各 白质 和 酶 学 研究 方法 第 一 Wt 了 AS 全 my HE | wi WN HU ON O00 at Bk mh @ 1989 24310 内 容 简介 本 书 着 重 介绍 生化 实验 室 中 常用 的 各 种 蛋白 质 和 酶 学 研究 方法 , 目 的 在 于 读 完 相应 章节 后 即 可 在 实验 室 中 进行 具体 操作 。 第 一 册 的 内 容 主 要 包括 制备 及 分 析 和 蛋白 质 的 一 部 分 最 基本 方法 ， 例 如 在 溶液 中 蛋白 质 浓度 的 测定 、 盐 析 、 结 晶 、 透 析 、 超 滤 、 分 离 ,序列 测定 等 等 。 可 供 生 物化 学 研 究 人 员 和 实验 室 工作 者 ,大 专 院 校 有 关 专 业 的 师 生 参考 。 蛋白 质 和 酶 学 研究 方法 第 一 . 册 RFR ER | REAR RHR 只 eek ma i 北京 朝阳 门 内 大 街 37 号 # OMS ha Ay EDR 新 华 书店 北京 改行 所 发 行 各 节 新 华 书店 经 售 > i> at 19894 4 月 第 — 版 开本 :787x1092 1/16 i989 年 4 月 第 一 次 印 而 印张 :9 1/2 AUR ; 0001 一 8,240 FH = 218,000 ISBN 7-03-000885-5/0.140 定价 ; 5.20 元 En e 序 言 作为 生物 化 学 和 分 子 生物 学 研究 的 重要 对 象 一 “蛋白 质 ,对 它 的 研究 经 久 不 衰 ,研究 方法 不 断 有 所 创新 。 酶 是 最 重要 的 一 类 和 蛋白质 , 虽 有 一 些 特殊 的 研究 方法 ,但 多 数 方法 与 蛋白 质 的 是 一 样 的 。 由 于 这 些 方法 是 生物 学 许多 实验 室 日 常 的 需要 ， 因 此 我 们 应 科学 出 版 社 之 邀 ,组 织 富有 实践 经 验 的 人 员 扎 写 。 我 们 也 欢迎 国内 有 实践 经 验 的 同行 来 联系 , 参 加 今后 各 分 册 有 关 章 节 的 撰写 。 顾名思义 ,本 书 着 眼 于 方法 的 应 用 。 我 们 的 原则 是 各 章 可 大 可 小 ,在 简单 地 阐述 基本 原理 后 ， 着 重 描述 各 种 实验 的 具体 操作 。 但 是 我 们 不 希望 用 一 种 简单 的 模式 来 束缚 各 作 者 的 写作 风格 ,因此 写作 的 模式 在 同一 分 册 中 并 不 完全 一 样 。 我 们 想 , 读 者 可 能 会 欢迎 这 种 格局 的 。 以 往 的 经 验 是 同类 题目 完成 写作 的 时 间 很 难 同步 。 我 们 采用 先 完成 先 编 人 分 册 出 版 的 方法 ;来 克服 这 一 困难 ,但 各 分 册 的 内 容 也 因此 而 显得 零乱 。 我 们 希望 有 机 会 将 木 书 出 第 二 版 。 在 那 时 ,我 们 将 根据 方法 的 性 质 来 编排 分 册 ,以 利于 读者 使 用 。 《有 惨白 质 和 酶 学 研究 方法 》 主 编 vA “村 其 谁 “ 鲁 子 贤 1988 年 于 中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 = AN se sa ” 慕 液 中 蛋白 质 浓 度 的 测定 pe 只 到 工 ) | 蛋白 质 的 盐 析 法 并 荣 华 FR (8) 酶 或 蛋白 质 的 结盟 cee cee cee ce eee nee eeeeeeeteeencoosenes Si seecduvhathes Auhee Sisk (17) 透析 和 GR (29) Mere VaR AS tM Soe «+--+ 2 neo stncrcassoetiavnmseses valdtpaceetebeotonssees «toon tae ERB (37) 离子 交换 层 析 pe 陈 远 聪 ( 53 ) 年 白 质 亲 条 供 生 入 霖 六 pice se OF Re Pe ee (73) ee ee ee a, (77) Edman 降解 法 测定 蛋白 质 序列 … ee ev 林 南 琴 (99 ) 4-N;N- 二 甲 胺 基 偶 氮 苯 -4'- 异 硫 和 氰 酸 酯 (DABITC) ) ERIE PR 区 人 (108) WE A A — BRAS FT Hy veers eee eee eee teeaecee eer eeecsseeceseserseeeceenite fi (131) 和 溶液 中 蛋白 质 浓 度 的 测定 天 各 六 下 (中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 有 ) bs PS eH AUTH AEE A CE MT IEC 定 ;可 用 化 学 反应 方法 ,如 克 氏 定 氮 、 双 缩 脲 反 应 MRM ee, ee 基 黑 、 考 马 斯 亮 蓝 测 定 ; INA BADR, AK T、 放 射 性 同位 素 计数 等 灵敏 度 较 高 的 方法 -4。 上述 方法 中 ,紫外 吸收 法 、. 双 缩 腺 法 、 福 林 - 酚 试剂 法 , 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 最 为 常用 ,它们 操作 简单 ,不 需要 昂贵 的 设备 。 以 下 主要 介绍 这 几 种 方法 。 一 、 紫 外 吸收 法 1. 280nm JERR" HFEARtRARMAAMRENEMA AER, AILSA PSE 275am 一 280nm 处 有 一 个 紫外 吸收 高 峰 , 在 一 定 浓 度 范围 内 , 蛋白 质 溶液 在 280nm 的 光 吸 收 值 (简写 作 As) 与 其 浓度 成 正比 ,因此 可 作 定 量 测定 ,该 法 测定 范围 为 0.1 一 1.0mg 和 蛋白质/ ml 溶液 。 该 测定 方法 简单 .灵敏 ,快速 ,不 消耗 样品 , 低 浓 度 的 盐 类 不 干扰 测定 ， 因 此 在 蛋白 质 和 酶 的 生化 制备 中 广泛 应 用 ,特别 是 在 柱 层 析 分 离 中 , 常 利用 Au 进行 紫外 检测 ,来 判断 蛋白 质 洗 陪 的 情况 。 由 于 不 同 蛋 白质 中 酷 氨 酸 和 色 氨 酸 的 含量 不 同 、 所 处 的 微 环 境 也 不 同 ,因此 不 同 蛋白 质 溶液 在 280nm ADEM BAAR. HMI, MEH Img/ml 溶液 的 1800 HE 白质 及 蛋白 质 亚 基 在 280nm 的 光 吸 收 值 在 0.3 一 3.0 之 间 中 ,平均 值 为 1.25 士 0.51。 (1 测定 方法 W3 毫升 蛋白 质 溶液 ,以 缓冲 液 作为 对 照 ,用 光 径 为 lcm 的 石英 比 色 杯 , 在 280nm 测 光 吸收 值 - 通 常 以 浓度 为 Img 蛋白 质 /ml 溶液 的 Aw 为 1.0 作为 估 算 。 若 已 知 该 蛋白 质 的 文献 值 呈 ,可 直接 计算 出 样品 盗 液 中 蛋白 质 的 浓度 。 该 方法 适用 于 一 般 的 半 定 量 测定 ， 也 可 用 于 纯 蛋 白质 的 定量 测定 。 由 于 蛋白 质 的 紫 外 吸收 高 峰 常 因 pH 值 的 改变 而 有 变化 , 必用 紫外 吸收 法 时 要 注意 溶液 的 pH 值 。 2. 280nm 和 260nm 的 吸收 差 法 5 若 样品 中 含有 味 叭 , 喀 喧 等 核酸 类 吸收 紫外 光 的 物质 ， 在 用 Ais 来 测定 蛋白 质 浓度 寺 : 会 有 较 大 的 干扰 。 由 于 核酸 在 260nm 的 光 吸 收 比 280nm 更 强 ， 因 此 可 利用 280nm : 及 260nm 的 吸收 差 来 计算 蛋白 质 的 浓度 。 常 用 下 列 经 验 公式 估算 : 蛋白 质 浓 度 (mg/ml) = 1.45 A. —0.74 Argo (假设 Img SA/ml 溶液 的 Aw A 1.0), 3.215nm 和 225nm AURIS ROW J St A AA 7E 200nm—250nm 有 强 的 紫外 光 吸 收 , 其 光 吸 收 强 弱 在 一 定 范围 与 浓 度 成 正比 , 且 淫 长 越 短 光 吸收 越 强 号 笠 选 取 215nm 可 减少 干扰 及 光 散 射 ， 用 215nm 和 225nm 光 吸 收 差 值 与 单一 波长 测定 相 比 可 减少 非 蛋 白质 成 分 引起 的 误差 。 因 此 , WH 液 中 蛋白 质 浓 度 测定 可 用 215nm| 和 225nm | 光 吸 收 差 法 ,常用 下 列 经 验 公式 : BERR ee (mg/ml) = 0.144(Ass—A2s) , ill HIGH 20—100yug 蛋白 质 /ml。 该 方法 测定 灵敏 度 高 ， 且 不 同 蛋白 质 之 间 差 异 较 小 。 和 氧化 钠 、 硫 酸 贸 以 及 0.1mol/L PR, HRM Tris 等 缓冲 液 都 无 显著 和 干扰。 但 是 ，0.1mol/ 工 HAMM, CR. re 酸 琥珀 酸 , 邻 茶 二 甲酸 、 巴 比 妥 等 缓冲 液 在 215nm 的 光 吸 收 较 大 ， 必 须 降 至 Smmol/L 才 无 明显 干扰 。 =. mM 4a MK (—) BEM seis HZARSASTAR. ALA WARM ,在 碱 性 溶液 中 蛋白 质 与 铜 离子 形成 紫红 色 化 合 物 , 可 在 540nm 比 色 测 定 ,其 颜色 深浅 与 蛋白 质 浓 度 成 正比 ,而 与 蛋白 质 的 分 子 量 及 氨基 酸 组 成 无 关 ,该 法 测定 范围 为 1 一 10mg 蛋白 质 /mle。 双 缩 逐 法 最 常用 于 需要 快速 的 测定 ,硫酸 铵 不 于 扰 此 显 色 反应 ,使 其 有 利于 对 蛋白 质 纯化 早期 步骤 的 测定 。 于 扰 此 测定 的 物质 有 Tris 及 含 氨基 酸 、 多 肽 的 缓冲 液 ,以 及 蕨 糖 、 甘油 等 。 1. 测定 方法 (1) 溶液 配制 蛋白 质 标准 溶液 “准确 称 取经 真空 干燥 的 标准 蛋白 质 ( 常 用 和 牛 血 清白 蛋白 )， 用 水 配制 成 10mg/ml 的 溶液 ，( 可 用 lmg 和 牛 血 清白 蛋白 /ml 的 Aw 为 0.66 来 校正 ) 四 。 如 果 和 蛋白 质 不 易 溶解 , 可 用 0.05mol/L 氧 氧 化 钠 溶 液 配 制 ， 也 可 加 热 或 放置 过 夜 以 助 深 。 4G PRI FA PRAM 1.5g 硫酸 铜 (CuSO, - 5H,0), 6g 酒石酸 钾 钠 (NaKC4H4O4 - 4HO)， 依 次 盗 解 于 500ml 水 中 ,在 搅拌 下 加 入 300m] 10 多 氧 氧化 钠 溶液 ， 用 水 稀释 到 ll, RAMA lg 碘化钾 以 防止 铜 离子 自动 还 原形 成 一 价 氧化 铜 沉 淀 。 所 用 的 蒸馏 水 应 煮沸 以 逐 出 所 深 解 的 二 氧化 碳 ， 待 冷却 后 配制 。 柄 好 的 双 缩 腺 试剂 应 贮存 于 塑料 瓶 中 (或 内 壁 涂 以 石蜡 的 瓶 中 )。 此 试剂 可 长 期 保存 ; 若 瓶 中 有 黑色 沉淀 出 现 则 需 重 配 。 (2) 标准 曲线 ， - ae ae to 在 试 答 中 分 别 加 和 人 0,006 .0.12,0.24 ,0.36,0.48,0.60ml 标准 蛋白 质 溶液 ， 用 水 补足 到 0.60ml, 然 后 各 加 2.4ml 双 缩 腺 试剂 ， 混 匀 后 在 室温 (20 一 25"C) 保 温 15 分 钟 ， 然 后 在 540nm 比 色 测定 。 以 溶液 中 蛋白 质 浓度 为 横 坐 标 ，Ass 为 纵 坐 标 作 标 准 曲线 。5mg 和 后 血清 白 蛋 白 /ml 溶液 的 Ai 约 为 0.27。 该 方法 标准 曲线 的 线性 及 重复 性 较 好 ,一 般 每 配 ， 一 次 溶液 作 一 次 标准 曲线 即 可 。 % 2 anne 取 0.6ml 未 知 浓度 的 样品 同上 测 _ As, 然后 从 标准 曲线 上 查 得 其 浓度 ,注意 样品 浓度 若 超过 10mg/ml 时 ,应 作 适 当 稀 释 。 若 样品 中 脂 类 等 含量 过 高 ,在 30 分 钟 后 会 有 雾 状 况 证 产 生 , 故 须 注意 控制 在 30 分 钟 内 比 色 完 毕 。 (=) 微量 双 缩 脲 法 ”1 该 法 显 色 原 理 与 双 缩 又 法 相同 ， 由 于 铀 与 蛋白 质 复合 物 的 最 大 吸收 峰 在 260 一 280 am .但 在 此 区 域 干扰 因素 及 空白 的 吸收 都 很 大 ， 而 在 310 一 330nm 测定 ， 干 扰 因 素 少 一 此 ,但 仍 比 540nm 测定 灵敏 10 倍 以 上 ,因此 可 选用 310nm 进行 比 色 测 定 ， 测 定 范围 为 0.1 一 1.0mg 蛋白 质 /ml; 或 用 330nm 测定 ,测定 范围 为 0.2 一 2.0mg 蛋白 质 /ml。 干扰 此 测定 的 物质 包括 组 氨 酸 、 丝 氨 酸 、 苏 氨 酸 Tris、 乙醇 胶 .葡萄糖 、 多 肽 、 硫 酸 铵 、 尿素 GS. 1. 测定 方法 (1) 溶液 配制 标准 蛋白 质 深 液 ”1.0 或 2.0mg 和 牛 血 清白 蛋白 /ml。 MEM BRRA PHL 173g 柠檬 酸 三 钠 (NaCeHi0). 2H:O)、100g 无 水 碳酸 钠 《NaCO;) 一 齐 溶解 于 温水 中 , 称 取 17.3g 硫酸 铜 (CuSO,. 5HO) WF 100ml 水 中 ,两 者 合并 用 水 稀释 至 1 升 。 该 试剂 可 长 期 保存 。 出 现 黑 色 帝 淀 需 重 配 。 6% BARB IK (2) Petrie hee 在 试管 中 分 别 加 0 .0.15 .0.3 .0.6 0.9.1.2. 1.5ml 标准 蛋白 质 溶液 ,用 水 补足 到 1.5ml, 加 15ml16 色 氨 氧 化 钠 溶 液 混 勺 ,再 加 0.15ml 微量 双 缩 豚 试 剂 , 混 匀 后 在 室温 (20 一 25%C ) (hig 15 分 钟 ， 然 后 在 310nm 或 330nm 比 色 测定 ， 作 标准 曲线 。 10mg 和 牛 血 清白 蛋 白 /ml 溶液 的 Aw AW 1.04, As. 约 为 0.67。 取 1.5ml 未 知 浓度 的 样品 同上 测定 ,然后 从 标准 曲线 上 查 得 其 浓度 。 三 、 福 林 - 酚 试剂 法 4031 这 方法 是 双 缩 逐 法 的 发 展 ,首先 在 碱 性 溶液 中 形成 铜 与 蛋白 质 复合 物 ,然后 这 个 复合 物 以 及 酷 所 酸 和 色 氨 酸 残 基 还原 磷 钼 酸 - 磷 钨 酸 试 剂 ( 福 林 试 剂 ) ,产生 深蓝 色 。 这 个 测定 法 比 双 缩 腺 法 灵敏 ,但 要 花费 较 长 时 间 。 此 法 也 适用 于 酷 氨 酸 和 色 氮 酸 的 定量 测定 ,对 那 至 含 这 两 个 残 基 与 标准 蛋白 质 差异 较 大 的 蛋 白 质 有 误差 。 进 行 测定 时 ， 加 福 林 试剂 要 特 别 小 心 ， 因 为 福 林 试 剂 仅 在 酸性 条 件 下 稳定 ， 但 上 述 还 原 反 应 只 是 在 pHI10 的 情况 下 发 生 , 因 此 当 福 林 试 剂 加 到 碱 性 的 铀 与 蛋白 质 溶液 中 必须 立刻 混 匀 ;以 便 在 福 林 试 剂 被 破坏 之 前 ， 还 原 反 应 即 能 发 生 。 该 法 可 用 750nm 比 色 测定 ， 范 围 为 0.03 一 0.3mg 蛋白 质 / ml; 或 500nm 比 色 测 定 ,范围 为 0.05 一 0.5mg 和 蛋白质/ml。 该 法 标准 曲线 线性 较 差 ， 样 胸 浓 度 需 按 标准 曲线 校正 。 由 于 福 林 - 酚 试 剂 法 使 用 很 广泛 ， 对 其 干扰 因素 了 解 得 最 多 。 已 知 的 干扰 因素 包括 -有 Tris; HEPES,PIPES MOPS、MES、CAPS、 IES、CHES、 森 檬 酸 、 下 珀 酸 、 谷 氮 酸 、 组 氨 酸 、 甘氨酸 、N- 二 ( 羟 乙 基 ) 甘 氮 酸 、 甘 氨 酰 甘氨酸 等 缓冲 液 ;EDTA、EGTA SHAH RB. 甘油 、 氨 基 葡 萄 糖 ,果糖 , 甘 露 糖 . 鼠 李 糖 , 木 糖 .山梨 醇 等 糖 类 ; 酚 .二 绩 基 苏 糖 醇 、 纺 基 乙 RADE KADER SAR HR. fk AS — ERS F ; Triton, Tween,Lubrol 等 去 GH WRC. CIM ROM IA AEBS. BREA. MG eek RS Te. HAC. Ce. LR. AM. BASKA mE Wa] t29?-4 04) 1. 测定 方法 (1) 溶液 配制 标准 蛋白 质 深 液 ”0.3 或 0.5mg 和 牛 血 清白 蛋白 /ml。 福 林 - 酚 试剂 试剂 甲 : 由 下 述 3 种 溶液 配制 : (1) 称 取 20g 无 水 碳酸 钠 、,4g 氢 氧 化 钠 湾 解 于 1 升 水 中 ;(2) 称 取 0.2g 硫酸 铜 溶 于 20ml 水 ; (3) 称 取 0.4g 酒石酸 钾 钠 深 于 20mil Ke 在 测定 的 当天 将 这 三 种 溶液 按 100:1:1 的 体积 比 混合 , 即 为 福 林 - 酚 试剂 甲 * 混 合 后 放 30 分 钟 后 使 用 ,混合 液 只 能 用 一 天 。 三 种 溶液 分 开 可 长 期 保存 。 试剂 乙 ( 福 林 试剂 ); 试剂 乙 市 上 有 售 ， 上 海 医学 化 验 所 生产 的 名 为 “ 酚 试剂 "。 自 己 配制 时 ， 在 2 升 的 磨 口 回流 装置 内 加 入 100g BH) (NaWO, - 2HO)，25g RR (Na,MoQ, - 2HO),700ml 蒸馏 水 ,再 加 50ml 85% 磷酸 及 100ml 浓 盐 酸 , 充 分 混 匀 后 ,以 小 火 回流 10 小 时 ,再 加 入 150g 硫酸 锂 (LiSO,), 50ml 蒸馏 水 及 数 沉 液 体 省 ,然后 开口 继续 沸腾 15 分 钟 ,以 便 驱除 过 量 的 省 ,冷却 后 定 容 到 1 升 UR ARERR , 置 于 棕色 试剂 瓶 中 冰箱 保存 。 使 用 时 将 购买 的 或 自制 的 试剂 乙 用 标准 氢 氧 化 钠 溶 液 滴定 ， 以 酚 栈 为 指示 剂 , 而 后 用 水 适量 稀释 ( 约 2.3 倍 ) ， 使 酸度 最 后 为 lmol/L, 此 为 福 林 酚 试剂 乙 , 贮 于 冰箱 中 可 长 期 保存 。 (2) 作 标 准 曲线 在 试管 中 分 别 加 入 0、0.025、0.05、0.075 \0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 、 0.50ml 标准 蛋白 质 溶液 ,用 水 补足 到 0.50ml, 加 2.5ml 当天 配制 的 试剂 甲 , 混 匀 后 在 室温 (20—25°C ) 放 10 分 钟 ,再 加 入 0.25ml 试剂 乙 ,立即 混 匀 ,室温 放 30 分 钟 ， 然 后 在 500nm 或 750nm 比 色 测定 , 作 标 准 曲线 。 该 法 显 色 受 时 间 与 温度 影响 较 大 ， 要 注意 控制 在 同一 条 件 下 进行 。0.2mg 和 牛 血 清白 蛋白 /ml WRAY Aw 4% 0.33, Am AY 0.565 2. 膜 蛋白 质 的 测定 与 改进 的 福 林 - 酚 试剂 法 在 对 膜 制 剂 (如 红细胞 膜 线粒体 膜 等 ) 上 的 蛋白 质 含 量 进 行 测定 时 ,由 于 膜 制剂 不 洲 于 水 ,悬浮 液 有 光 获 射 现 象 ， 因 此 不 能 用 紫外 光 吸 收 法 测定 ;在 用 去 拍 剂 增 溶 膜 蛋白 的 深 AEE FRAC Triton X-100) 在 280nm 有 强烈 的 光 吸 收 守 ,也 妨碍 了 紫 外 光 吸 收 法 的 测定 。 由 于 膜 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 与 一 般 水 溶性 蛋白 质 差 异 不 大 ， 虽 然 非 极 性 氨基 酸 所 占 比例 略 高 ,但 色 氮 酸 和 酷 氨 酸 残 基 与 一 般 蛋 白质 相近 ,因此 ， 用 双 缩 逐 和 福 林 法 均 可 直接 测定 膜 蛋 白质 的 浓度 ”…”'。 对 膜 制剂 也 可 先 在 3 多 BARA ik 10 分 钟 ， 使 膜 “YY YE eer ee ee 1 ep a 容 解 后 再 加 双 缩 逐 试 剂 测定 叫 。 有 些 生物 膜 样品 所 含 的 脂 类 较 多 (大 于 1 色 ) ,或 膜 蛋白 质 的 增 溶 溶 液 中 去 垢 剂 (Tri- ton, Tween, Lubrol 等 ) 含量 较 高 (大 于 05 和 )， 在 用 福 林 法 测定 时 会 与 试剂 显 色 或 形 成 复合 物 沉 淀 影响 测定 ,这 时 可 对 膜 样品 作 下 述 处 理 : C1) 生物 膜 悬 浮 液 或 增 溶 后 的 膜 蛋白 质 盗 液 与 等 体积 的 0.5mol/ 工 氧 氧化 钠 和 4% 脱氧 胆 酸 钠 ( 或 10% SDS) 溢 液 混合 后 保温 10 分钟， 使 膜 蛋白 质 充 分 溶解 后 用 福 林 法 测 定 ,脱氧 胆 酸 钠 或 SDS 本 身 不 干扰 显 色 反 应 , 其 存在 可 防止 复合 物 的 形成 与 沉淀 。 (2) 在 试剂 甲 中 加 入 九 分 之 一 体积 的 10 双 SDS ARID, fH SDS 在 试剂 甲 中 的 最 终 浓 度 为 1% ,然后 用 福 林 法 直接 对 膜 样品 测定 "9。 (3) 若 去 垢 剂 或 脂 类 浓度 过 高 , 可 在 0.5 毫升 蛋白 质 样品 液 中 加 50ml 1% 的 脱氧 胆 酸 钠 溶液 混 匀 ,再 加 和 lml 109 的 三 氯 乙酸 溶液 , 使 蛋白 质 充 分 沉淀 ， 在 每 分 钟 3000 转 离心 5 分 钟 或 用 每 分 钟 DLE Eppendorf 离心 机 离心 1 分 钟 , 吸 去 上 清流 ,注意 残 留 的 溶液 必须 小 于 50 岂 ,沉淀 用 含 1% SDS 的 试剂 甲 直接 溶解 后 测定 〈 若 不 易 溶解 可 放置 数 小 时 或 适当 加 热 促 使 其 溶解 )。 这 一 方法 还 可 用 于 稀 蛋 白质 溶液 浓缩 后 测定 〈 含 0.02% 赔 氧 胆 酸 钠 及 6 一 15 色 三 氯 乙酸 ), 以 及 溶液 中 有 各 种 干扰 物质 时 的 测定 。 许 多 干 扰 物 质 经 一 次 沉淀 就 可 以 消除 干扰 影响 ， 但 有 些 物 质 〈 如 0.03mol/L. Tris- #2 0.015% 乙酰 丙酮 \0.015% MAS) KE. 溶液 配制 10 多 或 50% 的 三 氯 乙 酸 配制 后 可 长 期 保存 。 1% 或 4% 脱氧 胆 酸 钠 溶 波 需 新 鲜 配 制 或 配 后 在 冰箱 中 冰冻 保存 。 若 有 胶 状 物 出 现 应 重 配 。 10% SDS 溶液 可 长 期 保存 。 市 售 的 SDS 若 纯度 不 高 或 溶解 不 好 时 ， 可 用 乙醇 重 结晶 后 使 用 。1% SDS 也 可 配制 在 福 林 酚 试剂 甲 (1) 〈 即 碳酸 钠 - 氢 氧 化 钠 ) 溶 液 中 长 期 保存 。 在 天 冷 时 SDS 往往 从 溶液 中 结晶 析出 ,可 在 温水 浴 中 溶解 后 使 用 。 在 用 以 上 改进 的 福 林 法 测定 时 ， 要 注意 对 照 及 标准 曲线 的 制作 应 与 样品 在 同一 条 件 下 进行 。 四 、 考 马 斯 亮 蓝 G-250 染色 法 [ua 考 马 斯 亮 蓝 G-250 在 酸性 溶液 中 为 棕 红 色 ，, 当 它 与 蛋白 质 通过 疲 水 作用 结合 后 ， 变 为 蓝 色 ,可 在 595nm 比 色 测 定 。 该 法 反应 快 ,操作 简便 ,消耗 样品 量 少 ， 但 不 同 蛋白 质 之 间 差 异 较 大 , 且 标 准 曲线 线性 较 差 。 测 定 范 围 为 0.01 一 1.0mg 蛋白 质 /ml。 高 浓度 的 Tris\EDTA、 尿 素 . 甘 油 \ 蔗 糖 \ 丙酮 ,硫酸 匀 \ 去 垢 剂 对 测定 有 于 扰 , 缓 冲 液 浓度 过 高 改变 测定 液 pH 会 影响 显 色 。 考 马 斯 亮 蓝 染 色 能 力 很 强 , 比 色 杯 不 洗 干 净 会 影 啊 光 吸收 值 ,注意 不 可 使 用 石英 比 色 杯 ”。 (3) suet | ey A oe (1) 溶液 配制 标准 蛋白 质 溶液 0.1 或 1.0mg 咎 血清 白 蛋 白 /mle 下 于 KER RAL 100mg 6 SMSK G-250 溶解 于 50ml95% 乙醇 中 , 加 100ml 85% SOR, DIK MRS IS. RAR RE A SRM KREME. HE WR YE th 在 试管 中 分 别 加 0.6 .12.24 36,48 60 ul MEE YAR, Kah 到 601, Jn 3ml 染色 液 , 混 匀 后 在 室温 (20 一 25%c ) 保 温 15 分 钟 ,在 595nm 比 色 测 定 , 作 标准 曲线 。 该 法 标准 曲线 线性 较 差 ,要 注意 校正 ; 且 显 色 受 时 间 与 温度 影响 较 大 ,要 注意 控制 在 同一 条 件 下 进行 。0.5mg 牛 血 清白 蛋白 /ml 溶液 的 Ass 约 为 0.50。 取 60 未 知 浓度 的 样品 溶液 同上 测定 ,然后 从 标准 曲线 上 查 得 其 良 度 。 当 样 品 中 蛋白 质 浓 度 较 稀 时 (0.01~~0.1mgjml) ,可 在 3ml 染色 液 中 加 O.3m1 样品 溶 液 ,同时 作 标 准 曲线 ， 测 595nm 的 光 吸 收 值 。0.05mg 牛 血 清白 蛋白 /aal WRAY Ass 约 A) 0.29, 2 REATEMSE ARE ACR 测定 范围 Av 品 体积 m &@ & & R HK fh (ug/ml) (ml) A120 100 ~1000 3 300 ~3000 RIS IEICE Tt oH Asso， 样品 可 回收 人 :is-225 20 一 100 3 60 一 300 紫外 分 光 光 度 计 ， 测 Ajisy A225 Fan 7 EU 双 缩 上 | 1000 一 10000| 0.6 |600~6000 可 见 分 光 光 度 计 * 测 Asso 微 量 | 100 一 2000 1.5 3 .5 1150~3000 REE ; RIP ICICLE 9B As 或 Asso 可 见 分 光 光度 计 ; 测 Asoo 或 Arse Se ee SSS! EX 193) 10~500 0.2 2 一 100 可 见 分 光 光 度 计 测 Aco MUR ARB ff "| ao. 10~5000 | 小 于 0.3 | 3 一 600 天 可见 分 光 光 度 计 ， 测 Asso Bite. BE 100~1000 | 小 于 0.06 | 6 一 60 小 可 见 分 光 光 度 计 测 Asso Bite. BRE 考 有 斯 亮 蓝 | 10 一 1000 | °K | 3 一 60 大 | AME Awe BRO - SEIKK* 223) 2~200 0.25 0.5~50 AN AKA 395nm 激发 ;475nm KH 一 -一 | 一 | 一 一 | | 氯 胺 丁 cxal 0.07 一 0.7 | 小 于 0.3 |0.02 一 0.2 大 可 见 分 光 光 度 计 ， 测 Ase 小 型 柱 凝 胶 过 滤 CA 1 一 100 0.05 “|0.05 一 5 天 同位 素 放 射 计数 仪 ‘aE | ee 微量 克 氏 定 氮 仪 全 套 Bien | 200~ 1000 | 0.4 80 ~400 yh PAI BTL EIGEETT oil Aso 注 : 除 米 外 各 方法 均 按 3 ml 左右 溶液 比 色 测定 计算 ， 比 色 杯 光 径 为 lem, GER 1ml 体积 的 比 色 杯 可 将 样品 及 试剂 的 量 作 相应 减少 。 SS \ rte EEE 11) [2] [3] [4] [5] [6] [7] {8] 19] [10] f11] [12] [13] [14] [15] 116) [17] [18] [19] {20} {21] [22] [23] [24] {25] [26] {27] See oe Thorne, C. J. R., Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry, B104, (1978) Elseviee/North-olland. RAR BER «AMM AeA. 89 页 ，1982， 科 学 出 版 社 . 张 龙 翔 等 生化 实验 方法 和 技术 >，164 页 ，1981， 人 民 教 育 出 版 社 ; Peterson, G. L., Methods in Enzymology. 91, 95. (1983). Warburg, O. et al., Biochem. Z., 310, 384, (1941). 303, 40, (1939). Layne, E., Methods in Enzymology, 3, 447, (1957). Kirschembaum, D. M., Int. J. Protcin Res., 3, 109, 157, 237, 329, (1971). 4, 63, (1972). Int. J. Peptide Protein Res. 4, 125, (1972). 5, 49, (1973). Anal. Biochem., 55, 166. 56, 237, (1973). 64. 186,. 68, 465, (1975). 80, 193. 81, 220. 82, 83, (1977). Kalckar, H. M., J. Biol. Chem. 196, 461, (1947). Waddell, W. J., J. Lab. Clin. Med., 48, 311, (1956). Murphy, J. B. & Kies, M. W., Biochim. Biophys. Acta, 45, 382, (1960). Gornall, A. C.-et al. J Biol. Chem., 177, 751,.(1949). Goa, J., J. Clin. Lab. Invesz., 5, 218, (1953). Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem. 193, 265, (1951). Bennett, J. P., Techniques in Lipid and Membrane Biochemistry, B408, (1982), Elsevier/North-Holland. Holloway, P. W., Anal. Biochem., 53, 304, (1973). . Dunn, M. J. & Maddy, A. H., Biochemical Analysis of Membranes, p. 197, (1976), London Chapman and Hall. | Capaldi, R. A. and Vanderlooi, G., Proc. Natt. Acad. Sci. USA., 69, 930, (1972). Bramhall, S. et al., Anal. Biochem, 31, 146, (1969). Nakao, T. et al., Anal. Biochem., 55, 358, (1973). McGuire, J. et al., Anal. Biochem., 83, 75, (1977). McKnight, G. S., Anal. Biochem., 78, 86, (1977). Bohlen, P. et al., Arch. Biochem. Biophys., 155, 213, (1973). Goldberg,’ M. L., Anal. Biochem., 51, 240, (1973). Schulz, R. M. & Wasserman, P. M., Anal. Biockem., 77, 25, (1977). Chibnall, A. C. et al., Biochem. J, 37, 354, (1943). Jacob, S. et al., Methods of Biochemical Analysis, 13, 241, (1965). Jacob, S., Nature, 183, 262, (1958). 蛋白 质 的 盐 析 法 Ree aT (中 国 科 学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 7 蛋白 质 的 溶解 度 因 溶液 中 含 盐 的 浓度 变化 而 变化 。 一 般 的 占 蛋 白 和 球状 蛋白 质 在 盐 ， 浓度 高 的 时 候 , 都 因 盐 浓度 的 增加 而 溶解 度 降 低 。 当 盐 浓 度 增 加 到 某 一 浓度 后 , 蛋 碧 质 就 从 溶液 中 析出 。 这 种 现象 称 盐 析 。 不 同 的 蛋白 质 盐 析 所 需 盐 的 浓度 不 同 ， 因 此 可 以 利用 这 一 性 质 将 蛋白 质 分 离 ( 表 1)。 盐 析 法 是 纯化 蛋白 质 最 经 典 的 方法 之 一 ,但 是 今天 仍 是 实 验 室 和 工厂 中 纯化 蛋白 质 的 重要 方法 。 表 1 血浆 蛋白 质 的 盐 析 pie por ee Stes eae Cae 纤维 蛋白 原 0.3 ett 20 优 球 蛋 白 Tae 3 a WREA I 1.3 17 40 UREA U 0.5 7 46 白 蛋 白 5 69 62 70 影响 蛋白 质 盐 析 行 为 的 首先 是 蛋白 质 的 性 质 ,其 次 是 盐 的 性 质 , 溶 液 中 盐 的 浓度 DH 值 及 温度 。 —-, ht Me th OT TRRBEE ATE AE. BALSA: 水 中 的 溶解 度 大 ， 对 绝 大 多 数 蛋 昌 质 的 天 然 状 态 没 有 影响 ,价格 便宜 ,没有 大 的 公害 问题 ,在 饱和 的 硫酸 铵 溶液 中 ;, 几 乎 所 有 的 蛋白 质 都 能 沉淀 析出 ， 因 此 可 以 盐 析 几 乎 所 有 的 蛋白 质 。 -硫酸 镍 的 缺点 是 : 溶解 度 因 溶 液 温度 变化 而 有 较 大 的 变化 ; 该 试剂 中 含有 极 微量 的 金属 元 素 ,不 易 纯 化 。 前 一 缺点 在 处 理 浓 硫 酸 冬 溶液 时 会 引起 一 些 麻烦 ,将 样品 溶液 移 至 冷 的 环境 (如 4s ) 时 ,硫酸 贸 也 同时 析出 。 后 一 缺点 在 纯化 某 些 活 力 与 金属 离子 有 重要 关 系 的 蛋白 质 时 要 特别 注意 。 另 外 ,硫酸 匀 缓 冲 能 力 较 差 , pH 较 难 控制 。 制备 蛋白 质 时 ， 习 惯 上 都 以 饱和 度 来 表示 它 的 浓度 。 饱和 度 (Satn) 可 以 定义 为 : Satn = 所 用 六 液 的 浓度 /饱和 溶液 的 浓度 所 以 可 以 用 小 于 1 的 数值 ， 或 百分数 表示 。 由 于 硫酸 镁 的 溶解 度 因 温 度 变化 而 有 较 大 变 oo 人 6 表 2 硫酸 铵 饱和 度 的 常用 表 (17) 硫酸 铵 溶液 饱和 度 表 (0Y ) at é Fi 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 | 95 | 100 0 106 |134 |164 |194 226 258 |291 |326 |361 |398 |436 426. 516 (559 |603 [650 |697 5 79 |108 |137 |166 |197 |229 262, |296 |331 |368 405 444 1484 [526 [570 |615 |662 10 53 | 81 {109 1139 |169 |200 |233 |266 |301 |337 |374 |412 |452 |493 |536 581 627 A 15 26 | 54 | 82 {111 |141 |172 |204 |237 |271 |306 |343 |381 |420 |460 |503 547 [592 i 20 0 | 27 | 55 | 83 |113 143 |175 |207 |241 |276 |312 |349 |387 |427 |469 |512 [557 = 25 i -| 0 | 27 | 56} 84 |115 |146 |179 |211 |245 |280 |317 |355 |395 |436 |478 [522 : 30 0 | 28 | 56 | 86 |117 |148 |181 |214 |249 [285 |323 |362 |402 |445 |488 35 0 | 28 | 57 | 87 |118 |151 |184 |218 |254 |291 |329 |369 |410 |453 本 40 0 | 29 | 58 | 89 |120 |153 |187 |222 |258 |296 |335 |376 |418 45 0 | 29 | 59 | 90 |123 |156 |190 |226 |263 |302 |342 |383 = 化 ， 因 此 在 定义 Sam WAR, SRPLRLARAAA BE FRIIS, 样 , 为 了 使 各 家 实验 室 间 可 相互 重复 ,就 必须 指定 盐 析 时 溶液 的 温度 。 表 2 是 两 种 温度 下 的 硫酸 锐 包 和 度 表 。 拓 表 中 不 仅 可 找到 达 某 一 饱和 度 时 单位 体积 水 中 所 需 加 入 的 硫酸 匀 的 量 ， 还 能 找到 从 某 一 饱和 度 上 升 到 更 高 饱和 度 时 所 需 加 入 的 硫 酸 接 的 量 。 后 一 数值 很 有 用 ,因为 蛋白 质 纯化 方法 中 大 多 数 都 是 利用 硫酸 镁 来 分 级 , 即 先 加 硫酸 冬至 饱和 度 S, 将 出 现 的 沉淀 去 除 后 , 往 清 液 中 加 硫酸 锐 至 饱和 度 3， 将 沉淀 收集 。 所 得 沉淀 常 称 为 是 S.—S, 饱和 度 级 份 , 个 别 情 况 下 加 至 Si 后 不 去 沉淀 。 继续 加 硫酸 适 至 So 此 时 溶液 体积 中 包含 了 相当 体积 的 沉淀 , 计算 加 固体 硫酸 匀 的 量 时 要 扣除 沉淀 的 体积 。 加 固体 硫酸 锐 来 纯化 蛋白 质 , 用 多 饱和 度 方 法 来 计算 ,有 下 列 不 足 之 处 :1。 用 狗 饱 和 度 来 表示 硫酸 锐 浓 度 不 如 摩尔 浓度 精确 ,因为 溶液 的 摩尔 浓度 不 因 温度 而 变 ,但 用 免 饱和 度 时 即 有 影响 ;2. 在 一 般 的 文献 中 往往 只 有 20-25 的 多 饱和 度 表 ， 但 是 许多 蛋白 质 的 e 9 。 (2) 硫酸 铵 溶液 饱和 度 表 (25°C) 表 2( 续 ) tig po 10 | 20 | 25 | 30 | 33 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 80 | 90 | 100 0 56 |114 |144 [176 [196 |209 |243 |277 |313 |351 |390 |430 |472 {516 |561 |662 767 10 57 | 86 |118 |137 [150 [183 |216 |251 |288 |326 |365 |406 1449 |494 |592 |694 20 29 | 59 | 78 | 91 [123 |155 |189 [225 |262 |300 [340 |382 |424 |520 619 ye 25 30 | 49 | 61 | 93 |125 |158 |193 |230 |267 |307 |348 |390 |485 |583 # 30 19 | 30 | 62 | 94 |127 |162 |198 |235 |273 |314 [356 |449 (546 33 12 | 43 | 74 |107 |142 |177 [214 |252 |292 |333 |426 |522 4 35 31 | 63 | 94 |129 |164 |200 |238 {278 |319 |411 |506 40 31 | 63 | 97 |132 |168 j205 [245 |285 |375 {469 e 45 32 | 65 | 99 |134 |171 {210 |250 |339 {431 i 50 33 | 66 |101 |137 |176 |214 |302 |392 z 55 33 60 65 70 75 | 80 90 | | | | =: 始 浓度 : MHKAMRANRRH ME. RKRE: 加 固体 硫酸 贸 后 溶液 的 饱和 度 。 沉淀 往往 在 0%C 附 近 ;3. 硫酸 狠 的 比 容 被 假定 为 常数 并 等 于 它 饱和 时 的 数值 ,然而 , 当 硫 酸 铵 的 浓度 从 O 上 升 到 3.9mol/L 时 【〈 在 0°C 时 饱和 硫酸 铵 溶液 是 3.895mol/L)， 比 容 从 0.39ml 到 0.53ml/g, 在 变化 着 。 比 容 是 常数 假设 在 浓 硫 酸 镑 溶液 中 仅仅 引起 水 于 2 多 的 误差 ;然而 ,为 得 到 希望 的 浓度 而 加 浓 硫 酸 铵 溶液 的 误差 可 能 略 大 (4 驳 或 更 大 )。 表 3 给 出 硫酸 匀 的 重量 加 到 一 种 溶液 中 得 到 所 须 浓 度 。 表 4 给 出 加 入 3.8mol/L He BAERS GORE, 表 5 MROBW MARA MRA 3.8mol/L MRE Wikis BWRARR. 操作 注意 点 : CQ) 可 以 直接 往 蛋 白质 溶液 中 加 固体 硫酸 锐 ， 但 要 小 量 地 一 点 点 加 ， 加 时 要 充分 搅 拌 , 避 免 在 固体 表面 出 现 过 浓 的 硫酸 镁 而 将 不 该 析出 的 蛋白 质 析出 。 为 了 减轻 这 一 问题 ， 可 以 用 饱和 硫酸 匀 溶 液 来 分 级 〈 表 7)， 表 格 给 出 1 升 BRP MARIAM RRA ml 数 , 用 以 生成 所 需 的 饱和 百分数 混合 后 体积 的 变化 略 去 不 计 。 但 这 种 方法 站 人 了 水 ,将 溶 被 稀释 ,经 常会 影响 蛋白 质 的 产 率 。 《2) 蛋白 质 盐 析 时 要 考虑 到 溶液 的 pH, 将 蛋白 质 溶液 pH 调 至 等 电 点 附近 时 ,使 其 溶解 度 达 到 最 低 , 这 时 蛋 扎 质 最 易 析 出 , 产 率 也 最 高 « 10 * 00°0 I°sI [°9S 0 "6 Z81 691 L0Z bez 182 gle SSE 16¢ 87+ b9F 66+ SEs OLS $09 6£9 €L9 LOL 06°¢ 0"5L | 2°9€ | 00°0 Ah Oi Fey Bath A) Se 051 ORT PS LL L81 Srl 401 b7Z 781 (aa 097 8Iz SLI L672 Sz £17 €€€ | 067 | 8bZ 69€ | SZE} 787 COP 09€ LIE Tyt | S6E Ise LL Of | 98E (ats S9r 07+ 9bS 66 | St 18s £€€S | 98b 5I9 | 99S} 61S 669 | 66S Z55 789 | Z859.| S8S 00°0 O°SE 8°69 POI 61 | 807 ZhyZ 94Z Ole ere OLE 60+ tbh SLb LOS 6€S os*e | O9°E | OPE | OZ"E 00°0 (Se A 5 7°89 cor 9¢1 OLI £02 9857 04Z £0€ See 89E 00r 7Eb b9r S6b 00°¢ 00°0 如 "和 L°99 8°66 eel 991 66T Tez $97 967 87E 6SE T6€ ZzZt £Sb 08°2 00°0 Luce 和 59 L° L6 vet Z91T #61 927 8SZ 682 1Z¢ Z98 £8¢ 和 IT 6'e9 | ele | 00°0 1°56 | 9°29 | 六 08 tz1 | 2°€6 | 6°19 6s1 | sz | 6°16 o6t | 9st | 221 1zz |} 981 | £€S1 zsz_| “Iz] €8I sez | lez | £12 ble | 8Lz | bz bee | 805 | 222 cue | gee | z08 00°0 7° 0€ z°09 7°06 0z1 OsT 6L1 602 8EZ £97 09°Z | OFZ | OZ°Z | 00°Z | O8"T 00°0 9°62 T° 6s S°88 SIT Let 9LT $02 beZ 09"T 00°0 T° 62 1°8s 0°28 911 bot eZt 202 Or’t 00°0 9 ”87 T” /5 S°S8 bit trl OLI | oz*1 00°0 1°82 Z ”95 Z 了 8 ZII Ort 00°T PUGS MID RRE 1 EOE HO.0 | % OTB asl a GH SE OH AUT : 强 激 浙 © WAY GYR A 2 +R | 06°¢ 0° 00T 08°e 9°16 o9°¢ +" 76 0ty 和 48 0Z "8 7°78 00 和 O°LL 08°72 6°TL ) 09°72 8°99 0y "2Z o519 07°72 5 995 00°2 €°Ts 08 "1T Z “9 09°T T° Tr Ort 6°SE 0z°T 8 " 05 00"T L°Sz 00°0 08 "0 5"0Z £° Lz | 00°0 09°0 $°ST "55 | #° LZ | 00°0 0b°0 £°or 0"58 | 45 | O°2Z | 00°0 0z°0 BS IIT | 6°I8 | 0"y5 | 2°92 | 00 0 00°0 0°0 Hy, 08*0 | 0970 | op"0 | 07*"0 | 00°0 Hie 3S BA th BY % 11 ( 00 08°72 09°72 Or°z ORI sya GUS I Z/joug:¢ OE TAIWEs oR AS RICH YG T/Tom8 5 Ul +R +R 00°0 ty "85 | 00°0 AVL. | €°Ss OZ°Z | 00°27 | O8*T | O9*T | Ob*T | OZ°T | OO'T | 08°O | 09°0 | OF°O | 02°70 Re 1m CORRS Ye T/jows es VORA EP 0.0 6 00°0 00°0 Fs ae 0b 0Z "5 00°¢ 08°72 09°72 Or°z 07°72 00°72 08°T 09°T Ort 0z°T 00°T 03°0 09°0 0y “0 02"0 00 "0 0001 0Z0T 0y0I 0901 6201 8601 OIIT cell ZSTT 0LIT L8IT £021 8IZT ggzi 8r7l 7971 SLcl dr 0001 6T01 0801 8501 9201 6601 agai OcIT Lett cOrt 6LIT boll 6021 £771 Lect 6b1 “00°E 000! 6101 | O00T LEOT | 8I0T 950I | 950T 5&01L | SOT IT601 | ITL0T 80LI | 880[ SZII | +YOTT IfTt | 0211 OST | SEL ZET | OSTT 9811 | P9TT OO7T | 8ZI1 €1zI | TI6IT S771 | £0cI GE | 09°72 (yor) eS OG Sls eH} 000T 8I0T S850T csol 8901 P80 OOTT STII 6cLT eit ZSII 69TT I8Tl. Or°z 000T L101 5501 050T S90T T801 9601 0TII1 bert CET 6rIT I9II 07°7 000T 9TO0I ceor 8r Ol £901 LLOT 1601 50TT 8IITI rs tril 00°7 000T stor 0501 bror ZL50T 0Z01T £801 S601 90ITI 09°T 0001 LI0T 8Z0T Zy0T bSOl £901 6L01 0601 0y “TI SA WA SAY A GH 2 A 2 A PU + SE °F 204 Sy Bd GH Bk 2S SH 0Z "1 0001 TIOI | O00T IZ0I | O10! | OOOT 0v*0-| 0Z°0 | 00°0 Ay, “4 BH 06°¢ 08 09 0 07°E 00 "8 08°? 09°72 Or? 13 CMAN MIA TIlom8.e Ut SAS BUY MURA WY T/jourg-¢ I THUG TR 000! Ore 86rT | O00T 0Z "8 $661 | Teel | O00T 00°¢ 88yZz | TOOT | ShZT | OOOT 08 "7Z 6467 | 6861 | Ort | 86TT | OOOT 09°72 69rE | 9IEZ | OPLT | POET | HOTT | OOOT Or°z 9S6E | 797 | PRET | O6ST | BZET | IyIT | OOOT vs 07°7 z Ipbp | S962 | 4ZZZ | SBLT | TOT | O8ZT | ZZTT | OOOT 00°72 ZZ6bh | LEZE | 69b7 | 6L61 | ZSOLT | GIT | yzT | BOTT | OOOT 08"T Z0k5 | 9095 | 6OLZ | TLTZ | ELST | 255T | 598T | 9TZT | 460L | 0001 09°T 8L485 | P76E | 8y6Z | E9EZ | ELT | FOOT | OBPT | HZET | FOTT | 880I | OOOT : Or°t OSE9 | ObZh | SBTE | ESsz | TELZ | TEST | SOOT | 08S8T | O6ZT | OLIT | O8OT | 000T 07°T 8189 | ZSSb | OZHE | THLZ | 68ZZ | 996T | ETLT | SEST | SBET | Z9ZT | OOTT | HLOT | OOOT 00°T Z8ZL | Z98b | ZSOE | L767 | HHT | 6607 | TIy8T | OP9T | 6LET | SPET | GEZT | ZIT | 890T | OOOT 08°0 tte | gots | ease | ztte | 865z | zezz | eset | EbZT | ELST | SSbT | LTE | 6TZL\| sett | 90t | O0OT 09°0 9618 | ZLbS | TIT | #6zZE | TSZz | E97 | ZZ0Z | 9%y8T | SOOT | LIST | POET | T6ZE | ZOZT | 9ZTT | 650I | O0OT 0y "0 9y98 | €LL5 | LS8h | OLHE | ZO6Z | 8g65Z | 98TZ | LOOT | LSLT | TI09T | IT | 798ST | 89ZT | 48IT | LITT | SSOT | OOOT 07"0 1606 | 0209 ysoe | IS0€ | ITz9z | 86zZ | LhO7 | LpST | ESOT | LEST | ZEbT | EEET | BHZT | HLTT | GOTT | TsoT | 0001 00°0 iM Orr's | 07 5 0g°z | 09"z | op"z | Oz*z | OO'Z | O8'T | O9*T | OFT | OZ°T | OO'T | 08°0 | 09°0 | OFO | O2°0 | 00°0 LI (jar) WPA CORRES BI 机 /oug'e YOR MRE LIP O.0 9% 表 7 用 饱和 硫酸 铵 溶液 分 级 硫酸 铵 制备 中 的 初始 浓度 (饱和 百分数 ) 5 52.6 10 | 111/55.8 所 需 15 .| 177| 118158.8 硫 8B 20 | 250| 188} 125|62.5 so 的 25 | 333| 267| 200| 133|66.7 最 $e 30 | 429| 357| 2861 214 Py rE 35 | 559] 4621 385] 308| 2311 154176.9 = d Ms 40 | 667! 583| 500] 417] 333] 250| 167/83.3 8 45 | 818| 727| 637| 546| 455] 364] 273 | % 50 |iooo| 900] soo| 700] 600] 5oo| 400 55 |1222/1111/1000} 889) 778) 667) 556 60 |1500|1375|1250|1125|1000| 875) 750 | 125 | 571) 429| 143 833| 667 FA 333) 167 65 = |185711714]157 1/1429/1286}1143)1000 70 = |2333)2 167|2001/1833/1667|1500}1333)1167)1000 75 — |3000)2800|2600|2400)2200|2000)1800/1600/1400)1200|1000) 800) 600; 400; 200 80 = |4000/3750/3500)3250)3000}27 50)2500)2250/2000)1750)1500/1250)1000) 750) 500; 250 85 ”|5667|5333|5000|4667|4333|4000|3667|3333 667! 333 3000 wire 2000/1667|1333)1000 90 |9000/8500/8000}7500/7000)6500)6000!5500/5000)450014000 :和 大 2500|2000 aa peel 500 (3) MBE Ta GRA RA 8). MRT DAH, 0°C 和 25°C 时 1000 ml KAMA He MD AIA 706.8 和 766.88, 4RARBRME 25°C 加 入 固体 硫 BACAWAN, UHMRRBSSHHH OCH, RMRRLANTL, ANSA RRERNATRLS, FP RRSEK., MUOERRRARTN, ERS ix. 8 不 同 温度 时 的 饱和 硫酸 铵 溶液 ECC) 0 10 20 25 30 每 1000g 水 中 含 硫酸 铵 摩尔 数 5.35 5.53 5.73 5.82 5.91 ‘ent KARAM! — 796.8 730.5 755.8 766.8 777.5 重量 百分数 41.42 42.22 43.09 43.47 43.85 SHAWMMARSRBR Re 数 514.8 525.2 536.5 541.2 545.9 饱和 溶液 摩尔 浓度 3.90 3.97 4.06 4.10 4.13 » 45 = 二 、 其 他 盐 的 盐 析 除 硫酸 锐 外 ,还 有 其 他 盐 可 用 来 盐 析 和 蛋白质 。 如 氧化 钠 ,硫酸 钠 ， 硫 酸 镁 等 等 。 这 些 盐 一 般 都 不 呈 氧 化 还 原 性 质 , 还 都 是 中 性 盐 。 其 中 用 得 最 多 的 是 氯 化 钠 6 用 氯 化 钠 做 盐 析 剂 有 许多 优点 。 它 价 廉 ,容易 纯化 ,医药 工业 中 有 药 用 氧化 钠 ， 可 用 于 药 用 蛋白 质 的 分 离 。 同 时 它 的 溶解 度 随 温度 变化 只 有 很 小 的 变化 ,因此 从 室温 降 至 4% 左右 时 不 太 会 析出 盐 结晶 。 它 的 阴阳 离子 都 是 一 价 的 ,因此 离子 强度 与 浓度 是 相同 的 。 这 些 优 点 使 得 它 是 蛋白 质 盐 析 剂 中 仅 次 于 硫酸 贸 的 常用 试剂 。 氧化 钠 的 缺点 是 溶解 度 不 够 高 ， 在 它 的 饱和 溶 沪 中 还 有 些 蛋白 质 不 能 沉淀 出 来 。 其 他 的 盐 相 对 讲 用 得 很 少 。 酶 或 蛋白 质 的 结晶 kK 企 (中 国 科 学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 》 nllg By 一 个 酶 或 蛋白 质 制剂 , 在 经 历 组 织 破 碎 、 提 取 `\ 分 离 和 精制 等 步 又 之 后 ,有 时 还 需要 结 Bo ;结晶 作用 对 蛋白 质 来 讲 含有 四 项 重要 意义 : 人 六 作为 一 个 纯化 方法 ;(2) 作为 二 个 均一 性 证 据 ; GG) 作为 一 个 稳定 的 贮存 方法 ; (4) 长 成 单 晶 后 可 提供 作 开 射线 衍射 分 析 用 材料 。 二 、 基 本 原理 蛋白 质 结晶 原理 与 一 般 小 分 子 的 结晶 原理 略 同 。 简单 地 讲 ,结晶 过 程 类 似 凝 聚 过 程 。 就 是 在 一 定 的 溶剂 条 件 下 , 竭力 降低 分 散 相 的 深 _ 解 度 , 使 溶质 处 于 过 饱和 状态 。 在 合适 的 过 饱和 状态 下 ,溶质 分 子 通过 扩散 .旋转 、 磁 撞 等 运动 方式 ,形成 晶 核 。 结 晶 时 ,溶质 分 子 通过 适当 途径 在 恰好 成 90 度 角 时 ,以 相互 对 撞 的 作用 方式 有 序 而 反复 地 堆砌 到 唱 核 上 。 于 是 , 晶 核 长 大 ,晶体 形成 。 晶 体 从 溶 小 中 析出 。 ”结晶 时 ,蛋白 质 与 普通 小 分 子 的 主要 差别 是 ,分子 的 不 稳定 性 和 敏感 性 较 大 ， 必 有 需 维 持 其 基本 水 合 状态 处 于 或 接近 于 生理 pH 及 温度 。 保 持 蛋 白质 分 子 的 天 然 状态 对 蛋白 质 的 结晶 至 关 重 要 。 蛋白 质 结晶 作用 由 两 个 因素 决定 。 一 个 是 它 的 溶解 度 即 热力 学 平衡 因素 ; 另 一 个 是 动力 学 因素 , 即 控制 晶 核 过 程 和 晶 核 生长 。 三 、 结 ia & 蛋白 质 溶解 度 理论 是 摸索 蛋白 质 结晶 条 件 的 路 标 。 下 面 讨论 一 些 因 素 。 Q) 沉淀 剂 这 是 改变 蛋白 质 溶解 度 最 重要 也 是 最 普遍 采用 的 方法 。 包 括 盐 类 和 各 种 有 机 溶剂 。 盐 类 中 最 突出 的 便 是 硫酸 贸 。 硫 酸 锐 具 有 强 的 盐 析 能 力 ， 同 时 在 水 中 深 解 度 很 高 。 大 多 数 盐 类 影响 蛋白 质 的 溶解 度 是 起 盐 析 或 盐 溶 作用 。 有 机 深 剂 也 是 一 种 沉 淀 州 ， 用 于 蛋白 质 结晶 的 通常 是 乙醇 和 丙酮 。 近 来 发 现 两 种 有 机 物 是 理想 的 使 蛋白 质 结 cn, weer CB (PEG) 和 2- 甲 基 -2，4- 戊 二 醇 ( 简 称 MPD)， 有 很 多 实例 报 io (2) 蛋白 质 纯度 一般 讲 ,纯度 愈 高 愈 容易 结晶 。 晚 近 一 些 工作 指出 ,均一 性 提高 对 晶体 大 小 \ 加快 结晶 过 程 以 及 大 单 晶 培养 有 很 大 影响 。 但 50 年 代 以 前 ， 很 多 结晶 蛋 所 质 是 从 蛋白 质 混合 物 中 获得 的 ， 有 的 甚至 是 粗 提 息 ， 说 明 结 晶 作 用 对 蛋白 质 纯度 有 时 要 RAB Alt. 当 受 试 蛋白 质 达到 比较 纯 的 程度 时 ;就 可 作 结 晶 试 验 。 结 晶 ， 也 含有 进 一 步 分 离 纯化 的 目的 。 (3) 蛋白 质 过 饱和 程度 蛋白质 过 饱和 程度 高 ， 结 量 容易 形成 。 但 过 饱和 程度 很 高 时 析出 的 晶体 多 数 是 微小 晶体 。 欲 获得 较 大 晶体 ， 需 经 适当 稀释 。 通 常 球 蛋白 的 浓度 采用 10 一 50mg/ml。 很 少 采 用 浓度 低 于 lmgy/ml 的 。 (4) BK 晶 核 数 在 结晶 开始 ， 也 就 是 当 蛋 白质 达到 过 饱和 点 时 就 有 可 能 形成 。 控制 晶 核 数 的 方法 往往 是 调整 过 饱和 度 。 一 般 讲 , 晶 核 数 愈 少 愈 容易 生成 犬 晶体 。 (5) pH 很 多 蛋白 质 对 pH 相当 敏感 。pEH 值 改变 , 晶 型 也 随 着 改变 。 有 时 ,无 定形 沉淀 、 微 晶 和 大 单 晶 之 间 的 pH 差别 只 有 0.2pH 单位 ,或 者 更 小 。 因 此 , 必须 选 定 恰 SBM Ro = (6) 温度 ”这 是 影响 蛋白 质 溶解 度 的 重要 参数 之 一 。 大 多 数 球状 蛋白 质 在 高 盐 浓 ET, 20-30C 时 ,溶解 度 最 小 。 这 正 是 盐 析 法 结晶 常 采用 的 温度 。 相 反 , 在 低 离子 强度 下 ,4sC 时 ,大 多 数 蛋白 质 溶解 度 最 小 。 已 知 的 蛋白 质 结晶 温度 在 0 一 40%C Zi, Bix 择 4°C WR 25°C 温 箱 进行 结晶 。 (7) 金属 离子 和 离子 强度 “离子 强度 对 很 多 球 蛋 白 溶解 度 影响 极 大 。 一 些 金属 离 子 及 无 机 化 合 物 常 党 有 利于 蛋白 质 晶体 的 形成 。 如 胰岛 素 RIA. Pe RRS EY A. 超 氧化 物 歧化 酶 等 。 (8) Nil 晶体 形成 需要 有 充分 时 间 。 从 几 个 小 时 到 拖 个 月 不 等 ， 也 有 近 一 年 的 。 蛋 白质 分 子 庞 大 所 以 结晶 过 程 缓慢 。 从 方法 上 讲 , 盐 析 法 结晶 可 能 快 些 , 几 天 或 几 汪 时 。 但 晶体 质量 以 及 大 小 ,肯定 受 生 长 速度 支配 , 即 愈 慢 愈 好 , 愈 慢 长 得 愈 大 。 (9 其 他 ”结晶 条 件 还 受 微量 杂质 气泡 ` 还 原 剂 ,甚至 底 物 、 辅 酶 \ 压 力 \ 种 属 来 源 等 等 影响 ,这些 都 必须 给 予 重视 和 考虑 。 WS. 2a ue Fe RAT EE A AA AER eo RAE MIL Be 1. 盐 析 法 盐 析 是 通过 加 盐 降低 蛋白 质 溶 解 度 , 使 其 从 溶解 状态 转变 成 过 饱和 状态 ,于 是 以 结晶 形式 离 析 。 结晶 用 盐 如 下。 TPR Be. TBA TREN. TRAE 磷酸 钠 、 磷 酸 钾 BULAN. SUC BU HGR. Aa 硫酸 镁 十 六 烷 基 三 甲 基 贸 盐 聚 乙 二 醇 1000;4000,6000,15000 Ri. Ake A He 甲酸 钠 e 18 ° (1) 加 固体 盐 “将 盐 于 研 态 中 研 细 待 用 。 然 后 取 少 量 受 试 液 作 预 试 。 称 取 定 量 盐 ， 分 批 加 入 。 每 次 加 盐 应 边 加 边 搅动 溶液 ,防止 局 部 盐 浓 度 过 高 。 搅 动 切 鼠 激 烈 ,特别 要 避 免 出 现 泡沫 。 待 盐 溶解 后 再 加 下 一 批 。 每 次 盐 量 应 酌 量 减少 。 如 发 觉 盐 溶解 速度 明显 变 慢 或 因 局 部 盐 浓度 高 而 产生 的 沉淀 不 易 重 新 溶解 ， 此 时 应 立即 停止 加 盐 。 待 沉淀 彻底 溶 解 后 , 静 置 片刻 。 观 察 溶液 有 否 出 现 浊 光 。 若 有 轻微 浊 光 , 记 下 所 加 盐 量 。 放 置 。 放 置 后 溢 液 很 快 变 浑 并 出 现 沉淀 颗粒 ， 说 明 盐 量 已 过 多 。 待 下 批 实验 时 校正 。 本 法 以 维持 浊 度 不 消失 为 度 。 放 置 时 避免 振 动 。 实例 : 兔 肌 醛 缩 酶 结晶 。 SVL 50% 饱和 度 硫酸 镑 溶液 抽 提 ,去 除 沉 淀 。 清 液 中 逐 量 加 人 固体 硫酸 锐 ， 至 达 52% RARE, KH HRB. TH. (2) 加 饱和 盐 溶液 ”本 法 即 以 饱和 盐 溶液 代替 固体 盐 。 优 点 是 溶液 与 溶液 易于 混 和 ,各 免 局 部 盐 浓 度 过 高 ,同时 可 免除 气泡 产生 。 其 他 注意 事项 同 (1)。 实例 : 和 牛 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 A 结 晶 。 每 100g WLI HF, MM 150ml 水 使 溶解 。 所 得 溶液 中 逐 滴 加 和 人 饱和 硫酸 铵 溶液 50 mle 加 入 Smol/L NaOH 调节 溶液 pH 值 至 5.06-20 一 25%c 放置 2 天。 长 针 状 结晶 过 渐 Ems (3) 透析 ”市 售 透 析 袋 ， 截 取 所 需 长 度 。 经 Immol/L EDTA 钠 盐 溶液 或 1% NaHCO, 溶液 煮沸 处 理 10 分 钟 ,去 除 所 含 杂质 ,然后 用 去 离子 水 洗 净 s 淄 人 结晶 用 缓冲 液 中 。 使 用 前 结扎 一 端 并 固定 ， 用 歇 气 或 灌注 溶液 加 压 下 检查 袋 壁 有 无 漏洞 。 之 后 往 和 人 待 试 咨 液 ,结扎 另 一 端 。 浸 入 已 配制 好 的 结晶 盐 溶 恋 。 内 外 液 的 体积 比 一 般 为 1:10。 结 唱 过 程 有 时 需 更 换 外 液 几 次 。 实例 : BEARERS 取 纯 化 后 盐 析 滤 饼 100g, 加 150ml 蒸馏 水 使 溶解 。 深 液 装 人 透析 袋 。 浸 人 结晶 用 盐 次 液 中 。. 移 至 0 一 5%C 透析 。 外 透 液 每 喇 12 一 24 NBR, BRN BRL ER BB LR. NBM see (4) H#RBESTERAREE “本 法 利用 蛋白 质 在 低温 时 溶解 度 高 ， 逐 步 升 高 温度 溶解 度 降低 的 性 质 , 使 其 从 溶解 状态 很 快 转变 成 过 饱和 状态 ,并 以 结晶 形式 析出 。 操 作 时 , 先 将 受 试 蛋白 质 用 硫酸 贸 沉 淀 下 来 ,并 在 低温 离心 。 离 心 所 得 盐 析 物 再 在 0%C HB 步 降低 浓度 的 硫酸 贸 咨 液 抽 提 ， 抽 提 沪 然后 置 室温 下 使 结晶 。 已 有 一 百 多 种 蛋白 质 按 此 法 得 到 了 结晶 。 和 蛋白 用 量 约 10mge 方法 实例 参见 葡萄 糖 淀粉 酶 的 结晶 。 (5) RRB 溶剂 通常 指 水 。 即 通过 缓慢 蒸发 提高 盐 浓度 。 容 器 一 般 用 Parafilm 封口 ,然后 在 上 用 针 开 孔 , 放 置 , 令 其 浓缩 。 实例 : 肽 酶 A 结 晶 。 9mg/ml 蛋白 质 溶 液 ,内 含 30 多 饱和 度 硫 酸 锐 ，0.15mol/L 醋酸 钠 ，pH4.4, 于 小 烧 ' 杯 中 。 杯 口 封闭 ,其 上 端 置 1 毛细 琉 管 ,溶液 通过 缓慢 蒸发 产生 结晶 。 (6) 微量 样品 ”可 参照 自由 界面 扩散 法 、 微 量 扩散 法 ,微量 透析 法 进行 。 2. 有 机 溶剂 有 机 溶剂 分 子 与 水 结合 后 便 充 当 盐 离子 角色 作用 ,使 大 多 数 蛋白 质 的 溶解 度 降 低 其 © 19-¢ 优点 是 有 机 溶剂 分 电 常数 小 ,因而 蛋白 质 水 溶 该 由 于 它 的 参 人 ,导致 溶 该 介 电 常 数 下 降 ， 从 而 使 蛋白 质 结 晶 析 出 。 使 用 时 有 两 点 必须 注意 : 第 一 ,有 机 溶剂 浓度 不 宜 过 高 ; 第 二 ， MAN DRREDS. NABAAS END ABARTH, S25 BERR RE AE 剂 以 预 冷 至 OC 左右 后 加 和 蛋白质 水 海流 中 为 好 。 第 用 有 机 盗 剂 如 下 。 乙醇 Ae © 2- 甲 基 -2;4- 戊 二 醇 (MPD) 二 氧 杂 环 己 烷 丙酮 TR Cia 二 甲 基 亚 砚 255=- 已 工 醇 甲醇 ai the 1,3-A_— cx- 了 本 内 酯 (1:3- 丁 内 酯 ) | Parafilm: _Parafilm 蛋白 质 溶液 zit ‘cise 蛋白 质 溶液 一 沉淀 剂 小 试管 i ， oa (a) 自 由 界面 扩散 法 (b) 微 量 透析 平衡 法 图 1 (1) 直接 加 有 机 溶剂 加 有 机 溶剂 时 ,应 边 加 边 搅动 蛋白 质 溶液 , 巨 应 注意 流速 。 以 逐渐 加 入 为 好 。 可 借用 分 液 漏 斗 或 滴定 管 滴 加 。 须 随 时 测量 温度 ， 以 观察 混合 热 产 A2 蒸汽 扩散 法 装置 生 。 另 一 方法 是 先 将 蛋白 质 溶液 冷冻 成 固态 ,然后 加 入 有 机 溶剂 。 待 水 溶液 慢 慢 咒 化 ， 蛋 Fy it (EI REE Bho es 20 = 实例 : 牛 胰 核 糖 该 酸 酶 A 结 晶 。 取 订 冻 蛋 白质 溶液 先 融 化 其 一 部 分 ， 然 后 将 醇 (MPD) 溢 液 边 搅动 边 缓 缓 加 和 样品 中 ,使 MPD 浓度 达到 55%。 置 于 24-25 恒温 槛 。 当 在 部 分 已 融化 的 样品 中 添加 有 机 溶剂 时 ,应 充分 搅拌 ,以 尽量 避免 蛋白 质 分 子 直接 与 无 水 有 机 溶剂 接触 ， 因 为 混合 热 会 使 温度 上 升 。 (2) 气体 平衡 扩散 ”这 是 利用 挥发 性 溶剂 特性 ， 通 过 气体 扩散 而 将 溶剂 加 到 蛋白 质 溶液 中 的 方法 。 这 样 做 第 一 可 缩短 结晶 时 间 ，, 第 二 ,样品 溶液 与 有 机 深 剂 分 别 置 于 密闭 容器 中 如 于 燥 器 中 ,不 像 方法 (1) 容 易 生 成 无 定形 。 (3) 固体 融化 固体 系 指 经 过 真空 冷冻 于 燥 后 的 蛋白 质 。 方 法 : 先 将 有 机 溶剂 与 水 溶液 1: 1 混合 ,冷却 。 然 后 投入 上 述 干粉 ， er 一 般 情 形 下 ,蛋白 质 干 粉 由 浸润 膨 胀 而 成 粘 稠 状 , 再 由 粘 稠 状 转 成 结晶 。 (4) 混合 溶剂 抽 提 “实例 , 脲 酶 结晶 。 方 法 : 把 重 蒸 过 的 丙酮 150ml, 于 22sC 时 以 蒸馏 水 稀释 至 500ml。 将 此 滚 倒 人 含 100g 刀 豆 粉 的 烧杯 中 ， 搅 拌 3 一 4 分 钟 ， 用 滤纸 过 泪 。 过 滤 先 在 室温 进行 ,至 滤 出 150ml .时 ,连同 剩余 部 分 移 至 2 一 2.5%C 冷 室 ， 继 续 过 滤 。 次 日 即 见 结晶 在 滤液 中 析出 。 3. 等 电 点 结晶 蛋白 质 溶解 度 明 显 受 溶液 pH 影响 。 当 蛋白 质 净 电 和 荷 等 于 零 即 在 等 电 点 近 侧 时 , 其 溶解 度 往往 最 小 。 这 一 性 质 可 用 作 等 电 点 结晶 。 实例 : 溶菌 酶 结晶 。 ，50mg/ml 溶菌 酶 水 溶 沾 ,10ml。 加 入 0.5g 氧化 钠 ,使 完全 溶解 。 以 NaOH 调节 pH #:10.5,4%° Ro 4. 脱盐 结晶 球 蛋 白 易 咨 于 盐 溶液 而 几乎 不 溶 于 水 。 这 一 性 质 可 用 作 于 结晶 。 先 将 蛋白 质 咨 于 适 当 缓冲 液 , 然 后 分 别 对 去 离子 水 和 稀 缓 冲 液 透析 。 实例 : 生 胰 羧 肽 酶 B 结晶 。 经 纯化 后 的 羧 肽 酶 原 B, 溶 于 pH8，0.1mol/ 工 KPO,， 蛋 白质 浓度 10mg/ml。 加 适 量 胰 蛋 白 酶 ( 胰 蛋 白 酶 : 羧 肽 酶 原 B 的 摩尔 比 为 1:10),37%cC ,保温 活化 。 5 小 时 后 , 混合 液 对 pH8, -0.01mol/L Tris-HCl 透析 ,4%C。 几 小 时 后 结晶 开始 。 连 续 透 析 48 小 时 ,并 更 换 外 透 流 ,使 结晶 完全 。 重 结晶 时 ,将 离心 所 得 晶体 加 少量 lmol/L 氧化 钠 使 盗 , 离 心 去 不 溶 物 。 清 液 再 对 上 述 pH8，0.01mol/ 工 Tris-HCl tT, 4°C,4 晶 很 快 形成 。 5. 温差 结晶 有 些 蛋 白质 在 低 离子 强度 下 ,对 温度 特别 敏感 ,其 溶解 度 随 温 度 变 化 极 大 。 因 此 可 用 温差 法 使 其 结晶 。 实例 : 25 一 >20sC 猪 胰 弹 性 蛋白 酶 结晶 。 蛋白 质 浓度 9mg/ml;, 内 含 pH5.5 0.05mol/L 柠檬 酸 钠 缓冲 流 。 温 度 逐 渐 由 25%C 降 » Ae 320, 晶体 在 24 小 时 内 形成 。 实例 : 4 一 >25%C 大 肠 杆菌 碱 性 磷酸 酯 酶 结晶 。 蛋白 质 浓度 20 一 25mg/ml, 内 含 56% TAAIRE RR, pH8.0, 0.05mol/L Tris= Hol: 缓冲 液 及 0.01mol/ 工 MgCl. Wiki Aw M 4°C FHF 25°C 6. 金属 离子 实例 : 硫 氧 还 蛋白 (thioredoxin) 结晶 。 本 制剂 从 pH3.5 到 9.0, 各 种 结晶 试验 均 未 获 成 功 。 当 蛋白 质 浓 度 为 mg/jml 时 ， 用 微 量 透 析 法 ,4%C，, 对 外 透 液 (pH45，0.01mol/L 醋酸 钠 缓冲 液 含 0.001m6ljL a 9 20— 25 匈 乙醇) 透析 2 天 后 ,晶体 出 现 。 S .% Boast 中 下 1] A. McPherson., Methods in Enzymology, H. W. bolas C. H. Hirs, and S. N. Timasheff, ed, Vol. 114, Academic Press, New York (1985) 112. {2] J. B. Sumner and G. F. Somers., “Chemistry and Methods of Enzymes” 2nd ed, Academic Press, New York (1947). {3] J. H. Northrop, M. Kunitz and R. M. Herriott., “Crystalline Enzymes” Columbia Univ. Press, New York (1948). Sia EP et {4] K. Bailey. Trans. Faraday Soc, 38, 186(1942). | £5] T. B. Osborne.,..dm. Chem. J., 14, 662(1892). ; [6] R. K. Scopes., “Protein Purification”, Springer-Verlag, New York (1982). ‘ [7] ™M. Dixon and E. C. Webb., “Enzymes”, 3rd ed, Longman Group, “London (1979). 4 {8] A. McPherson, Jr., Methods of Biochemical analysis, Vol. 23 (1976), 272. 法 [9] R. Czok and T. Bucher., Advance Protein Chemistry, 15, 315(1960). {10] W. B. Jakoby., Aval. Biochem., 26, 295(1968). Methods in Enzymology, Vol. 22, p. 248 OT, { 11] R. Henderson., Nature, 287, 490(1980). ip. & CLs g12] C. W. Carter and C. W. Carter, Jr., J. Biol. Chem., 254, 12219(1979). wus 22" '* ie 让 went 4 => ha in, WT hg ile - ~~ * 的 -一 二 ad pe o OF 图 版 vu F - WHRUREB: He $B *F FR 1955195389, - 尖顶 蚌 闭 壳 肌 原 肌 球 蛋白 : ”生理 学 报 ?1955 19,389。 未 化 兔 原 肌 球 蛋白 : 生化 学 报 ?1958>1287 。 兔 皮 原 胶原 : He FEE Hg 51956 520,164, 。 葡萄 糖 淀粉 酶 ;: HAWS IR,1976,16,200, ‘ 物 物理 进展 ,1981)155。 immer: (Geib, 1973,15,281, } 。 天 花粉 蛋白 科学 通报 ,1978，176 一 178。 . 半 夏 蛋白 ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ;1981>13，77 。 - Mee RRMA SR EDC 54 WF FIR > 1981,13,237, . 蛇 胰 岛 素 中 国 科 学 B 辑 ?1981;7， 图 版 。 - RD 科学 通报 ,1982>18,1142。 2. 白 链 胰岛 素 ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ?198214,29。 .和 白 链 胰 高 血糖 素 “生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ?1982?14;23。 . 牛 胰 高 血糖 素 ( 人 工 合成 ) ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ,1975;7*119。 。 PERS MIRA ”动物 学 研究 ;1981?2，No. 4 增刊 。 . Ree kes B Biochemistry ,1962,1,1069. . BEQRRC(4AHL) «sd. Biol. Chem.,1948,173,591. . RAZEA J. Mol.Biol.,1970,54,387. . EKRBA ‘J. Mol. Biol., 1969, 44, 569. . FREERRARRM sd. Biol. Chem., 1970, 245, 4976. : 。 核 糖 核酸 酶 ( 牛 ) “Crystalline Enzymes” (Northrop, Kunitz, Herriott, 1948), . 22。 牛 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 “Crystalline Enzymes” (Northrop, Kunitz Herriott, 1948), % 23. +RRAEAS “Crystalline Enzymes” (Northrop, Kunitz Herriott, 1948), 24. REAR “Crystalline Enzymes” (Northrop, Kunitz Herriott, 1948), 25. 溶菌 酶 “Enzymes” (M. Dixon .and E. C. Webb), 1979. ; 26. 猪 胰 弹性 蛋白 酶 “Enzymes” (M. Dixon and E. C. Webb), 1979. 27. BERSERK “Enzymes” (M. Dixon and E. C. Webb), 1979. 28. 羊 胰 和 蛋白酶 ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 *1966632。 29) 猪 胰 糜 让 蛋 白 酶 ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ;1963》3,191。 30. GRRREAS ”生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ,1986;18;448。 31. 绿豆 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ?19633)229。 32, 绿豆 TI1+ HT rh BAL B H4,1985,(7): 628, 33. RRMAR Sct. Sin., 1979, 22, 1443. 34。 和 牛 胰岛 素 ( 人 工 合成 ) ”中 国 科 学 ,1965，No. 11. 35. 8RSK FREARAAH1I81, on KN NA em wD 属 hu ys — © ee ee ee wo ontnu 人 W Nw = © ° 28 e ma OT i tf & (中 国 科 学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 7 生物 化 学 工作 者 为 了 去 除 蛋 白质 制剂 中 的 盐 或 在 分 离 \ 分 析 蛋 白质 \ 酶 或 其 他 生物 大 分 子 而 需要 与 特定 的 缓冲 液 平 衡 时 ， 首 先 想到 透析 。 透 析 方 法 的 核心 部 件 是 一 个 半 透 膜 飞 透析 膜 ), 一 般 做 成 袋 状 , 被 透析 样品 装 于 袋 内 ， 透 析 时 允许 溶剂 和 小 分 子 物 质 通过 透析 嵌 进 和 人 透析 外 沪 , 大 分 子 溶 质 如 蛋白 质 \ 酶 等 留 在 袋 内 。 驱 使 小 分 子 物 质 通过 透析 膜 的 力 是 扩散 压 * 扩 散 压 是 由 于 横 跨 膜 的 浓度 梯度 形成 的 。 在 这 种 力 的 作用 下 ,小 分 子 不 断 通 过 模 直 至 浓度 梯度 为 零 。 将 扩散 方程 dt iSitn 2408 (2) at (1) x 改写 为 dS Cu 一 (Ci | 7 AGiem Gi Mu (2) IS 为 在 时 间 d 内 通过 透析 膜 的 物质 的 量 ; 4 为 透析 膜 的 面积 : C。 和 C, 为 透析 膜 两 侧 溶 质 的 浓度 ;AX 为 透析 膜 的 厚度 ; & 为 透析 膜 对 给 定 的 盗 质 的 半 透 性 常数 。 由 式 (2) 可 知 ,透析 速度 与 透析 膜 的 面积 \ 溶 质 的 浓度 梯度 成 正比 ， 与 透析 膜 的 厚度 成 反比 。 很 多 透析 装置 的 设计 (下 面 讨 论 );, 都 是 绅 在 努力 改善 上 述 一 个 或 多 小 参数 以 提高 透析 速度 。 此 外 ,透析 速度 还 直接 受 温度 影响 。 一 般 在 *%C 左 右 透 析 。 如 果 样 品 稳定 ,在 室温 透析 ,速度 会 显著 提高 。 自从 Thomas Graham (1861) 发 明 透 析 方 法 至 今 已 有 一 百 多 年 了 ， 人 们 对 透析 膜 的 制备 .透析 装置 的 设计 以 及 透析 方法 的 应 用 进行 不 断 的 研究 ,推陈出新 ， 是 生物 化 学 实 验 室 中 始终 处 于 不 衰 的 技术 之 一 。 一 、 常 规 透 析 方法 吕 2 常规 透析 方法 适用 于 被 透析 样品 溶液 体积 1 至 数 百 ml。 根据 需要 保留 的 分 子 量 大 小 选择 透析 绕 。 现 在 市 售 的 透析 袋 ,一 般 都 是 由 再 生 纤维 素 做 成 的 ,商品 名 Spectra/Por, Spectra/Por 透析 袋 不 带 有 固定 的 电荷 ,对 绝 大 部 分 溶质 没有 吸附 作用 , 像 是 一 个 简单 的 筛子 。 不 同型 号 的 透析 袋 其 微 孔 大 小 不 一 样 ， 截 留 分 子 量 〈( 即 留 在 透析 绕 内 的 最 小 分 子 量 , 缩写 为 MWCO) 从 1000 到 50 000( 表 1), Spectra/Por 1、z、3 和 4 以 干 的 成 卷 包 装 出 售 ,为 防止 变 脆 , 在 出 厂 前 已 用 10 匈 甘油 处 理 过 。Spectra/Por 6 是 淄 在 含有 1% # 甲酸 钠 防 腐 液 中 出 售 。 应 该 指出 ，、MWCO 值 仅 是 一 个 参考 值 ， 在 实际 应 用 中 很 多 因素 e 29 。 表 1 一 种 常用 透析 狼 型 “号 截留 分 子 量 4 a Spectra/Por 1 6 000—8 000 23 14.6 32 20.4 50 : 31.8 Spectra/Por 2 12 000—14 000 10 6.4 25 15.9 45 28.6 Spectra/Por 3 35 000 18 11.5 45 28.6 Spectra/Por 4 12 000—14 000 25 ISSO Clowest price) 45 28.6 Spectra/Por 6 1000 12 7.6 38 24.2 2 000 12 7.6 38 24.2 35 00 18 11.5 10 000 10 6.4 25 000 12 7.6 28 17.8 50 000 12 7.6 34 21.6 半 微 量 管 12 000 一 14.000 4 23 / Sea FA . PTET BE A ME — SE PT EE HT RR. Spectra/Por 1 一 4 除 含 有 甘油 外 ， 还 有 很 少量 杂质 如 微量 重金 属 和 硫化 物 等 。 —ik 在 用 前 用 蒸馏 水 衣 泡 一 定时 间 , 然后 用 蒸馏 水 洗 数 次 就 可 以 了 。 但 在 某 些 实验 中 ;如 果 甘 油 、 重 金属 离子 和 硫化 物 可 能 对 结果 有 影响 ,这 时 需要 在 透析 前 彻底 除去 这 些 杂 质 。 王 般 R2 透析 袋 (不 含 重金 属 和 硫化 物 ) 2 BER 型 号 BoD FH ae ~~ | B 3} LY Spectra/Por 7 1000 12 7.6 18 , 155 38 24.2 45 28.6 10 000 10 6.4 32 20.4 15 000 10 6.4 32 ‘ 20.4 25 000 12 7.6 28 17.8 50 000 12 7.6 28 17.8 « 30 。 50% 乙醇 和 10mmol/L 碳酸 氨 钠 各 浸泡 两 次 ,再 用 mmol/L EDTA 处 理 ， 最 后 用 蒸 馏 水 冲洗 即 可 。 或 选用 不 含 重金 属 离子 和 硫化 物 的 透析 仆 , Spectra/Por7(〈 表 2)o 虽然 Spectra/Por 透析 袋 可 以 经 消毒 蒸 锅 或 冰冻 处 理 而 不 受 损 伤 , 但 如 果 对 MWCO 值 要 求 很 高 的 实验 最 好 不 这 样 处 理 ,否则 MWCO 值 可 能 发 生 改 变 。 Spectra/Por 1 一 4 应 贮存 在 温度 大 于 35% 的 环境 中 , 最 好 装 在 密封 的 聚 乙烯 袋 中 放 在 冰箱 内 。Spectra/Por 6 应 贮存 在 冰箱 内 并 防止 防腐 液 挥 发 而 干燥 。 在 处 理 和 使 用 时 切忌 透 PRET, 于 本 局 就 不 能 再 使 用 J* 已 处 理 好 的 透析 袋 要 浸 raceme 4 若干 天 以 后 使 用 则 应 在 Pa = FG SGA) —UEHI, ML PRI 皮 筋 等 扎 紧 ， 现 在 有 市 售 的 专用 封 透 析 袋 的 夹子 。 如 果 用 透 析 袋 打 结 的 办 法 封 ,至 少 应 打 两 个 结 ,防止 深 液 漏出 。 然 后 向 透析 袋 装 满 蒸馏 水 或 适 折 外 液 ， 捏 紧 未 封口 一 端 并 加 适当 压 力 于 透析 袋 检查 是 否 有 漏洞 。 最 后 将 水 倾 出 。 装 人 待 透析 样 品 , 按 上 述 方法 封 好 另 一 端 , 置 于 盛 有 足够 量 透析 外 液 的 容器 中 (一 般 用 量 简 或 浇 杯 ` 三 角 瓶 等 ) 透 析 。 装 人 样品 后 ,在 封 透 ， 析 袋 时 必需 留 有 足够 的 空间 ， 以 便 在 透析 过 程 中 使 溶剂 进 人 袋 。 浓 的 蛋白 质 溶液 透析 过 夜 ,体积 增加 50 % 是 正常 的 ,如 果 不 留 空间 ,透析 袋 会 因 严重 膨胀 导致 微 孔 孔径 发 生 改 变 ; 甚 至 透析 袋 破裂 。 为 了 加 快 透析 速度 , 除 多 次 换 透 析 外 液 外 ,一 般 在 容器 底部 放 一 磁 棒 并 将 容 器 放 在 电磁 搅拌 器 上 ,搅拌 透析 (图 1)。 Al 常规 透析 装置 二 、 大 体积 透析 大 规模 制备 酶 或 其 他 生物 大 分 子 时 允 要 透析 的 溶液 体积 很 大 ,超过 数 百 ml, 用 上 述 常规 透析 方法 很 困难 。 对 流 透 析 能 很 好 地 适用 这 种 情况 。 对 流 透 析 的 基本 原理 是 使 被 透 析 该 沿 透析 膜 的 一 侧 流 动 , 而 透析 外 液 则 取 相 反方 向 在 另 一 侧 流 动 。 对 流 透析 装置 很 多 ， 有 兴趣 的 读者 可 参阅 有 关 文 献 ””, 设 计 制 造 适 合 自己 要 求 的 对 流 透析 仪 。 三 、 小 体积 透析 小 于 lml 的 溶液 用 常规 透析 也 比较 困难 。 当 人 们 获得 纯 的 生物 大 分 子 样 品 时 , 要 进 行 物化 性 质 的 鉴定 和 分 析 , 常 常 面临 着 要 平衡 和 透析 体积 小 于 lml 的 样品 溶 液 。 有 若干 方法 可 以 进行 小 体积 透析 ,其 中 最 简便 的 是 用 细 的 透析 绕 。 但 细 透 析 袋 往往 MWCO 值 比较 大 ( 约 10 000 以 上 )。 另 一 简便 方法 是 用 普通 透析 袋 进行 小 体积 透 本 2。 即 在 透析 袋 内 放 一 个 用 玻璃 管 做 的 塞 子 ， 将 金属 棒 或 尔 封 在 玻璃 管内 以 增加 比重 。 塞 子 的 直径 比 透析 袋 略 小 ,长 度 依 待 透析 液 的 体积 而 定 。 透 析 时 首先 把 透析 袋 一 端 封 好 ,把 玻璃 塞 装 人 透析 袋 , 再 加 入 被 透析 波 并 紧 靠 玻璃 塞 上 端 封 好 透析 袋 ,然后 按 常 规 方法 透析 。 四 、Zeineh 3 析 器 和 65] Zeineh 透析 器 的 原理 是 对 流 透析 , 其 构造 是 将 两 张 透析 膜 夹 在 两 块 有 衬 束 的 树脂 玻 璃 间 , 形 成 管状 通道 ,被 透析 液 流 经 此 通道 ,而 透析 外 液 取 相反 方向 从 透析 膜 另 一 侧 流 过 ， 使 被 透析 液 与 透析 外 液 形成 连续 的 对 流 【 图 2)。 Zeineh 透析 器 透析 速度 快 效率 高 5 Fl ya ay 1 sb 10 @Le = saint FRR ee 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 4 a SS 有 4 — 透 折 后 分 部 图 2 图 3 如 ， 用 该 透析 器 从 30ml & 3mol/L NaCl 的 蛋白 质 溶液 中 脱盐 ,1 小 时 可 脱 去 NaCl 99.9 匈 ,所 用 透析 外 液 不 到 200ml。 如 果 用 常规 透析 ,需要 用 1000 多 ml 透析 外 液 ,透析 过 夜 ， 才 能 达到 同样 指标 。Zeineh 透析 器 的 面积 : 体积 的 比例 为 50cm-:, 常 规 透 析 只 有 0.5cm-:， 效 率 提高 100 倍 ; 被 透析 液 和 透析 外 液 自然 地 相对 流动 ， 起 到 了 很 好 的 搅拌 作 表 3 Zeineh 透析 器 ity 透析 速率 (被 透析 液 含 通 径 规格 3mol/L NaCl, 每 小 Ro Sy 叶 透 析 ml %&%)* 长 宽 深 体积 NaCl 透析 效率 (cm) (cm) (cm) (ml ooo 99.9% | 95.0% D-DG 3X%3X1 1 5 0.3 0.02 0.05 } 1 2 D-1 3X3X1 1 112 0.33 0.02 0.50 18 25 D-1 5x5KI 1 260 0.33 0.02 1.30 25 60 ID=1 7X7XI1 1 350 0.5 0.02 3.50 55 140 L-D-3** 7X7X1 3 1050 0.5 0.02 10.50 fer | eee LL-D-2** | 12X12X1 | 2 1400 1.1 0.04 30.00 440 1120 LL-D-4** | 12X12x1) 4 2800 1.1 0.04 60.00 | 880 2240 * 以 NaCl 为 100920， 其 他 物质 透析 效率 为 : KCl 128%, CaCl, 81%, MBH 16%, HAM72%, AER 45— 62% TRRR 33%, ZARB Zeinch 透析 器 ,可 透析 单一 样品 ， 也 可 每 个 通 径 透 析 一 个 样品 ， 但 透析 外 滚 是 各 通 径 共用 的 。 1 英寸 王 0.0254 m, es 32° 用 并 形成 治 着 通道 的 扩散 梯度 ， 很 大 地 加 快 了 透析 速度 ;在 透析 过 程 中 不 需要 用 电 和 泵 。 Zeineh 透析 器 可 用 于 生物 大 分 子 大 体积 的 透析 ， 也 可 用 于 小 体积 制剂 的 透析 ,还 可 以 和 柱 层 析 连 接 脱 去 移出 流 的 盐 或 平衡 洗 出 波 (图 3)。 美国 生物 医学 仪器 公司 (BIOMED INSTRUMENTS, INC) 已 经 生产 的 Zeineh 透析 器 列 于 表 3。 五 、 透 析 在 蛋 自 质 浓缩 中 的 应 用 利用 透析 浓缩 蛋白 质 溶 沾 的 方法 很 多 ,下面 介绍 几 个 常用 的 方法 。 C1) 最 简便 的 方法 是 将 蛋白 质 溶 液 装 在 透析 袋 内 ,悬挂 在 支架 上 ,在 室温 或 4*C 用 电 风扇 吹 至 所 需要 的 体积 。 也 可 将 装 有 蛋白质 咨 液 的 透析 袋 埋 在 PEG 〈 聚 乙 二 醇 ) 或 干 的 葡 聚 糖 凝 胶 中 ,使 其 吸收 溶剂 达到 浓缩 的 目的 。 (2) C- 袋 蛋白 质 浓 缩 器 (C-bag protein concentrator); C-RERARTAKHA 子 高 分 子 多 聚 物 的 、MWCO 值 低 的 透析 绕 。 使 用 时 将 CRHERAEARARHA 器 中 ,水 经 透析 膜 进 入 C- 袋 被 高 分 子 多 聚 物 吸收 (图 4)。 高 分 子 多 聚 物 和 蛋白 质 都 不 能 we Soe . ® O9-729-75 图 4 A 5 通过 透析 膜 。C- 袋 是 一 个 快速 简便 的 浓缩 蛋白 质 咨 液 的 工具 ;平均 每 小 时 浓缩 速率 4 一 5 毫升 。 目 前 市 售 C- 袋 有 两 种 ,分 别 可 吸收 30 ml 和 60 ml K, (3) 指 状 蛋 白质 浓缩 器 : 该 浓缩 器 由 指 状 物 和 浓缩 槽 组 成 (图 5)。 指 状 物 以 不 锈 钢 棒 作 支持 由 透析 膜 和 浓缩 加 速 剂 组 成 。 将 待 浓缩 的 蛋白 质 溶液 放 人 浓缩 槽 内 ,把 指 状 物 插 人 其 中 ,浓缩 即 开始 。 当 指 状 物 插 人 盛 有 样品 溶液 的 浓缩 槽 时 ;浓缩 加 速 剂 产生 高 次 透 压 ， 样品 的 水 份 通过 透析 膜 很 快 被 加 速 剂 吸 收 ,而 高 分 子 加 速 剂 则 不 能 通过 透析 膜 。 目 前 市 售 e°33 9 的 这 种 浓缩 器 (Spectra/Con Disposable Concentrator) 有 1.0, 2.5, 5.0 和 10ml 四 种 规 格 。 。 (4) 抽 压 蛋白 质 透 析 浓 缩 器 :， 该 装置 (图 6) 可 以 自动 地 同时 透析 和 浓缩 蛋 自 质 等 生 物 大 分 子 桩 品 至 预先 选 定 的 体积 ,是 比较 理想 的 透析 浓缩 右 。 核心 部 件 是 特制 的 透析 袋 (ProDiMem)。 ProDiMem 由 透析 袋 和 连 在 底部 的 用 Polycarbonate 制 做 的 桩 品 收集 槽 及 顶部 的 凸 缘 组 成 的 (图 2y)。 另 一 重要 部 件 是 样品 收集 io 透析 浓缩 时 将 选 定 的 后 者 插 人 前 者 ,可 以 准确 地 自动 地 获得 被 浓缩 样品 的 最 终 体积 。 样品 收集 棒 有 不 同 规格 ， 能 使 最 终 体 积 从 26A4 到 1000mle BATRA MBIT 容器 中 ;装配 好 后 插 和 人 ProDiMem 于 容器 内 ， 抽 气 使 透析 外 滚 变 为 负 压 加 大 待 透析 浓 缩 样 品 , 插 人 选 定 的 样品 收集 棒 于 ProDiMem 1, 最 后 取出 桩 品 。 负 压 蛋 自 质 浓 缩 器 和 不 同 规格 的 ProDiMem 及 样品 收集 棒 都 有 市 售 。 ProDiMem 可 以 用 蒸汽 消毒 但 不 能 让 6 图 7 % 其 变 千 ,一 般 在 28°C 贮存 。 (5) 中 空 纤维 束 浓缩 器 :该 浓缩 器 由 Fleaker 杯 、 橡 皮 帼 和 支架 组 成 (图 8). RE 幅 上 有 四 个 孔 分 别 插 玻 璃 管 和 尼龙 连接 器 。 核 心 部 件 是 中 空 纤维 束 ， 是 由 中 空 的 不 同 规 MBH (MWCO 值 1000 二 9000) 形 成 的 纤维 组 成 的 ,一 般 纤 维 东 长 25cm, 依 不 同 规 格 含 22 一 176 根 纤维 。 小 分 子 溶质 可 以 自由 通过 透析 上 膜 。 使 用 时 将 料 品 放 在 Fleaker 杯 中 ; 通过 尼龙 连接 贷 装 好 中 空 纤维 束 , 塞 好 玻璃 管 。 为 了 透析 样品 ,在 中 空 纤维 的 两 端 通 过 连接 器 分 别 接 蒸馏 水 和 收集 器 ， 当 蒸馏 水 流 经 中 空 纤维 时 被 透析 溶液 中 的 小 分 子 淤 质 通过 透析 膜 进 入 中 空 纤维 束 ; 然 后 随 水 流 流 人 收集 器 ,大 分 子 样 品 留 在 Fleaker 杯 中 ; 浓 缩 祥 品 时 除 在 中 空 纤维 的 一 端 接 减 压 装 置 外 其 余 和 透析 时 二 样 ， 通 过 减 压 装置 将 深 剂 和 。 34 。 通过 透析 膜 的 小 分 子 溶质 抽出 使 样品 浓缩 。 - 六 .平衡 透析 平衡 透析 是 透析 方法 在 分 析 中 的 应 用 ， 特 别 是 在 研究 小 分 子 物质 和 离子 与 生物 大 分 子 如 蛋白 质 、\ 酶 等 相互 作用 时 ,常用 平衡 透析 方法 。 平 衡 透 析 装 置 很 简单 ， 在 两 块 有 机 玻 璃 或 其 他 材料 板 上 各 做 一 个 小 池子 ,两 者 形状 和 容积 相同 ,然后 将 两 块 板 用 金属 框 或 不 锈 钢 螺丝 固定 在 一 起 ， 在 两 小 池 之 间 放 透析 膜 。 在 每 个 小 池 的 顶部 留 有 一 个 孔 以 便 加 和 或 取出 样品 (图 9)。 待 测 样品 加 好 后 ， 在 适当 温度 下 摇动 48 小 时 至 平衡 。 小 池子 的 容积 可 根据 实验 要 求 选 择 或 制 做 。 透析 的 原理 和 核心 部 件 (透析 膜 ) 都 很 简单 ， 册 于 它 是 生物 化 学 实验 室 最 简便 和 最 常 用 的 技术 之 一 ,一 百 多 年 来 人 们 设计 和 研究 了 适用 于 各 种 目的 的 大 量 装置 和 仪器 ,这 里 只 列举 了 其 中 少数 。 有 兴趣 的 读者 尤其 是 具有 小 型 工厂 的 单位 或 仪器 设计 部 门 可 自行 设计 和 制作 适合 自己 要 求 的 透析 器 。 实 际 上 透析 技术 的 应 用 远 远 超 出 生物 化 学 实验 室 ， 在 工 业 \ 医 药 和 医疗 等 都 有 广泛 的 应 用 。 - 可 入 :. 3: > so =) Cas Craig, ‘s Cy in Methods in Enzymology, 11, 870, 1967. p73 : - 1T21 McPhie，P.，in Methods in Enzymology, 22, 23, 1971. edi 内 7 i - [3] Craig. L. C. & Stewart, K., Biochemistry, 4, 2712. 1965. 2 [4] Mandeles, S. & Woods, E. C., Anal. Biochem., 15, 523, 1966. — ae 出 [5] Zeineh V. K. G. et al, J. Lab. Clin. Med., 79, 648, 1972, £6] Malmstrom, B. G., Arch. Biochem. Biophys., 46, 345. 1953. 7] Lindskog, S. & Malmtrom, B. G., J. Biol. Chem., 237, 11 | iy er b } H by 4 i * 7 io i 5 4 q + dd ， + 4 有 证 人 ¥ n is rs * Bre 3 4 ~ > ieee gh, Ol — > ae ane } ms i) a 2 - 4 A to <<} i ot 等 直入 wa AS ‘ % 9 44. 3 水 =} 2 \ ; Re cry: Bint 9 4 ‘ mh: 4 4 jet seme S. . 4 ithe 4 ° ’ Be: ap 二 i P Zoe : ‘ ae | ae % : Sa + ery . > Vera of 1 ra f ‘ « 1544 i ss 2 Wes 4 点 +4 Y 更， ‘i> : z : ‘ ia} 5 ‘ . Ve le aS iF ate eee a - ' by : > ak 到 & : ve . . may oT ; 区 > \ : ° 36 。 糖 蛋 日 中 糖 含量 的 测定 EHR (中 国 科 学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 ) 各 种 糖 蛋 白 中 糖 含量 可 有 很 大 的 变化 , 少 至 不 到 1%, 多 则 可 达 80%, 甚至 更 高 。 然 而 存在 于 天 然 糖 蛋白 中 糖 的 种 类 却 不 多 ,常见 的 单 糖 大 致 可 分 为 三 大 类 : 中 性 己 糖 ,氨基 CHMMERR, EAZREAPARWA 工 - 岩 藻 糖 *( 一 种 C RACH) 以 及 木 糖 和 工 - 阿 拉 伯 糖 等 戊 糖 。 糖 蛋白 中 糖 含 量 理应 是 所 有 单 糖 的 总 和 ， 可 是 目前 通常 测定 的 则 是 上 述 三 大 类 单 糖 。 本 文 也 仅 介绍 这 三 类 单 糖 常用 的 测定 方法 各 一 种 。 如 若 读者 有 需要 可 以 参阅 已 发 表 的 众多 的 参考 文献 ,例如 参考 文献 [1 一 3] 及 其 后 所 引 的 文章 。 一 、 中 性 己 糖 的 测定 测定 中 性 己 糖 的 方法 ,很 多 是 比 色 法 ,常用 的 显 色 剂 有 划 酮 .5- 甲 基 间 苯 二 酚 等 ,使 用 ”这 些 显 色 剂 一 般 都 需要 沸水 浴 加 热 。1956 Dubois 等 由 ,首先 应 用 的 酚 - 硫 酸 法 却 不 用 加 热 , 同 时 重复 性 和 灵敏 度 也 较 好 。 此 方法 另 一 特点 是 蛋白 质 存在 对 显 色 反应 影响 不 大 。 因此 ， 酚 -硫酸 法 更 适合 于 直接 测定 糖 蛋白 中 的 中 人 性 己 糖 。 这 里 介绍 的 是 经 改进 的 酚 - 硫 酸 法 四 。 试剂 : 分 析 纯 的 硫酸 、 比 重 为 1.84。5% (w/w) 酚 溶液 : 5g BABA 95ml RK ik , 摇 匀 备用 。 WH: 0.5ml 内 含 2 至 25wg 中 性 已 糖 的 溶液 置 于 (13 x 100mm) 的 试管 中 , 加 人 0.3ml 5% 酚 溶液 。 混 和 后 ， 快 速 加 和 1.8ml 浓 硫 酸 。 振 摇 混 和 。 室温 放置 26 分 钟 , 即 呈现 橙黄 色 ,可 在 490nm 比 色 测定 。 室 温 过 夜 ,颜色 依旧 稳定 。 所 用 样品 最 好 重复 两 份 。 以 水 代替 糖 溶液 作为 比 色 测定 的 空白 。 HA: 这 方法 不 需 沸 水 加 热 , 显 色 反 应 所 需 热量 来 自 浓 硫 酸 和 水 的 混和 。 因 此 ,加 浓 硫酸 时 ;或 用 流速 较 快 的 移 液 管 ,将 硫酸 于 5 至 10 秒 内 全 部 加 到 样品 咨 液 的 表面 上 ;然后 剧烈 振 摇 混和 ; 或 沿 试管 壁 加 入 ， 但 同时 用 振 摇 器 迅速 混和 。 为 了 使 浓 硫酸 和 样品 混和 迅速 ,放出 足够 的 热量 ,建议 使 用 较 粗 的 试管 ,同时 试管 又 要 有 一 定 的 长 度 , 以 免 反 应 放出 AER. 这 方法 不 仅 可 以 测定 中 性 已 糖 , 也 可 测定 它们 的 甲 基 化 衍生 物 。 戊 糖 和 6- 脱 氧 已 糖 也 能 用 此 方法 显 色 ,但 反应 产物 的 最 大 吸收 发 生 位 移 。 氨基 已 糖 不 能 用 这 方法 显 色 ,但 经 过 简单 的 脱 所 反应 后 , 仍 可 测定 @。 * 本 文中 所 提 及 的 糖 *\ 凡 未 表明 工 -型 的 , 均 为 D- 型 。 . 37 > 二 、 氨基 己 糖 的 测定 Elson-Morgan 法 "中 是 最 常用 的 测定 乙酰 氨基 已 糖 的 方法 。 氨基 已 糖 的 测定 也 使 用 这 一 方法 ,只 是 应 先 将 氨基 已 糖 乙醚 化 。 试剂 : 5% CRM: ”用 冰 水 配制 ， 贮 放 冰 中 ， 每 天 必须 配置 新 鲜 的 溶液 。 饱和 NaHCO, 溶液 。5 匈 KB,O，( 或 硼砂 ) WK. 16% MIRA: log 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 深 于 冰 乙 酸 - 盐 酸 (95:5) 混 合 海 液 中 。 过 程 : 40pl 样品 深 液 ( 含 2.2 至 22 微克 氨基 已 糖 ) 置 于 具 宕 试管 中 ， 先 后 加 入 10pl 饱和 NaHCO, 溶液 和 10m 5% 乙酸 醋 海 液 ,室温 放置 10 分 钟 。 这 一 步骤 是 使 氨基 已 糖 乙酰 化 , 乙酰 氨基 已 糖 的 测定 ， 可 免 去 这 一 步 。 然 后 加 入 50mlL 5% KB4O; 溶液 ;加 塞 者 沸 7 分 钟 ,立即 取出 样品 , 并 放 人 冰 浴 中 。 加 入 500al 冰 乙 酸 和 200ul 16 多 对 二 甲 氨基 苯 甲 醛 溶 液 后 ,37aC 保温 20 分 钟 , 立 刻 在 585nm 测定 光 吸 收 。 HOA: 反应 产物 的 颜色 随时 间 而 变 淡 。 在 冰 浴 中 放置 ,30 分 钟 不 褪色 。 和 K:B,O， 溶液 混和 后 ,样品 加 热 时 间 不 同 ， 最 终 发 色 率 也 不 同 。 实 验 结果 表明 。 加 热 7 分 钟 为 好 。 为 了 得 到 理想 的 实验 重复 性 ,加 热 时 间 应 严格 控制 。 | =. 唾液 酸 的 测定 ”和 硫 代 巴 比 妥 酸 已 被 用 于 多 种 脱氧 糖 的 测定 。 唾 液 酸 是 一 类 3- 脱 氧 -2- 酮 糖 酸 , 故 目前 +h FF ERA ROTEL) Warren” 提出 ,后 经 一 些 实验 室 改进 om 试剂 : 25mmol/L 过 碳酸 溶液 ,以 0.125N 硫酸 为 溶剂 。1.6 多 亚 砷 酸 钠 配制 在 0.4 狗 盐酸 中 。0.1mol/L2- 硫 代 巴 比 妥 酸 的 水 溶液 .用 当量 NaOH 调 至 pH9.0。 乙 二 醇 甲 酝 或 丙酮 -盐酸 混合 液 (97.5:2.5V/V)。 过 程 : 0.2ml HERBBK( AG 3 至 long ERM) 置 于 具 塞 试管 中 ， 加 人 0:1ml 过 PREBA IK 37°C 保温 30 分 钟 。 然 后 加 入 0.1lml WHR, 振 摇 试 管 至 棕 黄 色 消 失 。 在 加 入 1.0ml 硫 代 巴 比 妥 溶液 后 ， 加 塞 ， 在 沸水 滩 中 严格 加 热 7.5 分 钟 ， 随即 置 于 冰 浴 中 。 最 后 加 入 2ml 乙 二 醇 甲 醚 或 酸 丙酮 溶液 , 振 摇 至 溶液 完全 混和 均匀 。 如 果 最 后 加 人 的 是 乙 二 醇 甲 醚 , 则 测定 552nm 的 光 吸 收 ;如 果 加 入 的 是 酸 丙酮 ， 则 测定 55lnm HIER Ko HR: 硫 代 巴 比 妥 酸 溶液 每 天 要 新 鲜 配 置 。 氧 化 剂 和 还 原 剂 则 在 冰箱 中 至 少 可 保存 一 月 。 蛋白 质 对 这 一 测定 过 程 有 千 扰 。 大 量 的 岩 菠 糖 等 也 会 引起 552nm 光 吸 收 下 降 包 。 脱 氧 核糖 的 存在 ,可 以 生成 红色 产物 ,但 其 最 大 吸收 在 5320m™, 以 上 三 种 方法 可 以 测定 中 性 已 糖 、 氨 基 己 糖 和 唾液 酸 这 三 大 类 单 糖 。 但 各 种 中 性 已 糖 、 氨基 己 糖 的 吸光 率 却 有 所 不 同 。 例如 甘露 糖 在 490nm 的 吸光 率 大 于 半 乳 糖 ; 用 Elson-Morgan 法 测定 乙酰 氨基 已 糖 时 ,乙酰 氮 基 半 乳 糖 的 吸光 率 仅 是 乙酰 氨基 葡萄 糖 的 « 38 » 35 狗 。 因 此 本 文中 介绍 的 测定 糖 蛋 白 中 糖 含 量 也 只 能 是 粗略 的 测定 如若 要 精确 地 定量 ， 则 应 先 从 糖 蛋白 上 水 解 得 到 各 种 单 糖 ， 然 后 再 分 离 各 种 单 糖 加 以 测定 。 甚 至 还 需 测定 其 他 一 些 单 糖 , 如 工 - 岩 划 糖 \ 木 糖 等 。 液 相 单 糖 自动 分 析 法 ”2 和 糖 类 的 气 液 层 析 5 、 高 效 液 相 层 析 技术 ”4 可 满足 精确 定量 的 要 求 。 结合 状态 的 氨基 己 糖 和 唾液 酸 都 无 法 测定 。 因此 ， 首 先 应 进行 水 解 。 用 0.1N H,SO,, 80°C 水 解 1 小 时 ， 可 使 唾液 酸 从 糖 蛋白 上 释放 出 来 。 而 乙酰 氨基 已 糖 的 水 解 条 件 是 4mol/L HCl PHE,100C 4 到 8 小时。 为 了 分 别 定量 各 种 中 性 己 糖 , 则 用 2N 三 氟 乙 酸 ,100*C 封 管 水 解 2 到 4 小 时 。 过 [1] ，Dische，Z.，Methods Carbohydr. Chem., 1, 507,. (1962). [2] Spiro, R. G., Methods in Enzymol. 8, 3, (1966). [3] Aminoff, D., Carbohydrats. Chemistry and Biochemistry, IIB. eds. Pigman, W. & Horton, D, 2ad ed, p 739, 1970, Academic Press, New York. [4] Dubois, M. et. al., Anal. Chem, 28, 350, (1956). [5] McKelvy, J. F. & Lee, Y. C., Arch. Biochem. Biophys., 132, 99, (1969). [6] Lee, Y. C. & Montagomery, R., ibid, 93, 292, (1961). [7] Elson, L. A. & Morgan, W. J. T., Bicchem. J., 27, 1824, (1933). {8] Strominger, J. L. et. al., J. Biol. Chem, 234, 3263, (1959). [9] Warren, L., sbid., 234, 1971, (1959). {10] Aminoff, D., Biochem. J, 81, 384, (1961). [11] Uchida, Y. et al, J. Biochem. (Tokyo), 82, 1425, (1977) [12] Lee. ¥. C., Methods in Enzymol., 28, 63, (1972). [13] Laine, R. A. et al., Methods Enzymol. 28, 159, (1972). [14] Honda, S, Anal. Biochem. 140, \l, (1984). 蛋白 质 的 水 解 a HF (中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 ) 蛋白 质 的 水 解 , 一 般 有 两 种 可 能 。 一 是 把 大 分 子 的 蛋白 质 裂 解 成 小 分 子 肽 的 碎片 ; 另 一 种 是 完全 水 解 成 游离 氨基 酸 。 本 节 将 介绍 后 一 种 情况 ,用 于 测定 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 。 蛋白 质 水 解 的 方法 很 多 ,常用 的 有 酸 水 解 、 碱 水 解 和 酶 解 等 。 由 于 酸 水 解 比较 简便 \ 水 解 后 只 需 蒸 发 可 把 残余 的 酸 除去 ,因而 广泛 采用 。 碱 水 解 在 水 解 后 需 用 酸 中 和 ,和 革 成 的 盐 对 以 后 的 分 析 有 干扰 , 酶 解 则 难以 使 全 部 样品 都 生成 游离 气 基 酸 , 故 后 两 种 方法 仅 在 特殊 酉 况 下 采用 。 酸 水 解 也 有 其 缺点 ;水解 后 ,有 少数 氨基 酸 遭 到 不 同 程度 的 破坏 ， 但 如 果 注 意 水 解 条 件 ,可 以 减少 破坏 ,对 于 遭受 破坏 的 部 分 氨基 酸 如 加 以 校正 数字 ， 仍 能 得 到 较为 精确 的 数据 。 一 、 酸 水 解 盐酸 (AR 级 ) 是 常用 的 酸 , 所 用 的 盐酸 需 重 蒸 , 浓 度 为 5.7mol/L。 方 法 是 将 浓 盐 酸 用 蒸馏 水 冲 希 一 倍 , 在 全 磨 口 蒸馏 器 中 , 常 压 重 蒸 三 次 ,每 次 收集 恒 阐 点 馏分 ，110 一 ll ， 即 得 浓度 为 5.7 的 盐酸 。 水 解 用 的 玻璃 管 需 用 硬 质 玻 璃 制 成 ,形状 为 底部 蛋 形 ， 使 用 前 ,将 玻璃 管用 6mol/ 工 盐酸 浸泡 数 小 时 ,然后 ,用 水 冲洗 干净 ,最 后 用 玻璃 责 葵 馏 水 洗 一 次 , 烘 王 备用 。 水 解 , 将 样品 约 10nmol 和 5.7mol/L 盐酸 0.5ml 加 入 水解 管 中 ， 为 了 防止 个 别 氨 基 酸 水 解 时 被 破坏 ,在 样品 管 中 加 入 0.1% MRRBCM. Ra, 水 解 管 在 氧气 喷 灯 上 将 距 管子 口 约 lcm 处 拉 细 , 待 ` > 却 后 ,将 管子 液体 部 分 涛 人 干冰 乙醇 洽 中 ,使 样品 咨 液 立即 冷 Ui» 然后 将 水 解 管 口 与 真空 油泵 相 联 , 抽 真 空 至 25 nm 以 下 ,将 管子 从 冰 浴 中 取出 ,在 室温 下 ,冰冻 样品 逐渐 融化 成 透明 溶液 时 ,不 断 振 摇 管 子 ， 除 去 溶解 于 流体 中 的 空气 ， 立 即 封 @.8T 110 烘箱 中 24 小 时 。 保 温 时 ， 将 玻璃 管理 在 沙 浴 内 ， 如 免 管 子 受热 不 均匀 而 爆炸 。 水 解 结束 后 ,冷却 ; 开 管 ,真空 下 把 盐酸 蒸 干 后 , 即 可 分 析 氨 基 酸 组 成 。 水 解 时 间 ,一 般 蛋 白质 在 24 小 时 可 以 完全 水 解 成 游离 氨基 酸 ， 对 于 小 肽 ， 只 需 水 解 16 小 时 已 经 足够 了 。 蛋 白质 中 某 些 肽 键 , 如 Val- 键 在 水 解 24 小 时 还 不 能 水 解 完 全 ,需要 更 长 的 时 间 。 因 此 ,常常 在 未 知 蛋白 质 样品 的 氨基 酸 组 成 的 精确 分 析 时 , 从 不 同 的 水 解 时 间 , 如 2448472 小 时 ,得 到 的 分 析 数 据 进行 比较 , 取 其 中 的 最 高 值 为 标准 。 酸 水 解 中 的 氨基 酸 破坏 情况 ,在 上 述 操作 条 件 下 , 色 氨 酸 全 部 破坏 ， 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 BAA 10 一 15 多 。 在 蔬 基 乙酸 或 醇 存 在 下 可 减少 色 氢 酸 的 破坏 ,可 以 测 出 色 氨 酸 的 数值 。 « 40 。 1 酸 水 解 条 件 下 一 些 氨基 酸 的 变化 1. 水 解 11 至 70 小 时 维持 不 变 的 氨基 酸 有 Asp、Glu、 Pro、Ala、Met、GlLy 和 Tyr, 2. 随 着 水 解 时 间 的 延长 其 值 增 加 的 有 _Lys、His、Arg、Val、lle、Leu 和 Phe, 3. 随 着 水 解 时 间 增 长 而 量 减少 的 有 Thr 和 -Sero 水 解 也 可 用 人 恒 沸 盐酸 过 流 ,或 以 甲酸 : 盐酸 一 1:1(5ml/g BAR) Ser 和 Thr 的 回 收 鸭 90 一 959%。 vi ik 水 解 2mol/L 氧 氧化 钠 在 硬 质 玻璃 管 中 , 使 样 晶 海 解 ; 封 口 ，1103C 水 解 2 小 时 ， 可 使 样品 完全 水 解 成 游离 氨基 酸 。 冷 却 后 , 开 管 ,用 2mol/L 盐酸 中 和 。 色 氮 酸 在 碱 水 解 中 较 少 破 Ro 如 果 在 水 解 时 ,再 加 入 5% SnCl, + 2H;9; 则 色 氨 酸 破坏 更 少 o! 因 此 , 碱 水 解法 经 常用 于 测定 色 氨 酸 。 1 蛋白 质 中 Trp 的 测定 碱 水 解 用 600mg Ba(OH), - 8H,0 + 0.5mlHO , 置 于 水 解 管 中 ; 按 上 法 封口 。120sC TORS 15 小 时 ,防止 爆炸 \ 水 解 管 置 于 沙 浴 内 。 冷 却 ; 开 管 后 用 3.5ml 6mol/L HCl PALA 后 测定 Trp 的 含量 。 Trp, Cys 定量 回收 ,也 可 采用 4-N- 甲 基础 酸 含 0.2 色 3-2- 氨 己基 - 叮 吕 [3-(2-amino- ethyl) indole] 水 解 ,在 115°C 保 刘 22—72 :小 时 ;水 解 液 用 赤 苏 醇 〈dithiothreit) 处 理 , 然 .后 加 过 量 连 四 硫酸 盐 (tetrathionate)。 测 定 Trp. Cys 都 能 接近 理论 值 。 此 法 的 优点 是 水 解 液 , 中 和 后 可 以 直接 用 氨基 酸 分 析 仪 测定 ,但 唯一 的 缺 反 是 样品 站 含 糖 、 如 糖 蛋白 能 使 色 氮 酸 降 低 回 收 率 。 =. fe mk SF ARS ARS, Met came H th S— te RAS 2 Zk fe sl PE AY & Fk Ee A WHA, AAR KRM SRR, (IE RDATARD AT. 四 、 二 硫 键 的 定量 分 析 盐酸 水 解 的 蛋白 质 水 解 该 ， 用 于 氨基 酸 自动 分 析 ， 所 得 的 胱 氨 酸 数值 偏 低 。 但 在 蛋 白质 水 酶 前 , 先 经 过 甲酸 氧化 把 蛋白 质 中 的 半 胱 氨 酸 都 氧化 成 磺 基 丙 氨 酸 (cysteic acid) 后 ,经 氨基 酸 自动 分 析 仪 可 以 测 得 蛋白 质 分 子 二 硫 键 的 准确 数值 。 过 甲酸 的 配制 。 含量 为 99 多 的 浓 甲 酸 (AR 级 )， 加 33 多 过 氧化 所 (AR 级 )、 以 95:0.5 的 比例 混合 ,室温 放置 2 小 时 ,于 冰 浴 中 冷却 后 ; 取 0.5ml MAG 10nmol 样品 , 放 置 10 分 钟 ， 置 于 含 粒状 氢 氧 化 钠 的 干燥 器 真空 蒸 干 。 然 后 ， 再 按 上 法 用 5.7mol/L 盐酸 水 解 测 定 氨基 酸 的 组 成 分 析 。 ee 超 滤 法 及 其 应 用 夏 其 旧 (中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 超 滤 法 是 一 种 根据 溶液 中 分 子 的 大 小 和 形态 ,在 埃 (10-%m) 数量 级 选择 性 过 滤 的 技 术 。 这 种 方法 ,在 二 定 的 压力 下 (外 源 N， 压 或 真空 泵 压 ); 使 咨 剂 和 较 小 分 子 的 溶质 能 通 过 一 定 孔 径 的 薄膜 ,大 分 子 的 溶质 则 不 能 透 过 , 从 而 可 以 使 高 分 子 物质 脱盐 ,脱水 和 浓缩 ; 在 一 定 的 条 件 下 ,还 可 以 起 到 分 离 和 纯化 的 作用 。 从 另 一 角度 来 看 , 超 泪 也 可 以 庆 鸭 具有 溶液 相 的 分 子 筛 作用, 根据 所 用 超 滤 膜 的 型 号 不 同 ， 可 以 在 分 子 量 500 一 100 000 内 进行 i 0 | 超 滤 主 要 作为 一 种 浓缩 蛋白 质 和 酶 的 方法 ,具有 三 大 优点 : 《1) 在 整 不 工作 过 程 中 ， 条 件 温 和 。 与 蒸发 \ 冻 干 等 其 他 方法 相 比 ,没有 相 的 变化 ， 可 以 维特 原来 的 .En 和 离子 强 度 , 并 可 在 低温 下 操作 ， 这 样 就 不 致使 蛋白 质 和 酶 在 浓缩 过 程 中 变性 , 失 活 或 自 溶 因此 对 不 稳定 酶 的 浓缩 尤其 适用 。(2) 应 用 过 程 中 不 需 涵 加 任何 化 学 试剂 ;设备 和 运转 费用 均 较 低廉 ,是 一 种 比较 经 济 的 方法 。(3) 在 浓缩 的 同时 还 可 以 除去 一 些 低 分 子 量 的 物质 ， 具有 一 定 的 纯化 作用 。 如 果 在 分 级 分 离 的 方法 学 方面 获得 较 大 的 进展 ;可 以 预见 ; 超 江 法 在 蛋白 质 和 酶 的 分 离 提 纯 上 , 将 会 起 相当 大 的 作用 叫 。 PER, 近年 来 , 超 滤 法 越 来 越 多 地 为 生物 制品 工业 、 食 品 工业 , 多 聚 物 工业 以 及 三 废 处 理 等 方面 广泛 地 采用 。 当 然 , 超 滤 法 也 有 一 定 的 局 限 性 ,例如 它 和 其 他 浓缩 方法 相 比 风 不 能 直 接 得 到 干粉 制剂 ,对 于 蛋白 质 溶液 一 般 只 能 得 到 10 一 50% 的 浓度 。 Sas BREBRRARE-SREOMD. PASHARNRAMME, REL Te AREA, ARR AA —Z RRA LR 1, 1. 膜 的 结构 早期 的 障 是 各 向 同性 的 均匀 了 膜 , 即 现在 常用 的 辜 滤 技术 中 使 用 的 微 孔 薄膜 Millipore 公司 生产 的 各 种 微 孔 薄 障 的 孔径 见 图 1。 其 中 0.05am 和 0.025pm 和 孔径 的 膜 曾经 用 作 超 泪 。 近 几 年 来 发 展 了 一 些 各 向 异性 的 不 对 称 超 滤 膜 。 一 种 各 向 异性 扩散 膜 是 由 一 层 非常 薄 的 `. 具 有 一 定 孔 径 的 多 孔 RRR ORY 0.1 一 1.0wm)， 和 一 层 相对 厚 得 多 的 ( 约 1mm) 更 易 通 次 的 、 作 为 支撑 用 的 海绵 层 ` 组 成 (图 ?b)。 皮 肤 层 决定 了 了 膜 的 选择 性 ， 而 海 编 层 增 加 了 机 械 强度 。 由 于 皮肤 层 非常 薄 , Abe Bee Re, RAZR SMS Rpt FRE Amicon 公司 生产 的 各 种 Diaflo 薄膜 即 属于 这 种 类 型 , 它 的 型 号 参见 表 1 « 42° MR ee An NS LMR 20 ee aa SS 表 1 常用 各 向 异性 超 滤 腊 水 if 透 型 号 ieee] 组 ”成 100 pai? 时 的 流速 CT 1 纤维 型 Diaflo UM-05 2 高 分 子 电 解 质 络 合 物 0.05 350 (FER) Diaflo UM-2 2 高 分 子 电解 质 络 合 物 0.1 600 〈 棉 子 糖 ) Diaflo UM-10 2 高 分 子 电解 质 络 合 物 0.3 10,000 (#38 #810) Diaflo PM-10 2 SEKSRD 0.5 10;000( 细 胞 色素 C) Diaflo PM-30 2 芳香 族 多 聚 物 0.7 30,000 (S344) Diaflo XM-50 2 烯 类 物质 0.7 "0,000 (S48) Diaflo XM-100 2 HEE 0.9 100,000 (78 REA) Diaflo XM-300 2 烯 类 物质 1.1 300,000 《 脱 铁 蛋 和 白 ) HEFA-100 3 醋酸 纤维 0.07 10,000 (77K 107 - HFA-200 3 醋酸 纤维 0.40 205000 (APF 20) HE A-300 3 醋酸 纤维 1.40 70,000 (HBA4) PSAC 、 4 纤维 型 1.2 1,000 《省 甲 酚 绿 ) PSED 4 纤维 型 0.75 25?000《〈《c- 胰 凝 乳 蛋白 酶 ) PSDM 4 纤维 型 1.0 40?000《 卵 白 蛋白 ) 1) 1 一 -一 上 海 医 药 工业 研究 院 ; 2—Amicon Corp.; 3——Abcor Inc.; 4——-Millipore Corp. Bl PLR WALT ADR 2 ARARVPBRRHADARAA INT] REGAL ERS] b 一 一 各 向 异性 扩散 膜 ; < 一 一 各 向 异性 微 孔 膜 。 + 43° 和 表 2。 另 一 类 各 向 异性 的 人 微 孔 膜 ;, 如 Abcor 公司 生产 的 各 种 HFA MBE (图 2c)， 它 的 纵 切 面 呈 喇叭 只 型 。 显 然 它 也 要 比 毛 细 管 型 的 各 向 同性 超 滤 膜 性 能 好 ,流量 大 , 亦 不 易 被 溶质 阻塞 。 上 述 各 种 膜 有 不 同 的 大 小 (直径 由 13mm 到 数 百 mm)。 此 外 , 还 有 螺旋 膜 、 管 形 膜 AI DAHER, 2. 膜 的 化 学 组 成 和 稳定 性 瞳 一 般 由 栈 酸 纤维 或 硝酸 纤维 或 此 二 者 的 混合 物 制 成 。 近 年 来 为 适应 制药 和 食品 工 业 上 灭 昔 的 需要 ,发展 了 非 纤维 型 的 各 向 异性 膜 。 这 种 上 膜 在 pH1 一 14 PERE, BFE EC 下 正常 工作 。 超 滤 膜 通常 是 比较 稳定 的 , 若 使 用 检 当 ,能 连续 用 1 一 2 年 。 暂 时 不 用 ,可 在 1% 甲醛 溶液 或 者 0.2 9 NaN, 中 保存 。 #2 Diaflo 超 滤 膜 的 溶质 分 子 保留 百分数 〈%2) UM-05* UM-2 | UM-10 | PM-10| PM-30 | XM-50 |XM-100__ p 百 5 | pH10 D- 两 氢 酸 89 so | 15 0 0 0 0 0 - DEL- 葵 两 氨 酸 165 90 ja 0 0 0 0 0 BA 204 80 |15—20 0 0 0 0 0 K ® 342 80 80 60 10 0 0 0 棉 子 糖 594 90 90 80 50 5 0 0 HK 1 400 75 75 60 50 35 0 0 细胞 色素 C 12400 | >95 | >95 | >95 90 90 0 0 7 16 000 >95 | >95 | >95 80 = 一 明 红 蛋白 17800 | ~100 | >95 | >95 | <95 | 0 0 o- EE VEHR 24500 | ~100 | 一 100 | ~100 | >95 0 0 胃 和 蛋白 酶 35000 | 一 100 | ~100 | ~100 | ~100 80 0 AeA 45000 | ~100 | ~100 | ~100 | ~100 80 0 血红 蛋白 64000 | 一 100 | ~100 | 一 100 | 一 100 0 人 血清 白 蛋 白 67000 | 一 100 | ~100 | 一 100 | ~100 10 MR 110 | 110000 | ~100 | ~100 | ~100 | ~100 0 RE Sa RS 142 000 ~100 | ~100 | ~100 | ~100 20 7- 球 蛋白 160000 | 一 100 | ~100 | ~100 | 一 100 90 脱 铁 蛋白 480000 | 一 100 | ~100 | ~100 | 一 100 Soe Ml ae ie ee 现 有 约 十 个 厂商 生产 超 滤 仪 器 设备 ,大 体 上 可 分 为 四 种 类 型 : 静止 态 型 ,搅拌 或 震动 型 , 错 流 庙 动 型 , 错 流 薄 层 层 流 型 (图 3)2。 Charm 和 Lai 曾 对 过 氧化 氢 酶 用 PM-30 RC TT SAR Ae EE A KS tou, sa 44 « 1. 静止 态 型 这 是 一 种 早期 的 超 滤 器， 类 似 目前 的 膜 港 技术 。 它 易 形 成 浓度 设 化 现象 而 引起 流速 下 降 。 在 超 涉 过 程 中 ,溶液 与 腊 表 面 之 间 总 会 形成 一 个 浓度 梯度 ， 越 接近 腊 表 面 浓度 越 高 ， 这 种 现象 称 为 浓度 极 化 现象 (图 4)。 | 和 s 多 8 8 S s 多 $s s ais s ry 3 s 二 和 和 二 “下 二 S $95 £54843 3 3:8 3 8 273 *& Gy St Ss 3 8 e$ssesessseqsss3S8 S sss ssSsSS$S3 535 85956 : a #} H2O H.O H20 H20 H20 图 3 几 种 类 型 超 滤器 的 模式 图 As 沸 留 溶质 的 浓度 极 化 现象 $8 it tia as 一 一 静止 态 型 3; b 一 一 搅拌 型 ; < _ 动 型 ;d 一 错 流落 层 层 流 型 Millex-FG 单元 办 S=p>—— » HES ———— *KHAK 《加 水 以 调整 终点 ) Immersigie #70 AS 浸入 型 的 小 超 滤器 近年 来 ,发 展 了 一 些 超 小 型 的 过 滤器 ,被 广泛 采用 。 《1 BAB “整个 超 滤器 仅 小 手指 那么 大 ; 可 处 理 几 十 毫升 样品 s 品名 为 Immersible CX™ (Millipore 产品 )， 只 需 把 小 型 超 滤器 浸 到 试管 或 容器 中 ， 一 端 联接 到 « 45 。 ”真空 系统 (图 5), 即 可 使 溶液 达到 浓缩 之 目的 “。 (2) MiniconTM-ecs15 (Amicon 产品 ) Minicon 及 其 同系 列 产品 是 可 奔 式 的 多 单元 超 滤器 , 用 不 到 任何 辅助 设备 。 每 个 超 滤器 有 10 个 分 隔 的 小 单元 , 可 以 同时 进行 10 个 相同 样品 或 不 同样 品 的 浓缩 ,每 个 单元 容纳 2.5ml 样品 ,单元 的 内 表面 是 选择 性 的 超 滤 (A 6A) ,溶剂 或 小 分 子 溶 质 能 涂 透 过 膜 到 厚 的 吸收 层 (海绵 质 的 纸 层 )， 样 品 因 此 浓缩 而 体积 减 小 , 单元 小 室外 标明 5x\10x\20x 和 80x, 分 别 代表 浓缩 情况 ， 整 个 操作 只 需 用 滴 管 滴 人 或 取出 样品 (图 6B)。 图 6 Minicon- 系 列 超 滤器 2. 搅拌 或 震动 型 模 简 单 地 安置 在 多 孔 支 持 物 上 ,在 上 膜 上 端 有 搅拌 装置 或 震动 装置 ,这 样 能 使 膜 表面 累 积 的 大 分 子 层 分 散 到 溶液 中 去 ,减低 了 浓度 极 化 现象 。 在 这 种 系统 中 ,单位 时 间 内 通过 液 体 的 体积 与 可 交换 面积 成 正比 ,压力 可 加 到 4 一 5 大 气压 。 这 类 仪器 在 实验 室 最 常用 。 图 7 是 上 海 生 化 所 仿制 产品 , 超 滤 杯 (3) 由 聚 碳酸 酯 材料 制 成 , 超 滤 膜 (7) 放 置 在 多 孔 聚 乙烯 一 类 物质 的 支持 片 (8) 上 ; 搅拌 磁 世 (9) 用 聚 四 氟 乙 烯 或 有 机 玻璃 封闭 ,仪器 的 顶部 (2) 和 “底座 (5) 由 尼龙 制 成 ,联结 部 分 均 由 硅 焰 咬 的 环 状 垫 圈 (4) 借 不 锈 钢 的 固定 架 (I1) 夹 住 ; 项 部 有 一 安全 闪 (6), 此 处 旋 开 可 以 进 样 ,工作 时 拧紧 ,顶部 侧 边 是 N; 压 进口 装置 (10), 底 座 上 有 超 滤液 的 出 口 (11)。 整 个 仪器 置 于 电磁 搅拌 器 上 工作 。 超 滤 杯 容量 10ml, 搅拌 最 小 有 效 体积 为 lml, 超 滤 膜 直径 2.5cm, 有 效 膜 面积 3.6cm?, 最 大 工作 压力 约 5 大 气压 。 这 种 仪器 也 可 扩大 超 泪 杯 容量 到 数 百 毫升 这 种 超 滤器 自 上 海 生 化 所 和 上 海 医 工 院 试制 后 , 国 内 已 有 很 多 厂商 生产 此 类 产品 。 3. 满 流 型 它 是 在 比较 大 的 管道 (25.4mi 或 更 大 直径 的 管道 ) 中 与 膜 平行 方向 引 大 高 速 流 动 的 Hk, 在 管内 产生 汕 动 现象 (图 3c) 以 减少 浓度 极 化 现象 。 超 滤液 与 膜 成 垂直 方向 流出 。 es 46 。 4. 薄 层 层 流 型 这 类 设备 在 实验 室 和 工业 生产 中 应 用 极 广 ， 还 可 能 进一步 发 展 。 它 是 在 很 薄 的 管道 ( 药 0%5mm) 中 与 膜 平 行 方向 引入 高 速 薄 层 液体 流 ,流速 可 达 3 一 30m/sec， 因 此 这 类 仪器 所 能 处 理 的 液体 量 是 相当 大 的 。 被 处 理 的 溶液 高 速 流动 , 超 滤 效 果 可 能 受到 一 些 影响 ,但 它 流 过 的 膜 表 面积 比 搅拌 型 要 大 得 多 ,同时 还 可 采用 循环 超 滤 的 方法 ,所 以 在 总 效果 上 仍 优 于 搅拌 型 。 在 处 理 稀 溶 液 时 ,达到 同样 效果 。 其 速度 要 比 搅拌 型 快 2 一 6 倍 。 在 处 理 高 REAR ERAN. 优点 更 加 显著 。 属 于 这 一 类 型 的 仪器 设备 有 : (1) Sistem" mm DC-30 型 超 泪 设 备 , 由 三 根 套 简 和 其 他 辅助 设备 组 成 , 每 根 套 简 内 由 无 数 根 空心 纤维 丝 的 超 滤 膜 成 束 构成 , 膜 表面 积 2.7m， 在 约 3 大 气压 下 工作 A? PRBS 8 ZABRBARERA ] 一 一 国定 架 ; 2 一 一 顶部 ; 3 一 一 起 滤 杯 ; 1: 歧 管 3?2. 截 留 分 离 饰 ( 膜 );3 ,过滤 分 离 筋 ( 膜 ); 4 一 一 环 状 垫 图 ;5 一 一 底座 ;6- 一 一 安全 闽 ; 4 .截留 物 人 口 355. 过 滤波 ;3 6. 截 留 物 出 口 ; 7. 滤 7 一 一 超 滤 膜 38 一 一 多 孔 支持 片 ; 9 一 一 搅 膜 ;8 . 膜 包 拌 磁 世 ;10 一 一 N， 进口 装置 ; 11 一 一 超 滤 液 出 口 时 流量 达 世 /min。 其 优点 是 能 在 各 种 pH 和 高 温 (90%C) 条 件 下 连续 工作 ,缺点 是 不 适 于 Mite. ABS LAER Ah (分子量 截止 值 分 别 为 50000 和 10000); 大 型 的 表面 积 达 148m ,可 用 于 生产 超 纯 水 。 目前 国内 已 有 上 海 医 工 院 和 上 海 医疗 器 械 研 究 所 等 单位 生产 中 空 纤维 型 超 瑟 器 ， 后 者 商品 化 的 铜 氨 中 空 纤 维 透 析 器 表面 积 达 1.2m?, 可 用 环 氧 乙 烷 灭 菌 。 (2) 盒 式 超 滤 器 小 型 的 可 把 200 一 3 000ml 处 理 到 20 一 30ml (Minitan), 大 型 的 可 把 5 一 3001 处 理 到 最 后 体积 200 一 2000ml (Pellicon), 适用 于 实验 室 大 量 样品 的 浓缩 、 47 。 脱盐 和 纤 胞 的 洗涤 ， 以 及 产物 〈 例 如 抗体 * FHA) 的 洽 清 。 超 滤 膜 的 分 子 量 截止 值 有 10 000,30 000 和 100 000 等 几 种 , 膜 的 类 型 有 纤维 素 型 ， 也 有 聚 硕 型 。 这 类 盒 式 超 滤器 也 可 以 安置 0.1、0.22 和 0.45pm 的 微 孔 滤 膜 作 微 孔 过 滤器 用 。 仪 器 如 图 8 Bra, MAAR (4) 套 人 待 处 理 的 液体 ,保留 的 物质 以 切 向 横流 过 滤 膜 包 (8)， 最 后 从 歧 管 板 流出 (6) 并 回 WE) KORA HE APRA), ARAM RRA, 总 体积 中 某 些 特定 组 成 流 穿 某 膜 ， 且 被 引出 到 歧 管 板 外 (图 中 黑色 流 ) 经 过 滤 旁 路 而 被 收集 分 离 。 盒 式 过 滤器 可 以 只 用 一 个 滤 膜 包 (图 8 中 (8) 和 图 9), 也 可 以 把 几 个 滤 膜 包 串 联 起 来 使 用 ,这样 效 率 更 高 。 Ao anaes - =. aleve Al as 1. RRR BeAr HE OF RULE KR, BIKA LIERRRE DOT HR) Bie. MIR RBS ATI. (KE—MRAERAT NS SRE, BEF 性 和 许多 因素 有 关 , 主 要 有 : (1) 溶质 的 分 子 特 性 , 除 分 子 的 大 小 外 ,还 和 形状 `\ 电 荷 等 有 关 。(2) 膜 的 特性 ， 除 保留 大 分 子 的 情况 和 孔径 外 , 尚 有 膜 本 身 的 不 对 称 性 、 皮肤 层 的 分 布 和 电荷 等 因素 。(3) 超 滤 的 条 件 , 例 如 溶质 的 浓度 ` 采 用 的 压力 大 小 及 流体 动力 学 等 方面 。 PSED 超 泪 膜 的 分 子 量 截止 曲线 如 图 10 所 示 。 一 般 被 分 离 的 两 种 物质 的 分 子 量 差 别 在 5 一 10 倍 时 较为 有 效 。 因 此 ， 超 滤 对 于 脱盐 或 浓缩 来 讲 是 非常 有 效 的 方法 。 Pe Fy BURR 2 Ao SAT AER SEF, EGE FB TT EO 2. 流速 水 的 通 透 性 一 般 可 以 近似 地 用 流速 ， 即 在 一 定 压 力 条 件 下 每 分 钟 通过 单位 面积 膜 的 RAE KRAMER 实验 室 常 用 ml/cm /min 来 表示 ， 国 外 工业 上 常用 加 仑 /英尺 /天 来 表 5 48 。 示 *。 对 于 各 类 型 仪器 , 蒸 饮水 的 六 速 和 压力 都 成 正比 关系 ;但 当 有 溶质 存在 时 ， 甚 至 在 要 当 好 的 搅拌 条 件 下 ， 也 不 能 一 直 保持 正比 关系 (图 11)， 并 且 仪 器 类 型 不 同 , 情 况 也 不 要 同 。 访 速 和 分 子 量 截止 值 是 两 个 不 同 的 概念 ， 二 者 之 间 不 一 定 存 在 着 平行 关系 (例如 , 表 1 中 Millipore 厂 产品 )。 一 般 各 向 异性 的 膜 流速 要 快 得 多 , 约 10 一 50 加 仓 /英尺 2/ 天 ,而 各 疝 同 性 的 膜 流速 只 有 0.1 一 0.5 加 仑 /英尺 "/ 天 。 其 它 的 因素 ,包括 温度 时间、 阴离子 和 阳离子 等 无 机 盐 对 超 滤 流 速 也 有 影响 。 例 如 低温 操作 时 , 比 室温 超 滤 时 的 流速 要 慢 得 多 。 流 速 的 快慢 ,在 一 定 程 度 上 也 会 影响 到 分 离 的 效果 ”。 (M.W 2000000) ~ @- BEF E Ars (M.W.25000) 80 (M.W.24500) ® 应 ek 60 jag 小 中 胰 和 蛋白酶 (M.W.20000) 三 :40 (M.W.1357) /~ 细胞 色素 C(M.W.12400) “ 葡 聚 糖 10(M.W.10000) 流速 (加 仓 /英尺 2/ 天 ) 16107 10 20 30 分 子 量 (M.W.) FE) (psi) 图 10 PSED @BRAT BRILL 图 11 蒸馏 水 和 192 葡 聚 糖 70( 分 子 量 70000) 在 不 同 压 力 下 的 流速 14.70psi 王 1 大 气压 《 注 :-- 工 加 仑 /英尺 /天 之 40.7 升 / 米 ?/ 天 ) 3. 溶质 浓度 的 影响 上 面 提 到 浓度 极 化 现象 会 引起 流速 下 降 , 它 也 会 影响 到 选择 性 ,因为 溶质 分 子 通过 腊 的 情况 也 依赖 于 它们 在 膜 表面 的 浓度 。 对 相同 浓度 的 深 液 来 讲 ， 浓 度 极 化 现象 的 增强 会 导致 通过 膜 的 溶质 量 的 下 降 。 溶 质 在 膜 表面 的 累积 ,也 可 以 看 作为 一 层次 级 膜 ,降低 了 分 离 能力 , 使 选择 性 变 差 , 直到 超过 溶解 度 限 度 而 出 现 沉 证 。 这 种 现象 在 各 向 同性 的 膜 中 更 为 严重 ,甚至 会 阻塞 薄膜 的 微 孔 。 实验 室 用 的 超 泪 仪 器 中 , 常 采用 使 溶液 搅拌 或 震动 的 方法 减少 浓度 极 化 ,搅拌 速度 不 * 1 英尺 一 0.3048 米 。 1 加仑 ( 英 ?一 4.546092 升 。 © 49 。 A ,对 超 滤 效 果 也 有 影响 。 近 年 来 更 普遍 采用 错 流 (cross-flow) 方式 以 降低 极 化 现象 4. 其 他 | 7 He RMA RK 因此 对 溶质 分 子 的 吸附 也 不 同 ,选用 的 膜 对 被 超 滤 溶 质 的 吸 附 作 用 应 尽量 地 小 。 此 外 ,吸附 作用 与 选用 的 缓冲 液 或 pH 有 关 ， 例 如 ，Diaflo UM 型 膜 不 能 在 高 于 0.02mol/L 的 磷酸 缓冲 波 中 使 用 ， 因 为 组 成 膜 的 多 聚 物 水 合 后 能 与 某 些 离 子 强烈 地 相互 作用 而 影响 溶质 的 通过 。 某 些 分 子 在 溶液 中 能 够 以 不 同形 式 存 在 ,设计 超 滤 实 验 时 ,可 改变 pH SR ES 使 它们 形成 二 聚 体 或 多 聚 体 ,以 便 采 用 较 大 孔径 的 膜 ,增加 流速 。 四 、 iN ei A 1. 浓缩 和 脱盐 自从 Blatt 等 人 (1965)59 开 始 应 用 超 滤 法 于 生物 样品 的 浓缩 后 , Wang, D. 1. C. 等 也 报告 浓缩 了 几 种 酶 和 叹 菌 体 ， 以 后 更 广泛 地 应 用 于 许多 酶 的 浓缩 。 一 般 在 酶 的 浓缩 工 No & | 超 滤液 BER “被 洗 的 " b 保留 液 Nom HINES | ee c N :或 系 溶剂 贮存 瓶 分 UM-10 mt | UM-2 | 超 滤液 ( 废 液 ) 含有 产物 的 滤液 图 12 ” 几 种 超 滤 用 法 Als 超 滤 和 酶 反应 联 用 a— Mis; b 一 一 透 滤 ; < 作 中 回收 率 可 高 达 90%52 ,同时 除去 了 溶 访 中 的 盐 和 低 分 子 杂 质 , 比 活 有 明显 的 提高 ， 是 . 一 种 简单 和 快速 的 浓缩 方法 。Bixber 比较 了 各 种 浓缩 酶 方法 的 经 济 价值 ,认为 超 滤 最 经 。50 。 济 。Kcay 认为 在 微生物 酶 制剂 的 生产 中 ,采用 超 滤 作 为 最 初 的 工艺 ,能 大 大 缩小 体积 , 降 低 成 本 ,是 一 种 有 效 且 有 发 展 前 途 的 方法 超 滤 也 广泛 地 用 于 酶 制剂 的 脱盐 。 ERR, 电解 质 (CE) 和 盗 液 中 囊 通过 膜 的 溶液 〈PS) 流出 了 超 江 器 ;大 分子 溶质 (MS) 被 浓缩 ,同时 部 分 纯化 ; 即 a 二 直 在 增加 。 而 在 脱盐 过 程 中 , 盐 可 以 认为 是 一 种 PS, 在 简单 的 超 洪 中 (图 12a), EERE 液 和 保留 液 中 浓度 是 相同 的 , 旦 维持 恒定 。 为 了 从 保留 液 中 完全 除去 盐 , 则 可 采用 透 涉 法 (Diafiltration)， 即 在 压力 源 和 超 滤器 之 间 增加 一 个 体积 比 超 滤器 容量 大 的 贮存 瓶 (图 12 b); 瓶 内 贮 洗涤 液 ( 水 或 低 浓度 的 缓冲 液 ), 洗 涤 液 不 断 地 压 人 超 滤 杯 ， 超 滤 杯 中 的 溶液 体 积 和 大 分 子 溶质 (MS) 不 变 , 而 电解 质 和 其 他 小 分 子 溶质 和 盐 等 (PS) 则 随 着 洗涤 液 而 除去 , 滤 出 液 的 电导 迅速 下 降 , 这 样 能 把 小 分 子 物 质 或 盐 彻底 洗 干 净 。 在 浓缩 样品 时 ， 若 样品 量 很 大 而 超 小 器 容量 较 小 时 ,也 可 把 样品 放 在 贮存 瓶 中 连续 进 样 *a。 2. 分 离 和 纯化 Wang, D.1.C. 等 曾 报告 用 超 滤 法 纯化 胰 蛋 白 酶 粗 制 剂 。 但 更 多 的 报道 是 把 超 滤 和 酶 反应 联 用 ;这 种 联 用 是 基于 所 利用 的 酶 反应 是 把 大 分 子 多 聚 物 水 解 成 小 分 子 产 物 ; 因 ”而 可 选择 一 种 膜 , 它 能 够 保留 底 物 和 酶 分 子 , 而 允许 产物 通过 。 这 样 首先 可 使 生产 过 程 连 续 ; 产 物 纯化 简化 ;其 次 由 于 不 断 除 去 了 产物 ,减少 了 逆反 应 ,反应 可 保持 在 较 高 的 初速 度 下 进行 ;第 三 , 酶 可 连续 使 用 ,减少 了 酶 的 用 景 , 未 作用 的 底 物 也 能 充分 地 利用 "“ (图 13)。 因此 , 酶 反应 和 超 滤 结 合 可 以 降低 生产 成 本 ,目前 已 经 较为 普遍 的 采用 。 例 如 。， 大 豆 的 酶 解 产物 分 离 ”" ，c- 胰 凝 乳 蛋白 酶 水 解 乳 清 蛋 白 后 的 酶 解 产 物 分 离 ， 链 霉 素 蛋白 酶 和 胃 和 蛋 白 酶 水 解 水 不 溶性 的 鱼 蛋白 浓 波 ， 纤 维 素 酶 水 解 纤维 素 ，c- 淀 粉 酶 或 糖化 型 淀粉 酶 水 解 淀粉 等 ;尤其 是 最 后 一 种 反应 ,用 PM-10 膜 能 得 到 非常 纯 的 葡萄 糖 , 并 且 连 续 工 作 12 天 ， 酶 活力 没有 损失 “2。 在 实际 应 用 中 ,有 时 因 酶 和 产物 分 子 相近 , 较 难 分 开 。 为 了 克服 这 个 缺点 ， 近 来 把 酶 偶 联 到 高 分 子 量 的 可 溶性 多 聚 物 上 去 ， 获 得 了 很 好 效果 。 例 如 胰 凝 乳 蛋白 酶 结合 到 可 洲 性 葡 聚 糖 (分 子 量 2 Xx 10 ) 上 25， 它 对 大 分 子 底 物 酷 蛋 白 和 小 分 子 底 物 ATEE 的 活力 分 别 为 游离 酶 的 81% 和 73%, 这 种 酶 制剂 的 热 稳定 性 也 有 很 大 的 提高 , 且 不 易 自 溶 。 当 选 用 XM-100 膜 来 分 离 水 解 栈 蛋白 的 产物 时 ,20sC 下 连续 工作 二 周 ， 活 力 无 损失 。 此 法 也 可 用 于 溶菌 酶 和 一 些 核酸 酶 。 还 有 一 种 联 用 方法 是 把 酶 包 埋 到 空心 纤维 丝 的 膜 中 ， 而 底 物 分 子 和 产物 分 子 都 能 自 由 进出 ,然后 进行 产物 和 底 物 的 分 离 。 例 如 ,转化 酶 水 解 蔗糖 成 为 果糖 和 葡萄 糖 ， 尿 酶 分 解 尿素 成 为 所 和 二 氧化 碳 等 一 类 反应 。 超 沽 除了 上 述 一 些 应 用 外 ， 在 其 他 生物 样品 中 的 用 途 也 是 多 种 多 样 的 。 可 以 浓缩 蛋 白质 ` 多 糖 \ 病 毒 , 也 可 以 从 尿 中 浓缩 蛋白 激素 。 在 纯化 方面 有 : ， 糖 中 除去 蛋白 质 ,青霉素 中 除去 蛋白 质 , 生 物 样品 中 除去 毒素 \ 热 原 或 细菌 ， 或 者 即 所 谓 冷 无 菌 法 。 蛋 白质 混合 物 中 的 分 离 应 用 也 很 多 ,例如 在 结晶 的 ~- 乳 清白 蛋白 中 分 离 除去 白 蛋 白 加 。 {1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] eee eee ae 夏 其 昌 ? 超 波 法 及 其 应 用 ,生物 化 学 与 生物 物理 进展 第 2 期 ，36 Wy 1975, Chian, E. S. K. et al., Ultrafiltration of biological materials, Process Biochem., 4(9), 47(1969). Blatt, W. F., Ultrafiltration for enzyme concentration, in “Method in Enzymology”, 22, p. 39(1971). Charmand, S. E. and Lai, J., Comparison of ultrafiltration system for concentration of biologicals, Biotechs. Bioeng., 13, 185(1971). Millipore: AB-822. Porter, M. C., Application of membranes to enzyme isolation and purification, Biotech. Bioeng. Symp., No.. 3, 115(1972). Altena, C. Van, Production scale ultrafiltration, Process Biochem., 8(10), 7(1973). Blatt, W. F. et al., An ultrafiltration membrane for the resolution and purification of bovine alpha-lactal- bumin, Anal. Biochem, 18, 81(1967). 7 Michaels, A. S., New separation technique for CPI, Chem. Eng. Progr. 64(12), 31(1968). Wang, D. I. C. et al., Enzyme and bacteriophage concentration by membrane filtration, Anal. Biochem., 26, 277(1968). hee Blatt, W. F. et al., Protein solution: Concentration by a rapid method, Science, 150, 224(1965). Wang, D. I. C. et al., Recovery of biological materials through ultrafiltration, Biotech. Bioeng., 11, 987° t (1969). an! pm, t Blatt, W. F. et al., Fractionation of protein solutions by membrane partition chromatography, Nature, 216,. 511(1967).° tee RAY Blatt, W. F. et al., A modified ultrafiltration cell for separating the products of proteolysis, Anal. Biochemi,. 22, 161(1968). pea), 和 和 Wang, D. I. C. et al.，Biochemical engineering, Chem. Eng., 76(27), 108(1969). 7”? Roozen, J. P. and Pilnik, W., Ultrafiltration controlled enzymatic degradation of Soy protein, Precess Bio. chem., 8(7), 24(1973). = 本 a O’Nell, S. P. et al., An ultrafiltration-reactor system using a soluble immobilized enzyme,” Biotech. Bioeng. 13, 319(1971). x 4 aa 离子 交换 属 析 陈 2 R (中国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 一 、 基 本 原理 蛋白 质 是 两 性 分 子 ， 在 水 溶液 中 能 解 离 而 带 正 电荷 和 负电 荷 : 分 子 中 的 氨基 末端 租 碱 性 氨基 酸 的 侧 链 基 团 , 解 离 后 带 正 电荷 ， 羧 基 末 端 和 酸性 氨基 酸 的 侧 链 基 团 , 解 离 后 带 负电 荷 。 各 种 蛋白 质 解 离 后 所 带电 和 荷 不 尽 相同 , 由 此 分 酸性 、 碱 些 和 中 性 蛋白 质 。 由 于 等 电 点 的 差异 ， 在 一 定 pH 值 的 缓冲 液 中 的 解 离 度 就 不 一 样 。 应 用 离子 交换 层 析 法 纯化 蛋 白质 ,就 是 利用 这 些 差 异 把 它们 吸附 在 层 析 柱 上 ,用 不 同 离子 强度 的 缓冲 液 把 蛋白 质 解析 ， ”下 来 , 按 各 种 蛋白 质 吸附 力 的 强 弱 而 展现 出 不 同 移动 速度 的 色 层 带 ,分 部 收集 洗 脱 液 ， 可 得 到 较为 纯净 的 蛋白 质 (A 1)。 P,>P,P3------ Bam lb — BTR Al 离子 交换 柱 层 析 分 离 蛋 白质 示意 图 做 离子 交换 层 析 纯化 蛋白 质 需 要 考虑 的 问题 ; ,如 要 纯化 的 蛋白 质 是 否 适 合用 这 种 方 法 ， 就 是 说 经 过 离子 交换 柱 后 会 不 会 引起 变性 而 丧失 活性 ;为 了 使 分 离 纯化 达到 最 佳 效 果 , 需 要 选用 何 种 离子 交换 剂 ; 层 析 柱 的 大 小 和 安装 ;缓冲 液 的 选择 和 洗 脱 时 的 流速 , 洗 脱 液 的 收集 ,浓缩 和 鉴定 ;离子 交换 剂 的 处 理 和 保存 等 。 如 果 缺 少 这 些 知识 和 经 验 ， 常 常 难 以 达到 纯化 蛋白 质 的 预期 效果 。 二 、 对 要 分 离 纯化 的 蛋白 质 的 基本 了 解 蛋白 质 的 生物 活性 取决 于 它 的 一 定 的 空间 结构 , 如 果 空 间 结构 遭 到 破坏 ,引起 了 蛋白 二 质变 性 , 活 狂 就 形 失 。 各 种 蛋白 质 的 稳定 度 不 同 , 变 性 的 条 件 也 不 一 样 。 引 起 变性 的 因素 很 多 , 如 温度 、 pH 等。 一 般 的 蛋白 质 对 温度 十 分 敏感 ， 层 析 最 好 在 较 低温 度 下 进行 。 偏 酸 或 偏 碱 下 容易 变性 ,一 般 适 合 的 pH 在 6 一 8 之 间 。 我 们 曾 分 离 一 种 蛋 昌 酶 ,其 最 适 pH 为 8, 低 于 pH6 或 高 于 pH9 就 失 活 。 还 分 离 过 一 种 金属 蛋白 酶 ,在 用 阴离子 交换 树脂 时 ， 能 保持 活性 , 当 改 用 阳离子 交换 剂 后 ,活性 立即 丧失 ， 可 能 是 阳离子 交换 剂 从 蛋白 质 分 子 中 夺 走 了 活性 必需 的 金属 的 缘故 。 因 此 在 进行 柱 层 析 前 ， 先 妥 观 察 在 什么 条 件 下 会 发 生 活力 的 变化 ,作为 选用 层 析 条 件 的 参考 。 =. BFR KH 在 不 溶 于 水 的 基质 (matrix) 上 共 价 联 上 能 解 离 的 基 团 ， 并 与 其 电荷 相反 能 移动 (mobile) 的 离子 结合 ,这 些 离子 能 与 溶液 中 电荷 相似 的 离子 进行 可 逆 的 交换 。 根据 可 供 交换 的 离子 的 性 质 把 离子 交换 剂 分 为 阳离子 和 阴离子 两 种 类 型 。 | 一 + 阴离子 交换 剂 阳离子 交换 剂 离子 交换 剂 又 可 分 为 强酸 、 强 碱 \ 弱 酸 、 弱 碱 几 种 类 型 ,它们 之 间 的 差别 在 于 联结 在 基 质 上 的 不 同 基 团 的 解 离 度 。 强 酸 和 强 碱 型 交换 剂 能 在 较为 广泛 的 pH 范围 内 完全 解 离 , 相 当 于 pH2 一 10 之 间 。 弱酸 型 交换 剂 在 低 于 pH6 ， 弱 碱 型 交换 剂 高 于 pH9 就 失去 了 电荷 ， 于 是 失去 了 交换 能 力 。 因 为 一 般 蛋 白质 在 pH6 一 8 之 间 稳 定 ， 所 以 常用 弱酸 和 弱 碱 型 交 表 1 类 型 名 称 结 构 式 3] 酸 CM—(# #>Carboxymethyl-) —OCH,COO- a 酸 SE—( AZ, Sul foethy!-) —OC,H,SO; SM—( RB, Sulfomethyl-) | —OCH,SOz SP—(HA.Sulfopropyl-) —O0C,H,SO; P 一 (磷酸 ,Phospho-) 一 DOPO,Hz c= 3] 碱 DEAE 一 (二 乙 基 胺 乙 基 ,Diethylaminoetbhyl-) —OC,H,N+(C,H,), AE—(&Z#>,Aminoethyl-) —OC,H,NHf aw QAE 一 ( 季 胺 乙 基 Quarternary-) —OC,H,—N*(C,H,), 换 剂 。 目 前 交换 剂 的 基质 的 种 类 较 多 。 早 期 的 用 于 分 离 氨 基 酸 和 其 他 小 分 子 物 质 的 离子 交换 树脂 的 基质 是 聚 茶 乙 烯 类 ,由 于 具有 强 的 下 水 性 、 容 易 引 起 蛋白 质变 性 ; 另 一 方面 由 于 其 交 联 度 大 、 孔 径 小 ` 蛋 白质 只 能 吸附 于 基质 的 表面 , 故 交换 容量 小 ,实践 证 明 ， 不 适 于 蛋白 质 纯化 。 60 年 后 发 展 起 来 的 离子 交换 剂 ,是 亲 水 性 的 基质 ,由 糖 链 组 成 ,如 纤维 素 型 ， 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephadex) 型 ,琼脂 糖 (Sepharose) 型 , 球状 纤维 素 (Sephacel) 型 等 。 合 成 时 ， 控 制 其 交 联 度 ， 得 到 不 同 孔径 的 基质 ,如 25.50 和 CL-2B、CL-6B 等 。 在 基质 上 联结 的 基 团 有 下 列 各 种 类 型 ， 如 表 1。 商品 名 冠 以 C 的 。 如 _C-25. 或 -G-50y 为 阳离子 (cation) 交换 剂 , 冠 以 A 的 为 阴离子 〈anion) 交换 剂 - 这 些 类 型 的 交换 剂 能 很 好 保持 蛋 白质 的 活性 ,得 到 广泛 应 用 。 以 上 几 种 类 型 的 性 能 比较 ， 分 辩 能 力 好 的 以 Sepharose 和 Sephacel, a 纤维 素 型 的 价 廉 ， Se aspect ee 一 -一 一 一 一 ~ 一 一 一 效果 。 离子 交换 剂 容量 是 其 能 提供 交换 离子 的 量度 ， 是 分 离 纯化 时 选用 交换 剂 数量 的 重要 参考 数据 。 交 换 容量 即 总 交换 容量 或 有 效 交 换 容 量 (available capacity)。 表 2 列 出 各 种 离子 交换 剂 的 交换 容量 。 表 2 离子 交换 剂 的 交换 容量 meq/100ml 17 .5 Sephadex Sepharose Sephacel | DEAE- | 1.4 17 人 55 - 交换 容量 的 测定 是 用 1g 交换 剂 干粉 ， 用 酸 或 碱 定 量 满 定 的 mg 当量 数 。 阳 离子 交 也 剂 用 盐酸 处 理 后 ,无 离子 水 洗 至 接近 中 性 ,在 1mol/L KCl 溶液 中 , 用 稀 碱 咨 补 滴 定 ， 而 阴离子 交换 剂 用 相反 的 方法 测定 。 在 实际 应 用 时 ， 离 子 交换 剂 的 用 量 大 大 超过 从 上 述 交 换 容量 的 计算 值 ， 是 由 于 交换 容量 受到 实验 条 件 的 影响 ， 如 样品 与 交换 剂 的 基 团 可 接近 ， 的 程度 , 洗 脱 液 的 浓度 与 离子 强度 ,互相 交换 离子 的 性 质 等 因素 而 改变 了 交换 容量 。 CM-Sephadex 10 Wats Mier iy). kee meq NaOH 图 2 CM-Sephadex 交换 容量 的 测定 ?于 lmol/L KCl Amb eHR 五 、 交 换 剂 的 处 理 ， 再 生 和 保存 离子 交换 纤维 素 常 含 细 颗 粒 ,会 堵塞 层 析 柱 的 滤 板 , 需 经 浮 选 除去 。 浮 选 方 法 是 ， 先 : 经 充分 溶 胀 后 ,在 大 烧杯 里 用 蒸馏 水 调 成 稀薄 的 悬浮 液 , 静 置 1 至 2 小 时 ， 倾 去 上 层 混浊 液 ,如 此 反复 多 次 ,直至 上 清 液 澄清 为 止 。Sephadex Sepharose 等 系 球形 颗粒 ， 无 须 经 过 浮 选 ,直接 用 缓冲 液 平衡 , 即 可 装 柱 。 离子 交换 剂 的 价格 较 贵 ,每 次 用 后 只 须 再 生 处 理 ,能 反复 使 用 多 次 。 处 理 方法 是 交替 用 酸 、 碱 处 理 ,最 后 用 水 洗 至 接近 中 性 。 阳 离子 交换 剂 最 后 为 Na 型 , 阴离子 交换 剂 为 Ci 型 ,是 最 稳定 型 式 。 如 果 分 别处 理 呈 也 型 和 OH BARE, SHEAR BBM, BHR 剂 的 颜色 变 黄 , 容 量 降 低 。 故 处 理 的 顺序 分 别 为 ,阳离子 交换 剂 是 , 酸 一 水 一 碱 一 水 , 阴 离 子 交换 剂 是, 破 一 水 一 酸 一 水 。 由 于 上 述 交换 剂 都 是 糖 链 结构 ,容易 水 解 破坏 ， 须 加 免 强 酸 、 强 碱 长 时 间 浸 泡 和 高 温 处 理 。 其 再 生 条 件 如 表 3。 baad 雪 3 剂 型 处 理 用 的 酸 碱 浓 度 浸泡 时 间 纤 维 嵌 0.5mol/L HCl 或 NaOH 加 lmol/L NaCl 3 一 4 小 时 Sephadex 0.1mol/L HCl NaOH 半 小 时 Sepharose Imol/L 酷 酸 钠 ，pH3.0 或 0.1mol/L NaOH 离子 交换 剂 容 易 长 霉 引 起 变质 ,不 用 时 , 需 洗 涤 干 净 ， 加 防腐 剂 置 冰箱 内 保存 。 常 用 « 56 。 Wi 0.02% 的 登 氮 钠 防腐 , 登 氮 钠 遇 酸 放 出 有 毒气 体 , 也 是 剧 毒 易 爆 炸 的 危险 品 , HANS 倍加 小 心 。Pharmacia 产品 使 用 的 防腐 剂 如 表 4。 有 人 也 用 高 浓度 的 有 机 溶剂 作 防 腐 剂 ， 袁 4 剂 型 盗 补 的 pH 防腐 剂 及 其 浓度 阴离子 交换 剂 弱 碱 人 性 Phenyl mercurie salt 0.001% Chlorohexidine (Hibitane) 0.002% 阳离子 交换 剂 弱酸 人 性 Ethyl mercuric thiosalicylate (Merthiolate, Thimersal) 0.005% 阴 、 则 离子 交换 剂 弱酸 人 竹 Trichlorobutanol (Cheoretone) 0.05% 095% 酒精 。 我 们 发 现在 重新 使 用 时 ， 有 机 溶剂 难以 一 下 于 除 尽 ， 对 交换 容量 有 影 ‘Milo A. Tus Be 离子 交换 用 层 析 柱 , 一 般 粗 而 短 , 不 宜 过 长 ,除非 分 离 较为 复杂 的 蛋白 质 混 合 物 时 ,可 Uke, 根据 分 离 样品 量 选用 合适 的 层 析 柱 ， 一 般 其 直径 与 柱 长 比 约 在 1 比 10 或 1 比 20 之 让 为 的 可 过 L 比 ES MAR sn eatiaceoas eh pe 于 四 分 之 一 。 RAO, BRM, SMALLS 5 HAZ 吸附 于 交换 剂 表面 上 的 气泡 , 抽 气 不 得 少 于 105, ERT OO, eA 人 硅 内 , 待 层 析 柱 滤 板 上 沉积 约 数 厘 米 较 粗 颗 和 粒 后 ,再 开启 四 百 * 证 液体 流出 ,不 断 添加 县 ee he SAR a KEEN, NG Ts 或 断层 ， 需 倾 出 重 装 。 层 析 相 Zs HL : 前 用 平衡 液 把 出 口 处 的 气泡 全 部 赶 出， SET DL RE APRA IL SIME, | HE Bh OA RO + Ue Hh a oh HR 洗 脱 层 析 柱 的 缓冲 液 , 常 用 缓冲 能 力 较 强 的 ,如 Trie-HCl, PERE ED. REM PURER eR 冲 液 等 。 对 于 分 离 未 点 的 蛋白 质 桩 品 , 可 先 用 试管 内 试验 ,以 确定 最 适 平衡 缓 症 液 | pH, 如 图 3 所 示 。 1G E My My, 5 ‘ ; 5.5 图 3 oh 离子 交换 剂 7.5 e 57 e 上 上 列 各 试管 中 ,各 加 入 等 量 的 离子 交换 剂 约 100mg 和 相差 0.5pH 的 系列 缓冲 液 , 对 阴离子 交换 剂 选用 pH5 一 9,， 阳 离子 交换 剂 选用 pH4 一 8, 先 用 体积 为 交换 剂 的 10 He HR 度 为 0.5mol/L 的 缓冲 液 平 衡 。 摇 匀 , 放 置 ， 吸 出 上 清 液 ， 再 用 浓度 为 0.01 一 0.05mmol/ 工 的 平衡 液 反 复 处 理 5 次 。 然 后 每 管 中 加 入 等 量 样品 , 摇 匀 ， 放 置 10 分 钟 ,检测 上 清 液 的 样品 含量 。 图 3 显示 在 pH6.0—6.5 之 间 样 品 被 完全 吸附 ， 可 选择 . PH6. 5 为 初始 平衡 组 冲 的 pH. 如 果 选 用 平衡 绥 症 沪 PE 俩 高 或 偏 低 时 。 由 于 要 分 离 的 蛋白 质 吸附 大 牢 ; 往 在 丙 玫 脱 芒 需 用 高 个 浓度 或 比较 剧烈 的 条 件 开 能 从 层 析 柱 上 解析 下 来 而 带 来 麻烦 5 图 4 图 中 搅拌 瓶 中 接 搅拌 器 , 下 部 与 贮 液 瓶 有 一 小 孔 联 通 。 两 瓶 内 所 贮 的 流 面 高 度 相 齐 。 安 装 时 ， 需 仔细 把 联通 管 中 的 气泡 排除 ， 并 夹 住 ， 避 免 不 同 浓度 的 绥 冲 液 混合 。 洗 脱 开始 后 才 把 联通 管 打 开 * 并 开始 搅拌 。 50 100 150 200 图 5 和 牛 血 清 的 分 离 ，QAE-Sephadex A-50， 层 析 柱 1.5X26cm 样品 : 4mg 3% 牛 血 清 冻 干 粉 (W/V) A. 直线 梯度 洗 脱 ，0.1mol/ 工 Tris-HCl 缓冲 液 ，NaCl EAR 070.5 mol/L NaCl B. fi—@47h#R, NaCl 浓度 由 O.170.2>0.30.4 mol/L NaCl 的 分 级 洗 脱 。B 中 巍 4 和 5 为 血清 白 蛋白 ,相当 于 A 中 峰 4。 se。 58 。 洗 晓 是 把 层 析 柱 上 吸附 的 蛋白 质 解析 下 来 ,常用 增加 盐 浓度 或 改变 pH 两 种 方式 。 因为 考 起 到 蛋白 质 的 稳定 性 ， 一 般 常用 增加 盐 浓 度 洗 脱 ， 示 会 产 至 引起 蛋白 质变 性 的 危 险 》 其 方式 又 可 分 为 直线 梯度 (linear gradient) ARB (stepwise gradient), jb 还 有 止 状 梯度 (concave gragisitJ 和 回头 樟 度 (convex gradient) 等 。 后 两 种 方式 较 少 应 用 。 直 线 梯度 法 需要 一 个 梯度 装置 , 即 由 一 个 盛 放 低 离子 强度 溶液 的 搅拌 瓶 ,一 边 联结 在 层 析 柱 上 , 另 一 边 与 盛 放 高 离子 强度 的 贮 液 联结 而 成 , 如 图 4 直线 宰 度 的 离 于 强度 变化 呈 直 线 关系 ,其 分 关 效 果 较 好 。 而 分 级 洗 脱 ,由 于 变化 呈 阶 宰 式 ,常常 会 把 已 分 开 的 色 层 带 拼 在 一 起 被 洗 脱 下 来 ;有 时 也 会 把 一 条 色 层 带 分 成 两 条 而 HOR, 分辨 力 较 差 。 但 作为 初步 摸 素 时 ,可 以 很 快 找到 所 需要 分 离 的 蛋白 质 能 在 某 种 离子 强度 的 缓冲 液 洗 下 求 的 条 件 。 以 便 进 一 步 选择 合适 离子 强度 的 直线 梯度 缓冲 系统 时 参考 。 分 级 洗 脱 的 装置 很 简单 ,只 需 把 层 析 柱 与 一 个 贮 液 瓶 联结 , 洗 脱 时 ， 瓶 内 的 缓冲 液 由 低 离子 强度 到 高 离子 强度 ， 以 相隔 一 定 体 积 连 续 更 换 。 图 5 为 两 种 洗 脱 方式 的 比较 。 NN. Bei A Tek 洗 陪 流 的 流速 快慢 影响 色 层 带 的 分 离 效 果 , 一 般 来 说 慢 比 快 的 效果 好 ,但 太 慢 也 有 分 离 时 间 长 , 色 带 扩散 等 不 利 因素 。 究 竟 柱 层 析 选用 多 大 流速 最 好 ， 要 根据 具体 情况 而 定 ， 如 层 析 柱 的 容量 大 小 ， 交 换 剂 的 性 能 ， 如 强度 ( 即 涨 缩 性 )， 和 孔径 大 小 多 少 ， 颗 粒度 等 都 有 关 。 选 择 流速 常常 带 很 大 的 经 验 人 性 ， 没 有 具体 的 规范 化 。 图 6 比较 两 种 流速 的 分 离 效 果 。 图 示 B 较 A 的 分 辩 力 差 。 流 速 的 表示 法 ,常用 mlI/h\ 也 有 用 cm/b Rm, HABA 流量 计 测 量 ,比较 少 用 。 NaCl(mol/L) 洗 脱 液体 积 图 6 ”两 种 洗 脱 波 流 速 的 比较 ?血红 蛋白 与 白 蛋白 的 分 离 图 谱 A. 流速 8ml1/h; B. 流速 20ml1/h。 DEAE-Sephadex A50); 洗 脱 液 ?0.1mol/ 工 Tris-HCl, pH8.3。 九 、 样 品 BR 离子 交换 层 析 对 样品 液 的 体积 要 求 不 如 凝 胶 过 滤 层 析 严 格 ,后 者 的 上 样 体积 愈 小 ,分 离 效果 愈 好 。 对 离子 交换 层 析 的 样品 液 的 离子 强度 和 pH 的 要 求 严 格 , 否则 分 离 效果 不 好 ;其 体积 稍 大 些 无 关 紧 要 ， 一 般 限 制 在 柱 床 体积 的 1 一 59% 为 宜 。 为 了 保证 全 部 样品 吸 ea 59 。 只 在 柱 的 上 层 ， 阳 离子 交 apn pH (AU FAR pH 单位 为 宜 ; 对 阴离子 交换 层 析 可 高 一 个 pH 单位 为 宜 。 上 样品 时 ,要 保持 上 层 表面 的 平整 ， 防 止 气泡 进入 表层 。 cea eenaaeial ec atcame IE fe Fate AAA. HD at — FRR ELK HARI, BR aot hho +. wea MAKE 离子 交换 层 析 的 收集 液 , 含 大 量 的 无 机 盐 , 体 积 也 较 大 ,需要 浓缩 和 去 盐 , 才 能 得 到 产 量 。 浓 缩 的 方法 有 很 多 种 ,如 超 滤 、 透 析 , 硫酸 铁 沉 淀 ，Sephadex 或 右 旋 糖 本 (Dextran) 赔 水 处 理 等 。 国 内 已 生产 各 种 类 型 的 超 滤器 和 超 滤 腊 ,可 用 于 浓缩 ,但 有 时 也 会 发 现 蛋 自 质 户 失 或 变性 。 在 选择 何 种 方法 时 , 需 经 初步 试验 ,找到 理想 的 方法 。 得 到 的 产物 ， 如 果 冻 干 后 不 会 失 活 ,以 冻 干 后 低温 保存 为 宜 。 Tae Je 离子 交换 层 析 是 目前 纯化 蛋白 质 常 用 的 重要 方法 。 由 于 从 生物 材料 中 有 种 类 繁多 的 蛋白 质 , 经 过 一 次 离子 交换 层 析 就 达到 高 纯度 的 例 于 并 不 多 ,需要 与 其 他 纯化 蛋 自 质 方法 瑟 合 ,才能 达到 预期 的 效果 。 如 用 经 典 的 方法 ,如 盐 析 ,分 部 沉淀 ,有 机 溶剂 抽 提 ,调节 pH 沉淀 等 初步 纯化 后 ,再 经 亲 和 层 析 , 凝 胶 过 滤 等 方法 精制 ， 离 子 交换 层 析 从 利用 其 带电 和 荷 性 质 的 差异 发 择 其 专长 ,就 能 取得 理想 的 效果 。 即 使 离子 交换 层 析 本 身 , 有 时 也 须 改 换 层 本 条 件 或 重 层 析 才 能 使 分 离 的 蛋 日 质 达到 高 纯度 。 $4 Ze {11 Jon Exchange Chromatography, Principles and Methods. Pharmacia Fine Chemicals, Printed in Sweden by Rahms i Lund (1980). (2) Pao) ZB . 姜 涌 明 、 罗 贵 民 、 林 永 齐 ,< 蛋 白质 分 子 基础 ?高 等 教育 出 版 社 ，1981. {3] Bikales, N. M. and Segal，L.，Cellulose and Cellulose Derivatives, Wiley and Sons Inc. (1971). 疏水 层 析 届 贤 锅 (中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 —,HEA RR & BARDOT LARK, CNEZHRAR. RAM FEAR. MAB. AAARS 非 极 性 的 侧 链 密集 一 起 形成 ,并 暴露 于 分 子 的 表面 。 但 不 同 蛋白 质 分 子 的 蕊 水 区 强 弱 有 较 大 差异 。 朴 水 层 析 技术 的 基本 材料 是 在 不 带电 荷 的 载体 上 偶 联 朴 水 基 团 而 成 的 牙 水 吸 附 剂 。 根 据 这 些 芒 水 基 团 和 有 蛋白质 蔓 水 区 间 相 互 作用 的 强 弱 ， 可 以 达到 分 离 的 目的 。 六 水 层 析 的 分 离 效 果 依 赖 于 系统 中 的 三 个 主要 组 成 成 分 之 间 的 祖 互 作用 : 即 蕊 水 吸 附 剂 \ 溶 剂 水 .和 带 部 分 标 水 性 质 的 溶质 (生物 大 分 子 ), 见 图 1。 溶 质 和 站 水 吸附 剂 之 间 相 互 作用 的 强度 依赖 于 溶质 和 偶 联 在 载体 上 芷 水 基 团 的 牙 水 性 ， 及 它们 和 溶剂 水 的 相互 作 用 。 任 何 微小 的 扰动 ,如 如 度 pH、 离子 强度 等 变化 都 会 影响 到 这 三 种 组 分 中 的 一 种 或 多 种 ， 都 将 可 能 影响 芷 水 层 析 的 分 离 效果 ”。 这 就 使 实验 设计 和 选择 洗 脱 条 件 具 有 较 大 的 弹性 ,也 使 芒 水 层 析 成 为 适用 于 多 方面 应 用 的 技术 。 疏水 溶质 〈 蛋 白质 ) | | iat | | Ad wo Bl 豚 附 剂 蛋白 质 样品 分 子 (疏水 溶质 ) 和 溶剂 水 在 莹 水 层 析 中 相互 作用 。 改 变 这 三 种 组 分 的 一 种 或 多 种 都 可 能 影响 分 离 效果 / ” =. BEAR RPL HELE sill GB Be PER rie Bae RPT FA Bit 7K SAS FA — $e A Soe A BEB ST RR KR, TRAE (A RE RE EP, Ue 1 中 的 I、I、III。 瑞 典 Phamacia 公司 有 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B * 61 。 (Octylsepharose CL-4B) 和 共 基 交 联 琼脂 糖 凝 胶 4B (Phenyl-Sepharose CL-4B) 商品 出 ， 和 售 ， 能 满足 一 般 使 用 的 要 求 。 玫 1 中 的 IV 和 V 是 这 两 种 疏水 吸附 剂 的 部 分 结构 。 由 于 这 两 种 吸附 剂 的 载体 是 交 联 了 琼脂 糖 。 所 以 有 很 高 的 化 学 与 物理 稳定 性 。 它们 能 抗 尿素 、 氧化 有 等 变性 剂 。 吸 附 剂 里 的 水 被 有 机 海 剂 置换 也 不 影响 凝 胶 的 结构 ， 对 离子 型 或 非 离 子 型 的 去 垢 剂 也 是 稳定 的 。 两 种 吸附 剂 偶 联 上 的 配 基 浓 度 大 约 40umol/ml 沉降 后 凝 胶 体积 。 其 取代 程度 相当 于 每 mol 半 乳 糖 上 大 约 有 0.2mol 的 蓝 水 取代 基 。 吸附 剂 的 结 - 合 容量 视 实验 条 件 及 蛋白 质 性 质 布 有 所 不 同 。 在 含有 1 mol FERPA 0.01mol pH6.8 磷 酸 缓冲 液 中 这 两 种 吸附 剂 每 ml 胶 可 结合 大 约 15 一 20mg 人 血清 白 蛋 白 或 3 二 5mg 太 - 羽 球 蛋白 这 两 种 吸附 剂 应 该 以 悬浮 状态 保存 。 虽 然 凝 胶 本 身 具有 抗 生 物 降解 的 能 力 , 但 由 于 在 悬浮 液 的 基质 中 特别 有 磷酸 根 离子 的 存在 下 ,微生物 很 容易 生长 ,因此 通常 悬浮 液 rh fe Bp FE 0.02 % ) 以 防 微 生物 生长 。 并 且 应 该 贮存 在 低 于 8%c 的 冰箱 中 。 DANE 冻结 。 = ER 1 Rl 常见 的 一 些 合成 疏水 层 析 吸 附 剂 编号 结 ; 构 I §—NH(CH,),NH—Co— ¢ 》 上 7 Il §—NH(CH,),CH, III § —NH(CH,),CH, Iv §—O —CH,—CH—CH,— 0 —(CH,),—-CH, _ | OH V 4 一 O 一 CH 一 CH 一 CH 一 O 一 ¢ 》 | = OH § 代表 琼脂 糖 凝 胶 或 交 联 琼脂 糖 凝 胶 表 2 了 朴 水 相互 作用 的 离子 效应 < 一 增加 盐 析 效 应 阴离子 POR. 503-,CH,.COO-, Clas Br-5 NO;,C10;, I-, SCN” ® 阳离子 NH?#, Rb+,K+t, Nat ,Cst, Lit,Mg?+, Ca?+, Ba?+ 增加 减 极 效应 -一 > 三 、 吸 附 、 洗 脱 和 吸附 剂 的 再 生 吸附 生物 大 分 子 采用 柱 层 析 法 ， 装 柱 和 拆 柱 和 其 他 类 型 的 柱 层 析 法 祖 同 。 将 吸附 齐 装填 柱 内 后 (最 好 先 用 水 泵 减 压 抽 去 气泡 ), 用 样品 缓冲 液 充分 平衡 吸附 剂 ,再 将 样品 溶 该 在 一 定 条 件 下 过 柱 。 为 了 使 要 分 离 的 生物 大 分 子 能 紧密 地 结合 在 柱 上 ， 适 当选 择 缓冲 芒 的 性 质 ,pPH 和 离子 强度 ,同时 也 要 考虑 温度 的 因素 , 洗 脱 缓冲 液 的 选择 对 有 效 的 分 离 更 其 es。 62 。 ‘AB Bre. DA HE EEE BE (6 Ys HA BS FBR BEI, BT RR Bit Zk PE SR EE — ARK ik, FA Bit ZK FS | 析 方 法 分 离 生物 大 分 子 ,为 使 所 要 分 离 的 物质 吸附 到 吸附 剂 上 ,在 样品 溶液 中 加 入 较 高 的 | 盐 浓度 (如 4mol 浓度 的 氧化 钠 溶液 )。 不 同 的 盐 对 促进 朴 水 作用 的 效应 根据 它们 的 离 于 性 质 是 不 同 的 。 表 2 给 出 几 种 常用 阴离子 和 阳离子 增强 贾 水 效应 〈 盐 析 效 应 salting out effect) 或 降低 朴 水 作用 强度 ( 减 极 效应 chaotropic effect) 的 级 序 。 为 有 效 地 洗 脱 吸 附 在 吸附 剂 上 的 生物 高 分 子 达到 分 离 的 目的 。 可 根据 这 些 物 质 与 吸 : 附 章 的 不 同 想 水 作用 强度 来 改变 洗 脱 条 件 , 以 达到 选择 性 的 解吸 附 , 这 可 以 用 下 列 方法 中 的 一 种 或 几 种 改变 洗 脱 液 来 实现 。 1. 变换 一 种 具有 较 低 盐 析 效应 的 离子 ,参看 表 2。 2. 降低 离子 强度 。 3. 减弱 洗 脱 剂 的 极 性 ， 可 参看 表 2。 也 可 加 入 乙 二 醇 。 4. 含 有 去 垢 剂 的 洗 脱 剂 。 5. 增高 洗 脱 剂 的 pH (Ho 吸附 剂 的 再 生 : 每 次 实验 结束 后 ， 吸 附 齐 需要 再 生 。 因 为 吸附 剂 中 尚 留 有 结合 得 非 常 紧密 的 生物 高 分 子 , 去 垢 剂 等 。 未 经 再 生 的 蔬 水 吸附 剂 , 其 吸附 容量 将 明显 降低 ， 甚 至 一 点 也 不 能 吸附 物质 。 一 般 来 说 ， 吸 附 剂 经 过 再 生 可 以 反复 使 用 。 资 料 中 曾 有 报道 再 生 过 程 可 以 在 层 析 柱 中 进行 。 但 根据 我 们 的 经 验 ， 在 层 析 柱 中 进行 再 生 的 吸附 剂 柱 很 容易 “出 花 " “断裂 "。 为 免 遭 整个 实验 失败 ,还 是 在 烧杯 中 再 生 为 好 。 从 柱 中 取出 的 吸附 剂 通 常用 各 种 溶剂 在 烧杯 中 悬浮 ,再 用 沙 芯 漏斗 吸 滤 ;每 换 一 次 洗涤 溶剂 ,再 如 此 操作 一 遍 。 再 生 过 的 吸附 剂 在 重新 装 柱 前 , 需 减 压 抽 去 深 解 在 滚 体 中 的 气体 ,以 免 柱 装 好 后 因 温度 变化 或 洗 脱 剂 的 变换 而 出 现 气泡 ， 使 柱 "出 花 或 断裂 。 具 体 过 程 可 用 下 列 溶剂 依次 洗涤 。 1. 用 蒸馏 水 洗 闪 二 次 以 上 ;2. 用 乙醇 洗 一 次 ;3. 用 正 丁 醇 洗 二 次 ;4. 用 乙醇 洗 一 次 ;5. 用 蒸馏 水 洗 一 次 , 减 压 除 气泡 , 装 柱 ;6. 用 初始 缓冲 液 平 衔 吸附 剂 ,为 下 次 实验 作 好 准备 。 四 、 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B 和 茜 基 交 联 琼脂 糖 4B 应 用 举例 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B: 蛋白 质 的 纯化 ,通常 是 在 组 织 匀 桨 后 用 硫酸 锐 分 级 沉淀 。 高 当 度 的 硫酸 按 能 非常 有 效 地 促进 疏水 作用 。 因 而 分 级 后 得 到 所 需 的 级 分 就 可 直接 加 到 上 水 吸附 剂 柱 上 进行 朴 水 层 析 分 离 。 图 2 给 出 从 大 麦 粉 抽 提 液 用 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B 朴 水 层 析 纯化 8- 淀粉 酶 的 一 个 实 验 。 样 品 在 0.01mol/L 磷酸 缓冲 液 pH6.8 中 含有 0.25 饱和 度 的 硫酸 匀 ， 这 一 浓度 略 低 于 使 8- 淀 粉 酶 沉淀 的 浓度 。 将 其 加 到 柱 上 后 ， 未 结合 的 蛋白 质 用 样品 缓冲 液 [ 即 0.01 mol/L 磷酸 缓冲 液 (pH6.8) 中 含 0.25 饱和 度 的 硫酸 贸 ] 从 柱 上 洗 去 。 然 后 ,吸附 的 蛋白 质 用 降低 硫酸 镑 浓度 并 增加 乙 二 醇 浓 度 的 梯度 洗 脱 〈 最 终 浓 度 分 别 为 0% 和 50%)。 洗 ACSA MBB HR, BATA 14 倍 。 若 不 加 减 极 性 剂 乙 二 醇 DF REREEL. BOA. ALBEKRERRREACOBS 葵 基 交 联 琼脂 糖 4B: ATR ERS A BBE EH As RRS BS 4B 上 结合 得 很 定 。 解 吸 这 种 蛋白 质 所 用 的 洗 脱 条 件 往 往 会 使 蛋白 质变 性 。 试 以 三 种 蛋白 质 : 细胞 色素 es 63 。 人 zaonm 100 200 300 400 洗 脱 体积 (m]) 图 2 ”用 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B 朴 水 层 析 纯 化 大 麦 8- 淀粉 酶 : 40m1 0.01mol/ 工 磷酸 缓冲 液 (pH6.8X% 中 含有 0.25 饱和 度 的 硫酸 铵 的 大 考 抽 提 液 柱 的 床 体积 30 症 1 流速 25mm1/h> 样 品 加 入 后 用 85ml 样品 缓冲 液 洗 桨 。 然 后 ， 用 降低 硫酸 铵 浓度 并 增加 乙 三 醇 浓 度 梯度 洗 脱 ( 最 终 浓 度 分 别 为 099 和 592)。. 实 线 是 蛋白 质 的 洗 脱 峰 ; 酶 活力 以 虚线 峰 标 出 。 C、5- 乳 球 蛋白 和 血红 蛋白 为 例 。 在 最 适 条 件 下 ， 踊 水 性 相对 低 的 细胞 色素 C Bae Al 留 在 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B 柱 上 ， 但 还 可 解吸 出 来 。 其 他 两 种 更 强 疏 水 性 的 蛋白 质 委 本 不 能 从 柱 上 解吸 。 此 时 如 用 苯 基 交 联 琼脂 糖 4B- 能 洗 它 们 很 好 地 分 离 。 因 丝 强 蕊 水 性 蛋白 质 宣 用 苯 基 交 联 琼脂 糖 4B。 苯 基 交 联 琼脂 糖 4B LARK, 界 于 直 链 的 正 丁 基 和 正成 基 之 间 。 对 于 蛋白 质 上 的 葵 基 和 酷 氨 酰基 亦 可 能 显示 出 更 加 专 一 的 芳 基 性 相互 作用 (<-r 相互 作用 )， 这 可 说 明 在 特定 例子 中 的 分 离 作 用 。 图 3 是 大 麦 5- 淀粉 酶 在 葵 基 交 联 琼脂 糖 4B 上 的 层 析 结果 。 所 用 的 实验 条 件 和 图 2 一 样 ,但 从 图 谱 上 看 p- 淀 粉 酶 活性 的 洗 脱 要 延 后 得 多 ， 这 说 明 有 一 些 特 殊 的 相互 作用 发 生 ,很 可 能 由 于 载体 上 葵 基 的 芳 基 性 所 为 。 光 吸 收 280nm 乙 二 醇 浓 度 多 BRA A) 3 用 葵 基 交 联 琼脂 糖 4B KR SULAR 68- 淀 粉 酶 实验 条 件 局 图 2。 我 们 的 经 验 也 发 现 辛 基 交 联 琼脂 糖 48 与 葵 基 交 联 琼脂 糖 48 的 蕊 水 性 有 较 明 显 的 差别 。 在 纯化 杆 乔 晴 血 淋巴 杀菌 肽 D 的 过 程 中 ,样品 经 葡 聚 糖 凝 胶 G-100 过 滤 ， 两 次 羧 甲 基 琼 脂 糖 柱 层 析 分 离 , 再 经 沸水 浴 加 热 3003, BDADLAK PMA RAS 2 摩尔 浓度 。 若 将 此 样品 加 到 辛 基 交 联 琼脂 糖 48 EA, 很 难 使 杀 著 肽 D 在 不 变性 条 件 下 解吸 » Gs 出 来 。 但 将 此 样品 在 苯 基 交 联 琼脂 糖 4B 柱 中 进行 朴 水 层 析 ， 以 降低 洗 脱 液 的 离子 强度 进行 解吸 ,可 以 达到 很 有 效 的 分 离 , 得 到 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 单 一 区 带 的 杀菌 肽 ”。 五 、 臣 水 层 析 吸附 剂 其 他 方面 应 用 的 举例 1. 作为 固 相 酶 的 载体 有 些 具有 非常 强 臣 水 性 质 的 酶 可 以 很 牢固 地 被 吸附 在 诅 水 吸附 剂 上 ， 特 别 是 辛 基 交 联 琼脂 糖 4B。 这 类 吸附 剂 能 作为 可 逆转 的 固定 化 酶 载体 制 成 酶 反应 器 。 由 于 这 种 男 定 化 并 非 共 价 键 结合 ,因此 当 这 种 酶 反应 器 使 用 过 入, 酶 已 失 活 , 便 可 将 这 部 分 老 酶 洗 去 ,再 固定 新 鲜 的 酶 达到 重复 使 用 。Hijertey2 等 人 曾 用 辛 基 交 联 琼脂 糖 48 MELT ABA 6- 半 乳 糖 昔 酶 ,经 过 几 星期 的 使 用 酶 的 活力 仍然 保留 。 2. 作为 “去 垢 剂 交换 层 析 ”” 在 研究 内 膜 蛋白 质 时 经 常 需要 变换 不 同 的 去 垢 剂 。 例 如 提纯 内 了 膜 蛋白 质 细胞 色素 C 氧化 酶 常常 要 变换 去 拍 剂 胆 酸 盐 、 脱 氧 胆 酸 盐 、Triton X-100、Nonide P-40、 lauryl maltoside、Tween 20、Tween 80 或 Brij 96。 变 换 不 同类 型 的 去 垢 剂 ， 可 用 葵 基 交 联 琼 脂 糖 4B 来 完成 ,就 像 用 Dowex !1 氧 型 或 醋酸 型 树脂 去 交换 阴离子 或 Dowex50 钠 型 或 钾 型 去 交换 阳离子 一 样 方便 , 且 回 收 率 也 高 。 由 于 其 方法 类 似 于 离子 交换 层 析 , 因此 Robi- nson 等 人 把 这 种 方法 称 之 谓 去 拍 剂 交换 层 析 (detergent-exchange chromatography)。 在 实验 步骤 设计 时 要 注意 下 列 三 点 : C1) 用 需要 的 去 垢 剂 平 衡 弓 水 吸附 剂 ， 此 去 垢 剂 可 交换 出 已 和 蛋白 质 结合 的 原先 的 Eo (2) 为 避免 膜 蛋白 的 凝集 或 沉淀 ， 所 用 去 垢 剂 的 浓度 要 高 于 各 自 去 拍 剂 的 临界 胶 柬 浓度 (critical micelle concentration), G3) 为 使 蛋白 质 和 吸附 剂 结合 得 最 小 ,应 该 用 相当 高 的 PH(9.0), 低 离 子 强度 (0.01) 的 去 拆 剂 盗 液 预先 饱和 臣 水 吸附 剂 。 上 面 三 个 步骤 的 条 件 都 已 满足 和 完成 后 就 可 开始 交 换 另 一 类 型 去 拍 剂 的 层 析 。 = + xX 【1] Hyjerten, S., Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins on Neutral Adsorbents, In “Methods of Protein Separation”, N. Catsimpools. Ed., Vol. 11, 1976. [2] APR PSA BRE RE RIK RATS REBAR: Ul. BHRKENTA. 动物 学 研究 ,4， 255—259,1983, ; [3] Axen, R., Porath, J., Ernback, S., Chemical Coupling of Peptides to Polysaccharide by Means of Cyanogen Halides, Nature, 214, 1302—1304, 1967. . [4] Xian-ming, Qu ( H}4%), Hakan Steiner, Ake Engstrom, Hans Bennich and Hans Boman, Insect Immunity: Isolation and Structure of Cecropins B and D from Pupae of the Chinese Oak Silk Moth Antheraca Pernyi, Eur. J. Biochem., 127, 219—224, 1982. [5] Hyjerten, S. Rosengren, J., Pahlmans, S., Hydrophobic interaction Chromatography: The Synthesis and Use of Some Alkyl and Aryl Derivative of Agarose, J. Chromatogr., 101, 281—288, 1974. [6] Neal, C, et al., Phenyl-Sepharose-Mediated of Detergents Bound to Membrane Proteins, Biochem., 23, 6121—6126, 1984. ° 65 e 蛋白 质 亲 和 层 析 技术 于 (中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 蛋白 质 的 分 离 纯化 方法 近 20 年 来 取得 很 大 进展 ,其 中 尤 以 亲 和 层 析 引 人 人 注目， 已 有 大 量 文献 和 一 些 专著 ”。 蛋白 质 亲 和 层 析 的 一 般 过 程 是 ， 在 一 种 固 相 载 体 上 接 有 某 种 基 团 或 某 种 分 子 作为 配 基 , 国定 化 的 配 基 装 成 层 析 柱 , 经 平衡 后 ,将 一 多 种 蛋白 质 的 混合 物 通过 之 ,用 平衡 滚 洗 去 杂 蛋 白质 ,只 有 能 和 配 基 作 用 的 蛋白 质 , 因 非 共 价 作用 (有 时 也 可 以 是 共 价 键 ) 被 吸附 在 柱 上 ,最 后 用 适当 的 试剂 将 被 吸附 的 蛋白 质 洗 脱 下 来 。 经 这 一 层 析 过 程 , 所 需 的 蛋白 质 可 以 被 纯化 几 十 倍 , 乃 至 上 于 倍 。 亲 和 层 析 使 蛋白 质 分 离 纯化 过 程 大 为 简化 ,从 而 提高 了 被 分 蛋白 质 的 得 率 。 最 突出 的 例子 是 血液 中 维生素 Bu 结合 蛋白 的 分 离 。 这 一 蛋白 质 在 血清 蛋 白质 中 的 含量 只 有 一 于 万 分 之 五 ， 要 分 离 纯化 这 样 微量 的 蛋白 质 极 为 困难 ,不 仅 步 又 多 ， 而 且 产 率 低 ， 然 而 使 用 订 和 层 析 法 则 得 到 令 人 满意 的 结果 ”。 亲 和 层 析 还 有 另外 两 个 很 多 方法 无 法 比拟 的 优点 : 一 是 ,可 把 具有 活性 的 成 分 和 其 失 活 状 态 分 开 ; 男 一 是 ;能 从 较 21 蛋白 质 亲 和 层 析 的 分 类 依 据 | 被 分 物质 的 特异 组 成 或 性 质 «© 亲 和 吸 附 剂 上 的 配 基 常用 的 洗 脱 条 件 @9 iif EH iOS PAE Ins RAW MEIAI 基 化 | Wisk ABLE 硼酸 基 团 改变 PH， 通常 降低 pH nash A 金属 | wai EDTA, SEE PH 或 加 大 离 于 强度 特 或 | eee 具有 一 定 结构 的 染料 (0 低 浓度 的 辅酶 ,或 改变 PH 等 RG | wee, mE SRI ELMER pH 氨基 或 羧基 羧基 或 氨基 (2 改变 pH 或 加 大 离子 强度 酶 及 其 蛋白 质 类 抑制 剂 ”| 相应 底 物 、 抑 制剂 \ 辅 酶 或 酶 “| 专 一 的 小 分 子 化 合 物 ( 如 底 物 ) 改变 pH 抗体 等 免疫 话 性 物质 相应 抗原 或 有 关 的 免疫 活性 剂 | PH2 AM, pH10.5 的 有 机 胺 或 《作为 抗原 的 7) 蛋白质 其 诱导 产生 的 抗体 3mol/L NaSCN Aika fix Th TRE RE 其 专 一 作用 的 糖 类 半 抗 原 糖 类 ， 低 PH 维生素 或 激素 的 结合 蛋白 | 与 了 结合 的 维生素 或 激素 受 体 与 之 作用 的 配 基 -可 ms C1) 在 一 定 程度 上 可 视 为 鄞 水 层 析 。(《2) 通常 这 类 层 析 被 称 为 离子 交换 层 析 。 就 其 本 质 而 言 ， 和 上 画 几 种 层 析 完全 相同 。(3) 亲 和 层 析 的 洗 脱 条 件 , 原 则 上 是 先 用 专 一 的 小 分 子 配 基 * 如 小 分 子 配 基 不 易 得 到 ;或 被 分 物质 强烈 吸附 在 柱 上 ，, 则 再 选用 改变 pH 增加 离子 强度 ,高 浓度 变性 剂 等 。 NS SHE Ht PE oN 4 ak Fok BE AYR BR Eh Pe BR 5) FA es。 66 。 纯 的 样品 中 除去 通常 方法 难以 去 除 的 少量 杂质 ， 有 人 称 之 为 反 亲 和 层 析 。 蛋白 质 的 亲 和 层 析 大 致 可 以 分 为 两 大 类 :一 类 是 基于 被 分 离 物质 中 含有 特殊 的 组 分 ， 例如 游离 斑 基 金属 或 辅酶 I\II 等 ; 另 一 类 则 是 以 它们 的 生物 活性 为 依据 。 详 见 表 1。 表 2， 亲 和 层 析 中 常用 的 载体 及 其 活化 和 偶 联 方法 活化 方法 偶 联 方法 具体 实例 (1) 交 联 琼脂 糖 C1) 省 化 氛 活 化 碱 性 条 件 下 和 氨基 反应 (2) Sei A AR HE (2) 过 碘 酸 氧化 生成 醛 基 还 原 剂 存在 下 和 胺 、 肝 类 化 合 物 反应 (3) 淀粉 RI, a die okie ath ce SE een eae 3 Zi : & —B, RA 4) 纤维 索 (3) Reape Hea RAMS KARA ROB BEAL a LA | 与 胺 类 反应 RG MM 双 功 能 团 试剂 : ROM 用 带 有 功能 田 的 有 机 硅 | 根据 所 接 有 的 功能 团 的 性 质 洼 行 个 联 * SESA 为 68- 硫酸 酯 乙 现 基 苯 胺 亲 和 层 析 中 最 关键 的 物质 是 具有 亲 和 活 性 的 载体 。 表 2 则 列举 了 几 种 目前 最 常用 的 载体 、 它 们 的 活化 方法 以 及 和 配 基 偶 联 的 方法 。 人 们 还 常用 一 些 具 有 一 定 长 度 的 双 功 能 团 化 合 物 作为 间隔 物 (俗称 手臂 ) 插 在 载体 和 配 基 之 间 ， 以 期 减 小 因 载 体 和 配 基 过 于 靠 近 而 造 威 的 空间 位 阻 现象 。 下面 举 斤 个 实例 。 而 且 主 要 是 表 1 中 的 后 一 大 类 。 一 、 RRR 凝集 素 是 自然 界 中 广泛 存在 的 一 大 类 能 和 糖 类 专 一 结合 的 蛋 和 白质。 目前 分 离 纯化 凝 集 素 最 常用 的 方法 之 一 就 是 亲 和 层 析 。 天 然 存在 的 一 些 多 糖 经 交 联 ， 就 可 用 作 很 多 凝集 RAMEE ORAM. SAMDRRAND BAI. 1. 分 离 过 程 2kg BID AAAS MOLT Ra. 用 8 升水 在 4*c 搅拌 抽 提 3 ON. BRERA, Smol/L HCl 调节 抽 提 液 的 pH 至 4.6, 产 生 的 沉淀 经 1500Xg 离心 30 分 钟 除去 。 加 入 BIA TAR ER, HE 60% 饱和 度 ，3000Xg 离心 30 分 钟 。 收 集 蛋 白质 沉淀 ,并 用 869 毫升 水 YR. 49°C 下 对 10mmol/L, pH7.2 的 含 0.15mol/ 工 NaCl 的 磷酸 缓冲 液 充 分 透析 。3000 Xg 离心 30 分 钟 , 清 液 即 是 所 需 的 粗 产 品 。 BE RK Wa FRE EE G-100 KE (4 X 55cm) 用 2.5 升 上 述 磷 酸 缓冲 液 平 衡 ,流速 为 1Iml/ ming 粗 产 品 上 柱 后 ,用 平衡 液 充分 洗涤 ,除去 未 被 吸附 的 杂 蛋 白质 。 至 洗涤 液 的 OP 小 于 0.05。 改 用 0.2moel/L 葡萄 糖 咨 液 (用 平衡 液 配制 ) 洗 脱 ， 即 可 得 基本 上 纯 的 殉 豆 凝集 素 ， 产 率 为 650mg/kg。 所 得 的 产品 经 DEAE 纤维 素 柱 层 析 可 得 A 和 了 两 种 同 功 凝 集 素 , 其 中 B 约 占 75 多 ,其 余 为 A 成 分 。 ea 67 e 2 说 明 目前 很 多 对 甘露 糖 或 葡萄 糖 专 一 的 凝集 素 常 用 与 上 述 过 程 大 同 小 异 的 方法 来 分 离 o 对 半 乳 糖 专 一 的 凝集 素 则 用 交 联 琼脂 糖 48 或 6B 进行 分 离 纯化 。 如 交 联 琼脂 糖 凝 胶 经 酸 处 理 , 则 可 改进 其 亲 和 层 析 效 果 ”。 甲 壳 质 已 被 用 于 对 _N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 专 一 的 凝集 素 的 分 离 。 许 多 凝集 素 的 分 离 纯化 可 参看 有 关 的 综述 和 专著 乌 。 用 上 述 简单 过 程 纯化 得 到 的 殉 豆 凝集 素 和 其 他 一 些 凝 集 素 已 达到 相当 的 纯度 ， 可 用 于 蛋白 质 一 级 结构 的 测定 。 这 个 例子 说 明 一 些 天 然 高 聚 物 已 被 用 作 亲 和 层 析 的 吸附 剂 。 但 这 类 例子 除 凝集 素 外 还 很 少见 。 与 此 相似 的 是 ， 一 些 实验 室 用 交 联 的 细胞 作为 亲 和 吸 附 剂 ， 这 是 因 为 细胞 表 面 也 具有 一 些 糖 蛋白 或 受 体 ,它们 可 作为 配 基 ;, 而 细胞 则 被 视 为 载体 。 然 而 更 多 的 亲 和 层 析 所 用 的 吸附 剂 , 则 是 将 某 种 特定 的 配 基 分 子 接 到 载体 上 8 二 、 胰 重 白 酶 抑制 剂 的 分 离 05] 这 是 一 个 以 生物 大 分 子 为 配 基 进 行 亲 和 层 析 的 例子 。 1 固定 化 胰 蛋 白 酶 的 制备 15ml 压 积 的 交 联 琼脂 糖 4B8 用 砂 芯 漏斗 过 滤 , 用 水 洗涤 后 , 悬 序 在 40ml KH, MA 省 化 氰 溶液 (2g HF 3ml 水 中 ) ,立即 用 Smol/L NaOH 节 调 pH 至 1 升 ,搅拌 10 耸 名 ,同时 用 碱 维持 pH 为 11。 然 后 用 砂 世 漏斗 过 滤 已 活化 的 交 联 琼脂 糖 4B ,并 迅速 用 正 升 冷水 和 1 升 50mmol/ 工 、pH9 的 硼酸 缓冲 液 先 后 洗涤 。 洗 净 的 活化 交 联 琼脂 糖 4B ASE 20mi 上 述 硼酸 缓冲 小 中 ， 并 很 快 好 加 入 300mg 胰 蛋 白 酶 (用 含 10mmol/L CaCl, MERAH TREC Hi) JIRA ME 4°C 温和 搅拌 18 小 时 。 接 有 胰 蛋 白 酶 的 交 联 琼脂 糖 8 用 工 升 含 有 0.3mol/L NaCl, 10mmol/L CaCl, 的 上 述 缓冲 液 洗 洗 。 然 后 装 和 人 入 15X7.5c WHA, 用 0.1mol/ 工 ;pH4.0 的 乙酸 缓冲 液 乎 衡 , 备 用 。 2 忠 蛋白酶 抑制 剂 的 分 离 18mg 部 分 纯化 的 牛 卵巢 抑制 剂 溶 于 2ml pH4.0 的 乙酸 缓冲 液 中 ， 上 已 平衡 的 固定 化 胰 蛋 白 酶 柱 , 用 平衡 波 充 分 洗涤 柱 , 并 未 见 任何 抑制 剂 活性 。 改 用 含 0.5mol/E NaCl 和 10mmol/L CaCl, 的 0.1mol/L HCI(CpPH~1.2) 洗 脱 ， 可 得 一 有 抑制 剂 活性 的 蛋白 质 峰 。 话 性 成 分 对 水 透析 , 再 经 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 G10 柱 (0.9 X 61cm) Bish, RUT 3 说 明 这 例子 介绍 的 是 经 典 的 交 联 琼脂 糖 活化 的 方法 。 近 年 来 有 所 改进 。 一 是 将 省 化 握 盗 eT CAD ,通常 是 1g RAAT 2ml 乙 且 中 。 这 一 改进 的 好 处 是 省 化 氰 易于 溶解 ,而 己 且 又 能 和 水 混 溶 ,提高 了 活化 效率 。 另 一 改进 是 将 交 联 琼脂 糖 48 悬浮 在 等 体积 的 .2molj L NaCO (或 K.CO;) 中 ,在 整个 活化 过 程 中 pH 基本 上 稳定 在 10.5 左右 ， 从 而 不 必用 5mol/ 工 NaOH 来 调节 并 恒定 悬 序 让 的 pH, s 68 « 固定 化 胰 蛋 白 酶 不 仅 用 于 动物 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 分 离 ， 也 已 用 于 植物 来 源 的 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 分 离 ;例如 天 花粉 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 分 离 。 本 节 和 叙述 的 交 联 琼脂 糖 活化 以 及 与 大 分 子 配 基 的 偶 联 过 程 也 可 用 于 其 他 很 多 活性 蛋 白质 的 固定 化 。 应 该 提 及 的 是 ， 免 疫 球 蛋白 的 固定 化 又 为 许多 抗原 的 分 离 纯化 以 及 样品 中 少量 杂质 的 除去 提供 了 有 效 手 段 。 不 论 用 固定 化 胰 蛋 白 酶 来 分 离 抑 制剂 ， 还 是 用 固定 化 抗体 来 纯化 抗原 都 遇 到 同样 的 问题 , 即 如 何 选择 洗 脱 剂 ?因为 这 两 个 例子 中 , 配 基 和 被 分 离 物 质 都 是 大 分 子 , 而 且 它们 之 间 的 相互 作用 又 相当 专 一 ,很 难 找到 合适 的 半 抗 原 。 因 此 ,这 类 亲 和 层 析 中 常用 的 洗 脱 方 法 都 是 较为 届 烈 ,或 是 使 用 较为 极端 的 pH (例如 pH2 一 3 的 盐酸 , 或 pH10 一 11 的 有 机 胺 ), 或 是 使 用 脲 ` 盐 酸 胀 、 硫 氰 酸 盐 等 。 这 样 的 洗 脱 条 件 都 会 影响 到 层 析 柱 的 流速 以 及 缩 短 亲 和 吸附 剂 的 使 用 寿命 。 =. DA NAD 为 辅 基 的 脱 氢 酶 的 分 离 [] 更 多 的 亲 和 层 析 过 程 是 以 小 分 子 作 为 配 基 。 很 多 含有 辅 基 的 酶 , 辅 基 就 可 作为 配 基 。 这 一 节选 用 以 NAD 为 辅 基 的 脱氧 酶 的 分 离 为 例 。 1 e- 氢 基 已 酰 -NAD+- 交 联 琼脂 糖 的 制备 200ml 交 联 琼脂 糖 AB (PBA 8¢) 用 省 化 氰 活化 ,如 上 所 述 。20g s- 氢 基 已 酸 溶 于 200ml0.1mol/LNaHCoO, 中 ,加 类 活化 的 交 联 琼脂 糖 4B 悬浮 液 中 ,用 4mol/LNaOH 调节 pH 至 8.5。 此 混合 物 在 室温 中 搅 择 15 小 时 ,然后 顺序 用 0.1mol/L NaHCO,, 10mmol/L HCl,0.5mol/L NaCl 和 水 充分 洗涤 。 过 滤 后 得 80g 〈 温 重 ) 凝 胶 , 再 用 大 量 的 80%(V/V) PUNE KS MU. HA s- 氨 基 已 酸 的 凝 胶 转移 到 三 角 烧 瓶 中 ,加 入 NAD+ 溶液 (0.8g YF 24ml 水 中 ) 和 二 环 已 痰 二 亚 胺 (40g WF 96ml 吡啶 中 )。 这 一 悬 绎 液 在 室温 下 温和 搅拌 10 天 。 过 滤 ，* 并 先后 用 水 、 乙 醇 \40sc WET B.C KA 80%(V/V) 的 吡啶 水 深 液 洗 涤 , 以 除去 已 形成 的 二 环 已 脲 。 处 理 后 的 凝 胶 悬 浮 在 第 一 次 的 过 滤液 中 ,另外 加 入 10g 痰 三 亚 胺 ， 一 周 后 再 重复 前 述 洗涤 过 程 。 此 外 ,再 用 lmmol/L HCl 洗 30 分 钟 ， 冰 冷 的 0.Imol/L NaHCO, 洗 5 分钟， 最 后 用 0.5mol/L NaCl 和 水 充分 洗涤 。 这 样 所 得 的 制剂 以 湿 的 凝 胶 方法 在 4%C 保 存 , 在 几 个 月 内 是 稳定 的 。 每 克 干 重 凝 胶 接 有 50kmolNAD+。 2 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 和 乳酸 脱 氢 酶 的 分 离 gs- 氮 已 酰 -NAD+- 交 联 琼 脂 糖 4B 柱 (1.0 X 10.3cm) 含 有 约 17zxemol 辅酶 ,用 0.1mol/ 工 、 pH7.0 的 磷酸 缓冲 液 平 衡 。 4.1 单位 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 、37 单位 乳酸 脱氧 酶 和 0.9mg 和 牛 血 请 白 蛋白 溶 于 0.2ml 缓冲 液 的 混合 物 上 亲 和 层 析 柱 。 先 用 平衡 缓冲 液 洗 涤 柱 ， 可 将 和 牛 血 清白 蛋白 洗 脱 下 来 ， 不 杂 有 任何 酶 活性 o 而 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 和 乳酸 脱 氢 酶 则 分 BAY 0.15mmol/ 工 NAD+ (氧化 型 辅酶 ) 和 0.15mmol/L NADH (还 原型 辅酶 ) 所 洗涤 。 二 者 都 不 含有 另 一 种 酶 的 活性 。 se 69 。 3 说 明 很 多 酶 、 维 生 素 和 激素 的 结合 蛋白 以 及 激素 受 体 蛋 白 的 配 基 都 是 一 些小 分 子 化 合 物 。 它 们 大 多 可 以 直接 挂 到 载体 上 。 人 然而 这 样 连接 ,小 分 子 和 载体 过 于 靠近 ,致使 一 些 生 物 大 分 子 不 易 与 配 基 结 合 。 因 此 ,在 接 上 小 分 子 配 基 前 ,常常 先 接 上 一 些 具 有 相当 长 度 的 间隔 物 k 例 如 这 一 节 中 所 用 的 s- 氮 基 已 酸 ), 以 此 减 小 空间 位 阻 ,提高 亲 和 层 析 效 果 s* 有 一 些 双 功 能 团 试 剂 ,诸如 双环 氧 类 化 合 物 \ 戊 二 醛 等 ,它们 既 可 起 到 间隔 物 的 ,同时 又 作为 偶 联 试 剂 。 四 、 染料 配 基 末 和 层 析 纯化 碱 性 磷酸 单 酯 酶 长 期 来 蓝 色 葡 聚 糖 2000 被 用 于 测定 凝 胶 过 滤 柱 的 外 水 体积 。 后 来 发 现在 凝 胶 过 滤 夺 , 有 些 酶 竟 和 蓝 色 葡 聚 糖 结合 在 一 起 。 此 后 ,新 的 染料 配 基 亲 和 层 析 逐 渐 成 为 多 种 蛋白 质 分 离 纯化 的 有 效 的 手段 。 今 举 一 个 用 国产 活性 染料 制备 亲 和 吸 附 剂 及 其 应 用 的 实例 ”。 1 染料 配 基 吸附 剂 的 制备 ; 这 类 亲 和 了 吸附 剂 的 制备 很 方便 。 因 为 染料 工业 提供 了 很 多 活性 染料 ， 它 们 大 多 数 是 染料 和 三 聚 氯 且 之 类 多 功能 团 交 联 剂 的 反应 产物 。 这 些 中 间 产 物 既 有 反应 能 力 ， 在 一 定 条 件 下 仍 能 保存 。 目 前 最 常用 的 染料 配 基 是 Cibaron 蓝 F3GA (一 种 蓝 色 的 草 柄 染料 的 衍生 物 )。 国 产 的 二 种 活性 染料 ， 艳 蓝 K-GRS 和 ; Procion 红 .HE-33( 这 两 者 为 上 海 染 化 八 厂 生产 ) 都 可 代替 Cibaron 蓝 F3GA。 典型 的 制备 过 程 如 下 : 150g 慢 重 的 交 联 琼脂 糖 4B 悬浮 在 500ml 水 中 。 室 温 下 ;于 15 分 钟 内 慢 慢 加 入 te 活性 染料 (悬浮 在 100ml 水 中 )。 此 后 加 入 12g NaCcl， 搅 拌 38 分 钟 , 再 加 入 4g NaiCOi。45sC 水 浴 中 搅拌 48 小 时 。 反 应 结束 后 ， 过 滤 凝 胶 ， 用 大 量 水 选 Be. BI RMIAA ike FAZER AR EE G-100 代替 交 联 琼脂 糖 4B 也 可 。 2 PEON BEB Dot HL 由 1500g 新 鲜 小 牛 小 肠 上 刊 下 约 500ml 肠 粘 膜 ， 加 入 1500ml & 2mmol/L MgCl, 2mmol/LZnCl, 的 .10mmol/ 工 Tris-HCl 缓冲 液 ;pH7.4〈 以 下 简称 缓冲 液 甲 )。 久 浆 并 搅 Ff 3 小 时 。 然 后 加 入 750ml 正 丁 醇 至 匀 浆 中 ， 冷 室 搅 拌 过 夜 。 次 日 4000Xg 冷冻 离心 1 小 时 ,收集 水 相 。 界 面 处 的 沉 注 用 500ml 缓冲 液 甲 再 抽 提 30 分 钟 , BE, PRTG Ho WANAKA RK pH 至 5.0。4%C 搅拌 2 小 时 后 ,4000Xg 冷冻 离心 ; 取 上 清 液 ;加 入 固体 NaCOj， 调 PH 至 7.0。 硫 酸 筱 分 级 , 取 35—65% 饱和 度 这 一 级 分 。 此 级 分 先 用 -DEAE 纤维 素 柱 层 析 纯 化 。 接 着 再 顺序 用 蓝 色 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 G-100 和 红色 交 联 琼脂 糖 4B SE 化 碱 性 磷酸 单 酯 酶 。 染料 配 基 柱 (3.5 X 40cm) 用 缓冲 液 甲 平衡 后 ,将 DEAE 纤维 素 纯 化 的 样品 上 柱 ， 并 用 平衡 菩 充 分 洗涤 ,至 0O.Da < 0.1。 蓝 色 交 联 葡 聚 糖 柱 用 含 0.1mol/LE 磷酸 盐 的 缓冲 液 甲 洗涤 , 则 得 有 酶 活性 的 蛋白 质 峰 。 红 色 交 联 琼脂 糖 4B 柱 则 用 含 9.1mol/L 磷酸 盐 的 缓冲 锌 甲 对 缓冲 被 甲 柳 度 洗 脱 , 碱 性 磷酸 单 酯 酶 约 在 0.05mol/L 磷酸 盐 时 被 洗 脱 。 经 红色 染 « 70. 。 料 配 基 柱 纯化 的 样品 在 SDS- 聚 丙 炳 酰胺 凝 胶 电泳 上 仅 呈 一 蛋白 质 染色 带 。 整个 纯化 过 程 , 酶 比 活 提高 1300 倍 , 回 收 率 为 23 旬 。 用 正 丁 醇 处 理 时 损失 近 一 半 。 Ba A 化 4 倍 ,这 一 步 的 回收 率 为 62 匈 ， 而 经 红色 染料 柱 则 可 纯化 11 倍 ;而 回收 率 高 达 96%, 3 说 明 原始 的 文献 的 在 80°C 加 热 条 件 下 进行 偶 联 , 这 是 因为 活性 染料 上 第 三 个 可 反应 基 团 在 此 温度 易于 反应 ， 但 是 交 联 琼脂 糖 48 在 80°C 时 全 部 分 降解 。 故 上 述 偶 联 改 为 45%C 较 长 时 间 的 反应 。 染料 配 基 亲 和 层 析 最 早 被 用 于 一 些 与 核 背 酸 类 有 关 的 酶 的 分 离 。 后 来 发 现 它们 有 很 RRMA. 很 多 血液 中 的 蛋白 质 也 可 和 染料 配 基 结 合 。 通 过 改变 pH 和 离子 强度 等 方法 ,有 27 种 血浆 蛋白 可 用 这 类 层 析 分 离 纯化 。 特 别 要 指出 的 是 血清 白 蛋白 和 染料 配 基 柱 也 有 强烈 的 亲和力 * 约 有 96 多 的 白 蛋 白 可 以 被 此 柱 吸 附 ; 而 90% 以 上 的 免疫 球 蛋白 却 不 被 吸附 。 这 就 为 一 些 血 清 蛋 白质 制剂 中 少量 白 蛋白 的 除去 以 及 免疫 球 蛋白 的 纯化 提供 了 一 种 简便 有 效 的 方法 。 亲 和 层 析 已 被 广泛 使 用 ， 有 关 的 文献 多 得 不 胜 枚 举 。 然 而 基本 大 类 则 如 表 1 所 列举 药 ， 亲 和 层 析 所 用 的 吸附 剂 的 制备 大 体 上 也 不 外 乎 上 述 几 种 方式 。 但 在 实际 使 用 亲 和 层 析 时 则 于 变 万 化 ,应 根据 所 需 分 离 物 质 及 其 原始 材料 的 性 质 , 以 及 实验 室 所 具备 的 试剂 条 件 ( 包 括 载体 \ 间 隔 物 、 偶 联 试 剂 以 及 配 基 等 ) 设 计 简易 又 切实 可 行 的 方案 。 ”尽管 亲 和 层 析 是 一 种 分 离 纯化 蛋白 质 的 有 效 方法 ， 但 在 通常 的 分 离 纯化 过 程 中 还 得 辅 以 其 他 一 些 手段 ， 借 此 得 到 预期 的 效果 。 例 如 用 硫酸 匀 等 试剂 对 原始 材料 进行 分 级 仍 不 失 为 一 种 常用 的 有 效 方法 。 这 是 因为 分 级 这 一 步骤 不 仅 可 以 富 集 所 需 的 物质 ， 而 且 还 可 能 除去 一 些小 分 子 物质 ,其 中 有 的 则 是 能 与 所 需 分 子 相互 作用 的 小 分 子 配 基 或 抑 制 剂 ， 这 就 能 提高 亲 和 层 析 的 效果 。 很 多 亲 和 层 析 所 得 的 样品 虽然 都 是 具有 所 需 生 物 活 性 的 分 子 ， 但 其 中 仍 不 乏 活 性 相同 ， 而 化 学 结构 略 异 的 所 谓 “ 同 功 ` 蛋白质。 要 进一步 分 离 这 些 “ 同 功 蛋白 质 尚 需 借助 离子 交换 层 析 ,等 电 聚 焦 等 等 其 他 蛋白 质 分 离 纯化 方法 。 严格 地 说 , 杀 和 层 析 是 专 一 的 有 生物 学 选择 性 的 分 离 纯化 方法 ,然而 实际 应 用 时 也 会 发 现 一 些 非特 异 的 吸附 作用 ,有 时 会 致使 产物 不 纯 。 这 种 非特 异 的 效应 可 以 来 自 被 分 离 物质 与 亲 和 吸 附 剂 中 非 配 基 的 相互 作用 。 例 如 分 离 8- 半 乳糖 背 时 ,所 用 的 配 基 是 酶 的 抑 制剂 一 -对 氨基 苯 基 硫 代 半 乳糖 将 。 可 是 高 浓度 的 配 基 或 酶 的 底 物 都 不 能 作为 洗 脱 剂 ， 以 至 于 只 能 通过 改变 pH 的 方法 把 酶 洗 脱 下 来 。 用 苯胺 代替 上 述 抑 制剂 , 即 除去 与 酶 作 用 的 特异 部 分 ， 同 样 可 以 达到 分 离 纯化 的 目的 。 这 足以 说 明 一 些 非特 异 作用 在 此 酶 分 离 中 的 重要 性 。 另 一 原因 则 是 由 于 亲 和 吸 附 剂 中 的 其 他 因素 ， 诸 如 因 使 用 间隔 物 而 引进 的 朴 水 作用 , 因 偶 联 而 引进 的 电荷 等 。 例 如 省 化 氰 活化 交 联 琼脂 糖 时 ,很 自然 地 引进 了 正 电 和 荷 * 致 使 亲 和 吸 附 剂 带 有 一 定 程 度 的 离子 交换 特性 。 为 此 ,在 使 用 亲 和 层 析 时 ,要 尽 可 能 地 消除 或 减少 各 种 非特 异 的 效应 ,在 讨论 所 得 结果 时 也 应 慎重 。 CC *{1] Jackeby，W. B. & Wilchek，M. (eds.)，Methods Enzymol., 34, (1974). {2] Scouten, W. H., Affinity Chromatography-Bioselective Adsorption on Inert Matrices, 1981, John Wiley & * 71. 9 电 Sons, New York, a2 “aaa [3] Allen, R H. & Majerus. P. W., J. Biol. Chem, 247, 7709, (1972). oe Ye T.4 = vat . soet A [4]. ‘Trowbridge, ‘I. S. J. Biol. Chem., 249, 6004, (1974). £5.) ， 孙 册 等 ,< 凝集 素 > 第 9 页 ，1986， 科 学 出 版 社 . 人 YN 光华 二 本 [6] Chauvert, J. & Acher，R.，PEBS Letters, 23, 317, (1972). im. Tyas (7) 王 克 夷 等 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ，15>623,(1983). Ags aot [8] Mosbach, K., Methods in Enzymol. 34, 229, (1974). [9] ES A 5 HH, 1841001986), ， [10] Béhme, H. J. et al, J. Chromatogr, 69, 209, (1972). 1 | 1% : is — [11] Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem, 245, 3059, (1970). ew : Ph ‘Hofstee, B. Hy Biochem. Biophys. Res. Commun, 50, 751; ORE 如 rai oe A te ES ie ea 大 了 eMac He A a Ac oc aa aeaeae « « => Pi ORES. i fe = en { es: Bu a 7 4 ey oi, 站 全 公交 7 sik J BI ert Cer 四 f ie 4 wd ， Le 7 未 rr tc i . \ ef oe ek es np 4 in ns a ae eA ERE * . ¥s “3 2 Z ue 人 让 ahs FG do-it 3s tt rc) U ! } t A ~ : : 4 fan 剖 3 ’ 3 a 下 re i 所 世 Ory e P | aii 区 : 中 Ns ty 3 ooh m ae yor 《或 从 Rol XN Sr «8 5 ii . v rv? ice Ri | ar \ N i . eh 新 亲 和 层 析 用 于 糖 蛋 白 的 分 离 Bi OE Crh BS AS Be _b 4 (6 ERT) 自然 界 存在 的 蛋白 质 中 有 相当 数量 是 糖 蛋白 。 血浆 中 已 发 现 的 蛋白 质 有 上 百 种 ,但 表 1 常用 凝集 素 的 分 类 ” 类 型 i oN ( 按 糖 C, 和 C, 构 型 ) 来 A 惯用 名 或 缩写 糖 结合 专 一 性 (血型 专 一 性 7 /一 D 欧洲 草 豆 UEA-I a-L-Fuc(i H) i: Ha \ » (L-Fuc) Saag LTA cx-L-Fuc( 抗 H) 8 ih a-L-Fuc(# H) {Sy ete rare Pree ane Te oe ane EB 区 Gal-@6-1-3-GalNAc 7E + PNA 86-Gal( 抗 T) 西非 单 叶 豆 BS-I a-Gal>a-GalNAc(i B) —oO 欧洲 卫 矛 EEA Gal( 抗 B+ H) HO 一 oH ) a OK RCA 8-Gal 羊蹄 甲 BPA GalNAc-Gal 7 Gal 或 GalNAc 双 花 扁豆 DBA c-GalNac( 抗 A) a= SBA a-GalNAc>8-GalNAc(i A) Cay Mn a a-GalNAc>ae-GlcNAc(# A) 利 马 豆 LBA a-GalNAc>a-Gal(# A) #2 SJA 6-GalNAc>8-Gal(tt A) ZIERE WFA GalNAc 巨 刀 豆 ConA 兵 豆 a-Man>a-Gle WO hE PSA ~ ao ) Ba Favin hex Ps 西非 单 叶 豆 BS-II GlcNAc — TAREE 高 . 陆 PWM 3. Gle 或 GlcNAc 马 铃 昔 STA GlcNAC-6-1-4-GlcNAc AS UEA-II 党 GlcNAc, NANA 小 麦 胚 WGA GlcN Ac-6-1-4-GlcNAc NANA t 受 陀 罗 DSA (Gal-86-1-4-GlcNAc)。 4. EH * BF (Man), 菜 豆 PHA-L 见 参考 文献 [8] * (1) 本 表 主要 参考 文献 [4] , 略 加 补充 。 (2) 表 中 糖 的 缩写 如 下 : Fuc, BRR; Gal, +A RE;GalNAc, N- 乙 酰 氨基 半 乳 糖 ; Glc, 和 葡萄糖 ;GlcNAC,N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 ; NANA;,N- 乙 酰 神 经 氨 酸 。 凡 未 表明 L- 型 的 糖 ; 均 为 D-H. 仅 十 余 种 是 简单 蛋白 ， 其 他 均 是 糖 蛋白 。 又 如 鸡蛋 请 中 很 多 蛋白 质 也 是 我 们 经 常 研 究 瞪 对 象 ,这 些 蛋白 质 中 糖 蛋白 的 比例 竟 高 过?20 色 以 上 。 这 些 糖 蛋 白 可 以 用 前 一 节 巴 介绍 的 亲 和 层 析 方 法 , 根据 它们 的 生物 活性 ,进行 分 言 苑 化 。 而 它们 又 含有 特殊 的 组 分 一 一 糖 类 ， 这 为 其 分 离 纯化 又 提供 了 另 一 类 型 亲 和 层 析 方 法 。 因为 自然 界 中 还 广泛 地 存在 着 一 大 类 可 以 和 糖 类 专 一 结合 的 蛋白 质 ， 被 称 为 凝集 素 2ao 原 则 上 ,将 对 某 一 种 糖 专 一 结合 的 凝集 素 作为 配 基 接 到 载体 上 ， 制 成 固定 化 的 凝集 素 后 ， 就 可 用 亲 和 层 析 分 离 纯化 含有 这 类 糖 的 糖 蛋 白 。 例 如 ， 伴 刀 豆 球 蛋 自 ABSA Con A) 对 甘露 糖 专 一 结合 ,目前 ,固定 化 的 ConA 已 被 广泛 地 用 于 很 多 糖 蛋白 的 纯化 或 分 Bo | 近年 来 由 于 亲 和 层 析 技 术 的 进展 ， 以 及 商业 上 提供 的 凝集 素 和 固定 化 凝集 素 种 类 的 增多 , 越 来 越 多 的 糖 蛋白 可 以 用 固定 化 凝集 素 进 行 分 离 纯化 。 再 者 , 随 着 生物 膜 研究 的 深 入 以 及 细胞 生物 学 和 免疫 学 等 学 科 的 发 展 , 人 们 对 生物 膜 上 糖 蛋白 更 感 兴趣 ,从 而 也 纷纷 借助 固定 化 凝集 素来 分 离 纯化 膜 糖 蛋白 , 力 至 于 在 这 基础 上 对 细胞 进行 分 级 。 表 1 中 列举 了 一 些 可 用 于 糖 蛋白 研究 的 凝集 素 , 并 按 它们 的 结合 专 一 性 分 为 四 大 类 。 本 文 企图 通过 几 个 实例 说 明 固 定 化 凝集 素 在 糖 蛋白 分 离 纯化 中 的 应 用 。 一 、 固定 化 麦 豚 凝集 素 纯 化 人 血液 结合 素 血液 结合 素 是 血液 中 一 种 糖 蛋白 ， 它 可 和 游离 的 血红 素 类 结合 ， 并 将 后 者 运送 至 肝 脏 。 多 年 来 虽然 运用 了 一 些 方法 也 可 得 到 几乎 纯 的 血液 结合 素 ,但 产 率 低 、 步 又 多 。1977 年 Pharmacia 公司 利用 了 固定 化 的 WGA 纯化 了 人 血液 结合 素 , RARE. 的 分 离 过程 如 下 所 述 巴 。 | 100ml 新 鲜 人 血清 ,加 入 数 滴 当 量 NaoOH , 调 至 pH8.0, 加 入 43ml (50V/V) HU3EZ 二 醇 ( 平 均 分 子 量 为 4000),4%c 搅拌 1 小 时 ,3300Xg 离心 15 分 钟 。 上 清 液 用 当量 HC ， 调 至 pH4.6, 加 入 14g 固体 聚 乙 二 醇 ,搅拌 ,使 最 后 聚 乙 二 醇 浓 度 为 25% (W/V). 3300 Xg 离心 15 分 钟 , 沉 淀 溶 于 水 , 用 当量 NaOH 调 至 pH6.0， 得 92ml WHR. We 15—25% CO, BRE DEAE- 交 联 琼脂 糖 -CL-6B #E (2.6 X 14.5cm), 该 柱 用 50mmol/ L,pH5.2 的 乙酸 缓冲 液 平 衡 ,并 展开 。 流 速 为 85ml/bh。 最 先 流出 的 蛋白 峰 含 有 血液 结合 素 和 转 铁 蛋白 。 Pharmacia 公司 的 产品 固定 化 的 WGA (每 ml 凝 胶 上 接 有 5mr 凝集 素 ) 装 成 1.6X4.5cm 的 层 析 柱 , 用 50mmol/ 工 , pH7.0 94 0.2mol/L NaCl 的 磷酸 缓冲 流 平衡 ,流速 22ml/h。 离 子 交 换 柱 分 得 的 含 血液 结合 素 的 级 分 上 固定 化 WGA 柱 , 用 平衡 波 可 洗 去 杂质 转 铁 蛋 白 , 血 液 结 合 素 则 被 100mg/ml 的 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 〈 用 平衡 该 配 till) AT Be Bio | RHER=ETPR. MKRASAVAKHH40%, ARMEMK—-H MM eAIIZ, 样品 的 损失 在 离子 交换 层 析 过 程 中 。 用 此 方法 得 到 的 血液 结合 素 进行 聚 丙烯 酰胺 梯度 凝 胶 电泳 时 , 仅 呈 一 条 蛋白 显 色 带 , 其 他 一 些 理化 性 质 和 生物 学 活性 均 和 文献 值 一 致 =. 男 定 化 兵 豆 凝集 素 分 离 猪 淋巴 细胞 质 膜 糖 蛋白 中 1. 固定 化 兵 豆 凝集 素 的 制备 e 74 « 每 ml 压 积 的 交 联 琼脂 糖 4B 用 20mg 溴 化 氰 活化 。 然后 悬 序 在 含有 0.1mel/L 甲 基 -o- 葡 萄 糖苷 的 0.1mol/L\pH8.4 的 NaHCo, wie, MA LeA (以 每 毫升 压 称 交 联 琼脂 糖 加 入 ling Le A th), 2°C 搅拌 18 小 时 。 过 滤 后 , 交 联 琼脂 糖 再 悬 评 在 _ pH.4 的 5 mmol/L 乙醇 胺 溶液 中 ,再 搅拌 1 小 时 。 继 之 ， 顺 序 用 0.1mol/L NaHCO, K. 1% fi 胆 酸 钠 、2 匈 甲 基 -c- 甘 露 糖苷 (用 1 多 脱氧 胆 酸 钠 配 制 ) 以 及 1 多 脱氧 胆 酸 钠 洗 涤 , 以 充分 洗 . 去 可 能 吸附 的 Lc A。 装 柱 备 用 。 使 用 前 ,此 柱 再 用 1% 脱氧 胆 酸 钠 洗涤 一 次 。 2. 猪 淋巴 细胞 质 膜 糖 蛋白 的 亲 和 层 析 猪 淋 巴 细胞 质 膜 制 备 后 ,用 1 多 脱氧 胆 酸 钠 增 溶质 膜 蛋白 "2ml 增 溶 的 膜 蛋白 ( 约 & 至 10mg) 上 LeA 亲 和 柱 (1 X Bem). FEA 1% 脱氧 胆 酸 钠 洗涤 可 得 一 个 280nm 有 吸收 的 蛋白 质 峰 ， 至 光 吸 收 降 至 基线 , 改 用 2 多 (W/V) BR -o- Be 1% 脱氧 胆 酸 配 ， 制 ) 洗 脱 , 即 得 另 一 蛋白 质 峰 。 前 后 两 蛋白 质 峰 中 ,蛋白 质 和 中 性 己 糖 的 比例 分 别 为 87;13 和 17:83。 这 表明 大 部 分 糖 蛋白 在 糖 咨 液 洗 脱 部 分 。 总 的 蛋白 质 回收 率 达 95 多 。 后 一 蛋 白质 峰 用 SDS- 育 丙烯 酰胺 电泳 揭示 是 多 种 糖 蛋 白 的 混合 物 ， 但 不 含有 兵 豆 凝集 素 。 3. 说 明 ConA 和 LcA 具 有 相似 的 糖 结合 专 一 性 , 且 两 者 都 有 促 有 丝 分 裂 活性 。Con A- 交 联 琼脂 糖 也 被 用 于 淋巴 细胞 质 膜 糖 蛋白 的 分 离 , 但 是 总 蛋白 的 回收 只 有 80 多 ,而 糖 蛋白 的 产 率 仅 5 多。 而 固定 化 Lec A 则 可 有 较 高 的 蛋白 质 回收 率 和 糖 蛋白 产 率 。 这 是 因为 对 甘露 糖 等 的 亲和力 ，LcA 比 ConA 低 50 倍 。 商业 上 已 有 固定 化 的 ConA 和 LcA 产品 。 在 实验 室 制 备 时 ,以 及 其 后 使 用 和 保存 期 : 闻 , 应 注意 两 点 : 第 一 ,为 了 防止 凝集 素 在 偶 联 过 程 中 失 活 ， 通 常 在 悬浮 液 中 加 入 一 定量 的 葡萄 糖 或 甘露 糖 或 它们 的 衍生 物 。 在 固定 化 其 他 凝集 素 时 ， 则 也 加 入 它们 专 一 的 半 抗 原 。 在 保存 期 间 , 加 入 一 些 专 一 结合 的 糖 类 ,对 其 活性 保存 也 有 利 。 只 是 在 使 用 前 ， 必 须 洗 净 加 入 的 糖 类 ;第 二 ，ConA 和 LcA 的 凝集 活性 都 有 赖 于 Ca ” 和 Mn ”的 存在 , 因 此 在 制备 使 用 和 保存 时 ,所 用 缓冲 液 的 pH 不 适宜 过 高 ,同时 加 入 一 定量 (例如 1mmol/ L)HY Ca** 1 ali 固定 化 凝集 素 是 分 离 纯化 糖 蛋白 的 一 个 有 用 工具 ,但 正 像 其 他 方法 一 样 , 仅 用 周 定 化 : 凝集 素 往 往 不 能 获得 很 纯 的 糖 蛋白 。 这 是 因为 许多 糖 蛋白 的 糖 组 分 很 相似 ， 因 此 同一 固定 化 凝集 素 可 以 吸附 多 种 糖 蛋 白 。 猪 淋巴 细胞 质 膜 上 的 很 多 糖 蛋白 都 被 吸附 在 固定 化 LcA 上 ,而 且 又 同时 被 2 多 的 甲 基 -c- 甘 露 糖 所 洗 脱 。 又 如 WGA 除了 可 以 和 血液 结合 相互 作用 外 , 还 可 以 和 血清 中 很 多 糖 蛋白 结合 ,如 铜 蓝 蛋 白 、%- 酸 性 糖 蛋白 oe BREA 等 。 为 此 要 得 到 较 纯 的 糖 蛋白 ,往往 要 同时 结合 使 用 其 他 一 些 蛋 白质 分 离 纯化 方法 ,或 者 顺序 地 使 用 多 种 固定 化 凝集 素 , 或 用 半 抗 原 进 行 梯度 洗 脱 。 在 分 离 血液 结合 素 时 , 则 先 用 聚 乙 二 醇 分 级 ,除去 mw- 巨 球 蛋 白 \ 脂 蛋白 等 ,再 经 DEAE 离子 交换 层 析 分 离 去 o- 抗 胰 蛋 白 酶 .w- 酸 性 糖 蛋白 等 。 主 要 杂质 转 铁 蛋 白 最 后 才 用 WGA 亲 和 层 析 除 去 。 又 如 ， 固定 化 LcA 分 得 的 猪 淋巴 细胞 质 膜 糖 蛋白 仍 是 一 个 混合 物 ， 但 它们 中 间 有 一 些 对 菜豆 凝集 下岗 本 中 京 的 素 和 能 力 有 所 不 同 ， 玖 而 可 再 次 用 固定 化 的 菜豆 凝集 素 进 -- 步 分 离 这 一 混合 物 这 种 本 i NRE bes . | eis, & 8 | ye | ac ts cee eee | Bd ERR MA BH 66 页 。 Bie og 7 cOb ee a | 全 2] Goldstein, I. J. & Hayes, C. E., Adv. Carbohyrd. Chem. Biochem oh we'd, ; ia | [3] 孙 册 等 *< 凝 集 素 >，1986 年 科学 出 版 社 ， [4] 直 勉 和 大 况 利 昭 , 蛋 白质 . 核酸 . BE, 2851181983), t £5] Vretblad, P. & Hjorth, R., Biochem. J. 167, 759, (1977). ROKR [6] Hayman, M. J. & Crumpton, M. J., Biochem. Biophys. Res Commu., 47, von 5 {71 Allan, D. & Crumpton, M. J., Biochem. J, 128, 967(1971). thei or Ve T8]. Cumming, R. AD: & Kornfeld, Sa a ( Biol. Chem., 257, 11235(1982). > | 站 79) Cumming, R. D. & Kornfeld, S., J. Biol. Ghetas 258, 6253, aoe eet i¢ te 3 } ‘ — { A . Hh . | ) mA ie Ri ‘a 4 ‘ a! . ; We Ih: n anne ot “re ec RaN , : "Og ep sta t.. 2 Me’ tts oo Be EE ce | penis , - W ‘ ’ a+ ; ec ERO A St See 《 é ad \ ’ " QO 省 Ce a Ai 心 于 ? fy 和 Vv > th A SLT Te A how iy ’ thi ie 和 sd} A Bese ire 1. & : fue hat te f t tes =’ pak eS, j ins ay i int! w of aS Lytle’ Phat “ad im OO Gaia cS Sao iS ， : , J AR. ya ’ , uy al 2. nae aes ‘ ep LT ) ras BEC. ba: WR tA 7 iia ee | oe er palo k - ; by . i | 民 = a? ai t 3 ast pal at . i aa ich iis oe (au, ee m4) | | at m4 uy 43 二、 4 让 ey a ne i So Mit eee, Osh ae 人 9 Ry 说 ES a : : 7 i SN i ‘et cy 2 1 cb 站 toe J to ' t a 3 i q a Te E> Pull ; | ; li vi 1 ° 76 。 高 效 液 相 色 谱 在 蛋白 质 和 酶 学 中 的 应 用 RR E 《中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 ) 高 效 液 相 色谱 (HPLC) 是 一 项 分 辩 力 很 高 的 液 相 色 谱 技术 e-9。 它 是 由 非常 均一 的 微 位 色谱 载体 和 设计 很 精密 的 仪器 组 成 。 HPLC 和 经 典 的 液 相 色 谱 技 术 相 比 较 , 有 下 列 风 个 优点 : (1) 快速 。 常常 以 分 钟 为 单位 ， 整 个 分 离 过 程 仅 几 十 分 钟 。 (2) 分 辩 力 高 。 (3) 分 析 灵 敏 度 高 ,样品 量 只 需 ng 或 pg 水 平 。(4) 分 析 样 品 若 用 紫外 检 出 时 可 以 回收 ， 如 果 用 作 制 备 ， 制 备 量 可 达 1 一 10mg。(5) 同一 根 柱子 可 以 分 析 几 百 个 、 甚 至 上 千 个 样 | 唱 , 而 用 不 到 重新 填 装 柱 。 HPLC 的 仪器 设置 类 似 于 经 典 的 液 相 色 谱 装 置 (图 1)。 差 别 在 于 柱 由 不 锈 钢 (标准 柱 AE 4.6mm, 长 250mnim) 和 微粒 色谱 载体 (5 一 10w) 组 成 。 由 于 载体 粒度 小 ,因此 驱使 液 体 流 经 柱 需 借 高 压 泵 来 完成 。 与 经 典 液 相 色 谱 相 比 ,HPLC 的 管道 很 细 , 检 出 器 内 流动 池 约 10ml。 近 年 来 还 引入 34 的 载体 ,提高 了 分 辩 力 。 同 时 也 出 现 内 径 仅 2mm 的 微粒 ,不 但 节省 了 洗 脱 溶剂 ,也 提高 了 分 析 的 灵敏 度 , 图 2 模式 地 说 明了 微粒 载体 的 优点 吕 。 程序 控制 器 于 | L| : 记录 仪 图 2 微粒 载体 在 平衡 和 分 析 时 间 上 都 比 经 典 的 大 粒 载 体 有 所 改善 。 同时 减 小 了 扩散 ? 峰 形 也 更 为 尖锐 一 、 几 类 高 效 湾 相 色 谱 和 一 些 基 本 参数 1. 载体 的 结构 柱 (其 肉 含 物 为 载体 ) 通 常 称 为 HPLC 的 心脏 ,它们 可 以 由 多 和 孔 硅 胶 , 多 孔 玻璃 , 亲 水 的 有 机 凝 胶 或 交 联 的 聚 葵 乙 烯 等 为 基础 形成 。 现 有 的 HPLC 主要 包括 体积 排除 色谱 ; 离 了 于 交换 色谱 \ 反 相 色 谱 \ 芷 水 色谱 和 亲 和 色 谱 等 类 型 。 分 离 都 是 依赖 于 (1) 固定 相 的 结构 ai © .和 组 成 , (2) 流动 相 和 固定 相 之 间 的 相互 作用 。 2. 吸附 色谱 和 分 配色 谱 在 载体 硅胶 的 表面 上 有 很 多 硅烷 醇 基 团 ( 约 8 一 9wmol/m")， 仅 5% 硅烷 醇 基 团 形 成 RS \ ‘sik =Si-O-H —si-on Ssix_/ 292 O , HO re OH 图 3 ”存在 于 硅胶 颗粒 表面 上 的 硅烷 醇 基 - 分 子 内 氢 键 ,所 以 它 的 反应 力 很 强 。 这 些 基 团 呈 锚 酸 性 (PKa5 一 7)， 能 迅速 和 极 性 分 子 相 互 作用 ， 这 种 性 质 被 用 于 吸附 色谱 中 样品 分 子 中 的 极 性 组 分 由 于 和 载体 侍 烷 醇 基 团 相互 作用 最 强 而 被 保留 在 固定 相 上 。 加 入 极 性 组 分 (水 、 甲醇 、 乙 且 ) 至 流动 相 中 ， 它们 能 ， 作为 极 性 分 子 覆盖 在 硅胶 粒子 表面 上 而 被 保留 ， 这 样 不 同 的 样品 分 子 由 于 对 吸附 液 层 的 不 同 分 配 而 被 分 开 。 因 此 很 难 对 吸附 色谱 和 分 配色 谱 的 机 理 作 一 个 截然 的 区 别 。 3. RABBIS” oe BP HY PEE He AIRS (Ode BP ER TR Et -R 基 团 ( 称 之 为 键 合 表 1 常用 的 键 合 相 介 质 HEE I, 2 ; 应 用 范畴 CH:CCH2):: 一 极端 非 极 性 HB RAR CH;(CH,)s— 所 有 的 生物 样品 CH,(CH,),— 肽 、 蛋 白质 CH,;CH,— BRE CeH: 一 所 有 的 生物 样品 CH,O— 蛋 白 质 \ 糖 类 NC— 蛋白 质 \ 糖 类 CH,OH—CH(OH)— AY Fi NH,— 糖 类 R,Nt— BRE HO,S— 阳离子 交换 剂 肽 和 和 蛋白 质 se。 7T8 。 相 ), 如 果 这 个 -R 基 团 仍 为 极 性 基 团 , 则 仍 属 正常 相 色 谱 。 如 果 -R 基 团 为 非 极 性 基 团 ， 则 就 成 了 反 相 色谱 载体 。 它 与 样品 混合 物 中 的 非 极 性 组 分 相互 作用 。 表 1 列 出 某 些 常见 的 键 合 相 色谱 载体 。 友 相 柱 的 制备 是 把 不 同 链 长 的 三 氯 硅烷 (常见 是 C, 和 Ca) 通过 硅 氧 烷 桥 联接 到 硅胶 上 去 。 应 当 指 出 ,这 种 反应 是 不 完全 的 ， 因 此 各 厂 产 品 之 间 有 很 大 的 差别 ,可 以 造成 分 离 效果 不 同 。 由 图 4 可见; 仍 残留 有 部 分 的 三 Si-OH 基 ， 这 时 可 用 .(CH;):;-Si-Cl BRK 应 从 而 封闭 所 有 的 游离 硅烷 醇 基 团 , 称 之 为 “ 戴 帽 “。 这 一 处 理 对 某 些 样 品 的 分 离 很 有 影 响 ( 表 2)。 Cl | =Si—OH + Cl—Si—C,;H,, Cl C.3Hs, C,.H;, C,;H;, CisHyy i Cl 一 Si 一 C1 Si 一 0O 一 S1 一 0 -一 S1 WN | aN Oo oO Cl Oo Oo OH pS 人 SS | —Si—O —Si—_-O —-Si—-0 — Si— O-—-Si—_ o—‘Si 一 0 一 | | | | | ie C,,H,, ees rae ir HO—Si—OH Ssi—o—Si—O—Si | “N | ANS ; “Rg” Oo Oro OH ero OH ‘ | SN | —Si—O —Si—_-O —Si— 0 —— Si-O -一 91- 一 0 —_Si—-O ——> | ca 一 si 一 cl CisHa) C,3H;, C,3H;, C,,H,, : } : | (CH); ae S36 —si-- 0 sicer;)} . sio— si, 0 —-' Si | | eas, a O | O 人 AD 9 | O | SN —Si —O —Si— 0 —Si— 0 — Si—O—Si—0O—Si—0O— A4 #2 Ce 反 相 至 硅胶 表面 2 “ 戴 帽 ”和 “未 戴 帽 "的 C,。 柱 对 PTH- 所 基 酸 保留 值 的 影响 “as | —CH(CH,), 4.34 4.73 Hae —(CH,),—NHC(=NH)NH, 4.33 1.67 AAR —CH,— C=CH 2.49 1.08 a NH N Nate CH * 3K’ 值 测量 。[ 采 自 N. H. Cooke and K. Olsen, Amer. Lab., 45(1979)). > oe 2 反 相 色谱 可 算是 疏水 色谱 的 一 个 分 支 ， 其 作用 都 是 发 生 在 蛋白 质 非 极 性 表面 和 周 定 相 之 间 。 和 朴 水 色谱 相 比 , 反 相 色谱 更 为 非 极 性 ,和 蛋 白 质 甚至 在 低 离子 强度 的 水 党 该 缓冲 液 中 也 能 结合 到 载体 上 去 ,通过 增加 有 机 溶剂 的 浓度 而 达到 不 同 的 解析 。 4. 离子 交换 色谱 224 在 各 种 材料 上 共 价 联结 上 不 同 的 离子 基 团 , 除 强 阴 离子 交换 材料 中 之 季 胺 (一 +NRI 强 阳离子 交换 材料 中 之 磺 酸 型 (一 SO ) 外 ， 还 有 能 离子 交换 材料 DEAE( — CHANG CEL) 和 CM(COO-) 等 。 它 们 对 各 种 蛋白 质 具有 很 好 的 交换 能 力 , 有 的 高 达 10mg/ 分 析 柱 。 其 效果 比 经 典 的 离子 交换 柱 层 析 好 ， 而 分 析 时 间 只 需 几 十 分 钟 。 这 种 分 离 方 法 与 样品 中 蛋白 质 离子 性 质 有 关 ， 载体 不 但 可 以 区 别 重 白 质 中 能 和 它 反 应 的 基 团 , 也 能 识别 电 荷 相 同 但 电荷 分 布 不 同 的 蛋白 质 。 载体 和 和 蛋白 质 的 结合 强度 是 很 多 因素 的 协同 结果 (蛋白 质 上 离子 基 团 数 ,载体 上 的 电 荷 密度 ,流动 相 的 离子 强度 等 ), 所 以 蛋白 质 从 柱 上 的 洗 脱 可 以 用 增加 盐 浓度 , 也 可 用 pH 梯度 变化 ,或 者 二 者 结合 。 硅 胶 的 衍生 物 是 最 常用 的 载体 CTSK-SW), RKNAPAR 物 (TSK-PW) hit Hi, BEE iti PH 范围 均 广 沁 些 。 表 3 一 些 常用 的 HPLC 离子 交换 柱 te 原 材 料 功能 基 团 | 适用 分 离 对 象 TSK gel SCX “ 聚 葵 乙 烯 凝 胶 —SO,-Ht | AER BERK SR [SK gel SAX REZ —N(CH,)tCl- - “5s TSK gel CM-2SW 硅胶 TSKgel G2000SW —CH,COO-Nat 肽 ,生化 代谢 产物 TSK gel DEAE-2Sw | 硅胶 TSKgel G20008W | —C,H,N+(C,H,),HCI- ATER ALR TSK gel CM-3SW 硅胶 TSKgel G3000SW —CH,COO-Nat 碱 性 蛋白 质 TSK gel DEAE-3SW 硅胶 TSKgel G3000SW | —C,H,N+(C,H,).HCI- | att htt Sa TSK gel DEAE-5PW 亲 水 多 副 凝 胶 —C,H,N+(C,H;),HC]” | RePEc PE BEE i TSKgel G5000PW 其 他 厂商 的 离子 交换 柱 有 Pharmacia 的 Mono Q (FAR FARE) 和 Mono S (fA 离子 交换 柱 )， Synchropak 的 AX-100, AX-300, AX-500, AX-1000 和 CM-300, QX-300 等 。 5. 体积 排除 色谱 ” 又 称 为 凝 胶 过 滤 色 层 ， 它 在 经 典 的 液 相 色谱 中 长 期 以 来 就 是 一 种 重要 的 分 离 蛋 白质 和 多 肽 的 方法 。 载 体 本 身 有 不 同 的 孔径 (100, 300, 500A REA), 可 根据 样品 的 分 子 大 小 和 形状 选择 合适 的 载体 而 达到 分 离 的 目的 。 因为 大 分 了 被 载 体 孔 各 排除 而 首先 被 洗 脱 出 柱 , 较 小 的 分 子 次 人 载体 孔径 内 而 保留 较 长 的 时 间 。 载体 材料 可 以 是 多 孔 硅 胶 〈SW)， 也 可 以 是 有 机 凝 胶 (PW)， 前 者 应 用 pH 范畴 2 一 7.5， 后 者 可 在 pH2 一 13 范畴 内 使 用 。 一 般 用 水 溶性 缓冲 液 作为 流动 相 ，pE 影响 到 « 80 ¢ _ 样品 的 离子 化 程度 ,从 而 影响 到 结合 至 带电 的 固定 相 上 去 。 水 溶性 流动 相 又 可 以 分 为 非 变 仁和 变性 洗 陪 液 二 种 : 前 者 常 含有 0.1 一 0.3mol/L NaCl 以 减 小 次 级 离子 的 作用 ， 后 者 is ARR. WMsk SDS, 这 种 色谱 法 对 泵 的 要 求 较 高 ,需要 很 恒定 的 流速 。 例 如 TSK 3000 SW 柱 (7.5 x 600mmy) 的 内 体积 约 为 13ml, 适用 于 测定 分 子 量 40 0 00 一 400 000 的 蛋白 质 ,这 意味 着 测 量 精度 土 1% 了 时， 分 子 量 测定 值 的 误差 可 达 10%, HANK RAR DE), 同时 重演 性 也 高 ,应 在 2% 内 。 此 外 ,流速 对 塔 板 数 影响 很 大 。 这 一 类 柱 有 各 种 型 号 的 Protein I-60，I-125，I-250 和 LiChrospher。 Synchropak 和 Separon HEMA 等 。 6. Hi Ee EA FA BE Wie Ei zk A AB 2k FE 7 za HOA Be EF TK Bd AR 一 种 HPLC， 其 中 包含 三 种 因素 的 相互 作用 : HKRA, 流动 相 的 性 质 和 样品 分 子 。 通 常 疏 水 色谱 在 高 盐 浓度 下 把 蛋白 质保 留 在 固定 相 上 ， 当 降低 盐 浓 度 或 降低 溶剂 极 性 或 上 升 pH 时 ， 使 不 同 的 蛋白 质 在 不 同 的 时 间 从 固定 相 上 释放 出 来 。 例 如 Spherogel-TSK- Phenyl 5 PW 柱 。 站 水 色谱 的 另 一 个 优点 是 省 去 了 一 般 色 谱 上 样 前 需要 平衡 脱盐 的 处 理 , 而 蛋白 质 的 脱盐 和 平衡 往往 是 很 耗 时 间 的 。 7. 亲 和 色 谱 亲 和 色 谱 法 是 在 合适 的 载体 上 共 价 联接 上 一 个 配 基 ， 此 配 基 能 和 样品 混合 物 中 某 一 组 分 形成 专 一 的 络 合 物 而 被 吸附 在 柱 上 ， 在 一 定 的 条 件 下 又 能 使 该 络 合 物 解 离 释 放出 吸 附 的 组 分 。 这 种 利用 生物 分 子 之 间 亲 和 性 质 来 达到 从 混合 物 中 提纯 样品 的 方法 应 用 十 分 广泛 。Beckman 公司 有 Ultraffinity-™-EP 柱 供应 ,， 它 是 以 一 种 刚性 的 硅胶 粒子 作为 载 体 , 粒 度 约 gu, 平均 孔径 300 人 A , 具有 活性 的 环 氧化 物 基 锚 在 硅胶 微粒 的 表面 , 约 70xmol/ g 载体 ， 且 “手臂 ” 间距 为 6 个 碳 原 子 。 这 种 分 析 柱 蛋白 质 容量 可 达 10mg， 制 备 柱 可 达 100—200mg, 例 妇 在 提纯 谷 胱 甘 肽 -S- 转 移 酶 时 , 先 把 谷 胱 甘 肽 作为 配 基 衍 生 到 亲 和 柱 ; 纯化 t(RNA’'- 合成 酶 可 用 tRNA™ 作为 配 基 。 因为 环 氧 基 对 拥有 一 NH,， 一 SH， 一 OH 的 配 基 能 形成 稳定 的 化 学 键 (一 般 有 20% 可 以 衍生 ), 所 以 使 用 Ultraffinity™-EP 柱 很 方便 ， 只 须 将 含有 配 基 的 溶液 低速 下 〈0.1 一 0.2ml/min) 循环 流 过 色 层 柱 就 可 以 将 柱 衍生 ,而 成 为 对 某 一 样品 专 一 的 亲 和 柱 。 也 可 以 自己 制备 各 种 亲 和 色 谱 柱 中 。 8. 一 些 基本 参数 和 色谱 的 关系 7 最 重要 的 有 三 个 参数 : 容量 因素 K', 分 离 因 素 c 和 塔 板 数 N。 测量 容量 因子 K'， 可 以 了 解 到 样品 在 分 离 出 现 之 前 是 否 成 功 地 保留 在 柱 上 。 一 般 K' 值 必 需 大 于 2。 分 离 因素 w 是 指 色 谱 柱 对 两 种 不 同 的 物质 产生 不 同 保留 时 间 的 能 力 。 又 称 为 选择 ， PE * 82 5 ”方面 信息 。 塔 板 数 受 很 多 因素 的 影响 ,是 对 柱 质量 检查 的 一 个 重要 指标 。 柱 受到 污染 后 ， V 1 一 一 ~y,——-| 图 5 ， 色 层 谱 的 参数 Vi— Ve Vv K,= Vo 系统 的 绝对 体积 ?不 能 保留 的 物质 在 此 处 出 现 。 V, AV, 分 别 代表 样品 1 和 样品 2 的 保留 体积 。 上 式 也 可 以 用 保留 时 间 To. Tr: 和 Tre 来 表示 。 Ki _ Vi— Vo Ka V, 一 V 如 果 ac 一 1， 则 两 种 物质 之 间 无 分 辩 力 可 言 。e 这 一 项 受 整个 系统 的 化 学 性 质 所 影 网 。 如 果 有 一 个 好 的 ic 值 , 其 分 离 效果 是 相当 好 的 。 Ni ie 塔 板 数 N 指 在 色谱 展 层 过 程 中 ,样品 分 子 保持 不 扩散 ,得 到 较 罕 峰 形 的 能 力 。 常 用 N 来 代表 柱 效 。 a= 2 K .74 Ultrasphere-ODS 柱 = Laker ok ee ars ee oe 8 Ze OSES | LOZ te tR7 o> 图 6 ， 柱 效 测定 和 对 称 性 测定 / FE: Ultraphere-ODS 4.6X150mm 检 出 器 : UV254nm 流动 相 ;: CH,OH:H,O = 60:40 流速 : 1.0ml/min FABRA: ;1. BMA 2. 硝 基 葵 3. 4. A tr: 样品 的 保留 时 间 WwW: 峰 高 二 时 的 峰 宽度 As: 峰 的 对 称 性 ,用 峰 高 10% 时 的 左右 二 侧 峰 半 宽 度 来 测量 。 不 同类 型 的 柱 ， 用 不 同 的 试验 混合 物 来 测量 柱 效 ， 一 般 厂 方 在 新 柱 商 品 内 都 提供 这 “ BZ N 扩 值 会 明显 下 降 , 当 下 降 10-20% 时 ,应 采取 措施 以 恢复 柱 效 。 塔 板 数 的 大 小 和 柱 的 长 度 有 关 , 为 了 不 同 长 度 柱 的 比较 方便 起 见 , 还 引信 了 一 个 不 依 赖 于 柱 长 度 的 量 一 一 理论 塔 板 高 度 H. H 数值 愈 小 ,色谱 柱 的 柱 效 念 高 。 H=L } N 这 里 工 是 色谱 柱 的 长 度 。 =. 实验 中 一 些 技术 注 意 事项 1. 新 柱 的 安置 新 柱 安 置 到 HPLC 系统 中 去 ,要 确保 最 小 的 无 效 体 积 , 即 各 部 件 之 间 的 连接 管道 妥 短 , 用 细 内 径 〈~ 0.3mm) 的 不 锈 钢管 。 用 的 螺 帽 和 不 锈 钢 套 圈 应 匹配 , 连接 处 拧 得 松紧 恰当 而 又 不 泄漏 出 液体 。 新 柱 内 都 含有 适当 的 有 机 溶剂 ， 如 果 内 含 的 有 机 溶 宰 和 流动 相 的 溶剂 系统 不 能 互 淤 ， 则 需 用 一 种 居间 的 溶剂 洗涤 新 柱 。 例 如 对 含有 己 烷 的 柱 , 在 引入 甲醇 、 乙 且 或 水 性 溶剂 前 要 用 两 醇 洗 ; 反 相 柱 常 含有 甲醇 或 乙 有 睛 ,在 使 用 缓冲 液 或 盐 溶液 前 要 用 水 洗 。 如 果 新 柱 是 2mm 内 径 的 微 柱 , 则 还 要 考虑 一 些 其 他 因素 ,譬如 检 出 系统 中 是 否 要 用 更 小 的 流动 池 ; ee eae ee vee tis 2. 柱 效 的 测定 新 柱 常 有 厂 方 提供 的 资料 , 说 明 柱 的 塔 板 数 是 多 少 , 用 的 什么 标准 样品 和 分 析 条 件 。 这 些 标 准 样品 通常 是 小 分 子 , 在 一 般 实 验 室 容 易 得 到 的 。 建 议 重 复 一 下 这 项 实验 , 以 便 确 定 柱 在 运输 过 程 中 是 否 损坏 。 实 验 误差 在 5 一 10 多 范围 内 应 该 属于 正常 ， 因 为 涉及 到 深 剂 的 差别 和 柱 以 外 的 各 种 实验 因素 的 影响 。 同 时 保存 图 谱 和 数据 ， 如 果 日 后 怀疑 柱 受 污 染 质量 下 降 时 ,作对 照 检查 用 。 3. 流动 相 的 制备 "% 流动 相 的 选择 是 HPLC 中 的 一 个 重要 环节 。 常常 因为 溶剂 选择 不 当 而 使 样品 清 尝 不 充分 而 影响 到 色谱 柱 的 寿命 。 溶 剂 也 可 能 含有 不 溶性 杂质 而 保留 在 柱 上 ， 渐 渐 改 变 了 男 定 相 的 性 质 。 不 溶性 物质 也 可 能 阻塞 接头 部 分 或 管道 ， 导 致 操作 压力 明显 上 升 。 为 了 避免 这 些 问题 ,要 求 采用 高 纯度 级 的 溶剂 和 试剂 , 且 在 使 用 前 经 微 孔 滤 膜 过 滤 。 深 剂 还 需 脱 气 以 免 空 穴 作用 ,因为 泵 都 是 止 回 阀门 ,形成 空 穴 会 影响 正常 的 流速 。 此 外 溶解 在 深 剂 中 的 氧 还 会 引起 低 紫 外 区 的 吸收 ,造成 噪音 和 梯度 洗 脱 时 的 基线 倾斜 。 溶 剂 若 未 经 脱 气 处 理 ， 它 在 通过 色谱 柱 后 由 于 压力 迅速 下 降 ,溶解 在 溶剂 中 的 气体 会 释放 出 来 ,在 检 出 器 的 六 动 池内 形成 小 气泡 而 造成 基线 噪声 。 ~ GQ) 水 ”水 是 HPLC 中 最 基本 的 溶剂 ， 要 得 到 不 含有 机 杂质 的 纯 水 不 是 一 件 容 易 的 事 。 水 或 缓冲 液 中 的 杂质 往往 积累 在 柱 的 顶端 ,其 中 大 部 分 可 在 高 梯度 时 洗 脱 出 来 ; 另外 几乎 所 有 的 有 机 杂质 在 低 紫外 区 可 以 检 出 。 国际 市 场 上 专门 有 HPLC 级 的 纯 水 供 应 ,各 个 实验 室 也 可 以 方便 地 制备 各 级 纯 水 。 例 如 把 水 通过 离子 交换 柱 、 活 性 几 柱 , 最 后 se BS *e 全 玻璃 蒸馏 ;也 可 把 市 售 蒸馏 水 ,加 入 适量 高 锰 酸 钾 后 重 蒸 ,除去 前 馏分 和 后 馏分 。 蒸 水 器 和 贮 水 器 的 连接 部 分 都 不 能 用 乳胶 管 或 橡皮 管 等 联接 ， 因 为 这 会 造成 污染 。 水 质 的 优 劣 可 测 电导 和 测绘 紫外 全 波 图 谱 来 判别 ， 有 机 溶剂 质量 的 优 劣 也 可 以 根据 紫外 光谱 来 判断 (BWA 7.8). 波长 nma 波长 nm A7 AMA CHRIS 图 8 一 些 有 机 咨 剂 的 紫外 光谱 1. 工 业 品 ， 2. 无 水 AIC], 处 理 后 , 蒸 1.7K CHPLC), 2.7, FRCHPLC#R), (r= Gy, 3. KMnO,/LiCO, 处理 后 重 3. Harding KEMAH, 4- %e> +. KHSO, ¢P RWB, 5. CaH, ”甲醇 CHPLCH) 5. RAY (A. R), 处 理 后 重 蒸 。 (2) 有 机 溶剂 ”最 简单 的 方法 是 采购 HPLC 级 的 溶剂 。 因 为 较 差 的 溶剂 在 梯度 洗 脱 时 会 引起 严重 的 基线 倾斜 ,特别 在 低 紫外 检测 时 ,甚至 无 法 进行 工作 。 图 7 示 不 同 级 IAI CRAIN FARIA EE BORA Bh, 并 通 N, (避免 0,) RH. BEM 氧化 剂 会 引起 麻烦 ,因为 这 些 添 加 剂 的 分 解 ,会 产生 有 紫外 吸收 的 物质 。 在 正常 相 色谱 中 ,有 机 溶剂 中 若 有 水 会 降低 硅胶 柱 的 效率 和 影响 分 离 的 重复 性 ,甚至 重 蒸 或 光谱 级 的 溶剂 也 可 能 含有 水 而 影响 到 灵敏 的 分 离 工 作 , 这 时 要 求 进 水 无 水 处 理 。 表 4 一 些 常用 于 肽 和 有 蛋 白质 HPLC 分 析 的 有 机 溶剂 性 质 Me 介 电 常数 (20%C)| ”溶剂 强度 7 * 3.6 ey 210 3.0 240 210 * RA Buk UV cut-off (AH XMA UV limit) 是 指 在 此 波长 处 ， 座 剂 的 光 吸 收 值 为 1.0。 这 个 指标 可 供 我 们 选择 低 波 长 检测 时 的 溶剂 系统 ?也 可 用 于 判别 一 个 溶剂 质量 的 优 劣 。 « 84 。 (3) 离子 对 试剂 ”蛋白 质 的 溶解 性 质 与 带电 状态 密切 相关 ， 受 溶 流 中 带 相反 电荷 的 离子 影响 最 大 。 这 种 离子 称 为 配对 离子 或 离子 对 。 在 大 多 数 反 相 色 谱 中 ， 亲 水 性 太 强 以 致 保留 时 间 短 的 化 合 物 , 在 流动 相 中 可 以 加 入 蕊 水 的 离子 对 ,以 增加 保留 时 间 , 达到 提 高 分 辩 力 的 目的 。 相 反 情 况 下 则 可 在 流动 相 中 加 亲 水 性 的 离子 对 以 减少 保留 时 间 。 离 子 对 试剂 的 浓度 一 般 在 5 一 10mmol/ 工 ， rene Res AT alge acevo ra 也 可 能 在 流动 相 中 形成 沉淀 ,阻塞 管道 和 泵 。 RS 离子 对 试剂 BARS (RNH+,, R,NH*+, R,N*+) SB. ® BR, PR, CM, SRC: PBR. BOR, mR, WAR, FRE, 磷酸 盐 ? 磺 酸 盐 。 阳离子 CRCOO-, HR, ROSO;Z) R,N+ -R=C,—C, R,NHt R=C,, Cy, cs 吡啶 R,NH' R=C,,C, RNHt R=C,—(C,, (4) 流动 相 的 稳定 性 iPeAMSKRAREARAREN, WCE mhR 《0.1 多 磷酸 ) 中 ,会 由 CH,—C=N 十 H+ >CH;—*C=N—H> 22H 异 丙 醇 在 酸 存 在 下 ,对 空气 氧化 更 加 敏感 。 由 于 这 些 原 因 ， 流动 相 切 勿 配制 后 贮存 过 久 ， 尤其 对 于 低 紫外 波长 检测 的 工作 ,最 好 新 配制 。 4 流动 相 的 过 滤 和 去 泡 六 动 相 在 用 于 色谱 之 前 ， 必 需 经 过 微 孔 滤 膜 过 泪 ， 对 水 相宜 用 HA 型 (纤维 素 型 ) 0.45um 滤 膜 ， 对 有 机 相 推 荐 用 FH 型 〈( 氟 材料 ) 0.5pm 滤 膜 。 流 动 相 的 灭 菌 也 是 很 重要 的 ， 因 为 许多 盐 (特别 是 磷酸 盐 ) 提 供 了 微生物 生长 的 适宜 环境 ,这 种 污染 可 以 影响 到 和 泵 ， 并 在 梯度 洗 脱 中 出 现 伪 峰 。 而 微 孔 滤 膜 过 滤 是 一 种 很 方便 的 冷 灭 菌 方 法 。 脱 泡 对 于 保证 泵 的 有 效 工 作 和 最 适 分 离 是 重要 的 ， 脱 泡 的 方法 有 : 搅拌 状况 下 真空 抽 气 ; 0.5pm BRE RWB 2 一 3 次 ; 超声 和 氨 脱 气 法 。 抽 真空 的 办 法 最 简单 ,但 要 防止 橡 皮 材 料 〈 压 力 管 , 塞 子 等 ) 的 污染 而 引起 紫外 吸收 ， 有 机 深 剂 的 百分比 也 会 因 挥 发 而 有 些 变化 ,可 能 会 影响 到 色谱 的 重复 性 。 氨 脱 气 法 要 求 氨 气 纯度 高 ,否则 会 影响 到 含有 异 丙 醇 的 流动 相 的 稳定 性 。 5. 预 柱 在 进 样 器 和 分 析 柱 之 间 安 置 一 支 预 柱 可 以 延长 分 析 柱 的 寿命 , 一 般 增 加 2 一 5 倍 , 因 为 流动 相 中 的 一 些 组 分 ， 特 别 是 离子 对 试剂 和 去 污 剂 ， 令 不 可 逆 地 吸附 到 固定 相 上 从 而 改变 了 固定 相 的 性 质 。 预 柱 中 的 载体 应 和 分 析 柱 一 致 。 通常 预 柱 为 4.6 X 50mm， 粒 度 30 一 50wm ， 预 柱 在 进 样 50 一 100 次 后 重新 填 装 。 我 们 通常 在 进 样 器 和 分 析 柱 之 间 增 加 一 个 过 滤器 (inline filter)， 可 以 过 滤 除 去 杂 质保 护 色谱 柱 , 过 滤器 内 为 0.2 一 0.5pm 的 微 孔 不 锈 钢 片 ， 易 于 更 换 或 取 下 超声 洗涤 , 对 系 绕 来 讲 也 不 增加 无 效 体积 。 本 6. 样品 预 处 理 这 是 一 个 遇 到 问题 最 多 的 项 目 之 一 。 由 于 样品 来 源 不 同 ， 处 理 方法 也 极 繁多 。 对 于 很 多 样品 ( 蛋 自 质 \ 肽 等 ) 因 为 已 经 初步 提纯 , 所 以 在 进 样 前 只 需 除去 微粒 即 可 , 但 对 其 他 的 一 些 样品 ,例如 血液 或 尿 中 的 小 分 子 组 分 的 分 析 , 可 以 用 有 机 溶剂 把 小 分 子 抽 提 出 来 分 “ 析 ， 也 可 以 用 酸 或 有 机 溶剂 处 理 把 蛋白 质 除去 ,再 进行 分 析 。 很 多 资料 报道 用 Sep-Pak C-18 小 柱 预 处 理 样品 ,效果 颇 佳 。 7. 洗 脱 方法 常 液 洗 脱 法 最 简单 , 即 色谱 过 程 中 只 用 单一 的 平衡 柱 的 缓冲 液 作为 流动 相 ,在 体积 排 除 色谱 中 即 应 用 这 种 洗 脱 方法 。 阶 梯 洗 脱 法 是 采用 几 种 不 同 浓度 的 盐 或 有 机 淤 剂 分 几 次 HEM RAAB AER AKAD, BERRIEN ARMA, FRA Bal 器 来 达到 任意 梯度 。 | 常 液 法 允许 大 量 样品 的 司 速 分 析 , 因为 至 少 可 以 节省 去 平衡 色谱 柱 的 时 间 ; 同 时 它 有 平稳 的 基线 ， 尤 其 对 于 紫外 检测 来 讲 是 一 个 很 大 的 优点 。 但 此 法 用 王 未知 样品 探测 时 常 常 不 易 得 到 准确 的 结果 ,譬如 某 样品 在 5 和 甲醇 时 不 能 洗 脱 出 柱 , 但 在 40 和 甲醇 时 ,样品 却 被 沉淀 在 色谱 柱 上 ;这 种 方法 的 另 一 个 弊病 是 一 些 杂 质 被 保留 在 柱 上 并 逐渐 积累 ,总 会 影响 到 分 离 效果 。 常 液 洗 脱 法 对 于 保留 能 力 相当 大 的 样品 , 洗 脱 时 峰 形 不 够 好 。 梯度 洗 脱 法 的 优点 是 允许 样品 在 一 次 色谱 中 以 很 广泛 的 极 性 来 分 离 样品 。 因 此 对 确 定 未 知 物 的 分 离 条 件 很 有 用 。 由 于 可 任意 设置 梯度 的 形状 ， 选 择 分 离 条 件 有 很 大 的 可 塑 性 ;对 保留 能 力 很 大 的 样品 也 能 给 于 很 好 的 峰 形 ; 在 高 梯度 时 ,实际 上 也 起 着 清洗 柱 的 作 用 。 缺 点 是 每 次 色谱 后 要 重新 平衡 柱 , 平衡 条 件 不 同时 对 重复 性 有 影响 ; 梯度 洗 脱 时 ( 特 别 采 用 有 机 溶剂 和 低 紫 外 检测 ), 会 使 基线 倾斜 ， 为 降 小 基线 倾斜 ， 必 需 采 用 高 纯度 的 试 Fill, | " 在 采用 离子 对 试剂 时 ,为 了 最 佳 重复 性 ,离子 对 的 浓度 在 整个 梯度 中 应 保持 一 致 。 在 洗 脱 过 程 中 ,温度 、pH 和 压力 对 色谱 都 有 影响 2271。 8. 检 出 器 有 关 资 料 统 计 指 出 ，HPLC 的 检 出 器 中 , 分光 光 度 计 占 首 位 ， 约 70 吧 (其 中 获 光 计 表 6， 不 同样 品 的 最 小 检 出 量 (ng) 样品 折光 检测 紫外 检测 (BBE) 荧光 检测 和 氨基酸 一 1—200 (190—200) 5-—15 肽 一 100—1000 (195—205) 0.3—15 蛋白 质 ”一 80—200 (200—220) hoon 10—15 ti fae xe 10" 10°—10* (192) | 一 呈 5X 104 10?—10* (203—214) — BER 一 1 (254) 0.2 Rao ee a ee 86 ° 520%), 第 二 位 是 示 差 折光 ,第 三 位 是 电化 学 检测 器 。 HPLC 中 常用 的 检 出 方法 灵敏 度 见 表 6, 为 了 提高 检测 灵敏 度 ,蛋白 质 也 常用 低 紫 外 区 ,这 对 溶剂 的 纯度 要 求 很 高 。 菊 光 方 法 一 般 比 紫外 检 出 灵敏 二 个 数量 级 ,有 的 样品 有 内 源 荧 光 , 有 些 样品 本 身 没有 荧光 , 这 可 以 设法 转变 成 有 茨 光 的 衍生 物 后 再 检测 ,例如 用 苯 二 醛 (OPA) 法 检测 氨基 酸 。 在 肽 和 和 蛋白质 的 分 离 中 ， 可 从 柱 的 洗 脱 液 中 借 取 样 阀 分 出 1 一 10%% 的 量 去 和 荧光 试 剂 ( 荧 光 胺 ) 反 应 而 检测 ,其 余 绝 大 部 分 可 用 收集 器 收集 (图 9), 近年 来 发 展 了 快速 扫描 楷 外 检 出 器 ,采用 几 百 个 通道 的 二 极 管 列 阵 , 建 立 相应 的 光学 系统 和 测量 系统 ,实现 了 随 峰 扫描 全 波 ,这 样 可 以 同时 得 到 有 关 组 分 的 色谱 图 和 光谱 图 。 折光 检测 是 测量 流 过 滚 体 的 折光 变化 ,是 种 通用 型 的 检测 器 ,灵敏 度 比 紫外 检测 低 二 到 三 个 数量 级 。 电化 学 检测 器 的 特点 是 选择 性 高 ,灵敏 度 也 很 好 。 BER : Mee 至 收集 器 RHE 控制 部 分 记录 仪 9 “蛋白质 和 肽 的 荧光 胺 柱 后 分 样 系统 装置 图 9. 柱 的 平衡 、 清 洗 和 贮存 在 多 肽 和 蛋白 质 的 分 离 中 , 除 凝 胶 过 滤 法 用 常 液 洗 脱 外 , 大 多 采用 梯度 洗 脱 法 ,确保 每 次 分 析 前 色 层 柱 处 于 相同 的 状态 是 获得 重复 性 的 关键 。 最 好 采用 反 梯 度 回 到 原始 状 态 ,再 用 起 始 的 缓冲 让 平衡 5 一 10 柱 体积 。 如 果 A 液 和 B 液 是 不 同 的 pH， 则 需 平衡 更 多 的 时 间 。 柱 在 应 用 多 次 后 ,有 些 物 质 很 强 地 吸附 在 柱 上 , 引起 压力 上 升 和 色谱 行为 的 改变 , 这 时 需 用 多 种 溶剂 洗涤 以 清除 吸附 在 柱 上 的 “杂质 ”。 没 有 一 种 通用 的 深 剂 能 除去 固定 相 上 所 有 的 杂质 。 表 7 列举 出 一 些 常 用 有 效 的 溶剂 系统 供 参考 。 有 些 高 浓度 的 有 机 溶剂 在 蛋白 质 色谱 中 并 不 是 最 强 的 洗涤 溶剂 ， 而 这 些 溶 剂 和 缓冲 液 、 有 机 酸 或 离子 对 试剂 50: 50 时 , 却 是 较 好 的 洗涤 体系 。 PURER. TRA 水 溶液 - 丙 醇 是 一 个 很 有 效 的 除 污染 溶剂 。 去 拍 剂 SDS 和 Triton 是 很 好 的 除去 HPLC 中 蛋白 质 的 系统 ,一般 作为 较 Se #7 清洗 HPLC 柱 的 溶剂 反 相 色谱 和 体积 排除 色谱 乙酸 1% 水 溶液 三 氟 乙 酸 1% 水 溶液 0.1% 三 氟 乙 酸 / 正 两 醇 40:60 TEAP*/ 正 丙 醇 40:60 RAR MAKE IR 5—8inol/L ACA RRA TR AKER 0.5—1.0mol/L DMSO-7K 50:50 离子 交换 色谱 乙酸 1% 水 溶液 磷酸 1% KHER SULA AEA it AKER 1—2mol/L *# 三 乙 胺 -磷酸 : 用 三 乙 胺 调节 0.25N 磷酸 至 pH2.5 后 采用 的 方法 , 且 用 后 立刻 用 超 纯 水 充分 洗涤 ,再 用 甲醇 洗 。 清除 柱 时 也 要 注意 前 后 采用 的 洗涤 系统 相互 闯 溢 的 问题 。 在 使 用 粘度 较 大 的 次 剂 洗 : 柱 时 ,应 降低 疲 速 , 防 止 太 高 的 压力 。 .只 有 采取 一 系列 洗涤 系统 不 太 见 效 的 情况 下 ， 可 考虑 打开 柱 的 顶端 ， 除 去 污染 的 表 : 面 , 再 用 相同 的 载体 填 柱 的 办 法 。 柱 在 不 用 时 应 充分 用 水 洗 去 盐 或 缓冲 液 ,然后 用 甲醇 或 乙 且 ( 硅 胶 类 反 相 柱 ) 充 满 柱 e。 柱 端 封闭 口 要 拧紧 ， 防 止 干 酒 可 能 引起 载体 几何 形状 的 变化 。 Regnier 详细 介绍 了 凝 胶 柱 TSK 3000SW 的 再 生效 果品 。 =. HPLC 在 蛋白 质 化 学 中 的 应 用 蛋白 质 结构 分 析 自 1953 年 Sanger 测定 牛 胰岛 素 顺序 (51 个 氮 基 酸 残 基 ) 以 来 已 有 三 十 多 年 历史 ， 近 年 来 已 能 测定 到 8- 半 乳糖 背 酶 的 全 顺序 《1021 个 氨基 酸 残 基 )o 以 往 一 ` 二 十 年 中 ,各 类 离子 交换 柱 和 凝 胶 过 滤 法 是 常规 的 提纯 蛋白 和 分 肽 的 方法 ， 但 色谱 全 过 程 需要 很 长 的 时 间 。 小 肽 的 分 离 过 去 常用 纸 电 泳 和 纸 层 析 法 ,但 滤纸 的 预 处 理 很 麻烦 ， 回收 率 也 较 低 。 HPLC 技术 在 70 年 代 中 期 引 和 人 蛋白质 化 学 分 析 领 域 中 ， 逐 渐 取 代 了 上 述 经 典 的 色谱 法 ,显示 了 巨大 的 生命 力 。 这 主要 是 在 柱 的 载体 化 学 上 有 了 突破 , 目前 经 典 的 色谱 法 都 可 以 在 HPLC 中 找到 相应 的 方法 ;同时 在 仪器 上 也 有 很 大 的 发 展 ,， 微电脑 的 普遍 使 用 ,已 能 控制 梯度 , 柱 的 再 生 和 自动 进 样 \ 结 果 数 据 处 理 等 等 ,达到 了 智能 化 。 1. 氨基 酸 分 析 蛋白 质 化 学 中 应 用 最 广泛 的 是 氨基 酸 分 析 ， 自 从 Spackman、Stein 和 Moore 的 所 基 酸 自动 分 析 方法 建立 以 来 ,又 发 展 了 一 些 更 灵敏 的 荧光 测定 法 ， 特别 吉村 前 反攻 的 全 二 甲醛 〈OPA) 法 ,因为 仪器 要 求 简单 ,为 很 多 实验 室 所 采用 。 氨基 酸 分 析 可 以 分 为 柱 后 反应 法 和 柱 前 衍生 法 两 大 类 。 前 一 种 方法 是 将 游离 氨基 酸 经 过 色谱 柱 分 离 后 ,各 种 氨基 酸 再 与 显 色 剂 ( 曹 三 酮 ,荧光 胺 、 邻 苯 二 甲醛 ) 作 用 ,仪器 需 用 « 88 - 专门 的 氨基 酸 分 析 仪 或 用 .HPLC 加 上 柱 后 衍生 装置 (参见 图 9)t9j。 后 一 种 方法 是 把 氨 ， | 基 酸 和 荧光 试剂 先 作用 生成 氨基 酸 的 衍生 物 , 然 后 再 用 柱 把 各 种 衍生 物 分 离 , 直 接 检测 衍 生物 的 荧光 ,此 法 可 检测 OPA 一 、PTC 一 、PTH 一 、Dansyl 一 、DABTH 一 和 DABS 一 氨基 酸 等 au。 2. OPA 柱 前 衍生 法 定量 分 析 氨 基 酸 吕 (1) 作用 原理 WAAR (OPA) 能 在 还 原 剂 一 SH 存在 下 与 一 级 胺 产生 具有 AR 5 DE IE RY FESR RTE Do 人 ,CH,OH ages + NH,—CH—R + SH — CH,CH,OH OH N—CH—R op ii aie OBE Gane (2) 试剂 配制 与 反应 条 件 5.0mg OPA ar 0.1ml 甲醇 ,加 入 50d RECESS 用 0.2mol/L pH9.5 的 硼酸 缓冲 液 稀释 至 lml， 每 隔 二 天 加 和 Sal 纺 基 乙醇 以 维持 离子 强度 。 此 试剂 通 氮气 后 贮存 于 暗 处 ,能 使 用 约 2 周 。 1l0gl 标准 氢 基 酸 混 合 液 〈50 一 500pmol) 或 样品 水 解 芒 , 加 和 人 10M4 0.4mol/L pH9.5 硼酸 缓冲 液 ,然后 再 加 入 10ul OPA 试剂 ,室温 下 混合 均匀 ，!1 分 钟 后 加 和 20zl 0.1mol/L 的 KH,PO, 中 止 反 应 ,并 立刻 取 20pl 进 样 至 RP- 100 C18 柱 中 进行 分 析 。 (3) 结果 和 讨论 ， ”本 实验 室 常规 分 析 如 图 10 RAR, Me 灵敏 度 BASRA DK oR WS 析 氨 基 酸 水 平 在 1 一 nmol， 而 OPA 法 可 达 100pmol 或 更 少 ( 荧 光 检 测 的 EX360nm, EM455 nm)， 如 果 没 有 荧光 检 出 器 , 也 可 检测 340nm 的 ERIC, AHS OPA 荧光 检测 可 3K 50—100fmol*" 这 一 方面 与 仪器 有 关 , 但 实 际 上 这 些 实验 室 的 常规 分 析 仍 在 100pmol 水 平 上 。 加 和 人 SDS 或 表面 活性 剂 Brig-35 到 OPA 20 中 , 可 以 改善 赖 氨 酸 的 稳定 性 和 增强 其 荧光 握 4。 ‘ 重演 性 ”为 获得 稳定 的 保留 时 间 ， 柱 的 平 相对 荧光 | 40 衡 时 间 和 条 件 要 相同 ,这 点 是 很 重要 的 。OPA FH 7 eo oe ao hae 法 的 一 个 固有 缺点 是 衍生 物 的 荧光 不 稳定 ， 随 时 时 间 (min) 间 变 弱 ， 这 可 以 加 和 内 标 o- Ba (a-ABA) 10 “标准 氨基 酸 图 谱 作为 校正 因子 来 克服 上 。 柱 : Altex RP-18 5um(4.6X250mm) 标 准 氨基 5 酸 : Pierce 产品 ?各 种 氨基 酸 均 为 430pmol ABA 次 级 气 基 酸 ”次 级 氨基 酸 不 能 和 OPA 反 本 er 让 二 和 各 名人 应 ,这 可 在 反应 前 将 它们 转变 成 一 级 胺 来 补救 执 。 乙醇 : 50mmol/L 栈 酸 组 冲 液 PH5.9 = 3:12:85 证 、 、 B. 乙醇 : 50mmol/L 栈 酸 组 冲 滚 H5.9 = 半 胱 氨 酸 在 OPA 中 灵敏 度 很 低 ， 这 可 以 用 过 甲 2.55, jem? Tee aca ote SAC Oe DEB (CA) RATA CEA RR 仪 和 荧光 检测 器 均 为 本 实验 室 自 装 。 s189;，。 甲 基 半 胱 氨 酸 ( 色 层 位 置 在 谷 氨 酸 后 面 ) 后 再 与 OPA 反应 ,从 而 提高 了 灵敏 度 。 流动 相 各 种 流动 相 系 统 很 多 ,大 多 采用 甲醇 、 乙 且 。 本 实验 室 发 展 了 无 毒 的 乙醇 -系统 ,但 由 于 粘度 较 大 ,所 以 系统 的 压力 也 偏 高 一 些 。 ，， 袖 度 ” ”不 同型 号 的 仪器 在 梯度 上 会 有 些 差别 ， 各 实验 室 可 在 文献 的 基础 上 作 些 修 改 以 适应 自己 仪器 的 需求 。 生理 体液 和 血清 中 的 游离 氨基 酸 分 析 : “样品 预 处 理 可 用 1 KREME RCE (含有 斑 基 乙醇 ) 混 合 均匀 后 高 速 离心 , 取 上 清 液 进行 氨基 酸 分 析 c。 3. PIH- 和 毛 基 酸 Edman 在 1956 年 引入 异 硫 氰 酸 葵 醋 (GHSNCS, 简称 PITC) 试剂 用 于 蛋白 质 和 Ki N- 端 氨基 酸 分 析 。 这 个 经 典 的 方法 发 展 至 今 有 液 相 法 ， 也 有 固 相 法 ;有 手工 顺序 操 作 , 也 有 自动 化 的 顺序 分 析 仪 。PTH- 氨 基 酸 的 鉴定 有 纸 色谱 、 薄 层 色谱 、 高 效 液 相 色 谱 和 把 PTH- 氨 基 酸 反 水 解 成 游离 氨基 酸 再 来 鉴定 。 其 中 用 HPLC 最 为 快速 和 灵敏 并且 能 自动 化 。 分 析 的 柱 可 以 是 -CN 柱 ,也 可 用 反 相 C-18 柱 , 还 有 专门 用 于 分 析 PTH- 氨 基 酸 柱 供应 。 分 析 的 方法 有 常 液 法 ,也 有 用 各 种 梯度 法 。 操 作 可 以 在 常温 下 进行 ,更 多 的 报道 是 在 恒温 (45 一 55%C) 条 件 下 进行 分 析 。 方 法 繁多 ,直到 现在 每 年 还 有 很 多 改进 的 报 道 发 表 。 11 标准 PIH 世 - 氨 基 酸 图 谱 Beckman 344 PTH-AA: ~50—100pmol #: Ultraphore PTH-AA 柱 5 (4.6X%250mm), 柱 温 : 水 浴 夹 套 恒温 50%0， is: A. 15mmol/L 酷 酸 钠 缓 冲 攻 (PH4.5): CiH=90:10 B. 15mmol/L BRAHAM (PH4.5): CZ. fe— 10:90 流速 : 1ml/min 检 出 器 : UV254nm RE 。 0.05AUFS, #8EF: 0—imin 0—30%B 1—llmin 30—55% B 11 一 16min 55—0% R。 e 990 —— 我 们 采用 Beckman PTH- 氨 基 酸 专用 柱 ， 把 常 出 现 的 17 种 _ PTH- 氨 基 酸 在 20 分 钟 内 分 辩 开 , 灵 敏 度 为 50pmal 或 更 少 (图 11)。 如 果 峰 形 分 辨 不够 理想 时 ,可 以 改变 pH 或 者 变化 缓 症 液 离子 强度 来 调整 各 个 PTH- 氨 基 酸 的 位 置 (保留 时 间 )。 4. 肽 和 有 蛋白 质 的 分 离 纯化 《 “在 肤 的 分 离 中 , 反 相 色谱 是 最 有 效 的 。 肽 先 溶解 在 组 冲 液 或 稀 酸 水 溶液 中 上 柱 , 最 初 用 于 分 肽 的 溶剂 系统 是 稀 磷酸 ,但 大 肽 在 稀 磷 酸 中 的 溶解 度 不 好 , 且 在 制备 工作 时 样品 中 引入 了 很 多 盐 。 甲 酸 和 乙酸 以 及 三 氟 乙 酸 在 分 肽 中 是 很 有 效 的 系统 ,吡啶 系统 也 极 佳 , 它 们 都 是 挥发 性 的 溶剂 。 流 动 相 中 有 机 溶剂 用 甲醇 或 乙 有 睛 ,对 大 肽 和 芯 水 性 强 的 肽 用 丙 醇 ， 有 机 溶剂 浓度 一 般 在 15 一 60% 范围 内 。 由 洗 脱 肽 的 能 力 来 安排 ,其 顺序 大 致 为 : LAS > SAB > Sake = 二 氧 六 环 > 乙醇 一 CAS 甲醇 “ 反 相 色谱 中 ,孔径 也 是 一 个 重要 的 因素 ， 对 分 子 量 大 的 蛋白 质 来 讲 , 300 人 A 柱 的 回收 比 100A 要 高 ,而 对 小 肽 或 分 子 量 小 的 蛋白 质 而 言 , 则 孔径 影响 不 是 很 显著 。 此 外 ,流速 、 温度 、pH 对 色谱 行为 都 有 影响 。 蛋白 质 和 含有 芳香 族 氨 基 酸 的 肽 的 检 出 可 在 280nm 或 254nm。 如 果 用 210 一 230nm 检 出 灵敏 度 可 提高 5 一 10 倍 ,当然 对 溶剂 的 要 求 也 要 高 得 多 。 HBA ore 光 改 收 550nm 12 FASKEAW EHR ONMIR ROO 图 13 DABTC- 肽 谱 IamolR{LSBRAER (Cal) 用 TPCK- 胰 蛋白 酶 消 RP-18 柱 (4.6 X 250mm) 10pm 100A 流动 相 化 、 然 后 用 RP-C18 柱 〈4.6X250mm ) 分 离 、 流动 相 (A) 0.1% TFA 流动 相 (B) 0.1% TFA, 60% A: 0.1% TFA Kw B: 0.1% TFA-40% ERR 异 两 醇 wii: 1m1/min。 除 用 紫外 检 出 外 ,也 可 用 荧光 方法 ， 例如 将 肽 和 荧光 胺 或 DABITC 等 试剂 反应 后 生 成 有 色 的 肽 ,可 在 荧光 下 或 可 见 光 下 检 出 品 。 合成 多 肽 也 能 用 反 相 色谱 层 法 分 离 , 反 相 色谱 还 成 功 地 用 在 肽 的 异 构 休 分 辩 上 。 蛋 昌 质 的 分 离 纯化 , 除 用 反 相 色谱 外 (图 15), 还 广泛 地 用 离子 交换 柱 , 芯 水柱 和 高 速 e 91 6, 和 A 280 0 5 10 时 间 (min) 时 间 (min) 图 14 肽 异 构 体 的 色谱 分 离 Al 某 些 蛋白 质 的 反 相 色谱 柱 : RP-18,10um, 46 X 250mm 柱 ; Cg 0.41X5cm 300A Spm BAH: 0.1mol/L 磷酸 pPH2.1 BREF: 0.1% TFA-5 ABR 流速 ， 2ml1/min \ 流速 : 0.7ml1/min 温度 : 25°C 样品 : 1. 核糖 核酸 酶 A， 2, 胰岛 素 ， 3. 细 1, TL-Ala-L-Ala-L-Ala 胞 色素 C， 4. 牛 血清 白 蛋 白 。 5. 卵 白 蛋白 。 和 \ 2. L-Ala-L-Ala-D-Ala 3. L-Ala-D-Ala-L-Ala BRE. a By ， 全 =< S > : 2 ra 图 16 蛋白 质 混 合 物 的 阳离子 HPLC 色谱 = 柱 : CM 4.1X50mm 流动 相 A, 0.01lmol/L MBRAMR PH6.0; B, 0.5mol/L RMAMmR pHo.0. 梯度 : 30 分 钟 流速 : 1ml1/min。 10 20 30° 样品 : 依 洗 脱 顺序 为 : 牛 血 清白 蛋白 ;杆菌 肽 ; 胰 时 间 (min) 凝 乳 蛋白 酶 原 ; 细 胞 色素 C; ARM. i=) 5. 高 效 体积 排 除 色 谱 法 测定 蛋白 质 分 子 量 和 鉴定 蛋白 质 纯度 经 典 的 生物 高 分 子 排除 色谱 ( 凝 胶 过 滤 ) 是 利用 软 性 的 亲 水 凝 胶 ， 例 如 合成 的 聚 丙烯 ee 92 。 酰胺 (Bio-Gel p), 4 A HEwEE (Sephadex) 和 琼脂 糖 (Sepharose 或 Bio-Gel A)o 它 们 只 能 在 低压 下 工作 ,因此 平衡 和 分 离 是 一 个 很 长 的 过 程 ; 通 常 需 几 小 时 甚至 几 天 。 采用 控制 孔径 的 刚性 珠 状 硅胶 ,开拓 了 另 一 类 的 蛋白 质 体 积 排除 色谱 法 ,这 一 类 材料 有 很 高 的 极 性 和 呈 弱 酸性 的 硅烷 醇 基 团 ， 且 密度 很 高 。 硅 烷 醇 基 团 作 为 阳离子 交换 部 位 而 吸附 变性 的 生物 高 分 子 ， 特 别 是 等 电 点 大 于 7.5 的 蛋白 质 ,， 这 一 现象 限制 了 其 应 用 的 范畴 近年 来 用 硅胶 为 载体 ， 涂 合 或 化 学 键 合 上 一 层 亲 水 相 到 硅胶 表面 二， 从 而 发 展 成 HPLC 中 一 个 重要 的 分 支 。 根据 原材料 ,主要 有 SW 和 PW 二 种 ,但 一 般 情况 下 , 仍 首 先 考 虑 采用 SW 型 , 适 用 pH 范围 为 pH227.5 ,主要 规格 有 TSK-2000SW,TSK-3000SW 和 TSK-4000SW (或 者 Protein I-60 I-125 和 I-250)。TSK-2000SW 适用 于 小 分 子 量 蛋白 质 的 分 子 量 测 定 和 分 离 鉴 别 , 分 子 量 约 ,5000 一 100000; TSK-4000SW 适用 于 分 子 量 大 的 蛋白 质 , 范 围 约 50000—1000000, MOR RA RHR PR RRA IK). wea KA LAA PRO log MW 5,00 2000SW 4.80 4,60 4A0 Be eet 6 18 20 22min Tr 17 HPLC MRUBEMEBA RAF 仪器 : Beckman 344 421 程序 控制 器 112 BR 160 型 检 出 器 280nm, 0.5AUFS 柱 : Beckman TSK-2000SW 和 _TSK-4000SW 流动 相 ;: 40mmol/L 磷酸 组 冲 液 pH6.8 150mmol/L NaCl 流速 : 0.5m1/min 纸 速 : 0.5cm/min Eh: 1. 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 ; 2.0098 EA; 3. 牛 血 清白 蛋白 ; 4. HVS; 5. EA. 93 。 Wi) AAS AIRE WSL SDS), wes SA AF 0.1mol/L, 的 氧化 钠 以 克服 次 级 离 “ 子 的 作用 ,一 般 总 的 离子 强度 不 超过 0.5mol/L, 凝 胶 柱 的 塔 板 数 N 和 流速 有 很 大 关系 。 流速 一 般 不 超过 lmlmin， 流速 慢 肝 塔 板 数 N 也 大 ,分 辩 力 好 些 。 | | 对 蛋白 质 回收 或 酶 活性 回收 一 般 都 很 高 ， 常 用 于 纯化 蛋白 质 和 测定 蛋白 质 的 分 予 量 或 鉴定 纯度 ，15 一 30 分 钟 即 可 完成 ,这 个 方法 和 SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 配合 使 用 * wD 用 在 测定 蛋白 质 或 酶 的 解 离 聚合 研究 \ 亚 基 组 成 和 蛋白 质 装 配 等 研究 工作 中 。 蛋白 质 的 分 子 量 测定 : 采用 标准 蛋白 质 为 1 胰 北 乳 蛋 白 酶 原 ，MW 25 700 ]gMW 4.41 本 实验 室 制 备 2 卵 白 蛋白 45 000 4.65 SEVER 产品 =I disso : 3 和 牛 血 清白 蛋白 67 000 4.83 ，Fluka 产品 4 蛇 肌 醛 缩 酶 160 000 5.20 AMS HS 001 5 #EY 480 000 5.68 SEVER 产品 ae Azs00.02AUFS (A) ee 2041 AFP TOS ey Oe Py 12.7 5 | 40 ao CD @ 加 30 | 20 | [ae z 10 mm ck Be co Al ; fall an Al 18 PF AGkk Se Be Se #0 CA) FRRRKEA CAFP), 进 样 量 204g，20 分 钟 完成 分 析 ; (CB) AFP BOAR PA MERC mERS 电泳 \ 样 品 量 分 别 为 2、 双 8 16ng， 实 验 条 件 同 图 17， 纪 录 纸 全 量程 为 0.02 (0.02AUFS), hs 四 、 HPLC 在 酶 学 中 的 应 用 对 任何 一 种 酶 进行 研究 都 需要 一 个 灵敏 可 靠 的 活性 测定 方法 。 很 多 酶 的 活性 测定 是 借 产 物 和 底 物 有 不 同 的 光谱 性 质 而 采用 分 光 光 度 法 。 这 种 方法 简便 、 灵 敏 .重复 性 好 。 例 如 脱 氨 酶 系 都 采用 NAD+ (或 NADP+) 和 NADH (或 NADPH) 在 340nm 处 的 差别 而 进行 活性 测定 。 另 一 些 产 物 和 底 物 是 同 源 的 (例如 ATP 和 -ADP) ,光谱 完全 相同 ,但 也 可 用 酶 偶 联 方法 来 测定 ,如 丙酮 酸 激酶 ,可 把 它们 与 NAD+-NADH 体系 偶 联 起 来 。. 除 分 光 光 度 法 外 ， 酶 的 活性 测定 还 经 常 采用 同位 素 法 和 在 不 同时 间 取 样 进 行 化 学 比 色 或 色谱 分 析 来 计算 酶 的 活性 。 HPLC 方法 也 被 发 展 用 于 测定 酶 的 活性 ， 族 今 已 有 近 百 种 酶 建立 了 用 HPLC 测 活 的 方法 ,而 且 还 开展 了 酶 动力 学 的 研究 8 和 低温 HPLC -的 研究 aae 。 94 e 色谱 洗 脱 时 间 (min) 图 19， HGPRTase 测 得 系统 的 HPLC 图 谱 50umol/L 鸟 叮 了 蛤 (6G);50Pmol/ 儿 L 次 黄 车 叭 (也 )，100umol/L P-Rib-pp, immol/L MgCl, 在 pH7.4 磷酸 钾 缓 冲 牙 中 ,不 同时 间 (0 一 ?min) 取 10&1 进 HPLC 离子 柱 。0.5mol/L PRR (PH4.0)， 常 液 洗 脱 ，254nm 检测 。 Pu > q ADO HYP (b) (c) 光 吸 收 (254nmy) ” 光 吸 收 (254nmm) fe a ey |) re 7 5 1607! 5 ‘tC oy & 100 5 Wot s - Ro 时 间 (min) 时 间 (min) 20 用 HPLC 法 测定 人 红细胞 中 逐 叮 聆 脱 氨 酶 活性 (2) 人 红细胞 盗 胞 产物 的 空白 对 照 和 三 种 标准 样品 : RRB (HYP), 次 黄 昔 CUE INO) ARM (ADO);(b) (c)(d) 不 同 反应 时 间 (3、30、50 分 钟 )。 可 有 更 到 底 物 腺 味 叭 的 下 降 和 产物 的 形成 柱 : Bondapak/C18; 洗 脱 液 : 0.01mol/L KH,PO,/CH;,;OH, 86:14(V/V)3; 流速 2m1/min。 140 120 i 100 3H 80 v2 60 40 20 00.00 0.05 0.10 0.15 0.00 0.25 酶 重 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 = pH ; (a) . 图 21 (a) pH XHR US Ri A NORE COR Oa; (b) 不 同 红 细胞 体积 ( 酶 量 ) 和 酶 测定 的 关系 。 (b) © 95 。 1. 酶 活性 测定 用 HPLC 法 测定 腺 叮 叭 脱 氨 酶 的 活性 吗 通过 鉴 测 腺 叮 叭 浓度 的 变化 来 进行 。 与 其 他 方法 相 比较 ,此 法 可 把 内 源 酶 引起 的 干扰 降 到 最 小 ,同时 可 以 监测 几 种 竞争 酶 反应 的 产 物 , 图 19 一 21 是 用 HPLC 法 测定 人 红细胞 中 腺 顺 吟 脱 氨 酶 的 结果 。 经 典 的 测定 谷 胱 甘 肽 过 氧化 物 酶 (GSH-Px) 活性 方法 是 基于 谷 胱 甘 肽 还 原 酶 - NADPH KAS, Bis NADPH 在 340nm 处 光 吸 收 的 下 降 。 本 实验 室 建 立 了 一 种 新 的 测定 GSH-Px 活性 的 方法 ， 系 用 RP-HPLC 直接 测定 生成 的 产物 GSSG™, xR 法 微量 ， 要 求 的 辅助 试剂 也 少 。 特别 用 酶 偶 联 法 测定 GSH-Px 活性 时 不 能 观察 到 直接 产物 对 酶 的 激活 或 抑制 作用 ,新 的 方法 则 无 此 观 病 ,可 用 于 动力 学 研究 。 (1) GSH-Px 活性 测定 50pl 反应 系统 中 含有 50mmol/L, pH7.2 磷酸 缓冲 液 ， Immol/L GSH, Immol/L -本 基 过 氧化 氨 ，1mmol/ 工 NaN;, 0.4mmol/L EDTA 和 适 峰 高 (cm) Oo, ，、 峰 高 (cm) 10 15 2.0 nmol 0 40 20 30 40 50 ng GssG GSH-Px 图 22 GSH 和 GSSG 的 分 离 图 谱 图 23 GSSG 的 标准 线 tw 3.61 Salt 87 GSH 5.19 GSSG 8 STOP 站 | 时 间 (min) 24 GSH-Px 反应 的 时 测 线 25 酶 笑 狂 示 酶 量 的 关系 5 96。， 量 GSH-Px (20 一 30ng)。 以 加 人 t- 丁 基 过 氧化 氨 开 始 反 应 ，25%C 反应 3 分钟 后 加 入 等 体积 0.5% TFA 停止 反应 。 取 20w 上 样 于 RP-C18 柱 , 通 过 对 GSSG 的 生成 定量 分 析 而 计算 酶 活性 。 酶 单位 定义 为 25°C 下 ， 每 分 钟 氧化 lpmol 的 'GS 瑞 为 二 个 酶 单位 ; 它 相 当 于 每 分 钟 生成 0.54 mol 的 GSSG。 (2) RP-HPLC 分 析 Beckman 344 HPLC; Altex iat: C18 (4.6 X 250mm); 检 出 器 ， UV 214nm 0.1AUFS; 流动 相 为 0.1% TFA-10% 甲醇 水 溶液 :流速 -lml/min。 【《3) 结果 图 22 一 24 分 别 示 底 物 和 产物 的 分 离 ; 产物 的 标准 线 ， 酶 活性 和 时 间 的 关系 以 及 酶 活性 和 酶 量 的 关系 。 “二 酶 活性 计算 : _ (CH 二 0)13 10° Hots ee = AH y 933 P. 式 中 实验 中 测 得 的 产物 GSSG BE (cm) H H 空白 对 照 中 的 GSSG BE (cm) AH i445 = (H-H,) F lpmol GSSG 的 峰 高 (~4.0 x 10°cm) P 50gl 酶 活性 测定 系统 中 的 GSH-Px BAH (ng)o 酶 反应 柱 RK 26 ， 酶 的 分 离 和 活性 连续 监测 装置 示意 图 10. 20 30 By a] (min) 时 间 (min) ， 图 27 “商品 牛 肠 碱 性 磷酸 酶 的 分 级 图 谱 (A) 8mg/ml 样品 。 分 析 柱 DEAE-Glycophse/CPG (37—74pm, 250A), 25°C HEH 0.05. mol/L Tris pH8.0, 最 后 梯度 为 0.05mol/L Tris pH8.0—0.3mol/ L NaCl, A280 监测 ;3 (B) 0.4mg/ml 样品 ,加 上 活性 量 测 装 置 ， 酶 反应 柱 _Glycophase G/ 非 多 孔 性 硅 酸 钠 《40mm ) 底 物 8mmol/L 对 硝 基 酚 磷 酸 于 0.05mol/L Tr is pH8.0 44; TE 1.3ml1/min， 底 物 泵 0.35m1/min 压力 300psi Ago 监测 。 其 他 条 件 同 (A)。 ¢ 97 » 如 果实 验 室 中 有 积分 仪 , 则 计算 中 可 用 相对 积分 面积 取代 记录 仪 中 的 峰 高 庆 s 2. 酶 纯化 过 程 中 的 酶 活性 连续 监测 ” 酶 的 , HPLC 分 离 纯化 过 程 和 蛋白 质 提 纯 相 同 ， ae so 1 性 。 以 商品 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 为 例 ， 用 上 述 装置 得 到 结果 如 加 27 所 示 s 用 此 法 测定 酶 活性 呈 线 性 关系 ， 司 时 也 检查 了 样品 在 分 析 柱 后 和 酶 反应 柱 后 的 扩散 情况 和 滞后 现象 。 这 一 方法 也 用 于 肌 栈 激酶 和 乳酸 脱氧 酶 同 工 酶 的 分 离 鉴定 强 届 近年 来 有 关 酶 活性 测定 的 报道 急剧 增加 ,例如 有 关 和 氨基酸 合成 酶 系 ， 均 可 在 停止 反应 后 用 OPA 法 测定 生成 的 氨基 酸 量 来 计算 酶 活性 5 S$ 4% .%& 8 [1] Hughes, G. J. and Wilson, K. J., High- performance liquid chromatography: Appliations in protein struc- ture determination, Methods of Biochem. Analysis, 29, 59(1983). [2] Hancock, W. S. and Sparrow, J. T.,. HPLC analysis of biological oe a Chromatographic Selence Se- ries, 26, 1(1984). [3] Regnier, F. E., High performance liquid chromatography of Proteins, Methods in Enzymology, 91, 137(1983). [4] Wehr, C. T., High performance liquid chromatography: Care of columns, Methods in Enzymology, 104, 133 (1984). [5] Unger, K., High performance size exclusion chromatography, Methods in se ie 104, 154(1984). [6] Regnier, F., High performance ion exchange chromatography, Methods in Enzymology, 104, 170(1984). [7 Hearn,-M. 4 W; = lay -phase high performance liquid chromatography, Methods in Enzymology, 104, 190 (1984). [8] Larsson, P. O., High performance liquid affinity chromatography, Methods in Enzymology, 104, 212(1984). (9] BHES. SKRERMRAS AAA EHR RES 54 YB FAR 20, 424(1988), (10) ERAS, NACBARNS ARAB RIE 10 微微 摩尔 水 平定 量 分 析 氮 基 酸 5 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 ， 17,747(1985), [11] Chang, J. Y. et al., Amino acid analysis in the picomole range by precolumn derivatization and high per- ~ formance liquid chromatography, Methods in Enzymilogy, 91, 41(1983).: [12] Jones, B. N. et al., Amino acid analysis and enzymatic sequence determination of peptides by an improved O-phthaldialdehyde precolumn labeling procedure, J. Liguid Chromatogr., 4, 565(1981). — [13] Bohlen, P., Analysis for imino acid with O-phthaldehyde, Methods in Enzymology, 91, 17(1983). [14] Chan, M. M. S., Amino acid analysis by HPLC, Beckman Bulletin, 5925. [15] Jones, B. N. and Gilligan, J. P, O-phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase HPLC of polypeptide hydrohysates “and physiological fluids, J. Chromatogr., 266, 471(1983). [16] Xia, Q. C. et al., The primary structure of the COOH-terminal half of cholera toxin subunit A; containing the ADP-ribosylation site, Arch. Biochem. Biophys., 234, 363(1984). [17] Sloan, D. L:, Kinetic analysis of enzymatic reactions i high performance liquid chromatography, Adv. Chromatogr., 23, 97(1984). [18] Henderson, D. E. and O’Connor, D. J., Low-temparature high performance liquid chromatography for separation of thermally labile) species, Adv. Chromatogr., 23, 65(1984). [19] Hartwick, R. A. et al., An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure chromatography, J. Chromatogr. Sci., 16, 427(1978). {20] Chang, S. H. et al., High performance liquid chromatography of proteins, J. Chromatigr., 125, 103(1976). [21] Unnithan, S. et al., A high performance liquid chromatography assay for asparagine synthetase, Anal. Bio- ， chem. 136, 195(1984). [22] SESCIB > FA ACE LC A Bt (LP St ta 20, 373 | (1988), e。 98 。 Edman 降解 法 测定 蛋白 质 序 列 k HF (中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 ) 50 ERM, Edman 采 甲 异 硫 氰 酸 茶 酯 (Phenylisothio Cyanate， 简 称 PITC, Edman 试剂 ) 首 先 建立 了 测定 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 的 方法 。 1968 年 Edman 终于 研制 成 功 自动 顺序 仪 〈Sequencer)。 近 年 来 ,又 有 高 度 自 动 化 \ 微 量化 和 精确 灵敏 的 气 液 顺序 仪 问世 。 在 各 种 测定 蛋白 质 氨基 酸 序列 方法 中 ，Edmana -降解 法 仍 是 最 为 准确 、. 可 靠 的 方法 。 1 Edman 降解 法 的 基本 原理 Edman 试剂 的 化 学 反应 ,从 蛋白 质 的 多 肽 链 的 N- 端 进行 降解 ,一 次 只 去 掉 一 个 氮 基 酸 残 基 ! 经 过 反复 循环 反应 * 能 依次 得 到 一 系列 氨基 酸 的 衍生 物 (PIH- 氮 基 酸 )， 分 析 鉴 PTH 氨基 酸 就 得 到 从 N- 端 开始 的 肽 的 氨基 酸 序列 -其 主要 反应 分 为 以 下 三 步 吕 :- (1) 偶合 蛋白 质 的 多 肽 链 N- 端 氨基 酸 的 氨基 与 PITC 在 无 氧 条 件 下 , 在 pH8 一 9 的 缓冲 液 中 ,进行 偶合 ,生成 葵 基 硫 代 氮 甲 酰基 肽 的 衍生 物 RE 由 (2) 裂解 苯 基 硫 代 氨 甲 酰基 肽 衍生 物 与 无 水 三 所 醋酸 反应 * 释 放出 N- 端 的 氨基 酸 产 生 葵 胺 唆 TAA DK Bilal Ly egy aan 简称 机 个 残 基 的 多 肽 链 8 (3) 转 位 1 生成 的 , AIZ 衍生 物 极 不 稳定 ， 必须 迅速 转化 成 茶 基 乙 内 酰 硫 脲 -氨基 酸 (Phenyl thiohydantion 简称 PTH) 后 ,进行 鉴定 e -总 反应 式 为 : Gu BARS KE | | oogt 4 es Bog NH (His. Ae. Te Pi N N—C-N—C—C-Nn- EG RES ik Gt | | C=O pH8—9 | —_—_ R 和 Cc | | R-c—H #28 | S Nu J TFA 裂解) H.N“—| RARSKE | * 为 从 蕊 - 端 开 始 的 蛋白 质 多 肽 链 的 第 一 个 氨基 酸 的 氨基 。 ” 为 从 人 - 端 开始 的 第 三 个 氨基 酸 的 氨基 * 每 次 反应 减 去 一 个 氨基 酸 依次 可 以 进行 多 次 循环 反应 8 « 99 。 2. Edman 降解 反应 对 样品 要 求 (1) 首先 必须 将 蛋白 质 进 行 解 聚 成 一 条 多 肽 长 链 分 子 。 如 果 测 定 的 蛋白 质 分 子 中 含 二 硫 键 ,必须 将 二 硫 键 用 氧化 或 还 原 的 方法 拆 开 , 得 到 的 含 半 胱 氨 酸 的 肽 链 必须 保护, B 免 二 硫 键 重新 组 合 。 含 亚 基 的 蛋白 质 分 子 , 需 将 亚 基 拆 开 、 纯 化 \ 分 别 测定 。 (2) BARS KA N- 端 必须 是 游离 基 团 。 有 些 蛋 白质 N- 端 被 乙酰 基 (CHICO 一 ) 封闭 ， 如 乙酰 细胞 色素 C， 乙 酰 烟草 花 叶 病毒 等 。 有 的 蛋白 质 的 N- 端 为 环 谷 氨 酸 (pyroglutamic acid)、 如 免 IgG 的 重 链 、 许 多 活性 多 肽 等 ， 都 不 能 直接 用 Edman: 法 降 解 。 唯 N- 端 是 乙酰 -丝氨酸 时 ,有 个 别 报道 可 与 Edman 试剂 反应 =。 3. Edman 反应 要 求 反应 率 尽 可 能 接近 完全 这 样 ,从 而 能 使 蛋白 质 多肽 链 降 解 得 到 更 多 步 的 氨基 酸 序列 所 如 表 玉 所 示 & 表 1 Edman 降解 反应 率 与 剩余 的 N- 端 量 ”- He) RAK Sa Yo 连续 降解 步 数 100 36 0.6 0,003. 9 祯 如 果 每 步 反 应 率 为 90%， 到 第 10 步 循环 反应 后 ,其 剩余 NH, KH (0.9)"=0.35, 因为 产 率 低 于 30 多 ,得 到 的 PTH 毛 基 酸 衍生 物 已 无 法 检测 了 ?所 以 序列 测定 只 能 到 10 步 左 右 。 为 了 保证 高 反应 率 , 首先 要 求 是 高 纯度 的 试剂 与 严格 的 操作 条 件 ; 如 反应 在 充 氮 无 氧 条 件 下 进行 ;以 及 反应 过 程 中 尽量 避免 可 能 产生 的 副 反 应 ,同时 要 求 待 测定 的 蛋白 质 具有 较 高 的 纯度 等 。 这 样 ,一 般 可 以 使 每 步 反 应 率 达 到 99% 以 上 。 4. 可 能 产生 副 反应 的 几 个 因素 ” (1) 偶合 反应 的 pH 必须 严格 控制 在 8 一 9; 不 能 > 10, 因 过 碱 会 导致 PITC 与 一 ， 级 胺 、 二 级 胺 反应 。 NH, 十 Ph — N=C=sS 一 Ph 一 NH 一 CS 一 NHL 当 这 些 副 反 应 的 产物 生成 后 ,就 很 难 除去 。 从 而 影响 了 PTH- 氨 基 酸 鉴定 。 (2) 偶合 反应 也 不 能 < pH8。 测 定 的 样品 不 可 偏 酸 。 因 偏 酸 会 使 缓冲 液 bH 一 8， 导致 偶合 反应 不 完全 。 (3) 在 偶合 反应 中 ,必须 严格 控制 在 无 氧 条 件 下 进行 ,氧化 会 导致 二 硫磺 酸 副 产 物 的 产生 。 (4) 偶合 时 ;必须 用 高 纯 的 缓冲 液 , 杂 质 中 往往 含 醛 ， 会 造成 氨基 被 反应 ， 以 及 形成 "” 100 。 Schiff 碱 使 蛋白 质 多 肽 链 产 生 不 纯 的 联结 有 , 而 造成 肽 链 氨 基 酸 序列 训 定 中 断 。 (5) 在 反应 过 程 中 ,必须 控制 反应 的 时 间 及 温度 。 延 长 反应 时 间 及 提高 反应 刘 度 ,都 会 导致 副 反 应 增加 而 影响 鉴定 。 (6) 蛋白 质 肽 链 中 色 氨 酸 残 基 很 不 稳定 ,在 反应 中 易 被 氧化 而 使 产物 终止 。 因 此 , 必 须 严 格 控制 无 氧 的 反应 条 件 , 否 则 色 氨 酸 将 会 测 不 出 。 (7) PTC-Gly-His, PTC-Pro-His 按 常 规 的 偶合 和 有 裂解 反应 不 能 完全 。 必 须 通 过 反复 循环 测定 ,改变 反应 条 件 , 如 延长 反应 时 间 等 。 若 反应 不 完全 会 影响 下 步 循 环 中 产生 以 上 的 联结 肽 ,而 影响 肽 链 氨基 酸 序列 测定 的 继续 。 所 .试剂 的 纯化 Edman 反应 中 ,在 需 用 的 高 纯 试 剂 中 , 除 PITC、TFA 在 重 燕 时 需 特殊 处 理 外 ,其 他 试剂 均 为 国产 A、R 级 , RBA OS, BK (1) B% PITC ARE, CAT WR SERA, WORM. TRE, 直到 蒸馏 液 呈 无 色 透 明 溶液 。 小 量 分 装 于 安 褒 瓶 中 ,封口 低温 保 存 。 (2) BR TFA 国产 TEA 加 入 相当 于 1% 的 固体 无 水 硫酸 钙 , 脱 水 ,室温 放置 两 天 , 常 压 重 蒸 一 次 ， 重 燕 后 的 淤 液 加 人 相当 于 0.2% 固体 甘氨酸 。 用 以 除去 封 头 试剂 。 室 温 放置 两 天 ,再 重 藻 两 次 。 重 蒸 液 小 量 分 装 ，4%c 冰箱 保存 。 6. Edman 降解 手工 操作 法 (1) 偶合 反应 PRM 150nmol 蛋白 质 样 品 置 于 10ml 僚 底 磨 口试 管 中 ,， 用 0.4mi, 0.4mol/L DMAA 缓冲 液 ，pH9.0, 溶解 样品 (DMAA 即 N, N-dimethy! N-allylamine)， 也 可 用 N- 甲 基 吗 啉 (N-methyl-morphonine) 缓冲 液 代 替 。 有 具体 配 法 是 , HR DMAA 为 9mol/ 工 ， 以 吡 we /7K = 3/2 体积 比 为 溶剂 ,用 TFA 调 pH~9:5 再 用 吡啶 /水 稀释 至 欲 配 溶液 的 体积 。 然后 ,加 0.06ml PITC 后 , 通 氮气 , 盖 紧 磨 口 塞 , 摇 匀 ， 置 于 50cC KA, Rig 30 分 钟 。 反 应 毕 , 反 应 液 用 3ml 苯 洗 涤 , 共 5 次 。 每 次 摇 匀 ,， 抽 提 , 离心 2500 转 /分 钟 ,3 分 钟 , HEE 上 清 液 ,经 洗涤 后 的 下 层 水 相 用 氮气 吹 于 或 置 于 真空 于 燥 器 内 于 燥 。 (2) 裂解 偶合 后 的 样品 ,加 入 0.5ml 无 水 三 氟 酯 酸 \ 通 氮气 , 盖 紧 磨 口 塞 , 充 分 摇 匀 。 样 品 全 部 溶解 后 , 置 于 50°C 水 洽 中 , 保 刘 10 一 15 分 钟 ， AF MAURER ET AS FIRS AIR. (3) 抽 提 经 有 裂解 后 的 样品 加 0.6ml 水 , 摇 匀 ,将 样品 溶解 ,加 2ml 醋酸 乙 酯 抽 提 ,离心 2500 转 / 分 钟 ,3 分 钟 。 上 层 有 机 相 收 集 于 试管 中 ， 下 层 水 相 再 重复 抽 提 两 次 ， 合 并 三 次 抽 提 上 相 溢 液 ,用 氮气 歇 于 ,下 层 水 相 用 氮气 吹 于 后 进入 第 二 轮 反 应 。 (4) 转化 上 相 抽 提 物 加 0.4mllmol/L 盐酸 ,使 样品 溶解 , 置 于 80°C 水 浴 , 保 温 10 分 钟 , 待 样品 冷却 后 ,加 入 1.5ml 酷 酸 乙 酯 抽 提 ,离心 ,2500 转 / 分 钟 3 分 钟 , 共 抽 提 三 次 ,合并 上 层 有 机 "101 。 相 , 通 氮气 了 歇 于 后 ,留待 鉴定 .水 相 溶液 内 含 PIH-Arg; PTH-His; 及 PTH-CysO,, i 在 有 机 相 检 测 不 到 PTH- 和 氨基酸。 则 必须 检查 该 一 步 的 水 相 样品 内 是 否 含 上 述 三 个 氨基 酸 之 一 。 | (5) 鉴定 LER EER CBB, BREE E. Merck 荧光 硅胶 板 走 单 相 层 析 鉴 定 。 利 上 用 各 种 PTH- 氨 基 酸 在 溶剂 中 展开 的 先后 次 序 (Rf 值 不 同 ) 不 同 来 确定 。 但 用 一 种 溶剂 常常 还 不 能 使 18 种 天 然 氨 基 酸 全 部 展开 ,还 须 改 换 层 析 溶 剂 系统 再 次 鉴定 。 所 以 每 次 鉴 定 必须 走 二 个 单 相 层 析 。 若 欲 鉴定 的 氨基 酸 在 水 相 中 , 则 还 需 走 第 三 个 单 相 层 析 8 层 析 溶剂 系统 : 第 一 相 “ 氧 仿 :乙醇 一 98:2 Se A: Ce: PE 三 88.2:1.8:10 第 三 相 CF) 吡啶 : 栈 酸 :水 一 4:1:1 - ( 乙 ) BRT: FAB = 10:4 取 ( 甲 ) 溶 剂 3ml 加 ( 乙 ) 溶 剂 ?ml 混 匀 。 层 析 分 配 图 谱 第 一 相 : 9 ° ° oS ; 2 ° 8 ° ° ° ° fo} M* Asp Glu Asn Gin Ser Thr Met 第 二 相 : 9 V Qo 8 ; ° ° 8 er 8 ° a ° = 由 ° ° ° ° 8 ° ° See a ee ai ee ee ee ee M* SerThr | Tyr ASer Gly _ \ Trp AThr Ala Val Phe Met Ile Leu Pro M-Lys di-Lys : ; 第 三 相 : O O O O M* ABABA PTH- 氨 基 酸 。 * 102 。 每 次 层 析 时 ， 必 须 同 时 跟随 标准 混合 _ PTH- 氨 基 酸 一 起 展开 。 层 析 后 ， 歇 去 有 机 深 剂 , 层 析 板 在 254nm 紫外 灯 下 检测 , 画 出 与 标准 PTA- 氨 基 酸 相对 映 的 恤 点 ， 进 行 比较 ， 就 能 得 出 欲 鉴定 的 样品 是 那 一 个 气 基 酸 。 有 些 PTH- 氨 基 酸 在 二 个 相 溶剂 中 都 能 展开 ， 所 以 ,可 以 将 二 个 相 展 开 图 谱 进 行 比较 鉴定 。 将 每 步 降解 的 ; PTH- 氨 基 酸 逐个 鉴定 就 能 得 出 从 N- 端 开始 的 蛋白 质 多 肽 链 的 序列 。 高 效 液 相 色谱 法 (HPLC) 鉴定 PTH- 氨 基 酸 , 既 可 定性 又 可 定量 测定 ,是 最 精确 的 方法 ,如 实验 室 有 条 件 , 应 尽量 采用 。 应 用 HPLC 仪器 鉴定 PTH- 氨 基 酸 的 方法 ,各 生产 仪器 的 公司 均 有 说 明 书 介绍 。 应 用 于 蛋白 质 一 级 结构 测定 也 有 许多 报道 sea。 本 文 仅 简单 介绍 四 ，Beckman 公司 产品 HPLC Model 165 检测 器 村 254nm 及 269nm 下 ,定量 测定 15 种 PTH- 氮 基 酸 的 方法 。 层 析 条 件 : 层 析 柱 : 4.6mm X 15cm ultrasphere ODS 流速 1.0ml/ min 洗 脱 溶剂 : Apa: (A) 50mmol/L BEBE, pH5.2, (B) 50mmol/L BER aAF 7k: FRE IE WB (40:50:10) pH3.0 混和 溶剂 中 。 当 柱 平衡 至 20 多 (B) 时 ,开始 进行 梯度 洗 脱 条 件 : time (min) function duration (min) 0 J%oB 38 样品 浓度 : 4 15 pg/ml PTH- 氨 基 酸 , 除 PTH-Histidine 是 :5 pg/ml, PTH- 氨 基 酸 254nm(Bu) . 269nm[ 图 2] 1。Asp 69 112 2. Asn ’ 55 92 3. His 8 12 4, Glu 93 145 5. Gln 86 149 6. Ala 79 125 Won DY C 46 71 8. Pro 58 72 9. Met 48 76 10. Val 75 124 ll. Trp 83 129 12. Phe 26 37 13. Ile 70 115 14. Leu 34 51 15. NorLeu ' 43 | 67 。 103 。 样品 注射 体积 : 20ul, IDR AGRE: 0.25cm/min, 鉴 测 : 0.1 AUF, 测 得 的 PITH- 毛 基 酸 峰 形 顺序 ， Asp, Asn, His, Glu, Gln, Ala, Tyr, Pro, Met, Val、Irp、Phe、le、Leu、NorLeu。 峰 高 (mm) 在 0.1 AUF, 4 Model 165° Detector at 254nm 图 1 7. 应 用 固 相 序列 仪 测定 蛋白 质 或 多 肽 的 氨基 酸 序列 70 年 代 ，LKB 公司 试制 了 固 相 顺 序 仪 。 它 是 一 合 自动 测定 蛋白 质 或 多 肽 的 氨基 酸 序列 而 设计 的 仪器 。 操 作 原 理 是 建立 在 _ Edman 降解 的 一 系列 化 学 反应 上 * 实际 上 ,所 研 究 的 蛋白 质 或 多 肽 样品 是 共 价 结合 到 一 种 惰性 支持 体 上 一 一 APG(3-amino-propyl-glass)， 随后 装 人 一 根 小 口径 的 反应 柱 中 ,用 作 Edman 降解 的 试剂 以 后 逐个 用 和 泵 打 人 柱 中 , 顺 次 释放 出 单个 氨基 酸 衍 生物 ,把 它们 分 别 收集 起 来 ， 再 进行 转化 ， 层 析 鉴 定 (方法 同 手工 操 作 )。 (1) 仪器 组 装 按 图 3 所 示 。 仪器 共 分 三 个 主要 部 分 : (1) 电子 部 分 , 负责 运转 信号 , 由 程序 卡片 指令 。(2) 机 械 部 分 ,由 五 个 和 泵 ,负责 所 有 溶剂 的 运载 工作 。(3) 柱 \ 恒 温 装 置 及 部 分 收集 器 。 每 释放 一 个 氨基 酸 衍 生物 大 约 需 80 分 钟 , 根据 蛋白 质 中 所 含 氨基 酸性 质 不同 , 顺序 卡片 可 以 人 工 编 排 来 控制 反应 的 速度 。 | (2) 蛋白 质 或 多 肽 祥 品 与 固 相 载体 (APG) 的 连接 a. 称 取 300nmol 样品 , 置 于 磨 口 尖 底 管 中 ， 以 Edman 试剂 首先 将 蛋白 质 或 多 肽 的 N- 端 氨基 酸 的 氨基 进行 保护 。 中 104 . 5 Model 165 Detector at 269nm N,(50 PSI) Progrommer Naz(2 PSH Aspirator 图 3 图 3 说 明 : Programmer， 程 序 控制 仪 ;》 Aspirator， 出 气 器 ; B， 征 温水 浴 ; Cy 柱 ; FE， 部 分 收集 器 ; G， 运载 高 纯 氮 器 ; P. Rs R, WHF APG 处 理 。APG 在 联接 前 必须 预先 处 理 除去 不 结合 的 部 分 。 称 取 180mg APG (LKB 公司 产品 )\ 置 于 4 号 砂 芯 漏斗 中 , 用 5ml lmol/L 吡啶 -盐酸 pH5.0， 洗 涤 二 次 ， 。 105。 每 次 溶液 保留 5 分 钟 , 抽 去 。 再 用 水 洗 HHT. FA DMF Riek, BSD, Hh 去 溶液 ，APG 待 用 。 c. 联接 3mg EDC(N-ethyl-N-dimethylaminopropylcar bodiimide, E. Merck 产品 ) 溶 于 0.5ml DMF 中 ,然后 ,加 入 样品 管 中 , 使 样品 溶解 ,并 与 EDC HK 然后 慢 慢 加 大 经 处 理 过 的 APG 与 样品 溶液 混合 , 通 氮气 , 盖 紧 磨 口 塞 , 置 于 37%c 水 浴 中 ,保温 3 小 时 ， 不 时 搅动 ,然后 , 37sC Rima Ko 次 日 ,加 0.25ml N- 甲 基 吗 啉 及 0.05ml PITC, MAA. 50° 水 浴 保 温 30 分 钟 。 使 APG 上 的 多 余 氮 基 封 头 。 将 联接 上 样品 的 APG 转移 至 砂 世 漏斗 中 ， 用 甲醇 浸 洗 5 次 , 抽 于 , 酯 酸 乙 酯 浸 洗 2 KT. PRATER, eee aig Gel (3) 仪器 的 运转 共 5 个 贮存 深 训 瓶 、 如 图 3 所 示 , 从 右 开始 ,分 别 装 人 甲醇 二 氧 甲烷 \ 缓 冲 液 (0.4mol/ Li DMAA pH8.4), PITC (5% PITC, DMF 溶液 )、 三 所 栈 酸 。 在 正常 运转 前 必须 将 各 瓶 充 满 氮 气 , 然 后 , 按 控制 程序 卡片 上 的 指令 进行 实验 ,仪器 可 以 不 停 地 循环 , 直到 序列 测 不 出 为 止 。 每 次 循环 约 80 分 钟 。 与 手工 操作 相同 ,由 于 Edman 反应 不 能 每 步 100 匈 完 全 及 系列 中 不 是 绝对 无 氧 而 产生 的 副 反 应 。 所 以 应 用 仪器 也 只 能 一 次 连续 测定 30 FR 基 酸 序列 。 | (4) 固 相 仪 正面 图 (图 4) 4 LKB 4020 序列 仪 (正面 观 ) 以 上 介绍 的 应 用 Edman 降解 手工 及 仪器 操作 测定 蛋白 质 氨基 酸 序列 方法 。 虽 然 具 有 优越 性 ,但 由 于 所 需 测定 的 样品 量 大 及 一 次 只 能 连续 测定 近 30 步 氨 基 酸 序列 。 所 以 测 ， 定 分 子 量 较 大 的 蛋白 质 的 一 级 结构 仍 存在 许多 困难 。 近 年 , 曾 报道 了 应 用 DABITC/PITC * 106 « 双 和 偶合 微量 液 相 测定 ' 2, 可 使 样品 微量 化 及 用 样品 固 相 化 , 并 应 用 双 偶合 法 进行 降解 、 可 能 使 测定 序列 延长 2。 目 前 ,国际 上 最 先进 的 气 、 液 、 固 微量 序列 仪 ,可 使 用 Pmol 水 平 的 样品 ,一 次 连续 降解 60 一 70 步 氮 基 酸 序列 "。 其 基本 原理 仍 建立 在 Edman 降解 的 -一 系 列 化 学 反应 上 。 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 17] [8] 参 考 文 uB G. Allen,Sequencing of proteins and peptides, 1981. RA RS HEMI, 1986 年 第 8 期 。 A. S. Bhown and J.C. Bennett, Anal. Biochem., 137 (1984), 256—260. R.Knecht, Anal. Biochem., 130(1983), 65—71. 4 Beckman 公司 ,PTH-Amino Acid Analysis. Chang, J. Y. et al., FEBS Lett., 93 (1978), 205--214. RES S £025 HMB Fiz. 1984 (16), 6, Hewick, R. M. et al., J. Biol. Chem., 1981, 256 (15), 7990—7997, ° 107° 4-N, N- 二 甲 胺 基 偶 氨 共 -4 - 异 硫 和 氰 酸 酯 (DABITC) 蛋白 质 微 量 序列 分 析 钱 hi 铅 《中 国 科学 院 上 海 有 机 化 学 研究 所 在 蛋白 质 化 学 中 对 多 肽 氨 端 残 基 作 逐步 序列 降解 的 反应 已 被 广泛 地 采用 ， 其 中 用 得 最 普遍 和 最 成 功 的 应 数 Edman 降解 趾 。 目 前 它 既 可 用 手工 方法 叫 , 又 可 用 自动 的 步骤 思 进行 。 新 近 发 展 的 序列 仪 吧 虽然 已 能 对 皮 摩 尔 量 的 多 肽 作 高 效 的 自动 序列 降解 。 但 是 微 量 的 手工 序列 分 析 当 前 仍 被 许多 实验 室 普遍 而 有 效 地 采用 着 。 1976 年 Chang 等 人 四 提出 用 一 种 有 色 的 4-N, N- 二 甲 胺 基 偶 氮 茶 -4- 异 硫 氰 酸 酯 (DABITC) 试剂 作 蛋 白质 序列 分 析 ， 它 能 使 降解 释放 的 氨基 酸 形成 红色 的 衍生 物 (DABTH) ,后 者 易于 用 薄 层 层 析 鉴 定 . 灵 敏 度 高 也 有 人 提出 用 其 他 改进 的 Edman- 型 斌 剂 作 肽 的 序列 降解 外 ,但 是 现在 已 经 清楚 ,凡是 在 异 硫 氰 酸 苯 酯 (PITC) WOE LAE 大 体积 取代 基 团 的 Edman- 型 试剂 ,它们 与 肽 的 氨 端 残 基 的 偶 联 产 率 要 比 用 PITC 反应 的 降低 很 多 ,以 至 难于 被 实际 采用 。 就 像 DABITC 试剂 , 它 在 通常 反应 条 件 下 的 偶 联 产 率 仅 约 60 多 。 这 就 要 求 反应 物 在 用 酸 进行 裂解 之 前 必需 先 被 PITC 再 偶合 一 次 ,使 剩余 未 偶合 的 氨 端 残 基 尽 可 能 地 被 偶 联 完全 ， 以 各 免 在 序列 降解 过 程 中 出 现 严重 的 残 基 残 贸 现象 。 这 就 是 DABITC/PITC 双 偶 合法 的 原理 。 自从 DABITC/PITC 双 偶 合 步骤 被 发 展 为 纳 摩尔 水 平 的 蛋白 质 序列 技术 加 以 来 , 许 多 实验 室 都 先后 采用 这 一 技术 取代 以 往 所 用 的 直接 手工 Edman 或 Edman-Dansyl™ 技术 ,后 者 曾 一 度 被 广泛 地 用 于 肽 的 半 微 量 序列 分 析 , 可 是 _Dansyl- 肽 在 酸 水 解 时 不 可 各 免 地 会 引起 谷 氨 酰 胺 与 天 冬 酰 胺 侧 链 脱 酰胺 和 色 氨 酸 破坏 ， 这 是 它 的 饮 点 。 手工 微量 DABITC/PITC 双 偶合 序列 分 析 技 术 还 具有 下 述 优点 : 〈1) 它 很 容易 被 一 般 实 验 室 所 采 用 ,设备 简便 ,化 学 试剂 费用 低廉 ， 并 易于 被 初学 者 所 掌握 。 (2) 它 可 同时 作 多 个 样品 的 顺序 分 析 ， 这 就 有 可 能 在 不 太 长 的 时 间 内 测 得 一 系列 由 蛋白 质 的 酶 解 或 化 学 降解 产生 的 肽 碎片 的 氨 端 序列 。(3) 它 对 被 分 析 肽 的 长 度 与 朴 水 性 的 要 求 较 低 , 有 些 不 适合 于 在 序列 仪 中 分 析 的 肽 ,也 可 用 手工 DABITC/PITC 双 偶 合 技术 进行 测定 。 (4) 它 可 作 纳 摩尔 肽 的 顺序 分 析 , 因 此 从 纤维 素 薄 层 双向 描 纹 图 谱 四 上 洗 脱 下 来 的 , 或 从 高 效 液 相 层 析 上 收集 的 纯 肽 碎片 ,一 般 可 直接 被 DABITC/PITC 双 偶 合 技术 测定 序列 。 由 于 上 述 优点 ， 我 们 在 测定 天 花粉 蛋白 一 级 结构 时 也 普遍 地 采用 这 一 技术 。 在 本 节 中 我 们 将 叙述 DABITC/PITC 的 手工 双 偶 合 方法 ,包括 它 在 固 相 载 体 上 进行 多 肽 序列 降 解 四 的 应 用 。 和 料 为 了 使 蛋白 质 和 多 肽 的 序列 测定 能 取得 最 理想 的 结果 ， 所 用 的 化 学 试剂 和 设备 都 ”108 « 一 定 的 要 求 。 1. 化 学 品 (1) DABITC* 从 东风 生化 试剂 厂 (中 国 上 海 )，Fluka (瑞士 ), Pierce (美国 )， BDH( 英 国 ) 或 Polysciences( 美 国 ) 等 公司 得 到 的 新 鲜 制备 的 试剂 是 暗 棕色 的 结晶 ,可 直接 用 于 序列 分 析 。 久 置 的 试剂 可 用 下 述 重 结晶 法 进行 纯化 : le 试剂 溶 于 80ml RA 中 ,少量 不 溶 物 趁 热 用 玻璃 砂 芯 漏斗 泪 去 , 滤液 置 于 冰箱 中 冷却 析出 深 棕色 片 状 晶体 , 滤 集 并 立即 真空 干燥 之 ， 一 般 可 得 0.6 一 0.7g 固体 ，m. p. 168 一 170*C。 固体 试剂 在 充 氨 —20°C 下 贮藏 。 用 作 微量 手工 序列 分 析 时 可 先 将 1.41mg DABITC (5pmol/L) 深 于 lml 丙酮 中 ,然后 分 装 于 25 支 毛细 管 中 ( 每 支 40 岂 , 即 200nmol/L), 先 置 于 真空 干燥 器 中 用 水 泵 减 压 抽 去 大 部 分 丙酮 ,然后 再 用 油泵 真空 于 燥 , 在 氮气 流下 封 管 , 并 于 一 20%c 保存 。 使 用 时 再 溶 于 40 岂 吡啶 中 *##。 (2) PITC 分析 用 的 PITC 在 减 压 、 充 氮 下 重 燕 一 次 ,将 馏分 分 装 在 充 氮 的 毛细 管 中 ( 每 管 20 岂 ) 于 —200 下 保存 。 吡啶 ”分析 纯 吡 啶 先 用 氢 氧 化 钾 (10g/1) 回流 2 小 时 , 蒸 出 , 再 用 曹 三 酮 (1g/1) 回流 2 小 时 , 蒸 出 ,最 后 再 用 氢 氧 化 钾 〈10g/D) 回 流 , 收 集 b. p. 114—-116°C 的 馏分 。 (3) 三 氟 乙 酸 ”化 学 试剂 三 氟 乙 酸 用 少量 铬 本 回流 后 \ 重 蒸 , 再 用 硫酸 钙 于 燥 ， 重 蒸 ,收集 b. p. 72—73°C 的 馏分 。 正 庚 烷 、 乙 酸 乙 酯 .乙酸 正 丁 酯 .乙醇 和 丙酮 均 为 分 析 纯 溶剂 #+*。 薄 层 层 析 用 的 溶剂 也 是 分 析 纯 的 ,水 是 两 次 重 蒸 的 。 (4) 序列 测定 用 试管 .通常 对 1 一 10namol/L 肽 的 分 析 ， 可 采用 内 径 为 6mms 长 为 50mm 带 玻璃 磨 口 塞 的 锥 形 底 小 试管 (图 1a) ,如 分 析 的 量 更 少 , 则 可 采用 更 小 的 序列 测定 管 。 电 加 热 器 : 可 采用 中 国 科学 院 上 海 分 院 科 学 仪器 厂 制造 的 WKJIR-1 型 或 相似 性 能 的 温 控 加 热 器 。 (5) DABTZ 转化 管 ”可 采用 带 盖 的 4 x 40mm 的 聚 丙烯 管 (图 lb)。 =. 标准 DABTH 衍生 物 的 制备 (1) a-DABTH 衍生 物 称 取 氨基 酸 0.5mg WH 图 1 序列 分 析 试 管 sa。 与 1004] pH~10.5 的 Et,N-HOAc 缓冲 液 ****#* (0.5ml Et,N+ DABTZ 转化 管 b. 5ml 0.2mol/L HOAc 十 50ml 丙酮 十 50ml 7k), HMA 50u1 DABITC 的 丙酮 溶液 (4nmol/L/AL)， 于 54°C 反应 50 分 钟 , 真 空 于 燥 , 然 后 再 加 入 100ul 50% 三 氟 乙 酸 于 54 Rik 45 分 钟 ， 再 真空 干燥 , 抽 王 的 氨基 酸 的 DABTH 衍生 * DABITC 是 一 种 致癌 试剂 ,操作 时 请 带 橡皮 手套 ,不 要 直接 与 皮肤 接触 。 ** DABITC 在 吡啶 中 不 稳定 ;因此 切 缴 将 DABITC 配 成 吡啶 盗 液 贮 存 ! *** 它们 对 Tollen 与 KI/ 淀 粉 试剂 呈 阴 性 反应 ,否则 也 要 进行 去 醛 与 去 过 氧化 物 的 处 理 。 sexx 当 His, Asp 与 Glu 溶解 时 pH 会 下 降 ? 这 时 需 用 lmol/L NaOH WARN pH 至 一 10， 然 后 再 加 入 DABITC。 «109 « 物 可 在 —20% KARE Ao | (2) a-DABTH-e-DABTC-Lys 的 制备 称 取 H-Lys-Asp-OH —k(40nmol/L) 溶 于 1001 水 中 ， 并 与 200pxL DABITC ADU MEA HK (10nmol/L/ al) 在 .70sc 反应 50 分 钟 , 用 4 x 500 岂 庚 烷 -乙酸 乙 酯 (2:1 V/V) 抽 提 去 除 过 量 的 试剂 *, 水 相 真空 干燥 ， 因 体 湾 于 1001 50% 三 氟 乙 酸 ,并 在 54%c 反应 45 分 钟 ,再 真空 干燥 , 抽 寺 的 样品 于 一 20qc 保存 备用 。 (3) 标记 化 合 物 的 制备 7£ 500.1 50% mime A 30d —Z ke, 30 由 CAR, 和 339ug DABITC(1000nmol/L),4 54% 反应 50 分 钟 ， 真空 干燥 后 取 少 量 溶 于 80% Z, Bo, —2c 保存 备用 。 =. FW DABITC/PITC 双 偶 合 从 高 效 液 相 层 析 或 指纹 图 谱 上 收集 得 到 的 纯 肽 〈1-10nmol/ 工 ) 在 序列 测定 管内 径 为 0.6cm ,长 5cm 带 玻璃 磨 口 塞 的 尖 底 试管 ) 中 真空 干燥 ,加 入 80pl 50% tue +5 DABITC 的 吡啶 溶液 (新 鲜 配 制 的 10nmol/L/pl) 40 岂 ， 充 氮 盖 塞 后 在 54°C 保温 50 分 钟 ,进行 第 一 次 偶合 ; 开 塞 加 10 al 纯 的 PITC， 并 充 氮 盖 塞 后 再 在 55%C 保温 30 分 钟 作 第 二 次 偶合 。 序列 管 中 过 量 的 试剂 和 副 产 物 用 4 x 120pl 庚 烷 -乙酸 乙 酯 (2:1 V/V) BL HRS 器 混和 ,再 离心 加 速 分 层 ) ,每 次 提取 时 用 滴 管 小 心 吸 去 有 机 相 , 最 后 一 次 提取 后 的 水 相 用 真空 干燥 ***。 抽 于 的 残余 物 加 入 50 三 氟 乙 酸 、 充 氮 盖 塞 后 在 55< 保温 10 Shrew LN, HS the = ZB, RIM 80nl 水 人 试管 , 并 用 3 X 120 CBT REE 放 的 DABTZ 衍生 物 , 留 在 水 相 中 氨 端 减少 一 个 氨基 酸 残 基 OK, BEES 降解。 乙酸 丁 酯 的 提取 波 ( 黄 色 ) 经 真空 干燥 后 ,用 50nd 50% 三 氟 乙 酸 水 溶液 于 55°C 45 分 钟 , 使 DABTZ 转化 为 相应 的 DABTH, AGRA FR, RAAF ~1ul 80% CB 中 , 作 薄 层 层 析 或 高 效 液 相 层 析 鉴 定 用 。 四 、 固 相 DABITC/PITC 降解 肽 的 固 相 序列 分 析 包 括 两 个 主要 步骤 : 〈1) 将 肽 共 价 联接 到 固 相 载 体 上 。(2) 固 相 肽 的 序列 分 析 。 其 中 第 一 步 的 成 功 与 否 是 固 相 序列 分 析 的 关键 ， 对 于 不 同类 型 的 肽 已 发 展 了 各 种 合适 的 固定 化 方法 “限于 篇 幅 这 里 只 能 扼 妥 叙述 几 个 常用 的 固定 化 方法 。 1. 利用 Lys 的 es-NH， 将 肽 联 在 DITC- 玻 璃 珠 上 将 肽 (5 一 10nmol/ 工 ) 加 入 固 相 序 列 管 (图 2) 中 ,真空 干燥 后 , 溶 于 400el 0.2mol/L ”有 些 葛 水 性 肽 在 用 ge 1 或 3:1( 庚 烷 : 乙 酸 乙 柄 V/V RN AKER MRIFTKASAUACA WOR 去 ! 有 些 蒋 水 性 肤 在 用 2: 1 3:1 (Ree CROCE V/V) 提 取 时 易 悬 浮 于 两 相 之 间 形 成 沉积 物 * 切 幻 弃 去 ! “es 避免 样品 溅 出 而 损失 。 wee 一 般 在 作 手 工 DABITC/PITC 双 偶 合 时 ,用 两 只 真空 干燥 器 为 宜 ， 即 一 个 是 抽 酸 的 ， 如 抽 T.F. A., 90% T.F. A. 或 乙酸 丁 酯 提取 液 的 抽 王 用 * 另 一 个 是 抽 碱 的 , 即 抽水 相 的 真空 干燥 用 。 切 纪要 混 用 。 110。 NaHCO,/NaOH pH~9.0( 如 肽 的 溶解 度 差 也 可 用 pH9.5 的 N- 甲 基 吗 啉 /三 氟 乙 酸 缓冲 锌 ) 缓 冲 液 中 ,取出 1/10 作 微 量 氮 基 酸 分 析 用 ， 再 往 管 中 加 人 用 甲醇 预 洗 过 的 DITC- 玻 珠 :(10mg)， 脱 气 、 充 氮 , 并 在 50°C 电磁 搅拌 1 小 时 进行 固定 化 。 过 量 的 一 NCS 用 乙醇 ie (20-1) 饱和 掉 (50%cC 保持 15 分 钟 ) ,然后 用 水 (2ml)， 甲 醇 ml) 分 别 洗涤 玻璃 珠 ， RETR. 2. 利用 人 C- 端 次 基 将 肽 联 在 固 相 上 ik (S—10nmol/L) 加 入 固 相 序列 管 中 , 真 空 干燥 后 加 入 100ml 无 水 三 氟 乙 酸 , 充 揪 加 塞 后 在 室温 放置 一 刻 钟 ,真空 抽 干 样品 后 加 入 EDC (2mg) 的 二 甲 基 甲 酰胺 (200md) 溶液 与 用 甲醇 预 洗 的 氨基 玻璃 珠 (APG，10mg)， 脱 气 充 氮 后 于 室温 搅拌 30 一 60 分 钟 ， 使 男 定 化 。 反 应 后 的 玻 珠 分 别 用 水 〈2ml) 与 甲醇 〈(2ml) 洗 两 次 , 固 相 上 上 过量 的 氨基 相 继 用 PITC (20m4) 的 二 甲 基 甲 酰胺 (100gl) Ys Hee FOUL BE (50 pl) 的 二 甲 基 甲 酰胺 (200ui) YE 50°C 反应 20 分 钟 进行 封闭 。 玻 珠 再 用 二 甲 基 甲 酰胺 2a) 与 甲醇 (2 由) 分 别 洗 两 次 后 真空 干燥 。 图 2 适用 于 手工 固 相 DABITC/PITC 降解 的 装置 a- 电磁 搅拌 子 ;”h. 电热 板 (可 调 温 ); b. 玻璃 磨 口 mt; ¢. 序列 管 ; d. 带 玻璃 硝 芯 的 盖子 (每 当 抽 真 空 时 带 上 d， 以 免 载体 损失 3. 利用 羧 端 的 同型 丝氨酸 (Hse) 内 酯 将 肽 联 在 固 相 上 i Hse 的 肽 〈5-10nmol/ 工 ) 加 入 固 相 顺序 管 中 , 经 POs 干燥 器 中 真空 于 燥 后 ， 加 入 300ml 无 水 三 所 乙酸 , 充 氮 加 塞 后 在 室温 放置 1 小 时 ,使 Hse 完全 转化 为 它 的 内 酯 。 再 抽 真 空 干燥, 样品 溶 于 300ml 二 甲 基 甲 酰胺 中 ,加 入 10mg 氮 基 玻璃 微 珠 和 50ul 三 乙 kk, BARRA 5c 反应 2 小 时 。 离心 弃 去 溶剂 ， 玻 珠 经 真空 干燥 ， 过 量 的 氨基 用 ， PITC 偶合 饱和 , 因此 肽 的 氨 端 第 一 个 残 基 不 能 以 DABTH 鉴 出 。 五 、 FLEA DABITC/PITC 双 偶 合 步骤 GQ) RBS 。 往 上 述 联 接 肽 的 固 相 载体 (~10mg) 的 固 相 序列 管 中 加 入 200 岂 水 、 200pl 吡 吓 和 200m DABITC 的 吡啶 溶液 (2.3mg/ml)， 加 入 小 磁 鱼 ， 充 氮 加 塞 后 在 55°C 搅拌 50 分 钟 , 再 加 入 PITC 30 岂 ， 充 氨 后 在 55%c 搅拌 30 分 钟 ,离心 移 去 过 量 的 试 剂 , 并 用 2 X 500g 吡啶 与 2 x 500g 甲醇 分 别 洗涤 和 真空 干燥 。 (2) 有 裂解 ”真空 干燥 后 的 残 漆 加 入 2001 三 氟 乙 酸 ， 充 氮 加 盖 后 在 55°C 反应 10 “1ll。 DH ASMA B= ACR (3) 转化 ”降解 释放 的 DABTZ 用 2X 400nl 甲醇 提取 , 洗 剩 的 玻 珠 真空 干燥 后 作 下 一 步 偶合 用 , 合并 甲醇 提取 液 ,真空 抽 去 甲醇 后 加 入 50% 三 氟 乙 酸 ， 充 氮 加 塞 后 于 55 转化 45 分 钟 , 真 空 抽 王后 作 层 析 鉴 定 用 。 六 、 DABTH 衍生 物 的 鉴定 1. DABTH 用 双向 薄 层 层 析 鉴定 图 3 是 27 个 DABTH- 氮 基 酸 衍生 物 在 聚 酰胺 薄膜 (Schleicher & Schill) 上 的 双向 层 析 谱 。 在 谱 中 除了 DABTH-Leu-5 DABTH-lle 不 能 被 分 离 外 *, 其 他 DABTH 衍生 物 , 包 括 Lys, Ser 与 Thr 的 副 产 物 都 能 被 分 离 **。 在 层 析 中 为 了 便于 席 点 的 确认 还 .引入 两 个 内 标 化 合 物 DABTC- 二 乙 胺 与 DABTC- 乙 醇 胺 ， 它 们 经 双向 层 析 后 分 别处 于 Ob BSiK ABA, 5 DABTH 的 红色 隆 点 不 同 , 很 容易 分 辨 。 其 他 DABTH RAH 据 它们 与 内 标的 相对 位 置 来 确定 。 在 分 析 鉴 定时 ,将 上 述 从 降解 中 得 到 的 DABTH 溶 于 1 一 5md 乙醇 中 ,并 用 毛细 管 或 微量 移 液 管 吸取 试 液 (通常 为 0.5~.1md) 点 在 聚 酰胺 膜 (2.5 x 2.5cm) 的 左下 角 ORR 时 直径 不 超过 Imm 为 宜 ), 用 气流 吹 干 店 再 在 相同 位 置 点 一 次 内 标 液 , 再 歇 干 ,用 下 述 溢 剂 展开 双向 上 行 层 析 **#*: 1. 第 一 向 ;醋酸 :水 (1:2 V/V) | 2. 第 二 向 :甲苯 : 正 已 烷 : 酷 酸 (2:1:1 V/V/V) 第 一 向 层 析 展 开 后 需 歇 干 , 再 在 它 的 垂直 方向 作 第 二 向 展开 ,第 二 向 溶剂 展开 ,干燥 后 , 薄 层 用 HCL @AR— 7 (REGS HCl 液体 接触 而 使 层 析 谱 损坏 ), 原 来 膜 上 的 黄色 刘 点 会 显 出 红色 或 蓝 色 。 然 后 与 标准 层 析 谱 比较 , 读 出 相应 的 氨基 酸 。 双 向 层 析 一 般 在 10 分 钟 内 可 完成 。 2. DABTH 的 反 相 HPLC 鉴定 DABTH 的 反 相 HPLC 可 以 在 可 见 范围 〈 极 大 吸收 在 420nm 处 ) RH, 灵敏度 为 pmol 水 平 。 \ 图 4 显示 了 DABTH #ultrasphere 反 相 柱 上 的 HPLC 谱 , 所 有 的 DABTH 在 一 次 梯度 或 isocratic 洗 脱 中 得 到 分 离 。 商 品 ultrasphere 柱 对 DABTH-Arg 和 DABTH- His 的 洗 脱 时 间 有 时 有 些 起 伏 , 它 可 通过 改变 缓冲 液 的 盐 浓 度 来 调节 。 ti. OE 虽然 DABTH 分 析 鉴 定 的 灵敏 度 为 pmol 水 平 ， 但 在 实践 上 这 么 微量 肽 的 降解 循 环 的 重复 性 产 率 是 很 低 的 ， 而 且 试 剂 中 含有 的 杂质 也 会 干扰 分 析 。 目前 ， 我 们 对 1 一 5nmol 肽 ， 作 10 至 20 步 顺 序 分 析 是 没有 太 大 困难 的 。 如 果 序 列 分 析 的 肽 少 于 1mmol * DABTH-Leu 与 DABTH2Ile 可 用 二 相 甲 酸 - 乙 醇 《10:9V/V) LAER! ss. ** Lys 可 出 现 三 个 不 同 颜色 的 衍生 物 ，w-DABTH-s-DABTC-Lys 〔( 紫 色 )，w-PTH-s-DABTC-Lys ( 蓝 色 ) 和 a-DABTH-e-PTC-Lys (4 f4), *### 保证 层 析 的 重复 性 ,展开 咨 剂 均 为 新 鲜 配 制 。 e112 » «= a ee _DABITC “tg 图 3 27. 种 氨基 酸 的 DABTH 衍生 物 在 聚 酰胺 薄 层 (2.5 尺 2.5 厘米 ) 上 的 双向 薄 层 层 析 第 一 向 : 酷 酸 -水 〈1:2，V/V 1) 为 展开 剂 第 二 向 : 甲苯 -正己 烷 - 酷 酸 (2:1:1, V/V/V) 为 展开 剂 。 图 中 实 线 表示 HCl BAMA ANA BRERA ABA ”dase 分 别 为 内 标 二 乙 胺 与 乙醇 胺 的 DABTC- 衍 生物 。r 为 DABITC, 是 一 蓝 色 副 产物 ，N，N- 二 甲 胺 偶 氮 葵 -N- RR. S^、SD、So、T^ 和 To 是 DABTH-Ser 和 DABTH-Thr 的 副 产 物 *; K， 是 a-DABTH-s-DABTC- Lys; K, 是 a-PTH-e-DABTC-Lys; K, 是 a-DABTH- e-PTC-Lys; Cy # DABTH-CySO,H; Cm 是 羧 甲 基 pea BAY DABTH; P % DABTH-Pro; L/I 是 DABTH-Leu (Ile); V 为 DABTH-Val; F 4 DABTH- Phe; W % DABTH-Trp; M A DABTH-Met; A X% - DABTH-Ala; G % DABTH-Gly; E % DABTH- Glu; T 4 DABTH-Thr; Q 是 DABTH-Gln; Y 为: DABTH-Tyr; D 是 DABTH-Asp; S @ DABTH- Ser; N # DABTH-Asn; H 是 DABTH-His 和 .及 A DABTH-Arg, * 用 三 氟 乙 酸 处 理 时 经 常会 出 现 Ser 5 Thr 的 失 水 反应 * 从 而 形成 多 个 产物 "以 Ser 为 例 就 有 产物 DABTH- Ser, DABTH-Ser* (A7K7*%]). DABTH=Ser〈 失 水 后 再 聚合 ) 与 DABTH-Ser”(〈 失 水 后 再 加 水 )。 其 反应 如 下 图 所 示 : DABTH-Ser-…。 于 ESAs HN=c —NH—DaAB H+N=c —NH—DAB ral | T.F.A. HN NHDAB 1 S Ts S Ses net SF H.C | H.C | Ad . O O S CH， OH DABTZ-Ser DABTZ-Ser® O | aaa | Ht/H.O DABTZ-Ser® 2 O o | H+/H,0 \, —N—pDaB \ N—DAB oO t.. ae pees 8 ZEA Ai 会 3 CA H,C ee CS Fee AE OE _N 13 H HN | eH, DABTH-Ser4 \ fa ge DABTH-Ser | H+/H,0 S 4 DABTH-Ser9 \—n—DaB HO, | H,c7 \n7\5 DABTH-Ser® A 436 nm(0, 0O2AUFS) DABTH|—A.A.(4 5 pmol) G Mr p x¢ NOSp iy; WyP 436um 0 5 10 15 20 时 间 (min) 图 4a 标准 氨基 酸 的 DABTH 的 HPLC yy \ pagent tao) 梯度 洗 脱 溶剂 A 是 0.035mol/L REM. pH,5.05 图 49 DABTH- 氨 基 酸 用 反 相 HPLC 的 isor WHBECH. BEE 45-70% B/O 一 10min 从 cratic 分 离 10—14min 保持 7095 By 70—80% B/14+—16min, 层 析 柱 用 Hypersil MOS Sum 为 载体 柱 长 16 —22min 保持 80% B。 然后 80—45% B/22 一 250X4mm。 流速 1.2ml1/min; 温度 为 45°C 26min 柱 是 Zefbax-ODS- 温度 22 流速 1m1/ 洗 脱 溶剂 为 12m mol/L BMH (pHS.0)/ZHe/ min, 4= 436nm, 9.005AUFS,, AZ (50:5020.5V/V/V) 检 出 波长 为 436nama 则 所 用 的 顺序 分 析 管 要 更 小 些 ， 对 试剂 与 溶剂 纯度 的 要 求 更 高 。 在 高 效 真 空 系统 下 ,一 般 完 成 一 步 DABITC/PITC 双 偶 合 , 需 要 2.5 小 时 ， 因 此 一 个 熟练 的 操作 者 可 在 一 天 同时 对 8 一 10 个 样品 作 两 步 DABITC/PITC 双 偶 合 降解 分 析 。 使 ， 手工 序列 分 析 的 效率 赶 上 甚至 超过 自动 序列 仪 。 采用 双 内 标的 双向 薄 层 层 析 使 DABTH 较 容 易 被 辨认 。 但 对 于 初学 者 来 说 用 未 知 样品 与 已 知 的 DABTH 共 层 析 ， 对 判断 未 知 DABTH 也 是 有 帮助 的 ， 尤 其 像 对 Phe, Vol, Leu/Ile 的 DABTH 衍生 物 的 确定 。 大 多 数 氨基 酸 的 DABITH- 衍 生物 在 反 祖 HPLC 柱 上 都 有 重复 性 的 阻 留 时 间 , 比较 : 容易 确定 ， 但 对 DABTH-His & DABTH-Arg 往往 需 用 标准 共 层 析 才 能 确定 。 从 双 假 ， 合 降解 中 释放 的 Ser 与 Thr 衍生 物 往 往 在 HPLC 中 出 现 多 重 峰 。 上 述 两 种 分 析 DABTH 的 方法 各 有 优 缺 点 ;读者 可 以 根据 自己 的 条 件 任 意 选 用 。 但 . 一 般 说 来 有 下 列 比较 : 薄 层 层 析 的 优点 (1) 简便 、 经 济 和 有 效 ; (2) DABTC 衍生 物 ( 蓝 色 ) 与 DABTH 衍生 物 ( 红 色 ) 不 同 的 色泽 便于 从 污染 的 层 析 谱 中 读 出 DABTH 来 。 缺点 : C1) 不 能 定量 (2) RABE (~ 10pmol) HPLC 的 优点 : (1) 定量 (2) 灵敏 (~1pmol) thea: 不 易 区 分 氨基 酸 与 氨基 污染 物 之 间 在 色泽 上 的 差异 。 大 量 实验 的 经 验 说 明 ,对 于 没有 明显 背景 的 短 肽 ， 单 用 OFLC 分 析 DABTH 也 产生 ; 很 可 靠 的 结果 。 (1) 液 相 和 固 相 DABITC/PITC 方法 的 对 比 到 目前 为 止 , 由 于 不 是 每 一 个 肽 “ ° 114° ~ PB AE Ok ea PE HOE CE AR AL Ate DABITC/PITC 方法 是 一 种 远 比 固 相 法 更 为 有 用 的 技术 。 一 般 对 手头 上 很 少量 的 肽 1 ~2nmol) Pal ee ARIE Cm RA 遭 到 不 完全 的 联接 而 损失 掉 。 可 是 固 相 法 确 有 其 自身 的 优点 。 例如 : 〈1) 它 允 许 非常 亲 水 的 氨基 酸 残 基 , 如 半 胱 磺 酸 或 与 Asn 联接 的 糖 的 提取 与 直接 的 鉴定 ， 而 它们 在 被 相 序 列 分 析 中 往往 出 现 空白 。(2) 它 可 使 过 量 的 试剂 彻底 洗 去 ,这 在 芒 相 方法 中 有 时 是 难以 达 到 的 。 参 考 x @ [1] Edman, P., Arch Biochem., 22, 475(1949). Acta Chem. Scand., 4, 283(1950). [2]. Edman, P & Sjoquist, J., Acta Chem. Scand. 10, 1507(1956). [3] Edman, P & Begg, G., Eur. J. Biochem., 1, 80(1967). [4] Hewick, R. M., Hunkapiller, M. W., Hood, L. E. & Dreyer, W. J., J. Biol. Chem., 256, 7990(1981).. [5] Chang, J.-Y., Creaser, E. H. & Bently, K. W., Biochem. J., 153, 607(1976). Chang, J.-Y., Brauer, D., & Wittmann-Lcebold, B., FEBS Lett., 93, 205(1978). Chang, J.-Y., Biochem. Biophys. Acta., 578, 188(1979).: Chang, J.-Y., Biochem. J. 199, 557(1981). [6] L’Italien, J. J. & Kent, S. B. H., J. Chromatogr., 283, 149(1984). [7] Gray, W. R., “Methods in Enzymology”, vol. 25, part B, pp. 121, 333, New York, Academic Press (1972):- [8] Laursen, R. A., Eur. J. Biochem., 20, 89(1971). [9] Laursen, R. A., “Methods in Enzymology” vol 47, part E p. 277, New York, Academic Press (1977). Allen, G., “Sequencing of Proteins and Peptides”, p. 208, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, (1981), [10] Yang, C. Y., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 360, 1673(1979). 11) Chang, J.-Y., Biochem. J., 199, 557(1981). Wittmann-Liebold, B., Kimura, H. & Kimura, M., “Advanced Methods in Protein Microsequencing Analysis”, p. 78, Springer-Verlag, (1986). Lehmann, A & Wittmann-Liebold, B., FEBS Lest, 176(2), 360(1984). $115 » 超 离心 分 析 法 测定 分 子 量 许 秋 薄 BFR 《中国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 》 超 离心 分 析 法 是 利用 具有 光学 监测 系统 的 分 析 超 离心 机 进行 的 。 在 50 至 60 年 代 中 超 离 心 分 析 法 是 测定 生物 大 分 子 分 子 量 的 主要 方法 ， 与 后 来 发 展 的 凝 胶 电 泳 测定 分 子 量 方法 不 同 , 它 不 需要 已 知 分 子 量 的 参考 标准 , 此 外 在 研究 分 子 之 间 的 相互 作用 方面 , 超 离 心 分 析 法 至 今 仍 是 十 分 有 用 的 。 关于 超 离 心 分 析 法 的 基本 原理 和 应 用 已 有 较 详 细 的 介绍 ”~ , 读者 可 以 参考 , 这 里 不 再 重复 。 下 面 介 绍 实际 测定 蛋白 质 分 子 量 的 两 种 基本 超 离心 分 析 法 ， 即 帝 降 速度 法 和 议 降 平 衡 法 。 一 、 沉 降 速 度 法 测 分 子 量 对 于 含有 均一 溶质 的 盗 液 ， 或 含有 少数 几 种 分 子 量 有 明显 差别 的 溶质 的 溶液 ， 可 应 用 帝 降 速度 法 结合 扩散 系数 ,根据 Svedberg 公式 测定 分 子 量 M; RTS NM FE ee 上 式 中 了 为 气体 常数 , 工 为 绝对 温度 , $ 为 生物 大 分 子 的 沉降 系数 , D 为 扩散 系数 ( 测 定 方 法 见 辅助 实验 1), Y 为 微分 比 容 ( 测 定 方法 见 辅助 实验 2)，p 为 溶剂 密度 ,应 用 这 公 式 时 要 注意 S 和 D 值 都 有 浓度 依赖 性 ,应 使 用 无 限 稀释 时 的 外 推 值 。 若 已 知 蛋白 质 的 S、D 和 Y 立 值 ， 即 可 利用 上 式 计算 分 子 量 。 如 果 蛋 白质 是 简单 的 球 形 分 子 , 虽然 没有 测定 D 值 ， 也 可 利用 已 知 蛋 白质 的 $ 值 与 分 子 量 的 关系 式 估算 其 分 子 量 CUPS SE 1)。 下 面 先 介绍 生物 大 分 子 的 沉降 系数 Sow 的 测定 : 1. 样品 准备 超 离心 分 析 的 理论 依据 是 以 不 带电 荷 的 颗粒 作为 模型 ， 而 大 部 分 生物 大 分 子 在 水 溢 该 中 处 于 离子 状态 ， 因 此 有 必要 在 溶剂 中 莹 加 小 分 子 中 性 无 机 盐 以 减弱 蛋白 质 或 核酸 等 生物 大 分 子 的 离子 电荷 效应 。 一 般 在 溶剂 中 加 入 中 性 盐 ， 如 0.1 到 0.2mol/L NaCl 即 可 ,或 所 用 的 溶剂 已 是 具有 0.1 至 0.2mol/L 离子 强度 的 缓冲 滚 。 配制 成 的 样品 溶液 可 对 次 剂 透析 平衡 。 对 不 纯 样 品 更 是 需要 ,因为 借 此 可 减少 样品 中 的 小 分 子 杂 质 , 以 避免 干扰 正确 测定 大 分 子 的 浓度 。 透析 外 液 可 作为 参考 液 用 (如 装 人 双 启 形 槽 离心 池 的 参考 该 孔 ， 中 ); 或 作为 合成 界面 池 中 的 上 层 液 用 。 为 了 便于 计算 ,溶剂 可 选用 常用 的 溶剂 ， 例 如 磷酸 缓冲 液 ， Tris-HCl 缓冲 液 等 。 这 | *。116。 些 溢 剂 的 粘度 和 密度 有 现成 的 资料 可 查 ( 见 附录 2)。 所 配制 的 蛋白 质 样品 浓度 可 在 lmgjml 至 0.5mg/ml。 为 便于 用 紫外 光学 系统 检 测 ,样品 溶液 在 波长 280nm 的 光 吸 收 Aw 可 选 在 0.2 至 0.7 之 间 。 2. 转速 的 选择 Ot Wah. 可 先 估计 其 帝 降 系数 的 大 致 范围 ,然后 参考 表 1, 选择 适当 的 转速 : 31 转速 的 选择 沉降 系数 S ef (rpm) <5 >50000 10 50000 20 35000 30 28000 40 25000 50 . 22000 100 15000 3. 离心 池 的 选择 离心 池 由 离心 简 、 中 心 片 、 石 英 窗 、 螺 丝 及 垫圈 等 部 件 装 配 组 成 。 其 中 心 片 用 各 种 不 同 的 材料 制 成 。 例 用 铝 、Kel-F、Epon- 充 碳 、Epon- 充 铝 等 。 不 同 材 料 制 成 的 中 心 片 、 承受 的 最 大 转速 和 耐 化 学 腐蚀 性 不 同 。 实验 时 , 根据 样品 需要 的 转速 和 化 学 性 质 选 择 合 适 的 中 心 片 既 能 耐 化 学 腐蚀 又 能 达到 需要 的 转速 。 中 心 片 的 型 式 又 分 为 单 扇形 槽 型 、 双 扇形 槽 型 (如 图 1) 和 合成 界面 型 (如 图 2)。 但 最 常用 的 是 双 扇 形 槽 型 。 双 扇形 槽 离心 池 也 有 不 同 的 容积 ( 见 表 2)，0.48ml 为 最 常用 , 容积 大 透 光 距 离 长 的 双 扇形 槽 片 适用 于 浓 度 稀 的 样品 。 图 1 “双肩 形 槽 离心 池 (a) 具有 加 液 小 室 的 合成 界面 池 (b) 具有 毛细 沟 的 合成 界面 池 图 2 RSA ite 表 2 离心 地 扇形 盛 液 槽 的 容积 RRM RAR (ml) SE IC HE RK (mm) ° 1176 离心 池 选 择 好 后 ,仔细 检查 每 个 部 件 是 否 完好 ,然后 按照 分 析 超 离心 机 说 明 书 的 操作 WEEE. FA MR .平衡 离心 地 ,并 把 离心 池 和 平衡 凶 装 入 分 析 转 头 内 。 4. 扫描 记录 沉降 界面 把 转 头 装 于 转轴 上 ， 按 照 操作 规程 预定 温度 〈 如 果 祥 品 对 温度 无 特殊 要 求 ， ATE 于 校正 至 标准 温度 , 可 直接 选用 20C) 和 预选 转速 。 机 器 起 动 后 ， 加 速 到 预定 的 转速 时 ， 即 可 启用 紫外 光 扫 描 装置 扫描 ， 在 记录 仪 图 纸 上 记 录 离 心 池内 大 分 子 样 蝇 沉 降 的 情况 。 在 离心 力作 用 下 ,离心 池 中 溶液 的 浓度 发 生变 化 ;产生 浓度 梯度 dc/dz， 并 出 现 溶 剂 与 深 液 的 界面 ,扫描 记录 的 浓度 分 布 曲线 。 开始 5 分 钟 扫描 1 次 ， 观 察 沉 降 界 面 移 动 速度 。 此 时 还 可 适当 调节 转速 ,使 在 60 分 钟 内 样品 的 沉降 界面 线 能 达到 离心 池 的 中 部 ,在 确定 转速 后 ,立即 每 隔 3 分 钟 或 更 长 的 时 间 扫 描 1 次 , 共 10 次 左右 。 如 果 所 用 分 析 超 离心 机 拥有 其 他 光学 检测 装置 ， 则 溶质 在 帝 降 过 程 中 出 现 溶 训 和 黎 液 的 界面 ,可 以 观察 和 记录 到 如 图 3 的 各 种 图 象 。 外 会 考 孔 边 内 参考 孔 边 C . crm 后 dc Schlieren “dx. 光学 图 象 Eta mare = Sa 和 3 ”不同 光 学 系统 测 得 沉降 界面 的 图 象 5. 沉降 系数 的 计算 溶质 分 子 的 沉降 系数 是 代表 深 质 分 子 在 单位 离心 力 场 中 的 沉降 速度 ， 可 以 用 下 式 末 示 了 司机 Hs lied | (2) wr dt wo? dt «760 沉降 系数 的 量 纲 为 种 ， 一 般 蛋白 质 沉 降 系 数 的 数量 级 为 10- 至 10-2， 改 习惯 以 ， Svedberg [S] 单位 表示 , 即 1S 一 1072 HH, 上 式 中 中 是 角速度 (弧度 / 秒 ) (BU < x N，N 为 每 分 钟 转 数 )，r 是 界面 中 心 至 转 灿 中 心 的 虐 离 (cm) ,在 记录 图 上 可 以 测量 到 不 同时 间 扫描 的 * 值 ,+ 及 * 为 时 间 。 分别 。118。 以 秒 及 分 钟表 示 。 若 以 Ine 作为 纵 坐标 ,作为 横 座 标 作 图 ,所 得 直线 斜率 即 为 8 , 代 入 上 式 便 可 计算 沉降 系数 。 6. 将 $ 实 验 值 校正 至 标准 条 件 因为 沉降 系数 与 温度 溶剂 的 粘度 和 密度 有 关 。 为 便于 比较 ， 需 要 把 S rae ee 2 EERE (20, BHAKIA Sow 值 , 即 Soo.w' = Seal Tasers (1 —_Vi0,w O20.w ) (3) 120,W => Vie.8o1vPeysoty 上 式 中 $ 代表 测 得 的 沉降 系数 , 1 代表 粘度 (脚注 上 代表 实验 温度 ,20 代表 20°C, W ”代表 水 ，S$oly 代表 深 剂 ), 粘 度 的 测定 见 辅助 实验 3，Y 代表 溶质 的 微分 比 容 ，p 代表 溶 剂 密度 。 2 7. 为 校正 溶液 浓度 对 S 值 的 影响 常 测定 一 系列 不 同 浓度 溶液 的 S 值 。 溶 小 浓度 可 选择 在 光 吸 收 Ax 0.1 至 1.0 之 间 ， 然后 外 推 至 0 ,得 到 Sow 的 值 。 若 待 测 样品 的 沉降 系数 较 小 (如 Sx,w < 3)， 而 离心 转速 又 小 于 60000rpm， 最 好 选 用 合成 界面 池 (图 2)。 因 为 它 能 迅速 使 深 剂 与 溶液 人 为 地 合成 界面 ， 便 于 测量 界面 的 移 动 。 否 则 对 于 分 子 较 小 的 样品 ,容易 扩散 ,界面 也 易 消 失 , 就 难于 测量 。 此 外 也 可 利用 密度 梯度 超 离心 分 析 法 ， 以 已 知 沉降 系数 的 同类 型 生物 大 分 子 作为 校 正 标 准 , 可 相对 地 比较 ,用 以 测定 生物 大 分 子 的 沉降 系数 。 8. 以 测定 猪 甲 状 腺 球 蛋 白 为 例 具体 说 明 HE DRE AH 0.16%, BHA BAMA (0.06mol/L NaHPO4、 0.094mol/L KH,PO,, 0.043mol/L NaCl, pH5.76), 离心 条 件 为 :,; 34856 转 / 分 、 温 度 20°C. 、 利 用 Beckman 公司 生产 的 L5-75B 型 超 离 心机 进行 实验 。 离 心 池 的 安装 、 充 液 及 平衡 已 如 前 节 所 述 。 在 达到 预定 转速 后 不 久 , 每 隔 3 分 钟 扫描 1 次 ,得 到 11 张 不 同时 间 的 扫描 图 ,对 记录 图 (以 图 2 为 例 ) 的 测量 步骤 如 下 : C1) 测量 记录 仪 上 的 离心 池 底 部 的 外 参考 孔 线 Re 至 离心 池 顶 部 的 内 参考 孔 线 R, 之 IAI EBRSA 20.1cm, (2) 扫描 图 放大 倍数 了 的 计算 。 因 Re 至 Ry :之 间 的 实际 距离 为 1.62cm(《 由 厂家 提 20.1 供 的 ), 故 OF Te sy ac | 3) 测量 界面 中 心 , 即 浓度 中 点 ( 见 图 2) 到 R, 的 距离 x， 加 上 R, 至 转轴 中 心 的 实 际 距 离 5.70cm (由 厂家 提供 的 )， 即 得 到 界面 中 心 至 转轴 中 心 距离 r, 即 r 一 5 + 5.70 (cm), (4) 依据 每 隔 3 OPA 1 次 的 记录 图 ,测定 11 次 的 不 同时 间 界 面 中 心 至 转轴 中 心 的 移动 距离 r〈 见 表 3)。 es。 TIl9。 表 3 ， 猪 甲状 腺 球 蛋 白 扫 描 图 > 值 测量 玫 r 一 = + 5.70 (cm) 界面 中 心 至 转 头 中 心 距 离 6.1714 6.2036 。2278 6 6.2600 6.2882 6.3164 6 » 3446 an - 3688 an +3970 ©4252 «4534 以 lar 作为 纵 座 标 , 时 间 t 《分 钟 ) 作 为 横 坐 标 作 图 ( 见 图 4)。 y 一 bxz 十 a a= 1.8205, Inr -0 6 12 18 24 30 t(min)) 4 lar Wt 作 直线 图 (5) 应 用 最 小 二 乘法 求 最 佳 直 线 : (6) 代 人 公式 〈2) 计算 S 值 : 斜率 b 一 1.4784 X 107° 回归 系数 — 0.9997 因为 转速 为 34865rpm HM w= 0.10472 X 34865 = 3651.06 A /e Seu = pier Peds 3 dt 60 1.4784 x 107° (0.10472 X 34865)? x 60 (7) 校正 至 标准 条 件 : 。 120。 = 18.48 x 10°° ® a _ ee ee mas 已 知 ew 一 0.9982g/cm*, 甲状 腺 球 蛋白 的 立 为 0.72， 所 用 的 溶剂 为 磷酸 缓冲 该 可 在 常用 溶剂 表 中 〈 见 附录 2) a3 约 为 1.035. proserv AA 1.0097g/cm e 故 120,Sel¥ (1 a Van »wW P20, w) now (1 — Vi,seiver,soiv) = 18.48 X 1.035 x 229-72 X 0.9982 199 x 10-8 种 1 — 0.72 X 1.0097 AAAS Pan 0.16%, 已 很 稀 , 基 本 趋向 于 零 浓 度 故 可 略 去 浓度 校正 。 对 已 从 实验 测 得 S 值 的 样品 ， 如 果 扩 散 系数 D 已 知 ， 或 已 从 实验 测 得 即 可 计算 分 子 ! 量 。 以 猪 甲状 腺 球 蛋白 为 例 : Show 已 校正 为 19.7X 10° 秒 。 已 知 其 扩散 系数 Drow 一 2.65 X 10-’em?/#b, V = 0.720cm’/g(20°C), T = 273.2 + 20 一 293.2°K, R 一 8.314 XX 10’ ARR / BE + 摩尔 ，pPzow = 0.9982g/cm ， 把 上 述 参 数 代入 公式 《1): Szo,w = Sis we RTS _ 8.314 X 10%’ X 293.2 X 19.7 X 107 a D(1 — Vp) 2.65 X 10°7(1 — 0.72 X 0.9982) = 64.4206 = 6.44 X 10’ 二 、 沉 降 平 衡 法 测 分 子 量 沉降 平衡 法 自 1950 年 后 期 发 展 以 来 特别 受到 重视 ,现在 也 是 鉴定 蛋白 质 分 子 量 的 重 要 方法 之 一 。 也 可 以 说 是 测定 大 分 子 量 最 为 可 靠 的 方法 。 通常 由 于 达到 平衡 的 时 间 较 长 ,不 利于 不 稳定 的 材料 。 但 应 用 短 液 柱 离心 , 结合 优良 的 光学 系统 和 分 析 方 法 ,可 缩短 达到 平衡 的 时 间 。 例如 对 于 分 子 量 在 20 000 至 70 000 之 问 的 生物 大 分 子 ( 许 多 蛋白 质 包 括 在 这 范围 内 ), 达 到 平衡 的 时 间 只 需 数 小 时 。 对 于 近 500 000 的 较 大 分 子 , 则 需 1 一 2 天 Hae, : 这 个 方法 的 主要 优点 是 有 热力 学 理论 为 依据 的 坚实 基础 。 除了 可 以 测定 单 分 散 体 系 , 即 仅 含 一 种 溶质 分 子 的 均匀 体系 中 的 溶质 分 子 量 , 还 可 鉴定 蛋白 质 多 分 散 体系 中 的 分 子 量 分 布 。 沉 降 平衡 法 也 是 研究 大 分 子 相互 作用 的 一 个 有 力 研究 手段 。 从 沉降 和 扩散 相 平 衡 的 原理 推导 出 计算 溶质 分 子 量 M 的 公式 为 : RT dine (4) (1—Vp)w? dt 上 式 中 了 为 气体 常数 , 工 为 绝对 温度 ， 有 为 溶质 的 微分 比 容 , p 为 溶剂 的 密度 , wo 为 角 速度 , © 为 溶液 浓度 ,rz 为 平衡 图 上 浓度 分 布 曲线 各 点 至 转轴 中 心 距 离 。 WR © 又 以 离心 机 光学 系统 所 测量 的 光 吸 收入 代表 , 则 上 式 中 dinc 可 改写 为 dlnA。 从 上 式 可 以 看 出 ,通过 超 离心 的 沉降 平衡 实验 得 到 平衡 图 后 ， 从 中 测量 到 A 和 r 值 ， 然后 以 MA 对 ? 作 图 ,所 得 直线 斜率 代 人 上 式 , 即 可 计算 分 子 量 。 若 实际 所 作 图 不 是 直线 ， 则 表明 溶质 分 子 是 不 均一 的 。 曲 线 上 每 点 的 斜率 将 比例 于 池内 溶液 中 每 点 溶质 分 子 的 平均 分 子 量 。 沉降 平衡 实验 的 具体 步骤 如 下 : M 一 wo Cs 1. 离心 池 装 液 准备 待 测 分 子 量 的 蛋白 质 样品 溶液 浓度 ,范围 内 取 光 吸收 As 一 0.2 至 0.3 之 间 ( 一 0.5mg/ ml)。 对 缓冲 液 透 析 平衡 后 , 备用 。 仍 选用 双 扁 形 槽 离心 池 〈 见 图 1)。 在 右 槽 中 预先 装 氟 化 碳 油 0.03ml1， 然 后 加 入 0.12ml 样品 溶液 。 在 左 槽 中 加 入 0.17ml 溶剂 ,最 好 是 用 样品 透析 后 的 外 液 。 2. 达到 平衡 时 间 的 估计 离心 池 中 加 样 量 的 多 少 决 定 流 柱 的 长 度 ， 后 者 则 决定 达到 平衡 的 时 间 。 从 下 式 可 估 , 计 达 到 平衡 的 时 间 ( 误 差 小 于 0.19 ): tog = 0.7(b — a)?/D (5) 上 式 中 bb 是 离心 池 样 品 咨 液 底部 至 转轴 中 心 的 距离 ，a 是 波 面 至 转轴 中 心 的 焉 离 ， (b 一 a) 代 表 液 柱 的 长 度 , D 为 扩散 系数 。 从 上 式 可 知 液 柱 越 短 则 平衡 时 间 越 少 。 故 用 短 液 柱 可 缩短 达到 平衡 的 时 间 , 但 随 之 误差 也 增 大 , 故 有 一 定 的 限度 。 3. 所 需 达 到 平衡 转速 的 选择 实验 前 若 能 大 致 推测 待 测 蛋白 质 疗 品 的 分 子 量 (MW), 则 可 利用 下 式 佑 算 所 需 转 速 (rpm): log(rpm) = 6.34 一 0.496log(mw) (6) 或 从 下 图 查 得 。 AM TRIS / 0.25 1 23456 10 20 30 100 a cs 1983， 科 学 出 版 社 。 [2] 程 伊 浴 . 王 克勤 yx 仪器 分 析 及 其 在 分 子 生 物 学 中 的 应 用 > 第 三 册 ，138 页 ，1978， 科 学 出 版 社 。 [ 3] Schchman, H. K., “Ultracentrifugation, diffusion, and viscesity” in Methods in Enzymology, vol. 4, p. 32, 1957, Academic Press Inc., New York. [4] Haschemeyer, R. H. & Haschemeyer, A. E. V., Proteins: A guide to study by physical and chemical methods, p. 160, 1973. [5] Marmorosch, K. & Koprowski, H., Methods in’ Virology, pp. 3—86, 275, 1967, Academic Press Inc., New York. [6] Osterman, A. L., Methods of protein and nucleic acid research, I. Electrophoresis, isoelectric focusing, ul- tracentrifugation, 1984, Springer-Verlag, Berlin, Heidelherg. \ °130¢ 从 蛋白 质 的 一 级 结构 预测 二 级 结构 | 5， 庆 (中 国 科 学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 7 蛋白 质 的 一 级 结构 决定 高 级 结构 ， 因 此 可 以 从 一 级 结构 推测 高 级 结构 。 从 这 个 思想 基础 出 发 ,人 们 一 直 在 致力 于 研究 一 级 结构 与 高 级 结构 的 关系 ， 建 立 高 级 结构 的 预测 法 。 在 二 级 结构 的 预测 中 ,经 验 参数 法 是 其 主要 的 一 支 ;在 这 里 介绍 的 Chou 与 Fasman 的 经 验 参 数 法 是 其 中 使 用 得 较 广泛 的 ,也 是 比较 简便 的 ,在 对 球 蛋白 的 预测 中 ， 总 准确 率 可 达 到 70 一 809。 mail tee 1. 构象 参数 Chou 与 Fasman 对 用 X 光 晶体 衍射 法 已 知 立体 结构 的 29 种 蛋白 质 进 行 了 统计 处 理 ， 构 建 了 20 种 氨基 酸 残 基 在 o Rie. CHEM 6 转角 中 的 构象 参数 P。、 “ Po RA 法 如 下 。 首先 得 到 20 种 氮 基 酸 残 基 在 各 构象 单元 的 出 现 频率 : fj. = 0j, «/ mij (其 中 mix 为 j 残 基 在 第 k 种 构象 单元 出 现 的 次 数 ,ni 为 j 残 基 的 总 出 现 次 数 ) 再 将 fx 除 以 20 种 残 基 在 各 构象 单元 的 总 平均 出 现 闫 率 : 《和 下》 = fis 即 可 得 到 构象 参数 : 站 二 从 to> 一 人 .efey》 、 és = f;,./¢f,)> 在 这 些 参数 的 基础 上 ，Choa 与 Fasman 根据 归纳 的 经 验 , 将 20 种 氨基 酸 残 基 对 不 同 的 构象 单元 划分 成 下 列 几 种 ; H: 强 形 成 者 h; 形成 者 I; SE KA i; 中 立 者 b: 破坏 者 B: 强 破 坏 者 对 于 不 同 的 构象 ;各 残 基 的 这 种 作用 及 其 构象 参数 列 于 表 1 中 。 ss 131。 表 1，20 种 氨基 酸 残 基 在 各 构象 中 的 参数 P.，P,， gn fy, fay, 3? 人 + 人 43 分 别 为 20 种 残 基 在 86 转角 中 4 个 部 位 的 出 现 几率 Asn 0.161 | Pro 0.301- | Asn 0.191 Trp 0.167 Met 1.45 Cys 0.149 Ser 0,139 Gly 0.190 Gly 0.152 Ala “the Asp 0,147 | Lys 0.115 | Asp 0.179 | cya 0.128 Leu 1.21 His 0.140 Asp 0.110 Ser 0.125 Tyr 0.125 Lys 1.16), ‘ Ser 0.120 | Thr 0,108 | Cys 0.117 | Ser 0.106 Phe 1 ia + Pro 0,102 Arg 0.106 Tyr 0,114 Glin 0,098 Gin 1,11 re Cys 1.19 he Gly 0.102 | Gln 0.098 | Arg 0.099 | Lys 0,095 Trp 1.08 DT Thr 0.086 Gly 0,085 His 0.093 Asn 0,091 Ile 1.08 Gln 1.10 Tyr 0.082 Asn 0,083 Glu 0.077 Arg 0.085 Val 1.06 Met 1, Trp 0.077 | Met 0.082 Lys 0,072 | Asp 0.081 Asp 1 ota Arg 0. a Gln 0.074 | Ale 0.076- | Thr 0.065 | Thr 0.079 His 1.00 Asn 0.89 Arg 0.070 | Tyr 0.065 | Phe 0.065 | Leu 0.070 © Arg 0.98 His O. 中 Met 0.068 | Glu 0.060 | Trp 0.064 | Pra 0.068 Thr 0.83 Ala 0,83 Val 0,062 | Cys 0.053 | Gln 0.037 | Phe 0.065 ser 0.77{ “| Ser 0.75 Leu 0,061 | Val 0.048 | Leu 0.036 | Glu 0,064 Cys 0.70 Gly 0 5h Ala 0.060 | His 0.047 | Ala 0.035 | Ala 0.056 ~ Tyr 08 Lys 0.74 Phe 0,059 Phe 0.041 Pro 0.034 | Ile 0.056 Asn 0.67 Pro 0.55 Leu 0.5 Glu 0,056 Ile 0.034 Val 0.028 Met 0.055 Pro aa Asp 0, st Val O, Lys 0,055 | Leu 0.025 | Met 0.014 | His 0,054 Gly 0.57 Glu 0.37 Ile 0,043 Trp 0,013 Ile 0.013 Val 0,053 Ile 0.47 于 是 Chou 与 Fasman 方法 可 以 同时 作 两 种 处 理 。 一 是 利用 残 基 的 构象 参数 ,可 以 计算 任 一 蛋白 质 小 片 眉 中 残 基 的 P。、P。、P, ASE CP)» (Po)> (Pr) 来 求 得 该 片段 的 构象 潜能 。 片 外 的 构象 潜能 越 大 ， 则 形成 该 构象 的 可 能 性 越 大 。 其 次 是 沿 蛋 白质 或 多 肽 的 氨基 酸 序列 把 各 残 基 分 别 归属 为 gc 螺旋 和 8 折合 的 形成 者 ,中 立 者 或 破坏 者 , 然后 按 下 面 的 方法 和 规则 搜寻 和 判断 o wee 折 登 区 。 2. a 螺旋 的 搜寻 步骤 (1) 螺旋 的 核心 。” 肽 链 的 6 个 连续 残 基 中 ， 如 果 有 4 个 或 4 个 以 上 的 残 基 是 螺旋 的 形成 者 或 强 形成 者 (bh. 或 H-)， 同 时 螺旋 的 破坏 者 或 强 破坏 者 (be 或 Bo) 的 总 数 少 于 2 个 , 则 此 肽 女 可 以 形成 螺旋 的 核心 。 弱 形成 者 (le) 可 作 05h. 计 人 ,因此 假如 6 个 连 续 残 基 中 有 3 个 he 和 2 个 LI。 则 可 作为 螺旋 的 核心 。 (2) 螺旋 的 延伸 和 终止 ” 从 螺旋 核心 向 N 末 端 和 C 末端 两 个 方向 延伸 ， 直 到 出 现 四 肽 破 环 者 ( 即 平均 CP.) “NF 1.00 的 4 个 连续 残 基 ， 一 般 为 bp、bi、bsh、bzia、b: 韦 、 bjh、bi、bizh、bih， 和 il 一 一 b 代表 b。 和 B。，i 代 表 ie M1. h 代表 ba 和 Ha)» BR 旋 乃 终止 。 邻 近 出 现 8 折 登 时 螺旋 也 终止 。 在 此 基础 上 重新 分 析 被 划 人 螺旋 区 的 肽 侦 , 要 求 最 终 的 螺旋 区 至 少 1/2 的 残 基 是 螺旋 的 形成 者 , 螺旋 破坏 者 的 残 基数 不 得 多 于 1/3。 “432i (3) 螺旋 的 边界 = Pro, Asp’, Glu WERE HERON AIK, His‘t’, Lys? Arg? 常 出 现在 螺旋 的 C 末端 区 。 因 此 当 Pro 或 Asp’? 在 螺旋 N 末 端 区 或 Arg 在 螺旋 C 末端 区 时 可 以 作为 Le 来 考虑 。 (4) Pro 是 螺旋 的 强 破 坏 者 Pro 不 能 出 现在 螺旋 中 央 或 螺旋 的 C 末端 ,但 可 出 现在 螺旋 N 未 端的 前 三 个 残 基 中 。 《规则 一 ?任何 6 个 或 6 个 以 上 的 连续 残 基 , 如 果 满 足以 下 几 点 : Leh) > nes; 2. €Be)i>eGhp)s 3. 满足 上 列 四 种 情况 。 则 可 预测 其 构象 为 c Mle. 3. 有 8 折叠 的 搜寻 步骤 (1) BRR RSS 个 连续 残 基 中 ， 如 果 有 3 个 或 3 个 以 上 的 残 基 是 8 折叠 的 形成 者 或 强 形成 者 (hs 或 Hy), 且 破 坏 者 (bs 或 By) 的 残 基数 少 于 两 个 , 则 此 肽 女 可 形成 折合 的 核心 。 (2) BBM Ne 折叠 的 核心 向 N 未 端 和 C 未 端 两 个 方向 延伸 。 直 到 出 现 一 个 四 肤 破 坏 者 ,8 折叠 乃 终止 。 四 肽 破坏 者 的 条 件 参照 螺旋 的 延伸 ,将 其 中 相应 的 螺旋 换 成 8 折合,c HEB Bo (3) B 折叠 的 边界 ”带电 荷 的 残 基 较 少 在 8 折叠 中 出 现 。Trp 经 常 出 现在 8 HS 的 N 未 端 ,但 很 少 出 现在 C 未 端 。 (4) BP RBRAS Glo Bee HAH, Pro 不 能 出 现在 8 aH 央 。 《规则 二 任何 5 个 或 5 个 以 上 的 连续 残 基 如 果 满 足下 列 条 件 : ). CS 1055 2. (Py) > ， 如 《了 Be? > 《Ps>， 则 判断 其 为 < 螺旋 , 如 《〈《P。》 < 《Ps7> 则 为 8 折 倒 。 也 可 根据 强 形成 者 和 强 破 坏 者 的 多 寡 来 判断 。 假 如 : 一 个 六 肽 片段 由 (Hzb,ib). #1 (〈HhsiB)e。 组 成 ， 由 于 螺旋 的 形成 者 较 8 HBA EA aR eA, 因此 可 判断 此 片 且 为 “ 螺旋 。 2. 可 以 根据 边界 参数 ( 表 略 ,参照 Biochemistry, 13:211) 的 预测 结果 进行 判断 。 3. 统 计 结 果 表 明 , c 螺旋 一 般 包 含 的 残 基数 较 8 HaNAS, AK-RRKWHH RM He (Pa) > (Pp), WURDE RH A— PNW BE, (Pe) > 《Po， 也 可 判断 为 a 螺旋 。 ¢ 133 ¢ 10 SCREEN 2,1:KEY OFF 20 SEFINT N,K,J 30 DIM AS(26) ,BS(10) ,F (14, 26) AQ REM read parameter 50 CLS : 60 OPEN "DCHOU-F.DAT” FOR IHPUT AS #1 70 FOR I=1 Te 26 80 [NPUT#1, AS(1) 90 FOR J=0 79 14: ineUT#i, FU, 了) 160 NEXT J 110 CLOSE 120 OPEN "SCRH:" FOR QUTPUT AS #3 130 GOTO 160 140 K=0:FILES"x. AA” Bed i 15¢ IF K>5 THEN 140 160 BEEP:PRINT: INPUT " Protein Neme (Max 8-charactor)":N$:AS=LEFTS (NS, 1): IF AS<" A’OR AS>"z" THEN K=K+1:G0TO 150 ELSE IF LEN (8S)>& THEN K=K+1:G0TO 150 z 170 PRINT NS:PRINT :KC=0 ert hE 180 OPEN NS+".AA” AS it1 LEN=75 : 190 FIELD #1,75 AS S$ 200 ALL=0:1F LOF(1)=0 THEN GOSUB 4180 210 OPEN.NS+". dat" AS #2:K=LOF (2) :CLOSE#2: IF K=O THEN KC=1:KILL NS+" -DAT" 220 GOSUB 400:GOSUB 3970 230 IF ALLO THEN GQSUB 560 ELSE GOSUB 2920 260 CLS:LOCATE 1,10:PRINT "<< Data Gutput Menu >>":LOCATE 3,3: PRINT NS, IF NB>1 ， OR NE.5 THEN PRINT “ on” ELSE PRINT “off” 下 300 PRINT TAB(9)"10. re-calculation”;TAB(9)"99. ,end":PRINT:INPHT " Your choi ce" "SNP 310 IF NP=i THEN GOSUB 360 ELSE IF NP=4 THEN GOSUB 2160 ELSE IF NP=3 THEN GOSUB 1510 ELSE IF NP=2 THEN GOSUB 2500 ELSE IF NP=5 THEN GOSUB 2000 ELSE If NP=6 THEN GOSUB 3160 ELSE iF NP=10 THEN GOSUB 1460:KC=1:€070 240 - 320 IF NP=8 THEN GOSUB 1460:CLOSE#1:GOTO 160 ELSE If NP=7 THEN GOSUB 3740 ELSE I F NP=99 THEN PRINT “end program" :SYSTEM 330 IF HP=9 THEN BEEP:CLOSE#3:IF PRIN>.5 THEN PRIN=0:OPEN “SCRN:" FOR \OUTPUT AS #3:GOTO 260 ELSE PRIN=1:OPEN "LPT1:" FOR OUTPUT AS #3:GOT0 260 349 GOSUB 3930:G0TO 260 350 REK sub get sequence 360 PRINT:PRINT "TOTOL" ALL; "RESIDUES" : PRINT 370 IKMST "BEGIN NUMBER"sNB: IF NB<1 OR NB>ALL THEN NB=1 380 INPUT "END NUMBER";NE:IF NEDALL THEN NE=ALL 4 gy 390 RETURN 人 400 CLS:PRINT HS, : IF ALL>O THEN PRINT "1 -"SALL ELSE PRINT 410 NEN=THT(LOF (1)/75) +1 AZO DIM SECNEX) :PRINT ca] 430 FOR I%=1 TO 4EX a 440 GET #1, 1% 450 S$(1%¥-1)=S$:PRINT S$; 460 IF RIGHTS(S$,1)<"A" THEN 480 470 NEXT 1% ASO PRINT: IF ALL>O THEN 520 490 FOR KP=1 TO 75:IF MIDS(S$,KP,1)<"A" THEN 510 500 NEXT KP 510 ALL=(1%-1)75+KP-1:PRINT" Totol "sALL:PKINT 520 N=ALL:NB=1:NE=ALL:DIM P(9,N) 530 RETURN pS «134° 540 REM 550 REM calculation block 560 N=ALL: DIM A(i,N).B(1,N), T(N-3) :NUA=0:NUB=0:NUT=0: PRINT 570 PRINT " Please wait a couple of minutes.......... “PRINT 580 FOR J=1 TO N-3:PA=0:PB=0:PT=0:FT=1:FA=0:FB=0:BA=0:BB=0:FAN=1 :FAC=1 :FBN=1 FBC =1:FA2=0:BA2=0:BB2=0 590 FOR K=0 TO 5 :KP=J+K:GOSUB 2430: IF D$<"A" THEN 760 600 S=ASC (D$) -64 610 PA=PA+F (0,S) :PB=PB+F (1,S): IF K<4 ‘THEN PT=PT+F (2,S) :FT=FTsF (114K, S) 620 IF K<3 THEN FAN=FAN*F(5,S) :-FAC=FAC#F (4,S) :FBN=FBN=F (9,S) :FBC=FBC+F (8,5) ELSE FAN=FAN*F (3,S) :FAC=FAC*F (6, S) : FBN=FBN&F (7,S) :FBC=FBC+F (10,8) 630 IF F(0,S)>1.03 THEN FA=FA+1 ELSE IF F(0,S)>.~9899999 THEN FA2=FA2+.5 ELSE IF F(0,S)<.7 THEN BA=BA+1 640 IF D$="P" THEN BB2=5:IF K>2 THEN BA2=BA2+5 ELSE FA2=FA2+.5:BA2=BA2-1: IF K=0 THEN P(8,J)=3 650 IF D$="E" THEN BB2=5 660 IF K>2 AND (DS="K" OR D$="C") THEN FA2=FA2+.5 670 IF F(1,S)>1.03 THEN FB=FB+1 ELSE IF F(1,S)<.8 THEN BB=BB+1 680 IF K<>3 THEN 730 690 P(0,J)=PA/4:P (1,J)=PB/4 700 IF (PA<4 AND (BA>.9 OR FA<.9 OR FA+FA2<1.9))OR PA<3.6 THEN P(8,J)=1 ELSE IF BA2>1 THEN IF P(8,J)=3 THEN P(8,J)=1 ELS2 P(8,J)=2 ELSE P(8,J)=0 710 IF (PB<4 AND (BB>.5 OR FB<1.9))OR PB<3.6 THEN P(9,J)=1 ELSE P(9,J)=0 720 P(2,J)=PT/4:P (7, J)=FT:FTT=FTT+FT: IF PT>4 AND PT>PA AND PT>PB AND FT>7.500001 E-05 AND J>2 THEN NUT=KUT*1:T(NUT)=J 730 IF K=4 THEN IF PB>5 AND FB>2.9 AND BB<1.6 AND BB2<1 THEN NUB=NUB+1 :B(O,NUB) =J :PRINT Js" B ",:G9T0 750 740 IF K=5 THEN P(3,J+3)=FAN:P (4, J+Z) =FAC: AN=AN+FAN: AC=AC+PAC:P (5, J+3) =FBN=P (6,3 - +2) =FBC:BN=BN+FBN:BC=BC+FBC: IF PA>6 AND FA+FA2>3.9 AND BA+BA2<1.9 THEN NUA=NUA+1 7A(0, NUA) =J: PR INT J3” A ry 750 NEXT K 760 NEXT J 770 AN=AN/(N-5) :AC=AC/ (N-5) :BN=BN/ (N-5) :BC=BC/ (N-5) :FTT=FTT/ (N-3) 780 AV (3) =AN:AV (4) =AC: AV (5) =BN: AV (6) =BC: AV (7) =F TT 790 I=0:K=-1:EN=0 800 I=I+1:IF DNUA THEN 830 810 IF A(O,1)>EN THEN EN=EN+2:K=K+1:A (0, K)=BEG:A(1,K) =EN:BEG=A (0, I) 820 EN=A(0, 1)+3:GOTO 800 830 EN=EN+2:K=K+1:A (0, K) =BEG:A(1,K) =EN:NUA=K 840 [=0:K=-1:EN=0 850 I=I+1:IF DNUB THEN 880 860 IF B(O,1)>EN THEN EN=EN+2:K=K+1:B (0, K) =BEG:B(1,K) =EN:BEG=B (0, I) 870 EN=B(0,1)+2:GOTO 850 880 EN=EN+2:K=K+1:B (0,K)=BEG:B (1,K) =EN:NUB=K ao an NB=1 AND NE=ALL THEN GOSUB 2700 M ; 910 REM check block 920 PRINT:GOSUB 4830 930 PRINT:PRINT "HELIX AT:":FOR NA=1 TO NUA:AB=A(0,NA)-1:AT=A(1,NA)-2 940 IF AB<1 THEN GOTO 1010 950 IF ABS(P(8,AB)-1.5}>.6 THEN AS=AB-1:GOTO 940:REM <>1,<>2 960 KM=AB:AB=AB+3:KH=3:AV=0 970 IF KN=0 THEN 1010 980 KP=KM+KN:GOSUB 2430:S=ASC (DS) -64: AV=AV+F (0,8) ite »S)<.7 AND DS<>"P" AND DS<>"T" THEN 1010 ELSE IF AV/(4-KN)>=1 THEN AB= + - 1000 KN=KN-1:G0TO 970 1010 IF AB>A(O,NA) THEN GOSUB 3300 1020 REM helix C-term 1030 IF AT2N THEN 1090 ELSE M=ABS(P(8,AT)-2) :ELSE IF M<.5 OR M>1.5 THEN AT=AT+1: GOTO 1030 :REM <>1,03 1040 KM=AT:KN=1:AY=0 1050 IF Kii=4 THEN 1090 1060 KP=KM+KN-1:GOSUB 2430:S=ASC(D$) -64: AV=AV+F (0,S). 1070 IF F(0,S)<.8 AND D$<>"R" AND D$<>"C" THEN 1090 ELSE IF AV/KN>=1 THEN AT wd KN ~ 1080 KN=KN+1:GOTO 1050 1090 IF AT=1 THEN BB=KM+KN-1 1220 KN=KN-1:GOTO 1190 1230 IF BB>B(O,NB1) THEN GOSUB 3360 1240 REM sheet C-term 1250 IF BT>N THEN 1320 ELSE IF P(9,BT)<.5 THEN BT=BT+1:GOTO 1250 1260 KM=BT:KN=1:AV=0 1270 IF KN=4 THEN 1310 1280 KP=KM+KN-1:GOSUB 2430:S=ASC (DS) -64: AV=AV+F (1,S) 1290 IF F(1,S)<.8 AND D$<"N" THEN 1310 ELSE IF AV/KN>=1 THEN BT=KM+KN 1300 KN=KN+1:GOTO 1270 1310 IF BT,";TAB(7)"The third line is N-boundary data of Helix,Sheet”;TAB (7)"The forth line is C-boundary data*of Helix,Sheet” 1520 PRINT:PRINT-TAB(14) "(Solid line --------- Helix)"sTAB(14)"(Dash line - - - - ~ Sheet)":PRINT:PRINT TAB(7)"The fifth line is Pt=f (i)*f (i+1)*f (i+2)+f (i+3)": PRINT:PRINT TAB (7) "After the figure, press (n/N) to quit, press other to next pi cture":PRINT 1530 PRINT: INPUT" Residue per figure (70-80) ";KL: IF KL<70 THEN KL=70 ELSE IF KL>8 0 THEN KL=80 1540 K=-KL:CLS 1550 A1=100:AN1=130:AC1=160 1560 B1=100:BN1=130:BC1=160 1570 T1=200:TT=200- INT (7.5) 1580 FOR J=NB TO NE 1590 KP=J:GOSUB 2430 1600 IF INT((J-NB)/KL)=(J-NB)/KL THEN GOSUB 1830 1610 PRINT DS; 1620 A=210-INT(P (0, J)*140) ¢ 136 1630 B=210-INT(P (1, J)*140) 1640 T=200- INT (P(7,J)*100000!) 1650 AN2=130-INT(P (3, J) /AN*3) 1680 AC2=160-INT(P (4, J) /AC#3) 1670 BN2=130~INT(P (5, J) /BN+3) 1880 BC2=160-INT(P (6, J) /BC+3) 1690 M=(J-NB-K) +38 1700 LINE (M, Al) -(M+8, A) 1710 LINE(M, AN1) -(H+8, AN2) 1720 LINE(M, AC1)-(M+8, AC2) 1730 Y1=B1:Y=B:GOSUB 1920 1740 Y1=BN1:Y=BN2:GOSUB 1920 1750 Y1=BC1:Y=BC2:GOSUB 1920 1760 LINE (M,T1) -(M+8,T) 1770 A1=A:B1=B:T1=T: AN1=AN2:AC1=AC2:BN1=BN2:BC1=BC2 1780 NEXT J 1790 LOCATE 2,1:PRINT N$:NB+Ks"-"3NE 1800 AS=INKEYS: IF AS="" THEN 1800 1810 RETURN 260 1820 REM sub 1830 BEEP: IF K>-2 THEN LOCATE 2,1:PRINT N$:NB+K;"-";NB+K+KL-1 ELSE 1860 1840 AS=INKEYS: IF AS="" THEN 1840 1850 IF AS="n" OR AS="N" THEN RETURN 1810 1860 K=K+KL:CLS:LINE (1,70) - (640,70) :LINE(1, TT) - (640, TT) 1870 LINE (1,125.5) -(640, 125.5) 1880 LINE (1,155.5) - (640, 155.5) 1890 LOCATE 1,1:RETURN 1900 REM eo 1910 REM dash line 1920 ST=SQR ((Y-Y1)+ C1060) 1930 FOR I=0 TO ST-4 STEP 1940 LINE (M+8*1/ST, Wey: I/ST) - (M+8%(1+1) /ST, Yi+ (¥Y-Y1) * (T+1) /ST) 1950 NEXT I 1960 IF J/10=INT(J/10) THEN LINE (M+7,0) - (+7, 20) RETURN REM sub data 2000 PRINT#3, :PRINT#3, rs PRINTH3, CPRINTES, KA. Pa Pb Pt fan fac fbn fbc ft" 2010 PRINT#3, 2020 FOR J=NB TO NE 2030 KP=J:GOSUB 2430:S=ASC (D$) -64 2040 PRINT#3, USING "###"3J;:PRINT#3, " “sAS(S);" "3 2050 FOR I=0 TO 2 :PRINT#3, USING "#.##"SP(I,J); 2060 PRINT&3, “ ";:NEXT I 2070 FOR I=3 TO 7 :PRINT#3, USING "#.##°°°°"SP(I,J)3 2080 IF P(I,J)>AV(D#1. .5 THEN IF P(I,J)>2sAV(I) THEN PRINT#3, “* ": msr PRINT#3 » "2 "3 ELSE PRINT#3, " "; 2090 NEXT I 2100 PRINT#3, USING “#";P(8,J);P(9,J); 2110 PRINT#3, :NEXT J 2120 PRINT&3, :PRINT#3, “1. 5AVERAGE", "fan="sAN*1.5, “fac="3AC#1.5, “fbn="sBN*1.5,* fbc="5BC#1.5, “ft="sFTT#1.5 ; 2130 RETURN 2140 REM 2150 REX sub print overlap 2160 NA=0:NB1=0:NT=0 :NX=0:NY=0:NZ=0:NZT=0 2170 PRINT#3, :PRINT#3, NS,1;"-"sALL:PRINTH#3, 2180 PRINT#3, STRINGS(75,"_") :PRINT#3, 2190 FOR J1=1 TO ALL STEP 75 2200 NC=INT(J1/10)*10-J1 , 2210 IF NC>O THEN NC1=NC+INT(J1):PRINT#3, TAB(NC);NC1;:IF NC1>ALL THEN 2230 2220 NC=NC+10 :IF NC<76 THEN 2210 2230 PRINT#3, :KP=J1:KL=75:GOSUB 2480:PRINT#3, QS 2240 REM helix °137¢ 225 If NX>O THEN NXA=NXA+1: IF NXAC76 THEN NX=NX-1:IF NXA>O THEN PRIRTH3，TAB (NX ny "A"; :GOTO 2250 ELSE 2250 ELSE NXA=NXA-76:GOT0 2270 2260 NAFRA+1: IF NADNUA THEN 2270 ELSE NXA=A (0, ii4)-J1:NX=A(1,NA)-A(O,NA)+1:GOTU 2 250 2270 PRINT#3, 2280 REX sheet 2230 IF NY>O THEN NYB=NYB+1:IF NY3<76 THEN NY=HY-1:IF NYB>O THEN PRINT#3, TAB (RY B)i"B"s :GOTO 2290 ELSE 2290 ELSE NYB=NYB-70:GOTC 2310 2300 NB1=NB1+1: IF NBIDNUB THEN 2310 ELSE NYB=B(0,KB1)-J1-:NY=B (1,NB1)-B(O,NB1) +1 GOTC 2290 2310 PRINTS#3, 2320 RE turn 2330 IF NZ>O THEN NZT=NZT+1:1F NZT<76 THEN PRINT#3, TAB(NZT);"T"; :NZ=HZ-1:G0TO 2330 ELSE NZT=NZT-76:GOTO 2370 2340 NT=NT+1: IF NIDRUT THEN 2370 2350 DT=T(NT)-J1-NZT: IF DT1 2460 KP1=INT((KP-1)/75) : ee KP-KP 175: 20$=HIDS (S6(KP1) ， KP2, KL) 2470 RETURN 2480 REM 2490 REM sub print result 2500 NA=0:NB1=0:PRINT#3, :PRINT#H3, NS 2510 PRINT#3,:PRINT#3, TAB(20) "Hel ix”s TAB (48) "Pa"; TAB (54) "Pb" ; TAB (58) "R-break"sT AB (67) "C-break” 2520 NA=NA+1: IF NA>NUA THEN 2560 2530 KP1=A(0,NA) :KLI=A(1,NA)-A(O,NA) :IF (KP1+KL1NE) AND NP=2 THEN 2520 2540 ST=1:GOSUB 3430 2550 PRINT#3, :GOTO 2520 2560 PRINT#3, :PRINT#3, :PRINT#3, TAB (20) "Sheet" TAB (48) "Pa" TAB (54) "Pb" s TAB (58) "KR -break” ; TAB (67) "C-break” 2570 NB1=NB1+1:IF NBI>NUB THEN 2610 a KP1=B (0,NB1) :KL1=B(1,NB1)-B(0,NB1): IF (KP1+KL1NE) AND NP=2 THEN 2590 ST=2:GOSUB 3430 2600 PRINT#3, :GOTO 2570 2610 PRINT#3, :PRINT#3, :PRINT#3, TAB (15) "b-Turn" ;TAB (30) "Ft/0. 75e-4" ; TAB (48) “Pas TAB (54) "Pb"; TAB (60) "Pt" 2620 FOR I=1 TO NUT:KP=T(1) 9630 IF (KP+3NE) AND NP=2 THEN 2670 2640 PRINT#3, KP;" -"sKP+3; :KP=KP-1 2650 PRINT#3, TAB(15)" "s:FOR J=0 TO 3:KP=KP+1:GOSUB 2430:PRINT#3, D$3:NEXT J 2660 KP=KP-3:PRINT#3, TAB(32)USING"##. ##"3P (7, KP) /7.500061E-05; :PRINT#3, TAB (45) USING" ###. ##"5P (0, KP) ?P (1 ,KP) 5?P (2, KP) 2670 NEXT I 2680 RETURN 2690 REM put data 2700 OPEN N$+".dat" AS #2 LEN=40 :K1=0 2710 FIELD#2,4 AS BS(0),4 AS B&(1),4 AS ye 4 AS BS(3),4 AS BS(4),4 AS BS(5),4 AS BS(6),4 AS BS(7),4 AS BS(8),4 AS BS(9) 2720 A1S=MKIS (NUA) : :A2$=MKIS(NUB) : :LSET BS (0) =A1$+A2$: A1$=MK I$ (NUT) : A2$=MK I$ (ALL) : LSET B$(1)=A1$+A2$:K=2 2730 FOR I=1 TO NUA:A1S=MKIG(A (0, I)) sA2$=MKIS(A(L, I)) :LSET BS(K)=A1$+A2$:K=K+1:T F K=10 THEN K=0:K1=K1+1:PUT#2,K1 2740 NEXT I 2750 FOR I=1 TO NUB:A1S=MKI$(B (0, I)) :A2$=MKI$(B (1, I)) :LSET BS(K) =A1$*A2$:K=K+1?T ° 138 » oe _F K=10 THEN K=0:K1=KI+T:PUTS2,K1 2760 HEXT I. * 2770. FOR I=1 TO NUT :A1S=MKSS(T(I)) :LSET BS (K)=A1$:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:K1=K1+ 1:PUT#2, Ki 2780 NEXT i 2790 AiS=MKSS (AN) :LSET BS(K) =AiS:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:K1=K1+1:PUT#2,K1 2800 A1S=HnS$(AC) :LSET BS(K)=A1$:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:K1=K1+1:PUT#2, Ki 2810 A1$=HKS$ (BN) :LSET BS(K)=A1$:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:Ki=K1+1:PUT#2, K1 2820 A1S=MKS$ (BC) :LSET BS(K) =A1$:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:K1=K1+1:PUT#2, 41 2830 A1S=MKS$(FTT) :LSET B$(K)=A1$:K=K+1: IF K=10 THEN K=0:K1=K1+1:PUT#2, KL 2840 IF K>O THEN K1=Ki+1:PUT#2,K1 2850 FOR I=1 TO a 2860 FOR J=0 TO 2870 AISSIKSS PC T)) :LSET BSW) =A1$ 2880 NEXT J 2890 PUT#2, I+K1:NEXT I 2900 CLOSE#2:RETURN 2910 REM sub get data 2920 OPEN NS+".dat" AS #2 LEN=40 :K1=1:K=2 2920 FIELD#2,4 AS BS(O),4 AS BS(1),4 AS BS(2),4 AS BS(3),4 AS BS(4).4 AS BS(5),4 AS BS(6),4 AS BS(7),4 AS BS(8),4 AS BS(Q) 2940 CET#2, 1:NUA=CVI (LEFTS (B$ (0) ,2) ) :NUB=CV I (RIGHTS (BS (0) , 2) ) : NUT=CV 1 (LEFTS (BS (1 ),2)) :AL=CVI (RIGHTS (B$(1) ,2)) :IF AL<>ALL THEN KC=1:CLOSE#2:RETURN 230 2950 DIM A(1,NUA),B(1,NUB) , T(NUT+1) 2960 FOR I=1 TO NUA:A(O, I)=CVI(LEFTS (BS(K) ,2)) :A(1, I)=CVI (RIGHTS (BS (K) ,2)) :K=K+1 :IF K>9 THEN K1=K1+1:GET#2,K1:K=0 2970 NEXT I 2980 FOR I=1 TO NUB:B(0, I)=CVI(LEFTS(BS(K) ,2)) :B(1, I) =CVI (RIGHTS (BS (K) ,2) ) :K=K+1 :IF (>9 THEN K1=K1+1:GET#2,K1:K=0 2990 NEXT I 3000 FOR I-1 10 NUT:T (1) =CVS (BG (K)) :K=K+12 IF K>9 THEN K1=K1+1:GET#2, K1:K=0 3020 AN=CVS(B$(K)) :K=K+1: IF K>9 THEN K1=K1+1:GET#2, K1:K=0 3030 AC=CVS (B$(K)) :K=K+1: IF K>Q THEN K1=K1+1:GET#2,K1:K=0 3040 BN=CVS (BS(K)) :K=K+1: IF K>Q THEN K1=K1+1:GET#2,K1:K=0 3050: BC=CVS (B$(K)) :K=K+1: IF K>9 THEN K1=K1+1:GET#2. X1:K=0 3060. FIT=CVS (B$(K)) :K=K+1 : 3070 AV (3) =AN:AV (4)=AC:AV (5) =BN: AV (6) =BC: AV (7) =F 3080 FOR I=1 TO ALL 3090 GET#2,K1+I 3100 FOR J=0 TO 9:P(J, 1)=CVS(BS(J)) 3110 NEXT J,1 3120 CLOSE#2 3130 IF NP<>1 THEN GOSUB 920 3140 RETURN . 3150 REM sub parameter 3160 PRINT#3, :PRINT#3, NS:FOR I=NB TO NE STEP 10 3170 PRINT#3, :PRINTH3，I3"-"3:JPF I+9>NE THEN PAINT#3, NE: ELSE PRINT#3, +93 3180 PRIKT#3, TAB(14)" "s 3190 FOR J=0 TO 9:KP=I+J:IF KP>NE THEN 3210 ELSE GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3200 PRINT#3, AS(W)s" -"s:NEXT J 3210 PRINT#3, :PRIRT#3，TAB (4) "Pa" :TAB(14)” "3 3220 FOR J=0 TO 9:KP=I+J: IF KP>NE THEN 3240 ELSE GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3230 PRINT#3, USING "#.## "sF(O,W)3:NEXT J 3240 PRINT#3, :PRINT#3, TAB(4);"Pb";TAB(14)" "s 3250 FOR J=0 TO 9:KP=I+J:IF KP>NE THEN 3280 ELSE GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3260 PRINT#3, USING "#.## "3F(1,W)3:NEXT J 3270 NEXT I 3280 RETURN 3290 REM - sub average 3300 AB=A(0,NA)-1:KP=AB+1 :GOSUB 2430 :W=ASC (DS) -64 3310 IF F(O,W)<.7 THEN AB=AB+1 ELSE IF F(0,W)>1 THEN 3320 ELSE KP=KP+1:GOSUB 243 a :IF F(O,W)<,7 THEN AB= AB+2 > 139 & 3330 AT=A(1,NA)+1:KP=AT-1:G0SUB 2430:W=ASC (D$) -64 3340 IF F(0,W)<.7 THEN AT=AT-1 ELSE IF F(0,W)>1 THEN 3350 ELSE KP=KP-1:GOSUB 242 0:W=ASC (DS) -64: IF F(O,W)<.7 THEN AT=AT-2 3350 RETURN 3360 BB=B(0,NB1)-1:KP=BB+1:GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3370 IF F(1,W)<.8 THEN BB=BB+1 ELSE IF F(1,W)>1 THEN 3380 ELSE KP=KP+1:GOSUB 243 0: ¥=ASC (D$) -64: IF F(O,W)<.8 THEN BB=BB+2 3380 RETURN: 3390 BT=B(1,NB1)+1:KP=BT-1:GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3400 IF F(1,W)<.8 THEN BT=BT-1 ELSE IF F(1,W)>1 THEN 3410 ELSE KP=KP-1:GOSUB 243 Q:W=ASC (D$) -64: IF F(1,W)<.8 THEN BT=BT-2 3410 RETURN 3420 PRINT#3, KP1;" -"sKP1+KL1+1; 3430 AV=0:AV1=0:PRINT#3, KP1;" -"sKP1+KL1;TAB(i5)” “s 3440 FOR I=0 TO KL1:KP=KPi+I:GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3450 ON ST GOSUB 3890,3910 3460 IF ST=1 THEN IF (D$="P" AND I<2.5) OR (D$="R" AND IDKL1-1.5) THEN F$="1" 3470 PRINT#H3, F$s:AV=AV+F (0, W) :AVI=AV1+F (1, ¥) 3480 NEXT I - 3490 AV=AV/ (KL1+1) :AY1=AV1/ (KL1+1) 3500 PRINT#3, TAB(45) USING" H##. ##"5AV3AV1;:PRINT#3, TAB(59)" "3 3510 REM N-tern 3520 IF KP1<5 THEN KN=5-KP1 ELSE KN=0 3530 FOR I=1 TO KN:PRINT#3, "*"5 :NEXT I 3540 FOR I=KN TO 3:KP=KP1+I-4: GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3550 ON ST GOSUB 3890,3910:PRINT#3, F$3:NEXT I 3560 REM C-term 3570 KN=KP1+KL1+4-ALL : IF ENO THEN KN=0 3580 PRINT#3, TAB(68)” 3590 FOR I=1 TO 4-KH: KP=KP1+KL1+1: GOSUB 2430:W= ASC (D8) -64 3600 ON ST GOSUB 3890,3910:PRINT#3, F$;:NEXT I 3610 FOR I=1 TO KN:PRINT#3, “*";:NEXT I 3620 RETURN 3630 REM sub hand predict 3640 REM .Sub sequ 3650 PRINT#3, :PRINT#3,N$: IF AS="S" OR AS="s" THEN ST=30 ELSE ST=15 3660 FOR I=NB TO NE STEP ST . 3670 PRINT#3, :PRINT#3, USING"###"3Is:PRINT#3, "-"s:K=I+ST-1:IF KONE THEN K=NE 3680 PRINT#3, USING"###"sKs:PRINT#3, TAB(10)" "3 _ 3690 FOR J=0 TO ST-1:KP=I+J: IF KP>NE THEN 3730 ELSE GOSUB 2430 . 3700 IF A$="S" OR AS="s" THEN PRINT#3, D$sELSE W=ASC (D$)-64:PRINT#3, AS(W)s 3710 IF KP/10=INT(KP/10) THEN PRINT#3, "/"; ELSE PRINT#3,"-"; 3720 NEXT J, I 3730 PRINT#3, ‘RETURN 3740 PRINT#3, :PRINT#3, N$:ST=30 3750 FOR I=NB TO NE STEP ST 3760 PRINT#3, :PRINT#3, USING"##A"51;:PRINT#3, “-"s:K=I+ST-1: IF KONE THEN K=NE 3770 PRINT#3, USING’ ###"3K3:PRINT#O, TAB(10)" "5 3780 FOR J=0 TO ST-1:KP=I+J: IF KP>NE THEN 3810 ELSE GOSUB 2430 3790 PRINT#3, D$3:IF KP/10=INT(KP/10) THEN PRINT#3, "/"s ELSE PRINT#3,"-"s 3800 NEXT J F 3810 PRINT#3, :PRINT#3, TAB(4);"Pa"; 3820 FOR J=0 TO ST-1:KP=I+J:IF KP>NE THEN 3840 ELSE GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3830 GOSUB 3890:PRINT#3, TAB(11+J#2) F$; :NEXT J 3840 PRINT#3, :PRINT#3, TAB(4) "Pb"; 3850 FOR J=0 TO ST-1:KP=I+J:IF KP>NE THEN 3880 ELSE GOSUB 2430:W=ASC (D$) -64 3860 GOSUB 3910:PRINT#3, TAB(11+J#2) F$3:NEXT J 3870 NEXT: I 3880 PRINT#3, :RETURN 3890 Z=F(0,W):IF Z2>1.2 THEN FS="H" ELSE ma 21. 03 THEN F$="h" ELSE IF Z>.9899999 THEN FS="I" ELSE IF Z>.6950001 THEN F$="i" ELSE IF Z>.6 THEN FS="b" ELSE IF Z>. 5 THEN FS="B" ELSE PRINT#3, “WRONG” :END 3900 RETURN 3910 Z=F(1,W):IF Z>1.4 THEN FS$="H" ELSE IF Z>1.03 THEN F$="h" ELSE IF Z>.8 THEN F$="i" ELSE IF Z>.6 THEN F$="b" ELSE IF Z>.3 THEN F$="B" ELSE PRINT#3, "WRONG" © 140+ 208 LOA 25,1:BEEP:PRINT"Please press any key”: 3940 AS=INKEYS: IF AS="" THEN 3940 3950 CLS:RETURN 3960 REM sub open manu. 3970 CLS:LOCATE 1,10:PRINT "<< Sequence Menu >>":LOCATE 3,3:PRINT NS, :TIF NB>1 0 R NE.5 THEN PRINT “on” ELSE PRINT “off" 4010 PRINT TAB (9) "10. re-calculation";TAB(9)"99. end":PRINT: INPUT " Your cho ice” ;NP 4020 IF NP=3 THEN GOSUB 4080 ELSE IF NP=10 THEN KC=1:GOTO 4070 ELSE IF NP=8& THE N ERASE P,S$:CLOSE#1:GOTO 160 ELSE IF NP=99 THEN PRINT " END":SYSTEM 4022 IF NP=7 THEN GOSUB 3740:IF PRIN<.5 THEN GOSUB 3930 4030 IF NP=6 THEN PRINT: INPUT” Single or Three-charactor Lable of AA. (S/T)";A$:I F AS="S" OR AS="s" OR AS="T" OR AS="t" THEN GOSUB 3650 ELSE BEEP:GOTO 4030 4040 IF NP=9 THEN BEEP:CLOSE#3:IF PRIN>.5 THEN PRIN=0:OPEN "SCRN:" FOR OUTPUT AS #3 ELSE PRIN=1:0PEN “LPT1:" FOR OUTPUT AS #3 4050 IF NP=0 THEN 4070 ELSE IF NP=2 THEN GOSUB 4190:GOSUB 400 ELSE IF NP=4 THEN GOSUB 4350 ELSE IF NP=5 THEN GOSUB 4510 ELSE IF NP=1 THEN GOSUB 4710 4060 GOTO 3970 4070 NB=I>NE=ALC:RETURN 4080 CLS:PRINT "Change ,¥$,:GOSUB 4630 4090 PRINT: INPUT" Numbe.- change” ;NUMB 4100 IF NUMBNE THEN 4160 4110 KP=NUMB:GOSUB 2430:W=ASC (D$)-64:PRINT KP;" Old residue: "sD$;" "sAS(W) me i New residue sA$:IF AS="" THEN 4160 ELSE IF A$<"A" OR A$>"Z" THEN BE oo ,1): IF aes THEN W=ASC (AS) -64:PRINT” Change to "sA$3" “sAG(W)- 4140 MIDS (S$(KP5), KP6) =A$: KC=KC+1:LSET S$=S$(KP5) :PUT#1, KP5+1 4150 GOTO 4090 4160 RETURN 4170 REM sub new sequence 4180 CLS:PRINT NS," New":PRINT 4190 KP1=0 :KP2=0 4200 IF ALL>O THEN KP1=INT(ALL/75) :¥P2=ALL-KP1#75 :QG=LEFTS (S$ (KP1) ,KP2) :CLS:PRIN T N$, "1 -"SALL,” Sequence”:GOSUB 4630:PRINT:ERASE P,SS 4210 N=0 4220 PRINT ”Please use capital single lable of amino acid(AA), (Esc) to end.” 4230 GOSUB 4290 4240 IF AS=CHR$(27) THEN 4260 ELSE N=N+1:KP2=KP2+1:Q$=Q$+A$: IF KP2=75 THEN LSET $$=G$:KP1=KP1+1:KP2=0:PUT#1,KP1:Q$¢="" 4250 GOTO 4230 4260 IF N>O THEN KC=1:ALL=ALL+N:KP1=KP1+1:LSET S$=Q$: PUT#1,KP1 4270 RETURN 4280 REM sub get AA. 4290 PRINT ” No."sKP1%75+KP2+1;" AA. 2"; 4300 AS=INKEY$: IF A$="" THEN 4300 4310 PRINT AS 4320 IF A$<"A" OR AS>"Y" THEN IF A$=CHR$(27) THEN 4330 ELSE GOSUB 4240 ELSE IF A $="B" OR AS="J" OR AS="0" OR AS="U" OR AS="X" THEN GOSUB 4349 4330 ETURN | 4340 BEEP:PRINT ”Please use capital single lable of amino acid(AA), (Esc) to end ":RETURN 4290 . 4350 CLS:PRINT” Insert",N$:GOSUB 4630:PRINT: INPUT " Begin number";KP:IF KPNE THEN 4480 4380 KP1=INT((KP-1)/75) :KP2=KP-KP1+75-1 :N=0: I$="" 4370 PRINT " Please use capital single lable of amino acid(AA), (Esc) to end." 4380 GOSUB 4290 。141 。 4390 IF AS$=CHR$(27) THEN 4410 ELSE N=N+1: I$=I$+A$:KP2=KP2+1: IF N=225 THEN: 441¢ 4400 GOTO 4380 4410 IF N<1 THEN 4480 ELSE KC=1:ALL=ALL+N:KP5=KP1:KP2=KP-KP1375 4420 Q$=LEFTS (S$ (KP5) , KP2-1) +I$:N=N-(76-KP2) :IF NNE THEN 4600 4520 INPUT “ How many residues to be deleted":N:IF N<=0 OR NB+N-1>NE THEN 4600 4530 KP1=INT ((KP-1)/75) :KP2=KP-KP1+75 :KP5=KP1 4540 Q$=LEFTS (S$(KP5) , KP2-1) :N=76-KP2-N 4550 IF NNE THEN 4700 ELSE GOSUB 2430 4680 PRINT D$; :IF KP/10=INT(KP/10) THEN PRINT "/"s ELSE PRINT"-"s 4690 NEXT J ,I 4700 PRINT:RETURN 4710 PRINT:PRINT" Please input analogue name. Then use other function to change residue.”:PRINT 4720 INPUT" Analogue Name(Return to exit)"sN2$:IF N2$="" THEN 4820 ELSE A$=LEFT$ (N2$,1):IF A$<"A" OR A$>"z" THEN 4720 4730 CLOSE #1 4740 OPEN N2$+".AA" AS #1 LEN=75 ' 4750 IF LOF(1)>0 THEN BEEP: INPUT" Analogue already exist. Over-print it (Y/N)"3A $ ELSE 4790 4760 IF A$="y" OR AS="Y" THEN 4790 4770 IF AS="N" OR AS="n" THEN CLOSE#1:OPEN N$+".aa" AS #1 LEN=75:FIELDtl,75 AS S $:GOTO 4820 4780 GOTO 4750 4790 NG=N2$:KC=1:FIELD#H1,75 AS S$ 4800 FOR I%=1 TO INT((ALL-1)/75)+1 4810 LSET S$=S$(IX-1) :PUT #1, 1% :NEXT I% 4820 RETURN 4830 PRINT#3, "Helix Nuclear "s:IF NUA>O THEN PRINT#3, "At:" ELSE PRINT#3, “None™:G OTO 4860 4849 FOR I=1 TO NUA:PRINT#3, AQO,1)s" -"sA(1,I), :NEXT I 4850 PRINT#3， 4860 PRINT#3, "Sheet Nuclear ";:IF NUB>O THEN PRINT#3,"At:" ELSE PRINT#3, "None”:G OTG 4890 4870 FOR I=1 TO NUB:PRINT#3, BQO, 1)s" -"3B(1, 1), :NEXT I 4880 PRINT#S3, 4890 PRINT#3," Turn "s:IF NUT>O THEN PRINT#3, “At:" ELSE PRINT#3,“None”:GOTO 4910 4900 FOR I=1 TO NUT:PRINT#3, T(I)s" -"sT(1)+3, :NEXT I 4910 PRINT#3, :RETURN ©1425 4. 当 两 个 重 释 区 与 一 个 已 预测 的 8 转角 相 邻 时 ， 可 以 预测 为 8 折 登 。 一 般 利 于 形成 反 平 行 的 8 折 登 。 5. B 转角 的 预测 Chou 与 Fasman 绕 计 了 20 种 氨基 酸 残 基 在 8 转角 中 四 个 不 同位 置 上 的 出 现 频率 fi. fini. fia. figs. M1 ATA 通过 计算 8 转角 的 发 生 几 率 Pt =f, X fins X fin X figs 和 平均 6 转角 潜能 《Pt?， 可 以 按 下 列 规则 预 训 B 转角 。 《规则 三 > 在 何 1 个 四 肽 片 有 侦 , 如 果 满 足下 列 条 件 ， 起 7S5040， 2. BB) > 1.005 3. (Pa) < (P.) > (Pe)s 则 可 预测 其 构象 为 8 转角。 6. 一 个 预测 蛋白 质 二 级 结构 的 计算 机 程序 Chou 与 Fasman 的 方法 包含 了 重复 的 加 和 求 平 均值 的 运算 和 一 些 简单 的 逻辑 判 断 ， 把 这 些 工作 交 给 计算 机 将 使 该 方法 的 应 用 更 为 方便 。 这 种 程序 很 多 。 作 者 根据 国内 现 有 情况 ,选用 了 人 机 对 话 功能 较 强 的 IBM 磁盘 BASIC 语言 ， 编 成 一 个 实用 程序 。 程序 主要 由 氨基 酸 序列 的 输入 与 编辑 ,参数 的 运算 与 二 级 结构 预测 ,结果 的 输出 等 三 个 部 分 组 成 。 人 机 对 话 均 有 提示 ， 应 答 如 有 错误 ， 计 算 机 将 重新 提问 。 程 序 中 有 作 图 指 令 , 因 此 如 果 需 要 图 表 时 要 配置 图 形 显 示 系 统 。 以 下 以 胰 隆 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 二 级 结构 预测 为 例 来 说 明 程 序 的 使 用 方法 。 在 DOS 状态 打 人 BASICAUI (空格 ) Chou-FASt) ( 回 车 符 ) 后 ,程序 即 开始 运行 。 首先 屏幕 上 显示 要 求 输入 蛋白 质 名 称 或 记号 ,名 称 要 以 字母 开头 ,最 长 不 超过 8 个 字符 。 在 本 例 中 键入 Try-Inh 人 ,程序 就 进入 第 一 个 氨基 酸 序列 编辑 子 程序 。 因 为 Try-Inh 是 一 个 新 的 蛋白 质 ， 计 算 机 将 直接 要 求 用 户 读 人 氨基 酸 序 列 。 氮 基 酸 残 基 是 以 大 写 的 单字 符 形 式 输入 ,不 需 打 回 车 。 如 果 格 式 有 错误 ， 计 算 机 将 鸣 声 报警 ,并 显示 符号 提醒 用 户 重 新 打 人 。 在 此 连续 地 键 人 RPDF……s 58 RAS MAH (ESC) 键 退出 。 在 序列 输入 中 如 有 多 打 , 漏 打 , 错 打 等 ,可 跳 过 错误 按 序号 继续 输入 ,错误 留 给 氨基 酸 序列 编辑 子 程序 去 处 理 。 序 列 编辑 的 菜单 如 图 2(A) 所 示 。 它 的 功能 有 下 列 几 种 可 供 选择 。 0. 计算 功能 : 结束 编辑 , 进 和 人 下 一 步 计 算 ; 10. 重 计算 功能 : 结束 编辑 ,进入 下 一 步 并 重新 计算 ; 1. 设 定 同系 物 功 能 : 读 和 人 同系 物 名 ， 给 同系 物 一 个 相同 序列 的 找 贝 并 转向 对 同系 物 的 序列 编辑 ; 2. 序 列 的 延续 : 接 在 C 末端 后 继续 输入 毛 基 酸 序 列 ; 3. (EMILE: 打 人 相应 的 残 基 序 号 ,输入 新 残 基 ; 4. 插 人 序列 : FARHAN iE, AAR; 5. 删除 序列 : 打 人 需 删 除 的 序列 的 起 始 位 置 和 删除 的 残 基 个 数 , 去 除 该 段 序列 : 6. 显示 序列 : 可 选择 单字 符 和 三 字符 两 种 形式 ; 7 手工 预测 表 列 : 按 序列 将 残 基 归属 为 “ 螺旋 和 8 折 葵 的 形成 者 ， 中 立 者 和 破坏 者 .143 。 «Sequence Menu» Try-Inh 1—58 - calculation - analogue i - sequence continue . change residue - imsert residue . delete residue - print sequence . hand prediction . change to another protein wont ana VNRs& WwW ND —& CO - print now off 10. re-calculation 99. end Your choice? 2 (A) 氨基 酸 序列 编辑 菜单 «Data Output Menus Try-Inh 1—58 : output Limit . check . figure . total result data . parameter . hand predict . another protein XO. .¢co NN Ge w’ & Ww NO ] . . - print now on 10. re-calculation 99. end Your choice? 图 2 (CB) 数据 输出 菜单 Ss 9. 打印 选择 开关 : 决定 6 和 7 的 显示 内 容 是 否 打印 ; 8. 另 一 个 蛋白 质 : 结束 编辑 , 存 贮 序列 ,重头 开始 ; 99. 结束 : 运行 结束 , 存 贮 序列 后 回 到 DOS 状态 。 用 户 可 以 打 人 相对 应 的 数字 选择 这 些 功能 。 现 在 我 们 打 人 数字 Dt, 进入 下 一 步 的 计算 。 在 计算 前 ,如 果 序 列 以 前 已 计算 过 ,又 没有 修改 , 在 进入 计算 时 选择 的 是 计算 功能 而 不 是 重 计 算 , 则 计算 机 只 需 调用 以 前 已 存 贮 的 数据 即 可 。 现 在 这 是 一 个 新 的 蛋白 质 ; 程 序 开始 参数 运算 。 首 先 计 算 沿 着 氨基 酸 序列 逐 格 移动 的 “四 肽 窗口 "的 《Pe》《Pe>《P,>、Pr 值 ， 预 测 8 转角 的 位 置 并 判断 此 四 肽 是 否 “ 或 8 的 破坏 者 。 同 时 也 寻找 螺旋 的 六 肽 核 心 和 8 折 有 登 的 五 肽 核心 ,找到 核心 后 在 屏幕 上 显示 开头 位 置 和 对 应 的 (A) 或 (B)。 接着 . 计算 边界 数据 ,进行 核心 合并 ,特殊 氨基 酸 特例 分 析 , 核心 的 延伸 和 终止 判断 ,边界 残 基 的 取舍 等 操作 ,由 此 得 到 的 螺旋 和 8 折合 相互 独立 的 预测 结果 存 人 磁盘 ,进入 下面 的 数据 。144 。 Try-Inh 1 - 58 10 20 30 40 S0 60 RPDFCLEPPY TGPCKARIIRYF TNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA AAAAA AARAARA AARARARARARAA AAARARARA BBBBBBB BBBBBBB BBEBB ~ TPP TT ik, Tata 可 了 下 本 Try-Inh Helix Pa Pb N-break C-break Set 7 IhiHH 1.11. 6.396 kx 1B BBb i 14 - 20 ihHihhI 1.06 1.12 biBB bhib 22 - 34 hibHHHBHihihh 2 O24 wicca: hhib bBBI 45 - 53 hhiHHIiHI 1.13 0.86 hibb iiBB Sheet Pa Pb N-break C-—break 18 - 24 HHi Hhh i 0. 32 1.25 hbi i ibib 29 - 35 hhhhhHH 0.96 1.33 ibib bbhi Si = SS hhihh ».9S3 1,42 biBB bbi»x b-Turn Ft/0.7S5e-4 Pa Pb Pt 日 一 11 PPYT 3.63 0.66 0.94 1.29 LG = is YTGP p ST 0.66 0.39 1.30 Ze. eS GPCK 4.55 g,. 755 0.81 . i232 3S - 38 YGGC 2. 26 0.63 1.04..1.365 41 —- 44 KRNN 1.30 0.87 90.86 1.27 43 - 46 NNFK 是 < 让 6.91 0.97 1.18 S4 - 57 TCGG 2.09 a-G7,. 0:57 2.52 3(A) 显示 的 结果 上 图 A, BLT SSIS oie. 6 TAN BRAN: FASRARHERKSD BREEAM ADH N.C 两 个 末端 的 四 肽 破坏 者 组 成 。 IPPC cr 下 cca Try-Inh 1 - 58 / AN I i (a) mC Aw G a i} j LA a Ne or = 一 @ pads Od 入 Be RSS (c) a) a Al Bef es : 图 34B) 图 形 显示 (4) 为 四 个 连续 残 基 的 平均 《Pe>, 《Pa2; (Cb) 为 和 8 的 号 端 边界 参数 ; 《〈5) 为 和 8 的 C 端 边 界 参数 。(a)、(b)、(c) 中 实 线 表示 螺旋 虚线 表示 B HH KF BRN

= 1.005 Cd) 为 转角 几率 直线 的 P, 一 1.0 X 10, EO Trv-Inh 2 =—-t'6 Ars —Pro —Asp -Phe -Cys -Leu -Glu. -Pro. 一 Pro -Tryt = Pa A seie Sr 1 pd 2.35: 0.70 1.22. 1.517 Glog 0.57 G268 Pb 0.93 0.55 0.54 1.38°1.19 1.30 0.37 0.55 0.55 1.47 a2) = 20 Thr -Gly -Pro -Cyvs -Lys -Ala -Ars -Ile -Ile -ATa = Pa 0.83 0.57 0.57 0.70 1.16 1.42 0.98 1.08 1,08%0.98 Pb 1.19 0.75 0.55 1.19 0.74 0.83 0.93 1.60 a 60 CIs 21 一 3D Tyr -Phe -Thr -Asn —-Ala -Lys -Ala -Gly -Leu —Cvs 一 Pa 0.69 1.13-0.63 0.67 1.42 1.16 1.42 0.57 1.21 0.70 Pb 1.47 1.38 1.19 0.89 0.83 0.74 0.63 0.75 1.350 Diage 3si-— 40 Gln -Thr -Phe -Val -Tyr -Gly -Gly -Cys -Ars —Ala 一 Pa 1.11 0.83 1.13 1.06 0.69 0.57 0.57 0.70 0.96 I4@e Pb fatnete toe se 1°70 1.47. 0.750.275 1.19 0.93 0.83 41 一 S50 Lys —Ars -Asn —-Asn -Phe -Lys -SeT —Ala 一 GLU 一 和 SP 一 Pa 1 t6 0.98 02s7 0.67 1.13 1.16 0.77 1oaZ VS. 2 0e Pb 0.74 0.93 0.69 0.89 1.3e 0.74 0.75 0.83 O37 0.Sd4 . 51 一 58 Cys -Met -Ara -Thr -Cys -Gly —-Gly -ALa 一 Pa 0.70 1.45 0.98 0.83 0.70 0.57 0.57 1.42 Pb 1.1971.05 0.935 1.19'/1.19 0.75 0.75 Doss ' 图 3(C) 参数 表 列 Br. 1- 50 = R-P-D-F-C-L-E-P-P-¥/T-@-P-C-K-A-R-I-I-R/V-F-T-N-A-K-A-G-L-C7 Pa iBIh tHHBBbS i BB The t hh i.b fh 1 baa q, Pb i BBrhhB BPH b BA bOF FH HT A RA Co epeieoeeeee 31- S@ 9 Q-T-F-U-Y-G-G-C-R-A/K-R-N-N-F-K-S-A-E-D/C-M-R-T-C-G-G-A- Pa fh teh ht bee Bisa h i ob ob Reine HHL i Ae fee Pb Rha Heep Phere Pr bt ft il huh bi UB Boh ho) tee 30D) 手工 预测 表 列 Try-Inh AA. Pa Pb Pt fan fac fbn fbc te 44 Asn 0.93 0.94 1.15 0.81 0.98 1.17 1.01 0.50E-04 11 45 Phe 1.12 0.92 0.93 0.86 0.87 1.29% 1.16% 0.49E-04 01 46 Lys 1.21 0.67 0.96 1.08 0.93 1.09 1.09 0.17E-04 01 A7 Ser 1.18 0.62 1.07 1.31 1.01 0.85 0.99 0.57E-04 O01 43 Ala 1.16 0.73 1.01 1.54% 1.10? 0.73 0.83 0.82E-04 Ol 49 Glu 1.17 0.79 1.00 1.40 0.99 0.80 0.80 0.40F-04 01 50 Asp 1.04 0.93 1.05 1.11 0.96 0.95 0.76 0.11E-04 01 51 Cys 0.99 1.09 0.93.0.76 0.93 1.03 0.93 0.96E-04 10 52 Met 0.99 1.09 0.93 0.82 1.06 1.19% 0.94 0.60E-04 10 53 Arg 0.77 1.02 1.17 0.77 \1.23 1.03 1.06 0.13E-03= 10 54 Thr 0.67 0.97 1.32 0.72 1.30% 0.90 1.08 0.16E-03* 11 55 Cys 0.81 0.88 1.24 0.74 1.15 0.77 1.14% 0.14E-03% 11 FASCE) 片 眉 的 数据 输出 。Pa、Pb、P: DAIAURREAS—THOK 构象 潜能 《Pe>，