MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN 1933 - 1934 TOMO VIII I São Paulo, Brasil Caixa Postal. 65 SciELO MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN 1933 - 1934 TOMO VIII I São Paulo, Brasil Caixa Postal. 65 ÍNDICE Pag. Noticiário * • ALCIDES PRADO — Contribuições ao conhecimento dos culicidcos de S. Paulo — — V. Synopse das espccics de Manaonia 1 J. LEMOS MONTEIRO — Vaccina contra o “typho exanthematico" de S. Paulo. Novas correlações entre esta infecção c a febre moculosa das Montanhas Rochosas ® J. LEMOS MONTEIRO — Comportamento experimental do viras do “typho exan- thenvatico” de S. Paulo após passagem peio carrapato (Amblyomma ca- jennenae) 21 J. LEMOS MONTEIRO — Comportamento experimental do coelho aos viras do “typho exanthcmatico" de S. Pnuln c da febre maeulosa das Montanhas Rochosas 2® J. LEMOS MONTEIRO e FLAVIO da FONSECA — Localização da RleketUla bra- silienaia nos ceUulas dos diverticuloa intestinaes do Amblyomma ca- •»< J. TRAVASSOS e J. LEMOS MONTEIRO — Contribuição ao estudo da rcacção de Weil-Fclix na infecção experimental pelos viras do “typho exanthcmatico” de S. Paulo e febre maeulosa das Montanhas Rochosas 57 R. GODINHO — Resistência de differentes germes pathogenicos experimcntohncntc associados ao s-irus vaccinioo 81 R. GODINHO e D. vos KLOÜl/SITZKY — Influencia do pll sohrc a actividade do viras vaccinico D. vox KLOBTSITZKY — l/m micm-mclhodn para pesquisa de \nrios saes de estrychnina 10® D. vox KLOBCSITZKY — Estudos physico-chimicos sobre proteínas cm presença de álcool. — I. Sobre a coagulação pelo calor das soro-proteinas em presença do álcool 111 R. GODINHO — Immunizaçâo com o riras voecinico cultivado na allantoide do embryão de galllnha • 1^1 ALCIDES PRADO — t/ma nova especie de escorpião do genero Bothriura» Pctcrs 145 AFRANIO do AMARAL — Notas sobre chromatisnto de ophidios. — III. l"m caso de xanthismo c um novo de albinismo, observados no Brasil 149 AFRANIO do AMARAL — Estudos sobre ophidios ncotnopicos. XXX. Novo genero e especie de Colubridco na fauna du Colombia . . 157 XXXI. Sobre a especie Bothrop» alternata D. A B, 1854 (Crotalidae). Va- riações. Redcscripção 181 AFRANIO do AMARAL — Collecta hcrpctologica no nordeste do Brasil .... 183 SciELO 6 17 J. LEMOS MONTEIRO — Contribuição ao estado das relações immunologicas entre o “typho cxanthcmatico” de São Paulo c demais febres cxanthematicas que occorrcm na America do Sul 195 J. LEMOS MONTEIRO — O “typho cxanthcmatico" de S. Paulo e suas relações com a febre maculosa das Montanhas Rochosas, á luz das provas de immu- nidade cruzada 207 J. LEMOS MONTEIRO e J. TRAVASSOS — A reocção de fixação do complemento na determinação de fooos e no diagnostico retrospectivo da febre amarella 221 J. TRAVASSOS — Estudo experimental sobre toxina estaphylococcica .... 233 THALES MARTINS — Estudos sobre gonadas e hypophyse. — I. Desenvolvimento precoce dos caracteres sexuacs cm gallinaceos tratados com substancias gonado-estimulantcs do soro gravidico equino .... 347 — II. Sobre os resultados da pa rabio se de rotos femeas com ratos castrados c hypophyseetomizados . 333 AVALDEMAR PECKOLT — Contribuições á matéria medica vegetal do Brasil. — I. Estudo phnrmaeognostico da Caeurbita maxima Duch e Cucurbita pepo L. (Cucurbitaceae) 357 — II. Estudo pharmacognostico de Struthanthus marginatus (Desr.) Blumc (Loranthacrae). Cm novo principio da planta 371 — III. Estudo pharmacognostico do Chondrodendron platyphyllum (St. Hil.) Mie rs (Menispermaceae) 379 Artigos de collaboração: CLODOMIRO PICADO — Serpentes \ cnenosas occorrcntcs em Costa Rica. — I. Sobre a cspccic Bothrops lansbcrgii e formas affins. Seu veneno c microomamentos epidérmicos 3S9 — II. Sobre a especie Bothrops godmanni. Seu veneno c microornamentos epi- dérmicos C. de MELLO LEITÃO — Tres aranhas novas nas collecçòcs do Instituto Butantan C. pé MELLO LEITÃO — Novas Gonyleptidae nos collecçõcs do Instituto Butantan NOTICIÁRIO Em virtude da grande crise financeira nitidamente acccntuada no primeiro semestre de 1933 como consequência da agitação política de 1932, que inter- rompeu o rhythmo das actividades de S. Paulo, não nos foi possível dar á pu- blicidade, no devido tempo, o presente numero das Memórias. Diversos origi- naes sobre trabalhos, realizados em nossos laboratorios e recebidos para publi- cação ainda no segundo semestre de 1933, ficaram ã espera do restabelecimen- to da marcha dos serviços de pesquisa e de producçáo do Instituto, de sorte que, só agora, vêm á luz, conjunctamente com outros cujo preparo se ultimou no de- curso do corrente anno. Com a melhora das nossas condições, que começou a fazer-se sentir no prin- cipio do exercício, poude o governo do Estado dar ao Instituto Butantan elemen- tos para a creação e instollaçáo de mais duas das secções technicas previstas no plano de reorganização apresentado em 1928. Essas duas secções são a de Bo- tânica Medica, destinada espccialmente ao estudo da matéria medica vegetal bra- sileira e ao preparo de drogas de consumo constante em nossas pharmacias, e a de Physio-pathologia Experimental, dedicada a investigações principalmente sobre Endocrinologia e ao preparo de princípios opotherapicos estalonados. Com a vinda de technicos experimentados para a chefia dessas duas secções, foi-nos possível dar immediato inicio a pesquisas especiaes e delles obter con- tribuições originaes para o presente numero das Memórias, no qual também fi- guram artigos de collaboraçáo de elementos estranhos ao Instituto, a demonstra- rem nosso proposito de approximação scientifica. Desses artigos, dois, escri- ptos pelo prof. C. de Mello Leitão, do nosso Museu Nacional, versam sohre no- vas formas de aranhas e opiliões encontradas nas collecçôes do Instituto, as quaes lhe foram remettidas para estudo; dois outros, preparados pelo dr. Clo- domiro Picado, dizem respeito a serpentes da Costa Bica, pais com cujos technicos temos mantido estreita collaboraçáo nestes últimos annos, desde que lã esteve, em visita de caracter scientifico, o actual director do Instituto Bu- tantan. Ao ser distribuído este volume c provável que já se tenha celebrado o con- tracto de outros especialistas para as novas secções de Chimica Experimental, de Pharmacologia Experimental e de Genetica e Cytologia, previstas na reor- ganização do Instituto e para cuja installação o actual governo de S. Paulo pro- nietteu dar os necessários elementos, zelando, assim, pelo nosso constante pro- gresso scientifico. Actualraente, o pessoal superior encarregado de serviços technicos do Insti- tuto Butantan é o seguinte: Director - superintendente — 1 Afranio do Amaral, B. Sc. & L., D. M., D. Hyg. (Med. Trop., Harvard), Editor das “Memórias do Instituto Butantan”. Assistentes chefes: (Chefes de departamentos) José B. Arastes, dipl. Phcia., D. M. J. Lemos Mosteiro, B. Sc. 4 L., D. M. S. Camargo Calazass, D. M. Diosysio vos Klobusitzky, D. M. Thales Martiss, D. M. Waldemar Peckolt, B. Sc. & L., dipl. Phcia. 4 Chim., D. M. Assistentes : ( Encarregados de laboratorios • Raul B. Godisho. D. M. Joaquim Travassos, B. Sc. 4 L., D. M. Cícero Neiva. B. Sc. Sí L., Med. Vet. Alcides Prado, B. Sc. 4 L., D. M. Flavio da Fonseca, D. M. A ^í*jltv4r> do inocii ação do viru* r 2- i % t » • * « ■ n u h n 105<3 0.5 cr U 12 í - ... //Ss ^ — 1030 l,cc 12 40 3* 1038 05« - 12 M 3* 3» v /v nn \ s\/\ ^ Ui 0|% 1040 U - 12 OI M fw u-cav 1044 ' - 12 « 34 31 _ r*H 1045 - 12 10 14 1081 V '» 'aí 5 14 Memórias do Instituto Butantan Tomo MII Valor protector da vaccina contra o “typho” de S. Paulo em relação á febre maculosa das .Montanhas Rochosas Em 28 - IV - 933 e 5-V-933 foram inoculadas 4 cobaias com a nossa vaccina: 2 com uma só dose de 1 cc. e 2 com duas doses de 0,5 cc. e 2 cc. ou 1 cc. e 2 cc.. Decorridos 18 dias após a ulti- ma inoculação, em 23 - V - 933, estas 4 cobaias, assim como 3 cobaias normaes, como testemu- nhas, foram inoculadas com o virus da febre maculosa das Mon- tanhas Rochosas, oriundo da co- baia N.° 1084. A dose do virus era representada por 2 cc. de uma emulsão, em 25 cc. de agua physio- logica, de 3 cc. de sangue desfi- brinado, metade de um testículo e um quarto de cerebro, convenien- temente emulsionados. Resultados (Quadro II) — Das 4 cobaias vaccinadas, 3 não apresentaram reacção febril du- rante 15 dias de observação e 1 morreu, por infecção intercorren- te, na noite do 4.° dia após a ino- culação, não se verificando, pela necropsia, augmento do baço. As 3 cobaias testemunhas inoculadas com o mesmo virus, no mesmo dia, apresentaram infecção cara- cteristica. O quadro II resume estes re- sultados. QUADRO-II mrumzAÇÃo de cosaiaS com vaccina preparada com antuonna ccjíhhíhsi ihfictacos com o vaus oe SRNAO. RFSU.IASO M PRCVA DElMMUNiOAOC f>1 RELAÇÃO AO VAUS PA FEBRE MACULOSA DAS MONTANHAS ROCHOSAS. N* i% C.W». D* 4 Vâ«( »•* k •* m — D.*> ResJtado da inoculação dovwuj y A* i i ) « m Moiimjiti) 1029 2cc 13 c 4C 32 3* A. nu 0* «n 1031 lcA 2c A 13 ♦O 3* 3 1 A Hnfc / \ _0«J* 1041 lec - 13 40 ** 3* IINM 1042 lec 13 40 J» - * ^ t isnccÂ* «Tintoonin 1092 TVstemunha m 54 31. MAC IXMU& + TTMC»5 / 1093 TViíWpuAiKa «i * 32 3» A AIM IV Wf*L E *U3«I3 Tir / 1094 Tc stcm„nhs 4l « 5» - 1 / c Monteiro — Yaccina contra o “T. exanthematico" dc S. Paulo 15 Valor protector da vaccina contra a febre maculosa das Montanhas Rochosas (vaccina de Parker) em relação ao “typho exanthematico” de S. Paulo (*) Em 13 -VII -933 foi inicia- da a vaccinação, com a vaccina de Parker, de 10 cobaias. Em 5 foi inoculado, nesse dia, por via sub-cutanea, uma dose de 1 cc. ; decorridos 12 dias, as 5 cobaias e 2 testemunhas foram inoculadas com o virus do "typho exanthe- matico de S. Paulo” (emulsão de cerebro da cobaia X.° 1173). As 5 vacei nadas e uma das testemunhas (X.° 1190) foram inoculadas com emulsão de cerebro e a outra tes- temunha, com sangue da mesma cobaia, 3 dias antes. As 5 restantes receberam, de- pois de 5 dias, em 18- VII -933, nova inoculação sub-cutanea de 2 cc. da mesma vaccina. Decorri- dos 16 dias, todas e 1 cobaia tes- temunha foram inoculadas com o '"ir us do ‘‘typho” de S. Paulo (emulsão de cerebro da cobaia X. # 1195); a outra testemunha (X.° 1203) foi inoculada, no mesmo dia, com sangue da que forneceu a emulsão de cerebro. Resultados com 1 dose da vac~ cina (Quadro III) — Das 5 co- baias vaccinadas com uma só dose da vaccina contra a febre maculo- sa c inoculadas, depois de 12 dias, com o virus de S. Paulo, 1 (X.° 1158) apresentou reacçào febril QliADftO III inriUNiM(Ão W CODAlAOi COM 1 DOM Df VAC ( IHA rui mKAOAcon P4 HnmêAtroH anMK-jO»n iNitrusos DO*TTPMO IAAMTM?”*DI t> PAui O. rr d» sOtâlA 4* Pu*. Rodado da inoc uIaÇao do vitwj, P ** o «t 1 I ) « ) t M 1 « n M || i) 1157 lec - 12 c ♦' / \ M J 1155 Icc - 12 ♦0 y* 1159 Ice - 12 «d 59 54 / \ 1*1 0* \_J X w o** 1160 1 cc - 12 *0 51 r*i o* \ ° e> * 1161 lec - 12 •0 31 /\ 9*** •• II&2 Testemunha di «0 a *«uc rxftou*. y x 1190 Testemunha «© isce» nrcAs (*) Deixamos aqui consignados os nossos maiores agradecimentos aos drs, R. R. Par- ker. dc Hamilton. McCoy e R. E. Dyer. de Washington (National Institute of Health), que nos forneceram diversas partidas da vaccina contra a febre maculosa. tornando possíveis as experiências descriptas, assim como a immunização de varias pessoas entre nós. / 16 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII de 40°0 durante 3 dias, resistindo á infecção; não apresentou reacção escrotal. parecendo ter sido pequena a immunidade conferida, que apenas protegeu da morte, a se julgar pelas duas testemunhas. Duas outras (X.“ 1157 e 1160), apresentaram uma curva thermica pouco nitida, não ultrapassando 39°5, porém acima da media normal dos animaes. As 2 restantes (X. M 1159 e 1161) apre- sentaram maior immunidade, não reagindo á inoculação. As 2 cobaias testemu- nhas apresentaram reacção característica, inclusive reacção escrotal em unta, mor- rendo ambas como consequência da inoculação do viras. O quadro III mostra os resultados desta ex- periencia. Resultados com 2 doses da zvc- ciua (Quadro IV) — As 5 cobaias vaccinadas com 2 doses da vacci- na de Parker e inoculadas, após 16 dias, com o viras de S. Paulo, nenhuma reacção apresentaram, não se lhes modificando a tempe- ratura da media normal, enquanto que as 2 testemunhas apresenta- ram reacção característica, mor- rendo ambas como consequência da infecção. O quadro IV mostra os re- sultados desta serie. Provas de immunidade cruzada entre os dois virus; novas experienclas Xo nosso citado trabalho an- terior (1) descrevémos os resul- tados de provas de immunização cruzada entre os virus de S. Paulo e da febre maculosa. Ve- rifica-se por clles que cobaias que resistiram á infecção pelo viras de S. Paulo, após terem tido reacção febril característica, não reagiam á inoculação do viras da febre ma- culosa. O facto ficou demonstra- — quadkoiv rfWfAÇÃO W CC6MI- cai 1 005» j DC \*TC»tA rtIFMjCA ron avinat wíciasos ccn o .»ir> unm rurjiosA >>ro«! *««(*tc»win rviiií-jwin-jUWXitArtju n mtuM (n niAÇÃO AOVIKU*. DOMlfHO UWOHrei íxtMHO. H» 4 • Dw> *• r> D.» Pc>olUdo mocuUfÃo do viru* V V ►*•» l< ' « 1 % 7 1 1162 lec 2cc 16 c 46 34 Jl *043* 1163 lec 2cc • 16 w 39 MIM o»v 1164 Ire 2cc 16 •c y> 34 fMIM 1165 Icc 2cc 16 31 M 1166 ler 2cc 16 ♦o 39 JS •r* *+ 1205 Testemunha 4« • . 39 38 4 '«M4* fJJU ■ ^ 1 MUUM Ui* 9 TTfOJ 1204 Tealer^unh a - •o 31 * t /V 8 Moxteibo — Vaccina contra o “ T. exanthrmatico” de S. Paulo 17 do com virus de S. Paulo proveniente originariamente de doentes e mantido por passagem em cobaias e com o mesmo virus, passado previamente pelo Ani- blyomma cajcnncnse e reisolado. Acrescentamos agora alguns resultados obtidos em sentido inverso, isto é, da reinoculação do nosso virus em cobaias que haviam resistido á infecção pelo virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas. Xesta nova serie de experiencias foram utilizadas 5 cobaias que haviam resistido á infecção pelo virus da febre maculo- sa das Montanhas Ro- chosas, sendo que 3 haviam tido reacção fe- bril mais ou menos ca- racterística. Decorri- dos 30 a 45 dias foram reinoculadas com o vi- rus do “typho” de S. Paulo, sendo emprega- da uma emulsão de cé- rebro de 2 cobaias in- fectadas com as 2 amostras que mante- mos em nosso labora- torio: virus L, da 140*. passagem (cobaia N* 1155) e virus W, da 64*, passagem (cobaia •N.° 1154). Como tes- temunhas foram ino- culadas 2 cobaias com as respectivas amostras do nosso virus. Resultados (Quadro V) — As 3 cobaias (N.« 1109, 1122 c 1127) que reagiram ao virus da febre macu- losa com reacção fe- bril mais ou menos ca- racterística, não apre- sentaram, após a ino- culação do virus de S. Paulo, reacção febril 0 18 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII ou outro signa! de infecção, mostrando-se immunizadas. Outra cobaia (X.® 1118) que teve ligeira a primeira infecção, sendo reinoculada, amanheceu morta no 6.° dia, talvez devido a infecção intercorrente. A 5.* cobaia que apresentou infecção ligeira (39®8) após a inoculação do vinis da febre maculosa, não se mostrou completamente immunizada quando reinoculada, após 30 dias, com o vinis de S. Paulo, tendo tido infecção ligeira a julgar pela intensidade da reac- ção febril, morrendo porem na noite do 8.® para o 9.® dia e apresentando baço augmentado de volume, exsudato peritoneal e presença de rickettsias nas cel- lulas mesotheliaes da parede peritoneal. As cobaias testemunhas (X.“ 1173 e 1174) apresentaram infecção cara- cterística com passagens positivas do vinis. Estes resultados são consignados no quadro V. DISCUSSÃO Dos resultados experimentaes expostos verifica-se, em confirmação aos dados anteriores, as intimas relações immunologicas existentes entre os vinis do “typho exanthematico” de S. Paulo e da febre maculosa das Montanhas Ro- chosas (typo “West”). A inimunidade que um virus confere relativamente ao outro depende cm muito do grau de intensidade da infecção anterior (experiencias do quadro V), o que não se observa, ou só occorre, em menor escala, em se tratando de reinfec- ção homologa. Alem disto, a immunidade activa provocada pelas vaccinas pre- paradas com os Ixodideos ( Dermacentor e / imblyomma ), se mostra mais ele- vada rclativamcntc á infecção pelo virus homologo, sendo conferida após uma só dose, embora pequena; ao passo que, nas mesmas condições, isto nem sem- pre acontece relativamentc ao virus heterologo (experiencias dos quadros I e III). !Estas pequenas “nuanccs” immunologicas talvez explicáveis por condições experimentaes inherentes ao grau de sensibilidade do animal e á actirídade dos virus ou á potência das vaccinas respectivas, não modificam, todavia, as con- clusões anteriores. Pelo contrario, os resultados experimentaes aqui expostos confirmam os já publicados por Parker c Davis (2, 4 c 5), Dyer (3) e por nós (1) c pelos quacs ficou bem estabelecido que, immunologicamcnte, os virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas e do “Typho exanthematico de S. Paulo”, são semelhantes ou, pelo menos se poderiam dizer muito proximos. Esta semelhança ou afíinidade no comportamento immunologico, por enquanto, não autoriza, de accordo com os conhecimentos actuaes sobre o assumpto, acre- dita-se que os dois virus sejam idênticos no sentido systematico, isto é, que se trata em ultima analyse, de um só virus. 10 Monteiro — Vaccina contra o “T. eianthematico" de S. Paulo 19 Discutimos já este assumpto (1), achando que a prova de immunidade cruzada nas infecções que constituem a íamilia typho-exanthematica ou Ricket- tsioses serve somente para reunir certo numero de modalidades nosologicas em determinados grupos, sendo insufticiente para a distincção das modalidades de um mesmo grupo. E’ o que acontece com as infecções que se collocam em cada um dos 4 grupos, mais ou menos definidos, que constituem as “Rickettsio- ses”, segundo a classificação suggerida por Amaral e Monteiro (9 e 10) : grupo I, que tem como infecção typo a Rickettsiose oriental, typo japonês (Tsut- sugamushi); grupo II, cuja infecção typo é a Rickettsiose tropical, typo Ma- lavo, constituindo um grupo intermediário; grupo III, cuja infecção typo é a Rickettsiose maculosa nearctica, typo oeste (Febre maculosa das Montanhas Rochosas) ; grupo IV, tendo como infecção typo a Rickettsiose major (Typho cxanthematico epidemico ou dassico ou historico, etc.). Estes grupos, forma- dos cada um por um certo numero de infecções immunologicamente seme- lhantes, mas distinguíveis por outros caracteres (comportamento experimental, histo-pathologia, epidemiologia, etc.), separam-se entre si pelas provas de im- munidade cruzada. Nestas condições c á vista dos argumentos anteriormente expostos, o " Ty- pho exanthematico de S. Paulo” que, agora, também se poderia diamar de “Fe- bre maculosa de S. Paulo” ou melhor, segundo a classificação dtada, de "Ri- ckettsiose maculosa neotropica, typo de S. Paulo”, se collocaria com as infec- ções pertencentes ao grupo III de Rickettsio-es, que tem como typo a Febre maculosa das Montanhas Rochosas, que se denominaria melhor de "Rickettsiose maculosa nearctica, typo oeste”. SUMMARIO E CONCLUSÕES Preparando, conforme a tedmica exposta, uma vaccina contra o “Typho cxanthematico de S. Paulo”, usando carrapatos (Atnblyomma cajcnncnse) in- fectados, verificámos que ella protegeu a cobaia contra a infecção homologa me-tno em pequena dose (até de 0,5 cc.) e em uma só injecção, mostrando-sc também eííicaz contra a Febre maculosa das Montanhas Rochosas. A vaedna contra a Febre maculosa, preparada com Dcrmaccntor ander- ■foni infectados (vaccina de Parker), apresentou, em relação ao “Typho cxan- thematico de S. Paulo”, completo poder protector para a cobaia, com a inocula- ção de 2 doses e incompleto com a de uma só dose. Os factos anteriormente expostos sobre as relações immunologicas do “Ty- pho exanthematico de S. Paulo” e da Febre maculosa das Montanhas Rochosas sao agora corroborados por novas experiencia» que mostram o seguinte : a) co- baias que resistiram á Febre maculosa revdaram-se também immuncs ao “Typho 11 20 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII de S. Paulo”; b) o grau de immunidade adquirida parece estar em relação com a intensidade da primeira infecção. ABSTRACT A single dose of a tick vaccine for the S. P. spotted fever has completely protected guinea-pigs against not only the specific infection but the R. M. spott- ed fever as well ; a single dose of a tick vaccine for the R. M. spotted fever (Parker’s vaccine) has incompletely protected guinea-pigs against the S. P. spott- ed fever, their complete protection being obtained only when two doses of it were given. Guinea-pigs immunized against the R. M. spotted fever have proved to be immune to the S. P. spotted fever, the degree of their acquired immunity ap- parently depending on the severity of their original infection. BIBLIOGRAPHIA 1. Monteiro. J. Lemos — O “Typho exanthematico de S. Paulo” e suas relações com a Febre maculosa das Montanhas Rochosas, á luz das provas de immunidade cruzada — Brasil Medico XLVII(25) :437. 1933. 2. Parker. R. R. & Davis, G. E. — Protective value of convalescem sera of São Paulo exanthenntic typhus against virus of Rocky Moutain Spotted Fever — U. S. Publ. Health Rep. XLVIII(19) :501.1933. 3. Dycr, R. E — Relationship bctween Rocky Mountain Spotted Fever and “ Exanthc- matic typhus of S. Paulo" — U. S. Publ. Health Rep. XLVIII(20) :521. 1933. 4. Parker , R. R. £r Daz-is, G. E. — Further studies on the relationship of the viruses of Rocky Mountain Spotted Fever and São Paulo exanthematic typhus — U. S. Publ. Health Rep. XLVIIK29) :839. 1933. 5. Davis. G. E. & Parker. R. R. — Additional studies on the relationship of the viruses oi Rocky Mountain Spotted Fever and São Paulo exanthematic typhus — U. S. Publ. Health Rep. XLVIII .1933 (in press). 6. Monteiro, J. Lemos; Fonseca, F. da & Prado, A. — Pesquisas sobre a possibilidade da transmissão experimental do virus por Ixodidae — Brasil Medico XLVI(3) :49. 1932 et Mem. Inst. Butantan VI:139.1931. 7. Monteiro. J. Lemos & Fonseca. F. da — Novas experiências sobre a transmissão expe- rimental por carrapatos ( Boophilus microplus e Amblyomma cajennense) — Bra- sil Medico XLVI(48) :993.1932 et Mem. Inst. Butantan VII :35. 1932. 8. Sfencer, R. R. & Parker R. R. — Improvcd methods of manufacture of the vaccine and a study of its properties — Hyg. Lab. Bullctin (154) :63. 1930. 9. Amaral. A. do & Monteiro, J. Lemos — Ensaio de classificação das Rickettsioscs á luz dos nossos actuaes conhecimentos — Mem. Inst. Butantan VII :349. 1932. 10. Amaral, A. do & Monteiro, J. Lemos — Historia Natural e Classificação das Rickettsio- ses. Posição systematica do “Typho exanthematico de S. Paulo" — Apres. ao 2.’ Congresso Med. Paulista. Nov. 1933 et Rev. Sud-Amêr. Méd. & Chir. IV(ll) :781-S17. 1933. (Trabalho da SeccSo de Vírus e Virusthrrapia do Instituto Butantan. apresentado ao 2.» Congrego Medico Paulista em novembro de l r . 12 COMPORTAMENTO EXPERIMENTAL DO VIRUS DO “TYPHO EXANTHEM ATIÇO” DE S. PAULO APÓS PASSA- GEM PELO CARRAPATO ( AMBLYOMMA CAJENNENSE ) POR J. LEMOS MONTEIRO (com 12 grafíticos e 2 fhotografhias no texto) 2 11 12 13 14 15 16 17 614.526:614.43. +6X6. 9685 COMPORTAMENTO EXPERIMENTAL DO VIRUS DO “TYPHO EXANTEMÁTICO” DE S. PAULO APÓS PASSA- GEM PELO CARRAPATO (AMBLYOMMA CAJENNENSE ) POR J. LEMOS MONTEIRO Em trabalhos anteriores publicámos, juntamente com Fonseca e Prado (1) e Fonseca (2), os resultados de estudos sobre a transmissão experimen- tal do "typho exanthematico” de S. Paulo por meio de carrapatos. Pela pró- pria epidemiologia da infecção e pelas observações experimcntaes que apresen- tamos, o papel possivelmente representado pelo carrapato Amblyomma cajcn- nense, como transmissor do virus na natureza muito se evidencia, visto este Ixodidco poder transmittir a infecção pela picada, alguns dias após a alimen- tação em cobaias infectadas, c ser ella "hereditária”, no sentido de ser trans- missível á futura geração de carrapatos. Neste trabalho mostraremos os resultados da transmissibilidadc do virus por novos lotes de Amblyomma cajcntumse infectados, confirmando aquelles nossos primeiros resultados; mostraremos também o comportamento experimen- tal do “virus” reisolado dos carrapatos e suas relações com o “virus” de pas- sagem, original de doentes, por nós já estudado (3). Technica e methodo de estudo Amblyomma cajenncnsc, adultos, de preferencia femeas, colhidos cm ca- 'allos do Instituto, eram postos a sugar, em lotes de cerca de 20 exemplares, eni cobaias infectadas, de s de o l.° ou 2* dia de rcacçáo febril c durante 3 a 4 dias. Os exemplares que se desprendiam depois de cheios eram colhidos c coUocados cm tubos separados e rotulados com as indicações precisas. No fim daquelle prazo, os exemplares ainda seguros eram também retirados e colloca- dos em tubos, com as respectivas indicações. Os exemplares mais cheios, devido cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 24 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII ao desenvolvimento dos ovos após a alimentação eram separados, em tubos aparte, para postura e desenvolvimento das larvas respectivas. Para a alimen- tação infectante, os carrapatos eram postos a sugar directamente sobre a cobaia, protegidos das mordidas do animal por uma especie de canga de papelão, como mostra a figura 1, technica que exige muita paciência e muito cuidado (princi- palmente si se tratar de exemplares já anteriormente infectados) ; ou então se- gundo o methodo usado no Rocky Mountain Spotted Fever Laboratory, em Hamilton. A figura 2 que reproduzimos de photographias que nos foram gen- tilmente enviadas por Parker, mostra uma cobaia na qual carrapatos estão sendo alimentados pelo dispositivo que adopta e que também empregamos com exito para alimentação e infecção de Amblyomma. Após differentes períodos, exemplares dos diversos lotes infectados eram fixados para posterior inclusão e cortes destinados a pesquisa e localização das Rickettsias. Outros eram postos a sugar cobaias normaes, afim de transmit- tir o viras por picada e os restantes, emulsionados (após conveniente lavagem) em agua physiologica e inoculados em cobaias normaes. As reacções dos animaes eram observadas (temperatura diaria, reacção escrotal, etc.) e feitas passagens do viras pela sangria durante a reacção febril c inoculação do sangue a novas cobaias ou pela inoculação de emulsão de seu cerebro após sacrifício. As que resistiam á infecção, eram reinoculadas, após certo periodo, com o viras de passagem, original de doentes, para prova de im- munidade e comparação dos viras. Um Amblyomma ( Ç ) do lote XI que, depois de infectado, tornou a su- gar nova cobaia c desovou no fim de 30 dias após a alimentação infectante. trouxe nova confirmação de transmissão do viras á sua progenie, visto os ovos, após inoculação, se terem mostrado iníectantes. Ovos provenientes de desova feita após somente 8 ou 10 dias da alimentação infectante, portanto já prcfor- mados naquella occasião. não se mostraram iníectantes após a inoculação. Resultados das experiencias Os resultados das experiencias referidas são resumidos nos protocollos se- guintes e respectivos graphicos. Amblyomma Lote IXa (graphicos 1, 2 e 3) : Cobaia 983 ( fcmea ) — Inoculada em 21 -III -933 com emulsão de 1 9 que, 5 dias antes, terminava a alimentação (de 13 a 16-III-933) na cobaia 967, infectada. Xo 2.° dia a temperatura se elevou a 40°5, o que se pode attribuir a influencia do material inoculado, descendo a seguir para se elevar durante 2 4 Monteiro — Viras do “T. exanthemalico" de S. Paulo 25 dias (40° e 39°8), nos 5.° e 6.° dias após a inoculação. Durante a reacção (6.® dia) foi sangrada: o sangue inoculado na cobaia 990; no 8.® dia foi sacrificada, verificando-se augmento do baço, sendo inoculada emulsão de cerebro na co- baia 994. Graphlco 1 Cobaia 990 (fctnc a) — Inoculada em 28 -III -933 com 1 cc. de sangue da cobaia 983. Reacção febril característica após incubação de 5 dias. Xo 2.® dia de reacção febril foi sangrada e o sangue inoculado na cobaia 997 ; sacrifica- da no 4.® dia de reacção febril, mostrou lesões typicas, sendo inoculada emul- são de cerebro na cobaia 1000. Cobaia 994 ( femca ) — Inoculada em 29- III -933 com emulsão de cere- bro da cobaia 983. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 4 dias e morte na noite de 6 para 7 - IV - 933. Xo 2.® dia de reacção febril foi sangrada e o sangue inoculado na cobaia 998. 5 26 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Cobaia 997 ( fetnca ) — Inoculada em 4 -IV -933 com 1 cc. de sangue da cobaia 990. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 4 dias, sendo sacrifi- cada. Lesões typicas, emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1009. Graphico 2 Cobaia 998 (fetnca) — Inoculada em 4 -IV -933 com 2 cc. de sangue da cobaia 994. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 4 dias e morte duran- te a noite de 13 para 14 -IV -933. No 3.° dia de reacção febril foi sangrada e com o sangue inoculada a cobaia 1008. ' Cobaia 1000 — Inoculada em 6 - IV - 933 com emulsão de cerebro da co- baia 990. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 4 dias e morte na noite de 13 para 14 -IV -933. Cobaia 1008 — Inoculada em 1 1 - IV - 933 com 2 cc. de sangue da cobaia 998. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 5 dias, sendo sacrificada em 6 Monteiro — Vírus do "T. exanlhemalico” de S. Paulo 27 18 -IV -933. Lesões typicas. Emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1014 e na cobaia 986. Esta ultima havia sido inoculada com emulsão de cerebro da cobaia 974, virus de passagem, original de doente, tendo tido infecção caracte- rística, mas resistido. Após reinoculação com o virus da cobaia 1008, pas- sado pelo carrapato, não apresentou reacção alguma; posteriormente foi tam- bém inoculada com virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas, não rea- gindo igualmente. Cobaia 1009 (/ entea) — Inocu- lada em 12 -IV -933 com emulsão de cerebro da cobaia 997. Incubação de 3 dias, febre durante 3 dias, du- rante os quaes nclla foram alimen- tados 13 Amblyomma (Lote IV) ; apresentando-se muito mal, foi sacri- ficada em 19 - IV - 933 : lesões typi- cas; emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1015. Cobaia 1014 — Inoculada em 18 -IV -933 com emulsão de cerebro da cobaia 1008. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 4 dias, apre- sentando reacção escrotal c morren- do na noite de 25 para 26- IV -933. Durante a reacção febril foi sangra- da c o sangue inoculado na cobaia 1019. JÊ. Cobaia 1015 ( fcuiea ) — Ino- culada cm 19- IV -933 com emulsão de cerebro da cobaia 1009. Incubação de e morte na noite de 28 para 29 - IV - 933 grada, sendo inoculada a cobaia 1021. CruMco 3 2 dias, reacção febril durante 4 dias . Durante a reacção febril foi san- Cobaia 1019 — Inoculada em 24 -IV -933 com 1 cc. de sangue da cobaia 1014. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 5 dias, apresentando rcac- ção escrotal e morrendo na noite de 3 para 4 - V - 933. Cobaia 1021 — Inoculada em 25 - IV -933 com 1 cc. de sangue da cobaia 1015. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 4 dias e morte durante a noite de 3 para 4 - V - 933. cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 28 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Estes protocollos mostram que o virus isolado do carrapato sofíreu, nesta serie, 6 passagens pela cobaia e não provoca reacção na cobaia já immunizada relativamente ao virus original de doente, conservado em cobaia. Amblyomma Lote IXb (graphico 4) : Cobaia 988 (femea) — Inoculada em 27 -III -933 com emulsão de 1 9 que, 11 dias antes, se havia alimentado (de 13 a 16- III -933) na cobaia 967 infectada. Não apresentou reacção febril característica. No 10.* dia foi san- grada c o sangue inoculado na cobaia 1001. Em 2- V -933 foi inoculada com virus de passagem (emulsão de cerebro da cobaia 1024), mostrando-se immu- nizada. Posteriormente, em 23 - V - 933, foi inoculada com virus da febre ma- culosa, ao qual também não reagiu. Cobaia 1001 ( fetnca ) — Inoculada em 6 -IV -933 com 3 cc. de sangue da cobaia 988. Não apresentou reacção febril caracteristica, pelo que em 2 - V - 933 foi reinoculada com virus de passagem (emulsão de cerebro da co- baia 1024) : apresentou, após incubação de 4 dias, reacção relativamente pouco accentuada, morrendo em 12-V-933, com lesões typicas. Verifica-se, nesta serie, que o virus do carrapato não provocou infecção da primeira cobaia, porém sua immunidade; já na 2.* passagem, a sua virulen- 8 Monteiro — Yirus do “T. exanthematico" de S. Paulo 29 cia ou quantidade era mais reduzida e incapaz de determinar mesmo immunida- de do animal. Amblyomma Lote IXc (graphicos 5, 6 e 7) : Cobaia 1004 ( femea ) — Inoculada em 6 -IV -933 com emulsão de 1 9 que. 21 dias antes, se havia alimentado (de 13 a 16 -III -933) na cobaia 96 7, Oraphlco S infectada. Após incubação de 2 dias. apresentou reacçáo febril durante 3 dias, sendo sacrificada em 12 -IV -933. Verificam-se lesões typicas, sendo a emul- são de ccrebro inoculada na cobaia 1011. Cobaia 1011 — Inoculada em 12 -IV -933 com emulsão de ccrebro da co- baia ÍOOL Incubação de 4 dias, rcacção febril durante 5 dias, morrendo na manhã de 22 -IV -933. Durante a reacçáo febril foi sangrada e o sangue ino- culado na cobaia 1017. Xa necropsia verificaram-se lesões typicas; as rickctt- sias, pesquisadas nas cellulas mesotheliacs do pcritonco, mostraram-se abun- dante» (-) — | | — )-); emulsão de cerebro foi inoculada na cobaia 1018. Cobaia 1017 — Inoculada em 19 -IV -933 com 1 cc. de sangue da cobaia 1011. Incubação de 2 dias, reacçâo febril durante 4 dias, apresentando rcacção 9 30 Memórias do Instituto Butantan Tomo MII escrotal. Sacrificada em 26 -IV -933. Rickettsias pesquisadas no perito- neo (+) ; emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1025. Cobaia 1018 — Inoculada em 22 - IV - 933 com emulsão de cerebro da co- baia 1011. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 4 dias e morte na noite Graphico 6 de 28 para 29 -IV -933. Durante a reacção foi sangrada, sendo inoculada com seu sangue a cobaia 1027. Cobaia 1025 — Inoculada em 26 -IV -933 com emulsão de cerebro da co- baia 1017. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 3 dias e morte na noite de 6 para 7 - V - 933. Durante a reacção foi sangrada, sendo inoculada a co- baia 1037. Cobaia 1027 ( fetnca ) — Inoculada cm 28 -IV -933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1018. Incubação de 4 dias, reacção febril durante 3 dias, sendo san- grada e com o sangue inoculada a cobaia 1048 e sacrificada. Rickettsias pes- quisadas no peritoneo mostraram-se abundardes (ri — f-4-). Emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1052. Cobaia 1037 ( fcmca ) — Inoculada em 2 - V - 933 com 2,5 cc. de sangue da 10 Monteiro — Virtu do “T. exanthematico” de S. Paulo 31 cobaia 1025. Incubação de 3 dias, reacção febril durante 3 dias e morte na manhã de 9-V-933. Rickettsias pesquisadas no peritoneo (-j — f-+); emulsão de cerebro inoculada na cobaia 1054. Cobaia 1048 — Inoculada em 5 - V - 933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1027. Incubação de 3 dias, reacção febril durante 3 dias e morte na noite de 12 para 13 -V -933. Cobaia 1052 — Inoculada em 6 - V - 933 com emulsão de cerebro da co- baia 1027. Incubação de 3 dias, reacção febril durante 2 dias e sacrificada em 12- V * 933, por se apresentar muito mal. Emulsão de cerebro foi inoculada na cobaia 1069. Cobaia 1054 — Inoculada em 9 - V -933 com emulsão de cerebro da co- baia 1037. Incubação de 3 dias, reacção febril durante 3 dias, apresentando rcac- ção escrotal e, estando muito mal, foi sacrificada cm 16- V- 933. Cobaia 1069 ( femea ) Inoculada em 17 -V- 933 com emulsão de cerebro da cobaia 1052. Incubação de 3 dias, rcac- çáo febril durante 2 dias, sendo sangra- da c inoculada a cobaia 1083 ; morte na noite de 18 para 19-V-933. O viruj passado pelo carrapato c rcisolado soffreu, nesta serie, 6 passa- gens pela cobaia. Amblyomma Lote Xa (graphicos cos 8 e 9) : ou. 125U5678 Cobaia 996 — Inoculada em 3 - IV -933 com emulsão de 1 9 que, 18 dias antes, havia terminado a alimentação na cobaia 968, infectada. Após incuba- ção de 2 dias, apresentou reacção febril característica durante 6 dias, durante a qual foi sangrada e o sangue inoculado na cobaia 1006, resistindo, porém, á infecção. Em 2-V-933 foi reinoculada com o vinis activo, de passagem (emulsão dc cerebro da cobaia 1024), que nenhuma reacção determinou, pro- vando a immunidade do animal. Posteriormente, em 23 - V - 933, se mostrou também immunc cm relação ao vinis da febre maculosa das Montanhas Ro- chosas. 11 32 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Cobaia 1006 — Inoculada em 10- IV -933 com 2 cc. de sangue da cobaia 996. Incubação de 5 dias, reacção fe- bril durante 7 dias e morte na noite de 23 para 24 - IV - 933. Durante a reac- ção febril foi sangrada e inoculada a co- baia 1013. Cobaia 1013 ( femea ) — Inocula- da em 18- IV -933 com 2 cc. de san- gue da cobaia 1006. Incubação de 2 dias. reacção febril durante 5 dias, sen- do sacrificada; emulsão de ccrebro ino- culada na cobaia 1020. Cobaia 1020 — Inoculada em 25 - IV -933 com emulsão de cerebro da cobaia 1013. Incubação de 2 dias, reac- ção febril durante 4 dias e morte na noite de 3 para 4 - V - 933. Nesta serie, o virus do carrapato soffreu 4 passagens pela cobaia, verifi- cando-se que a cobaia a elle immuniza- do, o é também ao virus de passagem, original de doente. 12 Monteiro — Viras do “T. exanthemalico" de S. Paulo Amblyomma Lote XI (graphico 10) : 33 Cobaia 1005 — Picada de 10 a 12- IV -933 por 1 9 que, 18 dias antes, se havia alimentado (de 18 a 23 -III- 933) na cobaia 974, infectada. Incuba- ção de 6 dias, reacção febril durante 4 dias e morte na noite de 21 para 22 - IV- 933. Lesões typicas. Durante a reac- ção febril foi sangrada e o sangue ino- culado na cobaia 1012. Cobaia 1012 — Inoculada em 18- IV- 933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1005. Incubação de 3 dias, reacção febril du- rante 4 dias e morte, com lesões typi- cas, na noite de 25 para 26-IV-933. Xcsta serie, o virus passado pelo car- rapato e transmittido por picada sof- freu 2 passagens em cobaia. er»phi«> io Amblyomma Lote XIII (graphico 11): Cobaia 1026 — Inoculada, por via subcutânea, cm 26 -IV -933 com emul- são de 1 ç que, 15 dias antes, se havia alimentado (de 7 a 11 -IV -933) na co- 13 cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 34 Memórias do Instituto Bulantan Tomo VIII baia 999, infectada. Incubação de 2 dias, reacção febril durante 3 dias, tendo tido reacção escrotal, sendo sangrada e o sangue inoculado na cobaia 1035 e morrendo durante a noite de 3 para 4 - V - 933. Cobaia 1035 — Inoculada em 2-Y-933 com 3 cc. de sangue da cobaia 1026 (sangria após a queda da temperatura). Incubação de 5 dias, reacção fe- bril durante 4 dias, sendo sangrada e inoculada a cobaia 1059, resistindo á in- fecção. Em 23 - V - 933 foi inoculada com o virus da febre maculosa das Mon- tanhas Rochosas, ao qual não reagiu, mostrando-se immunizada. Cobaia 1059 — Inoculada em 10 - V - 933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1035. Incubação de 3 dias, reacção febril durante 2 dias e morte na noite de 16 para 17 - V' - 933. Nesta serie, o virus passado pelo carrapato soffreu 3 passagens pela co- baia. Um dos animaes que resistiram mostrou-se immune em relação ao virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas. Ov. Amblyomma XI (30 dias) (graphico 12) : Cobaia 102' — Inoculada, por via subcutânea, em 25 - IV - 933 com emul- são de 20 ovos de 1 Amblyomma do Lote XI, infectado na cobaia 974, na qual se alimentou de 18 a 23 -III -933. A mesma íemea se alimentou novamente 14 SciELO 11 12 13 14 Monteiro — Vinis do "T. exanthematico” de S. Paulo 35 na cobaia 1005, que infectou (experiencia anterior e graphico 10), de 10 a 12- I\ -933. Desovou em 24 -IV -933, após 10 dias da 2* alimentação e 30 dias depois da 1* alimentação infectante. Resultado da inoculação: após incuba- ção de 4 dias, reacção febril durante 5 dias, num dos quaes foi sangrada e o sangue inoculado na cobaia 1034, resistindo á infecção. Em 15 -V- 933 foi inoculada com o virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas, ao qual se mostrou immunizada. Cobaia 1034 ( femea ) — Inoculada em 2-V-933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1022. Incubação de 5 dias, reacção febril durante 4 dias e morte na noite de 12 para 13 -V -933. Lesões typicas. Durante a reacção foi sangra- da e o sangue inoculado na cobaia 1058. Cobaia 1058 (f entea) — Inoculada em 9 - V -933 com 2 cc. de sangue da cobaia 1034. Incubação de 3 dias, teve 1 dia de reacção febril, morrendo em 14 - V - 933, não tendo sido aproveitado material para novas passagens. Esta serie de experiencias traz nova confirmação da transmissão do virus pelo Atnblyomma infectado á geração seguinte. Ovos de postura, datando de 30 dias após a alimentação infectante, mostraram-se inícctantes. Em experiencias parallelas, feitas com ovos de postura datando somente de 8 a 10 dias da alimentação infectante, obtivemos resultados negativos, indican- do serem os ovos prcformados e que apenas completaram o seu amadurecimento ou evolução cm virtude da alimentação, não tendo permittido a entrada ao virus infectante. DISCUSSÃO E SUM MARIO Os resultados das differentes series de experiencias assignaladas são suffi- cientes para se ter uma idea cxacta sobre o comportamento experimental do virus do “typho exanthematico” de S. Paulo após ter sofírido passagem pelo carrapato Amblyotnma cajcnncnse. Quando a infecção pelo virus passado pelo carrapato se processa por pica- da do Ixodideo, nota-se, em geral, um augmento do periodo de incubação. Fora destas condições c nas passagens successivas do virus pela cobaia, o seu comportamento experimental não differe do do virus isolado de doentes c mantido da mesma forma e já por nós estudado (3) cm seus principacs carac- terísticos, não havendo, por isso, necessidade de agora repetil-os. Interessante c a verificação do facto de que, como consequência da picada ou inoculação de carrapatos infectados, não se observa, ás vezes, uma infecção característica, porém uma immunidade do animal á reinoculação do virus. Este resultado, estudado com maiores minúcias em outro trabalho (4), justifica a 15 36 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII hypothese de que o virus apresenta no organismo do carrapato phases em sua evolução, nem todas infectantes. embora immunizantes, e que a virulência pode ser adquirida sob certas condições, como acontece com o virus da febre macu- losa das Montanhas Rochosas, no organismo do Dermacentor andersoni, de ac- cordo com os estudos de Spencer e Parker (5 e6). A não alteração do virus da nossa Rickettsiose após passagem pelo An i- blyomma cajcnncnse, alem do comportamento experimental já referido, ainda se patenteia pelas provas de immunização cruzada com o virus original de doentes. Cobaias immunes a este ultimo, o são da mesma forma ao virus do car- rapato, o mesmo acontecendo em sentido contrario. Finalmente, da mesma maneira que o virus original de doente apresenta suas relações immunologicas com o da febre maculosa das Montanhas Rochosas, conforme expusemos em outros trabalhos (7 e 8), o virus após passagem pelo carrapato revela ainda as mesmas relações: cobaias immunizadas contra clle não mostram reacção quando reinoculadas com o virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas. Estas relações immunologicas justificaram já a inclu- são do nosso “typho exanthematico’’ no grupo de Rickettsioses ou febres exan- thematicas que tem como infecção typo a febre maculosa das Montanhas Ro- chosas. CONCLUSÕES A passagem do virus do “typho exanthematico” de S. Paulo pelo orga- nismo do carrapato ( Atnblyomtna cajcnncnse ) não lhe modifica os caracteres cssenciaes, manifestados pelo seu comportamento experimental e relações immu- nologicas. ABSTRACT The virus of the S. Paulo spoítcd fcvcr secms to keep all of its fundamental charactcrs after having passcd through the tick Amblyomma cajcnncnse, to judgc from its experimental behaviour and immunological relationships. BIBLIOGRAPHIA 1. Monteiro, J. Lemos; Fonseca, F. da & Prado, A. — Pesquisas sobre a possibilidade de transmissão experimental do virus por lxodidae — Brasil Medico XLVI(33) : 49.1932 et Mcm. Inst. Butantan VI:139.1931. 16 Monteiro — Viras do “ T. exanthematico" de S. Paulo 37 2. Monteiro, J. Lemos & Fonseca . F. da — Xovas experiências sobre a transmissão expe- rimental por carrapatos ( Boofhilus microflus e Amblyomma cajennense) — Brasil Medico XLVI(48) :993.1932 et Mem. Inst. Butantan VII :33. 1932. 3. Monteiro. J. Lemos — Estudos sobre o typho exanthematico de S. Paulo. 1.* parte: Comportamento experimenta! e propriedades do virus — Mem. Inst. Butantan VI :7.1931. Monteiro. J. Lemos & Fonseca. F. da — Localização da Rickettsia brasiliensis nas cel- lulas dos diverticulos intestinaes do Amblyomma cajennense — Apres. Congr. Med. Paulista. Xov. 1933 et Mem Inst. Butantan VIII. 1933-1934. 5. Sfeneer. R. R. £ ■ Parker. R. R. — Studies on Rocky Mountain Spottcd Fever. Infec- tivity oi fasting and reccntly fed ticks — U. S. Public Health Rep. XXXVIII (8) :333.1923. (>. Sfeneer. R. R. & Parker, R. R. — Rocky Mountain Spottcd Fever. Experimental stu- dies on tick virus — U. S. Public Health Rep. XXXIX (48) :3027. 1924. 7 Monteiro, J. Lemos — O “Typho exanth^sático de S. Paulo” c suas relações cora a Febre maculosa das Montanhas Rochosas, á luz das provas de immunidadc cruzada — Brasil Medico XLVII(25) :437. 1933. 8. Monteiro. J. Lemos — Vaccina contra o “ Typho exanthematico de S. Paulo . Xovas correlações entre essa infecção c a Febre maculosa das Montanhas Rochosas Apres. Congr. Med. Paulista. Xov. 1933; VHIa. Reunião Soc. Arg. Path. Rcg. dei Xorte. Out. 1933 et Mem. Inst. Butantan VIII. 1933-1934. (Trabalho da Secçio de Vira* e Viro «Ibera pia do Iiutituto liuUoUn, 4|irr«mUodcm servir de novo meio de distineção dos dois virus. Estas differenças baseiam-se principalmcnte na tendência maior que tem o virus da Febre maculosa cm determinar phenomenos hcmorrhagicos c necrosan- tes, como manifestação da reacção escrotal que provoca quando inoculado no pe- ritoneo daquclle animal. ABSTRACT The comparative study of thc experimental behaviour oí the virus of thc Neotropical rickettsiosis, S. Paulo type (S. Paulo spotted fever) with that of the Xearctic rickettsiosis, type west (Rock)' Mountain spotted fever) upon ino- culation into adult male rabbits shows, together with other known characters, certain differences to exist between these viruses so as to facilitate their separa- tion. rhese differences consist particularly in the greater tendency bome by tive 'irus of R. M. spotted fever to bring about hemorrhages and necrosis in the scrotum of rabbits that have been pcritoneally inoculatcd with it. SciELO 46 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII BIBLIOGRAPHIA 1. Amaral. A. do & Monteiro, J. Lemos — Ensaio de classificação das Rickettsioses á luz dos nossos actuaes conhecimentos — Mem. Inst. Butantan VII :349. 1932. 2. Amoral, A. do & Monteiro, I. Lemos — Historia natural e classificação das Rickett- sioses. Posição systematica do “ Typho exar.thcmatico de S. Paulo" — Apres. ao Congresso Mcd. Paulista. Nov. 1933 et Rcv. Sud. Aroér. Med. & Chir. IV (11) :781. 1933. 3. Monteiro. J. Lemos — Typho endemico de S. Paulo. Comportamento experimental do virus — Brasil Medico XLV(48) :1 109. 1931. 4. Monteiro, J. Lemos — Estudos sobre o “Typho exanthematico de S. Paulo" — Mem. Inst. Butantan VT:3. 1931(1932). 5. Felix, A. — The rabbit as experimental animal in the study of the typhus group of viruscs — Trans. Royal Soc. Trop. Med. & Hyg. XX\ 1(4) :365. 1933. 6. Trazassos, J. & Monteiro. J. Lemos. — Contribuição ao estudo da rcacção de Weil- Felix na infecção experimental pelos virus do “ Typho exanthematico de S. Paulo” e Febre maculosa das Montanhas Rochosas — Apres. ao Congresso Med. Paulista. Nov. 1933 et Mem. Inst. Butantan VIII. 1933-1934. (Trabalho da SccçJo de Virus c Yirustherapia do Instituto Bu- tantan, apresentado ao 2.* Congresso Medico Paulista em novembro de 1933. Dado á publicidade em agosto de t934). 8 \ Coelho e vinis do T. E. de S. Paulo 1 e da F. M. das M. Rochosas Mem. In.t. Butantan Vol. VIII. 19SJ-I9J4 J. Lemos Monte ir.o C 0 £ L M O *~h\) ■ - I /* TLL Í * -'.'a -• Fic. I Fic. 2 Receio c-vrotal do coelho Inoculado com o viru. da Febre maculou da. Montanha. Kochou. 1'ha.e inicial da nrcrou. m, Fic. 3 Fic. 4 K«c*M mcrutal do coelho inoculado com „ v.ru. d. Febre maculou da. Monlanh.. Rocbo... Phaae adiantada da necrou. cm 5 6 7 SClELO 1:L 12 13 14 15 16 17 LOCALIZAÇÃO DA RICKETTSIA BRASILIENSIS NAS CELLULAS DOS DIVERTICULOS INTESTINAES DO AMBLYOMMÁ CAJENNENSE POR J. LEMOS MONTEIRO e FLAVIO DA FONSECA (Com 2 grafhicos t 7 figuras coloridas no texto ) 614. 526:616. 96S5 LOCALIZAÇÃO DA RICKETTSIA BRASILIENSIS NAS CELLULAS DOS DIVERTICULOS INTESTINAES DO AMBLYOMMA CAJENNENSE POR J. LEMOS MONTEIRO e FLAVIO DA FONSECA Em trabalhos anteriores (1,2) e em outro mais recente (3) foram descrip- tas numerosas expericncias de transmissão experimental do virus do “Typho cxanthematico de S. Paulo” por meio de Ixodidae, evidcnciando-sc, sobretudo, o papel possivelmente representado cm condições naturaes pelo Atnblyomma cajennense, cspccialmente á luz de certos aspectos da infecção, inclusive o epi- dcmiologico. Nesta nota, resumimos algumas pesquisas preliminares feitas para a verifi- cação da presença c localização da Rickettsia brasüicnsis em exemplares de A. cajennense expcrimentalmcntc infectados, mostrando que este assumpto precisa de ser continuado e ampliado para que se elucide complctamcntc o papel deste carrapato na transmissão da nossa Rickettsiosc. Em exemplares de numerosos lotes de Atnbiyotnmi cajennense infectados foi eífcctuada, cm periodos diversos, a pesquisa das Rickcttsias, quer cm emul- sões com elles preparadas, quer a {xis fixação, inclusão e coloração adequada de cortes nelles praticados; aqui assign alaremos apenas os resultados dos exames em exemplares dos lotes que se acham documentados com desenhos das res- pectivas preparações. Citaremos, ao mesmo tempo, os resultados das provas de infecção de cobaia com exemplares de carrapatos de um dos lotes estudados, para confirmação da infecção dos exemplares em que foram encontradas Ri- ckettsias, estando estas provas já descriptas, para os outros lotes, em trabalhos anteriores. Antes de mais nada devemos indicar, em resumo, a technica por nós em- pregada para a fixação e coloração dos cortes de carrapatos. 3 SciELO 11 12 13 14 50 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Methodo de estudo e technica Exemplares de Amblyomma cajciinense são postos a alimentar em cobaias infectadas durante 3 ou 4 dias, no periodo de reacção febril, nas condições des- criptas com maior minúcia em outro trabalho (3). Exemplares desprendidos ou retirados no final desse prazo, mantidos separadamente em tubos apropriados, ião, decorrido certo numero de dias, lavados convenientemente, emulsionados para pesquisa directa em esfregaços ou fixados para posterior inclusão. Fixação e inclusão — Empregamos mais commummente a technica de Hoare (4), que assim se pode resumir: Fixador: liquido de Bouin modificado: Sol. saturado de acido picrico em álcool a 90 % 75 partes formol (40^0) 25 acido acético 5 ” ; a quantidade a usar é addicionada, na occasião, de 1 ou 2 gottas de chloroformio ; fixação durante 24 horas, sendo que nas primeiras o frasco deve ser collocado na estufa a 56®. A marcha a seguir, até inclusão, é : Álcool a 90®, durante 3 a 7 dias, sendo o álcool trocado varias vezes ; depois, passar por 24 horas nas seguintes misturas: álcool absoluto; mistura, em partes iguaes, de álcool e chloroformio; chloroformio aquecido, saturado de parafina; parafina pura, estufa a 56®, por 5 — 6 horas; inclusão. Coloração dos cortes — O methodo preferido para coloração dos cortes, após dissolução da parafina c hydratação, é o de Gicmsa, sendo indispensável uma diffefenciação cuidadosa afim de se conseguirem bons preparados. Para esta differenciação foram empregadas duas technicas. Na primeira, a colora- ção era feita durante 12 - 24 horas no soluto do corante (1 gotta para cada 2 cc.), seguindo-se uma lavagem e differenciação com agua destillada fracamente aci- dulada com acido acético, até coloração rósea, seguindo uma lavagem em agua corrente e destillada, álcool absoluto, xylol e montagem em oleo de cedro. Na segunda technica, a de Mudrow (5), que é mais simples, a differencia- ção se torna mais perfeita, fornecendo prepwrados mais claros e que melhor se prestam á conservação. 4 Monteiro * Fonseca — Localização (/<: Rickettsia brasi/iensis 51 Resume-se no seguinte: tomam-se 4 frascos de Borrei, perfeitamente lim- pos e seccos; nos 2 primeiros (I e II) colloca-se acetona pura. neutra, e, nos outros 2 (III e IV), xylol puro. A coloração é feita durante 20 - 30 minutos em soluto de Giemsa (1 gotta para 1 cc. de agua destillada, de pH = 7.2) ; após lavagem por meio minuto em agua destillada, retira-se o excesso dagua da lamina: passa-se em acetona I, por 15-30 segundos; por acetona II por 10 segundos; por xylol III por 1 minuto, controlar a coloração com objectiva secca para se saber si a differenciação está perfeita ou si ha necessidade de se retomar á acetona II, e. finalmcnte, xylol I\ por 10 minutos, seguindo-se a montagem em balsamo do Canadá. As pesquisas registadas neste trabalho ioram feitas em exemplares de Atn- Myoumta cajennense infectados nas seguintes condições: Lote III, cm 4 exemplares, sendo 3 Ç e 1 í alimentados na cobaia infectada No. 864, durante a reacção febril, nos dias 21 a 23 -X -932, sendo os carrapa- tos fixados depois de 7 e 15 dias do fim da alimentação. Lote V, alimentados na cobaia No. 917, durante a reacção febril, nos dias 6 a 11 - XII -932, sendo fixados a 24 do mesmo mês; a pesquisa foi feita numa 9 fixada após ter desovado. Lote VI, pesquisada 1 9 . que se encheu bem, assim como outros exemplares, alimentados durante apenas 1 dia (devido á morte do animal), na col>aia No. 955 c 2 dias na cobaia No. 954, duiantc a reacção febril, na ultima, logo após serem retirados da primeira, nos dias 2 a 4 -III -933. Esse exemplar desovou e foi fixado cm 27 -III -933. Ao serem cortadas as pernas, foi emittida certa por- ção do conteúdo intestinal do carrapato, sendo recolhida, emulsionada (para pesqui>a da Rickettsia em esfregaços) c inoculada na cobaia No. 989, cuja in- fecção comprovaria a da pesquisa de Rickettsia nos cortes do mesmo exemplar. Lote IX, constituído por cerca de 20 exemplares que foram alimentados na cobaia No. 967, durante a reacção febril, nos dias 13 a 16- III -933. O exem- plar pesquisado foi fixado cm 27-111-933. Exemplares deste lote foram rc- mettidos a Dyer c Parker, nos Estados Unidos, que verificaram a infecção, iso- lando o nosso virus. Esta verificação tinha, aliás, já sido por nós feita, inocu- lando emulsão de 1 exemplar, na cobaia No. 983 em 21 -III -933, após 5 dias do final da alimentação, 1 na cobaia No. 988, após 11 dias, cm 27 - III -933 c 1 na cobaia No. 1004 cm 6 - IV - 933, isto é, 21 dias após a alimentação iníectantc. Resultados das experiências Infecção dos carrapatos — Apenas a-signalaremos os resultados da verifi- cação da infecção de exemplares dos lotes VI c IX, que forneceram cspccimes para fixação e cortes, pois os obtidos com os dois lotes restantes estão já expo;- tos em outros trabalhos. cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 52 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Cobaia Xo. 989 — inoculada em 27-III-933 com emulsão de material pro- veniente de um Ainblyommo 9 (Lote VI ) , após ligeiro corte na cutícula ex- terna. Não apresentou reacção febril característica, o máximo attingido tendo sido 39°2. Após 36 dias foi reinoculada com o vinis activo, de passagem (emul- são de cerebro da cobaia Xo. 1024), não apresentando reacção, mostrando-se immunizada. Posteriormente, 21 dias após esta ultima injecção, foi inoculada com o viras da Febre maculosa das Montanhas Rochosas, que também não pro- vocou qualquer reacção. Cobaia A o. 983 — (Graphico 1) inoculada em 21 -III -933 com emulsão de 1 Amblyomtna 9 (Lote IX), alimentado, 5 dias antes, na cobaia Xo. 967, de 13 a 16- III -933. Apresentou reacção febril e infecção característica como se verifica no Graphico 1, onde estão registadas apenas as 4 primeiras passa- gens feitas (cobaias Xos. 990, 994, 997 e 998). 6 Monteiro * Fonseca — Localização da Rickettsia brasiliensis 53 Cobaia Xo. 988 — inoculada em 27 - III - 933 com emulsão de 1 Amblyom- tna Ç ÍLote IX) que, 11 dias antes, de 13 a 16, se havia alimentado na cobaia Xo. 967. Xão apresentou reacção febril característica, pelo que foi reinoculada com o vinis activo (emulsão de cerebro da cobaia Xo. 1034) decorridos 36 dias, mostrando-se immunizada. Posteriormente também se mostrou immune ao virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas. Cobaia No. 1004 — (Graphico II) inoculada em 6- IV -933 com emulsão de 1 Amblyomma 9 (Lote IX), alimentado 21 dias antes, de 13 a 16 -III -933 na cobaia Xo. 967. Apresentou infecção e reacção característica, como se ve- rifica no Graphico II, onde estão apenas também registados os resultados de al- gumas passagens feitas (cobaias Xos. 1011, 1017 e 1018). Pesquisas e algumas localizações da Rickettsia brasiliensis nos carrapatos infectados — Em esíregaços directos de emulsão dos carrapatos, como os assignalados c feitos com exemplar do Lote VI, as RicWettsias apresentam a morphologia typica, com coloração de aspecto bipolar ou de finos bastonetes, que se coram cm roseo pelo methodo de Giemsa. Xos cortes c com a coloração l>elo Giemsa, segundo os mcthodos acima indicados, o seu aspecto morphologico cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 54 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII é typico, dependendo a coloração em grande parte da boa diíferenciação conse- guida, apresentando-se corados em violeta ou roseo nas boas diíferendações ou mais ou menos azuladas, mas não perfeitamente diííerenciadas. Nos differentes lotes estudados, de carrapatos infectados, foram verificadas algumas localizações da Rickcttsia brasiliensis. Em primeiro logar assignalamos a presença dos microorganismos nos diverticulos intestinaes dos Atnblyomma, o que não ddxa duvida sobre a natureza desses elementos. Nos diverticulos as Ri- ckettsias são encontradas no interior das cellulas epitheliaes da parede, as quaes fazem saliência na luz do vaso, tal como villosidades, augmentando deste modo sua superfície de absorpção. Com morphologia typica, as Rickettsias mostram-se muitas vezes em massas consideráveis, occupando quasi todo o interior de algu- mas cellulas. As figuras 1 e 2 (Atnblyomma do Lote III) e 3 (Lote IX), dando esta ultima o aspecto das cellulas em seu sentido longitudinal, mostram a locali- zação referida. Devido á ruptura das cellulas as Rickettsias podem ser verifica- das livres na luz do diverticulo. Em outros exemplares do mesmo Lote III, fixados depois de decorrido maior periodo, verificámos formas pleomorphicas, alem dos elementos typicos, as quaes se apresentam como bastonetes mais grossos e incurvados. Taes ele- mentos são vistos mesmo no interior dos núcleos cellulares, mas não sendo pas- sível positivar sua natureza e relação com os elementos typicos. Ainda nos diverticulos verificámos um aspecto interessante e typico das Ri- ckettsias, que se apresentam muito pequenas, cocciíormes, cm massas conside- ráveis, no interior das cellulas e fora delias. Este aspecto é o reproduzido nas figuras 4 e 5 (Lote V), approximando-se do^ apresentado pela Rickcttsia pro- v/azcki no estomago de piolhos infectados. Outra localização interessante por nós observada passa-se nos tubos de Mal- pighi. Sabc-sc, porem, ser esta uma localização electiva de symbiontcs (pa- rasitos cndocellulares dos organs genitacs e dos tubos de Malpighi) das femeas na superfamilia Ixodoidca, segundo Mudrow (5), os quaes podem ser confun- didos com aquelles elementos observados sob morphologia typica no cytoplas- ma cellular. As figuras 6, com pequeno augmento, assignalando o ponto exa- minado, e 7 com grande augmento, para a demonstração das Rickettsias, dão kiéa dos microorganismos e da sua situação nos organs citados. Proseguindo nestas pesquisas, ainda em andamento, podemos adeantar ter- nos sido dado observar a presença de microorganismos com os caracteres de Rickcttsia em musculos e em tecidos pertencentes ao apparelho buccal. Não nos é, todavia, possível sustentar a asserção por nós feita, em nota ao pé da pagina, em trabalho anterior (2). sobre a situação intranuclear das Rickettsias nas cel- lulas intestinaes dos carrapatos infectados. Tal verificação preliminar poude ser recti ficada logo que nos foi dado obter material rico e mais bem corado. 8 Monteiro 4 Fonseca — Localização da Rickettsia brasHiensis 55 SUM MARIO E CONCLUSÕES Novos dados experimentaes demonstram a infectuosidade de carrapatos (AnMyomma cajcnncnsc) alimentados em cobaias infectadas com o “virus” do "Typho exanthematico de S. Paulo”, incluindo-se entre elles alguns dos prin- cipaes aspectos morphologicos e certas localizações da Rickcttsia brasilicnsis nesse Ixodideo. Em cortes histologicos de Ambiyotnma cajcnncnsc infectados ficou patente a penetração das Rickettsias nas cellulas epitheliaes dos diverticulos intestinaes, bem como de outros teddos. A morphologia característica da Rickettsia pode variar dentro de certo pleomorphi-mo que parece apresentar. Como acontece com o virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas no seu transmissor, verificam-se no Ambiyotnma phases de evolução do “virus” da nossa Rickettsiose, o qual ora se mostra infectantc, ora apenas vaccinante, readquirindo provavelmente aquelle caracter sob certas condições, ainda não per- íeitamente estabelecidas. ABSTRACT Furthcr experiments made on the ròle oí ticks of thc spccies Ambiyotnma cajcnncnsc ícd on guinca-pigs infectcd with thc virus of the S. Paulo spottcd íever liavc brought to light ncw data on the morphological features of Rickcttsia brasihcnsis as well as on its localization in thosc ticks. Histological examination of infectcd ticks oi that spccies showcd thc Rickctt- siae to enter thc cndothelial cclls of thc intestinal diverticula and othcr tissues. The characteristic morphology of R. brasiliensis may vary within ccrtain limits. Fhc same stages of evolution as íound in the virus of thc Rocky Mountain spottcd fever within the body of its carrier sccm to be bome by thc virus of the S. Paulo spottcd fever in the Ambiyotnma. Thc lattcr virus proves to be some- times infecting, some other times immunizing, this change taking placc under certain conditions not yct fully understood. , BIBLIOGRAPHIA i- iloHíetro. J. Lemos; Fonseca, F. da & Prado, A. — Typho exinthcmatico de S. t aulo. Pesquisas sobre a possibilidade da transmissão experimental do virus por ixoàidae — Brasil Medico XLVI(3) -.49.1932 et Mem. Inst. Butantan VI :139. 1931. 9 SciELO 11 12 13 14 6 17 56 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII 2. Monteiro. J. Lemos & Fonseca. F. da — Novas experiencias sobre a transmissão ex- perimental por carrapatos ( Boophilus microfhu e Amblyomma cajennense) — Brasil Medico XLVI (-18) .-933.1932 et Mem. Inst. Butantan VII :41. 1932. 3. Monteiro, J. Lemos — Comportamento experimental do vírus do "Typho exanthematko de S. Paulo” após passagem pelo carrapato (Amblyomma cajennense) — Apres. Congr. Med. Paulista. Nov. 1933 et Mem. Inst. Butantan. VIII :1933-1934. 4. ll enyon. C. M. — Protozoology, New York. 1926. 5. Mudroic, E. — über die intrazellulãren Symbicnten der Zecken — Zeitschr. f. Para- sitenk. V(l) :13S. 1932. (Trabalho da SecçSo de Vinis e Yirustherapia do Instituto Bu- tantan, apresentado ao 2.« CongTesso Medico Paulista em novembro de 1933. Dado á publicidade em agosto de 1931) 10 Mem. Inst. BuUnUn Monteip.o * Fonseca - Localização da Rickettsia brasihensis Vol. VIII, 19SS-19W Fic. 1 X 940 Fic. 2 X 940 cm 2 3 4 5 6 7 SClELO 2.1 12 13 14 15 16 17 Monteiro 4 Fonseca - Localização da Rickettsia brasil iens is Mm. Irvst. ButanUn Vol. VIII, 1953-1954 Fic. 3 x W Fia 4 X 940 cm 2 3 4 5 6 7 11 12 13 14 15 16 17 Mrm. ln»t. BuüinUn Vol. VIU. 1933 - 1931 M'*ntkii:o A Foxsf.ca Lxcaliztu <~n- em pouco tempo muito relativo. Felix mo Resultados negativos 14 . . . 384$ % Reacções praticadas do 11* ao 15.° dia: Numero de casos 23 Resultados positivos 20 . • . 86.9 9« Resultados negativos 3 .. . 13.0 Reacções praticadas do 16.* ao 20.* dia: Numero de casos Resultados positivos 8 . . . 100 9» Resultados negativos 0... 0 9« Reacções praticadas do 21.* dia em diante: Numero de casos 9 Resultados positivos 7 .. . 77 J 9® Resultados negativos 2 . . . 222 95» Analysando as percentagens registadas, verifica-se uma curva ascendente de resultados positivos, attingindo um máximo cm período correspondente do 16.* ao 20* dia da itifecção, tendendo a decrescer cm seguida. Uma cursa cm sentido opposto observa-se com os resultados negativos. Um estudo mais attento do Quadro I faz rcsaltar um facto significativo e de importância: o prognostico foi mais íavoravel cm quasi todos os casos cm que a agglutinação foi positiva c attingiu titulos elevados; nestes se verificou a alta dos doentes. Todos os outros casos, em que estes factos não se verificaram, tiveram exito fatal, muito embora se possa attribuir esse resultado a uma evolu- ção mais rapida e fulminante da infecção. cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 61 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Na pratica da reacção de Weil-Felix, o emprego dos diíferentes typos de Protcus X, é de grande importância e. segundo Felix (7), serviria para a dis- tineção antigenica dos vinis correspondentes. Felix (6), estudando uma serie de soros que lhe foram daqui remettidos, obteve, relativamente aos Protcus 0X19, 0X2 e OXK, os resultados consigna- dos no Ouadro II : QUADRO II Titulo de agglutinação com Proteus Soros (*) 0X19 OX2 OXK 1 20.000 0 200 O 2.000 0 500 3 200 0 200 4 10.000 100 100 5 20.000 0 200 6 2.000 0 0 7 5.000 0 100 8 5.000 0 0 9 5.000 100 0 (*) A correspondência dos numeros da maioria destes soros com os respectivos casos clinicos consta do trabalho de Carvalho Lima (5). Estes resultados são concordes com os que obtivemos e cujos soros remet- temos também a Felix. Carvalho Lima (5), praticando a reacção em soros de vários doentes com esses typos de Protcus X e com o typo que isolou, Protcus XL, empregando as respectivas variantes O e HO, obteve com este ultimo typo resultados na maioria positivos, sendo os titulos registados um pouco inferiores aos obtidos com o Pro- tcus X19. Com o typo XK a percentagem dos seus resultados positivos foi menor. Reacção de Weil- Felix na infecção experimental pelo virus do “Typho exanthematico de S. Paulo”, Resultados comparativos com a Febre ma- culou das Montanhas Rochosas Entrando na parte principal desta contribuição, vamos assignalar os resul- tados obtidos com a reacção de Weil-Felix que praticamos com soros de ani- maes (macaco, coelho, cobaia) inoculados com o virus de S. Paulo, mostrando, comparativamente, os que obtivemos em alguns animaes inoculados com virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas. 8 Travassos * Monteiro — fí. de Weil-Felix no “T. exanth.” experimental 65 Tcchnica e methodo de estudo Soros — Os soros de animaes, provenientes de sangrias feitas em differen- tes períodos, eram separados por centrifugação, empolados, convenientemente ro- tulados com os numeros e datas respectivas c conservados em frigorifico até o momento da prova. Proteus X — As differentes amostras de Protcus X, em suas variantes HO e O eram conservadas segundo as recommendações que Felix gentilmente nos enviou. De tempos em tempos praticavamos o reisolamento das colonias cm piacas de agar, isto sempre que se suspeitava a reversão O ►HO. A varian- te O era conservada em tubos de agar pcríeitamente sccco, sem agua de con- densação, o que difíiculta essa reversão. Reaeção — Os soros eram diluidos em agua physiologica e a emul ão mi- crobiana obtida de cultura em agar commum de 24 horas. A leitura dos re- sultados era feita após 2 horas de permanência dos tubos em banho-maria a 37° c, cm definitivo, após 18-24 horas de temperatura do laboratorio. Por esta ultima leitura poder-se-á ter uma idea cxacta quanto ás agglutininas do typo O, c>pecificas, muitas vezes não reveladas naquellc periodo. Resultados das experiências Reacções praticadas com soros de cobaias inoculadas com o i~irus do " Tyfho exanthcmatico de S. Paulo" Com estes animaes foram feitas duas series de experiências: a) reacções com soros colhidos durante a reaeção febril; b) reacções com soros colhidos cm differentes dias após a reaeção febril. Resultados durante a reaeção febril (Quadro III) — As reacções foram feitas com soros obtidos de sangrias praticadas do 3* ao 6* dia dc reaeção fe- bril. Os resultados com os differentes typos dc Protcus X são resumidos no Quadro III. Verificam-se reacções positivas (titulo ate 1/100) somente com a amostra XK, resultados que não são espccificos visto serem obtidos da mesma forma com soros dc cobaias normacs. Resultados afós a reaeção febril (Quadro IV) — Xcsta serie as cobaias foram sangradas desde o 2® ao 53* dia após a reaeção febril c os resultados estão resumidos no Quadro IV. Não levando em consideração os resultados com o Proteus XK, pelo motivo acima exposto, verifica-se, pelo quadro dos resultados desta serie, que cm 18 cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 66 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII soros de cobaias sangradas em difíerentes períodos, 6 deram reacção positiva, em titulos acima de 1/25, com o Proteus 0X19; 5 com o 0X2 e 5 com o OXL, tendo com este typo sido feitas reacções com soros de 12 cobaias somente. Com alguns soros (cobaias X.” 898 e 896) obtivemos titulos elevados (até 1/1600; com os Proteus 0X19 e OXL e 1/100 com o 0X2. Xão encontramos uma explicação que satisfaça plenamente na interpretação dos resultados obtidos com estes dois últimos soros assignalados. Talvez se poderiam attribuir a uma infecção anterior ou concomitante dos animaes com algum Proteus; todavia, o facto de serem do typo O as agglutininas verificadas torna pouco provável essa hypothese. Como para certos auctores o Proteus X seria uma evolução das Ri- ckettsias, poder-se-ia pensar que nessas duas cobaias essa evolução se tenha pro- cessado. Kuczynski e Anigstein, usando meios especiaes, afíirmam ter isolado o Proteus X de animaes infectados experimentalmente, porém as tentativas de Felix (7) têm sido negativas neste particular. Dos resultados desta serie pode-se ver que os soros de algumas cobaias apresentam, na convalescença dos animaes, agglutininas provavelmente especi- ficas para os tvpos de Proteus X19, X2 e XL. Resultados com soros de algutnas cobaias inoculadas com virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas (Quadro V) — Reunimos no Quadro V os resultados de algumas rcacções praticadas com soros de cobaias sangradas du- rante e após a reacção febril. Verificam-se resultados em geral negativos, não se levando em conta os com o XK, não específicos na cobaia. Apenas 1 soro de cobaia, sangrada após maior período e cuja infecção teve uma incubação mais longa, mostrou um resultado positivo, cm titulo a 1/80 com o Proteus X19. Reacções praticadas com soros de macacos ± coelho s-inoculados com o virus do " Typho exanthematico de S. Paulo” Resultados durante e após a reacção febril (Quadro VI) — Xesta serie são registados os resultados obtidos com soros de animaes sangrados após o período de reacção febril (coelhos) e do ultimo dia de reacção (macaco). Alguns dos coelhos haviam sido reinoculados com o virus. Observa-se uma maioria de resultados positivos (titulos de 1/50 e 1/100) com os typos de Proteus X19 e XL e menor numero com o X2. Para melhor juizo a respeito da presença de agglutininas nos soros dos coelhos, praticámos as experiencias descriptas em seguida. Resultados com soros de coelhos inoculados com os virus de S. Paulo c da Febre Maculosa c sangrados em differentes períodos (Quadro VII e Graphico I) — Sendo o coelho o animal de escolha para o estudo da variedade antigenica dos difíerentes virus das Rickettsioses, de accordo com os trabalhos, principal- 10 Travassos a Monteiro — /?. de Weil-Felix no “T. exanlh" experimental 67 - .5 u tz rz ITi m V > rz C "y O ~ ei n - D O* rt u r K *Õ »3 - et Q ej ,e? V» - o rt o 'tr o s 2 ; x ! c 1 1 ° ° 1 1 1 ° ° ° 1 I o 1 1 1 - £ . *% *** 1 l°° 1 1 1 ° ° ° 1 I o 1 I 1 V o % JL > X ^ O s 5 S w 8 8 8 8 i u; o X mt — 1/ •— p» 8S§8|8§SSSS8g 8 8 8 3 *5 ^ — y 3 o ooooooooooooo O O O i o «*• “ 2 1 S ooooooooooooo o o o 1 O. 5- X O ooooooooooooo oco X ooooooooooooo o o o 1 « « .2 .3 ■3 = -Ü * n - ç ^ X et mOOCNNN«ff CN Cs Ov o 1 1 1 c et \ fXi rt «3 5 n 2 z*>~z~ú è x s = * = 160 21 160 28 io 35 40 5 20 > 160 > 160 40 10 0 20 160 > 160 10 0 0 10 160 > 160 10 0 0 40 20 40 10 0 5 80 20 80 10 0 0 20 > 160 80 40 5 0 ■ > 160 80 20 5 <8 3 s 1 12-IX-33 19-IX-33 0 7 1 5 20 20 0 10 0 20 10 40 10 to 5 20 S 1 20 i Amanheceu mor- to no 11.* dia após inoculação. P s 12-IX-33 19-IX-33 26-IX-33 3-X-33 10-X-33 17-X-33 0 14 21 28 35 0 20 > m 160 so 20 0 20 > 160 160 80 20 0 0 160 160 10 0 0 0 160 160 10 10 5 20 40 40 0 0 5 40 40 40 10 0 0 10 > 160 160 80 10 0 20 > 160 > 160 40 10 . I 8 1 4 ' 12-IX-33 19-IX-33 26-IX-33 j - 160 5 20 160 “1 0 10 80 0 10 80 5 20 40 5 20 20 0 20 80 0 20 80 Morto por acci- dente após a 3.* sangria. Travassos a Monteiro — fí. de Weil-Felix no “T. exanth." experimental 77 mente, de A. Felix (6), resolvémos, em nova serie de experiencias, praticar as reacções com soros destes animaes inoculados com o virus de S. Paulo e san- grados em períodos successivos. A titulo de comparação fizemos a mesma ve- rificação em coelhos inoculados com o virus da Febre maculosa. 21 1, | SciELO 78 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII O Quadro VII resume os resultados obtidos com 5 coelhos inoculados com o vinis do “Typho exanthematico de S. Paulo” e 4 com o da Febre maculosa das Montanhas Rochosas. Para melhor interpretação dos resultados consignados, organizámos o Gra- phico I, com os principaes resultados obtidos com a variante O dos differentes typos de Prolcus X. Neste graphico, onde assignalamos o periodo de reacção fe- bril, as curvas de agglutinação podem ser melhor estudadas. Comparativamente aos dois virus estudados verifica-se por estes resultados: o) o Protcus 0X19 mostrou maior agglutinabilidade em presença das aggluti- ninas provocadas nos coelhos inoculados com o virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas. Nestes, os titulos attingiram 1/160 ou mais, enquanto, nos coelhos inoculados com o virus de S. Paulo, os titulos attingiram 1/80 em sua maioria. Verifica-se em ambos os casos, um augmento de agglutininas logo após o periodo de reacção febril, decrescendo posteriormente; b) o Protcus 0X2 comporta-se, mais ou menos, da mesma forma com ambos os virus, notando-se também um augmento após a reacção febril e posterior decrescimento, sendo a queda do titulo menos brusca com o virus de S. Paulo ; c) o Protcus OXK mos- tra titulos mais irregulares, ora não ultrapassando 1/40 e ora mais elevados. Ve- rifica-se com este typo maior estabilidade da curva de agglutinação, com uma só exeepção; d) o Protcus XL agglutina-se em titulos igualmente elevados com ambos os virus, attingindo 1/160 e mais, logo após a reacção febril, mas decres- cendo também de modo mais brusco com o virus da Febre maculosa. Num estudo de conjuncto destes resultados, nota-se somente certa irregula- ridade com o Protcus OXK; os outros comportam-se mais ou menos semelhan- temente, o que mostra corresponder aquelle typo a um antigeno de grupo(?). Alem disto, ao contrario do que Se verificou na infecção humana, o Protcus OXL e sobretudo o Protcus 0X2 agglutinam-se, na infecção experimental do coelho, pelo virus do “Typho exanthematico de S. Paulo”, em titulo relativamentc mais elevado do que o Protcus 0X19. Na Febre maculosa os Protcus 0X19 e OXL agglutinam-se em titulos mais elevados do que o OXK, relativamente aos soros de coelhos inoculados experimentalmente com o virus. SUM MARIO E CONCLUSÕES Pelos resultados das pesquisas agora relatadas na infecção experimental pelo virus de S. Paulo, estudado comparativamente com o da Febre maculosa das Montanhas Rochosas, ficaram evidenciados os seguintes factos: a) o Pro- tcus 0X19 mostra maior agglutinabilidade em presença de agglutininas provo- cadas pelo virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas e que attingem nos coelhos infectados com este vinis titulos mais elevados do que nos inoculados com o virus de S. Paulo ; em ambos os casos, o augmento das agglutininas se dá Travassos a Monteiro — R. de Weil-Felix no “T. exanth." experimental 79 após a reacção febril ; queda brusca do titulo, após certo período, na Febre macu- losa e menos brusca, mantendo-ee depois mais ou menos estacionada, no “Typho de S. Paulo” ; b) o Proteus 0X2 comporta-se de modo mais ou menos semelhante relativamente á infecção desse animal por ambos os virus, com queda mais brus- ca no caso do virus da Febre maculosa e menos brusca, mantendo-se depois mais ou menos estacionada, no do virus de S. Paulo; c) o Proteus OXK mostra cur- vas mais irregulares, porem apparentemente mais estáveis para o virus de S. Paulo; d) o Proteus OXL agglutina-se em titulos elevados rclativamente aos dois virus, com o máximo após a reacção febril, decrescendo também de modo mais brusco no caso do virus da Febre maculosa; e ) ao contrario do que se ve- rifica na infecção humana pelo “Typho exanthematico de S. Paulo”, o Proteus OXL e, sobretudo, o Proteus 0X2 agglutinam-se na infecção experimental do coelho pelo virus desta Rickettsiose.em titulos relativamente mais elevados do que o Proteus 0X19; f) na Febre maculosa das Montanhas Rochosas os Proteus 0X19 e OXL são agglutinados em titulos mais elevados do que o Proteus OXK; O) na infecção experimental do coelho e em presença de todos esses typos de Proteus X, a queda do titulo agglutinante é mais brusca e acccntuada nas inocula- ções com o virus da Febre maculosa das Montanhas Rochosas, sendo menos ac- centuada e mais estável nas inoculações com o virus de S. Paulo. ABSTRACT Felix’ findings as regards the presence of a principal antigen for Proteus 0X19 and, in a lower titer, of a group antigen for Proteus OXK in the S. Pau- lo spotted íever are confirmcd and serve to enlightcn the serological status of this infection. Furthcr tests made on the experimental infection caused by the S. Paulo virus comparatively with that by the Rocky Mountain virus have brought to light the following facts: 1. Proteus 0X19 shows a greater agglutinability by agglutinins originat- ed from the Rocky Mountain virus ; the agglutinin titer of the serum of rabbits «nfected with the latter is higher than with the former, its increase taking placc following the íever reaction in both infections; the decrease in the agglutinin titer is sharp and definite in the R. M. fever, whilst it is slowcr and sometimes interrupted in the S. P. íever. 2. Proteus 0X2 behaves more or less in the same way as Proteus 0X19 *n regard to the virus of either infection. 23 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 80 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII 3. The curves of the agglutinin titer as regards Proteus OXK are more irregular but apparently more stable in the case of the S. P. virus. 4. The agglutinin titer of Proteus OXL is relativdy high in both íevers, but it decreases also more sharply and deíinitely in the case of the R. M. virus. 5. The titer for Proteus OXL and particularly for Proteus 0X2 is rela- tively higher than for Proteus 0X19 in the rabbit experimental iníection caused by the virus of the S. P. spotted íever, the opposite being found in the human infection by the same virus. 6. The titer for Proteus 0X19 and for Proteus OXL is higher than for Proteus OXK in the case of the R. M. virus. In the rabbit experimental infect- ion the decrease of the agglutinin titer for all these types of Proteus X is consis- tently sharper and more definite in regard to the R. XI. virus than in regard to the S. P. virus. BIBLIOGRAPHIA 1. Pira. /. T.; Saltes Gomes. F. c L.; Fleury. J. P.; Meyer, J. R.; Castro. J. O.; Rodri- gues, C. 6 r Lima. H. da Rocha — CR. Soc. Biologie CVI (II) :1020. 1931. 2. Monteiro, J. Lemos — Brasil Medico XLV(47) :1109. 1931 et Mem. Inst. Butantan VI :3. 1931. 3. Pisa. J. T. — Com. Soc Mcd. & Cir. S. Paulo (Semana de Laboratorio) janeiro 1932. 4. Lima. F. de O. — These apres. á Fac. Med. Bahia. 1932. 5. Lima, J. Canvlho — Brasil Medico XLVII(4) :64.1933. 6. Felix, et. — Trans. Royal Soc. Trop. Med. & Hyg. XXVI(4) :365.1933. 7. Fetix, A. — Trans. Royal Soc. Trop. Med. & Hyg. XXVII (2) :147. 1933. 8. Pisa, J. T.; Meyer, J. R. & Gomes. L. Saltes — Ed. Soc. Editora Paulista. 1932. (Trabalho da* Seeç<5e* de Immunologia e Virus do Instituto Butantan, apresentado ao 2.* Congresso Medico Paulista em novembro de Pd Dado á publicidade em agosto de 19M) 42 RESISTÊNCIA DE DIFFERENTES GERMES PATHOGENICOS EXPERIMENTALMENTE ASSOCIADOS AO VIRUS VACCINICO R. GODIXHO (com 1 gravura no texto) 614.5Il-f5S9.93 RESISTÊNCIA de differentes germes pathogenicos experimentalmente associados ao vírus vaccinico POR R. GODINHO O descobrimento de Edward Jenner, em 1798, conseguindo immunizar o ho- mem contra a varíola por inoculação directa do cozv pox, assignala uma era que P°de perfeitamente ser denominada cra Jenneriana, distincta, por sua vez, de duas outras: a era pre- jenneriana, cuja característica principal c o emprego da variolização e a cra post-jenneriana, que corresponde ao uso do virus vaccinico preservado no laboratorio depois de cukura no organismo animal. Durante a cra pre- jenneriana só se conhecia e praticava a variolização, isto e > a passagem do virus da variola de indivíduo a indivíduo, visando a transmissão da doença em caracter mais attenuado. Iníelizmente, o recurso prophylactico também para facilitar a propagação das grandes epidemias de variola que v arrcram todos os cantos da terra. Todavia, de sua pratica intensiva, abrindo caminho á verificação da immunidade conferida ao homem pela contaminação benefica da variola bovina, resultou o descobrimento da vacei na de Jenner. A transmissão directa da pustula bovina a custo conseguiu acccitação uni- versal, arrostando uma das campanhas mais tenazes que a hygiene tem enfren- tado em todos os tempos. Entre outras razões predominava o receio dos incré- dulos de que os humores oriundos da vacca pudessem constituir uma ameaça de possível “vacalisation”, ou, vernaeularmente de “avacalhamento” da humanida- de. Mas, antes do occaso completo do século passado, o beneficio da vaccina vencia as derradeiras resistências, surgindo então a cra post-jenneriana, ou era propriamente do virus vaccinico autonomo que teve inicio quando Copemann, etn 1891, destacou do vitello a polpa vaccinica e a trouxe para o laboratorio sob 'íifluxo das conquistas de Pasteur. Desde então novos aperfeiçoamentos vem o processo conquistando até os nossos dias, assignalando-se, entre os principaes, a •apino-receptividade que dá logar, alem da lapino-vaccina de Gailleton, a orchi- '■'accina de Hcnseval, Convent c Noguchi, em 1910, e a neuro-vaccina de Leva- ^iti, em 1922. E dentro do mesmo proposito de purificação do virus pelo afas- 3 1, | SciELO 84 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII tamento dos germes de associação da polpa, outras conquistas de grande valor são feitas cm 1929, tanto na Escola Medica de Harvard, nos Estados Unidos, como entre nós, no Instituto Butantan, por meio da filtração do virus através de velas dratomaceas sendo que o producto aqui obtido foi, pela primeira vez no mundo, em condições de completa efficiencia para emprego immediato na pra- tica. Caminhando, finalmente, para um grão de aperfeiçoamento que todos espe- ram alcançar, procura-se, por toda parte, encontrar um meio de cultura do virus vaccinico in vitro, em estado perfeito de pureza e actividade. Esta summaria descripção das principaes fontes de virus vaccinico para fins de immunização põe em evidencia a preoccupação que têm tido os pesquisadores de obtel-o tanto quanto possível em estado de pureza, isto é, libertado dos ger- mes de associação que vulgarmente o acompanham, obice maior á sua geral ac- ceitação. Os processos da technica moderna de preparo da vaccina e os rigorosos cui- dados que lhe são dispensados no laboratorio reduzem ao minimo o teor quali- tativo e quantitativo da flora microbiana associada, embora o ideal para a prati- ca seja o virus absolutamente puro, como ficou demonstrado em trabalho an- terior publicado nas Memórias do Instituto Butantan (1) comquanto, pela sua extrema exigência de condições especiaes de nianutenção da actividade, não se preste, larga inonu, a uso corrente entre nós. A contaminação de que se reveste a polpa vaccinica é propriamente nulla quando demoradamente depurada no laboratorio. Entretanto, não é para ser desprezado o grande cuidado que deve merecer cada partida de polpa, resultante da colheita de um vitello, visto que, cm circunstancias especiaes, uma contamina- ção de germes pathogenicos poderia ter logar durante o período de 120 horas consecutivas em que o animal permanece estabulado á espera do completo de- senvolvimento pustular. Tanto do organismo do proprio animal, como dos pro- duetos da ração alimentar ou ainda vehiculados pelos tratadores e por meios ou- tros inevitáveis podem chegar até a vasta area de pustulação di ff crentes germes ou esporas pathogenicos que, dc mistura com a polpa, seriam em conjuncto pre- servados até o momento dc ser esta entregue ao consunto. São bem raros os casos conhecidos na literatura medica de contaminação humana de tal natureza, mas, desde que possivd, não é injustificável a insistên- cia na verificação do limite do seu perigo e dahi a natureza da orientação das presentes investigações, no particular das polpas vaccinicas do Butantan, unico centro produetor da vaccina neste Estado. Da flora normal das polpas vaccinicas — Estudos completos procedidos em todos os Institutos Vaccinogcnicos do mundo demonstram que, mesmo dentro de condições óptimas da technica de semeadura e colheita da polpa, afastada toda hypothese de infecção do animal vacdnifero, com immediata comprovação pela 4 R. Godinho — Germes associados ao vírus vacei nico 85 necropsia, a polpa fresca é acompanhada de rica flora de associação de germes cuja media oscilla ao infinito. Somente um longo período de depuração em baixa temperatura, pode atenuar esse teor de germes, sem o emprego de antisépticos outros, entre nós desaconselhado, a não ser a glycerina. Alem das verificações que fizemos em trabalho já publicado (2) para de- monstrar a possibilidade de reducção da flora microbiana da vaccina, revelam as fichas do nosso registo de polpas que, num total de 162 verificações durante o período de 1929 até o momento presente, apenas a partida Xo. 4711 teve de ser desprezada, logo depois da colheita, por ter a necropsia do vitello evidenciado iesões tuberculosas do parenchima pulmonar, não obstante prova negativa de tubercuiina feita previamente. Xenhuma das demais partidas revelou presença de associação pathogenica que indicasse o seu não aproveitamento. Xão obstante rara e esparsamente assignalados, germes altamente pathogeni- cos para o homem accidentalmente podem viver em symbiose com o virus vac- cinico e determinar infecções graves e mortaes. Para esses accidentes ainda em sessão de 5 de julho de 1932 M. Luciens Camus chamava a attenção da Academia de Medicina de Paris em virtude de re- clamações recebidas (3). Entre os germes que podem occasionar taes accidentes encontram-se alguns proprios do organismo bovino, v.g. o virus da febre aphtosa; °utros a elle adaptaveis, tanto do tegumento externo, como das mucosas ou do tubo gastro-intestinal e outros ainda vehiculados pelos alimentos ou pelos pro- prios tratadores. Procurando pesquisar o comportamento desses diífervntes germes vimos fa- 2en do, ha mais de um anno, detidas verificações, desprezando apenas a parte que respeito ao virus aphtoso cm virtude da existência de trabalho experimental completo a seu respeito. Technica empregada Tomamos em 4 de maio de 1932, como ponto de partida para o presente estudo, duas polpas em stock no Laboratorio Yaccinico da Secção de Virus do ^utantan, de Xos. 4762 e 4767 e delias destacamos determinado volume que ini- oalniente foi submettido a provas bacteriológicas e de verificação da actividade T* resultaram a seguinte demonstração: cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 86 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Xo. da partida | Evolução da Data da vaccina no colheita da vitello polpa Verificações bacteriológicas e dosea- mento da aetividade do virus Observações Data: 4-V-1932 4762 normal Inoculação em cobaia : Resul- tado negativo. Verificação de germes anaero- 18-III-1932 bios pathogeni- cos : Resultado negativo. No. de colô- nias de germes banacs por c.c. 800.000. Methodo de Gins DiL 1/10.000 + + + + > 1/50.000 + +++ 4767 normal Inoculação em cobaia : Resul- tado negativo. Verificação de germes anaeró- bios pathogcni- 28-IV-1932 cos: Resultado . negativo. No. de cok>- nias de germes ba na es por c.c. ' 950.000. Methodo de Gins Dil. 1/10.000 ++ + + > 1/50.000 + +++ Os resulta- dos dos exa- mes de am- bas as pol- pas indica- ram perfei- tas condições para empre- go. Apenas elevado teor de colonias de germes banaes em razão do curto espaço de tempo de permanência no frigo. Dc ambas as partidas de polpas distribuímos igual quantidade de 5 cc. em vidros apropriados dc pequeno tamanho e cm outros, de maior capacidade, um volume maior de 50 cc.. Nestes últimos semeamos, ao mesmo tempo, 10 gottas dc uma emulsão concentrada dc culturas dos seguintes germes: estaphylococcos, cstreptococcos ( raças virulentas); b. da tuberculose (typos humano, bovino e equino) ; Ebcrthella typhi, Saluionclla paratyphi e Saimonella shottmüUcri; Ebcr- thclla dyscntcrioc v. Shiga; Bntcella abortus (typo bovino) e Brucclla melitcn- sis; Closlridium iccUhii e germes esporulados: do tétano e do carbúnculo (*) (typos Fischer, B e B 4 ). Nos recipientes menores, contendo volume igual de 5 cc. de polpa, semea- mos 1 gotta, separadamente, das mesmas emulsões acima referidas para estudo isolado do seu comportamento em synibiose com o virus vacdnico. (*) Em Janeiro de 1932. G R. Godixho — Germes associados ao viras vaccinico 87 Com as precauções necessárias foi todo esse material collocado no mesmo apparelho de frigo a -10°C usado para depuração das nossas polpas e exames periódicos foram feitos com o fim de demonstrar a resistenda de cada um delles em associação com o virus e postos nas mesmas condições de ambiente por este exigidas. A partir dessa data, 4 de maio de 1932, durante o periodo successivo de 3, 6, 9 e 12 meses fizemos verificações consecutivas não só quanto á actividade do v >rus vaccinico como também em relação á resistenda dos germes que a elle foram assodados. O comportamento geral vae resumido nos dois quadros jun- tos e os respectivos protocollos de inculações em animaes apropriados, annexos ao presente trabalho. DISCUSSÃO E SUMMARIO A possivel assodação de germes pathogenicos ao virus vaednico, em virtu- de da sua fonte de origem bovina, adoptada pelos mais importantes laboratorios do mundo, desperta em primdro logar a preoccupação quanto ao virus da febre a phtosa, moléstia commum entre os nossos rebanhos e que pole ser transmittida ao homem. Já comprovada a assodação dos dois virus, deixamos por isto mesmo de Parte o estudo especial do seu caso e cm trabalho por nós anteriormente publica- do de collaboração com S. Calazans (4) accentuamos que: ‘*E’ facto fora de qualquer duvida que numa mesma polpa vac- dnica possam coexistir os dois virus, vaednico e aphtoso, sem que uma longa permanência em baixa temperatura exerça sobre qualquer delles influenda nociva. Alem dos trabalhos de Mohler c Rosenau (5) e das experiendas de M. Bdin (6) sobre a conservação c exal- tação da virulenda do virus aphtoso, por culturas simultâneas com o virus vaednico, um estudo completo sobre o assumpto vem publica- do nos “Annales” do Instituto Pasteur, deste anno, por Hcllsbergen, provando que os dois virus, mantidos em baixa temperatura, guar- dam integralmente as suas propriedades espcciacs”. Estaphylococcos — Os estaphylococeos são encontrados regularmente na P°lpa vaccinica e para certos auctores, como Ponndorf (7) não representam ger- 0163 pathogenicos tendo apenas papel preparador do terreno para o desenvol- Vlr nento do virus vaccinico. Sobre o assumpto, em trabalho que fizemos de Elaboração com J. Travassos (8) demonstramos, á luz dos modernos conhed- a invalidez desse conceito. E’ certo que, no commum dos casos, as varias raças de estaphylococcos en- tradas na vaccina não tem acção pathogenica para o homem; mas o desen- cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 88 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII volvimento da pustula vaceinica não está condicionado á sua presença. E' que o valor bactericida da glycerina e o longo periodo de permanência da polpa em baixa temperatura, de -10°C não são por si só capazes de extinguir, senão em parte, a flora de associação, como ficou demonstrado, pelas nossas verificações que as amostras pathogenicas de estaphylococcos semeadas ha mais de um anno na polpa mantiveram, pelo menos qualitativamente, a sua integridade. Estreptococcos — Provenientes tanto da pelle, como da saliva, muco nasal e fezes do vitello, varias especies de estreptococcos podem attingir a area de vaq- cinação e demonstrar a sua presença pelo maior ou menor gráo de reacção local que, por sua vez, indica desde logo cuidados especiaes para a colheita da polpa. Trabalhos de Belenky & Popowa (9) demonstraram que, na pelle dos vitellos, se encontram estreptococcos, entre os quaes, Estreptococcus acidominimus 34 e Estreptococcus zdridans bovis 27 %. Depois de descreverem os A. A. as princi- paes especies de estreptococcos encontrados na saliva, muco nasal e fezes con- cluem que das experiendas de 54 culturas recentes de estreptococcos do organis- mo dos vitellos, pertencentes a diversas espedes, se comportam os mesmos para animacs de laboratorio como não pathogenicos. A inoculação experimental que fizemos nas duas polpas de Nos. 4762 e 4767 de algumas amostras virulentas de estreptococcos mostrou que elles resistiram á acção depuradora da glycerina du- rante o periodo de mais de um anno comportando-se em condições de determi- nar intensa reacção geral e local nos animaes de experiencia, segundo demons- tram os respectivos protocollos e photographia annexa. Germes do grupo coli-typhico-dyscntcrico — Também os germes cujo habi- tat c o canal intestinal dos vertebrados podem, eventualmente, contaminar a pol- pa vacdnica. Expcrimentalmente elles se comportaram, como se vê dos quadros 1 e 2 apenas com persistência para a Escherichia coli, ainda no prazo de 6 me- ses. Os demais não resistiram á acção conjugada do irigo e da glycerina. Tuberculose — Ao lado da febre aphtosa, a tuberculose é sempre objecto de acurada preoccupação na escolha do animal vaccinifero e ante a íalübilidade d3 prova de tuberculina a pesquisa necroscopica de alguma lesão tuberculosa deve ser revestida do maior cuidado. O temor de uma contaminação tuberculosa pela vaccina sempre existiu e na longa campanha contra ella chegou mesmo a ser in- vocada a theoria de que a vaccinação preparava o terreno para a tuberculose. Dentro da lógica do moderno conceito da tuberculose seria de temer uma symbiosc dos dois virus, mas assegurada a permanência da polpa durante vario» meses em baixa temperatura, como praticamos, está, por sua vez, garantida a destruição do bacillo da tuberculose, porventura associado ao virus vaccinico. As nossas verificações comprovaram a nullidade da resi.-tencia do bacillo, quer do typo humano, como do bovino ou equino, a partir da primeira verificação, ao fim de tres meses. Devemos ainda assignalar que todos os cobaios empregado» 8 R. Godinho Germes associados ao virus vaccinico 89 nas provas de verificação de tuberculose foram previamente submettidos a provas de tuberculina. Germes esporulados — Tctano — O bacillo tetânico e seu esporo constituem, realmente, serio perigo no preparo da vaccina. Ha condições muito propicias Para que elle possa contaminal-a e a acção conjuncta da glycerina e baixa tem- peratura empregadas na depuração da polpa não chegam e influir na sua acti- vidade pathogenica. Na própria literatura da vaccina são conhecidos casos de tétano consecutivos á vaccinação (10). Demonstraram as nossas verificações que, tanto nas amostras de polpas con- taminadas isoladamente com o bacillo tetânico, como na amostra semeada com a miscellanea de vários germes, a sua persistência foi mantida perfdtamente inte- gral ainda depois de um anno, com todas as suas propriedades pathogenicas. Carbúnculo — Apesar de bem conhecida a longevidade de resistência dos esporos carbunculosos e estudada por numerosos auctores, em meio antiséptico e em baixa temperatura, esta longevidade não é conhecida com bastante precisão. Estudos de Seiffert (11) demonstraram grande valor bactericida da glycerina Para todas as bactérias da lympha vaccinica com excepção dos germes esporo- genicos, em ensaios realizados, entretanto, durante algumas semanas apenas. As nossas verificações tomadas, em relação a tres typos differentes de ba- cilo do carbúnculo, tanto em conjuncto com outros germes, como isoladamente, «n duas polpas vaccinicas differentes, ainda dentro do prazo de 12 meses, reve- laram franco poder pathogenico de todos elles. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 90 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII EXPERIEXCIA Xo. I — POLPA Xo. 4762 - 1 - (*) Polpa Xo. 4762 Vol. 50 cc. 1.* verif. c/3 meses 2.* verif. 6 meses 3.* verif. 9 meses 4.- verif. 0bstrva{õts 1 anno Preparada em « de maio de 1932 e semeada com 10 gottas da emul- são concentrada de cullura dos se- guintes germes : estaphyloeoccos, estreptococcos (raças virulentas) bacillos da tuberculose (typos hu- mano. bovino e equino) Ebrrthtlla t\phi. Salmonrlla paratsphi. Sal- inonella schottmüllrri. Efchrrichia cali. Ebrrthtlla dystntrriar. v. Shiga. Clostridhtm nrlchii. fíru- crlla mrlitrnsi «. bacillo do tétano e bacillo do carbúnculo (tvpos Fis- cher B e B4). + + + + e u £ • ~ -3 *> O < — 2 — Mesma polpa No. 4762. Volume de 5 CC. mais 1 gotta da emulsão de cultura de estaphyloeoccos. + + + + » — 3 - Idem, idem, mais estreptococcos (raças virulentas). _ — 4 — Idem. idem. mais bacillos da tu- berculose. (Typos humano, bovino c equino). » — 5 — Idem. idem. mais Ebrrthella typhi . » — 6 — Idem. idem, mais Salmonrlla pa- ratypki . _ 9 — 7 — Idem. idem. roais Salmonrlla schottmüllrri. _ — — — » — 8 — Idem, idem, mais Eschrrichia coli- — » — 9 — Idem. idem. mais Ebrrthtlla dys- rntrriar, v. Shiga. — — — — 9 — 10- Idem, idem. mais Clostridium artl- chií. + — — — > -ti- ldem. idem. mais Brucrtla abortus e mrUtensis. — — — 9 — 12 — Idem, idem. mais bacillo do tétano* + + + + 9 -13 - Idem. idem. mais bacillo do car- búnculo (typos Fischer Be B4) + + + + 9 Predominância do bacillo do tétano até no período de um anno. 10 cm SciELO 0 11 12 13 14 15 16 R. Godixho Germes associados ao viras vaccinico 91 EXPERIEXCIA Xo. II — POLPA Xo. 4767 - 1 - (•) Polpa X.» 4767 VoL 50 cc. 1.* verif. c/3 meses Z* verif. 6 meses 3.* verif. 9 meses 4.* verif. 1 anno Observações Preparada em 4 de maio de 1932 * «etneada com 10 gottas da emul- concentrada de cultura dos sc- S^intes germes : estaphyiococcos, estreptococcos ( raças virulentas ) “*ciIlos da tuberculose (tvpos hu- bovino e equino) Eberthella ‘Jphi, Salmonella paratyphi, Sal - "tone II a schuttmüUeri, Escherickia £«/». Eberthella dysentcriae. v. Clastrxdium tcelchii, Bru- cc//a melitensis, bacillo do tétano e b 5 ciUo do carbúnculo (tvpos Fis- ç her Ü e B 4). + + + + - u 3 • .2 *> 0 ^3 1 u < o Mesma polpa No. 4767. Volume de 3 cc. mais 1 gotta da emulsão de cultura de estaphyiococcos. o. + + + » Jdem, idem, mais estreptococcos 'aças virulentas). + + + -1- • — 4 — J*iem. idem, mais bacillos da tu- ^rculose. (Tvpos humano, bovino e equino). — — — > - õ Hem, idem, mais Eberthella typhs. — — — » 6 — Hem, idem, mais Salmonella pa- r <*lypki. — • — 7 — ‘■tem. idrm, mai» Salmonella Khottmullrrí. _ » - 8 — I4em, idem. mai, EschericUa coU. » 9 Hem. idem, mais Eberthella dy*- ^ teria e, r. Shiga. — — » - 10 - ' Hem. mais Clostridium trW- fsj/. * T + _L + » ,, . - ii - Ie ®« idem. mais Brucella abortus Melitensis. — - — » — 12 — Hem, idem. mais bacillo do tétano -i- + + + > — 13 — Hem, idem. mais bacillo do car- tninculo (typo* Físcher B e B 4). + + • + » (*) Predominância do bacillo do tétano até no periodo de um anno. 11 1, | SciELO 92 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII RESUMO 1. A flora normal das polpas vaccinicas, embora não exercendo papel in- dispensável na formação da pustula, não constitue elemento nocivo, uma vez reduzida qualitativa e quantitativamente pela acção bactericida da glycerina ou por outros meios não prejudiciaes ao vinis vaccinico. 2. Si o preparo da polpa não se reveste dos necessários cuidados technicos, a esta flora podem estar accidentalmente associados germes dotados de patho- genicidade, como certos vinis da febre aphtosa, germes do grupo coli-typhico-dy- senterico e germes esporulados como o bacillo do tétano e bacillo do carbúnculo. 3. Desta flora pathogenica accidental, com exoepção dos germes do grupo coli-typhico-dysenterico e dos bacillos da tuberculose, os demais podem resistir, mesmo depois de um anno, ao poder bactericida da glycerina, quando mantidos na polpa, em temperatura de -10°C. ABSTRACT The normal flora although playing no necessary rôle in the pustule me- chanism seems to exert no detrimental action on calf’s vacdne lymph provided that it be conveniently reduced both qualitatively and quantitatively by the ad- dition oí glycerin or by some other way not harmíul to the vaocine vinis. Some pothogenic germs such as the viras of foot-and-mouth disease, re- presentatives of the coli-typhoid-dysenteric group, and tetanus, anthrax and tu- berclc bacilli, may be found accidentally associated with this flora in case the preparation of the vaccine is not made under technical precautions. Of these germs only those of the coli-typhoid-dysenteric group and the tu- bcrcle bacillus are not ablc to rcsist the bactcricidal action of glycerin over a year in a vaccine batch maintained at -10*0. BIBLIOGRAPHIA 1. Monteiro, J. Lemos & Godinho, Raul — Do preparo da lympha vaccinica — Mem. Inst. Butantan V:3-23.1930. 2. Godinho, Raul — Da purificação da vaccina animal — Arch. Hygienc I V :75-79. 1930. 3. Cam-.is, M. L. — Rapport de la Commission permanente de la Vaccine sur plusieurs ac- cidentcs graves imputes à la vaccination — Buli. Acad. Med. CVII :933 . 1932. 4. Calasans, S. & Godinho, Raul — Possibilidade de contaminação da lympha vaccinica pelo vinis da febre aphtosa — Mem. Inst. Butantan VII -.269-281 . 1932. 12 R. Godinho — Germes associados ao virus vaccinico 93 3- Mohler, J. R. & Rosenau, M. — Contamination of vaccine virus by the virus of foot. and-mouth discases. — U. S. Dept. of Agriculturc B. A. I. Circular 147. June 16. 1909. 6. Belin. M. — Conservation et exaltation de la virulence du virus aphteux par cultures simultanées avec le virus vaccinal — C. R. Soc. Biologie XCIV :816.1926. 7. Ponndorf — Le staphylococcus albus du vaccin — Rev. Internat. Vaccine IV(1): 114.1913. 8. Travassos, J. & Godinho. Raul — Influencia dos estaphylococcos sobre a actividade do virus vaccinico — Mem. Inst. Butantan V II :261-26S.1932. 9. Belcnk y, D. E. & Popows, N. -V. — Streptococci of normal calves contaminating vac- cine — Zentralbl. f. Bakt. Orig. CXVIII :435-444.1930. 10 Deux cas de tétanos à la suite de la vaccination — New York. Med. Jour- nal (6) .1911 cil. in Rev. Internat. Vaccine 11(3) :395. 1911-12. 11- Seiffert, G — Zentralbl. f. Bakt. Orig. LXXIV:644.1914. (Trabalho da Secçlo de Virus e Viruslherapia do Instituto Bu- tantan, recebido em dezembro de 1931 Dado i publicidade em agosto de 1934). 13 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 lí. Godixho — Germes associados ao vinis oaccinico. Mm. Inst. Butantan Vo!. VIII, 1933-1934 L*»õcs produzidas pela vaccina normal (cm cima) c pela vaccina contaminada (cm haixo) 1, | SciELO INFLUENCIA D 0 pH SOBRE A ACTIVIDADE DO VIRUS VACCINICO POR R. GODIXHO e D. von KLOBUSITZKY 614. 321 + 612. 0144626 INFLUENCIA DO P H SOBRE A ACTIVIDADE DO VIRUS VACCINICO POR R. GODIXHO e D. VON- KLOBUSITZKY A necessidade do descobrimento dc mcthodos de controle da actividade do virus vaccinico surgiu desde quando a immunização contra a variola passou a ser ieita por meio da lympha preservada no laboratorio, depois dc destacada da pus- tulação dos animaes sensíveis. Abandonado o velho systema da vaccinação directa dc "pis-à-bras” c in- dustrializado o preparo da polpa nos institutos vacdnogenicos, começaram, desde logo, a apparecer os methodos de investigações da actividade da vacei na antes do sou emprego na pratica. O primeiro dentre os processos divulgados foi o dc Calmettc c Gucrin que aproveitou a receptividade do coelho, descoberta por Gailleton, em 1SS9. Este mcthodo, dado a conhecer cm 1901, é ainda hoje adoptado, com cartas modifi- ^Çõcs, por vários laboratorios e rccommendado, entre outros, pelo comité per- manente de variola e vaccina da Commissão dc Hygiene da Sociedade das Nações. Valendo-se dessa lapino-rcceptividade, Gucrin, Kelsch, Bclin c outros in- troduziram, posteriormente, modificações no primitivo processo de Calmettc c Guérin, c Chaumier, 1910, tentou instituir um mcthodo de controle humano. Henscval e Convent, quasi na mesma epoca, preconizaram um mcthodo baseado n o poder de neutralização do soro do coelho vaccinado. Em 1921, Groth expe- rimentou um novo mcthodo visando, ainda no coelho, a via intradermica. Gor- don e Sobernheim, respectivamente em 1923 e 1925, do mesmo modo que o Hy- Penic Laboratory de Washington cm 1927 (1), suggcriram alterações interes- ^tes no methodo de Calmette e Guérin. Todos esses processos de doseamento do virus podem ser enfeixados em nm só grupo com a denominação de dcnno-rcacçõcs, que se separariam dc outro, P°r sua vez constituído pelas cornco-rcacçõcs, baseadas, seja nas verificações °nginaes de Gorini, feitas em 1903, por meio de inoculação do virus na comca do coelho, seja, mais tarde, em 1925, nas de Gins, que usou para esse fim a tornea da cobaia. O processo de Gins proporcionou ao experimentador íami- 3 1, | SciELO 98 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII liarizado com o seu uso, um meio pratico e economico de determinar facilmente no laboratorio o limite de actividade do vinis vaccinico em qualquer estado em que este se encontre. A interpretação dos resultados no controle da actividade antigenica da vaccina exige, por sua vez, cuidados especiaes em virtude das ex- tremas variações individuaes dos animaes sensíveis, principalmente o coelho, cuja grande facilidade de infecção accidental já foi experimentalmente confirmada. Por outro lado, para a garantia da actividade da vaccina, como condição prin- cipal que lhe deve ser sempre assegurada, não bastam as precauções tomadas desde a selecção da semente para inoculação no animal vaccinifero até a sua colheita cercada de especiaes cuidados. Alem de grande numero de agentes de natureza physica, chimica ou biologica, todo o material de conserva que a seguir entra em contacto com a polpa pode exercer decisiva influencia na determina- ção ou perda de actividade do virus. Neste particular, as Secções de Virus e de Physico-Chimica do Instituto Butantan vêm emprehendendo, desde 1932, uma serie de verificações para bem esclarecer o problema da reacção das polpas e ter sempre garantido o grau de virulência da vaccina aqui preparada contra a variola. A primeira experimentação realizada foi no sentido de determinar a reacção cxacta das nossas polpas existentes em 1932, com difíerentes prazos de perma- nência cm baixa temperatura e, em seguida, o grau de actividade do virus vac- cinico. 4 Klobcsitzky & Godixho — pH e vaccina uariolica 99 QUADRO Xo. 1 Verificação do pH das polpas vaccinicas quando emulsionadas em glyce- rinas acidas, (“neutras” segundo os respectivos rotulos), de procedências di- 'crsas, e doseamento da actividade do virus. *Vo. das polpas Reacção Actividade do virus vaccinico pelo methodo de Gins DU. 1/10.000 Dil. 1/50.000 4689 .... SM ++ + + + + 4690 ... . 5.76 +++ + +++ + 4691 ... . 5.52 ++ + + — 4692 .... 5.60 +++ + +++ + 4694 .... 5.63 ++ + + + + + 4696 .... 4.92 4* + + “f* — 4697 ... . 5.16 ++++ + + + + 4699 .... 4.91 ++++ — 4700 ... . 5.66 J-+++ — 4701 .... 523 ++++ 4702 .... 526 ++++ 4-+ + + 4703 .... 5.02 ++++ + + + + 4704 .... 6.08 ++++ — 4712 .... 527 ++++ + + + 4713 .... 5.91 + + +4- + + 4739 .... 5.61 +++ + — 4740 .... 520 +++ + + + + 4758 .... 5.62 +++ + + + + 4792 .... 5.65 +++ + — 4798 ... . 5.97 ++ + + Todas as determinações foram feitas clectrometricamcntc, em condições na- ^Talmente muito demoradas, dada a viscosidade das polpas, cm cujo caso o cqui- kbrio entre o gas H c os ions de H só é alcançado muito lentamcntc. Os resultados de uma serie de verificações (Quadro No. 1) demonstraram T»e havia, incontestavelmente, um elemento a desviar o grau de reacção das P°!pas para um ponto de acidez e, por conseguinte, capaz de favorecer a destruí- do do virus, cuja integridade não é mais conservada desde que o pH chegue a fingir o indice de 4.0 ou se eleve a 10,0, de accordo com os estudos de Cun- nin gham e Maskar (2). Xo doseamento da actividade do virus vaccinico nem todas as polpas attin- ?' r am o limite “fortemente positivo” na diluição de 1/50.000 pelo mcthodo de Gins. Procurando, em seguida verificar a reacção das polpas rccem-colhidas desde a T*lla epoca, foi encontrado um resultado dentro do limite do ponto optimo c c ^ n ' a actividade do virus nas mesmas condições segundo demonstra o Quadro X°. 2. 5 100 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII QUADRO No. 2 Reacção das polpas in natura, recem-colhidas. e doseamento da actividacte do vinis vaccinico. No. das fotfas Reacção Doseamento do vírus vaccinico feio methodo de Gins. Dil. 1/50.000 4751 .... 6,67 + + + + 4752 .... 6.58 + + + + 4753 .... 6.74 + + + + 4754 .... 6.88 + + + + 4755 .... 6.74 -f + + + 4756 .... 676 + + + + 4757 .... 7,12 + + + + 4793 .... 670 + + + + ■«794 .... 6.76 + + + + 4795 .... 675 + + + + 4797 .... 6.76 + + + + 4798 .... 6.57 + + + + 4799 ... . 660 + + + + 4SOO .... 6.92 + + + + 4802 .... 6,70 + + + + 4803 ... . 8.00 + + + + 4804 . . . . 6 95 + + + + 4806 . . . . 6.67 T + + T 4807 . . . . 6.59 + + + + 4824 ... . 7.70 + + + + Tratámos, immediatamente, de verificar a reacção das glycerinas até então empregadas e fornecidas ao Instituto, de varias procedências, com a indicação de “neutras”. Em quatro typos analysados os resultados revelaram que taes glycerinas, tanto as de procedência nacional, como as estrangeiras, eram forte- mente acidas, o que explicava a tendcncia a franca acidez das polpas então exis* tentes no nosso laboratorio. QUADRO No. 3 Analyses procedidas cm glycerinas de vários typos correntcmente forneci- das ao Instituto Butantan. Marca da glycerina Reacção fotcnciometrico SCHERING 5,12 ELLEQUEIROZ 470 GLOBO 470 EVANS 475 6 Kloblsitzky t. Godixho — pH e vaccina variolica 101 Sendo a glycerina um producto largamente empregado nos laboratorios e centros de experimentação de natureza biologica, queremos chamar a attenção dos interessados para este ponto importante da questão, pois não é possivel encontrar tal substancia em estado de neutralidade. Com eí feito, normalmente 35 glycerinas são sempre acidas, e isto porque, ao serem purificadas por destil- ação no vacuo, não se separam completamente dos ácidos oriundos do proces- 50 geralmente usado na sua preparação, que é o da hydrolyse de substancias gordurosas por meio do addo sulíurico. Xestas condições, a própria glycerina bidestillada ainda pode conter traços desses ácidos. Na neutralização da glycerina temos usado, com resultado satisfactorio, ° hydroxido de Na ou un soluto tampão de phosphatos com pH 7,4. Do soluto ta mpão é geralmcnte sufficiente 1 cc. para 1.000 cc. de glycerina. Na neutrali- ^Ção com NaOH precisamos sempre determinar com exactidão a quantidade a 5c r usada. Xestas condições, depois que passámos a fazer no Instituto a neu- “•ralização systematica da glycerina empregada para emulsionar as polpas, estas, exames posteriores, feitos após quinze mezes de permanência no frigo a 10°C, têm demonstrado perfeita approximação do ponto optimo (pH 7,8) á integridade do virus; este, de seu lado, ao ser doseado, também tem revelado a ctividadc sempre positiva ainda na diluição de 1/50.000 pelo methodo de Gins, Sç ndo que bastaria para ser considerado em optimo estado de comcrvação desde 0 limite de diluição a 1/10.000, segundo esclarece o Quadro Xo. 4. QUADRO Xo. 4 Doseamento do virus vaccmico pelo •Vo. das polpas Reacfão methodo de Gins. DO. 1/50.000 4796 . 7.55 + + + + 4797 . 726 + + + + 4799 . 7.67 + + + + 4800 . 7.11 + + + + 4802 . 7.68 + + + + 4803 . 8.17 + + + + 4804 . 7.46 + + + + 4823 . # 726 + + + + 4826 . 7.13 + + + + 4828 . 7.45 + + + + 4829 . 7.91 + + + + 4831 . 7.84 + + + + 4832 . 3.01 + + + + 4833 . 8.11 + + + + 4834 . 8.10 + + + + 4835 . 7.81 4- + + + cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 102 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII RESUMO A interpretação dos resultados no controle da actividade antigenica da vac- cina que deve ser feita systematica mente antes do emprego humano, exige cui- dados e-peciaes em virtude não só das variações individuaes dos animaes sensí- veis, bastante conhecidas do experimentador familiarizado com o seu uso, como ainda do grande numero de influencias, de ordem phv-icochimica ou biologica, que determinam a diminuição ou perda da actividade do vinis vacdnico. Entre estas figura a da reacção das polpas porque a integridade do viras não é mais conservada, desde que o pH destas chegue a attingir o indice de 4,0 ou se ele- ve a 10,0. Xa determinação electrometrica de uma serie de partidas de polpas vaccini- cas do Instituto Butantan, emulsionadas em glycerina, foi verificada a existência de um elemento que desviava o primitivo grau de reacção quando recem-colhi- das, entre pH 6,20 e 8,17, para um ponto de accentuada acidez, com prejuizo para a actividade do virus. Analysadas as glycerinas empregadas na suspensão das mesmas polpas com a indicação de neutras, os resultados demonstraram que, tanto as de procedência nacional como as estrangeiras, eram fortemente acidas. Sendo a glycerina um produeto largamente empregado nos laboratorios e centros de experimentação de natureza biologica, è necessário chamar-se a attenção dos interessados para este ponto importante da questão, pois não é possível encon- trar-se tal substancia em estado de neutralidade. Com eí feito, normalmente as glycerinas são sempre acidas, e isto porque, ao serem purificadas por destillação no vacuo, não se separam compietamentc dos addos oriundos do processo gcral- mente usado na sua preparação, que é o da hydrolysc de substancias gordurosas por meio do acido sulfurico. Nestas condições, a própria glycerina bi-dcstillada ainda pode conter traços desses ácidos. Xa neutralização da glycerina usada no Laboratorio Vaccinico, emprega-se, com resultado satisfactorio. o hydroxido dc sodio ou um soluto tampão de pho* - phato com pH 7,4. Do soluto tampão c geralmente sufficicnte lcc. para 1000 ce- de glycerina. Xa neutralização com XaOH sempre se determina com cxactidão a quantidade a ser usada. Nestas condições, depois que se passou a fazer no Instituto a neutralização systematica da glycerina empregada para emulsionar 35 polpas, estas, em exames posteriores, feitos após quinze meses de permanência no frigo a -10°C, têm demonstrado perfeita approximação do ponto optimo (pH 7,8) á integridade do virus ; este, dc seu lado, ao ser doseado, também tem reve- lado actividade sempre positiva ainda na diluição de 1/50.000 pelo methodo de Gins, sendo que bastaria, para ser considerado em optimo estado de conservação, o limite de diluição a 1/10.000. 3 Klobusitzky * Godixho — pH e vaccina variolica 103 ABSTRACT The pH of the lymph occupies a prominent plaoe among the elements that must be carefully controled in the preparation of small-pox vacdne in order for tts activity not to be rapidly modiíied. By using the best brands of so-called neutral” glycerin it was found at the Instituto Butantan Vaccine Department the pH of the vacdne pulp originally near the neutral point or slightly alka- line rapidly changed towards addity with consequent decrease of the virus acri- An analysis made of these “neutral” brands of glycerin disdosed that they "ere all decidedly add so as to require a previous neutralization by sodium hy- 'iroxide or by a buffer sulphate solution to become acceptable for the vacdne preparation. 1 . BIBLIOGRAPHIA A method por estimating the potency of stnallpox vaccine — Hygicnic La- boratory Buli. (149) :l-27. — U. S. P. H. Service. Washington. D. C. 1929. 2 - Cunningham, J. & Síaskar, K, S. — The hydrogen ion content of vaccine etc. — Iml. J. Med. Res. XV (3) :819.1928. (Trabalho da» Secçfte» de Vtma e de Phyaico-Chimiea do In»- tiluto Butantan. janeiro de 1934. Dado A publicidade em agosto de 1*04). cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 615 97 -i- 541. 4:542. 65 UM MICRO-METHODO PARA PESQUISA DE VÁRIOS SAES DE ESTRYCHNINA POR D. VON KLOBUSITZKY Xo decorrer de certas experiencias de laboratorio, havianios observado ^ue o sal sodico do addo glycerophosphorico (glycerophosphato de Na, Xa-POíCgHgOs) dá um precipitado quando aquecido com sulfato de estrychni- n a. pelo que nos lembramos de pesquisar este phenomeno sob um ponto de v «ta mais geral. Novas experiencias mostraram-nos que a mencionada reacção de precipitação c característica de alguns saes de estrychnina, de que se presta mesmo para a pesquisa de pequenas quantidades. Nossas investigações giraram em torno dos seguintes compostos de estry- ríinina e alcaloides: a) sulfato, chlorhydrato, nitrato, phosphato, hypophosphito, arseniato, ca- codylato e glycerophosphato de estrychnina ; b) atropina c sulfato de atropina, chlorhydrato de morphina, veratrina, c^feina, digitoxina, chlorhydrato de pilocarpina, aconitina. Como reagente usámos o glycerophosphato de sodio cm solutos aquosos a 2, 20 c 50 e em quantidades variaveis, tendo logo verificado que os melhores resultados eram obtidos quando usavamos soluto a 4 % cm quantidades iguacs ; com solutos mais concentrados separava-se, sob a influencia dos saes de estry- chnina c ás vezes mesmo a frio, tanto glycerophosphato de Na, que sc tomava muito difficil o reconhecimento dos crystaes característicos dos saes dc estry- chnina. Achamos preferível a seguinte technica: Juntar 0,5 cc. do soluto com estrychnina num pequeno tubo centrifugo conico; addicionar o mesmo volume de um sol. a 47c dc glycerophosphato dc hs, agitar e aquecer até a ebullição. Após curta ebullição (meio minuto é *ufíiciente), resfriar o conteúdo do tubo centrifugo c centrifugar, quando os Sa es de estrychnina estiverem presentes em quantidades muito pequenas. Com mua pipeta capillar (pipeta de Pasteur) separar a parte fluida e com uma alça cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 108 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII de platina retirar um pouco do sedimento que é collocado numa lamina e, antes de seccar, examinado ao microscopio. Dos compostos de estrychnina examinados deram resultado positivo os se- guintes : sulfato de estrychnina chlorhydrato de estrychnina nitrato de estrychnina phosphato de estrjchnina glycerophosphato de estrjchnina Pelas formas crystallinas pode-se reconhecer com certeza de que sal de es- trychnina se trata, conforme se pode verificar nas annexas microphoíogra- phias (*), sendo que as formas crystallinas ou o tamanho dos crystaes não de- pendem da quantidade do composto de estrychnina. •Embora, baseado na forma crj*stallina, nada se possa dizer em relação ás reacções chimicas que se passam entre os mencionados saes de estrjchnina e o glycerophosphato de Na, todavia podem-se tirar da observação algumas sug- gestões : 1. *) é bem provável que o glycerophosphato de Na forme com os saes de estrychnina combinações complexas (segundo a theoria de Wemer), as quaes dariam formas crystallinas variaveis de accordo com as uniões dos saes de es- trychnina. Julgamos que essa supposição deva ser levada em consideração, porque os ciystaes são muito instáveis e facilmente modificados, pois, quando, p. cx., são expostos demoradamente em temperatura do ambiente, tornam á mesma forma, o que nos leva a pensar que este composto formado seja estrj- chnina livre. 2. *) pode-se tirar uma outra indicação sobre a natureza da reacção con- frontando-sc as figuras 1, 2 e 3: nota-se, com ef feito, que estas microphotogra- phias, apesar de differentes entre si, mostram alguns crystaes com formas idên- ticas, (prismas curtos c grossos, triângulos, hexágonos, octagonos) ao passo que as figuras 4 c 5 não têm formas idênticas, nem entre si, nem cm relação ás anteriores. Pensamos que o facto de o sulfato, o chlorhydrato e o nitrato de estrjchnina formarem crjstaes cm parte idênticos se pode explicar aihnittindo-se que haja uma reacção secundaria entre estes saes e o glycerophosphato de Na, de que re- sulta a libertação de uma parte de estrjchnina (**)• até 10 y até 50 Y (•) As photographias foram tiradas com um microscopio Lcitz cm luz polarizada, ccm objcctiva 3 e ocular 8. (*•) Foi verificado que não sc trata dc saes de estrychnina precipitados. 4 D. yon Klobusitzky — ilicromcthodo para saes de estrychnina 109 Além disso, esta supposição nos parece bastante provável, porque as formas crystallinas idênticas e acima mencionadas são muito parecidas ás que se formam sícundariamente, isto é, depois de seccagem do phosphato e do glycerophosphato de estrychnina. A presença de outros alcaloides mencionados no principio deste trabalho não atrapalha, nem lhe altera a sensibilidade. Apenas, como excepção, se verifi- ca que, na presença de aconitina, o chlorhydrato de estrychnina só pode ser pes- quisado numa quantidade de 150 Y- A prova não pode ser usada na urina, porque ella dá com o glycerophos- phato de Xa um precipitado volumoso, tornando mesmo impossível o encontro dos crystaes característicos. RESUMO Para o conhecimento de sulfato, chlorhydrato, nitrato, phosphato e glycero- phosphato de estrychnina em presença de outros alcaloides pode-se empregar Mm micro-methodo, baseado no facto de esses saes de estry chnina darem, com nm soluto aquoso a 4$í> de glycerophosphato de sodio, um precipitado de crys- taes característicos e facilmente reconhecíveis. ZUS AM M EXFASSUXG Es wird cine Mikromethode beschriebcn, dic es zulãsst schr klcinc Mcngen v °n Strychninsulfat, Strychninchlorid, Strychninnitrat, Strychninphosphat und Strychninglycerophosphat in Anwcsenhcit von andcren Alkaloiden nachzuwciscn Das Verfahrcn bcruht darauf, dass die crwãhnten Strychninverbindungcn °iit einer 4 %-igcn Xatriumglycerophosphatlõsung bcim Sicden charakteristi- sche une leicht erkennbare kristallicnische Xicderschlãgc gcben. (Trabalho da SeeçSo de Physko-chitnica do Instituto liutantan» a %rr publicado cm alcmlo im **Diocherat»che Zeitschnít** e apresentado em ferereiro de 1934. Dado á publicidade em acosto de 1934). cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 SciELO Jp 2 3 5 6 11 12 13 14 15 L cm ESTUDOS PHYSICO-CHIMICOS SOBRE PROTEÍNAS EM PRESENÇA DE ÁLCOOL D. VON KLOBUSITZKY (com 6 figuras no texto) I, | SciELO 61I.39S.12 ESTUDOS PHYSICO-CHIMICOS SOBRE PROTEÍNAS EM PRESENÇA DE ÁLCOOL *• Sobre a coagulação pelo calor das soro-proteinas em presença de álcool ethylico POR D. VON KLOBUSITZKY A coagulação pelo calor das soro-proteinas em presença de álcool consti- tu e objecto de relativamente poucos trahalhos e estes tratam quasi que cxclu- sivamente da proteína de Bencc-Joncs. Ha pouquíssimas communicações sobre e xperiencias feitas com soro ou com albuminas typicas (seralbumina ou oval- ^umina). Xa literatura que nos era accessivel só encontrámos indicações, quer obre a relação reciproca entre a acção do álcool e do sal, quer sobre o compor- tamento de proteínas que, com solutos tampão (em quasi todos os casos foram usados solutos tampão de acetato), davam uma reacção mais ou menos acida. Alem disso, a maioria dos auctores experimentava apenas com solutos albu- roinosos muito diluídos. Xão existem dados quanto ao comportamento do soro { °tal c de suas fraeções albuminosas na reacção normal do sangue, com um teor sal correspondente ás condições physiologicas. Sobre preencherem uma lacuna em nossos conhecimentos sobre as soro- Pfotetinas taes pesquisas são necessárias c úteis do ponto de vista puramente theorico. Com o uso do álcool como factor auxiliar da coagulação pelo calor, 0s phenomenos coHoido-elect ricos, que tornam as circunstancias mais compli- cas, passam para um plano secundário, de maneira que as alterações de dis- persão c estabilidade se processam em condições as mais simples possíveis, o r iue facilita sensivelmente a verificação geral das condições de deshydratação. Correspondendo a esse fim, esta parte do nosso trabalho relata as expe- r *cncias feitas com soro, fibrinoglobulina, euglobulina, pseudoglobulina c seral- *'Umina de concentrações diversas, nas quaes se conservavam constantes o pH 3 114 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII e as concentrações de sal dos solutos albuminosos, variando apenas as quanti- dades de álcool. Methodo Com soro desfibrinado de cavallo eram preparadas, por precipitações frac- cionadas com soluto de (XHsjnSOs saturado, fibrinoglobulina (saturação de 30%), euglobulina (saturação de 36%), pseudoglobulina e seralbumina. As differentes fracções eram previamente dialysadas, em saccos de pergaminho, com agua corrente de torneira e, depois de ter sido sufficientemente diminuida a sua conductividade, electrodialysadas, no electrodialysador de Pauli, entre duas membranas de pergaminho, ou em um electro-ultrafiltro (1) por nós construído, até obtenção de solutos perfeitamente livres de electrolytos, ou pre- cipitados. Os precipitados de fibrinoglobulina e euglobulina assim obtidos eram dissolvidos em quantidades minimas de XaCl physiologico. A pseudoglubina c á seralbumina addicionava-se NaCl deshydratado até a concentração final de 0,9%. A reacção de todos os solutos era, por meio de um soluto a 2 % de NasCOs, ajustada mais ou menos em pH 7,4 (*). O pH dos solutos prom- ptos para uso era determinado electrometricamente. Com excepção da fibrinoglobulina, da qual não conseguimos preparar um soluto sufficientemente concentrado (não achámos conveniente, em virtude das eventuaes alterações do grau de dispersão, proceder á concentração por meio de ultrafiltrações), preparámos solutos padrão a 30,00% de todas as ou- tras proteínas. A concentração desses solutos padrão era determinada pelo methodo micro- KjeldahL Para a diluição dos solutos padrão usámos sempre XaCl a 0,9 %, cuja reacção com o mencionado soluto de Xa 2 CO s estava iguai- mente ajustada ao pH 7,4. O soro obtido do sangue desfibrinado de cavallo era, sem tratamento nenhum, diluido com soluto physiologico de XaCl até a con- centração total de proteína 3,00%. Usámos o álcool cthylico, "pro analysc" de Merck, deshydratado por nós. As experiências foram executadas da seguinte maneira: de cada soluto de proteína preparavam-se series, contendo uma proveta 5 cc. desse soluto e quantidades variaveis de álcool, mas de sorte que o volume total da mistura proteina-alcool fosse igual em todos os tubos da serie. Isto se obtinha addi- cionando ao primeiro tubo de cada serie 3 cc. de soluto de XaCl physiologico. enquanto nos demais este soluto era juntado gradativameníe com o álcool. Sendo elevada de 0,5 cc. a quantidade de álcool em cada tubo seguinte da serie, quantidade esta que corresponde a uma concentração de 6 %, a concentração de álcool poude ser augmentada até 36 %. Conclue-se dahi que as concentrações (•) Em experiências previas verificámos qnc a baixa do pH em consequência da fer- vura é insignificante, pois representa menos de Q.l unidade. 4 D. vox Klobusitzky — Estudos physico-chimicos sobre proteínas 115 proteína effectivas na fibrinoglobulina eram: 0,93, 0,465 e 0,233 Ç», enquan- to nas demais fracções albuminosas e no soro correspondiam aos valores : 1,86, 0.93 e 0,465 fo A determinação da coagulação era feita em banho-maria, agitando-se cons- tontemente. O conteúdo das provetas era, durante toda a determinação, reme- ndo com o thermometro, o qual, afim de evitar o mais possível uma evapora- do do álcool e da agua, estava fixado, guardando, porém, liberdade de movi- mento, em uma rolha de cortiça. Mantinha-se, naturalmente, uma illuminação uniforme dos tubos. A verificação das alterações occasionadas pelo aquecimento era feita pela observação das seguintes circunstancias: opalescencia (Op.) t turvaçáo nitida (T. n.), flocos finos, com aspecto de fios (Fl. f.) e flocos grossos, granulosos (*• gr.). F J arte experimental Os resultados estão representados nas tabellas seguintes. A segunda co- lumna contém as concentrações percentuaes de álcool e as demais assignalam as temperaturas, nas quaes houve as alterações que constam da primeira linha. TABELLA I Fibrinoglobulina Concentração da proteína: 0.93% pH 748 No. CjHjOH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 62 66 63 72 2 6 59 63.5 65 67 3 12 524 57 59 60 4 18 48 534 55 55 5 24 * 42 46 49 V* * * Já opalcsce em temperatura ambiente (15*). TABELLA II , • ,t Fibrinoglobulina Concentração da proteína : 0,465 % pH 7,42 No. C 3 H 5 OH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 57 62 62 75 2 6 53 59 56 68 3 12 47 57 53 63 4 18 * 38 42 56 bota: * Já opalesce em temperatura ambiente (15*). 5 116 Memórias do Instituto Bulantan — Tomo VIII TABELLA III Fibrinoglobulina Ccncentração da proteína : 0.233 % pH 7.41 No. C.H.OH Op. T. n. FL f. Fl. gr. 1 0 55 64 .57 70 2 6 55 64 57 70 3 12 46 60 53 65 4 IS 38 43 45 35 5 24 * * 36 49 Nota: * Opalesce c mostra turvação em temperatura ambiente (15*). TABELLA IV Euglobulina Concentração da proteína : 1,85 Sé pH 750 No. c 2 h.oh Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 72 76 76 80 2 6 65 70 67 74 3 12 58 65 63 67 4 18 49 58 55 60 5 24 43 48 45 53 6 30 * Xotas * Opaicscc e apresenta forte turvação cm temperatura ambiente (15*). TABELLA V Euglobulina Concentração da proteína : 0.93 % pH 7.43 No. C-H.OH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 66 75 72 80 2 6 60 68 68 72 3 12 55 60 60 63 4 13 45 50 45 55 5 24 40 45 40 46 6 30 * Opalesce e apresenta forte turvação em temperatura ambiente (16*). G 118 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII flocos, porém o soluto, mesmo durante a fervura, permanece liquido e leitoso, sem que augmcnte o numero dos flocos. ** A 84* podem-se observar alguns flocos mais gros- sos. t A 85* observam-se alguns flocos mais grossos, tf Turvo a 65*, clarifica-se cotn a fervura, mas. depois de resfriado, volta a turvação. f * A 56* turva clarifica-se quando aquecido até fervura; após resfriamento turva-se novamente, t** Turva-se a 46*. á fervura c ao resfriamento comporta-se como o X* 5. tt* Já se turva em tempera- tura ambiente (19*). TABELLA IX Pscudoghbuliiia Concentração da proteina : 0.465 fc C 2 H 5 0H Op. T. n. Fl. f. pH 7,45 Fl. gr. 1 0 65 76 65 * 2 6 62 69 62 ** 3 12 58 66 58 t 4 18 52 57 52 tt 5 24 47 53 t* 58 t ** 6 30 tt* 42 40 50 .Votar : • Xão se formam flocos grossos. nem á fervura. Fervido a fogo livre, pode-se observar abundante floculação. ** Mesmo aquecido até fervura não ha floculação. t Comporta-se como o Xo. 7. tt A 80* apresenta maxima turvação. com a fervura clari- fica-se consideravelmente. Após resfriamento a turvação augmenta novamente. t * A observação é impossibilitada pelas muitas bolhas de ar. t ** Turva-se a 57*, clarifica-se á fera-ura, após resfriamento apparece novamente a turvação. tt ** Já se turva cm tem* peratura ambiente (19*). TABELLA X Scralbutnina Concentração da proteina: 1.86 ?c pH 7.40 No. CjHjOH Op. T. n. Fl. £. Fl. gr. 1 0 76 79 * 90 ** 2 6 73 76 * 86 t 3 12 67 72 * 80 tt 4 18 62 67 * 75 t * 5 24 55 60 * 68 t ** 6 30 45 53 ♦ 59 tt * 7 36 36 43 * 49 tt ** Xotas : * Ausência completa de flocos finos. ** A 86* torna-se turvo e gelatinoso. Aque- cido até fervura não se altera. Fervido ao fogo livre observam-se também flocos fino*- t A 81: turvo e gelatinoso: a difíerença. mencionada em Xo. 1. entre o aquecimento et® banho-maria c a fogo livre, existe neste como em todos os tubos da serie. t+ A 76* tof 8 D. yon Klobcsitzky — Estudos physico-chimicos sobre proteínas 119 ^-se turvo e gelatinoso, t * A 69* turvo e gelatinoso, f ** A 62* turvo e gelatinoso, tt * A 48* turvo e gelatinoso, tt ** A 48* turvo e gelatinoso. TABELLA XI Ser albumina Concentração da proteina : 0,93 Çó pH 7J5 No. C 2 H s OH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 77 84 • , 2 6 74 78 ** — 3 12 69 75 t — 4 18 64 70 tt — 5 24 57 61 tt — 6 30 49 55 58 62 7 36 39 t * 46 50 55 otas : Durante o aquecimento augmenta visivelmcntte a viscosidade dos solutos 2-7. N“ * * 5 : não se formam flocos grossos, nem á fervura. Fervido ao fogo livre, podem-se °t>servar flocos grossos. * Flocos finos isolados a 90*. ** Flocos finos isolados a 85*. t Flocos finos isolados a 80*. tt Não ha formação de flocos finos, t * Conscrva-sc «laro mesmo após 20 minutos de permanência cm temperatura ambiente (21*). TABELLA XII Scralbumina Concentração da proteina : 0,465 t fc. pH 7J8 Aoioj . ,! no, ; ^ocos No. CjHjOH Op. T. n. FL f. Fl. gr. 1 0 77 84 87 2 6 72 80 86 — 3 12 67 73 78 — 4 18 62 68 • — 5 24 59 64 ** — 6 30 50 56 t — 7 36 39 t* 46 tt — Não se formam flocos grossos. nem com aquecimento ao fogo livre. • Flocos olados a 69*. ** Flocos finos isolados a 65 *. t Flocos finos isolados a 60*. tt finos isolados a 49*. t • Conserva-se claro mesmo após permanência por 15 mi- 9 120 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII TABELLA XIII Soro de cavallo Concentração total da proteina: 1.86 fc pH 7.43 Na c 2 h 5 oh Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 71 76 81 — 2 6 67 72 78 ? — 3 12 60 66 82 ? — 4 18 54 59 * — 5 24 ** 47 t 60 6 30 tt tt t * 52 K otas : Nos. 1 - 4 : não se formam flocos grossos, nem mesmo fervido a fogo livre. A observação dos flocos finos é muito difficil nos Nos. 2 e 3. por causa das bolhas de ar. e dahi incerteza dos numeros indicados. * A 78* toma-se denso e as bolhas de ar impos- sibilitam a observação dos flocos finos. ** Opalesce já em temperatura ambiente (24*). t Observação de flocos finos impossibilitada pelas bolhas de ar. Gelatinoso a 35*. tt Turva-se cm temperatura ambiente, t * Gelatinoso a 48*. TABELLA XIV Soro de cavallo Concentração total da proteina: 0.93 «5. pH 7,41 No. CjHjOH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 74 78 84 — 2 6 69 73 78 — 3 12 62 67 73 — 4 18 51 57 71 — 5 24 * 45 ** — A fotos: Em nenhum tubo da serie formaram-se flocos grossos. nem com fervura a fogo livre. * Turva-sc cm temperatura ambiente (23*). ** Por causa das bolhas de ar não se podem observar os flocos finos. TABELLA XV Soro de cavallo Concentração total de proteina : 0.465 % pH 7,36 No. C 2 HjOH Op. T. n. Fl. f. Fl. gr. 1 0 74 78 70 2 6 62 70 62 — 3 12 58 68 • — 4 18 43 55 •* — 5 24 t — — Notas: Não se formaram flocos grossos em nenhum tubo da serie, nem quando fervidos a fogo livre. * Não ha flocos finos. ** Observação impossibilitada pelas bolhas de ar- t Opalesce já em temperatura ambiente (23*). • 10 D. vom Kujblsitzky — Estudos physico-chimicos sobre proteínas 121 Antes de pasarmos á discussão dos resultados, desejamos mencionar que t^bem fizemos algumas experiencias com íracções de pseudoglobulina. Nessas ^periencias a pseudoglobulina era novamente precipitada com um soluto de I XH 4 ),S0 4 saturado a 43 %, sendo considerado o precipitado como pseudo- globulina I e o filtrado como pseudoglobulina II. A dialyse e o preparo dos solutos promptos para uso eram feitos conforme está indicado na parte do me- thodo. Os resultados obtidos com esses solutos divergiam daquelles alcança- dos com os solutos de pseudoglobulina total apenas dentro do limite dos erros de observação, de maneira que nos restringimos á apresentação de uma tabella de cada um. TABELLA XVI Pseudoglobulina I Concentração da proteína: 0,39 5» pH 731 Na C 3 H s OH Op. T. n. Fl. 1. Fl. gr. 1 0 63 79 68 — 2 6 62 70 62 — S 12 56 66 58 — 4 18 52 57 52 * 3 24 47 53 •• 58 ó 30 t 42 40 50 •\oí" BiochemUche ZeitschrifU Dado à publicidade cm agosto de 1934.). 20 IMMUNIZAÇÃO COM O VIRUS VACCINICO CULTIVADO NA ALLANTOIDE DO EMBRYÃO DE GALLINHA R. GODIXHO ( com 2 grainras no texto) 61 « . 521 : 614 . 47 . IMMUNIZAÇÃO COM O VIRUS VACCINICO CULTIVADO na allantoide do embryão de gallinha POR R. GODIXHO A cultura do virus vacdnico em larga escala, fóra do organismo bovino, tem ^stituido preoccupação continua dos pesquisadores e visa, não sómente a sim- plificação do methodo de obter a vaccina activa, senão também a sua absoluta Pureza do ponto de vista bacteriológico. Datam as iniciativas neste sentido do começo do século actual, quando foram 'atentadas por Calmctte e Guérin (1) (1901); desde então uma serie de nota- '^s trabalhos a este respeito tem feito sequência: de um Lado apparcccram innu- tentativas de multiplicação do virus em differentes orgãos de animacs sen- Slv «s e, de outro, foi experimentada a sua cultura cm meios especiaes de labo- ^torio, tanto cellulares, como acellulares. Em continuação aos trabalhos de Calmctte c Guérin destacamee. entre os importante*, os de Henscval e Convcnt (2) (1910) e os de Noguchi (3) ^ 1915, de cultura do virus vacdnico, com propagação cm serie no testieulo do ^Iho, baseados todos nas verificações feitas por Coundlman (4) e outros sobre 4 localização do virus da variola cm differentes vísceras e orgãos; as pesquisas ^ Eornet (5) em 1913; os trabalhos de Edna Harde (6) em 1916, de cultura rirus em meio composto de plasma e córnea ou testieulo de coelhos e cobaias nor nines ; os resultados obtidos por Levaditi (7) em 1921, com a introducção do x,r Us vacdnico no ccrebro do codho, conseguindo a neuro-vaedna que lhe con- o nome; as verificações de Cracium c Oppenhdmer (8), realizadas no de- l^Htamento de pathologia da Universidade Jolm Hopldns sobre cultura dos gra- n . U '° s vaccinicos in vitro em tecido embryonario ; os trabalhos de Nye e Parker (9) cm 1929, demonstrando a multiplicação do virus em cultura de tcddos e ^ando á condusão de que elle não póde ser cultivado com o uso de teddo ou sob condições anaerobicas; as observações de Maitland c Maitland empregando meio composto de partículas de rim de gallinha suspensas em ^ ! *tura de sóro do mesmo animal c liquido de Tyrodc; as pesquisas de Eagles c c v-lean (11) em 1929, conseguindo não só a cultura em meio ccllular, mas ainda cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 134 Memórias do Instituto Bntantan Tomo VIII quatro gerações em subcultura. Ainda os trabalhos de Li e Rivers (12) em 1930, do Hospital do Instituto Rockeíeller. de cultura de uma amostra de neuro- virus, e os de Rivers e Ward (13) e (14) em 1931 e 1933, com o emprego tam- bém do embrvão de gallinha su penso em Tyrode como meio de cultura, obtendo quinze passagens successivas do virus com applicação do material da 10* e 11* passagem em immunização de crianças, com bom resultado. Apenas a duração da actividaie do virus, mantido embora em baixa temperatura, não ultrapassou de um mez. Xos laboratorios do Butantan tivemos occasião de emprehcnder também va- rias tentativas orientadas para o mesmo fim. Procurámos em 1931 repetir as ex- periências de Maitland e Maitland, semeando em particulas de orgãos de coelho novo o nosso virus filtrado. Obtivemos sensivel multiplicação, demonstrada por provas de vacccinação em coelhos, mas sem melhores resultados nas passagens successivas. Com J. Travassos tentámos também a cultura do virus vaccinico cm vários meios preparados com macerado de orgãos de coelho (cerebro e rim) em dií- ferentes temperaturas. Xão alcançámos, do mesmo modo, melhores resultados. Ainda com o mesmo fito de empregar nas tentativas de cultura do virus o te- cido cellular obtido pela technica de Carrel, fomos incumbido de estudar a espe- cialidade no Instituto Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro, cm 1932, e tratar da sua installaçâo no Butantan opportunamente. Xo decurso despas tentativas chegou-nos a publicação de Stevenson e Butler (15) sobre inoculação do virus na allantoide do embryão de gallinha, utilizan- do-se do methodo descripto por Woodruíf e Goodpasture (16). Aquelles aucto- res, lançando mão do virus -vaccinico isento de germes extranhos e obtido com toda precaução das vesículas de coelhos previamente inoculados eom o dermo-vi- rus, conseguiram infectar a membrana chorio-allantoidica de ovos íerteis no 12" dia de incubação, segundo technica especial, separando quatro dias depois a mem- brana referida, onde em grande extensão se dá o desenvolvimento da vaedna no seu proprio tecido. A vida do embryão ate ahi não soffre prejuízo, uma vez que o material inoculado não contem germes associados ao virus. Obtido o material livre de contaminação extranha, perfeitamente activo, as- seguram que a colheita correspondente a 28 ovos produz 36,0 grs. de polpa suí- ficiente para immunizar 7.000 pessoas. Verificações pessoaes Primeiros ensaios. — Sem demora procurámos repetir as interessantes ex- periências descriptas, dispondo, para facilidade das inoculações embryonarias (Fig. 1), do nosso virus filtrado obtido desde 1929 em Butantan (17). 4 R. Godinho — Ovo-vaccina varíotica 135 A technica por nós usada, com ligeiras modificações, foi quasi a mesma des- ^pta por Stevenson e Butler, só divergindo na escolha da semente, que da nossa I^ne foi conseguida com mais facilidade por termos á mão virus puro filtrado suspenso em caldo glycosado. Depois de mais quatro dias de incubação dos ovos a allantoide destacada do embryão vivo foi tratada então como a polpa comraum. Semeado o material em vários meios de laboratorio, este mostrou-se esteril e, 'eri ficada a actividade do virus por vários methodos, o resultado foi plenamcn- te satisfactorio. A actividade da vaccina assim obtida era igual á da polpa corn- am fomedda pelo vitello. Usando o mesmo material como semente em inoculação no vitello Xo. 26, Pesando 111 kilos, no dia 24-XI-1933, o desenvolvimento das pustulas foi per- 'dtamente normal, produzindo 80,0 gms. de polpa (Fig. 2). Ha a assignalar ain da que a pustulação se fez sem reacção geral ou local e sem infiltração no te- cido cellular subdermico, como acontece nas inoculações de polpas contaminadas conununs. Vários coelhos inoculados com o mesmo virus tiveram idêntica for* 1113 de pustulação normal e, trinta dias depois, reinoculados com a vaccina com- n,Ul n, mostraram-se completamente immunes. Observações experimentaes relativas ao virus vaccinico cultivado na allan- toide do embryão de gallinha I — Vitello (Photo 1) °- do animal Data da laceinação Resultado * 1 Quantidade de folfa obtida Doseamento do i-irus. Methodo de Gins. V 't«llo Xo. 26 24-XI-933 Positivo. Evo- lução normal da vaccina. Co- lheita cm 28-XI-933 80 gms. Dil. 1/10.000 + + + + > 1/50.000 + + + + cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII II — Coelhos A. Valor immunizante do vinis em relação á lympha comnuim. Animal Virus usado Data da inoculação Resultado Virus usado Data da inoculação Resultado Coelho No. 302 Virus de cultura no cmbryão de gallinha 6-XI-933 + + + + Postulação normal Vaccina commum 6-XII-9 33 Negativo Coelho Na 303 •% ■% > > > Coelho No. 304 Dil. 1/1000 12-XI-933 > > 13-XII-933 • Coelho No. 9 > > > > > > Coelho No. 10 Dil. 1/10.000 12-1-934 > > 12-11-934 > Coelho No. 11 Dil. 1/10.000 > > 12-11-934 > B. Immunização com a vaccina commum e ulterior inoculação com o virus de cultura no cmbryão de gallinha. I Animal Virus usado i Data da inoculação Resultado Virus usado Data da • inoculação Resultado Coelho No. 39 Polpa vac- cinica Na 4.788 15-XII-9J3 + + + + é' Virus dc cultura no cmbryão dc gallinha | 16-1-934 Negativo Coelho No. 28 > > J. + 4-+ ! > > > Coelho No. 45 > > + + + + > > > Passagens successwas do zdrus dc cmbryão a cmbryão — Embora posta tóra de duvida esta parte importante da questão pelos citados A-A. que, segundo re- cente publicação (18), já tinham obtido setenta e dnco passagens em serie, sem prejuízo para a integridade do virus, tratámos de repetir-lhes a pesquisa, pos- suindo no momento virus já na 14.* passagem. Os resultados da verificação d3 actividade do ovo-virus pelo methodo de Gins revelaram sensivel decréscimo desta em relação ás primeiras e ás demais passagens. 6 R. Godixho — Ovo-vaccina variolica 137 O exame comparativo, que fizemos com a vaocina commum, com o virus Puro filtrado e com o ovo-virus, demonstrou que a relativa acceleração, natural- tucnte observada, na reacção ocular, na qual se baseia o methodo de Gins, parece *r devida á interíerencia da flora de associação que, por um processo irritativo, prepara o terreno. Desde as primeiras 24 horas em seguida á escarificação da comea do animal de experiencia essa irritação parece preparar o terreno para a ceratite vaccinica. Esta, por sua vez, se evidencia, francamente, depois do 4.° dia nos casos de grande riqueza de virus. Com o virus puro filtrado, o processo de formação da ceratite é mais tardio, iniciando-se sempre depois do 5.° ou do 6.° dia. O mesmo se observa quanto á tormação da pustula nos indivíduos vaccinados com o virus puro, cujo cyclo evo- lutivo é diverso do da vaccina commum. Com o ovo-virus obtivemos este mesmo desenvolvimento tardio, tanto da p ustulação, como da reacção ocular nas cobaias. Apenas nas primeiras passa- gens do virus de embryão a cmbryão foi mais precoce c intensa a reacção: este phenomeno seria devido á provável existência de formas filtráveis de certos ger- mes existentes cm associação com o virus filtrado, formas essas que perdura- riam nas primeiras culturas do ovo-virus. Este assumpto constituirá objccto de Uma investigação especial, já por nós iniciada. Immunização humana. — Restava-nos também o estudo desta ultima parte c °nx) finalidade das interessantes pesquisas sobre o novo methodo de cultura do virus, que parece fadado a resultados mais animadores do que todos os demais a *c aqui tentados para substituir o clássico sys terna de inoculação bovina e ob- tenção da polpa, afinal, isenta de contaminação extranha. Emlrora não existindo duvida acerca da innocuidade da vaccina assim obtida, verificada a sua não pathogenicidade, por todos os meios de laboratorio e con- vencidos de que os seus resultados seriam perfeitamente idênticos aos que temos t*btido com o emprego do virus puro filtrado, ainda não tinhamos, todavia, feito a sua applicação humana, quando tivemos conhecimento, pela publicação já citada “Science”, dos exoellcntcs resultados obtidos com a sua applicação in anima n obilc, com todas as provas de immunidade cruzada e feita comparativamente eom a vaccina commum, com tal methodo, as vantagens foram consideradas bem Patentes, conforme se deprehende do seguinte trecho do alludido trabalho: “The lesions developing from thc virus cultivate.1 on the chick embryo •vvere slightly milder in their appearance. /The different stages of the lesion were dclayed about one day, as comparcd with those appearing from thc regular calf vaccine. Thcre was less in- duration of the surrounding subcutancous tissues, and the invol ve- ntem o í the adjacent lymph nodes was not quite so extensive. In the pustular stage the lesions from the chick strain of vaccine did not cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 1 38 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII contain as large an amount oi pus. The crusts were thinner and more ílaky and when separated did not leave so marked a depres- sion as those írom the calf strain oi vinis. On the whole the lesioní from the chick strain of vaccine were less painíul and caused less discomfort. The lesions produced by the %-accine virus carried through se* venty-five passages on the chick membrance were definitely milder throughout the first eight days oi their course, but passed through the successive stages in a typical manner. They then rapidly in- creased in severity to reach their height on the tenth to the twelíth day when their appearance was quite comparable to the lesions pro- duced by the regular calf strain of virus. The scars left by all the vacdnations are quite comparable as to size, all averaging about 1 to 1.5 cm in diameter. They are all slight- ly depressed below the surrounding surface. Those produced by the calf strain of virus are slightly deeper. There is evidently less :car tissue formation in the lesions produced by the chick strain of vac- cine, as they feel thinner and are less pitted and wrinkled.” Estas vantagens coincidem perfeitamente com os resultados do emprego por nós feito do virus puro filtrado e, cm 1930, referidas do seguinte modo ( 19) : “Applicação do virus filtrado na pratica Emprego do virus puro como semente e na pratica — Para a ve- rificação da actividade do virus puro, filtrado e dos resultados da sua utilização como semente, servimo-nos de um vitello, vaccinando-o, em uma zona do ventre, com o virus filtrado e, em outra zona, com a suspensão do virus não filtrado. As duas zonas, de cerca de 10 cm* cada uma, foram cscari ficadas, e os virus, na dose de 1 cc., fonun esfregados na respectiva zona, estando o operador com luva de bor- racha. Em ambas as regiões as pustulas se desenvolveram : com o vi ruí não filtrado, notou-se reacção local mais intensa, ao passo que coin o virus filtrado, não se observou reacção inflammatoria e as pustu- las, embora menores, se mostraram mais ty picas. Outro vitello foi vaccinado igual mente com o virus filtrado, conservado em condições favoráveis (abaixo de 0°C.) durante 2 me* ses. A pustulação mostrou-se bem característica, não se observando reacção inflammatoria. cm SciELO 1 0 11 12 13 14 15 16 R. Godinho — Ovo-vaccina variolica 139 Ainda outro vitello foi vaccinado exclusivamente com o virus puro e filtrado, já para uso industrial da vacdna, cora excellente re- sultado de desenvolvimento das pustulas e rendimento da polpa. Dean te destes resultados experimentaes e da applicação do virus no vitello, tratámos primeiro de %-erificar a immunidade conferida pelo virus filtrado era relação á lympha commum e vice-versa, em experiências cruzadas, em coelhos, e vitellos, para em seguida iniciar- mos o emprego do nosso virus filtrado, puro, na vaccinaçáo anti-va- riolica. Essa immunidade provocada pelo virus filtrado em relação á polpa vaccinica commum ficou bem demonstrada, tanto sob o ponto de vista experimental, por meio das citadas observações em coelhos e vitellos, como sob o ponto de vista pratico, em resultado da vaccina- çáo de pessoas, tendo igualmente sido verificado que a vaccina com- mum confere immunidade em relação ao virus filtrado. Para a applicação pratica, o virus filtrado é distribuído em em- polas de 0,5 cc., de modo a se tomar facil sua utilização. Essa quan- tidade é suíficiente para a vaccinaçáo de, pelo menos 5 pessoas, por- quanto as empolas contêm geralmente um excesso de produeto. Antes de se proceder á vaccinaçáo, é aconselhável fazer-se uma applicação previa de ether sobre a região a ser escari ficada c isto para se reduzirem as probabilidades de infecções secundarias. Em se- guida se deposita uma pequena gotta do liquido contido na empola em dois pontos sufíicientementc separados (região deltoidiana de preferencia ou outro qualquer ponto que se escolha). Faz-se então a escarificação do tegumento segundo os mcthodos usuacs, tcndo-sc sempre o cuidado dc evitar o appareci mento de sangue. Resultados clínicos — Ate agora praticamos com o virus filtrado 33 vaeti nações em pessoas, adultos e creanças, residentes em Butan- tan e proximidades. Quanto á evolução das pustulas, não se observa a rcacçáo local, muitas vezes intensa, como commununente. As pustulas são bem for- madas e cercadas por uma ligeira arcola pouco avermelhada. Pelas vaccinaçõcs já praticadas, verifica-se um resultado dc 100% de casos positivos cm primo-vaccinados ; em 19 revaccinados, 7 tiveram a vaccina propriamente dita, 11 tiveram rcacção dc im- munidade e em 1 o resultado é desconhecido. Para confirmação experimental da immunidade conferida pelo virus vacdnico puro e filtrado, praticamos, como vimos, algum tem- po depois, a inoculação da vaccina commum em 5 creanças que ha- viam sido primo-vaccinadas com o filtrado e em todas ellas observá- cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 140 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII mos reacção de immunidade typica, o mesmo acontecendo tanto no coelho como no vitello anteriormente vaccinados com o virus puro, filtrado. Devemos assignalar ainda que todos os individuos por este meio vaccinados apresentam um processo especial de cicatriz das pustulas, que não deixa senão uma imperceptível mancha com tendencia franca ao completo apagamento.” Deste modo começámos, sem receio, o emprego humano da vaccina de cul- tura no ovo e os resultados até agora são idênticos aos obtidos por Stevenson e Butler e as vantagens semelhantes as do emprego do virus filtrado que vimos praticando desde 1929. III — Observações clinicas Primo- loccinado Resultado No. Da lo N ome Idade Rezaccinado Primo- Rcac(& i Mccina iinmu * w 1 30-XI-33 M. M. 0. 4 Sim Sim 2 > L. T. 4 > > 3 > A. T. 0.7 > > 4 3-1-34 N. C S. 2 Sim Si® S 5-1-34 A. N. S. 2 > > 6 » S. S. 8 > > 7 > R. S. 6 > > 8 > S. S. 4 > > 9 > L. M. S. 2.9 > > 10 6-1-34 J. M. G. 5.6 > > 11 » F. R. G. 4 > 12 » W. R. G. 1.6 > > > 13 9-1-34 M. D. G. 4 > > 14 > A. D. G 2 > > > 15 > O. G. M. 2 > > > 16 > D. C. 1.8 > > 17 > B. C. 8 > 18 > J. C. 6 > > > 19 > J. C. F* 4 > > > 20 > D. R. B. \^ > > > 21 > Y. R. B. 3 > > 22 > M. L. C. 6 > 23 > J. I- C 4 > > > 24 > A. L. C. 1.7 > > > 10 R. Gooinho — Ovo-vaccina variollca 141 Resumindo estas considerações em tomo das tentativas, feitas por toda Parte, sobre cultura artificial do virus vaccinico para a sua obtenção em estado -e pureza podemos accentuar que nenhuma delias alcançou a desejada finalidade de substituir a bovo-vacdna com reaes vantagens. Embora podendo-se produzir em maior volume, sinão em escala industrial, a orchi-vaccina de Noguchi e a neuro-vaccina de Levaditi perderam o seu valor pratico por força dos estudos de Duran-Reynals (30) ; estes estudos evidencia- ram que os extractos de orgãos, principalmente de testiculo, exercem ef feito no- o%o sobre a vaccina, porquanto augmentam as lesões por ella determinadas. Por s ua vez, os tristes casos de encephalites post-vacdnicas, surgidos ultimamente, «>ntra-indicam também o emprego da ncuro-vaccina, embora não se acredite em geral seja esta o verdadeiro incitante daquella complicação. ; Das demais tentativas de cultura tn vitro, as baseadas no emprego de meios cellulares foram as que deram melhores esperanças aos pesquisadores e, na bi- bliographia do assumpto, chegamos a ver, com satisfacção, que Rivcrs e Ward, Jã citados, conseguiram quinze passagens em serie e até mesmo resuhado satis- 'actorio na applicação humana; todavia, o virus por elles obtido mostrou-se de fraco poder de preservação da actividade e por isso inefficaz do ponto de vista Pratico. O meio acellular é improprio á manutenção da actividade do virus vaccinico, Uuaesquer que sejam as condições da sua conservação. Para que perdure a sua integridade, mesmo quando mantido cm baixa temperatura, ao abrigo da luz e ern meio chimico optimo, é necessária a presença de cellula viva a clle adaptada. Si para tanto a cultura do tecido, como rotina, não tem dado os resultados pre- gos por Carrcl, é provável que a nova technica de aproveitamento da membra- ^ chorio-allantoidica do ovo, possibilitando a multiplicação de virus puro e cm In cio ccllular, consiga resolver o problema, porquanto a secular utilização do vi- Irilo, por si só, não tem podido fornecer o virus puro, apezar de todos os aper- feiçoamentos introduzidos na technica até o presente. RESUMO Muitas têm sido as tentativas, feitas por toda parte, para a cultura artifi- a al do virus vaccinico, mas nenhuma delias alcançou a desejada finalidade de rtibstituir a bovo-vaccina com reaes vantagens. A extensa bibliographia do assumpto mostra que os meios cellulares são os lüe têm dado melhores esperanças aos pesquisadores, porquanto a presença da ce Uula viva é sempre necessária á manutenção da actividade do virus vaccinico. taes condições, a nova technica de Stcvcnson e Butler baseia-se na ino- ^'açâo do virus na allantoide do embryão de gallinha, utilizando o methodo des- ^Pto por Woodruff e Goodpasture. Aquelles auctores, lançando mão do virus 11 1, | SciELO 142 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII vaccinico isento de germes estranhos e obtidos com toda precaução das vesiculaS de coelhos previamente inoculados com o dermo-virus, conseguiram infectar a membrana chorio-allantoidica de ovos ferteis no 12° dia de incubação, segundo technica especial, separando quatro dias depois a membrana referida onde em grande extensão se dá o desenvolvimento da vaccina no seu proprio tecido. A vida do embrvão até ahi não soffre prejuizo uma vez que o material inoculado não contem germes associados ao virus. Obtido o material livre de contaminação estranha, perfeitamente activo, as- seguram que a colheita correspondente a 28 ovos produz 36,0 gms. de polpa suí- íicientc para immunizar 7.000 pessoas. A secção de Virus do Instituto Butantan, ao decidir ensaiar essa nova te- chnica, levava a vantagem sobre os demais laboratorios de já possuir virus vac- cinico puro, obtido por previa filtração, conforme publicação feita em 1929, de sorte que facilmente conseguiu repetir as interessantes experiencias de Steven- son e Butler, obtendo, não só passagens successivas do virus de embrvão a em- bryão, como resultados satisfactorios com o seu emprego na immunização expe- rimental e na vaccinação humana, sendo de 24 o numero de casos até agora. As vantagens do novo processo coincidem períeitamente com os resultados obtidos no Instituto desde 1929, quando foi iniciado o emprego do virus puro, filtrado. E’ provável que a nova technica do aproveitamento da membrana chorio-allan- toidica do ovo, possibilitando a multiplicação do virus cm meio cellular, consiga resolver o problema do fornecimento directo do virus puro em escala industrial. ABSTRACT The Virus Department of thc Instituto Butantan has applicd with excellent results Stcvenson and Butler's techniquc of inoculation of vaccinia virus into thc allantoid of chickcn embryo, as originatcd by Woodruff and Goodpasture. In applying that techniquc thc Instituto Butantan had over the other laboratories thc advantage of alrcady possessing the pure vaccinia virus as obtained by f il- tration since 1929. The application of virus cultivated in successive passages from embryo to embryo has givcn in both experimental and human immunizat- ions (24 cases) the same good results as obtained with the pure filtered virus and described in Mem. Inst. Butantan V:3-23.1930. BIBLIOGRAPHIA 1. Calmctte, & Cucrin. C. — Recherches sur la vaccinc expérimcntale. Es sais de culture «in vivo* dc 1’agcnt virulent du vacei n — Annales de lTnstitut Pasteur XV (1) :166. 1901. 12 R. Gootxiio — Ovo-vaccina variolica 143 2. Henscval, SI. Sr Convent. A. — Contribution ■ 1'étude expérimentale : 1'injcction de vaccin dans Ies tcsticules — Bali. Acad. Roy. Méd. de Belg.que. Série 1 V.XXIV : 635.1910. 3. Xoguchi. H. — Pare cultivation «in vivo» of vaccine virus írec from bactéria — J. Exper. Med. XXI :539. 1915. 4. Coimrílman. IV. T.; SIagrath. G. B. &• Brinkerhoff. lí'. R. — The pithological anato- my and histology of variola — J. Med. Research XI:12.1904. 5. Fomct. IV. — Die Rcinkultur des Pockencrregers — Berlin. 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Duran-Reynals, F. — The effccts of certains organs from normal and immunizcd animais on the infccting power of vaccine virus — J. Exper. Med. L(3) :327.1929. (Trabalho da Secçlo de ' in» e Viru*lhrrap»a do Instituto Bo- ta ntan. recebido era maio de l í JTL Dado i publicidade em agosto de 19S4.) 13 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 í’. Godiniio Ovo-vaccina variolica Mcm. InsL Butantan Vol. VIII, 1933-1W4 Fig. 1 Enchcma de o/o de gallinba, com a xona da allantoide. enco- lhida para inoculação do riru» vaccinico, em corte tangencial. = , .> ; % r: c . Vitello No. 26, inoculado com ovo-vaccina c qu« produtiu Ms».* polpa. C~ \ 2 3 4 cm SciELO LO 11 12 13 14 15 16 UMA NOVA ESPECIE DE ESCORPIÃO DO GENERO BOTHRIURUS PETERS POR ALCIDES PRADO (com 2 gravuras no texto) 2 3 4 5 6 SCÍELO 10 2.1 12 13 14 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 593.»6:9S1 UMA NOVA ESPECIE DE ESCORPIÃO DO GENERO BOTHRIURUS PETERS POR ALCIDES PRADO Entre os espedmes de escorpiões existentes na collecção do Instituto Bu- ‘ a ntan, um se achava sob a rubrica de Bothriurus sp.. Examinado pelo prof. Mello-Leitão, do Museu Nacional do Rio de Janeiro, foi o mesmo confirmado c °mo representante de especie nova. Consta, pois, este trabalho, da descripção do holotypo, íemea, do Bothriurus ,nc llo-leitãoi, sp. n., nome este dado em homenagem áquelle distincto arachnologo ^sileiro. Bothriurus mellodeitâoi, sp. n. 9 — Cephalothorace pardo, ligeiramente marmorado, cm negro. Tcr- S 110 * da mesma côr, com uma faixa pardo-amarellada, mediana. Esternitos ^do-amarellados. Cauda uniformemente pardo-escura; vesicula pardo-aver- ^dhada, com a ponta pardo-escura. Palpos pardo-avermelhados, levemente ^^rmorados, cm negro. Patas pardo-amarclladas, com manchas reticuladas, ne gras. Cephalothorace : liso, brilhante, apenas com uma fileira estreita de grânulos 40 longo da borda posterior. Comoro ocular sem sulco mediano. Tergitos I a VI, finamente granulosos, com uma camada de grossos gra- nu *°> na sua parte posterior; tergito VII com grânulos grossos mais ou menos dl5 *minados. Bstemitos I a IV lisos; esternito V, com quilhas longitudinacs reduzidas. Cauda: segmentos I a III com as cristas mediano-dorsaes e latero-dorsaes COnr p!etas; segmentos IV c V, com as primeiras bem marcadas e as segundas ^^tes ; espaços entre as cristas escavados c finamente granulosos; face ven- ir al do segmento I, com quilhas longitudinaes nitidas; segmentos II a IV lisos; ^^S^nto V, granuloso, característico (fig. 1): uma fila de granulações algum ^ nto curva para cada lado, na porção posterior, que se dirige para a linha mc- ^ na . formando uma area terminal bem visivel; outra fila mediana de gra- cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 148 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII nulos se eleva a partir dessa area e se prolonga até á porção anterior; gra- nulações esparsas dos lados; vesícula lisa e chata na parte dorsal, granulosa e arredondada na ventral ; sulco liso para cada um dos lados. quasi lisas e ligeiramente escavadas no lado inferior; mão, cerca do dobro da largura da tibia; dêdo movei pouco menor do que a mão, com uma crista gra- nulosa flanqueada por cinco grânulos maiores. Paias: metatarsos III e IV, com duas filas inferiores, cada uma com dois espinhos na metade apicilar dos respectivos artículos; fi" leira mediana de pequeninas cerdas por toda extensão desses artículos ; metatarso II, apenas com dois espinhos inferiores; metatarso I, sem espinhos inferiores. Opcrculo genital: com duas placas triangulares, cujas bordas parallelas se juxtapõem na linha mediana. Órgãos pcctincos pi- Collcccionado por Sylvio Burian. Holotypo, femea, em vidro sob No. 93, na collecção do Instituto Butantan, tingue pelo numero de dentes pectineos, como também pela disposição das gra- nulações ventraes no segmento caudal V, alem das pequenas diversidades no colorido geral. in thc arrangement of the granules under ventral segment V and in colouration- Palpos: fêmur com minúsculas quilhas granulosas no lado inferior; tibias tahy. Estado de S. Paulo, Brasil. losos; pente (fig. 2), com 10 dentes. Medidas: comprimen- to total: 35 mm.; tronco 16 mm.; cauda 19 mm.. Mão 3 tnm.5 x 2; dêdo S. Paulo. Esta especic é affim de Bolhriurus signatus Pocock, 1893, da qual se di ? ' ABSTRACT Bolhriurus mello-leitãoi is described as a new species of scorpion ( Bothri u- ridae), differing írom B. signatus Pocock in the number of pectineal teeth. (Trabalho da Secção de Zoologia Medica do In, titulo un, apre**nUdo rm rra a£o«to df 19CM). 4 NOTAS SOBRE CHROMATISMO DE OPHIDIOS POR AFRANIO do AMARAL (eom 4 gravuras) ♦ 091.137 : 395. 121. SI NOTAS SOBRE CHROMATISMO DE OPHIDIOS III. L 7 m caso de xanthismo e um novo de albinismo, observados no Brasil POR AFRAXIO do AMARAL Xos primeiros trabalhos sobre anomalia de chromatismo em serpentes eu me Ocupei de casos de albinismo, respectivamente (1, 2, 3), cm uma “Boicorá” (Pscudoboa trigemina ) , em quatro “Cascavéis” ( Crotalus I. terrifieus) c em 121,11 “Dorme-dormc” ( Sibynomorphus turgiáus). A primeira Xota da presente serie (4) versou sobre a predominância do pi- mento vermcliio e a compieta ausência de xanthina cm um exemplar da rcíe- “Boicorá” ( Pscudoboa trigemina), recebido vivo da localidade Monte Azul, Paulo. A actual Xota diz respeito a dois novos casos de anomalia chromatica, o l.° quacs, porventura mais raro, consiste na predominância da xanthina que Su bstituc a melanina por todo o corpo do exemplar correspondente. P-stc caso era o seguinte: 1. Exemplar de Sibynomorphus turgidus (Cope), Xo. 8648, na col- ação do Instituto Butantan, recebido vivo de Bebedouro, S. Paulo c portador seguintes principaes caracteres de pholidose: supralabiacs 8/8; dorsacs 15; '*ntraes 162 ; anal 1 ; subcaudacs 58 pares ; exemplar jovem, com o comprimen- !r * to tal de 306 mm. — 62 mm. de cauda. Xo seu colorido falta completamentc qualquer indicio de melanina, de sorte ^ Jc manchas cephalicas, dorsaes c ventraes, normalmente pardo-escuras, ap- ‘^eciam nelle substituídas por zonas incoiores, separadas por faixas transver- ,Çs ou semi-aneis brancos ; o olho era, igualmente, incolor. Outro ponto curioso deste raro caso (Fig. 1 da estampa) de anomalia chro- ,n *tica reside no facto de o exemplar incriminado ter sido capturado no mes- ^ local e data que um outro quasi do seu tamanho, e. portanto, apparentemente 77,1 ifmão, mas de chromatismo normal, o qual corresponde á Fig. 2 da estampa. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 132 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Este exemplar é uma Ç , Xo. 8649, na collecção do Instituto Butantan, pos- suidora da seguinte pholidose : supralabiaes 7/7 ; dorsaes 1 5 ; ventraes 166 ; anal 1 ; subcaudaes 49 pares; exemplar jovem, com o comprimento total de 295 nun- — 50 mm. de cauda. O 2.” caso era representado por um albino, cujos caracteres são os seguintes : 2. Exemplar $ de Crotalus lerrificus tcrrificus (Laurentius), Xo. 8638, na collecção do Instituto Butantan. recebido vivo de Marilia, S. Paulo e por- tador dos seguintes principaes caracteres de pholidose: supralabiaes 14/14; dor- saes 27; ventraes 179; anal 1; subcaudaes 21; exemplar também jovem, com o comprimento total de 498 mm. — 38 mm. de cauda. A' semelhança do que occorreu no caso acima descripto, o colorido do pre- sente exemplar caracteriza-se pela falta completa de qualquer signal de mela- nina, cujas zonas de concentração macular, occorrentes na cabeça e, sobretudo, no dorso dos indivíduos nonnacs, são occupadas apenas pela xanthina, margeada internamente de erythrina, o que empresta ao dorso do indivíduo, quando vivo, um aspecto roseo-sulfuraceo, de grande eííeito ã luz directa, dado o contraste das tarjas brancas dos losangos ou rhombos ali existentes; olho apigmentado. Como si fora propositado para augmcntar o excepcional interesse desta observação de um facto já de si extremamente raro, ou para provar o valor do elemento coincidência nos cálculos estatisticos, esse exemplar de anomalia chro- matica (Fig. 3 da estampa) foi, como o anterior, capturado no mesmo local e data que um outro quasi do seu tamanho, c, portanto, apparentemente seu irmão, mas de chromatismo normal, o qual se acha representado na Fig. 4 da estamp 3 - Este exemplar c um cf , Xo. 8639, na collecção do Instituto Butantan, possui- dor da seguinte pholidose: supralabiaes 13/14; dorsaes 29; ventraes 169; anal 1; subcaudaes 30; exemplar jovem, com o comprimento total de 558 mm. — 55 mm. de cauda. Esta curiosa anomalia parece provar que. nos exemplares de colorido typico, as manchas escuras, cephalicas, dorsaes ou ventraes, são de facto resultantes 8a invasão da melanina e de sua concentração nos primitivos depositos de xanthm 3 no derma dos exemplares. ABSTRACT Two cases of pure xanthism in snakes are described, showing compl c,e absence of melanin. Thcse specimens, belonging both to the collection of In 5ÍI tute Butantan, are respectively : a young q of the Dipsadin Sibynomorfh** turgidus (Cope), and a young Ç of the Crotalid Crotalus terrificus tcrrif* cuS (Laurentius). 4 A. do Amaral — Chromatismo de ophidios 153 BIBLIOGRAPHIA Amaral, A. da — Albinismo cm cobra coral in Rev. Mus. Paulista XV:l-9. 2 tabs. 1927. 2- Amaral, A. do — Da occorrencia de albinismo em Cascavel. Crolalus tcrrificus (Laur.) m loc. cit. -.53-57. 4 figs. 1927. 2. Amaral. A. do — Albinismo cm Dorme-dorme (Sibynomorphus turgidus) in loc. cil. :59-62. 2 figs. 1927. Amaral. A. do — Xota sobre o chromatismo de ophidios — I. Primeiro caso de ery- thrismo em serpente, observado no Brasil in Mem. Inst. Butantan VII:75-79. 1 tab. 1932. (Trabalho da Secçio de Ophiologia e Zoologia Medica do Ins- tituto Butantan. apresentado em agosto de 1934. Dado á publicidade em dezembro de 1934). cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 598.12:591.9S6 ESTUDOS SOBRE OPHIDIOS NEOTROPICOS Novo genero e especie de Colubrideo na fauna da Colombia POR AFRANIO do AMARAL Xa Xota anterior (1) relatei observações systematicas por mim feitas em ^uas collecções de ophidios colhidos na Colombia, inclusive 3 especies novas, de 1 genero e 6 especies até então desconhecidos para aquellc jrais. Xessa Xota eu previa que, apesar de já ter elevado, o numero de especies até *ntâo ali registadas viria a augmentar consideravelmente com o estudo de ma- !ç rial mais abundante e de' collecções mais intensivas. Esta previsão acaba de Afirmar-se ao simples exame de um ]>equeno lote de sequentes conservadas, ^ me foi remettido para estudo por meu prezado corres pondente, Rev.® Irmão ^Hiel, do Collegio Departamental de San José, de Jericó. Esse lote, representado por 7 exemplares de especies differentes de colu- J rideos, comprehende um que corresponde a genero e especie provavelmente no- '°* Para a sciencia e que, por isso, vão aqui dcscriptos: Mastigodryas, g. n. Descri f>ção — Physionomia de Eudryas Fitzinger c Masticophis Baird * Gira rd. Corpo quasi attenuado; cauda antes longa; caleça algo alongada e Avaria; escamas dorsaes. lisas, sem fossetas apicilares, em 17 filas, reduzidas a pela perda de 2 filas lateraes; anal dividida; subcaudaes cm 2 filas. Es- Aellação cephalica c tamanho do olho semelhantes aos de Eudryas. Dentes tna *ülares 19, subeguaes, typo nitidamente syncrantcriano ; dentes mandibula- 21, ligeiramente mais longos adiante, de typo escaphiodonte. Este genero é affim de Eudryas Fitzinger e 3 íasticophis Baird * Gira rd. P^tingue-se de Masticophis, que foi revisto por Ortenburger (in Occ. P. Mus. Univ. Michigan Xo. 139, 1923) : pelo typo nitidamente syncrantcriano dos 'Ws maxillares ; pela relativa curteza da cauda; pela ausência de fossetas api- cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 158 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII cilares nas escamas dorsaes. Separa-se, igualmente, de Eudryas, que foi, ha pouco, objecto de discussão por parte de Stuart (*» Occ. P. Mus. Zool. Univ. Michigan. No. 236, 1932), pela maneira de reducção do numero de escamas dorsaes e que consiste na queda da 4* fila lateral; pela ausência de fossetas api- edares nas mesmas. Em trabalho recente (in Occ. P. Mus. Zool. Univ. Mi- chigan. No. 284, 1934), Stuart considerou typica de Masticophis a queda dessa 4.* fila na reducção de 17 para 15 filas dorsaes em serpentes desse grupo; toda- via, preferiu motivos de ordem geographica e caracteres penianos para ligar a sua nova especie ortenburgcri ao genero Coluber, acreditando (talvez um tanto apressadamente, em virtude da inexistenda de observações sobre exemplares vivos desse grupo e da insufficiencia de material conservado nos museus) que ella pudesse representar a forma primitiva de emergenda dos alludidos generos .\fasticophis e Coluber. Mastigodryas danieli, sp. n. Olho grande, cerca de metade do comprimento do fodnho. Rostral bem mais larga do que alta, apenas visivel de cima ; intemasaes quasi tão longas quan- to as prefrontaes; frontal cerca de 1 vez e meia tão longa quanto larga; parie- taes alongadas, algo mais longas do que sua distancia das intemasaes ; nasal subdi- vidida; frenal 1 vez e meia tão longa quanto alta; 1 preocular, extendida á su- perfície exterior da cabeça, mas não contigua á frontal; 2 postoculares ; 2 + 2 temporaes; 9 supralabiaes (4.*, 5.* e 6.* contíguas á orbita); 5/6 iníralabiaes contíguas ás mentacs anteriores, que são 1/3 mais curtas do que as posteriores, sendo estas divergentes c separadas por escamas para trás. Escamas dorsaes 17. sem fossetas apicilares. Ventraes 187. Anal dividida. Subcaudaes 70 pares. Coloração pardo-azulada, mais ou menos uniforme por todo o corpo, apenas mais clara ou acinzentada na face ventral. Dimensões: comprimento total 895 mm.; cauda 190 mm.. Holotypo : No. 8694, 9 . na collecção do Instituto Butantan, colhido em Medellin, Colombia, e recebido do Rev.° Irmão .Daniel, a quem a espede é dedicada. Os demais 6 exemplares de colubrideos desse lote e enviados da Colombia pelo Rcv.° Irmão Daniel, correspondem ás seguintes espccies: a) Colubrinae Xcnodon severus (Linneu) : o , No. 8688 coll. Inst. Butantan, procedente de Medellin e com 8/9 supralabiaes, 21 dorsaes, 142 ventraes, 2 anaes e 40 p. subcaudaes. 4 A. do Amaral — Ophidios neotropicos 159 b) Boiginae 1. Leplodeira amiulata amiulata (Likneu) : O . Xo. 8690 coll. Inst. Bu- ^tan, procedente de Medellin e com 8/8 supralabiaes, 21 dorsaes, 186 ventraes, 2 anaes e 91 p. subcaudaes. 2. Pscudoboa pctola (Likneu): Xo. 8691 coll. Inst. Butantan, proce- ^nte de Robledo e com 8/9 supralabiaes, 19 dorsaes, 19S ventraes, 1 anal e 100 P- subcaudaes. 3. Pscudoboa cloclia , (Daudix) ; c. Xo. 8692 coll. Inst. Butantan, pro- ^ente de La Seja e com 7/7 supralabiaes, 17 dorsaes, 205 ventraes, 1 anal e '4 p. subcaudaes. 4. Barbourina equatoriana Amaral: c, Xo. S6S8 coll. Inst. Butantan, pro- °cdente de Pensilvania e com 7/7 supralabiaes, 19 dorsaes, 212 ventraes, 1 anal e ^2 p. subcaudaes. Este exemplar, jovem como o typo por mim assignalado na collecção do Museu Xacional dos Estados Unidos (2) e de colorido igualmente roseo, delle 50 distingue pela presença de 1 pequena frenal de cada lado e de maior numero subcaudaes. A um exame meticuloso deste exemplar e do typo se tem a im- P r «são de se tratar de jovens de Pscudoboa cloclia (Daudin), embora desta Cs pecie os afaste a presença de menor numero de dentes maxillarcs c de escamas ^rgadas na fila vertebral. Todavia, cumpre ter em vista essa possível iden- bdade, examinando-se, para resolvel-a, series de exemplares de P. cloclia, de '"irias idades e procedentes do Equador e da Colombia, onde não é improvável < P |e occorra uma raça particular desta especie. 5. Stenorhina degenhardtii (Berthold) : c ", Xo. 8693 coll. Inst. Butan- 5an . procedente de Medellin c com 7/7 supralabiaes: 17 dorsaes, 148 ventraes, 2 a nacs e 42 p. subcaudaes. ABSTRACT Mastigodryas unicolor is describcd as representing a new genus and specics bc included in the Colombian fauna. Barbourina equatoriana is also report- ^ from Colombia in a lot of otlier common specics of snakes. BIBLIOGRAPHIA *• Amaral, A. do — Estudos sobre ophidios neotropicos. XXIX. Xovas notas sobre es- ^ pecies da Colombia in Mcm. Inst. Butantan VII:103-124. 1932. • Amaral, A. do — New genus and spedes of South American snakes contained in the U. S. Nat Museum in J. Washington Acad. Sciences XIV(9) :201-202.1924. (Trabalho tia Secçlo de Ophiologia e Zoolojra Medicado Ins- tituto Butantan, apresentado cm agosto dc 1934. Dado 1 publicidade cm dezembro de 1934). cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 SciELCVo 2 3 5 6 11 12 13 14 15 16 z cm 162 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Todavia, eu já demonstrei (11,12) a occorrencia de alguns casos de colo- rido atypico nessa especie, entre os quaes inclui os dois que serviram a Maga- lhães (13) de base á descripção da forma que, tendo considerado nova, chamou de Lachcsis inacquaüs. I. Invalidez de Lachesis inaequalis Das variações chromaticas offerecidas por Bothrops altermta uma das mais interessantes é justamente aquella apresentada pelos 2 exemplares que fornece- ram elementos á descripção de Lachcsis inaequalis, de cuja invalidez eu tratei nos referidos trabalhos (11, 12.) Magalhães, tendo provavelmente em vista o curioso chromatismo desses 2 exemplares, repetiu, mais tarde, a descripção de Lachcsis inaequalis cm publicação em separado (14), chamando-a novamente de “cspecie nora” [“Lachesis inaequalis", n. s.]. Tres annos mais tarde, ainda lhe repetiu a descripção (15), continuando a chamal-a de “especie nova" [“Lachesis inaequalis”, n. sp. -f- “Lachesis inaequalis” sp. nov.]. Em vista da invalidação, por mim suggerida, dessa sua especie, Octavio Magalhães encarregou E. da Fonseca Barros de um estudo comparativo entre inacqttalis e altcrnata. Xesse seu trabalho (16), que concluiu pela separação de inaequalis e altcrnata, Barros procurou demonstrar que a mim escasseava razão para as considerar synonymas. Porisso, sou levado a analysar-lhe as premissas, antes de tentar invalidar- lhe, definitivamente, a alludida conclusão. A. Inicialmente direi que, em sua publicação original, Magalhães infrin- gira certos preceitos da Systematica e das Regras Intcrnacionaes de Nomencla- tura Zoologica, a saber: 1. ° Com ef feito, este auctor patricio chamou a Urutu de Lachcsis altcr- natus. Mesmo que a Urutu fosse uma Lachcsis, seu nome especifico seria alterna - ta, porque a palavra Lachcsis é feminina. Portanto, o certo seria Lachesis al- tcrnata, de accordo com o art. 14 das Regras Intemacionaes. 2. ° Igualmente, ao publicar a descripção de Lachcsis inaequalis, chamou-a repetidamente de especie no% - a (“n. s.”, “n. s*p.”, e "sp. nov.”), respectivamente, em 1920, 1922 e 1925. Nestas condições, si algum zoologo, conhecedor portanto das regras de no- menclatura, desejasse, certo dia, citar por extenso essa especie de accordo com ° art. 22, ficaria em duvida sobre si deveria escrever Lachcsis inaequalis Maga- lhães, 1920, Lachcsis inaequalis Magalhães, 1922. ou Lachcsis itiacqualis Maga- Ihãcs, 1925. Essa citação dependerá de qualquer dos 3 trabalhos que, por acca- so, lhe cahir sob as vistas, conforme vão citados na “ Bibliographia” deste artigo- 8 A. do Amarai. — Ophidios neotropicos 163 3“ Ao demais, deixou de designar o typo de L. inacqualis. Manda a praxe internacional que cada auctor, ao descrever uma forma nova qualquer, a faça acompanhar de uma indicação que facilite o exame do typo. Par a tal fim, este deve vir acompanhado de um numero fixo, correspondente a «nia determinada collecção ou museu. 4.° Em qualquer das tres descripções originaes de Lachcsis inacqualis, de- P°is de haver dito, na introducção, que “foram enviados daquella villa para o Ins- touto de Hygiene especimes de uma cobra venenosa cuja classificação foi impos- Vt l”. Magalhães se referiu, explicitamente, a um exemplar ( 9 ) como si fôra o typo. Todavia, logo depois, af firmou que elle possuia “ventraes em numero de a 171”. Sendo impossível a um determinado exemplar possuir mais de um numero ventraes, fica-se na duvida sobre si essa femea era o “typo”, ou si a dacrip- Ç*o do “typo” foi baseada em mais de um exemplar ou “cotypos”. A resolu- to desta duvida é impossível á luz dos 3 referidos trabalhos. B. De seu lado, Barros, logo no inicio da revisão de inacqualis, mostrou em numero de 2 os especimes dessa serpente, estudados por O. Maga- lhães. 1. Em nota ao pé da pagina, accrescentou Barros que o genero Laclicsis é «« considerado por alguns zoologistas como tendo caido em synonimia a favor do Kcttero Bothrops”. Confesso desconhecer quaes são esses zoologos que consideram ter o nome Bothrops substituído Lachcsis em systematica ophiologica. Em trabalho publi- tdo cm 1926 (17) e baleado, em parte, nos estudos de Mocquard (18), sub- dkidi o primitivo genero Lachcsis, sensu Boulenger, nos gêneros Lachcsis, Tri- 'fcresunis e Bothrops; neste particular, sinto-me feliz em estar na companhia de Stejneger, Barbour, Schmidt, Ruthven. Xoble, Mcrtens, Müller, Parker e ou- ttos herpetologos de igual auctoridade mundial. Ao que me conste, nenhum de n ° s até hoje se lembrou de synonymizar Lachcsis com Bothrops. Temos dito, È JOr exemplo, e eu aqui repito, que espccies como alternata, atrox, ncuwicdii, c ottara e outras affins não se devem collocar no mesmo genero que mula. Com '•feito, a especie mula deve ficar aparte, no genero Lachcsis Daudin, 1803 (ge- inonotypico), enquanto as demais se devem congregar no genero Bothrops ' V agler, 1824 (typo-atrox). O genero Lachcsis separa-se de Bothrops pelos ^guintes caracteres íundamentaes: a) Dentes pterygoideos nunca existentes além da articulação transverso- pterygoidea ; b) Escamas granulosas sobre a cabeça c tuberculares sobre o dorso; c) Escudos ausentes perto da extremidade da cauda, onde são substituídos 5 filas de escamas, cujas 3 medianas são estreitas, longas e espinhosas. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 104 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII [Xesta altura devo confessar que não sei bem como seguir a ordem chro- nologica das minhas citações, em virtude de, entre as prováveis datas de publi- cação do trabalho de Barros (1930 e 1931) e a de sua distribuição (fim de 1933), haver medeado a “Semana de Laboratorio”, realizada em janeiro de 1932 sob os auspícios da Sociedade de Medicina e Cirurgia de S. Paulo e de ter eu, em uma de suas reuniões, tido ensejo de communicar uma nota sobre variações de colorido em serpentes. Xessa occasião, coube-me a grata tarefa de mostrar aos collegas presentes, inclusive a Octavio Magalhães, auctor de Lachcsis inacqnalis, dois exemplares de Bothrops altcniala portadores de varia- ções chromaticas semelhantes ás descriptas naquella sua especie. A anomalia chromatica desses dois exemplares, por mim referidos em trabalhos anteriores (11, 12), tem-se apresentado em outros exemplares, posteriormente recebidos pelo Instituto Butantan, os quaes se acham, como aquellcs, á disposição dos in- teressados, para exame e verificação]. 2. Em seguida, Barros estranhou que, para passar inaequalis para a s>" nonyma de altcniala, eu me houvesse limitado a comparar os caracteres da pri' meira com os da segunda, em relação ao tamanho e forma, pholidose e marcas da cabeça e do corpo. Apenas isto. Xada mais. Devo dizer, de um lado, que, quando preparei os originaes do meu citado trabalho (11), tinha apenas em mão um exemplar (Instituto Butantan, Xo. 3009. colhido em Bagé, Rio Grande do Sul) de altcniala portador de alongamento e fusão dos ocellos lateraes. Cumpre-me accentuar, de outro lado, que, naquella occasião, Magalhães só havia publicado (?) o primeira c a segunda dcscripçõcs, aliás cxcellcntcs, de sua cspccic norva, nenhuma das quaes fizera acompanhar de gra- vuras. Porisso, naquella occasião preferi, por prudência, considerar inaequalis como "a local color racc oí B. altcniala”. Actualmente, depois de ter cxariU" nado as gravuras annexas á terceira descripção da espccie nova de Magalhães c reproduzidas em sua quasi totalidade na revisão de Barros. eu não consideraria inaequalis como representante de “uma raça chromatica local”, sinão apenas como mera “variação individual de colorido” de B. alternata. 3. Para demonstrar a “relativa raridade da especie” criticada, Barros al* legou que ella “parece, até, confinar-se ao Rio Grande” e que “em Bello Ho- rizonte, na secção antiophidica do Instituto Ezcquiel Dias, em 13 annos (191& - 1931) de trabalhos dessa secção, jamais se recebeu exempíar algum similhante”. Conforme veremos adiante, houve, no caso, confusão entre raridade de unta anomalia superficial e raridade de especie. 4. A proposito, Barros, para justificar tal “raridade da especie”, apr*' sentou um quadro dos exemplares de Urutu recebidos pela secção antiophidic* 1 daquelle Instituto desde 1919 até maio de 1931, os quaes eram em numero do longitudinal, de sorte a simularem, no ultimo caso, uma estria intercisa so- bre a 1.» fila de escamas dorsaes. As manchas lateraes propriamente ditas formam normalmente uma serie de ocellos renifonnes mais ou menos regulares ao longo de cada flanco. Como an °roalia, esses ocellos podem-se agrupar nos seguintes typos, além daquellc já P° r mim assignalado anteriormente (11 :tab.XII-fig.73) ; o) ocellos reduzidos, seja na altura, seja no comprimento e, portanto, bem 'b&inctos c separados entre si (Est. II — Xo. 7737 — coll. Inst. Butantan) ; à) ocellos com a orla para-vertebral achatada ou rectilinea, de sorte a ficarem separados dos do lado opposto por uma cspccie de eslTia clara medio- dor sal (Est. II — Xo. 8000 — coll. Inst. Butantan) ; c) ocellos alongados verticalmente c fundidos com os oppostos através da linha mediana (Est. II — Xo. 8381 — coll. Inst. Butantan) ; d) ocellos bem delimitados, completamentc circulares por força da fusão ^ suas extremidades; desse modo, o colorido do fundo do dorso fica conccn- lr ado em u’a mancha clara, tarjada de negro, a representar o centro do occllo f£*t. IX — Xo. 7672 — coll. Inst. Butantan) ; 0 ocellos cujas extremidades estão, pelo contrario, destacadas do corpo; ^Pparecem como 3 manchas, 1 superior, semi-lunar, e 2 inferiores, sub-arredon- 'kdas, a envolverem uma pequena mancha supplemcntar, também parda, tarjada ^ Hegro (Est. II — Xo. 8425 — coll. Inst. Butantan) ; /) ocellos virtualmentc completos ou quasi circulares, com o centro rcla- bvamente muito claro; a este typo corresponde o maior ajagamento das man- para-vertebracs c jara-ventraes acima assignaladas (Est. II — Xo. 7673 coll. Inst. Butantan) ; g) finalmente, ocellos fundidos entre si ao longo de cada flanco e a si- tiarem estrias, ora mais ou menos completas sob a forma de extensas linhas, ° ra relativameste incompletas, sinuosas ou onduladas pela persistência das cx- ‘Cniidades livres de seus elementos componentes (Est. II — Xo. S083 — coll. Butantan). A este ultimo typo correspondem, além dos 2 exemplares de ' na fqualis, os referidos especimes Xos. 3009, 6195, 7865, 7866 c 8083 da collec- do Instituto Butantan. 17 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 172 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII b. Variações tnorphologicas Depois de ter assignalado as mutações chromaticas por mim até agora ob- servadas em Bothrops altcnmta , devo examinar, á luz da biomeíria, as varia- ções morphologicas que nella tenho encontrado, afim de lhes verificar o valor em relação ao aexo e ao indivíduo. Posso desde logo accentuar que essas variações se mostram mais extensas quanto ao numero de escamas dorsaes, e de escudos ventraes e subcaudaes c menos nitidas quanto as demais placas e escamas. Apenas entre as ultimas di- rei que. na serie de exemplares por mim examinada e maior do que a utilizada por Boulenger, as supralabiaes variavam de 8 a 9 (excepcional mente 10) ; a 5 escamas inter-supraoculares oscillavam entre 9 (cxoepcionalmente 8) e 13 - e ~ ries; as infra-oculares, entre 1 e 4, apresentando-se separadas das supralabiaes por 1 ou 2 series de escamas. De referencia ás escamas dorsaes e aos escudos ventraes c subcaudaes, sua discriminação por sexo e por exemplares encontra-se no anncxo Quadro com a correspondente distribuição geographica, de accordo com os exemplares actualmcntc conservados no Instituto Butantan. A observação attenta desse Quadro I. particularizada aos individuos de cada sexo dentro da mesma distribuição geographica. dá margem ás seguintes indicações : la. as variações da pholidose são mais accentuadas entre os individuos de sexo opposto na mesma localidade do que entre os do mesmo sexo em locali- dades diversas; 2a. não existe, por conseguinte, relação, pelo menos apparente. entre 3 distribuição geographica c as variações da pholidose nos exemplares, do mesmo sexo, de Botlirops altcniata. Por esse motivo, resolvi completar a lista de exemplares de procedência co* nhccida, constante do Quadro I, com alguns outros, retirados do cobril do Ins* tituto Butantan c. portanto, já sem procedência. Estes acham-se arrolados n° seguinte Quadro II. O exame conjuncto desse Quadro II com o Quadro I fornece mais esta» indicações : la. as escamas dorsaes variam de 27 a 31 (excepcionalmente 32 ou 33) nos £ c de 29 a 33 (excepcionalmente 27 a 35) nas J 5 ; 2a. os escudos ventraes variam de 165 a 177 (excepcionalmente 161 3 183) nos o" c de 170 a 183 (excepcionalmente 164 a 185) nas 9 $ ; 3a. os pares de escudos subcaudaes variam de 40 a 49 (excepcionalmente 38 a 50) nos q £ e de 33 a 40 (excepcionalmente 31 a 44) nas Ç $ . Analysando-se agora biometricamente, em conjuncto, os exemplares cada sexo (Quadro III e Graphicos), chega-se ás seguintes conclusões: 18 A. do Amaral. — Ophidios neotropicos 173 QUADRO I EXEMPLARES DE B. ALTERXATA NA COLLECÇÃO DO INSTITUTO BUTANTAN (com procedência conhecida) Procede sei a No. Sexo E. DORSAES Vextraes SUBCAU- DAES do R:o de Janeiro (Carmo di Cachoeira) 8016 $ 33 178 35 de Minas Geraes (Alfcnas) 8385 O 30 175 45 » (Lambary) 8542 > 29 179 44 » (Trcs Pontas) 8543 > 29 177 46 > (Barbaccna) 8544 > 30 181 45 » (Campanha) 8546 > 27 171 46 » (Vicente Carvalhaes) 8547 > 29 165 45 » (.Trcs Pontas) 8616 > 27 179 42 » (Campanha) 8720 > 29 170 41 » ( Pedro Leopoldo) 631 9 31 174 33 » (Campanha) 7966 > 33 173 39 > (Vicente Carvalhaes) 8078 > 33 177 40 » (.Campanha) 8381 * 33 174 33 > > 8382 > 31 175 38 » (Poços de Caldas) 8389 > 33 176 34 » (Nogueira) 8392 > 33 179 35 > (Barbaccna) 8545 > 31 177 33 > (Fama) 8675 > 31 177 37 » (Tres Pontas) 8682 * 31 179 35 » (.Caxambú) 8721 31 173 33 > (Fama) 8723 > 31 168 36 > (Alfcnas) 8728 > 32 173 32 > > 8729 > 31 175 34 Eu * * 8730 > 30 172 36 Matto Grosso (Tercnos) 8540 29 180 45 > > 8623 > 32 177 43 > % 77 > 29 177 45 » (Campo Grande) 8680 > 31 174 47 * > (Terenos) 8622 9 31 185 39 '*«0 de São Paulo (Santa Adelaide) 5324 29 173 47 » ( Carambchy) 7865 > 27 168 46 > (Cons.® Martim Francisco) 7967 > 31 166 44 * (Monte Aiul) 7991 > 33 172 44 » (Desembargador Furtado) 8004 > 29 169 43 » (Macuco) 8009 > 29 167 45 > (Leme 8010 > 29 175 46 » (Cosmopolis) 8089 > 31 168 44 19 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 174 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Estado de São Paulo (Victorino) > (Itapolis) » (Cordeiro) » (Eng.° Hermillo) » (Araras) » (Vicente Carvalhaes) > (Villa Americana) > (Ibitirama) » (Butantan) » (Cosmopotis) > (Casa Branca) » (Eng.® Hermillo) » (Mogy Mirim) » (Cosmopolis) » (Macuco) > (Andrades) » (Tatuhy) > (Bariry) > (Cosmopolis) » (Mococa) » (Cesario) » (Collina) > (Alberto Moreira) > (Lobo) » (Icanga) > > > (Ibitirama) > (Palmar) > (Maninho Prado) » (Vicente Carvalhaes) » (Martinho Prado) > (Araras) > (Eng.® Coelho) » (Villa Americana) » (Andes) » (Terra Roxa) > (Remanso) Estado do Paraná (Joaquim Murtinho) * (Ponta Grossa) » (Fernandes Pinheiro) > (Balsa Nova) » (Pirahy) > > » (Araucaria) No. Sexo E. DOaSAES Vextraes ScbcaC- daes 8092 30 170 46 8387 > 30 168 43 8388 > 55 169 43 8395 > 31 172 42 8398 > 33 167 45 8415 > 31 174 44 8421 > 31 167 47 8427 > 29 174 45 3184 9 33 180 39 7673 > 31 176 cortad* 7988 > 31 174 44 7992 > 31 170 35 7993 > 27 171 39 8003 > 31 173 39 8008 > 31 178 38 8014 > 35 178 39 8017 > 31 179 39 8018 > 33 170 33 8072 > 32 172 35 8081 > 32 175 37 8090 > 33 176 38 8093 > 35 179 39 8095 > 31 172 39 8384 > 32 176 38 8390 > 32 177 17 + 8391 > 33 179 37 8396 > 32 174 23 + 8405 > 33 178 37 8409 > 33 184 36 8412 > 31 173 41 8414 > 33 181 38 8416 > 33 170 35 8422 > 33 164 34 8423 > 35 172 39 8424 > 33 182 39 8425 > 31 176 37 8426 > 33 172 34 5794 29 172 40 7866 > 27 169 44 7965 > 29 165 43 8013 > 27 171 44 8075 > 27 169 41 8079 > 29 172 47 8380 > 29 172 46 A. do Amaral — Ophidios neotropicos 175 Procede x cia No. Sexo E. DORSAES Vextraes SUBCAU- DAES do Paraná (Balsa Nova) 8383 d 27 170 43 » (Araucaria) 8386 9 31 173 42 » (Campo Lar* da Piedade) 8397 > 29 172 45 > (Balsa Nova) 8399 > 27 166 46 » (Entre Rios) 8514 > 29 164 41 » (Araucaria) 8339 > 29 171 47 > > 8549 > 29 16S 44 > (Balsa Nova) 8554 > 27 169 42 > (Araucaria) 8555 > 27 172 45 > > 8557 > 27 166 43 » (Lapi) 8615 > 29 175 45 > ( Balsa Nova) 8617 > 29 169 42 > (Curitiba) 8618 29 161 41 » (Entre Rios) 8620 > 28 172 41 > > 8621 > 29 174 46 » (Rio da Varzea) 8624 > 27 170 39 + > > 8625 > 29 163 43 > (Araucaria) 8627 > 27 166 43 > (Palmeira) 8629 > 29 167 45 » (Porto Amazonas) 8631 > 27 169 43 > > 8632 > 29 165 42 > (S. José dos Pinheiros) 8633 > 29 170 42 > (Palmas) 9634 > 29 167 45 > (Poma Grossa) 3165 $ 29 178 35 » (Entre Rios) 5241 > 29 171 31 > (Curitiba) 7672 > 29 174 34 > (Balsa Nora) 7989 > 29 170 37 » (Carambehy) 8006 > 31 177 39 * (Balsa Nova) 8012 > 32 173 35 > (Araucaria) 8015 > 29 170 34 > (União da Victoria) 8076 > 32 177 36 > > 8077 > 31 172 36 » i (Entre Rios) 8083 > 29 174 33 > > 8064 > 31 173 36 > (Ponta Grossa) 8393 > 31 170 39 > (Araucaria) 8406 > 29 175 36 > > 8407 > 31 174 40 » (Ponta Grossa) 8408 > 29 173 35 * (Balsa Nova) 8410 29 179 34 » > 8411 > 29 172 34 » (Araucaria) 8417 > 29 176 39 > (Carambehy) 8537 > 31 175 36 » (Curitiba) 8338 29 170 37 > (Araucaria) 8541 > 30 171 34 21 17C Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Procede x ci a No. Sexo E. DORSAES Ventraes Estado do Paraná (Araucaria) 8548 9 30 173 > > 8550 > 29 171 > > 8551 > 31 173 > > 8552 » 29 179 > > 8556 > 29 175 > > 8558 > 27 183 » (Porto Amazonas) 8559 » 33 172 » (Araucaria) ■'-24 > 30 177 > (Curitiba) 8630 > 29 176 Est. de Sta. Catharina (.Tres Barras) 8074 O 27 168 > > 8073 9 29 181 » (Taunay) 8394 31 174 F.st. do Rio G. do Sul (Pelotas) 656 ■* o 29 172 > (.AlegTcte) 664 > 29 168 > (Bagé) 3009 * 27 173 > (Sertão) 6195 29 163 » ( S. Leopoldo) 6900 > 29 173 » (Uruguayana) 7986 27 167 1 > ( Saican) 8094 31 169 » (Uruguayana) 8553 * 31 173 » (Capella) 8619 > 31 183 » (Restinga Sccca) 8678 > 30 173 > > 8679 29 166 > (S. Simão) 8681 > 30 176 > (Capella) 8722 > 32 168 > > 8725 29 173 Est. do Rio G. do Sul (Uruguayana) 7987 9 33 179 » (Saican) 8061 33 176 > (Tigre) 8082 32 185 > (Canóas) 8091 > 31 171 > (Rosário) 8400 > 33 174 > > 8413 > 33 176 » (Alegrete) 8560 > 31 180 > (Capella) 8561 > 33 175 > (Saican) 8626 > 31 177 » (Itaqui) 8669 > 31 178 > (Rosário) 8676 > 31 182 » (S. Simão) 8724 > 33 180 > (João Arreguy) 8726 * 35 184 > (S. Simão) 727 33 173 Republica do Uruguay (Melo) 8671 d* 29 170 > > 8670 9 33 175 > > 8672 » 30 171 > > 8673 > 35 175 > > 8674 » 173 22 A. do Amaral — Ophidios ncotropicos 177 QUADRO II EXEMPLARES DE B. ALTERNATA NA COLLEÇÃO DO INSTITUTO BUTANTAN (sem procedência conhecida) Procede x cia No. Sexo Vextraes EL DORSAES SUBCAU- DAES r 'l do Instituto Butantan 2065 • H» 47 > 5790 > 33 178 46 > 7737 > 29 174 40 > 7968 > 31 164 43 > 7969 > 29 163 43 > 7970 > 27 172 43 > 7972 > 27 168 32+n > 7973 > 29 168 45 > 7974 31 178 43 > 7975 > 29 168 39 > 7976 29 173 47 > 7977 29 165 40 > • 7978 > 31 173 46 > 7979 > 29 170 44 > 7983 > 29 167 33 > 7984 > 31 177 49 > 7985 31 174 45 > 7996 > 29 176 46 > 8000 29 177 45 > 8002 * 29 165 46 > 2565 9 35 178 40 > 2956 > 35 176 38 > 3305 > 31 178 38 > 4512 » 31 178 42 > 7960 > 33 169 37 > 7961 33 178 38 > 7962 > 35 174 36 > 7963 > 31 173 41 > 7964 > 33 183 39 > 7971 » 31 176 36 > 7980 » 33 174 39 > 7981 > 31 173 37 > 7982 > 31 176 37 y 7990 > 29 175 33 > 7994 31 181 33 > 7995 » 31 174 38 7997 > 33 178 34 > 7998 > 33 176 35 > 7999 > 33 180 39 > 8001 > 35 173 33 Alem dos exemplares acima, haviam sido anteriormente examinados alguns °* rtr os, procedentes da Argentina e do Paraguay. As variações de sua pholido- ^ c de seu colorido, no entanto, não trouxeram elemento algum novo a ajun- tar -se ás conclusões deste trabalho. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 178 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII QUADRO III VERIFICAÇÕES BIOMETRICAS SOBRE A PHOLIDOSE DE EXEMPLARES DE BOTHROPS ALTERXATA 24 A. do Amaral — Ophidios neotropicos 179 la. as escamas dorsaes apresentam maior tendenda a ser em numero dc 27 ou 29 entre os c? o* ede31 ou 33 entre as : $ ; 2a. os escudos ventraes apresentam maior tendenda a variar entre 168 e 173 nos £ e entre 173 e 178 nas Ç $ ; 3a. os escudos subcaudaes tendem mais a variar entre 42 e 47 nos cT O e entre 33 e 40 nas 9 9 . Taes tendendas surgem nitidas nos Graphicos seguintes : ca Redescripção de Bothrops altcnuita D. & B., 1854 Estampa III B°throps altcniatus Duméril et Bibron — Erp. Gén. VII:1512. tab. LXXXII : 1.1854. Lachcsis altcniatus Boulenger — Cat. Sn. Brit. Mus. 111:541.1896. ^-Qclicsis altcniatus Ihering — Rev. Mus. Paulista \ III :357 . 1910. 25 180 Memórias or do abdome uma lista estreita escura ao longo da linha mediana, desde as ultimas gutturaes até atrás da chamada região cervical, onde se confunde com 0 systema de manchas ventraes. Comprimento máximo — 1.690 mm.; cauda — 130 mm. (9). Distribuição gcographica: região centro-meridional do Brasil, Uruguay, 1’araguay e Argentina. ABSTRACT A revision is made of the description and plates of Lachcsis inacqualis Ma- S^hães, (year?) comparatively with a large series of spedmens (210) of Bo- thr °ps altcrnata Dm. & Bibr., 1854, its conclusion being that the former is a str lct synonym of the latter, of which it represents but a colour variation. This ^firms in general the previous study made by the samc reviser and jntblished ú» 1925. In the light of the present investigation the species Bothrops altcrnata is tedescribed. Its pholidosis variation is analysed and tabulated; its great marking v *riability is figured in severa! plates. B I BLIOGRAPH I A 1. 2. 3 . 4. 3 . 6 . 7. 8 . 9. 10 . U. 12 . 13. Dumêril c Bibron — Erp. Gcn. VII :1512. tab. LXXXII bi*:L-l.*. 1854. Guichenaud. in Castelnan — Anim. nouv. Amcr. du Sud — * Reptilcs: 76.1855. Jan — Icon. Gén. XLVII. tab. VI :1.1875. Boulengcr — > Ann. Mag. Nat. Hist. (5)XVIII:438.1886. Jan — Rev. & Mag. Zocd. :155. 1859. Boulenger — Cat. Sn. Brit. Mus. 111:541.1896. Ihtring — Rev. Mus. Paulista VIII :357. 1910. Brasil, V. — La Défense contre 1'Ophidisme (Butantan) :95. tab. XV. 1914. Houssay, B. A. — N. c. serp. ven. Rcp. Argentina, etc. :18. figs. 8 e 9 QA Flaiban, Buenos Aires) 1918. Serié, P. — • An. Soc. Cicnt. Argentina XCII : 1 7 1 . 192 1 . Amaral. A. do — Contr. Harvard Inst. Trop. Biol. & Med. 11:54-55. tab. XII: 6-7.1925. Amaral. A. do — Mem. Inst. Butantan VII :84. fig. 7.1932. Magalhães. O. — (A Folha Medica?). A’o/a : A separata está datada de 20-V-1922 c trai como capa um fac-simile de «A Folha Medica — Anno I — 16 de Março de 1920 — Xo. 3». Xessa revista, todavia, não foi publicado o trabalho original de Magalhães! 27 182 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII 14. Magalhães , O. — Idem. Bello Horizonte 20-V-1922 (Canton & Bayer, Rio). 15. Magalhães. O. — Metn. Inst. Oswaldo Cruz XVIII (1) -.153-154. 158-160. tabs. VII- XII. 1925. 16. Barros, E. da Fonseca — Aim. Fac. Med. Univ. Minas Geraes A. III. 1 : 129-138. fitP- 1-4, 6. 8. (.1931 ?). Xota : Esse volume dos Annaes foi distribuído em dezembro de 1933. A separata- que tem paginação diiferente, traz a indicação dos «Annaes de 1930> e esti datada de 9 de junho de 1931. 17. Amaral, A do — Rcv. Mus. Paulista XIV :34-40. 1926. 18. Mocquard Buli. Mus. Hist. Xat. Paris :1 15-1 17. 1905, et Miss. Scient. aux Mexiq 0 * :95 1.1909. 19. Gliesch, R. von — Alm. Agric. Brasil, (separata) :16. 1925. n*rahaIho d* SecçSo de Ophiologia e Zoologia Medica do I** títuto Butantan, recebido era novembro de 1934 e dado publicidade em dezembro de 1934). 28 cm SciELO 0 11 12 13 14 15 16 do Amarai. — Sobre a especie Bothrops alternata Mrm. Inst. Butantan Vol. VIII. 1933-1934. S390 Estarrpa I O* No*, quv appftrvfrvn nob as jrravura». corrr«pondrm a «fmplirw da rollecçáo do Instituto Itutantan A. no Amaral — Sobre a especie Bothrops alternata Mm. Inst. Butantan Vol. VIII. 1933*1934. *013 7737 *000 *381 Citampa I I O, Nos. que apoarvcvm sob as gravura». r»>rro»:«mdrm . evMrsdar» da colisão do InftitutD IhiUntin •«72 8425 171 cm Mnn. Inst. Butantan do Amaral — Sobre a espccie Bothrops a/ternata Vol. VIII. 19SS-19S4. SciELO Estampa III 0 11 12 13 14 15 16 59S.1SX COLLECTA HERPETOLOGICA NO NORDESTE DO BRASIL POR AFRANIO do AMARAL Relativamente pouco sc conhece sobre o caracter da fauna hcrpctologica do **tenso e arido districto nordestino do Brasil. Essa relativa ignorância é devi- ^ a que, para fins de collecta systematica, o Nordeste tinha, até agora, sido apenas percorrido: 1.®, pelos grandes naturalista» Spix e Martius, em sua conhc- c *da expedição scientifica, realizada, em parte, através da Bahia, Peniambuco c I‘iauhv (Mappa 1), no anno de 1818; 2.°, por Ernesto Garbc, o conhecido e ^udoso naturalista viajante do Museu Paulista, que fez ali, no primeiro quartel século presente, diversas incursões, capturando interessante material, repre- sado especialmente por Lacertilios, de cujas formas novas para a scicncia eu I a nie oecupci, cm grande parte, em trabalho anterior ( 1 ) , tendo, agora, cm ela- h°raçào o catalogo geral de todos os exemplares colligidos ; 3.°, por algumas Pisoas residentes na zona e que occasionalmentc enviavam exemplares para os ^Useus europeus e para o Instituto Butantan. Esta situação, no entanto, está eni via de ser comjietamesitc modificada por ‘ 0r Ça da creação da “Commissão Technica de Piscicultura do Nordeste do Bra- **' ’ sob a direcção do eminente zoologo, dr. Rodolpho von Ihering, que. com seus aa xiliares e companheiros, está a colher ali abundante material para levantamen- do Catalogo da Fauna Nordestina. Conforme indica o Mappa 2 (modificação f ‘ ç outro da C. T. P. N. B.), o districto que vem sendo percorrido pela Commissão, uma vasta area que, de uma maneira geral, sc poderia caracterizar pela ^tativa aridez. o que deve contribuir, naturalmente, para a concentração de for- ‘ ,las zoologicas especiaes e, provavelmente, não cncontradiças em outros pontos f ^ J território brasileiro. Até o fim de 1933, o material herpeíologico colligido pela Commissão e a remettido para identificação e tdterior accessão ás collecçõcs do Instituto tttântan, era representado por 12 exemplares de Ophidios e 65 de Lacertilios. 3 186 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII O P H I D I O S Fam. COLUBRIDAE Subiam. COLUBRINAE (series aglypha) Lygophis lineatus (L., 1758) Especie por mim registada (2) para as zonas septentrional, central e oca* dental do Brasil. Representada na collect3 da C. T. P. X. B. por 3 exemplares: No. 8702. Adulto cf . sem cabeça e com o ventre mutilado, procedente d e S. Gonçalo, perto de Macahyba, Estado do Rio Grande do Norte. V. 155 + n - A. 2. Sbc. 66 p. -j-n. No. 8703. Adulto <3 , procedente da mesma localidade. Spl. 8. V. 164. A. 2. Sbc. 71p.. No. 8704. Adulto ^ , sem cabeça, procedente de perto do Açude Cruzeta, Estado do Rio Grande do Norte. V. 165 + n. A. 2. Sbc. 78 p.. Colorido de todos, como no typo. Leimadophis poecilogyrus (Wied, 1825) Esta especie, por mim considerada communissima em todo o Brasil, es» representada por 3 exemplares, que correspondem a uma das raças em que cU a vou proximamente subdividir. No. 8705. Semi-aduito çj* , procedente de Umbuzeiro, Estado da Pa»' hyba. V. 151. A. 2. Sbc. 49p.. No. 8706. J ovem $ , procedente da mesma localidade. V. 148. A .2 Sbc. 50 p.. No. 8707. Jovem o , procedente da mesma localidade. V. 145. A. 2. Sbc. 49 p.. Colorido nos 3 exemplares typico da raça a ser por mim descripta. Liophis occipitalis (Jan, 1863) . Especie já por mim dada como occorrente na zona oriental até a meridi' 7 ' nal e Occidental do Brasil. 4 A. do Amarai, — Collecta herpetologica 187 Xo. 8708. Adulto $ , procedente de Areia, Estado da Parahyba, onde a es P e cie é conhecida pelo nome do "Cobra Jericoá." V. 168. A. 2. Sbc. 72p.. Colorido typico. Lioheterophis, g. n. Dentes maxillares 17, os 15 anteriores augmentando de tamanho para l ‘* s . diastema largo, os 2 posteriores muito grandes e col locados sob uma verti- ^ baixada da placa temporal anterior; dentes mandibulares subeguaes. Cabe- ^ ligeiramente mais larga do que o pescoço; oiiho moderado, com pupilla re- ^da. Corpo cylindrico; escamas dorsaes lisas, sem fosscías apiedares, em 21 *das ao meio do corpo; ventraes arredondadas latcralmentc. Cauda media (1/6 comprimento total) ; subcaudacs cm 2 filas. Lioheterophis iheringi, sp. n. Rostral mais larga do que alta, bem visivel de cima; intemasaes mais ^s do que as prefrontaes; frontal cerca de 1 vez tão longa quanto larga c 7 longa quanto sua distancia da ponta do focinho e quanto as parietacs; nasal dividida; f renal tão longa quanto alta; prcocular extendida á superfície supra- ^Pbalica, mas separada da frontal; post oculares 2; temporacs 1+2; suprala- ° lacs 8, a 4.* e a 5.* contíguas á orbita; mcntacs anteriores tão longas quanto c ntus largas do que as posteriores c contíguas a 5/6 infralabiaes. Escamas dorsa €s em 21 filas, com a forma 23-27-20-19-17-15. Ventrae; 151; anal Ivldida; subcaudaes 50 pares. Coloração — dorso pardo-plumbco com estreitas estrias negras transver- S4es > ligeiramente obliquas pana baixo e para trás, interrompidas por uma faixa C ‘ ara < mas apagada, longitudinal, começando depois do meio do corpo e desap- ^eeendo sobre a região anal ; cabeça negro- plúmbea, cm cima, com lábios e *‘ ar 8anta claros som manchas; face ventral esbranquiçada, com numerosas man- c " as transversaes cinzentas, sobretudo nitidas nos 3/5 médios do comprimento. Typo: Xo. 8362, ?, colhida viva, em Campina Grande, Estado da Para- is, conservada em perfeito estado. Comprimento total — 360 mm.; cauda 65 mm.. Especie dedicada ao dr. Rodolpho von Ihering. Xota: Em trabalho recente (Occ. P. Mus. Zool. Univ. Michigan Xo, 1-1932), Dunn achou indicado subdividir os generos Lcimadophis e Liophis, * Jr ' r mim reconhecidos na fauna ophidica ncotropica (Mem. Inst. Butantan IV: 5 188 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII 127-271.1929), em 5 outros generos, que assim se distinguiriam : A. Dentição maxillar diacraníeriana, com presas posteriores I. Hemipenis simples, de ponta calycular e livre Escamas sem fossetas apicilares Rhadinaca II. Hemipenis bifido, de ponta calycular e livre 1 . Escamas com 1 fosseta apidlar Dromicus 2. Escamas com 2 fossetas apicilares .... Alsophis III. Hemipenis bifido, de ponta acalycular e capitada Escamas com 2 fossetas apicilares Lciinadophis AA. Dentição maxillar syncranteriana, sem presas posteriores. Hemipenis bifido, de ponta acalycular e capitada Escamas sem fossetas apicilares Liophis Caso se acceitasse como definitiva esta subdivisão, o novo genero Liohc tcrophis, por possuir dentição maxillar de typo diacranteriano c não apresen- tar fossetas apicilares nas escamas dorsaes, deveria ficar ligado a Rhadinaca- Isto, naturalmente, si, conseguindo-se outros exemplares, inclusive o' 0 . de ihcringi (cujo holotypo é $ ), se verificasse que a estructura do hemipenis e semelhante á supra-assignalada para Rhadinaca: simples e de ponta calycular c livre. Mesmo assim, essa ligação não me pareceria de modo algum justificada, porque o genero Liohcterophis Amaral, representado pelo typo ihcringi, di í fere consideravelmente de Rhadinaca Cope, typo ver mitnaculai ice ps, pelos seguinte* caracteres fundamcntaes : l.° physionomia: 2° caracteres exteriores; 3.” cho" rologia, pois R. vcnnimaculaliccps occorre no centro-sul da America Central, en- quanto L. ihcringi procede do extremo nordeste do Brasil ; 4.° e principalmente, proporção da cauda cm relação ao total do corpo, que é approximadamente de 1 :5,6, cm Liohcterophis ihcringi contra 1 :2,8 em Rhadinaca vcnnimaculaticcp s ■ Subfam. Boiginae (series opisthoglypha) 1*56030800 trigemina (D. & B., 1854) Especie abundantíssima no Brasil. Xo. 8709. Adulto o » procedente de Umbuzeiro, Estado da Parahyba. V. 185. A. 1 . Sbc. 73 p.. Xo. 8710. Jovem ç? , procedente de Garanhuns, Estado de Pernambuco- V.179. A.l. Sbc. 66 n.. A. do Amaral — Collecta herpetologica 189 Xo. 8711. Jovem o*, sem cabeça, procedente de Umbuzeiro, Estado da Pa- rahyba. V -187-f n . A.l. Sbc. 60 p.. Colorido dos 3 exemplares como no typo. Chlorosoma nattereri (Steind., 1870) Especie já assignalada no nordeste. Xo. 8712, Adulto $ , procedente de Umbuzeiro, Estado da Parahyba. Spl. 7. V. 215. A. 2. Sbc. 105p.. Por seu colorido e pela proporção da cauda, este exemplar talvez correspon- ^ a uma das raças em que a especie deve ser subdividida. LACERTILIOS Fam. GECKOMDAE Hemidactylus mabouia (JONNÈS, 1818) Xo. 352. Adulto desta “Lagartixa”, capturado em Jatobá, Estado de Per- ^aibuco. Gymnodactylus conspicuus Amaral, 1932 Xos. 353 e 354. Dois exemplares, procedentes de Santa Luzia, Estado da ^ataliyba, desta "Lagartixa”, a confirmarem a descripção, por mim apresentada ^ 1932 (3), sendo que o typo e paratvpos procediam todos de Villa Xova, Es- da Bahia. Fam. IGUANIDAE Iguana iguana (L., 1758) Xo. 355. Adulto procedente de Joazcirinho, Estado da Parahyba. Xome no Xordeste: "Tejibú” (Tejubú), que, em tupi, significa “lagarto ver- • Outro nome, também tupi, applicado a este lagarto c o de “Senembu” ^ninibú), que significa “o lustroso” (ou que emitte brilho). A proposito, diz Soares de Souza (in Roteiro do Brasil, cap. CXIV) : “Xo mato se outros lagartos, a que os indios chamam senembús, que também são muito ^^des, mas não tamanhos como os jacarés; estes remetem á gente, e criam-se a} troncos das arvores ; cuja carne é muito boa e saborosa”. 7 190 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Tropidurus torquatus torquatus (Wied, 1820) Xos. 356 a 380. Uma serie de 25 exemplares deste “Papa- vento” ou “Ca- lango”, em varias idades e de ambos os sexos, colhidos em Curraes Xovos e perto de Acary, Estado do Rio Grande do Xorte; Caruaru, Estado de Pernam- buco; Moageiro de Baixo, Umbuzeiro e Proximidade do Açude Puxinanan, perto de Campina Grande, Estado da Parahyba. Um dos exemplares 9 apresentava 6 ovos sub-ellipticos. Tapinurus scutipunctatus Amaral, 1932 Nos. 381 a 390. Uma serie de 10 exemplares procedentes de Umbuzeiro e da proximidade do Açude Puxinanan, perto de Campina Grande, Estado da Parahyba, com excepção de Xos. 388, 389 e 390, que procedem de Brejo de Areia, no mesmo Estado. Fsta serie ratifica cabalmente a descripção dessa especie por mim publica- da em 1932 (4) e baseada em 8 exemplares de ambos os sexos, todos proceden- tes de Vflla Xo va, Estado da Bahia. Nota : O meu prezado collega, prof. Robert Mertens, do Senckenbergis- ches M use um, de Frankfurt, a/M, teve a gentileza de cscrcver-me recentemen- tc, lembrando a possibilidade de esta especie ser synonyma de Tropidurus setni- tacnialus (Spix). A descripção de Spix (5) deixa muito a desejar c a refe- rencia a ella feita por Boulcnger (6) é muito superficial, de sorte que, sem exa- minar comparativamente os typos. nada posso decidir a proposito desse caso. E' bem verdade que o typo de scmitacniatus provém igualmente da Bahia, o que torna provável a identidade das 2 especics, conforme pensa Mertens. Todavia, a forma em apreço se distingue nitidamente das especics validas de Tropidurus, pela physionomia, chateza do corpo e presença de escamas dorsaes absoluta- mente lisas; nestas condições, provada que seja a identidade de scutipunctatus e de scmitacniatus, o nome Tropidurus deve ficar retricto ás especics caracteri- zadas facilmente por escamas dorsaes mais ou menos carinadas, validando-se o presente nome generico Tapinurus em relação a scmitacniatus, que logo se dis- tingue por suas escamas dorsaes lisas Fam. TEIIDAE Amei va ameiva ameiva (L., 1758) Xos. 391 a 396. Uma serie de 6 exemplares deste lagarto colhidos cm Pesqueira, Estado de Pernambuco ; Moajeiro de Baixo e Umbuzeiro, Estado da Parahyba; e S. Gonçalo, perto de Macahyba, Estado do Rio Grande do Xorte. 8 A. do Amaral — Collecta herpelologica 191 Xome vulgar: “Jacaré-pinima”, que, em tupi, significa “lagarto manchado”, proposito desta especie explica Gabriel Soares de Souza: “Pelos matos se criani outros lagartos pequenos pintados como os de Hesponha, a que os indios c ^mam jacaripimma, os quaes criam por entre pedras, e em tocas de arvores, C0R t os quaes tem as cobras grandes brigas”. Cnemidophorus lemniscatus lemniscatus CL.. 1758) Xos. 397 a 412. Uma serie de 16 exemplares de ambos os sexos deste Calango”, procedentes de Umbuzeiro e Joazeirinho, no Estado da Parahyba e tia vizinhança do Açude dos Tambores, em Pesqueira, Estado de Pernambuco. O Xo. 405, $ em bom estado de preservação, apresenta um colorido ro- ^o-abobora no interstício das escamas da dupla prega guiar. Gymnophthalmus muitiscutatus Amaral, 1932 Xos. 413 e 414. Dois exemplares, procedentes de Umbuzeiro, Estado da Parahyba. Esses exemplares, que se acham em excellente estado de preservação, infirmam a descripção, por mim publicada (7) da espccie cm apreço c sugge- 11011 as seguintes modificações naquella definição original, que fòra baseada cm Urn exemplar mal conservado, ora reexaminado sob o microscopio : o holotypo c ° s dois presentes exemplares apresentam 7, em logar de 5, supralabiaes e infra- k^iaes; 16, em logar de 15, filas de escamas ao redor do meio do corpo (12 dor- e 4 ventracs) ; 5, em logar de 6, poros íemoraes ; no colorido do dorsb, se n( *am 12, em vez de 10, estrias longitudinaes ; a garganta é punctuada de negro; c n 'i cauda a face dorsal é rosea, lineolada de pardo escuro. Fam. AMPHISBAENIDAE Amphisbaena alba L., 1758 Xo. 415. Um exemplar typico desta “Cobra de duas cabeças”, procedente Areia, Estado da Parahyba. Amphisbaena pretrei D. & B., 1839 Xo. 416. Um exemplar, adulto, desta cspecie relativamente rara. occor- rcn *c no Brasil septentrional. Foi colhido entre raizes de “Macambira”, perto Pocinhos, zona de cariry, Estado da Parahyba; apresenta 236 aneis sobre o 9 192 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII corpo e 24 sobre a cauda, estando cada anel do corpo dividido em 14 segmentos dorsaes e 16 ventraes. Occipitaes 2 ; a esquerda maior, subdividida e quasi tão grande quanto qualquer das 2 frontaes. ABSTRACT A list is given of 12 snakes and 65 lizards collected in X. E. Brazil (States of Pernambuco, Parahyba and Rio Grande do Xorte) by the Commissão Te- chnica de Pipcicultura. Of the snakes one specimen corresponds to a form neW to Science and which has been named Liohctcrophis ihcrítiffi, g. n., sp. n. (Colu- bridae, Colubrinae) ; Liohcterophis is close to Liophis, sensu Dunn, and Rhadi- tiaca Cope. Of the lizards various spedmens serve cl to confirm the description, respectivdy, of the following íorms: species Gymnodactylus cottspicuus Ama- ral and Gymnophthalmus multiscutatus Amaral and genus Tapinurus Amaral as published in 1932; in regard to the species G. multiscutatus a few little chan- ges ha ve been madc in its definition as suggested by two specimens included i° the present collection. BIBLIOGRAPHIA 1. Amaral, A. do — EstttJos sobre Lacertilios Xeotropicos. I. Xovos gcncros c especies de de lagartos do Brasil — Mem. Inst. Butantan VII :31-74. 55 íigs. 1932. 2. Amaral. A. do — > Contribuição ao conhecimento dos Ophidios do Brasil. IV. Lista Rí* missiva dos Ophidios do Brasil — Mcm. Inst. Butantan IY:87.1929. 3. Amaral. A. do — Estudos sobre Lacertilios Xeotropicos. I. Xovos gêneros e especies de lagartos do Brasil — ioc. eit. :57-58. figs. 9-10. 4 Amaral, A. do — Estudos sobre Lacertilios Xeotropicos. I. Xovos generos e especies de lagartos do Brasil — Ioc. cit. :65-66. figs. 22-25. 5. Spis — Species novac lacert. brasil. :13. tab. XVI :1. 1825. • 6. Bculengrr — Cat. Liz. Brit. Mus. 11:178.1885. 7. Amaral, A. do — > Estudos sobre Lacertilios Xeotropicos. I. Xovos generos e especies de lagartos do Brasil — Ioc. cit. :73-74. figs. 51-55. (Trabalho da SecçSo de Ophiologia e Zoologia Medica do Ia" titnto Butantan, recebido em agosto de 1*01 e dado ã pu- blicidade em dezembro de 1*04.) 10 Mera. Inst. Dutantan A. do Amaral. — Collecta herpetologica VoL VIU. 1933-19S4. Roteiro de expedições científicos no Brasil e regiões vizinkas WW 4 . - — ....... (kstiUkw kttWrer *••••••• Spi* » \1 Hitkirf Mappa 1 cm 7 SCÍELO, 1X 12 13 14 15 16 17 (»ikl A. do Amaral — Collecta herpetologica Mem. Iost. Rut*n‘.» a VoL VUL 19S3-XSW- Zonas aridas e chuvos^ :za do Nordeste » ' - ! ♦*•*•*> ♦ / -»*«*-«***.. 4 — - *. '♦*** — * -*-*»*2*« •* ♦** ^ - — t- ;% %«{■. • ) ^ V>V J i V-y j *. .%*?.*. . . . V r^-u? *— VA*A*. ' 4 TkW • /. • * » • 4 * • • 4 . - • • • r* - - -J. . pm w _ Kg:* / <*4* • »T «• r»^ *>^% 4-t-4 V> r * 4 -% ÉÍfâ|i^^K!S!i|gí^p iliir"'----'-' kmm ♦*•*«•* »*•* •* X »*4** < **«*OÍ.«*»** - :S#:oÍ^™®As •••AV/a — > •«•••- ;KvIv3>Xv.;.vrO Chuva* Legenda Mais de 1 metí 0 0.60 a I metro 0.40 a 0.60 Menos de 0.40 Mappa 2 cm 2 3 4 ISciELO D 11 12 13 14 15 16 CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DAS RELAÇÕES IMMUNO- LOGICAS ENTRE O “TYPHO EXANTHEMATICO DE SÃO paulo” e demais febres exanthem atiças que OCCORREM NA AMERICA DO SUL J. LEMOS MONTEIRO 2 11 12 13 14 15 16 614.516 80 CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DAS RELAÇÕES IMMUNO- LOGICAS ENTRE O “TYPHO EXANTHEMATICO DE SÃO PAULO" E DEMAIS FEBRES EXANTHEM ATIÇAS QUE OCCORREM NA AMERICA DO SUL POR J. LEMOS MOXTEIRO O estudo das relações imnuinologicas entre as varias Rickettsioses apresen- não somente um interesse meramente scientifico, como também grande impor- ^cia sanitaria e ipratica, em virtude dos elementos que pode fornecer j>ara a filiação das varias modalidades clinicas em determinados grupos e, portanto, P^a a orientação das medidas eíficicntcs de prophylaxia a serem tomadas nos diferentes paises. Em trabalhos anteriores, estudando, com Amaral (1 e 2), a liistoria natu- ^1 e classificação das Rickcttsioses em geral, mostrámos a importância da prova d« inimunidade cruzada, que contribue para dividil-as em quatro grandes gru- f* 05 . constituído cada um por um certo numero de infecções mais ou menos af- fin*. Estas, por sua vez, se distinguiriam entre si por outros caracteres e elc- n *nitos de natureza experimental, epidcmiologica c clinica. Pela prova de immunidade cruzada, praticada por Parker c Davis (3. 4 e i ), Dyer (6) e por nós (7 e 8), ficou estabelecida a posição do “Typho cxan- dematico de S. Paulo” ( Rickettsiose neotropica, typo de S. Paulo) no gnipo fll, segundo a classificação proposta (1 c 2), ao lado da Febre maculosa das M °ntanhas Rochosas, typo oeste (Rickettsiose nearctica, typo oeste) e das dttras nxxlalidades : Rickettsiose nearctica. typo leste e Rickettsiose botonnosa, typo mediterrâneo. \’a impossibilidade de se praticar a prova de immunidade cruzada para a filiação de determinada febre exanthematica a um dos grupos propostos, po- dem-s e pesquisar as relações immunologicas por meio da verificação do poder P r otector do soro de convalescente contra o virus de uma determinada Rickcttsio- a cujo gnipo se deseja saber si se liga o virus que determinou o caso clinico do qual proveiu o soro. cm 7 SCÍELO, 2.1 12 13 14 15 16 17 198 Memórias do Inslituto Butantan — Tomo VIII Por esta prova, de protecção com soro de convalescentes, iniciámos taa>* bem o estudo das relações immunologicas entre a Rickettsiose de S. Paulo e a 5 modalidades que occorrem sob forma, quer endemica, quer epidemica, em <**' tros paises sul-americanos (Argentina, Giile e Boi i via). Os nossos resultado» já foram, em parte, resumidos (9 e 10) em notas apresentadas á Sociedade com o Protcus OXL: 1/1.280 (4~f)- Prova de protecção. — Os resultados da prova de protecção deste soro re- lativamente ao virus de S. Paulo (sangue dcsíibrinado da cobaia 1377), pra- teada em 23.XI.933, constam do Quadro I. . quadko- i SOM» JO »Jl(C»0*C«ll»T| CA A»0l»Tm*) CACva Cl CtOTCCtÃO RIlArnMnlnTI AA*lTf*0 WANTM M > /»U10* CA COIAIAA CCATJCA0A I» *m% IUm M - T.,t. — A.» ' H- . • l«)«h»4« itl («U.» • • % m + + * • i i«t i > n «'•i.iMici 0A. OL 1341 >* M - t 01.. 1343 ** »• V\ os. OJ.. 1J42. • •• H M QiL 1346 • • I# II //^ \t Qi. Qtt 1344 »• M 05.. O 1349 •• 1» II ' l — ■ ^ Xt oAj 0». 1345 » H 'rv N • » V £ cl.L Rc>ultA4o »*j inscul&cões Soe O 1 Virv* ..l| 1 1 < 1 « 1 1 1 IN UDMiiiii' 0,5.. 0,1,. 1391 c 40 5» 31 «... 0,25.. 1393 ♦O 3* 31 0,5«. a o* 1395 40 Jl SI 0,1c. 1392 40 39 31 i.k..*. 0,25.. 1394 40 39 31 ToWw. O.5.. 1396 40 3» 3» € |R.« fv>.' i cm 'SciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteibo — Relações immunologicas 201 De uma das cobaias inoculadas com mistura soro- viras (cobaia 1503), o '‘irus foi mantido cm novas passagens successivas, sempre com infecção cara- cterística (cobaias Xos. 1527, 1546, 1561, 1571, etc.). O mesmo se obteve com uma das testemunhas (cobaia N.° 1508), sendo feitas passagens successivas para as cobaias Xos. 1523, 1537, 1553, etc.. Somente uma das cobaias testemu- nhas, inoculadas com 0,5 cc. de vinis (cobaia Xo. 1509), não reagiu de modo typico, não sendo obtida passagem. Este resultado, porém, não modifica a con- clusão geral, pois as outras duas testemunhas, inoculadas com menor proporção de virus, reagiram de modo característico, sendo obtidas novas passagens. çuAo*o-m — — 3o>o •• 30 * ji(r*o*i»aHTe o* ahintiua) p*o»a dc **otccção »iiAT«vAm»rn uamt*. • 1 3. da COIA.A • Mh), MATlCAlA |N «• Q«3* - 3 »J. 1 (•U t *• » H (•A* • *••• ; .. i 1 1 * M > i > ^ • t J *1*1 1 ««llflN 01. . 1501 M Q5. . 1505 u .. 01. 01- 1501 •i J* M Q5. . 0.5. . 1506 • •4 " •• - tu.. 1507 •• >• M J Q5.. 1509 - • • tt 01. QXi. 1505 *• >• II 05.. 011. 1504 1» M Uto. 0X5.. 1506 •* •a M '/-KT w — II. Soros provenientes do Chile Em numero de 5, foram os soros colhidos em 22 c 25. XI. 933 de deentes 1)0 5» dia, mais ou menos, da convalescença. A reacção de Wcil-Felix, pratica- ^ na occasião, mostrou-se positiva, tendo-nos sido communicados os seguintes rç su!tados : Com o Protcus X19: soro Xo. 1, (titulo de 1/1000) ; soro Xo. 2 (1/6400) ; *° r o Xo. 3 (1/25.600); soro Xo. 4 (1/3200); soro Xo. 5 (1/12.800). 202 Memórias do Instituto Butantan — Tomo MII Prova dc protecção. — Os resultados desta prova, praticada em 15 . III. 934 . relativamente ao vinis de S. Paulo (sangue desfibrinado da cobaia 1581 ) são consignados no quadro IV. Verifica-se que também estes soros, de convalescentes da recente epidemia chilena, não manifestaram acção protectora relativamente á infecção experimen- tal pelo vírus do “Typho exanthematico de S. Paulo”. Com os soros Nos. 1 e 5 observou-se uma ligeira attenuação do virus. não tendo sido elevada a reacção febril de algumas das cobaias e resisti sdo os ani- QUADMO -IV 3 50(t 05 ■' 1, M.i. « l> h CHK() Ml» ít paoticção ml»ti»a*«»ti ajStPuO (UNIH St A PAULO* ^VIRUS PA COSAIA »* ISIl) PAATICAPA Dl M-l- U 4 •jy-c tis— , “ •TiT* >•»* | -• **• M Ro JUi* Wo iROCllàt»*) 1 ! L <*.' (grupo III da classificação de Amaral e Monteiro). 10 cm ISciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteiro — Relações immunologicas 205 II. Os casos de onde provieram os soros estudados filiar-se-iam, muito provavelmente, ao grupo IV da mesma classificação, no qual se incluem o Ty- pho exanthematico clássico ou europeu (Rickettsjose epidêmica) e o Typho ame- ricano ou endemico (Rickettsiose endemica). ABSTRACT Testing the protective povver oí a fcw samples of scra seaired from con- '■alescents of typhus or petechial fever in Argentina, Chili and Bolivia, against l he experimental S. Paulo spotted fever has yielded results that soem further to justify the separation of these diseases into 2 different groups. One of tnese groups should include the petechial fever besides the European or epi- fcmic typhus and the American or endemie typhus; the other should include { he S. Paulo spotted fever besides the known tyi>es oí Rocky Momitain sjxitted ttsver. BIBLIOGRAPHIA 1- Amaral, A. do & .Monteiro. J. Lemos — Ensaio de classiiicação das Rickcstsioses á luz dos nossos actuacs conhecimentos. Memórias do Inst. Butantan \'II :343. 1932. 2- Amaral. A. do & Monteiro. J. Lemos — Histoire naturcllc et classification des Rickett- sioscs. Position systematique du «Typhus cxanthematiquc de S. Paulo». Rcv. Sud-Amér. de Méd. et Chir. IV(ll) :781-1933. h Parker. R. R. fc Davis. G. E. — Protective Valuc oi Convalescem Scra of São Paulo Exanthcmatic Typhus Agamst Virus of Rocky Mountain Spotted Fever. Publ. Health Rcp. XLVIII(19) :501.1933. Parker, R. R. & Davis. G. 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I.cinos — • Êtude comparative da «Typhus exanthématique de São Paulo» (Rickettsiose néotropique) et du «Typhus exanthématique» d'autres lieux, basée sur 1’ép reave de protection par le sérum de convalescent. C R. Soc. BioL . CX V ( 12) :1360. 1934. 10. Monteiro, }. Lemos — Êtude comparative entre le «Typhus exanthématique de São Paulo» (Rickettsiose néotropique) et le «Typhus exanthématique du Chili» (Rickettsiose épidémique) par 1’épreuve de protection avec des sérums de coa' valescents. C. R. Soc. Biol. CXVI(26) : 1131. 1934. «Trabalho da Secção de Viros e Viruslherapia do Instituto B«* tantan. apresentado em outubro de 1934. Dado á publi- cidade em derembro de 1934). 12 o “TYPHO EXANTHEMATICO DE S. PAULO” E SUAS RELA- ÇÕES COM A FEBRE MACULOSA DAS MONTANHAS ROCHO- SAS, Á LUZ DAS PROVAS DE IMM UNIDADE CRUZADA POR J. LEMOS MONTEIRO 614.526 o “TYPHO EXANTHEMATICO DE S. PAULO” E SUAS RELA- ÇÕES COM A FEBRE MACULOSA DAS MONTANHAS ROCHO- SAS, Á LUZ DAS PROVAS DE IMMUNIDADE CRUZADA POR J. LEMOS MOXTEIRO Lm dos problemas dc pathologia humana que mais têm prcoccupado, nestes u fàmos tempos, a attenção dos experimentadores, muito espccialmcnte em S. * **»lo, é o da modalidade da febre exantbematiea que surgiu na capital do nosso Estado e que foi denominada de "typlio exantliematico de S. Paulo”. Da nossa parte, como de outros companheiros dc trabalho em Butantan c ^Stins collegas de S. Paulo, não tem sido poupados esforços c mesmo sacrifícios ^ ra sua elucidação sob o ponto dc vista experimental, ctiologico, cpidcmiologico, étnico c anatomo-pathologico. Os resultados deste esforço perseverante, condensados já numa serie dc nu- tncr osos trabalhos publicados, necessitavam, porém. j>ara nos levar a conclusões seguras, da collaboração dos experimentadores dc outros paiscs, onde as diff fos crentes formas affins de rickcttsioses são também estudadas e com as quacs sem feitos certos estudos comparativos. Xestc proposito, desejamos, desde °&°* salientar esta collalx>ração que nos foi prestada pelos illustres experimen- tas norte-americanos. R. E. Dyer, do Xational Instituto oí Health, de Wa- *hi ln gton e R. R. Parker, do Rocky Mountain Spotted Fever Laboratory de Ha- ^'^on, ambos do U. S. Public Health Service. A clles enviámos, por via aerea, soros de animaes (macacos, cobaias e coe- 5 ) immunizados, para que fossem realizadas as provas de protecção, assim C ° tn ° exemplares de carrapatos (Amblyomma cojenncnse), infectados com o ^so V !rus, para que pudessem, por sua vez, isolal-o, por simples picada ou ino- naquelles laboratorios norte-americanos. Tanto Dyer como Parker, por communicação epistolar que nos fizeram, ^seguiram o virus, infectando cobaias com os carrapatos que enviámos, tra- ído assim nova confirmação aos resultados dc transmissão experimental rea- ‘^dos em Butantan. cm 7 SCÍELO, 2.1 12 13 14 15 16 17 210 Memórias do Instituto Butantan Tomo YTII Por sua vez. retribuindo a remessa do nosso material, Parker enviou-nos. gentilmente, um lote de Dennacentor andersoni infectados com a febre macu- losa das Montanhas Rochosas, para que também pudéssemos realizar aqui 05 estudos experimentaes comparativos que tanto nos interessavam (*). Pusemos parte desse precioso material á disposição de collegar- que, entre nós, se interessam mais directamente pelo assumpto, e iniciámos, como fazetu Dyer e Parker nos Estados Unidos, nossos estudos pelo isolamento, dos carra- patos enviados, do viras da febre maculosa das Montanhas Rochosas. Xesta nota desejamos, apenas, consignar os primeiros resultados de algt*' mas experiencias já feitas de immunização cruzada e o fazemos desde logo. e® virtude do seu interesse e importância para a elucidação do problema do nos* 3 “typhus” e teceremos sobre elles alguns commentarios. Isolamento do virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas Os carrapatos ( Dennacentor andersoni) foram divididos em lotes de 5 e 6 exemplares. Um lote (com 5 exemplares) foi posto a sugar numa cobaia, permanecendo durante 4 dias; no fim deste tempo, 4 exemplares estavam ainda seguros, sendo retirados. Deste, 1 foi conservado para inoculação após maio 1 ’ prazo, 2 foram emulsionados e inoculados em 2 cobaias c 1 foi fixado para i°' clusão e cortes. Outro lote (com 5 exemplares ) foi collocado na estufa durar.* te 24 horas, cm seguida emulsionado (sempre depois de convenientemente la- vado) c inoculado cm 2 cobaias. Os resultados destas experiencias não serão agora tratados com maiore* minúcias, assim como as feitas com os outros lotes. Apenas relataremos 05 que interessam ao fim desta ligeira nota e que são os seguintes: Cobaia 1056. — Inoculada em 9. V. 33 com 1 cc. de emulsão (em 2,5 cc. de agua physiologic 3 ) de 2 Dennacentor andersoni infectados após se terem alimentado durante 4 dia 5 na cobaia 1049. Foi a seguinte a evolução da infecção: após incubação de ^ dias, rcacção febril durante 3 dias (40\O; 39°,8; 40“,4.) Com esta ultima teC** peratura, 6 dias após a inoculação, foi sangrada e o sangue, emulsão testicula r e emulsão de cerebro inoculados em outras cobaias normaes, assim como 01,1 3 cobaias immunizadas, em differentes período, contra o "typho cxanthema 0 ' co de S. Paulo”, correspondentes á 1." série de provas. As cobaias normaes inoculadas com o material iníectante para passag* 0 ' do virus e como testemunhas tiveram, em geral, infecção característica ou a tjT pica, porém devidamente comprovada. (.*) Devemos aqui agradecer também ao dr. R. R. Parker a remessa de 3 tubos c* 0 vaccina contra a febre maculosa. que tem occasionado vktimas entre os homens de Lsbot*' torio, para que nos immtinirasscmos e aos nossos auxiliares immediatos. cm ISciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteiro — O “typho exanthematico de S. Paulo ” 211 Registemos, resumidamente, apenas os protocollos das cobaias que nos serviram para o isolamento do viras da febre maculosa e que, por sua vez, o forneceram para as provas de immunização cruzada que relataremos em se- guida. Cobaia 1072 ( testemunha ). — De pequeno porte, pesando cerca de 200 gms., foi, apesar disto, inoculada com 1 cc. de sangue da cobaia 1056. Não apresen- tou reacção acima de 38°, 6. no 4.® dia e no 5.® amanheceu mal, prestes a mor- rer, sendo sacrificada. Pela necropsia, exames íeitet. e prova de passagem, ob- servou-se uma evolução atypica da infecção, facto que, portanto, se verifica com 0 viras da febre maculosa, em certas condições ligadas a uma menor resistência °u estado de carência do animal. A infecção se confirma, entre outros dados, pelo augmento do baço, exsudato peritoneal (encontrado nestas formas atypi- 8; 40“ 5, com reacção escrotal intensa, com phenomenos hemorrhagicos ; 39® 0 ; air tanheccu morta cm 27.V.33, sendo feita passagem do viras para outra co- baia). A cobaia 1084, que interessa agora, teve a seguinte evolução thcrmica: dia, 38°4 (inoculação); 2.®, 39°0; 3.®, 3S“8; 4.®, 39®0; 5.®, 400, quando f °i sangrada e sacrificada. Embora somente no 1.® dia de reacção febril veri- fica-se, á necropsia, augmento accentuado do baço; nas cellulas mesotheliaes do Peritoneo encontram-se raras rickettr-ias. Órgãos diversos foram fixados. Como a quantidade de sangue obtido não tivesse sido sufficiente para a inoculação 'ks 4 cobaias immunizadas (2.® série), das 4 vaednadas com a vaedna prepara- ^ com Amblyomma cajennense infectados com o nosso viras (3.® serie), assim °°too 3 testemunhas, preparámos uma emukão, em 25 cc. de agua physiologica, ^stituida de sangue desfibrinado (3 cc.), testiculo (1/2), baço (1/3) e ce- tobro ()4), da qual foi inoculada a dose de 2 oc. em cada animal. As teste- munhas apresentaram infecção característica. Mo-tremos apenas a evolução de mua delias : 212 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Cobaia 1093. — Inoculada em 23.Y.33 com 2 cc. de emulsão de virus da cobaia 1084. A evolução da infecção foi a seguinte; temperatura no dia da inoculação 38° 3 ; nos dias seguintes : 38’ 0 ; 39° 6 ; 40“ 0 ; 40° 5 ; 40° 0 ; 39" 6 ; 39° 5. A cobaia apresentou reacção escrotal. Em 31. V. 33 foi sacrificada, com* provando-se infecção typica, sendo colhido material para exame histologico e feita nova passagem do virus. Immunização cruzada Esta prova foi realizada em 3 séries de experiencias, com relação a 7 co- Ixiias immunizadas seguramente com o typho de São Paulo e a 4 cobaias ino- culadas com uma vaccina que preparamos com A mblyomma ca jnmoy.se infecta- dos com o nosso virus. Os primeiros resultados podem ser assim resumidos: 1/ Série: Cobaia 914 — Sofíreu a 1.* inoculação do virus de S. Paulo em 25. XI. 32 (2 cc. de ■sangue da cobaia 906); 2.* inoculação em 5.1.33 (emulsão de cerebro da cobaia 937), não reagindo, mostrando-se immunizada. Em 15.V.33 foi inoculada com o fvirus da febre maculosa das Montanhas Rochosas (2cc. de sangue da cobaia 1056). Não apresentou reacção al guina, a temperatura não sahindo da media normal (38° 0; 38° 5 c maxima de 38“ S) durante uma observação já de 15 dias. Cobaia 986 — Foi inoculada com o virus (emulsão de cerebro da co- baia 974) cm 23. II 1.33; apresentou, após 3 dias de incubação, reacção typica- febril, durante 6 dias, resistindo. Foi novamente inoculada com o nosso virus (proveniente de carrapato Atnbly. Lote IXa, 4a. passagem) em 18. IV. 33, nto»* trando-se immunizada. Em 15.V.33, foi inoculada com o virus da febre ffl** culosa das Montanhas Rochosas (2cc. de sangue da cobaia 1056). Xão apre* sentou reacção alguma, o máximo da temperatura foi de 39° 2, num dia, durante tuna observação já de 15 dias. Cobaia 1022 — Foi inoculada, em 25. IV. 33, por via subcutânea, coo> emulsão de cerca de 20 ovos de 1 Aniblyomma cajcnncnse infectada. Este car* rapato foi alimentado novamente após a infecção por picada em cobaia doente c desovou 30 dias após a primeira alimentação, iníectantc, e 10 dias após a s** gunda alimentação. A cobaia teve infecção característica: incubação de 4 dia 5, reacção febril durante 5 dias (com passagem positiva do sangue) e resistiu. & 11 15.V.33 foi inoculada com o virus da febre maculosa das Montanhas Rochosa» (2 cc. de sangue da cobaia 1056). Da mesma forma nenhuma reacção apre- sentou, a temperatura maxima foi de 39“ 0, mostrando-se immunizada. 2." Serie: Cobaia 988 — Foi inoculada em 27. II 1.33 com emulsão de ^ Amblyomvia cajcnncnse Ç (Lote IX), infectado 11 dias antes. Xão aprese 11 ' cm ISciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteiro — O “ typho exanthematico de S. Paulo" 213 t0u reacção typica, pelo que em 2.V.33 foi inoculada com o nosno vírus (cmul. ^ cerebro da cobaia 1024), não reagindo e mostrando-se immunizada. Em 23. ^ -33 foi inoculada com o virus da febre maculosa (2 cc. de emulsão de vinis ta mostrando-se, pois, immunizada. 3.* Serie: Consta de 4 cobaias que foram vaednadas, 2 com 1 dose c 2 2 doses, com uma vaccina que preparamos, utilizando Amblyoinma cajcn- infectados com o virus do “typho” de São Paulo. Esta vaccina demons- * r °u possuir valor antigenico, tuna só dose tmmunizando a cobaia contra o nosso v,r us, o que melhor mostraremos em outro trabalho, onde daremos a technica que ^pregamos para o seu preparo. Os resultados desta serie foram os seguintes: Cobaia 1029 — Tomou a 1.* dose de 0,5 cc. da vaccina preparada com Am- ^JOwuno (Lote XIII) em 28. IV. 33; a 2.* dose de 2 cc. em 5.Y.33. Xão apre- çou reacção e 18 dias após foi inoculada com o virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas (2cc. de emulsão de virus da cobaia 1084). Xão apre- stou até esta data reacção febril, a temperatura mais elevada foi de 39® 0, num k*’ podendo ser considerada como immune em relação ao virus inoculado, 214 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII maximé si se levar em conta o resultado com as testemunhas que tiveram 2íl * íecção característica, como se viu com a cobaia 1093. já assignalada. Cobaia 1031. — Como a 1029, sendo, porém, a 1.* dose da vaccina de 1 cC ‘ e a 2.* de 2 cc. Após 18 dias foi inoculada com o vinis da febre maculosa (- cc. de emulsão de vinis da cobaia 108+) . Da mesma forma, não apresento* 2 reacção febril, mostrando-se immune em relação ao vinis inoculado. Cobaia 1041. — Tomou 1 só dose da vaccina em 5.V.33 e 18 dias após f°* inoculada com o vinis da febre maculosa (2cc. de emulsão de vinis da coba 1 * 1084). Também não apresentou, até esta data, reacção febril, resistindo ao vi 1 *** inoculado. Cobaia 1042. — Como a 1041, sendo após 18 dias da vaccinação in noculaá* com o vinis da febre maculosa das Montanhas Rochosas (2 cc. de emulsão & vinis da cobaia 1084). A cobaia não apresentou reacção, porém amanhece* 1 morta em 28.V.33. A necropsia foi somente feita no dia seguinte, não pode* 1 do, pois, ser aproveitado material para passagem. Ycriíicou-sc, em todo ca^ % que o baço apresentara tamanho normal, nada indicando ter sido a morte de' 1 * da ao vinis inoculado. Veri fica-se, portanto, que coliaias seguramente immunizadas cm relação vinis do “typho” de S. Paulo, apó, terem recebido uma ou mais inoculaÇÓe > mostram-se também immuncs relativamente ao da febre maculosa das Montanh* 1 Rochosas, injectado posteriormente, decorridos períodos varia veis de teH»P^ até mesmo após mais de 4 meses da ultima inoculação do primeiro vinis, mesmo se verificou com 4 cobaias raccinadas contra o nosso vinis (vacõ** preparada com Amblyomtna cojennensc infectados) e rdnoculadas, 18 dias pois, com o da febre maculosa. df DISCUSSÃO Os resultados acima mostram que os animacs immuncs relativaincntr febre exanthematica que tem surgido em São Paulo, o são também em rei 3 ' ao virus da febre maculosa das Montanhas Rocliosas, nas condições expcrin*^ tacs descriptas. Nos nossos estudos sobre o typho exanthematico de S. Paulo, desen'’ 0 *^ dos com maior minúcia em trabalho publicado no tomo VI das “Memória* Instituto Butantan”, mostrámos que, pelos aspectos estudados, a infecção se parecia filiar ao grupo que tem como typo o typho exanthematico das**’ 1 ' do velho mundo, onde se eollocam outras modalidades, entre as quaes o t}?^ endemico (do México, Estados Unidos, etc.). Num quadro indicámos as P* 1 cipaes difíerenças experimentaes entre estas infecções. cm ISciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteiro — O “ typho exanthemalico de S. Paulo ” 215 Por outro lado, deixámo; sempre accentuado que. relativamente ao com- portamento experimental e outros caracteres dos respectivos virus, a nossa in- jeção apresentava maiores affinidades com a febre maculosa das Montanhas Rochosas. As provas de immunidade cruzada agora realizadas entre nós e na Ame- tica do Xorte trazem novo contingente a estas affinidades com esse grupo, que tt3n como typo a febre maculosa das Montanhas Rochosas, ao qual se filiam inibem a forma este desta ultima infecção, a “febre botonosa” e outras. Xo nosso trabalho (1) dissemos, relativamente ao typho cxanthematico de S- Paulo, que “embora não se possa ainda concluir em definitivo, parecem inaio- rcs suas relações com o grupo da febre maculosa das Montanhas Rochosas, cons- htuindo, talvez, uma nova modalidade da infecção” e, “até que novos estudos ^J^m emprchendidos, o* corpúsculos dc Mooscr, que melhor se denominariam Ri- 'kcttfia tnooscri, deverão considerar-se distinctos da Rickctlsia brasil iensis, res- P^savel pelo typho cxanthematico de S. Paulo. O mesmo podcr-sc-á dizer, maiores suas affinidades. cm relação á Rickctlsia rickctlsi Wolbach, r<; sponsavcl pela rickettsiosc das Montanhas Rochosas, assim como cm relação outras especics descriptas, pertencentes ao genero creado pelo prof. Rocha e responsáveis por outras rickettsioscs”. Entre esses novos estudos, estão agora incluídas as provas dc immunização frizada. E’ assumpto cm ordem do dia em scienda a importância que esta prova PO'ía ter como elemento decisivo para a distineção dc infecções dc certos gru- Po*. principalmentc quando causadas por “virus”. E’ o caso do grupo varioli- ligado aos Chlamydozoarios, c do grupo das febres cxanthcmaticas, ligado ** Pickcttsias. Rclativamentc ás rickettsioscs. numa das suas divisões, o grupo do “ ty- apesar de ser positiva, sob certos aspectos, a prova dc immunização cru- cia entre duas importantes das suas modalidades clinicas, como o typho exan- ^ lc niatico clássico ou epidêmico c o typho americano ou endêmico, a distineção ellas é acceita por muitos experimentadores, entre os quaes se colloca, ^ra. Charles Xicolle. Em estudo a respeito, Xicolle c Laigret (2) íocalizam 0 assumpto de um modo experimental c acham que a prova deve ser feita sob critério quanto á antiguidade da immunidade, concluindo que, por cila, os V,f us dessas infecções são vizinhos, o que, porém, não demonstra que sejam j^icos. Também, mais rccentcmente, o assumpto foi debatido por Ricardo _ Re (3), em communicação ao Comité permanente do Office International fygiène Publique, da Liga das Xações, que diz: “o critério da immunidade Crüz ada prova que os dois virus são da mesma familia: um protege contra o 7®*°- Deduzir dahi da sua identidade de natureza absoluta, é muito arrisca- : o coic-pox protege contra o small-pox e reciprocamente, e entretanto as duas ^Jdalidades não se confundem”. 21G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Portanto, a prova de inimunidade cruzada seria util somente para distincção dos dois grupos e não das suas infecções componentes. Si no caso dos tvphos epidêmico e endemico este modo de pensar, sobre 3 relatividade da prova de immunização cruzada, nos parece justificado, visto se possuírem outros elementos (de natureza experimental, epidemiologica e histo- pathologica) para a distincção das infecções, o mesmo talvez occorra quanto ao grupo da febre maculosa das Montanhas Rochosas. Nestas condições c diante dos novos factos experimentaes trazidos pd 15 provas de immunização cruzada e com as quaes concordam as realizadas p° r Dycr e Parker, devemos considerar realmente a febre exanthematica que sur- giu em S. Paulo (typho cxanthematico de S. Paulo) (*1) como uma infecção do grupo da febre maculosa das Montanhas Rochosas, sinão muito próxima a própria infecção typo, na sua forma mais grave (typo oeste), pelo menos, c com mais razão, tuna das suas modalidades nosologicas. Este ultimo modo de ver, sobre ser o nosso “typho” uma variedade do grupo da febre maculosa, parece-nos mais acertado. Desta opinião já nos ha* riamos manifestado cm palestra feita numa das reuniões semanaes no nosso Instituto c está consignado cm trabalho que A. do Amaral e nós elaborámos (5) c onde fizemos um estudo geral sobre as di ff crentes febres exanthematicas c procurámos classifical-as convenientemente, de accordo com os estudos ul ti ma- mente realizados cm diversos paizes. O “typho de S. Paulo”, portanto, pertenceria a esse grupo, em virtude de provas valiosas, entre as quaes, agora, se junta a de immunização cruzada, q llC o desliga do grupo do “typhus” (* 2 ) . Seria, porém, uma variedade nosologie 3 ' porque entre cllc c a infecção typo existem certos elementos differcnciaes q 1 * 1 i^ginido pensamos, autorizam essa separação parcial. Como variedade do mesmo grupo, também consideramos a forma E*t e da febre maculosa, que se distinguiria da forma typo, apesar da prova de i* 0 * munidade cruzada, pelo caracter clinico e experimental mais benigno e por ccr* tas lesões histológicas ainda recentemente postas cm evidencia por Harris (6)- (*1) Esta designação refcre-sc á febre exanthcmitica que surgiu cm S. Paulo. ffla zonas de preferencia de aspecto rural, objecto jã dc numerosos estudos. Não é improva'*'’ cm todo caso, a existência, entre nós, de outras modalidades das febres exanthematicas. d° grupo do «typhus», a se julgar pelos resultados, que. com F. da Fonseca, jã publicam 0 * (4), relativos a um outro vinis isolado dc ratos da zona urbana da cidade c que, iiumuno" logicamente, também differc do que agora estudamos c estamos comparando com a f«* ,r * maculosa. (*2) Em carta, recebida ha poucos dias. Dyer nos communicou seus primeiros resu 1 * tados sobre a immunização cruzada com a febre maculosa e com o «typhus» e que concof dam. no primeiro caso. com os que assi gruíamos. Assim se manifestou a respeito: «G 5 * 1 * nea-pigs rccovcrcd from typhus fever are not immunc. A recovcred spotted fever monk*? lias also bccn found immunc to your vinis». 10 cm 'SciELO D 11 12 13 14 15 16 J. Lemos Monteiro — O “lypho exanthemalico de S. Paulo 217 Vejamos, rapidamente, a possível difíerenciação da variedade de S. Paulo. Sob o ponto de vista clinico. Piza (7), reconhecendo que mais se approxí- n *a da febre maculosa, poude aí firmar, embora sem concluir em definitivo, “que 0 mal que aqui appareceu não se enquadra perfeitamente em nenhuma das febres typho-exanthematicas conhecidas, desde que se leve em conta a moléstia expe- rimental, em cobaia, e o aspecto histo-pathologico do material humano”. Experimentalmente, si a pathogcnicidade dos virus das duas infecções se niostra igualmente elevada, verifica-se com a nossa uma menor proporção de re- acção escrotal e, portanto, uma menor constância dos phenomenos hemorrhagi- para o lado da bolsa escrotal (*), como já assignalámos (1 e 8), as)im ^Mno L. Salles Gomes (,7). Histo-pathologicamentc, as principaes alterações que caracterizam a infec- to de S. Paulo foram evidenciadas por J. Meyer (7) e um estudo comparati- v °, de natureza experimental, se impõe para melhor elucidação de possíveis ele- *®entos differenciacs. Ainda se poderia considerar o aspecto epidemiologico, baseado na diversi- dade do tran missor intermediário. Esta diversidade talvez modifique biolo- gicamente o agente infectuoso, embora as espccics de Ixodidcos possam trans- n) ittir experimentalmcntc ambos os virus. O da febre maculosa das Montanhas Rochosas, segundo nos communicou R. R. Parker, pode ser transmittido pelo 'hnblyomma cajcnncnsc, o que c de grande importância para os Estados Unidos, °ode este carrapato também existe. Este auctor prometteu-nos verificar si o bermaccntor andersoni pode, por sua vez, transmittir o vinis da febre de S. Poder-se-ão ainda considerar como elemento de difíercnciação as rcacçõcs sorologicas. Pela reacção de Weil-Felix, praticada com os differentes typos de í>r oteus X, A. Fdix (9) considera o typho de S. Paulo uma nova variedade so- rologica. Ha, além disso, interesse em se verificarem as relações do Prolcus XL, dc Será, finalmente, necessário estudar immunologicamentc as infecções deste fFupo, de aceordo com o critério estabelecido por Xicollc e Laigret (2) para as mfecções do grupo do “typhus” e também realizar a prova de immunização cru- ^ sob um critério quantitativo, isto é, quanto ás doses minimas infectantes Paulo. Orvalho Lima (10), que antigenicamente melhor corresponderia ao typho dc S. Paulo, com a febre maculosa das Montanhas Rochosas. vinis respectivos, assim como provas de protecção com os respectivos soros 218 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII immunes (*) e outras que nos dariam os detalhes e nuanças immunologioos. como a reacção do desvio do complemento (estudo que já iniciámos com ]■ Travassos) etc., pelos quaes se distinguiriam as infecções componentes de cada grupo da familia exanthematica ou rickettsioses. RESUMO E CONCLUSÕES Um estudo feito com o virus da febre maculosa das Montanhas Rochosas comparativamente com o virus da febre exanthematica de S. Paulo mostrott a existência de estreitas relações immunologicas entre os dois, pelas provas de immunização cruzada. Aquelle virus foi conseguido graças á gentileza dos drs. R. E. Dyer, do National Institute of Health e R- R- Parker, do Rock}' Moimtain Spottcd Fever Laboratory, de Hamilton, tendo o ultimo ren>ettido iun lote de carrapatos ( Dcrmacentor andersoni ) infectados, o que tornou po»' sivel o seu isolamento c estudo entre nós. As provas de immunização cruzada foram feitas numa serie de cobaias k ,r munizadas contra o "typho exanthematico de S. Paulo, e cobaias previamente inoculadas com uma vaccina preparada com carrapatos (Amblyomma cajennen- sc ) infectados com o nosso virus c contra o qual se mostra eíficaz preventiva mente. i Os resultados obtidos foram discutidos á luz dos modernos conhecimen tos sobre as febres cxanthematicas, sendo as seguintes as conclusões: 1 . Cobaias immunizadas contra a febre exanthematica que surgiu cm Paulo (typho exanthematico de S. Paulo), mostram-se também immunes cm relação á febre maculosa das Montanhas Rochosas, não reagindo quando inocula* das com o virus desta ultima, oriundo de Dcrmaccntor andersoni, infectados. 2. Cobaias vaccinadas contra o vinis de S. Paulo, por meio de uma vaccina preparada com carrapatos (Amblyomma cajcnncnsc) infectados, não reage» * 1 * (*) A este respeito. Parker, icz alguns ensaios cujos resultados teve a gentileza nos communicar c que transcrevemos no seguinte trecho de uma das suas cartas: «I ccrtainly verv grateful for your kindncss in sending thc inícctcd specimcns of Amblyo* cajenntnse and thc additioiul scra. Thcsc materiais arrived today and your letter oi ‘ 22nd arrived ycstcrday. . . All thc fctnalc ticks wcrc alive and two of thc males. Thcy are alrcady on guinca V* for íccding. Aftcr discarding thc brokcn. contaminated and otherwise non-usable scrtU» samples from thc lot prcviously sent me. wc had six specimcns left ior test. One oi tíic rabbit takcn 17 days aftcr tcmiination of fever. the othcr iive wcrc all guinca I"» scra; one takcn 15 days. two takcn 2 days. and two takcn 1 day aftcr deícrvcsccncc. will doubtlcss bc interested to Icam that three oi thesc samples gave complete protectw**- Thcse includcd thc 15 and 17 day scra. Thc founh samplc gave a very considerablc degr<* of protection. thc fifth and sixth. not so much. but very definite protectivc value was prese»* in botlu. 12 J. Lemos Monteiro — O “ typho exanthematico de S. Paulo” 219 guando inoculadas, alguns dias depois, com o virus da íebre maculosa das Mon- tan ha» Rochosas. 3. Cobaias e macaco immunizados contra a febre maculosa das Montanhas °ehosas mostram-se immunes em relato ao viras de S. Paulo, enquanto que c °oaia-, immunizadas contra o typho exanthematico (typhus) não o são (resul- t4c ^> obtido e gentilmente communicado por R. E. Dyer). 4. O “typho exanthematico de S. Paulo” pertence ao grupo das febres tJt *nthematicas que têm por typo a febre maculosa das Montanhas Rochosas, Qual constituiria, talvez, uma variedade. ABSTRACT AND CONCLUSIONS A comparative study made between the viras of thc Rocky Mountain ^ted fever and the virus of the “S. Paulo typhus” and bascd on cross im- ^Unity tests shows thcir closc immunological rclationship. Thc viras oi the r**}’ Mountain spotted ícver was obtained through the kindncss of dr. R. - Dyer, of the National Institute of Health and dr. R. R. Parker, of the Rocky * r *untain Spotted Fevcr Laboratory, Hamilton. From the lattcr was also rcceivcd 4 of infected tick. ( Dcrmacentor andersoni) , which made possible the iso- and subsequent study of that viras in S. Paulo. The cross immunity tests \vere made on a series of guinca-pigs immu- against thc “S. Paulo typhus” and guinea-pigs previously inoculatcd with * hacterin prepared from ticks (Amblyomma cajcimcnse) infected with thc S. J u!<> virus, against which it proves to be prcvcntively cfficacious. The results of such tests are discusscd in the light of our modem know- of the exantliematic íevers and sccm to warrant the íollowing conclusions : 1. Guinea-pigs immunized against thc exantliematic fevcr that has ap- ^ earc d in S. Paulo (S. Paulo typhus) are found to be immune also in regard *° thc Rocky Mountain spotted fever sincc thcy do not react to an inoculation thc virus of the lattcr infcction obtained from infected Dcrmacentor ander- i9 ni. 2. Guinea-pigs immunized against the S. Paulo viras by means of a bac- !tf in prepared with infected ticks (Amblyomma ca/ctincnsc) do not react whcn lCrjc ulatcd. some days later. with tlie virus of the Rocky Mountain spotted fever. 3. Guinea-pigs recovered from Rocky Mountain spotted fever are immune l he S. Paulo virus while typhus immune guinea-pigs are not immune ; like- * l5ç . a recovered spotted fever tnonkey has been found immune to thc S. Paulo * ,rüs . both of these observations having just been made by R. E. Dyer, as re- ^* >r,c d in a personal communication. 220 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII 4. The “S. Paulo typhus”. therefore, belongs in the group of exanthematic fevers whose type infection is the Rocky Mountain spotted íever, of which rt may represem but a variety. BIBLIOGRAPHIA 1. Monteiro, J. Lemos — Estudo sobre o typho exanthematico de S. Paulo — Meffl- Inst. Butantan VI. 1931. 2. Nicolle, Ch. & Laigret, J. — Uépreuve des immunités croisées dans les diííerents ty- phus (avcc quelques considerations sur le ma usais emploi que l’on fait quelqt* fois de ccttc méthode) — Arch. Inst. Past. Tunis XXI (2) -.251.1932. 3. Jorge, Ricardo — La famillc typo-exantbcmatique — • Off. Intcrn. d'Hyg. PubL Buli. Mensuel XXV (2) :289.1933. 4. Monteiro, J. Lemos & Fonseca, F. da — Sobre um vinis isolado de ratos da zoa* urbana da cidade e suas relações com o do typho exanthematico de S. Paulo 1 Brasil Medico XLVI (50) :1029.1932. 5. Amoral, A. do & Monteiro, J. Lemos — Ensaio de classificação das Rickcttsioses 1 luz de nossos actuaes conhecimentos — Mem. Inst. Butantan VII. 1932. 6. Morris, P. V. — Histological study of a case of the Eastem type of Rocky Mountain spotted fever — Am J. Path. IX ( 1 ) :91 . 1933. 7. Pica, J T.; Meyer, J. R. & Saltes Gomes L. — Typho exanthcmatico de S. Paulo. 19a£ 8. Monteiro, J. Lemos — Comportamento experimental do vinis — Brasil Medico X' ^ (48) :1 109. 1931. 9. Felix, A. — The rabbit as experimental animal in the study oi the typhus group ol ' viruscs — ’ Trans. Royal Soc. Trop. Med. 5: Hygicne XXVI (4) :365. 1933. 10. Lima, J. Canxilho — Bacillo Proteus XL c typho exanthcmatico de S. Paulo. Brasil Medico XLVII (4) :64.1933. (Trabalho da Secção de Vmn e ViruMherapia do ln»título P®" tantan apresentado ã Soc. Mcd. 4 Gr. S. Paulo, cm I-' 1133. Dado « publicidade in Boi. Soe. Med. á Gr. S. P*» 1 ' WH AS. 1933 ti Bra.il Medico XLVII(2S^«T1933.) 14 A REACÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO NA DETERMINAÇÃO DE FOCOS E NO diagnostico retrospectivo da febre amarella por J. LEMOS MONTEIRO e I. TRAVASSOS 61 « . 541 : 616.076 A REACÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO NA DETERMINAÇÃO DE FOCOS E NO DIAGNOSTICO RETROSPECTIVO DA FEBRE AMARELLA roR J. LEMOS MONTEIRO e J. TRAVASSOS Em publicações anteriores (1), descrevémos os resultado», dos nossos estu- sobre a possibilidade do diagnostico retrospectivo da febre amarclla por **<<> da reacção de fixação do complemento. Na presente nota daremos os resultados de rcacçõcs praticadas em sóros indivíduos suspeitos de febre amarclla e provenientes de Santa-Cruz de la ^ :e rra, capital do Departamento de Santa-Cruz na Boi i via. Estes soros nos 0r am enviados pelo dr. Salvador Mazza, chefe da "Missão de Estudos de Pa* •hologia Regional”, da Universidade de Buenos Ayres, que, por parte do gover- ^ da Provinda de Salta, Argentina, procedeu ás investigações de comprovação ^diostica òi loco, estudando clinicamcntc os casos e colhendo o material nc- ° C5 5ario aos differentes exames. A epidemia, em prinripios ele 1932, alastrou-sc entre os soldados do regi- sto boliviano “Colorados”, victimando cerca de GO % dos homens da tropa, apagando-se á população de Santa-Cruz c fazendo varias victimas. O presente 000 do Departamento de Santa-Cruz attingiu principal mente a cidade de Santa- Cr «z de la Sierra, extendendo-se ás províncias de Vallc Grande e Cordillcra, ^do de presumir que, antes de fevereiro de 1932 c já ha vários annos, rcinas- * a febre amarella sob a forma endêmica em differentes zonas «laqucllc Dc- ^^amento. Segundo informações de Mazza (2), Santa-Cruz e circunvizinhanças pa- r ' C ° c já terem sido visitadas pela febre amarclla anteriormente. Documentoi da- ‘^do de JS87 c que foram posteriormente publicados na “Revista dei Instituto ®d>co Sucre” (N.° GO, julho 1932), referem a exi tencia do mal nessa epocha 1 População das Missões (Misiones), desde Santo Antônio de Parapcti até Mu- c hiri. na provinda de Cordillera. cm 7 SCÍELO, 2.1 12 13 14 15 16 17 224 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII A doença, até então classificada sob a rubrica de “icterícia grave de cara- cter epidêmico’’ , manifestou-se. segundo a descripção do dr. Mamerto Salas, medico do regimento “Colorados”, do modo seguinte:” os doentes apresenta- vam febre alta de 39° a 40°, mal estar geral, cephaléa intensa, lingua saburrosa. dór epigastrica com irradiações para o figado, vonutos frequentes em alguns casos e diarréa; em outros, myalgias do thorax e dos membros, pulso accelerado; seguia-se um segundo periodo apyretico com depauperamento accentuado, de- pressão mental e manifesta intolerância gastrica. A maioria dos doentes me- lhorava definitivamente neste periodo, mas outros sof iriam de hemorrhagi* 5 múltiplas e abundantes: epistaxes, estomatorrhagias, hematénreses, melenas e. ainda, lhes apparecia uma sub-ictericia nas conjuncíivas e na pelle. Em certos doentes, a urina revelava grande quantidade de albumina”. O material que nos foi enviado pelo dr. Mazza constava de soros dc doen- tes e de convalescentes e destinava-se ás provas de protecção de Macacus rhcsuS e fixação do complemento. A primeira prova não poude ser realizada neste Ins- tituto por faltar actualmcnte o material adequado, tendo sido feia somente 3 prova de fixação do complemento nos 11 soros enviados. Aquelle illustre collega, concomitantemente, enviou os sóros e material àc necropsia ao Instituto Oswaldo Cruz, do Rio de Janeiro, tendo também rentf*.' tido soros ao dr. Nelson Davis, do laboratorio da Fundação Rockefeller, na Bahia, onde foram realizadas as provas de protecção em camondongos brancos- No Instituto Oswaldo Cruz. o dr. H. Aragão procedeu ás provas de agglutinaçá 0 para Leptospira ictero-hcmorrhagiae e os drs. Burle dc Figueiredo e Magarin 0 ® Torres procederam ás verificações anatomo-pathologicas . Corroboraram as coU' clusões destes últimos exames os professores Rocha Lima, do Instituto Biolog 1 co dc S. Paulo, c Hoffmann, de Havana. Todos os resultados foram concordes cm firmar o diagnostico de febre an>a relia e é de notar que todas essas pesquisas foram cííectuadas por esses di' 1 ^' sos investigadores sem que soubessem dos resultados obtidos pelos demais. 0 que vem realçar o valor dessas differentes provas no diagnostico do mal am 3 rillico. A prova da reacção de fixação do complemento, por nós realizada, con’ portou-se egualmente a contento e a accentuamos por ser um meio de diagnosti* co recentemente estudado e ser esta a primeira vez que é chamada a prestar s®* viços no diagnostico da infecção e elucidação de um foco. (*) (*) Recentemente, tivemos conhecimento do resumo, m Tropical Diseases Bulle* 19 XXX (1) :3. 1933. de um trabalho de Soper. Frobisher. Kerr c Davis, onde são consigna 1 *'-’ 5 os resultados por ellcs obtidos com a9 provas de reacção de fixação do complemento CL<0 parativamente com a de protecção cm macaco rhesus. feitas depois dc um surto ep5d*® uI« I, e Ilt ' > cm ISciELO D 11 12 13 14 15 16 Monteiro & Travassos — Fixação do complemento e febre amarella 22o Resumiremos agora a technica empregada, os resultados obtidos c faremos algumas considerações em torno do tempo optimo da sangria dos doentes em evolução do mal. Xa nossa 2.* nota publicada nas Memórias do Instituto do Bu- buitan (1), expusemor» a technica que empregámos nos nossos estudos sobre a reacção. Como os nossos antigeneos, conservados no frigo, datassem de quaii 2 an- nos, antes de realizarmos as provas definitivas procedémos a um ensaio com *oros, mantidos em stock, de antigos doentes de febre amarella, de Silcnus ( Ma - cacus) rhesus sagrados 1 a 2 meses após a infecção e de individuos normaes, videntes na Bahia (Brasil) e de resultados positivos, anteriormente verificados. O quadro Xo. 1 dá os resultados dessas investigações e os resultados ante- riormente obtidos com esses mesmos soros, o que nos permittiu aífirmar (3) que o antigeno amarillico preparado com figado de rlursus infectado conserva «Atáveis e, talvez, mesmo fortalecidas, suas propriedades fixadoras do comple- mento por um tempo relativamente longo (vcriiicação após quasi 2 annos), em íace de sóros específicos. O quadro Xo. 2 reune os resultados obtidos com os 11 soros enviados. Xesse quadro são assignalados apenas os resultados de : a) iv acções por nós praticadas, embora outras tenham sido feitas pelo dr. S. Mazza com anti- geno que lhe enviáramos; b) prova de protecção, quando também realizada com ° s referidos soros. As informações clinicas que completam o quadro nos foram enviadas pelo dr. Mazza e os resultados das provas de protecção para camondongos brancos, re alizadas pelo dr. Xclson Davis, foram transcriptas do trabalho do dr. Maz- *( 2 ). 42%, resultados muito approximados ao anteriorroente por nós obtido (Mcm. Irut. “atantan V:185.1930); isto serve para confirmar ainda a nossa asserção quanto á possível “nrrtunizacão dos moradores cm zonas endêmicas, independente de infeccão apparcntc c cx- •'■Kavcl talvez pelo mcchanismo já suggerklo por um de nós (Mcm. Inst. Butantan V:112.- 1930). Em 101 soros de pessoas residentes longe da zona de cndcmicidade. aquelles pesquisadores Criticaram somente 3% de resultados positivos o que concorda com os nossos estudos ^7v) realizados com sóros de estrangeiros (japoneses) reccm-chegados ao Brasil, podendo * Pequena differença ser explicada pela inclusão fortuita de soros dc pessoas immuncs an- te riormcnte residentes cm zona endêmica Comparativamente com a prova dc protecção cm macaco, cllcs verificaram cm regra Afirmando os resultados de nossas pesquisas anteriores, que os soros dc reacção positiva '^'arn protecção completa, apenas com uma discordância dc 13% favoravel a esta ultima l*rova. a prova de protecção, cm todo caso, pode tambem falhar, como aconteceu cm 1 e * ío - descripto pelos auetores, cm que foi cila praticada com intcrvallos dc meses, mostrando, 0ra completa protecção, ora ausência de protecção e ora protecção incompleta. 22G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII cm SciELO 3 11 12 13 14 15 16 QUADRO No. 2 Xo. do soro Informações clinicas c outros dados Reacção de fixação do complemento Prova de pro- tecção para camondongo bronco OBSERVAÇÕES 02 de soro 0.1 de soro 2 J. M. C. de Santa-Cruz. clinicamente febre typhoide, Widal posi- tivo a 1/200. pesquisa plasmodios negativa. 0 0 ? 3 C. C, de Valie Grande, sub-ictcricia. 14 dias de doença, pesquisa Leptospira negativa. PLasmodio negativa. -f 4- + + > 5 A. M- de Potosi, doente ha 5 dias. epistaxes, Plasmodio tnxur no sangue. 0 0 ? 10 S. L. R.. soldado chegado de Sucre. com 1 anno de residência cm Santa-Cruz. Sem dados clínicos. Pesquisa Plasmodio negativa. + + Positiva >■ J. A., de Comarapara (Valle Grande). Convalescente. Sem dados clinicos. Plasmodio negativa. ++++ ++++ Positiva 12 M. M., de Warnes (Santa-Cruz). Symptomas de ictericia grave. Internado a 15 de março, sangue colhido a 25 de abril. Plasmodio negativa. +++ +++ Positiva 14 D. A., recem-chegado de La Paz. ictcricia grave, paralysia espás- tica dos membros. Entrado a 1 de abril, sangue colhido a 26 de abril; ainda doente com sub-ictericia e paralysia. 0 0 Negativa 18 R. M.. soldado, de Santa-Cruz, sem dados clinicos, convalescente. Plasmodio negativa. ++ +++ ? 19 M. E.. civil, de Santa-Cruz. hcmorrhagia, manchas petcchiaes. ictc- ricia. considerado paludico. 0 0 ? 20 H. H., civil, de Santa-Cruz. com ictcricia. sem hcmorrhagias, con- siderado paludico. Plasmodio negativa. Convalescente. 4* + ? 21 F. V.. civil, de Charagua. com ictericia, hcmorrhagias, manchas petcchiaes. Plasmodio negativa. Wcil-Felix positiva a 1/200. 0 0 ? Testem unhis Rhesus . .103 Rhesus . . 57 Rhesus . . 9 Cobaia . .471 j Immunizados febre amarelli j Inoculados ctypho exanthemaico de S. Paulo.» ++++ ++++ 0 0 ++++ ++++ 0 0 ( Sangrados j após 30 dia» 4 - a ++++ = diffcrentes graus de reacção 0 = resultado negativo ? = reacção não praticada ou de resultado não conhecido cm SciELO L3 14 15 16 17 lí 19 20 21 22 Monteiro & Travassos — Fixação do complemento e febre amarella 229 As reacções variaram em graus, do positivo intenso ao fraco. E’ de crer que os soros que mostravam resultados fracos tenham sido colhidos em períodos um tanto precoces, existindo o> anticorpos fixadores em quantidade insuf riden- te para provocar o phenomeno da fixação total do complemento. Pelas observações que temos colhido, os resultados mais intensos têm sido obtidos com soros de doentes sangrados a partir de 20 a *40 dias após a queda da temperatura. Xão podemos, entretanto, predsar definitivamente o período optimo da sangria, por isso que não nos foi dado até agora acompanhar no homem, nas differentes phases da infecção, a evolução dos anticorpos fixado- res do complemento. Nos rhcsns infectados experimentalmente, sangrados entre 10 e 30 dias após a inoculação do vinis, os resultados francamente positi- vos se mostram na porcentagem de 88,45c e nos sangrados entre 31 e 70 dias obtem-se 100 %, para depois decrescer a 36,3 % nos sangrados mais de um anno após a inoculação do ivims. No homem, é de crer que a evolução dos anticor- pos fixadores soffra a mesma marcha decrescente, para depois, talvez, se es- tabilizar, sob determinado teor (dependendo da própria infecção), conforme acontece com os anticorpos protectores, revelados pela immunidadc adquirida. Pelos dados que foi possível colher, enviados pelo dr. Mazza, presume-se que o soro do doente 3, com resultado fraco (-j — f-)» tenha sido colhido aos 14 dias da doença; o caso 11, francamente positivo (-j — 1 — ! — [-)> na convalescença (?); o caso 12, positivo (-1 — | — h). aos 40 dias; o caso 18, positivo fraco (-) — (-). na convalescença (?); quanto aos demais não temos outras informa- ções. Seriam necessários dados mais minuciosos a esse respeito para que fi- casse esclarecido definitivamente o período optimo em que se deve praticar a sangria. Em conclusão, a noção a tirar destes resultados, embora cm numero redu- zido, é que a reacção se presta sobretudo para o diagnostico retrospectivo da febre amarella, servindo como uma prova a mais para firmar o diagnostico desta infecção e elucidação de novos focos. Um outro ponto para o qual queremos mais tuna vez chamar a attenção é o da technica. Os elementos da reacção devem ser rigorosamente doseados c em especial o complemento que deve ser addicionado na dose óptima, principal- mente nos casos em que se presuma a presença de anticorpos em pequena quan- tidade, o que se verifica nas sangria* precoces. Nestes casos, a reacção deve ser ensaiada com o complemento addicionado na unidade complementar justa ou ligeiramente accrescida. pois só assim as reacções fracamentc positivas po- derão ser apreciadas. A leitura dos roultados deve ser feita cm 2 tempos: 1 .* — 10 minutos após a hemoly-e completa, no tubo testemunha do soro; 2.*: — cerca de 8 a 10 horas dc permanência no frigo, não sendo conveniente prolon- gar em demasia essa segunda leitura . A reacção bem executada pode dar informações de grande utilidade pratica. 9 230 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII RESUMO A reacção de fixação do complemento efíectuada em uma serie de soros de doentes de febre amarella provenientes de Santa-Cruz de la Sierra, Bolivia. deu resultados que variaram em graus do fraco ao forte e pareciam estar na dependencia do teor de anticorpos fixadores presentes no sangue por occasiáo da sangria. Conforme se deduz das observações já colhidas, as reacções mais accentuadas se verificam a partir dos 20 a -10 dias após a queda da temperatura, não tendo sido, entretanto, até agora estabelecido definitivamente esse ponto optimo, ponto em que os anticorpos amarillicos fixadores do complemento se encontrem mais abundantemente no sangue. Provavelmente o inicio de sua formação se processaria desde o final da infecção, elevando-se na convalescen- ça, attingindo um máximo, para depois decrescer, como acontece nos rhesus e et-tabilizando-se talvez sob terminado teor, conforme occorre com os anticor- pos protectores, indice verificável da immunidade adquirida pelo individuo- Este modo de ver justifica-se pela percentagem de resultados positivos obtidos com soros de indivíduos residentes em zonas onde o mal se tem mostrado en- dêmico. Os resultados da reacção de fixação do complemento com os soros exami- nados concordaram, em geral, com os da prova de protecção, servindo a reac- ção como um meio para o diagnostico retrospectivo da febre amarella e taiir bem para a elucidação de novos focos da infecção. Xa realização daquella prova deve-se dar especial attenção ao doseamento dos elementos que entram na reacção, especialmcnte o complemento, que deve ser addicionado na dose justa, sobretudo nos casos de doentes cujo soro tenha sido colhido nos primeiros dias após a queda da temperatura, nos quacs o teor de anticorpos é quasi sempre pequeno. ABSTRACT Complement fixation reaction performed in a series oi sera of yellow feveT patients írom Santa-Cruz de la Sierra, Bolivia, yielded results varying from weakdy positive to highly positive apparently depending on the rate at which the espedfic antibodies were present in the blood at the bleeding time. The reactions appear to be more marked whh sera taken after 20 to ^ days since the drop of temperature; the optimun period for bleeding, howcver, lias not yet been established. Probably such antibodies begin their appearance since the end of the fever itself and raisc during the convalescence, first reaching a maximum onlv t0 decrease aftenvards and become stabilized at a certain rate as íound with the 10 Monteiro & Travassos — Fixação do complemento e febre amarella 231 protecting antibodies which serve as an indication for acquired immunity. This opinion seems to be justified by the percentage of positive rcactions obtained % ith sera of persons living in localities where yellow fever has been endemic. The results of the complement fixation reaction performed with the 11 simples of sera received frotn Santa-Cruz de la Sierra, Bolivia, through Dr. S. Mazza, of Buenos Aires, agreed in general with those of the protection tests 'ndependently conducted by Dr. N. Davis, at his laboratory, in Bahia. Thcre- fore, that reaction may be used as a means both of establishing the retrospec- live diagnosis of yellow fever and of tradng new foci of this infection. The complement fixation reaction must be conscientiously performed es- pecial attention been given to all of the elements used, particular)' the comple- n *nt, which must be added in the right dose. This precaution is cssential in dealing with sera that have been secured during tlie first days following the drop of temperature, when the rate of antibodies is still low. BIBLIOGRAPHIA 1* Monteiro, J. Lemos & /. Travassos — C. R. Soc. Bio!. CIV (21) :697.I930; Brasil- Medico XLV (12) :288 . 193 1 ; Sexta Reunion Soc. Arg. Path. Rcg. dcl Xortc, Salta, Oct. 1930; Mem. Inst. Butantan V:173.1930. 2- Mac: j, Sakador — Univ. Buenos Ayres. Miskrn de Estúdios de Pat. Rcg. Arg., Jujuy, Publicación Xo. 9. 1932. ^ Monteiro. J. Lemos & /. Travassos — Brasil-Mcdico XLVI(27) :597. 1932. 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IV — Propriedades geraes: resistência ao calor, á luz. ao envelhecimento; acção dos ácidos do álcool e do formol; adsorpção pelo caolim c pek> alume; filtração, con- centração e deseccamcnta V — Producção da toxina in vivo. Vi — Poder antigenico da toxina: antitoxina estaphylococcica. a) vias de immunização experimental; b ) neutralização das varias acções toxicas da toxi- na; e) relações quantitativas do poder de neutralização das varias acções toxicas; d) immunização activa e passiva e acções toxicas dos filtrados; t) poder curativo da antitoxina cm relação aos cf- feitos toxicos da toxina. ^ II — Immunização activa c passiva c infecção sob condições experimentacs. 'Hl — Anatoxina estaphylococcica: a) preparação; b) poder antigenico; c) poder floeulante; d) emprego therapcutico. IX — Producção de antitoxina em escala industrial: a) processos de immunização; b) processos de doseamento; c) novo processo de doseamento; d) concentração. X — Discussão. Summario. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 ESTUDO EXPERIMENTAL SOBRE TOXINA ESTAPHYLOCOCCICA POR J. TRAVASSOS Em janeiro de 1928, cm Bundaberg, Queensland, a contaminação por esta- phylococcos dc mistura toxina-antitoxina diphterica, usada cm immunização prc- v entiva, causou a morte dc 12 dentre 21 crianças então inoculadas, perecendo todas de septicemia estaphylococcica cm 24 horas ou mais. Este desastre veiu o^is uma vez focalizar a necessidade de uma investigação mais completa desta deteria, sobretudo de seus productos toxicas, para os quaes a "Royal Com- ^•■ssion”, encarregada do estudo dessa occorrencia, chamou em especial a atten- nos seguintes termos: "massive producticn oi toxic substances must have placc in the fatal cases if staphylococci were the rcsponsiblc agents” (1). A’s septicemias estaphylococdcas, por vezes occorrcndo em inJividuos appa- r cntcmentc sãos, sem o desenvolvimento de uma infecção geral c somente reve- ndas pelos abcessos metastaticos, provavelmente oriundos de embolias bactcria- ^ partidas de focos em evolução ou de focos latentes cm remissão, contra- Põctn-se as toxemias estaphylococdcas que apresentam um quadro typico, quasi ^'npre de prognosticos desfavoráveis c de mortalidade elevada, conforme se dc- í^ehende dos artigos de Otten (40) que 'verificou 80% dc casos fataes em 55 Atados; de Soper (59) que constatou 72 % de morte em 40 casos; de Lowcn- (29) que refere 57 casos com 51,4% de mortalidade. Estas septicemias, l^i sempre de marcha fulminante, seriam conscquenda, não só da menor re- '-‘stencia do organismo, como da maior virulcncia da bactéria infectantc (Bowlcr c Boardman) (7). “Parasita constante da supcrficie do corpo e das mucosas, S^almcntc de fraco poJer invasor, não se poderia explicar este augmento ra- Mo c sensivel da virulência do estajjhylococco si não por uma accentuada di- ^^uiçâo da resistência individual, embora se admittisse a hypothcse dc uma con- ■^inação externa por organismos altanjente virulentos” (Lowcnstcin). As ^Pricemias por estaphylococcos dc fraca virulência, cm organismos de resisten- ^ diminuida, seriam mesmo de prognosticos mais desfavoráveis do que as cau- *** por estaphylococcos altamente virulentos, mas em organismos de resisten- cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 238 Memórias do Instituto BuLantan — Tomo VIII cia normal. Só assim se poderia comprehender a alta mortalidade das septi- cemias e particularmente daquellas resultantes das amostras de estaphylococcos ordinariamente de fraca virulência (Lowenstein). Ora, as septicemias secun- darias a íurunculos (forma erysipelatoide de George e Giroire) (17), em or- ganismos de resistência normal, de marcha fulminante e quasi sempre íataes [Pc* 1 (42), Reed e Stiles (55), Lowenstein, George e GiroireJ, não justificavam cer- tamente esse modo de pensar. A resistência organica contrapor-se-ia ã fraca virulência do germe, oriundo de idêntico modo da superfície do corpo. Nestas condições, um novo elemento, o poder toxigenico do estaphylococco, deveria sef chamado á explicação do facto. Com cf feito, a virulência nem sempre acom- panharia o poder toxigenico nas bactérias. O proprio quadro toxemico dessas septicemias, observado pelos clinico», não deixando duvidas quanto á intoxicação profunda do organismo, falaria accentuadamente em fatvor desta hypothese. A toxina estaphylococcica, elaborada mais ou menos intensamente, afastanlo as de- fesas naturaes, facilitaria a invasão do organismo e agindo sobre os pontos mais vulneráveis seria responsável pela morte, tantas vezes observada no decurso das septicemias provocadas por esta bactéria. Poderia o estaphylococco produzir uma toxina solúvel? Teria esta toxina propriedades que inhibiriam as defesas organicas? jAgiria ella, por si só, sobre certos orgãos, provocando a morte pelo modo brutal e rápido tantas vezes obser- vado nas septicemias estaphylococcicas ? Qual o mecanismo de sua acção mortal ? Uma rapida digressão pela literatura do assumpto deixar-nos-á a par d» questão : Pesquisas experimentaes. algumas bem antigas, demonstram o poder toxico de ftHJ** dos de culturas dc certas amostras de estaphylococcos. Lcber (Jl). Christmas (.10). c Courmont (56). Mosny c Marcano (32). Lingclsheim (30). entre os mais antigos. Krao* c Pribram (27). Xicolle e Cesari (35). Parker (43 a 46), mais recentemente, entre outro*» estudaram um principio activo existente nos filtrados dc cultura de estaphylococcos. co*° poder pyogenico, necrosante e letal para animaes de laboratorio. Os cf feitos erythrocytoly tico c lcucocytolytieo desses filtrados, ficaram bem conhecidos através das publicações 4* Kraus (26). Vati dc Velde (64 e 65). Bail (4). Lingehhcim e Xeisser c Wechsberg (36)» tendo sido posteriormente objecto dc numerosos estudos por vários experimentadores- •' producção dc uma gelatina se. de um fermento protcolytico de acção sobre o leite, albumi»* do ovo e soro, coagulados; e acção coagulante do plasma c o cf feito fibrinolytico — 1* constituiram assumpto para numerosas pesquisas experimentaes. Russ (57), Kellawray, Burnct e Williams (25). investigando a pharmaco-dynamica & toxina, em preparações de coração-pulmões isolados dc animaes inoculados por via venos*» verificaram que cila tem um cf feito nocivo sobre a circulação pulmonar, paracendo pro^*' zir grande damno sobre os capillarcs e sobre os pequenos vasos. A morte dos animaes da* 1 ' do-se minutos após a inoculação da toxina por via venosa, seria consequência de t 30 * queda brusca da pressão sanguínea. Os trabalhos de Burnct (1), ultimamente apparccidos c realizados em consequência »°* desastres oc corridos em Bundabcrg, reuniram uma serie de pesquisas sobre a toxina est*' phylococcica e não deixaram margem para que seja posta em duvida a capicidade tox:g c0 ’" cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 239 ca de certas amostras desta bactéria. As publicações de Gross ( 1-4). de Parish c Clark (47 a ■*9), Gengou (15). Panton. Yalentine e Dix (51 e 52), Ddman (12). Burky (3). Xelis (37 a 39) e de outros, posteriores aos de Burnet. confirmaram os seus magníficos estudos. Xo decorrer de nossos estudos sobre a toxina estaphylococcica. alem das propriedades lá assignaladas, tivemos occasião de verificar, também, o cííeito tetanizante da toxina quando inoculada directamentc no ccrebro de animacs (Travassos (63) ]. Este cffeito tornaria este principio activo responsável pelas chamadas meningites e meningismos. eviden- ciados com frequência em clinica, na phasc terminal das septicemias ou consequentes a infecções oto-rhinologicas. Também uma substancia de acção gastro-intestinal foi descripta c recentemente estu- ada por Jordan (20 a 22), NVoolpcrt c Dack (66) e outros. Esta ligeira revisão da literatura mostrados de relance todos os ef feitos co- nhecidos dos filtrados de culturas de estaphylococcos. O ef feito lytico sobre as cellulas do sangue e dos teddos, o poder coagulante do plasma e o íibrinolytico, c o mecanismo d amorte rapida dos animaes inoculados por via venosa, explica- riam provavelmente a pathogenia «da maioria das lesões cstaphylococcicas : trom- boses, necroses e consequentes abcessos e o mecanismo da morte nas septicemias, caso outros factores não interviessem. Dando á toxina e ás secreções da oellula estaphylococcica a responsabilidade das lesões causadas por esta bactéria, facto aliás cabível ante as differentes acções toxicas dos filtrados, o antigo problema novamente se focaliza: cm que Condições o cstaphylococco, parasita da pcllc e das mucosas do homem c dos animaes, se pode tornar virulento e altamente toxigcnico? O problema enca- po por este prisma, já tão debatido nos primórdios da bacteriologia, acarreta 0 estudo de uma serie de factores, inherentes ao organismo infectado c á pro- Pria ccllula bacteriana e dos quacs a maioria permanece ainda dcsconlíccida. Xesta publicação, mostraremos os resultados dos nossos estudos sobre a toxina estaphylococcica e, também, sobre a antitoxina c a anatoxina, de tão pro- 'hettedor alcance thcrapeutico nas cstaphylococcias localizadas c generalizadas. Xo decorrer destes estudos experimcntacs tivemos a assistência da dra. Jandyra Planct. presentemente em estagio de aprendizagem cm nosso laboratorio. •^gradeccmo-lhc aqui a sua efficientc cooperação technica. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 240 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII I Preparação da toxina in vitro. As condições necessárias para a producção da toxina in vitro, já bem esta- belecidas por Walbum (57), Parker, Oppenheimer (41), Bigger e collaborado- res (8 e 9) e recentemente por Burnet, reterem-se em particular á reacção do meio de cultura e a certas substancias que favorecem ou impedem a sua maior elaboração. Tanto em meio liquido (Walbum, Parker, Burnet), como em agar semi-solido (Oppenheimer, Bigger e Burnet), pode-se obter um 3 toxina bem activa, si a concentração do ião H se mantem entre 6, 0-7,0. Walbum. que melhor estudou o problema sob este aspecto, af firma que um pH inicial de 5,0 é o mais apropriado, embora possa variar entre 5,0 e 10,0; porem, em um caldo commum, após 5 dias de desenvolvimento, a reacção final deve estar entre 7,6 e 8,6. Par 3 esse fim, um soluto tampão de phosphato poderia ser usado, con- forme posteriormente também fez Parker, mas, quando se emprega uma quantidade sufíiciente do soluto tampão, o resultado c bem ia* ferior. O fim almejado seria, entretanto, obtido indirectamente, desde que se conservassem as culturas em uma atmospbera que contivesse de 10 a 25 % de CO 3 . Os estudos de Walbum e Parker mo st nua que este gas age como uma verdadeira substancia tampão, diminuía* do a progressiva alcalinidade do meio durante o crescimento do germe- Burnet, cm estudos mais minuciosos, suggere que, sob a acção do CO 3 , as cellulas estaphylococdcas do typo ourais, se tomariam mai$ permeareis aos iões H, ficando o meio interno mais acido, condiç a ° necessária para a elaboração e dif fusão da toxina. As variantes aU> aS > naturalmente permeáveis aos iões H, requereriam exclusivamente u®* pH do meio para o lado da acidez, dispensando todo e qualquer tra- ço de CO 3 . Combieseo e collaborado res (11) substituiram, com r* - sultado, o CO 3 pelo gas de illuminação. Certas substancias addicionadas aos meios de cultura favorece- riam a producção da toxina, enquanto que outras a inhibiriam. O* saes de magnésio, segundo Walbum, seriam até certo ponto esse 3 * cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina eslaphylococcica 241 ciaes, sendo suíficiente a addição de pequena dose de 0,03% de sul- fato de magnésio para que a elaboração da toxina fosse maior. Os saes de potássio, nickel, manganez, ouro e platina teriam o mesmo ef feito. Ao contrario, o chloreto de sodio, eommummente usado na dose de 0,05%, bem como os saes de cálcio, seriam substancias inhi- bidoras. A glycose, como diz Parker, teria poder impediente, po- dendo isso ser explicado, ou pela acção de poupança da proteina (pro- tein sparing action), demonstrada por Kendall (28), ou pelo facto de ser impossivel a manutenção do pH pela formação de acido (*). Cultivos em anaerobiose mostraram a Burky, que, apezar de não conterem uma forte hemolysina, os filtrados se mostram toxicos para coelhos por via venosa. Dos difíerentes meios de cultura que usamos para a preparação da toxina 'staphylococcica (caldo commum, caldo Martin, meio de Parker, etc), des- tac amos os 2 seguintes que nos deram filtrados mais activos: a) meio de Wal- ■' u ni modificado por Bumet — a 1 litro de agua de carne preparada com coração ds boi (250,0 para 1 litro de agua), addiciosar 5,0 grs. de peptona Witte, 2,0 8 f s. de phosphato de potássio (KH : P0 4 ) e 0,3 grs. de sulfato de magnésio ^IgSO 4 ) ; dissolver, filtrar e ajustar o pH entre 6,0 c 7.0; distribuir cm fras- es de 50 cc. c esterilizar a 120° por 30 minutos; b) agar commum a 0,8%, de pH 6,0. Cultivos em caldo de 24 horas são transplantados para os frascos com o ‘^io a) ou para placas contendo o meio b). Estes frascos ou placas são col- taados cm uma campanula munida de 2 tubuluraduras. Ycda-se com parafina l °da a reborda da campanula c, cm seguida, faz-se passar mna corrente de preparada num apparelho de Kipper, ligado directamcnte a uma dessas tubuluraduras. A outra, ligada a um tubo recurvado na extremidade c que pe- ttrira numa proveta graduada repleta dagua c, por sua vez, invertida numa cuba t^cia desse liquido, serve para dar passagem ao ar deslocado. 20% do volume d° ar da campanula é substituido por uma corrente de CO s , vedando-sc então orifícios das tubuluraduras. A campanula permanece na estufa a 37°, por 6 d‘ as , sendo que geralmente no 4.® dia é renovado o CO : . As culturas de 6 dias, Adicionadas de uma camada de toluol para matar os germes, permanecem no tr igorifico por 24-48 horas, quando são então filtradas ou centrifugadas for- tc mente. A conservação faz-se sob toluol e no frigorífico, ou após desseca- (*) Rcccntctncnte Xclis (37) dix ter obtido toxinas cstaphylococcicas cm meio de tnon - usado na preparação da toxina diphterica. as quacs não só sc mostravam mais activas ^Ção hcmolytica) do que as preparadis cm meio de Walbum. como attingiam um alto tttulo jj no f; m cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 242 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII mento. Antes do uso verifica-se a esterilidade da toxina por semeadura effl caldo e a "ar commum. Varias experiencias por nós realizadas demonstraram que se obtêm toxinas mais activas: a) quando o pH do meio era ajustado entre 6,0 e 7,0 antes da esterilização; b) quando o volume do liquido não ultrapassava de 50 cc.; c) quando o cultivo era feito em recipientes de larga superfície. Para se obter a toxina dos meios de cultura semi-solidos, procedia-se do seguinte modo: as culturas de 24-48 horas de varias placas eram cortadas cotn uma espatula em pedaços bem finos e estes amassados com um bastão de vidro até que fosse formada uma massa bem homogenea. Esta era íortemente espr*' mida em gaza, o liquido centrifugado, addicionado de toluoJ e conservado no frigorifico. II — Poder toxico: a) acção erythrocytolytica; b) acção leucocytolyt*- ca; c) outras acções cytolyticas: d ) acção necrosante; e) acÇ*° coagulante do plasma e acção fibrinolytica; f) acção mortal; acção tetanizante; h) acção gastro-intestinal. Os auctores que estudaram o assumpto verificaram que nem todas as amos- trar de estaphylococcos pathogenicos são boas productoras de toxina. ÍRuss (57)> trabalhando com 250 amostras, achou que somente 80 eram hemolyticas e, destas, apenas 16 produziam toxina capaz de matar o coelho por via intravenosa. Bur- nct (1) achou que os resultados de Russ, seriam bem melhores si este auctor ti- vesse realizado suas experiencias usando meios de culturas em condições mai* adequadas. Xas nossas experiencias em meio de Walbum, de 67 amostras de estaphyl 0 " coccos pathogenicos estudadas sob este ponto de vista, sómente 7 deram toxina 5 de accentuado poder crythrocytolytico. Xesse estudo, não verificamos nenhuma relação entre a virulência das amostras e o poder toxigenico das mesmas. Certas amostras isoladas de casos graves (septicemias, meningites) não mo?' traram actividade toxigenica mais elevada que outras, isoladas de lesões bem calizadas (úlceras, ostco-myelitc) e apparentemente sem maior gravidade. Algumas das amostras mais toxigenicas faziam parte da nossa colleção c foram isoladas ha vários annos (1928 a 1932), o que revela que o poder to* 1 ' gcnico c mantido por longo tempo. Por outro lado, algumas das amostras i? 0 * ladas reeentemente não mostraram maior poder toxigenico. O augmento da virulência dos estaphylococcos por passagens successivas 1,0 organismo do coelho, não modificou o poder toxigenico de 3 amostras en ' saiadas Ha portanto uma verdadeira dissociação entre a virulência e o poâC* toxigenico. 10 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 243 As acções toxicas das culturas ou dos filtrados de culturas estaphylococ- cicas, até agora estudadas são as seguintes : erythrocy tolyt ica, leucocytolyiica, ly- tica para as cellulas dos tecidos e particularmente acção necrosante para a pelle ; acção coagulante do plasma e ef feito fibrinolytico ; as acções proteolyticas so- bre o soro, leite e albumina do ovo coagulados, e acção dissolvente sobre a gelatina; paler mortal, quando inoculada por via intravenosa; acção tetanizan- quando inoculada directamente no cerebro, e, ainda, um veneno gastro-in- testinal. .Xo decorrer dos nossos trabalhos tivemos oecasião de estudar vários desses «f feitos de filtrados de culturas de estaphylococcos e resumimos a seguir os re- sultados obtidos. a ) Acção erythrocytolytica — Os filtrados de culturas de certas arnos- as de estaphylococcos têm o poder de lysar mais ou mcsos mtcnsamente os glo- bos vermelhos do sangue dos differentes animaes. Essa acção lytica, pela qual é rç sponsavel um principio activo filtrarei, é dcstruida pelo calor e pela acção dos a <ádos e do formol e provoca, quando inoculada em animaes, o apparccimento 'k um anticorpo que a neutraliza. Para a avaliação quantitativa da acção erythrocytolytica dos nossos filtra* dos, usamos a seguinte tcchnica: a 0,5 cc. de differentes diluições dos filtra- dos (1/25, 1/50, 1/100, etc.), addiciona-se 0,5 cc. de uma diluição a 2 % de Sutiãs de carneiro, previamente lavadas e resuspensas cm salina a 0,85%, ^ quantidade correspondente ao volume inicial do sangue. Incuba-sc em ba- n ^o-maria a 3/° por 1 hora, agitando os tubos cada 15 minutos, sendo estes depois levados á geladeira até a manhã do dia seguinte, quando então é feita i leitura definitiva. A quantidade de toxina contida no tubo cm que se verifica de hcmolyse Bumct a considera como a unidade erythrocytolytica do fil- hado (D. M. H.). Para uniformidade e estudo comparativo dos resultados, a ^ividade hemolytica das nossas toxinas foi avaliada sob as mesmas bases. As diluições dos filtrados feitas em salina addicionada de 10% de caldo ^ímum, como aconselha Bumet, augmentam, até certo ponto, o poder hemo- fílico de certas toxinas, embora não exerçam maior influencia sobre outras. O doseamento por incubação no frigorifico não nos deu resultados ani- ^dores. Xestas condições, certas toxinas não mostram cí feito algum enquanto outras revelam um poder hemolytico entre 100 e 200 unidades. Se após a *•* incubação no frigorifico incubam-se os tubos cm '«anho-maria a 37° por 1 ^ 0r a, o cf feito hemolytico se revela acccntuado, alcançando titulos elevados. As ^wtias sensibilisadas pela toxina (no frigorifico) centrifugadas c resuspensas ^ salina e incubadas a 37°, são lysadas rapidameste, o que demonstra a fixação ^ toxina sobre esses elementos. O volume do meio de cultura tem grande importância na producçâo de 11 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 244 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII erythrocytolysina de alto titulo. Usando a principio frascos contendo 500 a 250 cc. de caldo para o cultivo do germe, nunca conseguimos toxinas de poder acima de 50 unidades por cc.. Com a technica recente, empregando frascos contendo 50 cc. do meio de cultura, os resultados foram muito melhores, al- cançando por vezes 3.200 unidades por cc.. A producção da erythrocytolysina é ainda favorecida pelo cultivo em meio liquido em frascos de larga superfície» parecendo isto correr por conta de um maior contacto de CO 2 com o meio. & um modo geral, as nossas toxinas de maior titulo hemolytico revelaram um p^ variando entre 6,9 e 7,6. Erythrocytolysinas de alto titulo também podem ser obtidas em agar semi* solido. A elaboração da erythrocytolysina por uma mesma amostra de estaphylo* cocco, nem sempre revela idêntica actividade, embora o meio de cultura seja d» mesma partida, de volume igual e mesmas as condições de temperatura e p^' centagem de CO 2 . Assim, as amostras 264, M. C. A. e 115, cultivadas naquellas condições, deram os seguinte valores hemolyticos : a amostra 264, cultivada cnl 3 frascos, deu 1 .400, 1.600 e 2.800 unidades por cc.; a amostra M. C. A., na 5 mesmas condições, deu 50, 100 e 200 unidades; a amostra 115 forneceu, nos 3 frascos, o mesmo titulo de 800 unidades por cc.. Varias colonias de uma mesma amostra de estaphylococcos, também, em igualdade de condições, mos- tram actividades hemolyticas diversas, umas mais accentuaias que outras. Estas experiências parecem mostrar que as cellulas estaphylococcicas não são igual' mente toxigenas e suggerem a technica a seguir para a selccção das amostras bóas produetoras de toxina. Xo que diz respeito aos globulos vermelhos de differentes espccies de aiu- macs, a actividade erythrocytolytica sc revela maior para os de coelho do <1^ para os de carneiro, cobaia, rato, pombo, em ordem decrescente. Dólman, ve * rificou variações do grau hemolytico dentro da mesma espccie, mostrando c fr * tas toxinas maior poder erythrocytolytico j>ara hematias de um animal do q uí para as de outro da mesma especie. Em geral, as nossas experiencias para 3 avaliação do poder erythrocytolytico de filtrados estaphylococcicos, foram fei t3Í com hematias de 1 unico carneiro, sangrado por varias vezes. Como se pode verificar no Quadro 1, nem todas as amostras de estaphylo coce os são boas produetoras de erythrocytolysina. iDc 67 amostras por nós C5 ' tudadas c que se mostraram hemolyticas em placas de agar-sanguc de coelh 0, somente 25 amostras revelaram valores erythrocytolyticos acima de 50 unid 3 ' des por cc.. Experimentando o poder hemolytico de varias toxinas para hematias de car * neiro e de coelho, verificamos (Quadro 2) que as toxinas apresentam um M tulo mais elevado para hematias de coelho do que para as de carneiro, g^' dando geralmente uma relação de 1 para 4. 12 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 245 A presença de um soro activo não parece fadlitar a hemolyse, o que vem confirmar as experiencias de Julianeile (23), além de que soros de certos ani- maes podem conter propriedades anti-hemolyticas por vezes accentuadas. QUADRO 1 Acção erythrocytolytica (hematias de carneiro) das varias amostras estudadas, cm unidades por 1 ce.. Total <50 > 50 < 100 > 100 < 300 >400 <800 > 1600 <3200 67 42 6 4 3 QUADRO 2 Acção erythrocytolytica dc vários filtrados para hematias de carneiro c de coelhos, cm unidades por 1 cc.. Amostras Hematias de carneiro Hematias dc coelho Relação Carolina 1.600 6.400 1 4 177 1.600 6.400 1 4 » 400 1.600 1 4 m.c.a 400 1.600 1 4 115 400 1.600 1 4 > 800 3.200 1 4 Af. 4 400 1.600 1 4 > 800 3.200 1 4 193 400 1.600 1 4 Francisco 400 1.600 1 4 O tittilo erythrocytolytico de uma toxina não se mantem estável por muitos ^ias. Toxinas conservadas no frigorifico, sob toluol e em frascos escuros, mos- caram, já no fim de 20 dias, uma actividade hemolytica diminuida dc 30% a Em temperatura ambiente, os filtrados perdem muito mais rapidamente 0 seu titulo hemolytico, embora os demais ef feitos toxicos se mostrem mais es- btveis, como por exemplo o poder mortal. Burky, mesmo após um anno de c onservação á temperatura ambiente, encontrou filtrados de cf feito mortal para 13 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 246 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII o coelho por via venosa, filtrados estes cuja acção erythrocytolytica tinha quasi desapparecido. No estado se oco, após a perda inicial sempre observada, o titulo erythro- cytolytico é mais estável, notando-se, contudo, uma pequena diminuição apos alguns meses. Glenny (em trabalho não publicado, cit. por Parish) (47), ea- controu 2 hemolysinas em filtrados estaphylococcicos, com anticor- pos especificos. Panton e Valentine (51), encontraram também to- xinas com alto titulo erythrocytolytico para hematias de coelho e que apresentavam um titulo menor para as cellulas de carneiro, não chegando a hemolysar os globulos vermelhos humanos. Uma sa- turação previa com globulos vermelhos humanos de uma toxina for- temente hemolytica para globulos de coelho e inactiva para cellulas vermelhas do homem, não reduziu o titulo hemolytico para os gl°* bulos de coelho. Pareceria então que as hemolysinas para cellulas humanas e de coelho seriam distinctas e que a toxina estaphylococ- cica raramente agiria sobre as cellulas humanas f» vilro. Comprovando estas experiencias com 3 filtrados provenientes de 3 amos- tras toxigenicas de estaphylococcos, verificámos a menor sensibilidade das he- matias humanas, submettidas á acção lytica da toxina. Assim a toxina 264, fortemente hemolytica (1/3.200) para hematias de carneiro c de coelho, mos- trou fraco ef feito erythrocytolytico para hematias humanas (1/4); do mesmo modo, as toxinas 115 e M. C. A., muito activas para hematias de coelho (1/1 .600) c regularmente para hematias de carneiro (1/400), somente mostraram bemol)'* completa para as hematias humanas, quando puras. Os globulos vermelhos hu- manos seriam, então, mais resistentes á acção lytica da toxina do que as hema- tias de carneiro e de coelho. Restaria comprovar si, em ensaios com hematias de indivíduos cujos soros são isentos ou pelo menos contem pequena quantidade de antitoxina, o poder lytico desses filtrados não se mostraria mais acccntuado. Com cffeito, Brycc e Bumet (2), em estudos detalhados sobre o desenvolvi- mento da immunidade natural á toxina estaphylococdca, estabeleceram tuna cur- va do teor antitoxico dos soros de indivíduos de varias idades, que se assemelha á curva da immunidade natural á toxina diphterica, na qual se vê que nos in- divíduos adultos o teor anti-erythrocytolytico do soro é sempre elevado. ,Occa- sionalmente em coelhos (5%) se poderia observar também tuna certa immtini- dade natural. b) Acção leucocytolytica — O estudo da leucocidina estaphylococcica teve o seu ponto de partida nas experiencias de Yan de Yelde (1894) (64), q llC descobriu, nos exsudatos de coelhos inoculados por via pleural, uma substancia q 1 ^ provocava a degeneração bolhosa e a lyse dos leucocytos. Lingelsheim (30) > 14 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estapht/lococcica 247 estudando mais minuciosamente o principio leucolytico das culturas dos esta- pbyloeoccos, verificou que os leucocytos de coelho são mais sensíveis do que os f -“ cão, camondongo e cobaia, em ordem decrescente. Os leucocytos de sapo se- r wni completamente insensíveis. Para os nossos ligeiros estudos sobre a acção leucocytolytica da toxina esta- Pbylococcica usamos o processo de Xeisser e Wechsberg (36), baseado na re- 'lucção do azul de methyleno. A technica que empregámos foi a seguinte: a ) o exsudato pleural obtido após a inoculação de aleurona em coelhos, era recolhido e addicionado, á razão de 1/3 de seu volume, de uma solução a 0,5% XaCl com 2 % de citrato de sodio; os exsudatos muito hemorrhagicos não ^ani utilizados; b) a quantidade padrão da suspensão de leucocytos era do- ® ea da em presença de 0,05 de uma solução a 1/10.000 de azul de methyleno. Eít! uma serie de tubos com aquella quantidade de soluto de azul de methyleno, a ddidonavam-se quantidades crescentes da suspensão de leucocytos, sendo o vo- lume de 1 cc. completado com salina e os tubos coliertos com uma camada vaselina. Incubavamos cm banho-maria a 37° e a leitura final era feita 20 uunutos após. A quantidade padrão era dada pelo tulx> que apresentava a rc- dticção completa do azul de methyleno naquellc periodo de tempo; c) a essa Quantidade padrão de leucocytos, addidonavam-se, em uma serie de tubos, quan- tidades crescentes de toxina cstaphyloeoccica c o volume de todos os tubos era beirado a 1 cc. com salina. iLevava-se ao banho-maria a 37° por 1 hora e cm *Rui05 contornados. d) Acção xecrosante para a pelle ( dermo-toxina ) — A acção dern*** 7 " xica da toxina cstaphylococcica é facilmente verificável pela necrose que brevem á inoculação intradermica dos filtrados. Esta acção necrosante, já bem estudada por Parker e Burnet, revela-se c 01 * 1 toda a imensidade nas 24-48 horas após a inoculação da toxina. Tres a q lUtr ° horas após a inoculação do filtrado já se nota uma area de côr azul escura, OP* varia em diâmetro com a toxicidez do mesmo. No dia immediato, a região tor0 * uma côr amarellada c em tomo delia notam-se phenomenos isflammatorios, 000 16 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 249 si st indo estes em intenso rubor e edema mais ou menos extenso. Com o de- correr do tempo, pela eliminação do tecido necrosado forma-se uma ulcera. Os filtrados de culturas que não contêm toxina, quando inoculados, não produzem reacção de especie alguma, excepto occasionalmente uma area avermelhada que desapparece em 24-48 horas. jA maior ou menor extensão da necrose depende da maior ou menor actividade toxica do filtrado. Xo Quadro 3, podem ser verificados os resultados da acção dermo-toxica de varias toxinas, obtida com a inoculação de 0,2 cc. de varias diluições por fia intradermica, em coelhos. As lesões provocadas pelas doses fracas são mais do typo inflammatorio, não chegando a verificar-se a placa de necrose. QUADRO 3 Acção dermoioxica da toxina (inoculação por via intradermica em coelhos) Toxinas Dil u i ç õ c s 1/5 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50 115 (2) ... . Nec. Nec. Nec. Nec. Ed. Ed. 264(3) ... . Nec. Nec. Nec. Nec Ed. Ed. M.C.A. (4). . Nec. Nec. Nec. Ed. Ed. Ed. Carolina (1). . Nec. Nec. Nec. Ed. Ed. Ed. Af 4 Nec. Nec. Ed. Ed. Ed. — 21 (2) Nec. Nec. Ed. Ed. Ed. — Mistura .... Nec. Nec. Ed. Ed. — — Legenda: Nec. = necrose ed. = edema Xo Quadro 4, vêem-sc as lesões necrosantes avaliadas pela extensão do ede- ^ e da placa necrosada, medidas cm seus maiores diâmetros, de 3 toxinas, ^jo poder crythrocytolytico era de 400 doses mínimas hemolyticas (D. M. H.) P° r cc.. As quantidades de toxina inoculadas foram calculadas de modo que 'fciTespondessem a uma serie crescente de unidades hemolyticas. Verifica-se que, c? nbora as 3 toxinas apresentassem o mesmo titulo erythrocytolytico, as lesões Provocadas não se corresponderam totahnente. Com ef feito, enquanto a toxina origina uma placa de necrose de 1,6X0,9 com 1 D. M. H., a toxina ^rolina, nessa mesma dose, provoca uma placa 24 vezes menor: 0,2 x 0,3. A t0 *ina 264 mostrou uma acção dermotoxica pouco accentuada, só provocando üt ria placa de necrose com 5 D. M. H. A sensibilidade do coelho ás inoculações intradermicas de toxina, porém, e 'ariavel em certo grau. A menor dose de toxina capaz de produzir a lesão ^rosante na pelle de um animal "em sempre é suffidente para produzir este 17 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 251 mesmo ef feito quando inoculada em outro; a essa mesma dose um terceiro ccelho poderá reagir mais intensamente. Com doses mais elevadas de toxina e tomando por norma a extensão da lesão, esta variação ainda é observada. Os coelhos de pello branco mostram placas de extensão mais uniforme, sendo que os da mesma prole apresentam resultados mais constantes e talvez fixos. Os coelhos adultos são mais sensíveis. A cobaia reage menos intensamente do que o coelho, nus, como bem obser- varam Parish e Gark, existe maior regularidade de resposta a uma quantidade de toxina considerada como dose minima necrosante (D. M. X.). Coelhos successivamente inoculados de 4 em 4 dias com 0,25 cc. de uma toxina, mostram lesões necrosantes que diminuem cada vez mais de tamanho e intensidade, até se tomarem nullas da 4.* á 6.* inoculação. Estes animaes, assim tornados immunes, posteriormente inoculados por via venosa com uma dose de toxina seguramente mortal, nada apresentam. Os soros destes coelhos neutra- lizam mais ou menos intensamente todas as acções toxicas da toxina. A acti- vidadc necrosante da toxina é, também, neutralizada por soros de cavalios ino- vados com toxina, e, bem assim, por soros de pessoas que tenham recebido varias injecções de toxina tratadas pelo foimol (anatoxina). e) Acção coagulante no plasma f. acção fibrinolytica — De 28 cultu- r a» de estaphylococcos pnthogenicos foi verificada a acção coagulante sobre o plas- nui oxalatado: duas, quatro e seis gottas das culturas de 18-24 horas eram addi- CK >nadas a 0,5 cc. de plasma oxalatado dc coelho; incul>ava-se a 37° e faziam-se ^ituras após 2, 6 e 18 horas dc estufa. .V cxccjtção dc 1 amostra, as demais c °agularam o plasma, algumas delias já no fim dc 2 horas dc incubação. Todas tss *s amostras produziram hemolysina, mais ou menos accentuadamentc. Numa serie de 18 amo>tras de estaphylococcos saprophytas da pcile, todas Scni acção coagulante para o plasma, 6 mostraram fraca acção hemolytica ; em Vra serie de 15 amostras dc estaphylococcos isolados da polpa vaccinica, cuja ^ioria somente com 6 gottas de cultura e no fim de 18 horas coagulou o plas- n,a . 4 mostraram acção hemolytica um pouco mais accentuada, não alcançando l °davia 100 D. M. H. por cc.. A lyse do plasma coagulado foi também observada na serie rapidamente lysam o coagulo, ksla observação confirma as de Gratia (16) e as de Gengou (15), que consi- ^Wam a coagulação do plasma unta phase da fibrinolysc. A cstaphylo-coagulase é em grande parte retida pela filtração c mostra-se 'Vs thcrmo-estavel do que a hemolysina c a dermotoxina. Sudhues (60), observou que os soros de portadores dc infecção estaphylococcica, bem como os de coelhos infectados, não mostram 19 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 252 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII nenhum ef feito de neutralização, evitando ou retardando a coagulação do plasma. O phenomeno de coagulação seria ef feito de trocas phy- si co-chi micas não especificas e não dependeria dos phenomeno s de immunidade. f) Acção mortal para differextes aximaes ( Icto-toxina ) — A’ inocu- lação da toxina por via venosa em coelhos ou outros animaes, sobrevem a morte em espaço de tempo variavel, que se relaciona com a quantidade e o poder toxico dos filtrados. Este facto, claramente assignalado desde 1906 por Kraus e Pn* bram (27) e, em 1914. por Xicolle e Cesari (35), foi estudado em seu meca- nismo por Russ (57), em 1916, e recentemente, por Kellaway, Bumet e Wil* liams (25) e Xélis e Bouckaert (38). Coelhos — Os coelhos inoculados por via intravenosa com uma forte dose de uma toxina bem activa cahem como que fulminados, morrendo instantanea- mente. As doses menores prolongam o tempo da morte dos animaes, o que acon- tece também com as doses elevadas de toxina menos activa, conservando-se aquelles como que normaes, até alguns minutos antes do periodo final. O P rl ' meiro signal da acção letal da toxina sobre o organismo do animal injectado c tuna certa difficuldade respiratória, traduzida por inquietação, com pequenos mo- vimentos lentos da cabeça e dos membros. O rythmo respiratório, a princip 10 lento, torna-se irregular c penoso, não tardando a queda do animal, precedida» as mais das vezes, por um grito angustioso. (O coelho mostra movimentos des- connexos da cabeça e dos membros (menos frequentemente, fortes contractu- ras) ; logo depois, a respiração e todas as actividades musculares lhe cessam, seguindo-se a morte. O reflexo pupillar durante o processo revela-se primeiramente por uma d*' latação, seguida de forte myose; no periodo terminal, com a abolição dos re- flexos corncos, a pupilla dilata-sc novamente. Durante a crise pode-se notar» em certos animaes, forte anemia peripherica e micção e dejecçáo frequentes- Xecropsiando os animaes que morrem logo após a inoculação da toxin 3, observa-se o coração direito dilatado; os pulmões, com pequenas hcmorrhag» 35 e algumas vezes edema. Xos animaes que morrem após algumas horas, alem destes aspectos, observam-se derrame e mesmo pequenas hemorrhagias no J*' ricardio, sendo que, cm alguns, ha um estravasamento sanguineo em todo o 11 lC ' diastino posterior, infiltração sanguínea no tecido pulmonar e congestão do t 1 ' gado. A’ puneção do ventrículo esquerdo não se consegue retirar sangue; o s 30 * gue colhido da aurícula, cujo tempo de coagulação não parece alterado, quando centrifugado, mostra-se lysado. Cortes histo-pathologicos, sobretudo do figado, mostraram * Xélis e Picard (39) intensa lyse dãs cellulas e. nos vasos, sangt* lysado. 20 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 253 Russ. estudando o poder letal de uma toxina bem activa, em coelhos e gatos curarizados ou não, uns submettidos á respiração artificial, outros com a medulla seccionada, alguns tendo as carótidas ligadas, e ainda outros operados segundo o methodo de Hering-Bock (coração-pulmão isolados), observou que o phenomeno da morte es- tava ligado: a) a uma immediata queda da pressão sanguínea, se- guida de volta á normal, havendo após alguns minutos uma profun- da queda terminal; b) á diminuição da amplitude dos movimentos respiratórios nos animaes submettidos á respiração artificial; c) á parada do coração, com dilatação da aurícula e ventrículo direitos e da artéria pulmonar, conservando-se o ventrículo esquerdo virtual- mente vasio; d) o phenomeno da morte seria independente de qual- quer acção do systema nervoso central. Os estudos histologicos de- monstraram o ef feito da toxina no bloqueio da circulação pulmonar, não tendo sido observado nenhum ef feito directo sobre o coração. Russ concluiu que a acção mortal da toxina está directamente ligada á obstrucção da circulação pulmonar. .Kellaway, Bumet e Williams, estudando a acção pharmaco-dy- namica da toxina, verificaram os mesmos phenomenos descriptos por Russ e observaram que a primeira queda da pressão sanguínea, se- guida da volta á normal, é de origem vaso-motora e corre por conta dos principios pharmacologicamentc activos do caldo de cultura. So- mente a queda final da pressão sanguinca é devida ao principio acti- vo do filtrado, obstruindo a circulação pulmonar. Xélis e Bouckacrt (38), registando os movimentos respiratórios, a pressão arterial e a actividadc cardíaca de animaes inoculados por via venosa com uma dose de 2,5 cc. de toxina estaphylococcica, che- garam á conclusão dc que a causa tnoríis estaria ligada a uma de- ficiência da actividade cardíaca, dc origem sinusal. Xos animaes ino- culados com doses menores, cuja morte sobreviria após alguns dias, o ef feito letal teria ainda como causa perturbações funccionaes dc outros orgãos (figado, tubo digestivo, rins, pulmões, etc.). As toxinas de varias amostras por nós preparadas mostraram poder mor- ' 4 ' muito variavel. Enquanto algumas matam por ria venosa 1 K. de coelho c ° ni doses inferiores a 0,25 cc., outras se mostram muito menos activas, sendo tle ° e ^sarios 3 c 5 cc. para se obter esse ef feito. O Quadro 5 mostra o poder ^rtal de differentes amostras. A inoculação por via subcutânea ou por via peritoncal, alem dc mostrar Afeitos um tanto irregulares, prolonga o tempo de morte dos animaes. Quan- a inoculação se dá por via subcutânea, ha necessidade dc uma maior quan- 'kde de toxina para obtenção do ef feito mortal, embora dependa mais da re- 21 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 QUADRO 5 234 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII oo J. T ha vas sos — Toxina estaphylococcica 255 sistencia individual do coelho. Uma dose menor pode matar num espaço de tempo por vezes menor do que uma dose 2 ou 3 vezes maior. A' necropsia observa-se edema hemorrhagico no ponto de inoculação, e, dos orgãos, o mais attingido, é o pulmão, que mostra pequenas hemorrhagias disseminadas por toda a sua area, verificando-se também derrame nas cavidades pleural e pericardica. Cobaias — A inoculação por via intracardiaca de uma toxina que mata 1 k° de coelho por via venosa com 1 cc. em 33 minutos, deu resultados varáveis. Assim é que, numa serie de cobaias inoculadas com quantidades de toxina equi- valente a 4, 2. 1 e 0.5 cc. por K. de animal, morreu em 4 horas a cobaia inoculada ®°ni a quantidade equivalente a 0.5 cc., amanheceram mortas as cobaias inocula- das com as quantidades equivalentes a 2 cc. e 4 cc., enquanto que sobreviveu a tnoculada com a quantidade equivalente a 1 cc.. Por via subcutânea, uma cobaia injectada com a quantidade equivalente a 3 cc. por K. amanheceu morta, enquanto que uma outra injectada com a quan- tidade equivalente a 5 cc. sobreviveu. Por via peritoneal occorreram as mesmas irregularidades. X uma serie de c °baias inoculadas com quantidades equivalentes a 5. 3. 1 e 0.5 cc. por K., so- ante amanheceu morta a que foi inoculada com a quantidade equivalente a ^ cc.. Pombos — O pombo mostra-se sensível, quer por via venosa, quer por v >a muscular: 0,4 cc. da mesma toxina, inoculada por via venosa, matou um Pombo adulto em 4 horas c 1 cc.. injectado na massa muscular do peitoral, ma- outro durante a noite. Camondongos — O camondongo mostra-se sensível (via peritoneal). g) Acção tbtanizajíte — Em nota anterior (63), mostramos que a ino- vação de 0,2 ou 0.1 cc. de uma toxina estaphylococcica, bem activa, no ccrebro d? coljaias ou de coelhos, quer por via transocular. cisternal ou após trejxuia- w. produz rapidamente nos animaes uma syndroma tetanizante caracterizada P°t contracturas generalizadas, rigidez da musculatura da rache, opisthotono. con- jeturas sobretudo dos membros anteriores, entrecortadas de movimentos rapi- dos (Figs. 1 e 2) ; tachypnca e tachycardia iniciaes e rhythmo de Chcyne-Stokes jminal; dejecção e micção frequentes; sensibilidade exaggerada; a morte da-se ^Suínas horas após a inoculação, ou, mais raramente, alguns minutos mais tarde e * neste ultimo caso, é sempre precedida por uma hemorrhagia nasal com os Car acteres da do edema pulmonar, parecendo correr por conta da intoxicação do ^tro bulhar. Doses menores de toxina (0,005 a 0,01 cc.) retardam o apparccimcnto da 'yndroma c pode-se então notar, antes de evidenciados os symptomas tetani- ‘jes, o eriçamento dos pellos, prurido, movimentos mcndibulares, perda mo- ^"itanea do equilíbrio, movimentos e marcha rotatoria. Em alguns animaes marcha rotatoria toma-se excessivamente rapida, atirando-se as cobaias com 23 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 256 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII facilidade de encontro aos obstacnios, excitação esta que dá a impressão de um verdadeiro delirio; vem afinal a queda em tetania, a que se segue a morte em tempo variavel. Estes últimos symptomas, demonstrativos da participação do cerebello no processo, servem para caracterizar assim uma syndroma que se superpõe á da “tetania acerebellada”. Com a dose que limita a actividade da toxina, notam-se certas irregula- ridades no apparecimento dos symptomas, o que certamente corre por conta da maior ou menor resistenda offerecida pelo animal : certos delles apresentam symptomas menos accentuados, occorrendo em tempo muito mais prolongado, faltando por vezes o opisthotono; outros, não chegam a apresentar a syndroma definitiva, mostrando somente ligeira perda do equilibrio e marcha rotatoria, refazendo-se em seguida, podendo, ou não vir a morrer; outras cobaias, enfim, nada apresentam. Nas doses próximas ao limite de actividade da toxina, varias cobaias se refazem, retomando o equilibrio, mantendo-se em quietude ou em movimentos e marcha rotatoria, mas, dessas, raras são as que sobrevivem nas 24 horas após a inoculação. Guardada uma escala ascendente de diluições da toxina, observa-se uma relação chronometrica muito estreita entre a occorrencia dos symptomas e a quantidade de toxina inoculada. Assim, procedendo-se a varias diluições da to- xina (1/5, 1/10, 1/20, etc.) e inoculando-se, por via transocular, 0,2 cc. d< cada diluição em uma serie de 3 cobaias, observa-se uma chronometria muito estreita no apparecimento da queda tetanizante. Nos quadros 6 c 7, vemos os resultados obtidos com a inoculação de duas das nossas toxinas, guardado o cri- tério das concentrações decrescentes. (Quatro toxinas, originadas de amostras differentes, comportaram-se mais ou menos identicamente. No quadro 8 vemos as curvas fornecidas pelas medias do tempo de queda tetanizante de varias to- xinas estudadas sob este ponto de vista, podendo-se verificar as diífercnças de poder toxico das varias toxinas e, também, o parallelismo existente entre a toxi- cidcz e a percentagem de mortes. Si se objectiva mais o valor quantitativo da toxina, não se levando cm conta a concentração desta no vehiculo, os resultados são bem differentes, no- tando- se claramente que a acção tetanizante da toxina occorre cm funeção da concentração. No Quadro 9, vê-se que uma determinada dose de toxina q l,c numa concentração mais elevada é capaz de produzir a syndroma tetanizante na cobaia, nada produz em diluição maior. Vemos ainda que, além de uma certa diluição, é impossível obter qualquer symptoma da syndroma ou mesmo morte tardia, embora as doses inoculadas correspondam ás mesmas quantidades de toxina que em diluição inferior foram capazes de produzir uma symptomato- logia completa, seguida de morte. Para explicação deste facto devemos ter em conta que, pela inoculação P° r via transocular na cohaia, o liquido quasi sempre se dif funde sobre os orgãos 24 U.H l/'A*« * <• Ai \.Ut tctiinU»ntc 4 (o) cm ro/viúi, />»»r viu tranxoculur J. Travassos — Toxina eslaphylococcica 2 2 2 « •r. •J «rt sjoiEAjasqQ © © © “* *“ VO VO LO VO N ^1 jt 3UOU1 Ep CXUUA T “ vo > © vo ir, N. \ 1 © rí 3 (/) *5 1 «« w y: — ^1 M f © -r S5 -T oijq 35 35 õc «O 2 à -I[inb3 OE E1[0^ ©“ © © s. sojnmtu qç ap Io *r> uiajE SEUioidui-C^ © a O II- 3 - . _ _ c S 5 .5 S = N W o c S .... rt ac j 5 rs = ' ^ f» * 1 * í o -r f o -T r r 1 © O O c © c © © © © © © © C © © © © © © WCOOD tp OÇJJ vo © © « 3 * 0 " n ^ * 2 J *0 * * ^ 1 i §§§§ Hg ? :i tuixoi w nni 1 N M N Í • «o 8 -OSqE SpEpUtlEtlQ o = =' C • * A ' © © A A A © A 4 © A A OpEpiOOU! 3um\0 \ B N *1 A| N M M *1 A| M a I PVJ •'l W W W = © © C 0 0 0 © © © © © © © © - © 0 •f J 1 • . 3 © õ ■x. O 25 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 Acção tctanizantc da toxina No. 1 15 (9). via transocular, cm cobaias 258 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII saoSuAjasqo • «n 9) Z 2 -_g .j? S m ^ IO »r> auoui rp odu»x -•*>.* «... « r*j>0 — ÍVJPvJ • "1 m C N ''I Ü r Ü — N *TT-r -r — ^ — ir „ ■- C o 2 ^ 10 f ^ t ir, ir, ^ ^ ~r oijq -ipnbo oz o ãã — ?í « so;nuiui 0£ majc sruioxtuiAg - ^ * ~ ro minutos ° * nC rsj -r 1 s s ■s ’ - ff z £ 1 1 u rt * X 1 o ri * *t 2 o ao o -r c* o It Ú - X-t mqco cp osoj O O © O O OCO o o o c SS '4‘ 2 2 £ f' '5 £ 2 - ^ N ^ ^ ^1 N N n M S fv 5 0 0 C 2 £ í p*j c^j rs O o tuixoi qnj «osqc opepiiurnQ 3E 'S - çy o 5 í '£ ® ° ° O d cptjnDour aumjo^ d d * * d*'* d * * J * » 0 ! * * o CP '5 s* §** 1* . ?,. * I 1 í 26 cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 259 QUADRO S Media do tempo da queda tetanizante produzida em cobaias pela inoculação por via trans- ocular de varias toxinas. Legenda : 1 Tcmoo medio da queda tetanizante. em series de cobaias variavcis cm numero (3. 4. 5 e 6). > Alguns animacs apresentam a syndroma tetanizante typica. outros somente os phenomenos cerebellares da syndroma nos 30 minutos de observação. Alguns animaes apresentam tardiamente os symptomas cerebellares da syndro- ma. enquanto que outros nada mostram. > Nenhum symptoma acccntuado. 27 260 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII QUADRO 9 Acção tctanizante da toxina cstaphylococcica avaliada em íuncção da concentração Diluições da toxina Volume inoculado em cc. 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 72. 5 + +5' t 75 4-4-22' R O ° t + +9’ t yio + -r20';R. o o t g + + 12';R. O t 720 +33' ;R 8 +26' ;R. o + 8 ' o <=> + o t d t 730 s 0 is C s ç o d t. O d t 740 l/V 0 g °’ S - 0 o d s 750 0 s 0 õ ® S 760 e s 0.005 «*1 • 780 a ~ l/V 0 3 ® s 7100 0 S l/V S 3 => e Legenda: + 4-22' : queda tctanizante em 22 minuto* + : movimento e marcha rotatoria, perda momentânea do equilíbrio R : retoma o equilíbrio t : morte nas 24 horas t. : morte na* 43 horas 0 : nenhum symptoma S : sob revida cm 5 dias. 28 J. Travassos — Toxina estaphijlococcica 261 nervosos, banhando-os mais em superfide do que em profundidade; outrosim, devemos levar em conta que a fixação da toxina sobre a cellula nervosa obedece, talvez, ás mesmas leis que regem as colorações vitaes electivas, regulando-se por um coeffidente de repartição, solubilidade e penetração, ou ainda ás leis de adsorpção por superfícies limitadas entre systemas micro-heterogenos ou col- lokles. As inoculações de toxina corada pela fuchsina, em idênticas diluições ás da experiencia, mostram-nos que tanto maior é a superfide do cerebro co- tada, quanto maior é o volume do liquido inoculado. Assim, a inoculação de 0,1 cc. da toxina corada attinge somente a superfide dos orgãos que repousam na caixa craniana; a de 0,2 cc. cora não só essa região, como parte do cerebro e do cerebello do lado opposto ao da inoculação; as de 0,3 cc. e de 0,4 cc. che- gam a corar até os pontos mais elevados do cerebro, corando praticamente toda a superfide da massa encephalica. Como a acção da toxina é immediata, não sendo assim sujeita a outros factorcs como o da absorpção, de acção mais pro- longada, é fadl de presumir que uma maior extensão do tecido nervoso é submet- ida á acção da toxina, si esta é inoculada em maior volume. Este farto é cor- toborado pela experimentação que nos mostra que, si de uma mesma diluição áa toxina, inocularmos 0,1 cc., 0,2 cc., 0,3 cc. e 0,4 cc. em cobaias, os tempos de queda tetanizante desses animaes serão tanto menores quanto a quantidade inoculada é maior. O coeffidente de repartição da toxina, nestas condições «xperimentacs, para qualquer de suas diluições, permanece o mesmo para um determinado volume inoculado. O farto, porém, das concentrações menores en- fraquece o poder de fixação que se toma nullo, quando attinge determinada di- luição. A inoculação, por exemplo, de 0,1 cc. da diluição a 1/20 banha deter- minado território, mas, como nessa diluição a toxina está dentro do seu limiar de fixação, o animal apresenta os symptomas tetanizantes ; a inoculação de 0,2 da diluição a 1/40 reparte-se cm um território muito maior, mas, como o li- miar de fixação da toxina está aquem dessa diluição, o processo fixador não ** realiza e, embora as quantidades absolutas de toxina inoculadas sejam as mesms, os animaes reagem irregularmentc, ou nada apresentam. Essa experiencia sugere a falta de especificidade (neurotropismo) da to- xina estaphylococcica para o tecido nervoso. Reproduzindo as experiências clas- s *cas de Wassermann c Takaki (71), sobre a adsorpção da toxina tetanica pelo * ceie] o nervoso, verificamos qt:e o filtrado estaphylococcico. após contacto mais °U menos prolongado com esse tecido, não perde o seu ef feito mortal e tetani- **nte. iOs animaes inoculados repetidas vezes com doses não mortaes de to- *ma, por via subcutânea, intradermica, venosa e, mesmo, carotidiana. não mos- tr am symptomas nervosos que possam affirmar o neurotropismo da toxina. - — Os resultados registados nos quadros ó, 7 c 8 c os obtidos com varias °utras toxinas inoculadas na dose de 0.2 cc. de diluições mais estreitas (ver mais a 'liante), permittem estabelecer: a) uma dose tetanizante symptomatica (D. S.), que assignala o limite de actividade symptomatica da toxina, limite em 23 2G2 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII que se notam irregularidades no apparecimento dos symptomas, podendo pro- duzir urna queda tetanizante tardia definitiva ou somente symptomas de exci- tação, tal como prurido, movimentos mandibulares, movimentos e marcha ro- tatória, perda momentânea do equilíbrio, ou nada produzir em certos animaes mais resistentes; b) uma dose tetanizante letal (D. T. L.), que representa, em íuncção da concentração, a menor dose de toxina capaz de produzir systema- ticamente a syndroma nos 30 primeiros minutos após a inoculação e a morte nas 24 horas, em todas as cobaias inoculadas. Estes dados e o da neutraliza- ção da acção tetanizante da toxina pela antitoxina, foram aproveitados para o estabelecimento de um novo processo de doseamento da antitoxina, do qual fala- remos mais adiante. A toxina inoculada por via lombar na rache do coelho produz rapidamente a paralysia dos membros posteriores e, quando inoculada em doses acima de 0,5 cc.. tardiamente (4 a 5 horas mais tarde), causa os symptomas cerebraes c sobretudo o opisthctono, que progridem muito lentamente. Os animaes geral- mente morrem na noite do dia da inoculação. Sob a marco se. pelo chloroíormio, ou pelo ether, os symptomas tetanizantes diminuem de intensidade e mesmo desapparecem, mas retomam á actividade pri- mitiva logo que o animal volta ao normal. Cortes histo-pathologicos, feitos em cerebros e cerebellos de cobaias ino- culadas, mostram uma degeneração do typo hydropico das cellulas desses or- gãos, phenomenos de polychromatolyse e extravasamento sanguíneo em determi- nados pontos, com lyse dos globulos vermelhos. Xo» animaes que morrem ou 5 horas após a inoculação da toxina não se observa reacção da ncurogU*- Para o lado das meninges, observa-sc ligeira infiltração leucocytaria. Como testemunhas foram inoculadas cobaias, não só com o caldo usado pa** as culturas collocado sob as mesmas condições de experiencia, como também com toxinas diphterica e tetanica. filtrados de culturas de E. lyphi, gonococco, estrepto* cocco, meningocooco, veneno de jararaca e solução de trypsina. Somente com as inoculações de filtrados de culturas de meningocooco em meio hormonico Huntoon c de estreptococco hemolvtico conseguimos, quando eram inoculada* doses elevadas (0,3 cc. a 0,5 ce), um eífeito semelhante, porem os animaes retomavam o equilíbrio muito facilmente, em alguns minutos, embora morres- sem nas 24 horas. h ) Acção gastro-intestinal — Desde as observações de Barker (5), n3S Philippinas, foi aventada a hypothese de certos alimentos contamina- dos por estaphylococcos produzirem, quando ingeridos, symptonia 5 gastro-intestinaes ( salivação, nauseas, vomitos, dores abdominae*< diarrhéa profusa, prostração e tremores de frio), mais ou nieno* accentuados. De então para cá apparcceram vários trabalhos nesse sentido 30 J. Travassos — Toxina eslaphylococcica 2C3 são mencionados num artigo recentemente publicado por McBur- ney (33). As experiencias de 150 > 4 > 1 37.5 200 115 800 < 200 < 10 < 1 20.0 80 > 100 > 2 > 1 50.0 200 M. C. A. 400 < 150 < 4 < 1 37.5 100 > 150 > 4 > 1 37.5 800 264 3.200 < 200 > 10 < 1 20.0 320 > 50 > 2 > 1 25.0 200 Af. 4 400 < 100 < 4 < 1 12.5 100 > 100 < 2 > 1 25.0 800 21 1.600 < 50 < ■» < 1 12.5 400 Os valores correspondentes á acção necrosante, avaliada tal como foi refa' rida acima, em relação a 1 D. M. L. para 1 K. de coelho, não guardam unta relação muito definida. Bumet, fazendo a verificação pela extensão do edema» encontrou uma relação de 1/400 entre o poder necrosante e o letal. Xo Quadro 11. onde estão analysados os valores toxicos de 3 toxinas con- servadas sob toluol e no frigorifico, verifica-se que ha uma certa disparidade entre o poder crythrocytolytico e o poder letal, e, quanto ao poder necrosante. agora avaliado pela extensão do edema, os resultados, do mesmo modo. não guardam uma relação muito definida. Xeste mesmo quadro, já agora avalian- do o poder tetanizante em relação ás demais acções toxicas da toxina, verifica-^ que para as 2 toxinas de poder erythrocytolytico correspondente a 400 D. M. ^ ' por cc., uma quantidade equivalente a 12.5 D. M. H. é necessária para produzi a syndroma tetanizante nas cobaias e a morte nas 24 horas. Com 6,25 D. M. H •• os symptomas evidenciados são ligeiros, morrendo os animaes em 48 hora 5 * A acção tetanizante, igualmente, guarda certa relação com o poder letal, m* 5 * com o poder necrosante, avaliado pela extensão do edema, o parallelismo r> 3 ° é evidente. Como essas verificações tivessem sido feitas com toxinas conservadas h* dias sob toluol c no frigorifico e os doseamentos realizados em differentes d ,3í ’ 34 Relações entre os poderes erythrocytolytico. necrosante, letal c tetanizante de toxinas cstaplylococcicas. (Toxinas conservadas sob tolnol c na geladeira) 35 Legenda — ++ t : queda tetanizante c morte nas 24 horas. t- • morte cm 48 horas. 4_ : movimentos rotatorios. S : sobrevida em 5 dias de observação. •0 : nenhum symptoma. 2G8 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII fizemos outras pesquisas das relações entre o poder erythrocytolytico e o poder tetanizante, sendo a verificação deste realizada no dia seguinte ao doseamenU’ daquelle, em toxinas de preparação recente e em toxinas dessecadas (Quadro 12). O poder erythrocytolytico foi avaliado para hematias de carneiro. Co® as toxinas que se mostram mais erythrocytotoxicas para hematias de carneiro necessitamos de uma maior cifra de D. M. H. para produzir a syndroma teta- nizante na cobaia, ao passo que com as que mostram ef feito erythrocytotoxico menor, já com 2 unidades hemolyticas ou com um pouco mais se consegue u®a syndroma tetanizante typica. A differença que se observa nas relações destas duas acções toxicas, q uír nas avaliações de toxinas conservadas, quer nas de toxinas recentemente p®* paradas e doseadas, deve corresponder ao facto da queda do poder crythrocy- tolytico, já observada por Burky em relação a este ef feito e ao poder mortal, 51 outras causas estrictamente technicas não estiverem, por sua vez, em jogo. E* t3í discordâncias também se podem enquadrar na argumentação de Burnet, sob® a transformação rapida da toxina em toxoide, facto que seria responsável falta de concordância absoluta entre os valores das differentes acções toxica 5 dos filtrados. Acreditamos haver certa difíiculdade para assentar as relaçóc* numéricas entre os valores dessas differentes acções, não só pelos argumento* acima expostos, como pelas differenças de technica usadas pelos diversos perimentadores na determinação do poder erythrocytolytico, o que faz varia r em quantidade e qualidade as hematias. Accresccm a isso as oscillações de stfi" sibilidade dos animacs empregados na determinação das acções necrosante e mortal. A prova do poder dermo-toxico, por exemplo, avaliada pela extensa 0 do edema ou pelo diâmetro da placa necrosada, deixa muito a desejar, uma ve* que a uma mesma dose limite os animaes reagem differentemente, como a** 1 ' gnalámos mais acima, o que foi também observado por Burnet, Parish c Cl* 1 * c por Burky. A prova do poder mortal para coelho, mesmo em funeção peso, oíferece as mesmas variações. Burnet teria encontrado raças de anir®* 5 mais sensíveis e, por outro lado, Burky registou maior numero de animaes siveis á toxina entre os coelhos adultos. Xós mesmo, por differentes ve® 5, tivemos variações com uma dose determinada como D. M. L. por K. de coelh 0, resistindo alguns animacs á inoculação de uma tal dose. O critério indirecto adoptado por Burnet, avaliando o poder ncutrali* a ^° r da antitoxina para as varias acções toxicas da toxina, certamente seria o mclh°‘ para o julgamento final, si a determinação das unidades limites dessas vari* 5 acções toxicas não estivesse revestida de idênticas causas de erro. Cont^ 0, podendo tuna approximação estreita ser estabelecida, o facto constituiria ariP 1 mento forte e seguro que falaria em favor de um unico principio activo da t ox® 3- As nossas verificações neste particular resumiram-se no registo da r,eU tralização das varias acções toxicas da toxina por 3 antitoxinas, oriundas d e cavallos em serviço de immunização industrial, recebendo inoculações de ana*- cr 36 tfiunen* «/<• unMmtr « henmtyt/cA* necesamrt»» jKtra a protiucçMo d a ayndronta tetanisantc. (Verificação em toxinas recentemente prepãndas c cm toxinis dessecadas) J. Travassos — Toxina estaphylococcica 269 37 queda tctnuuante definitiva soí)rcvi 2.500 1 — toxina 160 cc.) 180 12.5 Cavallo 82 (anatoxina 630 cc 16.000 > 300 — toxina 160 cc.) 2130 10 Doses mínimas anti-letaes Doses minai 1 * anti-sympt^' tetanizante* 162 > 75 < 100 c 1 200 > 63 80 < 1 2.500 12.5 jJOO^ 10 Legenda: o numerador da fracção representa o numero de unidades antitoxicas por cc-- o denominador da fracção dã o numero de unidades correspondentes a 1 ° nl dade anti-letal. J. Travassos — Toxina estaphylococcica 271 Quanto aos efíeitos lcucocytolytico, coagulante do plasma, fibrinolytico e acção gastro-intestinal, cujos estudos até agora realizados demonstram correr por conta de princípios activos distinctos, somente pesquisas ulteriores poderão esclarecer melhor o assumpto. «V — Propriedades geraes: resistência ao calor, á luz, ao envelheci- mento; acção dos ácidos do álcool e do formol; ndsorpção pelo caolim e pelo alume; filtração, concentração e dessecamento. A toxina estaphylococcica mostra fraca estabilidade, perdendo sua Atividade á medida do envelhecimento. A acção erythrocytoxica é a que se mostra inicialmente mais attingida. podendo mesmo perder grande parte de sua Atividade sem que as demais acções mostrem uma destruição estrictamente Parallela. Burky (3), com filtrados abandonados á temperatura ambiente, cerca de 1 anno depois, ainda observou acção mortal para o coelho, enquanto que o Poder erythrocytolytico se mostrava bastante diminuído ou quasi nullo. Certas de nossas toxinas, conservadas em frascos escuros na geladeira e sob toluol, per- deram grande parte do seu poder hemolytico c tetanizante, já no fim dc 2 meses; outras conservaram sua actividade por periodo superior (70 dias), embora esse facto aconteça menos frequentemente. Exposta á luz e á temperatura do la- boratório a perda é bem mais rapida. A toxina congelada conserva- se quasi Que indefinidamente. Xo estado seceo, a toxina conserva por muito tempo hxlas as suas actividades. Mesmo a acção crythrocytotoxica, que se mostra Seralmente mais diminuída, soffrc nesse estado uma baixa rclativamente pe- quena, após 6 meses. O dessecamento pode ser feito, tanto no vacuo, sob a Ação do acido sulfurico, como na estufa a 37.° por 24-48 horas, ou ainda submet- ida a uma corrente constante de ar quente c de temperatura entre 25-30.°. Uma °orrente de ar aquecido a 40-45.°, por 24 horas, destroe quasi totalnnmte as Atividades crythrocytolytica e tetanizante do filtrado. (Temos cm estado sccco, sob chloreto dc cálcio, toxinas de mais dc 1 anno que ainda conservam os seus e f feitos toxicos: 0.000125 produz a syndroma tetanizante na cobaia e 0,0000625 bemolysa 0,5cc. de hematias dc carneiro a 2 $c. A toxina estaphylococcica submettida á acção do calor, conforme a tem- peratura, perde parcial ou totalmente seus cficitos toxicos. A 55.° por 15 minutos, uma toxina que doseava 3.200 M. H. por cc., passa a dosear 1.600 M. H. por cc.. Prolongando-se o aquecimento por 30 minutos, 0 titulo cahe a 800, e, por 1 hora, vem a 200 M. H.. A essa mesma tempera- *Ura, durante 30 minutas, o poder necrosante é apenas alterado, mas, por 1 hora, 0 titulo cahe de metade, provocando placa de necrose, rubor e edema bastante 29 272 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII diminuídos. A essa temperatura, por 1 hora, o effeito tetanizante ainda mantem quando se inocula 0,2cc. da toxina pura. A 75.° por 15 minutos, o titulo erythrocytolytico baixa a SOO M. H.; p° r 30 minutos vem a 400; por 1 hora cahe entre 100 e 200 M. H.. O effeito te- tanizante a essa temperatura, por 1 hora, diminue de intensidade, observando-se contudo a syndroma tetanizante na dose de 0.2 cc., mas os animaes retomam o equilíbrio em poucos minutos, alguns resistindo á morte nas 24 horas. O p°" der necrosante, nessa mesma temperatura e espaço de tempo, baixa a 1/3 do titulo, notando-se a placa necrosada muito diminuida de extensão, bem como o rubor e o edema. A 100.° durante 5 minutos, o poder erythrocytolytico de 3.200 M. H. cahe abaixo de 100 e, prolongando-se o aquecimento por 10 minutos, baixa a 0. 100.° por 5 minutos, é destruída toda actividade necrosante, mortal e tetani- zante da toxina. Os addos fortes destroem o poder toxico dos filtrados. Néh» (37) que estudou o assumpto, encontrou que o H2S04 e o HC1 3 5% e a 37.°, destroem completamente a toxina em algumas horas- A 1% e após 24 horas a 37.°, os resultados seriam idênticos. 0 acido acético a 5 % destruiria a toxina somente após 24 horas. ^ acido tartarico e láctico a 1% e a 5%, não modificariam o pod* r toxico em 10 dias. O formol a 0,1% por 24 horas a 37.°, faz baixar a acção c rythrocytolyti 03, imas o poder necrosante ainda é em parte conservado. A 0,3% e 0,4%, 3 baixa é bem maior nas 24 horas, c. nas 48 horas, o titulo hemolytico baixa a $ M. H.; 5 cc. por via intravenosa não matam o coelho, mas 0,25 da toxina, p° r via intradermica, ainda produzem necrose de 1 x 1 cm. de extensão; nesta vn&‘ ma dose, ainda provoca a syndroma tetanizante na cobaia, esta porem de peq u< * na intensidade, resistindo a maioria dos animaes nas 24 horas. Ajustando-se 0 pH da toxina para 8.5 e addicionando-se formol a 0,4%, mantendo-se na tcit** peratura de 37.°, a desintoxicação é bem mais rapida. A filtração retem parte dos princípios activos das culturas de estaphylo* coccos. A estaphylo-eoagulase, por exemplo, é retida em grande parte, quand 3 as culturas são filtradas em velas Chamberland. A acção tetanizante mostt 3 um limite de actividade maior nas culturas apenas centrifugadas do que nas turas filtradas. O mesmo acontece, cm menor escala, com as acções necrosan {C e mortal. Velas Mandler e Berkefeld filtram melhor a toxina. Em di^ 05 Seitz, os resultados são superiores a todos os demais. Pesquisas de adsorpção pelo caolim, talco e alume mostraram-nos q uC toxina é facilmente adsorvi la por essas substancias. A adsorpção pelo caob !fl 40 J. Travassos — Toxina eslaphijlococcica 273 Processa-se já no fim de 2 horas, período em que grande parte (cerca de 90%) 'ia toxina é adsorvida. Os resultados da adsorpção da actividade tetanizante de 3 cc. de uma toxina por 1,0 gr. de caolim, são expostos so Quadro 14. Vê-se em fina, ou sob 4 acção de uma corrente de ar aquecida a 30.°, por 24-48 horas, quanto no vacuo, a acção do acido sulíurico, sendo mantida a tiragem constante afim de evi- ^r a acção deleteria dos vapores do acido. Pelos resultados registados no Quadro 15, verifica-se que a perda da actividade tetanizante da toxina submet- ia a estes dois processos de dessecamento è rclativamente pequena. Neste ^esmo quadro é dado o limite de actividade tetanizante da toxina completa- ^nte dessecada por uma corrente de ar aquecida a 30.°, por 48 horas, calculada ^ peso. Vê-se que um pouco mais de 1 decimo de milligrammo do pó é nc- ^ssario para provocar a syndroma tetanizante na cobaia. A unidade crythro- ^lolytica desta toxina dessecada foi de 0,0000625, do pó. ' — Producção da toxina in vivo. Para a comprovação definitiva de que o estaphylococco elabora uma to- * In a solúvel no organismo infectado, seria de interesse verificar si, nos cxsu- ^utos de coelhos ou outros animaes inoculados com culturas, se encontraria esse I^ucto toxico. A elaboração in vivo da toxina riria assim comprovar o ^Pri toxico dessa bactéria, já evidenciado pelas observações clinicas demons- ,r ativas da profunda intoxicação que acompanha certas septicemias estaphylo- c °ccicas. algumas mostrando no mecanismo da morte uma perfeita analogia com 0 'lue se observa após a inoculação da toxina por ria intravenosa em animaes. 41 274 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII QUADRO 14 Adsorpção pelo caolim. (5cc. de toxina 4- 1.0 gr. de caolim. Agitação constante, verificação no liquido sobrenadante após centrifugação). Volume Acção tetani- Após 10 mino- Após 2 horas Após 24 hora s de con.a-j^ Diluições zln ; e inicial tos de contacto de contacto n - , .. , n c> com O.a de caolim com 1.0 ac Pura 0.4 + + P Pura 0.2 t 18’ H.X. + + 4’ t 1/16’ + 15' t X + + 3' t 15' H. X. 1/3 0.2 0/S o/s 1/10 0.2 + + 6’ + 24’ + 39' 1/20 0.2 t 2/9’ 0/S 1/40 0.2 + 22 ' T X. 1/50 0.2 0/S 0 = nenhum symptoma ; + = sympt ornas cercbcllares sem queda tetanizante ; + + =qucda tetanizante definitiva; S = sobrevida cm 5 dias; t 2/9' = morte cm 2 horas e 9 minutos. 42 QUADRO 15 Concentração da toxina Actividade tetanizante inicial Concentração ã estufa a 37° por de + 5 vezes 24 horas. Concentração no vacuo, temperatura ambiente sob a acção do acido sulfurico e tiragem constante, por 24 horas, de + 10 vezes. Toxina dessecada sob a acção de uma corrente de ar aquecida a 30*. Acção tctanizante ava- liada cm peso. I Jiluição Volume inocu- lado em cc. •9 *| M ü j$ £ 5 ^ s - 4*3 5 y * - V. 3 Ti C b y í g ü - 1 -2 s — T* O ■H '* *3 || J ; : s 0* * 2 ■« 8 s " - ü S JJ . 5 . “ v SC 8 | 5 '§ 5 1.1 S VI /. b ^ Diluição Volume inocu- lado em cc. Quantidade ab- soluta de toxi- na original em cc • • n •3*3 ■g Z | ü e í 1 a 8 « rs J3 O ; = 5 «í o 3 ■ã r Cl o: i à á •s 8 <= g n .5 c 1 1 '-5 w 1 X Oi O ís) 0.04 1/5 0.2 0.04 0.2 + 3' t 3/10' 1/50 0.2 0.004 0.04 + + 7* 0.001 mgr. + + 8' 1 23' H. N. t N. 1/10 0.2 0.02 + + 6’ 1/50 0.2 0.004 0.02 + + 16' 1/100 0.2 0.002 0.04 + + 18' 0.000124 4* + 18' t 4/32' t X. t 5/42' t N. 1/20 0.2 0.01 + + 16' 1/100 0.2 0.002 0.01 + + 1/32' 1/200 0.2 0.001 0.01 + + 22' 0.0001 • 57' t 5/42' t N. t 5/0 S 1/30 0.2 0.0066 + + 23' 1/300 0.2 0.00066 0.0066 0/S 0.000075 O/S + N. X 4* O O k) 0.005 + 2/8' 1/200 0.2 0.001 0.005 0/S 1/400 0.2 0.0005 0.0005 O/S ü. 00005 o/s t N. j 1/50 0.2 0.004 0/S Legenda : 0 = nenhum symptoma ; + = symptomas cerebellarcs Pleural 3 + ’ 4 + 4 4 4 + 4 + 0.2 e — v — n - 0.5 O t > 36 intra- venosa 0.5 cc. Pericardico H. C. H.C. H. C. H. C. H. C. 0.1 e 4 v 4 n 4- 0.1 1 gotta e + v — n — 0.2 4 4 6' t 0.2 1 gotta O S > Peritoneal H. C. r H. C. 1 + 4 + Ú.l e + v Hh n — > Pleural 2 + 4 + 4 + 4 + 4 + 0.2 e 4 v — 0.3 0 t- > 29 intra- venosa 0.5 cc. Pericardico H. C. H. C. H. C. H. C. 2 + 0.2 e + v ± n — 0.2 1 gotta e — v — n — 4 t > Pleural 2 + < + 4 + 4 -f 4 + 0.3 e 4 v — n — 0.3 0 S > 58 intra- venosa 0.5 cc Pericardico 0.3 e 4 v 4 n - 0.3 4 4 5* t. % Pleural H. C. H. C. 4 + 4 + 4 + 0.3 c 4 v 4 n — 0.3 O t. > Peritoneal 0.3 e + v + n + 0.3 0 s » 1 60 Pericardico H. C. H. C. 2 + 4 + 4 + 0.2 e 44 v 4 n 44 intra- venosa 0.5 cc. Pleural H. C. H. C.' 4 4 4 + 4 4 0.3 e 44 v 4 n 4 0.3 ' 4 4 16' S > Peritoneal H. C. H. C. 3 + 4 + 4 + 0.3 c 44 v 4 n 44 0.3 4 4 3’ t 10' H. N. 0.25 1 gotta O s > 47 intra- venosa 0.5 cc. Peritoneal 0.2 1 e 44j v ±| e 44 0.25 4 4 1’ t N. 0.25 1 gotta ü s > Legenda: — - negativo e = edema ^ menos de 1 cc. 4 entre I e 2 cc. + + mais de 2 cc. + + 8' = queda tetanizante cm 8 minutos c mor I te nas 24 horas. acção necrosante v = rubor 4 muito ligeiro 4 perceptível + + acccntuado acção teta- nizante _ nenhum symptoma nos 30 primeiros mi nutos de observação. + = symptomas ccrcbellarcs. n = necrose + muito ligeira + placa de í cm. + + placa de mais de 1 cm. t- — morte cm 48 lioras. H. N'. = licmorrhagia nasal. cm J. Travassos — Toxina eslaphylococcica 279 As nossas experiencias neste particular constaram de inoculações em coelhos, por via venosa, e, em camondongos, por peritoneal, de 0,5 cc. de emul- são de uma cultura em agar de 20 horas de um estaphylococco virulento, pre- viamente lavada com salina e estandardizada ao Xo. 3 da escala de Mac Farlum. Após a morte dos animaes, o que occorria geralmente entre 12 e 48 horas, colhiam-se os exsudatos peritoneal. pleural e pericardico, recebendo-os em pe- quenos tubos sób uma camada de toluol. Vinte e quatro horas depois, ao mesmo tempo que era feita uma prova de esterilidade por semeadura em caldo de uma gotta de cada exsudato, procedia-se ás verificações das propriedades hemolytica, necrosante e tetanizante, e á neutralização das mesmas pela anti- toxina. O Quadro 16 motsra os resultados destas differentes provas. Este quadro regista somente os resultados positivos, tendo-se verificado, em 5 outros animaes do mesmo modo inoculados, nenhum resultado toxico dos exsudatos. Com alguns exsudatos daquelles animaes observámos placas de necrose por vezes muito nitidas, embora na maioria das vezes somente fosse observado edema e rubor. O effeito tetanizante verifica-se com mais nitidez, morrendo a maioria dos animaes nas 24 horas após a inoculação. A antitoxina neutra- liza esses ef feitos toxicos dos exsudatos. Estes resultados são demonstrativos da elaboração da toxina in vivo. VI — Poder antigenico da toxina: antitoxina estaphylococcica. a) vias de immunização experimental; b) neutralização das varias acções toxicas da toxina; c) relações quantitativas do poder de neutralização das varias acções toxicas; d) immunização activa e passiva e acções toxicas dos filtrados; e) poder curativo da antitoxina em relação aos effeitos toxicos da toxina. Os filtrados das culturas de estaphylococcos, quando inoculados repetidas vezes em animaes, provocam a formação de uma antitoxina que neutraliza todas as acções toxicas da toxina. Esta antitoxina, já assignalada por vários aucto- res, foi estudada minuciosamente por Bumet (1) e posteriormente por Parish e Clark (48 e 49), Panton, Valcntine e Dix (51 c 52), Dólman (12) c outros, resaltando desse estudo a identidade antigenica de filtrados oriundos de varias amostras de estaphylococcos. a) Vias dc immunização — Repetindo as inoculações de pequenas quan- tidades de toxina, pelas vias subcutâneas e intradennica, em coelhos, conse- guem-se obter titulos antitoxicos por vezes accentuados. Os animaes injecta- dos por via venosa, mostram-se difficilmente immunizaveis, não supportando na maioria das vezes as inoculações de doses crescentes de toxina. Parker já tinha mostrado esse facto, mas Burnet diz ter conseguido uma immunização pe- •17 280 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII quena de animaes inoculados por esta via, com doses sub-letaes de toxina. Quatro coelhos por nós ensaiados, com 2 inoculações de 0,lcc. de lana toxina que matava em 1 hora 1 K. de coelho com 0,5ce., não resistiram a uma terceira inoculação de 0,25cc. da mesma toxina. Por esta via, mesmo em immunização com anatoxina que, por ser atoxica, pcrmitte inoculações de doses crescentes e elevadas do filtrado (ver os resultados mais adiante), não conseguimos resul- tados satisfactorios, pois os soros dos animaes (coelho) mostraram poder de neutralização quasi nullo. Na immunização de coelhos por via intradermica e subcutanca, as injecções de toxina foram feitas com intervallos de 4 dias e em doses crescentes, tendo sido feitas 4 e 5 inoculações. Sangrámos os ani- maes 8 dias após a ultima injecção c os soros foram ensaiados sob o ponto de vista da neutralização das acções erythrocytolytica, necrosante, tetanizante e letal da toxina. b) Neutralização das varias acções toxicas da toxina — Os nossos pri- meiros ensaios visaram a avaliação da capacidade de neutralização dos diffe- rentes soros dos coelhos inoculados em relação a uma quantidade fixa de toxina. Para isso, foi tomada a quantidade de 1 cc. de uma toxina bem activa, á qual eram addicionados 1, 0,5 0,1 e 0,05 cc. e 0,01 dos soros a dosear, completando-se com salina o volume final de cada tubo para 2cc.. Com essas differentes mis- turas, após incubação em banho-maria a 37.° por 1 hora, foram feitas as provas da maneira seguinte: para avalição do poder anti-erythrocytolytico tomavamos 0,5 cc. da diluição a 1/5 dessas differentes misturas e addiciona vamos 0,5 cc. de uma emulsão de hematias a 2$í, renovando-se a incubação por mais 1 hora, sendo a leitura final realizada 24 horas depois, tendo os tubos permanecido du- rante este tempo na geladeira; a prova do poder anti-necrosantc foi realizada por inoculações intradermicas no coelho, de 0,1 cc. também da diluição al/5 dessas differentes misturas; a avaliação do poder anti-tetanizante foi feita pela inoculação transocular dc 0,25 cc. dessas mesmas misturas, e, finalmentc, a prova do poder anti-letal, inoculando-sc 1 ,5 5cc. das misturas por via venosa em coelhos de mais ou menos 1 K.. 0 Quadro 17 resume os resultados obtidos. O soro do coelho No. 7, de todos o que se mostrou mais activo, neutralizando na dose de 0,lcc. a quantidade de 1 cc. da toxina bem activa (0,25 cc. matavam 1 K. de coelho em 1 hora e 0,2cc. da diluição a 1/30 provocavam a syndroma tetani- zante definitiva na cobaia), foi colhido de um animal que já na primeira ino- culação intradermica da toxina mostrou necrose pequena (1,0 x 2,0cm) e, nas demais, somente edema e ligeiro rubor. ,í£s c e animal, mostrando antecipada- mente menor sensibilidade a inoculações intradermicas da toxina, comparativa- mente aos demais que revelaram lesões necrosantes extensas, embora gradati- vamente menores, faz-nos pensar numa inununidade anterior, natural ou adqui- rida. A neutralização de todas as acções toxicas do filtrado por todos os soros ensaiados foi evidente, revelando os vários soros maior ou menor poder de neu* 18 cm SciELO .0 11 12 13 14 15 16 QUADRO 17 Poder neutralizante de soros de animaes immunizados com toxina para as acções erythrocytolytica. necrosante. tetanizante e letal da toxina *1 z *5 0 k >4 1 = s o *cs 1 -41 4$ - -2 3 £ O d 2 • m \ 5 c 2 ^ JU JZ 1 cc. toxina + 0.1 cc. soro 1 cc. toxina + 0.5 cc. soro 1 cc. toxina + 0. 1 cc. soro t cc. toxina + 0.05 cc. soro 1 cc. toxina + 0.01 cc. soro t O O ? - - V i; íl (4 JZ O « — c u c 43 £ -r ZZ íí 2 t rs X o .§ I rs C rs • rs O rs • t >» >v u *r & c 0 ? •5 - « O .3 o c la D ta 3 íí 2 k X V 2 c •3 ri V N s H 2 t4 tfS ■~r Q PS • • o z _ X *3 í - ^ * 2 PS — *— Ò H □ C a a - rs rs «ri 1 rs X õ 1 'p 2 « ’s rt X â 3 1 1 >* >v o õ © í •3 © - hr J: 8 ?S — ò u t c O u '5 H íí 2 . PS X V O C tf | ps C rs X O •P3 * _ acçao ery- throcytoly- tica è o c O • ■-r z rt V rt X V •§. I fcr.a rs C rs X O ■ rs t/* O PS 7 Intra- dermica 3 0.85 N.C. 0 N. C. 0 0 s s H + 0.1x02 O 5 s H + + + 3. 5x3.0 + + 4' t 1/31 H. C. 5. 0x2.0 t 17’ 57 Sub- cutânea 4 1.85 N. C. 0 X. c. 0 0 s s H + + 1.5x1. 5 o s s H. C. H. C. 32 Sub- cunnea 4 1.85 N. C. 0 X. c. 0 o s H + + + 02x02 + + 14- t 3/8’ H. C. 3.0x2. 3 t 11' H. C. 17 Intra- dermica 5 1.6 N. C. 0 £ s s X. c. 0 0 s s H+ + + 10x1.5 + +■ 5' t X. t X. H. C. H. C. t 8’ 11 Intra- dcrmica 4 1.85 X. C. 0 H. + 05x1.0 + 1/23' s H. C. 55x1.0 + + 7' t 2/3' H. C. • H. C. t X. 1 39’ H. X. Teste- rnjiíu H. C. 3. 5x2.5 + +3’ 1 17' H. N. t 7' H. C. H- C. H. C. H. C. Legenda : X. c. = neutralização completa H. + = 25 % de hemolyse H. + + = 50 % de hemolyse + + 14' H. + + + = 75 % de hemolyse t 3/8’ + + 3' H. C. = Hemolyse completa O — = nenhum sympíoma tetanizante. sobrevida cm 5 dias S = queda tetanizante cm 14', morte cm 3 hs. c 8 minutos = queda tetanizante cm 3'. morte em 17', hemolyse nasal t 17* H. X. t X. = morte durante a noite S — sobrevida cm S dias de observação. J. Travassos — Toxina estaphylococcica 283 tralização. Por outro lado, o poder neutralizante de cada soro para as differcn- tes acções toxicas guarda uma relação constante, evidenciando assim a unidade antigenica da toxina. c) Relações quantitativas do poder ou neutralização das varias acções to- xicas — A avaliação quantitativa do poder neutralizante de soros de animaes immunizados, para as differentes acções da toxina tomadas em suas diversas unidades (D. M. H.; D. M. X.; D. M. T. ; D. M. L.), realizada com soros de cavallos em serviço de immunização industrial, está resumida no Quadro 13 e por esses resultados a identidade antigenica da toxina ficou mais uma vez com- provada. d) Immunização activa c passiva e acções toxicas dos filtrados — Para a verificação na neutralização in vivo da toxina pela antitaxina, foram tomados animaes immunizados activa ou passivamente e submettidos á acção da toxina pelas vias intradermica, intravenosa e transocular. Ds coelhos immunizados activamente, cujos soros foram estudados ante- riormente, foram submettidos á inoculações intradermica de toxina 14 dias de- pois da ultima injecção, e, 2 dias após, foram injectados por via intravenosa com uma quantidade de toxina que correspondia a 4 D. M. L. para 1 K. de coelho. O Quadro 18 mostra os resultados dessas provas. Somente o coelho Xo. 1 1, justamente o portador de soro menos activo, mostrou pequena necrose no ponto da pelle em que foi inoculado, sobrevivendo, entretanto, á dose por via venosa. Os demais mostraram-se immunes. — Para demonstrar a neutralização in vivo cm animaes immunizados pas- sivamente, tomámos differentes coelhos e cobaias que foram submettidos á ino- culações de diversas quantidades de antitoxina, sendo posteriormente provados ás acções dermotoxica e mortal e tetanizante da toxina. 1) acção necrosante — Dez coelhos foram inoculados por via subcutânea com diversas quantidades de uma antitoxina concentrada, preparada em cavallo, 'loseando 750 unidades tctanizantes( doseamento pelo nosso mcthodo, vide mais adiante); 1, 4 e 8 dias depois, receberam por via intradermica. 0.1 cc. de uma toxina que, nessa quantidade, produziu uma lesão necrosante extensa em coelho. Ds resultados que se veem no Quadro 19, mostram nos coelhos submettidos á Pcova, no dia immediato d ainoculação da toxina, ligeiras rcacçõcs, sobretudo edema, não se chegando a observar a necrose nitida, o que se verificou no coe- lho testemunha. Essas rcacçõcs mostraram-se muito mais attenuadas, quasi nul- 1*3. nos coelhos inoculados com 4 dias de intervallo, quando a absorpção da *ntitoxina foi completa. Porém, nos ensaios realizados com 8 dias de inter- vallo, as lesões mostraram-se extensas, com necrose acccntuada, demonstrando a eliminação total ou quasi total da antitaxina. 2) acção mortal — Coelhos immunizados passiva mente com 0.5 cc.. 1. 2 e ^ cc. da mesma antitoxina concentrada, preparada em cavallo, foram submet- 51 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 284 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII QUADRO 18 Coelhos immunizados activamentc e submettidos a inoculações intradermica e intravenosa de toxina. _ ,, Via dc im- Coelhos mumzaçao No. de ino- culações Quantidade de toxina inoculada em cc. Prova de acção nccrosan- tc. 14 dias apôs a ultima inoculação com Prova do poder mor- tal 16 dias após a ulti- ma inocula- ção com 4 D. M. L. 0.1 da dilui- ção da toxi- na a 1/5 0.1 da dilui- ção da toxi- na a 1/2 57 subcutanca 4 1.85 0 0 S 52 subcutanca 4 1.85 0 0 S 17 intradermica 5 1.6 0 0.2 x 0.2 S 11 intradermica 4 1.85 1.0x0. 5 l.Ox 1.0 s Teste- munha — — 3.5 x2. 5 3.7 x 3.0 - tidos á prova do poder mortal da toxina, inoculada por via venosa, em dose que matava 1 K. de coelho cm menos de 20 minutos. O Quadro 20 mostra os resultados nos animacs assim immunizados c posteriormente submettidos a prova da acção mortal da toxina, decorridos 2, 5 e 9 dias após a inoculação da antitoxina. Os animacs ensaiados com 48 horas de intervallo resistiram nos 5 dias de observação, demonstrando assim uma immunização completa. Dos que receberam toxina após 5 dias. somente 1 coelho, que foi immunizado com uma dose elevada (5 cc.) resistiu aquellc período, enquanto que os demais im- mtmizados com doses menores mostraram um tempo de morte muito mais pro- longado do que os testemunhas. Os coelhos inoculados após 9 dias morre- ram nas 24 horas. 3) acção tctanicante — O poder preventivo da antitoxina estaphylococcica em relação ao ef feito tetanizante da toxina, foi verificado experimentalmente, obcdecendo-sc ao seguinte critério: inoculações da antitoxina e da toxina mis- turadas no momento da injecção c inoculações da antitoxina por differentes via 5 » 52 QUADRO 19 Imrcunização passiva e acção necrosante da toxina Xo. dos coelhos Dose de an- titoxina con- centrada Dose de toxina inoculada após 24 r.. Resultado nas -18 horas Dose de toxina Resultado no 5* dia Dose de toxina Resultado no 9* dia ei Z Verme- lhidão Necrose inoculada após 4 dias 3 7 s ,S — u .r > = o •m : — ■- V Z inoculada apos 8 dias rt | Verme- lhidão u u - o 2 19 0.5 0.1 Tox. a 1/5 0.1 Tox. pura + 0 + 0 0 r 9 0.5 0.1 Tox. a 1/5 0.1 Tox. pura 0 + 0 0 0 0 30 0.5 0. 1 Tax pura ++ + + ++ 9.0 x 2.0 32 1 cc. 0.1 Tox. a 1/5 0.1 Tox. pura + + T + 0 29 lcc 0.1 Tox. a 1/5 U.l Tox. pura + 0 + + ° + + 15 7 0.1 Tox. a 1/5 0.1 Tox. pura + + 0 T 0 + 7 2 cc. 0.1 Tox pura + 4- + 4* 22 2 cc 0.1 Tox. a 1/5 0. 1 Tox. pura 0.1 Tox. pura 4*4* 4- + + 1.8 x 1.0 3 5 cc. 0 + 0 + 0 55 5 cc 0.1 Tox. a 1/5 0. 1 Tox. pura 0.1 Tox. a 1/5* 0. 1 Tox. pura 0 + 0 0 0 0 Test. ! + + ++ + ++ ++ ++ Test. 0.1 Tox. a 1/5 0.1 Tox. pura ++ ++ 4*4 4*4* 4-4- ++ 28x3.0 Test. 0.1 Tox. pura ++ ++ + + 3.0 x 32 legenda : O = nenhum symptoma — menor de 1 cc. + = muito ligeira + = entre 1 e 2 cc. Vermelhidão + = perceptível Necrose 4- = maior de 2 cc + + = accentuada + = muito ligeira + = placa de l cc. + + = placa de mais de 1 cc oyâcAjaiqo •>!> *«;p ff mhi *o/>cjjnsj}f J. Travassos Toxina estaphylococcica 287 55 t 16 minuto » após 288 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII sendo os animaes, em tempos diversos, posteriormente submettidos por ria transocular á acção tetanizante da toxina; as vias empregadas para a inocula- ção da antitoxina foram a transocular, a cistemal, a lombar e a subcutane3. I — inoculações misturadas — Tomavamos 0,2 cc. da diluição da toxina que correspondia a 2 L t (ver a determinação da L f no doseamento da anti- toxina) e 0,2 cc. da diluição da antitoxina que correspondia a 10 e a 150 uni- dades neutral izantes (doseada pelo nosso methodo) e injectavamos, immedia- tamente após a mistura feita na própria seringa e no momento da inoculação em 2 series de cobaias. O Quadro 21 mostra que, enquanto as cobaias teste- munhas soí irem a queda tetanizante logo após a inoculação das 2 L t da to- xina e morrem pouco depois, as cobaias da 1.* serie, inoculadas com essa quan- tidade de toxina de mistura com as 10 unidades de antitoxina, mostraram somen- te alguns signaes da syndroma, sem queda tetanizante definitiva, morrendo 2 cobaias durante a noite e sobrevivendo as outras nos 5 dias de observação. Na 2.* serie, porém, com 150 unidades de antitoxina, as 4 cobaias inoculadas com a mistura nada apresentaram, sobrevivendo todas nos 5 dias de observação. A aridez da antitoxina pela toxina, nestas experiencias, mostrou-se evidente. II — inoculações separadas com 10 minutos de intervallo — A antitoxina foi inoculada por ria transocular, num volume de 0,2 cc., correspondendo a 10 e a 150 unidades ncutralizantes e a toxina, 10 minutos após, foi injectada pela QUADRO 21 Poder preventivo da antitoxina em relação ao cffeito tetanizante da toxina. 1) Antitoxina c toxina misturadas no momento da inoculação. Toxina Unidades _ . . . , Cobaias experimentadas Antitoxina Testemunha» 2 L t + 9’ +56’ + 10 t N. t N. S t 1/1 O o o 0 + + 1* 2 L t 150 — 1 _ ! — s 1 S S s 1 2/20' Legenda : 0 = nenhum sjmptoma. + — symptomas cerebellarcs, sem queda tetanizante definitiva. ++ 8' = queda tetanizante em 8 minutos. S = sobrevida em 5 dias de observação, t 2/1 = morte após 2 horas e 1 minuto. 56 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 289 mesma via na dose de 2 Lt. O Quadro 22 mostra os resultados destas 2 series. Na 1* serie, sem que fosse evitada a syndroma tetanizante das cobaias, contudo notou-se o tempo de queda e de morte mais prolongado, relativamente á testemunha. Na 2.* serie, porém, todas as cobaias inoculadas mostraram pro- tecção completa. III — inoculações separadas com 1 hora dc intcrvallo — Nestas experiên- cias, a antitoxina foi inoculada pelas vias transocular, cistcrnal e lombar, e a toxina, 1 hora depois, por via transocular, na dose correspondente a 2 L t. Usámos cobaias para as experiencias do poder preventivo da antitoxina por QUADRO 22 Poder preventivo da antitoxina em relação ao ef feito tetanizante da toxina, a) Inoculações separadas, com 10 minutos de intervallo. Toxina Unidades Antitoxina Cobaias experimentadas Testemunhas 2 L t 10 + + 8‘ t 48 hs. + + 12' t N. + + 1* t 2/2 1 2 L t 150 0 0 0 0 + + 1' S S s S t 2/21 1 Legenda: 0 = nenhum symptoma. + = symptomas ccrcbclkres sem queda tetanizante definitiva. + + 8' = queda tetanizante cm 8 minutos. S = sofcrevida cm 5 dias de observação, t 2/1' = morte após 2 horas e 1 minuto. v ia transocular e coelhos para as series de inoculações pelas vias cisternal e lombar. O Quadro 23 regista os resultados das experiencias. Com 10 unidades da antitoxina por qualquer das vias inoculadas, não se verificou a protecção dos animaes, enquanto que com 75 e 150 unidades pelas vias cisternal ou transo- cular os animaes mostraram-se protegidos, sobrevivendo a maioria delles nos 5 dias de observação. Os coelhos inoculados com antitoxina por via lombar apre- sentaram symptomas tetanizantes definitivos e morreram nas 24 horas. Pro- curando verificar a cansa dessa falta de protecção, procedemos a inoculações de antitoxina corada pela fuchsina por via lombar em coelhos, e, 1 hora após a inoculação, pela abertura do canal racheano, verificámos que somente a parte 57 Poder preventivo da antitoxina em relação ao cf feito tetanizante da toxina. 3) Inoculações separadas com 1 hora de intervallo. 290 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII 58 As experiências pelas vias cisterna! c lombar foram realizadas cm coelhos c as pela via transocular, cm cobaias. bcvcnAi*, làcntvci ú do quadro 2\. J. Travassos — Toxina estaphylococcica 291 da medulla mais próxima do ponto da inoculação se mostrara corada; mesmo augmeníando a quantidade do liquido corado para 1 cc., verificámos somente a coloração de 2/3 da medulla naquelle espaço de tempo. Isso nos indica que pela via lombar, a antitoxina não chegou a banhar os centros nervosos superiores, donde não ter sido verificada a neutralização da toxina. IV — inoculações separadas com 3 e 6 horas de intervaUo — Seis cobaias inoculadas por via transocular com 150 unidades de antitoxina divididas cm 2 gnipos de 3, soffreram, decorridos 3 e 6 horas, a inoculação de 2 L t de toxina. Xo Quadro 24 reunimos os resultados. Como se vê, uma das 3 co baias de cada serie não resistiu, enquanto que as demais não apresentaram sym* ptomas e sobreviveram nos 5 dias de observação. QUADRO 24 Poder preventivo da antitoxina cm relação ao cífeito tetanizante da toxina •D Inoculações separadas com 3 e 6 horas de intervallo. Toxina Unidades Antitoxina Intervallos Cobaias experimentadas Testemunhas 2 L t 150 3 horas 0 + 17’ + + 4' + + 1* S S t N. t 2/4' 2L1 150 6 horas 0 0 + + + 1* S S tN. t 1/14' Legenda: 0 = nenhum symptoma. + = symptomas ccrcbcllares sem queda tetanizante definitiva. + + 8’ = queda tetanizante em 8 minutos. S — sobrevida em S dias de observação, t 2/1' = morte após 2 horas c 1 minuto. V — inoculações separadas com 24 horas de intervaUo — Xestas expe- r 'cncias usámos para a inoculação da antitoxina as vias riste mal, transocular e subcutânea, provando a protecção dos animaes pela inoculação de 2 L t e c °m 2 D. T. M., da toxina, por via transocular, após 24 horas. O Quadro 25 ^stra os resultados obtidos. Observa-se que, com a inoculação da antitoxina Pelas rias risternal e transocular, até um limite máximo de 280 unidades, e 24 ^°fas após a toxina, não se conseguiu a protecção dos animaes, sendo prova- velmente a absorpção da antitoxina sido feita naquelle espaço de tempo. Xas 'noculações por via subcutânea, somente com dose ao redor de 3.750 unidades, ! °i conseguida uma protecção completa das cobaias. 59 292 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII J. Travassos — Toxina estaphylococcica 293 VI — inoculações separadas com 96 horas de intervallo — Quatro cobaias inoculadas por via subcutânea, 2 com 3.750 unidades de antitoxina e outras 2 com 7.500 unidades. 96 horas após provadas com a inoculação de 2 L t de toxina, mostraram ainda protecção. Das 2 inoculadas com 3.750 unidades, 1 apresentou a queda tetanizante cm 17 minutos e nwrte durante a noite, enquanto que a outra nada apresentou e sobreviveu nos 5 dias de observação. As duas outras inoculadas com 7.500 unidades nada apresentaram e sobreviveram na- quelle periodo. VII — inoculações separadas com 10 dias de intervallo — Uma cobaia ino- culada com 3.750 unidades e 3 outras com 7.500 unidades, por via subcutânea, não resistiram, após 10 dias de inoculação, á prova realizada com 2 D. T. L. da toxina, por via transocular. c) Poder curativo da antitoxina em relação ao cf feito tetanizante da to- xina — Xa cobaia, uma vez declarai la a syndroma tetanizante, mesmo que a intervenção com a antitoxina seja precoce, difficilmente se consegue o resta- l»elecimento de todos os animaes. Com 100, 200 e 300 unidades de antitoxina, inoculadas pelas vias cistemal e transocular, não conseguimos restabelecer o equi- líbrio de 9 das 10 cobaias inoculadas com 1 L t da toxina, 5 minutos após a queda tetanizante. A unica cobaia que conseguiu restabeelcer-se, retomou o equi- líbrio 48 minutos após a applicação de 200 unidades de antitoxina c sobreviveu nos 5 dias de observação, enquanto que as outras permaneceram cm tetania di- finitiva, morrendo a maioria durante a noite da inoculação. O ef feito cura- tivo da antitoxina mostrou-sc assim muito limitado, não pela falta da neutrali- zação da toxina porventura livre no cerebro, mas pelo facto de não haver resti- lutio ad integrum das cellulas nervosas lesadas mais ou menos profundamente. Eni cortes de cerebros de cobaias inoculadas com a toxina e mortas 4 a 5 horas ‘lepois, Maffey, dos laboratorios da Faculdade de Medicina de S. Paulo, en- controu a degeneração hydropica das cellulas nervosas, quer do cerebro, quer «lo cerebello, mais accentuada em certas zonas do que em outras. Em cortes «lc cerebros de cobaias que morreram muitas horas após a inoculação da to- xina, zonas de intensa polychromatolyse. edema, por tezes com lyse accentuada «lo tecido, podem ser vistos principalmente nas proximidades da base do cerebro. Este cf feito accentuadamente necrosante c lytico da toxina estaphylococcica, cau- sador sem duvida da tetania da cobaia, e, quiçá, por analogia, responsável j>elas Meningites estaphylococcicas do homem, lesando as cellulas nervosas anatômica funccionalmente não deixa tempo á intervenção da antitoxina. 61 294 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII VII — Immunização activa e passiva e infecção sob condições experimentaes. Um dos pontos mais interessantes destes estudos sobre a antitoxina esta- phylococcica seria a verificação de sua actividade preventiva em relação ás septi- cemias. Panton, Yalentine e Dix, que já tiveram occasião de experimentar a sua applicação em casos de septicemia do homem, colheram a impres- são de um ef feito neutralizante do principio toxico, não havendo influencia decisiva sobre a reproducção do estaphylococco in vivo. Jamieson (24), também em casos de septicemia, interpretou do mesmo modo o ef feito da antitoxina. Bumet, em verificações sobre o poder preventivo na septicemia experimental do coelho, observou uma maior resistência dos animaes immunizados, relativamente aos testemunhas, registando contudo um augmento do numero de germes na corrente circulatória, tanto nestes, como naquelles. Parece assentado então que a antitoxina não apresenta um ef fei- to lytico ou de qualquer maneira nocivo ao germe em si, demons- trando exdusivamente um ef feito antitoxico. Neste particular, ha- veria certa analogia com os estreptococcos que, segundo Parish c Okell (49) possuem 2 modos de ataque: um agudo pela toxina c um segundo, séptico ou pyogenico. Não seria por isso contraindicada a applicação precoce da antitoxina, uma vez que, neutralizada a to- xina, possuidora de acções toxicas que afastam as defesas organicas- restaria ao organismo a integridade dessas defesas, capazes de p° r si só destruírem o germe. Procurámos realizar essas demonstrações em coelhos, activa e passivamen- te immunizados, e submettidos á inoculações intravenosas com culturas de cs- taphylococcos. Também fizemos experiencias cm cobaias immunizadas passiva* mente, e posteriormente submettidas a inoculações ccrebraes de culturas. Rea- lizámos amda verificações sobre o desenvolvimento de uma lesão localizada na pelle, em animaes immunizados, provocada pela inoculação de uma cultura àc estaphylococcos em caldo de 20 horas. No Quadro 26 vemos os resultados das experiencias realizadas com coelho* immunizados activa c passivamente. A immunização activa dos coelhos foi rea- lizada por inoculações intradermicas e subcutâneas de doses crescentes de to- xina e de anatoxina, geralmente num total de 5 injecções; para a immunizaçã° passiva usámos uma antitoxina preparada em cavallos e concentrada, doseand^ 750 unidades anti-tetanizantes por cc., em inoculações subcutâneas feitas 2 horas antes da applicação intravenosa de 0,5cc. de uma cultura cm caldo. & 20 horas, de uma amostra de estaphylococco virulento. As experiencias d c immunização passiva foram feitas em animaes jovens de 300 a 400 grs. c c ' nl 62 QUADRO 26 Immunização activa e passiva e infecção por via intravenosa Coelhos Peso Im. activa ti «r > ü 5 s |J a . J £ Sc -r -* rt cm i 2.S O O ■s ° 1 . Z a C Resultados Toxina nos cxsu- datos Toxina Anatoxina Coelhos novos n £ V H 269 350.0 — — — 0.5 cc. t <24 horas — 262 310.0 — - - 0.5 cc. t <24 horas 4-4- 239 330.0 “ 0.5 cc. t <24 horas + Im. passiva 240 350.0 — — 5 cc. 0.5 cc. t > 36 hs. < 48 hs. 4-4- 232 370.0 — — 5 cc 0.5 cc. t > 36 hs. <48 hs. + 246 270.0 — - $ cc 0.5 cc. t > 36 hs. <48 hs. 259 300.0 — 5 cc 0.5 cc. t <24 horas _ 241 350.0 — 5 cc. 0.5 cc. t > 36 hs. < 48 hs. + O f* c c o O Im. activa 52 — 4 x 1 .85 cc — — 0.5 cc. t > 11 dias < 12 dias ± U “ 4 x 1.85 cc. — 0.5 cc. t > 12 dias < 13 dias + 7 p. — — 5 x 7.75 cc. — 0.5 cc. t > 10 dias < 11 dias + 13 — — 5 x 7.75 cc. — 0.5 cc. t > 9 dias < 10 dias 4- Testemunhas 50 1.600.0 — — _ 0.5 cc. t > 11 dias < 12 dias + 61 1.550.0 — — — 0.5 cc. t > 9 dias < 10 dias — 4-4- 60 1.870.0 — — 0.5 cc. t > 2 dias < 3 dias 4-4- 53 1.90S.0 — — — 0.5 cc. t > 7 dias < 8 dias — tt > I è 56 1.750.0 1.2 cc. 0.5 cc. Sobrevida > 106 dias 51 1.930.0 2.2 cc. 0.5 cc. t > 3 dias < 4 dias 58 1.830.0 — 2.8 cc. 0.5 cc. t 10 dias 4- — 59 1.750.0 — 4 cc. 0.5 cc. Sobrevida > 106 dias 54 1.820.0 — — 2.5 cc. 0.5 cc. t > 29 dia s < 30 dias — Legenda : + + = necrose na pelle do coelho, acção tetanizante para a cobaia (0.3 cc). 4- = edema » » > » . ligeira acção tetanizante para a cobaia ( 0.3 cc). 4- = edema ligeiro na pelle do coelha sem acção tetanizante para a cobaia (0.3 cc). — = negativo . = não foi feito calculo por peso. 294 VII — Ui phylcxx cernias. Pr. te imir taphylo mente, lizámos pelle, e estaphy No immuni lizada xina e passiva 750 ur horas ; 20 hor immun: 62 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 297 animaes adultos de peso entre 1.500 a 2.000 gs.. Um numero elevado de testemunhas foi inoculado somente com a cultura. Logo após a morte dos animaes procurámos verificar si nos exsudatos colhidos existia toxina livre, o que demonstraria uma possível influencia desta no mecanismo da morte, já por um bloqueio da circulação pulmonar, já por uma Iyse mais ou menos accen- tuada dos orgãos, tal como foi demonstrada pelas experiencias de Nélis e Picard (39). Vemos neste quadro, na serie de coelhos jovens, mais sensíveis ás inocula- ções venosas de estaphylococcos, que os testemunhas morrem num espaço de tempo menor do que 24 horas, enquanto que os coelhos injectados previamente com a antitoxina sobrevivem mais tempo, não ultrapassando de 48 horas. Na serie de coelhos adultos, os testemunhas perecem num tempo variavel de 3 a 12 dias, sendo que a maioria morreu entre 7 c 12 dias ; os coelhos immunizados activamente também pereceram entre 9 e 13 dias (o soro do coelho 13, immu- nizado com anatoxina por via venosa, não mostrou nenhum poder neutral izador) ao passo que dos coelhos adultos immunizados passivamente, 2 pereceram entre 3 e 10 dias, 1 resistiu 29 dias e os 2 outros ainda sobrevivem por mais de 106 dias. Nestes últimos animaes não houve uma relação definida entre a morte ou sobrevivência c a quantidade de antitoxina inoculada. Após 106 dias, estes animaes (coelhos 56 c 59) receberam por via venosa 2 cc. de uma toxina re- gularmente activa (0,25 matava 1 K. de coelho em menos de 24 horas). O coelho 59 morre cm menos de 18 horas, enquanto o 56 sobreviveu. O poder toxico apresentado pelos exsudatos, embora em gráu não muito elevado, corroborado pela lyse natural do sangue do coração, demonstra que a toxina encontra-se em estado livre. Por outro lado os pequenos alxxssos en- contrados nos rins, figado c myocardio, o aspecto especial do figado c peque- nas hemorrhagias disseminadas, demonstram um estado pathologico especifico desses orgãos. A ausência de antitoxina circulante nesse final de infecção, demonstrada pela presença livre de toxina, toma patente o seu exgottamento no decorrer da mesma. A septicemia que decorre das inoculações de doses macissas dc cultura c contingente ás condições de experiencia em animaes de relativa sensibilidade ao germe, não permitte uma reacção orgatuca maior, mesmo com o auxilio da antitoxina. Que ha em inicio uma defesa provavelmente devida á presença da antitoxina não resta duvida, conforme demonstra a sobrevivência por maior tempo dos animaes immunizados em relação aos testemunhas. O Quadro 27 mostra os resultados de uma serie de cobaias immunizadas passivamente por via transocular, com doses dc antitoxina variando dc 100 a 280 unidades e 24 horas depois inoculadas com 0,1 cc. da diluição a 1/10 de cultura recente. Observa-se uma maior sobrevivência dos animaes immuniza- dos relativamente aos testemunhas. 65 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 21)8 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII As nossas pesquisas sobre o desenvolvimento de unia lesão localizada na pelle, em ani ir_-.es immunizados, provocada jiela inoculação de 0.1 cc. de unia cultura de estaphylococcos em caldo, de 20 horas, mostraram: a) em 2 coelhos immunizados por via intradermica com antitoxina circundante ao local da in- jecção ele 0,1 de cultura, não houve nas 48 horas o desenvolvimento da lesão característica; no 3.° dia um pequeno foco purulento foi observado, sem maior desenvolvimento ulterior: nesses mesmos animaes, uma lesão accentuada. embora de dimensões menores do que as observadas no coelho testemunha, occorreu em outro ponto de inoculação não circundado pela antitoxina e afastado do primeiro: b) em 2 coelhos immunizados por via venosa com antitoxina (5 cc. e 2 cc.) um ligeiro ponto purulento surgiu no ponto da inoculação infectante, no fim de 24 horas: esta diminuta lesão regrediu nos dias immediatos; c) no coelho testemunha, que não recebeu antitoxina. no ponto de inoculação desen- volveu-se uma placa de necrose de 3,0 x 3,0, com edema e rubor accentuados, abcedando no dia immediato, trazendo, após a queda do tecido necrosado, a formação de uma escara que perdurou por vários dias. QUADRO 27 Imnv.mização passiva e infecção por via cerebral Cobaias Im. passiva. An- _ , . Cultura esta- ntaxina - >. p^yiococco a Resultados antes por un,- ’ dades 3 — 0.1 cc. t < 24 horas 65 — 0. 1 cc. t < 24 horas 96 ; 0. 1 cc. t 28 horas 39 130 0.1 cc. t > 3 dias < 4 dias 97 100 0.1 cc. t a dias 133 280 0.1 cc. t > 5 dias < 6 dias 9 210 0.1 cc. t 6 dias 4 160 0. 1 cc. t > 8 dias < 9 dias 62 130 0.1 cc. t> 8 dias <9 das 64 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 299 VI I! — Anatoxina estaphylococcica: preparação e propriedades. As exotoxinas. quando tratadas pelo formol e mantidas por certo tempo a uma determinada temperatura, perdem a sua acção toxica, conservando, entre- tanto, a propriedade antigenica. Opera-se uma transformação, no sentido de Ramon. obtendo-se uma anatoxina. para a qual certos auctores ainda conser- vam o nome de toxoide de Ehrlich. A toxina estaphylococcica, segundo já foi verificado por Burnet, Parish e Clark, Dólman, Gengou e outros, do mes- mo modo, transforma-se em unta anatoxina sob a acção do formol. Sua de- sintoxicação, muito mais rapida do que a observada com a toxina diphterica, é influenciada, não só pela percentagem de formol usado, como pela temperatura e pH do material. Ella é muito mais rapida em meio alcalino do que em meio acido. Estudasdo a anatoxina estaphylococcica, procurámo.-, inicialmente, verificar em que condições sua transformação se o])era ; posteriormente, fizemos pesquisas sobre o seu poder antigenico, sobre a cajaridade de ser íixavel pela antitoxina e sobre o seu poder flocculante. Os dados fornecidos por Burnet esclarecem muito Item as condições cm que se processa a desintoxicação da toxina tratada jielo formol. (As nossas verificações foram feitas com a percentagem de 0,2 e 0,4% de formol com to- xinas de pH não ajustado (o pH final de nossas culturas tem variado entre 6,8 a 7,6) ou com toxinas previa mente ajustadas a um pH 8,2 — 8,4 mantidas a 37.®, avaiiando-sc em tempos diversas a actividade toxica. Os Quadros Nos. 28, 29, 30 e 31 resumem os resultados obtidos em um desses ensaios. Esses resultados mostram-nos que a toxina, sob a acção do formol. perde rapidamente o seu poder toxico e mais rapidamente ainda si o pH do material c ajustado previamente para 8.4. Rcsalta ainda deste estudo o facto de todas as actividades toxicas do filtrado diminuírem parallelamente, não havendo con- servação maior de uma ou diminuição mais rapida de outra, o que parece cor- roborar o argumento da unidade do principio activo, o qual, por si só seria responsável pelos vários ef feitos. Poder antigenico — O poder antigenico da anatoxina foi ensaiado em coelhos, cm cavallos e no homem. As inoculações em coelhos foram feitas Pelas vias intradermica, subcutânea e intravenosa. .Quatro a cinco injecçõcs de doses crescentes de uma anatoxina completamente atoxica, obtida a partir d* uma toxina regularmente activa, ajustada ao pH 8.4 e submettida á tem- peratura de 37.® por 5 dias. foram feitas com 4 dias de intcrvallo. Após 8 dias da ultima inoculação, os animaes foram sangrados c doscado o poder neu- ir alizador dos soros para tuna determinada quantidade de toxina. Tomámos 67 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 300 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII QUADRO 28 Desintoxicação pelo formol a 0.2 e 0.4 % e 37'C. I — Verificação da acção erythrocytolytica (numero de. D.M.H. por cc.) Tempo Toxina original Tox. pH 7.0—72 0.2% HCHO Tox. pH 7.0 —72 0.4 % HCHO Tox. pH 8.0-8. 2 0.2% HCHO Tox. pH 8.0-S-* 0.4 % HCHO 0 1.600 1.600 1.600 4 horas > 160 <320 > 80 < 160 > 40 <80 > 20 <40 24 horas 1.600 > 40 < 80 > 10 < 20 < 10 0 48 horas > 10 < 20 > 5 < 10 0 0 QUADRO 29 Desintoxicação pelo formol a 0.2 e 0.4% c 37* C. II — Verificação da acção necrosantc. Tempo Toxina original Tox. pH 7. 0-7.2 0.2% HCHO Tox. pH 7.0— 7.2 0.4% HCHO Tox. pH 8. 0-8.2 0.2% HCHO Tox. pH 0.4% 0 0.005 cc. necrose 1.0 x 12 cm. 0.1 «c- edema 08 x 0.6tf^ 4 horas 0.1 cc. edema, necrose 5.0 x 3.0 cm. 0.1 cc. edema, necrose 3.0 x 4.0 cm. 0.1 cc. edema 1.0x0 8 cm. 24 horas 0.2 cc. edema necrose 1.0 x 1.4 cm. 0.2 cc. necrose ligeira edema 1.0x08 cm. 0.2 cc. 0 0.2 cc. 0 48 horas 0.4 cc. edema, necrose ligeira 0.6 x 0.5 cm. 0.4 cc. edema ligeiro 0.4 cc. C 0.4 cc. 0 68 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 301 QUADRO 30 Desintoxicação pelo formol a 0.2 c 0.4 % e 37* C. III — Verificação da acção letal. Toxina original Tox. pH 7. 0-7. 2 0.2 % HCHO Tox. pH 7.0 — 7.2 0.4 % HCHO Tox. pH 8. 0-8.2 0.2% HCHO Tox. pH 8.0 — S.2 0.4% HCHO 0 0.25 cc. por K. t 1/12' 0.25 cc. por K. t 1/42' kas 2 cc. por K. t 0/16' 2 cc. por K. t < 15/0 2 cc por K. S 2 cc. por K. S kas 3 cc. por K. S 5 cc. por K. S 5 cc. por K. S 5 cc. por K. S 10 cc. por K. S 10 cc por K. S 10 cc. por K. S 10 cc por K. S Legenda: t 1/42' = morte cm 1 hora (numerador) c 42 minutos (denominador). S = sobre vida cm 5 dias de observação. 2 cc. por K. = 2 cc. de toxina inoculada por via venosa por 1 K. de coelho. QUADRO 31 Desintoxicação pelo formol a 0.2 e 0.4 % e 37* C. IV — Verificação da acção tetanizante. V* Toxina Tox. pH 7.0 — 7.2 Tox. pH 7. 0-7.2 Tox. pH 8.0— 8.2 0.4% HCHO original 0.2% HCHO 0.4 % HCHO 0.2% HCHO Tox. pH 8. 0-8. 2 0.01 cc. f > + + 16’ + 3/54' V 0.1 cc. 0.1 cc. 0.1 cc. 0.1 cc. + + 8' ++ 22' + + 38' 0 t 27* H. N. t N. S S 0.2 cc. 0.2 cc. 0.2 cc. ++ 54' + 0 0 S S S S k 0.4 cc. 0.4 cc. 0.4 cc. + 0 JL 0 s s s S 0-4 cc. a 0.01 cc. + + 8 ' t 27* H.N. = quantidade absoluta de toxina inoculada, por via transocular em cobaias. = queda tetanizante em 8 minutos, morte cm 27'. com hcmorrhagia nasal. = nenhum symptoma. sobrevida cm 3 dias de observação. f.9 cm SciELO 1 0 11 12 13 14 15 16 302 Memórias ilo Instituto Butantan — Tomo VIII lcc., 0.1 e 0.05cc. dos soros e misturámos a 1 cc. de unia toxina bem activa (0.25cc. matava 1 K. de coelho em 1 hora; 0.2 cc. da diluição a 1/30 provocava a syndroma tetanizante na cobaia), completando-se com -alina o volume final para 2 cc.. Foram verificadas as propriedades hemolytica, necrosante, teta- nizante e letal dessas misturas, segundo a orientação seguida anteriorntente (p.48). O Quadro 32 regista os resultados: os soros dos coelhos immunizadós por via intravenosa não apresentam um ef feito neutralizador apreciável, mostranio- se esta via imprópria para a obtenção da antitoxina ; os demais soros, de coelhos immunizadós com anatoxina por via intradermica e subcutânea, mostraram um poder neutralizador um pouco inferior aos obtidos com soros de coelhos immu- nizados com toxina não tratada pelo formol (Quadro 17), embora maiores quantidades de anatoxina tivessem sido usadas. Estes coelhos, assim immunizadós, foram submettidos á inoculação intra- dermica de toxina 14 dias depois da ultima injccção, e, 2 dias após. foram in- jectados por via intravenosa com uma quantidade de toxina que correspondia a 4 D. M. L. para 1 K. de coelho. O Quadro 33 mostra os resultados dessas provas. Por estes resultados verifica-se que os coelhos immunizadós por via intra- venosa não se mostraram immunes ãs acções necrosante e letal da toxina, ao passo que os demais revelaram immunidade completa. O estimulo antigenico primário da anatoxina foi melhor a(preciado em cavallos. Após uma serie de inoculações subcutâneas com doses crescentes de anatoxina. passou-se a uma segunda serie de inoculações com toxina activa, sangrando-sc os animacs após a primeira c depois da segunda serie, sendo os soros doseados pelo methodo que descreveremos mais adiante, baseado na neu- tralização do cf feito tetanizante da toxina. O Quadro 42, onde estão regis- tados os resultados, mostra-nos que em tun unico animal foi augmentado o titulo antitetanizante e, assim mesmo, ligeiramente, ao passo que em 3 outros o titulo foi mantido e. em mais um, notou-se uma queda do valor antitoxico do soro. O estimulo antigenico primário da anatoxina é, assim, evidente, attingindo a curva antitoxica do soro dos animaes com cila inoculados, após certo numero de inoculações, o seu maior titulo, o qual na maioria das vezes não é ultrapassa- do, mesmo que a própria toxina activa seja usada como estimulo antigenico secundário. Tanto as nossas verificações realizadas em coelhos, como as que fizemos com soros de 3 cavallos cm serviço de immunização, em que tamlxnu foi ve- rificado o poder neutralizador desses soros para as differentes acções toxicas da toxina tomadas em suas respectivas unidades (Quadro 13), mostram-nos ° paralklismo da neutralização desses vários ef feitos, indicativo da unidade anti- genica da anatoxina c da unidade da antitoxina. 70 cm 2 3 4 5 6 SciELO 0 11 12 13 14 15 16 QUADRO 32 Poder neutralizante de soros de animaes immunizados cora anatoxina. para as acções erythrocytolytica. necrosante. tetanizante e lcttal (h toxina. H,. C. = hemolyse completa + 3/8’ + + 3' _ que da tetanizante cm 3'. morte cm 17’. hemolyse nasal = morte durante a noite — sobrevida cm S dias de observação. « »«•//#<»• J. Travassos — Toxina estaphylococcica 305 Xo homem, injecções repetidas de anatoxina em doses crescentes augmen- tani o titulo antitoxico do soro. Xo decorrer do tratamento de casos de fu- tttnculose, anthrazes. acmes nodulares, osteomyelites, pyodennites. etc., cujos r esultados therapeuticos serão posterionnente discutidos em tralialho a ser pu- blicado, tivemos opportunidade de, por vezes, doscar o titulo antitoxico dos *oros antes e depois do tratamento. Esse doseamento foi feito pela verifica- do do poder anti-erythrocytolytico e, também, em um numero menor de vezes, I*la verificação do poder anti-tetanizante. Para a verificação do primeiro pro- savamos qual a menor dose de soro que neutralizava 10 D. M. H. e, para a segundo, qual a dose de soro que neutralizava 1 L t da toxina (ver mais *diante), calculando-se o numero de unidades por cc.. QUADRO 33 immunizados com anatoxina e submrttidos ás acções nccrosame e letal da toxina. Via da immu- nização ■ Ê - X g •g ’§ 4 o 1 1 i “ 5 = ■= = ã-S S -3 Prova da acçào nccrosante. 14 dias após a ultima inoculação Prova do poder 1c- til. 15 dias após a ultima inoculação, com 4 D. M. L, 0.1 da diluição da tox. a 1/5 0.1 da diluição da tox. a 1/4 intravenosa 5 7.75 1.5 x l-.Ocm. 2.8 x 3.0cm. t 4/20 1 > 5 7.75 0.5 x l.Ocm. 1.5 x l.Ocm. t 6 horas subcutânea intradcrmica / ./5 0.5 x 0.5 cm. 3. 5x2. Sem. 3.7x3.0cm. t T O Quadro 34 mostra esses resultados, rcsaltando o regular augmento do •'Uniero de unidades anti-erythrocytolyticas após a serie de inoculações com ana- *°*ina, e, taml>em, a neutralização do eí feito tetanizante da toxina. Conclue-se desses estudos que uma toxina, submettida á acção do fonrvol. Crj mpleían>cnte atoxica, conserva evidente poder antigenico, manifestado jxtlo iJ tpiKnito crescente do teor antitoxico dos soros dos animacs com cila repetida- ** lctl te inoculados. O tratamento das estaphylococcias pela anatoxina só poderia ser um facto ^'idente: a) si o titulo antitoxico do soro pudesse ser augmentado pelo emprego 73 30G Memórias do Instituto Butanlan — Tomo VIII therapeutico da anatoxina; b) si se verificasse, antes do tratamento dos p 3 ' cientes, um titulo antitoxico inferior ao geralmente necessário para serem obser- vadas as curas clinicas; c) si ficasse demonstrado que a cura coincide com o augmento desse titulo. No Quadro 34, em que damos os resultados dos doseamentos realizados antes e depois do tratamento, de alguns casos submetíidos ás inoculações pd 3 anatoxina e clinicamente curados, podemos verificar que todos esses itens são preenchidos. Um unico ponto restaria a comprovar: qual o teor antitoxico dos soros dos indivíduos normaes? Bryce e Bumet (2) estudaram com minúcia 0 assumpto, doseando o titulo antitoxico de numerosos indivíduos de varias idades, desde o nascimento até 80 annos e estabeleceram uma curva das medias do teor antitoxico normal por idades. lEssa curva, que reproduzimos aqui (Graphico D* assemelha-se á da diphteria: nos recem-nascidos o teor antitoxico corresponde geralmente ao teor materno, decrescendo em seguida até um titulo praticamente nullo, elevando-se depois gradativamente com a idade até o máximo titulo da curva (entre 80 a 100 unidades), attingido entre 6 e 7 annos de idade. Entre 10 e 20 annos esse titulo baixa para depois subir ao mesmo nivel. Comparando os titulos de indivíduos normaes com os titulos que mostra- ram os pacientes portadores de estaphylococcias, verificamos que só nas ostco- myelites se observam e, assim mesmo, em alguns casos, titulos elevados, proxinio* dos mais baixos obtidos após o tratamento com a anatoxina. Nos demais p 3 ' cientes, o titulo antitoxico antes do tratamento, ou approximou-se da curva nor- mal, ou mostrou-se apenas ligeiramente superior, não tendo alcançado em nc- nhum caso o titulo elevado obtido após o tratamento. Este facto talvez esteja ligado á própria natureza da lesão: na lesão chro- nica o foco reveste-se de formações diversas, que constituem uma parede de- fensiva por vezes espessa a delimitar toda a arca necrosada; a toxina, dial)" sando lentamente, forneceria o elemento antigenico que estimularia a formação da antitoxina, mas esta não poderia transpor a barreira (tromboses dos peque- nos vasos e lymphaticos, membrana defensiva), pelo menos em quantidade SO*" ficiente para collocar a colonia estaphylococcica em condições de menor aggre*' sividade. Fixação da anatoxina pda antitoxina — O methodo commummente usado para esta verificação baseia-se no facto de que a união anatoxina e antitoxi 03 torna esta ultima incapaz de neutralizar uma pequena dote de toxina posterior- mente addicionada. pelo menos em tentpo requerido para que a dissociação n3 ° se tenha efíectuado. Usa-se unta antitoxina de titulo conhecido e diluições convenientes de to ' xina e anatoxina que mostrem um ponto de neutralização em partes iguaes ° u em quantidades muito próximas. Numa serie de tubos tomam-se quantidade* decrescentes de antitoxina na diluição óptima (0,9, 0.85, 0.8, 0.75, etc. até 0.05)* 7t QUADRO 34 Immunização humana com anatoxina (Casos clinicamente curados. Doseamento do teor antitoxico antes e depois do tratamento). Kes Natureza da infecção o -o .= rt v> c a o '3 O i :s « Poder anti-erythrocytolytico dos soros em unidades por cc. Poder anti-tetanizante dos so- ros em unidades por cc. -3 *0 5 d -g g 55 3 5 ^ “ H — • rt u o c H - S Antes do tratamento Depois do tratamento Antes do tratamento Depois do tratamento acme nodular, si- nusite frontal, ab- cesso perinephre- tico 1 8 10.5 25.600 >100 <200 furunculose 6 5.3 100 1.600 L furunculose 6 5.5 100 1.600 <5 25 furunculose 6 4.1 200 6.400 furunculose 6 5.3 6.400 furunculose 6 7.6 oO 1.600 furunculose 100 1.600 <5 25 acme nodular 6 4.2 50 1.600 <5 25 M. acme nodular 5 3.2 100 400 <5 — acme nodular 7 6.4 200 6.400 <5 >25 <50 acme nodular 5 2.0 100 3.200 acme inílamma- toria 7 8.3 1.600 osteo-myelite — — 800 6.400 osteo-myelite — — 200 3.200 osteo-myelite , - 800 6.400 sycose 5 3.2 100 1.600 'A. cm 2 3 4 7 SciELO 2.1 12 13 14 15 16 17 GRAPHICO I Desenvolvimento da immunidadc cstapliylococcica (.Curva de liryce c Burnet). 308 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII CO 76 Idades (ânuos - ) J. Travassos — Toxina estaphylococcica 309 e quantidades de toxina, também na diluição requerida, em quantidades cres- centes. completando sempre o volume final para 1 cc. (0.1, 0.15, 0.2, 0.25, etc.). Uma nova serie com anatoxina. substituindo a toxina, é feita nas mesmas con- dições. Incubam-se essas 2 series em banho-maria por 30 minutos. De cada tubo destas 2 series toma-se 0.75 cc. ; dividem-se os tubos em 3 filas com 0.25 cc. para cada tubo, dando no final 6 filas de tubos, 3 com a mistura toxina- antitoxina e 3 com a mistura anatoxina-antitoxina. Para facilidade de exposi- ção denominaremos essas filas de A e AA, B e BB, C e CC, respectivamente. Em A e AA addiciona-se 0.25 cc. de salina, cm B e BB 0.25 cc. da diluição da toxina que, no volume final, corresponda a 1 minima hemolytica e em C e CC 0.25 cc. de diluição tia toxina que. no volume final, corresponda a 2 minimas hemolyticas. Incuba-se por mais 1/2 hora e addiciona-se, em todos os tubos, 0.5 cc. «de unta emulsão a 2 r /< de hematias de carneiro, lavadas. |Xova inculia- ção por 1 hora, permanecendo depois os tubos na geladeira até a manhã do dia seguinte, quando é feita a leitura definitiva. O Quadro 35 mostra os resultados tle uma dessas experiências. Verifica- se que a anatoxina guarda cerca de 50'í do poder de ser fixavcl pela antitoxlna. Temos presentemente em andamento um estudo experimental mais minu- cioso do assumpto, no qual investigamos particularmcnte as relações existentes entre essa capacidade da anatoxina de ser fixarvel pela antitoxina e o ponto opti- mo de flocculação especifica. Em publicação posterior daremos os resultados desse estudo. IX — Producção de antitoxina estaphylococcica cm escala industrial. O emprego therapcutico da antitoxina estaphylococcica. já tentado por Va- lcntin. Panton e Dix c por Jamieson c Powell, tem mostrado resultados ani- madores. evidenciados sobretudo pela neutralização dos j>henomenos toxicos. Porisso. procuramos também produzir a antitoxina estajihylococcica em es- cala industrial, afim de verificarmos as suas propriedades preventivas c curati- vas no homem. Immunizámos 8 cavallos, que receberam semanalmente, por via subcutânea, doses crescentes de anatoxina. seguida de uma serie de injecções também em doses crescentes, de toxina. A expcriencia de Parker, neste particular, serviu- nos jara estabelecer este methodo de immunização. Com ef feito, a maioria dos animaes de Parker (45), immunizados com doses crescentes de toxina não mo- dificada, pereceram no decorrer da immunização. Dos nossos 8 cavallos, ino- culados com uma serie de doses crescentes de anatoxina, seguida de uma outra de toxina, somente 1 morreu, quando já recebia 80 cc. de toxina. cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 310 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VHI Iniciámos a immunização com 5 cc. de anatoxina por via subcutânea, au- gmentando gradativamente as doses até attingir 150 cc., inoculados de uma só vez; então era iniciada a serie de injecções de toxina activa, também com a dose inicial de 5 cc., gradativamente augmentada até 100 cc.. No ponto de ino- culação das injecções com toxina quasi sempre sobrevinha edema, por vezes accentuado, que desapparecia no fim de 4 a 5 dias; alguns animaes apresentaram abcessos que se romperam espontaneamente. As reacções febris, quasi sempre de pequena intensidade, attingiam o máximo na manhã do dia seguinte da ino- culação, em nenhum dos animaes ultrapassando 40°, mantendo-se em media a 38°5 e 39°. Durante a immunização os animaes perdiam um pouco de seu peso, sobretudo quando as doses de toxina eram augmentadas, em inicio e brusca- mente, de muitos centímetros cúbicos. Este inconveniente foi evitado pelo augmento gradativo da dose, não ultrapassando de 20 cc. entre tuna inocula- ção e a seguinte. Sempre que o animal perdia de 10 a 20 Ks. esperavam-se alguns dias para ser effectuada a inoculação seguinte, cuja dose de toxina não era augmentada, repetindo-se a da inoculação anterior. As inoculações duraram de 4 a 5 meses. Sangrias exploradoras foram fei- tas no fim da serie de inoculações com a anatoxina, e também quando as in- jecções com toxina attingiram a 50 e 80 cc.. Inicialmente procurámos dosear o titulo antitoxico do soro, verificando ° poder de neutralização para as varias acções toxicas da toxina, tomadas em uni- dades. Assim é que foram verificados os poderes anti-erythrocytolytico, anti- necrosante, anti-tetanizante e anti-letal, da maneira seguinte: a! para a avaliação do poder anti-erythrocytolytico tomavamos, em p 3 rtes iguaes, diluições do soro (1/100, 1/200, 1/300, etc.) c uma diluição da toxina que, no volume final, correspondesse a 10 unidades hemolyticas. Essa mistur3 era incubada a 37° por 1 hora e depois addicionada de igual volume de henta- tias a 2%, renovando-se a incubação por mais 1 hora. O titulo anti-hemoly* tico era dado pela quantidade de soro contida no ultimo tubo que não apresen- tasse hemolyse. b) o poder anti-necrosante foi avaliado na pelle de coelhos por inocula* ções de 0.2 cc. de differentes misturas, em partes iguaes, de varias diluiçõe» de antitoxina e de uma diluição da toxina equivalente, no volume final, a 1 do^ minima necrosante, após incubação a 37® por 1 hora. Considerava-se com° D. M. N. a quantidade de toxina contida em 0.2 cc. que produzisse lesão ne- crosante na extensão de 1 x 1 cm., inoculada por via intradermica. c) o poder anti-tetanizante foi verificado também com misturas em parte-' iguaes previamente incubadas, de differentes diluições de antitoxina e de 10 uni* dades tetanizantes symptomaticas : D. T. S. é a dose que assignala o limite actividade symptomatica da toxina e a ella já nos referimos acima. 78 QUADRO 35 Fixação da amtoxina pela antitoxina (Verificação pela prova da hemolyse) -Vnatoxina ou toxina a 1/5 Antitoxina a 1/100 0.25 0.75 0.J 0.7 0.35 0.65 0.4 0.6 0.45 0.55 0.5 0.5 0.55 0.45 0.6 0.4 0.65 0.35 0.7 0.3 0.75 0.25 0.8 0.2 1 | 0.85 0.15 0.9 0.1 0.95 0.05 íl K O u O ç/í (Tox. + antitox.) A — 0 25 cc. da mistura +■ 0.25 cc. salina 4 4 4 tr tr tr 3 2 1 1 + HC HC HC HC B — 0.25 cc da mistura 4- 1 D. M. H. 4 4 4 tr 3 3 2 i 1 HC HC HC HC HC C — 0.25 cc da mistura + 2 D. M. H. 4 tr 3 2 2 1 1 4- HC HC HC HC HC HC rs S X 2 rz Xj 'Z u ir t (Ana tox + antitox.) A A — 0.25 cc. da mistura + 0.25 cc salina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BB — 0.25cc da mistura + 1 D. M. H. 4 4 4 4 4 4 4 4 tr 3 3 3 2 2 1 CC — 0.25 cc. da mistura + 2 D. M. H. 4 4 4 4 4 tr tr 3 3 1 3 2 2 2 i HC Legenda : nenhum traço de hemolyse 25 % de hemolyse 50 % de hemolyse 75 % de hemolyse cerca de 90 de hemolyse menos que 5 % de hemolyse hemolyse completa cm 2 3 4 5 6 7 9 SciELO 13 14 15 16 17 18 19 20 21 J. T iiavassos — Toxina estaphylococcica 313 d) o poder anti-ktal foi avaliado em face de 1 D. M. L. de toxina, con- siderando-se como tal a menor dose de toxina capaz de matar 1 K. de coelho em 1 hora. Xo Quadro 13 vèem-se os resultados desses doseamentos, calculados em relação a 1 cc. de antitoxina (numerador da íracçâo) e a uma unidade anti- fetal (denominador da fracção). As relações numéricas mostradas pelos doseamentos da neutralização pelos soros das varias acções toxicas da toxina, são de tal modo estreitas, que falam a favor da antigenicidade de um tmico principio activo e, logicamente, da uni- ( fede da antitoxina: uma unidade anti-letal corresponderia a 160 anti-e rythro- rytolyticas, a 10 unidades anti-necrosantes e anti-tetanizantes. Esse facto veiu corroborar as pesquisas de Burnet, feitas nesse sentido. O titulo antitoxico seria assim facilmente avaliavel pelo doesamento do Poder neutralizante do soro para qualquer uma dessas actividades da toxina, si diversas causas de erro pudessem ser afastadas. Com effeito, a prova mais sim- pfes da neutralização do poder hcmolytico tem o inconveniente proprio de todas 45 provas in vitro, isto é, de nella intervir o contingente todo pessoal do tcchnico ir Ulv>ta. As provas de neutralização do effeito letal c necrosantc, têm contra Sl . em primeiro logar, a differença de sensibilidade dos animacs; cm segundo lo- nas doses múltiplas que poderiam ser usadas para afastar esse inconvenien- o volume sempre maior a ser inoculado não toma pratico o seu uso. Por °utro lado, a toxina conservada nas condições habituaes, perde, dentro de curto íç mpo, parte de sua actividade, transformando-se talvez cm toxoide. E’, por- tanto, um elemento variavcl c de estandardização irregular, além do que a pre- ‘'nça do toxoide tomaria falsos os resultados pelo facto de sua fixação á anti- toxina. Por estas razões procurámos um methodo de doseamento que parecesse, por ^os motivos, superior aos demais. O facto de a antitoxina ser um elemento Eticamente estável, quando conservada em boas condições (dessecada c guar- dada no vacuo, ao abrigo da luz c no frigorifico), permitte o seu aproveitamento ,ero de unidades tetanizante letacs (D. T. L.), podendo mes- ^ atingir, si trabalharmos com toxina concentrada ou dessecada, a centenas * Unidades, o que permittiria seguir mais estreitamente o methodo u-ado para 81 cm SciELO 11 12 13 14 15 16 17 314 Mejnorias do Instituto Butantan Tomo VIII as demais antitoxinas. A inoculação cerebral não será obstáculo maior para 3 realização desse processo de doseamento desde que se use a via transocular, de technica extremamente simples e rapicla. Este methodo consiste, em ultima analyse, na determinação previa da me- nor quantidade de toxina que, em presença da unidade de antitoxina tomada como padrão, produz systematicamente a queda tetanizante e a morte em cobaias, den- tro de certas bases experimeníaes ; essa quantidade (L t) é tomada como uni- dade para a avaliação do poder neutralizante das antitoxinas a dosear. Fundamentamos então esse methodo sobre as seguintes bases: a) deve set considerada como unidade tetanizante letal da toxina (D. T. L.) a menotematicamente, a morte num periodo de 24 horas; b) deve ser considerada como unidade da antitoxina padrão a menor quantidade de antitoxina que, misturada a 10 D. T. L. de uma toxina recen- temente avaliada (na vespera), evita, não só a queda tetanizante dos animaes nos primeiros 30 minutos de observação, como a morte nas 24 horas; c) a L t da toxina é a menor quantidade do filtrado que, misturada a uma uni- dade de antitoxina, produz, systematicamente, a queda da cobaia nos 30 mim 3 ' tos e a morte nas 24 horas, cm 100 r ? das cobaias inoculadas. Estudemos, ago* ra, expcrimentalmcnte, a avaliação dessas unidades: /) Determinação da unidade tetanizante letal da toxina (D. T. L.) Im** culan do-se em uma serie de cobaias, por via transocular, 0.2 cc. de differentes diluições de uma toxina cstaphylococcica (1/5, 1/10, 1/20, etc.) consegue-se tabeleccr um limite de actividadc (D. T. S.), além do qual não mais se cV1 dcnciam os symptomas que caracterizam a syndroma tetanizante. Nesta s« rl3 çáo notam-se, entre outros factos, os seguintes: a) o tempo do apparccimen^ da syndroma. avaliado pela queda tetanizante definitiva da cobaia, aumenta medida que diminue a quantidade absoluta de toxina; b) varias cobaias. in °" culadas com a mesma quantidade (0.2 cc.) de uma das diluições menores toxina, apresentam com muita regularidade a queda tetanizante no mesmo e ' paço de tempo, porém, á medida que a diluição se approxima do limite de ac vidade (D. T. S.), esse tempo de queda toma-se variavel, notando-se taint*»’ certas irregularidades so apparecimcnto dos symptomas e na occorrencia da nic te, que pode faltar nas 24-48 horas; c) as doses maiores de toxina P roV °^ a syndroma tetanizante deíintiva seguida de morte dos animaes após alg 3 horas ou mesmo após alguns minutos, mas. neste ultimo caso, determinam pre uma hemorrhagia nasal que traduz o edema pulmonar, enquanto que ás ses menores advém inicialmcnte os symptomas cerebellares, seguidos ou não queda tetanizante, retomando alguns animaes o equilíbrio. Numa serie de diluições mais estreitas, abaixo da que marcou o limite ^ actividadc tetanizante symptomatica (D. T. S.), e acima da que produz’ 13 82 J. Tri.vvA.ssos — Toxina estaphijloeoccica 315 queda tetanizante nos 30 minutos e a morte em lOO^c do animaes em algumas horas. 6 possível, por inoculações em cobaias, determinar a D. T. L., isto é, a dose minima tetanizante letal da toxina, tal como foi definida acima. Para a uniformidade dos resultados do metho.io devemos ter em conta, na determinação da D. T. L. da toxina, não só o volume a ser inoculado por via transocular em cobaias, como a concentração final da toxina. A concentração da toxina no vchiculo, como vimos anteriormente, tem ef feito decisivo na pro- ducção da syndroma tetanizante. Determinada dose de toxina que, numa con- centração mais elevada, é capaz de produzir a syndroma tetanizante na cobaia, on diluição que ultrapasse certo limite de coscentração (limiar de iixação) é incapaz de produzir qualquer symptoma da syndroma, ou mesmo morte tardia. Xa determinação da D. I . L., assim, o volume a ser inoculado deve ser fixo, variando as diluições da toxina como acima ficou dito e não por inoculações de varias quantidades de uma mesma diluição. Quanto ao volume a ser inoculado, para maior margem das pesquisas c pos- sibilidade de se trabalhar com toxina menos activa, pode ser usado o de 0.4 cc.. Quando são usadas toxinas muito activas ou toxinas concent radas, esse volume deve ser fixado em 0.2 cc.. O volume de 0.4 cc., quando inoculado por via transocular em cobaias, provoca em alguns animaes ligeiros phenomenos de com- pressão, porem estes dcsappareccm em poucos minutos, não perturbando os re- sultados do methodo. O volume usado na determinação da D. T. L. deve ser conservado em todas as operações ulteriores, tomando-se para as misturas to- *ina-antitoxina, conforme o caso. 0.2 cc. ou 0.1 cc. para a diluição da toxina e cc. ou 0.1 cc. para a diluição do soro. E’ claro que a toxina, nesses volu- tfes a serem misturados, entrará em dose dupla, ficando na diluição final com a mesma concentração usada na primeira determinação. Quando jã se possue uma antitoxina de padrão conhecido, c possível mais facilmente controlar a D. T. L. de uma toxina, usando uma prova previa de hcntoly.-e. Para isto. cm u:na serie de tubos contendo 0.4 cc. de uma mis- l ura. previamente incubada a 37° por 1 hora, de 0.2 cc. da diluição da antito- *>na padrão (que corresponde á quantidade que neutraliza 1 D. T. L.) c 0.2 cc. difíerentes diluições da toxina a dosear, addiciona-sc 1 gotta de hematias '■c carneiro a 20 %, renovando-se a incubação por mais 1 ltora. O tubo que n) °stra 50 % de hcmolvse coincide gcra!n>cnte com o ponto de neutralização para a cobaia. Como a concordância dos re-ultados não se tem mostrado absoluta. ponto tem-nos servido como ponto de partida para as inoculações na dc- te nninaçáo da D. T. L. de toxinas, poupando-se, com este modo de proceder, Muitos animaes. II) Padronização da anli toxina — Xas bases fundamenta es deste mctho- deve ser considerada como unidade padrão da antitoxina a menor quantidade ^ antitoxina que, misturada a 10 D. T. L. de uma toxina recentemcntc ava- S3 31G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII liada (preferivelmente na ve .pera), evita, não só a queda tetanizante das co- baias nos 30 primeiros minutos de observação, como a morte delias nas 24 horas. Toma-se uma antitoxina oriunda de cavallo immunizado após repetidas ino- culações de anatoxisa e procede-se a varias diluições: 1/10, 1/20, 1/30, etc-, pipetando-se 0.8 cc. de cada uma dessas diluições para uma serie de tubos. De uma toxina pura, cuja D. T. L. doseada na vespera foi de 0.4 cc. de uma di- luição a 1/20, addicionam-se 0.8 cc. em cada tubo, agitando-se a mistura e in- cubam-se os tubos em seguida a 37° por 1 hora. Após esse período, 3 cobaias são inoculadas com 0.4 cc. de cada uma das misturas e observadas convenien- temente. O Quadro 36 mostra os resultados: verifica-se que 0.2 cc. da dilui- ção original de 1/40 do soro foi capaz de neutralizar as 10 D. T. L. da toxina. Repetindo-se a verificação somente com 1 D. T. L. da toxina e com diluições 10 vezes maiores da antitoxina (1/350, 1/400, 1/450, 1/500), obtêm-se resultados comparáveis (Quadro 37). Procurando-se em seguida verificar o ponto justo de neutralização, recorre-se á prova de hemolyse, da maneira seguinte: em tuna serie de tubos pipetam-se 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 cc. etc. até 0.95 cc. da diluição da toxina a 1/5 c comp!ctam-se os volumes de todos os tubos para 1 cc., addi- cionando-sc 0.9, 0.85, 0.8 cc. etc., da diluição da antitoxina a 1/200. Após agi- tação de todos os tubos c incubação de 1 hora a 37°, addicionam-se a cada 0.5 cc. das differentes misturas 0.5 cc. de hematias de carneiro a 2%. Apo* incubação de 1 hora os tubos são collocados na geladeira e os resultados lidos na manhã do dia seguinte. Xo Quadro 38, que mostra os resultados obtidos, verifica-se que, no tubo em que a toxina c a antitoxina se encontraram cm partes iguaes, somente ligeiros traços de hemolyse são observados, não chegando mesmo a lysar 5^í das hematias, enquanto que, nos demais tubos da direita, se observa um ef feito crythrocytolytico cada vez maior, até a hemolyse completa nos últimos tubos. Estas 3 verificações, superpondo seus respectivos resultados, permittiram* nos fixar como unidade padrão da antitoxina a dose de 0.005 ou seja 0.2 cc- da diluição a 1/40. Prescntcmcntc temos a nossa antitoxina padrão cm otado sccco, cm tubo* em que foi feito o vacuo e fechados á Iampada c conservada ao abrigo da l uí e no frigorifico. Em duas verificações já feitas, no espaço de um anno, tem encontrado titulo idêntico ao primitivo. Xcsta ordem dc pesquisas damos preferencia actualmente a toxinas cong° ladas no frigorifico a — 10", pelo facto do poder toxico manter-se estável 1*^ longo tempo, permittindo verificações espaçadas sem maior causa dc erro. III) Determinação da L t da toxina — Xas ba«cs fundamentaes des ,e methodo, deve ser considerada como L t da toxina a menor quantidade de fü tr3 84 ivstanda rdiiaç ão < oc M ü d d = *o +l d d N **> d d »o 'O d d - >o -r c d »o "í T O «O to 1 d d ; 1 IO u d d T >o d d -r «O s d d •*r o d 6 -r iP N r>* d d T et et rs O 2 X S O o a X 2 O c — H < « ■° I sl c “ ± * B „ **» ^ ~ ,>> •= 8 -tS.t?. § £ £ «O O IO o C — tN U-J t>. — II II II II II II 87 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 320 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII do que, de mistura com 1 unidade de antitoxina padrão, produz systematica- mente a queda tetanizante da cobaia nos 30 primeiros minutos de observação e a morte nas 24 horas, em 100% dos animaes inoculados. Para a determinação da L t toxinas muito activas devem ser utilizadas e, no caso de toxinas fracas, somente quando previamente concentradas podem servir. Com toxinas dessecadas obtem-se uma margem de experimentação muito maior. Mistura-se a 0.8 cc. da diluição da antitoxina padrão que contem 1 unidade (0.2 cc. da diluição a 1/40 neutralizam 10 D. T. L.) quantidades crescentes, geralmente em centésimos, da toxina, completando-se com salina o volume para 1 .6 cc.. Agitam-se todos os tubos e incubam-se por 1 hora. Após esse periodo, 3 cobaias são inoculadas com 0.4 cc. de cada uma das misturas c observadas convenientemente. A menor quantidade de toxina capaz de, após contacto de 1 hora com 1 unidade de antitoxina, produzir a queda tetanizante dentro de 30 minutos e a morte geralmente nas 24 horas, em todas as cobaias, é considerada como a L f. Entre a Lo (ponto de neutralização justa) e a L t ha uma zona de transição, caracterizada pela irregularidade no apparecimento dos symptomas e na morte dos animaes e que corresponde a uma determinada dose de toxina livre praticamente incapaz de, por si só, produzir a queda e a morte em todas as cobaias. O Quadro 39 mostra uma dessas determinações, realizada com uma toxina 2 vezes mais activa do que a que serviu para as determinações anteriores. Ve- rifica-se que o ponto neutro corresponde á dose de 0.1 cc. da toxina, enquanto que a Lf está entre 0.12 e 0.13. Repetidas verificações da L* de varias toxinas mostraram um comporta- mento semelhante, com variações de 2 e 3 centésimos a Lo e a L t. Quando se usam toxinas concentradas ou dessecadas, essas variações são mais estreitas, e, nesse caso. devemos trabalhar com diluições que nos permittam fixar as ditte- rcnças em millesimos. A determinação de L f deve ser sempre feita na vespera do doseamento das antitoxinas, embora as toxinas congeladas ou dessecadas permittam um espaço de tempo maior entre as duas verificações. IV) Doseamento das antitoxinas — Para o doseamento das antitoxina*, pratica-se uma serie de diluições dos soros a dosar, das quaes 0.8 cc. são addi- cionados a 4 L da toxina, completando-se o volume de 1.6 cc. com salina. Ag 1 ' tam-se os tubos e incubam-se por 1 hora a 37®. Tres cobaias são inoculadas com 0.4 cc. de cada mistura e observadas convenientemente. Uma prova inicial de hcmolyse facilita a determinação do ponto de neutralização. A 0.4 cc. ó« cada mistura após a incubação, addiciona-se 1 gotta de hematias de carneiro 3 20% c incuba-se novamente. O tubo que mostra 50% de hemolyse no fim 1 hora, coincide as mais das vezes com o ponto de neutralização para cobaia* • não sendo, porem, de concordância absoluta (Quadro 40), elle só servirá “ c 88 HptmuinAÇãt» iLi t.,i r J. Travassos — Toxina estaphylococcica 321 O " p* T* X 'SI w ;/) ‘5 '5 co 2 2 — o c ^ co 2 ^ = s iO o o +1 I to O» euixoj, íuixoitjuy" ! A /V A A A A A A 1 — T _ | - W « - w n ci eo — ci n — Cl c 3 - c *1 ca i ca o.oos s d o.oos d o.oos 0.11 o.oos d a d fl'0 0.005 = => o.oos sro s e J S ir * — O Q Ü M •< M 00 S ? o o o 0.8 soro dil. 740 0.4 toxina 1 0.4 salina 0.8 soro dil. 1/40 0.44 toxina g f* WS s d $ c 5 * 2 ac 5 d o 0.32 salina 0.8 soro dil. 1/40 0.52 toxina 0.28 salina C -1 V C - $ ac c > f 1 i £ = g ir 2 t M d 0.8 soro dil. 1/40 0.6 toxina 0.2 salina 89 QUADRO 40 Relação entre o grau de hemolysc das misturas toxina-antitoxina e a acção tctanizante Antitoxinas Resultados da prova de hemolyse em IS' 30' 1 h. 15’ 30* 1 h. 15' 30’ 1 h. 15' 30’ 1 h. I 15' I 30’ 1 h. 15' 30' 1 h- X. C. X. C X. C. X. C 25 7e 25 7o 25 7 50 7c 50 r /c 50 % > 50% 75 % l-l 1 50 % ~5 7» > 75 7c ( > 757o H.C H. C Equino 81 Mistura dos plasmas 0 1/25 = — S + + 0/30' 1/50 = t 3/5’ + + # /14' 1/75 = — t N. Equino 81 Concentrada 0 1/250 = — S + 2/12' 1/275 + 1/36* t -48 hs. ++ 0/19' 1/300 t 2/54’ Equino 82 Mistura dos plasmas + + VIS’ 1/25 - t N. Equino 82 Concentrada 0 1/100 = — s 0 1/125 = — S + + 0/16' 1/150 = t N. + 4- 14' 1/175 = + N. Equino 80 Mistura dos plasmas 0 1/5 7= _ S 0 1/10 = — S + + 17' 1/20 = t N. Equino 80 Concentrada 0 1/50 = — S + + 18' 1/75 = t N. + + 7' 1/100 = t 3/12' Equino 80 II 1.* sangria + 1/12’ ++ 0/46’ + + 16' 1/50 + + 4' S t N. + N. t N. Equino 83 1.* sangria 0 1/10 = — s + + 12’ 1/20 = t 3/10' + + 10’ 1/30 = f 721' H. X. Humano L. A. Immunizado com anatoxina 0 1/10 = — s 0 1/20 = — S + + 12' 1/40 = t N. Mistura de antitoxi- nas concentradas 0 1/50 = — s 0 1/100 = — S ++ 15' + + 7' t 1/52- + + 15' 1/lSU — t N. 1 / —00 — 1/250 t N. QUADRO 41 Doseamento dos soros dos cavallos 81 e 82, antes e depois de concentrados, pelo methodo da neutralização da acção tetanizante. L t da toxina = 0.15 Toxina Antitoxina Cavallo 81 Cavallo 82 í? s £ O * rt . 2.5 g Unidades por cc. % Hetnolyse Ef feito tetanizante % Hemolyse Ef feito tetanizante 1 g T < r- o 15' 30' i 1 h. Cobaia 1 Cobaia 2 Cobaia 3 15' 30' , 1 h. Cobaia 1 Cobaia 2 Cobaia 3 0.8 soro a 1/25 0.6 toxina 0.008 125 x.c X. C X.C 1 0 0 0 I 75 H. C. H.C. + + 15' + + 14' 0.2 salina 0.15 S s S t X. t N. 0.8 soro a 1/50 0.6 toxina 0.004 250 50 > 50 75 ++ 30' + + 31' H.C. H.C H.C. + + 6' 0.2 salina 0.15 t 3/5' t N. t 2/12' 0.8 soro a 1/75 0.6 toxina 0.002666 375 H. C. H.C H.C + + 14' H. C. H.C. H.C. + + 6' 0.2 salina 0.15 t X. t 1/2' 0.8 soro a 1/100 0.002 500 H. C. HC H.C + + 6' H. C. H.C. H.C. 0.2 salina 0.15 t 3/43' após concentração 0.8 soro a 1/100 0.6 toxina 0.2 salina 0.002 500 X.C. X.C X. C. 0 0 0.15 S S 0.8 soro a 1/225 0.0016 625 , X.C 25 25 0 0 0 0.2 salina 01S S S S 0.8 soro a 1/150 0.6 toxina 0.00133 750 50 75 >75 + + 16' ++ 18' • 0.2 salina 0.15 t N. t N. 0.8 soro a 1/175 0.6 toxina 0.00114 875 N.C X.C X.C 0 0 H.C. H. C. H. C. + + 14' 0.2 salina 0.15 S S t N. 0.8 soro a 1/200 0.001 1.000 x.c 0 0 0 H.C. H.C. H.C. 0.2 salina 0.15 »S7v. s s s 0.8 soro a 1/225 0.6 toxina 0.2 salina 0.00088 1.125 x.c 0 0 0 0.15 s s s 0.8 soro a 1/250 0.6 toxina 0.0008 1-250 25 a 25 0 0 0 0.2 salina 0.15 s s s 0.8 Soro a 1/275 0.6 toxina 0.000727 1J75 25 50 50 + 2/1 2' + 1/36* + 1/2' 0.2 salina 0.15 5 t 48 hs. t X. 0.8 soro a 1/300 0.6 toxina 0.000666 1.500 50 75 > 75 + + 19' 0.2 salina 0.15 t 2/54' QUADRO 42 Immimixaçio dc cavaüos c doseamento pelo methodo da neutralização do effeito tetanizante. J. Travassos — Toxina cslaphylococcica 327 95 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 328 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII ponto de orientação para as pesquisas nos animaes. O Quadro 41 mostra um desses doseamentos. E’ considerada como unidade de antitoxina a menor quantidade do soro que, inoculada nas 3 cobaias de mistura com a L t da toxina, evita, não só a qued3 tetanizante nos 30 primeiros minutos, como a morte nas 34 horas. Este methodo de doseamento foi usado para avaliação das antitoxinas dos differentes cavallos em serviço de immunização e cujos resultados estão resumi- dos no Quadro 42. Analysando esses valores, vemos que, já no fim da serie de inoculações com anatoxina, se consegue um titulo antitoxico que, na maioria das vezes, perdura no segundo doseamento, feito após as inoculações com toxina activa, o que demonstra o poder antigenico da anatoxina. Estes resultados mostram-nos ainda a possibilidade de se concentrarem estas antitoxinas pelo methodo commum de precipitações fraedonadas, usado nas varias antitoxinas (diphterica, tetanica, escarlatinica, antivenenos, etc.), che- gando-se a obter concentrações de volume e actividade, de 5 a 10 vezes. Presentemente, temos, distribuída em empolas de 10 cc., antitoxina concen- trada, doseando 500 unidades por cc.. Quanto ao seu valor em emprego therapeutico ainda não temos dados q 1 * permitiam fazer um juizo seguro. Deste ponto occupar-nos-emos em proximo trabalho. DISCUSSÃO f Os estudos actuacs sobre as propriedades e características da toxina esta* phylococcica fornecem-nos, não só noções theoricas interessantes, como dados de applicação pratica. Esta toxi-proteina, existente em estado livre nos meios liquidos e solidos cm que foram cultivadas amostras de cstaphylococcos toxigenicos, guarda, pd aS propriedades que apresenta, um parallelismo evidente com as exotoxinas ate agora conhecidas. Com ef feito, sua maior elaboração depende, não só da amostra produetora, como da constituição do meio de cultura, do pH deste e do ambiente do cultivo; suas propriedades toxicas são especificas, actuam senip 1 * do mesmo modo; a propriedade lytica, que é a principal, é verificável cm dose* minimas ; a toxina é solúvel na agua e insolúvel no álcool, sendo absorvida p e ' , ‘ f precipitados ou coágulos, pelo caolim e pelo alume; é destruida pelos ácidos e c sensivel á luz, ao calor c á oxydação; é retida em parte pelos filtros e dial)' 53 lentamente; possuc poder antigenico especifico, provocando, no organismo do* animaes injectados, a formação de uma antitoxina, que a neutraliza e possu* todos os característicos das verdadeiras antitoxinas; é susceptível de ser tran s ' formada, pela acção do formol, em uma anatoxina, perdendo sua toxicidez, g u3r * dando, entretanto, o seu poder antigenico, a capacidade de ser fixada pela » ntl 96 J. Travassos — Toxina estaphylncoccica 329 toxina e flocculando especiíicamente em presença desta (Burnet) ; age após um período de incubação bastante estreito, mas seguramente variavel de accordo com a dose empregada. Xão se trata de um producto de lyse dos germes. Com eí feito, a toxina é encontrada com facilidade no estado livre, assim em meios liquido» como em solidos ; sua maior elaboração guarda certa relação com o crescimento do germe, baixando o seu teor gradativamente, á medida do envelhecimento da cultura (Juiianelle) ; nem todas as amostras de estaphylococcos pathogenicos são boas preduetoras dessa toxi-proteina, embora tenham sido isoladas de casos graves, parecendo necessária a adaptabilidade da amostra ao meio em que se desenvolve ; as amostras não pathogenicas não a produzem; necessitam de certas condições de meio de cultivo para elaborarem a toxina em maior quantidade; as amos- tras boas produetoras não a produzem cm quantidade apreciável em meio syn- thetico (meio de Uschinski) e, bem assim, a toxina não se toma mais abun- dante após a autolyse dos cultura» em condições de anaerobiose (Burky) ; culturas de estaphylococcos lavadas e lysadas (mycolysado de Gratia, bactcrio- phago) não apresentam a toxina (Gengou) ; as emulsões de estaphylococcos la- vadas. mortas pelo calor ou por outros meios, lysadas (mycolysado) ou sub- tncttidas á acção do bactcriophago, têm, quando inoculadas cm anima es, acção amigenica diversa da produzida pelos filtrados que contêm a toxina, pois os roros desses animaes não as neutralizam nem flocculam (Gengou) ; particular- mente os centrifugados de cultivos toxicos, lavados e submettidos á acção do bacteriophago, são desprovidos de acção toxica e, inoculados em animaes, não geram do mesmo modo anticorpo que neutralize a toxina ou com esta flocculc (Gengou). Estas razões, hoje bem fundamentadas em pesquisas experimentaes reali- zadas por não pequeno numero de seiemistas (Burnet, Panton c Valetnine, Dól- man, Parish e Oark, Gengou, Burky, Xélis, etc.), não nos deixam a menor duvida quanto á natureza desse principio toxico; — trata-sc de uma verdadeira exotoxina . Avulta de valor a natureza deste principio activo elaborado pelos estaphy- lococcos, quando nos lembramos que este mesmo principio c secretado iii vivo, confornx- revelam as pesquisas que ralizámos e demonstrativas da presença de üm principio toxico nos exsudatos de coelhos inoculados por via venosa, com Pílulas estaphylococcicas «vivas, isentas de toxina, com as mesma» propriedades da toxi-proteina elaborada in vitro, inclusive a de ser neutralizada pela antito- Xina. A intoxicação do organismo infectado, no decurso de certas septiccmais e de certas estaphylococcias apparentemente localizadas, jã referidas pelos cli- m'cos, é então um facto real, perfeitamente demonstrado experimentalmente. A e laboração da toxina in vivo acarretaria a lysc accentuada das ccllulas dos or- güos (figado e rim) e, sobretudo, uma perturbação da circulação pulmonar, re flectindo-se no trabalho do coração esquerdo, processo idêntico ao verificado 97 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 330 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII experimentalmeníe após inoculações intravenosas em coelhos com a toxi -pro- teína. A diminuição ou abolição completa das defesas organicas, directamente ligada ao ataque mais ou menos accentuado ás cellulas defensivas, pela maior ou menor elaboração da toxina pelo germe iníectante, permittiria a invasão cada vez maior do organismo pela bactéria, fornecendo condições óptimas para sua maior vitalidade, reproducção e toxigenicidade. Por esse mecanismo, uma in- fecção estaphylococcica na maioria das vezes localizada, poderia generalizar-se, intoxicar e destruir os elementos mais nobres da economia. O poder invasor da oellula estaphylococcica, felizmente, é limitado. Men- kin (31.*) demonstrou experimentalmente a existência de barreira lymphatica, correspondente a uma formação fibrinosa que thrombosa os lymphaticos e que se estabelece em volta de um foco inflammatorio estaphylococcico, jã 1 hora depois da inoculação infectante. Nas mesmas cor»iições, seriam precisas, res- pectivamente, 6 e 30 horas para que em focos inflammatorios provocados por inoculações de pneumococcos e estreptococcos, se estabelecesse o bloqueio da circulação lymphatica. As inoculações subcutâneas, intradermicas e muscula- res em animaes, de germes medianamente virulentos, provocam lesões localiza- das, e, somente com microorganismos altamente virulentos (toxigcnicos?) se consegue, por estas vias, uma invasão á circulação sanguínea. A barreira de- fensiva do organismo só seria efficaz desde que a toxigenicidade da bactéria fosse de pequena monta. Certamente a menor resistência organica desempenha- ria papel influente na invasão do organismo pelo estaphylococco ; mas. mesmo em organismos normaes, com todo o seu poder defensivo, é possível a invasão pela bactéria, desde que esta tenha em alto grau o poder toxigcnico ou que condi- ções locaes o favoreçam. Seriam, assim, explicadas as septicemias decorrentes de focos limitados e bem localizados, em individuos em pleno estado hygido, tal como foram dcscriptas e observadas por Georgc e Giroire, Pect, Reed e Stiles. etc. Todavia, que condições locaes seriam essas que poderiam collocar a bacté- ria em estado optimo de toxigenicidade? Para a producção da toxina i» vitro ha necessidade de uma certa tensão de CO s . "A necrose cm uma lesão estaphj" lococcica poderia sobrevir em um foco cm que a tensão de oxygenio estivesse diminuída. Fildes, mostrou em seu trabalho sobre tétano que, cm um tecido damnificado, uma condição local de anaerobiose pode ser produzida, favoravel n producção da toxina pelo bacillo. Similarmente, um augmento local da ten- são de CO 2 pode levar o estaphylococco a produzir a sua toxina” (72). N* nossa opinião, o mecanismo deve ser mais complexo. Com ef feito, experimen- talmente, a elaboração da toxina in vitro nem sempre acompanha a gravidade do caso de que foi isolada a amostra em estudo: isto é, estaphylococcos isolados de pacientes que apresentam uma infecção grarvissima, com uma intoxicação chm* camentc evidente e mesmo intensa, podem ser fracos produetores de toxina 1,1 vitro (em condições de menor tensão de oxygenio e maior de CO 2 ), enquanto que outros, isolados de lesões localizadas, apparentemente sem exercerem mai° r 98 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 33! damno para o organismo, a elaboram fortemente. De nossas amostras de es- taphylococcos isoladas de septicemia (2) e de meningites (2) mortaes, nenhuma mostrou poder toxigenico comparável á de certa samostras boas productoras e que foram isoladas de osteo-myelites, pyodermites. furunculose e ulceras. Ve- mos então, que, pelo menos in vitro, as cousas não se passam com a identidade do que se poderia theoricamente suppor. O acertado é que as condições não ?ão as mesmas, e. por enquanto, não temos ainda elementos experimentaes .se- guros que supportem uma argumentação em prol do facto da maior elaboração da toxina in vivo ou in vitro , condicionada a este ou ãquelle factor. Tudo faz- nos pensar que estas condições existem, tendo sobretudo em vista os symptomas clinieos de intoxicação observados nas septicemias de marcha fulminante e as experiências demonstrativas da elaboração da toxina in vivo; mas esses facto- res necessários á elaboração da toxina ainda não estão elucidados c muito me- nos provados experimentaimente. O problema também deve ser encarado sob o ponto de vista da dissociação entre o poder toxigenico e a virulência das ba- ctérias. Aliás, o facto não é novo. nem sempre as amostras de C. diphtcriae, C. tetani c S. dyscnieriae , isoladas de caso sgraves, são as mais toxigenicas in vitro. Xão conseguimos obter toxinas mais activas de culturas de 3 amostras de e-taphylococcos augmentadas de virulência por passagens succcssivas no or- ganismo do coelho. Devemos ter em conta, então, a adaptabilidade da amos- íra ás condições artiiiciaes de cultura. Altaincntc toxica no organismo infecta- do, pode não o ser nos meios artificiacs de cultivo, ou fracamente toxica in vivo c muito toxigenica in vitro. Os filtrados de culturas de estaphylococcos pathogenicos e mais toxigeni- cos por suas condições de adaptabilidade aos meios artificiacs de cultivo, apre- sentam propriedades diversas. O ef feito lytico sobre as cellulas sanguíneas e dos tecidos c de todos o de maior evidencia. Hcmatias, lcucocytos, hcmatoblas- tos c cellulas dos demais tecidos, sofírem a sua acção Mica. Este effcito lytico c demonstrado por uma previa degeneração hydropica das cellulas. seguida de necrose e dissolução ccllular. Van de Yelde foi o primeiro a verificar a dege- neração bolhosa e a lyse dos íeucocytos submettidos á acção da toxina; Parker acomi>anhou o phenomeno necrosante na pelle do coelho inoculado por via intra- dermica; idêntica degeneração hydropica observámos, com Maffey. na- cellulas nervosas do cercbro e do ccrcbello de cobaias inoculadas com a toxina por via tfansocular ; Xelis registou a degeneração do mesmo typo nas cellulas hepati- 53 * de coelhos inoculados por via intravenosa com doses submortaes de toxina. Porem, segundo as pesquisas de Gengou, o desapparecimento da estruetura °cllular não se acompanha da destruição das substancias ás quaes as cellulas devem as suas propriedades. Com effcito. a destruição da estruetura ccllular Pela toxina não teria modificado as seguintes propriedades ccllulares: a) a Propriedade que têm os Íeucocytos de transformar em grânulos os vibriões cho- lericos; b) o poder que têm os hematoblastos do coeiho de conferir ao soro 99 332 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII deste animal a faculdade de destruir a Bacteridia carbúnculo sa ; c) a partici- pação das substancias fornecidas pelos hematoblastos (cytozymas) na coagu- lação do sangue; d) a participação do cytozyma das hematias no mesmo phe- nomeno. As pesquisas de Gengou, sem duvida interessantes por trazerem um con- tingente de real valor para o estudo do mecanismo da acção das toxinas sobre os elementos cellulares, não auctorizam uma generalização ás demais substan- cias a que devem as cellulas suas propriedades especificas, e não será fora de proposito suppor, e é Gengou que lança a hypothese, que “lors de la lyse des cellules, le sort de leurs éléments constitutifs dépend aussi bien de la nature de ces éléments eux-mêmes que de la nature du íacteur lytiquc”. Xo presente trabalho foram estudadas experimentalmente as seguintes ac- ções toxicas das culturas de estaphylococcos : erythrocytolytica, leucocytolytica, necrosante (dermotoxina), mortal por via venosa para o coelho (leto-toxina). tetanizante e acção coagulante do plasma e fibrinolytica. A não ser esta ultima, que parece não correr por conta do principio activo filtravel, as demais estão dircctamente relacionadas á presença da toxi-proteina- Com effcito, a acção coagulante e fibrinolytica das culturas, independentemente de coexistir com poder sempre maior nas culturas em que a toxi-proteina se re- vela em altos titulos, é cm grande parte retida pelos filtros, é mais thermo-es- tavel do que a erythrocytolysina e a dermo-toxina, não se mostrando neutrali* zavel pelos soros de portadores de infecção estaphylococcica, bem como pelos soros de coelhos infectados e soros de alto titulo erythrocytolytico. Segundo Sudhues, auctor dessas verificações, o phenomeno da coagulação seria cf feito de trocas physico-chimicas não especificas e não dependeria dos phenomenos de immunidade. Seja ou não verdadeira essa interpretação de Sudhues, a coa* gulação do .plasma e a íibrinolyse, dependentes de um mesmo processo (s®" gundo Gengou a coagulação do plasma seria uma phase de íibrinolyse), e inde* pendentes da toxina propriamente dita, desempenham papel importante na p 4 ' thogenia das estaphyloeoccias, tanto que a prova in vitro de Much ainda é hoje um elemento seguro para o reconhecimento de um estaphylococco pathogenico. A acção gastro-intcstinal, também referida neste trabalho, observada n 30 só após a ingestão de alimentos contaminados como com filtrados de culturas de estaphylococcos isolados desses alimentos, no julgar de Woolpert e Dack» correria por conta de um outro principio activo, independente da toxina propna* mente dita, embora com esta guardasse certa relação de presença e proporcio- nalidade. Woolpert e Dack, que operaram em macacos, não conseguiram neu- tralizar pela antitoxina o veneno gastro-intestinal das culturas; igualmente, ma- cacos immunizados passivamente não se mostraram : mm unes ao filtrado P° r via oral. Estes auctores, entretanto, não estudaram o veneno gastro-intestiual em relação á acção coagulante do plasma e fibrinolytica das culturas, ficando este ponto ainda aberto aos estudos experimentaes. 100 J. Travassos — Toxina estaphylococcica 333 Xo que diz respeito ás demais acções toxicas dos filtrados de culturas de estaphylococcos : lytica para as cellulas sanguíneas (hematias, leucocytos, hema- toblastos) e dos tecidos (figado, rim, myocardio e cerebro), acção particular- mente necrosante para a pelle, acção letal por via venosa e ef feito tetanizante, parecem correr por conta de um unico principio activo, filtravel e seguramente neutralizavel por uma mesma antitoxina. Dizemos uma mesma antitoxina, pelo facto de, nas nossas verificações, ccsno nas de Bumet, a neutralização desses vários effeitos toxicos, tomados em suas unidades, guardarem uma relação de- masiadamente estreita, que fala a favor, não só da identidade antigenica das toxinas preparadas com varias amostras de estaphylococcos, como da realidade de uma unica antitoxina, neutralizando as differentes acções toxicas de um uni- co principio activo. Com ef feito, no caso da existência de vários princípios res- ponsareis pelas differentes acções toxicas, os titulas de neutralização desses vá- rios effeitos não se mostrariam em tão estreita c constante relação numérica, dados os graus de antigenicidadc differentes que, íorçosamente, teriam esses vários princípios toxicos. Ainda corroboram essa opinião as experiencias que realizámos de neutra- lização da toxina, não mais tomada em unidades toxicas, mas em volume fixo, variadas as quantidades de antitoxina, experiencias demonstrativas da scriação quantitativa da toxina necessária para a obtenção dos effeitos crythrocytolytico, necrosante, tetanizante e letal, respectivamente. Uma seriação idêntica c sem- pre observada na rerificção dos effeitos toxicos dos iiltrados de culturas de varias amostras, tomando a toxina em quantidades decrescentes, é verdade que, si procurarmos as relações numéricas dessas differentes acções toxicas tomadas cm suas unidades, poderemos verificar que os numeros não guardam entre si uma relação tão estreita que permitta dizer-se, com segurança, que uma unida- de X (poder letal) equivale a tantas unidades, Y, W ou Z (poderes tetanizan- te, necrosante c crythrocytolytico) . Xão só o facto da transformação rapida da toxina em toxoide, como as diíferenças de critério technico tomado pelos vários experimentadores, e, ainda as variações de sensibilidade dos elementos cm ensaio e também dos animacs empregados na determinação das varias uni- dades, tudo concorre para difficultar o assentamento das relações numéricas dessas differentes acções toxicas da toxina. Todavia, corrobora ainda o ponto de vista unicista o facto de, sob a acção do formol, todas as propriedades toxi- cas da toxina diminuírem parallelamente, tal como demonstrou Burnet c nós mesrno confirmamos. A hypothcse pluralista, defendida principalmcnte por Weld c Gunther c por Panton e Valentin, dissocia o ef feito crythrocytolytico do leucocytolytico, c também o primeiro do ef feito nerosante. Esta hypothcse, ante a evidencia de um principio activo unico, aí firmado pela neutralização proporcional dos vá- rios effeitos toxicos da toxina por antitoxinas obtidas á custa de filtrados de 101 334 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII culturas de varias amostras de estaphylococcos, parece não mais se poder fir- mar em boas bases experimentaes. Encaremos, agora, particularmente o eí feito erythrocytolytico. Como tivemos occasião de verificar, as hematias de differentes animaes, inclusive as do homem, não mostram uma sensibilidade igual ao efíeito lytico da toxina. As hematias humanas se teriam mesmo mostrado resistentes á acção de 3 das nossas toxinas altamente lyticas para hematias de coelho e de carneiro. Glenny (em trabalho não publicado, cit. por Parish), encontrou 2 hemolysinas em filtrados estaphylococricos, com anticorpos específicos. Pan- ton e Yalentin também assignalam toxinas com alto titulo erythrocytolytico para hematias de coelho, que não chegavam a hemolysar os globulos vermelhos humanos. A saturação dessa toxina com globulos vermelhos humanos não teria reduzido o titulo hemolytico para os globulos de coelho. Os globulos vermelhos humanos seriam, então, mais resistentes á acção ty' tica da toxina do que as hematias de carneiro e coelho. Restaria comprovar si, em ensaios com hematias de indivíduos cujos soros são isentos ou pelo menos contem pequena quantidade de antitoxina, o poder lytico desses filtrados não se mostraria mais acccntuado. Com eífeito, Bryce e Burnct, em estudos cuidado- sos sobre o desenvolvimento da immunidade natural á toxina estaphylococcica, estabeleceram uma curva do teor antitoxico dos soros de indivíduos de varias idades, a qual se assemelha á curva da immunidade natural á toxina diphterica: por cila se vê que. nos indivíduos adultos, o teor anti-crythrocytolytico do soro c sempre elevado. Occasionalmcnte em coelhos (5G ) se poderia observar tam- bém uma certa immunidade natural. Por outro lado, Mullcr (34) pensa que o phenomeno da hemo-destruição. por parte do cstaphylococco sobre as hematias, não estaria unicamente ligado ã presença do estaphylococco (erythrocytolysina), mas também a um princi- pio filtravcl existente no sangue humano. Este principio seria thermo-labil c a sua actividade hemo-destruetiva seria por sua vez condicionada á presença do cstajihylococco. Por fim, não seria de extranhar que, inversamente, os filtrados de cultu- ras pouco e ryth rocytolyt icos para hematias de coelho ou carneiro tivessem tini maior efíeito lytico sobre hematias humanas. Estas verificações, ainda não realizadas, merecerão futuramente de nossa parte estudo cuidadoso, dada a sua importância na explicação de factos até agora obscuros no mecanismo desse cf feito lytico. Os resultados obtidos nos nossos estudos experimentaes, relativamentc aS acções r.ecrosante e mortal da toxina, em nada diíferiram dos já publicados p° r Parker, Burnet, Dólman. Parish e Clark, Burky c outros. A acção tetanizante que se segue ás inoculações da toxina directamente r ‘° cerebro dc coelhos e cobaias, não referida nos trabalhos publicados por aquelR 5 102 J. T ha vas sos — Toxina estaphylococcica 335 auctores, foi por nós estudada experimentalmente e os nossos resultados, em parte já publicados, são registados aqui na sua totalidade. A syndroma experimental obtida pelas inoculações dos filtrados de cultu- ras de estaphylococcos toxigenicos, e só por estes, directamente no cerebro após trepanação ou pelas vias cistemal ou transocular, parece superpor-se á da te- tania acerebellada, que occorre nas meningites iníectuosas, permittindo esta ob- servação firmar de uma vez a pathogenia do mal como decorrente do ataque aos elementos nervosos (cerebro, cerebello) pelas toxinas bacterianas. Os chama- dos meningismos, observados concomitantemente a infecções pyogenicas das pro- ximidades (sinusites, otites, mastoiditesj, teriam assim sua explicação numa infiltração por parte da toxina elaborada pelo germe, alcançando determinado território cerebral. Aberto o foco cirurgicamente, o escoamento íacil para o ex- terior logicamente eliminaria a infiltração que no caso seria de ordem me- cânica. A syndroma tetanizante agora observada parece não ser apanagio do pro- ducto aggressivo do estaphylococco. Alguns dos nossos filtrados de culturas de cstreptococcos hemolyticos e de meningococcos (cm meio hormonico de Huntoon) provocaram-na, embora em menor intensidade: os animaes inoculados (cobaias ) retomavam o equilíbrio em alguns minutos, si bem que a maioria morresse nas 24 horas. Os estudos recentes de Zdrowski e Voronine (73), de Branham c Lillie (74) e os de Ferry e collaboradores (75) sobre a meningite do coelho que sobrevem ás inoculações dstemaes de culturas de meningococcos ou de seus filtrados, falam do mesmo modo nesse sentido. Nas nossas verificações com filtrados de culturas de E. typhi ou toxinas dysenterica c tetanica, veneno de jararaca ou soluto de trypsina c com o caldo-Walbum collocado sob as mesmas condições de experienda, não foi obtido effdto semelhante. Essa acção toxica dos filtrados estaphylococdcos sobre as oellulas nervo- sas, demonstrada pela degeneração do typo hydropico em elementos ccllulares do cerebro e do cerebello, mostra-se idêntica ao phenomeno inidal da necrose c lysc cellular, provocado pela toxina sobre differentes tecidos, parecendo não guardar qualquer especifiddade. Esta falta de especificidade para o tecido ner- voso é revelada nos animaes inoculados por differentes vias, os quaes não de- monstram symptomas da syndroma tetanizante. Este ultimo facto foi compro- vado pela rcproducção das classicas experiências de Wasscrrnann e Takaki sobre a adsorpção da toxina tetanica pelo tecido nervoso: o filtrado estaphylococcico, após contacto mais ou menos prolongado com esse teddo (cerebro), não per- deu em todo ou cm parte o seu ef feito mortal e tetanizante. Neste particular a toxina estaphylococcica se afasta inteiramente da toxina tetanica, que apresenta uma especificidade accentuada para aquelle tecido. A inoculação por via lombar da toxina estaphylococcica c seguida da para- lysia dos membros posteriores e, quando inoculadas doses, acima de 0.5cc. ap- 103 33G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII parecem tardiamente os symptomas cerebraes, sobretudo o opisthotono, que progridem muito devagar . Xas inoculações por via cistemal e transocular de toxinas muito activas e em do;es fortes, pode-se ainda observar em certos anima es um ataque aos cen- tros bulbares. frequentemente revelado por um íypo de edema pulmonar que se traduz por uma hemorrhagia nasal característica, morrendo os animaes, neste caso, em poucos minutos. Xormalmente, a morte dos animaes é verificada após algumas horas da inoculação, notando- se certa relação entre o tempo de morte e a dose de toxina inoculada. Uma relação chronometrica muito mais estreita poude ser verificada entre a dose de toxina inoculada e o apparecimento da syndroma, tomando-se como critério de avaliação a queda tetanizante, revelada por perda do equilíbrio, con- tracturas dos membros, opisthotonos. Estes dados, guardado certo critério te- chnico, permittiram assentar as bases experimentaes para a determinação de uma unidade, a dose tetanizante letal (D. T. L.), que foi usada nas experiên- cias immunologicas por nós realizadas. A D. T. L. da toxina, pouco superior á dose que limita a actividade da toxina (dose tetanizante symptomatica — D. T- S.), representa, em funcção da concentração, a menor dose de toxina cap 3 Z de produzir, systematicamente, a syndroma tetanizante typica. em periodo de tempo não superior a 30 minutos em cobaias de mais ou menos 350 grs. de peso e inoculadas por via transocular e a sua morte constante nas 24 horas. Dizemos cm funcção da concentração, porque as experiências por nós realizadas nesse sentido demonstraram que determinada dose de toxina, que numa concentração mais elevada é capaz de produzir a syndroma tetanizante na cobaia, cm certa diluição maior nada produz. Ficou também verificado que, alem de um certo limite de diluição do filtrado, não é possível obter-se qualquer symptoma na cobaia ou mesmo morte tardia, embora as doses de toxina inoculada sejam supe- riores á menor dose que. na diluição limite, foi capaz de produzir uma syndro- ma tetanizante completa com morte do animal. Xcsie particular, a fixação da toxina sobre as cellulas nervosas obedeceria, talvez, ás mesmas leis que regem as colorações vitaes electivas, regulando-se por um coefficiente de repartição, solubilidade e penetração, ou ainda, ás leis de adsorpção por superficies limi- tadas entre systemas micro-hcterogcneos ou colloides. Xovas verificações serão futuramente feitas afim de comprovar si a toxina, em seus vários outros ef feitos toxicos, guarda um comportamento semelhante. A toxina estaphylococcica possue um poder antigenico accentuado: os soro» de animaes repetidas vezes inoculados com pequenas quantidades de toxina pelas vias subcutanca e intradermica, possuem propriedades antitoxicas evidentes. Os animaes kijectados por via venosa mostram-se difficilmente immunizaveis, não supportando na maioria das vezes as inoculações de doses crescentes de toxina. A antitoxina desse modo obtida, segundo mostraram as nossas experiên- cias, neutraliza, tanto in vitro, como in vivo, todas as propriedades toxicas ** Lwõe. nccro»»nt« ptoJuiMm p»U inoeuUçio ; atura, preparado com o sangue de ^Çuas, de 60 a 90 dias de prenhez. A detse diaria do soro, variante de 0,5 a 2,5 foi bem supportada pelos pintos. Os primeiros effeitos assignalados consistiram num desenvolvimento acce- ^do dos appendices carnosos da cabeça (crista, barbela e caruncula), que se (*) Zondek denominou dc «Prolan» aos hormonios gonado-cstimulantcs do lobo an- '■^ricr c*a hypophyse e ás substancias de effeitos semelhantes, encontradas nos humores gra- ^cos. Tratando-se de substancias provavelmente differentes. é defeituosa essa denomi- ^Çáo globaL Julgamos que o termo «Prolan» deve ser applicado somente á substancia go- ^o-estimulante da urina c sangue de mulher gravida. Com Evans, usamos nós tal nome *° P*ra esse caso especial. cm SciELO 0 11 12 13 14 15 16 350 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII tomaram perceptíveis já no 4.® dia de tratamento, tanto nas í eme as como nos machos, porém mais pronunciados nestes últimos. Foram injectados 8 pintos, com resultados concordantes, conforme se deprehende dos seguintes exemplos: a) Serie de pintos da raça gigante negra, de Jersey, da mesma ninhada. Tratamento iniciado no 13° dia de idade. Xo 36° dia: Areas da superfície de uma das faces dos appendices carno- sos, decalcadas em papel millimetrado : Macho tratado : Crista 536 mm- ; barbela 203 mm 3 ; carunculas bem desen- volvidas (Fig. 2). Femea tratada: Crista 244 mm 5 ; barbela 80 mm 5 (Fig. 3). Macho testemunha: Crf ta 94 mm 5 ; barbelas rudimentares (Fig. 1). O testículo do injectado cerca de 8 vezes maior que o do controle. b ) Serie de pintos da raça Leghorn, branca. Tratamento iniciado no 2.® dia de idade. Mensurações feitas após 19 dias: Macho tratado: Crista 359 mm 5 ; testemunha 30 mm 5 ; femea tratada: 189 mm 5 Os appendices carnosos apresentaram-se túrgidos, succulentos e vermelhos escarlate, principalmente nos pintos de raça gigante negra. Figs. 2-3. As cloacas, nas dois sexos, apresentaram-se bem desenvolvidas, rubras e vascularizadar-, fi- cando a da femea muito maior. Domm, que trabalhou com extractos de lobo anterior, interpretou os ef* feitos observados sobre a crista e barbela das femeas como devidos ao estimulo da parte medullar dos ovários, que produziriam hormonio masculino. Xotámos um desenvolvimento precoce do instincto combativo, nos machos injectados, e algumas modificações na phonaçáo. Um canto de gallo, entre* tanto, não foi possível observar, pelo menos durante o prazo observado ; P° r questão de dosagem, talvez. O exame da genitalia mostrou que, tanto os testículos, como os ovários» augmentaram de tamanho; a diíferença foi maior nos testículos. O canal de- ferente e, mais ainda, os oviduetos adquiriram também grande desenvolvimento- O exame histologico revelou, no caso dos testículos, augmento do diâmetro dos tubos seminiferos e espermatogenese em franca evolução; intersticios mais de- senvolvidos do que no testemunha. 4 T. Martins — Gonadas e hypophyse 351 Quaes são as indicações que se podem tirar destes resultados? Podemos resumir assim as prindpaes acções biológicas provocadas pelas substancias go- nado-estimulantes, conforme os dados clássicos: 1. Os extractos de lobo anterior da hypophyse são igualmente activos em mammi feros nonnaes e nos hypophysectomizados, e muito activos em aves. 2. O “Prolan” do sangue e da urina de mulheres gravidas é inactivo, ou age de modo difíerente, sobre íemeas hypophysectomizadas segundo se de- prehende dos estudos de Evans e collaboradores (6) ; elle é completamente inac- tivo sobre aves. 3. O soro de egua prenhe entre o 2 o e o 3 o meses é activo em mammi feros normaes e nos hypophysectomizados (Evans e collaboradores) ; o é também em aves, conforme acabámos de demonstrar. As substancias gonado-estimulantcs encontradas no soro gravidico equino são, portanto, do ponto de vista dos ef feitos biologicos, muito mais próximas dos hormonios do lobo anterior do que o “Prolan” gravidico humano. ABSTRACT Experiments consisting in the inoculation of serum of prcgnant mares into chicks have showed the extracts of pre-hypophysis to be equally active on tnammals either normal or hypophyscctomized. Thcsc extracts, however, are very active on birds. Prolan obtained írom bkxxl or urine of prcgnant women is inactive or acts difíerently on hypophyseetomized females (Evans and collab.). lt is complete- ly inactive on birds. Serum takcn írom mares betvveen their 2nd and 3rd month of pregnancy is active on mammals both normal and hvpophy scctomi zed (Evans and collab.). It is active also on birds. The gonado-stimulating substanccs found in normal equine prcgnant serum are, therefore, much closer to the pre-hypophysis hormone than to tlic human pregnant Prolan from the standpoint of their biological effcct. BIBLIOGRAPHIA 1. Riddle, O. — Endocrinology XV :307 . 1931. 2. Schockaert, J. — * C. R. Soc. Biologic CVIII :429. 1931. 3. Domrn, E. V ’. — Proc. Soc Expcr. Biol. & Mcd. 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Embora a sobrevida na; parabioticos de nossas expericncias anteriores- ° ss c cm media muito longa houve uma mortalidade alta nos casos em que um 7 334 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII dos parceiros era hypophysoprivo. De 15 pares assim operados sobreviveram mais de 7 dias somente os cinco pares aqui relatados. Todavia, os resultados são bem itidcs: em nenhum delles o parceiro normal apresentou estro; ao passo que, nos pares com um animal simplesmente castrado, o estro se manifestara, na maior parte dos casos, antes do 9 o dia. Outrosim, as diíferenças de peso dos ovários nos dois grupos de experiencias são suggestivas (Quadro A). O exame microscopico dos ovários e da genitalia accessoria mostrou um pa _ rallelismo com os effeitos ponderaes. Assim, nos casos de femeas parabiosadas com parceiros simplesmente castrados, viam-se folliculos e corpos amarellos bem desenvolvidos, em numero superior ao normal, e utero e vagina bem crescidos, em estro. Já nos pares em que o parceiro castrado era também hypophysecto- ntizado, a genitalia da femea normal não se distinguia da que se observa nos animaes normaes solitários, do mesmo peso e idade. O papel do traumatismo operatorio fica relegado, pois nos pares controles Al, A2 e F4K, sujeitos * mesma intervenção, o fragmento do lobo anterior restante foi suffidente pata estimular os ovários da parceira normal. Conclusão: Em experiencias de parabiose de ratos femeas com ratos cas* trados, verificámos que a ablação da hypophyse do parceiro castrado impede os effeitos de estimulo á genitalia da rata normal, pelo menos durante os 14 pn- meiros dias de existência parabiotica. Trazemos, assim, uma confirmação a interpretação anterior, de que os intensos effeitos de estimulo, observados na genitalia do animal ngrmal em parabiose com um castrado, correm por conta de um excesso de hormonios pre-hypophysarios nos humores deste ultimo. ABSTRACT Experiments of parabiosis of normal íemalc rats with castrated rats sho"' cd that hypophysectomy performed on the lattcr inhibits the stimulus exerted on the genitalia of the normal female rats at least during the íirst 14 days o* their parabiotic existence. From the data available it is clear that the stimulu* on the genitalia is due to the pre-hypophyseal hormones circulating in excess ,n the castrated rats. BIBLIOGRAPHIA 1. KaUas, H. — Arch. f. d. ges. Physiologie CCXXIII :232. 1929. 2. Ftls. E. — Arch. i. Gynãkologie CXXXVIII :16.1929. 3. Martins, Th. — Suppl. Mera. Iast. Oswaldo Cruz (10) :233. 1929 ; C. R. Soc. Bio! í x CXV: 1342. 1934. — Martins, Th. & Rocha. A. — Endocrinology XV:421.1931. 4. Koyama. R. — Jap. J. Med. Sciences V:41.l93t. (Trabalhos da Secção de Physiopathologia Experimenta! e docrinologia do Instituto Butantan, apresentados em ^ bro de 1934. Dados á publicidade em dezembro de 1 8 QUADRO Martins & Mello — Gonadas e hypophyse 353 cm SciELO 0 11 12 13 14 15 16 CONTRIBUIÇÕES Á MATÉRIA MEDICA VEGETAL DO BRASIL POR WALDEMAR PECKOLT 615.32S.1 CONTRIBUIÇÕES Á MATÉRIA MEDICA VEGETAL DO BRASIL I. Estudo pharmacognostico da Cucurbita maxima Duch e Cucurbita pepo L. (Cucurbitaceae) POR WALDEMAR PECKOLT Nomes vulgares: — Aboboreira, Abobora, A. grande, A. menina, A. mo- ranga, Jurumú, Gerimú, Gerurnú (em tupy-guarany “Bago molle”), Taqueira. Pelo nome de Abóbora, são conhecidos os fructos de diversas Aboborei- ras plantas da extensa familia Cucurbitaceae, sendo incluídas na Phar- macopéia brasileira: a Cucurbita maxima Duchesne, vulgarmente Abóbora mo- ranga, Abobora grande, Jerumú, Jerimú, Jurumú, Gerurnú e Gerumú-peba, va- riedade de fructo menor, á qual os indios Guaranys deram tal denominação, c a Cucurbita pepo Linn., vulgarmente Abobora menina, que parece ser variedade daquclla, produzindo outras tantas variedades e variações, vulgarmente designa- das pelos nomes de Abobora moranga. A. porqueira, A. Chila, etc.. Os indios Guaranys denominam de Vercmú ou Jerumú á Abobora moranga c de Gerumú- peba a uma variedade, de fructo pequeno, achatado c de casca lisa, que também cultivam. Os franceses chamam indistinctamente ás Aboboras de “Courge” ou “Potiron”; os ingleses, de “Gourd” ou “Pumpion”; os alemães, de "Kürbiss”; os espanhóes, de "Calabacera" e os italianos, de “Zucca”. Patria: — America do Sul, Asia meridional, índia e África (cosmopolita). Distribuição geographica: — Perú, Brasil (Amazonas e diversos Esta- dos) e outros paises, onde é bastante cultivada para uso alimentar, inclusive sob a forma de algumas das numerosas variedades e variações, decorrentes do cruza- mento entre diversas espedes. Predomina, no Rio de Janeiro, a Abóbora me- nina; em S. Paulo, a A. moranga c a Gerimú; no Norte, a Taqueira e a Gerimú; no Sul, a A. moranga c a Chila; em Minas Geraes, a A. moranga e a A. por- queira ; etc. . Historico: — Essas plantas, que pareciam ter como patria a Asia meridio- nal, são, no entanto, originarias da America do Sul (Perú e Brasil), conforme 3 3C0 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII o provam as investigações do illustrado botânico Whitmark. Diz e te que 3 Cucurbita marima existia no Perú, onde era cultivada desde tempos remotos, antes do descobrimento da America, pois suas sementes, em relativo estado de conservação, foram encontradas nos tumulos peruanos do Arem, pelos naturalis* tas Reiss e Stübel.” Gustavo Peckolt, em sua “Monographia das Cucurbitaceas brasileiras”, diz, com fòros de razão, que devemos consideral-a planta brasi- leira, por ter sido encontrada na maloca dos indígenas da Amazônia, por occa- sião do descobrimento do Brasil, sendo por elles cultivada antes daquella epoca e existindo em logares onde se presume não ter anteriormente penetrado algum civilizado. Posteriormente, foi também encontrada em estado de plena cultura, entre os indios Nhambiquaras. quando do desbravamento dos sertões matto- grossense e amazonico (Roquette Pinto, in Rondonia, 1918). Do que não se pode duvidar c de ser a Abobora planta cosmopolita. q l!e se acclimatou em todos os paises tropicaes do universo, desenvolvendo-se tão bem na America, como na África e na Asia, dahi espalhando-se então para ou- tras partes do mundo. Iníelizmente, não se conhece, até agora, a planta primitiva que deu origem ás centenas de variedades e variações, hoje existen- tes ; parece, entretanto, que ella se ficou na índia, onde tem sido cultivada desde os mais remotos tempos. Xos escriptos de Olivier de Serres, fins do século XVI ou começo do XYII, já se acha mencionada uma noticia sobre a Abobora, provinda da África e da índia e ate mesmo doutros pontos da Asia. Semente, fruet© e Fi*. I rama da Cucurbita pepo lA. menina). Piiytographia ( Figs. 1 e 2) : — Planta de caule herbáceo, raste : ro. sarmento- so, cylindrico, caniculado, íistuloso, carnudo e piloso, de 6 a 12 m. de extensa 0 ’ munido de gavinhas ramosas. Por vezes, alastra-se pelo sólo ou apoia-se sob* -0 os galhos de outras plantas, tornando-se ascendente, subindo sobre arbustos P r0 * I \Y. Peckolt — Matéria medica vegetal do Brasil 3G1 ximos, aos quaes se prende á custa de suas numerosas e íortes gavinhas. Caule que pode subdividir-se em muitas ramificações, formando tantos outros, radis- centes. Suas folhas são grandes, alternas, longamente pecioladas, de contor- nos angulosos e denteados, com cinco lobos arredondados e obtusos, aspero- pubesccntes, apresentando a nervura me- diana principal proeminente na pagina inferior e avelludada. As flores são axillaro', grandes, companuladas, de côr amarella característica, monedcas, apre- sentando 5 divisões unidas inferiormen- te em cálice. A flor masculina possue caüce campanulado, afunilado na base, com 5 estames triadelphos synanthereos e inserido na base da corolla. As an- theras são lineares em forma de S, cur- vas, abrindo-se longitudinalmente; pis- tillo rudimentar. A flor feminina pos- sue o cálice e a corolla da mesma forma que a masculina, tendo, porém, o cálice adherente ao ovário. As antheras são estereis; o ovário, infero, com 3 a 5 lojas; e tyletc curto, apresentando na j>ar- te superior 3 grossos estygmatos glandu- losos. O frueto (peponideo) é glolniloso, achatado, segundo as especies, alcançando grandes dimensões e peso, de super- ficie lisa, lustrosa, de côr amarcllo avermelhada, ou pallida, quando maduro. Suas sementes, enoerradas na cavidade do frueto, são adhcrcntes á sua polpa ou parede interna; são geralmcntc largas, achatadas, ellipticas, revestidas, em seu contorno exterior, por rebordo saliente; episperma crustáceo, apresentando uma amêndoa, que constituc a droga. Esta amêndoa é de cór branca, ou esver- deada, de sabor agradavel, medindo cerca de 1 cm. de extensão por 12 cm. de largura. *• itr- •í Cueorbita maiimi DITH. Abobora grandr. Droga: Endosperma seminis cucurbitae. Caracterização da droga: — A semente, também chamada “pevide”, é oval, mais aguda em uma das extremidades, onde se encontra o hilo com a mi- cropyla, que mede 18 a 23 mm. de extensão, 8 a 10 mm. de largura e 2 a 3 mm. de espessura. Suas faces, ligeiramente convexas, são margeadas por um rebordo saliente, cylindro-circular c recobertas por delgada pellicula, facilmente destacável, deixando a descoberto o endosperma. duro e de côr branca embacia- 5 362 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII da. A amêndoa, alem deste espermoderma espesso e cartilaginoso, é recoberta de tegumento subjacente, finíssimo, de côr branco esverdeada, adherente; é composta de dois cotyledones plano-convexos, esbranquiçados, oleosos e ligados, nas suas partes mais afiladas, por uma radicula delgada. Estructura microscópica (Fig- 3) : — “O espermoderma é constituí- do por 6 camadas differentes: a) fi- leira de grandes cellulas dispostas em paliçada e paredes delgadas; b ) segun- do invólucro, formado de 3 a 4 filas de cellulas alongadas na direcção tangen- cial, com paredes providas de dilata- ções reticuladas ; c) camada esclerosa, formada de tuna só fila de grandes cel- lulas alongadas radialmente, de cerca de 75 1 i de comprimento, de paredes espessas e canaliculadas ; d) parenchy- ma formado em sua parte exterior, espessa, de cellulas, irregulares, de pa- Cort. 2 «m*nu d«corti- redes não reticuladas ; e) nova ca- ead» 13.630 » 1.400 » Gordura e matéria corante . vestígios 0.080 » 0,060 > Dextrina, subst extrat., acido malico, etc. . 29.360 gms. 126.020 » 20.920 » Saes inorgânicos (cinzas) 24.500 » 38790 » 41700 » Azoto (pesquisado por Péligot) . . . . , 0771 > 2.181 » 0724 > Idcm por 100 gms. de substancia secca . . 4.660 > 10.730 > 3700 > As citadas substancias inorgânicas são: carbonato dc potássio, sulfato de potássio, chlorcto de potássio, chloreto de magnésio, phosphato de cálcio e ma- gnésio, alumina, oxydo de ferro e silido. Pela analyse de Braconnet verifica-se que a A. moranga é a mais rica em substancia nutritiva, tomando-se o azoto por valor nutritivo; comparando-lhe o valor nutritivo com o do trigo, verifica-se que 100 partes dc trigo equivalem a 147 partes da polpa do írueto da Abobora moranga, dentre todas as analysadas a mais rica em substancias azotadas. — Maior interesse do que as demais partes da planta apresenta-nos a se- mente, cm virtude da sua acção especifica contra as Tenias ou “Solitárias”, pla- thelminthos que parasitam o homem c os animaes. G. Peckolt, analysando todas as partes constituintes dessa planta, encon- trou, no frueto maduro da Abobora moranga (Cucurbita maxinta), em 1000 gms. da polpa ott parte carnosa, que constitue sua parte util a fins culinários : gms. Humidade 897,000 Principio corante ( Abobrina ) ou Abobora — carotina 3,550 Substancia aromatica espcci.il 0,120 Acido abobrico 0,250 Principio amargo 0,220 Amido, substancias albuminoides, gonimosas, etc. 32,550 Matéria extractiva, saccharina 55,940 Saes inorgânicos (cinzas) 4,120 Cellulosa, etc 5,450 O principio corante abobrina (abobora-carotina) é de côr amarello-ouro, tornando-se, ao contacto do ar, mais escuro ou alaranjado; assemelha-sc muito ã carotina, por suas propriedades tanto physicas, como chimicas. 7 364 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII A substancia aromatica é solúvel no ether sulfurico, sendo ella que em- presta á massa da abobora o aroma particular que esta possue. O acido abo- li rico é um acido orgânico sui gencris, de sabor idêntico ao da parte carnosa e polpuda da abobora madura. O principio amargo é solúvel na agua e no ál- cool de 96 °C. A presença do amido, na massa polposa da abobora madura, é a substan- cia que representa a liga da massa cosida e que reduz o valor nutritivo do íructo. O valor alimentício da abobora é comparado ao das cenouras e não deve. por- tanto, ser desprezado, tanto mais quanto, durante a cocção, elle perde grande quantidade da agua que encerra, fornecendo, em estado secco. cerca de 4,6 (Pcligot) a 10.7 G (Peckolt) de azoto, conforme a “variedade” da planta. Isto sem falar em ácidos aminados e, sobretudo, na vitamina A, cuja presença estudos moderníssimos têm revelado em quantidade apreciável, sob a forma de carotenio, na abobora. Pesquisando todas as demais partes da planta, G. Peckolt encontrou, apen3S nas sementes, um acido orgânico sui gencris, ao qual denominou acido cucurbico, não obtendo outro qualquer principio orgânico, alcaloide, ou glycoside, embora empregasse diversos methodos de ensaio. A este acido orgânico (acido cucurbico), que acompanha o oleo em pequena porção, attribuem-se as propriedades teni fugas da semente de abobora. Xa analyse das sementes frescas, privadas da casca (pevides), da Cucurbita maxitna (Abobora moranga), o alludido chimico encontrou, por 1000 gms.: Oleo gorduroso 468,321 Acido cucurbico 0,522 Aleurona, acido resinoso, etc 23,544 Subst. albuminoides, gommosas, acido malico, assucar, etc 106,527 Saes inorgânicos 72,325 Parenchyma, partes insolúveis, etc 236,117 Humidade 94,540 Idêntica analyse, pelo mesmo chimico procedida nas sementes descorticadi- da Curcubita pcfo (Abobora menina) revelou, por 1000 gms.: Oleo pingue 215,300 Acido cucurbico 0,520 Acido malico, etc 106,550 Emulsina, gomma, etc 24,630 Saes de ácidos inorgânicos 72,570 Parenchyma, partes insolúveis, etc 5S0.430 8 W. Peckolt — Matéria medica vegetal do Brasil 365 — “O oleo é de còr amarello-esverdeada eom ligeira fluorescência averme- lhada, transparente, muito fluido, de aroma um tanto semelhante ao da oliveira e quasi do mesmo sabor.” Seu peso especifico a + 18°R = 0,917, solidifican- do-se a — 10°C. E’ solúvel no eiher de petroleo, no álcool amylico, na essencia de thenebintina, no sulfureto de carbono e na benzina. Pouco solúvel no ál- cool de 36°C e no álcool de 98°C; seu indice de iodo é de 116,5 a 120,5. Este oleo compõe-se de palmitina, myritina, e acido olcico. — Segundo o ehimico Heckd, a acção tenifuga das sementes de abóbora é devida a um principio resinoso, por elle obtido e denominado pepo-resina, o qual achou na proporção de 1 17 na pdiicula 'verde que envolve as sementes. Os chimicos Schulze e Banceri. examinando os brotos da planta nova, en- contraram os ácidos aminados, leucina c tyrosina, na proporção de 0,15 o , 00 , aos quaes attribuem valor nutritivo. — Xo serviço da Secção de Botanica Medica do Instituto Butantan obti- vemos o oleo cucurbico e o acido ciicurbico das sementes frescas e descorticadas, da Cucurbita tnaxima, na proporção de 400 gms. de oleo puro para 1000 gms. das sementes e. igualmente, pelo ether sulfurico, conseguimos isolal-os das se- mentes integraes (com perispenna), reduzida a pó, na proporção de 215 gms. de oleo por 1000 de sementes da planta. O oleo das sementes descorticadas é de còr esverdeada com reflexos ver- melhos, consistência xaroposa c aroma agradavel que faz lembrar o das amên- doas. O oleo obtido das sementes integraes c de còr verde escura, com reflexos sul- ferinos, mais viscoso e pesado, de sabor acidulo c algo adstringente, aroma cs pecial da abóbora madura. Este oleo pode ser obtido a irio pela pressão das sementes, quando descor- ticadas, na proporção de 25 a 28%. Nós o obtivemos, igualmcnte, pela fer- vura em agua, processo clíc que nos forneceu produeto de qualidade inferior, còr amarello esverdeada, consistência bem mais espessa, de aspecto grosseiro, turvo; quanto ao rendimento, foi muito inferior ao obtido pdo ether sulfurico, ether de petroleo, ou tetra-chloreto de carbono. Podemos adiantar que o melhor mc- thodo se nos revelou ser o da extraeção pelo ether sulfurico, a 1 :2, pois o pro- dueto c de óptima qualidade e aspecto, limpido, de côr esverdeada com refle- xos avermelhados e de acção mais constante. Experimentámos ainda obtcl-o directamente pelo oleo de rícino, mas o produeto conseguido não logrou satis- fazer-nos, quanto ás suas propriedades geraes, physicas, chimicas c therapeu- ticas. O oleo cucurbico que obtivemos pelo ether sulfurico é solúvel no chloro- forniio, no ether de petroleo, no álcool amylico, na benzina, na essencia de therebintina e no sulfureto de carbono; dif ficilmente no álcool de 96°C, no ab- soluto na proporção de 1 :260 e insolúvel no de 36°C e de 42°C. a 36G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Ultimamente na França alguns auctores têm obtido um acido orgânico (aci- do citrulico ), que suppomos seja de outra espeeie do genero Cucurbita, pois a escassez de suas propriedades não permitte que o julguemos analogo ao do oleo cucurbico, anteriormente isolado pelo chimico G. Peckolt da Cucurbita maxhna e da C. pepo. — O acido cucurbico, que obtivemos por separação do oleo cucurbico, é de sabor amargo acidulo, aroma pouco accentuado (a lembrar o das sementes, quando contusas) ; é solúvel no ether sulfurico, no chloroformio e difficilmente no álcool de 98 %. Seu soluto aquoso incompleto apresenta turvação íluores- oente, mantendo-o em suspensão permanente. Precipitado pela agua destillada e retido por filtração, sêcco na estufa, apresenta-se amorpho, de cór amarellada e sabor acre amargo, fortemente acido, um tanto adstringente, dando reacção franca ao tomasol. Foi obtido na proporção de 0,52 °\°°, ou sejam de 200 gms. de oleo das sementes desprovidas da casca. — Reacções do oleo cucurbico, que obtivemos, pelo ether sulfurico, das se- mentes descorticadas e frescas da Cucurbita maxima : I. Tratado pelo addo sulfurico (D. = 1.840) a 1:5 — coloração vermelho castanha, que passa ao pardo immediatamente. II. Pelo acido azotico — não ha reacção. III. Pelo nitrato acido de mercúrio 1 :5 — vascolejada, a mistura torna- ra-se amarellada e semi-opaca. IV. Com a soda caustica liquida (D = 1.15) — a mistura torna-se ama- rello clara que passa ao esbranquiçado, ficando gelatinosa. V. Com a ammonia liquida e concentrada — a mesma reacção, passan- do, porém, á cór leitosa. VI. Com a potassa caustica liquida (D = 1.21) — vascolejada, a mis* tura torna-se leitosa e, ao fim de 5 m., transforma-se em massa semi-solida. VII. Com o acido nitrico fumegante (1:2) — coloração esverdeada na camada de contacto dos dois líquidos, desapparecendo logo em seguida, pd a agitação. — O oleo que obtivemos pela fervura das sementes reduzidas a pó e in* tegras, da mesma planta, é de cór vermelho parda transparente quando em queno volume, turvo quando em mas^a. Tratado pelo addo sulfurico (D ^ 1.840) a 1:5, adquire coloração vermelha barrosa, mais carregada. Com o acido nitrico fumegante, dá coloração verde na zona de contacto c > ao fim de 2 m., apresenta nova reacção com desprendimento de vapores nitrosos. tornando-se a mistura de cór amarellada. Propriedades e ixdicações therapeuticas : — O oleo das sementes da abobora é um tenifugo, bastante reputado e efíicaz, actuando igualmente sobre as ascarides. 10 W. Peckolt — Matéria medica vegetal do Brasit 3G7 O oleo das sementes descorticadas pode vantajosamente substituir o oleo de rícino, nas preparações vermífugas de chenopodio, porque, em dose igual á daquelle, actua como laxativo, augmentando o valor da formula, reforçando-a na sua acção vermífuga. Pharmacologia e emprego official: — As amêndoas das sementes fres- cas descorticadas são usadas como teniíugo, na dose de 40 a 60 gms. para crian- ças e de 100 a 150 gms. para adultos, uma vez piladas e emulsionadas no leite de vacca, leite de cóco, no mel ou na agua; devem ser tomadas em jejum e se- guidas de um purgativo salino 1 a 2 horas após. Para esse fim, aconselhamos a seguinte formula: Electuario tenifugo : Sementes frescas, descorticadas e piladas, da Cucurbita maxima 100 gms. Leite de Cocos nucifera (Cóco da Bahia) . . 100 Assucar ou mel para adoçar q. s. Para ser usado em jejum e seguido, 1 a 2 h. após, de um purgativo salino. Ás crianças, 40 gms. do electuario, para cada 5 annos de idade, ou sejam 20 gms. das sementes de abóbora, proporcionalmente. O oleo cucurbico é usado na dose de 15 gms. contra a teniase, conforme indicação da Pharmacopéia dos E. U. do Brasil; Carvalho de Lima, que o en- saiou experimentalmentc, recommcnda-o, para o adulto, na dose de 20 gms. de uma só vez, em jejum e seguido de um purgativo após 1 hora. — Preparámos, com o endosperma fresco da semente descorticada da Cm- curbita maxima, um extracto ctherco, que aconselhamos para succedaneo do Extracto etherco de feto macho, como teniíugo, nas doses de 1 gm. por anno de idade ás crianças e de 20 até 25 gms. aos adultos, administrado cm capsulas gelatinosas, ou simplesmente addicionado ao oleo de rícino ou ao mel: esta foi a forma que nos pareceu ofíerccer maiores vantagens. Dos resultados c ob- servações de seu emprego therapcutico será publicado proximamente minucioso relato, em coilaboração com Alcides Prado, que está procedendo ás competentes verificações helminthologicas na Secção de Parasitologia do Instituto Butan- tan, cm cuja Secção de Pharmacologia será feita opportunamente a experimen- tação meticulosa de todos esses princípios. Com o oleo, o extracto etherco, e a emulsão das sementes frescas, nunca ob- servámos, nem tivemos notida, de qualquer acddente, visto ser essa droga com- pletamente destituída de toxiddez, razão bastante para preíeril-a ao feto ma- cho, no tratamento da teniose humana. 11 3C8 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Emprego officinal: — Amêndoa da semente fresca, em electuario; oleo cucurbico e extracto ethcreo da semente descorticada da Cucurbita maxima. Usos da Aboboreira: — A aboboreira e suas numerosas variedades são das plantas mais frequentemente cultivadas em nosso país, e raro é o agricultor que de suas múltiplas propriedades não se utiliza. A polpa do frueto maduro é usada como alimento, tanto para o homem, como para alguns animaes. Sob todos os artifícios da arte culinaria, ella figura nas mesas dos habitantes do interior do Brasil, mormente dos menos abastados. Seus brotos e pídunculos floraes, bem como as novas folhas, são usados como hortaliça, muito estimada e vulgarmente conhecida pelo nome de “cambuquira”. A “puree” feita com a polpa do frueto maduro se dá o nome de "quibebe”. Os doces são muito estimados, quer em compotas, quer como cremes; quando sec- cos ao sol, chamam-se "cocadas de abobora” e são muito apreciados no país, de norte a sul. O pequeno valor alimentício que módicas porções dessa polpa encerram é perfeitamente corrigido pela addição do leite, do assucar e de cereaes moidos, ou da manteiga; desta forma, a abobora pode con'tituir um bom creme infan- til e saborosas e nutritivas sobremesas. — Em algumas regiões do pais, os naturaes preparam, com as flores da Aboboreira, um xarope que empregam nas cólicas infantis. Quanto ás se- mentes, usam-n’as torradas como amêndoas, ou sob a forma de emulsão, em- pregando-as no tratamento do rheumatismo, moléstias das vias urinarias e nas dysenterias. A proposito, dizem esses nativos que a “aboboreira é a despensa do pobre”. . . Cultura e biologia: — A aboboreira é geralmente plantada em covas de 10 a 40 palmos de distancia, no centro de uma elevação, a qual os nativos cha- mam “murundú”, dispostas entre as ruas do milharal. É necessário abrigal-a das correntezas dagua ou enxurradas, pois as plantas novas se resentem da hu- midade excessiva. A época do plantio occorre do mês de setembro a novembro, quando tar- dam as primeiras chuvas. É crença popular que, smdo o plantio feito por oc- casião da lua nova, os fruetos serão maiores e mais húmidos. A aboboreira é plantada cm logar definitivo, geralmente proximo a algU' ma sébe ou latada, na qual tende a subir. Deitam-se 2 a 4 sementes em cada cova, ao redor da qual eleva- se a terra para evitar a acção das chuvas. A aboboreira exige, para sua boa producção, terra fofa, bem adubada e isen- ta de humidade: é costume entre os ertanejos lançarem ua “mão cheia” de es- terco de curral, curtido, no centro de cada "murundú" e ahi depositar, então, as sementes. Quando a planta attinge 1 m. de extensão, usam cortar o primei- ro broto (operação a que denominam “capação”), afim de ramificar-se o caule, extendendo a rama em diversas direcções. 12 \V. Peckolt — Matéria medica vegetal do Brasil 309 E' vegetal bi-annual. regulando produzir 15 a 30 íructos (aboboras) de diversos tamanhos em cada planta, alcançando alguns a media de 20 e até mes- mo 30 kgms., de accordo com a fertilidade do solo. Os sertanejos costumam deixal-os amadurecer ligados ao pedunculo, pois, desta forma, se conservam em perfeito estado por mais de 6 meses, época da próxima colheita. Esta é rea- lizada facilmente, amontoando-se os fructos em pilhas, para serem transporta- dos depois, para logar abrigado da humidade, paiol geralmente. — A aboboreira é cultivada desde os primeiros tempos do descobrimento do Brasil ; tendo sido encontrada pelos primeiros colonizadores, foi por elles es- palhada, ao ponto de servir para manter intenso commercio com as colonias da índia. A aboboreira reproduz-se também por “mergulhões”, assim feitos: quando a planta cresce livremente e deseja-se augmentar o numero de pés, faz-se, sobie o segundo nó acima do íructo, uma incisão longitudinal, abaixo desse nó, fir- mando-o no solo por meio de uma forquilha, cobrindo-o com terra, de modo a abranger uma parte do caule, o qual não tardará a enraizar, formando uma nova planta. Para outras plantações, devem-se escolher de preferencia os fructos mais desenvolvidos, e que mais expostos ao sol estiverem, mormente aquelles situa- dos na parte superior da “latada”; para o fim cm vista, deve-se colher o ini- cio escolhido, quando a planta tiver completado o seu cydo vegetativo, isto é, quando seccar complctamente. Os sertanejos usam um methodo original jxira se certificarem da epoca da completa maturação do frueto; embora este, logo que se inicia o amadurecimento, mude de coloração, passando ao amardlo ala- ranjado em algumas especies, o que também coincide com a sécca do peduncu- lo. preferem, para maior certeza, dar duas a tres pancadas scccas sobre o frueto, o qual, estando completamente maduro, produz um som cavo, semelhante ao produzido pela pancada em um larril vazio c fechado, dando impressão de achar-se óco, methodo este muito simples e pratico. O rendimento produzido pela cultura da aboboreira cm 1 hectare de terra é muito variavel. pois não se pode calcular da fertilidade do terreno c das condi- ções atmosphericas de um modo geral ; em media o rendimento é de 80 a 100 mil kilos por hectare de terra. O agronomo Joiqucaine diz ser a media geral do peso total dos fructos de uma cultura de aboboreira de 100 a 125 mil kilos por hectare de terreno. Mas esta cifra está na depcndencia dos diversos íactores necessários ao desenvolvi- mento normal dos fructos: algumas vezes se têm alcançado fructos da Abobora moranga pesando 40 ou mais kilos e com 150 cm. de circumfercncia! Quanto á quantidade de sementes em cada frueto, varia cila igualmente; a media é de 120 a 160 litros de sementes integraes, para cada 100 aboboras; ge- falniente, podemos dizer que um hectolitro de sementes é reduzido a 25 litros, 13 370 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII quando descascadas, dão um rendimento total de 20 litros de oleo cucurbico, Para deseortical-as, é bastante deixal-as previamente a humedecer em agua du- rante 12 horas: desse modo, uma ligeira pressão da unha é o bastante para des- tacar-lhes com facilidade a casca. — As sementes da abobora. guardadas em logar bem secco e privadas da humidade (previamente enxutas), conservam-se perfeitas durante alguns an- nos, mantendo o seu poder germinativo. Sempre que se tiver em vista seleccionar uma qualidade de abobora, é im- prescindível plantar-se de uma unica das especies, porque facilmente degeneram pelo cruzamento, fornecendo outras tantas variações e nunca reproduzindo 0 typo primitivo. — Muitas aboboras existem com denominações vulgares as mais diversas, as quaes não passam de simples “variações”, provenientes da íórma typica c devidas a successivas culturas e cruzamentos, que modificam, não comente 0 aspecto, como a fórma e a coloração do frueto. Os sertanejos do pais e agricultores opinam que a Abobora moranga, pc* quena e achatada, de casca duríssima e gommos salientes, còr vermelha, carme- sim ou verde rosada tal uma maçã, vulgarmente denominada Abobora paro- guaya, quando cultivada ao lado de outras especies, degenera, dando a Abobora moranga, bem maior, mais alta. e ainda apresentando gommos: em outras cul- turas, passará a apresentar-sc oval arredondada, com ligeiras depressões, vestí- gios dos gommos: transformando-se, finalmentc, em outra inteiramente di* versa, sem gommo algum e arredondada, que é a Abobora moranga ou Gcnti** ( Curcubiia maxima Duch.), representada na inclusa Fig. 3. A-sim tambe* 0 a Cucurbi/a pepo L., “Abóbora menina”, “A. de pescoço”, dá a “A. orlada”. 3 “A. redonda”, a “A. garrafa”, etc., nomes que ainda mudam segundo as loca- lidades, as condições ambientes, formas e qualidades dos fruetos. 14 615.323 . 1 CONTRIBUIÇÕES Á MATÉRIA MEDICA VEGETAL DO BRASIL II. Estudo pharmacognostico de Struthanthus marginatus (Desr.) Blume (Loranthaceae) . Um novo principio da planta. POR WALDEMAR PECKOLT e DOMINGOS YERED Nomes vulgares: — Herva de passarinho miuda. Ocra. Nome scientifico: — Struthanthus marginatus (DESR.) BLUME. Família: — Loranthaceae. Parte usada: — Folha. Droga: — Folia struthanthi. PhytografHIa (Fig. 1): — Planta arbustiva ramosa, pequena c parasita, que cresce geralmentc sobre as arvores as mais diversas. Possue ramos delgados, compridos, muito esparsos, ascendentes, reptantes, possuindo numerosas radicellas. Suas folhas são geralmentc ovaes c muito semelhantes ás de um cufcciro; agudas, de côr verde escura na face superior, mais clara na inferior, luzidias, ovaes e lanccoladas. Inflorescencia axillar, em pequenos racimos, com flores de côr branca. Fructo, pequena baga, oval arredondada, de sueco viscoso e acidulo. Patria: — Brasil. Distribuição geographica: — Habita geralmente os Estados de S. Pau- lo, Rio de Janeiro, Minas Geraes, Goiás e Paraná. Historico: — Esta planta pertence á interessante familia das Lorantha- ccas, verdadeiros parasitas vegetaes, sempre verdejantes e viventes sobre os ramos de diversas arvores, onde se implantam, emittindo abundantes c fortes raizes, que se unem fortemente aos ramos da arvore parasitada e a cuja custa se nutrem. 15 372 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII A denominação desta íamilia origina-se do genero Loranthus e este, do gre- go À o'p ò ; — a correia e ãvfro; — a flor, porque suas flores são geralmente coriaceas e parecem cortadas á semelhança de correias. As Loranthaceae são muito prejudiciaes ás arvores sobre as quaes se im- plantam, nutrindo-se de sua seiva, e, deste modo, exgottando-as progressiva- mente. Fig. 1 Stnithanthus margimtus * parasitar uma Canneltira. Seus fruetos fornecem “gutta percha” e uma substancia viscosa c resinosa (visgo) que, passando incólume através da via digestiva dos passaros que os comem, facilita a adherencia das sementes excretadas aos galhos e ramos das ar- vores, onde gcralmente elles pousam e dejectam. Verdadeira e curiosa defesa c artificio da natureza sabia para a subsistência de uma cspecic que, sem esta circumstancia, talvez não pudesse manter-se no meio ambiente. Estas plantas habitam geralmente a região intertropical, sendo raras vezes encontradas nas regiões temperadas e frescas do nosso continente. Caracterização da droga: — Encontradas no commercio em estado sec* co, as folhas são partidas em pedaços irregulares. Quando inteiras, são ovaes» de vertice agudo ou sub-cordi forme, raramente agudas, curtamente pecioladas, medindo geralmente de 5 a 8 cm. de comprimento e podendo, porém, ntting> r até 1 1 cm. por 3 a 6 cm. de largura ; são coriaceas. circumdadas por uma tnar* gem cartilaginosa sub-diaphana. plana ou arqueada, brilhante na face ruperior e um tanto opaca na inferior; sua nervura mediana faz saliência nesta pag' 113 ’ 16 SciELO 0 11 12 13 14 Peckolt & Yeiied — Matéria medica vegetal do Urasil 373 sendo as demais pouco pronunciadas. O peciolo é plano-convexo c mede ge- ralmente de 8 a 15 mm. Estructura microscópica (Fig. 2): — “O epidemia, glabro e recoberto por espessa cutícula, é formado de cellulas polygonacs largas e de paredes re ftag ou ligeiramente curvas e guarnecidas em ambas as faces por estornas volu- mosos, envolvidos por duas cellulas symmetricas, dispostos em crescente, sendo os estornas mais confluentes na face inferior. O mesophyllo é homogeneo e formado de cellulas polyedricas, levemente arredondadas, mais regulares proxi- mamente ao epidemia. A nervura mediana é bi-convexa, fazendo saliência na face inferior. O systema libero-lenhoso é representado por tres feixes ovaes, constituídos por um cordão lenhoso, recoberto em baixo por uni phloema molle, bastante de- senvolvido e por um arco de pericyclo levemente lenhi ficado. O parenchyma fundamental, rico em cellulas tannicas, encerra algumas cellulas esclcrencliynia- tosas, munidas de paredes espessas e pontuadas” (apud Phamiacopcia brasi- leira — A. D. da Silva) (Fig. 3). F*. 2 Corte trinitmo dâ folha do Stmthanthu* manrinata*. Fig. 3 Corte transversal da raiz do Strathanthaz marcinatu» PHARMACOcniMiCA : — Estas plantas curiosas encerram geralmente prin- cipios combinados com os do vegetal parasitado. fDi ff crentes analyses o têm provado. Theodor e Gustavo Peckolt, analysando as folhas de uma planta que vege- tou sobre um velho “cafeeiro”, encontraram um produeto crystallizado, mui se- melhante á cafeina, mas não possuindo todas as suas propriedades, quer phy- sicas, quer chimicas; essa substancia crystalliza-se cm agulhas finíssimas, so- SciELO cm 0 11 12 13 14 15 16 37-1 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII luveis no ether, no aicool e na agua, não o sendo, entretanto, no chloroformio e no benzol. Para differença!-a da cafeína, chainaram-n’a “cafcinstruthanthina”; não encontraram, porém, o acido coffcalannico, existente em grandes propor- ções no cafeeiro ( Coffea arabica L. ; Rubiaccae), nem tampouco o acido tanni- co furo, frequente em outras Loranihaccac que analysaram. Encontraram, entretanto, acido gallico, devido provavelmente a alguma transformação do acido coffca-tannico. As relações obtidas por aquelles chimicos foram de: “ Cafeinst ruthanthina ” crystalizada. . 0,042 gms. ° l °° Acido gallico . 4,460 gms. °> nas analyses procedidas nas folhas do Struthanthus marginatus (Herva de passa- rinho miuda) que parasitava um velho “cafeeiro”. — A analyse, a que procederam em outra planta igual, parasitando uni “jambeiro" ( Jambosa malaccensis D. C), revelou por mil grammas: Agua 636.000 gms. Gomrna elastica 0,500 Cera vegetal 0,900 Chlorophylla 2,000 Resina molle 8,600 Acido resinoso “a” 3,900 Acido resinoso “b” 32,a00 Principio amargo, amorpho : cstrutlianthina ■ ■ 1,700 Acido estruthanthino-tannico 1,077 Substancia corante vermelha 1,231 Substancia album., mat. extractiva, etc. . . . 51,760 Saes inorgânicos 45,000 CeUulose 214,232 ” A cera vegetal encontrada é de côr branca, dura e semelhante á cera da “carnaúba” - (Copcrnicia ccrifica L., Palmcaccae ) ; a resina molle é pegajosa, inodora e de sabor particular, solúvel no ether de petroleo, na benzina, no chlo- roformio, no ether sulfurico e no álcool absoluto fervente. O acido resinoso "a” tem côr amarclla, consistência molle, é inodoro e in- sípido; completamente volátil na platina incandescente, solúvel no ether de petroleo, no chloroformio, no ether sulfurico, no álcool absoluto c na ammonea. O acido resinoso “b" é de côr pardo escura, pegajoso, sem aroma e de sa- bor particular; solúvel no chloroformio, no acido acético concentrado, no ál- cool e na ammonea. Outro acido resinoso, ao qual chamaram“c”, que acom* 18 Peckolt & Yered — Matéria medica vegetal do Brasil 375 panha o anterior, em pequena proporção, é de còr castanho escura, pegajoso, sem sabor e aroma; é solúvel no álcool e na ammonea. O principio amargo estruthanthina foi obtido do extracto alcoolico das fo- lhas, tratado pelos meios habituaes. — Pelo mesmo proceder, obtivemos, no laboratorio da Secção de Botâni- ca Medica do Instituto Butantan, em diversas experimentações e com diifcren- tes amostras de Loranthaccae, colhidas no "Horto Oswaldo Cruz”, actualmen- te em reorganização como dependenda desse Instituto, quer o principio amar- go estruthanthina, como o acido estruthanthino-tannico, de diversas plantas da- quella especie, que parasitavam Canneleiras (Lauraccae), Figueiras ( Moraccae ), Ccsalpinias ( Leguminosae ), Mirindibas e Pitangueiras ( Myristicaceae ), Cedros (Meliaceae), Angicos ( Leguminosae ), etc. — Xas experimentações procedidas com amostras do Struthanthus margi- natus colhidas em Ilex (/. paraguaycnsis ST. HIL.; I. theezans MART.; I. pubiflora REISS; llicineae), de uma alameda ahi existente, muitas das quaes já fenecidas pelo exgottamento dos parasitos, obtivemos um prindpio analogo á " cafein-estruthantina ”, ao qual se poderia chamar de thein-estruthanthina. Ob- servámos, igualmente, que a relação entre a " cafein-estruthanth ina” obtida por Th. e G. Peckolt, e a thein-estruthanthina por nós obtida não é proporcional á sua percentagem em cafcina; assim c que obtivemos 0,29 ° l °° do novo princi- pio, ao passo que aqitelles chimicos obtiveram, da planta que parasitava o “ca- feeiro”, 0,04-2 ° 00 do antigo principio; no entanto, a equivalência cm cafcina entre as duas plantas cafeeiro c malte é de 2,666 °j" para o café e de 2,510 °|°° para o malte , cm media. O inverso, entretanto, succedeu com o acido galUco, que encontrámos na proporção de 6.320 0 j°°, do que se deduz ser verdadeira a asserção daquelles chimicos, para os quaes a presença desse addo derivaria de alguma transformação do acido matte-tannico, encontrado cm proporções maio- res no llex do que o acido coffea-tannico no Coffea. Verificámos que a estruthanthina, por nós obtida dai- amostras que parasi- tavam as "Canneleiras”, c mais rica, de odor agradavel, sabor amargo resinoso um tanto adstringente, volátil á incandescência, desprendendo aroma especial, e '■apores densos, de còr branca, os quaes foram mais espessos, irritantes c de aroma empyreumatico nas amostras colhidas sobre as “Figueiras bravas”, ou amarelladas e mais tenues nas amostras que parasitavam “Angicos” c outras Leguminosae. O acido estruthanthino-tannico, que obtivemos em maior escala do que a thein-estruthanthina, é pulverulento, de còr sepia amarellado e de sabor forte- uiente acido-adstringente. É solúvel no álcool e incompletamente na agua destillada. Esse acido foi °btido tratando o extracto alcoolico das folhas pela agua destillada, filtrando-a e tratando o filtrado pelo acetato neutro de chumbo ate não apresentar siquer 19 376 Memórias do Instituto Butanlan — Tomo VIII turvaçáo; recolhido pelo filtro, o precipitado é posto a seccar na estufa e dis- persado, resultando um corpo amorpho. de reacção fortemente adda, inodora, de sabor acido-adstringente, cuja sensação na lingua perdura por algum tempo- Tratado pelo soluto normal de per-chloreto de ferro, cora-se de preto es- verdeado. Com a gelatina, dá abundante precipitado. — A cstruthaiithina crystaUizada foi por nós obtida do seguinte modo: de- pois da separação do acido cstruthanthino-tannico, o filtrado resultante foi sub- mettido á passagem de uma corrente de H2S (gas sul fhyd rico), até não mais se formar o sulfureto de chumbo. Filtrado o producto assim tratado, foi o filtra- do (separado do chumbo) evaporado a B. M. até consistência xaroposa. Trata- do e agitado com ether sulfurico e separado em “frasco extractor”, o soluto ethereo foi evaporado espontaneamente; obtivemos, assim, um producto que, secco sobre o chloreto de cálcio fundido, crystalliza em agulhas íinissimas, de sabor amargo, de aroma fraco e volátil na platina incandescente: é a thcin-cs- truthanthina. Solúvel no ether sulfurico, no álcool de 42° e no de 36° e na agua; insolú- vel no chloroformio e no benzol. Tratada pelo acido sulfurico concentrado, cora-se em vermelho tijolo, dis- solvendo- se. Seu soluto aquoso tem reacçao neutra. Com o rcactivo dc Mcycr, dá precipitado de côr avermelhada e, com o de Draggcndorff, precipita em amarello sujo. Com o acido phospho-molybdtc° dá precipitado amarello. Com o chloreto dc ouro dá abundante precipitado ama* rello pardo. Com o bi-chlorcto dc mercúrio dá ligeira turvaçáo. — A estruthanthina, que obtivemos das amostras que parasitavam as rete- na incandescente, apresentando-se o liquido, resultante da precipitação peio g ;l5 sulfhydrico, em Minas Geraes, floresce, porém, em abril, fructificando em setembro. Vive em terreno rico e solo humoso, á sobra dos capoeirões; nestas condi- ções, é passivel de ser cultivada. Parte usada: — Raiz da Abutua. Droga: — Radix abutuac. Caracterização da droga: — A raiz de Abutua ( Chondrodcndron pMT phylla) apresenta-se no commercio em fragmentos irregulares, tortuosos, ta* 24 W. Peckolt — Matéria medica vegetal do Iirasil 381 miíicados, duros, de tamanho variavel (2 a 6 cm. de comprimento e 3 a 8 cm. de largura). Sua superfície externa é constituída por suber de facil desaggre- gação; còr pardo-escura, quasi preta, com rugas transversaes e sulcos, por ve- zes profundos no sentido longitudinal (Fig. 2). Em corte longitudinal apresenta-se com aspecto grosseiro, fibroso, côr cin- zento amarei lada, ou ligeiramente esverdeada. Cortada no sentido opposto, transversalmente, apresenta uma serie de zonas irregulares, bastante espessas, encaixadas umas nas outras, em torno de um ponto geralmente excêntrico e se- paradas entre si por uma linha ondeada de còr parda. Estas zonas são forma- das de feixes libero-lenhosos, cuneiformes, em numero crescente, do centro para a peripheria, crivados de poros e separados pelos raios medullares. A mais in- terna delias é formada de 12 feixes que se prolongam até o centro, onde não existe medulla alguma e são divididos em dois grupos de seis jx>r uma camada de tecido parenchymatoso, mais largo do que os raios medullares, e interrompi- dos por dois feixes le- nhosos primários. A mais externa é recoberta por uma camada cortical pou- co espessa. Esta raiz pos- sue aroma pouco sensí- vel ; porém, quando fres- ca, é de cheiro penetran- te e de sabor pronunciado, mas passageiro ( Phar- macopeia dos E. U. do Iirasil, R. A. Dias da Silva). EsTRt:cn:R.\ micros- cópica: — “Suber facil- mente exíoliavel, de côr pardo-negro : é bastante espesso c formado de cel- lulas tubulares dispostas em filas radiaes. (Fig. 3). O parenchyma corti- cal, pouco desenvolvido, é constituído por cellulas polygonacs alongadas no sen- tido tangencial e apresenta certo numero dc cellulas esderosas de jxiredes jwuco espessas e pontuadas: é limitado internamente por uma faixa continua de cellu- la. esclerosas, dispostas sobre quatro a cinco fileiras providas de paredes muito espessas, canaliculadas. Abaixo desta camada esclerosa, nota-se a zona mais externa dos feixes libero-lenhosos, muito numerosos c nitidamente separados entre si por largos raios medullares: estes feixes são cuneiformes. constituídos Fig. 3 382 Memórias ilo Instituto Butantan — Tomo VIII por um macisso de fibras de paredes muito espessas e de largos vasos geralmen- te isolados, recobertos externamente por um lilxrr molle, um pericyclo lenhoso e antarello. Os feixes da mesma zona não têm todos o mesmo comprimento, devido á disposição excêntrica do eixo da raiz. Esta disposição reproduz-se em cada uma das zonas concêntricas que constituem o cylindro lenhoso; a linha ondeada que os separa uns dos outros é formada de uma camada mais ou menos espessa, de cellulas esclerosas; de estructura semelhante á descripta acima. Esta» camadas esclerosas possuem geralmente um contorno externo, bastante regular; em certos pontos, porém, de sua face interna, a esclerose é mais activa ; ellas formam então prolongamentos cuneiformes. que se encaixam nos raios medul- lares que separam os feixes libero-Ienliosos." ( Pharmacojxna dos E. U. do Bra- sil, R. A. da Silva). Historico: — A Abutua (droga) é conhecida na Europa desde os meiados do século XVII, quando chegaram ao Brasil os missionários portugueses, que delia tiveram conhecimento através de informações de que os aborígenes usa- vam constantemente e para diversos males, inclusive os decorrentes do abuso da alimentação carnívora, a raiz de uma planta conhecida pelos nativos com o nome de “buta” ou "abutua”. Assim puderam os portugueses surprehender aquella planta no uso habitua! pelos aborígenes e, pela semelhança de seus íructos com os da “vinha” ou “videira” ( Vitis vinifera L.), denominaram-na de “Parreira do matto”, “Vinha silvestre” ou “Uva do matto”. Com real interesse e admi- ração, enviarant-na para Lisboa, tendo a noticia de suas propriedades seduzido a muitos, inclusive a Michel Amelot, embaixador de Luis XIV, que presenteou ao rei com uma boa porção dessas afamadas raizes, em 1688, quando de seu re- gresso á França. Amostras dessa raiz também chegaram ás mãos de Tourne- fort. que, em 1694, a presenteou a R. Pomet para estudos. Posteriormente, Luis R. Rouillé. successor de Amelot na embaixada de Lisboa, levou-a novamente 3 Paris, acompanhada de pormenorizada noticia; foi esta a primeira “Memória sobre a raiz de Abutua e suas propriedades medicinaes, embora fantasiadas ao talante do auctor. Alguns annos depois, em 1741, De La Mare, official da marinha, obteve no Brasil nova porção da raiz daquella planta, offerecendo-a á Academia fran- cesa, a qual, por sua vez. a entregou a Geoffroy, professor de medicina e phar- macia no Collegio de França, para estudal-a e emittir parecer. Este, expen* mentando-a. forneceu minucioso e pomposo relatorio. aconselhando-a “nas nto- lestias da bexiga, retenções da urina e suas areias”. Adrien Helvetius, medico das cortes de Luis XIV e de Luis XV, fez, e nl 1703, daquella planta uma verdadeira panacéa, empregando-a nos casos indicados por Geoffroy e muitos outros males, para os quaes era o famoso medico con- sultado; dahi a rapida queda do enorme conceito de que gozava a Abutua, passando em relativo descredito e olvido por alguns annos. 2G \Y. Pf.ckolt — Matéria medica vegetal do Brasil 383 Lochner, de Xuremberg. em 1719 publicou um “Tratado” sobre a pretensa “Parreira brava”, referindo-se a uma planta da África oriental, desenhada em 1675 por Zanoni, e a qual suppunha produzir a famosa droga, Radix parcirac, cuja verdadeira identificação era ainda desconhecida. A Inglaterra, em 1728, chegara também a influencia de tão discutida dro- ga, tendo Brodie procurado introduzil-a na tlierapeutica de seu pais, reajustando suas reaes propriedades e aconselhando-a apenas nas moléstias da bexiga, cys- tites, lithiase vesical, etc. Mais se avolumou a confusão em tomo da “Parreira brava” quando se at- tribuiu a um Cissampelos, conhecido dos portugueses residentes no Brasil, a pro- ducçáo da discutida droga Radix parcirac ou Railix abutvac; essa confusão maior ainda se tomou, quando o sábio botânico Linneu, em 1753, cftou uma nova especie Cissampelos parcirac, para designar a “Parreira brava”, erro que perdu- rou por mais de um século! — Sloane. botânico inglês que receljera de Geoffroy e de Helvetius amos- tras dessa raiz, ainda conservadas no British Museum, entregou-as a Hambury para identificação, pois até então era ignorada a cxacta classificação da verda- deira Abutua ou Parreira brava, ligada ao Cissampelos parcira de Linneu. Nesta occasião, procurando definitivamente desvendar essa questão, Hambury procurou obter de Wilson, director do Jardim Botânico da Jamaica, hastes c raizes e alguns exemplares de Cissampelos originários da Trindade, do Brasil e de Ceylão, verificando então que essas amostras differiam muito da verdadei- ra “Parreira brava”, fornecedora da famosa droga Radix abutuac. Conhecida a origem do Cissampelos, já identificado, restava-lhe saber qual era a planta em apreço, conhecida por Abutua ou Parreira brava legitima, quando em 1859 lhe foram enviadas do Rio de Janeiro, por Theodor Peckoh a seu pedido, amostras completas da verdadeira planta. Parreira brava ou Abutua legitima. Por com- paração com os exemplares existentes no herbário de Sloane no British Museum, aquelle sabio chegou á conclusão de que a Radix parcirac ou Radix abutuac tão discutida e famosa era fornecida pelo Chondrodcndron tomentosum RUIZ & PAV., ou Botryopsis platyphylla MIERS, actualmentc Chondrodcndron platy- phylla (ST. HIL.) MIERS; verificou, igualmente, que outra planta, aliás da mesma familia, era também conhecida pelo nome de Parreira brava, esta per- tencendo ao genero Cissampelos. Hambury, identificando-as, publicou então os elementos para a caracterização da verdadeira Radix abutuac, pondo essim ter- mo á grande confusão reinante entre esta c especics próximas, além de Cissam- pclos parcira L., com a qual era geralmente confundida, por possuir idêntica nomenclatura vulgar, recebida dos portugueses, c, ainda mais, por pertencer á mesma familia botanica. Identificação da droga em relação a fraldes e impcrezas: — A raiz de Abutua legitima é encontrada nas pharmacias e hervanarias do pais, cm pe- daços irregulares, duros, lenhosos, tortuosos, de espessura c dimansões differen- 27 384 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII tes, mas sempre protegidos por uma casca de cór parda, rugosa. com algumas radiceüas pretas e estriadas, tendo face interna lenhosa, de cõr amarellada ou parda, de fractura fibrosa e grosseira, notando-se, pelo corte transversal, dispo- sição regular e concêntrica dos feixes fibro-vasculares em camadas concêntricas, o que caracteriza geralmente o genero Chondrodcndron. Muitas vezes são encontradas como fraudes, juntarrrmte á droga, raizes de plantas differentes, embora de aspecto e côr idêntica, mas que, pelo corte transversal, são desvendadas como falsificação da Radix abutuae. Os elementos citados para a caracterização da droga nos dão para ella uma disposição especial das camadas concêntricas em numero de 5 a 6, sendo a interna, como já vimos, formada por 12 fileiras que se prolongam até o centro, onde são divididas em 2 grupos de 6, para uma camada de tecido parenchymatoso, mais largo do que os demais raios medullares, fileiras essas interrompidas, para o cen- tro, por 2 feixes lenhosos primários, compostos de fibras delgadas com paredes espessas. — Como fraude, encontram-se também algumas vezes, junto ás raizes d3 verdadeira AJbutua, liastes da planta, que variam de tamanho e que á primeira vista se confundam com aquellas; mas, si as examinarmos em um corte trans- versal, veremos apenas 5 a 9 camadas lenhosas e concêntricas, possuindo raros grãos de amido, ao passo que, nas raizes da Abutua legitima, cada camada ou zona é separada por uma orla circular de cellulas esclerenchymatosas, de côr ama- rella, com paredes pontuadas e espessas, notando-se, no meio dessa,» camadas, numerosos grãos arredondados ou ellipticos, ás vezes truncados, constituídos pelo amido. As hastes da planta, que acompanham como fraude a raiz, cons- tituem impurezas da droga, depreciando sua cotação no mercado. Parmacochimica: — A Abutua foi, em 1838, analysada na Alemanha jxdo prof. Wiggers, que de suas raizes isolou um alcaloide que denominou, im- propriamente, de Cissampelina, julgando a planta como Cissampelos pareira I— confundida ao principio com a verdadeira Radix abutuae; mais tarde, porém, foi essa denominação emendada para a de Pelosina, que ainda perdura. Sua determinação atômica C u H Jl NO J e seu peso atomico 3.741,46 foram estabelecidos pelo chimico Bõdiker, que ainda obteve vários saes do alcaloide, taes como o chlorhydralo, o chromato e o sulfato da pelosina. — Flückiger, estudando a pelosina e o processo para obtel-a em estado de pureza, demonstrou que este principio era idêntico á buxina, á berberina c á p a ' ricina; confirmando, assim, a opinião de Walz que, em 1860, já o tinha meneio" nado, embora obtivesse da raiz da Abutua apenas 0,5 ojoo daquelle alcaloide- A pelosina é um alcaloide amorpho que, pela evaporação do soluto ethereo. se deposita sob a forma de um verniz, o qual, pela addição de agua ao ether c consequente evaporação, se separa em pó amorpho, branco, de sabor amargo, pouco solúvel na agua. 28 W. Peckolt — Matéria medica vegetal do fírasil 385 — Seguindo o processo de Wiggers para extracção da pelosina, obtivemos no serviço da Secção de Botanica Medica do Instituto Butantan, com material provindo de Ipiabas, Estado do Rio, esse alcaloide pelo seguinte proceder: redu- zidas a pó grosso, foram as raizes da Abutua exgottadas pela agua fervente aci- dulada com acido sulfurico; os líquidos, reunidos e evaporados á terça parte, fil- trados e tratados pelo carbonato de sodio em soluto concentrado, até não pro- duzirem precipitado. Separado este, lavado em agua destillada e dissolvido em agua acidulada com acido sulfurico, foi agitado com carvão animal, filtrado e precipitado novamente pelo carbonato de sodio; separado pelo filtro, lavado em agua destillada e secco pela evaporação, foi dissolvido em acido acético dilui- do ao terço, precipitado novamente pela sóda; separado, este precipitado foi lavado pela agua destillada c finalmente secco sobre o chloreto de cálcio fundi- do, fornecendo então um pó amorpho, de côr branca, sabor amargo, incompleta- mente solúvel na agua destillada. Esse pó constitue a pelo si va. Pclositia, alcaloide amorpho, é solúvel em 13 partes de ether, cuja dis- solução, evaporada espontaneamente, fornece um verniz, que, pela addição d’a- gua destillada e ether, novamente separado e evaporado, dá um pó amorpho, de côr branca, solúvel em 1.S00 partes dagua fervente c 6.600 partes dagua fria. Solúvel no ether, no sulíureto de carbono, no chloroformio, na acetona c no álcool amylico ; muito pouco solúvel no álcool de 42° c no de 96°C, c na benzina. Seus solutos dão reacção alcalina ao tomasol e alteram-se facilmente em contacto com o ar e o calor. O acido azotico resinifica a pelosina. — Flückiger, \\ illiam. Th. Peckolt e outros chinuoos estudaram c prepara- ram muitos saes de pelosina, os quaes são precipitados pelos reactivos geracs dos alcaloides; a ella attribuiram as seguintes rcacções: "é precipitada de seu so- luto chlorhydrico pelo sal ammoniaco e pelo nitro, c pelo iodureto de potássio ctn soluto muito diluido. Destillada com potassa caustica, fornece methylatnma, diniethylamina e uma base analoga ao pyrol." (Thcodor Peckolt e G. Peckolt, Hist. PI. Med. Ut. Bras. 188S). Obtivemos o cMorhydrato dc pelosina, tratando o alcaloide obtido pelo acido chlorhydrico, em soluto aquoso; o resultado forneceu um precipitado de côr '•rança, amorpho, que se mostrou completamentc solúvel na agua, de sabor amar- go. inodoro, constituindo o chlorhydraio de pelosina. Os chimicos Thcodor e Gustavo Peckolt, analysando os íruetos da Abutua ^gitima, encontraram : Um fnicto de tamanho regular pesava em media 3,945 gms., dos quaes 2,832 guis. para a polpa e as cascas e 1,113 para as sementes. Em 100 gms. da polpa fresca obtiveram: Agua 84,583; substancia gordurosa 0.308; matéria corante 2.273; glycose '1.430 ; acido tartarico 0.357 ; acido malico. pectina, substancias gommosas, etc. *•331; substancias albuminoides 1,013 e saes inorgânicos 1,480. Pela analysc a rima, verifica-se que a composição dessa polpa se approxima da da uva ( Vitis 29 38G Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII vinifcra ) e é passível de melhorar bastante, ganhando em glycose, pela cultura, ao ponto de se tornar fructo de regalo, como sóe acontecer a muitos outros ; é, pois, muito razoa vel a sua denominação de Uva do matto ou Parreira brava. As sementes, igualmente analysadas pelos referidos chimicos, revelaram em 100 gms. : agua 53,004; oleo gorduroso 5,073; àbutuina ou pelosina 0,530; acido botryopsis-tannico 0,914; amido 11,491; substancia amarga e matéria extractiva 0,913; matéria saccharina 0,814; substancias albuminoides 1,554; substancias gommosas, etc. 3,909; saes inorgânicos 1,8S0. A resina molle é de còr amarel- la, inodora e sem sabor; o oleo gorduroso é de còr parda, inodoro e de sabor particular. A abutuina ou pelosina foi obtida exgottando-se as sementes pelo álcool d< 40°C, acidulado com acido acético, reunidos os liquidos alcoolicos e destillados. O residuo foi exgottado pela agua fervente, e filtrado; o soluto aquoso resultan- te, precipitado pela soda caustica liquida, e o precipitado, dissolvido no acido acé- tico diluido, depois novamente precipitado pela soda caustica, separado, lavado» seccado e dissolvido no sulíureto de carbono, que, pela evaporação, forneceu áquelles chimicos a abutuina (Theodor e Gustavo Peckolt, Hist. Pl. Med. Ut. Bras. 1888). Esses fruetos fornecem matéria corante carmezim mui linda, a qual pode- ria ser utilizada para coloração de doces, balas e confeitos, como substituta do» corantes syntheticos tão empregados para esse fim e quasi sempre nocivos. Propriedades e indicações thesapeüticas : — Tonico amargo, estoma- chioo, empregado nos embaraços gástricos e na hypopepsia. A Abutua é um amargo isento de adstringência e de propriedades excitantes; tonifica o estomago sem exercer acção particular sobre o pulso e a circulação; é o succedaneo brasi- leiro da Calumba, aliás da mesma íamilia. A pelosina, alcaloide da raiz da Abutua legitima, foi em 1857 experimenta- da na Italia, por Vitali, que aí firmou ter obtido grande successo de seu emprego como succedaneo da quinina, no tratamento do impaludismo. Mazzolini rela- tou observações de Tibaldi, Buzzini, Albani e outros, que o experimentaram cm dose de 1,20 a 1,50 gms. em 3 ou 6 vezes nas 24 horas, durante a apyrexia, ein cerca de 310 casos de febres malaricas, allegando ter alcançado curas rapidas em 235 pacientes ou seja a proporção de 75 % dos casos tratados. Xo Brasil, a raiz de Abutua legitima, embora considerada bom tonico amar- go, diurético, emmenagogo e febrífugo, é pouco usada em a nossa matéria me- dica; no entanto, é muito reputada na medicina empirica, entre os naturaes do país. Tem sido ur-ada como lithotriptieo na lithiase vesical e como cmnienagog 0 nas insufíiciencias ovaricas; algumas vezes mesmo =cus resultados se têm mos- trado satisfactorios, como oxytocico, por favorecer a expulsão placentaria, apo* retenções demoradas. Em doses elevadas produz vomitos e pode intoxicar. 30 \V. Peckolt — Matéria medica vegetal do Brasil 387 E’ prescripto nas diarrhéas, dyspepsias hypochlorhvdricas ou hypopepticas, nas cólicas gastricas acompanhadas de flatulência, e nos casos em que a diges- tão se processa irTegularmente, ou, quando a assimilação estiver embaraçada, por ser a Abutua um tonico da funcçáo digestiva, augmentando ligeira e mode- radamente a secreção dos suecos gástrico, pancreatico c biliar. Indicada vanta- josamente no catarrho gástrico e nas dyspepsias atônicas acompanhadas de inap- petencia, que de certo modo beneficia, despertando o appetite, mormente nas dyspepsias dos nervosos e em algumas toxicoses intestinaes. Pharmacologia e emprego officixal: — A Abutua legitima é conside- rada um amargo puro e como tal usada em tinctura a 1 :5, cxtracto hydro-alcoo- lico, cxtracto aquoso ou cxtracto fluido, pó, infuso e cozimento. tA tinctura das raizes dc Abutua legitima, na dose de 15 a 20 gottas por vez, e 1 a 10 gms. nas 24 horas. O cxtracto alcoolico das raizes dc Abutua legitima na dose de 0,05 a 0,10 cgms. p. vez e 0,20 a 1 gm. nas 24 horas. O cxtracto fluido das raizes dc Abutua legitima, na dose de 0,50 a 2 gms. p. vez e de 2 a 14 gms. nas 24 horas. O pó das raizes da Abutua legitima na dose de 0,50 a 2 gms. p. vez, c de 3 a 4 gms. nas 24 horas. O infuso das raizes da Abutua a 30 "j 00 depois de maceração por 12 ho- ras, na dose de 50 gms. p. vez, e de 200 a 300 gms. nas 24 horas. O cozimento das raizes da Abutua a 50/1500 aos cálices, 3 c 4 vezes no dia, como diurético e lithotriptico. Succedaxeos: — A raiz de Abutua pode substituir nas mesmas doses c usos a Calumba ou Colombo : ( Cocculus palmatus D. C. ou Jatrorrhiza palmata MIERS, Mcnispcrmuceac) planta exótica originaria da África c pertencente, aliás, á mesma familia c como ella considerada entre os "amargos puros não ads- tringentes”, dos quaes fazem parte o colombo, a genciana, a quassia e o condu- rango. Usos accessorios: — Os fruetos da Abutua legitima poderiam pela cultura rivalizar com os da Parreira ou Videira (Pi/ã vinifera L.) e constituir artigo de commercio no pais, pois se conservam durante muitos meses e, alem de serem aproveitáveis como fruetos de regalo, fornecem matéria corante cannezim de linda cór, própria para tingir xaropes, doces, balas e liquidos alcoolizados : licores e elixires. (Trabalho* da Sccçio dc Botanica Medica do Instituto ITufan- tan. apresentado» cm setembro dc 1934. Dados á publici- dade cm dexembro dc 1954.) 3L 598.126, SERPENTES VENENOSAS OCCORRENTES EM COSTA RICA I. Sobre a especie Bothrops lansbergii e formas affins. Seu veneno e microomamentos epidérmicos. POR CLODOMIRO PICADO Xosso illustre mestre, dr. Afranio do Amaral, director do Instituto Butan- tan, em uma revisão publicada alhures (1), logrou felizmente desmembrar o grupo da B. lansbergii cm 3 especies: B. lansbergii, B. nasuta e B. ophryomc- gas, cuja heterogeneidade havia sido recentemente discutida por E. R. Dunn (2). Durante vários annos só recebémos em Costa Rica indivíduos que deviam separar-se nitidamente em duas especies. Xo artigo anterior por nós publicado (3) as microphotographias 6 e 5 correspondiam, respectivamente, á B. nasuta e á B. lansbergii, esta conhecida por nós havia algum tempo e sobre cuja posição especifica reinava cm nosso espirito alguma duvida, embora estivessemos certo de ser ella differente de B. nasuta, conforme expusemos em nossa publicação “Serpientes Venenosas de Costa Rica”, editada pela Secretaria de Saude Publi- ca de Costa Rica, cm 1931. Foi somente em fins de 1931 que tivemos opportunidade de observar juntas e vivas (Figs. 1-3) as tres especies que A. do Amaral distinguiu entre si no re- ferido grupo. Essas especies acham-se representadas na annexa Estampa, cm que se vêem: 1. B. nasuta, nascida no laboratorio, com 5 annos de idade, sendo a ultima sobrevivente de uma parição de 18 jovens que se entredevoraram. Esta mordeu em nosso laboratorio a dois empregados que haviam confiado em sua lerdeza, verdadeiramente falsa, porque é uma das poucas serpentes que podem saltar. Manteve-se devorando exemplares de lagartos do genero Anolis (2 a 3 por se- mana) e seu veneno não mostrou differenças resultantes do regime alimentar. Podemo-nos, pois, referir á representante desta especie que apparece na Fig. 1 como a "uma velha conhecida”. 3 392 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII 2. B. ophryomegas. Em um desmonte levado a cabo em “El Coyolar” (vertente do Pacifico), foram mortos, em poucos dias, 180 exemplares. Foraffl collocados em uma caixa cerca de 12, que recebi ha alguns meses. Separei-os em grupos de 6, guardando cada grupo em pequenas caixas teladas, onde vivem em boa harmonia, amontoando-se uns sobre os outros sem que jamais se moles- tem, embora se mostrem bastante aggressivos quando retirados da jaula para ali- mentação forçada por meio de carne de boi. O maior dos exemplares media 72 centímetros e produziu 67 milligrammas de veneno secco, o que representa a quantidade maxima obtida na especie. Parece não haver duvida alguma sobre a homogeneidade de seus representantes, os quaes correspondem ao que havia- mos chamado, em publicações anteriores, de Bothrops lansbcrgii, nome que, to- davia, segundo a revisão de Amaral, que deve ser acceita, convém ser substituído por B. ophryomegas (Fig. 2). 3. B. lansbcrgii. Recebemos, ha algumas semanas, 2 exemplares prove- nientes de “Chitaría” (vertente do Atlântico), cujo “focinho” voltado para cima recordava a “Tamagá”, mas cujo corpo, coberto de escamas pouco finas, assemelha-se ao de uma Bothrops numinifera. Estes exemplares correspondem á B. lansbcrgii de Amaral (Fig. 3). .Pelo estudo comparativo dos venenos das tres especites, verificámos, con- tra toda expectativa, que o veneno de B. lansbcrgii é semelhante ao de B. ophryo- megas e totalmente diíferente do de B. nasuta. O que se poderia esperar, si se confiasse apenas no "porte” das serpentes, seria a semelhança entre B. lansbcrgii e B. nasuta. O quadro annexo resume os característicos de seus respectivos venenos: Bothrops nasuta Bothrops ophryomegas Bothrops lansbcrgii MJnima mortal para coelho, por via ve- nosa 1 mm. por Kg. Coagulação de sangue Abrevia a coagula- normal de coelho 2,5 mm. por Kg. Impede a coagulação ção (O.lcc. a l°/oo cm 8 horas. Coagu- por cc. de sangue). la em 24 (Guardado na geladeira). 2.5 mm. por Kg. Impede a coagulação em 8 horas. Coaguk em 24 (Guardado n 3 geladeira). Agglutinação de he- matias de coelho Ligeira agglutinação Hcmolyse de hema- tias de coelho Ligeira hcmolyse em 7 horas Ligeira hcmolyse em 7 horas Ligeira hemolyse e*° 7 horas Hemolyse de hema- tias humanas Digestão de gelatina timolada 1 hora 5 1/2 horas. 5 1/2 horas. 4 C. Picado — Serpentes venenosas occorrenles em Costa Rica 303 De referencia aos microomamentos epidérmicos, nota-se na Estampa que, enquanto em B. nasuta occorre um desenho comparável a cellulas finas com pa- redes delgadas, em B. ophryomegas o desenho recorda tecidos vegetaes de cel- lulas alargadas com paredes grossas, e B. lansbcrgii apresenta cellulas desenhadas regularmente como as de B. nasuta, mas cujas paredes são tão grossas como as de B. ophryomegas (Figs. 3 A, 3B, 3C). Aproveitamos a opportunidade para agradecer ao dr. Rotter a execução das microphotographias annexas e ao dr. A. do Amaral a gentil versão deste artigo para o português. RESUMO O estudo de uma serie de exemplares vivos de serpentes do grupo da Bo- throps lansbcrgii confirmou as verificações de A. do Amaral sobre a separação das tres especies Bothrops lansbcrgii (Schlegel), Bothrops ophryomegas Bocourt, Bothrops nasuta Bocourt. Na pesquisa de certas de suas propriedades biochimicas, o veneno de B. lansbcrgii revelou-se semelhante ao de B. ophryomegas, parecendo estes dois to- talmente differentes do de B. nasuta; todavia, a observação dos caracteres dos microomamentos epidérmicos revelou differenças comparáveis ás assignaladas por A. do Amaral na morphologia geral dessas tres especies. ABSTRACT The study oi a series of live specimcns oí serpents of the Bothrops lans- bergii group confirmed A. do Amaral’s revision on the differentiation of the following species: Bothrops lansbcrgii (Schlegel), Bothrops ophryomegas Bo- court, Bothrops nasuta Bocourt. On the examination of certain of its biochemical properties the poison of B. lansbcrgii proved to be similar to that of B. ophryomegas, both of thesc venoms being entirelv differcnt from that of B. nasuta; however, the observat- ion of the characters of the epidermal microomaments of the se snakes brought to light differences comparable to those found by A. do Amaral in the general morphology of the three specics envolved. BIBLIOGRAPHIA 1. Amaral. A. do — Studies oí Neotropical Ophidia XII. On the Bothrops lansbcrgii group — Buli. Antivenin Inst. America III(l) :19-27. 1929. 2. Dunn, E. R. — Notes on Bothrops lansbcrgii and B. ophryomegas — Buli. Antivenin Inst. America 11(2) :29-30. 1928. 3. Picado. C. — Epidermal microomaments oí the Crotalinac — Buli. Antivenin Inst. Ame- rica IV(4) :104. 1930. 5 SERPENTES VENENOSAS OCCORRENTES EM COSTA RICA II. Sobre a especie Bothrops godmanni. Seu veneno e microornamentos epidérmicos. POR CLODOMIRO PICADO A especie Bothrops godmanni (Günther) não fòra até agora assignalada em Costa Rica, mas apenas em certas regiões de Guatemala e de Honduras, a julgar pelas publicações herpetologicas por nós consultadas. Ha alguns annos, vimos recebendo serpentes de quasi todos os districtos costa-riccnses c nunca havíamos visto aquella especie, nem suspeitavamos, mesmo remotamente, de sua existência no país. Todavia, a partir de 1933, começámos a receber exemplares vivos dessa especie, bem como a ver indivíduos por ella mordidos, que nos procuravam para tratamento no laboratorio de que somos director. Assim é que ultimamente tivemos ensejo de observar 4 casos de picada por Bothrops godmanni, nos quaes injcctámos, com optimo resultado, antivenenos do Instituto Butantan. Xesses indivíduos picados verificámos pouco intensa reacção local e ausência de hemorrhagias á distancia, de paralysia e cegueira; todavia, a origem do envenenamento foi confirmada, porque, em um dos casos da mesma symptomatologia, tivemos o feliz e insolito ensejo de examinar a ser- pente, que fòra morta logo depois de ter produzido o accidcnte. Conforme veremos, a pequena gravidade desses casos de picada por B. god- manni não é devida á pouca toxicidade do seu veneno, mas sim á quantidade exigua delle secretada. Dados geraes sobre B. godmanni. Todos os exemplares por nós examinados provinham de districtos altos (de 1700 a 2400 metros sobre o nivel do mar) e distantes cerca de 15 a 30 km. e ao N. E. desta capital, de San José. Alguns delles provinham dos arredores de 396 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII uma localidade onde se acha installado nosso sanatorio para tuberculosos, loca- lidade essa bastante visitada ha já alguns annos e em que até agora não se sus- peitara da existência de serpentes venenosas. O brusco apparecimento de numerosos exemplares desta especie em taes districtos tem coincidido com o augmento. verificado nelles, da especie dendri- cola do planalto, Bothrops nigroviridis. Desta especie quasi todos os exempla- res, capturados ultimamente em pontos vizinhos á capital e antes pobres em ophi- dios solenoglyphos, são jovens, o que parece corresponder a um phenomeno de migração recente e eventual concentração de tal especie nessa zona. Xo caso dessa especie (B. nigroviridis) acreditamos que se possa eliminar a hypothese de ter occorrido uma excessiva multiplicação nesse local, porquanto ella só pro- duz cerca de 5 filhos de cada vez e, portanto, sua multiplicação, sendo lenta, não poderia ter passado despercebida durante vários annos em localidades, como essas, quasi todas cultivadas. Igualmente podemos pensar que tal phenomeno tenha occorrido em relação á especie B. godmanni, de que a Fig. 4 representa um adulto em atitude cara- cterística e a Fig. 5 reproduz os microornamentos epidérmicos. Tamanho máximo observado em B. godmanni: 660 mm.. Caracteres do veneno de B. godmanni. Quantidade maxima secretada: 23 mgs.. Côr: amarclla clara, cm estado secco. Toxicidade: A) in vivo. — DML para o coelho = 0,5 mg por kilo. •A morte succede a symptomas de asphyxia, convulsões e paralysia das patas P° s * teriores; trepidação dos musculos abdominaes durante 4 minutos. Metade dessa dose não produz taes symptomas. A acção local é muito energica; dose de 0,1 mg em 1 cc., inoculada por v^ 3 hypodermica em cobaia, produz, em 11/2 hora, grande edema, pouca hcmorrha- gia c destruição da pelle, conforme se observa também com o veneno da casca- vel costa-ricense (C. terrificus durissus). B) in vitro. — Digestão da gelatina — completa em 1 hora. Agglutinação de hematias de homem e de coelho — nitida (mais intensa com as de coelho, conforme se dá com veneno de Lachcsis mula). Coagulação do sangue citratado do coelho — até 1 :16.000 em 15 minuto», cm forte concentração (1:1000), o sangue coagula em 30 segundos. Lyse de hematias de homem e de coelho — ligeira e em 6 horas (um pouco mais intensa com as de coelho). 8 C. Picado — Serpentes venenosas occorrentes em Costa Rica 397 — Servimo-nos deste ensejo para exprimir nossa gratidão: ao dr. Afranio do Amaral, pela verificação da determinação especifica de B. godtnanni, bem como pela versão deste artigo para o português e sua inclusão nas Memórias do Instituto Butantan ; ao dr. \\ . Rotter, pelo cuidadoso trabalho photomicrogra- phico. (Trabalhos dc collaboração do Laboratorio do Hospital de San Jos*, Costa Rica, recebidos para publicação, respectiva- mente, cm dezembro de 1903 e agosto de 1934 e dados á publicidade em dezembro de 1904). 9 Picado Bothrops /ansbergii e formos affins Mom. Inst. Butantan Vol. VIU, 1933-1934 A*5>ícto cerni de: r.aiula. Tif. 2 -- II. ophryomrcx. Fif. 2 — B. UnnhfrKii. 1 A 2 A Microorn*m«*nto* epidérmico* d*: 3 A Fi*. IA — B. nauta. Fig. 2 A B. ophf?omrcn«. Fif. 3 A — B. laruherKÍi. C. Picado — Boi hr o ps godmanni Mem. Inst. BuUntan Vol. VIII, 1933-1934 ri C. 4 Bothrop, godmanni. cm altitude caraeteriatica. FU.*. S Microorna mento* ep dermin» de B. godmanni. TRES ARANHAS NOVAS NAS COLLECÇÕES DO INSTITUTO BUTANTAN POR C. de MELLO LEITÃO 395 . 44:931 TRES ARANHAS NOVAS NAS COLLECÇÕES DO INSTITUTO BUTANTAN POR C. DE MELLO LEITÃO Em material que me foi enviado para estudo pelo illustre director do Ins- tituto Butantan. encontrei dois novos generos e tres especies novas, que passo a descrever : Fam. BARYCHELIDAE Androthelopsis, g. n. Olhos anteriores em fila íortemente procurva, os médios bem maiores e mais afastados entre si do que dos latcraes. Olhos posteriores em fila quasi direita, os médios menores, pontudos adiante, subcontiguos aos olhos médios anteriores e dos lateraes posteriores. Olhos lateraes iguaes. Ccphalothoracc baixo, de fovea thoracica transversa. Comoro ocular cerca de duas vezes mais largo do que longo. Escopulas tarsacs anteriores inteiras; posteriores, divididas por estreita faixa de cerdas. Protarsos I e II com escopulas no terço apicilar; III e IV, sem escopulas. Tibias anteriores do macho sem apophyse apicilar; os protarsos levemente dobradas na base. Tarso dos palpos do macho bilo- bado; bulbo de inserção basilar, abruptamente afilado na ponta. Sigillas es- temaes lineares, quasi obsoletas. Cheliccrios com rastello forte, de numero- sos espinhos; margens do sulco ungueal inermes. Peça labial trapezoide, muito mais larga do que longa, com uma fila apicilar de pequeninas cúspides. Ancas dos palpos com pequena area cuspulosa. Só duas fiandeiras, de segmento api- cilar globuloso, muito menor do que o segmento intermediário. Tubérculo anal cônica, muito conspícuo. Todas as patas com espinhos. Unhas denteadas, maiores do que os fascículos de sustentação. Este genero, o terceiro genero sul-americano de Diplothclinae, é muito affim a Diplothclopsis Tullgren, do qual se distingue pela armadura da peça labial, forma da fovea thoracica e forma singular do bulbo do palpo do macho. Typo: cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 102 Memórias do Instituto Liutantan — Tomo VIII i Androthelopsis Androthelopsis sinçularis. K*n. n., *p. n. ( £ ) singularis, sp. n. Fík.2 Androthelopsis singularis. gtn. ru »p. n. ( Palpo tio ^ ) cf — 20 mm.. Cephalothorace : 1 1 X 8,5 mm.. Abdome : 9 X 4,5 mm.. Patas Fêmur Patella Tibia Protarso Tarso Total em mm. I 7.5 4.5 5 6.5 4 27.5 II 7.5 4 5 6 4 26.5 III 7 3.5 5 7 4.5 27 IV 9 4 6 9,5 5 33.5 Cephalothorace baixo, cerca de um quarto mais longo do que largo, de fos- seta thoracica profunda, transversal, direita. Comoro oailar quasi duas vezes mais largo do que longo. Olhos anteriores em fila fortemente procurva, os mé- dios bem maiores, separados um do outro cerca de um diâmetro e subcontiguos aos lateraes. Olhos posteriores em fila quasi direita, os médios muito menores, pontudos adiante, subcontiguos aos lateraes e aos médios anteriores, na ponta quasi tangenciando a borda externa destes últimos. Olhos lateraes anteriores e posteriores iguaes. Chelicerios com forte rastello negro, de numerosos espinhos. 4 C. de .Mello Leitão — Aranhas novas do Instituto Butantan 403 settiformes fortes. Margens do sulco ungueal inermes. Peça labial trapezoide, duas vezes mais larga do que longa, com uma fila apicilar de cinco cúspides ; ancas dos palpos com algumas cúspides angulares. Todas as patas com robustos espinhos: tibias I e II com um verticillo apicilar; protarsos I com 1-1 inferiores, robustos, em pequenos tubérculos na metade basilar, 1-1 lateraes e 1 dorsal, e levemente anguloso na base. Escopulas dos tarsos I e II inteiras; dos tar- sos III e IV divididas por estreita faixa de cerdas; protarsos I e II com esco- pulas na metade apicilar; III e IV sem escopulas. Unhas denteadas, tão longas como os fascículos de sustentação. Segmento basilar das fiandeiras vez e meia mais longo do que o segundo, e este 3 vezes maior do que o apicilar, que é sub- globuloso. Tarso dos palpos bilobado, o bulbo de inserção basilar, piriforme, com es- tylete pontudo, apicilar, na porção abruptamente estreitada. Colorido geral negro, os tegumentos revestidos de pelos cervinos, sendo as escopulas tarsaes pardo-acinzentadas. Habitat: Villa Bom fim, S. Paulo, Brasil. Typo: N* 15, na collecção do Instituto Butantan. Psalistopoides, g. n. Cephalothorace pouco mais longo do que largo, de fos cta thoracica pro- curva. Comoro ocular quasi circular, pouco mais largo do que longo, muito alto. Olhos anteriores iguaes. em fila fortemente procurva, os médios um pouco mais afastados entre si do que dos lateraes. Olhos posteriores cm fila íortemente recurva, os médios muito menores do que os lateraes e contíguos a estes. Olhos lateraes iguaes. Peça labial bem mais larga do que longa, com uma fila de cúspides apicilares. Sigillas estcrnaes conspícuas, as posteriores cl- lipticas e separadas da margem mais de um diâmetro, as outras marginacs. Chc- licerios com rastello fraco, de espinhos settiformes pouco abundantes. Escopu- las dos tarsos anteriores inteiras, as posteriores divididas por larga faixa de cer- das. Quatro fiandeiras; as superiores robustas, de segmento apicilar pouco me- nor do que o intermédio. Tibias anteriores do macho sem apophyse apicilar Typo: cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 404 Memórias do Instituto Butantan Tomo VIII Psalistopoides fulvimanus, n. Fifc- 3 1‘ialiiíopoidn fuh imanut, (tcn. «l». n. (cí) n*. 4 /'salistofoijfs fulvimanti «, gen. n-, *p n. (Palpo cio ç* ) £ — 24 mm.. Cephalothorace : 12X10 mm.. Abdome: 12X6 mm.. Patas Femur Patella Tibia Protarso Tarso Total cm mm. I 9 5 8.5 8.5 6 37 II 9 4.5 8 8.5 6 36 III 8 4 6.5 9 6 33.5 IV 11 5 10 12 7 45 Cephalothorace baixo, um sexto mais longo do que largo, de fosseta tho* racka pouco procurva. Comoro ocular alto, pouco mais largo do que longo- Olhos anteriores iguaes, em fila fortemente procurva, os médios separados entre si mais de meio diâmetro e a menos de meio diâmetro dos lateraes. Olhos po»' teriores em linha fortemente recurva, os médios tres vezes menores do que os la- teraes, aos quaes são contíguo- e separados entre si mais de quatro diâmetros. G SciELCVo 2 3 5 6 11 12 13 14 15 16 L cm 406 Memórias do Instituio Butanlan Tomo VIII lateraes iguaes, a peça labial com uma fila regular de cúspides e o segmento apicilar das fiandeiras menor do que o segundo. Distingue-se de Psalistops, por ter os olhos lateraes iguaes e a escopulas tarsaes anteriores integras. De ambos differe pela ausência de apophyse apicilar nas tibias anteriores do macho. 9 — 17 mm.. Abdome: S X 4 mm.. Patas Fenuir Pateüa Tibia Protarso Tarso Total em mm. I 8 2 6 5.5 3.5 25 II 8 3 5.5 6 3. 25.5 III 6 5 2.5 4,5 5.5 3 22 IV 8 3 7 9 3.5 30.5 Cephalothorace pouco elevado, bem mais longo do que largo, lados da re- gião thoracica arredondados, a região cephalica rectangular. Olhos anteriores em fila procurva, os médios duas vezes menores, contiguos, separados dos lateraes mais de um diâmetro. Olhos posteriores formando um trapézio mais largo do que alto, de base posterior, e obliquo. Area dos olhos médios mais larga do que alta, os olhos posteriores tres vezes o tamanho dos anteriores. Gypeu mais baixo do que os olhos lateraes anteriores. Sulco thoracico longo e profundo. Margem inferior do sulco ungueal dos chelicerios com quatro dentes fortes, iguaes, equidistantes. Pernas I e II com os femures com tres filas dorsaes de espinhos fracos; patellas com um espinho apicilar; tibias com 2-2-2 espinhos in- feriores, os últimos menores, e com um tufo de pelos na metade apicilar inferior; protarsos com tres verticillos de espinhos e densa escopula na metade apicilar; tarsos densamente escopulados. Pernas III e IV com espinhos mais robustos, só os tarsos com escopulas. Abdome estreito, pontudo atras. Peça labial mais longa do que larga, ultrapassando o meio das laminas, dilatada e chanfrada adiante; laminas dilatadas adiante, exeavadas externamente. Esterno quasi cir- cular, com abundantes cerdas. Fiandeiras posteriores mais longas c mais del- gadas do que as anteriores, de segmento apicilar oval. Tegumentos do cephalothorace côr de mogno, a região ocular fulvo-negra, revestidos de pelos plumosos brancos marginaes, e com uma linha mediana clara que se bifurca atrás do sulco thoracico, dirigindo-se para diante em estreito V, em cujo intervallo ha outra estreita linha mediana, que não chega ao sulco e vai até quasi os olhos posteriores. Chelicerios fulvo-escuros, ennegrecendo para o apice. Esterno amarello com um triângulo fulvo; ancas amarellas; peça labia e laminas pardo-amarelladas. Abdome pardo-claro uniforme; o ventre pardo. Patas I e II do mesmo colorido do cephalothorace, mas os femures com uma faixa negra anterior, as tibias com largo anel negro no terço apicilar; protarsos com os dois terços apicilares negros; os tarsos de face dorsal fulva e escopulas 8 SciELO^o 2 3 5 6 11 12 13 14 15 16 L cm SciELCVo 2 3 5 6 11 12 13 14 15 16 L cm 410 Memórias do Instituto Butantnn — Tomo VIII Borda anterior granulosa. Cepralothorace com granulações esparsas. Como- ro ocular com um tubérculo mediano, maior na femea. Areas I a IV inermes, com poucas granulações irregularmente es- parsas; areas I e IV divididas por um sulco longitudinal mediano. Areas lateraes, area V e tergitos livres com uma fila de grânulos, os tergitos II e III com um tubérculo mediano. Operculo anal granuloso. Esternitos livres, area estigmatica e ancas IV lisos; ancas III e I com uma fila de granulações setti feras. Palpos: trochanter com um espinho apicilar inferior; femur com um espinho basilar in- ferior e um espinho maior, apicilar interno; patella inerme: tibia com 4 espinhos internos e tres externos e tarsos com tres de cada lado. Femures da femea direitos. Tarsos de 7-13- 10-11 segmentos. Patas posteriores do macho: anca muito saliente, com algumas granulações (sendo as da face posterior bem maiores e pontudas) e com uma apophyse apicilar externa curta e recurva ; trochanter mais longo do que largo, com dois espinhos dorsaes (o apicilar bem maior do que o basilar), um espinho apicilar interno c robustíssima apophyse apicilar in- terna. recurva para dentro; femur granuloso, levemente sinuoso no apice, onde ha alguns fík- i - Afnmiu» amanii, dentes um pouco maiores. * n " ,p ' ( - ) Colorido geral castanho-queimado uniforme, de palpos e patas I a III amarcllos. Habitat: Japyra. Paraná, Brasil. Colleccionador : Estanislau Petruski. Typo: Xo. 6 na colleção do Instituto Butantan. \ T ota: .Dedicados o genero e a especie ao dr. Aíranio do Amaral, director do Instituto Butantan. Genero Japyra, g. n. Comoro ocular com um espinho mediano. Areas I, II, IV e V do escudo dorsal, tergitos livres I e II e operculo anal, inermes. Area III do escudo dorsal com dois espinhos medianos e tergito livre III com um espinho. Femur dos palpos inerme. Tarsos I. III e IV de seis segmentos, II de mais de seis. Genero muito proximo de Mctcusarcoidcs e Itaoca M. L., distinguindo-se 4 C. de Mei.lo Leitão — Gonyleptidae do Instituto Tiutanlun 411 do primeiro, por ter dois espinhos, em vez de tubérculos na area III, e de Itaoca, por ter um só espinho mediano (em vez de dois) no coinoro ocular, e de ambos, por ter o fêmur dos palpos inerme. Typo: Japyra regularis, sp. n. (Fig. 2) Macho — 6 mm.. Patas: 12,5-20-12,5-17 mm.. Femures: 4-Ó-4-5 mm.. Borda anterior lisa, sinuosa. Comoro ocular granuloso, com um espinho mediano. Cephalothorace liso, com dois grânulos atrás do comoro ocular. Area I do escudo dorsal com dois grânulos de cada lado do sulco mediano; area II com uma fila de pequenos grânulos e mais dois medianos; area III com uma fila de pe- quenos grânulos c dois espinhos curvos - ‘ ' j )ara trás. Áreas lateraes com duas filas de grânulos. Araeas IV e V, tergitos e estemitos livres com uma fila de granu- lações, o tergito III com um espinho me- diano. Operculo anal granuloso. Ancas IV e area estigmatica muito granulosas; ancas I a III com uma fila de granu- lações. Palpos: trochanter com duas granula- ções inferiores; femur com uma fila in- ferior de granulações ; patclla inerme c lisa ; tibia c tarso com tres espinhos de cada lado. Tarsos I, III c IV de seis segtnen- ^ tos; II de nove. Todos os femures di- X: reitos. Fiit. 2 — Japyn regaiuu. g. «, »p. n. ( <4) p a tas IV do macho: anca granulosa, com robusta apophyse apicilar externa, muito obliqua e de ramo inferior, e com outra apophyse, apicilar interna; trochanter pouco mais longo do que largo, com dois espinhos internos; femur robusto, com um espinho basilar dorsal, ro- busto, recurvo, e com uma fila de espinhos menores, de cada lado, no terço apicilar ; patella granulosa, com tres espinhos apicilares ; tibia granulosa. Colorido geral amarcllo-queimado, de cephalo-thorace mais escuro; espinhos da area III e apophyses das ancas posteriores, negros; apophyses dos femures e patelias posteriores castanho-negros. Habitat: Japyra, Paraná, Brasil. Colleccionador : Estanislau Petruski. Typo: Xo. 7 na collecção do Instituto Butantan. 5 f: & 9 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 412 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII Subiam. GONYLEPTINAE Genero Leitaoius ROEWER. 1930 Leitaoius ornatus, sp. n. (Fig. 3) Macho — 9 mm.. .Patas: 40-95-63-83 mm.. Fêmures: 11-30-19-25 mm. Borda anterior inerme e lisa. Comoro ocular liso, com dois altos tubér- culos bem separados. Cephalo-thorace com algumas granulações esparsas. Áreas I e II inermes, com alguns grânulos; porções da area I muito separadas pelo nmlnnrrnrrv^ntn nnfprinr rln arM TT Arpa 5 0 1 * ) i » iCUIUiCd UltCUOS. 1U1ÍU5 cuul ( - ) 11-20-12-14 segmntos. Patas IV do macho: anca pouco granulosa, com pequena apophyse apicilar externa; trochanter pouco mais longo do que largo, granuloso, com pequena apo- 6 C. de Mello Leitão — Gonyleptiilac do Instituto Butantan 413 SciELO physe apicilar dorsal; fêmur com duas filas de dentes ponteagudos na metade basilar. Femur III com uma fila de dentes semelhantes nos dois terços apicilares. Dorso castanho- oüvaceo, lavado de fusco, com os sulcos esbranquiçados e um Y branco ou amarello no cephalo-thorace. extendendo-se dos tubérculos do como ocular ao sulco 0; patas olivaceas, de patellas mais escuras; femures IV com a metade basilar negra. Habitat: S. Paulo (?). Typo: Xo. 8 na oollecção do Instituto Butantan, sem procedência. Leitaoius guttulatus, sp. n. (Fig. 4) Macho — 10 mm.. Patas: 39-81-56-72,5 mm.. Femures: 11,5-23-18-21,5 mm.. Femea — 9 mm.. Patas: 35-74-50-70 mm.. Femures: 10-21-16-20 mm.. Femea — Borda anterior inerme e lisa. Comoro ocular liso, com dois tubér- culos muito pequenos. Cephalo-thorace com duas grossas granula- ções atrás do comoro ocular. Areas I a IV com algumas granula- ções esparsas; na arca III dois espinhos erc- ctos. Areis lateraes com uma fila media de granulações. Arca IV e tergitos livres com uma fila de poucos grâ- nulos c um espinho nos ângulos posteriores. Es- ternitos livres com uma fila de granulações me- nores. Arca estigmati- ca e ancas IV com ra- ras granulações setti fe- ras; ancas I a III com uma fila de grânulos. Palpos: trochanter com dois fracos espinhos ; Fig. j — Lriuoíut guttuUtu*, »p. n. ( 3 *) íemur com uma fila de 7 414 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII espinhos inferiores e robusto espinho apicilar interno; patella inerme: tibia com 4 espinhos internos e 5 externos; tarso com 3 internos e 4 externos. Todo os femures direitos. Tarsos de 9-19-10-10 segmentos. Região cephalo-thoracica quasi negra; escudo dorsal castanho, com manchas circulares em torno das gra- nulações, e com os espinhos negros; patas castanhas de articulações mais claras. Macho — Espinhos da area III do escudo dorsal e espinhos angulares da area IV e dos tergitos livres, bem menores. Operculo anal com pequenino cone. Tarsos de 10-21-12-12 segmentos. Femures III com uma serrilha de pequenos espinhos anteriores no terço apicilar. Patas IV: anca granulosa, com robusta apophyse apicilar externa, quasi transversal e curta apophyse apicilar interna, dirigida para trás ; trochanter muito robusto, mais longo do que largo, com uma apophyse basilar erecta. um espinho apicilar interno e outro apicilar dorsal, dirigido para dentro, sobre o segmento; íemur curvo em S, com filas de grânulos e robusto espinho interno no terço me lio. O resto como na femea. Habitat: Japyra, Paraná, Brasil. Colleccionador : Estanislau Petruski. Typo: Xo. 9 na collecçáo do Instituto Butantan. As tres especies do genero Leitaoius RWR. podem ser separadas pela se- guinte chave: A — Cephalo-íhorace com granulações esparsas; espinhos angulares da area IV e tergitos livres, fortes: B — Colorido geral negro-brunette uniforme; femur III do ma- cho inerme; femur IV com um espinho apicilar interno, curvo para o dorso — L. hamatus (RWR.) BB — Dorso com um desenho branco; femur III do macho com espi- nhos anteriores espaçados; femur IV com fila de espinhos internos n3 metade basilar — L. ornaius M. L. AA — Cephalo-thoraee com duas granulações atrás do comoro ocular; espi- nhos angulares da area IV e tergitos livres, pequenos; colorido castanho, man- chado de pontos mais claros; femur III do macho com uma serrilha apicilar; femur IV curvo, com forte espinho interno, no terço medio — L. gutlulatus M. L. Genero Diplocaldasius, g. n. Comoro ocular com dois espinhos. Areas I, II e III do escudo dorsal com dois tubérculos; area IV", tergito livre I e operculo anal, inermes; tergitos II e III com um espinho mediano. Femur dos palpos com dois espinhos apicilares internos. Tarsos I de seis segmentos, os outros de mais de seis. Ha, descriptos, tres generos com dois tubérculos nas tres primeiras areas do escudo dorsal e um espinho mediano nos tergitos II e III, todos com a mesma 8 C. de Mello Leitão — Gonyleptitlae do Instituto Butanlan 415 nhos. segmentação dos tarsos; Caldasius RWR., Xygoleptcs e Caldasiclla M. L., Diplocaldasius distingue-se de Caldasius, por ter dois espinhos no eomoro ocular (em vez de um só, mediano) e de Xygoleptcs e Caldasiclla, por ter espinhos, em vez de tubérculos, no eomoro ocular; de todos, por ter dois espinhos apici- lares internos no íemur dos palpos (um só em Caldasius e Caldasiclla e nem um em Xygoleptcs). Fora da serie muito homogênea dos generos do grupo Go- niosoma PERTY, é este o unico com dois espinhos apicilares no fêmur dos palpos. Typo : Diplocaldasius pallidus, sp. n. (Fig- 5) Femea — 10 mm.. Borda anterior com uma notável elevação mediana, armada de dois espi- Comoro ocular liso com dois espinhos baixos. Cephalo-thorace com al- gumas granulações pequenas. Areas I. II e III irregularmente granulosas e com dois tubérculos medianos. Areas lateraes com duas filas de grâ- nulos. Area IV, tergitos e esternitos livres com uma fila de granulações; nos tergitos II e III robusto espinho mediano, o do tergito III maior. Op;rculo anal granuloso. Area estigmatica c ancas densamente granulosas. Palpos: trochan- ter com dois grânulos inferiores, settiferos; fê- mur com uma fila inferior de tres pequenos es- pinhos inferiores e com dois espinhos apicilares internos; patella inerme; tibia com 3 espinhos externos e 4 internos, tarso com 6 de cada lado, sendo os apicilares apenas setti formes. Todos os íemures direitos. Tarsos com 6-10-3-8 segmentos. Colorido geral amarello-queimado, com leves laivos escuros c de granulações mais claras. Typo: No. 10 na antiga collecção do Insti- 45 Fig. 5 — iplocaldaiiu* pallidui g. n., »p. n. ( Ç ) tuto Butantan. sem procedência. Genero Gonyleptes KIRBY, 1818 Gonyleptes antiquus, sp. n. (Fig. 6) Macho — 6 mm.. Patas: 9-18-13-19 mm.. Femures: 2,5-5-4-5 mm.. Borda anterior lisa, com uma elevação mediana com espinhos. Comoro cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 416 Memórias do Instituto Butantan — Tomo VIII granulações esparsas. Areas I a III com granulações esparsas e dois pequenos ocular chagríné, com dois pequenos tubérculos. Cephalo-thorace com algumas tubérculos. Areas lateraes com tres filas de granulações. Area IV, tergitos e esternitos livres, com uma fila de grânulos. Area estigmatica e ancas IV» fina e irregularmente granulosas. Palpos: trochanter com pequeno espinho; fêmur liso, com pequeno espinro apicilar interno; patella inerme; tibia com tres espinhos interno: e dois externos; tarso com cinco de cada lado. Todos os íemures curvos em S. Tarsos de 6-9 -7-7 segmentos. Patas IV do macho: anca granu- losa, com uma curta apophyse apicilar externa, robusta, dirigida para trás; trochanter com uma pequena apophy- se externa e duas internas; femut curvo em S. com grande apophyse basilar dorsal erecta, em V, com uma fila interna, de 3 grandes dentes pon- teagudos e outra externa, de dentes mais numerosos; patella e tibia gra- nulosas. Colorido geral castanho-queima- do uniforme. Typo: Xo. 11 na antiga collec- ção do Instituto Butantan, sem pro- cedência. A presente especie é muito pró- xima de G. brienni (GILTAY) e G. bortjmcyeri M. L., das quaes se dis* F'r. 6 — GonUcpte» aniiquus *p. »• ( c ) tingue, alem dos caracteres das patas IV do macho, por ter dois espinhos (em vez de tubérculos) na elevação me- diana da borda anterior do cephalo-thorace. Genero Aletagonyleptes ROEWER, 1913 Aletagonyleptes misandrus, sp. n. (Fig. 7) Fe mea — 12 mm.. Patas: 25,5-51,5-36-48,5 mm.. Femures: 7-15-11-14 mm.. Borda anterior do cephalo-thorace com dois tubérculos medianos. Comoro ocular com dois altos espinhos divergentes. Cephalo-thorace liso dos lados e irre- 10 C. de Mello Leitão — Gonyleplidae do Instituto Biilantan 417 gularmente granuloso atrás do comoro ocular. Áreas I, II e III do escudo dorsal muito granulosas, as duas primeiras com dois tubérculos e a terceira com dois robustíssimos espinhos. Areas lateraes irregular mente granulosas nos terços anterior e posterior e com duas filas de pequenos tubérculos. Area IV e ter- gitos livres com duas filas de granulações : cada tergito livre com uma apophyse mediana quasi igual em qualquer dos tres. Estemitos livres com uma fila de grânulos. Area estigmatica e ancas granulosas. Palpos: trochanter com um espinho apicilar infe- rior; íemur com um fila ventral de granulações settiferas; tibia com 4 espinhos fracos de cada lado; tarso com dois espinhos internos e tres ex- ternos e algumas cerdas. Femures I a III direitos; - IV levemente curvos. Tarsos de 6-1 1-7-8 segmentos. Colorido geral negro; tubérculos da borda an- terior do cephalo-thorace e espinhos do comoro ocular amarello-queimados ; granulações do terço anterior das areas lateraes amarello-pallidas. Typo: No. 12 na collecção do Instituto Bu- tantan; sem procedência. A presente especie é muito próxima de M. fallax M. L., da qual se distingue pela armadu- ra- da borda anterior do cephado-thoracc e pelos altos espinhos da area III do escudo dorsal. i Fip. 7 — Mctajconvlepte* mi- sandru9, ap. n. ( O ) ABSTRACT The description is given of seven new forms of Gonyleptid Opiliones as represented in the arachnological collection of the Instituto Butantan. Of these two belong to the Pachyliuac : Afranius antarali, g. n., sp. n. and Japyra regu- larís, g. n., sp. n. ; the other five belong to the Gonylcptinac : Lcitaoius oniatus, sp. n., L. guttulatus, sp. n., Diplocoldasius pallidus, g. n., sp. n., Gonylcptcs antiquus, sp. n. and Mctagonylcptcs nUsandrus, sp. n.. (Trabalho de collabora{2o do Mu»cu Nacional. Hio, recebido para publicação cm ago»to dc 1**34. Dado á publicidade cm dexembro dc 11 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16