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MEMÓRIAS

DO

INSTITUTO BUTANTAN

1944-1945

TOMO XVIII

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*

Sáo Paulo, Brasil
Caixa Poatal 65

MEMÓRIAS

DO

INSTITUTO BUTANTAN

1944-1945

TOMO XVIII

*

São Paulo, Brasil
Caixa Pottal 65

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« I

ÍNDICE

Pág.

1. AXfAR.\L, T. P. do & ANDRADE. M. C dc — Portadores do bacilo de

I.ocffler entre os escolares de São Paulo 1- 8

Diphtfria carríers amotig São Paulo school chUãren.

2. AXfARAU J. P. do &- SOUZA e SILVA, O. R. dc — Imunidade antidifté-

rica na mãe c no recém-nascida Suas rdações com o ScbkJc test . . 9-20

Antídiphtheric inimunity in the motkcr and in thc nno-hom, and tis
relolions to lho Scktck tfst.

.L .\RA>:tES. T. P,.; KARMANN, G. h PTHR, O. G. — En-.-reso da rc-íSo

de flo^ilarão especifica na dosagem do antíveneno crotilico 2J- 26

ylpplhabilily of Ike sponfic flocculalion reactUm for Iko in vilro
titration of crotaVu anlivcnin.

4. BTER. O. G. — Estudo quantitatiro da reação dc H' •'idação entre o veneno

e o antiveneno croiãlico 27- 32

,d tpuontilaik-f sludy of fko floccutolion reactiem bftxeen the í-etiom
ef Crota!us I. ternfirJS and tts specxfie cn/íírnm.

5. BIER. G. 3,- .\MARAL. J. P. do - - Dcrcnca icaraento do fa'.óaiuH) de

Shwart.-man em coelhos m -diante a injeção vcr.csa dc giiecgcnio piao 33- 36
Tíemorrhagie reocfion at lhe lile of inlraeutaneous injeclion of hacte-
■ix! eslracts after intrat\‘r.<nts Injeclicn of p.ire glyeogcn in rabhüs.

6. EIOCCA, F_; AMARAI-, J. P. do & BIER, O. G. ~ P.stmJos sòbre a

ruim'?íc'.i.-ia da infecção meningo-.óeira cx;:':r;mcn;al do camundongo;
dens-ados aminados da difenüstdf.om e ruhstãncias antibiótica* de

oripem microbiana (penicilina c piocianina) 37- 44

Sludics on the chemotherapy of experimental tneningocoeeiral infe-
clioH in mke: amine-derirotions of diphenylsnlfone and of Ike aníi-
hioties penicUlin and pyoeyantne.

7. CARRIJO. L. NOGUEIRA; PIRES. C D. .\VIIv\ & BRANDAO, C

— Vacinação T. A. B. Formação dc agictinina “ O ” no bomcin pelo

emprego dc vacina formolada 45- 54

T. A. B. taerination. The drtrlopmenl of "O" agglulinins m man
after inociJation icitk formoUtreated xaeeine.

8. I,E.-\L PR,\DO. J. — Hemoglobina dos ofídios — Valores normais e pre-

sença dc uma forma inativa no sangue i!a Batkropt jararaca Sf- 66

The normal hemogíobin contenl of snake blood and Ike presenee of
‘'inaelkv” kemoglobin in Ike blood of Botkrops jararaca.

9. LEAO, A. T. — Dbeussão cm tòmo dos gênero* Ocklosoma Bmun, I901j c

Renifer, Pratt, 154X2 (Tremaloda) 67- 74

Conceming lhe genera Ocklosoma, Broun, 1901, and Renifer, Pratt,

1902 (Tremaloda).

10. M.ARCONDES SILVA, A. — Citologia vagina] e seu emprêgo cm gineco-
logia endócrina 75-100

Vaginal eilology and ils nse in endocrine gynecology.

cm

SciELO

11 12 13 14 15 16 17

Pãg.

11. MILLER de PA1V.\, I. — Efeitos de um extrato pre-hipotisário sobre as

adrenais e o timo de camundongos infantis 101-104

Effeds oj an anterior pituitary eitract on lhe adrenais and tkymus
of infantile mice.

12. PRADO, .\. — Xotas Ofiológicas. 18. .\ posição do gênero Rhadinaea

em sistemática (Continuação) 105-108

Xotes OH Ofhidia. JS. The systewafie position of lhe genus Rhadi-
naea (continued} .

13. PRADO. A. — Xotas Ofiológicas. 19. Atraclus da Colômbia, com a re-

descrição de três novas espécies 109-114

Xotes on Ophidia. 19. Atraclus from Columbia, tríth a redescripiion
of three netc species.

14. PRADO Jor., F.; TABORD.\, A. & TABORDA. L. C. — Ensaios tera-

pêuticos com a penicilina preparada no Instituto Butantan 115-128

Therapeutie lest xcilh penicillin prepared in the Instituto Butantan.

15. ROSEXFELD, G. — Observações sôbre dez casos de eliptocitose (ovaloci-

tosê) 129-144

Observations on ten cases of Ellyptocytosis.

16. TRAV.ASSOS, J. & V.ALLEJO-FREIRE, A. — Criação artificial de Am-

blyomma cajennense para o preparo da vacina contra a febre maculosa 145-236
Artificiai breeding of Amblyomma cajennense for the preparation of
ivccine againsi São Paulo spottcd fever.

17. V.\LLE, J. R. do — Sobrevida da Parelheira (Philodryas, sp.) depois da

adrenalectomia 237-240

The surfkxil of snakes (Philodryas, sp.) foUoteing adrenalectomy.

18. V.ALLE, J. R. do & LE.\L PRADO, J. — Xota sôbre a hematologia dos

ofidios. índices de Wintrobe da Bolhrops jararaca 241-246

CoHceming lhe hematology of snakes. The JFintrobe indexes in the
.blood of Bothrops jararaca.

19. VALLE, J. R. do & PORTO. — .\ note on the adrenin content of the

adrenais of snakes 247-250

.Vo/o sôbre o conteúdo de adrenalina das adrcTiais de ofidios.

20. VAXZOLIXI. P. E. & FERREIRA BRAXDAO. J. H. — XoUs sôbre

diferenças sexuais na folidose de Bothrops allemata D. & B., 1854,

e sua variação geográfica 251-258

Some sexual differcnces cm the pholidosis of Bothrops alternata D.

6r B., 1854, and their geographicol lariation.

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

PORTADORES DO BACILO DE LOEFFLER ENTRE OS ESCOLARES

DE SAO PAULO

POR

JANDYRA P. DO AM.ARAL & MARIA CAROLIXA de ANDRADE
{Do L(àforatário de Bacteriologia do Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

Um ponto de extrema importância no estudo da epidemiologia da difteria é
o de saber se numa populaqão tomada 100^ Schick-n^ativa, seja pela imunização
natural, seja pela \-acinação profilática, o desaparecimento da difteria clinica está
associado a uma redução correspondente da porcentagem de portadores sãos do
bacilo de Loeffler. Dudley (1), em 1934, sugeriu mesmo que a \'acinação con-
tra a difteria pudesse aumentar o número de portadores sãos de bacilos diftéricos
s-irulentos. Fôra \'erdadeiro esse fato c a imunização dos escolares poderia redun-
dar num perigo para as creanças em idade pre-escolar.

Felizmente, porém, a sugestão de Dudle\' não encontra apôio nos dados
estatísticos acumulados sóbre o argumento. Assim, Df_adman (2) refere que em
Hamilton, Ontahio, enquanto que em 1920, de 8261 culturas feitas em seu
laboratório, resultaram 1040 positi\*as para o bacilo de Loeffler, havendo dfra
igualmente elemda de resultados positivos cm 1921 (1234 em 9645), depois do
início da %'acinação, em 1932, de 3929 culturas examinadas apenas 85 mostraram
bacilos diftéricos. Em 1934 e 1936, não se encontrou um único caso de portador
de bacilo de Loeffler em 3817 e 3949 culturas respectivamente.

Igualmcnte convincentes são as estatísticas feitas em Toronto, cm 1934-1936
(4 culturas de bacilos diftéricos virulentos em 7800 exames de material de nariz
e de garganta) e em Montreal (1935-1937) onde se evidenciaram apenas 2 porta-
dores de bacilo de Loeffler num total de 1774 escolares examinados.

Em São Paulo, a vacinação antidiftérica sistemática e em escala considerá-
vel foi iniciada em 1940 pelo Dr. H. Sampaio Corrêa, diretor da Seção de Epi-
demiologia do Departamento de Saúde. Eiste ser\'iço conseguiu vacinar com trés
doses de anatoxina simples (0. 5-1.0 e 1.5 ml) um total de 108.952 escolares de
São Paulo, sendo que 9891 creanças receberam \-acinação incompleta (3).

Pareceu-nos de interésse proceder a uma verificação do índice de portadores
entre os escolares de São Paulo, comparando dois lotes-vacinado e não s-acinado,

1

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SciELO

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1

o

Memórias do Instituto Butantan

Tomo X\TII

tanto mais quanto eram escassas as estatísticas de portadores de bacilos diftéricos^
entre nós, destacando-se apenas a tese de doutoramento de Castko Simões (4),
em 1921, a qual registra a percentagem de 3, /Çc num total de 1054 indivíduos
de todas as idades examinados em São Paulo. Além dêsse trabalho, temos conhe-
cimento apenas do estudo feito por Monteiko Filho (5), em 1937, no Rio
de Janeiro, que. examinando 548 escolares no bairro de TijiKa naquela cidade,
encontrou 3% de portadores de bacilos diftéricos virulentos e 1% de a\’irulent05.

As nossas verificações foram feitas em 1943-1944, abrangendo um total
de 3071 creanças, pertencentes a 5 grupos escolares denominados Butantan,
Alfredo Bresser, Pinheiros. Vila Madalena e São Paulo, o primeiro no bairro
de Butantan. os dois seguintes no bairro de Pinheiros e os dois últimos respecti-
\’amente nos bairros de Vila Madalena e Consolação.

M.\TERIAL E MÉTODOS

Com estilete apropriado foi colhido separadamente o material do nariz e da
garganta de cada creança, o qual le\'ado logo ao laboratório foi semeado em
meio de Loefflcr. Após 18 horas de inatbação a 37.° foram feitos esfrega-
ços que, corados pelos métodos de Neisser e Gram, foram cuidadosamente exa-
minados ao microscópio para seleção das culturas morfològicamente suspeitas.

O isolamento dessas foi feito em placas de agar-sôro-telurato (técnica ado-
tada no Instituto A. Lutz) e em meio de Mc Lcod. .■Ks colônias suspeitas fo-
ram selecionadas, culti\adas cm meio de Loeffler e as culturas de 24 horas
consideradas puras foram objeto das verificações seguintes;

i) Fermentação de carbohidratos: de.xtTosc, maltose, sacarose, dextrina,
amido e glicogénio. incorporados na proporção de 1% (com e.xceção do glico-
genio, que se usou a 0.5%) em sôro-água de Hiss com indicador --\kdrade.

ii) Poder hemolitico: verificado com glóbulos vermelhos de coelho, se-
gundo a técnica de Hammerschmid, tal como é indicada por Schiff &
Werber (6).

iii) Test de vinilència: pela prova intradérmica cm cobaia, segundo W.
Mair (7).

iv) Poder toxigeno: verificado em culturas feitas em caldo Martin' —
meio clássico para a produção da toxina diftérica, em presença de quantidades
variáveis de ferro e tendo-se sempre o cuidado de e.\perimentar por compa-
ração com a raça toxigena Park 8. Aferição das toxinas em d.m.r., pelo mé-
todo intracutánco, em coelhos.

2

Jandyih P. do Amar.\l Jt ÍLuua Cuiouna de Andkade — Portadores do
bacilo de Loefflcr entre os escolares de São Paulo

3

RESULTADOS E COMENTÁRIOS

A tabela 1 mostra o número de creanças examinadas em cada Grupo Es-
colar separadamente e a percentagem de portadores de bacilo de Loeffler.

Tabela 1

Portadores de bacilos de Loeffler em alguns Grufos Escolares da Cafdtal

Gnipo Escolar

creaacas

examinadas

% de Tactnados

% de portadores

no lote racinado
(1072 creanças)

ao lote pIo ▼ao*
eado (ISTO crean*
cas)

Butantan

506

33.8

0

2.03

.Alfredo Bresser . .

865

45.3

1.53

3.28

Pinheiros

215

26.5

0

2.56

\Tla Madalena . . .

567

55.4

2.22

4.38

São Paulo

018

15.03

1.44

1.09

Totais

3071

34.9

1.39

2.3

Diferença das % de portadores nos lotes vacinado e nSo sadnado: 0.91
Desvio standard da diferença: 0J5S — Chi-quadrado : 2.74

.V porcentagem total de portadores verificada foi de 1.88 (58 cm 3071),
inferior portanto à registrada por Castso Simões, cm 1921 (3,7%).

Poder-se-ia pensar que tal diferença fosse imputável à vacinação, embora
no largo espaço de vinte e dois anos que separam as duas investigações (de 1921
a 1943) muitos outros fatores cpidcmiológicos possam ter atuado, de modo a
modificar completamcnte as proporções observadas.

Comparando-se os lotes vacinados e não vacinados, chega-se, porem, à con-
clusão de que não há diferenças .significativas entre as porcentagens ob.servadas,
pois, embora a diferença registrada (0.91) seja igual a 2,5 vezes o desvio stan-
dard dessa diferença, o valor chi-quadrado correspondente ás porcentagens ob-
servadas atinge apenas a 2,74, equivalente a uma probabilidade de 0,1.

.Aproveitando ainda as fichas organizadas para cada creança particularmen-
te. pudemos elaborar as tabelas 2 c 3, que indicam as percentagens de portado-
res em relação à côr e ao sexo.

3

4

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVni

Tabela 2

Portadores de bacilos de Loeffler em relação à cór

Côr

Xo. de creaoc^
examinadas

Portadores

Xúmero

Percectagem

Brancos

2.531

47

2,85

Amarelos

145

5

3,44

Pardos

152

1

0,65

Pretos

1S3

5

2,73

Inf. falha

60

0

—

Total

3.071

58

1,88

Tabela 3

Portadores de bacilos de Loeffler em relação ao sexo

Sexo

No. de creaoçju

Portadores

examinadas

Xúmero

Percentacem

Masculino

1.525

31

2,03

Feminino

1.516

27

1,74

Total

3.071

58

1.88

Pela inspet^ão da tabela 3 notamos uma percentagem mais alta de portado-
res nos amarelos (3,44) seguindo-se imediatamente as creanças de côr preta
com ( 2 , 73 %), os brancos (1,85%) e, por fim, os pardos (0,65),

Em relação ao sexo a diferença de percentagem observada foi de 0.29
apenas (2,03% para os meninos e 1,75% para as meninas).

Em última etapa foram estudadas as características das 58 amostras isola-
das, as quais figuram resumidamente na tabela 4.

Devemos ressaltar desde logo que encontramos uma única amostra \’irulenta,
o que se fosse computado para a seleção dos portadores, como querem alguns
epidemiologistas, viria reduzir a nossa percentagem de 1,88 para 0.32.

Com relação à capacidade de produzir toxina, encontramos 9 raças que
mostraram, quando injetadas na pele do coelho, em comparação com uma to-

4

SciELO

jANDm\ P. DO Am.uial & Mvria Carouxa de Andrade — Portadores do

bacilo de Loeffler entre os escolares de São Paulo ã

xina standard, d.m.r. correspondente a 0,2 ml das s^uintes diluições: 1/200 —
1; 1/20.000 — 2; 1/-K).000 — 1 ; 1/60.000 — 1 e 1/100.000 — 4.

Precedendo à classificação dos tipos segimdo um esquema clássico de
.Axdersox & col., encontramos 8 amostras pertencentes ao tipo gravis, 17 ao mitis,
34 ao intermedius e uma amostra atípica.

É talvez digno de menção o fato que a única amostra virulenta encontrada se
classifique como intermediária.

RESUMO

1 . Foram e.xaminadas 3.071 creanças de alguns grupos escolares da capital
de S. Paulo, a fim de determinar-se a incidência de portadores de bacilos diftéricos
no nariz ou na garganta, encontrando-se um total de 58 culturas positivas, o que
dá uma porcentagem de 1,88%.

2. Pela separação desses escolares cm 2 lotes — A-acinado (3 doses de ana-
to.xina simples) e não A-acinado, não se Ic^rou A-erificar uma diferença significa-
tÍA-a das percentagens obserA-adas (respectÍA-amente, 1.39 e 2.3).

3. Das amostras isoladas, 1 única (aliás, isolada de creança vacinada) se
mostrou A-irulenta e apenas 9 se revelaram toxigenas.

4. .A incidência dos diferentes "tipos” foi a seguinte:

mitis — 15; intermedius — 34; gravis — 8, alêm de 1 raça atípica, cujo tipo não
poude ser determinado.

.-\BSTR.ACT

1 . 3.071 children from sevcral public schools of the city of São Paulo AA-cre
examined, in order to inA-estigate the occurrence of carriers of diphtheric bacilli in
nose or throat. and 58 positÍA-e culturcs AAcre found, this is, a rate of 1.88 per
cent.

2. These children wcre separated in two lots: A-accinatcd (3 doses of
simples anatoxin) and not vaednated children, however it AA-as not possible to
detect a significant difference betAA-cen the observ-cd rates (1.39 and 2.3 per cent,
respectÍA-cly).

3. Of the 58 isolated samples, only one (isolated from a A-accinatcd child)
proved virulent and only 9 proA-cd toxigenic-

4. The incidence of the diffcrcnt tA-pes vA-as the following:

mitis — 15; intermedius — 34; gravis — 8, besides one atA-pical race, the tj-pe
of which could not bc determined.

5

6

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVII 1

BIBLIOGRAFIA

1. Ducley, P. M. & 0’Flynn, J. A., Sp. Med. Council, Loodoo, n.® 195.

2. DeadnuiH, IV. J. & Elliot, F. J. (1933). Canad. J. Pub. Health, 24. 137.

Iniormação pessoal.

4. Simõet, João Castro (1921). Tese Doutoramento da Fac. Med. de S. Paulo.

5. MoulAro Filho, A. (1937). Investigações sôbre portadores do bacilo diftérico no Rio

de Janeiro. Arq. de Hig., 1-2. 371-377.

6. Schiff & IVerber (1935). Deutsche med. IVchruchr., 61, 259.

• 7. ir. .Wair (1930). On testing C. Diphtheriae for tirulcnce by the intracutaneous methoJ.

/. Path. & Bact„ 33, 230-231.

(Recebido para ptiUicaçâo cm março de 1945).

6

CAUACTERISTICAS DE ESPÉCIE 11 CAUACTEHISTICAS DE TIPO

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10

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Com relação à raça, os trabalhos de Kleine e Kkoo (4), Gr.\sset A.
Parret-Gentil (5), J. Cauchi e Smith (6), referem um mais alto grau imu-
nitário nos individuos de raça negra em detrimento dos brancos. Kinneard (7)
em estatisticas realizadas entre negros e brancos duma mesma região refere 90%
'' de negros Schick negativos e somente €0% de brancos nas mesmas condições

* imunitárias.

Nelly e Ramon (8) em pretos do Congo Belga, constataram 95,7% de
adultos e 78% de crianças com mais de 1/30 de unidade antitóxica, cifras estas
^ bem mais elevadas que as existentes para pessoas da mesma idade constituintes

das populações brancas.

t ■. Nossas estatisticas são bem resumidas com referência ao assunto.

Dull e Ferreira (9) no Rio de Janeiro realizando a prova de Schick em
1217 pessoas de ambos os sexos e de diferentes idades, revelam 21,8% de Schick
positivos, sendo que 12, 4% são enquadrados nos adultos.

Em 1924, Borges Vieira (11), resumindo estatisticas de Castro Simões,
Cavalcanti, B. Vieira de Almeid.a e a do Posto Experimental, assinala a por-
centagem de Schick positivos nas diferentes idades, encontrando entre 12 e 15
anos 21,5%; não faz referenda, porém, ao test no adulto.

Ulhoa Cintra (12), em trabalho correlato com o assunto, ainda em São
Paulo, refere 28,2% de adultos Schick positivos.

A cur\a de imunidade natural, bem conhedda hoje, se inicia no recém-
nascido pela transmissão passi\‘a dos anticorpos da mãe ao filho através da pla-
centa. Se até 1923 havia alguma dúdda sôbre a transmissão da imtmidade anti-
diftérica na espécie humana por esta via, o trabalho de Kutner e Ratner (13)
focalizando o assunto não deixa a menor dúvida sôbre a questão, demonstrando
claramente esta transferênda de antitoxina em quantidades práticamente iguais.
Interessante será registrar o recente trabalho de Sordelli (14), que leranta
dúvidas sôbre a questão, anotando titulos bem diferentes.

Esta imunidade inidal na vida da crianças, que se intensifica ainda pdo
aleitamento ao seio materno e que se esgota no prazo, de mais ou menos um ano,
é readquirida depois ativa e gradati\-amente até a idade adulta pelo contato suces-
sivo com os germes causadores de infecções subdinicas, mas vacinantes.

Apesar de estar fora de dúvida de que a infecção desempenha o principal
papel no aparecimento da imunidade à difteria, devemos dtar outros fatores ainda
não especificados; assim é que Hirszfelo (15) e outros crem na possibilidade
de fatores hereditários na determinação do aparedmento dos chamados anticorpos
"normais”. Xo caso particular da imunidade antidiftérica Hirszfeld pretendeu
demonstrar a correlação existente entre a herança das hemaglutininas (tipos san-
guineos) e da antitoxina diftérica (reação de Schick).

SciELO,

2

Jandykk P. do Amaral Jc O. R. de Sovz.\ e Silva — Imunidade antidifté-

rica na mãe c no recém-nascido 11

Entre nós Ulhoa Cixtra (12) em sua tese de doutoramento estuda êste
assunto e confirmando as ideias de Hirszfeld conclui que o problema da consti-
tuição sorológica” é de suma importância no aparecimento da imunidade antidifté-
rica no adulto.

Em nossa presente comunicação referiremos o resultado de 250 Schick tests
realizados em adultos do se.xo feminino, puérperas. e em seus respectivos filhos.
Se bem que em pequena escala, acreditamos poder tirar conclusões, naturalmente
com reservas, sobre o índice imunitário das mães e dos recém-nascidos em nosso
meio. — As verificações foram realizadas em puérperas e recém-nascidos da
Maternidade do Hospital São Paulo, de acõrdo com a técnica abaLxo discrimi-
nada.

MÉTODOS

Técnica do Schick test — A reação de Schick foi feita de acõrdo com a
técnica usual, inoculando-se, com seringa graduada cm centésimos e agulha ade-
quada, na derme da face anterior do antebraço, 0,1 cm3 de uma diluição de toxina
diftcrica em solução tampão de borato, segundo Moloney, representando 1/50 de
D.L.M.. A estabilidade da toxina foi continuadamente verificada não só em
relação ao seu poder tóxico, como também qiunto ao seu poder de combinação
com a antitoxina, visando os preceitos recomendados pela Comissão de estandar-
dização biológica da Liga das Xações.

O Schick test está baseado na particularidade de que uma determinada quan-
tidade de antitoxina circulante, usualmcntc estabelecida como 1/30 ou 1/25 de
unidade por cm3 de sòro, é suficiente para .salvaguardar a pessoa contra o risco
de uma infecção diftérica.

A técnica do Schidv test consiste na injeção intracutânca, na fase anterior
do antebraço, de uma quantidade de toxina correspondendo a 1/50 da D.M.L.
num volume de 0.1 cm3. Sendo o Schick test uma reação em que prevalece o
fator quantitativo, importante se torna o uso de uma toxina acuradamente diluida
e aferida, para que a reação tenha algum valor. .Assim é, que, tanto o diluente
como a diluição devem obedecer a condições já estipuladas e tidas como impres-
cindíveis.

.A toxina usada foi por nós diluida em solução tampão de borato segundo a
técnica de Molonej*. Cuidados especiais foram tomados com o peder tóxico e
sua estabilidade e ainda com o poder de combinação da toxina com a antito.xina
padrão, visando a técnica de estandardização da Comissão Biológica da Liga das
Nações. Assim é, que, pelo preparo da solução de toxina em meio adequado, e
pela observação das dosagens exigidas, pudemos observar a estabilidade pelo espaço

3

\

ScíELOIq

12

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIIl

de mais ou menos 6 mêses da toxina padronizada, e ainda a porcentagem boa de
reações que coincidiram com as dosagens diretas dos soros dos pacientes. Com
o fito de distinguir a verdadeira reação produzida pela toxina de possíveis pseudo-
reações, resultantes da irritação da pele por constituintes não tóxicos da cultura,
foi injetada por via subcutânea, no braço oposto ao da prova, igual quantidade
(0.1 cm3) da mesma toxina, mas inativada a 70° por 5 minutos. A leitura das
reações foi feita durante o espaço de 4 dias, obedecendo ao seguinte critério :

1° — Reafão positkv — Xo braço em que foi inoculada a toxina, aparece,
24 a 36 horas após, uma área circunscrita de eritema no local da injeção, área essa
■que aumenta de intensidade em coloração, e de tamanho até o 4° e 5° dia para,
a seguir, ir desaparecendo gradativamente.

2° — Reação negalhxt — Xeste caso há ausência de qualquer área vermelha
■ou de qualquer outra reação em ambos os braços.

3° — Pseudo-reação — Desenvolve-se igualmente em ambos os braços e nas
primeiras 24 horas, uma zona vermelha circunscrita e mais azulada que desaparece
com rapidez, tomando-se a pele normal no 3° ou 4° dia.

4° — Reação combinada — Esta reação é uma combinação da precoce pseudo-
reação com o subseqüente desenvolvimento da verdadeira reação á toxina; esta
última pode ser lida sem dificuldades no 4° ou 5° dia.

5° — Reação dutddosa — Foi considerada reação duridosa aquela que, não
.apresentando em 3, 4, ou, eventualmente. 5 dias os característicos de uma reação
positiva não era totalmente inexistente, parecendo assim uma reação positiva
■dissimulada.

A falta de antitoxina foi indicada sòmente pelas reações positims e combi-
nadas.

Dosagem da antitoxina — As dosagens de antitoxina foram realizadas segundo
a técnica usada para o Kellog test, misturando-se as partes iguais de diferentes
<liluições (1/1, 1/2, 1/5, 1/10. 1/100 e 1/150) do sôro com uma diluição de
toxina contendo 1/30 de L-f- por cm3. As diluições referidas de sóro correspon-
dem respectimmente a 1/30, 1/15, 1/6, 1/3, 3 e 5 U. -■\. per cm3. De cada
mistura, após contato de 1/2 hora à temperatura ambiente, injetaram-se 0,2 de
cm3 na derme de cobaias de pêlo branco, pesando, em média, 350 g.

Os resultados das reações foram acompanhados até o 4° dia. Cada cobaia
recebeu no má.ximo 5 inoculações da mistura sôro -j- toxina, e uma inoculação
de 0.1 cm3 de 1/30 do L-f- da toxina que serriu como testemunha da reação,
indicando a potência necrosante da toxina, de um lado, e de outro o indice reacio-
nai da cobaia.

Jandyr^ P. do Amar\l & 0. R. de Souza e Silva — Imunidade antidifté-

rica na mãe e no recém-nascido 13

Reação negativa — É aquela em que no local da inoculação nada de anormal
se verifica ou apenas se nota uma área vermelha nas primeiras 24 horas, desapa-
recendo porém logo depois.

Reação posith-a — .A reação é positira quando nas 24 e mais acentuadamente
nas 4S ou 72 horas seguintes se nota, além da área vermelha inflamatória, uma
zona de necrose no p>onto de inoculação.

Sempre que a reação testemunha apresentou-se nítida, os resultados foram
computados, pois as cobaias não são passíveis de apresentar falsas reações.

Quanto à colheita de sangue foi feita, no caso da mãe, por punção venosa
nas veias mediana ou basilica do antebraço e no recém-nascido, da veia do cordão
umbilical.

As amostras de sangue foram recolhidas em tubo estéril e os soros separados
quer após a retração natural do coágulo, quer por centrifugação.

RESULTADOS E COMENTÁRIOS

Pela inspeção do quadro I verifica-se que em 121 mães, 94 apresentam imu-
nidade à difteria (Schick negativas) ; 20 são sensíveis à toxina, não tendo, por-
tanto, imunidade suficiente, e 7 apresentam-se com reações duvidosas. Xos
recém-nascidos nota-se que o número de Schick negativos é maior (105), 15
apresentando reação positiva típica e aparecendo ainda 3 reações duvidosas.

Quadro I

Relação entre as frotos de Schick na mãe e no recim-nascido

Sckkk podttTM

Schick

Rr«<6c«

duvidosas

<âtipécas>

Total

Mãe

20

94

6

121

Recém-

nascido

15

105

3

123

Ainda com relação às reações, queremos referir, cm destaque, reações atípicas
<lo tipo bolhoso. que se apresentaram em 4 puérperas. Esta reação foi surpreen-
dida pela primeira vez no 16° caso observado; no dia seguinte à proN^a, ao exa-
minarmos a puérpera, notamos que no braço em que fóra praticado o test havia
a zona avermelhada característica da reação positi\-a, c, no centro, uma pequena
bolha simulando queimadura. Nos 2 dias subsequentes, a bolha em questão
aumentou de volume, para em seguida desaparecer em 2 ou 3 dias.

5

14

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

O controle foi negativo, e no recém-nascido a reação íoi positiva com os
característicos normais. Suspeitamos inicialmente que a reação estivesse ligada
a quelquer infecção secundária da pele. não obstante o carater aquoso do liquido
da bolha, e a escrupulosa assepsia com que pratica^•amos todas as reações. A
seguir, porém, novos casos surgiram (Xo. 26, 59 e 100) sempre com os mesmos
característicos. Foi, então, que revendo a literatura em questão, encontramos
referência a tal fato no trabalho de Fisher, Rubix & Gkeenwald (16) no qual
os autores atribuem o aparecimento de tal reação a um fenômeno semelhante ao
de Shw-artzman, surgindo, porém, no curso de certas moléstias infecciosas agu-
das e podendo ou não, corresponder a reações posith-as.

Fazendo referências unicamente a reações praticadas em creanças, afirmam
que a dosagem do teor imunitário no sôro revela pequenas quantidades de antito-
xina circulante, suficiente, não obstante para conceder certo grau de imunidade.
Devemos assinalar aqui. que nos casos por nós obser^-ados a dosagem de antitoxina
no sôro de 3 pacientes revelou um indice imunitário abaixo de 0.03, em um caso
o nivel se elevando entre 0.03 e 0.06. Em 3 dos pacientes a reação bolhosa cor-
responderia, portanto, a um grau insuficiente de imunidade, e, no quarto caso,
estaria relacionada a um indice imunitário pequeno. Os exames clínicos não
revelaram moléstia infecciosa aguda nas 4 pacientes, causa que os referidos auto-
res apontam como provável na reação de tipo bolhoso. É bem verdade que a
puérpera experimenta em seu organismo consideráveis alterações gerais e de vários
órgãos em particular. Os exames clínicos, porém, de nada referiam de anormal
nestas pacientes que as pudesse separar do grupo das 120 puérperas consideradas
normais.

Preferimos, assim, registrar esta reação, sem tentar esclarecer por ora sua
etiologia.

Queremos também fazer referência ás reações observadas no antebraço con-
trõle, que enunciam a sensibilidade às proteínas do bacilo diftérico. Como era
de esperar, nas mães (adultos) esta reação apareceu em número relativamente
elc\‘ado, sendo em 14 mais ou menos intensa e obser\'ando-se em 7 reação ligeira.
Xos recém-nascidos somente em 6 casos encontramos ligeira reação.

A relação entre a prova de Schick e o teor de antitoxina do sôro foi estudada
em 106 mães e 123 recém-nascidos, tendo os titulos antitóxicos de seus soros
variado entre 0.033 a 5 unidades.

Pela comparação inicial entre as reações típicas e o teor de antito.xina circu-
lante foram encontradas na puérpera 94 reações que se rclacionasam de maneira
perfeita com o titulo antitóxico do sóro, sendo 14 positivas para soros de dosagens
inferiores a 0.03, e 80 negativas correspondendo a indice imunitário acima déste
limite.

Jandyrv P. do Am.\r.\l & O. R. de Souza e Silva — Imunidade antidifté-

rica na mãe e no recém-nascido lã

Foram observadas, por outro lado, 4 reações positivas em relação com títulos
antitóxicos baixos (> 0.03 e < 0.06), e 3 reações negativas com teor imunitá-
rio < 0.03.

Devemos assinalar ainda 5 reações atípicas ou du\-idosas que se relacionavam
os títulos limítrofes (> 0.03 < 0.06).

Com referencia aos recem-nascidos, em 123 reações realizadas, 120 se mos-
traram típicas, sendo que destas, 1 14 estão de acordo com as dosagens, sendo 101
negati\'as para soros de teor imunitário acima de 0.03, e 13 positivas para índices
inferiores.

Devemos referir ainda 2 reações Schick positi\'as relacionadas com índices
imunitários bai.xos (> 0.03 < 0.06) e 3 negati\-as para dosagens inferiores
a 0.03.

.\ observação evidenciou ainda 3 reações atípicas ou duvidosas das quais 2
estão relacionadas em índices antitóxicos baixos (> 0.03 < 0.06) e uma com
dosagem inferior a 0,03.

Os dados que acabam de ser referidos, vem sumarizados no quadro II.

Quadko II

Rtlação entre a protn de Sckick e o teor imunitário do tôro

Schick 4*

cooi teor

imumtirio

<0.03

ReacSo
Schide +
com teor

imoaitirio

>0.03

_<0.06_

Rcaçío
Schick —
cooi teor

inuoaitirio

>0.03

RcaçSo
Schick —

coca teor

imonitlrio

<0.03

RcA<<Se« datí*
do»*s ou «U*
p«ca« com teor
imunitário

> 0.03
<0.06

Rco^oco duTÍ*
doto* ou att*
picas com teor
imumtirio

<0.03

1

puérperas

14

4

80

3

5

106

recém-

nascidos

13

m

101

0

O

1

123

Considerando apenas as reações típicas, encontramos nas puerperas, em 101
reações. 94 relacionadas com a dosagem de antitoxina do sôro e nos recém-nascidos
em 120, 114 concordantes.

No recém-nascido, pois. em 120 reações típicas, só 6 se apresentaram em
divergência com o título imunitário, isto é, 4 reações que deveriam teòricamente
ser positivas não se comportaram como tal e em 2 casos com reação positi\'a. o
sôro revelou titulo > 0.03 < 0.06.

Os resultados apresentados estão em contradição com os de vários autores
que também estudaram a prova de Schick no recém-nascido (Kellogg (19)

16

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Friedberger e Heiu (20), Okell (21), Cooke e Sharma (22), entre outros)
e que se referem à falta de sensibilidade da pele do recém-nasddo à toxina difté-
rica, mesmo quando a antitoxina circulante está abaixo do mínimo determinado.
SoRDELXi (14) em recente trabalho confirma igualmente esta tese num grupo
de 13 recém-nascidos sem antitoxina circulante, acometidos de coriza diftérico,
em 11 dos quais obser\-ou reação de Schick negativa.

Não pretendemos infirmar teorias já pro\'adas e aceitas; limitar-nos-emos
unicamente a ressaltar que, em nossas verificações as disparidades não se mostra-
ram tão intensas quanto se poderia calcular em face dos dados anteriormente
apresentados. -Assim é, que, em 17 recém-nascidos que deveriam apresentar rea-
ção positira dada a ausência de antitoxina no sôro, 13 se comportaram de maneira
regular e 4 entraram no número dos insensíveis à toxina.

Assinalaremos ainda os vários resultados obtidos em relação á côr e à nacio-
nalidade.

De 110 puérperas cujos soros foram e.xaminados.

89

eram

brancas.

15

•»

pretas.

14

>>

pardas e

2

ff

amarelas.

No que se refere à nacionalidade a grande maioria é de brasileiras (96)
aparecendo 6 portuguesas, 4 talianas, 3 espanholas, 2 lituanas, 2 húngaras, 2
japonesas, 2 jugoslavas, 1 polonesa e 1 alemã.

Embora o número de dados seja insuficiente para um julgamento estatístico,
é interessante discriminar as 17 reações de Sch ck po5Íti\-as em relação à côr e
á nacionalidade.

Assim, em 89 puérperas brancas a reação de Skrhick foi positi\’a em 10,
registrando-se 2 reações positivas cm pretas, num total de 15, 1 em amarela,
num total de 2 e 2 em pardas, num total de 14.

Quanto à nacionalidade houve 14 reações positivas brasileiras, num total de
96. 1 em húngara, num total de 2. 1 em japonesa, num total de 2 e 1 em italiana,
num total de 4.

Pelo exposto conclúe-se que foi impossível verificar qualquer correlação entre
a positividade da reação de Schick e a raça ou a nacionalidade.

Com relação á pro\-a de Schick no adulto, cm 121 reações praticadas, 20
foram positivas e 7 du\ndosas, sendo que destas, 5 como já foi anotado, correspon-
diam a mulheres com títulos antitóxicos baixos.

JANDYR.K P. DO Am.\r.\l &. O. R. DE SouzA E SiLVA — Imunidade antidiflé-

rica na mãe c no recém-nascido 17

Podemos referir, pois, em nosso meio, uma porcentagem de 16,6 de Schick
positivos para adultas, indice um pouco maior que o obtido por Dull e colabora-
dores no Rio. de Janeiro.

Consideremos, finalmente, a relação entre os títulos antitóxicos verificados
na mãe e no reccm-nasddo, que vém resumidos no quadro III.

O estudo comparativo foi realizado em 110 soros, tendo as dosagens \’ariado
entre 0.033 e 5 unidades, pois, infelizmente, o material disponivel não permitiu
dosagens mais acuradas.

Quadso III

Rfla(ão entre os títulos antitóxicos na mãe e no reccm-nascida

UnkUdes

< 0.03

>0.3

<0.06

> 0.06
<0.17

> 0.17
< 0.3

> 0.03
<3

>3

<5

Toul

mães e
recém-
nascidos

17

21

3

2

54

2

99

Destes 110 soros, 99 apresentaram títulos antitóxicos pràticamente iguais na
mãe e no recém-nascido.

Xos 1 1 soros restantes, em 9 o titulo do sôro da veia do cordão (recém-nas-
cido) é maior que o da mãe, em 2 aparecendo o caso inverso. Como, porém, o
método empregado não permite uma aproximação maior dos resultados, não tendo
êles s^ariado além dos limites de uma diluição para a imediata, é possível que as
di'=cordáncias assinaladadas sejam muito pequenas.

Se computarmos o total das 110 dosagens, verificamos que 17 soros de recém-
nascidos e os soros de suas respecti^•as mães apresentam-se com titulo antitóxico
alaixo de 0.03; ao que parece podemos julgar que a toda a mãe não imune cor-
responde um recém-nascido susceptível ã difteria.

Nesta ordem de ideias é que Sorrentino (23) propõe e estuda a \’acinação
antidiftérica em gestantes Schick positU^as.

.•\ análise do quadro III evidencia ainda que o maior número de títulos de
soros se encontra na escala de dosagem entre 0.3 e 3 u.

Para economia de espaço, omitimos a obser\-açâo minuciosa de cada caso cm
particular, com a descrição da reação obsci^^ada e dos resultados de dosagem da
antitoxina no sôro sanguíneo da puérpera e do recém-nascido, protocolos estes
que se encontram arquivados, à disposição dos interessados, na Biblioteca do
Instituto Butantan.

9

18

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMII

RESUMO E CONCLUSÕES

Foram realizadas pro^^as de Schick em 123 puérperas e em seus filhos.

Simültâneamente foi feita a dosagem da antitoxina circulante no sangue mãe
e no sangue do cordão umbelical.

Nos recém-nascidos foram encontradas 15 reações Schick positi\-as, 105
reações Schick negatiras e 3 reações duvidosas.

Em 4 casos, nas mães, apareceram reações do tipo bolhoso, não apresentando
as pacientes carater de anormalidade orgânica que pudesse ser ligada à sua etiolo-

gi^-

Nos filhos das citadas puérperas, a reação de Schick foi positira, com os
característicos normais.

Foram encontradas em 21 adultos reações evidenciando sensibilidade à pro-
teína, sendo 6 de carater ligeiro. Nos recém-nascidos só em 6 casos foram veri-
ficadas ligeiras reações no controle.

Pela dosagem direta da antito.xina em 106 soros de puérperas e em 123 de
recém-nascidos ficou verificado que 17 mães e 18 recém-nascidos possuíam menos
de 0.03 de unidade de antitoxina circulante.

No que se refere à pro\-a de Schick no adulto com relação ao teor imuni-
tário, ficou demonstrado mais uma vez que ela é de importância desde que prati-
cada com técnica perfeita.

Quanto à pro^^a no recém-nascido, não tivemos dados que pudessem afirmar
a insensibilidade da pele â toxina diftérica, pois em 13 soros sem poder antitóxico,
seus pacientes reagiram bem â toxina e apenas em 4 com titulo antitóxico inferior
a 0.03 a reação foi negati^-a.

No recém-nascido, pois, uma reação de Schick positi\-a traduz, de uma
maneira geral, falta de imunidade â difteria.

A reciproca também foi observada.

Parece-nos que as reações duvidosas ou atípicas estão geralmente em relação
com os títulos imunitários limítrofes.

Pela comparação entre o teor imunitário das mães e dos recém-nascidos
pudemos obsei^ar títulos antitóxicos práticamente iguais.

De um modo geral encontramos 16,6 de adultos susceptíveis á difteria em
nosso meios, independen temer te da raça ou da nacionalidade das pacientes.

A e.xistência de 11% de recém-nascidos com teor de antitoxina circulante
abaixo de 0.03, isto é, susceptíveis á difteria justifica a inclusão desta afecção
nas preocupações de diagnóstico diferencial nessa idade.

Jandyr\ P. do Amar.\l Sí 0. R. de Souza e Silva — Imunidade antídifté-

rica na mãe e no recém-nascido

19

BIBLIOGRAFIA

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(Rcccbwlo SkATA pqbitaiçio rtn de<embro dc 1944).

11

SciELO

3 11 12 13 14

EMPRÊGO DA REAÇÃO DE FLOCULAÇAO ESPECÍFICA NA
DOSAGEM DO ANTIVENENO CROTÁLICO

roB

J. B. .ARANTES. G. ICARM.ANN & OTTO G. BIER

^Do Laboratório de Imvnologia, Instituto Bulantan, São Paulo, Brasil)

Poucos e contraditórios são os trabalhos que se referem á possibilidade de
medir o valor antitóxko dos antivenenos oíidicos tomando como índice a precipi-
tação que êles produzem quando misturados ao veneno homólogo.

Lamb, em 1904, foi o primeiro a se ocupar do assunto e, trabalhando com o
sistema veneno-antiveneno cobra, chegou à conclusão de que se obtém precipitação
com os soros preparados em coelho, mas não com os anti-soros de cavalo.

Em 1909, Calmette & Massol (1) verificam, todavia, também com o anti-
veneno cobra, uma correlação bastante apro.ximada entre a formação de precipitado
c o valor neutrallzante (cm camundongos) de soros preparados em cavalo, che-
gando à conclusão de que, ao contrário do que afirmava Lamb, podia o antiveneno
cobra ser dosado in fitro com razoável aproximação

Vital Brazil (2) manifesta-se discretamente sóbre o assunto e, embora
assinale que a tuiração observada nas misturas de antiveneno (crotálico e bolró-
pico) e veneno homólogo só se desenvolve numa zona estreita vizinha do ponto de
neutralização (compro>‘ado mediante injeção venosa no pombo), conclui que a
concordância não é perfeita e que, por isso, a verificação de prccipitinas não
pode ser utilizada para a dosagem exata dos soros antiofídicos* Do mesmo modo,
Houssay & Xet.rete (3). afirmam não haver relação entre o poder precipitante
e o poder neutralizante trabalhando com sóro antiofidico polivalente (anti- C.
terrificus - B. alternata - B. ncttzincdn) c veneno de B. altemata.

Mais recentemente (1935), Mallick (4), com o sistema sóro anti-cofrro-F.-
russeUii mais veneno de cobra, chega também à conclusão de que a floculação.
segundo Ramox, não pode ser usada para a aferição do antiveneno, embora não
seja aparente, dos protocolos de suas experiências, porque se manifesta ele tão
pessimisticamente acerca daquela possibilidade.

À mesma conclusão chegam Ghosb & Kunda, cm 1940 (5), havendo, porém,
estes autores, encontrado valores bastante próximos nas titulações feitas í»i viw
(no pombo) e ín infro (floculação) do antiveneno Vipera russeüii.

1

SciELO,

14

22

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Nos últimos quatro anos, no Instituto Butantan, um de nós (J.B.A.), vem
acumulando dados comparativos das dosagens in zii’o (por injeção venosa no
pombo, segundo Vital Brazil) e in vitro (misturas de 1 cm3 de soro com quan-
tidades variáveis de veneno) de numerosos antivenenos ofidicos preparados em
cavalo, tendo chegado à definida impressão de que a precipitação especifica pode
servir de guia seguro na aferição do sôro contra o veneno da cascavel neotrópica
(CrotaJus tcrrificus terrificus), embora não o seja no caso do antiveneno botró-
pico*

No presente trabalho tais resultados são consubstanciados, estabelecendo-se
com maior precisão as condições técnicas favoráveis à evidenciação do ótimo de
precipitação, quer usando-se o método dito a (Deax & Webb), no qual dife-
rentes quantidades de antígeno são adicionadas a uma dose fixa de anticorpo, quer
o método inverso (p), segundo Ramox, tal como se usa para a dosagem m vitro
da antitoxina diftérica e outras.

MATERI.\L E MÉTODOS

Antivenenos — Foram usados soros crotálicos monovalentes ou soros antiofi-
dicos mistos (crotálico-botrópico), quer de sangria direta, quer purificados e con-
centrados.

Solução de veneno — As soluções de veneno foram preparadas a partir do
veneno-padrão do Instituto (dessecado 5 dias a 37°C) e geralmente na concen-
tração de 1 mg por ml. Como solvente (e também como diluente no preparo
de soluções menos concentradas) usou-se soluto de cloreto de sódio a 0.85% tam-
ponado com fosfatos a pH 7.4 e adicionado de mertiolato na proporção de
1:10000.

Conservadas na geladeira a 4®C, tais soluções de veneno mantêm o seu titulo
inalterável durante 15 dias, após o que começam a enfraquecer progressivamente.

Técnica das reações de precipitação — A precipitação das misturas veneno-
antiveneno foi estudada quer \-ariando o antígeno, segundo Dean & Webb (método
a), quer \'ariando o anticorpo (método P), de acordo com o método de RAMceí.

Em ambos os casos foi o volume final completado a 3 ml com água fisiológica
e os tubos imersos em banho-maria a 50“, até 1 /3 da coluna liquida neles contida,
de maneira a provocar a formação de correntes de convenção, que aceleram a
formação de partículas e facilitam-lhes a visibilidade. O tempo total de obser-
vação foi de 4-5 horas. Reproduzimos abaixo o protocolo seguido na pesquisa
do ótimo de floculação, segundo Ramon e que permite a titulação de soros capazes
de neutralizar por ml desde 0.1 até 2.5 mg de veneno (tab. 1).

J. B. Arantes, G. Karmann i Orro G. Bier — Emprego da reação de

Hoculação específica. 23

Tabeuv 1

Protocolo de dosagem feio método P (Ramon)

Sol. TmeikO

1 mc^nl

SÃTO

N-»a 0.85 Í4

0o^ti<l4dc de reocno
seatr^iiada por 1 nl
de »òro

ml

ml

ml

mg

1

0.25

2.5

0.25

0 10

2

0.25

2.1

0.65

0.12

3

0.25

1.8

0.95

0.14

4

0.25

1.6

1.15

0.16

5

0.25

1.4

1.35

0.18

6

0.25

1.2

1.55

0.21

7

0.25

1.0

1.75

0.25

8

0.25

0.9

1.85

0.27

1

0.25

0.8

1.95

0.31

2

0.25

0.7

2.05

0.35

4

0.25

0.6

2.15

0.41

3

0.25

0.5

2.25

0.50

5

0.25

0.45

2.30

0.55

6

0.25

0.40

2.35

0 62

7

0.25

0.35

2.40

0.71

8

0.25

0.30

2.45

0.83

1

0.25

0.26

2.49

0.92

2

0.25

0.23

2.52

1.09

3

0.25

0.20

2.55

1.25

4

0.25

0.17

2.58

1.47

5

0.25

0.15

2.60

1.66

6

0.25

0.13

2.62

1.92

7

0.25

0.11

2.64

2.27

8

0.25

0.10

2.65

2.50

Técnica das dosagens in vivo — Para as dosagens in tdvo foi usado o método
da injeção venosa em pombos de 300 g, segundo Vital Brazil (2)-

RESULT.ADOS E COMENTÁRIOS

A fim de estabelecer a melhor técnica a seguir na determinação do ótimo de
precipitação fizemos uma série de ensaios de tipo "checkerboard”, usando um
único sôro para determinar os ótimos a e p.

Na tabela 2 (a,b) vêm expressos os resultados obtidos.

3

24

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Tabela 2

a) Determinação do ótimo de precipitação pelo método de Dean 6r IVebb
Quantidade de feneno, mg.

Quantidades
de »óro. ml

2.30

1.90

1.60

1.30

1.10

0.90

0.75

0.60

0.60

0.40

0.35

Ratio — ^

0.32

105

27

45

145

220

1.87

0.39

104

25

28

98

130

1.92

0.47

113

40

10

25

75

95

108

125

1.91

0.67

ISO

30

10

15

40

1.92

0.70

57

37

10

12

42

ISO

1.86

0.S6

65

50

34

42

45

60

1.88

1.00

10

13

15

40

50

270

1.90

b) Determinação do ótimo de precipitação pelo método de Romon
Quantidade de sôro, ml

Quantidades
de %^nefM>

2.30

1.90

1.00

0 85

0.70

0.57

0.47

0.39

0.32

0.27

0.22

0.19

0.16

Ralio

0.35

280

120

65

22

70

1.84

0.40

200

68

22

100

1.81

0.60

130

45

12

140

1.S5

0 60

232

115

42

28

50

1.87

0.75

137

55

25

20

246

1.92

0.90

260

240

140

102

38

16

14

42

120

1.91

1.10

90

45

15

10

8

30

135

1.92

1.30

135

10

95

1 S6

1.60

250

180

10

60

1.88

1 90

22

38

135

1.90

\'c-se na tabela 2 que o antiveneno estudado se comporta como um sôro
do tipo H no sentido de Bovd (6) e que os seus ótimos a e P pràticamente coinci-
dem, as ratios G/A em ambos os casos \-ariando apenas de 1.86 a 1.92 para o
ótimo a e de 1.81 a 1.92. no caso do ótimo p. Êste resultado, aliás baseado
em floculações feitas com um único antiveneno, está em oposição ao ponto de
vista e.xpendido recentemente (1944) por BovD & Tcrneix (7) de que os ótimos
a e P jamais podem coincidir. ’

cm

SciELO,

11 12 13 14 15 16 17

J. B. Ar.\ntes, G. K\iimann & Orro G. Bieh — Eníprêgo da reação de

floculação especifica. 2ã

Conhecido o fato que os ótimos a e P frequentemente cáem na zona de
equivalência, fizemos algumas verificações dos sobrenadantes correspondentes a
tais precipitados e pudemos realmente compro^^ar, mediante injeção venosa em
camundongos, a inexistência de veneno livre. Esta verificação é consubstanciada
pela concordância entre as dosagens in vk'o e in vitro de diferentes antivenenos
crotálicos, tal como se pode ver na tabela 3.

TABEl-^ 3

Concordância entre as dosagens in viro {fomboy e in vitro (Jtocuiofão) de
diferentes anlhmcnos crotálicos

Antiveneno

Dottctm «n viro:
qnmstidnde de Tcneno
nentmlizadA por 1 ml
de antiveneoo

quADtidnde de veneno
qne floctiln ótimameote
com 1 ml de aotiveneno

tu r«c'o

Ritio

tn t%tra

mg

mg

C 30

0.10

0.92C)

0.93

0.92

0.92

0.96

0.94

1.09

0.82

C 29

2.10

1.78C)

1.2

1.64

1 3

C 17S

0.50

0.50

1.0

C 193

0.30

0.27C)

l.I

0.27

C 011

0.40

0.35

1.1

C 016

0.45

0.41

1.1

C 006

0.30

0.20

1 5

C 014

0.25

0.27

0.93

C 015

0 45

0.41

1.1

324

0.50

0.41

1 2

424 (••)

0.60

0 62

0.97

(*) Do«afent irpetidAt com diferentes sotucões de venetm.

(**) Sóro satiofidico mirto espu de neutrslitsr por ml, 0.6 de veneno crotilico e 1.2 de eeoeoo bo
trópico.

.•\ relação foi, na maioria das vezes, muito próximo de 1. só tendo

havido um afastamento apreciável no caso dos soros C 29 e C 006. Tais desvios,
que aliás são muito pequenos quando comparados, p. cx°, com os observados na
dosagem do' sôro antidiftérico, não invadem o valor da floculação na dosagem
dos soros anti-ofidicos, uma vez que esta indica a dose justamente neutralizada

ã

SciELO

3 11 12 13 14

26

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

por uni certo volume de sôro (Lo), ao passo que a dosagem in zivo indica um
valor frequentemente intermediário entre Lo e L-j- (dai ser a ratio " ■

quase sempre superior a 1.0).

CONCLUSÕES

1. A reação de floculação especifica observada entre o veneno e o anti-
veneno crotàlico mostra ótimos o e P pràticamente coincidentes e que correspon-
dem à zona de neutralização.

2. Comparando-se os resultados das dosagens í« vivo (método de Vital
Brazil) e í« tntro (floculação) de uma série de antivenenos crotálicos, obteve-se
uma ratio *° muito próxima de 1. Dai a conclusão de que a floculação

io ritro

especifica poderá seiv-ir como um guia seguro na aferição do antiveneno crotàlico.

ABSTR.\CT

1. The optimal proportions ratios are verj* dose for the System Crotalui.
tcrrificus venom-antivenin, when determined either by the alpha (Dean & Webb)
or the beta methods (Ramon).

2. The comparativo titration of a series of Crotaius antivenins, by using

the flocculation and pigeon methods, showed a ratio ver\- near to 1.0.

ia Titro

3. The conclusion is drawn that the flocculation reaction is a reliable index
for the tiration of the neutralizing potenc>’ of Crotalus antivenins.

BIBLIOGRAFIA

1. Calmelte, A. & Massol, L. (1909). Les précipitines du sérum antivenitncux vis-à-vi»

du venin de cobra. Ann. Insl. Pastfur, 23, IIS.

2. Vital Brasil (1914). La défense cootre rophidbme. Pocai-Weiss & Cia., São Paulo,

a. pág. 246.

3. Housiay, B. A. Sr StgrtU, J. (1917). Propriedades precipitantes especificas de los

sueros antiofidicos. Rex\ dei Inst. Bacteriológieo dei Dep, Sac. de Higiene, 1,
15-31.

4. Maliick, S. M. K. (1935). The appiicability of floccrilation tests for standardization of

antis-cnene. Indian J. Med. Res^ 23, 525-529.

5. Ghosh, B. M. & Kundu, ,V. L. (ISMO). The reaction between Vipera muellii venom

and its antivenene. Ind. and J. Med. Res^ 27, 1121-1127.

6. Boyd, IC. C. (1943). Fundamentais of Immunology. Interscience Publ., Inc., New

Yorlc, a. pág. 215-219.

7. Boyd, tV. C. & Tumell, M. A. (1SM4). The essential difference between the two opli-

mum proportions flocculation ratios. /. exper. med., 80, 289-298.

(Recebido para poblicacão na maio dc 194S).

ESTUDO QUANTITATIVO DA REAÇAO DE FLOCULAÇAO
ENTRE O VENENO E O ANTIVENENO CROTALICO

TOK

OTTO G. BIER

(com a assistência técnica de Maria Brazil Esttves)

(Do Laboratório de Imanologia. Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

Arantes, Karmaxx & Bier (1) demonstraram que a reação de floculação
observada entre o veneno de Crotalus t. terrificus (cascavel neotrópica) e o res-
pectivo antiveneno deve ser considerada como uma reação antígeno-anticorpo
especifica, em vista da estreita correlação in vivo - 1 « vitro por êles verificada,
experimentando o veneno em relação a um grande número de partidas de antive-
neno.

Uma vez que os métodos quantitativos desenvolvidos para a dosagem das
precipitinas (2) foram aplicados com sucesso ao estudo da reação toxina-antito-
xina, quer no caso da toxina diftcrica (Pappexheimer & Robixsox, 1937), quer
no caso da toxina escarlatinica (Hottle & Pappexheimer, 1941), pareceu-nos
que tal técnica devera ser aplicada também ao sistema V-A crotálico. A intenção
foi a de obter, assim, dados importantes para a avaliação da atividade imunológica
do veneno jxiro, independentemente do seu isolamento, bem como para a deter-
minação quantitativa do antiveneno.

MATERIAL E MÉTODOS

Solução de veneno — As soluções de veneno foram preparadas adicionando- se
o veneno sêco padrão do Instituto, na proporção de 0,4Çfc, a um soluto hipertõnico
de NaQ (1.5%), de acordo com a técnica aconselhada por Vital Brazil (5), a
qual permite assegurar rápida e completa dissolução.

Esta solução-mãe foi conser^-ada na geladeira sem adição de qualquer preser-
vativo c usada dentro de 3 a 4 dias, no máximo, preparando-se diluições da mesma
em soluto isotõnico de NaQ (0.9%) que, antes de serem usadas nas experiências
de floculação, eram centrifugadas na câmara fria a 2000 r.p.m. durante meia hora.
a fim de obter-se um sobrenadante perfeitamente límpido.

28

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XYHI

Anlnvncnos — Foram usadas três partidas diferentes de antiveneno crotálico,
sob a forma de sôro de cavalo hiperimune, não purificado, de sangria direta
feita, no máximo, oito dias antes das experiências. O sôro, separado do coágulo
por sifonagem, foi centrifugado no dia seguinte, deixado em repouso durante
mais 24 a 48 horas em câmara fria e no\'amente centrifugado, a 2000 r.p.m. meia
hora, no dia da experiência.

As três partidas de antiveneno utilizadas, correspondentes aos ca\’alos de
números 152, 190 e 188, neutralizavam respectivamente 0.22-0.40 e 0.54 mg
de veneno de Crolalus t. tcrrificus per ml de antiveneno, sendo as dosagens feitas
no pombo, pela via intravenosa, de acordo com o método de uso corrente no
Instituto.

Técnica das reações de {precipitação — De cada antiveneno determinou-se o
ótimo de floculação, quer usando-se o método a (proporções ótimas, segundo
De.\x & Webb), quer o método P (R.\mox). Xo primeiro caso, a 2 ml de sôro
adicionaram-se quantidades \'ariáveis de veneno, igualando-se os volumes com
água fisiológica: no segundo caso, a 2.5 ml de uma solução contendo 0.1 mg de
veneno per ml, adicionaram-se quantidades \-ariáveis de sôro, igualando-se tam-
bém os volumes finais com solução isotônica de XaQ.

Os tubos foram imersos, então, em banho-maria a 50®C até uma altura
correspondente a cêrea de 1/3 do seu conteúdo, fazendo-se leituras em intervalos
repetidos, a fim de registrar o ótimo de floculação.

Xas experiências quantitativas, a porções de 4-5 ml de sôro adicionaram-se
quantidades variáveis de um soluto de veneno contendo 1 mg per ml, misturando-sc
cuidadosamente o conteúdo dos tubos e deixando-se completar a precipitação
durante a noite na geladeira.

Determinação de nitrogênio nos precipitados — .Após centrifugação (na
câmara fria) e decantação dos sobrenadantes. os precipitados foram desagregados
e lavados três vezes com água fisiológica gelada, proccdcndo-sc á recentrifugação
dos sobrenadantes, de acôrdo com a referência (6). .As análises foram feitas em
duplicata, só se considerando satisfatórios os resultados compreendidos dentro de
um érro de á: 3% ; ocasionalmente, quando os valores mais baixos não estiveram
compreendidos dentro daquela variação, foram êles desprezados, computando-se
apenas o valor superior.

.As determinações de nitrogênio foram feitas pelo método mkro-Kjeldahl.
segundo a técnica de Meeker & Wagxer, recebendo-se a amónia acarretada por
uma corrente de vapor dágua em soluto saturado de ácido bórico e titulando-se
diretamente com HG n/70.

RESULTADOS

Os resultados das determinações quantitativas feitas com três diferentes anti-
venenos figuram nas tabelas 1, 2 e 3.

Otto G. Bier — Estudo quantitativo da reação de floculação entre o ve-
neno e o antiveneno crotàlico. 29

Tabela I

Flocuiação quantitalh-a do sôro crotàlico 190

Quantidades crescentes de t^neno adicionadas a 4 ml de antiverteno.

I

Sol. rrneno

I ZOK- p€T
ml

II

N-reneao (*1

III

N*pfecipiudo

IV

N-antiTeneno

(III-II)

V

Ratio

N-antirrn^ao

>i«vencDo
<IV . !l)

VI

ótimo dc
RocttiaçSo

ml

mg

mg

mg

(f) 0.77 mc de

1.1

0.0S24

1.1&4

1.082

vroeno para 2

1.2

0.0898

1.202

1.112

ml de a&ro.
Ratio: 2.6

1.3

0.0973

1.311

1.214

0.6 ml <le

1.4

0.1048

1.398

1.293

12.3

•Ãro para 0.2S

1.5

0.1123

1.425

1.312

11.7

mc de veneno.

Ratio; 2.4.

1.6

0.1198

1.408

1.288

10.7

Tempo de fk>*

1.7

0.1273

1.420

1.292

10.1

ctilaçio:

1.8

0.1348

1.401

1.269

9.4

JO min.

(*) Calculado da seguinte maneira; Cada ml do soluto de s^eneno empregado con-
tinha, em realidade, 0.78 mg de veneno crú (descontando-se 12% de água contidos no vo
neno padrão pulverulento).

Sôbre a base do rendimento máximo de crotoxina obtido por Suitta & Fbaeskel-
CosBAT (7) e que é de cèrca de 60%, pode-se calcular que 0.78 mg de veneno crú contem
O.-lbS mg de crotoxina, ou sejam, 0.468: 6,23 = 0.07488 mg dc X-crotoxina.

Tabela II

Floculofão quoMtitathv do sôro crotàlico 188
Quantidades crescentes de tvneno adicionadas a 4 ml de antiveneno.

I

Sol. veneno

1 m« per
ml

II

N - veneno

III

N*precip«tado

IV

N-anlireneno
(111 - II)

V

Ratio

N*anttveneno

S*veneno
(IV . II)

VI

ótimo de
nocola^Io

ml

mg

mg

ft) Sio poll^k

1.1

0.0824

0.133

•er determina*

do com exati*

1.2

0.0898

0.386

dSo.

1.3

0.0973

0 679

fi) 0.6 ml <ie

1.4

0.1048

0.931

0.826

•ôro para 0.2$

fttf de veneno.

1.6

0.1198

1.340

1.220

10.2

Ratio: 2.4.

1.7

0.1273

1.442

1.315

10.3

Tempo de (lo*

cuUcio;

1.8

0.1348

1.586

1.451

10.8

150 min.

SCÍELO3

13

15 16

30

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Tabela III

Floculaçao quanlitatrixi do sôro crotálico 152
t) Quantidades crescentes de tmeno adicionadas a 4 ml de antk-cneno.

I

II

III

IV

v

\T

SoL TCOCDO

N-T<Qeno

N>precipiudo

N*«ntÍTrneoo

Ratio

Otímo de

1 mg per

(III . U)

N-reneno

noenU^So

ml

K-antireoefio

(IV - II)

td\

mg

mg

mg

q) 0.46 mg de
reneoo para 2

0.8

0.0599

0.532

0.472

ml de t6ro.
Ratio: 4.3.

0 9

0 0674

0.723

0.655

9.7

P) l.IJ mg de

1.0

0.0749

0 696

0.621

8.3

toro para 0.25
mg de Teneno.

1.1

0.0824

0 674

0.591

Ratio: 4.5.
Tempo de fio-

1.2

0.0898

0.540

0.450

ctalaçio:

60 min.

ii) Quantidades crescentes de feneno adicionadas a 5 ml de antiveneno

1.2

0.0898

0.856

0.766

8.5

1.3

0.0973

0.819

0.721

1.4

0.1048

0.647

0.542

1.5

0.1123

0.410

DISCUSSÃO

Os dados quantitativos apresentados indicam que a floailação entre o veneno
e o antiveneno crotálico, tal como acontece com a reação toxina-antito.xina di itérica,
apresenta uma faixa mais ou menos estreita na qual o valor de X-precipitado passa
por um máximo, decrescendo abruptamente abaixo ou acima desta zona ótima.

A\-aliando-S€ em 60% o teor de veneno puro (crotoxina) contido no veneno
crú (7) pode-se calcular o N correspondente ao veneno e, por subtração do
X-precipitado, o X correspondente ao antiveneno.

Verifica-se, assim, que a ratio X-antiveneno : X-veneno, no tubo correspon-
dente ao máximo de N-precipitado ^•ariou, nos três soros experimentados, entre
9.7 c 11.7. Tomando-se, por exemplo, o \-alor 11 para tal relação, admitindo que
o antiveneno é uma globulina de pêso molecular igual a 180.000 e que o precipitado
formado entre veneno e antiveneno crotálico, no ponto de floculação ótima tem
a mesma composição molecular que os precipitados nos sistemas to.xina-

Otio G. Bikr — Estudo quantitativo da reação dc floculação entre o ve-
neno e o antiveneno crotálico. 31

antitoxina diftcrica e o\-albuniina-antio\-albumina (de ca\-alo), chega-se à conclu-
são dc que o peso molecular da crotoxina deve ser próximo de 33.000 ^

Ora, éstc é justamente o valor atribuído por Slotta & Forster (8), ao pêso
molecular da crotoxina, calculado pelo teor de metionina. A uma ratio de 12
corresponderia um pêso molecular dc 30.000: segundo as determinações de
Gralén & The Svedeberg (9), o pêso molecular da crotoxina é de 30.500.

Quanto ao X correspondente ao antiveneno, atingiria, para os soros 190, 188
c 152, respecti\-amente os valores de 1.312-1.451 e 0.655 para 4 ml de sôro, ou
seja de 328, 363 e 164 mg per ml, ^-alorcs que estão dc acôrdo com o poder
ncutralizante dos soros correspontes e que permitem aferir a atividade do anti-
veneno crotálico na base de cêrea de 600 n^ de X-antiveneno para a neutralização
de 1 mg dc veneno bruto (ou 0.6 mg de crotoxina).

As especulações teóricas expostas têm, porém, \*alor limitado, sendo
necessário compro%'á-las à custa de dados quantitativos que permitam o cálculo
direto da ratio de combinação entre o veneno e o antiveneno na zona de equira-
lência. Estudos quantitativos com a crotoxina são também claramente indicados.

RESUMO E COXCLUSOES

1 . O estudo quantitativo da reação de floculação entre o veneno e o antive-
neno crotálico conduz a resultados semelhantes aos que se observam na reação
toxina-antitoxina diftérica.

2. Os dados quantitativos apresentados não permitiram calcular a ratio de
combinação entre o veneno e o antiveneno. .\\'aliando-se esta, porém, em função
do pêso molecular da crotoxina, chega-se a interessantes conclusões sôbre a ativi-
dade imunológka do veneno puro e do anti\‘cncpo, que são brevemente discutidas
no texto.

ABSTRACT

1 . The quantitative course of the reactions is «ry similar for Crotalus t.
terrificus venom-antivenin and diphtheria toxin-antitoxin s)’stcms.

2. From the data obtained so far it was impossible to calculate the ratio
X-anti\'cnin :N-vcnom in the prccipitate formed within the equiii^alence zone.

However, when this ratio is determined on the basis of the molecular weight
attributed to crotoxin, interesting conclusions may be drawn regarding the immu-
nological activities of venom and antivenin which are briefly discussed in the
texí.

5

32

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

BIBLIOGRAFIA

1. Arantfs, 1. B., Karmann, G. & Bier, O. G. (1W5). Elmprêgo da reação de flocula-

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(Rcctiwlo para paUicação cn marfo de 1945).

cm

SciELO,

11 12 13 14 15 16 17

DESENCADEAMENTO DO FENÔMENO DE SHWARTZMAN EM
COELHOS MEDIANTE A INJEÇÃO VENOSA DE
GLICOGÊNIO PURO

roR

OTTO G. BIER & J.\XDYR.-\ P. do AMARAL

{Dos Laboratórios de Batteriologia e de ImuHologia, Instituto Butantan,
São Paulo, Brasil)

Dentre numerosas substâncias ensaiadas com o fim de provocar a baixa do
teor de plaquetas sanguineas (goma acácia, amido solúvel, polisacárides extraidos
do liquido hidático ou de extratos de Ascaris luinbriíoides, glicogenio), referem
recentemente (1945) Rocha e Silva, Graxa & Porto (1) que o glicogenio atúa
de maneira excepcional, ocasionando, já na dose de 5 mg per quilo, uma plaqueto-
penia de cerca de 90^^, minutos após a injet^âo intravenosa em coelho.

Pareceu-nos importante, do ponto de vista de elucidação do mecanismo do
fenômeno de Shwartzman, verificar se tal reação podia ser desencadeada pela
injeção intravenosa de glicogenio, tanto mais quanto, alem dos filtrados bacteria-
nos e dos piecipitados especificos, somente se lograra observar o desencadeamento
daquele fenômeno por meio de suspensões de agar (Sickles, 1931) ou de amido
solúvel (Freuxd & Hosmer, 1935).

PARTE EXPERIMENTAL

Coelhos brancos depilados na véspera, ao nivel da região abdominal, foram
injetados intradèrmicamente com 0.25 ml de “agar washings” de culturas de
meningococo de 24 horas cm agar-sangue (adição de 10 ml de água fisiológica
fenicada a 0.4% a cada garrafa de Roux de cultura, centrifugação enérgica).

24 horas após a preparação intradérmica, procedeu-se à injeção intravenosa
desencadeante de extrato meningocócico (controle), bem como dc quantidades
variáveis de glicogenio (de 10 a 300 mg per quilo).

O glicogénio usado (1) foi extraido de figado e purificado por precipitações
sucessiras com álcool ; dissolvido na proporção de 25% cm água distilada, a quente,
prodiu uma solução quase perfeita, apenas com ligeira opalescénda.

(1) CentilBcste ctiÍi4o p«U> Di. M. Rocva %. StLTA« de lD»tituto de S. Paulo, a quem

aproveitamoa a oportuaidade para acradcccr.

1

34

>[emórías do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Os resultados de uma série típica de experiências vêm resumidos na tabela 1.

Tabela 1

Incidência da reação hemorrágica de SktcartjnnaH em coelhos pref^rados com extrato
sneningocócico após injeção do mesmo extrato ou de quantidades variáveis de glicogêmo.

Coelho X.»

Sobstincia desencadeante

Intensidade
da reaçio
bemorrifica

Tempo de
aparecimento
da reaçio

horas

191

Extrato meningo, Iml/kg

-H-H-

3

172

• »

-H-H-

3

121

Glicogênio, 300 mg/kg

■f ; : 1

3

194

ft

— r-H-

1

232

•1

4-H-h

1

l&l

Glicogênio, 100 mg/kg

‘-H-f

1

178

«*

-H-H-

1

218

• *

'H i •

1

201

Glicogênio, 30 mg/kg

.-H-H-

1

163

**

-H-H-

1

189

ê$

—

—

143

Glicogênio, 10 mg/kg

-

—

50

$i

—

—

123

$$

—

-

DISCUSSÃO

Pode-se ver na tabela 1 que em dose superior a 100 mg por quilo o glico-
•gcnio desencadeou rapidamente (dentro de 1 hora) forte reação hemorrágica em
:100^ dos .coelhos preparados de véspera mediante a injeção de 0.25 ml de extrato
meningocócico. Na dose de 30 mg/kg houve forte reação hemorrágica, também
.dentro de 1 hora, em 2 de 3 coelhos experimentados, ao passo que com 10 mg, o
resultado foi sempre negativo.

A potência desencadeante do glicogênio parece ser mais intensa do que
.a verificada por Freum> & Hosmer com o amido solúvel que, na dose de 1 g
(para cçelhos de 1 a 3 quilos), só produz lOOÇó de reações positivas nos coelhos

Orro G. Bier & Jandyrk P. do Amar.\l — Desencadeamento do fenô-
meno de Shwarizman em coeihos 35

de pêso superior a 2 quilos, sendo geralmente negativos os resultados obtidos nos
animais de pêso compreendido entre 1 e 2 quilos.

Fic. I

NecrcMc bcmorrâcica íoIcdm c«n coelho preparado
aediante a iajeçâo totradênaica de 0^5 ml de
eatraio meaingoeócko, 48 horas apôs a injeção
deameadeaate de 100 ipk de flieocénio por qail^

Em nossas e.xpcricncias usamos sempre coelhos de cerca dc 1 500 g, nos quais
obtivemos pràticamcnte 100% dc reações dc Shwartzman intensa c ràpidamcntc
positix^as, ate com 30 mg/kg de glicogênio. .X correlação entre a idade tio coelho
e a cai>acidade de reagir verificada por Frecxd & Hosmer jwra o amido não se
obsci^-a, pois, no caso do glicogênio. Possivelmente a ação plaquetoj>ênica do
glicogênio, sendo superior à do amido, independe de fatores relacionados com a
idade do animal.

COXCLUS.^O

O fenômeno de Shwartzman jKwIe ser desencadeado com impressionante
rapidez e intensidade em coelhos prejarados pela injeção intradcmiica de extrato
mcningocócico, mediante a injeção venosa de pequenas doses de glicogênio (ate
30 mg per quilo). É altamente sugcsti\-a a hipótese de que tal efeito provocado
quer pelo glicogênio, quer pelo amido, deva ser atribuido à intensa ação plaque-
topênica das referidas substâncias.

3

3G

Memórias cio Instituto Butantan

Tomo XVIII

ABSTRACT

The intrcxluction of glycogen into the blood stream of rabbits led to the
development of rapid and severe hemorrhagiç necrosís in the skin at the site of
injection of meningococxus extract.

The reacting potenc)- of glycogen is verj* high (even 30 mg/kg produced
intense hemorrhages in 2 of 3 rabbits) and the frequency of reactions did not
var)’ with the weight of the rabbits.

The hypothesis that this action of glycogen (and also of starch) may be due
to a decrease of the circulating platelets is highly suggestive and deser\es further
speculation.

BIBLIOGRAFIA

1. Rocha e Siliv, ^í., Grana, A. & Porto. A. (1945). Inhibitoiy Effcct of Glycogen

upon Anaphylactic Shock in the Rabbit. Proc. Soe. exp. biol. and mcd., 59,
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of Toxins after intrarcnous Injectkm of Starch in young and adult Rabbits. Joum.
Immunol., 29, 279-283.

(Rcctbido para publicação cin abril de 1945).

4

SciELO,

11 12 13 14

ESTUDOS SÔBRE A QUIMIOTERAPIA DA INFECÇÃO MENINGO-
CÓCICA EXPERIMENTAL DO CAMUNDONGO; DERIVADOS AMI-
NADOS DA DIFENILSULFONA E SUBSTANCIAS ANTIBIÓTICAS
DE ORIGEM MICROBIANA (PENICILINA E PIOCIANINA)

roR

E. BIOCCA, J. P. DO AMARAL & OTTO G. BIER
(Do Laboratório de Bacteriologia, Instituto Bntantan, São Paulo, Brasil)

Numerosos são os trabalhos que versam sôbre a ação da sulfanilamida e seus
deri\-ados nas infecções meningocócicas humana e experimental. De particular
importância, no tratamento das meningites humanas, c que a droga atinja no
liquor uma concentração terapeuticamente suficiente, destacando-se por esta pro-
priedade, aliada a uma ação bacteriostática intensa, a sulfadia 2 Ína.

O uso associado das sulfas ao sõro específico é também assinalado como
particularmente eficaz.

Com o intuito de encontrar agentes terapêuticos mais \'antajosos do que os
atualmente conhecidos, procedemos a algumas experiências na infecção meningo-
cócea e.xpcrimental em camundongos, nas quais ensaiamos comparati\'amente a
atividade quimioterápica de seis deri\'ados aminados da difenilsulfona, liem como
de duas substâncias antibióticas produzidas por microorganismos (penicilina e
piocianina).

No que concerne às sulfonas, embora a 4-4’-diamino-difeniIsulfona tenha sido
sintetizada em 1908 por From e Wittmann', só em 1937 foi ela experimentada em
proras quimioterápicas por Bcttle e colaboradores.

Logo a seguir foram ensaiados o de^i^'ado diacetilico (Rodilone), por
Fourxeau e colaboradores (1937), e o formil-derivado (Formilone), por Nim,
Bo\-et e Hamox, em 1938.

Recentes estudos na quimioterapia da tuberculose vieram focalizar a impor-
tância de certas sulfonas, tais como o Promin c o Diasone, que são derivados de
bases de Schiff, pois provém da reação do grupo aminico da sulfona com aldeídos.

Uma série de novos derivados da 4-nitro-4'-amino-difenilsulfona foi sinteti-
zada por Mixgoja (4), sendo tais produtos ensaiados por um de nós (5) na
toxoplasmose experimental e, menos extensi\'amente, na infecção pneumocócica
do camundongo. Observámos, em tais ensaios, que os deris^ados contendo um H

1

SciELO)

14

38

>(enióría5 do Instituto Butantan

Tomo XVHI

amínico substituído por um radical alifático possuíam elevado ralor quimioterápico,
aliado a uma toxidez relativamente baixa- Dentre os produtos estudados, os
ma's ativos foram os acil-derivados, que possuíam o menor número de átomos
de C na cadeia lateral e, portanto, entre êles, o formil-derivado.

Nas experiências referidas no presente trabalho, propuzemo-nos a verificar:
1) si os derivados da série 4-4’-diamino-difenilsulfona eram mais ou menos ativos
do que os correspondentes da série 4-nitro-4’-amino-difenilsulfona; 2) si também
na infecção meningocócica o formil-derivado era mais ativo do que o acetil-
deri\’ado, que possui um átomo de C a mais na cadeia lateral; 3) qual a atividade
antimeningocócica do derivado tricloracetilico da 4-4’-diamino-difenilsulfona.

Quanto aos agentes bioquimioterápicos, possui a penicilina, no tratamento
das meningites, uma decidida vantagem sôbre a maioria dos derivados sulfani-
lamidicos e sulfônicos, que é a de poder ser introduzida dirctamente no canal
raqueano. A rápida eliminação que o organismo faz déste produto, não representa
um inconveniente ponderável, em infecções de decurso tão rápido como as menin-
gocócicas. Observações recentes (6) evidenciam a atividade antimeningocócica da
penicilina na infecção experimental do camundongo. Nosso objetivo foi o de
controlar estas pesquisas, usando diferentes amostras de meningococos e quan-
tidades variáveis de penicilina.

A piocianina, o pigmento azul da P. aeruginosa, apesar de muito bem conhe-
cida sob o ponto de vista químico (N-metil-a-hidroxifenazina) tem sido pouco
estudada sob o ponto de vista da sua atividade in vivo, não sendo de nosso conhe-
cimento qualquer trabalho relacionado com o ensaio de sua atividade quimioterápica
na infecção meningocócica experimental.

MATERIAL E MÉTODOS

Sulfonas — Das sulfonas ensaiadas quatro eram derivados da 4-4’-diamino-
difenilsulfona (formil, acetil e tricloracetil-derivados, Diasone) e dois o eram da
4-nitro-4’-aminodifenilsulfona (formil e acetilderivados).

Substâncias antibióticas — Foi usada a penicilina seca e-xistente no comércio
para uso terapêutico, proveniente dos Laboratórios Parke, Da>ns & Co., de Detroit,
Mich. Dissolvido o produto em água distilada esteril, foi o seu titulo (em uni-
dades Oxford) reverificado, pelo método usual.

A piocianina empregada foi purificada por recristalizações sucessivas, ten-
do-sc a precaução de não expô-la excessiramente à luz depois de dissolvida, por
se tratar de uma substância fotoquímicamente sensível.

E. Biocca, J. P. do Amar.\l Jt Otto G. Bieh — Estudos sôbrc a quimio-
terapia da infecção meningocócica 39

Técnica — A infecção experimental dos camundongos foi feita com diferen-
tes amostras de meningococos da coleção do Instituto Butantan, usando-se sus-
pensões em mucina, de acordo com a técnica já conhecida.

O ensaio quimioterápico foi precedido da determinação da virulência da
cultura de meningococo utilizada, sendo cada experiência acompanhada pelos indis-
pensáveis controles, injetados com o mesmo número de D.L.M. que os animais
tratados.

A obsers*açãc dos camundongos foi feha durante quatro dias, considerando-se
como não protegidos todos os mortos antes do 5.® dia da infecção e tomando-se
em consideração apenas as provas, nas quais todos os controles morreram dentro
daquele prazo.

As sulfonas (e a sulfanilamida incluida para comparação) foram injetadas
sob a forma de suspensão oleosa a 2.5^; a penicilina e a piocianina, em solução
aquosa. EHias a três horas antes da injeção infetante, os camundongos (20 g. ±
lO^í») receberam subeutaneamente 0.5 cm^ da suspensão oleosa da droga em exame.
A suspensão de meningococos em mucina foi injetada por via intraperitoneal, na
quantidade correspondente ao número de D.L.M. desejado.

Quanto às diluições de penicilina, foram injetadas nas quantidades e segundo
as modalidades indicadas na tabela 2.

RESULTADOS

As tabelas 1 e 2 resumem os resultados das e.\pericncias realizadas.

Tabela 1

Acõo de diferentes sulfonas na infecção tneningocõcica experimental do camundongo.

DROGA

MEXI.NGOCOCO 39 TIPO III
1-10 DLM 10-100 DLM 100-1000 DLM

XH.CO.H

\/

SO,

FORMILOXE

8/8

1/4

XH.CO.CHj

XH-CO-CCIj

/\

\/

SO,

RODILOXE

T/8

4/8

0/4

XO,

SO,

XH.CO.CHj

/\

\/

ACETIL D

5/8

1/8

1/4

I I

\/

SO, XH,

SULFANHLAMIDA

3/8

2/8

2/-1

COXTROLES

0/16 0/8

0/8

O numerador indica o número de lobreriTentea e o denominador o total de animaii inoculadoa.

cm

2 3 4

5 6 7SCÍELO, ;l1 12 13 14 15 16 17

E. Biocc\, J. P. DO Amaral & Orro G. Bieb — Estudos sobre a quimio-
terapia da infecção meningocócica 41

Tabeu 2

PmUilinotfra^ da infecção meninçocàetca experimental no camundongo.

Dote e Bâdo <Sc administr»^
da penicilina

Mctünco 33

Tipo n

MO DLM

Me&iseo 27
Tipo IV

MO DLM

MeninfO 39
Tipo III

MO DLM

Meninco 17
Tipo I

MO DLM

Dose única de 100 u. O.
2 horas após a infec-
ção: tota! — 100 a O.

3/4

1/4

4/4

2/4

Duas doses de 100 u. O.,
2 e 4 horas após a in-
fecção: total — 200U.O.

4/4

4/4

4/4

3/4

Quatro doses de 100 u.0.,
2. 4. 6 e 8 horas após
a iidecção: total —
400 u. O

4/4

4/4

3/4

4/4

CONTROLES

0/4

0/4

0/4

0/4

Em três series de e-xpericncias feitas com a piocianina em relação às raças
M 39 e M 52 \*cri ficou-se ação protetora praticamente nula.

CO.MEXTARIOS

Como se pode facilmente verificar na Tabela 1, há uma evidente diferença
entre os resultados obtidos quando a infecção ê feita com poucas doses minimas
letais de meningococos (1 - 10 e 10 - 100) ou com um número ele\-ado
(100 - 1000). Xo primeiro caso é possivel obter uma proteção bem evidente com
várias sulfonas, o que permite, de certa maneira, fazer confrontos das diferentes
atis-idades terapêuticas; no segundo caso, ao contrário, a proteção ê nula ou
irregular.

Fazendo um paralelo da ação dos deri\'ados da 4-4’-diamino-difenilsulfona
com a dos dcri\'ados da 4-nitro-4’-amino-difcnilsulfona, parece evidente, no con-
junto das provas, uma ação mais eficaz dos primeiros na infecção meningocócica
do camundongo.

.Analogamente quanto foi observado na terapêutica da infecção toxoplas-
mica, o formil-derivado parece provido de atividade superior à do acetil-derivado
correspondente, que possui um átomo de carbono a mais na cadeia lateral.

O Diasone, deri\-ado aldeidico, possui um valor anti-meningocócico apro.xi-
madamente correspondente ao do Formilone, derirado acilico. (Usando grande
número de DLM, os resultados irregulares obtidos em repetidas e-xperiências não
permitiram concluir si a atividade do Diasone ê ou não sujierior á do Formilone.)

42

Memdrías do Instituto Butantan

Tomo XVIII

O Diclorone, como salientámos, é um derirado da 4-4’-diamino-difenilsul{ona
com o radical tricloroacetilico.

Êste radical halogenado, já assinalado por Bergmaxx e colaboradores (7)
como particularmente interessante nas pesquisas sôbre quimioterapia contra germes
alcool-ácido resistentes, encontra-se, no Diclorone, junto com um radical sulfônico,
o radical mais ativo até agora conhecido na infecção tuberculosa. Como se pode
observar, a substituição de três átomos de H do grupo acetilico do Rodilone, por
três átomos de Cl, não modificou sensivelmente a atividade anti-meningocócica
do produto.

Elntre os antibióticos de origem microbiana estudados, a piocianina mos-
trou-se praticamente inatira na proteção dos camundongos contra a infecção
meningocócica, mesmo quando usada em doses bastante elevadas (próximas das
doses tóxicas) e repetindo muitas vezes as injeções.

sumario

São relatadas pesquisas sóbre a ação protetora de seis derivados da difenil-
sulfona e de duas substâncias antibióticas de origem microbiana (penicilina e
piocianina) na infecção meningocócica experimental do camundongo.

Os resultados das experiências foram demonstrativos somente quando a
infecção se fez com um número limitado de D.L.M. (1 - ICO). Observou-se,
nestas condições, que todos os derivados da difenilsulfona possuem ação protetora
anli-meningocócica ín vivo mais intensa para os derirados da 4-4’-diamino-difenil-
sulfona do que para os da 4-nitro-4’-amino-difemlsulfona. Dentre os produtos
mais ativos, salienta-se o formil-dcrivado da 4-4’-diamino-difenilsulfona, já assi-
nalado em pesquisas anteriores. O tricloroacetil derivado da mesma série, de
particular interesse em pesquisas de quimioterapia antituberculosa, manifestou
também clara ação anti-meningocódea.

.\ piocianina, substância antibiótica de origem microbiana, resultou inatira,
enquanto que a penicilina, confirmando trabalhos precedentes de outros, mostrou
acentuado poder anti-meningocócico.

ABSTRACT

The paper deals with the study of the protective value of six diphenylsulfone
deriratives and of two antibiotic substances (penidllin and pyocyanin) in menin-
gococcus infection in mice.

VACINAÇÃO T.A.B.

FORMAÇÃO DE AGLUTININA “O” NO HOMEM PELO EMPRÊGO
, DE VACINA FORMOLADA

POR

L. NOGUEIRA CARRIJO. C. D. AVILA PIRES & CELSO BRANDÃO

(Do Laboratório de Imunologia do Inslilulo Butanian, São Paulo, Brasil)

Em trabalhos anteriores foi estudado o emprego das vias sul)cutânea e
intradcrmica para a vacinação antitííica, usando-se uma \-acina T.A.B., morta
pelo formol e adicionada de ácido fcnico como presci^-ativo (1 e 2). O resul-
tado obtido foi de todo inesp)erado, revelando-se o produto incapaz de induzir a
formação de aglutinina "O” nos individuos \'acinados, por qualquer das vias.

Resultados semelhantes, é certo, já haviam sido obtidos anteriormente, com
outros tipos de vacina, por diferentes pesquisadores (3 a 8). Entretanto, a suces-
são de numerosos trabalhos ^•eio demonstrar, de maneira exaustiva, que as vacinas
antitificas podem e devem induzir a formação de aglutinina "0” (9 a 18). Êsses
resultados foram ampliados pela experimentação posterior com endotoxóides e
vacinas "Vi” (19 a 24).

Outros pesquisadores, que haviam inicialmente tido resultados negativos,
obtiveram-nos posteriormente positivos, atribuindo aqueles a deficiências, de diver-
sa natureza, do produto utilizado (25).

importância do antigeno “O” para a virulência bacteriana. o seu valor
como agente imunizante e a conveniência de mantê-lo o mais possivelmente in-
tegro. numa \’acina antitifka, parecem estar perfeitamente estabelecidos (26 a 30),
O seu papel nem mesmo foi diminuido pelos trabalhos mais recentes, de Felix
e Prrr (31 e 32), que resultaram na descoberta do antigeno “\’i”, princijxil
responsável pela virulência do bacilo tifico. Apenas foi melhor delimitado, fi-
cando evidenciado ser de natureza essencialmente tóxica, representando a en-
dotoxina bacteriana, aliás, fator indispensável da virulência.

SciELO

3 11 12 13 14

4G

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Fomos, assim, le\’ados a realizar a presente investigação, visando elucidar
a causa da deficiência verificada no produto usado anteriormente (1 e 2). Con-
siderando que os cuidados dispensados ao seu preparo garantem a presença do
antigeno, em concentração suficiente, na suspensão bacteriana inicial, a sua
ausência, no produto final, seria devida, proràvelmente, à incidência posterior
de qualquer causa alterante. Esta poderia ser:

a) uma ação lesiva, desnaturante, do formol usado para matar e desinto-
xicar as suspensões bacterianas;

b) uma ação semelhante do fenol, empregado como preservativo do pro-
duto, ou, finalmente,

c) conseqüência do envelhecimento exagerado da ^-acina.

A elucidação dêstes itens constitui o objeto da presente comunicação.

MATERIAL E MÉTODOS

Usamos várias \-acinas formoladas, obedecendo todas aos principios gerais
seguidos no preparo do produto utilizado anteriormente (1 e 2). As diferen-
ças necessárias ao nosso experimento resumiram-sc à adição ou não de preser-
vativo (fenol a 0.25%) e ao envelhecimento maior ou menor do produto. Fo-
ram usadas as seguintes >’acinas, todas conservadas a 5°C até o momento
do uso :

VACINA I — Formolada, sem preservati%-o e de preparo recente — 3 meses;

VACINA II — Formolada, sem preservativo e envelhecida — 18 mêses;

N'.\CIN.\ III — Formolada, fenolada e de preparo recente — 4 mêses, sendo que um mês
sem fenol;

V.\CIN.\ IV — Formolada, fenolada e envelhecida — 19 mêses, sendo seis mêses sem e
13 com fenol;

VACINA V Formolada, fenohda e envelhecida — 21 mêses, sendo 14 sem e 7 com
fenol;

\'ACINA VI — Morta e preserrada pelo sublimado a 1 :S.000, segundo BArros & Buca-
CKABPi (33). De preparo recente — 3 mêses e usada coroo controle.

As vacinações foram feitas em 319 indivíduos, em sua quase totalidade de-
tentos recolhidos à Penitenciária do Estado, onde é obrigatória a vacinação
T.A.B. (*). Tratava-se de indivíduos em ótimo estado de saúde e nutrição,

(*) Agradecemos ao Prof. Flaminio Favero, Diretor da Penitenciária do Estado, todas
as facilidades que nos foram concedidas.

L. Nogueir.\ CvRRiJO. C D. Avila Pires Celso Brandão — Vacinação

T.A.B. — Formação de aglutinina "O” no homem 47

a maioria dos quais já havia sido \-acinada anteriormente, há dois anos ou mais,
com vacina formolada-fenolada de outra procedência.

As técnicas utilizadas para o preparo do antigeno (alcoólico) e e.\ecução
das pro%'as de aglutinação foram as mesmas usadas anteriormente (1 e 2).

A \-acinaçâo foi feita pelas vias intradérm!ca e subcutânea. .As doses, sem-
pre intercaladas de uma semana, foram de 0.10 — 0.15 e 0.20 ml no primeiro
caso e de 0.5 — 1.0 e 1.5 ml no segundo. A pesquisa de aglutininas foi feita
no sôro obtido imediatamente antes da primeira dose e uma semana após a
terceira.

RESULTADO E DISCUSSÃO

A distribuição percentual do titulo de aglutinina “O”, antes e depois da
s'acinação, consta do quadro da página seguinte.

.A sua simples inspeção basta para dar uma ideia bem nitida da ação lesi\'a
do fenol sóbre o antigeno “O”.

Mais demonstratis^a, contudo, é a análise do gráfico que representa o titu-
lo medio de aglutininas. \'erifica-se, ao analisá-lo, que a \'acina I provocou
aumento de 9.4 vezes do titulo médio de aglutinina “O”. Tratava-se de uma
vacina formolada, sem preseiA^ativo e de preparo recente. A \acina II, tam-
bém formolada e sem preser\-ativo, jwrém envelhecida — 18 meses, ainda foi
capaz de induzir um aumento de 6.3 vezes do titulo médio, o que revela uma
ação desnaturante quase nula do formol, porquanto a alteração havida pode
ser imputada apenas ao envelhecimento.

A ação lesi^-a do feno] começa a ser evidenciada na vacina III. .Ainda
que o seu preparo seja recente — 4 méscs, foi bastante um contato de 3 méses
com o preservativo para que o seu v^alor antigênico sofresse uma luixa quase
igual à ocasionada pelo envelhecimento de 18 méscs da \-acina II: — aumento
do titulo médio de 6.3 vezes nesta e de 6.2 naquela. Mais se evidencia tal
ação desnaturante quando o contato do preservativo com o produto é prolon-
gado de muitos méscs. Assim é que na vacina I\', cm que o fenol exerceu
a sua ação durante 13 méses, o titulo medio tomou-se apenas 2.6 vezes mais
elevado, enquanto que. na vacina onde a sua ação se exerceu sòmcntc 7 mé-
zes maior, o titulo medio aumentou de 4.5 vezes. Não deixa de ser, a seu turno,
bem nitido o maior efeito lesivo ocasionado por 7 méses de contato com o feno!
(vacina \’) quando comparado com o devido a apenas 3 méscs da ação (va-
cina III) desse preservativo.

Por outro lado, é interessante notar que o sublimado, u.sado para o pre-
paro c preservação da vacina de contrólc (VI), denotou ser tão lesivo para o

SciELO)

3

48

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

antigeno “O” como o fenol. Realmente, datando o preparo dessa \-acina de
apenas 3 mêses, o tempo de ação do sublimado, nesse caso, foi igual ao do fe-
nol no caso da s-acina III, sendo o aumento do titulo aglutinante médio —
6.7 vezes, observado em seguida à injeção da primeira, pràticamente o mesmo
que o resultante do emprego da última, o que revela uma acentuada inferiori-
dade antigênica da vacina controle em relação à s-acina I. Toma-se interessan-
te salientar êste fato em virtude de ser o sublimado inócuo para o antigeno "Vi”
e aconselhado para o preparo dêsse tipo de vacinas (34).

título medio de aolutinina ‘©"antes e depois da
VACINAÇÃO COM DIFERENTES VACINAS T. A. B.

ANTES

VACINA I FormoUcU, •em presenratÍTo e d« preparo recente — 3 mèfCf

VACINA II — Forroolada, tem pre«ereatÍTO e enrelbecida — 18 »ê«e%

VACINA III — FomoUda, fenolada e de preparo recente. Aç^ do fenol — S meies
VACINA IV — Fonnoiada* fenolada e enTeIbcctda. Açio do fenol 13 mê»es

VACINA V Formotada, fenolada e enrethecida. Açio do fenol — 7 inéies

VACINA VI — SuUtmado. Preparo recente — 3 aèses.

Os nossos resultados, além de confirmarem os de Spasskv e Darrenfeld,
demonstrando não haver qualquer ação desnaturante do formol sóbre o antíge-
no “O”, ainda ampliam os de Dennis e Berberian (em relação ao sublimado),
que constataram a superioridade imunogénica “O” das \-acinas fomioladas (re-
centes e sem preservativo), quando comparadas com várias outras (35 e 36).

XOGlEIR.\ CORRIJO. C D.

T.A.B.

Avila Pires A Ceeso Brandão —
— Formação de aglutinina “O”

Vacinação
no homem

49

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5

I I 'SciELO

15

50

Memórías do Instituto Butantan

Tomo XVIII

A ação lesiva do fenol era, de há muito, conhecida (37). Sôbre as \-acinas
mortas pelo calor o sçu poder desnaturante parece ser mais intenso (25). Isto
talvez seja devido a uma ação protetora exercida pelo formol. Realmente, o
emprego desse agente parece ocasionar lun enrijedmento do corpo bacteriano,
tomando-o muito resistente à ação posterior de numerosos agentes lesivos (38).

Aliás, ésse enrijedmento da bactéria, dificultando a sua reabsorção pelo or-
ganismo, parece explicar a ação menos tóxica das anavacinas quando inoculadas
subcutáneamente. Tal hipótese foi formulada por Pfeifer, segundo relata
Pattaxée (38). De fato, as endotoxinas das bactérias Gran-negati\‘as, que
são de natureza glúcido-lipidica não são desinto-xicadas pelo formol, o que che-
ga a constituir, segundo Boivin, um caráter distintivo das mesmas em relação
ás toxinas verdadeiras, cuja natureza é protéica (39).

Realmente, usando a via peritoneal para inoculação, em experiências não
publicadas, não logramos observar qualquer diminuição da toxidez de uma ana-
vacina tifica, quando comparada à de uma \-acina morta pelo calor, proveniente
da mesma partida e contendo o mesmo número de germes por ml. .A dose mi-
nima mortal foi a mesma ainda depois de 30 dias de desintoxicação a 37°C,
tanto para o camondongo como para a cobaia. Tal resultado confirma a su-
gestão de que a aparente desintoxicação das anavacinas esteja apenas ligada a
uma maior dificuldade de reabsorção pelo organismo, quando dada subcutânea-
mente. O enrijecimento da bactéria se processa rapidamente, em poucos mi-
nutos, dispensando a prolongada desintoxicação a 37°C, de várias semanas, co-
mumente usada, o que favorece um rápido preparo, em beneficio de uma esto-
cagem menos prolongada. .-Miás. .-\LrvisATOS. quem primeiro usou a anava-
cina tifica em larga escala, prolongava a desintoxicação apenas por 6 horas, neu-
tralizando em seguida o e.xcesso de formol (40).

Finalmente, deve ser salientado o fato de terem sido usadas, concomitante-
mente, as vias subcutâneas e intradérmica (41), para todas as vacinas experi-
mentadas nêste trabalo.

Xenhuma diferença significativa foi verificada no comportamento das mes-
mas, do ponto de vista da produção de aglutinina “O” para a E. typhosa.

SUMARIO

1 . O titulo de aglutinina "O” para o bacilo tifico foi determinado no sóro de
319 detentos da Penitenciária do Estado, antes e depois de v-acinados.

2. A vacinação foi feita com seis diferentes vacinas T.A.B., tendo sido usa-
das as vias subcutânea e intradérmica para todas elas.

3. .As vacinas, todas consen-adas a 5°C até o momento do uso, foram
as seguintes :

L. Nocleir.\ Cawujo, C. D. Avila Pires Jt Celso Brandão — Vacinação

T.A.B. — Formação de aglutinina “O” no boraem õl

a) Duas s-acinas formoladas, sendo uma de preparo recente e a outra
envelhecida de 18 meses.

b) Três A-acinas formoladas e fenoladas, que permaneceram sob a ação
do fenol, respecti\-amente, 3, 7 e 13 meses.

c) sexta \-acina, morta e presei^-ada pelo HgCIj, usada como controle.

4. Os resultados obtidos indicam que o formol não exerce qualquer ação le-
six^a sóbre o antigeno “O” do bacilo tifico, pelo menos quanto à sua ca-
pacidade de induzir, nos indivíduos >-acinados, a produção de aglutininas.

5. .A ação desnaturante, le\-ida ao envelhecimento, c muito pequena nas vaci-
nas formoladas não adicionadas do preservativo.

6. O fenol, geralmente empregado como preser^^ativo, é altamente lesivo para
o antigeno “O” do bacilo tifico.

7. O sublimado exerce ação tão fortemente lesiva como o fenol.

8. O comportamento das vias subcutânea e intradcrmica, quanto à produção
de aglutininas, foi idêntico.

.ABSTRACT

1 . The titer of E. typhosa “O" agglutinins has been determined on sera secured
from 319 inmates of the State prison, before and after \-accination.

2. Subcutaneous and intradermal vaednation has been carried out with six
diffcrent T.A.B. vaccines.

3. The vaccines, kept at 5®C until just before use, wcre the following:

a) two formol “killed” vaccines, one of rccent preparation and the other
aged for 18 months.

b) three formol “killed” and phenol "preser^xd” vaccines aged respcc-
tively 3, 7 and 13 months.

c) one Hglj “killed” and "preserved”, used as control

4. The results seem to indicate that the formol does not denatures the E.
typhosa "O” antigen. at least to the extend so as to interfere with “O”
agglutinins prodixrtion in the %*accinated indidduals.

5. Only slight denaturation oceurs on aging by formol “killed” vaccines
without “preservative”.

6. Phenol, generally emplo)-ed as a “preseni-ative” has a pronounced denaturing
action on £. typhosa “O” antigen.

7. The action of HgCI* may be compared with that of phenol.

52

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

8. Xo diíference ín the effectiveness of agglutinin production could be obsers-ed
bv either route: subcutaneous or intradennallv.

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(Kecebido para pnblicaçSo em d e x emhr o de 1944).

HEMOGLOBINA DOS OFÍDIOS — VALORES NORMAIS E PRE-
SENÇA DE UMA FORMA INATIVA NO SANGUE DA -
BOTUROPS JARARACA (*)

POR

J. LELAL PRADO

(Do Ijtboralórío de Endocrínologia do Instituto Butontan, São Paulo, Brasil)

No decurso de experiências sôbre a regulação da glicemia dos ofídios, surgiu
a necessidade de saber si o sangue obtido por secção de pequeno segmento da
cauda, dada a possível diluição pelo líquido intersticial, teria a sua composição
modificada. A determinação da hemoglobina no mesmo animal, em sangue colhido
daquela maneira, comparada com a determinação em sangue obtido diretanicnte
de um vaso responderia àquela pergunta, Porteriormente, considerando a pobreza
da literatura a respeito e o interesse despertado pelas primeiras determinações,
fui levado a estudar melhor o assunto.

No presente trabalho, escolho um método para a determinação da hemoglo-
bina nos ofídios, apresento os resultados obtidos, mostrando, além disso, a exis-
tência de uma quantidade apreciável de hemoglobina inativa (não combinável ao
oxigênio) no sangue destes vertebrados.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram empregados exemplares adultos de Bothrops jararaca e de Phüodryas
sp., recém-chegados ao serpentário dêste Instituto e ainda não usados até o momento
para qualquer outro fim. Somente os animais aparentemente em boas condições
de saúde foram utilizados.

A colheita do sangue foi feita na cauda ou na aorta abdominal.

a) Na cauda. Depois de bem la^-ada corta-se, com tesoura forte, um segmento
da cauda, de 3-4 mm de diâmetro na superfície de corte. G)m o aninul em
posição vertical, cabeça para dma, o sangue goteja facilmente. Terminada

(*) Êste üabalho fot poMsbfliudo, em parte, graças à benemerência dos drs. A. Alvu
F n.no e A. Rnzno Lima, por intermédio dos Fundos Universitirios de Pes<iuisas.

Tomo XVIII

56 Memórias do Instituto Butantan —

a colheita, inverte-se a posição do animal e estanca-se a hemorragia colocan-
do-se uma gôta de percloreto de ferro mais ou menos a 30 por cento na
superficie de corte.

b) A’o aorta. Fixado o animal numa prancha de cortiça, faz-se uma incisão
^ntral na união do terço posterior com o terço médio do animal e a aorta.
Ixm isolada, é alçada com um fio de linha e puncionada introduzindo-se a
agulha contra a direção da corrente sanguínea. O sangue é colocado em tubos
contendo oxalato de potássio na diluição final de 0.2 g por cento.

Foram empregados os seguintes métodos para a determinação da hemoglo-
bina:

1. Hematina ácida; método de Cohex & Smitii (1919).

2. Hematina alcalina; modificação de Wu (1922) da hematina ácida de Cohex
& Smitii.

3. Capacidade de fixação do oxigênio: Vax Slvke & St.adie (1921). O
nosso aparelho é agitado a motor e o periodo de extração dos gases foi
sempre de 10 minutos.

4. Determinação do ferro (do sangue ou da hemoglobina). Foi usado o método
de PoxDER (1942 a), modificação ligeira do Woxe original, empregando-
se 1 ml de sangue de jararaca ou a quantidade correspondente da hemo-
globina pulverizada e sêca. Em determinações anteriores, mesmo com os
tempos recomendados por Poxder, obtive alguns filtrados corados e tui^-os.
Êste inconveniente foi afastado após adotar como rotina a técnica de deixar
ficar o material de um dia para o outro depois da junção da solução saturada
de pcrsulfato de potássio.

ESCOLH.-\ DO MÉTODO

Foi tentado, de início, o método da hematina ácida pela facilidade de execu-
ção, mas como a diluição do sangue de cobra em HCl 0.1 N dá sempre uma
solução muito turva para a colorimetria,íoi abandonado o processo. Entretanto,
a alcalinização desta solução ácida, turva, com um décimo do volume de XaOH a
10 por cento, dá uma solução limpida, de tonalidade esverdeada, aparentemente
utilizável para a colorimetria. O emprego do método da hematina alcalina pare-
cia, pois, satisfatório. Para testar a sua precisão na determinação da hemoglo-
bina do sangue dos ofidios foi feita, preliminarmente, uma série de determinações
da hemoglobina, no mesmo sangue, pela capacidade fixadora de o.xigênio, tomada
como padrão e pelo processo da hematina alcalina (Tabela I). .As diferenças,
grandes e variáveis, observadas na quase totalidade dos casos e, sobretudo, o fato

J. Ltu, Pr\do — Valores normais e presença de uma forma inativa no

sangue da Bothrops jararaca. 57

dos valores serem quase sempre mais altos com a hematina alcalina, fizeram-me
pensar na existência de uma quantidade variável de hemoglobina inativa (não
combinável ao oxigênio) no sangue dêstes ofídios, uma vez que o fato já tinha
sido assinalado por Ammuxdsex (1939, 1941), para o sangue humano normal.
Esta possibilidade da presença de hemc^lobina inatis-a afastou, logo de inicio, o
emprêgo da capacidade de oxigênio como método de rotina, ou mesmo como método
padrão de comparação.

TABE1.A I

Hemoglobina do sangue de jararacas. Determinofões comparalkas
feia cofacidade de oxigênio e pela hemaiina alcalina

a»

IIS 1 %
Casxcidade

Hb t%
lIcmatinA

Dilrmica

%

1

4.8

5.1

1

6.2

O

6.6

6.6

0.0

3

5.0

5.1

-1-

2.0

4

4.7

5.1

+

8.5

5

5 1

4.9

—

3.9

C

5.0

5.9

+

18.0

7

3.8

4.2

-J-

10.5

8

4 2

4.2

0.0

0

7.2

7.7

+

6.0

10

5.7

5.9

+

3.5

11

5.8

6.3

+

8.6

12

8.7

9.4

+

8.0

13

6.0

6.1

O.

1.7

14

6.7

7.0

-r

4.5

15

6.1

6.5

-r

6.6

16

7.6

8.2

T

7.9

17

4.8

5.7

O.

1

18.8

O método da hematina alcalina foi, então, comparado com a dosagem do
ferro do sangue. A concordância precária entre os dois processos, (Tabela II)
tomada naturalniente a dosagem do ferro como a mais precisa, levou-me ao aban-
dono definitis-o do método da hematina alcalina. Apesar do elogio ao último
método feito recentemente por Clecg & Kixc (1942), observei que na determi-
nação das hemoglobinas da jararaca e do cão (Prado, 1944) os valores encontra-

3

58

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

dos não concordaram com os obtidos pela dosagem do ferro total. Aliás é êste o
resultado a que chegou Pondek (1942 b), trabalhando com sangue humano.

Tabela II

Hemoglobina do sangue de jararacas. Determinações comparativas
pelo ferro total e pela hematina alcalina

Jararaca

X.«

lih c%
Ponder

Hb *%
Hem. akal.

DiferetKA

%

8

6.3

5.3

— 15.9

10

6.6

5.5

— 16.7

11

6.6

5.6

— 15.2

12

6.9

6.9

0.0

23

7.8

6.1

— 21.8

24

7.8

6.8

— 12.8

27

8.1

8.4

+ 3.7

28

8.1

7.0

— 13.6

29

8.1

6.6

— 18.5

33

8.4

7.8

— 7.1

34

8.4

7.1

- 15.5

35

8.4

8.1

— 3.6

36

8.7

8.4

— 3.4

46

9.3

8.6

— 7.5

Diante do exposto, foi escolhido o método de dosagem do ferro total porque
me pareceu o único capaz de dar os •valores mais precisos no material em estudo.
Surgiu, assim, uma última dificuldade; qual a concentração de ferro na hemoglo-
bina da jararaca?

CRISTALIZAÇAO E PORCENTAGEM DE FERRO NA HEMOGLOBINA

DA JARARACA

A transformação das concentrações de ferro total do sangue em mg para
hemoglobina em gramas por cento, exige que se conheça a porcentagem de ferro
na hemoglobina pura. Com esta finalidade, foi tentada a cristalização das hemo-
globinas de jararaca e parelheira pelo método de Delory (1943), usando tolueno
como agente hemolisante (HEmELBEscER, 1922), cm substituição ao éter. Em
experiendas preliminares, este método permitiu, perfeitamente bem, a cristaliza-
ção da hemoglobina de cão (microfotografia I). A média das determinações de

SciELO

I

4

J. Leal Paux) — Valores normais e presença de uma forma inativa no

sangue da Bothrops jararaca. 59

ferro em três preparações cristalinas de hemoglobina de cão, reduzidas a pó e sêcas
na estufa a 105°C, durante 30 minutos, tratamento êste que não altera a sua
composição. (Mowusox & Hisey, 1935), foi de 333 mg%. Com o sangue de
parelheiras c jararacas, entretanto, o método de Delory deixou precipitar muito
material amorfo, juntamente com os cristais de henu^lobina (microfotografia II).
Repetidas vezes foi tentada a cristalização, >-arian<lo as concentrações de álcool
etilico de 15-35^, mas sempre sem cristalização completa, como no cão. .V microí-
fotografia de hemoglobina de jararaca corresponde a uma prejaração obtida usan-
do-se álcool na concentração de 16^. Quanto maior a concentração do álcool,
maior a quantidade de material amorfo que se precipita. Aparentemente, a hemo-
globina destes ofidios é de mais dificil cristalização que a do cão mas, diante dos
resultados, parece possivel a cristalização comideta. A tentativa do processo de
Delory em vários pH talvez resolvesse a dificuldade encontrada.

I 11

MicrofoCofrafta áo% cristait <Se brmock) 6 itta.

I) Saoftw «Se do, II) Saacoe de jararaca.

As determinações de ferro nas preparações imjxiras de hemoglobina de jara-
raca variaram em tômo de 300 mg % e o valor mais alto foi de 306 mg ^ em uma
das preparações. Diante disto e levando cm conta que as preparações são, segura-
mente, impuras, suponho que a porcentagem de ferro na hemoglobina da jara-
raca de\a ser igual, ou muito pouco menor, que a da hemoglobina dos mamiferos.

5

1

J. Leal Pr.ux) — Valores normais e presença de uma forma inativa no

sangue da Bolhrops jararaca. 61

Hall & Geay (1929) fazem a mesma afirmação referindo-se à hemoglobina dos
peixes. Xa Tabela III, coluna 5, calculei a hemoglobina a partir da concentra-
ção de ferro total do sangue, supondo que na jararaca a hemoglobina contenha
335 mg ^ daquele elemento. Si esta suposição não corresponder à realidade o
erro proveniente deste cálculo não poderá ser maior do que 10%, pois a hemo-
globina destes ofídios contém, no mínimo, 306 mg % de ferro.

C0MPAR.\Ç.\0 DAS DETERMINAÇÕES NA CAUDA E NA VEIA

Em experiências preliminares foi feita uma série de comparações, ainda com
o método de hematina alcalina, retirando-se sangue, no mesmo animal, por corte

Tabela IV

Determinafõtí d* hemoglobina, nas mesmas jararacas,
em sangues de cauda e de veia

KàmcfO

Hb c%

TvU

in» ■%

caoda

1

6.2

4.3

2

7.1

3.4

3

6.1

5.6

4

6.3

3.8

5

8.4

6.0

6

6.8

6.2

7

7 8

7.7

8

7.7

6.8

9

6.4

5.8

10

6.0

5.6

11

6.7

5.2

12

4.6

4.8

13

7 2

6.3

14

8.8

7 6

15

7.6

6.0

16

6.2

5.3

17

10.0

9.9

13

4.8

4.4

19

5.5

5.0

20

8.4

6.0

21

8.2

7.1

22

6.2

6.4

23

6.2 .

5.5

24

6.1

6.8

25

9.1

3.3

.Médias

7.0

5.8

da cauda e por punção da veia cava caudal (processo inteiramente semelhante à
colheita na aorta). A dosagem de hemoglobina nas duas amostras conduziu aos
resultados da Tabela IV. A diluição média de 17 por cento observada em sangue

7

62

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

obtido da cauda tornou obrigatória a colheita em um -v-aso. A colheita na aorta
foi adotada porque permite a retirada de luna quantidade maior de sangue, sufi-
ciente para •v’ários exames, o que é mais difícil quando se faz a punção venosa.

CONCENTRAÇÃO NORMAL DE HEMOGLOBINA

Foi determinada a concentração de ferro total do sangue em 49 jararaca,*;
adultas, 30 9 e 19 á . O s-alor minimo foi de 15 mg ^ ; o máximo, 33 mg ;
a média, 26.1 mg ^ e o dessdo padrão de 4.2 mg Os resultados estão na
Tabela III, onde se vêm ainda o pêso e o sexo dos animais estudados. Na coluna

Tabei-a V

Hemoglobina do sangue de jararacas. Determinafões comparativas pela
capacidade de oxigênio e pelo ferro touü. Relafões OtIFe.

Jararaca

Hb g%
Capacidade

Hb

Capacidade

Relação

X.»

Fooder

oxifcoio

O/jFe •

2

4.2

5.4

18

5.6

311

3

3.9

5.4

18

5.2

289

4

5.2

6.0

20

6.9

345

7

4.9

6.3

21

6.6

314

13

5.6

6.9

23

7.5

326

14

6.2

7.2

24

8.3

346

15

6.7

7.2

24

9.0

375

16

6.5

7.5

25

8.7

348

17

5.6

7.5

25

7.5

300

18

6.3

7.5

25

8.4

336

21

6.6

7.8

26

8.9

:t42

22

5 8

7.8

26

7.8

300

25

7.1

9.1

27

9.5

352

26

7.2

8.1

27

9.7

359

30

6.9

8.1

27

9.2

341

31

6.5

8 4

28

8.7

311

37

7.8

9.0

30

10.3

343

38

7.0

9.0

30

9.4

313

39

7.5

9.3

31

10.1

326

41

8.0

9.3

31

10.7

345

42

7.4

9.3

31

9.9

319

43

8.1

9.3

31

10.9

352

47

7.8

9.6

32

10.4

325

* ml de 0| combíiudoe com 1 g de Fe <U bemofloUna.

5 os s-alores de ferro foram transformados em gramas por cento de hemoglobina.
Encontramos os seguintes ^•alores : mínimo, 4.48 ; máximo, 9.86 ; médio, 7.80 com
um desvio padrão de 1.3. Não houve diferença significativa ligada ao pêso ou
ao sexo do animal.

J. Leal Prado — Valores normais e presença de uma forma inativa no

sangue da Bolhrops jararaca. 63

HEMOGLOBINA INATIVA

Para verificar sua presença no sangue de jararaca foi feita uma serie de
comparações determinando-se a hemc^lobina, nas mesmas amostras de sangue, pelo
método de ferro total e pela capacidade de oxigénio. As determinações foram
feitas l<^o depois da colheita do sangue. Com os dados obtidos cakulou-se o
volume de oxigénio, cm ml, que se combina a 1 g de ferro da hemoglobina (Tabela
\', coluna 6). A média encontrada, 331 ml de oxigénio, foi bem bai.xa, indicando
uma quantidade média de hemoglobina inativa de 17 por cento. O valor mais
baixo, 289 ml de oxigénio c o mais alto, 375, indicam, rcspectiv-amente, 28 c 6 jxjr
cento de hemc^lobina inativa.

COMENTÁRIOS

.'X determinação da hemoglobina no sangue de ofidios pela dosagem de ferro
total e.xige cri.stalização completa da mesma para verificação da sua concentra-
'ção percentual precisa de ferro. Além disso, deve estar correta a suposição que
o ferro plasmático nestes vertebrados existe em quantidade dcsprczivcl cm rela-
ção ao ferro total, como acontece no homem. .Acredito ser este provàvclmente o
caso. De quahiuer maneira, fica determinado o ferro total c os \-aIorcs poderão
ser recalculados a qualquer tempo. Na transformação do ferro em hemc^lobina
preferi usar ainda a antiga constante (335 mg ^ de ferro), pois não vejo razão
suficiente para usar as determinações mais recentes dc Berniiakt & Skeggs
(1943) para a hemoglobina humana, ou as de Morriso.v & Hisey (1935) para a
hemoglobina do cão.

Só fiz as determinações cm jararacas e em pequeno núntero dc parclheiras.
Hall & Cray (1929), trabalhando com peixes, observaram uma enomie \-ariação
no conteúdo de ferro do sangue dc espécie para espéoc, salientando uma relação
direta entre a atividade do pci.\e c a ri«jucza hemoglobinica do sangue. Quanto
maior a atividade do peixe, maior o teor dc hemoglobina. Seria interessante
estudar os ofidios sob o mesmo aspecto. As determinações dc hemoglobina no
sangue de parelheiras, anbora cm pequeno número, não figurando porisso no
presente trabalho, indicam que nestes vertebrados não parece haver diferenças
significativas nos resultados obtidos em exemplares dc duas familias tão distintas
— as crotalideas (jararacas) e as colubrideas (parelheiras). Numa espécie única
os valores de Hall & Cray são bem constantes. Nas jararacas encontrei uma
variação bem apreciável no teor de ferro total do sangue. Entretanto, não acre-
dito ter usado exemplares anémicos porque 26 deles serviram também para a
determinação dos respectivos índices dc Wixtrobe (Valle a. Prado, 1944) e
como a concentração média da hemoglobina corpuscular foi de 37^c, fica afastada
aquela possibilidade.

9

SciELO

3 11 12 13 14

64

^lemórías do Instituto Butantan

Tomo XMII

Há muito tempo se sabe que 1 grama de ferro da hemoglobina se combi-
na a mais ou menos 400 ml de oxigênio. Mais recentemente (Marenzi & Lida,
1938; Weise, 1937) êste \*alor tem sido recalculado e verificado ser aproxima-
damente exato. A concordância entre métodos por dosagem de ferro total com
métodos por capacidade de oxigênio ou monóxido de carbono era tida mesmo
como fato assentado até que Ammukdsen (1939), confirmando, aliás, suspeitas
anteriores, fez a verificação contrária, determinando, posteriormente, a quan-
tidade de hemoglobina inativa existente no sangue humano normal (Ammundsen,
1941). Esta hemoglobina inativa, cuja natureza química ainda está por deter-
mianr, variou de 2-12% em relação á hemoglobina total e esteve presente era
40% das amostras de sangue estudadas. Ammuntjsen supõe que a hemoglo-
bina inati\’a seja metahemoglobina ou, talvez, hematina. Nas determinações em
jararacas, a grande discordância entre os valores obtidos pelo método do ferro
total e pelo processo da capacidade fixadora do oxigênio é explicável, a meu
ver, pela presença no sangue déstes vertebrados de regular quantidade de he-
moglobina inativa. Interessante que o fenômeno foi verificado na totalidade
dos vinte e três casos estudados sob êste aspecto e a quantidade média de hemo»
globina inati\’a é muito maior do que a encontrada por Ammundsen no homem
normal. Embora seja possivel encontrar outros vertebrados com maior teor de
hemoglobina inativa do que o registrado agora para os ofídios, o aproveitamen-
to dêste dado para a análise mais acurada do fato poderá conduzir a melhor
compreensão do significado fisiol^ko da chamada hemoglobina inativa

CONCLUSÕES

1. O sangue colhido por secção de pequeno segmento da cauda de jararacas
ficou diluído em média de 17% em relação ao sangue venoso.

2. Dos métodos estudados, sómente a dosagem de ferro total do sangue per-
mitiu a determinação precisa da hemoglobina dos ofídios.

3. A concentração média normal do ferro do sangue de 49 jararacas,

30 9 e 19 á, foi de 26.6 4.2 mg %.

4. A concentração de ferro da hemoglobina da Bothrops jararaca é igual ou
pouco menor do que a dos mamíferos. Usando como fator da transfor-
mação 0.335 g % de ferro, a concentração média normal da hemoglobina
do sangue foi de 7.80 dt 1.3 g %.

5. Foi encontrada uma forma de hemoglobina inativa, isto é, não combinávcl
ao o.xigênio, na totalidade de vinte e três casos estudados. A concentra-
ção média da hemoglobina inati^-a foi de 17% da hemoglobina total.

6. O pêso ou o sexo do animal não influenciaram significativamente a conr
centração do ferro total do sangue da jararaca.

J. Leal Prado — Valores normais e presença de nraa forma inativa no

sangue da Bolhrops jararaca. 65

RESUMO

O teor de homoglobina do sangue de ofidios foi determinado em parelhei-
ras e jararacas pelos métodos da hematina ádda, da hematina alcalina, pela
capacidade fixadora do oxigénio e pela dosagem do ferro total. Somente o
método do ferro total deu resultados precisos.

A cristalização da hemoglobina destes ofidios foi tentada pelo processo de
Delory, que, em minhas mãos, produziu cristalização completa da hemoglobina
do sangue de cão. Nos ofidios, a cristalização foi parcial e o teor cm ferro
da hemoglobina assim obtida \'ariou em tõmo de 300 mg % enquanto que na
do cão foi, cm média, de 333 mg %. Tomando a porcentagem média de ferro
da hemoglobina dos ofidios como sendo a mesma da hemoglobina dos mamíferos
e usando o fator de transformação 0.335 g a concentração média normal
de hemoglobina no sangue da jararaca foi de 7.80 d: 1.3 g %. A concentra-
ção média normal de ferro no sangue foi de 26.1 ± 4.2 mg

Em todos os casos estudados foi achada uma proporção de hemc^lobina
inati\'a (não combinável ao oxigênio) cm tômo de 175& da hemoglobina total,
cujo significado nestes vertebrados, assim como no homem onde ela aparece em
40% dos sangues estudados, na proporção de 2 a 12%, não está ainda
esclarecido.

Pelos resultados das determinações de hemoglobina foi observado que o
sangue dos ofídios, obtidos por secção da cauda, se apresentou diluido em mé-
dia de 17% em relação ao sangue obtido por punção venosa.

Foi ainda verificado que o peso e o sexo dos animais empregados não mo-
dificaram significati\'amcnte a concentração do ferro total do sangue da jararaca.

ABSTRACT

1. Hemoglobin determinations wcre made in blood of snakes by four usual
methods: acid and alkali hentatin, ox}-gen capacity and a modification of
thc original Wong’s method. Only the iron mcthod could be used accuratcly.
The normal total blood iron concentration of 49 Bothrofs jararaca
(19 á and 30 9 ) was 26.1 :í: 4.2 mg%. This value xv^as not influeneed
by the sex or the body wcight.

2. Thc crystallization of ophidic hemoglobin «•as tried «-ith the method of
Delory and successfully used with dog’s blood. Partial crv’stallization was
obtained with an iron content averaging 300 mg%.

3. Assuming the iron concentration of snake’s hemoglobin to be the same as
in mammals, i.e. 0.335 g %, the normal blood hemoglobin concentration
of B. jararaca was 7.80 á: 1.3 g %.

6G

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

4. \\’ithin a group of 23 B. jararaca the blood samples analysed have sho\%-n
in all cases an average of 17^ of inactive hemoglobin (non-oxygen-com-
bining forni).

5. Blood collected by cutting a littie segment of the tail of snakes could not be
used for hemoglobin estimation in ^-irtue of a mean dilution of 17^ com-
pared with venous blood.

BIBLIOGR-AFLA

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(Recebido pata cablicafio em dexembro de 1944).

DISCUSSÃO EM TÔRNO DOS GÊNEROS OCUETOSOMA
BRAUN, 1901, E REMFER PRATT. 1902 (TREMATODA)

POR

ARISTOTERIS T. I^AO

{Do Laboratório de Parasilologia do Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

Xeste trabalho procuramos apresentar argumentos em favor do género
Ochetosoma, cuja validez tem sido posta em dúvida sob a alegação de ter sido
insuficientemente descrito c figurado.

Braun, 1901. descreveu sob o nome de Ochetosoma mostruosum um novo
gênero e espécie de trematóide por ele achado no frasco Xo. 005 do -Museu
de \ iena, que afirma ter sido encontrado no esófago de Corone venustissima,
não apresentando figura do material cm sua lacônica descrição.

Braun, 1902, num substancioso tralalho sóbre trcmatúides de aves, volta
ao assunto, propondo diagnose genérica e rcpro<lu 2 Índo, em lioa figura, o mate-
rial por ele descrito cm 1901. A diagnose genérica então proposta foi
a seguinte:

“Kõqier unter mittelgross, ganz abgeplattct kann rinncnfõnning
Gckrümmt werden; bestachelt. Saugnãpfe gross, Pliarj-n.x klein,
Oesophagus wcnig lãngcr, Damischcnkcl kurz, den Bauchnapf nicht
überschreitend ; Genilalporus \-cntral, jcdoch in dcrXâlie eines Sei-
tenrandes, Zwischen den Saugnãpfcn; Cirruslicutel langgcstrcckt
krãftig. mit tvstcula scminalis. cirrus dick, unbewaffnet ;

Hoden sjmmctrisch hinter <Iem Bauchnapf ; Kcimostock assym-
metrisch vor einem Hoden; Dotterstõckc schwach cntwickclt, nicht
laumcnfõrming, zu den Seiten des Bauchnapfes und hinter diesen.
Uterus mit ab-und aufsteigcndcm Schenkcl und quer gcrichtctcn, das
Mittelfeld nicht überschrcitcndcn ScMcigcn, vorzugswcise in der hin-
teren Korperhãlfte sich ausbreitend. Eier dünncschalig klein. liii
Rachen von \'õgcln”.

Comentando as possiveis relações do helminto diz;

. Dieser Art nãhcrt sich das dic Lunge von Hctcrodon plat\rhinus

bcwohncnde Dislomum ischokkei voLZ, 1899, und cine zwcitc, in

1

68

Mcmórías do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Xenodon sp. gefundene, noch unbennante Art, die ich aus einer mir
von Herrn Dr. Brande-Halle übersandten 2íekhnung kenne. Es
scheint mir jedoch fraglich, ob man diese beiden Arten in dia Gattung
Ochetosoma stellen kann.”

Pratt, 1902, trabalhando com trematóides parasitos de répteis, descreveu
um novo gênero e espécie, que denominou Renifcr ellipticus, considerando-o
também muito próximo de Distomum sschokkei. Não cita, porém, na biblio-
grafia, o trabalho de Braun, 1901, o que demonstra não o ter consultado. A
diagnose genérica apresentada por Pratt foi a seguinte:

“Small distomes with body more or less elliptical and covered
with minute spines or scales. Mouth subterminal; acetabulum so-
mewhat larger than oral sucker and in anterior half of body.
Pharynx present; Oesophagus short or w-anting; intestinal caeca
reach about to the middie of the body or a little past it.

Excretory vesicle veiy large, shaped, extending into the forward
end of the body. Genital pore in front of the acetabulum often to
the left or right of the median line. Testes two. usually lobate, in
the same transverse plane near middie of the body; drrus sac often
long, containing a vesicula seminalis which bends on itself. Ovary
just posterior to the acetabulum and in front of the testes; yolk-
glands lateral in position and occupyng the middie third of the body;
Laurer’s canal present; uterus composed of a descending and as-
cending limb, and extending to the hinder end of the body; recepta-
culum seminis absent or minute. Parasitic in the mouth or air pas-
sage of snakes and in the intestine of turile”.

Nicoll, 1911, descreveu, de Leptodira annulata, a segunda espécie do gê-
nero de Braun, Ochetosoma formosum.

Tal3ot, 1934, transferiu a espécie de Nicou. para o gênero Renifer dizendo:

"Ochetosoma formosum Nicoix, 1911, is placed in the genus
Renifer, because in this spedes the intestinal caeca extend beyond
the acetabulum”.

No entanto, si compararmos as figuras de Braux, Pratt e Nicoll, não
encontraremos diferenças que justifiquem tal procedimento. Ainda no mesmo
trabalho diz:

"Five gcncra: Styphlodora Looss, 1899; Astiotrema Loos^
1900; Ochetosoma Braun, 1902; Oistosomum Odhner, 1902, and

Aristoteris T. LE.to — Discussão em tôrno dos gêneros Ochtlosonta

Braun, 1901. e Rtnifer Pralt, 1902 (Trematoda) 69

Mediorima Nicoll, 1911, formcrly induded in the Reniferinae have

been «cluded by the prcsent subfamily diagnosis The genus

Ochetosoma is not induded because it has been insufidently descri-
bed and no figure of the type spedes is as-ailable”.

Xão são, entretanto, verdadeiras as aíirmaqõcs de Talbot, pois si Braun
não apresentou diagnose genérica e figura do material resumidamente por ele
descrito em 1901, esta falta foi compensada no seu segundo trabalho, 1902, onde
são apresentadas duas figuras do verme total e diagnose genérica.

Mehra, 1937, à pág. 457, diz:

" Ochetosotna monstruosum Braun, 1901, should not be consi-
dered as separate from Renifcr. In the former the intestinal caeca
do not extend behind the acetabulum as mentioned by Braun, but
from the figure of Ochetosoma monstruosum it is dear that they
extend a little behind the posterior margin of the acetabulum as in
Renifer. It, therefore, appears, that there is hardly any difference
between these two genera”.

Meu RA não inclui, porém, o género Ochetosoma na cTiave dos Reniferinae,
que então apresentou, o que indica não o ter reconheddo como gênero dos Reni-
ferinae.

Byrd e Denton, 1938. discutem a sistemática dos Reniferinae e, cm rela-
ção ao gênero Ochetosoma, dizem:

"In the present diagnosis of the subfamily Reniferinae wc
agree wth Talbot, 1934, in cxduding the genera Styphlodora
Looss, 1902, Astiotrema Looss, 1900, Ochetosoma Braun, 1902,
and Oistosomum Odiiner, 1902, for reasons stated by Talbot”.

O hospedador de Ochetosoma monstruosum Braun, 1901, citado nos tra-
balhos de Braun é Corone venustissima, o qual o referido autor afirma ser
uma ave.

Hughes. Hiccinbotiiau e Clary, 1942, dtam, entretanto:

"Ochetosoma monstruosum, Braun, 1901.

From Erythrolamprus srenustissima" .

Procurando esclarecer esta divergência, pedimos, por carta, a opinião de
especialista do Dr. Ouverio Pinto, ornitologista e diretor do Departamento
de Zoologia do Estado de São Paulo, cuja resposta foi a seguinte:

70

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

“ — Estudando o caso nela ventilado, parece-me fora de dúvida
que só por engano teria Braux se referido a Coronc venustissima,
querendo escrever Coromlla venustissima, nome usado por Schlegel
para a conhecida cobra descrita pelo príncipe Maximiliano, com
o nome de Coluber venustissimus. Trata-se, no fim de contas, de
mero sinônimo de Erythrolamprus aesctãapii, como fazem supór as
citações de sua própria carta. Corone é gênero e.\clusivamente de
ave, subordinado à familia Corviidac. .

Por outro lado pedimos também esclarecimentos ao Dr. Alcides Prado,
herpetologista do Instituto Butantan, o qual nos disse:

“Erythrolamprus venustissimus Neuwied foi, por Boulexger,
considerado sinônimo de Erythrolamprus aesculapii (L.), que habi-
ta a América tropical, com o que estou de acôrdo”.

Temos, portanto, razões jiara acreditar que o material de Braux provinha,
com tóda probabilidade, do esôfago de Erythrolamprus aesculapii (L.) ( — E.

z-enustissimus Xeuwied), serpente muito comum nas Américas do Sul e Cen-
tral, e não de uma ave. Ora, sendo Coronc género de Corviidae, não existente
nas Américas, mais uma razão, portanto, em apôio às nossas considerações.

Parece, portanto, ter havido engano ao ser rotulado o material encontrado
no frasco No. 605 do Museu de Viena, na qual, em lugar de escreverem Co-
ronclla venustissima, grafaram erradamente Corone z-enustissima.

Apesar de terem aparecido numerosos trabalhos sôbre trematóides de aves
desde a ereção do género Ochetosoma, nunca foi a sua presença assinalada na
referida classe, ao passo que em serpentes a presença de representantes do gé-
nero Rcnifer tem sido registrada com freqüéncia desde a sua descrição em 1902,
o que vem em apôio ao nosso ponto de vista.

Talbot, 1934, bem como Byrd e Dextox, 1938, citam Ochetosoma mons-
truosum Brau.n, 1902, o que não nos parece exato, pois o trabalho, no qual foi
feita a descrição original, foi publicado em 1901. Por outro lado, a data de
nifer Pr.\tt é por alguns autores citada como 1902 e por outros 1903.

No Zoological Record (volume de 19(M) é citado 1903, porém, Pratt
(Synopses of North .American Invertebrates) cita 1902. De qualquer forma
o género de Br.\ux é anterior, pois traz a data de abril de 1901.

Morfologicamente, os gêneros de Braux e Pratt aqui tratados são indis-
tinguíveis, apresentando apenas diversidade de hospedadores, a qual, pelas con-
siderações expostas neste trabalho, não tem razão de ser. Achamos, porísso, ló-
gico concluir pela prioridade de Ochetosoma Braux, 1901, sôbre Renifer
Pratt. 1902.

Aristoteris T. Leão — Discussão era tòrno dos gêneros Ochetosoma

Braun, 1901, e Renifer Pralt, 1902 (Trematoda) 71

Por outro lado, sendo Renifer sinônimo de Ochetosoma, cessarão também
as razões de existência de Reniferidae e Renifcrinae e lógico será criar novos
nomes de família e subfamilia para substituir aqueles julgados inaproveitáveis
à luz das regras internacionais de nomenclatura zool^ca.

. Ochetosomalidae, n. n.

Com os caracteres dados por Baes, 1924, e refundidos por McMuu-en
1937, para a família Reniferidae e que reproduzimos na íntegra;

" Plagiorchiodea: Excretorj* bladder in larv^al and adult forms
Y-shaped with main excretory tubes attached laterally and posterior
to tips of arms. Cercariae with small stylets and 8-10 pairs of stylets
glands. Body of adults elongate, may or may not be spined. Ex-
tent of intestinal ceca \-ariable. Genital pore prcacetabular, mcdian
or lateral. Cirrus well developed. Position of gonads variable.
Vitellaria follicular and variable in extent. Uterus extends into pos-
terior end. Adults parasitic in the digestive and respiratory tracts
of reptiles”.

Género tipo: Ochetosoma Braun, 1901.

Ochelosomalinae, n. n.

Com os caracteres dados por Byrd e Deston, 1938, para a subfamilia
Reniferinae e que reproduzimos integralmente:

Ochetosomatidae: "Distomates trematodes with elongated oval
bodies and rounded ends, with or without spines. Prepharynx usually
present. Esophagtis and pharj-nx usually with gland cells. Ceca
variable en length, reaching to ot beyond center of body. Osary
behind acctabulum, smooth or lobed in outline. Laurer’s canal pre-
sent. Receptaculum seminis absent. Uterus descending and asccnding
beta-een testes, descending to posterior end of body. Metraterm
present, \ariable in Icngrh and degree of development. Vitellaria
follicular, follidcs distintct or demtritic, usually lateral do ceca in
ventral third of body cxccpt in Natriodera. Genital pore in front of
acetabulum, mcdian or lateral. Testes smooth to lobate, oppositc or
obliqúe, behind o\-ary. Cirrus sac well des-eloped, rarcly extending
posterior to s-cntral siKker. Excretory \*csicle Y-shaped, comua in
adults endrcling acctabuliun cxcept in Natriodera. Flame cell pattem
of 2 X 6 X 3 t)’pe. Lars-al stages remarkably uniform, eggs fully
embrj-onated whcn oviposited; miracidia with two large penetration

72

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVm

glands, without eye-spots; sporocysts simple; xiphidiocercariae with
small stylet, 8-10 pairs of penetration glands and Y-shaped excretory
vesicle with cornua encirding acetabulum; adolescarieae using various
species of tadpoles as intermediate hosts. Parasitic in Rqjtilia”.

Gênero tipo: Oc/ie/ojowia Braün, 1901.

Gênero Ochetosoma Braun, 1901.

Com os caracteres dados por Pratt, 1902, e refundidos por Byrd e Dexton,
1938, para o gênero Renifer e que reproduzimos:

Ochetosomatinac: With the characteres of the subfamily. Ceca
variable in lengthh, may or may not be directed toward center of body
beriveen testes. Genital pore lateral outside area between bifurcation
of caeca and acetabulum, on levei with bifurcation of ceca. Metraterm
A-ariable, usually wdl developed and muscular, usually pulled away
from drrus sac. Cirrus sac muscular, not extending posterior to ace-
tabulum. Parasitic in uppcr digestive tract of snakes”.

«

Espécie tipo: Ochetosoma monstruosum Br-acx, 1901.

Não discutiremos, neste trabalho, o valor dos diversos gêneros e espécies
incluidos na familia Ochetosomatidae, bem como a divisão desta em subfamilias,
pois pretendemos tratar o assunto em conjunto em uma publicação futura.

i

RESUMO

• s

Neste trabalho é feito um estudo bibliográfico sôbre os gêneros Ochetosoma
Braun, 1901, e Renifer Pratt, 1902. A diversidade de hospedadores é discutida,
concluindo-se pela sua inexistência. Não sendo encontrados elementos diferen-
dais, que justifiquem a separação dos dois gêneros e tendo Ochetosoma Braun,
1901, prioridade sôbre Renifer Pr.att, 1902, o último é considerado sinônimo do
primeiro. Reniferídae e Reniferinae passam a denominar-se respectivamente
Ochetosomatidae, n. nom., e Ochetosomatinae, n. nom.

ABSTRACT

\ \

1 — The genera Ochetosoma Braun, 1901, and Renifer Pratt, 1902, have

been revised.

2 — The question of different hosts has been considered and the conclusion

of its non-existence is reached.

*

Arjstoteris T. Leão — Discussão cm tôrno dos gêneros Ochelosoma

Braun. 1901. e Renifer Pralt, 1902 (Trematoda)

3 — No differentiating elements have bcen found that justify the separation

o£ the gencra.

4 — Renifer Pratt, 1902, shall bc considered sjTionimous o{ Ochetosoma

Braun, 1901, on account of the earlier descríption of the last one.

5 — Reniferidae and Reniferinae become therefore respcctívely Ocheloso-

matidae, n. nom., and Ochetosomatidae, n. nom.

Cumpre-nos deixar aqui consignados os nossos agradecimentos a todos aqueles
que, direta ou indiretamente nos tem prestigiado na consecução dos nossos tra-
balhos, lembrando, espedalmcnte, os nomes dos Profs. Drs. Lauro Travassos,
Paulo de Toleix) Árticas e Flavio da Fonseca.

BIBLIOGRAFIA

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Braun, M. (1902). Zool. Jahrb. Sytl.. 16, 1.

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Mehra, H. R. (1937). Z. ParasUenk., 9. 429.

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Hughes, R. C, Higginbotkam, J. IP. (1942). The Trematodes oí Reptiles, Part 1, Sys-
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SíeStnJlen, D. B. (1937). A discussion of the taxonomy of the famiJy Plagiorehidae Lülie,
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(Estrtra* P*r* poblicaeSo ca deteabeo de 1944 ).

cm

'/SCÍELO3 ;l1 12 13 14 15 16

cm

SciELO,

11 12 13 14 15 16 17

CITOLOGIA VAGINAL E SEU EMPRÊGO EM GINECOLOGIA

ENDÓCRINA (*)

POR

ALVARO MARCONDES SILVA

(Do Laboratório de Endocrtnologia do IiutiMo Bulantan, SSo Paulo, Brasil)

O exame do conteúdo \-aginaI como processo de investigação da atividade
o\'aríana foi praticamente introduzido em 1917 por Stockard & Papanicolaou
(1), ao demonstrarem pela primeira vez que era possivel determinar a época do
estro na cobaia mediante o exame citológico de esfregaços Nagmais. .-Vs varia-
ções que apresentam as células, nas diversas fases do ciclo estral, são tão nítidas
nos roedores que permitiram a Allen & Doisy (2), alguns anos mais tarde,
crear o seu já clássico teste ptara pesquisa de estrógenos, l)aseado nas modifica-
ções induzidas por tais substâncias na citologia vaginal de camundongas e ratas
castradas.

\'ariações periódicas do conteúdo celular da vagina foram posterionnente
comprovadas em outras espécies superiores, inclusive na humana, mas não com
a mesma nitidez que a observada nos roedores. Em relação à espécie huma-
na, nem todos os autores concordam com a existência de um paralelismo entre
essas variações e a atividade ciclica do ovário, isto é, o ciclo menstrual, embora
não se n^ue a existência de diferenças entre a citologia vaginal da infância c
da menopausa e a da mulher adulta em plena atividade ovariana. Di Paola
(3) que é um dos que negam o paralelismo acima citado, sugere ter o epitélio
vaginal um limiar de resposta baixo cm relação aos estrógenos, o qual, uma
vez atingido, não lhe permite mais apresentar modificações cm relação às pe-
quenas variações na concentração de estrógenos da mulher adulta. Todavia,
desde que Papanicouaoc (4) publicou o seu exaustivo estudo afirmando de modo
convincente que as nxxlificações periódicas encontradas na citologia vaginal hu-
mana estão diretamente relacionadas á atividade ovariana, muitos foram os au-
tores que o apoiaram nessa afirmação, aduzindo muitas e muitas provas que não
{xxieriam ser desprezadas. Entre éstes se destaca Rubenstein (22, 7, 23, 24).

(•) Trahatho apresentado etn 9 de íercrciro de 1944 à SceSo de Ginecologia e Obste-
trícia da Associaçio Paniista de Medicina.

76

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMIl

No presente trabalho são referidos os resultados do exame citológico vagi-
nal num grupo selecionado de casos, durante o ano de 1943, no Serviço Qínico
da Seção de Endocrinologia do Instituto Butantan, confrontando-os com os acha-
dos de outros autores, afim de julgar do \’alor do método como meio de ava-
liação da atividade o^'ariana.

MÉTODOS

A colheita de material tem sido feita de modo um tanto diverso pelos dife-
rentes pesquisadores.

Papaxicolaou (4), em 1933, preconizou o uso de uma pipeta de vidro
curva numa extremidade e provida de uma pera de borracha na outra. A técni-
ca consistia em comprimir a pera, introduzir a porção cuiva da pipeta na \’agina
e, então, por aspiração, colher o material e depositá-lo numa lâmina, fixando-o
imediatamente. Ésse é o processo adotado pela maioria dos autores, inclusive
por SnoRR, cujo método de coloração adotamos.

Salmon, Walter & Geist (5) adotaram um processo diferente. As pa-
cientes eram instruidas para fazer uma lavagem vaginal com água na tarde em
que iam se submeter a exame. Êste era feito, introduzindo um espéculo na va-
gina e limpando bem a cervice e os fundos de saco \’aginais para, em seguida,
ao retirar o instrumento, arrastar com a sua valva posterior o fluido da parede
vaginal anterior. O flúido vaginal presente na valra posterior do espéculo era
então diluido cm uma porção igual de sôro fisiológico e espalhado numa lâmina,
que se dei.xava secar ao ar para fixar.

Geist & Salmon (6), em outro método, introduziam prèviamente o espé-
culo na vagina, com o fim de observar a presença ou não de infecção e, por
meio de uma pipeta de vidro, aspiravam uma pequena quantidade do flúido va-
ginal existente na superfície da sua vah^a posterior.

Rubenstein (7) aconselha o emprego de uma alça para a colheita do ma-
terial, que é feita raspando-se brandamente a parede do fomix posterior da va-
gina, após a introdução prévia de um espéculo.

Dl Paola (3) utilizava a mesma técnica de Papanicolaou, apenas introdu-
zindo a pipeta de vidro já com algumas gótas de sóro fisiológico no seu interior,
que eram expelidas dentro da vagina, de modo a fazer com que o flúido vaginal,
então diluido no sóro fisiológico, entrasse espontâncamente na pipeta pelo vasio
estabelecido.

Fournier, Manaro & Blanco (8), após experimentarem várias técnicas
de colheita, deram preferência a uma pipeta de vidro ligada a um tubo de borra-

Alvabo Marcovdes Silva — Ciiologia vaginal e seu emprego cm gine-
cologia endócrina.

77

cba, que por sua vez era ligado a um pequeno tubo de vidro que ser\-ia de peça
bucal, e dessa forma faziam a aspiração por sucção, argumentando que a van-
tagem de tal processo era a de se poder graduar a aspiração à vontade. Xos
casos de material escasso procediam como Di Paola, isto é, introduziam a pi-
peta já com 0.3 cm* de sôro fisiológico no seu interior e expeliam o liquido
na luz ^-aginal para, em seguida, fazer a aspiração.

Mack (9) aconselha introduzir na vagina um bastão de vidro com a pon-
ta envoh-ida em algodão, fazendo um le^*e movimento de rotação, cerca de uma
volta completa, contra as paredes vaginais e, em seguida, colocar a extremida-
de envolta cm algodão desse bastão sóbre uma lâmina bem limpa e imprimir-lhe
um mosTmento de rotação, evitando a frição, de modo a produzir um esf regaço
fino, com um minimo de pregueamento e destorção celular.

Depois de experimentar todos estes métodos e outros de menor importân-
cia de que tivemos conhecimento, chegamos à conclusão de que o melhor deles
era o original de Papaxicolaou, ligeiramente modificado para se poder graduar
a aspiração do flúido vaginal. Utilizamos tubos de vidro esterilizados e secos,
com cerca de 17 cm de comprimento, 4 mm de diâmetro externo e 2 mm de diâ-
metro interno (correspondente à luz do tubo), apresentando, pois, uma parede
de vidro com 1 mm de espessura, que nos pareceu sufidenteinente forte para não
quebrar no interior da vagina durante as manipulações necessárias. O tubo é
curvo numa extremidade e apresenta um orifido próximo a outra, orificio esse
situado em direção oposta â do recurvamento da outra extremidade; êsse orifido
é por nós chamado "orifido de escapamento" (Fig. 1). Para crianças, usamos
tubos semelhantes mas de dimensões menores.

As peias de borracha por nós empregadas são as de tipo Mercúrio n.® 1
(Rio Grande do Sul), que são sufidentemente moles para fazer uma sucção
moderada; elas são adaptadas à extremidade retilínea do tubo.

O tubo de vidro é introduzido na vagina pela sua extremidade curva, ate
que se tenha verificado que a mesma tocou o fundo de saco posterior, pois só
o material contido nessa porção da vagina é que deve ser colhido. Comprime-
se, então, a pera de borracha, fazendo-se sair o ar pelo orifido de escapamento,
e, em seguida, oblitera-se este com o dedo; a pera de borracha passa então a
fazer sucção pela extremidade curva do tubo, cuja direção conhecemos, através
da posição do orifido de escapamento, que, como dissemos, está situado no lado
oposto. Faz-se movimentos de rotação com o tubo, da dirdta para a esquerda
e da esquerda para a dirdta, afim de aspirar o máximo possível de flúido va-
ginal e, quando se verificar que não há mais aspiraçao, destapa-se o orifido de
escapamento, fazendo assim entrar o ar para o interior da pipeta e da pera de
borracha; esta manobra é útil porque evita o refluxo de material para o interior
do tubo de vidro, o que dificultaria a execução posterior do esfregaço. A pi-

SciELO)

3

78

Memórias do Institulo Butantan

Tomo XVHI

peta é então retirada e executa-se o esfregaço, graduando, por uma combinação
de pressão na pera de borracha e maior ou menor obliteração do orifício de
escapamento, a quantidade de fluido a ser depositada na lâmina. Tivemos sem-
pre a preocupação de fazer um esfregaço muito pouco espesso. Uma vez exe-
cutado o esfregaço, êste é imediatamente imerso numa mistura de álcool a 95^^»
e éter, em partes iguais.

A coloração dos esf regaços foi feita pelo método de Shork (10), que nos
pareceu o melhor para o fim a que nos propuzemos e que consiste essencial-
mente no seguinte:

1. Fixar o esfregaço enquanto úmido em álcool 95Ç{> — éter (1:1) por
1-2 minutos.

2. Corar 1 minuto com o corante único Shorr 3.

3. Desidratar em álcoois (70% — 95% e absoluto) mergulhando a lâ-
mina cêrca de 10 vezes em cada frasco.

4. Qarificar pelo xilol.

5. Montar em damar ou em balsamo do Canadá.

O corante único recomendado por Shorr (Shorr 3 ou S 3) tem a se-

guinte composição:

Álcool etílico a 50% ICO cni^

Biebrich Scarlet (solúvel em ágna) 0.5 g

Orange G 0,25 g

Fast Green FCF 0,075 g

Acido fosfotúngstico 0,5 g

Acido fosfomolibdico 0,5 g

Acido acético glacial 1.0 cm^

Êssc método é o último de uma série de modificações introduzidas por
Shorr em seu método original (11, 12) e nele emprega corantes (Biebrich
Scarlct e Fast Green FCF) da firma americana “National Aniline and Chemi-
cal Company” em virtude da escassez dos produtos originalmente empregados
(Ponceau de Xylidene e Licht Grün), que provinham da Alemanha. Nós em-
pregamos o Biebrich Scarlet e o Licht Grün de Grübler, com bons resultados.

Uma vez corada. e.xaminamos a lâmina ao microscópio para analisar a ci-
tologia existente e fazer, quando se desejou, a contagem percentual dos diferen-
tes tipos celulares, assim como avaliar a quantidade de leucócitos, hematias, mu-
co e o tipo da flora microbiana encontrada. A diferenciação morfológica das
células ^-aginais foi feita de acordo com o critério estabelecido por Papaxicolaou
(4, 13). que nos pareceu melhor traduzir a realidade, por fugir á complicada

Alvabo >LufcoxDES Silva — Citologia vaginal e seu craprúgo em gine-
cologia endócrína. 79

variedade de tipos descrita por outros autores (14, 7). Quanto à interpreta-
ção das propriedades corantes dos diversos elementos encontrados, seguimos os
dados de Shorr (10); ao invés, porém, de denominarmos as células com cito-
plasma corado em vermelho-alaranjado de células comificadas, chamamo-las de
células acidófilas, reservando o termo "comificado” para as células cujas alte-
rações morfológicas permitam essa qualificação. As células com citoiilasma co-
rado cm verde pelo Licht Grün e que Shorr denomina de células não comifi-
cadas. foram por nós denominadas de células basófilas, embora realmcnte se
trate de elementos não coraifkados, c isso apenas para que houvesse harmonia
de denominações.

Baseados nesses dados, podemos, então, distinguir 3 tipos de células nos
es f regaços vaginais, que, em virtude de sua situação num epitélio vaginal proli-
ferado pela ação de substâncias estrogémeas, foram por Papanicolaou deno-
minadas células basais, células intemiediárias e células superficiais. As células
basais (outer basal cells), são as mais profundas, situadas próximo a túnica
própria, e se caracterizam por serem de pequeno tamanho, núcleo vcsiculoso c
muito grande cm relação ao tamanho da célula c com citoplasma sempre basofilo.
As chamadas células basais internas (inner basal cells) não são encontradas
em esfregaços e mesmo que o fossem não poderíam ser diferenciadas das cha-
madas células basais externas (outer basal cells): tal divisão só é justificada
em cortes de. epitélio.

Entre as células basais Papasicolaou descreve, por tamliém apresentarem
pequeno tamanho, as células de origem ccr\’ical ; estas células tém caracteres
próprios e deverão ser reconhecidas, pois aparecem geralmente em esfregaços
de epitélio \'aginal altamente proliferado, ao contrário das células basais tipicas
que são encontradas em esfregaço de epitélio vaginal pouco ou nada proliferado.
As células intermediárias se caracterizam, de um modo geral, por serem alon-
gadas c apresentarem um núcleo comumente alongado e excêntrico; o seu cito-
plasma é basófilo. podendo, todavia, ser acidófilo. As células superficiais são
células chatas, de formato variável, núcleo veskruloso ou picnótico, citoplasma
basófilo ou acidófilo. As células comificadas apresentam de característico a
reabsorção ou fragmentação do núcleo, que poderá estar ausente nas células mais
tipicas.

Quando o epitélio vaginal está em repouso, isto é, não submetido a ação
proliferadora das substâncias estrogénicas, éle é constituído unicamente por cé-
lulas basais, dispostas em um número de camadas muito reduzido, em geral
duas. L.^go, porém, que éle fique submetido a ação do hormônio folicular,
o que se dá é, fundamentalmente, uma proliferação á custa das células liasais.
À medida que o epitélio se espessa, as células mais superficiais \áo, a princi-
pio. se alongando e posteriormente se achatando, de modo a diferenciar as cé-

5

80

Mcniórías do Instituto Butantan

Tomo XVIIl

lulas intermediárias e superficiais. A medida que essas células se vão afastan-
do da camada basal toma-se cada vez mais dificil a sua nutrição e elas vão
sendo sede de processos degenerativos, tais como picnose do núcleo, addofilia
do citoplasma e comificação. Tais processos, juntamente com as modificações
de tamanho das células, traduzem a ação das substâncias estrogênicas sôbre o
epitélio vaginal. A ordem de aparecimento dessas modificações num epitélio
sob ação de estrógenos nem sempre é a mesma e a importância dêsse fenômeno,
assim como a do valor da sua maior ou menor intensidade, constitui objeto atual
de nossas investigações.

MATERIAL

Procedemos a exames do flúido \'aginal em meninas, em fase comprovada-
mente pré-puberal, em adolescentes tanto normais como com atraso da menarca
ou com amenorréia primária, em mulheres adultas eumenorreicas, em casos de
amenorréia secundária (pelo menos um deles acompanhado repetidamente du-
rante o tratamento hormonal pelos estrógenos), em casos de menopausa e em al-
guns casos de distúrbios menstrmis não especifkamente aqui mencionados.

Nosso material é ainda escasso, pois compreende apenas 26 casos; tratan-
do-se, porém, de casos bem selecionados, nos qtiais foi cxcluida a existência
de qualquer infecção do trato genital susceptível de alterar os resultados, parece-
nos licito tirar dêles conclusões.

Desejamos, como já foi dito, relatar apenas o que o estudo do nosso ma-
terial e os trabalhos de outros autores nos sugeriram em relação ao valor do
método como meio de se avaliar a atividade orariana num dado caso. Poste-
riormente, quando contarmos com maior número de casos, publicaremos dados
estatisticos sôbre a freqüência do que será dito a seguir.

RESULTADOS E COMENTÁRIOS

Nos casos de ausência total de atividade o^^ariana, isto é, de meninas em
fase comprovadamente prépuberal, em que não havia nem esboço de cararteres
sexuais secundários e a genitália era infantil, obtivemos sempre aquilo que
Papanicocaou chama de esfregaço vaginal de tipo atrófico. Achamos mais con-
veniente denominar êste tipo de esfregaço, de esfregaço de epitélio vaginal cm
repouso, isto é, não submetido a ação estrogênica e justificamos essa denomi-
nação em virtude da insignificante excreção de estrógenos encontrada em me-
ninas impúberes (15), bem como por ser a atividade estrogênica a única que
repercute de modo indubitável sôbre o epitélio vaginal (16, 17, 18). A ação

Alvabo Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprègo em gine-
cologia endócrína. 81

da progesterona sôbre êsse cpitélio ainda é discutida, poucas sendo as pesquisas
até agora feitas para evidenciá-la (19).

Xesse tipo de esfregaço \'aginal a quase totalidade das células encontradas
é de tipo basal, havendo apenas uma ou outra célula intermediária ou superfi-
cial com dtoplasma basófilo, rarissimamente addófilo. Há, também, regular-
mente, um grande número de leucócitos e uma quantidade regular de muco
(Figs. 2 e 3).

Esfregaços >aginais désse tipo foram também encontrados na menopausa com
vários anos de duração por Papanicolaou e Shobr (16)*, apenas com a diferença
de, ao lado da abundànda de células basais, haverem aqueles autores encontrado
um número relatisamentc maior de células intermediárias e superficiais do que
o observado nos nossos casos de meninas em fase compro%-adamcnte prépuberal.
Tais células eram, todavia, em número escasso e com citoplasma raramente aci-
dófilo. Tinoco Cabral (34) tem o mérito de haver sido o primeiro a descrever
esses esfregaços vaginais da menopausa.

Em adolescentes ainda não menstruadas, mas cujos caracteres sexuais secun-
dários estavam se desenvolvendo normalmentc e assim como nos primeiros anos
da menopausa, isto é, em períodos de transição entre a ausência de atividade
o\-ariana e a plena atividade ovariaiu da mulher adulta, o aspecto dos esfregaços
\'aginais que obtivemos foi muito variável, dependendo do grau dessa atividade
e da sua repercussão sôbre o epitélio %*aginal. Como a atividade ovariana é unu
atividade cíclica, que se traduz por uma alternância de períodos cm que ora há
aumento e ora diminuição na concentração de estrógenos do organismo, é possível
que ela possa se realizar em níveis snbnormais, onde a menstruação ou não exista
ou, se existir, se traduza apenas pelo aparecimento microscópico de hematias.
Pelo menos, em relação à menopausa, é o que poude es-idenciar Papanicolaou
(20, 16), que encontrou, por duas vezes, cm um caso de menopausa examinado
diariamente durante seis méses, a transformação gradual do esfregaço de tipo atró-
fico em um esfregaço de tipo folicular, seguido de um pequeno período em que
apareciam eritrocitos c do retômo do esfregaço novamente ao tipo atrófico. É
possível, num exame diário de tim grande número de casos, não só de menopausa
mas também de adolescentes normais não menstruadas, descobrirmos cm que
extensão tal ocorrência existe c assim contribuir para esclarecer alguns aspectos
do fenômeno da menstnução.

Dessas considerações se deduz que a citologia vaginal em tais periodos de
transição não só é variável em relação ao nivel em que o ovário exerce a sua
atividade, mas também, numa mesma paciente, em relação às variações por que
passa essa atividade. Todavia, baseado num único exame, pudemos, de um modo
geral. eiKontrar nesses periodos dois tipos de esfregaços vaginais, a que deno-
minamos :

82

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

1. Esf regaço de epitélio vaginal sob pequena ação estrogênica, em que as
células epiteliais encontradas são, na grande maioria, ainda de tipo basal; em
número pequeno e variável, de tipo intermediário e superficial, com citoplasma
basóíilo e, mais raramente, acidófilo (Fig. 4). O número de leucócitos é variá-
vel e. de um modo geral, tanto maior quanto menor fôr a porcentagem de células
epiteliais superficiais existentes. A quantidade de muco é também variável e, nos
casos de menopausa, os esf regaços vaginais dêste tipo contém com frequência um
número maior ou menor de eritrocitos.

2. Esf regaço de epitélio vaginal sob moderada ação estrogênica, em que
predominam de modo nitido as células epiteliais superficiais, em grande maioria
com citoplasma basófilo e algumas vezes acidófilo. A picnose nuclear é rara.
As células de tipo basal e intermediário, principalmente as primeiras, são encon-
tradas em quantidade pequena e variável e os leucócitos, em geral, são abimdantes.
Xão há eritrocitos e a quantidade de muco é \-ariável (Fig. 5).

Os dois tipos de esfregaços mencionados representam, todavia, apenas dois
pontos de referência, necessários num estudo descritivo como o que estamos
fazendo, durante uma série crescente de modificações encontradas desde o esfre-
gaço de epitélio vaginal em repouso até o esfregaço de epitélio vaginal sob franca
ação estrogênica, encontrado na maior parte do ciclo menstrual da mulher adulta
normal, como veremos mais tarde. Sempre os encontramos em nossos casos de
adolescentes ainda não menstruadas, com exceção de um único, em que o esfregaço
era nitidamente de tipo folictilar, revelando ação estrogênica normal, exatamente
igtial à encontrada no meio do ciclo menstrual da mulher adulta normal ; neste
caso, as mamas e a genitália eram bem desenvolvidas, havendo regular número
de pêlos pubianos, e é de se pressupor que o ovário já estivesse desempenhando a
sua função em nível normal e que essa nossa paciente estivesse já em vésperas da
menarca, Não nos tendo sido possível acompanhar com exames repetidos êste
caso, não podemos, porém, tirar conclusões a respeito déle.

Os dois tipos descritos de esfregaços foram por nós também comumente
encontrados em casos de amenorréia, tanto primária como secundária, e nos pri-
meiros anos da menopausa. Papaxicolaou (21), baseado no exame da citologia
vaginal, propôs para as amenorréias em geral uma classificação em 3 grupos : a)
cm que o esfregaço vaginal é permanentemente atrófico, indicando ausência de
atividade ovariana; b) em que o esfregaço vaginal é permanentemente de tipo
intermediário entre o atrófico e o encontrado na mulher adulta normal, indicando
atividade ovariana subnormal c uniforme e c) em que o esfregaço \’aginal revela
a existência de modificações cíclicas e irregulares, imitando as que existem no ciclo
menstrual normal e traduzindo uma atividade ovariana periódica, todavia, insu-
ficiente para produzir a menstruação. Os casos dêste último grupo são em tudo
análogos aos de menopausa um pouco atrás relatados, em que foram demonstradas

Alvabo M\rcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprego em gine-
cologia endócrina.

83

varia(;ões periódicas no csfr^aço vaginal. Êste fato foi por nós também verifi-
cado cm u’a mulher solteira de 35 anos de idade, que apresentava amenorreia
secundária de 20 anos de duração e obesidade; de acordo com Papanicolaou,
deve-se supor que o ovário de tal paciente estivesse fimcionando cm nível subnor-
mal, provàvelmcnte sendo essa a causa da falta de menstruação. Em outro caso
de amenorreia secundária, no qual fizemos exames repetidos da citologia vaginal,
encontramos sempre esf regaços vaginais de tipo sob moderada ação estrogênica;
este mesmo caso. sendo tratado posteriormente pelos estrógenos, apresentou, ao
exame citológico do esfregaço vaginal, modificações caracteristicas de uma reação
folicular, s^uidas, alguns dias após à 3a. injeção de 10.000 U. I. dc benzoato de
estradiol, da eliminação de uma serosidade sanguinolenta. Neste caso havia con-
comitantemente obesidade do chamado tipo ovariano, antecedentes de hipo e oligo-
menorreia e esterilidade.

Na mulher adulta eumcnorrcica é gcralmentc admitido que o aspecto do
esfregaço \'agina1 varia periòdicamcnte. sendo cm número muito pequeno os auto-
res que negam a existência dc tais variações. discussão entre os autores começa,
entretanto, como já salientamos, quando se procura saber se tais variações periódi-
cas apresentadas pelo epitélio vaginal c consequentemente refletidas no exame do
fluido vaginal, estão ou não relacionadas com a função ciclica do ovário, como
acontece com a mucosa uterina que indubitavelmente apresenta uma fase de pro-
liferação e uma de secreção em cada ciclo menstrual normal.

Nos casos cumenorreicos, que examinamos diàriamentc durante um a dois
ciclos menstruais completos, constatamos sempre variações jieriódicas da citologia
vaginal que, por se terem repetido com as mesmas características durante cada
ciclo examinado e apresentado a mesma duração dele, consideramos correlatas à
função cíclica do ovário. Expcrimcntalmentc tal correlação já foi demonstrada
em macacas por Allex (25).

.•\ nosso ver, a dificuldade encontrada pelos autores que não puderam inter-
pretar essas variações, considerando-as pouco nitidas, de dificil interpretação e
não permitindo p'ecisar o que rcalmente está se passando no ovário, decorre do
uso dc métodos que não permitem uma boa diferenciação entre os elementos celu-
lares, como é o caso do primitivo método dc Papanicolaou (4), gcralmentc empre-
gado por todos e hoje substituído até mesmo pelo próprio autor (26, 27). Demos
preferência ao método dc coloração de Shorr (10). que toma bem evidentes tais
variações, corando o citoplasma dos elementos acidófilos (comificados, segundo
o autor) cm vermelho-alaranjado e o dos basófilos (não comificados. segundo o
autor) cm verde, mais intenso nos elementos mais jovens e mais pálido nos ele-
mentos mais diferenciados.

As rariações encontradas em nossos casos c cuja existência já mencionamos
serão descritas pormenorizadamente mais adiante, no estudo dc cada fase do ciclo

9

SciELO)

14

84

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIll

menstrual. O fato que nelas mais chama a atenqão é o aumento do número de
células acidófilas que ocorre durante a chamada fase folicular; o número dessas
células vai aumentando até atingir um valor máximo, mais ou menos no meio
do ciclo menstrual, para em seguida decrescer até atingir a um valor mínimo na
fase menstrual e no inicio da fase folicular seguinte. Tal fato tem sido encon-
trado também por outros autores (13, 28, 14) e portanto repetidamente confir-
mado. Papanicolaou (13) diz mesmo textualmente: “During the early part
of the follicular phase both basophilic and acidophilic superficial type cells are
well represented with the basophilic usually in the majority. As the follicular
reaction approaches its peak, the superficial squamous cells become larger and
more discret, while the acidophilic cells increase in number and often become
predominant”.

Para esse aumento do número de células acidófilas adotamos a sugestiva
denominação de Papanicolaoü, que se vê no texto citado, e que é a de “reação
folicular”. Durante a fase proliferati\'a ou pré-o\nilatória desse autor, o que há
é uma típica reação folicular. Essa reação êle a interpreta como sendo conse-
qüente a um aumento da quantidade de estrógenos cm ação sóbre o epitélio va-
ginal. Elxperimentalmcnte ela tem sido induzida por injeções de estrógenos em
casos de menopausa (16) e de amenorréia secundária, conforme relatamos um
pouco atrás.

Afim de documentar e demonstrar de uma maneira clara e objetiva as va-
riações da citologia vaginal por nós encontradas, fizemos, durante os ciclos mens-
truais normais que examinamos, a contagem diária dos elementos epiteliais com
citoplasma basófilo e com citoplasma acidófilo, afim de estabelecer o seu valor
percentual nas diferentes fases do delo. Tal procedimento já foi também em-
pregado por outros autores (14, 28). O seguinte gráfico traduz nitidamente
essas variações durante o delo menstrual normal de u’a mulher adulta cumonor-
rcica, com intervalos de 28 dias entre as menstruações. A porcentagem de cé-
lulas acidófilas é pequena tanto na fase menstrual, como nos dias subsequentes,
a grande maioria dos elementos epiteliais existentes nessa ocasião apresentando
dtoplasma basófilo. \ medida que decorrem os dias, o número de células aci-
dófilas vai. de um modo geral, com pequenas osdlações diárias, aumentando
até às proximidades do meio do delo menstrual, quando então apresenta um
aumento mais ou menos súbito que, no caso em apreço, foi de 27 para 66%
em 48 horas. O \'alor percentual das células acidófilas permanece nesse nivel
máximo por alguns dias, com pequenas oscilações, e daí por diante vai, de um
modo geral, através de grandes oscilações diárias, decrescendo, de sorte que na
fase menstrual seguinte existem no\'amente poucas células com dtoplasma
acidófilo.

A reação folicular traduz o aumento da taxa de estrógenos que se dá du-
rante o período de maturação folicular e o seu ápice, segundo Papanicolaoü,

Altaro Marcondes Silva — Gtologia vaginal e seu emprego em gine-
cologia endócrína. 85

traduz o momento em que a oiiTilação deve se dar. Por essa razão, é possível
que o súbito aumento do número de células addófilas encontrado neste caso
seja o reflexo de uma ruptura folicular recente, com consequente súbito aumento

Citt So ciclo

CaSrtco

VarÍK««« <Jo T»Ior p»««oto»l «U* imnaf vm ddo raMorWko d« JS o«».

Varíaúoot ia iW p*rt«ita»I t»!»* oI wóò n çk Mr crib daríac u rawaorrknc cjtU o( 2» d*r*-

da taxa de estrógenos no organbmo c mais intensa atis-idade estrogênka sobre
o epitélio s-aginal em constante descamaipo. Todavia, como tal fenômeno nem
sempre é encontrado, o aumento das células acidófilas se fazendo às vezes de

11

SciELO

3 11 12 13 14

86

Meznórías do Instituto Butantan — Tomo XVIII

modo gradual, não sabemos por enquanto qual seja a sua importância. O nú-
mero relativamente alto de células addófilas encontrado na segunda metade do
ciclo menstrual talvez seja devido ao fato de o corpo lúteo também secretar hor-
mônio estrogénico.

Não temos ainda elementos, isto é, um número suficiente de casos, para,
baseado neles, dividir o delo menstrual em fases e, por isso, adotamos a divisão
estabelecida por Papanicolaou (4, 13).

Durante todo o ciclo menstrual normal predominam as células de tipo su-
perficial. As células de tipo intermediário são às %-ezes encontradas em qual-
quer época do ddo e as de tipo basal só raramente e apenas durante o periodo
que vai do fim da fase pré-menstrual até o inido da fase pré-ovulatória seguinte.
Em virtude déste fato e por serem geralmente de citoplasma basófilo os ele-
mentos superficiais e.xistentes nesse periodo, os esfregaços \-aginais feitos na fa-
se menstrual e no inido da fase pré-o\’ulatória ou folicular, se assemelham aos
esfregaços de epitélio vaginal sob moderada ação estrogênkra e, como tal, podem
ser classificados, mesmo em se tratando de mulher adulta eumenorréica.

Os esfregaços vaginais feitos desde o fim da fase pré-ovulatória até quase o
fim da fase pré-menstrual seguinte, em que há um número variável de células epi-
teliais superfidais basófilas e addófilas e, às vezes, um número rariável de cé-
lulas intermediárias, constituem o que denominamos de esfregado de epitélio va-
ginal sob franca ação estrogênica. Neles o número de leiKÓcitos e a quantidade
de muco são rariáveis em relação às diferentes fases do ddo. As figuras 8,
9 e 10 são exemplos deste tipo de esfregaço, durante as várias fases do ciclo
menstrual.

Fase menstrual: Tem a duração de 7 dias e se inicia quando se notam
os primeiros sinais macroscópicos de menstruação; caracteriza-se nos três a qua-
tro primeiros dias pela perda macroscópica de sangue e, nos esfregaços vaginais,
pela existência de numerosas hematias.

A presença de hematias em outras épocas do delo só raramente é encon-
trada, exceto na chamada zona o\ulatória. onde foi descrita (4) uma pequena
hemorragia microscópica subseqüente à ruptura do foliculo e sôbre cujo signifi-
cado não há acórdo entre os autores.

Sob outros aspectos o esfregaço raginal da fase menstrual é análogo ao do
inido da fase pré-o\ulatória ou folicular a ser descrita logo a seguir. Êle pode
apresentar, todavia, de caracteristico, células do endométrio exfoliado. principal-
mente nos 2.° e 3.° dias quando o sangramento menstrual é mais intenso.
Essas células, quando isoladas, são difidimente reconhecivds, confundindo-se
com os histiocitos, e porisso as percebemos sob a forma de fragmentos de te-
ddo que uma vez encontrados têm ralor patognomônico para o diagnóstico
da fase.

12

cm

SciELO,

11 12 13 14 15 16 17

Alvabo Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprego em gine-
cologia endócrina. 87

Fase pré-ovulalória ou folicular: Tem a duraqão de cérca de 4 dias. ou
seja. dura do 8.° ao 12.° dia do ciclo. Predominam as células epiteliais super-
ficiais e, entre estas, as de citoplasma basófilo; todavia, à medida que se vai
aproximando o fim da fase, as células epiteliais superficiais com citoplasma aci-
dófilo vão gradati^^amente aumentando em número. Há também freqüentemente
células de tipo intermediário e, às vezes, apenas no início da fase, células de
tipo basal (Fig. 6).

À medida que aumenta o número de células acidófilas, as células vão se
tornando maiores e mais chatas e vai liavendo uma diminuição do tamanho do
núcleo, que tende a tornar-se picnótico (Fig. 7). Êsse aumento é, todavia, \-a-
riável e o número máximo de células acidófilas encontrado será maior ou me-
nor segundo éste ou aquele caso; Papaxicolaou fala apenas em predominância
(13), Rubenstein encontrou valores até 100% (28) e nós valores de 60 a 80^.

Xo início desta fase há uma grande quantidade de muco e numerosos leu-
cócitos, e à medida que se aproxima o fim rai havendo, geralmente, uma pro-
gressira leucopcnia.

Fase pós-ot'u]alória : Tem a duração de cérca de 5 dias, isto é, dura do
13.° ao 17.° dia do ciclo. Entre ela e a anterior estaria a zona de o\'uIação de
Papanicolaou, que se caracteriza por um súbito aumento da quantidade de leu-
cócitos e, às vezes, pela presença de uma hemorragia microscópica (4) ; estas
modificações são, todavia, de difícil constatação, não existindo ainda acórdo
geral em relação à sua existência.

Predominam como sempre as céluhs superficiais e o inicio da fase se ca-
racteriza por uma leve diminuição ou uma igualdade do \'alor percentual das
células acidófilas em relação à última verificação feita. De um modo geral, os
elementos basófilos vão gradati\amente aumentando em número e, cm virtude da
maior descamação existente, as células apresentam os bordos comumente do-
brados oferecendo um aspecto muito irregular, tendendo a se colocarem em gru-
pos. às vezes grandes, de células descarnadas. São frequentes as placas de cé-
lulas descamadas c a pienose do núcleo é ainda frequentemente encontrada. Os
leucócitos, a princípio escassos, tendem a aumentar cm número com o decorrer da
fase (Fig. 8).

Fase pré-menstrual: Tem a duração de cerca de 10 dias, isto é, dura do
18.° ao 28.° dia do ciclo. As células epiteliais superficiais basófilas predomi-
nam francamente sóbre as acidófilas e essa predominância é tanto maior quan-
to mais próxima a fase menstrual, embora seja variável, isto é, maior ou menor.
Com o decorrer da fase. A pienose nuclear é mais rara e \’ai gradualmente desa-
I>arecendo. O número de leucócitos é muito \-ariávcl, tanto maior quanto mais
próxima a fase menstrual (Fig. 9).

13

88

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVni

É difídl estabelecer um marco de separação entre esta fase e a anterior,
assim como é possível confundir-se um esfregaço feito nesta fase com outro
feito no início da fase pré-o^’ulató^ia. Por esssa razão, às vezes, são necessá-
rios 2 a 3 esfregaços consecutivos para se conseguir determinar a fase do ciclo.

^çâo dos andrógenos: A ação do hormônio andrt^ênico sôbre o epitélio
\'aginal se exerce em sentido contrário ao das substâncias estrogênicas e, porisso,
tem sido denominada de antiestrogênica. Tal ação foi pesquisada por vários
autores (28), tendo ficado demonstrado que ela determina em mulheres adul-
tas normais, a parada do fluxo menstrual e uma involução do epitélio vaginal
que se toma atrófico; estas modificações segundo os referidos autores podem
ser acompanhadas pelo exame da dtologia vaginal, onde se notará a transição
gradual do esfregaço de epitélio vaginal sob franca ação estrogénica da mu-
lher adulta normal para um esfregaço de epitélio vaginal em repouso ou sob
ação estrogénica nula.

A maneira pela qual os andrógenos exercem essa ação sóbre o epitélio va-
ginal ainda é discutida; se bem que pareça que êles atuem diretamente sôbre
o epitélio vaginal (29), é possível que a sua atividade se exerça inibindo a
ação gonadotrópica da hipófise, dêsse modo diminuindo indiretamente o esti-
mulo estrogênico sôbre o epitélio vaginal (30, 31).

Ação do fator gonadotrópico: A ação da fração gonadotrópica da hipófise
sóbre o epitélio vaginal se exerce através do ovário e é porisso idêntica à dos
estrógenos; ela já foi demonstrada na espécie humana por Shorr e Papa-
NICOLAOU (32).

O exame da citologia vaginal, em virtude da simplicidade de sua técnica,
pode ser utilizado rotineira e intensamente no estudo dos problemas concernen-
tes à fisiologia e patologia ovariana, permitindo não só uma melhor compreensão
das diversas ginecopatias endócrinas, como também uma terapêutica melhor o-
rientada das mesmas.

Assim, pelo seu estudo, nos é possível determinar o estado funcional dos
ovários em casos de amenorréias. tanto primárias como sectmdárias, e de me-
nopausa. A existência de variações dclicas nesses casos revela um ovário fun-
cionante mas não em grau suficiente para que a menstruação se dé.

A terapêutica estrogénica nesses casos poderá ser regulada pelo exame re-
petido da citologia vaginal, evitando-se conseqüentemente o emprego de doses
excessivas, superiores ás necessárias para a produção de uma reação folicular
tipica, que, de per si, bastaria ao tratamento, como já foi demonstrado para a
menopausa (16).

Alv.\ro Mkrcokdes Silva — Citologia vaginal e seu emprègo em gine-
cologia endócrína. 89

A terapêutica pelos hormônios gonadotrópicos também de muito se bene-
ficiará sendo acompanhada pelo exame da citologia vaginal; a falta de respos-
ta do ovário, no caso de uma glândula atrófica ou hipoplásica, assim como a in-
suficiência da dose empregada, poderiam ser precocemente descobertas pelo não
aparecimento das alterações de tipo folicular no esfregaço vaginal.

Xo tratamento androgênico das ginecopatias será útil, através dos esfre-
gaços \’aginais, determinar a dose necessária para induzir modificações atró-
ficas no epitélio vaginal e assim evitar o emprêgo de doses excessivas. Do mes-
mo modo, a castração radiológica poderá ser controlada e a^'aliada através das
modificações que aparecerem na citologia vaginal.

O método dos esfregaços vaginais tem ainda, ao que parece, uma grande
aplicação como meio de testar na espécie humana as substâncias estimulantes ou
inibidoras da estrogênese, à semelhança do que se faz para a tiróide dessecada,
cm que se empregam casos de mixedema com metabolismo basal baixo.

Xos problemas de esterilidade, êsse método pode ser usado para a deter-
minação da época em que a ovulação se deve dar. D’Amour (33), em traba-
lho recente, comparando diversos métodos utilizados para a determinação da
época da ovulação, dá grande valor ao método dos esfregaços vaginais.

No nosso entender o exame da citologia \aginal é um exame de real valor
c com múltiplas aplicações, das quais citamos apenas as principais; de um modo
geral, sempre que o estudo da função o\ariana se fizer necessário êsse método
poderá ser utilizado para refletir, de modo fácil e mais ou menos seguro, as
>ariações da taxa de substâncias estrogênicas, que, em última análise, traduzem
fenômenos que ocorrem nos ovários durante o cklo menstrual e particularmcnte
durante as diversas fases da vida sexual feminina. O exemplo mais recente
de um tal estudo é o do emprêgo dos esfregaços vaginais com o fim de tradu-
zir as alterações ciclicas da função o\'ariana para correlacioná-las com as alte-
rações que se operam no psiquismo e interpretadas â luz da psicanálise (23, 24).

SUMARIO

Foram relatados os resultados obtidos com o exame da citologia vaginal
humana durante o ano de 1943, na Seção de Endocrinologia do Instituto
Butantan.

Preliminarmente foi estudada a questão técnica, e então apresentada uma
raodiíicação da pipeta utilizada por Papanicolaou.

Os casos estudados foram os mais variados de modo a tomar possivel uma
visão de conjunto. Foram feitos exames em meninas em fase comproradamen-
fc prepuberal, em adolescentes, tanto normais como com atraso da menarca ou
<^oni amenorréia primária, em mulheres adultas cumenorrékas, em casos de ame-

15

í

90

Memórías do Instituto Butantan

Tomo XVHI

norréia secundária, pelo menos um dêles acompanhado repetidamente durante
o tratamento hormonal pelos estrógenos, em casos de menopausa e em alguns
casos de distúrbios menstruais.

Foi sugerida a classificação dos esfregaços vaginais encontrados em 4 ti-
pos gerais: 1.®) esfregaços de epitélio vaginal em repouso, isto é, não subme-
tido à ação estrogênica; 2.®) esfregaços de epitélio ^-aginal submetido a peque-
na ação estrogênica; 3.®) esfregaços de epitélio \-aginal submetido a moderada
ação estrogênica e 4.®) esfregaços de epitélio \-aginal sob franca ação estrc^ênica.

Foram encontradas, confirmando os achados de Papanicolaou, Rubexstein
e outros, modificações cíclicas da citologia vaginal durante o ciclo menstrual
normal, tendo sido possível, por meio da contagem dos diferentes elementos
celulares, tornar mais evidente a chamada reação folicular característica da épo-
ca em que a ovulação deve se dar.

Finalmente, com base nos resultados obtidos e no de outros autores, foram
analisadas as possibilidades do método como meio de estudar a função o>'ariana
e traduzir as variações da taxa de substâncias estrogênicas, durante o ciclo
menstrual e as diversas fases da vida sexual feminina.

ABSTRACT

The results with the vaginal smear technic in patients from the “Seção de
Endocrinologia do Instituto Butantan” are presented. The material was obtaincd
by using a curved glass pipette, a slight modiíication of that of Papanicolaou,
and stained by the Shorr’s method.

The cases studied were of normal prepubcnal or adolesccnts girls, with
delayed menarche or primary amenorrhea, adult eumenorrheic women, secondarj*
amenorrhea or others disorders of the menstrual cycle and menopause.

classification of the vaginal smears in four general types was suggested:
1 . ) smears from vaginal epithelium no submitted to estrogenic action, characte-
rized by cells of the outer tiasal type and numerous leucocjtes: 2) smears from
vaginal epithelium submitted to slight estrogenic action, characterized by an
increasing number of cells of the intermediate and superficial types with baso-
philic cytoplasm and vesiculous nucleus;- 3.) smears from vaginal epithelium
submitted to moderate estrogenic action, characterized by a greater number of
sui)erficial cells with still predominantly basophilic cjtoplasm and vesiculous
nucleus, and, finally; 4.) smears from vaginal epithelium submitted to full estro-
genic action, characterized by the greatest number of superficial cells with pre-
dominantly acidophilic cjloplasm and pienotie nucleus and a few leucocytes.

IG

Álvaro Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprego em gine-
cologia endócrina.

91

In the adult eumenorrheic women, cj-clic modifications of the vaginal dtology
"ere encountered, in agreement with the findings of Papanicolaou, Rl^bens-
teín and othcrs. The so called follicular reaction was evidenced by counting the
cells during all the cyde.

The possibilitíes of the vaginal smear technics a method of stud>-ing the
human o\-arian function through the variations in organic estrogenic leveis and
tts action in vaginal epithelium were considered.

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i8

Mem. Inst. Butantan

Álvaro Marcondks Silva — Citologia vaginal e sfu emprégo

em ginecologia enilócrina VoL xviii — 1944-45

Fic. 1

Pipeta dc ridro. Xotar o orifick» de ncapamento.
CbM pipette. Xote tbe opemnf (or air pa»«afe.

lü

SCÍELO3

13

Men. Inst. But^ntAn

Ai-Varo Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprégo

em ginecologia endócrina VoL xviii — 19-*4-45 .

Fig. 2

Ksfrcsaço de epitclio vasínal não »ubmetido à acão estrogcnica« obtido de menina ímpú*
bere. Pode ser encontrado também nos últimos periodos da menopausa. X 50.
Smear from vacina) eptthelium no submítted to estroftenic action, from .1 girl in the
prepubcrtal State. It is aiso found in the last periods of menopause.

Fic. 3

Esfregaço de epitélio vaginal não submetido ã ação estn^ênica, era maior aumento para
se verificar as células basais. X ãOO.

Smear from vaginal epithelium no submitted to estrogenic action in higber-power view,
to sec the outcr basal ccUs.

20

Mcm. Inst. Butantan

Álvaro Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprêgo

em ginecologia endócrina Voi. xvni — i9«-i5

Fic. 4

E»íreita«o de epitclio raciiul sob pequena aqjo e>tr<H^nica. oblido de uma mulber no
•ecumlo ano da roenopauu. t. encontrado lamtirái na adolexcncia. X 300.

Smear from vaginal epttbcliura submittrrl to slight evtrocenic action. from a vroman with
two jrears of menopauK. It is also (oond in adolescmt girli.

Fio. 5

Esfregaco de epitclio vaginal sob moderada agão cstrogênica obtido em ura caso de in-
suficiência ovariana (ameoorréia). fe lambem encontrado no inicio da mersopausa, na
adolescência e no inicio da fase prê-ovulalória. X 300.

Smear from vaginal epitbelium submitted to mofleratr estrogmic action, from a case of
°''**^** failure (amenorrbea). It is also foond in eatljr menopause, adolesceot giris and
in the first part of Ibe preesvulative phasc.

21

Mcm. Inst. Butant^n

Alvaho Marcondes Silva — Citologia vaginal e sea emprego

em ginecologia emlócrina Voi. xviii — 1944-45

Fic. 6

cpitélio ragínal sob moücratia açáo estrocêoica* óo início da fase pré-
OTuUtóría. Assinalaria vé-se uma célula intennediária. X ^00.

Smear from vai^nal epitbclium submitted to moderate estrofenic action, írom tbe earljr
part of the pre-orulative pbase. Tbe arrow sbows an intermediate celK

Fic. 7

Ksfrefcaco de epitélio vaginal sob franca acâo estro^ênica, do fim da fase pré-ovulatória
ou folicular, tradoaindo o ápice da reação folicular. Vêm-se sòmente células superficiais,
a irrande maioria com núcleo cariopicnótico e citoplasma acidófilo. X 300.

Smear from va^niutl epitbelium submitted to futl estroeenic action, from tbe end of tbe
pre-ovutatisT or follicular pbase, correspondinit to the peak of tbe follicular reaction. Tbere
is onljr superficial cells in tbe vicw, tbe great majority witb ptcnolic nucleus aml acirlo-

philic c^toplasm.

SciELO

Tnst. Butantan

Alvabo Marcondes Silva — Citologia vaginal e seu emprego

em ginecologia endócrina

Vol. XVIII — 1944-15

Fig. 8

Esfrciraço dc rpitclio *ob franca acão cstroccnica, da fa»c poft^nruUtória. Nota*se

(Cramlc número de células dot>radas, tra<luxindo KC^nde descamacáo. X <100.

Smear from vaginal ctnthelium suhmittrd to full estrogenic action, from the piMt-ovuIalory
phasc. Tberc is a greater number of foldcd cells corresponding to great dcscamation.

Fic. 9

Esfregado de epitélío vaginal sob franca a<ão estrngénica da fase pré*menstruaK Notar o
grande número de leucócitos. X ^00.

Smear from vaginal rpitbelium suhmitte«l to full estrogenic aclion. from the premrnstrual
t>hase. Tbere is numerous leococytes.

1 SciELO

ÍL^iicoxdes Silva — Citologia vaginal e seu emprego Mrm. Inst. Buuntan
em ginecologia endõcrina

Vol. XVIII — 19-M-«5

Fic. 10

trtclm a corc» ilas roicn>fo(acraria» aprrwntailat. O nútiKfo ao lado c o momo da fÍKura
mkrololotrafia cormponlrntc. 0« número* J, 4. 5 c 7 Iradaicm o* 4 tipo* fcrai* de nfresao»

eaxinait, a saber:

3 — E»frt*aço de eptlélio eaginal em repouso.

4 — Esfrecaco de eptlélio racinal suliiDelitla a pequena ação estronénira.
í — Eíírega^o de eptlélio Tafinal submetido a moderada aqão esln«éniea.

' — Esfregado de epilélio raginal submetido a franca ação estrogénica.

números 5, 7, 8 c 9 traduaem as modificações ciclicas da cilologia raginal durante o ciclo mrnslru.tl

ooTToa]:

5 — Início da ía»c prc>orulatórtas

7 — Fim da fase prê^rulatôria oa ipkr da reaçôo íoltcular, indicando o
momento cm <]oe a omlação dcire ac fiar.
í — Fas« poat-ovulatóría.

9 — Faae prc-mcnstrual.

O,

*

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

cm

ífc/aL.L.Tf SCÇAf.

efeitos de um extrato pré-hipofisario sôbre as
adrenais e o timo de camundongos infantis (♦)

POR

L. MILLER DE PAIVA

(Z7o Laboratório de Endocrinologia do Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

Os estudos sóbre as correlações entre a adrenal, a hipófise e o timo, bem
como os trabalhos recentes sôbre o hormônio corticotrópico (1-3), induziram-nos
à revisão da atividade corticotrópica de um extrato de lobo anterior de hipófise
bovina. O teste mais seguro para o hormônio em apreço é o da manutenção ou
recuperação do pêso das adrenais de ratos hipofisoprivos (4) ; dada, porém, a
dificuldade de se dispor de elevado número de animais nessas condições, procu-
ramos verificar aquele efeito em camundongos infantis, já empregados, entre
outros, por Jores (5), na pesquisa do referido hormônio no sangue de hiper-
tensos.

m.ateriae e Métodos

Empregamos neste trabalho 331 camundongos infantis, repartidos cm 4 lotes:
a) 100 machos e 78 fêmeas para a determinação do peso normal das adrenais ; b)
40 machos e 80 fémeas normais, tratados; c) 15 machos castrados e, íinalmente,
d) 10 machos e 8 femêas castrados e adrenalectomizados.

À exceção do primeiro lote, os demais foram tratados ou com sôro fisioló-
gico ou com uma solução de extrato de lobo anterior de hipófise bovina, preparado
neste Laboratório, de acordo com o método de Bates e Riddle (6) . Tal extrato,
nsado como ponto de partida para a obtenção da prolactina, possui também consi-
derável atividade corticotrópica.

Os animais recebiam duas injeções subcutâneas diárias de 0.25 cm* durante 4
dias e, no 5.® dia, depois de pesados em jejum c sacrificados com éter, eram as
ndrenais e o timo desembaraçados dos elementos conjuntivos e pesados em balança

(*) Agradecemos i Diretoria do Instituto Butantan as facilidades concedidas e ao Dr.
J- R. DO Vaux, pela orientação e estímulo durante o estágio que fizemos na Secão de En-
4ocnnologia do referido Itutituto.

1

cm

SciELO

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102

Memórias do Instituto Butantan

Tomo X\TII

\

de torção. Os animais não operados pesaram à autópsia de 7 a 14 g e os opera-
dos de 10 a 17 g, e isto por decorrer certo tempo, em média de 8 dias, entre a
operação e o inicio do tratamento.

Os camundongos adrenoprivos eram mantidos em boas condições numa dieta
rica em cloreto de sódio. As doses do extrato correspondiam ao total individual
de 10, 15 e 20 mg da preparação sêca.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

Os pesos médios das adrenais e do timo nos diferentes grupos experimentais
figuram na tabela 1.

Tabela I

Gro-

pos

Sexo

CofKÜçOet

N .• de
aoi*

mais

Péso

corp.

m4d»o

((C*

Tratamento

P4so em mg.

Adre"

naís

Timo

A

<í

NonxuU

lOO

9.8

Nihil

3.1

B

9

78

9 3

Nibil

3.9

C

cf

30

10.7

Sdro fisioló|(i^o

3.7

32.6

D

d

10

9.7

Extr. t. aateríor (15 mg)

4.3

10.1

E

9

**

40

10.1

Sàto fisiológico

3.8

39 4

F

9

W

1081

Extr. 1. aiwerior (10 mg)

6.1

21.8

G

9

f*

10

8.9

. . . (is m{c)

5.1

8.9

(i

9

«•

10

9.8

. . „ (20 m«c)

5.3

12.1

1

O

Costradot

7

14.7

Sóro fisiológico

4.0

43.1

J

e

Castrados e Adrenoprirot

5

10.8

..

—

61.0

K

0

Castrados

8

12.7

Extr. 1. anterior (15 mg)

7.1

17.1

L

ê

Castrados e AdreaoprÍTos

5

10.2

, . (15 mgi

—

71.0

M

9

«* <• ••

4

10.0

Sôro fisiológico

—

54.3

N

9

m *9 <•

4

12.0

ExU. I. uichor (15

41.3

Os resultados, nos grupos de camundongos normais, mostram que em 248
dêles, pesando em média 10 g, não tratados, ou, então, injetados com sôro fisio-
lógico. as adrenais pesaram, em média, 3.6 mg e o timo 36 mg. Dos 50 camun-
dongos normais, 10 machos e 40 fêmeas, com peso corporal médio de 9.6 g, tra-
tados com extrato pré-hipofisário, as adrenais e o timo pesaram, respectivamente,
5 e 13 mg. Vê-se, pois, que o extrato empregado aumentou as adrenais e dimi-
nuiu o timo dos animais tratados. No grupo de machos castrados os efeitos da
corticotropina sóbre as adrenais foram ainda mais pronunciados. A diminuição
do pêso do timo como conseqüência do tratamento não foi observada nos animais
adrenalectomizados, o que se interpreta por não ser direta a ação da corticotropina
sóbre o timo.

2

L. Miller de Paiva — Efeitos de um extrato pré-hipofisário sôbre as

adrenais e o timo de camundongos infantis. 103

Para se aN^aliar o efeito do tratamento dos camundongos castrados e adreno-
privos, reproduzimos na Tabela II a variação individual do pêso do timo. A dife-
rença entre as médias registradas para os dois grupos, 61 ± 8 mg para os teste-
munhas e 71 ±21 mg para os injetados com extrato, não é estatisticamente
significativa. A corticotropina, por conseqüência, não modifica o peso do timo
na ausência da supra-renal.

Tabela II

Camundongos castrados c adrcnalcctomizados

No

PíM)

COfp.

(K)

TnUmetiio

Píxo
do (Imo
(mg)

!

11

0.2Scm’ dc Bôro fisioldgico, 2 Tnet ao dia darante 4 dias.

SI

3

11

..

69

7

11

0 .

60

11

11

69

13

10

-

S6

9

10

0.25cm3 Extr. 1. antehor 2 ▼esea ao dia doraolc 4 diat (Total 15 ibk).

S4

U

10

•

94

13

10

«•

36

16

11

•

93

17

10

-

58

O fato da atrofia timica se obser\’ar nos camimdongos normais ou castra-
dos, mas não nos adrenalectomizados, parece indicar que o extrato injetado atuou
por intermédio da cortical da glândula supra-renal, como, aliás, já foi demons-
trado em ratos infantis, entre outros, por Moon (7). Como já se conhece o
efeito dos hormônios sexuais diminuindo o tamanho do timo (8), é provável
tloe o aumento do hormônio cortical seja o responsável por aquela ação, suben-
tendido que o hormônio cortical é tomado aqui na acepção de grupo dos hormô-
t>ios esterólicos.

Do que ficou exposto é lícito concluir que o extrato de lobo anterior de
hipófise bovina empregado nestas experiências : a) aumentou até de 50% o pêso
das adrenais de camundongos infantis dos dois sexos e até de 80^ o de machos
Estrados; b) diminuiu o pêso do timo cm normais e castrados; c) não dimi-
nuiu o pêso do timo nos adrenoprivos, o que parece indicar ser o efeito precedente
tuediado pela córtex da adrenal.

cm

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104

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVm

RESUMO

Foram estudados os efeitos de uma preparação de lobo anterior de hipófise
borina sôbre as adrenais e o timo de camimdongos infantis, registrando-se hiper-
trofia das adrenais e diminuição no tamanho do timo. Este último efeito não foi
obser\'ado em animais adrenalectomizados, o que sugere ser êle indireto, mediado
pela córtex supra-renal.

ABSTRACT

Hypertrophy of adrenais and reduction in size of thj-mus in infantile mice
were observed following the treatment with an alkaline extract of bovine anterior
hypophysis. The thjmiotrophic effect «•as not obtained in adrenalectomized
animais, therefore being mediated through the adrenal córtex.

The hypophyseal, adrenal and thj-mic relationships are discussed.

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(Recebido para pnblicaçSo em norembro de 1944).

4

NOTAS OFIOLÓGICAS

18. A posição do gênero Rhadinaea em sistemática (Continuação),

POR

ALCIDES PRADO

{Do Laboratório de Ofiologia e Zoologia Médica do Instituto Butantan,
São Paulo, Brasil)

Depois de me referir em trabalho anterior às espécies do género Rhadinaea,
Rh. affinis, Rh. poccüopogon e Rh. beui, passo a redescrever Rhadinaea occipi-
talis (JAN), que, como as ciladas, parece enquadrar-se nêsse mesmo gênero, por
seus caracteres gerais, dentários e hemipénicos. Esta espécie ocorre em quase
todo o Brasil e países limítrofes.

Rhadinaea occipilalis (Jan)

in Arch. Zool. Anat. Phys. 2:267.1863.

Dentes maxilares cérca de 16, aumentados gradativamente de tamanho de
diante para trás, separados dos dois últimos, pouco desenvolvidos, por um curto
inteiA-alo ; dentes mandibulares subiguais.

Cabeça proporcionalmente alongada, não muito distinta do pescoço, com
focinho arredondado; ôlho moderado, com pupila redonda. Corpo cilíndrico;
escamas lisas, sem fossetas apicilares. Cauda moderada ou longa, com ponta
«tfilada.

Rostral mais larga do que alta, apenas visível de cima; internasais mais largas
do que longas, porém mais curtas do que as prefrontais; prefrontais também mais
largas do que longas ; frontal quase 2 vézes tão longa quanto larga, mais longa do
que sua distância da extremidade do focinho, mais curta do que as parietais;
estas últimas tão longas quanto sua distância das internasais; loreal um pouco
mais longa do que alta ; 1 pré- e 2 postoculares ; 1 -{- 2 temporais; 8 supralabiais,
eom 3*, 4* e 5* junto ao ôlho; 4 infralabiais em contacto com a mental anterior,
que é geralmente mais curta do que a posterior. Escamas em 15. Ventrais 160
® 194; anal dividida; subcaudais 55 a 81, pares.

cm

SciELO

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106

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XYIII

Cauda aproximadamente entre um terço a um quinto do comprimento total.
Pardo-olivácea, em cima, com duas séries de manchas arredondadas, negras, areola-
das de claro e, por vêzes, confluentes sôbre o dorso; lados cinza-escuro; cabeça
enegrecida, com um traço negro através dos olhos e uma estria dara, cantai, late-
ralmente; partes inferiores branco-amareladas, ornada de um ponto negro sôbre
cada uma das extremidades das ventrais; labiais, mentais e guiares, quase sem-
pre portadoras de vermiculações negras.

Hemipénis mais alongado do que em Rh. affinis e Rh. poecilopogon, capitato,
não dividido, com cálices mais ou menos papilosos no ápice; sulco bífido; densa-
mente crirado de espinhos na parte posterior, onde há três outros basilares, sendo
um mais desenvolvido.

RESUMO

Nesta nota, redescreve-se a espéde Rhadinaea occipilalis (J--\N), que ocorre
em quase todo o Brasil e países limítrofes. Por seus caracteres gerais, dentários
e hemipênicos, parece a mesma enquadrar-se no gênero Rhadinaea, como as demais
estudadas em trabalho anterior.

.•\BSTR.\CT

In this paper the species Rhadinaea occipitalis (J.AN) is redescribed. It
occurs throughout Brazil and bordering countrics. By its general characteristics,
dental and hemipenic, it seems possible to place it in the genus Rhadinaea, together
with other ones studied in anterior papers.

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107

Rhadinaea occipitalis (Jan)

Etpí-

cimes

N‘o$.

ProcedeocU

e

M

fc.

90

E.

V.

A.

Sobe.

Labiais

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S«nto André, S. Paolo .

9

15- 15-13

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98

4

1

2

514

124

7Õ39

Casa Branca, S. Paolo

,

9

15-15-13

191

li

6969

S

4

1

2

566

126

9119

Campo Limpo, S. Paulo .

.

9

15-15-13

181

1/1

71.71

s

4

1

2

450

104

SS55

S. José Campos, S. Paulo

.

9

15-15-15

194

11

68 68

8

4

1

2

587

131

93»

Campinas, Goiás . . .

.

9

15-15-15

1S6

1/1

74 74

8

4

1

2

551

138

1733

Pelotas, R. G. do Sul

.

9

15-15-13

187

1 1

59 59

8

4

1

2

535

91

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Capital, S. Paolo . . .

O*

15-15-13

175

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81.81

8

4

1

2

42S

122

501

Terezioa, Ptaol ....

9

15-15-15

172

l/l

7171

S

4

1

2

320

80

1791

Pelotas, R. G. do Sul

.

9

15-15-15

179

11

75 75

8

4

1

2

430

96

IM

Anápolis, & Paulo . .

.

c?

15-15-15

175

1/1

77.77

8

4

1

2

515

129

007

Caçapaea, S. Paolo . .

.

9

15-15-15

191

1.1

5355

7j«

4

1

2

572

110

U27

Dutantan, S. Paolo . .

.

d“

15-15-13

176

11

6767

8

4

1

2

538

132

9996

Rocinha, S. Paolo . . .

9

15-15-15

177

1.1

7171

8

4

1

2

435

106

10021

Aimorés, S. Paolo . . .

9

15-15-15

181

11

7171

8

4

1

2

465

115

1021S

Tambad, S. Paolo . . .

9

15-15-15

179

11

7171

S

4

1

2

569

154

1246

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,

í

15-15-13

169

1.1

6969

87

4

1

2

417

112

9633

Capital. S. Paulo . . .

.

9

15-15-15

18U

l/l

68,68

8

4

1

2

506

117

4306

Caçapava, S. Paolo . .

,

9

15-15-15

194

11

6666

8

4

1

2

549

121

1403

7 , Bahia .

,

9

15-15-15

160

11

7171

8

4

1

2

371

100

1404

? , Bahia .

,

d“

15-15-15

161

11

74 74

8

4

1

2

395

118

<873

Butaolao, S. Paolo . .

,

9

15-15-15

185

11

73 73

8

4

1

2

231

53

06

Bntanlan, S. Paulo . .

.

9

15-15-13

187

11

73,73

8

4

1

2

541

133

92Ô8

Roxo Rou, Paraná . .

.

9

15-IS-15

184

11

69,69

8

4

1

2

475

114

569

Terexina, Paiol ....

9

15-15-15

173

11

75,75

8

4

1

2

428

115

8734

Campinas, Goiás . . .

.

9

15-15-15

184

11

78,73

8

4

1

2

506

121

1241

Capital, S. Paulo ...

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15-15-13

177

11

7373

8

4

1

2

421

107

6199

Capital, S. Paolo . . .

<?

15-15-15

179

11

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8

4

1

2

468

120

153

Dutantan. S. Paolo • .

.

9

15-15-15

181

11

7575

8

4

1

2

346

85

826

Bulanlan, S. Paulo . .

.

9

15-15-13

187

11

7171

8

4

1

2

506

118

7156

Rinc&o, S. Paolo . . .

9

15-15-13

188

11

6968

8

4

1

2

494

116

1242

Capital, S. Paolo . . .

9

15-15-15

181

11

71,71

8

4

1

2

404

96

9753

Orláodia, S. Paolo . .

.

9

15-15-15

184

11

6868

8

4

1

2

555

128

6714

Ptnda, S. Paulo . . .

9

15-15-13

179

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7575

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1

2

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C. Cesar, S. Paulo . .

•

9

15-15-13

1»

11

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C. Largo, S. Paolo . .

.

9

15-15-15

179

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1

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S. Bernardo, S. Paolo .

.

cf

15-15-13

179

11

69 69

8

4

1

2

402

96

9100

Campo Limpo, S. Paolo

,

í

15-13-13

173

11

79,79

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2

538

142

5204

C. do Pinhal, S. Paulo .

.

9

15-15-15

183

11

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2

469

117

8337

Campo Limpo, S. Paolo •

.

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15-15-13

181

11

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Campo Limpo S. Paolo ,

.

9

15-15-15

199

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7171

8

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1

2

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122

9763

Jacaré, S. Paolo • • •

9

15-15-13

ISO

11

79.79

8

4

1

2

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NOTAS OFIOLÓGICAS

19. Atractus da Colômbia, com a redescrição de três novas espécies.

POR

ALCIDES PRADO

(Do Laboratório de Ofiologia e Zoologia Médica do Inslilulo Bulanlan,
São Paulo, Brasil)

De um lote de serpentes, enviado da Colômbia, em 1943, pelo revmo. Hermano
Daniel, do Colégio de San José, de Medellin, duas espécies se destacaram, sendo
as mesmas aqui redescritas. No mesmo ano, de outro lote, remetido pelo revmo.
Hennano Niceforo Maria, do Instituto de La Salle, de Bogotá, foi possível des-
crever-se mais uma como nova, que agora é aqui também redescrita.

Atractus andinus Prado

9 — Fodnho arredondado. Rostral mais larga do que alta, pouco visível
de cima; intemasais pequenas, tão largas quanto longas; prefrontais grandes,
também tão largas quanto longas; frontal mais larga do que longa, mais curta
do que sua distância da extremidade do focinho ; loreal 2 vezes tão longa quanto
alta; 2 postoculares ; 1 -f- 2 temporais; 7 supralabiais, com 3* e 4* junto ao
ôlho; 3 infralabiais em contacto com a mental. Escamas lisas, sem fossetas api-
cilarcs, cm 17; ventrais 174; anal inteira; subcaudais 37/37.

Pardacenta em cima, com u’a linha negra vertebral, orlada de manchas arre-
dondadas, da mesma côr, em toda extensão, paravertebrais ; pontilhados negros
paraventrais, formando como que uma listra longitudinal, de cada lado; cabeça
enegrecida, porém desmaiada nas têmporas; lábios e partes inferiores manchados
de pardo-negro.

Comprimento total 287 mm; cauda 37 mm.

Holotipo, adulto 9, sob o No. 231, na coleção do Colégio de San José, de
Medellin, Colômbia.

Procedência : Andes.

Afim de Atractus maculatus (Günther), do qual se distingue pelo número
de ventrais e subcaudais e pelo colorido geral.

1

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMII

Atractus sanguineiu Prado

á — Fodnho arredondado. Rostral cêrca de 2 vêzes tão larga quanto alta,
pouco visível de cima; internasais pequenas, tão largas quanto longas; prefrontais
grandes, também tão largas quanto longas ; frontal pouco mais larga do que longa,
mais curta do que sua distância da extremidade do focinho; loreal cêrca de 3
vêzes tão longa quanto alta ; 2 postoculares ; 1 -r 2 temporais ; 7 supralabiais, com
3“ e 4“ junto ao õlho: 3 infralabiais em contacto com a mental; Escamas lisas,
sem fossetas apiedares, em 17; ventrais 179; anal inteira; subcaudais 43/43.

Vennelho-sanguinea em cima, onde sõbre a linha mediana corre um traço
negro, ladeado em toda extensão por manchas arredondadas da mesma côr, para-
vertebrais; cabeça enegrecida; partes inferiores branco-amareladas, salpicadas de
pardo-negro.

Comprimento total 424 mm ; cauda 58 mm.

Holotipo, adulto i , sob o No. 232, na coleção do Colégio de San José, de
Medeilin, Colômbia.

Procedência: Yarumal (N. de hledellin).

Próxima à anterior, da qual se separa por um número ainda mais ele\'ado de
ventrais e subcaudais, pelo alongamento da loreal e pelo colorido geral.

Atractus wagleri Prado

9 — Focinho arredondado. Rostral pouco mais larga do que alta, apenas
visivel de cima; internasais muito pequenas, tão largas quanto longas; prefrontais
muito grandes, tão largas quanto longas; frontal tão larga quanto longa, pouco
mais longa do que sua distância da extremidade do focinho; loreal 2 vezes tão
longa quanto alta ; 2 postoculares ; 1 -j- 2 temporais ; 7 supralabiais, com a 3* e 4“
junto ao ôlho; 3 infralabiais cm contacto com a mental. Escamas lisas, sem
fossetas apicilares em 17-17-17; ventrais 174; anal inteira; subcaudais 43/43.

Avermelhada em cima, com fabcas transversais e irregulares sõbre o dorso,
flanqueadas por outras menores, alternadas; cabeça enegrecida; ventre pardo-
negro.

Comprimento total 411 mm; cauda 56 mm.

Holotipo, adulto 9 , sob o No. 228, no museu do Instituto de La Salle, de
Bogotá, Colômbia.

Procedência: Humbo (Boj^acá).

.■\fim de Atractus sanguincus, do qual se distingue pelos seguintes caracteres:
pela rostral que é pouco mais larga do que alta e não 2 vêzes tão larga quanto

2

Alcides Pa\DO — Xotas Ofiológicas. 19. 111

F. Prado Jr., A. Taborda & L. C. Taborda — Ensaios terapêuticos com

alta; pela frontal que é tão larga quanto longa e não pouco mais larga do que
longa; pela loreal que é 2 vêzes mais longa do que alta e não três vêzes; e,
finalmente, pelas variações de colorido.

O nome desta espécie foi dedicado à memória de Jean Wagleb, conhecido
naturalista, e criador do gênero Atraclus.

RESUMO

Redescrevem-se os Atractus andinus Prado e Atracius tanguineus Prado,
procedentes, respecti^-amente, de Andes e Yarumal, na Colômbia, e posteriormente
Atractus wagleri Prado, próxima à segunda daquelas, e proveniente de Humbo
(Boj-acá), no mesmo pais.

ABSTRACT

Atractus andinus Prado and Atractus sanguincus Prado, provenient respecti-
vely from the Andes and Yarumal, in Colombia, are redescribed, followed by
Atractus uxtgleri Prado, which resembles the latter and carne from Humbo
(Boj-acá), in the same country.

BIBLIOGRAFIA

^oulengcf, G. A. (1894). Cat. Sn. Brit. Mus., 2:306.
Prado, A. (1944). Ciência (México), 5(4-5) :111.
Prado, A. (1945). Géncia (México), 6(2) :61.

(Rcccbi<lo parm publicacSo no 6 d« mat^o de 1944).

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Atrtutms ãndinns Prado

UroítMi súmçutneus Prado

Atr€ctvs infflen Prado

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Alcides Prado — Xotas Ofiológicas

19

Mcm. Inst. Butantan

Vol. XVni — 1944-45

ensaios terapêuticos com a penicilina preparada

NO INSTITUTO BUTANTAN (*)

FOR

F. PRADO JR.. A. TABORDA & L. C. TABORDA

(Doj Laboratórios de Conlrõle e de Química do Instituto Butontan, São Paulo, Brasil)

No presente trabalho referimos as observações clínicas pormenorizadas de
seis casos graves tratados com a penicilina preparada no Instituto Butantan.(**)
Foi nosso objetivo verificar a atividade terapêutica do produto fabricado em
pequena escala, afira de assentar uma base segura para eventualmente empreender
o preparo da penicilina em escala industrial.

Em virtude do fato de dispormos apenas de uma produção limitada, rescr-
'^os o emprego da penicilina por nós preparada a casos extremamente graves,
que, por já haverem falhado outros recursos terapêuticos, bem pudesseraos
^'■aliar d:^ eficácia do nosso.

MATERIAL E MÉTODOS

.A penicilina obtida e purificada em Butantan, sob a forma de sal de bário,
^oi dissolvida em sôro glicosado isotônko, de maneira a dar imia concentração de
a 2000 unidades Oxford por centimetro cúbico e empregada pelas vias venosa,
intramuscular ou subcutânea. Para aplicação local usamos quer uma solução de
de bário contendo 100 u. 0. por centímetro cúbico ou o próprio caldo de
<niltura do cogumelo, dosando 20 u. 0. por cm^, com o fim de economizar o sal,
que ficava reservado para as injeções.

A quantidade total de unidades administrada variou de um caso a outro,
nscilando entre 30000 e 200000 u. 0. em 24 horas. Doses adequadas para deter-
nunadas infecções mostraram-se completamente ineficázes para outras.

(*) Trabalho auxiliado por uma subTcnção dos Fundos Universitários de Pesquisas.

(**) As pesquisas relativas às condições de preparo e aos ensaios de produção senii-
•ndustrial de penicilina foram comunicados à Associação de Quimica do Brasil na sessão de
de novembro de 1943, por Taborda, Tabobda & Prado Jb..

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMII

O tratamento foi sempre iniciado por meio de injeções venosas, pois todos
os casos eram de natureza grave e de prognóstico reser\'ado. O sal de bário era
dissolvido em 250 cm* de sôro glicosado isotônico e administrado gota a gota na
veia, s^uido de outras doses no músculo ou na veia em inten^dos regulares de
4 horas, dia e noite, afim de manter uma concentração suficiente de penicilina no
sangue, compensando a rápida eliminação urinária do medicamento.

As injeções venosas foram sempre de uma tolerância perfeita, ao passo que
as injeções intramusculares produziram, em certos doentes, dôr «va local, especial-
mente si as injeções eram feitas em regiões próximas.

OBSERVAÇÕES CLINICAS

1 . Infecção puerperal — M. J. R., brasileira, 24 anos, casada, preta, doméstica.

Histórico — Parto normal, realizado no Hospital Municipal cm 23-1-44. Priraigcsta. Um
ponto de sutura no períneo. Alta em 27-1-44. Xo dia 9 de fevereiro deu entrada
novamente no Hospital, queixando-se de dôr no baixo ventre, temperatura de 39°C
e 160 pulsações por minuto. Apresentava defesa abdominal e supuração do ponto
cirúrgico do perinca A doente informou ter realizado lavagens vaginais (sic).

Diagnóstico — Endometrite. Parametríte puerperal. Septicemia (Dr. 3IiIton Olinto de
Arruda). *

Tratamento — Cibazol (1 comprimido de 3 em 3 horas). Soluseptazine (1 empola diaria-
mente na veia). Cardiazol e efedrina.

10- 2-14 — Temperatura 38®C Pulso, 140. Defesa abdominal. Vômitos. Ci-
bazol e Soluseptazine. Gelo no baixo ventre e poção de Rivière.

11- 2-44 — Temp. 39.8®C, pulso, 142. Transfusão de 10 cm* de sangue. Ve-
rítol (1 empôla cada 4 horas). Coramina e vitamina C (500 mg). Cibazol e So-
luseptazine.

12- 2-44 — Temp. 37.8°C, ptilso 64. Estado geral ruim. Veritol, Coramina»
Kecroton. 250 cm* de sôro glicosado isotônico. Cibazol e Soluseptazine.

12-2-44 — Temp. 38®C, pulso 120 (pela manhã). Transfusão de 150 cm* de
sangue. 250 cm* de sôro glico-fisiológica Veritol, Cbazol e Soluseptazine. As
20 horas a doente tinha o seu estado agravado, entrando em colapso periférico.
Temp. 35.2®C, pulso filiforme, incontável. Suspendeu-se a administração de sulfa-
midicos e iniciou-se o tratamento pela penicilina. 50 000 unidades Oxford dissolvi-
das em 250 cm* de sôro glicosado a 59^, em transfusão continua na veia. .^pôs
uma hora de transfusão continua, foram administradas mais 50000 unidades db-
solWdas em 250 cm* de sôro glicosado isotônico em transfusão continua no músculo.

14-2-44 — Às 2 horas, 50 000 unidades em 250 cm* de sôro glicosado, por via
subcutânea. As 10 horas, 10000 unidades na veia. Temp. 36.4°C, pulso 120. As
15 horas, 20 000 tmidades na svia. As 19 e às 23 horas, 10000 imidades.

2

F. Prado Jr., A. Taborda & L. C. Taborda — Ensaios terapêuticos com

a penicilina preparada no Instituto Butantan

117

15- 2-44 — TempL 36.5“C, pulso 100. Transfusão de 100 cm* de sangue. As 3,
7 e 16 horas, 10000 unidades de penicilina. Às 20 horas, 12000 unidades, sendo
10 000 em 250 cm* de soro glicosado na veia e 2 000 no músculo. As 23 horas,
10 000 unidades por via muscular.

16- 2-44 — Temp. 37.2®C, pulso 120. As 4 e 8 horas, 10000 unidades por sna
muscular. As 16, 20 e 23 horas, 2000 imidades por via muscular.

17- 2-44 — Temp. 377®C, pulso 110. As 4, 8, 12 e 15 horas, 1 500 imidades por
i-ia muscular. As 23 horas, 1 500 unidades por \-ia muscular e 3 000 unidades dis-
solvidas em 250 cm* de sôro glicosado, por via subcutânea.

18- 2-44 — Temp. 37.2®C, pulso 120. A começar das 4 horas até 24 horas, 1 500
unidades por via muscular de 4 em 4 horas.

19- 2-44 — Temp. 37®C, pulso 100. A mesma dose de penicilina do dia anterior.

20- 2-44 — Temp. 37.2°C, pulso 110. Suspendeu-se a administração da peni-
cilina. Não recebeu outra medicação qualquer.

21- 2-44 — Temp. 36.2°C, pulso 84. Sôro glicosado e vitamina C.

22- 2-44 — Temp. 37.2“C, pulso 94. l^Iacissez na base do pulmão direito.

Diagnosticada uma basite de decúbito. Cálcio e viumina C Extrato de fí-
gado. Sôro gUcosado bipertônico.

23- 2-44 — Temp. 37.5®C, pulso 82. Mesma medicação do dia anterior.

24- 2-44 — Temp. 38®C, pulso 100. Radiografia dos pulmões: opacidade da
base direiu, com apagamento do seio costo-diafragmático (Dr. Rafael de Lima Filho).
Gluconato de cálcio e \-itamina C. .^nemotrat forte.

No dia 28, a paciente não apresenta\-a febre, começando a lei-antar-se do leito,
fazendo pequenos exercícios diários. .■X medicação pelo cálcio e vitamina C pro-
longou-se até o dia 5-3-44. Recebeu alta em 6-3-44.

Exames de laboratório — Exame de fites (em 12-2-44) : raro* ovo* de etscaris.

Tifo sanguíneo: 1 (Moss).

Hemocultura (18-2-44): negativa, apôs ter recebido 286 000 unidades Ox-
ford de penicilina.

Hemograma (3-3-44) (Dr. Gusuvo Fleury da Silveira Filho) :

neutrófilos

leucócitos por ram* ..

4.700

segmentados

82%

bastonctes

...... 1%

metamielocitos

0%

eosinófilos

basôfilos

monódtos

2%

linfodtos

Reações pela penicilina — Gôsto metálico após as injeções endovenosas. Dôr local
apôs aplicação muscular e subcutânea.

UNIDADES ADMINISTRADAS — 306 500 unidades Oxford por via parenteral.

cm

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118

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMII

2. Infecção estafUocócica — J. C., brasileira, 34 anos, casada, branca, doméstica.

Histórico — Deu entrada no Instituto Paulista em 25-2-44 com elevação térmica, acusando
dõres abdominais. Abscesso do fundo de saco de Douglas operado pelo Dr. Luix
do Rega

Depois da colpotomia a temperatura se manteve oscilante, razão pela qual, de-
corridos 10 dias, foi feita nova intervenção cirúrgica com dilatação do orificio de
drenagem. Como continuasse a supuração e a febre, em 10 de março foi realizada
uma laparatomia, tendo sido constatado um quisto hemático supurado do ovário
esquerdo. Retirada do quisto e drenagem da parede e do fundo de saco. A tem-
peratura continuou oscilante, alcançando, por vezes, 40.J®C. Estado geral ruim.

Diagnóstico — Quisto hemático supurado do ovário esquerdo (Dr. A. Luiz do Rego).

Tratamento — Transfusões de sangtie de 500 cm*. Albucid, Anaseptil a 25% na veia (3
empôlas diárias). Como o estado da doente piorasse dia a dia, iniciamos o trata-
mento pela penicilina, após suspender a administração de sulfamidicos.

Com a aplicação de 20 000 unidades Oxford dissolvidas em 250 cm’ de sõro
glicosado isotõnico e administradas gota a gota na veia, a temperatura da padente,
que era de 40-3°C, caiu para 36.5®C. Diariamente foi administrada a penicilina
em transfusão continua durante 2 horas, seguida de aplicações intermitentes de
outras doses de 4 em 4 horas, dia e noite. No terceiro dia de tratamento foram
administradas 30 000 imidades em transfusão continua e 10 000 unidades de 4 em
4 horas. Ao tratamento geral associou-se o local, injetando-se pelos drenos caldo
de cultivo de P. notatum dosando 20 unidades Oxford por centimetro cúbico. .4
febre caiu c permaneceu estável, notando-se grande melhoria do estado geral da
paciente. Desaparecimento quase completo da supuração pelos drenos. Conjunta-
mente com o tratamento pela penicilina, continuou-se a adminbtração de vitamina
C, sôro glicosado e transfusões de sangue de 250 cm’ em dias alternados.

Decorridos 7 dias, sobreveiu nova elevação térmica, concomitantemente com au-
mento da supuração pelos drenos, a despeito do tratamento pela penicilina estar cm
curso. Dado o cheiro característico do pús, suspeitou-se de uma infecção secun-
dária por E. coli, para a qual a penicilina é inativa. A cultura do pús revelou >
presença de bacilos Gram-negativos, morfologicamente idênticos â E. coli. A ad-
ministração da penicilina foi suspensa, iniciando-se a aplicação de Anaseptil a 25%
(uma empola diária). Em poucos dias a febre cedeu, desapareceu a supuração <
a doente teve alta em 12 de abril.

Exames de laboratório — Hemocultura (9-3-44) : negativa.

Hemograma (9-3-44) :

leucócitos por mm’ 13.900

mielocitos 0*

neutrófilos metamielocitos 1'

núcleo em bastonctes 31%

. núcleo segmentado 44%

eosinófilos 0%

basófilos 0%

linfocitos 14%

mocxxntos 9%

plasmodtos 1%

4

F. Prado Jr., A. Taborda & L. C. Taborda — Ensaios terapêuticos com

a penicilina preparada no Instituto Butantan

119

Conclusões — Processo infeccioso agudo, inflamatório, ligeiramente exsuda-
tivo, provavelmente da mucosa. Boa defesa. Não há caracteres hematológicos de
especialidade de qualquer natureza (Laboratório de análises clinicas dos Drs. Fe-
lipe de Vascoocellos e Gastão Rosenfeld).

Cultura do f>ús (15-3-44) — Estafilococos.

Cultura do pús (21-3-44) — Bacilos Gram-negativos morfologicamente seme-
lhantes à E. colL

Reações pela penicilina — Durante as transfusões continuas havia náuseas e, por
vezes, vómitos. Gõsto metálico durante as aplicações na veia. Dór local nas apli-
cações musculares.

UNIDADES ADMINISTRADAS — 255 000 unidades Oxford em injeção e
6 000 unidades localmente.

3. Infecção por Staphylococcus aurcus — E. M., brasileira, 31 anos, branca,
doméstica.

Histórico — Periodo de gravidez normal. Constatado um granuloma no 2.® molar superior
esquerdo no 5.® mês de gravidez. Em novembro de 1943, decorridos 5 dias Post
parium, formou-se um abcesso no seio direito, acompanhado de febre. Aplicou ca-
taplasmas de linhaça localmente e uma empola diária de Anaseptil durante 5 dias.
O abcesso foi aberto, com salda de pús espesso, amarelado. Reaparecimento de
novxM abcessos dos dois seios, que foram também abertos. Durante 30 dias a su-
puração desses fócos continuou, acompanhada de elevação térmica, a despeito do
tratamento pelo sulfamidica

Tratamento — Suifanil\'acin, Pioloco e água oxigenada localmcnte. Um comprimido de
Sulfadiazine de 4 em 4 horas (20 comprimidos). 9 empolas de Pioformine. For-
mação de novos abcessos. Foram prescritos mais 20 comprimidos de Tiazamida.
Durante 5 dias foi administrado 1 empola diária de Soluseptazine na veia. A su-
puração dos fócos persbtia, acompanhada de febre. Glicemia de 2 g por ml. Apli-
cação diária de 20 unidades de insulina em duas doses. Necroton. Saiu do hos-
pital com 5 fócos supurati\x>s em ambos os seios. Inicio de erisipela na perna
direita. Tomou mais 10 empolas de Soluseptazine e 20 comprimidos de Septazinc,
sem resultado. Propidon. Febre atingindo por vézes 39®C Estado geral ruim.
Grande prostaçãa

Em 16 de fevereiro iniciou-se o tratamento pela penicilina localmcnte, suspen-
dendo-se toda a medicação sulfamidica, O tratamento inicial consistiu em aplica-
ção local de uma solução isotônica do sal de bário de penicilina, dosando 100 uni-
dades Oxford por cm*. Irrigações continuas dos fócos supurativos (Carrel) du-
rante 4 dias. Diminuição acentuada da supuração, que se tomou mais fluida. Desa-
parecimento da febre. Como o processo evoluisse para a cura. a solução isotônica
do sal de bário foi substituida por filtrado de cultivo de Penicillium notatum, do-
sando 20 unidades Oxford por cm*. Desaparecimento completo da secreção e ten-
dência á deatrízação. Inicio de erisipela na perna direita com elevação térmica.
Aplicação da penicilina injetável na dose de 5000 unidades de 4 em 4 dias. Com
20000 imidades injetáveis e aplicação local do filtrado na perna, a temperatura
baixou, regredindo os sintomas erisipelóides.

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

120 Memórias do Instituto Butantan — Tomo XVIII

Durante o tratamento pela penicilina continuou-se a administração de insulina.
Em 10 de março suspendeu-se todo tratamento, pois o estado da paciente era botn,
tendo desaparecido a glicosúria e cicatrizado os fócos. Extração do dente com gra-
nuloma. A paciente ficou sob observação clúuca durante três meses, estando com-
pletamente curada.

Examfs de laboratório — A cultura do pús res'eloa o crescimento de cocos
Gram-positisos, com comportamento biológico semelhante ao Stafhylococcus aureus.
A hemocultura antes do tratamento pela pem'cilina foi negativa.

Dosagem de glicose no sangue: 2 g por mil.

Rea(ões Pela penicilina — Não apesentou.

UNIDADES ADMINISTRADAS — 20'000 unidades Oxford em injeção e
45 000 unidades localmente.

4. Infecção estreptocócica — H. A. P., brasileiro, 31 anos, casado, branco,
médico-veterinário.

Histórico — Deu entrada no Hospital Oswaldo Cruz com uma inflamação do artelho médio
do pê esquerda Pequena ulceração interdigital e fortes dores, que excediam qual-
quer limite de suportabil idade. O artelho se apresentava escuro e o pé edemaciado
com algumas placas vermelhas, luzidias e quentes. Temperatura inferior a e
pulso filiforme, atingindo a ISO pulsações por minuto. Estado geral mim.

Diagnóstico — Infecção estreptocócica do artelho (Dr. Quirino Pucca).

Tratamento — Medicação contra a dôr, aplicando-se ao todo, 8 centigramos de morfina, para
consegmr aliviar o paciente. Tonicardiacos e glicose a 50% na veia. Seis empolas
de Anaseptil a 25% na veia, sem melhora. Líquido avermelhado, saindo do artelho.
Como o estado do paciente se agravava, suspendeu-se a administração do sulfamí-
dico e inidou-se a aplicação local da penidlina. Um filtrado de cultivo de P. no-
tatum, dosando 20 unidades Oxford por cm*, foi aplicado localmente em compressas,
renovadas cada 15 minutos, dia e noite. Decorridas 12 horas da aplicação local,
notou-se a diminuição da dõr, pé menos edemaciado, melhoria do estado geral. Ini-
ciou-se a aplicação do sal de bário por via parenteral, na dose de 10 000 unidades
Oxford de 4 em 4 horas. Como o paciente se queixasse de dór nas aplicações por
via muscular, passou-se a administrar a penicilina na veia, dissolvida em sõro gli-
cosado hipertõnica Com a aplicação de 70000 unidades injetáveis e 15 200 local-
mente o paciente teve alta do Hospital.

Reações pela peniciliw — .4pós a segunda dose injetável de penicilina manifes-
tou-se um surto de urticária, que cedeu com medicação pela adrenalina, cálcio e
Necroton. Gôsto metálico nas injeções endovenosas. Rubor das faces. Dór nas
aplicações intramusculares.

UNIDADES .\DMINISTRADAS — 70 000 unidades Oxford em injeção e 15 200
unidades localmente.

5. M. M. C., brasileiro, 16 anos, solteiro, branco.

Histórico — Queixava-se de cefaléias intensas, que cediam com analgésicos. Decorridos 4
dias apresentou edema inflamatório nas pálpebras do olho esquerdo. Diariamente
apresentava febre. Internado no Hospital Municipal, em 25-1-44. Temperatura

6

F. Pbado Jr., a. Taborda & L. C. Tadorda — Ensaios terapêuticos com

a penicilina preparada no Instituto Butantan 121

37J°C Radiografia: Opacidade dos seios frontais, cujos limites são indistintos, fa-
zendo suspeitar de um processo de osteite peri-sinusal (Dr. Rafael de Lima F.®).
Hemocultura negati\'a.

^loffnósiico — Sinusite frontal aguda — ostcomielite do frontal (Drs. A. Perella e Cassio
M. Alves).

tratamento — Durante oito dias tomou um comprimido e meio de Cibazol de 4 em 4 horas,
dia e noite. Diariamente glicose na veia a SO^c e Kecroton- Vacina antistafilocõdca
“ Pinheiros Transfusões de sangue. Radiografia em 9-2-44 : o estudo compara-
ti%-o com a radiografia anterior demonstra agra^ação do processo de osteomielite
do frontal, o qual, partindo dos limites do seio frontal esquerdo, atinge já a bossa
frontal esquerda: observa-se um processo de osteoclasia, com perda da estrutura.
Os limites externos e superiores do seio frontal acham-se desaparecidos (Dr. Ra-
fael de Lima F.®).

O paciente apresentava um tumor com flutuação na região frontal esquerda;
abertura do seio frontal. Transfusões de sangue diariamente, glicose hipertõnica e
curativos locais. Radiografia em 2Õ-2-44: não houve modificação do aspecto ra-
diológico do processo de osteomielite frontal (Dr. Rafael de Lima F.®). Foi ini-
ciado o tratamento pela penicilina pelo método de transfusão continua na veia. No
1.® dia foram administradas 90 000 U. Oxford, sendo 40 000 gõta a gõta na veia
e 10 000 u. O. de 4 em 4 horas; localmente foram aplicadas 5 000 u.O. da solução
do sal de bário. Nos trés dias subsequentes o paciente recebeu 40 000 unidades
Oxford em 24 horas, sendo 12 000 aO. gõta a gõta na veia e 4 000 u.O. de 4 cm
4 horas. Foi aplicada diáriamente 2 400 u.O. localmcnte. Com quatro dias de
tratamento, desaparecimento da supuração e da febre. Em 22-3-44, após a apli-
cação de 403 000 u.O. por via parenteral e 31 400 u.O. localente, foi feita nova
radiografia: o estudo comparativo com o exame anterior demonstra maior delimi-
tação do processo destrutivo, o qual não se extendeu, sendo, entretanto, mais intenso
(Dr. Rafael de Lima F.®).

A dose de pem'cilina foi sendo reduzida até completar 30 dias de tratamenta
Nos últimos dias a dose de penicilina administrada em 24 horas era de 10000 u.O.
por via parenteral e 1 200 localmente. Radiografia em 3-4-44 ; o estudo comparativo
com o exame anterior demonstra boa delimitação do processo e menor grau de des-
truição nos bordos, notando-se zonas de neo- formação óssea, no centro da zona de
destruição (Dr. Rafael de Lima F.®). Decorridos três dias após o término do
tratamento pela penicilina, foi feita outra radiografia: o estudo comparativo com as
radiografias anteriores demonstra evolução favorável, acentuando-se a reconstituição
óssea e redução da zona de osteoclasia, restabclecendo-se a nitidez dos limites do
seio frontal esquerdo (Dr. Rafael de Lima F.®). O paciente teve alu no hospi-
tal, ficando cm observação, sem qualquer tratamento clínica Radiografia cm 24-4-44 '
o estudo comparativo com o exame anterior demonstra nítida reparação do tecido
ósseo, sendo atualmente difícil estabelecer os primitivos limites da lesão, reduzida
a uma zona de desmineralização discreta (Dr. Rafael de Lima F.®). O paciente
ficou cm observação durante 9 meses, estando aparentemente curada

Exames de laboratório — Reações de Wassermann, Kline e Kahn (1-2-44) ne-
gativas.

cm

SciELO

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122

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Tipo sanguin^o — II (Moss).

HemocuUuras (26-1- ; 10-3; 16-3) — negativas.
Culturas do pús — Staphylococcus aureus.
Hemogramas (Dr. Gustavo Fleury da Silveira F.®) :

13-2-44

17-3-944

29-3-44

13-4-44

hemoglobina . .

eritrocilos

leucócitos

valor globular,
segmentados . .
neutrófilos bastonetes ....

(metamielocitos.
eosinófilos ....

bâsófilos

monocitos

linfocitos

12.500

45%

1%

0%

4%

1%

1%

48%

67 %

5.010.000

9.S00

0.67

51%

1%

0%

11%

0%

1%

36%

73%

5.210.000

7.800

0.75

43 •/,

0 5 %

0%

6.5%

0.5 %
0.5%

49 ^

75%

4.630.000

6.550

0.81

46%.

1%

0%

7%

1%

1%

44%

Reações Pela penicilina — Dõr local nas aplicações intramusculares. Gôsto me-
tálico nas aplicações na veia.

UNIDADES ADMINISTRAD.AS — 563 000 unidades Oxford poc via pa-
renteral e 44 000 unidades localmente da solução do sal de bário.

6. Infecção estafüocócica — A. C, italiana, 50 anos, viuva, branca, doméstica.

Histórico — Deu entrada no Hospital N. S. Aparecida com abcesso no calcanhar e parte
plantar do pé direito. Abertura dos abcessos e drenagem. Supuração intensa e
difícil dcatrização. Temperatura atingida 38®C Há 5 meses teve nefrite c furun-
culose. Diabética.

Diagnóstico — Flegmão do pé direito.

Tratamento — Curativos diários com éter e 20 unidades de insulina localmente. Três com-
primidos diários de Cibazol durante 7 dias. 40 unidades de insulina diariamente
por via parenteral. Radioterapia. Supuração intensa e perna edemaciada. Decor-
ridos 30 dias de hospitalização, os fócos sépticos continuas-am ativos. Suspendeu-se
a administração do sulfamidico e iniciou-se o tratamento locai pela penicilina, jun-
tamente com a aplicação de insulina localmente e cm injeção. A penicilina foi apli-
cada em compressas e irrigações dos fócos supurativos, usando-se, para isso, um
filtrado de cultivo de Penicillium, dosando 30 unidades Oxford por cm*. Nos pri-
meiros cinco dias de tratamento foram aplicadas localmente 5 000 unidades, cora di-
minuição da supuração e da dõr, seguida da aplicação de mais 3 000 unidades diá-
rias. Cora 30 dias de tratamento desapareceu completamcnte a supuração, cicatri-
zando os fócos. A paciente teve alta cm 2-5-44.

Exames de laboratório — Exame de urina (25-2-44) : 26-20 g de glicose por
litro; (6-3-44): 33.10 g por litro. Exame de sangue (29-3-44): 2.80 g de glicose
por mil. Exame de pis: Staphylococcus.

UNIDADES ADMINISTRADAS — 100 000 unidades Oxford localmente.

8

F. Prado Jr., A. Taborda & L. C. Taborda — Ensaios leraiiêuticos co.n

a penicilina preparada no Instituto Uutaniai. 123

COMENTÁRIOS

Da análise dos casos clínicos por nós tratados com penicilina, vê-se que O'
tempo de duração do tratamento variou de 4 a 30 dias, notando-se, logo às pr.
meiras doses, melhoria dos sintomas mórbidos. Assim é que, no caso da infecção
puerperal, a paciente já se encontrava em estado de colapso periférico, sem que
se tivesse obtido qualquer resultado pela administração precóce de sulfami^ícos.
Com a aplicação de 150000 unidades O.xford de penicilina, as primeiras 14 horas
evidenciou-se acentuada melhora do estado geral da paciente. Pouco a pouco,
com as doses elevadas, que a gravidade do caso requeria, a infecção foi sendo
debelada. Após alguns dias de apirexia, foi obser\*ada nora elevação térmica,
atribuída a uma basíte de decúbito, comprova radiológicamente, a qual cedeu com
o tratamento pelo cálcio, extrato de fígado e vitamina C.

Apesar de não ter sido realizada a hemocultura antes do tratamento pela
penicilina, o que nesse caso seria de inestimável valor, tal falha não nos impede
de apreciar a sua rápida ação na infecção, pois todos os recursos terapêuticos já
se haviam esgotados. Após a administração de 286000 unidades de penicilina,
a nosso pedido, foi realizada uma hemocultura, com resultado negativo, o que já
era de prever, pois geralmente conseguem se hemoculturas negativas com 100000
unidades de penicilina. Qinicamente, foi diagnosticado pelo médico assistente
como sendo um caso de septicemia puerperal.

A administração da penicilina deve ser feita por um período bastante longo,
até que o processo infeccioso mostre eridéneia de regressão e a temperatura haja
voltado ao normal. Depois de vários dias de tratamento intenso, associado com
a melhoria clínica, a dose da droga pode reduzir-se gradualmente até que os sinais
clínicos sugiram que o paciente esteja capacitado para defender-se com seus recur-
sos naturais; então suspende-se a sua administração (1).

Quadro I reproduz a curva térmica referente ao caso citado, mostrando a dose
grande de penicilina administrada nas primaras 24 horas, dada a natureza grave
da infecção, para depois, pouco a pouco, ir diminuindo, á medida que a tempera-
tura se normalizava.

Num outro caso, uma infecção estaíilocócica consequente a um quisto hemá-
tico supurado do ovário, a medicação sulfamidica falhou lamentavelmente. Recor-
reu-se logo á penicilina e o seu êxito no combate à infecção não se fez esperar.
O estado da paciente era grave, atingindo a temperatura, por vézes, a 40.3®C.
Decidiu-se logo a aplicação da penicilina, iniciando-sc o tratamento com uma
dose de 20000 unidades Oxford, dissolvidas em sôro glicosado isotônico, em
transfusão contínua na veia. A temperatura que, no inicio da venoclise, era de
40.3°C, após 3 horas e meia, tempo que levou a aplicação gota a gota, caiu para
36.5°C, mantendo-se a doente em apirexia até o 7° dia de tratamento. Quando

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XYIII

tudo demonstrava que o processo evoluía para a cura e já tencionávamos suspen-
der a aplicação da penicilina, nova elevação térmica foi observada com reapareci-
mento da supuração pelos drenos.

Verificando a causa dêsse aparente insucesso da penidlinoterapia, constatou-se
uma infecção secxmdária pelo E. coli, para a qual a penicilina não tem ação (2, 3).

Quadro 1

DIAGNOSTICO; tndotnetrite - Taram.ttrilt fuerptral • ScpCictnia
NOMEtKJÇ. IDADE; 22 oAOj MÉDICO: Ur Miltoi OliRto d* Qrruda

UOxf.

P E N 1 C I L I N A

Bastaram alguns gramas de sulfamidico para que a infecção secundária fosse
debelada, de vez que as condições gerais da paciente já haviam melhorado. A
cultura do pús antes do tratamento revelou a presença de estafilococos e ausência
de bacilos Gram-negativos, ao passo que, ao ressurgimento da supuração, encon-
traram-se bacilos coli e ausência de cocos.

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SciELOi'o

2

3

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16

L

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126

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

A ação favorável da penicilina sobre a infecção é bem observada no Quadro
II, em que se nota a queda da temperatura após a aplicação de 20000 unidades,
gota a gota, na veia. Xas 10 primeiras horas a paciente recebeu 35 000 unidades
de penicilina e no dia imediato 27000 unidades. Apesar da queda de temperatura
verificada à primeira dose de penicilina, no dia seguinte nova eleração térmica
se fez sentir, o que nos obrigou a administrar, no terceiro dia, 90000 unidades
Oxford, sendo 30000 unidades em transfusão continua na veia e 10000 unidades
de 4 em 4 horas. Em 7 dias de tratamento, uma infecção grave por estafilococos
foi debelada com 255000 unidades Oxford de penicilina e 6000 unidades em apli-
cação local pelos drenos.

Uma das séries complicações da sinusite frontal é a osteomielite. de mortali-
dade elevada, atingindo por vezes 80^. Todo tratamento clinico até agora tem
falhado e, no dizer de Fürstenberg, a única esperança em tais casos reside na
remoção radical do osso lesado.

Entre nós, Gam.\ e Rezende Bakbosa (4) descrevem um caso de osteomielite
do frontal, em que a intervenção de Fürstenberg foi praticada com sucesso, porém
nem sempre isto acontece.

Com a introdução da penicilina, tém-se conseguido melhores resultados na
cura da osteomielite dos ossos da face. Williams e Nichols (5) apresentam
dois casos, complicados com septicemia, curados pelas penicilinoterapia. Kirby e
Hepp (6) relatam 5 casos de osteomielite dos ossos da face, tratados com bons
resultados. dose de penicilina aplicada nesses casos é motivo de controvérsias.
Kirby e Hepp, em dois pacientes tratados com pequenas doses durante poucos
dias, observaram recidivas, as quais só puderam ser evitadas por um tratamento
prolongado e com doses macissas como foi verificado cm 3 casos, que chegaram
a receber um total de 754CXXX) u. O.xford.

Num ponto quase todos estão de acórdo: em infecções graves é mister
administrar a penicilina em transfusões continuas na veia. seguidas de doses fra-
cionadas em intervalos regulares. Ótimos resultados foram conseguidos, aplicando
200000 u. 0. gôta a gôta na veia e 15000 u. 0. de 3 em 3 horas.

O caso grave de osteomielite do frontal por nós referido, onde somente
restava o recurso da inteixenção mutilante de Furstenlierg, cedeu com doses
rclativamente pequenas de jienicilina. Tpmámos o cuidado de prolongar o tra-
tamento durante 30 dias, reduzindo jxiuco a pouco a dose de penicilina em 24
horas. Diariamente a penicilina foi aplicada, parte em transfu.são continua na
veia e parte cm doses fracionadas de 4 em 4 horas, por via intramuscular e
endovenosa. No primeiro dia o paciente recelieu 40000 u- 0. em transfusão con-
tinua e 10000 unidades por via venosa de 4 em 4 horas, com uma dosce de 90000
u. 0. em 24 horas. Nesse mesmo dia foram aplicadas 5000 u. 0. da solução do
sal de liário localmentc na incisão operatória. Nos três dias subsequentes a dose

12

F. Prado Jr., A. Taborda & L. C. Taborda — Ensaios terapêuticos com

a penicilina preparada no Instituto Butnntan

127

foi reduzida para 12000 u. 0. em transfusão continua e 4000 u. 0 de 4 em 4 horas.
O total de unidades administrativas por via parenteral e local foi de 607 000 u. 0.
em 30 dias de tratamento, sendo que, decorridos 9 meses, sob constante vigilância
clinica, o paciente está aparentemente curado.

Acreditamos que na penicilinoterapia o mais importante é o tempo de duração
do tratamento e não tanto a quantidade de medicamento administrado em 24 horas.
As recidi^-as conseqüentes a doses baixas talvez possam ser atribuidas ao curto
tempo de tratamento.

O caso relatado de infecção do artelho era de mau prognóstico, pois havia
inicio de gangrena e o estado do paciente era grave. Logo ás primeiras aplica-
ções locais de penicilina em compressas, as dôres cessaram e o estado geral do
paciente melhorou. Decorridas 12 horas da aplicação local, iniciou-se a penicili-
noterapia por via parenteral. Em 4 dias de tratamento com um total de 70000
u. 0. em injeção, a infecção foi debelada.

Deixamos consignados nossos agradecimentos aos Drs. A. Luiz do Rego
e Eugênio F. Marcondes F®, do Instituto Paulista, ao.s Drs. Milton Olinto de
Arruda, Américo Armando Bruno, Renato Barbosa, A. Perella, do Hospital
Municipal, pelo auxilio inestimável, que prestaram na realização do presente
trabalho.

RESUMO

Apresentam os autores as observações clinicas de seis casos tratados e curados
com a penicilina obtida e purificada no Instituto Butantan, sob a forma de sal
de bário. Como a produção do sal fosse em pequena escala, a penicilina foi
aplicada em casos selecionados, nos quais já haviam falhado outros tratamentos
espedficos. As doses empregadas variaram entre 20000 e 588 00 u. Oxford-

O insucesso aparente, verificado na cura de uma infecção estafilocócica, con-
seqüente a um quisto hemático supurado do ovário, é atribuido á associação secun-
dária da E. coli, contra a qual a penicilina é inoperante.

Em aplicação local foi usado, quer o sal de bário em solução isotônica, dosando
de 100 a 1000 u. Oxford por centimetro cúbico, quer o filtrado do cultivo de
P. notatum, dosando de 20 a 30 u. 0. por cm^. O filtrado mostrou ser um
potente antisséptico e excelente adjuvante do tratamento geral, por meio de inje-
ções continuas na veia, seguidas de injeções venosas ou intramusculares, com
intervalos de 4 horas, afim de manter uma concentração sanguinea adequada.

Poucas ou nulas foram as reações produzidas pelo sal de bário. Nas apli-
cações endovenosas, os pacientes queixavam-se de gõsto metálico e, por vêzes,
náuseas. Nas aplicações pelas vias muscular e subcutânea, observaram-se reações
dolorosas. Um caso de urticária foi verificado.

13

cm

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128

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

ABSTRACT

1. The clinicai results of six cases, treated ^-ith penicillin (Purified barium salt
— Instituto Butantan) are described.

2. Due to the small amount o£ penicillin a\-ailable, only those cases ha ve been
selected in which previous spedfic treatment failed.

3. The total dosage varied between 20000 and 588000 Oxford units (0. U.)-

4. The apparent failure of penicillin to cure a Slaphylococcus infection of hema-
tic suppurated of the o\-ary, was due to a secondary E. coli infection of
known penicillin ineffectiveness.

5. Filtrates of Pentcillium notatum cultures, 20 O-U., per ml, and Solutions of
isotonic barium salt solution, 100 O. U. per ml, have also been used locally.
The filtrate has proved a potent antiseptic and an excellent adjuvant in
general treatment by intravenous dry infusion followed by intramuscular
injections t\ery four hours.

6. Few, if any, reactions were noticed with the barium salt, when applied intra-
venously. The patients comjJained of a metallic taste and sometimes nausea.
Painful local reactions have been observed when the intramuscular and sub-
cutaneous routes were used. One case of urticaria was observed.

BIBLIOGRAFIA

1. Keefrr, C. S.; Blake, F. G.; Marshall, E. Jr.; Lochcood, J. S. & IFood, IV. B, Jr.

(1943). Penicillin in the treatment of infections: a rejxMt of 500 cases. /. Amer.

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14

OBSERVAÇÕES SÔBRE DEZ CASOS DE ELIPTOCITOSE

(OVALOCITOSE)

POR

GASTAO ROSEXFELD

{Do Laboratório de Anatomia Patológica, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

A eliptocitose é uma anomalia congénita do “Eritron” bem individualizada,
porém rara. Xa América do Sul há somente a verificação de Silvestre &
ItnuRRAT (1931), na Argentina (1), e a de Crcz & Mello (1940), no Brasil
(2) ; éstes últimos mencionam apenas um caso no seu trabalho sôbre a verificaç.no
do grau de eliptocitose em individuos normais.

Tivemos ocasião de observar 10 casos em 4 gerações de uma familia brasi-
leira e estudamos alguns fatos ocorrentes nessa anomalia.

M.ATERIAL E MÉTODOS

Casos observados'.

O primeira caso encontrado foi um achado casual no decurso de um exame
hematológico para verificação de anemia. Os outros eram parentes desse doente,
solidtados para verificação da eliptocitose, tendo sido praticados os exames adiante
fcladonados somente nos que apresentavam a anomalia.

Caso 1 — B. S. U. — brasileira, branca e com toda a ascendência da mesma naturali-
«lade. 70 anos de idade, tendo tido 14 filhos: 1 falecido na presente guerra com 30 anos,
*adio c 4 falecidos na primeira infância, sem ictericia ou anemia. Nada sente, há alguns
»nos tem hipertensão moderada. Todos os casos apresentados a seguir são seus descendentes.

Caso 2 — A. U. K. — filha do caso 1, 51 anos, com 4 filhos, todos vivos, sem abortos;
'^«mea tes-e icterícia, nem anemia. Queixa-se de digestão difícil, prisão de ventre há vários
anos e rebelde a todos os tratamentos; exames parasitológicos de fezes negatisx».

Caro 3 — O. U. K. — filho do caso 2, 31 anos, com 2 filhos sadios; sua esposa não
‘esc abortos. Nunca apresentou icterícia, nem anemia. Sente astenia, tem hipotensão, porém
**tá cansado por excesso de trabalho.

Caso 4 — C. U. K. J. — filho do caso 2, 29 anos, com 1 filho rívo e outro que faleceu
ao nascer, em consequência de trabalho de parto com fórceps, e que era de peso e aspeto
normais. Tem amebiase crónica {Endamoeba histolytica), ora em tratamento; sente aste-
•'•a, tem hipotensão.

Coro 5 — C. K. Neto — filho do caso 4, 15 meses de idade, nascido a têrmo, forte i
'le aspeto sadio.

cm

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130

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XMII

Caso 6 — N. U. K. — filha do caso 2, com 21 anos, solteira. Xunca tes-e icterícia,
nem anemia. Aos 3 anos teve paralisia infantil. Xada sente.

Caso 7 — B. U. L. — filha do caso 1, 40 anos, com 2 filhos, nunca teve abortos, nem
ictericia ou anemia. Há um ano teve uma mielite ascendente, da qual está quasi completa-
mente curada, sentindo apenas uma fraqueza nas pernas. Este caso a|K'esenta uma anemia
sem hemólise, que julgamos ser consequência secundária da sua moléstia, não tendo sido
feito tratamento nesse sentido.

Caso 8 — L. U. L. — filha do caso 7, cora 7 anos de idade. Xunca teve anemia, nem
ictericia. Ê de aspeto sadio e nada sente.

Caso 9 — H. A. U. L. — filho do caso 7, 3 anos de idade. 15 dias depob de nascer
teve espasmo do piloro. Xunca teve anemia, nem ictericia. Ê de aspeto sadio.

Caso lo — H. U. O. — filha do caso 1, 30 anos; tem 1 filho sadio, nunca teve abortos,
nem anemia ou ictericia. Tem maus dentes e piorreia; quanto ao mais, nada sente.

Qcasio 1

•tC

MÉTODOS

O volume globular foi determinado pelo método de WixntoBE; o diâmetro
médio, difractometricamente com o eritrocitómetro de Haden-Hausser; para os
outros dados observados foram utilizados os métodos usuais.

Foram considerados como valores eritrocitários normais, os de Haden', porém
para a hemoglobina foi admitido 15 g = 100%. A concentração média da hemo-
globina por hemácia foi deduzida desses dados.

Quanto à forma, foi adotado o critério de divisão dos eritrocitos em trés
categorias: redondos, os circulares ou um pouco ovalados, porém dentro dos
limites usuais de variação; eliptkos, os que apresentavam essa forma bem evi-
dente ; fortemente elipticos, os que eram muito alongados, com uma largura máxima
de aproximadamente 2 a 3 mkrra.

2

Gastão RosexfeU) — Observações sôbre dez casos de eliplocitose (ova-
locitose).

131

Para observar as hemácias, evitando tanto quanto possível a alteração de
suas formas primitivas, foi empregada a seguinte técnica: 2 gotas de sangue
venoso oxalatado eram misturadas a 0.5 ml de solução fisiológica com 10% de
formalina. O sangue periférico era gotejado diretamente em idênticas propor-
ções na mesma solução adicionada de 0.5% de o.xalato de potássio. Após 5
minutos de espera, afim de permitir a fixação, eram feitas as preparações entre
lâmina e lamínula e esf regaços corados com eosina a 1% ou métodos pancromá-
tkos.

Para a verificação da resistência das diferentes formas de hemácias em
soluções hipotónicas, foi utilizado o seguinte método: os tubos com sangue, uti-
lizados para verificação da resistência globular, após a leitura foram adicionados
com 10% de formalina e agitados. Depois de um repouso de 5 minutos, afim
de fixar as hemácias, foram centrifugados ligeiramente. Os esfr^aços feitos
com o sedimento, depois de sêcos, foram fixados pelo metanol e corados com
eosina a 1%. Em cada lâmina foram contados 100 eritrodtos não hemolisados,
classificados em 3 tipos: redondos, nitidamente e fortemente elípticos. Proce-
demos desse modo nos tubos da zona intermediária, isto é, desde o primeiro ao
último tubo, em que houve hemólise parcial. Com essa técnica evitamos qual-
quer alteração da forma das hemácias durante a distensão sôbre as lâminas e a
eventual destruição das que estivessem no limiar da hemólise.

Para verificar si a microdtose era um caráter intrínseco do eliptocito ou
devida à falta de concentração de hemoglobina, fizemos no caso 4 um tratamento
de 50 dias pelo cloreto ferroso (4 drágeas ao dia, equivalendo a 700 mg de ferro).
Esse paciente não tinha anemia, o volume médio das hemácias era baixo, o que
poderia ser devido â falta de saturação pela hemoglobina existente no caso.

RESULTADOS

Os dados hematológicos da Tabela 1 mostram que havia uma ligeira ten-
dência à baixa do número de hemácias e da hemoglobina, sem anemia, que exis-
tia só no caso 7. Êste tinha, porém, outra causa possível para a anemia, sendo
mais provável não ser esta, consequência da eliptodtose. Com exceção de um
caso, os outros tinham diminuição do diâmetro médio das hemácias. A percen-
tagem de reticulodtos e a resistência globular não mostraram alterações. O índice
ictérico normal em 4 casos, estava ligeiramente aumentado nos outros, havendo
causa estranha possível para isso somente na obsei^-ação 4. Com exceção de um,
todos apresentaram um aumento ligeiro do baço, que chega\’a a ser palpável em
dois deles. Encontramos cm todos percentagens elevadas de eliptocitos e êsses
números eram constantes nas verificações feitas com diversos intervalos em três
casos.

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Gastão RosexfeU) — Observações sôbre dez casos de eliplocilose (ova-
locitose).

133

Variação do núntoro de eliptocxtos — Observamos que no mesmo esfregaço
nas partes em que é delgado, sâo encontradas quasi tão somente formas redondas
(Fig. 1), enquanto nas partes mais espessas o número de eliptocitos é muito

Hemaci as
%

GaJlrico t

Percenutmt de bemacU* redoodat, forteix>e«te eltptkas e eltptícA», que
tiram i beiaiUte na* »olt»ç6ea cloretadas rm que hotnre bemóUte parcial. Mé>
dias obtidas dos 10 casos (Tabela 1).

++ bemacias redondas; — bemacias fortemcnte elípticas; — — beaacias

elípticas.

ele\-ado (Fig. 2). Nas preparações a fresco, o número de eliptocitos era maior
e mais uniforme. Nas lâminas a fresco ou cm esfregaços feitos com sangue
formolado ,a eliptodtose era mais evidente, regular e de constatação mais segura
do que nas preparações usuais (Fig. 9).

Fonna ein naveta — Numerosos eliptocitos apresentavam-se com um aspeto
de naveta. Essa forma é devida à depressão central ser redonda ou, quando é
oval ,não acompanha totalmente a forma da hemácia, acarretando uma zona peri-
férica mais espessa nas extremidades (Figs. 9, 5 e 6).

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Gastão Rosenfelo — Observações sôbre dez casos de eliptocitose (ova-
locilose).

135

EsferocUos — Foram encontrados em todos os casos nas preparações formo-
ladas, alguns esferodtos típicos (Figs. 7 e 8). lEm esf regaços feitos sem fixa-
ção prévia, também foi notado um ligeiro grau de esferocitose, que aparecia nas
partes mais delgadas do esfregaço, o que é lun artifício de técnica, pois nessas
condições as hemácias tendem â forma redonda e perdem a depressão central
(Figs. 1 e 3).

Resistência dos eliptocitos — Os resultados da Tabela 2, representados m
Gráfico 1, demonstram claramente que os eliptocitos resistem mais do que as
hemácias redondas â hemólise nas soluções salinas hipotônicas. Os eritrocitos
fortemente elípticos, quando se hemolisa\’am, conser\’avam a stia forma, ao passo
<lue dos elípticos uma parte tomava a forma esférica, pela hipotonicidade do li-
quido, o que explica a percentagem das formas redondas ser maior nas soluções
menos concentradas e diminuir gradativameme com a maior proporção de Cl Na.

Microcitose — Em todos os casos foi constatada uma mkrocitose de grau
variado. Na experiência feita com o caso 4, o volume médio das hemácias não
se modificou, conser^-ando-se baixo, apesar do tratamento ter aumentado a con-
centração de hemoglobina, tendo mesmo o indice de saturação chegado muito
próximo do máximo (Tabela 3).

Tabela 3

C&to 4

Antet do

Após tratamento peto Fc

tratameato

JO dias

50 dias

Hemácias por mmj

5.4S0.000

5.500.000

5.420.000

Hemoglobina grs.

14,4

15,6

16,0

Concentração da Hb cor-
puscular media em Tt

26,3

28,3

29,4

Índice de saturação ...

0,875

0,945

0,980

Volume médio da hema-
cia em

75

72

75

Discussão

Variação do número de eliptocitos — Günther (1928) (3) e Terry e cola-
^radores (1932) (4) notaram nos esf regaços um número menor de eliptocitos
^ relação às preparações a fresco. Stephens e Tatelbaum (1935) (5),
^Vyandt e colaboradores (1941) (5), notaram que há variações no número de
^Jiptodtos em preparações iguais, colhidas no mesmo momento de um mesmo
•ndivíduo. Essas diferenças foram atribuídas a causas externas secundárias não

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136

Memórias do Instituto Butantan — Tomo XYHI

determinadas. Obser^•amos que a causa dessa irregularidade é a própria distensão
do sangue na lâmina, que deforma os eliptocitos parcialmente e de modo variável
para a forma redonda nas partes finas dos esfregaços. Com a técnica de fixação
prévia das hemácias, podem-se evitar alterações devidas a causas externas, con-
servando os glóbulos suas formas tais quais eram no sangue circulante. Permite,
além disso, evidenciar rapidamente e com segurança os casos de eliptocitose, que
poderiam passar desapercebidos em esfregaços usuais.

Forma em naivta — Êsse método de exame evita também confusão com os
casos de pseudo-eliptocitose, em que não aparece a forma em naveta. Xão encon-
tramos ésse tipo de hemácia eliptica em casos de anemias, moléstias diversas ou
individuos normais, que, no entanto, apresentavam alguns eliptocitos nos esfregaços
comuns. £ssa forma parece ser caraterística da eliptocitose.

EsferocUos — Wvaxdt e colaboradores (1941) (5) apresentaram a foto-
micrografia de um caso, em que é erídente a presença de esferodtos. Há vários
outros casos semelhantes na literatura e em todos havia anemia hemolitica com
diminuição da resistência globular. Até agora não houve explicação para ésse
falo e em geral atribuiu-se-o a uma concomitância da presença da esferocitose
(icterícia hemolitica familiar), o que julgamos pouco provável. Leitner (1939)
(6), nos seus casos em que não havia anemia, notou a presença de hemácias
menores do que as normais. Verificamos o mesmo fato em todos os casos e a
fotomicrografia 6 demonstra que essas hemácias menores são esferociticas, o que
modifica o conceito geral de que a presença de esferocitos existe somente nalguns
casos, em que há coincidêiKia com a esferocitose moléstia. O eventual aumento
do número desses esferocitos, acrescido da alteração devida ao esfregaço usual,
que faz com que tendam a essa forma mais hemácias, pode ter levado êsses autores
à afirmação da concomitância das duas moléstias. Os esferocitos que encontra*
mos, não podem ser imputados a artifícios do esfregaço, pois o sangue havia sido
previamente fixado.

Resistência dos eliptocitos — Terry e colaboradores (1932) (4) afirmaram,
baseados em observação sumária, que os eliptocitos são mais resistentes do que as
hemácias redondas nas soluções hipotônicas. Confirmamos ésse fato, que é contrá-
rio à hipótese de Leitxer (1939) (5), para a explicação das anemias hemolíticas
observadas por outros autores na eliptocitose; atribuiu a hemólise a uma maiof
facilidade de destruição dos eliptocitos, em consequência da sua maior fragiH'
dade, por serem células mais velhas. Contra êsse ponto de vista, além dos dados
acima, há ainda a contestar que, si é fato comprovado que os eliptocitos assumem
sua forma depois da fase de reticulocitos, não há provas de que isto se dê em
período tardio da fase madura de erítrocito, não se podendo, portanto, assegurar
que sejam mais velhas do que as outras hemácias maduras.

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Gastão Rosexfelo

Observações sõbre dez casos de eliptocitose (ova-
locilose).

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Microcitose — Diversos autores (Stephexs & Tatelbaum, 1935,
LiEBERHERjt, 1938, SÕDERSTRÕM, 1938, Leitxes, 1939, e Wyandt e colaborado-
res, 1941) (5) constataram uma diminuição do volume da hemácia num número
bem elevado de casos, porém atribuiram essa alteração a uma mera coincidência.
ObseiA-amos o mesmo nos nossos pacientes e na e.xperiência relatada, mesmo
elevando o indice de saturação da hemácia até muito próximo do normal, não se
obteve aumento do volume, que permaneceu sempre baixo. A verificação de
microcitose em número relatix-amente tão elevado de casos, ao lado dessa obser-
vação, leva a supor que a diminuição do volume da hemácia faz parte do quadro
da anomalia e é inerente à forma do eliptocito.

RESUMO

O autor apresenta 10 casos de eliptocitose em 4 gerações de uma família
brasileira. Observou número muito ele\*ado de eliptocitos, microcitose. diâme-
tro médio diminuído, resistência globular e reticulocitos normais, indice ictérico
ligeiramente aumentado em 6 casos, baço um pouco aumentado em 9 e ausência
de anemia.

Nos esfregaços há variação do número de eliptocitos, que tendem à forma
redonda nas partes finas das lâminas. Para evitar alterações secundárias das
formas das hemácias, tanto a fresco como em esfregaços, jimtam-se 2 gotas de
sangue periférico a 0.5 ml de solução fisiológica com 0.5% de oxalato de potássio
e 10% de formalina; si for usado sangue venoso pode ser dispensado o oxalato.
Com essa técnica, quando existe eliptocitose, a percentagem de hemácias elipticas
é elevada (cerca de 90%).

Os eliptocitos apresentam muitas vezes uma forma de naveta, por haver umj
zona periférica mais espessa nas duas extremidades. Essa forma não foi encon-
trada nos casos normais ou com outros moléstias que apresentavam eliptocitos cm
esfregaços.

Há sempre alguns esferocitos. Os eliptocitos são mais resistentes do que
^ hemácias redondas em soluções hipotónicas e a microcitose existe mesmo
quando não há anemia e as hemácias estão saturadas de hemoglobina.

.ABSTR.\CT

The author presents 10 cases of elliptocytosis in 4 generations of a Brazilian
family. A ver)’ high number of elliptoc)’tes were observed, as well as microc)’-
tosis, reduced median diameter, somcwhat incrcased icteric index in 6 cases, slightly
•^largcd spleen in 9 cases ; absence of anemia, globular resistance and reticulocv-tes
normal.

cm

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Memórias do Instituto Butantan

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In smears the elliptocjies vary in number and tend to round shape at the
thinner portions of the slide. In order to prevent secondary alterations of the
shape of the red cells, whether fresh or in smears, 2 drops of peripheric blood
are added to 0.5 ml. of saline solution with 0.5% potassiiim oxalate and 10%
formaline; when venous blood is useo, no oxalate is needed. With this technic
it is possible to obtain a high percentage of elliptical red cells (about 90%) in
eüiptocjtosis.

The elliptoc}'tes are very often spindle-shaped, due to the thicker peripheric
zone at both extremities. This form \vas not recorded in normal cases or cases
of other diseases which showed elliptocjtes in smears.

There are always some espheroc>-tes. The elliptocytes are more resistant
than the round red cells in h)-potonic Solutions and microcjdosis occurs even
when there is no anemia and the red cells are saturated with hemoglobin.

BIBLIOGR.\FI.\

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Febiger, pp. 65-67.

(Recebido {«ra pubticaçio era abri] de 1945).

1U

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Memórias do Instituto Butantan

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Fic. J (Fotomicro)

Mesmo qoc a fig. 1 com efeito estereoscópico.

12

Fic. 4 (Fotímiicro)

Mesmo que a fíg. 2 com efeito estereoscópico.

Gastão RosesfeU) — Observações sôbre dez casos de eliplocilose (ova-
locilose).

Fic. 5 (Potomicro)

Prrparacâo pcU doma tècníca, c«írcfa^ fixado e corado com ctmna.
Afpecto cm naveta.

Fic. 6 (Fotomicro)

Mrrnio qoc a íif. $ com efeito cstereofcôptco.

142

Memórias cio Instituto Butantan

Tomo XVIII

Fic. 7 (Fotomicro)

M»nu limina qoe a fig- 5. Nocam-st 2 csferócito».

14

Fio. 8 CFoComicro)

Xltsmo qur a tig. 7 com efrilo cjtrrcoscopico.

(Iastão Rosenfeld — Observações sõbre dez casos de eliplocilose (ova-
locitose).

143

Fic. 9 (Fotomicro)

Prrpara^ão a fimeo mtundo a Innica que acofiKlhamoa. Eliptociluie «em variações
etn to«la a lâmina e a»peto em “naveta".

lá

cm

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CRIAÇAO ARTIFICIAL DE AMBLYOMMA CAJEASESSE PARA O
PREPARO DA VACINA CONTRA A FEBRE MACULOSA

POR

J. TRAVASSOS & A. VAU-EJO-FREIRE

(Do Laboratório de Virus e Ri^juêtsias do Instituto Butantaii, São Paulo, Brasil)

CONTEÚDO

A — Introdução

B — Considerações sobre as vacinas contra as riquétsioses
C — O Amblyomma cajennense c o preparo da \-acina contra a febre
maculosa pela técnica de Spencxr e Parker
D — Pessoal e instolações.

E — Amblyomma cajennense. Ciclo evolutivo e identificação
F — Amblyomma cajennense. Criação artificial

1. Colheita das fémeas. Fecundação

2. Postura dos ovos

3. Fase larval — 1.* alimentação infetante

4. Fase ninfal — 2.* alimentação infetante

5. Fase adulta — .Mimentação estimulante
G — Preparo da vacina

1. Trituração, desinto.xicação e purificação

2. Provas de esterilidade, inocuidade e capacidade antigéniva
H — Aplicação da vacina

1. Doses

2. Reações

3. Resultados
I — Bibliografia

— INTRODUÇÃO

Dilatam-se cada vez mais os limites geográficos da incidência da febre ma-
culosa na América do Sul.

Reconhecida pela primeira vez no Estado de São Paulo. Brasil, em 1929 (1,2)
e aparentemente circunscrita a áreas suburbanas da Capitai, a febre maculosa foi
nestes últimos anos continuamente identificada em outras regiões, não só do nosso
Eaís, como do continente sulamericano.

1

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Xo Brasil, só no Estado de São Paulo, onde ela é melhor conhecida, várias
centenas de casos fatais da doença foram obsers-ados em cêrca de 30 áreas dife-
rentes e distanciadas umas das outras. Em muitas dessas áreas, novos casos são
constatados anualmente e, em algumas delas, já foram encontrados vetores natu-
ralmente infetados, o que permite considerá-las verdadeiros focos de infecção.

X*o Estado de Minas Gerais, a febre maculosa foi diagnosticada nas mais
^•ariadas localidades e, ultimamente, no Estado do Rio de Janeiro, algtms casos
foram reconhecidos em quatro zonas diferentes.

À medida que se difundem os conhecimentos relativos ao diagnóstico desta
riquetsiose, o número de casos aumenta nas estatísticas demógrafo-sanitárias. A
larga disseminação dos vetores (carrapatos do gênero Amblyomma) responsá-
veis p)ela propagação da infecção, faz com que grandes extensões territoriais se-
jam consideradas focos potenciais da doença.

Acentua-se, desta sorte, e cada vez mais, a importância desta grave infecção,
que atinge principalmente o trabalhador rural. Certamente, com o tempo poderá
assumir proporções de grande significação nacional e quiçá continental, não só
quanto ao número de casos como quanto à extensão das áreas atingidas, dada a
tendência natural à formação de novos núcleos de colonização agrícola-pastoril
em regiões até então despovoadas.

O número de casos até agora conhecidos não exprime a realidade do pro*
blema. Mesmo no interior do Estado de São Paulo, onde a densidade de popula-
ção rural é das maiores do Pais, grande é ainda o número de jjequenos núcleos
praticamente à distância do controle direto dos set^nços de saúde pública. En-
tretanto, vários casos de febre maculosa tém sido surpreendidos nestes últimos
anos. Êstes. certamente passariam desapercebidos ou seriam rotulados sob ou-
tras denomiijações, não fòra o contato cada vez nuior das nossas autoridades
sanitárias com o trabalhador rural. O aparecimento de casos da doença entre
trabalhadores recém-chegados a certas áreas até então aparentemente indenes, é
que, pòr vézes, desperta a atenção e faz descobrir, por cuidadoso inquérito re-
trospectivo, a incidência da doença, sem que tivesse sido anteriormente reconhe-
cida e comunicada ás autoridades sanitárias.

O combate aos carrapatos, medida altamente dispendiosa e somente aplicável
a zonas de grande valor econômico, toma impraticável o seu emprégo na maioria
das regiões atingidas. A \'acinação repetida constitui o meio mais prático de
proteção direta do homem.

A vacina preventiva c cada vez mais solicitada. Apesar de sua produção
sempre crescente, a necessidade de proteger as populações dos focos cada vez
mais numerosos não tem ultimamente permitido ao nosso Laboratório atender a

2

J. Travassos Jt A. Vallejo-Fkeibe

Criação artificial de Amblyoiuma
cajennense.

147

todos os pedidos de vacina, quer das autoridades sanitárias do nosso e dos outros
Estados, quer de outros serviços médicos, ci\-is e militares ou diretamente de
particulares, que já a procuram espontaneamente.

O interesse ultimamente manifestado por investigadores de diversas institui-
ções cientificas no sentido de conhecerem detalhes dos métodos de trabalho usados
no Instituto Butantan para o preparo da ^•acina preventi^•a contra a febre ma-
culosa e, principalmente, as técnicas de criação e manuseio de Ixodidas, induziu-
nos a publicar êste artigo de divulgação (*).

Descreveremos, assim, neste trabalho, as instalações, métodos e técnicas es-
pedalizadas, que vimos aperfeiçoando e adaptando às nossas condições de tra-
balho no decorrer dos últimos anos.

.Alguma experiência adquirida no constante manuseio de Ixodidas, utilizando
a técnica padrão de Spexcer-Pakker, permitiu-nos igualmente adotar na rotina
modificações que julgamos proveitosas na e.xecução de certos detalhes técnicos.
Elssas modificações referem-se aos métodos de criação dos Ixodidas e aos meios
de proteção de que nos servimos para conseguir segurança e eficiência nos serviços.

No intuito de tomar facilmente reproduzireis os diversos métodos utiliza-
dos, objetivamos por meio de desenhos e fotografias todas as fases da técnica.

Relataremos, igualmente, alguns dados sobre a biologia do Amblyomma ca-
jcnnensc. desde que diretamente se relacionem com as diversas fases do prepa-
ro da vacina. Detalhes mais completos sòbre a biologia deste I.xodida, atual-
mente cn) estudo em nosso I.aboratório, serão oportunamente publicados.

B — CONSIDERAÇÕES SÔBRE AS VACINAS CONTRA AS

RIQUÉTSIOSES

.Antes de definitivamente firmada a importância e significação etiológica das
riquétsias, não foram satisfatórios os resultados das inúmeras tentativas feitas
com o fim de serem obtidas vacinas preventivas contra as diversas doenças tifo-
e.xantemáticas.

.As vacinas preparadas com emulsões de órgãos de animais infetados, pobres
em riquétsias, aquecidas ou tratadas por vários agentes quimicos. não se mostra-
vam antigênicas. Só vacinas preparadas com vinis-tecido vivo, em doses sub-
infetantes, ou com o emprtgo de amostras de pouca virulência, atenuadas por pro-
cessos especiais (vacina de Blaxc e Laigret) revelaram-se eficientes. Essas va-
cinas, de dificil controle, não são entretanto recomendáveis para aplicação gene-
ralizada.

(*) Elsta descrição, não é sinão uma simples adaptação do protocolo geral das
técnicas empregadas no Instituto Butantan e obrigatoriamente feitas em cada seiviço.

cm

SciELO

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148

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVni

4

PlC. 1

UUtriWKâu iU frbrv nucu)u«a no K«tatU> ilc S&u 1'aulo. ftti uuvrmbro üc 1943.

Críaçüo artificial de Amblyomma
cajennense.

Travassos Sí A. > allejo-Freire

cm

SciELO

1

lõO Memórias do Instituto Butantan — Tomo XYHI

O uso de vacinas ricas em riquétsias, mortas por agentes quimicos, teve
origem nas experiências de Rocha Lima (3), que deu, desde o inicio, signifi-
cação etiológica à riquétsia. O achado de grandes massas desses elementos
nos tecidos de piolhos infetados levou-o a utilizar material proveniente desses
vetores para fins de imunização. Suas primeiras experiências mostraram o
acêrto dessa orientação. '

Weigl (4,5,6), posteriormente, por meio de delicada técnica, conseguiu
criar piolhos em grande número, infeta-los artificialmente e preparar uma va-
cina fenolada, muito rica em riquétsias, dotada de eficiente valor antigênico.

Spencer e Parker (7) utilizaram também triturados de Dennacentor an-
dersoni previamente infetado, para obter uma vacina preventiva.

Em consequência dêsses fatos ficou, pelo menos aparentemente, estabele-
cida uma estreita relação quantitativa entre o número de riquétsias contidas em
uma vacina e o seu valor vacinante.

Nestes últimos anos, por meio de outros processos de obtenção de suspen-
sões ricas em riquétsias, pôde-se preparar vacinas fenoladas eficientes.

Aos métodos iniciais de Zixsser e colaboradores (8 a 13) (raspados peri-
toneais de ratos tratados pelo benzol ou irradiados pelos raios X) juntaram-se
os mais recentes de Castaneda (14), que obteve riquétsias, em grande número,
de pulmão de animais inoculados por via réspiratória.

Do mesmo modo, pelos métodos de cultura de riquétsias em tecidos, taml)ém
foram obtidas emulsões antigênicas, ricas em riquétsias. Dêstes últimos destaca-
se o de Cox (15), de cultivo na vitelina de embrião de galinha.

Assim, por meio de três métodos são obtidos hoje antígenos ricos cm ri-
quétsias para o preparo de vacinas preventivas contra doenças tifo-exantemá-
ticas: a) por cultura de riquétsias nòs artrópodos s-etores; b) por cultura nos
pulmões de animais inoculados por via respiratória; c c) por cultura na vitelina
do embrião de galinha.

O primeiro dêles é o presentemente adotado na rotina de nosso Laborató-
rio para o preparo da \-acina contra a febre maculosa. Os dois outros estão
ainda em estudos e observações experimentais.

C — O AMBLYOMMA CAJES^ESSE E O PREPARO DA VACINA
CONTRA A FEBRE MACULOSA PELA TÉCNICA DE SPENCER E

PARKER

Os caracteristicos clínicos e anátomo-patológicos, a alta mortalidade aliada
a uma morbidade reduzida, a ocorrência em zonas rurais ou semi-rurais, a trans-
missibilidade por Ixodidas, o comportamento experimental do agente infetante

6

J. Travassos & A, Vallejo-Freire

Criação artificial de Amblyonima
cajennense.

151

e, sobretudo, as provas de imunidade cruzada permitiram identificar o então cha-
mado ‘‘tifo exantemático de São Paulo” à febre maculosa das Montanhas Ro-
chosas. Êste fato possibilitou adotar entre nós as medidas profiláticas já ampla-
mente estudadas e aplicadas por Spekcer e Parker nos Estados Unidos. Adap-
tadas ao nosso meio, essas medidas foram aconselhadas por uma comissão no-
nieada em novembro de 1933 pelo diretor do Departamento de Saúde do Estado
e \nsavam o combate ao vetor — o carrapato — e a vacinação preventiva.

Lemos Monteiro, em trabalho apresentado à S>a. Reunião da Sociedade
•Argentina de Patologia Regional do Xorte, reunida em Mendoza nos primeiros
dias de outubro de 1935 (16), relatou os métodos a serem usados na profila.xia
racional e prática da infecção, dando à vacinação preventiva o principal papel.
Aconselhou, para o preparo da vacina, a técnica de Spencer e Parker, consi-
derando como problema inicial a ser resolvido, a criação em larga escala do
Amblyomma cajennense. Com efeito. Lemos Monteiro demonstrou que o Am-
hliomma cajennense, além de ser um ótimo vetor da infecção (17, 18, 19), os seus
órgãos apresentam grande número de riquétsias com as quais se pode preparar
uma \-acina do tipo americano.

A infecção acidental e fatal de que foram vitimas esse e.\penmentador e o
seu au.xiliar, Edison Dias, interrompeu bruscamente as suas atividades.

Em janeiro de 1936, um de nós assumiu a direção dos seix-iços de febre
maculosa do Instituto Butantan, tendo a preocupação inicial de criar o Atn-
hlyonima cajennense em grande número, com o fim de preparar a \’acina pelo
método mais aconselhável no momento, preparando para isso aparelhagem e ins-
talações indispensáveis ao bom êxito do empreendimento e o mais possivel a co-
berto de novos acidentes.

Embora, na ocasião em que publicara aquèle trabalho a que nos referimos.
Lemos Monteiro não tivesse ainda conseguido observar nenhum e.xemplar de
Atnblyomtna cajennense naturalmente infetado, já hana informes clínicos de
Piza. Meyer e Gomes sõbre a presença de carrapatos desta espécie, fixados em
doentes de febre maculosa.

O encontro de Atnblyomma striatuni naturalmente infetado, primeiramente
por Salles Gomes (20) e posterionnente por Travassos (21 a 27), assim como
os resultados concludentes de Monteiro e colaboradores sõbre a transmissão
experimental da febre maculosa pela espécie Amblyomma cajennense e ampliados
para as espécies Atnblyomma striatnm, Amblyomma brasiliensis e Amblyomma
cooperi, firmaram de modo definitivo a transmissibilidade da febre maculosa
entre nós por algumas espécies do gênero Amblyomma.

Decorridos alguns anos de pesquisas intensivas com Ixodidas capturados
em vários focos da doença cm São Paulo, pudemos encontrar ultimamente vários
exemplares de Amblyomma cajennense naturalmcnte infetados. Êstes exames

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

positivos não só foram obtidos com exemplares adultos, como com larvas e nin-
fas, estas últimas cuidadosamente estudadas e identificadas após a terminação
do ciclo em laboratório.

O fato de ter sido o Amblyomtna striatum o primeiro Ixodida encontrado
naturalmente infetado em São Paulo, fez com que éle fosse focalizado como a
espécie de escolha para o preparo da \-acina. Contudo, por ser o Atnblyomma
cajennense mais abundante íw natiira, mais facilmente criado no laboratório e em
seus órgãos ter sido endenciada a abundante reprodução de riquétsias, foi êste
último o escolhido. Agora, os nossos recentes resultados positivos de infecção
natural vêm mostrar quão acertada foi essa escolha.

O estudo minucioso <la infecção e.xperimenta! do Amblyotnma cajennense
evidencia que, tal como no caso do Dcnnacenlor andersoni, o agente infetante se
reproduz no seu ot^anismo e se transmite também congenitamente às gerações
seguintes.

As riquétsias no Ixodida infetado podem ser encontradas nas células dos
tecidos dos órgãos internos. Em cortes histológicos, têm sido evidenciadas
riquétsias em grande número principalmente nas células epiteliais dos diverticulos
intestinais, na sua maior parte de localização intracelular (19).

A infecção do Ixodida é relativamente fácil, bastando para isso uma alimen-
tação de algumas horas em animal infetado. Com uma única alimentação de
exemplares adultos, seguida de inteix-alos de cerca de 8-12 dias à temperatura
ambiente. Lemos Monteiro conseguiu após trituração desses carapatos prepa-
rar uma emulsão fenolada vacinante para cobaia. Resultados mais regulares em
capacidade vacinante, porém, são obtidos quando se utilizam emulsões de adultos
conseguidos por criação artificial no laboratório, alimentando-os nas fases ante-
riores de lar\-a e ninfa, em animais infetados. A infecção processa-se de modo
relativxunente fácil, quando os Ixodidas são colocados a sugar coelhos ou cobaias
infetados no momento propício, isto é. na fase de reação febril.

D — PESSOAL E INSTALAÇÕES

Dado o perigo a que estão sujeitos os que manuseiam o material infetante
necessário ao preparo da vacina, torna-se indispensável escolher cuidadosamente
os auxiliares, especialmente aquéles que se destinam a trabalhar na criação dos
Ixo<iidas. Deve-se dar preferência aos mais calmos e habilidosos, possuidores de
suficiente prática de trabalhos com material infetante. Serão instruídos detalha-
damente sóbre os diferentes modos pelos quais se podem contaminar, exigindo-se
dêles treino prévio, técnica acurada na manipulação e cuidados especiais de inspeção
do seu próprio corpo antes e depois de encetar os trabalhos com Ixodidas.

8

J. Tr.\vassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyonima

cajennense. 153

As infecções durante os trabalhos de laboratório são geralmente devndas:

a) a acidentes por ocasião das manipulações de animais infetados: inocu-
lações, necropsias, colheitas de material; ou devidos a descuidos no
manuseio de recipientes contendo material infetante;

b) à picada de Ixodidas infetados;

c) ao esmagamento de Ixodidas infetados ou de outros hematófagos (re-
pletos de sangue de animais infetados) entre os dedos, sujando-os com
material infetante e permitindo a infecção pelas escoriações cutâneas ou
pelas mucosas;

d) à inspiração de partículas desprendidas por ocasião da trituração de
Ixodidas ou em consequência do manuseio de recipientes contendo ou que
contiveram hematófagos infetados, cujas fezes e outros detritos desse-
cados podem, ao se desprenderem, ser aspirados.

Os cuidados e.xigidos são:

a) vacinar todos os auxiliares com 3 doses de 2 cm* da vacina ao serem
admitidos ao serviço. Re\acinar cada 3 ou 4 meses com uma dose-
estimulo de 2 cm*;

b) os au.xiliares ao chegarem ao serviço, despirão todas as roupas de uso
externo e vestirão aventais apropriados;

c) trabalhar com as mãos prot«^idas com lu\'as quando se manipulam ani-
mais ou com qualquer outro material infetado;

d) triturações e manipulações com material infetante serão sempre feitas
nas caixas cn\'idraçadas de proteção;

e) nos traljalhos com Ixodidas serão utilizadas mesas protetoras, obedecen-
do-se rigorosamente à técnica estabelecida;

f ) à saida do serviço, os auxiliares farão inspeção do seu próprio corpo em
espelhos adequados, prevenindo imediatamente o chefe dos au.xiliares no
caso de encontrarem algum Ixodida fixado ou não;

g) esterilizar os aventais diariamente após terminar o serviço. As luvas
usadas devem ficar mergulhadas em solução desinfetante.

Os serviços técnicos devera dispor de instalações especializadas, distribuidas
em espaço adequado. Êsse espaço deve ser suficientemente amplo para permitir
desembaraço nas manipulações técnicas, evitando acúmulo de material e dos fun-
cionários, sempre prejudiciais e quase sempre causas de acidentes.

O Instituto Butantan dispõe de um pavilhão — Pavilhão Lemos Monteiro
• — para os ser\iços da Seção de \'irus. O andar térreo deste Pavilhão destina-se

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154

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

exdusivamente ao estudo das riquetsioses e nêle estão instalados os serviços téc-
nicos de preparo da vacina contra a febre maculosa.

A planta anexa mostra as instalações e distribuição dos serviços no pavimento
térreo. A única comunicação que liga diretamente o edifício com o exterior dá

Fic. 3

Planta do andar ftirto do PavilhSo Lemot Monteiro. Serriço de febre snacnlosa.

10

J. T3.\vassos Jt A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense.

155

aceãso a uma entrada, onde está o vestiário geral utilizado pelos auxiliares antes
de entrarem nos laboratórios propriamente ditos. Esta entrada comunica-se por
meio de um corredor, á direita, com outro vestiário (F), ante-sala do biotério.
Ai estão armários indmduais. instalações sanitárias, chuveiro, jògo triplo de
espelhos e estufa para descarrapatização eventual dos “over-alls”, que deverão
ser utilizados por todos os auxiliares antes de entrarem nos diversos laboratórios
ou no salão dos biotérios. Do lado esquerdo, o corredor comunica-se diretamente
com o escritório e laboratórios (A), onde não são manipulados Ixodidas. Êstes
laboratórios, destinados a estudos bacteriológicos e sorológicos correlatos ao pro-
blema, controle da vacina, etc., estão igualmente aparelhados para trabalhos expe-
rimentais de culturas em tecido ou em embriões de galinha (B). O restante da
parte esquerda do pavimento térreo constitui a sala de criação de carrapatos (C),
contando com uma grande câmara-estufa (C 1). armários (C 3), geladeiras (C 4)
e mesas de manipulações (C 2).

Toda a ala direita (E) compreende um grande salão destinado aos biotérios
(E 2, 3 e 5), contando com dispositivos para facilitar a alimentação de Ixodidas.
Ai estão mesas de proteção (E 1) e de necropsias (E 6), além de um forno crema-
tório para a incineração dos animais (E7). Os alimentos destinados aos animais
que permanecem no biotério, são depositados em uma caixa especial (E 4), co-
municável com o exterior, a fim de evitar a entrada de funcionários estranhos aos
ser^-iços de biotérios.

Xa parte central (D) estão instalados os frigorificos para a conservação dos
virus, bem como mesa e fichários de contrólc dos animais usados nas experiên-
cias em curso ou nos trabalhos de rotina. Xo centro da sala de controle um
elerador permite a comunicação com o andar superior do “Parilhão Lemos Mon-
teiro , onde estão instalados os scnidços de rirus em geral, cuja seção de prejjaro
c esterilização de material fornece todos os aparelhos ou demais utensílios de uso.

Esta distribuição foi feita em obediêiKia a requisitos técnicos que julgamos de
\‘alia para o maior rendimento dos ser\nços, bem como à necessidade de aproveitar
ao máximo o reduzido espaço de que podiamos dispor.

Os detalhes das instalações désses diversos laboratórios serão descritos a
s^uir e á medida que nos ocupamos das diversas fases do preparo da \acina.

E — AMBLYOMMA CAJENNENSE
CICLO EVOLUTIVO E IDENTIFICAÇÃO

•A zona de distribuição do Amblyomma cajennense (F.\bricil's, 1787) com-
preende toda a .Aníérica do Sul e Central, podendo ser encontrado no sul da

11

cm

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Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

América do Xorte, muito mais frequentemente, porém, nas zonas relativamente
quentes. E’ um dos Ixodidas mais frequentes no Brasil. De parasitismo extre-
mamente eclético, êle pode ser risto fixado em animais de sangue quente, como
em alguns de sangue frio. Quando adulto, parasita principalmente o cavalo, o
boi e o cão. O seu hospedeiro habitual é o ca%-alo. Tem sido também encon-
trado nos seguintes animais : carneiro, cabra, porco e porco do mato, veado, ca-
pivara, cachorro do mato, coelho, cotia. tatú. tamanduá-bandeira e outros.

1 . Ciclo evolutivo.

O Amblyomma cajcnnciise faz um ciclo evolutivo que conta com quatro es-
tádios diferentes: ovo, larva, ninfa e adulto. As larvas e ninfas distinguem-se
dos adultos não só pelas dimensões, como também pela ausência do orificio
genital.

lar\a diferencia-se da ninfa por seu menor tamanho e pelo fato de ser
hexápoda. .\ ninfa é octópoda. E' conhecida entre nós pelas denominações
populares de “miaiim”, “carrapato pólvora’’, “carrapato fogo”, além de outras,
peculiares a cada r^ão.

.•\ ninfa é comumente chamada de “carrapatinho”, denominação que o povo
dá igualmente à larva. -•\racão aconselha manter essa denominação somente
para a ninfa.

Os adultos são mais conhecidos pelos nomes de “carrapato rodoleiro” e
principalmente “carrapato estréia”.

Somente na fase adulta distinguem-se os sexos: na fêmea, o escudo cobre
somente a parte anterior do dorso e no macho inteiramente.

.•V fêmea, no momento propicio, fi.xa-se ao hospedeiro, e inicia a sua alimen-
tação. Aos poucos aumenta de volume e, ao fim de alguns dias, repleta de
sangue e distendida ao má.ximo, desprende-se do animal caindo ao solo. Pro-
cura uma cobertura protetora em algum vegetal próximo e ai inicia dentro de
poucos dias a postura dos ovos.

Decorridas algumas semanas e após a eclosão dos ovos. saem as larvas que
esperam o momento propicio para atingir um hospedeiro ao seu alcance para se
alimentarem.

Após alguns dias de alimentação, desprendem-se do animal, caem ao sólo e
transformam-se, dentro de alguns dias, em ninfas, procedendo-se assim, a 1.*
fase da metamorfose.

12

Fic. 4

CicJo evololiTo do A. c^jrmnrnse. Cnaçâo artificial

coclhot.

A — ff adulto
B Ç adulta

9 adulu c lüo alimentada
9 adulta alimentada

I) —

E — Urras

F ~ Ur>*as alimentadas
G — > ninfas nâo atimenta«Uf
H ~ ninfas alimentadas
(-> alimentação em coelho
ecdíse

cm

I, i'(SciELO,

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J. Travassos 4 A. Vallejo-Fbeibe — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 159

Estas, novamente, procuram alimentar-se em um novo hospedeiro, antes de
se transformarem (2.® metamorfose) na fase final de maturidade sexual, em
carrapato adulto. Com a alimentação da fêmea, em um terceiro hospedeiro,
inicia-se novo ciclo evolutivo.

Como vemos por essas resumidas noções gerais sóbre o ciclo evolutivo do
Amblyomma cajcnuensc, esta espécie vetora da febre maculosa, alem de exigir
três hospedeiros para a sua evolução, faz todas as fases de sua metamorfose fora
dos mesmos. Êste fato. aliado à indiferença com que ataca os diversos animais
e mesmo o homem, permite que, uma vez infetado em qualquer de suas fases
evoluti\’as, já na seguinte possa o Ixodida inocular o material infetante em outro
animal ou. acidentalmente, ao homem.

2. Identificação.

Incluimos aqui os caracteres genéricos e especificos de acordo com a descrição
de Robixson (28) e que correspondem aos da espécie com que trabalhamos:

Caracteres genéricos:

“ 5feu$triata, isto é, sulco* anais «n tomo do anus de situação posterior ;
geralmente ornados com manchas escuras e listras sõbrc fundo pálido; olhos c
festões presentes. Palpos geralmente longos, o 2.® articulo mais longo do que
o* demais. Os capitulos basais são de forma «riável. Os exemplares machos
não possuem escudo» adanais, porém frequentemente têm placas ventrai». Es-
piráculos subtriangulares ou em forma de virgula.

Espécie tipo: Amblyomma cajennense (Fawiicivs)."

Caracteres especificos :

",\ía(ho.

Diatmôstico: Carrapato pequeno ou de tamanho médkx, com a ornamen-
tação carateristica no escudo, formada por manchas ou listras \-crmclho-parda-
centas sõbrc fundo pálido; sulco marginal continuo; sulco cerxkal curto e pro-
fundo, sigmóide; patas de colorido pálido, coxa I com dois espinhos fortes,
dos quais o externo roais longo e mais afilado; um espintio salieme e pontea-
gudo nas coxas II e IV; espinho longo, robusto e afilado na coxa IV. ^

Fêmea.

Diagnóstico: Esctxio triangular, arredondado anteriormente, com o ângulo
posterior de largura moderada, ornado com manchas vermelho-pardacentas sóbre
fundo pálido; sulco* cervicais curtos, profundos e sigmóides, numerosas pon-
tuações de tamanho médio uniformememe distribuidas ; coxa I com dois es-

15

160

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

pinhos de ponus desiguais; coxas II e III com espinho saliente ponteagudo,
coxa IV com um único espinho ciuio, rombo e arredondado, pouco mais longo
do que largo; festões sempre com pequeno tubérculo no lado rentral, no ân-
gulo póítero-intemo. "

ric. $

ctjtnHttut, ^ . Eacwto. asp<cto dorssl e ventral tSo capitolo, couj I a IV, tarsos
I e IV (Kcnndo Roaixiov im *Thr (cnu> .1mbly«mma~).

Robinson, em sua monografia “The genus Amblyomma” (28), ao des-
crever a espéde Amblyomma cajennense (Fabricics. 1787) coloca a Amblyom-
ma sculptum Berlese, 1888, em sinonimia. Entretanto recentemente Ron-
delli (29) admite a possibilidade de ser Amblyomma sculpluin considerado es-
pécie afim ou variedade de Atnblyomma cajennense. Sugere ainda Rondelli,
dada a grande difusão desta última espécie, que o pequeno número de casos de
febre maculosa em S. Paulo deva correr por conta da raridade relativa de A. sculp-
tum ou de outra qualquer das pretensas espécies que revalida ou descreve e que
poderiam ser os verdadeiros vetores da riquetsiose.

Não nos parece estar a razão com Rondelli, pois ainda admitindo a multi-
plicidade de espécies, as verificações de infecção e de transmissão até agora

16

J. Tr,\vassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyointna

cajennense. j01

feitas não só com outras espécies de Ixodidas do gênero Amblyomma (A. slria-
tum, A. brasilicnsc e A. coopcri), como com espécies de outros gêneros, Dcrma-

Fic. 6

Ambijomma njnmnst, 9. Face dorsal c rratral. a.p«to do rapiiulo. «pirictilo.
COM» I a IV. urios I c IV (Meando Roíixiox -Tbc grnas Amtíyemma-).

centor e Rhipiccphalus, são demonstrativas de que todas se infetam facilmente e
transmitem com muita regularidade a iníec<;ão a animais. Do mesmo modo que

17

162

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Amblyomma cajennense, todas as demais espécies citadas acima transmitem a
infecção de estágio a estágio de sua evolução. Desta sorte, parece-nos que pelo
menos as espécies citadas do gênero Amblyomw.a, jarasitos dos animais de sangue
quente, podem, quiçá indiferentemente, infetar-se e transmitir a riquétsia da febre

Fic. 7

ExrfnpUrrs de Ambtycmmta ^ ^9» dorsAl e retilraL

maculosa. Xão podemos, assim, aceitar a sugestão de Roxde li. que, confundindo
um simples indice baixo de infecção natural do Amblyotmna cajcnncnse, tal como
se dá também com o Dcrmaccntor amicrsonx nos Estados Unidos, sugere uma
“imunidade” para essa espécie em relação à febre maculosa e empresta a uma
suposta variedade caraterísticos especiais de infecciosidade e transmissibilidade.

18

J. Travassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense.

163

Fic. 8

Atmihlycmm* c^jfnntnst, ^ • 7ac« dorsal e rcotraL

19

cm

SciELO

0 11 12 13 14 15 16

J. Travassos &. A. Vallejo-Freire — Criação artificial dc Amblyomma

cajennense. 167

Os dados diferenciais utilizados por Rondelli para Justificar a \'alidade des-
tas pretensas espécies, não nos parecem igualmente suficientes; acreditamos
mesmo terem sido o resultado de estudos feitos em pequeno número de exemplares,
todos conservados. A variação de dimensões entre Ixodidas da espécie Ambly-
omma cajennense é muito grande, mesmo quando se examinam adultos provenien-
tes de u’a mesma geração de ovos. Temos, por exemplo, largamente verificado
que u’a maior ou menor sucção de sangue pelas ninfas de u’a mesma geração tem
decish-a influência sôbre o tamanho do adulto correspondente, e naturalmente,
sôbre o de partes de sua estrutura, como, por exemplo, o escudo que apresenta
modificações de forma e tamanho provavelmente da mesma natureza das que ser-
viram àquela autora para diferenciar as espécies mixtum, sculptum, tapiri e fini-
thnum.

Não cabem aqui argumentações mais extensas a êste respeito. Entretanto,
para que não surjam futuras dúvidas sôbre a espécie com que trabalhamos, inclui-
mos propositadamente a descrição dos caraterísticos principais, constantemente
encontrados nas muitas gerações de Amblyomma cajennense conseguidas com a
finalidade de preparar a vacina e oriundas de fêmeas colhidas em diferentes locais
do Estado de São Paulo, inclusive em focos dc febre maculosa, onde tem sido
encontrados Ixodidas naturalmente infetados. Os desenhos de exemplares adul-
tos vistos pela face ventral e dorsal obtidos de Ixodidas vivos, são aqui incluídos
com o fim de orientar e facilitar a sua identificação.

F — AMBLYOMMA CAJE^WESSE — CRIAÇAO ARTIFICIAL

1 . Colheita das fêmeas. Fecundação.

A criação artificial do Amblyomma cajennense c feita cm nosso laboratório
a partir de exemplares adultos fémeos, obtidos anualmentc cm grande número nos
meses de outubro a março em equinos soltos durante alguns dias cm pastagens.
Êsses Ixodidas são colhidos somente quando bem alimentados, repletos de sangue.

Abolimos ultimamente a prática de iniciar a criação a partir dc exemplares
adultos capturados quando ainda não alimentados, tal como o faz Parker. Nos
laboratórios de Montana, onde a sacina é preparada com o Dcnnacenlor andersoni,
a criação artificial tem inicio, colhendo-se no campo, por meio de uma bandeira
de flanela, grande número de exemplares na fase adulta, antes de se fi.xarcm
no hospedeiro, portanto, quando as fêmeas ainda não foram fecundadas, nem ali-
mentadas. A fecundação e alimentação se faz ao colocar êsses Ixodidas (machos
e fémeas) cm coelhos, por meio de aparelho especial aplicado ao corpo do animal.

9

23

168

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Os coelhos utilizados para êste fim são previamente infetados. As larvas pro-
venientes dos ovos das fêmeas alimentadas, já se mostram assim infetadas.

A técnica por nós usada é vantajosa, não só sob o ponto de vista econômico
(menor uso de animais de laboratório), como também pelo fato de se obter maior
rendimento em fêmeas bem alimentadas e em estado satisfatório para uma per-
feita evolução. Êste fato está principalmente ligado a dois fatores. Em primeiro
lugar, apesar da ubiquidade de seu parasitismo, o Amblyomma cajcnnense não é,
como no caso do Dermacentor andersoni, um carrapato de roedores, pelo contrá-
rio. prefere na fase adulta animais de grande porte, especialmente equinos e mua-
res, de modo que a alimentação em roedores (coelhos e cobaias) não é feita de
maneira tão rendosa. Em segundo lugar, temos verificado que somente as fê-
meas fecundadas alimentam-se de modo satisfatório, o que se processa melhor
na natureza. Não trabalhando nesta etapa inicial com lar\-as já infetadas elimi-
namos o perigo da manipulação do Ixodida na fase mais perigosa, que exige
maiores cuidados técnicos dadas as suas pequenas dimensões.

Constantes verificações feitas em carrapatos parasitando cavalos mostram
que a alimentação dos exemplares adultos fêmeos faz-se mais ou menos rapida-
mente, prolongando-se por 48-72 horas, desde que estejam elas preria ou con-
comitantemente fecundadas. Os machos procuram em geral as fêmeas quando
estas já estão fixadas ao hospedeiro. Somente as que não se mostram em con-
tacto com o macho, podem permanecer fixadas ao cavalo durante vários dias, po-
rém sem que aumentem de volume. Desde que fecundadas, se alimentam com-
pleta e rapidamente. Verificamos que os exemplares fêmeos não se alimentam
complctamente sem que esta condição seja preenchida e que, pelo contrário, a
alimentação é sempre rápida e total após a fecundação, não se prolongando ge-
ralmente além de 3 a 4 dias.

As fêmeas deverão ser colhidas bem cheias para que desovem a contento.
Teoricamente, deveriam ser utilizadas apenas aquelas que após farta alimentação
se desprendem espontaneamente dos animais parasitados; na prática, porém, isto
é inatingível, devendo-se colher os Ixodidas quando ainda fixos à pele dos ca\-alos.

Várias pesadas de fêmeas colhidas dêste modo e que foram cuidadosamente
obsers-adas quanto ao rendimento da desova, mostram que fêmeas pesando cêrea
de 0.5 g já podem ser aproveitadas para início da criação. Deve-se dar prefe-
rência. contudo, a fêmeas de maior pêso. Nas colheitas de grande número de
fêmeas nos serviços de rotina, são mais frequentes as de pêso entre 0.75 g a 0.9 g,
podendo algumas atingir a mais de 1 grama.

Fi.xam-se, elas, de preferência, nas regiões mais vascularizadas, como, por
exemplo, na parte inferior do animal, no pescoço ou principalmente na face in-
terna e posterior das coxas, onde a epiderme é igualmente menos espêssa.

J. Travassos & A. Yallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 169

A colheita de Ixodidas deverá ser cuidadosa. Qualquer lesão poderá ocasio-
nar a morte da fêmea ou a não desova. São principalmente prejudiciais as
fraturas do aparelho de sucção, o que pode facilmente acontecer quando se
procura por meio de trações bruscas destacar carrapatos fortemente fLxados.

As fêmeas quando bem alimentadas, sempre se destacam facilmente. Qual-
quer auxiliar adquire a prática necessária ení pouco tempo, que consiste em fa-
zer manobras suaves de tração no sentido oposto ao da penetração do hipostoma.

Nas observações feitas no decorrer de 1939 sôbre 1.000 fêmeas cheias colhi-
das por auxiliar inexperto, 94 exemplares (9.%) morreram sem ter iniciado a
desova; já na criação de 1942, entre 5.548 exemplares colhidos só no mês de
novembro, apenas 308 exemplares (5.5%) morreram ou não desovaram em con-
sequência de defeitos na manobra da colheita. Eista diferença correu, sem dúvida,
em parte por conta das precauções tomadas ao destacar os Ixodidas fixados aos
cavalos. Seria possível eliminar estas últimas perdas, selecionando as fêmeas bem
cheias e desprezando aquelas que ao exame no microscópio entomológico mos-
trarem lesões do hipostômio.

A época em que Amblyomma cajennense ê encontrado na fase adulta,
inicia-se nos últimos dias de setembro e pode prolongar-se atê fins de março.
As lar\-as, pelo contrário, são mais frequentes nos meses de maio e junho e as
ninfas de julho atê setembro. Êsses limites não são, entretanto, fixos, pelo
contrário, variam largamente nos diferentes localidades do território paulista,
variação decorrente, sem dúvida, das diferenças climáticas das respectivas
fegiões, principalmente das relacionadas com a temperatura e o grau higrométrico.
Mas condições de trabalho de criação artificial de Ixodidas em nosso laboratório,
êste delo se reproduz de maneira aproximada e atingimos a fase adulta dos Ixo-
«lidas de nossa criação, quando mantidos à temperatura ambiente, quase sempre
t>os primeiros dias de setembro.

Os locais cm que Amblyomma cajennense é encontrado mais freqüente-
*ncntc são aquêles nos quais abundam equinos e muares e onde, igualmente, são
preenchidas certas exigências relati\-amentc ao tipo de vegetação, umidade e
temperatura.

Há no Estado de São Paulo algumas plantações de eucaliptos, que reunem
maneira ideal, todas as condições propicias à manutenção e reprodução de
Rrande quantidade de Ixodidas. Uma dessas plantações constitui foco bem
estudado de febre maculosa e o local tem mesmo a denominação de "carra-
I>atal”, tal a quantidade de Ixodidas, principalmente de Amblyomma cajennense,
*Ii encontrada. Além da sombra relatisa proporcionada pelos eucaliptos que
permite manter um estado higrométrico favorável, há abundante vegetação ras-

25

170

Mcxnóriíís do Instituto Butantan — Tomo XVIII

teira e de arbustos, onde a desora das fêmeas faz-se satisfatoriamente ; por outro
lado, o giande número de muares e equinos usados pelos cortadores de lenha para
0 transporte, serve de abundante repasto às exigências nutritivas dos carrapatos,
de modo a facilitar o seu ciclo evolutivo.

DISPOSITIVOS DE DUPLA PROTEÇÃO PAR.\ A CRIAÇAO DE IXODIDAS

Após préria la\-ageni, seguida de secagem ao ventilador, cada exemplar fêmea é co-
locado em um dispositivo especial que denominamos “ frasco de dupla proteção Este
dispositivo serve para conter os carrapatos em todas as fases evolutivas c consta de 2 tubos,
um menor, chamado “tubo de contenção”, no interior do qual são colocados os Ixodidas, e
outro maior, servindo de continente do primeiro e denominado “tubo de proteção”.

O “tubo de contenção” é ura cilindro de vidro, medindo 2.5 cm de diâmetro por
cm de comprimento e aberto cm ambas as extremidades. Uma tampa de alimiinio perfei-
tamente adaptável ao diâmetro deste tubo, mantém fixa numa das aberturas uma tela de
organdi, de malhas suficientemente finas para não ivermitir a passagem das menores larvas.
Esta peça de aluminio é perfurada no centro e fixa-se ao vidro — após adaptar o organdi
— por meio de uma camada de parafina, que se aplica aquecida e fundida. A outra extre-
midade do tubo de contenção é fechada por uma rolha de cortiça recoberta com gase. O tubo
fechado deste modo permitirá a fácil aeração pelas aberturas superiores. A fémea desti-
nada á criação deverá ser colocada sóbre a gase que cobre a rolha.

Usamos os tubos de contenção assim preparados preferentemente aos fechados em unia
extremidade e abertos na outra, porque as nossas verificações tém evidenciado um retarda-
mento considerável do inicio da saída de larvas, quando são usados os tubos fechados co-
muns. Acreditamos que o grau de umidade ótimo, agindo mais diretamente sóbre os ovos,
facilite e mesmo ecclere a evolução.

Q>locadas as fémeas nos “tubos de contenção”, estes são guardados no interior doS
“tubos de proteção", que medem 9 cm de comprimento por 3.5 cm de diâmetro e são aber-
tos somente em uma das extremidades. Néste tubo costumamos colocar uma base de areia
de 2 a 2.5 cm de altura, que se molha frequentemente com água e é destinada a manter a
umidade requerida pelo Ixodida. .A rolha de cortiça do “ tubo de contenção ” deve repousar
na areia e a gase que envolve poderá assim permanecer úmida, transmitindo umidade ao
Ixodida. A contínua evaporização da água da areia mantém no interior de todo o tubo
de proteção um grau higrométrico ambiente ótimo.

O “tubo de proteção” é obturado na parte superior por meio de um pedaço de organdi
fixado nos bordos externos superiores do tubo por uma tira de esparadrapo. Êste disposi*
tivo permite u’a maior segurança nas manipulações, bem como facilita a manutenção cons-
tante da umidade indispensável á boa evolução do Ixodida; igualmente veda a passagem d<
algum Ixodida. que por qualquer motivo possa transpor o obstáculo constituído pelo “tub®
de contenção”.

As indicações sóbre data e local da colheita, número de ordem do tubo, bem com®
quaisquer outros informes, são anotados em ficha especial, onde se registram todos os dado*
relativos á evoluçãa No esparadrapo que serve para fixar o pedaço de organdi, fica*^
•notado apenas o número de ordem correspondente á ficha.

26

J. Trvvassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial cie Amblyomma

cajennense. 1 7 j

Os frascos de dupla proteção acima descritos, contendo os Lxodidas, são sempre co-
locados cm caixas especiais, qu; podem receber 42 frascos cada uma. Estas cai.xas são
mantidas cm armários de capacidade para 2.100 tubos cada um.

Fic. 10

Tubo de dupU prtMceio. com o Inbs de contenção (menor) e o de proteção (nuior).

Apesar da dupla proteção oferecida pelos tubos, o armáro, que é de mrtal pera facilitar
limpeza mais riRorosa. repousa cm uma bacia que contem solução carrapaticida. Esta
riecaução impedirá, em caso de arídcnle. a pasraRcm de carrapatos do armário para o piso
da sala.

Todo este conjunto tem-se mostrado satisfatório para a segurança do trslalho c csUs
precauções nos parecem de utilidade.

MODIFICAÇÕES XOS .AP.ARELHOS CS.ADOS P.ARA .\ CRI.AÇAO DE IXODID.AS

Todos os dados sobre detalhes do ciclo esolutivo do Amblyomma cajennensf incluidos
néste trabalho, foram obtidos cm obsersações de lxodidas mantidos no nosso tubo padrão
de “dupla proteção". Êste dispositivo parece-nos bastante prático c os resultados de sua
aplicação, sem dúvida, são satisfatórios quando o solume da \acina a produzir não e grande.
Si. entretanto, se cogita preparar sacina em maior volume, o que reejuer como ponto de
lartida muitos milhares de fêmeas alimentadas e não se dispõe de muito (lessoal. é de todi

172

Mcniúrías do Instituto Butantan

Tomo XVHI

a com-eniência alterar as dimensões do aparelho de proteção e reunir cm um só vários
“tubos de contenção”.

Passamos ultimamente a trabalhar com lotes de 50 a 100 tubos de contenção, colocados
em um cristalizador de aproximadamente 10 cm de altura. Xêste crisulizador, que exerce
a função do tubo de proteção, coloca-se, igualmente, a base de areia um:xlecida até a altur.v

Fic. II

Armário com Ixodídat.

de 2 cm. Os tubos contendo carrapatos são dispostos sôhre a areia com a parte fcchad-i
pela rolha de cortiça \-ollada para baixo. Com organdi ã pros-a de larvas preso ao bordo
superior do cristalizador por meio de esparadrapo, obtem-se a dupla proteção desejada.

Para simplificar o trabalho, juntam-se no mesmo cristalizador somente Ixodidas da
mesma fase evolutiva, colhidos num mesmo dia c nas mesmas condições de alimentação.
Procedendo-sc dêste modo. pode-se prever com certa segurança, qual o momento propício
para a alimentação de torlos os e.xcmplarcs contidos no mesmo aparelho de proteção, desd-i
que sejam bem conhecidos os dados referentes aos períodos de tempo necessários à este
lução do carrapato nas suas sárias fases.

28

J. TawAssos & A. Valxejo-Freike — Criação artiricial cie Amblyomma

cajennense. 173

Oirtro dispositivo frequentemente utilizado é o constituido de um tubo contenedor (A)
fechado na extremidade inferior com o tecido dc organdi (D) e na superoir com uma rolha
de cxjrtiça perfurada no centro, de abertura igualmentc protegida com tecido à prova dc
larvas (E). Este tubo, cilíndrico c idêntico ou pouco mais longo do que o tubo padrão
de contenção e deverá ficar suspenso pela parte mediana por meio de uma rollia de cor-
tiça, que se adapta à parte superior aberta de um outro tubo (B), dc diâmetro ligciramcmte
maior do que o nosso tubo de proteção. No fundo deste tubo coloca-se também a indis-
pensável areia umedecida (C).

Fic. 12

Aparelho dc dopU proteção, conlenio 100 loliinhoe com carrapato».

Os carrapatos mantidos no interitw do tul» cilindrico menor c. depositados s«>bre o
organdi. ficam em ótimas condições de aeração e sofrem a influência benéfica tia livre pas-
sagem da umidade através do tubo de contenção, sem que sejam umedecidos por contato
direta

Aconselhamos, entretanto, utilizar éste modélo somente quamio se estudam Ixodidas
não infetados.

Os inconvenientes que podemos apontar contra o uso generalizado drste dispositivo no
manuseio de carrapatos infetados, são os seguintes: 1) fornece menor segurança do que
o nosso tubo dc dupla proteção; éste, além da liarreira apresentada pelo organdi protetor
do tubo dc contenção, apresenta novo obstáculo |>ara a saida dc Ixcnlidas, constituido jiclo
tubo dc proteção, fechado com tecido á prova de lanas; 2) facilita na base do tubo de
contenção o crescimento dc bolores que frequentemente interferem ta evolução normal dos
oTOs dos carrapatos ou das lanas c ninfas cheias; éste crescimento se verifica á custa Jo
material nutritivo constituido dc detritos, principalmentc plasnu sangüinet», que vem ade-

29

174

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHl

rente aos carrapatos; 3) nas obsen-ações muito prolongadas pode acontecer que o organJi
venha a se desfa 2 er devido a ação continuada da umidade e ao crescimento de bolores, acar-
retando a queda dos Ixodidas no interior do tubo maior. A resistência do organdi poderá
ser aumentada, embebendo-o de parafina antes de fixá-to ao tubo de contenção.

Xota: QuaiKlo, nos cristal izadores de que fa-
lamos. SC deseja colocar tubos abertos nas duas ex-
tremidades. não devem eles ser deixados em contato
direto com a areia úmida. Xesse caso. interca!a-sc
entre a superfície da areia e a base dos tubos de
contenção uma tela de metal inoxidável, sõbrc a qual
devaão rej-ousar os tulinhos com os carrapatos.

CAMARA-ESTUFA PARA IXODIDAS

Colocados os tubos d; contenção com Ixo<lidas
ro interior dos tubos de proteção, podem eles por-
mnccer ou nos armários já anteriormmte citados
ou ainda cm uma câmara-estufa, de temperatura ro-
gulAvel c umidade constante, de modo a ser possível,
quando necessário, apressar a postura c eclosão dos
c-.xí cu fadlitar a eedise de larvas ou ninfas.

.-\ cámara-estufa usada para a criação dos Ixo-
didas c uma sala cora 220 m de largura. 3.50 m
de comprimento e 220 m de altura, completamente f t-
chada por meio de caixilhos de vidro. Xo seu in-
terior há duas estantes capazes de conter 120 caixas
de Ixodidas, correspondendo a 5.010 tubos de dupla
proteção.

Estas estantes são de metal e construidas <•<■
modo a ficar completamcnte isoladas das paredes
laterais. .A ba.se em que se apoiam ao solo e mergulhada cm bacias escavadas no a5Soalh--\
erntendo solução de carrapaticida.

.•\ temperatura da estufa poderá ser regulada á vontad: ou mantida constante jkI >
aparelho automático conectado a uma serie de resistências distribuídas em posição apro-
priada no interior da câmara. O contrôle da umidatie ê feito por meio de um higrómetro
registrador Zeiss. Um pequeno exaustor colocado na parte superior da câmara regula a
a.eração de combinação com o aparelho regulador da temperatura. Xo interior da câmara,
a temperatura não deve ir alêm de 26®C. Xossas experiências têm demonstrado, que a!
temperaturas mais elevadas, si bem que apressem de alguns dias o ciclo evolutivo do ca."-
rapato. po«lcm. por vêzes. trazer como consequência um menor rendimento da criação, dada
a facilidade com que morrem os Ixodidas que permanecem muito tempo expostos a essas
temperaturas, tomando-se necessário manter constante e meticulosa vigilância para evitar
perdas desastrosas.

.-\ possibilidade de se controlar atê certo ponto a eedise das larvas, ê, sem dúvida,
maior importância, porquanto a colheita de carrapatos no campo pode ser feita somente
durante um periodo de tempo relativamente reduzido. Si bem que as fêmeas cheias possain

A — tnbo dc contcnçioí ^ “ tubo d«
protr^o; C — arria umidcci^U; D-K —
abertura protefttla cotn orsandí.

30

J. Travassos & A. \ allejo-Fbeire — Criação rrlificial clc .Xmbti/oinma

cajenitense. 1 75

ser obtidas a partir do mês de setembro ate março, a grande maioria é encontrada no curto
periodo de tempo que vai de 15 de dezembro a 30 de janeiro.

Por vezes, em colheitas satisfatórias chegam ao laboratório num mesmo período de
tempo mais de 2.000 fémeas cheias, colhidas cm idênticas circunstâncias. Ora, si todas per-
manecessem nas mesmas condições de temperatura c umidade, as Iar\-as resultantes teriam
de ser alimentadas na mesma ocasião, o que seria pouco prático, não só por e.xigir grande
quantidade de pessoal técnico especializado c instalações mais amplas, como principalmente
porque predsariamos contar, no mesmo momento, com grande núnwro de coelhos i>ara ali-
m:ntar todas estas larvas, sem o que seriam perdülas muitas gerações de Ixodidas.

Fio. 14

Cinura.«cura par» Ixodidas.

2. Postura dos ovos.

Devemos considerar três períodos :

1. Periodo prévio à desova (protóqtiia).

2. Periodo próprio à desova (cotóquia).

3. Tempo decorrido entre o último dia de desova e a morte da fêmea
(metatóquia).

31

176

Memórias do Inslituio Butantan — Tomo XVHI

Período prez-io à desova (protóquia).

la. Experiência: Temperatura ambiente do laix)ratório.

Mantidas as fêmeas de Ainblyomtna cajennense à temperatura ambiente do

laboratório, a deso\-a tem inicio 5 a
9 dias após a colheita. As fêmeas
observadas nesta nossa 1.® experiên-
cia foram todas colhidas quando
ainda fixadas nos equinos. Os re-
sultados seriam possivelmente dife-
rentes, si fizéssemos a mesma obser-
ração a partir de exemplares que
espontaneamente se desprendem dos
caValos após a alimentação. A varia-
ção dos resultados, entretanto, seria
insignificante, pois no momento em
que procedemos à retirada das fê-
meas cheias, elas estão muito próxi-
mas a cair espontaneamente.

As experiências levadas a têrmo
nos anos de 1939, 1941-42 e 1942-43
confirmam os dados estal)elecidos pa-
ra o periodo prévio à desova. Xa cria-

Fic. 15

Amtblyomma cairmmftue, ç ebeta.

Amblyoítnna cajennense, retiradas de ca-

ção de 1939, por e.xemplo, fêmeas de

ralos usados nos seniços do Instituto, constituindo três lotes separados, fci
ram levadas ao lalwratório logo após a colheita, cobKadas no mesmo dia no
tubos individuais de dupla proteção c mantidas à temperatura do lalx>ratóric
Ao todo 301 fêmeas iniciaram a desora, ficando os três lotes usados nesti
observação assim constituidos :

1. ° lote® 35 fêmeas, colhidas a 17-1-.39

2. ® lote; 114 fêmeas, colhidas a 14-2-39

3. ® lote: 152 fêmeas, colhidas a 1-3-39.

32

J. Travassos Jt A. Vallejo-Freihe — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 177

Os resultados obtidos foram os seguintes:

Período prério á deoora (protóqnia)

(temperatura ambiente)

IHas

J.* lote

2.* lote

J.» lote

Toul

»

4

_

6

6

1.99

5

21

2

36

59

19.60

6

9

87

34

130

43.18

7

5

21

24

50

16.61

8

—

4

47

51

16.94

9

—

5

5

1.66

Total

55

114

152

301

As médias das temperaturas registradas nos meses de janeiro, fevereiro e
tnarço foram as seguintes:

AleM^

mêdU

terop. mÃx.

média
temp. min.

ampntode

média

Miai ma
abaolttta

Mínima

abaoJota

janeiro

26.9

17.3

9.7

31.8

12.9

Icvcreiro . . .

28.9

17.3

11.6

31.9

15.4

março

28.3

17.5

10.8

33.1

15.4

AnaIisando*se separadamente os resultados das observações em cada lote,
que correspondem a carrapatos colhidos em 3 meses diferentes, obsers’a-se que
a desova se faz com menor oscilação do período prévio no lote correspondente
ao més de fevereiro, quando entre os dias 5.® e 8.® todos os Ixodidas iniciaram
a desova. Nos outros dois lotes, embora a maioria das fémeas tenha mantido
o mesmo período de tempo para início da deso\-a, 5-8 dias, este, ainda que ra-
ramente, foi por vezes mais precoce ou mais tardio. No conjunto verifica-se
que 43.18% das fêmeas iniciou a deso%-a no 6.® dia.

2a. Experiência: Temperatura constante de 26.®C e umidade relativa de 90%.

Para verificar qual o tempo decorrido entre a colheita e o inicio da postu-
ra de ^émea de Amblyomma cajennense mantidas à temperatura constante e
umidade controlada, destacamos um grupo de 464 fêmeas colhidas em condições
idênticas às referidas na primeira e.Nj)eriên:ia, entre os dias 15-11 e 15-12. Os
tubos de dupla proteção, contendo as fêmeas para desova, foram colocados cm
uossa câmara de criação de Ixodidas, à temperatura de 26.°C e o grau de umi-

33

178

Memórias do Instituto Butanian

Tomo XVIII

dade relativo a 90%. Nessa obsen-ação, o período prévio ^•ariou entre 4 e 12'
dias, como se pode ver no quadro abaixo:

Periodo prévio á desora (ProCóqnia)
tcmperatnra 26*C

Dias

N.* de
txodklas

%

4

3

O.&t

5

6

1.29

6

124

26.50

7

214

46.12

S

77

16.59

9

35

7.54

10

3

0.64

11

1

0.21

12

1

0.21

Total

404

COMP.\R.\ÇAO DOS RESULT.\DOS

O gráfico comparativo dos resultados obtidos para o período prévio à de-
sova nas condições das duas experiências (Fig. 16), evidencia que não houve
diferença muito acentuada. À temperatura ambiente do laboratório, a curva de
frequência percentual, além de ser semelhante e bem uniforme, antecede de um
dia a que representa a de temperatura constante. As médias aritméticas são
respectivamente = 6.3 e X» = 7.6 dias.

3a. Expericncta: Temperatura ambiente do laboratório.

Uma outra observação mais rigorosamente conduzida foi feita ainda êste
ano com 100 fémeas colhidas num mesmo dia em animais provenientes do mes-
mo local, selecionados em peso e tamanhos mais ou menos idênticos e mantidas
à temperatura ambiente do laboratório, sempre no tubo de dupla proteção

Periodo prerio à deaora (proCiqvU)
Temperatura ambiente- loicío da
experiência eni 77 ^ 2^43

Dias

N.* de carrapatos

5

6

6

28

7

38

8

8

9

19

10

1

Total

100

34

J. Travassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 179

PCIIiOOO >KVIO * tCLOiio OC OVOS OC A CAjtMNCHSt

à TCHPCRATURA 00 LAOORATÓRIO C à TCMRtIUTUIU COttSTAHTt (M*C)

Fic. J6

As temperaturas obsers-adas durante o período da obser\ação foram
as seguintes :

Dia>

Tetnp^attira

máxima

Temperatura

minima

Mn] ia

27

28.6

17.3

22.9

28

28.7

15.9

22.3

1

28.4

17.0

22. 7

2

28.2

15.5

21.9

3

26.9

15.0

20.9

4

28.0

14.5

21 .2

5

28.1

14.9

21.5

6

27.5

16.1

21.8

7

26.9

17.2

22.1

8

24.7

16 5

20.6

Xesta última experiénda a maioria das fêmeas (38.0ÇÓ) iniciou a postura
depois de decorridos 7 dias da colheita.

33

180

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

É curioso notar que, selecionadas desta maneira, todas as 100 fêmeas te-
nham iniciado a desora, o que raramente acontece quando não se usam exem-
plares escolhidos.

Fic. 1*

Amh!y^mmta ftjcmtu-nsr, Ç em desova.

\'ê-se, então, a julgar pelas rei)etidas exjiericncias feitas com diversos gru-
ix)s de Ixodidas colhidos numa mesma ocasião, ([ue o período prévio à desova
jx)r nós observado é aproximadamente a metade do verificado por Rohr (30)
à temperatura ambiente (11 a 13 dias) e Lf.mos Monteiro à temperatura cons-
tante de 28.°C (9 a 14 dias). Êste fato deve correr por conta das condi<:'’>es
técnicas em que são mantidos os carrajiatos em nosso lalwratório.

Xa fase inicial da criação, a umidade é mantida constante no interior dos
tubos que contém os carrapatos, umedecendo-se com freqüéncia a areia coloca*
da no tubo de proteção. Para esta manobra não se toma necessário retirar
a gaze que protege a parte su|>erior do tubo de proteção, bastando fazer escorrer
a água jielas paredes laterais internas do organdi.

Período f'róprio à dcsoi-a (cotóqiiia)

O período próprio à desova, isto é. o tempo decorrido entre o início e o
fim da postura dos ovos. é maior do que o jieriodo prévio. A postura

36

J. Tb.\vassos & A. Vallejo- Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 181

prolongar-se por período de tempo variável entre 7 a 26 dias, quando as fêmeas
permanecem à temperatura de 26.®C e de 10 a 32 dias, quando à temperatura
do laboratório.

la. Experiência: Temperatura e umidades constantes.

O período próprio à deso^^a foi observado numa primeira experiência em
448 fêmeas da criação, iniciada com a colheita feita durante o mês de novem-
bro de 1941, tendo-se tido o cuidado de retirar diariamente de junto de cada
fêmea todos os ovos postos no dia anterior, juntando-se num tubo de contenção
separado. ELsta observação, cujos resultados estão resumidos no quadro anexo,
foi feita em carrapatos mantidos à temperatura constante de 26°C.

p

Tem

criado prdprío 1 dnora (colóqoU)
peratura 260C uatidade rclaiira 90%

DUs

X.* de txodidu

%

7

1

0.22

8

2

0.45

9

lí

2.45

10

26

5.80

11

34

7.54

12

89

19.86

13

70

15.65

U

100

22.34

IS

61

13.61

16

19

4.24

17

9

2.45

18

3

0.66

19

3

0.66

20

4

0.89

21

1

0.22

22

9

2.45

23

—

24

3

0.66

25

2

0.45

26

1

0.22

Total

448

2a. Experiência: Temperatura ambiente do laboratório.

O período de tempo necessário à desova do Atnblyomma cajennense pode
ser maior quando as fêmeas são mantidas á temperatura do laboratório no mês
de março. O quadro abaixo resume os resultados da experiência feita em um
Çrupo de 100 Ixodidas, colhidos a 27-2-13:

37

182

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XYHI

Período próprio á detora (cocóqtiia)

Temperatura do labortôrio (março 1943)

Dia>

N.* de Ixodídas

'i

10

1

1.03

11

1

1.03

12

2

2.06

13

í

1.03

14

7

7.21

15

1

1.03

16

1

1.03

17

—

—

18

3

3.09

19

5

5.15

20

2

2.06

21

1

1.03

22

o

2.06

23

6

6.18

24

13

13.40

25

17

17.43

26

14

14.44

27

7

7.21

28

3

3.09

29

—

—

30

5

5.15

31

4

4.12

32

1

1.03

Totnl

97

As médias das temperaturas observadas durante o mês de março de 1943
foram as seguintes:

Média temperaturas máximas 27

” minimas ló.O^C
Temperatura média 21.8°C

” máxima absoluta 30.4°C (dia 27)
mínima " 11.3®C (dia 17)

Amplitude média 11.6®C.

Desta segunda experiência foram excluídos três exemplares, que morreram
logo após a postura dos primeiros ovos. Êstes resultados se referem, pois, àque-
las fêmeas, que deram uma desova satbfatória, isto é, pelo menos um volume
de ovos correspondente à metade do máximo geralmente observado. É de inte-
rêsse assinalar que todas as fêmeas, que deso\’aram somente durante 10 a 1^

38

J. Tr.\vassos & A. Vallejo-Freibe — Criação artificial de Amblyoninta

cajennense. 183

dias (eni número de 13), estavam mortas no último dia em que a desova foi
verificada, tendo ha\-ido, assim, uma precoce interrupção da postura dos ovos
devido à morte da fêmea. Todas as demais, cujo periodo de desova se pro-
longou além de 16 dias, morreram somente decorridos alguns dias após o último
em que houve desota, como, aliás, se verifica normalmente.

Os ovos provenientes daquelas 13 fêmeas, cuja postura foi interrompida
devido à morte, não evoluiram a contento, como veremos adiante, obtendo-se
dêles somente uma ou outra larva, após decorrido o periodo prévio à eclosão.
Ao contrário, todos os ovos oriundos das fêmeas cuja morte só foi verificada
alguns dias após a desova final, evoluiram satisfatóriamente, obtendo-se da maioria
dêles 100% de eclosões.

Sem que ainda possamos afirmar de maneira definitiva, parece-nos que le-
sões do capitulo das fémeas comprometendo a glândula de Gcné, acarretam a
má lubrificação dos ovos, facilitando a posterior degeneração.

COMPARAÇAO DOS RESULTADOS

Comparando-se os resultados das duas observações anteriormente citadas,
vê-se que é possivel apressar o periodo próprio ã desova das fêmeas de
blyomma cajenneuse, mantendo-as a uma temperatura mais clct^ada do que a
do laboratório (Fig. 18).

A maioria dos Ixodidas mantidos na estufa a 26°C fez a postura dos ovos
durante 7 a 19 dias (95%), ao passo que entre os que permanecem à tempera-
tura ambiente do laboratório, 95% fizeram a desova do 7.® ao 30.® dia. N'a
primeira e.xperiência, 13.7 dias representam a média (Xj) do periodo próprio
à desora, enquanto que na segunda X foi igual a 23.3 dias. Há. desta sorte,
uma abreviação prática de 10 dias no prazo necessário à postura, mostrando
as cur\as de freqüência u’a melhor distribuição e uniformidade à temperatura
constante do que à temperatura ambiente do laboratório. Esta curva até o 21.®
dia foi bastante irregular, definindo-se somente após éste prazo. Êste fato fica
bem evidenciado pela comparação das médias. temperatura constante a mé-
dia quase coincide com o máximo de frequência, caraterística da curva normal
de freqüência. A temperatura do laboratório, pelo contrário, a média distancia-
se sensivelmente do máximo de freqüência, o que pode, sem dúHda. ser\’ir para
confirmar o fato de, no primeiro caso, as condições biológicas terem sido real-
mente mais favoráveis. Em ambas as condições, o período correspondente às
deso>'as mais rápidas foi sensivelmente igual, isto é, as causas determinantes
sôbre a fêmea em desoi^a agiram em {leriodos idênticos (morte da fêmea). Essa
economia de alguns dias, somada à que pode ser feita nos demais períodos do
ciclo evolutivo, traz vantagens apreciáveis, pois encurta o tempo de trabalho.

39

184

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

rtoiooo mÒMiD cc ocsov* ot « oucmcau

â TtMnMTUM OO lAMIUTÔfK I â TCM^CIUTUM COMSTMTC (»*C)

caraterísticas dos ovos de amblvomma cajewexse

o número de ovos de uma postura atinge alguns milhares e geralmente
são tanto mais numerosos, quanto maior é o tamanho da fémea. Xo quadro
apresentando adiante damos os resultados de quatro posturas observadas cuida-
dosamente, podendo-se apreciar o número de o%’Os postos diariamente, a\alia-
dos por contagem direta. Tratando-se de experiência realizada em ambiente,
cujas temperaturas foram mais regulares e inferiores às das experiências atrás
citadas, a desova se processou durante maior número de dias, como é natural.

A desova máxima diária obsersada corresponde á fêmea Xo. 4, no seu 5.®
dia. com um total de 1.237 ovos.

.As desovas em geral foram continuas para todas as fêmeas, com exceção
da fêmea Xo. 3, que passou o seu 9.® dia sem deso\ar.

A morte das fêmeas deu-se algum tempo após terminada a postura: duas
delas 4, uma 5 e a outra 8 dias depois do término da desova.

A fêmea de maior pêso (960 mg) deu uma postura de 9.830 ovos e a de
menor pêso (750 mg), 5.773 ovos.

Os ovos de Amblyomma cajennense em boas condições para a evolução são
de forma ovoide e coloração pardacenta brilhante. Quando apresentam còr
tendente para castanho escuro, quase negro, perdem aos poucos o brilho cara-
terístico, tomam-se em pouco tempo menores e encarquilhados e não mais evo-

40

J. Tr-Wassos & A. Yallejo-Freire — Criação artificial de Amblyoinma

cajennente. 185

luem até largas. Decorridos alguns dias após o inicio da postura, pode-se ob-
sei^^ar no interior dos ovos a presença de pequena mancha de côr branca, que,
com o correr dos dias, aumenta de tamanho, tornando-se por fim bem visível,
mesmo à vista desarmada. Esta mancha é um indke prático da boa evolução
dos ovos e da proximidade do inicio da eclosão. Segundo alguns autores, ela
é constituída de guanina, produto de e.\creção dos tubos de Malpighi, que as
laivas posteriormente eliminam, salpicando de branco as paredes do tulx) de
contenção.

AiíBL YOMMA CAJ ESSES SE
Estudo da dfstna f efolufão dos ovos
Colheita das fêmeas em 12-11-43

Pr»o cm li>ll>43

9^

mc

751 ra(

767 mg

UO mc

Tcmpcmtorat

Fcraeaf Noc.

1

2

3

4

Máxifiu

Mintfna

18—11

20 ovos

-

23

23

19—11

149

—

69

21

23

20

20-11

103

—

195

95

23

22

21—11

128

19

193

391

23

21

22-11

338

318

656

533

23

21

23—11

882

708

221

1237

22.5

21

24—11

714

482

185

353

19.0

18

25—11

643

253

604

292

20.0

18.0

2«-ll

458

220

501

360

21

20.3

27—11

412

158

0

479

19

16

28—11

105

301

420

415

20

16

29-11

885

362

552

495

20

17

30-11

741

48

786

413

20

18

1 — 12

494

461

610

410

21

18

2-12

672

301

494

316

oo

20

3—12

344

213

344

225

21

19

4—12

318

41

179

185

20

19

5—12

228

219

252

243

21

19.5

6-12

359

266

290

289

22

20.0

7—12

248

176

249

236

22

21.0

8—12

201

159

209

142

22

21

9—12

283

213

V75

245

24.5

21

10—12

210

164

218

178

25.0

h

11 — 12

III

120

123

114

25

23

12-12

115

162

146

84

25

24

13—12

85

179

118

167

26

24

14—12

29

42

79

45

V6

25

15—12

4

111

54

41

25.5

24

16—12

0

51

26

24

25

24

17—12

0

3

21

33

25

23

18-12

0

0

0

10

22.5

20

19—12

0

0

0

0

21.0

19

20-12

0

0

0

0

20.0

20.0

21 — 12

0

+

0

0

20.0

19.5

22—12

+

—

-f

+

20

18

Total ovos

9834

»

5753

8069

8071

22.2

20.38

Ditj de desoTi

28

27

29

30

41

186

Memórias do Instituto Butantaa

Tomo XYIII

3. Fase larval — 1* alimentação infetante

Eclosão dos ovos de Anblyõmma cajennense

a) Período prh-io à eclosão.

Terminada a desova, são necessários alguns dias para que os ovos sofram
a eclosão e dêm origem às primeiras lar\-as ou neolarvas. A determinação desse
periodo de tempo, que denominaremos período prérío à eclosão, foi feita em
duas séries de observações realizadas com várias gerações de ovos de Amblyomma
cajennense. A primeira, com ovos de Ixodidas mantidos à temperatura cons-
tante de 26°C e umidade relativa de 90%, e a segunda cora gerações de ovos
que permaneceram à temperatura ambiente do laboratório.

O material utilizado constou de ovos das fêmeas usadas nas experiências
anteriormente citadas, coletados diariamente num só tubo de contenção corres-
pondente a cada fêmea. Os resultados serão, pois, relativos à evolução do con-
junto de ovos da postura total de cada fêmea, isto ê, de ovos depositados du-
rante todo o periodo próprio à desova; não se referem, portanto, ao prazo real
necessário à evolução dos ovos da postura de um mesmo dia. Levamos somen-
te aqui em consideração os resultados do conjunto, devido à sua direta impor-
tância para os trabalhos da criação de Ixodidas destinados ao preparo da vacina.

la. E.rperíênc!a: Temperatura e umidade constantes.

Duzentas e vinte gerações de ovos mantidos à temperatura constante de
26®C foram observ’adas na primeira e.xperiência. O início da eclosão se proces-
sou entre fins de dezembro e 15 de janeiro. O quadro anexo resume os
resultados.

2a. Experiência: Temperatura ambiente do laboratório.

Uma segunda experiência foi feita no corrente ano com 82 gerações de ovos
provenientes da desova de fêmeas colhidas no mesmo dia, no mesmo local e man-
tidas em idênticas condições à temperatura ambiente do laboratório.

A desova começou nos primeiros dias de março, sendo o inicio da eclosão
verificado entre fins de março e princípio de abril. Os resultados foram os se-
guintes :

42

J. TR.4TASSOS & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyoinma

cajennense. 187

Periodo prério á cclosio

(B)

(A)

Temperatura ambiente

DUs

Temperatura 26*C

(março 1943)

(A)

(B)

fV

%

X.* de fcra^õe» de oroe

N.* de feraçSes de orot

13

3

_

1.36

14

1

—

0.45

—

15

6

—

2.77

—

16

5

—

2.27

—

17

9

1

4.09

1.21

18

18

1

8.18

1.21

19

34

1

15.45

1.21

20

26

3

11.81

3.65

21

41

3

18.63

9.78

22

25

8

11.36

13.41

23

9

11

4.09

10.97

27

4

9

1 81

12.19

25

5

10

2.27

8.53

26

6

7

2 77

6.09

27

—

5

6.09

28

O

5

0.99

6.09

29

4

5

1.81

4.87

30

—

4

—

4.87

31

—

4

—

1.21

32

1

1

0.45

2.4i

33

8

O

3.68

1.21

34

2

i

0.99

—

35

í

—

0.45

—

36

9

4.09

1.21

37

1

1

0 45

“

Total

220

82

As temperaturas registradas durante o período prévio à eclosão dos ovos
utilizados nesta experiência foram as seguintes;

tttarfo — média temperatura máxima
27.6°C

temperatura máxima absoluta
28.4»C (em 27J)

abril — média temperatura máxima
22.1®C

temperatura máxima absoluta
28.4X (em 9.4)

média temperatura minima 16°C

temperatura mínima absoluta 11.2°C (em
17J)

média temperatura minima 12J^C

temperatura minima absoluta 7.9®C (em
28.4)

43

188

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

O gráfico comparativo destas duas experiências mostra que a distribuição
da freqüência em ambas as cur\-as é bastante regular.

KXlOOO ratvio A DCSOVA DC A. CAJCIMOISC
à TCMPCRATURA 00 LABORATOAn E A TEMPERATURA CONSTARTE <*

■O

A cur\-a que representa os resultados obtidos à temperatura constante é no
seu conjunto mais normal do que a que representa os da temperatura ambiente
do laboratório, mostrando, também neste caso, que o periodo préno à eclosão
à temperatura constante precede de 4 dias o da temperatura ambiente do labo-
ratório nos meses em que a experiência toi feita. média no primeiro caso
foi de 21.7 dias (Xi) e no segundo 25.5 dias (Xs).

b) Periodo próprio à eclosão.

A eclosão obser\ada em ovos da postura total de uma fémea, isto é, de
toda uma geração de ovos, quando mantidos á temperatura constante de 26®C
e umidade relativa de 90% pode se prolongar durante 17 a 23 dias. Xa expe-
riência à temperatura ambiente do laboratório, realizada no decorrer dos mese»
de abril e maio de 1943, com as mesmas gerações de ovos utilizados na expe-
riência anterior, verificou-se que o período próprio à desova foi consideravel-
mente menor do que naquela cm que os ovos permaneceram à temperatura re-
gular de 26°C.

•U

I

J. TiuvASSos Si A. Vallejo- Freire — Criação artificial de Antblyontnm

cajennense. 189

Período próprio á eclosào dot oroo

Dias

7

8

9

10

11

12

1?

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Total

(1) tempe-
ratura do
laboratório

2

6

5

14

14

19

12

5

O

79

(2) tempe-
tura a 26*C

1

1

23

108

72

14

1

220

(1) Obterraçõo com aaxiUo do microteópio estomológico

(2) Obserração á ri»ta desamuda

A disparidade observada nos resultados destas duas experiências c apenas
aparente ou, então, pelo menos neste caso, os resultados não são comparáveis.
Ka segunda experiência, executada à temperatura de 26®C, para se julgar o mo-
mento correspondente à saída total das larvas, foi levada em conta a separa-
ção destas de seus detritos. Isto devido à mobilidade que apresentam as larvas
a esta temperatura e à manifesta tendência que têm de subir pelas paredes do
tubo de contenção logo após a eclosão, procurando alcançar a parte superior,
onde então se agrupam. \’’eri ficamos, entretanto, que as larvas, mesmo alguns
dias depois da eclosão dos ovos, continuam no fundo do tubo e só alguns dias
depois se libertam, afastam os detritos e sobem a parede do tubo de contenção.

O inicio e o fim da eclosão só poderão ser bem obsei^udos com auxilio
do microscópio entomológico. A côr dos detritos é apenas um indice prático,
porem não exato, do fim das eclosões. Uma obsei^ução mais cuidadosa de-
monstra que a coloração amarelo clara, que apresentam os detritos livres das
larvas, não é verificada imediatamente após a saída desta, mas, pelo contrário,
só se toma evidente alguns dias depois da eclosão de todos os ovos. No lote
de Ixodidas que permaneceu à temperatura ambiente, a observação foi realizada
com o auxílio do microscópio entomológico, motivo pelo qual conseguimos sur-
preender na maioria das vêzes, a saída das primeiras lai^-as alguns dias mais
cedo do que quando observámos à %nsta desarmada. Com o fim de facilitar ainda
mais o exame e tomá-lo mais rigoroso, espalhamos os ovos em placas de Petri
nos últimos dias da eclosão, não só para verificar as últimas eclosões, como tam-
bém para a^uliar o rendimento ou percentagem de ovos evoluídos satisfa-
toriamente.

Desta forma, os dados máximos le\'ados em conta na última experiência,
sem dúvida mais exatos, diferem grandemente da experiência realizada no ano

45

190

Mcmórías do Instituto Butantan

Tomo XMII

anterior, cujos resultados evidentemente estão prejudicados. Uma nova expe-
riência somente poderá ser feita no próximo ano, ao iniciarmos a criação e es-
clarecerá então melhor a influência da temperatura, tomando comparáveb os
resultados das observações.

Percentagens de eclosões dos ovos de Ai-Myomma cajennenst

A eclosão dos ovos, quando mantidos em boas condições, é quase sempre
total. Contudo, podem ser verificadas posturas, nas quais só um reduzido nú-
mero de ovos dão saída a larvas. Em geral, os ovos provenientes de fêmeas
que morrem durante a postura, geram ovos que não evoluem satisfatoriamente.
A mesma causa que acarreta a morte da fêmea deve ter influência sóbre a via-
bilidade dos ovos. Acreditamos que as lesões ocasionadas pela retirada defei-
tuosa das fêmeas, quando ainda fixas aos animais, acarretem igualmente o com-
prometimento de certas glândulas que segregam substâncias impermeabilizadoras
dos ovos, substâncias estas, que exercem uma função protetora contra a desse-
cação durante a evolução normal até a eclosão das larvas.

Quando a evolução dos ovos se faz satisfatoriamente, a eclosão se veri-
fica em lOOÇi dos ovos. Assim, por exemplo, em ovos provenientes de 79 fê-
meas mantidas à temperatura do laboratório, obtivemos as seguintes percenta-
gens de eclosões, avaliadas por observação cuidadosa ao microscópio entomológico :

67 gerações de ovos tiveram eclosão total (100%)

2

3

2

2

1

o

de 95 % dos ovos apro.ximadamente
” 90 %

" 80 %

” 70%

” 40%

” 30%

Total 79

A eclosão total pode ser praticamente julgada pelo aspecto dos detritos
das membranas ou envoltórios dos ovos, depositados no fundo do tubo, junto
com a fêmea já morta. Quando todos os detritos têm cór amarelo-creme e não
são encontrados resíduos de coloração marron claro, êsíe caraterístico pode ser-
vir de índice prático da eclosão de todos os ovos. As neolarvas se agrupan’
na maior parte na extremidade superior do tubo de contenção e, uma minoria,
na periferia da extremidade inferior, no circulo de contato do tubo com a ro-
lha de cortiça* coberta pelo organdi, e.xatamente onde é maior a umidade.

46

J. "niAVASSos & A. Vau-ejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 191

As neo!ar\-as provenientes de ovos de deso\-as incompletas não são apro-
veitáveis para a limentação infetante. Mesmo as oriundas de posturas media-
namente volumosas, não devem ser aproveitadas, pois a prática nos tem larga-
mente demonstrado o constante inaproveitamento final, geralmente ocasionado
por luna alimentação sempre defeituosa por parte destas neolarvas, mesmo quan-
do colocadas a se alimentarem em momento propício.

Coniiderações tôbre a evolução do An-blyomma cajenntnse até a fase de neolarvz

Nas experiências anteriores, ao estudarmos a evolução da espécie Am-
blyomma cajennense, mostrámos as acentuadas variações do número de dias ne-
cessários à postura e eclosão dos ovos, verificadas entre diversas gerações de
Ixodidas mantidos à temperatura do laboratório.

O total de dias decorridos entre a colheita das fémeas alimentadas e o final
da eclosão não foi, no entanto, muito variável. As varbções mais pronuncia-
das verificadas nos resultados parciais corresponderam quase sempre aos exem-
plares que não evoluiram a contento ou mesmo não deram saida a larvas, de
modo que não forant computados entre as gerações que fizeram evolução
completa.

Entre as 79 gerações obser\adas, os dias requeridos para a completa evo-
lução, desde a colheita das fémeas ate a saida de todas as larvas, variaram entre
64 e 80 dias; a grande maioria (91%) o fez entre o 67.° e 70.° dia. Colhidas
as fémeas a 27 de fevereiro, a eclosão dos ovos csta\’a praticamente terminada
entre os dias 5 e 8 de maio.

ToUl d« di
Tenpci

M decorridos da collieiu das (rtcieas até eclos&o dos oros.
ratura axabieatc do laboratório <27*2-43 a lS-5-43)

No. dc dU«

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

71

75

76

77

78

79

80

Total

.Vo. de grn^to

1

0

]

19

26

19

8

1

0

2

0

0

1

0

0

0

1

79

I.»

1.26

24 05

S2.4I

24 05

10 12

1.26

2 53

1.26

1.26

Recumo esquemático da evolução até larva:

Si esquematizarmos, para uma orientação prática, a evolução do Amblyomma
cajennense no período que \-ai da colheita das fémeas cheias até a eclosão total
dos ovos, lesmrdo em conta somente o dia em que maior percentagem de Ixo-
didas completou a evolução correspondente a cada periodo. estudado, teremos
05 seguintes dados;

47

192

Memórias do Inslituto Butantan

Tomo XVIII

Esqoematixação da erolocão até a fase de larra

Fase

Postura

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Dias

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(*) A comparação entre os resultados obtidos à temperatura do laboratório c à tem-
peratura de 2ó“C só é possível entre os dados da postura e do período prévio à eclosão, por-
< 4 uanto pelas razões que explicamos atrás, não são comparáveis os números correspondentes
ao período próprio à eclosão.

Rendimento

Todos os detalhes relativos à evoluqão dos Ixodidas que usamos nas ex-
periências anteriores, podem ser analisados no quadro que inserimos no final
deste capitulo. Vemos, desta sorte, que das 100 fêmeas colhidas obtivemos so-
mente 79 gerações de lan-as em condições satisfatórias para se proceder à pri-
meira alimentação infetante.

Na experiência feita entre Ixodidas que permaneceram sob a influência
da temperatura e umidade sempre variáveis do ambiente do laboratório, as per-
das foram assim distribuidas :

1. Até o periodo próprio à desova — 18 gerações de ovos

2. Até a eclosão — 3 gerações.

As 18 gerações de ovos inaproveitados eram provenientes da postura de
fêmeas que morreram antes de conduida a desova.

Três exemplares morreram depois de um único dia de desova e os 15 ou-
tros quando já haviam desovado durante 10 a 15 dias.

Em quase todos os casos de posturas parciais, os ovos nunca evoluem de
maneira satisfatória; não são tão brilhantes, nem de dimensões tão grandes
quanto os ovos normais, em poucos dias escurecem, desidratam-se rapidamen-
te, não dando mais saida a neolarvas.

Entre as gerações de ovos das fêmeas que desolaram satisfatoriamente,
três não evoluiram a contento, tendo-se verificado a eclosão de apenas raros
ovos (1 ou 2 dezenas no máximo). Correspondem éles às fémeas: No. 33,
cujo periodo próprjo da desova foi de 23 dias; No. 43, com desova durante 25
dias, e No. 59, com o mesmo número de dias para o periodo de desova.

48

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DO CICLO EVOLUXnO DO AMBLYOMMA CAJEXXEXSE ATÉ A
FASE DA LARVA

Observação de 100 gerações de ovos. Fêmeas colhidas a 27-2-43

Exf'eriência à temperatura ambiente

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(+) Morte da femea antes do inicio da denova
+ Intemiptáo da desora derido i morte da femea
(*) E c losão de raros oros; dcscneração dos demaia

J. Ta.vvAssos Jt A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

caiennense. 19õ

Rendimento da criação em larga escala até a fase de larva

Criação de 1938 — Xa criação de Amblyomma cajcnnensc iniciada em 1938
com a colheita de 1 .000 fêmeas cheias, perderam-se durante o período aqui con-
siderado 231 gerações, ou seja, 23.10% do total. Morreram antes de iniciar
a postura 94 fêmeas (9.4%), possivelmente devido às lesões provocadas na
ocasião da colheita; as demais 137 (13.70%) gerações de ovos não aproveita-
dos eram provenientes de posturas médias ou mesmo totais, que não evoluiram
satisfatoriamente atê a fase de larva.

Criação de 1943 — Para os trabalhos de produção da vacina iniciamos a
criação de I.xodidas com a colheita de 5.548 fêmeas de Amblyomma cajcnnensc.
Vejamos em resumo qual foi o rendimento atê o periodo de eclosão entre exem-
plares mantidos até a fase de neolarvas à temperatura ambiente dq laboratório.

1. fêmeas mortas antes de iniciar a postura 308 ou 5.55%

2. gerações de ovos nas quais as lar\-as obtidas não
estavam em boas condições ou somente em número

reduzido 497 ou 8.95%

Total de perdas atê eclosões dos ovos 805 ou 14.50%

As restantes, ou sejam 4.743 gerações de ovos. deram praticamente eclo-
são total dos ovos, isto é, 1(X)% de lar\-as aproveitáveis.

3. Fase larval — 1.* alimentação infetante.

Alimentação das neolarvas

Caraleristicas das lanas de A. cajcnnensc: Escudo — Comprimento 0.235,
largura 0-336. Muito mais largo do que longo. Sulcos cetvicais rasos, longos
e mais ou menos paralelos. Superfície lisa, Icvcmente cliagrinada, sem pon-
tuação. Capitulo — Comprimento 0.18, largura O.IS. Base curta e larga, com
pontas arredondadas dos lados. Superfície lisa, sem pontuações. Palpos lon-
gos. com artículos 2 e 3 quase iguais, pelos finos e em pequeno número. Com-
primento total dos artículos II e III cerca de 0.11. Hiposlômio — Curto e
alargado na ponta. Dentição 2/2. Comprimento cerca de 0.066. (Cooley, R.
.A. & Kohls. G. M. (31)).

Perfodo de espera

Processada a saida de todas as neolarv'as, denominação que se dá às lar-
vas não alimentadas, estas sobem pelas paredes do tubo de contenção e se amon-

ãl

196

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

toam próximo à abertura superior protegida pelo organdi. Decorridos alguns
dias, só resta no fundo dos tubos detritos formados pelos envoltórios dos ovos.
Após a eclosão, a côr desses detritos, que inicialmente é castanho pouco escuro,
clareia aos poucos, apresentando a princípio coloração amarelo sujo e em pou-
co tempo se transforma em amarelo quase canário. Nessa ocasião, as neolar-
\-as, que ao sair dos ovos são claras e relativamente transparentes, já se apre-
sentam bem mais escuras, o que provavelmente decorre de u’a maior quitini-
zação, não só das patas, como do próprio corpo do carrapato. A intensidade
dessa quitinização pode servir de índice prático para julgar qual o momento
propício à alimentação. Quando a quitinização é verificada em 100% das neo-
lai^as, a mobilidade destas é sempre acentuada e, si colocadas a se alimentarem
em coelhos, o fazem de maneira constante, colhendo-se ao fim de 8 dias eleva-
da percentagem de larvas cheias; o contrário, quando ainda restam muitas lar-
vzs se quitinizarem, o rendimento em lar\-as cheias nunca é satisfatório.

O exame da intensidade de quitinização das patas das larvas deverá ser
feito com auxílio de uma lente de aumento médio, não sendo para isso neces-
sário tirar o tubo de contenção do interior do tubo protetor. Orientando-nos
dêste modo, temos obtido o máximo aproveitamento dos animais usados para
a alimentação das lar\-as.

Após repetidas experiências concluimos que o periodo de tempo que se
deve dei-xar transcorrer entre o fim da eclosão e a alimentação das neolar^^as.
que permanecem à temperatura ambiente do laboratório durante os meses de
maio e junho, deve ser no minimo 32 dias. A escolha deve recair de preferên-
cia no 38.° ao 40.° dia, mesmo quando, devido à espera prolongada, uma pe-
quena parte das neolar\'as morra antes de chegado o momento de colocá-las
nos coelhos. E’ sempre preferível agir assim, pois o rendimento obtido é sem-
pre maior neste caso do que si colocarmos a se alimentarem lars'as quando ainda
não aptas a picar.

O periodo de espera pode ser prolongado satisfatoriamente, si as neolarvas
forem mantidas à temperatura mais baixa (entre 14.° e 16.°C), o que retarda a
atividade metabólica do Ixodida, enquanto se aguarda a possibilidade de pro-
ceder à sua alimentação.

Para esta última exigência possuímos uma geladeira especial, regulada â
temperatura conveniente, na qual pode permanecer grande número de caLxas com
vidros de proteção repletos de lar%'as, aguardando o momento da alimentação.

52

J. TawAssos & A. Vallejo-Fbeire — Criação ariificial de Amhlyomma

cajennense. 197

Técnica para alimentar as neolarvas

É com a alimentação das neolarvas que verdadeiramente se inicia a criação
artificial dos Ixodidas. Esta fase é das mais delicadas, pois que de cada fêmea
se obtêm em média 7.000 ovos e, ponanto, 7.000 larvas. Em consequência da
quantidade e da diminuta dimensão destas, foi necessário aperfeiçoar uma téaiica
que permitisse, não só bem aproveitar os animais que vão ser\'ir para alimentá-las,
como também que fornecesse perfeita segurança durante o trabalho.

Preparo dos coelhos

Inoculação infctantc. — Coelhos de i)êso não inferior a 2.5 quilos são inocula-
dos ix)r via peritoneal com virus da febre maculosa. Para estas inoculações
utilizam-se 2*a 5 cnP de sangue dos coIkiíos que servem para manter as diferentes
amostras de virus no laltoratório. jKir meio de passagens em série, feitas de cobaia
a cobaia, jwr inoculação peritoneal. .\ sangria deverá, ser feita durante a reação
febril do animal, preferivelmente no 2.° ou 3.° dia de reação ténnkra, (piando se
deve verificar a esterilidade do sangue por semeadura em meios aeróbios e anaeró-
bios. Quatro a cinco dias após a inoculação, os coelhos jxxlem ser preiiarados
jiara o serviço de alimentação das larvas.

53

Colocarão dos saqninkos frotriorcs. — \crificada
a predileto das larvas de cQjcuucm^ a

se fixarem na orelha dos coelhos, onde se aliroenUm
melhor e mais facilroente, resolvemos aproveitar esta
circunstância para obter um alto rendimento. Cotn
esta finalidade preparamos uma espécie de cartucho
ou cilindro de organdi de dimensões que permitam
conter com certa folga as orelhas dos coelhos (* (**) ).
Êstes cilindros ou cartxKhos, após introdoaida a ore-
lha no seu interior, são fixados na cabeça do coelho,
em tomo da base da orelha por meio de esparadrapo.
Com o fim de facilitar a adesão do esparadrapo, re-
tirara-se os pêlos em tomo da inserção do pavilhão
auricular por meio de mãquina de cortar cabelo, na-
valha ou mesmo usando qualquer dcpilatório (a). A
fixação do cilindro de organdi na base das orelhas
do coelho deverã ser feita de modo a não dificultar
a circulação sanguínea. Uma tira de esparadrapo de
J,5 cm de largura deve prender inicialmente na ca-
beça e de forma circular subir até atingir a base do
cilindro, de modo que uma volta do esparadrapo se
venha sobrepor ã metade superior da volta anterior,
fechando-a por fim na base (b).

Fixaçãò no interior das mesas de manipulação.

Colocados os saquinhos protetores, os coelhos são
levados ãs mesas (•*) de manipulação de Ixodi-
das (c), onde podem ser fixados em bandejas apro-
priadas, cuja parte mediana tem uma exeavação em
forma de meio cilindro longittidinal, servindo para
contc-los e imobiliaã-Ios por meio de fixadores arma-
dos de faixas de pano. £stes fixadores podem mover-
se longitudinalmente, deslisando sobre frisos dispos-
tos paralclamente ao longo do meio cilindro exea-
vado (d).

Uma toalha branca, tendo no seu terço anterior
um corte suficientemente grande para permitir a pas-
sagem das orelhas do coelho, cobre todo o animaT e
evita que durante a manobra de colocação das neo-
larvas, estas possam vir a espalbar-se nos pêlos «lo
coelho, acautelan«lo-nos, assim, contra a posMvcl dis-
persão de Ixodidas (e, f).

Colocação das neoUsrras. — Cada coelho adulto,
de pêso não inferior a 2.5 quilos, pode servir para
a alimentação infetante de larvas resultantes da
desova de quatro femeas; em cada orelha sao colo-
cadas em meuia 14.WU ncviarvas, isto c, o produto
tíe uuas gerações de ovos úe Amoljomma catennense.

Coelhos de pêso inferior, que geralmente não
resistem a iotccçao, não suportam tao grande nume-
ro üe neolarvas.

ImobtiUaçao das neolarx-as. — Os tubos de con-
tenção cneios ue neolarvas s^ retirados uo in»erior
aos tubos ue proteçuo c ucpositados na oscsa ae tra-
baioo oepois ue (•ermanecerem alguns minutos na
geladeira, naturai que a temperatura amoiente uo
«aooratorio, pnncipalmemc nos atas oc verão, a mo-
oiituaue uas ncviarvas seja oastanic granuc, u que
uiticuita o trauaino ae cvtoca-ias nas oictoas dos coe-
iâM>s. l^ela açao uo ino itcain imooiiiradas,
ticandu o manuseio.

(*) Ressaltamos aqui a importância da escolha
do tecido usado no preparo dêstes saquinho» ou car-
tuchos. £ indispensável que as malhas do tecido não
permitam a passagem das larvas, e não sejam tani-
oem demasiado a|>cTtadas, de modo a diticuJtar a
ac ração. ^

(**) Adiante descreveremos as mesas de ma-
nipulação de Ixodidas.

Fic. 20

cm

Fic. 20

Dt^ribmtção. — A colocação dot Ixodidaj na
parte intema do f^vilhão auríctibr. envolto pelo sa-
quinho protetor de orcandi. é facilitada pelo uso
de um funil de vidro ou mesmo um cartucho de
papel; as neolarvas, primeiramente deposiudas no
receptáculo do funil, são, com o auxilio de uma es-
pátula fina, manejada com precaução, levadas para o
interior do pavilhão auditivo do coelho (g).

Terminada esU manobra, a abertura superior do
saco protetor de organdi é fechada, dobrando-se a
extremidade duas vères e obturando-a com espara-
drapo (h). As neolarvas, que acidentalroente tenham
caído na toalha, são facilmente visíveis e podem ser
retiradas por meio do tubo coletor de carrapatos,
ligado ao aparelho de váctso facilmente manuseado*
pelo auxiliar (í). (Por ocasião da descrição dos deta-
lhes técnicos acerca da colheita de larvas cheias des-
creveremos o tubo ou aparelho de coleta). Esta úl-
tima manobra é quase sempre desnecessária quanjo
se usam fxodidas preriamente imobiliaados pela per-
manência durante alguns minutos á baixa temperatura.

Retirado o pano que cobre o coelho, este potie
ser desamarrado e manuseado sem perigo, fora da
mesa de proteção (j)-

Prctrçia das oreikct dos eoctkas. — Os saqui-
nhos contendo as larvas são protegidos contra as
tentativas feitas peto coelho para retirã-Iot, por meio
de um aparelho de couro, que permite o fácil areja-
mento através de duas fendas laterais (k). As fendas
laterais são igiulmente protegidas por meio de tela
de arame fino.

O aparelho protetor é constituido de um cilimlro
de couro, medindo !£ cm de altura por 1 cm dc diâ-
metro que permite conter as duas orelhas. A parte
inferior do cilindro é fixada a uma faixa circular,
também de couro, destinada a bem se adaptar ã ca-
beça do animal, servindo de apoio ãs duas correias
que a fixam abaixo do pescoço por meio de uma
fivela que as ajusta perfeitamente. Desta mesma
faixa circular parte posteriormente uma fila, tam-
bém de couro, tendo na porção terminal um cinta
com fivela para prender o aparelho ao corpo do coe-
lb% atrás dos membros anteriores (k). Xa parte su-
perior metliaoa da fita acima referida, existe um
botão de pressão, cujo negativo está colocado no ci-
lindro de couro, de imulo a poder fixá-lo no seu
terço superior, dando ao mesmo tempo uma inclina-
ção conveniente ã perfeita posição das orelhas sem
prejudicar a circulação sanguínea.

/VrMuméiM-M na biatéria. — Os coelhos com as
orelhas assim protegt<ias são leva<}os para os compar-
timentos isolados do biotério, onde permanecera du-
rante toilo o período da alimentação infetante das
lars-as <l). Deverão èles ser * revistos duas vêxes
por dia pelo menos para controlar a perfeita ailapta-
ção dos aparelhos de proteção e tomar as medidas
aconselhadas no caso dc sakla dc fxodidas.

Pelas nossas d^servações podemos afirmar que,
bem cooduaúla esta tccniea, são raras as vêxes em
que as lar\'as são encontradas fóra das orelhas no
cor^ do coelho c» nas paretlcs do biotério e mesmo
assim, quando isto acontece, é somente com meta-
larvas isto é, larvas ji alimcnatdas apresenlatid i,
P^ conseguinte, pouco perigo para o serviço. S.ío
mais facilmente risíveis e pouco móveis além do
estando jã liem alimentadas não lém mais ten-
dência a picar.

cm

200

Memórias cio Instituto Butantan

Tomo XVIII

Biotéríos

A riquétsia. agente etiológico da fehre maculosa é incmltivável nos meios arti-
ficiais cie cultura ; sua reprodução só é possivel em presença de tecido vivo e se
processa no interior das células vivas. O meio mais fácil usado nos traljalhos ex-
jíerimentais para manter e reproduzir êste material virulento, ainda é a inocula-
•ção seriada feita em animais sensiveis. Desta sorte, torna-se indispensável,
(juer jara os trabalhos de rotina, cjuer para os de investigação, usar um gran-
de número de animais (cobaias, coelhos), mantidos em rigorosas condições e
proairar dentro do possivel afastar as causas de erro c|ue possam influir no
julgamento das reações apresentadas. Xas experiências ou mesmo nas inoada-
ções rotineiras dos traljalhos de febre maculosa. os anirtiais de prova têm de
ser mantidos no interior dos laljoratórios. sob controle imediato dos técnicos e
sem qualciuer contato com o e.xterior. Devido a êste fato. tornou-se indispen-
sável constntir biotérios apropriados, que permitissem a manutenção, em con-
dições satisfatórias, dos animais durante o pcricxlo de observação, ol»edecendo
a recjuisitos práticos:

a) comijortar grande número de animais no menor espaço possivel;

b) possuir comjartimentos separados, de mcxlo a isolá-los.

c) contar com proteção eficiente contra possíveis acidentes devidos a de-
feitos nos aparelhos u.sados para manter os Ixcxlidas colcKados aos
animais ;

d) ijcnnitir fácil limjjeza.

Em obediência a éstes princípios básicos, ideali.samos e fizemos construir
biotérios. que. a nosso ver. preenchem jjer feitamente as exigências requeridas
nos traljalhos desta natureza.

Foram construídos no interior do laljoratório três biotérios de concreto
armado; dois para jjequenos animais e um para animais de maior pjrte.

Descreveremos ajjenas os biotérios destinados aos animais de pequeno jjor-
te (coelhos e cobaias). O biotério para animais maiores é do mesmo tipo e oIjc-
dece às mesmas caraterísticas, variandcj apenas no número e nas dimensões dos
compartimentos.

Descrição dos biotéríos

Os biotéríos para coelhos c cobaias constam dc um conjunto de gaiolas dispostos em
4 fileiras c apoiadas em uma coluna retangular central, cujo interior ôco, ligado aos con-
dutos dc esgotos, serve para a passagem dos detritos (dejetos, restos de alimentos ou, aci-
ílcntolmentc. carrapatos), que são assim levados para a fossa asséptica, situada fora do
edifício.

.‘.«j

J, Tr.\vassos & A. Vallejo-Fbeihe — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 201

- BIOTÉRIO VISTA DE FRENTE

^ Efcou —

Fic. 21-a

PUnta do biocírío para pequenos animais.

57

202

Memórias do Instituto Butantan — Tomo XYIII

Na parte mais alta da coluna central, há um conduto perfurado era todo o seu com-
primento, colocado no sentido ãntero-posterior do biotério, por meio do qual se pode fazer
jorrar, dentro da colima, um jacto de água quente ou fria para facilitar a limpeza interna,
eritar que detritos fiquem aderentes ãs paredes da coluna, arrastando-os até a fossa as-
séptica.

A primeira série de gaiolas fica a 70 cm acima do assoalho; as demais são espaçadas
tunas das outras apro.ximadamente 35 cm.

Em ambos os lados do biotério, cada fileira tem nove pequenas gaiolas com as seguin-
tes dimensões; 27 cm de frente, 21 cm de altura e 35 cm de profundidade.

Nas extremidades há ainda em cada andar ou série de gaiolas um grande comparti-
mento, que toma toda a largura do biotério e que mede 90 cm de frente, 35 cm de lado
e 21 cm de altura.

Os compartimentos laterais têm espaço suficiente para conter 4 cobaias ou um coelho
de grande porte. São destinados cspecialmente aos cobaios e coelhos inoculados para ali-
mentação infetante dos carrapatos. Propositalmente, não foram construidos mab espaçosos,
afim de, até certo ponto, restringir aos coelhos a liberdade de fazerem movimentos ma:s
amplos, quando são levados a se coçarem em consequência do prurido provocado pela pi-
cada dos Ixodidas. o que poderia provocar o desprendimento ou mesmo a ruptura dos apa-
relhos de proteção.

As gaiolas são separadas umas das outras por meio de um caixilho de concreto ar-
mado, cujo centro telado permite ampla ventilação entre os diversos compartimentos. .\
frente é fechada por uma grade de ferro, facilmente removível e que pode ser bem ajustada
por um dispositivo de segurança.

O assoalho de cada compartimento, escatado em estrias longitudinais, permite a fácil
limpeza das gaiolas, assim como a queda das dejeções ao piso, que constitui o teto do com-
partimento que lhe fica abaixo. Por meio de um simples jacto dágua, quente ou fria, pro-
cessa-se facilmente a limpeza.

Todo conjunto do biotério está. na sua parte inferior, isolado do assoalho do labora-
tório por meio de uma bacia, que ultrapassa em 25 cm a projeção \-ertical dos bordos mais
salientes das fileiras de gaiolas. A função desta bacia, que tem a altura de 10 cm e que
contém solução carrapaticida, é impedir aos Ixodidas acidental mente livres, ir além dos li-
mites do biotério.

Lateralmente, os biotéríos podem ainda ser protegidos por uma cortina, que, presa a
argolas, pode correr em uma haste metálica fixa, cm cima. no alto da fileira superior de
gaiolas e, abaixo, no assoalho da última, atingindo, assim, todas as séries de gaiolas. £
esta uma medida complementar de proteção. Evita sejam projetados Ixodidas. derido aos
violentos movimentos dos coelhos, além dos limites do biotério, ultrapassando a barreira dc
carrapaticida constituida pela bacia.

As obscrsações feitas durante os trabalhos de rotina nestes últimos anos, permitem
concluir pela eficiência destes biotérios. De grande capacidade, ocupando pouco espaço, per-
mitem realizar todo o trabalho de manutenção seriada das várias amostras de virus já iden-
tificadas ou em estudo, assim como a alimentação dos carrapatos, mantendo-se os animais
dc experiência durante todo o período de observação em condições satisfatórias.

Uso dos biotérios

Quando há necessidade de isolar cada animal, eles podem ser colocados
em compartimentos separados ou mesmo em andares diferentes.

58

cm

SciELO

0 11 12 13 14 15 16

J. Travassos & A. Vallejo- Freire — Criação artificial de Ambluomma

cajennense. 203

Todo animal inoculado com qualquer material dé passagem j)ara manu-
tenção de vinis ou de experiência recebe um número, que é gravado numa
chapa metálica, adaptável ás orelhas. .\ êste número corresponde uma ficha,
na qual constam todos os detalhes do animal fornecido pela Seção de criação,
além de dados relativos ao material inoculado. Nesta ficha, a cun-a térmica
é acompanhada diariamente e, após a morte ou sacrificio do animal, anotam-se
os achados na necropsia com a sua eventual interpretação.

O encarregado do biotério registra em um livro o “andar” e a divisão onde
colocará o animal ou os animais já numerados. Esta indicação é dada do se-
gtiinte modo:

Cob. 2850 — 1 .A 4

o que significa: Cobaia No. 2850, biotério No. 1, andar gaiola 4.

O lado esquerdo de cada conjunto de gaiolas tem numerações iguais às do
lado direito, de mo<lo que a mudança diária para o comjxirtimento limiK) é feita
para a mesma gaiola .A 4 do lado oposto. O animal jienuanece até a morte
ou término da obsenação no mesmo comixtrtimento A 4 de um ou de outro
lado do biotério. Isto permite encontrar rapidamente o animal procurado.

Os animais em observação são trocados diariamente de conuiarlimento, de
modo a facilitar a limpeza e jierfeita secagem de cada comixirtimento do bio-
tério após a lavagem que se faz pela manhã. Isto não ,xKle, nem é aconselhá-
vel se fazer com os animais que estão .servindo à alimentação dos Ixodidas;
éstes permanecem na mesma divisão até que os carrai«tos sejam retirados.

No nosso serviço dispuzemos de um dos biotério;^ e.xclusivamente para ani-
mais que servem jara alimentar os Ixo<li<ias e o outro somente i>ara os usados
na manutenção das amostras de virus ou |>ara animais em exjicriéncia. Neste
últimò caso usamos a ala direita do biotério nos dias j^ares e a estjuerda nos
dias impares, de modo que jicla manhã de cada dia os animais vão jara um
comjMrtimento limi», praticamente esterilizado com água quente c absoluta-
mente séco.

O encarregado do biotério, além da limjKza c da alimentação dos animais,
deverá tirar diariamente, a {«rtir de 8 horas da manhã e após 2 horas da tarde,
as temperaturas de todos os animais, no que é auxiliado jwr outros funcioná-
rios, que nes.sa ocasião verificarão íjualquer anomalia notada, como, jwr exem-
plo, presença de reações escrotais, escaras cutâneas, etc.

Após a tomada das temperaturas, são elas. juntamente com os outros dados,
registrados em livro de registro e nas fichas individuais até o momento cm
que um dos assistentes da Seção, verificando o movimento geral, controlará as
exjieriéncias e evcntualmente mandará rej)etir a tomada das tenqieraturas, de-
terminará os animais a .sacrificar, suspenderá a observação de alguns, verifi-
cará as lesões evidenciadas na necrópsia ou fará passagens de virus.

09

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15

204

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Sala dos biotéríos

A sala eni que estão dispostos os diversos coqjuntos de gaiolas tem dois
exaustores, que esgotam o excesso de umidade e arejam o ambiente. Isto é
principalmente necessário nos dias quentes de verão, em consequência da gran-
de superficie de evajxjração das bacias e do grande número de animais alí
contidos.

.•\s paredes e o teto da sala de biotérios deverão ser preferivelmente la-
drilhados ou pintados a óleo, de modo não só a facilitar a limpeza diária, como
evitar o crescimento de cogumelos em consequência da umidade alí mantida.

Xas experiências que requerem observações durante longos períodos de
tempo, tanto as cobaias como os coelhos se ressentem da permanência muito
prolongada no biotêrio; nesse caso precisamos intenir e reforçar a alimentação,
juntando à ração diária alimentos frescos, óleo de fígado de peixe contendo
vitaminas A e D.

Fic. 22
Biotrrio*.

É de toda conveniência que o local onde se encontram os biotérios para obser-
^•açoes dos animais durante longo período, fiíjuem situados de modo a i)emii-
tir o isolamento, j)elo menos durante algumas horas do dia, protegendo-se o
recinto j)or meio de parerles envidraçadas.

CO

J. Travassos át A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 205

A sala de controle geral está ao lado da sala dos biotérios e isolada desta
por divisões de vidro.

Todo o alimento dos animais é trazido ao interior do laboratório por meio
de uma caixa metálica, que da sala dos biotérios se comunica com o exterior.

Os animais sacrificados são logo após a necrópsia conduzidos a um tomo
crematório, cuja porta se comunica com o interior da sala de biotérios. Um
botão elétrico aciona um massarico alimentado a óleo, que, fundonando al-
guns minutos, reduz a cinzas os animais ali colocados. .A. limpeza do forno
para a retirada dos residuos é feita por uma outra porta, que está ligada ao
lado externo do padlhão.

Mesa de proteção para trabalhos com Ixodidas

Esu mesa de proteção destina-se aos trabalhos de manipulação com Ixodidas infetados
« foi espedalmente coostrukia para e\-iur o conuto direto do técnico com o material in-
fetante. Elstá localizada na própria sala dos biotérios. Compõe-se esscncialmente de uma
grande bacia de concreto armado, sustentada por uma coluna central, no interior da qual
passam encanamentos para água quente e fria, esgotos, vácuo, gás, ar comprimido e cor-
rente elétrica, necessários aos trabalhos. Xa parte superior, a bacia tem a forma de um
retângulo e mede 2 metros de comprimento por 80 cm de largura; destina-se a conter 2 ban-
dejas, que se encaixam em suportes fixados na parte inferior por meio de fortes hastes
metálicas. Com éste dbpositivo as duas bandejas removi\-eis ficam perfeitamente isoladas
do retângulo, que constitui as margens da bacia. Esta é cheia com uma solução concen-
trada de liquido carrapaticida para impedir a passagem de quaisquer carrapatos da bacia
I>ara a mesa propriamente dita.

O retângulo tem em todo o seu contómo uma margem superior horizontal de 2S cm ;
na extremidade é eia bem maior, servindo de mesa au.xiliar para depositar o material que
deverá ser introduzido na câmara.

Uma armação de madeira, de forma retangular é encaixada no concreto da bacia. Esta
armação tem aproximadamente 20 cm de altura no sentido vertical e desde ésse ponto sai,
por meio de caixilhos de vidro, ligar-se a um outro retângulo bem menor, situado na parte
central e 40 cm mais alta

Xéste segundo retângulo, há um exaustor, qiK permite retirar todo o \apor de ágtu
acumulado no interior da mesa de proteção e que se deposita na parte interna dos vidros,
dificultando a visão. .\ abertura onde funciona o exaustor deverá ser protegida por uma
tela de malhas bem finas á prova de carrapatos.

Xa parte lateral da base retangular de madeira há aberturas que permitem adaptar em
armações especiais de metal, luvas brancas de cano longa

O esquema que juntamos mostra os detalhes de construção da mesa, podendo-se obser-
sar todos os dispositivos internos que facilitam o trabalho com carrapatos, trabalho éste.
que poderá ser feito por dois grupos de dois homens, um técnico e um auxiliar, no mesmo
momento, destinando-se uma das bandejas para cada grupo, ficando o auxiliar sempre na
frente do técnico.

O material usado no serviço, como sejam: tubos de contenção, tubos de proteçãa espa-
radrapo. gaze, aparelhos para os coelhos, etc, bem como os animais já previamente ino-
culados, é introduzido na mesa pelas aberturas terminais ou mesmo pelas laterais. O fe-

61

206

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

MESA DE PROTEÇÃO

Escoio ^

dOem

ric. 23

Eiqoema da mesa de protego.

62

J. TawAssos & A. Vallejo-Freihe — Criação artificial de Antblijomma

cajennense. 207

chamento da mesa de trabalho se faz de maneira perfeita, ajustando as aberturas ou jane-
las por meio de borboletas de pressãa

Terminados os trabalhos diários, o interior da mesa é lasado ou com água quente
ligada á torneira existente no interior ou com solução de cárrapaticida.

Tubo de colheita de carrapatos

O tubo de colheita destina-se a facilitar a coleta de Ixodidas nas fases de larva c
ninfa, quer antes, quer depois da alimentação.

O aparelho ou tubo de colheita de Ixodidas consta de um tubo cilíndrico de vidro
com diâmetro igual ao dos tubos de contenção, anteriormente descrito. Êste tub<j c es-
tirado cm uma das suas extremidades, tendo no conjunto um comprimento total de 15 cm.

p.arte estirada sers-c para ser conectada á torneira de vácuo por meio de um tubo de
borracha, N'a outra extremidade adapta-sc um tubo de contenção, de modo que a parte
protegida pelo organdi (parte fechada) fique em contato com a alwrtura maior do tuho de
coleta. fixação do tubo de contenção ao de coleta faz-se por meio de uma fita de es-

Fic. 2 *

Me«a d? prote^Ãx

|aradra|io. Na parte aberta do tubo <lc contenção já fixado ao aparelho — que normal -
mente é fechada com a rolha de cortiça — coloca-se uma rolha de borracha jicrfurada c
atravessada por um tubo de vidro ligeirametitc estreitado na sua extremidade distai c com
abertura suficiente para deixar passar com facilidade uma lana bem cheia.

Um tubo com esta abertura sen-irá para coletar ncolar\-as ou metalarsas, bem como
neoninfas. N'o caso de metaninfas ou ninfas já alimentadas usa-se um tulw de abertura
maior, que pode senir também i>ara manipular adultos não alimentados.

6:i

208

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Abrindo-sc a torneira de vácuo, o aparelho de coleta está pronto para ser utilizado.
Aproxima-se a parte aberta do tubo aos Ixodidas, que são então aspirados para o interior
do tubo de contenção, onde ficam retidos pela proteção da tela de organdi.

Quando os tubos estão sufjcientemente cheios (em média 150 larsas cheias) e desli-
gado o vácuo, retira-se a rolha de borracha do aparelho, substituindo-a nosamente peta de
cortiça. Destacando-se o esparadrapo, os tubos de contenção cheios de Ixodidas estão prontos
para serem acondicionados nos tubos de proteção, numerados e colocados nas caixas que
permanecem nos armários à temperatura ambiente do laboratório ou nas estufas até se ve-
rificar a eedise.

ESCflLfl l:l

1 f 4 »

Fic. 25

Tubo de coleta de carrapatos.

o vácuo utilizado para a manobra da colheita dos Ixodidas deverá ser ajustado, de

modo a facilitar a cmrada de larvas ou de ninfas, vazias ou cheias, no tubo de contenção,
sem pros-ocar correntes violentas, que podem lesar os Ixodidas, ocasionando perdas na cria-
ção, perdas estas que são, %-ia de regra, tanto maiores, quanto maior for o tamanho do
carrapato. N'a fase ninfal, por exemplo, a ausência destas precauções pode ser altamente
prejudicial, acarretando a morte de grande parte dos exemplares, principalmentc quando
se trabalha com metaninfas ou ninfas já alimentadas.

Alimentação e colheita das larvas alimentadas

Os coelhos, nos quais foram colocadas as larvas, j)ermanecem nos compar-

timentos isolados do biotério durante vários dias, geralmente 8 a 10. Na rea-

lidade, a alimentação de uma larva, isoladamente, do momento da fixação ao
hospedeiro à queda espontânea, não demora tanto tempo, podendo ser feita de
matieira completa em 3 a 4 dias. A desigualdade do momento de fixação das
larvas se explica pela idade variável das neolarvas. A desova das fêmeas faz-
sé por período de tempo que se prolonga por vezes até 26 dias, tendo as neo-
larvas resultantes também idades variáveis. Quando, portanto, colocamos uma
mesma geração de larvas a se alimentar, teremos variações muito grandes quan-

€4

■J. Tb.\vassos li A. \ allejo-F‘reire — Criação artificial de Ántblyontma

cajennense. 209

to ao nioniento propicio à picada. Xão convem dilatar o i)razo de 8 a 10 dias,
poríjue a alimentação das larvas só é util na fase de circulação sanguinea do
virus; essa fase coincide com aquele espaço de tempo.

Tendo-se em conta as precauções acima citadas, obtêm-se após êsse pra-
zo: larvas totalmente alimentadas e já destacadas do hospedeiro, larvas em ali-
mentação, ainda fixadas, e larvas não alimentadas e não fixadas. Estas, con-
tudo, nem sempre são em larga percentagem, o que torna o processo útil para
fins práticos.

Quando os coelhos são de pequeno porte ou a quantidade de lanas muito
elevada, pode acontecer que aqueles venham a morrer antes de decorridos os
dias necessários à alimentação das lanas. Xeste caso, aquelas que forem en-
contradas cheias serão imeliatamente retiradas e aproveitadas. Quando o coe-
lho permanece vivo, a colheita é feita após sacrificio do animal por meio de

Fic. 26

Abcrtur» A» uquinbot contrado u or.Ih». de coeibo* repleui de ixodidu ji alimetnado».

pancada na cabeça. As orelhas, protegidas pelos saquinhos, são em seguida cor-
tadas na base com tesouras abaixo do ponto de fixação do saquinho de organ-
di, depois de retirado o aparelho protetor de couro. As orelhas, ainda envoltas
pelo saquinho de organdi, são colocadas em bandejas numeradas que são condu-
zidas à mesa de proteção. Os coelhos são imediatamente levados ao forno cre-
matório.

Os saquinhos são al)ertos um a um com tesoura sóbre folhas circulares de
papel branco ou sóbre grandes cristalizadores. As larvas cheias estão quase
sempre soltas, enquanto que aquelas ainda fixadas são retiradas, cuidadosamen-
te, por meio de pequena espátula. Feita esta coleta, orelhas e pano de organdi
são mergulhados na solução carrapaticida. que circunda a l«cia da mesa de ma-
nipulação já descrita.

65

1 SciELO

•210

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

As larvas cheias e coletadas são passadas em tamizes laradores, que cons-
tam de três cilindros, cuja base de tela de malhas progressivamente menores
permite a retirada de detritos, como sejam pêlos, lar\as mortas não alimentadas,
etc. L'm jacto dágua facilita esta limpeza e ao mesmo tempo retira os detritos
orgânicos, que. conforme temos verificado, podem permitir não só a colagem
das laicas umas às outras, como também ser\em de meio para o crescimento
de certos parasitas durante a permanência das metalarvas na estufa, à espera
da ecdise.

Uma vez bem lavadas, as larvas cheias são colhidas jx)r um aparelho especial
de coleta, que. por meio de vácuo, permite reuni-las diretamente nos nossos tu-
bos de contenção.

Para facilitar a secagem, jxxle-se exjmr as larvas à corrente de ar de um
ventilador ou deixá-las durante algum tempo na estufa a 37°C.

Invadas e secas, as lar\as cheias são distribuidas nos tulx)s de contenção
e guardadas nos tulxís de proteção, onde à temperatura ambiente ou na estufa
para carrapatos, permanecem até ocorrer a primeira metamorfose com a ecdise
das neoninfas.

4. Fase ninfal — 2.* alimentação infetante

1." metamerfose. Período prévio à ecdise das neoninfas

Decorridos alguns dias. as metalarvas ou larvas alimentacbs transformam-
se cm neoninfas. efetuando-se. desta forma, a primeira metamorfose, isto ê.
a jKissagem da fase larval ou hexájwda jiara a fase ninfal ou octójxKla. O j.e-
riixlo de temix> compreendido entre a colheita das larvas alimentadas e a saida
das primeiras neoninfas denominamos periodo prévio à ecdise das neoninfas.

Xo quadro seguinte vêm-se os resultados gloljais de experiências feitas com
7.000 metalarvas, corresponlendo à observação de 152 lotes diferentes, manti-
dos em estufa com temperatura entre 30 e 329C.

Os lotes de metalanas foram obtidos do seguinte modo:

Entre as larvas cheias c espontaneamente desprendidas de orelhas de coe-
lhos, foram selecionados ICO exemplares, que. após lavagem e secagem prévias,
foram divididos em dois lotes de 50 e mantidos durante a experiêiKia nos tii-
Ixjs padrão de contenção protegida. Um dos lotes foi inculsido em estufa re-
gulada entre 30 e 32”C c o outro serviu para as experiências feitas à tempe-
ratura ambiente do lal>oratório relatadas adiante.

1)6

J. Travassos & A. Vallejo-Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 211

À medida que se processou a ecdise das neoninfas, estas foram retiradas
diariamente de junto das metalarAas e colocadas em outro tubo de dupla pro-
teção, mantido á temperatura ambiente do laboratório.

Os resultados aqui apresentados devem servir somente como indice prático
de orientação, pois não se referem à evolução unitária. Com efeito, partindo
de grande número de larvas alimentadas, não é praticável a anotação do mo-
mento exato do final da alimentação de cada unidade isoladamente e da conse-
quente queda espontânea do respectivo hospedeiro. As larvas permanecem 8
a 10 dias nas orelhas dos coelhos, podendo-se fixar, alimentar e desprender
em prazos diferentes.

Êstes resultados, portanto, se referem ao número de dias decorridos desde
a colheita dos lotes de larvas até o dia em que se verifica a presença da pri-
meira neoninfa nos tubos contendo 50 exemplares.

A ecdise das primeiras metalarvas se verificou entre 5 e 15 dias após a
colheita das metalarvas, à temperatura de 30 — 32®C. Na maioria dos lotes
(91.4%) esta teve inicio entre o 7.® e 13.® dia.

i.* Xlftam^rfcst: Periodo prério á ectfife
das ocomofas. Tnaperatura 30 — 32*C

Dias

N." d* loit»

%

5

5

3.3

6

2

1.3

7

21

13.8

8

21

1 .1

9

17

15.7

10

24

19.7

11

30

10.5

12

16

6.5

13

10

2.6

14

4

1.8

15

2

Total de
lotes

152

A outra expericrKia com os lotes de larvas da mesma procedência que a
dos utilizados na prova anterior, foi feita à temperatura A-ariável do ambiente
do laboratório.

Tratando-se de Ixodidas alimentados em meses diferentes, os resultandos
são dados separadamente, pois a temperatura ambiente do laboratório variou de
alguns graus em cada periodo:

67

212

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

i.* Mtiamorfose: Periodo prévio á ecdise d^s neoninfas.

Temperatura ambiente do laboratério.

Dias

Colheita

19-MJ

n-5-*3

22-6-43

7

1

M

1

9

2

1 1

4

11

4

12

6

13

4

14

6

15

4

16

5

17

3

18

—

19

2

20

0

21

6

22

8

23

7

24

10

25

5

26

1

27

2

28

6

20

2

30

7

31

5

32

9

33

3

34

8

35

1

Total de
lotes

40

33

49

Iniciada a experiência com 152 lotes de metalarvas, somente em 122 foi ve-
rificado início de eclosão. Xos demais 30 lotes as metalars-as não evoluiram,
não sendo, porisso tomados em consideração.

São particularmente significativos os resultados desta observação. Lars-as
alimentadas em meses diferentes, durante os quais a temperatura ambiente do
laboratório baixou progressivamente, mostraram um periodo prévio à eclosão
das ninfas relacionado a essas \-ariações de temperatura. Nos meses mais frios,
junho e julho, foi maior o número de dias decorridos até se verificar o inicio
da eclosão das neoninfas. Nas colheitas feitas no mês de abril, o periodo pré-
vio à primeira metamorfose foi de 7 dias para a metalar\a de evolução mais
rápida é de 17 dias para as de evolução mais retardada. Nos lotes colhidos
a 11 de maio, o periodo préno \-ariou entre 19 e 24 dias. enquanto que para

68

J. Tr.\vassos Jt A. Vallejo-Freihe — Criação artificial de Amblyomma

cajennerue. 213

03 lotes de Ixodidas colhidos a 22 de junho íoram necessários 25 dias para se
verificar a primeira eclosão de neoninfas nos diferentes lotes, sendo que em um
dos tubos somente após 35 dias foram encontradas as primeiras neoninfas.

Elm São Paulo, as temperaturas mais baixas do ano correspondem aos
meses de junho, julho, atingindo a média das minimas 9-10'*C e a das má-
ximas 21 — 22®C. Em maio e abril as médias são mais ele\'adas, havendo
quase sempre uma diferença de mais ou menos 29C entre um mês e outro. No
interior do laboratório as médias das minimas mostram-se sempre mais ele\'adas,
16°C para junho e julho, e as oscilações entre a máxima e a mínima nesse
período não ultrapassaram 2®C. Essas oscilações, entretanto, foram maiores
nos meses de maio e sobretudo de abril.

1.* metamorfose — Período próprio à ecdise das neoninfas ^

O ^Tmpo decorrido entre a ecdise da primeira neoninfa e a ecdise da úl-
tima viável de cada lote, denominamos “periodo próprio à ecdise das neoninfas".
À temperatura de 30 — 329C foram obtidos os seguintes resultados:

!.• Metaii»orfo*e — Periodo próprio i ecdise dA« oeooiníes, Temperatare 30 —

DUi

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Total dc
lotes

1

13

la. Exp.

O

13

12

4

1

3

52

11

2a. Exp.

—

—

7

10

12

—

1

50

3a. Exp.

7

8

20

9

10

—

2

6

—

50

Total

7

10

34

28

34

14

15

9

1

152

4.6

6.5

22.3

18.4

22.3

9.2

9.8

5.9

0.6

o tempo de ecdise oscilou, no conjunto de lotes observados nas três expe-
riências, entre 6 e 14 dias. Levando-se em conta os resultados totais, pode-
se considerar como mais frequente a demora de 8 a 12 dias para a ecdise com-
pleta das neoninfas viáveis.

As verificações feitas para a determinação do periodo próprio à ecdise das
neoninfas à temperatura ambiente nos meses de junho e julho (médias das tem-
peraturas máximas inferior a 18°C), eridenciaram precariedade de evolução,
dando lugar à obtenção de ecdise satisfatória somente em pequeno número de
lotes. Assim é que. partindo de 172 lotes de metalarvas que iniciaram ecdise.
obtivemos apenas 23 lotes com evolução normal. £sses 23 lotes tiveram um
período próprio de 12 a 18 dias. sendo que mais frequentemente de 17 dias.

G9

214

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Tomando em consideração o período necessário para ser obtida a la. me-
tamorfose, isto é, desde o momento da colheita das metalar\as até a ecdise de
todos os elementos viáveis, os resultados obsen-ados à temperatura de 30 — 32°C
foram os seguintes:

1.» Metamorfose —

Tetnperatura 30 — Í2*C

Dias

I .* Exp.

2.* Exp.

3.* Exp.

Toul

%

15

4

4

2.6

16

6

6

3.9

17

25

2

27

17.8

18

10

—

12

7.8

19

—

2

22

25

16.»

20

7

3

1

12

7 8

21

4

16

39

25.6

22

23

2

18

11.8

23

16

6

8

5.2

24

2

1

1

0.6

Total

52

50

50

152

Verifica-se, então, que nos diferentes lotes a ecdise completa \-ariou de
15 a 24 dias.

Rendimento

No que diz respeito ao rendimento, já mostramos como foi pequeno quan-
do os Ixodidas foram mantidos à temperatura ambiente nos meses mais frios
do ano. Ao contrário, foi particularmente elerado na criação feita à tempera-
tura de 30^0; desta sorte, dos 152 lotes estudados observamos:

36

lotes

com

1005»

de eedises

41

»»

99

mais de 80 e menos

de IOO5Í,

de eedises

15

9f

99

99

60

8O5Ó

99

27

»>

99

99

40

(X)<^

99

23

99

99

20

405Í

99

10

99

com

menos

de 2O5Í de eedises.

Os resultados destas experiências demonstram que durante os meses frios,
que coincidem com a la. metamorfose dos Ixodidas criados no loboratório, as
temperaturas são desfavoráveis à evolução dos Ixodidas e que, pelo contrário,
à temperatura de 30°C a evolução decorre de maneira satisfatória na quase to-

70

J. Trwassos & A. Vallejo-Freire — Criavão {'rlificial de Amblyonitna

cajennense.

21Õ

taüdade dos lotes de metalar\-as. Aconselliainos, entretanto, para criação em
larga escala do Amblyomma cajcnncnsc na fase lar\o-ninfal. utilizar tempera-
turas entre 22 — 28°C no máximo. .A pennanéncia a temperaturas mais ele-
vadas não é aconselhável, pois é grande a monalidade verificada entre os exem-
plares que sofrem a metamorfose nos primeiros dias e pcnnanecem à espera da
evolução das metalarvas restantes.

criação de Ixodidas em nosso Lalwratorio é rotineiramente feita entre
24 e 26°C, sempre que se deseja apressar a evolução da fase de larva para a
de ninfa. Recomendamos, entretanto, manter constante ob.servação, para não
prolongar desnecessariamente a permanência na estufa. E' mesmo indispensá-
vel levar os lotes de carrapatos logo após a eedise da maioria das neoninfas jMra
temiieraturas mais liaixas até o momento da alimentação ou proceder à retira-
da diária das neoninfas ecloidas de junto das metalarvas mantendo-as a
seguir a temperatura mais Iwi.xa (20"C ±). Esta sejaração facilmente se con-
segue mediante o uso do aparelho adaptado para tralalhos com grandes quan-
tidades de metalar\as.

Modificaçees dos aparelhos para trabalhos com grande quantidade de metalarva:

Para grandes (piantidades de larvas cheias utilizamos jwr vezes um disjxtsi-
tivo. que pode conter 4O.C00 larvas ou mais. Este aitarelho, confeccionado sob
os mesmos princípios de dupla proteção, permite colher as neoninfas diretamente

j

!

i

í

1

J-]

U-Zl

Fic. 27

E«)iKfiu do apanlbo jar» crú(ia de ninfa» e adulto»
em (rande quantnlade. A = Tutw de proteção;

B = Tnl» de eonteneSo remoritel: C = Câmara para
o dep.l»tto de txodída»; D = Caixa para a dupla
proteção inferiitr: E = Areia umideeida; F = Te-
eido de organdi â prora de carrapato»; G = Teta
de araipe fino.

em tubos de contenção à medida que se processa a ectlise. Evitamos, desta sorte,
o uso do aparelho de vácuo, qtie. tiuando não manobrado com cuidado, iwde tra-er
prejuízo aos carraixitos etn consequência do violento movimento a que são sub-

71

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15

21G

Meniórías do Instituto Butantan

Tomo XVHI

metidos. As neoninfas logo após a ecdise, orientadas pelo fototropismo positivo,
passam do interior do aparelho, que pennanece ao abrigo da luz, para os tubi-
nhos de contenção, situados na parte externa, sendo assim coletadas espontanea-
mente nos tubinhos, que são substituídos à medida que contenham um número
razoável de exemplares. A montagem do aparelho permite a fácil substituição
dos tubos de contenção.

Xas melhores condições, a retirada dos tubos de contenção é feita cada 24
horas depois de iniciar a ecdise dos primeiros exemplares. Os tulxjs de con-
tenção que contém as neoninfas coletadas espontaneamente, isentas de pêlos ou
outros detritos, são fechados, numerados e colocados nos tulxjs de proteção
comuns, sob a camada de areia umidecida. onde então permanecem à espera do
momento projucio à alimentação.

Fic. 28

Aparelhos para criacâo dc ninfas e adoltos cm frande quantidade.

A fotografia e o de.<enho mostram melhor do que qualquer descrição a
montagem e funcionamento deste ajíarelho. A circulação de ar umidecido se faz
perfeitamenite à custa dc evaporação .da água (pie emlielje a areia na grande
bandeja, onde são depositados os ajiarelhos. O tecido de organdi ou tela fina de
arame (pie protege o fundo de cada aparelho j)crmite a livre circulação de ar
necessário ao desenvolvimento dos Ixodidas, ao mesmo temjxj que veda a jiassa-
gem destes i>ara o exterior.

Travassos & A. Vallejo-Freire

Criação artificial de Amblyomma
cajennense.

217

Para trabalhos a temperaturas mais elevadas, quando se deseja apressar a
evolução dos Ixo<lidas, êste dispositivo tem particular aplicação. A medida que
se coledonam as neoninfas nos tubos de contenção, estas podem imediatamente
ser transportadas para temperaturas mais liai.xas à espera do momento adequado
par se proceder a 2.® alimentação infetante.

Descrição da ninfa

Corpo — Ox-al largo. Comprimento (antes dc sugar) IJ8, largura 1.14.
Capitulo — Comprimento 0.42, largura da base OJ. Base sulxjuadrada, mar-
gens laterais cons-exas, cornua inconspicuas ou ausentes, margem posterior
cóneas-a ou quase reta. Superfiac lisa, sem pontuação. Palpos longos c com
alguns pêlos finos. Comprimento total dos articulos II c 111, 0J4. Hiposlôma
— Espatulado, de comprimento médio, levemente fendido no ápice. Dentição
2/2. Comprimento cerca dc 0_24. Escudo — Comprimento 0.66; largura 0.84.
Cordiforme largo, mais largo do que longo, largura máxima mais ou menos
no meio, com escápulos arredondados. Sulcos cerricais fundos e longos, atin-
gindo as proximidades .tas margens jwstcro laterais. Olhos grandes, pálidos,
meio convexos. Com número médio dc pontuações pc(|uenas. aiiagadas, vistas
melhor á luz refletida. Patas — Sem csiãnhos ventrais na extremidade distai
dos tarsos. Comprimento do tarso 1, 0.42; do nKtatarso, 024. Comprimento
do urso 1\', OJO; do metatarso, 021. Coxas — Coxa 1 com ,lois espinhos dis-
tintos, o interno menor. Coxas II. 111 e IV cada uma ctjm um sõ espinho. To-
dos os espinhos curtos c os das co.xas II. III e IV chatos e relatiwmente mais
estreitos do que em amcricanum. Placa cspiracular — Ij,rga. quase plana.
jKjrém aprofumlada na ahertura respiratória. Com|>rimcnto 021, largura 0.14.
(Coolej', R. A. & KohI.s, G. M.) (JI).

Alimentação infetante das ninfas

Período dc espera. Conto vimos anteriormente, a.s neotiinfas são colecio-
nadas em nútncro ade<|itadn tios tubinhos tlc contenção e tiiantidas etn geral à
temperatura do lalxiratório até decorrer o tempo de esjtera neces.sário à aliitien-
tação.- Ainda aqui, do mesmo nimlo que jtara o caso das larvas, a quitinização
das patas das neoninfas. avaliada pela cór pardacenta que aprcsetitam, é, sem
dúvida, um bom indice i>ara avaliar o momento adequado à alimentação das ninfas.
Quando a quitinização é verificada cm cérca de 100% das neoninfas, elas são co-
locadas nos coelhos. Além disso, devemos tomar como ponto dc refêréticia a me-
nor repleição das neoninfas que decorre do jejum a que são submetidas e que pode
ser avaliada pelo seu menor diâmetro (as neoninfas se mostram mais chatas) c
niaior transparência. .\ temperatura do lalviratório pode-se calcular eitt 30 — -10
dias ésse periodo de espera, sendo preferível, quatido se visa criação cm larga
escala, pecar {tela discreta dilatação desse perioelo. a diminui-lo, pois os resultados
percentuais dc rendimento são ligeiramente maiores.

73

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

218

.Meniórías do Instituto Butantan

Tomo XYHI

Técnica dc alimentação. — A técnica empregada para alimentar ninfas é, na
rotina, a mesma usada para aIimenta(;ão de lar\as, isto é, são colocadas em orelhas
de coelhos infetados e estas envoltas pelos saquinhos de organdi protegidos contra
dilacerações pelo protetor de couro.

Também outras técnicas podem ser empregadas, mas sem maiores vantagens
sôbre as acima assinaladas. Assim, podem-se utilizar, por e.xemplo, coelhos
depilados no tronco e abdomem, protegidos com uma camisa de organdi fixada
nas extremidades com esparadrapo e. por cima desta uma tela de arame fino

Fic. 29

Ninfa» de AmbljQmma fújenmciw.

ajustada ao corjx) do animal. Êsse processo tem a vantagem de oferecer maior
superficie à alimentação dos I.xodidas, que não se aglomerant tão intçp^menie
como acontece quando são colocados nas orelhas. Este método, entretanto,
afasta-se da técnica standard, necessita da confecção de novos ajiarelhos e. sobre-
tudo, exige manipulação fóra da mesa de proteção, não sendo, jwrisso. adotado
entre nós.

Outro dispositivo que pode ser empregado é o usado para a alimentação
de adultos (vide “Técnica de alimentação de adultos”).

A manipulação das ninfas requer maiores cuidados do que a de larvas-
Tratando-se de I.xodidas já infetados na fase lar\'a!, podem transmitir a infecção

74

J. TiiwAssos & A. Vallejo- Freire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 219

ao homem. Porisso, toda e qualquer manipulação deverá ser feita sempre nas
mesas de proteção, com os auxiliares protegidos pelas lu\’as adequadas, obedecendo
rigorosamente à técnica standard.

Os coelhos utilizados para alimentação das ninfas são mantidos nos compar-
timentos isolados do biotério pelo espaço de 8-10 dias, até a colheita das meta-
ninfas.

Colheita das nietaninfas. — As metaninfas (ninfas alimentadas) são colhi-
das das orelhas dos coelhos de idêntico modo ao das larvas alimentadas. Os
animais sacrificados por pancada na cabeça, são mantidos no biotério pelo espaço
de 3-4 horas até se verificar a coagulação do sangue no animal.

Cortam-se as orelhas pela base por meio de tesouras e, uma vez numeradas,
são levadas em bandejas para a mesa de proteção, onde são manipuladas. Aber-
tos os saquinhos de organdi, as ninfas são colecionadas em tamises laradores.
As que ainda estiveram fi.xadas às orelhas são despregadas por meio de manobras
delicadas com uma espátula.

Após cuidadosa lavagem strf) jacto dágua corrente, são le%’adas a secar em
estufa a 37°C ou mesmo com auxilio de ventiladores. Terminada esta fase,
procede- se à distribuição nos tubos de proteção (50 a 70 para os pequenos e 2500
a 2000 nos grandes). Os recipientes de dupla proteção contendo as metaninfas
são levados à estufa, onde são retidos até se verificar a 2a. metamorfose com a
eedise dos adultos.

5. Fase adulta — Alimentação estimulante
Periodo prévio i eedise de adultos

Êste periodo é o que precede a segunda metamorfose, isto é, a passagem da
fase de ninfa para a de adulto. Compreende o tempo que decorre entre o fim
da alimentação das ninfas (metaninfas) até verificar-se em um lote a saida dos
primeiros exemplares adultos.

Os resultados obtidos nas verificações feitas com 50 lotes de metaninfas
estão resumidos no quadro abaLxo. Foram estudados 2.500 exemplares, pois cada
lote de metaninfas contou com 50 unidades.

O periodo prévio à eedise ^•ariou entre 9 e 12 dias apenas. Na maioria dos
lotes o inicio da eedise ocorreu no 11.® dia, quando em aproximadamente 44^
dos lotes se observou saida dos primeiros exemplares adultos.

75

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

220

Memórías do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Período prédio à ecdiie
Temperatura 30 —

de adultos

32*C

X.* de dias

X.* de lotes

%

5

13

26

6

23

46

7

9

18

s

4

8

9

1

2

Total

50

Período próprio i ecdise
Temiieratara 30 —

de adultos

32*C

X.* de dias

X.* de lotes

s

9

8

16

10

17

34

11

22

44

12

3

6

Total

50

Período próprio à 2.* metamorfose

Nas obser\’ações feitas com os mesmos lotes da experiência anterior pôde-sc
concluir que o período próprio à ecdise de adultos mantidos em temperatura entre
30 e 32®C oscilou entre 5 e 9 dias. Em 23 lotes de Ixodidas a saída dos

adultos se processou durante 6 dias.

2.* metamorfose

Si computarmos todo o período de tempo necessário à verificação da 2a.
metamorfose, isto é. o tempo decorrido entre a alimentação das metaninfas e a
ecdise de todos os exemplares contidos em cada lote, verificamos que para a obten-
ção da 2a. metamorfose são necessários de 14 a 19 dias, a maioria necessitando 16
e 17 dias para completa evolução, como se verifica no quadro abaixo. Xa prá-
tica. portanto, os lotes de metaninfas devem permanecer 20 dias na estufa regulada
entre 30 a 32®C para se obter a ecdise de Amblyoinma cajenncnse adultos.

2.* Metamorfose — Temperatura

30 — 320C

X.* de dias

X.* de lotes

íi

14

1

2

15

6

12

16

21

42

17

12

24

18

5

10

19

5

10

Total

50

76

J. Tr.\vassos a a. Vallej o- Freire — Criação artificial de Ámblyomma

cajennense.

221

Rendimento

Os rendimentos encontrados neste lotes de Ixodidas foram bastante
satisfatórios sob o ponto de vista prático, quando se utilizaram temperaturas
variáveis entre 30 e 32®C.

Precisamos, no entanto, novamente frizar aqui, que a estas temperaturas
necessário se toma ir retirando os adultos de junto das outras ninfas ou detritos,
pois não é conveniente mantê-los a estas temperaturas.

A utilização dos aparelhos que pennitem a seiiaração natural dos exemplares
que se vão libertando dos detritos, pennite obter de maneira simples esta separação
diária.

Em mais de 60^ dos Ixodidas observados nos diferentes lotes, o rendimento
variou entre 80 e 90%, o que consideramos bastante satisfatório.

Resumimos no quadro seguinte as percentagens obtidas quanto ao rendimento :

Rendimento durante a 2.* meUmorfo*e.
Temperatura 30 — 32*C

N.» He lo(r«

%

Entre 30 e 50

3

6

> 50 e 60

2

4

» 60 e 70

5

10

> 70 e 80

7

14

» 80 e 90

29

58

» 90 e 100

4

8

50

100

A evolução de Amblyomtna cajennense no transcorrer da 2a. metamorfose
pode ser muito mais demorada quando as metaninfas pennanecem à temperatura
ambiente do laboratório até a eedise dos adultos. Em observações feitas com lotes
de metaninfas colhidas na mesma ocasião das utilizadas na experiência anterior
e procedentes dos mesmos coelhos, verificou-se um rendimento praticamente nulo,
sendo minima a quantidade de adultos obtidos e a perda superior a 80%. Durante
os meses mais frios do ano (junho, julho) obser\-ou-se um periodo prévio à
eedise dos adultos rariável entre 23 e 60 dias, com grande irregularidade entre
os diferentes lotes, sendo que na maioria os primeiros e.xemplares adultos foram
vistos entre o 35 e o 45 dias após a colhe’ta das metaninfas.

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

222

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Uma segunda experiência foi le^■ada a têrmo com outros 50 lotes de meta-
larvas colhidas a 1 1 de outubro e observadas durante outubro e novembro. Foram
os seguintes os resultados obtidos;

Periodo prévio k cedite de adultos.
Temperatura ambiente
(Meses: outubro e ix>Temtro)

N.* de dias

N.* de lotes

a

23

17

34

24

17

34

25

5

10

26

6

12

27

—

—

28

2

4

29

1

2

30

1

2

Total

50

Período próprio à ecdise — Temperatura
ambiente

(Meses: outubro e oorembro)

X." de dias

X.* de lotes

%

10

1

2

11

3

6

12

8

16

13

4

8

14

9

18

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2

4

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5

10

19

6

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20

4

8

Total

50

Comparando êstes resultados com os obtidos nas experiências feitas à tem-
peratura de 30 — 32^. verifica-se grande diferença no número de dias necessá-
rios para a 2a. metamorfose. temperatura constante de 30 — 32®C, o período
prévio à ecdise de adultos oscilou entre 9 e 12 dias, enquanto que nos lotes mantidos
à temperatura ambiente do laboratório nos meses de outubro c novembro, o
inicio da ecdise só foi verificado a partir do 23 dias da colheita das ninfas alimen-
tadas. Para o periodo próprio à ecdise o mesmo se ohser\a. A 30 — 32°C. a
mudança da j)ele se faz nos diversos lotes durante 5 a 9 dias, ao passo que nesta
última experiência, entre 10 e 20 dias. Xos meses ile outubro e novembro a média
das temperaturas má.ximas no laboratório foi de 25®C e a média das temperaturas
minimas de 15°C.

Conservação dos adultos destinados ao preparo da vacina

medida que os e.xcmplares adultos de Amblyomma cajennensí se libertam do ensx)!-
tório e.xterno da fase anterior de ninfa, desem ser coletados e conservados eonveniente-
mente até o momento de ser utilizado no preparo da vacina.

78

J. Travassos & A. Valu^jo-Freire — Criação nrtificial cie Arnhlyomma

cajennense.

223

Os Ixodidas adultos são cc!<xados cm núme'-o vaii::n'Jo entre 159 c 200 em petiuenas
caixas circulares de cartolina com 5 cm de diâmetro e 1 1/2 cm de altura. .As caixinhas
são fechadas por uma fita de esparadrapo e colocadas. em número de 10 em bolsas de or-
gandí. Estas bolsas fechadas nas extremidades com um pedaço circular de esparadrapo
servem dc proteção contra eventuais acidentes. .Assim acondicionadas, as caixinhas con-
tendo os carrapatos são guardadas cm craixas metálicas capazes dc conter 21 bolsas. Cada
cai.xa pode, portanto, guardar cm media -1.000 I.xodidas, machos c fêmeas, infetados.

No fundo destas caixas há uma camada dc algodão, que é mantida umedccida c que
fica separada das bolías jxjr uma placa metálica perfurada, de modo a permitir um grau
de umidade apropriado em todo ambiente interior da caixa sem umedecer por contato as
caixinhas de cartolina.

Fio. JO

Conierracão dc Amtlyomma cajrmnrntf, ^ r 9* infcstaiioí para o preprro fia vacina.

.As caixas metálicas, contendo os carrapatos na sua última fase evolutiva, permanecem
n? geladeira á ttmpc.-atura reguEda entre 10 c 15“C. .A esta temperatura os I.xodidas
podem ser ccnscrcados vivos durante longo período dc tempo, ate o momento da .ilimen-
tação estimuladcra. Os pesquisadores americanos, que traballiaram com DcrmacctUor ju-
dersoni, demonstraram a conveniência dc prolongar êste estágio por um pcríoilo mais ou
menos longo, quase sempre durante um ano. Desta sorte, os carrapatos correspondentes á
criação de um ánc, só são utilizados no ano seguinte. Esta espera, segundo aquêles ex-
p-erimentaderes. teria importáceia para a obtenção de melhores resultados após a alimenta-
ção estimulante, dando maiores quantidades dc riquêtsias e \acinas mais eficientes.

Sempre que possivel, prolongamos o pCriodo de tempo cm que os Amblyomma cajennen-
SC são mantidos com metabolismo diminu.do em ccnscqãcncia da temperatura em que são

cm

SciELO

22i

Memórias do Instituto Butantan — Tomo XVHI

conserwdos, porém cm média após seis meses e às vezes menos já os empregamos para
o preparo da vacina, premidos pela necessidade de atender aos urgentes pedidos do pro-
duto, obtende, entretanto, quase sempre vacinas altaroente satisfatórias sob o ponto dc
vista protetor.

Alimentação estimulante

Xos Ixodidas adultos infetados e conservados por longo tempo em baixas
temiteraturas, as riquétsias reproduzidas no interior das células dos órgãos inter-
nos encontram-se em uma fase de atenuação de sua virulência. Suspensões dos
órgãos internos desses Ixodidas, obtidas por trituração e sejtaração da parte qui-
tinosa. inoculadas em coltaias de prova, em geral só fornecem petjuena percen-
tagem de infecções benignas. Si 10 a 15 dias depois reinocularmos êsses animais
com virus de passagens, êles se mostram na maioria protegidos contra a febre
maculosa, o que põe indiretamente em evidência a presença nos carrapatos dos
princípios antigcnicos — as riquétsias.

Spe.vcer e Parker provaram cm exiieriéncias com o Dcrmaccntor andersoni,
qtie lastava manter os adultos à temperatura de Í7°C durante 24 horas, para que
fosse obtida u’a maior percentagem de infeções nos animais inoculados e mais
ainda, que, si êstes carrapatos se alimentassem parcialmente em colxiias e fossem
a seguir mantidos durante algum tempo à temperatura do lalx)ratório, poder-se-ia
obter de um só Ixo<lida um grande número de doses infetantes.

Foi com o uso de emul.sões fenoladas a 0.5%. obtidas de triturados de Ixo-
didas adultos infetados, conservados em bai.xas temperaturas durante alguns meses
e parcialmentc alimentados por ocasião da trituração, que Spencer e Parker con-
seguiram provar a possibilidade de prejarar vacinas capazes de. quando inoculadas
em cobaias, conferir sólida imunidade perante a inoculação de prova feita com a
injeção peritonial de 1 cm-^ de sangue de col^aia infetada.

Trabalhos feitos em nosso laltoratório mostraram que os mesmos fatos se
verificam com o Atnblyoiuina cajcnncnsc, isto é, as riquétsias se repro<luzeni
abundantemente nos Ixotlidas após a prévia alimentação estimuladora, antes de
serem utilizados para o preparo das emulsões destinadas ao fabrico das vacinas.

Foi possível, igualmentc. comprovar que éste resultado pode ser obtido, quer
utilizando cobaias, quer coelhos, para a alimentação final estimuladora. Ultima-
mente. temos dado preferência ao uso de coelhos, pela possibilidade de alimentar
um número maior de exemplares.

80

Técnica para a alimentação
estimulante

Preparo dos aparelhos. — • Como dispositivo uti-
liudo para a última alimcnução dos adultos, empre-
gamos artificio semelhante ao descrito por PatKca,
constítuido de pequenas bolsas protetoras, a^ptaveis
ãs partes laterais do animal préviaroente depilado.

As bolsas ou receptáculos dos carrapatOT ím
moldados em tela de arame fino, por meio de for-
ro», de dimensíes variáveis, de acordo com o ta-
manbo do animal.

Era uma faixa de tecido adesivo de 10 cm
de Urgnra, si fõr destinado a coelhos, e de 6 a 8
cm cm. si fõr para cobaia. - fax-sc uma abertura
circular de dimensões idêntica, a parte saliente da
bolsa ou receptáculo moldado na tela de arame, man-
tendo-se a parte adesiva do esparadrapo vol^ para
cima. Ajusta-se e encaixa-se a armação de arame
da maneira indicada na Fig- JI. •: »
cobrei com tecido de organdi fino a parte interna
do receptáeulo, fixando-se com esparadrapo nos bor-
do, internos (Fig. Jl. b). Pode-«; com êste disposí-
tivo manter uma ventilação satisfatorm no interior
das bolsas e, ao mesmo tempo, uma boa proteção
contra a saída dos Ixoilidas. Poilem-se preparar lai-
xa. contendo 1 ou 2 bol«ls devemlo-se neste ul-
timo caso faier coincidir cada uma com a parte
Utml dcpiUtl» do cocibo.

Colocúçãa d 9 S carrapatoi aãnlt^. — Corlbo» cu
cobaUs de«m ser prevUmente depilado, na parte
medUna. atingindo Unto o dorso, co^ o ventre. O.
carrapatos retirado, da geladeira são mantido,
rante 24 hora, na estufa á temperatura de J/*C.
por — da colocacáo nos animais po.lem ser res-
friado. durante alguns minutos, para facilitar a co-
Imracáo no, receptáculos. Mantem-se a faixa em aiM
de uma mesa e colocam-se no “ *

mêdU de 250 Ixodiila. (Fig. 21. e) C); logo a se-
guir. o coelbo seguro pelas paus anteriores e poste-
riores ê levado de encontro ã faixa, de modo que
a bolsa fiqne situaiU Uteralroente. na parte depi-
lada do coelho (Fig. 21. d). A faixa é então aju^
Uda ao corpo do animal. fa«endo-a aderir á pele.
Tiras estreita, de esparadrapo cimipleum a fixação
nos limites externo» da faixa (Fib. 21, e. f).

Com êste dispositivo pode-se manter uma su-
ficiente proteção contra a. tenutiva. do coelbo no
sentido de procurar retirar o mesmo. Iode-se. como
precaução, manter a. pata, posteriores amarradas
porém temo. dispensado essa medida por serem rara,
09 acidentes.

o» coelbo, asrira preparados, são lev^os a-as
compartimentos isolado, do biotêrio. utllixados pa.a
esu fase de alimenucão. A parte dianteira da. gaio-
las, contendo os animais ê protegida por uma cor-
tina de borracha, de modo a evitar qne. no caKi ue
desprender algum aparelho, o. carrapatos transio-
nham a» barreira* constituída» pela» bacia» de »olu*
ção carrapaticida.

(•) Ulilixar coelbo» cíwn pé»o acima de 2 qui-
lo» ou cobaia» com mai» de 500 %. Oua»lo »e em-
pregam cobaia», deve-se colocar de 75 a 1(» adultos.

SciELO

cm

220

Memórias do Insliluio Bulantan — Tomo XVHI

Tempo do ahmentatão estimuladora. — A alimentação estimuladora dese fornecer ac
carrapato uma quanti^de de sangue jnstamente suficiente para reativar a reprodução e a
virulência das nquétsias que se encontram nos tecidos dos órgãos internos do Ixodida.

alimentação e depois de permanecer 24 horas ã temperatura de
os adultos se fixam facilmente nos animais.

Rotinciramente. retiramos os carrapatos dos coelhos ou cobaias depois de 4 a 6 dias.
iste prazo e regulado de acordo com o tempo e a temperatura a que foram submetidos os
Ixodidas. Quanto maior a demora e mais alta a temperatura, tanto menor o número de
dias necessários para se processar a alimentação estimuladora.

Colheita dos adultos após a alimentação estimuladora. — Os coelhos ou cobaias ainda
VIVOS, contendo os Ixodidas. são fi.xados nas bandejas situadas no interior das mesas para
mampulaçao protegida, onde se desprendem os aparelhos e. por meio de pinças especiais
sc procede à colheita tanto nos exemplares machos, como fêmeos.

Os carrapatos adultos ainda não totelmente alimentados, encontram-se fortemente fi-
xados a pele do animal, do qual somente se destacam por tração. Ixodidas eventualmente
lesados nao poilem mais ser usados para a vacina, pois morrem em seguida, entrando cm
decomposição, razão pcla qual têm de ser eliminados.

Os exemplares femeos que sc encheram demasiadamente, não devem ser utilizados para
o preparo da vacina, no entanto podem ser guardados para iniciar a criação do ano se-
guinte ou então eliminados.

Colhidos um a um. os carrapatos são colocados cm placas de Petri. agrupados cm
lotes de 500.

Antes de se iniciar o preparo da vacina pcla trituração, eles devem permanecer ã
temperatura ambiente do laboratório durante 4vS a 96 horas. Em geral, o máximo de vi-
rulência das emulsões feitas com os órgãos internos dos carrapatos sc verifica entre 8 a
10 dias, contados a partir c’o momento em que os Ixodidas são colocados nos animais para
a alimentação estimulante.

Controle de infecção com Ixodidas

É sempre conveniente na fase ninfal, verificar si a maioria das metaninfas
fot infetada em consequência das duas alimentações anteriores. Para isto reti-
ram-se. ao acaso. 10 e.xemplares de cada grande lote de metaninfas, 10-12 dias
deiHiis tia colheita e tritura-se cada carrapato separadamente, de mistura com 2
emí de salina. A suspensão obtida é injetada em coliaias pela via stilxutânea e
observa-se os animais durante 15 dias. Quando se trabalha com a técnica e os

cuidados por nos tndicados, quase sempre a totalidade das ninfas mostra-se infe-
tada.

Xao aconselhamos fazer a prova de infecção após a primeira alimentação
na fase larval, porque às vezes pode acontecer que. apesar das precauções tomadas
para fazer coincidir a picada dos I.xodidas com a fase de circulação do vinis no
animal, o período de incul^ção da infecção se tenha prolongado deniasiadamente

82

J. TaWASSns & A. VALLIUO-FBEinE

Criação rrlificial clc Aniblijoiuma
cujennense.

ou mesmo, devido a uma resistência individual imprevista, o animal não ai)resente
virus na corrente sanguinea. a não ser por curto jjeriodo de tempo, insuficiente
para infetar todos os carrapatos que foram colocados no coelho. Pequena, evi-
dentemente, será a probabilidade de que estas mesmas condições se rei>rtKluzam
com o mesmo lote em uma segunda alimentação, na fase ninfal.

Xa fase adulta é sempre aconselhável verificar a presença de riquétsias nos
esfregaços feitos com os órgãos internos do carrajjato. liem como avaliar a
virulência cjuc apresentam, o que poderá servir de indice prévio do valor antigê-
nico provável das vacinas a serem preparadas com êsses Ixodidas.

Os esfregaços jKira a pes<|uisa de riquétsias deverão ser corados jwr um
dos métodos usuais para a coloração destes micr(M)rgauismos. LMtimamente
temos com vantagem dado preferência ao de Machiavello. (jue fornece mais fácil
- e raiiidamcntc bõas prqaraçws. .As ritpiétsias apresentam-se coradas em
verme’hí). destacando-se facilmente no interior das células coradas em azid.

Para controle de infecciosidade procede-se do seguinte modo: Ixodidas
retirados dos lotes de carrajMtos adultos, que sofreram a alimentação estimulatUe
e a seguir permaneceram 4 ou 5 dias à tem|>eratura ambiente do laixjratório. são
dissecados jara a retirada do conteúdo dos órgãos internos. Km gral esteril,
com o auxilio de areia de quartzo, faz-se uma fina trituração de mistura com
solução fisiológica na proixirção de 1 enf* jxira cada l.xotlida utilizado; centrifu-
ga-se jHjr alguns minutos para a retiratla do quartzo e detritos celulares não Ikmii
desintegrados e utilÍ7.a-se o liquido sobrenadaute |)ara o preparo de diluições
seriadas. Km colaias de cérca de .?00 g injeta-se. i)ela via sul)cutánea, 1 cm*
das diluições acima de 1/1.000. usando-se duas cobaias para cada diluição.

Para o prejwro das vacinas deve-se empregar lotes <!e Ixotlidas. (juc fornecem
emul.sões de atividade nunca inferior a 1.000 do.ses infetantes jKir adulto infetado.
.-\ produção de vacinas potentes dejiende diretamente <la concentração do virus
nos carrapatos que se utilizam para o .seu preixiro. \^^cinas i)reiKiradas com
Ixotlidas que contenham 5.000 ou mais doses infetantes. sã«> (jiiase sempre alta-
mente protetoras (Spe.nter e P.arker).

O jwso medio dos órgãos de um Ixodida isento da jxirte quitino.sa não
ultrapassa em geral 0.01 g. po<lcndo-.sc avaliar, desta sorte, a grande concentração
de virus. compara :ia com o número de doses infetantes existente no sangue de
cobaias infetadas, onde raramente vai além de 1.000 por cm*.

G — PREPARO DA VACINA

Terminada a descrição das técnicas utilizadas para criação do Atnblyowma
cajcnneitsc, finalidade princii)al déste trabalho, relataremos resumidamente a
maneira de preparar a vacina. .\ técnica é. aliás, idêntica à utilizada j>elos inves-

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cm

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228

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

tigadores americanos que trabalam com o Dennacenlor andcrsor.i. Aqueles dire-
tamente interessados nos pormenores poderão recorrer aos artigos originais rela-
cionados com o assunto; alguns dos mais informativos estão incluidos nas refe-
rências no fim dêste trabalho (32 a 34).

A vacina quase sempre é elaborada em pequenos volumes e à medida que os
exemplares adultos infetados vão sendo submetidos à alimentação estimulante.
Habitualmente, preparamos partidas de 500 ou 1000 cm^. A maioria das elabora-
ções é feita com volumes de meio litro.

quantidade de Ixodidas pode variar entre 1 e 2 exemplares adultos para
cada centimetro cúbico do produto final. O número de carrajjatos a ser usado
poderá ser avaliado, quer pelo número de doses infetantes encontradas nas diluições
do triturado dos Ixodidas do lote utilizado, (juer pelos resultados do valor antigê-
nico das |)artidas elal)oradas, determinando-se, então, por experiências repetidas,
qual a concentração mais adequada para obter, com regularidade, resultados satis-
fatónos.

Como norma orientadora pode-se utilizar um carrapato e um quarto ou um
carrapato e meio ixira cada centimetro cúbico de vacina. É esta a mesma proiwr-
ção u.sada nos lalwratórios de Hamilton e que tem. igualmente, dado Iwns resul-
tados e de forma regular, quando se emprega o Amblyomma cajcnnensc.

Para o prejxiro de uma partida de meio litro, emj)regamos quase sempre 750
Ixodidas vivos, machos e fêmeas, infetados, isto ê. um carrapato e meio para
cada centimetro cúbico de vacina.

1. Trituração, desintoxicação e purificação

Preparo dos carrapatos, desinfecção. — Selecionados e separados de detritos
ou excreções, os carrapatos são colocados em contacto com solução salina formo-
lada a 4%. durante alguns minutos. j>ara desinfeção rápida da parte externa.
seguir são repetidamente lavados em água destilada ou mesmo água corrente e
colocados em um provete, cobrindo-os com solução de mertiolato de sódio
(1 : 1.000), em contacto com a qual devem os carraj)atos permanecer durante 48
horas à temjxjratura ambiente. .V seguir são lavados 2 ou 3 vezes com solução
salina formolada a 0.4^ e fenicada a 1.6%. deixando-se escorrer bem todo o
liquido, de modo a ficarem apenas úmidos : então, estão prontos para a trituração.

Trituração. — .-\ trituração é feita em gral mecânico ou manual, no interior
de uma mesa de câmara de proteção (*). com au.xilio de quartzo esteril ou,

(*) .\ nic.<ia para trituração é utilizada não só para o preparo da vacina, conto

ainda para manipular qualquer material, carrapatos ou órgãos de animais infetados,
tiestinados às inoculações rotineiras.

81

J. Tr.\vassos & A. Vallejo-Freire

Criação artificial ile Amblyomma
cajennense.

229

simplesmente, congelando previamente os carrapatos, mantendo-os durante a noite
no frigorífico à temperatura de — 15°C.

A mesa para trituração é um modelo simplificado da mesa de proteção já
descrita (p. 59) ; apenas não possui tanque para solução carrapaticida. A câmara
protetora tem guarnições de metal e é envidraçada de modo a permitir ampla
visibilidade: os auxiliares traljalhani ao abrigo de contaminações, protegidos com
longas lu\-as de Ijorracha. adaptáveis às alxírturas laterais. Dentro da mesa, antes

Fic. u

Mrsa iriturâçSo de carrafuios c manipulacSo de nutcrial infetado em iterai.

de iniciar o tralialbo, colocam-sc: grais com os carrapatos a triturar; frascos com
solução salina formolada a 0.4^r e fcnicada a 1.6% ; copos c provetas graduadas;
funis montados com gase esteril ; frascos estereis de 500 cm^ de ca]Kicida(lc com
rolhas de vidro esmerilhado, etc.

Fechadas as alierturas, jxKlc-se iniciar a trituração dos l.xodidas: inicial-
mente. sem acréscimo de liquido c a seguir, juntando-se lentamente a cada gral
pequenos volumes de solução formnlada-fenicada, até que os carrajvitos estejam
perfeitamente desfeitos. Terminada a trituração, faz-se uma espécie de rinsagem
do conteúdo do gral, utilizando nas diver.<as lavagens .solução de fenol-fonnol até
completar o volume de 125 cm*, ao mesmo tempo que se vai fazendo o transva-
samento do liquido fiara um frasco de 500 cm^ de capacidade, contendo fiérolas de
porcelana. .V manobra de extravasamento fioderá ser feita jKir meio de funil
montado com gaze. com, a finalidade de reter as carajiaças dos Ixodidas ou
detritos mais grosseiros. Os frascos contendo a suspensão bruta são então fecha-
dos e rotulados com o número da fiartida cm elaboração.

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cm

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230

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

Todo o material utilizado para a trituração permanece dentro da câmara,
exposto a vaixires de formol até o dia seguinte, para o que se derrama, em cada
gral utilizado, algumas gotas de solução de formol a 40%, No dia seguinte,
abre-se a câmara e se retiram os frascos; todo o material usado é levado à Seção
de esterilização.

Desintoxicação. — Os frascos contendo o produto da trituração dos carra-
patos são guardados na geladeira (8 a lO^^C-), onde permanecem durante 10 dias;
diariamente, são agitados durante 15 a 20 minutos com auxilio de um agitador
mecânico.

Decorrido êsse prazo, completa-se o volume de 500 enr’, adicionando 375cm^
de solução fisiológica esteril. O produto final a ser purificado contem, pois, 0.1%
de formol e 0.4% de fenol.

Purificação. — .-\ purificação visa eliminar todos os detritos da trituração
dos Ixodidas, l)em como uma jxirte grosseira do produto (jue foi precipitado i)c’a
ação do formol e do fenol.

.•\|)ós 10 dias de desintoxicação, a susiiensão é centrifugada a uma velocidade
de 1 .600 rotaçíães por minuto durante 30 minutos. O liquido .sobrenadante cons-
titui a vacitui purificada. Decanta-se, jara retirar o sobrenadante e guarda-se o
produto em frascos apropriados, tendo-se o cuidado de retirar u'a amostra (20cm*)
para controle de esterilidade, inocuidade e verificação da capacidade antigênica
da vacina.

centrifugação do produto bruto não precisa ser feita logo aix)s decorridos
os 10 dias necessários i>ara a esintoxicação. Mantida na geladeira à tempera-
tura não inferior a 5®C. a susjiensão jxxle ser conservada, sem inconveniente,
durante algum tempo, à esi)era do momento ntais apropriado jara .<e prcKetler à
purificação e distribuição.

Distribuição. — A distribuição do produto é feita em vidros com rolha de
Imrracha perfurável para vacinação individual (6 cni^) ou coletiva (30 cm^).
Ketiram-se de cada partida algumas unidades jxtra o segundo controle de esterili-
dade. O produto final deve ser conservado à temperatura entre 12 e 15°C.

2. Prova de esterilidade, inocuidade e capacidade antigênica

A prova de esterilidade é feita com o fim de afastar a possibilidade da pre-
sença de contaminações por germes aeróbios e anaeróbios, utilisando-se as técnicas
empregadas no Instituto Hutantan jtara produtos biológicos em geral.

.-\ prova de inocuidade e a detenninação do valor vacinante das diferentes
jxirtidas é feita cm coltaias de cerca de 300 g de peso. Seis an mais de prova são
incKulados com 1 cm^ de vacina j)cla via sulxrutânea e a seguir observados durante

SG

J. Tb.\vassos & A. V.\LX£JO-FrE1RE

Criação artificia] de Aniblyomma
cajennense.

231

12 dias. Xão devem diminuir de peso, apresentar reações no local de inoculação
ou mostrar ele\-ação térmica acima de 39.6-C.

Decorridos os 12 dias, as cobaia.s de prova, bem como duas testemunhas, são
inoculadas pela via peritoneal com 0.5 cm^ de sangue citratado de cobaia infetada,
obtido por punção cardiaca no segundo ou terceiro dia de reação febril. .Afim
de tornar mais uniforme a atividade dos virus usados nas diferentes provas, visto
que costumam ser grandes as \'ariações do número de doses infetantes no sangue
de diferentes animais infetados e não ser praticável avaliar quantitativamente a
atividade do virus cm cada prova, procedemos do seguinte modo:

Um minimo de 5 animais, utilizados para fornecer o material infetante, rece-
bem previamente pela \na peritoneal virus de passagem, oriundo de ca.so humano
de febre maculosa ou isolado de Ixodida naturalmente infetado. Todos os ani-
mais são sangrados na véspera do dia previsto para a inoailação e o volume de
sangue citratado de cada cobaia é mantido na geladeira à temperatura entre
0 e 5°C durante 15 a 18 horas, enquanto se processa a pro\'a de esterilidade para
afastar a possibilidade de contaminações devidas a bactérias. Xo dia seguinte
faz-se a mistura do sangue esteril, usando-a para a prova de antigenicidade da
vacina.

Procedendo-se déste modo, é sempre conveniente juntar várias partidas de
vacina para fazer a prova na mesma ocasião e com a mesma mistura de virus.

Os animais \-acinados e inoculados com virus de passagem continuam a ser
obseiA-ados durante mais 15 dias, registrando-se as temperaturas tomadas duas
vezes ao dia: pela manhã e à tarde. Dcjwis deste prazo, tanto as coluiias de
prova, como as testemunhas ainda vi\-as, são sacrificadas e necropsiadas para
observar eventuais lesões macroscópicas.

O comportamento déstes animais constituirá um indice prático da avaliação
do poder vacinante da partida de vacina elalKirada. desde que as testemunhas apre-
sentem infecção tipica, isto é. periodo de inculação de 3 a 5 dias, quadro térmico
carateristico, podendo ou não morrer da infecção, mas apresentando sempre, após
a morte espontânea ou quando necropsiadas, após serem sacrificadas, as lesões
macroscópicas mais frequentemente encontradas na febre maculosa e.xperimental :
esplenomcgalia acentuada, exsudação periesplênica e perihepática, congestão das
suprarrenais e, por vezes, reação escrotal mais ou menos intensa. A pesquisa de
ríquétsias poderá ser feita nos animais mortos ou sacrificados, em preparações
obtidas de raspados da parede {>eritoncal, o que é, desnecessário, pois que se
trata de virus de jvassagens em coliaias, bem estudado. Quando as testemunhas
não apresentarem um comportamento déste tipo, a prova deverá ser repetida.

cm

SciELO

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232

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

Os resultados são referidos da seguinte maneira, classificando-se as partidas
de vacina em quatro graus diferentes:

1 . Vacina ótima — As 6 cobaias são totalniente prot^idas :
não apresentam reação térmica durante o período de observação e,
sacrificadas, não mostram lesões macroscópicas, caraterísticas da
febre maculosa;

2. l'acina bôa — Somente uma cobaia tem reação térmica mais
ou menos caraterística, morrendo ou não da infecção. As demais
são totalmente protegidas;

3. Vacina regular — Duas entre as 6 coba'as reagem febril-
mente, morrendo ou não da infecção, as restantes não têm elevação
térmica, nem quando necropsiadas apresentam lesões evidentes de
febre maculosa;

4. Vacina sem valor — Mais de duas reagem tèrmicamente de
forma caraterística, morrendo da infecção ou apresentando à necropsia
lesões caraterísticas.

H — APLICAÇÃO DE VACINA. VACINAÇÃO
1 . Dosea

As pessoas adultas devem receber três injeções de 2 cm^ pela via subcutânea.
Crianças com menos de 10 anos recebem três doses de 1 cm*.

É de todo conveniente repetir as vacinações com relativa frequência, prin-
■cipalmente entre indivíduos residentes em locais onde há constante aparecimento
de casos de febre maculosa, em consequência da existência de abundante quanti-
dade de carrapatos infetados. Nestes casos, a reracinação com 1 ou 2 doses
deverá ser feita pelo menos anual — ou, melhor ainda, semestralmente.

2. Reações

As reações observadas nas inúmeras pessoas \'acinadas com a \-acina prepa-
rada em nosso laboratório nestes últimos anos são relati\'amente benignas, só
raramente aparecem indivíduos com sensibilidade exagerada ao material vacinante.
sem, no entanto, acarretar conseqüéncias maiores de molde a dificultar a v-acina-
ção generalizada. Elias são de ordem local e geral. A reação local traduz-se por
edema e eritema. mais ou menos acentuados, .ã reação geral acarreta febre, ge-
ralmente pouco acentuada, e, raramente, calefrios e dores pelo corpo.

88

J. Trwassos & A. Vallejo-Fbeire — Criação artificial de Amblyomma

cajennense. 233

3. Resultados

O julgamento do valor preventivo para o homem, de uma vacina desta
natureza, feito em focos, onde os casos aparecem com bastante irregularidade, é
sempre dificil, principalmente quando ainda o tempo decorrido desde o inicio da
campanha de vacinação preventira não permite esclarecer de modo decisivo até
onde a vacinação foi efiaente. Os dados obtidos pela aplicação da vacina de
Spencer e Parker, nos Estados Unidos e entre nós durante alguns anos são
l)astante animadores, porém confirmam que proteção satisfatória só se obtem com
vacinações repetidas (35,36).

Nos serviços do laboratório desde a ocorrência dos casos fatais nas pessoas
do Dr. Lemos Monteiro e seu auxiliar, Sr. Ediso.n Dias, não foram verifica-
dos novos acidentes. .Acreditamos que realmente a vacinação e revacinação cons-
tante dos técnicos tenham concorrido de maneira eficaz para éste fato. São fá-
ceis de compreender as inúmeras ocasiões de infecção em trabalhos desta natureza,
por mais rigorosas que sejam as precauções tomadas, em conseqücncia da inten-
sidade do trabalho com a constante manipulação de material muito virulento.
Todos os funcionários ocupados nos trabalhos de febre maculosa são vacinados
pelo menos cada seis meses, recebendo três inoculações de 2 cm* cada, por oca-
sião da vacinação semestral.

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91

cm

SciELO

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SOBREVIDA DA PARELHEIRA (PHILODRYAS, í^p.)
DEPOIS DA ADRENALECTOMIA

POR

JOSH:’ ribeiro do valle

{Do Laboratório de Endocrinologia do Instituto liutantan, São Paulo, Brasil)

São Ixriii conhecidos os efeitos da adrenalectoniia nos inainiferos, principal-
mente no rato c no cão. mas embora o assunto tenha sido e.vaminado tamltém
nas aves e nos anfibios, até ajjora, ao que me parece, os reptis ainda não foram
empregados como material de estudo neste jjarticular.

A maior sobrevida do rato infantil adrenoprivo cm dieta apropriada é de
10 dias. Segundo BcLBRtxo (1), jiatos adrenoprivos sobrevivem cm média aj)e-
nas 11 horas. Herrick e ToR.sxvEtr (2) operaram pintos Leghorn e a sobrevida
dos adrenoprivos totais, sem tratamento substitutivo, foi de 15 a 16 horas. Ersxt-
xoxi (3) estudou Ixrm o problema nos batrãtiuios; a sobrevida dos sa]H)S ointrados
bilateralmente foi. em média, de 14 dias, sendo m.aior no inverno c menor no
verão. Estes datlos mostram o interesse da obscrv.ação do que jxxleria ocorrer
nos ofidios. Pertenceriam esses vertebrados, quanto ao tenqw de sobrevida
dcjxHs da ablação das adrenais, ao grupo das aves ou ao dos mamiferos e anfi-
bios ?

Xesta nota comunico os resultados observados depois da o]K;ração de 30
exemplares adultos de jwrelheiras (Pliilodryas, sp.) sendo 24 fémeas e 6 machos,
recém-chegados a êste Instituto c cm condiqiles ajarentes de Ijoa saúde. Empre-
guei essas colubrideas não peçonhentas, ao invés das crotalideas. uão só jK‘Ia maior
facilidade de manejo mas. sobretudo, porque aquelas possuem adrenais mais cur-
tas e menos afi’adas e jior isso mais facilmente extirpáveis.

MÉTODO OPERATÓRIO

.-\ anestesia é feita com éter, primeiro colocando o aninul num recipiente de
vidro contendo algodão prèviamente cmliebido no anestésico que depois, no dccur.NO
da intervenção, é ministrado por meio de uma jtequena máscara afunilada de
folha de Flandres. Uma vez sob narcose a scrjicnte é distendida numa placa de
cortiça e o nivcl das duas incisões látero-ventrais, uma superior jxira a adrenal

cm

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238

Memórías do Instituto Butantan

Tomo XYHI

direita e a outra inferior para a adrenal esquerda, estabelecido graças à contagem
das placas ventrais a partir da cloaca. (*)

Fotografias dc uma Parclbcira {Pkylodry^ sp.) fémea.

A. Projeto cutânea das adreoais pela contagem das placas a partir da cloaca. A adrenal es*
querda corresponde â xona delimitada pelas 35.* e 39.* e a direiU pelas 55.* e 59.* placas
ventrais. (Nos machos a adrenal direita fica mais distai, ao nível da 45.* placa ventral).

B. Incisões ventrais para mostrar a localização glandular.

Aspecto das saturas Utero>ventrais depois de terminada a adrenalectomia (vista dorsal).

Nos machos e nas fêmeas a projeção da adrenal esquerda corresponde à
superficie cutânea delimitada pelas 35a. e 39a. placas ventrais, em geral ao nivel
da 37a. placa; a adrenal direita corresponde ao nivel da 45a. para os machos e
da 58a. placa ventral para as fêmeas. (Fig. 1 A).

(*) Êste processo de localização visceral nos ofidios pela contagem das placas '\-en-
trais e que não vi ainda descrito, deu bom resultado também na pancreatectomia dc jararacas.

2

José Ribeiro do Valle

Sobrevida da Parelheira {Philodryas, sp) de-
pois da adrenalectomia.

239

A assepsia é relativa. Incisão látero-ventral obliqua acompanhando a direção
das costelas e separação das fibras musculares até a cavidade geral. A adrenal é
identificável como um órgão esbranquiçado, alongado e próximo à gonada (^'ig.
1 B). Exteriorizados a glândula, os s-asos e tecidos adjacentes, isola-se com
cuidado o órgão, ligam-se os pediculos anterior e posterior e suturam-se os ramús-
culos venosos transversais que deixam a glândula para desembocarem ou na veia
cava caudal (adrehal direita) ou na mesma veia cava ou na veia aferente renal
(adrenal esquerda) (4).

Em alguns exemplares, as veias adrenais eferentes são curtas e, então, o
órgão se apresenta muito acolado ao tronco venoso. Nestas condições, o isola-
mento e a extirpação glandulares, sem hemorragia, são bastante dificultados. De
qualquer modo a veia cava e a veia eferente renal precisam ser poupadas. Os 2
ou 3 filetes arteriais, que irrigam a adrenal provenientes da aorta, ficam livres
nas suas ramificações no processo de descolamento do tecido conjuntivo, não exi-
gindo, por isso, ligadura particular. Rc{X)stos os ói^ãos na cavidade geral, faz-se
a sutura com “cat-gut” do plano muscular e da pele (Fig. 1 C). Si a operação
decorrer bem. as condições do animal no dia seguinte são satisfatórias.

.■\ntes e depois da operação as parelheiras são mantidas em gaiolas teladas
com vasilha de água e alguns camundongos para eventual alimentação espontânea.

Seguindo o método que ficou descrito foi feita a adrenalectomia unilateral
em 12 e a bilateral em 18 parelheiras (•) como base para o estudo preliminar do
assunto.

RESULTADOS

Nestas experiências cuidei apenas da questão técnica e da sobrevida dos
animais operados, deixando para estudos ulteriores o problema do metabolismo
do sódio e do potássio e a influência do tratamento pelo homtônio cortical.

Das 12 parelheiras adrenoprivas unilaterais, 5 sobreviveram mais de 20 dias
e nas outras 7 a sobrevida média foi de 7 dias. Nas 18 parelheiras adrenopris^as
totais, apenas 2 sobreviveram mais de 20 dias, respectivamente 32 e 45 dias, mas
cm ambas a autópsia mostrou restos glandulares suspeitos no local da operação.
A sobrevida média das restantes foi também de 7 dias.

No grupo de adrenalectomizadas unilateralmente a maior sobre\nda observada
foi de 80 dias, sendo a mortalidade de dentro dos 12 primeiros dias depois
da interx-enção. No grupo de adrenopriras bilaterais a mortalidade em igual
período foi de 835*^. Si forem excluidas deste último grupo as duas parelheiras
nas quais eu observei, à autópsia, restos glandulares no local da operação, então
a mortalidade dentro dos 12 primeiros dias sobe a 94 Dentro de 20 dias seria
de 100%.

(•) Agradeço ao meu antigo auxiliar Francisco Ribeiro Gomes a valiosa ajuda técnica
prestada no decorrer dèste trabalho.

cm

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240

Memórias do Instiluto Butantan

Tomo XVIII

Diante dos resultados observados e à semelhança do que ocorre nos outros
vertebrados, a adrenal dos ofídios é também indispensável à vida. O período de
sobrevida das parelheiras adrenoprivas bilaterais parece em tôrno de 12 dias.
Outras experiências, no entanto, se fazem necessárias para conclusão definitis-a
e melhor análise da questão abordada nesta nota. De qualquer modo. quanto ao
tempo de sobrevida após a ablação das adrenais, os ofidios pertencem antes ao
grupo dos mamíferos e anfíbios, com sobrevida de alguns dias, do que ao grupo
das aves com sobrevida apenas de algumas horas.

RESUMO

Nesta nota é descrito um método de adrenalectomia dos ofidios e registrado
o periodo de sobre^da de 30 exemplares adultos de Philodryas sp. sendo 12
operados unilateralmente e 18 adrenoprivos bilaterais. A mortalidade dentro dos
12 primeiros dias depois da operação foi de para o primeiro e de 83% para
o segundo lote. Os ofidios. quanto ao tempo de sobrevida depois da ablação das
adrenais, pertencem pois ao grupo dos mamíferos e dos anfíbios e não ao grupo
das aves.

ABSTRACT

»

A method of adrenalectomy in snakes, after localization of the glands by
counting the ventral scales, is described and the sur\-ival time of 30 adult Philo-
dryas sp.. 12 unilaterally and 18 bilaterally operatcd, was obser\'ed.

The mortality in the control group was 58% within the first 12 days following
the operation. .^fter total adrenalectomy and within the same period, the mortality
was 83%. Excluding 2 animais on account of fragments of adrenal tissue at the
site of the operation, 100% of the bilaterally adrenalectomized snakes died within
20 days.

Ophidia belong therefore, as far as the survival time after adrenalectomy is
concemed, not to birds but to mammalia and amphibia groups.

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(Recebido para pabHca<Ío em 20 de janeiro de 194f).

4

NOTA SÔBRE A HEMATOLOGIA DOS OFÍDIOS
ÍNDICES DE WINTROBE DA BOTHROPS JARARACA

POR

J. R. VALLE & J, LEAL PRADO

(^Do Laboratório dc Endocrinologia do Instituto Butanton, São Paulo, Brasil)

Em 1934, WiXTROBE (1) determinou as ^ariaçõe5 de tanunho e o teor de
hemoglobina dos eritrocitos de vários vertebrados partindo do número de glóbulos
vermelhos por mm^ de sangue, da taxa de hemoglobina em gramas por cento e
da relação percentual plasmo-globular. Os valores, hoje conhecidos por indices
de WiNTRCBE, expressam; 1.®) o volume médio da hematia em micra cúbicas
chamado volume corpuscular médio (V.C.M.) ; 2.®) o teor de hemoglobina do
eritrocito em micromicrogramas, ou hemoglobina corpuscular média (H.C.M.) e
3.®) a concentração média percentual de hemoglobina em cada glóbulo vermelho
ou cencentração média de hemoglobina corpuscular (C.M.H.C.).

Dentre os ofidios. examinou aquele autor o sangue de 2 Helcrodoti contortrix,
2 Eulanio sirlalis e 1 Xatrix sipedon, encontrando de 500 a 1390 mil hematias por
mm^, 3.7 a 11.3 g % de hemoglobina, 13.3 a 37 ^ para a relação percentual
plasmoglobular, 266 a 465 u* para o V.C.M., 74 a 131 mcromicrogramas jxira
o teor de hemoglobina corpuscular c. finalmente, 28 a 31% para a concentração
média de hemoglobina no glóbulo, sem a correção devida ao volume ocupado pelo
núcleo.

Xo decurso de experiências usando serpentes colubrídeas e crotalideas como
material de estudo, tivemos ocasião de dosar a hemoglobina no sangue da jararaca
e aproveitamos, então, a oportunidade para calcular aqueles indices e verificar si
nestes vertebrados os valores encontrados apresentavam diferenças ligadas ao
sexo.

M.-\TERIAL lE MÉTODOS

Elmpregamos 26 exemplares adultos de Bothrops jararaca, 12 machos e 14
fêmeas, em condições de saúde aparentemente boas e recém-chegados ao serpen-
tário do Instituto. Dentro dos primeiros 10 dias de permanência no Laboratório
colhia-se o sangue por punção da aorta, acessível depois de incisão \*entra1 na

cm

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242

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVni

união do terço médio com o terço posterior do animal. Xão se empregou anes-
tesia; a serpente era fixada com os devidos cuidados, distendida numa prancha
de cortiça, e, depois da colheita, sacrificada por decapitação. O \’aso era alçado
por meio de um fio de linha e a agulha introduzida contra a corrente sanguínea.
G)lhiam-se de 2 a 3 cm^ de sangue, que eram transportados imediatamente para
um tubo de vidro contendo oxalato de potássio na diluição final, após conveniente
agitação, de 0.2 g *jc.

Todos os exames foram feitos dentro dos tempos recomendados por
OsGOOD, Haskixs * Trotm.an (2).

a) Hematócríto. Utilizamos segmentos de 10 cm de pipetas usadas de
0.1 ml. .Aspira-se o sangue bem misturado até á altura aproximada de 7 cm e
fecha-se o aparelho com uma laçada de borracha flexível que obtura simulta-
neamente as duas extremidades. Depois de 45 minutos de centrifugação a 2500
r.p.m., a leitura é feita contra papel milimetrado e o resultado expresso em volume
globular por cento.

b) Hemoglobina. A determinação de hemoglobina foi feita a partir da
dosagem do ferro total em 1 ml de sangue pelo processo de Pokder (3) ligeira-
mente modificado.

c) Contagem dos critrocitos. Foi feita a contagem em câmara de Buehkek
com o sangue diluido a 1/200 ou 1/100 em solução de cloreto de sódio a 0.6

.\ contagem era direta ou indireta em cópia microfotográfica do retículo, seguin-
do-se para i.sto. em linhas gerais, o processo descrito por Lid.k * Gcc.berg (4).

d) Volume corpuscular medio. Conhecidos o número de eritrocitos por
mm^ e a relação plasmo-globular é fácil calcular o volume eritrocítico médio.

e) Hemoglobina corpuscular média. O teor de hemoglobina em gramas por
cento e o número de glóbulos vermelhos no mesmo volume de sangue são os dados
para se calcular o teor médio de hemoglobina corpuscular.

f) Concentração tnédia percentual de hemoglobina corpuscular. É encon-
trada multiplicando por 100 o teor de hemoglobina em gramas por cento e
dividindo o produto pela relação plasmo-globular.

O grau de dispersão dos ralorcs cm tôrno da média e o érro padrão foram
calculados por meio das conhecidas fórmulas c r= \'-dVn-i e E = "/VouT

RESULT.ADOS

Os resultados obtidos vém sumariados na Tabela I e referidos conforme o
sexo dos exemplares examinados. Xa última coluna horizontal figuram os valores
médios gerais e o grau de dispersão de cada lun. A média geral para a relação

2

244

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

plasmo-globular foi de 24^o com um desvio de ^ 4.6^c. O teor de hemoglobina
variou de 5.2 a 12.1 gramas sendo a média e o desvio de 7.9 — 1.7 g O
número de glóbulos vermelhos nos dois sexos variou de 315 a 825 mil, sendo a
média e o desvio de 566 zíz 128 mil eritrocitos por mm^ de sangue.

Os valores para os indices de Wixtrobe foram : volume corpuscular médio,
de 311 a 635 p*, média 449 i 86 u®; hemoglobina corpuscular média, de 112 a
225 yy. média 141 ^ 25vy; e concentração média de hemoglobina corpuscular de
26 a 39^, média 32 i 3 . 3 ^.

COMENTÁRIOS

Para facilidade de comparação damos na Tabela II as médias dos valores
encontrados por Wixtrobe nos 5 exemplares de ofidios que estudou e aquelas
que obtivemos nas 26 jararacas examinadas.

TABELA 2

GHCPOS

Hematr^

frito

Hemogto*

bina

K •#

Gl. vermelho*
(milhares f por
mm^

V.C.M.

H.C.M.

XV

C .M.H.C.*

*.

Valores médios se-
gundo os dados de
Winlrobe

25.8

7.7

800

330

98

30

Valores médios en-
contrados para a
Dothrops jararaca

24.0

7.9

566

449

141

32

* Sem « correrão drviUa ao volume do núcleo.

As médias que mais se afastam são as relativas ao número de glóbulos ver-
melhos, ao volume corpuscular médio e á hemoglobina corpuscular média ; as duas
últimas, conseqüentes da primeira. Em experiências anteriores. Leal Prado e
Miller de Paiva (5) fizeram contagens de eritrocitos no sangue de 25 jararacas
e de 10 parelheiras (Philodryas sp.) encontrando os extremos de 240 e 965 e a
média de 516 mil glóbulos vermelhos por mm*, com um desvio padrão de 188 mil.
Embora examinando exemplares de duas famílias distintas — crotalideas e colu-
brideas — a média referida é mais próxima da encontrada no presente estudo do
que da calculada a partir dos dados de Wi.xtrobe.

A dosagem de hemoglobina feita de maneira sistemática, ao que nos consta,
pela primeira vez nestes vertebrados, dado o interesse das observações registradas,
constituirá trabalho a parte de um de nós.

4

J. R. Valle & J. Leal Prado — índices de Wintrobe da Bolhrops ja-
raraca.

•J45

Quanto à diferença das médias conforme o sexo vemos na Tabela I que ela
é apreciável sómente em relação ao pêso dos animais. A média ponderai dos
machos é bem inferior á registrada para as fémeas e a aplicação da conhecida
fórmula m-mW* E- -f- E’- deu o resultado 3.4 que mostrou ser a diferença
estatisticamente significatiA-a. O mesmo não acontece, porém, com os demais
elementos da tabela. Em outras palavras, os valores e os indices registrados
não são significativamente diferentes conforme o sexo dos animais e.xaminados.

Mensurações preliminares, pelo processo da ocular micrométrica, em esfre-
gaços corados pelo Leishman, de sangue de jararacas e parelheiras, deram para
as hematias elípticas e nucleadas destes ofídios, as médias de 20 e 11 p respecti-
A^amente para o maior e o menor diâmetros. A superfície de uma face do glóbulo,
admitindo-se com Wintrobe que o eritrocito seja um pequeno cilindro, será de
l72\i-2 e a espessura, dividindo o volume corpuscular médio de 449 p® pela sui^er-
fície, de 2.6 p.

Medindo o maior e o menor diâmetros do núcleo, considerada a sua espes-
sura igual á do glóbulo, poude Wintrobe determinar o volume nuclear e deduzi-lo
do volume globular, para então calcular a verdadeira concentração média de
hemoglobina corpuscular. Si empregarmos a correção média de 5^, usada
por Wintrobe nos ofídios que examinou, teremos para a C.M.H.C. na jararaca o
A^alor de 37%. Como ficou bem assinalado pelo autor norte-americano, embora
os A-alores e os indices hematológicos A-ariem muito entre os vertebrados, a concen-
tração média de hemoglobina corpuscular é muito constante desde Cycloslomata
até MaminaUa, inclusÍAe na sub-ordem Of'liidia estudada no presente trabalho
com maior casuística.

É claro que os A-alores numéricos mencionados têm mero caráter aproximativo,
representando, no entanto, os primeiros dados jiara o estudo da hematologia,
inclusive das propriedades da hemoglobina, e a compreensão da fisiologia da res-
piração em tão importante grupo zoológico.

RESUMO

O sangue da Bolhrops jararaca, examinado em 26 exemplares adultos, 12 á e
14 9 , contém, em média, 566 mil hematias por mm® e 7.9 gramas de hemoglobina
por cento. O volume globular em relação ao plasmático é de 24%. O volume
médio de um eritrocito, a hemoglobina corpuscular média e a concentração média
de hemoglobina corpuscular são. respectÍA-amente, 449 micra cúbicas, 141 micro-
microgramas e 32%.

Não se r^strou diferença estatisticamente significatÍA-a nestes A-alores, con-
forme o sexo dos animais examinados.

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

246

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

ABSTIL\CT

Hematological data of Bothrops jararaca

The blood of 26 B. jararaca, 12 males and 14 females, was examined. Red
blood cells counts, hemoglobin concentration and hematocrit values were deter-
mined and from these data, according to Wintrobe, the mean corpuscular volume
(C.V.) in cubic microns, the mean corpuscular hemoglobin (C.H.) in micromi-
crograms and the mean corpuscular hemoglobin concentration (C.C.) in percent,
were calculated.

The results are summarized in the table below, where the mean and the
Standard denation are given.

Groops

Average
bodjr wci^t

ff

llerootocrít

%

Hemoglo-

Irin

ff %

R.B.C

tbousand ^
mtn*

C.V.

u’

C.H.

YY

C.C. (•)

%

12 '

■' 145 ±'43

25 ± 4.6

8.1 ± 1.9

606 ± 155

434 ± 91

135 ± 22

31 ± 3.5

14 9

265 ± 120

24 ± 4.5

7.7 ± 1.4

530 ± 88

460 ± 75

145 ± 28

31 ± 3.2

26 c'?

209 ± 116

24 ± 4.6

7.9 ± 1.7

566 ± 128

449 ± 86

141 ± 25

32 ± 3.3

(*) Witbouth nudear correctioo.

Although a statistical significant difference has been obser\-ed for the body
weight depending on the sex, there is not such a correlation in regard to the
hematological data here prcsented.

BIBLIOGRAFIA

1. trintrobe, J/. M, (1934). Variations in súc and hemoglobin content oi erythrocj-tes

in the blood of «rious vertebrates. Folia haematol^ 51, 32-50.

2. Osgood, E. E., Haskins, H. D. & Troltnan, F. E. (1931). Uniform System of hema-

tologic methods for use with oxalated venous blood. J. Lab. clin. Mtd., 16. 476-
481.

3. Ponder, E. (1SM2). Relation between red blood cell density and corpuscular hemoglobin

concentration. /. biol. Chem„ 144, 333-338.

4. Lida, E. & Goldberg, /. (1940). Recuento de eritrocitos por la fotomicrografia. Ret’.

Soc. Arg. Biol., 16, S23-S27.

5. Leal Prado & Miller de Pakv. (1944). Xota sõbre a hematologia dos ofídios. Com.

à Soc. Biol. de S. Paulo, sessão de 8 de maio.

(Kecebtdo para publicação cm 14 de outubro de 1944).

c

A NOTE ON THE ADRENIN CONTENT OF THE
ADRENALS OF SNAKES

J. R. VALLE & A. PORTO

(Defartment of Endocrinology of Instituto Butantan)

Preliminarj' studies have been reported on the morphologj- ot the adrenals
of (1) as well as on the survival period after adrenalectomy in the reptilia (2).

This note deals with the approximate adrenin content of the same organs
of the Bothrops jararaca, as determined biologically.

METHODS

\

1) Prcparalion of Extracts: Immediately after decapitation of 10 to 13
healthy, adults, weighing from 160 to 340 g, the adrenals were remo-
ved, cleaned from connecting tissue and weighed on a torsion balance. Appro.xi-
matelly 1 g of fresh glands are so secured. The, in a mortar ground glands,
are then cxtracted w-ith 0.1 N HCl (1 ml/100 mg of glands) and filtered. The
filtrate neutralized with 10% sodium acetate to congo red indicator. Heatcd
for 5 minutes and filtered hot. The filtrate may be adjusted by dilution with
distilled water to a 1% solution, i.e., the equi\-alcnt extract of 10 mg per ml.
Control extracts of ovaries and liver of the same snakes were prejiared essentially
by the same known method of Folin et al. (3).

Concentrated and diluted extracts have been used for the assay.

2) Biological assay: The pressor activity of the extracts was assayed in
dogs with complete abolition of all central nervous functions. This is obtained
aceording to the method of G.^LVÃo and Pekeira (4) by injecting in the “cisterna
magna”, under 50 cm Hg pressure, a 20% sodium chloride solution. Artificial
respiration and hcating are used. The carotid artery is connectcd by rubber
tubing to a Hg manometer and the extracts injected into the femoral vein.

The action of the extracts upon the smooth musculature "in vitro” was
studied with duodenal strips and uterine horns of adult rats. The smooth mus-
cles were immersed in 50 ml of oxygenated Ringer-Locke solution, at 38°C. and
their longitudinal contractions registered in the usual manner.

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

248

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

In both instances, for the pressor activity in dogs and the inhibitory eftect
in rats, we tested also a known solution of adrenaline (*) as a basis tor the
approximate quantitative bio-assay of the mentioned extracts.

RESULTS

The diluted extracts of the ophidian adrenals, injected intravenousiy, rose
the blood pressure of dogs in all the experiments performed. The intensity and
the duration of the effect were proportional to the amount administered (Fig. 1,
A and C). In one instance the increase of the carotidean pressure, following
the injection of 1 ml = 2 mg of adrenals, ^\•as as high as that induced by a dosis
of 5 y of adrenaline (Fig. 1, C and E). This means, therefore, a hormonal
concentration of 2.5 mg of adrenaline per gram of fresh tissue. However, in
another test, a low concentration of 0.5 mg/g tvas obtained. Xone reaction
followed the administration of the control extracts (see Fig. 1, B).

An e.\ample of the inhibitorj- action of the extracts of adrenals of snakes ujwn
the intestinal and uterine contractions is shown in fig. 2. A and B. A dosis of 0.5
ml = 10 mg of an adrenal e.xtract causes a fali of the duodcnal tonus as strong
as that of 50 y of adrenaline (Fig. 2, A.). This is equis-alent concentration
of 5 mg of adrenaline per gram of adrenal gland. We prefer, however, as more
reliable, the approximate content determined by the dog method.

Studies conceming the adrenin content of adrenals of mammals have been
summarized by Bomskov (5). The average vallues reported are from 0.2 to 4.2
mg of adrenin per gram of adrenal tissue. As the \-alues above mentioned for the
ophidian adrenals varied from 0.5 to 2.5 mg/g. it seems that the approximate
adrenin concentration in adrenals of snakes can be compared with those data for
mammals.

CONXLUSIOX

Extracts of adrenals of Bothrops jararaca increased the blood pressure of
dogs with complete abolition of the central nervous activities and inhibited the
spontaneous contractions “in \-itro” of duodenal and uterine strips of rats. These
Peripherie actions, analogous to those observed after a known adrenaline solution,
were not obtained with control extracts of ovaries and liver of the same donors.

The approximate adrenin content of the adrenals of those ophidia was found
to be 0.5 to 2.5 mg/g. This adrenin concentration in snake’s adrenals does not
seem to be inferior to the known values for the same organs of mammals.

(•) Adrenaline hydrochloride. Parke Davis & Co.

2

J

J. R. Valle i A. Porto — A note on the adrenin conlenl of lhe adrc-

nals of snakcs. 249

Fic. 1

Do|r. 18 Vk. Complete abolítion of the central nervou» activities folknrinj; the císternal
injectton of 20% sodium chloríde under 50 cra Hk (Time intenrait 30*).

A. 1 ml = I mg of an adrenal extract of B. jararaca, effecttve.

B. 1 ml =: 1 mg of an orarian extract of B. jararaca, ioeffective.

C. 2 ml = 2 mg of the $ame adrenal extractf as in A.

D. and E. 3 y and 5 y adrenaline b^rochloride.

Note the comparable responses in A and D, C aml £.

RESUMO

Extratos de adrenais de jararacas adultas, de anilx)s os sexos e sacrificadas
por decapitação, elevam a pressão arterial do cão, com o sistema nervoso central
destruido conforme a técnica de Galvão e Pereira, e iniliem as contrações espon-

cm

SciELO

200

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVni

Fic. 2

l«ongttti<{inal spontancous contraction^ “in vitro" of duodcnum and uteruj» of an aduU
ra:. (Time intcr>*als 5**).

A. Inhihttion and fall of tonus of tbc duodenum followini; tbc additúm to thc nutrí*
ti\-e fath of 0.5 ml = 10 nifc, 1 ml =: 20 mg of an adrenal cxtract of B.

jararacc and of 50 y of adrcnaline bj-drochloridc.

B. Inbihition of tb« uteríne contractions with 0.5 ml = 10 mg of tbc Minc adrenal
cxtract a5 tn A.

tâücas, “iii vitro", cio duodeno e do útero do rato. Estes efeitos periféricos, não
observados coni extratos testemunhas de ovário ou de figado dos mesmos doadores,
foram comi)arávcis aos obtidos (X)m uma solução de cloridrato de adrenalina.

O teor das adrenais dos ofidios cm adrenalina seria de 0.5 a 2.5 mg por grama
de glândula fresca. Esta concentração não parece, pois. inferior àquela referida
por diferentes autores para os mesmos órgãos de niamifcros.

KEFERENXES

1. Junqucha. L. C. (104-t). Xota sóbre a morfologia das adrenais cios ofidios. Rrz'.

liras, fíiohqia. 4. 63-67.

2. I allc, J. R. (1945). Sobrtvida da parelhtira (PItilodryas sp) depois da adrcnaltctomia.

Memórias do ínstDulo Butantan, in f>ress.

3. Fclin, O., Cannon, I! . B. & Denis. II. (1913). .-X ncw colorimctric metbod for tbc

dctcrniinatk n of crpincphrir.e. J. Biol. Chem., 13. 477-483.

•1. Gahvo, P. E. &■ Pereira. J. (1943). Estudo das condições para a compkla destruição de
tcxlo o sistema nervoso central nos mamiferos. .-Irq. Inst. Biolói/ico São Paulo,
13. 1-8.

í. Bomskov. C. (1939).

1, pp. 592-595.

Methodik der Hormonforschung. Geor>j Thieme, Lei^ziit.. Vol.

(Recrived for publication ín Januarr, 1915).

4

I

NOTAS SÔBRE ALGUMAS DIFERENÇAS SEXUAIS NA FOLIDOSE
DE BOTUROPS ALTERXATA D. & B.. 1854. E SUA VARIAÇÃO

GEOGRÁFICA. (*)

POR

P. E. VAXZOLIXI e J. H. FERREIRA BRAXDAO

(Do Laboratório d{ Parastlología do Instituto Butantan, São Paulo, Brasil)

Representam estas notas os primeiros resultados obtidos no decurso de pes-
quisas sôbre as variações da folidose na Unitú {B. alternata), visando estabelecer
de modo preciso esta face da questão do dimoríismo sexual, t)em como lançar
alguma luz sôbre a sua importância na solução do problema mais árduo da esjíecia-
ção.

Em cuidadosa revisão da espécie Bothrops alternata, dá .^mar.^l (1934)
grande ênfase às variações da folidose, contrapondo-as fortemente à diferenciação
geográfica, segundo se depreende dos seguintes trechos do seu trabalho (pg. 172) :

“A observação atenta dêsse Quadro I, jiarticularizada aos indivíduos de
cada sexo dentro da mesma distribuição geográfica, dá margem às seguintes indi-
cações :

Ia. as v-ariações da folidose são mais acentuadas entre os indivíduos de sexo
oposto na mesma localidade do que entre os do mesmo sexo em localidades di-
versas ;

2a. não existe, por conseguinte, relação, pelo menos aparente, entre a dis-
tribuição geográfica e as \-ariações da folidose nos exemplares, do mesmo sexo,
de Bothrops alternata.”

E mais adiante:

(•) Desejamos consignar aqui os nossos agradecimentos ao Prof. Fl.svio d.k Foxsec.v,
chefe da Seqão de Parasitoiogia do Instituto Butantan, onde foi realizado o presente tra-
balho; ao Dr. Afranio do Amaral, pelo auxilio de sua valiosa experiência e cessão de dados
bibliográficos; ao Dr. Clemente Pereira, do Instituto Biológico, a quem devemos inestimá-
vel orienucão, apóio e encorajamento e, finalraente, ao Prof. Otto Btra, atual Diretor do
Instituto Butantan, pelas facilidades de trabalho e estimulo que nos proporcionoa

1

V

Tabela 1
Dorsais

Am.

O 0

O O

d

t

P

c-‘

P

M

n'

M

s"

n*

p

29.rj97 ± 0.SL5

1.403

33

r^.za i 0.217

14S7

27

I.4T5

4.72S

0.101

-

-

aP

:9.4Õ0 ± (UTl

ijsn

10

29,429 ± 0 j70

2495

7

0471

1597

05

1.65S

0.05

Pl’

ISjTI ± 025 «

0.905

14

26j38 ± 0420

0.629

12

2,033

5.792

0.001

-

-

MG

SI.»»* ± o;m3

1.424

12

2S2100 ± OJOO

1500

6

3,167

4.964

0,001

-

-

C

32,100 ± 05:s

2.7f6

10

3a7ãO i 0.7Õ4

4.S44

8

1550

1564

05

1631

0,05

oRG

S3J0S ± 0J46

1.SC4

13

29.167 ± 0,749

3567

6

4.141

5.434

0501

5153

0.05

Tabela 2
{‘'entrais

Am.

. O

o

d

t

P

P

■M

s.*

n*

•M

n*

p

174.121 ± 0569

10.666

33

168,779 - 0566

11.949

27

5543

5.037

0501

-

-

aP

173.000 ± 055

10,711

10

169.714 ± 1.123

9.906

7

5596

3,192

0.01

-

-

PP

179.714 ±0444

114*4

14

174546 ± O.SSS

10,474

13

4,969

3595

0.001

-

-

MG

174.667 ± 0.932

10.424

12

175537 ±1500

15567

6

07«)

0532

0.7

1.474

0.05

C

172500 ± 1.2M

16500

10

169575 ± 1.031

8551

9

4.125

2.27Ò

054

1,929

055

<>RG

17S565 ± l.OSj

13 929

13

171.'9)0 ± l.l."»

12.490

6

7595

4.0*2

0.001

-

-

Tabela 3

Sub-caudais

.\m*

X V

cT d*

d

‘

p

P

■M

n

n'

M

»•

n'

p

36519 ± 0526

32

43.615 ± 0.109

3.126

26

7596

11.155

0,001

2,937

051

aP

.16.444 ± 1,042

9.77S

9

415*6 ± 0,695

3539

7

7.942

5534

aooi

3.020

0.06

Pl’

39.643 ± 0.693

6555

14

47,946 ± 0.517

3,474

13

8.203

9.004

aooi

1.997

0,05

MG

35500 ± 0.605

4596

12

44,150 ± 0,596

4.400

6

8,730

7«955

aooi

-

-

C

38533 ±0.726

4.750

9

44575 ± 0532

2568

6

a043

9515

0,001

2.094

056

oRG

38508 ± 0581

4397

13

44533 ± 1539

7,767

6

6525

5^

0,001 1 1.766

0.06

P. E. Vanzolini i J. H. Ferreira Brandão -

Diferenças seuxais na folitluse
de Bolhrops allentuta.

253

“O exame conjunto dêsse Quadro II com o Quadro I fornece mais estas
indicações :

la. as escamas dorsais rariam de 27 a 31 (excepcionalmente 32 ou 33) nos
5 6 e de 29 a 33 (e.xcepciona!mente 27 a 35) nas 9 5 ;

2a. os escudos ventrais variam de 165 a 177 (excepcionalmente 161 a 183)
nos á <5 e de 170 a 183 (excepcionalmente 164 a 185) nas 9 9 ;

3a. os pares de escudos subcaudais \-ariam de 40 a 49 (excepcionalmente 38
a 50) nos 5 á e de 33 a 40 (excepcionalmente 31a 44) nas 9 9 .”

Desde que a análise estatistica desses mesmos dados de .■Kmaral, feita à
luz da Nova Sistemática, nos le\'ara a conclusões um tanto diversas, inclinando-
nos a dar grande pêso à variação geográfica, resolvemos encarar êste problema
do dimorfismo sexual na folidose de B. aitcrmta dentro de amostras o mais
homogêneas possivel, afastando assim, em nossa análise, a influência da diferen-
ciação geográfica.

il.^TERI.AL E MÉTODOS

Utilizamos os dados publicados por .Amaral (e que julgamos desnecessário
rever), completados tanto quanto possivel por observações próprias. O material
foi distribuido em amostras, seguindo um critério que teremos ocasião de discutir,
com mais pormenores, em trabalho futuro. Por enquanto diremos que. depois
de reunidos os exemplares segundo as características biogeográ ficas da sua região
de origem (isto é, considerando além da proximidade geográfica, a semelhança
de aspectos ecológicos) verificamos a propriedade dêsse agrupamento, tendo como
base de comparação uma série de e.xemplarcs (amostra aP) de proveniência única
(.Araucaria, Est. do Paraná).

Consideramos, no presente tralialho, apenas aquelas amostras que nos parecem
indubitavelmente homogêneas à luz dos nossos resultados atuais. Constam elas
de um total de 142 exemplares, assim distribuídos.

Amostra P — 33 fêmeas e 27 machos provenientes da zona leste do
Estado do Paraná (.Araucaria, lialsa Nora, Campo Largo,
Caraml)ei. Curitilia, lEntre Rios. Fernandes Pinheiro,
I.apa, Palmeira, Ponte Grossa, Porto .Amazonas, Rio da
Várzea. São José do Pinhais).

Amostra aP — 10 fêmeas e 7 machos de .Araucária, Est. do Paraná (con-
siderados também na amostra anterior).

Amostra pP — Uma ninhada de 27 filhotes (13 machos e 14 fêmeas)
de Palmeira. Est. do Paraná, não incluidos na amostra P.

Amostra MG — 12 fêmeas e 6 machos do sul do Est. de Minas Gerais —
(.Alfenas, Campanha. Carmo da Cachoeira, Caxambu,
Fama. I^mliari, Nogueira. Três Pontas).

cm

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

254

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVHI

.-imostra C — 10 fêmeas e 8 machos provenientes de Americana, Araras,
Cordeiro, Cosmópolis, Desembargador Furtado, Enge-
nheiro Coelho, José Paulino, Leme, Martim Francisco,
Mogi Mirim. Remanso e Ressaca.

.■imostra oKG — 13 fêmeas e 6 machos da zona oeste do Est. do Rio Grande
do Sul — (Alegrete, Canabarro, Itaqui, João .Xrregui,
Rosário, Saican, São Simão, Tigre, Tupari e Uruguaiana).

O estudo conjunto das amostras P, aP e f<P, se revela muito interessante,
sobretudo no que diz respeito à variabilidade, pois inclui a amostra P, pertencente
a uma zona das mafs homogêneas fisiogeogràficamente a amostra aP contendo
exemplares de proveniência única e a amostra pP que se refere a uma ninhada
onde, por .sinal, a razão se.xual é de 1 :1.

Quanto aos métodos estatisticos empregados foram o test de t (Stiidcnt) para
diferenças entre médias de pequenas amostras e o test de r (por intermédio de
tábuas de e-**) para as comparações de varianças.

RESULTADOS

Os resultados obtidos estão consignados nas tabelas 1, 2 e 3 e nos corres-
pondentes gráficos. As tabelas não requerem maiores explicações : convém ape-
nas esclarecer que o valor de P não é o \-alor exato, mas o valor correspondente
ao t tabulado mais próximo ao obtido.

Nos gráficos, comparamos as amplitudes teóricas das distribuições (M 3s)
e os limites fiduciais da médias (M 3snj).

DISCUSS.^O

NP dc fileiras de escamas dorsais — Considerando inicialmente as amostras
P, pP, e aP, verificamos que. enquanto t atinge alto nivel de significação para as
duas primeiras, para a amostra aP apresenta um valor de 0,2, isto é, insignificante.
.A causa disso parece residir na variança muito elevada dos machos. Com
efeito, enquanto para as amostras P e pP temos e^ igiul respectiramente a 1,012
e 1.439, na antostra aP temos e-* igual a 1,658, sendo a variança dos machos a
maior. Veremos, na análise das ventrais, que. também aqui, t para esta amostra,
se bem que significante, é menor que nas duas outras. Com as subcaudais, nota-
mos a mesma coisa. Aliás, mesmo que isso se verificasse apenas com uma das
variáveis em questão, isso em nada diminuiria a importância do fato, pois as
correlações calculadas entre elas não são significativas.

4

P. E. Vanzolini & J. H. Ferkeir.\ Bb.\ndão — Diferenças sexuais na folidose

de Bolhrops allernala.

255

Uma hijjótese para explicar êste comportamento anormal da amostra aP é
a de que existam nela individuos provenientes da mesma ninhada. Comparando

Fic. 1 — Fitas de escamas dorsais. Comparação das amostras; para
cada uma estão indicados a média e os pontos ± 3 S e (±3 Sm) bem
como o número de exemplares.

Fic. 2 — Escudos s-entrais. Mesmos dados que a fig. 1.

as medias das amostras P e pP, vemos o forte afastamento entre elas, não obs-
tante a amostra pP ser composta de filhotes de uma cobra proveniente da região
P. Compreende-se assim que, numa amostra pequena, a existência de individuos

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256

Memórias do Instituto Butantan

Tomo XVIII

provenientes de uma mesma ninhada possa trazer distorções. Êste, contudo, é
ura ponto que só poderá ser elucidado com obsei^-ação de mais material.

Das outras amostras, a ilG e a oRG apresentam \-alores de t de alto nivel de
significação, notando-se de passagem que as suas médias de fêmeas são mais altas
que as das amostras anteriormente consideradas (Est. do Paraná) enquanto os
machos mantém valores próximos.

B. ALT ER NATA

SUB-CAUOAIS

I

1

1

••

1

í:

1

]

t í

i S i

» <5

ij * »

• •

C

.RG

Fic. 3 — Escudos sub-caudais. Mesmos dados que as figs. precedentes.

Já para a amostra C, t não se apresenta significante, em vista dos altos valores
apresentados pelos machos, os quais, além disto, possuem variança notavelmente
elevada. Este fato é de grande importância, mormente se considerarmos a posi-
ção geográfica da região. Com efeito, ela se situa entre o planalto paulista e
a Serra da Mantiqueira, que a separa da região MG. Por outro lado, se liga à
região centro-norte do Est. de S. Paulo, a cujo respeito, apesar do material rela-
tivamente alnmdante. não conseguimos ainda formar uma idéia sólida. Por outro
lado, esta amostra fica no caminho natural entre as regiões supracitadas e a
região centro-sul do Elst. de São Paulo, da qual a separa o \-ale do Rio Tieté.
Esta última região (centro-sul) se intergrada com o Estado do Paraná; dela,
porém, somente possuimos material escasso.

Xo. dc escudos i’enlrais — Xotamos altos valores de t para as amostras P,
aP e pP, valendo aqui o que observamos com relação ás dorsais. A amostra oRG
também apresenta \-alores significantes, e no mesmo sentido.

6

P. E. Yanzolixi i J. H. Ferbeira BR-andão — Diferenças seuxais na foliilose

de Bothrops altert}-:.U:.

257

Aqui de novo deparamos com um fato interessante relacionado com a amostra
C. A diferença entre médias de machos e fémeas se acha próxima do limiar de
significação; as fêmeas apresentam \-alores baixos e uma variança relath’amente
cleA-ada, se bem que, aqui como nas outras amostras, o pequeno número de obser-
\-ações prejudique bastante o test de comparação de varianças.

Finalmente, a amostra MG apresenta um valor baixissimo para t. Ora,
valores como se veem nesta amostra para machos e fémeas se veem também nas
outras. Mas, A-alores como ésses nos dois sexos foram encontrados apenas nesta
amostra. Além disto, os machos se apresentam com \-ariança maior, embora seu
pequeno número não permita conclusões sólidas.

.V." dc pares de escudos subcaudais — Todas as diferenças sexuais com refe-
rência às subcaudais são significantes ; / apresenta aqui Acalores clevadissimos.
Mas, além désse, outro aspecto interessantíssimo apresentam estas distribuições
a questão das A'arianças.

Para a amostra P as fémeas são significant emente mais Avariáveis. Para a
amostra aP, e^ se aproxima do nÍAel de significação. No entanto, se conside-
ramos que os A-alores de tais Aarianças, baseadas em poucos graus de lilierdade, não
diferem sensÍAelmente dos da amostra P, baseados em 31 c 25 graus de liberdade,
podemos considerar éste resultado da amostra aP como significatiA-o. Já com a
amostra pP não podemos dizer o mesmo; é necessário ter mais cautela. .*\ssim,
qualquer conclusão nesse sentido fkra dependendo de maior acúmulo de material.

.Y amostra MG não apresenta praticamente diferença nenhuma; mas a amostra
C apresenta uma diferença a faA’or das fémeas, e a oRG, a favor dos machos.
Êstes também são fatos que, por enquanto não permitem conclusões alguma, desde
que se baseiam em poucos indivíduos.

CONC1.USOF..S

1 . Bothrops alternata Duméril et Bibrox, 1854, apresenta marcado dimor-
fismo sexual no que diz respeito à folidose, especialmente nitido quanto ao nú-
mero de pares de escudos subcaudais, se bem que também significativo quanto aos
c.scudos A-entrais e fileiras de escamas dorsais [S] (vide as tabelas e os gráficos
para os dados exatos).

2. A diferenciação geográfica desempenha importantíssimo papel no esta
belecimento de tal dimorfismo sexual ; o estudo das particularidades déste é talvez
dc grande importância para a elucidação de problemas relatÍA-os à especiação.

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Impreêêo no ★

U P R B S A O R í r I a A DA
RBVISTA DOS TRIBUNAIS" LTDA.
■ir SSo Paulo ★

E. Biocca, J. P. do Amarvu & Otto G. Bieh — Estudos sõbre a quimio-
terapia da infecção meningocócica 43

Undoubtful protcction could be recorded only against few M. L. D.
(1 - 100) of microorganisms and the actis-ity in t-ivo has been found to be
grcater for the 4-4’-dianiinodiphenylsulfone than for the 4-nitro-4’-aminodi-
phenylsulfone derivativcs.

Among the most active drugs is the acjlic formyl derivative of 4-4’dia-
minodiphenylsulfone. The trichloracetyl deri\-ative of the same series presumahly
interesting in studies on the chemotherapy of tuberculosis, did aiso exhibit an
evident antimeningococcic s-alue.

Pyocj^anin proved ineffective, whereas penicillin, as already pointed out by
other investigators, showcd a remarkable antimeningococcic power.

•k.

Açradtcemos oo Prof. Q. ilingoja e ao Dr. F. Btrti, qut prepa-
raram as diferentes sulfomu experimentadas neste trabalho.

BIBLIOGRAFIA

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(Rcccb»4o para pobUca^ip cm t&aio de 1945).

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