 原子 核 与 氧 原 
子 核 连 线 之 间 形 成 的 夹 角 约 为 105", 是 一 个 高 度 极 化 的 极 性 分 子 , 具 有 很 高 的 介 电 常 数 , 
图 1-2 是 水 分 子 结构 示意 图 。 


(2) 由 于 偶 极 分 子 中 场 力 的 作用 , 水 分 子 彼 Hu who. 
HER S| MAA, 很 少 单独 存在 。 每 个 水 分 子 通过 Sr 氧 原子 
氨 键 可 与 另外 四 个 水 分 子 配 价 , 形 成 四 面体 “ 冰 id 


格 ” 的 结构 , 随 着 周围 条 件 的 变化 ,结构 中 的 氢 键 正 电 性 部 分 


十 = + 


不 断 破 坏 又 不 断 形 成 , 水 分 子 间 这 种 独特 结构 全 RAK LDP 
AA BEN AVE To e ip 


(3) 水 淤 液 中 的 水 分 子 因 自 身 形成 气 键 的 直 /人 入, 
势 极 强 , 故 水 分 子 的 存在 可 使 其 它 分 子 形成 氢 键 ue - 
能 力 减 弱 , 水 分 子 还 可 以 减弱 离子 键 的 相互 作用 , 
TSMR AE WE HEB kK MOEA B.S hereon 

(4) GIARWAOE ESEMD TUS EH ERR BRST HORE 
或 氧 、 氮 等 原子 都 可 以 通过 氢 键 与 水 结合 ,从 而 具有 巨大 的 水 合 或 称 “水 化 ”能 力 。 

上 述 关于 一 些 生物 分 子 中 的 结合 力 及 分 子 间 的 作用 力 的 简单 介绍 , 可 以 看 到 生物 体 
系 中 分 子 结构 及 分 子 之 间 联 系 的 作用 力 十 分 复杂 。 作为 一 个 生物 分 子 , 其 基本 骨架 各 原 
子 及 基 团 之 间 都 是 共 价 结合 , 整个 分 子 一 级 结构 是 比较 稳定 的 。 但 分 子 与 分 子 间 的 连结 
主要 通过 一 些 非 共 价 键 如 氢 键 、 盐 键 、 金 属 键 、 范 德 瓦 耳 斯 引力 所 维系 ,其 键 能 较 弱 ,而 且 
键 的 性 质 差 别 较 大 , 故 可 采取 不 同方 法 使 之 分 离 ,而 不 损伤 其 分 子 基 本 结构 。 但 须 注意 的 
是 许多 生物 大 分 子 的 二 、 三 级 立体 结构 也 是 一 些 非 共 价 结合 , 因 此 分 离 时 就 必须 十 分 小 
心 , 使 其 立体 结构 不 受 破坏 。 故 常常 保持 在 十 分 温和 的 条 件 下 ,以 避免 由 于 强烈 的 外 界 因 


eo 5 re 


子 而 丧失 其 生理 活性 。 这 就 是 生化 分 离 制备 技术 与 有 机 化 学 分 离 制备 技术 最 重要 区 别 之 
处 。 


第 二 节 ”生化 分 离 制备 方法 特点 及 基本 原理 
一 、 生 化 分 离 制备 方法 特点 


混合 物 中 各 组 分 的 分 离 是 化 学 科学 中 一 个 重要 内 容 , 但 但 某 些 经 典 的 化 学 分 离 方 法 如 
蒸馏 、 熔 炼 等 , 对 具有 特殊 生理 活性 物质 的 分 离 是 不 适合 的 。 许 多 生理 活性 物质 如 蛋 自 
质 \ 酶 、 核 酸 等 的 分 离 已 给 经 典 的 化 学 分 离 方法 带 来 了 新 的 课题 , 并 有 力 地 推动 了 化 学 分 
离 技术 向 另 一 分 支 一 一 生化 分 离 技 术 的 发 展 。 生化 分 离 技术 由 实验 目的 的 不 同 , 可 分 为 
生化 分 离 分 析 和 生化 分 离 制备 二 个 方面 。 前 者 主要 对 生物 内 各 组 份 加 以 分 离 后 进行 定 
性 ,定量 鉴定 , 它 不 一 定 要 把 基 组 份 从 混合 物 中 分 离 提 取出 来 。 而 后 者 则 主要 是 为 了 获得 
生物 体内 某 一 单纯 组 份 。 生化 制备 技术 与 一 般 化 学 分 离 制备 技术 比较 , 其 特点 有 下 列 几 
Fa: 

第 一 ,生物 材料 组 成 非常 复杂 。 一 个 生物 材料 常 包括 数 百 种 甚至 数 千 种 化 合 物 , 各 种 
化 合 物 的 形状 、 大 小 、 分 子 量 和 理化 性 质 都 各 不 相同 ,其 中 有 不 少 化 合 物 迄 今 还 是 未 知 物 
- 质 , 而 且 这 些 化 合 物 在 分 离 时 仍 不 断 在 代谢 变化 中 。 

第 二 , 有 些 化 合 物 在 材料 中 含量 极 微 。 只 达 万 分 之 一 , 几 十 万 分 之 一 甚至 百 万 分 之 

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取 竹 笋 素 等 ,都 是 用 几 吨 或 几 十 吨 的 原料 才 提取 到 几 个 毫克 的 目的 物 。 

第 三 ,许多 具有 生物 活性 的 化 合 物 一 旦 离开 了 生物 体内 的 环境 , 很 易 变 性 、 破 坏 。 因 
此 ,, 在 分 离 过 程 中 要 十 分 小 心 保护 这 些 化 合 物 的 生理 活性 , 这 是 生化 制备 最 困难 的 地 方 , 
许多 生物 大 分 子 在 分 离 过 程 中 ,过 酸 、 过 碱 \ 重 金属 离子 \ 高 温 、 剧 烈 的 机 械 作用 、 强 烈 的 辐 
射 和 机 体内 自身 酶 的 作用 均 可 破坏 这 些 分 子 的 生理 活性 。 故 分 离 具有 生物 活性 的 生物 分 
子 , 特 别 一 些 生物 大 分 子 , 常 选择 十 分 温和 条 件 , 并 尽 可 能 在 较 低 刘 度 和 洁 静 环境 下 进行 。 

第 四 ,生化 分 离 方法 几乎 都 在 溶液 中 进行 ,各 种 参数 (温度 、pH 值 \ 离 子 强度 等 ) 对 溶 
被 中 各 种 组 成 综合 影响 常常 无 法 固定 ,以 致 许多 实验 的 设计 理论 性 不 强 , 实 验 结果 和 常常 有 
很 大 经 验 成 份 。 因 此 ,一 个 实验 的 重复 性 的 建立 , 从 材料 到 方法 直至 各 种 环境 条 伟 , 使 用 
的 试剂 药品 等 都 必须 严格 地 加 以 规定 。 

第 五 ,为 了 保护 所 提取 物质 的 生理 活性 及 结构 上 的 完整 ,生化 分 离 方法 多 采取 温和 的 
“多 阶 式 " 进 行 , 也 就 是 我 们 常 说 的 逐 层 剥皮 ”方法 ,一 个 生物 分 子 的 分 离 制备 常常 少 至 几 
个 步骤 ,多 至 十 几 个 步骤 ,并 不 断 变 换 各 种 分 离 方法 , 才 达 到 纯化 目的 。 “多 阶 式 的 分 离 
制备 方法 操作 时 间 长 , 手续 繁琐 , 和 常常 会 给 制备 工作 带 来 许多 影响 。 近 年 来 出 现 所 谓 ` 多 
fate” ,利用 某 些 分 子 特有 的 专 一 亲和力 ,将 某 一 化 合 物 从 极 复杂 的 体系 中 一 次 钧 出 ,这 一 
方法 目前 虽 只 用 于 某 些 大 分 子 如 酶 .抗体 和 核酸 等 的 分 离 提 纯 工 作 , 但 比 起 任何 经 典 化 学 
方法 都 具有 很 大 的 优越 性 。 

第 六 ,生化 分 离 方法 最 后 均一 性 的 证 明 与 化 学 上 纯度 的 概念 并 不 完全 相同 。 这 里 由 
于 生物 分 子 对 环境 反应 十 分 敏感 ,结构 与 功能 关系 比较 复杂 , 故 对 其 均一 性 的 评定 常常 是 


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$ 
A 


AAR RS RN AR AE WE. RIAA RE Ao READ. 


法 所 得 纯度 的 结论 往往 是 片面 的 ,甚至 是 错误 的 。 


二 、 生 化 分 离 制备 方法 基本 原理 


生化 分 离 方 法 与 一 般 化 学 分 离 方法 虽然 有 着 许多 不 同 特点 , 但 生化 分 离 方法 与 一 般 
化 学 分 离 方 法 原理 上 又 有 许多 是 相同 的 或 者 说 是 相通 的 地 方 , 这 充分 说 明 反 映 了 近世 纪 
来 生物 化 学 的 发 展 与 经 典 化 学 及 物理 学 的 密切 关系 。 用 于 生物 化 学 分 离 的 制备 技术 , 大 
都 根据 混合 物 中 的 不 同 组 份 分 配 率 的 差别 把 它们 分 配 于 可 用 机 械 方法 分 离 的 两 个 或 几 个 
物 相 中 (如 有 机 溶剂 抽 提 、 盐 析 、 结 晶 等 )。 或 者 
将 混合 物 置 于 某 一 物 相 (大 多 数 是 液 相 ) 中 ,外 
加 一 定 作用 力 , 使 各 组 份 分 配 于 不 同 区 域 ,从 而 
达到 分 离 目的 (如 电泳 \ 超 离心 . 超 滤 等 )。 除 了 
一 些小 分 子 如 氨基 酸 、 脂 肪 酸 、 某 些 维生素 及 固 TRS 
醇 类 外 , 几 乎 所 有 机 体 中 大 分 子 物质 都 不 能 融 ae 

化 , 也 不 能 蒸发 , 只 限于 分 配 在 固 相 和 液 相 中 ,, 图 13 分 离 时 ?溶质 分 子 所 受 的 不 同 作 用 力 示意 图 


TREE 
F? -__——___.@_- F; 


表 1-4 生化 分 离 方 法 分 类 表 "” 


分 离 方法 推动 力 F, | Hw 力 F, AIS) sme we ie 

一 ,色谱 

(a) 吸附 流体 动力 表面 能 ? 范 德 瓦 耳 斯 力 位 阻 效应 F, | 极 性 、 位 阻 因素 

(b) 离子 交换 流体 动力 静电 吸引 力 , 极 化 度 分 子 筛 效应 F, 离子 性 质 及 分 子 大 小 

(c) 分 配 流体 动力 渗透 (扩散 ), ARE RAMRBRY F. | REAR 

Cd) AFI 流体 动力 Bare A PF, 分 子 大 小 
二 、 逆 流 分 配 机 械 作用 |B wA RRR F, | 极 性 因素 
三 、 电 场 力 

@) 在 自由 溶液 中 静电 引力 分 子 摩擦 力 , 极 化 度 动 电 作用 F, | 离子 性 质 

(b) 在 多 孔 支 持 物 中 静电 引力 分 子 摩 掠 力 ? 极 化 度 动 电 作用 * 表 面 能 F, | 离子 性 质 

() 在 凝 胶 支 持 物 中 | .静电 引力 分 子 筛 效应 F, 和 FE; | 离子 性 质 和 分 子 大 小 

(d) SH RR 静电 引力 平衡 作用 | 离子 性 质 

Co) 对 流 电泳 静电 引力 分 子 摩 掠 效应 F, | 离子 性 质 

(Electrophoresis- _ 电动 Ww , 

convection) (Electrokinetic) 

©) 电 渗析 静电 引力 分 子 筛 效应 F, 和 -FE; | 分 子 大 小 和 离子 性 质 
四 、 扩 散 方法 电 动力 电动 力 

(a) 透析 BEA 分 子 筛 效应 下 2 

(b) 超 滤 流体 动力 分 子 筛 效应 ,表面 能 (吸附 ) F, 分 子 大 小 

(c) ERR DAD a RE ERE 分 子 摩擦 效应 F, 分 子 大 小 

ww 

五 、 结 晶 结晶 格子 能 | 扩散 FL | 分 子 大 小 及 形状 
Nr De 

(a) 动力 学 的 重力 、 离 心力 “| 分 子 摩擦 效应 F, 分 子 大 小 

(b) 等 密度 的 离心 力 平衡 作用 | 分 子 大 小 及 介质 密度 


.并 在 这 两 相 之 间 相 互 交替 进行 分 离 纯化 。 

摩 里 斯 (Morris) 认为 许多 生化 分 离 制备 方法 都 可 以 看 作 是 各 种 溶质 分 子 在 溶液 中 
洛 着 一 条 狭 罕 路 线 移动 的 结果 外。 例如 溶质 分 子 (A) 在 一 定时 间 内 只 有 一 个 运动 方向 , 
它 受 二 个 不 同方 向 力 的 作用 (如 图 1-3)。 

F, 表示 与 溶质 分 子 运动 方向 相同 的 推动 力 ,F; 表示 与 溶质 分 子 运动 方向 相反 的 阻 滞 
力 。 作 为 推动 力 可 能 是 流体 动力 (如 色谱 ) ,电场 力 ( 如 电泳 )\ 重 力 \ 离 心力 (如 沉降 ) 及 其 
他 作用 力 如 扩散 ,渗透 中 的 分 子 运动 等 。 许 多 分 离 方 法 常常 不 止 一 种 推动 力 ,而 是 几 种 推 
动力 联合 起 作用 。 阻 滞 力 一 般 包 括 : 

(1) 在 均一 溶液 中 分 子 的 摩擦 效应 ; 

(2) 极 化 分 子 的 静电 作用 , 尤 其 是 生物 大 分 子 溶质 与 溶液 中 其 他 溶质 分 子 的 静电 引 
力 ,往往 造 成 这 些 大 分 子 溶质 流动 时 遇 到 的 主要 阻碍 力 。 

(3) 在 两 相 体系 中 ,溶质 在 两 相 中 的 分 配 系数 及 分 子 租 效 应 等 。 

(4) 吸附 作用 ,渗透 作用 及 其 他 因素 所 引起 的 阻 滞 力 。 

因此 , 图 1-3 中 溶质 分 子 A 的 移动 速度 取决 于 Ft 一 FA = AF^, 而 溶质 分 子 了 的 移 
动 速度 取决 于 _F? 一 F} 一 AFs。 溶质 分 子 A 与 溶质 分 子 B 的 分 离 效 果 将 取决 于 AEA/ 
AF® = AF 的 比值 。 所 以 , 在 分 离 混合 物 的 各 组 份 中 ;必须 尽量 设法 扩大 各 组 份 之 间 AF 
的 差别 ,以 其 达到 各 组 份 彼此 之 间 的 完全 分 离 。 

史 特 朗 (Strain) 和 他 的 同事 根据 物质 分 离 各 种 力 的 作用 把 许多 分 离 方法 作 了 一 些 归 
纳 及 评论 思 。 摩 尔 里 斯 (Morris) 等 在 史 特 朗 等 基础 上 进一步 把 各 种 分 离 方法 中 FE; 及 
分 离 时 主要 依据 一 物理、 化 学 因素 作 了 小 结 , 如 表 1-4 所 示 。 

表 1-4 中 所 列 各 种 生化 分 离 方法 , 在 制备 中 使 用 较 多 的 有 吸附 色谱 、 离 子 交换 色谱 、 
分 子 饰 色 谱 、 逆 流 分 配 、 凝 胶 电 泳 \ 电 次 析 、 透 析 、 超 滤 、 结晶 \ 沉 降 等 , 其 中 大 部 分 方法 将 在 
以 后 各 章 中 分 别 予 以 介绍 。 


第 三 节 生化 分 离 制备 实验 的 设计 及 实验 方法 的 选择 


一 、 生 化 分 离 制备 实验 的 设计 


生化 分 离 制备 实验 的 设计 , 首 先 面临 的 是 所 要 求 分 离 的 物质 的 化 学 结构 及 性 质 存在 . 
着 -已 知 "与 未知" 两 种 情况 。 已 知 结构 性 质 物 质 的 分 离 制备 ,前 人 肯定 已 做 过 一 些 研究 , 
在 继续 进行 这 类 实验 时 ,常常 是 为 了 取得 更 纯 、 更 多 的 产物 或 者 希望 找 出 更 简便 、 效 率 更 
高 的 实验 方法 。 因 此 ,这 类 物质 分 离 制备 方法 的 改进 ,主要 依赖 于 对 所 分 离 物 质 的 理化 性 
质 的 了 解 和 参照 前 人 已 用 过 的 各 种 实验 方案 ,通过 自己 具体 实验 条 件 加 以 比较 优选 ,或 者 
是 参考 其 他 类 似 物 质 最 新 分 离 方法 加 以 引进 试用 ,从 而 求 得 最 佳 的 实验 方法 或 工艺 六 程 。 
经 较 小 的 制备 规模 过 渡 到 中 间 规 模 试 验 , 最 后 到 较 大 规模 的 工业 生产 。 但 任何 技术 方法 
都 有 时 间 性 和 受到 具体 条 件 的 限制 ,一 个 认为 比较 理想 的 分 离 制备 方法 ,并 不 是 永远 都 是 
最 好 的 , 随 着 时 间 的 推移 和 新 的 技术 实验 仪器 和 实验 器 材 的 出 现 , 总 得 不 断 革 新 , 完善 ; 
否则 便 将 逐步 地 被 新 的 方法 所 代替 。 所 以 , 熟练 掌握 实验 原理 , 根据 自己 实验 具体 条 件 , 
及 时 了 解 国内 外 有 关 先 进 技术 发 展 动态 ,不 断 改进 自己 实验 方法 ,才能 适应 日 新 月 异 的 技 


人 


术 发 展 的 要 求 。 

对 于 一 个 未 知 化 学 结构 性 质 的 物质 的 分 离 制备 , 情况 则 比较 复杂 , 由 于 所 分 离 制备 
物质 还 是 一 个 “未 知 数 ”, 没 有 什么 经 验 和 固定 方法 可 以 遵循 , 开始 设计 实验 时 ,只 能 根据 
该 物质 某 一 生物 学 或 生物 化 学 的 性 质 或 现象 来 指导 每 一 分 离 制备 步 又 (这 里 ,往往 也 需要 
参照 前 人 有 关 工 作 , 并 不 是 赁 空想 出 )。 有 时 在 摸索 过 程 中 , 往往 认为 自己 设计 的 方法 很 
理想 完善 了 ,但 最 后 得 不 到 什么 结果 或 得 到 很 小 的 结果 ,这 是 常 有 的 事 。 只 有 经 过 多 次 反 
复 实 践 ,不 断 总 结 失败 原因 ,修改 原 有 的 实践 方案 , 才 有 可 能 取得 最 后 成 功 。 当 实验 一 旦 
的 导 5 直下 以 要 提 志 局 绸 下 天 拓 疾 确 源 化 性 质 : 改进 已 有 制备 方法 条 件 ; 光 
步 提高 产品 的 质量 和 产量 。 

Hens E48 Uo, FESR MEOH LOR PRG ACT ET 
B: 

CG) 确定 制备 物 研 究 目 的 及 建立 相应 的 分 析 鉴 定 方法 。 

(2) 制备 物 物 理化 学 性 质 稳定 性 的 预备 试验 。 

(3) 材料 处 理 及 抽 提 方法 的 选择 。 

(4) 分 离 纯 化 方法 的 摸索 。 

(5) 获得 制备 物 以 后 ,均一 性 的 测定 。 

现 就 以 上 五 个 基本 阶段 所 涉及 的 实验 设计 原理 及 实验 程序 简要 介绍 和 讨论 如 下 : 


(—) 制备 物 研究 的 目的 及 分 析 鉴定 方法 的 建立 


前 已 提 到 ,分 离 制备 某 一 生物 组 份 的 目的 ,如 果 不 是 为 了 在 原 有 的 实验 方法 上 加 以 改 
进 , 以 求 得 更 多 更 纯 的 产品 , 就 是 为 了 获得 新 的 物质 。 这 里 主要 涉及 的 问题 是 后 一 种 情 
况 。 在 生物 化 学 研究 工作 中 , 新 组 份 的 分 离 常常 是 科研 工作 主要 的 内 容 。 机 体内 一 个 新 
的 物质 的 发 现 , 对 了 解 有 机 体 的 生理 功能 具有 很 重要 的 意义 。 如 核酸 的 发 现 对 揭 开 生物 
体 遗 传 变异 规律 之 谜 , 环 化 腺 一 磷 的 发 现 对 进一步 了 解 激 素 和 代谢 调节 的 关系 , 反 向 转录 
酶 的 发 现 对 于 了 解 RNA 控制 蛋白 质 的 合成 等 。 可 以 说 生物 体内 每 一 种 新 的 物质 的 发 现 , 
都 不 同 程度 地 推动 着 生物 化 学 甚至 整个 分 子 生物 学 前 进一步 。 通 过 科学 工作 者 的 长 期 劳 
动 , 现 在 我 们 虽然 知道 了 很 多 机 体内 组 成 成 份 及 分 论 的 物质 ,但 也 许 我 们 尚未 知道 的 东西 
比 已 知 的 东西 数量 还 要 多 。 从 生物 不 断 变 异 的 观点 来 看 , 入 们 对 机 体 记 组 成 的 物质 的 认 
识 是 没有 尽头 的 。 

从 机 体内 分 离 制备 一 种 未 知 物质 的 企图 ,通常 是 由 于 二 种 情况 引起 的 。 一 种 是 无 意 
识 的 ,例如 ,在 进行 某 种 有 目的 的 实验 时 ,偶然 出 现 了 某 些 异常 现象 ,引起 了 研究 人 员 的 注 
意 和 兴趣 ,从 而 进一步 去 追踪 研究 。 属 于 这 类 情况 往往 在 研究 者 获得 了 这 种 制备 物质 后 , 
开始 并 不 了 解 这 种 物质 的 生理 意义 或 实际 上 有 什么 用 处 。 只 有 经 过 一 定时 间 后 才 被 人 们 


所 认识 。 这 种 开始 并 没有 固定 目的 的 实验 工作 , 对 于 应 用 研究 部 门 往往 容易 疏忽 或 缺乏 | 


深 和 人 探索 的 兴趣 。 基 础 理论 研究 部 门 则 常 视 为 一 种 新 的 发 现 , 而 比较 重视 加 以 研究 。 第 
二 种 情况 是 有 目的 的 , 人 们 在 一 定 自 然 条 件 或 人 工 条 件 观 察 到 某 种 异常 的 生物 学 或 生物 
化 学 现象 , 从 而 有 意识 地 追踪 研究 引起 这 种 现象 发 生 的 物质 基础 。 这 种 例子 在 科研 工作 
中 是 很 多 的 如 根据 细菌 生长 被 抑制 的 情况 有 目的 分 离 某 种 新 的 抗菌 素 , 根 据 某 些 物 质 对 
动 \ 植 物 的 代谢 调节 所 引起 的 作用 探求 新 的 激素 ,根据 昆虫 某 些 特殊 生理 反应 研究 它们 所 


* 9 e 


分 这 的 通讯 物质 , 以 及 从 机 体内 某 种 代谢 中 间 产 物 的 积累 寻找 催化 这 一 反应 的 酶 等 等 。 
属于 这 类 有 既定 目的 而 设计 的 分 离 制备 实验 方案 , 效果 一 般 比 较 显著 。 建立 相应 的 分 析 
鉴定 方法 也 比较 容易 ,获得 制备 物 后 对 其 生理 意义 及 实用 价值 事前 也 已 有 一 定 的 认识 。 

生化 分 离 制备 实验 目的 性 尽管 有 不 同 , 当 一 旦 着 手 进行 实验 工作 时 ,都 必须 首先 建立 
对 制备 物 的 分 析 鉴定 方法 ,才能 保证 分 离 制备 工作 顺利 进行 ,指导 生化 物质 分 离 制备 工作 
的 分 析 鉴定 方法 大 致 可 分 为 三 种 类 型 : 

1. 生物 测定 方法 ”对 一 个 未 知 结构 的 新 物质 , 生 物 测 定 方法 常常 比 一 般 物 理化 学 
方法 具有 更 大 优越 性 , 且 是 实验 取得 成 功 必 不 可 少 的 一 步 ,生物 测定 方法 全 面 涉及 生物 学 
各 科 的 实验 内 容 , 如 微生物 学 、 细 胞 学 、 生 理学 、 组 织 解剖 学 、 药 理学 及 动 植物 形态 分 类 学 
等 。 一 个 生物 测定 方法 的 建立 , 必 须 选 择 适 当 的 生物 对 象 , 继 而 决定 测试 的 生物 反应 类 
型 ,如 细菌 的 生长 或 抑制 ,肌肉 的 舒张 或 收缩 , 某 种 器 官 呈现 抑制 或 兴奋 反应 ,血压 的 升 高 
或 降低 , 受到 试验 物质 刺激 后 某 种 组 织 分 泌 物 增加 或 减少 等 。 然后 在 这 些 定性 反应 基础 
上 进一步 建立 生物 反应 的 定量 标准 。 生物 测定 方法 很 多 , 而 且 每 一 测定 方法 具体 规定 标 
准 及 条 件 各 不 相同 ,其 详细 内 容 的 介绍 可 参看 有 关 专 著 及 资料 Ba 

2. 理化 测定 方法 ”这 是 最 常用 最 方便 的 分 析 测 定 方法 , 生 物 测定 方法 虽 有 很 高 特 
异性 ,但 手续 繁 玉 , 对 于 指导 分 离 制备 实验 的 进行 ,时 间 上 太 受 限制 。 因 此 ,对 于 一 个 未 知 
化 学 结构 的 物质 ,如 生物 反应 测定 确定 其 存在 后 ,应 立即 着 手 建立 理化 测定 方法 。 理化 测 


| 定 方 法 的 建立 一 般 是 先进 行 预 试 ,初步 肯定 该 物质 属于 那 一 类 有 机 物 , 然 后 按 各 类 有 机 物 


质 的 特殊 物理 化 学 性 质 建立 定性 \ 定 量 鉴定 方法 ,这 类 方法 常 有 : 

C1) SHE: 包括 染色 和 比 色 法 。 

(2) 色谱 法 : 包括 纸 上 色 谱 、\ 薄 层 色 谱 `\ 气 相 色 谱 和 高 效 液 相 色谱 等 。 

(3) 光谱 法 : 包括 紫外 光谱 、 红 外 光谱 \ 获 光 光 谱 等 。 

(4) 电泳 法 : 包括 纸 电 泳 , 凝 胶 电 泳 等 。 

《5) 核磁 共振 波谱 法 。 

(6) 其 他 : 如 电子 显微镜 观察 。 Ve | 

理化 测定 方法 的 最 大 优点 是 实验 操作 简便 快速 ,能 及 时 指导 分 离 制备 工作 。 

3. 理化 方法 与 生物 学 方法 结合 测定 ”对 于 某 些 生物 体内 含量 较 低 , 或 所 建立 的 理 
化 测定 方法 的 特异 性 和 灵敏 度 不 足以 反映 该 物质 定性 与 定量 的 要 求 时 , 常 需要 结合 生物 
学 测定 方法 才能 全 面 地 准确 地 反映 该 物质 的 存在 情况 。 例如 Kaslson 和 Schmialak 根据 
生物 反应 知道 虾 也 存在 晓 皮 激素 并 借用 昆虫 中 提取 旷 皮 酮 的 方法 企图 从 是 提取 这 种 物 
质 , 由 于 使 用 的 理化 分 析 方 法 不 够 灵敏 和 分 离 度 程 的 不 合理 ,用 了 三 和 干 公斤 虾 为 实验 材料 
而 毫 无 所 获 。 后 来 Hampshire 和 Horn DL Aika (Calliphora) 的 生物 测定 为 指导 , 并 结合 
理化 分 析 方 法 ;改进 了 实验 分 离 六 程 , 才 由 一 千 公 斤 虾 的 废 小 中 成 功 地 分 离 了 2mg 非 结 
ae Ate Be AK Ss 又 如 从 家 等 中 提取 家 蚕 醇 ,使 用 气相 层 析 方法 和 等 蛾 兴奋 反应 相 结合 , 
使 分 离 制备 六 程 效果 大 大 提高 。 

理化 分 析 方 法 与 生物 学 测定 方法 相 结合 ,用 于 各 类 抗菌 素 、 信 息 素 \ 激素、 维生素 和 各 
种 具有 生理 活性 的 生化 药物 的 定性 及 定量 相当 普遍 。 

不 论 是 生物 学 方法 或 物理 化 学 方法 或 是 二 者 结合 使 用 , 一 个 好 的 分 析 鉴 定 方法 必须 
满足 以 下 要 求 : 


“IO 。 


3 
: 


1. 特异 性 或 专 一 性 强 ; 

2. 重 现 性 好 ; 

3. 准确 度 大 ; 

4. 灵敏 度 高 ; 

5. 手续 简便 ; 

分 析 方 法 的 特异 性 或 专 一 性 ,对 于 整个 分 离 纯 化 实验 的 成 功 与 否 非常 重要 。 一 个 特异 


”性 高 的 分 析 方 法 的 建立 是 分 离 一 个 未 知 结构 的 化 合 物 的 指南 针 , 如 果 分 析 方 法 特异 性 不 


高 ,分 离 工作 前 进 方向 不 明 ,必然 造 成 错误 的 结果 。 一 个 分 析 方法 的 特异 性 除了 方法 本 身 
因素 外 ,与 环境 因子 关系 十 分 密切 。 特 别 在 分 离 纯化 初始 阶段 ,各 种 干扰 物质 大 量 存在 情 
况 下 ,一 个 专 一 性 高 的 分 析 方 法 更 显得 重要 ,但 除了 极 个 别 情况 外 , 很 少 有 绝对 专 一 的 分 
析 方 法 。 所 以 为 了 提高 分 析 方 法 的 特异 性 , 常常 需要 把 起 始 材料 中 干扰 成 份 减少 到 最 低 
量 , 或 尽量 选择 适当 条 件 使 干扰 物质 不 起 作用 。 选 用 制备 物质 含量 较 丰 富 的 材料 ,也 可 大 
大 提高 分 析 方 法 的 特异 性 。 

重 现 性 或 称 重复 性 , 是 指 分 析 结 果 能 经 受 起 时 间 的 考验 重复 测 出 的 程度 。 重 现 性 的 
获得 主要 是 认真 规定 每 次 的 实验 条 件 , 包 括 分 析 仪器 装置 , 试剂 药品 的 标准 度 , 样品 的 浓 
度 , 操 作 方 法 及 材料 的 来 源 、 保 存 和 处 理 等 。 如 果 把 样品 、 测试 仪器 、 试 剂 等 因素 固定 后 。 
分 析 方 法 的 重 现 性 ,主要 和 实验 人 员 主 观 因素 有 关 。 

分 析 方 法 的 准确 度 主 要 反映 在 定量 测定 上 的 误差 范围 。 在 一 般 情况 下 对 分 析 方 法 要 
求 的 准确 度 当 然 越 高 越 好 ,但 在 生化 制备 过 程 中 ,制备 物 由 一 个 混杂 体系 逐步 向 一 个 纯 烷 


单一 的 物质 过 渡 , 开 始 时 杂质 的 干扰 是 不 可 避免 的 ,因此 ,分 离 提纯 每 一 阶段 ,定量 上 存在 


的 误差 只 要 不 影响 分 离 提纯 工作 沿 着 正确 方向 进行 , 即 可 满足 测定 要 求 。 有 的 分 析 的 精 
确 度 甚至 可 以 粗略 到 用 正 反 应 (十 ) 或 负 反 应 (一 ) 表 示 , 也 能 获得 很 好 分 离 效果 。 所 以 在 
分 离 制备 过 程 中 ,分 析 工 作 的 特异 性 和 重 现 性 在 某 种 意义 上 比 要 求 精 确 度 更 为 重要 一 些 。 

灵敏 度 是 指 制备 物 在 某 一 体系 中 含量 的 可 测度 。 MAM, 即 我 们 使 用 的 分 析 方 法 


对 制备 物 所 能 测 出 的 最 低 含 量 是 多 少 。 在 分 离 纯化 开始 阶段 或 所 用 原料 含 制备 物 的 量 较 


低 时 ,高 灵敏 度 的 分 析 方 法 显得 比较 重要 些 。 此 外 ,高 敏 度 的 分 析 方 法 在 多 步骤 的 分 离 提 
纯 工 艺 流程 中 ,可 以 帮助 收回 一 部 分 产品 ,达到 节省 原料 消耗 ,增加 产量 的 目的 。 

最 后 谈 谈 分 析 工 作 操作 手续 的 繁 简 与 指导 分 离 纯化 实验 的 关系 , 人 们 往往 存在 这 样 
一 个 倾向 , 即 盲目 追求 某 一 分 析 方法 的 特异 性 或 灵敏 度 等 指标 ,而 忽视 操作 手续 简便 的 重 
要 性 , 这 对 于 一 些 代谢 速度 较 快 或 者 容易 失去 生理 活性 的 物质 的 制备 , 将 是 一 严重 的 错 
误 。 生 化 分 子 一 般 都 是 一 些 具 有 生理 活性 的 物质 或 代谢 的 中 间 产 物 , 因 此 ,简便 快速 的 分 
析 测 定 方法 有 着 重要 意义 。 人 们 在 提取 一 个 代谢 速度 较 快 的 中 间 产 物 时 , 往往 宁愿 要 一 
个 快速 简便 而 精确 度 较 差 的 方法 ,而 不 要 一 个 繁琐 费时 而 高 精确 的 方法 ,这 似乎 是 一 个 普 
通 的 原则 。 


(=) 制备 物 的 物理 化 学 性 质 及 稳定 性 的 预备 试验 59 


制备 物 的 理化 性 质 及 稳定 性 的 预 试验 是 对 一 个 未 知 物质 分 离 制备 实验 设计 的 基础 。 
许多 生化 物质 在 有 机 体 特定 环境 中 比较 稳定 , 一 旦 离开 机 体 后 容易 受 外 界 条件 影 响 而 失 
活 。 因 此 ,在 各 个 阶段 的 分 离 纯 化 步骤 中 , 都 必须 在 制备 物 的 稳定 条 件 范围 内 进行 , 以 保 


e ll 。 


证 被 分 离 物质 不 受 破坏 。 设计 一 个 未 知 结构 的 生化 物质 的 分 离 纯化 实验 方案 , 通常 所 涉 
及 的 预备 试验 项 目 如 表 1-5 所 示 : 
R1S 分离 制 备 物质 的 预备 试验 项 目 表 


A: 溶解 性 能 
1. 在 水 或 各 种 稀 盐 溶液 中 的 溶解 性 能 ; 
2. 在 弱 极 性 溶剂 中 溶解 性 能 (如 甲醇 乙醇 \ 丙 酮 等 )3 
3. 在 各 种 非 极 性 溶剂 中 的 溶解 性 能 (如 氯仿 和 各 种 烃 类 等 )。 
B: BRE 
l.pH 稳定 范围 ; 
2. 温 度 效应 ; 
3. 各 种 缓冲 溶液 的 影响 ; 
4. 有 机 溶剂 (如 乙 昔 \ 丙 贾 ) 的 影响 。 
C: 固态 时 稳定 性 
玉 温 度 影 响 ; 
2. 水 份 含 量 的 影 啊 ; 
3. 低 压 冻 干 效应 。 
D: 物理 性 质 ° 
工 . 透 过 不 同 大 小 孔径 膜 的 能 力 ; 
2. 在 固体 上 的 吸附 作用 , 
3. 在 电场 中 每 一 pH 变化 的 迁移 值 ; 
4. 在 超 离心 力 场 中 的 沉降 作用 。 
E: 化 学 性 质 : 
1. 对 胰 和 蛋白酶 及 其 他 蛋白 水 解 酶 作用 的 稳定 性 ; 
2. 对 DNase 和 RNase 作用 的 稳定 性 ; 
3. 对 糖 类 分 解 酶 作用 的 稳定 性 ; 
4. 在 温和 条 件 下 乙酰 化 作用 的 稳定 性 ; 
5. 对 亚 硝酸 作用 的 稳定 人 性; 
6. 在 温和 条 件 下 本 化 作用 的 稳定 性 。 


表 中 所 列 项 目 较 繁 多 ,不必 在 实验 一 开始 便 全 部 进行 试验 , 先 选择 某 些 预 试 项 目 , 其 
结果 能 说 明 一 个 未 知 物 的 主要 物理 、 化 学 性 质 就 够 了 。 例 如 未 知 物 是 极 性 还 是 非 极 性 化 合 
物 , 是 电解 质 还 是 非 电解 质 , 是 大 分 子 还 是 小 分 子 及 pH 值 ,温度 、 稳定 范 围 等 。 至 于 其 他 
一 些 细 目 ,往往 需要 结合 分 离 制备 过 程 出 现 的 具体 情况 ;有 必要 时 ,, 才 进一步 加 以 测试 。 

在 上 表 所 列 到 各 预测 项 目 中 , 溶解 性 能 的 测定 是 指导 制备 物 的 提取 、 沉淀 、 结晶 的 基 
础 。 必 须 最 先 完成 , 然 后 在 此 基础 上 , 求 出 pH 值 ` 温 度 、 离 子 强度 对 制备 物 溶解 度 及 稳 
定性 的 影响 ,以 便 在 溶液 中 找 出 最 适 提纯 条 件 。 对 于 绝 大 多 数 生化 物质 来 说 ,只 有 在 一 定 
pH 值 、 温 度 及 离子 强度 下 进行 分 离 纯化 才能 保证 其 活性 不 受 损失 ,这 方面 内 容 在 本 书 以 
后 几 章 中 还 详细 讨论 ,在 这 里 需要 指出 的 是 制备 物 在 分 离 过 程 中 , 随 着 其 他 成 份 不 断 被 除 
去 ,原来 B 项 试验 有 关 的 化 学 性 质 将 有 所 改变 ,这 点 应 随时 予以 注意 。 

物理 性 质 的 试验 主要 了 解 制备 物 的 分 子 大 小 、 形 状 及 带电 性 质 。 在 电场 中 可 逆 移 动 
的 方向 及 进行 离子 交换 树脂 或 离子 交换 纤维 素 的 试验 , 可 判断 此 未 知 物 是 否 属于 两 性 电 
解 质 及 其 带电 荷 性 质 与 数量 情况 。 其 次 进行 某 些 吸附 试验 (如 活性 碳 、 ER, Ae 
酸 钙 等 的 吸附 试验 ) 可 以 帮助 分 离 初期 制备 物 在 选择 方法 上 的 设计 。 吸附 作用 可 起 到 党 
缩 收 集 作用 ,但 注意 活性 碳 和 硅胶 的 吸附 作用 不 适宜 蛋白 质 及 核酸 衍生 物 ,因为 活性 碳 和 
硅胶 对 这 些 物质 的 吸附 常常 是 不 可 逆 的 ,不 仅 洗 脱 困难 ,而 且 容易 造成 变性 失 活 。 膜 透 过 


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Ce ay ee ee Le ee eS 


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性 、 分 子 筛 层 析 及 超 离心 沉降 作用 的 试验 , 主 要 是 为 了 获得 制备 物 分 子 大 小 及 形状 的 证 
48, 在 制备 中 后 期 的 提纯 是 十 分 有 用 的 。 但 这 种 试验 只 待 分 离 工 作 到 了 一 定 程 度 后 才 按 
需要 进行 。 到 了 分 离 纯 化 的 后 期 , 半成品 和 成 品 保存 的 温度 及 水 份 含量 对 其 稳定 性 的 影 
响 也 很 重要 ,大 多 数 生化 物质 固 相 保存 都 要 低温 、 干 燥 ( 但 也 不 是 有 温度 越 低 、 含 水 量 越 少 越 
好 7) 还 有 些 生化 物质 除了 对 温 度 含水 量 敏 感 外 ,对 光线 \ 气体 及 某 些 微量 金属 也 十 分 敏感 。 
分 离 后 期 的 产品 如 以 液态 保存 ,影响 其 稳定 性 因素 更 多 , 更 不 可 有 所 忽视 ,否则 辛苦 制 得 


细 讨 论 。 

~ 分 离 制备 物 如 果 是 一 复合 成 份 , 或 某 制备 物 的 生理 活性 与 分 子 内 某 一 基 团 或 分 子 外 
某 一 辅 基 有 关 ,, 则 其 他 一 些 预 备 试验 便 不 能 获得 正确 的 结果 。 此 时 常 将 复合 物 拆 离 ,决定 
其 中 那 一 组 份 是 所 要 制备 的 部 分 。 有 些 蛋 白质 和 酶 , 其 生理 活性 与 分 子 上 某 一 氨基 、 凑 


化 学 性 质 。 还 有 些 酶 , 其 生理 活性 与 金属 离子 和 小 分 子 辅 基 有 关 , 常 用 透析 或 超 离心 
沉降 方法 , 观 察 其 失 活 及 重组 后 复活 的 过 程 , 便 从 中 了 解 到 整个 复合 分 子 中 各 组 份 的 关 
系 。 

“总 之 ,在 整个 实验 的 设计 时 ,对 制备 物 各 项 稳定 性 及 一 些 理化 性 质 的 预 试 验 是 整个 研 
究 工 作 最 费 精 力 及 时 间 的 部 分 ,但 也 是 不 可 缺少 的 部 分 。 


(|) 材料 处 理 及 提取 方法 的 选择 
选择 材料 主要 根据 实验 的 目的 而 定 , 同 一 种 物质 由 于 进化 的 关系 通常 在 不 同 种 类 的 


时 材料 来 源 丰 富 但 含量 不 高 ,或 者 材料 来 源 , 含 量 都 很 理想 , 而 材料 中 杂质 太 多 ,分 离 纯化 
手续 十 分 繁琐 ,以 致 影响 质量 和 收 率 , 反 不 如 含量 低 些 但 易于 操作 获得 纯 品 者 。 因 此 ,, 必 
须根 据 具 体 情 况 , 抓 住 主要 矛盾 而 决定 取舍。 但 为 了 科学 实验 某 种 特殊 需要 ,例如 对 某 种 


验 目 的 即 可 。 


季节 和 生长 时 期 而 变化 , 动 物 材料 中 的 各 种 组 份 处 于 不 同 生理 状态 也 有 很 大 差别 。 微 生 
物 材 料 中 的 各 种 组 份 的 变化 受 环境 因子 影响 尤为 显著 , 培 养 基 的 成 份 、_pH、 温 度 的 影 只 
外 ;诱导 物 、 抑 制剂 的 添加 都 可 以 大 大 增加 所 需 物质 的 含量 。 菌 种 的 筛选 、 诱 变 已 是 人 们 
所 邹 悉 的 提高 微生物 体内 某 种 物质 含量 最 常用 的 方法 。 此 外 ,近年 来 使 用 转 导 、 核 酸 重 组 
即 遗 传 工程 等 新 方法 已 使 细菌 中 一 些 原来 含量 很 少 的 物质 大 量 增加 , 原 来 没有 的 物质 成 
份 , 也 可 以 通过 遗传 工程 方法 ,使 之 产生 。 当然 后 者 不 属于 材料 选择 讨论 范围 , 但 这 些 都 
说 明生 物 材 料 所 含 的 组 分 并 不 是 一 成 不 变 的 , 必 须 因 时 因 地 和 根据 实验 的 目的 要 求 而 具 
体 解决 。 一 个 材料 选择 是 否 合理 ,不 仅 关系 到 实验 进行 的 难 易 ,而 且 常 常 是 导致 实验 的 成 
败 的 原因 。 

Ne 实验 材料 选 定 后 ,常常 需要 进行 预 处 理 , 如 动物 材料 要 除去 一 些 与 实验 无 关 甚 至 有 防 
碍 的 结缔 组 织 ,脂肪 组 织 和 血 污 等 , 植物 种 子 需要 除 壳 , 微生物 材料 需 将 菌 体 和 发 酵 液 分 
开 等 。 材 料 处 理 及 洗 净 以 后 ,下 一 步 就 是 选用 适当 方法 将 组 织 细胞 破碎 ,进行 抽 提 。 材 料 


AG ha 


和 


的 样品 最 后 受到 破坏 或 损失 是 令 人 痛心 的 。 各 种 样品 的 保存 方法 在 本 书 最 后 一 章 还 将 详 


基 或 羟基 有 关 , 在 温和 条 件 下 进行 硝化 , 己 酰 化 及 酯 化 试验 , 便 可 推测 这 些 分 子 大 致 、 


生物 体 中 都 有 存在 。 从 工业 生产 角度 上 来 郑 虑 , 首先 是 材料 来 源 丰 富 , 含 量 高 \ 成 本 低 <s 有 


材料 或 某 一 生物 品种 中 寻找 某 种 未 知 物质 ,选材 时 则 无 需 全 面 郑 虑 上 述 问题 ,只 能 达到 实 


与 无 机 物 不 同 , 生物 体内 某 种 成 份 不 是 一 成 不 变 的 。 如 植物 材料 所 含 各 种 成 份 常 随 


中 被 制备 物质 的 存在 形式 及 部 位 与 组 织 破 隘 及 抽 提 方法 有 直接 关系 , 必 须 在 实验 前 有 所 
了 解 。 如 属 体液 .血液 中 的 游离 物质 或 生物 体 分 这 到 体外 的 分 这 物 , 则 不 必 进 行 组 织 细胞 
的 破碎 。 但 细胞 内 含 物 不 论 存在 于 哪些 部 位 (如 在 膜 上 , 核 中 或 细胞 浆 内 ) 均 需 采取 不 同 
ee 

组 织 细胞 的 破碎 方法 很 多 ,有 机 械 方法 , 物理 方法 , 化 学 及 生物 化 学 方法 等 。 不 同 实 
验 规模 ,不 同 实验 材料 和 实验 要 求 ,使 用 的 破碎 方法 和 条 件 也 不 同 。 例 如 一 些 坚 韧 组 织 如 
遇 肉 ,植物 的 根 \ 芭 等 , 则 常 需 强烈 的 绞 碎 或 研磨 作用 ,才能 把 其 组 织 细胞 破坏 。 而 比较 骤 
软 的 组 织 如 肝 、 脑 等 , 用 普通 的 玻璃 匀 浆 器 即 可 达到 完全 破坏 细胞 的 目的 。 同 样 一 种 实 
验 材料 ,但 制备 大 分 子 量 的 核酸 和 制备 小 分 子 的 核 昔 酸 ,对 细胞 破碎 的 方法 和 条 件 也 不 相 
同 , 后 者 可 以 采用 强烈 手段 , 而 前 者 则 必须 保持 十 分 温和 的 条 件 , 才 不 致 于 损坏 其 分 子 的 
完整 性 。 组 织 细胞 破碎 常用 方法 有 如 下 几 种 : 

1. 机 械 法 ”主要 通过 机 械 切 力 的 作用 使 组 织 细胞 破碎 的 方法 , 常 用 的 器 械 有 组 织 
的 碎 机 , 匀 浆 器 , 研 钵 和 研磨 ,压榨 器 等 。 

(1) 组 织 的 碎 机 : 一 般 用 于 动物 组 织 , 植物 肉质 种 子 , 和 柔嫩 的 时 , 芽 等 材料 的 破碎 。 
-国产 的 的 碎 机 最 高 转速 可 达 每 分 钟 1 一 2 万 转 。 由 于 旋转 刀片 的 机 械 切 力 很 大 ,制备 一 些 
较 大 分 子 如 核酸 则 很 少 使 用 。 

(2) GRE: 匀 浆 器 的 研 杆 磨 球 和 玻璃 管内 壁 之 间 间 隙 常 保 持 在 十 分 之 几 毫 米 距 
离 。 破 雁 细胞 的 程度 比 组 织 的 碎 机 高 。 制 作 匀 浆 器 的 材料 , 除 至 璃 外 , 还 可 以 用 硬 质 闻 
料 ,不 诱 钢 、 人 造 荧光 树脂 等 制 成 。 

(3) 研磨 : “多 用 于 细 戎 或 其 他 坚硬 植物 材料 ,研磨 时 常 加 入 少量 石英 砂 , 玻 璃 粉 或 
其 他 研磨 剂 ,以 提高 研磨 效果 。 细 菌 磨 是 一 种 改良 了 的 研磨 器 , 比 一 般 研 钵 具有 更 大 的 研 
磨 面积 ,而 且 底 部 有 出 口 。 操 作 时 先 把 细菌 和 研磨 粉 调 成 糊 状 , 每 次 加 入 磨 内 一 小 勺 , 研 
HS 20 一 30 秒 钟 即 可 将 细菌 细胞 完全 破碎 。 

(4) 其 他 大 型 细胞 破碎 器 : 如 French 压榨 器 Manton-gaulin HBS, 主要 是 高 压 
-下 使 细胞 通过 小 孔隙 而 被 挤 碎 ,每 小 时 可 处 理 数 十 升 至 数 千 升 样品 ,适用 于 微生物 发 酵 工 
业 生 产 。 

2. 物理 法 ”主要 通过 各 种 物理 因素 使 组 织 细胞 破碎 的 方法 。 在 生化 制备 中 常用 的 
有 : 

(1) 反复 冻 融 法 : 先 将 样品 深 冷 至 一 15%c 至 一 200 使 之 冻 固 , 再 缓 覃 地 融化 , 反 
复 多 次 可 将 大 部 分 细胞 破碎 ,此 法 多 用 于 动物 性 材料 。 

(2) BIE: 将 样品 材料 投入 沸水 , 维持 85 一 90%C 数 分 钟 后 , 置 冰 浴 中 急速 次 
却 , 使 细胞 壁 结构 受到 破坏 。 此 法 可 用 于 细菌 及 病毒 材料 , 但 制备 对 热 敏 感 的 物质 时 慎 
用 。 

(3) 超声 波 处 理 : “此 法 多 用 于 微生物 材料 , 频 率 一 般 选 在 10KC 至 200KC, Was 
200 一 500 瓦 范围 , 对 于 不 同 细菌 , 应 视 具 体 情况 而 定 。 处 理 时 间 有 数 分 钟 至 数 十 分 钟 不 
等 。 处 理 效果 和 样品 浓度 及 使 用 功率 有 关 。 在 处 理 过 程 中 如 溶液 温度 升 高 时 ,注意 冷却 。 

3. 化 学 及 生物 化 学 法 ”主要 有 自 溶 法 , 酶 解法 和 表面 活性 剂 处 理 法 等 。 

(1) 自 深 法: 自 溶 法 是 在 一 定 的 pH 和 适当 的 温度 下 , 利 用 组 织 细胞 内 自身 的 酶 系 
统 将 细胞 破碎 的 方法 。 自 溶 法 所 需 时 间 较 长 , 常 添加 少量 防腐 剂 如 甲 茶 、 氧 仿 等 防止 细菌 


ss 14 se 


RB 


的 污染 。 

C2) 酶 解法 : 利用 各 种 水 解 酶 如 溶菌 酶 ,纤维 素 酶 \ 蜗 牛 酶 . 半 纤 维 素 酶 、 壳 糖 酶 、 脂 
酶 等 专 一 性 地 将 细胞 壁 分 解 , 使 细胞 内 含 物 释放 出 来 。 适用 于 制备 大 分 子 核酸 材料 的 破 
壁 。 有 些 细菌 对 溶菌 酶 不 敏感 , MAD Bea HM 8M 脲 素 处 理 后 ,使 转 为 对 溶菌 酶 敏 
感 而 融 溶 。 mrs 
《3) 表面 活性 剂 处 理 : Mr Che, Att eee EARNS ANA 


了 胞 膜 有 一 定 破 坏 作 用 。 


此 外 ,使 用 真空 干燥 及 冷 丙酮 处 理 制 成 丙酮 粉 ” 均 可 以 改变 细胞 的 透 性 ,不 同 程度 地 
破坏 细胞 膜 结构 ,以 利于 提取 。 

有 时 为 了 防止 其 他 细胞 组 份 中 的 物质 对 制备 物 干扰 或 污染 , 或 由 于 对 细胞 组 分 上 某 
一 物质 进行 特殊 研究 的 需要 , 常 将 各 种 细胞 器 先行 分 离 , 然 后 在 某 一 细胞 器 中 提纯 某 一 物 
质 。 细 胞 组 份 的 分 离 , 一 般 使 用 差 速 离心 法 , 即将 破碎 后 的 细胞 在 适当 介质 中 进行 离心 。 
常用 的 介质 有 生理 盐水 , 芒 糖 或 葡萄 糖 - 聚 乙 二 醇 等 高 分 子 溶液 。 各 种 细胞 组 份 按照 质 
量 \ 大 小 不 同 ,经 过 不 同 速度 的 离心 后 , 便 沉降 于 离心 管 不 同 部 位 , 经 过 多 次 分 步 离心 分 
离 , 即 可 获得 所 需要 组 份 。 

组 织 细胞 破碎 过 程 中 ,大 量 胞 内 酶 及 细胞 内 含 物 被 释放 出 来 , 须 立 即 选择 适当 条 件 进 
行 提取 分 离 ,避免 因 长 久 放 置 造成 制备 物 的 分 解 破 坏 。 

提取 是 分 离 纯 化 的 第 一 步 , 它 将 制备 物 从 复杂 的 生物 体系 中 转移 到 特定 的 人 工 洲 相 
体系 中 (通常 是 水 、 缓 冲 液 , 稀 盐 溶液 或 有 机 溶剂 )。 抽 提 所 用 溶剂 的 选择 标准 首先 对 被 制 
备 物 具 有 最 大 溶解 度 ,并 在 提取 中 应 尽 可 能 减少 一 些 不 必要 的 成 份 。 为 了 更 好 地 达到 以 上 
两 个 目的 ,常用 的 手段 是 调整 溶剂 的 pH 值 、 离 子 强度 、 溶 剂 成 份 配 比 和 温度 范围 等 。 关 
于 提取 方法 本 书 第 二 章 另 有 详细 介绍 ,这 里 不 再 更 述 。 

表 1-6 供 选择 分 离 某 些 生物 分 子 的 方法 时 参考 
te 术 

ee | eee a a em MST Rei] 电泳 “| 超速 离心 


一 -| 一 | 一 |- | 一 |-  ) | | | 


AMS / PTE 
核酸 
单 糖 和 二 糖 
FRM S RE 
脂肪 酸 


人 MORN MCI Neer ea Oy a Re 
叶绿素 


国 醇 和 类 固 醇 


1) 可 以 使 用 的 情况 下 ,十 ?一 表示 选择 适宜 程度 。( 士 ) 示 适宜 \(C++) 较 适宜 \(Ctt+) 最 适宜 江 一 ) 示 不 适宜 。 


es 15 。 


(BO) 分 离 纯化 方法 的 摸索 


分 离 纯化 是 整个 生化 制备 过 程 的 核心 部 分 。 生物 体 的 组 成 成 份 于 千 万 万 种 , 分 离 纯 
.化 的 实验 方案 也 千变万化 。 没有 一 种 分 离 纯化 方法 可 适用 于 所 有 物质 的 分 离 纯化 , 一 种 
物质 也 不 可 能 只 有 一 种 分 离 纯化 方法 。 所 以 对 于 某 一 种 物质 , 究竟 选用 什么 分 离 纯 化 方 
法 最 理想 , 主 要 是 根据 该 物质 的 物理 化 学 性 质 和 具体 实验 条 件 而 定 。 认 真 参考 借鉴 前 人 


”经 验 可 以 避免 许多 盲目 性 ,节省 实验 摸索 时 间 。 即 使 是 分 离 一 个 新 的 未 知 组 份 ,根据 分 析 


和 预 试验 的 初步 结果 ,参考 别人 对 类 似 物 质 分 离 纯 化 经 验 , 也 可 以 帮助 少 走 些 弯路 。 威 廉 
斯 (Wiliams) 和 威尔逊 《Wilkson) 等 根据 一 般 规 律 性 对 各 种 分 离 纯化 方法 适用 于 什么 物 
质 的 作用 , 提出 了 很 好 的 意见 ,( 详 见 表 1-6)" 摩尔 里 斯 (Morris) 等 对 于 各 种 分 离 方 法 
中 所 依据 溶质 的 物理 化 学 性 质 , 作 了 一 个 分 类 表 ( 见 表 1-7) 均 可 供 读 者 参考 。 
表 1-7 以 溶质 物理 性 质 为 基础 的 各 种 分 离 方法 
3+ + HW a ff A 


Ae 分 子 大 小 分 子 电荷 
Aga Birk 48 & 

色谱 

吸附 \ ni 十 十 十 二 + 十 

分 配 十 ++ 十 + 十 +++ 

离子 交换 树脂 +4 +H i + 

BRE 主 十 + 十 于 

SS FSi ++ + 一 2: 

气相 十 ++ 十 十 十 十 二 十 
逆流 分 配 十 二 +++ +++ 
电泳 

自由 溶液 ++ +++ 一 一 

聚 乙烯 介质 ++ H+ = 二 

纤维 素 ++ 十 + 十 十 一 

凝 胶 十 + 二 + 十 十 + Ze 

等 电 聚 焦 a: +++ = > 
沉降 十 十 十 十 一 = 
膜 穿 透 (透析 ) 和 扩散 十 + 十 +4 + 主 
TE FREE + ++ +++ +++ 


二 、 分 离 纯化 各 阶段 对 实验 技术 的 选择 


这 是 一 个 十 分 灵活 掌握 而 且 难 以 绕 一 规定 的 问题 ,但 是 也 不 是 说 没有 一 点 规律 可 循 。 
现 根据 文献 介绍 的 经 验 和 一 般 原 则 ,对 分 离 纯化 各 阶段 对 各 种 方法 的 选择 作 简 单 的 讨论 : 
(—) 分 离 纯化 的 早期 使 用 方法 的 选择 

分 离 纯化 的 早期 , 由 于 提取 让 中 的 物质 十 分 复杂 , 制备 物质 浓度 较 黎 \ 在 理化 性 质 上 
与 被 制备 物 相 似 的 杂质 , 数量 较 多 。 因此 在 这 一 阶段 选用 一 些 分 辩 能 力 较 高 的 分 离 纯化 
方法 一 般 认 为 不 大 合适 。 原因 是 一 种 高 分 辩 率 的 分 离 纯 化 方法 在 大 量 杂质 存在 下 不论 
是 根据 物质 分 子 大 小 或 物质 带电 性 质 而 进行 分 离 , 都 不 可 能 使 被 分 离 的 物质 集中 于 一 个 


ee 16 。 


区 域 。 只 可 能 在 预定 区 域 中 得 到 一 些 理化 性 质 相 近 的 同类 物 , 而 把 真正 要 分 离 的 成 份 漏 
dio 出 现 这 种 现象 的 主要 原因 , 是 高 分 辩 率 的 分 离 方 法 在 杂质 多 的 情况 下 位 置 效应 比较 
严重 ,大 批 理 化 性 质 相 近 的 分 子 在 相同 分 离 条 件 下 :彼此 在 电场 中 或 力 场 中 相 竞 占据 某 一 
位 置 。 这 样 , 被 目的 物 占据 的 机 会 就 很 少 , 或 者 分 散在 一 个 很 长 区 域 中 而 无 法 集中 于 一 - 
Ro 高 分 辩 效 力 的 分 离 方法 大 部 分 是 根据 物质 二 个 以 上 理化 因素 而 建立 的 , 如 区 带电 泳 
和 北 胶 电泳 是 根据 分 子 大 小 及 带电 数量 而 进行 分 离 的 ,一 次 分 离 物质 的 量 不 大 , 即 负 谷 能 
力 都 比较 小 。 如 电泳 法 虽 有 较 高 分 离 能 力 , 但 如 果 早 期 使 用 电泳 法 ,不 仅 得 不 到 理想 效果 


而 且 郊 杂 着 大 量 类 似 物 ,给 以 后 纯化 工作 带 来 更 大 困难 。 


早期 分 离 纯化 用 华 取 、 沉 淀 \ 吸 附 等 一 些 分 辩 力 低 的 方法 比较 有 利 。 这 些 方法 不 仅 负 
荷 能 力 大 ,一 次 分 离 的 量 多 ,同时 可 以 除去 大 部 分 理化 性 质 相差 较 大 的 杂质 。 蔡 取 、 沉 演 、 
吸附 分 离 方 法 既 起 着 分 离 提纯 的 作用 ,又 起 着 浓缩 的 作用 ,可 为 以 后 进一步 分 离 纯化 创造 
良好 的 基础 。 rue 

离子 交换 树脂 分 离 有 时 也 用 于 早期 纯化 , 如 搅拌 交换 或 短 胖 柱 交换 方法 用 于 发 酵 液 


中 分 离 浓缩 抗菌 素 比 较 常见 。 纤 维 素 离子 交换 色谱 也 常 直接 用 于 粗 抽 提 液 中 进行 多 种 蛋 


白质 的 制备 , 没 有 出 现 明 显 的 同位 效应 , 且 具有 和 较 高 的 负荷 能 力 。 其 中 的 DEAE- 纤 维 素 
特别 适 于 从 中 性 或 碱 性 蛋白 质 中 分 离 纯 化 酸性 蛋白 质 。 实 验 时 , 先 将 上 柱 波 调 到 pH 4.0~ 
4.55 通过 DEAE- 纤 维 素 柱 时 ,酸性 蛋白 质 被 吸附 ,其 他 杂质 及 非 酸性 蛋白 质 不 被 吸附 ,从 
下 面 流 出 。 然 后 进行 洗 脱 和 浓缩 ,这 样 一 步 分 离 后 得 到 的 酸性 蛋白 质 纯度 可 提高 许多 倍 。 
据 A, Atkinson 报道 ,早期 使 用 DEAE- 纤 维 素 、. 羟 基础 灰 石 , 从 B. Stearothermophilus 菌 
体 细胞 提取 液 中 ,同时 分 离 了 十 多 种 酶 ,已 达到 了 工业 生产 规模 水 平局 。 

亲 合 色谱 法 由 于 具有 极 高 生物 特异 性 , 分 离 目的 物 受 到 理化 性 质 相 似 的 杂质 干扰 极 


” 少 ,能 从 比较 复杂 的 组 织 抽 提 液 或 细菌 发 酵 液 中 一 步 提取 分 离 出 所 需 的 物质 ,提纯 倍数 可 


达 一 百倍 以 上 。 如 从 大 肠 杆菌 粗 抽 提 流 中 一 步 提 纯 8- 半 乳糖 背 酶 , 即 达 电泳 纯 "2。 亲 合 
色谱 是 一 种 既 优越 又 简便 的 方法 。 用 于 早期 分 离 一 些 含量 少 而 又 不 稳定 的 生物 大 分 子 是 


一 个 值得 推广 的 方法 。 


总 的 来 说 , 早期 分 离 提纯 的 方法 , 选择 的 原则 一 般 是 从 低 分 辩 能 力 到 高 分 辨 能力 ,而 
且 负 荷 量 较 大 为 合适 。 但 随 着 许多 新 技术 的 建立 ,一 个 特异 性 方法 其 分 辩 能 力 越 高 , 便 意 
味 着 提纯 步骤 的 简化 ,提纯 步 又 的 减少 , 回收 率 便 越 高 , 具有 生理 活性 物质 变性 的 危险 性 
就 越 少 , 这 是 所 有 生化 制备 研究 工作 人 员 所 希望 的 。 如 上 述 亲 和 层 析 和 纤维 素 离子 交换 
色谱 就 是 很 好 的 例子 。 其 他 方法 如 连续 流动 电泳 , 连续 流动 等 电 聚 焦 等 , 在 一 定 条 件 下 , 
用 于 早期 从 粗 抽 提 波 中 分 离 制备 小 量 物质 也 具有 许多 优点 ,但 目前 仍 处 于 探索 发 展 阶段 , 
不 如 前 两 者 已 达到 比较 成 熟 的 程度 。 当 然 所 谓 低 分 辩 能 力 的 分 离 纯化 方法 如 有 机 溶剂 沉 


.证 \ 盐 析 、 有 机 溶剂 萃取 等 也 不 限于 分 离 的 早期 使 用 ,在 整个 分 离 制备 过 程 中 经 常 反 复 应 


用 :而 每 次 应 用 其 分 离 的 能 力 和 效果 也 是 不 同 的 。 


《二 ) 各 种 分 离 纯化 方法 的 使 用 程序 


生物 体内 各 种 物质 的 分 离 都 是 在 液 相 中 进行 的 。 故 分 离 方 法 常 根据 这 些 物 质 的 分 配 
系数 、 分 子 量 大 小 、 离 子 电荷 性 质 及 数量 和 外 加 环境 条 件 的 差别 等 因素 构成 不 同 分 离 方 
法 的 基础 。 而 每 一 种 分 离 方 法 又 都 在 特定 条 件 下 发 挥 作用 的 。 因此 , 在 相同 或 相似 的 条 


2 ALS 。 


件 下 连续 作用 同一 种 分 离 方 法 就 不 大 适宜 。 例如 纯化 某 一 两 性 物质 时 , 前 一 步 已 利用 次 
物质 阴离子 的 性 质 ,使 用 了 阴离子 交换 色谱 分 离 方 法 ,那么 下 一 步 提纯 时 应 用 阳离子 交换 
色谱 或 作为 一 个 阳离子 应 用 电泳 方法 分 离 , 则 比 再 用 其 阴离子 性 质 作 色 谱 或 电泳 具有 更 
好 的 分 离 效果 。 各 种 分 离 方法 的 交叉 使 用 对 于 除去 大 量 理化 性 质 相近 的 杂质 也 较为 有 
效 。 某 些 杂 质 在 各 种 条 件 下 带电 性 质 可 能 与 制备 物 相 似 ,但 分 子 大 小 与 形状 与 制备 物 相差 
较 大 ;而 另 一 些 杂 质 的 分 子 大 小 形状 可 能 与 制备 物 相似 ,但 在 某 种 条 件 下 与 制备 物 带电 性 
质 不 同 。 在 这 样 的 情况 下 , 先 用 分 子 筛 \ 超 速 离心 沉降 或 膜 过 滤 方 法 除去 分 子 量 相差 较 大 
的 杂质 , 然后 在 一 定 pH 值 和 离子 强度 范围 下 使 制备 物 变 成 有 利 的 离子 状态 , 便 能 有 效 地 
进行 色谱 分 离 。 当 然 ,这 两 种 步骤 的 先后 秩序 反 过 来 应 用 也 会 得 到 同样 效果 。 

纯化 方法 顺序 先后 的 安排 ,还 考虑 到 有 利于 减少 工序 ,提高 效率 。 如 在 盐 析 法 后 采取 
吸附 法 ,必然 因为 盐 离 子 过 多 影响 吸附 效果 。 中 间 增 加 透析 脱盐 一 步 , 则 使 操作 大 大 复杂 
化 。 如 倒 过 来 先 吸 附 , 后 盐 析 , 吸附 洗 脱 时 的 含 盐 洗 脱 液 即 可 直接 进行 盐 析 , 则 可 达到 宫 
作 简化 节省 原料 时 间 的 目的 。 此 外 , 分 离 体积 过 大 时 使 用 盐 析 法 和 有 机 溶剂 沉淀 法 都 能 
达到 浓缩 效果 ,但 使 用 盐 析 法 成 本 就 低 得 多 。 

对 于 一 未 知 物 通过 各 种 方法 的 交叉 分 离 纯化 ,还 可 以 进一步 了 解 到 制备 物 的 性 质 ,以 
补充 预 试验 时 所 获得 的 知识 片面 性 。 但 不 论 是 已 知 物 或 未 知 物 , 当 条 件 改 变 时 ,连续 使 用 
同一 分 离 是 允许 的 ,如 分 级 盐 析 和 分 级 有 机 溶剂 沉淀 等 。 分 离 纯化 中 期 ;有 时 由 于 某 种 原 
因 (如 样品 含 盐 太 多 ,或 样品 过 大 等 ) ,一 个 方法 一 次 分 离 效果 不 理想 ,可 以 连续 使 用 二 次 , 
这 种 情况 在 凝 胶 过 滤 ,.DEAE- 纤 维 素 色谱 等 比较 常见 。 当 分 离 纯化 工作 已 进行 至 后 期 
时 ,大 部 分 杂质 已 经 除去 ,和 欲 制备 的 物质 已 十 分 集中 ,重复 应 用 先 几 步 所 应 用 的 方法 ,对 进 
一 步 肯 定 所 制备 的 物质 在 分 离 过 程 中 其 理化 性 质 有 无 变化 和 验证 所 得 的 制备 物 是 否 属于 
RE LAGE Lo : 


(=) 分 离 纯 化 后 期 的 保护 性 措施 


各 种 活性 物质 在 生物 体内 的 含量 一 般 都 是 很 少 的 。 有 的 本 来 含量 已 经 是 十 分 微量 , 

再 由 于 多 步骤 的 纯化 过 程 的 流失 ,到 了 分 离 制备 后 期 可 获 的 产品 已 经 是 十 分 微量 了 ,有 的 
量 只 有 原材料 的 和 干 分 之 几 。 有 的 只 有 万 分 之 几 , 或 几 十 万 分 之 几 。 如 果 所 制备 的 物质 是 
未 知 物质 ,分 离 纯化 方法 还 属于 探索 性 质 , 分 离 过 程 中 损失 更 为 严重 。 现 在 数学 上 作 一 简 
单 推算 : 假设 某 材 料 含 A 物 质 为 万 分 之 一 。 纯 化 后 回收 率 只 有 20%, 即 在 分 离 过 程 中 损 
失 了 百 分 之 八 十 (这 是 常 有 的 ), 如 开始 投料 为 一 和 王公 斤 , 应 得 产品 是 20 克 , 到 了 分 离 后 
期 ,损失 了 一 克 产 品 ,就 等 于 损失 了 五 十 公斤 的 原料 。 因 此 , 到 了 分 离 工作 后 期 , 必 有 需 注 
意 吉 免 产 品 的 损失 。 后 期 产品 的 损失 主要 途径 有 玻璃 器 四 的 吸附 。 操 作 过 程 样品 液体 的 
残留 ,空气 的 氧化 和 某 些 事先 无 法 了 解 的 因素 ,当然 后 者 是 很 难 避 免 的 。 所 以 对 于 一 些 探 
索性 的 制备 实验 ,为 了 取得 一 定量 ( 那 怕 是 很 少 也 好 ) 的 产品 , 提供 分 析 鉴 定之 用 , Ree 
要 加 大 原材料 的 用 量 , 并 在 后 期 纯化 工序 中 注意 保持 样品 溶液 较 高 浓度 ,以 防止 制备 物 在 
黎 溶 液 的 变性 ,有 时 常 加 和 一些 电解 质 以 保护 生化 物质 的 活性 ,减少 样品 溶液 在 器 严 中 的 
残留 量 等 ,这 些 都 是 十 分 重要 的 。 


(DQ) 对 分 离 纯化 每 一 步骤 方法 的 优 劣 进行 综合 评价 


二 


每 一 个 分 离 纯化 步骤 方法 的 好 坏 , 除 了 从 分 辨 本领 和 重 现 性 二 方面 考虑 外 ,还 注意 方 
法 本 身 的 回收 率 的 高 低 , 特 别 是 制备 某 些 含量 很 少 的 物质 时 ,回收 率 的 高 低 十 分 重要 。 表 
1-8 是 分 离 制备 的 几 种 常用 方法 中 有 关 分 辨 本 领 、 重 现 性 及 回收 率 的 一 些 初步 评价 (参考 
Morris 并 有 所 删 减 ) 国 。 按 现 生化 制备 中 应 用 的 分 离 纯化 方法 ,一 个 制备 的 原始 活力 经 过 五 
至 六 步 的 提纯 后 ,一 般 都 可 以 达到 5% 以 上 的 回收 率 。 当然 , 不 同 物 质 由 于 其 稳定 性 的 
不 同 及 分 离 的 难 易 , 所 得 回收 率 是 不 同 的 。 


表 1-8 一 些 常 用 的 分 离 纯 化 方法 的 几 项 特性 


膜 透析 及 扩散 法 
溶解 度 法 


生化 物质 在 分 级 分 离 中 对 每 一 步骤 方法 的 优 劣 的 记录 , 和 常 体 现在 所 得 产品 重量 及 活 
性 平衡 关系 上 。 这 一 关系 ,可 通过 每 一 步骤 的 分 析 鉴 定 即 可 求 出 。 例如 酶 的 分 离 纯化 每 
一 步骤 产物 重量 与 活性 关系 ,通过 测定 酶 的 比 活 力 及 溶液 中 蛋白 质 浓度 的 比例 ,其 他 活性 
物质 也 可 通过 测定 总 活性 的 变化 与 样品 浓度 或 体积 作 比 较 而 求 出 。 最 后 根据 各 步骤 所 得 
样品 重量 或 体积 和 测 出 的 活力 列表 进行 对 比分 析 , 算 出 每 步 的 提纯 倍数 及 回收 率 。 现 以 
从 长 春花 (Cathasanthus roseus) 中 提纯 Strictosidine 合成 酶 的 实验 为 例 中 , 将 各 步骤 提纯 
倍数 及 回收 率 总 结 于 表 1-9。 


表 1-9 长 春花 中 Strictosidine 合成 酶 的 提纯 


和 Gass) pea aig Ul trae kik ath ah ee 
CD) Mp 654 0.008 5.2 100 1 
(ID Pee RUTH 466 0.011 ome! 98 {4 
(IIT) DEAE-2¢ 4: EE 38.7 0.10 3.9 75 12.5 
(Iv) BERRA 5.9 0.64 3.8 73 80 
(V) Sephadex G 75 0.72 2.8 2.0 38 350 
(VD 等 电 焦 点 0.08 5.9 0.5 10 737.5 


* 比 活性 项 中 nKat 的 换算 方法 见 下。 


按 国际 酶 学 会 议 规定 : 一 分 钟 转化 一 个 微克 分 子 底 物 为 一 个 国际 单位 酶 量 , 而 一 个 
国际 单位 酶 量 一 16.67nKat, 原 酶 量 单位 “Katal ”定义 为 每 秒 钟 转化 一 个 克 分 子 底 物 的 
酶 量 , 因 所 需 酶 量 太 大 , 现 一 般 很 少 应 用 。 

上 面 表 中 : 比 活 力 一 一 总 活力 除 以 总 蛋白 质 含量 (或 蛋白 氮 ) 的 比值 。 

回收 率 一 一 为 本 步骤 所 得 的 总 活力 与 第 一 步骤 所 得 总 活力 之 比值 , 以 百 
分 比 表示 ,开始 时 回收 率 假定 为 100 罗 。 


_ 提纯 倍数 一 一 为 本 步 又 所 得 之 比 活力 与 第 一 步骤 所 得 之 比 活力 之 比值 , 


开始 时 假定 提纯 倍数 为 1 。 

从 表 1-9 的 内 容 中 可 以 看 到 提纯 倍数 为 737.5, 但 回收 率 只 有 10%, 即 90% 损失 于 
操作 中 。 总 蛋白 量 由 654 毫克 减少 至 0.08 Sit, 共 减 少 了 八 千 倍 , 而 酶 损失 仅 10 倍 , 
而 获得 了 纯化 。 从 每 一 纯化 步骤 看 , 比 活 力 越 高 , 酶 的 提纯 倍数 越 大 , 一 个 好 的 分 离 提纯 
方法 应 该 是 提纯 倍数 和 回收 率 都 同时 有 较 大 的 提高 。 但 必须 指出 , 整 个 分 离 提纯 步骤 是 
连续 进行 的 ,前 一 步骤 虽然 提纯 程度 和 回收 率 都 不 高 , 但 它 是 必需 的 , 前 一 步 主要 为 后 一 
步 提供 更 有 利 的 分 离 纯 化 的 基础 。 


(五 ) 对 制备 物 均一 性 的 鉴定 


对 制备 物 均一 性 的 鉴定 是 分 离 制备 过 程 最 后 一 个 工序 ,一 个 新 分 离 的 物质 是 否 纯 , 常 
用 “均一 性 表示 ,, 均一 性 即 指 所 获得 的 制备 物 只 具有 一 种 完全 相同 的 成 份 。 均 二 性 的 评 
价 常 须 经 过 数 种 方法 的 验证 才能 肯定 。 有 时 
某 一 种 测定 方法 认为 该 物质 是 均一 的 , 但 另 
一 种 测定 方法 却 可 把 它 分 成 二 个 甚至 更 多 的 
组 份 , 这 就 说 明 前 一 种 鉴定 方法 所 得 的 结果 
是 片面 的 。 如 果 某 一 物质 所 具有 的 物理 、 化 
学 各 方面 性 质 经 过 几 种 高 灵敏 度 方法 的 鉴定 
都 是 均一 的 ,那么 大 致 可 以 认为 它 是 均一 的 。 
“当然 , 随 着 新 的 鉴定 方法 的 出 现 , 还 可 以 发 现 
加 入 的 国体 蛋白 质量 它 不 是 均一 的 。 绝 对 的 标准 只 有 是 把 制备 的 
了 ES 全 部 结构 弄 清 楚 并 经 过 人 工 全 合成 证 明 具 有 
相同 的 生理 活性 ,才能 肯定 所 分 离 的 物质 是 绝对 纯净 的 。 但 通过 这 样 严格 的 核对 ,小 分 子 
物质 还 是 容易 办 到 的 ;大 分 子 物质 如 蛋白 质 、 酶 、 核 酸 或 某 些 多 糖 则 是 一 件 十 分 困难 的 事 
了。 就 目前 水 平 来 说 ,除了 极 少数 成 功 的 例子 外 ,生物 大 分 子 的 结构 全 面 分 析 及 人 工 全 合 
成 工作 还 处 于 早期 发 展 的 阶段 。 
现 以 蛋白 质 为 例 , 说 明 均 一 性 试验 常用 的 一 些 物理 一 化 学 方法 。 蛋 白质 均一 性 的 经 
典 试验 主要 基于 它 的 溶解 度 \ 电 泳 和 沉降 行为 。 近 年 来 增加 了 未 端 氨基 酸 残 基 测 定 方法 , 
即 一 个 纯 的 蛋白 质 含 有 一 定量 未 端 氨基 酸 残 基 , 而 且 这 些 残 基 成 整数 比例 地 存在 于 蛋白 


溶解 的 蛋白 质量 


质 分 子 中 , 如 有 其 他 末端 氨基 酸 残 基 和 不 成 整数 比例 存在 于 蛋白 质 分子 中 则 表示 该 蛋白 , 


质 不 纯 。 另 还 有 生物 特殊 功能 测定 法 , 具有 某 些 特 殊 功能 的 蛋白 质 , 如 酶 、 激 素 蛋 白 、 氧 


载体 ,抗体 等 ;都 可 以 通过 其 特有 的 催化 效率 ` 生 理 活性 和 免疫 反应 等 加 以 测定 ,这 种 测定 . 


方法 稼 可 以 检 出 非常 低 的 杂质 含量 , 在 某 种 意义 上 比 物 理 和 化 学 鉴定 更 为 优越 。 DRE 


es 20 s 


~ 


白质 均一 性 常用 的 几 种 鉴定 方法 介绍 如 下 : 

1. 溶解 度 法 KERR Gibb 相 律 理论 而 建立 的 一 种 经 典 测 出 物质 纯度 的 方法 。 
它 不 仅 用 于 蛋白 质 , 也 可 用 于 其 他 物质 的 纯度 测定 。 Gibb 相 律 理论 认为 ,一 个 单一 成 份 
的 物质 在 一 定 条 件 下 其 溶解 度 是 一 定 的 , 因 此 , 当 某 一 物质 在 溶剂 中 的 溶解 度 达到 饱和 
时 ,其 溶解 曲线 有 着 非常 明显 的 转折 点 。 溶 解 度 测定 法 操作 简单 ,方法 也 很 灵敏 。 例 如 用 
此 法 测定 酶 的 纯度 时 ,将 一 系列 不 同 量 的 酶 制剂 分 别 加 人 等 容积 的 溶剂 中 (水 或 盐 溶 液 )o 
搅拌 溶解 后 ,过 滤 除 去 固体 部 分 。 然 后 分 别 测定 各 管 滤波 中 蛋白 质 含 量 或 酶 的 活力 , 当 固 
体 酶 蛋白 溶解 后 未 达到 饱和 度 时 , 加 入 的 酶 量 和 滤波 中 的 蛋白 质量 或 酶 活力 是 按 比 例 上 
升 的 。 加 入 酶 量 至 一 定 程 度 即 达到 饱和 度 时 ,固体 酶 蛋白 则 不 能 溶解 ,滤液 中 的 蛋白 质 含 
量 或 酶 活力 也 不 再 提高 。 于 是 ,在 溶解 度 曲线 上 在 饱和 度 时 出 现 一 个 转折 。 如 固体 酶 制 
剂 中 含有 少量 不 纯 物 质 时 ,就 不 会 出 现 一 个 明显 的 饱和 度 转 折 点 。 如 图 1-4 Prat, 

在 图 1-4 中 ,曲线 1 只 出 现 一 个 明显 转折 点 ?表示 只 有 一 种 蛋白 质 组 份 。 曲 线 2 含有 
二 种 组 份 的 混合 蛋 昌 质 , 故 出 现 二 个 转折 点 。 一 般 来 说 ,混合 蛋白 质 中 有 多 少 组 份 便 出 现 
多 少 个 转折 点 ,但 实际 上 组 份 太 多 时 ,溶解 度 曲折 点 便 不 明显 了 。 曲 线 1 在 转折 点 以 前 直 
线 的 斜率 应 为 1, 转折 点 以 后 直线 与 横 座 标 平行 ,斜率 为 零 。 曲 线 .2 在 二 个 转折 点 之 间 直 
” 线 的 斜率 (图 中 虚线 部 分 ) 表 示 不 纯 成 份 在 混合 蛋白 质 中 所 占 比 例 。 

溶解 度 法 测定 物质 均一 性 的 试验 , 在 实际 应 用 时 常 选 择 几 个 不 同 pH 和 离子 强度 的 
条 件 进 行使 所 得 结果 更 加 准确 。 溶 解 度 法 的 测试 工作 因 需 要 大 量 的 样品 ,现在 已 很 少 应 
用 。 
2. 电泳 均一 性 的 测定 法 ” - 近 二 十 年 来 电泳 法 有 了 很 大 发 展 。 早期 在 自由 溶 芒 中 , 
建立 在 不 同 pH 及 离子 强度 条 件 下 测定 带电 物质 电泳 迁移 率 , 以 表示 电泳 的 均一 性 ,在 理 
论 上 是 很 理想 的 ,但 在 实际 操作 中 党 存在 许多 影响 因素 ,难以 达到 理想 程度 。 前 沿 电泳 法 
则 主要 由 于 分 辩 率 较 低 及 使 用 的 仪器 和 操作 都 比较 复杂 ,所 以 使 用 的 人 不 多 。 此 外 ,以 上 
两 种 方法 样品 用 量 也 比较 多 , 故 已 渐渐 被 凝 胶 电 泳 所 代替 。 凝 胶 电 泳 不 仅 具有 电泳 作用 , 
同时 还 具有 分 子 筛 作用 。 因此 有 极 高 的 分 辨 能力 。 如 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 可 以 检测 出 
10° 210% 克 样 品 的 含量 , 含 量 10 一 15 微克 分 子 的 蛋白 质 或 5 一 10 微克 左右 的 核酸 在 
一 定 的 pH 下 能 做 出 很 床 亮 的 均一 性 试验 的 结果 。 凝 胶 电 泳 在 测定 样品 均一 性 的 同时 , 
还 可 以 分 析 鉴 定 样品 分 子 大 小 和 形状 。 是 目前 许多 生物 大 分 子 普遍 采用 的 均一 性 鉴定 的 
方法 。 凝 胶 电 泳 也 适用 于 小 分 子 电解 质 的 纯度 测定 。 

用 凝 胶 电 泳 《 包 括 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 ) 进行 蛋白 质 均 一 性 测定 时 ,一 般 都 要 变换 二 
至 三 种 pH 值 进行 实验 , 才能 对 所 得 结果 是 否 均一 加 以 评定 。 蛋 曰 质 可 以 作为 阴离子 或 
阳离子 进行 电泳 试验 ,核酸 只 能 作为 阴离子 进行 试验 。 近 年 来 ,还 发 展 了 各 种 免疫 电泳 和 
最 近 流行 专门 检验 糖 蛋白 使 用 的 亲 和 电 泳 。 它 们 都 是 由 凝 胶 电 泳 衍生 出 来 的 , 具 有 更 专 
一 ,操作 更 简便 的 优点 。 

3. 高 速 离心 沉降 法 ”对 于 蛋白 质 及 其 他 生物 大 分 子 均 一 性 的 测定 也 是 一 个 经 典 方 
法 ,在 理论 上 这 一 方法 是 完善 的 。 主 要 问题 是 离心 设备 本 身 的 缺陷 ,以 至 每 个 组 份 在 离心 
管 中 所 能 移动 的 距离 很 短 。 如 果 每 个 组 份 的 分 子 大 小 \ 形 状 、 带 电 性 质 差 别 不 大 时 ,由 于 
影响 分 子 移动 的 各 种 因素 综合 平衡 的 结果 ,往往 使 各 组 份 所 受 的 力 场 作 用 相等 ,于 是 就 很 
难 区 分 。 所 以 使 用 高 速 离心 沉降 方法 测定 物质 的 均一 性 ,其 精确 度 的 提高 受到 一 定 限 制 。 


e« 21 e 


但 由 于 其 具有 测定 时 间 短 ,样品 用 量 少 等 优点 , 现 仍 是 经 常 使 用 的 方法 之 一 。 


以 上 仅 就 蛋白 质 均 一 性 测定 作 一 简略 讨论 , 对 于 其 他 小 分 子 物 质 纯度 的 测定 , 供 使 


用 分 析 方 法 更 多 , 如 制备 物 获得 一 定量 的 结晶 后 , 可 进行 核磁 共振 波谱 \ 质 谱 , 紫 外 光谱 , 
红外 光谱 测定 ;或 作 高 效 滚 相 色谱 、 气 相 色 谱 \ 旋 光 和 熔点 等 试验 ,经 过 综合 分 析 后 , 便 可 
以 对 被 鉴定 物 作出 纯度 的 结论 。 


[1] 
G2] 


[3] 
[4] 
[5] 
[6] 


[7] 
[8] 
[9] 
[10] 
[11] 
[12] 
[13] 
- [14] 


有 关 各 类 生化 物质 的 分 析 鉴 定 方法 , 本 丛书 各 分 册 均 已 详细 介绍 。 REAR BAR 


Ss 4+ xX ® 


沈 同 、 王 镜 岩 、\ 赵 邦 娣 主编 : 生物 化 学 ,人 民 教 育 出 版 社 (1980)7 
Lehninger, Albet L., Biochemistry The moleculas basis of cell structlre and function, Worth 
Publishers Inc, 2nd ed. (1975) [中 译 版 ;上册 ,, 科 学 出 版 社 (19817] 

中 山大 学 生化 微生物 教研 室 编 : 生化 技术 导论 * 人 民 教 育 出 版 社 〈1979) 

阿南 功 一 等 著 : 基础 生化 实验 法 [2] ,日 本 丸 善 株式 会 社 〈1974) 

W. 费迪南德 著 : 酶 分 子 (中 译本 )? 科 学 出 版 社 〈19807 

Morris, C. J. O. R. and Morris, P., Separation Methods in Biochemistry, 2nd Ed, p. 5—8, Pi- 
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Strain, H. H., Sato, T. R., and Engelke, J. Analyt. Chem., 26, 90(1954) 

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T. G. HRS: 生物 化 学 工具 (中 译本 ) 人民 卫生 出 版 社 〈19807 

B. L. RBM K. 威尔逊 编 : 实用 生化 化 学 原理 和 技术 (中 译本 ), 科 学 出 版 社 (1979) 

Atkison, A., Process Biochem., 8(8): 9(1973) 

Steers, E., Cuatrecasas, P. and Pollard, H. B., J. Biol. Chem., 246: 196 (1971) 


Mizukami, H., Nordlév, H., Lee, S. L. and Scott, A. J. Biochemistry, 18:, 3760 (1979) 
Neilands, J. B. and Stumpt, P. K., Outlines of Enzyme Chemistry, 2nd Ed, John Wiley and Sons 
TeSNN YL 


ss II7 。 


mk 贰 


第 一 节 引言 


提取 常 指 制备 物 与 细胞 固体 成 份 或 其 他 结合 成 份 的 分 离 , 由 固 相 转 人 波 相 或 从 细胞 
内 生理 状态 转 和 人 外界 特定 溶液 环境 的 过 程 。 如 果 被 提取 物质 在 细胞 内 呈 固 相 或 与 固体 结 
合 存在 ,提取 时 由 固 相 转 人 该 相 , 常 称 为 固 一 液 萃 取 。 如 被 提取 物质 原来 已 呈 液 相 存在 , 
提取 时 由 一 熙 相 转 人 另 一 互 不 相 溶 的 芒 相 , 这 种 提取 方法 称 波 一 液 萃取 , 或 称 抽 提 。 提 
FL. AREAS ER NAPE Extraction, 其 含义 基本 上 相同 。 习惯 上 , 提 取 多 指 分 离 纯化 前 
.期 , 被 提取 物质 从 破碎 的 细胞 中 释放 出 来 的 过 程 , 而 抽 提 则 贯穿 在 分 离 纯化 整个 过 程 中 。 
如 核酸 制备 中 用 氯仿 或 苯酚 反复 振荡 抽 提 除去 蛋白 质 ,分 离 DNA 和 RNA, RAAB 
剂 从 细胞 膜 上 抽 提 一 些 可 溶性 蛋白 质 等 。 所 以 提取 应 是 分 离 纯化 工作 的 开始 , 提取 的 效 
果 , 主 要 取决 于 被 提取 物 在 溶剂 中 溶解 度 的 大 小 ,由 固 相 扩散 到 液 相 的 难 易 ,同时 ,选择 提 
取 的 条 件 对 制备 物 稳 定性 的 影响 ,是 否 有 利于 以 后 的 提纯 步骤 等 因素 均 应 顾及 。 


第 二 节选 用 的 溶剂 与 物质 溶解 度 的 一 般 规律 


溶解 度 因素 用 于 分 离 提纯 有 两 个 主要 的 目的 , 一 是 选择 一 个 对 制备 物 溶解 度 大 而 对 
杂质 溶解 度 小 的 溶剂 ,使 制备 物 从 混合 组 份 中 有 选择 地 被 孤 离 出 来 ; 另 一 是 选择 一 个 对 制 


” 备 物 溶解 度 小 而 对 杂质 溶解 度 大 的 溶剂 , 使 制备 物 沉 淀 或 结晶 析出 。 但 不 论 是 使 溶质 有 


选择 地 溶解 或 有 选择 地 沉淀 都 是 为 了 达到 与 杂质 分 离 的 目的 。 
一 个 物质 溶解 度 的 大 小 与 溶质 和 溶剂 性 质 都 有 关 。 即 溶质 一 溶质 ,溶质 一 溶剂 ,溶剂 
一 溶剂 三 个 相互 作用 力 综合 平衡 的 结果 ,这 种 相互 作用 可 用 下 图 表示 : 
溶质 溶剂 
Al =. 2 
溶质 溶剂 
过 程 A 是 溶质 分 子 相互 作用 ,过 程 3B 是 溶剂 分 子 相互 作用 ,过 程 C 是 溶质 与 溶剂 相互 
作用 。 这 三 种 相互 作用 过 程 中 ,如 果 溶 质 一 溶剂 相互 作用 占 优势 , 则 溶质 的 溶解 度 大 。 反 
如 溶质 一 溶质 或 溶剂 一 溶剂 其 中 一 个 系统 相互 作用 很 强 , 或 者 两 个 系统 两 个 系统 相互 
作用 都 很 强 , 则 溶质 在 该 溶剂 中 的 溶解 度 小 。 
溶质 一 溶质 ,溶剂 一 溶剂 ,溶质 一 溶剂 之 间 相 互 作 用 力主 要 有 : 
《1》 偶 极 一 偶 极 相互 作用 ; 
《2》 偶 极 一 诱导 偶 极 作用 ; 
(3) 弥散 力 ; 


es 23 。 


《4》 氧 键 ; 

(5) 离子 基 团 的 静电 作用 等 。 

当然 ;要 定量 测定 每 一 种 作用 力 是 十 分 困难 的 ,影响 因素 也 很 复杂 。 所 以 对 于 一 个 有 _ 
机 分 子 或 生物 分 子 来 说 其 在 某 一 溶剂 中 的 盗 解 度 , 往往 只 能 根据 实际 表现 而 加 以 描述 。 
如 属 已 知 物质 ,可 查阅 有 关 资 料 或 手册 。 对 于 一 个 未 知 物质 ,只 能 衫 据 物质 溶解 的 一 般 规 
律 进行 预 试 验 , 最 后 确定 其 溶解 度 性 质 。 物 质 溶解 性 质 的 一 般 规 律 可 归纳 如 下 几 点 : 

1. 极 性 物质 易 溶 于 极 性 溶剂 中 , 非 极 性 物质 易 溶 于 非 极 性 溶剂 中 。 能 溶 于 水 的 物质 
一 般 都 是 极 性 分 子 或 离子 化 合 物 ; 有些 化 合 物 虽 然 是 非 极 性 物质 ,但 分 子 内 有 较 多 极 性 基 
团 , 也 易 溶 于 水 ,如 糖 类 。 

2. 碱 性 物质 易 溶 于 酸性 溶剂 中 ,酸性 物质 易 溶 于 碱 性 溶剂 中 。 

3. 在 极 性 溶液 中 ,溶剂 的 介 电 和 常数 的 减少 ,溶质 的 溶解 度 也 随 之 减少 。 

上 述 规律 也 可 以 用 所 谓 相 似 物 溶解 于 相似 物 的 原则 进行 解释 叫 。 所 谓 相似 , 一 方面 
表示 溶质 、 深 剂 分 子 结构 上 的 相似 , 另 一 方面 是 指 溶剂 与 溶质 二 者 分 子 间 作用 力 天 小 相 
似 。 前 者 如 石油 等 烃 类 溶剂 是 烃 类 化 合 物 的 优良 溶剂 。 后 者 例子 如 具有 OH, COOH, 
NH), “SO,+* += + 等 基 团 之 物质 都 易 溶 于 水 ,, 因 这 些 基 团 周 围 有 与 水 分 子 周 围 同样 天 小 的 
引力 场 ,* 含 有 这 些 基 团 的 分 子 能 均匀 地 分 布 于 水 分 子 之 间 , 并 通过 一 定 的 配 价 键 而 相互 结 
合 。 已 烷 不 溶 于 水 而 溶 于 葵 ,由 于 已 烷 与 葵 分 子 间 吸引 力 大 致 相同 ,而 已 烷 与 水 分 子 间 吸 
引力 很 小 ,水 分 子 自 身 吸 引力 较 大 之 故 。 相 似 物 溶 于 相似 物 的 结论 一 般 地 符合 实际 情况 。 

一 些 常 用 溶剂 按 其 极 性 的 大 小 , 可 依 顺 序 大 致 排列 如 下 : ”饱和 烃 类 去 全 亢 代 烃 类 过 


表 2-1 Hecker 的 溶剂 分 类 法 


类 All 3 


形成 气 键 的 能 力 3 个 或 更 多 
(个 数 ) 让 


AIK—OH 
go 
R—C—OH 
R =NOH 
% 
—CH,—CN 
剂 —CH,_NO, 
功 Ar—OH 
R—NH, 
能 R; 一 NH 


D 一 质子 供 体 A 一 质子 受 体 


es 24 © 


不 饱和 烃 类 二 醚 类 二 未 全 卤 代 烃 类 一 脂 类 一 芳 胺 类 一 酚 类 二 酮 类 二 醇 类 。 
AK (Hecker) 认为 溶剂 按 极 性 进行 分 类 带 有 较 多 经 验 成 份 , 而 按 形 成 氢 键 能 力 分 
类 科学 性 更 强 些 。 他 提出 非 电解 质 溶 于 极 性 或 非 极 性 溶剂 时 ,根据 形成 氢 键 能 力 的 大 小 , 


可 把 溶剂 分 为 五 类 ”: 


(OC) 能 形成 二 个 以 上 氢 键 的 溶剂 分 子 , 在 溶液 中 这 些 分 子 有 三 维 空间 网 状 结构 。 水 
就 是 这 类 溶剂 的 典型 例子 , 水 的 二 个 氧 原子 和 一 个 氧 原子 都 可 以 形成 氢 键 。(2) 能 形成 


2 a 
TLRS RRA ES 


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R2-2 一 些 常用 溶剂 的 性 质 


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介 电 


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Ww ID NY 


111 


ONAN AHN FSP ANN NN YN NY NY 一 一 
a: Led “weet” he Oe owen ls ee ee 8 


常数 


80 
88 
02 
21 
24 
29 


-37 
38 
-46 
5 
Bk 


80 
02 
15 
89 
58 
78(60°C) 


Aa 
“47 
9 
LAs 


“I 


溶剂 在 水 中 (927) 


溶 解 BE 


几乎 不 盗 


0.00095% 
0. 


010% 


任意 混 盗 


0. 
-1780% 
-1515% 
-0196% 
-294% 
-04% 
-17% 
-815% 
.08% 


co oS: Cate & = 


077% 


FERRY 


Ef 


38% 


FERRE 


8. 


66% 


FERRE 
FERRE 


Rs 
i 


19% 
67% 


(20—25%c) 


水 在 溶剂 中 (927 


LF AE 


0. 
0. 


0111% 
0055% 


FERRY 


0. 
0. 
.0334% 
-9402% 
<0. 
1.468% 
1.15% 
0. 
2.94% 


oe © 


010% 
063% 


005% 


072% 


任意 混 盗 


4i. 


76% 


任意 混 咨 
28.72% 
FERRE 
ERR 


A 
9. 


41% 
61% 


:任意 混 溶 
任意 混 溶 
任意 混 溶 
FERRIS 
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25.3% 
任意 混 深 


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二 个 氢 键 的 溶剂 分 子 , 即 既是 氢 供 体 又 是 氨 的 受 体 ,例如 脂肪 族 的 醇 类 。(3) 只 作 质子 受 
体 的 溶剂 分 子 , 如 脂肪 族 的 醚 类 。(4) 只 作 质 子供 体 的 溶剂 分 子 , 如 毛 仿 。(5)》 不 能 形成 
氢 键 的 烃 类 ,如 四 氯 化 碳 。 

以 上 分 类 法 见 表 2-1 所 示 。 | 

按照 表 2-1 的 溶剂 分 类 ,a、b 二 类 溶剂 宜 用 于 极 性 化 合 物 的 提取 ,c, d 二 类 溶剂 宣 
于 对 溶液 中 弱 极 性 或 非 极 性 化 合 物 进行 抽 提 。 在 抽 提 中 如 加 入 质子 供 体 溶剂 酚 或 质子 受 
体 溶剂 胺 , 均 可 增加 质子 受 体 溶质 或 质子 供 体 溶质 的 溶解 度 。 

以 上 仅 对 物质 溶解 一 般 规律 在 理论 上 简单 介绍 ,实际 应 用 时 ,各 类 物质 的 溶解 有 关 数 
据 均 可 在 手册 或 文献 中 查 到 。 现 将 一 些 常 用 溶剂 的 沸点 \ 介 电 常 数 及 溶解 度 列 于 表 2-2。 


第 三 节 ”影响 物质 溶解 度 的 几 个 主要 因素 
BS ae 


离子 强度 是 影响 物质 溶解 度 主 要 因素 之 一 。 有 些 物 质 在 高 离子 强度 下 溶解 度 增 加 
《如 DNA- 和 蛋白 ), 另 一 些 物质 〈 如 RNA- 和 蛋白 ) 在 低 离 子 强度 下 溶解 度 增 加 , 而 在 高 离 
子 强度 下 溶解 度 反而 减少 。 绝 大 多 数 球 蛋 白 和 酶 , 在 低 离子 强度 的 溶液 中 都 有 较 大 的 放 
解 度 , 如 在 纯 水 中 加 入 少量 中 性 盐 , 蛋 白质 溶解 度 比 在 纯 水 时 大 大 增加 。 称 为 盐 溶 ` 现 

象 。 但 中 性 盐 的 浓度 增加 至 一 定时 , 蛋 白质 的 

ARE MAM TH ,直至 沉淀 析出 。 则 称 为 盐 

析 ” 现 象 。 溶液 离子 强度 与 蛋白 质 溶解 度 的 关 

系 见 图 2-1。 盐 溶 现象 的 产生 主要 是 少量 离子 

的 活动 , 减 少 了 偶 极 溶质 分 子 之 间 极 性 基 团 静 

电 吸 引力 , 增 加 了 溶质 和 溶剂 相互 作用 力 的 结 

果 。 盐 溶 现象 不 仅 在 水 溶液 中 , 而 且 在 低 介 电 

r/2 离 子 强度 ”常数 溶剂 如 乙醇 中 也 同样 发 生 , 低 离子 强度 溶 

ere.) eee 液 除 了 增加 许多 生化 物质 的 溶解 度 外 , 还 对 一 

图 2-1 淤 液 离子 强度 与 蛋白 质 溶解 度 的 关系 些 物 质 生理 活性 有 稳定 作用 , 所 以 稀 盐 溶 流 常 
用 于 大 多 数 生化 物质 的 提取 。 


log s (溶解 度 ) 


ot. ple ge! fe 


许多 有 机 分 子 或 生物 分 子 都 同时 具有 酸性 或 碱 人 性 基 团 , 这 些 基 团 在 不 同 pH 下 有 着 
不 同 的 解 离 状 态 ,在 水 中 或 有 机 溶剂 中 便 有 不 同 溶解 度 。 当 两 性 物质 分 子 上 酸 、 碱 性 基 团 
解 离 情 况 相 等 时 , 整 个 分 子 所 带电 荷 总 和 为 零 , 此 时 溶 芒 的 pH 值 称 为 该 分 子 的 等 电 点 。 
在 等 电 点 时 ,两 性 溶质 分 子 易 相 互 聚集 , 溶解 度 最 低 , 而 远离 等 电 点 两 侧 的 pH 值 时 溶解 
度 增 大 。 对 于 一 些 酸性 或 碱 性 小 分 子 物 质 , 当 pH 很 低 时 ,酸性 物质 大 部 分 呈 非 解 离 分 子 
状态 而 碱 性 物质 大 部 分 呈 阳 离子 状态 。 如 pH 很 高 时 , 酸性 物质 大 部 分 呈 阴 离子 状态 存 
在 ,而 碱 性 物质 则 呈 非 解 离 分 子 状 态 。 离 子 状态 的 物质 ,不 论 是 阳离子 或 阴离子 都 易 溶 于 


© 26 。 


7k , 非 离 解 的 分 子 状态 则 易 溶 于 有 机 溶剂 。 所 以 当 酸性 物质 处 于 低 pH 值 , 碱 性 物质 处 于 
高 pH 值 时 , 都 可 以 转 溶 于 有 机 溶剂 。 但 有 些 两 性 物质 如 氨基 酸 , 在 等 电 点 以 外 任何 pH 
值 时 , 均 呈 离子 状态 存在 ,所 以 氨基 酸 一 般 不 用 有 机 溶剂 提取 ( 稀 的 乙醇 例外 )。 

酸性 或 碱 性 物质 在 不 同 pH 下 的 溶解 性 质 的 差异 ,和 它们 的 酸性 与 碱 性 的 强 弱 程度 
有 关 。 如 非 滑 弱 的 酸 , 则 需要 高 PH 值 的 溶剂 内 ,才能 使 这 种 酸 解 离 。 

以 上 从 pH 值 与 物质 溶解 度 之 间 的 关系 作 一 简单 的 讨论 。 HHA. MB. BRS 
物 大 分 子 来 说 , 提取 溶液 选择 pH 值 首 先 要 保证 这 些 生物 大 分 子 活性 不 受 破坏 为 前 提 , 过 
酸 、 过 碱 均 尽 量 避 免 , 一 般 控制 在 pH 6 一 8 范围 , 币 选 接近 中 性 的 pH 比较 稳定 。 如 单纯 
从 溶解 度 方面 考虑 ,等 电 点 在 酸性 范围 的 蛋白 质 或 酶 ,可 选用 偏 碱 性 溶 流 提 取 ,, 等 电 点 在 
碱 性 范围 时 , 则 选用 偏 酸 性 溶液 提取 ,酸性 条 件 还 可 以 解 离 一 些 蛋 白 质 与 其 他 组 分 的 离子 
键 结合 。 并 有 利于 细胞 壁 的 溶解 。 


ER 


温度 的 升 高 可 增加 物质 的 溶解 度 , 减 少 溶液 的 粘度 ,这 是 大 家 熟知 的 。 所 以 , 略为 提 
高 温度 对 提取 是 有 利 的 , 这 叫 热 提取 法 。 热 提 取 法 多 用 于 一 些 植物 成 份 和 某 些 小 分 子 生 
化 物质 , 提取 温度 常 控制 在 50~70C 左右 。 热 提取 法 虽然 提取 效率 高 , 但 所 得 提取 液 含 
杂质 较 多 ,不 如 冷 提 法 含 杂 质 少 ,这 是 热 提 法 的 缺点 ,对 于 绝 大 多 数 生 物 大 分 子 , 除 了 某 些 
特殊 例子 外 , 一 般 提 取 温 度 选择 O~ 10°C 范围 , 选择 温度 范围 不 但 使 溶质 有 较 好 溶解 度 , 
更 主要 是 防止 生物 大 分 子 的 变性 。 


2: a = ee 


去 垢 剂 是 一 类 既 具 有 亲 水 基 又 具有 朴 水 基 的 物质 。 可 分 阴离子 、 阳 离子 和 中 性 去 拍 
剂 等 多 种 类 型 , 去 垢 剂 一 般 具 有 乳化 、 分 散 和 增 溶 作 用 , 其 中 中 性 去 拍 剂 对 蛋白 质 的 变性 
作用 影响 较 少 , 宜 于 蛋白 质 或 酶 提取 之 用 。 一 般 市 售 中 性 去 拍 剂 有 Tween 20、40、60、 
85, Triton X-100 420; Lubrol W 等 多 种 规格 。 中 性 去 垢 剂 使 用 后 可 通过 Sephadex LH- 
50 柱 除去 外 ,和 欲 直接 用 DEAE-Sephadex 柱 层 析 , 不 必 先 分 离 除去 去 垢 剂 中 , 洗 脱 所 得 蛋白 
| 质 溶液 ,接着 可 用 盐 或 有 机 溶剂 分 部 沉淀。 

某 些 阴离子 去 拍 剂 如 十 二 烷 基 砚 酸 钠 , 它 可 以 促进 核 蛋白 的 解体 , 将 核酸 释放 出 来 , 
并 对 核酸 酶 有 一 定 抑制 作用 ,常用 于 核酸 的 提取 。 


SOT Re PH a RH A 


4 EI FA ABR Ao BE AN ea HERA SAD aE 
用 有 关 。 扩 散 作用 中 各 项 因素 关系 可 用 下 式 表 示 ; 
GDFAC: 
Ax 


A: G 为 已 扩散 的 物质 量 。 


«27 。 


D 为 扩散 系数 。 物 质 分 子 量 越 大 ,扩散 系数 越 小 ,温度 升 高 ,扩散 系数 增 大 ,溶液 粘度 : 
增加 ,扩散 系数 减少 。 

F 为 扩散 面积 。 

AC 为 两 相 界面 溶质 的 浓度 差 , AC 越 大 ,扩散 越 快 。 

Ax 为 溶质 扩散 的 距离 ,Ax 越 大 ,物质 扩散 到 溶剂 中 的 速度 越 慢 。 

t 为 扩散 时 间 , 时 间 越 长 ,扩散 的 量 越 多 。 

从 上 式 各 因素 的 关系 可 知 ,为 了 增加 扩散 物质 的 量 , 也 就 是 提高 提取 速度 , 常 采 取 如 
下 措施 : 

《1》 提 高 材料 的 破碎 程度 ,以 增加 扩散 面积 ,减少 扩散 距离 。 

《2》 进 行 搅拌 ,使 已 扩散 的 溶质 迅速 与 溶剂 混 匀 , 以 保持 两 相 界 面 最 大 浓度 差 , 或 分 
次 提取 ,不 断 更 换 新 鲜 溶剂 ,以 提高 扩散 速度 。 

《3》 延 长 提取 时 间 , 提 高 提取 温度 (但 对 一 些 不 耐 热 的 物质 , 温度 不 宜 过 高 ), 以 及 减 
少 溶液 粘度 (如 属 大 分 子 核酸 干扰 ,加 入 少量 鱼 精 蛋白 或 硫酸 链 霉 素 沉淀 去 除 ) 等 。 

因 一 液 提 取 常 见于 动物 骨骼 .肌肉 组 织 及 中 草药 等 材料 ,往往 由 于 这 些 材 料 的 组 织 细 
胞 破碎 比较 困难 ,提取 效果 受 扩散 作用 的 影响 较 大 。 

实际 上 从 破碎 后 的 固体 细胞 提取 所 需 组 分 , 当 细 胞 破碎 程 度 及 提取 温度 受到 限制 时 , 
采用 少量 多 次 提取 方法 较为 有 利 四 。 

设 了 为 所 制备 的 溶质 (A) 在 固 相 和 液 相 中 分 配 系数 ,,x 为 固 相 中 原 有 的 “〈A) 的 重 
量 , xn 为 提取 n 次 后 固 相 中 所 剩 (A) WER. WH 
被 抽 提 固体 材料 体积 ,L 为 每 次 抽 提 剂 所 用 溶剂 的 
体积 。 可 得 如 下 公式 : i 

—_ lar) 
KW +L 
从 上 式 可 看 出 用 同样 体积 的 溶剂 抽 提 , 分 二 次 


抽 提 比 一 次 抽 提 收 率 高 得 多 , 抽 提 次 数 与 zi 比 可 用 
--e 2-2 BA: 


ea Sa meme 
分 配 定律 的 应 用 


液 一 液 萃取 选用 的 溶剂 必须 与 被 抽 提 的 溶液 互 
不 混和 ,, 且 对 被 抽 提 的 溶质 有 选择 性 的 溶解 能 力 。 萃取 的 过 程 是 溶质 在 两 相 中 经 充分 振 
荡 平 衡 后 按 一 定 比例 分 配 的 过 程 。 溶 质 在 两 相 中 达到 平衡 后 分 配 比 例 受 分 配 定律 的 支配 , 
分 配 定 律 可 表示 为 在 恒温 \ 恒 压 及 比较 稀 的 浓度 下 ,溶液 在 两 相 中 的 浓度 分 配 比 是 一 个 党 
数 , 即 : 

Cy 

— ears 
式 中 Ci 一 一 表示 分 配 达 到 平衡 后 ,在 上 层 液 相 中 溶质 的 浓度 。 
C: 一 -表示 分 配 达到 平衡 后 ,在 下 层 液 相 中 溶质 的 浓度 。 


aa Z8 。 


图 2-2 “提取 次 数 与 提取 率 的 关系 


一 一 为 分 配 常数 。 

不 同 溶质 在 不 同 溶剂 中 有 不 同 的 K 值 。 开 值 愈 大 , 表 示 该 溶质 在 上 层 液 相 中 溶解 度 
KA, KM), 表示 该 溶质 在 下 层 液 相 中 溶解 度 愈 大 。 当 混合 各 组 分 的 区 值 很 接近 时 , 
须 通过 不 断 更 新 溶剂 进行 多 次 抽 提 才能 彼此 分 开 。 分 配 系数 与 物质 在 二 相 系 统 中 的 溶解 
度 有 关 ; 但 分 配 系数 不 等 于 溶质 在 二 个 相 溶剂 中 溶解 度 的 比例 , 因 溶解 度 是 指 饱和 状态 而 
言 ,而 一 般 萃取 常 限于 稀 的 溶液 。 

如 溶质 分 子 在 提取 的 溶剂 有 缔 合 现象 , 则 分 配 定律 公式 改写 为 : 


M, , 

oa 为 溶质 缔 合 后 分 子 量变 化 的 数目 。 其 数值 等 于 在 上 层 相 中 的 分 子 量 〈M:) 和 下 层 

WEPOT Ss (M:) 之 比 。 例如 ,醋酸 分 子 量 为 60, 在 水 和 乙醚 之 间 分 配 , 因 没有 缔 合 
现象 发 生 , 故 ,M: = 60,M, = 60 


60 


SOB RAE 7k ASE. (14) A EEE ch HE  CCHLCOOH), 4453 -F st My = 120, - 


此 时 
TY 
所 以 酷 酸 在 水 一 葵 体 系 中 ,分配 系 数 开 应 为 : 
= 
_ CF ; 

HAE EE CS +o i Re A AAA: 水 , 水 一 醇 为 一 相 , 另 
一 相 为 与 水 不 相 混和 的 各 种 碳 氧 化合物, 如 低级 醚 , 酯 、 葵 酚 等 。 液 一 液 萃取 有 简单 一 次 
提取 和 多 次 提取 ,, 提取 时 可 用 普通 分 液 漏斗 人 工 操 作 , 也 可 以 用 自动 转 液 的 逆流 分 配 仪 
逆流 分 配 仪 是 一 种 多 次 液 一 液 萃 取 的 装置 , 可 以 自动 进行 数 十 次 甚至 数 百 次 连续 的 转 液 
抽 提 ,最 后 将 一 系列 天 值 十 分 相似 的 组 份 , 经 过 多 次 二 相 系 统 不 断 抽 提 和 重新 分 配 后 , 达 
到 彼此 分 离 的 目的 。 逆 流 分 配 仪 已 广泛 用 于 多 肽 如 垂体 激素 、 加 压 素 、 催 产 素 、 短 杆菌 肽 
和 tRNA 的 分 离 。 


第 六 节 ”提取 时 对 具有 生理 活性 物质 的 保护 措施 


对 于 一 些 具 有 生理 活性 的 物质 的 提取 , 除 了 考虑 所 选用 的 溶剂 对 被 提取 物 有 较 大 的 
溶解 度 , 对 杂质 有 较 少 的 溶解 度 外 ,还 应 综合 芳 虑 提取 所 用 的 溶剂 中 各 种 成 份 的 组 合 及 其 
他 因素 ,使 这 些 活性 物质 在 提取 时 处 于 稳定 状态 , 对 于 一 些 生 物 大 分 子 如 蛋白 质 、 酶 和 核 
酸 来 说 ;主要 措施 常 有 如 下 几 点 : 

1. 采用 缓冲 系统 。 防止 提取 过 程 中 某 些 酸 碱 基 团 的 解 离 , 造 成 溶液 中 pH 值 变 化 幅 
度 过 大 , 导 致 茶 些 活性 物质 的 变性 ,或 由 于 pH 影响 提取 的 效果 。 在 生化 制备 中 , 提取 用 
的 缓冲 系统 常 有 磷酸 盐 缓 冲 滚 ,柠檬 酸 盐 缓 冲 液 ,Tris Ra ,醋酸 盐 缓 冲 液 , 碳 酸 盐 组 


© 29 « 


冲 液 和 巴 比 妥 缓冲 液 等 。 缓冲 液 所 使 用 的 浓度 均 比 较 低 , 以 利于 增加 溶质 的 溶解 性 能 。 

2. 加 入 保护 剂 。 防 止 某 些 生理 活性 物质 的 活性 基 团 及 酶 的 活性 中 心 受 到 破坏 。 如 最 
常见 的 琉 基 ,是 许多 活性 物质 和 酶 催化 的 活性 基 团 , 它 极 易 被 氧化 , 故 提 取 时 常 加 和 一些 
还 原 剂 如 半 胱 氨 酸 , c- 琉 基 乙 醇 , 二 往 基 赤 侮 糖 醇 , 还 原型 谷 胱 甘 肽 等 以 防止 它 的 氧化 。 
其 他 的 措施 如 提取 某 些 酶 常 加 入 一 些 底 物 。 一 些 易 受 重金 属 离子 抑制 生理 活性 的 物质 , 
加 入 某 些 金属 整合 剂 , 把 有 害 金 属 离子 鳌 合 掉 ,而 保持 被 提取 的 活性 物质 的 稳定 性 s 

3. 抑制 水 解 酶 的 破坏 。 是 提取 生化 物质 中 最 重要 保护 性 措施 之 一 。 可 根据 不 同 水 解 
酶 的 性 质 采 用 不 同方 法 , 如 需要 金属 离子 激活 的 水 解 酶 〈 如 DNase), 常 加 入 EDTA 或 
用 柠檬 酸 缓 冲 液 除去 溶液 中 的 某 些 金属 离子 ,使 酶 的 活动 受到 抑制 。 对 热 不 稳定 的 水 解 
BS, 可 用 热 提 取 法 使 之 失去 作用 ,, 或 根据 水 解 酶 的 溶解 性 质 的 不 同 , 采用 不 同 pH 值 提取 
以 减少 水 解 酶 释放 到 提取 站 中 的 机 会 ; 或 选用 pH 范围 使 酶 活力 最 低 。 但 最 有 效 方法 还 
是 针对 性 地 加 入 某 些 抑制 剂 , 以 抑制 水 解 酶 的 活性 。 核糖 核酸 酶 是 制备 完整 RNA 分 子 
的 最 大 障碍 , 在 长 期 研究 中 已 发 展 了 许多 特殊 抑制 剂 对 付 此 酶 。 例如 阴离子 去 拍 剂 十 二 
烷 基 磺 酸 钠 ,脱氧 胆 酸 钠 , 蔡 -1,5- 二 磺 酸 钠 , 三 异 丙 基 茶 磺 酸 钠 , 4- 氮 基 水 杨 酸 钠 等 , 均 
已 被 广泛 应 用 于 核酸 的 提取 。 另 最 近 还 使 用 了 皂 土 “〈 了 Bentonite,AlOi4SiOHO), 肝 素 
(Heparin), DEP (Diethyl-pyrocarbesate, 二 乙 基 焦 碳 酸 盐 ), 和 蛋白酶 K( 该 酶 最 适 pH 7.5 ~ 
12, 对 热 稳定 ,在 很 高 浓度 的 SDS 和 尿素 溶液 中 仍 有 很 高 活性 ) 等 多 种 核酸 酶 的 抑制 剂 , 
使 具有 活性 的 核酸 提取 纯化 工作 获得 了 很 大 进步 。 

此 外 提取 各 种 具有 活性 的 蛋白 质 或 酶 分 子 时 , 常 加 入 某 些 蛋白 酶 抑制 剂 如 葵 甲 基 砚 
酰 氟 化 物 (PMSF), —S ARAB (DIFP 或 DFP), 夏 乙酸 等 。 但 这 些 抑制 剂 在 抑 
制 蛋白 水 解 酶 的 同时 ,也 常 抑制 其 他 蛋白 质 和 酶 的 活性 , 使 用 时 必须 小 心 选择 。 一 般 阅 , 
提取 和 蛋白质 时 , 加 入 蛋白 水 解 酶 的 抑制 剂 没 有 象 使 用 核酸 酶 抑制 剂 在 核酸 提取 时 那样 普 
遍 和 迫切。 

4. 其 他 一 些 特殊 要 求 的 保护 措施 , 除 前 面 已 提 及 过 种 种 引起 生物 大 分 子 变 性 因素 , 姐 
ZOMG, BUR. WRK, 高 温 、 冻 结 等 均 避 免 外 。 某 些 生物 大 分 子 提 取 时 的 特殊 要 
求 , 如 固氮 酶 钼 一 铁 蛋 白 , 提 取 分 离 时 严格 要 求 无 氧 条 件 下 进行 , 以 及 某 些 对 冷 或 热 敏感 
的 蛋白 要 求 一 定 的 温度 下 操作 等 均 应 根据 不 同 具 体 对 象 予 以 不 同 处 理 。 


第 七 节 ”各 类 物质 的 提取 分 离 


—, SA ANBNERD 


(一 ) 不 同 结构 的 蛋白 质 及 其 溶解 性 质 


蛋白 质 按 其 功能 可 分 为 活性 蛋白 和 非 活 性 蛋白 二 类 , 按 结构 又 可 分 为 简单 蛋白 和 结 
合 蛋白 二 类 ; 再 一 种 分 类 法 是 根据 蛋白 质 的 深 解 度 差 别 而 分 为 水 溶性 蛋白 , 醇 溶性 蛋白 
等 , 还 有 一 类 硬 蛋白 不 溶 于 水 , 稀 酸 , 稀 碱 和 有 机 溶剂 , BER ERK, SRE 
溶解 性 质 见 表 2-3。 

根据 表 2-3 所 列 各 类 蛋白 质 的 深 解 性 质 ,可 以 看 出 大 部 份 蛋白 质 可 溶 于 水 、 稀 盐 、 稀 
碱 或 稀 酸 溶液 ,少数 与 脂 类 结合 的 蛋白 质 则 溶 于 乙醇 、 丙酮、 丁 醇 等 有 机 溶剂 。 蛋 白质 在 


« 30 。 


表 2-3 不 同 结构 的 蛋白 质 及 其 溶解 性 质 


蛋白 质 类 别 a 解 te 质 

简单 蛋白 质 
1. 白 蛋白 VS F 7k Be Pi Eh » FH ER » Fh RIS HK » BT RK 50% HOME HR RAT Ho 
2. 球 蛋白 

真 球 蛋 白 一 般 在 等 电 点 不 溶 于 水 ,但 加 入 少量 的 盐酸 \ 碱 则 可 溶解 。 

拟 球 蛋 白 溶 于 水 ?可 为 3092 饱和 度 硫 酸 铵 析出 。 
3. 醇 溶 蛋白 WT 70—80% 乙醇 中 ,但 不 溶 于 水 及 无 水 乙醇 。 
41.4358 AAs AF ako LRT DM, HST RR BS 
5. 精 蛋白 溶 于 水 和 稀 酸 , 易 在 稀 氮 水 中 沉淀 。 
6.4K A WT KMMM >, DEMAKP UE, 
BEAR ARE TK » Eh > FAR » Fi Tek 
结合 蛋白 质 此 类 蛋白质 溶解 度 性 质 随 蛋 白质 与 非 蛋 白 结合 部 份 的 不 同 而 异 , 除 


脂 蛋 白 外 ,一 般 可 溶 于 硝酸 , 稀 碱 及 盐 溶液 中 , 脂 蛋白 如 脂 质 部 分 露 于 
外 , 则 脂 溶性 占 优 势 , 如 脂 质 部 份 被 包围 于 分 子 之 中 , 则 水 溶性 占 优 势 。 


《包括 磷 蛋 白 , 粘 蛋白 , 糖 蛋白 , 核 
SA WEA MAA SRA, | 
黄 素 蛋白 等 ) 


不 同 溶剂 中 的 溶解 度 差 别 , 主 要 取决 于 蛋白 质 分 子 中 极 性 基 团 与 非 极 性 基 团 的 比例 和 这 
些 基 团 的 排列 位 置 及 偶 极 距 , 因 此 采用 不 同 溶剂 和 调整 影响 蛋白 质 溶解 度 的 外 界 因素 如 
温度 、pH\ 离 子 强度 等 , 即 可 把 所 需 的 蛋白 质 和 酶 从 细胞 内 复杂 的 组 份 中 提取 分 离 出 来 。 


(=) 蛋白 质 及 酶 的 一 般 提取 方法 


1. 水 溶液 提取 凡 能 溶 于 水 、 稀 盐 、 稀 酸 或 稀 碱 的 蛋白 质 或 酶 ,一 般 都 可 用 稀 盐 溶 
液 或 缓冲 溶 液 进 行 提 取 。 稀 盐 溶液 和 缓冲 溶液 有 利于 稳定 蛋白 质 结 构 和 增加 蛋白 质 溶解 
度 。 加 入 的 提取 液 的 量 要 适当 ,加 人 量 太 少 提取 不 完全 ,加 的 量 太 多 , 则 不 利于 浓缩 ,一 般 
用 量 为 原材料 3 二 6 AREA, 可 一 次 提取 或 分 次 提取 。 提 取 时 常 缓慢 搅拌 , 以 提高 提 
取 效 率 。 以 盐 溶液 或 缓冲 液 提取 蛋白 质 和 酶 时 , 常 综合 考虑 下 列 因 素 : 

C1) 盐 浓度 : 提取 蛋白 质 的 盐 浓度 ,一 般 在 0.02 一 0.2M 的 范围 内 。 HAMAR 
和 缓冲 液 有 0.02 一 0.05M 磷酸 缓冲 液 ,碳酸 缓冲 液 ,0.09~ 0.15M 氧化 钠 溶液 。 在 某 些 情 
况 下 , 也 用 到 较 高 的 盐 浓 度 , 如 提取 脱氧 核糖 核 蛋白 及 膜 蛋白 。 有 时 为 了 整合 某 些 金属 
离子 和 解 离 酶 分 子 与 其 他 分 子 的 静电 结合 , 选 用 柠檬 酸 缓冲 液 和 焦 磷 酸 钠 缓冲 液 可 获得 
较 好 效果 。 故 稀 盐 溶液 和 缓冲 溶液 的 浓度 及 缓冲 液 的 组 份 的 选择 , 应 根据 不 同 对 象 及 具 
体 情况 而 定 。 有 时 为 了 破坏 蛋白 质 与 其 他 物质 的 离子 键 或 氢 键 的 结合 , 加 入 少量 多 价 阴 
离子 也 有 助 于 对 这 些 蛋白 质 提取 分 离 。 总 的 来 说 , 能 溶 于 水 溶液 而 与 细胞 颗粒 结合 较 松 , 
的 蛋白 质 或 酶 , 在 细胞 破碎 以 后 , 只 要 选择 适当 的 盐 浓 度 和 pH (A, 一 般 是 不 难 提取 的 。 

(2) pH: 蛋白 质 和 酶 所 用 的 提取 液 pH 值 一 般 选 择 在 被 提取 的 蛋白 质 等 电 点 两 侧 的 
稳定 区 内 。 如 细胞 色素 丙 是 一 碱 性 蛋白 质 ,常用 稀 酸 提取 。 肌 肉 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 是 
一 酸性 蛋白 质 , 则 用 稀 碱 提取 。 植物 组 织 中 的 一 些 酸性 或 碱 性 蛋白 质 常 分 别 用 0.1 多 一 
0.2% 的 氢 氧 化 钾 水 溶液 或 1% 碳酸 钠 溶液 提取 。 在 某 些 情况 下 ,为 了 破坏 所 分 离 的 蛋白 
质 与 其 他 杂质 的 静电 结合 ,选择 偏 酸 (pH 3 一 6) 或 偏 碱 (pH 10 一 11) 提取 ,可 以 使 离子 


e Sr. 4 


键 破坏 而 获得 单一 的 蛋白 成 份 。 

(3) mE: 蛋白 质 和 酶 一 般 都 不 耐 热 , 所 以 提取 时 通常 要 求 低 温 操 作 。 只 有 对 某 些 
耐 高 温 的 蛋白 质 或 酶 (如 胃 和 蛋白 酶 .酵母 醇 脱 氢 酶 及 某 些 多 肽 激素 ) 才 在 比较 高 的 温度 下 
提取 ,使 更 有 利于 和 其 他 不 耐 热 蛋白 质 的 分 离 。 

2 有 机 溶剂 提取 ”一些 和 脂 质 结 合 比较 牢固 或 分 子 中 非 极 性 侧 链 较 多 的 蛋白 质 和 
酶 , 难 溶 于 水 , 稀 盐 , 稀 酸 和 稀 碱 ,常用 有 机 溶剂 提取 。 如 丙酮 . 异 丙 醇 、 乙 醇 \ 正 丁 醇 等 , 均 
可 溶 于 水 或 部 份 溶 于 水 , 这 些 溶剂 都 同时 有 亲 脂 性 和 亲 水 性 。 其 中 正 丁 醇 有 较 强 的 亲 脂 
性 ;也 有 一 定 亲 水 性 , 在 0*c 时 于 水 中 有 105% 的 溶解 度 。 它 在 水 和 脂 分 子 间 起 着 类 似 
去 污 剂 的 桥梁 作用 ,在 取代 和 蛋白质 与 脂 质 的 结合 位 置 后 ,由 于 丁 醇 与 蛋白 质 极 性 基 团 结合 
的 竞争 力 比 脂 质 大 , 能 阻止 脱落 了 的 脂 质 重 新 与 蛋白 质 结 合 。 使 原来 蛋白 质 在 水 中 溶解 
度 大 大 增加 。 丁 醇 在 水 溶液 及 各 种 生物 材料 中 解 离 脂 蛋白 的 能 力 极 强 , 是 其 他 有 机 溶剂 
所 不 及 的 。 我 国生 化 工作 者 曾 用 此 法 成 功 地 提取 了 琥珀 酸 脱氧 酶 各 , 对 于 碱 性 磷酸 酯 酶 
的 提取 效果 也 十 分 显著 ”。 

有 些 蛋 白质 和 酶 既 溶 于 稀 酸 、 稀 碱 , 又 能 溶 于 一 定 比 例 的 有 机 溶剂 一 在 这 样 的 情况 


下 ,采用 稀 的 有 机 溶剂 提取 常常 是 为 防止 水 解 酶 的 破坏 ,并 兼 有 除 杂 和 提高 纯化 效果 的 作 


用 。 现 举例 说 明 如 下 : 

如 胰岛 素 可 溶 于 稀 酸 、 稀 碱 和 稀 醇 溶液 ,但 针对 组 织 中 共存 的 麻 蛋 自 酶 对 胰 高 素 有 极 
高 的 水 解 活性 ,采用 68 % 酒精 溶液 并 用 草酸 调 至 pH 25~3.0, 这样 便 能 在 三 方面 抑制 了 
糜 蛋白 酶 的 活性 : C1) 8% 酒精 可 以 使 糜 蛋 白 酶 暂时 失 活 ; 2) 草酸 可 以 除去 激活 麻 
蛋白 酶 的 金属 离子 Ca++;(3) 选 用 pH 2.5 ~ 3.0 是 魔 蛋 白 酶 不 适宜 作用 的 PHA. md 
上 条 件 对 胰岛 素 的 溶解 度 和 稳定 性 并 没有 影响 , 并 可 以 除去 一 部 份 在 稀 醇 及 酸性 溶液 中 
不 溶解 的 杂 和 蛋白 。 当 然 胰岛 素 的 提取 现 已 有 了 新 的 进展 ,但 上 面 的 设计 仍 是 干 分 侣 理 的 。 

又 如 提取 垂体 前 叶 ACTH 常 采用 酸性 70 多 丙酮 ,其 设计 原理 是 酸性 可 以 促进 ACTH 
的 溶解 ;而 70 多 浓度 丙酮 对 ACTH 的 溶解 度 没 有 影响 , 却 可 大 幅度 地 抑制 其 他 杂 和 蛋白 的 
溶出 ,对 提高 分 离 纯化 的 效果 极为 显著 。 

3. 从 细胞 膜 上 提 权 水 溶性 的 蛋白 质 和 酶 方法 中 虹 上 的 蛋白 质 或 酶 一 豚 有 二 种 看 
在 状态 ,一 是 在 膜 表面 上 ,与 膜 成 份 联系 比较 松 ;第 二 是 膜 的 内 在 成 份 之 一 ;或 与 膜 成 份 结 
合 较 紧 。 蛋白 质 与 膜 成 份 的 结合 可 通过 脂 质 形成 复合 物 , 也 可 以 通过 金属 离子 与 膜 成 份 
结合 ,或 与 膜 其 他 蛋白 质 形 成 复合 物 。 与 膜 成 份 结合 较 松 的 蛋白 质 或 酶 ,经 过 充分 破碎 细 
胞 ,在 一 定 pH 范围 用 稀 盐 溶液 即 可 提取 分 离 。 如 线粒体 上 的 细胞 色素 c, 是 与 细胞 器 结 
合 较 松 的 一 个 酶 , 用 pH 4.0 HMRAB KCl 溶液 破坏 其 与 膜 成 份 的 静电 引力 , 线粒体 
上 的 细胞 色素 <“ 即 解 离 转 到 提取 沪 中 。 但 一 些 与 膜 成 份 结合 较 牢 或 属于 膜 组 成 的 蛋 自 
- 质 , 提 取 则 比较 困难 , 须 用 超声 波 , 去 污 剂 或 其 他 比较 强烈 的 化 学 处 理 , 才 能 从 膜 上 分 离 册 
来 。 一 般 常 用 方法 有 如 下 几 种 : 

C1) 浓 盐 或 尿素 等 溶液 提取 :如 NaClo,, 尿素 、 肛 盐酸 盐 等 溶液 均 有 人 应 用 于 提取 膜 
蛋白 , 当 以 上 溶液 浓度 达到 2M 时 ,可 抽 去 27 多 以 上 的 膜 蛋白 , 但 使 用 这 样 条 件 易 引起 
蛋白 质 和 酶 的 变性 。 

(2) 碱 溶液 提取 : , 碱 性 条 件 也 可 以 解 离 与 膜 上 成 份 结合 的 蛋白 质 。 在 pH 8 一 11 范 
围 内 , 某 些 膜 蛋白 随 着 pH 值 的 提高 而 溶解 度 大 大 增加 , 至 pH11 时 , WA 40~50% 


e 32 。 


噶 蛋 白 被 抽出 ,但 碱 提取 法 也 容易 引起 蛋白 质 和 酶 的 失 活 , 应 用 上 不 广 。 ) 
(3) 加 入 金属 整合 剂 : ”蛋白 质 通 过 金属 离子 与 膜 成 份 结合 时 , 加 入 金属 束 合 剂 如 
EDTA 可 使 蛋白 质 释放 出 来 。 用 此 法 曾 成 功 地 提取 了 膜 上 ATP 酶 的 偶 联 因子 IEDTA 
与 超声 波 联合 处 理 抽 提 膜 上 磷 酰 转移 酶 , 据 报导 效果 更 好 中 。 

C4) 有 机 溶剂 抽 提 f"9: 使 用 乙醇 吡啶 \ 叔 戊 醇 \ 正 丁 醇 等 溶剂 抽 提 及 用 冷 丙酮 做 成 
丙酮 汾 ,是 提取 膜 上 与 脂 质 结合 的 脂 蛋 白 或 膜 内 脂 蛋 白 组 份 最 常用 也 较 有 效 的 方法 ,其 中 


披 戊 醇 及 正 丁 醇 用 于 膜 内 脂 蛋 白 效 果 尤 佳 。 前 已 提 到 正 丁 醇 可 在 广泛 的 pH 值 (pH 3 一 


10) Mime CHA C—2—+ 40°C) 使 用 。 用 有 机 溶剂 结合 其 他 方法 已 成 功 地 提取 了 多 


种 膜 上 蛋白 质 和 酶 ,如 NPDH 脱氧 酶 , 琥 珀 酸 脱 气 酶 ,细胞 色素 氧化 酶 , 碱 性 磷酸 酯 酶 , 


胆 碱 脂 酶 等 。 

《5) 去 垢 剂 处 理 : 去 垢 剂 处 理 是 目前 广泛 应 用 于 提取 膜 上 水 溶性 蛋白 和 脂 蛋 白 的 方 
法 ,常用 的 去 拍 剂 有 弱 离 子 型 去 拍 剂 脱氧 胆 酸 盐 , 胆 酸 盐 , 强 离子 型 去 拍 剂 十 二 烷 基 磺 酸 
钠 (SDS), 和 非 离子 型 去 拍 剂 Triton X-100 和 Tween, Lubrol 和 Brij 等 去 垢 剂 处 理 膜 


蛋白 时 的 浓度 通常 为 1 多 左右 ,用 此 法 提取 的 膜 蛋白 和 酶 有 细胞 色素 bs、 胆 碱 脂 酶 、 细 胞 


色素 氧化 酶 、DPNH 氧化 酶 、ADP/ATP 载体 蛋白 等 。 Klingenberg 认为 用 去 垢 剂 分 离 
BREAN, 选择 去 垢 剂 首先 考虑 : 〈1) 去 拍 剂 的 盗 解 能 力 ; (2) 去 拍 剂 的 温和 性 。 强 离 
子 型 去 垢 剂 如 SDS) 一 般 具 有 很 好 溶解 能 力 , 但 温和 情况 不 理想 ,容易 引起 蛋白 质变 
性 。 弱 离子 型 或 非 离子 型 去 拍 剂 对 蛋白 质变 性 影响 较 小 , 而 溶解 能 力 差 。 去 垢 剂 的 溶解 
能 力 与 溶液 的 离子 强度 大 小 有 关 。 一 般 来 说 ,离子 强度 增加 ,去 垢 剂 的 咨 解 能 力也 随 之 增 
大 。 所 以 使 用 去 垢 剂 盗 解 膜 蛋白 时 , 须 考 虑 各 种 条 件 。 根据 Klingenberg SHAR, OB 
线粒体 膜 ADP/ATP 载体 蛋白 ,选用 Triton X100 比 用 Lubrol, Brij 和 Aminoxide 等 去 
拍 剂 效果 较 好 , 所 得 ADP/ATP 载体 蛋白 具有 较 高 的 天 然 活 性 。 但 主要 缺点 是 Triton 
x100 在 280nm 处 有 强 的 紫外 吸收 ,干扰 用 紫外 法 测定 蛋白 质 的 含量 吓 ]。 

脱氧 胆 酸 盐 和 胆 酸 盐 也 常用 提取 细胞 色素 系统 的 酶 和 线粒体 膜 上 的 ;ATP fig), tz 
近 我 国 尤 美 莲 等 比较 了 Triton X100- 胆 酸 和 脱氧 胆 酸 - 胆 酸 对 猪 心 线粒体 内 膜 H+-ATP 
酶 复合 体 的 分 离 效 果 , 结 果 表 明 Triton X100- 胆 酸 盐 法 ,操作 简便 产 率 高 ,重复 性 好 ;而 脱 
氧 胆 酸 - 胆 酸 盐 法 ,操作 较 繁 琐 , 脱 氧 胆 酸 对 酶 活性 影响 较 大 。 

另 有 报导 使 用 去 垢 剂 , 再 加 上 温和 条 件 的 超声 波 处 理 使 细胞 结构 松散 开 来 ,可 提高 膜 
蛋白 的 提取 率 。 

(6) 加 入 酯 酶 或 磷酸 酯 酶 水 解 蛋白 质 - 脂 质 复合 物 , 也 是 一 个 有 用 的 方法 : 其 中 蛇毒 
中 提取 的 磷酸 脂 酶 A 主 要 作用 于 磷脂 ,最 适 pH 为 6 一 8。 从 胰 脏 中 提取 的 酯 酶 作用 于 单 、 
三 、 三 甘 铀 酯 , 酶 作用 最 适 pH 为 7 一 8g。 酯 酶 和 磷酸 酯 酶 均 需 要 Ca + 所 激活 。 用 酶 
法 处 理 提 取 的 膜 蛋 白 及 酶 有 细胞 色素 c,cx- 磷 酸 甘油 脱氧 酶 ,TPNH- 细 胞 色素 <“ 还 原 酶 
等 


(=) 蛋白 质 和 酶 提 权 后 的 进一步 纯化 


蛋白 质 和 酶 从 细胞 内 提取 出 来 后 , 仍 处 于 十 分 混杂 的 体系 中 , 必须 进一步 纯化 。 但 经 
过 提取 除去 了 大 量 与 制备 物理 化 性 质 差别 较 大 的 杂质 , 只 剩余 与 制备 物理 化 性 质 大 致 相 
近 或 类 似 的 物质 。 因 此 ,经 过 有 选择 性 的 提取 这 一 步骤 ,对 以 后 纯化 工作 创造 十 分 有 利 条 


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件 。 蛋 白质 和 酶 溶剂 提取 后 进一步 分 离 纯 化 常用 方法 有 如 下 几 种 : 

(1) 选择 性 变性 除去 杂质 ; | 

(2) 分 段 盐 析 及 有 机 溶剂 沉淀 ; 

(3) 吸附 色谱 分 离 ; 

(4) 多 糖 基 离子 交换 色谱 分 离 ; 

(5) 凝 胶 过 滤 分 离 ; 

(6) 亲 和 色 谱 分 离 ; 

(7) 制备 超 离心 分 离 ; 

(8) 其 他 方法 分 离 纯 化 以 及 后 期 结晶 纯化 等 。 

由 于 各 类 蛋白 质 和 酶 从 细胞 中 提取 分 离 后 进一步 纯化 的 方法 选择 及 操作 步骤 每 简 都 
不 相同 ,很 难 作 统一 规程 。 但 对 于 同一 类 的 蛋白 质 * 在 提取 分 离 上 仍 有 许多 共同 起。 例如 
病毒 的 提取 分 离 常 分 为 三 步 a4。 

1. 病毒 的 提取 病毒 寄主 细胞 经 过 物理 或 机 械 方法 破碎 后 ,常用 中 性 缓冲 液 在 4%C 
左右 提取 ,大 多 数 病毒 在 这 一 条 件 下 比较 稳定 , pH 7.0,,0.1M 磷酸 缓冲 液 ,0.5M, pH 6.5 
柠檬 酸 缓冲 液 使 用 较 多 。 在 提取 中 为 了 消除 对 病毒 某 些 有 害 物质 , 还 常 加 入 一 些 还 原 剂 
(亚硫酸钠 , RELES) 以 抑制 多 酚 氧 化 酶 活力 或 加 入 一 定量 EDTA 除去 Cutt 和 使 多 
酚 氧 化 酶 不 起 作用 。 另 加 入 EDTA 除去 Catt 和 Mgt+ 还 可 以 使 混在 提取 液 中 的 核糖 
体 降解 以 便于 除去 。 

2. 净化 提取 液 , 粗 提取 液 中 , 除 含有 病毒 外 , 还 包括 有 大 量 细胞 碎片 , 每 种 各 样 的 
大 分 子 和 颗粒 必须 除去 。 常 用 方法 有 : 3000 一 10,000g 低速 离心 ,除去 一 些 细胞 碎片 ; 细 
胞 核 、 线 粒 体 、 叶绿体 等 大 的 颗粒 , 加 入 皂 士 、 活 性 炭 吸 附 除去 色素 及 一 些 非 病 毒 蛋 白 组 
份 ,用 有 机 溶剂 如 氧 仿 `\ 丁 醇 、 乙 醇 等 使 寄主 蛋白 质变 性 ,但 对 含 脂 质 外 膜 的 病毒 应 避免 使 
用 , 将 提取 液 反复 冻 融 或 50—60°C 加 热 5 一 10 分 钟 , 使 杂 和 蛋白 质变 性 或 凝聚 再 通过 低速 
离心 除去 。 

3. 从 净化 后 提取 液 中 进一步 纯化 病毒 ”除去 了 大 部 份 色素 和 寄主 蛋白 质 、 细 胞 碎 
片 以 后 , 常 选择 如 下 一 些 方法 进一步 纯化 病毒 : 

(1) REX (PEG 6000, 12000) RMR: 植物 病毒 一 般 使 用 硫酸 钞 为 
1/3 饱和 度 , 如 使 用 PEG 6000 其 浓度 为 6 驳 左右 ( 另 加 3 多 的 NaCl)。 

(2) 差 速 离心 和 超 离心 : 差 速 离心 先 除去 一 些 与 病毒 颗粒 质量 悬殊 的 组 份 , 然 后 在 ” 
40,000—100,000g 下 离心 1 一 2 小 时 ,把 病毒 沉 下 ,如 此 反复 数 次 , 即 得 到 较 纯 的 病毒 。 

(3) 色谱 分 离 , Sepharose 2B, Sephadex G 200, DEAE 纤维 素 ,CM FHA, RRS 
凝 胶 等 均 可 用 于 病毒 的 纯化 ;上 柱 与 洗 脱 与 一 般 蛋 白质 分 离 基本 相同 。 

又 例如 凝集 素 〈lectin) 是 一 类 能 使 红细胞 凝集 的 蛋白 质 , 广 泛 分 布 于 植物 及 部 分 低 
等 动物 、 哺 乳 动物 和 病毒 中 , 现 已 查 明 凝集 素 近 千 种 , 绝 大 多 数 与 糖分 子 共 价 结合 。 这 
上 千 种 不 同 凝集 素 分 离 一 般 都 是 生理 盐水 或 缓冲 液 提取 ( 脂 质 多 的 材料 需 事先 脱脂 ), 提 
取 后 比较 老 的 工艺 流程 是 硫酸 贸 分 级 沉淀 (或 乙醇 分 级 沉淀 ) ,离子 交换 色谱 ,分 子 饰 凝 胶 
过 滤 ; 超 离心 等 。 目 前 新 的 工艺 主要 是 采用 亲 合 色谱 法 ,提取 后 含 凝集 素 的 混合 液 直接 上 
Sepharose 或 Sephadex 柱 , 或 者 通过 固定 化 配 体 的 亲 合 柱 而 纯化 , 配 体 包括 糖 蛋白 、 糖 肽 、 
单 糖 \ 双 糖 及 其 衍生 物 。 一 些 凝集 素 的 提取 分 离 纯 化 方法 见 表 2-4。 


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二 、 核 酸 的 提取 分 离 
《一 ) 不 同 种 类 的 核酸 及 其 溶解 性 质 


核酸 分 为 DNA 和 RNA 两 大 类 。 DNA 主要 存在 于 细胞 核 内 , 核 内 DNA 占 整 个 


细胞 DNA 量 的 90 多 以 上 , 核 外 的 DNA 主要 有 线粒体 DNA 或 植物 叶绿体 DNA) 
和 质粒 DNA, RNA 主要 存在 于 细胞 浆 中 , 其 中 微粒 体 中 RNA 约 占 细胞 RNA 总 量 
50 色 , 细 胞 液 中 RNA 约 占 总 量 30 多 ,其 余 便 在 核 仁 , 线粒体 及 其 他 细胞 右 中 。 核酸 是 
两 性 化 合 物 , 有 一 定 等 电 点 , 能 与 金属 结合 成 盐 ,, 又 能 与 碱 性 物质 结合 形成 复合 物 。 在 核 


酸 大 分 子 中 , 由 于 磷酸 基 的 酸性 和 味 吟 \ 喀 啶 基 的 碱 性 比较 ,酸性 占 优势 , 故 其 水 溶 芒 呈 酸 


性 。 不 论 DNA 或 RNA 都 能 溶 于 水 ,而 不 咨 于 乙醇 等 有 机 溶剂 。 

DNA 和 RNA 在 细胞 中 常 与 蛋白 质 结合 存在 。 这 种 蛋白 质 -核酸 复合 物 是 细胞 结构 
的 组 成 部 份 之 一 。 根据 蛋白 质 与 核酸 结合 的 不 同 可 分 为 三 种 类 型 的 核 蛋白 : 〈1). BSS 
白 一 一 核酸 与 精 蛋 白 结合 而 成 ,最初 发 现 于 动物 精子 中 ; 〈2) 核 组 蛋白 一 一 核酸 与 组 蛋 
白 结合 而 成 , 常 存在 于 细胞 核 中 ; (3) -—RKRER FERRER, 核酸 结合 的 蛋白 


质 大 部 份 是 非 碱 性 蛋白 ,还 有 些 细胞 浆 中 的 核 蛋白 是 核酸 与 脂 蛋 白 结合 在 一 起 。 因 此 , 细 


胞 破碎 后 提取 分 离 核酸 ,首先 遇 到 的 问题 是 如 何 把 核 蛋 白 与 其 他 蛋白 质 分 开 , 然后 才 进 一 
步 把 核酸 和 蛋白 质 拆 离 。 故 最 早 提取 分 离 核 酸 方法 是 在 以 蛋白 质 提取 分 离 原理 为 基础 上 
进行 的 。 人 们 根据 DNA- 核 蛋白 和 了 NA- 核 蛋 白 溶解 度 的 研究 发 现 , 在 氧化 钠 浓 度 为 
0.14M 时 ,脱氧 核糖 核酸 蛋白 的 溶解 度 仅 为 水 中 的 1 /100, 当 氧 化 钠 浓度 增加 时 , 脱氧 核 
糖 核 蛋白 的 溶解 度 逐 渐 增 加 ,氧化 钠 浓度 增 至 1M 时 , 脱氧 核糖 核 蛋白 溶解 度 比 水 中 大 二 
倍 。 而 核糖 核 蛋白 在 0.14M 氧化 钠 浓 度 时 仍 有 相当 大 溶解 度 。 而 当 氧 化 钠 浓 度 增 大 时 , 
溶解 度 又 相对 减少 。 因此 早期 常用 0.14M 和 氧化 钠 提取 核糖 核 蛋 白 , 此 时 脱氧 核糖 核 蛋 


白 溶解 度 极 少 , 从 而 与 核糖 核 蛋 白 分 开 。 反 之 提取 脱氧 核糖 核 蛋白 时 , 则 用 IM 浓度 氧化 


钠 咨 液 。 由 于 各 类 核酸 在 细胞 内 分 布 不 同 ,有 时 可 事先 将 各 部 份 细胞 眉 分 开 , 然后 在 不 同 
细胞 器 提取 所 需 的 DNA-S AR RNA- 和 蛋白 ,再 进一步 把 核酸 与 蛋白 质 分 离 。 这 常 称 为 二 
步 法 。 近 年 来 ,由 于 分 子 生 物 学 的 发 展 , 核酸 制备 技术 突 飞 独 进 , 二 步 法 提取 核酸 由 于 操 
作 时 间 过 长 ,核酸 降解 比较 严重 , 现 多 采取 一 步 法 , 即 细胞 破碎 后 ,用 求 酚 一 步 提取 核酸 并 
同时 除去 蛋白 质 ,中 间 不 用 把 核 蛋 白 分 离 。 当 然 近年 来 核酸 提取 工作 最 大 的 进步 ,还 在 于 
克服 核酸 的 降解 作用 以 及 采取 了 比较 高 效 而 又 十 分 温和 的 方法 除去 所 结合 的 蛋白 质 。 因 
而 所 获得 的 核酸 分 子 较 大 ,活性 较 高 。 这 里 为 了 叙述 上 方便 和 系统 起 见 , 仍 按 核 蛋 白 及 核 
酸 的 提取 分 别 予 以 介绍 : 
(=) BRAKE 

LRABRRERWRR! 提取 完整 的 脱氧 核糖 核 蛋白 常用 方法 有 低 离 子 强度 
PAREN RREA REM, 对 于 细菌 的 脱氧 核糖 核 蛋 白 则 多 用 缓冲 液 提 取 。 低 离 
子 强度 溶 菩 提取 的 优点 是 避免 核 蛋 白 暴露 于 高 盐 浓 度 中 ,引起 蛋白 质 和 核酸 的 分 解 ,但 低 
离子 强度 盗 液 不 能 抑制 核酸 酶 的 作用 , 常 需 加 入 酶 的 抑制 剂 。 低 盐 盗 液 提 取 法 ,大 致 过 程 
如 下 : 


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组 织 与 0.1M NaCl 和 0.05M 柠檬 酸 钠 在 pH7 匀 浆 ,破碎 细胞 后 ,2000Xg 离心 。 
然后 用 蒸馏 水 洗涤 沉淀 三 次 (用 0.004M NaHCO, 调 pH 至 7 ), 除 去 电解 质 后 所 得 粘 笛 
沉淀 与 蒸馏 水 混合 摇动 提取 , 并 放置 过 夜 ,次 日 离心 后 , 取 上 请 液 , 用 0.14M NaCl 沉淀 即 
得 脱氧 核糖 核 蛋白 。 

高 盐 浓度 溶液 提取 法 则 在 第 一 步 0.14M NaCl 和 0.05M 柠檬 酸 钠 破碎 细胞 , 所 得 
沉淀 离心 后 ,沉淀 用 5 % AY NaCl 抽 提 ,, THEIR KA 0.15M 的 NaCl 浓度 , 使 脱氧 
核糖 核 蛋 白 沉 淀 。 

2. 核糖 核 蛋 白 的 提 权 ”核糖 核 蛋白 的 提取 最 常用 的 方法 是 以 0.14M 氧化 钠 抽 提 , 
此 时 核糖 核 蛋白 是 可 溶性 的 ,而 脱氧 核糖 核 蛋 白 留 于 细胞 固体 组 份 或 沉淀 中 。 离 心 后 ;上 
KA CRIA pH 至 4 一 5 之 间 , 核 糖 核 蛋 白 被 沉淀 下 来 , 即 得 包括 tRNA 蛋白 在 内 的 各 
种 核糖 核 蛋 白 沉 淀 。 此 外 ,提取 细胞 质 中 的 核糖 核 蛋白 及 植物 病毒 中 核糖 核 蛋 白 , 有 时 也 
采用 分 步 差 速 离心 法 和 硫酸 铵 分 步 盐 析 法 ,其 原理 与 操作 与 一 般 盐 析 法 及 离心 法 相同 。 

3.DNA 一 般 提 取 方 法 “从 DNA- 和 蛋白 中 提取 分 离 DNA, 是 解 离 DNA 与 蛋 自 
RAG. DNA 释 出 的 过 程 , 饱和 和 氧化 钠 溶 液 、 高 浓度 高 氯 酸 盐 、 氧 仿 \ 阴 离子 去 污 剂 、 
, 茶 酚 等 均 可 使 DNA 与 蛋白 质 解 离 。 饱和 和 氯 化 钠 法 由 于 提取 时 间 很 长 及 蛋白 质 帝 淀 不 
完全 , 实际 上 应 用 很 少 。 用 5M NaClo, 解 离 DNA- 蛋 白 , 然后 在 30% 蔗糖 中 超 离心 分 
离 DNA SSA RAR DNA 是 成 功 的 必 ]。 但 应 用 最 广泛 的 还 是 氯仿 法 、 
”去 污 剂 法 和 葵 酚 法 。 现 分 别 介绍 如 下 : 

CG) BBE: ”氯仿 法 提取 核酸 最 早 的 是 由 Sevag 等 人 于 1938 PREM, RH 
法 主要 过 程 如 下 : 

培养 18 小 时 的 Szwcpxococcxs。zp. 的 菌 体 悬 序 液 , 经 超声 波 破碎 细胞 后 , BD REA 
液 , 用 0.1V HCl 沉淀 上 清 液 中 的 核 蛋 白 , 再 离心 取 沉 淀 , 溶 于 水 中 ,调节 pH 7.0 离心 。 
Lim SAR 95% 乙醇 处 理 ,离心 除去 不 溶 物 。 加 入 0.1V HCl 至 核 蛋白 沉淀 , 再 离 
心 ; 沉 淀 以 95 多 乙醇 洗涤 二 次 , 后 将 沉淀 溶 于 水 中 , 调 pH 7.0 滤 除 不 溶 物 。 AAR 
0.5%Na;,CO;, F 50—55°C 水 浴 加 热 , 1 一 2 小时。 冷却 离心 取 上 清流 并 调 pH 7.0, 加 
人 0.25 体积 氯仿 和 0.1 体积 成 醇 , 振 荡 60 分 钟 。 离 心 后 ; 上层 为 水 层 ( 含 核酸 ), 下 层 为 蛋 
白质 胶 状 物 和 和 氯仿 层 。 

Sevag 的 氯仿 法 提取 的 核酸 ,含有 DNA 和 RNA 二 种 成 份 , 加 热 和 0.1V HCl 都 能 
使 核酸 产生 降解 现象 , 但 其 优点 是 除 蛋 白质 比较 完全 , 故 一 直 为 人 们 所 重视 。 1946 年 
Mecarty 和 Arery 对 此 法 进行 了 改良 9 , 主要 用 0.1M NaCl 和 0.1M 柠檬 酸 钠 和 去 氧 胆 
酸 钠 破 碎 细 菌 细胞 , 从 而 抑制 了 核酸 酶 活性 。 另外 还 加 入 RNase 消化 RNA, FA Ca** 
除 多 糖 ,使 氯仿 法 逐渐 趋 成 熟 。 以 后 又 经 多 人 改进 , 直 至 1961 年 ,Marmnur BATRA 
仿 法 提取 50 多 种 细菌 核酸 的 经 验 , 此 法 才 逐 渐 被 广泛 应 用 C0。 Marmnur 法 主要 步骤 包括 
用 含有 EDTA 溶液 洗涤 细菌 -一 > 用 十 二 烷 基 磺 酸 钠 和 溶菌 酶 破碎 细胞 一 > 加 入 过 氧 酸 
钠 至 1M 浓度 分 离 蛋 白质 和 核酸 一 > 以 等 体积 氯仿 一 戊 醇 振 荡 30 分 钟 一 > 吸取 水 层 加 
两 倍 体积 乙醇 沉淀 核酸 一 > 沉淀 再 溶 于 柠檬 酸 盐 溶液 中 ,反复 以 氯仿 一 戊 醇 振荡 提取 , 直 
至 除 净 蛋白 质 一 > 加 入 核糖 核酸 酶 消化 RNA 一 -> 最 后 在 含有 柠檬 酸 盐 和 EDTA 的 溶液 
Hh, 滴 加 0.54 体积 的 异 丙 醇 或 乙醇 以 沉淀 DNA。 目前 氯仿 法 除 应 用 于 细菌 DNA 提取 

外 ,植物 和 动物 组 织 也 常 应 用 此 法 。 当 然 许 多 具体 细节 上 已 有 了 改进 中 习 , 但 基本 原理 及 


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WEA marmur 报告 大 致 上 是 相同 的 。 

(2) 去 污 剂 法 : 去 污 剂 法 早 在 三 十 年 代 已 经 有 人 提出 ,但 直到 1951 年 以 前 此 法 并 无 
太 大 进展 。1952 , Key 等 人 对 此 法 作 了 详细 的 介绍 呈 , 才 逐 渐 被 人 们 所 重视 。 1957 年 
Zamenhof 报道 在 动物 组 织 中 制备 DNA 时 ,使 用 0.1M 柠檬 酸 钠 (或 0.1M EDTA) 3 
分 洗涤 组 织 及 破碎 细胞 ,然后 以 2M NaCl FH, 乙醇 沉淀 后 , 所 得 的 核 蛋白 在 标准 缓冲 
液 〈0.14M NacCl 十 0.01M 柠檬 酸 钠 ) 中 加 入 乙醇 -十 二 烷 基 磺 酸 钠 混 合流 ,搅拌 使 核 
BAW. FRAN DNA 和 和 蛋白 质 溶液 中 加 入 固体 NaCl, 使 最 终 浓 度 为 5 多 ,沉淀 
蛋白 质 及 去 污 剂 ,离心 后 的 上 请 液 , 再 以 乙醇 沉淀 DNA, 反 复 在 标准 缓冲 沪 中 以 去 污 剂 
去 蛋白 ,最 后 得 到 具有 活性 的 DNA 产品 , 以 上 方法 已 应 用 于 小 牛 胸腺 、 脾 脏 \ 鸡 的 红 睾 
球 等 材料 的 DNA 提取 分 离 2。 许 多 去 污 剂 都 具有 溶解 细胞 ,使 蛋白 质 和 核酸 解 离 ,抑制 
核酸 酶 的 活性 , 调节 各 类 核酸 在 酚 相 及 水 相 的 溶解 度 等 作用 。 常用 的 去 污 剂 有 十 二 烷 基 
磺 酸 钠 (SDS), 十 二 烷 基 硫酸 锂 (LDS). hi SAR, 4- 氮 基 水 杨 酸 ,三 异 丙 基 磺 酸 钠 , 蔡 - 
1 5 二 磺 酸 钠 , 二 甲苯 磺 酸 钠 等 。 实 际 上 , 目 前 单独 使 用 去 污 剂 法 提取 分 离 核酸 , 除 超 离 、 
心 法 外 [如 提取 叹 菌 体 (CG) DNA 一 一 以 5 匈 浓 度 SDS 一 0.1M EDTA 提取 ,于 CsCl 中 
超 离心 分 离 DNA]。 一 般 多 和 苯酚 法 、 氧 仿 法 或 其 他 方法 结合 使 用 。 如 用 苯酚 抽 提 核酸 
时 ,水 相 为 RNA 和 多 糖 ,DNA 和 和 蛋白 质 留 在 酚 层 或 两 相交 界 处 , 但 在 1 MSDS 或 6 % 
的 对 氨基 水 杨 酸 存在 下 ,可 将 DNA 和 RNA 同时 提 到 水 相 (0.1% 的 SDS 只 能 将 RNA 
提 到 水 相 )。 蔡 -1, 5 二 磺 酸 钠 与 酚 法 结合 使 用 时 , 可 将 tRNA、IRNA 提 到 水 相 , 而 把 
DNA 和 mRNA 留 在 酚 层 。 

(3) ARE: 苯酚 法 是 近年 来 较 流 行 的 一 种 提取 核酸 方法 。 早期 由 Westphal 等 人 
《19522) 用 酚 和 水 混合 液 处 理 细 菌 分 离 多 糖 时 ;发现 多 糖 和 核酸 留 于 水 相 , 而 蛋白 质 溶 于 栈 
相 。 1956 年 Kirby 用 此 法 提取 了 RNA20。 接 着 1957 年 ,Kirby 又 将 此 法 作 了 改进 2。 
BEE: 鼠 肝 与 6 多 对 氨基 水 杨 酸 做 成 匀 浆 , 然 后 用 90% 酚 水 混合 液 抽 提 , 使 DNA 与 


_RNA 同时 进入 水 相 , 再 用 2- 乙 氧 基 乙醇 沉淀 DNA, DNA 与 RNA 的 分 离 采 用 加 人 核 


糖 核酸 酶 降解 法 。 多 糖 的 除去 采用 在 浓 磷 酸 盐 存在 下 的 2- 甲 氧 基 乙 醇 抽 提 法 《多 糖 溶 
FPA, DNA 溶 于 上 面 有 机 相 )。 以 后 ,Kirby 又 对 酚 法 作 了 多 次 改进 2 ,为 酚 法 
提取 DNA 商定 了 基础 。 葵 酚 法 可 用 于 RNA 和 DNA 的 提取 ,由 于 其 盗 解 蛋白 质 能 力 
强 , 对 核酸 酶 具有 一 定 抑制 作用 , 并 可 以 不 经 分 离 核 蛋白 直接 从 细胞 匀 浆 中 提取 分 离 核 
酸 , 抽 提 后 留 在 水 相 残 余 的 酚 很 易 被 乙醚 洗涤 除去 , 以 及 所 获得 的 核酸 分 子 也 较 完 整 等 , 
故 在 核酸 提取 中 是 一 种 比较 受 人 欢迎 的 方法 。 

(4) DNA 提取 实例 : DNA :提取 分 离 方法 文献 资料 很 多 ,很 难 一 一 介绍 。 现 就 上 述 
几 类 主要 方法 , 现 举 例 说 明 如 下 : 

例 一 , 豆 胚 东 DNA 的 提取 分 离 2: 豆 胚芽 收集 后 , 用 蒸 馏 水 充分 洗 净 ,500 SOR 
轴 加 入 2 毫升 pH7.5 的 0.5M NaCl (内 含 0.1M EDTA) 再 加 入 40 毫克 链 丝 菌 蛋 白 酶 
及 5 克 莽 糖 。 研 磨 破 壁 , 匀 浆 溶 于 50 毫升 0.5M NaCl—0.1M EDTA 溶液 (内 含 5 毫升 
20%SDS) 中 , 37°C 保温 4 小 时 。 后 加 入 等 量 氧 仿 - 异 戊 醇 〈《40:1) 混合 液 振荡 30 分 钟 , 
10,000 转 /分 下 离心 10 分 钟 , 上 清 液 两 次 用 等 量 氧 仿 -苯酚 (1:1) 混 合 液 振荡 ,离心 取 上 面 
tho MASE CHILE DNA, FARR ARIAT 10 毫升 0.15M NaCl 一 0.015M 柠 
檬 酸 三 钠 溶 液 《PH 7.0) 中 ,同时 按 每 毫升 2 微克 及 0.006 微克 的 量 分 别 加 入 核糖 核酸 栈 


se。 39 6 


A AIRE TK Ti 核糖 核酸 酶 ,37%c 保温 60 分 钟 。 接着 用 50 微克 /毫升 的 链 丝 菌 蛋 白 酶 
37°C 处 理 二 小 时 。 此 混合 物 溶液 再 用 氯仿 一 苯酚 (1:1) 反 复 抽 提 , 除 去 RNA REAM, 
mA Cette DNA。 

例 二 ,短小 芽孢 杆菌 抗 药性 质粒 PCJ 3 YS) A": 37°C 振荡 培养 的 细菌 至 对 数 期 o 收 
集 菌 体 ,以 咨 菌 酶 及 SDS 先后 处 理 , 将 破 壁 裂解 后 的 粘 稠 物 加 入 5M NaCl 至 浓度 为 TM, 
以 沉淀 染色 体 DNA。 置 冰箱 过 夜 ,取出 于 0 一 3”C 离心 (47;000 一 20,000g) 一 小 时 , 取 填 
RMA 10wg/ml 核糖 核酸 酶 消除 RNA。 继 加 入 固体 聚 乙 二 醇 (MW 6,000) 210% 
浓度 (W/V) 沉淀 质粒 DNA, 0—-3°C 放置 20 小 时 以 上 , 离 心 〈600g) 2 分 钟 得 沉淀 
将 沉淀 悬浮 于 40%(NH,),SO,—0.05M Tris-HCl (pH 8.0) 一 0.05M NaCl—5mM EDTA 
中 , 离 心 (3500 转 / 分 ) 10 分 钟 除去 液 面 的 悬浮 物 及 聚 乙 二 醇和 下 面 的 蛋 白 质 沉 省 将 
溶液 以 50mM Tris—HCl (pH 7.5) 一 5mM EDTA—5mM NaCl 低温 透析 过 夜 。 BATIK 
用 酚 抽 提 三 次 后 再 用 氯仿 抽 提 三 次 。 最 后 以 50mM Tris—HCl(pH 7.5) 一 20mM NaCl— 
10mM MgCl, 透析 一 次 。 取 出 用 紫外 分 光 光 度 计 测 定 含量 后 置 4" 保 存 。 

所 得 的 质粒 DNA 经 电镜 观察 , 并 依 电镜 照片 用 图 形 数字 转换 器 测定 质粒 DNA 分 
子 的 长 度 , 除 以 放大 倍数 得 到 各 个 分 子 实际 长 度 , 然 后 从 平均 长 度 计 算出 -PCJ3 的 分 子 量 
4.33 X 10% 


LE] 本 文 质粒 分 离 的 主要 根据 下 列 文献 的 方法 略 加 修改 : 
(1) Guerry, D. J. et al.: J. Bacteriol. 116: 1064, 1973 
(2) Hympherys, G. O. et al.: Biochem. Biophys. Acta, 383: 457, 1975 
(3) Johnson, J. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm., 75: 13, 1977 


例 三 , 酵 母线 粒 体 DNA 的 提取 分 离 @0; 酵母 原生 质 体 在 0.15M NaCl—2.5% SDS 
(pH7.0) 中 60°C 保温 搅拌 一 小 时 ,溶解 后 加 入 氧化 钠 至 1M 浓度 ,在 冰 浴 中 过 夜 。 次 日 
离心 后 取 上 清 液 ,加 一 倍 体积 95 鸭 乙醇 沉淀 。 离心 分 离 , 沉 淀 再 溶解 于 1M NaCl 溶液 
中 ,如 此 反复 处 理 数 次 。 然 后 用 15%SDS 和 和 氯仿 处 理 去 除 蛋白 , 再 按 Bermardi 法 四 , 上 
AMIR (CHA 柱 ) 进行 吸附 , 洗 脱 后 可 得 两 个 峰 。 第 一 个 峰 为 核 DNA, SBME 
线粒体 DNA。 

4. RNA 的 一 般 提取 方法 ”RNA 的 提取 方法 一 般 有 酚 法 , 去 污 剂 法 和 盐酸 肛 法 
等 ,这 些 方法 都 可 以 用 来 提取 具有 生物 活性 的 核糖 核酸 。 此 外 ,工业 上 还 常用 稀 碱 法 和 浓 
盐 法 提取 酵母 RNAS, 用 稀 碱 法 和 浓 盐 法 所 提取 的 核酸 均 为 变性 的 RNA, 主 要 用 作 
制备 核 苷 酸 的 原料 ,其 工艺 比较 简单 。 稀 碱 法 使 用 1 多 氢 氧化 钠 使 酵母 细胞 裂解 ,使 核酸 
稀 放 出 来 。 然 后 用 盐酸 中 和 , RAK, 水 溶液 中 的 RNA 用 酸 调 pH 2.5, 即 沉淀 得 核 
糖 核酸 粗 品 。 浓 盐 法 是 在 10% 氯 化 钠 溶液 90%c 提取 3 一 4 小 时 ;然后 提取 液 经 离心 后 以 
乙醇 沉淀 RNA。 下 面 主要 介绍 提取 具有 生物 活性 RNA 的 几 种 方法 : 

C1) 盐酸 肌 法 中 FARRIS RNA 是 五 十 年 代 提 出 的 , 早期 由 于 各 实验 
使 用 盐酸 县 的 浓度 不 同 , 所 得 到 RNA 分 子 量 大 小 差别 较 大 , 后 来 证 明 4 M BMA 
可 以 使 蛋白 质变 性 而 与 核酸 分 离 , 而 且 还 有 效 地 抑制 了 核糖 核酸 酶 。 但 2 M 浓 度 的 盐酸 
县 则 不 能 很 好 地 抑制 RNase, 故 所 得 RNA 分 子 量 较 低 。 如 使 用 其 他 抑制 剂 配合 2 MER 
酸 且 提取 分 离 ,也 可 以 获得 较 高 分 子 量 的 RNA。 如 1959 年 Reichmann 和 Stace-Smith 总 
成 功 地 用 2.5M 盐酸 胀 加 0.005M EDTA 提取 了 土豆 病毒 中 具有 感染 性 的 RNAG0。 
盐酸 且 法 也 可 用 于 DNA 的 提取 ,如 Widnell 和 Tata 兽 用 6 M 盐酸 肛 提 取 大 鼠 细胞 核 


« 40 e 


中 DNA, 但 具体 例子 不 多 。 总 的 来 说 , 盐酸 县 是 提取 分 离 RNA 的 一 种 方法 , 但 不 如 酚 
法 和 去 污 剂 法 效果 好 , 故 应 用 不 广 。 

(2) EMH: 去 拍 剂 不 仅 广泛 应 用 于 DNA 的 提取 ,也 普遍 应 用 于 提取 各 种 RNA。 
其 中 使 用 最 多 的 是 十 二 烷 基 砚 酸 钠 (SDS), 使 用 浓度 范围 为 0.5 一 2 多 , 早 期 单独 使 用 此 法 
提取 动物 组 织 的 RNA 和 植物 病毒 的 RNA 取得 一 定 成 功 ,但 除去 蛋白 质 不 完全 。 近年 
来 多 与 酚 法 、 氧 仿 法 、 超 离心 法 结合 提取 不 同 材料 的 tRNA, rRNA, mRNA 获得 十 分 良 
好 的 效果 。 其 中 尤 以 去 污 剂 -苯酚 法 最 受 欢迎 ,其 例子 将 在 酚 法 中 介绍 。 这 里 简要 地 提 一 
提 Key 和 Dounce®? 以 及 Fraenkel-Conrat86 单独 使 用 去 污 剂 提 取 动 物 和 植物 病毒 RNA 
的 大 致 过 程 : 

从 动物 肝脏 中 提取 RNA 的 主要 过 程 如 下 : 动物 杀 死 后 ,尽快 将 组 织 在 冰 浴 中 冷却 , 
并 在 0.9% NaCl (内 合 0.01M 柠檬 酸 钠 ) Ailes HARI 离心 后 ,上 清 液 以 IN HCl 
调 pH4.5, 离心 取 沉淀 再 溶 于 0.9 罗 NaCl Ho MA 2 SSDS 溶液 去 蛋白 质 ,以 10 匈 NaOH 
调 pH 7.0 搅拌 3 小 时 。 后 加 入 NaCl 至 1M 浓度 抽 提 ,离心 后 取 上 清 液 ,用 2 倍 乙醇 沉 


证 RNA, Fi SDS 去 蛋白 可 反复 进行 ,直至 RNA 达到 所 需 纯度 。 


从 烟草 花 时 病毒 (TMV) 中 提取 RNA 的 主要 过 程 如 下 : 将 4 体积 1 “TMV CA 
@ 10“EDTA) 在 50%C 及 pH8.5 下 ,加 和 人 SDS 使 最 终 浓 度 为 1 多。 搅拌 5 分 钟 ,冷却 
后 ,以 33 多 饱和 度 硫酸 铵 沉淀 蛋白 质 ,离心 后 的 上 清 液 于 冰箱 中 过 夜 使 RNA 沉淀 ,第 二 
天 离心 后 ,再 将 沉淀 溶 于 水 中 ,加 入 几 滴 pH 5.0,3M BRAM, 并 以 二 倍 体积 乙醇 沉 
淀 RNA。 最 后 将 沉淀 溶 于 水 中 ,用 超 离 心 法 除去 病毒 及 凝集 物 , 即 得 RNA 水 溶液 。 

(3) ABE: .苯酚 法 用 于 提纯 RNA 先 于 DNA, 现 仍 是 分 离 提取 RNA 最 好 的 方 
法 , 此 法 可 以 单独 使 用 或 与 其 他 方法 结合 使 用 ,广泛 用 于 各 种 RNA 的 提取 。 根 据 其 使 
用 条 件 及 与 其 他 方法 结合 情况 可 分 为 冷 酚 法 \ 热 酚 法 , 皂 土 - 酚 法 \ 去 拍 剂 - 酚 法 等 ,其 中 热 
酚 法 多 用 于 植物 组 织 及 病毒 RNA 的 提取 , 主要 由 于 这 些 材料 细胞 壁 及 外 壳 比 较 坚 硬 , 脂 
质 较 多 ,必须 升 高 酚 的 提取 温度 ,才能 使 RNA 释放 出 来 。 皂 土 - 酚 法 和 去 拍 剂 - 酚 法 , 有 
利于 抑制 RNase 的 作用 及 解 离 蛋 白质 与 核酸 的 结合 ,使 蛋白 质变 性 而 除去 。 各 种 方法 的 
综合 使 用 是 目前 提取 核酸 最 常用 和 最 有 效 手 段 , 其 原理 通常 是 相互 取长补短 ,以 便 获 得 更 
纯 更 完整 的 核酸 分 子 ,满足 分 子 生物 学 对 核酸 分 子 结 构 和 功能 方面 研究 越 来 越 高 的 要 求 。 
由 于 RNA 酚 法 提取 的 应 用 十 分 广泛 ,资料 甚 多 ,下 面 简单 地 介绍 几 种 以 说 明 此 法 应 用 的 
大 致 过 程 : 

(4) 酚 法 提取 RNA 实例 

例 一 、 植 物 组 织 RNA 的 提取 分 离 中 :新 鲜 植 物 组 织 在 溶液 A (1 克 SDS 溶 于 100% 
Fr 0.1M Tris 缓冲 液 内 含 5 x 10°M EDTA 和 约 1 克 皂 土 并 调 pH 7.4) 中 。 加 砂 ( 酸 


` 处理 过 ) 研 磨 成 匀 浆 《不 同 组 织 有 时 须 变动 破碎 细胞 方法 )。 将 一 倍 体积 的 酚 先 预 热 60% , 
.再 倒 进 组 织 匀 浆 , 维 持 此 温度 3 分 钟 并 不 断 振荡 ( 某 些 难 提取 的 植物 组 织 需 提高 至 70%C 


并 延长 提取 时 间 )。 然 后 迅速 冷却 和 离心 , 使 悬浮 该 分 成 二 相 。 取 出 上 面 水 相 ,, BMA 
被 A 反 复 抽 提 酚 层 。 合 并 水 相 后 ,用 乙醚 洗涤 数 次 ,除去 水 相 残余 的 酚 。 然 后 以 二 倍 体积 
预 冷 的 95 92 乙醇 沉淀 RNA。 

例 二 \ 大肠 杆 菌 中 tRNA 的 提取 : tRNA 分 子 量 小 ,在 105,000g 离心 后 常 存在 于 上 
清流 中 而 与 微粒 体 的 核 蛋白 很 易 分 开 , 故 提取 方法 早 在 六 十 年 代 已 解决 , 现 已 能 十 分 简便 


w 41T。 


地 大 规模 制备 , 下 面 主 要 以 大 肠 杆菌 中 tRNA 的 提取 为 例 , 说 明 目 前 常用 酚 法 的 基本 过 
程 。 

”对 数 生 长 期 的 大 肠 杆菌 菌 体 -一 > 破 壁 酚 处 理 去 蛋白 质 , 水 相 以 乙醇 沉淀 RNA 并 除 
去 低 分 子 量 物质 和 酚 一 > 沉淀 用 1M NaCl 抽 提 使 tRNA 和 大 分 子 RNA 分 离 一 > 进 一 
步 提 纯 用 异 丙 醇 沉淀 或 上 DEAE- 纤 维 素 进行 吸附 分 离 a。 每 公斤 大 肠 杆 菌 细胞 可 得 
2~2.5 克 tRNA, 

例 三 、 大 鼠 肉 瘤 -180 腹水 细胞 肌 动 蛋白 mRNA 的 提取 分 离 22: “收集 感染 6 一 8 天 . 
后 的 大 鼠 肉 瘤 -180 腹水 细胞 ,在 完全 培养 液 中 培育 工 小 时 后 ,用 Tritonx-100 在 低 离 子 强 
度 下 破碎 细胞 ,并 以 镁 盐 沉淀 法 从 原生 质 体 中 分 离 得 聚 核糖 体 %。 聚 核糖 体 悬 序 于 50mM | 
KCI,lmM MgCl 和 50mM Tris-HCl (pH 7.6) 缓冲 液 中 , 于 液 氮 或 一 85%C 处 存放 后 , 
按 Brawerman 法 品 在 碱 性 pH 下 用 酚 提 取 分 离 RNA, EHH 0.1M Tris-HCl (pH 
9.0) 抽 提 。 合 并 水 相 , 再 用 酚 一 氯仿 一 异 戊 醇 〈1:1:0.1) 反复 抽 提 ,使 二 相 界 面 无 蛋 自 质 
为 止 , 取 出 水 相 加 NaCl 至 0.1M 及 2.5 倍 体积 的 乙醇 ,4%C 过 夜 。 次 日 离心 收集 议 淀 , 
以 66% 乙醇 及 0.1M NaCl 洗涤 。 用 乙醚 除 乙 醇 , 再 溶 于 水 中 ,吹风 除 乙 栈 , 所 得 的 聚 核 
atk RNA 存放 于 —20C 下 , 待 进一步 分 离 mRNA, 

将 上 面 所 得 聚 核糖 体 RNA #1 digo (dT)-F## AES HEA CMA 500mM NaCl, 
5mM MgCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.6 和 0.1%SDS), Mit 30 分 钟 后 离心 。 并 用 上 述 组 
冲 波 洗涤 二 次 , 每 次 离心 后 的 上 清 液 合并 。 用 0.1M NaCl 和 2.5 FCB Poly(A)” 
RNA。 然 后 用 水 连续 地 洗 下 被 digo (dT) 所 吸附 的 Poly (A)+RNA, 收 集 后 用 上 述 乙 醇 
一 盐 帝 淀 。 

Poly(A)-RNA 的 进一步 纯化 , 可 以 用 3—30% 蔗糖 密度 梯度 离心 (介质 中 含 10mM 
NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.1% SDS), {#}H Sw-27 Spinco 转子 , 4 23,500 4/4 
下 离心 17 小 时 ,Poly (A)-RNA 在 18S 处 被 纯化 。 

例 四 、T 感染 的 大 肠 杆菌 中 RNA 的 提取 %: 

T, 感染 的 细胞 4 毫升 按 Hagon 和 Young 法 加 入 0.5 毫升 SDS HRAMR (AG 
0.5M Tris,pH6.8 0.02M EDTA, 10% SDS) 在 沸水 中 加 热 2 分钟, 破碎 细胞 。 然后 在 
提取 液 中 加 入 醋酸 钠 《pH 5.2) 至 最 后 浓度 0.2M, 接 着 用 酚 和 和 氧 仿 混合 溶剂 抽 提 , 离 忌 
后 取 上 层 水 相 , 以 乙醇 沉淀 。 离 心 后 收集 沉淀 再 溶 于 Tris-Mg** (4X 0.01M,pH 7.0) 
缓冲 液 中 ,加 入 DNase 〈 用 前 经 碘 代 乙酸 盐 处 理 ) 至 最 后 浓度 为 每 毫升 10 微克 o 在 37% 
保温 半 小 时 , 加 入 醋酸 钠 至 0.2M, 再 用 氯仿 抽 提 除去 DNase, 上层 水 相 用 乙醇 沉淀 
RNA, 

(5) 其 他 提取 具有 生物 活性 RNA 方法 : 除 上 述 几 种 外 ,还 有 热处理 法 , 曾 用 于 制备 
具有 感染 性 的 TMV-RNAOC。 氟 碳化 合 物 法 , 曾 用 于 制备 某 些 肿瘤 细胞 中 的 RNA“, A 
目前 应 用 不 广 , 这 里 就 不 再 详细 举例 说 明 。 

核酸 的 提取 分 离 、 纯 化 ,其 技术 方法 进展 极 快 ,日 新 月 异 ,不 胜 枚 举 。 仅 就 提取 或 盗 剂 
分 离 方法 来 说 ,近年 来 发 展 特点 主要 有 如 下 几 方 面 : 

第 一 \ 分 离 提取 方法 更 趋 简便 快速 。 例如 1978 年 Dirnoboin 和 Doly 介绍 一 种 快速 
碱 抽 提 法 分 离 质粒 DNA,, 一 天 之 内 可 提取 100 多 个 质粒 样品 ,只 要 一 个 人 操作 。 方 法 十 
分 简单 ,将 培养 的 大 肠 杆菌 用 溶菌 酶 破 壁 后 ,以 SDS-NaOH 处 理 菌 液 使 pH 达 12 一 12.5, 


es 42 。 


此 时 染色 体 DNA 变性 而 质粒 DNA 不 变性 , 再 用 高 浓度 酸性 醋酸 钾 一 酷 酸 中 和 菌 液 , 
已 变性 染色 体 DNA、 大 分 子 RNA 和 和 蛋白质-SDS 复合 物 均 沉淀 下 来 ,离心 后 上 清 液 用 
无 水 乙醇 沉淀 即 可 获得 纯度 很 高 质粒 DNA, 有 少量 RNA 可 用 RNase 除去 。 又 如 分 离 
We Gk DNA 时 ,在 离心 管 底层 放置 5M NaClO,, 上 层 小 心 铺盖 30% FEE HEIMAB 
碎 菌 体 。 由 于 30% 蔗糖 层 只 让 喉 菌 体 通过 到 达 管 底 , 遇 到 5M NaClo, 后 ,噬菌体 内 DNA 
即 释放 出 来 , 再 经 低速 离心 除去 一 些 杂 质 碎 片 , 所 得 DNA 失 活 少 且 产 率 很 高 。 此 法 只 
BAS DIES. LSPA A MRA DNA 提取 出 来 。 

第 二 、 提 取 高 活性 大 分 子 核酸 时 , 条 件 要求 更 加 温和 , 实验 设计 更 加 合理 。 在 操作 上 
强调 温和 ,对 提取 大 分 子 核酸 CEE DNA) 也 是 近年 来 技术 改革 一 个 方向 。 例 如 , 为 
了 如 免 切 力作 用 , 尽 量 不 用 吸管 和 滴 管 或 改 用 大 口 吸管 ; 改 用 缓冲 液 而 不 用 酸 碱 进 行 中 
和 ;破碎 细胞 时 要 求 低 温 、 短 时 ,使 用 高 剂量 溶菌 酶 等 等 ,都 直接 关系 到 所 提取 的 大 分 子 核 
酸 的 活性 大 小 。 在 使 用 各 种 溶剂 提取 核酸 时 , 条 件 也 越 来 越 具 体 细致 , 包括 各 种 缓冲 液 、 
变性 剂 , 去 污 剂 和 核酸 酶 的 抑制 剂 如 何 搭配 , 谁 先 加 谁 后 加 均 极 讲究 。 以 其 中 酚 试 剂 提取 
核酸 为 例 , 不 同 pH A. 不 同 缓冲 液 或 试剂 饱和 酚 以 及 不 同 摇 荡 次 数 , 对 各 种 核酸 的 提取 
其 效果 差别 很 大 ,如 0.1%SDS- 酚 提取 ,只 能 将 RNA 提 到 水 相 ,1%SDS- 酚 提取 时 ,可 将 
DNA, RNA 同时 提 到 水 相 ;中 性 酚 无 法 将 含有 多 聚 A 的 mRNA 提 到 水 相 , 但 pH .8.5 以 
上 或 加 入 少量 氯仿 的 酚 , 即 可 把 mRNA 提 到 水 相 ; 用 Tris-HCl 饱和 酚 提取 细菌 质粒 
DNA,, 剧 烈 振 摇 20 次 以 上 和 轻 轻 的 上 下 把 试管 颠倒 三 次 , 被 提取 的 内 含 物 差别 很 大 , 前 
者 包括 染色 体 DNA、 质 粒 DNA, RNA 和 和 蛋白质 全 部 被 提出 ,后 者 只 有 质粒 DNA A> 
量 小 分 子 内 含 物 被 提取 。 

最 后 ,分 离 提取 阶段 防止 核酸 酶 〈 主 要 是 RNase) 的 作用 仍 是 一 个 棘手 问题 。 由 于 
RNase 很 难 失 活 , 使 制备 完整 的 RNA 分 子 遇 到 很 大 困难 ,如 提取 大 分 子 rRNA 和 mRNA, 
常常 未 纯化 就 被 RNase 降解 。 使 用 过 的 抑制 剂 如 ;SDS、 皂 土 、 肝 素 、 精 胺 、 核 昔 - 钒 复合 
物 、 蛋 白 酶 K, Macaloid (一 种 复合 硅 酸 盐 ) 和 二 乙 基 焦 碳 酸 (DEP) 等 , 均 未 能 完全 抑 
制 RNase 的 活力 。 新 的 更 有 效 的 方法 还 不 断 研 究 中 。 

以 上 主要 指 核酸 的 提取 方法 而 言 , 至 于 核酸 提取 后 的 纯化 包括 沉淀 法 、 超 离心 法 、 各 
种 色谱 法 \ 电 泳 法 、 免 疫 法 和 分 子 杂 交 法 等 ,其 种 类 之 多 、 内 容 之 广 , 要 讨论 其 发 展 方向 及 
每 一 方法 具体 内 容 , 已 超出 本 书 篇 幅 范 围 , 读 者 可 参阅 有 关 核 酸 研 究 文献 。 但 核酸 一 一 作 
为 生化 物质 中 的 一 大 类 ,此 处 从 历史 到 现状 把 不 同类 型 的 核酸 提取 方法 作 一 简单 介绍 ,并 
列举 一 些 例 子 , 其 目的 是 使 读者 了 解 一 些 主 要 核酸 提取 方法 原理 ,并 不 意味 着 这 些 例 子 是 
最 新 的 和 完满 的 方法 。 当 然 其 中 不 少 是 很 有 价值 的 现在 仍 有 普遍 应 用 的 意义 。 

5. 核酸 提 权 时 注意 事项 及 提取 后 进一步 纯化 .这 里 主要 指 提取 具有 生物 活性 的 核 
酸 〈 包 括 DNA 和 RNA) 都 必须 注意 如 下 几 个 问题 

(1) 选用 的 材料 必须 要 新 鲜 , 材 料 的 预 处 理 不 要 时 间 太 长 。 

(2) 整个 提取 分 离 过 程 , 除 注 明 在 某 一 温度 下 进行 外 , 一 般 均 维持 0 一 4sC 中 进行 操 
作 。 但 不 同 材料 和 不 同方 法 对 温度 要 求 的 严格 程度 也 不 等 。 

(3) pH 要 适当 , 除 特别 注 明 在 某 步 又 需 要 比较 高 或 低 的 pH 值 外 , 一 般 在 中 性 附近 
进行 。 

(4) 避免 强烈 的 理化 因素 作用 。 如 局 部 过 酸 过 碱 \. 过 热 , 以 及 强烈 机 械 切 力 ,, 及 剧烈 


ea 43 。 


搅拌 等 。 特 别 对 大 分 子 量 的 DNA 或 mRNA 等 的 提取 尤 须 注意 。 

(5) 防止 核酸 酶 的 作用 ,是 十 分 重要 的 问题 , 从 材料 预 处 理 , 细 胞 破碎 直至 提取 分 离 
纯 均 注意 抑制 核酸 酶 的 作用 。 

核酸 提取 后 的 纯化 工作 ;由 于 各 类 核酸 性 质 的 不 同 ,牵涉 的 讨论 面 比较 广 。 除 和 核酸 
相 结合 的 蛋白 质 和 性 质 相 似 的 多 糖 的 分 离 方法 大 致 相同 外 , 不 同 种 类 及 不 同 大 小 的 核酸 
的 分 离 仍 是 一 个 十 分 复杂 的 问题 ,如 闭合 环 状 DNA Omit DNA) 与 染色 体 DNA 的 分 
离 , 主要 根据 二 者 变性 的 难 易 。 采取 CsCl-EB 〈 非 啶 误 红 一 一 种 核酸 染料 ) 密度 梯度 
离心 法 、 硝 酸 纤维 膜 吸 附 法 或 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 、 聚 乙 二 醇 一 葡萄 糖 二 相 分 配 法 而 分 离 。 
mRNA 与 其 他 RNA 的 分 离 主要 根据 真 核 细胞 中 mRNA 末端 常 含 PolyA 顺序 ,利用 这 一 
特点 ,而 采取 Oligo(dT) 纤 维 素 或 PolyU- 琼 脂 糖 特异 性 吸附 mRNA 与 其 他 RNA 分 子 分 离 , 
这 是 一 个 十 分 简便 和 有 效 方法 。 但 末端 没有 PolyA 顺序 的 许多 原核 细胞 mRNA 的 纯化 , 
则 不 能 采取 上 述 方法 ,只 能 用 一 般 比 较 繁 琐 的 分 子 杂 交 方 法 。tRNA 由 于 分 子 量 较 涉 , 与 
其 他 大 分 子 DNA、RNA 的 分 离 ,方法 则 比较 简单 ,如 用 20% 甲 氧 甲 酚 (Cresol), 0.54 体积 
的 异 丙 醇 ,1M NaCl 或 43 多 AME RRA AeA DNA 及 RNA, 上 清 液 中 回收 
tRNA。 除了 以 上 所 述 一 些 特殊 方法 外 , 许多 带 有 共性 的 核酸 纯化 方法 如 梯度 超 离 心 法 , 
分 子 杂 交 法 , 柱 层 析 法 , 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 法 等 。 均 可 根据 不 同 对 象 采 取 不 同 条 件 进行 实 
验 。 以 上 共性 分 离 纯化 方法 ,在 Cantoni 和 Grossman 等 人 所 编著 的 核酸 研究 方法 手册 中 
已 有 详尽 的 介绍 ,读者 有 兴趣 时 ,请 参阅 [45,46]。 


三 、 脂 类 化 合 物 的 提取 分 离 


用 热 乙 醇 或 乙醚 抽 提 生物 组 织 可 得 到 油状 物 , 它 包括 脂肪 、 蜡 \ 磷 脂 、 糖 脂 、 因 醇 及 它 
们 的 水 解 产物 (如 高 级 脂肪 酸 ), 这 些 物 质 虽 结构 功能 不 同 , 但 都 属于 油脂 类 化 合 物 , 都 能 
溶 于 脂 溶性 溶剂 中 。 脂 类 化 合 物 可 分 为 中 性 脂肪 和 类 脂 二 大 类 。 中 性 脂肪 的 比重 都 小 于 
1.0,, 不 与 水 相 混 溶 ,但 都 溶 于 乙醚 、 氧 仿 \ 丙 酮 \ 茶 、 二 硫化 碳 、 热 酒精 及 其 他 脂肪 溶剂 中 。 
类 脂 主 要 有 磷脂 \ 脑 苷 脂 \` 固 醇 及 蜡 等 磷脂 也 是 一 种 甘油 脂 , 但 不 同 于 中 性 脂 , 主 要 是 甘油 
上 的 三 个 羟基 其 中 有 一 个 不 是 与 脂肪 酸 结合 ,而 是 与 磷酸 胆 碱 等 相连 ,不同 的 磷脂 具有 不 
同 的 溶解 性 质 , 如 脑 磷脂 不 溶 于 丙酮 而 溶 于 氧 仿 及 乙醚 , 卵 磷 脂 不 盗 于 冷 乙 醇 而 溶 于 热 乙 
醇 , 神 经 磷脂 则 不 溶 于 乙醚 。 这 些 溶解 性 质 的 差别 常 作为 提取 分 离 磷 脂 类 化 合 物 的 依据 。 
固 醇 类 化 合 物 都 不 咨 于 水 \ 仅 在 水 中 溶 胀 或 形成 乳胶 状 物 ), 而 溶 于 有 机 溶剂 。 固 醇 类 化 
合 物 中 因 无 脂 链 的 存在 , 故 在 碱 性 条 件 下 不 能 发 生 皂 化 反应 ,可 用 皂 化 法 使 固 醇 与 脂肪 分 
开 , 又 因 固 醇 类 化 合 物 都 比较 容易 结晶 , 故 从 生物 材料 中 提取 制备 并 不 十 分 困难 。 

油脂 化 合 物 的 提取 分 离 方法 党 有 下 面 几 种 : 

1. 机 械 压榨 法 ”主要 通过 各 种 压榨 机 在 10 一 100 公斤 /厘米 * 的 压力 下 , 将 流动 性 
较 大 的 油 从 材料 破碎 的 细胞 中 挤 压 出 来 , 这 种 纯 属 于 物理 的 方法 常用 于 一 些 油 料 作物 种 
子 的 制 油 ,如 人 花生油, 棉 子 油 的 生产 等 。 

2. 水 代 法 “这 是 我 国 劳动 人 民 几 千年 前 制造 的 一 种 简便 取 油 法 , 其 原理 是 以 水 代 
油 。 因 油料 细胞 中 蛋白 质 亲 水 性 强 , 而 油 的 下 水 性 强 , 在 热 的 条 件 下 加 入 大 量 的 水 ,剧烈 
搅拌 ,水 进入 细胞 与 蛋白 质 结合 而 将 油 顶 替 出 来 。 此 法 设备 简便 , 成 本 低廉 , 生产 安全 而 


es 44 e 


出 铀 率 高 。 驰 名 中 外 的 小 磨 麻 油 就 是 用 此 法 提取 的 。 

3. 皂 化 法 ”甘油 酯 易 与 碱 (如 氢 氧 化 钾 或 氢 氧 化 钠 ) 作 用 而 水 解 生 成 能 溶 于 水 的 脂 
肪 酸 钠 或 钾 ( 即 肥皂 ) 和 甘油 ,此 过 程 称 为 皂 化 。 皂 化 波 再 经 酸化 处 理 , 即 分 离 析出 高 级 脂 
肪 酸 。 不 被 皂 化 部 份 如 固 醇 等 通过 皂 化 反应 后 与 甘油 酯 分 开 , 再 进一步 用 有 机 溶剂 提取 
纯化 。 

4 有 机 溶剂 蔗 芭 法 ”是 实验 室 常用 的 一 种 比较 精细 的 分 离 方法 , 它 主要 根据 不 同 
油脂 化 合 物 , 在 不 同 溶 剂 和 不 同 条 件 下 溶解 性 质 的 差别 而 进行 分 离 。 有 机 溶剂 萃取 的 实 
验 仪器 及 操作 方法 都 比较 简单 , 在 各 种 有 机 化 学 实验 指导 中 都 有 描述 , 这 里 不 再 作 介绍 , 
而 各 种 脂 类 化 合 物 的 溶剂 系统 分 离 法 可 参考 图 2-347, 2-449, 2-3 是 一 般 生物 材料 
” 在 不 同 溶剂 中 系统 分 离 ; 图 2-4 是 一 种 抗 酸 菌 的 菌 体内 不 同 脂 类 化 合 物 在 不 同 溶剂 的 系 
统 分 离 情 况 。 


总 抽 提 液 
| 诚 压 浓缩 
氯仿 一 甲醇 (2:1 一 1:2) 


BAB Rie HY HEE) 
| 少量 氧 仿 及 10 倍 容积 的 两 本 


si 


Tit PRAT Hs 20 0) CA ASD, HDR, cP EAD, ASA b I) 
| SROs 10 倍 容积 的 乙 酝 
HCO 


沉淀 prs tee -全 乙醚 可 溶 部 份 ( 卵 磷脂 , 脑 磷脂 , 其 他 甘油 脂 类 ) 


So ie pe 


VAIL EZ BERS He 34 
沉淀 (白色 ) 

| sateen 
放置 (fo 过 夜 ) 
同 以 上 用 吡啶 溶解 并 抽 提 3 一 4 次 吡啶 可 溶 部 份 糖 脂 类 ) 


沉淀 (神经 磷脂 类 ) 
Al2-3 脂 类 化 合 物 有 机 溶剂 系统 提取 分 离 示意 图 


四 、 其 他 脂 溶性 生化 物质 的 提取 分 离 


除开 面 所 说 的 脂 类 化 合 物 外 , 生物 体内 还 有 许多 非 脂 类 物质 , 它们 不 深 或 难 溶 于 水 , 
而 易 溶 于 有 机 溶剂 。 如 植物 组 织 中 的 不 含 酚 羟基 的 醒 类 ,内 酯 类 、\ 皂 起 类 和 大 部 份 生物 碱 
都 属于 脂 溶性 物质 。 常 用 氯仿 、 乙 醚 、 热 乙醇 \ 甲 醇 \ 甲 茶 ` 乙 酸 乙 脂 等 有 机 溶剂 分 别提 取 。 


e 45 6 


抗 酸 菌 菌 体 
ZB: CBC: 1) 


可 溶 部 份 Bie 
浓缩 后 , | 氯仿 抽 提 


KE 可 溶 部 份 不 深部 份 
加 少量 氧 仿 后 乙醇 一 乙醚 一 
2 从 丙酮 沉淀 I%HCI fhe 


ARE bY BaD hy 
《磷脂 类 ) Gai A) 


图 2-4 , 抗 酸 菌 菌 体 脂 质 的 系统 分 离 示意 图 
fe 5, 
| 80% 甲醇 浸 提 过 小 
Bee (GEE) 甲醇 滤液 
| 减少 浓缩 至 水 相 ,过 沁 。 


水 相 Beles (FFA) 
| pH8.6 (IN NaOH) Z.ASZ.BSERR 


| 


乙酸 乙 酯 相 水 相 


pH2.8 (INHCD 
乙酸 乙 脂 萃取 


至 水 相 , pH 2.8, 
乙酸 乙 脂 萃取 


| 乙酸 乙 脂 相 水 相 
aC1) (#4) 


pH 5.5, 用 水 饱和 
IE T BEEK 


乙酸 乙 脂 相 
含 GD 


ren se 
含 (I) ( 茎 去 ) 
图 2-5 植物 样品 几 种 植物 激素 的 提取 分 离 示意 图 
图 中 (1) 含 IAA、ABA、GA,(ID SHAK, CID 含 细胞 分 裂 素 
由 于 这 些 化 合 物种 类 繁多 ,本 章 只 能 扼要 地 提 及 ,详细 介绍 他 们 的 分 离 方法 请 参阅 有 关 植 
物 成 份 化 学 的 专著 。 


此 外 , 许 多 植物 激素 如 呵 唆 乙酸 CAA), ABR (GA), Pie (ABA) 及 细胞 分 , 


有 裂 素 等 ,这 些 物质 均 具 有 极 高 的 生理 活性 ,对 植物 的 生长 、 开 花 、 结 实 等 均 有 明显 的 影响 , 
在 农业 生产 上 应 用 较 广 ,这 些 物 质 , 其 分 子 都 具有 非 极 性 基 团 ,可 党 于 甲醇、 乙醇 及 乙醚 等 


.46。 


> ogi ae. ne 


G2. ee 


有 机 溶剂 中 。 但 分 子 中 也 有 某 些 极 性 基 团 , 因此 又 可 溶 于 一 定 pPHMKARH. 根据 它 
们 的 溶解 度 的 共性 , 一 般 先 用 五 倍 于 材料 的 80% 甲醇 提取 后 , 再 通过 改变 pH 条 件 及 改 
用 不 同 溶剂 抽 提 使 各 组 份 分 开 。 其 系统 分 离 见 图 2-552。 

以 上 几 种 植物 激素 提取 初步 分 离 后 ,进一步 纯化 时 , 和 常用 离子 交换 树脂 柱 色 谱 ( 包 括 
使 用 强酸 性 树脂 Dowex 50 或 强 碱 性 树脂 Amberlite IRA-400) 或 用 DEAE 纤维 素 分 离 。 


五 、 糖 ` 毛 基 酸 及 其 他 水 咨 性 生化 物质 的 提取 分 离 


游离 单 糖 及 小 分 子 寡 糖 易 溶 于 水 , 材料 破碎 以 后 , 用 水 或 在 中 性 条 件 下 以 50% 稀 乙 

矢 进 行 搅 拌 提取 , 提取 液 以 醋酸 铅 除去 蛋白 质 及 其 他 杂质 , 铅 离子 可 通过 HzS 而 除去 。 然 

后 浓缩 至 干 , 再 用 沸 甲 醇 或 热 乙 醇 抽 提 , 冷 却 后 单 糖 便 结晶 析出 。 单 糖 或 小 分 子 寡 糖 也 可 
在 提取 后 ,用 吸附 柱 色谱 或 离子 交换 法 而 纯化 。 

.大 分 子 的 多 聚 糖 或 杂 多 聚 糖 情况 则 比较 复杂 , 应 依照 不 同 种 类 的 多 糖 的 具体 溶解 性 


质 而 决定 提取 方法 。 如 昆布 多 糖 , 果 聚 糖 、 糖 原 、 易 深 于 水 。 壳 多 糖 纤维 素 溶 于 浓 酸 。 直 


链 淀 粉 易 溶 于 黎 碱 。 许 多 具有 医药 价值 的 酸性 粘 多 糖 常 含 有 所 基 己 糖 \ 己 糖 醛 酸 ,以 及 硫 
酸 等 多 种 成 份 * 其 结构 种 类 复杂 ,并 常 与 蛋白 质 结 合 在 一 起 ,提取 分 离 时 , 先 用 蛋 自 酶 破坏 
蛋白 质 与 糖 的 结合 后 ,再 将 水 提取 让 减 压 浓 缩 , 以 乙醇 或 十 六 烷 基 三 甲 基 首 化 匀 涡 淀 酸性 
粘 多 糖 ,最 后 用 离子 交换 树脂 柱 色 谱 进 一 步 纯 化 。Danishefsky 和 Bell 等 曾 用 不 同 浓度 的 
稀 氧 化 钠 , 从 人 的 肚脐 带 提 取 了 几 种 含有 透明 质 酸 和 软骨 素 的 酸性 粘 多 糖 思 。 其 方法 如 


A 2-65 


SA 经 DowexI 分 离 所 得 SAA, SAB, SAD 三 个 组 份 均 含 有 葡萄 糖 胺 、 糖 醛 酸 ,但 所 


含 硫酸 基 及 和 蛋白质 差别 较 大 。SB、SC 所 含 葡 萄 糖 胺 较 微量 ,其 中 SB 含 半 乳 糖 胺 及 硫酸 


ERS. P-l, P-I 部 份 也 以 半 乳 糖 胺 为 主要 氮 基 已 糖 组 份 。 
500 SAA O.2%NaCl 在 0 一 5%C 匀 浆 5 分 钟 并 用 0.296NaCl 提取 (5%C) 一 天 
离心 


Lisi Bait 
| 如 十 六 烷 基 氧化 吡啶 至 196 ike | GREK ERIS 18% 乙醇 沉 这 


| 


bak 沉淀 沉淀 上 清流 
| 0.4M NaCl 提取 (PD | 35% 乙醇 沉淀 
BR te FHP 沉淀 上 清 液 
| 1.2M (SA) (P-I1) 
NaCl 提取 1.6% 
ie 
2.1M 
NaCl 提取 29 
BoB Hite ie 
(SC) 
0.04 远 


2-6_ 从 人 肚脐 带 提 取 几 种 酸性 粘 多 糖 图 解 


ea 47 。 


肝素 也 是 一 类 酸性 粘 多 糖 , 水 解 后 生成 葡萄 糖 醛 、 氨 基 葡 萄 糖 及 硫酸 ,临床 上 用 于 各 
种 血栓 栓塞 。 肝 素 易 溶 于 水 ,不 溶 于 乙醇 ,丙酮 等 有 机 溶剂 ,在 水 溶液 中 带 强 负电 和 荷 , 故 用 
水 提取 后 ,能 用 各 种 阴离子 交换 树脂 吸着 ,目前 国内 制备 方法 多 用 离子 交换 树脂 分 离 或 在 
酸性 条 件 下 以 省 化 十 五 烷 吡啶 《简写 为 PPB) 选择 性 沉淀 而 获得 纯 品 。 

此 外 , 某 些 水 溶性 的 小 分 子 物 质 如 氨基 酸 、 核 彰 酸 及 其 衍生 物 , 大 部 份 都 溶 于 水 ,不 溶 
于 乙醇 \ 乙 醚 等 有 机 溶剂 , 当 材 料 经 破碎 后 ,用 水 或 一 定 pH 范围 的 水 溶液 提取 后 , 滤 去 残 
瘟 即 可 用 离子 交换 树脂 进行 分 离 , 最 后 以 乙醇 或 调整 pH 至 等 电 点 沉淀 。 如 需要 较 纯 产 
品 , 可 通过 反复 结晶 方法 而 获得 。 


六 、 植 物 次 生物 质 的 提取 及 溶剂 系统 分 离 的 选择 2 


植物 次 生物 质 种 类 繁多 , 包括 各 种 生物 碱 \ 帖 类 `\ 苷 类 、` 黄 酮 类 和 有 机 酸 等 , 其 中 大 部 


分 在 工业 上 医学 上 有 着 广泛 用 途 。 如 挥发 油 , 蜡 \ 油 潜 、 橡 胶 、 县 质 等 都 是 一 些 重要 工业 原 
料 , 这 些 物 质 的 工业 提炼 方法 不 属 本 书 讨论 范围 。 但 其 中 某 些 对 人 类 或 动物 具有 极 强生 
理 作 用 的 药物 , 它 们 的 提取 分 离 纯 化 方法 和 其 他 生化 物质 的 提取 分 离 纯化 方法 有 着 许多 
共同 之 处 。 这 里 主要 根据 广州 医药 工业 研究 所 丘 晨 波 经 验 总 结 作 一 简要 介绍 : 


作为 药 用 的 植物 次 生 代谢 产物 ,不 论 干 或 鲜 的 材料 BHAT ER 


” 取 二 部 分 。 醇 提 部 分 ,使 用 最 多 的 溶剂 是 甲醇 ,有 时 也 用 60% 或 95% 乙醇 代替 。 如 样品 
中 含 挥 发 油 较 多 , 并 着 重 研 究 这 些 成 份 , 可 用 石油 醚 提取 。 各 类 药 用 成 份 提取 选用 的 深 
剂 , 主 要 依据 被 提取 物 的 极 性 大 小 而 定 , 欲 作 系统 分 离 , 其 溶剂 选择 可 参考 表 2-5, 由 于 植 
物 药 用 成 份 种 类 繁多 ,系统 分 离 时 很 难 一 次 完成 。 先 粗 分 后 细 分 , 多 次 完成 。 如 仅 研究 其 
某 一 成 份 ,如 生物 碱 可 选择 氧 仿 为 主要 溶剂 进行 抽 提 控制 不 同 pH, plate it li 
药 用 植物 成 份 的 分 离 系统 , 丘 晨 波 提出 了 如 下 模式 《图 2-7)。 


表 2-5 植物 药 用 成 份 及 其 适用 的 提取 溶剂 


BEAN a bw Kk H® KX ® 适用 提取 溶剂 “| 提取 溶剂 介 电 常数 
亲 脂 性 最 强 Ai EH BMA 石 ith 醚 1.80 
( 极 性 小 ) SHE RIT Ze We 1.87 
亲 脂 性 强 SHRI RSD) Ea eS | 乙 本 4.3 
起 类 2 仿 5.2 
中 等 极 性 (小 ) 某 些 起 类 (如 强 心 起 ) 氯仿 :乙醇 (2:1) 一 
(中 ) Heo ns RR) 乙酸 乙 脂 6.1 
HAM Kh BERS) ET # 19 
亲 水 性 强 极 性 大 的 不 类 \ 糖 类 和 氨基 酸 等 A 两 21 
a 8 26 
A 31 
亲 水 性 最 强 蛋白 质 ,粘液 质 , 果 胶 、 本 四 


《 极 性 大 ) aE ABS 


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药 用 植物 材料 

| RFE (9096。6096 各 浸 二 次 ) 
醇 提 浓 缩 液 

| 热 水 浸 ,搅拌 悬浮 , 石油 醚 (或 茶 ) 抽 提 五 次 


水 层 (及 悬浮 物 ) 石油 醚 层 
| ike: 
KERB) | 
LECIRAG:CB=211) AGERLRED 
揪 提 五 次 CHEE NEB BY) 
KE 


正 丁 醇 ( 水 饱和 ) 脂 层 
GLEE CIN? CA =231) CEH NEY) 
本 
| aera ETM RCLELE-~ZO)E 
gag | 水 洗 \ 减 压 浓缩 
( 极 性 中 大 部 份 ) 


图 2-7 植物 成 份 分 离 系统 简 图 


BS oer sk 


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第 三 章 Te Rm ee 
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第 一 节 5| £ 


沉淀 是 溶液 中 的 溶质 由 液 相 变 成 固 相 析出 的 过 程 。 在 生物 化 学 、 有 机 化 学 和 无 机 化 
学 制备 工艺 中 ,沉淀 都 是 一 种 最 常用 的 方法 。 在 制备 过 程 中 采取 沉淀 的 手段 ,主要 是 为 了 
通过 沉淀 达到 浓缩 的 目的 ,或 者 通过 沉淀 固 液 分 相 后 ,除去 留 在 液 相 (如 果 目 的 物 是 固 相 ) 
或 沉积 在 固体 中 (目的 物 留 在 液 相 ) 的 非 必要 成 份 ;其 次 ,沉淀 可 以 将 已 纯化 的 产品 由 被 态 
变 成 固态 加 以 保存 或 进一步 处 理 。 沉淀 方法 用 于 分 离 纯化 是 有 选择 性 的 , 即 有 选择 地 沉 
证 杂质 或 有 选择 地 沉淀 所 需 成 份 。 对 于 生物 活性 物质 的 沉淀 ,情况 更 为 复杂 ,不 仅 在 于 沉 
淀 作用 能 否 发 生 , 还 要 注意 所 用 沉淀 剂 或 沉淀 的 条 件 对 生物 活性 物质 结构 是 否 有 破坏 作 
A, 沉淀 剂 是 否 容易 除去 ; 用 于 食品 医药 的 沉淀 剂 还 应 考虑 对 人 体 是否 有 害 等 。 在 生化 
制备 中 常 有 下 列 几 种 沉淀 方法 和 沉淀 剂 : 

1. 盐 析 法 。 多 用 于 各 种 蛋白 质 和 酶 的 分 离 纯化 。 

2 有 机 溶剂 沉淀 法 。 多 用 于 生物 小 分 子 、 多 糖 及 核酸 类 产品 的 分 离 纯 化 ,有 时 也 用 于 
蛋白 质 沉 淀 。 

3. 等 电 点 沉淀 法 。 用 于 氨基 酸 、 蛋 白质 及 其 他 两 性 物质 的 沉淀 , 但 此 法 单独 应 用 较 
少 , 多 与 其 他 方法 结合 使 用 。 

4. 非 离子 多 聚 体 沉淀 法 。 最 近 使 用 于 分 离 生物 大 分 子 的 例子 很 多 , 是 发 展 很 快 的 一 
种 方法 。 

5. 生成 盐 复合 物 沉淀 。 用 于 多 种 化 合 物 , 特 别 是 一 些小 分 子 物 质 的 沉淀 。 

6. 热 变性 及 酸 碱 变性 沉淀 法 。 这 一 类 方法 也 常 称 为 选择 性 变性 沉 注 。 在 分 离 制备 
中 , 常 有 选择 地 用 于 除去 某 些 不 耐 热 及 在 一 定 pH 值 下 易 变 性 的 杂 有 蛋白。 但 应 以 在 实验 
条 件 下 所 分 离 物质 的 活性 不 受 影响 为 前 提 。 

72. 其他。 除 以 上 所 述 沉淀 方法 外 ,只 对 某 一 种 或 某 一 类 物质 产生 沉淀 的 沉淀 方法 及 
沉淀 剂 。 

下 面 介绍 几 种 主要 沉 汪 方法 的 原理 , 操作 及 应 用 实例 : 


第 二 节 盐 析 法 


一 、 基 本 原理 


一 般 地 说 , 所 有 固体 溶质 都 可 以 在 溶 牙 中 加 入 中 性 盐 而 沉淀 析出 , 这 一 过 程 称 为 th 
析 。 在 生化 制备 中 ,许多 物质 都 可 以 用 盐 析 法 进行 沉淀 分 离 , 如 蛋白 质 ` 多 肽 ,多糖 、\ 核 酸 


o Sik 


等 。 20 一 40 多 饱和 度 的 硫酸 贸 可 以 使 许多 病毒 沉淀 , 使 用 43% 饱和 度 的 硫酸 铵 也 可 以 
使 DNA 和 rRNA 沉淀 ,而 tRNA 保留 在 上 请 液 中 。 但 盐 析 法 应 用 最 广 的 还 是 在 蛋白 
” 质 领 域内 。 用 盐 析 法 分 离 提纯 蛋白 质 已 有 八 十 多 年 的 历史 ,特别 是 粗 提 纯 阶段 , 盐 析 法 是 、 
一 种 十 分 常用 的 纯化 手段 。 当 然 在 生化 制备 技术 高 度 发 展 的 今天 , 盐 析 法 由 于 共 帝 作用 , 
不 是 一 个 高 分 辩 的 方法 ,但 和 其 他 方法 交替 使 用 , 盐 析 法 仍 具 有 许多 罕 出 的 优点 : 

1. 成 本 低 , 不 需要 什么 特别 昂贵 的 设备 。 

2. 操作 简单 ,安全 。 

3. 对 许多 生物 活性 物质 具有 稳定 作用 。 

关于 盐 析 原 理 , 现 以 蛋白 质 为 例 讨 论 如 下 吓 : 

Se A ea TP EIT, 在 低 盐 浓度 下 发 生 盐 溶 。 盐 咨 现象 在 第 二 章 中 已 作 
过 介绍 ,主要 是 中 性 盐 离 子 对 蛋白 质 分 子 表 面 极 性 基 团 及 水 活 度 的 影响 ,增加 了 蛋白质 分 
子 与 咨 剂 分 子 相互 作用 力 , 从 而 使 蛋白 质 的 溶解 度 增 大 。 但 中 性 盐 的 浓度 渐 增 至 一 定 程 
度 时 ,水 分 子 在 中 性 盐 的 作用 下 活 度 大 大 减少 , 蛋白 质 表 面 电荷 大 量 被 中 和 , 最 后 破坏 了 
蛋白 质 分子 外 表 的 水 化 膜 , EM ERA SZ ASE MTT TE 蛋白 质 盐 析 时 与 盗 液 中 
中 性 盐 的 离子 强度 有 如 下 定量 关系 : 

Leg = Ks I (3-1) 


这 里 $ 是 指 在 离子 强度 为 | 时 蛋白 质 的 溶解 度 , S esa (GII= 0) 时 蛋 自 质 
的 溶解 度 。Ks 是 一 个 常数 ,也 称 盐 析 常 数 。 离 子 强度 I 决定 于 下 式 : 


pe = Bn sabe (3-2) 


im?’ EMAAT ERNE, Rim HERP SHAT RO TRKE, zNSHs 
子 的 价 数 , 3-1 式 中 当 溶 剂 的 温度 为 一 定时 , So 对 于 某 一 溶质 也 是 一 个 常数 , 即 


LogS) = Bb; 
所 以 3-1 去 可 以 改写 为 : 
LogS = 6 — Ks +I : (3-3) 


8 值 的 大 小 取决 于 溶质 的 性 质 , 不 可 能 直接 测定 , 是 假定 盗 解 度 在 I= 一 0 时 ,用 外 推 
法 求 出 。 HKG 值 带 有 经 验 性 性 质 。 

盐 析 常数 Ks 值 , 主要 决定 于 加 入 盐 的 性 质 ,Ks 大 小 与 各 种 离子 价 数 成 正比 , 与 离子 
半径 及 溶液 的 介 电 常数 成 正比 。 而 离子 价 数 对 Ks 影响 比较 主要 。 由 于 蛋白 质 表 面 有 很 
多 亲 水 基 团 ,是 一 个 偶 极 离子 , 它 需 要 较 高 的 工 值 才 能 从 咨 液 中 析出 ,所 以 蛋白 质 的 .Ks 党 
数 很 高 , 常 比 一 般 小 分 子 高 出 10 一 20 fF. Ks 和 和 蛋白质 性 质 关 系 不 大 , 但 受到 溶液 的 p 瑟 
(AMES Ze 3-1 WA SLR AWA HR 

在 表 中 可 以 看 出 多 价 阴 离子 如 硫酸 根 和 磷酸 根 有 很 高 Ks, 但 高 价 阳 离子 如 镁 (或 钙 ) 
的 存在 反而 降低 Ks 值 。 表 中 还 可 以 看 到 ,蛋白 质 性 质 对 Ks 值 也 有 一 定 影 响 《 虽 然 不 是 主 
要 的 ), 如 在 一 种 盐 浓度 中 ,大 而 不 规则 分 子 如 纤维 素 原 , Ks 最 大 ,p8- 乳 球 蛋白 Ks 最 小 , 
但 目前 还 设 有 适当 理论 详细 说 明 盗 质 的 分 子 性 质 与 Ks 的 关系 。 

等 式 3-3 中 的 8 是 溶质 的 特征 常数 ,对 于 蛋白 质 来 说 , & 值 大 小 主要 决定 于 不 同 蛋 白 
质 的 性 质 。 

关于 蛋白 质 的 盐 析 条 件 的 研究 ,四 十 年 代 至 六 十 年 代 已 做 了 大 量 工 作 。Czok 和 Bucher 


« 52 e¢ 


一 
“aga 


83-1 一 些 蛋 白质 的 盐 析 常数 ”” 


Dixon 和 Webb 对 利用 盐 析 方 法 进行 蛋 折 质 分 离 纯化 作 了 系统 总 结 "%, 并 在 等 式 3-3 基 


> 础 上 将 盐 析 方法 分 为 两 类 : 


(1) 在 一 定 的 pt 和 温度 下 改变 离子 强度 ( 盐 浓 度 ) 叫 Ks 分 段 盐 析 法 。 

(2) 在 一 定 离子 强度 下 改变 pH 和 温度 叫 “pP 分 航 盐 析 法 。 

Czok 和 Bucher 认为 第 一 组 适 于 早期 粗 抽 提 液 的 分 步 分 离 , 而 第 二 组 则 适 于 后 期 进 
卫 步 分 离 纯 化 和 结晶 时 使 用 。Czok 和 Bucher 应 用 “Kg” 分 段 盐 析 法 曾 成 功 地 从 肌肉 抽 


` 提 液 中 分 离 了 多 种 酶 。 Jakoby 发 现 蛋 白质 在 硫酸 铵 溶液 中 的 溶解 度 随 着 温度 升 高 而 降 


低 , 从 而 提出 了 在 0°C FAR MRR REAR RA REE BIA. Rate SETA 
晶 。 此 法 曾 成 功 地 分 离 了 许多 酶 。《〈 详 细 介绍 见 本 书 结晶 一 章 )。 
下 面 ,我 们 以 蛋白 质 为 主要 对 象 讨 论 应 用 盐 析 法 的 几 个 问题 。 


二 、 影 响 盐 析 的 若干 因素 


《一 ) 蛋白 质 的 浓度 与 盐 析 的 关系 


“利用 盐 析 方法 分 步 分 离 蛋 白质 各 组 份 和 溶液 中 蛋白 质 实际 浓度 有 很 大 关系 。 例 如 一 
种 蛋白 质 在 溶液 中 的 浓度 为 CG, 加 入 中 性 盐 , 浓 度 直至 离子 强度 等 于 工时 , 蛋白 质 开 始 沉 
淀 并 从 溶液 中 析出 。 些 时 等 式 3-3 TSK: 

LogC, = 8 — KA (3-4) 
这 里 的 工 是 蛋白 质 开 始 沉淀 时 的 离子 强度 。 但 如 果 这 种 蛋白 质 在 溶液 中 含量 较 低 
《 设 其 浓度 为 C), 则 需要 加 入 较 多 的 中 性 盐 , 蛋 白质 才 开始 沉淀 。( 设 此 时 离子 强度 为 了 ) 
应 写作 : 
LogC, = 8 — KsI, (3-5) 
3-4 式 减 3-5 式 得 : 
Log a Kale) (3-6) 


Dixon 和 Webb JH iiMe 2 ill ERIM ALS A, (Carboxymyoglobin) 4 RENAE AR 
HEA 30 S2/F+ >, RRMA 58% 时 开始 出 现 沉淀 。 而 羧基 肌 红 蛋白 的 浓度 为 3 克 / 
天 ;加 至 58 多 TAMER RAS HITE. HBF) 66% 饱和 度 时 才 开 始 产生 沉淀 。 但 在 
较 浓 的 蛋白 质 溶 液 中 (30 克 / 升 ) 当 硫酸 贸 达 到 66% 饱和 度 时 已 有 90 和 蛋白 质 度 沉 淀 析 
出 < 根据 上 述 实 验 结 果 ,Dixon 等 计算 出 C = 10C, 时 , 应 增加 大 约 7% HY AR RAE 


¢ 53 2 


A AT ATER EE (Ca) 的 蛋白 质 沉 淀 下 来 

所 以 在 不 同 浓度 的 蛋 白 质 溶液 中 进行 盐 析 , 使 用 硫酸 贸 的 饱和 度 范 围 是 不 同 的 。 高 
浓度 蛋白 质 溶液 可 以 市 约 盐 的 用 量 , 但 许多 蛋白 质 由 于 “86” 和 “Ks” 常数 十 分 相近 ,, AS 
_ 百 质 浓度 太 高 , 会 发 生 严重 的 共 沉 作用 。 但 在 低 浓 度 蛋 白质 溶液 中 盐 析 , 所 用 的 盐 量 较 
多 ,而 共 沉 作用 比较 少 , 因 此 需要 在 二 者 之 间 进 行 适 当选 择 。 用 于 分 步 分 离 提纯 时 ,宁可 选 
择 稀 一 些 的 蛋白 质 溶 小, 多 加 一 点 中 性 盐 , 使 共 帝 作用 减 至 最 低 限 度 , 当 然 浓 度 不 能 太 稀 , 
一 般 认 为 2.5 多 一 3.0 多 的 蛋白 质 浓度 比较 适中 ,如 果 蛋 白质 浓度 太 稀 , 消 耗 大 量 的 中 性 盐 , 
对 和 蛋 日 质 的 回收 也 有 一 定 的 影响 。 


(=) 离子 强度 和 离子 类 型 对 盐 析 的 影响 


上 面 介绍 过 ,在 低 离子 强度 下 , 许多 蛋白 质 比 在 纯 水 中 的 溶解 度 大 大 增加 , 但 当 溶液 
中 离子 强度 不 断 增加 时 ,各 离子 之 间 及 离子 与 溶质 分 子 之 间 相 互 竞争 水 分 子 结 果 导 致 深 
质 的 溶解 度 渐渐 减少 ,产生 盐 析 现 象 。 一 般 来 说 离子 强度 越 大 ,蛋白 质 的 溶解 度 越 低 。 但 
蛋白 质 的 盐 析 现象 比 一 般 有 机 分 子 复杂 一 些 , 蛋白 质 分 子 大 ,而 且 有 许多 表面 电荷 ,这 些 
a ’ 表面 所 带电 荷 常 随 着 周围 离子 和 溶剂 分 子 排 

列 秩序 的 影响 而 不 断 变化 着 , 蛋 白质 分 子 内 


3 
4 
还 有 许多 相互 作用 的 基 团 , 这 都 造成 了 许多 
经 典 理论 不 能 十 分 完美 地 解释 蛋白 质 盐 析 的 
4 6 


0.5 


原因 。 

几 种 蛋白 质 在 不 同 离子 强度 下 的 盐 析 效 
应 见 图 3-195, 从 图 中 可 以 看 出 , 当 硫 酸 较 饱 
和 度 达 到 20 多 时 , 纤维 蛋白 原 首先 析出 , 饱 
$ 1 “和 度 增 至 28 一 33 儿 时 ,血红 蛋白 析出 饱和 
图 3-1 几 种 蛋白 质 析出 时 所 需 硫 酸 铵 的 离子 的 强度 BRS Ap 72? @ Ble iss Lil le 
SEAR, 2—heea, 3—peee, 2S? 以 上 , 清 蛋 白 析出 * 饱和 度 最 后 达 

4 一 一 血清 清 蛋白 。 5 一 一 肌 红 蛋白 到 80 多 时 , 肌 红 蛋白 析出 。 可 见 不 同 蛋白 质 

发 生 盐 析 时 所 需求 的 离子 强度 是 不 同 的 。 所 以 用 不 同 离子 强度 分 步 盐 析 的 方法 , 就 可 以 
分 离 混合 物 中 各 种 组 份 。 在 进行 分 离 的 时 候 , 一 般 从 低 离子 强度 到 高 离子 强度 , 顺 次 进 
行 。 每 一 组 份 被 盐 析 出 来 后 ,经 过 固 - 液 分 离 (冰冻 离心 或 过 滤 ), 再 在 溶液 中 逐渐 提高 中 
性 盐 的 饱和 度 , 使 另 一 种 蛋白 质 组 份 盐 析 出 来 。 离子 强度 的 大 小 对 蛋白 质 的 深 解 度 起 着 
决定 性 的 影响 。 但 在 同样 的 离子 强度 下 ,离子 种 类 的 不 同 对 蛋白 质 溶解 度 的 影响 也 不 同 。 
图 3-2 所 示 是 七 种 不 同 电解 质 下 ,一氧化碳 血 红 蛋 白 溶解 度 曲线 四。 图 中 不 同 离子 种 类 对 
蛋白 质 溶解 度 的 影响 ,可 以 从 Hofmeister 系列 理论 中 获得 解释 : 即 离子 半径 小 而 很 高 电 
荷 的 离子 在 盐 析 方面 影响 较 强 ,离子 半径 大 而 低 电 荷 的 离子 的 影响 较 弱 。 单 价 盐 如 KCl, 
NaCl 的 盐 析 效果 一 般 比 较 差 。 图 3-3 表示 不 同 盐 类 对 同一 蛋白 质 的 盐 析 效应 具有 不 同 
的 “Ks” 值 四 ,Ks 值 可 由 各 种 盐 的 盐 析 曲线 的 斜率 表示 。 它们 的 减少 顺序 是 :磷酸 钾 之 硫 
酸 钠 之 硫酸 铵 > 柠檬 酸 钠 之 硫酸 镁 。 按 照 Hofoneister 系列 , 镁 离子 比 贸 离 子 小 ,但 实际 
上 硫酸 匀 的 盐 析 效 应 比 硫酸 镁 好 , 主 要 是 镁 离子 在 高 离子 强度 下 产生 了 一 层 颇 大 的 离子 
雾 ,从 而 减少 了 它 的 盐 析 效 应 。 


es。 54 。 


溶解 度 〈 克 / 升 ) 的 对 数 


离子 强度 (I) 


“ 
> 


‘logS 


~" gp K,SO 
4(NH)SO, ~*~ 


离子 强度 


logS 


A 3-3 25°C pH6.6 时 一 氧化 碳 血红 蛋白 在 不 同 电解 质 中 的 盐 析 效 应 
@ Na:SO, 口 (NH,):SO,, & MgSO, A 柠檬 酸 三 钠 , O KH,PO, + K,HPO, 


(=) pH 对 盐 析 的 影响 


一 般 地 说 ,蛋白 质 所 带 净 电 荷 越 多 , 它 的 溶解 度 越 大 ; 如 果 所 带 的 电荷 减少 至 接近 于 
零 时 溶解 度 最 少 , 我 们 称 此 时 的 pH 值 为 该 蛋白 质 的 等 电 点 (PD. 改变 pH 或 特异 地 加 
人 与 蛋白 质 极 性 基 团结 合 的 离子 ( 叫 反 离 子 ) 即 可 改变 蛋白 质 的 带电 性 质 ,也 就 是 改变 了 
蛋白 质 的 溶解 度 。 图 3-4 是 在 不 同 pH 的 浓 磷 酸 盐 缓 冲 流下 血红 蛋白 《Haemoglobin) 的 
REE”. 从 图 中 曲线 可 见 , 蛋 白质 在 不 同 的 ,pH 下 有 着 不 同 的 溶解 度 , 远离 等 电 点 
处 蛋白 质 的 溶解 度 最 大 , 等 电 点 处 溶解 度 最 小 。 因此 在 盐 析 时 常 选择 溶液 pH 值 在 该 蛋 
白质 等 电 点 附近 。 但 必须 注意 在 水 中 或 稀 盐 溶液 中 测 得 的 蛋白 质 等 电 点 与 高 盐 浓度 下 所 
测 的 结果 是 不 同 的 。 需 根 据 实际 情况 调整 pH 值 至 蛋白 质 溶解 度 最 低 处 , 才 能 使 盐 析 获 
得 更 好 效果 。 


4 


logS 
logS 


(b) 
图 3-4 不 同 pH PF ERRRAM KH MAS Ae ie ee 
(Ab 是 由 图 a 所 衍生 的 ) 


《四 ) 温度 对 盐 析 的 影响 


温度 是 影响 溶解 度 的 重要 因素 , 对 于 许多 无 机 盐 和 小 分 子 的 有 机 化 合 物 , 温度 升 高 , 
溶解 度 也 相应 增 大 。 但 对 于 蛋白 质 \ 酶 \ 多 肽 等 生物 大 
分 子 在 高 离子 强度 溶液 中 ,温度 的 升 高 ?它们 的 溶解 度 
有 时 不 但 不 升 高 , 反而 减少 。 许多 蛋白 质 在 高 离子 强 


2.0 ee 
离子 强度 


3-5 不 同 温度 下 \ 血 红 蛋 白 在 浓 磷 酸 
缓冲 液 中 的 溶解 度 


COHb 0° 


“= O,Hb 0° 
9 COHb 25° 
oS 


BE YEW A 25°C 时 的 溶解 度 比 4°C 时 溶解 度 明 显 地 减 
少 。 如 图 3-5 PRA 但 必须 指出 这 种 温度 升 高 溶解 
度 的 下 降 现 象 只 有 在 高 离子 强度 下 才能 发 生 。 在 低 离 


子 强度 或 纯 水 中 , 和 蛋白 质 溶解 度 大 多 数 在 一 定 范围 内 | 


是 随 着 温度 增加 而 增加 的 。 

在 一 般 情 况 下 ,蛋白 质 的 盐 析 温 度 要 求 不 严格 ,可 
以 在 室温 下 进行 ,只 有 某 些 对 温度 比较 敏感 的 酶 ,要 求 
在 低温 0 一 4"C 下 操作 ,以 避免 活力 的 丧失 。 


三 、 一 般 营 用 的 中 性 盐 盐 析 方 法 


一 一 从 


一 般 常 用 的 中 性 盐 有 硫酸 铵 硫酸 钠 、 硫 酸 镁 、 磷 酸 钠 、 磷 酸 钾 、 氯 化 钠 、 氯 化 钾 、 酷 酸 
钠 和 硫 氰 化 钾 等 ,其 中 用 于 蛋白 质 盐 析 的 以 硫酸 铵 、 硫 酸 钠 最 广泛 。 在 表 3-1 中 虽然 磷酸 
盐 的 盐 析 效 果 强 于 硫酸 铵 ,但 后 者 的 溶解 度 比较 大 (在 0°C 时 饱和 度 为 5.35M ,在 25°C 时 
为 5.82M) 而 且 受 温度 影响 较 少 。 关 于 不 同 温度 下 硫酸 冬 在 饱和 水 溶液 的 性 质 详 苑 表 3-20 

由 于 有 上 述 的 优点 在 蛋白 质 盐 析 时 , 硫 酸 饼 乃 是 最 受 欢 迎 的 盐 类 。 但 硫酸 铵 也 有 不 
足 的 地 方 , 如 缓冲 能 力 比 较 弱 ,此 外 , 因 含 有 氮 原 子 , 对 蛋白 质 的 分 析 会 带 来 一 定 影响 。 硫 
酸 钠 也 较 常 用 于 蛋 日 质 的 盐 析 , 它 的 优点 是 不 含 氮 , 不 影响 蛋白 质 的 定量 测定 。 缺 点 是 在 
30°C 以 下 溶解 度 太 低 。 在 30S LL ERE RAR WERE TREN, CS at 


a. 3G. 


表 3-2 不 同 温度 下 硫酸 铵 在 亿 和 水 溶液 的 性 质 ”” 


on arid 
aon” 


摩尔 /1000 克 水 
"35/1000 sk 
重量 % 
a 
” 克 /1000 毫升 溶液 
摩尔 /1000 毫升 溶液 
克 /1000 毫升 水 


也 用 于 有 蛋 白 质 的 盐 析 。 但 由 于 溶解 度 低 ,, 易 与 其 它 金 属 产生 沉淀 , 或 因 酸 性 过 强 , 都 不 如 
硫酸 铵 应 用 那样 广泛 。 


(—) 硫酸 铵 盐 析 法 


1. 硫酸 铵 使 用 前 的 预 处 理 一般 生化 工业 制备 用 的 硫酸 铵 。 选择 三 级 纯度 即 可 , 
但 对 于 实验 定 沉淀 蛋白 质 或 酶 用 的 硫酸 铵 , 常 需要 纯度 较 高 或 进行 重 结晶 后 才能 使 用 。 
硫酸 铵 中 含有 少量 重金 属 离子 对 蛋白 质 的 往 基 十 分 敏感 ,使 用 时 必须 用 HS 进行 处 理 。 处 
PAE EON MMA KB. AeA HS 至 饱和 ,放置 过 夜 , 用 滤纸 过 滤 除 去 重金 
属 离子 后 ,滤液 在 瓷 蒸发 茵 中 浓缩 结晶 , 在 100sc 下 烘 干 后 即 可 使 用 包 , 另 高 浓度 的 硫酸 
BIR -REBH 〈pH 5.0 左右 ), 使 用 前 也 需要 用 氨水 或 硫酸 调 至 所 需 pH 值 。 

2. 硫酸 铵 的 饱和 度 及 调整 法 “ 盐 析 时 硫酸 铵 的 浓度 常用 饱和 度 表 示 , 达 到 饱和 状 
ASIN AU TARR AIEE (P) 4 100%, 当 盐 析 要 求 不 同 的 硫酸 铵 饱和 度 时 可 用 下 面 三 种 
方法 调整 : 

CQ) MAM AGE: 这 当 盐 析 要 求 饱和 度 较 高 而 又 不 增 大 溶液 的 体积 时 ,多 用 此 法 。 
操作 时 先 将 硫酸 铵 磨 碎 成 均匀 细 粒 , 在 搅拌 下 缓慢 分 批 加 入 。 各 种 不 同 的 饱和 度 应 加 和 人 
硫酸 贸 的 量 可 以 从 表 3-3, 3-4 中 查 得 。 

(2) 加 入 饱和 溶液 法 : 饱和 硫酸 铵 的 配制 ,一 般 方法 是 取 过 量 硫酸 铵 加 热 溶 解 ,再 在 
0C 或 室温 放置 ,直至 固体 硫酸 铵 析出 为 度 。 

实例 : 取 800 一 850 克 化 学 纯度 的 硫酸 铵 加 人 蒸馏 水 至 总 体积 为 1 升 , MZ 50°C, 
保温 10 分 钟 , 待 大 部 分 固体 溶解 后 , 趁 热 滩 去 不 溶 物 , 放置 过 夜 ,第 二 天 如 有 少量 硫酸 匀 
晶体 析出 , 即 达 100% 的 饱和 度 。 

盐 析 时 要 求 的 饱和 度 所 需 加 入 饱和 硫酸 铵 溶液 的 体积 计算 如 下 式 : 

V=V(S = S,)/C1 一 $2) 

V = ze ia U0 A Ta Pt REA KA AO 

Vo = 原来 待 盐 析 溶液 的 体积 。 

Si 一 原来 溶液 的 硫酸 铵 饱和 度 。 

3 = 所 需 达 到 的 硫酸 铵 的 饱和 度 。 


se 57 。 


加 入 饱和 溶液 法 适 于 要 求 硫酸 铵 饱和 度 不 高 , 而 且 原 来 溶液 体积 不 大 时 使 用 。 二 种 : 
不 同 浓度 的 硫酸 铵 溶液 混合 时 ,体积 的 变化 的 计算 误差 在 2 多 左右 ,在 一 般 实 验 工作 及 工 
业 生 产 上 影响 是 不 大 的 。 但 如 加 入 饱和 溶 液 后 体积 增加 甚大 , 选用 固体 加 入 法 较 好 。 饱 
和 硫酸 铵 溶液 加 入 法, 操作 时 也 需 注 意 少 量 分 批 在 搅拌 下 缓慢 地 倾 人 人 。 以 免 造 成 局 部 过 
浓 , 影 响 分 离 的 效果 。 


表 3-3 室温 25;C 硫酸 铵 水 溶液 由 原来 的 饱和 度 达到 所 需要 的 饱和 度 时 , 
每 升 硫酸 铵 水 溶液 应 加 入 固体 硫酸 按 的 克 数 ? 


EZR HOM hee OH WM mM E (%) 


tea Hh TS F SF 


C&) 


在 25°C F Wee Beis i Ha RL BIR EN SH IT A RY 

(3) 透析 平衡 法 : 先 将 待 盐 析 的 样品 装 于 透析 袋 内 , 然 后 诅 和 人 饱和 硫酸 镑 溶液 中 进 
行 透 析 , 外 部 的 硫酸 铵 由 于 扩散 作用 不 断 通过 半 透 膜 进 入 透析 袋 内 ,逐步 达到 所 需要 的 盐 
析 饱 和 度 , 蛋 白质 便 产 生 沉 演 , 此 时 即 停止 透析 。 透 析 法 的 优点 是 硫酸 铵 浓度 变化 有 连续 
性 , 盐 析 效果 较 好 ,但 透析 法 计算 饱和 度 的 测定 工作 手续 烦琐 。 除了 结晶 时 多 使 用 外 ;一 
般 盐 析 沉 淀 比较 少 用 。 


3. 使 用 硫酸 铵 进行 盐 析 必 需 注意 的 几 个 问题 

C1) 加 固体 硫酸 铵 时 ,必须 看 清楚 表 上 所 规定 的 温度 ,一 般 有 0° 或 室温 (20 "一 25% ) 
两 种 ,加 入 固体 盐 后 体积 的 变化 已 考虑 在 表 中 。 例 如 在 室温 时 S 一 0, 要 求 达 到 $ XH 100% 
ME, SHARMA AREA 767 克 。 MES: 4 50% 饱和 度 时 应 加 313 克 而 不 是 
767/2 一 383.5 克 。 


«58 。 


表 3-4 OC FHS, 提高 到 S, 时 每 100 迹 升 加 固体 硫酸 铵 的 克 数 


在 0°C 时 所 达到 的 硫酸 铵 饱和 度 (9?2) 
20 | 25 | 30 | 35 | 40] 45] 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 | 95 | 100 


在 100 SR Fk MAK HR EH we KR 


2}45 «2/49 . 3/53. 6158. 1162.7 


一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 一 


液 1|42.0|46.0l50.3|54.7|59.2 

9|38.7|42.7|46.9|51.2|55.7 

的 7|35.5|39.5|43.6|47.8|52 .2 

5/32 .2136.2/40.2144.5/48.8 

原 Tee o ee De 

4/29 . 1132.9/36.9141.0/45.3 

: 2/25 . 8|29 .6133.5|37.6141.8 

始 = $23 CES OS aaa a 

0]22 . 6126. 3|30.2134.2|38.3 

饱 9|19.4|23.0l26.8|30.8|34.8 

6.1| 9.3|12.7|16.1|19.7|23.5|27.3|31.3 

和 j 3.1| 6.2| 9.5|12.9|16.4|20.1|23.1|27.9 

3.1] 6.3| 9.7|13.2|16.8|20.5|24.4 

度 3.2] 6.5| 9.9|13.4|17.1|20.9 

3.21 6.610. 1]13.7|17.4 

oN 一 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 -一 

% 3.3] 6.7/10.3]13.9 
wy 


0 | 3.4) 6.8|10.5 


0 | 3.4) 7.0 
OF 35 
0 


2) 分 段 盐 析 时 ,要 考虑 到 每 次 分 段 后 蛋白 质 浓度 的 变化 ,蛋白 质 浓度 的 不 同 要 求 盐 
析 的 饱和 度 也 不 同 。 一 种 蛋白 质 如 经 二 次 盐 析 , 第 一 次 盐 析 分 离 范 围 比较 宽 , 第 二 次 分 离 
范围 较 罕 。 如 胆 碱 酯 酶 第 一 次 硫酸 铵 盐 析 的 饱和 度 范 围 为 35 多 至 60%, B— MR 40% 
60% 脱氧 核糖 核酸 酶 第 一 次 硫酸 镑 盐 析 的 饱和 度 范围 为 20% 至 40 匈 ,第 二 次 则 为 


. 30% 至 40% 

4 3) 为 了 获得 实验 的 重复 性 , 盐 析 的 条 件 如 pH HEEMKRAHALALA™ mM 
s 控制 。 

f 盐 析 后 一 般 需 放置 半 小 时 至 1 小 时 , 待 沉 淀 完 全 后 才 过 滤 离 心 ; 过 早 的 分 离 将 影响 收 
率 , 低 浓度 的 硫酸 铵 溶液 盐 析 后 固 液 分 离 常 采用 离心 方法 ,高 浓度 硫酸 扳 溶 液 则 常用 过 滤 


方法 。 因 高 浓度 硫酸 锐 的 密度 太 大 ,蛋白 质 要 在 悬浮 液 中 沉降 出 来 ,需要 较 高 离心 速度 和 
长 时 间 的 离心 操作 , 故 采 取 过 滤 法 较 合 适 。 


ea 59 。 


A. 硫酸 铵 盐 析 的 实例 
例 〈1) 血清 中 各 主要 蛋白 质 组 份 的 盐 析 分离 @? 
100 毫升 血清 + 100 毫升 PBS** 
| sit 200 Ft i ABR (pH 7.2) 
| 


Eni 沉 汪 再 溶 于 PBS 中 ,使 体积 达 100 毫升 
nae LAP) | sain 25 毫升 饮 和 硫酸 铁 约 达 2096 饱和 度 
Lie Wiike SF Heme CRD 


| iain 18 一 25 aes Ha RUBE eA 30 一 3396 饱和 度 


| 


上 清 液 RES ”- 球 蛋白 和 少量 6- 球 蛋白 
iii im 35 一 40 毫升 饱和 硫酸 
Bae ede Tae WSF PBS 中 使 体积 达到 100 毫升 
| | | iin 43—50 se FORA 
ERY e- 球 蛋 , 沉 淀 主要 为 6- 球 蛋白 Bees 907-3390 tee 
让 用 少 基 清 委 白 。《 沦 杂 少量 “ 及 THRE) | 
ie REA | 
上 清 液 为 。 沉淀 为 ”- 球 蛋白 重复 上 法 
WE PBS HAR BREA 1-2 次 得 TREE 
达 100 毫升 
满 加 43 一 50 毫升 饱和 硫酸 镑 
Hi 30— 33% HAE 
上 清 液 沉淀 为 少量 7- 球 蛋白 
ijn 30 一 40 37} ies FB 
约 达 45% (AE 
上 清 液 少量 w- 球 WUE BREA 
蛋白 及 清 蛋白 


** PBS 为 磷酸 缓冲 液 ,0.2M,. pH 7.2 并 加 入 氧化 钠 至 0.15M。 


例 〈2) 高 活性 组 织 蛋 白 酶 C( 二 肽 酰 氨基 肽 酶 ) 的 分 段 盐 析 制 备 
Fale 5 公斤 (除去 脂肪 肋 膜 》 


—15°C 冻 硬 , 绞 碎 、 室 温 融 化 , 再 在 一 15°C 冻 硬 , 反 复 冻 融 四 次 。 然后 加 入 10 升 冷 蒸 馏 水 
0 一 42C 浸泡 半天 ,盐酸 ( 重 蒸 ) 酸 化 至 pH 4.0,1 小 时 后 过 滤 。 


滤液 (8000 毫升 ) 
| mime BRE RE A 560 ETD, 0*c WHR, AOE. 
沉 注 
PSE ARB] pH 4.0,0.1M 柠檬 酸 缓冲 该 中 。 离心 得 抽 提 沪 720 毫升 。 加 饱和 硫酸 勿 溶液 
(pH 4.0) 3 50% 饱和 度 ,0*C 过 滤 。 
滤液 (850 BF) 
| iA wii ASAE 70% 饱和 度 , 放 置 2 小 时 后 0 离心 y 沉 证 为 50 一 7096 饱和 度 硫酸 铁 部 分 。 
mnie 


| 资 于 汪 量 396 Be (2b MAP He, EUR RAEI 5 毫升) TCEEABTC MT» 60°C 水 洽 加 热 20 分 名 
加热 后 立即 用 冰 水 冷却 ,0'C 离心 ,得 上 清 液 竹 毫 天 


Ei 
| mie eB ABUL e MGM pH 5.6,0.02M pene EMR 0°C 透析 过 夜 

透析 液 上 DEAE- 荷 聚 糖 凝 胶 A-5〈Cl-) HCE pH5.6 0.02M 磷酸 钠 缓 冲 液 平衡 ) 

上 pH 5.6 0.02M 磷酸 钠 缓冲 液 洗 脱 

收集 第 一 峰 活 性 部 分 

Ey oa am 然后 对 pH 4.0, 0.005M 柠檬 酸 钠 缓 冲 液 透 析 最 后 得 透析 液 和 4 


ea 60 。 


透析 液 在 O°C 上 Sephadex G200 柱 
《6 克 Sephadex G200 置 于 pH 4.0,0.005M 和 栓 机 芯 钠 缓冲 液 中 ,冰箱 存放 待 完全 胀 开 ) 


Ji pH 4.0, 0.005M 柠 榜 酸 缓冲 液 展开 

收集 第 一 峰 活 性 部 分 , 共 得 20 毫升 ( 含 蛋白 质 30 毫克 ; 比 活 为 214 单 位/ 毫克) 
| onc 下 对 蒸馏 水 透析 

透析 液 再 上 Sephadex G200 柱 

| osc 用 蒸馏 水 展开 


收集 第 -- 峰 活性 部 分 
( 比 话 为 310 单位 /毫克 ) 
(=) 硫酸 钠 盐 析 法 


在 很 早 以 前 已 有 人 用 硫酸 钠 来 分 离 血 请 中 的 蛋白 质 , 但 由 于 其 盐 析 效果 不 如 硫酸 匀 , 
因而 应 用 范围 也 不 及 硫酸 铵 盐 析 广泛 。 其 操作 方法 如 硫酸 铵 盐 析 一 样 , 这 里 不 另 赣 述 。 
~ 硫酸 钠 在 不 同 温度 下 的 溶解 度 见 表 3-5。 
表 3-5 不 同 温度 下 硫酸 钠 的 溶解 度 "…"” 


Mi 


溶解 度 ( 克 / 升 ) 13.8 18.4 .24.8 28.2 32.6 34.0 


硫酸 钠 应 用 于 蛋白 质 分 段 盐 析 举 例如 下 : 
例 : 使 用 硫酸 钠 提 取 较 纯 IgG (*RREA)™ 
100 毫升 血清 + 100 毫升 PBS〈0.2M,PpH 8.0) 


加 36 克 硫 酸 钠 合 最 后 浓度 达 189% 

离心 取 沉淀 再 将 沉淀 溶 于 80 Ft PBS 中 
离心 取 上 清 液 加 入 9.6 克 硫 酸 钠 使 最 后 浓度 达 1296 
离心 取 沉淀 深 于 40 毫升 PES- 中 
离心 取 上 清 液 , 加 入 4.8 克 硫 酸 钠 使 最 后 浓度 达 1296 


离心 得 沉淀 为 IgG【《 免 疫 球 蛋 白 ) 透析 脱盐 得 较 纯 的 IgG 


(=) 其 它 中 性 盐 应 用 于 蛋白 质 的 盐 检 


例如 : ”用 低 浓度 氧化 钠 沉 淀 DNA 核 蛋 白质 , 用 低 浓 度 硫 筷 化 钾 沉 演 人 脐 干扰 素 
等 el。 但 没有 硫酸 匀 应 用 那样 广泛 。 


q met 第 三 节 , 有 机 溶剂 沉淀 法 


一 \、 基 本 原理 


有 机 溶剂 对 许多 能 溶 于 水 的 小 分 子 生化 物质 以 及 核酸 多糖 、 蛋 白质 等 生物 大 分 子 都 


61 。 


能 发 生 沉 淀 作 用 。 有 机 溶剂 的 沉淀 作用 主要 是 降低 水 溶液 的 介 电 常 数 ,如 20°C 时 水 的 介 
电 常数 为 80, 而 82% 乙醇 溶液 的 介 电 常 数 为 40。 溶 液 的 介 电 常 数 减少 就 意味 着 溶质 分 子 
异性 电荷 库仑 引力 的 增加 从 而 使 溶解 度 减 少 。 这 一 点 可 以 从 静电 学 的 库仑 定律 中 得 到 立 
明 。 在 库仑 定律 的 公式 中 带电 离子 基 团 之 间作 用 力 随 着 介 电 常数 的 减少 而 增 大 , 离 子 之 
间 不 断 接近 ,两 带电 基 团 的 距离 也 随 之 减少 ,因此 带电 溶质 便 互 相 吸引 凝集 。 对 于 具有 表 
面 水 层 的 生物 大 分 子 来 说 ,有 机 溶剂 与 水 的 作用 不 断 使 这 些 分 子 表面 水 层 厚 度 压缩 ,最 后 
使 这 些 大 分 子 脱 水 而 相互 聚集 析出 。 不 同 溶质 的 沉淀 要 求 不 同 浓度 的 有 机 溶剂 , 是 有 机 
溶剂 分 步 沉 淀 的 理论 基础 。 

有 机 溶剂 沉淀 法 的 优点 是 : C1) 分 辨 能力 比 盐 析 法 高 , 即 一 种 蛋白 质 或 其 他 溶质 只 
有 在 一 个 比较 窄 的 有 机 溶剂 浓度 范围 内 沉淀 。(2) 沉 淀 不 用 脱盐 , 过 滤 比 较 容易 。(3) 在 
生化 制备 中 应 用 比 盐 析 法 广泛 。 其 缺点 是 对 某 些 具有 生物 活性 的 大 分 子 , 如 酶 ,容易 引起 
变性 失 活 ,操作 常 需 在 低温 下 进行 。 | , 


二 、 有 机 溢 剂 的 选择 及 浓度 计算 


用 于 生化 制备 沉淀 的 有 机 溶剂 的 选择 首先 是 能 和 水 混 咨 。 使 用 较 多 的 有 机 溶剂 是 己 
醇 . 甲 醇 \ 丙 酮 。 还 有 二 甲 基 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 硕 、 乙 有 睛 和 2- 甲 基 -2,4- 成 二 醇 〈MPD) 
等 。 作 为 核酸 、 糖 类 氨基 酸 和 核 苷 酸 等 物质 的 沉淀 剂 最 常用 的 是 乙醇 , 对 于 蛋 自 质 和 酶 
的 沉淀 ,乙醇 .甲醇 和 丙酮 都 可 以 使 用 , 但 甲醇 和 丙酮 对 人 体 有 一 定 毒 性 。 总 的 来 说 蛋白 
质 的 有 机 溶剂 沉淀 法 不 如 盐 析 法 普遍 。 核酸 的 有 机 溶剂 沉淀 ,除了 乙醇 外 , 异 丙 醇 和 co- 二 
气 基 乙醇 也 常 被 采用 。 
其 他 一 些 有 机 溶剂 如 二 甲 酰 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 砚 、 乙 有 睛 以 及 氯仿 、 乙 醚 等 ,作为 沉淀 剂 
其 应 用 的 对 象 及 条 件 , 则 必须 根据 不 同 具体 情况 而 选择 。 - 
进行 有 机 溶剂 沉淀 时 , 欲 使 原 溶液 达到 一 定 的 有 机 溶剂 浓度 , 需 加 入 的 有 机 溶剂 的 浓 
度 及 体积 可 按 下 公式 计算 : is 
: V 一 Vo(S — S,)/(100 — S,) 
式 中 : 
V= HMA 100% 浓度 有 机 溶剂 的 体积 。 
Vo= 原 溶液 体积 。 
Si = 原 盗 液 中 有 机 溶剂 的 浓度 。 
”8 一 所 要 求 达 到 有 机 溶剂 的 浓度 。 


一 种 组 份 的 浓度 
ys 
peme ERORE 


96% 80-75=5 


Bho 


80% 96-80=:16 份 


0 


图 3-6 一 种 组 份 溶剂 的 比例 图 解 计算 法 


e 62 。 


* 


WU He SH 
浓度 % (V/V) 


表 3-6 制备 较 低 浓度 乙醇 工 升 所 需 较 高 浓度 乙醇 及 水 的 用 量 表 ( 毫 升 , 207C) 


63 。 


100 指 加 入 的 有 机 溶剂 浓度 为 100 多 , 如 所 加 入 的 有 机 溶剂 的 浓度 为 95 多 , 上 式 . 
(100-S,) 项 应 改 为 《95-Sz)。 

上 式 的 计算 由 于 未 考虑 混 深 后 体积 的 变化 和 溶剂 的 挥发 情况 , 实 际 上 存在 一 定 的 误 
差 。 如 有 机 溶剂 浓度 不 要 求 太 精确 时 , 可 用 简单 的 图 解 方法 求 出 忆 〈 见 图 3-6)。 有 时 为 
了 获得 沉淀 而 不 是 进行 分 离 , 可 用 溶液 体积 倍数 如 一 倍 ` 二 倍 ` 三 倍 等 来 表示 。 

表 3-6 是 制备 不 同 浓度 乙醇 溶液 所 需 较 高 浓度 乙醇 及 水 的 用 量 表 叫 。 


三 、 A Lie 5 FA TL BE BS ae MTA Fk BER ST 

(—) 温度 

多 数 蛋 白质 在 乙醇 一 水 混合 液 中 的 溶解 度 随 着 温度 的 降低 而 降低 , 对 于 其 他 物质 也 
大 致 如 此 。 值 得 注意 的 是 大 多 数 生 物 分 子 如 
和 蛋白质、 酶 和 核酸 在 有 机 溶剂 中 对 旭 度 反应 © 
特别 敏感 ,温度 稍 高 即 发 生变 性 。 因 此 ,加 人 
的 有 机 溶剂 都 必须 预 冷 至 较 低 远 度 , 操 作 要 
在 冰 浴 中 进行 , 同 时 加 入 有 机 溶剂 必须 缓慢 
而 且 不 断 搅拌 以 免 咨 剂 局 部 过 浓 。 一 种 低温 
下 使 用 有 机 溶剂 沉淀 装置 如 图 3-7 所 示 89。 
有 机 溶剂 沉淀 一 些小 分 子 物 质 ( 如 核 背 酸 、 氮 
基 酸 、 生 物 碱 及 糖 类 等 ), 其 温度 要 求 没有 生 
物 大 分 子 那样 苛刻 。 这 是 因为 小 分 子 物 质 结 
构 比 较 稳 定 , 不 易 破 坏 。 但 低温 对 于 提高 沉 

A3-7 低温 有 机 溢 剂 沉淀 装置 淀 效 果 仍 是 有 利 的 。 

(=) HARE 

样品 浓度 对 有 机 溶剂 的 影响 与 盐 析 情 况 相 似 , 低 浓度 样品 使 用 有 机 溶剂 的 量 大 但 共 
沉 作 用 小 ;利于 提高 分 离 的 效果 ;但 低 浓 度 样品 损失 较 大 《〈 即 回收 率 小 ), 具有 生理 活性 的 
样品 易 产 生 稀 释 变 性 。 反 之 高 浓度 桩 品 可 以 节省 有 机 溶剂 , 减 少 变性 危险 , 但 共 沉 作用 
大 ;分 离 效果 较 差 。 一 般 认 为 蛋白 质 最 初 浓度 为 5 一 20 毫克 /毫升 , 粘 多 糖 1 一 2% 范围 较 
为 合适 * 再 加 上 选择 适当 的 pH 值 ,进行 分 段 沉淀 , 即 可 获得 较 好 的 结果 。 
(=) pH 值 

在 样品 结构 稳定 范围 下 选择 溶解 度 最 低 处 的 pH 值 , 有 利于 提高 沉淀 效果 。 另 外 , 适 
宜 的 pH 值 也 可 大 大 提高 分 离 的 分 辩 能 力 。 例如 鞋 海 生化 制药 厂 用 乙醇 分 段 沉 淀 糖 蛋 白 
绒 膜 激素 (HCG), BARREN 1%, CBRE 55%, 一 部 分 HCG 产生 沉淀 , 但 
不 完全 。 加 入 一 定 酷 酸 铵 后 ,乙醇 浓度 增 至 66 匈 ,但 没有 产生 沉淀 ,再 结合 调整 pH 至 5.7 
附近 ,HCG 则 在 非常 狭 宰 的 乙醇 浓度 下 沉淀 下 来 。 
(四 ) 金属 离子 的 影响 

一 些 多 价 阳 离子 如 Znz+ 和 Caz 在 一 定 pH 值 下 能 与 呈 阴 离子 状态 的 蛋白 质 形成 


ea 64 。 


Ve 


复合 物 XMS A WEEK PRA BLA Tl BAYA fe BE ABA AAR, i BR ne AE 
性 。 如 使 用 0.005M 至 0.02M 的 Zn 可 以 使 原来 沉淀 蛋白 质 的 有 机 溶剂 用 量 减 少 


a 至 总 ,这 在 工业 上 很 有 实用 价值 。 但 使 用 此 一 方法 时 , 需 事 先 加 有 机 溶剂 除去 杂 和 蛋白 , 
同时 在 沉淀 后 尽 可 能 避免 这 些 离子 残存 于 蛋白 质 中 。 Me Zo 时 ,蛋白质 溶液 中 则 
不 能 含有 磷酸 盐 ; 以 免 产 生 磷 酸 锌 沉淀 不 易 与 蛋白 质 分 开 。 

钙 与 锌 离子 的 存在 ,也 可 提高 粘 多 糖 乙醇 分 步 沉淀 的 效果 ,二 价 饥 离 子 也 有 同样 作用 。 
(五 ) 离子 强度 的 影响 


离子 强度 是 影响 溶质 在 有 机 溶剂 及 水 混合 液 中 溶解 度 的 一 个 重要 因素 , 盐 的 浓度 太 
小 或 太 大 都 对 分 离 有 不 利 影 响 , 对 于 蛋白 质 和 多 糖 ,在 有 机 溶剂 中 盐 的 浓度 不 超过 比 
较 合适 ,使 用 的 志 醇 量 也 以 不 超过 二 倍 体积 为 宜 。 

有 机 溶剂 沉淀 所 应 用 的 对 象 是 比较 广泛 的 。 许多 种 类 的 生化 物质 , 只 有 选用 合适 的 
有 机 溶剂 ,注意 调整 样品 浓度 温度 、pH 值 和 离子 强度 , 使 这 些 因 子 综合 地 发 挥 作 用 ,, 都 
可 以 获得 较 好 的 实验 结果 。 有 机 溶剂 沉淀 所 得 的 固态 样品 , 如 果 不 是 立即 深 解 进行 第 二 
i a a AR es nei i 


四 、 有 机 溶剂 沉淀 法 实例 


~ 


例 ( 一 ): 血浆 一 乙醇 分 步 沉 淀 法 ea [Cohn 方法 6] 
血 , 浆 - 
乙醇 89%6,pH7.2, 温 度 一 3, 
离子 强度 0.14, 蛋白 质 浓度 5. 1 多 
上 清 液 I 沉淀 ICPD 


乙醇 2596,pH 6.9, 温 度 一 
离子 强度 0.09, sen 0% 


上 清 液 II + II ftw WW + MCP + Il) 
CB 18%, pH5.2, —56 = 
离子 强度 0.09, aed 1.6% 
Lif Iv-1 沉淀 IV-1 (PIV-1) 
CB? 40%, pH5.8, WAR —5° 
离子 强度 0. 09, He RIE. 0% 


上 清流 IV-4 沉淀 1V-4(PIV-4) 


e 65 e 


| 


乙醇 4092,,pH4.8, 温 度 一 5%C 
离子 强度 0.11, Be BRE 0. 8% 


Liam v(sv) 沉淀 VCPV) 


CR? 10%, pH4.5, tak —3°C 
离子 强度 0.1 HE BRE 3% 


| 


se RAD 


乙醇 40%5 pH 5.25 温度 一 59 
离子 强度 0.01, 蛋白 质 浓度 2.592 


| 


LTH  ,” 清 蛋 白 (纯度 95%) 
附 : [方法 6] 乙 醇 分 步 沉 淀 有 关 条 件 及 组 份 的 分 析 


1. [方法 6] 分 离 的 条 件 及 各 阶段 蛋白 质 浓度 的 测定 


TII 
PIv-1 
PIv-4 


PV 


SV 


| Ss Ss J | | se, | 


PU + Ul 


eT 


PIv-1 


PIV-4 


PV 


° 66° 


> PN 一 4 


Pii—M (0.09) 


48.5.2 75.8. 6.8. 7.2 
pH - 
图 3-8 各 分 离 阶 段 分 离 条 件 图 解 


(=) ”小 牛 胸腺 核 组 蛋白 ,全 组 蛋白 和 组 蛋白 各 组 份 的 分 离 29 


小 牛 胸腺 《i00 3) 
0.9% NaCl 0.05M NaHSO (pH 3.5) 洗涤 七 次 


核 组 蛋白 
0.25N HCI 抽 提 - 10% Gucl 的 259% 乙醇 抽 提 


| 乙醇 -1.25N HCI 抽 提 | 
下 清流 ¥ 上 清流 


8 倍 体积 | | # HC1,1.75 
. 全 组 蛋白 
(1,700 毫克 ) | xz 本 0.25N HC) | 
eae ied 抽 提 Livi Tit Fer 
LiBik 沉淀 ine 
F, 上 清 液 BeaAA 
300 毫克 Fi! 
3 倍 体 积 3 “oy 345 毫克 
F,,! 上 清流 沉淀 F500 毫克 
600 毫克 | 2 tk RA 
F2, 
520 训 克 


TE: Fiy Foaty Footy Fon 和 Fs A Johns 和 Butler 对 组 蛋白 的 分 类 系统 [ 见 Prog. Biophys. 
Mol. Biol, 18, 209 (19687] 


AWS) £eAHDa 

多 糖 类 的 水 溶液 加 和 等 量 或 倍 量 的 乙醇 《或 用 丙酮 和 甲醇 代替 ), 可 以 破坏 多 糖 颗粒 
胸水 化 膜 及 降低 溶 流 的 电解 常数 ,使 多 糖 沉 证 而 析出 。 含 有 糖 醛 酸 或 硫酸 基 团 的 多 糖 ,可 
以 在 其 盐 类 溶 补 中 直接 加 入 乙醇 , 则 多 糖 以 盐 的 形式 沉淀 。 如 在 其 酷 酸 或 盐酸 溶液 中 加 
和 乙醇, 则 多 糖 以 游离 酸 形式 沉淀 。 乙 醇 分 步 沉淀 右 旋 糖 栈 例 子 如 下 : 


We 


12% Atle BRET in 2 
37.5—38.5% 乙醇 


LAK 沉淀 
eas 分 子 量 18 万 以 上 的 右 旋 糖 酝 


LIBR Tie 
分 子 量 4.5 一 7 万 的 右 旋 糖 栈 


上 清 液 沉淀 
oe 分 子 量 2.5 一 4.5 万 的 右 旋 糖 本 


| 


Lik Deve ‘ 
分 子 量 为 1] 一 2.5 万 的 右 旋 糖 本 


SOT ”等 电 点 沉淀 法 


等 电 点 沉淀 法 主要 利用 两 性 电解 质 分 子 上 的 电 中 性 时 溶解 度 最 低 , 而 各 种 两 性 电解 
质 具 有 不 同等 电 点 而 进行 分 离 的 一 种 方法 。 氨基 酸 、 核 昔 酸 和 许多 同时 具有 酸性 及 碱 性 
基 团 的 生物 小 分 子 , 以 及 蛋白 质 、 酶 、 和 核酸 等 生物 大 分 子 都 是 一 些 两 性 电介质 。 在 处 于 等 
电 点 时 的 pH 值 , 再 加 上 其 他 沉淀 因素 , 则 很 易 沉 淀 析出 。 如 不 加 其 他 沉淀 因素 , 带 有 水 
膜 的 大 分 子 如 蛋白 质 等 仍 有 一 定 溶解 度 , 不 易 沉 淀 析出 。 另 许多 蛋白 质 的 等 电 点 十 分 接 
近 , 单 独 使 用 此 法 效果 不 理想 ,分 辩 率 也 差 。 一 般 用 于 提取 液 中 除去 杂 和 蛋白 ,如 在 工业 上 
生产 胰岛 素 时 ,在 粗 提 取 液 中 先 调 pH 8.0 去 碱 性 蛋白 质 ,再 调 pH 3.0 去 酸性 蛋白 (以 上 
均 常 加 入 一 定 有 机 溶剂 以 提高 沉淀 效果 )。 利用 等 电 点 除 杂 蛋白 方法 须 事先 了 解 所 制备 
的 物质 对 酸 碱 的 稳定 性 ,不 然 , 盲 目 使 用 是 很 危险 的 。 不 少 蛋白 质 与 金属 离子 结合 后 , 等 
电 点 会 发 生 偏 移 , 如 胰岛 素 等 电 点 为 5.3, 与 Znt+ 结合 后 ,形成 胰岛 素 锌 盐 , 其 等 电 点 度 
为 6.2, 故 加 入 金属 离子 后 选择 等 电 点 沉淀 时 , 必 须 注意 调整 pH A. 等 电 点 法 常 和 盐 
析 法 \ 有 机 溶剂 法 或 和 其 他 沉淀 剂 一 起 使 用 ,以 提高 其 沉淀 能 力 。 ee 


第 五 节 ”生成 盐 类 复合 物 沉淀 法 


生物 大 分 子 和 小 分 子 都 可 以 生成 盐 类 复合 物 沉淀 ,此 法 一 般 可 以 分 为 〈1) 与 酸性 功 
能 团 作 用 的 金属 复合 盐 法 〈 如 铜 盐 、 银 盐 、 锌 盐 、 铅 盐 \ 锂 盐 、 钙 盐 等 ),(2) 与 碱 性 功能 团 
作用 的 有 机 复合 盐 法 (如 苦味 酸 盐 \ 苦 酮 酸 盐 \ 丹 宁 酸 盐 等 ),(3) LIBS: (OB 
酸 盐 、 磷 钼 酸 盐 等 )。 以 上 盐 类 复合 物 都 具有 很 低 的 溶解 度 , 极 容易 沉淀 析出 , 若 沉 淀 为 金 
属 复合 盐 , 可 通 以 HS 使 金属 变 成 硫化 物 而 除去 , 若 为 有 机 盐酸 盐 、 磷 钨 酸 盐 , 则 加 人 无 
机 酸 并 用 乙醚 萃取 , 把 有 机 酸 , 磷 钨 酸 等 移 人 乙醚 中 除去 ;或 用 离子 交换 法 除去 。 但 值得 : 
注意 的 是 , 重金 属 、 某 些 有 机 酸 与 无 机 酸 和 蛋白质 形 成 复合 盐 后 , 常 使 蛋白 质 发 生 不 可 逆 
的 沉淀 ,应 用 时 必须 谨慎 。 


se。 68 。 


+e 


rd 
£ 
ies 


(—) 金属 复合 盐 法 

许多 有 机 物 包括 蛋白 质 在 内 ,在 碱 性 溶液 中 带 负 电荷 ,都 能 与 金属 离子 形成 沉淀 。 所 
用 的 金属 离子 , 根 据 它 们 与 有 机 物 作用 的 机 制 可 分 为 三 大 类 。 第 一 类 包括 Mn’*, Fe’*, 
Cox、Ni+、cCue+、Zo+ 和 ,Cd , 它 们 主要 作用 于 羧 酸 、 胺 及 杂 环 等 含 氮 化 合 物 。 第 二 
类 包括 Ca’*, Ba’t, Mg’* Al Pb “, 这 些 金属 离 于 也 能 和 羧 酸 起 作用 , 但 对 含 须 物质 的 , 
配 基 没 有 亲和力 。 第 三 类 金属 包括 He’. Ag’ A Pb”“, 这 类 金属 离子 对 含 硫 氢 基 的 化 
合 物 具 有 特殊 亲和力 。 蛋 白质 和 酶 分 子 中 含有 羧基 、 氮 基 、 咪 只 基 和 硫 氢 基 等 , 均 可 以 和 


上述 金属 离子 作用 形成 盐 复 合 物 。 但 复合 物 的 形式 和 种 类 则 依照 各 类 金属 离子 和 蛋白 质 


的 性 质 , 溶液 离子 强度 和 配 基 的 位 置 等 而 有 所 不 同 。 关于 蛋白 质 一 金属 复合 物 形成 的 机 
理 ,Gurd 和 Wilcox 等 曾 作 过 全 面 论述 2 ,读者 有 兴趣 时 ,可 进一步 查阅 。 

蛋白 质 一 金属 复合 物 的 重要 性 质 是 它们 的 溶解 度 对 介质 的 介 电 常 数 非常 敏感 , 调 整 
水 溶液 的 介 电 常 数 ( 如 加 入 有 机 溶剂 ), 用 Zn ,Ba” 等 金属 离子 可 以 把 许多 蛋白 质 沉淀 
下 来 , 而 所 用 金属 离子 浓度 约 为 0.02M 左右 即 可 。 金属 离子 复合 物 沉 淀 也 适用 于 核酸 


或 其 他 小 分 子 , 例 如 0.01N 的 Ca’? 或 Mg” 在 室温 下 可 以 完全 沉淀 PolyA 和 Polya 


金属 离子 沉 演 氨基酸, 人 详 见 实例 。 


(=) 有 机 盐 法 


含 所 有 机 酸 如 苦味 酸 \ 苦 酮 酸 、 轰 酸 等 都 能 与 有 机 分 子 的 碱 性 功能 团 形成 复合 物 而 沉 
淀 析出 。 但 这 些 有 机 酸 与 蛋白 质 形成 盐 复合 物 沉淀 时 ,常常 发 生 不 可 逆 的 沉淀 反应 ,工业 
上 应 用 此 法 制备 蛋白 质 时 , 需 采 取 较 温和 的 条 件 , 有 时 还 加 入 一 定 的 稳定 剂 , 以 防止 蛋白 
质变 性 。 

近年 来 应 用 一 种 许 啶 染料 雷 凡 诺 《2- 乙 氧 基 -6,9- 二 氮 基 昱 啶 乳酸 盐 ,2-ethoxy-6,9- 
diaminoacidine lactate), 虽然 其 沉淀 机 理 比 一 般 有 机 酸 盐 复 杂 , 但 其 与 蛋白 质 作 用 也 主要 
是 通过 形成 盐 的 复合 物 而 沉淀 的 。 此 种 染料 据 报导 时 提纯 血浆 中 >- 球 蛋白 有 较 好 效 
7, 实际 应 用 时 以 0.4 多 的 雷 凡 诺 溶 液 加 到 血浆 中 , 调 pH 7.6 一 7.8, 除 7Y- 球 蛋白 外 , 
可 将 血浆 中 其 他 蛋白 质 沉 淀 下来。 然后 以 5 多 浓度 NaCl 将 和 雷 凡 诺 沉淀 (或 通过 活性 内 
柱 或 马铃薯 淀粉 柱 吸 哈 除去 )。。 WRN Y- 球 蛋白 可 用 25 多 乙醇 或 加 等 体积 饱和 硫酸 
铵 溶液 沉淀 回收 。 使 用 雷 凡 诺 沉淀 蛋白 质 , APSA MBH, 并 可 通过 调整 pH 值 , 分 
段 沉 淀 一 系列 蛋白 质 组 份 。 但 蛋白 质 的 等 电 点 在 pH 3.5 以 下 或 pH 9.0 以 上 ,不 被 雷 凡 
ite BRKT RK pH 值 时 (pH 2.4 左右 ), 被 雷 凡 诺 沉 淀 。 


(三 ) 无 机 盐 法 
- 一 般 用 于 小 分 子 如 氮 基 酸 的 分 离 制备 ,大 分 子 蛋白 质 \ 酶 和 核酸 则 很 少 使 用 。 
(四 ) 实例 
关于 各 类 生化 物质 盐 类 复合 物 沉 淀 法 举例 如 下 : 
实例 一 ” 雷 凡 诺 提取 免疫 球 蛋 白 巴 


°e 69 e 


4 


100 毫升 血清 + 69 inte + 65 毫升 雷 凡 诺 液 G%, pH7.5) 十 工 滴 辛 酸 
~ 离心 


Wiz EH) 上 清 液 
(+11.7 spe cine 5%) 
离心 2 


aac | Liam 
(+5 ABA RR RIA) . 


je - 
i 


沉淀 
C8 F 50 毫升 水 中 erelimara: 公司 全 和 
离心 
沉淀 为 IgG (KRRBA) 
实例 二 RUNNERS Raw 
25 AFH FMR EM, 109NaCl 抽 提 二 次 ; 共 得 清 液 12 Ft > Far BIA pH4.5* 


Lisi FA) 


MA 0. 06%6 二 氧化 硫 ,0. 0292 抗坏血酸 作 稳定 齐 


在 搅拌 下 缓慢 加 入 0.5% 莱 酸 至 沉淀 完全 。 
离心 
沉淀 用 pH4.5,0.02%2 A ARR HC HTL OMEN ROCA) 


Tite TRA RS & A ie hae 
* #8) Garis) £°Le 


实例 三 ” 铀 盐 沉 淀 法 制备 谷 胱 甘 肽 


10 ArH, ALG Ten A ee 乙醇 - nee 10,000 毫升 * 
降温 30%C 以 下 ,搅拌 拍 提 30 分 钟 


| save 
ie HELL HARI AB 0.5 当量 酸度 


约 得 8 升 滤液 在 40 ew pe 4 Se A(t Wd, EE 20 分 钟 。 
沉淀 用 0.5N H,SO, HRA MRBKERRK, BABWRSAAATHED AME. 


刮 下 无 硫酸 根 的 谷 胱 甘 肽 铜 盐 * 加 入 2 一 3 ERAT » EI 
A HS 三 小 时 * 抽 滤 , 得 饱和 的 硫化 氢 谷 胱 甘 肽 滤 芒 。 


BARA BRB HOH HLS 
| | foc me shi 
BE WEI A. 10 倍 堪 右 的 丙 本 ;冷库 放置 1 一 2 天 


沉淀 物 用 两 倍 冷 丙酮 洗 几 次 ,干燥 后 得 谷 胱 甘 肽 产品 约 100 克 。 
* ,硫酸 ,乙醇 -乙醚 混合 液 的 配制 ;: 在 耐酸 缸 中 加 入 86% 乙醇 5000 毫升 (在 冰 浴 中 )* 逐 渐 加 入 浓 硫 酸 , 1000 毫升 
(使 温度 不 超过 30°C), 硫酸 加 完 后 待 液 温 降 至 10%C 以 下 时 ,加 入 乙醚 4000 毫升 。 
引 自 上 海 酵 母 厂 的 生产 工艺 


上 法 用 有 机 溶剂 较 多 , 现 多 使 用 热 水 抽 提 ,, 上 离子 交换 树脂 柱 纯 化 , 产 率 较 高 。 举 此 


e 70 « 


和 让 


例 只 说 明 金 属 盐 沉淀 方法 而 已 。 


实例 四 HA 工 - 异 白 氮 酸 2 
鳃 齿 棒 状 杆菌 (Corynebacterium crenatum) AS1.998 ERE 1 升 ( 约 含 1%L-# BAM) 
| 离心 (3500 转 / 分 ) 30 分 钟 
a. 上 清 液 
| 加 0.5 克 cuco,、3H0, 升 温 咨 解 \ 冷 后 过 下 


| 加 6.5 克 CuCO,, 31,0 MARANA DOA 
mit 
| 加 水 老 沸 。 溶 解 后 缓慢 冷却 
Ma IKE : 
We Rie HS 气体 ,过 滤 。 


fede 100 26s pH 6,0, MARA 9590 ZARA RO 
Bits 

| 加 水 250 毫升, 用 HC1 调节 pH 至 4.0, 加 活性 炭 2 克 ,煮沸 20 ahhh, WLR. 

i | 

| 浓缩 至 100 毫升 ;用 氨水 调节 pH 至 6.0, 加 二 倍 体积 9596 乙醇 ,放置 过 夜 , 离心 
Bie: 

| 70° RF 
半成品 《6.5 38) 

| 170 毫 天 水 ,用 HCI 调节 pH 4.0, 加 活性 央 1 AW 20 分 钟 ,过 让 。 

i 

jeern 毫升 ,用 氨水 调节 .PE 至 6. 0, 加 二 倍 体积 9596 CH WELK. ile 


中 70°C HEF 
精制 品 (5 克 ) 


zoe 盐 类 复合 物 沉 ef A SC 


本 蛋白 质 盐酸 水 解 液 
去 除 盐酸 及 酸性 胡 敏 酸 
低 氧 化 正 铜 处 理 
一 -一 | inane: 
| 硫化 气 处 理 
WERT TED) | 
od 1 
硫化 铀 
rte 
RAR 滤液 
| 第 一 次 石灰 乙醇 处 理 
第 一 次 将 酸性 氨基 酸 钙 予 以 脱 和 十 , HEE TL LF LBS 
SB SHARKS cote 


* 71 


第 一 次 磷 钨 酸 处 理 


第 一 次 将 碱 性 氨基 酸 分 离 ARR Iie AF 


7} AES I — BER 


生成 铜 盐 
人 
FABIA ADB OD Hit, Cate 甲醇 不 溶解 部 份 
一 > 不 溶 于 乙醇 的 一 氨基 酸 
苦味 酸 处 理 提取 滚 冷水 提取 , 脱 铜 
分 离 膊 氨 酸 苦味 酸 盐 ms 
溶解 于 冷水 部 份 不 溶 于 冷水 部 份 
Sa A a OR ah Mieke PERERA | 脱 铜 脱 铜 
LAO ; 
—_—_> : 
jak xg 析出 一 氨基 酸 
第 二 次 从 酸性 氨基 酸 中 分 离 .、 将 滤液 脱 钙 与 去 除 乙醇 
出 谷 氮 酸 ,天 门 冬 氨 酸 Soe 
第 二 次 沉淀 碱 性 氨基 酸 EP BR RO Al 
分 离 一 氨基 酸 
分 离 出 碱 性 氨基 酸 hin 
FABER 


第 六 节 ”选择 性 变性 沉淀 法 


这 一 特殊 方法 主要 是 破坏 杂质 ,保存 目的 物 。 其 原理 是 利用 蛋白 质 \ 酶 和 核酸 等 生物 
大 分 子 对 某 些 物理 或 化 学 因素 敏感 性 不 同 , 而 有 选择 地 使 之 变性 沉淀 ,使 达到 分 离 提纯 的 
目的 。 此 方法 可 分 为 : 

(1) 利用 表面 活性 剂 或 有 机 溶剂 引起 变性 。 如 制备 核酸 时 ,加 入 含水 酚 、 氧 仿 、 十 二 
烷 基 础 酸 钠 等 有 选择 地 使 蛋白 质变 性 与 核酸 分 离 。 

(2) 利用 对 热 的 稳定 性 不 同 , 加 热 破坏 某 些 组 份 , 而 保存 另 一 些 组 份 。 如 脱氧 核糖 核 
酸 酶 对 热 稳定 性 比 核糖 核酸 酶 差 , 加 热处理 可 使 混杂 在 核糖 核酸 酶 中 的 脱氧 核糖 核酸 酶 
变性 沉淀。 又 如 由 黑 曲霉 发 酵 制备 脂肪 酶 时 , 常 混杂 有 大 量 淀粉 酶 , 当 把 混合 粗 酶 液 在 


« 72° 


40°C 水 浴 中 保温 二 小 时 半 (pH 3.4), 90% 以 上 的 淀粉 酶 将 受热 变性 而 除去 。 热 变性 方 
法 简单 易 行 ,在 制备 一 些 对 热 稳定 的 小 分 子 物 质 过 程 中 ,除去 一 些 大 分 子 蛋白 质 和 核酸 特 
别 有 用 。 | 

(3) 选择 性 的 酸 碱 变性 。 在 本 章 第 三 节 中 已 述 及 调节 pH 值 除去 杂 蛋 白 的 方法 。 利 
用 酸 、 碱 变性 有 选择 地 除 杂 蛋白 在 生化 制备 中 的 例子 很 多 , 如 用 2.5 多 浓度 的 三 氯 栈 酸 处 
PERE SAS MAM CHEM, 均 可 除去 大 量 杂 蛋白 , 而 对 所 提取 的 酶 活性 
没有 影响 。 有 时 还 把 酸 碱 变性 与 热 变性 结合 起 来 使 用 ,效果 更 为 显著 。 但 应 用 前 ,必须 对 
制备 物 的 热 稳定 性 及 酸 碱 稳定 性 有 足够 的 了 解 , 切 勿 言 目 使 用 。 例 如 胰 蛋 白 酶 在 pH 2.0 
的 酸性 溶液 中 可 耐 极 高 温度 , 而 且 热 变性 后 所 产生 的 沉淀 是 可 逆 的 。 冷 却 后 沉淀 深 解 即 
可 恢复 原来 活性 。 还 有 些 酶 与 底 物 或 者 竞争 性 抑制 剂 结合 后 , 对 pH 值 或 热 的 稳定 性 显 
著 增 加 , 则 可 以 采用 较 强 烈 的 酸 碱 变性 和 热 方法 除去 杂 和 蛋白。 


第 七 节 “ 非 离子 多 聚 物 况 泥 法 
一 、 基 本 JB 理 [24;27] 


非 离子 多 聚 物 是 六 十 年 代 发 展 起 来 的 一 类 重要 沉淀 剂 , 最 早 应 用 于 提纯 免疫 球 蛋 白 
(IgG) 和 沉淀 一 些 细 菌 与 病毒 , 近 年 来 逐渐 广泛 应 用 于 核酸 和 酶 的 分 离 纯化 ””。 这 类 


” 硬 离 子 多 篆 物 包括 各 种 不 同 分 子 量 的 聚 乙 二 醇 (Polyethylene Glycol 简写 为 PEG), EA 


乙烯 化 氧 (简写 为 NPEO), 葡 聚 糖 , 右 旋 糖 本 硫酸 钠 等 。 其 中 应 用 最 多 的 是 聚 乙 二 醇 , 其 
结构 式 如 下 : 


CH,—- (CH,—CH,—O),, —CH, 
| 
OH OH 


根据 和 射线 衍射 和 红外 光谱 分 析 , 证 明 聚 乙 二 醇 具 有 螺旋 状 的 结构 。 聚 乙 二 醇 亲 水 
性 强 , 有 很 广 范围 的 分 子 量 , 在 生化 制备 中 用 得 较 多 的 是 PEG 2000 一 6000, 分 子 量 超过 
20,000 以 上 的 聚 乙 二 醇 , 则 具有 很 高 的 粘性 。 操 作 十 分 不 便 , 平 时 很 少 使 用 。 聚 已 二 醇 及 
其 他 非 离子 多 聚 物 应 用 于 生物 大 分 子 微粒 病毒 和 细菌 的 沉淀 时 , 其 效果 与 沉淀 剂 本 身 浓 
度 有 关外 ,还 受到 离子 强度 、pH 和 温度 等 因素 的 影响 , 例如 , 用 PEG 沉淀 蛋白 质 , 使 用 
PEG 的 浓度 与 溶 该 中 盐 的 浓度 常 呈 反比 关系 ,在 固定 pH 值 下 , 盐 浓度 越 高 , 所 需 的 PEG 
WEB Ro WK pH 值 越 接 近 微粒 的 等 电 点 , 沉淀 微 粒 所 需 PEG 的 浓度 越 低 。 其 次 , 使 
PEG 的 分 子 量 大 小 也 与 沉淀 效果 有 直接 关系 。 在 一 定 范围 内 ,高 分 子 量 的 PEG ite 
的 效力 较 高 。 此 外 ,如 使 用 的 PEG 分 子 量 和 浓度 相同 、 沉 淀 效果 与 被 沉淀 微粒 的 分 子 大 
小 \ 形 状 有 关 。 以 上 这 些 现象 ,到 目前 为 止 , 仍 未 找到 很 合适 的 理论 解释 。 曾 提出 的 假设 
有 如 下 几 种 : CL) 认为 沉淀 作用 是 多 聚 物 与 大 分 子 发 生 共 沉 作 用 。(《2) 多 聚 物 使 大 分 子 
在 多 聚 物 与 水 之 间 发 生 分 配 , 使 大 分 子 脱水 而 沉淀 。(3) 多 聚 物 与 大 分 子 之 间 以 氢 键 相 
互 作用 形成 复合 物 ; 或 由 于 大 分 子 被 多 聚 物 包 埋 形成 复合 物 ,在 重力 作用 下 沉淀 析出 。 但 
以 上 假设 都 没有 充分 根据 支持 。 最 近 罗 兰 梯 〈Laurent) 等 基于 多 聚 物 的 沉淀 作用 主要 依 
赖 于 多 聚 物 的 浓度 和 被 沉淀 物 的 分 子 大 小 的 众多 事实 。 提 出 PEG 的 沉淀 机 理 主 要 是 通 


ea 7T3 。 


过 空间 位 置 排 斥 , 使 流体 中 的 微粒 (包括 生物 大 分 子 、 病 毒 和 细 戎 等 ) 被 迫 挤 聚 在 一 起 而 引 
ETL TEN HE"), 根据 上 述 排斥 理论 , 被 排斥 的 体积 、 其 数值 应 是 多 聚 物 的 浓度 函数 。 
如 多 聚 物 的 浓度 固定 以 后 ,微粒 的 沉淀 则 主要 和 微粒 分 子 大 小 、 形 状 \ 带 电 情 况 有 关 s 而 
YURI EE. pH 值 和 离子 强度 正 是 通过 影响 微粒 分 子 性 质 而 起 作用 的 。 对 排斥 理论 , 目 
前 虽 有 某 些 异 义 , 但 得 到 较 多 的 实验 支持 。 

水 溶性 非 离子 多 聚 物 的 沉淀 方法 , 近 年 来 在 生化 制备 应 用 发 展 迅速 , 其 主要 优点 在 
于 : 操作 条 件 温 和 ,不 易 引 起 生物 大 分 子 的 变性 。 同时 具有 极 高 的 沉淀 效能 。 很 少量 的 
非 离子 多 聚 物 则 可 以 沉淀 相当 多 的 生物 大 分 子 。 涡 淀 后 的 多 聚 物 也 容易 除去 。 因 此 广泛 
应 用 于 细菌 \ 病 毒 、 核 酸 ` 蛋 白质 和 酶 等 多 种 微粒 的 沉淀 分 离 。 


二 、 应 用 方法 和 范围 


用 非 离子 多 聚 物 沉 演 生物 大 分 于 和 微粒 , 一 般 有 两 种 方法 : 一 是 选用 二 种 水 溶性 非 
离子 多 缘 物 组 成 液 一 波 两 相 系统 ,使 生物 大 分 于 或 微粒 在 两 相 系统 中 , 不 等 量 分 配 , 而 造 
成 分 离 。 这 一 方法 主要 基于 不 同 生 物 分 子 和 微粒 表面 结构 不 同 , 有 不 同 分 配 系数 。 并 外 
加 离子 强度 , pH 值 和 慢 度 等 因素 的 影响 ,从 而 扩大 分 离 的 效果 。 二 是 选用 一 种 水 盗 性 非 
BARD ,使 生物 大 分 子 或 微粒 在 同一 外 相 中 ,由 于 被 排斥 相互 凝集 而 沉淀 析出 。 对 后 
一 种 方法 ,操作 时 先 离心 除去 粗大 悬 序 颗粒 , TEAR PH 值 和 
温度 至 适度 ,然后 加 入 中 性 盐 和 多 聚 物 至 一 定 浓 度 , 冷 处 贮 一 段 
时 间 , 印 形成 沉淀 。 

非 离子 多 聚 物 沉 淀 法 的 应 用 , 主 要 在 下 列 三 方面 : 


\ 


pEG 


ae (一 ) 细菌 和 病毒 方面 的 应 用 


六 十 年 代 初 , 艾 伯 森 〈Albertson) 等 人 用 此 法 分 离 多 种 细菌 

和 病毒 ,他 们 以 葡 聚 糖 和 聚 乙 二 醇 作为 二 相 系统 ,经 过 逆流 分 配 

操作 先后 分 离 了 不 同 株 的 大 肠 杆 菌 和 烟草 花 叶 病 毒 , 脊 髓 灰白 

Benge 质 炎 病毒 , 牛 癌 病 毒 和 echo WHS" 以 后 , VRC 

ED RAS MERA TSR RRS "+E RRE 

科学 院 有 关 研 究 所 也 先后 使 用 此 法 分 离 病毒 成 功 。 关 于 各 种 病毒 和 叹 菌 体 使 用 PEG 沉 

淀 所 选用 的 条 件 见 表 3-6。 沉 淀 后 所 得 的 含有 病毒 沉淀 物 ,可 用 透析 法 或 逆向 PEC 梯度 

离心 法 将 病毒 分 离 , 制 备 性 的 逆向 PEG 梯度 组 成 见 图 3-9。 含 病毒 的 PEG 沉淀 经 离心 
后 ,病毒 在 适当 的 PEG 浓度 下 , 则 被 分 配 在 一 多 窄 区 带 内 。 


待 溶解 含 病 
PEG 沉淀 


x 
洱 


《二 ) 核酸 方面 的 应 用 


用 葡 聚 糖 和 聚 乙 二 醇 作为 二 相 系 统 分 离 单 链 DNA、 双 链 DNA 和 多 种 RNA 制剂 , 
在 六 十 年 代 也 有 过 报导 。 近 十 多 年 来 发 展 很 快 , 特 别 是 用 聚 乙 二 醇 沉 淀 分 离 质粒 DNA, 
BH ei. KE 0.01M 磷酸 缓冲 液 中 加 聚 乙 二 醇 达 10% 浓度 , 即 可 将 DNA 沉 
省 下 来 。 在 遗传 工程 中 所 用 的 质粒 DNA 的 分 子 量 一 般 在 10' 范围 , 故 选用 的 PEG 分 
于 量 也 常 在 6000( 即 PEG 6000) 因 它 易 与 分 子 量 在 10° 范围 的 DNA 结合 而 沉淀 


ae 74 。 


e 表 3-7 用 PEG ARLATSHRSHREO? 
外 


4 | ik 度 
和 网 名 :和 人 Pic 3 ¥ 8 Ree 用 -的 .条 件 
i 氧化 钠 (M) | PEG (%) % 
一 “动物 病毒 ‘ae 
Echo 29 0.15 15.0 15,000 | pH 7.4,7.6 ae 
a 爱 淡 斯 坦 氏 -巴尔 氏 病毒 | 0.45 8.0 6,000 . 
) 4 口蹄疫 病 病毒 0.15 6.0 20,000 |0.02M Tris 组 冲 液 (pH 7.6) pbs: 
es 流感 病毒 0.9 7.5 盐水 (pH7.4) 
Ri 3.7 6,000 OA 
由 麻疹 病毒 0.4 8.0 6,000 vb, 
多 瘤 病毒 0.5 10.0 6,000 iy 
劳 斯 氏 肉瘤 0.4 7.0 6,000 Bes 
. 风疹 病毒 0.9 a3 盐水 (pH 7.4) a 
猿 猴 病 毒 40 0.5 10.0 6,000 aS 
= BRS - eh 
AAEM AE 0.2 8.0 | 20,000 | 叶 匀 浆 在 0.2M 磷酸 缓冲 液 中 (pH 6.5) a 
0.5mM ei 
苹果 绿叶 斑 病 毒 - 一 6.5 6,000 | 氧化 镁 bs 
HELM RBE 0.2 8.0 6, 000 . 
狼 把 草 斑驳 病毒 二 8.0 6,000 | 0.5M 磷酸 缓冲 液 C(bH7.5),0.55%6 NaSO,, 
1M 尿素 ,892 >z- 丁 醇 
淮 麦 草花 叶 病 毒 0.08 5.4 6,000 |pH 5.0 
Matyas 0.2 4.0 6,000 | pt4j3z 22°C 
DURA RAS 0.24 6.4 , 6,000 |pH 5.0 
FAA BE RS ry = 8.0 6,000 |0.5M 磷酸 缓冲 液 (pPH7.5), 0.5%NaSO,, ee 
IM 尿素 8%n-TR ea 
Dee Y ae age 8.0 6,000 | 同上 thi 
REARS 一 8.0 6,000 |pH 7.0 ; 
PAEMBE 0.1 4.0 6,000 |66mM RRR (pH 7.0) 
5mM Fi CE 
REM AE 0.3 2.0 6, 000 
RARE 0.3 8.0 6,000 
芜 鞭 黄花 叶 病毒 0.47 6.7 6,000 MRAM (pH 6.0) 
_ BRAS 一 2.0 6,000 |0.1M 磷酸 缓冲 液 (pH 7.5) 
三 “分 枝 杆 菌 叭 菌 体 
丁 酸 分 梳 杆 菌 0.5 9.0 6,000 
草 分 枝 杆 菌 0.5 6.0 6, 000 
BEERS) ART BB CV 72) 0.5 8.0 6, 000 
PaH, MEE 0.5 7-0 6,000 
Ry MARK 0-5, 6.0 6,000 
T, Mea 0.2 8.5 6, 000 
T, MERI 0.5 6.0 6,000 
PX174 叭 菌 体 0.5 10.0 6,000 
ARB HA 0.5 10.0 6,000 


《依照 Vaida 所 制 表格 * 删 去 部 份 无 关 的 内 容 ) 


(=|) 蛋白 质 和 酶 方面 的 应 用 
Polson AS Sl Ze 1964 年 已 开始 使 用 聚 乙 二 醇 分 离 纯 化 免疫 球 蛋白 , 以 后 关于 这 


e 754 


方面 报导 逐渐 增多 。 使 用 聚 乙 二 醇 的 分 子 量 多 为 2000 一 6000, 多 数 认 为 使 PEG 6,000 rt. 

淀 蛋白 质 较 好 ,但 是 近 有 报导 认为 低 分 子 量 的 PEG 也 获得 较 好 的 结果 。 用 聚 乙 二 醇 进 行 

酶 的 沉淀 分 离 , 有 人 认为 容易 引起 变性 , 早期 应 用 较 少 , 仅 有 少数 例子 如 黄 素 蛋 白 己 醇 氧 
化 酶 ,葡萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 等 的 分 离 纯化 29。 最 近 又 有 新 的 发 展 , 如 国内 从 大 肠 杆菌 中 : 
al LRA RS ODES LD IS -6- AS, EAT ROO 
淀 法 ,获得 了 很 好 的 效果 sa。 


三 、 应 用 实例 


关于 育 乙 二 醇 沉 证 分 离 方法 举例 如 下 : 
实例 一 ”水 稻 普 遍 矮 缩 病毒 的 分 离 ”” 


低温 冰冻 病 时 300 克 


加 900 毫升 ypH 7.0,0.1M 磷酸 组 
纱布 过 滤 , 7000 转 / 分 离心 20 分 钟 


| | 
上 清 沉淀 


加 20 一 2592《〈 体 积 比 ) 的 氯仿 ? 冰 浴 搅拌 或 分 液 漏斗 振动 5 分 钟 , 
FZ EBA SMR, 7000 转 / 分 离心 20 分 钟 。 


冲 液 绞 肉 机 绞 碎 , 


沉淀 bis 
MACHR 〈 分 子 量 为 12,000 oe 6,000) 到 6%, NaCl 
到 3% 冰箱 过 夜 , 7000 转 / 分 ,离心 20 分 钟 


上 清 沉淀 
加 60 6A 0.1M> pH 7.0. 碳酸 缓冲 沪 
抽 提 2000 转 /分 ,离心 20 分 钟 


bis 人 重复 二 次 


Sa vast 


St | pata ( 


加 少量 pH7.0,0.1M MaMa mig 
10°000 # /45 Bat 15 分 钟 ) 


重复 二 次 
沉淀 


ZA NARA SURN ile 
小 麦 病 苗 ( 鲜 重 300 克 ) 


加 900 毫升 0.3M 甘氨酸 (G..B) 内 含 0:01M MgCl, pH 8.0 缓冲 液 (内 
加 NaN; 40.01%) 用 绞 肉 机 或 高 速 组 织 的 碎 机 绞 碎 ?双重 纱布 过 滤 。 
汁液 


| 3000 ~5000 转 / 分 离心 10 一 15 分 钟 
沉淀 上 清 
加 20% CRE SG AEF} ie aL A 2 分 钟 , 弃 去 底部 白色 
| tee wt 4000 转 /分 离心 20 分 钟 


eee. 


沉淀 上 清 


_> | 加 聚 乙 二 醇 〈 分 子 量 为 12,0007 到 69%6。NaCl 到 3%, tt 
拌 均匀 置 冰箱 过 夜 ,7000 转 / 分 离心 20 分 钟 。 


! 清 Re 


加 0.1M 甘氨酸 MgCl, thik (pH 7.0) 
4) 3 倍 体积 抽 提 ,7000 转 /分 离心 20 分 钟 。 


| 


Lif 沉淀 
(三 次 合并 7) | 重复 二 次 
40,000 转 /分 全 -一 
离心 60 分 钟 
上 清 沉淀 
加 少量 pH7.0 0.1M G. B Hage 7000 转 / 分 
离心 15 分 钟 
Lif | 重复 二 次 
(三 次 合 


re 1. | 


上 清 
抗原 制剂 ( 约 1 毫升 ) 


实例 


肾上腺 葡萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 的 分 步 沉淀 ?94 

小 牛 肾 上 腺 体 在 含有 8- 斑 基 乙 醇 ,EDTA, 甘 油 的 磷酸 缓冲 液 (pH 8.0) 中 , 

匀 浆 , 提取 , 离心。 上 清 液 加 入 等 量 含 有 15% 乙醇 的 栈 酸 缓冲 液 中 (pH 4.5) 

进行 沉淀 沉淀 所 得 的 酶 ,再 深 于 上 述 提取 用 的 磷酸 缓冲 液 中 ,为 已 提纯 10 倍 比 
活力 一 3.0 RFR ARI BENE Ae 


MARC—H CPEG-6000) 使 浓度 达 992, 
停留 5 分 钟 ,35,000Xg 离心 30 分 钟 。 


| | 


沉淀 上 清 
〈 比 活力 0.03) 加 入 PEG-6000, 使 浓度 达 2392; 停 
TREE 相同 5 分 钟 ,35;000Xg 离心 30 分钟。 
沉淀 Lis 
( 比 活力 0.80) ees PEG-6000, 使 浓度 达 33%, 停留 
j 5 分 钟 , 35,000 Xg> Bt 30 分 钟 。 


77 e 


沉淀 表 
〈 比 活力 2.00) 加 人 PEG-6000, 使 浓度 达 4196。 停 
5 分 名 35,000xe Bpds 30 分 钟 。 


ibe 上 清 
( 比 活力 5.607) 加 入 PEG-6000 使 浓度 达 50%, & 
>———_ | 8 aris 35,000%2 Bit 30 分 钟 
沉淀 上 清 
Bere MA PEG-6000, SVE 70%. 
> | 8 Fs 35, 000% a 离心 30 分 钟 。 
沉淀 上 清 
( 比 活力 1.40) ( 比 活力 0.01) 


以 上 操作 均 在 4°C 下 搅拌 进行 ,从 图 解 可 见 酶 活力 主要 在 41 一 5092 浓度 的 
PEG 沉淀 部 份 。 沉 演 后 的 :PEG 可 以 通过 DEAE- 纤 维 素 以 除去 。 


SINT F fh a ce Hl 


除 上 述 各 节 应 用 较 普 遍 的 沉淀 剂 和 沉淀 方法 外 , 还 有 一 EOL Be AM IL YETI IK A LAAT 
某 些 物质 的 沉 剂 作用 。 


一 氨基酸 类 


例如 使 用 葵 偶 氮 葵 磺 酸 选择 性 地 沉淀 丙 氨 酸 和 丝氨酸 ,2, 4- 二 硝 基 茶 酚 -7- 磺 酸 选 
择 性 地 沉 深 精 氨 酸 ,二 氨 合 硫 氰 化 铬 贸 选 择 性 地 沉 省 且 氨 酸 和 产 且 氨 酸 等 。 


二 、 大 分 子 核酸 类 


多 价 阳 离子 鱼 精 蛋白 和 硫酸 链 霉 素 对 带 有 大 量 负 电荷 的 核酸 分 子 , 也 是 两 种 十 分 有 
效 的 沉淀 剂 。 但 由 于 沉淀 后 分 离 比较 困难 ,成 本 也 高 , 较 少 使 用 于 核酸 的 制备 , 主要 用 于 
制备 酶 时 选择 性 地 沉淀 除去 核酸 。 


=. oS TER 


一 些 粘 多 糖 的 沉淀 剂 , 除了 较 多 地 使 用 乙醇 外 , 十 六 烷 基 三 甲 基 季 胺 盐 的 溴 化物 ( 简 
称 为 CTAB), 十 六 烷 基 氯 化 吡啶 〈 简 称 为 CPC) 等 阳离子 表面 活性 剂 也 是 用 于 分 离 粘 
多 糖 的 有 效 沉 淀 剂 史 中。CTAB 具有 下 列 结构 : 

CH;—(CH:2) 4—CH2—N*(CH;,);—Br7~ 

地 胺 基 上 的 阳离子 与 粘 多 糖分 子 上 的 阴离子 可 以 形成 季 胺 络 合 物 。 此 络 合 物 在 低 离 
子 强度 的 水 溶液 中 不 溶解 ,但 当 溶液 离子 强度 增加 至 一 定 范围 , 络 合 物 则 逐渐 解 离 , 最 后 , 
溶解 。 除 了 离子 强度 的 影响 外 ,CTAB 对 各 种 粘 多 糖 的 分 级 沉淀 效果 与 各 种 粘 多 糖 硫酸 
化 程度 和 溶液 pH 值 有 关 。 由 于 CTAB 的 沉淀 效力 极 强 , 能 从 很 稀 的 溶液 中 (如 万 分 之 
一 浓度 ) 通 过 选择 性 沉淀 回收 粘 多 糖 。 


es 7T8 。 


Ci] 
[2] 


me 

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| [6] 
2 [7] 


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/ 


© 79 e 


第 四 章 ”生物 小 分 子音 用 色谱 分 离 法 
ERY RRE 


”我 们 所 需 的 生物 体 组 成 成 份 ,经 过 溶剂 提取 初步 分 离 , 常 选用 沉淀 方法 进行 粗 分 及 浓 
缩 , 接 着 上 柱 色谱 分 离 ,或 者 不 经 沉淀 分 离 直接 上 柱 进 行 色谱 纯 化 。 在 现代 生化 制备 技术 
中 ,色谱 分 离 占 有 核心 地 位 。 色 谱 方 法 按 分 离 机 制 的 不 同 可 分 为 吸附 色谱 、 分 配色 谱 、 离 
于 交换 色谱 、 凝 胶 过 滤 ( 或 分 子 筛 ) 色 谱 和 亲 和 色 谱 等 。 用 于 制备 量 色 谱 要 求 一 次 进 样 量 
大 并 容易 回收 ,故常 用 柱 型 色谱 , 板 状 薄 层 色谱 也 常用 于 小 量 样品 的 制备 , 且 有 快速 ,操作 
简便 的 优点 。 

应 用 色谱 分 离 方法 制备 的 生物 体 组 成 成 份 , 包 括 各 种 初级 代谢 产物 如 氨基 酸 、 核 阁 
呈 ` 单 糖 类 有 机 酸 、 脂 肪 酸 ;次 级 代谢 产物 如 生物 碱 \ 熙 类 、 糖 苷 \ 精 油 * 色 素 和 几 质 类 以 及 
各 种 组 成 生物 体 的 大 分 子 如 和 蛋白质, 多 肽 , 酶 ,核酸 多糖 等 。 这 些 物 质 使 用 色谱 分 离 制备 
时 , 常 根 据 它 们 之 间 分 子 结 构 和 化 学 特性 ,分 子 量 大 小 以 及 在 色谱 分 离 过 程 中 生理 活性 的 
稳定 情况 ,选择 不 同色 谱 方 法 。 蛋 白质 \ 酶 、 核 酸 等 生物 大 分 子 由 于 它们 分 子 量 大 , 容 易 在 
操作 中 失去 生理 活性 , 同 时 这 些 大 分 子 常常 具有 与 其 结构 相对 应 的 专 一 分 子 可逆 地 结合 
的 特性 (或 称 生物 亲 和 性 ), 较 多 地 选用 多 糖 基 离子 交换 色谱 、 分 子 筛 色谱 和 亲 和 色 谱 法 , 
这 几 种 色谱 方法 ,将 在 本 书 第 五 章 介绍 。 而 一 些 代谢 产物 即 各 种 类 型 的 生物 小 分 子 , 由 于 
它们 分 子 量 小 ,结构 和 性 质 比 较 稳 定 , 操 作 条 件 要 求 不 太 苘 刻 , 采 用 吸附 ,分配 柱 色 谱 和 离 
子 交 换 柱 色谱 进行 分 离 较为 适宜 。 其 中 氨基 酸 、\ 核 背 酸 \ 有 机 酸 等 一 些 离子 化 合 物 的 制备 
多 用 离子 交换 色谱 法 ,而 生物 碱 \ 车 类 \ 昔 类、 色素 等 次 生 代谢 小 分 子 则 多 采用 吸附 色谱 法 
或 反 相 分 配色 谱 法 分 离 。 现 根据 一 些 发 表 的 资料 , 统 计 近 年 来 植物 化 学 成 份 应 用 色谱 分 
离 技术 的 情况 如 下 呈 : 和 


分 离 手段 应 用 色谱 技术 占 总 的 分 离 方法 百分数 
硅胶 柱 色谱 49.4% 
制备 量 薄 层 色谱 16.4% 
氧化 铝 柱 色谱 10.1% 
溢 剂 法 7.3% 
ABE Bis 4.5% 
离子 交换 柱 色谱 3.8% 
SEE Ae 1.9% 
制备 量 气 相 色 谱 1.3% 
其 他 方法 5.3% 


HLABS KIVA ARERPEEKRADND Ble tO HRA CW 
硅胶 柱 色谱 方法 使 用 情况 最 多 ,其 次 是 各 种 制备 薄 层 色谱 。 

色谱 技术 近年 发 展 很 快 ,各 种 固定 相 填 料 〈 或 称 支持 剂 ) 型 号 日 益 增 多 ,分离 性 能 越 
来 越 好 ,各 种 色谱 附加 的 检验 系统 如 紫外 和 可 见 光 吸收 分 光 计 ,折光 计 , 获 光 计 等 装置 日 


e §0 e 


My 
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趋 完善 ,特别 是 高 效 液 相 色谱 系统 装置 的 出 现 (包括 分 配 与 吸附 ,离子 交换 , 凝 胶 过 滤 等 高 
效 液 相 色谱 ) ,不 论 在 柱 分 离 效 率 上 ,仪器 自动 化 程度 上 ,或 者 在 应 用 广泛 性 上 都 远 远 超过 
了 其 他 经 典 色 谱 方法 。 已 成 为 当前 生化 分 离 制备 最 有 效 的 手段 之 一 。 本 章 将 结合 生物 小 
分 子 的 分 离 制 备 介绍 吸附 色谱 法 、 离 子 交 换 色谱 法 和 高 压 液 相 色谱 法 。 

”但 应 该 指出 的 是 : “根据 分 子 大 小 和 某 些 化 学 性 质 分 别 选择 使 用 不 同色 谱 法 , 并 不 
意味 着 某 一 色谱 方法 只 适用 于 某 一 类 物质 , 只 能 说 某 类 物质 较 多 地 使 用 某 一 色谱 法 。 例 
如 , 高 效 液 相 色谱 最 初 只 应 用 于 小 分 子 物 质 , 最 近 出 现 使 用 了 凝 胶 固 相 及 改进 了 仪器 结 
构 , 应 用 于 生物 大 分 子 的 分 离 已 越 来 越 多 。 又 如 吸附 色谱 法 , 较 多 用 于 小 分 子 的 分 离 , 但 
其 中 磷酸 钙 凝 胶 吸 附 柱 色谱 却 十 分 适用 于 蛋白 质 的 分 离 , 迄 今 还 是 工业 上 和 实验 室 大 量 
制备 酶 的 常用 方法 之 一 , 亲 和 色 谱 方 法 绝 大 多 数 情况 用 于 生物 大 分 子 的 分 离 制备 ,但 反 过 
来 以 大 分 子 酶 作 配 基 , 相 对 应 地 吸附 一 些小 分 子 辅 基 或 酶 的 底 物 ,也 是 可 以 的 , 只 是 使 用 


机 会 较 少 而 已 。 


第 一 节 吸附 色谱 法 


吸附 色谱 法 是 指 混合 物 随 流动 相通 过 吸附 剂 时 , 由 于 吸附 剂 对 不 同 物质 有 不 同 的 吸 
附 力 而 使 混合 物 分 离 的 方法 。 

吸附 色谱 法 是 最 早期 的 一 种 色谱 分 离 技术 。1903 年 俄国 植物 学 家 User FSH EE 
研究 植物 色素 的 提取 物 ,以 石油 醚 冲洗 ,得 到 分 离 的 黄色 、 绿 色 区 带 , 故 称 为 色谱 分 离 法 。- 
1931 年 又 有 人 用 氧化 铝 柱 分 离 了 胡 梦 卜 素 的 两 种 同 分 异 构 体 , 显示 了 本 法 具有 较 高 的 分 
辩 率 ,同时 ,吸附 色谱 法 操作 较 简单 ,不 需 特 殊 的 实验 装置 , 分 离 物 质 的 量 小 至 毫克 ,大 至 
上 百 克 ,主要 应 用 于 某 些 分 子 量 不 大 的 物质 的 分 离 提纯 。 个 别 的 (如 羟基 础 灰 石 ) 也 适用 
于 生物 大 分 子 的 分 离 提纯 ,应 用 范围 比较 广 。 本 法 虽然 比较 古老 ,但 目前 仍 有 其 实用 的 意 
义 。 特 别 是 一 些 新 的 改良 的 吸附 剂 的 出 现 ,结合 快速 的 分 离 和 监测 器 ;如 高 效 液 相 吸附 色 
谱 法 的 发 展 ,赋予 吸附 色谱 技术 更 新 的 生命 力 。 


一 、 吸 附 过 程 的 本 质 


吸附 是 表面 的 一 个 重要 性 质 之 一 。 任 何 两 个 相 都 可 以 形成 表面 , 其 中 一 个 相 的 物质 
或 溶解 在 其 中 的 溶质 在 此 表面 上 的 密集 现象 称 为 吸附 。 在 固体 与 气体 之 间 , 固 体 与 液体 
之 间 , 吸 附 被 体 与 气体 之 间 的 表面 上 ,都 可 以 发 生 吸 附 现象 。 

凡 能 够 将 其 他 物质 聚集 到 自己 表面 上 的 物质 ,都 称 为 吸附 剂 , 聚 集 于 吸附 剂 表面 的 物 
质 就 称 为 吸附 物 。 既 然 吸附 是 发 生 在 表面 上 的 表面 现象 , 因 此 要 了 解 固体 吸附 剂 的 吸附 
作用 的 本 质 , 就 要 了 解 固体 的 表面 特性 。 

为 什么 分 子 能 在 固体 表面 停留 一 定时 间 呢 ? 这 是 因为 固体 表面 上 的 分 子 〈 离 子 或 原 
子 ) 和 固体 内 部 分 子 所 受 的 吸引 力 不 相等 。 在 内 部 的 分 子 , 分 子 之 间 相 互 作用 的 力 的 对 称 
的 ,其 力 场 互 相抵 消 ,而 处 于 固体 表面 的 分 子 所 受 的 力 是 不 对 称 的 , 向 内 的 一 面 受到 固体 
内 部 分 子 的 作用 力 大 ,而 表面 层 所 受 的 作用 力 小 ,因而 气体 或 溶质 分 子 在 运动 中 磁 到 固体 
表面 时 受到 这 种 剩余 力 的 影响 ,就 会 被 吸引 而 停留 下 来 。 


es @f s 


在 不 同 条 件 下 ,吸附 剂 与 被 吸附 物 之 间 的 作用 , 既 有 物理 作用 的 性 质 又 有 化 学 作用 的 
特征 。 物 理 作 用 又 称 范 德 华 吸附 ,是 分 子 间 相 互 作用 的 范 德 华 力 所 引 起 的 ,其 特点 是 无 选 
择 性 ,吸附 速度 快 ,吸附 的 过 程 是 可 逆 的 ,伴随 放出 的 能 量 较 小 ,吸附 不 牢 , 吸 附 的 分 子 是 
单 层 或 多 层 的 。 化 学 吸附 主要 是 由 原子 价 力 〈 化 学 键 ) 的 作用 引起 的 ,如 电子 的 转移 或 分 
子 与 表面 共用 电子 对 等 。 其 特点 是 有 选择 性 , 吸 附 速 度 较 慢 , 不 易 解吸 , 放 能 大 , 一 般 
吸附 的 分 子 是 单 层 的 。 物 理 吸 附和 化 学 吸附 可 以 同时 发 生 , 在 一 定 条 件 下 也 可 以 互相 转 
化 。 

由 于 吸附 过 程 是 可 逆 的 , 因 此 被 吸附 物 在 一 定 条 件 下 可 以 解吸 出 来 。 在 单位 时 间 内 | 
被 吸附 于 吸附 剂 的 某 一 表面 积 上 的 分 子 和 同一 单位 时 间 内 离开 此 表面 的 分 子 之 间 可 以 建 
立 动态 平衡 , 称 为 吸附 平衡 。 吸 附 色谱 法 过 程 就 是 不 断 地 产生 平衡 与 不 平衡 ,吸附 与 解吸 
的 矛盾 统一 的 过 程 。 


二 、 生 用 吸附 剂 的 特性 和 应 用 


(—) 硅胶 


是 应 用 最 广泛 的 一 种 极 性 吸附 剂 , 它 的 主要 优点 是 化 学 情 性 ,, 具 较 大 的 吸附 量 , 易 制 
备 不 同类 型 、 孔 径 、 表 面积 的 多 孔 性 硅胶 ,一 般 以 SiO,,, xH2O HARA. 
硅胶 制备 是 将 硅 酸 钠 溶 液 酸化 ,产生 硅 溶 胶 , 同 时 发 生 絮 凝 作 用 ,放置 一 定时 间 ( 陈 化 ) 
后 ,收集 沉淀 , 充 分 洗 去 可 溶性 杂质 , 干 燥 磨 碎 。 用 前 要 在 150~200 Met. Ae 
作用 的 速率 取决 于 pH。 在 pH 3 一 4 时 , 辊 凝 作 用 缓慢 , 产 生 了 大 的 表面 积 硅胶 《800 
米 "/ 克 ); 而 在 pHE6 时, 加 凝 作用 很 快 , 产 生 的 硅胶 结实 致密 , 其 比 表 面积 生 400 米 4/ 
克 。 
硅胶 的 吸附 活性 取决 其 含水 量 , 吸 附 色 
谱 法 一 般 采 用 含水 量 10~12 狗 的 硅胶 ;, 当 含 
50k | KENT 1S 时 活性 最 高 , 而 大 于 20 免 时 , 
吸附 活性 最 低 。 用 加 热 脱 水 法 可 使 硅胶 活 
化 。 图 4-1 表示 加 热 活化 温度 与 吸附 活性 之 
we 30 间 的 关系 。 
20 当 加 热 到 150sc 时 , 吸 附 剂 失去 物理 结 
合 的 水 ,活性 上 升 , 在 150~250°C 时 ,吸附 活 
性 几乎 恒定 , M4 NRE 250~400 时 , 失 
100 500 500 400 去 硅烷 醇 基 上 的 水 ,这 是 化 学 结合 水 ,从 而 使 
AT a ee 训 吸附 活性 下 降 , 加 热 400°C 以 上 时 ,由 于 部 份 
DEH EHO BER! AE GAY ee oe ESE AY Bt 7k FB eT EUG 35 
O 在 N: 中 活化 15 分钟 外 部 份 硅胶 颗粒 的 熔 结 , 而 使 吸附 活性 迅速 
@ 在 空气 中 活化 16 小 时 下 降 , 而 且 部 份 不 可 逆 , 至 1000sc 时 ,成 为 无 
水 Si9, 失 去 活性 , 因 此 硅胶 的 热 活化 通常 在 小 于 250%c 下 进行 。 
降低 活性 的 硅胶 (纯化 ) 能 显著 改善 分 离 性 能 ,增加 样品 的 负载 量 。Scott SM UAE 
胶 是 由 三 层 小 分 子 覆 盖 在 表面 上 ,如 下 图 式 所 示 : 


es 82 。 


4 


H<—FA=RBRBAVN F, 70°C MAR AF PRAY A Al ot REM Ho 


oa 


<—F_-—EBRNKD F, 120° MARA FRNA RARE 


Y 
x 


<- 一 第 一 层 强 吸 附小 分 子 ; 需 200 一 650%c 加 热 才 能 除去 ,为 氢 键 结合 的 小 分 子 。 


ok 
—Q—#—0—----0—----0—Z----0—-= 
fe 


O<—ZE 450° 1100°C 加 热 可 使 硅烷 醇 基 脱 水 成 醚 基 * 为 不 可 逆反 应 。 


O 


活性 硅胶 是 指 在 150~~195%c 加 热 活化 后 覆盖 有 第 一 层 小 分 子 的 硅胶 ,对 样品 溶质 分 
子 有 较 强 的 吸附 作用 ,其 缺点 是 活性 部 位 非 均匀 性 ,样品 的 线性 容量 明显 地 小 , 甚 至 产生 
催化 反应 或 不 可 逆 吸 附 。 采用 加 水 纯化 的 办 法 可 解决 ,一 般 100 米 ` / 克 比 表面 积 的 吸附 
剂 , 加 水 1 一 2 多 相当 覆盖 30~ 60% 的 吸附 剂 表面 , 能 提高 5 ~100 倍 样品 负载 量 。 
实验 表明 ,加 入 4 ~20% 水 的 硅胶 ,能 提高 柱 效 。 这 是 因为 加 水 后 , 表面 活性 部 位 纯 
化, 加快 了 样品 溶质 在 吸附 剂 上 的 吸附 和 解吸 过 程 , 另 外 ,由 于 硅胶 上 的 细 和 孔 被 水 堵 住 ”, 
也 改善 了 传 质 作 用 。 mh 

硅胶 的 吸附 活性 测定 可 用 偶 氮 染料 法 ,含水 量 与 吸附 活性 的 关系 见 表 4-1" 

硅胶 的 再 生 : 用 过 的 硅胶 用 5 一 10 倍 量 的 工 % NaOH 水 溶液 退 流 30 Osh, Aw ae, 
然后 用 蒸馏 水 洗 三 次 , 再 用 3 一 6 倍 量 的 5 多 醋酸 过 流 30 分 钟 , 过 滤 , 用 蒸馏 水 洗 至 中 
性 ,再 用 甲醇 洗 \ 水 洗 二 次 ,然后 在 120*c HEF YEE 12 小 时 , 即 可 重新 使 用 。 


(=) Bie . | 
以 氧化 铝 作为 吸附 剂 的 色谱 法 适用 于 亲 脂 性 成 分 的 分 离 制备 。 氧 化 铝 具 较 高 的 吸附 


容量 ,价格 低廉 ,分 离 效 果 好 ,因此 应 用 也 较为 广泛 。 
氧化 铝 的 吸附 原理 一 般 认 为 是 物质 与 氧化 铝 表面 上 的 羟基 形成 氢 键 (如 下 式 ), BR 


| 
oO 
ou 4 re) | O 
Dia aii, le da Se a 
Al Al Al Al Al 


H | H 
wes hw 

N 

O 


子 提供 亲 电 子 中 心 , 从 而 吸引 电子 供 体 基 团 ( 如 —OH, —NH)o 

影响 氧化 钻 吸附 色 谱 法 的 因素 很 多 , 操 作 时 要 注意 选择 具 适 当 活 性 及 适当 的 酸碱度 
的 氧化 铝 。 

用 于 吸附 色谱 法 的 氧化 钻 通常 可 按 制 备 方法 的 不 同 而 分 为 以 下 三 种 : 

1. 碱 性 氧化 铝 ”直接 由 氧 氧 化 铝 高 温 脱 水 而 得 , 柱 色谱 法 一 般 用 100~150 目 。 一 
ATK BERL pH 为 9 ~10, 经 活化 后 即 可 使 用 。 碱 性 氧化 铝 主要 应 用 于 碳 氧化 合 物 的 
分 离 , 以 碳 氧化 合 物 中 除去 含 氧化 合 物 以 及 某 些 中 性 、 碱 性 物质 的 分 离 。 


ss 83 。 


2. 中 性 氧化 铝 ”用 碱 性 氧化 铝 加 入 蒸馏 水 ,在 不 断 搅 拌 下 煮沸 10 分 钟 , MA LA 
液 。 反 复 处 理 至 水 洗 流 的 pH 为 7.5 左右 , 滤 干 活化 后 即 可 使 用 。 中 性 氧化 铝 使 用 范围 最 
广 ,适用 于 醛 、 酮 \ 醒 、 某 些 背 类 及 在 酸 碱 溶液 中 不 稳定 的 酯 .内 酯 等 化 合 物 的 分 离 。, 

3. 酸性 氧化 铝 ”氧化 铝 用 水 调 成 糊 状 ,加 入 2N 盐酸 ,使 混合 物 对 刚果 红 呈 酸性 反 
应 。 倾 去 上 清 沪 ,用 热 水 洗 至 溶液 对 刚果 红 呈 弱 紫 色 , 滤 于 活化 备用 。 酸 性 氧化 铝 适 用 于 
天 然 和 合成 的 酸性 色素 以 及 醋酸 的 分 离 。 水 洗 液 pH 为 4 一 4.5。 

氧化 铝 的 吸附 活性 与 含水 量 关 系 很 大 ,在 一 定 的 温度 下 除去 水 分 可 使 氧化 铝 活化 ,加 
人 一 定量 的 水 又 可 使 氧化 铝 活性 改变 。 活性 与 含水 量 的 关系 见 表 4-1。 

R41 和 氧化 铝 、 硅 胶 、 硅 酸 镁 的 活性 与 含水 量 关 系 


舌 tt CK) Rg) 
I 级 0 0 
II 级 3 5 
II 级 6 15 
IV 级 10 25 
V 级 15 35 


氧化 铝 活 性 的 测定 可 采用 薄 层 色谱 法 , 按 表 4-2, 所 列 的 Re 值 确定 活性 级 别 。 
表 4-2 测定 氧化 铝 活 性 的 Ri 值 
按 Brockmann 和 Schodder 划分 活性 5 


Il II IV V 

BAA 0.59 0.74 0.85 0.95 

对 - 甲 氧 偶 氮 茶 0.16 0.49 0.65 0.89 

苏丹 黄 0.01 0.25 0.57 : 0.78 

苏丹 红 aw) 0.00 0.10 0.33 0.56 

对 -氨基 偶 氮 苯 0.00 0.03 0.08 0.19 
(=) BHR 


CERWKRAIDADDR BORAT DROD=M DAADMNAS ABE 
BRBRtmR. THHEERKSRUAB MRE. MAE 700~800C Bier ts 
活化 ;经 适当 处 理 除 杂质 而 成 。 

根据 其 粗细 程度 活性 炭 可 分 为 以 下 三 种 : (1) 粉末 活性 炭 : MARA BRAK 
表面 积 大 ,吸附 量 及 吸附 力 大 ,但 因 颗 粒 太 细 ,流速 慢 , 故 一 般 柱 色谱 法 极 少 用 。(2) 颗粒 
eR: 颗粒 较 大 ,其 比 面 积 及 吸附 力 都 较 粉末 活性 炭 小 ,但 易 控 制 流速 ,便于 装 柱 使 用 , 
故 在 柱 色 谱 法 中 应 用 较 广 。(3) 锦纶 一 活性 炭 : 以 锦纶 为 粘 合剂 将 粉 未 活性 炎 制 成 颗粒 , 
比 表 面积 介 于 粉末 活性 几 和 颗粒 活性 炭 之 间 , 吸 附 能 力 较 两 者 弱 。 一 般 用 于 前 两 种 因 吸 
附 力 太 强 而 不 易 洗 脱 的 物质 。 

活性 火 的 吸附 作用 ,在 水 溶液 中 吸附 力 最 强 , 在 有 机 溶剂 中 吸附 力 较 弱 。 在 一 定 条 件 
下 ,对 不 同 的 物质 的 吸附 力 不 同 ,一般 说 对 极 性 基 团 (如 COOH、 一 NH:、 一 OH 等 ) 多 的 
化 合 物 的 吸附 力 大 于 极 性 基 团 少 的 化 合 物 。 在 酸性 溶液 中 活性 炭 的 吸附 力 大 , 在 pH 6.8 


。84 。 


以 上 ,吸附 能 力 较 差 。 活 性 炭 在 水 溶液 中 对 同系 列 有 机 化 合 物 的 吸附 量 , 随 吸附 物 的 分 子 
量 增 大 而 增 大 。 活 性 炭 对 化 合 物 的 吸附 力 一 般 认为 主要 为 范 德 华 力 。 

活性 火 用 前 需 活 化 ,一 般 在 150°C 加 热 4 一 5 小 时 ,将 吸附 的 大 部 分 气体 除去 ,对 于 锦 
纶 活性 几 , 因 易 受 热 变形 , 活化 时 常 不 超过 100°C, 


(四 ) RR 


聚 酰 胺 是 一 类 化 学 纤维 原料 ,国外 名 称 尼龙” ,我国 名称 锦纶 ”。 由 己 二 酸 与 已 二 胺 


FRE I RAINY FA25 66。 由己 内 酰胺 聚合 而 成 的 叫 锦纶 6 。 因 为 这 两 类 分 子 都 舍 有 大 量 的 
”酰胺 基 团 CPR ARKO 
聚 酰胺 柱 色 j 兽 特 别 适 用 于 低 分 子 量化 合 物 的 分 离 。 如 对 酚 RAR, DNP- eR, BR 


LESAN OD BEPC ATTIRE BLY ER 
是 成 线性 的 。 

聚 酰胺 具有 特异 的 色谱 分 辨 能力, 它 对 极 性 化 合 物 的 吸附 作用 ,是 由 于 聚 酰胺 与 被 分 
离 物 之 间 形 成 氢 键 , 如 酚 类 和 酸 类 是 与 其 羟基 与 酰胺 键 的 几 基 的 氧 形成 氢 键 。 被 分 离 物 


, 质 形成 气 键 能 力 的 强 弱 ,决定 了 吸附 力 的 大 小 。 在 色谱 过 程 中 , 洗 脱 剂 与 被 分 离 物质 在 聚 


酰胺 粒子 表面 上 竞争 形成 氨 键 ,可 选择 适当 的 洗 脱 剂 ,使 被 分 离 物 质 在 洗 脱 剂 与 聚 酰胺 表 
面 之 间 的 分 配 系数 有 最 大 差异 。 经 过 吸附 与 解吸 的 色谱 过 程 , 就 可 使 化 合 物 与 杂质 分 离 
Ako 

聚 酰胺 与 化 合 物 形成 氢 键 的 能 力也 与 所 用 的 溶剂 有 关 , 一 般 在 水 中 形成 氢 键 能 力 最 


强 , 而 在 有 机 溶剂 中 形成 气 键 能 力 较 弱 。 在 碱 性 溶剂 中 形成 氢 键 能 力 最 弱 。 


anise ahead haat B- ARMS AS RA DAN RAR 


《五 ) REZ OH 


Amberlite XAD —T 4 MAIER RAF, EC AAC i CARRS ko E 
的 比 表 面积 达 300 米 ?/ 克 ,和 孔径 约 90 人 ,虽然 它 是 多 孔 的 , 但 溶解 物质 穿 透 进 孔 内 的 能 力 
很 弱 , 吸 附 作 用 主要 发 生 在 吸附 剂 表面 上 。 聚 茶 乙 烯 对 化 合 物 的 吸附 作用 是 基于 化 合 物 
的 臣 水 基 与 非 极 性 吸附 剂 之 间 的 范 德 华 力 作用 。 

聚 茶 乙 烯 吸 附 剂 已 成 功 地 应 用 于 肉 香 味 前 体 的 水 溶液 分 离 ; 除去 过 量 的 蛋白 质 沉 演 
剂 昔 味 酸 ; 硝 基 和 和 氧 酚 的 分 离 ,Amberlite XAD-2 也 用 于 高 效 液 相 色谱 的 固定 相 “”。 


CR) RRS 


在 无 机 吸附 剂 中 ,磷酸 钙 是 唯一 的 适用 于 生物 活性 高 分 子 物质 (如 蛋白 质 ,核酸 ) 的 分 
离 的 吸附 剂 。 

Swingle 等 用 芒 糖 钙 的 水 溶液 加 入 磷酸 ,得 到 磷酸 钙 沉 证 ,用 于 蛋白 质 的 色谱 分 离 , 但 
为 了 获得 适当 的 流速 , 需 挨 加 硅 藻 土 。 后 来 , Tiselius 用 0.5M CaCh 加 0.5M 磷酸 二 钠 盐 , 
在 室温 下 反应 ,得 到 满意 的 流速 的 磷酸 钙 。CaHPO,. 2H,0 在 pH 7 以 上 , 慢 慢 变 为 羟基 
磷 灰 石 , 即 Cas(PO,),0H 放出 HsPO,. Levin 等 叙述 了 羟基 础 灰 石 的 制备 方法 ”。 

羟基 础 灰 石 主要 适用 于 蛋白 质 的 色谱 分 离 , 也 适用 于 较 小 分 子 的 核酸 , 如 转移 RNA 
的 分 离 。 


a“ 


Bernardi 等 用 几 个 合成 的 多 聚 氮 基 酸 在 羟基 础 灰 石上 进行 色谱 分 离 , 以 磷酸 盐 梯度 洗 
脱 , 研 究 其 对 蛋白 质 的 吸附 机 制 , 又 研究 几 种 蛋白 质 在 8 M 尿 素 存 在 下 或 无 尿素 下 的 色谱 
分 区 性 质 , 最 后 指出 , 磁 酸 钙 对 蛋白 质 吸 附 的 机 制 是 溶质 的 酸性 基 团 与 在 洗 脱 该 中 的 磷酸 
根 离子 对 吸附 剂 的 阳离子 钙 的 竞争 性 作用 。 对 核酸 分 子 的 吸附 机 制 也 与 蛋白 质 类 似 , 多 
核 昔 酸 的 负电 性 磷酸 基 与 羟基 础 灰 石 结晶 表面 上 的 阳离子 钙 之 间 的 相互 作用 , 糖 和 碱 基 
没有 直接 影响 。 例 如 , 叮 叭 和 喀 啶 碱 及 其 相应 的 核 苷 在 羟基 础 灰 石 柱 上 没有 阻 留 作用 (用 
0.001M 磷酸 缓冲 液 平衡 )。 而 单 核 苷 酸 则 稍 有 阻 渤 , 对 二 和 三 磷酸 酯 则 需 较 高 磷酸 盐 浓 
度 才能 洗 脱 下 来 。 多 聚 核 昔 酸 从 羟基 础 灰 石上 的 洗 脱 是 由 于 缓冲 液 的 无 机 磷 离 子 和 溶质 
的 磷 残 基 之 间 对 吸附 剂 上 鳃 离子 的 竞争 作用 。 

产 基 础 灰 石 对 于 分 辩 有 次 序 和 无 次 序 的 生物 大 分 子 结构 (包括 蛋白 质 和 核酸 ) 是 很 有 
用 的 一 个 吸附 剂 。 生 物 大 分 子 从 有 序 到 混乱 的 螺旋 变性 结构 过 程 中 常常 伴随 着 电 茶 密度 
的 降低 ,这 可 能 是 由 于 破坏 了 高 级 结构 ,离子 基 团 间 的 静电 排斥 的 结果 所 引起 的 。 


三 、 吸 附 柱 色 谱 的 实验 技术 


(—) 吸附 剂 的 选择 及 处 理 


吸附 剂 的 选择 是 吸附 色谱 法 中 的 关键 问题 ,选择 不 当 , 达 不 到 要 求 的 分 离 效果 。 因 为 
作为 吸附 色谱 中 的 吸附 剂 种 类 很 多 ,无 机 吸附 剂 有 硅胶 、 氧 化 铝 、 活 性 炭 、 硅 酸 镁 、 氧 化 镁 、 
碳酸 钙 、 磷 酸 钙 等 。 还 有 一 些 人 工 合成 的 硅 铝 酸 盐 (如 和 人造 沸 石 ); 有 机 吸附 剂 有 纤维 素 、 
淀粉 .蔗糖 、 聚 酰胺 等 。 而 对 吸附 剂 的 选择 尚 无 固定 的 法 则 ,一 般 需 通过 小 样 实验 来 确定 , 
但 要 注意 ,同一 种 吸附 剂 因 制备 及 处 理 方法 不 同 , 吸附 性 能 有 很 大 差别 。 例 如 ,活性炭 在 
500°C 活化 后 吸附 酸 而 不 吸附 碱 , 但 在 800°C 活化 者 却 易 吸 附 碱 而 不 吸附 酸 ; 硅胶 , 磷酸 
钙 凝 胶 的 吸附 能 力 与 陈 化 程度 有 关 。 

一 般 来 说 ,所 选 吸附 剂 应 有 最 大 的 比 表面 积 和 足够 的 吸附 能 力 , 它 对 欲 分 离 的 不 同 物 
质 应 有 不 同 的 吸附 能 力 , 即 有 足够 的 分 辩 力 ; 与 洗 脱 剂 、 溶 剂 及 样品 组 分 不 会 发 生化 学 反 
应 , 还 要 求 所 选 的 吸附 剂 颗粒 均匀 。 在 操作 过 程 不 会 破裂 。 吸 附 的 强 弱 可 概括 如 下 ; 吸 
附 现象 是 与 两 相间 界面 张力 的 降低 成 正比 , 某 物质 自 溶液 中 被 吸附 程度 与 其 在 溶剂 中 的 
溶解 度 成 反比 , 极 性 吸附 剂 易 吸 附 极 性 物质 , 非 极 性 吸附 剂 易 吸附 非 极 性 物质 , 同族 化 合 
物 的 吸附 程度 有 一 定 的 变化 方向 ,例如 , 同系 物 极 性 递减 , 因而 被 非 极 性 表面 吸附 的 能 力 
将 递增 。 

许多 吸附 剂 一 般 先 经 过 筛 取 得 较 均匀 的 颗粒 (100 一 200 A), HAAR AAR, 
可 用 有 机 溶剂 如 甲醇 乙醇 、 乙 酸 乙 酯 等 浸泡 处 理 或 提取 除去 , 有 些 吸 附 剂 可 用 沸水 洗 去 
酸 碱 使 呈 中 性 ,有 些 需 经 加 热处理 活化 。 


(=) 溶剂 与 洗 脱 剂 
溶剂 与 洗 脱 剂 实用 上 常 为 同一 组 分 , 但 用 途 不 同 。 习 惯 上 把 用 于 溶解 样品 的 溶液 称 
溶剂 。 把 用 于 洗 脱 吸 附 柱 的 溶液 称 洗 脱 剂 。 原则 上 所 选 的 溶剂 和 洗 脱 剂 要 求 纯度 合格 , 
与 样品 和 吸附 剂 不 起 化 学 反应 , 对 样品 的 溶解 度 大 , ME), Dish, 易 与 洗 脱 的 组 分 分 
开 。 常 用 的 溶剂 与 洗 脱 剂 有 饱和 碳 氢 化 合 物 \ 醇 \ 酚 \ 酮 , 醚 \ 贞 化 烷 \ 有 机 酸 等 。 选 择 深 剂 


es 86 e 


与 洗 脱 剂 时 ,可 根据 样品 组 分 的 溶解 度 \ 吸 附 剂 的 性 质 \ 溶 剂 极 性 等 方面 来 郑 虑 , 极 性 大 的 
洗 脱 能 力 大 ,因此 可 先 用 极 性 小 的 作 溶 剂 , 使 组 分 易 被 吸附 , 然后 换 用 极 舍 关 的 溶 讯 作 让 
脱 剂 , 使 组 分 易 从 吸附 柱 中 洗 出 。 

表 4-3 按 介 电 常数 反映 的 极 性 递增 顺序 列 出 了 各 种 稼 用 溶剂 。 


表 4-3 溶剂 的 脱 附 系列 〈 按 极 性 递增 排列 ) 


溶 剂 介 电 常数 (25sC) 溶 if 介 电 常数 (255%C) 
己 烷 1.89 KC 6.15 
庚 烷 1.92 Po ae mi 7.58 
RO 2.02 二 所 甲烷 9.14 

LAZAR 2.21 wx- 甲 基 丙 醇 〈2) 10.9 
四 毛 化 碳 吡啶 12.3 
x TH 15.8 

FAA a- FA AR C1) 17.7 
Zia TH 17.8 
乙醚 AR (2) 18.3 
=A Pk AB C1) 20,1 
甲酸 丙酮 20.7 
cx- 甲 基 丁 醇 乙醇 24.3 
乙酸 乙 酯 甲醇 33.6 


(=) 柱 的 装填 和 样品 的 加 入 


吸附 色谱 法 通常 采用 柱 型 装置 ,色谱 柱 一 般 为 玻璃 或 有 机 玻璃 管制 成 , 柱 下 端 装 上 一 
块 2 一 4 号 烧结 玻璃 或 垫 一 层 玻璃 丝 以 支持 吸附 剂 。 柱 高 与 直径 比 根据 实验 的 要 求 而 定 。 
BARR. BAY SRA Ra PERI ER. Pan AT AY eo FB EE HE 
出 管 , 并 在 胶管 上 装置 螺旋 夹 以 控制 流速 。 有 条 件 可 附加 压 或 减 压 装置 , 使 流速 保持 恒 
定 , 色 谱 柱 外 也 可 配 恒温 管 套 。 

装 柱 的 方法 通 和 党 是 将 一 种 在 适当 溶剂 中 的 吸附 剂 调 成 糊 状 , 慢 慢 地 倒 人 关闭 了 出 水 
马 的 柱 中 ,同时 不 断 搅拌 上 层 糊 状 物 , 赶 去 气泡 ,并 使 装填 物 均 匀 地 自然 下 降 ,装置 所 需要 
的 高 度 后 ,打开 出 水 口 ;让 溶剂 流出 。 注 意 柱 的 任何 部 分 不 能 流 干 , 即 是 说 ,在 柱 的 表面 始 
终 就 保持 着 一 层 溶 剂 。 

小 心地 用 移 波 管 把 样品 液 沿 绕 柱 内 壁 小 心地 加 入 , 不 要 冲击 着 吸附 剂 的 表面 。 加 样 
的 另 一 个 办 法 是 用 一 个 注射 器 或 蠕动 泵 把 样品 直接 送 到 柱 表面 上 。 


《四 ) 洗 脱 

在 整个 洗 脱 过 程 中 ,要 使 洗 脱 液 通过 柱 时 保持 恒定 的 流速 ,可 以 用 调节 “操作 压 ” 来 控 
制 (操作 压 相 当 于 在 柱 上 部 的 贮 液 瓶 中 溶剂 的 水 平和 柱 出 水 口 位 置 的 水 平 之 差 )。 另 一 
办 法 是 使 用 蠕动 泵 。 

洗 脱 过 程 中 柱 内 不 断 发 生 溶解 (解吸 ), 吸 附 , 再 溶解 , 再 吸附 。 被 吸附 的 物质 被 溶剂 
解吸 , 随 着 溶剂 向 下 移动 , 又 遇 到 新 的 吸附 剂 又 把 该 物质 自 溶剂 中 吸附 出 来 , 后 来 流下 的 


e 87 。 


» 
i, et ek ee i A, * i, 


新 溶剂 又 再 使 该 物质 溶解 而 向 下 移动 。 如 此 反复 解吸 ,吸附 , 经 一 段 时 间 后 , 该 物质 向 下 
移动 至 一 定 距 离 , 此 距离 的 长 短 与 吸附 剂 对 该 物质 的 吸附 力 及 溶剂 对 该 物质 的 溶解 能 力 
有 关 , 分 子 结构 不 同 的 物质 溶解 度 和 吸附 能 力 不 同 ,移动 距离 也 不 同 , 吸 附 较 弱 的 就 较 易 
溶解 ,移动 距离 较 大 。 经 过 适当 时 间 后 ,各 物质 就 形成 了 各 种 区 带 , 每 一 区 带 可 能 是 一 种 
纯 的 物质 ,如 果 被 分 离 物 质 是 有 色 的 , 就 可 以 清楚 地 看 到 色 层 。 随 着 洗 脱 剂 向 下 移动 , 最 
后 各 组 分 按 吸 附 力 的 不 同 顺序 流出 色谱 柱 , 以 流出 体积 对 浓度 作 图 ,可 得 由 一 系列 峰 组 成 
的 曲线 ,每 一 峰 可 能 相当 于 一 个 组 分 。 

如 果 样 品 中 含 组 分 较 多 , 某 些 组 分 吸附 力 相近 , 易 形成 两 峰 重 登 间 界 限 不 清 , 可 采用 
梯度 洗 脱 法 。 


第 二 节 ”离子 交换 色谱 法 


离子 交换 作用 是 指 一 个 溶液 中 的 某 一 种 离子 与 一 个 固体 中 的 另 一 种 具有 相同 电荷 的 
离子 互相 调换 位 置 , 即 溶液 中 的 离子 跑 到 固体 上 去 , 把 固体 上 的 离子 替换 下 来 。 这 里 , 溶 
液 称 流动 相 , 而 固体 称 固定 相 。 

自从 人 类 远古 的 时 代 , 就 知道 利用 这 种 离子 交换 现象 ,例如 用 砂粒 来 净 水 。 但 真正 了 
解 这 种 离子 交换 现象 的 机 制 以 及 在 实验 上 的 广泛 应 用 则 要 到 十 九 世纪 以 后 。1950 一 1955 
年 期 间 出 现 了 以 聚 两 乙烯 为 母 体 的 阳离子 和 阴离子 交换 剂 , 使 离子 交换 层 析 技 术 得 到 迅 
速 发 展 。 目 前 ,离子 交换 剂 已 发 展 到 数 百 种 ,各 种 离子 交换 色谱 法 已 成 为 最 广泛 应 用 的 色 
WAKZ—o 


一 、 离 子 交 换 剂 的 类 型 


(一 ) 聚 茉 乙烯 阳离子 和 阴离子 交换 树脂 


这 是 最 重要 的 一 类 离子 交换 树脂 ,由 葵 乙 烯 和 二 乙烯 茉 的 共聚 物 作为 骨架 ,再 引信 所 
需要 的 酸性 基 或 碱 性 基 。 例 如 聚 葵 乙 烯 磺 化 型 阳离子 交换 树脂 是 由 苯 乙 烯 (母体 ) 与 三 忆 
烯 茶 ( 交 联 剂 ) 共 聚 后 再 磺 化 引入 磺 酸 基 而 成 的 。 其 中 茉 乙烯 是 主要 成 分 ,形成 网 的 直 链 , 


其 上 带 有 可 解 离 的 磺 酸 基 ,而 二 乙烯 茶 把 直 链 交 联 起 来 形成 网 状 结构 ,所 得 的 产物 有 像 海 、 
绵 似 的 结构 , 磺 酸根 连 在 树脂 上 , 氢 离子 与 磺 酸 根 的 负电 荷 互相 平衡 , 颗 粒 内 部 就 像 一 


个 茶 磺 酸 的 浓 溶 液 , 只 是 负 性 根 不 能 自由 移动 , 只 有 和 氢 离 子 才能 与 外 来 的 离子 相互 交 
换 。 


CH=CH, CH=CH, 人 
aN aN zo Po ae 
Cede taleglewtre?sGoliak ube. Gd 
a SS A. Ferre 
CH=CH 

(〈 葵 乙烯 ) (=z) ----CH—CH,—CH—CH,—CH-=-- 
a “~ 


se 88 e 


= QO) 


| 
«---CH—CH—CH—CH,—CH--—- 
| | 


¢ s 
16 S 
i SO;Ht die 


调节 加 入 不 同 的 悬浮 液 稳定 剂 和 控制 介质 的 温度 、 粘 度 及 机 械 搅拌 速度 可 得 到 不 同 
大 小 规格 的 树脂 (直径 从 1 微米 至 2 BK), 而 改变 二 乙烯 茉 的 量 则 可 得 到 不 同 交 联 度 的 
树脂 。 

根据 引入 的 可 离 解 基 团 的 性 质 又 可 分 为 下 列 两 类 离子 交换 树脂 。 
1. 聚 茶 乙烯 阳离子 交换 树脂 “这 类 交换 剂 可 再 分 为 强酸 型 、 中 强酸 型 及 弱酸 型 三 
种 ;各 含有 以 下 的 可 解 离 基 团 。 


磺 酸 基 —SOFH* (GRAB AY) 


ya 
一 卫 

wil 一 ?oa 
Oo 


Vas 
亚 确 酸根 一 P 人 (中 强酸 型 ) 
|| Sou 
Oo . 


pc eee wo 
_ 磷酸 基 一 O 证 所 
O 
羧基 . —COOH (弱酸 型 ) 
这 些 交换 剂 在 交换 时 氢 离 子 为 外 来 的 阳离子 所 取代 ,如 下 式 所 示 : 


R—SO,H 十 Na+ = 有 一 SOINa + H* 


R—COOH + Nat —=R—COONa + Ht | 

2. FR CO Hh BA BS 32 Hh 5, FY FE Ky Be Wa EE: FE Hak HE Boe 5 Tk HE = AB, 1X = 2B 
都 是 含有 胺 基 , 碱 性 的 强 弱 按 胺 基 碱 性 强 弱 而 分 。 如 仿 季 胺 盐 [—N*(CH3)4] 为 强 碱 性 、 
叔 胺 [一 NGCCH3)]、 仲 胺 [一 NHCH:]、 伯 胺 [一 NH:] 类 都 属 弱 碱 性 、 既 含 强 碱 性 基 团 又 
含 弱 碱 性 基 团 即 为 中 强 碱 性 ,交换 时 反应 如 下 : 

R—N*(CH;),OH + Cl =R 一 N+CCH CI + OH™ 

+ R—N(CH;), + HCl==R—N(CH;)2 - HCl 
R—N(CH;). + H,O = = R—N(CH;),H,OH7 
R—N*(CH;)H, OH + Cl’ == R—N?*(CH;),H,Cl + OH™ 


«© 89 « 
‘ 


(> 聚 丙烯 酸 阳 离子 交换 树脂 
CH, CH, CH, 
a : —CH,— ee ae E ae 
| 


| | 
CH, CH—CH, COOH COOH | COOH 
| | Pas 
C=CH, + AY 
| 
COOH SR 
SS CH, CH, CH, 
| | | | 
CH=—CH,. —c—CH,—c—CH;—CH+cH,—c— 
| 
COOH COOH COOH 


是 由 甲 基 丙 烯 酸 和 二 乙烯 葵 聚 合 而 成 。 这 类 树脂 具 高 度 的 交换 量 , 每 克 于 重 树脂 可 
交换 10 毫克 当量 物质 。 在 pH 8 以 下 , 这 类 树脂 中 的 羧基 不 完全 解 离 , 因此 要 在 高 的 PS 
值 下 树脂 才 有 完全 的 交换 量 , 由 于 相 邻 羧基 距离 较 短 而 产生 的 缔 合 作用 , 故 有 很 高 的 表 观 
PK 值 , 在 低 离子 树脂 强度 下 特别 明显 。 这 种 高 度 缔 合 的 非 离子 化 凑 基 使 树脂 的 表面 形成 
一 个 杂 水 层 , 对 极 性 分 子 能 起 一 种 很 有 效 的 吸附 作用 。 

由 丙烯 酸 或 甲 基 丙 烯 酸 在 季 胺 型 阳离子 交换 树脂 (如 Dowex 1) 中 聚合 而 成 的 一 类 
At AB PR“ hE SE AAG” ~=(Snake-Cage resins) 人 


1 
1 
1 
cH— —CH,—Nt (CH,); —O—CO -ca 
ie Ss 


JEN 
| 
CH oe \ ons —N+ (CH,); —O— Coes 
| 站 全 
CH, | 
1 
1 


由 于 树脂 中 的 羧基 (一 COO- ) 和 季 胺 基 [一 N"(CH:)] 是 等 当量 的 , 故 树 脂 在 反应 上 
的 中 性 的 。 这 类 树脂 可 用 于 生物 化 学 上 的 脱盐 ,例如 一 个 NaCl 溶液 通过 这 类 树脂 柱 , 则 
Na* 为 树脂 中 的 —COO” PRA, 而 Cl” 则 为 季 胺 基 除 去 , 故 脱盐 后 的 溶液 没有 明显 的 pH 
改变 ,随后 用 水 洗 柱 即 可 回收 盐 。 这 类 树脂 也 可 用 来 从 电解 质 中 分 离 非 电解 质 ,因为 非 电 
解 质 直接 通过 柱 流出 。 另 外 也 用 于 从 大 分 子 的 等 电 点 两 性 电解 质 中 分 离 电解 质 , 因 为 前 
者 不 能 进入 树脂 的 网 孔 中 。 


(=) 其 他 离子 交换 剂 


例如 选择 性 离子 交换 剂 是 利用 某 些 特殊 的 有 机 试剂 可 与 某 些 金属 离子 起 选择 性 反应 
的 原理 而 制备 的 。 

整形 树脂 是 利用 金属 离子 与 有 机 试剂 生成 丈 形 化 合 物 的 性 质 而 制备 的 。 如 用 含 秒 的 
MHD SSAA wR A, 半 胱 氨 酸 、 谷 胱 甘 肽 等 )o 

吸附 树脂 是 一 类 有 很 大 的 表面 积 ,吸附 能 力 强 , 但 离子 交换 的 能 力 很 小 的 树脂 主要 用 
于 脱色 和 除去 蛋白 质 等 ,也 称 为 脱色 树脂 ” 

电子 交换 树脂 , 这 类 树脂 使 交换 的 不 是 离子 而 是 电子 , 交换 反应 一 个 氧化 还 原 反 应 , 
也 称 氧化 还 原 树 脂 "“。 可 用 于 氧化 剂 或 还 原 剂 再 生 , 由 于 上 述 几 种 离子 交换 剂 与 生化 物 


es。 90 。 


| 


下 


质 的 分 离 制备 关系 不 大 ,这 里 不 作 详细 介绍 。 


二 、 离 子 交 换 树 脂 的 性 质 


(一 ) 一 般 离子 交换 剂 的 特性 


1 多孔 性 树脂 为 莞 松 的 , 多 孔 的 网 状 物质 ,而 活性 基 团 一 般 都 处 于 树脂 网 孔 内 , 
外 来 离子 必需 进入 到 网 孔 内 才能 进行 离子 交换 。 
2. 不 溶性 。” 树脂 在 水 中 及 稀 酸 、 稀 碱 和 一 般 有 机 溶剂 中 都 不 溶解 ,经 常 维持 其 立体 


网 状 结构 。 


3. 稳定 性 离子 交换 树脂 具有 强 稳 定 的 化 学 性 质 , 母 体 本 身 不 与 酸 \ 碱 起 作用 。 例 
如 强酸 型 阳离子 交换 树脂 CDowex50, 国产 732 树脂 等 ) 很 稳定 ,可 使 用 几 百 次 ,其 交换 当 
BABAK, AKAN RIT 5 匈 NaOH, 0.1% KMnO,, H,0;, 0.1N HNO, 中 , 耐 热 性 
较 好 ,可 在 100°C 左右 处 理 。 一 些 强 碱 性 阴离子 交换 树脂 〈 如 Dowex 1, 国产 717% ”树脂 等 ) 
对 酸 碱 及 有 机 溶剂 稳定 ,但 在 浓 HNO; 中 不 稳定 。 一 般 游 离 型 ( 即 一 OH 型 ) 树 脂 , 其 耐 热 


” 性 较 差 (不 超过 45°C) 而 制 成 盐 型 (Cl 型 ) 则 耐 热 性 大 大 提高 ,可 耐 受 100°C 处 理 。 


4. 离子 交换 性 离子 交换 树脂 必需 具备 相当 数量 的 可 交换 离子 或 带电 基 团 , 这 些 
离子 或 基 团 的 类 型 决定 了 离子 交换 剂 的 类 型 , 而 基 团 的 总 数 和 它们 的 亲 和 性 决定 树脂 的 
交换 容量 。 

(二 ) 总 交换 量 | 
“总 交换 量 是 指 交换 剂 中 可 交换 离子 数 ,一 般 用 单位 重量 ( 干 树 脂 ) 或 单位 容积 Cab 


踢 7 交换 剂 所 能 交换 的 毫克 当量 离子 来 表示 , 即 毫 克 当 量 / 克 或 毫克 当量 /毫升 。 总 交换 量 


为 离子 交换 树脂 的 特性 ,与 操作 条 件 无 关 。 这 两 种 表示 法 之 间 的 关系 式 如 下 : 
Wwe WwW | 
| V. w 
Qv 和 Qw 各 为 体积 和 重量 表示 的 总 交换 量 ; Vt 为 总 床 体 积 ; V。 为 外 水 体积 ;W 是 树 

脂 含 水 量 的 百分数 ; 2 是 树脂 的 温 密 度 。 

以 上 的 方法 仅 适 用 于 一 些 能 穿 透 树脂 网 孔 进 入 树脂 内 部 的 小 离子 , 而 对 于 一 些 大 分 
子 的 多 电解 质 则 有 很 大 的 区 别 , 取 决 于 它们 穿 透 进入 树脂 的 能 力 。 

在 实验 条 件 下 所 得 到 实际 交换 量 称 为 有 效 交 换 量 ", 其 大 小 取决 于 活性 基 团 的 亲 和 
力 , 洗 脱 剂 的 浓度 ,离子 强度 , 反 离 子 性 质 及 活性 基 团 的 选择 性 。 


(=) 交 联 度 


合成 树脂 时 所 用 的 交 联 剂 (如 二 乙烯 葵 ) 在 原料 总 重量 中 所 占 的 百分比 叫做 树脂 的 交 
联 度 。 交 联 度 也 是 离子 交换 剂 的 一 个 重要 参数 , 交 联 度 的 大 小 与 树脂 的 膨胀 性 及 交换 量 
均 有 关系 , 交 联 度 越 大 ,树脂 的 网 孔 越 小 ,膨胀 性 小 ; 故 交 换 量 也 少 ;反之 , 交 联 度 越 小 , 网 
孔 越 大 , 孔 内 活性 基 团 越 多 , 故 交换 量 也 越 大 ,但 膨胀 性 增 大 ,从 而 易 引 起 树脂 的 机 械 变 形 


., Bo 


交 联 度 的 表示 方法 是 在 树脂 型 号 后 面 标明 共 聚 物 中 所 加 交 联 剂 的 比例 ,如 Dowex 1 


e 91 。 


X2 表明 为 Dowex 阴离子 交换 树脂 1 号 ,其 交换 度 为 2% ,Amberlite IR-120 (10%) 表明 
其 交换 度 为 10 多 。 而 国产 树脂 的 编号 规定 如 下 : 

强酸 : 1 一 100 弱酸: 101—200 

强 碱 : 200—300 5%: 301 一 400 

磷酸 : 401 一 500 

如 201X 7 表明 为 强 碱 性 阴 树脂 , 交 联 度 为 7 多 。 有 些 单 位 仍 沿用 原 有 和 名称 让 相 732 
1X7) 其 中 !L 为 强酸 编号 ,7 为 交 联 度 。 


(四 ) 离子 交换 剂 中 活性 基 的 性 质 


所 用 离子 交换 剂 的 性 质 决定 于 它们 功能 基 的 性 质 。 阳离子 交换 剂 的 活性 基 有 强酸 基 

(—SO;) 或 弱酸 基 (—COO~) 及 中 强酸 基 

A 〈(.POH-), 而 阴离子 交换 剂 的 活性 基 团 有 强 

碱 基 (-N*R;) 或 弱 碱 基 (-N*HR,) 等 , 它 
们 的 滴定 曲线 见 图 4-2。 

图 4-2a 中 曲线 A 是 聚 茶 乙 烯 磺 酸 型 阳 

0 区 离子 交换 树脂 的 滴定 曲线 。 在 pH2 以 上 , 磺 


中 


交换 量 
(毫克 尘 量 / 克 ) 


二 酸 基 完 全 离 解 , 树 脂 有 最 大 的 交换 量 ;曲线 了 
10 为 强 碱 型 聚 葵 乙 烯 阴离子 交换 树脂 的 注定 曲 
ap A, 带 有 季 腕 交换 基 , 在 pH 10 FRE 
a - 解 离 , 树 脂 有 最 大 的 交换 量 。 
38 ee | 图 4-2 中 曲线 Cy 和 C,, 表 示 一 个 弱酸 性 
m4 PLM AT ARE HR, SMa 
x, 强 碱 性 的 树脂 相反 , 曲 线 的 形状 明显 地 受 介 


质 的 离子 强度 所 影响 。 曲 线 Ce 是 在 水 中 , Cy 
DR 是 在 0.1 M NaCi 中 。 从 曲线 中 可 看 到 ,交换 


an 量 随 pH AMR RA, He DARK 


图 4-2 离子 交换 树脂 的 注定 曲线 
¥ : 完全 离 解 。 


(A) 离子 交换 树脂 对 离子 的 亲和力 


溶液 中 某 一 离子 能 否 与 交 联 剂 上 的 离子 进行 交换 主要 取决 于 离子 的 相对 浓度 质量 
作用 ) 与 交换 树脂 对 离子 的 相对 亲和力 。 一 般 说 来 , 电 性 越 强 , 越 易 交 换 , 对 于 阳离子 树 


脂 ,在 常温 常 压 的 低 浓 度 溶 液 中 ,交换 量 随 交 换 离子 的 电价 增 大 而 增 大 ,如 Nat < Catt 


Al** << Tit***, 如 原子 价 数 相 同 , 则 交换 量 随 交换 离子 的 原子 序数 的 增加 而 增 大 , 


Lit < Na* < K*<Pb*Ss*, 阴离子 也 有 一 定 的 规律 ,在 常温 常 压 下 低 浓度 溶液 中 强 碱 性 


交换 树脂 的 各 负电 性 基 团 的 离子 亲和力 次 序 如 下 : CHCOO 二 FE 二 OH - 二 HCOO 二 
Cl- < SCN7 < Br> < CrOF < NOZ <I < C,OF < SOF < FF RB. 

弱 碱 性 阴离子 交换 树脂 对 OH 有 极 高 亲和力 ,对 各 负 性 基 的 亲和力 次 序 如 下 : 

RF < Cl < BrX 三 和 一 CHICOO- < MoOF < POF < AsOF < NO; < BARR < 


«92 。 


性 阴离子 交换 树脂 的 滴定 曲线 ,在 pH5 以 下 4 


让 


柠 嵌 酸根 -< Croz < SOF < OH- 


三 、 离 子 交 换 的 动力 学 


在 溶液 中 的 盐 (B*S ) 中 的 阳离子 Bt 与 一 个 完全 解 离 的 树脂 盐 CATR) 上 的 阳离子 
At 发 生 交换 的 过 程 可 分 为 以 下 五 个 阶段 : 

(1) 离子 B+ 扩散 到 交换 树脂 的 表面 。 

(2) BF BY 通过 树脂 孔 中 的 液体 扩散 到 颗粒 网 孔 内 可 能 交换 的 位 置 上 。 

3) BF BSA 进行 离子 交换 ,这 个 过 程 是 一 个 平衡 的 过 程 。 

《4) BT AT 通过 树脂 孔 的 液体 扩散 到 树脂 的 表面 。 

GS) BT A* 最 后 扩散 到 外 部 溶液 中 。 

以 上 1、2、4、5 阶段 的 动力 是 次 透 作 用 , 它 们 服从 Fick 的 扩散 定律 。 阶段 3 为 树 
脂 盐 CA*R™) 1 (BTR) 之 间 的 化 学 电位 的 差别 所 决定 。 

Boyd 等 “对 整个 交换 过 程 作 了 理论 上 的 分 析 , 假定 离子 B* 进入 树脂 的 量 很 小 , 故 离 
FA” 的 浓度 不 变 * 可 以 用 放射 性 示 踪 离子 B` 来 进行 实验 。Reichenberg 更 进一步 扩充 了 
这 个 理论 , 假 定 有 相当 量 的 离子 BY 进入 树脂 相 中 。Boyd 及 后 来 的 研究 者 都 认为 ”, 对 于 
小 的 无 机 离子 ,交换 过 程 3 不 是 决定 交换 速率 的 阶段 ,因为 假如 B 与 A* 的 交换 是 决定 整 
个 交换 过 程 的 速率 AA AT 应 与 树脂 的 颗粒 大 小 无 关 , 但 事实 上 在 所 有 的 动力 学 研究 中 
都 表明 并 非 如 此 。 

Boyd 等 把 交换 过 程 1 和 5 称 为 外 扩散 或 膜 扩 散 , 过 程 2 和 4 称 颗 粒 扩散 或 外 扩散 。 并 
推导 出 膜 扩 散 或 颗粒 扩散 的 交换 动力 学 公式 , 指 出 其 交换 速率 的 控制 过 程 可 以 从 时 间 
一 一 百 分 交 换 量 的 曲线 形状 推导 出 来 。 


Tam =. Ds) be 
oF EEX Ve 
D,. 和 Da EE REAMI REPT RAM, CEDAR, 是 颗粒 半径 ,5 是 在 
离子 交换 树脂 周围 固定 相 液 膜 的 厚度 。 
T (bb 1 小 时 说 明 颗 粒 扩散 为 交换 过 程 速 率 的 主要 控制 过 程 , 而 工 值 比 1 大 则 表示 


ey BoE AER 

从 上 式 中 也 明显 地 看 到 ,在 Ds 值 ( 高 交 联 度 、 紧 密 的 交 联 剂 结构 ), 低 “ 值 ( 低 交 换 量 ) 
AUK 5《〈 低 流速 , 因 5 与 线性 流速 成 反比 ) 如 有 利于 颗粒 扩散 ,相反 对 于 松散 的 交换 剂 结构 
高 “ 值 、 低 六 速 、 颗 粒 小 (这 些 条 件 通常 认为 有 助 于 提高 色谱 效率 ) 的 情况 下 , 则 有 利于 膜 
扩散 。 

虽然 在 离子 交换 树脂 中 ,扩散 系数 D,/Da 的 比率 通常 较 小 〈0.01 一 0.1), 但 交换 速率 
仍 为 颗粒 扩散 所 控制 ,用 多 糖 离 子 交换 剂 色谱 时 ,,D,/Da 较 大 〈0.1 一 1.0), 所 以 通 篆 用 于 
高 分 辩 率 的 色谱 ,其 交换 速率 主要 为 膜 扩 散 所 控制 。 

膜 扩散 控制 的 交换 过 程 的 速率 通常 比 颗粒 扩散 慢 10~~100 倍 , 大 分 子 溶质 在 两 相 的 
扩散 系数 都 较 小 ,例如 在 多 糖 离子 交换 剂 上 的 大 分 子 色谱 , 其 离子 交换 速率 较 慢 ,这 一 点 
地 支持 了 膜 扩 散 控 制 的 主张 e 


es 93 ws 


四 、 离 子 交 换 剂 的 选择 


(—) 选择 交换 剂 时 要 考虑 下 列 的 一 些 因素 


被 分 离 物 质 带 何 种 电荷 ;分 子 的 大 小 ; 被 分 离 物质 所 处 的 环境 , 环境 中 是 否 有 其 他 离 
子 的 存在 ;这 些 离子 的 电 性 ,数量 如 何 ;被 分 离 物 的 物理 化 学 性 质 , 是 否 耐酸 、 碱 \ 高 温 等 ; 
被 分 离 物质 的 大 概 数量 等 。 

在 阳离子 交换 剂 中 以 磺 酸 型 应 用 最 广 , 它 在 酸 及 中 性 溶液 中 均 可 使 用 ;简单 及 复杂 的 
无 机 及 有 机 离子 都 可 交换 , 但 带 正 电荷 的 胶体 和 高 分 子 的 阳离子 则 不 能 被 交换 或 交换 很 
少 。 对 于 一 些 两 性 化 合 物 , 如 分 子 较 小 的 氨基 酸 也 可 进行 交换 。 含 有 苯酚 的 磺 酸 型 树脂 
不 宜 在 碱 性 溶液 中 应 用 。 羧 酸 型 的 阳离子 交换 剂 较 有 选择 性 ,可 用 于 强 碱 与 弱 碱 分 离 ,也 
可 用 于 碱 性 氨基 酸 与 其 他 氨基 酸 的 分 离 , 此 类 交换 剂 对 氨 离 子 有 特大 的 亲和力 ;少量 的 酸 
就 可 把 碱 置换 掉 , 故 再 生 手 续 简便 。 

阴离子 交换 剂 与 阳离子 交换 剂 相 似 , 强 碱 型 树脂 应 用 范围 广 ,在 酸性 溶液 中 强 碱 型 与 
弱 碱 型 均 可 使 用 ,但 弱酸 与 碳酸 硼酸、 硅 酸 等 不 能 与 弱 碱 型 树脂 产生 交换 作用 ;必需 用 强 
碱 型 树脂 才 可 除去 。 在 中 性 溶液 中 ,以 用 强 碱 型 或 中 强 碱 型 树脂 为 宜 , 而 在 碱 性 溢 液 中 则 
只 有 强 碱 型 树脂 才 适 用 。 


(=) 交换 剂 的 处 理 及 转型 


商品 的 树脂 是 干 树脂 ,使 用 前 要 用 水 浸透 使 之 充分 吸水 膨胀 ,又 因 含 有 一 些 水 不 溶性 
的 杂质 , 故 要 用 酸 、 碱 处 理 除去 。 步 又 如 下 : 干 树脂 用 水 漫 泡 2 小 时 后 减 压 抽 去 气泡 * 倾 
EK ALSTKESBE, 倾 去 水 后 加 入 4 倍 树脂 量 的 2N_ HCL, 搅拌 四 小 时 除去 酸 
液 ,水 洗 至 中 性 ,再 加 4 倍 量 2 N NaOH, 搅拌 4 小 时 ,除去 碱 液 ,水 洗 至 中 性 备用 。 

根据 需要 用 适当 的 试剂 ,使 树脂 成 为 所 需要 的 型 式 〈 称 为 转型 ), 阳 离子 交换 树脂 用 
HCl 处 理 则 转 为 Ht 型 ,用 NaOH 处 理 则 为 Na+ 型 ,用 NHIOH 处 理 为 NH+ 型 ;阴离子 交 
换 树 脂 用 HCL 处 理 则 转 为 Cl” 型 ,用 NaOH 或 NH,OH 处 理 为 一 OH- 型 , 用 甲酸 签 处 理 
为 甲酸 型 。 其 

树脂 长 期 使 用 后 ,如 杂质 含量 太 高 , 则 可 在 酸 碱 处 理 前 用 沸水 处 理 , 或 用 热 酸 与 热 碱 
处 理 , 甚 至 用 有 机 溶剂 (如 乙醇 \ 丙 酮 等 ) 处 理 , 再 用 水 洗 干净 。 

树脂 保存 时 以 盐 型 较 稳定 。 用 过 的 树脂 一 定 要 洗 干 净 ,防止 发 霉 。 如 短期 存放 ,可 保 
存 于 LN NaOH ( 阳 树 脂 ) 或 1 N HCL( 阴 树脂 ) 中 。 


(=) RERMFE 


实验 室 的 离子 交换 柱 一 般 用 玻璃 或 有 机 玻璃 制 成 ,下 部 有 缩 口 , 管 底部 烧 接 上 3 Se 
芯 滤 板 或 垫上 玻璃 纤维 ,下 口 带 有 调节 活塞 (如 图 4-3)。 柱 的 大 小 视 需 要 而 定 , 可 根据 被 
交换 物质 的 数量 和 交换 剂 的 总 交换 量 来 决定 。 工 厂 也 有 用 离子 交换 缸 的 〈 如 图 4-4)o 一 
般 用 塑料 或 不 锈 钢 为 材料 ,在 饶 中 有 分 布 液体 用 的 交换 器 及 支持 树脂 的 筛 板 ,为 了 便于 反 
冲 , 饶 的 上 部 需 留 有 足够 空间 ,为 咏 止 酸 碱 的 腐蚀 , 饶 用 涂料 保护 的 钢板 ,或 用 耐酸 碱 的 塑 
料 制 成 。 


es 94 。 


图 .4-3 ”离子 交换 色谱 装置 图 4-4 BT Ace 


离子 交换 剂 的 装 柱 与 一 般 柱 色谱 法 相同 , 主要 是 防止 出 现 气泡 和 分 层 , 装填 要 均匀 。 
防止 产生 气泡 和 分 层 的 方法 是 装 柱 时 柱 内 先 保持 一 定 高 度 的 水 〈 一 般 为 柱 高 的 1/3), 加 
和 树脂 时 使 树脂 借 水 的 浮力 慢 慢 自然 沉降 。 

装 柱 完 毕 后 ,用 水 或 缓冲 液 乎 衡 到 所 需 的 条 件 , 如 特定 的 pH 值 . 离 子 强度 等 , 即 可 上 
样品 液 。 上 柱 中 的 二 不 重要 问题 是 控制 流速 的 加 压 或 减 压 装置 , 尤 其 是 采用 细 长 柱 或 细 
目的 交换 剂 。 外 加 可 用 减 压 法 ,也 可 用 
加 压 法 , 前 者 是 在 柱 的 排出 口 增设 抽 
气 装置 (工业 生产 上 多 用 此 法 ); 后 者 
是 用 打气 人 和 柱 的 方法 进行 加 压 的 ,( 见 
图 4-5) ,这 是 最 简单 的 装置 ,用 一 个 装 


图 4-5 简便 加 压 装 置 图 4-6 自动 加 压 装置 


有 样品 液 的 分 液 漏 斗 与 柱 用 橡皮 塞 连接 , 分 液 漏斗 上 端 串 有 压力 计 并 经 缓冲 瓶 与 打气 管 . 


相连 ,, 当 达 到 所 需 压 力 时 就 将 打气 管 夹 紧 , 假如 树脂 为 100 目 , 柱 高 7.2 厘米 , 柱 内 径 1.2 
厘米 时 采用 30 厘米 汞 柱 压 力 就 可 达到 2 毫升 /分 的 流速 。 

国内 有 的 实验 室 采用 自己 设计 制造 的 自动 加 压 装 置 , 如 图 4-6 所 示 , 操 作 时 首先 移动 
压力 计 左 侧 的 白金 丝 , 使 它 的 尖端 处 于 所 需要 的 压力 位 置 上 , 插 人 电源 ,马达 即 起 动 , 压 缩 
空气 很 快 进 入 色谱 柱 , 同 时 压迫 压力 计 中 水 银 柱 , 使 压力 计 左 侧 水 银 上 升 , 当 水 银 受 压 上 
升 接触 到 白金 丝 尖 端 时 , 因 白金 丝 与 继电器 相连 而 使 空气 压缩 机 马达 断路 。 经 过 一 定时 
间 后 , 因 色 谱 柱 中 液体 的 流动 , 外 压 逐 渐 下 降 , 压力 计 中 水 银 柱 也 随 之 下 降 而 与 白金 丝 脱 
离 , 此 时 继电器 恢复 原状 ,马达 又 起 动 。 由 此 周而复始 ,保持 色谱 柱 中 稳定 的 压力 , 即 得 到 
恒定 的 流速 。 


《四 ) 洗 脱 


对 分 离 不 同 的 物质 所 用 的 洗 脱 液 也 不 同 , 原 则 是 用 一 种 更 活泼 的 离子 把 交换 上 的 物 


质 再 交换 出 来 。 常 用 的 洗 脱 剂 为 酸 类 、 碱 类 或 盐 类 的 溶液 ,改变 整个 系统 的 酸碱度 和 离 寺 


强度 ,以 使 交换 物质 的 交换 性 能 发 生变 化 ,已 交换 上 去 的 物质 就 逐渐 洗 脱 下 来 。 为 了 提高 , 


分 辩 率 , 常 采用 梯度 洗 脱 法 ,装置 上 有 如 下 三 种 设计 (图 4-7)。 


图 4-7 梯度 洗 脱 装置 
(a) 凸 形 梯度 装置 (b) 线性 梯度 装置 (c) 非 线性 梯度 装置 (Cd) 浓度 梯度 曲线 
图 4-7 (2) 包括 一 个 洗 脱 液 储存 器 A 和 混合 室 B 相连 ,混合 室 又 与 柱 连 接 , 混合 室 中 
装 和 色谱 分 离开 始 使 用 的 溶剂 ,储存 器 A 包 括 的 洗 脱 液 用 以 增加 流动 相 的 洗 脱 能 力 , 液 流 
从 B 流入 往 中 ,而 洗 脱 液 将 以 同样 流速 从 A 到 B, 所 以 在 B 中 液体 体积 不 变 。 洗 脱 液 和 深 
剂 的 混合 设置 有 电磁 搅拌 卫 以 使 混合 均匀 。 
这 种 装置 产生 一 个 凸 形 指数 梯度 ,以 下 式 表示 : 


* 96 « 


a wr ee 


iT rs 


Cy = CA 一 (C, — Cy) Y e Vp 


Cy 是 体积 V 后 洗 脱 液 的 浓度 ,CA 是 储存 器 A 中 的 浓度 ,Ca 是 开始 在 混合 室 B HE 
脱 液 的 浓度 , Ve 是 在 B 中 液体 体积 。 

这 种 装置 现 已 很 少 应 用 。 

图 4-7 〈b) 包括 两 个 同一 横 截 面积 的 容器 A 和 B, 连 接 在 一 起 , 故 两 者 的 液 面 保持 
一 致 ;在 B 室 中 有 电磁 搅拌 以 保证 混合 均匀 , 管 F 把 层 析 柱 C 和 B 室 连接 起 来 。 在 流出 体 
ARV JB 室 中 洗 脱 流 的 浓度 Cy 可 由 下 式 计 算 : 

人 


tot 


CA 和 Ca 各 为 容器 A 和 3 中 溶液 的 浓度 。 
Vee 为 开始 在 两 个 容器 中 液体 总 体积 。 
4-7 (c) 表示 容器 A 和 B 不 需要 相同 的 横 截 面 , 洗 出 体积 V 后 洗 脱 波 的 浓度 计算 如 


Cy = Cy — (Ca — ) (1 - v Vrs 


tot 


Ax 和 As SHAE ARB 的 横 截 面积 ,其 他 符号 同上 。 
图 4-7 (d) 表示 浓度 梯度 曲线 , 当 As = As 时 为 线性 梯度 , Aa > As 时 为 凸 形 梯度 , 
Aa 一 Ag 时 为 凹 形 梯 度 。 


五、 离子 交换 色谱 法 的 应 用 


《一 ) 氨基 酸 


离子 交换 树脂 用 于 氨基 酸 的 系统 分 离 研究 工作 已 有 几 二 年 的 历史 , 但 早期 的 工作 效 
果 不 大 满意 , 特 别 是 对 碱 性 氨基 酸 回收 率 很 差 。 自 从 Moore 和 Stein” 引进 了 两 根 层 析 柱 
分 离 氨基 酸 的 方法 之 后 ,在 氨基 酸 系 统 分 离 方面 有 了 很 大 的 发 展 。 方 法 是 在 Dowex 50X 8 
的 100 厘米 层 析 柱 上 分 离 酸性 和 中 性 氨基 酸 , 开 始 洗 脱 液 为 pH 3.41 的 柠檬 酸 钠 (37.5%C ), 


天 四 a 
门 硫 苏 丝 4g Ti Fe 
中 fae meek 
i am i 2 al 区 
0.4 a 酸 氨 Re a 
0.3 酸 酸 所 | 酷 两 
x i A 所 
0.2 Ee 酸 酸 
id Wt ee 
0. 枫 = 酸 


0 25 50 75 100 125150 175.200 225 250275 300 325 350 375 400 425 450 475 0 25 50 75100 125 
上 一 150cm 长 柱 ,pH3.25,- 一 十 一 150cm 长 柱 ,pH4.25 | 50cm 短 柱 ,PH5.2 
0.2 NV 柠 楼 酸 钠 0.2 信 柠檬 酸 钠 0.35.VET RRA 
图 4-8 氨基 酸 自动 色谱 仪 对 各 种 氨基 酸 分 离 结果 


ae 97 e 


= © 


= ee 


Oe a OE Sy Te OR ee ey ee 
7 站 


RAVER A pH 4.25 的 柠檬 酸 钠 (50°C); FA 15 厘米 的 Dowex 50 X 8 层 析 柱 , 以 磷酸 
AGT BAH (pH 6.8 和 6.5) 洗 脱 分 离 色 氨 酸 和 碱 性 氨基 酸 及 游离 氮 。 

到 1958 年 , 以 上 的 手工 分 离 方法 被 氨基 酸 自动 色谱 仪 所 代替 ,Moore 等 四 用 粉 状 树 
H$ Amberlite IR-120 (400 一 600 目 ), 150 X 0.9 厘米 层 析 柱 以 分 离 中 性 和 酸性 氨基 酸 , & 
个 操作 过 程 在 50°C 下 进行 , 仅 用 一 种 缓冲 液 , 从 0.2 M 柠 檬 酸 钠 (pH3.25) 到 0.2 M 柠檬 
酸 钠 (pH 4.25), 而 碱 性 氨基 酸 的 分 离 则 在 15 X 0.9 厘米 的 短 柱 上 用 同样 树脂 进行 , 以 


-0.3 M 柠檬 酸 缓冲 液 (pH 5.28) 50° 下 洗 脱 ,其 分 离 结果 如 图 4-8。 


(二 ) 糖 
离子 交换 色谱 法 也 可 用 于 中 性 不 带电 荷 的 糖 类 的 分 离 。 主 要 原理 是 利用 糖 和 硼酸 盐 
生成 的 糖 -硼酸 盐 复合 物 有 离子 性 质 , 从 而 可 用 离子 交换 层 析 法 分 离 。 某 些 多 羟基 化 合 物 
包括 糖 ) 在 碱 性 溶液 中 和 硼酸 盐 离 子 反应 生成 稳定 的 复合 物 , 可 包括 以 下 三 种 形式 : 
| | | 
—C—O H —C—oO o— C— 
和 
[了 [LI {iil | 
[1] 型 实际 上 是 非 离子 化 的 形式 , 而 (1) 和 [II] 型 在 碱 性 溶液 中 是 完全 离子 化 的 , 
为 中 等 强度 的 酸 。 这 些 化 合 物 的 形成 为 以 下 的 因素 所 决定 : 糖 的 绝对 浓度 , 硼 酸 盐 的 离 
子 浓度 ,两 者 的 比率 。 在 低糖 浓度 和 低 的 糖 /硼酸 盐 的 比率 下 ,主要 产生 [1] 型 复合 物 。 
Khym 和 Zill!?) 用 强 碱 型 阴离子 交换 树脂 Dowex-1 层 析 分 离 果糖 、 半 乳糖 和 葡萄 
糖 的 混合 物 , 用 0.016M K,B,O, 洗 脱 果糖 和 半 乳 糖 , 以 0.3 M K,B,O, 洗 脱 葡萄 糖 。 这 个 
方法 也 可 用 于 寡 糖 和 六 元 醇 的 分 离 c0, 如 山梨 糖 醇 、 半 乳糖 醇和 甘露 糖 醇 可 在 Dowex-1 
硼酸 柱 上 用 K.BO, 溶液 洗 脱 , 其 中 甘露 醇 由 于 它 的 一 对 顺 式 二 烯 基 而 在 柱 上 产生 强烈 
的 滞留 。 
对 单 糖 和 低 聚 糖 的 分 离 如 采用 硼酸 盐 复 合 物 阴 离子 交换 体系 , 虽 然 具 有 较 高 的 分 辩 
力 , 但 由 于 流速 慢 ,溶质 要 暴露 在 碱 性 条 件 中 的 缺点 ,不 如 采用 分 配 层 析 为 佳 。 


| 一 
C 一 O 

有 
| > BOH 


Ht Ht 
—c—o 


OD 260 x 50 
= 


5 x 
1.038 be 
i rs 
0.5+| jis 
UMP UO CMP AMP 
10x3 20x3 30 x3 40 X3 50x3 


V=NO x3 立 升 
4-9 阳离子 交换 柱 分 离 四 种 单 核 苷 酸 曲 线 及 pH 值 变化 曲线 


°® 98 e 


Ste ee a ee 
7, 


(=) 四 种 5 - 单 核 昔 酸 的 分 离 ” 


在 pH1.5 时 ,AMP、CMP、GMP 上 的 氨基 离 解 , 带 正 电荷 可 被 阳离子 交换 树脂 所 吸 
Bio UMP 没有 氨基 ,不 带 正 电荷 ,大 部 分 直接 流下 来 。 当 用 无 离子 水 洗 脱 时 , 随 着 pH 值 
的 变化 , GMP, CMP, AMP 上 的 氨基 解 离 度 降 低 的 程度 不 同 , 而 先后 失去 阳离子 交换 树脂 
上 的 吸着 能 力 , 按 GMP, CMP, AMP 的 顺序 依次 洗 脱 下 来 。 结果 如 图 4-9。 

树脂 : 聚 葵 乙 烯 -二 乙烯 苯 磺 酸 型 ,200~300 目 ,1 X 8。 柱 : 10 X 58 厘米 。 上 
柱 量 : 占 树 脂 全 交换 量 1.7 狗 


(四 ) Dowex-1 PRA WIRES BRE, AMP, ADP 和 ATP 


分 离 条 件 如 下 : 树脂 : Dowex-1 甲酸 盐 。 柱 : 1 X 30 BK Rink: SSHARA 
AMP, ADP 和 ATP 各 10 毫克 , 调 pH 至 7.9。 
LA D-SN 甲酸 线性 梯度 洗 脱 


吸收 度 260 mm. 


和 
组 分 X10 
图 4-10 在 Dowex-1 甲酸 盐 树脂 柱 上 腺 苷 、AMP、ADP 和 ATP 的 分 离 图 谱 54 
(五 ) 图 4-11 为 人 血红 蛋白 的 氨 乙 栈 化 B8 链 的 胰 和 蛋白酶 水 解 物 的 色谱 分 离 ” 


实验 条 件 如 下 : 柱 0.9 x 18 HK. WHE: 磺 化 阳离子 交换 树脂 Spinco 15A, 在 50°C 
下 以 线性 梯度 洗 脱 (混合 室 : 250 毫升 0.2 M 吡啶 醋酸 缓冲 液 pH 3.1; 贮存 室 : 250 毫升 
2.0M 吡 啶 醋酸 缓冲 液 , pH 5) 流速 , 300 毫升 /小 时 。 


第 三 节 高效 液 相 色谱 法 
| 


Dll 


高 效 液 相 色谱 (简称 HPLC) 是 最 近 十 多 年 兴起 来 的 一 门 新 技术 , 它 最 主要 的 特点 是 
流动 相 在 高 压 泵 作用 下 高 速 地 能 准确 控制 流量 地 通过 色谱 柱 。 使 样品 中 各 组 分 在 流动 相 
和 固定 相 之 间 迅 速 地 达到 平衡 ; 其 次 采用 了 封闭 的 能 重复 使 用 的 柱子 并 特殊 制作 了 各 种 
类 型 固定 相 , 这 些 固定 相 不 仅 具 备 体 积 小 、 均 匀 而 且 有 耐 压 和 传 质 快 等 特点 ,使 色谱 分 离 
效率 大 大 提高 , 一 般 定 量 分 析 可 达 +1% 准确 度 。 用 于 制备 色谱 时 又 可 以 连续 操作 。 每 
次 制备 样品 量 最 高 可 达 克 量 级 。 高 效 液 相 色谱 不 同 于 气相 色谱 是 对 分 离 的 样品 类 型 具有 


aa 99 e 


非常 广泛 适应 性 ,样品 还 可 以 回收 。 从 各 种 无 机 化 合 物 、 
有 机 化 合 物 到 具有 生理 活性 的 各 种 生物 大 分 子 ; 极 性 的 
和 非 极 性 的 都 适用 ,此 外 整个 仪器 装置 自动 化 程度 很 高 , 
附加 的 各 种 检测 器 种 类 繁多 , 因 此 , 高 效 液 相 色 谱 已 成 
为 现代 化 学 和 生物 化 学 分 析 和 制备 最 有 力 武器 之 一 。 在 
生化 领域 中 广泛 应 用 于 下 列 产物 的 分 离 和 鉴定 :《1) 氢 
基 酸 及 其 衍生 物 ; (2) 有 机 酸 ; (3) 省 体 化 合 物 ;(4) 生 物 
碱 ; (5) 抗菌 素 ; (6) 糖 类 ;(7)nk 啉 ;〈8) 核酸 及 其 降解 
产物 ; (9) 蛋白 质 、 酶 和 多 肽 ; (10) 脂 类 等 。 

高 效 液 相 色 谱 的 分 离 原 理 与 经 暴 色 谱 相同 , 主 要 是 
各 种 溶质 在 色谱 柱 中 差 速 迁 移 的 结果 。 这 种 差 速 迁 移 现 
象 ,是 样品 在 固定 相 和 流动 相 之 间 分 配 不 同 所 引起 的 ,所 
以 按照 固定 相对 样品 的 保留 作用 机 理 不 同 , 高 效 液 相 色 
谱 常 分 离 以 下 几 类 ; 

1. 液 一 液 分 配色 谱 ”又 可 分 为 正 相 色谱 和 反 相 色 
谱 。 正 相 色谱 以 极 性 较 强 的 填料 作 固 定 相 , 而 以 极 性 较 
小 的 溶剂 作 流动 相 , 极 性 较 强 的 化 合 物 被 保留 , 极 性 弱 的 
化 合 物 先 被 洗 脱 下 来 。 反 相 色 谱 则 固定 相 极 性 小 , 流 动 
相 极 性 大 , 用 于 分 离 非 极 性 或 弱 极 性 物质 。 

2. 液 一 固 吸 附 色谱 

3. 离子 交换 色谱 

4. 凝 胶 色谱 

此 外 最 近 正 出 现 高 效 聚焦 色谱 和 和 蛋白 质 快速 液 相 色 
谱 (FPLC) 等 主要 是 高 效 离子 交换 剂 和 琼脂 糖 凝 胶 等 色 
HATE AR. SAMBO RE. | 


—=— (ml) 
“al 4-11 AMAA AA CRC He C100 mg) 的 胰 蛋 白 酶 水 解 物 的 制备 色谱 图 


一 、 高 效 液 相 色 谱 仪 概述 


高 效 熙 相 色谱 仪 主要 由 高 压 泵 、` 色 谱 柱 \ 检 测 器 三 大 
部 分 组 成 。 附 件 可 增设 自动 记录 仪 、 洗 脱 液 自动 部 分 收 
SICKER RARER RIE ES. fis 
柱 是 获得 良好 分 离 率 的 核心 部 件 , 但 好 的 色谱 柱 必须 配备 优良 的 整 机 装置 ,才能 获得 满意 
的 结果 。 图 4-1 是 高 效 液 相 色谱 仪器 装置 示意 图 。 现 按 仪器 各 个 部 分 作 一 简单 介绍 : 

LBA ROE) ”商品 贮 饶 是 用 不 锈 钢 制 成 , 常 附 加 脱 气 设备 如 搅拌 、 
加 热 \ 抽 真空 和 歇 氮 等 。 自 制 简单 溶剂 糟 可 用 玻璃 瓶 代替 。 

2. 溶剂 程序 控制 器 , 主要 用 于 梯度 洗 脱 , 梯 度 的 形成 可 分 党 压 混 合 和 高 压 混合 两 
类 。 前 者 是 在 常 压 下 将 溶剂 混合 再 用 单 泵 输送 给 色谱 柱 。 后 者 是 不 同 溶剂 用 双 泵 在 高 压 
条 件 下 混合 , 目 动 化 程序 较 高 , 可 在 较 大 范围 的 流速 600 毫升 一 3 升 /小 时 ) 和 较 长 时 间 
范围 内 〈15 分 钟 至 16 天 ) 获 得 梯度 。 


* 100+ 


Myre Fi TNE 
让 


a a a are 


= 


| eae | 淤 剂 程序 控制 器 | 


| 过 站 器 | | 
| 一 一 
= 
—_ BER 
| | 样品 注射 器 或 进 样 闽 | 


| 
| ae] 


4-12 高 效 小 相 色 谱 仪 装置 示 意图 


,3. 高 压 泵 “是 高 效 液 相 色 谱 主要 部 件 之 一 , 可 用 优质 不 锈 钢 或 陶瓷 制 成 。 有 较 强 
抗 化 学 侵蚀 性 和 抗 机 械 破 损 性 能 。 输 出 压力 最 高 达 350 至 400 巴 ( 约 为 5 一 6 千 磅 /英寸 )。 
常 分 机 械 泵 和 气动 泵 两 大 类 ,使 用 时 各 有 优 缺 点 , 对 于 制备 色谱 来 说 ,一 般 要 求 泵 压 没有 
分 析 色 谱 高 。 但 希望 有 较 大 流量 。 一 个 好 的 泵 应 该 是 工作 压力 范围 大 , 没 有 输液 脉冲 或 
者 很 小 的 输液 脉冲 (脉冲 对 荧光 、 紫 外 检测 影响 较 小 ,对 化 学 检测 影响 较 大 ,有 时 需 加 脉冲 . 
阻尼 限制 器 以 减弱 之 )。 

4. 进 样 装置 ”最 简单 的 方法 是 使 用 注射 器 ,注射 器 进 样 隔膜 的 设计 应 能 承受 高 压 , 
多 用 硅 酮 弹性 体 或 氯 丁 橡胶 制 成 。 另 一 种 是 进 样 痉 , 能 在 高 压 下 操作 而 无 扰 流 , 宜 于 大 体 
积 样品 的 注入 , 注射 器 和 进 样 阀 见 图 4-13。 

5. 检测 器 检测 器 是 高 效 液 相 色谱 仪 的 眼睛 ,必须 具有 足够 灵敏 度 , 而 且 要 求 适应 
条 件 范围 比较 广 些 ,最 常用 的 检测 器 有 : 

C1) 紫外 吸收 光度 计 : 凡是 有 紫外 吸收 的 化 合 物 都 可 以 使 用 。 使 用 最 多 的 波长 有 
280 毫 微米 , 260 毫 微米 (蛋白 质 类 ), 254 CARMA), 210, 206 亳 微 米 等 。 有 一 个 以 上 的 双 
键 生 色 团 的 化 合 物 都 能 产生 紫外 吸收 。 有 些 蛋 白质 如 r- 球 蛋白 在 206 毫 微米 比 在 280 毫 
微米 的 吸收 度 大 40 倍 。 故 选择 波长 范围 时 还 需 依 不 同化 合 物 具体 情况 而 定 。 

(2) 示 差 折光 计 : 也 是 应 用 较 广 的 检测 器 之 一 。 多 应 用 于 脂 质 、 糖 类 物质 沙 色 的 测 
定 。 在 适当 的 条 件 下 能 检测 到 3 微克 /毫升 的 样品 量 , 人 缺点 是 对 温度 比较 敏感 


*,101 。 


FIR 
图 4-13 HSA AAA 


表 4-4 SHR SHH —ER 


一 | 一 | 一 -| 一 -一 | 一 一 | 一 | 一 | 一 


紫 外 
参 
(吸收 值 ) 
选择 性 
用 于 梯度 洗 脱 可 
线性 动态 范围 上 限 | 2.56 
线性 范围 5X 10¢ 


HEX 1% 噪音 下 满 | 0.05 
刻度 灵敏 度 


对 合适 样品 灵敏 度 | 5 又 10-2 


be / EF 
对 流速 敏感 性 无 
对 温度 敏感 性 低 


* 也 称 火焰 离子 化 检测 器 


折光 | 溶质 迁移 * 极 谱 
(折光 指 
数 单位) | CER CED 
普 #43 选择 性 | 选择 性 
不 可 可 可 未 定 
10-3 10-* “| 无 现成 数据 | 2x10-7 
10* ~105 大 104 
10-5 10-2 | 无 现成 数据 | 2X10-。 


5X10’ |10-* si /#] 50 Be/ |} 10-'° 
克 / 毫 升 |( 约 5XI0-| “毫升 克 / 毫升 
克 / 毫升) 
zi 有 区 下 有 
VT 0 可 忽略 可 忽略 | 1.5%/°C 


红外 
荧光 “| 电导 ( 微 欧 ) 
(吸收 值 ) 
选择 性 选择 性 选择 性 
可 可 -| 不 可 
1.5 | 无 现成 数据 | “1000 
10¢ 一 10 | 2%10¢ 
0.01 0.005. | 0.05 | 


10- = {10-*~10-*9) —10-* 
克 / 毫 升 | 克 / 毫 升 | 克 / 毫升 


无 无 有 
低 AK 2% /°C 


(3) 放射 性 检测 器 : 主要 利用 色谱 柱 中 流出 含有 放射 性 标记 的 溶质 与 检测 圳 中 闪烁 
体 接 触 时 产生 脉冲 而 被 检 出 。 多 用 于 代谢 途径 中 间 产 物 的 分 离 。 

(4) 欧 光 检测 器 : 也 是 一 种 受 干扰 小 , 灵 敏 度 很 高 的 测验 方法 。 只 要 能 在 紫外 光 激 
发 下 能 发 射出 荧光 的 溶质 都 可 以 使 用 。 灵 敏 度 可 达 10°—10-" 克 / 毫 升 。 HT AHR 
基 酸 、 胺 类 维生素 、 当 醇化 合 物 的 测定 。 

此 外 ,还 有 溶质 迁移 检测 器 或 称 火焰 离子 化 检测 器 , 极 谱 检 测 器 , 电 导 检 测 器 等 。 溶 
质 迁 移 检测 器 对 样品 有 一 定 破坏 性 ,制备 分 离 中 比较 少 用 , 由 于 制备 色谱 、 溶质 的 浓度 一 
般 都 比较 大 ,对 检测 器 灵敏 度 的 要 求 没有 分 析 色 谱 那 样 严格 ,在 高 效 液 相 色谱 中 , 一 些 向 


102。 


用 的 检测 器 有 关 规 格 性 能 见 表 4-4。 
三 、 高 效 六 相 色谱 的 固定 相 填 料 


经 典 液 相 色谱 所 用 的 多 孔 物 质 如 硅胶 、 氧 化 铝 , 离 子 交 换 珠 等 ,由 于 粒度 大 , 传 质 慢 而 
不 均匀 ,造成 谱 带 扩 散 严重 ,影响 了 柱 的 分 离 效率 。 针 对 上 述 缺 点 , 高 效 液 相 色谱 所 用 的 
国定 相 填 料 大 部 分 具有 实心 圆 核 外 右 多 孔 薄 层 构成 , 使 溶质 在 多 孔 薄 层 中 易于 出 人 。 另 
一 种 是 形状 规则 的 全 多 和 孔 微 粒 (直径 一 般 在 5 一 10 um 左右 ), 这 样 小 的 颗粒 ,溶质 在 孔 中 
移动 的 距离 是 很 短 的 ,以 上 结构 都 使 溶质 易于 在 二 相 之 间 达 到 平衡 ,加 快 分 离 速 度 和 提高 
分 离 效率 。 形 状 规则 的 填料 及 均匀 装填 都 使 样品 分 离 获得 良好 重 现 性 。 现 代 高 效 液 相 色 
Me AOE AR HA PULA: 

1. 按 形状 可 分 为 球形 和 无 定形 两 类 , 圆 球形 填料 有 利于 分 离 效率 和 重 现 性 。 

2. 按 硬度 可 分 为 硬 质 填料 , 半 硬 质 填料 凝 胶 及 一 些 如 琼脂 糖 的 生物 软 胶 。 

3. 按 结构 可 分 为 表面 多 孔 薄 层 填料 与 完全 多 和 孔 填料 两 类 : 

现 根 据 不 同色 谱 的 要 求 ,介绍 一 些 常用 固定 相 填 料 的 名 称 及 其 主要 结构 的 性 质 。 


《一 ) 液 一 液 分 配色 谱 常 用 的 固定 相 填 料 


液 一 液 分 配色 谱 的 固定 相 一 般 多 选 表面 积 小 ,孔径 较 大 的 为 填料 ,全 多 孔 和 表层 多 筷 
TAR BE AT tle KK A IR, EBA: 

1. 全 多 和 孔 硅 珠 : 如 商品 名 Porail 或 Spherosil, 

2. 表层 多 和 孔 硅 胶 : 如 商品 名 Zipax 和 Corasil, 

3. 化 学 键 合 相 : 是 在 表面 多 孔 或 全 多 和 孔 的 小 球 上 经 过 化 学 反应 结合 上 一 层 固 定 相 。 
有 的 在 多 孔 硅 珠 上 用 醇 类 脂 化 生成 脂 化 硅 质 填料 ( 刷 型 ) 如 商品 名 Durapak , 或 经 硅烷 化 
生成 聚 硅 氧 烷 型 ( 涂 层 型 ) 盾 料 如 商品 名 Permaphase, 以 上 化 合 键 合 相 固定 相 都 比较 稳定 , 
不 易 在 使 用 中 脱落 。 


《二 ) 液 一 固 吸附 色谱 常用 的 固定 相 填 料 

与 经 典 吸 附 色 谱 相 似 , 需要 选择 良好 表面 吸附 性 能 的 物质 , 其 中 极 性 吸附 剂 有 硅胶 、 
BUC AR, ERR (Florisil) 等 。 非 极 性 吸附 剂 有 活性 央 。 如 按 结构 和 性 质 不 同 又 
可 分 为 : 

1. 全 多 孔 高 效 吸附 剂 ”如 全 多 和 孔 硅 胶 〈 商 品 Porasil A-F), 全 多 孔 氧 化 铝 〈 商 品 
Bio-Red AG) 等 。 

2. 全 多 孔 低 效 吸附 剂 ”如 多 和 孔 硅 胶 ( 商 品 Divason Code 800)。 

3. 表面 多 孔 吸 附 剂 ”如 薄 壳 型 硅胶 《商品 Corasil ID 及 用 于 制备 高 容量 薄 壳 型 氧 
化 铝 ( 商 品 Pellumina HC), 


(三 ) 离子 交换 色谱 常用 固定 相 填料 


主要 有 离子 交换 树脂 制 成 的 微 网 或 大 网 状 结构 的 全 多 和 孔 颗 粒 , 或 在 固体 惰性 核 上 涂 
渍 一 层 多 孔 离 子 交 换 剂 而 成 薄 索 结构 。 离 子 交换 剂 的 骨架 有 聚 葵 乙 烯 , 葡 萄 糖 和 纤维 素 


e。 103。 


等 。 它 们 都 可 以 带 上 大 量 可 交换 基 团 。 一 些 以 糖 基 为 骨架 的 离子 交换 剂 适 用 于 分 离 各 种 
生物 大 分 子 物质 ,使 用 较 多 的 有 : 
弱 碱 性 DEAE Sephadex A25,A50。 
强 碱 性 QAE Sephadex A25,A50。 
弱酸 性 CM Sephadex C25,C50。 
强酸 性 SP. Sephadex C25, C50, 


四) 凝 胶 色 谱 常 用 固定 相 填 料 


用 于 凝 胶 色 谱 的 凝 胶 有 : 

1. 软 胶 和 半 硬 胶 , 如 葡 聚 糖 凝 胶 〈Sephadex) 交 联 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 (Bio-gel-P) 和 琼 
Ht (Sepharose) 等 ,这 些 凝 胶 多 使 用 水 或 缓冲 液 作 流动 相 , 凝 胶 承 受 压 力 较 低 , 一 般 在 
7 一 14 BZ, 过 去 由 于 高 效 液 相 色谱 高 压 泵 的 设计 未 能 满足 这 一 技术 要 求 ; 在 生化 中 实 
际 应 用 很 少 。 近年 来 由 于 制 出 了 流速 低 而 稳定 的 低压 有 及 各 种 防止 缓冲 液 中 金属 的 腐 亿 
的 装置 ,生物 凝 胶 类 填料 才 广泛 用 于 HPLC。 

2. 刚 性 和 半 刚 性 凝 胶 , 包 括 刚 性 多 孔 玻 璃 和 多 孔 硅 胶 ( 商 品 Bio-glas, Porasil 和 Merck- 
O-gel-Si 等 ); 半 刚性 聚 葵 乙烯 珠 (商品 Poragel,Styragel,Bio-Bead-S) 乙烯 乙酸 脂 珠 ( 商 
品 Merck-O-gel-OR), 以 上 刚性 和 半 刚 性 凝 胶 一 般 汐 可 承受 60 一 70 巴 以 上 压力 ,并 能 在 
有 机 溶剂 中 使 用 。 


四 、 色 谱 方法 的 选择 


待 分 离 样 品 对 色谱 法 的 选择 主要 基于 样品 的 物理 化 学 特性 及 溶解 度 。 对 于 一 个 未 知 
样品 ,首先 要 大 概 了 解 它 的 分 子 大 小 ,然后 进一步 试验 其 溶解 性 能 。 根 据 分 子 大 小 和 溶解 
性 能 便 又 粗略 地 选 定 一 种 色谱 柱 进行 初 分 .一 般 来 说 ,吸附 色谱 多 适用 于 非 极 性 样品 , 它 的 
柱 容 量 主要 决定 于 吸附 剂 表 面积 的 大 小 。 离 子 交 换 色 谱 和 液 一 液 分 配色 谱 多 用 于 水 溶性 
样品 , 柱 容 量 分 别 决定 于 离子 交换 量 和 固定 相 中 固定 小 的 体积 , 凝 胶 过 滤 色 谱 可 根据 填料 
的 性 能 不 同 分 别 用 于 亲 水 和 亲 脂 性 样品 ,但 以 上 选择 也 不 能 绝对 化 ,如 吸附 色谱 的 填料 经 
过 特殊 处 理 后 也 可 以 吸附 极 性 很 强 的 水 溶性 化 合 物 , 液 一 液 分 配色 谱 的 正 相 和 反 相 就 可 
分 别 用 于 分 离 极 性 和 非 极 性 化 合 物 。 关 于 对 色谱 方法 的 选择 ,可 参考 世 .R. 斯 奈 德 (Snyder) 
和 J. J. FASE (Kirkland) 合 著 的 “现代 滚 相 色谱 法 导论 -一 书 中 所 提出 的 图 解 ( 见 图 4- 
14), 另 LKB 和 Beckman 公司 根据 他 们 生产 的 产品 也 提出 了 类 似 选 择 色谱 方法 的 图 解 
CLA 4-15, 图 4-16), 均 可 结合 我 们 具体 情况 参考 选择 。 

注 : 离子 对 分 配色 谱 , 是 可 离子 化 或 离子 型 的 化 合 物 (在 水 的 介质 中 ) 用 一 个 适当 的 
反 离 子 (如 四 烷 基 铵 化 物 / 苦味 酸 ) 与 离子 或 可 离子 化 的 溶质 生成 离子 对 ,该 离子 对 便 在 二 
相 中 产生 新 的 分 配 系数 ,大 大 提高 柱 分 离 率 和 选择 性 ,此 法 用 途 很 广 。 


五 、 分 离 度 的 调整 


液 相 色 谱 的 分 离 度 (或 称 分 辩 率 ) 常 以 下 面 公式 表示 : 


。104 。 


Rs 


PES a a :了 


Se A LI ee EN RT I a A 


OP IIE Nie > 


Ro 


~~ Slyragel 
Ss sae wis | FARA 
: 透 色 谱 __Porasil 


一 高 于 2000 一 Sephadex 
eh Syke asi [ea 
着 色谱 | 。 | _ 多 孔 玻璃 
一 | sepetie eit |-sephadex (小 孔 ) 
ait 一 酸性 阴 高 子 一 树脂 Aminex-A 25 
范围 人 a -| ea | 化 合 物 ““ 交 换 剂 一 薄膜 (Pellionex-SAX) 
re 碱 性 阳 树脂 CDurrum Type DCIA) 
eee (Zipax SCA) 
_ | 分 配色 谱 上 水 / 蜡 辛 烧 / 乙 醇 一 三 元 含水 固定 相 ) 
低 于 2000 


一 Corasil-II 
——|—-Zorbox-Sil 
—Pellumina-HS 


—8»8'-4— Ala /Ake 


—KRE— 
oye re | 


a BRE | Poragel 
透 色谱 上 
非 水 盗 〈 按 分 子 大 小 显著 差异 分 离 ) 


pores 
—ETH- ee 
Ane CRD 成 烷 异 
aw 分 配 ee eee hele 
不 稳定 & if 
一 化 合 物 “aan ie ke/7k-FS 
eyed ——|—ODS-Permaphase/ 
(GR) iNest 
—RE/K- Cia 


4-14 流 相 色谱 方法 选择 


RONG BT Linc Sh Oe pee 
Peat ( a VN, (; oe = 
(1) 2, 表示 分 离 度 ,也 即 是 在 色谱 图 中 二 个 相 邻 的 峰 分 离 的 程度 。R, 值 越 大 , 表 示 


二 峰 尖 分 隔 愈 远 , 二 峰 的 峰 宽 越 窄 。 分 离 度 也 可 以 在 色谱 图 计算 而 得 ,下 面 是 一 个 双 组 分 
的 色谱 图 : 


Ro a(ty, — tr,) 
s 
W, + W;, 


Wi W2 ZANT — “MEAN TE EEE » te,» te, TASB MEAS PR BT To 
1 Q) N 表 示 理 论 塔 板 数 。 N 与 柱 长 (CL) 成 正比 , 与 每 个 理论 塔 板 的 高 度 (H) 成 反 


比 。 即 N 3 HH 也 是 一 个 色谱 柱 单位 长 度 的 效率 的 量度 , 小 的 五 意味 着 得 到 高 的 柱 效 


率 , 它 受 各 种 因素 的 影响 ,如 小 的 填料 颗粒 直径 , 低 的 溶剂 流速 和 粘度 ,以 及 提高 分 离 温 度 
均 可 获得 较 小 的 五 值 。 


i= 
人 色谱 法 LKB 产品 的 选择 HPLC-CAT-EOL P.5 


凝 胶 过 波 色 谱 
《和 蛋白质) 2150 HPLC 泵 二 流速 可 控制 10ml 一 5ml/min 之 内 
核酸 2154 注射 器 
多 糖 2210 RW 
2158 紫外 检测 器 
制备 色谱 柱 2135 LKB Ultropac TSK G2,000, 3,000 或 4,000 SW 
21.5mmX 60mm (2135 蓝 色 柱 ) 如 特异 吸附 少 , BIR, 每 次 
可 分 离 样 品 最 高 达 100 毫克 , 此 柱 可 在 缓冲 芒 和 有 机 咨 剂 使 用 
碎片 能 经 受 变 性 剂 及 各 种 去 污 剂 的 侵蚀 。 
(2b 离子 交换 色谱 
STEER 2150 HPLC # 
SLR 2154 注射 器 
2210 记录 器 2158 紫外 检测 器 
11300 Ultrograd 梯度 混合 器 
制备 色谱 柱 : LKB 535/545 CM/DEAE 柱 ,21.5X150mm (2133 蓝 色 
柱 ) 
反 相 液 一 液 色谱 
2150 HPLC 泵 . 
DAFKAD 2154 注射 器 
(AEB) 2210 ios a 
BHR 2158 紫外 检测 器 或 2151 UV/VIS 检测 器 


2134—210 Lichrosorb RP-18 2134-220 Lichrosorb RP-8 
2134—230 Lichrosorb RP-2 


4-15 LKB 产品 色谱 方法 的 选择 


(3) c 为 选择 因子 也 称 分 离 因 子 , 是 二 种 物质 容量 因 于 之 比 。 

2B ae 

RAF (a) 可 以 通过 变更 流动 相 和 固定 相 的 组 成 性 质 而 改变 。 

(4) K' 为 容量 因子 ,一 般 可 以 看 作 溶 质 在 固定 相 中 的 总 摩尔 数 与 在 流动 相 中 总 摩尔 
之 比 。 对 于 一 定 的 柱子 \ 溶 剂 \ 分 离 温 度 和 样品 浓度 足够 小 时 , K' 是 一 个 常数 , 容 量 因 于 
与 分 配 常数 关系 如 下 : 

K' 二 固定 相 中 溶质 量 _ 固定 相 中 溶质 浓度 、 固定 相 体积 
ROAR ”六 动 相 中 溶质 浓度 ”流动 相 体积 

sh 固定 相 体积 

一 分 配 常数 X 流动 相 体积 

以 上 影响 分 离 度 的 三 个 因子 w\ N、K' 基本 上 是 独立 的 , 可 以 调整 好 其 中 一 项 , 然 后 
再 调整 另外 两 项 。 不 一 定 三 项 同时 改变 。c、N、K' 三 个 因子 对 R, 的 影响 情况 比较 复杂 , 
每 一 因子 的 作用 都 可 以 作 专门 的 论述 。 对 于 二 个 组 份 的 色谱 峰 来 说 , 变 动 选择 因 了 于 
时 , o 使 其 中 一 个 谱 峰 发 生 位 移 ,而 峰 高 不 变 。 增 大 理论 塔 板 数 N 时 , 可 以 使 二 个 谱 峰 同 
时 变 罕 , 峰 尖 增高 。 而 变动 K’ 时 ,对 分 离 度 影响 较 大 ,减少 K' 时 ,又 使 谱 峰 提前 呈现 , 但 
分 离 度 减少 ,增加 K' 可 以 提高 分 离 度 , 但 延长 分 离 时 间 ,, 谱 带 变 宽 。 图 4-18 ANG, Ny 


© TID6。 


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I Min 


O*H/NOV 


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ee ee 


K’ 三 个 因素 对 色谱 图 的 影响 。 

在 制备 色谱 图 中 ,和 常常 在 混合 组 份 中 要 求 分 离 其 中 一 个 组 份 , 此 组 份 如 在 谱 图 中 是 一 
个 较 大 的 峰 时 ,可 先 提高 分 离 度 (改变 流动 
相 成 份 ) 使 成 为 单 峰 , 再 使 样品 的 负载 增 至 
最 大 , 然 后 收集 谱 峰 中 心 部 分 。 如 所 要 求 
组 份 在 谱 图 中 是 一 个 较 小 的 峰 〈 表 示 样 品 


图 4-17 一 个 双 组 份 色谱 图 计算 R, 的 方法 图 4-18 改变 @, K’, N 
保留 时 一 一 分 辨 率 一 了 R, 峰 宽 一 一 W 对 样品 色谱 图 影响 


中 含 所 要 求 组 份 的 量 很 少 ), 便 经 过 多 次 分 离 将 此 组 份 收 集 浓 集 后 再 上 柱 , 按 第 一 种 情况 
处 理 , 先 提高 分 离 度 , 使 成 单 峰 , 然 后 在 超 负荷 下 收集 纯 品 。 


六 、 具 体操 作 及 注意 事项 


(—) 进 样 前 准备 工作 


首先 使 用 的 溶剂 , 即 流动 相 要 求 具有 较 高 纯度 。 有 机 溶剂 事前 须 重 蒸 ;用 水 要 经 过 混 
合 离子 交换 树脂 处 理 和 活性 火 处理 后 , 重 蒸 除 去 各 种 杂质 才能 使 用 。 盐 类 铝 须 经 过 重 结 


三 | 
BHO 


各 种 溶剂 一 般 要求 新 鲜 配 制 , 使 用 前 经 过 脱 气 处 理 。 

挥发 性 有 机 溶剂 脱 气 较 常 用 方法 是 超声 波 振荡 。 水 和 缓冲 液 先 通过 微 孔 薄膜 滤 去 固 
体 微粒 后 ,缓慢 加 热 挠 拌 (在 电磁 搅拌 器 上 ) 抽 真空 去 气 。 

样品 加 入 前 ,必须 用 流动 相 充 分 洗 柱 , 待 流出 液 经 过 检测 器 的 基线 校正 , 证 明 柱 内 残 
留 杂质 确 已 全 部 除 净 , 才 能 进 样 。 

进 样 时 ,样品 用 与 流动 相 相同 的 或 志 溶 的 溶剂 完全 溶解 , 如 有 悬浮 状 颗 粒 , 需 过 滤 除 
去 ,然后 通过 注射 器 或 进 样 浆 进 样 。 进 样 量 的 多 少 ; 视 不 同 的 柱 容量 而 定 , 一 般 制 备 性 柱 © 
每 次 最 大 上 柱 量 可 达 10 一 100 毫克 。 


(=) 洗 脱 
进 样 后 洗 脱 的 条 件 常 按 事先 计划 好 的 溶剂 程序 进行 ,内 容 一 般 包括 : 
C1) 每 次 色谱 计划 所 需 时 间 。 


* 108。 


了 


(2) 洗 脱 液 ( 即 流动 相 ) 的 组 份 (单元 或 多 元 ) 及 对 形成 梯度 的 要 求 。 如 样品 各 组 份 与 
固定 相 之 间 的 亲 和 能 力 差 别 较 大 时 , 采 用 梯度 洗 脱 方法 〈 包 括 极 性 , pH 和 离子 强度 的 改 
变 ), 可 获得 较 好 的 分 离 效果 。 

C3) 流动 相 的 流速 ,是 恒 速 或 变速 或 每 分 段 时 内 要 求 流动 相 的 流速 。 

实际 上 ,样品 展 层 以 后 所 得 色谱 图 一 次 很 难 获 良 好 的 分 离 效 果 , 需 要 根据 色谱 图 各 组 
峰 形状 、 位 置 进行 综合 分 析 , 并 按 自己 所 需 制 备 的 组 份 的 谱 峰 分 离 情况 ,调整 流动 相 的 极 
性 (或 离子 强度 ) 梯 度 组 合 、 流 速 及 展 层 时 间 等 。 以 上 这 些 因素 一 般 现代 高 效 小 相 色 谱 仪 


”都 有 自动 控制 程序 装置 ,再 加 上 检查 温度 和 pH 对 分 离 的 影响 , 直至 选择 到 最 好 的 分 离 条 
件 后 , 便 开 始 大 规模 分 离 ;收集 所 需 的 组 份 。 


各 类 色谱 柱 加 进 样品 后 如 何 选择 适应 的 洗 脱 液 ( 即 流动 相 ) 其 基本 原理 与 经 典 色谱 洗 “ 
脱 法 大 致 相同 。 例如 液 一 液 分 配色 谱 的 正 相 与 反 相 色谱 的 操作 原则 大 致 如 表 4-50 


R45 正 相 与 反 相 色谱 操作 原则 


| E # 反 , 相 
固定 相 极 性 强 弱 
溶剂 的 极 性 弱 至 中 中 至 强 
样品 洗 脱 程序 弱 极 性 组 份 先 流出 强 极 性 组 份 先 流出 
增加 溶剂 极 性 的 影响 减少 洗 脱 时 间 增加 洗 脱 时 间 


当然 高 效 液 相 制 备 色谱 对 流动 相 的 要 求 , 需 照顾 到 与 检测 器 相 匹配 ,同时 还 要 尽 可 能 
获得 较 大 的 分 离 度 ,因此 ;使 用 有 机 溢 剂 时 要 求 粘度 要 低 并 有 一 定 挥发 度 。 其 中 最 常用 的 
有 机 深 齐 有 乙 脐 ,甲醇 、 二 氧 甲 烷 \ 已 煤 \ 硝 基 丙酮 等 。 有 些 工厂 生产 的 色谱 柱 还 限定 不 准 


使 用 某 种 溶剂 ; 则 应 注意 遵守 。 


(=) 色谱 柱 的 清洗 及 保存 


色谱 分 离 完毕 后 ,应 用 溶剂 彻底 清洗 色谱 柱 ,或 色谱 柱 用 后 存放 时 间 过 久 也 应 定期 清 
洗 。 硅 胶 柱 先 用 甲醇 和 乙 且 冲 洗 ( 乙 有 睛 价格 较 贵 ,可 少 用 ,多 用 甲醇 ) 再 用 干燥 的 二 氧 甲烷 
清洗 后 保存 , 烷 基 键 合 相 色 谱 柱 可 用 甲醇 一 氧 仿 一 甲醇 一 水 顺 次 交叉 冲洗 除去 有 脂 溶性 
及 水 溶性 杂质 。 离 子 交 换 柱 可 按 一 般 经 典 方法 经 过 酸 碱 缓 冲 液 平 衡 后 , 再 以 水 和 甲醇 洗 
净 。 凝 胶 柱 则 以 根据 其 使 用 流动 相 的 不 同 分 别 以 甲苯、 四 和 氢 呐 喃 、 氯 仿 或 水 大 量 冲 洗 至 
净 。 但 亲 水 性 凝 胶 及 其 他 亲 水 性 色谱 柱 保存 时 , 常 加 入 少量 甲苯 或 氯仿 以 防止 微生物 污 
Ro 


《四 ) 一 些 生 化 样品 分 离 色 谱 图 的 举例 
| 高效 芒 相 色谱 的 使 用 ,除了 认真 了 解 仪器 的 设计 原理 和 各 种 色谱 柱 的 性 质 \ 应 用 范围 


。 外 ,要 真正 掌握 好 这 门 技 术 , 还 要 通过 大 量 实践 才能 得 心 应 手 。 目 前 国外 内 高 效 液 相 色谱 


仪 和 色谱 柱 型 号 繁多 ,每 个 厂家 对 于 自己 产品 都 有 比较 详细 说 明和 应 用 举例 ,只 要 遵守 操 
作 规 则 及 结合 有 关 色 谱 的 原理 加 以 具体 运用 , 在 短期 内 掌握 仪器 操作 开展 实验 工作 是 不 
困难 的 。 下 面试 举 几 个 生物 样品 分 离 色 谱 图 的 例子 , 供 读者 参考 。 

1. 标准 核 昔 酸 混合 液 的 分 离 : 使 用 一 种 大 孔径 多 孔 硅 胶 高 效 阴离子 交换 剂 , 分 


° 109 。 


Hy: 


四 ees ae he 


离 各 种 5- 核 昔 磷 酸 盐 , 在 室温 下 进行 , 每 次 色谱 时 间 约 35 分 钟 。 色 谱 条 件 及 结果 见 图 , 
4-19。 

2. 数 种 单 糖 及 双 糖 的 分 离 9 使 用 一 种 极 性 键 合 相 微粒 硅胶 , 作 正 相 液 一 液 分 配 
fi%, MERE IS: 水 (80:20) 出 峰 顺 序 与 样品 的 极 性 相同 , 极 性 强 最 后 被 洗 脱 , 色谱 
条 件 及 结果 见 图 4-20。 

3. 人 血清 蛋白 的 分 离 ”使 用 的 是 一 种 KLB 
出 品 的 凝 胶 制 备 柱 , 每 次 可 进 样品 1.5 毫升 血 1 


OD 254 毫 微米 
CMP 
= == "CMP AMP UMP 
; NDP 
——"\\ CMP CDP CMP 
SRE BES ADP are 
CTR 
: ATP 
GDP 
GTP. 2 
由 
on 
DQ 


和 
10 20 30 0. 60629870 
分 钟 (分 ) 
图 4-19, 标 准 核 苷 酸 混合 液 的 分 离 “ 图 4-20 JL BRR MBAS 
样品 : 12 种 5 " 核 苷 酸 混合 液 样品 : 1. 溶 剂 , 2.75, 3.55, 4. 葡 萄 糖 , 
色谱 柱 : Poiyomion Si 阴离子 交换 柱 5. FER, | 6. 乳糖 
洗 脱 液 : 磷酸 盐 缓冲 液 0.01 摩尔 至 1 摩尔 pH 7.0 色谱 柱 : Partisil 1025-PAC #: (10u) 4.6 X 250 mm 
流速 : 0.4 毫升 /分 BEML: Cit 7K (80:20) pH5.0 (HasPO4), 流速 : 
检测 : 紫外 254 nm 1.3 毫升 /分 ww: 折光 计 . 
已 
品 . 
a 
〇 
1 


wh 
1 
A 4-21 人 血清 蛋白 质 分 离 色 谱 图 


REL: 未 稀释 的 人 血清 1.5 毫升 “色谱 柱 : LKB Ultropac, TSK G-4000 SWG 2135 蓝 色 柱 
21.5X600mm; 流速 ; 70 微 升 /分 检测 器 UV 280nm 


清 ,回收 率 可 达 90% 以 上 ,色谱 条 件 及 结果 见 图 4-21。 - 
4. 长 春花 培养 细胞 中 赐 | 嗓 生物 碱 的 分 离 cma 使 用 Water w Bondapak C18 (十 八 烷 
基 硅烷 ) 反 相 色 谱 柱 , 按 Perkin-Elmer 3B 编 序 , 深 剂 系统 分 配 如 下 : 


*,110 。 


are 


平衡 ry T, T; Yr, Ts 
A Zit 35 40 55 85 90 90 
B. 10mM 磷酸 缓冲 液 C(pH7.5) 75 55 45 15 10° 16 
时 间 ( 分 0 10 10 25 5 
曲线 2 1 4 | 1 


色谱 结果 如 图 4-22。 


(aurd:yewly) 


~~ 
Q 
© 
> 
ry 
—] 
- 
ce 
5 
o 
~ 


O.D254nm 


时 间 (a>) 


图 4-22 Rael PRED 


样品 : 粗 生 物 碱 , 色 谱 柱 : p Bondapak C18 十 八 烷 基 硅烷 柱 “ 洗 脱 液 : Zi /10mM 磷酸 缓冲 
液 (pH7.5) 梯度 洗 脱 “ 流 速 : 1 毫升 /分 “检测 器 : 紫外 ,254nm 


Re 


[1] 姚 广元 ; 古 德 珍 : 中 草药 ,第 五 期 ,41 页 (1982) 
[2] Morris, C. J. O. R and Morris, P., Separation Methods in Biochemistry (1976) 


[3] Mikes, O., Laboratory Handbook of Chromatographic and Allied Methods (1979) 
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[13] 中 国 科 学 院 微生物 研究 所 编 : 核 苷 酸 类 物质 的 生产 和 应 用 。 科 学 出 版 社 〈1971) 
[14] Tenanee G. Cooper, The Tools of Biochemistry (1977) 


[15] L .R. WRB. J. Mie HAI, Ba: 现代 液 相 色谱 法 导论 ?化 学 工业 部 出 版 社 (1980) 
[16] Rabel, F. M. et al., J. Chromatogr. 126, 731(1976) 


17) FRAY. SLR: 未 发 表 的 工作 。 


ellls 


第 五 章 , 生 物 大 分 子 的 色谱 分 离 法 
£8 if 


生物 大 分 子 的 色谱 分 离 法 是 六 十 年 代 以 后 发 展 起 来 的 一 类 新 技术 。 包括 多 糖 基 离 子 ; 
交换 色谱 法 、 分 子 筛 色谱 法 `, 亲 和 色谱 法 和 色谱 聚焦 法 等 。 这 类 方法 的 建立 ,其 原理 虽然 不 
完全 相同 ,如 分 子 筛 色谱 分 离 主要 建立 在 分 子 大 小 形状 差别 的 基础 上 , 亲 和 色 谱 则 根据 分 
于 生物 功能 团 对 载体 上 的 配 基 的 特殊 亲和力 而 建立 。 但 在 总 体 上 都 属于 色谱 分 离 范 畴 , 
即 生 物 大 分 子 与 其 他 组 份 的 分 离 主要 依赖 于 溶质 彼此 间 理 化 性 质 的 差别 在 固 相 载体 和 六 
动 相 之 间 分 布 和 六 动 速度 不 同 而 达到 分 离 目的 。 

生物 大 分 子 色谱 分 离 与 生物 小 分 子 色谱 分 离 在 固 相 载 体 性 质 和 色谱 条 件 上 要 求 稍 有 
不 同 。 

第 一 生物 大 分 子 要 求 固 相 载体 具有 亲 水 性 , 并 具有 一 定 三 维 空间 结构 及 芯 散 度 。 使 
生物 大 分 子 易于 接近 和 出 人 固 相 部 分 ,通过 表面 吸附 或 筛 眼 作 用 达到 分 子 之 间 的 分 离 ;此 
外 ,要 求 固 相 载 体 对 生物 大 分 子 生 理 活 性 有 稳定 作用 , 按 上 述 要 求 , 各 种 来 源 于 生物 材料 , 
的 凝 胶 及 其 衍生 物 是 比较 理想 的 固 相 载体 , 凝 胶 的 使 用 ,是 生物 大 分 子 色谱 分 离 近年 来 得 
以 迅速 发 展 最 主要 原因 之 一 。 

第 二 ,与 生物 小 分 子 比 较 , 生 物 大 分 子 色谱 分 离 条 件 ( 包 括 上 柱 、 洗 脱 等 工序 ?> 要 求 比 
较 温 和 。 一 切 强酸 、 强 碱 \ 高 压 \ 高 温 都 不 适用 。. 

生物 大 分 子 色谱 分 离 在 近代 生化 制备 技术 中 ,在 细 分 阶段 使 用 较 多 ,效果 也 远 比 其 他 
方法 好 。 因 每 一 种 色谱 原理 和 方法 所 涉及 的 知识 面 都 很 广 , 在 本 丛书 中 其 他 分 册 中 已 另 
有 详细 介绍 ,这 里 为 了 对 生化 制备 技术 有 一 系统 认识 ,只 结合 制备 有 关 方 面 作 一 简要 补充 
介绍 。 


第 一 节 “多糖 基 离子 交换 剂 色 谱 法 


这 类 交换 剂 中 应 用 最 广泛 的 有 离子 交换 纤维 素 和 离子 交换 交 联 葡 聚 糖 两 类 * 必 外 ,还 
有 离子 交换 琼脂 糖 ,但 应 用 不 广 。 其 中 离子 交换 剂 特别 适用 于 生物 大 分 子 活性 物质 (如 蛋 
白质 、 核 酸 及 其 衍生 物 ) 的 分 离 。 因 为 这 类 交换 剂 的 多 糖 骨 架 来 源 于 生物 材料 , 具 亲 水 性 、 
对 生物 活性 物质 是 一 个 十 分 温和 的 环境 。 它 们 的 色谱 原理 与 离子 交换 树脂 基本 相同 ”…”。 


“Ty 多 糖 基 离子 交 换 剂 的 分 类 


(—) 离子 交换 纤维 素 


离子 交换 纤维 素 是 开放 性 的 长 链 骨 架 , 大 分 子 物 质 也 能 自由 地 进入 和 迅速 地 扩散 , 它 
也 有 较 大 的 表面 , 故 对 生物 大 分 子 的 吸附 容量 比 离子 交换 树脂 大 得 多 。 另 外 ,由 于 离子 交 
换 纤 维 素 上 所 含 的 离子 交换 基 团 较 少 , 排 列 芷 散 , PUMA TORN BALE, AR 


e112. 


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"113。 


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_ SE-Sephadex C25 磺 乙 基 强酸 阳离子 “| 一 (CH,), 一 SO;- Nat 
SE-Sephadex C50 BCE aa PES |--(CH,)—SO,- — Nat 
SP-Sephadex C25 BAK asm PASS |—(CH,),—SO,- Nat 
SP-Sephadex C50 Ax ‘eR PAE |—CCH,),—SO,;~ Nat 


“dint FBS SR PER EE Ge BB OK » FE DL A ER RK ED 5 REE KD FI A. 


脱 过 程 中 不 致 因 变 性 而 失 活 。 
根据 它们 联结 在 纤维 骨架 上 的 交换 基 团 , 可 分 阳离子 交换 纤维 素 和 阴离子 交换 纤维 
素 两 类 。 阳 离子 交换 纤维 素 又 可 分 为 强酸 型 中 强酸 型 、 弱 酸 型 三 种 ; 阴离子 交换 纤维 素 
也 可 分 为 强 碱 型 中 强 碱 型 , 弱 碱 型 三 种 ,常用 的 离子 交换 纤维 素 及 其 特性 如 表 5-1 所 示 。 
根据 离子 交换 纤维 素 存在 的 物理 状态 , 又 可 分 为 纤维 型 和 微粒 型 两 类 。 微 粒 型 纤维 
素 颗粒 细 , 溶 涨 性 小 ,能 装 成 紧密 而 分 离 效率 高 的 吸附 柱 ,适用 于 分 析 , 而 纤维 较 长 的 纤维 
型 纤维 素 适 用 于 制备 。 


(=) 离子 交换 交 联 葡 聚 糖 


离子 交换 交 联 葡 聚 糖 是 将 离子 交换 基 团 连结 于 交 联 葡 聚 糖 上 制 成 各 种 交换 剂 , 由 于 
交 联 葡 聚 糖 具有 三 度 空间 网 状 结构 ,因此 ,离子 交换 交 联 葡 聚 糖 寻 有 离子 交换 作用 , 又 有 
分 子 筛 作用 。 
表 5-2 常用 的 离子 交换 葡 聚 糖 和 琼脂 糖 (meq/g) 


商品 名 化 学 名 类 型 活性 基 结 构 反 离 子 | 吸 附 容量 
CM-Sephadex G-25 35s FA Et 弱酸 阳离子 “| 一 CH 一 COO- Nat 
CM-Sephadex G-50 羧 甲 基 弱酸 阳离子 “| 一 C 五 ;一 COO- Nat 


DEAE-Sephadex A25 |— C327, | Hoe GRABS F|—(CH.),—NH+(C,H,), | CL 

DEAE-Sephadex A50 |—ZC#A27 Z|} iba | (CH,).—N*(C,H,), CT 

QAE-Sephadex A25 季 胺 乙 基 强 碱 阴离子 “| 一 (C 卫 一 Nt+ 一 (C:Hy); ci- 
CH,CH(OH)CH, 

QAE-Sephadex A50 BERLE a PRA RS | |-—-(CH2),—-Nt—(C,H,), cl- 
CH,CH(OH)CH, 


CM-Sepharose CL-6B | 羧 甲 基 弱酸 阳离子 | 一 CSCOO- Na 
DEAE-Sepharose CL-6B| 二 乙 基 氨基 乙 基 | 中 强 碱 阴离子 | 一 (C 联 :); 一 NHY+CC2H:) | CE 


离子 交换 交 联 葡 聚 糖 有 很 高 电荷 密度 , 故 比 离子 交换 纤维 素 有 更 大 的 总 交换 量 , 但 当 
洗 脱 介质 的 pH 或 离子 强度 变化 时 ,会 引起 凝 胶体 积 的 很 大 的 变化 , 由 此 而 影响 流速 , 这 
是 它 的 一 个 缺点 。 

常用 的 离子 交换 交 联 葡 聚 糖 及 其 某 些 特性 见 表 5-2。 


二 、 实 验 操作 技术 


(一 ) 多 糖 基 离 子 交 换 剂 的 选择 “2 


与 离子 交换 树脂 的 选择 相似 ,一 般 情 况 下 , 带 正 电 的 物质 用 阳离子 交换 剂 ; 带 负电 物 
质 用 阴离子 交换 剂 。 物 质 的 带电 性 质 可 用 电泳 法 确定 。 对 于 已 知 等 电 点 的 两 性 物质 , 可 


。114 。 


人 


根据 其 等 电 点 及 介质 的 pH 确定 其 带电 状态 ,同时 考虑 该 物质 的 稳定 性 和 溶解 度 ,选择 合 
适 的 pH 范围 。 

实验 室 中 最 常用 的 为 DEAE- 纤 维 素 ,CM- 纤 维 素 或 DEAE-Sephadex,CM-Sephadexo 
如 需 在 低 pH 下 操作 时 ,可 用 P- 纤 维 素 , SE- 纤 维 素 或 SE-Sephadex, 而 需 在 pH 10 以 上 操 
作 的 可 用 GE- 纤 维 素 。 对 于 大 分 子 两 性 物质 (如 蛋白 质 ), 其 选择 情况 见 图 5-1e。 


一 一 一 一 一 一 一 一 一 mm 一 一 一 履 二 二 ~ 


一 一 一 


DEAE 


“sw M—C 


= _CM—C 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 -一 


(b) 
95-1 蛋白 质 色 谱 的 离子 交换 剂 的 选择 
(a2) 酸性 蛋白 , () 碱 性 蛋白 
图 5-1 (a) 表示 酸性 蛋白 (等 电 点 约 为 5) 的 解 离 曲 线 和 DEAE- 纤 维 素 及 CM- 纤 维 素 : 
的 解 离 曲线 。 蛋 白质 作为 一 个 阴离子 在 DEAE- 纤 维 素 柱 色谱 可 在 pH 5.5 一 9.0 范围 内 进 
行 , 在 这 个 pH 范围 内 ,蛋白质 和 交换 剂 都 是 解 离 的 , 带 相反 的 电荷 。 在 CM- 纤 维 素 上 色 
谱 则 严格 限于 较 窜 的 pH 范围 内 (pH 3.5 一 4.5) 进行 。 

图 5-1(b) 表示 碱 性 蛋白 质 (pPI 一 8) 和 羧 甲 基 纤维 素 ,DEAE- 纤 维 素 及 强 碱 阳离子 
交换 剂 QAE-Sephadex 的 解 离 曲线 。 蛋 白质 作为 一 个 阳离子 在 羧 甲 基 纤 维 素 上 色谱 可 在 
pH 3.5 一 7.5 之 间 进 行 , 如 作为 阴离子 在 DEAE- 纤 维 素 上 色谱 则 仅 限 于 pH8.5 一 9.5 的 范 
围 内 进行 ,用 QAE-Sephadex 则 在 pH 8.5 一 11.0 之 间 进 行 。 


(=) 缓冲 液 的 选择 

对 缓冲 液 pH 的 选择 , 决定 于 被 分 离 物 质 的 等 电 点 、 稳 定性 和 溶解 度 。 也 就 是 说 , & 
选择 这 样 的 缓冲 液 条 件 , 保 证 被 分 离 的 组 份 有 足够 大 的 溶解 度 , 并 且 不 会 变性 失 活 。 选 择 
pH 时 ,也 要 考虑 离子 交换 剂 的 PK 值 , 用 阴离子 交换 剂 时 , pH 要 小 于 PK, 用 阳离子 交换 
FRY pH 要 大 于 PK。 

起 始 缓冲 液 的 浓度 要 尽 可 能 的 低 些 (如 0.001 一 0.01 M), 使 色谱 柱 上 能 吸附 更 多 的 被 


e 115° 


分 离 物质 。 为 了 获得 足够 的 缓冲 容量 ,选用 的 缓冲 液 离子 ,其 PK 值 要 尽量 接近 起 始 缓冲 
HAY pH 值 4( 最 好 在 0.5 个 pH 单位 之 内 )。 
在 进行 梯度 洗 脱 时 ,多 采用 离子 浓度 梯度 , 尽 可 能 不 用 pH 梯度 , 因为 pH 过 高 或 过 低 
可 能 引起 一 些 蛋 白质 的 变性 失 活 , 而 且 pH 偏离 pK 值 过 远 , 会 降低 溶液 的 缓冲 能 力 , 而 提 
高 离子 浓度 不 仅 增加 洗 脱 能 力 , 还 可 增加 溶液 的 缓冲 能 力 。 
为 了 在 不 提高 缓冲 离子 的 浓度 情况 下 增加 洗 脱 能 力 , 常 在 缓冲 液 中 加 入 适当 的 
NaCl, KCl LiCl 等 非 缓 冲 盐 。 


(=) 多 糖 其 离子 交 换 剂 的 处 理 : 


1. 离子 交换 纤维 素 的 处 理 ”将 离子 交换 纤维 素 悬 溯 于 大 体积 的 水 中 让 其 自然 沉 
降 , 用 倾倒 法 除去 细 颗 粒 。 然 后 采用 碱 一 酸 一 碱 的 顺序 反复 洗涤 ,除去 杂质 及 活化 交换 基 
团 。 即 先 用 0.5 NaOH 浸泡 工 小 时 ,然后 燕 馏 水 洗 至 中 性 , 再 用 0.5 NHC RM. KEE 
中 性 ,用 0.5 N NaOH 洗 , 最 后 充分 用 水 漂洗 。 再 把 其 调节 到 起 始 缓冲 滚 的 pH 即 可 使 
用 。 

2. 离子 交换 交 联 葡 聚 糖 的 处 理 将 离子 交换 交 x 联 葡 聚 糖 在 水 中 使 凝 胶 充 分 溶 涨 
然后 浮 洗 除去 细 颗 粒 , 用 0.5 N NaOH 浸泡 1 小 时 * 水 洗 至 中 性 , 用 0.1 一 0.5 N HCl BiH, 
水 洗 至 中 性 ,再 以 0.5 N NaOH 洗 , 最 后 用 水 充分 漂洗 ,除去 空气 后 备用 。 


(四 ) 装 柱 
装 柱 方法 有 重力 沉降 法 和 加 压 法 两 种 。 重力 沉降 法 与 离子 交换 树脂 的 装 柱 法 相似 
CUA). MEE: 在 色谱 柱 顶 上 连接 一 个 耐 压 的 厚 壁 犁 型 瓶 , 其 中 贮 放 离子 交换 齐 
的 悬 溯 溶 液 。 梨 型 瓶 直 接 与 加 压 装 置 连接 (氮气 钢瓶 或 压缩 空气 钢瓶 ), 将 柱 按 十 等 分 划 
线 , 开 始 加 0.3 个 大 气压 ,沉积 床 每 升 高 一 个 刻度 ,增加 0.07 个 大 气压 ,最 后 达到 一 个 大 气 
压 立刻 减 压 。 装 柱 时 要 不 时 振荡 犁 型 瓶 使 县 泽 液 均匀 ,另外 ,用 提高 贮 液 器 高 度 的 办 法 进 
行 加 压 ,也 能 得 到 好 的 效果 。 
CH) mt 
加 样 量 的 多 少 和 体积 主要 取决 于 待 分 离 组 份 的 浓度 及 其 对 交换 剂 的 亲和力 。 也 要 考 
虑 实验 的 目的 要 求 ,假如 待 分 离 组 份 含量 很 低 , 被 吸附 又 很 牢固 , 则 加 样 的 量 和 体积 可 以 
相当 高 。 如 果 要 求 高 分 辨 率 时 , 加 样 量 不 得 使 紧密 吸附 的 区 带 超过 床 体积 的 10%。 
样品 上 柱 前 要 以 起 始 缓冲 液 充分 平衡 , 常用 的 方法 为 : CL) 样品 在 49°C 下 对 20 倍 体 
积 的 起 始 缓冲 液 透 析 。(2) 凝 胶 过 滤 法 : 用 Sephadex G-25 或 G-50 HE, HERI 
冲 液 平衡 ,然后 加 样 , 再 用 起 始 缓冲 液 洗 脱 。 和 蛋白 质 在 一 个 外 水 体积 〈Vo) 流出 。 
加 样 方法 与 一 般 柱 色谱 法 相似 。 


CI) 洗 脱 

加 样 后 ,用 足够 量 的 起 始 缓冲 液 洗 柱 ,除去 未 吸附 的 物质 ,再 进行 洗 脱 。 

洗 脱 的 办 法 可 采用 (1) 改变 缓冲 液 的 DH, 使 大 分 子 的 电荷 减少 ,从 吸附 状态 变 为 解 
吸 。 (2) 增加 缓冲 液 的 离子 强度 , 使 离子 的 竞争 力 加 大 ,. 将 大 分 子 从 交换 剂 上 置换 下 
Eo ; 


° 116° 


Re ee ea, — SS ea se yi, a, 


Te FS (8 A Be A Wt Be ic Ht Be BE EH 


FRE 60 
5-2 在 DEAE- 纤 维 素 上 人 血清 蛋白 的 色谱 图 


结合 蛋白 。 


三 、 应 用 实例 


(—) DEAE- 纤 维 素 柱 色谱 分 离 人 血清 蛋白 (图 5-2) 
DEAE- 纤 维 素 用 Tris- 磷 酸 缓冲 波 (0.005 M, pH 8.6) 平衡 , 以 0.5 M Tris- 磷 酸 缓冲 


液 洗 脱 。 从 图 中 看 出 ,IgG 型 的 
免疫 球 蛋 白 最 先 出 现 ( 即 组 份 1 一 
6), 峰 8 是 铁 传递 蛋白 , 在 组 份 
10 和 11 中 发 现 脂 蛋白 , 接着 是 
结合 球 蛋白 和 血红 蛋白 〈 光 吸收 , 
在 405 nm), 从 11 一 14 的 大 峰 主 
要 为 血清 白 蛋白 ,从 15 起 是 一 个 
复合 物 , 包括 “和 AP REA, 16 
和 17 发 现 IgM 巨 球 蛋白 ;组 份 20 
为 含 铜 的 血浆 铜 蓝 蛋白 。 凝血 酶 
和 wx- 酸 性 糖 蛋白 也 存在 色谱 区 
内 。 随 后 又 发 现 一 些 其 他 蛋白 质 
存在 , 如 类 风湿 因子 和 维生素 Bu 


(=) 在 羧 甲 基 纤 维 素 柱 色谱 分 离 卵 清 蛋白 
5 2 克 混 合 的 卵 清 蛋白 , 色谱 柱 14x 2 厘米 , 用 栈 酸 铵 -NaCO; 缓冲 液 , pH 4.4 一 1.0 


逐步 洗 脱 , 一 个 典型 的 洗 出 液 
曲线 如 图 5-3。 

图 峰 A 包 括 卵 粘 蛋白 和 黄 
素 蛋白 , 峰 C、D 和 瑟 各 为 卵 清 
蛋白 A, A, 和 As, 峰 G 和 HH 
含 伴 清 蛋 白 , 而 峰 世 和 N 各 为 
抗 生 物 素 蛋白 和 溶菌 酶 。 其 中 
卵 清 蛋白 还 可 在 pH3.7 下 重 


| 复 色谱 与 黄 素 蛋 白 分 离 。 


(=) 大 肠 杆 菌 的 30S 核 蛋 白 
体 亚 单位 的 蛋白 色谱 分 级 
分 离 


光 密 度 280 nm 


ft iyi 了 5.0 a, 8.55 <10.0 10.0 
1.0 
0.5 
0.0 


0 50 100 150 200 250 300 350 400 
管 数 


图 5-3 在 CM- 纤 维 素 上 卵 白 蛋白 的 分 级 分 离 "7” 


以 磷酸 纤维 素 ( 交 换 量 0.9 一 1.1 毫克 当量 / 克 ) 为 固定 相 ,0 一 0.6 M NaCl C4 6M I 
素 -0.05 M NaH:PO-0.012M 甲 胺 , pH'6.5, 每 升 含 50 wl 2- 莹 基 乙 醇 ) AAR EE BE A RE 
脱 , 一 个 典型 的 洗 脱 曲线 如 图 5-4。 


。117。 


me et Te ee ad - 


eT eee 


3 10 12+12a 


500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 
洗 脱 液体 积 (ml) 


图 5-4 在 磷酸 纤维 素 上 30 S 核 蛋白 体 亚 单位 蛋白 的 色谱 图 


有 二 十 多 个 峰 , 其 中 10-11 相当 于 单一 成 份 * 在 大 峰 中 的 混合 物 可 在 pH5.5 的 同样 体系 中 
(或 Sephadex G-100) 重复 色谱 分 离 


(四 ) ECTHAM- 纤 维 素 柱 色谱 分 离 哺乳 动物 肝 抽 提 液 的 线粒体 上 清 液 的 组 份 


用 0.005 M Tris-HCl, pH 7.5 (4 0.005 M HgCl) 平衡 , 在 抽 提 液 中 大 部 分 可 湾 性 蛋 
白 和 糖 原 无 阻 留 地 通过 色谱 柱 。 加 进 0.9 多 的 非 离子 型 去 拍 剂 (Trizon X-100) 以 除去 微粒 
体 脂 蛋白 。 核 蛋白 体 用 0 一 2 M NaCl (5% KCl) Fil 0.005—0.02 M MgCl, 的 梯度 溶液 洗 脱 , 
结果 如 图 5-5。 峰 工 包 括 可 溶性 蛋白 , 峰 开 为 Triton X-100 洗 脱 物 , 而 双 峰 包括 核糖 体 , 
第 王 组 分 为 RNPI, 在 0.04 M NaCl 洗 脱 , 主要 含 B3ISHEAR, MAU A RNPU 
0.14 M NaCl 洗 脱 ,主要 含 778 核 蛋 白 。 


2.4 10 
hae 
fo 
2.0 8 
7 
= 1.6 
S 1.5 
CN 
| 12 
1.0 & 
fe Ks 
0.8 zg 
0.5% 
0.4 = 
a 
0 0 


洗 脱 体积 〈 糖 ) | 
图 5-5 在 ECTHAM- 纤 维 素 色谱 柱 上 分 离 核糖 体 "? 


RNPI 和 RNP 在 核酸 含量 上 也 有 差别 ,RNPI 在 重复 色谱 时 不 可 逆 地 转 为 RNP 
II, 


«118 


了 REs 
~~ as 


a a ia a a a 


(五 ) CM-Sephadex G25 柱 色 谱 分 离 眼 镜 王 蛇 蛇 毒 组 份 


分 离 条 件 如 下 ; CM-Sephadex G25 用 0.05 M 醋酸 钠 缓 冲 液 (pH 5.8) 浸泡 上 柱 并 平 
衡 。 柱 2.5X 60 厘米 。 广 西 产 眼镜 王 蛇 蛇毒 1 克 溶 于 9 毫升 上 述 缓冲 息 中 上 柱 。 洗 脱 分 
=H. (1) 用 平衡 缓冲 液 洗 脱 ; (2) 0 一 0.43 M NaCl 梯度 洗 脱 ;(〈《37 0.43 一 0.64 M NaCl 梯 
度 洗 脱 。 每 管 6 毫升 ,每 小 时 24 毫升 , 得 17 个 蛋 白 质 峰 如 图 5-6。 


OD 280 
2.8 
2.4 
1.0 
2.0 
. 0.8 
1.6 
pox 0.6 
2 gf 
. See 
Tat 0.4 
0.8 Sa 
nie a 0.2 
0.4 Bs ait 
ae | 
0 50 100 150 200 250 300 350 


ml 


图 5-6 HR SE dee EE ei” 


第 二 节 2 F ii Bis 


分 子 筛 色 谱 又 称 凝 胶 色谱 或 凝 胶 过 滤 , 它 是 六 十 年 代 发 展 起 来 的 一 种 快速 简便 的 生 
物化 学 分 离 分 析 方法 ,目前 已 在 生物 化 学 、 分 子 生物 学 ,生物 工程 学 以 及 医药 学 等 有 关 领 
域 中 得 到 广泛 的 应 用 。 

分 子 筛 色谱 是 指 混合 物 随 流动 相 经 固定 相 ( 凝 胶 ) 的 色谱 柱 时 , 混合 物 中 各 组 份 按 其 
分 子 大 小 不 同 而 被 分 离 的 技术 。 固 定 相 ( 凝 胶 ) 是 一 种 不 带电 荷 的 具有 三 维 空间 的 多 和 孔 网 
状 结构 的 物质 , 凝 胶 的 每 个 颗粒 的 细微 结构 就 如 一 个 筛子 , 小 的 分 子 可 以 进入 凝 胶 网 孔 , 
而 大 的 分 子 则 排 阻 于 北 胶 颗粒 之 外 , 因 而 具 分 子 筛 的 性 质 。 又 因 整个 色谱 过 程 一 般 不 变 
换洗 脱 液 , 好 像 过 滤 一 样 , 故 也 称 凝 胶 过 滤 。 


一 、 分 子 筛 色谱 的 基本 原理 


当 含有 大 小 分 子 的 混合 物 样 品 加 入 到 色谱 柱 中 , 这 些 物质 随 洗 脱 液 的 流动 而 移动 。 
大 小 分 子 ( 指 分 子 量 ) 流 速 不 同 , 分 子 量 大 的 物质 ( 阻 滞 作 用 小 ) 沿 凝 胶 粒子 间 的 孔隙 随 洗 


e119 


脱 液 移 动 , 流 程 短 , 移 动 速度 快 , 先 洗 出 色谱 柱 ; 而 分 子 量 小 的 物质 ( 阻 潇 作用 大 7) 可 通过 凝 
胶 网 孔 进 入 粒子 内 部 , 然 后 再 扩散 
出 来 , 故 流 程 长 , 移动 速度 慢 , 最 后 
流出 色谱 柱 〈 见 图 5-7)。 也 就 是 , 
分 子 筛 色谱 的 基本 原理 是 按 溶质 分 
子 量 的 大 小 ,分 别 先后 流出 色谱 柱 , 
大 分 子 先 流 出 , 小 分 子 后 流出 。 当 
两 种 以 上 不 同 分 子 量 的 分 子 均 能 进 
和 人 凝 胶 粒子 内 部 时 , 则 由 于 它们 被 
排 阻 和 扩散 程度 不 同 , 在 色谱 柱 内 
所 经 过 的 时 间 和 路 程 长 短 不 同 , 从 a 37 See 
Bee Me C1) RAGE AVA Fe IEE EDS 
SF iii iE AE RACV.) (2) 样品 溶液 流 经 色谱 柱 , 小 分 子 通过 扩散 作用 进入 凝 胶 颗 
可 分 为 三 个 组 分 , 即 ,V 二 V 十 RRL, ADT OT RZ. A. MOF 


向 下 移动 的 速度 发 生 差 异 而 将 大 \ 小 分 子 分 离开 来 ; (3) 向 色 
Vi 十 Vao HH, V。 为 凝 胶 颗 粒 之 间 谱 柱 顶 加 入 洗 脱 液 ; 大 、 小 分 子 分 开 的 距 离 增 大 ; (4 大 分 子 


液体 的 体积 ( 即 外 水 体积 )。Vi 为 凝 Banh See 
胶 颗粒 内 所 含 的 液体 体积 ( 即 内 水 体积 ),Va 为 凝 胶 颗 粒 本 身 的 体积 。 

“每 个 溶质 分 子 在 流动 相 和 固定 
相 之 间 有 一 个 特定 的 分 配 系数 〈 称 
Ku)。 所 以 , 它 的 洗 脱 体积 (Ve) 为 : 

Ve = Vo + KaV; 
_. Veuae 
Vi 
当 Ka 一 0 时 ,V。 三 V, 即 次 
质 分 子 〈 高 分 子 ) 完全 不 能 进入 凝 
are 胶 颗 粒 内 , 完 全 被 排 阻 于 凝 胶 颗 粒 
V 微 孔 之 外 而 最 先 洗 脱 下 来 当 天 a 一 
图 5-8 ”分子 得 色谱 的 区 带 轮廓 图 1 时 , BD V。 = V.+V;, 说 明 这 种 深 
质 分 子 ( 小 分 子 ) 完 全 向 北 胶 颗粒 内 扩散 ,在 洗 脱 过 程 中 将 最 后 流出 柱 外 , 通 常 0 二 Ku 王 1 
意味 着 溶质 分 子 以 某 种 程度 向 凝 胶 颗 粒 内 扩散 ,Ka 意 大 , 进 入 凝 胶 颗 粒 内 的 程度 愈 大 ,在 
中 间 情 况 下 ,例如 Ka = 0.5 时 ,其 洗 脱 体积 Ve 一 Vo + 0.5Vi( 见 图 5-8)。 : 
因此 V.<Ve<CV. 十 Vi), 相 应 为 O<Ky<1_ 实际 上 ,Ku 很 难 达 到 大 于 0.80.9, 


上 式 中 总 床 体积 Vt, 可 由 圆柱 形 色谱 柱 的 体积 计算 (v 一 是 =Dib, iii Sh OK TER 


Kg 


| 
i 05Vi 一 一 | 


《V。 的 测定 , 可 采用 一 个 分 子 量 远 超过 凝 胶 排 阻 极限 的 有 色 大 分 子 的 溶液 通过 色谱 床 , 
其 洗 脱 体积 就 等 于 V。 最 常用 的 参照 物 为 蓝 葡 萄 糖 2000。Vi 的 测定 则 可 选用 一 个 自由 扩 
散 的 小 分 子 ( 如 中 性 盐 类 ) 通 过 色谱 床 , 此 时 , Ka 一 1 则 Vi 一 Ve 一 Vo。 表 5-3,5-4 列举 
了 茶 些 凝 胶 的 性 质 。 

SS ACA (Ka) 是 分 子 筛 色谱 的 一 个 特征 常数 , 即 溶质 在 流动 相 和 固定 相 之 间 分 配 的 


¢ 120 » 


CT eee Te eS 


% 5-3 Sephadex Fifi MAHER 


得 水 值 
〈 克 / 克 干 胶 7 


KER Ve 外 水 体积 Vo 
《毫升 / 克 干 胶 ) | 《毫升 /区 干 胶 7 


la si) all 2 


G-10 0.8 1.0 1.24 
G-15 1.540.2 3 1.1 1.5 1.19 
G-25 2.540.2 5 2.0 65 1.13 
G-50 5.00.3 10 4 5 1.07 
G-75 7.50.5 13 1.05 
G-100 10.0+1.0 17 1.04 
G-15 15.041.5 24 1.03 
20.0+2.0 : 


表 5-4 Bio-Gel 分 子 得 色谱 物质 的 性 质 


WS P-X 得 水 值 〈 克 / 克 ) KARR Ve (毫升 / 克 ) 
p-2 1.5 3.8 
pad 2.4 5.8 
P-6 ° 3.7 8.8 
P-10 4.5 12.4 

(p30 5.7 14.8 
'  P-60 7.2 - 19.0 
P-100 7.5 19.0 
P-150 9.2 24.0 
P-200 14.7 34.0 
P-300 18.0 - : 40.0 


比例 。 : ; ; 
AFA Vi ADEE» TM Vn 所 造成 的 偏差 又 不 大 , HAE MER BEM 
定 相 , 则 分 配 系数 以 Key 表示 (文献 中 Ka 及 Kasv 均 有 使 用 )。 


Vern Ka_ Vi 
e 0 或 Kad =. d i 
i a WA V; 了 两 Vie 


Ky = 


=. ARB AE 
(一 ) Seam Re 


1959 年 Porath 和 Flodin BEAM T 2K RRR, 因 其 具有 良好 的 化 学 稳定 
性 等 优 点 ,目前 在 分 子 筛 色谱 中 已 成 为 最 常用 的 凝 胶 , 商 品名 为 Sephadex. 

交 联 葡 聚 糖 的 基本 骨架 是 葡 聚 糖 《dextran), 它 是 一 种 以 右 旋 葡萄 糖 为 残 基 的 多 糖 , 
分 子 间 主要 是 w-1,6 糖 背 键 ( 约 占 95 匈 ), 分 枝 为 13 HCA A 5%), 以 3- 氧 -12- 环 氧 
AA ke okie lap 为 交 联 剂 , 将 链 状 结构 连接 成 为 三 维 空间 的 网 状 结构 的 高 

O 

分 子 化 合 物 ,其 网 孔 大 小 可 通过 调节 交 联 剂 和 葡 聚 糖 的 配 比 及 反应 条 件 来 控制 , 交 联 度 越 
大 ,网 孔 结构 越 紧密 ; 交 联 度 越 小 ,网 孔 结构 越 蓝 松 。 交 联 葡 聚 糖 的 结构 如 下 页 。 

# 5-5 列 出 8 种 Sephadex 对 蛋白 质 和 多 糖 的 平均 分 级 范围 。 从 表 中 可 看 出 它们 对 
这 两 类 不 同化 合 物 的 分 级 范围 各 不 相同 , 这 意味 着 这 两 类 化 合 物 在 溶液 中 有 不 同 的 物理 


e121 而 


O 
| 
CH, 
Dass CH, | 
eH + int 
H \ CH 
OH aon OE ie 
_ ey; 
H H 
| H OH WA Oo | 
om Mula: seg, 
| H / H 
CHOH wa H 4 
| OH : an | 
CH, | so Do H —-O 
| 让 H 
‘ a 
O 
Ab Rays: = [Oe 
ee | 一 o H 


图 5-9 交 联 葡 聚 糖 的 化 学 结构 


结构 。 蛋 白质 为 紧密 的 椭圆 形 的 结构 ,而 多 糖 主要 是 无 规则 线 团 的 链 状 结构 ,其 旋转 半径 
可 能 比 相 同 分 子 量 的 蛋白 质 分 子 大 。 同 样 的 情况 也 出 现在 核酸 中 , 因 为 核酸 在 溶液 中 有 
一 种 类 棒状 结构 ,它们 的 聚集 状态 受洗 脱 流 的 组 成 ,特别 是 某 些 离子 (如 Mg**) 的 浓度 影 

响 很 大 。 


# 5-5 Sephadex 的 分 级 范围 


能 分 级 的 分 子 量 
型 号 
球状 蛋白 质 “mR i 
G-10 . <700 <700 
G-15 <1500 <1500 
G-25 1000—5000 100—5000 
G-50 1500—30, 000 500—10, 000 
G-75 3000—70, 000 1000—50, 000 
G-100 4000—150, 000 1000—100, 000 
G-150 5000—400, 000 1000—150, 000 
G-200 5000—800, 000 1000—200, 000 | 
葡 聚 糖 凝 胶 是 一 种 化 学 性 质 比较 稳定 的 物质 ,不 溶 于 水 、 弱 酸 、 碱 和 盐 溶液 ,也 不 盗 于 上 
"122。 


EIR LE IO LI DE OT ae 


一 般 有 机 溶剂 中 。 但 在 强酸 中 , 凝 胶 的 糖 背 键 易 水 解 ,一 般 在 0.02 N HCI 低温 下 能 保持 半 
年 , 在 碱 性 环境 下 却 十 分 稳定 , 如 Sephadex G-25 在 0.25 N NaOH #1, 60° 经 两 个 月 仿 
不 改变 其 色谱 性 质 , 故 常用 0.5 N NaOH ( 含 0.5 N NaOH) 来 除去 残留 在 凝 胶 上 的 变性 蛋 
白质 及 其 他 杂质 。 此 外 ,Sephadex 结构 上 的 羟基 在 过 强 的 碱 性 下 对 氧 敏 感 , 易 氧化 成 酸 。 
凝 胶 对 热 稳定 , 湿 态 凝 胶 在 110°C 高 压 灭 菌 40 分 钟 , 性 质 不 变 , 干 态 凝 胶 可 耐 受 120”c 左 
右 。 

由 于 Sephadex 中 含有 许多 亲 水 性 羟基 ;* 故 干 胶 有 很 强 的 吸水 性 , 吸 水 性 主要 取决 于 
网 孔 大 小 ,不 同型 号 的 Sephadex 用 G 表 示 , 在 G 后 面 的 阿拉 伯 数 字 为 凝 胶 得 水 值 再 乘 以 
10, G 值 愈 大 , 则 得 水 值 愈 大 。 

表 5-6 列举 某 些 常用 物质 的 葡 聚 糖 凝 胶 分 子 筛 色 谱 的 Ku 值 : 


5-6 某 些 常用 物质 的 Sephadex HF HEH Ks 值 


Ka 值 
化 合 物 
G25 G-50 G-75 -G-100 G-200 
纤维 蛋白 原 , 0 0 0 0 0 
r- 球 蛋白 〈19S) 0 0 0 0 0 
r- 球 蛋白 (7S) 0 0 0 0 0.2 
铁 传递 蛋白 0 0 0 0.1 0.3 
血清 清 蛋白 0 0 0 0.2 0.4 
血红 蛋白 0 0 0.1 0.3 0.5 
BABA 0 0 0 0 0 
RASA 0 0 0 0 0.2 
卵 清 蛋白 0 0 0 0.2 = 
REAR 0 0 0.3 0.5 0.7 
BEARS 0 0 0.3 0.5 0.7 
BEAR 0. 0 0.3 = Bua 
细胞 色素 < 0 0 0.4 0.7 
溶菌 酶 0 0 0.7 i 
RAR 0 0 0.4 = es 
HAR 0.9 一 0.1 as 
AA AR 12 1.0 ee aa wel 
酷 氨 酸 1.4 kil 一 一 — 
色 氨 酸 rhe 1.6 {2 = me 
KCI 1.0 1.0 一 一 一 
(NH,),SO, 0.9 一 一 一 一 


《二 ) 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 


聚 丙烯 酰胺 凝 胶 也 是 一 种 人 工 合成 凝 胶 , 其 商品 名 为 生物 凝 胶 -P(〈《Bio-Gel-P), 和 交 
联 葡 聚 糖 一 样 ,为 颗粒 状 干粉 ,在 溶剂 中 能 自动 吸水 溶 涨 成 凝 胶 。 其 组 成 单位 是 丙烯 酰胺 
(CH, = CH 一 CONH2),(〈 称 为 单 体 ) 和 交 联 剂 ( 甲 叉 双 丙烯 酰胺 ,简称 Bis) 通过 自由 基 引 
发 聚合 反应 形成 聚 丙 烯 酰 胺 ,经 于 燥 粉碎 加 压 成 形 处 理 即 成 为 生物 凝 胶 , 只 要 控制 单 体 用 
量 和 交 联 剂 的 比例 就 能 得 到 不 同型 号 的 凝 胶 。 


8Z°0-| 9£°0 


IT 6 


人 二: 


Z0 0 | 90°0 
81°0 | 67°0 
€7°0 | 6£°0 
cz°0 | IY 0 
85 0 | €S°0 
€r°0 | 79°0 
Zb*0 | 79°0 
L 5 


me 


“中 50"0 MIG R Soyer Ww IDH-srL FAME LS > 


. (Y) 
< 六 —. | TO 20-0 och) 00 本 0 人 2 了 
| El BSH eT 
CED) 
£0°0 | b0°O | ZI°0 | 8770 | 20°C | F0°0 | 80°0 | £770 | 20°0 | Z0°0 | TI°0 | 10°O | 40°0 | 20°70 | 1270 | 9¢€°0 | s9°E | 0°0Z 
EVE AU 
S0°O | OL°0 | 81°0 |. — | $0°0 | 60°0 | TO LOO | O1°0 | 61°0 | $0°0 | g0°0 | ST°0 | TE"O | Sb°O | 80° 1599 (WORRY 
£0°0 | I1°0 | 02°0 | bE*O | 200 | Z1°0 | BIO OT°0 | FE°O | 227°0 | 80°0 | €1°0 | TZ7°0 | SE°O | 6b | O8°Z | O'Sh | EIB ARNG 
CAIIGY) 
CTD | Teor! Ze" 0. he SEO peo pee LT°0 | 2°0 | 9€°0 | ZI°0 |cez°0 | TE°0 | 8h°O | 6S°0 | SE°Z | OIE 
aa tW : 
pee ct 
OCS G0 Bet Tyo O =e SCO Oe OrieteHO b2°0 | SE°0 | Zh°O | S20 |} TE°O | LE-O | ES°O | $970 | 92°7 | SIZ 
El HEMEL. 
S20 | ZE°0 | bh°O | €S°0 | 82°0 | TE*O | OO 87°0 | 8€°0 | Sb'0 | TE°O | Be°O | bh°O | 6S°0 | 29° | 10°72 | ba FA Re : 
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—CH,—CH—CH,—CH—CH,—CH—CH,—CH— 
| | | | 


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WH, NH NH, NH 

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' 5-10 FRA MRR A 
FEAR PA he Be HE A A I EH , BA RASS IK HAY Be BT A FERRE. Hierten!” 最 


Siren MMIC Ss AEC Bie A, LA CT) 代表 100 EF BEB KPA RAIS 


剂 总 克 数 , 称 为 凝 胶 浓 度 , 而 其 中 交 联 剂 占 单 体 加 交 联 剂 总 量 的 百分比 称 交 联 度 , 以 (C) 
表示 。 如 8X25 的 凝 胶 的 制备 是 每 100 毫升 溶液 中 含 6 克 丙 烯 酰胺 和 2 克 Bis.。 应 用 于 
分 子 筛 色 谱 中 的 单 体 浓度 (T) 在 5 一 25 之 间 , 开 在 5 之 下 的 凝 胶 太 软 易 碎 裂 , THOU 
”上 士 的 凝 胶 使 小 分 子 蛋白 质 也 几乎 不 能 穿 透 。 实 际 上 应 用 C 值 为 11-25% 之 间 。 
聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 稳定 性 不 如 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 , 在 酸性 条 件 下 酰胺 键 易 水 解 为 羧基 , 
使 凝 胶带 有 一 定 的 离子 交换 基 团 ,一般 应 在 pH 2 一 11 之 间 。 

表 5-7 提供 了 一 些 典型 的 蛋白 质 〈 分 子 量 12,000 一 160,000) 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 色 谱 
上 的 Kw {fo 

表 5-8 列举 了 各 种 型 号 -Bio-Gel p 的 分 级 范围 s 


表 5-8 Bio-Gel P 的 分 级 范围 (球形 分 子 ) 


型 号 分 级 范围 (分 子 量 ) 
Bio-Gel P-2 = 170—2600 
Bio-Gel P-4 600—3500 
Bio-Gel P-6 1000—5000 
Bio-Gel P-10 2500—40, 000 
Bio-Gei P-30 3000—50,000 
Bio-Gel P-60 5000—65,000 
Bio-Gel! P-100 5000—100,000 
Bio-Gel P-150 5000—200,000 
Bio-Gel P-200 40,000—250,000 
Bio-Gel P-300 50,000—600,000 


(=) 琼脂 糖 凝 胶 


琼脂 是 一 种 天 然 存在 的 多 糖 混合 物 , 它 来 源 于 几 种 海藻 。Arakit” 认为 , 琼 脂 主要 由 
两 部 分 组 成 ,一 为 中 性 链 状 多 糖 , 称 琼脂 糖 〈agarose), 其 结构 是 由 8-D- 吡 叶 型 半 乳 糖 和 
3,6- 脱 水 - 工 - 吡 喃 半 乳 糖 相间 结 合 的 链 状 多 糖 ; 另 一 为 带 负 电荷 的 琼脂 糖 〈agaropectin), 
含有 磺 酸 基 和 羧基 ,可 采用 氧 代 十 六 烷 吡 啶 , 聚 乙烯 醇 等 把 琼脂 胶 沉淀 而 除去 。 


防 脂 糖 凝 胶 的 商品 名 因 生 产 厂 家 不 同 而 异 , 目 前 有 Sepharose (瑞典 轧 Sagavac《〈 英 国 ) 


Bio-Gel A (美国 ); Gelarose (丹麦 ); Super Ago-Gel (美国 )。 
表 5-95-10 列举 了 某 些 蛋白 质 在 Sagavac 和 Sepharose 凝 胶 上 的 Ka (A: 


。 125。 


表 5-9 几 种 蛋白 质 在 4 一 1096 Sagavac 琼脂 糖 凝 胶 上 的 KK,, 值 


分 子 量 stokes 琼 脂 ey 
蛋 A WR 半径 

X* 10° mRX10- 10 8 6 5 4 
肌 红 和 蛋白 17% 20.0 0.60 0.70 ee ne 0.88 
it UL a GIB) 40 | 30.0 0.33 0.50 ae 22 0.82 
HEShias 150 45.5 0.11 0.23 — 0.50 0.70 
SARA 258 60.0 0.02 0.08 0.02 0.37 0.58 
FARRER EA 670 83.0 一 — 一 0.20 0.42 
芜 其 黄花 叶 病 毒 3500 0 一 we 0.07 0.19 


表 5-10 JL##BH RH Sephadex G-200 Sepharose 4B 和 6B 上 的 K,, f€ 


stokes 半径 Srubarie Sephadex 
& 8B Ia DFBX10 Ce MIG, SLICE Se 

BK Xx 107° 4B 6B G-200 
BERBERS 13.7 0.86 . 0.78 0.75 
WeSA 45 0.72 0.62 0.53 
铁 传递 蛋白 71 0.68 0.53 0.40 
葡萄 糖 氧 化 酶 186 0.60 0.42 0.27 
甲状 腺 球 蛋 白 670 0.45 0.27 0.00 
cx%- 结 晶 蛋 和 白 1000 0.38 0.22 0.00 


(四 ) KAR LH-20 (Sephadex LH-20) 


交 联 葡 聚 糖 LH-20 是 亲 脂 性 Sephadex 的 衍生 物 , 能 在 有 机 溶剂 中 溶 涨 , 溶 涨 的 性 
质 决定 于 原 凝 胶 的 交 联 度 ,羟基 取代 的 程度 ,溶剂 的 性 质 等 。 


Sephadex LH-20 是 交 联 葡 聚 糖 的 羟基 被 羟 丙 酰基 [HOCCH 一 CHO — ] 所 取代 , 


已 成 为 商品 ,可 用 于 分 离 脂 溶性 的 物质 。 
Sephadex LH-20 在 各 种 有 机 溶剂 中 的 性 质 见 表 5-11。 


表 5-11, 交 联 葡 聚 糖 LH-20 的 性 质 


得 溶剂 值 毫升 / 克 干 胶 床 体积 毫升 / 克 干 胶 


& 剂 
二 甲 基 甲 酰胺 222 4.0—4.5 
水 oe 4.0—4.5 
甲醇 1.9 4.0—4.5 
乙醇 1.8 3.54.5 
BCA 1% 乙醇 稳定 1.8 3.5 —4.5 
氯仿 1.6 3 
ETS 1.6 3.0—3.5 
二 和 氧 杂 环 已 烷 1.4 3,.0—3.5 
PO a BK Mi 1.4 3,0 
丙酮 0.8 
C&C 0.4 
甲苯 0.2 


© 126« 


9 Fu 


三 、 分 子 得 色谱 的 实验 技术 


(一 ) 凝 胶 的 选择 及 处 理 
交 联 葡 聚 糖 \ 琼 脂 糖 和 交 联 么 丙烯 酰胺 凝 胶 都 是 三 维 空间 网 状 结构 的 高 分 子 聚 合 物 。 
混合 物 的 分 离 程度 主要 决定 于 凝 胶 颗 粒 内 部 微 孔 的 孔径 和 混合 物 分 子 量 的 分 布 范围 。 微 
FLFL Co) 的 大 小 与 凝 胶 物质 在 凝 胶 相 中 的 浓度 (C ) 的 平方 根 成 反比 ,而 与 凝 胶 聚 合 物 
分 子 的 平均 直径 (2) 成 正比 ,它们 之 间 的 关系 可 近似 地 以 下 式 表示 89: 
1.5d 
e Ve 
实验 证 明 , 琼脂 凝 胶 的 浓度 以 8.9 匈 为 宜 。 

和 北 胶 孔径 大 小 有 直接 关系 的 是 凝 胶 的 交 联 度 , 凝 胶 的 交 联 度 越 高 ,孔径 越 小 。 交 联 
度 决 定 了 被 排 阻 物质 分 子 量 的 下 限 ,移动 缓慢 的 小 分 子 物质 ,在 低 交 联 度 的 凝 胶 上 不 易 分 
离 , 大 分 子 物 质 同 小 分 子 物质 的 分 离 宜 用 高 交 联 度 的 凝 胶 。 

凝 胶 的 颗粒 粗细 与 分 离 效果 有 直接 关系 ,颗粒 细 的 分 离 效 果 好 。 但 流速 宴 , 而 粗 粒子 
流速 过 快 会 使 区 带 扩 散 , 使 洗 脱 峰 变 平和 宽 , 因 此 ;要 根据 工作 需要 ,适当 选择 颗粒 大 小 及 
调整 流速 。 为 使 凝 胶 颗 粒 均匀 ;并 除去 影响 流速 的 过 细 上 颗粒 ,一 般 采 用 自然 沉降 , 再 用 倾 
倒 法 除去 悬浮 的 过 细 凝 胶 颗 粒 。Kawata 等 介绍 了 一 种 在 干燥 乙醚 中 的 沉降 法 ,从 过 细 的 
Sephadex 中 制备 适当 流速 的 凝 胶 部 份 aa。 

” 交 联 葡 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 通常 的 商品 为 干燥 的 颗粒 ,使 用 前 必须 充分 溶 涨 ,而 这 
个 永 洗 过 程 在 室温 下 进行 缓慢 , 可 用 加 热 100*C〔〈 沸 水 浴 ) 方法 加 速溶 涨 平衡 ( 见 表 5- 
12)。 在 装 柱 前 , 凝 胶 的 溶 涨 必需 彻底 ,否则 由 于 继 继 溶 涨 过 程 , 会 逐渐 降低 流速 , 影响 色 
谱 的 均一 性 ,甚至 会 使 色谱 柱 涨 裂 * 

表 5-12 Sephadex 和 Bio-Gel 的 水 合作 用 和 平衡 时 间 ( 小 时 ) 


物 质 室 ii 100°C 水 浴 
Sephadex G-10 G-15 3 1 
Sephadex G-25 G-50 6 je 
Sephadex G-75 24 3 
Sephadex G-100 48 fe) 
Sephadex G-150 72 5 
Sephadex G-200 72 5 
Bio-Gel P-2-P-10 2—4 
Bio-Gel P-30, P-60 10—12 


Bio-Gel P-100, P-150 24 
Bio-Gel P-200, P-300 48 


(=) 柱 的 选择 及 装填 


色谱 柱 一 般 用 玻璃 管 或 有 机 玻璃 管制 成 , 管 底部 放置 玻璃 纤维 或 砂 世 滤 板 (2 号 或 3 
号 ), 上 面 再 装 上 2 厘米 厚 的 玻璃 球 ( 球 径 约 0.5 厘米 ), 柱 顶部 联接 一 个 长 颈 漏 斗 ,长 约 100 
厘米 ,直径 约 为 柱 径 的 一 半 , 漏 斗 中 安装 搅拌 器 。 然 后 在 玻璃 柱 和 漏斗 中 加 满 水 或 洗 脱 剂 , 


©1276 


在 搅拌 下 绥 缓 加 入 凝 胶 悬 浮 液 ,毛细 管 出 口 的 流速 维持 在 5 一 10 毫升 /分 。 凝 胶 粒 沉积 管 . 
底 后 关 紧 毛细 管 ,使 其 自然 沉积 达 1 一 2 厘米 时 再 打开 毛细 管 , 直 至 达到 所 需 高 度 为 止 o 拆 
除 凋 斗 , 用 较 小 的 滤纸 片 盖 住 凝 胶 床 表面 ,再 用 大 量 的 水 或 洗 脱 剂 洗涤 过 夜 。 

色谱 柱 的 大 小 规格 的 选择 也 很 重要 , 通 常 对 于 高 分 辩 率 的 柱 则 采用 高 的 (ZL1D 即 长 
度 / 直 径 ) 比 率 。 例 如 ,Killander 发 现 分 离 血 清 蛋 白 的 柱 工 / 为 23:1 时 , 效 果 最 佳 。 为 
了 提高 分 辩 率 有 人 甚至 采用 100:1 (L/D) 的 比率 。 增 高 柱 长 虽然 提高 了 分 辩 率 ,但 影 啊 
Pits AHS DN TS PE AY Fi EE pce Seine EE Seer SO Shen ca a 
格 。 

色谱 分 离 效果 和 装填 起 来 的 色谱 床 是 否 均匀 有 大 关系 , 因此 使 用 前 必需 检查 装 柱 的 
质量 ,最 简单 的 方法 是 用 肉眼 观察 色谱 床 是 否 均匀 ,有 没有 ”纹路 "和 和 气泡, 或 用 一 种 有 色 
的 物质 的 溶液 〈 如 铁 蛋白 小 ,印度 墨水 或 带 色 的 多 糖 溶 液 等 ), 当 有 色 溶 液 流 过 色谱 柱 床 , 
后 ,观察 色 带 的 移动 ,如 色 带 狭 罕 , 刚 勾 平整, 说明 性能 民 好 , 色 带 出 现 算 曲 ,散乱 变 宽 , 则 
必需 重新 装 柱 。 

(=) 加 样 及 洗 脱 

分 子 第 色谱 中 由 于 其 洗 脱 昌 线 是 分 配 等 慢 线 , 洛 质 的 浓度 与 分 配 等 浊 线 无 关 ; 攻 对 比 
许多 其 他 的 色谱 法 ,溶质 可 采用 较 高 的 起 始 浓度 , 但 也 不 要 太 高 ,浓度 太 高 粘度 太 大 ,一 般 
溶质 的 粘度 不 能 超过 溶剂 的 两 倍 。 

对 于 高 分 辩 率 的 分 子 筛 色谱 ,开始 溶液 的 体积 主要 为 内 体积 CFz) 所 决定 , 歼 高 得 水 
值 凝 胶 ( 如 Sephadex G-200), 每 毫升 总 床 体积 (F,) 可 加 0.3 一 0.5 毫克 溶质 ,使 用 体积 约 
为 0.02 Ve, 而 低 得 水 值 凝 胶 〈 如 as G-75) BET RAR (V,) INS ie 0.2 S58, 
样品 体积 为 0.01 io 

样品 上 柱 也 是 分 子 筛 色 谱 的 一 项 重要 操作 , 要 求 尽 可 能 保持 色谱 床 表面 的 稳定 , 可 用 
人 工 方法 , 当 色 谱 柱 经 平衡 后 , 吸 去 上 层 流 体 , 待 平衡 液 流 至 床 表面 以 下 1 一 2 SANK 
闵 出 口 , 以 最 小 体积 样品 用 滴 管 慢 慢 加 入 ,打开 出 口 , 调 整流 速 , 使 样品 慢 慢 渗 人 色谱 床 
内 ,* 当 样品 加 完 六 至 快 王 时 ,小 心 加 入 洗 脱 沪 洗 脱 。 加 符号 的 体积 越 小 ,分 离 效果 越 好 , 
样 体积 不 得 超过 (Ke 一 Ka)o 

非 水 溶性 物质 的 洗 脱 都 采用 有 机 溶剂 《如 共和 丙酮 等 ), 水 咨 性 物质 的 洗 脱 一 般 采 用 
水 或 具有 不 同 离子 强度 和 pH 值 的 缓冲 液 , pH 的 影响 与 被 分 离 物质 的 酸碱度 有 关 , 在 酸 
性 pH 值 时 , 碱 性 物质 易于 洗 脱 , 在 碱 性 PH (AN ,酸性 物质 易 洗 脱 。 多 糖 类 物质 的 洗 脱 以 
水 为 最 佳 。 有 时 为 了 使 祥 品 增加 溶解 度 而 使 用 含 盐 洗 脱 剂 , 盐 类 的 另 一 个 作用 是 抑制 交 
联 葡 聚 糖 和 琼脂 糖 凝 胶 的 吸附 性 质 。 

某 些 物质 洗 脱 剂 的 选择 实例 见 表 5-13。 


《四 ) Baie EA RIF 


Ze BAG TE AAS EDL & BK EB, HAE Wd WHE HK HS 
2 RAR ORK BAEAEONERD A, CRAKE A th ee ee 
谱 特 性 。 为 了 抑制 微生物 的 生长 ,磷酸 离子 和 所 有 底 物 必需 在 凝 胶 床 保存 之 前 完全 除去 
将 柱 真空 保存 或 低温 保存 ,但 温度 不 可 过 低 , 介 质 的 离子 强度 要 高 一 些 , 以 防冻 结 。 


2 128 。 


| 3S 
; 
: 


ts." 


ee eS 


RS 


表 5-13 “ 某 些 物质 的 洗 脱 剂 


分 离 物质 凝 BE BE 脱 剂 
多 肽 ,氨基酸 Sephadex G-25 乙酸 : 吡啶 : w= 65215225 
MASA, MASA 7% 琼脂 0.07 M 磷酸 盐 缓冲 液 pH 7.2 
球 蛋 白 类 Sephadex G-25 0.15M 磷酸 盐 缓冲 液 PH8.0 
营 青 蛋白 , 营 红 和 蛋白 Sephadex G-75 0.1 M. 柠檬 酸 盐 -磷酸 盐 缓冲 液 pH7.0 
蛋白 质 类 9956 琼脂 0.04M 磷酸 钾 -0.12 M KCI 缓冲 液 pH7.0 
染料 结合 蛋白 Séphadex G-25 0.1M 磷酸 盐 组 冲 液 pH7.0 
Sh SAG » BRAR BT AG SSR A hi BE HE 0.05M 磷酸 盐 缓冲 液 PH8.0 
胃 和 蛋白 酶 Sephadex G-50 0.2M 乙酸 钠 pH4.9 
酸性 磷酸 酯 酶 Sephadex G-75 1M 乙酸 
ips 9% 琼脂 水 
甲状 旁 腺 激素 Sephadex G-50 0.2M CB-CEREMR pH4.72 
*. HEE RR Sephadex -G-25 0.1M NH,OH 
烟草 花 叶 病毒 8% 琼脂 0:2M NaH:PO,-0.3MNaCl pH6.8 
维生素 Bi Sephadex G-25 7k 
4b Fh RIB Sephadex G-50 0.5M 磷酸 缓冲 小 pH7.4 
RACK FER & 
RT law 丙酮 ;乙酸 , 乙 酯 


Oe ae ee a a ee Se 


RANDDELERR MAEM, MARW (0.02%); =AT HB (0.01— 
0.02%); CHER PAK GBB (0.005—0.01%); KEKE GHEERACRE ER 


Eh, HIRE) (0.001—0.01 %)o 
(4) 凝 胶 的 再 生 和 干燥 


涛 胶 色谱 的 载体 不 会 与 溶质 发 生 任何 作用 , 因 此 色谱 分 离 后 稍 加 平衡 即 可 进行 下 一 
次 色谱 。 但 在 实际 操作 中 常 有 一 些 污染 凝 胶 或 色谱 床 表面 , 必 需 作 适 当 处 理 。 交 联 葡 案 
糖 凝 胶 柱 可 用 0.2N NaOH 和 0.5 N NaCl 的 混合 液 处 理 , 聚 丙烯 栈 胺 凝 胶 和 琼脂 糖 凝 胶 由 


于 遇 酸 碱 不 稳定 ,常用 0.5 N NaOH 处 理 。 


”经 稼 使 用 的 凝 胶 以 湿 态 保存 为 主 , 只 要 在 其 中 加 和 人 适当 的 抑 菌 剂 就 可 放置 几 个 月 至 
一 年 ,不 需要 干燥 ,尤其 是 琼脂 糖 凝 胶 , 干 燥 操 作 比 较 麻烦 , 干燥 后 又 不 易 溶 涨 , 一 般 都 以 
湿 法 保存 。 如 需 进 行 干燥 时 应 先 将 凝 胶 按 一 般 再 生 处 理 彻 底 序 选 , 除 去 碎 颗 粒 , 以 大 量 水 


”洗涤 除 和 杂质, 然后 用 逐步 提高 乙醇 浓度 的 方法 使 之 脱水 煞 缩 ,方法 是 先 用 70 多 乙醇 ,接着 
是 90% 乙醇 ,最 后 为 95 多 乙醇 逐步 脱水 ,然后 在 60—80% 下 干燥 或 用 乙醚 洗涤 干燥 。 


四 、 分 子 得 色谱 的 应 用 


(一 ) 脱盐 


生物 大 分 子 物 质 ( 如 蛋白 质 、 核 酸 \ 酶 .多糖 等 ) 在 分 离 提纯 时 ,常用 盐 溶液 洗 脱 , 故 洗 
RAVE, 一 般 采 用 透析 法 除 盐 ,费时 又 繁琐 , 如 果 采 用 分 子 筛 层 析 法 除 盐 , 时 间 
短 ,也 不 影响 生物 大 分 子 的 生物 特性 。 葡 聚 糖 凝 胶 G-25 因 其 流动 阻力 小 , 交 联 度 适 宜 , 故 
利 用 于 蛋白 质 溶液 的 脱盐 ,一 般 要 达到 完全 脱盐 , 溶液 的 体积 应 在 0.8 了 以 下 , 如 果 样 品 
粘度 不 大 , 0.75V, 可 达到 完全 脱盐 ,但 在 一 般 情况 下 , 采用 0.3 左右 体积 即 可 1。 


129。 


进行 蛋白 质 样品 的 脱盐 应 注意 蛋白 质 溶液 在 去 除 电解 质 后 因 溶解 度 显 著 下 降 而 沉 . 
省 ,以 致 被 吸附 在 柱 上 不 能 洗 脱 焉 来 ,解决 的 方法 是 先 使 用 含有 挥发 性 盐 类 (如 甲酸 贸 ; 栈 
酸 儿 等 缓冲 液 ) 使 色谱 柱 平 衡 , 然 后 加 入 样品 ,并 用 同 种 缓冲 液 洗 脱 , 洗 脱 液 再 用 冷冻 干燥 
法 除去 挥发 性 盐 类 。 


(=) 分 子 量 的 测定 


用 一 系列 已 知 分 子 量 的 标准 样品 放 人 同一 凝 胶 色 谱 柱 内 , 令 其 在 同一 条 件 下 进行 凝 
胶 色 谱 分 离 , 记 下 每 一 种 成 分 的 洗 脱 体积 ,并 以 洗 脱 体积 对 分 子 量 的 对 数 作 图 , 在 一 定 分 
子 量 范围 内 可 得 一 直线 , 这 就 是 分 子 量 的 标 
准 曲线 (图 5-118), HUE AR AOA SS Fe 
时 , 可 将 样品 加 在 测定 了 标准 曲线 的 凝 胶 柱 
内 , 洗 脱 后 根据 此 物质 的 洗 脱 体积 ,可 在 标准 
曲线 上 查 出 它 的 分 子 量 。 用 本 法 测定 高 分 子 
物质 的 分 子 量 时 不 需要 复杂 的 仪器 设备 , 操 
作 简 便 , 样 品 用 量 少 , 有 一 定 的 实用 价值 , 但 , 
本 法 也 会 产生 一 定 的 偏差 , 如 对 一 些 纤维 状 
蛋白 质 , 糖 蛋白 等 ,因此 要 作 精 确 的 测定 , 要 
和 其 他 方法 结合 比较 。 


图 5-11 .溶质 的 洗 脱 特征 和 分 子 量 之 间 的 相互 关系 


一 -入 一 全 一 一 , ARAB G-200; = 
Re 3 eee ail (=) 用 于 物质 的 分 离 提纯 
区 1. 糖 John 等 四 用 微 孔 聚 丙烯 酰胺 凝 


胶 P-2 分 离 葡萄 糖 寡 聚 糖 Cn 一 11), 采 用 色谱 柱 127X1.5 厘米 , 凝 胶 小 于 400 目 , 在 
65°C 用 水 洗 脱 ,流速 28 毫升 /小 时 ,得 到 良好 的 分 离 结果 (图 5-12)o 
Laurent & Granath5 研究 了 在 Sephadex G-200 上 可 溶性 葡 聚 糖 的 一 系列 色谱 特性 。 


0.7 G2 


0.5 Gi 


G3 


Mie HE 420 nm 
S 


G5 
G9 G6 
GG, S38 
‘ 3 4. 5 6 
时 间 〈 小 时 ) 
5-12 在 Bio-Gel P-2 MMe RHA aA 


© 130° 


MRE 


1000 1200 1400 
Vo RR (ml) Vi 


图 5-13 在 Sephadex G-200 上 可 溶性 葡 聚 糖 的 分 离 图 


葡 聚 糖 的 分 子 量 从 13,600 (组 份 D-6) 到 59,000 (组 份 D-1) 用 92X5.1 厘米 凝 胶 床 , 以 
0.2 M NaCl 洗 脱 ,流速 1.5 毫升 /小 时 “* 厘米 "。 分 离 结 果 如 图 5-13。 

2. 核酸 及 其 衍生 物 “用 分 子 筛 色谱 法 研究 核酸 及 其 衍生 物 的 分 级 分 离 首要 问题 是 
选择 一 个 适当 的 国定 相 。 在 Sephadex G-100 或 G-200 或 相应 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 都 可 
满意 地 分 离 转 移 RNA (4S. 分 子 量 约 25,000 一 28,000) 和 5S 核糖 体 RNA, 但 对 于 核 
糖 体 16S 和 23S 及 信使 RNA HOB, 则 需要 较 大 孔 的 基质 (如 琼脂 糖 )。 这 可 能 是 由 于 
核酸 和 具 相 同 分 子 量 的 球 蛋 白 比 较 有 较 大 的 分 子 体积 ,例如 : Hayes & Mitchell22 发 现 一 
个 合成 的 寡 聚 脱氧 核 苷 酸 ( 分 子 量 为 25,000) 在 琼脂 糖 柱 上 其 了 e/ 7。 值 为 1.29, 而 在 同样 
柱 上 对 c- 糜 蛋白酶 (分 子 量 22,500), 其 了 e/ 7。 值 为 2.29, 这 个 区 别 意味 着 寡 娶 脱氧 核 音 
酸 有 比 蛋 白质 大 的 斯 托 克 (stoke) 半径 , 这 是 因 多 核酸 链 中 相 邻 的 离子 化 磷酸 基 之 间 的 静 
电 排 斥 结果 。 增 加 洗 脱 液 的 离子 强度 可 以 降低 静电 效应 ,使 分 子 更 紧密 ,从 而 降低 这 种 排 


A260nm 


组 分 
图 5-14 在 Sephadex G-100 上 大 肠 杆菌 细胞 的 RNA 的 分 级 分 离 


e。]31。 


FH 

Reynier 等 2] 用 pie, G-100 SE ADF BARA RNA, fie 187X3 
厘米 ,以 0.05 M NaCl 洗 脱 , 得 色谱 图 5-14。 显 示 有 四 个 峰 ,第 一 峰 出 现在 色谱 柱 的 外 水 
体积 中 , 含 核糖 体 16 S 和 23 SRNA, 开 峰 含 一 些 中 等 分 子 量 的 代谢 上 稳定 的 RNA 的 混 


合 物 , 峰 II 是 5S 核糖 体 RNA, 而 峰 IV 为 转移 RNA。 


对 于 分 子 量 超过 500,000 的 溶质 的 分 离 , 特 别 是 对 那些 有 展开 结构 的 分 子 , 需要 大 也 
际 的 固定 相 〈 如 琼脂 糖 珠 )。Oberg A: Philison"” 测定 了 细胞 和 病毒 的 核酸 在 几 种 不 同 的 
芒 脂 糖 浓度 上 的 色谱 行为 , 如 图 5-15 a AA RRMA RRR Ae RNA 的 合 
成 混合 物 在 60X2.1 厘米 柱 的 1 和 % 琼脂 糖 珠 上 分 离 结果 。 WIR DNA, AI aie 
RNA; 峰 II 和 IV 各 为 核糖 体 和 tRNA, A 5-15 表示 分 离 过 程 中 琼脂 糖 浓度 变化 的 影 
ie], DNA 在 所 用 的 琼脂 糖 浓度 下 都 被 排 阻 , 而 tRNA 在 4% 琼脂 糖 浓度 的 Ka 值 为 0.6, 
在 1% 琼脂 糖 浓度 中 则 上 升 到 1.0, 洗 脱 液 pH 在 5 一 8 范围 内 变化 对 分 离 影 响 很 小 , NaCl 
浓度 从 0.01 到 1.0 M 的 变化 不 影响 DNA 或 tRNA 的 色谱 行为 。 由 此 看 出 DNA 完全 
为 固定 相 所 排 阻 ,而 tRNA 有 一 个 紧密 的 构 型 核糖 体 (16 S 和 23 S) 和 腺 病毒 RNA 由 于 
NaCl 浓度 的 增加 而 降低 了 静电 排斥 ,从 而 形成 更 紧密 的 构 型 , 故 在 柱 上 有 更 大 的 阻 留 图 
5-15 (c) 表示 腺 病毒 型 DNA (分 子 量 20X 10°), AHEK IR RIS RNA (4 FE 370,000) 
FORE IRE Ie RNA (分 子 量 370,000) 在 1% 琼脂 糖 珠 上 的 分 离 结 果 BiB KOO 
厘米 。 


30 40 50 60 70 80 
<b) 床 体积 的 百分数 «) 
o—e Argo O—0O %8/4t10-2 %*——1 数目 /分 10-3 


图 5-15 高 分 子 量 核酸 在 琼脂 糖 珠 上 的 分 离 


(a) Se a RNA 与 细胞 核酸 分 离 ; (b) 琼脂 糖 浓 度 对 核酸 洗 脱 体积 的 影响 , ©—e DNA, 
O—O rRNA,D 一 口 8K RAW RNA, X—X tRNA; (c) 病毒 核酸 的 分 离 ,X 一 X RAB 
RNA, 0O—O #fKARAS RNA,@ 一 @ 随 体 烟 草 坏 外 病 毒 RNA 


3. 蛋白 质 。 ”分子筛 色谱 年 期 重要 的 应 用 是 血清 蛋白 的 分 级 分 离 。 按 分 子 大 小 可 分 


为 二 组 。 第 一 组 (A) 包括 约 50 多 总 血清 蛋白 。 其 中 主要 为 白 蛋白 〈 分 子 量 70,000), 较 


少量 的 o-1 前 白 蛋白 (分子量 61,000) ,血清 粘 蛋白 (分子量 54,000) , 铁 传递 蛋白 (分 子 量 
60,000); 第 二 组 (G) 包括 免疫 球 蛋 白 ,, 主 要 为 IgG 及 较 少 量 的 I5A、Ig8D MIgE (分 子 量 
15,000—170,000), 少量 的 血浆 铜 蓝 蛋白 (分 子 量 151,000)、 结 合 珠 蛋 白 (DFR 200,000) 
和 6-2A 球 蛋白 ; 第 三 组 (M) 包括 免疫 巨 球 蛋白 〈IgM) Me 及 8 脂 蛋白 《分 子 量 约 
2,000,000—3,000,000). 

图 5-16 (a)、(b)、(c) 咖 表示 在 Sephadex G-100,G-150 及 G-200 上 这 些 组 别 的 分 

离 图 谱 。 分 离 结果 最 好 为 G-200, 在 聚 丙烯 酰胺 球 上 则 以 6x5 的 孔径 上 分 辩 率 最 佳 [图 


。 132 。 


与 重 目 一 


“日 重音 一 9 
TAB SUE :(D“(d)“、(3) SW ee :G) 


‘Ase = w 
“@) “(P) SY xapeydag 3 :(2) *(q) *(e) 


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008 09Z 002 OST 00T 


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(®) 


00I—5 


° 1336 


5-16 (d)、(e)、(f)], 但 巨 球 蛋 白 组 份 的 分 辩 率 最 好 为 5X5 的 凝 胶 。 蛋白 质 的 分 子 量 在 : 
200,000 之 下 的 在 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 效 果 不 好 , 但 10% 的 琼脂 糖 浓度 可 以 用 来 分 离 巨 球 
蛋白 [5-16(G) CH)、 CD]1, 而 6 多 凝 胶 仅 用 于 分 离 如 病毒 的 颗粒 , 分 子 量 在 300,000 以 
BS 上 的 物质 。 

RST SHU SCT EE 1 厘米 长 200 厘米 下 进行 , 床 体积 80 一 300 BF, 
了 最 大 加 样 量 5 一 50 毫克 , 这 对 于 大 分 子 溶 质 的 混合 物 的 分 离 有 良好 的 分 辨 力 。 假如 适 
by 当选 择 操作 条 件 , 在 制备 范围 上 可 获得 高 分 辨 力 ,Mauritzen 等 cg 在 3007.6 OKAY 
et, Sephadex G-100 色谱 柱 上 对 0.5 克 小 牛 胸腺 组 蛋白 的 富有 精 毛 酸 组 份 的 分 级 分 离 , 以 
ao 0.01 MHC! 洗 脱 , 流 速 67 一 90 毫升 /小 时 。 分 离 结果 如 图 5 一 17 得 五 个 峰 , 按 9 个 组 分 
收集 ,蛋白 质 回收 率 达 到 85% , 组 蛋白 在 峰 IT, 而 峰 LV 和 V 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 上 实 
际 上 均一 组 份 。 假如 应 用 特别 的 双 头 柱 , 工 / 疡 比率 (40:1) 控制 适当 流速 , 1.5 一 2 毫升 / 
小 时 . 厘米 2。 较 低 加 样 量 ( 少 于 0.04 毫克 /毫升 床 体积 ), 可 得 良好 分 辩 力 。 


吸收 度 230fim 


40 80 120 160° 200 240 280 
Sp RFK (32453EF) 


图 5-17 在 Sephadex G-100 上 富有 精 氮 酸 -组 蛋白 的 分 级 分 离 


小 时 
5-18 人 血浆 铜 蓝 蛋 白 的 循环 分 子 饰 色谱 
以 上 的 色谱 操作 多 采用 长 的 柱 , 故 柱 的 装填 及 操作 较 繁 琐 , 但 在 许多 情况 下 , 可 用 一 


。134 。 


oF Te BE AS 


- v ~ 上 Late) 


根 短 柱 , 以 循环 色谱 法 代替 。 例 如 Porath 和 Bennicht 报导 的 人 血浆 铜 蓝 蛋白 的 分 级 分 
By (图 5-18)。 用 粗 备 浆 铜 蓝 蛋白 156 毫克 , 93 X 2.2 厘米 色谱 柱 ,Sephadex G-100, 以 
Tris-HCl 缓冲 液 (pH8.0) 循环 上 柱 , 流 速 20 毫升 /小 时 。 在 三 次 循环 后 得 到 A 和 了 B 成 分 
的 不 完全 分 离 , 进 一 步 的 循环 色谱 可 除去 B 峰 的 尾随 物质 (阴影 部 分 ); 至 第 四 循环 时 A 部 
分 已 与 任何 残余 B 部 分 分 开 ; 至 第 六 和 第 八 循环 之 间 , 某 些 尾 随 物 质 已 除去 ;到 第 八 循环 
可 得 纯 A 组 分 。 


第 三 节 亲 和 色谱 
一 、 基 本 原理 


生物 体 中 许多 高 分 子 化 合 物 具有 和 某 些 相对 应 的 专 一 分 子 可 逆 结 合 的 特性 , 例 如 酶 


蛋白 和 辅酶 .抗原 和 抗体 ` 激 素 及 其 受 体 、 核 糖 核酸 与 其 互补 的 脱氧 核糖 核酸 等 体系 ,都 具 


有 这 种 特性 。 生 物 分 子 间 的 这 种 结合 能 力 称 为 亲和力 , 根 据 生 物 分 子 间 亲 和 吸 附和 解 离 
的 原理 ,而 建立 的 色谱 法 称 为 亲 和 色 谱 法 。 

亲 和 色 谱 的 基本 过 程 如 下 : 把 欲 分 离 的 可 亲 和 的 一 对 分 子 的 一 方 作为 配 基 (ligand), 
在 不 伤害 其 生物 功能 情况 下 与 不 溶性 载体 结合 使 男 定 化 ; 装 和 人 色谱 柱 ( 称 亲 和 柱 ,然后 把 
含有 和 欲 分 离 物质 的 混合 液 作为 流动 相 , 在 有 利于 配 基 固 定 相 和 欲 分 离 物质 之 间 形 成 络 合 
物 的 条 件 下 进入 亲 和 柱 。 这 时 ,混合 物 中 只 有 能 与 配 基 形 成 络 合 物 的 物质 分 子 被 吸附 ,不 
能 形成 络 合 物 的 杂质 则 直接 流出 。 变 换 通 过 亲 和 柱 的 深 液 , 促使 配 基 与 其 亲 和 物 解 离 ,从 


his pe maa 


SA 载体 
十 Bh 


亲 和 物 Ch 


RRB Mp BE hy 
再 生 os oa 


eo) 
5-19 亲 和 色 谱 基本 过 程 示意 图 
亲 和 色 谱 中 最 常用 的 生物 体系 如 下 : 


酶 : 基质 类 似 物 ,抑制 剂 ,辅酶 。 

抗体 : 抗原 ,病毒 ,细胞 。 

外 源 凝集 素 : 多 糖 , 糖 蛋 日 ,细胞 表面 受 体 , 细 胞 。 
核酸 : 互补 碱 基 序列 ,组 蛋 日 ,核酸 聚合 酶 ,结合 蛋 日 。 
激素 及 维生素 : Sh RARE Ao 

细胞 : 细胞 表面 特异 蛋 日 、 外 源 凝集 素 。 


亲 和 色 谱 的 优点 是 在 温和 条 件 下 操作 简单 ,效率 高 ,特别 对 分 离 含量 极 少 而 又 不 稳定 | 


的 活性 物质 最 有 效 。 甚 至 从 粗 抽 提 锌 中 经 亲 和 色 谱 一 步 就 能 提纯 几 百 至 几 千 倍 。 例 如 分 
离 胰岛 素 受 体 时 ,把 胰岛 素 作为 配 基 , 偶 联 于 琼脂 糖 载体 上 ,经 亲 和 色 谱 , 从 肝 细 胞 抽 提 液 


© 135 


中 纯化 达 8000 fe 

亲 和 色 谱 的 局 限 性 在 于 不 是 任何 生物 高 分 子 都 有 特定 的 配 基 , 针对 某 一 分 离 对 象 就 
需要 制备 专 一 的 配 基 和 选择 特定 的 色谱 条 件 。 

由 于 芒 脂 糖 这 一 理想 载体 的 出 现 以 及 固定 化 技术 的 改进 , 使 亲 和 色 谱 技术 得 到 越 来 
越 广泛 的 应 用 ,发 展 十 分 迅速 ,目前 已 有 几 百 成 功 的 例子 , 也 有 了 作为 亲 和 色 谱 载 体 的 商 
品 供应 。 因此 , 亲 和 色谱 技术 已 成 为 生物 化 学 中 分 离 提纯 生物 活性 物质 的 重要 方法 之 


[28,29] 
° 


二 、 载 体 的 选择 


亲 和 色 谱 的 理想 载体 应 具备 下 列 特性 : (1) 不 溶性 ; (2) Bate: BAAR, 
许 大 分 子 自 由 通过 ;〈3) 高 硬度 及 适当 的 颗粒 形式 (最 好 为 均一 的 珠 状态 47 最 低 的 吸附 
力 ;〈5) 较 好 的 化 学 稳定 性 ;〈6) 抗 微 生物 和 酶 的 侵蚀 ;〈77 亲 水 性 ;(〈8) Peis 
的 化 学 基 团 可 供 活化 , 能 与 大 量 配 基 共 价 连 接 。 


(—) FER 


亲 水 性 纤维 素 衍生 物 已 用 于 抗体 和 酶 的 纯化 。Lerman 最 早 用 于 酪 氨 酸 酶 的 分 离 ,将 
栈 氨 酸 的 抑制 剂 对 葵 重 氮 酚 连接 于 纤维 素 上 ,用 来 提纯 蘑菇 中 的 栈 氨 酸 酶 ""; 黄 素 衍生 物 
偶 联 于 羧 甲 基 纤 维 素 上 ,能 特异 吸附 肝 黄 素 激 酶 ,使 酶 纯化 几 百 倍 ”"。 纤 维 素 衍 生物 用 于 
核 彰 酸化 学 上 特别 有 效 , 例 如 ,用 于 纯化 核酸 的 互补 链 转移 RNA 和 核 背 酸 。 

虽然 纤维 素 衍 生物 有 价 廉 及 来 源 充足 的 优点 , 但 由 于 它 的 纤维 性 和 非 均一 性 限制 了 
大 分 子 的 挨 人 ”2。 而 且 非 专 一 吸附 作用 较 严 重 , 因 而 限制 了 其 广泛 的 应 用 。 


(=) MR eK 


F670 PE BCE HA DFR AA AA eS TT, EA 良好 的 化 学 及 物理 稳定 
性 ,但 多 孔 性 则 较 琼 脂 糖 凝 胶 为 低 , 并 且 经 过 偶 联 配 基 的 操作 后 , 凝 胶 的 膨胀 度 将 进一步 
缩减 ,因而 在 亲 和 色 谱 中 的 应 用 也 受到 一 定 限 制 。 


(=) 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 


聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 物理 化 学 性 质 也 十 分 稳定 , 抗 微 生物 侵蚀 的 能 力 比 琼脂 糖 强 , 有 更 
多 的 可 供 化 学 反应 的 酰胺 基 , 提 高 了 配 基 的 浓度 , 故 特别 适用 于 配 基 和 亲 和 物 之 间 亲 和 力 
比较 弱 的 系统 。 用 Biogel 制 得 配 基 高 度 取代 的 衍生 物 , 就 能 增强 物质 间 的 相互 作用 而 成 
功 地 进行 亲 和 色 谱 。 从 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 为 载体 可 制 得 各 种 衍生 物 。 

1. 侄 氢 衍 生物 ”通过 育 丙 烯 酰胺 的 酰胺 基 经 水 合 腹 处 理 后 形成 酰 肝 基 , 再 由 亚 硝 
酸 处 理 而 成 登 氮 衍 生物 。 它 可 以 和 具有 脂 族 或 芳香 族 氨基 的 配 基 偶合 《以 { RRA 
酰胺 )。 


y 9 nu,—| fa | | 配 基 | 
ne Ae et le 


Oo 
WA H,N 要 NH, 
aX, C—NH, 


a H,0, 
Bl SS: PR | Spee 


we Ls te) 


© 136° 


2. 氨基 衍生 物 “” 带 有 酰胺 基 的 聚 丙烯 酰胺 衍生 物 可 与 脂 族 二 胺 反应 制 得 氨基 衍生 
物 。 它 可 以 和 带 羧基 的 配 基 偶 合 。 利 用 脂 族 二 胺 中 的 烃 长 度 可 以 控制 手臂 的 长 短 。 


O 
H,N CH, nNH, 
ie - NH, wer. 人 
Hooc 一 | 配 基 | aes Bo 
ee CET CE,’ n—c—| 配 基 | 
WK 


3. 酷 氨 酰 衍生 物 “- 聚 丙烯 酰胺 僚 氮 衍生 物 进 一 步 和 甘 氨 酰 酷 氨 酸 反应 可 制 得 酷 氨 


栈 衍 生物 , 它 可 以 和 带 有 氨基 的 配 基 经 重 氮 化 后 相 偶 联 。 


oO O 
Lon 有 站 本 ~#- 酷 一 ‘—OH 
a vex [i] 
5 a | + -m—C it Dae 
So a] 
(四 ) 多 孔 玻璃 


多 和 孔 琉璃 的 优点 在 于 不 受 微生物 的 侵蚀 ,经 受 得 起 有 机 溶剂 和 缓冲 液 组 成 的 改变 。 但 
是 玻璃 表面 由 于 含有 羟基 ,因而 在 水 溶液 中 显示 轻微 负 性 的 表面 电荷 ,' 对 于 大 多 数 酸性 蛋 
白质 \ 病 毒 . 多 糖 或 核酸 , 洗 陪 时 没有 任何 阻挡 或 吸附 ,而 对 所 有 强 碱 性 蛋白 质 和 一 些 中 性 
蛋白 质 及 病毒 都 可 吸附 。 多 和 孔 玻璃 表面 对 蛋白 质 这 种 非 专 一 性 吸附 , 也 影响 了 其 广泛 应 、 
用 。 
” 烷 基 胺 取代 的 多 孔 玻璃 (商品 名 Bio-Glass) 共 价 连 接 甘 氨 酰 -D- 共 再 氨 酸 , 制 得 羧 肽 
BEA NIAAA HIS, NAD* 偶 联 于 Bio-Glass 制 得 水 不 溶 辅酶 ea。 


《五 ) 琼脂 糖 


琼脂 糖 是 D- 半 乳糖 和 3,6- 脱 水 -L- 半 乳糖 交替 结合 的 链 状 多 糖 。 


商品 中 相应 于 2, 4 和 6% 的 琼脂 糖 浓 度 的 珠 状 凝 胶 , 分 别称 为 Sepharose 2B, 4B 和 
6B。 凝 胶 浓度 越 低 , 其 结构 也 越 蓝 松 , 即 多 和 孔 性 越 高 , 其 机 械 强度 则 随 浓 度 的 降低 而 减 


少 。 


*。137。 


OO 


SS ee 


Pala DS TURK TH, Ze 40°C 以 下 即 形成 不 溶性 凝 胶 〈 甚 至 浓度 低 于 04%). 与 葡 
聚 糖 和 聚 丙 烯 酰胺 相反 ,其 多 聚 链 是 由 氢 键 连接 一 起 的 而 不 是 由 共 价 键 连接 的 ,这 就 使 琼 
脂 糖 凝 胶 在 化 学 上 的 稳定 性 比 葡 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 差 , 要 吕 兔 在 pH 低 于 4 高 于 9 下 操 
作 。 破 坏 氢 键 的 试剂 能 降低 凝 胶 的 机 械 稳定 性 。 但 通常 用 0.1 M NaOH 或 1M HCl 处 理 
2 一 3 小 时 不 致 引起 凝 胶 颗 粒 的 变化 。 琼 脂 糖 凝 胶 不 为 有 机 溶剂 (如 乙醇 、 丙 酮 ) 所 破坏 , 
而 葡 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 用 丙酮 处 理 则 完全 收缩 。 经 6M 盐酸 县 或 7M RAKE, 只 
引起 凝 胶 略 微缩 小 ,而 不 影响 吸附 性 能 ,这 种 稳定 性 保证 了 吸附 剂 可 反复 使 用 , 并 可 采用 
蛋白 变性 剂 作为 洗 脱 大 分 子 及 彻底 洗涤 吸附 剂 的 手段 。 

由 于 琼脂 糖 凝 胶 是 一 种 热 可 逆 凝 胶 , 凝 胶 受 热 即 失去 稳定 性 , 最 后 溶解 。 因 此 , Bele 
必需 保存 在 低温 下 ,但 不 能 冻结 , 因为 冻结 也 破坏 可 逆 结构 。 凝 胶 不 能 加 热 消 毒 , Bids 
储存 , 表 5-14 总 结 了 琼脂 糖 对 一 些 溶剂 和 介质 的 耐 受 条 件 。 

表 5-14 琼脂 糖 耐 受 的 溶剂 和 介质 的 条 件 


qe Hl zk x Hl 


溶 Fil a, : 
0.1M NaOH | 2 一 3 小 时 (室温 ) | CAF | 2—3 小 时 (室温 ) Axe 80% V/V 2 一 3 小 时 (室温 ) 
1M HCi 2 一 3 小 时 (室温 ) | FR | 2 一 3 小 时 (室温 ) 有 水 二 甲 基 甲 酰胺 50% V/V) 2 一 3 小 时 (室温 
6M 盐酸 且 2 一 3 小 时 (室温 ) | TH | 2 一 3 小 时 (室温 )| 乙 二 醇 509%6 V/V 2 一 3 小 时 (室温 ) 
7M 尿素 2 一 3 小 时 (室温 ) | 丙酮 | 2 一 3 小 时 (室温 )| 无 水 二 氧 六 环 eOPA”. 


三 、 琼 脂 糖 的 活化 及 其 衍生 物 的 制备 


琼脂 糖 使 用 前 需 活化 ,通常 是 在 碱 性 条 件 下 用 溴 化 氰 处 理 引入 “ 亚 氨基 矶 酸 盐 ,再 在 
弱 碱 的 条 件 下 直接 偶 联 含有 游离 的 脂 族 或 芳香 族 氨基 的 配 基 , 形 成 氨基 矶 酸 盐 和 异 腔 簿 
生物 。 


HuN-| we | pace: NH—| Rae | 
NH 


—OH CNBr 
i 
一 OH 活化 


C=NH ge © 


-.OH 


由 于 亲 和 色 谱 中 常用 一 些小 分 子 化 合 物 作为 配 基 制 备 亲 和 吸附 剂 , 但 小 分 子 的 配 基 


直接 连接 于 琼脂 糖 上 常 产 生 无 效 吸附 剂 , 其 原因 是 由 于 载体 的 空间 位 阻 关系 ,使 大 分 子 化 


合 物 ( 亲 和 物 ) 不 能 直接 接触 到 配 基 (如 图 5-20)。 解 决 的 办 法 是 在 载体 和 配 基 之 间 引 入 
适当 长 度 的 手臂 减少 载体 的 空间 位 阻 , 增 加 配 基 的 活动 度 。 作 为 FR SE DE 
连接 于 载体 ,再 通过 它 连 接 于 配 基 上 。 

图 5-21 表示 纯化 8- 半 乳 糖 背 酶 的 几 种 琼脂 糖 吸附 剂 。E., coli 6- 半 乳糖 背 酶 的 竞争 
性 抑制 剂 对 氨基 葵 -8-D- 敏 基 吡 喃 半 乳 糖 是 相当 弱 的 抑制 剂 , 直 接连 于 琼脂 糖 上 的 衍生 
物 不 能 用 来 纯化 8- 半 乳糖 苷 酶 (图 :5-21 A), 而 在 抑制 剂 和 载体 之 间 引 入 手 悍 ” ,在 溴 己 
酰 氮 乙 基 琼 脂 糖 上 (图 5-21B) 和 琥珀 酰 化 的 3,3 -二 氮 基 二 丙胺 琼脂 糖 〈 图 5-21C) 上 连 


¢ 138 « 


图 5-20 亲 和 色 谱 中 引入 “手臂 ?原因 示意 图 


Agarose 
CH,OH 
A mit \-s o 一 NoH 
HO 
OH 
Agarose 
O CHOH 
ae 
B S—NHCH,CH,NHCCH,NH S On 
3 HO 
OH 
Agarose 
9 ? CH;OH 
C HOH.CH.CHANHCH.CHoH,NHCCHCH,CNH-{ Ys 
| HO 
OH 


OH 


5-21 Sh AG B- EFL ET BS SIL PPB a AO 


接 抑 制剂 , 发 现 B 衍 生物 (手臂 长 度 ~10A"?) 与 衍生 物 A 有 本 质 上 的 差别 ,8- 半 乳糖 背 酶 


的 洗 脱 峰 在 柱 色谱 图 上 比 杂 蛋白 峰 的 迁移 稍 迟 缓 , 而 衍生 物 C( 手 臂 长 度 约 21A") 则 对 B- 
半 乳 糖 背 酶 有 很 强 的 亲和力 。 


ATP 和 NAD*) 的 相互 作用 。 在 同一 实验 条 件 下 研究 它们 之 间 亲 和 力 的 大 小 关系 ,从 而 


图 5-22 表示 几 种 激酶 和 脱 氢 酶 与 琼脂 糖 衍 生物 (含有 不 同 长 度 的 次 甲 基 手 臂 连接 的 


得 出 以 下 重要 结论 。 当 伸 长 手臂 含有 四 个 次 甲 基 时 , 核 苷 酸 与 载体 骨架 很 接近 ,(0 一 5A?) 


酶 和 亲 和 吸 附 剂 的 结合 力 很 弱 , BETS, 而 当 伸 长 手臂 ”达到 5 一 10A“( 即 次 甲 基 增 加 


到 8 个) 时 ,其 结合 力 有 很 大 的 增加 , 故 需 较 高 的 盐 浓度 才能 把 结合 的 酶 从 柱 上 洗 脱 下 来 , 
但 当 载 体 和 配 基 之 间 的 手臂 ”含有 8 个 以 上 的 次 甲 基 ( 长 度 >10A*) 时 , 酶 和 亲 和 吸 附 剂 , 
之 间 的 结合 力 反 而 下 降 , 这 可 能 是 由 于 手臂 "过 长 易 弯曲 , HART RRR, 从 
而 减弱 了 与 酶 的 作用 。 


*。, 139 。 


3 6 9 12 3 6 9 12 
在 伸 长 “手臂 ”中 次 甲 基数 


图 5-22 ” 某 些 脱 氢 酶 和 激酶 与 固定 化 核 苷 酸 结合 时 伸 长 手臂 长 度 的 影响 59 
(2) 0 SEMPRA Ms; @ 猪 心肌 乳酸 脱 氢 酶 Hy 苹果 酸 脱 氢 酶 ; 
B 葡 苟 糖 6- 磷 酸 脱 氢 酶 ;固定 化 的 NAD+, 
(b) 0 已 糖 激酶 ; om 3- 磷 酸 甘 油 激酶 ; O 甘油 激酶 ;固定 化 ATP, 6 代表 酶 和 固定 化 的 核 背 
酸 之 间 相 互 作用 的 强度 值 及 洗 脱 酶 所 需 的 .KCI 浓度 mM) 

在 所 有 的 琼脂 糖 衍生 物 中 ,最 重要 是 w- 氨 烷 基 琼脂 糖 。 

琼脂 糖 经 溃 化 氰 活化 后 和 甲 又 二 胺 或 乙 又 二 胺 的 一 个 氨基 偶 联 。 这 些 脂 族 三 胺 分 子 
的 烃 链 的 长 所, 可 以 控制 插入 手臂 的 长 短 , 其 双 - 氨 基 可 与 带 羧基 的 配 基 在 关 一 亚 胺 的 
作用 下 脱水 连接 。 


| H,N(CH,),NH, }—NH(CH,),NH, Hooc 一 | 配 基 | 配 基 | —NH(CH,),NH . ca 一 | 配 基 | 
脂 cl Se Ee oy 
糖 CNBr 4 — Wik 


wm- 氨 烷 基 琼脂 糖 可 用 来 进一步 制备 一 系列 的 琼脂 糖 衍生 物 (如 图 5-23)。 
四 、 杀 和 色谱 普 条 件 的 选择 


亲 和 色 谱 一 般 采 用 柱 色谱 法 。 亲 和 柱 的 平衡 缓冲 液 的 组 成 、pH 和 离子 强度 应 选择 
亲 和 物 双方 作用 最 强 、 最 有 利于 形成 络 合 物 的 条 件 。 一 般 用 接近 中 性 pH 为 亲 和 吸 附 条 
件 , 上 柱 的 样品 液 应 和 亲 和 柱 平衡 缓冲 液 一 致 。 为 了 有 利于 络 合 物 的 形成 * 亲 和 吸附 可 在 
4°C 下 进行 ,以 防止 生物 大 分 子 的 失 活 , 上 柱 流速 尽 可 能 慢 。 

样品 通过 亲 和 柱 后 ,用 大 量 平 衡 缓 冲 液 洗 去 杂质 ,也 常用 不 同 的 缓冲 液 洗 涤 , 进一步 
除去 非 专 一 吸附 的 杂 和 蛋白 , 尽 可 能 使 亲 和 柱 上 只 留 下 有 专 一 吸附 的 亲 和 物 ,然后 再 用 洗 脱 
液 洗 脱 亲 和 物 , 洗 脱 液 所 选取 的 条 件 正 好 与 吸附 条 件 相反 ,应 能 减弱 配 基 与 亲 和 物 之 间 的 
亲和力 ,使 络 合 物 完全 解 离 。 

由 于 亲 和 色 谱 中 亲 和 对 象 差异 很 大 , 很 难 有 统一 的 标准 ; 表 5-15 中 列举 了 一 些 亲 和 
吸附 和 洗 脱 条 件 , 以 供 参 考 。 , 

洗 脱 结束 后 , 亲 和 柱 需 继续 用 洗 脱 剂 洗涤 至 无 亲 和 物 存在 为 止 , 再 用 平衡 缓冲 液 使 亲 
和 柱 充分 平衡 ,存放 于 冷 室 (4°C 左右 )。 


。 140 » 


i 


—NH (CH,),—COOH ar 
(CH—Sepharose 4B) RNH —NH(CH,),CONHR 
2 


| NH.(CH,),cooH 
CNBr 活化 的 Sepharose 48 -———————> 
NH,(CH,),NH, 


—NHR 


WK 


Setar 


| | NH, Ay 
一 一 一 > Ne (CH,)s ert olde 
CH, 一 S 
cu, | 
| ER 
(同型 半 胱 氨 酸 硫 内 酯 7 
-一 一 —NH(CH,).NHCOCH, Br 


oO 
1 \ 
BrCH, C ON: 
Vj 
O 


—NH(CH,). NH, 


(AH—Sepharose 4B) 


DON 一 ms 
an ae 
N 


(〈O- 省 乙酰 -N- 羟 基 琥珀 酰 亚 胺 ) 


〈 对 硝 基 茶 甲 酰 释 氮 ) 
| —NH(CH,),NHCO(CH,),COOH 
(2) Na,S,0, 
( 连 二 硫酸 钠 ) AR 
(3) HNO, 
《 亚 硝酸 ) CRIME) 


j—Nucon, ).NHCo—¢ \_nt= N 


图 5-23 琼脂 糖 的 衍生 物 


五 、 亲 和 色谱 应 用 举例 


(—) 醇 脱 氢 酶 及 磷酸 果糖 激酶 的 纯化 “ 


在 N - 氮 已 基 -5 -AMP- 琼 脂 糖 柱 上 以 部 分 提纯 的 酶 芒 可 纯化 醇 脱氧 酶 及 磷酸 果糖 激 
酶 。 结 果 如 图 5-24 (A) 0.5 毫升 酶 抽 提 小 〈 每 毫升 含 40.5 单位 的 磷酸 果糖 激酶 ,10 单位 . 
或 9.9 毫克 的 醇 脱 氧 酶 ) 对 10 mM 磷酸 盐 (pH 6.8, 含 0.2M KCl) 充分 透析 , 然 后 吸附 

在 AMP- 琼 脂 糖 柱 上 , 用 以 下 溶液 顺序 洗 桨 。 《〈a) 平衡 缓冲 液 (10 mM 磷酸 盐 ,pH 6.8) 
24 毫升 ; (b) 5mM NADH 5 毫升 (同上 缓冲 液 );(c) 缓冲 液 5 Bt; (d)5mM ATP, 5mM 
Mg**(4E 5 毫升 缓冲 液 中 ) ,流速 0.4 毫升 /分 。(B) KCI 梯度 处 理 : 与 (A) 同样 条 件 处 理 
后 吸附 , 以 10mM 磷酸 盐 (pH 6.8, 含 0.2M KCl) 20 毫升 洗涤 , 再 以 0.2 一 0.8 M KCI 的 


”线性 梯度 (40 毫升 ) 洗 脱 。(C) pH 梯度 处 理 : 样品 对 10 mM-N-2-#8 CZ ZEMMUR-N’- CE 


。141 。 


tine a 


x 


ee ae 


全 
和 


Sa 


5-1 亲 和 色 谱 中 配 基 的 选择 和 洗 脱 条 件 "””: 


亲 和 对 象 


乙酰 胆 碱 酯 酶 
醛 缩 酶 

天 冬 酰 胺 酶 
Tea ET AS 
PRAKG A 

羧 肽 酶 B 
枝 酸 变 位 酶 
a-KE AB 
BUR 


37 脱氧 -D- 阿 拉 伯 糖 - 庚 酮 糖 酸 -7- 
磷酸 合成 酶 
脱氧 核糖 核酸 酶 抑制 齐 


二 气 时 酸 还 原 酶 
6-7 Es 


3- FRE HT AS 
fiz 2 Bais 

hE sa Bs 
核酸 酶 (葡萄 球菌 ) 


BE Se Er AG OB Sill 
木瓜 蛋白 酶 


AME BBs 
胃 和 蛋白酶 , 胃 和 蛋白 酶 原 


MA#E ABBR 
蛋白 酶 (小 麦 ) 

核糖 核酸 酶 A( 胰 腺 ) 
核糖 核酸 酶 -<S- 肽 
凝血 酶 

eA 

oA BREA 


Bi 2a ASCs 
B&ACA) 

绒毛 膜 促 性 腺 激素 (人 ) 
DNP- 和 蛋白 质 

B-*F FUR AS 


REABA Igk 
IgG 
IgM 


胰岛 素 


。142 。 


a 基 


对 氨基 茶 - 三 甲 基 氧 化 铁 
醛 缩 酶 亚 单位 
D- 天 冬 酰 胺 

磺胺 

工 - 酷 氨 酰 -D- 色 氮 酸 
D-ARM-L-BAB 

工 - 色 氨 酸 

D- 色 氨 酸 甲 酯 

胶原 (豚鼠 皮肤 ) 


工 - 酷 氨 酸 
核糖 核酸 酶 


254-—6-10-MB age 
酰 - 蕊 - 谷 氮 酸 
Xf BE AE- B-D-FE 
JEU EFL 
3- 磷 酸 甘 油 
肝素 
N-( 对 氨基 葵 )- 草 氨 酸 
对 -氨基 茶 - 磷 酰 -脱氧 
胸 昔 -5 -磷酸 
BEA he 
甘 氨 酰 - 甘 氨 酰 -( 邻 葵 甲 酰 -L- 
栈 氮 酰 - 工 - 精 氮 酸 
对 氨基 茶 - 栈 酸 示 
聚 赖 氨 酸 


工 - 赖 氨 酸 

血红 蛋白 

对 氨基 茶 - 磷 酰 - 尿 苷 2 3 -磷酸 
核糖 核酸 酶 -S- 蛋 白质 
AA 

MLE H&S fide 5’ -磷酸 

卵 粘 蛋白 


3- 呵 喉 栈 氨 酸 
抗 血 清白 蛋白 

绒毛 膜 促 性 腺 激素 (人 7 
DNP 卵 清 蛋 百 

6- 半 乳糖 背 酶 


IgE 


BE 脱 we 


1M NaCl 

6M 尿素 

D-RAM 

乙酰 偶 氮 酰胺 

0.1M 醋酸 
0.05MNaCl, Tris-HCI, pH 7.9 
0.001M 工 - 色 氨 酸 

0.1 M BE 

1MNaCl, 0.05M Tris-HCl 
pH 7.5 0.005M CaCl, 

0.2M wRREH, pH 6.5 

0.001 M Cuso, 

0.7 M 盐酸 县 

(在 0.5 玉 醋酸 钠 -3096 甘油 中 7 
5- 甲 酰 四 氢 叶 酸 


NaB,pH 10 


0.5M 3- 磷 酸 甘 油 
0.16 一 1.5M NaCl 梯度 
0.1 M NaHCO, pH9.1 


0.1M 醋酸 
0.2M KCI 一 HCL pH2 


水 


0.0005 M MgCl, 
0.15—1M NaCl 梯度 , 
(在 醋酸 钠 中 ) pH 5.2 
0.2M_E- 氨 基 已 酸 
0.1M BE 
0.2M BER 
50% 醋酸 
1LM 葵 胺 -HCL (在 磷酸 钠 , pH7 中 ) 
0.25M 谷 氨 酸 ,1M BERBER, pH4.5 
0.1M 甲酸 -0.5MKCI 
pH4.5 一 2.75 梯度 
0.001 M KOH 
0.5MNacl, 甘 氨 酸 -HCL, pH2.8 
6M 盐酸 县 ,pH3 
0.1M REE 
0.1M NaCl, 0.05M 


Tris-HCl, pH7.4, 0.01MMgCl,.. 


0.15 M NaCl, 0.1M 甘氨酸 - 
FG pli sO 

5M 盐酸 县 

5M hei 

0.1 M BRB, pH 2.8 


亲 和 对 象 配 基 ve 脱 液 
淋巴 细胞 ( 鼠 ) 抗 淋巴 细胞 , 球 蛋白 偶 联 于 0.2M EAR 
Sepharose 2B 上 
fEFLRACA) © 人 胎盘 催乳 激素 4M KSCN 
转移 RNA 转移 RNA 0.14M NaCl, 0.01 M 磷酸 盐 pH7.4 
补体 (组 分 Cu) IgG 0.2 M 二 氨基 丁 烷 pH11.0 


皮质 醇 - 结 合 蛋白 (人 ) 皮质 醇 0.08 M 皮质 醇 , 在 0.05 M 磷酸 盐 , 
pH6.8 中 


7k, pH8 (NH,OH) 


视 黄 醇 - 结 合 蛋白 (人 ) HAA 


RBH SRE L- 酷 氨 酸 0.002 M KOH,pH 9.3 
抗 生 物 素 蛋白 E-N- 生 物 素 酰 -L- 赖 氨 酸 6M 盐酸 肌 
胰岛 素 , 抗 胰岛 素 , IgG 6M 盐酸 县 
3 
5mM 
sent ATP +Mg* 20 
2 
未 th 
四 s 
3 ey 
Hx 
= oz 
1K 党 
pial 
Be 


洗 脱 体积 〈 毫 升 ) 


5-24 以 N - 氨 已 基 -5 -ATP- 琼 脂 糖 亲 和 柱 上 专 一 洗 脱 醇 脱 氢 酶 及 磷酸 果糖 激酶 
© HAR; 0 3- 磷 酸 -甘油 醛 脱 氢 酶 ; 全 BAR, = 磷酸 果糖 激酶 


磺 酸 盐 (pH 6.8) 平衡 ,其 他 条 件 同人 A), 然后 吸附 在 柱 上 ,, 以 缓冲 滚 20 毫升 洗涤 , pH 梯 
度 〈10 mM #CEMR-CERRME, 5 mM 甘 氨 酰 甘 氮 酸 , pH 10.4) 40 毫升 洗 脱 。 
(=) c- 抗 胰 和 蛋白 酶 的 分 离 纯 化 2 


在 伴 刀 豆 球 罩 白 A- 琼 脂 糖 〈ConA-Sepharose) 柱 上 从 人 血清 中 可 分 离 纯化 c- 抗 胰 蛋 
ABS 


° 1435 


人 


吸收 度 280mm 


当 部 分 纯化 的 人 血清 制剂 通过 ConA-Sepharose 柱 时 ,蛋白 质 出 现在 外 体积 中 ,其 中 包 
含 大 量 血 清白 蛋白 , 随 后 用 01M 甲 基 c-D- 葡 萄 糖苷 洗 脱 可 得 75 一 80% 的 抗 胰 蛋 白 酶 
活性 ,其 中 也 包含 有 少量 的 蛋白 质 ( 死 图 5-25)。 

ConA-Sepharose 柱 1.5 X 10 厘米 ,以 0.05M BERBER MK (pH7.6) 平衡 ;无 吸附 的 
蛋白 质 被 洗 下 。 从 箭头 所 指 起 用 0.1M 甲 基 -c-D- 葡 萄 糖 吡 喃 苷 (在 同上 缓冲 液 中 ) 洗 脱 , 
分 部 收集 ,流速 15 毫升 /小 时 。 入 


NaCl (MY) 


0.8 


3 
被 抑制 的 胰 酶 (ug/ml) 
吸收 度 (260nm ) 


0 0 
10 20 30.440. 50 | 60 0 100 200 300 400 
分 部 数 〈2.5ml/ 管 ) 洗 脱 体积 (SF) 
图 5-25 -人 血清 x- 抗 胰 蛋 白 酶 在 固 图 5-26 在 赖 氨 酸 -琼脂 糖 4B 
定 化 - 伴 刀 豆 球 蛋白 A 上 的 杀 和 色谱 上 rRNA 的 色谱 


(=) rRNA 4B" 


用 赖 氨 酸 -琼脂 糖 4B 可 把 几 种 rRNA 按 分 子 大 小 分 开 (如 图 5-26)。 

色谱 柱 1.6 X 7.5 厘米 〈 床 体积 15 毫升 ), 流 速 15 SAN, WE 22°C, 洗 脱 液 : 
0.02 M Tris-HCl 缓冲 液 (pH 7.5) 含 0.01 M MgCl, 以 0.05 一 0.30 M NaCl 线性 梯度 洗 脱 。 
Pink: E. coli rRNA (在 缓冲 小 中 )。 


(四 ) 还 原型 辅酶 A (CoA) Bee 


由 于 发 现 芯 黄 八 登 球 菌 透 析 的 抽 提 液 中 的 蛋白 质 绝 大 部 份 为 CA KNEE MAB 
接 将 此 透析 抽 提 液 与 CNBr 活化 的 Sepharose 6B 反应 , 制 得 固 相 CoA 亲 和 和 蛋白 柱 (1X 


02E0.8 
Seal 

EO | 0.6 

ot ee yah 
v= |s 

E< g.1bS 0.4 

= 20.2 
< 

ol. 0 


分 部 数 〈 人 为 单位 ) 


图 5-27 固 相 CoA 亲 和 和 蛋白 柱 的 吸附 专 一 性 
----; 离子 强度 ,A: AMP, B: 氧化 型 'CoA, C: ADP, D: 还 原型 CoA, 
E: ATP, F: [ii CoA, G: 还 原型 CoA 


«©1446 


5 BK), 以 醋酸 钠 (pH 6.0, 离子 强度 0.01) 缓 冲 液 平 衡 。 还 原型 CoA 可 吸附 在 柱 上 , 增 
加 NaCl 的 离子 强度 可 把 CoA 洗 脱 下 来 ,如 图 5-26, 还 原型 CoA 有 了 两 个 洗 脱 峰 , 洗 脱 的 
离子 强度 各 为 0.025 和 0.06, 这 说 明 在 吸附 剂 中 至 少 存 在 两 类 CoA 亲 和 和 蛋白 , 对 CoA 有 
不 同 的 亲和力 。 氧 化 型 CoA, 脱 磷 CoA, ATP 和 ADP 也 被 吸附 ,但 AMP 不 吸附 。 收 集 的 
还 原型 CoA 纯度 达 92-94 % , 

图 5-27 让 表示 固 相 CoA 亲 和 蛋 白 柱 的 吸附 专 一 性 。 洗 脱 的 化 合 物 在 260 om 测 光 吸 , 
收 ,第 一 峰 为 平衡 的 缓冲 液 洗 下 ,其 他 峰 则 以 NaCl 线性 梯度 洗 脱 。 


《五 ) 绒毛 膜 生 长 激素 的 提纯 ”” 


在 抗 HCS- 琼 脂 糖 柱 上 , 以 正常 人 血清 提纯 人 绒毛 膜 生 长 激素 (HCS)。 以 放射 免疫 
调 定 法 测定 , 发 现在 非 阻 留 组 分 中 没有 激素 ,, 99% 的 激素 在 且 洗 脱 液 中 , 几乎 定量 回收 , 
结果 如 图 5-28。 


1 1 
wa ot 琼脂 糖 - 抗 HCS 
i 9 HCS 30032 % . 
’ 《在 正常 血清 中 ) 
] -4 6M thi 
alt 0.05% HSA 
- 1 pH3.1 1.5 
1 ' 
a | ae é 
= 1 1 & 
a 60 | = 
1 Nasr 
eels = 
#1 I 1 0.15M NaCl . x 
i : | 0.01 BER 
x pH? 4 
R30 r \ 0.5 
\ 
I \ e 
I \ ; 
| Q 
| < 99.0% \ 
OQ 
人 a ion 8= 0.0 
0 25 5 100 
REBAR EF) 
5-28 


第 四 节 色谱 聚焦 


色谱 聚焦 是 〈chromatofocusing) 一 种 高 分 辩 率 的 新 型 的 蛋白 质 纯化 技术 。 Sluyterman 
等 首先 发 展 了 这 一 技术 %'9。 它 是 根据 蛋白 质 等 电 点 , 结合 离子 交换 技术 的 大 容量 色谱 , 
能 分 离 几 百 毫克 蛋白 质 样品 , 洗 脱 峰 被 聚焦 效应 浓缩 , 峰 宽 度 可 达 0.04 一 0.05 pH 单位 ,分 
辩 率 很 高 ,操作 简单 ,不 需 特殊 的 实验 装置 。 

本 法 适用 任何 水 溶性 的 两 性 分 子 , 如 蛋白 \ 酶 多肽、 核酸 等 。 


。145 。 


一 、 色 谱 缘 焦 的 原理 [254 


(一 ) pH 梯度 的 形成 

一 般 的 离子 交换 色谱 中 ,pHL 梯度 的 产生 , 通常 是 利用 一 个 梯度 混合 器 , 例 如 要 得 到 
一 个 下 降 的 pH BE, 混合 容器 中 盛 高 pH 的 起 始 缓冲 小, 另 一 个 容器 装 低 pH 的 限制 缓 
冲 液 〈limit buffer)。 当 溶液 离开 混合 容器 进 到 柱 时 , 低 pH bi i 容器 ,, 使 
mA EER pH mee Us (Aj 5-29). 


ml 
图 5-29 梯度 形成 图 解 
A: 离子 交换 色谱 ; 8B: 色谱 聚焦 


色谱 聚焦 是 利用 离子 交换 剂 本 身 的 带电 基 团 的 缓冲 作用 , 当 洗 脱 缓冲 液 滴 到 离子 交 
换 剂 上 ,自动 形成 pH 梯度 。 

例如 要 形成 PH9 一 6 的 下 降 梯 度 , 色 谱 柱 内 的 pH bhi. 可 选择 一 个 具有 碱 
性 缓冲 基 团 的 阴离子 交换 剂 , 如 商品 名 为 PBE 94 的 阴离子 交换 剂 装填 在 柱 上 ,, 首先 平 
衡 到 pH 9, 洗 脱 滚 的 pH 相应 为 限制 缓冲 滚 ) 选 定 为 pH 6, 其 中 含 商 品名 为 多 组 冲剂 
Cpolybuffer) 的 物质 (如 polybuffer 96)。 当 洗 脱 液 从 顶部 滴 人 PBE 94 色谱 柱 , 大 部 份 酸 


性 成 份 与 阴离子 交换 剂 的 碱 性 基 团 结合 , 最 初 从 柱 上 流出 的 溶液 的 pH 接近 于 起 始 缓冲 ” 


被 (图 5-30),, 洗 脱 过 程 中 在 柱 上 每 一 点 的 pH 随 着 更 多 的 缓冲 剂 加 入 而 逐渐 下 降 , 最 后 
几乎 整个 色谱 柱 被 洗 脱 流 所 平衡 ,最 后 流出 液 的 pH SP PERRY pH CBN PH6)o 


C 


流速 
DLL TI 


移动 速率 
a Ze 
OO 


ml 
图 5-30 PBE 94 FERS Ze mpAIER A 5-31 蛋白 质 分 于 在 色谱 聚焦 时 的 行为 
pH 梯度 (pHI—6) 的 形成 假定 蛋白 质 工 等 电 点 为 7 。 蛋 白质 2 等 
a, by c. d 代表 不 同 的 洗 脱 阶段 电 点 为 8 


。146 。 


E 


(=) 蛋白 质 的 行为 
蛋白 质 所 带 的 电荷 取决 于 它们 的 等 电 点 和 介质 的 pH, 当 介 质 的 pH 低 于 它 的 等 电 点 


时 ,蛋白 质 带 正 电 荷 , 它 不 与 阴离子 交换 剂 结合 , 随 洗 脱 液 向 下 移动 , 然而 , 在 蛋白 质 从 柱 


顶 向 下 移 的 过 程 中 ,其 周围 的 pH 逐步 增高 (图 5-31) 当 它 移动 到 某 一 点 ,其 环境 的 pH 高 
于 蛋白 质 等 电 点 时 ,蛋白 质 由 带 正 电 荷 变 为 带 负电 荷 ,而 与 离子 交换 剂 结合 。 随 着 洗 脱 过 
程 的 进行 ,所 形成 的 pH 梯度 也 不 断 下 降 , 当 pH 下 降 至 蛋白 质 的 等 电 点 时 ,蛋白 质 又 重新 
脱离 交换 剂 而 下 移 , 移 至 pH 大 于 其 等 电 点 时 又 重新 结合 ,这样 不 断 重复 , 直 至 蛋白 质 从 
柱 下 流出 。 不 同 的 蛋白 质 有 不 同 的 等 电 点 , 在 它们 被 离子 交换 剂 结合 以 前 将 移动 不 同 的 

距离 , 按 等 电 点 顺序 流出 (图 5-31)。 


(=) 聚焦 效应 

当 一 种 蛋白 质 在 柱 上 随 洗 脱 液 下 移 至 等 电 点 处 , 此 时 其 移动 速度 明显 减 慢 。 如 果 此 
时 加 上 相同 的 第 二 个 桩 品 , 它 将 以 洗 脱 液 移动 的 速度 下 移 ,直至 追 上 正在 慢 移 的 第 一 个 样 
品 处 (聚焦 )。 然 后 这 两 个 样品 一 起 下 移 , 从 柱 下 一 起 洗 脱出 来 。 但 是 所 有 样品 必须 在 第 ”, 


”一 个 样品 峰 尚 未 被 洗 脱 之 前 加 入 , 否 则 就 10 


不 能 聚焦 。 如 果 加 和 的 第 二 个 样品 的 等 电 9 
点 比 第 一 个 样品 高 , 它 可 以 越过 第 一 个 样 
品 区 而 先 被 洗 出 〈 图 5-32)。 


Polybuffer 96 


HiME ESRS Ree Polybuffer 74 _ 


TEL og 
OS, OOG 
GOG 
CO) eeie| 
TEAtAtZARAHTAHTA+7 + 
ci er one 7 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 
‘ meq NaOH 
图 5-32 ”色谱 聚焦 的 聚焦 效应 图 5-33 ”2 毫升 多 缓冲 剂 用 0.1 N NaOH 滴定 曲线 . 
二 、 多 .组 冲 Fil 


多 缓冲 剂 是 一 种 两 性 电解 质 性 缓冲 剂 , 性 质 与 两 性 载体 电解 质 相 似 ,是 分 子 量 大 小 不 
同 的 多 种 组 分 的 多 羧基 多 氮 基 化 合 物 , 瑞典 的 Pharmacia 公司 专门 设计 生产 的 Polybuffer 
96 和 Polybuffer 74, 它们 分 别 适 用 于 pH 9 一 6 和 pH 7 一 4 范围 的 色谱 聚焦 。 这 二 种 多 组 
冲剂 相 匹配 的 多 缓冲 交换 剂 是 PBE 94。 对 于 pH 9 以 上 的 色谱 聚焦 则 选用 pH8 一 10.5 的 
两 性 载体 电解 质 〈Pharmalyte) 配 以 相应 的 PBE 118, 

在 所 使 用 的 pH 范围 内 ,多 缓冲 剂 9%6 和 74 有 很 均衡 的 缓冲 容量 , 当 色谱 聚焦 时 , 能 
提供 一 个 平滑 的 线性 pH BE, 它们 的 滴定 曲线 见 图 5-33。 

多 缓冲 剂 在 280 nm 的 吸收 很 低 , 但 在 250 nm 有 较 大 的 吸收 , 故 洗 脱 液 的 监测 应 在 
280nm (图 5-34)。 


。147 。 


1.0. 1.0 
0.9 0.9 
0.8 0.8 
0.7 O%7 
0.6 0.6 
0.5 0.5 
0.4 0.4 
0.3 0.3 
0.2 0.2 
0.1 0.1 
200 300 400 200 300 400 ~ 
波长 (mm) 波长 (mm) 


图 5-34 多 缓冲 剂 的 紫外 吸收 光谱 


多 缓冲 剂 通常 以 无 菌 的 液体 形式 提供 (0.075 毫 摩尔 pH 单位 /毫升 ), 用 前 稀有 释 。 于 
SBC 瞳 处 贮存 。 


三 、 多 缓冲 交换 剂 


PBE 118 和 94 是 以 交 联 琼脂 糖 6B (Sepharose 6B) 为 载体 , 并 在 糖 上 通过 醚 键 偶 合 上 
配 基 而 成 的 。 它 们 在 pH 3 一 12 的 范围 内 对 水 \ 盐 \ 有 机 溶剂 都 是 稳定 的 。 它们 也 能 在 8M 
逐 中 使 用 。 多 缓冲 剂 的 交 联 性 质 使 它 有 很 好 的 物理 稳定 性 和 流速 ,并 防止 了 由 于 不 同 pH 
值 静 电 相互 作用 所 引起 的 床 体 积 的 变化 , 它 的 盐 型 在 pH 7 能 耐 受 110—120°C 的 高 压 灭 
菌 处 理 。 
偶 联 剂 Sepharose 6B 上 的 配 基 经 特别 选择 , 确 保 在 很 宽 的 pH 范围 内 有 均衡 的 缓冲 
表 5-16 多 缓冲 交换 剂 PBE 96 和 PBE 118 的 缓冲 容量 资料 


多 缓冲 
ZERR FA 


总 容量 meq/100 毫升 不 同 pH 间隔 凝 胶 


PBE 94 


PBE 118 


1.0 2.0 3.0 
meg NaOH 


5-35 10 毫升 PBE 118 和 PBE 94 在 1M KCl PAH HE HA 


。148 。 


| 


一 


容量 。 这 两 种 多 缓冲 交换 剂 的 缓冲 容量 数据 见 表 5-16, 它们 的 滴定 曲线 见 图 5-35。 它们 
的 商品 是 以 悬浮 被 形式 提供 ( 含 24 多 乙醇 )。 


四 、 操 作 步 骤 情 2 
测定 样品 的 等 电 点 
选择 适当 的 多 缓冲 剂 和 PBE 


调节 起 始 缓冲 ”用 起 始 缓冲 液 平 衡 凝 胶 , 装 和 人 适当 的 
一 一 
MIG ER 8 柱 中 


* 紫外 监测 器 
* pH it 
* ;记录 仪 
*# 部 分 收集 器 


调节 多 缓冲 剂 pH “ 让 5 一 10 毫升 多 缓冲 刘 
一 一 < 
到 梯度 下 限 流 过 柱 


假如 需要 平衡 样品 一 > 加 样 
用 多 组 冲剂 洗 脱 用 起 始 缓冲 液 重 新 平衡 
凝 胶 再 生 
分 析 和 改进 分 离 条 件 < 一 一 一 一 一 


(—) 凝 胶 和 缓冲 剂 的 选择 


每 次 使 用 的 多 缓冲 剂 和 多 缓冲 交换 剂 的 pH 间隔 为 三 个 单位 。 为 了 提高 分 辩 率 , 选 
择 的 实验 pH 范围 应 包含 要 分 离 样品 的 等 电 点 , 并 使 其 有 2/3—1/2 的 柱 长 的 吸附 解吸 时 


TA ANIA) pH 范围 色谱 聚焦 缓冲 剂 和 凝 胶 的 选择 见 表 5-17。 


(=) BRENDES 


色谱 聚焦 需要 的 凝 胶 量 取决 于 样品 的 量 、\ 样 品 的 性 质 \ 杂 质 的 情况 以 及 实验 分 辩 率 要 
求 。 大 多 数 情况 下 , 20 一 30 毫升 床 体积 已 足够 分 离 :1 一 200 毫克 蛋白 质 /pH 单位 。 

装 柱 之 前 , 凝 胶 必 须 用 起 始 缓冲 液 平衡 ,每 种 pH 相应 的 起 始 缓冲 液 见 表 5-17。 交换 
剂 的 反 离子 是 Cl, BC 以 外 的 单价 阴离子 也 可 作为 反 离 子 , 但 这 些 阴 离子 的 PKa 必须 
比 梯度 选择 的 最 低 点 至 少 低 二 个 PH Bir, 碳酸 氧 盐 离子 (HCO5 ) 会 引起 pH BREWS 
化 ,所 以 所 有 的 缓冲 液 使 用 前 必须 除 气 。 大 气 中 的 Co; 在 pH 5.5 一 6.5 条 件 下 会 使 梯度 变 
平坦 ,用 本 酸根 作 反 离子 可 防止 这 一 情况 ,但 对 多 缓冲 剂 74 则 不 能 用 本 酸根 作 为 反 离子 。 

柱 装 填 的 好 坏 直接 影响 分 辩 率 ,如 果 操 作 得 当 , 可 达 0.02 pH 带宽 的 分 离 效果 。 通 党 
装 柱 过 程 如 下 : 


。149 。 


Pt se 


i. > <a 4 eae 


> te 


io = 


凝 胶 的 pH 范围 


10.5—9! PBE 118 


10.5—8 PBE 118 


10.5—7 PBE 118 


9—8? PBE 94 


9—7 PBE94 
9—6 PBE94 


8—7 PBE94 


8—6 PBE 94 


8 一 53 PBE 94 


7 一 6 PBE 91 
7 一 5. PBE.94 


7 一 4 PBE94 


6 一 5 PBE94 


6 一 个 PBE 94 


5—4 PBE 94 


表 5-17 不 同 pH CHEBRAMARRARAH 


RAHM 


pH 11 
0.025 M 
三 乙 胺 -HCI1 


pH 11 


0.025 M 
三 乙 胺 -HCI1 


pH 9.4 0.025M 
乙醇 胺 -HCI 

pH 9.4 

0.025 M 
乙醇 胺 -HCl 

pH 9.4 0.025M 
乙醇 胺 CH,COOH 


pH 8.3 

0.025M Tris. HCl 
pH 8.3 

0.025 M 

Tris - CH,;COOH 
pH 8.3 

0.025M 

Tris - CH,;COOH 


pH 7.4 

0.025 M PERE 
CH,COOH 
pH7.4 0.025M 
咪唑 -HCI 
pH7.4 0.025M 
PKRE-HCI 


pH6.2 0.025M 
组 氮 酸 -HCl 
pH6.2 0.025M 
组 氨 酸 -HCI 
pH5.5 

0.025 M 

IW - HCl 


所 用 盗 液 近似 体积 
(以 柱 体积 为 1 计算 ) 


pH 8.0 
pharmalyte 
pH8-10.5 - HCI 
pH7 
pharmalyte 

pH 8-10.5 HC! 


pH 8.0 
pharmalyte 
pH8-10.5 - HCI 
pH7.0 
polybuffer 96-HCl - 
pH 6.0 
polybaffer 96-CH,COOH 


pH 7.0 

polybuffer 96-HCl 
pH 6.0 

polybuffer 96 
CH,COOH 

pH 5.0 

polybuffer 96 

(30%) + polybuffer 
74 (70%)—CH,COOH 


pH 6.0 
polybuffer 96- 
CH,COOH 

pH 5,0 polybuffer 
74.HCI 

pH 4.0 


一 一 一 一 一 一 ii © -一 一 一 一 一 


pH 5.0 
polybuffer 74 « HCl 
pH 4.0 
polybuffer 74 - HCl 


一 -| 一 | | | 


pH 4.0 


polybuffer 74 - HCl 


C1) 凝 胶 按 1:1 (V/V) REFERAHRH REV 

(2) 将 柱 调 垂直 并 除 尽 底部 尼龙 网 下 的 气泡 ,关闭 柱 下 端 出 口 。 

(3) 在 柱 中 放 2 一 3 毫升 起 始 缓冲 液 , 在 搅拌 下 将 凝 胶 倒 人 柱 中 。 

(4) 打开 柱 底 部 开关 ,, 待 凝 胶 况 降 后 仔细 将 柱 顶 部 接头 装 好 ,排除 所 有 气泡 。 


© 150。 


(5) 用 10 一 15 个 床 体积 起 始 缓冲 液 平 衡 至 流出 液 的 pH 和 电导 系数 与 起 始 缓冲 液 相 
同 。 

色谱 柱 的 装填 好 坏 可 用 有 色 的 牛 细胞 色素 < 检查 , 因 其 等 电 点 为 10.5, 不 被 柱 吸附 , 
很 快 穿 过 柱 流出 。 


(=) 样品 的 准备 


上 样 量 取 决 于 每 个 区 带 中 蛋白 质 的 量 , 通 常 每 10 毫升 床 体积 可 加 100 毫克 蛋白 质 样 
品 , 由 于 有 聚焦 效应 ,因此 样品 的 体积 是 不 重要 的 , 只 要 在 欲 分 离 的 物质 从 柱 上 流下 之 前 
-加 入 样品 ,对 分 离 结果 均 无 影响 , 样品 体积 最 好 不 超过 0.5 个 床 体积 , 样 品 不 能 含 过 量 盐 
(L<0.05), 

上 样 前 样品 要 对 洗 脱 液 或 起 始 缓冲 液 透析 平衡 ,如 果 样 品 体积 小 于 10 毫升 , 最 好 先 
通过 一 个 Sephadex G-25 柱 , 用 起 始 或 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 ,以 达到 最 好 的 平衡 效果 。 如 果 组 
THRE RE MIR, 样品 pH 也 不 重要 。 | 


《四 ) 上 样 和 洗 脱 


上 样 最 好 是 通过 一 个 加 样 器 ,为 了 确保 样品 均匀 平整 地 加 到 床 面 上 ,可 在 床 顶 部 小 心 
铺 一 层 1 一 2 厘米 厚 的 Sephadex G-25。 上 样 前 应 先 加 5 毫升 洗 脱 液 以 和 避免 样 品 处 于 极端 
〈 过 碱 ) 的 pH. 

上 样 后 , 首 先 用 洗 脱 缓冲 滚 淋 洗 , pH 梯度 自动 形成 。 梯 度 的 PH 上 限 由 起 始 缓冲 流 
确定 , 其 下 限 由 淋 洗 缓冲 液 的 pH 决定 。 

推荐 使 用 的 缓冲 流 组 成 及 所 用 洗 脱 液体 积 见 表 5-17。pH 梯度 的 斜率 (或 梯度 体积 ) 
是 由 用 于 洗 脱 的 多 缓冲 剂 的 浓度 决定 的 。 浓度 高 , 所 需 的 梯度 体积 小 , pH 梯度 斜率 陡 , 
洗 脱 峰 穿 , 但 分 辩 率 下 降 , 反之 ,pH 梯度 斜率 小 , 洗 脱 峰 宽 , 但 分 辩 率 高 。 采 用 通常 推荐 
的 多 缓冲 剂 浓度 ,总 洗 脱 体积 需 12 一 13 个 床 体积 , 洗 脱 时 的 流速 一 般 选 择 30 一 40cm.h :o 


(A) 从 分 离 的 蛋白 质 中 除去 多 缓冲 剂 的 方法 


1. 沉淀 法 MAAR AA 80—100% 饱和 度 , 放 置 1 一 2 小 时 ,使 蛋白 质 帝 淀 。 
因为 处 在 等 电 氮 pH 的 蛋白 质 很 容易 沉淀 。 离 心 收集 帝 淀 ,用 饱和 硫酸 贸 洗 两 次 ,然后 透 
析 除 硫酸 铵 。 

2. BRM “用 Sephadex G-75 可 以 将 分 子 量 大 于 25,000 的 蛋白 质 和 多 缓 冰 剂 分 
天 5 

3. 亲 和 色 谱 法 ”应 用 一 个 亲 和 色 谱 柱 , 分 离 的 蛋白 质 通过 柱 为 柱 中 的 吸附 剂 所 吸 
BAS ,而 多 组 冲剂 没 阻 留 地 流出 柱 外 ,再 将 蛋白 质 洗 下 。 

4. 疏水 相互 作用 色谱 法 ”利用 载体 与 蛋白 质 样 品 的 疏水 基 团 间 的 相互 作用 。 在 水 
相 中 提高 中 性 盐 的 浓度 或 降低 乙 二 醇 的 浓度 增强 体系 的 疏水 性 可 增强 芷 水 基 团 的 相互 作 
用 。 

蕊 水 色谱 柱 中 装填 葵 基 或 酚 基 -琼脂 糖 CL-4B, 用 80% THAIS RRO, 10% 
wi As 1 毫升 凝 胶 , 用 2 一 3 个 床 体积 的 80 驳 RRM. RAR MBE 
生 芯 水 作用 的 结合 ,然后 用 低 离子 强度 的 缓冲 流 洗 脱 。 


(六 ) 多 缓冲 离子 交换 剂 的 再 生 


多 缓冲 离子 交换 剂 的 再 生 可 以 在 柱 上 进行 。 凝 胶 用 2 一 3 个 床 体积 的 1 M NaCl 洗 , 
-以 除去 结合 的 物质 。 用 0.1 M HCI 洗 则 可 除去 结合 牢固 的 蛋白 质 。 (UA HCL 一 当 
洗 完 凝 胶 就 要 尽快 平衡 到 较 高 的 pH。 


五 ,应 AS pile 


1 蛋白 质 的 一 个 模式 混合 物 的 分 离 BRIA 5-36。 

从 图 中 显示 了 高 分 辩 率 和 窒 的 分 离 峰 。 

分 离 条 件 如 下 : 在 pH 7 一 4 范围 内 , 柱 C 10/20 床 高 15 EDK, 祥 品 , 4 毫升 洗 脱 缓 
液 含 有 马 肌 红 和 蛋白 《12 毫克 ), 碳 酸 酝 酶 (8 毫克 ) 和 白 蛋白 〈12 毫克 ), 洗 脱 条 件 : 起 始 绥 
THR 0.025M BKM HCl,,pH7.4, 洗 脱 缓冲 液 0.075 mM /pH 单位 /毫升 多 组 冲剂 74, PH4, 
流速 12.5 厘米 /小 时 。 


OD280 
0.5 
Dire pH 
; Ni 7 
0.4 1 
; ‘\ 
03 \ 6 
* 
\ 
\ 
0.2 ;: 
} 5 
是 
\ 
0.1 : 


4 


50 100 150 , 200 
体积 (ml) 


50 > 1007” 150 
图 5-36 蛋白 质 的 一 个 模式 混合 物 的 分 离 图 5-37 ” 卵 白 的 分 级 分 离 


2. 粗 卵 蛋 白 的 分 级 分 离 ”图 5-37 为 粗 卵 蛋白 在 pH 7 一 4 梯度 上 的 分 级 分 离 。 多 
白 过 小 ,用 多 缓 剂 ?4 稀释 ,然后 30008 离心 10 分 钟 ,上 PBE 94 柱 ,以 0.025 M Bk HC] 
(pH 7.2) 平衡 ,用 1:10 多 缓冲 剂 74 (pH4) 洗 脱 ;分 辩 率 良好 。 

分 离 条 件 如 下 : 柱 SR 10/50, 床 高 30 厘米 , 样 品 5 毫升 , 洗 脱 缓冲 液 含 0.5 BETTI 
白 。 洗 脱 条 件 :起 始 缓冲 液 0.025 M 咪唑 -HCl,pH7.5, 流速 40 厘米 /小 时 6 

3. 糜 鹿 肌肉 提取 水 溶性 蛋白 的 分 离 ”图 5-38 表明 在 高 pH 下 也 有 良好 的 分 辨 率 。 
10 克 糜 鹿 肌 肉 用 等 体积 水 匀 浆 ,3000g 离心 10 分 钟 , 上 清 液 用 洗 脱 液 平衡 ,上 PBE94 BE, 
以 多 缓冲 剂 96 洗 脱 。 

分 离 条 件 如 下 ; BEC 10/40, 床 高 45 厘米 ;样品 : 5 毫升 靡 放 肌 肉 匀 浆 上 清 液 ; 洗 脱 
条 件 : 起 始 缓冲 液 , 0.025 M 乙酸 贸 —HCl, pH 9.4, 洗 脱 缓冲 液 ,0.0075 maM/pH 单 位 / 


“152。 


) 


毫升 ,多 组 冲剂 96 ,pH6 流速 20 悍 米 /小 时 。 


9 50 100 150 200 250 
体积 (ml) 


5-38 从 糜 鹿 肌肉 提取 的 水 溶性 蛋白 质 的 分 离 


4. Trichoderma reesei 细胞 的 蛋白 质 的 分 离 ”图 5-39 表明 色谱 聚焦 具 高 容量 分 
离 的 优点 。Trichoderma reesei 是 产生 大 量 胞 外 纤维 素 酶 的 微生物 , 这 些 酶 可 用 在 PBE 94 
上 色谱 聚焦 制备 分 离 。 

分 离 条 件 如 下 : 柱 SR 10/50, 床 高 30 厘米 ,样品 : 5 毫升 , 洗 脱 缓冲 液 含 460 毫克 冷 
冻 千 燥 的 培养 上 清 液 。 洗 脱 条 件 : 起 始 缓冲 液 0.025 M 咪唑-HCl, pH 7.4, 洗 脱 缓冲 液 
0.0075 mM /pH 单位 /毫升 ,多 缓冲 剂 74, pH4, 流速 30 厘米 /小 时 。 


1.0 


体积 (ml) 
5-39 Trichoderma reesei 胞 外 蛋白 质 的 分 离 


oF Boge bg 


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©1536 


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。154 。 


= = 


| 


第 六 童 ” 制 备 离心 技术 
uv oT te 


Teal | aa 


离心 机 是 借 离 心力 分 离 液 相 非 均 一 体系 的 设备 。 离 心 的 形式 有 : C1) Bows, 2) 
离心 沉降 (或 证 清 ),(3) Bbos. REANEKAA-KRRK-KOHDSo BAA 
旋转 运动 的 离心 力 , 以 及 物质 的 沉降 系数 或 浮力 密度 的 差别 进行 分 离 ` 浓 缩 和 提纯 的 一 项 
ERE 

FEBALREN ES DPULPEUNBI ROBE RANEAR ON: MARA 
比重 的 差异 在 离心 机 无 孔 转 鼓 或 管子 中 进行 悬浮 液 沉 降 分 离 者 为 离心 沉降 〈 如 用 于 净 制 
含 少 量 固体 的 流 体 时 也 称 离心 澄清 ); 利 用 不 同 溶质 颗粒 在 芒 体 各 部 分 分 布 的 差异 , 分 离 
不 同比 重 流体 的 过 程 为 离心 分 离 。 离 心 过 滤 \ 离 心 沉 降 同属 固 一 液 分 离 , 离 心 分 离 则 属 液 
一 液 分 离 。 

离心 机 可 以 按 以 下 几 个 方面 进行 分 类 : 〈1) 转速 : 低 \ 高 ,超速 ;(2) 用 途 : 工业 或 实 
TA, 分 析 或 制备 ;〈3) 离心 形式 : 过 滤 、 沉 降 或 分 离 ; (4) 操作 方式 : 连续 、 半 连续 、 间 
K;O) 结构 特点 : 如 依 转动 部 分 的 形状 可 分 转 鼓 ( 有 和 孔 或 无 孔 )、 长 管 式 的 转 简 、 角 式 和 
外 摆 式 转子 、 分 析 型 转子 和 区 带 转子 等 。 依 驱动 方式 有 手 摇 式 ` 油 涡轮 式 、 气 动 式 \ 磁 悬 式 
和 电动 式 等 。 依 旋转 轴 位 置 有 直立 式 \ 水 平 式 、 倾 斜 式 等 ; (6) MRE: 人 工 、 重 力 、 离心 
力 \ 刮 刀 \ 螺 旋 、 活 塞 、 震 动 \ 喷 器、 蠕动 泵 等 ; (7) 使 用 温度 :冷冻 和 无 冷冻 ; (8) 工作 性 质 : 
通用 型 或 专用 型 ,小 型 或 大 型 等 。 

一 般 分 类 如 下 : 

es de 


A, Ai 

低速 离心 机 ie 超速 离心 机 制备 分 折 
(<0.4 rpm) (0.4—1.5H rpm) (1.5—5 F rpm 或 — bade dis, 

更 高 ) .普通 离心 机 冰冻 离心 机 

sea 
2.5— 
万 rpm 
更 高 ) 
由 于 离心 机 的 结构 ,性 能 和 用 途 等 差别 很 大 ,分 类 法 也 各 不 相同 ,特别 在 转速 范围 上 , 
有 关 文 献 \, 教 科 书记 载 的 出 人 较 大 。 同 时 , 随 着 离心 技术 的 发 展 , 离心 机 现 已 趋向 于 多 效 
能 。 如 制备 超速 离心 机 也 配备 分 析 型 转子 和 光学 检测 系统 ,可 作 某 些 分 析 研 究 工 作 ; 而 分 


e155. 


析 型 离心 机 有 些 也 附 有 制备 用 转子 。 又 如 某 些 附 有 大 容量 区 带 转子 或 连续 流动 式 转 子 的 


超速 离心 机 ,能 用 于 工业 生产 ,也 远 远 超 越 了 实验 室 的 应 用 范围 。 


第 二 节 一般 制备 离心 


一 般 制备 离心 是 指 在 分 离 \ 浓 缩 \ 提 纯 样 品 中 , 不 必 制 备 密度 梯度 的 一 次 完成 的 离心 


操作 。 使 用 的 机 种 包括 所 有 工业 离心 机 和 实验 室 用 低 、 高 速 离心 机 。 下 面 介绍 几 类 离心 
机 的 简单 结构 、\ 原 理 和 使 用 。 \ 


rae 过 滤 式 离心 机 


这 种 离心 机 转速 一 般 为 450 一 3,.500 rpm, 按 操 作 方式 和 甸 料 方式 可 分 为 : RRO 
工 或 刮刀 自动 卸 料 ) ;连续 式 (自动 、 震 动 、 活 塞 或 螺旋 务 料 )。 


图 6-1 三 足 式 离心 机 的 结构 
1, FER, 2 主轴 。 3. 机 座 。 4. HH, 5. KH, 6. 缓冲 弹簧 , 7。 电 动机 

目前 最 常用 的 过 滤 式 离心 机 是 三 足 式 (下 动 式 ) 离心 机 。 其 主要 部 件 有 : 〈1) WH: 
上 方 开口 。 有 安全 保护 和 收集 滤液 的 作用 ; (2) SIRE: 位 于 外 壳 内 ,固定 在 转轴 上 , 
转 鼓 内 表面 复 以 滤 布 ; (3) 制 动 装置 ; (4) 电动 机 传动 装置 ; (5) 支架 。 其 结构 如 图 6-1。 

离心 时 , 转 鼓 滤 布 内 装 人 待 过 滤 的 悬浮 液 , 当 转 速 逐 渐 加 快 而 高 速 运转 时 , 鼓 内 基 浮 
液 受 离心 力作 用 ,, 液体 穿 过 滤 布 被 甩 出 转 鼓 外 。 滤液 经 外 壳 下 部 排出 , 固体 则 留 在 布袋 
内 ,从 而 达到 固 液 分 离 目的 。 

这 类 采用 间歇 式 人 工 印 料 的 离心 机 结构 及 操作 均 较 简单 , 性 能 良好 。 其 缺点 是 取出 
滤 饼 费力 \ 耗 时 ,而 且 由 于 驱动 和 制 动 装置 设 在 转 鼓 下 面 , 容 易 引 起 液体 渗 漏 腐蚀 及 带 来 
维修 保养 的 不 便 。 为 了 克服 以 上 缺点 ,人 们 设计 了 上 悬 式 离心 机 ,这 种 离心 机 的 传动 系统 
安装 在 转 鼓 上 方 ,具有 稳定 、 印 料 较 快 \ 固 体 颗粒 破碎 少 和 不 受 液体 腐蚀 的 优点 。 

在 生化 \ 微 生物 工业 中 ,过 滤 式 离心 机 已 用 于 味精 \ 柠 檬 酸 、 抗 菌 素 及 某 些 生化 药物 和 
酶 制剂 等 结晶 或 较 大 固体 颗粒 的 过 滤 , 脱 水 效率 很 高 。 


“156。 


P ae re-swieesaaa 
ee ee ee assistmasecaeaemssciaaic alias ai xuand 了 and 


oe 


二 、 沉 降 式 离心 机 


“这 类 离心 机 品种 较 多 ,根据 其 结构 又 可 分 为 管 式 、 钵 式 、 碟 片 式 和 倾 析 式 。 它 们 的 外 
料 方式 也 很 多 ,如 人 工 \ 离 心力 \ 刮 刀 \ 螺 旋 \ 喷 嘴 、 自 动 印 料 等 。 

1. 台式 或 地 面 式 普通 离心 机 “这 是 一 类 结构 最 简单 的 实验 室 常用 的 低 、 中 速 离心 
机 ,转速 在 3,000—6,000 rpm。 其 转子 一 般 用 角 式 或 外 摆 式 ,多 用 交流 整 六 子 电动 机 驱动 , 
但 电动 机 的 碳 刷 易 磨损 而 导致 离心 机 损坏 ;转速 是 用 电压 调节 咒 调 节 ,, 起 动 电 流 大 ,速度 
升降 不 够 均匀 。 操作 一 般 在 室温 下 进行 , 但 个 别 机 种 也 配 有 冷却 装置 , 如 贝克 曼 公 司 的 
IJ-6R 台式 离心 机 的 可 调 温度 为 0 一 20"C。 

2. 高 速 冰冻 离心 机 这 类 实验 室 常用 的 离心 机 最 高 转速 可 达 18,000 一 25,000 rpm, 
因此 需 有 冷却 离心 腔 的 致 冷 设备 ,并 用 热电 侦 监测 腔 内 的 温度 , 一 般 温 度 控 制 在 0 一 4%C。 
:其 转动 部 分 是 各 种 角 式 或 外 摆 式 转子 , 有 的 还 配备 区 带 转子 、 连 续 流 动 式 转子 或 其 它 转 
子 。 速 度 控制 比 台 式 离 心机 精密 准确 。 操作 方式 除 间 鞭 式 外 也 有 连续 式 。 其 应 用 见 表 
6-1, | 


A 6-2 , 管 式 超 速 离 心机 结构 图 

1, 转 鼓 , 2. 悬浮 液 加 入 管 , 3. 折 转 板 , 4: 十 字形 挡 板 。 5。 转 鼓 头 。 6. HH. 7. ME, 

8. 重 液 排出 管 , 9. 轻 流 排 出 管 。 10. 传动 装置 

3. 管 式 高 速 或 超速 离心 机 “这 是 一 类 工业 用 离心 机 ;转速 约 在 8,000—45,000 rpm, 
用 于 固 一 液 分 离 时 为 间 软 式 操作 ,也 可 用 于 液 一 液 连 续 分 离 。 主要 由 五 部 分 组 成 : (DK 
fais (2) 主轴 ; (3) 电动 机 及 传动 装置 ; (4) 制动器 ; ©) 外 壳 和 机 座 。 管 式 超速 离心 机 的 
结构 如 图 6-2。 

离心 沉降 时 , 先 把 转 筒 上 部 的 重 液 出 口 堵塞 , 后 将 悬浮 液 在 静止 、 慢 速 或 全 速 下 从 转 


© 157° 


简 底 部 加 让 管 送信。 悬浮 液 向 转 筒 上 部 移动 时 ,颗粒 受 离心 力作 用 而 沉降 到 转 简 内 辟 上 ,. 
形成 沉 涛 层 , 留 在 内 层 的 清 液 或 轻 液 ( 含 细 颗 


粒 ) 则 从 上 方 轻 液 出 口 流出 。 离心 完 后 取出 
$e, ALR. FRED 
离 时 ,液体 即 按 不 同比 重 从 转 简 上 部 的 轻 ` 重 
液 出 口 分 别 排出 ,工作 原理 与 离心 沉降 相同 。 

管 式 离心 机 结构 简单 .紧凑 、, 转 速 高 \ 窗 
封 性 好 ,有 良好 的 沉降 效果 ,主要 用 来 从 绊 养 
液 (5 一 500 升 ) 中 回收 著 体 及 用 于 化 工 \ 食 品 
等 部 门 。 其 缺点 是 印 料 麻烦 ,容量 有 限 。 

4. 碟 片 式 离心 机 碟 片 式 离心 机 是 在 
管 式 离心 机 的 基础 上 发 展 起 来 的 , 转 过 为 


6-3 ” 碟 片 式 离心 机 的 工作 原理 4,500—7,500 rpm, RIBAS HENNA A 
左 侧 : IS , 分 为 喷嘴 型 矶 片 式 离心 机 和 自动 间 鞭 外 料 型 
AE: RRR TEST 碟 片 式 离心 机 。 其 主要 工作 部 分 是 转 鼓 , 在 


转 鼓 中 加 入 了 许多 重 迭 的 碟 片 ,每 个 碟 片 间距 约 1 毫米 , 缩短 了 颗粒 的 沉降 距离 , 大 大 提 : 


高 了 分 离 效果 。 这 种 离心 机 可 用 于 固 一 液 和 液 一 液 两 相 分 离 , 也 可 用 于 液 一 沪 一 固 三 相 
分 离 。 其 工作 原理 如 图 6-3。 两 相 分 离 的 碟 片 无 孔 ; 三 相 分 离 的 碟 片 有 孔 , 液 体 由 各 碟 片 
孔道 最 后 移动 到 转 鼓 上 方 出 口 , 并 根据 两 部 分 液体 比重 不 同 各 自从 轻 、\ 重 小 出 口 排出 。 

这 种 离心 机 结构 简单 \ 沉 降 距 离 短 \ 沉 降 面积 大 ,能 连续 生产 、 分 离 效率 高 , 已 广泛 用 
于 发 酵 工业 , 作 菌 体 的 收集 及 抗菌 素 \ 疫 苗 的 分 离 , 也 用 于 化 工 ` 医 药 \ 食 品 等 部 门 。 


三 、 分 离 式 离心 机 


主要 指 上 述 用 于 液 一 液 分 离 的 碟 片 式 离心 机 ,以 及 分 离 式 管 型 高 ,超速 离心 机 。 离 心 
时 各 组 分 在 离心 力作 用 下 , 彼 比 重 六 小 的 不 同 将 液 相 分 成 者 王 层 , 比重 大 的 在 外 层 , 比重 
小 的 在 内 层 , 分 别 从 转 鼓 ( 管 ) 的 不 同 出 口 排出 。 


四 、 一 般 制 备 离心 机 的 选择 


通常 是 根据 离心 物料 的 性 质 选 择 离心 机 。 凡 固 相 颗 粒 比 重 小 于 或 等 于 液 相 、 颗 粒 直 
径 在 0.01 一 1 毫米 《或 以 上 ) 的 物料 可 选用 过 滤 式 离心 机 。 固 相 颗 粒 的 比重 大 于 液 相 ( 相 
# 3% 左右 ) 颗 粒 直径 小 于 10 微米 以 及 具有 压缩 性 (纤维 状 或 胶 状 ) 的 物料 则 应 选用 沉降 
式 离 心机 。 如 颗粒 直径 为 10 微米 左右 宜 用 普通 帝 降 离心 机 ,用 过 滤 式 则 沽 饼 薄 、 损 失 大 。 
直径 小 于 工 微米 的 颗粒 须 用 管 式 高 \ 超 速 或 钵 式 高 速 , 以 及 夸 片 式 离心 机 , 但 管 式 离心 机 
仅 在 悬 序 芒 颗 粒 浓度 小 于 19 才 适 用 ,浓度 太 大 要 用 连续 式 离心 机 ,以 免 印 料 、 拆 装 频繁 
而 损坏 机 件 。0.01 一 0.1 毫米 (或 以 上 ) 的 颗粒 可 用 沉降 式 或 过 滤 式 , 如 固体 浓度 高 达 1 一 
50% » 固 液 相 比重 差 较 大 的 悬 译 液 , 最 好 用 倾 析 式 螺旋 务 料 的 沉降 离心 机 。 压 力 较 高 C10 
个 大 气压 以 下 ) 或 有 毒 、 易 燃 、 易 爆 物 料 须 用 倾 析 式 螺旋 务 料 和 碟 片 式 等 密闭 型 离心 机 ,或 


。158。 


用 管 式 高 \ 超 速 离心 机 。 固 液 分 离 时 ,有 时 还 要 结合 考虑 离心 液 的 澄清 度 或 固形 物 的 含水 
量 , 过 滤 式 比 沉 降 式 的 沉渣 温度 大 。 分 离 式 离心 机 只 适用 于 乳 浊 分 离 或 含 固体 很 少 的 
BF RNR 


第 三 节 制备 超 离心 


制备 超 离 心 技术 就 是 在 强大 的 离心 力 场 下 , 依据 物质 的 沉降 系数 、 质 量 和 形状 不 同 , 
将 混合 物 样 品 中 各 组 分 分 离 , 提 纯 的 一 项 技术 。 在 生物 化 学 \ 分 子 生物 学 以 及 细胞 生物 学 
的 发 展 中 , 制备 超 离心 技术 起 着 很 重要 的 作用 。 迄 今 , 这 项 技术 已 广泛 用 于 各 种 细胞 右 、 
病毒 以 及 生物 大 分 子 的 分 离 ; 成 了 生物 学 、 医 学 和 化 学 等 领域 中 现代 实验 室 不 可 缺少 的 制 
备 和 分 析 手 段 。 . 

制备 超 离心 不 同 于 分 析 超 离心 , 它 的 主要 目的 是 最 大 限度 地 从 样品 中 分 离 高 纯度 的 
所 需 组 分 。 在 离心 技术 的 发 展 史 上 ,制备 超 离心 是 制备 离心 发 展 的 最 高 形式 , 它 与 其 它 低 
级 离心 形式 的 不 同 之 处 如 表 6-10 


表 6-1 三 种 不 同 级 别 的 制备 离心 机 的 比较 


普通 离心 机 高 速 离心 机 超速 离心 机 
和 6,000 25,000 75,000 以 上 
6,000 89,000 510,000 以 上 
几 十 毫升 到 几 升 一 般 1.5 升 左 右 〈《 有 大 容量 连续 “| 几 十 到 几 百 毫升 , 最 大 达到 1.7 
容量 流动 式 ) 升 以 上 (如 用 连续 流动 式 则 一 次 
分 离 可 达 几 升 至 几 十 升 ) 
分 离 形 式 。 | 。 固 液 沉降 分 离 固 液 沉降 分 离 人 
0.253% 0.1 克 


角 式 、 外 摆 式 和 区 带 转子 (有 些 还 
配备 分 析 和 连续 式 转子 ) 
“ 备 有 消除 转子 与 空气 摩擦 热 的 真空 
和 冷却 系统 。 有 更 为 精确 的 温度 和 速 
度 控制 \ 监 测 系统 * 有 保证 转子 正常 运 
转 的 传动 和 制 动 装置 等 


FEO RMR WS BR, BA 
硫酸 铵 沉淀 物 和 免疫 沉淀 物 | 质 、 多糖 等 ,甚至 能 分 开 分 子 大 小 相近 
等 。 但 不 能 有 效 沉淀 病毒 、 小 “| 的 同位 素 标记 物 2“N-DNA 和 未 标记 
mis eK). BARS |) DNA, 

大 分 了 矛 8 


角 式 和 外 摆 式 转子 ree 


带 转子 或 其 它 转子 


有 消除 空气 和 转子 间 摩 擦 热 的 致 
冷 装置 , 速 度 和 温度 控制 较 准 


速度 不 能 严格 控制 , 


收集 易 沉 降 的 大 颗粒 | 收集 微生物 \ 细 胞 碎片 ,大 细胞 器 、 


由 于 许多 具有 生物 活性 的 生物 大 分 子 和 细胞 器 很 不 稳定 ,在 分 离 时 要 求 温度 低 , 操 作 
条 件 缓和 ,不 能 应 用 一 般 的 化 学 分 离 法 。 制 备 超 离 心机 具有 冷却 和 真空 系统 ,分 离 制备 上 
有 了 明显 的 优越 性 。 


© 159 


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a - ~ -一 人 


一 、 原 理 和 计算 r967710 


制备 超 离 心机 的 设计 原理 是 : 利用 转子 高 速 旋 转 时 所 产生 的 强大 离心 力 , 加 快 颗粒 
的 沉降 速度 , 把 样品 中 不 同 沉降 系数 或 浮力 密度 差 的 物质 分 离开 。 制 备 超 离心 实验 的 关 
键 是 如 何 根据 颗粒 和 介质 的 性 质 以 及 转子 的 某 些 参数 来 确定 转速 和 离心 时 间 。 颗粒 《 细 
胞 、 细 胞 器 及 大 分 子 的 统称 ) 在 离心 力 场 下 的 沉降 情况 都 与 沉降 速度 和 沉降 时 间 相 关 , 沉 
降 的 时 间 和 速度 取决 于 :, (1) 离心 力 ;〈2) 颗粒 的 大 小 、 形 状 和 密度 ;《3) 沉降 介质 的 密 
度 和 粘度 。 

1. 离心 力 ”制备 离心 是 根据 物质 在 离心 场 中 发 生 的 变化 来 分 离 物 质 的 。 当 离心 机 
转子 以 一 定 的 角速度 © (弧度 / 秒 ) 旋 转 , 颗 粒 的 旋转 半径 为 5 (厘米 ) 时 , 任何 颗粒 均 经 受 
一 个 向 外 的 离心 力 ,此 离心 力 为 : 

FE 一 or - (1) 

F 通常 以 地 心 引力 表示 , 称 为 相对 离心 力 (RCF )。 相 对 离心 力 是 指 在 离心 场 中 ,作用 
于 颗粒 的 离心 力 相当 于 地 球 重 力 的 倍数 ,单位 是 重力 加 速度 g (980 厘米 / 秒 )。 这 时 RCF 
可 用 方程 式 规定 如 下 : 

《2) 

实用 上 ,这 一 关系 式 常 用 每 分 钟 转 数 (CR rpm), 以 更 通用 的 表达 方式 来 表示 。 由 于 


2xrn 
LU Se 于 是 : 


60 
2 
RCE =z 1 As*trgs 
3600 X 980 
简化 得 : 
RCF 一 1.119-X-10=5o2r (3) 


一 般 情 况 下 , 低 速 离心 时 常 以 rpm 来 表示 , 高 速 离心 则 以 & 表示 。 计 算 颗 粒 的 相对 
离心 力 时 ,应 注意 离心 管 与 旋转 轴 中 心 的 距离 r。 沉 降 颗粒 在 离心 管 中 所 处 位 置 不 同 , 所 
受 离心 力也 不 同 。 

因此 , 报 告 超 离心 条 件 时 , 通 常 总 是 用 地 心 引 力 的 倍数 《xxg) 代替 每 分 钟 转 数 
(rpm), 因 为 它 可 以 真实 反映 颗粒 在 离心 管 不 同位 置 的 离心 力 及 其 动态 变化 。 科技 文献 
中 ,离心 力 的 数据 常 指 其 平均 值 (RCFrs), 即 离心 管 中 点 的 离心 力 。 | 

为 了 便于 进行 转速 和 相对 离心 力 之 间 的 换算 , 人 们 在 式 (3) 的 基础 上 制作 了 三 者 关 
系 的 列 线 计算 图 《如 图 6-4)。 图 示 法 比 公 式 法 计算 方便 ,由 图 中 两 者 数值 的 点 的 延 线 , 即 
得 与 第 三 者 的 交点 ,此 即 为 所 求 第 三 者 数值 。 

2. 离心 时 间 ”离心 时 间 是 由 实验 要 求 所 决定 。 为 了 避免 不 稳定 颗粒 的 凝聚 、 挤 压 
损伤 或 变性 失 活 , 并 使 扩散 所 导致 的 区 带 加 宽 现 象 减弱 ,在 保证 分 离 的 前 提 下 , 应 尽 可 能 
缩短 离心 时 间 。 相 反 , 分 离 某 些 沉降 较 快 的 大 颗粒 时 ,为 了 达到 预期 的 分 离 效果 , 往 往 使 
用 粘度 较 大 的 梯度 ,以 阻止 颗粒 的 过 度 沉 降 , 并 延长 离心 时 间 。 离 心 所 用 方法 不 同 , 离 心 
时 间 也 不 相同 。 


。 160。 


半径 〈 悍 米 ) 相对 离心 力 (ge) 转速 (rpm) 
30 ,5,000- 二 50,000 
6.000-+ 600.000 4,500 主 45,000 


4.000-4-400,000 47200-—F-40, 000 
3,000-+ 300,000 3500-35, 000 


13 2,000-F- 200,000 3.000 主 30.000 
17 1,500 十 150,000 
16 
15 1,000 十 100.000 2,500 7 25,000 
14 300-F-80, 000 
13 00 70.000 
12 6007F 60.000 2,000 十 20.000 
11 400 ~~ 40, 000 
10 300 + 30. 000 
9 1,500 15, 006 
200+ 20.000 4" 4og-4-1 4000 
. 150--15,000  1,300-13,000 
1,200 12,000 
\ 100 + 10,000 : 
80 8,000 1,100— 11.000 
7 : 
6 2 二 200 于 000 
50 -人 5,000 900 9.000 
40 4- 4,000 
5 800 十 8.000 
30- 人 3,000 
7007 ,000 
4 20-2, 000 
15 + 1.500 600+ 6,000 
‘ 10-F 1,000 as FEU 


| A 6-4 离心 机 转速 与 离心 力 的 列 线 计算 图 
(1 颗粒 沉降 时 间 的 计算 : 
颗粒 的 沉降 时 间 可 用 下 面 公式 计算 : 
本 
9 | wo | (4) 
AH, t 为 样品 颗粒 完全 沉降 到 离心 管 底 的 时 间 ( 秒 ), 世 叫 澄 清 时 间 ; S 为 颗粒 沉降 
ARG on. n 分 别 为 旋转 轴 中 心 到 离心 管 底部 及 样品 液 液 面 的 距离 (厘米 )。 
括号 内 的 部 分 可 用 常数 必 表 示 。 此 时 , 
K=St (5) 
i t 的 单位 用 小 时 , SLL Svedberg (S) HAR, 1S = 10% Hae: 
lnr 一 lnr 10% 
Ko ee 


6 
f 3600 (6) 


KES FWMEAT GEE KH 10—1,000 REX), 与 转子 大 小 和 速度 有 关 。 Sy 
nyt 不 变 时 ,由 上 述 公 式 可 以 得 出 : C1) K 值 越 低 , 颗 粒 沉 降 时 间 越 短 ,, 转子 使 用 效率 越 
高 52) wit) = wt; (3) K PSR FAMILLE, wiki = oK.. 转子 出 厂 时 都 已 标 上 最 大 
转速 时 的 区 值 , 由 此 可 求 得 低速 时 的 KK 值 。 有 了 开 值 就 可 估计 具有 一 定 沉降 系数 的 某 种 
颗粒 的 沉降 时 间 。 但 文献 或 厂家 所 给 了 值 均 从 离心 管 隘 顶 部 而 不 是 从 液 面 计算 的 , 故 实 
际 及 值 比 理论 K 值 小 。 

如 果 颗 粒 接近 圆 球状 ,但 不 知 其 沉降 系数 , 也 可 借助 其 它 有 关 参 数 , 用 下 式 估算 颗粒 


。I61。 


5 ys 


R62 某 些 盐 的 密度 梯度 比例 常数 B" 


Bx 10> 
阴离子 


“i. hE 
(25°C, g/cm?) 全 SOz= 
17 1.06 
81 0.76 
0.67 
55 0.64 
0.66 
0.69 
0.74 


-20 
.30 
40 
50 
60 
-/70 
-80 
.90 


— hh 
wy sta Ee 
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oS eee we ee, te 
i) 
Nm 
Se 2. oS = 
i See 
CN 
Ww 


.20 
-30 
-40 
50 
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Bot ReERY ia] CD): 


9n T2 : 
C= 一 一 一 一 一 一 一 -一 In + 7 
200 a? (Co ae Po) Ty ¢ ) 


式 中 , d QRURSZI CBOK)s 1 为 介质 粘度 CIB) 0, 00 分 别 为 颗粒 和 介质 密度 
( 克 / 厘 米 ?)。 

经 验 表明 , 角 式 转子 离心 管内 悬浮 颗粒 沉降 到 管 底 的 时 间 比 外 摆 式 转子 稍 短 , 但 较 易 
产生 对 流 干 扰 。 

(2) 颗粒 平衡 时 间 的 计算 : 上 述 离心 时 间 的 计算 仅 适 用 于 沉降 分 离 , 在 密度 梯度 区 , 


。162。 


带 离心 中 , 颗 粒 到 达 平 衡 点 所 需 时 间 的 计算 则 要 复杂 得 多 。 如 在 离子 介质 中 进行 平衡 等 
密度 离心 ;计算 样品 中 颗粒 在 盐 梯 度 中 的 平衡 时 间 时 ,其 方法 如 下 : 
《a) 样品 和 盐 介 质 一 起 离心 时 , 
_ 1.13 x 10 x 6° x (ep — 1) | (8) 
n‘t’Sio,w 
SUA, t 为 时 间 ( 小 时 7; 8" 为 特定 溶剂 (水 ) 中 盐 梯度 的 比例 常数 ( 见 表 6-2); 2 为 颗 
粒 的 浮力 密度 ( 克 / 厘 米 7; So,w 2) 20°C 时 颗粒 在 水 中 的 标准 沉降 系数 (S);n 为 转子 转速 
4rpm);r 为 平衡 颗粒 至 旋转 轴 中 心 的 距离 (厘米 )。 
因为 样品 颗粒 在 盐 梯 度 中 的 平衡 区 带 是 位 于 梯度 的 中 间 部 分 ; 故 x 值 可 用 等 浓 点 (与 
起 始 均匀 盐 介 质 密度 相同 的 梯度 中 某 一 点 ) 公 式 计 算 : 


n-[LG@tan ts) | (外 摆 式 转子 用 ) (9) 
或 = 一 [二 (十 巧 | (区 带 转子 用 ) SO E10) 


公式 (9) BIATARRT. VRER. SRACAPH 1 CRBE RAMS OR 
管子 未 充满 梯度 液 , 则 应 经 适当 换算 求 出 mn (以 缩短 离心 时 间 )oe 
此 法 计算 的 时 间 是 颗粒 平衡 的 时 间 也 即 总 离心 时 间 ),, 形成 盐 梯 度 所 需 的 平 衔 时 间 
则 要 少 得 多 。 
(b) 用 预 形成 的 非 平衡 梯度 时 , 
2.53 X 10% x (p — 1)[ log (r, — 1.) /r, + 4.61] (11) 
n’rSy,w X de/dr . 
式 中 , de/dr HAEBERENRS t/BK/BK)s nn 分 别 为 梯度 顶部 和 平衡 
诡 部 与 旋转 轴 中 心 的 距离 (厘米 ); 其 余 符 号 与 式 (8) 相同 。 
公式 11) 和 (8) 仅 适 用 于 相对 粘度 约 等 于 工 的 梯度 液 〈 如 CsCl), gastos = 
HC , WT UAL AY Io ME A ETE 4 RIED 
了 此 法 虽 用 预先 形成 的 梯度 ,但 离心 时 仍 存在 梯度 重新 平衡 、 再 分 布 问题 , 故 也 与 平衡 
或 稳定 梯度 所 需 的 离心 时 间 有 关 ( 总 离心 时 间 比 (a) Do 


t 一 


二 、 制 备 超 离心 的 方法 及 其 选择 9368] 


制备 超 离心 法 可 分 为 二 大 类 型 : 〈1) 差 速 离心 法 ; (2) 密度 梯度 区 带 离心 法 。 WMD 
别 介绍 如 下 : 


《一 ) 差 速 离心 法 

采用 逐渐 增加 离心 速度 或 低速 和 高 速 交 替 进 行 离心 * 使 沉降 速度 不 同 的 颗粒 ,在 不 同 
离心 速度 及 不 同 离心 时 间 下 分 批 分 离 的 方法 , 称 为 差 速 离心 法 。 差 速 离心 一 般 用 于 分 离 
沉降 系数 相差 较 大 的 颗粒 。 

进行 差 速 离心 时 ,首先 要 选择 好 颗粒 沉降 所 需 的 离心 力 和 离心 时 间 。 离 心力 过 大 或 离 
心 时 间 过 长 ,容易 导致 大 部 分 或 全 部 颗粒 沉降 及 颗粒 被 挤 压 损伤 。 当 以 一 定 离心 力 在 一 定 


。 了 63。 


的 离心 时 间 内 进行 离心 时 ,在 离心 管 底部 就 会 得 到 最 大 和 最 重 颗粒 的 “沉淀 ,分 出 的 “上 


请 被 在 加 大 转速 下 再 进行 离心 ,又 得 到 第 二 部 分 较 大 \ 较 重 颗粒 的 “沉淀 ”及 含 小 和 轻 颗 , 


粒 的 上 请 流 "。 如 此 多 次 离心 处 理 , 即 能 把 液体 中 的 不 同 颗粒 较 好 地 分 离开 。 此 法 所 得 
沉淀 是 不 均一 的 , 仍 杂 有 其 它 成 分 , 需 经 再 悬 译 和 再 离心 (2 一 3 次 ), 才 能 得 到 较 纯 颗 粒 。 

差 速 离心 法 主要 用 于 分 离 细胞 器 和 病毒 。 其 优点 是 :操作 简易 ;离心 后 用 倾倒 法 即 可 
将 上 清 液 与 沉淀 分 开 ;并 可 使 用 容量 较 大 的 角 式 转子 。 缺 点 是 : (1) 分 离 效果 差 , 不 能 一 
次 得 到 纯 颗 粒 。(2) 壁 效 应 严重 。 特别 当 颗 粒 很 大 或 浓度 很 高 时 , 在 离心 管 壁 一 侧 会 出 
现 沉 演 。(3) 颗粒 被 挤 压 ,离心 力 过 大 、\ 离 心 时 间 过 长 会 使 颗粒 变形 、 缘 集 而 失 活 。/ 


(=) 密度 梯度 区 带 离心 法 (或 简称 区 带 离心 法 ) 
这 是 1940 年 发 展 起 来 的 一 种 方法 。 区 带 离心 法 是 样品 在 一 惰性 梯度 介质 中 进行 离 


心 沉降 或 沉降 平 衔 ,在 一 定 离心 力 下 把 颗粒 分 配 到 梯度 中 某 些 特定 位 置 上 ,形成 不 同 区 带 


的 分 离 方法 。 此 法 的 优点 是 : 〈1) 分 离 效果 好 ,可 一 次 获得 较 纯 颗 粒 ;3〈2) 适应 范围 广 e 
能 象 差 速 离心 法 一 样 分 离 具 有 沉降 系数 差 的 颗粒 , 又 能 分 离 有 一 定 浮力 密度 差 的 颗粒 ; 
3) 颗粒 不 会 挤 压 变形 , 能 保持 颗粒 活性 , 并 防止 已 形成 的 区 带 由 于 对 六 而 引起 混合 。 缺 
点 是 :(1) 离心 时 间 较 长 ; (2) 需要 制备 梯度 ; (3) 操作 严格 , ARASH. 区 带 离 忆 法 又 可 
分 为 差 速 - 区 带 离心 法 (动态 法 或 沉降 速度 法 ) 和 等 密度 离心 法 (平衡 法 或 沉降 平衡 法 )o 
1. 差 速 -区 带 离心 法 ”” 当 不 同 的 颗粒 间 存 在 沉降 速度 差 时 , 在 一 定 离 忆 力 作用 下 , 


颗粒 各 自 以 一 定 速度 沉 降 , 在 密度 梯度 的 不 同 区 域 上 形成 区 带 的 方法 称 差 速 = 区 带 离 心 
- 法 。 差 速 -区 带 离心 仅 用 于 分 离 有 一 定 沉降 系数 差 的 颗粒 , 与 其 密度 无 关 。 大 小 相同 , 密 


度 不 同 的 颗粒 (如 线粒体 \ 溶 酶 体 和 过 氧 物 酶 体 ) 不 能 用 此 法 分 离 。 
离心 时 ,由 于 离心 力 的 作用 ,颗粒 离开 原样 品 层 , 按 不 同 沉 降 速度 沿 管 底 帝 降 。 离 心 
一 定时 间 后 ,沉降 的 颗粒 逐渐 分 开 , 最 后 形成 一 系列 界面 清楚 的 不 连续 区 带 。 沉降 系数 越 


大 , 往 下 沉降 得 越 快 ,所 呈现 的 区 带 也 越 低 。 沉 降 系数 较 小 的 颗粒 , 则 在 较 上 部 分 依次 出 


现 。 从 颗粒 的 沉降 情况 来 看 ,离心 必须 在 沉降 最 快 的 颗粒 《大 颗粒 ) 到 达 管 底 前 或 刚 到 大 
管 底 时 结束 ,使 颗粒 处 于 不 完全 的 沉降 状态 , 而 出 现在 某 一 特定 区 带 内 。 此 时 ?了 离心 管 梯 
度 液 面 上 的 样品 层 , 由 于 颗粒 沉降 而 变 成 了 仅 有 溶剂 分 子 的 上 清 液 。 若 样品 液 中 含有 夫 
量 沉降 系数 不 同 的 颗粒 ( 即 浓度 很 大 ) 时 ,也 可 能 得 到 一 条 不 同 颗粒 连续 分 布 的 区 带 。 

在 离心 过 程 中 ,区 带 的 位 置 和 形状 (或 宽度 ) 随 时 间 而 改变 。 因 此 ,区 带 的 宽度 不 仅 取 


” 决 于 样品 组 分 的 数量 ,梯度 的 斜率 、 颗 粒 的 扩散 作用 和 均一 性 , 也 与 离心 时 间 有 关 。 时 间 


越 长, 区 带 越 宽 。 适 当 增 加 离心 力 可 缩短 离心 时 间 , 并 可 减少 扩散 所 导致 的 区 带 加 宽 现 
象 , 增 加 区 带 界面 的 稳定 性 ,特别 是 较 小 的 颗粒 ,沉降 慢 , 易 扩 散 , 需 用 高 速 离心 

差 速 - 区 带 离心 的 分 辩 率 (不 同 区 带 相互 间 分 开 的 请 晰 程度 ) 比 差 速 离心 高 ,分 辩 率 高 
低 受 颗粒 沉降 速度 和 扩散 系数 实验 设计 的 离心 条 件 〈 样 品 带 的 宽度 和 浓度 、 离 心力 和 离 
心 时 间 , 梯 度 斜 率 和 长 度 、\ 梯 度 介 质 的 性 质 等 )\ 离 心 操 作 的 匈 练 程度 所 影响 。 梯 度 介 质 的 
摩擦 阻力 (或 粘度 ) 越 大 、 颗 粒 沉 降 速度 和 扩散 系数 越 少 。 沉 降 速度 的 大 小 还 与 颗粒 的 表面 
积 \ 形 状 有 关 , 大 的 、 球 形 的 颗粒 比 小 的 、 长 形 的 颗粒 沉降 得 快 ;与 颗粒 和 周围 介质 间 的 密 
度 差 及 梯度 上 某 一 点 的 离心 力 成 正比 。 若 颗粒 沉降 速度 差 值 小 ,就 会 影响 分 辩 率 ,颗粒 的 扩 
散 系 数 可 改变 区 带宽 度 , 也 影响 分 辩 率 。 操 作 中 应 尽量 避免 在 装 样 ,离心 及 取出 梯度 时 扰 


- 164 。 


乱 梯 度 。 离 心 条 件 对 分 辩 率 的 影响 ,将 在 有 关 部 分 叙述 。 

2. 等 密度 离心 法 文献 中 有 多 种 叫 法 ,但 均 离 不 开 平衡 ”这 二 个 字 的 含义 , 故 也 称 
平衡 法 。 当 不 同 颗粒 存在 浮力 密度 差 时 ,在 离心 力 场 下 ,颗粒 或 向 下 沉降 ,或 向 上 译 起 ,一 
直 沿 梯度 移动 到 与 它们 密度 恰好 相等 的 位 置 上 《〈 即 等 密度 点 ) 形成 区 带 , 此 即 为 等 密度 离 
心 法 。 处 于 等 密度 点 上 的 颗粒 没有 重量 ,区 带 的 形状 、 位 置 均 不 受 离心 时 间 所 影响 ,体系 
处 于 动态 平衡 。 等 密度 离心 的 离心 过 程 与 差 速 离心 、 差 速 -区 带 离心 的 比较 如 图 6-5。 


(a) 


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@p.-> 
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Ft a) AA Ze > ST 


258 Bb 差 速 一 区 带 离 心 等 密度 离心 
6-5 颗粒 沉降 过 程 的 示意 图 


, 等 密度 离心 的 有 效 分 离 取决 于 颗粒 的 浮力 密度 差 , 密度 差 越 大 ,分 离 效 果 越 好 , 与 大 
小 和 形状 无 关 ,但 后 二 者 决定 着 达到 平衡 的 速度 、. 时 间 和 区 带 的 宽度 。 颗 粒 的 浮力 密度 不 
是 恒定 不 变 的 ,还 与 其 原来 密度 ,水 化 程度 及 梯度 溶质 的 通 透 性 或 溶质 与 颗粒 的 结合 等 因 
素 有 关 。 例如 某 些 颗 粒 容易 发 生 水 化 ,使 密度 降低 ; 亲 水 梯度 材料 可 能 次 人 颗粒 , 取代 结 
构 内 的 水 化 水 而 增加 表 观 密度 ,分 离 时 就 要 考虑 这 些 因素 的 影响 。 

等 密度 离心 的 分 辩 率 受 颗粒 性 质 (密度 、 均 一 性 、 含 量 )\ 梯 度 性 质 (形状 斜率 、 粘 度 )、 
转子 类 型 .离心 速度 和 时 间 的 影响 。 颗 粒 区 带宽 度 与 梯度 斜率 、 离 心力 、 颗 粒 分 子 量 成 反 
比 。 低 速 离心 虽 可 使 颗粒 稳定 沉降 ,但 不 易 建 立 平衡 , 需 延 时 离心 ,有 时 要 达 数 天 之 久 。 这 
会 增加 某 些 分 子 的 扩散 速度 , 使 区 带 加 宽 , 分 辩 率 降低 。 所 以 等 密度 离心 的 转速 一 般 较 
高 。 

根据 梯度 产生 的 方式 可 分 为 预 形成 梯度 和 离心 形成 梯度 的 等 密度 离心 〈 后 者 又 称 平 
衡 等 密度 离心 )。 前 者 需要 事先 制备 密度 梯度 ,常用 的 梯度 介质 主要 是 非 离子 型 的 化 合 物 
(如 蔗糖 ,Ficoll)。 离 心 时 把 样品 铺 放 到 梯度 的 液 面 上 ,或 导 人 离心 管 的 底部 。 平 衡 等 密 
度 离 忆 常用 的 梯度 介质 有 离子 型 的 盐 类 、 三 碘 化 苯 衍生 物 , 还 有 Ludox 等 (后 者 扩散 慢 ,最 
好 用 梯度 产生 器 制备 )。 离 心 时 是 把 密度 均一 的 介质 液 和 样品 混合 后 装 人 离心 管 ,通过 离 
心 形成 梯度 ,让 颗粒 在 梯度 中 进行 再 分 配 。 离 心 达 平衡 后 ,不 同 密度 的 颗粒 各 自分 配 到 其 
等 密度 点 的 特定 梯度 位 置 上 ,形成 不 同 的 区 带 。 颗 粒 到 达 等 密度 点 需要 一 定 的 离心 时 间 , 
转速 不 驶 高 ,可 以 用 延长 时 间 来 弥补 ,而 提高 转速 可 缩短 平衡 时 间 。 大 颗粒 的 平衡 时 间 可 
能 比 梯度 本 身 的 平衡 时 间 短 , 而 小 颗粒 则 较 长 。 因此 , 离心 所 需 时 间 应 以 最 小 颗粒 到 达 
平衡 点 的 时 间 为 基准 。 如 果 采 用 “松弛 技术 ”, 即 先 高 速 离心 建立 梯度 , 后 降 至 原 定 速度 
维持 6 一 8 小 时 , 可 大 大 缩短 平衡 等 密度 离心 时 间 。 

当 已 知 某 种 颗粒 的 浮力 密度 时 , 也 可 不 用 梯度 而 进行 等 密度 离心 。 方 法 是 先 在 适当 


*。165。 


速度 下 沉降 , 除 去 较 重 颗粒 , 然 后 把 待 分 离 颗粒 的 样品 悬浮 在 与 其 序 力 密度 相同 的 介质 
中 ,离心 直至 所 需 颗 粒 沉降 到 管 底 。 此 法 适 于 分 离 特定 已 知 颗粒 ,用 于 多 种 颗粒 的 分 离 则 
很 费事 。 


(三 ) 离心 方法 的 选择 


如 上 所 述 , 差 速 离心 , 差 速 -区 带 离心 的 分 离 是 依据 颗粒 的 沉降 速度 差 ,等 密度 离心 分 
离 则 依据 颗粒 的 浮力 密度 差 , 二 者 互 为 补充 。 差 速 离心 的 关键 在 于 选择 离心 力 和 离心 时 
间 ; 而 区 带 离心 关键 是 选择 梯度 及 其 范围 。 可 参照 6-3 来 选择 合适 的 分 离 方 法 。 


表 6-3 超 离 心 分 离 方法 的 选择 


颗粒 沉降 系数 “| 颗粒 浮力 密度 | 离心 特点 分 离 效果 适用 范围 
相差 大 (1- 几 个 短 时 间 、 多 次 采 | 粗 分 离 , 纯 度 和 | 分子量 或 大 小 ) 相差 大 、 
差 ES) 用 不 同 速度 和 离心 | 收 率 不 高 。 不 稳定 、 易 变性 、 易 受 梯度 介 
四 时 间 进 行 分 段 离 上 质 损伤 的 颗粒 。 常 用 于 从 组 
i 心 。 织 匀 浆 息 中 分 离 细胞 器 及 分 
离 病毒 

相差 较 少 209 短 时 间 , 低 速度 ,| 可 分 出 较 纯 颗 | 大 小 不 同 而 密度 相似 、 受 

差 ”成 更 少 )。 RIF 样品 不 完全 沉降 。| 科 。 差 速 离心 拼 压 变形 、 受 低 浓 、 
ela 3 倍 的 蛋白 度 梯度 介质 损伤 较 少 的 颗 
Bite Ho ULB, Tete 
离 分 析 分 离 。 可 分 离 核酸 \ 蛋 白 
‘a 质 、 核 糖 体 亚 基 及 其 它 成 分 

(如 整 细胞 、 脂 蛋白 )。 
有 差异 。 如 相差 | 长 时 间 \ 高 速度 ,| 可 分 出 较 纯 颗 | 大 小 相 局 而 密度 不 同 、 稳 
0.005 克 / 厘 米 : 的 | 颗粒 完全 沉降 到 平 | 粒 。 这、 不 受 高 浓度 介质 损伤 的 
= is DNA, 相差 0. 01 一 | 衡 位 置 。 其 中 平衡 BRL, 一 次 分 离 样品 量 大 , 
度 0. 02 克 /厘米 ?的 亚 | 等 密度 离心 多 用 较 用 于 制备 及 分 析 分 离 。 可 分 
“i 细胞 器 。 低 转速 (3 一 4 万 | 离 核 酸 、 亚 细胞 器 、 整 细胞 , 
rpm)、 较 长 时 间 也 可 分 离 复合 蛋白 质 , 但 简 
0-3 天)。 单 蛋白 质 不 适用 。 


选择 分 离 方 法 必须 注意 以 下 几 点 : 

(1) 区 带 法 分 离 颗 粒 的 能 力 由 大 小 或 密度 所 决定 。 沉 降 系数 和 序 力 密度 都 相同 的 颗 
粒 , 经 处 理 后 也 可 用 超 离 心 法 分 开 。 常 用 方法 是 改变 梯度 的 组 成 (如 加 入 少量 无 机 盐 或 另 
一 种 梯度 材料 以 改变 活 透 性 促进 颗 粒 的 结合 作用 等 ) 及 有 选择 损伤 某 种 颗粒 从 而 影响 颗 
粒 的 浮力 密度 和 沉降 系数 。 

(2) 颗粒 在 一 定 溶剂 或 介质 中 都 有 其 特征 的 沉降 系数 和 浮力 密度 (nw 6-6), AW 
从 文献 或 手册 中 查 得 。 已 知 分 子 量 的 某 些 大 分 子 , 可 用 经 验 公式 计算 (如 表 6-4)6 哺乳 
动物 细胞 主 成 分 的 沉降 系数 ($) 近似 为 : 可 溶 蛋 白 1 一 25, RNA 4—30,DNA 20—100, 
核糖 体 亚 基 30—60, 核糖 体 70—80, 聚 核糖 体 100—400, BOK fk 100—1.5X10', 质 膜 
100X105, 溶 酶 体 1X10 一 2 X104, 线粒体 2X10 一 7 X104, 细胞 核 4X104 一 1075 必要 时 , 
也 可 参考 同类 颗粒 或 经 反复 试验 求 出 。 然 后 由 所 得 数据 列表 或 作 S 一 o 图 ,从 中 确定 分 离 
的 最 佳 方法 和 条 件 s 


。 166 6 


8 
RNA® aR) BREE 
DNA® 


颗粒 的 浮力 密度 〈p, 克 / 厘 米 ?》 


RNA® 


RNA® 


a 10! 10? 103 104 108 10° 10? 
沉降 系数 (S) 
6-6 某 些 细胞 成 分 和 大 分 子 的 . S—e 
(1) 在 水 或 0.25 M RES 《2) ERS 《3) 在 Cs2SO, 中 ; (4) 在 CsCl 中 。 

(3) 制备 超 离心 分 离 颗粒 的 分 子 量 为 10 以 上 《或 直径 20 MAKE)», 小 于 10° BYR 
和 粒 分 离 效 果 不 好 ,小 分 子 核酸 \ 蛋 白质 \ 多 肽 等 在 目前 实验 室 所 用 离心 力 下 还 无 法 分 离 , 还 
须 寻 求 其 它 分 离 技术 (化 学 处 理 、 分 子 筛 , 超 滤 、 到 焦 电泳 等 )。 

《4) 高 密度 的 颗粒 可 用 盐 介质 进行 平衡 等 密度 离心 分 离 。 含 脂 颗粒 可 利用 其 沉降 速 
度 差 进行 差 速 -区 带 离心 分 离 〈 样 品 铺 放 在 梯度 顶 上 ), 或 用 浮力 密度 差 进行 等 密度 分 离 
《样品 分 布 在 梯度 底部 )。 

《5) 同 种 颗粒 由 于 其 不 均一 性 ,沉降 系数 或 浮力 密度 可 能 变动 很 大 ,分 离 时 容易 出 现 
相当 宽 的 区 带 或 发 生 不 同 颗粒 区 带 的 交错 重 人 释 。 核 酸 \ 核 蛋白 \ 蛋 白质 均 存 在 分 子 的 不 均 
一 性 , 如 哺乳 动物 DNA 在 CsCl 中 的 浮力 密度 为 1.68 一 1.72 克 / 厘 米 :。 细胞 和 细胞 器 
的 非 均 一 性 更 甚 。 

《6) 分 离 方法 的 灵敏 度 与 操作 有 关 。 熟练 的 操作 者 用 差 速 - 区 带 法 可 分 离 沉降 系数 
相差 5 多 的 颗粒 ,而 初学 者 往往 只 能 分 离 相差 20 一 30 多 的 颗粒 。 

表 6-4 某 些 生物 大 分 子 沉 降 系数 的 经 验 计算 公 式 


2 yy FF #H B 分 子 量 范围 
SSo,w = 0.00242M9.557 蛋白 质 1.7X10*—4.9K10? 
Soo.w = 2.8 + 0.00834M°*7° 双 链 线性 DNA 10°—10° 
Soo,w = 0.0528M?-4 单 链 碱 性 DNA 1.5X10°—7 X10’ 
So = 0.0105M°-2*? 单 链 中 性 DNA 1.5% 10°—7 X10" 
S° = 2.7 十 0.1759M044; WHER DNA 3X10°—3 X 107 
S°= 7.44 + 0.00243M*8 WHI DNA 10°—3 X10’ 


«167 « 


三 转子 \ 离 心 管 及 其 选择 54;35?11] 


制备 超 离心 机 的 结构 装置 比较 复杂 ,, 一 般 由 四 个 主要 部 分 组 成 : C1) 转子 ; (2) 传动 

和 速度 控制 系统 ; (3) 温度 控制 系统 ; (4) 真空 系统 。 其 结构 特点 是 : 有 完善 的 冷却 和 真 
” 空 系统 ,以 消除 摩擦 热 ( 转 速 大 于 20,000 rpm 时 ,摩擦 生 热 很 严重 ,保护 转子 和 离心 样品 ; 
有 精确 \ 产 格 的 传动 系统 ,以 及 速度 `\ 温 度 监 测 和 控制 系统 ,此 外 还 有 防 过 速 装置 、 词 宵 油 
目 动 循 环 系统 \, 电 子 控制 装置 和 操纵 板 等 , 以 保证 操作 安全 , 自动 化 和 获得 最 好 的 离心 效 

果 。 | 
. 与 制备 超 离 心 使 用 密切 有 关 的 是 转子 和 离心 管 , 现 将 其 结构 \ 性 能 及 用 途 介 绍 如 下 。 


《一 ) 转子 和 转子 的 选择 


离心 转子 是 当代 离心 机 发 展 的 重要 内 容 之 一 , 自 50 年 代 起 至 今 已 有 近 百 种 转子 出 
现 。 制备 用 转子 主要 分 为 和 朋 式 转子 (fixed angle rotor), 外 摆 式 转子 (Swinging-bucket 
rotor) FUIK #46 (zonal rotor) 等 三 类 , 现 介 绍 如 下 : 

1. 角 式 转子 “和 角 式 转子 是 指 离 心 管 腔 与 转轴 成 一 定 倾角 的 转子 。 角 式 转 子 的 型 号 
因 管 子 的 倾角 数目、 容量 以 及 转子 的 材料 半径、 转速 而 异 。 管 子 的 倾角 对 离心 沉降 有 很 


, 大 影响 ,角度 愈 大 ,沉降 愈 结实 ,分 离 效 果 愈 好 。 角 度 小 ,颗粒 沉降 距离 短 , 沉 降 速度 快 , 但 


不 结实 ,分 离 效 果 差 。 角 式 转子 的 重心 低 , 运 转 平衡 ,寿命 也 较 长 。 

颗粒 在 角 式 转子 中 沉降 时 , 先 沿 离心 力 方向 撞 向 离心 管 (如 图 6-7), 然 后 再 沿 管 壁 洽 
向 管 底 。 因 此 管 的 一 侧 就 会 出 现 颗粒 (尤其 大 颗粒 ) 沉 积 , 此 现象 称 “ 壁 效应 “。“ 壁 效应 ” 
容易 使 沉降 颗粒 受 突然 变速 所 产生 的 对 流 扰 乱 , 影 响 分 离 效果 ,尤其 在 分 离 沉 降 特 征 相 似 
的 颗粒 时 更 为 显著 。 用 于 区 带 离心 时 ,颗粒 区 带 在 减速 后 需要 重新 定向 ,定向 后 管 下 部 区 
带 变 窄 ,上 部 区 带 变 宽 。 


2. 外 摆 式 转子 “,” 转子 活动 管 套 内 的 离心 管 ,旋转 时 随 着 转子 的 运动 ,从 垂直 悬 吊 上 


升 到 水 平 位 置 ( 约 200 一 800rpm 下 ), 这 种 转子 称 为 外 摆 式 转子 。 外 摆 式 转子 的 结构 较 复 
杂 , 也 有 管 数 、 容 量 `\ 材 料 ` 半 径 、 转 速 等 的 差别 。 | 
BAIMELAS HORE ARSRRRT OAR, LET AMM. BEER 


了 .外 摆 式 转子 
图 6-7 ”颗粒 在 不 同 转子 中 的 沉降 情况 
(Smit; C 旋 转 中 心 ; FRA) 


¢ 168。 


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心中 颗粒 沉降 区 带 横 过 离心 管 , 离 心 后 区 带 不 必 重 新 定位 。 由 于 颗粒 在 离心 力 场 中 沿 离 
心力 方向 散射 地 运动 ,而 不 是 按 平行 线 沉降 (图 6-7B), 只 有 处 于 样品 区 带 中 心 的 颗粒 才 
直接 向 管 底 沉降 ,其 它 颗 粒 则 撞 向 管 的 两 侧 ,产生 类 似 角 式 转子 的 “ 壁 效应 ”现象 。 颗 粒 也 
受 振动 和 变速 扰乱 ,但 对 流 现象 要 小 得 多 。 

3. 区 带 转子 ”区 带 转子 主要 由 一 个 转子 桶 和 可 移动 的 顶 差 组 成 。 福 中 心 位 于 转子 
的 旋转 轴 上 , 转 子 桶 中 装 有 时 片 状 (或 隔 板 ) 装 置 , 把 转子 内 部 分 隔 成 四 个 或 多 个 扇形 小 
室 。 叶 片上 有 导管 , 梯 度 液 或 样品 液 从 转子 中 央 液 管 东 人, 通过 这 些 导管 分 布 到 转子 四 
周 。 转 子 内 的 叶片 装置 可 防止 样品 或 梯度 受 突然 变速 时 产生 涡流 , 有 改善 分 离 效 果 的 作 
用 。 这 种 转子 的 缺点 是 : 样品 和 介质 直接 接触 转子 , 耐 腐蚀 要 求 较 高 ,操作 较 复杂 。 

区 带 转子 的 型 号 很 多 , 自 1964 年 至 今 已 发 展 到 40 种 以 上 ,但 制备 上 广泛 应 用 的 仅 几 
种 〈 如 B-XIV、B-XV 等 )。 一 般 按 其 结构 和 应 用 特点 可 分 为 As B.JK.…:; 按 操 作 方式 
分 为 分 批 式 (又 有 动态 和 静态 装 放 料 之 分 ) 和 连续 式 ; 按 转速 可 分 高 速 和 低速 等 ;$ 有 些 区 
带 转子 还 可 和 光学 系统 连用 ,用 于 离心 监测 和 扫描 记录 。 各 种 转子 的 结构 ,性 能 和 用 途 可 
从 有 关 专著 或 转子 手册 中 查 得 。 
颗粒 在 区 带 转子 中 的 沉降 情况 不 同 于 角 式 和 外 摆 式 转子 , 在 径 向 的 散射 离心 力作 用 
下 ,颗粒 的 沉降 距离 不 变 (如 图 6-7C)。 因 此 区 带 转子 的 “ 壁 效应 * 极 小 ,可 各 免 低速 晃动 所 
造成 的 区 带 或 沉降 颗粒 的 扰乱 ,分 离 效 果 好 。 而 且 还 有 转速 高 \ 容 量 大 ,回收 梯度 容易 和 不 
影响 分 辩 率 的 优点 ,使 超 离心 用 于 制备 和 工业 生产 成 为 可 能 。 

区 带 转子 除了 在 沉降 特点 “ 壁 效应 ”上 与 以 上 二 类 转子 有 明显 差异 外 ,还 有 如 下 不 同 
之 处 ( 表 6-5)。 


RES “三 类 转子 结构 上 的 比较 


= 数 
4—12(SiKILT. 上 百 7 个 


管子 容量 管子 与 转轴 的 角度 
0.2 一 500 毫 升 14—45° 
5 一 25( 多 至 707 毫升 静止 时 .0 ", 离 心 时 90° 


转 桶 容量 300 一 1700 毫 ,|, 桶 中 心 位 于 转轴 上 。 
升 ( 多 至 8 FER 
可 分 离 几 十 升 ) 


有 一 转子 桶 ,无 离心 管 。 
区 带 转 子 


4. 转子 的 最 大 允许 速度 “任何 转子 都 有 一 定 的 使 用 速度 和 使 用 限度 , 随 着 使 用 时 


间 和 次 数 的 增加 , 转 子 长 期 疫 劳 必然 引起 运转 速度 下 降 。 所 以 使 用 转子 时 , 必 须 设 立 档 
案 , 记 录 每 次 的 使 用 时 间 。 一 定时 间或 次 数 后 ,应 重新 估算 其 最 大 人 允许 速度 , 以 保障 使 用 
安全 。 各 制造 三 生产 的 转子 均 已 标明 其 保证 使 用 期 限 。 如 Beckman 转子 可 保证 在 最 大 
转速 下 使 用 1,000 次 或 2500 小 时 或 5 年 , 此 后 转速 降低 10 多 后 又 能 再 用 1000 次 或 
2,500 小 时 。 但 转子 的 使 用 保证 仅 适 用 于 完好 的 转子 。 

由 于 最 大 额定 转速 是 以 装载 好 的 离心 管 的 重量 为 依据 的 , 影 响 离 心 管 重量 还 有 管子 
及 管 幅 材料 和 样品 或 梯度 液 重量 等 因素 ,所 以 为 了 便于 安全 操作 ,必须 估算 某 一 特定 重量 
离心 管 的 最 大 人 允许 转速 。 上 述 因素 和 转子 最 大 允许 转速 间 有 如 下 关系 : 
Wa 
Ws 


N’ =N (12) 


。 169 


式 中 , N 为 最 大 人 允许 转速 ; N 为 最 大 额定 转速 ;3 WA 为 注 满 了 平均 密度 为 1.2 克 / 厘 一 
米 溶液 的 塑料 离心 管 加 硬 铝 帽 的 总 重量 ; We 为 操作 时 所 用 离心 管 加 管 帽 及 溶 洲 后 的 总 
重量 。 

如 果 离 心 管 . 帽 不 变 , 但 样品 该 和 梯度 液 的 平均 密度 p 大 于 1.2 时 ,应 降 速 运转 ,其 最 


大 人 允许 转速 应 为 N’ 一 N 2. — 


5. 转子 的 选择 ”制备 用 超 离心 机 附 有 各 种 转子 以 供 选择 。 例 如 贝克 曼 公 司 生 产 的 
L8 系列 超速 离心 机 就 配备 有 角 式 、 垂 直 、 外 摆 式 、 区 带 和 连续 六 动 式 等 43 种 转子 。 在 超 
离心 制备 中 ,转子 的 选择 可 结合 分 离 的 目的 要求 和 方法 ,从 转速 、 容 量 和 形状 等 三 方面 状 
虑 。 

C1) 转速 : 转子 通常 可 用 铁合金 〈《 钛 铝 合 金 )、 钻 合金 ( 铝 镍 合金 ) 或 塑料 做 成 。 低 速 
运转 用 塑料 转子 ,中 速 运转 可 用 铝 合金 转子 ,而 高 \ 超 速 须 选用 钛 合金 转子 。 

塑料 转子 (如 聚 氧 茶 \ 有 机 玻璃 , 聚 四 氟 乙 烯 ) 的 固有 弱点 是 强度 低 , 使 用 速度 仅 限于 
6,000 rpm 以 下 。 铝 合金 具有 轻便 、 价 廉 、 易 加 工 、 有 一 定 强度 和 抗 爆 性 能 等 优点 ; 但 不 能 


加 热 消毒 、 易 氧化 、 抗 化 学 腐蚀 性 差 〈 易 为 酸 碱 及 CsCl 等 盐 类 腐蚀 , 仅 在 中 性 或 生理 pH 


6.5 一 7.5 下 使 用 )。 此 外 , 抗 金属 疲劳 损伤 的 性 能 也 差 。 高 速 运转 时 , 铝 转子 会 出 现金 属 


疲劳 , 易 受 应 力 影响 而 损伤 其 晶体 结构 ,导致 水 进入 微 晶 界面 ,加 重 裂 锋 的 扩展 (这 种 现象 


称 应 力 腐蚀 或 应 变 损 伤 )。 化 学 和 应 力 腐蚀 均 会 造成 运转 失衡 , 酿 成 事故 。 

钛 合金 转子 虽然 价格 昂贵 ,加工 困 难 , 内 含 的 铜 会 抑制 一 些 酶 活 ,也 比较 策 重 ;但 它 强 
度 大 \、 耐 用 ,能 经 受 冷冻 及 高 温 消 毒 处 理 , 抗 化 学 腐蚀 (如 «CsCl, pH3.5—11 的 酸 碱 液 ) 和 
应 变 侵 蚀 的 性 能 强 , 是 当前 最 理想 的 转子 。 由 于 钛 转子 的 强度 大 ,同样 大 小 转子 的 抗 离心 
力 的 能 力 要 比 铝 转 子 大 二 倍 左右 , 并 至 少 可 增加 最 大 人 允许 转速 20 狗 。 

转子 的 型 号 ,来 源 不 同 , 转 速 也 不 同 。 久 用 的 转子 受 化 学 或 应 力 腐蚀 , 须 重新 估算 最 
大 多 许 转速 。 任 何 转子 都 不 允许 在 满 额 或 超额 定 转速 下 运转 。 有 人 建议 使 用 转速 为 最 大 , 
额定 转速 (或 最 大 允许 转速 ) 的 75 狗 ,, 以 保证 安全 , 延长 使 用 寿命 。 角 式 转子 的 转速 除 受 
转子 材料 强度 限制 外 ,也 受 离心 管 的 塑料 强度 限制 。 

(22) OR: 转子 的 形状 可 直接 影响 颗粒 的 分 离 效 果 。 区 带 转子 具有 与 外 摆 式 转子 相 
同 或 稍 好 的 分 辩 率 ;5 既 能 进行 区 带 离心 ,也 能 进行 差 速 沉降 。 但 颗粒 沉降 区 带 随 半径 增 大 
而 被 径 向 稀释 , 故 一 般 不 用 于 浓缩 , 仅 适 于 分 离 纯化 。 区 带 转子 的 分 辩 率 与 转子 的 高 度 / 
直径 之 比 旺 反比 关系 。 

外 摆 式 转子 主要 用 于 区 带 分 离 。 等 密度 离心 选用 粗 短 离心 管 管 ; 而 差 速 - 区 带 离心 选用 
细 长 离心 管 的 外 摆 式 转子 。 

角 式 转子 不 能 用 于 差 速 -区 带 分 离 , 加 减速 期 间 样 品 或 颗粒 区 带 易 被 扰乱 , 通 常 在 差 
速 离心 中 作 组 分 的 粗 分 。 但 在 差 速 分 离 有 显著 沉降 系数 差 的 样品 时 , 效 果 却 很 好 。 用 在 
等 密度 离心 ,尤其 在 平衡 等 密度 离心 时 ,由 于 沉降 距离 短 , 梯 度 和 颗粒 容易 建立 平衡 。 但 
所 用 的 梯度 密度 范围 小 ,多 用 于 分 离 DNA 一 类 颗粒 ,分 离 效 果 比 外 摆 式 转子 好 。 而 且 在 
CsCl HH, RNA 沉积 于 管 外 壁 , 不 仿 碍 用 穿刺 法 取出 DNA 区 带 。 

还 有 一 类 垂直 管 转子 , 它 是 角 式 转子 的 特殊 形式 ,主要 用 作 等 密度 离心 。 其 优点 是 颗 
粒 移动 距离 短 , 梯 度 离心 时 , 约 比 外 摆 式 和 角 式 转子 各 节省 4/5—2/3 及 1/2 一 213 的 时 


«170 


间 。 但 转子 须 承受 很 大 的 与 管子 成 垂直 作用 的 离心 力 , 速 度 的 剧变 容易 产生 对 流 扰 乱 。 

(3) 容量 : 转子 的 容量 依次 是 区 带 转 子 > 角 式 转子 > 外 摆 式 转子 , 每 一 类 型 的 转子 
也 有 大 小 之 分 。 区 带 转子 不 仅 容 量 大 ,有 些 还 有 连续 流动 装置 或 光学 监测 系统 ,很 适 于 大 
规模 分 离 制 备 。 角 式 转子 用 于 差 速 离心 分 离 时 ,由 于 每 次 处 理 样 品 多 ,离心 时 间 短 , 可 增 
加 样品 的 处 理 次 数 和 体积 。 


(=) 离心 管 及 其 选择 


离心 管 通常 由 玻璃 .塑料 和 金属 (如 不 锈 钢 、 铝 合金 ) 制 成 。 玻 璃 管 虽 质 硬 ,但 很 脆 , 不 
能 耐 受 超速 离心 的 应 力 。 超 离心 所 用 离心 管 主要 用 塑料 和 不 锈 钢 制 成 。 

塑料 离心 管 常用 的 材料 有 聚 乙烯 (PE)、 栈 酸 - 丁 酸 纤维 素 (CAB)、 聚 碳酸 酯 (PC), HE 
丙烯 (PP)、 硝 酸 纤 维 素 (NC) 等 。 塑 料 管 的 最 大 优点 是 透明 (或 半 透 明 ), 硬度 小 , 可 用 穿 
刺 法 取出 梯度 。 某 些 管 子 还 具有 和 良好 的 物理 性 能 ,如 抗 张力 、 耐 高 (或 低 ) 温 等 ,可 经 受 高 
温 消毒 .冷冻 、 超 速 离心 等 不 同 处 理 。 其 主要 缺点 是 易 变 形 , 抗 腐蚀 性 差 ,使 用 寿命 短 。 

不 锈 钢 离 心 管 强度 大 ,不 变形 、 能 抗 热 \ 抗 冻 \ 抗 化 学 腐蚀 。 但 使 用 时 也 应 避免 接触 强 
腐蚀 性 的 化 学 药品 , 如 HCL、H;SO,、HF 等 。 在 某 些 特殊 场合 下 ,也 可 使 用 塑料 衬里 的 
不 锈 钢管 。 

离心 管 的 选择 主要 从 容量 ` 强 度 、 抗 温 变 ` 抗 化 学 腐蚀 等 方面 考虑 。 此 外 ;高速 离心 的 
应 力 还 会 加 剧 介 质 对 管子 的 腐蚀 。 因 此 ,必须 根据 制备 离心 的 不 同 要 求 (体积 、 转 速 \ 介 质 
等 ) 选 择 相应 的 离心 管 。 选 择 管子 的 最 好 办 法 是 查阅 有 关 管 子 的 资料 或 产品 说 明 书 , 并 在 
离心 前 测试 梯度 介质 或 样品 对 离心 管 稳定 性 的 影响 。 制备 超 离心 普遍 采用 不 锈 钢管 ; 塑 
料 管 则 主要 用 于 区 带 离心 。 选 用 塑料 离心 管 时 ,管子 的 大 小 须 与 梯度 液 或 样品 液 相 适应 。 
未 充满 液体 的 管子 (甚至 拉力 强度 较 大 的 PC 管 ) 应 降 速 使 用 ; 在 角 式 转子 中 高 速 离心 时 , 
管 壁 受 压 不 匀 将 引起 管子 变形 或 崩 裂 。 上 下 密度 差 较 大 的 梯度 管 , 也 容易 发 生 类 似 的 离 
心 变形 ,使 转子 不 平衡 而 造成 严重 事故 。 有 些 管 子 (如 NC 管 、PP 管 ) 即 使 充满 液体 ,也 不 
能 在 5 万 rpm 以 上 转速 下 离心 。 超 速 离心 宜 选用 不 锈 钢 管 , 厚 壁 塑料 管 、polyallomer (PA, 
丙烯 和 乙烯 单 体 的 共聚 物 ) 管 。 严 禁 使 用 显著 变形 、 损 伤 或 老化 的 离心 管 。 另 外 , 还 应 了 
解 管子 的 容量 最 高 转速 、 使 用 次 数 、 保 存 方法 等 ,以 便 合 理 使 用 。 薄 壁 管 在 6.5 万 rpm 的 
高 速 下 仅 用 一 次 , 4 一 6 万 rpm 下 可 用 3 一 5 次 。 厚 壁 管 使 用 次 数 可 多 些 。 

此 外 ;还 要 考虑 介质 对 管子 (如 前 述 ) 或 管子 对 分 离 颗粒 的 影响 ,例如 某 些 塑料 管 (如 
硝酸 纤维 素 管 ) 的 表面 会 吸附 核酸 , 管子 的 长 短 \ 大 小 等 也 要 适当 注意 。 如 外 摆 式 转子 用 
细 长 管 作 差 速 -区 带 离心 可 获得 较 高 的 分 辩 率 ; 薄 壁 管 仅 用 于 外 摆 式 转子 ; 角 式 转子 及 垂 
直 转 子 用 的 管子 承受 的 压力 大 ; 须 用 厚 壁 离心 管 等 等 。 


(=) Bde 

超速 离心 机 的 离心 管 常 附 有 管 帽 。 离心 前 管子 必须 戴 好 管 帽 。 管 帽 有 三 种 作用 : 
C1) 防止 样品 外 泄 。 用 于 生物 危险 、 放 射 性 或 腐蚀 性 的 样品 时 , 这 点 尤其 重要 。(2) 防 止 
样品 挥发 。 样 品 暴露 于 真空 时 ,很 容易 挥发 , 使 转子 失衡 运转 而 发 生 事故 。(3) 支持 离心 
管 ,防止 离心 变形 。 

管 巾 一 般 由 塑料 ,电镀 铝 合金 或 不 锈 钢 制 成 ,内 衬 橡胶 密封 垫圈 。 


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(一 ) 梯度 介质 


常用 梯度 介质 可 分 为 五 类 ,各 类 介质 的 优 缺 点 如 表 6-6, 

市 售 的 梯度 材料 均 含 有 杂质 ,影响 分 离 或 测定 ,用 前 必须 进行 精制 , 除去 杂质 。 例 如 
重金 属 可 用 EDTA (1 一 10 mM) 或 Dowex 整合 树脂 (1/20 一 1/10 体积 ) 除 去 ;紫外 吸收 物 
质 可 用 酸 处 理 过 的 活性 炭 (1/40 一 1/20 重量 ) 煮 沸 一 段 时 间 后 吸附 除去 ;核酸 酶 可 用 活性 
交 或 焦 碳 酸 二 乙 酯 进行 处 理 ; 高 分 子 介质 所 含 低 分 子 杂 质 可 透析 除去 。 


《二 ) 梯度 介质 的 选择 
理想 密度 梯度 材料 的 条 件 是 : C) 深度 足 够 大 ,能 形成 颗粒 分 离 所 需 的 有 效 密 度 。 常 
见 梯 度 介质 的 最 大 密度 见 表 6-7; (2) 溶液 稳定 、 惰 性 、 渗 透 作用 小 、 粘 度 和 离子 强度 低 , 
不 损伤 待 分 离 组 分 ;3) 不 干扰 组 分 分 析 ;《〈4) 具有 某 些 特性 (如 折射 率 ) 以 便于 测定 其 浓 
度 或 密度 。 此 外 ,还 应 考虑 纯度 、 价 格 , 毒 性 腐蚀 性 和 水 化 作用 ,能 否 除去 或 回收 ,能 否 加 
MIA SAR o 
6-7 常见 梯度 介质 的 最 大 密度 (20°C) 


“4 #5 BE Coe / BK) 材 料 密度 ( 克 / 厘 米 ?7 

ER 1,33 

Rk 1.26 
ARE Liz RbBr 1.68 
Ficoll 1. 16—1,45 RbI > 1.95 
牛 血清 白 蛋 白 1,12 FARE SO 1.85 
三 氧 乙 醛 水合 物 1.91 Na 了 Br r.53 
重水 1.105 Nal 1.90 
Ludox 1.219 甲酸 钠 1.32 
Metrizamide 1.46 KBr 1.37 
Urografin é 1.45 KI 7 | We 7 友 
Renografin 145 甲酸 钾 1.57 
CsCl , 191 乙酸 钾 1.411 
Cs,SO, 2.01 BART 1.485 
CsBr 1.72 REE 1.485 
CsI 1.65 LiBr 1. 83 
FARE Ha 2.10 Ludox- 葡 聚 糖 1.25 

HE: 用 重水 代替 水 作 溶 剂 ,通常 最 大 密度 可 增加 0. 06 一 0. 08, 并 可 使 粘度 下 降 。 低 温 影响 盗 解 度 , 密 度 也 相应 降 
低 。 


实际 上 不 存在 适用 于 所 有 颗粒 分 离 的 理想 梯度 材料 ,常用 材料 都 有 一 定 的 局 限 性 。 几 
类 梯度 材料 的 应 用 见 表 6-8。 下 面 简单 介绍 梯度 介质 材料 的 性 质 和 应 用 。 

1. 碱 金属 盐 e | 盐 梯 度 介 质 主要 用 于 平衡 等 密度 离心 ,分离 RNA、DNA 或 核 
酸 占 优势 的 病毒 颗粒 。 由 于 核酸 的 浮力 密度 大 ,不 能 选用 蔗糖 、Ficoll 等 梯度 材料 , 须 用 溶 
度 大 \ 能 形成 高 密度 液 的 盐 类 。RNA 的 分 离 几 乎 全 用 CsSO, 理由 是 : (1) RNA 不 溶 于 
浓 CsCl, 离心 时 在 管 外 壁 沉 淀 ; (2) Cs,SO, 溶解 度 比 csCl 大 , 形 成 梯度 的 斜率 比 CsCl 大 


° 173 


表 6-8 几 类 梯度 材料 的 主要 应 用 , 


梯度 材料 大 分 也 核 蛋 白 亚 细 胞 器 细 ial 
单 糖 或 双 糖 一 一 些 过 
多 糖 二 元 和 十 
三 碘 化 葵 衍 生物 二 十 + 一 
胶 态 SiO, CLudox) 一 一 十 + 
CsCl Me 一 些 下 = 


“十 ?表示 可 用 ,“ 一 ?表示 不 用 。 
二 倍 , 适 于 浮力 密度 很 宽 的 不 同 核酸 分 子 的 分 离 ; (3) 核酸 在 “CssSO, 中 的 水 化 程度 比 在 
CsCl 中 大 ,使 浮力 密度 大 为 降低 , 也 即 降 低 了 所 用 梯度 的 盐 浓 度 ;〈4) CsCl 在 水 中 的 密度 
低温 下 约 为 1.7 克 / 厘米 ?, 已 接近 溶解 度 的 极限 , 不 能 产生 足够 密度 以 分 离 RNA。 虽 然 


Cs,SO, 对 某 些 单 链 RNA 分 子 有 聚合 ` 沉 淀 作 用 ,但 仍 可 用 于 其 它 单 链 RNA、 双 链 RNA 和 


RNA-DNA 杂交 分 子 的 分 离 。 

DNA 的 衣 力 密度 较 小 ,普遍 用 CsCl 来 分 离 。 CsSO 离心 形成 的 梯度 斜率 大 ,分 辩 率 
比 CsCl 差 , 而 且 SOF 能 与 内 烁 剂 沉 淀 ,妨碍 同位 素 标 记 物 的 测定 , 故 一 般 不 宜 作 DNA 分 
离 的 梯度 介质 。 CsCl 分 离 DNA 的 优点 是 分 辩 率 好 ; DNA 在 浓 CsCI(7M) 中 也 溶解 ; 
天 然 DNA 在 中 性 CsCl 中 的 浮力 密度 还 与 其 CC 含量 呈现 出 近似 线性 的 关系 〈o 一 
0.098 X GC% + 1.660); mA Cs,CO, 则 观察 不 到 这 种 关系 5 

核酸 在 csCO, 和 CsCl 中 的 浮力 密度 依次 为 RNA > RNA-DNA® > 变性 -DNA > 
RNA-DNA“>> 天 然 DNA (杂交 分 子 的 序 力 密度 随 组 成 而 改变 )。 核酸 的 浮力 密度 会 受到 
某 些 因素 的 影响 。DNA 的 浮力 密度 与 以 下 因素 有 关 : (1) 在 盐 介 质 中 的 水 化 程度 。 已 利 


, 用 水 化 程度 的 不 同 而 分 离 单 \, 双 链 DNA, (2) 螺旋 度 。 利用 在 CsCl 或 csSO 中 加 人 


洗 化 乙 锭 而 影响 DNA 的 浮力 密度 。 螺 旋 度 大 的 ,结合 染料 少 , 浮力 密度 降低 就 不 明显 。 


《3) 碱 基 组 成 。 天 然 DNA 的 GC 含量 \ 碱 基 的 修饰 \ 同 位 素 标记 等 对 密度 均 有 影响 。 


钨 盐 介 质 也 用 于 病毒 及 某 些 复合 蛋白 (如 血 请 脂 蛋白 .mRNA 蛋白 \ 核 RNA 蛋白 等 ) 
或 经 特殊 处 理 的 核 蛋白 的 分 离 , 但 盐 介 质 所 产生 的 高 阔 透 压 和 高 离子 强度 对 少数 病毒 及 
多 数 复合 蛋白 的 稳定 性 不 利 , 可 能 会 导致 结构 改变 而 丧失 感染 活性 。 

- 分离 核 酸 类 物质 也 用 其 它 盐 类 ,但 缺陷 更 多 , 仅 在 特殊 情况 下 使 用 。 如 某 些 动物 病毒 
在 酒石酸 钾 梯 度 中 相当 稳定 ,分 离 效 果 比 CsCl 好 。NaI 可 用 于 分 离 核酸 ,NaBr 则 专用 
于 分 离 脂 蛋白 等 。 

2. 小 分 子 有 机 物 ” 单 、 双 糖 梯度 主要 用 于 差 速 -区 带 离心 。 最 常用 的 是 蔗糖 , 梯度 
范围 是 5 一 20 多 《大 分 子 及 小 颗粒 ) 或 15 一 30 多 《有 具 膜 颗粒 )。 蔗糖 有 对 多 数 病毒 安全 ,无 
损伤 ` 浮 力 密度 低 ( 在 CsCl 中 浮力 密度 为 1.38 的 病毒 ,在 蔗糖 中 为 1.20) 等 优点 。 除 少 数 
病毒 外 (如 f, 吻 菌 体 ,,80 S), 多 数 病 毒 的 沉降 系数 为 120—1,000 So 使 用 蔗糖 梯度 时 ,通常 
在 90,000 一 420,000 g 下 离心 0.5 一 3 小 时 即 可 。 

蔗糖 也 常用 于 亚 细 胞 器 , 某 些 RNA、DNA 和 核 蛋 白 的 分 离 ,但 分 离 亚 细 胞 器 时 , 颗 
粒 完 整 性 可 能 受到 一 些 影 响 

如 果 待 分 离 样 品 液 含有 蔗糖 酶 或 芒 糖 干扰 某 些 酶 的 测定 时 , 可 用 甘油 代替 莽 糖 。 革 
油 在 性 质 上 类 似 蔗糖 ,但 可 保护 酶 活 , 能 高 压 消 毒 , 易 蒸发 除去 。 


。174 。 


3. 有 机 高 分 子 ”多 糖 、 白 蛋白 等 渗透 压低 , 适 于 具 膜 颗粒 的 差 速 -区 带 和 等 密度 离 
心 分 离 。 许 多 动 植物 ,微生物 的 细胞 、 亚 细胞 器 和 病毒 已 成 功 地 用 多 糖 介质 进行 分 离 ,, 颗 
粒 经 分 离 后 ,一 般 损 徐 极 小 ,但 高 浓度 下 多 糖 的 疾 透 性 增加 , 易 使 细胞 失 活 , 故 不 常用 于 活 
细胞 的 等 密度 分 离 。 差 速 - 区 带 离心 却 可 获得 相同 或 更 为 有 效 的 结果 ,而 且 时 间 短 , 转速 
低 , 其 中 最 为 广泛 使 用 的 是 聚 芒 糖 和 和 牛 血 请 白 蛋 日 。 生 物 颗 粒 在 多 糖 中 高 度 水 化 , 其 浮力 
密度 比 在 蔗糖 中 低 。 

高 浓度 的 大 分 子 梯 度 介 质 , 对 颗粒 损伤 比 蔗 糖 小 ,但 成 本 较 高 、 湾 度 较 小 , 而 且 粘 度 
高 ,需要 延长 离心 时 间 , 不 宜 用 于 小 颗粒 的 分 离 , 应 用 上 并 不 优 于 芒 糖 。 

4. 三 碘 化 苯 衍 生物 复合 蛋白 质 对 高 离子 强度 敏感 , 容 易 引 起 结合 键 的 断裂 或 亚 


基 解 离 。 分 离 这 类 复合 物 须 选 用 非 离子 型 的 梯度 介质 。 最 常用 的 三 碘 化 葵 衍 生物 是 非 离 


子 型 的 Metrizamide, AMY tH ATR HH. Metrizamide 不 解 离 核 蛋白 , 但 其 它 三 碘 化 葵 衍生 物 
均 为 弱 离 子 型 ,会 影响 核 蛋白 组 成 ;应 用 上 受到 一 定 限 制 。 

三 碘 茶 衍生 物 也 能 用 于 分 离 核 酸 ,蛋白 质 \ 病 毒 \ 亚 细胞 器 和 细胞 等 ,许多 成 功 的 例子 
已 显示 出 它 的 潜在 作用 。 

颗粒 在 三 碘 茉 衍生 物 中 的 浮力 密度 与 介质 本 身 有 关 。 DNA 在 Metrizamide AY 
力 密 度 为 1.12 克 / 厘米 ?接近 完 全 水 化 时 的 密度 ;而 在 离子 型 三 碘 共 衍生 物 中 , 密 度 还 稍 
大 些 。 改变 Metrizamide 的 离子 强度 或 pH 也 能 改变 DNA 的 浮力 密度 。 SKE MA 
衍生 物 能 与 蛋白 质 牢固 结合 , 使 浮力 密度 增 大 达 1.30 克 / 厘 米 * 以 上 。 采 用 重水 作 溶 剂 或 
将 样品 分 层 到 梯度 顶 上 ,或 用 较 低 浓度 的 Metrizamide 〈 弱 结合 )、Urografin 〈 不 结合 ) 可 
减弱 或 排除 这 种 结合 作用 。 蛋 日 质 、 复 合 蛋白 质 在 Metrizamide 隐语 1.27 和 
1.22 克 / 厘米 ?。 

三 磺 葵 衍生 物 几 乎 可 用 于 任何 颗粒 的 分 离 , 是 很 有 前 途 的 一 类 介质 。 

5. RAS SiO, (Ludox) 上 有 具 膜 颗 粒 对 渗透 压 敏 感 ,不 能 用 高 渗透 性 的 盐 类 、 莽 糖 或 
高 粘性 的 Ficoll, Metrizamide 来 分 离 。 粘 度 高 ;沉降 慢 , 离心 时 间 长 也 易 引 起 不 稳定 颗粒 
的 破坏 或 变性 。Ludox 的 活 透 压 和 粘度 均 很 低 , 是 分 离 不 稳定 颗粒 的 理想 介质 。 但 Ludox 
在 pH4 一 7.5 不 稳定 ,对 细胞 有 低 毒 性 , 须 与 多 聚 体 ( 如 葡 绢 糖 , 聚 乙 二 醇 ) 配 成 混合 梯度 介 
质 后 才 适 用 ,或 采用 新 型 号 的 Ludox (40 MCS AYI, I 2), Ludox MCS 不 仅 保留 了 胶 态 
SiO, 的 优点 ,而且 避免 了 加 多 聚 体 所 带 来 的 弊病 ,在 渗透 性 、pH、 离 子 强度 上 接近 细胞 的 


生理 条 件 > FE— PRA BIRR BO, 


颗粒 在 Ludox 中 的 译 力 密度 较 低 ,大 部 分 细胞 器 小 于 1.10 克 / 厘 米 ?《〈 在 蔗糖 中 则 达 , 
1.15 一 1.2 克 / 厘米 ), 细 胞 器 分 离 常 用 介质 是 溶 于 0.25 M 蔗糖 的 Ludoxe 

选择 梯度 介质 还 要 考虑 介质 的 稳定 性 。Ludox 在 高 速 下 (> 100;,000g) 会 出 现 SiO, 
颗粒 沉淀 ,只 能 分 离 沉降 速度 比 SiO, 颗粒 快 的 较 大 颗粒 ,不宜 分 离 大 分 子 或 大 分 子 复 合 
MRE). 大 量 制 备 还 要 考虑 材料 的 成 本 ,来 源 及 回收 等 。 

如 一 时 找 不 到 合适 的 材料 作 梯 度 介 质 ,或 颗粒 不 稳定 ,不 能 用 高 粘度 介质 时 , 也 可 用 
混合 材料 作 介 质 。 混 合 材料 的 梯度 在 等 密度 离心 中 已 得 到 广泛 应 用 , 如 40% Ludox 和 多 
糖 的 梯度 第 用 于 完整 细胞 的 分 离 。 


“175 \9 


《三 ) 梯度 的 选择 

梯度 的 作用 是 使 颗粒 沉降 稳定 或 稳定 颗粒 区 带 界面 , 防 止 因 局 部 温度 变化 或 机 械 震 
动产 生 的 对 流 扰 乱 而 影响 分 离 效果 。 在 区 带 离心 中 , 梯度 的 有 效 密度 范围 、 锦 度 的 侍 率 、 
形状 和 容量 的 选择 是 颗粒 分 离 的 关键 。 

1. 梯度 的 形状 ”梯度 可 按 其 形状 分 为 五 种 类 型 : BAB RA, ne 《或 指数 
型 人 四 形 (或 对 数 型 ) 阶 梯形 和 复杂 梯度 。 

超 离心 制备 常用 线性 梯度 。 差 速 -区 带 离心 一 般 用 预 形成 线性 梯度 ; 等 密度 离心 则 


可 用 预 形 成 或 离心 形成 的 线性 梯度 。 预 形成 梯度 一 般 用 于 : 〈1) 不 稳定 的 颗粒 53(《27) 直 散 、 


慢 , 不 易 离心 形成 梯度 的 介质 ;《〈3) 沉降 快 的 大 颗粒 《细胞 、 细 胞 器 等 )。 当 颗粒 在 高 速 下 
离心 18 小 时 (或 18 小 时 以 下 ) 后 ,能 清楚 分 成 区 带 时 ,可 用 预 形 成 线性 梯度 , 因 离心 形成 
”的 梯度 ,梯度 介质 经 长 时 离心 后 重新 分 配 ,梯度 形状 会 发 生 改 变 。 


” 有 时 为 了 某 种 分 离 需要 , 也 采用 某 些 特殊 形状 的 梯度 。 阶 习 梯 度 用 于 颗粒 区 带 很 靠 , 


近 、 连 续 梯 度 难 分 开 的 场合 , 最 适 于 亚 细 胞 器 、 整 细胞 、 某 些 病 毒 分 离 , 具 有 梯度 容量 
大 ,分离 迅速 、 效 果 好 的 优点 。 主 要 用 于 等 密度 分 离 , 有 时 也 用 于 差 速 - 区 带 离心 。 使 用 
阶梯 梯度 须 有 线性 梯度 的 分 离 数 据 作 依据 。 四 形 梯 度 常 用 于 低 密度 颗粒 (如 脂 蛋白 ) 的 土 
浮 等 密度 分 离 ; 凸 形 梯度 则 用 于 较 高 密度 颗粒 的 沉降 等 密度 分 离 。 通 常 都 采用 长 离心 管 , 
以 提高 较 低 密 度 区 (四 形 ) 或 较 高 密度 区 ( 吓 形 ) 的 分 辩 率 。 复 杂 梯 度 可 同时 用 混合 物 中 颗 
粒 的 沉降 系数 差 和 密度 差 。 这 种 混合 物 一 般 需 依次 经 颗粒 密度 差 及 沉降 系数 差 二 步 离心 
分 离 (或 反之 ), 采 用 复杂 梯度 ,一 次 即 可 得 较 彻 底 的 分 离 , 简 化 了 分 离 步骤 。 沉 降 系数 或 密 
度 范 围 很 宽 ( 即 同 种 颗粒 大 小 不 均一 ) 的 颗粒 ,用 复杂 梯度 往往 也 能 与 其 它 颗粒 很 好 分 开 。 

线性 梯度 的 缺点 是 离心 力 随 管 长 《或 半径 ) 增 加 , 无 法 抵消 粘度 增加 对 这 降 速度 的 影 
响 , 使 颗粒 的 沉降 变 慢 , 影 响 了 梯度 下 部 分 的 分 辩 率 。 为 了 使 粘度 与 离心 力 的 增加 相 平 


衡 , 让 颗粒 作 恒 速 运动 , 有 人 在 外 摆 式 和 区 带 转 子 的 差 速 -区 带 离心 中 使 用 了 等 动力 学 和 


j 


等 体积 梯度 ,但 制备 上 除 常 用 的 5 一 20% 蔗糖 梯度 外 ,其 余 实 用 价值 不 大 。 

2. 梯度 的 密度 范围 «| 线性 梯度 上 下 密度 比 为 114 最 好 。 差 速 -区 带 离心 所 用 梯度 的 
密度 范围 小 , 其 最 大 密度 ( 即 底部 密度 ) 小 于 样品 液 中 所 有 颗粒 的 密度 。 这 种 梯度 的 作用 
既 可 以 使 大 小 不 同 的 颗粒 在 离心 力 场 下 往 管 底 沉降 ,又 能 防止 对 流 , 维 持 沉 降 稳 定 , 使 颗 
粒 不 致 很 快 降 到 管 底 , 从 而 有 足够 时 间 形 成 区 带 。 还 能 避免 某 些 颗粒 形成 等 密度 区 带 ; 而 
与 其 它 颗 粒 的 沉降 区 带 相 混淆 。 等 密度 离心 所 用 梯度 的 密度 范围 较 大 , 包 括 样品 液 中 所 
有 颗粒 的 密度 在 内 。 梯 度 的 最 大 密度 要 大 于 样品 中 所 有 颗粒 的 密度 , 防 正 某 些 颗 粒 在 没 
有 等 密度 点 稳定 的 情况 下 ,继续 往 下 沉降 ,造成 与 其 它 等 密度 区 带 重 翁 ,影响 分 离 效 果 。 

选择 樟 度 的 最 小 密度 〈 即 梯度 顶部 的 密度 ) 的 依据 是 , 它 必须 能 支持 样品 液 , 并 在 未 
离心 前 尽 可 能 减少 颗粒 的 沉降 , 又 必须 具有 分 离 所 要 求 的 最 小 密度 和 粘度 , DAE BS 
速 。 因 此 , 樟 度 顶部 的 密度 必须 比 样品 液 的 大 。 在 分 离 具 膜 颗粒 〈 细 胞 或 细胞 器 ) 时 ,为 
了 避免 溶 涨 , 一 般 将 样品 悬浮 于 等 渗 介 质 中 。 如 用 0.25M 的 等 渗 蔗 糖 液 , 基 糖 梯度 的 最 
小 密度 为 0.3 M 或 0.35 一 0.40M。 分 离 大 分 子 或 核 蛋 白 体 亚 基 时 , 因 颗 粒 不 必 悬 浮 于 等 渗 
介质 中 ,梯度 的 最 小 密度 可 用 0.15 M。 此 时 ,由 于 粘度 下 降 ,分离 时 间 大 为 缩短 。 

如 果 用 盐 介质 进行 平衡 等 密度 离心 , 形 成 梯度 的 密度 范围 与 梯度 介质 的 性 质 、 离 心 


«176. 


: 
4 
E 
. 


力 、 梯 度 顶部 和 底部 与 转轴 的 距离 及 梯度 液 的 起 始 密度 有 关 。 可 用 公式 表示 如 下 : 
网 二 各 oe A A) (13) 

自 公 式 可 见 ,离心 力 大 ,梯度 的 密度 差 也 大 。 通 常 起 始 密度 均 应 稍 高 于 样品 中 颗粒 的 最 大 
浮力 密度 (大 于 0.01-0.02 克 / 厘 米 ), 以 避免 梯度 形成 之 前 出 现 颗粒 的 沉淀 ,并 让 所 有 颗 
粒 都 能 在 平衡 梯度 中 分 成 稳定 区 带 , 出 现在 梯度 的 较 上 部 分 。 

3. 梯度 (线性 ) 的 斜率 ”, 颗粒 的 沉降 系数 或 浮力 密度 差 较 大 , 可 选用 较 大 的 梯度 仙 
率 及 较 短 的 离心 管 , 但 这 会 导致 颗粒 区 带 变 穹 , 降 低 区 带 容量 ( 指 稳定 区 带 所 容纳 颗粒 的 
最 大 量 , 它 与 区 带宽 度 平 方 成 正比 , 与 斜率 成 反比 )。 梯度 的 斜率 越 大 , KM, 靠 得 越 
近 , 回 收 区 带 时 就 易 产生 交叉 污染 ;梯度 的 斜率 小 ,虽然 区 带 容量 大 , 但 由 于 粘度 小 , 扩散 
严重 ,使 区 带宽 度 增加 ,并 可 能 导致 区 带 重 登 而 降低 分 辩 率 。 超 离心 分 离 一 般 采 用 斜率 较 
小 的 线性 梯度 ,但 需 达到 一 定 的 梯度 斜率 ,以 阻止 对 流 的 影响 ,维持 颗粒 区 带 的 稳定 性 。 差 
速 -区 带 离心 所 用 梯度 斜率 一 般 比 等 密度 离心 小 ,但 在 高 速 离心 并 使 用 低 样品 浓度 和 相对 
宽 的 样品 区 带 时 ,用 斜率 较 大 的 线性 梯度 也 能 得 到 很 好 的 分 辩 率 。 

平衡 等 密度 离心 的 梯度 斜率 与 转速 \ 梯 度 底部 与 转轴 的 距离 ,介质 性 质 或 p" 值 、 浓 度 
《成 正比 )、 温 度 (成 反比 )\ 转 子 类 型 ( 角 式 大 于 外 摆 式 ) 有 关 , 可 用 公式 表示 如 下 : 


= 
有 (14) 


由 公式 可 知 AGRE S/S R A AB, RR. BER ERS PRIOR 
闻 , 已 知 CsSO, > CsCl > Nal, 与 盐 的 6" 值 相 反 。 一 般 的 分 离 最 好 用 斜率 稍 大 的 盐 梯度 
(AA tH PER) ,斜率 太 小 的 梯度 仅 作 纯化 使 用 。 

平衡 等 密度 离心 所 产生 的 梯度 斜率 一 般 较 小 ,如 事先 使 用 阶梯 梯度 或 线性 樟 度 ,可 使 
梯度 斜率 增加 ,但 此 梯度 不 稳定 ,离心 时 将 重新 分 配 为 斜率 小 的 梯度 。 

4. 梯度 的 容量 , 梯度 容量 取决 于 样品 体积 和 浓度 、 梯 度 体积 和 斜率 .所 要 求 的 分 状 
率 、 所 用 的 回收 方法 和 转子 的 效率 等 。 已 发 现 梯 度 的 实际 容量 低 于 理论 值 , 为 后 者 的 
90 多 。 梯 度 的 容量 带 有 很 大 的 经 验 性 ,如 差 速 -区 带 离心 为 每 毫升 梯度 体积 1 一 1000 微克 , 
一 般 在 100 微克 以 下 ;外 摆 式 转子 的 离心 管 ( 直 径 2.5cm ), 每 厘米 直径 所 容许 的 样品 量 约 
为 0.15 一 0.8 毫升 〈 随 直径 而 变化 )。 梯 度 斜 率 相 同时 , 角 式 转子 的 梯度 容量 比 外 摆 式 转 
子 大 , DNA 容量 为 后 者 的 10 倍 左右 。 角 式 转子 如 用 于 分 离 二 种 DNA (密度 差 0.005 克 / 
惠 米 5 时 ,梯度 容量 为 50 一 150 微克 DNA, 如 用 于 制备 总 DNA, 容 量 可 大 至 5 毫克 。 


五 、 制 备 超 离心 的 操作 543、 14] 
《一 ) 梯度 的 制备 : 


梯度 可 用 机 械 法 或 手工 操作 法 制备 , 也 可 用 离心 法 形成 。 常 见 梯度 的 制备 方法 介绍 
如 下 : 
1. 不 连续 密度 梯度 〈 或 阶梯 梯度 ) 的 制备 密度 随 管 长 或 半径 阶梯 式 增 加 梯度 ,为 


不 连续 梯度 。 其 制备 方法 最 为 简单 ,通常 先 配 好 一 系列 不 同 密度 的 溶液 ,然后 用 移 液 管 将 


梯度 介质 从 浓 到 稀 沿 管 壁 小 心 加 入 ,或 用 一 加 细 管 的 注射 器 针头 插 到 管 底 , 从 稀 到 浓 一 层 


., 层 地 铺 到 离心 管 中 , 即 可 产生 一 个 不 连续 的 密度 梯度 。 这 梯度 不 稳定 , 放 置 一 段 时 间或 


*。, 177° 


用 金属 丝 轻 轻 搅 拌 , 或 轻 裔 离心 管 后 , 由 于 分 子 的 扩散 作用 , 就 会 慢 慢 变 为 连续 的 线性 . 
梯度 。 

2. 连续 密度 梯度 的 制备 密度 随 管 长 或 半径 逐渐 增加 的 梯度 为 连续 梯度 。 连 续 梯 
度 又 可 分 为 : 〈1) 线性 梯度 ; 2) 凹 形 或 凸 形 梯度 ; (3) 复杂 梯度 。 制备 超 离心 常用 线性 
梯度 ,其 制备 方法 有 三 种 : 

C1) 阶梯 梯度 自动 扩散 法 : 由 上 述 方法 以 相同 体积 和 等 差 浓度 制 得 阶梯 梯度 后 , 将 
梯度 自然 放置 一 段 时 间 , 即 能 形成 所 需 的 线性 梯度 。 此 法 仅 适 用 于 低 分 子 梯度 介质 (分 子 
量 入 1000) ,每 层 梯度 液 以 1 一 2 厘米 为 宜 。 阶 梯 梯度 应 在 无 振动 下 自动 扩散 形成 , 形成 时 
的 温度 最 好 与 离心 时 的 相同 .扩散 形成 线性 梯度 所 需 的 时 间 与 梯度 材料 的 分 子 量 和 扩散 
系数 , 梯 度 的 温度 、 浓 度 和 粘度 ,以 及 每 层 液 的 厚度 、 密 度 差 等 有 关 , 通 常 需 8 一 24 小 时 以 
上 上 。 温 度 高 ,时 间 可 略 短 。 例 如 蔗糖 梯度 不 易 离 心 形成 ,制备 5 一 50 % 蔗糖 线性 梯度 时 ,是 
让 50 匈 、45%.……5 狗 浓度 的 蔗糖 液 及 水 各 0.9 毫升 的 阶梯 梯度 , 在 4 下 放置 过 夜 (或 
室温 下 2 一 3 小 时 ) 自 动 扩散 而 成 。 如 用 1 毫米 直径 的 细 铁 丝 轻 轻 散 击 ,可 大 大 缩短 时 间 。 
多 糖 需 数 天 才能 扩散 成 线性 梯度 。 Ra ve 

(2) 梯度 产生 器 法 : 此 法 最 通用 .其 装置 又 可 分 为 手动 式 和 自动 式 , 实 验 室 自制 的 
简易 梯度 产生 器 即 属 前 者 。 梯 度 产生 器 系 由 玻璃 或 有 机 玻璃 等 材料 制 成 的 天 小 相同 的 内 
外 两 室 所 组 成 ,通常 把 外 室 称 为 储存 室 , 内 室 称 为 混合 室 。 小 室 高 度 与 直径 之 比 为 2.5 一 
。 3:1。 二 个 圆柱 形 小 室 间 有 一 连接 管 , 管 中 间 配 备 有 作 开 关 用 的 活塞 或 螺旋 夹 。 混 合 室 底 
部 沿 连接 管 的 水 平方 向 上 还 装 有 一 塑料 导 液 管 ,以 螺旋 夹 控 制 梯度 液 流 和 人 离心 管 的 速度 。 
混合 室 中 附 有 搅拌 器 ,使 用 时 一 般 控制 转速 为 60 rpm 左右 。 

现 以 芒 糖 作 梯度 材料 为 例 , 制 备 5 一 30% 的 线性 蔗糖 梯度 。 先 关闭 两 室 的 活塞 ,然后 
向 外 室 和 内 室 分 别 加 入 10 毫升 5% 和 30 多 的 芒 糖 液 。 装 液 时 必须 先 装 外 室 , 在 芒 糖 液 快 
满 过 连接 管 时 轻 轻 打开 中 间 活 塞 , 使 蔗糖 液 充 满 连 接管 到 活塞 间 的 通道 后 立即 关闭 活塞 。 
手工 操作 中 这 是 一 个 重要 的 步 又 ;不 排除 管内 的 空气 ,将 会 影响 梯度 的 形状 <。 内 室 充 液 时 , 
可 将 导 液 管 流出 端 提起 ,使 之 高 出 液体 的 水 平面 ,以 阻止 液体 流出 。 两 室 中 的 溶液 应 调节 
在 同一 水 平面 上 ,使 两 室 连通 时 线性 梯度 不 致 为 相互 产生 的 对 流 所 扰乱 。 两 室 都 加 完 疼 糖 
液 后 ,用 固定 支架 将 导 液 管 紧 贴 离心 管 壁 , 使 梯度 液 沿 管 壁 流下 , 以 避免 扰乱 梯度 。 开 动 
电磁 搅拌 器 ,并 打开 两 室 连接 管 活塞 。 当 梯度 液 自 内 室 流 出 时 ,不 允许 再 移动 固定 于 支架 
.上 的 离心 管 。 混 合 时 流速 要 慢 ,控制 在 1 毫升 /分 左右 。 制 备 好 梯度 后 ,将 离心 管 小 忌 移 到 
冷 室 中 放置 备用 ,梯度 在 几 小 时 内 是 稳定 的 。 也 可 把 稀 液 加 入 内 室 , 浓 液 加 入 外 室 , 但 此 
时 梯度 液 导 液 管 必 须 直播 到 离心 管 底 ,让 浓 溶 液 将 稀 溶液 顶 浮 起 来 ,最 后 仔细 地 将 导 液 管 
取出 。 此 法 适用 于 蕊 水 的 \ 在 管 壁 不 形成 水 流 的 塑料 离心 管 (如 聚 碳酸 酯 管 和 polyallomer 
管 ) ,流速 可 相对 大 些 , 一 般 可 达 2 毫升 /分 . 

手动 式 梯度 产生 器 虽 简 单 , 容 易 操 作 , 但 不 能 同时 制备 几 个 梯度 。 近 年 来 ; 各 种 自动 
梯度 产生 器 已 相继 出 现 , 这 些 装置 尽管 在 产生 梯度 的 体积 ( 几 毫升 ,多 至 100 毫升 以 上 ) 或 
形状 上 各 不 相同 ,但 都 由 一 蠕动 泵 所 操纵 。 例 如 日 立 公司 55 P-2 型 超 离心 机 的 DGF-U 型 
密度 梯度 产生 器 可 同时 制备 6 支 梯度 管 , 又 能 在 离心 后 自动 分 层 取 出 梯度 中 各 区 带 。: 

改变 内 室 或 外 室 的 横 截面 积 也 可 得 到 某 些 特殊 的 非 线 性 梯度 .如 图 6-8 a, 
A 和 了 时 为 凸 形 梯度 , A> B 时 为 四 形 梯度 。 


。178。 


]} 三 


(a) B 4” C 


‘(b) B A 


i?) 
bd 


(c) 


AN 
meee eee ee 


V 


图 6-8 ABUL. ote Ure Arey 


BASS (hi FH)» IRM AAS ORSS)» ASH. Cay Cay Vay Va 分 别 为 回收 梯度 的 
KEMAR, Vr 为 残留 体积 


梯度 产生 器 制备 梯度 虽 有 许多 优点 ,但 也 有 其 不 足 之 处 。 如 : 小 室 中 有 残留 液体 ,使 
梯度 达 不 到 最 大 密度 ;机 械 搅拌 增加 内 室 压力 ,使 梯度 变形 ; 小 室 间 连 接管 太 小 不 易 迅 速 
建立 平衡 ;高 粘液 难以 用 泵 控制 恒定 流速 等 。 

(3) 平衡 梯度 法 : 盐 介 质 的 线性 梯度 须 用 平衡 法 , 通 过 长 时 间 高 速 离心 均匀 盐 溶液 
和 样品 被 (有 时 还 含 Tris-HCI, 磷 酸 盐 等 缓冲 荒 ) 达 平衡 而 产生 。 盐 介质 离心 足够 长 的 时 
闻 ; 当 盐分 子 的 沉降 速度 等 于 其 反方 向 的 扩散 速度 时 , 即 形成 盐 的 平衡 梯度 。 样 品 中 的 颗 
粒 也 由 于 受 离心 力 影响 而 沉降 或 上 浮 到 梯度 内 相应 的 等 密度 点 上 , 建 立 另 一 种 平衡 。 将 
所 需 梯 度 的 最 大 和 最 小 密度 液 分 成 二 层 , 让 盐分 子 静 置 扩散 12 小 时 ,然后 进行 离心 ,可 缩 
短 平 衡 梯度 形成 的 时 间 。 外 摆 式 转子 离心 形成 的 梯度 线性 比 角 式 转子 的 好 。 

此 法 的 关键 是 选择 介质 的 起 始 密度 , 并 通过 折射 计 进行 准确 校对 。 起 始 密度 所 需 盐 
的 重量 (以 CsCl 为 例 ), 可 从 表 6-9 求 得 。 

也 可 用 下 面 公式 求 出 : 


y 138.11 
W/W) = : = 137.48 一 一 一 一 15 
x(%, / ) bay 025 ¢ ) 


式 中 ,7 为 1 毫升 DNA 样 液 中 加 人 入 的 CsCl 克 数 ,p25 为 需要 制备 的 CsCl 密度 (25°C) 

此 外 , 有 人 介绍 一 种 制备 大 体积 芒 糖 梯度 的 简单 方法 ,此 法 是 将 20 匈 蔗糖 液 通过 反 
复 在 —20°C—— 40°C 冰冻 , 然 后 在 4°C 或 室温 融 解 (2 一 3 次 ), 可 获得 近似 线性 的 10 一 
30% je RE REO), 


¢ 179 


% 6-9 CsCl 的 起 始 密度 与 重重 及 最 后 体积 间 的 关系 


起 始 密度 ( 克 / 厘 米 | 1.66 | 1.67 | 1.68 | 1.69 | 1.70 | 1.71 


重量 ( 克 ) 117 Md. 1927220) 1.24.26 4 129 


最 后 体积 (毫升 ) 1 .230430331 ieSonrdz32 


(二 ) 样 品 的 装 信 和 离心: 

样品 在 超 离心 之 前 ,应 作 适 当 的 预 处 理 。 许 多 大 分 子 ( 或 颗粒 ) 在 溶液 中 都 带 有 电荷 , 
离心 沉降 时 ,沉降 快 的 分 子 可 被 沉降 慢 的 带 相反 电荷 的 分 子 所 吸引 , 减 慢 沉降 的 速度 。 分 
离 这 类 样品 前 , 应 加 入 适量 的 低 分 子 电 介质 , 以 排除 沉降 时 电荷 的 相反 影响 。 如 在 10% 
蛋白 质 溶液 中 , 加 入 0.2 M NaCl 或 KCl 可 使 静电 吸力 对 沉降 速度 的 影响 减少 到 1 多 以 
Fo 样品 中 如 有 容易 沉淀 的 凝聚 物 或 其 它 不 溶 物 时 , 也 应 预先 泪 除 。 还 要 注意 样品 的 
让 定性 , 有 时 须 加 入 缓冲 剂 、 稳 定 剂 CHB. EDTA, ARM, Met) 等 。 样品 液 的 , 
密度 应 小 于 梯度 的 最 小 密度 。 必要 时 也 可 将 样品 用 介质 做 成 倒 梯 度 , 使 高 分 子 样品 的 
颗粒 向 梯度 方向 的 扩散 与 高 浓度 小 分 子 梯度 介质 向 低 浓度 样品 带 的 扩散 速度 相等 , 以 减 
少 因 离心 前 颗粒 局 部 沉降 所 造成 的 分 辩 率 下 降 。 

样品 在 梯度 中 所 处 位 置 有 四 种 , 即 顶部 、 底 部 \ 中 间 及 混合 。 一 般 样 品 是 以 薄 层 铺 放 
在 梯度 顶 上 。 样 品 的 用 量 对 分 辩 率 有 很 大 影响 。 当 颗 粒 沉降 系数 或 浮力 密度 差 较 小 时 , 
。 常 采用 罕 样 品 带 《〈 梯 度 总 体积 的 5 多 以 下 )。 样 品 浓度 不 要 太 高 (为 梯度 介质 最 低 浓度 的 
10 匈 )。 操 作 时 用 吸管 吸取 ,然后 沿 管 壁 小 心 放 人 。 吸 管 的 尖端 绝 不 允许 接触 梯度 的 液 面 , 
一 般 要 离开 0.5 毫米 ,, 紧 贴 管 壁 , 避免 自由 滴 落 。 离 心 管 最 好 事先 放 人 转子 内 , 以 免 管子 
装 和 人 时 扰乱 梯度 和 样品 层 。 外 摆 式 转子 加 样 后 的 液 面 与 管 口 相距 2 一 3 毫米 s 如 果 用 角 式 
转子 离心 ,最 好 将 管子 部 分 充满 ,以 防止 梯度 重新 定向 时 , 管 帽 分 裂 梯度 ,还 可 避免 梯度 介 
质 对 金属 管 帽 的 腐蚀 。 盛 放 深 液 的 多 少 与 管子 角度 、 材 料 强度 、 厚 薄 有 关 * 一 般 装 量 约 为 
1/13 一 1/2。 塑 料 离心 管 要 加 满 ,一 般 梯 度 介 质 及 样品 加 完 后 须 用 密度 小 于 水 的 \ 与 水 不 相 
溶 的 惰性 液体 一 一 矿 物 油 (如 轻 石蜡 油 ) 填 满 ( 差 速 离心 可 全 用 样品 液 充满 )s 有 时 样品 也 
可 通过 一 根 长 金属 导管 导 人 管 底 。 此 法 对 分 离 密度 较 小 的 颗粒 特别 有 用 , 已 用 于 分 离 细 
胞 、 核 蛋白 等 。 徒 用 时 须 注意 不 能 让 气泡 进入 梯度 ,样品 密度 需 用 固体 介质 调 到 大 于 梯度 
底部 的 密度 。 

样品 装 好 后 ,将 离心 管 盖 拧 紧 , 小 心 放 和 松紧 恰好 的 离心 管 腔 内 , 按 照 事先 设计 的 离 
心 条 件 及 转子 \ 离 心机 的 使 用 说 明 书 进行 超 离心 操作 。 因 为 生物 颗粒 均 不 稳定 , 离 它 一 般 
均 在 低温 下 进行 ,管子 、 梯 度 液 、 转子 也 最 好 预 冷 至 一 定 温度 后 再 装 人 样品 。 但 低温 会 增 
加 梯度 的 粘度 ,使 离心 时 间 延 长 , 不 利 颗粒 的 分 离 。 开 始 离心 时 应 缓 组 加速, 离心 达 所 需 
时 间 后 , 须 让 转子 自由 地 慢 慢 停 下 (不 许 制 动 ! )。 尤其 在 5-000 rpm 的 低速 下 , 速 度 的 剧 
变 很 容易 扰乱 梯度 液 和 样品 层 或 梯度 中 颗粒 区 带 , 当 用 粘度 小 的 梯度 如 《〈CsCD 及 直径 大 
的 管子 时 ,这 种 扰乱 更 为 严重 。 进 行 平 衡 等 密度 离心 时 , 转 速 不 能 过 高 ,以免 盐 梯度 的 平 
均 密度 超过 1.2 , 管 底 盐 浓度 过 高 而 出 现 结晶 。 高 密度 的 盐 结 晶 ( 如 CsCl 结晶 可 达 4 克 1/ 
匣 米 纹 受 很 大 的 离心 应 力作 用 ,此 应 力 超出 了 转子 的 设计 限度 ,会 造成 事故 。 


180。 


区 带 转子 的 离心 操作 不 同 。 以 动态 装 放 料 区 带 转子 为 例 。 梯度 液 是 在 转速 约 3.000 
rpm 的 低速 下 泵 人 。 首 先 泵 人 的 是 低 密 度 液 , 通 过 导管 分 布 于 转子 的 四 周 。 由 于 离心 力 
的 作用 , 在 转子 内 壁 成 均匀 的 一 层 。 随 着 梯度 液 的 不 断 加 入 , 较 浓 梯 度 液 将 把 较 稀 液 不 
断 推 向 转子 的 中 心 。 梯 度 液 加 完 后 ,再 用 一 种 最 浓 的 液体 作 “ 垫 层 ” ,将 转子 整个 密闭 空间 
充满 ,以 防止 颗粒 在 转子 壁 积累 。 然 后 通过 转子 的 中 心 导管 缓慢 地 (5 毫升 /分 ) 加 入 样品 
《样品 层 一 般 为 10 一 200 毫升 ), 最 后 再 加 入 一 种 更 低 密 度 的 液体 作 “ 覆 盖 层 ,同时 有 等 体 
AW “WE” 从 转子 四 周 被 取代 出 来 。 上 述 梯度 液 及 样品 加 完 后 移 去 转子 上 的 加 液 装置 , 
_ 将 转子 加 速 到 预定 速度 , 经 过 一 定时 间 后 , 就 能 得 一 系列 分 级 分 离 区 带 。 然 后 转子 减速 
到 3,000 rpm, 以 回收 颗粒 区 带 。 此 时 ,通过 进一步 把 “ 垫 层 ” 液 加 到 转子 周围 , 可 逐渐 置 
换 出 密度 较 小 一 端的 梯度 液 ,并 进行 分 部 收集 、 测 定 。 用 区 带 转子 可 大 量 制 备 样品 , 一 次 
可 高 达 100 毫克 以 上 。 


(=) 取出 梯度 : 


从 离心 机 提出 转子 和 从 转子 取出 离心 管 并 进行 回收 梯度 区 带 的 操作 时 ,应 十 分 小 心 , 
避免 管子 震动 。 操 作 的 温度 最 好 与 离心 时 的 二 致 ,以 防 温度 变化 引起 的 热 对 流 扰 乱 区 带 。 
否则 的 话 , 最 好 的 分 离 也 往往 由 于 回收 方法 的 不 当 或 回收 操作 的 错误 而 招致 失败 。 在 处 
理 粘度 小 或 斜率 小 的 梯度 时 ,更 应 特别 小 心 ;以 免 使 分 辩 率 降低 。 

梯度 区 带 的 分 部 回收 有 如 下 三 种 方法 : 

1. 底部 收集 法 〈 穿 刺 法 ) 。 这 是 一 种 简易 的 手工 操作 法 。 采 用 针 穿刺 离心 管 底部 : 
使 梯 度 靠 重力 自由 滴 出 , 然 后 依次 作 分 部 收集 〈 如 图 6-9A)。 此 法 适用 于 薄 壁 塑料 管 , 
操作 时 先 将 管 固定 在 支架 上 ,然后 用 二 根 针 将 管 底 刺 穿 ,使 梯度 液 从 小 孔 滴 出 。 也 可 事先 
在 管 底 贴 一 块 胶布 ,防止 穿刺 后 液体 的 渗 户 ,后 用 22 SENS (AE) 小 心地 经 胶 
布 刺 人 管 底 ,让 液体 缓慢 沿 针头 滴 下 。 流 出 液 分 部 收集 于 小 试管 中 ,经 分 析 后 决定 取舍 或 
合并 。 液 滴 的 大 小 (或 流速 ) 可 通过 将 梯度 管 塞 上 橡皮 塞 , 塞 子 上 插 人 一 根 连 着 橡皮 管 和 
螺旋 夹 的 玻 管 ,或 通过 与 一 测 压 计 连 接 ,维持 恒定 的 压力 来 控制 。 也 可 将 离心 管 与 一 储 液 
容器 连接 ,以 油 或 稀 溶 液 补偿 滴 下 的 液体 ,保持 流速 不 变 。 流 速 一 般 控制 在 0.5 一 1 毫升 / 
分 ,特别 是 粘度 较 大 的 梯度 ,缓慢 的 流速 可 减少 区 带 沿 管 壁 的 拖 尾 现象 。 

此 法 对 梯度 扰动 小 ,但 离心 管 不 能 再 用 ,而 且 不 适合 回收 管 底 有 沉淀 或 粘度 大 的 梯度 
( 易 导 和 人 空气), 也 不 适 于 不 锈 钢 管 或 厚 壁 塑料 管 。 

2. 顶部 收集 法 “顶部 收集 法 又 可 分 为 取代 法 和 虹吸 法 a 

CG) 取代 法 : 是 回收 梯度 中 最 常 使 用 的 一 种 方法 , 分 为 向 上 及 向 下 取代 二 种 。 向 上 
取代 可 用 人 工 操作 ,方法 是 通过 用 针头 穿刺 管 底 或 由 插入 管 底 的 细 管 注 和 人 浓 梯 度 液 ,将 樟 
度 液 从 稀 到 浓 经 顶 盖 另 一 出 口 管 排 出 。 如 用 一 贮 液 器 代替 注射 器 进行 穿刺 取代 ,控制 流速 
的 效果 会 更 好 s 使 用 梯度 回收 仪 时 ,从 管 顶 盖 将 一 根 细 导 管 小 心 播 至 管 底 ,然后 用 蠕动 泵 
由 导管 注入 高 浓 液 体 ( 其 密度 比 梯度 大 ), 迫 使 梯度 中 的 分 离 区 带 依次 从 盖 上 另 二 出 口 管 
流出 以 小 试管 分 部 收集 (图 6-9B)。 操作 时 应 先 排除 导管 内 的 空气 。 用 作 取 代 液 的 溶 
质 应 是 惰性 的 ,深度 要 足够 大 , 能 形成 高 浓 溶 液 。 常 用 的 取代 液 有 蔗糖 、 盐 以 及 某 些 与 水 
不 相 混 合 的 浓 溶 液 ,如 四 省 甲烷 (密度 可 达 2.96 克 / 厘 米 9) 等 。 取 代 液 如 是 水 溶液 , 则 最 
好 与 梯度 介质 组 分 相同 ,以 免 产 生 扩 散 混合 现象 


*。,181。 


re 


(A) 


取代 液 


6-9 回收 梯度 的 方法 
CA) 底部 穿刺 收集 法 〈B) 向 上 取代 法 《〈C)7 向 下 取代 法 


向 梯度 顶部 充 人 空气 或 轻 液 体 (水 ), 也 可 从 插 和 人 底部 的 导管 由 浓 到 稀 地 从 顶 盖 取代 
出 梯度 液 。 这 种 取代 法 称 为 向 下 取代 法 (图 6-9C) 但 效果 较 差 , 较 少 使 用 。 

除 穿 刺 取代 法 以 外 ,其 它 取代 方法 多 用 于 不 锈 钢管 和 厚 壁 管 , 使 用 取代 法 时 流速 应 组 
慢 ,以 免 管 壁 滞留 液体 而 造成 梯度 混合 。 这 种 混合 现象 可 通过 使 用 卧 水 的 窜 ` 短 梯度 管 而 
减少 。 取 代 前 梯度 顶部 如 有 悬浮 不 溶 物 , 须 事先 除去 。 流 出 管 应 尽 可 能 短 , 以 减少 管内 混 
合 , 而 导致 分 辩 率 下 降 。 此 法 优点 是 不 破坏 离心 管 , 管 子 能 反复 使 用 ,能 用 于 较 粘 梯度 ,是 


¢ 182 。 


回收 梯度 最 好 的 一 种 方法 。 缺点 是 开始 取代 操作 时 易 引 起 扰乱 ,操作 需要 特别 小 心 , 而 且 


不 适合 炸 度 更 大 的 梯度 。 取 代 法 可 借 光 学 (或 放射 性 ) 系 统 进 行 流 出 流 跟 踪 , 简 化 分 析 化 验 . 


工作 。 

(2) 虹吸 法 : 此 法 是 用 一 根 聚 乙烯 小 管 插 到 管 底部 , 用 虹吸 法 吸出 梯度 。 它 也 不 损 
伤 离心 管 , 尤 其 适用 于 不 锈 钢管 中 物质 的 分 级 分 离 。 但 虹吸 时 易 引 起 分 离 区 带 扰 乱 , 最 好 
使 用 专门 的 装置 。 例 如 DGF-U 型 密度 梯度 自动 产生 器 , 就 是 一 部 用 蠕动 泵 逆向 运转 而 
以 虹吸 收集 梯度 区 带 的 分 部 收集 器 。 

_ 除 以 上 取代 法 和 虹吸 法 外 , 有 时 从 管 上 部 直接 仔细 地 用 注射 器 或 吸管 定量 移出 梯度 
液 ,也 可 收 到 较 好 的 效果 。 如 果 已 知 某 颗粒 区 带 的 位 置 , 也 可 用 注射 针头 刺 人 管 壁 抽取 , 
但 效果 差 。 

《3) 切 割 法 : 极 粘 的 梯度 宜 用 切割 法 。 所 谓 切 割 法 就 是 用 离心 管 切割 器 将 冻结 的 塑 
料 管子 切 成 莫 片 的 一 种 方法 。 此 法 仅 适 用 于 赛 璐 玫 管 或 硝酸 纤维 素 管 。 操 作 时 把 离心 管 
插 在 操纵 台 的 孔 中 ,后 用 一 锐利 的 切 刀 切 割 管 子 。 切 下 的 部 分 留 在 刀刃 上 ,然后 用 注射 器 
或 吸管 吸取 这 部 分 梯度 沪 , 如 此 即 能 逐一 将 梯度 分 部 收集 。 操 作 中 应 注意 夹 紧 各 可 动 部 
分 ,减少 切口 周围 的 渗 漏 现象 

切割 器 的 型 号 很 多 ,如 日 立 公 司 55 P-2 型 超 离 心机 的 TSU-2 型 离心 管 切割 器 。 较 新 
的 切割 法 是 在 梯度 中 加 入 丙烯 酰胺 、 核 黄 素 和 交 联 剂 , 离心 后 将 梯度 曝光 聚合 , 然后 再 进 
行 切片 操作 8 。 


《四 ) 梯度 的 分 析 


在 制备 梯度 和 样品 液 或 需 了 解 离心 后 颗粒 区 带 在 梯度 中 的 位 置 时 ,应 进行 密度 测定 。 
测定 密度 的 最 简单 方法 是 用 折射 计 , 此 法 迅速 ,用 量 少 , 如 阿 贝 折 射 计 仅 需 样品 25 微 升 左 
Ao 由 于 折射 率 与 密度 有 正比 的 关系 , 通 过 折射 率 即 能 换算 出 被 测 梯度 液 的 密度 〈 如 表 


, 6-10)o 但 折射 率 与 温度 等 因素 有 关 , 须 考虑 这 些 因素 的 影响 。 轧 订 的 秆 区 记 可 采 册 斑驳 


直接 测定 ,但 样品 用 量 较 大 ,通常 需 0.1 一 0.3 毫升 。 

梯度 通过 适当 方法 分 部 收集 后 ,应 进行 分 析 化 验 , 以 便 分 类 合并 或 作 后 处 理 。 分 析 梯 
度 中 的 回收 物质 常用 紫外 吸收 法 \ 酶 活力 测定 法 、 放 射 标 记 法 等 。 蛋 白质 , 核酸 或 某 些 含 
蛋 和 白质、 核酸 占 优势 的 细胞 器 ,病毒 等 可 用 紫外 吸收 法 测定 。 细 胞 器 一 般 可 测定 标志 酶 活 
性 ;通常 每 一 组 分 至 少 选 二 种 标志 酶 。 如 一 时 找 不 到 更 好 的 测定 目的 物 , 也 可 测 光 吸收 来 
推断 分 部 的 组 分 。 对 于 同位 素 标记 物 , 最 好 是 测定 其 放射 活性 。 此 外 , 某 些 情况 下 也 可 用 
免疫 法 、 电 泳 法 或 在 500 一 600 om 下 用 光 散 射 法 测定 物质 在 梯度 中 的 分 布 。 亚 细胞 成 分 
<0 ig i aii ahha ania 最 后 根据 分 析 结 
果 绘 图 。 

梯度 介质 对 梯度 分 析 的 影响 很 大 。 如 糖 介质 《尤其 芒 糖 )、metrizamide 能 抑制 酶 活 , 
测定 时 每 次 介质 浓度 应 一 致 。 有 时 适当 的 稀释 也 能 有 效 地 解除 这 种 影响 。 又 如 碘 化 物 、 
SWAT D, Ludox 等 有 强烈 紫外 吸收 ,能 干扰 核酸 蛋白 质 紫外 测定 。 三 矿 葵 衍生 物 , 
蔗糖 等 也 干扰 放射 活性 测定 。 

凡 对 分 析 有 干扰 的 梯度 介质 , 均 应 设法 避免 。 如 单 双 糖 、 多 糖 或 metrizamide 都 干扰 
核酸 `\ 蛋 白质 和 糖 原 的 分 析 。 单 双 糖 、metrizamide 可 透析 或 超 滤 除去 ,或 用 酸 、 乙 醇 使 核 


es] 83 。 


R610 各 种 梯度 介质 的 折射 率 7 SER p 的 换算 公式 


St 质 公 | OR 
TER Poe = 2.732900 — 2.6425 
Ficoll. 738 38 20° = 2.3817 20° — 2.175 
牛 血 清白 蛋白 0 一 1.412972ie — 0.8814 
Metrizamide P22 一 3.35072oe — 3.462505° = 3.453209 — 3.601 
Ludox pe = 8.204 — 9.936 


20° = 9.968890 一 12.292 (适用 于 密度 1.00—1.29, 折射 率 1.333 一 1.3607 

deg (2? = 10.9276y29° 一 13.593 GEA FRE 1.22 一 1.90, 折射 率 1.355 一 1.418) 
ose = 10.24027,,0 — 12.6483 (适用 于 密度 1.00—-1.38, 折射 率 1.333 一 1.3707 
Pas? = 10.8601725° — 13.4974 (适用 于 密度 1.25 一 1.90, 折射 率 1.357 二 1.418) 


Cs,SO, 025° = 12.12072,0 — 15.1662 (适用 于 密度 1.10 一 1.40, 折射 率 1.342 一 1.3667) 
P25° = 13.69867,50 一 17.3233 GE AFRE 1.40—1.80, 折射 率 1.366 一 1.3967) 


2: C1) 2k# 20°C 的 折射 率 为 1.3330。(2) 上 述 公式 仅 适 用 蒸馏 水 配制 的 介质 , 未 考虑 其 它 成 分 。 如 介质 中 还 
包含 缓冲 剂 \ 其 它 盐 、EDTA 等 成 分 > 应 作 折射 率 修正 。 


酸 ` 蛋 白质 沉淀 而 分 开 ; 多 糖 则 用 稀释 或 离心 解除 被 测 物质 的 浓度 也 影响 分 析 准 确 度 , 紫 


外 分 析 蛋 白质 浓度 应 为 0.2 一 3 多 ,核酸 浓度 最 低 限 度 为 0.004 多 。 
进行 梯度 分 部 的 分 析 时 ,对 颗粒 的 分 布 必须 心中 有 数 ,才能 有 目的 地 选择 测定 方法 s 


(A) 操作 注意 事项 


超速 离心 机 是 生化 制备 和 生化 研究 的 重要 精密 设备 , 又 因 其 转速 高 , 产生 的 离心 力 
大 ,使 用 不 当 或 缺乏 定期 的 检修 保养 ,都 可 能 发 生 事故 。 

离心 机 故障 大 多 由 转子 的 不 平衡 引起 。 离 心 管 的 称 量 误差 ; 长 期 使 用 造成 转子 表面 
的 腐蚀 、 损 伤 ; 离 心 管 放 错位 置 ;管子 重力 中 心 的 不 平衡 (重量 相同 的 梯度 管 和 非 宰 度 管 不 
能 一 起 离心 ); 塑 料 离心 管 的 变形 、 破 裂 等 是 引起 转子 失衡 的 主要 因素 。 失 衡 的 严重 后 果 
是 导致 驱动 杆 弯曲 ,甚至 使 转子 抛 离 转轴 。 在 离心 过 程 中 , ee it 
Se Fale es Pe hh» — FB Hee ah 2S HH BUT Ze, We BE Ha RE 88 Fo 

为 了 保障 使 用 安全 ,初学 者 除 严 格 按说 明 书 规定 的 程序 使 用 外 , ert a 
离心 机 和 转子 的 性 能 ,以 及 维修 保养 事项 。 遇 有 疑问 , 或 操作 中 发 生 故 障 时 , 应 请 专 大 处 
理 。 转 子 \ 离 心 管用 后 须 用 温水 或 中 性 去 污 剂 清洗 ,干燥 后 保存 。 塑 料 管 最 好 在 低温 避 光 
处 保存 。 区 带 转子 必须 拆 下 各 部 件 ,依次 用 自来水 \ 蒸 馏 水 (有 时 还 用 70% 乙醇) 洗涤 , 除 
去 痕 量 残存 的 梯度 液 , 以 防 结晶 堵塞 液 管 。 铝 转子 应 定期 上 蜡 , 防 止 水 分 进入 有 裂缝 。 


六 、 制 备 超 离心 实例 


(一 ) 用 CsCl 平衡 等 密度 离心 法 制备 质粒 DNA“ 
此 法 是 利用 添加 溴 化 乙 锭 影响 线形 DNA, 双 螺 旋 环 状 DNA、 或 超 螺旋 环 状 DNA 
等 的 浮力 密度 而 达 分 离 。 
(1) 在 大 肠 杆菌 培养 液 1.6 升 (E650 约 0.6) HINA 0.2% (V/V) HOA, 摇动 10 


se。 184 « 


| ae 


分 钟 以 杀 死 菌 体 , 然 后 除去 不 溶 氧 仿 。 

(2) 4£4°C, 8,000g F, 离心 15 分 钟 收集 菌 体 。 然 后 悬浮 在 1,200 毫升 pH 8.0 的 50 
mM Tris 一 HCL 中 ,再 在 4%C 8;,000 g 下 离心 15 分 钟 , 收 集 帝 降 细胞 。 

(3) 将 大 肠 杆菌 细胞 沉积 物 悬 浮 在 4°C 的 130 SH 25% (W/W) 蔗糖 的 5mM 
Tris 一 HCI (pH8.0) 中 ,并 加 入 13 毫升 溶菌 酶 溶液 (10 毫克 /毫升 , 溶 于 pH 8.0 的 50mM 
Tris—HCl 中 ), 5 分 钟 后 , 再 加 入 26 毫升 0.5 M EDTA (pH 8.2), 混 匀 后 30°C 保温 15 
分 钟 。 

(4) 加 大 120 BF 3.6% (V/V) 的 Triton X-100, 使 最 后 浓度 为 1.5% (W/V), # 
在 20°C 保温 10 分 钟 ,使 原生 质 体 胞 溶 。 

(5) 混合 液 于 4%C、65;000g 下 离心 1 小 时 。 

(6) 倾 析 除 去 上 清 液 , 在 约 200 毫升 残留 物 中 加 入 其 体积 1/9 的 5 M NaCl eed 


EEK 10% (W/V) 的 聚 乙 二 醇 ( 分 子 量 6.000)。 


(7) 混合 液 在 20°C 下 搅拌 ,使 聚 乙 二 醇 溶 解 , 然 后 在 4%C 下 放置 过 夜 。 

(8) 于 4%, 8,000¢ 下 离心 15 分钟, 再 将 沉淀 溶 于 10.8 毫升 0.1XSSC (15 mM 
NaCl, 1.5mM FMS, pH7.0) 中 , 然 后 再 加 大 11.7 克 CsCl 和 1.2 SHARE 2 
毫克 /毫升 )。 

(9) 剧烈 搅拌 使 CsCl 溶解 ,再 用 水 或 CsCl 将 溶液 的 折射 率 调 到 1.3880 一 1.3890。 

(10) 在 MSE 10 X 10 詹 角 式 转子 的 二 个 聚 碳酸 酯 管 中 各 加 入 7.5 SHEAR, AA 
用 石蜡 油 将 管子 加 满 。20*%C、40,000 rpm 下 离心 64 小 时 。 

C11) 用 顶部 收集 法 回收 质粒 DNA 的 区 带 。 

(12) 用 CsCl 所 饱和 的 异 戊 醇 或 异 丙 醇 反复 抽 提 , 或 将 收集 的 梯度 液 通过 Dowex 50 
树脂 而 除去 有 机 杂质 。 然后 在 4°C 下 对 0.1XSSC 透析 3 天, 可 得 基本 没有 非 质 粒 DNA 
的 活性 超 螺 旋 质 粒 DNA。 

此 法 所 得 的 质粒 DNA 较 多 ,每 管 可 达 500 微克 。 


(=) 用 RbCl HEALS RRS” 


C1) Fav) Be He ES EE Eagle 氏 培 养 基 加 10% 牛 血 清 ) 中 ,以 少 于 或 等 于 1 
转 /分 的 旋转 速度 进行 摇 瓶 培养 ,使 细胞 生长 汇合 。 每 瓶 含 汇合 细胞 约 10", 需 100 一 200 
毫升 培养 基 。 

(2) 培养 物 用 多 瘤 病 毒 毒 株 以 FEpfu/ 细 胞 进行 侵 染 , 在 37%C 下 保温 一 周 后 收获 。 

(3) 将 每 瓶 细胞 和 培养 基 转 人 离心 管 ,加 59 体积 的 0.4 M 磷酸 缓冲 液 (PH5.6), 并 
RAFI 4°Co 低 PH 和 低温 可 保证 大 多 数 病毒 吸附 到 细胞 上 , saeapninnhan o> 
《10 HAU/ FAME IK). 2,000 g 下 低速 离心 15 分 钟 , 弃 去 上 清 液 。 

(4) AS 10 个 细胞 重 悬 浮 于 2.5 毫升 Tris 盐水 中 , 4%C 下 存放 , 并 检查 有 无 细菌 污 
染 。 震 无 污染 则 将 样品 4 份 合 并 转 人 烧瓶 (每 瓶 X 10° 个 细胞 ,10 毫升 Tris 盐水 ) 中 冻 、 
融 三 次 。 

《5) 每 10 毫升 悬浮 液 中 加 入 25 SHAM BY SABA (RDE), 37°C 保温 24 
INT BRAS KR RTF IRA RDE 处 理 后 加 入 5% 体积 的 1M NaHCO, 使 呈 碱 性 ,加 热 至 
37"C。2'000g 下 离心 15 分 钟 以 除去 细胞 碎片 , 然 后 用 10 毫升 热 Tris 盐水 洗涤 沉淀 ,并 


° 185» 


悬浮 于 10 BF Tris 盐水 中 。 此 步 处 理 须 从 各 分 部 取样 0.1 毫升 ,用 磷酸 缓冲 的 盐水 稀释 
100 一 10,000 #%, 37°C 保温 30 分 钟 , 再 用 血球 凝集 测定 法 估算 解 离 出 的 病毒 。 经 一 次 
RDE 提取 后 ,如 仍 有 10-20% 以 上 病毒 留 在 细胞 碎片 上 ,应 重复 处 理 ,或 增加 RDE AS 
(但 应 避免 过 量 RDE 进入 病毒 液 )。 

(6) 将 较 稀 的 病毒 悬浮 流 在 80,000 g 下 离心 2 小 时 ,使 病毒 浓缩 ,并 重 悬 在 少量 Tris 
盐水 中 。 

(7) 5 克 RbCl WF 7.6 毫升 0.05 M Tris 缓冲 液 (pH 8.0) 中 ,以 每 管 3 毫升 量 分 
装 三 个 塑料 离心 管 。 SAMA 1 毫升 病毒 悬浮 液 并 搅拌 到 上 半 个 梯度 。 £1045 下 。 
30,000 rpm 离心 24 小 时 。 用 穿刺 法 分 部 收集 。 


(=) 用 CsCl 等 密度 离心 提纯 染色 质 蛋 白质 针 


C1) 将 染色 质 在 缓冲 流 ( 含 5M AR, lmM 二 硫 赤 父 糖 醇 、0.1mM EDTA #1 2MNaCl 
的 10 mM、pH7.5 Tris 一 了 CH 中 匀 化 , 然 后 在 12;000 g 下 离心 10 DF. ti Liem, 帝 
这 在 同一 缓冲 液 中 再 匀 化 , 使 染色 质 在 高 离子 强度 的 盐 介质 中 充分 解 离 为 核酸 和 和 蛋白质 
组 分 ,再 在 12,000 g 下 离心 10 分 钟 。 合 并 三 次 上 清 液 , 用 蒸馏 水 稀释 染色 质 的 蛋白 质 至 
浓度 为 1 毫克 /毫升 《或 更 少 ), 然 后 加 入 等 体积 的 含 0.1 mM AAR BRA 55% CW/ 


,W) CsCl BIR (5.5 M), 混 匀 。 


(2) 在 MSE 10 X 10 铁 角 式 转子 的 离心 管 中 放 人 5 毫升 上 述 混合 液 , FEB WER EM 
装 满 , 并 在 4°C, 50,000 rpm 下 离心 68 小 时 。 

《3) 离心 后 用 向 上 取代 法 取出 梯度 ,5 毫升 梯度 的 上 面 1.5 毫升 部 分 均 含 蛋白 质 , 可 
分 部 收集 。 

(4) 通过 透析 或 凝 胶 过 滤 脱 盐 , 得 纯 染 色 质 蛋白 质 。 


(四 ) 用 NaBr 等 密度 离心 分 离 血 浆 脂 蛋白 负 


(1) 用 稀 NaBr 液 (11.4 克 NaCcl 和 0.1 克 EDTA, 以 蒸馏水 定 容 至 1 升 ,pH 7.8) 
Fu NaBr 液 (263 克 NaBr、11.4 克 NaCl 和 0.1 克 EDTA, 以 蒸馏 水 定 容 至 1 升 , 调 TB 
7.8) 通过 梯度 产生 器 , 在 MSE 3 X 25 外 摆 式 转子 的 离心 管 中 制 备 20 毫升 密度 为 ,1.003 
一 1.2 克 / 厘 米 ; 的 NaBr 线性 梯度 。 

(2) 每 毫升 血清 样品 中 加 入 0.32 克 NaBr, 将 密度 调 到 1.22 克 / 厘 米 ?o 

(3) 将 05-1 毫升 样品 分 层 到 梯度 的 底部 ,样品 层 下 面 再 铺 放 1.5 一 2.0 毫升 浓 NaBr 
(0.582 克 / 毫升 )。 导 人 样品 层 应 注意 排除 气泡 ,以免 扰 乱 梯 度 。 

(4) 在 4°C, 30,000 rpm 下 离心 2 小 时 。 从 静止 到 5,000 rpm 要 上 得 慢 , 一 般 达 1-000 
rpm 应 为 3 分 钟 左 右 ,1,000 一 5,000 rpm 为 2 分 钟 , 后 按 正常 加 速 。 

《5) 离心 后 通过 向 上 取代 法 取出 梯度 。 通 常 最 低 密度 脂 蛋 白 在 梯度 顶部 , 较 低 密 度 
脂 蛋 白 在 顶部 以 下 10 一 15 毫升 之 间 ; 而 高 密度 脂 蛋 白 与 其 它 血 请 蛋白 一 起 在 原样 品位 
置 。 


(A) 用 线性 或 阶梯 蔗糖 梯度 制备 线粒体 一 
C1) 500 克 蕴 麻 籽 , 在 室温 下 用 水 误 泡 过 夜 , 浸泡 过 的 苞 麻 籽 在 30"C, 渴 润 条 件 下 萌 


e。 186 » 


25 Ko 

(2) 除去 萌芽 欧 麻 籽 的 胚 杆 和 子叶 ,将 胚乳 组 织 用 蒸馏水 洗涤 后 置 冰 中 冷 趣 。 

(3) 制备 500 毫升 由 下 列 成 分 组 成 的 混合 液 ( 研 磨 介质 ): 0.4M 蔗糖 , 0.165 MpH7.5 
麦 黄酮 (tricine) 缓冲 液 , 0.01 M KCl, 0.01 M MgCl, pH 7.50.01 M EDTA, 0.01M 二 硫 
苏 糖 醇 。 | 

(4) 在 60 克 胚 乳 组 织 中 加 入 90 毫升 上 述 混合 波 , 并 用 捣 碎 机 捣 碎 6 分 钟 。 

(5) 将 粗 糊 状 物 在 冰 浴 中 研磨 成 细 糊 。 

(6) 用 棉布 粗 滤 ,滤液 在 270g 下 离心 10 分 钟 , 除 去 细胞 和 大 细胞 碎片 。 上 清 液 倾 入 
冷却 离心 管 , 10,800 g 下 离心 30 分 钟 。 所 得 细胞 器 沉淀 物 再 悬浮 于 4 一 6 毫升 研磨 介质 
中 。 . 

(7) 用 pH 7.5、0.01 M EDTA 溶解 适量 芒 糖 ;, 配 成 60、57、50、44 和 33% 的 蔗糖 液 , 
然后 按 顺序 加 入 以 建立 蔗糖 阶梯 梯度 。 也 可 先 加 16 BH 60% 蔗糖 液 , 然 后 仔细 地 在 上 
面 建立 33 一 60% 的 蔗糖 线性 梯度 。 

(8) 在 梯度 上 仔细 地 铺 人 1 一 2 毫升 细胞 器 悬浮 液 的 样品 层 。 

(9) FA SW 25.2 外 摆 式 转子 于 23,000 rpm 下 离心 5 小 时 。 

(10) 离心 后 用 底部 收集 法 回收 分 离线 粒 体 。 测定 各 分 部 柠檬 酸 合成 酶 和 苹果 酸 脱 
ABS TEE} 


(六 ) 用 差 速 离心 法 分 离 大 白鼠 肝脏 中 各 种 亚 细 胞 成 分 名 


鼠 肝 及 组 织 

| 0.25 M 藤 糖 碘 酸 缓冲 液 
RX (10% W/V) 

| 1,005 10° Crass 8 厘米 ) 


a 
沉淀 ER 
i 0.25M 蔗糖 洗 三 次 。 | 
@ 1,000,510" (ra8 IK) 
Laie 
oe | 35300 g, 10’ G ra8 HK) 
《细胞 核 ) y Y 
沉 演 上 清 液 
ig 0.25 M 蔗糖 洗 三 次 
@ 3;300g;10′(r 坟 8 厘米 ) 
~ 上 清 液 
Tee CHB ok) | 100, 0008, 30°Cress 6 厘米) 
ER a 
沉淀 ER 
《微粒 体 ) 


0 


[1] 微生物 工程 编写 组 编 : 微生物 工程 (下 册 ), 上 海 科 技 出 版 社 , 第 32 页 (19827) 

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¢ 187 « 


eee aa 


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¢ 188 se 


第 七 章 , 过 涨 与 膜 分 离 技术 
eee FEX 


第 一 节 过 gt 


过 滤 是 利用 多 和 孔 介 质 阻 留 固体 而 让 液体 通过 , 使 固体 和 液体 分 离 的 方法 。 在 生化 制 
备 中 , 从 原材料 处 理 到 产品 的 提取 分 离 精 制 都 可 能 涉及 到 过 滤 。 过 着 的 目的 一 是 除去 不 
溶性 杂质 得 到 所 需 的 清 液 以 便 进一步 提纯 ,二 是 收集 固体 中 间 产 物 或 结晶 成 品 。 


一 、 过 滤 速 度 


一 般 以 单位 时 间 内 单位 过 滤 面 积 流出 的 站 液体 积 计算 。 和 常用 下 式 表示 
_ nad*AP, 
128pL 

U 一 过 滤 速 度 ; 

n 一 过滤 面积 上 的 滤 饼 毛细 和 孔道 数 ; 

AP, = 毛细 管 孔 道 两 端的 压强 降 ( 于 克 / 米 2 

“一 滤液 的 粘度 (于 克 “' 秒 / 米 ) 
1 工 一 滤 饼 厚度 ( 米 7; 

a= 毛细 管 孔 道 弯曲 程度 校正 系数 ; 

d= 毛细 管 孔 道 直 径 ( 米 ) - 

实际 上 滤 饼 毛细 管 孔 道 的 情况 很 复杂 , on. cd 难于 准确 测定 。 故 上 式 只 能 反映 各 因 
子 的 相互 关系 及 各 因子 所 起 作用 的 综合 结果 。 从 上 式 可 知 , 影 响 滤 速 的 因素 有 : 

C1) 流体 的 粘 滞 度 越 大 , 滤 速 越 慢 ; 粘 滞 度 随 温度 升 高 而 降低 , 故 升温 可 增加 滤 速 。 

(2) thet WN ET RBA EAR, 多 孔 陶 质 滤 板 等 ) 的 毛细 管 您 长 , FER 
小 或 数目 愈 少 , 则 滤 速 愈 慢 。 

(3) REMAX RAR. 

(4) BABRME , 滤 速 越 慢 。 

《5) 沉淀 中 有 胶 状 物 或 其 它 可 压缩 的 物质 (如 细菌 或 发 酵 液 中 的 悬浮 物 等 ), BAY 
塞 泪 孔 , 使 滤 速 大 大 减 慢 。 


二 、 提 高 滤 速 的 主要 措施 


MEPIS SAN WEST A eS EH, 增加 过 滤 推 动力 及 加 大 过 滤 面 积 等 , 均 可 增加 滤 
速 , 现 分 述 如 下 : 


"189。 


(一 ) 选 择 适 当 的 过 滤 介质 

1. 选择 过 滤 介质 应 考虑 的 因素 

(1) 和 孔径 大 小 适 于 截留 被 分 离 的 固体 微粒 , 和 孔径 过 大 , 则 滤液 不 清 , 太 小 则 滤 速 过 
慢 。 

(2) 孔 的 数量 多 ,孔道 短 且 不 很 弯曲 , 则 滤 速 快 ,否则 滤 速 慢 。 

(3) 耐酸 碱 ,化 学 稳定 性 好 。 

(4) 有 一 定 机 械 强 度 , 易 于 回收 。 

(5) 工业 上 要 求 再 生 方便 ,使 用 寿命 长 ,成 本 低 。 

2. 过 滤 介质 简介 

(1) 通常 棉 、 麻 、 丝 织品 适用 于 沉淀 颗粒 较 粗 或 较 粘 稠 的 中 性 、 弱 酸性 或 弱 碱 性 物料 , 
但 不 耐 强酸 强 碱 。 

(2) 实验 室 中 最 常用 的 是 滤纸 。 滤 纸 分 工业 用 和 分 析 用 两 类 。 按 其 材质 和 滤 速 的 差 
别 又 分 慢 速 ,中 速 和 快速 三 种 。 一 般 滤 纸 不 耐 强 酸 、 强 碱 。 近来 国外 滤纸 的 型 号 规格 很 
多 ,分 别 适 于 过 滤 各 种 物质 。 离子 交换 滤纸 在 过 滤 时 还 兼 有 分 离 作 用 。 日 本 TOYO 出 
品 的 离子 交换 滤纸 有 DEAE, ECTEOLA 阴离子 交换 泪 纸 和 CM 阳离子 交换 滤纸 。 此 
外 还 有 供 特 殊 试 验 用 的 活性 炭 滤 纸 、. 采 血 用 的 滤纸 、 玻 璃 纤维 滤纸 等 。 过 滤 时 滤纸 折叠 形 
状 对 滤 速 有 影响 ,有 平 折 法 与 多 折 法 , 见 图 7-1。 多 折 法 沽 速 一般 比 平 折 法 高 。 


图 7-1 滤纸 的 各 种 折 和 县 方法 
(3) 过 滤 介 质 还 有 玻璃 纤维 , 垂 熔 玻 璃 \ 石 棉 或 烧 瓷 滤 板 ,涤纶 等 。 
玻璃 纤维 或 垂 熔 玻璃 滤器 可 耐 强 酸 , 但 不 耐 强 碱 。 石棉 或 烧 瓷 滤 板 , 涤 纶 等 可 耐 强 
酸 、 强 碱 。 食 品 ` 医 药 及 发 酵 工业 中 因 过 滤 面 积 大 ,并 考虑 到 成 本 、 再 生 及 耐用 等 因素 ,多 
FR RG EH 66、 维 尼 纶 等 作 过 滤 介 质 。 它 们 不 仅 抗 酸 碱 ,耐用 ,而且 不 沾 料 , 多 


* 190+ 


再 生 。 涤 纶 有 多 种 规格 ,其 粗 密 孔 径 各 不 相同 ,可 根据 需要 选用 。 


(=) 加 助 滤 剂 


过 滤 时 滤 饼 的 形成 对 滤 速 影响 很 大 ,如 组 成 滤 饼 的 颗粒 很 小 而 粘度 较 大 , 则 增加 压力 
不 但 不 能 增加 滤 速 ,而 且 滤 饼 中 毛细 孔 变 形 缩 小 还 会 使 证 速 减 慢 。 这 时 需 加 助 滤 剂 ,以 增 
Tis BF GORA BE ,防止 堵塞 过 滤 介 质 的 孔道 。 常 用 助 让 剂 有 硅 营 土 , 活 性 痰 , Ki, Aso 
加 助 滤 剂 的 方法 是 在 过 滤 前 把 助 滤 剂 先 均匀 铺 在 过 庆 介 质 表 面 ,或 与 滤 洲 混合 一 起 过 沽 , 
滤 毕 再 回收 助 滤 剂 。 最 好 选用 易 与 样品 分 离 的 助 滤 剂 。 


(=) 增加 过 滤 推动 力 


通常 推动 力 愈 大 , 滤 速 愈 快 。 根 据 产生 过 滤 推 动力 的 条 件 不 同 , 分 为 常 压 、 加 压 和 减 
压 过 滤 三 种 。 

1. 常 压 过 滤 ”主要 由 滤液 位 差 产 生 推 动力 引起 过 
滤 。 因 此 滤 速 慢 , 操 作 时 间 长 ,很 少 用 于 分 离 大 量 样品 或 不 
稳定 物质 。 工业 上 的 吊 滤 及 实验 室 中 常规 过 滤 属 于 此 类 , 
简单 装置 如 图 7-2 及 图 7-3 (a)。 此 法 补充 加 样 时 间 难 党 
担 , 如 改 为 连续 过 滤 , 则 较 方便 ,简单 装置 如 图 7-3(b)o 

2. 加 压 过 滤 ”用 压缩 气体 加 大 液体 所 受 的 压力 或 用 | 
和 泵 把 样 液 输送 至 过 滤 装 置 时 产生 液压 作为 过 滤 的 推动 力 。 
加 压 过 滤 时 压力 愈 大 , 滤 速 愈 快 直 至 滤 饼 的 厚度 和 粘 结 度 
增加 至 一 定 限度 时 增 压 才 失 去 作用 。 加 压 过 滤 适 用 于 粘度 
较 大 ,沉淀 颗粒 较 细 的 溶液 。 如 工业 用 的 板 框 过 滤 机 ,加 压 
叶片 过 滤 机 属于 此 类 。 实验 室 常用 加 压 过 滤 装 置 如 图 7- 
4。 它 的 特点 是 装 样 漏斗 或 过 滤器 需 用 坚固 材料 〈 如 人 金属) 
制 成 且 密 封 。 并 注意 在 用 前 做 好 安全 检查 。 人 

3. 减 压 过 滤 ”和 加 压 过 滤 相 反 , 是 在 过 滤 介 质 下 方 抽 真 空 ,以 增加 过 滤 介 质 上 下 的 
压 差 , 推 动 溶剂 通过 过 滤 介 质 。 实 验 室 常用 的 和 特殊 的 减 压 装置 如 图 7-5 及 7-6。 工业 


(a) (b) 


图 7-3(a) KRSILP REVERE 


° 1916 


7-3(b) EST TRAIN ae 


2 一 一 具 虹 吸 瓶 的 装置 ; b 一 一 具 分 液 漏 斗 的 装置 ; c 


具 倒 置 锥 形 烧 瓶 的 装置 


金属 制 石 杭 过 滤 加 压 装置 金属 制 膜 过 滤 加 压 装 置 
图 7-4 实验 室 中 常用 加 压 过 让 装 置 


装置 有 陶瓷 抽 滤 缸 , 转 鼓 真 空 过 滤 机 等 。 


加 压 过 滤 与 减 压 过 滤 的 共同 点 是 过 滤 介 质 下 面 必 须 有 支持 滤 板 , 或 过 滤 介质 。 都 是 
一 些 强度 较 大 的 烧 瓷 焉 板 等 物质 。 


此 外 ,还 有 离心 过 滤 法 ,实验 室 装置 如 图 7-7 所 示 。 利 用 离心 机 产生 的 离心 力促 使 湾 
液 通过 过 滤 介 质 ,分 离 效果 更 好 。 但 过 商 液体 积 小 ,多 用 于 分 离 临床 的 小 量 组 织 样品 。 
(四 ) 提高 过 滤 时 的 温度 

升温 使 溶液 粘度 减少 ,溶质 淤 解 度 增 大 ,对 提高 让 速 显 然 有 利 。 但 此 法 不 适用 于 热 生 


。 192 。 


品目 日 四 80888 


烧 磁 漏斗 


垂 熔 玻 璃 漏斗 
图 7-5 ”实验 室 中 常用 的 减 压 过 滤 装 置 


HHL 


减 压 火 棉 胶管 膜 过 滤器 


茂 压 膜 片 过 滤器 
图 7-6” 实 验 室 用 的 特殊 减 压 过 滤 装 置 


物料 。 实 验 室 加 热 过 滤 装置 如 图 7-8。 


(A) 其 他 
增加 过 滤 面 积 , 减 少 滤 饼 厚度 等 均 可 提高 滤 速 。 


e。 193 。 


eS See) eee 


支持 架 


ooh 
过 王强 


滤 出 液 


图 7-8 实验 室 加 温 过 滤 装 置 


=. Et DWAR BRE 

《一 ) 板 框 压 滤 机 

它 是 一 种 加 压 过 滤 装 置 。 结 构 如 图 7-9。 主 要 部 分 由 交替 排列 的 滤 板 (1) 和 滤 框 2) 
组 成 ,其 中 滤 板 又 分 为 过 沽 滤 板 和 洗涤 滤 板 。 滤 板 和 滤 框 由 机 座 两 旁 两 条 平行 横梁 支撑 。 
机 座 (3) 上 有 固定 端 板 (4 和 借读 轮 移 动 的 可 动 端 板 (5)。 滤 板 和 滤 框 之 间 夹 着 滤 布 , 滤 布 
上 开 有 与 滤 板 孔洞 相通 的 孔 。 当 端 板 (4)〈57 将 板 框 压 紧 时 , 相 邻 的 每 两 个 滤 板 与 其 所 来 
住 的 滤 框 组 成 独立 的 过 滤 小 室 。 板 框 上 缘 有 三 个 孔 ( 有 的 只 在 上 缘 两 角 各 开 一 孔 )o 中 间 
孔 为 过 滤波 进口 通道 ,旁边 两 孔 为 洗涤 液 通道。 图 7-10 为 滤 板 与 滤 框 的 放大 图 。 

使 用 时 按 过 滤 滤 板 、 滤 框 ` 洗 涤 泪 板 的 顺序 安装 , 压 紧 。 在 加 入 待 滤 该 以 前 , 先 从 过 庆 
液 进 口 通 道 压 人 清水 试 漏 , 除 滤 清 液 开关 以 外 , 它 处 均 无 水 喷 出 。 即 证 明 滤 机 可 用 。 人 央 后 
通 人 压缩 空气 驱 去 机 内 试 漏水 , 再 用 泵 压 人 待 滤 液 。 图 7-11(a) AREER BOLLE 
图 。 待 滤 小 流 经 滤液 进口 通道 后 ,由 滤 板 瞳孔 进 人 滤 框 。 滤 液 通 过 证 板 上 的 滤 布 , 沿 板 目 
沟渠 目下 方 旋 塞 开 关 排 出 。 


。194 。 


” 统 \ 压 缩 空 气 系统 及 离心 泵 等 。 


| 


aT 
{Ka 


« 


be} 图 7-9 压 滤 机 
1. 滤 板 ,2. 波 框 ,3. 机 座 ,4- 固 定 端 板 ,5. 可 动 端 板 。6. 水 压 机 ,。7. 悬 浮 液 洗涤 水 及 压 


缩 空 气 的 进口 管 ,8. 滤液 及 洗涤 水 的 排放 旋塞 


人 | 


Sree 
| IRE oS 


(a) 


7-10 滤 板 G)MBE (KAA 
(a) RL AWBAS 〈b) 滤 框 中 空 


洗涤 滤 污 时 ,关闭 待 滤液 进口 通道 ,洗涤 液 由 洗涤 液 进 口 通道 压 人 , 经 洗涤 泪 板 上 的 
奢 孔 进入 滤 框 ,如 图 7-11(b) 所 示 , 关闭 过 滤 滤 板 下 的 滤液 排出 旋塞 , 洗涤 液 透 过 两 层 滤 
布 和 全 部 滤 沽 层 后 排出 。 

- 板 框 压 滤 机 的 操作 压强 由 待 滤 物 的 性 质 决定 ,一 般 为 表 压 2 一 3 个 大 气压 。 过 滤 中 人 竹 
或 碱 性 物料 多 用 铸铁 板 框 。 过 滤 酸 性 物料 常用 木 wee 3 2123212 3 


WS SSSI SSNS 
AWNZ]Z 


板 框 。 此 外 还 可 用 铸 钢 ,玻璃 钢 , 硬 聚 氧 乙烯 等 制 一 区 WZ 
“| 


2 ENN Z/Z WY 
成 板 框 。 CATS AULA, URE IR HERO \ \ 
B— A) 10 至 60, 如 过 滤 少 量 物料 ,不 需 通 过 全 \ 
| 


部 板 框 ,可 取 无 孔 隔 板 插 人 机 中 ,使 隔 板 后 面 的 板 
框 不 起 作用 。 

板 框 压 沽 机 因 结 构 简单 , 操 作 方便 , 造 价 较 
低 , 过 滤 效 果 好 ,, 现 仍 广 泛 应 用 , 近年 又 不 断 向 机 
械 化 \ 自 动 化 方向 发 展 。 -一 一 FS 


CLX 
ZINN 


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MUL: 


. 
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\¥ 


(=) 转 简 真 空 过 滤 机 


是 一 种 减 压 过 滤 装 置 , 也 是 生化 工业 中 常用 
的 过 滤 设 备 。 它 包括 转 简 分 配 头 , 料 槽 , 真 空 系 


Oe Na 


2 


当 物 料 进 入 料 模 后 , 需 搅 拌 使 固体 不 致 沉降 。 
料 槽 中 置 刮 刀 式 转 简 , 见 图 7-12. ii NST 
形 室 , 有 网 或 栅 便 于 铺 滤 布 。 已 铺 滤 布 的 转 简 转动 时 (转速 为 0.1 一 2.6 转 /分 ), 各 室 经 转 
简 的 空 轴 枢 内 的 通道 与 固定 的 分 配 头 相连 。 通 过 分 配 头 可 吸 气 或 压气 , 使 区 I 各 室 产生 


a 195° 


真空 ,将 滤液 吸 和 人 转 简 各 室 , 而 固体 则 被 阻 留 于 简 面 。 转 简 旋 转 时 , 滤 斗 随 之 上 升 到 区 了 
的 位 置 wAPMARRAM RRA KM 为 空白 区 。 到 区 IV 时 由 供水 管 7 KBR 
冲 沽 ,又 称 洗 族 区 。 区 V 又 是 空白 区 。 到 区 VI 时 通过 分 配 头 压缩 空气 将 转 简 上 已 洗 净 
RF ADAIR. Pei Ak hee BARA IAT, RAR LNwAEK VI 经 蒸汽 
洗 净 重新 循环 使 用 。 


图 7-12 ” 转 简 真 空 过 滤 机 操作 简 图 : 图 7-13 ” 转 简 真空 过 滤 机 分 配 头 : 


1. 转 简 ,2. 分 配 头 ,3.、4. 与 减 压 相 接 的 管 ,5、6。 , 1. 转动 盘 ,2. 固 定 盘 ,3. 与 减 压 管 相通 的 缝隙 4. 与 
与 压缩 空气 相 接 的 管 ,7. 喷 水 管 洗涤 贮 槽 相通 的 颖 险 ,5.、6. 与 压缩 空气 相通 的 绒 
lL RAKE, WU. 滤 瓶 吸 干 区 UM. Vv. xX. 空白 Pa, 7. 转动 盘 上 的 孔 


K, IV. 洗 涤 滤 饼 区 , VI. 吹 松 滤 饼 区 , VI. He 
BK, VIN. 滤 饼 清洗 区 

分 配 头 是 真空 过 滤 机 的 重要 部 件 , 各 区 的 工作 由 它 分 配 。 分 配 头 包括 转动 加 1 和 
不 动 圆 盘 2 , 见 图 7-13。 当 转 动 圆 盘 上 的 孔 与 不 动 圆 盘 上 的 大 颖 除 3 相对 应 时 , 局 形 室 
N5RSRHE BHRHBRERABRK ZH. RAR -EME, WKS 4M 
5 对 应 而 与 洗 液 贮 模 相 连 。 最 后 经 孔 6 和 7 使 转 简 室 与 压缩 空气 管 相连 , 以 便 吹 干 滤 饼 
和 清洁 滤 布 。 空 白 区 是 用 于 防止 作用 不 同 的 相 邻 的 两 区 相互 串联 而 设 下 的 缓冲 区 。 

转 简 真 空 过 滤 机 适用 于 中 等 细 度 和 粘度 不 大 的 物料 。 其 式样 较 多 , 转 简直 径 可 小 至 
30 厘米 ,大 到 4.5 米 , 长 度 由 30 厘米 到 6 米 , 适 用 范围 很 广 。 务 料 方法 有 : 

1. 刮刀 法 ,, 用 于 剥离 较 厚 (8 一 10 Sh HBA, TEARHRRBAN, BR 
周 阻 留 滤 酒 厚度 在 5 一 10 毫米 之 间或 更 少时 , 为 避免 用 刮刀 匈 料 损 及 滤 布 , 可 用 其 他 外 
料 方法 , 见 图 7-14。 

2WA#E GABE 2 一 4 毫米 ) 过滤 时 预先 将 绳索 其 在 滤 蓝 内 。 钾 料 时 , 滤 
饼 随 绳索 移动 而 脱落 。 见 图 7-14 (b) 

3. 橡皮 圆 辊 法 莓 让 法 和 粘 清 直 沽 被 紧 压 在 转 测 表面 上 旋转 的 柳 皮 加 辑 所 名 下 , 


绳索 二 
= (b) 7 #4 


图 7-14 BMRB BBO AE 
a. al] b. 用 环行 索 « 用 橡皮 圆 辊 d. AMT 


s 196。 


在 圆 辊 上 的 滤 沽 再 用 一 较 小 直径 的 圆 辊 除去 , 见 图 7-14(c)。 

4. 环行 滤 带 法 ” 滤 秸 区 特别 薄 时 (小 于 2 毫米 ) 可 用 此 法 , 滤 带 通过 一 系列 圆 辊 , A 
后 被 刮刀 外 除 , 滤 带 再 经 洗涤 回 到 转 简 上 。 其 原理 见 图 7-14(d) 

Ye fej ZS WP PLA Se ER AT Ra a Ee a EET. OR AE ET 
ROMER AIT. PERAK BH 10~30%, 若 要 得 到 较 干 的 滤 饼 , 可 将 转 简 的 一 
部 份 章 住 , 通 人 热 空气 使 之 干燥 。 


(=|) 加 压 叶片 连续 过 滤 机 


它 的 特点 是 主轴 每 转 一 周 , 依 次 完成 过 滤 、 水 洗 、 干 燥 、 外 料 四 个 工序 , 结 构 见 图 
7-15。 它 的 效率 高 ,密封 性 好 ,适应 性 强 。 多 用 于 过 滤 粘度 大 、 颗 粒 细 \ 有 毒 、 易 挥发 物料 。 
过 滤 面 积 为 5 米 " 的 叶片 过 滤 机 的 生产 能 力 , 相 当 于 六 人 台 过 滤 面 积 36 KARE PL, 


- 占 地 面积 缩小 213,, 设备 投资 减少 50 多, 每 年 所 用 滤 布 量 为 板 框 压 滤 机 用 布 量 的 1/160。 


7-15 MEN iA 


《四 ) 其 他 


如 叶片 真空 吸 滤 机 、 人 金属 圆 片 压力 过 滤 机 、 圆 形 板 框 压 滤 机 、 陶 瓷 抽 滤 缸 等 分 别 用 于 
生产 谷 氨 酸 钠 、 柠 檬 酸 ,抗菌素 及 其 他 生化 药物 。 


第 二 节 膜 分 离 技 术 


早 在 1861 年 Thomas Graham 就 已 介绍 用 膜 分 离 法 可 从 大 分 子 ( 多 糖 、 蛋 白质 ) BR 
中 除去 一 些小 分 子 的 无 机 盐 类 马 。 那 时 用 的 膜 还 只 是 来 源 于 动物 , 不 及 现 用 的 透析 膜 那 
样 精致 和 高 效 。 但 分 离 的 原理 还 是 相同 的 。 

膜 分 离 的 原理 ,主要 是 利用 溶液 中 溶质 分 子 的 大 小 \ 形 状 、 性 质 等 的 差别 ,对 于 各 种 薄 
膜 表 现 出 不 同 的 可 透 性 而 达到 分 离 的 目的 。 选 择 薄膜 在 膜 分 离 法 中 很 重要 。 薄 膜 的 作用 
是 有 选择 地 让 小 分 子 通过 ,而 把 较 大 的 分 子 挡住 。 分 子 透 过 膜 , 可 由 简单 的 扩散 作用 引 
起 ,或 由 膜 两 边 外 加 的 流体 静 压 差 或 电场 作用 所 推动 。 由 上 述 原 理 衍 生出 的 分 离 法 有 透 
析 、\ 超 泪 、 电 渗析 、 反 涂 透 等 。 它 们 还 可 根据 装置 的 不 同 或 所 用 膜 性 能 上 的 区 别 再 细 分 。 
如 超 滤 装 置 有 静止 无 挠 拌 式 ,搅拌 式 ` 浅 道 式 和 中 空 纤维 式 等 类 型 。 


。 197。 


膜 分 离 技 术 的 发 展 和 制 膜 工艺 水 平 直接 有 关 。 早 期 用 的 动物 膜 ,不论 在 材料 来 源 \ 再 . 
生 能 力 及 分 离 效果 上 都 有 许多 缺点 。 三 十 年 代 初 Elford 制 成 硝化 纤维 薄膜 ,可 用 于 测定 
某 些 病毒 颗粒 的 大 小 ,但 用 这 种 薄膜 时 ,流速 甚 慢 , 操 作 烦 珊 , 因 而 未 能 广泛 应 用 。 后 来 
Graig 等 对 玻璃 纸 ( 赛 璐 共 ) 做 的 透析 管 进 行 了 细致 研究 ,用 各 种 理化 方法 改变 玻璃 纸 孔径 
大 小 ,克服 再 生 能 力 低 ,流速 慢 等 缺点 ,并 改进 了 装置 使 透析 技术 前 进 了 一 步 避 "e 

制 膜 工艺 的 革新 高 潮 是 在 近 十 多 年 出 现 的 。 工业 废水 处 理 、 海 水 淡化 试验 及 制 盐 工 
业 的 发 展 , 医 学 上 AE 的 研究 等 ,使 人 们 对 薄膜 的 研究 的 兴趣 大 为 增加 。 因 此 新 的 
薄膜 及 装置 应 运 而 生 , 其 中 最 重要 的 是 各 向 异性 的 不 对 称 薄 膜 或 称 表层 膜 。 它 不 仅 提 
高 了 膜 的 选择 性 和 机 械 强 度 , 而 且 滤 速 也 比 玻 璃 纸 的 滤 速 增加 数 十 倍 甚至 成 百倍 。 其 次 
是 出 现 了 多 种 新 装置 。 

目前 ,迅速 发 展 的 膜 分 离 法 已 成 为 物理 化 学 分 离 法 中 重要 组 成 部 份 。 它 在 生化 制备 
中 用 于 浓缩 及 脱盐 已 占 压 倒 优 势 , 用 于 分 离 提纯 的 事例 逐年 增加 。 Tess 
几 种 膜 分 离 法 。 


Bie 透 BT 


透析 法 的 特点 是 半 透 膜 两 边 都 是 液 相 ,一 边 是 试验 液 , 另 一 边 是 纯净 溶剂 (水 或 缓冲 
液 )。 试 验 液 中 不 可 透析 的 大 分 子 被 截留 于 膜 内 ,可 透析 的 小 分 子 经 扩散 作用 不 断 透 出 膜 
外 ,直到 两 边 浓度 达到 平衡 。 以 前 透析 膜 两 边 的 液 相 用 的 名 称 较 混 乱 , RW AAR, 称 
“不 可 扩散 的 物质 ”, 或 称 “透析 残留 液 ”, 而 透析 后 的 溶液 称 “已 透析 液 "、“ 透 析 液 ”。Craig 


和 King 建议 使 用 的 “保留 芒 (retentate)” 和 “ 渗 出 芒 〈diffusate)” 分 别 代表 透析 后 膜 


AE, 已 被 广泛 承认 。 透析 法 多 用 于 制备 及 提纯 生物 大 分 子 时 除去 或 更 换 小 分 子 
物质 脱盐 和 改变 溶剂 成 份 。 近来 , 透 析 法 有 很 大 发 展 , 透 析 膜 和 透析 装置 更 有 新 的 进 
Fo 


(—) 透析 膜 


除 动物 膜 外 ,羊皮 纸 、 火 棉 胶 和 玻璃 纸 及 最 近 使 用 的 Visking RBBB, MEF 
维 或 纤维 素 衍生 物 制 成 的 。 纤 维 素 材料 来 源 丰 富 , 价 格 便宜 ,但 用 于 制作 透析 膜 的 高 聚 物 
还 应 有 如 下 特点 : | 

1. 在 溶剂 中 能 膨胀 形成 分 子 筛 状 多 孔 薄膜 。 只 允许 小 分 子 溶 质 和 溶剂 通过 , 而 阻止 
大 分 子 (如 蛋白 质 ) 通 过 。 

2. 具有 化 学 惰性 ,不 具有 可 以 和 溶质 起 作用 的 基 团 Ek DAR. RRA 
解 。 

3. 有 一 定 的 机 械 强度 和 良好 的 再 生性 能 。 

透析 膜 可 自制 (如 火 棉 胶 ) 或 购买 ,国外 的 透析 膜 常 有 以 下 几 种 , 见 表 7-1, 

商品 透析 膜 大 多 为 管状 , 各 公司 采用 的 大 小 规格 又 不 相同 , 曾 引起 混乱 。 购 买 时 需 
注意 ,如 Visking 公司 最 初 的 透析 管 大 小 以 装 满 水 时 管内 膨胀 直径 为 多 少时 表示 , UDR 
1132 为 一 个 单位 。 因 此 ,8/32 透析 管 的 膨胀 直径 约 为 0.25 时 ( 约 合 0.62 厘米 )。 Visking 
并 人 Union Carbide 公司 后 , 仍 用 “32? 为 分 母 基 数 , 但 商标 上 常 略 去 “32” 而 代 以 透析 管 


¢ 198 。 


表 7-1 几 种 商品 透析 腊 


bates 相当 于 Visking 扁平 宽度 膜 壁 厚度 
公司 型 号 CHK) (厘米 ) 
8 8/32 0. 390 21073 
20 20/32 0.984 8x 10-4 
27 27/32 1,312 10-3 
36 36/32 1.734 10-3 
7 a y 
itss 2 2.88—3.14 1.6X10 
1 ah y 
ass d 4.65 一 5.10 3.5x107 
% 7-2 Union Carbide 各 种 型 号 透析 管 的 渗透 范围 
a 8 iia naa 可 透 过 的 分 子 量 
8 透析 管 0.62 5,732 
18 透析 管 1.40 3,300 5,732 
20 透析 管 1.55 30,000 45,000 
27 透析 管 2.10 55732 20,000 
36 透析 管 2.80 20,000 wv 
if 透析 管 4.70 
不 详 , 但 与 8 号 管 大 致 相同 
34 透析 管 8.13 


长 度 * 如 36/100 即 表示 36/32 SERS IO 英尺 长 。 另 外 , 管 的 膨胀 直径 改 为 公制 ,以 厘 
米 表示 。 Union Carbide 公司 的 几 种 透析 管 滩 透 范围 见 表 7-2。 

透析 管 孔径 大 小 可 经 机 械 作用 和 理化 处 理 而 改变 。 例如 乙酰 化 作用 可 缩小 膜 的 孔 
径 , 直 至 能 阻 滞 甲 醇 分 子 通过 , 而 用 -64 多 ZnCl 溶液 浸泡 时 , 膜 的 孔径 可 增 大 到 能 使 分 子 
量 为 135,000 的 大 分 子 通过 。 机 械 法 对 管 膜 孔 径 的 影响 可 因 作 用 方向 而 异 。 线 形 膨胀 可 使 
孔径 减 小 至 50 天 ,而 放射 形 膨 胀 作用 由 于 管内 液体 静 压力 加 大 ,可 使 管 膜 孔径 增加 1 一 2 
倍 以 上 ; 表 7-3 是 Union Carbide 的 三 种 透析 管 径 不 同 处 理 后 孔径 的 变化 中。 

此 外 , 某 些小 分 子 溶质 的 渗透 性 也 因 溶液 中 存在 某 些微 量 表面 活性 剂 而 增加 , 可 能 是 
由 于 它们 吸附 在 膜 的 活性 位 置 “ 上 ,改变 了 膜 的 理化 特性 。 

各 种 纤维 素 透 析 膜 片 孔径 度 一 般 不 如 管状 膜 那样 易 受 控制 , 透 析 的 有 效 面积 也 小 于 
管状 膜 。 实 验 中 样品 量 少 , 用 透析 管 较 方便 ,而 工业 上 大 量 溶液 透析 脱盐 时 ,用 透析 膜 片 
有 利 。 

商品 透析 管 膜 常 涂 甘 油 以 防 破裂 ,并 含有 极其 微量 硫化 物 \ 重 金属 和 一 些 具有 紫外 吸 
收 的 杂质 。 它 们 对 蛋白 质 和 其 它 生 物 活性 物质 有 害 , 用 前 必须 除去 。McBPhie 建议 先 用 50 % 
CRRA NN, Fall 50% 乙醇 ,0.01M 碳酸 氢 钠 溶液 , 0.001M EDTA 溶液 


。 199 + 


表 7-3 不 同 处 理 方法 对 Union Carbide 透析 管 孔径 度 的 影响 


透析 管 型 号 及 处 理 方法 分 子 量 范围 


18 DC 线形 膨胀 和 忌 酰 化 100—2,000 
18 DC 线形 膨胀 2,000—6,000 
18 DC 未 经 处 理 6,000—12,000 
20 DC 未 经 处 理 12,000—20,000 
20 DC 加 压 放射 形 膨 胀 20 ,000— 45,000 


20 DC ZnC!, XbF# 45 ,000—135,000 


RR, RI AR AKRAEK, 基本 可 除 杂 质 ”。 实 验证 明 , 50% 乙醇 处 理 对 除去 具 
有 紫外 吸收 杂质 特别 有 效 。 已 处 理 好 的 管 膜 如 果 不 用 , 可 贮存 于 4 cat. 如 需 长 
期 贮存 ,可 加 少量 倒 须 化 钠 、 氧 仿 以 防 细菌 侵蚀 。 再 用 时 需 用 蒸馏 水 充分 漂洗 ,再 以 透析 
时 用 的 溶剂 麻 洗 , 然后 灌 人 溶剂 ,仔细 检查 ,不 漏 即 可 用 。 


(=) 透析 方法 及 装置 


透析 方法 较 简 单 ,可 将 已 处 理 及 检查 过 的 透析 弘 用 绒线 或 尼龙 丝 扎 紧 底 端 ,然后 将 待 
Bitk A—100 毫升 ) 从 管 口 倒 人 袋 内 。 但 不 能 装 满 , 常 留 一 半 左 右 的 空间 ,以 防 膜 外 咨 
剂 大 量 透 人 袋 内 时 将 袋 胀 裂 ,或 因 透 析 袋 膨胀 , 而 引起 膜 的 孔径 大 小 改变 。 装 透析 液 后 , 
即 紧 扎 袋 口 , 悬 于 装 有 大 量 纯净 溶剂 〈 水 或 缓冲 流 ) 的 大 容器 内 (〈 量 简 或 玻璃 缸 ) 如 图 7- 
16, 7-17 RAO RET EH OF (水 或 盐 ) 可 从 透析 膜 内 透 出 , 直 到 膜 内 外 浓度 相等 。 

如 用 透析 膜 片 ,实验 室 中 简易 装置 也 可 装配 如 图 7-185: 在 二 个 刚好 可 以 互相 套 登 的 有 
| 


7-16, 透 析 袋 透析 简单 装置 图 7-17, 另 一 种 透析 袋 透 析 简 单 装置 


机 玻璃 圆 简 中 间 夹 和 透析 膜 , 短 紧 ,使 透析 膜 表面 平坦 ,然后 平 放 于 漏斗 中 。 漏斗 架 在 烧 
杯 上 ,漏斗 口径 应 比 烧 杯 大 4 一 6 公分 , 烧 杯 高 度 应 能 容纳 漏斗 , 使 其 末端 不 接触 烧杯 底 
部 。 在 烧杯 中 放 人 水 或 缓冲 液 。 液 面 高 度 以 刚 触 及 透析 膜 为 好 , 用 玻璃 正 盖 住 漏斗 ,以 免 
杂 物 污染 。 如 需 冷 却 , 可 在 冰箱 内 进行 。 此 法 简单 ,安全 , 适用 于 少量 样品 脱盐 。 实验 室 
小 型 透析 装置 常 加 上 搅拌 以 及 定期 (或 连续 ) 换 上 新 鲜 溶 剂 ,这 样 均 可 大 大 提高 透析 效果 。 
近来 ,国外 设计 透析 装置 多 是 如 此 。 现 举例 如 下 : 

1 旋转 透析 器 , 在 透析 容器 下 安装 电磁 搅拌 器 。 但 这 只 能 消除 膜 外 溶剂 的 浓度 榜 
度 ,而 不 能 消除 膜 内 溶剂 的 浓度 差 。Feinstein 介绍 的 透析 装置 , 可 使 膜 内 外 两 侧 滚 体 同 时 ”, 


*。200 。 


图 7-18 用 透析 膜 片 透析 简单 装置 图 7-19 旋转 透析 器 简 图 


C 一 一 盛 水 或 缓冲 液 容器 ; A、B 
轴 j; S, S: 一 一 透析 袋 ; Fi F: 
流动 ,使 透析 速度 大 大 增加 ,Feinstein 的 旋转 透析 器 如 图 7-19 Pro, 

图 中 , C 为 装 有 大 量 水 或 缓冲 液 的 容器 (可 用 玻璃 或 塑料 制 成 ), D 为 横 轴 连接 二 个 木 
轮 A,B, 横 轴 末端 为 滑轮 下 , 它 通过 传动 带 与 马达 相连 ,转速 约 4 转 / 分 。 BRB SAS 
put RATE A、B 木 轮 的 两 端 。 当 D 转动 时 ,Si、Sz 即 绕 着 横 轴 作 圆 周 运动 。 由 
于 透析 袋 安装 成 交叉 状 , 与 横 轴 不 平行 ,因此 D 轴 转动 时 透析 袋 中 液体 即 上 下 流动 。 必 要 
时 还 可 在 袋 中 放 几 颗 玻 璃 珠 -(FisFz)。 增 加 袋 内 液体 搅拌 速度 。 轴 D 及 轮 A、B 的 转动 , 
也 对 透析 膜 外 溶液 起 搅拌 作用 。 这 种 简单 装置 可 放 8 一 10 个 透析 袋 , 透 析 速 度 比 图 7- 
16, 7-17 示意 的 装置 约 快 2 一 3 倍 。 

按 上 述 原 理 尚 有 多 种 设计 。 有 的 仪器 将 许多 透析 红 县 挂 在 环 状 贺 简 上 , 圆 简 放 人 盛 
有 溶剂 且 装 置 搅拌 器 的 大 容器 中 ,由 马达 带动 旋转 。 这 种 装置 一 次 可 放 8 SEM. SR 
装 样 液 24 毫升 。 较 大 的 装置 一 次 可 放 16 个 透析 袋 ; 每 袋 装 样 液 220 毫升 。 这 种 装置 国 
外 已 有 生产 。 有 的 仪器 除了 由 鼓 轮 引起 旋转 外 , 还 用 一 凸 转轴 使 透析 袋 产生 10—30° 角 
的 振动 。 这 种 振动 透析 器 透析 0.1M 氧化 钠 仅 需 2 一 3 小 时 即 达到 平衡 。 

2. 平面 透析 器 “, 圆 简 形 透 析 管 虽然 使 用 较 方便 ,孔径 易 控 制 , 但 透析 面积 较 小 。 
Katz 等 介绍 了 平面 透析 器 装置 , 见 图 7-205a。 将 透析 管 装 在 长 方形 塑料 框 内 , 利 用 塑料 
框 把 透析 管 张 开 ,成 为 很 薄 的 平面 透析 器 。 然 后 把 它 的 两 端 连接 到 转动 装置 上 ,通过 电 磁 
转动 器 使 它 缓慢 转动 。 透析 器 外 面 是 盛 有 溶剂 的 玻璃 缸 或 塑料 箱 , 这 种 透析 器 一 -次 即 可 
装 样 液 0.5 一 20 毫升 。 效 率 比 管状 旋转 透析 又 有 提高 。 


图 7-20 平面 透析 器 简 图 
S 一 一 透析 袋 ; 3B 一 一 方形 塑料 框 3 El Ey 


3. 连续 循环 透析 器 上述 各 种 装置 在 膜 内 外 可 透析 物质 达到 平衡 后 必须 更 换 新 鲜 
溶剂 , 才 能 使 可 透析 物质 继续 通过 透析 膜 向 外 扩散 , 通 稼 要 更 换 3 一 4 次 溶剂 , 这 比较 麻 


+ 201+ 


AH; D 一 一 横 
玻璃 珠 


烦 。Hospethom 介绍 的 简单 装置 如 图 7-218”"。 用 一 根 很 长 的 粗 棉 北 缠绕 在 两 端 扎 紧 的 长 : 
透析 管 上 ,棉线 缠绕 的 螺 距 应 适当 ,以 保证 透析 液 有 一 定 流 速 。 深 剂 可 向 棉线 自 上 而 下 流 
动 把 透析 管 中 扩 散 出 的 小 分 子 不 断 移 去 。 用 这 种 装置 , 可 使 50 毫升 0.9 M 硫酸 RIA 
在 18/32 透析 管内 对 蒸馏水 透析 , 7 小 时 后 除去 99 多 的 盐 , 殉 图 7-21s 连续 循环 透析 器 如 
用 水 透析 可 在 冷 室 敞开 进行 。 如 用 缓冲 小 透析 , icici ane femee i 
装置 见 图 7-21 (b)0 


ae 


粗 棉线 


三 角 瓶 


图 7-21 连续 循环 透析 器 

Ca) 开放 式 ; () BHR 5 

连续 透析 装置 有 多 种 , 其 原理 都 是 使 溶剂 更 新 以 加 大 膜 内 外 的 浓度 差 。 提高 透析 速 
Eo KPRERATA BRA), 还 可 用 于 酶 促 连续 反应 。 我 国 轻工业 部 食品 发 酵 工业 
研究 所 试验 天 门 冬 氨 酸 酶 促 合 成 时 , 用 连续 透析 法 使 酶 和 底 物 溶液 分 别 缓慢 流 人 用 半 透 
膜 隔 开 的 压 滤 机 形式 的 连续 透析 器 中 进行 反应 。 可 提高 酶 的 利用 率 和 各 免 浴 人 杂质 。 天 
门 冬 氨 酸 转化 率 达 99 多 以 上 ca。 较 复杂 的 透析 装置 有 : 空心 纤维 透析 器 ` 线 流连 续 透 析 


7-22 “色谱 用 微量 透析 器 


as 202. 


器 、 薄 膜 反 流 连续 透析 器 等 ,其 透析 效率 远大 于 简单 装置 。 

4. 层 析 用 的 微量 透析 器 ”有 时 柱 层 析 收 集 的 各 组 小 量 样品 必须 分 别 进 行 层 析 。 用 
透析 袋 在 同一 条 件 下 同时 透析 小 量 样品 是 很 困难 的 。 Reitz, A. H. 和 Rilet, W. H. 介 
绍 的 方法 是 9: 在 一 块 平滑 的 硅化 橡胶 上 挖 许多 小 洞 〈《 如 图 .7-22), 每 个 洞 可 放样 品 
0.025—0.5 毫升 , 另 在 一 块 对 应 的 有 酒 硅化 橡胶 的 洞 中 放 咨 剂 ,用 平面 膜 把 样品 和 溶剂 隔 
开 , 进 行 透析 。 如 需 移 去 透析 物 , 即 在 溶剂 一 侧 开 一 贱 沟 , 使 透析 液 连 续 流 出 。 安装 时 将 
二 块 橡胶 (中 间 夹 着 膜 ) 用 夹子 紧 固 即 可 。 


. mete 它 使 样 液 和 溶剂 在 膜 两 侧 反 向 缓慢 流动 , 既 有 较 大 的 透析 面积 ,又 


能 使 膜 内 外 溶液 浓度 差 达 到 最 大 限度 , 透 析 效 率 极 高 , 透 析 的 样 液体 积 很 大 。 Craig 和 
Stewart 设计 很 简单 的 反 流 透 析 器 ae, 见 图 7-23。 样 液 由 输入 和 泵 往 和 人 后, 通过 内 管 从 膜 的 
底 端 上 升 。 而 溶剂 从 膜 另 一 侧 上 端 往 下 流动 。 使 膜 两 侧 分 别 形 成 不 同 流 向 的 薄 波 层 。 膜 
REA DATIVE MRD, 可 进一步 提高 透析 效率 。 调节 输入 和 泵 和 输出 泵 的 流 
速 可 以 控制 透析 速度 。Craig 和 Stewart 用 六 种 溶液 测定 透析 效率 ?结果 见 表 7-4。 

6. 减 压 透析 ”其 原理 是 在 渗 出 液 外 抽 真 空 使 膜 两 边 形成 压 差 ,加 速 膜 内 物质 透 出 。 


trl5nmmn” 


‘A7-23 SERBS 
1. 透析 溶液 ; 2. MMAR, 3. 聚 四 气 乙 烯 管 3 4. 支 持 夹 ; 5. 支 持 夹 ; 6. 溶剂 
7 虹吸 管 ; 8 透析 后 保留 流出 口 ; 9. 马达 ; 10. 皮带 : 11. 轴 承 ; 12. 内 管 〈 中 
空 ) 13. 透 析 膜 ;14. 外 管 (旋转 ); 15 RAK; 16. ROM CMS 17.8 
Sum MUR, 18 透析 后 次 出 芒 ; 出 口 


a 203 « 


表 7-4 两 种 不 同 膜 在 25:C 进行 水 层 反 流 透 析 的 比较 结果 ( 慢 泵 速 ) 


No. I8 Visking fi No. 20 Visking 膜 


' HT Hi 
溶质 品 称 Gea 小 除 百分率 aH) OR EL AD 
em | (%) | mem | Bum (%) 
BR (2.46% 107-°M) 1,00 94.2 
FER (1%) 1.16 86.1 } 
FFRAIK (1.92 X107-3M) 0.97 64.0 0.39 1,25 70.5 
INNaCl 1.00 99.7 0.33 1.18 99.7 
3% Tie 1.00 97.9 0.48 1.20 98.7 | 


50% BiRiee 


其 装置 见 图 7-24, AHDXH—* 15—60 KE AY Union Carbide 8 号 透析 管 , 下 端 用 线 “ 
扎 紧 , 放 和 真空 抽 滤 瓶 (F) 内 。 透析 管 上 端 套 塑料 

管 〈T) , 再 通过 黎 皮 塞 (S) PRD SOR 
漏斗 CR) 的 管 口 直接 相通 , 控 制 分 该 漏斗 活塞 
开关 , 把 样 液 加 和 透析 管内 。 抽 真空 后 , 将 抽 波 
瓶 抽 滤 嘴 处 橡皮 管 夹 紧 , 即 可 减 压 透析 。 必 要 时 
可 将 装置 放 人 冰箱 内 透析 至 平衡 。 操 作 时 , 要 预 
先 估计 透 出 液体 积 ,加 上 原 有 溶剂 ,使 抽 滤 瓶 内 最 
高 界面 不 得 超过 〈(L) 处 。 如 选用 其 它 透 析 膜 管 , 

” 应 测试 其 耐 受 压力 (不 得 低 于 一 个 大 气压 )。 在 4 
°C, 700—750 #6 CTorr) 时 , 滤 速 为 0.6 一 0.7 BFL 
水 / 理 米 管 / 小 时 。 此 装置 使 用 方便 。 效 果 很 好 。 
RBH 它 是 近年 发 展 的 新 型 透析 
装置 , 国 外 已 有 商品 。 它 可 兼用 于 透析 和 超 滤 。 
_,, 样 液 经 小 沟 由 中 心 沿 螺旋 浅 流 流向 外 周 , 沟 底 为 
图 7-24 ” 减 压 透析 装置 平面 膜 , 样 滚 边 流动 边 透析 。 当 样 液 流 至 未 端 , 透 

克昌 ONE, Og pl METER. AT RMATOKEKS AFH 
真空 抽 滤 并 影响 * Zeinch, R. A. 等 人 曾 作 详细 评论 aa。 有 

关 装 置 及 原理 请 参看 本 章 超 滤 部 份 。 


0.98 9453 0.40 Pap Re: 93. 工 


超 Tis 


超 滤 是 加 压 膜 分 离 技术 之 一 ,操作 简便 ,成 本 低廉 ,分 离 效率 高 , 且 不 引起 温度 、 离 子 
状态 及 相 的 变化 。 近 来 广泛 用 于 生物 制品 ` 食 品 和 制药 工业 、 三 废 处 理 及 其 它 浓缩 、 脱盐 
及 分 级 分 离 工序 。 至 今 ,国内 外 已 有 很 多 关于 超 滤 原 理 及 应 用 的 专著 ,评论 及 文献 。 

超 滤 原理 和 一 般 过 滤 一 样 , 主要 依赖 于 被 分 离 物 质 分 子 量 的 大 小 、 形 状 和 性 质 不 同 , 
在 一 定 的 压力 差 ( 外 源 No 或 真空 泵 压 ) 下 ,使 小 分 子 能 够 通过 具有 一 定 孔 径 的 特制 薄膜 , 
限额 以 上 的 大 分 子 被 膜 阻 留 ,使 不 同 大 小 的 分 子 得 以 分 离 。 要 在 膜 的 两 边 产生 压 差 , 可 在 
样 小 一 边 加 正 压 或 在 超 滤液 一 边 产生 负 压 。 前 者 应 用 较 多 ,因为 抽 真 空 产生 的 负 压 差 不 


- 204+ 


超过 一 个 大 气压 , 超 滤 效 果 差 。 所 以 超 滤 通常 是 指 外 源 加 压 的 膜 分 离 。 根据 所 加 的 操作 
压 和 所 用 膜 平 均 孔 径 的 不 同 ,可 分 为 微 孔 过 滤 \ 超 泪 和 反 诊 透 三 种 。 
微 孔 过 滤 所 用 操作 压 在 每 平方 时 5 磅 以 下 , 膜 的 平均 孔径 为 500 RB 14 微米 , 用 于 


分 离 较 大 颗粒 。 
加 压 超 滤 所 用 操作 压 为 5 一 100 磅 /时 , 膜 的 平均 孔径 为 10 一 100 埃 ,, 用 于 分 离 大 分 
子 溶质 。 


反 涂 透 作 用 操作 压 比 超 滤 更 大 , 常 达 500 一 2000 磅 /时 , 膜 的 平均 孔径 最 小 , 一 般 为 
10 埃 以 下 ,用 于 分 离 小 分 子 溶 质 。 
mS RSE FLT TA GBA 7-25, 7-264, 


图 7-25 超 滤 〈A) SREB 7-26 ik (A) 与 微 孔 过 滤 
(B) 的 比较 (示意 图 ) (B) 的 比较 (示意 图 ) 


(一 ) 超 滤 过 程 及 装置 

超 涉 在 密封 的 容器 中 进行 外 源 压力 迫使 溶质 通过 薄膜 。 开始 时 溶质 分 子 在 溶液 中 
均匀 分 布 ,后 来 由 于 小 分 子 溶质 通过 膜 ,而 大 分 子 溶质 被 截留 于 膜 面 , 渐 形成 浓度 梯度 , 称 
为 浓度 极 化 现象 。 大 分 子 溶质 在 膜 上 的 堆积 层 或 称 浓缩 层 ), 就 好 似 超 滤 腊 上 附加 的 次 
SR, 因此 , 深 质 涉 过 时 必须 首先 通过 这 层次 级 膜 。 见 图 2-27。 随 着 大 分 子 溶质 堆积 层 
的 加 厚 , 膜 的 选择 分 离 能 力 僵 来 僵 低 , 流 速 也 越 来 越 慢 。 如 用 各 向 同性 微 孔 薄膜 , 经 常会 
堵塞 ,而 完全 亦 失 过 滤 能 力 。 为 此 ,设计 超 小 装置 时 ,都 力求 克服 浓度 极 化 , 增加 流速 提 
高 选择 分 离 效率 。 现 有 装置 一 般 可 分 四 种 类 型 。 

1. 封闭 系统 无 搅拌 式 装置 它 比 较 简单 ,没有 搅 样 装置 ,浓度 极 化 较 严 重 。 而 且 腊 
的 使 用 面积 小 , 港 速 慢 , 常 需 较 大 压力 。 因此 只 适 于 浓缩 小 量 稀 溶液 。 早期 装置 如 图 7- 


。205。 


及 THEA 


超 滤液 
图 7-27 超 滤 过 程 的 浓度 极 化 现象 示意 图 图 7-28 “封闭 系统 无 挠 拌 式 超 滤 装 置 示意 图 

28。 目 前 已 不 常用 。 

2. 封闭 系统 有 搅拌 式 装 置 。” 超 滤 室内 溶液 中 放 铁 芯 搅拌 棒 , 室 外 底部 的 电磁 搅拌 
器 通电 后 可 带动 搅拌 棒 缓 慢 转 动 。 搅 拌 作用 减少 了 溶液 浓度 极 化 现象 ,使 滤 速 大 大 提高 , 
见 图 7-29。 北 京 植物 研究 所 设计 的 搅拌 式 超 庆 器 的 剖 视 图 见 图 7-302”, 超 滤器 由 盖 、 简 身 、 
简 底 三 部 份 组 成 。 盖 用 金属 制 成 , 盖 上 有 加 样 器 和 连接 压缩 气 钢瓶 的 进 气 口 , 以 螺旋 结构 
和 橡胶 垫圈 使 盖 和 简 身 保持 密封 。 简 身 和 简 底 用 有 机 玻璃 制 成 , 简 身 管 壁 厚度 为 4 SEHK 


13 


12 


y= | 
VIDED AAAADP AAA 


图 7-29 封闭 系统 有 搅拌 式 超 滤 装 置 图 7-30 搅拌 式 超 滤 器 剖 视 图 


1. 进 气 口 2. 加 样 口 盖 3. 加 样 口 4. 盖 5. 有 机 玻璃 底 简 


6. 超 滤 膜 7. 尼 龙 布 8. 支 持 板 9. 橡胶 垫圈 10. 塑料 杯 
11. 磁 搅 棒 12. 有 机 玻璃 简 身 13. 橡胶 垫圈 


简 身 底部 装 有 硬 塑料 环 ,密封 在 玻璃 管 中 的 铁 棒 ( 磁 搅 棒 ) 位 于 此 环 上 。 滤 膜 、 尼 龙 布 、 文 
持 板 装 在 简 身 与 简 底 之 间 , 简 身 和 简 底 以 螺旋 结构 和 橡胶 垫圈 保持 密封 ,支持 板 是 有 小 孔 


° 206° 


1 


的 塑料 板 或 不 锈 钢板 。 超 滤器 操作 压力 是 由 压缩 气 钢瓶 经 减 压 器 从 进 气 口供 给 的 。 压 力 
受 减 压 器 控制 。 超 滤器 装 在 磁力 搅拌 器 上 ,由 磁力 搅拌 器 带动 超 滤器 内 的 磁 抄 棒 转 动 , 滤 
出 收 集 在 结晶 亚 内 。 所 用 的 二 醋酸 纤维 超 滤 膜 ,也 是 植物 研究 所 目 制 的 , 超 滤 时 膜 的 有 
效 面积 为 6 厘米 ;压力 为 3 公斤/ 厘米", 8 小 时 内 可 将 100 毫升 的 Mo-Fe 蛋白 浓缩 至 10 
毫升 ,蛋白 质 浓度 由 3 毫克 /毫升 增 至 30 毫克 /毫升 , 这 种 超 着 器 结构 简单 ,使 用 方便 , 国 
内 已 有 不 少 商品 供应 ,用 于 生化 实验 。 

3. 浅 道 系统 超 滤 装 置 ”这 类 装置 使 液体 通过 螺旋 形 浅 道 , 向 与 膜 平 行 的 方向 疲 动 。 
浅 道 底部 有 膜 , 由 于 液体 在 膜 面 高 速 流 动 , 浓 度 极 化 不 显著 。 而 且 液 体 与 膜 接触 的 面积 也 
大 于 一 般 搅拌 型 装置 , 故 有 很 高 滤 速 。 浅 道 系统 见 图 7-31(a), 装 置 见 图 7-31(b)。 超 滤 
后 被 截留 的 大 分 子 溶液 从 浅 道 末端 流出 ,通过 蠕动 泵 再 循环 超 滤 , 见 图 7-31 (b), 最 后 浓 
度 可 达 40 色 。 该 装置 适用 于 大 分 子 混合 液 的 分 级 分 离 , 生物 制备 中 细菌 、 病 毒 、 热 原 的 
让 除 及 生物 大 分 子 溶液 的 浓缩 ,脱盐 等 。 

4. 中 空 纤维 系统 超 滤 装 置 ” ” 它 由 很 多 根 空心 纤维 丝 成 束 地 装配 组 成 。 每 根 纤维 丝 


WEE 


i (表层 ”向 上 ) 


(A) (8) 
7-31 浅 道 系统 超 滤 示 意图 


(A) 超 滤 过 程 。〈B) 超 滤 装 置 


@ 大 溶质 分 子 
© ”小 溶质 分 子 
一 溶剂 

图 7-32 ”空心 纤维 膜 超 滤 示 意图 7-33 PM- 空 心 纤维 膜 横 切 面 扫描 电镜 图 (放大 400 倍 》 


。207 。 


即 成 为 一 个 微细 管 型 膜 ( 相 当 于 一 个 超 滤 单 位 ), 如 图 7-32。 纤 维 丝 横 切面 内 壁 的 “表层 
细密 ,向 外 逐 壮 蔚 松 ,形成 各 向 异性 微 孔 膜 管 结构 。 图 7-33 为 PM- 空 心 纤维 膜 横 切 面 的 
扫描 电镜 图 。 空 心 纤维 管 的 内 径 一 般 为 0.2 毫米 ,有 效 面 积 约 1 厘米 ` ,表面积 与 体积 的 比 
率 极 大 ,所 以 让 速 很 高 。 例 如 DC-30 型 中 空 纤 维系 统 超 凑 装置 共有 三 根 装 有 许多 中 空 纤 
维 膜 管 的 套 简 , 膜 表面 积 达 2.7 米 “, 在 3 个 大 气压 下 让 被 流量 可 达 1 升 /分 。 中 空 纤维 用 
于 透析 、\ 脱 盐 ,不 到 1 小 时 即 可 从 溶液 除去 99% 的 盐 。 装 置 见 图 7-34。 


一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 人、 


图 7-34 中 空 纤 维系 统 超 滤 装 置 简 图 
表 7-5 各 种 超 滤 系 统 滤 出 液 流量 比较 * 


膜 面 积 操作 EE 流量 标准 流量 
(平方 厘米 ) CB /n42) (毫升 /分 ) 【毫升 /分 -厘米 : . 磅 时 ) 

非 搅拌 型 3.4 70 | 0.05  peinee aie 

搅拌 型 39 50 ied 257 

浅 道 型 40 25 ; 0. 008 

中 空 纤维 900 7 ae eee 


* 超 滤 材 料 为 192 牛 血 清白 蛋白 ,用 分 子 量规 格 为 10,000 RAH. 
** 平均 的 透 膜 压力 。 


以 上 几 种 实验 室 超 滤 装 置 的 规格 \, 用 途 及 滤 出 沪 流 量 的 比较 见 表 7-5 及 表 7-61, 


(二 ) 超 滤 膜 的 选择 及 使 用 


商品 膜 的 型 号 其 多。 在 选择 时 ,一般 应 注意 以 下 指标 。 

1. 额定 截留 水 平 ”表示 每 种 超 滤 膜 所 规定 截留 溶质 分 子 量 的 范围 。 在 这 个 范围 内 
绝 大 多 数 溶质 分 子 能 被 膜 截 留 。 截 留 分 子 量 愈 大 , 膜 的 表 观 孔径 愈 大 , 反 之 表 观 孔径 愈 
小 。 一 般 选 用 额定 截留 水 平 稍 低 于 所 分 离 、 浓 缩 的 溶质 分 子 量 。 由 于 额定 截留 水 平常 以 
球状 溶质 分 子 所 得 的 测定 结果 表示 , 故 纤维 状 或 不 规则 的 溶质 分 子 还 应 根据 实际 情况 在 


* 208。 


表 7-6 几 种 实验 室 超 滤 装 置 的 规格 及 其 用 途 


eR | BBE 


最 初 | 最 终 | 直径 
本 全 | REI | 最 低 | 最 高 


1.0 10 
Fs 65 
5.01 200 
400 


J | Ara 
菌 ,低温 操作 


= 


\、| ME BEK 
菌 , 低温 操 作 。 


150 | 138—690 


* oe He} 化 学 药剂 灭 菌 
色谱 柱 线性 洗 脱 波 的 浓缩 低温 操作 4 


FA ik Fe Be Mth » 如 处 理 蛋 
REAR BWR 


’ 


无 限 


1000 | 2000 


PK 
¥ 
st 
, 
gi 


500 | ;无 限 | 0.4 


5000 | 无 限 


BS Bk 


Ket ot 


BU BY 


FEY A 


#6 WH AA SE LDR DVL FLY 5 JL AH 2S Te LZ 7-721. Amicon 厂 
所 生产 的 Diaflo 型 号 的 十 种 超 小 膜 对 20 种 不 同 溶质 的 阻 留 率 及 11 种 空心 纤维 对 八 种 
不 同 溶质 的 阻 留 率 分 别 测定 结果 见 表 7-8(a)、7-8 (b)。 

2. 流 率 ”可 用 在 一 定 压力 下 每 分 钟 通过 单位 面积 膜 的 液体 量 来 表示 《一 般 用 无 离 
子 水 进行 测定 )。 .实验 中 常用 毫升 /厘米 /分 表示 流 率 单位 。 工 业 上 测定 流 率 〈 通 常 加 仓 / 
只 ?分 表示 简称 GFD) 时 , 需 注 明 条 件 才能 比较 。 如 UM、PM、XM50、DM 膜 流 率 
的 测定 规定 时 间 为 5 分 钟 ,压力 为 55 磅 /时 ?, 而 XM300,XM100A 膜 流 率 测定 规定 时 间 
也 是 5 分 钟 ,但 压力 为 10 磅 /时 ?。 流 率 大 小 不 仅 和 膜 的 表 观 孔径 大 小 有 关 , 而 且 和 膜 的 
结构 类 别 有 关 。 例 如 早年 的 各 向 同性 的 微 孔 超 滤 膜 [ 见 图 7-35 (a)] 和 近年 发 展 的 各 向 异 
性 不 对 称 超 小 膜 [ 见 图 7-35(b)、(c)、(d)] 作 比 较 , 虽 然 膜 的 表面 孔径 大 小 一 致 ,但 各 向 
异性 不 对 称 超 小 膜 的 流 率 却 大 得 多 。 它 是 由 很 薄 的 表层 (0.1 微米 或 以 下 ) 和 较 厚 的 多 和 孔 
基层 (200 一 250 微米 ) 粘 合 而 成 。 表 层 非常 薄 , 有 圆锥 形 (或 喇叭 形 ) 的 孔道 ,因此 溶剂 通 透 
性 极 好 ,流量 大 ,不 易 被 溶质 阻塞 。 多 和 孔 基层 厚度 大 ,可 以 增加 膜 的 机 械 强度 。 而 且 ,表层 
膜 选 择 性 高 ,商品 规格 多 ,合成 膜 时 各 种 性 质 易于 控制 ,质量 指标 较 有 保证 。 因 此 ,这 种 超 


。209。 


表 7-7 一 些 常 见 商 品 超 滤 及 透析 膜 的 性 质 


HS 制造 单位 组 成 材料 er bias) 
(100 磅 /时 9 eer Wat 
PEM 膜 Gelman 均 质 纤维 素 60,000 (S48) 
Diaflo UM-0.5 Amicon fae ees, 340 COED 
Diaflo UM-2 Amicon 高 分 子 电解 质 络 合 物 600 Ci) 
Diaflo UM-10 Amicon 高 分 子 电解 质 络 合 物 10,000 (Aj388E 10) 
Diaflo PM-10 Amicon SEES RY 10,000 〈 细 胞 色素 c) 
Diaflo PM-30 Amicon AGKSRD 30,000 (SBR SA) 
Diaflo XM-50 Amicon 烯 类 物质 50,000 (HBA) 
Diafio XM-100A Amicon 烯 类 物质 100,000 (7S REA) 
Diaflo XM-300 Amicon 烯 类 物质 300,000《 硫 铁 蛋 白 ) 
HFA-100 Abcor Inc 非 均 质 纤维 素 10,000 (〈 葡 聚 糖 10) 
HFA-200 Abcor Inc IEW RABE 20,000 (#388 29) 
HFA-300 Abcor Inc 非 均 质 纤维 素 70,000《〈 白 蛋白 ) 
PSAC aaa 非 均 质 纤维 素 750 一 1250 CHE) 
PSED ie 非 均 质 纤维 素 25,000 (a- BRE FL a a8) 
PSDM ake 非 均 质 纤维 素 40,000 〈 卵 白 蛋白 ) 


滤 膜 对 克服 以 往 超 滤 速 率 和 选择 性 都 不 高 的 缺陷 ,起 了 极 重要 作用 。 

3. 其 他 ,” 除 考 虑 额定 截留 水 平和 流 率 外 , 还 应 了 解 各 种 超 滤 膜 的 使 用 条 件 和 注意 
事项 。 例 如 : 

(1) 操作 温度 : UM, XM, HX, OM 型 膜 耐 受 温 度 不 超过 50"c, 而 PM, HP i 
耐 受 温度 可 高 达 120°C, 

(2) 膜 的 无 菌 措施 : 一 般 可 用 5 色 甲醇 、70 匈 乙醇 、 环 氧 乙 烷 CREAM 20%). 
有 的 超 滤器 (如 H1P8, H1P10, H1P100 和 10P100、H10P8 等 型 号 ) 可 高 压 灭 菌 ; 有 的 
超 滤器 (如 HIPS 和 H10P5 等 型 号 ) 则 不 能 高 压 灭 菌 。 

(3) 可 用 的 溶剂 与 禁用 的 溶剂 和 药物 : 不 同型 号 的 膜 也 不 完全 相同 。 需 先 查 明 膜 的 
配伍 性 。 例 如 ,DM 型 膜 禁 用 强 碱 \ 氮 水 \. 肝 、 二 甲 基 甲 酰胺 二 甲 基 亚 硕 、 二 甲 基 乙 酰胺 


。 210° 


(8xX0001) 
Wor TD 


(0T) 
008 WX 


Cor) 


VooTTNX 


(3X 区 对 责 )GM 量 区 轩 各 县 到 一 入 群 全 :zs 届 / 丝 ) 作 于 动 驾 区 各 于 量 半 


86< 
86< 
86< 
66< 
66< 


86< 
86< 
86< 


| | | 


86< 86< 86< 
86< 86< 86< 
86< 86< 86< 
= 66< 66< 
Pr 08 66< 
6 86< 86< 
c6< 66< 66< 
= 66< 66< 
7 56<< 66< 
06 c6< c6< 
09 cg> 6 
ea = 08 
od 06 06 
= = 06 

5 本 二 09 
aa Se 0S 
ae 0 05 
a 0 74 

0 0 0 

0 0 0 

0 0 0 
2 | =e 


(%) *% Ia 一 


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(SL) RBHEVUROMRA opeiq (*) 3-1 % 


“SRW * 
000096 (sol) Hey 
00008y Fe Ml 
00009T (si) Fix 
000Z+T By 
0000TT O11 Shee 
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000SF FARE la 
00055 io tig Ee A 
00SbZ ie fo El 3 A - 
00081 AG 
0009T a — 2 
0021 2 23 BL 
00001 OTL Base 
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OObT Yi 
b6S fay ty 
ZbE me ” 悍 
y0Z AS 
Sol fil Sd -TG. 
ee > Ai S-d 
See, WA SR 


。 211. 


表 7-8 (b) Diaflo 空心 纤维 膜 的 溶质 分 子 阻 留 率 


FEHR # (22)# 
溶质 分 子 
分 子 量 H,P, H,P, Pro H, X50 H,Pi00 
名 一 称 H5Pio 
H,P, HyoP. 31 Ho X50 10% 100 
棉 子 糖 594 0 5 — 一 二 
多 聚 .DL- 丙 氨 酸 | 1,000 一 5,000 65 所 过 es 
胰岛 素 5,000 至 15 0 0 0 
PVP Ky, 10,000 80 70 50 0 0 
肌 红 蛋白 17,000 >98 es 90 30 0 
PVP Kan 40,000 之 98 85 70 50 15 
白 蛋 白 67,000 >98 >98 >98 90 20 
PVP Keo 160,000 >98 >98 >98 | = 70 


* 测定 条 件 : 10psi (0.7 公斤 /厘米 ?)。 
PVP = Polyvinylpyrrolidone 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 。 


图 7-35 不 同类 型 超 滤 膜 的 纵 切 面 模式 图 

a. 各 向 同性 微 孔 膜 , b. 各 向 异性 扩散 膜 , .各 向 异性 微 孔 膜 d. Nucleopore UF 膜 的 显 微 照 相 
和 m-Pyroly XM, HX ARS APS Bld, CA RE PE Coc. PRE Ac A, RA 
甲 基 甲 酰胺 等 ; UM 型 膜 禁用 强 离子 表面 活性 剂 和 去 污 剂 。 可 用 的 溶剂 不 能 超过 一 定 浓 
度 , 如 磷酸 缓冲 液 浓度 不 能 大 于 0.05M, HCL 和 HNO; 溶液 浓度 不 能 超过 10%, MRE 
不 能 超过 -0.5 和 , 碱 的 pH 值 不 能 大 于 12; PM 和 - HP ARRAS SAE MR 
香 族 烃 化 物 、 脂 肪 族 酯 类 、 二 甲 基 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 砚 、m-Pyrol 和 浓度 >10% 的 磷酸 
等 。 

此 外 ,由 于 各 种 膜 的 化 学 组 成 不 同 , 对 各 种 溶质 分 子 的 吸附 情况 也 不 相同 。 使 用 膜 
时 , 应 选择 尽量 少 吸 附 溶质 的 。 某 些 缓冲 液 如 会 改变 膜 对 溶质 的 吸附 能 力 , 就 应 改 用 其 
它 缓冲 液 。 例如 磷酸 盐 缓冲 液 常 增加 膜 的 吸附 作用 , 改 用 三 羟基 甲 基 毛 基 甲 烷 《〈Tris) 
绥 冲 或 琥珀 酸 缓冲 液 , 则 可 减少 溶质 的 损失 和 保证 超 滤 时 溶剂 的 正常 流速 。 


«212° 


| eae 


4. 保存 超 滤 膜 较 稳定 ,如 使 用 适当 ,能 连续 用 1 一 2 年 。 暂 时 不 用 ,可 在 1% PR 
溶液 或 5 和 甘油 溶液 中 保存 ,避免 细菌 侵蚀 及 干燥 。 


《三 ) 各 向 异性 醋酸 纤维 素 超 滤 膜 的 制备 


国外 超 滤 膜 类 型 很 多 ,我国 北 京 、 上 海 等 地 近年 来 也 开始 研制 各 种 超 滤 膜 。 并 已 有 少 
量 商品 供应 市 场 。 

超 滤 膜 可 由 二 乙 基 纤维 素 或 硝 基 纤 维 素 〈Collodion ), 或 二 者 混合 制 成 , 称 为 纤维 性 
膜 。 另 一 种 是 为 适应 医药 、 食 品 工 业 上 灭 菌 的 需要 而 研制 的 非 纤 维 性 膜 ,主要 用 聚 偏 二 氟 
乙烯 、 各 种 游 香 族 多 聚 物 , 尼 龙 等 材料 制 成 。 实验 室 中 需要 的 各 向 异性 表层 超 滤 膜 可 按 
FA Van Oss 的 方法 制备 ca。 中 国 科 学 院 植物 研究 所 制备 CAn 各 向 异性 酯 酸 纤维 素 表 
层 膜 的 方法 如 下 号 ; 

1. 制 膜 材 料 

成 膜 剂 : 三 酷 酸 纤维 素 ( 结 合 酸 54.5 一 56 多 ,粘度 500 HA, LHF). 

溶剂 : 丙酮 (影响 制 膜 液 的 粘度 )。 

PRIN: 甲 酰胺 (影响 膜 的 性 能 )。 

2. 制 膜 液 的 配制 

将 25 克 酯 酸 纤维 素 、100 毫升 丙酮 、80 毫升 甲 酰胺 加 入 密闭 容器 内 , 间 歇 搅 拌 使 其 
溶解 (防止 丙酮 过 量 挥 发 )。 待 醋酸 纤维 素 全 溶 后 ,用 二 层 粗 棉布 、 一 层 尼 龙 布 在 3 公斤 / 
厘米 ?压力 下 过 滤 , 得 痰 黄色 清亮 粘 稠 滤液 , 室温 静 置 12 小 时 , 待 滤液 中 小 气泡 完全 消失 
后 ,立即 制 膜 ( 时 间 过 长 膜 液 变性 , 呈 棕 红色 ,影响 膜 的 质量 )。 

3. 制 膜 方法 

TA: 表面 平滑 的 玻璃 板 或 特制 的 抛光 玻璃 板 数 块 , 乔 膜 刀 可 用 表面 平 直 的 玻璃 管 、 
玻璃 板 或 金属 板 制 成 , 刀 面 平滑 而 穿 ,两 端 缠绕 细 铜 丝 (直径 0.27 SOK) 以 控制 膜 的 厚度 
(经 蒸发 得 水 后 实际 厚度 约 为 0.14 一 0.17 毫米 )。 

制 膜 条 件 : 最 好 在 恒温 (2041°C), UCR WEE 75—80%) 下 进行 , 成 膜 时 冷 浸 
水 温度 控制 在 4 一 5“%C。 

刊 膜 : 将 制 膜 液 倒 在 玻璃 板 一 端 , 用 刮刀 均匀 刊 膜 , 刊 13 X25 厘米 的 膜 约 需 5 秒 
钟 。 刊 膜 后 蒸发 5 秒 钟 ,立即 把 带 膜 的 玻璃 板 淄 人 冰 水 ,一 小 时 后 , 从 玻璃 板 上 取 膜 。 贴 
着 玻璃 板 的 膜 面 为 反面 , 取 膜 后 应 做 上 识别 标记 。 用 膜 时 需 将 正面 向 着 被 超 滤 的 溶液 。 
制 成 的 膜 贮 于 0.02 9 的 释 氮 化 钠 〈NaN3) 的 水 溶液 中 备用 。 

膜 刮 好 后 在 空气 中 停留 时 间 (蒸发 时 间 ) 越 长 , 膜 孔 径 越 小 。 粘 稠 溶液 表面 的 溶剂 蒸 
发 最 快 , 酷 酸 纤维 素 分 子 会 浓缩 形成 微 密 表 层 , 妨 碍 底层 溶剂 蒸发 。 冷 浸 时 溶剂 和 应 加 剂 
逐渐 被 漂洗 出 来 , 酷 酸 纤维 素 分 子 形成 凝 胶 而 沉积 下 来 , 由 于 表层 沉积 作用 最 强 , 故 结构 
更 严密 。 而 底层 沉积 作用 弱 ;结构 较 疏 松 ,形成 较 大 的 孔径 。 这 样 就 形成 了 表层 和 底层 结 
构 不 同 的 各 向 异性 超 滤 膜 。 

Edberg, Bronsen 和 Van Oss 指出 2 ,在 一 定 条件 ( 室 温 ,` 湿 度 、 蒸 发 时 间 \ 冷 浸 温 度 和 
时 间 ) 下 ,改变 甲 酰胺 与 酷 酸 纤维 素 \ 丙 酮 的 配 比 ,可 制备 不 同 孔径 的 膜 。 如 甲 酰胺 和 丙酮 
之 比 为 50/65(V/V) 时 ,可 获得 截留 分 子 量 35,000 的 孔径 ; 甲 酰 胺 与 丙酮 之 比如 为 35/165 
《V/V), 即 可 获得 截留 分 子 量 23,000 的 孔径 。 随 甲 酰 胺 量 的 增加 , 膜 的 孔径 增 大 。 


af kA 


《四 ) 影响 流 率 的 几 个 因素 


除了 上 述 膜 的 结构 性 质 起 重要 作用 外 , 流 率 还 受 以 下 因素 影响 : 

1. 溶质 的 分 子 性 质 ”包括 溶质 分 子 大 小 \ 形 状 和 带电 性 质 。 一 般 来 说 ,比重 大 的 纤 
维 状 分 子 扩散 性 差 ,对 流 率 影响 较 大 。 在 一 定 压力 下 浓缩 至 一 定 程 度 时 ,大 溶质 分 子 很 容 
易 在 膜 的 表面 达到 极限 浓度 而 形成 半 固 体 状 的 凝 胶 层 , 使 流 率 达到 极限 水 平 。 而 且 , 随 着 
凝 胶 层 的 不 断 增 厚 , 原 先 能 透 过 膜 的 小 分 子 溶 质 和 溶剂 也 受阻 碍 ,, 流 率 越 来 越 慢 , 最 后 降 
到 最 低 点 。 反 之 ,比重 较 小 的 球形 分 子 较 易 扩散 , 在 一 定 压力 下 虽 也 形成 浓度 梯度 , 但 不 
易 形 成 凝 胶 层 , 随 着 压力 的 增加 , 流 率 也 有 相应 提高 。 

2. 溶 质 浓度 ”溶液 浓度 对 流 率 有 影响 是 很 易 理 解 的 。 在 一 定 压力 下 , 稀 溶 液 比 浓 溶 
液 的 流 率 高 得 多 , 故 一 般 稀 深 流 浓 缩 至 一 定 浓度 时 流 率 逐渐 下 降 。 用 补充 溶液 来 稀 释 的 
办 法 ,可 以 减少 浓度 极 化 ,增高 疲 率 ,但 却 延 长 了 过 着 时 间 。 如 用 于 大 分 子 脱盐 ,可 在 超 凑 
器 和 压力 源 之 间 加 贮存 瓶 , 内 装 的 新 的 洗涤 液 不 断 补充 到 超 滤器 内 ( 流 率 与 超 滤器 流 率 相 
等 ), 于 是 超 滤器 内 大 分 子 溶 质 浓度 不 变 , 而 小 分 子 溶质 和 盐 类 不 断 被 洗涤 液 洗 出 ,最 后 可 
将 小 分 子 溶质 和 盐 类 脱 尽 。 此 法 已 称 透 凑 或 加 压 透 析 ,, 如 图 7-36o 用 此 法 脱盐 十 分 有 效 。 

进 样 


(a) 
保留 液 


N, aR 溶剂 贮存 瓶 超 滤液 


超 滤液 


7-36, 透 滤 装 置 示意 图 


3. 压力 对 于 具有 高 度 扩 散 性 的 溶质 分 子 和 较 稀 的 溶液 , 增 压 能 增加 流 率 。 但 增 
压 也 常 加 速 浓度 极 化 , 故 开始 增 压 时 流 率 增加 较 快 , 当 压 力 增 至 一 定 程 度 时 , 流 率 增加 便 
减 慢 , 二 者 并 不 成 比例 。 对 于 易 生成 凝 胶 的 溶质 , 一 旦 形成 凝 胶 层 , 增 压 对 流 率 就 不 再 起 
作用 。 因 此 ,对 不 同 溶质 ,应 选择 不 同 的 操作 压力 。 

4. 搅拌 搅拌 可 以 破坏 溶质 在 膜 表面 形成 的 浓度 梯度 , 即 加 快 溶质 分 子 的 扩散 , 减 
少 浓 度 极 化 ,从 而 提高 流 率 。 如 同时 增 压 , 可 大 大 提高 流 率 。 对 于 易 形成 凝 胶 层 的 溶质 , 
效果 更 显著 。 对 抄 拌 产生 的 切 力 较 敏感 的 大 分 子 ( 如 酶 和 核酸 ), 必 须 注 意 控制 搅拌 速度 , 
以 免 破坏 它们 的 活性 。 采用 单程 传送 的 浅 道 系统 的 超 滤 方法 , 有 时 能 避免 这 种 不 良 影 


。214 。 


Tilo 

5. 温度 ”通常 升 高 温度 可 以 降低 溶液 粘度 及 减少 凝 胶 的 形成 。 温度 升 高 , AME 
解 度 通常 也 增加 。 故 升温 可 提高 流 率 , 但 温度 过 高 易 使 活性 大 分 子 变性 。 所 以 考虑 升温 
提高 流 率 时 ,对 不 同 的 溶质 需 严 格 地 区 别 对 待 。 

6. 其 它 Wik pH、 离子 强度 及 溶剂 性 质 等 因素 对 流 率 均 有 影响 。 可 以 认为 , 凡 
能 增加 溶质 溶解 度 或 减少 溶质 形成 凝 胶 倾 向 的 因素 都 能 增加 超 滤 的 流 率 。 


《五 ) 超 滤 的 应 用 


LAH 乳 清 是 用 牛奶 生产 千 栈 和 栈 蛋 白 过 程 中 栈 蛋 白 凝固 收获 后 留 下 的 
Rik, 它 含有 牛奶 中 70 匈 左右 的 营养 成 份 (包括 20% BAK, 极为 丰富 的 乳糖 、 维 生 
素 及 矿物 质 ), 过 去 往往 作为 废水 弃 去 。 七 十 年 代 初 , 全 世界 每 年 约 产生 乳 清 500 亿 磅 。 
因此 , 乳 清 的 回收 不 仅 有 重大 经 济 意义 ,而 且 涉 及 环保 问题 。 采用 超 滤 法 后 , 乳 清 处 理 有 
很 大 改进 。 如 图 3-37 所 示 , 采 用 一 级 超 滤 一 级 反 淆 透 装 置 ,每 天 可 处 理 乳 清二 千 加 伦 ,分 
别 将 蛋白 质 及 乳糖 浓缩 回收 ,除去 约 90 % 7K HP, 


乳糖 浓缩 液 


低 BOD 物质 及 水 份 
7-37 乳 清 处 理 膜 分 离 法 示意 图 


2. 生物 大 分 子 浓 缩 和 脱盐 ” 酶 蛋白质、 核酸 、 多 糖 等 用 超 滤 法 浓缩 的 报道 日 益 增 


To ”其 中 较 多 用 于 酶 类 。 酶 的 回收 率 可 高 达 900, 同时 可 除去 盐 和 低 分 子 杂 质 , 
比 活力 有 较 大 提高 ,是 简单 高效、 经 济 \ 快 速 的 浓缩 法 。Wang,D. 1. C. 等 人 在 1970 年 
报告 了 使 用 UM-10 膜 浓 缩 及 回收 几 种 酶 的 情况 只 见 表 7-9。 


7-9 几 种 酶 UM-10 膜 超 滤 浓 缩 及 回收 率 


开始 体积 | 最 后 体积 | 体积 浓缩 


酶 的 名 称 
(毫升 ) (EF) 倍数 
HEAR 1800 150 (23 
6-+FAL BHR 1000 33 30.3 
REA 1400 310 4.52 
REA we 1320 290 4.56 


1 sag — UR ABI RHE X1 

C1) 回收 率 PEGE x 100 
(2) 对 照样 品 中 479 半 乳 糖苷 酶 活性 因 放 置 过 和 久 受 到 损失 ,故此 值 不 准确 。 
(3) 此 酶 在 11°C 下 过 滤 , 其 它 三 种 酶 在 25 一 26%"c 过 滤 。 


e 215。 


此 外 ,也 有 人 用 超 滤 法 浓缩 病毒 、 多 糖 , 从 尿 中 回收 蛋白 质 激 素 2, 汉 。 用 超 滤 法 浓缩 . 


MOA SE PF cel 2709 碱 性 蛋白 酶 时 , 酶 活力 损失 少 ( 和 5 多 ) ,浓缩 倍数 高 ,节约 能 源 ; 设 备 简 
单 ,还 能 同时 除去 低 分 子 杂质 和 部 份 色素 ”。 

3. 大 分 子 溶质 的 分 级 分 离 与 提纯 蛋白质、 酶 等 大 分 子 用 一 次 超 沽 法 很 难 达到 分 
离 纯化 的 目的 , 需 用 2 一 3 级 超 滤 装 置 , 才能 收效 。 串联 超 滤 装 置 是 根据 截留 不 同 大 小 的 
分 子 来 区 分 的 。 第 一 级 装置 选用 的 膜 分 子 量 截留 值 大 于 第 二 级 , 第 二 级 用 的 膜 分 子 量 截 
留 值 大 于 第 三 级 , 其 余 依 此 类 推 。 然后 用 色谱 分 析 法 测定 各 级 超 沽 装置 的 沥 出 熙 及 保留 
液 中 的 成 份 , 即 可 知 各 级 的 分 离 效果 及 组 份 的 纯度 2。 图 7-38 是 牛乳 乳 请 通过 二 种 不 
同 超 滤 串 联 装 置 (搅拌 型 和 浅 道 型 ) 分 级 分 离 的 色谱 分 析 示 意图 ”。 


搅拌 型 浅 道 型 


人 
CD 只 ”| 她 请 ew 
DRAG | A AD Aik Ne 
"a 


最 后 超 滤液 


图 7-38 ”牛乳 乳 清 用 二 种 超 小 装置 分 级 分 离 示 意图 
表 7-10 二 种 率 联 超 滤 装 置 对 牛乳 乳 清 分 离 的 产量 比较 


组 Be Pee 
额定 膜 闻 隔 分 子 量 范 转 


实际 产量 (%) 理论 产量 (92) 

搅拌 系统 730,000 50.3 1756-53: 
10 ,000—30,000 2.4 38.1 
2,000—10,000 5.7 4.1 
<2,000 41.5 40.1 
小 道 系统 >30,000 24.7 13.2 
10 ,000—30,000 32.8 41.5 
<10,000 42.5 45.2 


Blatt, W. F. 比较 了 二 种 超 滤 串 联 装置 对 牛乳 乳 清 分 离 的 理论 和 实际 产量 , 见 表 7- 
10。 
从 上 表 可 看 出 ,搅拌 系统 超 滤 中 各 级 分 离 所 得 实际 产量 与 理论 值 相差 较 大 ,而 在 浅 道 


。216。 


—— 


系统 中 ,所 得 数据 都 比较 接近 理论 值 。 采 用 浅 道 系统 型 串联 装置 分 部 分 离 的 效果 较 好 。 

4. 超 滤 分 离 与 酶 反应 器 (或 发 酵 ) 联 用 ”把 超 滤 分 离 与 酶 反应 器 联 用 多 见于 酶 促 分 
解 反应 。 将 大 分 子 底 物 变 成 小 分 子 产 物 后 ,被 超 滤 除 去 ,保留 下 来 的 酶 分 子 和 底 物 返回 反 
应 器 再 行 反应 ,连续 除去 底 物 。 反 复 进 行 反 应 ,结果 大 大 提高 底 物 利 用 率 , 减少 酶 用 量 和 
增加 酶 反应 速度 。 超 滤 分 离 与 酶 反应 器 联 用 装置 见 示意 图 7-39"9%。 这 类 装置 已 广泛 用 
于 纤维 素 糖化 蛋白 酶 对 蛋白 质 的 水 解 、 淀 粉 酶 对 淀粉 的 水 解 喇 、 以 及 大 豆 酶 解 产 物 的 分 
nse”. 


底 物 


浓缩 的 酶 及 底 物 


反应 器 


一 一 一 一 一 一 一 


含有 产物 的 滤液 
图 7-39 超 滤 分 离 与 酶 反应 器 联 用 装置 简 图 


图 7-40 超 滤 分 离 与 发 酵 甸 联 用 装置 简 图 


同 理 , 超 滤 与 发 酵 联 用 , 见 图 7-40, 可 以 使 超 滤 回 收 的 营养 物 继续 供给 细菌 利用 , 而 
产物 及 有 毒物 不 断 滤 去 , 以 减少 对 微生物 的 抑制 。 微生物 分 沁 至 胞 外 的 大 分 子 产物 在 超 
滤 时 被 截留 还 是 透 过 膜 ,主要 决定 于 对 膜 的 选择 。 如 果 超 滤 时 营养 物 的 损失 过 多 ,还 需 适 
当 补充 ;以 维持 微生物 正常 生长 环境 。 

Sonoyma 和 WangB4 倍 利用 超 滤 与 发 酵 联 用 装置 连续 培养 溶 组 织 梭 菌 ,使 蛋白 酶 分 沁 
至 胞 外 ;然后 用 Abcor 的 HFA-300 膜 分 离 , 除 去 有 毒 代谢 物 , 结果 酶 和 菌 体 的 产量 都 高 
于 常规 方法 。 

此 外 ;用 吸附 、\ 交 联 \ 共 价 键 合 等 方法 可 将 各 种 酶 做 成 单 酶 膜 或 多 酶 膜 ;已 大 量 用 于 生 
化 分 析 及 食品 医药 工业 em。 


* 317 


三 、 电 渗析 和 离子 交换 膜 电 渗析 540 


(—) 电 渗析 


是 在 半 透 膜 二 侧 加 电极 使 可 透 过 膜 的 带电 物质 彼此 分 开 的 方法 。 可 用 于 大 分 子 溶液 
脱盐 纯化 。 此 法 常 因 电流 作用 产生 大 量 的 热 , 需 要 附加 冷却 装置 才能 保证 透析 正常 进行 6 
此 外 ,通电 时 产生 电 殉 流 ( 即 外 加 电场 使 带电 粒子 与 介质 作 相对 移动 ), 也 常 对 膜 分 离 带 来 
不 良 影响 。 因 此 , 电 涂 析 在 生化 分 离 制备 上 不 如 超 滤 那 样 受 欢 迎 。 

HBA EU 7-414, 容器 中 有 二 块 半 透 膜 隔 成 三 个 室 , 中 心室 放 试 液 , 两 侧 

Mee met 室内 装 纯 净 溶 剂 (一 般 为 水 ), 并 分 别 插 人 正 

缓冲 液 。。 搅拌 器 ”缓冲 液 负电 极 。 通电 后 , 中 心室 内 试 液 的 阳离子 透 

| 过 膜 移 向 阴极 槽 , 阴离子 则 移 向 阳极 槽 。 B 

析 开 始 时 , 因 中 心室 内 离子 浓度 大 ,可 用 较 低 

电压 ,当中 心室 离子 浓度 很 低 时 ,可 适当 升 高 

HE, 以 缩短 透析 时 间 。 实验 室 电 姿 析 常 用 
电压 为 200 一 300 KR, BMRA 50 毫 安 左 右 。 

用 电 涂 析 法 也 可 分 离 一 些 带 有 电荷 的 生 
物 大 分 子 , 如 蛋白 质 和 核酸 等 。 但 具体 操作 
时 , 需 经 凝 胶 电 泳 将 样品 初步 分 开 后 ,再 通过 

1 电 活 析 方法 使 所 需 组 份 与 凝 胶 分 离 。 现 举 电 
渗析 法 分 离 质粒 DNA 一 例 于 后 5a, 

E. coli 8021 (pBR322) 加 氧 霉 素 扩 大 培养 后 ,离心 收集 菌 体 。 用 终 浓 度 为 2 匈 重 结 


晶 SDS 使 菌 体 裂解 。 加 等 体积 苯酚 (水 饱和 并 用 Tris 调 至 pH8.0) 及 一 体积 氧 仿 - 异 


戊 醇 (24:1) 提取 两 次 ,再 用 等 体积 氯仿 - 异 戊 醇 (24:1) 提取 两 次 。 在 水 相 中 加 入 A fe 


积 NaAc (2M, pH 5.0) 及 二 倍 体积 预 冷 的 无 水 乙醇 沉淀 DNA. 使 用 直径 为 1.4 厘米 
的 电泳 管 进 行 制备 电泳 , 每 管 上 样 量 200 微克 DNA, 以 省 乙 锭 为 DNA 定位 指示 剂 
电泳 后 切取 发 荧光 的 含 质粒 DNA 的 凝 胶 薄 片 , 放 人 透析 袋 中 , 在 冰 浴 中 电 闯 析 3 小 时 , 
电流 0.07 安培 , 在 电场 作用 下 质粒 DNA 与 凝 胶 分 开 , 进 和 人 透析 袋 内 的 溶 沪 中 , 吸 出 含 
pBR322 DNA 的 溶液 即 为 成 品 。 


(=) 离子 交换 膜 电 渗析 


离子 交换 膜 电 活 析 器 主要 由 离子 交换 膜 隔 板 , 电 极 及 电 渗析 池 和 外 接 直流 电源 组 成 。 
其 中 离子 交换 膜 最 为 重要 ,, 它 可 以 选择 透 过 或 阻 留 不 同 的 离子 。 离子 交换 膜 的 选择 透 性 
一 方面 决定 于 膜 表面 的 孔隙 度 大 小 ,只 让 小 于 膜 上 和 孔隙 的 物质 通过 ,大 于 膜 上 的 孔隙 的 物 
质 被 阻 留 。 另 一 方面 ,也 决定 于 组 成 膜 的 离子 基 团 ,它们 在 强 电场 作用 下 对 某 种 离子 所 起 
的 吸附 或 排斥 作用 ,能 够 达到 选择 分 离 的 目的 。 如 带 磺 酸 基 团 的 阳 膜 ,在 电场 中 电离 为 带 
负电 的 R-SO; , 它 吸引 和 让 阳离子 通过 ,而 对 阴离子 则 起 排斥 作用 。 同样 , 带 有 季 胺 基 
团 的 阴 膜 ,在 电场 中 电离 为 带 正 电荷 的 R-N*(CNH:) 为 , 它 只 吸引 和 让 阴离子 通过 ,而 对 限 


* 218 。 


ee 


表 7-11 国外 离子 交换 膜 电 渗析 应 用 简况 


* 别 试 验 中 cw t 

高 纯 水 海 ( 咸 ) 水 淡化 

四 蛋白 质 精制 放射 性 废 液 处 理 
糖 类 脱盐 在 清 陪 硫 酸 铁 
液晶 脱盐 A 9 7 es bs eh 

盐 ALE 氨基 酸 脱盐 

FRR He 

同位 素 分 离 海水 浓缩 
铂 、 色 、 人 金 、 钳 分 离 纸浆 票 液 处 理 
茉 与 环 已 烷 分 离 电镀 废 液 中 Ni 和 H,SO, 回收 
电镀 液 回收 人 造 丝 粘性 废 液 回收 
BRA RE 酸 的 回收 
造纸 废 液 回 收 
氢气 酸 分 离 
感光 乳剂 处 理 果汁 脱 酸 改 性 
磷酸 纯化 无 机 和 有 机 药品 制备 
醋酸 钠 电 解 食盐 电解 
硫酸 钠 电解 PRs He a AEE 
i A ACA: Be A Zn-Ni 合金 电 锐 
HERBS Fe 还 原 
铝 渣 回 收 
ERS 


2NaCl + Ca(OH), 
= 2NaOH + CaCl, 
2NaCl + (NH,),CO, 
= Na,CO, + NH,Cl 


电泳 同 价 离子 分 离 电泳 涂 潜 


离子 起 排斥 作用 。 现 以 淡化 海水 时 氧化 钠 的 电 渗析 为 例 , 说 明 电 淆 析 原 理 : 如 图 7-42 所 
A, 许多 阴 膜 和 阳 膜 交替 排列 组 成 多 槽 电 次 析 池 , 在 直流 电场 作用 下 ,Nat 趋向 阴极 并 
与 阳 膜 上 H+ 交换 而 选择 性 地 透 过 阳 膜 ,但 被 阴 膜 所 阻 而 留 于 有 # 符号 的 液 缩 室 中 ; CI 
趋向 阳极 并 与 阴 膜 上 OH- 交换 而 选择 性 地 透 过 阴 膜 , 但 被 阳 膜 阻 留 于 有 # 符号 的 浓缩 
室 中 。 于 是 在 有 和 符号 的 淡化 室 中 ,由 于 溶液 中 NaCtl 含量 减少 而 变 淡 ,而 浓缩 室 中 海水 
NaCl 含量 增加 而 变 为 浓 盐 水 。 各 室 中 淡水 , 浓 盐 水 分 别 由 不 同 管道 排出 ,就 达到 咸 水 
淡化 和 浓 盐 水 用 于 制 盐 的 目的 。 实际 操作 时 还 应 附加 预 处 理 设备 , 淡水 再 除 盐 装置 及 浓 
盐水 再 循环 处 理 等 。 
离子 交换 膜 电光 析 主要 用 于 海水 淡化 与 制 盐 , 工业 上 脱盐 浓缩 。 在 生化 方面 也 常用 
于 蔗糖 \ 柠 样 酸 和 抗菌 素 等 的 分 离 提纯 ,注射 用 水 的 制备 , 蛋白 质 与 氨基 酸 的 脱盐 等 %% 和 。 
六 十 年 代 后 , 离子 交换 膜 电 渗析 用 的 膜 及 各 种 电 淆 析 器 装置 日 新 月 异 。 如 日 本 德 山 
曹 达 公司 生产 的 离子 交换 膜 就 将 近 十 四 种 , 美国 AMF 公司 、 杜 邦 公司 、 英 国 的 Permutit 
公司 等 也 生产 多 种 型 号 的 离子 交换 膜 。 目前 离子 交换 膜 的 品种 繁多 ,根据 膜 上 所 带 活性 
基 团 可 分 为 阳 膜 和 阴 膜 二 大 类 型 。 近 来 按照 不 同 的 分 离 目的 还 发 展 了 许多 不 同性 能 的 离 


。219 。 


EE Oe nr 


图 7-42 ”海水 淡化 离子 交换 膜 电 渗析 示意 图 


子 交换 膜 ,如 磷酸 - 羧 酸 整合 型 膜 , 吡 啶 季 腕 - 羧 酸 两 性 膜 , 用 于 压 奖 (是 一 种 渗析 和 反 活 析 
相 结合 的 新 技术 ) 的 镶 欣 型 膜 , 以 及 无 机 离子 交换 膜 等 。 

离子 交换 膜 电 疾 析 在 国外 的 应 用 情况 见 表 7-1189, 近 年 来 , 国内 离子 交换 膜 的 研制 
及 电 渗析 的 应 用 ;也 发 展 较 快 * 如 上 海 化 工行 业已 生产 多 种 异 相 膜 YR RAR, A 
于 海水 淡化 ,污水 处 理 , 综 合 回收 等 试验 。. 在 生化 分 离 制备 方面 ,上海 酵 母 厂 用 电 奖 析 法 
从 柠檬 酸 发 酵 液 分 离 提 纯 柠 檬 酸 ,1977 年 经 鉴定 认为 可 以 投产 光 。 


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«221° 


第 八 章 结晶 方法 
第 一 节 ”结晶 与 晶体 一 般 性 质 


结晶 是 物质 从 液态 或 气态 形成 晶体 的 过 程 ,但 在 生物 化 学 领域 中 ; 绝 大 多 数 的 物质 的 
结晶 ,都 是 从 液态 通过 一 定 条 件 形成 晶 态 的 。 结 晶 是 物质 分 离 纯化 的 一 个 古老 而 目前 还 十 
分 常用 的 手段 , 它 普 遍 应 用 于 各 种 化 学 制备 工艺 中 ,制备 结晶 物 也 常 作为 结构 分 析 之 用 。 

按照 一 般 结 晶 化 学 原理 串 , 一 个 结晶 应 是 具有 一 定形 状 的 固态 物质 , 这 种 固态 物质 由 
许多 性 质 相 同 的 粒子 (包括 原子 、 离 子 和 分 子 ) 有 规律 地 排列 而 成 。 但 某 些 物质 如 玻璃 和 
树脂 ,外 观 很 像 晶 态 固 体 ,实际 上 是 熔 体 过 冷 而 成 的 无 定形 物质 ,只 因 粘 性 很 大 不 易 变 形 。 
某 些 液体 年 看 起 来 不 像 晶 体 , 但 内 部 结构 明显 地 具有 晶体 空间 排列 规律 性 ,如 某 些 棒状 大 
分 子 晶 体 受 热 转 为 液体 ,或 生物 大 分 子 中 所 结合 的 水 层 都 具有 此 种 规律 性 ,这 种 芒 体 称 为 
流 态 晶体 或 简称 滚 晶 。 滚 晶 是 物质 一 种 特殊 状态 , 即 在 一 定 退 度 内 既 具 有 六 体 的 特性 , 同 
时 又 具有 晶体 特性 的 物质 。 

物质 属于 晶 态 或 非 晶 态 , 主 要 区 别 是 晶 态 物质 的 许多 性 质 〈 如 电学 和 光学 等 性 质 ) 都 
具有 方向 性 , 即 一 个 晶体 在 同一 方向 上 具有 相同 的 性 质 , 在 不 同方 向 上 有 具 相 异性 质 , 称 为 
晶体 各 向 相 异 性 , 非 晶体 则 不 具 此 性 质 。 其 次 是 晶 态 物质 具有 一 定 对 称 性 。 晶体 外 形 对 
称 性 也 是 晶体 内 部 规律 性 的 反映 。 晶体 外 形 结构 的 几何 规律 性 可 以 归纳 成 许多 对 称 类 
型 。 晶体 上 述 这 些 特性 都 是 由 于 组 成 晶体 的 粒子 排列 具有 空间 点 阵 的 周期 性 所 引起 的 。 
所 谓 空 间 点 阵 学 说 , 简 单 地 说 ,就 是 把 构成 晶体 内 部 粒子 的 排列 ,形象 地 比喻 为 一 盘 皖 在 - 
三 维 空间 排列 的 “围棋 子 ”, 而 点 阵 中 每 一 个 点 子 ( 也 称 结 点 ), 便 代表 着 一 个 粒子 或 粒子 
集团 的 重心 , 而 整个 晶体 结构 即 由 每 个 结 点 沿 着 空间 不 同方 向 , 并 按 一 定 距 离 周 期 性 地 
平移 而 成 。 每 一 平移 距离 称 为 周期 , 不 同方 向 周期 不 
同 , 而 每 个 结 点 周围 环境 条 件 是 相同 的 。 空间 点 阵 学 
说 的 建立 ,使 晶体 许多 性 质 得 到 了 合理 的 解释 。 因 此 , 
晶体 的 现代 定义 是 : 许多 性 质 相 同 的 粒子 在 三 维 空间 
有 规律 地 排列 成 格子 状 固体 , 称 为 晶体 。 围绕 晶体 的 
RAF HPA aa, 二 个 晶 面 的 交 线 称 为 晶 棱 。 而 晶 
体 中 每 个 格子 称 为 晶 胞 。 图 8-1 是 尿素 晶体 中 一 个 晶 
胞 , 它 含 有 九 个 分 子 。 一 个 晶体 内 的 晶 胞 之 大 小 ,所 含 

8-1 尿素 昂 胞 示意 图 原子 或 分 子 数目 及 其 分 布 规律 , 可 通过 和 射线 衍射 方 
法 测定 并 计算 求 出 。 

晶体 内 部 有 规律 的 结构 ,规定 了 晶体 的 形成 必须 是 相同 的 离子 或 分 子 , 才 可 能 按 一 定 

距离 周期 性 地 定向 排列 而 成 。 所 以 能 形成 晶体 的 物质 是 比较 纯 的 。 在 生化 制备 中 , 许多 


e。222。 


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* 
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小 分 子 物 质 如 各 种 有 机 酸 . 单 糖 \ 核 童 酸 、 所 基 酸 、 维 生 素 、 辅 酶 等 , 由 于 其 结构 比较 简单 , 
分 离 至 一 定 纯度 后 , 绝 大 部 分 都 可 以 定向 聚合 形成 分 子 型 或 离子 型 的 晶体 。 至 于 如 多 糖 、 
蛋白 质 \ 酶 和 核酸 等 生物 大 分 子 , 由 于 分 于 量 大 ,结构 复杂 , 不 易 定 向 聚集 , 获 得 结晶 就 相 
对 困难 得 多 。 但 生物 大 分 子 都 是 由 相同 或 相似 的 小 分 子 “ 单 体 ” 缩 合 而 成 ,如 蛋白 质 和 酶 
由 三 十 种 -氨基 酸 通过 肽 键 组 成 , 多 糖 类 由 一 种 或 数 种 单 糖 通过 糖 音 键 组 成 , 两 大 类 核 
酸 由 四 种 核 背 酸 通 过 磷酸 二 酯 键 连接 而 成 。 因 此 ,生物 大 分 子 也 具有 形成 晶体 的 能 力 , 但 
这 种 能 力 和 大 分 子 结构 和 外 形 有 很 大 关系 。 一 般 来 说 ,分 子 支 链 较 少 、 对 称 的 比 支 链 多 、 
不 对 称 的 分 子 容易 结晶 ,分子量 越 大 越 难 结晶 ,分 子 量 小 , DAM. 例如 大 多 数 球 蛋 日 和 
酶 蛋白 比较 容易 结晶 , 一 些 大 小 均匀 的 病毒 特别 是 植物 球状 病毒 , 也 比较 容易 得 到 结晶 , 
高 度 不 对 称 的 核酸 大 分 子 ,与 蛋白 质 相 比 则 较 难 结晶 。( 在 一 定 条 件 下 ,小 心 操 作 , 也 可 以 
获得 一 定 结晶 度 的 固体 。) 还 有 一 些 结构 复杂 ,不 对 称 的 核酸 、 蛋 白质 和 多 糖 类 , 迄今 仍 未 
能 获得 晶体 。 

大 多 数 物质 结晶 都 是 在 溶液 中 进行 , 故 晶 格 中 常 含有 一 定 结晶 水 。 无 机 化 合 物 所 含 
结晶 水 的 量 常 在 分 子 式 后 予以 标明 , 如 蓝 碘 写作 CuSo' 5 H:O, 为 硫酸 铜 的 五 水 化 合 
物 。 有 机 化 合 物 及 生物 大 分 子 的 晶体 也 含有 结晶 水 ,如 许多 蛋白 质 和 酶 的 结晶 水 含量 常 
达 10 一 50 多 。8- 乳 球 蛋白 、 麻 仁 蛋 白 、 溶 菌 酶 的 晶体 水 份 分 别 占 晶体 重量 46%, 39.2% 
和 48 匈 ,而 原 肌 球 蛋白 的 长 角 片 晶 中 水 竟 占 总 重 90 多 ,可 见 水 在 蛋白 质 晶体 中 占 的 比重 
相当 大 。 晶 体 的 水 含量 与 晶体 蒸汽 压强 有 关 , 当 晶体 蒸汽 压强 高 于 大 气 蒸汽 压强 时 , 则 风 
化 失去 结晶 水 , 当 晶 体 蒸汽 压强 低 于 周围 大 气压 强 时 , 则 晶体 吸收 空气 中 的 水 分 而 潮解 。 
所 以 一 定 的 水 份 对 维持 晶体 的 结构 是 十 分 重要 的 。 

鉴定 物质 的 晶 态 与 非 晶 态 ,通常 在 光学 显微镜 或 偏光 显微镜 下 观察 其 形状 ,大 小 和 消 
光 现 象 ; 或 者 进一步 用 X 射 线 衍 射 方法 加 以 分 析 鉴 定 。 


第 二 节 ”生化 物质 形成 结晶 的 条 件 5234] 


物质 能 不 能 结晶 主要 决定 于 物质 的 本 性 , 但 具有 一 定 结晶 能 力 的 物质 进行 结晶 时 还 
必须 在 一 定 的 条 件 下 才能 形成 结晶 , 各 种 生化 物质 形成 结晶 时 , 往 往 要 求 一 定 样品 的 纯 
度 , 溶 被 的 饱和 度 和 溶剂 的 性 质 等 三 个 主要 条 件 , 其 中 纯度 和 溶液 饱和 度 是 决定 因素 。 


一 样品 纯度 


所 谓 纯度 是 指 所 需要 的 组 分 与 不 需要 的 杂质 所 占 的 比例 。 杂质 占 比例 越 低 ,, 则 所 制 
备 物 质 的 纯度 越 高 。 物 质 欲 在 溶液 中 析出 结晶 不 论 是 小 分 子 或 大 分 子 均 需 达 到 一 定 纯度 
才能 发 生 。 但 究竟 纯化 到 什么 程度 才能 结晶 , 则 依 各 种 物质 而 异 , 没 有 一 定 的 标准 。 有 些 
样品 虽然 纯度 很 不 高 , 欲 条 件 合适 , 也 可 以 从 混合 液 中 单独 析出 结晶 (如 毛发 水 解 液 中 结 
唱 胱 氨 酸 )。 对 于 大 多 数 的 蛋白 质 来 说 ,一 般 要 求 纯度 常常 达 50 驳 以 上 才 进行 结晶 。 样 品 
的 纯度 对 结晶 的 影响 是 由 于 结晶 过 程 具有 高 度 选 择 的 缘故 。 杂质 的 存在 , 有 的 影响 待 结 
唱 溶 质 在 晶 面 上 的 定向 排列 ,使 结晶 无 法 进行 或 进行 得 很 慢 , 阻碍 晶 核 的 形成 , 有 些 杂质 
还 能 与 结晶 溶质 化 合 或 结合 成 络 合 物 。 所 以 在 结晶 前 总 是 设法 通过 各 种 分 离 纯化 手段 , 


。223。 


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使 样品 达到 一 定 纯度 后 才 进 行 结晶 。、 


有 时 候 某 些 杂 质 吸 附 在 晶体 表面 ,只 影响 晶体 色泽 ,而 不 防 碍 晶体 的 形成 , 这 时 可 加 


少量 (一 般 为 1 一 2 多 ) 的 活性 炭 、 硅 藻 土 、 活 性 白土 等 ,利用 有 色 杂 质 一 般 具 有 较 多 双 键 与 
发 色 基 团 , 容 易 被 这 些 脱色 剂 吸附 的 特点 ,进行 有 选择 地 吸附 再 通过 离心 过 滤 方 法 除去 杂 
质 后 仍 可 以 获得 良好 的 结晶 。 但 使 用 以 上 吸附 剂 时 必须 防止 这 些 吸 附 剂 同时 对 样品 的 吸 
附 。 


结晶 形成 的 条 件 最 主要 的 是 建立 在 溶解 度 改变 的 基础 上 , 因此 找到 了 合适 的 浓度 , 结 
晶 物 的 分 子 或 离子 便 有 足够 的 相 碰 机 会 ,并 按 一 定 速率 作 定 癌 排列 聚集 而 形成 晶体 。 浓 度 
太 高 达 过 饱和 状态 时 ,结晶 物 的 分 子 在 溶 被 中 聚集 析出 的 速度 太 快 , 超 过 这 些 分 子 形成 唱 
核 的 速率 , 便 得 不 到 晶体 ,只 获得 一 些 无 定形 固体 微粒 ,或 虽 得 到 一 些 结晶 ,但 共 帝 物 (或 
杂质 ) 含 量 很 高 。 相 反 浓 度 太 低 , 样品 溶液 处 于 不 饱和 状态 , 结晶 形成 的 速率 远 低 于 晶体 
溶解 的 速率 ,也 不 能 得 到 结晶 。 因 此 只 有 在 稍稍 过 饱和 的 状态 (或 称 低 过 饱和 状态 ) 下 , 即 
形成 结晶 速率 稍 大 于 结晶 溶解 速率 的 情况 下 才能 获得 晶体 。 结 晶 的 大 小 和 均匀 度 和 结晶 
的 饱和 度 有 很 大 的 关系 ,获得 良好 的 结晶 一 般 常 控制 在 饱和 区 以 上 、` 过 饱和 区 以 下 的 稳定 
区 范围 内 〈 见 图 8-2)。 此 时 ,晶体 附近 的 溶液 浓度 接近 于 饱和 状态 ,而 较 外 层 的 溶 洲 为 过 
饱和 状态 ,利用 这 种 浓度 差 使 外 层 待 结晶 的 溶质 向 晶体 周围 扩散 ,最 后 定向 地 沉积 于 晶体 
表面 上 ,使 结晶 逐渐 长 大 。 所 以 , 结晶 开始 时 , 应 使 溶液 处 于 稍稍 过 饱和 状态 以 利于 晶 粒 
形成 ;然后 控制 在 稳定 区 范围 内 ,这 时 形成 新 的 唱 核 较 少 ,主要 使 已 形成 的 结晶 长 大 ; 便 可 
获得 较 大 的 和 均匀 的 结晶 。 

在 过 饱和 区 是 新 唱 核 大 量 形 成 的 浓 集 区 , 虽 核 形成 以 后 没有 一 个 稳定 的 使 晶体 长 大 
的 所 谓 “ 养 晶 区 ”", 于 是 只 得 到 一 些 颗粒 很 小 又 不 均匀 的 晶体 。 过 饱和 度 的 大 小 与 晶 核 生 


成 的 速度 关系 见 图 8-3, 在 图 中 可 以 看 到 ,过 饱和 越 大 , 晶 核 生成 速度 越 快 ,形成 结晶 的 颗 


粒 愈 小 。 晶 粒 过 小 不 仅 影响 分 离 过 庆 上 的 困难 , 而 且 造成 结晶 产 率 和 质量 下 降 。 如 在 味 
精 ( 谷 氮 酸 钠 ) 的 结晶 过 程 中 , 常 保持 溶液 在 04~05C EA, REAR 315~32 度 , 结 
晶 成 长 刚好 在 稳定 区 。 浓 度 过 高 时 ,结晶 波 发 生 混浊 现象 , 表示 新 的 晶 核 大 量 形 成 ,此 时 


品 核 形成 的 速度 


过 他 和 度 一 
图 8-2 晶体 形成 的 浓度 区 域 图 图 8-3 晶 核 形成 速度 和 过 饱和 度 关系 示意 图 


+ 224 。 


wee) Te ea ee 


必须 用 热 的 蒸 汐 水 调节 ,消除 混浊 现象 , 保持 溶 和 被 在 稳定 区 的 浓度 , 方 能 获得 较 大 整齐 的 
结晶 。 

在 晶 核 形成 时 ,如 何 控制 结晶 小 刚好 在 低 过 饱和 度 状 态 ? 在 工业 大 规模 生产 时 , 常 将 
结晶 溶液 浓缩 至 一 定 程 度 , 或 加 人 各 种 沉淀 剂 \ 盐 或 有 机 溶剂 ), 至 溶液 出 现 乳 白色 混浊 , 
即 认为 低 过 饱和 度 已 到 ,而 放置 结晶 。 这 种 粗略 估计 方法 ,对 于 制备 一 般 试剂 药品 用 的 生 
化 分 子 的 结晶 ,已 可 满足 要 求 , 但 对 于 制备 一 些 供 和 射线 结构 分 析 用 的 大 结晶 ( 须 大 于 0.1 
mm 直径 )。 按 常规 方程 ; 当 样 品 发 生 混 浊 时 ,实际 已 超过 最 低 的 过 饱和 度 , 此 时 很 难 取得 
较 大 的 晶体 , 必 须 小 心地 测 出 样品 的 溶解 度 曲线 ,然后 从 中 求 出 最 低 的 过 饱和 度 ; ”或 者 
通过 十 分 缓慢 的 蒸发 和 扩散 作用 ,使 结晶 波 达 到 低 过 饱和 度 后 , 并 保持 溶液 的 稳定 浓度 , 
才 可 获得 较 大 的 单 晶 体 。 关 于 以 蛋白 质 为 对 象 的 一 些微 量 结晶 方法 本 章 后 面 还 将 进一步 
讨论 。 


=, 溶剂 的 选择 


溶剂 对 于 晶体 能 否 形成 和 晶体 质量 的 影响 十 分 显著 , 故 找 出 合适 的 溶剂 是 结晶 实验 
首先 考虑 的 问题 , 一 个 物质 的 结晶 究竟 选用 什么 溶剂 合适 ? 需要 对 此 物质 某 些 性 质 如 溶 
解 度 、 稳 定性 及 温度 系数 等 进行 预 试验 才能 确定 。 对 于 大 多 数 生化 小 分 子 来 说 ,水 \ 乙 醇 、 
甲醇 \ 丙 酮 .氯仿 \ 乙 酸 乙 酯 . 异 丙 醇 丁 醇 \ 乙 醚 、N- 甲 基 甲 酰胺 等 溶剂 使 用 较 多 。 尤 其 是 
乙醇 , 既 具 亲 水 性 ,又 具 亲 脂性 ,而 且 价 格 便宜 安全 无 毒 , 所 以 应 用 得 最 广 。 至 于 蛋白 质 、 
MARS KD FBR HY Tt RR RAE RPA MK, Tris 缓冲 液 和 两 


Ad. Ce 7A kB 8 i AE DE OE aE TT A oe» WU EE RGA ICH , 


FUMLREAA IRE) BRYAN SC PF ie AYA EE BEAK BOTA TTA ER RD MAM 
样品 溶解 度 小 的 溶剂 ,直至 产生 混浊 为 止 , 然 后 放置 或 冷却 即 可 获得 结晶 。 也 可 选用 在 低 
沸点 溶剂 中 易 溶解 ,在 高 沸点 溶剂 中 难 溶解 的 高 低 沸 点 二 种 混合 溶剂 。 当 结 晶 被 放置 一 
段 时 间 , 低 阐 点 溶剂 由 于 慢 慢 蒸 发 掉 而 使 结晶 形成 。 许多 生物 小 分 子 结晶 使 用 的 混合 溶 
剂 有 水 一 乙醇 , 醇 一 醚 ,水 一 丙酮 ,石油 醚 一 丙酮 等 。 

Ree Ae Al TER OO PILATE: 

C1) 所 用 溶剂 不 能 和 结晶 物质 发 生 任何 化 学 反应 。 

(2) 选用 的 溶剂 应 对 结晶 物质 有 较 高 的 温度 系数 , 以 便利 用 温度 的 变化 达到 结晶 
目的 。 

(3) 选用 的 溶剂 应 对 杂质 有 较 大 的 溶解 度 , 或 在 不 同 的 温度 下 结晶 物质 与 杂质 在 溶 
剂 中 应 有 溶解 度 的 差别 。 

(4) 所 用 溶剂 如 为 易 挥发 的 有 机 溶剂 时 ,应 考虑 操作 方便 ,安全 。 工 业 生 产 上 还 考虑 
及 成 本 高 低 , 是 否 容易 回收 等 。 

当然 以 上 条 件 并 不 是 对 每 一 种 物质 都 是 符合 的 。 事物 的 矛盾 总 有 主 次 之 分 , 对 于 未 
知 物 的 结晶 ,溶剂 的 选择 主要 为 了 能 获得 结晶 , 重 结晶 时 才 考 虑 溶剂 其 他 方面 的 性 能 。 对 
于 具有 生理 活性 的 生物 大 分 子 , 溶 剂 对 分 子 活 性 的 影响 〈 即 生物 大 分 子 的 稳定 性 ) 常 是 最 
先 考 虑 的 问题 ,一 般 选 用 温和 的 条 件 下 缓慢 地 结晶 以 及 反复 多 次 地 进行 重 结晶 ,而 不 宜 使 
用 强烈 的 条 件 。 


。 225。 


第 三 节 。 晶 核 形成 及 晶体 生长 的 影响 因素 
一 、 晶 核 的 形成 及 诱导 方法 


晶 核 的 形成 一 般 方法 是 将 饱和 溶剂 冷却 \ 蒸 发 除去 部 分 溶剂 或 者 加 入 沉淀 剂 等 ,使 咨 
液 达 到 过 饱和 状态 , 则 其 中 过 饱和 部 分 的 溶质 便 渐渐 析出 晶 核 。 如 只 由 溶质 分 子 〈 或 离 
子 ) 自 身 定向 聚集 形成 的 晶 核 ; 叫 作 同 相 结晶 化 ” ,这 在 低 过 饱和 的 样品 溶液 中 很 难 发 生 , 
需要 较 高 过 饱和 度 或 放置 较 长 时 间 才 能 产生 结晶 核 ; 故 在 工业 生产 及 实验 常规 结晶 时 , 通 
向 竺 溶液 达到 稍 过 饱和 状态 后 ;, 加 入 同 种 晶 核 , 或 某 些 异 种 固体 微粒 , 使 形成 二 相交 界面 
诱导 晶 核 的 形成 ,这 叫 作 异 相 结晶 化 "。 在 异 相 结晶 化 中 加 晶 种 诱导 结晶 方法 是 最 常用 的 
方法 ,此 法 如 掌握 适当 ,不 仅 缩短 结晶 时 间 * 而 且 所 得 的 晶体 较 大 而 且 均匀 整齐 。 

应 加 品种 诱导 晶 核 形成 的 常用 方法 大 致 如 下 ”: 

C1) 如 有 现成 晶体 ,可 取 少 量 研 碎 后 ,加 入 少量 溶剂 , 离心 除去 大 的 颗粒 ,再 稀释 至 一 
定 浓 度 ( 稍 稍 过 饱和 ) ,使 悬浮 液 中 具有 很 多 小 的 晶 核 ,然后 倒 进 待 结晶 的 溶液 中 ,用 玻 棒 
轻 轻 搅拌 ,放置 一 段 时 间 后 即 有 结晶 析出 。 

《2) 如 果 没 有 现成 的 晶体 , 可 取 1 一 2 滴 待 结晶 溶液 置 表面 玻璃 血 上 , 缓慢 蒸 发 除去 


溶剂 ,可 获得 少量 晶体 。 或 者 取 少 量 待 结 晶 溶 臣 置 于 一 试管 中 , 旋转 试管 使 溶 小 在 管 壁 上 


形成 薄膜 ,使 溶剂 蒸发 至 一 定 程 度 后 ,冷却 试管 , 管 壁 上 即 可 形成 一 层 结 晶 。 在 琉璃 严 或 
试管 壁 上 的 结晶 ,用 玻 棒 刮 下 沾 取 少 量 接种 到 待 结晶 溶液 中 , 轻 轻 搅拌 ,并 放置 一 定时 间 , 
即 有 结晶 的 形成 。 

对 以 光学 异 构 体 进行 诱导 结晶 时 , 加 入 的 晶 种 须根 据 分 离 晶 体 性 质 而 定 。 如 加 入 光 
学 性 质 相 同 的 晶体 , 便 优 先 诱 导 形 成 同 种 异 构 物 的 结晶 。 


此 外 ,有 些 蛋白 质 和 酶 结晶 时 , 常 要 求 加 入 某 种 金属 离子 才能 形成 晶 核 。 如 僚 胰 岛 素 


和 售 铁 蛋白 的 结晶 。 它 们 结合 的 金属 离子 便 是 形成 晶 核 时 必 不 可 少 的 成 份 。 

实验 室 结晶 操作 时 , 人 们 较 喜 欢 使 用 玻璃 棒 轻 轻 刮 探 玻 璃 容器 的 内 壁 , 刮 擦 时 产生 
玻璃 微粒 可 作为 异种 的 晶 核 。 另 玻璃 棒 沾 有 溶液 后 暴露 于 空气 部 分 ,很 易 蒸 发 形成 一 层 
薄 薄 的 结晶 , 再 瘟 人 溶液 中 便 成 为 同 种 晶 核 。 同时 用 玻璃 边 刮 擦 边 缓 慢 地 搅动 也 可 以 帮 
助 溶质 分 子 在 晶 核 上 定向 排列 ,促成 晶体 的 生长 。 | 

最 后 应 该 指出 ,对 加 入 固体 微粒 诱导 形成 晶 核 的 方法 , 需 看 结晶 物质 的 用 途 而 有 选择 
地 使 用 。 如 要 求 纯度 很 高 或 用 和 射线 衍射 结构 分 析 的 晶体 , 结晶 时 异种 晶体 、 玻 璃 微粒 、 
尘埃 ,气泡 \ 变 性 生物 大 分 子 均 应 尽量 除去 。 制 得 的 晶体 的 纯度 才 合 乎 要 求 。 


二 、 影 响 结晶 生成 的 因素 
结晶 的 生成 除 与 溶液 饱和 度 和 溶剂 性 质 等 因素 直接 有 关外 ,还 受 下 列 因素 的 影响 : 


(—) 温度 
温度 对 溶解 度 的 影响 是 人 们 所 熟知 的 ,许多 物质 在 温度 升 高 时 ,溶解度 升 高 , 温度 降 


« 2266 


檐 时, 溶解度 也 随 之 减少 ,但 也 有 例外 。 故 许多 耐 热 小 分 子 物 质 一 般 采 用 高 温 溶 解 ,缓慢 
冷却 结晶 的 方法 。 冷 却 的 速度 及 冷却 的 温度 直接 影响 结晶 效果 , 冷 却 太 快 引 起 溶 被 突然 
过 饱和 , 易 形 成 大 量 结晶 微粒 ,甚至 形成 无 定形 沉淀 。 冷 却 的 温度 太 低 , 溶 小 粘度 增加 ,也 
会 干扰 分 子 定向 排列 不 利于 结晶 的 形成 。 温 度 不 同 , 同一 物质 其 结晶 形态 及 结晶 大 小 , 
质量 也 有 很 大 差别 。 

利用 温度 差 方 法 对 生物 大 分 子 进行 结晶 时 ,更 需 注意 掌握 结晶 的 条 件 , 各 种 蛋白 质 的 
结晶 对 温度 要 求 有 很 大 的 不 同 , 如 触 珠 蛋 白 在 高 盐 浓 度 下 党 需要 比 室温 稍 高 的 温度 才能 
结晶 , 而 血清 清 蛋白 则 需 较 低温 度 下 长 期 存放 才能 结晶 ”。 所 以 很 多 生化 大 分 子 结晶 上 
利用 温度 变化 的 方法 ,很 难 在 理论 上 划 定 标准 ,只 能 根据 实践 而 定 , 不 同 于 一 些 有 机 小 分 
子 物质 。 生 物 大 分 子 整个 分 离 纯化 过 程 ,包括 结晶 在 内 ,通常 要 求 在 低温 或 不 太 高 温度 下 
进行 。 低 温 有 利于 保护 生物 活性 ,尤其 是 使 用 有 机 溶剂 进行 结晶 时 ,要 求 温度 更 低 。 否 则 
由 于 有 机 溶剂 作用 引起 蛋白 质变 性 就 无 法 形成 结晶 。 


<—) pit 


pH 值 的 变化 ,可 以 改变 溶质 分 子 的 带电 性 质 , 是 影响 溶质 分 子 溶 解 度 的 一 个 重要 因 
素 。 在 一 般 情 况 下 ,结晶 溶 沪 所 选用 的 pH 值 与 沉淀 大 致 相同 。 蛋白 质 、 酶 等 大 分 子 结 
aR pH 多 选 在 该 分 子 的 等 电 点 附近 。 如 果 结 晶 时 间 较 长 并 希望 得 到 较 大 的 结晶 时 , 
pH 值 可 选择 离 等 电 点 远 一 些 , 但 必须 保证 这 些 分 子 的 生物 活性 不 受到 损害 。 BML, 
森 本 英 树 等 对 细胞 色素 <《〈 和 氧化 型 ) 的 结晶 条 件 做 了 一 系列 研究 ”。 细胞 色素 “ 浓度 从 
0.17% 至 5.0% 结晶 溶液 所 选用 的 pH 从 5.0、6.0、6.6、7.0、7.6 至 8.0, Hit Bee te AE 
(% hk 67 % B 85% 范围 ,实验 结果 表明 ,细胞 色素 <“(〈 氧 化 型 ) 结 晶 时 最 佳 条 件 为 : 样品 
KEA1%, pH6.0 左右 生成 的 结晶 最 佳 。 细 胞 色素 “〈 氧 化 型 ) 对 pH 值 范围 要 求 很 罕 , 
超过 pH6.6 或 不 到 5.0, 虽 然 增 大 细胞 色素 的 浓度 , 也 得 不 到 结晶 。 当然 对 不 同 蛋白 
质 及 生化 物质 结晶 时 所 要 求 pH 范围 宽 罕 不 一 , 当 视 具体 情况 而 定 。 


(=) 结晶 的 时 间 


唱 核 形成 后 ,在 晶 核 表面 即 密集 着 大 量 待 结晶 的 溶质 ,这 些 待 结晶 溶质 先 铺 满 一 层 晶 
面 后 才 开始 铺 第 二 层 晶 面 , 最 后 得 到 内 部 十 分 整齐 排列 的 晶体 。 

结晶 的 速度 以 单位 时 间 内 在 单位 晶体 表面 上 所 结晶 的 量 来 表示 。 当 结晶 速度 为 一 定 
NY ,单位 时 间 内 总 结晶 量 与 结晶 总 表面 积 成 正比 。 一 定 重 量 的 结晶 所 含 晶 体 数目 全 多 , 则 
总 面积 愈 大 ;单位 时 间 内 总 的 结晶 量 也 愈 大 。 也 就 是 说 生成 晶体 数量 很 多 , 但 颗粒 较 小 。 
所 以 结晶 速度 太 快 ;不仅 结晶 粒 小 , 而且 常 常 含 杂质 量 多 。 因 为 在 重量 相同 的 条 件 下 ,小 晶 
体 的 巨大 的 总 表面 积 对 杂质 吸附 的 机 会 要 比 大 晶体 多 。 故 大 的 晶体 总 比 小 的 晶体 纯净 。 

蛋白 质 \ 酶 等 生物 大 分 子 结晶 时 , 由 于 分 子 内 有 着 许多 功能 团 和 活性 部 位 , 其 结晶 的 
形成 过 程 也 复杂 得 多 。 简 单 的 无 机 或 有 机 分 子 形成 晶 核 时 需要 几 十 个 甚至 几 百 个 离子 或 
分 子 组 成 。 但 蛋白 质 分 子 形成 晶 核 时 ,。 只 有 很 少 几 个 分 子 即 可 。 不 过 这 几 个 分 子 整 齐 排 
列 成 唱 核 时 , 比 几 十 个 几 百 个 小 分 子 \ 离 子 所 费时 间 要 多 得 多 。 所 以 蛋白 质 \ 酶 、 核 酸 等 生 
物 大 分 子 形成 结晶 常 需要 较 长 时 间 , 如 Bernal 和 Crowfoot 在 1934 年 制备 用 于 和 射线 衍射 
的 骨 蛋 白 酶 结晶 花 了 几 个 月 才 完 成 。 现 在 ,由 于 方法 的 进步 ,结晶 一 个 生物 大 分 子 时 间 比 


© 227。 


以 往 少 得 多 了 ,如 最 近 梁 栋 材 等 用 微量 静 置 法 , 在 柠檬 酸 缓冲 液 中 , 培养 出 可 供 和 射线 结 
构 分 析 用 的 B 链 NH, 端 工 -蛋氨酸 牛 胰岛 素 单 唱 , 晶 体 大 小 可 达 1.0X1.0x1.0mm , 外 

BAERT—HK RATA RN”, 当然 不 同 物质 或 不 同 实验 要 求 所 需要 的 结晶 时 间 
长 短 不 同 。 但 欲 得 到 纯净 ,整齐 的 大 结晶 体 都 必需 一 定 结晶 时 间 。 


《四 ) 搅拌 


搅拌 主要 使 晶体 与 母液 均匀 地 接触 , 搅拌 的 快慢 , 对 晶体 大 小 和 均匀 度 有 一 定 影响 , 
搅 太 剧 烈 会 损坏 晶体 并 影响 晶体 的 生长 。 搅拌 速度 太 慢 , 不 能 保持 整个 结晶 器 中 低 过 饱 
和 度 的 恒定 ,甚至 使 大 部 分 晶体 颗粒 都 积 沉 在 容器 底部 , 晶体 生长 不 均匀 , 一 般 工 业 大 生 
产 所 设计 的 搅拌 结晶 装置 ,各 种 搅拌 器 的 搅拌 转 数 多 以 5 一 15 转 / 分 为 宜 。 


第 四 节 ”结晶 衍生 物 及 重 结晶 所 7”] 


一 、 结 晶 衍 生物 


生物 体内 某 些 组 份 ,其 游离 状态 很 难 形 成 结晶 , 可 考虑 先 制 成 结晶 衍生 物 , 然 后 用 其 

他 方法 复原 。 例 如 有 机 酸 类 与 铅 、 钾 、 钠 成 盐 , 某 些 生物 碱 及 具有 碱 性 基 团 的 胺 类 与 有 机 

酸 或 无 机 酸 成 盐 , 均 可 获得 很 好 结晶 衍生 物 , 然 后 通过 适当 方法 使 之 复原 。 有 些 生物 大 分 

子 的 结晶 * 也 可 以 先 通过 形成 无 活性 的 结晶 衍生 物 , 如 酵母 烯 醇化 酶 和 木瓜 蛋 自 酶 与 未 结 

合 , 生 成 无 活性 的 汞 烯 醇化 酶 和 和 汞 木瓜 蛋白 酶 结晶 衍生 物 , 再 经 透析 除去 汞 , 便 可 获得 活 
ERY his BS (CBS A ZK SE 


重 结晶 是 生化 制备 最 后 阶段 常用 的 一 种 精制 方法 , 当 粗 结晶 获得 后 ,再 结晶 则 可 得 到 , 
更 纯 的 产物 。 重 结晶 时 宜 选用 对 制备 物 比较 难 溶 而 对 杂质 较 易 溶解 的 溶剂 条 件 , 有 时 还 
需要 用 二 种 不 同 溶剂 分 别 除去 一 些 彼此 性 质 相 近 的 杂质 和 共 议 组 份 。 并 尽 可 能 利用 如 度 
差 及 其 他 改变 溶解 度 的 因素 ,使 通过 重 结晶 获得 较 纯 的 晶体 。 

如 粗 结晶 中 含有 两 种 以 上 的 成 份 ,它们 在 溶剂 条 件 下 溶解 度 存 在 差别 , 常用 分 步 结晶 
法 使 之 分 离 。 分 步 结晶 时 ,一般 将 粗 晶 中 含量 最 多 的 成 份 , 通过 溶剂 选择 及 温度 差 方法 
使 之 首先 分 离 出 来 , 然后 再 把 留 在 母液 中 其 他 成 份 逐 个 地 处 理 分开 。 分 步 结晶 的 方法 如 
图 8-4- 所 示 : 


实验 操作 时 , 先 将 粗 结 晶 咨 于 少量 选 好 的 咨 剂 中 , 并 经 一 定 操 作 后 , 使 达 稍 过 饱和 状 

态 , 放 置 后 得 结晶 1 。 离 心 或 过 滤 后 与 母液 分 开 , 结晶 工 再 在 新 鲜 的 溶剂 中 重 结晶 , 得 
fe 1A FORK 1A。 再 把 上 一 步 得 到 的 母液 1 浓缩 使 之 析出 结晶 2 和 母液 2 , 然 后 再 使 

结晶 2 与 母液 1 合并 再 结晶 ,得 结晶 2A 与 母 滚 2A。 如 此 交互 进行 再 结晶 , 在 某 一 溶剂 
系统 中 溶解 度 低 的 一 方 得 近似 单一 成 份 的 结晶 物质 , 而 在 另 一 方 的 母液 中 含有 溶解 度 高 
的 物质 ,最 后 通过 鉴定 可 分 别 获得 不 同 组 份 的 晶体 。 

物质 经 过 结晶 与 重 结晶 后 ,所 得 的 晶体 虽然 纯度 有 很 大 的 提高 ,但 还 不 能 说 已 经 达到 
十 分 纯 的 程度 了 。 有 时 须 经 多 次 重 结晶 ,直至 恒定 状态 ,并 通过 各 种 方法 的 鉴定 才能 判断 
晶体 的 纯度 情况 。 鉴定 晶体 纯度 和 鉴定 固态 或 液态 生化 物质 纯度 的 方法 基本 相同 , 但 结 
晶体 常 可 从 外 形 观察 晶 形 是 否 一致 及 色泽 是 否 均匀 加 以 判断 , 另 外 还 可 以 从 下 面 几 方面 
鉴定 其 纯度 : 

1. 熔点 及 熔 距 测定 是 否 符合 规定 范围 。 

2. 层 析 电泳 的 均一 性 的 鉴定 。 

3. 光学 活性 的 物质 的 旋光 测定 及 其 它 光 谱 法 鉴定 。 

4. 生 物 大 分 子 晶体 物质 的 纯度 除 参考 上 述 2, 3 二 点 测定 方法 外 , 还 可 进行 生物 活性 
而 定 。 

以 上 分 析 工 作 均 以 标准 品 为 对 照 , 以 判断 其 相对 ”纯度 ”。 


第 五 节 ”结晶 的 一 般 方法 


在 工业 上 ,结晶 的 方法 在 原理 上 常 分 为 两 大 类 ,第 一 类 是 除去 一 部 分 溶剂 , 如 蒸发 浓 
缩 使 溶液 产生 过 饱和 状态 而 析出 结晶 。 第 二 类 是 不 除去 溶剂 , 而 用 直接 加 入 沉淀 剂 及 降 
低温 度 等 方法 ,使 溶液 达到 饱和 状态 而 析出 结晶 。 实际 上 篆 是 两 者 结合 使 用 较 多 。` 在 实 
验 室 进行 一 些 生 化 组 份 结晶 可 细 分 为 下 列 几 种 方法 : 〈1) 盐 析 法 : 主要 用 于 大 分 子 如 有 蛋 
白质 \ 酶 \ 多 肽 等 物质 的 结晶 。 因 为 这 些 大 分 子 不 耐 热 , 对 pH 变化 及 许多 有 机 溶剂 的 使 
用 均 十 分 敏感 , 而 使 用 中 性 盐 作 为 沉淀 剂 , 降低 这 些 物质 的 溶解 度 而 产生 结晶 , 不 仅 安 全 
而 操作 简便 。 盐 析 结 晶 法 和 本 书 第 三 章 所 讨论 的 盐 析 沉 淀 法 原理 相同 ,并 按照 加 盐 的 方 
式 不 同 而 分 为 加 固体 盐 法 ,加 饱和 盐 溶 小 法 和 透析 扩散 法 22 有 机 溶剂 结晶 法 :此 法 较 稼 
用 于 一 些小 分 子 物 质 的 结晶 ,如 氮 基 酸 、 核 背 酸 类 等 。 固 醇 类 在 有 机 溶剂 中 也 很 易 获 得 结 
晶 。 如 用 一 些 低 极 性 溶剂 提取 固 醇 类 时 , 酯 类 常 被 皂 化 生成 水 溶性 酯 肪 酸 钠 盐 和 甘油 , 固 
醇 类 存在 于 中 性 不 皂 化 部 分 。 此 时 再 用 有 机 溶剂 把 固 醇 抽 提 于 甲醇 或 丙酮 中 , 浓缩 后 很 
快 形成 白色 鳞片 状 结晶 析出 。 某 些 蛋白 质 也 可 以 在 稀 的 有 机 溶剂 中 进行 结晶 , 但 党 保持 
比较 低 的 温度 以 防止 蛋白 质 的 变性 。(3) 等 电 点 结晶 法 : 多 用 于 一 些 两 性 物质 。(4) 其 
它 : 如 利用 温度 差 法 ,加 入 金属 离子 法 等 。 现 以 上 海 东 风 生 化 试剂 三 所 提供 资料 为 主 呈 , 
并 结合 国内 一 些 生 产 单位 近年 来 在 生产 及 实验 中 应 用 的 一 些 结晶 方法 ,举例 如 下 : 


(一 ) 盐 析 法 : 
1. 加 国体 盐 法 
例 : 酵母 醇 脱 氢 酶 的 结晶 

e 2279 0 


100 克 干 面包 酵母 经 磷酸 缓冲 液 提取 , 热 变性 除 杂 和 蛋白, 用 各 种 方法 纯化 至 一 定 程度 . 


后 ,用 冷 丙 酮 况 淀 ,得 配 母 醇 脱 氨 粗 酶 , 沉 证 悬浮 于 50 毫升 含 0.01% BA HA 0.001M 半 
DE BARRE HHA oH 3 Ft 0.001M 磷酸 缓冲 液 (pH7.5) 透析 3 小 时 ,离心 除去 沉淀 。 在 每 
100 毫升 上 清 溢 中 缓慢 加 入 粉末 硫酸 铵 36 克 , 边 加 边 搅拌 , 在 0%c 下 放置 30 分 钟 后 离 
心 。 沉 淀 溶 于 20 毫 升 蒸 饮 水 中 ,再 加 和 人 4 克 硫 酸 铵 粉末 ,离心 。 上 清流 加 入 4 RRB 
末 ( 绥 慢 地 在 几 个 钟头 内 加 完 )。 此 时 溢 液 呈 微 混浊 状 , 冰 箱 放置 直至 结晶 完全 。 

2. 加 饱和 盐 溶液 的 方法 

例 1: 牛 胰 核 糖 核酸 酶 的 结晶 米 

经 纯化 后 的 牛 胰 核 糖 核酸 酶 ,用 70 匈 ee et 1 
克 , 溶 于 1 毫升 水 中 ,稀释 至 2 毫升 。 逐 滴 加 入 饱和 硫酸 铵 至 微 浑 ,然后 加 LV NaOH, 使 
pH 至 4.6,20C 放置 待 析出 结晶 。 若 硫酸 和 狂 浓 度 过 高 时 出 现 沉淀 ,这 种 沉淀 有 时 在 3 一 4 
天 后 能 转化 成 晶体 。 若 沉淀 过 多 ,并 不 变 成 晶体 , 可 逐 滴 加 和 水 促使 转 成 结晶 ,3 一 4 天 后 
结晶 完全 ,得 针 状 晶体 。 

例 2: 溶菌 梅 的 结晶 

初步 纯化 后 的 400 毫克 溶菌 酶 溶解 在 5 毫升 0.04M pH 4.7 的 醋酸 缓冲 液 中 , 缓慢 搅 
拌 5 分 钟 ( 避 免 出 现 泡沫 ) 使 完全 溶解 。 后 慢 加 入 5 毫升 10 多 (W/V) AWB. WH 
边 搅 拌 , 5 分 钟 内 加 完 , 过 滤 。 滤 液 转 到 一 个 塑料 容器 中 ,室温 下 放置 2 天 后 结晶 析出 。 

3. 透析 法 

例 : 羊 胰 蛋白 酶 结晶 

盐 析 法 获得 羊 胰 蛋白 酶 粗 品 , 溶 于 0.4M、pH9 硼酸 缓冲 液 中 , 过 滤 。 滤 液 加 入 等 量 
“结晶 透析 小”(0.4M 硼酸 缓冲 波 与 等 体积 饱和 硫酸 镁 混合 , 以 饱和 碳酸 钾 调 pH8.0), 装 
和 人 透析 袋 内 ,于 0~5%c 对 上 述 结晶 透析 波 透 析 , 每 天 换 结晶 透析 液 一 次 ,3 一 4 天 后 出 现 
结晶 , 7 天 内 结晶 完全 。 


(=) 用 有 机 溶剂 结晶 法 


1. 直接 加 有 机 溶剂 结晶 的 方法 
例 1: 丙 氮 酸 的 结晶 米 


从 层 析 柱 上 收集 已 达 低 层 析 纯 的 丙 氮 酸 溶液 ,合并 后 减 压 浓缩 至 1 体积 , 趁 热 缓慢 


地 加 入 两 倍 体积 热 的 95 多 乙醇 ,结晶 逐渐 析出 。 冷却 放 置 过 夜 , ae aa 
Pl 2:. BARRA EA a * 

Ta 80% 乙醇 搅拌 抽 提 ,上 请 液 浓 缩 除 去 大 部 分 乙醇 ,后 用 水 稀释 ,依次 上 阳离子 
ct te erate 从 交换 柱 下 来 的 糖 液 浓缩 至 比重 1.35 EA. BRAAMA. BA 
后 加 人 等 体积 的 浓 乙 醇 * 边 加 边 抄 拌 ,并 加 入 少量 晶 种 。 放 置 半 个 月 以 上 ,结晶 完全 。 

糖 入 浓 缩 时 ,必须 控制 合适 的 浓度 ; 太 浓 不 易 结晶 ;即使 结晶 ,晶体 质量 也 很 差 。 过 稀 
时 ,结晶 不 完全 。 

例 3 : 赤 霉 素 的 结晶 ; 

5 克 粗 的 赤 霉 素 加 500 毫升 乙酸 乙 酯 加 热 回 流 半 小 时 , 大 部 分 溶解 后 , 脱色 , Wie 
滤波 慢 慢 加 入 1250 毫升 石油 醚 * 即 生成 赤 霉 素 结晶 。 


。 230。 


2. 利用 挥发 性 溶剂 蒸发 结 量 方 法 # 

例 1 : 1- 二 甲 胺 -5- 茶 磺 酰 氧 的 结晶 * 

1- 二 甲 胺 -5- 茶 磺 酸 和 五 氧化 磷 混 研 , 后 滴 和 冰 水 中 。 油 状 物 用 乙酸 乙 酯 抽 提 。 抽 提 
液 用 水 洗 3 一 4 次 ,用 无 水 氧化 钙 干 燥 1 一 2 KR. WRF 40°C 水 浴 中 减 压 浓缩 至 干 , 
得 1- 二 甲 胺 -5- 茶 磺 酰 氧 粗 结晶 。 粗 结晶 用 石油 醚 淤 解 ,过滤 。 滤 液 在 30%c KIS MEI 
缩 至 干 ,得 栖 色 1- 二 甲 胺 -5- 葵 磺 栈 氧 结晶 。 

例 2 : 麦角 固 醇 的 结晶 及 重 结晶 

干 酵母 粉 以 82 一 84 儿 乙醇 搅拌 抽 提 18 一 24 小 时 。 蒸汽 加 热 到 ?0 一 75%C 保温 3 小 
时 ; 冷 至 30%C DI Ftd. MIME 3 次, 过滤。 小 液 合并 减 压 浓缩 得 高 状 物 , 加 5—10% 
的 水 溶解 ,再 加 3 一 5 倍 体积 的 乙醚 , 剧烈 搅拌 2 一 3 小 时 , 静 置 16 一 20 小 时 ,吸出 上 清 液 
于 一 5%C 冰 箱 中 放置 一 天 后 析出 结晶 。 粗 结晶 港 集 后 加 10 倍 量 的 醚 酮 混合 液 , 在 50 一 
54%C 隔 层 水 浴 中 保温 30 一 40 分 钟 ( 间 断 搅拌 ) 静 置 , 后 吸出 上 清 液 于 一 5 "下 放置 过 夜 , 
得 白色 针 状 结晶 。 


(三 ) 等 电 点 结晶 法 


例 : 乙酰 -DL- 色 毛 酸 的 重 结晶 *# 
2.5 公斤 粗 乙 酰 -DL- 色 氮 酸 加 1.2 一 1.3 WF SN 氧 氧 化 钠 溶解 ,40 克 活 性 炭 脱色 后 
Wik. WARE 10°C 以 下 用 冰 酯 酸 调 pH3, 缓 慢 搅拌 即 逐 渐 出 现 大 量 结晶 。 


《四 ) 利用 温度 差 结晶 法 

例 : 葡萄 糖 -1- 磷 酸 负 盐 的 重 结晶 

葡萄 糖 -1- 磷 酸 负 盐 的 粗 结晶 溶 于 20 倍 体积 的 0.05N 盐酸 中 , 过 滤 除 去 不 溶 物 。 清 
RE 80°C 水 浴 中 加 热 到 60—65°C, JAH 1N AML WIA pH7.0, 乘 热 过 滤 除 去 无 机 盐 
Wie. TRIKE 4 CULPA PIE 24 小 时 ,得 葡萄 糖 -1- 磷 酸 饥 盐 的 片 状 结晶 。 
(A) 加 人 金属 离子 结晶 法 


Pl: 铁 蛋 日 的 结晶 法 六 
SDT AY 7k Fh eM RAS 50% 饱和 度 , 沉 淀 后 将 沉淀 再 溶 于 少量 蒸馏 水 中 。 每 


100 毫升 溶液 缓慢 加 入 5 克 固 体 硫酸 锅 , 冰箱 放置 过 夜 , 得 红 褐 色 凌 形 含 锅 的 铁 蛋 白 结 
BH 0 

(ALA * SAH LBRAAEIARN ADR a * 者 摘自 上 海 生化 制 
药 厂 ;上 海 酵母 上 ,武汉 生化 制药 厂 的 生产 工艺 规程 。) 


BAN ”有 关 蛋 白质 结 晶 的 几 项 技术 


一 、 抽 提 结 唱 撤 术 


这 是 Jakoby 介绍 的 一 个 比较 成 功 的 蛋白 质 用 不 同 浓度 硫酸 贸 抽 提 结晶 的 方法 咏 。 当 


。 231。 


蛋 昌 质 被 提纯 至 一 定 纯度 , 经 浓缩 至 每 毫升 含 蛋白 质量 1 一 2 毫克 后 , 加 入 足 量 固体 硫酸 , 


BES ARi. 然后 用 硫酸 铵 由 高 到 低 的 浓度 在 0 附近 进行 抽 提 ,, 按照 蛋白 质 在 硫 
酸 铵 中 低温 溶解 度 大 ,温度 逐渐 升 高 , 溶解 度 反而 减少 的 规律 , 将 低温 抽 提 的 蛋白 质 溶液 
置 室温 中 即 可 析出 结晶 。 

在 分 步 抽 提 中 ,溶解 在 高 浓度 硫酸 铵 中 的 蛋白 质 首先 被 抽 提 ,然后 按 各 种 蛋白 质 在 不 
同 盐 浓度 下 的 溶解 度 差 别 而 彼此 分 离 。 

具体 实验 时 , 先 选 好 已 提纯 蛋白 质 或 酶 的 硫酸 铵 盐 析 范围 。 如 某 一 酶 蛋白 的 硫酸 久 
盐 析 沉淀 范围 在 45 一 60 和 饱和 度 之 间 , 选 用 硫酸 铵 抽 提 的 饱和 度 依 次 为 65、61、58 和 
52%. 如 果 盐 析 沉 淀 范围 为 25 一 35 多 饱和 度 之 间 , 则 选用 硫酸 入 抽 提 的 饱和 度 依次 为 
38、36、34 和 32%。 如 在 实验 中 发 现 所 用 硫酸 铵 浓度 梯度 太 高 或 太 低 , 可 按 实际 情况 加 
以 调整 ,直至 增 减 到 所 需 提 纯 组 份 产 生 结晶 为 止 。 一 般 来 说 , 低温 抽 提 液 转 至 室温 后 , 儿 
小 时 或 几 天 以 后 即 可 出 现 结晶 。 表 8-1 是 一 些 蛋白 质 抽 提 盐 浓度 及 结晶 情况 2s 

Jakoby 法 已 十 分 成 功 地 抽 提 结晶 了 一 百 多 种 酶 蛋白 ,晶体 轴 长 一 般 为 1 一 4 微米 ;最 
大 可 达 50 微米 ,可 供 和 射线 分 析 使 用 。 另 外 , 此 法 对 分 离 纯化 蛋白 质 也 是 十 分 有 用 的 技 
术 。 现 以 微生物 研究 所 用 此 法 抽 提 结晶 红 曲 霉 葡 萄 糖 淀 粉 酶 为 例 , RA Aa ™: 

红 曲 霉 As3,978 的 变异 株 As 3.2199 菌株 生产 的 葡萄 糖 淀 粉 酶 经 过 抽 提 ,硫酸 狠 
(70% 饱和 度 ) 盐 析 沉 淀 ,Sephadex G25 凝 胶 柱 过 滤 脱 盐 , 后 上 DEAE- 纤 维 素 柱 。 所 得 
酶 浓缩 流 对 蒸馏 水 透析 除 盐 ,在 冰 浴 中 慢 慢 加 入 预先 磨 细 的 分 析 纯 硫 酸 铵 达 饱 和 ; 放 冰 箱 
中 过 夜 。 然 后 0 *c 下 离心 , FELAK. 根据 预先 所 作 硫 酸 铵 从 低 至 高 浓度 的 分 步 抽 提 
试验 结果 ,选用 饱和 度 为 60、56、52、509% HiME; 由 高 到 低 浓 度 地 依次 进行 质 提 。 每 
次 抽 提 后 ,将 抽 提 液 放 人 冰 浴 中 20 一 30 分 钟 。 然后 在 0 CBB ts (12,000 转 / 分 ) 20 分 钟 , 


表 8-1 一 些 蛋白 质 抽 提 结晶 的 条 件 


| 盐 浓度 结晶 
甲状 逐 球 蛋白 660,000 一 一 1% NaCl 42,39,37 70 
PREZ Th HK 25% 甘油 十 
BAS 200,000 7.0 |50mM2,3—3#4 5555147543 
(50mM) 基 丙 硫 醇 
Tris 缓冲 液 50mM 3 
羟基 丙 二 酸 半 醛 还 原 酶 一 7.4 55545540535 
(40mM) 基 乙 醇 
磷酸 缓冲 液 30mM 3 
羟基 丙 二 酸 半 醛 还 原 酶 | 104,000 7.0 55545540535 75 
(100mM) Ce 
BERR HK B 
苹果 酸 脱 氢 酶 43,000 7.2 60, 55 35 
(30mM) 
酒石酸 脱氧 酶 55,45,40,35 |, 40 
wh 65550545536 90 
BERR THR 3mM 
FEA Ad aR 76,000 7.2 50,45,40,35 70 
(30mM) Sie Ce 


* 232° 


立即 将 上 清流 倒 人 带 塞 玻璃 试管 中 , 放 人 和 人 4 吧 冰 箱 。 后 每 隔 10 一 12 小 时 交替 放 和 人 7 CM 
4sC 的 冰箱 中 《而 不 是 室温 中 ), 过 5 天 即 出 现 大 量 沉淀 。 继续 在 7sc 长 时 间 放 置 , 每 隔 
1 一 2 周 用 偏光 显微镜 检查 , 数 周 后 出 现 针 状 结晶 及 晶 徐 。 随 着 时 间 的 延长 , 晶 簇 增多 并 长 
大 ,,(50 一 100 微米 ), 由 麦 捆 状 变 成 放射 状 以 至 球状 。 摇 动 试管 可 以 见 到 明显 的 丝光 。 三 
批 结晶 试验 的 结果 如 表 8-2 所 示 。 


表 8-2 用 Jackoby 法 进行 葡萄 糖 淀粉 酶 结晶 情况 


Be AB FR Hh GE HK 
出 现 混浊 的 | 蛋白 质 沉 淀 | 看 到 结晶 


量 (目测 ) | WNC) 


实验 批号 


Bo 


样 


| 一 -一 | 一 | 一 一 | 一 | 一 | 一 一 


部 分 II 
30 毫升 含 蛋白 


1 

质 65 毫克 52 20 he a 胶 冻 状 

50 = rs 

#34} Il 56* 2 >72 + <> 

2 30 毫升 含 蛋白 54 2 1 十 十 十 十 50 

质 100 毫克 52 2 1 十 十 十 十 40 

部 分 I 60 a ae! ml 

30 毫升 含 蛋白 56 >72 - 一 


质 130 毫克 


* 实验 操作 有 失误 。 


二 、 蛋 白质 微量 结晶 技术 


(一 ) 热 盒 技术 一 一 溶解 度 温 度 梯度 法 


热 盒 技术 适合 于 某 些 对 温度 比较 稳定 、 而 在 高 温 中 比 在 室温 下 有 较 大 溶解 度 的 蛋白 
质 。 其 原理 和 利用 温度 差 进行 结晶 相同 ,设计 也 很 简单 ,如 图 8-5 所 示 。 

操作 时 ,, 先 将 蛋白 质 在 较 高 温度 下 溶 于 结晶 介质 中 , 并 装 人 一 带 塞 试管 内 ,试管 悬挂 
于 一 内 装 有 热 水 的 热水瓶 里 。 管 口 露出 水 面 , 以 免 热 水 漫 人 试管 造成 污染 。 然后 把 热 水 
瓶 垂 直 放 置 在 一 木 盒 内 , 盒 内 四 周 用 聚 茶 乙 烯 填 满 ,使 热水瓶 固定 不 动 。 上 面 加 上 木 盖 盖 
紧 , 让 热 盒 缓慢 冷却 , 当 试管 内 的 蛋白 质 溶液 到 达 一 定 温度 即 开 始 析出 结晶 。 

图 8-5 是 用 来 结晶 胰岛 素 的 一 个 热合 装置 。 热 盒 及 蛋白 质 溶液 最 初 均 处 在 50%C 的 
高 温 下 ,新 新 冷 却 至 25%C 时 , 大 的 胰岛 素 结晶 即 开始 形成 。 如 冷却 温度 低 于 20, 溶液 
过 饱和 度 太 大 ,反而 形成 晶体 较 小 。 此 法 曾 成 功 制备 了 胰 高 血糖 素 和 胰岛 素 的 结晶 。 这 
二 种 蛋白 质 在 50°C 低 离 子 强度 缓冲 液 中 都 比较 稳定 和 有 较 高 溶解 度 。 


?233 « 


ET -人 e. 


(二 ) 平衡 透析 技术 
平衡 透析 技术 早 在 1932 年 已 由 Theorell 介绍 并 于 1947 年 由 Boyes 一 Watson 等 人 用 
于 结晶 血红 蛋白 aq。 其 原理 是 通过 一 个 半 透 膜 
区 LLL 把 蛋白 质 溶液 与 外 界 结晶 介质 隔 开 , 膜 只 允许 
小 分 子 和 溶剂 透 过 , 而 阻止 蛋白 质 的 透 过 。 半 
透 膜 可 用 玻璃 纸 或 其 它 一 些 赛 璐 玫 衍 生物 制 
成 , 膜 内 蛋白 质 溶液 的 pH 值 及 离子 强度 可 通 
过 膜 外 介质 的 扩散 进行 调节 , 直至 到 达 蛋 白质 
形成 结晶 时 最 适 的 条 件 为 止 。 此 法 的 优点 是 , 
结晶 条 件 的 变化 可 通过 控制 扩散 作用 , 缓 慢 地 
C 到 达 结 晶 核 化 点 。 使 晶体 的 生长 颗粒 天 ; 整齐 
SOF ES 均匀 。 如 蛋白 质 在 某 种 条 件 下 出 现 无 定形 沉淀 
| RRL TTC DON] 。 和 小 晶体 ,可 以 人 为 地 改变 膜 外 部 咨 液 的 条 件 , 
使 沉淀 溶解 ,再 调整 到 形成 较 大 而 均匀 的 晶体 。 
oR A Sigman 平衡 透析 结晶 法 可 在 不 同 pH 和 不 同 溶剂 条 
ae } 件 下 进行 。 此 法 也 适用 于 某 些 需 要 金属 离子 的 
蛋白 质 结晶 。 操 作 和 一 般 透 析 法 相同 。 方法 并 不 难 , 只 是 需要 耐心 摸 出 结晶 的 适合 条 和 件 
便 可 获得 结晶 , 有 时 在 结晶 形成 后 还 需 进一步 改变 外 部 缓冲 液 的 浓度 及 pH A. ABA 
能 完成 。 平 衡 透 析 方 法 已 成 功 地 用 于 制备 多 种 蛋白 质 的 大 结晶 。 可 作为 常量 结晶 , 也 可 
以 进行 微量 结晶 。 如 Zeppezauer 设计 的 各 种 微量 毛细 管 及 穴 洞 透析 扩散 器 , ORAL 
微 升 , 大 的 也 不 过 几 十 微 升 ,也 就 是 说 , 只 要 一 滴 那 么 多 的 蛋白 质 溶液 便 可 进行 实验 。 其 
装置 形状 举例 如 图 8-6,8-705a9。 
图 8-6 是 一 种 毛细 管 式 扩散 透析 结晶 装置 。 图 8-6(a) 毛细 管 上 的 膜 用 有 三 个 “ 脚 ” 


的 PVC 环 固定 ,使 膜 稍 离开 容器 底部 ,以 免 损 坏 膜 。 操作 时 , 把 装 有 有 蛋白质 溶 芒 的 毛细 


管 垂直 置 于 结晶 介质 中 , 通过 改变 结晶 介质 的 条 件 促 使 毛细 管 中 蛋 白质 结晶 的 形成 。 图 
8-6(b) 是 毛细 管 的 一 端 放大 图 。 各 种 毛细 管 扩散 透析 器 一 般 内 径 为 0.5 一 工 微米 ;长 为 
20 一 50 微米 ,能 装 10 一 30 微 升 蛋白 质 溶液 ,这 对 于 样品 是 十 分 贡 约 的 。 

图 8-7 为 洞穴 式 扩散 透析 结晶 器 ,其 小 室 完 全 使 用 光学 处 理 过 的 玻璃 制 成 ,不 用 取出 
结晶 即 可 直接 用 显微镜 观察 。 因 此 它 比 毛细 管 扩 散 透 析 装 置 更 易 控 制 晶体 生长 时 间 。 


(=) RAT BARA 

待 结晶 溶液 通过 蒸发 作用 使 浓度 增加 ,最 后 达到 过 饱和 度 而 析出 结晶 ,这 是 小 分 子 传 
绕 结 晶 方 法 。 但 简单 的 蒸发 作用 很 难 控 制 饱和 度 并 容易 造成 盐 类 在 母液 中 形成 晶体 , 故 过 
去 较 少 用 于 制备 高 纯度 蛋白 质 结晶 。 近年 来 ,通过 浓 盐 溶液 与 结晶 溶液 蒸发 扩散 的 平衡 
作用 ,使 此 技术 具有 了 更 大 的 灵敏 度 , 用 于 蛋白 质 和 NA 的 结晶 逐渐 增多 所 。 其 方 
法 原理 是 : 先 将 蛋白 质 咨 于 一 个 适当 浓度 ( 低 于 沉淀 所 需 浓 度 的 10 多 左右 ) 的 盐 溶液 中 , 
并 使 蛋白 质 含量 约 为 1 毫克 /毫升 。 另 在 一 大 容器 中 盛 放 高 浓度 的 盐 溶液 ;二 者 同时 置 于 


一 密封 干燥 屁 中 。 于 是 蛋白 质 溶液 中 的 溶剂 ,通过 蒸发 逐渐 转 到 较 浓 的 盐 溶液 中 ,直至 到 , 


as 234。 


tc i i ee ra 


blast > ie 
(b) 


1=30-30mm @=% 0.5mm a<3mm (HH) 
<<1.2mm (高 分 子 ) b 磨 圆 管 口 边 缘 。 
图 8-6, 毛 细 管 扩散 透析 结晶 器 
(a) 毛细 管 扩散 透析 结晶 装置 (>) 毛细 管 磨 圆 的 管 日 边 ( 以 免 磨 玻 透析 膜 )。 


_ 蛋白 结晶 溶液 


(a) 


正面 图 


A8-7 KMART RBH Asa 
(a2) 透析 器 俩 面 及 正面 图 〈b) 透 析 器 全 套装 置 示意 图 
达 平 衡 为 止 5“ 当 蛋白 质 溶液 中 的 溶剂 蒸发 到 一 定 程度 后 , 蛋 白质 便 从 溶液 中 结晶 析出 。 
如 果 结 量 的 介质 不 是 盐 溶液 ,而 是 易 挥 发 的 与 水 混合 的 有 机 溶剂 , 则 不 需要 在 蛋白 质 溶液 
中 先 加 入 有 机 溶剂 (加 入 一 定 缓冲 液 及 调整 pH 值 仍 是 必要 的 ), 通 过 有 机 溶剂 的 燕 发 , 


« 235。 


很 快 便 扩 散 到 蛋白 质 溶液 中 s。。 如 所 用 有 机 溶剂 挥发 性 不 强 , 也 可 事先 加 入 适量 有 机 溶剂 


到 待 结晶 蛋白 质 溶 访 中, 这 样 可 避免 平衡 时 间 过 长 。 当 蛋 白质 溶液 中 的 有 机 溶剂 到 适量 


时 便 开 始 形成 结晶 。 图 8-8 是 二 种 简单 的 微量 蒸发 扩散 结晶 装置 的 示意 图 。 
8-8(a) 为 碟 式 蒸发 扩散 结晶 器 。 用 一 塑料 盒 (或 培养 下) 将 底部 隔 开 二 半 , 一 半 放 


置 浓 盐 流 或 有 机 溶剂 , 另 一 半 放 待 结晶 蛋白 质 溶液 ,一 次 可 结晶 16 个 样品 。 操 作 时 , 先 将 


盛 放 蛋 白质 溶液 的 玻 片 硅化 以 防止 蛋白 质 溶液 的 散 开 。 整 个 装置 密封 后 放置 在 一 定 温 度 
下 ;, 当 蛋白 质 中 溶剂 蒸发 或 吸收 有 机 溶剂 至 一 定 浓度 后 , 即 开始 结晶 。 图 8-8(b) HA 
式 蒸 发 扩散 结晶 器 ,容器 底部 为 浓 盐 液 或 有 机 溶剂 , 上 面 用 一 玻 片 , 其 中 央 加 一 滴 蛋 白质 


溶液 。 反 过 来 盖 住 容器 ,密封 后 即 可 进行 蒸发 结晶 。 此 法 比较 简易 ,容易 操作 。 下 面 以 毕 


汝 昌 、 雷 克 健 等 人 用 微量 气相 扩散 法 对 猪 和 和 牛 [Trp]: 胰岛 素 进行 结晶 为 例 : 
‘aA [Trp]: 胰岛 素 结晶 一 一 微量 气相 扩散 法 忆 
晶体 生长 甲 液 为 0.02NVHC1, 1 BARAK RE KCRW 0.07 SAME 30% 


丙酮 , 0.2M tree WOM EKA [Tip]” 胰岛 素 晶 体 , 乙 液 的 pH 分 别 调 至 6.9 和 7.70. 
生长 晶体 时 将 甲乙 二 流 等 体积 混合 , 按 每 滴 5 一 100 微 升 分 开 滴 在 预先 硅化 的 康 维 亚 内 


#83 X 射线 衍射 研究 用 的 一 些 生物 高 聚 物 的 结晶 方法 5 


生物 高 聚 物 结晶 方法 和 条 御 
RERE (rabbit muscle) 高 离子 强度 分 步 结晶 法 
Rw 
Mika piscine 5 在 低 离子 强度 下 加 入 乙醇 
POT la teak ethylicum) 缓慢 地 平衡 到 高 离 了 强度 
ASR (human L-type) 低 离子 强度 ;微细 管 平 衡 透析 法 
ASS Sas 低 离 子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 
人 血浆 铜 蓝 蛋 白 低 离子 强度 ;等 电 点 附近 缓慢 蒸发 结晶 
ee ee ey 高 离子 强度 分 步 结晶 法 ,或 平衡 透析 法 
PH Oe 高 离子 强度 ;平衡 透析 法 
Chay see a pH6.4--6.8, 高 离子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 
谷 氨 酰胺 合成 酶 〈E。coD2) 高 离子 强度 分 步 结 晶 法 
WL (sperm whale) 高 pH 值 和 高 离子 强度 分 步 结晶 法 
‘MB (una) 高 离子 强度 分 步 结晶 法 


高 离子 强度 ,缓慢 蒸发 结晶 法 


蛋 Aa BK 
(Penicillium janthinellum) 


iss at. 
i a I ie ere 405) 高 离子 强度 微细 管 平衡 透析 法 


高 离子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 


蛋 旦 & 
(Strain of Arthrobacter) 


原 肌 球 蛋白 Cabbit muscle) 中 度 的 高 离子 强度 , 平 衡 透析 法 
甲状 腺 球 蛋 白 高 离子 强度 ,温度 梯度 结晶 法 (Jackoby 法 ) 
转移 RNA 溶剂 平衡 或 等 温 蒸 馏 ,再 助 以 温度 梯度 法 
转移 RNA 分 步 结 晶 
硫 氧 化 蛋白 (EL. col#) 在 等 电 点 附近 ,微细 管 平衡 透析 法 
番茄 丛 缩 病 毒 高 离子 强度 ,分 步 结 晶 法 


CGE: 本 表 中 所 列 作者 文献 从 略 ) 


s 236。 


Eee ee 


一 滴 20ul RAR 
溶液 在 结晶 介质 中 


图 8-8 微量 蒸发 扩散 结晶 装置 示意 器 


室 , 再 将 10 毫升 的 乙 液 置 于 康 维 秋 外 室 中 ,然后 盖 上 玻璃 片 , 加 真空 油脂 封 密 , 于 培养 箱 
放置 1 至 数 周 , 即 形成 晶体 ,大 小 为 0.5 至 0.7 毫米 的 单 晶 , WBABBABL, BEX 
线 结构 分 析 之 用 。 

微量 结晶 方法 还 有 多 种 装置 ,由 于 篇 幅 限制 ,这 里 就 不 一 一 介绍 了 。 微量 结晶 法 的 优 
点 是 使 用 样品 较 少 ,所 得 的 蛋白 质 结 晶 较 大 ,可 用 使 入射 线 衍射 的 分 析 。 关 于 专 供 和 射线 
衍射 用 的 一 些 生物 大 分 子 的 结晶 方法 和 条 件 可 参考 表 8-3。 


Se Oe aR 


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N. Y. (1971) 

毕 放 昌 , 雷 克 健 等 ; 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ,14(1),35(1982) 


238 。 


第 九 章 浓缩 与 干燥 
A 文 
第 一 节 浓缩 2 


浓缩 是 从 低 浓 度 的 溶液 除去 水 或 溶剂 使 之 变 为 高 浓度 的 溶液 。 生 化 制备 中 往往 在 提 
取 后 和 结晶 前 进行 浓缩 。 加 热 和 减 压 蒸发 是 最 常用 的 方法 。 一 些 分 离 提纯 方法 也 能 起 浓 
缩 作 用 。 例 如 , 吸收 法 用 亲 水 凝 胶 很 容易 吸收 稀 溶 液 中 的 水 分 而 得 到 浓 溶 液 。 超 滤 法 利 
用 半 透 膜 能 够 截留 大 分 子 的 性 质 , 很 适 于 浓缩 生物 大 分 子 。 离子 交换 法 与 吸附 法 使 稀 溶 
流通 过 离子 交换 柱 或 吸附 柱 , 溶 质 被 吸附 以 后 , 再 用 少量 外 体 洗 脱 、 分 部 收集 能 够 使 万 需 
物质 的 浓度 提高 几 倍 以 至 几 十 倍 。 此 外 ,冷冻 融化 加 沉淀 剂 、 溶 剂 萃取 、 亲 和 层 析 等 方 
法 也 能 达到 浓缩 目的 。 有 些 方法 已 在 各 章 中 分 别 介绍 , ASR ET AR Ae BR 
缩 。 


Fay ORR BR 


蒸发 是 溶液 表面 的 水 或 溶剂 分 子 获得 的 动能 超过 溶液 内 分 子 间 的 吸引 力 以 后 , 脱 离 
液 面 进入 空间 的 过 程 。 可 以 借助 蒸发 从 溶液 中 除去 水 或 溶剂 使 溶液 被 浓缩。 
影响 蒸发 速度 的 因素 如 下 : 
1. 首 先是 温度 。 溶 芒 受 热 后 ,分 子 动能 增加 ,蒸发 加 快 。 
2. 其 次 是 蒸发 面积 和 溶剂 的 蒸气 压 。 恒 温 时 蒸发 情况 可 以 表示 为 : 
SG 一 日 
上 


凸 为 单位 时 间 的 蒸发 量 , 

$ 为 液体 的 蒸发 面积 , 

P 为 波 面 所 受 的 压力 , 

F 为 某 一 温度 时 溶剂 的 饱和 蒸气 压 , 

f 为 某 一 温度 时 溶剂 的 实际 蒸气 压 。 

由 上 式 可 见 : 

CQ) 当 气压 与 敬 发 面积 恒定 , 而 液 面 的 溶剂 蒸气 压 达到 包 和 时 , F 一 f, 压 差 为 0, 
蒸发 停止 。 妥 加 大 了 与 上 之 差 , 就 应 该 不 断 地 移 去 液 面 蒸气 。 采用 气流 吹 散 或 使 蒸气 准 
凝 的 方法 都 很 有 效 。 

(2) 加 大 蒸发 面积 (例如 采用 薄膜 蒸发 ) 可 以 增加 蒸发 量 。 液 体 沸 腾 也 能 加 大 蒸发 面 
积 。 这 时 气 化 不 限于 小 面 ; 液 内 的 气泡 表面 也 能 气 化 。 

《3) 压力 与 蒸发 量 成 反比 。 减 压 蒸发 是 比较 理想 的 浓缩 方法 。 因 为 减 压 能 够 在 温度 


。 2396 


不 高 的 条 件 下 使 蒸发 量 增 加 ,从 而 减 小 加 热 对 物质 的 损害 。 
总 之 ,实验 室 和 生产 单位 在 设计 蒸发 装置 时 要 考虑 适当 加 热 、 增 大 液体 面积 、 减 压 与 


MRS Ait ah S AR o 


(—) ERZRARANDDE 
1. 常 压 蒸发 ” 即 在 常 压 下 加 热 使 溶剂 蒸发 ,最 后 溶 洲 被 浓缩 。 方 法 简单 ,但 仅 适 于 


浓缩 耐 热 物质 及 回收 溶剂 。 

(1) 装置 

(a) 浓缩 而 不 需 回收 溶剂 ,可 用 蒸发 严 。 

(>) 在 浓缩 的 同时 回收 溶剂 , 则 应 在 装 液 容器 与 接受 器 之 间 安 装 冷 凝 管 使 溶剂 的 蒸 
” 气 冷 凝 。 

(2) 操作 注意 事项 | 

@) 需 用 圆 底 蒸馏 瓶 。 装 液 量 应 不 超过 蒸馏 瓶 的 1/2 容积 。 以免 沸 腾 时 溶液 雾 滴 被 
蒸气 带 走 或 溶液 冲 出 蒸馏 瓶 。 

(b) 加 热 前 需 加 少量 沸石 (或 碎 磁 片 、 小 的 磨砂 玻璃 珠 、 一 端 封闭 的 毛细 管 等 )、 使 深 
液 不 致 因 过 热 而 暴 沸 。 暴 沸 易 使 液体 冲 出 ,或 使 蒸馏 瓶 压力 陡 增 而 致 破裂 。 蒸发 过 程 中 


如 沸石 因 空 气 去 尽 而 失效 , 需 停止 加 热 待 溶液 冷却 后 , 补 加 或 更 换 讲 石 , 因 讲 石 中 有 空气 ,- 


DA Re 1H 5 | 1 AE FE o 
(c) 操作 时 先 接 通 冷却 水 。 冷 却 水 的 流速 容易 受 水 压 变化 的 影响 ,要 及 时 调节 。 


在 P 毫米 未 柱 时 常 压 沸点 ,C (校正 到 760 


观察 到 的 沸点 ,C 毫米 尔 柱 时 的 沸点 ) 
也 a 六 
400 A B 
Can SE 
1200 
600 600 € 1100 
300 1000 
500 
ae 900 
800 
400 
700 
200 400 
300 = 600 
500 
300 200-# 400 
300 
100 200 100 


100 


图 9-1 压力 -温度 直线 图 


e 240 。 


(d) 选用 适当 的 热 洽 , 避免 直接 火焰 加 热 。 流体 沸点 低 于 85°C 可 用 水 浴 或 蒸气 浴 , 
高 于 85°C 常用 油 浴 。 蒸馏 瓶 温 和 人 热 浴 应 使 内 外 该 面 大 致 接近 。 瓶 底 与 热 浴 底 保持 一 定 
距离 ,以 免 碰 碎 。 

Cc) 热 浴 温 度 较 溶剂 沸点 高 20 一 30%C HH, 温度 过 高 使 蒸发 速度 太 快 , 蒸馏 瓶 内 的 
蒸气 压 超过 大 气压 以 后 易 将 瓶 塞 冲 开 ,人 锡 出 大 量 蒸气 ?甚至 使 疗 馏 瓶 炸 裂 。 处 理 低潮 点 易 
燃 或 有 毒物 时 更 应 注意 。 否 则 引起 燃烧 或 爆炸 将 造成 严重 事故 。 此 外 , 过 热 还 容易 使 被 
浓缩 物 分解 或 变性 。 

@) 如 果 出 现 大 量 气泡 ,可 以 考虑 加 入 少许 醇 类 (例如 辛 醇 ) 或 其 它 消 泡 剂 。 

2. 减 压 蒸发 ”与 常 压 蒸发 相 比 ,此 法 所 需 温度 低 而 蒸发 速度 快 , 适 于 浓缩 不 耐 热 的 
物质 。 其 原理 是 使 液 面 压力 降低 。 而 压力 降低 , 痢 点 也 就 降低 ,于 是 蒸发 加 快 。 

从 压力 -温度 直线 图 可 以 了 解 溶剂 沸点 与 真空 度 的 关系 。 

使 用 图 9-1 时 ,可 用 小 尺 通过 表 中 二 条 直线 上 的 各 一 个 数据 点 连 成 直线 ,并 且 使 它 延 
长 与 第 三 条 线 相交 ,就 能 得 到 第 三 个 数据 点 。 

从 已 知 真空 度 可 求 得 在 该 真空 度 下 溶剂 的 沸点 。 例 如 某 流体 在 常 压 下 沸点 为 100"C, 


要 求 得 在 减 压 至 压力 为 50 毫米 汞 柱 时 的 沸点 。 用 小 斥 通 过 了 B 线 的 100%c 点 和 C 线 的 50 , 


毫米 冬 柱 点 ,可 以 看 到 小 尺 与 直线 全 相 交 的 点 为 20%C。 由 此 得 知 , 该 液体 在 50 SKRE 
ED FHAX 20, 


要 求 溶剂 沸点 不 得 超过 某 一 规定 温度 时 , 也 可 求 出 所 需 的 真空 度 。 例如 某 溶剂 在 常 


压 下 沸点 为 100%cC, 希望 在 20*C 蒸 出 ,同样 可 在 C 线 上 得 知 真空 度 应 达到 50 SKRES 

(1) 装置 : 

(a) 普通 减 压 加 温 蒸 发 器 :, 示 意 装置 见 图 9-2。 加 热 容 器 需 用 圆 形 或 圆锥 形 烧 瓶 , 
先 将 液体 加 入 容器 , 接 通 冷 却 水 ,再 打开 水 泵 或 真空 汞 ;开始 时 减 压 要 缓慢 ,加 热 至 一 定 温 
度 后 ,溶剂 即 天 量 蒸发 。 如 气泡 过 多 ,应 立即 打开 阔 门 ,降低 真空 度 ,或 加 入 适当 的 消 泡 剂 
防止 泡沫 溢出 。 

(b) 旋转 减 压 蒸发 器 : 原理 同上 。 改 进 部 分 为 装 液 容器 采用 旋转 烧瓶 。 旋 转 烧 瓶 由 
马达 带动 缓慢 旋转 ,液体 在 瓶 壁 展开 成 膜 ,溶剂 得 以 迅速 蒸发 。 烧 瓶 旋转 还 能 防止 溶液 暴 
沸 。 用 于 浓缩 产品 与 回收 溶剂 时 ,效率 很 高 , 是 实验 室 中 比较 理想 的 蒸发 器 , 示意 图 为 图 
9-34 


FY 9-2 EE i ae ee 


RARER ae iz RA LBA) EP ZFQ8BI-l, 0 Whee 
发 器 为 例 对 旋转 蒸发 器 的 使 用 说 明 如 下 : 


- 241+ 


ae eee a a 


真空 


9-3 旋转 蒸发 装置 示意 图 


几 种 溶剂 的 蒸发 速度 
〈 采 用 1 升 蒸发 瓶 转 速 为 100 转 / 分 ) 


溶剂 回收 量 
溶剂 
GER) (ani 本 

水 45 390 97.6 

水 370 92.6 
丙酮 360 90.0 
CB 390 97.6 

葵 390 97.6 


装配 示意 图 见 图 9-4, 9-5, 9-66 

支架 的 安装 : 将 座 杆 套 上 垫 套 ,用 弹簧 垫圈 ,螺母 与 底座 固定 。 把 升降 座 杠杆 、 固 定 
套 \ 联 接 支架 套 人 座 杆 ; 支 架 安装 完毕 。 

传动 部 分 的 安装 : 支架 装 好 后 , 将 传动 部 分 的 套 管 套 人 联接 支架 的 主轴 上 , 旋 紧 旋 
钮 ,使 传动 部 分 固定 。 

夹 头 部 分 的 组 合 :” 先 将 夹 头 套 在 夹 头 杆 上 ,然后 再 将 夹 头 杆 , 插 人 传动 部 分 的 盖 于 
上 ,并 用 夹 头 杆 调整 旋钮 旋 紧 。 

机 架 部 分 的 使 用 

传动 部 分 的 升降 移动 : 将 升降 调节 杆 手柄 逆 时 针 旋 转 , 使 它 与 杠杆 的 螺纹 联接 放松 , 
按 动 手柄 ,使 传动 部 分 随 杠 杆 的 作用 而 上 下 升降 运动 , 到 达 预 定位 置 , 顺 时 针 拧 紧 升 降 调 


。242 。 


、 图 9-4 
1. 座 杆 ,2. 传动 部 份 固定 旋钮 ,3. 联 接 支架 ,4. 夹 头 杆 调 正 旋钮 ,5.- 传动 部 份 ,6. 传动 
部 份 角 度 调 节 旋 钮 7. 水 平 旋转 旋钮 ,8. 调 速 旋 钮 ,9. 联 轴 节 螺母 ,10. 升 降 固定 旋钮 , 
11. 升 降 调节 手柄 ,12. 传动 部 份 电源 线 ,13. 手 柄 水 平 旋转 旋钮 ,14. 底 座 ,15. 电 源 线 。 
16. 变 压 器 章 ,17. 升 降 栖 杆 ,18. 夹 头 杆 19. 夹 头 


节 杆 与 杠杆 的 螺纹 联接 ,再 用 固定 套 使 联接 支架 的 位 置 固定 。 

升降 调节 杆 的 水 平 旋转 : 放松 手柄 的 水 平 旋转 旋钮 , 手柄 便 可 左右 偏转 。 到 达 所 需 
位 置 时 ,把 旋钮 拧紧 即 可 。 

传动 部 分 的 水 平 旋转 : 放松 水 平 旋转 旋钮 就 可 使 传动 部 分 左右 移动 。 

传动 部 分 的 角度 调节 : 放松 角度 调节 旋钮 ,传动 部 分 即 可 在 垂直 平面 内 偏转 , 选 定位 
置 后 拧紧 旋钮 。 

夹 头 部 分 的 安装 使 用 : 松 开 夹 头 杆 调整 旋钮 ,可 以 调节 来头 杆 与 传动 部 分 的 角度 ,使 
之 适 于 夹 固 不 同 角 度 的 冷凝 器 。 用 于 81-I 型 时 , 松 开 夹 头顶 部 的 螺丝 可 以 变化 夹 头 在 夹 
头 杆 上 的 位 置 , 若 用 于 81-I 型 时 , 松 开 夹 头 , 并 将 它 旋转 90"。 

旋转 速度 的 调节 : 将 传动 部 分 电源 线 的 播 头 , 插 人 变压器 章 上 的 电源 插座 中 ,再 把 电 
PAA Te Ai A 220V 电源 ,旋转 调 速 旋钮 即 可 任意 变速 (10 一 190 r.p.m)o 

衬 垫 的 使 用 : 把 玻璃 旋转 轴 插 人 传动 部 分 的 锥 套 内 , 如 图 9-5 所 示 方 向 依次 装 上 油 
EY 78 UG FAC lei HS Fr PERF 0 


° 243 « 


图 9-5 ZFQ81I-I 型 旋转 蒸发 装置 固定 部 件 示 意图 
1. 座 杆 ,3. 联 接 支架 ,5 .传动 部 份 ,10. 固 定 套 ,11. 升 降 调节 杆 ,!4. 底 座 。 
17: 杠 杆 ,18. 夹 头 杆 ,19. 夹 头 ,20. 垫 套 ,21. 弹 簧 垫圈 ,22. 螺母 


玻璃 部 件 的 安装 

装 拆 玻璃 旋转 轴 : ”将 玻璃 旋转 轴 从 传动 部 分 的 背面 插入 锥 套 内 , 当 轴 套 外 口 的 卡 环 
卡 住 玻璃 旋转 轴 的 轴 肩 即 可 。 在 拆 外 玻 璃 旋转 轴 时 ,左手 抓 住 传动 部 分 ,少许 用 力 往 后 拉 
即 可 拔 出 。 若 玻璃 轴 与 锥 套 结 合 较 紧 ,可 外 下 冷凝 管 , 右手 担 住 玻璃 轴 , 用 左手 掌心 轻 轻 
拍 击 玻璃 轴 的 端 部 ,就 能 取出 。- 

冷却 器 的 安装 : 玻璃 轴 装 人 传动 部 分 后 ,在 其 前 端 依次 套 人 油封 \ 聚 四 氟 乙 烯 片 。 再 
将 冷凝 管 的 法 兰 套 上 螺母 ,并 从 螺母 侧 孔 插 和 人 弹簧 ,然后 旋 紧 螺母 ,联接 冷凝 管 , 使 之 不 漏 
气 。 

旋转 浇 瓶 与 圆 底 烧 瓶 的 固定 与 拆 印 : 烧瓶 的 接头 口 均 为 标准 口 ,并 配 专用 接头 联接 。 
使 用 之 前 要 用 酒精 擦 净 各 个 接头 口 ,然后 涂 真 空 油脂 , 以 免 产 生 伤 痕 和 漏 气 。 减 压 解除 


。244 。 


lahat 


9-6 2ZFQ81-I 型 冷凝 器 安装 示意 图 
23. 圆 底 烧 瓶 ; 24. 茄 形 烧 瓶 ; 25。 玻 璃 旋转 轴 ; 26. 双 过 流 冷凝 管 ; 27. 加料 管 ; 31. 塑料 活 接头 


后 ;将 接头 旋 松 分 开 , 即 可取 下 烧瓶 。 

《2) 关于 真空 度 : 通常 把 压力 低 于 常 压 的 空间 称 为 真空 , 可 分 为 : 粗 真空 , 中 度 真 
空 ,高 度 真空 

《a) 粗 真空 (气压 760 一 10 毫米 汞 柱 ) 可 用 水 和 泵 达到 。 水 泵 的 最 大 真空 度 受 水 蒸气 压 
限制 。 而 水 蒸气 压 又 与 水 温 有 关 。 水 温 愈 高 , 蒸 气压 愈 大 。 例如 水 温 从 1 CHE 30°C, 
蒸汽 压 从 4.9 上 升 到 31.6 毫米 汞 柱 。 而 且 水 温 傅 高, 水 蒸气 压 上 升 愈 快 。 例如 水 温 由 
ICH 2°CH HAR EF 0.4 SKA, MK iH 29°C 升 至 30"C 时 压力 就 上 升 1.6 毫 
AR ARE o KAR #2 ES A 9-7, 用 时 应 在 水 泵 前 装 安全 瓶 , 以 防水 压 陡 降 时 水 倒流 进入 样 液 , 
停止 使 用 时 应 先 打 开 安 全 瓶 活塞 ,* 放 人 空气 ,再 关 水 泵 。 为 了 保持 水 条 的 工作 效率 , 需 经 
党 进行 请 洁 并 定期 拆洗 。 | 


图 9-7 KARAS 图 9-8 油泵 装置 
1. 接 压力 表 ; 2. 干 燥 系 统 ; 3.7 


(b) 中 度 真空 (气压 10-10% 毫米 汞 柱 ): 可 选用 油泵 , 真空 度 可 达 10 SKKES 
HHRRE MA 9-8, 常 在 安全 瓶 与 蒸馏 系统 之 间 加 冷 阱 ,不 让 低 沸 点 物 或 易 分 解 物 被 抽 人 
稍 内 ,真空 压力 计 平时 不 宜 与 系统 接 通 ,只 在 读数 时 与 系统 接 通 , 读数 后 立即 关闭 。 停机 
前 , 先 关闭 真空 容器 ,再 旋 开 安全 瓶 活塞 , 放 人 空气 后 才 停电 AGRI Ato 

(c) BER (10°—10% BARE): MAT BRR. HH BAT AR aN Eth SRR RA 
蒸发 与 冷凝 ,使 空气 被 吸附 在 冷凝 时 形成 的 液 滴 表面 , HRRMH, 因此 扩散 条 必需 与 
前 级 条 联 用 。 前 级 条 的 作用 是 抽 去 被 冷凝 吸附 的 气体 分 子 和 造成 真空 , 使 扩散 泵 内 沪 体 
的 沸点 降低 、 易 于 沸腾 。 其 最 大 真空 度 主要 决定 于 所 用 的 特殊 液体 的 性 质 。 


。245 。 


POU ae TRIE 9 9 装置 。 用 时 应 该 注意 各 个 系统 及 连接 处 的 密封 ,及 时 换 冷 阱 ,并 
根据 溶剂 阐 点 ,选用 合适 的 制冷 方法 。 

(3) 减 压 装置 的 选择 : 先 根据 溶剂 的 性 质 确 定 所 需 真 空 度 ,从 而 选用 合适 的 减 压 装 
a FAS EE ES 2 a AR ERE A ME ATI FA zk Ak WE IA BBS OR EAN SY ZR 

普通 油泵 如 能 达到 要 求 , 就 不 要 用 扩散 和 泵 。 人 否则 不 但 麻烦 ,而且 可 能 损失 产品 , 甚至 因 
eben oi ae 设备 。 


图 9-9 高 效 油泵 装置 
1. 接 油泵 ; 2. 小 船 及 P:0, 干燥 剂 ; 3. 接 转动 式 麦 氏 真空 表 ; 
4. 备 用 口 ; 5. 接 蒸馏 装置 ; 6.- 放 气孔 ; 7. 冷 凝 阱 
《4) 真 空 度 的 测量 一 一 真空 表 的 使 用 : 
《a) 缩短 的 真空 表 和 开口 的 吕 形 管 真 空 表 : ”用 它们 《〈 见 图 9-10) 测量 真空 度 各 有 优 
缺点 : 前 一 种 使 用 方便 ,但 装 汞 和 使 用 时 易 有 少量 空气 进入 和 汞 柱 顶端 ,导致 测量 不 准确 而 
需 重 装 。 后 一 种 装 汞 方便 但 管 长 应 超过 760 毫米 ,还 要 与 大 气相 通才 能 进行 比较 ;用 未 较 
多 且 开 口 处 汞 蒸气 容易 逸 出 , 较 不 安全 。 常 在 未 柱 顶端 加 少量 流体 石蜡 。 这 类 真空 计 能 
够 测 出 的 最 高 真空 度 为 1 一 2 ERK RES 


9-10 ,普通 真空 表 


图 9-11, 充 汞 装置 图 9-12 at 


FAA: 先 将 清洁 汞 放 在 小 圆 底 烧 瓶 内 , 然 后 用 高 效 油泵 抽 至 107 毫米 汞 柱 以 
下 ; 轻 拍 小 烧瓶 使 汞 内 气泡 逸 出 ,用 电 吹 风 加 热 玻 管 使 附 在 管 壁 的 气体 易 被 抽 去 。 将 冬 灌 
人 形 管 后 , 即 可 停止 抽 气 , 放 人 空气 。 充 示 装 置 见 图 9-11。 

如 使 用 的 汞 不 洁净 ,还 需要 按 图 9-12 装置 进行 净化 。 净 化 时 可 用 25 % HNO, 溶液 灌 
人 管内 ,使 分 成 细 滴 逐 层 滴 下 ,必要 时 可 重复 洗 数 次 \ 再 用 蒸馏 水 、 乙 醇 、 乙 醚 依次 洗 净 
F Ro 

(>) RKRSR: 能 够 同时 测量 粗 真空 和 高 度 真空 。 它 根据 波 义 耳 定律 比较 开 管 和 
闭 管 的 压力 差 。 一 种 为 直立 式 。 见 图 9-13 CH) 读数 前 应 慢 慢 旋 开 连接 系统 的 活塞 4 和 
连接 机 械 双 的 三 通 活塞 , 接 通 管 2, 使 麦 氏 真空 表 系 绕 与 贮 尔 瓶 1 之 间 的 压力 达到 平衡 。 
再 转动 三 通 活塞 , 接 通 管 3 使 它 与 大 气相 通 , 慢 慢 放 人 空气 ,加 压 未 面 , 迫使 未 柱 上 升 , 直 


图 9-13 ”万 氏 真空 表 
甲 .直立 式 ; 乙 .转动 式 


° 247 « 


至 比较 毛细 管 5 中 汞 面 与 测定 毛细 管 6 的 顶端 相 平 , 读 出 毛细 管 6 冬 面 对 应 的 刻度 , 即 为 
系统 的 真空 度 。 读 数 后 转动 三 通 活塞 连通 管 2 JOLAWREM ,恢复 原状 。 

另 一 种 为 常用 的 转动 式 , 见 图 9-13( 乙 ), 易 于 使 用 。 但 应 注意 : 读数 前 , 先 旋 开 真空 
系统 活塞 ,再 将 表 慢 慢 转 至 直立 状 。 使 比较 毛细 管内 的 汞 柱 准 确 升 至 零点 。 读数 后 立即 
将 表 慢 慢 恢复 横 卧 状 , 然 后 关闭 真空 系统 活塞 。 

(5) 减 压 操作 的 注意 事项 : 

(a) 使 用 的 厚 壁 橡皮 管 先 在 20 多 NaoH 溶液 中 煮沸 1 小 时 , 煮 时 应 使 管内 碱 液 流 
动 ,者 后 用 蒸馏 水 洗 数 次 以 除去 请 石粉 ,硫磺 等 杂质 。 

(b) 常 检查 橡皮 塞 是 否 漏 气 ,, 如 已 变质 应 该 更 换 。 橡皮 塞 在 蒸馏 鬼 上 的 露出 部 分 不 . 
得 少 于 1/3。 

Cc) 防 漏 与 涂 脂 : 如 发 现 真 空 系统 漏 气 ,, 可 用 等 量 的 蜂蜡 与 松香 混 熔 后 涂 封 。 MER 
空 度 低 于 1 毫米 冬 柱 可 涂 凡士林 ,高 于 1 毫米 汞 柱 应 涂 高 真空 活塞 油 。 涂 脂 要 注意 均匀 。 

@) 冷却 系统 : 要 在 冷 阱 周围 造成 低温 条 件 ,, 可 用 冷冻 机 制冷 或 加 冷却 剂 。 常用 的 
RANA: WA: ARK KAK FRAN —195.8°C, 可 冷 至 一 210%C。 

干冰 (固体 CO,): 升华 温度 为 —785°C, 用 时 ,加 适量 溶剂 (如 丙酮 、 乙 醇 、 乙 醚 等 ) 
则 冷却 均匀 。 可 冷 至 一 70 一 一 80sc 左右 。 

Se ABS: 能 达到 的 低温 随 结 晶 氯 化 馈 与 碎 冰 的 比例 而 变 , 最 低 可 冷 至 

—54.9°C (143 克 结 晶 氧 化 钙 与 100 克 碎 冰 )。 
食盐 与 碎 冰 :, 能 达到 的 低温 随 组 分 比例 而 变 , 最 低 可 达 一 21.3"C (33 克 食 盐 与 100 
克 碎 冰 )。 

使 用 冷 阱 时 , 应 先 接 好 蒸馏 系统 , 然后 再 加 冷却 剂 以 免 空 气 中 水 分 大 量 进入 冷 阱 , 降 
低 冷 阱 的 效率 。 

(Cc) 于 燥 系统 : 油泵 前 用 固体 氧 氧化 钾 ( 钠 )\ 毛 化 钙 活性 几 、 碱 石灰 等 ,也 可 以 用 五 
氧化 二 磷 。 活 性 炭 应 该 放 在 近 油 泵 的 一 端 。 

(f) neh: 常用 毛细 管 (应 该 先 检查 是 否 通气 )。 蒸 馏 或 浓缩 容易 氧化 的 物质 , 应 
由 毛细 管 通 和 人 氮气。 浓缩 过 程 中 如 有 固体 析出 ,可 将 毛细 管 倒 插 ( 粗 端 朝 下 ), 以 免 堵 塞 。 
浓缩 小 量 液体 时 ,可 用 抗暴 沸 管 ( 取 4 毫米 直径 的 玻璃 管 , 在 下 端 约 " 毫米 处 封闭 )o 

(g) 停止 浓缩 ,应 该 先 移 去 热源 。 稍 冷 ,再 关 真 空 泵 ,以 免 浓 缩 物 升 温 分 解 。 

Ch) 高 真空 操作 , 需 戴 防护 镜 。 

3. 薄膜 蒸发 ”又 称 薄膜 浓缩 。 

C1) 原理 : 薄膜 蒸发 是 使 液体 形成 薄膜 ,增加 气 化 表面 \ 加 速 蒸发 。 薄 膜 蒸 发 器 内 有 
直立 的 加 热 (蒸发 ) 管 , 传 热 面 较 大 。 流 体 在 减 压 下 进入 加 热管 ,把 未 蒸发 液体 拉 成 薄膜 迅 
速 通过 管 的 内 壁 ,连续 蒸发 。 

(2) 薄膜 蒸发 的 优点 是 : 
(_) 液 膜 表面 很 大 , 传 热 快 而 均匀 。 液 体 在 蒸发 管内 停留 的 时 间 很 短 ( 仅 数秒 或 不 足 
一 秒 )。 这 样 即 使 温度 略 高 ,物料 也 不 易 破坏 。 可 用 于 制备 对 热 较 稳 定 的 酶 、 蛋 白质 和 小 

分 子 物 质 。 

(b) 蒸发 管 较 长 , 液 体 沸腾 产生 的 泡沫 容易 在 管 壁 上 部 受热 破裂 。 加 热 室 上 部 安装 

泡沫 分 离 器 ,所 以 也 适 于 浓缩 易 产 生 泡沫 的 物料 。 


。248 。 


(3) 薄膜 蒸发 的 缺点 是 操作 温度 较 高 (浓缩 液 温 度 可 达 60—80°C), 且 流 体 被 拉 成 膜 
状 , 因 此 不 适 于 浓缩 对 热 敏 感 的 或 易 受 薄膜 切 力 破坏 立体 结构 的 酶 与 核酸 等 生物 大 分 子 
的 溶液 。 蒸 发 管 难于 清洗 和 更 换 , 不 适 于 浓缩 粘度 很 大 、 容 易 析 出 结晶 的 物料 。 因 为 它们 
不 易 成 膜 , 而 且 容 易 堵塞 蒸发 管 。 

(4) 使 用 薄膜 蒸发 时 , 应 该 控制 进 料 速度 使 泡沫 在 气 液 分 离 器 中 能 够 全 部 破裂 。 如 
速度 过 快 , 液 体 受 热 不 足 , 蒸 发 与 分 离 受到 妨碍 。 速 度 过 慢 , 则 气 该 难于 分 离 , 而 易于 在 蒸 
发 管 中 于 枯 ,导致 产 品 分 解 。 此 外 气 液 分 离 器 的 直径 不 宜 过 小 ,以 免 浓 缩 液 冲 人 冷凝 管 。 

《5) 小 型 薄膜 浓缩 装置 见 图 9-14。 用 时 先 夹 紧 14、13、12 的 螺旋 夹 , 以 水 通 人 冷凝 
管 5 的 人 口 处 6 ,然后 开 真 空 泵 , 待 气 正 降 至 500 毫米 汞 柱 以 下 , 打开 蒸汽 阀 并 适当 放出 
— MRK. 调节 螺旋 夹 14 使 溶液 缓 缓 沿 管 上 升 至 A 管 的 1/2 高 度 处 。 减 压 使 A 管 液体 迅 
速 蒸发 ,蒸汽 充满 A 管 并 将 部 分 液体 拉 成 薄膜 沿 管 壁 上 升 。 液 膜 迅速 蒸发 ,大 量 蒸 汽 和 人 少 
量 液 体 的 混合 物 通过 气 液 分 离 器 3。 液 膜 破裂 , 液体 逐 滴 流下 进入 2 中 即 为 浓缩 液 。 绝 
大 部 分 气体 被 抽 人 冷凝 器 5 PREAR RR 4。 浓缩 液 贮 瓶 2 装 满 后 , 抽出 液体 检查 浓 
度 。 如 浓度 不 够 可 以 反复 浓缩 。 结 束 时 先 关 蒸 汽 阔 RHMARES 8 ,再 关 真 空 泵 ,最 后 
KR BK. 

薄膜 浓缩 效率 很 高 ,例如 用 长 1 米 , A 2 BOR A Re) aes. B/N 
WR aM HK 1 一 2 升 〈 根 据 所 需 浓 度 而 定 )o。 还 可 按 图 9-15 装置 使 提取 与 浓缩 连续 进 
行 。 


1 k~ -全 


Waa SS RE 
= -一 一 一 一 
BOB SE I Sa Be 


<5 
图 9-14 ”薄膜 蒸发 器 图 9-15 薄膜 浓缩 与 提取 连续 装置 
1. 待 浓缩 液 ; 2. 浓 缩 该 ; 3. 气 -流体 分 离 器 ; 4. 冷 凝 液 ; 1. 连 抽 气 和 泵 ; 2. 溶 剂 ; 3. 提 取 物 料 ; 4. 浓 缩 液 ; 


S.-H; 6. 冷 水 进口 ;3.7. 冷 水 出 口 3 .8. 抽 气泵 接头 ; 5. 蒸 汽 导 人 
9. 温 度 计 ; 10. 浓 缩 液 吸出 管 ; 11. 冷 凝 液 吸 出 管 ; 12, 
13、14. 螺旋 夹 


。249 。 


(=) 工业 上 用 的 蒸发 浓缩 设备 


原理 与 实验 室 装置 相同 , 特点 为 容量 大 , 附属 设备 多 , 结构 较 复 杂 , 由 于 生化 物质 在 
60°C 以 上 一 般 容易 丧失 或 降低 活性 ,常用 以 下 减 压 浓 缩 装置 : 

.二 . 减 压 蒸发 器 见 图 9-16, 用 时 先 开 真 空 休 , 抽 出 内 部 空气 后 , 再 由 人 口 4 吸入 
待 浓 缩 液 。 继 续 抽 气 至 一 定 真 空 度 , 由 蒸汽 入口 5 BBA RA. MARA, BNA 
气 出 口 8 。 蒸 汽 经 隔 沫 装置 9 分 出 液 滴 后 , 进入 冷凝 器 11, 冷 凝 液 流 入 接受 器 14。 从 观 
RA 3 WAR MR AS ih, MARA AMAA 2 调节 真空 度 。 温 度 由 温 
度 计 1 显示, 调节 蒸汽 人 口 5 ,可 控制 蒸发 速度 。 停 止 蒸发 时 先 关 闭 蒸汽 人 口 及 抽 和 气泵, 
再 打开 放 气 阀 2 ,使 蒸发 锅 的 压力 恢复 正 委 。 浓 缩 该 由 出 口 6 放出 。 

2. 循环 减 压 蒸发 器 ”装置 见 图 9-17。 
蒸发 速度 很 快 。 例 如 容积 为 150 升 的 加 热 营 发 器 , 每 小 时 可 蒸发 LOTR GE 
由 外 加 热 室 1 和 分 离 室 2 组成。 加热 室 中 蒸汽 在 管 外 加 热 , 溶剂 蒸汽 由 上 部 横 管 经 分 离 


室 上 部 及 附设 的 隔 沫 装置 进入 冷凝 器 冷凝 后 排出 。 液体 沿 循环 管 4 回 到 加 热 室 再 蒸发 , 


如 此 循环 直至 达到 所 需 浓 度 。 加 热 室 的 管子 很 长 (可 达 7 米 ) ,沸腾 管 长 度 如 果 增 加 ,循环 
管 中 液 体 和 沸腾 管 中 气 液 混合 物 的 重量 之 差 也 增加 。 分 离 室 内 液体 温度 低 \ 比 重大 ,所 以 
不 断 流 和 蒸发 器 (加 热 室 ), 因 此 产生 搅拌 作用 加 速 蒸发 。 


9-16 JREEAR 


1. 温 度 计 ; 2. AR; 3. 观 察 窗 ; 4. 液 体 入 口 ; 5. 蒸 
汽 人 口 ; 6. 浓缩 流出 口 ; 7. 冷 水 出 口 ; 8. 废气 出 口 ; 


图 9-17 ”循环 减 压 蒸发 器 
9. 隔 沫 装置 3 10. ARKH 11. 冷凝 器 ; 12 冷水 人 《蒸发 器 加 热 室 在 外 面 7 
口 ; 13 连 抽 气 机 ; 14. 接 受 器 1. 加 热 室 ; 2. 分 离 室 ; 3. 气 波 混 合 管 ; 4. 循环 管 


循环 减 压 蒸发 右 适 于 浓缩 易 结 唱 、 多 泡沫 的 溶液 。 其 优点 是 生产 能 力 大 ,容易 维护 。 
3. 管 式 薄膜 蒸发 器 ”” 液 膜 在 蒸发 器 的 管 壁 受 热 , 溶 剂 迅 速 蒸发 使 溶液 达到 所 需 浓 
度 。 按 管 长 可 以 分 为 长 管 式 ( 管 疼 6 一 8 米 )、 MEK ( 管 长 3 一 4 米 )。 按 液体 流向 可 以 分 


。 250。 


为 升 膜 式 、 降 膜 式 。 它 们 的 构造 简单 ,便于 操作 , 传 热 效率 高 ,蒸发 速度 快 人 仅 数 秒 至 数 十 
秒 ) 适 用 于 对 热 敏 感 、 易 发 泡 的 物料 。 

C1) 升 膜 式 蒸发 器 : 见 图 9-18, 在 真空 下 操作 ,蒸发 管内 压力 小 ,蒸汽 流速 快 ,如 进 料 
BEY ,沸腾 液 被 蒸汽 流 急速 携带 向 上 ,, 沿 管 壁 形 成 薄膜 , 故 称 为 升 膜 式 。 如 进 料 过 多 ,加 
热 燕 汽 不 足 , 管 的 下 部 积 彼 过 多 , 则 液 柱 虽然 上 升 但 不 能 成 膜 。 进 料 过 少 易 造 成 物料 在 管 
中 于 酒 而 分 解 。 

《2) 降 膜 式 : 结构 与 升 膜 式 基本 相同 。 但 液 膜 和 蒸汽 的 流动 方向 与 升 膜 式 相 反 ; 见 
图 9-19。 料 液 由 项 部 人 ;通过 料 液 分 配器 被 均匀 地 分 配 到 每 根 加 热管 中 受热 而 蒸发 , 因 重 
力 的 影响 增加 了 蒸 泡 的 抽 拉 作用 和 液 膜 的 流动 速度 , 所 以 在 同样 条 件 下 降 膜 蒸发 器 的 液 
” 膜 比 升 膜 蒸发 器 的 液 膜 要 薄 一 些 。 而 且 流 的 加 速 方向 与 重力 方向 一 致使 得 降 膜 式 比 升 
膜 式 有 更 多 优点 ,目前 已 被 广泛 采用 。 


图 9-18 升 膜 式 蒸 发 器 图 9-19 ” 降 膜 蒸发 器 结构 
1. BYR AC2S; 2. 加 热 列 管 ; 3. 蒸 汽 挡 板 ; 4. 分 离 器 ; 5. 冷 凝 
水 滚 位 计 ; a. 料 液 进 口 ; b. 加 热 蒸 汽 进 口 ; “, AREA HEM 
口 ; d. 冷 凝 水 出 口 ; .浓缩 液 出 口 ; foRRAWO 


4. 真空 离心 薄膜 蒸发 器 ”利用 锥 形 盘 高 速 旋转 产生 的 离心 力 把 料 液 甩 到 锥 形 盘 的 
传 热 面 上 ,分 散 为 一 层 极 薄 的 堆 匀 液 膜 ( 仅 0.1 毫米 )。 由 于 离心 力 的 作用 , 液 膜 在 蒸发 面 
仅 停 留 1 秒 钟 。 操 作 是 在 700 毫米 示 柱 的 真空 度 下 进行 的 。 适 于 连续 浓缩 中 度 或 高 度 执 
敏 性 及 高 粘度 物料 。 


e251 « 


真空 离心 薄膜 蒸发 器 在 国外 已 广泛 用 于 浓缩 胰岛 素 、 葡 萄 糖 、 蛋 白质 .酵母 等 物料 。 例 
ROE AE 40°C 浓缩 就 会 损失 效 价 ,而 采用 真空 离心 薄膜 蒸发 器 仅 在 1 PSA RAED 
料 达到 一 定 的 浓度 , 故 可 避免 效 价 的 损失 。 我 国 福建 厦门 已 有 生产 ,型 号 为 LZ-X 了 26 型 , 
加 热 面 积 为 2.6 米 ,蒸发 能 力 为 800 一 900 公斤 水 /小 时 , 浓 缩 比 为 5 一 10, 物料 蒸发 温度 
Al 45°C 5 

5. 大 型 薄膜 蒸发 器 ”为 了 提高 薄膜 蒸发 器 的 效率 , 近 年 来 多 采用 一 种 改良 装置 是 


在 蒸发 器 处 安装 多 条 加 热管 图 9-20 所 示 。 
物料 = ink 


加 热 蒸汽 
图 9-20 ”离心 薄膜 蒸发 器 结构 示意 图 图 9-21 大 型 薄膜 蒸发 器 


1. 待 浓缩 液 ; 2. 流 量 计 ; 3. 预 热 器 ; 4. 蒸发 器 ;5. SR; 
6. 冷 凝 器 ; 7. 浓 缩 液 接受 器 ; 8. 热 水 槽 ; 9. 废气 出 口 ; 10. RA 
管 ; 11. 稳 压 箱 ; 12. 检 验 罩 ; 13. 阀门 ;14. 温 度 计 ; 

15 .冷水 管 


os 


吸收 浓缩 是 加 入 吸收 剂 从 溶液 中 吸收 水 或 溶剂 使 溶 小 达到 浓缩 的 方法 。 吸 收 剂 应 具 
有 不 与 溶液 起 反应 ,不 吸附 溶质 、 容 易 和 溶液 分 离 、 除 去 溶剂 后 还 能 重新 使 用 等 特性 。 OR 
用 的 吸收 剂 有 各 种 凝 胶 、 聚 乙 二 醇 \ 聚 乙烯 吡咯 酮 和 葡 聚 糖 等 。 吸 收 方法 有 用 凝 胶 直 接 吸 
收 和 在 半 透 膜 外 吸收 两 种 。 


fon) 用 凝 胶 直 接 吸 收 
凝 胶 ( 例 如 葡 聚 糖 凝 胶 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 等 ) 由 多 聚 物 组 成 ,具有 一 定 孔 径 的 微 孔 ;能 


* 252 « 


够 吸水 。 和 孔径 小 的 凝 胶 吸 水 能 力 弱 , 但 速度 快 。 孔 径 大 的 凝 胶 吸 水 能 力 强 , 但 速度 慢 。 选 
用 适当 孔径 的 于 凝 胶 投入 大 分 子 溶液 后 ,大 分 子 不 能 进入 凝 胶 网 孔 , 仍 然 留 在 溶液 中 。 溶 
剂 分 子 及 其 它 小 分 子 则 进入 凝 胶 内 , 除 去 凝 胶 即 得 浓 溶 液 。 用 凝 胶 浓 缩 有 两 种 方式 : 动 
态 浓缩 (使 稀 溶 该 通过 凝 胶 柱 ), 静 态 浓缩 (将 干 凝 胶 投入 稀 溶液 )。 

1. 使 用 凝 胶 直接 吸收 可 用 葡 聚 糖 凝 胶 Sephadex G-25、G-50, 还 有 近年 来 制 出 的 吸 
水 性 强 、 容 易 分 离 的 聚 丙烯 酰胺 干 凝 胶 〈Lyphogel)。 

C1) 使 用 以 前 应 先 测定 干 凝 胶 吸 水 率 , 方法 如 下 : 在 65%C 加 热 4 小 时 得 到 干 凝 胶 。 
然后 把 一 定 重量 的 干 凝 胶 吸 水 至 恒 重 后 测定 重量 ,可 用 下 式 计 算 吸 水 率 : 
W, % 


1 


Sin 


S 为 吸水 率 ; 
W: 为 干燥 凝 胶 的 重量 ; 
W, 为 干 凝 胶 吸 水 至 恒 重 后 的 重量 。 

和 根据 干 凝 胶 吸 水 率 计 算出 需要 加 入 的 干 凝 胶 量 。 例如 1 克 Lyphogel 吸水 达到 平衡 
时 能 吸收 5 克 水 , 则 10 毫升 溶液 浓缩 5 倍 需 加 1.6 克 凝 胶 。 如 使 用 Sephadex G-25, 其 
吸水 率 为 2.5 毫升 / 克 干 凝 胶 , 则 3 毫升 蛋白 质 稀 溶 液 中 加 入 1 克 干 凝 胶 后 蛋白 质 溶液 可 
浓缩 6 倍 。 

将 一 定量 的 凝 胶 投入 溶液 后 , 凝 胶 开始 浮 于 液 面 , KAMER, 应 放置 待 吸水 达到 平 
衡 以 后 ,再 离心 分 出 上 层 浓 溶 液 。 下 层 已 吸水 耻 胀 的 凝 胶 经 回收 处 理 后 可 以 再 用 。 

2) 直接 加 吸收 剂 的 优点 是 : 使 用 方便 , 吸收 剂 用 量 与 吸水 量 成 正比 。 浓缩 时 溶液 
中 盐 类 和 水 分 同样 进入 吸收 剂 , 浓缩 前 后 溶液 pH 及 离子 强度 无 变化 。 有 的 吸收 剂 甚至 
”在 高 压 灭 菌 后 性 能 也 不 改变 ,可 以 对 溶液 进行 无 菌 浓缩 。 
缺点 是 吸收 剂 表面 有 时 粘 附 一 部 分 溶液 造成 损失 。 


(=) 在 半 透 腊 外 吸收 

即 高 奖 透 析 。 半 透 膜 能 使 小 分 子 或 离子 透 过 而 蛋白 质 等 大 分 子 不 能 透 过 。 半 透 膜 袋 
的 外 面 如 果 有 浓度 很 高 的 能 够 吸水 的 高 聚 物 BERBERA TRA. RARR HAZ 
回 膜 外 扩散 ,立即 被 高 聚 物 吸收 直至 平衡 。 反复 操作 就 能 得 到 所 需 的 浓 溶 小 。 常用 的 吸 
Kim RDA A Citi td (polyvinyl pyrrolidone, 简 称 PVP, 分 子 量 12,000), 聚 乙 二 醇 
(polyethylene, 简称 PEG, 分 子 量 5000 一 10,000 适 于 浓缩 , 6000 最 好 ) 及 葡 聚 糖 等 。 使 
用 前 和 营 需 加 碱 中 和 PEG 中 的 酸 。 用 过 的 PVP、 和 葡 聚 糖 等 经 过 加 热 或 吹风 去 水 后 可 以 
Fino (He PEG 不能 加 热 和 干燥 ; 因为 加 热 使 它 转 变 为 无 用 的 螨 状 物 。 

此 法 的 缺点 是 : 吸收 剂 中 如 果 含 有 分 子 量 较 低 的 聚合 物 或 杂质 ,就 有 可 能 透 和 人 袋 内 ; 
有 些 物质 如 聚 乙 烯 吡咯 酮 对 280 毫 微米 波长 有 吸收 ,因而 对 测定 蛋白 质 有 王 扰 。 BAR 
不 能 全 部 回收 ,因为 半 透 膜 有 吸附 作用 。 


跤 分 离 方 法 在 本 书 已 有 介绍 。 这 里 简单 介绍 实验 室 用 的 浓缩 装置 。 


。 2353。 


(—) 减 压 透析 


1. 基 本 原理 是 利用 浓缩 装置 内 外 的 压力 差 , 将 样品 中 的 溶剂 挤 压 出 去 、 使 样品 得 到 
浓缩 。 例 如 在 图 9-22 所 示 的 装置 中 , 火 棉 胶 袋 的 容量 为 8 毫升 ,透水 速度 为 7 一 15 毫升 / 
小 时 ,可 以 反复 用 十 几 次 。 火 棉 胶 袋 装 液 后 , 置 于 吸 滤 瓶 内 进行 真空 吸 滤 , 直至 袋 内 高 分 
子 溶液 达到 所 需 浓 度 为 止 。 如 无 低温 工作 室 又 不 愿 连 
续 使 用 水 泵 ,可 以 在 室温 减 压 后 关闭 吸 滤 瓶 出 口 , 置 于 
冷 处 。 吸 滤 压 力 不 宜 过 大 ,否则 引起 滤 孔 堵塞 ,反而 延 
长 时 间 。 取 出 浓缩 液 时 为 了 不 损伤 膜 和 减少 样品 损失 , 
可 以 用 细 胶 管 套 在 吸管 (或 注射 器 ) LBBB 
为 了 防止 透析 袋 干 燥 或 长 霉 , 可 保存 于 25 驳 乙醇 中 。 

2. 微量 蛋白 质 减 压 透析 浓缩 器 , 见 图 9-23。 操 作 
时 透析 液 处 于 大 气压 下 。 利 用 膜 面 的 压力 差 能 够 有 效 

图 9-22 , 减 压 透 析 地 进行 浓缩 。 透 析 液 内 有 垂直 的 管状 透析 膜 。 膜 内 的 
杆 有 三 种 作用 : | 

(1) 增加 单位 体积 样 液 的 膜 面积 。 

G) BOE Fe SiR = 1> BO, 2% Lie ees ea 
确 地 预定 浓缩 的 最 终 体积 。 

微量 蛋白 质 浓缩 器 用 水 泵 (或 真空 泵 ) 抽 真 

后 ,用 夹子 夹 住 , 停止 抽 气 , 可 以 在 一 定 的 温 
度 条 件 下 进行 浓缩 。 加 样 液 后 透析 浓缩 立即 开 
始 ,, 样 液 弯 月 面 下 降 直 至 样 液 贮 存 室 的 尖端 。 
这 时 样 液 与 蛋白 质 透 析 膜 脱离 接触 , 透 析 液 的 
浓缩 就 自动 停止 。 因 此 样 液 不 会 浓缩 至 干 。 可 
以 自动 使 样 液体 积 最 终 定量 地 小 至 25 微 升 。 

透析 膜 如 不 垂直 , 重 力 使 被 截留 的 蛋白 质 
分 子 沉 淀 在 膜 上 。 膜 的 吸附 作用 使 蛋白 质变 
性 、 活 力 受 损失 ,而 且 产生 浓 差 极 化 。 搅 拌 虽然 
可 以 使 蛋白 质 分 子 离开 膜 , 但 又 产生 有 害 的 切 
变 作用 。 该 装置 中 透析 膜 是 垂直 的 , 能 消除 上 
述 有 害 作用 而 保留 重力 的 有 效 作 用 。 浓 缩 时 被 
截留 的 分 子 直接 沉淀 到 透析 膜 底部 已 经 硅 酮 化 
的 样 液 贮 存 器 中 。 这 些 改进 使 回收 率 平均 达到 - 
90 匈 , 而 且 不 损害 蛋白 质 的 酶 活性 或 生物 活 图 9-23 ”微量 浓缩 器 
性 。 

国外 有 多 种 这 类 装置 。 它们 还 能 与 高 压 消毒 装置 连用 。 浓 痛 达到 的 预定 体积 为 15 
微 升 至 1000 微 升 。 


(二 ) 离心 超 滤 
含 生物 大 分 子 的 少量 样 液 可 在 离心 管内 借助 于 离心 力 进行 超 泪 , 如 图 9-24, 用 小 圆 


。 254。 


简 插 入 离心 管 上 的 活塞 ,使 圆锥 形 亲 水 凝 胶 膜 固定 在 圆锥 形 支架 上 。 膜 内 装 有 样 液 ,离心 
2 一 30 分 钟 ,部 分 溶剂 和 小 分 子 杂 质 透 过 膜 , 成 为 
超 滤液 。 含 有 大 分 子 的 样 液 得 到 浓缩 。 


(=) MEER Res 


包括 加 压 超 滤 装置 .空心 纤维 浓缩 器 、 微 孔 腊 
过 滤器 及 反 渗 透 膜 过 滤 装 置 等 , 已 天 量 用 于 分 离 
与 浓缩 生化 产品 。 加 压 膜 浓缩 不 仅 效率 极 高 , 还 
有 以 下 优点 : 

(1) 条 件 温 和 : 与 蒸发 . 冻 干 \ 沉 淀 等 方法 比 
较 , 此 法 没有 相 的 变化 , 保 持原 来 的 pH 和 离子 
强度 ,可 以 在 低温 操作 ,能 较 好 地 保持 生物 大 分 子 
的 活性 ,因此 广泛 用 于 浓缩 生物 大 分 子 的 稀 溶 液 , 
特别 适 于 浓缩 不 稳定 的 酶 液 。 

(2) 不 需要 添加 化 学 试剂 ,设备 简单 、 费 用 较 图 9-24 ”离心 超 小 
低 , 操 作 方 便 且 能 较 快 地 处 理 大 量 的 稀 溶 液 。 

(3) 蛋白 质 和 酶 的 溶液 可 以 浓缩 到 10—50% 浓度 ,回收 率 高 达 90% 0 

(4) 有 纯化 作用 ,可 以 同时 脱盐 及 除去 其 它 小 分 子 杂质 。 

缺点 是 不 能 直接 得 到 干 品 。 膜 的 吸附 作用 会 造成 一 定 的 损失 。 


PO. Ok OR mah 4 


冰冻 融化 是 浓缩 生物 大 分 子 及 其 它 物 质 的 一 种 有 效 方法 ,能 用 于 浓缩 大 量 溶 液 。 样 
芒 在 缓慢 冻结 时 ,水 不 断 形成 冰晶 而 析出 , 盐 类 及 天 分 子 留 在 液 相 ,从 而 得 到 浓 溶 液 。 其 
装置 如 图 9-25 所 示 , 浓 缩 室 的 中 央 有 浮动 式 搅拌 器 。 溶 液 中 的 水 在 浓缩 室 的 周围 逐渐 结 
UK ,溶质 浓度 不 断 增 大 ,集中 到 浓缩 室 的 中 部 。 可 以 使 溶液 浓缩 4 一 30 倍 。 


图 9-25 冰冻 浓缩 机 


也 可 以 利用 溶剂 与 溶质 融 点 的 不 同 , 先 将 溶液 冻 成 固体 ,然后 缓慢 融化 。 用 此 法 浓缩 
蛋白 质 和 酶 的 盐 溶液 时 ,不 含 蛋白 质 和 酶 的 冰 块 译 在 液 面 上 ,而 蛋白 质 和 酶 则 集中 于 下 层 
溶 该 。 移 去 上 层 冰 块 , 可 以 得 到 蛋白 质 和 酶 的 浓 溶 液 。 


© 255。 


Ay, Kft 
离子 交换 ,吸附 剂 吸 附和 亲 和 层 析 方法 都 同时 具有 分 离 和 浓缩 的 作用 。 


(—) 离子 交换 


例如 : -水 解 RNA 可 以 得 到 四 种 单 核 背 酸 的 混合 液 。 经 阳离子 交换 树脂 分 离 AMP 
组 份 后 ,再 经 阴离子 交换 树脂 分 离 能 够 得 到 GMP, UMP 及 CMP 组 分 。 经 阳 柱 得 到 的 
AMP 组 分 所 含 的 杂质 很 少 , 可 以 进行 减 压 浓 缩 。 而 CMP, GMP, UMP At eee 
RR » Va ER GA HE A PR OE AER HEMT: ; 

CMP 组 分 用 6N NaOH 调 pH 8.0—8.5, UMP 组 分 调 pH9.0 一 9.5,GMP 组 分 调 
pH7.0 上 柱 ( 聚 葵 乙 烯 - 二 乙烯 葵 季 胺 型 树脂 ,100 一 200 目 , 交 联 度 1X8)。100 毫升 树脂 
可 上 柱 10 RETR CRM, aR) 上 柱 后 用 0.1VHCI(PHI1.0)》 3% 
NaCl 溶液 加 热 至 50"C 洗 脱 , 分 部 收集 ,用 10 倍 量 的 95 全 可 浓缩 
100 倍 , 收 率 在 80% 以 上 。 


(二 ) 吸附 剂 吸附 

常用 的 吸附 剂 有 活性 炭 、 磷 酸 钙 、 氧 化 钻 与 硅胶 等 。 溶 剂 的 极 性 和 溶解 性 对 吸附 作用 
“有 很 大 的 影响 , 所 以 考虑 吸附 作用 时 应 注意 两 个 方面 : ”被 吸附 物 的 极 性 和 溶剂 的 溶解 
性 。 

亲 和 层 析 与 有 选择 地 加 沉淀 剂 常用 于 分 离 , 但 同时 也 起 到 极 好 的 浓缩 作用 。 其 原理 
及 操作 前 已 介绍 ,这 里 不 再 赣 述 。 


第 二 节 于 PEL1-5> 11-18] 


FF PRE AOE OK TH DL HK RR HI RL : 

生化 制备 中 干燥 往往 是 最 后 一 道 工 序 。 生化 产品 含水 容易 引起 分 解 变性 、 影 响 质 
量 。 

干燥 的 目的 是 提高 产品 的 稳定 性 ,使 它 符合 规定 的 标准 ,便于 分 析 、 研 究 、 应 用 和 保 
存 。 
物料 含水 量 与 空气 湿度 之 间 存 在 着 动态 平衡 。 未 经 密封 的 物料 不 能 保持 干燥 ,因为 
空气 中 就 含有 水 蒸气 。 要 使 物料 干燥 或 含水 量 低 于 空气 温度, 就 应 放 人 密封 容器 内 进行 
于 爆 。 


一 、 影 啊 干 燥 的 因素 


《一 ) RABR 


干燥 过 程 中 ,水 或 溶剂 从 物料 表面 燕 发。 干燥 效率 与 蒸发 面积 成 正比 ,蒸发 面积 大 , 
有 利于 干燥 。 如 果 物 料 厚度 增加 ,蒸发 面积 减 小 ;不仅 难于 干燥 。 还 可 能 因 温 度 升 高 而 引 


。 256。 


起 物料 部 分 溶解 、 结 块 , 甚 至 变质 。 


`“《〈 二 ) 干燥 速度 
干燥 过 程 先是 表面 蒸发 ,然后 内 部 的 水 分 子 扩散 至 表面 ,继续 蒸发 。 如 果 干 燥 速 度 过 
快 ;表面 水 份 很 快 蒸发 ,就 使 得 表面 形成 的 固体 微粒 互相 紧密 粘 结 ,甚至 成 壳 , 妨碍 内 部 水 
份 扩散 至 表面 。 所 以 应 根据 表面 蒸发 的 情况 对 干燥 速度 进行 适当 控制 。 


(三 ) 物料 所 处 的 状态 ss 


静态 时 蒸发 面积 最 小 ,蒸发 效率 很 低 , 需要 有 充分 的 时 间 使 内 部 水 份 扩散 到 表面 , 7 
能 完全 干燥 。 如 用 气流 连续 吹 过 舍 水 的 固体 物料 使 之 分 散 跳动 ,可 以 提高 干燥 效率 。 


(四 ) 温度 

升温 能 使 蒸发 速度 加 快 ,蒸发 量 加 大 ,空间 相对 温度 降低 , 从 而 有 利于 干燥 。 但 很 多 
生化 物质 不 耐 热 ,所 以 干燥 的 温度 不 能 高 。 对 于 需 在 低温 下 进行 干燥 的 样品 说 来 ,冷冻 干 
燥 较 为 适宜 。 
(A) 湿度 

物料 所 处 空间 的 相对 湿度 越 低 , 越 有 利于 干燥 。 相 对 湿度 如 果 达 到 饱和 , 则 蒸发 售 
止 , 也 就 无 法 进行 干燥 。 降 低 相 对 温度 的 办 法 如 下 : 

1. 可 以 在 干燥 器 内 放 和 人 干燥 剂 吸 水 。 

2. 使 气体 流动 更 新 ,如 采用 鼓 风 干 燥 箱 和 烘 房 , 利 用 气流 降低 相对 温度。 而 在 暑 雾 干 
燥 时 ,相对 旨 度 决定 于 高 压气 流 的 相对 温度。 如 果 降 低 气 流 的 相对 湿度 (例如 用 干燥 剂 先 
吸 去 气流 中 的 水 份 ) 干 燥 效 果 更 为 理想 。 


(A) 压力 ; 
蒸发 速度 与 压力 成 反比 , 减 压 能 够 有 效 地 加 快 蒸 发 的 速度 。 还 能 降低 干燥 的 温度 ,并 


使 产品 变 得 蕊 松 。 
子 解 上 述 因 素 将 有 助 于 选择 和 改进 干燥 方法 。 


二 、 常 压 吸 收 干燥 


常 压 干燥 是 在 密闭 空间 内 用 干燥 剂 吸收 水 或 溶剂 。 此 法 的 关键 是 选用 合适 的 干燥 
Fillo 
1 干燥 剂 分 类 按照 脱水 方式 可 以 分 为 三 类 : 

C1) 能 够 与 水 可 逆 地 结合 为 水 合 物 。 例 如 无 水 氧化 钙 、 无 水 硫酸 钠 ` 无 水 硫酸 钙 、 固 
KAA RD) 等 。 这 类 干燥 剂 不 能 完全 除去 水 ,因为 它们 与 被 干燥 物 之 间 存 在 着 水 
分 的 平衡 。 

(2) 能 够 与 水 作用 生成 新 的 化 合 物 , 例 如 五 氧化 二 磷 、 氧 化 钙 等 。 

(3) 能 够 吸 去 微量 的 水 及 溶剂 * 例 如 分 子 筛 。 


ea。 257 ¢ 


2. 选用 干燥 剂 除 考 虑 效率 外 , 还 有 以 下 的 要 求 ) 不 与 被 干燥 物 发 生化 学 反应 
《例如 水 解 ` 酸 碱 中 和 或 生成 分 子 化 合 物 等 );(2) 不 溶 于 被 干燥 物 ; (3) 对 被 干燥 物 没 有 催 
化 作用 ;(4) 干 燥 速 度 快 ,吸水 量 大 ,价格 合适 。 

3. 常 用 的 干燥 剂 及 其 性 能 “ (1) 无 水 硫酸 钠 〈NaSO), 中 性 、 价 廉 、 吸 水 量 大 ,, 但 
作用 慢 、 效 力 差 。 NaiSO, 在 32.4°C 以 下 吸水 后 形成 NaSO,-10 H:O, 但 超过 该 温度 以 
后 ,这 种 水 合 物 即 不 稳定 。 

(2) 无 水 硫酸 镁 (MgSO,), 中 性 , 效 力 中 等 、 作 用 快 、 吸 水 量 也 大 , 吸 水 后 形成 
MgSO7H:O, 与 有 机 物 不 发 生 反应 。 

(3) 无 水 硫酸 钙 〈CaSO4), 作 用 快 ` 效 率 高 。 与 有 机 物 不 发 生 反应 ,而 且 不 溶 于 有 机 
溶剂 。 与 水 形成 稳定 的 水 合 物 〈2CaSoO'H;O),25"C 时 蒸气 压 为 0.004 KARE. 缺点 
是 吸水 量 小 ( 仅 为 其 重量 的 6.6 多 )。 可 用 于 进一步 干燥 (在 无 水 硫酸 钠 、 无 水 硫酸 位 吸水 
后 使 用 )。 

《4) 国体 氧 氧 化 钾 《 或 钠 ), 可 吸收 水 、 氮 和 胺 类 。 氧 氧化 钙 吸 水 能 力 比 所 氧化 钠 大 
60 一 80 倍 。 

(5) 五 氧化 二 磷 〈P:0;), 吸 水 、 效 力 最 高 ,作用 非常 快 ,但 是 价格 较 贵 。 

(6) 氧化 钙 〈Cao), 即 生石灰 , 碱 性 ,吸水 后 成 为 不 溶 的 氢 氧 化 物 、 价 廉 。 

7) OF ii: 常用 的 是 沸石 分 子 筛 。 TATA Pr Pe PRs 2 Te 

(a) A 型 ,又 可 分 为 : 
3A 型 : K,Na;[CAIO,),,(SiO, 2] .27H2O 
4A 型 : Nay[CAIO,)2(SiO,),] .27H2O 
5A 型 : CaysNa3[ (ALO, (SiO; 2] “30H2O 
(b) x # 
13 X AY. Nagg[(AlO, )ge( SiO) 106] - xH,0 . 

分 子 筛 有 高 度 的 选择 吸附 能 力 , 可 依据 它们 的 孔径 不 同 而 筛 分 不 同 大 小 分 子 的 混合 
物 。 分 子 筛 用 前 应 在 550+10° 活化 脱水 , 温 度 过 低 影响 吸附 量 。 温 度 超过 600% 则 使 
晶体 结构 遭 到 破坏 ,导致 降低 或 丧失 吸附 能 力 。 分 子 筛 活化 后 冷 至 200%c , 应 立即 取出 存 


表 9-1 分 子 得 的 吸附 性 能 


类 型 

Gk) em Ww 不 能 吸附 

7: GOANNHY REA 
Seis 4 2-oen Nay On Hay Ho ae ; 
4A 4.2—4.7 CH,OH, C,H,OH, CH,CN 


CH,NH,, CH,Cl, CO,, CS, 

CO, NH,, CH,, C,Hs 

以 及 能 被 3A 吸附 的 物质 
5A 4,9—5.5 (C;—C,,) Ee CHCl »(C.H,),NH 

(CH,),NH, C,H,Cl, CH,Cl 

以 及 能 被 3A, 4A 吸附 的 物质 


13X 9—10 小 于: 10 埃 的 各 种 分 子 (C,H5)3N 


及 更 大 的 分 子 


效 干 燥 器 内 备用 。 分 子 筛 用 后 活性 降低 , 需 用 水 蒸汽 或 惰性 气体 把 吸附 的 物质 置换 出 来 , 
再 进行 活化 脱水 。 

分 子 筛 适 于 吸 除 微量 水 份 , 如 果 样 品 水 分 过 多 应 先 用 其 它 干 燥 剂 吸水 , FE FISD Fibs 
行 干 燥 。 几 种 分 子 筛 的 吸附 性 能 如 表 9-16 


S=.B8 2 FR 
《一 ) 原理 
真空 干燥 即 减 压 干 燥 , 与 减 压 浓缩 原理 相同 。 
(=) ,装置 


包括 真空 干燥 器 ,冷凝 管 及 真空 汞 。 干燥 器 顶部 经 活塞 接 通 冷凝 管 。 冷凝 管 的 另 一 
端 顺序 连接 吸 滤 瓶 .干燥 塔 和 真空 汞 。 蒸气 在 冷凝 管 中 凝 聚 后 滴 人 吸 滤 瓶 中 。 干燥 器 内 
放 有 于 燥 剂 可 以 干燥 和 保存 样品 。 

实验 室 中 常用 的 装置 有 : 

1. 真空 干燥 器 

《1L) 使 用 时 真空 度 不 宜 过 高 , 抽 气 至 盖子 推 不 动 即 可 ,以 免 干 燥 器 被 压 碎 。 新 的 干燥 
圳 一 般 需 经 耐 压 试验 。 处 理 危 险 或 有 毒物 品 时 , 干燥 器 外 还 应 单 铁丝 网 或 用 布 包扎 。 HT 
开 干 燥 器 取样 时 放 人 空气 不 宜 太 快 , 人 在 通气 口 放 一 小 片 清洁 滤纸 ,也 能 
WA ,避免 冲 散 样品 。 

(2) 选用 合适 的 干燥 剂 : 常用 的 干燥 剂 及 其 作用 见 表 9-2。 


表 9-2 常用 干燥 剂 及 其 作用 


ee. Se 剂 RU HSS FA EE AR Ta 
无 水 Na.SO,, MgSO,, CaSO, ER 水 
CaO 水 、 乙 酸 \ 氧 化 所 
KOH, NaOH KC AS. Be 
JE7k CaCl,, P.O, 水 \ 醇 
石蜡 刨 片 醇 \ 醚 \ 石 油 栈 \ 葵 ,甲苯 ,氯仿 ` 四 氧化 碳 


(3) 待 干 燥 物 所 含 溶 剂 如 不 止 一 种 时 ,可 在 干燥 器 内 同时 放 两 种 干燥 剂 ( 例 如 无 水 氧 
化 钙 和 硅胶 ,氧化 钙 与 五 氧化 二 磷 、 石 蜡 与 氨 氧 化 钠 等 )。 不 应 同时 放 两 种 效率 相差 很 大 
而 又 吸收 相同 溶剂 的 干燥 剂 ( 如 五 氧化 二 磷 和 和 氧化 钙 )。 因 为 这 时 低 效 的 氯 化 钙 不 能 起 作 
用 。 必 要 时 可 以 分 两 次 进行 干燥 , 即 先 用 低 效 的 氧化 钙 吸 除 大 部 分 水 再 用 高 效 的 五 氧化 
二 磷 将 水 除 尽 。 

2. 真空 干燥 箱 ”可 以 调控 温度 。 用 时 需 连 接 冷 凝 器 和 真空 汞 。 它 能 处 理 较 大 量 的 
样品 ,但 是 被 干燥 物 的 加 量 应 该 适当 , 以 免 液体 起 泡 溢 出 容器 , 造成 损失 和 污染 真空 干燥 
箱 。 


H.R aR TR 
(—) 概述 


冷冻 干燥 〈Lyophilization), 是 先 将 溶液 或 混 悬 液 冷 冻 成 固态 , 然 后 在 低温 和 高 真空 
度 干 使 冰 升 华 , 留 下 干 物 。 冷冻 干燥 的 原理 可 用 深 刘 
的 三 相 点 相 图 来 说 明 , 见 图 9-26。 图 中 OA 是 固 液 曲 
线 ,OB 是 汽 液 曲线 ,OC 是 固 汽 曲 线 ,O 为 三 相 点 
当 温 度 在 三 相 点 0 以 下 时 将 压力 降 至 OC 线 以 下 , 溶 
剂 就 可 以 由 固 相 直接 升华 为 汽 相 。 例 如 , 冰 的 蒸气 压 
FE—40°C 时 为 0.1 SKRE,FHE—60° 时 为 0.01 毫米 
汞 柱 , 如 将 一 40sc 冰 上 的 气压 降 到 0.01 毫米 汞 柱 , Al 
ae 态 的 冰 就 吸收 大 量 的 热 C1 58 0°C 的 冰 变 成 0 的 蒸 
图 9-26, 三 相 点 相 图 汽 需 吸 热 580 千 卡 ) 直接 升华 为 水 蒸气 。 故 升华 可 以 
人 
因为 冰冻 干燥 是 在 低温 高 真空 度 下 进行 的 ,所 以 样品 不 起 泡 \ 不 暴 沸 。 干 物 不 粘 壁 、 易 
取出 ,而 且 成 为 臣 松 的 粉 块 , 极 易 溶 于 水 。 由 于 冰冻 干燥 有 上 述 优点 ,所 以 广泛 用 于 科研 
和 生产 , 适 于 对 热 敏 感 、 易 吸湿 、 易 氧化 及 溶剂 营 发 时 易 产 生 泡沫 而 引起 变性 的 制品 (和 蛋 自 
BBR AAMAS). 但 并 非 所 有 的 生化 物质 都 能 在 冻 于 时 稳定 。 应 该 先 用 小 
量 做 试验 ,确证 冻 干 对 该 种 物质 无 害 以 后 再 进行 大 量 处 理 。 


(二 ) 装置 
核心 部 件 是 具有 足够 抽 气 容量 的 真空 汞 。 为 了 保持 泵 的 效率 ,防止 蒸气 进入 泵 内 ,在 


和 泵 前 应 该 有 吸收 蒸气 的 装置 ;内 装 干 燥 剂 (如 P.O; 和 KOH) 用 以 吸水 。 冷 阱 也 是 整个 , 
装置 的 主要 部 件 。 冷 阱 外 围 可 用 化 学 制冷 或 机 械 制 冷 。 真 空 测量 装置 可 用 水 银 真 空 表 或 
麦 氏 真 空 表 。 


1. 实验 室 制 备 冻 于 品 的 简易 方法 


C1) 将 物料 置 培养 下 内 (厚度 不 超过 1 工 厘 米 ) ;在 冰箱 内 冻 成 硬块 (有 些 物 料 需 在 次 度 
低温 下 迅速 冻 硬 )。 准 备 真空 干燥 器 ,内 置 两 个 培养 四 分 别 放 固 体 KOH (或 NaOH) 及 


固体 CO :一 乙醇 


图 9-27, 实 验 室 冻 干 装置 〈1) 图 9-28 实验 室 冻 干 装 置 〈2) 


。260。 


P;9;, 迅 速 取 出 冻 块 放 人 干燥 器 ,干燥 器 通过 装 有 P.O, 的 于 燥 管 与 真空 泵 相连 , 管 中 要 有 
足 量 的 PO;, 两 端 塞 棉花 ,注意 切 纪 使 PO, 和 水 进入 油 系 。 抽 真空 后 ,经 过 5 一 10 小 时 
可 得 冻 于 品 , 见 图 9-27。 

(2) 物料 置 圆 底 烧 瓶 中 ,将 瓶 淄 人 干冰 -乙醇 混合 物 内 ,使 瓶 内 物 迅 速冻 成 硬块 ,然后 
连接 高 真空 度 的 真空 泵 , 见 图 9-28。 连 接 泵 的 管道 口径 不 宜 太 小 ,否则 降低 冻 干 效率 , 减 
压 时 加 温 可 以 加 速 蒸发 。 但 以 不 使 试 料 解冻 为 限 , 烧瓶 外 面 通 常 蒙 钉 。 如 果 霜 层 开始 融 
化 、 冻 块 起 泡 应 即 停止 。 检 查 和 排除 故障 后 将 试 料 重新 冻结 ,继续 冻 干 。 如 果 霜 层 全 部 融 
化 ,用 手 接触 烧瓶 不 感觉 冷 , 就 表明 升华 已 经 停止 。 但 可 能 还 有 冰 残 存 于 物料 内 部 ,因此 
需 适当 升温 或 延长 抽 真 空 时 间 以 彻底 脱水 。 

GB) 半 微 量 冻 干 : 简便 易 行 , 效 率 较 高 。 冻 干 30 总 升 以 下 水 溶液 仅 需 2 一 3 小 时 。 
其 装置 见 图 9-29。 它 由 A 与 B 两 部 分 组 成 ,A 用 于 冷却 与 贮存 抽出 的 咨 剂 , 支 管 C 与 A 
相 切 连接 。D 为 真空 活塞 。 王 为 盛 放样 液 的 容器 。 了 下 为 盛 放 制 冷 剂 的 保温 瓶 , 其 中 放 王 
”“- 丙 酮 混合 物 或 冰 盐 混合 物 或 液 氮 等 冷却 剂 。 
| 使 用 时 先 将 溶液 置 E A, 用 冰 - 盐 浴 或 丙酮 = 于 冰 洽 冷 至 固态 。 三 经 活塞 D SRR 
联接 。 开 动 真 空 泵 (可 以 用 2X-1 型 旋 片 式 真 
空 泵 ) 以 后 , 旋 开 活 塞 D。 王 中 冻 块 内 的 咨 剂 升 
华 , 由 支管 C 切 向 进入 并 沿 螺旋 线 通过 A, FAY 
冷却 作用 使 溶剂 蒸气 沿 A 的 周 壁 凝聚 。 15 分 
钟 后 关闭 D, 数 小 时 后 王 中 溶剂 全 部 升华 至 A, 
旋 开 卫 \ 放 和 人 空气 或 捧 气 , 中 留 下 冻 于 品 。 

几 点 说 明 : 

《a) 如 果 装 置 密闭 , 待 真空 度 恒定 以 后 就 
可 关闭 活塞 D, 再 停 真空 汞 。 冷 浴 F 需 维持 低 
ii (一 80%C 一 一 20"c), 以 保证 继续 冻 干 。 此 时 
系统 内 真空 度 等 于 该 种 冷 浴 的 温度 条 件 下 王 中 
YE FIA TATA ATE o 

Cb) 待 冻 干 物 中 如 果 混 有 少量 低 凝 点 溶剂 ae 
CAR. FE. CROCS) WEBEL FR: 图 9-29 SE REE TRF Rs 
SHE PAAMIE, RATA DHS, 待 真空 度 恒 定 以 后 关闭 D 使 E 升 到 室温 , 再 
RAE, 反复 操作 2 一 3 次 ,可 除去 混杂 的 溶剂 ,否则 样品 不 易 冻 干 。 

(c) 冻 干 速度 与 冷 阱 A 的 温度 有 关 。 A 与 王 的 温差 越 大 , 冻 干 效率 越 高 。 例如 要 将 
20 毫升 某 物 质 的 水 溶液 冻 干 ,F 处 用 干冰 -丙酮 混合 物 制 冷 ( 约 一 60%) 只 需 2 一 3 小 时 ; 
如 用 冰 盐 混合 物 制冷 ( 约 一 15"c), 则 需 8 小 时 。 

《d) 各 种 溶液 冻 干 效率 还 受 该 溶剂 的 汽化 热 等 因素 影响 。 汽化 热 越 小 , 冻 干 效率 越 
高 。 例 如 ,20 毫升 某 物质 的 葵 溶 液 , 用 干冰 -丙酮 制冷 ,1 小 时 即 冻 于 〈 葵 的 汽化 热 比 水 
Wo 

2. 旋转 冷冻 离心 式 冻 干 机 〈Spin-Freeze Centrifugal Freeze Dryer) 用 这 种 装置 可 
以 冻 干 小 量 的 样品 而 无 需 制 冷 设 备 。 该 装置 与 真空 泵 相连 ,高速 旋转 中 的 样品 上 面 的 压 
TIEN ELMIRA Ko 7 FEAR 2c AP AP FE ASE a Bd ET 2 UR 2 0 tes AW RT 


- 261+ 


机 中 ,如 果 使 样品 上 面 的 压力 降低 就 会 引起 沸腾 和 起 泡 , 导 致 损失 样品 。 然 而 旋转 冷冻 装 


置 利 用 离心 力 可 以 防止 起 泡 而 使 样品 的 损失 最 少 。 

旋转 产生 的 离心 力 ( 大 于 重力 五 倍 以 上 ) 还 有 一 个 好 处 就 是 能 够 迫使 部 分 样品 沿 管 壁 
升 高 ,从 而 减少 样品 的 厚度 ,增加 表面 积 。 并 不 需要 在 整个 冻 干 过 程 中 连续 旋转 。 冻 干 装 
置 中 的 定时 器 可 以 控制 旋转 时 间 ;, 样 品 冻 结 后 转子 停止 旋转 而 冻 干 过 程 仍 继续 进行 。 

3. 高 效能 多 用 途 的 实验 室 多 用 冰冻 干燥 机 LG-3 型 实验 室 多 用 冰冻 干燥 机 采 用 
目 动 控制 技术 ,操作 方便 。 它 是 在 小 型 半导体 内 冷 式 冻 干 器 的 基础 上 改进 设计 的 ,用 于 冰 
冻 干 燥 的 最 大 试 样 量 可 以 达到 500 毫升 (12 一 18 小 时 内 于 燥 , 用 13A BD Fo HR 
可 以 再 生 ) 此 外 还 能 用 于 : 《1) 室 温 真空 干燥 ; 〈2) 升温 真空 干燥 (在 —30°—+50°% 范围 
内 无 极 可 调 );(3) 低 温 冷 藏 (容积 50 升 ,最 低 一 25%); 4) 真空 低温 贮存 ;〈57 RAI 
Fo 

4. 大 型 冻 王 装置 “示意 图 见 图 9-30。 


ey 


tLJbLIgIlLjILjIL 
SS RATE | 


图 9-30 大 型 冻 干 装置 示意 图 


1. 装 待 干燥 物 ; 2. 真空 干燥 箱 ; 3. 冷 凝 器 ; 4. 增 压 泵 ; 5. 前 级 泵 ; 6. 
一 般 由 制冷 系统 、 真 空 系统 、 加 热 系统 和 电器 仪表 控制 系统 组 成 。 主 要 部 件 为 干燥 


箱 、 凝 结 器 ,冷冻 机 组 真空 泵 组 和 加 热 装置 等 。 制品 的 冻 干 在 干燥 箱 中 进行 。 BAM 


可 用 铸 铝 板 制 成 , 冷 管 及 热管 将 注 其 中 ,分 别 用 于 冷却 或 加 热 制品 。 凝 结 器 内 装 螺 旋 状 冷 
气 盘 管 , 使 其 工作 温度 低 于 干燥 箱 内 制品 的 温度 《可 达 60°C). MRR CEA ARSR)S 


增 压 泵 ( 罗 茨 真空 泵 ) 串 接 , 用 以 抽空 真空 系统 。 制 冷 系统 的 冷冻 机 并 联 使 用 ,根据 负荷 情 , 


况 可 以 只 开 一 人 台 也 可 同时 开 二 人 台 或 三 台 。 加 热 装置 由 油泵 、\ 油 箱 , 电 加 热 器 等 组 成 循环 管 


路 。 控 制 台 控制 全 机 的 电动 仪表 。 利用 铀 热电 阻 与 动 圈 式 温度 指示 仪 对 干燥 箱 中 各 层 的 
FR Ui Fill oe Ui BE Hein DA AS EET EM, 电阻 真空 计 能 够 测量 气体 的 全 压 , 并 具有 


反应 时 间 快 和 适 于 遥测 等 优点 已 在 冻 王 机 中 广泛 应 用 。 例如 我 国 LZG-40 型 冷冻 于 燥 
机 就 是 采用 电阻 真空 计 的 。 


(=|) 冻 二 注意 事项 


1. 样品 溶液 

C1) 样品 最 好 溶 于 水 ,不 含有 机 溶剂 ,因为 有 机 溶剂 降低 冰点 , BARRA BAR 
和 酶 溶液 的 冻 块 融化 后 再 经 减 压 则 引起 大 量 泡 沫 导致 变性 。 而 且 低 沸点 溶剂 (乙醇 或 两 
酮 ?的 蒸气 压 相当 高 ,不 易 凝 结 ;大 部 分 蒸气 将 经 过 冷 阱 进入 和 泵 内 ,, STRIP, AR 


* 262° 


稀释 将 损害 真空 泵 。 如 果冻 块 仅 含 少量 有 机 溶剂 可 按 前 述 操作 除去 。 

(2) 盐 浓度 的 影响 : 盐 浓度 高 , 冻 块 也 易 融 化 ,影响 样品 活性 及 延长 干燥 时 间 。 解 决 
方法 是 先 将 样品 溶液 脱盐 ,或 使 用 挥发 性 盐 (碳酸 锭 或 碳酸 氢 铵 ) 绥 冲 波 。 

(3) pH 值 的 影响 : 缓冲 液 冻结 时 pH 可 能 有 很 大 改变 ,例如 pH7.0 的 磷酸 缓冲 液 
冷冻 时 , 磷 酸 氧 二 钠 比 磷酸 二 氢 钠 先 结晶 析出 。 溶 被 PH 在 完全 冻结 前 接近 3.5。 使 用 
PH7.0 的 磷酸 钾 缓冲 液 时 结果 恰恰 相反 ,因为 磷酸 二 氧 钾 比 磷酸 氨 二 钾 的 溶解 度 小 , 溶液 
pH 最 终 可 以 达到 7.5 一 8.0。 溶液 冻结 愈 快 ,pH Baad. BRE KRARKRA 
ROAM, PH 同样 可 能 改变 。 因 此 某 些 物 质 (如 羧基 肽 酶 ,过 氧化 氢 酶 、 脂 蛋白 
等 ) 因 pH 改变 或 低温 影响 可 能 变性 失 活 , 需 加 入 适当 的 稳定 剂 (如 糖 类 、Ca” 等 )。 

《4) 溶液 的 浓度 应 该 适当 ,蛋白 质 浓 度 最 好 不 低 于 1.5 多 。 同 批 冻 干 的 溶液 浓度 相差 
也 不 应 过 大 。 

2. 装 样 容 器 

《LU 在 高 度 真空 条 件 下 应 该 能 够 耐 受 外 压 并 且 传 热 良 好 。 MAB, RRA 
和 青霉素 瓶 。 加 液 量 不 应 超过 容器 有 效 体积 的 1/5。 样 品 过 多 ,将 使 冷 阱 积存 厚 冰 , 影响 
传 热 , 并 延长 冻 干 时 间 。 

(2) 冻 干 稀 溶液 通常 得 到 很 轻 的 绒毛 状 物 , 容 易 飞 散 ,被 蒸气 带 人 冷 阱 。 在 装 样 容器 
上 面 扎 一 层 细 的 尼龙 网 能 够 截留 冻 干 物 , 而 且 不 影响 冻 干 速度 。 

《3) AMR RK ELE RBA RAT 

3. BRA : 

C1) RA URACHEIKT —20°C) 可 以 使 晶 粒 细小 \ 冻 块 均匀 。 实 验 室 内 通常 采用 静 
冻 法 ,干冰 -乙醇 冷 浴 的 液 面 应 该 高 于 样品 液 面 。 样 液 冻 成 白色 不 透明 时 即 可 。 如 果 用 小 
管 或 安 额 , 预 冻 后 可 以 用 多 接头 管 连接 冷 阱 , 见 图 9-31。 

(2) 旋 冻 法 可 以 加 速冻 干 。 在 圆 底 瓶 中 放 人 少量 样 液 ,将 瓶 倾斜 浸 在 冷却 剂 〈 干 冰 - 
乙醇 混合 物 ) 中 。 边 冻 边 旋转 直至 形成 薄 层 硬块 。 


= 
SELES => 
《一 —) 一 组 16 支 玻璃 管 或 安 颜 
二 =) 
= 
真空 表 OS =) 
( 约 0.02 托 ) G E 废气 
% = ==) 
or) 
eA 


冷 阱 浸 于 含有 于 冰 的 丙酮 中 
9-31 冷 阱 浸 于 含有 干冰 的 丙酮 中 实验 室 规 模 的 冻 干 器 


。 263。 


4. 冻 干 条 件 及 操作 注意 事项 

CQ) 在 冰 全 部 升华 以 前 不 要 扰 动 样 液 冻 块 。 在 除去 瓶 壁 冰 壳 或 移动 容器 时 , 应 避免 
水 蒸气 流 量 突然 增加 导致 冲 散 样品 。 

(2) 达到 一 定 真 空 度 后 , 冻 块 中 水 分 升华 、 温 度 降低 , 可 使 冻 块 自然 保持 冻结 状态 。 
这 时 容器 外 面 无 需 冷 却 ,甚至 还 需 适 当 加 温 以 补充 升华 时 被 消耗 的 热量 。 

G3) 冻 干 过 程 中 ,容器 外 壁 通 常 结 霜 ,这 表明 系统 运转 良好 。 将 近 结 束 时 , 外 壁 的 霜 
渐渐 消失 。 为 了 除 尽 水 份 , 应 适当 延长 时 间 。 

《4) 结束 时 ,缓慢 放 人 空气 ,避免 急速 的 气流 冲 散 冻 干 品 。 系 统 内 部 的 压力 升 至 大 气 

压 后 ,取出 装 样 容器 ,关闭 真空 汞 。 最 后 关 冷 冻 机 或 移 去 冷 阱 (上 述 次 序 不 能 颠倒 )o 如 果 

在 放 人 空气 以 前 停 真空 泵 , 泵 油 将 倒流 至 冷 阱 ,甚至 可 能 进入 干燥 器 , 污染 样品 。 wae 
防水 蒸气 进入 真空 泵 ,要 在 停 真空 泵 以 后 才 停 止 冷却 。 

GC) 冻 干 品 可 以 移 人 小 瓶 , 用 蜡 密 封 ,如 果 是 安庆 , 可 用 扁平 火焰 熔 封 ;保存 于 冰箱 
内 。 

(6) 真空 泵 是 冻 干 装置 的 主 件 。 应 注意 维护 , 经 常 换 油 。 常用 的 和 泵 至 少 每 月 换 一 次 
铀 。 如 果 发 现 水 有 机 溶剂 或 酸 进 入 泵 内 , 即 需 换 油 。 


Ay it STR 


喷雾 干燥 是 将 料 液 (7k 50% DEAR BIR RRS) 喷 成 雾 滴 分 散 于 热气 
流 中 ,使 水 分 迅速 蒸发 而 成 为 粉 粒状 干燥 制品 。 

喷雾 干燥 的 效果 决定 于 雾 注 大 小 。 雾 滴 直 径 为 10 KE AGW FATE REO 
数 可 以 达到 1.92 x 10", 总 面积 可 以 达到 600, BRE RAGE 10 一 50 MKS, R 
面 极 大 ,蒸发 极 快 \ 干 燥 时 间 很 短 (数秒 至 数 十 秒 )。 水 份 燕 发 带 走 热量 还 能 使 液 滴 与 周围 
的 气温 迅速 降低 。 因 此 可 以 在 常 压 下 干燥 热 敏 物 料 。 改 变 操 作 条 件 还 可 以 调控 产品 的 粒 
度 及 含水 量 , 并 且 可 以 制 成 空心 微 球状 产品 ,易于 溶解 。 因而 广泛 用 于 制备 粗 酶 制剂 、 搞 
菌 素 及 活性 干 酵母。 

但 这 种 方法 的 干燥 能 力 小 `. 占 地 面积 大 ,而 且 成 品 密度 低 、 粒 度 小 ,在 收集 和 除尘 方面 
要 求 较 高 。 物 料 需 经 雾 化 ,不 适用 于 对 切 力 及 对 热 敏感 的 具有 生物 活性 的 大 分 子 。 

1. 雾 化 器 的 类 型 8 按 液 滴 雾 化 的 方式 可 以 分 为 三 种 : 

(1) 机 械 喷雾 : 用 高 压 (50 一 200 大 气压 ) 泵 将 物料 送 进 喷嘴 ,由 喷嘴 高 速 喷 出 均匀 
Si WEA 1 米 。 喷 嘴 直 径 约 0.5 一 1:5 毫米 ;不 适用 于 悬浮 该 。 

(2) 气流 喷雾 : “利用 压强 1.5 一 5 公斤 /厘米 ;( 表 压 ) 的 压缩 空气 经 气流 喷雾 器 使 液 
体 喷 成 雾 滴 , 适 用 于 各 种 料 液 。 

G) 离心 喷雾 , 将 料 液 注 于 急速 的 水 平 旋转 的 喷 酒 盘 上 , 借 离 心力 使 料 液 沿 号 酒 盘 
的 沟 道 散 布 到 盘 的 边缘 , 分 散 成 雾 滴 , 离 心 喷 酒 盘 转速 为 4000 一 20,000 转 /分 , 周 速达 
100 一 160 米 / 秒 , 喷 距 直径 为 2 一 3 米 。 此 法 适用 于 各 种 料 波 , 但 功率 消耗 较 大 。 

2. 喷雾 干燥 装置 的 类 型 按 气 流 与 雾 滴 运 动 的 方向 可 以 分 为 并 流 、 着 流 与 混合 流 。 
并 流 使 雾 滴 运动 的 方向 与 气流 运动 的 方向 一 致 ,产品 不 致 过 热 ,应 用 较 广 , 见 图 9-32。 

3. 喷雾 干燥 装置 «HE: (1) 喷 雾 室 ,(2) 液体 喷 酒 装置 ,(3) 加 热 空气 并 且 将 它 送 


。264 。 


-_— 


水 平 并 流 垂直 下 降 并 流 


图 9-32 并 流 于 燥 装 置 


SSN5 


和 - 


11 
3 


OO 2 : 
Be sete 


La. 10 一 > = 


5 


图 9-34 REF RES 
1. 空气 过 滤器 ; 2. 鼓风机; 3. 空 气 预 热 器 ; 4. 喷 头 ; 5. 干 燥 室 ; 6. 收 集 器 ; 7. 袋 滤 
器 ; 8. 排 风口 ; 9. 贮 料 缸 ; 10. 压 缩 空气 ; 11. 风 压 表 


入 了 喷雾 室 的 设备 ,(4) 从 湿热 空气 中 分 离 细 粉 的 装置 。 
使 流体 成 筋 的 主要 部 件 是 转 嘴 或 喷洒 盘 。 见 图 9-33。 其 中 a 是 喷洒 盘 ,其余 为 喷嘴 。 
顺 雾 干燥 装置 见 图 9-34。 


* 265 * 


空气 经 着 框 1 过 滤 , 由 鼓风机 2 送 和 空气 加 热 室 3。 加 热 室 内 加 热管 的 气压 维持 8.5 
公斤 /厘米 , 热 空气 温度 130°C. 物料 由 空气 压缩 机 或 高 压 泵 以 70 公斤 /厘米 "的 压力 喷 
成 细 筋 ,在 喷雾 室内 与 热 空气 相遇 立即 蒸发 干燥 ,得 到 极 细 的 成 品 。 王 燥 的 细 粉 大 部 分 落 
在 喷雾 室 的 底部 ,小 部 分 被 热 空气 带 走 的 干燥 细 粉 则 被 收集 在 袋 滤器 7 中 ,废气 经 离心 式 
排 风 鼓风机 8 排放 到 室外 。 


图 9-35 ”离心 喷雾 干燥 设备 流程 图 


1. 发 酵 液 贮 槽 ; 2. 高 位 槽 ;》 3. 观察 玻璃 管 ; 4. 离 心 喷雾 盘 ; 5. 出 风 管 口 ; 6. 旋 
风 分 离 器 ; 7. 受 粉 器 ; 8. 沉 降 室 ; 9. 双 闸门 印 料 器 ; 10. 进 风 鼓 风机 ; 11. 空 
气 加 热 器 ; 12. 排 风机 ; 13. 排 风 温 度 计 ; 14. 百 页 窗 式 进 风 分 配器 


离心 喷雾 干燥 装置 包括 干燥 室 、 空 气 加 热 器 、 喷 雾 器 、 干 燥 成 品 收集 器 等 , 见 图 9- 
S55 

已 除去 水 份 \ 温 度 不 高 的 热 空 气 用 于 降温 喷雾 ,可 使 喷雾 干燥 技术 更 适用 于 热 敏 物料 
(例如 氨 葵 基 青 霉 素 钠 盐 等 )。 

降温 喷雾 干燥 的 原理 是 利用 吸湿 剂 (氧化 钙 \ 氯 化 锂 等 的 水 溶液 或 硅胶 ) 在 加 热 前 使 
空气 脱水 。 降 低空 气 湿度 ,可 以 进一步 降低 喷雾 干燥 的 温度 , 从 而 提高 站务 二, 人 
量 。 


x. RFR 
(—) 原理 


Ain T Ret CARRE YMENDRKAEMARRRMEUITE, RRB SS 
热 面 显著 增 大 有 利于 干燥 ,能 大 大 缩短 时 间 ,减少 受热 的 影响 , 也 可 以 进行 连续 生产 。 次 
fal Fas hee EOE PLE 涂 简 转速 可 根据 物料 干燥 情况 加 以 调节 。 如 转速 图 
定 , 则 可 控制 浓度 。 滚 简 干 燥 器 分 单 滚 简 及 双 滚 简 两 种 。 此 法 缺点 是 干燥 温度 较 高 ,产品 
质量 不 及 喷雾 干燥 ,而 且 是 片 状 , 需 粉 碎 , 设 备 构造 较 复杂 。 


(=) 装置 
1. 单 滚 简 干 燥 器 ”用 于 浓缩 抽 提 液 或 使 稠 厚 物 料 干燥 , 兼 有 蒸发 和 干燥 作用 ,装置 


° 266。 


图 9-36 单 滚 简 干 燥 器 图 9-37 ” 减 压 双 滚 简 式 干燥 器 
1. 槽 ; 2. 转 滚 ; 3. 外 壳 ; 4.87); 5. 螺 旋 运 输 机 ; I. 滚 简 ; 2. 加 料 槽 ; 3. 刮 刀 ; 4. 斜 壁 y》5. 收 集 罩 ; 
6. 贮 料 槽 ; 7.38; 8. 干 燥 成 品 6. 观 察 孔 


SUA 9-36。 

滚 简 2 中 空 , 由 铜 或 铝 制 成 。 波状 易 流 动 的 物料 呈 均 匀 薄 层 沿 上 四 槽 1 的 全 部 宽度 流 
下 , 涂 布 在 滚筒 2 的 表面 。 滚 简 由 齿轮 传动 ,以 2 一 8 转 / 分 的 速度 缓慢 转动 。 随 着 滚筒 的 
转动 ,从 蒸气 管 进 入 简 内 的 蒸气 供 热 使 薄 层 物料 中 的 水 分 迅速 蒸发 。 转 到 刮刀 4 时 ,物料 
兽 层 已 干燥 ,被 刮刀 4 从 滚筒 表面 刮 下 落 到 干燥 产品 接受 器 中 。 

如 果 将 干燥 装置 放 在 密闭 外 壳 中 , 吹 人 空气 或 抽 真 空 都 可 以 提高 干燥 能 力 。 

2. 双 滚 简 减 压 干燥 器 ”干燥 能 力 成 倍 高 于 单 滚 简 式 。 流 动 的 物料 经 加 料 室 2 Se 
层林 在 滚筒 上 , 滚 简 每 转 一 周 , 涂 布 于 滚筒 表面 的 料 液 立即 干燥 , 被 紧 贴 于 简 上 的 刮刀 3 
刊 下 ;, 沙 于 接受 器 中 。 干燥 器 中 蒸发 的 溶剂 蒸气 通过 捕 尘 器 进入 表面 冷凝 器 冷凝 。 HA 
和 对 接 在 冷凝 器 后 面 。 从 观察 孔 可 以 了 解 干燥 及 冷凝 情况 , 见 图 9-37。 这 种 干燥 器 的 蒸发 
效率 很 高 ,水 分 蒸发 量 可 以 达到 70 公斤 / 米 `/ 小 时 。 


BP Pet, ee vig 


C1] < 有 机 化 学 实验 技术 ?> 编写 组 : 有 机 化 学 实验 技术 ,科学 出 版 社 (1978》 

C2) 南京 药学 院 主 编 : 药剂 学 ,人 民 卫 生出 版 社 (1978) 

[3] 中 山大 学 生物 系 生 化 微生物 学 教研 室 编 : 生化 技术 导论 ”人 民 教 育 出 版 社 (1978)。 

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[5] 王 世 中 主编 : 免疫 化 学 技术 ,科学 出 版 社 (1980) 

[6] eM: 生物 化 学 与 生物 物理 进展 , 1 7101980) 

[7] 中 国 科 学 院 北 京 植物 研究 所 七 室 生 化 组 修理 组 : 生物 化 学 与 生物 物理 进展 , 2 ,22(1975) 

[8] 中 国 科 学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 三 室 : 生物 化 学 与 生物 物理 学 进展 ;36(1975) 

[9] Biomedical Products, Vol. 5,No. 2, p. 58(1980) 

[10] Freifeider, D. M., Physical Biochemistry Application to Biochemistry and Molecular Biology, W. H- 
Freeman and Company (1976) 

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[13] 上海 轻工业 设计 院 \、 上 海 医药 工业 研究 院 编 : 干燥 技术 进展 ?第 一 分 册 , 综 述 ;第 四 分 册 , 喷 雾 干 燥 (1977). 

[14] Jakoby,W. B. (Ed.), Methods in Enzymology, Vol. XXII, Academic Press (1971) 


。 267 


0 OO EE OO ee 


f15] Webb, F. C., Biochemical Engineering,D. Van Nostrand Company Ltd. London (1964) 


(16) ”中 国药 学 会 生化 药物 学 会 * 商 业 部 生化 药物 情报 中 心 站 : 1981 年 全 国生 化 药物 学 术 会 议 专题 报告 集 (—), 生 
化 药物 进展 (1981) 


[17] 商业 部 脏 器 生化 制药 情报 中 心 站 编著 : 动物 生化 制药 学 ;人 民 卫 生出 版 社 (19817 
[18] Freeze Dry Apparatus,Labconco p. 24(1978) 


* 268 « 


be 样品 的 保存 
Ste 


第 一 节 , 样品 的 保存 与 环境 条 件 的 关系 


生化 药物 或 生物 制剂 的 正确 保存 ,在 生物 化 学 以 及 医药 科学 领域 中 都 有 重要 的 意义 , 
不 适当 的 保存 不 仅 造成 经 济 上 的 损失 , 而 且 也 给 生化 研究 和 应 用 带 来 很 大 影响 。 特别 是 
一 些 用 于 大 分 子 结构 和 功能 研究 的 制剂 或 药品 ,以 及 分 析 用 标准 生化 样品 ,要 求 更 为 严格 
的 保存 条 件 , 防 止 失 活 、 失 效 或 变质 。 要 保存 好 样品 , 首先 就 要 对 样品 变质 的 一 般 规 律 以 
及 样品 的 理化 性 质 有 足够 的 了 解 ,才能 确定 某 种 样品 的 最 适 保存 条 件 。 

影响 生化 药物 或 制剂 质量 的 因素 很 多 ,主要 有 空气 `\ 温 度 \ 水 分 ` 光 线 \ 酸 碱 度 、 样 品 的 
状态 、 微 生物 活动 保存 时 间 和 容器 等 。 这 些 因素 可 单独 起 作用 ,但 更 多 情况 是 协同 作用 , 
互相 影响 , 从 而 加 速 样品 的 变质 破坏 。 每 种 生化 药物 或 制剂 的 理化 性 质 和 对 上 述 因 素 的 
稳定 性 都 不 相同 ,必须 结合 具体 情况 , 抓 住 主要 矛盾 , 选择 适当 的 贮存 环境 和 条 件 。 现 将 
影响 样品 质量 的 几 个 主要 因素 分 述 如 下 : 

LS 空气 的 影响 主要 和 潮解 、 微 生物 污染 和 自动 氧化 等 有 关 。 空气 中 的 微 生 
物 污染 可 以 使 样品 腐败 变质 , 吸 湿 后 的 样品 除 引 起 潮解 变性 外 也 造成 微生物 活动 的 有 利 
环境 。 某 些 具 有 较 强 还 原 性 的 样品 , 露 置 于 空气 中 不 久 便 氧化 变质 。 如 维生素 C 的 失效 、 
HIRAI SERIES. SR (特别 是 液体 样品 或 半成品 ) 在 空气 中 的 氧化 是 
一 种 自动 氧化 过 程 , 是 由 空气 中 的 氧 自发 3 起 的 游离 基 链 式 反 应 。 自动 氧化 的 机 理 很 复 
杂 , 包 括 氧 化 \. 还 原 、 聚 合 ,水 解 等 。 氧 浓度 、 水 、pPH、 温 度 、 紫 外 线 等 对 自动 氧化 均 有 影 
啊 。 

2 温度 ”每 种 样品 均 有 其 稳定 的 温度 范围 , 温 度 升 高 有 利于 许多 物理 和 化 学 变化 
Cin BEF 10°C, 氧化 反应 约 加 快 数 倍 , BRR MAIN 1 一 3 倍 。50%c 以 上 和 蛋白质 容 
易 变性 等 等 ), 不 利于 物质 的 稳定 。 同 时 ,适宜 的 温度 (如 室温 ) 又 是 微生物 感染 的 重要 条 
件 。 而 低温 却 可 以 抑制 氧化 ,水 解 等 化 学 反应 和 微生物 生长 ,使 微生物 处 于 生命 迟缓 和 隐 
蔽 状态 。 故 大 多 数 生化 样品 选择 低温 保存 ,稳定 性 可 大 大 增加 。 

3. 水 份 ”水 份 也 是 影响 样品 质量 的 主要 因素 之 一 。 这 里 所 指 的 水 份 , 可 能 来 自 样 
品 本 身 ,也 可 能 是 样品 吸湿 的 结果 。 水 份 除 直 接 参 与 水 解 \ 酶 解 , 水 合 和 加 合 等 反应 外 ,还 
能 加 速 氧化 聚合 \ 离 解 和 霉 坏 。 和 蛋白质、 核酸 等 大 分 子 含水 量 太 高 时 ,会 导致 高 级 结构 松 
散 ,稳定 性 下 降 而 易于 失 活 。 因 此 ,为 吉 开 或 削弱 水 分 子 的 影响 ,保存 固态 样品 要 密闭 , 液 
态 样品 须 冻 结 或 加 稳定 剂 。 

442 某 些 分 子 可 吸收 一 定 波长 的 光 , 反射 或 透 过 其 它 光 波 的 光 。 样品 吸收 光 
后 ,使 分 子 活化 ,内 能 增加 ,不 利于 样品 保存 。 日 光 中 的 紫外 线 能 量 大 ,对 生化 药物 或 制剂 


的 影响 最 大 。 在 不 同 条件 下 ,样品 对 光 的 敏感 性 各 不 相同 , 受 光 作 用 而 发 生变 化 的 程度 也 


。 269° 


不 同 。 
品 受 光 催 促 的 反应 有 变色 、 氧 化 和 分 解 等 , 通称 光 化 作 用 , 其 中 重要 的 是 在 有 氧 参 
与 下 的 自动 氧化 作用 。 光 化 作用 比较 复杂 , 如 肾上腺 素 在 空气 中 受 光 催化 进行 自动 氧化 
时 ,可 能 涉及 复杂 的 氧化 \ 聚 合 过 程 , 颜 色 由 淡 黄 一 淡 红 一 神色 一 棕 黑 色 。 
HO—7 —CHOH [0] o= <GHOHM / {O]) o=-0 > —OH 
Oo tl he ae 
HO—\_ cH, Ga CH, o= Pr 


i | 
HNCH, HNCH, 


CH, 
肾上腺 素 脱 氢 肾上腺 素 肾上腺 素 红 
Re. eae 
各 si ten 
dus, 
: 肾上腺 素 黑 
维生素 C 的 光 化 作用 也 涉及 一 系列 的 氧化 \ 水 解 等 反应 。 
C=O -- o=C— O=C—OH - -— 
HO 一 C | O, O=C H,0.. .O=C 
nome, | a 36 Oo=C 光 OC 
| Hs ial mh = HC- OH 
i esas HO cu HO---CH 
CH,OH CH,OH CH,OH 
维生素 C 脱 氢 抗坏血酸 二 酮 古 乐 糖 酸 
COOH COOH 
—— > coon’ * * Hc—oH 
iinalaiarae oe 
CooH 
草酸 L- 丁 糖 酸 


因此 ,保存 光敏 感 的 样品 时 ,必须 注意 避 光 。 

5. 酸碱度 ”酸碱度 对 液态 样品 的 保存 影响 较 大 。 不 同样 品 的 稳定 pH AMR), 可 由 
实验 求 得 或 从 文献 资料 查 得 。 液 体 桩 品 保存 时 , 控制 pH 常用 组 冲剂, 但 选择 缓冲 剂 不 
能 只 考虑 缓冲 容量 的 大 小 , 还 要 注意 缓冲 剂 的 种 类 和 浓度 对 样品 稳定 性 的 影响 。 Me 
该 度 的 氧 霉 素 液 用 磷酸 盐 和 酯 酸 盐 缓冲 剂 调 pH15.95 时 ,半衰期 分 别 为 6.3 和 10.9 小 时 , 
差别 很 大 。 青 霉 素 用 柠檬 酸 盐 而 不 用 磷酸 盐 和 醋酸 盐 作 缓 冲剂 , 因 前 者 催化 水 解 的 速度 
Nfs, 某 些 以 无 机 磷 或 有 机 磷 作 底 物 或 反应 产物 的 酶 , 不 宜 用 磷酸 和 焦 磷 酸 缓冲 
Bo 

6. 时间 ”按照 现代 技术 ,生物 或 生化 样品 的 永久 存活 仍 无 法 办 到 ,不 同样 品 均 有 其 
不 同 的 有 效 期 。 因 此 ,保存 的 样品 需要 作 定 期 检查 处理 或 更 换 。 


第 二 节 ”样品 保存 的 一 般 方法 
1. 密闭 保存 ,, 凡 露 置 在 空气 中 受 水 分 、 空 气 的 影响 易 发 生 吸 水 水 解 (如 含 RCO 一 、 


< 270 。 


HNC, RSO,—8 3E AHO RE BRM Bro, Cl“, SOF, SCN-, NOs, —COoH, 
—SO.H, —OH “SIE FINO BECEKAOA BL). ALC &@—SH, —CHO, —NO, 8:05, 


SO, 基 团 的 样品 ) 或 聚合 (如 含 一 CHO、>C 一 CC、\ 一 二 C 一 基 团 的 样品 )\ 吸 收 CO, 


而 碳酸 化 ( 含 OH 、R4 一 N+* 一 OH 的 样品 ) 易 风化 《 含 结晶 水 的 样品 )、 挥 发 或 霉 坏 的 , 
以 至 几乎 所 有 的 样品 ,都 可 用 密闭 保存 方法 ,以 防止 空气 及 水 份 的 侵入 。 FR, RAE 
密闭 保存 最 理想 的 容器 ,固体 \ 液 体 均 可 采用 。 有 些 极 易 氧化 的 样品 ,瓶装 时 应 尽量 装 满 , 
少 留 空隙 ,以 减少 瓶 内 氧气 的 相对 含量 ,加 塞 〈 或 盖 ) 后 蜡 封 保存 。 如 果 样 品 量 少 ,或 为 了 
取样 方便 及 避免 取样 时 样品 吸水 污染 ,可 用 安 颜 或 小 瓶 分 装 。 有 时 需 充 N; 或 抽 真 空 后 再 
保存 。 易 吸湿 发 霉 ( 如 胃 和 蛋白酶 、. 胰 蛋白 酶 .淀粉 酶 及 一 般 含 糖 和 蛋白 质 的 不 纯 制 剂 ) 或 吸 
温 后 易 分 解 失效 (如 青霉素 、NAD 等 ) 的 样品 ,应 放 人 内 盛 无 水 CaCl, TER. PO; 等 干 
燥 剂 的 干燥 器 中 密闭 保存 。 某 些 样品 吸湿 后 ,经 检查 如 不 变质 , 和 s 质 污染 , 干 
爆 后 仍 可 再 用 (如 糖 类 )。 

2. 低温 保存 ”生化 药物 或 制剂 一 般 对 热 敏感 , 特别 是 生物 大 分 子 , 性 质 很 不 稳定 , 
容易 受 温 度 等 环境 因素 的 影响 而 变性 失 活 。 对 热 敏 感 的 生物 活性 物质 及 易 水 解 、 氧 化 的 
物质 的 保存 ,一 般 是 温度 愈 低 愈 好 。 低 温 保存 是 多 数 样品 保存 的 必要 手段 ,但 由 于 不 同样 
品 具 有 不 同 理化 性 质 , 耐 热 性 不 全 相同 ,必须 根据 样品 的 具体 特性 选择 保存 温度 。 例 如 木 
IKEA Be A 100°C 干 热 3 小 时 ,甚至 在 溶液 中 对 热 也 极 稳定 。 抗 菌 素 、 抗 血清 和 胎盘 
球 蛋 白 等 血清 类 制剂 ,在 低温 冰冻 下 保存 最 稳定 。 但 一 些 对 低温 敏感 的 样品 ,保存 温度 不 
能 太 低 。 此 外 还 要 注意 ,用 玻璃 瓶 或 安放 低温 保存 液体 时 , 不 能 装 满 容器 ,以 防 液体 冻结 
AYE IK EHF RO 

3. 固态 干燥 保存 ”液体 样品 的 保存 虽然 可 省 去 较 费 时 的 干燥 处 理 , 但 由 于 水 的 存 
在 ,使 样品 稳定 性 大 大 下 降 。 加 稳定 剂 可 延长 保存 期 ,又 给 使 用 带 来 许多 的 不 便 。 因此 , 
样品 通常 都 制 成 结晶 ,或 经 干燥 以 至 冰冻 干燥 成 固体 后 再 干燥 保存 。 

固态 干燥 保存 排除 了 水 导致 的 不 稳定 , 创造 了 不 利于 微生物 生存 的 条 件 。 一 些 在 水 

VER PA Ze BAK AICS Penn. FE PR Ki TR PF ABER SE WIT REBAR 
完全 无 水 条 件 下 可 以 长 期 保持 效 价 不 变 , 但 吸湿 或 含水 在 10% 以 上 时 即 分 解 失 效 &a5 因 
此 , 干燥 后 的 固态 桩 品 须 钼 装 并 放 人 干燥 器 内 ,必要 时 置 冰箱 内 保存 。 于 燥 保存 是 最 古 
老 , 最 普遍 采用 的 方法 ,在 生化 药物 和 制剂 的 保存 中 占有 重要 的 地 位 。 

4. 避 光 保存 , 凡 见 光 引起 分 解 . 氧 化 或 变色 的 样品 , 均 应 置 棕色 玻璃 瓶 或 安放 内 如 
光 保 存 。 棕 色 玻璃 能 阻碍 某 些 波长 的 光线 ,特别 是 紫外 线 的 透 过 。 如 没有 棕色 瓶 , 也 可 用 
黑色 纸 包 襄 或 暗 处 避 光 保存 , 以 减弱 光 化 作 用 。 SEE BUR a is A te BS a 
黑 纸 保存 。 如 上 述 肾 上 腺 素 、 维 生 素 C 等 都 是 对 光 极 敏感 的 物质 。 维生素 B Famke te 
定 , 但 被 态 遇 光 也 极 易 变质 ,在 碱 性 下 生成 光 黄 素 , 中 性 或 酸性 下 生成 光 色素 。 和 蛋白质 
《如 葡萄 糖 氧 化 酶 ) 在 有 氧 存 在 下 也 受 光 的 影响 。 这 些 物 质 需 用 棕色 瓶 密封 后 置 冷 处 避 光 
保存 ,同时 还 要 设法 减少 参与 光 化 反 应 的 其 它 因素 (如 O,, HO, mB, pH) 的 影响 。 

5. 添加 稳定 剂 ”液态 保存 常 需 根据 不 同样 品 的 要 求 落 加 某 些 辅助 成 份 ,如 防腐 剂 、 
抗 氧 剂 , 酸 碱 调节 剂 等 。 这 些 物 质 对 样品 起 - 定 稳 定 作 用 , 故 通称 为 稳定 剂 。 


。271。 


C1) 防腐 剂 : 用 于 抑制 微生物 生长 ,繁殖 的 防腐 剂 有 : 乙醇 \ 酚 类 和 和 氧 琴 类 (如 葵 酚 、 
氧 甲 酚 ) 有 机 孙 化 合 物 (如 硫 柳 秒 、 硝 酸 苯 汞 、 栈 酸 苯 汞 )\ 对 羟基 葵 甲 酸 酯 类 (如 对 羟基 茶 
RADAR. CER. KAS. 选择 防腐 剂 应 以 防腐 能 力 和 对 样品 有 无 影响 为 依据 例如 
酶 的 保存 不 能 用 汞 和 其 它 重 金属 化 合 物 作 防腐 剂 , 因 它 们 对 酶 有 毒害 作用 。 酶 和 一 般 蛋 
白质 的 防腐 剂 常用 甲 茶 、NaN:、 和 氯仿 \ 百 里 酚 等 。 

(2) RAR: 抗 氧 剂 本 身 是 较 强 的 还 原 剂 , 容 易 氧化 。 有 和 氧 存 在 时 ,其 自身 首先 被 氧 
化 ,从 而 保护 并 延缓 了 样品 的 氧化 能 强烈 地 与 样品 争夺 OL 的 物质 ,或 能 固定 或 整合 金属 
离子 的 物质 都 可 以 作 抗 氧 剂 。 抗 氧 剂 选择 的 原则 是 : ” 它 不 应 与 样品 的 主要 成 分 作用 , 如 
本 身 是 还 原 剂 时 , 它 的 标准 还 原 电 位 要 比 样品 低 , 而 且 低 浓度 下 也 应 有 抗 氧 能 力 。 常 用 的 
水 溶性 抗 氧 剂 有 : ”Na2zSO,、NaHSO:、 焦 亚硫酸钠 、 硫 代 硫 酸 钠 、 半 胱 氨 酸 、 维 生 素 Cs、 hit 
了 又、` 甲 硫 氨 酸 等 。 和 常用 的 脂 溶 性 抗 氧 剂 有 : 没食子 酸 丙 酯 \ 对 葵 二 酚 、 邻 葵 二 酚 * EAR. 
二 上 板 丁 基 对 甲苯 酚 、 焦 性 没食子 酸 、 去 甲 二 氧 愈 疮 酸 等 。 例 如 纺 基 酶 用 半 胱 氨 酸 作 抗 氧 
剂 ,维生素 . A、D、 油 脂 等 可 用 没食子 酸 丙 酯 或 对 羟 板 丁 苘 香 醚 等 作 抗 氧 剂 。 

样品 中 微量 金属 杂质 (如 Cu**, Fe***) 是 自动 氧化 或 水 解 作 用 的 催化 剂 ,起 促进 分 
解 的 作用 ,通常 可 加 入 基 些 金属 整合 剂 或 沉淀 剂 来 防止 。 例 如 维生素 C 在 极 微量 的 Cuf+、 
Fe 、Mn” 存在 下 便 能 被 氧化 和 水 解 , 但 如 加 入 磷酸 三 钠 与 金属 离子 作用 即 能 抑制 分 
解 。 最 常用 于 结合 金属 的 抗 氧 剂 是 EDTA 钠 盐 (1 一 3 x 10°M) 4) ER pH 范围 内 它 
“都 能 与 样品 液 中 许多 金属 离子 获 合 ,生成 稳定 的 水 溶性 歼 合 物 。EDTA 已 广泛 用 作 酶 、 抗 
坏 血 酸 、 肾 上 腺 素 、 青 霉 素 等 的 抗 氧 剂 ,有 效 地 防止 或 延缓 了 氧化 分 解 作用 。 

《3) 情 气 填 充 剂 : 充填 惰 气 是 稳定 样品 , 防止 氧化 的 有 效 方法 之 一 。 少量 易 氧 化 固 
体 样品 可 用 安 颜 充填 惰 气 保存 。 如 果 是 液体 样品 ,也 可 用 情 气 驱除 液 中 残存 的 氧 , 然 后 再 
充气 保存 ,此 时 不 加 任何 抗 氧 剂 ,效果 也 很 理想 。 样品 充气 保存 的 例子 很 多 , 如 细胞 色素 
5 的 充 Na 保存 ,维生素 C 的 充 CO. 保存 等 。 但 不 是 所 有 样品 都 能 充 惰 气 保存 , 如 维 生 
素 必 充 情 气 后 反 使 分 解 速度 加 快 , 使 用 时 必须 加 以 注意 。 

6. 制 成 高 稳定 性 的 盐 类 或 衍生 物 ”许多 样品 由 于 水 解 或 氧化 会 使 稳定 性 下 降 , 但 
制 成 盐 类 或 对 其 结构 进行 化 学 修饰 改造 后 ,效力 不 降 ,稳定 性 却 得 到 了 很 大 的 改善 。 如 青 
霉 素 G 经 制 成 钾 、 钠 盐 , 维 生 素 C 经 修饰 为 维生素 C 葵 甲 酸 酯 后 , 效 价 不 变 , 但 稳定 性 大 
大 提高 了 。 

样品 的 保存 除了 正确 选择 上 述 方法 外 , 常 须 注 意 以 下 事项 : 

GC) 保存 的 样品 一 律 要 贴标签 ,标明 样品 的 名 称 、 制 造 单位 、 含 量 《〈 浓 度 、 效 价 或 活 
性 ) 应 加 成 份 ` 日 期 有 效 期 或 使 用 期 ,以 及 必要 的 附加 说 明 。 

(2) 定期 检查 ;如 有 变质 者 ,应 立即 查找 原因 ,并 作 及 时 处 理 。 凡 保存 期 过 长 的 样品 , 
均 应 愤 用 或 经 检验 、 处 理 后 再 用 。 变 质 样品 一 般 可 用 眼 ` 口 , 鼻 从 外 观 上 (如 发 霉 \ 变 色 、` 况 
CER BM ARE AS) AT ,但 也 有 的 外 观 不 变 而 已 失效 者 , 切 幻 大 意 5 


3) 不 同样 品 应 按 性 质 分 类 保存 。 如 干燥 样品 和 液态 样品 不 宜 一 起 存放 ,, ABER 


品 应 与 其 它 样 品 分 开 保存 等 。 


第 三 节 “各 类 生化 物质 的 保存 , 
一 、 和 蛋白 质 的 保存 


蛋白 质 失 活 受 多 种 理化 因素 的 影响 保存 时 必须 根据 其 不 同 特性 , 采用 不 同 措施 , 以 
防止 变性 或 降解 。 蛋 白质 的 保存 方法 如 下 : | 


(—) 液态 保存 


1. 在 低温 下 保存 “ “蛋白质 对 热 敏感 ,温度 越 高 ,稳定 性 越 差 。 Alt, 低温 保存 蛋白 
” 质 溶液 在 绝 大 多 数 情 况 下 是 有 利 的 。 一 般 蛋 白质 越 丝 , 其 稳定 性 越 差 。 特别 是 纯 酶 深 
液 ; 对 热 甚 不 稳定 《少数 酶 例外 , 如 核糖 核酸 酶 能 短期 煮沸 , 胰 蛋白 酶 能 在 稀 HCL 中 耐 
90sC, 及 某 些 高 温 细菌 产生 的 耐 热 性 酶 等 为 多 数 在 35—40°C 以 上 就 会 失 活 , 难 以 长 期 保 
存在 普通 冰箱 中 通常 也 只 能 保存 一 周 左右 。 A, 沪 态 蛋白 质 样品 常 芝 在 一 5 一 一 10%C 
”以 至 一 20%c 以 下 冰冻 保存 比较 理想 ,有 时 经 数 月 或 数 年 仍 保留 大 部 份 活性 ”。 

但 是 ,各 种 蛋白 质 的 耐 热 性 不 同 ,并 非 温 度 越 低 , 保存 越 稳定 。 例如 乌 肝 丙酮 酸 羧 化 
酶 对 冷 敏感 ,25%C 左右 稳定 ,低温 反而 容易 失 活 。 而 南北 极 中 某 些 鱼 类 的 抗 冻 蛋 白 , 在 极 
低温 度 下 仍 保留 其 活性 。 羧 肽 酶 、 脂 蛋白 和 某 些 抗体 经 冰冻 再 融 解 后 , 即 完全 变性 破坏 。 
但 茶 些 酶 如 酿 酶 液 经 冻 融 后 ,活性 反而 增加 ,这 可 能 是 由 于 酶 颗粒 发 生 了 散 解 ,表面 积 增 
大 ,暴露 出 更 多 活性 基 团 的 缘故 。 反复 冰冻 和 融化 一 般 会 导致 蛋白 质变 性 , 必 须 尽 量 避 
免 “3。 为 了 防止 冻 融 损伤 ,冰冻 保存 要 求 样品 浓度 大 \ 体 积 小 \ 表 面积 大 、 含 盐 低 、 冻 结 迅 
ZR. — 70° 以 下 保存 \ 用 时 迅速 融化 等 。 

2 在 稳定 PH 下 保存 , 多数 蛋白 质 只 有 在 很 狭窄 的 pH 范围 内 才 稳 定 , 超 出 此 
范围 即 迅 速 变性 。 如 鲸 肌 红 蛋白 在 等 电 点 pH6.8 附近 时 稳定 , 卵 类 粘 蛋 白 在 中 、 酸性 条 
件 下 对 热 稳 定 “。 和 蛋白 质 较 稳 定 的 ,pH 一 般 在 等 电 点 。 因 此 ,酸性 ,中 性 和 碱 性 蛋白 酶 的 
稳定 pH 分 别 为 pH2—6, pH6—9 和 pH5 一 10.5"。 但 也 有 例外 ,如 血浆 蛋白 质 的 等 电 
点 pH4.6, 而 其 稳定 pH 4 6.8, 稳定 pH 与 其 等 电 点 并 不 相同 。 酶 的 最 稳定 pH 也 并 
非 是 酶 反应 的 最 适 pH, 二 者 有 时 可 相差 1 至 数 个 pH 单位 。 所 以 保存 液态 蛋白 质 样 品 
时 ,应 小 心 调 到 其 稳定 pH 范围 内 。 

3. 在 高 浓度 下 保存 ”液态 蛋白 质 易 受 水 化 作用 影响 , 保 存 时 浓度 不 能 太 稀 〈 如 1 
毫克 /毫升 以 下 ) ,否则 将 可 能 引起 亚 基 解 离 ,表面 变性 或 器 壁 吸附 。 一 般 蛋 白质 在 浓 溶 液 
中 比较 稳定 ,中 间 样 品 的 保存 可 采用 温 的 沉淀 需要 保存 酶 溶液 时 ,其 蛋白 质 浓 度 也 应 大 


于 1 多 。 保 存 较 长 时 , 还 需 加 入 防腐 剂 \ 蛋 白 酶 抑制 剂 或 其 它 稳定 剂 。 如 免疫 球 蛋 白 可 加 - 


NaN; 4 0.04%, —20 下 进行 冰冻 钙 。 蛋 白 酶 抑制 剂 的 选择 : PHARMA EDTA; 
碱 性 蛋白 酶 用 二 异 丙 基 氟 磷 酸 (DEFP)\ 葵 甲 基 磺 酰 氟 〈PMSF); 酸性 蛋白 酶 用 十 二 烷 基 
磺 酸 钠 、N- 溴 琥珀 酰 亚 胺 。 活 性 中 心 为 丝氨酸 的 蛋白 酶 加 二 异 丙 基 氟 磷 酸 ;活性 中 心 为 


Site AY SB RS SR SARE, 但 某 些 抑制 剂 ( 如 DFP、PMSEF) 不 仅 抑制 蛋白 酶 , 


对 其 它 酶 可 能 也 有 抑制 作用 ,使 用 时 应 慎重 。 
4 在 保护 剂 存在 下 保存 | 很 早 就 有 人 观察 到 ,在 无 菌 条 件 下 ,室温 保存 了 四 十 五 年 


* 2736 


a a OE EE ee 


的 血液 ,血红 蛋白 仅 有 少量 改变 ,许多 酶 仍 保留 部 分 活性 s0。 另 一 方面 又 观察 到 , 有 些 纯 
酶 液 即 使 在 冷却 下 也 甚 不 稳定 , 保存 期 仅 为 几 小 时 至 几 天 。 这 是 由 于 血液 中 含有 某 些 蛋 
白质 稳定 因素 ,而 纯 酶 则 恰好 相反 ,缺乏 这 些 稳定 因素 。 为 了 较 长 期 保存 蛋白 质 溶液 ( 特 
别 是 敏感 的 纯 酶 或 稀 蛋 白 溶液 ) ,常常 加 入 某 些 稳定 剂 进行 保护 。 现 将 几 类 和 蛋白质 的 稳定 
剂 介 绍 如 下 : - 

C1) 畏 性 生化 或 有 机 物质 : 多 数 蛋白 质 要 求 较为 疏水 的 环境 才能 长 期 保存 。 加 人 某 
些 物 质 降低 溶液 的 极 性 ,可 保护 蛋白 质 以 免 变性 失 活 。 这 类 蛋白 质 的 稳定 剂 有 糖 类 【 单 、 
双 糖 ,或 多 糖 )。 脂 肪 类 (包括 脂肪 酸 )、 蛋 白质 类 (如 牛 血清 白 蛋白 \ 明 胶 )\ 氨 基 酸 (如 谷 所 
酸 钠 、 甘 氨 酸 ` 半 胱 氨 酸 ) 等 生化 物质 ,以 及 多 元 醇 ( 如 甘油 \ 丙 二 醇 )、 二 甲 亚 硕 `\ 有 机 溶剂 、 
羟 凑 酸 (如 柠檬 酸 钠 )。 多 聚 阴离子 (如 多 磷酸 盐 )、 表 面 活性 剂 等 普通 有 机 化 合 物 , 可 根据 : 
需要 而 加 以 选择 。 

如 消化 性 蛋白 酶 在 甘油 液 中 十 分 稳定 , 浓 酶 液 加 等 体积 甘油 于 20°C 下 可 较 长 期 地 
保存 , 但 稀释 时 活性 会 下 降 no5。 二 甲 基 亚 硕 也 是 蛋白 类 物质 低温 保存 的 常用 保护 剂 。 
在 某 些 情况 下 ,加 入 有 机 溶剂 使 酶 处 于 稳定 的 非 极 性 环境 ,对 酶 也 呈现 稳定 作用 。 如 小 田 
假 单 孢 菌 的 间 葵 二 酚 酶 在 含 10% 丙酮 的 50mM 磷酸 缓冲 液 (pH7.5) HR, BM 
菌 属 的 葵 甲 醇 脱 氢 酶 用 20%% 丙酮 或 乙醇 几乎 能 保存 全 部 活性 吧 . 

许多 蛋白 质 可 用 糖 类 来 保存 。 如 酵母 转化 酶 的 活性 与 糖 类 有 关 , 用 和 皂 土 除去 多 糖 后 
“稳定 性 即 下 降 。 血 浆 r- 球 蛋白 也 可 用 糖 类 (甘油 也 可 以 ) 来 稳定 , 但 不 为 脂肪 酸 稳定 中 。 

用 蛋白 质保 存 蛋 白质 也 是 一 种 常见 保存 方法 ,如 溶菌 酶 用 白 蛋白 \ 鱼 精 蛋白 \ 缘 赖 氨 酸 , 木 
瓜 蛋 白 酶 用 骨 胶 元 的 部 分 水 解 产 物 来 保护 Gos。 一 些 蛋 白质 也 用 脂肪 酸 保存 , 如 结晶 的 
人 或 牛 血清 蛋白 需要 少量 脂肪 酸 保护 ,除去 后 变 得 不 稳定 。 

(2) 中 性 盐 : 相当 部 份 的 蛋白 质 要 求 高 离子 强度 (1-4M MA) 的 极 性 环境 和 才 
能 保持 其 活性 , 加 入 中 性 盐 可 稳定 这 类 和 蛋白质。 例如 胰 蛋 白 酶 在 饱和 MgSO, 中 冰箱 放 
置 可 较 长 期 保存 。 未 瓜 蛋 白 酶 悬浮 在 浓 NaCl 中 , 40 下 可 保持 许多 个 月 不 失 活 。 和 蛋白 
ARATE ARBRE KARR RRA ERR DE, ABT 
再 透析 或 用 分 子 得 脱盐 2429。 

(3) FARA: 一 些 蛋 白质 表面 或 内 部 含有 半 胱 氨 酸 斑 基 , 易 被 空气 中 的 氧 缓慢 氧 
化 为 次 磺 酸 或 二 硫化 物 , 使 蛋白 质 的 电荷 或 (和 ) 形 状 发 生 改 变 而 失 活 。 保 存 时 可 加 入 绽 基 。 
试剂 半 胱 氨 酸 、2- 斑 基 乙 醇 二 斑 基 苏 糖 醇 、 二 斑 基 赤 侮 糖 醇 等 (浓度 10-' 一 5X10-3M)y 
保护 蛋白 质 处 于 还 原状 态 , 然 后 在 隔绝 空气 下 (甚至 真空 或 惰 气 中 ) 密 闭 保 存 。 

斑 基 酶 除 氧化 外 还 常 与 重金 属 (如 Fey Mn, Cu 等 ) 结合 而 失 活 , 这 时 加 人 微量 
EDTA, NaS 等 可 以 解除 。 在 保存 中 应 注意 容器 、 试 剂 和 水 的 质量 , 尽 可 能 避免 重金 属 污 
ye, 

(4) BRMAF: 某 些 酶 可 为 底 物 、 辅 酶 .竞争 性 抑制 剂 \. 活 化 离子 ` 反 应 产物 等 所 稳 
定 。 例 如 酵母 已 糖 激酶 . 顺 乌 头 酸 酶 、N- 甲 基 谷 氨 酸 合成 酶 等 只 有 分 别 与 底 物 葡 萄 糖 \ 柠 
檬 酸 、E- 谷 氨 酸 共存 ; D- 磷 酸 甘油 醛 脱 氨 酶 ( 兔 肌 ) 只 有 与 其 辅酶 NAD 共存 才能 稳定 。 
一 旦 这 些 底 物 或 辅酶 被 除去 或 不 存在 , 酶 的 稳定 性 大 大 下 降 。 又 如 淀粉 对 淀粉 酶 有 稳定 作 
用 , 故 往往 将 酶 吸附 在 淀粉 上 保存 。 D- 氨 基 酸 氧化 酶 与 其 底 物 D- 氨 基 酸 的 竞争 性 抑制 
剂 安息 香 酸 钠 或 其 辅酶 FAD 结合 时 , 抗 热 变 性 的 能 力 大 增 8a。 有 人 认为 , 底 物 ` 辅 酶 . 抑 


° 274° 


制剂 促使 酶 稳定 的 可 能 原因 是 降低 了 活性 中 心 的 能 量 水 平 , 使 酶 趋 于 稳定 。 
添加 活化 无 机 离子 也 能 增加 某 些 酶 的 稳定 性 。 例如 当 动 物 和 微生物 淀粉 酶 存在 
Catt, ARMM MAREE Mott 及 透明 质 酸 酶 存在 Cl 或 Br Nf, 稳定 性 可 大 大 
增强 ez。 青 霉 属 的 核糖 核酸 酶 和 脱氧 核糖 核酸 酶 当 存 在 1 X 10 一 1LX 107M AY Zt 
时 , 耐 热 性 则 大 大 提高 a。 因 此 , 某 些 含 金 属 离子 的 纯 酶 (如 淀粉 酶 ,蛋白酶 \ 脂 肪 酶 ) 变 
成 另 一 特定 活化 金属 离子 的 结晶 时 , 即 能 大 大 提高 酶 活 , 并 增加 酶 稳定 性 。 如 结晶 Ca 式 
淀粉 酶 和 明和 蛋白 酶 的 酶 活力 甚至 比 一 般 结 晶 酶 活力 高 2.8 一 3.6 倍 ”。 
点 但 是 , 同 一 类 保护 剂 对 一 种 蛋白 质 或 一 种 保护 剂 对 同一 类 蛋白质 的 保护 作用 往往 相 


差 很 大 。 例 如 5-AMP 能 激活 磷酸 化 酶 a 并 对 热 失 活 有 保护 作用 ,而 3-AMP 则 对 酶 无 激 


活 作用 且 能 加 速 酶 失 活 ka。 0.2MKCI 可 使 KB 细胞 DNA RAMAN, 稳定 并 使 活性 增 
加 13 匈 ,而 对 KB 细胞 的 DNA 聚合 酶 C 却 有 抑制 作用 , 使 酶 活 下 降 到 110", 使 用 时 
不 能 大 意 。 
(=) 固态 保存 

1. 制 成 干粉 或 结晶 ”固态 蛋白 质 比 液态 稳定 。 一 般 蛋 白质 含水 量 超过 10 多 时 , 无 
论 在 室温 或 低温 均 容 易 失 活 ;含水 量 若 降低 至 5% 时 , 在 室温 或 冰箱 中 均 比 较 稳 定 , 得 在 
37°C 活性 则 明显 下 降 。 低 含水 量 对 微生物 和 化 学 活性 不 利 , 一 般 认为 , 微生物 活性 在 含 
水 量 10% 以 下 \ 化 学 活性 在 3 多 以 下 即 被 抑制 2 

长 期 保存 蛋白 质 的 最 好 办 法 是 把 它们 制 成 结晶 或 干粉 。 干粉 的 制备 有 很 多 方法 , 冰 
冻 干燥 是 酶 保存 普遍 采用 的 方法 之 一 。 由 于 冰冻 干燥 蛋白 质 分 子 内 脱水 比 冻 融 更 完全 ,为 
“了 防止 冻 干 过 程 中 蛋白 质 的 部 分 变性 , 除 干燥 时 间 须 迅速 外 ,有 时 可 选择 加 入 某 些 稳定 剂 
或 缓冲 剂 (如 挥发 性 的 碳酸 盐 和 醋酸 盐 缓冲 液 )。 所 用 稳定 剂 与 前 述 冻结 保存 相同 , 最 低 
有 效 浓度 为 0.03M 即 可 达 保存 大 部 分 活性 的 目的 。 冻 干 失 活 也 与 温度 和 离子 强度 有 关 。 
如 谷 氨 酸 脱 氢 酶 对 冻 融 稳定 , 但 冻 干 也 引起 失 活 。 离子 强度 为 0.1 时 , —30, —80%, 
—196°C 冻 干 使 此 酶 活性 由 100% FRE 51%. 42% 38%; 离子 强度 为 0.01 时 , 活 性 
May BIEN 45%, 42% Fl 30%, 

结晶 和 冻 干 品 均 具 有 增强 抗 热 性 、 稳 定 蛋白 质 的 良好 效果 ,而 且 易于 保存 ,便于 运输 。 
多 数 固态 蛋白 质 和 酶 在 盛 有 干燥 剂 的 干燥 器 中 ,低温 下 (0 一 4*C 或 更 低 ) 可 相当 长 期 地 保 
存 。 如 生态 葡 萄 糖 氧 化 酶 在 0%c 下 可 保存 二 年 , 一 15*C 下 可 保存 八 年 。 有 些 甚 至 在 室温 
Fhe REM ARMAS AM, | 

2. 制 成 水 不 溶 酶 ,, 除 物理 吸附 法 制 成 的 不 溶 酶 热 稳定 性 下 降 外 ,在 多 数 情况 下 , 酶 
经 固定 化 后 , 其 对 酸 碱 、 蛋白酶 、 温 度 等 稳定 性 普遍 提高 , 并 更 易于 保存 。 如 氨基 酸 酰 化 
酶 用 离子 结合 法 与 DEAE-Sephadex 制 成 不 洲 酶 后 ,经 在 70°C 加 热 15 分 钟 进行 比较 ,天 然 
酶 与 DEAE-Sephadex- 酶 的 残留 酶 活 分 别 为 10% 和 80%, ERE EERE THRE 
白 酶 处 理 后 , 残 留 酶 活 分 别 为 23% 和 87%™), 不 溶 酶 的 耐 热 性 及 抗 蛋白 酶 能 力 均 比 天 
然 酶 大 大 提高 了 。 因 此 , 酶 和 载体 结合 普遍 增加 酶 的 保存 期 。 如 脲酶 4%C 保存 15 天 失 活 
60%, — AAI 80 儿 ,而 固定 化 腺 酶 4%c 保存 50 一 80 天 不 失 活 Pa。 乳酸 脱 氢 酶 25%C 
30 天 全 失 活 , 而 用 载体 交 联 法 〈 多 孔 玻 璃 加 戊 二 醛 ) AEWA A Ml RB 100% 活 
YEU 。 固 定 的 3- 核 糖 核酸 酶 低温 冰箱 保存 一 年 活性 仍 无 明显 变化 5。 

3. 制 成 酶 衍生 物 “ ”这 也 能 提高 某 些 酶 的 稳定 性 。 如 淀粉 酶 可 制 成 氧化 烷 二 甲 基 茶 


© 275。 


陀 或 聚 碳酸 贞 化 物 的 衍生 物 , 细 菌 蛋白 酶 、 核 糖 核酸 酶 、 葡 萄 糖 氧化 酶 和 酰 化 酶 等 都 可 用 
某 种 高 分 子 化 合 物 作成 衍生 物 。 天 然 酶 经 上 述 处 理 后 , 耐 热 性 均 得 到 提高 。 如 木瓜 蛋白 
酶 经 制 成 结晶 汞 衍生 物 后 ,稳定 性 增加 ,可 数 月 保持 不 失 活 忆 。 

总 的 来 说 , 和 蛋白“ 的 保存 主要 还 是 从 稳定 构 型 \ 保 护 活 性 中 心 、 避 免 辅助 因子 丧失 等 
方面 考虑 ,以 防止 变性 、 解 聚 或 降解 。 由 于 温度 和 水 份 对 蛋白 质 结 构 的 稳定 性 影响 最 大 , 
故 蛋 白质 最 好 是 低温 、 冰冻 或 冰冻 于 燥 后 低温 干燥 保存 。 一 些 酶 的 保存 方法 和 稳定 性 殉 
# 10-1, 


二 、 核 酸 的 保存 


核酸 保存 的 条 件 与 蛋白 质 和 了 酶 大 致 相同 , 凡 影响 核酸 变性 和 降解 的 因素 在 样品 保存 、 

中 均 应 避免 。 一 般 保 存 方法 如 下 : 村 
LRER ”由 于 水 、 稀 电解 质 都 可 以 断裂 核酸 的 氨 键 ,破坏 其 双 螺 旋 结 梅 ,使 核酸 

变性 。 因 此 ; 保存 核酸 时 , 必 须 注意 水 的 影响 , 防 止 稀释 变性 。 一 般 保存 可 用 浓 盐 液 、 
NaCl- 柠 榜 酸 缓冲 液 (pH7) 或 0.1 M 醋酸 缓冲 液 。 DNA 的 液态 保存 , 所 用 盐 浓 度 常 为 
1M 或 0.01 一 1LMNaCl, 浓 度 不 应 低 于 10-: 一 10-4M。 用 盐 溶 液 保存 核酸 时 , 须 配合 低温 
(0sc 以 上 ) 及 加 防腐 剂 (氯仿 或 ImMNaN:)、 核 酸 酶 抑制 剂 等 措施 ca。 如 TDNA 可 在 0.15 
MNaCl 和 0.015M 柠檬 酸 钠 深 滚 中 (1 毫克 /毫升 ) 加 几 滴 氧 仿 后 于 4%c 保存 , 几 个 月 仍 
ERE, 低 分 子 量 RNA (im tRNA) 可 干 态 保存 , 但 高 分 子 量 RNA 应 在 含 2 允 
NaAc 的 75% 乙醇 中 4°C FURR. 液态 质粒 可 加 甘油 后 贮存 在 二 10 史 ,也 可 
在 10mM Tris-HCl( pH7.8), 10mMNaCl, 1mM EDTA-Na, 溶液 中 于 4°C FRG, ~ 

2. 稳定 pH 核酸 溶液 的 保存 也 受 pH 的 影响 ,过 酸 过 碱 均 会 导致 碱 基 上 形成 氨 
键 基 团 的 解 离 , 使 氨 键 稳定 性 址 降 以 至 断裂 。 对 DNA 来 说 , 分 子 上 的 碱 基 在 pH4—11 * 
范围 较 稳 定 ; 超 出 此 范围 DNA 易 变 性 或 降解 。 低温 、 酸 性 或 稀 碱 下 保存 DNA 及 低温 
酸性 下 保存 RNA 均 较 稳定 。 

3. 低温 ”核酸 变性 温度 一 般 为 70—85°C, DNA 的 变性 温度 还 与 GC 含量 有 关 , 
GC 含量 愈 大 ,变性 温度 您 高 。 通常 固态 核酸 在 0*c 以 上 低温 下 干燥 保存 即 可 。 小 分 子 
核酸 保存 温度 还 可 更 低 些 ;如 固态 tRNA 可 在 一 10 下 保存 ea。 液态 核酸 室温 下 容易 变 
性 ,短期 最 好 低温 (4°C) 保存 , 但 不 宜 冻结 , 否 则 将 破坏 大 分 子 结构 ca。 也 有 报道 牛 肝 
RNA 溶 于 50mM NaCl 后 一 35%C 低 温 冰冻 保存 ,二 个 月 内 不 变性 或 降解 , 但 应 避免 重复 
冻 融 cm。 电解 质 的 存在 对 核酸 冰冻 有 一 定 保护 作用 。 如 将 含 0.15MNaCl 和 0.015M FR 
酸 钠 的 DNA 在 一 70%C 快 速 冷冻 ;后 于 一 20 吧 保存 ,可 长 达 一 年 之 久 不 变 ca。 

核酸 的 保存 也 与 使 用 目的 有 关 ,用 于 制备 单 核 昔 酸 和 用 于 结构 、 功 能 研究 的 样品 ,所 
要 求 的 保存 条 件 各 不 相同 。 


三 、 铀 脂 的 保存 


脂肪 和 油 保 存 不 当 会 发 生 酸败 ,酸败 是 由 水 解 和 氧化 作用 所 引起 。 酸败 的 油脂 比重 
减 小 、 碘 值 降低 、 酸 值 增高 , 可 作为 油脂 保存 中 质量 检查 的 指标 。 根据 油脂 酸败 时 化 学 变 


。276。 


化 的 特点 ,可 把 酸败 分 为 两 大 类 ,其 特点 及 保存 方法 如 下 后 汶 ; 

1. 水 解 酸败 ”水 解 酸败 是 由 于 油脂 杂 有 脂肪 酶 , 在 水 及 其 它 适 宜 条 件 下 (如 25 一 
35%C、pH4.5 一 5)。 催 化 油脂 的 不 饱和 双 键 水 解 ,产生 游离 脂肪 酸 。 含 水 油脂 容易 长 霉 苗 
和 酵母 菌 ,产生 脂肪 酶 和 脂肪 氧化 酶 ,因此 即使 在 O°C 以 下 保存 ,也 会 发 生 酶 水 解 。 所 以 , 
长 期 保存 油脂 的 关键 是 除去 水 分 ,在 无 水 状态 下 保存 。 通 常 把 油脂 加 热 灭 菌 处 理 , 即 可 达 
破坏 脂肪 酶 和 除去 水 分 的 目的 。 

2. 氧化 酸败 ”氧化 酸败 比 水 解 酸败 更 常见 在 油脂 保存 上 也 更 重要 。 油脂 一 般 都 | 
含有 不 饱和 脂肪 酸 ,不 饱和 程度 愈 高 , 也 即 含 双 键 愈 多 , 愈 易 发 生 氧化 酸败 〈 如 亚 油 酸 )。 
某 些 金属 (如 Co, Mn, Cu, Fe 等 )`. 光 \ 水 和 热 等 都 能 加 速 油脂 的 氧化 变质 , 使 不 饱和 双 键 
加 氧 生成 过 氧化 物 , 后 者 进一步 聚合 或 分 解 为 具有 特殊 臭 味 和 味道 的 低 分 子 游离 酸 、 醛 、 
酮 等 ,可 借 感 官 来 判断 。 

由 于 油脂 氧化 酸败 是 由 多 因素 引起 ,长 期 保存 必须 消除 不 利 因素 的 影响 。 因 此 ,油脂 
一 般 都 应 避 光 、 低 温 、 密 闭 保存 , 尽 量 充满 容器 , 除 尽 水 分 和 灭 菌 。 必 要 时 也 可 加 入 抗 氧 
剂 ; 阻 正 或 延缓 氧化 进行 。 粗 制 油脂 一 般 含有 天 然 抗 氧 剂 (如 维生素 ELM. SME 
胚 酚 等 ) 但 精制 后 含量 降低 , 故 精 制 油脂 (尤其 是 油 ) 较 不 稳定 ,容易 氧化 酸败 。 因 此 ,精制 
MY MINA TA HABA) ,但 非 天 然 抗 氧 剂 多 为 侵蚀 性 物质 ( 酚 、 胺 等 ), 较 理想 的 
抗 氧 剂 目前 还 很 难 找到 。 常 用 的 抗 氧 剂 有 五 倍 子 酸 的 酯 类 、 二 丁 基 甲 酚 、 维 生 素 王 等 , 也 
可 加 增 效 剂 (如 脑 磷脂 、 维 生 素 C 及 其 酯 类 ) 增强 抗 氧 效果 。 抗 氧 剂 、 增 效 剂 的 选择 标准 
FE: 〈1) 能 较 长 期 抗 酸败 ;(2) 能 溶解 油脂 ;(3) 无 不 良 气味 和 味道 ;(4) 无 毒性 。 

此 外 , 某 些 含 不 饱和 双 键 的 固 醇 类 (如 麦角 固 醇 )\ 磷 脂 类 COUN RAE) 也 容易 氧化 变 
io 如 麦角 固 醇 经 一 系列 光 化 反 应 可 变 为 维生素 D;, 后 者 继续 氧化 为 无 活性 或 有 毒 的 
化 合 物 。 所 以 这 类 物质 也 要 避 光 低温 下 密闭 保存 。 

高 级 不 饱和 脂肪 酸 、 油 脂 或 磷脂 类 也 可 根据 需要 固化 后 在 P:0O;, 中 保存 ,或 用 低 极 性 
溶剂 溶解 为 高 浓 溶液 ;后 者 在 避 光 低温 (一 20*C) 下 ,密闭 保存 1 一 2 年 不 分 解 e2。 


四 、 细 胞 及 生物 制剂 的 保存 


动 植物 培养 《或 分 离 ) 细胞 、 以 至 器 官 和 组 织 都 可 加 入 低温 保护 剂 ( 常 用 5 一 10 罗 甘 
油 和 二 甲 基 亚 硕 ) 后 ,于 低温 冰冻 下 保存 。 保存 细胞 的 存活 率 与 冰冻 方法 、 保 存 温度 和 时 
间 、\ 融 化 温度 \ 保 护 剂 、 细 胞 的 种 属 和 性 状 等 有 关 。 不 同 细胞 对 保存 条 件 的 要 求 往往 相差 
RX. 植物 培养 细胞 保存 的 主要 环节 如 下 : ” 预 培 养 一 加 等 体积 低温 保护 剂 混 匀 一 冰冻 
(HBR, 1—5°C/ 分 ; 预 冻 ,一 20 一 一 70%C RK, 直接 漫 大 液 氮 ) 一 一 40 一 一 100%C 一 在 营养 
条 件 下 低温 保存 〈 一 100 一 一 196") 一 迅速 解冻 (34 一 40%C) 一 再 培养 。 动物 细胞 的 冰冻 


。” 保存 大 致 相同 ,但 动物 细胞 与 植物 细胞 的 保存 期 和 存活 率 各 有 差别 ”。 


病毒 和 噬菌体 党 在 10mM Tris-HCl(pH7.6), 10mMNaCl, lmM EDTA-Na, 溶液 中 
4°C 下 保存 汪 。 纯 化 病毒 悬浮 液 也 可 加 少量 防腐 剂 (NaNa、 甲 葵 、 氧 仿 等 ) 或 等 体积 甘油 
保存 于 0—4°C 低温 中 。 冻 干 保存 时 ,一 般 加 入 5 一 10% 蛋白 有 栋 和 葡萄 糖 作 稳定 剂 , 以 防 
DRURY HER RR TE HES 

生物 制剂 (如 菌 苗 \ 疫 苗 、\ 类 毒素 \ 抗 毒素 等 ) 的 稳定 性 差别 较 大 , ALEK ANE 


° 277 


一 -一 一 一 一 


表 10-1 一 些 酶 保存 的 条 件 和 稳定 性 55,2?7 ?4 


FR Ff ® F Re eae = 


(1) 液态 pH3 冰箱 保存 (加 Catt 保护 | COM AAR. in pH? -3—3 室温 下 
更 好 );(2? 因 家 5%C 保存 Pees eee Satie 

冻 干 品 4 °C FR FRE PR ei ie +, Mik pPH>6 易 

CD) Fe -20'c 保存 ; (2 省 办 本 结晶 在 | PURE pO URE REN Ae Ee 


NaCl—CaCl, 或 2 一 3M 硫 琶 铵 中 4 冰箱 保存 HE RF BAIS 


C1) 干粉 4 保存 ; (2) 酶 液 pH2—6, 37°C] 《〈1) 一 至 几 年 内 稳定 ;(224 小 时 失 活 20%; 
保存 ;(3) 酶 液 pH3 冰箱 各 存 (37) 几 天 内 稳定 


冻 干 品 5%C 下 保存 2 一 5 年 内 稳定 


干粉 4% 下 干燥 保存 Pee ort Bei ie HEE (pH2—2.5) 


Gl), 70% 甘油 中 CF REOTS | 《1) 可 稳定 几 个 月 ;(27 可 稳定 一 年, 


O.1mg/ml 则 迅速 失 活 , 反 复 冻 融 引起 失 


(17 MAHER Re —20°0 FRESCO 2 可 长 期 保存 ;(2) 二 年 内 不 失 活 , 但 稀释 
Be oe ae a 5 HKG 25°CpH5.5--8.0 F 8 ht BE 


R24 SAKA RK 4°C 保存 较 稳 定 
酶 液 ( 在 水 或 pH7.5 T, 
ao ae pita ADA Tris 缓冲 液 | 二 年 内 稳定 


《1) .于 态 0 二 43?@ 保存 52 3M 
AERC ICRNCS 0.1 MpHO Ts Hcl Mama | CD MBE ILA SCORE THe 其。 


MgCl,)4°C 保存 


C1) ite EE og oe FB ii e:.p eaaeeee 
(tld 46 ROE ee | @) 可 保存 一 企 月 ;27 可 保存 二 芋 


-| 弹性 蛋白 酶 | FEC 下 保存 (一 10"C 更 好 ) 人 Te a mitin a 


FE 4°C 保存 Je Were Fe FLAK 50°C Fake, 62°C30" & 
jG £ 2 °C RE) BBTR NaCl 中 | 《17 可 稳定 6 个 月 (2 可 保存 许多 个 月 < 


56) Ui Fit FO PRES RET BERR | 《1) 1 一 2 年 内 稳定 ;(2) 6 A RIAD 10% 


ase UT am 4°C RFF 3(2 UR Fae —20°C 保 | 《17) 可 保存 半年 ;(27 可 保存 2 年 以 上 


1 2 2 Valo Fit 
(1) WF 4°C 保存 ;(27 RE AC 保存 leg Gry Oboe oh CLO RAHI BERR 0. 296 


明胶 保护 。 用 pH6 的 缓冲 液 可 增加 稳定 性 。 
一 年 以 上 不 失 活 。 酶 液 酸性 条 件 下 (PH4 一 


(1) 干粉 4sC 保存 Bae 
PEG ACS 可 保存 二 年 。 酶 液 中 性 pH, 70°C Wil 


FR —20°C 保存 小 时 ,PH<5 立即 失 活 


4°C 保存 | 4 一 6 个 月 内 稳定 


-一 一 


B-*E FH 
ie 


名 称 RF FF ® F ee OPS 


WARS egg ont CPR agate pH, 4°C qd) 可 稳定 半年 ;(2) 很 稳定 


纤维 素 酶 “| Fic 保存 可 保存 一 年 。 酶 液 pH4 一 6 最 稳定 
is (1) 能 保存 二 年 ;(2) 可 保存 半年 。 最 适 各 
BR) Ce SR SCOMIET I ie pti —10 ip) ot Hak HERES 25°C 
ae 可 保存 二 年 。 酶 液 在 pH<6-5 sti 
性 磷酸 柄 酶 | 冻 干 品 —20C 保存 _.| 人 符 榜 酸 和 酷 酸 , 降 低 pH 可 增加 稳定 性 | 
es ; 6 个 月 失 活 15%, BIR pH<5,\pH>10 A 
人 ME RES 


& (RABRAM) 在 1M KGI 一 1mM2 筑 基 乙醇 中 冰箱 保存 | 20—25 天 内 稳定 


C1) 干粉 —20°c 或 —50°C 保存 ;(27) 纯 酶 | CL) ALA AAR (DMM EMRE 
BEEK REIOCRS | 在 pH8 缓冲 液 中 冰冻 保存 “” 活 


乙 栈 胆 碱 醒 酶 | :7 CR CEs SOBRE 20m | 1) BERK) BERR 


gill 干粉 4 保存 , 一 年 内 不 失 活 。 酶 液 pH6 一 10 最 稳定 


C1) eGR 3—-15°C 下 保存 ;(27) 结 晶 酶 于 (1) 可 稳定 几 个 月 。 高 度 稀释 极 不 稳定 ;(3 7) 

31s RG 0.5 fa AEE GRR EF Ria PR Gxt 0.1M | 二 个 月 左右 活力 不 变 ;(4) 可 稳定 1 一 几 年 。 
pH7 磷酸 缓冲 液 透 析 后 冰冻 保存 ;(47 酶 结晶 | 纯 酶 水 波 不 稳定 

lee 3.2M, pH7 mie 4°C 保存 


LBA | (1) EB ORF s(2)44 A BIRT 3.2M 


化 酶 “|pH6 MBH ACR C1) 死 个 月 内 活力 不 变 ;〈27 可 保存 一 年 


D- 氨 基 酸 氧 


qd) Ba 40 保存 ; (2) 在 .8M Baa Bech 
化 酶 


a 
H6 25 ANG Be 


) 124 ARES CILA AA fae» 16 
稀释 后 


失 活 如 含 1X10 7M FAD aes 


易 
(1) 所 有 制剂 6 一 12 个 月 均 稳 定 , 但 冰冻 或 


) 
At As Bear nem 年 内 稳定 。 波 态 pH7 较 稳 


(1) 5sc RASC) HO BTM RH 


氧 

fe “| 过 氧化 物 酶 | 干粉 fc 吕 光 干燥 保存 志和 内 疝 证 。 访 pH<3'3, PH>12 不 
还 人 

RES AEF, FIR, 液态 酶 加 0.1% 
原 SBMS | UES, -200 保存 牛 血清 白 蛋 白 可 增加 稳定 性 

& 


"tng | 在 509% 甘油 中 40 下 保存 可 稳定 几 个 月 


0- 磷酸 葡萄 | Cl) 冻 于 品 45C RE Seen 


BLN (3.2 GREE (pH6) 中 4%G 保 C1) 3 一 6 个 月 内 稳定 ; (2) 几 个 月 内 稳定 


果 酸 C) RES CREO 7 二 结局 最 泽 于 709 (1) 一 年 内 不 失 活 ;(2) 二 年 不 失 活 。 稀 浴 
PERS a maak Bert °C 保 ide ES we ease He 
sae tn (1) SHB HE 4°C FREES (2S ROK YEAR TE 5, lala iii 10% £A3(2) 6 个 月 活 


| (1) WBA CR:O)BRIE pH4 一 6.5 | (1) 半年 至 一 年 内 稳定 ;(2) 酶 液 pH>8 温 
葡萄 糖 氧化 酶 | 并 加 和 葡萄糖 后 4 尼 He fe KF 508G ABE. IAA REI 


RRB Fan —20°C 干燥 保存 i heen tos 液态 pH6.5—10.5 较 


« 279 。 


续 表 


保 FR Cy Cai 


名 称 


RRA CRS UR Fain —20°C 保存 BRT. WAS pH7.2—7.6 最 稳定 


黄 味 叭 氧化 酶 | 冻 干 品 °C 保存 6 个 月 基本 稳定 ° 
还 gst ig # 0.5—1.0% Triton X-100 中 40 保存 “| 3 一 4 天 内 稳定 
原 [62 eae ee Se eee ee 
栈 冻 干 品 4°C 保存 相当 稳定 
悬浮 在 2.5M 硫酸 铵 中 0 一 4"C 保存 ABE, MIKE pH<6 不 稳定 
一 个 月 活力 不 变 。 冻 干 品 37%C 加 热 2 天 或 
Fi 5%c 密闭 保存 aS pH? 在 磷酸 缓冲 液 中 60°C 加 热 工 小 时 
活力 不 变 ;但 _ pH5 以 下 易 失 活 
转 LLL LL: 
换 至 少 可 保存 一 年 
Bs (1) F®}—20°CR# (2) 45 ANSE 3.2M : - ne 
Bike en 《569 fee dain (1) 可 稳定 2 年 (22 可 稳定 3 一 5 个 月 
®, Je Tae CPR (2)2E 3.2M BRR) (1) 6-12 4 RARE BEILTA 
C1) 冻 干 品 4aC 保 存 ; Onee 3.0M 硫酸 
己 糖 激酶 ee ie rh ay 50% Hig 0 一 4 保存 (1) 可 保存 年 (2) 可 保存 年 
6 个 月 内 稳定 。pH<4-5 酶 不 可 逆 变 性 
外 Ce 
或 (1) 至 少 可 稳定 二 年 ;(2) 可 保存 一 年 
is HOW pHS.5—10.0 较 稳定 ;离子 强度 为 
0.2 时 很 稳定 
纯 酶 液 中 〈0.85mg/ml) 含有 200mM Be 
酸 钾 组 冲 液 pit6.5)/ 10m 2-337 BL, | 10 个 月 内 活力 不 变 
50% 甘油 ,保存 在 —20°C 
- 纯 酶 在 50mM 磷酸 钾 缓 冲 液 (pH7.0)、 
LN 2-Bi HE ZB, 50% 甘油 中 ,保存 在 
RNA 
es fi E 
DNA 
: meron Gree T TT 
人 m , 0.lmM EDTA, 50% , 10mM i ‘ 
fis Tris-HCl (pH7.9) ‘PIE 7 N Pee 20] 2 一 3 个 月 活力 不 变 
wee 在 20 mM Tris-HCIl(pH8), 200mM NaCl, 
lma 组 基 乙醇 、0.1mAM EDTA, 50% 甘油 | 6 个 月 内 维持 稳定 
DMA A ea 中 —20°C 保存 
ECoRI fH 4i eel : 
oaks rit —. 4° BE —209 —20°CH REE E 
DMA Miers Geert. eee Sea 
ts 长 期 保存 不 失 活 
估 
ii 


冻 ? 液 氮 中 至 少 6 个 月 内 稳定 。 含 较 多 
PON ain inate te oh 一 年 半 内 稳定 


名 - 称 Rm fF R Ti 件 fm. EN 


C1) 450% 甘油 中 一 15 RE; (DE 
meaatk “|i0mix_ 确 酸 钾 缓 冲 液 (PH7.6)、lnmjf 二 硫 苏 |, QI, 8 PAE ABARAT 1095 2) 
T4DNA | 糖 醇 、50mMKCI、5055 甘油 中 —20°C 保存 ? 
连接 酶 “| 在 湿 冰 内 ;(3) 在 10mM Tris-HCI(pH7.6), 
, |L10mM 6- 综 基 乙 醇 \5092 甘油 中 一 55C RF. 


细菌 碱 性 磷 | 在 10mM Tris-HCl (pH8.0), 120mM 
酸 酯 酶 | NaCl, 50% 甘油 中 一 20 尼 Rewer | 对 热 较 稳定 


在 20mM Tris-HCl (pH7.5)、50m 
S, 核酸 酶 |NaCl、0.1mM ZnCl、 50% 甘油 中 一 0c 数 月 内 仍 稳定 
RNA RE, BT BAH 


或 
在 10mM Tris-HCl (pH7.8)、1mM 
DBA | 起 曝 旋 DNA |wgCb、5ml 6- 敬 基 乙 入、 5096 Ht ah 
ba —20C RH BEEK, 
i 


. 在 66 mM KCl, 25mM Tris-HCI (pH8), 
核酸 外 切 Im BARBER 50% Brake — 20°C > 


在 50mM Tris-HCI! (pH7.6), 30mM KCl, 
T4 RRE bmM 二 硫 苏 糖 醇 、mM MegCl,, 0.luM 
Miss “|AITP、5092 甘 油 中 一 207 保 存 ? 浸 于 湿 冰 中 


在 10mM Tris-HCl (pH8), 0.02% NaN; 


结合 的 
oe 中 45 保存 


基质 
ian 


在 50mM 磷酸 钾 缓 冲 液 (pH7.2), 500 
Ae capes mMNaCl, lmM B-3:3£7.B, 50% that 
—20C 保存 , 浸 于 湿 冰 中 。 


烟草 酸性 焦 磷 在 10mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM 


NaCl, 10mM 8- 斑 基 己 醇 、0:0150 Trito 
AME (TAP) 105, S090 Ham UO BEE. er keh 


保存 方法 。 菌 苗 、 疫 苗 或 抗原 、 抗 体 类 可 直接 冻 干 。 有 些 制剂 需 加 入 稳定 剂 ( 如 蔗糖 、 明 
胶 ) 或 杀菌 剂 , 然 后 冷冻 (2—10°C 或 更 低 ) 保 存 。 如 抗 血清 加 硫 柳 汞 或 NaN; 分 别 达 


0.01 $6 和 0.1 多 ,在 无 菌 安 蕉 分 装 后 冰冻 保存 , 则 可 维持 二 年 以 上 不 变 ea。 


五 、 小 分 子 生 化 物质 的 保存 


1. 辅酶 ”生化 中 的 辅酶 约 有 10 多 种 ,多 数 都 对 环境 敏感 , 故 辅酶 类 样品 应 做 成 干 
粉 , 在 阴凉 处 或 冰箱 内 密闭 避 光 保存 。 有 些 辅酶 如 ATP 也 可 加 入 稳定 剂 工 - 精 氮 酸 后 进 
行 冻 干 ,保存 期 可 大 大 延长 。 液态 保存 时 , 对 酸 碱 敏 感 的 FMN、FAD、ATP、NAD 等 
应 调节 到 稳定 pH 范围 。 例 如 ATP, CoA, NAD, NADP 在 碱 性 下 易 分 解 , 应 在 中 、 酸 
性 条 件 下 保存 ; NADH;、NADPH, 对 酸 不 稳定 ,保存 PH 应 大 于 75%, 

2 维生素 "”” ”固态 下 维生素 一 般 很 稳定 , 在 干燥 器 内 可 长 时 保存 , 如 维生素 C 密 


闭 保存 数 年 也 无 影响 。 但 液态 时 受 环境 因素 的 影响 ,稳定 性 大 为 下 降 , 对 光 、0; BUR, 


妥 密 闭 避 光 的 有 : 维生素 Ay Biy Bay Bey Buy Cy Di, Ey Ky, MRMRMY b RSH 
中 维生素 C. A, D, SAMASUR, RAMINEEStRA. 还 有 些 维生素 对 pH 敏感 
《如 B、B, kt KBR, Di. HR MRE), MI pH 保存 。 易 分 解 的 维生素 〈 如 Cy 


。281。 


D:、D:) HUBARF. 


3. 抗菌 素 " ” ”青霉素 不 稳定 , 固 态 也 应 4%C 才能 稳定 保存 , 液 态 更 易 分 解 失 效 。 


自然 界 存在 有 ?7 种 青霉素 形式 每 一 种 青霉素 之 间或 其 盐 的 稳定 性 都 不 完全 相同 。 BE 
青霉素 盐 对 热 较 稳定 , 但 易 吸 湿 , 应 密闭 保存 。 而 被 态 青霉素 盐 则 易 分 解 ,应 调 PH6 一 68 
后 保存 。 


链 霉 素 受 光 、 空 气 影响 小 ,但 易 吸 温 。 故 干 品 可 以 室温 下 密闭 保存 , 一 年 内 效 价 不 变 ,、 


数 年 内 也 影响 不 大 。 液 态 链 霉 素 也 较 稳 定 , 加 入 防腐 剂 冰箱 保存 可 数 月 不 失效 。 1 

四 环 类 抗菌 素 〈 人 金 霉 素 、 土 霉 素 、 四 环 素 及 其 衍生 物 ) 固态 下 都 较 稳 定 。 妇 人 金 霉 素 
20°C 下 3 一 5 年 内 效 价 不 变 , 一 般 密 闭 干 燥 保 存 即 可 。 液态 受 环境 因素 影响 , 稳定 性 差异 
较 大 , 须 结 合 其 性 质 采 取 相 应 保存 措施 s 

4. 激素 ”激素 一 般 对 环境 较 敏 感 (尤其 在 液态 下 ), 除 蛋 白质 激素 按 蛋 白质 要 求 保 
存 外 ,其 它 固 醇 类 激素 需 在 干燥 器 内 于 阴凉 处 (或 冰箱 内 ) 密 闭 避 光 保 存 。 液 态 保存 时 ,应 
选择 最 适 稳定 条 件 。 例 如 促 肾 上 腺 皮质 激素 液态 酸性 下 较 稳定 。 碱 性 下 则 容易 失 活 。 BK 
岛 素 水 溶液 易 受 环境 因素 (pH、 温 度 、 离 子 强度 ) 影 响 而 聚合 成 解 离 , 故 液态 应 调 弱酸 性 
或 在 中 性 缓冲 液 中 冰箱 保存 ra。 

5. 其 他 ”如 核 背 、 核 昔 酸 、 氨 基 酸 、 糖 类 等 对 环境 要 求 不 高 ,固态 一 般 只 要 室温 下 密 
闭 干 燥 保 存 , 则 可 稳定 相当 长 时 间 不 变 。 保 存 中 要 注意 防潮 ,以 免 造 成 霍 坏 (如 糖 类 )。 有 
些 物 质 ( 如 色 氮 酸 \ 半 胱 氨 酸 蛋氨酸、 肝素 等 ) 要 求 避 光 保存 它们 的 水 溶液 稳定 性 差异 较 
大 ,如 核 苷 酸 酸性 下 不 稳定 , 易 破坏 , 需 在 中 碱 性 条 件 下 保存 ,而 喀 喧 和 味 叭 碱 则 对 酸 碱 均 
稳定 ,应 视 不 同情 况 具体 处 置 。 


和 


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0 283 。 


附录 一 , 各 类 生化 物质 制备 
及 测定 的 参考 资料 


根据 R. M. C. Dawson, Daphne C. EJJiott,W. H. Elfiott and K. M. Jones 等 编 的 “DATA 
for BIOCHEMICAL RESEARCH” (Second Edition, Oxford University press, 1969.) 译 出 
FEAR Efe T Mi. 


BREASAS: 


V. S. Very soluble 
Sl. S Slightly soluble 
Sp. S. Sparingly soluble 


i. insolubie 


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« 284 


1. 糖 类 及 有 关 化 合 物 的 制备 


名 一 称 ” 分 子 量 溶解 度 制 - 备 - 方 法 分 析 方法 


D- 阿 拉 伯 糖 150.1 Satie oa Anni ae Sate 4546(1950) 成 糖分 析 测 定 王 般 方 法 
Sl. S. 7% Org. Synth. Coll. 3,101:(1955) 见 下 述 参 考 文献 


(D-Arabinose) i. 乙醚 
卫 - 来 苏 糖 150.1 S.\ 水 J. °A.C."S. 72; °-4546(1950) Meth. Biochem. Anal. 
(D-Lyxose) 2.177% [Bates et al., p. 469 2, 313(1955) 
) J. B. C. 167, 369 (1947) 
L- 来 苏 糖 酸 - 166.1 Ss. 水 J. B. Cz 235, 2518(1960) J. B. C. 194, 261 (1952) 
(L-Lyxonic acid) 
| J. B. C. 204, 1011 (1953) 
核糖 醇 152.1 | S. 水 ;乙醇 ”| A. C. S. 73; 4691(1951) J. B. C. 205,661 (1953) 
(Ribitol) i. BE iJ. C. S. 1949, 844 
D-R 150.1 S. x Ady. Carbohyd. Chem. 6, 135 B. J. 58, 288 (1954) 
(D-Ribose) Sl. S. ZA | (1951) 
Bates et al., p. 476 
2- 脱 氧 核糖 134.1 S. 水 Chemy Ind. 1955,92 The Nucleic Acids, eds. 
(2-Deoxy-D- Si. S. 579 BE |Biochem. Preps. 5, 75(1957) | Chargaff and Davidson, 
Ribose) i Vol, 1} p. 285 
D- 核 酮 糖 150.1 Helv.Chim. Acta. 18, 80(1935) “1J B. C. 204, 1011 (1953) 
(D-Ribulose) J. B. C. 201, 71 (1953) 
D- 木 酮 糖 150.1 S. 水 J. A. C. S. 60, 1201 (1938) J. A. C. S. 76, 5889 (1954) 
(D-Xylulose) J. B. C. 115, 731 (1936) B.J. 63, 542 (1956) 
L- 木 酮 糖 150.1 S. 水 J. B: C.215, 677 (1955) fal D- 木 酮 糖 
“(L-Xylulose) Ber. 68, 118 (1935) 
D-# SRE 164.2 S. xk - |J. C.S., 1945, 746 以 下 为 分 析 甲 基 戊 糖 一 般 方 
. (D-Fucose) is -7.BE ~~ 法 参考 文献 
Sl. S. 乙醇 : J. B. C. 175, 595 (1948) 
EW ba 148.1 | S. 757K |Meth. Carb. Chem. Vol. 1, J. B. C. 192, 579 (1951) 
(Digitoxose) i. 7B p. 240 (1962) Analyst, 80, 268(1955) 
L- 鼠 李 糖 164.2 |S. 7k, AB, CBJ. A. C. S. 43, 127 (1921) 
(L-Rhamnose) i. 3,7.Bk [Bates et al p. 475 


己 糖 分 析 测定 一 般 参 考 文献 : J. B.C. 220, 583 (1956) 
B. J. 58, 288 (1954) 
J. Physiol. 132, 289 (1956) 
十 B. C. 195, 19 (1952) 
(HARE): J. B.C. 192, 583 (1951) 
P. S. E. B. M. 74, 117 (1950) 
B. J. 63, 543 (1956) 
(已 糖 醛 酸 ); Analyt. Chem. 28, 1098 (1956) 


N- 乙 酰 - 半 乳糖 胺 | 221.2 S. 7k [Je Ae Cu Ss 765.301 (1954) |. B.C. 217, 959 (1955) 
(N-Acetyl D- B. J. 51, 379 (1952) 
galactosamine) 

N- 乙 酰 -D- 神 经 | 309.2 | S. 水 ,甲醇 |Biochem. Preps. 7, 1 (1960) 见 上 述 一 般 文 献 

氨 ( 糖 7) 酸 Sl. S. 乙醇 ”|B. B. A. 39, 161 (1960) 

(N-Acetyl-neura- i. CBR, AAAS 

minic acid) Ai 


一 | 一 一 | 一 


名 称 分 子 量 盗 解 度 
D- 果 糖 180.2 3 
(D-Fructose) S. 甲醇 ,乙醇 
D- 半 乳糖 胺 盐酸 盐 | 215.6 S. 水 
(D-Galactosa-mine- 
HCl) 
D- 半 乳糖 180.2 10°, 687? 水 
(D-Galactose) 5.457? 吡啶 
Sl. S. FAB 
D- 氮 基 葡 萄 糖 179.2 V. S 水 
(D-Glucosamine) S. 热 甲 醇 
Sl. S. 乙醇 
i. CH A 
工 - 古 洛 糖 180.2 S. 7K 
(L-Gulose) Sl. S. CB 
D- 甘 露 糖 胺 179.2 | S. 水 ,甲醇 
(D-Mannosamine) 
D-# 2 180.2 2487 水 
(D-Mannose) i. CBE 
L- e 180.2 5229 水 
(L-Sorbose) Sp. S. ACB 
甲醇 


Ady. Carbohyd. Chem. 
7, 53 (1952) 
J. A. C. S. 76, 301 (1954) 
Ady. Carbohyd. chem. 7, 
247 (1952) 
Bates et al., p. 462 


Ady. Carbohydy Chem. 7, . 
247 (1952) 

J. A. C. S. 67, 1713 (1945) 

J. A. C. S. 81. 2403 (1959) 

Bates et al., p. 471 

Adv. Carbohyd. Chem. 7, 


99 (1952) 
Bates et aJ., p. 479 


续 OR 


分 析 方 法 


J. B. C. 127, 601 (1939) 

J. B. C. 192, 583 (1951) 

Analyt. Chem. 28, 1743 
(1956) 


AnaJyt. Chem. 27, 857 
(1955) 


Analyt.Chem. 28, 1743(1956) 
B. J. 61, 586 (1955); 
Meth. Biochem. Anal. 

6, 289 (1958) 


庚 糖 一 般 分 析 测 定 方 法 参考 文献 : 本 B. C. 204, 983 (1953) 
J. B. C. 205, 661 (1953) 


D-c- 葡 庚 糖 210.2 9.5.7K 
(D-a-Glucoheptose) Sl. S. 乙醇 
D- 甘 露 庚 酮 糖 210.2 S. 7k 
(D-manno-Hep- Sp. S. 乙醇 

tulose) 
RRR MR 210.2 SK. 
_ (Sedoheptulose) Sp..S. Ce 
二 糖 一 般 分 析 测 定 方法 参考 文献 : 
纤维 二 糖 342.3 S.5K 
(Cellobiose) i. CeCe 
HAF 342.3 | S. 水 ,甲醇 
(Isomaltose) 
Hi — 342.3 5, 1 
(Kojibiose) 
5 342.3 | 21,67 7k 
(Lactose) 
i. FARE 
乙醇 ,乙醚 
昆布 二 糖 342.3 
(Laminaribiose) 


J. C. S. 1931, 2864 


J. A. C. S. 61, 1654 (1939) 


J. A. C. S. 78, 4717 (1956) 


B. J. 58, 288 (1954) 


Org. Synth. Coll. 2, 122 (1943) 


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B. J. 67, 49 (1957) 

J. A. C. S.°75,5911 (1953) 
J. B. C. 196,265 (1952) 
Nature, Lond. 182, 1303 

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191, 278 (1961) 

Ady. Carbohyd. Chem. 16, 


Sl. S. 冰 柄 酸 1159 (1961) 


S. 水 ,甲醇 |]. C. Ss. 1952, 1243 


J. C. S. 1958, 724, 729 


SS a ee a 


¢ 286 


名 称 分 子 量 溶解 度 制 备 方 法 分 析 方 法 
| 麦 车 糖 342.3 10820 水 “|Bates et al., p. 470 
(Maltose) Sl. S. 7 
i. C.K 
Be — 342.3 S. xk Ady. Carbohyd. Chem. 9, 
(Melibiose) ’ Sl. Ss. Ae 165 (1954) 
Bates et al., p. 473 
松 二 342.3 S. 7k Avd. Carbohyd. Chem. 2, 
(Turanose) SLS. 甲醇 1 (1946) 
j. A. C. S. 52, 2522 (1930) 
纤维 三 糖 504.4 S. 水 J. A. C. S..74, 5331 
(Cellotriose) S1.S. 甲醇 (1952) 
i. Ce 
芒果 三 糖 504.4 S. 水 Meth. Carb. Chem., 
(Kestose) Vol. 1, p. 360 (1962) 
昆布 三 糖 504.4 S. 水 J. C. S. 1958, 724 
(Laminaritriose) 
麦芽 三 糖 504.4 Suk i. G.S0 19535. 1293 
(Maltoriose ) J.B. .O-205, -75-€1953) 
J. A. C. S. 74, 3612 
(1952) 
6-ce- 7 HEHE 504.4 Ss. 水 J. A. C. S. 73, 2547 Analyt. Chem. 25, 231 
麦芽 糖 (1951) (1953) 
(Panose) 
密 三 糖 504.4 14.32 7k |Adv. Carbohyd. Chem. Meth. Biochem. Anal. 
(Raffinose) 9.8 甲醇 9, 167 (1954) 1, 308 (1954) 
V. SS. 吡啶 Bates et al., p. 475 
i. 乙醇 
水 苏 四 糖 666.6 S. 7k Chemy Ind. 1961, 475 
(Stachyose) Ady. Carbohyd. Chem. 
9, 149 (1954) 
EBS TER 828.8 Stan Ady. Carbohyd. Chem. 
(Verbascose) 9, 149 (1954) 
2. 脂 类 及 长 链 脂肪 酸化 合 物 的 制备 
名 称 ht Fi 溶解 度 il &@ AW 分 析 方 法 
花生 酸 312.5 | 0.457° ZB |J. Soc. Chem. Ind., Lond. Meth. Biochem. 
(Arachidic acid) S. Atj.7. ZB 44, 219 (1925) Anal. 8. 1 (1960) 
J. B. C.59, 905 (1924) T. P. Hilditch and 
Ber. 64, 2504 (1964) P. N. Williams, The 
Chemical Constitution 
of Natural Fats, 4th 
ed., p. 678, Chapman 
and Hall (1964) 
花生 四 烯 酸 304.5 S. 乙醚 J. B.c. 80, 455 (1928) 


(Arachidonic acid) 


i. 水 B. J. 34, 879 (1940) 
J. B. C. 142, 672 (1942) 


° 287 « 


名 称 分 子 量 溶解 度 il &@ FF & 
心 磷脂 (508.3) i. 7K J. B. C.. 161, 71 (1945) 
(Cardiolipin) 十 脂肪 酸 | S. AAW, A, |B. J. 70, 409 (1958) 
残 基 Ce, Cae IB. J. 78, 44 (1961) 
脑 磷脂 (296.2)| S. FARR, CB, |J. B.C. 146, 35 (1942) 
(Cephalin) 十 脂肪 酚 Alia B. J. 60, 353 (1955) 
残 基 », AAG Biochem. Preps. 5, 5 (1957) 
B. J. 80, 557 (1961) 
paws (488.6)) I. #57 BR IZ. P. C. 145; 144 (1925) 
(Cerebrosides) “| 十 脂肪 酸 | SI. s. TB |. B.C. 169, 77 (1947) 
BR FE S. Witte, i|JecB.ec.. 219; 977.:¢1956) 
丙酮 , 冰 酷 酸 ,|Biochem. Preps: 7, 31 (1960) 
氯仿 J. Lipid Res. 2, 228 (1961) 
AB Ss ae 386.6 S. 乙醚 Z. P. C. 192, 77, (1930) 
(Cholesterol) 氯仿 ) 葵 ;吡啶 :|Z.P. C. 241, 81 (1936) 
热 乙 醇 
Sp:.S. 7K 
35 i 388.6 | S. Zh, |Z. P. C. 223, 249 (1934); 
(Coprosterol) tis HE 225, 197 (1934). 
Sl. S. 甲醇 J. Lipid Res, 4, 337 
i. 7K (1963) 
二 氢 ( 神 经 ) 鞘 氨 醇 | 301.5 S. 乙醇 J. B. C. 170, 269 (1947) 
(Dihydrosphin- 乙醚 J. Neurochem. 6, 112 (1969) 
gosine) J. B.C., 236, 1912, C1961) 
Kil & 278.4 | S. 乙醚 , 热 冰 J. A. C. S. 56, 898 (1934) 
(Elaeostearic acid) BERR 
i, 水 
芥子 酸 338.6 | S. 乙醇 ;乙醚 IJ. A. C.S. 48, 968 (1926) 
(Erucic acid) (〈 顺 式 ) ( 顺 式 7 
Sl. s. 水 ;乙醇 |]. B. C..200, 287 (1953) 
S. 乙醚 CRA) 
( 反 式 ) J. A. C. S. 78, 3735 (1956) 
半 乳 糖 甘油 脂 Gi) S. FRR {J. Lipid Res. 2, 215, 
(Galacto-glycerides ) (ii) S. 7K 223 (1961) 
HHA HAS Z. P. iC. 278; 1) (1943) 
(Gangliosides) J. Biochem., Tokyo, 43, 
63 (1956) 
B. B. A. 53, 422 (1961) 
B. B. A. 60,350 (1962) 
Z. P. C. 327, 249 (1962) 
cx%- 单 油 酸 甘油 酯 | 6356.5 leak Chem. Zent BI. 1, 2971 
(a-Monolein) S. 乙醇 ,氯仿 (1935) 
乙醚 
cx%- 单 棕榈 酸 甘 油脂 | 330.4 i, 7K J. B..C...128, 475 ' (1939) 
(a-Monopalmitin) S. 乙醇 
DAG SPATE, 3:5 


续 OR 


分 析 方 法 


B. J. 84, 497 (1962) 
B. B. A. 84, 109 (1964) 


J.6B.'C. 157, 585°C1985) 


J. B. C. 192, 465 


(1951) 

B. J. 84, 497 (1962) 

J. B. C. 141, 545 
(1941) 

J. B. C. 219, 977 
(1956) 

Meth.Biochem. Anal. 
6, 178 (1958) 

Meth. Biochem. Anal. | 
10, 263 (1962). 

J. Lipid Res, 3, 283 
(1962) 

R. P Cook, Cholesterol, 
pp- 117, 481, 

Academic Press (1958) 


1B Lipid res., hy 40 
(1959) 


B. J. 59, 309° (1955) . 
Meth. Biochem, Anal. 
8, 1 (1960) 
J. A.C. S. 48, 968 
(1926) : 
Meth. Biochem. Anal. 
8, 1 (1960) 
B. B. A. 44, 49 (1960) 


B. J. 82, 527 (1962) 
J. Lipid Res. 3, 269 
(1962) 


B. J. 62, 455 (1956). 

J. Am. Oil Chem. Soc. 
37, 7(1960) 

见 单 油 酸 甘油 脂 


EE ee 


eR 


名 称 il &@ FT & 


B- 单 棕榈 酸 甘 油 酯 | 330.4 i. 2K J. MAb Gs. Shae, 1924 
(8-Monopalmitin) S. 乙醇 (1934) 
如 < 单 硬 脂 酸 甘油 脂 | 6358.5 分 散 于 水 中 “|J. B. C. 128, 475 (1939) 
(a@-Monostearin) Sl. s. 乙醇 
S. 热 乙 醇 , 热 
Chk, Ah 
S. RZ J. A. C. S. 56, 1724 (1934) 
热 乙 醚 
i. 2K J. A.C. S. 51; 866 (1929) 
Sl. s. 乙醇 
S. 氯仿 乙醚 , 苯 
i. 2K JSSC: S...1954, (1177. 


分 析 方 法 


见 单 油 酸 甘油 脂 


B- 单 硬 脂 酸 甘 油脂 | 358.5 
(8-Monostearin) 
三 月 桂 酸 甘 油脂 639.0 
(TriJaurin) 


Chem, Rev. 29, 333 
(1941) 


DL-2- 羟 基 硬 脂 酸 | 300.4 Aust. J. Chem. 13, 


(DL-2-Hydro- V. S. #GE |B. B. A. 45, 402 (1960) 80 (1960) 
xystearic acid) S. 乙醇 /乙醚 IJ. B. C. 236, 1912 (1961) 
ESB 426.7 Ie 7k Hely. Chim Acta. 27, WL SS 
(Lanosterol) S. 脂肪 盗 剂 472 (1944); 28, 759 
(1945); 29, 204 (1946) 
ARERR 200.3 | V. S. 乙醚 |J. Soc. Chem. Ind., Lond, B. J. 63, 144 (1956) 


《Lauric acid) 冰 醋 酸 , 甲 醇 ,| 49, 138T (1930) 


乙醇 等 JC. Sat 193612 83. 


0.0055 7k 
BURRS (329.3) I. 丙酮 J. B. C. 188,471 (1950) J.B C. 169, 137 .(1947) 
(Lecithin) 十 脂肪 酸 | S. 乙醇 ,乙醚 |Biochem. Preps. 4, 12 B. J. 84, 497 (1962) 
“和 残 基 氯仿 ?四 氧化 | (1955) 
> A B. J. 60, 353 (1955) 
B. J. 88, 414 (1963) 
亚 油 酸 280.4 ie 7k |Biochem. Preps. 4, 86 B. J. 59, 309, (1955) 
(Linoleic acid) V.S. 乙醇 ,乙醚 | (1955) 
溶血 卵 磷脂 i. @ Bk J. B. C. 129, 619 (1939) J. B. C. 206, 443; 647 
(Lysolecithin (8)) s. CB, vk |J. B.C. 211, 321 (1954) (1954) 
RRR, Ay 上. B. C. 206, 431 (1954) J. Lipid Res. 3, 1; 467 
Sp. S. Ai? |B. B. A. 30, 187 (1958) (1962) 
EK AFL 
i 282.5 i 水 J. A. C. S. 56, 1563 (1934) Analyt. Chem. 22, 1261 
(Oleic acid) S. CMa, |). C'S. 19397974: (1950) 
Si, ZB, |J. B. C. 154, 437 (1944) B. J. 59, 309 (1954) 
甲醇 Am Biochem. Preps. 2, 100 
(1952); 9, 113 (1962) 
棕榈 酸 256.4 i. 水 Ber. 21, 2265 (1888) B. J. 63, 144 (1956) 
(Palmitic acid) S. 乙醇 . 茶 ,|Ber. 24, 936 (1891) 
Ati, Bk, |J- C. S. 1931, 802. 
FAS, FYa Org. Synth, Coll. 3, 
607 (1955) 
磷脂 酸 226.1 i. 水 ;乙醇 。 |B. B. A. 41, 45 (1960) B. J. 84, 497 (1962) 
Phosphatidic acid S. 丙酮 ,\ 乙 酝 , |Can. J. Biochem. physiol. 
Ai Ga.) 5/5. 'C1955)) 


* 289 。 


名 称 


磷脂 酰 甘 泪 


(Phosphatidyl- 
glycerol) 


磷脂 酰 丝氨酸 
(Phosphatidyl- . 


Serine) 


缩 醛 磷 脂 
(Plasmalogens) 


谷 当 醇 


(Sitosterois) 


神经 鞘 磷脂 
(Sphingomyelin) 


a 烯 


(Squalene) 


硬 脂 酸 
(Stearic acid) 


11- 十 八 ( 碳 ) 烯 酸 


(Vaccenic acid) 


名 称 


乙酰 辅酶 A 


Acetylcoenzyme A 


抗坏血酸 
(维生素 C) 
Ascorbic Acid 


* 290。 


溶解 度 


在 水 中 乳化 
S. 乙醇 ,乙醚 , 
氯仿 丙酮 ? 葵 , 


FF a? 
ZETK PB FLIE 


Sl.s. 乙醇 
乙醚 , Ad a 
S. 热 甲醇 , 热 
CH, Ai 


(a) S. Abi 
乙醚 
(8) S. Afi 


i. CRE, A 
酮 , 水 
S. Ey AG 
ACH 


S. CRE, A 
is As CH? 


制备 AB 


B. B. A. 27, 189 (1958) 
B. J. 88, 42p (1963) 
B. B. A. 84, 35 (1964) 


B. J. 85, 251 (1962) 

B. B. A. 30, 41 (1958) 
Nature, Lond. 200, 887 (1963) 
B. B. A. 135, 624 (1967) 

(a) B. J. 70, 409 (1958) 

Js) Bs (C2237; 329 (C19625 

J. Neurochem. 10, 941 (1963) 
(b) J. B. C. 225, 859 (1957) 
B. J. 75, 251 (1960) 


(a) J. A. C. S. 58, 2446 
(1936) 

(8) Ber. 64,2167 (1931) 

J. A. C. S. 66, 489 (1944) 

J. B. C. 166, 677 (1946) 

J. B. C.-232, 63 (1958) 

Biochem. Preps. 8, 121 (1961) 


J. C. S. 1926, 1631, 
J. A. C. S. 74, 4321 (1952) 


Ber. 17, 1627 (1884) 
J. Soc. Chem. Ind., 
Lond. 43, 346T (1924) 
J. A. C. S. 62, 230 (1940) © 
J. C.S. 1931, 802. 
Biochem. Preps. 7, 84 
(1960) 
J. A. C. S. 70, 1102 (1948) 
J. Cc. S. 1950, 3484. 


3. 维生素 及 辅酶 类 的 制备 


il & Fi 


Meth. Enzymol. 3, 931 (1957) 


J. A. C. S. 74, 3205 (1952) 
Biochem. Preps. 5, 
27 (1957) 
B. J. 27, 279 (1933) 
J. B. C. 97, 325 (1932) 


分 析 方法 


B. J. 84, 497 (1962) 


J. B. C. 192, 465 (1951) 

B. J. 84, 497 (1962) 

J. Lipid Res. 3, 467 
(1962) 

J. B. C. 219, 39 (1956) 

J. B. C..217, 199. (1955) 

B. B. A. 38, 340 (1960) 

B. J. 84, 497 (1962) 

Prog. Chem. Fats 6, 1 
(1963) 


B. J. 56, 621 (1954) 

B. J. 84, 497 (1962) 

J. Lipid Res. 3, 467 
(1962) 

J. iAerCe SS. 745 4328 
(1952) 


B. J. 63, 144 (1956) 


J. B. C. 169, 227 (1947) 


分 析 方 法 


Meth. Enzymol. 3, 
935, 938 (1957) 


Methods of Vitamin 
Assay, 3rd ed., 
p- 287 (1966) 


B. B. R. C. 10, 333(1963) 


ap 


名 称 分 子 量 


辅酶 A 767.6 


Coenzyme A 


WGK 1355.4 
(BAR Biz) 


Cyanocobalamin 


辅酶 B,, | 1579.6 


Coenzyme Bi: 
DMBC 辅酶 


SHER 1382.4 
Dolichol 


麦角 固 醇 396.7 


Ergosterol 


. 脂 酰 辅酶 A 1006 
Fatty acyl (十 六 酰 ) 
coenzyme A 
RRRRR BAR 785.6 
(FAD) | 
Flavin adenine 
Dinucleotide 


RARPRHR 456.4 
FMN 


Fiavin Mono- 


nucjeotide 
vw 180.2 
Inositol 
硫 辛 酸 206.3 


Lipoic acid 


尼克 酰胺 [22 
《维生素 PP) 
Nicotinamide 

尼克 酰胺 腺 嘎 叭 二 | 663.4 
RE RCM 1) 
Nicotinamide adeni- 
ne dinucleotideNAD; 
DPN. coenzy mel 


溶解 度 制 备 方 法 
S. 7K Meth. Enzymol. 3, 
i。 两 酮 ;乙醚 907 (1957) 
J. A. C. S. 83, 663 
(1961) 
123k Science 107, 396 


S. CARH, | (1948) 
脂肪 酸 ; |Proc. R. Soc. B136 
i, WEE 592 (1940—50) 
2.674 7k 
S. 乙醇 , 酚 
i. 丙酮 ;乙醚 |Arch. B. B. 92, 381 (1961) 
J. C. S. 1963, 4146 
J. B. C. 236, 2119 (1961) 
S. 乙醚 Nature, Lond. 186, 470 
Sl. s. 乙醇 (1960) 
i, 7K B. J. 88, 470 (1963) 

S. FA»; |J. A-C. S. 67, 609 (1945) 
Sl. s. FAB, {Analyst 78, 509 (1953) 
乙醇 ,乙醚 ; 

i. 7K 
脂肪 酸 链 愈 十 六 酰 -辅酶 A: 
长 ; 溶 于 水 愈 少 |Biochem Preps. 7, 
80 (1960) 
Vv. S. Ks Meth. Enzymol. 3, 950 
S. 吡啶 酚 ; (1957) 

i. CB, CB, |Biochem. Prep. 7, 51 

Al, Afi | (1960) 


Biochem. Preps. 10, 


i. AA Meth. Enzymol. 3, 957 
乙醚 , 氧 仿 ; (1957) 
S. 7k vkKHE |J. C.-S. 1950, 3295 
AB 5 ULE » BD 5 
147": 7g: 
Sl. s. 乙醇 


J. B. C. 139, 29 (1941) 


V. S. #52, |Science 114, 93 (1951) 
醇 ,甲醇 ;|J.A. C. S..76, 1828 (1954) 
Sl. s. 石油 栈 ; |J. A. C. So 77, 416, 5144 
i, xk (1955) 
100 水 ; 
Sl. s. 4, CB 


s. 水 Biochem. Prep. 3, 20 (1953) 
J. B. C. 239, pc3598 (1964) 


Biochem. Prep. 11, 84 (1966) 
Meth. Enzymol. 3, 876 (1957) 


27 (1963), 12, 124, (1968) 


分 析 方 法 


Meth..biochenmn . 
Anal. 2, 189 (955) 
Meth. Enzymol. 3. 
913 (1957) 
Meth. biochem. 
Anal. 2, 189 (1955) 
The Vitamins. 2nd 
ed. Vol. 7, p. 277 (1967) 
J.*B.1@1.236; 2347, 
pei (1961) 


B. J. 82, 454 (1962) 


Analyst 78, 509, 
514, 519, 524 (1953) 


Meth. Enzymol. 3, 931 
(1957) 

J. B. C. 204, 329 (1953) 

Meth. biochem. Anal. 
10, 319 (1962) 

Meth. Enzymol. 3, 955, 
960 (1957) 

Jc Be Ch 223; 559 Cisse) 

Meth. Enzymol. 3; 958 
(1957) 

Meth. biochem. Anal, 
10, 319 (1962) 

Meth. biochem. Anal, 
7, 115 (1959) 

B. J. 64,. 523, (1957) 

Meth. biochem. Anal. 3, 

“23 (1956) 

Meth. Enzymol. 3,941 
(1957) 

The Vitamins, 2nd ed., 

vol. 7, p. 137 (1967) 


Meth. Enzymol. 3, 890 
(1957) 

Meth. Enzymol. 6, 792 
(1963) 


e291 * 


ee 


名 称 分 子 量 | | 溶解度 il 备 方 法 分 析 方 法 
尼克 酰胺 腺 叮 叭 二 | 743.4 Be KK Biochem. Preps. 3, 24 (1953) , |Meth. Enzymol. 3, 890 
BERAR Meth. Enzymol. 3, 879 (1957) (1957) 
(辅酶 TD) Biochem. Preps. 11, 87 (1966) Meth. Enzymol. 6, 792 
Coenzyme Il (1963) 
NADP ; | 
RAAB; 441.4 | Sls. 冰 栈 酸 ; |J. A, C, S, 70, 3 (1948) |.J B. C. 205, 361 (1953) | 
叶酸 ,维生素 Be i. FEAL |J. A. C. S. 77, 6365 (1955) The Vitamins, 2nd 
Pteroylglutamic 溶剂 ; ed., vol. 7, p. 243 (1967) | 
acid | 0.05800 水 
N’, Neat pgag | 457.4 Meth. Enzymol. 6, 806 (1963) | |Meth. Enzymol.6, 809 
叶酸 J. B. C. 238, 1498 (1963) (1963) | 
N’, N?°-Methenyl- J. A. C. S. 82, 4921 (1960) 7 
tetrahydropteroy!- . 


glutamic acid 


N*- 甲 基 四 氢 叶 酸 | 459.5 Ss, 水 Biochem. Preps. 10, 103 (1963) |J- B. C. 237, 1298 


(N5- 甲 基 四 氢 哗 酰 B. J. 105, 633 (1967) (1962) 
BAB) J. B. C. 238, 1746 
N’-Methyltetra- (1963) 
hydropter- 
Oylglutamic acid 
吡 哆 醇 盐酸 盐 205.7 22° Ks NJ. 53 Meth. biochem. 
(维生素 Be) SLs 丙酮 ; Anal. 12, 183 (1964) 

Pyridoxol hydroc- i. 乙醚 . 

hloride 
磷酸 吡 哆 醛 247.1 sf 水 Biochem. Preps. 3, 34 (1953) Meth. biochem. Anal. 
Pyridoxal phosphate Sl.s. FAf (Meth. Enzymol. 3, 965 (1957) 12, 183 (1964) 
i. AW Analyt. Biochem. 7, : 
Al. FE 335 (1964) 
BRE 376.4] 0.017% 7k; |Ber. 66, 315 (1933) The Vitamins. 2nd 
(维生素 B:) V.S. 冰 酷 酸 ; ed., vol. 7, p. 99 
Riboflavin i. CREA (1967) 
i 9 
He FAA — A A 867.6 s. 水 J. A. C. S. 75, 2520 (1953) 
Succinyl Biochem. Preps. 5, 30 (1957) 
coenzyme A 
硫 胺 素 盐 酸 盐 337.3 100 7k; = |J. A. C. S. 59, 1052 (1937) Meth. biochem. Anal. 
(维生素 B, RHE) 0.35 7m: U-C.S, 1937, 364 6, 191 (1958) 7 
Thiamin S. 甲醇 The Vitamins, 2nd ; 
chloride i. 乙醚 ,氯仿 ed., vol. 7, p. 53 (1967) / 
硫 胺 素 焦 磷 酸 , 畏 460.8 Su 7K Helv. chim. Acta 29, B. J. 62, 601 (1956) 
#38 (TPP) (cl-) 1909 (1946) B. B. A. 64,13 (1962) 

Thiamin Helv. chim. Acta 32 
pyrophosphate ’ 1478 (1949) 

生育 酚 430.7 S WaW.Z jj. B. C. 113, 319 (1936) Vitams. Horm. 20. 407 
a-Tocopherol . | A, CA; |B. J. 32, 1953 (1938) (1962) 

i, 7K j. A. GC. S. 65, 918 (1943) The Vitamins, 2nd 
Vitams Horm. 20, 389 (1962) ed., vol. 6, p. 291 (1967) 


* 292 . ! 


名 称 


iz 
(辅酶 Qio) 
Ubiquinone-10 


续 表 


分 子 量 溶解 度 制 备 方 法 分 析 方 法 


863.4 |S. 乙醇 /乙醚 |Biochem。Preps.,9,30 
轻 质 石油 醚 ; | (1962) 
i. 2K J. B. C. 234, 2169 (1959) 
B. B. A..32, 73 (1959) 
J. A. C. S. 82, 1647 (1960) 


维生素 A, 286.5 |S. 乙醇 ,甲醇 , |The Vitamins. 2nd ed., The Vitamins, 2nd 
(全 反 型 ) ti, CBR; vol. 1, p. 1 (1967) ed., vol. 6, p. 139 (1967) 
Vitamin A, i. 7K Vitams Horm. 18, 295 Meth. biochem. Anal. 
(1960) 4, 43 (1957); 15, 1(1967) 
维生素 A, 284.4 |S. 乙醇 ,氯仿 ,B. J- 52, 535 (1952) The Vitamins, 2nd 
(全 反 型 ) Ct WOR; |J. C. S. 1952,2657, ed., vol. 6, p. 139 
Vitamin A, i. 7K 1955, 2763 Meth. biochem. Anal. 
Vitams Horm. 18, 295 4, 43 (1957); 15; 1 
(1960), (1967) 
维生素 D, 396.7 28° 乙醇 ;h |B. J. 49, 45 (1951) The Vitamins, 2nd 
Vitamin D, 257° 丙酮 ; |J. A. C. S. 67, 609 (1945) ‘| ed., vol. 6, p. 211 
S. ZB (1967) 
i. 7K B. J. 49, 36, 45, 54, 
232, 243 (1951) 
-维生素 D, 384.7 S. 乙醇 ,两 Ij. A. C. S. 67, 609 (1954) The Vitamins, 2nd 
Vitamin D, 酮 ;氯仿 ; ed., vol. 6, p. 211 
i, 水 (1967) 
维生素 Ky, 450.7. | S. C,AW |Helv. chim. Acta. 22, Meth. biochem. Anal. 
Vitamin K, Hl, 2-5 CBR 310,945, 1464 (1939) ,| 11, 279 (1963) 
i. 7K J. A. C. S. 76, 4592 (1954) The Vitamins, 2nd ed 
vol. 6, p. 245 (1967) 
4. BE BREBRETEDHAS 
名 称 分 子 量 溶解 度 fl & Fy 分 析 方 法 
ets 1351 0.0977, *Levene and Bass, p. 114 Meth. biochem. Anal. 
Adenine 2.51 水 ; 1 {8-"*C. Biochem. Preps. 3, 97 (1956) 
Sl.s. CBs 5, 62 (1957) Meth. biochem. Anal. 
i. CBR, AG 6,79 (1958) 
REY RE 267.2 S. 水; J. B. C. 237, 2283 (1962) J. B. C. 167, 445 (1947) 
Adenosine Sls. C# |J. A.C. S. 73, 1650 (1951) Arch. B, 25, 347 (1950) 
Levene and Bass, p. 163 
腺 苷 -3 ,5 -磷酸 329.2 S. 水 J. B.C. 232, 1065, 1077 (1958) |Analyt. Biochem. 13 
(c’ AMP) J. B. C. 224, 463 (1957) 71 (1965) 


Adenosine-3’, 


5’-cyclicphos-phate 


腺 苷 -5 -二 磷酸 
(ADP) 
Adenosine- 


5’-diphosphate 


J. A.C. S379, 3608 (1957) 
J. A. C. S, 83, 698 (1961) 
J. Org. Chem. 31, 3247 (1966) 
427.2 Biochem. Preps. 1, 1 (1949) Meth. biochem. Anal. 
B. B. A. 91, 1 (1964) 1, 341 (1954) 
Ber. 95, 1664 (1962) 


Ber. 98, 1045 (1965) 


° 293 « 


名 称 


BRE -5'- PRA 


Adenos ne- 
5’-phosphate 


腺 苷 -5 -三 磷酸 
(ATP) 
Adenosine- 


5’-triphosphate 


Rel as EK EF 
Cytidine 


Ka f-5'-— wR 
(CDP) 
Cytidine-5 - 
diphosphate 
Hel 5-5’ -磷酸 
Cytidine-5’- 
phosphate 
胞 苷 -5 -三 磷酸 
(CTP) 
Cytidine-5’- 
triphosphate 
SERRE 


Guanosine 


-5'-— RK 
(5'-GDP) 
Guanosine-5’= 


diphos-phate 


SH -5'- BR 
(5 -AMP) 
Guanosine-5 - 
phosphate 
岛 苷 -5 -三 磷酸 
(GTP) 
Guanosine-5- 


triphos-phate 


。294 。 


507. 


243. 


403. 


523. 


483. 


283. 


443. 


363. 


D235 %, 


2 


2 


溶解 度 


S. 热 水 


Ss. 水 
Sls. 乙醇 


Arch. B. B 


0..08!95 3.0%? 
水 ; 
S. 稀 酸 碱 , 
PAK Ba 
i. 乙醚 G 
AL, Bi 


制 备 方 法 


Biochem. Preps. 9, 5 (1962) 
B. J. 58, 503 (1954) 

B. B. R. C. 24, 872 (1966) 
Biochem. Preps. 1, 5 (1949) 
Arch. B. B. 62, 253 (1956) 
B. B. Az 91,.1°(1964) 


‘|J. Aw C. S. 87, 2265 (1965) 


B. B. R. C. 9, 556 (1962) 
Meth. Enzymol. 10, 702, 
773 (1967) 

Levene and Bass, p. 164 

J. B. C. 237, 2283 (1962) 
j. C. S. 1950312084 

Arch. B. B. 35, 465 (1952) 
J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 
J. A. C. S. 83, 649 (1961) 


Arch. B. B. 35, 465 (1952) 
B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 
B. B. A. 91, 1 (1964) 


J. A.C. S. 37, 2265 (1965) 
Levene and Bass, p. 163 
Ber. 74, 694 (1941) 

J. B. C. 237, 2283 (1963) 
Jikan Serie) 95 Bg bac 


J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 
J. B. C. 218, 521 (1956) 


Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 


Ber. 98, 1045. (1965) 
B. B. A. 91, 1(1964) 
J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 


Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 


B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


j. B. C. 209,.23, 41 (1954) 

j. B. C. 218, 521 (1956) 

B. B. A. 91, 1 (1964) 

Biochem. Preps. 9, 120 
(1962) 

J. A. C. S. 87, 2265 (1965) 


Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 


Biochem. Preps. 9, 120 (1962) 


eR 


分 析 方法 


J. B. C. 167, 445 (1947) 
eth. Enzymol]. 10, 474 
(1967) 


Analyt. Biochem. 14, 261 
17, 456 (1966) 

Meth. Enzymol. 10, 474 
(1967) 


The Nucleic Acids, 
Vol. 1, p. 211 (1955): 


J. B. C. 167, 429 (1947) 


J. B. C. 218, 505 (1956) 


J. B. C. 209, 41(€1954) 


Se R 
名 称 分 子 量 溶解 度 tl & Fr 分 析 方 法 
RARER | 268.2 1.679 水 |Ber, 42, 336 (1909) J. B. C. 167, 429, 477 
CUD V. Sls. |B. B. R. C. 13, 394 (1963) (1947) 
_ Inosine ”乙醇 J. B. C. 167, 477 (1947) 
KERB K 348.2 S. 水 B. J. 36,729 (1942) 
HRM) 甲酸 J. B. C. 190, 611 (1951) 
Inosine-5- V. Skfs. B. J. 58, 503. (1954) 
phosphate 乙醇 , 乙 醚 ,|Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) 


B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


J. A. C. S.76, 2844 (1954) J. A. C. S. 76, 2844 


FLA BR B-5'- 368.2 


磷酸 Biochem. preps. 9, 5 (1954) 
Orotidine-5’- “ (1962) 
phosphate J. A. C. S. 85, 1118 (1963) 
胸腺 喀 啶 126.1 0.477 7k Levene and Bass, p. 57 J. B. C. 197, 227 (1952) 
Thymine S. #7k; «|B. J. 70, 642 (1958) Analyt. Biochem. 1, 


Sl. S. Z,Bi |Nature, Lond. 181, 254 (1958) 249 (1960) 
B. B. A. 61, 141 (1962) 

Ree 244.2 S. XK Levene and Bass, p. 165 
Uridine Sp.s. 乙醇 ,|J. B. C. 237, 2283 (1962) 
尿 苷 -5 -二 磷酸 404.2 J. B. C. 209, 23, 41 (1954) 

.UDP J. A. C. S. 81, 3032 (1959) 
Uridine-5- B. B. A. 91, 1 (1964) 
diphosphate Ber. 98, 1045 (1965) 


J. B. C. 209, 41 (1954) 


尿 苷 -5'- 磷 酸 | 324.2 J. B. C. 203, 319 (1953) 


5’-UMP Biochem. Preps. 9, 5 (1962) 
Uridine-5'- B. B. A. 61, 29 (1962) 
Phosphate B. B. R. C. 24, 872 (1966) 


RH-5’-=AM | 484.2 J. A. C. S. 75, 5449 (1953) J. B. C. 209, 41 (1954) 


UTP J. B. C. 209,-23, 41 (1954) 
Uridine-5’- Biochem. Preps. 9, 120 (1962) 
triphosphate J. A. C. S. 87, 2265 (1965) 

脱氧 尿 苷 -5 -磷酸 | = 308.2 B. B. R. C. 10, 289 (1963) 
Uracil deoxyribose 


-5'-phosphate 


tA RES 228.2 


Uracil deoxyriboside 


S. FAB%,7k |Nature, Lond. 166, 557 (1950) 
eC. Sy 1952, 2721 
i. (G5 Se. 19585, 3035 
RigH-5’-= | 482.2 B. B. A. 39, 82 (1960) 
磷酸 Biochem, Preps. 9, 120 


Thymine deoxyr- (1962) 


ibose-5’- J. B. C. 233, 263 (1958) 
triphosphate B. J. 86, 562 (1963) 
脱氧 胸 苷 242.2 J. C. S. 1950, 1990 Arch. B. B. 73, 180 
Thymine 下 Se 19525 2721 (1958) 
deoxyriboside B. J. 35, 855 (1941) 


。 295 。 


eR 


一 -| 一 一 | 一 -一 | 一 -一 


Thymine 


5— FA Ze fe Me E 
5-Methylcytosine 


6- Fe 
6-Methylamino- 


purine 


Wi Fel -5- = we 


Cytosine deoxy- 
ribose-5’- 


triphosphate 


i BRAS -三 磷酸 


Adenine deoxy- 
ribose-5’- 
triphosphate 

Reif -5'-— RR 
D- 葡 萄 糖 

Adenosine-5 - 

diphosphate D- 

glucose (ADPG) 

Ha -5'-— 

胆 碱 

Cytidine 5 -di- 

phosphate choline 

胞 苷 -5 -二 磷酸 
D- 葡 萄 糖 

CDPG 

SF-5'-— Re 
D- 葡 萄 糖 
Guanosine 

5’-diphosphate 
D-glucose 

胸腺 -5 -二 磷酸 
D- 葡 萄 糖 
Thymidine 

5’-diphosphate 
D-glucose 


RE-5' -二 磷酸 
N- 乙 酰 葡萄 糖 胺 
Uridine 5’- 
diphosphate 
N-acetylglucos- 
amine 


UDPAGal 


12D: 


1497 


467. 


491. 


589. 


506. 


565. 


605. 


564. 


607. 


2 


3 


4 


0.40477 水 
S. 热 水 
Sl. s. CH 
4.57 7K. 


J. A, C._S,°68, 912 (1946) 
Levene and Bass, p. 67 


B. J. 48, 581 (1951) 
Levene and Bass, p. 73 


J. A.C. S. 81, 178 (1959) 


0.122, 2.0'°7k|B. J. 68, 627 (1958) 


Ss. 水 
i. 甲醇 
丙酮 , 乙 醚 


J. A. C.\S..74, 411 (1952) 


B. B. A. 39, 82 (1960) 

Biochem. Preps. 9, 120 
(1962) 

B. J. 86, 562 (1963) 

B. B. A. 39, 82 (1960) 

Biochem. Preps. 9, 120 
(1962) 

B, J. 86, 562 (1963) 

Arch B. B, 106, 371 (1964) 

J.B. ©0237, 3577 (1962) 

B. B. A. 91, 1 (1964) 


J. A. C. S. 77, 250 (1955) 
J. B. C. 222, 185 (1956) 


B. B. R. C. 7, 1 (1962) 


. 15, 428 (1960) 

C. 237, 1260 (1962) 
. A. 91, 1 (1964) 

. S. 1961, 2574 


— to te ty 
Qp we 


= 
郧 


C. 263, 1791 (1961) 
. C. 237, 3014 (1962) 


a 
ioe) 


B. B. A. 46, 595 (1961) 


Meth. Enzymol. 6, 777 (1963); 


8, 147 (1966) 
Meth. biochem. Anal. 
10, 107 (1962) 


分 析 方 法 


J. B. C. 197, 227 (1952) 
J. Bact. 84, 17 (1962) 


B, J.48, 581 (1951) 


Meth. biochem. Anal. 
6, 79 (1958) 


J. B. C. 237, 3577 
(1962) 


B. B. A. 40, 425 (1960) 
J. B. C. 235, 37 (1960) 
B. J. 78, 209 (1961) 


J. B. C. 237, 3041 (1962) 


J. B. C. 203, 1055 (1953) 


LL 


* 296° 


Se 二 


续 R 


名 称 制 备 方法 分 析 方 法 
尿 苷 -5 -二 磷酸 Arch. B. B. 33, 186 (1951) 
D-4 FB J. B,C. 223, 977 (1956) 
Uridine 5 | J. A. C. S, 83. 659 (1961) 
diphosphate eth. biochem. Anal. 10, 
D-galactose 107 (1962) 
RF-5'-—RR B. B. A. 53, 589 (1961) 
D-- FL RRR Arch. B. B. 78, 401 (1958) 
Uridine 5’- J. B, C. 235, 910 (1960) 
diphosphate 
D-galacturonic acid 
尿 苷 -5 -二 磷酸 B. J. 51, 426 (1952) Meth. biochem. Anal. 
D-F J. B. C. 223, 977 (1956) 10; 107 (1962) 
Uridine B. B. A. 26, 146 (1957) Meth. Enzymol. 2, 676 
5-diphosphate eth. Enzymol. 6, 777 (1963) (1955); 3, 968, 974 
D-glucose J. A. C. S. 83, 659 (1961) (1957) 
尿 苷 -5 -二 磷酸 B. J. 59, 279 (1955) 
D- 葡 萄 糖 醛 酸 J. A. C. S. 79, 2342 (1957) 
Uridine 5’-di- J. B. C. 228, 357 (1957) 
phosphate J. Biochem., Tokyo 51, 
D-glucuronic acid 277 (1962) 
Biochemistry 1, 1171 (1962) 
RF-5’-— ww B. B. A.33, 276 (1959) 
工 - 鼠 李 糖 B,B. R. C. 8, 204 (1962) 
Uridine 5’-di- Arch. B. B. 103, 276 
phosphate (1963) 
L-rhamnose 
尿 苷 -5 -二 磷酸 J. B. C. 223, 977 (1956) 
了 D- 木 糖 Meth. Enzymol. 6, 782 
Uridine 5’-di- (1963) 
phosphate 
D-xylose 
5. 磷酸 酯 类 物质 
名 称 分 子 量 制备 方法 tt HA 
磷酸 精 氨 酸 254.2 |B. J. 62, 358°(1956) B. J. 63, 153 (1956) 
Arginine B. J. 92, 429 (1964) 
phosphate 
脱氧 核糖 -5- 磷 酸 214. Br BC 309 (人 9%55》 Biochem. Preps. 9, 35 (1962) 
Deoxyribose-5- J. B. C. 198,885 -(1952) 
phosphate Biochem. Preps. 9, 35 (1962) 
J. B. C. 235, 1292 (1960) 
D- 果 糖 -1,6- 二 磷酸 340.1 |J. A.C. S.…64,2722 (1942) J. B. C. 208, 55 (1954) 
D-Fructose-1, Arch. B. B. 3, 33 (1944) B. J.°53, 157 (1953) 
6-diphosphate Biochem. Preps, 2, 52 (1952) |Arch. B. B. 74, 326 (1958) 


Meth. Enzymol. 3, 240 (1957) 
B. Z. 161, 240 (1925) 


«297 « 


名 称 


D- 果 糖 -1- 磷 酸 
D-Fructose-1- 
phosphate 
D- 果 糖 -6- 磷 酸 
D-Fructose-6- 
phosphate 
2x-D- 葡 萄 糖 -1- 
磷酸 
a-D-Glucose-1- 
phosphate 
D- 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 
D-Glucose-6- 
phosphate 
D-1,3- 二 磷酸 甘 

油 酸 
D-Glyceric acid 
1,3-diphosphate 
D-( 一 )-3- 磷 酸 甘油 酸 
-(—)Glyceric acid-3-phosphate 
L-x- 甘 油 磷 酰 胆 碱 
L-a-Glycery!-phosphoryl- 


choline 


L-x- 甘 油 磷 酰 乙醇 胺 
L-a-Glycerylphosphoryl- 
ethanolamine 


“EY Yeh oe LB? 
Glyceryiphos- 
phorylinositol 


甘油 磷 酰 丝氨酸 
Glycerylphos- 
phorylserine 


aR i Be A A 
Phosphoenolpyruvic acid 


核糖 -1- 磷 酸 
Ribose-1-phosphate 


D- 核 糖 -5- 磷 酸 
D-Ribose-5-phosphate 


D- 核 酮 糖 -75- 磷 酸 
D-Ribulose-5-phosphate 


© 298 « 


分 子 量 


260.1 


260.1 


260.1 


260.1 


266.0 


186.1 


279t2Z 


中 到 


334.2 


259.2 


168.0 


230.1 


230.1 


230.1 


制备 方法 


J. B. C. 201, 645 (1953) 
Meth. Enzymol, 3, 169 (1957) 
Biochem. Preps. 7, 58 (1960) 
Arch. B. 3, 33 (1944) 

Meth. Enzymol. 3, 167 (1957) 


J. A. C. S. 66, 560 (1944) 

Biochem. preps. 4, 63 
(1955) 

B. J. 59, 203 (1955) 

Biochem. Preps. 2, 39 (1952) 

Biochem. Preps. 3, 71 (1953) 

B. J. 59, 13 (1955) 

B. Z. 301, 135 (1939) 


Arch. B. 3, 105 (1944) 
J.B. C. 226, 777 (1957) 
B. J.62, 689 (1956) 

J. B. C. 161, 523 (1945) 


Biochem. Preps. 6, 16 (1958) © 


J. B. C. 220, 1 (1956) 
J. A. C. S..75, 4510 (1953) 
B. J. 50, 449 (1952) 


B. J. 71, 195 (1959) 
J. A.C. S. 81, 2591 (1959) 
J. B. C. 236, 1907 (1961) 
J. A. C. S. 81, 2167 

(1959) 
B. J. 71, 195 (1959) 
B. Z. 273, 60 (1934) 
J. B. C. 180, 145 (1949) 
J. B. C. 190, 21 (1951) 
B. B. A. 78, 732 (1963) 


Biochem. preps. 11, 101 (1966) 


J. B. C. 167, 477 (1947) 

J. B. C. 193, 497 (1951) 

J. A. C. S.79, 441 (1957) 
Arch. B. B. 34, 209 (1951) 
J. A. C. S. 75, 1153 (1953) 
J.cAsvCus. 76,55523 (1954) 
B. J. 58, 503 (1954) 


KR 


分 析 方 法 


Meth. Enzymol.3, 171 (1957) 


Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


B. J. 53, 157 (1953) 
J. B. C. 208, 55 (1954) 


. C. 208, 55 (1954) 
Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


. 303, 132 (1939) 


. 297, 60 (1938) 


B. C. 197, 601 (1952) 
B. C. 212, 887 (1955) | 
J. 62, 693 (1956) 


. C. 212, 887 (1955) 


B. J. 71, 195 (1959) 


J. B.C. 212, 887 (1955) 


B. Z. 273, 60 (1934) 


J. B. C. 162, 421 (1946) 


J. B. C. 167, 369 (1947) 
Arch. B. B. 74, 306 
(1958) 


Meth. Enzymol.9, 41, 46 (1966)|Arch. B. B.74, 306 (1958) 


Arch. B. B. 74, 295, (1958) 
J. B. C. 236, 2975 (1961) 


J. B. C. 196, 135 (1952) 


D- 木 坪 糖 -5 磷酸 
D-Xylulose-5- 
phosphate 


名 称 


J. B. C. 223, 993 (1956) 
Meth. Enzymol.9, 41 (1966) 


6. 固 酵 类 物质 的 制备 


续 R 


分 析 方法 


Arch. B. B. 74, 306 (1958) 


名 称 


可 的 松 


Cortisone 


氢化 可 的 松 


Hydrocortisone 


178-#(S)—8 
Oestradiol-178 


fi S)=8 
Oestriol 


HEC) 


Oestrone 


陪 气 可 的 松 


Prednisone 


孕 ( 当 ) 二 醇 
Pregnanediol 


孕 ( 当 ) 烯 醇 责 


Pregnenolone 


=( 8) 


Testosterone 


AAKAR ASS 


Triamcinolone 


BiB CSA 


Prednisolone 


TEE A 5 — A 


Androstanedione 


RCS) 


Corticosterone 


分 子 量 溶解 度 


360.4 S. FBZ 


B, Ad 


Sl.s. 乙醚 , 


A, A 
362.4 Sls. 水 


S. Uk HBR, 
Ah, 甲醇 


272.4 ix 
Ss. 乙醇 


丙酮 及 碱 液 


288.4 Sp.s. 水 
S. CH, 


Allis CR 


270.4 S. FRR 
i ok 

4.0 乙醇 

358.5 | Sp. s. 水 


0.67 Ce 


J. B. C. 114, 613 (1936) 
J. A. C. S. 74, 4223 (1952) 


J. B. C. 124, 459 (1938) 
J. B.C. 175, 451 (1948) 


J. B. C. 115, 435 (1936) 

J. B. C. 134, 391 (1940) 

B. J. 34, 1293 (1940) 

Ber. 74, 1914 (1941) 

B. J. 24, 435, 1021 (1930) 
Nature, Lond.131, 766 (1933) 
J. B.C. 91, 641, 655 (1931) 


Am. J. Physiol. 90, 329 (1929) 


B. J. 34, 1293 (1940) 


Science 121, 176 (1955) 
J. A. C. S. 77, 4781 (1955) 


320.5 |Sp.s。 有 机 溶剂 | ] B. C. 143, 716 (1942) 


316.5 Sp.s. 7K 
17 AG 
2 乙醇 

288.4 i. 水 


S. 乙醇 ,乙醚 


ABLE 
394.4 S. 丙酮 、 


CH, Afi 


360.5 Shs. 水 
3.3 乙醇 


0.55 A 


288.4 - 


346.4 Ss. Ce 


S. CA > 


J. A. C. S. 60, 2931 (1938) 
Ber. 67, 1611 (1934) 
J. A. C. S. 71, 1840 (1949) 
J. B. C. 174, 925 (1948) 
. B. C. 233, 281 (1935) 
. P. C. 237, 89 (1935) 
Ber. 71, 2278 (1938) 
J. A. C. S. 78, 5693 (1956) 
81, 1689 (1959) 
Science 121, 176 (1955) 
J. A. C. S. 77, 4781 (1955) 


Ber. 68, 2097 (1935) 
J. B. C. 172, 263 (1948) 


J. B. C. 114, 613 (1936) 


分 析 方 法 


J. clin. Endocr. Metab. 
12, 519 (1952) 
B. J. 54, 523 (1953) 


J. clin Endocr. Metab. 
21, 1146 (1961) 


J. Endocr. 16, 49 (1957) 


iJ- Endocr. 16, 49 (1957) 


J. Endocr. 16, 49 (1957) 


J. clin. Endocr. Metab. 
21, 1146 (1961) 


«299 。 


7. 胺 酰胺 ,氨基 酸 , 多 肽 及 其 衍生 物 的 制备 


名 : 称 


乙酰 胆 碱 
Acetylcholine 


bromide 


D- 肾 上 腺 素 
D-Adrenaline 


I- 氮 基 丁 酸 


r-Amino-butyric acid 


L-$85 VL 


L-Anserine 


工 - 精 所 琥珀 酸 
L-Arginino-Succinic 
acid 
P ik 


Cadaverine 


A i 


Carnitine 


工 - 肌 肽 


L-Carnosine 


L- Mea 


L-Citrulline 


促 肾 上 腺 皮质 素 
ACTH 


Corticotrophin 


L-6-(3, 4-#% 
A) ARB 
L-6-(3, 4-Dihydr- 
oxy phenyl) 
alanine (DOPA) 
3,5-— Ma 


3,5-Diiodotyrosine 


« 300 « 


分 子 量 溶解 度 
226.1 
(Br) i. CRRA 
183.2 S. 冰 酷 酸 , 
矿 酸 碱 
Sl.s. Ks 
乙醇 
i CR, A 
mM, Als 
103.1 V. Sek 
i. 乙醚 , 乙 
Bi, 
240.3 V.S. 水 
Sl. s. 甲醇 , 
乙醇 
290.3 VS 
li。 乙醇 
102.2 se 7K 
Sl.s. 乙醇 , 
乙醚 
161.2 | V.S. 水 ,乙醇 
Sls. A 
Ai, HAR 
i. 乙醚 
226.2 32 7k 
i. CB 
Ly ae2 S. 水 
i. FARR 
乙醇 
4566 V.S. 7K 
Sl. s. J 
i- 72 AAA 
197.2 0.579 7k 
S. 酸 或 碱 
i. CBs G 
Bik 
433.0 S. TRH 


il 备 方 法 


V. S. 水 ,乙醇 |]. A. C. S. 73, -2968 (1951) 
J. gen. Chem, U. S. S. R. 28, 


3040 (1958) 

Am. J. Physiol. 5, 457 
(1901) 

Ber. 59, 1068 (1926) 


C. A. 28, 4398° (1934) 


B. J. 48, 429 (1951) 
Arch. B. B. 46, 248 (1953) 


Org. Synth. Coll. 2, 25 (1943) 


本 Biochem., Tokyo 54, 
349, 355, 363 (1963) 


J. Org. Chem. 29, 1968 (1964) 


J. B. C. 204, 95 (1953) 
J. B. C. 203, 143 (1953) 
B. J. 77, 135 (1960) 

J. C..S. 1946, 782 

Ber. 90, 1251 (1957) 

Cc. A. 59, 1583d (1963) 


Biochem. Preps. 7, 26 (1960) 


Arch.B. B. 66, 10 (1957) 
Z. P. C. 318, 129 (1960) 


Biochem. Preps. 4, 38 
(1955) 
Ber. 94, 2768 (1961) 


J. Org. Chem. 29, 1968 (1964) 


J. Biochem., Tokyo 53, 271 
(1963), 54, 349 (1963) 
Biochem. Preps. 3, 100, 
104 (1953) 


J. B.C. 213,. 171.4€1955) 
Science 124, 934 (1954) 


J. A. C. S. 78, 5051 (1956) 


Nature, Lond. 199, 172 
(1963) 

Biochem. Preps. 1, 25 
(1949) 


B. J. 39, 157 (1945) 


Biochem. Preps. 10, 171(1963) 
Meth. Enzymoi. 4, 856 (1957) 


分 析 方法 


Meth. med. Res. 9,125 
(1961) 


Meth. med. Res. 9, 125 
(1961) i 


Analyt. Chem. 28, 1679 
(1956) 


J. B. C. 235, 1398 (1960) 
B. J. 81, 98 (1961) 


J. B. C. 204, 115 (1953): 

Nature, Lond. 192, 555 
(1961) 

Nature, Lond. 197, 290 
(1963) 


Arch. B. B. 75, 24 (1958) 
Analyt. Chem. 32, 870, 
874 (1960) 


J. B. C. 235, 1398 (1960) 
B. J. 81, 98 (1961) 


J. B. C. 209, 145 (1954) 


Acta Endocr. 29, 70 (1958) 
Endocrinology 71, 13 
(1962) 


Ser. 90, 1687 (1957) 
Meth. Enzymol.4, 856 (1957) 


Meth. biochem. Anal. 12, 
143 (1964) 


KR 


名 称 fl & FD 分 析 方 法 


L- 谷 胱 甘 肽 (和 氧 J. B. C. 90, 409 (1931) Bergmeyer. Methods of 


化 型 》 ij。 乙醇 ,乙醚 IJ. B. C. 194, 119 (1952) Enzymatic Analysis, 
L-Glutathione Biochem. Preps. 9, 52 (1962) p, 363, Academic press 
oxidized GSSG : (1963) 

工 - 谷 胱 甘 肽 Ss. 水 Biochem. Preps. 2, 87 Arch. B. B. 82, 70 (1959). 
(还 原型 ) i. 乙醇 ;乙醚 | (1952) Analyt. Biochem. 8, 217 
L-Glutathione J. C. S. 1957, 880 (1964) 
reduced GSH Ber. 97, 2434 (1964) 
eth. Enzymol. 3, 603 (1957) 
5-FRARK 277,10 7k J. gen. Chem. U.S. S. R. eth. Enzymol. 6, 598 
5-Hydroxytrypt- S.。 冰 酷 酸 34, 1605 (1964) (1963) 
amine Sl. ss FAR, |J. C. S. 1961, 2919 eth. biochem. Anal. 
95% CZ. Bi J. Org. Chem. 24, 894 6. 95 (1958) 
ji, 丙酮 ;乙醚 ,| (1959) Analyt. biochem. 6, 393 
a JCecS, 1958,.3493 (1963) 
Wa) BB 0.16 7K; = |Ber. 85, 323 (1952) Analyt. Biochem. 4, 423 
Indolacetic  _ V.S.. ZB) [Je-A- GC. S. 75,3589 (1953) (1962) 
S. 丙酮 ;乙醚 ;|Ber- 91, 1141 (1958) 
Sl.s. #3 |J- Org. Chem. 28, 589, 
i AGG 1246 (1963) 
3-ABAR 6.7 B. J. 38, 320 (1944) Meth. biochem. Anal. 
3-Iodotyrosine Sits. Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) 12, 143 (1964) 
Nature, Lond. 197, 180 (1963) 
FRA S. 水 Biochem. Preps 3, 108 (1953) B. J. 53, 379 (1953) 
Kynurenine J. A. C. S. 76, 1708 (1954) J. B. C. 219, 985 (1956) 
C. A. 47, 12489d (1953) 
去 甲 基 肾 上 腺 素 S. 矿 酸 , 碱 | 上. A. C. S. 75, 1757 (1953) Arch. B. B. 85, 345 (1959) 
Noradrenaline Sl.s. 7K5 J. A. C. S. 77, 2896 (1955) Meth. med. Res. 9, 125 
FAR, CRE (1961) 
L- 鸟 氨 酸 V. S. 水 |Biochem. Preps. 3, 97 (1953) B. J. 39, 46 (1945) 
L-Ornithine Sls. ZB |Ber. 91, 2418 (1958) B. J. 41, vii (1947) 
C. A. 53, 19904i (1959) 
催产 素 8 J. A. C. S. 81, 2504 (1959) Endocrinology, 71, 
Oxytocin Sls. Afi |J- B. C. 233, 116 (1958) 196 (1962) 
MAR 4.817° 水 wiiG S,4765973213401954) J. B. C. 200, 803 (1953) 
SarcoSine Sls. 乙醇 ”| 上. C. S. 1931, 1894 
工 -甲状 腺 素 S. Tk Je CorSs 1949, .3424 二 Meth. Enzymol.4, 856 
L-thyroxine Sl.s. 水  |Ber. 96, 1 (1963) (1957) 
ji。 乙醇 Z@ |Biochem. Preps. 10, 171, Meth. biochem. Anal. 
176 (1963) 12, 143 (1964) 
Meth. Enzymol. 4, 856 
(1957) 
3555 3 -三 碘 -L- B. J. 53, 645 (1953) 同 工 - 甲 状 腺 素 
FRR Ber. 96, 1 (1963) 
3,5,3’,-Triodo-L- Meth. Enzymol. 4, 856 
thyroxine (1957) 


° 301° 


RR 


名 称 tl & FH 淮 分 析 方 法 


色 AK Ber. 85, 324 (1952) Meth. med. Res. 9, 169, | 
Tryptamine J. Org. Chem. 23, 146 : 175 (1961) 
(1958) Analyt. Chem. 32, 666 


J. A. C. S. 82, 2386 (1960) (1960) 
Bu mex \ J. B. C. 222, 951 (1956) © Methods in Hormone 
( 抗 利尿 激素 ) J. B. C. 233, 116 (1958) Research, vol. 2, p. 495, 
Vasopressin J. A. C.'S..82,° 3195 (1960) Academic Press (1962) 


8. 某 些 生物 大 分 子 的 制备 


名 称 分 子 量 ”制备 及 测定 方法 
EAC) 45, 000—-46,000 A B. J. 30, 227 (1936) 
Albumin The Proteins, eds. Neurath and Bailey, 
vol. 2A, p. 443, Academic Press, New York 
(1954) 

支 链 淀粉 {200, 000—400, 000 Modern Methods of Plant Analysis, 
Amylopectin vol. 2, p. 166, Springer, Berlin (1955) 
直 链 淀粉 “50,000 一 150,000 Modern Methods of Plant Analysis, 

Amylose vol. 2, p. 166, Springer. Berlin (1955) 
HEMEEA 66,000—70, 000 ; Arch. B. B. 39, 80(1952) 
Avidin B. J. 89, 591 (1963) 
B. J. 92, 16¢ (1964) 
BEA 75, 000—100,000 J. A. C. S. 66, 1725 (1944) 


Casein The Proteins, eds. Neurath and Bailey, 
vol. 2A, p. 397, Academic Press, New York 
(1954) | 
Analyt. Biochem. 9, 423 (1964) 
J. A. C. S. 84, 4929 (1962) 
纤维 素 ( 包 括 DEAE, 600,000 i. 7Ky 乙醇 。 |Methods in Carbohydrate Chemistry, vol. — 


CM 和 磷酸 乙醚 氯仿 3 (1963) 
化 衍生 物 ) S. 浓 硫 酸 , |Modern Methods of Plant Analysis, vol. 
Cellulose 发 烟 盐 酸 , 浓 2, p- 197, Springer, Berlin (1955) 


磷酸 , 氢 氧 化 |DEAE, CM 及 磷酸 化 衍生 物 见 : 
. 铀 的 氨 溶 液 。 1Biochem。Preps. 8; 39, 45, 47 (1961) 
几 丁 质 , 壳 多 糖 S. KB Ady. Carbohyd. Chem. 15, 371 (1960) 


Chitn i- 7K 测定 方法 见 透 明 质 酸 
硫酸 软骨 素 25,000 一 30,000 S. 水 J. B. C. 211, 605 (1954) 


Chondroitin 
硫酸 软骨 素 A 和 C | 30,000—50,000 S. 水 硫酸 软骨 素 A 与 C 在 与 其 他 酸性 多 糖分 离 提取 时 二 者 
Chondroitin sulphates 常 混 在 一 起 , 因 需 进一步 用 色谱 法 纯化 。 
A and’ B. B. A. 21, 506 (1956) 
硫酸 软骨 素 A, Meth. Enzymol. 3, 20 (1957) 
硫酸 软骨 素 C, Je B. C. 215, 685 (1955) 
硫酸 软骨 素 B 20,000 一 30,000 J. B. C. 233, 541 (1958) 
Chondroitin B B. B. A. 21, 506 (1956) 
硫酸 软骨 素 A. B.C. 的 测定 见 透 明 质 酸 的 方法 


*,302。 


名 i 


WFR BS 
右 旋 糖 本 


Dextran 


脱氧 核糖 核酸 
Deoxyribonucleic 
acid DNA 


糖 . ” 原 
《动物 淀粉 ) 
Glycogen 


血红 和 蛋白 


Haemoglobin 


硫酸 乙酰 肝素 
Heparan sulphate 


组 蛋白 
Histones 


透明 质 酸 


Hyaluronic acid 


菊 6H 


Inulin 


硫酸 角质 素 


Keratan sulphate 


6-AREA 
8-Lactoglobulin 


昆布 多 糖 


Laminarin 


FRIAR (Ee FR) 


Levan 


溶解 度 制备 及 测定 方法 


S 二 水 5 Ady.. Carbohyd. Chem. 15, 341 (1960) 


甲 酰胺 


Shs. 水 ; ”|J. molec. Biol. 3, 208 (1961) 


S.1—3M 盐 |Nature, Lond. 191, 1375 (1961) 
成 胶 液 , 稀 碱 ; |Prog. Nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) 
i 有 机 溶剂 “| 测定 方法 见 ; 


B. J. 62, 315 (1956) 

J. B. C. 213, 107 (1955) 人 
Meth. Biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958) 
14, 113 (1966) 


V.S. 7kK5 Adv. Carbohyd, Chem. 12, 262 (1957) 
S. AZM; (J. A.C. S. 64. 2349 (1942) 
i. SC J. B. C. 199, 97 (1952) 


测定 方法 见 : 

J. B. C. 220, 583 (1956) 

J. B. C.. 127, 123 (1939) 
Arch. B. 21, 224 (1949) 

J. B. C. 185, 231 (1950) 

J. Lab. clin. Med. 46, 255 (1955) 
测定 方法 见 : 

Nature, Lond. 175, 903 (1955) 
J. B. C. 235, 3283 (1960) 

B. B.A. 29, 443 (1958) 
测定 方法 见 透 明 质 酸 


S. 水 


17,000—20, 000 S. 7k 


“| 8400—57, 000 S. 水 , FEHB; |Phillips, Prog. Biophys. Chem. 12, 21 (1961) 
, ip 7K 
0.1—10 sj 水 |. B. A. 69, 574 (1963) 
BA J. B. C. 239, 726 (1964) 


B. J. 92, 34p (1964) 

测定 方法 见 : 

Meth. biochem. Anal. 2, 313 (1955) 
Meth. Enzymol. 3, 73 (1957) 

Meth. biochem. Anal. 8, 145 (960) 
Modern Methods of Plant Analysis. vol. 
2, p. 189, Springer, Berlin (1955) 

f. B. Cy 51, 275 (1922) 

P. S. E. B. M. 74, 117 (1950) 

J. B. C. 205, 611 (1953) 

Acta chem. scand. 11, 668 (1957) 
B. J. 58, 332 (1954) 

Biochem. Preps. 4, 23 (1955) 

Acta Chem. scand. 16, 2067 (1962) 
Modern Methods of Plant Analysis, vol. 
2, p- 178, Springer, Berlin (1955) 

J. B. C. 140, 105 (1941) 


3000—5000 


10,000—20, 000 


35, 000—42,000 


* 303 « 


名 称 


肌 红 和 蛋白 
Myoglobin 


RRR 
Pectic acid 


鱼 精 蛋 白 


Protamine 


核糖 核酸 
Ribonucieic acid 
(RNA) 


烟草 花 叶 病毒 
Tobocco mosaic 
virus 
转运 核糖 核酸 
Transfer-RNA 
(tRNA) 


制备 及 测定 方法 


18,500—18, 800 Arch. B. B. 91, 319 (1960) 

J. B. C. 236, 2238 (1961) 
Arch. B. B. 91, 310 (1960) 
Nature, Lond, 198, 1201 (1963) 


B. J. 47, 437 (1950) 


60, 000—-80,000 S. FREE 


J. Gen. Physiol. 30, 101 (1946) 
B. B. A. 91, 416 (1964) 
Ady. Protein Chem. 15, 1 (1960) 


8000 S. Ks 
REA AK 


10,000— Sl.s. 7K; |B. J. 96, 266 (1965) 
2,000,000 B. J. 93, 5c (1964) 
i. 有 机 溶剂 “|B- N..R. C. 13. 61 (1963) 


Progr. nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) 

J. B. C. 198, 297 (1952); 221, 635 (1956) 

Meth. biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958)3 
14, 113 (1966) 


40x 10¢ S. 7K, AE |Biochem. Preps. 9, 132 (1962) 
盐 水 
24;000 一 30,000 | Sx Prog. Nucl. Acid Res. 2, 259 (1963) 


J. B. C. 236, 200 (1961) 

J. B. C.236, 1726, 1741 (1961) 

J. Molec. Biol. 4. 347 (1962) 

B. B. A. 80, 574 (1964) 

Meth. Enzymol. 12B, 166, 169, 173 (1968) 


附录 二 “部 分 国际 单位 换算 及 缓冲 液 配制 方法 


A. 部 分 国际 单位 及 换算 方法 


1. RES fr 

% Gn) = 10 42K (dm) = 100 BK (cm) = 10° 毫米 《mm) = 10° HK Cum) = 10°44 (nm) 
= 10" # CAD 

1 英寸 二 2.539998 厘米 


2. 体积 单位 
FH C1) =10 BH Ct) = 100 BA Cl) = 10 BH (ml) = 10° HA Cu) 


3. 重量 单位 

公斤 (kg) = 10° 克 (g) = 10 Hae (dg) = 10? Bae (cg) 
= 10° 毫克 (mg) = 10° foe Cue) 

1% (g) = 10° 毫克 (mg) = 10° SE Cug) 

1 WA=500 克 

1 B=453.59237 克 


4. 浓度 单位 
1344) F 7K EE =1M = 1mol/L = 10°mol/m* (mole HHI: 摩尔 ) 


5. SI 单位 制 所 用 的 词 头 


因 数 词 a 符 “号 因 一 一 数 词 & fF 
10 a3 deca (da) 10-7 Ez centi (c) 
107 百 hecto (h) 10 zz milli (m) 
10° + kilo (k) 10-6 微 mijcroCby) 
10° 兆 mega(M) ins hGH) nano (n) 
10’ Gm) giga (G) 10 BCA) pico (p) 
10’? ACG) tera (T) uO=*4 飞 ( 母 托 ) femto (f) 
i 分 deci (d) 10-18 阿 ( 托 ) atto (a) 


SI SI SI 

单位 符号 单位 定义 单位 相当 量 

m’*kgs~? N-m 
mkgs~” kg - m/s? 

m~'kgs~? Nm 

m’kgs~* ie 

As Iva 

m’?kgs-3A7~! WA 

m?kys~3A7? VA" 

m7?kg7's? A? Av" 

m7*kg~'s*A? cv-! 


cd + sr 


7. SI 单位 制 ( 米 一 干 克 一 秒 ) 基 本 物理 量 数 及 符号 


° 306 。 


物理 量 数 SI 单位 制 名 称 符号 
基本 单位 
长 度 米 m 
质量 于 克 ( 公 斤 ) kg 
时 间 秒 S 
电流 £GE) A 
热力 学 温度 FFURX) K 
发 光 强 度 坎 ( 德 拉 ) cd 
物质 的 量 摩 ( 尔 ) mol 
补充 单位 
平面 角 mm 度 rad 
立体 角 球面 度 ake 
8. 一 些 常用 的 “C.G.S” 制 单位 与 SI 单位 制 换算 举例 
C1) EA: 每 平方 英寸 上 1 H=6894.76Pa 
每 1 OKIE (FE) =135.322Pa 
~ 1 KXK=101325Pa 
1 毫 巴 王 100Pa 
1 B=10'Pa 
(2) 能 : 1 尔格 王 10-7J 
1 升 ! 大 气压 三 101.328J 
1 卡 ( 热 化 学 ) 一 4.184] 
1 卡 (国际 表 ) (Cal) = 4.1868J 
1 卡 15*C (Call5) = 4.1855J 
电子 伏 ( 特 ) (eV) = 1.6021 x 10-J 
(3) WEE: 0°C=273. 15K 
0°F = 459.67K 
(4) 放射 性 : 1 BH Ci) =3.7 K 10s"? CHAD 
(5) 照明 ; 1 #R-RIE=10.76931x 〈 勒 克 斯 ) 
1 平方 英尺 -流明 三 10.7639lx 
1 平方 米 - 流 明 ( 光 通 量 ) 王 IIx 
B. 生化 分 离 制备 一 些 常用 缓冲 液 的 配制 方法 
1 挥发 性 缓冲 液 (pH1.9 一 8.9) 
pH 范围 组 
1,9 87 EF UKERR, 25 毫升 8896 MAKERS 1 Ft 
zit 25 Ft 88% 甲酸 ,用 水 稀释 至 1 升 
3.1 5 毫升 吡啶 100 毫升 冰 栈 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 


pH 范围 组 份 


3.5 5 毫升 吡啶 ,50 毫升 冰 酯 酸 。 用 水 稀释 至 1 升 
4.7 25 毫升 吡啶 , 25 毫升 冰 栈 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 
6.5 100 毫升 吡啶 , 4 毫升 冰 栈 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 
7.9 0.03M NH,HCO, 

8.9 (NH,),CO, (20 克 / 升 ) 溶 液 


[“Data for Biochemical Research” 2nd Edition P.505—506 (1969)] 


2. 挥 发 性 缓冲 液 (高 压 电 泳 用 ) 


pH 范 系 统 
接近 2 酷 酸 一 甲酸 
2.3 一 3.5 吡啶 一 甲酸 
3.5—6.0 吡啶 一 栈 酸 
3. 0 一 6.0 *# 三 甲 胺 一 甲酸 (或 酷 酸 ) 
5.5—7.0 =F Xi pe— ee 
7.0—12.0 *# 三 甲 胺 一 二 氧化 碳 
6.0 一 10.0 氨水 一 甲酸 (或 醋酸 ) 
6.5—11.0 单 ( 或 三 ) 乙 醇 胺 一 盐酸 
8.0 一 9.5 TER A PR ATK 


* 三 甲 胺 绥 冲 液 的 使 用 参考 Porath, Nature, Lond. 175,478 (1955) 


3. 毛 化 钾 - 盐 酸 缓 冲 液 CH 1.0—2.2) 
25 毫升 0.2 M KCI (14.919 克 / 升 ), 加 xz 毫升 0.2M HCL, 用 蒸馏 水 稀释 至 100 SH 


pH, 25°C x 毫升 0.2MHCL 
1.00 67.0 
1.10 52.8 
1.20 42.5 
1.30 33.6 
1.40 26.6 
1.50 20.7 
1.60 16.2 
1.70 13.0 
1.80 10.2 
1.90 8.1 
2.00 6.5 
2.10 5.1 
2.20 3.9 


[Bower and Bates, J. Res. natn. Stand. 55, 197 (1955)] 


4.45 B-RBS HR (pH2.2—3.6) 


甘氨酸 分 子 量 : 75.07 
25 毫升 0.2M 甘氨酸 (15. 01 克 / 升 )* 加 xz 毫升 0.2NHCI, 用 蒸馏 水 稀释 至 100 SF. 


se 307 « 


Ze, 22.0 
2.4 16.2 
2.6 12.1 
2.8 8.4 
3.0 Dat 
3.2 4.1 
won Sue 
3.6 Pe) 


[S#rensen, B. Z. 21, 131 (1909); Gomori, Meth. Enzymol. 1, 141 (1955)] 


5. HRR-BRA—ABPR (pH 2.6—7.6) 

0.1M frig: ARR - H.0 (FH 210.14) 21.01 克 / 升 。 ate? 

0.2M 磷酸 氢 二 钠 : 含 Na,HPO, (4) FH 141.98) 28.40 克 / 升 ;或 含 NazHPO4-2H2O (4 FH 178.05)35.61 - 
克 / 升 。 

xz 毫升 0.1M 柠檬 酸 和 ?7 毫升 0.2M BRA WHA. 


y 毫升 0.2M 磷酸 氢 二 钠 


sc) 
a) 


zx 毫升 0.1M 柠檬 酸 


Weg | Ta > 人 
NE Geo 人 一己 有 ON COCOA BRIN CO DA za NCO COON 
co 
Vi 
oO 


[Mcllivaine, J. B. C. 49, 183 (1921)] 


6. 32 BM (pH2.6—12.0) 
每 升 混 合 液 内 含 : 柠檬 酸 6.008 5, BOA BP 3.893 2, HAAR 1.769 eR 5.266 克 。 


© 308 « 


每 100 毫升 混合 液 滴 加 * 毫升 0.2NNaOH 至 所 需要 pH {A (18°C) 


pH x zzF+ 0.2NNaOH pH x 毫升 0.2NNaOH pH + 毫升 0.2NNaOH 
2.6 2.0 5.8 36.5 9.0 at 
2.8 4.3 6.0 38.9 9.2 74.0 
3.0 6.4 6.2 41.2 9.4 75.9 
3.2 8.3 6.4 43.5 9.6 77.6 
3.4 10.1 6.6 46.0 9.8 79.3 
3.6 11.8 6.8 48.3 10.0 80.8 
3.8 13.7 7.0 50.6 10.2 82.0 
4.0 15.5 72 52.9 10.4 82.9 
4.2 17.6 7.4 55.8 10.6 83.9 
A be 19.9 7.6 58.6 10.8 84.9 
4.6 22.4 7.8 61.7 11.0 86.0 
4.8 24.8 8.0 63.7 11.2 87.7 
5.0 27.1 3 65.6 11.4 89.7 
5.2 29.5 8.4 67.5 11.6 92.0 
5.4 31.8 8.6 69.3 11.8 95.0 
5.6 34.2 8.8 71.0 12.0 99.6 


{Johnson and Lindsey, Analyst 64, 490 (1939)] 


7. 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 (pH3.0—6.2) 


0.1M frig: SHRM - H.0 (FH 210.14) 21.01 克 / 升 
0.1M 柠檬 酸 钠 : SHRBR=W - 2H.0 (4>-FH 294.12) 29.41 克 / 升 。 


pH xz 毫升 0.1M Free 7 毫升 0.1M 柠檬 酸 三 钠 
Somes 82.0 18.0 
2 . 77.5 22.5 
3.4 73.0 27.0 
3.6 68.5 30.5 
3.8 63.5 36.5 
4.0 59.0 41.0 
4.2 54.0 46.0 
4.4 49.5 50.5 
4 4.6 44.5 55.5 
d 4.8 40.0 60.0 
5.0 35.0 65.0 
5.2 30.5 69.5 
5.4 25.5 74.5 
5.6 21.0 79.0 
5.8 16.0 84.0 
6.0 11.5 88.5 
6.2 8.0 92.0 


{N. Hemington and Rs M. C. Dawson] 


8. 乙酸 -乙酸 钠 缓冲 液 (pH3.7 一 5.8) 


0.2M 乙酸 钠 : 含 NaAc.3H2O (分 子 量 136. 09) 27.22 克 / 升 
-0.2M- 乙 酸 : 含 冰 乙 酸 11.7 毫升 / 升 


es 309 。 


pH, 18°C xz 毫升 0.2M CRB ?毫升 0.2M 乙酸 


Sat 10.0 90.0 
3.8 12.0 88.0 
4.0 18.0 82.0 
4.2 26.5 73.5 
7 old, 37.0 63.0 
4.6 49.0 51.0 
4.8 59.0 41.0 
5.0 70.0 30.0 
5.2 79.0 21.0 
4 86.0 14.0 
5.6 91.0 9.0 
5.8 94.0 6.0 


[Walpole, J. C. S. 105, 2501 (1914)] 


9 磷酸 氢 二 钠 -磷酸 二 氢 钠 缓冲 液 (pH5.8 一 8.0) 


Na,HPO,-2H,O 分 子 量 二 178.05,0.2M 溶液 含 35.61 克 / 升 
NaiHPO;-12H59 分 子 量 一 358.22y 0.2M 溶液 含 71.64 克 / 开 

NaH,PO,-H,O 分 子 量 138.01, 0.2M 溶液 含 27.6 克 / 升 

NaH,PO,-2H,O 分 子 量 156.03,0.2M 溶液 含 31.21 克 / 升 

x 毫升 0.2M 磷酸 氢 二 钠 加 ?毫升 0.2M 磷酸 二 氢 钠 ,用 蒸馏 水 稀释 至 .100 毫 开 。 


pH, 25°C x 毫升 0.2M 磷酸 氢 二 钠 y 毫升 ,0.2M ABO 


46.0 

43.85 
40.75 
和 


4.0 


CD OO GY oY eV RN 
. . . . . . . . . . . 
oon fF NO OH Bh N CO CO 


[Gomori, Meth. Enzymol. 1, 143 (1955)] 


10. KH,PO,-NaOH 缓冲 液 〈0.05M,pH5.8 一 8.0) 
xz 毫升 0.2 MKH,PO, 十 7 毫升 0.2NNaO 五 加 水 稀释 至 20 SH 


prt(20°0) : ; pH4(20°C) F 
《毫升 ) 《毫升 ) 
0.372 7.0 5 
0.570 rer 5 
; 0.860 “NS | 5 
1.260 ! 7.6 | 5 


pH(20°C) 


pH(20°C) | 
6.6 5 1.780 7.8 
6.8 5 2.365 8.0 


[ 潘 家 秀 等 ,蛋白 质 化 学 研究 技术 科学 出 版 社 〈19627] 


ll. 巴 比 受 缓冲 液 (pH6.8 一 9.6) 


0.04M 巴 比 妥 钠 盐 | “0.2NHCI 0.2NHCI 
pH(18°c) | pH(18°c) 

(毫升 ) (毫升 ) (CF) (Ft) 
6.8 100 18.4 8.4 100 5.21 
7.0 100 17. 8.6 100 3.82 
a2 100 16. 8.8 100 2.52 
7.4 100 9.0 100 1.65 
7.6 100 9.2 100 1.13 
7.8 100 9.4 100 0.70 
8.0 100 9.6 100 0.35 


8.2 


巴 比 妥 钠 盐分 子 量 一 206.20.04M RA 8.25 克 / 升 
[Britton and Robinson, J. Chem. Society 1931, 1456] 


12. 硼酸 缓冲 液 (0.2M PH, pH7.4—9.0) 


0.05M 硼砂 , 0.2M Ta 0.05M Wi 0.2M 硼酸 
pH pH 
(毫升 ) (Ft) 《毫升 7 CF) 
7.4 1.0 8.2 355 6.5 
7.6 15 8.4 4.5 5 
7.8 20 8.7 6.0 4.0 
8.0 3.0 9.0 8.0 2.0 


硼 丰 Na,B,O,-10H,O, 47 H=—381.43, 0.05 M 溶液 (=0.2M 硼砂 ) 含 19.07 B/F-, BRAT R=—61.84, 
0.2M WHR 12.37 H/F- 

BURREE Bk BAKER BYR ik th TD BEM RARE 

[Holmes, Anat. Record, 86, 157 (1943)] 


13. 甘氨酸 -NaOH 缓冲 液 (0.05M,pH8.6 一 10.6) 
x+ 毫升 0.2M 甘氨酸 十 y 毫升 0.2N NaOH KMS 200 毫升 


4.0 


8.8 50 6.0 
9.0 50 8.8 
OZ 50 12.0 
9.4 50 16.8 


甘氨酸 分 子 量 一 75.07,0.2M 溶液 含 15.01 克 / 逢 
[Gomori, Meth. Enzymol. 1, 145 (1955)] 


e 311° 


14。Tris- 缓 冲 液 〈0.05M,pH7 一 9) 
xz 毫升 0.2M 三 羟基 甲 基 氨 基 甲 烷 十 毫升 0.1NHCI 加 水 稀释 至 100 SH 


pH 
eS 2 eee A DO ts. | OST NICH.“ ee hh ee ee 0.1NHCI 

23% 37 

9.10 8.95 27325 
8.92 8.78 .5 30.0 
8.74 8.60 .0 32.5 
8.62 8.48 .5 35.0 
8.50 8.37 .0 37.5 
8.40 8.27 40.0 
8.32 8.18 ‘5 42.5 
8.23 8.10 5 45.0 
8.14 8.00 .0 


OCH、__y7CH:OH 


H 
SHRPZAEPR EE (, ) 4>-FH=121.14, 0.2M BRS 24.23 H/F 


C 
ocH,” NH, 
[ 潘 家 秀 等 ;蛋白质 化 学 研究 技术 > 科学 出 版 社 (19627] 


15. M-NaOH 缓冲 液 〈0.05M TARR) 
x Ft 0.05M 硼砂 十 7 毫升 0.2NNaOH 加 水 稀释 至 200 毫升 


[ 潘 家 秀 等 ,蛋白 质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 (19627] 


16. 碳酸 钠 - 碳 酸 氢 钠 缓冲 液 〈0.1M) Cat+,MSg+t+ 存在 时 不 得 使 用 


pH 0.1MNa,CO,| 0.1M pH 0.1M 0.1M oT 


NaHCo, Na,CO, NaHCO, 
20°C (毫升 ) 《毫升 ) (毫升 ) (Fy) 
9.16 1 9 6 4 
9.40 2 8 7 3 
DO c5il 3 7 8 ead 
9.78 4 6 9 1 : 
9.90 5 5 
Na,CO, . 10H,O 4} =286.2, 0.1M MA 28.62% 克 / 升 ; Na,HCO, 4}--H=84.0, 0.1M BRS 8.40 
克 / 升 


[ 潘 家 秀 等 ?蛋白 质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 〈19627] 


17. 磷酸 和 氢 二 钠 -和 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (pH 11.0—11.9) 
50 毫升 0.5 MNa,HPO, (7.10 克 / 升 )。 加 zx 毫升 0.1VNaO 珂 , 用 蒸馏 水 稀释 至 100 BF 


« 312 » 


pH, 25°C x BF 0. 1NNaOH zx 毫升 0.1NNaOH 
11.00 JJ 了 .1 
11.10 13.5 
11.20 16.2 
11.30 19.4 
23.0 


[Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] 


18. 氯 化 钾 - 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (pH12.0—13.0) 
25 毫升 0.2MKCI 加 xz 毫升 0.2NNaOH, 用 水 稀释 至 100 SF 


pH, 25°C x ZF 0.2NNaOH pH, 25°C x ZF 0.2NNaOH 
12.00 6.0 12.60 25.6 
12.10 8.0 12.70 BPE. 
12.20 10.2 12.80 41.2 
12.30 1242 12.90 53.0 
12.40 16.8 13.00 66.0 
12.50 20.4 


[Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] 


C. 常用 酸 碱 溶 液 的 比重 及 浓度 配制 
1 硝酸 溶液 的 比重 和 浓度 


ey eae | eee He | sent meoiene-|— Et Se 
1.100 2.985 7 1.440 17.06 74.68 
1.200 6.159 32. 1.450 18.53 79.98 
1.300 9.759 47. 1.480 20.21 86.05 
1.340 11.49 54. 1.500 22.39 94.09 
1.360 12.42 57. 1.510 23.50 98.10 
1.380 13.42 61. 1.520 24.04 99.67 


1.400 14.51 65. 


2. 盐酸 溶液 的 比重 和 浓度 


mmm |  BERe 溶液 的 当量 浓度 | OS 
6.037 20.01 10.03 31.52 
6.673 2L692 10. 33.46 
73 23.82 sh 35.38 
7.981 25.75 37.23 
8.648 27.66 39.11 
9 205s 


e313 


3 硫酸 溶液 的 比重 和 浓度 


mimosa ||P RRS Hi | aemeeimrene | RO eS 

3.219 14435 a3 95.6 

6.685 27532 ile 95.95 

10. 39. 1. 96.38 

14. 50. i S72 

18. 39。 i: 98.20 

22. 68. ts 98.52 

26. cre Li 98.72 

31, 86. 13 98.77 

32h. 88. " - 99.12 

33. 90. ‘ 99 she uy 

34. 92. : 100.00 
Hoe) Leesan) eee wens mreae | OS UR 
0.960 5.58 9.91 13.35 24.99 
0.950 7.10 12.74 14.97 28.33 
0.940 8.63 15.63 16.59 31.75 
0.930 10.18 18.64 18.10 34.95 
0.920 I375 21275 


) 


5. 车 性 钾 溶 液 的 比重 和 浓度 


同村 mie | ate eee aye. mma | ee 交 二 
1.100 2.13 10.85 1.34 8.26 34.60 
1.120 2.59 12.95 1.36 8.84 36.47 
1.140 3.05 14.99 1.38 9.42 38.25 
1.160 3.53 17.08 1.40 10.00. 40.09 
1.180 4.02 19.13 1.420 10.60 41.88 
1.200 4.52 21.15 1.440 11.20. 43.64 
1.220 5.03 23.13 1.460 11.81 45.38 | 
1.240 5.55 25.11 1.480 12.42 47.09. 
1.260 6.08 27.05 1.500 13.04 48.79 
1.280 6.61 28.97 1.520 13.68 | 50.48 
1.300 7.15 30.87 1.540 14.31 Bae! 
1.320 7.70 32.74 

e 314 » 


6. 苛 性 钠 溶 液 的 比重 和 浓度 


He | 溶液 的 当量 浓度 溶 沪 的 当量 浓度 | On AER ae 
1.100 2.47 ’ | 9. 28.92 
1.120 3.02 : ; 10. 30.78 
1.140 ~ 3.59 i : 11. 32.74 , 
1.160 4.17 Ti 34.66 
1.180 4.78 : ; 12. 36.60 
1.200 5.40 ‘ : 13. * 38.58 
1.220 6.04 和 ; 14. 40.58 
1.240 6.70 — ; é 15. 42.62 
1.260 7.37 : : 16. 44.70 
1.280 8.68 , P 17. 46.80 
1.300 8.79 : ; 18. 48.90 


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统一 书号 : 13031- 
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本 社 书 号 : 4062-1 
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