“Se ~ ‘ | f 5 | < > es - 人 ; EB Fea PDH PP es 蛋白 质 顺 序 分 析 技 术 RAK 编著 at #2 om fh 福 1988 HL Af ff 本 书 在 综述 蛋白 质 顺序 分 析 基 本 概念 和 知识 的 基础 上 ， 着 重 介 绍 测定 顺序 的 方法 和 技术 ,如 蛋白 质 裂 解 , 肽 侦 的 分 离 和 纯化 ,末端 残 基 测 定 * 手 工 液 相 和 固 相 微量 顺序 分 析 ， 以 及 高 效 液 相 色谱 在 蛋白 质 顺序 分 析 中 的 应 用 等 。 每 章 附 有 详细 的 实验 操作 和 主要 的 参考 文献 。 读 者 既 能 根据 书 中 介绍 的 方法 在 各 自 的 实验 室 开 展 工作 ， 也 能 了 解 有 关 技 术 的 最 新 发 展 概况 。 本 书 可 供 医 、 农 和 生物 学 中 从 事 蛋 白质 、 核 酸 及 其 他 生化 研究 的 工作 者 \ 研 究 生 和 大 专 院 校 有 关 专 业 的 师 生 参考 。 蛋白 质 顺序 分 析 技 术 QE BH 责任 编辑 RAM ER KBRH KH 北京 朝阳 门 内 大 街 1379 + OAK a AS Ail 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 ” 各 地 新 华 蔬 店 经 售 x 1933463 BB 一 版 FFA 3 7x7 x 1092. 1/16 1988 年 3 月 第 一 次 印刷 印张 : 14 172 Ae : 0001—2,500 字数 : 428.000 ISBN 7-03-000132-X/QO - 26 = tt: 3.55 前 言 在 当代 医学 和 生物 学 研究 中 ,* 蛋白 质 氨 基 酸 顺序 分 析 技术 是 不 可 缺少 的 手段 。 自 1955 年 英国 科学 家 Sanger，F. 发 表 胰岛 素 全 一 级 结构 以 后 , 蛋白 质 顺序 分 析 工 作 在 世界 各 国 竞相 开展 ,发 展 非常 迅速 。 根据 中 国 科 学 院 与 联邦 德国 马 - 普 学 会 的 交流 计划 ， 该 会 分 子 遗 传 所 的 Wittmann- Liebold, B. 博士 和 生化 所 的 Edman-Henschen, A. 博士 ,应 邀 于 1980 年 10 月 在 上 海 举 办 蛋白 质 微 量 顺序 分 析 讲习 班 ， 对 我 国 开展 蛋白 质 顺序 研究 起 了 很 好 的 促进 作用 。 为 了 交流 经 验 ， 推 动 我 国 蛋白 质 顺序 研究 工作 的 广泛 开展 ， 我 曾 参照 那 次 讲习 班 的 基本 内 容 , 查 阅 了 大 量 的 文献 资料 ,并 结合 林 人 工作 中 的 经 验 体会 ,编写 过 讲义 和 讲稿 , 先 后 于 1983 年 和 1984 年 在 北京 和 东北 等 地 区 举办 过 和 蛋白质 顺序 分 析 技 术 讲习 班 。 这 本 书 就 是 在 此 基础 上 进一步 修改 ,补充 后 写成 的 。 Ais 在 编写 过 程 中 ， 中 国 科学 院 生物 物理 研究 所 的 许多 同志 曾 给 予 热情 支持 和 帮助 : 中 国医 学 科学 院 桑 植 权 研究 员 ( 第 十 一 章 )、 中 国 科学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 陈 远 聪 研究 员 (第 一 一 三 章 )、 中 国 科学 院 生物 物理 研究 所 王 志 珍 副 研究 员 ( 第 十 章 ) 和 哈尔滨 医科 大 学 曾 立志 (第 十 一 章 ) 等 同志 在 百 忙中 对 有 关 部 分 进行 了 审阅 ,提出 了 许多 宝贵 意见 ;特别 是 中 国 科学 院 生物 物理 研究 所 雷 克 健 副 研究 员 仔 细 审 阅 了 第 一 一 十 章 , 并 作 了 认真 修改 ,在 此 一 并 表示 感谢 。 由 于 我 的 水 平 有 限 , 缺 点 和 错误 在 所 难免 ,欢迎 读者 批评 指正 。 徐 秀 璋 1985 年 5 月 于 北京 watt ee oe RE a3 Rett ea : 站 本 We Hh Oy , ea as eT i, © ‘ a oe ree ) 4 Cees okie tage Shor yh aries Spee 4 P a SR re .* ; » 二 rT es A ae 第 一 章 序 并 eee eee 1 =a = bid ll aceew il Shs Qe ee 1 二 、 历 史 回顾 与 现状 Ne 2 =) 展 Meee 10 第 二 章 “” 蛋 白质 顺序 测定 的 一 般 方 法 、 步 又 和 基本 战略 pp 14 一 、 和 蛋白 质 的 肽 链 结构 pe 14 (一 ) 蛋白 质 的 结构 单位 一 一 氨基 酸 aeeeseeooeooooooooeoooosoooooooooooooooooosooooosooeoooooooooooooeoo。 14 (=) 蛋白 质 顺 序 的 含 章 “ee 17 二 、 样 品 的 纯度 要 求 oo 18 三 、 顺 序 测 定 的 一 般 方 法 和 步骤 pp 19 (一 ) 顺序 测定 前 的 准备 ee。 Seg>paaeeheanpeee 19 ¢=3) 二 硫 键 的 断裂 aooeeesoeeooeoooeoosoooosooooooooooooooooooooesoooooooooooooooooooooooeosoeosoooeoooeososeooossso。 19 (三 ) 顺序 测定 的 一 般 方法 和 步骤 seoeooeosoosoooooeosooosoeooosoeooeoeoosoiooeoooeoooeooeoooeesoooeosoesessseo。 21 四 、 顺 序 测 定 的 基本 战略 ppp 22 第 三 章 和 氨基酸 组 成 分 析 5 EN 25 一 、 引 Fe .ee 25 二 、 氮 基本 自动 分 析 的 原理 及 有 关 仪 器 简介 pe 25 (一 ) 氨基 酸 自动 分 析 仪 的 一 般 构 造 及 功能 25 (二 ) 氨基 酸 自 动 分 析 的 原理 oooeeeesee seen seen 28 三 、 蛋 和 白质 样品 的 水 解 处 理 O0,0.0.6.0.00,0.0.0.0 0.00.00 veccieevcesecccsees ces. ccessecalsstineboccesesciemece 33 (一 ) 盐酸 水 解法 ea ceceyandcunecsanan docccscdua tre ses desssckoaas sect nas chaapaemeans man dacaicheacemaehicnas ss 34 0 37 本 Sop cednhees¥stib ene snl deb ewecnnases conus yenedgsaecaia 39 (四 ) 酶 永 解 法 .os eeeioeeeeieiee seven 39 四 、 氮 基 酸 组 成 分 析 的 误差 纠正 Sevoco 39 Ties 氨基 酸 残 基数 的 计算 aeeeeeeeoseseeeooeoeesososeoeoeseeoeecoeeooesoeeeseoeeeiesesaessoaeeeeeeeu 40 Sus 蛋白 质 的 裂解 eoecircvcceevccceswcecees ene ceceteccccccccoccuueepccvessceeceesecccvcecocoeseas 44 | -二 over 44 =. 蛋白 质 的 酶 裂解 ooesoeswoesoeseseosoooooosoeooseoeseeesesoeeeeeoeeeooooeooooeesoesoeeooooee。 44 (一 ) TR] TR oooooooovooooosoi oo viooi veooesoovciooiv 44 c=) 几 种 常用 的 肽 链 裂 解 酶 eeossss6oa56055e56o55000058050858esesoeaossodaosoesesseoeeooee5eseedeee oos 45 (=) 近年 来 发 现 的 几 种 高 特异 性 的 肽 链 内 切 酶 “ee 50 (四 ) SEER TT TE ooccececccccccccnccccscccasccsccsccrecccsscnscnssessesasesasansescecsansenscosseese. sossieo。 52 三 、 和 蛋白 质 的 化 学 裂解 cov eecececncceceecencccccceccscensesectentsacenseesseeeesaseseseessenees 54 (一 ) 省 化 氰 裂解 ooooo9oeoeeeoeseoeoeeeioeeoeee oooeiooe 55 () FFB ZU cneessecrecccessnnntaceccessccoccsescncscscccsscenssssceseesensncaeseessnnsesessensensoarsns 57 (三 ) FERRARO BLE nrecceeceenecreceerenetnreneterenstertnrsettessnetersenteneessaccasaaeseaeeesaes 59 CB) PASE AME. Secerosneasosecadsunvossapssenassuhgensniegs -=gyvhspere oSegern 9 -diiiae, Saeai aaa 61 第 五 章 ” 肽 段 的 分 离 纯 化 pp 65 一 、 引 言 .pe 65 二 、 凝 胶 过 波 层 析 pe 65 (一 ) 基本 原理 pp 65 (二 ) 凝 胶 的 类 型 pe 67 全 69 三 、 离 子 交 换 层 析 .ppp Pe sr 74 (一 ) 一 般 原 理 ee 74 (二 ) 畜 子 交换 痢 的 种 区 中 2 75 (三 ) 实验 方法 po pasar 86 PO, BARS EE HTSY BR 二 83 (一 ) 基本 原理 和 一 般 情 况 介绍 ee 83 . (二 ) SBT RE 0 85 五 、SDS 凝 胶 电 瀛 pp 86 BEAL EE 末端 氨基 酸 残 其 的 测定 pp 0 89 一 、N 末端 测定 .pp 89 (一 ) FDNB 分 析 法 .ee 89 () DNS 4} PFPE cowascansesccecacnscnssovacensoessccaacaccussesececoscnsensoudsnattqeser 于 生生 全 95 (四 ) DABITC 法 Vonctevecce camectcice Seticectlddite suse dee ween ace uustoseaacel che 可 所 各 se ecereewenes 97 (五 ) UPRMERE | 2 ebeaesecaaeticeptsacdsss.. Moca TE BO oe late lee aes 97 CF) No FES SESE BUIN HOM GE oo eee e cee cd esos sce cdecesceccencnesercccenentscecasnesssonsesncnens 98 ZC} FR MEM GE vee tenet eee eet scenes ceeeeeeneenennetneeeeccecceccecsnscecscenenecussusenessnpes 102 (一 ) FERRE weeee cee ceeeeeeceeecceteecceeeececsnececcnecncseesecsencsccencencensensansanseneeeseetenseerens 102 (二 ) Zi PABEFRIR RE cocewececcececssesceccccecceececsenseeceesesesescecassseceeceoenssaseceesebeeresceneens 104 (=) C Feo VERE MEATPRIBRE eee eee 村 于 104 (四 ) WRB C 未 端 测定 pe 105 CEL) FREE sscceessncescuanesdeescassceees escent tssdoceveepeocencseeqens sen absesnceronsedubs sapesgsheeng CF) FRIRHBRE o+-e-seccoenseccarenceaeivensenanes scanenvasasaive candeesdessccoues nad th Salaihs Maamaneaanae 106 第 七 章 手工 微量 顺序 测定 技术 pp se eeeees ee111 一 、 手 工 Edman {L232 PE HR GE ppp 111 (二 ) 实验 方法 ceceececccccccccccpececccccceveecccscrecsserscssecsesessqercscscsssssessesasassensseeceesens 113 CH=). PTH- REPAID US IE coccccvccccescosccoccescoesenses see sauswancleseccedenssessiossncsioessedastuaccseuue 114 =, DNS-Edman_ 测 顺序 法 -n-eee eee eee Agadth hab beh clap a vnkio 3 cnibh « Bawin wee Sioe ooh aus One een 120 So Pe Edman’ HNP RE Be vovecewwrssewnsaseseresswwes sovwvesteuweastateveat ate 0G} «oe 121 PY. DABITC/PITC 双 偶 合法 .ee ee。 122 (Fo 言 co ccnsceccevcccvccccccevecvesccnssccccevsvcauumecovcecscusascasseccudcvelutwewdvdsbsusctosstsuceunn t2z (二 ) 原理 .ee 123 (三 ) 实验 方法 ee 124 五 、 氨 肽 酶 降解 法 pp 129 第 八 章 ” 固 相 上 顺序 分 析 技 术 pp 133 一 、 载 体 的 选择 及 制备 sstseseereeeeeceescaceecsersecccsssscssssscaceucesscetcncccncenoaneesees 133 (一 ) 载体 的 选择 < (二 ) 载体 的 制备 eeocoeeeaeeeeeeeseeee 136 二 、 固 定 蛋 白质 或 多 肽 的 原理 及 方法 pp 137 (一 ) 对 葵 二 蜡 硫 氰 酸 (DITC) 法 ee 137 Ca) 高 丝氨酸 内 酯 法 ce ensce gee ae 141 C=) TKRPE PR WAR (EDC) 法 eeeeee cos 144 三 、 双 偶合 法 在 手工 国 相 顺 序 测 定 中 的 应 用 BES ae ee ee ee ee 146 (—) 用 EDC 方法 固定 胰岛 素 A 链 机 让 全 四 sees 146 =) 双 偶 合 手工 固 相 法 顺序 测定 assseseaseesee5aeeaess5o5esesossssesseaeoaeeeaessaeeea5eoaeeeeseaseeaeea 147 (=) TLC 鉴定 及 结果 coceeecccceeceeeeeeerereees gooeooeoeooooooooooeooo。oooooeo。 机 147 四 、 固 相 法 测 顺 序 的 优 缺 点 aalain Ung delewns a ackvlenie salambianue mnietana sis te ciel shia sas'cle ste ationag'els oa cen)s 149 (—) 固 相 法 的 优 缺 点 oaeeseoesoesoeeosoeososoeoooesooooooooooesooooooooooooss。。 ee 149 CX) FAAS RERUN ERO RR REI wn own cnneccecscccencccreccenseccesscctesconseenessonssceseseccsscoesees 149 第 九 章 ”蛋白 质 自动 顺序 分 析 仪 pp 155 EN = 6 2 =| Us eae ie) Ge eer ere eee ere 155 GEE Navencs-coscnussavedodccsonacecttcdtelaee ese ett a ee SL BE EG...) 155 (二 )》 流 相 顺 序 仪 的 一 般 和 构造 原理 .ee 156 (=) 蛋白 质 和 小 肽 样品 在 液 相 顺序 仪 中 的 降解 157 本 9 和信 5Pol7brEGt 相 大 必 就 和 $d tee hipaick ee ovate a 158 二 、 目 动 固 相 顺序 仪 pv ore159 sr 159 C=) AFBI FE (I — AH FH nn vwwececescccsccnnccccecccnseccencensescoesscnencccsccceasccens sess 159 (=) 固 相 顺序 仪 的 微量 顺序 分 析 ee 161 =, SCAB RN coccce cece ccccrccccccccccccccccncsencnccenscscnrcncsenserecsecseeceessessenessees 162 le iain eh Disk ondipatldnemmanepnandanvisduaesessescsencastavensedabelpidsseseisadshennnewsesasacecsns 162 C=), SUPE I RE FE RF naw ww ence n nce cccscctcnteccccscrscccndavevonsocssvecesonsessecceccess 165 第 十 章 ， 高 效 液 相 色谱 在 蛋白 质 顺 序 分 析 中 的 应 用 ppp 167 一 同人 - 167 二 、 高 效 液 相 色谱 仪 的 一 般 构造 原理 .pp 本 167 =. FFA CRA i RAR BS Le EG RAK PP 172 (—) PRE TAA sse 172 CE 应 用 示例 sesaa5aseao5es5osss5as5as 才 sweeSew ee 175 PQ. Edman 降解 产物 的 高 效 液 相 色 谱 .pp 180 (—) PTH- 氨 基 酸 高 效 液 相 色谱 …… et 180 (=) DABTH- 氮 基 酸 高 效 液 相 色谱 .pe pasha sseneOv se vaneavecod@uauedausteatedss. 185 (=) DNS- 氨基 酸 的 超 微 量 高 效 液 相 色 谱 .ae 186 第 十 一 章 ， 顺序 分 析 技 术 在 异常 血红 蛋白 结构 研究 中 的 应 用 PP 189 全 vesnann on egrsnvoorworirnaronrnavsapnesawey oemieaernime no 189 二 、 异 常 血 红 蛋 白化 学 结构 分 析 pe 194 (一 ) 血液 标本 的 采集 和 溶血 液 的 制备 ee 194 (=) 珠 蛋 白 的 制备 .ee 195 (=) 异常 肤 链 的 分 离 及 其 氨 乙 基 化 ee 195 (四 ) 胰 蛋 白 酶 水 解 “eeeeeeeeeeeeseesen 和 esi esininos sosonassososeos 196 (五 ) 酶 解 片段 肽 的 分 离 oo 本 199 (FS) 异常 肽 的 三 次 酶 解 和 分 离 2 203 (七 ) 不 溶性 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 的 处 理 pe 203 ( 八 ) 异常 肤 的 氨基 酸 组 成 分 析 和 和 拨 基 酸 顺 序 测 定 “pe 204 附录 一 ”常用 英文 名 字 缩 写 ppp。 .205 附录 二 部 分 试剂 和 溶剂 的 纯化 oooooosoooooooooooooooooo ooooooooooooooooooooooacooooeooeeaeo 206 附录 三 ”氨基酸 的 一 些 物理 常数 pp 207 附录 四 “缓冲 溶液 的 配制 ween ec ee ee ec ec ee cee cer eer eee ees cerca teeccereereetensersensenteneoeees ……209 (一 ) 几 种 特殊 缓冲 液 的 配制 .…………. Seer 209 (二 ) BE FBR Be Ba Billnw-o ence scence eccceccnsccnescoesccecteneressccensconsenswstonsseseesaes 209 (三 ) 标准 缓冲 液 的 配制 pp 214 BRE TL BS FR pp 215 (一 ) 某 些 有 机 溶剂 的 主要 物理 常数 ee 215 (=) 实验 室 中 常用 酸 碱 的 比重 和 浓度 的 关系 .pp 216 (=) 常用 固态 化 合 物 的 当量 浓度 (或 mol 浓度 ) 配 制 参考 表 pe216 (四 ) 常用 酸 碱 的 强度 .ppp 217 附录 六 “硫酸 铵 饱和 度 常 用 表 pp Ce 1 218 (一 ) 调整 硫酸 铵 溶液 饱和 度 计算 表 .ppe ceeeeeeene eee 本 218 一) 调整 硫酸 约 深 该 忻 和 度 评 算 表 nr 218 (=) 不 同 温 度 下 的 饱和 硫酸 我 溶液 浊 ee 219 BSE HUF FOF IRF pp 220 (== JHE FAIA 和 220 (二 ) FRR Fillecceereeeccecccecceccccccccccsenesesenseesserscsserensenrsersessessessessessesseseesees 220 二 vi e 第 一 章 序 F 一 、 有 蛋白 质 顺 序 分 析 的 意义 蛋白 质 是 构成 生物 体 的 一 类 十 分 重要 的 有 机 含 氮 化 合 物 ， 是 生命 的 物质 基础 。 蛋 白 质 是 多 种 多 样 的 ,并且 行使 不 同 的 功能 。 例 如 ,新 陈 代谢 中 的 各 种 化 学 反应 就 是 在 多 种 特 异 的 蛋白 质 酶 的 催化 下 进行 的 ; 作为 调节 代谢 过 程 的 激素 、 防 和 红 外 来 物 侵袭 的 抗体 以 及 与 遗传 控制 有 关 的 核 蛋 白 等 ,也 都 是 由 蛋白 质 或 它们 的 衍生 物 构 成 的 ;生命 现象 的 各 种 活 动 ; 如 呼吸 运动 \ 营 养 输送 、 神 经 传导 、 记 忆 思 维 等 ,也 是 通过 和 蛋白质 来 实现 的 。 蛋 白质 的 不 同 功 能 是 以 其 特定 的 结构 为 基础 的 。 所 有 和 蛋白质 不 论 功能 和 来 源 如 何 ， 均 由 二 十 种 基 本 氮 基 琶 组 成 。 氨 基 酸 按 不 同 的 顺序 排列 ,构成 蛋白 质 的 一 级 结构 ,在 此 基础 上 建立 起 相 应 的 二 级 、 三 级 以 至 四 级 结构 。 不 同 的 蛋白 质 行使 不 同 的 功能 ， 这 是 通过 其 特 定 的 结构 来 实现 的 。 一 级 结构 决定 高 级 结构 ; 蛋白 质 的 功能 归根 结 底 是 它们 一 级 结构 的 反映 。 因 此 , 措 清 不 同 蛋 白质 的 BRIM, PRS AP SSA A 功能 及 其 与 生物 进化 .遗传 变异 的 关系 ， 这 是 当代 生物 化 学 的 重要 组 成 部 分 吓 。 事实 证 明 ,通过 蛋白 质 顺 序 分 析 的 研究 ， 加 深 了 对 生命 科学 的 了 解 ， 推 动 了 分 子 生物 学 的 飞 妈 发 展 ， 同 时 对 国计民生 也 作出 了 一 定 的 贡献 。 (1) 蛋白 质 氨基 酸 顺 序 的 研究 使 古 老 的 进化 论 研 究 获 得 了 新 生 。 从 某 种 意 义 上 上 上， 蛋白质 一 级 结构 可 作为 “ 超 微 化 A”> Margolish, E. 及 其 同事 只 从 五 二 人 SHARAD eK 汪 生生 攻关 的 细 失 所 实 2 RERPROTTING Mie 全 面 研究 了 它们 的 氨基 酸 顺 序 变异 、 揭 ， 每 一 个 圆圈 表示 一 种 细胞 色素 “ 的 顺序 是 从 此 图 发 出 的 各 分 示 也 蛋 自 质 分 子 在 生物 进化 中 的 变 化 5 REMDHRAREM. MLA TOMER SEMAN 人 人 和， 的 雪人 异 ;绘制 了 种 属 发 生 树 ,显示 出 这 些 物种 物化 学 ?细胞 结构 与 功能 的 分 子 基础 ， Te p. 之 间 的 进化 关系 (图 1-1)。 223 £1281). (2) 3 RAE NUE DESC HET SUE ce CE AT 9 E]—PSE BB e 如 只 有 单条 多 肽 链 的 肌 红 蛋白 与 有 四 条 多 肽 链 的 血红 蛋白 具有 相当 多 的 顺序 同一 性 ， 两 种 蛋白 质 在 它们 的 亚 铁 血红 素 基 团 上 都 有 可 逆 地 与 氧 结合 的 能 力 , 只 是 前 者 来 自 肌 肉 ,后 as ° 者 来 自 红细胞 ， 因 此 它们 有 可 能 来 自 同 一 祖先 。 这 个 祖先 很 可 能 具有 一 条 单 链 及 一 个 单 纯 的 亚 铁血 红 素 基 团 巴 。 以 上 例证 还 揭示 了 蛋白 质 在 进化 上 的 另 一 个 重要 现象 一 一 基因 复制 。 (3) 在 医学 上 ,分 子 病 就 是 在 研究 蛋白 质 氨基 酸 顺 序 中 发 现 并 提出 来 的 ， 从 而 在 蛋白 质 分 子 水 平 上 了 解 病变 的 机 理 。 如 镰刀 状 贫血 患者 的 血红 蛋白 与 正常 人 的 血红 蛋白 分 子 比较 , 仅 在 8 链 上 存在 一 个 氨基 酸 的 差异 ， 即 第 六 位 的 谷 氨 酸 突变 成 顷 氨 酸 ,导致 功能 上 的 缺陷 名。 最 近 报 道 ,美国 国立 癌症 研究 所 Barbacid 和 麻 省 理工 学 院 的 Weinberg 发 现 ， 膀胱 癌 细 胞 中 分 子 量 为 21,000 的 一 种 Pn 蛋白 ,与 正常 细胞 的 蛋白 质 相 比 ， 也 仅仅 是 一 个 氨基 酸 的 差异 , 即 正常 的 第 12 位 甘氨酸 被 顷 氨 酸 所 取代 ,因而 发 生 瘤 变 。 现 已 清楚 ， 氢 基 酸 残 基 的 置换 是 基因 突变 造成 的 ,这 一 重大 发 现 将 为 癌 研 究 开 辟 新 的 前 景 。 (4) 蛋白 质 顺序 研究 在 医学 上 的 意义 还 在 于 为 合成 某 些 生物 类 药物 提供 依据 。 有 了 一 级 结构 的 分 析 基础 ， 我 们 就 有 可 能 在 多 肽 药物 方面 设计 合成 新 的 药物 。 我 国 在 一 种 多 肽 性 激素 即 促 黄体 释放 激素 一 级 结构 阐明 的 基础 上 ， 利用 多 肽 合成 技术 解决 了 访 激 素 的 生产 技术 ,在 淡水 养殖 上 推广 应 用 发 挥 了 很 大 经 济 效益 。 以 上 事例 说 明 ， 在 生物 学 和 医学 研究 中 ,蛋白 质 顺 序 分 析 是 揭示 生命 本 质 、 曾 朋 结 构 与 功能 的 关系 、 研 究 酶 的 活性 中 心 和 蛋白 质 的 高 级 结构 的 基础 ,也 是 当代 前 沿 科 学 一 一 基 因 工 程 中 研究 基因 表达 、 克 隆 和 DNA (或 RNA) 顺序 分 析 的 重要 内 容 。 历史 回顾 与 现状 在 一 个 世纪 前 ， 有 人 曾 提出 蛋白 质 结构 肽 的 假设 ,但 长 期 以 来 ,人 们 无 从 着 手 研究 并 真正 了 解 它 , 直 到 1955 年 英国 著名 科学 家 Sanger, F. 发 表 了 胰岛 素 的 全 部 氨基 酸 排列 顺 Fe, 从 而 开创 了 研究 蛋白 质 一 级 结构 的 新 纪元 ,Sanger 的 这 一 贡献 是 分 子 生 物 学 发 展 进程 中 的 一 个 重要 突破 ,因此 获得 诺 贝 尔 化 学 奖 。 但 由 于 受 实验 技术 的 限制 ,Sanger 当时 采用 的 是 比较 简单 的 方法 :如 氨基 酸 组 成 分 析 是 用 纸 层 析 法 ,N 未 端 及 N 端 顺序 测定 是 用 DNP 法 ,不 仅 费 时 而 且 要 消耗 过 多 样品 ,尤其 是 非特 异性 裂解 法 , 肽 段 的 分 离 相 当 困 难 。 Sanger 和 他 的 同事 用 了 上 百 克 的 胰岛 素 , 整整 花 了 十 年 时 间 才 完成 了 胰岛 素 的 二 级 结构 测定 。 尽 管 目前 分 析 方法 已 完全 改观 , 但 Sanger 当时 的 一 些 基本 战略 仍 被 广泛 采用 ， 在 Sanger 开拓 性 工作 的 直接 影响 下 ,蛋白 质 顺 序 分 析 研 究 于 六 十 年 代 达 到 高 峰 w1963 年 美国 洛克 非 勤 研 究 所 的 Moore，S， 和 Stein, W. 完成 了 第 一 个 酶 蛋白 一 二 核糖 核酸 酶 的 顺序 分 析 。 这 是 一 条 有 124 个 氨基 酸 残 基 的 单 链 ， 含 有 四 个 二 硫 键 。 他 们 对 Sanger 的 方法 有 如 下 的 发 展 : (1) 发 明了 氨基 酸 自 动 分 析 仪 ; (2) 用 离子 交换 柱 层 析 分 离 梅 解 后 ORK BES (3) 采 用 Edman 顺序 降解 法 。 他 们 卓有成效 的 工作 ， 大 大 加 快 了 顺序 分 析 的 进 程 ,推动 了 蛋白 质 顺序 测定 。 最 明显 的 例子 是 六 十 年 代 初 ,美国 和 法 国 的 两 个 实验 室 成 功 地 测定 了 血红 蛋白 两 种 多 肽 链 的 氨基 酸 顺 序 。1968 年 Edman 和 Begg 研制 的 自动 液 相 Fe WL? Fa ey Laursen (1971 年 ) 创 建 的 自动 固 相 顺 序 仪 四 的 问世 ,使 蛋白 质 氨基 酸 顺 序 研究 工作 的 面貌 焕然 一 新 。 图 1-2，1-3 和 表 1-1， 表 1-2 示 出 蛋白 质 顺 序 分 析 的 进展 情况 。 从 下 述 图 表 中 不 难看 出 ， 进 入 七 十 年 代 后 ， 蛋 白质 顺序 分 析 又 获得 迅猛 的 发 展 。 据 -“ 2e 15000 120 100 ~ 10000 cs RK g¢ al a ia = 60 5000 40 20 1955 1960 1965 1970 1975 年) 1955 1960 1965 1970 1975 (年 ) 图 1-2 1955—1976 年 测定 的 新 的 蛋白 质 (大 于 70 1-3 1955 一 1976 年 测定 的 蛋白质 顺序 残 残 基 ) 顺 序数 基数 表 1-1 过 去 三 十 年 中 测定 一 条 50 个 残 基 肽 所 需 的 样品 量 和 时 间 年 $3 表 1-2 过 去 三 十 年 中 蛋白 质 顺 序 测 定 的 进程 年 ” 份 被 测定 的 蛋白 质 顺 序 残 基数 1955 胰岛 素 51 1961 mAs A B 145 1962 血红 蛋 自 的 w 链 141 1962 细胞 色素 c 105 1963 核糖 核酸 酶 124 1963 溶菌 酶 129 1965 肌 红 蛋 自 153 1965 病毒 外 壳 蛋 白 159 1966 . 胰 蛋 白 酶 原 216 1967 甘油 醛 3- 磷 酸 脱 气 酶 340 1969 免疫 球 蛋白 > 链 446 1973 SP ERE bo HE 537 1975 血清 白 蛋 白 585 1977 兔 肌 肉 磷 酸 酶 841 1978 B-*E FUR BS 1,021 1981* 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 1,407 * 是 用 CDNA 方法 推导 的 。 Edman 估计 , 1976 年 已 定 出 的 顺序 总 数 为 8 万 氨基 酸 残 基 , 三 年 以 后 达到 16 万 个 残 基 ， 完成 近 1,100 个 蛋白 质 全 部 顺序 。 在 这 期 间 , 主 要 因为 自动 氨基 酸 分 析 仪 、 上 自动 波 相 顺序 仪 、 自 动 固 相 顺序 仪 和 高 效 液 相 色谱 仪 等 仪器 的 出 现 , 以 及 不 断 创造 的 新 方法 和 新 技术 在 顺序 分 析 中 得 到 广泛 应 用 。 MA 1-2 和 1-3 也 可 以 看 到 ,到 七 十 年 代 后 期 ,顺序 分 析 的 发 展 速度 开始 慢 下 来 了 。 蛋白 质 结构 研 究 进展 迟缓 的 原因 很 多 ,其 中 非常 重要 的 一 点 ,是 目前 采用 的 研究 技术 和 方法 跟 不 上 生物 学 日 益 发 展 的 需要 。 现 在 测 蛋 日 质 氨基 酸 顺 序 常 规 的 基本 方法 仍然 是 Edman 降解 法 。 尽 管 有 现代 化 顺序 仪 、 氨 基 酸 分 析 仪 和 高 效 波 相 色谱 仪 等 可 供 利用 ,但 是 效率 依然 不 高 ,特别 是 测定 大 分 子 量 (5 万 以 上 ) 的 蛋白 质 ( 见 图 1-8,1-9)。 又 因为 用 Edman 降解 法 一 次 连续 降解 次 数 有 限 , 而 未 知 的 蛋白 质 桩 品 分 离 纯化 又 相当 困难 ,对 于 较 大 的 蛋 白质 桩 品 , 用 酶 法 或 化 学 方法 裂解 成 肽 段 后 ,往往 遇 到 不 溶 甚至 聚集 等 问题 ， 给 分 离 纯化 带 来 很 大 困难 。 还 有 样品 量 的 问题 ， 有 的 蛋白 质 如 受 体 ， 要 想 提 取 上 百 微 克 量 已 相当 困 难 。 因 此 ,如 何 使 顺序 分 析 快 速 化 \ 微 量化 ,已 成 为 各 国学 者 共同 关心 的 问题 。 为 了 促进 顺序 测定 工作 的 开展 ,从 1975 年 开始 ,每 两 年 举行 一 次 世界 性 专题 会 议 , 交 流 、 探 讨 有 关 蛋 白质 顺序 分 析 中 的 新 技术 、 新 方法 和 它 的 战略 思想 问题 。 本 节 里 只 简要 介 绍 有 关 微 量 分 析 的 新 技术 、 新 方法 上 的 进展 情况 。 其 它 一 些 内 容 , 诸 如 顺序 分 析 中 的 有 关 ” 战略 思想 \ 高 特异 性 蛋白 质 水 解 酶 以 及 肽 段 的 高 效率 分 离 纯 化 上 的 进展 等 ,读者 可 参见 后 面 的 有 关 章 节 。 (1) Edman 降解 试剂 和 方法 上 的 改进 过 去 的 减法 Edman 方法 .Dansyl-Edman 方法 都 是 在 Edman 方法 基础 上 加 以 改进 。 1976 年 外 籍 华 人 张 瑞 耀 提出 一 种 新 的 Edman 反应 试剂 一 DABITC。 利用 DABITC/ PITC 双 偶 合法 测 顺序 , 无 论 是 手工 的 还 是 自动 的 , 固 相 方法 或 是 液 相 方法 都 很 有 效 ， 灵 敏 度 比 常 规 Edman 试剂 提高 1 一 2 个 数量 级 ( 详 见 第 七 章 )。 (2) 顺序 仪 设计 上 的 改进 和 创新 液 相 顺 序 仪 ， 由 于 在 伴 取 时 样品 损失 及 机 械 损 失 等 原因 ， 一 次 连续 降解 步 数 员 4 能 在 20 一 40 步 ,所 用 样品 量 也 大 (通常 二 50nmel) , 后 来 在 机 械 上 作 了 改进 , 如 提高 反应 标的 真 空 度 , 但 效果 不 明显 。1978 年 ,在 反应 杯 中 引入 Polybrene (一 种 四 级 氨 盐 聚合 物 ) 后 ,使 一 次 连续 降解 步 数 增 至 60 甚至 80 步 ， 且 祥 品 需 要 量 减 少 为 1 一 10nmol。 1981 年 Hewick, R. M. 和 Hunkapiller, M. W.™ 研究 了 一 种 新 型 的 顺序 仪 一 一 气相 顺序 仪 (Gas-Phase Sequencer), 只 要 5pmol 的 样品 量 就 能 上 机 测 顺 序 ,试剂 和 溶剂 的 消耗 量 仅 是 一 般 液 相 仪 的 十 分 之 一 ,给 微量 化 快速 化 的 分 析 提供 了 有 效 的 手段 ( 详 见 第 八 章 )。 (3) GC-MS 联 用 仪 进入 了 多 肽 顺序 分 析 行 列 质谱 法 是 不 同 于 Edman 化 学 降解 法 的 物理 化 学 分 析 法 。 其 原理 如 图 1-4 所 示 。 固体 或 液体 试 样 的 蒸汽 或 气体 分 子 受 一 定 能 量 的 电子 冲击 时 ， 将 形成 带 正 电 荷 的 离 子 , 在 电场 和 磁场 的 作用 下 ,离子 会 按照 试 样 组 分 物质 的 分 子 质 量 z 与 电荷 < 的 比值 ( 盖 /< 称 质 荷 比 ) 大 小 而 被 分 开 ,形成 一 定 的 谱 线 排列 ,这 叫做 质谱 ;, 若 用 照相 等 方法 将 质谱 记录 下 来 ,这 种 仪器 叫 质谱 仪 ; 若 借助 于 电子 学 方法 将 质谱 中 表现 的 各 条 谱 线 强度 显示 出 来 ， 这 种 仪器 称 质 谱 计 。 有 目前 商 售 的 质谱 仪 ， 尤 其 是 质谱 计 的 种 类 繁多 。 它 们 的 主要 部 件 可 分 为 离子 源 、. 电 场 、 磁 场 和 收集 器 或 记录 显示 系统 四 部 分 。 从 质谱 图 可 知 ， 被 测 分 子 的 单 SS 4e C fan) BEY — Be) GE GE ELC SG Yh FG pee ea ee EEO . ‘HO bag = = am | | z80L iW SHOO-- D- HO—N— pe Ho-—N— 3—HO—N—9O—HO—N— 9—HO— N— 9—HO—N— 9--"HO —N— 9—*HO oF | oF | i | if | I | I | I | *(zHD) at "HO OO es or ra ay re) | iN *HO— O—N "HO i Sa *HO fried te O ‘HO £2 (o8v) 1 ‘HO i la SS ene aed . 046'AA" SEEDO 一 9—HO—N— 9 —HO—— N— 9—HO— N— 9—HO— N— 9—HO— N-- D 一 多 0 一 人 一 D 一 "HE9 一 上 一 o— HO fl Vy ee ee SS OE TL il 【 re) he ug O '#0 ‘HO O HO. O ‘HO O "HO O "HO re) re) B13 甲 基 化 衍生 后 各 种 氨基 酸 的 质谱 值 (m/e) A B Cc HE 衍生 的 结构 N 端的 质谱 值 | Rae | < 端的 质谱 值 甘氨酸 —N—CH,—CO— 114 71 102 Rak 一 N 一 CH 一 CO 一 128 85 116 og ots —N—CH--CO— 156 113 144 Guteesy, CH; 亮 氨 酸 wet ch 170 127; Fi 158 | OH, | CH(CHs); CH, | 丝氨酸 —N--CH—CO— 158 115 146 CH, 苏 氨 酸 一 N 一 C 了 五 一 CO 一 172 129 166 天 冬 氨 酸 —N—co—_co— 186 143 174 精 氨 酸 —N—CH--CO— 199 156 187 BAM IE —N—CH-—CO— 213 170 201 CO 一 N(CH; )a 续 表 1-3 — i 62 6 Naan | 残 基 的 质谱 值 |< san pein CH, 葵 丙 氨 酸 HD 204 161 192 én -O) CH; MAR -Non 一 CO 一 234 191 222 cH, - » Ss mr CH; s eae vr:te Gtbhae 257 214 245 «Chia TO de CH, RA Sn cae Gee 241 © 198 229 | (CH: ),—N(CH3) co 一 CH CH, | ca RE cH, Imidazoie —CH, CH; : | a8 — N>--CH-—COo— . | (CH,)s N(CH) i CO-—CH, H, Cc CH, \ 位 质量 数 就 是 相应 的 分 子 量 或 它 的 倍数 。 肽 链 中 的 不 同 氮 基 酸 残 基 ， 其 侧 链 基 团 (R) 的 质量 数 是 不 同 的 ,因此 在 质谱 上 显示 不 同 的 图 谱 , 即 可 推算 出 不 同 的 氨基 酸 残 基 及 它 的 排 列 。 以 七 肽 为 例 , 者 采用 碘 代 甲烷 作 甲 基 化 试剂 ,以 氧化 银 为 催化 剂 , 将 肽 键 上 的 N—H 全 部 甲 基 化 ， 上 述 肽 在 质谱 值 m/e 是 43,114,275,436,627 及 756 的 地 方 出 现 主 要 的 谱 四 | KK ne ae Saat oon 对 照 表 ,1-3， 即 可 确认 该 肽 念 端 前 五 CH; ee D 大 UU SN w \\ 检 出 屏 、 NS 加 速 电场 离子 源 图 1-4 质谱 仪 的 示意 图 - 个 氨基 酸 排 列 顺序 为 Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-, 为 什么 要 将 质谱 (MS) 和 和 气相 色谱 (GC) 联 用 ? 因为 气相 色谱 适合 于 分 离 复 杂 物 质 ,无 论 该 物质 含 的 多 种 分 子 是 具有 极 性 的 ,或 是 沸 程 范围 宽广 的 ,几乎 都 能 完全 分 离 ,万 其 对 一 些 挥发 性 好 或 热 稳定 的 化 合 物 分 子 效 果 更 好 s 质谱 仪 不 仅 灵敏 ， 而 且 非 常 适合 于 分 析 高 度 挥发 性 的 或 热 稳定 的 物质 ， 它 刚好 与 气相 色谱 分 离 组 分 的 数量 级 大 小 和 分 子 性 质 相 吻 合 ,因此 将 这 两 种 仪器 联 用 能 使 各 自 的 优点 充分 发 挥 出 来 。 GC-MS 联 用 仪 测定 肽 链 顺 序 的 要 点 是 : @ 将 待 测 的 蛋白 质 样 品 裂解 成 大 肽 眉 , 并 分 离 这 些 肽 段 。 @ 将 各 个 大 肽 仆 裂 解 成 更 小 的 肽 段 。 @@ 再 次 分 离 肽 段 ,并 进行 部 分 水 解 。 这 时 形成 的 肽 眉 一 般 较 小 ( 几 个 或 十 几 个 残 基 )， 适合 GC-MS 分 析 。 @ 将 这 些小 肽 段 转变 成 挥发 性 的 衍生 物 (通常 是 N 末 端 烷 基 化 )， 然 后 送信 GC-MS 联 用 仪 分 析 。 @ 利 用 电脑 (仪器 配套 ) 对 测 得 的 质 荷 比 〈m/e) 参数 进行 大 量 分 析 后 后 ,就 可 确定 其 部 分 或 全 部 结果 。 @ 最 后 弄 清 楚 小 肽 顺序 。 图 1-5 是 测定 顺序 的 示意 图 。 用 GC-MS 法 测 多 肽 顺序 的 优点 很 多 ， 自 动 化 程度 很 高 ,只 要 数秒 钟 就 可 测 出 含 十 个 氨基 酸 残 基 的 小 肽 顺序 ,样品 用 量 很 小 。 现 已 证 明 , 用 这 个 方法 测 N 末 端 被 封闭 特别 是 酰 化 的 肽 有 顺 序 非常 有 效 。 二 所 叶酸 还 原 酶 是 第 一 个 用 质谱 法 测定 的 未 知 蛋白 的 全 顺序 ， 于 1979 年 完成 。 用 质谱 法 测 蛋白 质 氮 基 酸 顺序 是 大 有 前 途 的 ,有 人 预言 ?" 锯 , 将 来 此 方法 有 可 能 代替 传统 的 Edman 降解 法 ， 估 计 工 个 2 万 分 子 量 的 蛋白 质 只 需要 5 一 30nmiol 样 品 量 , 两 个 操作 熟练 的 工作 人 员 ， 用 1 一 2 个 月 时 间 就 能 完成 整个 顺序 分 析 。- 但 目前 看 来 还 有 它 的 不 足 之 处 ,如 m/e 的 测量 值 有 限 , 质 谱 图 很 复杂 , 解释 相当 困难 , 再 加 上 仪器 价 格 昂贵 \ 因 此 要 想 广 泛 应 用 * 还 有 许多 困难 。 (4) 用 测定 核酸 顺序 推断 蛋白 质 顺序 - ER 已 经 知道 ,遗传 信息 贮存 在 核酸 顺序 中 ,这 种 信息 能 指令 每 个 细胞 ， 按 照 分 子 遗 传 密 码 产 生 一 种 蛋 白 质 的 特征 性 结构 ,所 以 ， 在 每 种 蛋白 质 的 多 肽 链 中 ,氨基 酸 的 排列 顺序 归 根 到 底 是 由 核酸 的 核 昔 酸 残 基 顺 序 所 规定 或 编码 的 。 人 们 把 编码 一 条 完整 多 肽 链 的 核酸 分 子 片 段 称 为 基因 。 在 核酸 中 ,每 三 个 相 邻 的 核 苷 酸 残 基 称 作 一 个 三 联 体 密 码 , 每 个 三 联 o* gi 体 密码 编码 一 个 氨基 酸 。 基 因 通 常 存在 于 染色 体 中 。 在 核糖 体 进行 蛋白 质 生 物 合成 时 ， 它 并 不 直接 作为 模板 ， 而 是 基因 中 的 遗传 信息 首先 通过 酶 的 作用 转录 而 成 特殊 类 型 的 核糖 核酸 一 一 信使 核糖 核酸 (mRNA)。 它 的 核 昔 酸 顺 序 与 基因 DNA 的 核 背 酸 顺 序 是 互补 | 蛋白 质 | am am | om # | a LP i Lapa ) : | 计算 机 程序 a: A-B-C-D-B.------N-O-C-D A-B-C-D-B-+.--N-O-C-D Pi Pi 图 1-5 的 ,它们 的 三 联 体 密 码 也 是 互补 的 。 这 就 是 说 ，DNA 通过 RNA 中 间 模 板 而 与 它 编 码 的 多 肤 链 的 氨基 酸 顺序 一 一 对 应 〈 郊 图 1-6)。 遗 传 信 息 遵 循 DNA =~RNA 一 > 蛋白 质 的 方向 传递 。 因 此 , 通过 测定 DNA 的 核 背 酸 顺 序 可 以 推测 出 相应 的 蛋白 质 氨 基 酸 顺序 。 -其 方法 是 : 先 测 定 未 知 蛋 白质 的 肽 外 的 氨基 酸 排列 顺序 ， 然 后 利用 免疫 或 分 子 杂 交 分 离 出 相应 蛋白 质 的 mRNA, 通过 mRNA 反 转 录 成 为 DNA, AUREPRAS C. 胞 喀 啶 ，QU. PRRARES 引 自 A. L. 伦 宁 格 著 , 任 邦 哲 等 译 ;< 生 物化 学 :; 细胞 结构 与 功能 的 分 子 基础 > 上册， 科学 出 版 社 ?p. 58(1981), 此 外 ,还 出 现 一些 新 的 方法 ,如 通过 测定 蛋白 质 三 级 结构 推断 一 级 结构 ; 它 的 前 题 是 要 求 晶体 结构 的 分 辩 率 不 低 于 2 信 。 然 而 这 是 一 种 策 抽 的 办 法 ， 因为 测 高 级 结构 比 测 一 级 结构 通常 难度 更 大 ,个 别 的 有 可 能 做 到 ,但 要 普遍 推广 ,至 少 目 前 还 不 现实 。 利 用 核磁 共振 研究 蛋白 质 顺 序 是 新 近 开 始 尝 试 的 另 一 方法 , 测 很 单纯 的 小 肽 片段 顺序 虽 有 成 功 的 ， ERAS TESS HA SHH Be nine 综 上 所 述 , 自 胰岛 素 氨 基 酸 顺序 发 表 以 来 的 三 十 年 间 , 蛋 白质 氨基 酸 顺 序 分 析 取 得 了 飞速 的 发 展 。 这 些 成 就 的 获得 与 自动 化 仪器 的 出 现 以 及 技术 \ 方 法 的 不 断 改 进 密切 相关 ， 当前 顺序 研究 总 的 趋向 是 向 快速 化 \ 微 量化 发 展 , 这 是 生命 科学 日 新 月 异 发 展 的 需要 。 目前 测定 蛋白 质 顺序 最 基本 和 最 常用 的 方法 仍然 是 Edman 降解 法 ， 但 此 法 有 其 致 e« 10 « 命 的 弊病 ; 即 一 次 连续 降解 步 数 ( 循 环 数 ) 受 Edman 455 (PRA (ELA BLA 二 步 ) 的 产 率 限 制 。 反 应 产 率 与 降解 步 数 之 间 的 关系 是 : 99% 一 >120 步 98% 一 >60 步 97 多 一 >40 步 120 Beastite 00) 20 — 这 就 是 说 ,前 119 步 反应 残留 下 来 的 各 种 杂质 的 量 ， 已 远 远 超过 被 鉴定 的 物质 ， 势 必 准 以 将 结果 分 析 清 楚 。 据 Wittmann, Abt. fit; 目前 测定 蛋白 质 顺序 ,手工 技术 每 步 产 率 为 90 一 9 多? 固 相 顺 序 仪 产 率 为 93 一 95 儿 ， 改进 后 的 液 相 仪 产 率 为 98 狠 。 再 加 上 鉴定 方法 的 局 限 性 和 化 学 处 理 中 的 损失 等 ;一 次 连续 测定 氨基 酸 残 基 的 个 数 将 很 有 限 。 因 此 ， 测定 一 个 分 子 量 上 万 的 蛋白 质 顺序 ;事先 需 将 它 裂 解 成 若干 肽 段 ,分子量 越 大 需 裂 解 的 次 数 越 多 ， 每 次 裂解 产生 的 肽 碎片 也 越 多 。 它 们 的 分 析 效 率 将 随 着 肽 链 长 度 的 增加 而 明显 下 降 。 图 1-7 是 蛋白 质 顺序 分 析 在 效率 上 的 进展 情况 ， 也 示 出 了 不 同 大 小 的 蛋白 质 分 子 与 测 顺 序 效 率 之 间 的 关系 。 600 本 60 , 90 自动 * 3 400 | | ( 手工 =X Be a = ® = 30 w 200 “ : 20 2:0 日 “08 y o € 8 : 4 ist “hy & Sereeeres g a SEEEEEEEE 三 [ NERS SBSRS 三 1952 1955 1960 1965 1970 1975 1980 分 子 量 x 102 发 表 年 份 图 1-7 1952-1980 年 蛋白 质 顺序 分 析 在 效率 上 图 1-8 .已 测定 的 蛋白 质 顺序 按 分 子 量 大 小 分 布 的 变化 O<125 RH @125--250 A>280 RH 1-8 示 出 了 和 蛋白质 顺 序 与 分 子 量 之 间 的 关系 。 在 已 测定 的 上 千 种 蛋 自 质 全 氨基 酸 顺 序 1, 95% 以 上 蛋白 质 分 子 量 低 于 40,000。 这 并 不 意味 着 自然 界 中 的 大 分 子 蛋白 质 稀少 ， 而 是 人 们 不 愿 为 了 测定 一 个 大 分 子 蛋白 质 顺 序 而 耗费 过 多 的 时 间 和 资源 。 近年 来 随 着 生命 科学 的 飞速 发 展 和 和 蛋 白质 分 析 、 分 离 纯化 技术 的 不 断 改进 与 提高 , 蛋 e ll 。 白质 工作 者 的 研究 对 象 转向 膜 蛋 白 、 受 体 蛋白 、 病 毒 蛋 白 以 及 代谢 过 程 中 出 现 的 某 些 不 稳 ， 定 的 中 间 体 等 蛋白 质 。 这 些 蛋 白质 一 般 都 比较 复杂 ,很 难 提纯 ; 有 的 含量 极 低 ; 有 的 分 子 量 很 大 ,因此 ,对 于 顺序 分 析 所 遇 到 的 困难 ;不 仅 需 要 技术 方法 上 的 改进 与 创新 ,而 且 也 需 要 战略 思想 上 的 突破 。 在 有 关 学 者 的 努力 下 ; -这 死 年 也 确实 出 现 不 少 新 动向 ， 如 气相 顺 序 仪 的 问世 使 测量 灵敏 度 提 高 了 两 个 数量 级 ， 达 到 pmol 水 平 。 双 向 凝 胶 电 泳 和 银 染 色 法 ,以 及 灵敏 ,快速 ,高 分 辩 的 高 效 液 相 色 谱 仪 用 于 分 离 、 制 备 和 分 析 鉴 定 ， .为 生物 微量 样品 分 析 开 辟 了 道路 。 将 Polybrene 引入 液 相 顺序 仪 的 反应 杯 后 ,和 使 一 次 连续 降解 步 数 由 原来 的 40 一 50 步 提 高 到 80 44,7 可 以 相信 ， 通过 努力 ， 一 次 连续 测定 上 百 个 氨基 酸 下 基 必 将 成 为 现实 。 在 裂解 技术 止 ; 更 加 高 效 专 一 的 内 切 酶 和 化 学 试剂 的 发 现 ， 使 测 顺序 的 战略 设计 更 具 有 针对 性 , 测试 效率 也 随 之 提高 ,这 将 为 大 分 子 量 蛋 白质 顺序 分 析 创 造 条 件 NDNA Iii 序 推测 蛋白 质 顺 序 法 , 虽 有 某 些 弊病 ,但 已 预示 着 它 很 有 发 展 前 途 。 质 谱 计 和 气相 色谱 仪 或 液 相 色谱 仪 与 计算 机 联 用 ;应 用 于 蛋白 质 顺 序 分 析 ， 达 到 快速 化 \ 微 量化 区 如 果 能 进 兰 步 改进 质谱 计 装 置 , 使 mle 的 测量 值 成 倍 提高 , 那 末 必 将 给 顺序 分 析 带 来 福音 总 不 难 预 料 , 在 蛋白 质 顺序 分 析 中 , 若 将 质谱 法 和 DNA 顺序 法 有 机 地 结合 起 来 ;不 仅 使 上 前 的 从 析 效率 明显 提高 ,而 且 将 改变 我 们 现 有 的 蛋白 质 化 学 测 顺序 的 战略 思想 ,最 终 将 导致 我 们 放弃 传统 的 测 顺 序 方法 一 Edman 降解 法 a0。 Gray，W，R.55a9 就 曾 提出 一 种 独特 的 设 想 , 即 将 蛋白 质 裂 解 以 后 不 再 分 离 肽 , 直接 进行 Edman 降解 反应 ， 然 后 逐个 测定 降解 下 来 的 氨基 酸 。 这 样 便 可 从 不 同 裂解 方法 裂解 的 二 组 混合 肽 的 测量 结果 中 上 找 出 相同 的 所 基 酸 排列 顺序 。 因 为 两 组 混合 肽 都 来 自 同 一 个 蛋白 质 ， 所 以 应 包含 相同 的 先后 顺序 。 如 果 裂 解 次 数 很 多 ， 那 末 就 可 以 从 多 套 ( 每 套 二 组 ) 混 合 肽 测 得 的 结果 中 排出 完整 的 蛋白 质 顺序 。 作 者 以 核糖 核酸 酶 为 材料 ， 选 择 Arg, Met, Tyr, Lys, Cys, His 等 为 不 同 的 裂 解 点 ,按照 上 述 方法 从 六 套 混 合 肽 的 十 次 降解 结果 ,排出 了 核糖 核酸 酶 的 氨基 酸 顺 序 ， 其 中 只 有 第 24 位 谷 氨 酰胺 不 能 确定 。 按 理 说 这 是 很 成 功 的 ,但 自 文章 发 表 以 来 二 直 没 有 被 ， 人 采用 ,可 能 是 这 个 方法 要 求 太 苛 刻 , 既 要 求 肽 链 裂 解 的 产 率 很 高 ， 又 要 求 每 个 残 基 的 降 解 产 率 很 高 ;这 是 难于 达到 的 。 还 有 人 曾 想 从 蛋白 质 的 大 小 组 成 、 深 解 度 等 因素 通过 一 定 的 程序 设计 ， 用 电脑 计算 来 完成 顺序 分 析 。 但 这 一 尝试 一 直 无 法 确定 未 知 蛋白 质 的 一 级 结构 ， 所 以 能 否 单独 用 电脑 来 完成 顺序 分 析 ， 至 今 仍 是 个 谜 。 尽 管 如 此 ， 他 们 想 从 战 略 思 想 上 去 改变 以 前 的 方法 ,对 大 家 是 有 启发 的 。 可 以 相信 随 着 时 间 的 推移 ,在 蛋白 质 所 基 酸 顺序 分 析 中 ,会 有 许多 新 的 技术 、 新 的 方法 以 及 新 的 战略 思想 问世 。 s+ + xX Rm [1] A L. (7s, ERASE: “生物 化 学 > 细胞 结构 和 功能 的 分 子 基础 ， 上 册 ， 科 学 出 版 社 ，p.57 (1981). [2] Dayhoff, M. O., Park, C. M., and Mclaughlin, P. J., in Dayhoff, M. O., (ed): Atlas of Protein Sequence and Structure (1972), National Biomedical Research Foundation, Washngton, D. C. (1972). [3]. Lehman, H. and Kynoch, P. A. M.: Human Haemoglobin Variants and their Charecteristics, North-Holl- and Pub. Co. (1976). [4] Sanger, F., et al.; The Structure of Insulin, Biochem. J., 60, 541—565(1955). [5] Edman, P. and Begg, G.: A Protien Sequenator, Eur. J. Biochem., 1, 80—91(1967). [6] Laursen, R. A.: Solid-Phase Edman Degradation: an Automatic Peptide Sequencer, Eur. J. Biochem., 20, 89—102(1971). * 12 e FERS: FINI7-RBARELE—-RUNES. BAR. BR, BR. Vol. 23, No4, 238 一 253 (1978). Hewick, R. M. and Hunkapiller, M. W., ez al.: A Ges-Liquid Solid Phase Peptide and Protein Sequenator, J. Biol. Chem., 256, 7990—7997(1981). Morris, H. 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JRE SIME » G. 马 细 胞 色素 c， 再 。 家 条 的 丝 心 蛋 白 ， I。 人 碳酸 酝 酶 ， J. 马 醇 脱 氢 酶 ， K。 牛 核糖 核酸 酶 。 丝 心 蛋白 缺乏 谷 胺 酰胺 和 甲 硫 氮 酸 等 。 另 外 各 种 氨基 酸 在 蛋白 质 中 的 出 现 次 数 也 是 不 均 等 的 ， 如 组 氨 酸 、 色 氢 酸 、 甲 硫 氨 酸 等 残 基数 在 大 部 分 蛋白 质 中 的 含量 相对 较 少 :( 见 表 2-2)。 PRT ERR 20 种 基本 氨基 酸 外 ,在 少数 蛋白 质 的 水 解 物 中 还 发 现 有 几 种 比较 罕见 的 所 基 酸 。 它 们 是 某 些 基本 氨基 酸 的 衍生 物 , 如 4- 羟基 有 哺 氨 酸 是 且 氨 酸 的 衍生 物 ， 存 在 于 纤 维 状 蛋白 胶原 和 某 些 植物 蛋白 中 ; 产 赖 氨 酸 是 赖 氮 酸 的 5- 羟 基 衍 生物 , 存在 于 胶原 中 ,类 似 的 还 有 几 种 。 在 蛋白 质 中 很 可 能 还 会 发 现 至 今 尚 未 发 现 的 其 它 氨基 酸 。 根据 遗传 学 原 理 ， 可 以 预见 为 数 不 会 多 ,而 且 一 般 也 将 是 某 种 标准 氨基 酸 的 衍生 物 , 并 将 局 限于 某 种 特 殊 类 型 的 蛋白 质 之 中 。 新 近 联 邦 德国 法 兰 克 福 大 学 的 Wilhelm，G. 和 Kupka; K. D.4 发 现 , 从 小 牛 胸腺 、, 牛 和 人 的 脾脏 以 及 大 肠 杆 菌 等 分 离 出 的 核糖 核 蛋 白 (RNP) 中 有 一 种 新 的 氨基 酸 一 氨基 柠檬 酸 (aminocitric acid)， 其 结构 式 为 : es 16 。 N H,N— 4 —COOH HO— és —COOH H- 一 COOH H 认识 氨基 酸 的 性 质 ,尤其 是 氨基 酸 的 酸 碱 性 质 ,对 于 了 解 和 分 析 蛋 白质 的 性 质 是 很 重 要 的 ， 氨 基 酸 顺序 分 析 中 的 许多 技术 都 是 以 它们 的 酸 碱 性 质 为 基础 。 但 介绍 氨基 酸 的 多 种 性 质 已 经 超出 本 书 范围 ,读者 如 有 需要 可 参阅 附录 三 和 有 关 生 化 书籍 。 (二 ) 蛋白 质 顺序 的 含意 多 肽 链 的 化 学 结构 是 个 N 末端 ise RE. OC 末端 这 是 一 个 链 状 的 结构 ， 它 们 是 由 氨基 和 羧基 陪 去 二 分 子 水 形成 肽 键 相 互 ( 共 价 ) 连 接 而 成 的 。 两 个 氨基 酸 以 这 一 方式 连接 的 产物 称 为 三 肤 ; 三 不 氨基 酸 形成 三 肽 ;多 个 氨基 酸 连接 成 的 长 链 化 合 物 即 为 多 肽 或 多 肽 链 。 蛋白 质 (分 子 量 通常 在 5000 以 上 ) 就 是 由 一 条 或 多 条 多 肽 链 构 成 的 。 在 多 肽 链 中 相当 于 氨基 酸 的 单元 结构 称 为 残 基 。 肽 链 的 氨基 端 称 为 氨 端 或 N 端 , 关 基 端 称 为 次 端 或 C 端 ,表达 时 通常 都 是 从 左 到 右 ， 即 从 N 端 到 C 端 。 所 谓 蛋 白质 (或 多 肽 ) 顺 序 就 是 指 其 氨基 酸 的 排列 顺序 , 即 一 级 结构 。 .此 外 ,在 氨基 酸 之 间 还 有 另 一 类 型 的 共 价 键 , 即 半 胱 氨 酸 形成 的 二 硫 键 ， 它 们 是 半 胱 氨 酸 侧 链 中 的 开 基 氧化 形成 的 产物 。 在 一 些 蛋 白质 分 子 中 ， 假 如 二 硫 键 是 出 自 同一 条 肽 链 上 的 二 个 半 胱 氨 酸 的 琉 基 形成 的 ,这 种 二 硫 键 称 为 链 内 二 硫 键 ， 这 时 肽 链 成 环 状 分 子 ， 如 和 牛 核糖 核酸 酶 的 氨基 酸 顺 序 有 四 个 链 内 二 硫 键 (图 2-1)。 还 有 一 种 二 硫 键 是 在 两 条 链 之 间 形 成 的 , 称 为 链 间 二 硫 键 , 如 胰岛 素 分 子 (图 2-2)， 除 了 在 A 链 上 有 一 个 链 内 二 硫 键 外 ，A、B 二 条 链 是 通过 两 个 链 间 二 硫 键 连接 起 来 的 。 半 肛 氨 酸 的 综 基 很 不 稳定 ,所 以 在 蛋白 质 分 子 中 若 出 现 三 个 或 三 个 以 上 的 半 胰 氨 酸 时 ;原则 上 讲 ， 可 能 会 有 不 同 连接 方式 的 二 硫 键 ， 于 是 出 现 异 构 体 。 显 然 ， 异 构 体 的 数目 随 半 胱 氨 酸 的 含量 不 同 而 异 。 实 际 上 在 天 然 的 蛋白 质 分 子 中 至 今 尚 未 发 现 这 种 异 构 体 ， 这 就 是 说 它 只 有 一 种 联结 方式 。 如 果 在 蛋白 质 分 子 中 存在 有 二 硫 键 的 话 ， 确 定 二 硫 键 的 位 置 也 是 蛋白 质 顺序 测定 中 的 重要 内 Bo ’ 在 某 些 蛋 白质 中 还 有 非 肽 链 结构 的 部 分 ,其 中 有 一 类 是 通过 非 共 价 键 结合 的 , 称 为 畏 基 或 配 基 。 如 糖 蛋 白 分 子 中 的 糖 链 部 分 。 在 顺序 分 析 中 这 类 情况 相当 复杂 ， 可 供 参考 文 ml17—19], e 17 。 二 三 $2 赖 - 谷 - 苏 - 丙 - 丙 - 丙 : 赖 - 茶 丙 - 谷 - 精 - 谷 氨 酰胺 -组 - 甲 硫 - 门 冬 - 丝 - 丝 - 苏 - 丝 -两 ee ee TIS RK-BA 酰胺 - 甲 硫 志 -< 甲 硫 - 赖 - 丝 = - 精 - 门 冬 酰 胺 - 亮 - 苏 - 欺 -= 门 冬 - 精 - 半 胱 - 赖 - 须 - 绑 本 ] 冬 酰胺 - 苏 * 替 丙 - 纺 -组 - 谷 - 丝 - 亮 -两 - 门 冬 - 顷 - ini -A-2i-F Btse-22-48 Sh eR-Bi-NSR-Ai- -¢ pt-Hi-T 1 & Be R-H-G AR IE-H-11S R-E -B-SARR-4 -B- - 苏 - 甲 硫 - 丝 - 异 亮 - 苏 - 门 冬 - 半 M-B-B-H-H-2-2-G-B--1 he 半 胱 - 丙 - 酷 - 赖 - 苏 - 苏 - 谷 氮 酰 胺 - 丙 - 门 冬 酰 胺 - 赖 -组 - 异 亮 - 异 亮 - 统 - 丙 - 半 胱 - 谷 - 甘 - 门 冬 酰胺 - 膊 - 酷 - 顷 - 且 - 细 -组 - 葵 两 - 门 冬 - 丙 - 丝 - 贿 zs 图 2-1 和牛 核糖 核酸 酶 的 氨基 琶 顺 序 。 上 图 示 链 间 二 硫 键 位 置 = 网， 丝 , pT yt —Gin—Leu—Glu — Asn—Tyr-Cys — Asn—COOH i A INH.-Gly— lle — Val— Gin- Goner B 链 INH:-pPhe-val- Asit-Gla+ Hit Le ve Als 图 2-2 和 牛 胰 岛 素 的 一 级 结构 二 、 和 样品 的 纯度 要 求 每 种 蛋白 质 都 有 它 特定 的 氨基 酸 排列 顺序 ,因此 作 顺 序 测 定 的 蛋白 质 必须 是 纯 的 , 测 出 的 顺序 才 有 意义 ， 通 常情 况 下 杂 和 蛋白 含量 超过 5%% 时 便 很 难 测定 顺序 。 在 熟练 地 掌握 测定 顺序 方法 的 前 提 下 ,关键 是 如 何 拿 到 一 个 纯 的 蛋白 质 样品 ,然后 把 这 个 蛋白 质 切 成 若 干 肽 仆 ， 再 分 离 提纯 。 确 定 蛋 白质 (或 多 肽 ) 样 品 的 纯度 标准 大 致 如 下 : (1) 分 子 大 小 是 否 均一 。 (2) 电荷 是 否 均一 。 (3) 是 否 具 有 恒定 的 氨基 酸 组 成 。 (4) 是 否 具有 单 -一 的 N 未 端 和 C 未 端 残 基 。 (5) 进一步 纯化 时 生物 活性 是 否 再 有 提高 。 (6) 能 否 结晶 。 。18 。 (7) 从 N 未 端 测 几 步 顺序 ,一 般 在 4 POLL, MRR EM—HRRBRE) WSR 可 能 约 为 十 六 万 分 之 一 。 这 是 可 靠 的 。 上 述 七 条 是 比较 严格 的 要 求 。 很 难 全 部 达到 。 通 常 以 电泳 时 呈现 一 条 带 以 及 末端 残 基 鉴定 是 单一 的 即 可 进行 测定 顺序 。 “” 和 蛋白 质 很 复杂 ,往往 具 微 观 不 均一 性 ,这 种 不 均一 伺 可 分 为 二 种 情况 : 一 类 是 在 蛋白 质 肽 链 合成 后 ,在 加 工 中 造成 的 ,如 糖 蛋白 ,由 于 含 糖 量 不 同 ,它们 的 电泳 行为 常 表现 很 大 差异 ;又 如 赖 氨 酸 的 甲 基 化 ,丝氨酸 的 磷 酰 化 ,以 及 磺 酰 化 等 ,也 会 造成 电泳 行为 的 不 均一 性 ;还 有 一 些 则 是 在 分 离 纯化 过 程 中 人 为 造成 的 ,如 脱 酰 氨 等 。 这 种 不 均一 性 对 蛋白 质 顺 序 分 析 不 会 带 来 天 大 的 困难 。 另 一 类 不 均一 性 是 由 于 基因 家 族 产生 的 。 它 们 之 间 的 不 同 表现 为 个 别 氨基 酸 的 替换 、N 端 或 C 端 肽 段 的 缺失 等 。 这 种 不 均一 性 会 给 蛋白 质 顺序 分 析 带 来 很 大 的 困难 。 由 于 顺序 测定 工作 流程 长 ;工作 量 大 ,在 顺序 测定 前 如 发 现 样品 不 纯 应 该 仔细 区 分 ， 然 后 再 决定 相应 的 对 策 。 三 、 顺 序 测定 的 一 般 方法 和 步骤 (一 ) 顺序 测定 前 的 准备 在 拿 到 二 个 纯 的 蛋白 质 或 多 肽 样品 后 ， 测 顺序 前 还 需 完 成 下 列 两 项 工作 : (1) 氨基 酸 组 成 分 析 和 分 子 量 的 估计 。 (2) N 末 端 和 C 未 端 残 基 测 定 。 必须 注意 如 果 发 现 该 蛋白 质 含有 两 条 或 两 条 以 上 的 多 肽 链 时 ,首先 要 设法 将 它们 拆 开 ,然后 再 分 离 提纯 。 多 肽 链 的 数目 通常 可 以 从 测定 每 分 子 蛋白 质 所 售 的 N 末端 残 基数 ， 结合 SDS 凝 胶 电泳 推导 出 来 ,显然 两 者 数目 应 一 致 。 若 肽 链 之 间 非 共 价 交 联 , 可 用 高 浓 度 变性 剂 (如 8mol/L® 尿素 ) 或 解 聚 剂 (如 SDS) 拆 离 。 若 肤 链 是 由 二 硫 键 共 价 交 联 ,就 得 选用 适当 的 化 学 反应 断裂 二 硫 键 ,并 将 断裂 后 出 现 的 斑 基 保护 起 来 ,然后 再 分 离 提纯 。 拆 开 二 硫 键 最 常用 的 方法 是 过 甲酸 氧化 法 @ 和 还 原 - 羧 甲 基 化 法 只。 测定 分 子 量 的 目的 是 为 估计 测 顺 序 工 作 量 的 大 未。 分 子 量 测定 的 要 求 不 高 ， 目 前 用 物理 化 学 方法 测 出 的 分 子 量 , 误 差 在 10% 左右 就 足够 了 。 氮 基 酸 组 成 的 测定 是 顺序 测定 中 不 可 忽视 的 一 环 ,对 今后 的 直接 顺序 测定 有 参考 价值 , 它 可 以 帮助 发 现 分 离 时 肽 眉 的 丢 失 以 及 为 我 们 选择 解 裂 手段 提供 依据 。 后 者 是 顺序 测定 的 战略 设计 所 必须 的 。 测定 N.C 未 端 残 基 有 三 点 意义 ,第 一 是 鉴定 样品 的 纯度 ; 第 二 ， 测 定 了 N.C AM REHKE, WARES SPRRA SRN CHKE, CHM ERRNKR ER (BH) 提供 方便 ;第 三 ,通过 未 端 残 基 测 定 ,将 知道 六 未 端 是 否 被 封闭 或 酰 化 ,可 减少 顺序 测定 中 的 盲目 性 。 (=) 二 硫 键 的 断裂 1. 过 甲酸 和 氧化 法 (1) 原理 : 断裂 二 硫 键 的 方法 通常 有 两 类 ,一 是 氧化 法 ,二 是 还 原 法 。 氧 化 法 最 早 是 (1) 1N = 1m JX BF ite e*-$Q) » HH Sanger™ 建立 的 ,为 了 将 胰岛 素 ALB 链 分 开 , 他 用 过 甲酸 与 一 S 一 S 一 键 反应 ,使 它 转 变 成 磺 酸 , 肽 链 中 的 劳 基 同时 也 变 成 磺 酸 : 从 二 时 全 den 其 副作用 是 甲 硫 氨 酸 侧 链 氧化 成 砚 , 色 氨 酸 侧 链 破坏 。 尽 管 如 此 ,顺序 测定 中 还 常 离 不 开 它 , 如 二 硫 键 的 定位 和 半 胱 氨 酸 残 基 定 量 测定 等 。 过 甲酸 氧化 二 硫 键 或 蔚 基 的 反应 如 下 : H oO H Oo 链 1 —C—N—CH—C—N-— i Aa eal 1 | cx, 3 1 CH, H 二 硫 交 联 -> | pt Sal SO,H 7 cH, H H CE, H #2 —C—N—cH- re Li 链 2 | 有 | 磺 基 丙 氨 酸 残 基 反应 后 的 生成 物 磺 酸 基 团 很 稳定 ,不 必 再 进行 保护 ,但 也 不 能 恢复 到 斑 基 。 (2) SARC, 方法 I: . 过 甲酸 制备 : 4 ml 甲酸 十 He RO 过 氧 水 于 50%, RM 3 分 钟 备 用 。 氧化 : BAMA 50nmol | + 0.5ml 甲醇 溶液 | 十 5ml 过 甲酸 - $50° 保温 反应 .20 分 钟 去 过 甲酸 4 + 20ml 重 蒸 水 ,冰冻 干燥 (或 用 旋转 莹 发 器 干燥 ) 4 士 10ml BRK IMR 方法 I: 过 甲酸 制备 :0.9ml 甲酸 + 0.1m130%H,0, 于 室温 (20 一 25%C) 反 应 1 DN BKBAAAS Ho 氧化 : BAMA 50nmol 十 60ml 甲酸 溶解 4 + 201 过 甲酸 | —10——20°C 保温 2 小 时 1 十 2ml 重 蒸 水 (4%C) | 真空 干燥 ( 冻 干 ) 注意 : 过 甲酸 必须 新 鲜 配 制 。 2. 还 原 和 S-HF RL (1) 原理 : 二 硫 键 还 原 成 往 基 的 方法 很 多 ,最 常用 的 是 各 种 开 基 化 合 物 如 玉 基 乙醇 ， « 20 « 其 反应 式 是 : COOH 1 H,N—C —CH, dal COOH H s | | + 2SH--CH,—CH,OH=> 2H,N— C0 —CH, —SH aie PRET i: H,N— 0 —CH, + | HOH,O—€H,— S$ — S —CH,—CH,OH ， =-p-ACELHMD 形成 的 半 胱 氨 酸 斑 基 在 有 和 氧 的 空气 中 很 不 稳定 ， 必 须 进 行 保 护 。 碘 乙酸 (或 它 的 酰胺 ) 是 常用 的 保护 试剂 , 它 使 仁 基 烷 基 化 。 COOH COOH | H,N— C —CH,—SH + ICH,COOH—>H,N— C —CH,— S —CH,-: COOH | 1 H H 半 胱 氨 酸 HRC AB SRF HAE AZAR PE, I AES RHI, ABFA! eo", av ao: | | —NH—CH— C-——NH— + CH 二 CH,; 一 > 一 NH 一 CH 一 0 一 NH 一 | Nw | CH, H CH, | SH S—CH,—CH,—NH, - (GPE) Se EAE BT (WU EASE . THRE AR him] GK RE A RO (2) 实验 方法 : 。 15mg 蛋白 质 + 1mlTris 缓冲 液 (pH8.4) A 7moel/l 盐酸 县 | 十 0.1ml 二 硫 苏 糖 醇 〈65mg/ml) | Na，20*C 2 小 时 ) 碟 乙 酸 钠 .0.1ml(235mg/ml 用 1IVNaOH HAN) 4 No» 20°C 各 光 放 置 30 分 名 | 0.5ml Sid CRA IE (=) 顺序 测定 的 一 般 方 法 和 步骤 完成 了 上 述 工 作 后 , 即 可 着 手 制定 顺序 测定 的 方案 .正常 的 顺序 测定 包括 以 下 步骤 : C1) 根据 分 子 量 大 小 和 某 些 特殊 氨基 酸 的 组 成 情况 ,选择 合适 的 内 切 酶 或 化 学 试剂 ， 将 多 肽 链 断 裂 成 一 系列 较 小 的 肽 段 ， 并 分 离 纯化 这 些 肽 股 。， 一 | (2) 取 上 述 每 一 肽 段 的 少量 样品 ,进行 完全 水 解 , 测 定 氮 基 酸 组 成 。 (3) 测定 每 一 肽 段 的 氨基酸 顺序 。 《4) 取 另 一 份 样品 (适量 ), 用 第 二 种 方法 进行 肽 链 的 部 分 断裂 (注意 肽 链 的 切 点 位 置 « 21 as 应 不 同 于 第 一 次 的 切 点 位 置 ), 然 后 再 分 离 纯 化 ,并 按 第 2、3 步 分 别 测定 其 氨基 酸 组 成 和 氨基 酸 排列 顺序 。 (5) 比较 已 测 得 的 两 套 肽 段 的 氨基 酸 顺 序 , 找 出 前 后 两 次 断裂 点 相 重 迭 的 部 位 , 即 接 头 部 位 ， 就 不 难 排出 该 多 肽 链 的 整个 氨基 酸 顺 序 。 注意 ,对 于 个 别 较 大 的 肽 女 ,不 能 一 次 连续 测 出 ee eae 还 需 用 第 三 \ 第 四 甚至 更 多 种 的 肽 链 断 裂 方法 ,并 分 离 纯化 ,分 别 测 出 这 些 次 级 肽 段 的 氨基 酸 顺 序 ， 直 到 排出 肽 链 的 全 部 氨基 酸 顺 序 为 止 。 (6) 如 该 多 肽 链 有 三 硫 键 或 其 它 配 基 时 ， 还 需 分 别 确 定 它 们 在 顺序 中 的 联结 位 Fee —_ 、 顺 序 测定 的 基本 战略 在 第 一 章 曾经 提 到 ,当前 用 化 学 方法 测定 蛋白 质 顺序 ,最 基本 也 是 最 常用 的 方法 仍然 是 Edman 逐步 降解 法 。 用 Edman 降解 法 ,一 次 连续 测定 的 残 基 顺 序数 受 它 自身 的 降解 反 应 的 产 率 的 严格 限制 就 目前 的 一 般 水 平 看 ,手工 方法 一 次 只 能 连续 测定 10 一 20 RHE, 用 自动 固 相 仪 一 次 能 测 20 一 30 个 残 基 ， 用 改进 后 的 自动 液 相 顺 序 仪 和 新 近 问世 的 气相 顺 序 仪 ,一 次 也 只 能 连续 测 40 一 60 个 残 基 , 个 别 能 达到 80 个 。 因 此 要 想 测定 一 个 分 子 量 上 ， 万 的 蛋白 质 顺序 ,用 Edman 降解 法 是 无 法 一 次 完成 的 , MAE CWT IAB, 后 在 分 离 纯化 基础 上 ;逐个 测定 它 的 顺序 ， 最 后 把 各 肽 段 拼接 起 来 ,才能 确定 整个 蛋白 质 氨基 酸 排列 顺序 。 由 此 可 见 ， 和 蛋白 质 顺序 测定 是 一 项 相当 繁琐 的 工作 ， 流 程 长 ， 工 作 量 大 。 为 了 提高 效率 ; 少 走 弯路 ,在 顺序 测定 前 ,选择 最 佳 方案 , 即 制定 一 个 合适 的 战略 计划 是 很 重要 的 , 它 关 系 到 整个 顺序 测定 工作 的 顺利 与 否 , 甚 至 成 败 问题 。 顺序 测定 的 战略 考虑 关键 是 多 阮 链 片 自 裂解 方法 的 和 过 择 ， 同 时 也 取决 于 总 的 测定 大 序 战略 ,通常 要 考虑 下 列 三 个 因素 : (1) 根据 现 有 的 设备 条 件 以 及 样品 林 身 的 特性 和 量 的 多 少 选择 裂解 方法 。 如 自动 序 仪 ,一 次 能 连续 测 出 较 大 肽 奶 的 残 基 顺 序 , 可 选用 特异 性 很 高 的 裂解 试剂 ,如 省 化 氢 ,\ 胰 ， HAMS. (2) 裂解 后 肽 段 的 分 离 纯化 问题 。 多 肽 链 切断 成 肽 段 后 ,分 离 提纯 是 很 艰巨 的 工作 。 对 于 大 肽 段 ,通常 会 遇 到 样品 不 溶 , 甚 至 集聚 问题 。 但 同样 是 大 肽 豚 ， 用 胰 蛋 白梅 敢 解 和 用 溴 化 氢 裂 解 ,它们 的 分 离 纯化 条 件 就 有 所 区 别 ,后 者 的 不 溶 问题 更 加 突出 。 而 对 于 数量 较 多 的 小 肽 段 ,通常 很 难 将 它们 分 开 , 除 非 拥有 高 效 液 相 色 谱 等 先进 手段 。 (3) 裂解 还 要 考虑 下 一 步 肽 链 连接 问题 ,否则 即使 弄 清 了 许多 肽 段 的 顺序 ,如 找 不 到 接头 肽 侦 ， 也 难以 连 成 完整 的 顺序 。 从 目前 情况 看 ,裂解 多 肽 链 的 战略 设计 大 致 有 以 下 三 种 方案 中 : @ 非特 异性 裂解 (图 2-3) 这 是 Sanger 测 胰岛 素 结构 时 采用 的 方法 ,他 用 的 是 部 分 水 解法 9。 因为 当时 尚未 发 现 较 好 的 特异 酶 解法 ,用 非特 异性 裂解 生成 的 小 肽 ;对 一 次 只 能 测 几 个 残 基 顺 序 来 说， 不 仅 是 有 利 的 ， 并 且 对 胰岛 素 这样 小 的 蛋白 质 也 是 有 效 的 。 然 而 此 法 给 分 离 提纯 带 来 的 困 难 也 是 很 明显 的 。 如 果 多 肽 链 较 长 ,用 这 种 方法 裂解 形成 的 小 肽 数目 就 会 明显 增多 ,不 仅 « 22 « , eet m= im ica EE: oo) KUT BA, MAANBEA RAS, SECRETE ESAS 所 以 目前 已 不 采用 这 种 方法 了 。 © 两 种 或 两 种 以 上 的 特异 性 裂解 法 (图 2-4) 这 是 "Stein 和 Moore 测定 核糖 核酸 酶 顺序 时 提出 的 加 。 它 避免 了 非特 异性 裂解 的 证 目 性 ， 使 顺序 测定 的 效率 明显 提高 。 对 一 个 分 子 量 上 万 的 多 肽 链 ， 用 两 种 裂解 手段 〈 如 图 2-4) 通 和 常 是 不 难 定 出 它 的 氨基 酸 顺 序 。 适 用 于 这 种 方案 的 特异 性 蛋白 水 解 酶 人 如 胰 蛋 Als RAS AR. BEARS ASA MRAS), E-RIKSPhADR 到 。 因 此 在 顺序 测定 中 ， 这 个 方案 仍 被 广泛 采用 ， 无 其 是 用 CRA 1 一 2 万 分 子 量 的 蛋 白质 顺序 更 为 合适 。 图 逐 级 进行 特异 性 裂解 (图 2-5) 这 种 方案 是 进入 七 十 年 代 后 提出 的 , 它 对 测定 较 大 分 子 量 (一 般 2 一 3 万 以 上 ) 的 蛋白 质 尤 为 有 效 。 既 可 防止 请 目 性 ,有 利于 今后 的 肽 链 顺 序 重 排 , 又 可 给 裂解 后 肽 段 的 分 离 纯 化 带 来 方便 。 与 前 二 种 方案 相 比 逐 级 特异 性 裂解 是 比较 理想 的 ， 缺 点 是 选择 裂解 试剂 比 较 困 难 。 近 几 年 来 ,围绕 着 上 述 方案 ,无 论 在 分 离 纯化 手 侦 上 ， 还 是 在 裂解 试剂 的 选择 上 都 有 不 少 可 喜 的 进展 "9。 人 们 发 现 , 在 分 离 纯化 不 溶性 的 大 肽 外 时 通过 加 尿素 、SDS 等 变性 剂 或 通过 末端 及 侧 链 基 团 的 修饰 ,可 提高 溶解 度 。 在 寻找 裂解 试剂 方面 ,这 几 年 也 新 发 现 了 几 个 特异 性 很 高 的 肽 链 内 切 酶 和 化 学 试剂 , 象 专 切 Glu 羧 端 的 Glu 蛋白 酶 , 专 切 Pro 的 Pro SAAS, &Y) Trp 及 Asn-Glu，Asp-Pro 肽 键 的 化 学 试剂 等 。 它 们 的 发 现 为 测 2D3 。 : 定 某 些 较 大 分 子 量 的 蛋白 质 顺序 提供 了 有 力 的 武器 。 此 外 ,关于 如 何 微量 化 测定 顺序 ,如 何 提高 有 裂 解 后 的 肽 段 的 纯化 效力 和 回收 率 ， 如 何 增加 Edman 降解 循环 的 次 数 , 以 及 在 固 相 顺 序 中 如 何 利用 不 同 的 C 端 残 基 或 侧 链 基 团 巧 妙 地 选用 不 同 的 偶合 方式 ,以 使 分 离 纯化 肽 股 的 步骤 大 为 简化 等 ,也 都 是 顺序 战略 设计 考 虑 的 内 容 GOR ERK PRB SS. OE [1] Wilhelm, G. and Kupka, K. D.: New Amino Acid Found in Ribonucleoproteins, New Scientist, 89, 602 (1981). [2] Croft. L. R.: Introduction to Protein Sequence Analysis, John Wiley & Sons, p. 5—6{1980). [3] Hirs. C. H. W.: Methods Enzymol, 11, 197—199, Performic Acid Oxidation, Academic New York (1967). [4] Cole, R. D.:. Methods Enzymol, 11, 315, Academic New York (1967). [5] Ryle, A. P.,, Sanger, F. Smith, T. F., and Kitai, R.: The Disulphide Bonds of Insulin, Biochem. J., 60, 541—556(1955). [6] Smyth, D. G., Stein, W. H. and Moore, S.: Sequence of the Amino Acid Residus in Bovine Pancreatic Ribonuclease: Revision and Confirmation, J. Biol. Chem., 238, 227—234(1963). [7] Hirs, C. H. W.,: The Oxidation of Ribonuctease with Performic Acid, J. Biol. Chem., 219, 61111956). y [8] Clegg, J. B., Naughton, M. A., and Weatherall, D. 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ERA 离子 交换 色谱 法 来 快速 定量 分 析 氮 基 酸 s- 早 在 四 十 年 代 中 期 ， 他 们 用 淀粉 柱 层 析 分 离 和 定量 测定 氨基 酸 。 到 1951 年 ,他 们 作 了 重大 的 改进 ,用 磺 酸 型 树脂 代替 淀粉 ,以 缓冲 液 代 替 原 来 的 盐酸 作为 洗 脱 补 * 草 三 酮 试剂 作为 显 色 剂 ,以 分 光 光 度 计 作 定量 测定 。 直 到 1958 年 在 Spackman 的 协助 下 > 研制 了 第 一 人 台 自 动 氨基 酸 分 析 仪 吕 ,使 分 析 时 间 大 大 缩短 ， 从 而 使 氨基 酸 分 析 工 作 在 快速 化 \ 微 量化 方面 发 生 了 根本 的 变化 。 目 此 以 后 发 展 更 为 迅速 。 仅 就 日 本 而 言 , 六 十 年 代 的 产品 还 没有 自动 进 样 装置 \ 程 序 控 制 器 和 数据 处 理 器 ， 到 七 十 年 代 这 些 装置 都 有 了 。 分 析 一 个 蛋白 质 水 解 久 的 时 间 , 从 原来 的 24 小 时 缩短 到 七 十 年 代 后 期 的 1 小 时 ,现在 只 要 半 小 时 左右 。 分 析 的 灵敏 度 也 比 原 来 提高 几 十 倍 甚至 上 百倍 。 目 前 用 草 三 酮 显 色 , 需 样品 量 不 到 :lnmol， 用 菊 光 检测 需 样品 量 只 要 数 十 pmole =, REREAD RE RARE (—) 毛 基 酸 自 动 分 析 仪 的 一 般 构造 及 功能 氨基 酸 分 析 仪 的 型 号 很 多 , 但 由 于 仪器 的 工作 原理 相同 ,因而 主体 结构 基本 类 似 。 现 以 日 立 835-50 型 氨基 酸 目 动 分析 仪 2 为 例 ; 图 :3-1 是 该 仪器 的 流程 图 。 仪 右 大 致 可 划分 为 : 离子 交换 洗 脱 部 分 曹 三 酮 显 色 部 分 尖 检 测 部 分 和 自动 控制 系 So TABI Fo (1 六 离子 交换 洗 脱 分 离 部 分 ;这 是 仪器 的 “核心 ”, 它 包括 以 下 几 部 分 : OQ 分 析 柱 : 有 三 种 规格 : 内 径 2.6mmji Kk 150mm (用 于 蛋白 质 水 解 波 分 析 )、 内 径 2.6mm， 长 250mm 〈 用 于 分 析 生 理 体液 ) 和 内 径 4mm, K 150mm (AFORE KR 该 和 生理 体液 )o 柱 内 填 装 日 立 2619 型 离子 交换 树脂 ， 柱 外 包 有 套 管 ， 与 循环 水 浴 相 连 接 , 以 保持 柱 温 。 @ wa: Pi 0.2 一 1.0ml/ 分 ,最 大 压力 200kg/cm, 通过 它 输 送 缓冲 液 和 再 生 液 ， 能 在 一 定 的 压力 下 维持 一 定 的 六 量 。 和 泵 和 柱 是 整个 仪器 的 心 胜 ， 它 们 的 优 劣 将 决定 整个 仪器 的 分 析 性 能 。 图 循环 水 浴 : KBE 30 一 70%c， 以 保持 二 定 的 柱 温 。 e 25 。 (© 样品 注 和 系统: 有 自动 进 样 器 和 手动 进 样 器 。 自动 进 样 器 : 样品 管 定量 50a, 由 注射 式 泵 从 样品 杯 吸 人 样品 后 自动 注 估 分 析 柱 内 。 N2 thes _ Y) 记录 器 及 打印 装置 3-1 昌 立 835-50 型 氨基 酸 自 动 分 析 仪 流程 略图 样品 杯 装置 500 由 ， 可 容 样 品 数 72 个 ， 样 品 最 少 需要 量 300mls 手动 进 样 器 : 样品 管 容量 500 由 ,用 微量 注射 器 定量 注 人 分 析 柱 内 。 © 试剂 贮存 器 : 由 6 个 容量 为 1 升 的 特制 玻璃 瓶 组 成 , 其 中 5 个 贮存 缓冲 液 示 1 不 贮存 再 生 液 ,各 瓶 中 都 有 氮气 管 通信, 充 以 高 纯 氮 气 。 说 体 通过 瓶 中 的 另 一 导管 流 人 分 析 EA, 这 都 是 通过 计算 机 操纵 电磁 闪 和 和 泵 实现 的 。 (2) 曹 三 酮 显 色 部 分 - @ 草 三 酮 试剂 : 由 一 个 5 升 棕色 瓶 贮 存 , 平 时 放 在 专用 的 冰箱 内 , 瓶 内 通信 氮气 管 了 充 以 高 纯 氮 ,试剂 由 另 一 导管 经 由 微量 和 泵 1 往 人 混合 恬 。 @ eR 2: 构造 性 能 同 微量 泵 1, 专 供 压 送 曹 三 酮 试剂 ,能 在 一 eh 的 流量 。 图 混合 器 : 由 三 通 管 组 成 ,将 来 自分 析 柱 的 洗 脱 液 和 通过 泵 2 注入 的 昔 三 酮 试剂 在 混合 器 混合 后 ,由 连接 三 通 的 另 一 导管 流 和 人 反应 器 内 反应 。 * 26 * 表 3-1 几 种 氨基 酸 自 动 分 析 仪 的 性 能 仪器 型 号 立 m x« 捷克 斯 洛 伐 克 Beckman Backman Da ein KLA-5 L-7 AAA881 119CL 121MB Bean fe 3-25kg/cm? 60kg/cm? 25—40 Atm-g 100—S00 Psi 100—800 psi 分 析 时 间 ( 小 时 ) 4 gl ea 1 | 所 求解 物 ) he 6 Wri? - AE (mm) ; 8.2 SY 7 RE (um) 18 18—20 8 一 9 edie i: | 18—20 y 交 联 度 (92) 8 一 10 Ee! 12 仪器 灵敏 度 1nmol Inmol 0.004umol 100pmol | 程序 控制 纸 带 程序 数字 程序 插 孔 电子 程序 纸 带 程序 System1000 F 126 数据 数据 处 理 “| J221 BUH RAW ik HE BL = iii | ) | = FoR deo 1580» 35 3 22 4 3u5—5 sgn 日 立 英 Ea Durrum Beckman System 4400 835-50 Chromaspek D-500 6300 30—50 & * 20-200kg/cm? 高 压 3000 psi 3000 psi 1 1 1 1 1 > i 4 2.6 3.0 1.75 约 2 CS ee eee i foe OP 8.00.5 | 12 7.5—8 10 20 30 100 500 50 他 计算 机 计算 机 模拟 程序 计算 机 计算 机 数据 处 理 机 834 数据 处 理 机 数据 处 理 机 数据 处 理 机 hp3390A 积分 仪 25 18 12 10.4 10 图 反应 水 浴 : 水 浴 温 度 控制 在 98"C ,水 浴 内 装 有 聚 四 所 乙烯 反应 盘 管 ( 内 径 0.25mm 又 长 20m) 即 反应 器 。 毛 基 酸 和 草 三 酮 显 色 反 应 就 在 这 里 进行 s (3) 检测 部 分 © 检测 器 : 色 反 应 器 反应 显 色 后 的 氨基 酸 溶液 流 人 流动 池 用 以 检测 。 检测 器 -一 般 用 可 见 光 分 光 光 度 计 , 检 测 波长 分 别 为 570nm 和 440nm， 后 者 用 以 检测 且 氨 酸 和 产 且 氢 酸 。 新 近 也 有 用 荧光 检测 的 检测 器 。 检 测 后 的 液体 流入 废 液 贮存 瓶 。 @ 数据 处 理 器 : 是 由 微型 计算 机 控制 ， 经 分 光 光 度 计 检测 后 的 信号 通过 两 个 频道 ， 将 570nm 信号 (频道 1) 和 440nm 信号 (频道 2) 分 开 , 然 后 经 处 理 器 一 系列 计算 处 理 后 打 ae ae 印 出 数据 。 图 记录 器 : 为 书写 式 打印 机 ， 可 将 分 析 图 谱 (WICK) 及 结果 打印 出 来 。 另 外 ， 835-50 型 氨基 酸 自动 分 析 以 配 有 双 笔 记录 仪 , 它 可 将 氨基 酸 分 析 图 谱 以 峰 的 形式 如 实 记 录 下 来 。 (4) 控制 系统 这 是 流程 图 以 外 的 部 分 。 仪 器 的 各 部 分 都 由 微型 计算 机 来 操纵 和 控制 。 程 序 可 用 程 序 卡 或 键盘 直接 输入 。 一 有 旦 信号 出 了 毛病 ,控制 系统 能 立即 发 出 故障 显示 , 既 起 到 保护 仪 器 的 作用 ,又 便于 操作 人 员 维 修 。 目前 氨基 酸 分 析 仪 的 种 类 很 多 * 各 有 不 同 特点 表 3-1 列 出 了 几 种 氮 基 酸 自动 分 析 仪 的 性 能 。 其 中 前 四 种 是 常见 的 比较 老 的 型 号 ， 后 六 种 〈 包 括 日 立 835-50 型 ) 是 较 新 的 型 号 。 Peed ic» (=) 氢 基 酸 自动 分 析 的 原理 1. ARREEBMEP UDA 氨基 酸 分 离 主要 依据 离子 交换 原理 。 一 般 氮 基 酸 分 析 仪 所 用 的 离子 交 eit TB 型 的 强酸 性 阳离子 交换 树脂 ;其 骨架 由 葵 乙 烯 及 苯 二 乙烯 合成 ;其 中 苯 二 己 燃 作为 交 联 剂 。 交 联 树脂 经 磺 化 成 为 离子 交换 树脂 ,其 结构 如 下 : | AR —CH—CH, —CH-— CH,— | VA 会 | | YYZ SO,H —CH—CH, -—CH—CH, —CH--CH,— | Yor LOR \ \/ SO,H | —CH—CH, | —CH—CH, | —CH--CH,— | SO;H —CH— “4 使 用 离子 交换 树脂 要 注意 交 联 度 。 所 谓 交 联 度 ， 是 指 二 乙烯 葵 占 树脂 单 体 总 量 的 百 分 率 , 交 联 度 大 ,树脂 的 结构 紧密 ,和 孔隙 小 ,适用 于 分 子 量 较 小 的 氨基 酸 的 分 离 呈 一般 毛 基 酸 分 析 仪 用 的 树脂 的 交 联 度 为 8 一 12 多 。 反 之 , 交 联 度 小 的 , AWB, FLRK. DBE 白质 和 肽 类 的 树脂 的 交 联 度 通 常 为 2 一 4 多 。 氨基 酸 层 析 用 的 离子 交换 树脂 通常 是 Na* 型 的 (或 Li A), 可 用 X 一 SO5Na+ 表 示 。 由 于 氮 基 酸 是 两 性 电解 质 , 其 所 带 的 电荷 随 pH 高 低 而 变化 。 一 般 氮 基 酸 分 析 仪 都 用 pH2.2 WAM, PARA Ht 浓度 大 ， 五 ”的 解 离 被 抑制 ,这 时 氨基 « 28 « 酸 由 两 性 NHY 一 RCHCOO - 4% NH$—RCHCOOH, 带 正 电 荷 。 因 此 , 当 它 进 和 人 层 析 柱 后 , 即 被 柱 中 的 树脂 (固定 相 ) 所 吸附 , 同时 将 Na+* 交换 出 来 。 其 在 柱 中 的 离子 交换 过 程 如 下 : X 一 SO03(Na)- + NH3—RCH—COOH et x _§03(N*H,—RCHCOOH) + Na* pH3.3 一 4.9 X ;为 树脂 5 从 上 式 可 知 ， 氨基 酸 结合 到 树脂 上 的 紧密 程度 与 缓冲 疲 Cat) 的 pH 和 离子 《Na ) 强 度 有 关 。 当 洗 脱 缓 冲 液 相 继 流 经 树脂 时 , 由 于 pH 逐渐 增高 , 氮 基 酸 逐 渐 失 去 正 利 人 荷 , 因 而 与 树脂 的 结合 逐渐 减弱 ,最 后 从 树脂 上 被 洗 脱 下 来 。 在 低 pH HH, BRERA 基 酸 都 带 正 电荷 ,但 不 同 氮 基 酸 所 带 的 电荷 数 是 不 同 的 。 增 加 pH, 羧基 基 团 逐渐 由 非 离 子 型 【一 COOH) 变 为 阴离子 型 〈 一 COO- ) ,在 这 个 过 程 中 酸性 氨基 酸 ( 带 二 个 羧基 ，,: 一 个 氮 基 ) 最 快 失去 正 电 荷 ， 中 性 氨基 酸 ( 带 一 个 羧基 ， 一 个 氨基 ) 次 之 ， 碱 性 氨基 酸 ( 带 一 RAE, 2 一 3 个 氨基 ) 最 慢 。 但 氨基 酸 所 表现 出 来 的 净 电 荷 数 ， 不 仅 与 缓冲 液 的 pH 有 关 ， 籽 与 氨基 酸 本 身 的 等 电 点 有 关 。 根据 Henderson-Hasselbalch 弱酸 方程 和 [配对 的 碱 ] 一 PKa Sia pH P + log [ 酸 ] 在 等 电 点 条 件 下 ,氨基 酸 呈 中 性 ,这 时 pH dex (OOK es PKa a 以 天 冬 氮 酸 为 例 , 当 pH 逐渐 增高 时 ,有 如 下 反应 : CCOH COOH coo- coo- on, PK, cau PK, CH, PK, de, Geist 2 CH 一 NI Si CH—NH¢ 3.8 CH—NH, cooH coo- Gop! coo- 阳离子 两 性 离子 阴离子 阴离子 (一 个 兆 正 电荷 ) (SHA) ”一 个 净 负 电荷 ) 〈 两 个 净 负 电荷 ) 等 电 点 P7 一 3 (2.1 + 3.9) = 3.0 天 冬 氨 酸 在 单 柱 分 析 时 ,是 第 一 个 被 洗 脱 下 来 的 氨基 酸 。 又 如 赖 氨 酸 , 它 带 的 氮 基 多 , 当 pH 逐渐 增高 时 , 便 发 生 如 下 的 反应 : NHt NHt NI NH, (cH), PK, (CH), PK, toma PK; (cH), CH—NHt 2.2 CH—NHt 3.0 CH—NH, 70.5 CH—NH, | | COOH COO- COO- COO- 阳离子 阳离子 阴离子 《两 个 净 正 电荷 ) 〈 一 个 净 正 电荷 ) 《等 电 点 ) (一 个 净 负 电荷 ) es。 29 e Hi RBA SH OPK, # PK; 决定 的 ,等 电 点 Py es (9.0 + 10.5) = 9.75 | AMmaBSHraa? ALRE, 它 和 树脂 结合 得 较 紧 密 ;被 Na 置换 也 就 困难 ， 故 被 洗 脱 的 速度 也 较 慢 。 离子 强度 的 增加 也 将 改变 平衡 的 位 置 ， 使 氨基 酸 解 离 因为 增加 Nat 浓度 ,将 争夺 结 合 树脂 中 的 带 正 电荷 的 离子 (氨基酸 ) 位 置 。 不 同 氨基 酸 的 侧 链 带 有 各 种 不 同 的 化 学 基 团 ， 如 酚 基 (如 酷 氮 酸 )、 咪 哗 基 ( 如 组 氨 酸 ) 及 肌 基 (如 精 氮 酸 ) 等 ,这 些 基 团 也 能 在 一 定 条 件 下 解 离 s 它们 对 树脂 的 亲和力 和 被 洗 脱 的 速度 也 是 不 同 的 。 这 些 差别 也 是 各 种 氨基 酸 在 柱 层 析 过 程 中 被 分 离开 的 基础 。 氮 基 酸 在 树脂 中 分 离 也 会 受 温 度 影 响 ， 即 温度 升 高 平衡 移 向 吸 热 过程 的 方向 ， 即 解吸 作用 的 方向 。 这 在 生理 体液 的 分 析 中 特别 明显 ， 在 分 离 过 程 中 , 柱 温 是 变化 的 , 越 到 后 来 柱 温 升 得 越 高 ， 特别 在 再 生 时 柱 温 最 高 ,使 被 吸附 物 能 绕 统 洗 脱 坏 来 。 所 以 在 氨基 酸 分 析 中 ,只 要 正确 地 选择 洗 脱 的 . PH、 离 子 强度 、 流速 、 温度 等 条 件 , 就 可 使 混合 物 中 的 各 种 不 同 氨基 酸 一 一 分 开 。 不 同 氮 基 酸 对 树脂 的 结合 力 如 下 : ee eee ee ee RREABER. 图 3-2 是 日 立 835-50 型 氨基 酸 自动 分 析 仪 的 分 析 图 谱 。 n > 1S) 1 1 1 1 1 二 2 & i> - oe 1 1 ere oN He <2 oO t89 1) sis itl: | < i 1 Sigs it ‘2 = ® ae f #) REP KAEA E> Hi? 4 BE AO BRP FRR Bi AAO BO A 4 ARTA BSS BS RD BT AL SPR i BE LH WME IT AI, 1 = VBL EL 氨基 酸 。 如 工 K134400， DurrumD-500， Beckmanl19Cl, Chromaspek 等 的 排列 顺序 是 组 氨 酸 一 赖 氨 酸 一 所 一 精 氨 酸 。 上 日立 KLA-5, 捷克 AAA881 等 排列 顺序 是 赖 氨 酸 -> 组 氨 酸 一 所 一 精 氮 酸 。Beckman 121MB 的 顺序 与 日 立 835-50 型 相同 。 色 氨 酸 出 峰 位 置 不 图 定 , 在 人 LA-5 型 氨基 酸 分 析 仪 中 位 于 赖 氨 酸 之 前 ; 而 在 有 的 仪器 中 则 靠近 精 氨 酸 。18 se。 30 。 种 标准 氨基 酸 混合 液 内 没有 色 氨 酸 ， 因 此 往往 需 单独 测定 或 采取 特殊 方法 "20。 谷 氨 酰 氨 和 天 冬 酰 氨 在 酸 水 解 过 程 中 相应 变 成 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 ， 不 属 本 方法 测定 范围。 氨基 酸 的 洗 脱 是 用 不 同 pH 的 缓冲 液 来 进行 的 ,日立 835 型 氨基 酸 分 析 仪 分 析 蛋 白 质 水 解 样品 采用 柠 榜 酸 钠 盐 缓冲 液 。 它 们 是 : (1) TPH*-1: pH3.3 0.2N(Na+)， 用 于 洗 脱 酸性 氨基 酸 。 (2) IPH-2: pH3.3 0.2N(Nat), 与 IPH-1 的 区 别 只 是 乙醇 含量 不 同 。IPH- HZ 醇 含量 为 130ml/1，IPH-2 的 乙醇 含量 为 20ml/1， 用 于 洗 脱 中 性 氨基 酸 。 (3) IPH-3; pH4.3 0.2V(Na+), 用 于 洗 脱 异 亮 \ 亮 \ 酷 . 茶 丙 等 氨基 酸 。 (4)-IPH-4:- pH4.9 1.2N(Na™ ) 洗 脱 碱 性 氨基 酸 。 9 ` 下 外 ;分 析 仪 配 有 再 生 液 (IPH-RG)， 内 含 0.2NNaOH 溶液 ,用 作 柱 子 的 再 生 , 用 它 可 去 除 样品 中 所 带 的 其 它 阳离子 对 树脂 的 污染 ， 并 使 树脂 回复 到 初始 状态 。 因 此 每 做 一 个 祥 品 ,仪器 将 自动 吸 人 再 生 液 ,经 再 生 后 再 接着 下 一 个 样品 的 分 析 。 12. 氨基 酸 与 划 三 酮 的 显 色 反应 难 层 析 柱 中 洗 脱 下 来 的 氨基 酸 与 另 一 流 路 的 草 三 =m ， 在 微 酸性 溶液 中 与 氨基 酸 加 热 ,发 生 氧化 \ 脱 氨 、 脱 羧 作用 。 — HShiSs c- 氮 基 酸 反应 : Tate O lon CL a be aa .. oe w= came | BOER Ly | CX XY 4R-CHOINH3t+C O2,, 六 mer OH O tt EE= H O o oO ON y | 1 Il c.f oy 人 +2HO we 二 4 aaah aa ia * H)=ng (nanogram 一 107’mol) 此 项 数据 ( 纳 克 重 ) 计 算 机 能 同时 打印 出 来 ( 见 表 3-1), —B 处 理 器 出 了 故障 或 因 基 线 不 平 直 需 校正 某 氨 基 酸 的 峰 面积 时 ,也 可 用 手工 方法 计算 : 峰 高 乘 以 半 高 峰 宽 (Hx W) 为 面积 ( 见 图 3-4)。 从 已 知 标准 氨基 线 峰 面积 (4.). RE (C.) 及 测量 的 样 品 中 相应 氨基 酸 的 峰 面积 〈(4,) 可 求 出 该 未 知 氨基 酸 的 含量 Ce ns Aas x A, 但 手工 计算 峰 面 积 精确 度 差 。 三 :> 蛋白质 样品 的 水 解 处 理 分 析 蛋 白质 或 多 肽 的 氨基 酸 组 成 ， 需 将 各 个 肽 键 裂解 (俗称 水 解 ) 变 残 基 为 游离 氨基 酸 。 不 同 氨 基 酸 所 形成 的 肽 键 对 酸 水 解 的 耐 受 性 不 同 ， 一 些 带 长 分 叉 侧 链 的 氨基 酸 (如 亮 \ 异 亮 和 纺 等 氨基 酸 ) 所 形成 的 肽 键 ,对 酸 水 解 具 有 很 高 的 耐 受 性 ; 另 一 些 氨基 酸 (如 丝 、 。33 。 苏 、 甘 等 氨基 酸 ) 在 水 解 时 不 稳定 易 被 破坏 ,， 因 此 影响 了 分 析 结 果 ?””5-: 随 着 氨基 酸 自动 分 析 仪 的 分 析 精 度 不 断 提高 。 蛋 白质 或 多 肽 样品 的 水 解 处 理 已 成 为 影响 氨基 酸 组 成 分 析 精确 度 的 主要 问题 ? 当 。 准 确 测定 蛋白 质 氮 基 酸 组 成 需 根据 不 同 对 象 选 择 不 同 的 水 解 方 法 ,以 达到 满意 的 结果 。 ; (一 ) 盐酸 水 解法 beam 盐酸 水 解 仍然 是 目前 水 解 蛋白 质 或 多 肽 应 用 最 广泛 的 一 种 方法 。 此 法 能 较 满意 地 得 到 除 色 氨 酸 和 觅 氨 酸 以 外 的 其 它 所 有 氨基 酸 ,方法 也 较为 简便 。 1. 试剂 和 材料 C1) 5:.7VHCI: 优 级 纯 浓 盐酸 (含量 36 一 389% ,比重 1， 19) 用 双 蒸 水 1: 1 aRR aS 玻璃 蒸 饮 器 蒸馏 , 2 一 3 次 ;收集 恒 沸 点 溶液 ;其 浓度 为 ;5.7VHCl。 ， (2) 水 解 用 的 玻璃 试管 : 选用 约 1 x 7(cm) 的 硬 质 厚 壁 试管 eee 确 酸 (3:1) 混 合 液 ( 或 洗 液 ) 漫 泡 , 然 后 用 去 离子 水 冲洗 干净 ,并 高 温 (500%C 7. 以 去 除 有 ， 机 试剂 。 烤 干 后 在 火焰 喷 灯 上 将 试管 在 距离 管 口 1 一 2 厘米 处 加 热 并 拉 细 至 直径 为 2—4 mm 备用 。 Hy ty ) Say St Pak : 3) BER ANF AF UK) FAS FR THR EL KRIP o 由: 2. 操作 步骤 C1) ERY EMR 0.20 一 2.00mg 蛋白 质 或 多 肽 样品 (样品 量 应 视 蛋白 质 分 子 大 小 和 氨基 酸 分 析 仪 的 灵敏 度 定 ,下 同 )， 置 水 解 管 的 底部 。 有 的 无 法 称 量 的 样品 ;只 能 估计 适当 量 。 (2) FAWN 0.S—1.0ml ( 视 样品 量 定 ) S.7NHO 于 管内 最 好 再 加 -- 滴 去 泡 剂 GEE). at" FAI og ; (3) 将 试管 置 于 冷却 剂 中 冷冻 “和 (4) 将 冻 干 的 试管 与 真空 泵 连接 ， 抽 气 至 无 气泡 为止 使 真空 SBE <50 mo: +h (5) 在 走 空 下 或 充 氮气 后 立即 封 管 。 atk T we (6) 将 试管 置 于 水 解 炉 (或 恒温 箱 ) 内 ,在 110+ 1°C 水 解 24 小 时 。 a a CO OKAPRDTESHTECL, REAVER ALO, Su Fee FAR RA 干 。 如 一 次 去 除 盐 酸 不 彻底 ,加 去 离子 水 重复 一 次 。 (8) 抽 王 后 的 样品 加 适量 柠檬 酸 缓冲 液 (pH2.2) 或 0.02VHCI 溶解 ， 上 机 分 析 。 暂 时 不 分 析 的 样品 ,干燥 后 置 冰箱 (4%c ) 中 保存 。 3. if ie 盐酸 水 解 使 色 氮 酸 全 部 破坏 ， 苏 氨 酸 和 丝氨酸 破坏 S—10%2", 色 氨 酸 破坏 的 主要 AEA AINA 0.5 一 6 多 《体积 百分比 ) 的 斑 基 乙酸 就 能 起 到 保护 作用 , 一 般 能 达到 70 锡 的 回收 率 ““。 改 用 1 一 3 多 ARIE CBA 0.5 一 1 的 草酸 (重量 /体积 ) ERP, 效果 更 加 明显 ,最 高 能 达到 9%5 多 的 回收 率 吧 ,与 甲 基 础 酸 水 解法 的 回收 率 不 相 上 下 ( 见 表 3-2), 但 这 种 方法 对 糖 蛋白 或 含有 大 量 碳水 化 合 物 的 蛋白 样品 效果 较 差 。 | 34 «6 83-2 ”用 不 同方 法 水 解 溶菌 酶 测定 的 氨基 酸 含量 的 比较 (单位 : 氨基 酸 mol 数 |1mol WR) 理论 值 a ( 残 基数 ) “CB 21 7 10 5 12 ‘ 12 Pe 8 5.9 1 5.7 5. 6 1.9 .2 Lae i; 2 6.0 1 5.5 5. 6 8.4 “4 Led Pe 8 2.8 .9 2.9 2. 3 3.4 .6 2.9 2. +3 5.8 .8 5.9 6. 6 7 0.8 Bi 1.0 0.6 1 5.5 .8 4.1 一 6 ee 2 11.1 9. 11 1.4 9 1.6 2. 2. a. Liu, T. Y. and Chang, Y. H.: J. Biol. Chem., 246, 2842-2848, 1971, b. Matsubara, H. and Sasaki, R. M.: Biochem. Biophys. Res. Conmun., 35, 175, 1969. 盐酸 水 解 时 ， 甲 硫 氮 酸 易 被 氧化 转变 为 甲 硫 氮 酸 硕 。 一 般 认 为 将 损失 20% 左右 ,可 以 用 这 一 数值 进行 校正 。 如 要 准确 测定 这 一 氨基 酸 可 采用 如 下 两 种 方法 : 四 加 保护 剂 ， 在 盐酸 中 加 入 01-10% 莹 基 乙 酸 ， 可 在 水 解 中 减少 甲 硫 氮 酸 的 损 具名 ,到 @ 用 过 甲酸 氧化 ,这 时 除 胱 氨 酸 (或 半 胱 氨 酸 ) 被 氧化 成 半 联 磺 酸 外 ， 也 使 甲 硫 氮 酸 氧化 为 甲 硫 氮 酸 硕 。 此 氧化 物 的 出 峰 时 间 在 天 冬 氨 酸 之 前 。 但 这 一 峰 在 日 立 835 AER 分 析 仪 上 用 2.6 x 150(mm) 分 离 柱 无 法 将 它们 分 开 ， 若 用 直径 为 26 x 250(mm) 柱 或 直径 为 4.0 X 150mm 柱 , 采 用 特殊 程序 能 将 它们 分 开 。 图 3-5 是 它 的 分 离 图 谱 ， 分 辩 率 达 81.9%, 盐酸 水 解 中 , 可 将 酷 氨 酸 氧 化 成 3- 氧 酷 氨 酸 或 3- 诈 酷 氨 酸 ?%， 其 破坏 的 机 理 目 前 尚未 和 弄 清 ,可 能 是 发 生 以 下 反应 : bet NH, cl NH, ( \ | O, ‘ 》 | | OH 一 —CH,—CH—COOH + HCl 一 >OH 一 --CH 一 CH 一 COOB BAR 3- 氯 代 栈 氨 酸 es 35 。 NH, Br NH, | O, VA | | OH— —CH,— CH—COOH + HBr —>OH— —CH-—-CH—COOH 酷 氨 酸 3- 澳 代 酷 氨 酸 7 9s: = - RRM a COGS 3-5 HAR, PARE Ml eA is 4 产生 哪 一 种 反应 ， 取 决 于 盐酸 的 纯度 ， 一 般 是 前 者 ， 若 盐酸 中 含有 省 化 氢 时 ， 产 物 主要 是 后 者 。 Carraway 和 Lesmane2 发 现 盐酸 水 解 中 酷 氨 酸 的 破坏 率 约 为 10 多。 如 水 解 时 加 和 人 0.1—-1.0% (BEATE HAE LARA! 0.05 一 0.1 多 《重量 /体积 ) EM, 能 使 酷 氨 酸 和 丝 氨 酸 回收 率 明显 提高 。 这 时 甲 硫 氨 酸 也 能 避免 遭 到 破坏 。 “盐酸 水 解 中 胱 氨 酸 水 解 成 半 胱 氨 酸 。 后 者 不 能 与 曹 三 酮 产生 颜色 反应 ， 难 以 直接 定 量 测定 器 ,通常 采用 下 列 方 法 进行 。 Te (1) 在 水 解 前 对 样品 进行 过 甲酸 氧化 使 胱 氨 酸 转变 为 半 胱 磺 酸 (方法 见 第 四 章 )， 半 有 磺 酸 在 氨基 酸 分 析 仪 上 的 出 峰 时 间 在 酸性 氨基 酸 前 方 约 5 分 钟 处 ( 见 图 3-6)， 用 这 一 方法 能 获得 定量 测定 。 半 胱 磺 酸 _ RAH SAMPLE TAG 1 6 INST. DATE 1 1960. 5.09 MIN. A CAL TABLE 30000 7 1 NO. NAME TIME HEIGHT AREA FACT N MOL N GRAM 3. .Gys 4.72 31893 1155519 1500 1.733 416.33 6 MET 9.26 50862 1688255 3000 5.064 755.66 图 3-6 AE Ee AP Wit SY a; (2), 自然 氧化 法 9。 操作 步骤 是 : 取 一 定量 水 解 液 ,立即 干燥 后 加 Sm! 0.01IN & 氧化 钠 溶 液 , 调 pH 至 6.5, 在 空气 中 开口 放置 4 小 时 ,使 半 胱 氨 酸 氧化 为 胱 氨 酸 ,然后 上 机 测定 。 此 法 回收 率 低 , 通 常 只 能 达到 50% 左右 。 此 外 ,也 有 用 盐酸 水 解 液 的 过 甲酸 氧化 法 等 。 虽 然 胱 氨 酸 的 测定 方法 各 异 , 不 少 人 作 过 研究 , 但 至 今 尚 存在 不 少 问 题 。Sarwar 及 其 同事 e4 曾 在 不 同 实验 室 测定 胱 氨 酸 ， 发 现 它 的 测定 值 之 差 在 17 多 左右 ,所 以 如 何 提高 胱 氨 酸 的 测量 值 , 仍然 是 有 待 进一步 解决 的 问 题 。 大 量 实验 证 明 , 蛋 白质 中 某 些 氨基 酸 ,尤其 是 含 硫 氨 基 酸 易 被 空气 中 的 氧 和 各 种 化 学 试剂 氧化 。 因 此 ,使 用 高 纯度 水 解 试 剂 \ 清 洁 的 水 解 管 以 及 封 管 前 除 尽 水 解 管 中 的 氧 ， 对 于 定量 测定 十 分 重要 。 (二 ) 磺 酸 水 解法 二 ” 1. 原理 ” 磺 酸 是 非 氧 化 性 强酸 ,用 它 来 代 蔡 盐酸 水 解 有 许多 优点 ,近年 来 已 被 广泛 应 用 。 _ FAAN 甲 基础 酸 , 内 含 0.2%3-(2- 氮 乙 基 ) 阿 | 唆 ( 色 胺 ) 作 水 解 剂 ,其 中 3-(2- CE) 隐 | 唆 作为 色 氨 酸 的 保护 剂 。 此 法 可 使 色 氨 酸 的 回收 率 达 到 90% 以 上 , 丝氨酸 和 苏 氨 酸 的 回收 率 接近 定量 值 ( 表 3-2)。 其 中 半 胱 氨 酸 可 用 二 硫 代 苏 糖 醇 还 原水 解 液 中 的 胱 氨 酸 及 其 衍生 物 , 然后 用 过 量 的 连 四 硫酸 钠 氧 化 ,得 到 S- 磺 基 半 胱 氨 酸 而 加 以 测定 。 2. 试剂 和 材料 4N FARBER (PY 0.2% 3-(2- AZ A)EI) (顺序 分 析 级 )。 二 硫 苏 糖 醇 ; 吡 啶 5 固 体 连 四 硫酸 销 (分 析 级 刀 其 它 同 盐酸 水 解法 。 3. 操作 步骤 GD) 准确 称 取 0.20—2.00mg BE BARS BRP AR REE, 视 样品 量 加 0.5- 一 1.0ml 4N FBR, (2) 反复 通 氮 气 或 真空 下 封 管 。 (3) 在 115 士 1sC 的 水 解 炉 内 水 解 22 一 72 小 时 (通常 22 小 时 )5 《4) 水 解 后 切 开封 口 ,加 0.5 一 10ml 3.5VNaOH 中 和 (pH 至 中 性 )。 (5) 离心 或 过 滤 水 解 疲 , 取 一 份 上 清 液 测 定 除 半 胱 氨 酸 外 的 所 有 所 基 酸 。 (6) 另 取 1.0ml 水 解 液 ,冷却 至 4%c, 加 0.3ml 吡啶 ,随后 用 4NNaOH 调 pH 至 6.8， 再 加 4umol 二 硫 苏 糖 醇 ,立即 通 氮气 约 工 分 钟 ， 用 蜡 膜 (或 其 它 ) 封 口 , 于 37%c 保温 1 小 时 ,然后 加 固 和 株连 四 硫酸 钠 60meg(200umdl), BA 25°C 下 停放 至 少 5 小 时 ,然后 真空 干燥 ， 加 适量 -pH2.2 的 缓冲 液 溶 解 上 机 分 析 。 这 时 测定 的 是 半 胱 氨 酸 的 衍生 物 S- 磺 基 DE RAR 4. 讨论 这 一 方法 的 最 大 优点 是 中 性 水 解 液 可 直接 上 机 ， 色 氨 酸 较 稳定 。 当 水 解 温度 超过 * 37 e 15% BY, Ppa 22 Sa a aD, (A PRG Ree (Ae 3-3,3-4), RARER 表 3-3 4MN PEGRKRRRUNKRAHAAZBOKSHRM 人 氨基酸 me ti 22 vik 22 小 时 Ae 100 190 >. ae 组 OR BE 99.1 100 101 ‘oa 酸 98.2 99.2 100 色 氨 酸 100 96.8 95.4 100 苏 OB 100 94.1 89.9 ye eee 丝 eh 酸 100 90.4 81.4 ae 训 Yi a 酸 100 99.2 98.4 10.2 98.2 96.7 氨基 酸 zy Vik oF it 22 小 时 束 所 酸 6.0 on Am 酸 0.97. Mae Tet: 色 氨 酸 5 苏 Bm 酸 5.52 % 氨 酸 6.58 wi A 酸 5.72 FAR 5.43 NaOH 中 和 水 解 液 的 过 程 中 pH 很 难 掌握 。 此 外 磺 酸 水 解 也 有 局 限 性 ， 当 水 解 液 中 存 、 在 碳水 化 合 物 时 , 色 氮 酸 容易 破坏 。 有 人 吗 曾 用 3N 对 甲苯 磺 酸 试验 ,在 通常 水 解 (110% 22 小 财 ) 条 件 下 , 色 所 酸 的 回收 率 为 80—90% 5 无 碳水 化 合 物 时 ， 加 0.2 儿 3-(2- 氨 己基 ) TEE, ICH 87-93%; 当 样 品 中 含有 30% 碳水 化 合 物 时 ， 名气 酸 的 回收 率 明显 下 降 〈 见 表 3-5)。 \ 表 3-5 用 3N 对 甲苯 矿 酸 水 解 (在 有 或 无 390 碳水 化 合 物 时 改变 3-(2- 氨 乙 基 ) 吓 嗓 浓 度 ) 对 牛 胰 凝 乳 蛋白 酶 中 色 氨 酸 回 收 率 的 影响 汪 5 3-(2- CHE I & A BR Ff B&B CR #,) 百 分 含 量 (927 有 碳水 化 合 物 无 碳水 化 合 物 0 3.87(48.4) 6.95(86.9) ° 0.2 4.96(61.8) 7.45931 SI ya 1.2 6.14(76.8) 7.56(94.5) ; 2.4 6.41(80.1) 7.48(93.5) , BALA N-BBAMMMPRH RMR 1:4.5 比例 组 成 。 括号 中 的 回收 率 是 根据 每 摩尔 蛋白 酶 8 个 色 氨 酸 残 基 作 为 底数 计算 的 。 因此 对 含有 较 多 碳水 化 合 物 的 糖 蛋白 分 子 不 能 用 本 方法 测 色 所 酸 。 ,二 (三 ) wom 色 氨 酸 在 碱 性 条 件 下 是 稳定 的 ， 所 以 用 碱 水 解法 测定 色 氨 酸 是 有 效 的 。 碱 水 解 可 使 蛋白 质 中 多 数 氨基 酸 遭 到 破坏 ;故此 法 不 能 用 作 全 氨基 酸 的 分 析 , 仅 限于 测定 色 氨 酸 。 操 作 步 骤 如 下 : (1) 称 取 0.20—2.00mg 蛋白 质 样品 于 水 解 管内 ,加 0.5 一 1.0ml 5N NaOH( 内 含 5 多 氧化 亚 锡 )。 (2) 反复 充 氨 气 或 抽 真 空 后 封 管 口 (最 好 用 聚 丙烯 管 或 聚 四 氟 乙 烯 管 代 替 玻 璃 管 ,以 免 在 水 解 过 程 中 形成 硅 酸 盐 )。 (3) 在 110 士 1sc 水 解 炉 内 水 解 22 小 时 。 (4) 丈 解 后 切 开 管 口 ; 置 于 冰 水 浴 中 ， 用 6N 盐酸 中 和 ， 调 pH 至 6 一 7, eax LIKED HT. (四 ) Berk HEE 酶 水 解 比较 温和 。 选 用 专 二 性 低 \ 水 解 酶 活力 高 的 蛋白 酶 水 解 ,可 以 使 蛋白 质 完全 水 解 成 游离 氨基 酸 。 用 酸 水 解 易 受 破坏 或 转变 成 别 的 氨基 酸 , 如 色 氨 酸 \ 天 冬 酰 所 和 谷 氨 酰 氮 等 ， 均 可 用 酶 水 解 直接 得 到 。 存 在 于 蛋白 质 中 的 磷酸 丝氨酸 ， 在 酶 水 解 中 也 能 释放 出 Ko | | | M7kH— BARE: 先 将 蛋白 质 加 热处理 变性 ,使 之 易 受 酶 的 作用 ,然后 用 一 种 或 几 种 蛋白 酶 (如 上 胃 和 蛋白 酶 ,木瓜 蛋白 酶 ,枯草 杆菌 蛋白 酶 , REO, PREM RAS 白 酶 等 王 解 ,使 它 产 生 多 肽 混合 物 ， 再 用 氨 肽 酶 M 或 亮 氨 酸 氨 肽 酶 和 氨 酰 基 且 所 酸 酶 等 完全 水 解 成 氨基 酸 。 虽然 酶 水 解 有 不 少 优越 性 ;但 是 也 有 它 的 缺点 。 主 要 是 不 易 过 到 彻底 水 解 ,影响 氨基 酸 的 回收 率 ; 同时 水 解 中 释放 的 氨基 酸 有 可 能 受 蛋白 酶 自 溶 产 物 的 污染 。 这 些 都 会 影响 最 终 的 分 析 结果 。 四 、 和 氨基 酸 组 成 分 析 的 误差 纠正 [3] 在 蛋 自 质 或 多 肽 的 氨基 酸 组 成 分 析 中 ,测量 值 与 实际 值 (理论 值 ) 之 间 往 往 出 现 误差 ， 少数 几 个 氨基 酸 的 误差 很 大 ， 其 原因 来 自 以 下 两 方面 : 其 一 ,仪器 本 身 造 成 的 。 氮 基 酸 分 析 仪 具 有 快速 灵敏 的 特点 ,正常 情况 下 ， 可 以 认为 测定 结果 是 可 靠 的 。 但 有 时 由 于 外 界 电 信号 干扰 ,电压 变化 ,部 分 原件 老化 等 ; 或 操纵 者 管理 不 善 ,如 试剂 不 纯 , 缓 冲 液 配 制 有 差异 ,分 析 柱 内 树脂 污 染 或 树脂 填充 不 当 等 原因 , 降 低 了 仪器 的 性 能 ， 使 测量 值 受 到 影响 。 其 二 ,前 处 理 造成 的 。 其 中 有 的 是 不 可 避免 的 ， 如 用 盐酸 水 解 时 有 的 氨基 酸 受 破坏 ， 有 的 氨基 酸 释 放 很 快 ,而 有 的 氨基 酸 释 放 较 慢 , 因 此 用 同一 时 间 水 解 ,回收 率 必然 不 同 。 有 的 是 处 理 不 当 造 成 的 ,如 试剂 不 纯 , 水 解 管 清 洗 不 干净 , 封 管 前 没有 除 尽 氧 ; 反 应 温度 过 高 或 过 低 等 ,都 会 直接 影响 水 解 产 率 。 为 提高 氨基 酸 分 析 的 准确 性 ,要 求 仪器 操作 者 妥善 管理 仪器 , 合理 操作 ， 在 蛋白 质 水 e 39 。 fie Ab FR A EE Fe BR a FR Hes all 7k RR EH Ek RR A eR. 外 ,可 采取 误差 校正 方法 使 测量 值 接近 实际 值 , 具 体 方法 如 下 : (1) Ate", 选用 一 稳定 的 已 知 量 的 氨基 酸 ( 如 正 亮 氮 酸 ) 作 内 标 洒 水 解 前 加 到 和 蛋 白质 溶液 中 ， 水 解 后 在 氨基 酸 分 析 仪 上 测定 。 用 内 标的 回收 率 校 正 蛋白 质 申 氨基 酸 的 回 收 率 。 如 内 标 回 收 率 为 80 多 , 则 样品 中 氮 基 酸 的 实际 含量 应 为 测 得 含量 的 100/80 Fo 此 法 适用 于 单纯 蛋白 质 氮 基 酸 组 成 的 测定 。 内 标 物 加 在 水 解 后 的 氨基 酸 混合 臣 中 还 可 以 校正 仪器 的 测量 误差 。 由 于 不 同 的 氨基 酸 在 水 解 中 的 破坏 率 不 同 ， 用 单一 内 标 作 校 正 因子 有 二 定局 限 性 。 (2) SE: 水 解 时 ,由 于 蛋白 质 分 子 侧 链 基 团 的 影响 , 肽 键 水 解 的 难 巡 不 同 六 加 灿 在 通常 水 解 条 件 下 有 的 氮 基 酸 受 到 破坏 ,因而 造成 测量 误差 。 为 此 ;可 采取 不 同 的 求解 时 间 ; 分 别 测定 氮 基 酸 含量 ,然后 作 图 ， 外 推 到 零 时 或 无 限 长 时 水 解 为 它 的 含量 值 。 有 人 吧 2 曾 用 同一 样品 分 别 水 解 24.48、72 和 96 小 时 ， 将 测 得 的 氨基 酸 含量 与 水 解 时 间作 图 ,由 图 3-7 得 知 , 当 氮 基 酸 含量 不 随 水 解 的 时 间 改 变 时 (如 细 氮 酸 、 亮 氮 酸 ), 取 其 平 均值 ; 当 水 解 时 间 增 加 ,氨基 酸 胡 量 也 增加 时 (如 蜡 亮 氮 酸 ), 取 水 解 76 BK 96 小 时 的 值 ; 若 增加 水 解 时 间 ; 氮 基 酸 含量 反而 降低 时 (如 图 中 的 苏 氨 酸 、 丝 氮 酸 ) 则 通过 外 推 靶 ,在 纵 坐 标 上 取 零 时 水 解 值 。 但 需 注意 ， 对 某 些 氨基 酸 ， 由 于 水 解 时 间 与 测 得 的 氨基 酸 含量 是 非 线性 关系 的 ,外 推 东 也 是 非 线 性 的 , 这 就 导致 了 计算 上 的 麻烦 。 此 法 只 在 一 定 的 数值 范围 A Ax, . (3) 通过 标准 氨基 酸 混 合 该 的 实验 值 校 IE: 最 简单 的 办 法 是 : 在 实验 条 件 完全 二 致 的 情况 下 ， 分 别 水 解 蛋白 质 样品 和 标准 氨基 20 40 60 80 100 120 140 160 酸 混合 被 ， 然后 从 标准 氨基 酸 的 测量 数据 求 水 解 时 间 出 校正 因子 。 图 3-7 Kl. ge eae ATP-AMP 肌 如 用 5 .7NVHCI 水 解 24 小 时 ， 测 得 标准 氨基 酸 混合 液 中 的 丝 氮 酸 和 苏 氮 酸 的 回收 率 分 别 为 89.5% 和 94.7 匈 , 则 蛋白 质 水 解 后 的 丝氨酸 和 苏 氮 酸 的 测量 值 分别 用 «100/89.5 和 100/94.7 因子 校正 。 表 3-3 是 4V 甲 基 磺 酸 水 解 温度 对 混合 标准 氨基 酸 回 收 率 的 影响 。 但 在 许多 情况 下 ,游离 氨基 酸 的 破坏 率 与 水 解 蛋白 质 ( 或 多 肽 ) 中 氨基 酸 的 破坏 率 不 同 , 因 此 两 者 的 因子 也 有 差异 。 此 法 只 能 校正 水 解 过 程 中 不 稳定 氨基 酸 的 破坏 ， 而 不 能 校正 水 解 过 程 中 氮 基 酸 释放 不 全 。 1.2 1.0 um ol Ze wR 0.2 五 、 氨 基 酸 残 基数 的 计算 蛋白 质 中 的 氨基 酸 组 成 通常 可 用 不 同 的 方式 表示 ， 诸 如 每 百 克 蛋白 质 中 含 每 种 氨基 酸 的 克 数 (或 百分率 妃 蛋 白质 中 氨基 酸 含 氮 量 的 百分率 ;以 及 蛋白 质 中 各 氨基 酸 的 相对 百 « 40 。 分 含量 等 。 对 于 蛋白 质 结构 研究 者 来 说 ， 最 有 实际 意义 的 是 每 一 蛋白 质 (或 多 肽 ) 分 子 中 含 各 种 氨基 酸 的 分 子 数 , 即 残 基数 。 从 实验 结果 计算 蛋白 质 ( 或 多 肽 ) 中 的 各 种 氨基 酸 残 基数 ,可 采用 如 下 的 方法 : 从 理论 上 ,根据 已 知 蛋白 质 分 子 量 和 已 知 用 作 测 定 的 该 蛋白 样品 重量 ,算出 它 的 _mol ” 数 ,以 及 从 氮 基 酸 分 析 仪 上 测定 的 各 种 氨基 酸 的 mol 数 , 即 可 推 知 每 mol 蛋白 质 中 所 含 的 各 种 氨基 酸 的 残 基数 。 如 已 知 用 作 测 定 的 胰岛 素 量 为 1.72wg( 上 机 进 样 量 ), 用 它 除 以 分 子 量 5734;, 即 相当 于 0.3nmol。 经 氨基 酸 分 析 仪 测定 后 , 天 冬 氨 酸 为 0.9Inmol， 那 末 天 冬 氮 酸 在 胰岛 素 分 子 中 应 为 0.91/0.3 一 3.03 ,为 3 个 残 基数 证 。 实 际 上 这 样 计 算出 来 的 值 往往 与 理论 值 差距 较 大 ,原因 是 : 其 一 ， 分 子 量 的 测定 误差 一 般 在 10 多 以 上 3; HO, RK 称 量 的 样品 很 难 做 到 绝对 于 燥 和 绝对 纯 , 加 上 微量 称 量 中 有 误差 ;其 三 ， 在 水 解 处 理 过 程 中 样品 的 损失 ,或 甚至 草 三 酮 试剂 或 仪器 的 部 分 零件 (如 灯泡 ) 老 化 等 ,这 样 ， 常 使 测量 值 低 于 实际 值 。 据 我 们 的 经 验 , 较 好 的 计算 方法 是 : (1) 较 大 分 子 量 的 蛋白 质 的 计算 。 现 以 日 立 835-50 HAREM A DTT OO is 水 解 液 的 测量 结果 为 例 说 明 。 表 3-6 中 nmol 和 nGRAM 是 该 酶 的 直接 测量 值 。 加 和 , NGRAM 项 (应 包括 NHs 的 值 , 因 为 它 主要 是 酰胺 脱 氨 产 物 ) 2nGRAM = 9,835. 09ag, 溶 菌 酶 的 分 子 量 (14， 400 ) 加 上 被 脱 去 的 水 分 子 量 ， 14,400 + (14,400 +110 — 1) x 18 = 16,738.36， 二 项 相 除 : 9,835.09 + 16,738.36 = 0.588nmol , 即 为 实际 上 分 析 柱 测量 的 溶菌 酶 的 mol 数 。 根 据 测 量 表 3-6 溶菌 酶 水 解 液 氨 基 酸 组 分 NAME Nmol 天 冬 氨 酸 2 1650.10 21.1 21 苏 氨 酸 0577 2 二 482.80 6.9 7 丝氨酸 5.292 555.66 9.0 10 SBE 3.058 449.46 Soe 5 甘氨酸 7.040 528.05 12.0 12 ARE 7.062 628.56 12.0 12 半 胱 氨 酸 4.468 540.72 7.6 8 U5 5S Es 3.469 405.89 5.9 6 甲 硫 氨 酸 1.117 166 . 46 1.9 ‘2 RAR "3.528 $2006) tLe 6.0 6 RAR ， 4.939 647.03 8.4 8 MAR 1.646 297.99 + oe 3 RARR 1.999 329.87., 3.4 3 MAR 3.410 497.92 « 5.8 6 ee an 0.470. 72591» 0.8 1 BAe 3.234 659.74 5.5 6 AAR 6.588 1145.89 11.2 11 Hi 2a 0.823 94.67 1.4 2 氨 12.895 219.21 5.7NHCL (内 含 :296 FILMA 0.1% 草酸 ) 110°C 水 解 24 小 时 。 表 中 的 半 胰 氨 酸 系 过 甲酸 氧化 处 理 后 单独 测 定 。 的 nmol 值 , 可 算出 天 冬 氮 酸 在 溶菌 酶 分 子 中 的 残 基数 ,12.406 + 0.588. 一 21.1, 苏 氨 酸 为 ; Si 4.057 + 0.588 = 6.9 ( 见 表 3-3). (2) 小 肽 分 子 的 计算 。 一 般 可 以 测 得 的 nmol 值 中 找 出 数值 最 小 的 一 个 数 为 基数 , 定 它 为 工 个 残 基数 ,用 以 与 其 它 的 比较 ,它们 的 比值 就 是 其 相应 氨基 酸 的 残 基数 。 如 某 一 小 肤 , 测 得 最 小 nmol 值 是 His = 0.5amol， 其 次 是 Asp = 一 1.20，Ala = 1.90, Glu = 2.30, 则 该 小 肤 耸 子 中 His 的 残 基数 为 1, Asp = 2.4(2)，Ala = 3.8(4)，Glu = 4.6(5)。 MR 有 二 个 或 三 个 以 上 最 小 相近 似 的 值 ， 如 上 述 小 肽 若 有 le = 0.65nmol, Phe = 0.45nmol ， 则 可 取 其 平均 值 : (0.50 + 0.65 十 0.45)+3 一 0.53nmoi 0.53 为 基数 值 ,用 它 与 其 它 的 作 比 较 , 这 样 可 减少 误差 。 尽管 如 此 ,蛋白 质 或 多 肽 的 氨基 酸 残 基数 的 确定 ,还 有 待 于 该 蛋白 质 或 多 肽 顺序 的 最 后 测定 。 在 多 肽 链 分 子 中 ， 每 一 氨基 酸 所 含 的 当量 应 该 等 于 该 肽 链 加 入 的 当量 或 是 它 的 整 倍 数 。 所 以 对 一 个 纯 的 样品 ;其 分 子 中 所 含 各 氨基 酸 的 分 子 数 ( 残 基数 ) 应 该 都 是 整数 ， 最 少 是 1 或 是 1 的 整 倍 数 。 对 于 一 个 小 肽 分 子 ( 如 小 于 35 个 残 基数 )， 取 最 大 的 nmol 测量 什 为 基数 , 与 其 它 氨基 酸 的 nmol 测量 值 , 推算 它们 在 肽 链 中 的 残 基数 ,应 该 说 是 可 信 的 。 据 我 们 的 经 验 , 对 于 小 肽 分 子 , 只 要 其 中 各 氮 基 酸 的 分 布 比较 均匀 ， 那 末 氨 基 酸 自动 分 析 仪 对 其 水 解 滚 中 各 氨基 酸 的 _ nmof 测量 值 比值 一 般 都 较 接 近 整 数 倍 8 此 方法 用 于 较 实 分 子 量 的 蛋白 质 测定 时 应 该 谨慎， 因为 大 分 子 量 的 蛋白 质 中 的 各 秘 氨 基 酸 分 布 往往 很 不 殉 与 。 如 果 以 最 小 的 nmol 测量 值 为 基数 去 比较 ,二 般 说 来 误差 较 大 , 而 且 这 个 基数 所 对 应 的 氮 基 酸 究竟 是 1 个 残 基 还 是 2,3 个 残 基 也 难以 确定 。 如 表 3-6， 若 以 组 氮 酸 的 0.470nmol 测 量 值 为 基数 1， 则 天 冬 氮 酸 = 12.406/0.470 一 26.40(26 RE), FARAH 8.609 TR 基 )， 丙 氮 酸 为 15.0(15 个 残 基 )， 显然 与 理论 值 相 差 甚 远 。 SSeS x a [1] BRAS: 蛋白 质 化 学 研究 技术 ，p. 34-94, HSH Mt (1973), [2] Blackburm，S.: Amino Acid Determination: Methods and Techniques and ed New York, Marcel Dekker (1978). 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Biochem., 48, 233(1972). f e 43 e 第 四 章 蛋白 质 的 裂解 om pid Til 前 面 曾 提 到 ,用 Edman PEHEDE WU WAGED SEITE , — Ve AE EE AR 基 , 用 手工 方法 最 多 测 二 十 多 个 残 基 。 然 而 ,自然 界 蛋 白质 的 分 子 量 通常 在 一 万 以 止 ， 因 此 在 测 多 肤 链 顺序 时 , 需 将 它们 先 裂 解 成 一 系列 小 肽 ;分别 测 出 它们 的 顺序 ， 然 后 再 找 出 它们 的 接头 位 置 ,才能 定 出 该 肽 链 的 顺序 。 所 以 如 何 选择 肽 链 裂 解 的 切 点 ,将 对 顺序 测定 起 着 重要 作用 "”。 裂 解 时 要 求 裂 解 点 少 , 专 一 性 强 ,反应 产 率 高 裂解 方法 分 两 大 类 ;一 类 是 酶 靶 ， 另 一 类 是 化 学 法 。 早期 测 看 白质 顺序 采用 部 分 酸 水 解法 裂解 外, ESI, URERIRS ik, 造成 分 离 纯化 困难 ,工作 量 也 很 大 。 后 来 生化 学 家 改 用 蛋白 酶 酶 解 , 因 专 一 性 强 ,， 故 被 广 泛 地 使 用 。 有 一 时 期 ， 化 学 法 几乎 被 人 们 忽视 。 随 着 自动 顺序 仪 的 广泛 使 用 和 对 大 肽 妇 的 需求 ,生化 学 家 在 寻找 高 特异 性 蛋白 酶 的 同时 ,发 现 某 些 化 学 试剂 对 蛋白 质 的 裂解 有 特 异 的 优点 。 于 是 化 学 法 再 次 受到 重视 ， 并 重新 流行 起 来 。 酶 解 和 化 学 裂解 这 两 种 方法 已 成 为 当前 顺序 分 析 中 互 为 补充 缺 二 不 可 的 手段 。 二 、 蛋 白质 的 酶 裂解 (一 ) fi 用 特异 性 水 解 酶 裂解 肽 链 有 许多 优点 : 专 一 性 强 ， 降 解 后 的 肽 段 容易 纯化 ,， 产 率 较 高 ; 副 反应 少 , 在 酸 水 解 中 容易 受 破坏 的 谷 氮 酰 氨 、 天 冬 酰 所 和 色 毛 酸 等 在 酶 解 中 都 不 受 影响 。 在 整个 酶 解 反应 中 , 酶 解 条 件 的 选择 相当 重要 ， 需要 很 好 考虑 下 列 几 个 因素 q。 (1) 合适 的 pH; (2) 适宜 的 反应 温度 ; (3), 栓 当 的 酶 与 底 物 的 比率 ; (4) 选择 相应 的 反应 时 间 。 实验 前 可 先 用 极 少量 样品 按 上 述 四 个 因素 摸索 适宜 的 条 件 。 天 然 蛋白 质 具 有 一 定 的 三 维 空间 结构 ,会 影响 酶 解 ,卷曲 在 蛋白 质 内 部 的 肽 链 不 能 被 酶 解 ,因此 ,在 有 解 前 须 先 经 变性 处 理 , 破 坏蛋 白质 的 二 级 和 三 级 结构 ,使 肽 链 松散 。 变 性 的 方法 有 下 列 四 种 : C1) 热处理 : 在 水 浴 里 煮 10 一 60 分 钟 ,这 时 蛋白 质 因 变性 而 沉淀 ， 用 离心 收集 。 (2) 强酸 处 理 , 用 10 多 三 毛 醋 酸 沉淀 ,离心 收集 ,并 用 水 洗 若 干 次 ,以 去 除 残余 的 酸 。 当 蛋 白质 的 多 肽 链 内 有 二 硫 键 共 价 交 联 时 须 先 用 (3) 和 (4) 处 理 。 + 44 。 (3) 过 甲酸 氧化 ， 蛋 白质 用 过 甲酸 处 理 , 拆 开 二 硫 键 ， 其 生成 物 为 磺 基 丙 氨 酸 ( 半 觅 磺 酸 )( 详 见 第 二 章 )。 (4) S- 羧 甲 基 化 : 蛋白 质 在 一 定 溶剂 中 ,用 还 原 试剂 处 理 ; 把 二 硫 键 拆 开 成 半 胱 氨 酰 残 基 , 然 后 用 磺 乙 酸 反应 使 琉 基 保护 起 来 成 Se AEA EMBO), (=) JA FAB iA SE 表 4-1 几 种 常用 的 肽 链 裂解 酶 及 其 特异 性 eee, ee A—BYC—D (1 表示 酶 解 ) i B=Lys 或 Arg, C= Pro 抑制 ,)A 或 C RA, C 都 是 酸性 | BRE 氨基 酸 时 ) 酸 解 减弱 B = Met, leu, His Hi 7k ASE BSC = Pro 被 抑制 ,C RAE Rs RAR A.C MECHAM MRS -一 C= 让 水 氨基 酸 优 先 酶 解 ( 尤 其 是 Phe,leu,Val,Tyr'Ile,Met, Trp, 嗜 热 菌 蛋白 酶 Ala,Asp,Thr,His); C = Gly 几乎 不 梅 解 :D 三 Pro 或 BE 三 Pio 也 不 酶 解 Heo B 或 C, 或 BC， 都 是 路 水 氨基 酸 时 ， 酶 解 快 (尤其 是 Tyr， Trp, leu), 除 B= Pro 外 ?都 可 酶 解 LARS BG 胰 蛋 白 酶 是 最 常用 的 水 解 蛋 白 酶 , 专 一 性 强 , 只 断裂 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 的 羧基 所 形成 的 肽 键 。 从 顺序 测定 角度 来 看 ,在 所 有 的 水 解 蛋 白 酶 中 ， 胰 蛋白 酶 可 以 说 是 最 有 价值 的 酶 ， 用 它 裂 解 蛋 白质 常常 可 得 到 合适 的 肽 慨 。 尤 其 对 固 相 法 测 顺序 优越 性 更 大 ， 用 该 酶 水 解 后 的 肽 豚 ; 即 可 用 DIPC 方法 ( 详 见 第 八 章 ) 直 接 偶合 到 固 相 载 体 上 , 产 率 很 高 ,也 比较 方 便 。 某 些 商品 胰 蛋 白 酶 中 , 常 含有 少量 胰 凝 乳 蛋白 酶 ,这 样 ， 在 酶 解 时 会 产生 不 希望 有 的 KBs 因此， 使 用 前 需 用 L-1( 对 -甲苯 磺 酰 ) 苯 两 氨 酰 氧 甲 酮 (简称 TPCK) (图 4-1) CHREAB, 以 抑制 胰 凝 乳 蛋白 酶 的 活力 。 也 可 直接 订购 用 _TPCK 处 理 过 的 胰 蛋 白 CH, 图 4-1 TPCK 结构 式 酶 8。 但 有 时 即使 用 TPCK 处 理 过 的 胰 蛋 白 酶 也 不 一 定 完 全 能 抑制 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的 活力 。 Richardson 和 他 的 同事 马 在 研究 豌豆 外 源 凝 集 素 的 _c- 亚 基 顺 序 时 ， 发 现 TYr 一 Thr 键 往往 被 裂解 。 于 是 他 们 在 用 TPCK 处 理 后 ,再 用 lmmol/l 盐酸 处 理 ,以 进一步 抑制 胰 凝 ee 45 。 ” 乳 蛋 白 酶 的 活力 。 此 外 ,值得 提醒 的 是 : 用 胰 蛋 白 酶 酶 解 蛋白 质 ,除了 有 裂解 Arg 和 Lys 的 羧基 形式 的 肽 键 以 外 ,有 时 还 发 现 非 c- 胰 蛋白 酶 酶 解 的 键 也 被 裂解 , 象 Phe、Tyr 和 Met BUR 等 。 原 因 是 在 胰 蛋 白 酶 中 同时 混 有 c-、8- 或 ¢-RB AMS 44-2). Keil, B. 指出 , 即 使 是 结晶 胰 和 蛋白酶 ,也 总 混 有 这 些 杂 酶 成 分 。 当 然 如 果 用 Sp-Sephadex 柱 层 析 , 三 个 组 分 能 很 快 分 离 。 表 4-2 用 商品 胰 蛋 白 酶 和 纯 的 c-, 6-H 销 - 胰 蛋 白 酶 降解 胰 高 血糖 素 "( 个 表示 酶 解 作 用 点 ) Glucagon 〔〈《 胰 高 血糖 素 ) —Phe’—Thr’? —Lys”*—Tyr®— Arg” —Arg"*—Ala¥——Trp” —len*— BCE BB X x x ' t 个 一 一 < c- 胰 蛋白 栈 ot p- 胰 蛋白 本 4 hoot o- BES 4 ced t a. 5| KEIL, B.: ENZYMIC CLEAVAGE OF PROTEINS, in Methods in Protein Sequence Analysis, by M. Elzinga,291—301, Humana Press, Clifton, New Jersey (1982). 胰 蛋 白 酶 一 般 引 起 肽 链 中 的 Lys 和 Arg RMA, 4M SAR 肽 键 时 , 则 酶 失去 敏感 性 。 对 Lys—Asp 或 Arg 一 CySO;H 键 也 只 有 部 分 裂解 ,但 不 是 绝 对 的 。 例 如 ，Strong，D. D ”和 Hessel，B. 等 人 呈 曾 发 现 用 胰 蛋 白 酶 酶 解 血 纤维 蛋白 原 时 ,在 四 个 Arg—Pro 键 中 有 二 个 键 (Arg 一 和 Arg 一) 裂解 , 可 是 Lys*—Pro 键 仍 未 有 裂解。 酶 解 鸡 红血球 组 蛋白 45” 和 碳酸 栈 酶 "" 时 也 曾 发 现 Arg—Pro $2¢k A fe, Berg, A. Van Den 9) 在 豚鼠 核糖 核酸 酶 A 中 也 有 类 似 发 现 ， 可 以 在 Lys*—Pro™ 之 间断 用 。 然 而 在 核糖 核酸 酶 B 就 没有 发 现 这 种 情况 。 在 牛 精子 核糖 核酸 酶 中 , 赖 氮 酸 (或 精 氢 酸 ) 与 膊 氨 酸 之 问 的 键 也 同样 能 被 胰 蛋 白 酶 有 裂解。 另外，Bennett 等 人 吧 在 研究 三 氧 叶酸 还 原 酶 时 ,发现 第 52 一 53 之 间 的 键 也 能 被 胰 蛋 白 酶 裂解 。 这 个 键 周 围 的 顺序 是 :一 Gly* 盖 . Arg?—Pro®—Leu"—, Croft 等 9 也 发 现 晶状体 蛋白 有 类 似 的 顺序 : —Glo”—Arg*— Pro” 一 Aspx 一 ,其 中 的 Arg—Pro 键 和 人 骼 磷脂 中 的 致 脑 炎 和 蛋白 顺序 一 Gln 一 Arg-Pio 王 Gly 一 中 的 Arg 一 Pro 键 能 被 胰 蛋 白 酶 裂解 。 有 人 还 发 现 , 蛋白 质 中 的 某 些 非 常规 氨基 酸 可 为 胰 蛋 白 酶 降解 提供 敏感 位 点 。 如 SACLE ERA ERRORS 解 。 至 于 这 些 键 为 什么 能 被 胰 蛋 白 酶 裂解 ,目前 说 法 不 一 ， 或 许 与 邻近 基 团 的 性 质 有 关 ; 或 许 与 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 本 身 侧 链 基 团 有 关 。 例 如 , 致 大 脑 炎 和 蛋白 中 的 精 氨 酸 的 侧 链 一 ao 氨基 ,其 中 有 一 个 中 氨基 是 甲 基 化 的 ,也 有 二 个 w 氨 基 都 是 甲 基 化 的 。 尽管 胰 蛋 白 酶 有 很 高 的 专 一 性 ,只 在 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 的 羧 端 裂解 ,但 如 果 蛋 白质 分 子 量 较 大 ， 或 遇 到 碱 性 蛋白 含有 较 多 的 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 残 基 时 ， 则 酶 解 后 的 肽 眉 数 就 会 很 多 ， 将 给 顺序 测定 带 来 很 大 麻烦 。 为 此 ，Dixon 和 Perham (1968)oa 首 先 有 效 地 用 柠 康 酸 酬 可 逆 保 护 赖 氨 酸 的 © 氨基 ,使 胰 蛋 白 酶 酶 解 时 不 会 在 赖 氨 酸 凑 端 裂解 ,而 只 在 精 氨 酸 的 羧 端 裂 解 ,以 后 也 很 容易 去 掉 保 护 基 团 。Croft (i972)mtse 曾 利用 这 个 试剂 有 效 地 鉴定 和 分 离 了 z- 晶 状 体 蛋 外 的 N 端 肽 。 他 的 做 法 是 先 将 盖 晶状体 蛋白 柠 康 酰 化 ,这 时 赖 氨 BH e- 氨 基 和 未 端 氨基 被 柠 康 酸 酝 保 护 起 来 ,然后 用 胰 蛋 白 酶 酶 解 ， 并 通过 纸 电泳 分 离 得 到 一 个 酸性 很 强 的 肽 段 (N)。 随 后 将 此 肽 (N) 置 于 稀 栈 酸 溶液 中 (pH2.0) 室温 下 °° 46 。 过 夜 ,以 脱 掉 保 护 基 团 。 去 保护 后 的 肽 段 (N“) 再 次 用 胰 和 蛋白酶 酶 解 , 即 得 到 二 个 不 同 的 片段 肽 Na 和 Nb, 图 4-2 是 它 的 整个 反应 过 程 。 N-#: Bi Bi- Gly -(e-N-#¢ BRE) .Lys-Ile-Thna.Phe.Tyr*Glu.Asp.Arg 柠 康 酰 -N- 肽 pH2.0 20 小 时 Gly-Lys-lle-Thr-Phe-Tyr-Glu- Asp- Arg N - 肽 (去 掉 了 柠 康 酰 基 ) Trypsin ig i Gly-Lys {le-Thr- Phe-Tyr-Glu- Asp- Arg N’a-KBE N’b-EKBE 图 4-2 ”N- 肽 的 柠 康 酰 化 常用 的 保护 剂 还 有 马 来 酸 栈 ]2 和 挂 - 顺 -3,6- 桥 -A' 四 氢化 栈 酸 本 (简称 ETPA)oa。 以 上 三 种 方法 中 ,以 柠 康 酰基 最 不 稳定 , 当 pH 一 2, 20°C 1 一 2 小 时 ,就 可 使 这 一 保护 基 团 失去 一 半 。 马 来 酰基 最 稳定 ,在 30% 醋酸 溶液 中 ,37%C48 小 时 才能 除去 。ETPA 则 介 于 柠 康 酰基 和 马 来 酰基 之 间 , 它 的 去 除 条 件 为 在 10 多 酷 酸 溢 芒 中 室温 下 过 夜 。 图 ,4-3 是 以 上 三 oa glial O BRET 1 >. 8-N- 马 来 酰 -Lys 的 半衰期 * 11 iY, pH3.5, 37°C CH;—C —CO 柠 康 BT mS ye Lys 产生 两 个 s-N- 酰 化 衍生 物 ，pKe 不 同 半 衰 期 20 Fh, pH2, 20 到 [or 3 有 两 个 8s-N- 酰 化 衍生 物 ， 半 衰 期 4 一 5 小 时 ，pH3，25%C cot | R43 ”保护 Lys-e- Ra HERA 半衰期 是 指 保护 后 的 基 团 到 1/2 基 团 去 保护 所 需 时 间 。 1975 4 Patthy 和 Smith 提出 了 保护 精 氮 酸 的 方法 , 他 们 用 1，2- 环 已 二 酮 (1，2- cyclochexanedione)"? 专 一 地 与 蛋白 质 中 精 氨 酸 的 且 基 作用 生成 DHCH (1, 2-dihydroxyc- yclohexz-1，2-ylene)-Arg， 使 胰 蛋 白 酶 只 酶 解 赖 氨 酸 羧基 所 形成 的 肽 键 。DHCH-Arg 用 FEAR ANE pH7, 37°C 保温 7 一 8 小 时 , 即 可 恢复 成 精 氮 酸 ,反应 式 如 下 。 NH ll ae. + 7 — NH(CH,), — ae — COOH H,N O O NH 硼酸 组 冲 液 (pH7.9) 郑 氢 缓冲 液 (pH7.0) HN NH * \4% DHCH=arg NH | R < e 7 。 2. WHILE GRO” BLE OMA IORTLE OM, BE 245 个 氨基 酸 组 成 的 单 链 ， 有 5 不 二 硫 键 。 酶 原本 身 没有 水 解 活力 , 靠 胰 蛋 白 酶 激活 ,在 Arg* 一 le 肽 键 处 水 解 ， 形 成 去 胰 凝 乳 蛋白 酶 而 =- 且 凝 乳 蛋白 酶 又 反 过 来 对 本 身 起 作用 , 酶 解 掉 二 个 二 肽 See 一 Ar 和 Tha" 一 Asny, 生 成 具 完全 活力 的 “- 胰 凝 乳 蛋白 酶 。 这 就 是 我 们 通常 用 的 胰 凝 乳 蛋白 酶 。 因 此 =- 胰 凝 乳 蛋白 酶 由 A、B、C 三 条 多 肽 链 组 成 ,它们 分 别 含有 13，130，96 个 氨基 酸 残 基 。 这 个 酶 的 专 一 性 不 如 胰 蛋 白 酶 ， 然 而 在 顺序 测定 中 还 是 很 有 用 的 。 它 酶 解 Tyr、Phe、Trp、Len 等 朴 水 氨基 酸 的 羧基 所 形成 的 肽 链 , 也 能 在 Val, He, Ser, Gly 的 AE, 但 较 慢 。 如 果 被 裂解 的 邻近 基 团 是 碱 性 的 (如 Lys, Arg 或 His), WHE A 增加 。 俏 若 邻 近 是 Pro 或 Phe 一 Pro 则 不 能 酶 解 。 在 酶 解 中 ,增加 酶 的 比例 (对 底 物 ) 能 提高 酶 解 能 力 ， 这 时 ， 甚 至 象 Ala 一 Val 键 也 能 酶 解 3. AE eae 它 的 专 一 性 与 且 凝 乳 蛋白 酶 类 似 ,但 前 者 的 适宜 酶 解 pH 值 是 2, 这 在 顺序 测定 中 很 有 价值 ,因为 在 确定 二 硫 键 的 位 置 时 ,在 这 样 的 酸性 环境 下 二 硫 键 比较 稳定 ， 很 少 有 三 裤 2.000 1.600 x Fc = 1.200 BX te 0.800 0.400 20 40 60 80 100 120 10. 20 530. © 40) e750 peur a 管教 管教 图 4-4 胰岛 素 (100 毫克 ) HARARE 4-5 胰岛 素 〈500 毫克 ) 的 胃 有 蛋白酶 酶 解 物 在 Sephadex G-50 柱 上 的 层 析 行 为 ( 层 析 条 件 见 正 Sephadex G-50 柱 上 的 层 析 行为 ( 峰 III 为 羧 端 x. Wel 为 胰岛 素 ， 巍 Il 为 DPL, te II 为 五 LK, 其 它 说 明 同 图 1) 肽 Tyr—Thr -- Pro—Lys—Ala) BN ERM. —MiDK, AA MASE ee ECU 4-1), 但 如 果 反 应 条 件 选 择 恰 当 , 可 以 变 低 特异 性 为 高 特异 性 。 中 国 科 学 院 上 海 生物 化 学 研究 所 胰岛 素 组 5 在 pH ~ 25 的 水 溶液 中 ， 用 明和 蛋白 酶 酶 解 胰 咏 素 [ 酶 / 底 物 这 1/80 (重量 比 )] 于 3°C KKB « 48 « | 反应 1.5 IN REE), 此 后 用 ‘NNaOH 调 pH = 9 以 终止 反应 。 结 果 用 Sephadex G-50 柱 《〈《3.0X110cm) 分 离 得 到 了 很 纯 的 去 B RR MARRS ACA 4-4 和 图 4-5) ,说明 胃 和 蛋 白 酶 在 酶 解 中 只 降解 胰岛 素 B 链 中 第 25 位 苯 丙 氨 酸 的 羧 基 所 形成 的 肽 键 〈 一 Phe= | Thrx 一 Thr2 一 Pros 一 Lys3 一 Ala?)。 4. 嗜 热 菌 蛋 白 酶 Ca 它 是 含 金 属 的 酶 ,每 35,000g MA le AAT. Sis SRT. 锌 是 活力 所 必需 的 ; 人 钙 使 酶 在 高 温 下 稳定 ,该 酶 易 被 EDTA 所 抑制 。 它 的 专 一 性 比 土 面 三 种 酶 都 差 ,用 来 直接 酶 解 蛋白 质 不 太 合 适 ,因为 产生 的 肽 眉 相 对 较 多 ,不仅 纯化 起 来 麻烦 ,而 且 对 以 后 的 顺序 重 排 也 不 利 o 如 用 它 来 裂解 次 级 肽 , 即 先 用 专 一 性 较 强 的 酶 或 化 学 试剂 把 蛋白 质 多 肽 链 降 解 成 大 肽 眉 , 再 切 成 小 肽 段 时 BAR EAR 可 发 挥 很 好 的 作用 。 胰 凝 乳 蛋 白 酶 、 胃 和 蛋白酶 和 嗜 热 菌 蛋白 酶 有 一 个 共同 的 特点 , 即 它们 的 作用 范围 比较 Phe- =100 Trp Tyr GREET EA Be 4-6 -用 胰 凝 乳 蛋 白 酶 、 嗜 热 莫 蛋白 酶 和 胃 和 蛋白 酶 裂解 有 关 肽 键 的 相对 平均 比率 宽 寺 并 且 主 要 是 裂解 蛋白 质 中 的 中 性 氨基 酸 残 基 ( 见 表 4-1). Keil, B.2 对 这 三 种 酶 的 作用 范围 作 了 系统 比较 ,他 从 两 年 内 有 关 顺 序 研究 的 文章 中 ,经 过 计算 分 别 得 到 这 三 种 本 作用 范围 的 相对 平均 比值 (图 4-6)。 « 49 « (=) 近年 来 发 现 的 几 种 高 特异 性 的 肽 链 内 切 酶 在 第 二 章 曾 介绍 过 ,在 蛋白 质 顺序 测定 中 ,对 较 大 分 子 量 的 蛋白 质 采 用 逐 级 特异 性 裂 解 战略 是 比较 理想 的 。 这 几 年 来 ,文献 中 有 很 多 关于 高 特异 性 的 蛋白 质 水 解 酶 的 报道 , 租 真正 成 功 地 用 于 蛋白 质 顺 序 测定 的 并 不 多 。 表 4-3 列 的 几 种 是 比较 成 功 的 。 R13 BEABRH LASERS AS x Ff 2 Se I" 参考 文献 Glu ZAR 金黄 色 葡萄 球菌 ~100% [23][27] Pro BAS 小 羊 肾 ~100% [24] Lys SAS Armillaria Mellea ~100% [25][26] Myxobacter A3-1 Clostripain Clostridium ~ 100%; [28][29] histalyticcum ; thrombin( # in Bs ) Submaxillary gland protease 1. Glu 0% Glu ZAMNMES BOR BEAM, EH Houmard Al Drapean (1972) 从 金 黄色 葡萄 球菌 菌株 Ve 中 分 离 得 到 的 ,是 新 近 发 现 的 最 有 效 、 应 用 最 广泛 的 一 个 酶 ,目前 ， 已 商品 化 。 酶 分 子 量 只 有 12,000。 当 酶 解 在 磷酸 缓冲 液 (pH7.8) 中 进行 时 , 它 能 在 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 残 基 的 羧 端 处 裂解 肽 键 。 如 果 改 用 碳酸 氢 贸 (pH7.87 或 醋酸 胺 (pH4.0) 时 ， 则 仅 在 谷 氨 酸 的 羧 端 处 裂解 。 该 酶 对 下 列 蛋 白质 只 在 谷 氨 酸 的 羧 端 处 裂解 ;核糖 体 SAS", 12364, EL12°), #aR A SEA, BESEAM, afll1] RARE . He, 8, 小 球 蛋白 sa。 同时 也 在 天 冬 氨 酸 羧 端 处 裂解 的 蛋白 有 :，1x 核糖 体 蛋 白 Se2a “磷脂 酰 胆 碱 交换 蛋 Ao, 2x 血 纤 维 蛋 白 原 « 6, CAS To, CANE, 3x 免疫 球 蛋 白 a £ Cea”, -4x Bae, x 晶状体 凝集 素 54。 其 中 对 晶状体 凝集 素 ,Glu 蛋白 酶 裂解 天 冬 氨 酸 羧 端 比 裂解 谷 氨 酸 交 端 活力 高 ce 但 要 找 出 它 的 规律 是 困难 的 ,人 们 虽然 作 了 大 量 研究 ,原因 至 今 不 明 。 从 不 少 的 报道 来 看 ,也 不 是 所 有 的 谷 氨 酸 羧 端 都 能 被 Cle 蛋白 酶 酶 解 , 如 Glu 一 Pre 键 就 很 难 被 解 裂 。 相 反 , 对 个 别 蛋白 质 ,如 茄子 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 ,能 裂解 其 栈 氨 酸 羧 端 c9; 磷脂 酰 胆 碱 交 换 蛋 白 ,能 裂解 酷 氮 酸 羧 端 和 天 冬 酰胺 羧 端 @0; 血 纤维 蛋白 原 ， 能 裂解 丝 所 酸 的 羧 端 9。 当 然 这 些 是 很 罕见 的 。 对 于 Glu—Glu 和 Glu 一 Asp #, RAWBAREAR SIA), Vandekerckhove 和 Van Montagi (1977)ro 在 研究 大 肠 杆 菌 吻 菌 体 MS2 HA 蛋白 顺序 时 发 现 , 由 于 朴 水 性 ,即使 延长 反应 时 间 , 也 不 能 被 Glu BAR Hitz 等 报道 oj， 一 Glu 一 Glu 一 BA 能 裂解 。 对 一 Gly 一 Gly 一 Glu 一 Lys 一 Lys 一 这 样 的 肽 链 也 不 能 被 裂解 。 由 此 可 见 Gu 蛋白 酶 不 是 对 所 有 的 谷 氨 酸 羧 端 键 都 敏感 。 ea 50 。 尽管 如 此 ， 这 个 酶 在 蛋白 质 顺 序 测定 中 的 价值 是 无 可 置疑 的 。 表 4-4 是 利用 Gu 蛋 白 酶 特异 性 裂解 获得 成 功 的 例子 。 表 4-4 用 Gu 蛋白 酶 获得 的 特异 性 裂解 例子 za i 裂解 肘 键 处 A+B 或 A+ 参考 文献 RNA ¥4% 174—175 Asp—Ala [51] 的 e-W 197-+"198 Asp—leu = -233—-234 Asp--leu 280—281 Asp—leu 21—22 Ser—Thr 49—50 Ser—Ser 266 —267 Ser -- Ala eg 313 一 314 Ser—leu ea GS eT 14=-15 Asp— [52] 53-54 Asp— 83—-84 Asp— 121—122 Asp— 】 45-~46 Thr—Phe KSRBRRER : 121—122 Asp 一 RAS RBA, > “8 Ser -Met [53] 107 —108 Ser—Lys SRM A, 10—11 Lys—Cys + [54] . 43—-44 Arg—Cys RWURERK <- 亚 基 Asp 一 [55] “ Asp— Maeds 和 Tamiya54 兽 用 这 个 酶 纠正 Snaka erabutoxins 的 氮 基 酸 顺 序 。 从 胰 蛋 白 酶 裂解 肽 得 到 它 的 部 分 顺序 :一 Gly 一 (Glu，Ser) 一 Ser 一 ， 利用 减 数 Edman 方法 测定 这 段 肽 的 顺序 是 一 Gly 一 Ser 一 Glu 一 Ser 一 ,后 用 Glu 蛋白 酶 酶 解 , 得 到 的 顺序 是 : 一 Gly 一 Glu 一 Ser 一 Ser 一 ， 显 然 是 正确 的 。 前 面 的 错误 结果 是 由 于 在 Edman 反应 萃取 过 程 中 Glu 的 污染 引起 的 。 又 如 Begg 和 他 的 同事 吧 利 用 该 酶 研究 人 8- 凝 血球 蛋白 的 二 硫 键 的 位 置 。 他 们 和 证实, 在 这 个 酶 酶 解 反 应 的 最 适 pH4.0 中 ,基本 上 没有 二 硫 键 的 交换 反应 ， 因此 使 用 起 来 比 胃 和 蛋白酶 更 有 效 。 2. Arg & Hae?! 这 是 一 类 专 一 性 裂解 精 氨 酸 羧 端的 蛋白 酶 。Clostripain5 ' 吕 (从 一 种 梭 菌 中 提取 ) 是 蛋 白质 顺序 工作 者 最 感 兴 趣 的 一 种 ,原因 有 三 : 〈1) 专 一 性 很 高 ,一般 不 会 有 非特 异性 裂解 ; 〈2) 肽 链 的 羧 端 是 精 氨 酸 ,很 适 于 固 相 顺序 法 的 分 析 ;(〈3) 该 酶 在 6mol/1 尿素 20 小 时 内 仍 保持 活力 ， 这 样 对 不 溶性 蛋白 质 的 长 时 间 有 裂解 就 很 有 效 。 国 外 已 有 商品 酶 出 售 。 最 近 报 道成 功 的 例子 很 多 ， 如 用 高 活力 的 w-clostripain 对 核糖 核酸 酶 和 parvalbumin 的 裂解 ， 只 有 裂解 精 氨 酸 的 羧 端 ,而 众多 的 赖 氮 酸 不 被 裂解 名 。 类 似 的 情况 在 糖 蛋白 -结合 受 体 的 顺 序 测定 中 也 有 发 现 。 另 外 ,缩短 酶 解 时 间 有 不 同 的 效果 ,如 在 酶 解 异 营 青 蛋白 时 ， 减 少 反 应 时 间 , 结 采 10 个 精 氨 酸 残 基 只 有 裂解 3 个 ,对 维生素 A, 结合 蛋白 ， 在 14 个 精 氮 酸 中 也 只 有 裂解 3 个 ,并 且 在 上 述 两 个 例子 中 , 肽 链 中 的 全 部 赖 氨 酸 所 形成 的 肽 键 未 被 裂解 e 。 51 * #21 (thrombin) Z25—MEFRNABR nN. EMRANRE FP, Ext Arg—Gly #232 fF 4 5tRo Uehara, H. 等 双 在 研究 H-2K° 主要 组 织 相 关 性 复合 别 抗 原 [H=2 玫 4 major histocompatibility Complex alloantigen] 的 省 化 氢 片 段 肽 的 顺序 时 ， 发 现 凝 血 酶 只 在 四 个 精 氮 酸 中 的 二 个 精 氮 酸 羧 端 肽 键 处 裂解 。 该 酶 不 肥 解 赖 氨 酸 羧基 所 形成 的 肽 键 。 最 近 发 现 , 颌 下 腺 蛋白 酶 cm 也 有 裂解 精 氨 酸 所 形成 的 肽 键 的 专 一 性 , 它 对 磷脂 酰 胆 短 交换 蛋白 只 裂解 Arg 一 Glu #5", 对 血 纤 维 蛋白 原 只 裂解 Arg 一 Arg 键 富 。 这 个 酶 在 国 外 已 商品 化 。 3. Lys 有 蛋白酶 这 是 新 近 发 现 的 一 类 酶 , 它 的 选择 性 一 般 不 如 Arg 蛋白 酶 专 一 。 密 环 菌 (Armillaria mellea) 和 蛋白酶 呈 是 其 中 用 得 较 多 的 一 种 。 它 裂解 赖 氮 酸 氮 端 肽 键 的 条 件 是 ,在 赖 氮 酸 残 基 的 羧 端 必须 联 有 谷 氮 酸 \ 天 冬 氮 酸 或 天 冬 酰胺 残 基 。 这 个 酶 对 精 氮 酸 也 具有 活力 ,如 在 酶 解 天 冬 氢 酸 氮 转 移 酶 时 ,发现 它 在 部 分 赖 氨 酸 残 基 氮 端 裂 解 外 ,还 同时 裂解 三 个 Arg 一 Leu (Ile) #2, 血 纤 维 蛋 白 酶 裂解 血 纤 维 蛋白 原 时 也 发 现 除 裂解 部 分 的 赖 氨 酸 外 ， 也 裂解 精 氨 酸 氢 端 肽 键 。 Myxobacter AI-1 是 另 一 种 Lys SA, 它 是 从 一 种 粘 细菌 中 提取 的 寺 也 能 在 赖 氨 酸 残 基 的 氨 端 裂解 。Waeijer，W. J. 等 在 研究 对 羟 葵 甲酸 羟 化 酶 (P-hydroxybenzoate hydroxylase) 的 顺序 中 发 现 ， 它 裂解 赖 氨 酸 氨 端 的 条 件 是 , 束 氨 酸 残 基 的 羧 端 通常 联 有 Tyr, Ala #1 Gin WH, as OH AG RAR ie Lys 一 Leu 键 的 高 特异 性 Lys 蛋白 酶 是 类 似 凝 血 酶 样 酶 〈thromibinlike en- zyme ]'), 它 是 从 Agkistroden Contortrix 提取 的 ， 是 在 裂解 大 的 血 纤 维 蛋 白 硕 时 发 现 . 的 。 人 总 he Pro 蛋白酶 它 是 特异 性 在 Pro 羧基 所 形成 肽 键 处 裂解 的 蛋白 酶 ,从 小 羊 肾 中 提取 。 此 外 还 有 个 别 新 酶 的 特异 性 也 很 强 , 如 从 无 色 菌 (4cpromopecter) 分 离 的 一 种 酶 能 特异 性 裂解 x-Ala; x-Gly 键 。 (四 ) 实验 方法 主要 试剂 和 材料 : 各 种 肽 链 内 切 酶 。 ITPCK,，6mol/1 盐酸 县 , 柠 康 酸 醒 ,无 水 甲醇 (用 Mg RHR). | 0.2mol/1N- 甲 基 吗 啉 酷 酸 缓冲 液 (pH8.1):5.6ml N- 甲 基 吗 啉 (CN= Mechy lady YF 250ml WAKA, AMMA 1.5ml 50D REPR MAE Ko . 0.1mol/] SRR RAI (pH4.0); 用 双 蒸 水 稀释 醋酸 后 ,再 用 稀 氨 水 (NH,OH) 74 pH 到 4.0, 恒温 水 浴 , 人 台式 离心 机 ,液体 快速 混合 器 ,冰冻 干燥 装置 等 。 « 52 2 方法 : 1 胰 有 蛋白 酶 裂解 (1L)-IPCK- 胰 和 蛋白酶 降解 称 1.0mg 蛋白 质 ,加 0.5ml MAK, HAMA 0.5ml 0.2mol/1 N~ AZIM HR (pHS8.1), 注 意 使 蛋白 质 溶 解 。 然 后 加 10 一 20ug TPCK-REARCAF 10—20nl 双 AK). BOAT 37°C 保温 反应 4 一 6 小 时 (注意 随时 轻微 摇动 )。 冷冻 干燥 ， 冻 干 物 加 50mlj 双 蒸 水 深 解 ,离心 * 上 清 液 待 分 离 纯化 后 供 测 顺 序 用 。 (2) TPCK 处 理 胰 蛋白 酶 200mg 胰 和 蛋白酶 溶 于 62ml 0.001mol/!CaCl, (14.7mg 分 析 纯 CaCl WF 100 ml 无 离子 水 中 六 用 139 NaOH 调 pH 至 7.0。 在 15—20C 下 缓慢 加 入 含 omg TPCK 的 0.6ml 无 水 甲醇 溶液 ,继续 搅拌 并 维持 pH7.0 约 5.5 小 时 ,然后 用 pH3.0 的 盐酸 水 溶液 透析 2.5 KEBAB BRIER) ,然后 冻 于 (注意 使 用 前 须 测 酶 活力 )o (3) TPCK- 胰 蛋白 酶 活力 的 测定 方法 PRR MRR 工 - 精 氮 酰 乙 酯 盐酸 盐 (Benzyl-L-Arginine ethyl ester-HCl 简称 BAEE) 3.9mg 溶 于 10ml 0.05mol/1 Tris 缓 冲 液 (pH = 9.24) 中 ,将 TPCK 处 理 过 的 胰 蛋 白 酶 fe) a 《 > 一 C 分 子 量 一 345.88 Pane \ ) Arg.OC,H,.HCl Img }$F 10ml 0.001N HCl 中 , 鹃 底 物 3ml 在 紫外 分 光 光 度 计 上 (波长 253nm 处 )， 调 节 光 密度 为 0, 然 后 加 入 0.2ml HER SIG 30 秒 钟 读 一 次 光 密 度数 , 直至 读数 不 变 为 止 ， 一 般 在 10 分 钟 内 稳定 。 八 世 ， 光 密度 读数 / 秒 _ 活力 单位 的 计算 公式 : 酶 浓度 =a.u. (4) 保护 Lys e-NH, 的 方法 ORBLE, HK REA. F 6mol/1 AMMA 8mol/1, 尿素 (20 一 30mg 蛋白 质 /ml), 在 室温 (20*C) 下 , 用 12N NaOH 调 pH % 8.0, a UAT RERRET 25mg( 其 量 可 10 倍 于 蛋白 质 的 量 )， 激 烈 搅 拌 2 小 时 ， 在 室温 下 维持 pH8.5 EAs 随后 透析 或 用 Sephadex G-25 柱 除去 多 余 的 试剂 和 盐 。 ~ @ ETPA 法 : 以 ETPA 与 溶菌 酶 反应 为 例 。 在 蛋白 质 . 12mg/ml 0.2mol/1 硼酸 组 冲 液 (pH 一 8.8) 中 ,加 人 12 倍 过 量 的 ETPA ( 按 参与 反应 的 _Lys 基 团 数 计算 ), 搅 拌 下 分 批 滴 加 。 然 后 用 INNaOH 维持 pH 在 8.5 一 9.0。 在 溶菌 酶 中 加 入 ETPA 时 , 先 产生 沉淀 ,5 分 钟 后 再 溶解 , 约 2 小 时 反应 结束 。 随 后 对 pH 一 8 的 5% (W/V) NEHIHCO, 深 液 4*c 下 进行 透析 。 © 马 来 酰 化 法 : 马 来 酸 酬 需 用 无 水 氯仿 重 结晶 处 理 。 马 来 酰 化 在 pH 计 上 进行 。 称 200mg 和 蛋白质 溶 于 10ml 的 0.1mol/1 磷酸 钠 缓冲 液 中 , 冰 浴 冷却 ; 慢 慢 滴 加 300mg 马 来 酸 栈 ( 溶 于 3ml 无 水 三 氧 六 环 ), 用 0.1V 或 0.5VNaOH 严格 控制 pH 在 9.0， 于 0c 下 放置 半 小 时 。 再 继续 搅拌 1 小 时 ,室温 透析 48 小 时 (外 透 液 为 2V 氨水 调 pH 至 8 的 水 « 53 。 ER), 然后 冷冻 干燥 。 2. 胰 凝 乳 肥 和 白 酶 裂解 酶 解 条 件 及 缓冲 液 与 胰 蛋 白 酶 相同 : pH8.1, 37°C, Me: %y—1:100, Behe 1 一 4 小 时 ,一 般 2 小 时 。 3, SRHREZOBRG 缓 证 液 与 胰 蛋 白 酶 相同 ，pH8.1， 反 应 温度 50—55°c, ee 白 酶 的 副 反 应 。 酶 : 底 物 一 1:100 或 1:150, 酶 解 2 小 时 左右 。 4. FERRE 称 取 1.0mg 和 蛋白质 溶 于 0.5ml 0.05N 醋酸 或 稀 甲 酸 中 ,pH % 2.0, 加 10xg FEA 酶 ( 溶 于 10ml 双 蒸 水 )。37%C Fie RM 2 小 时 ， 冰 冻 干 燥 。 随 后 溶 于 50a! BAIS 离心 , 待 分 离 纯 化 。 5. Gul 6% RB 配制 pH 为 4.0 AY 0.1mol/] NH- 酷 酸 缓 冲 液 : 用 双 蒸 水 稀释 酮 酸 ， 然后 用 稀 氨 水 调 pH 到 4.0, 称 取 1.0mg 蛋白 质 溶 于 1.0m! 0.1mol/] FREER, pH4.0, jf 20ug Glu 蛋白 BEGET 20nl 双 蒸 水 ) 并 搅拌 。 酶 : 底 物 王 1:50。 37°C 下 保温 24 一 28 小 时 ,然后 冰冻 干 eo FIN 50a 双 蒸 水 溶解 , 待 分 离 纯化 。 6. Arg 有 蛋白酶 裂解 称 取 1.0mg 蛋白 质 溶 于 1.0ml 双 蒸 水 ， 加 8.0xg Are BAR CRF 20el WHE), 37°C 下 搅拌 反应 1 一 4 小 时 ,冰冻 干燥 。 再 溶 于 50m 双 蒸 水 待 分 离 纯 化 。 在 N- 甲 基 吗 啉 酷 酸 缓冲 液 (pH8.1) 中 ， 酶 : 底 物 = 1:100， 能 专 一 性 地 裂解 Arg Um BNE Are 的 羧 端 连接 Pro 的 情况 下 亦 可 酶 解 。 7. EROS OG Fe 称 取 1.0mg BAIR 0.5ml 0.1mol/] N- 甲 基 吗 啉 醋酸 缓冲 液 (pH8.1) Be 0.07% 氨水 (用 双 蒸 水 稀释 )。 将 lag BEAT Sal 双 蒸 水 ( 酶 : 底 物 一 1:1000)，37%c 下 搅拌 反应 4 一 6 小 时 。 冷冻 干燥 ,加 50d 双 蒸 水 溶解 后 待 分 离 纯 化 供 测 顺序 用 。 三 、 有 蛋白 质 的 化 学 有 裂 解 化 学 裂解 法 是 蛋白 质 顺序 测定 中 的 另 一 重要 手段 化 学 法 裂解 的 肽 仆 一 般 都 比较 大 ， 适合 于 在 自动 顺序 仪 中 测定 顺序 ， 同 时 也 有 利于 肽 段 的 吻合 。 因 此 化 学 法 对 较 大 分 子 量 AS BNP OEE EEA He 4-5 是 几 种 高 效 特 异 的 化 学 裂解 法 。 « 54 。 a - R45 几 种 高 效 特异 的 化 学 裂解 法 Rye BR 试剂 和 方法 参考 文献 Met 一 X CNBr (70% 乙酸 或 75% 三 氯 乙 酸 ) >8092 [63] Met—X 或 Irp—X CNBr (88% 乙酸 ) > 80% [64] rrp 一 X BNPS-Skatole ~50% [65][66] Trp 一 -X 或 Tyr—X NBS 室温 ~50% [67] l'rp—X, Tyr—x His—X NBS 高 温 一 50%2 [68] Trp 一 X - IBA 室温 24 小 时 70--100% [69] Aso 一 Gly - NH, oH pH9.0 50% ~50% [70][78] Asp—Pro _ pH2.5 37% 4 天 80—90% [71] X—CySH TNB—CN > 10% [72] a X 表示 任意 氨基 酸 。 因为 化 学 裂解 后 的 肽 段 较 大 ， 往 往 会 遇 到 不 溶解 和 集聚 等 问题 ， 分 离 较 困 难 ， 产 率 一 般 也 比 酶 解 为 低 。 (—) RRR 到 Re 省 化 氰 (CNBr) 裂解 法 是 多 种 化 学 法 中 最 重要 的 也 是 最 常见 的 方法 。 它 是 由 Gross 和 Witkop“ ”于 1962 年 建立 的 。 随 后 人 们 对 这 个 试剂 进行 了 详细 而 系统 的 研究 。 这 个 试 剂 能 专 一 裂解 甲 硫 氨 酸 残 基 的 羧 端 ， 产 率 达 到 85% 由 于 蛋白 质 中 的 Met 一 般 都 比较 少 ， 因 此 裂解 后 的 肽 仆 较 少 ， 新 生成 的 肽 段 往往 是 大 肽 毁 ， 这 样 很 适合 于 自动 顺序 仪 测 定 ， 更 适用 于 固 相 法 测定 。 把 它 与 胰 蛋 白 酶 裂解 配合 起 来 ， 通常 很 容易 获得 肽 段 的 排列 顺序 。 CNBr 裂解 里 硫 氮 酸 残 基 的 反应 机 理 见 图 4-7。 % > gs Sree N=C—S—CH; CH Br 一 CH H | 2 < ‘4 3 x: % 一 -一 上 Ce CH Br-C=N CH (0 CHz O | pH1 | Waa =HN—CH-CO= iris —HN-CH—C—NH- —HN—CH—C=N— CH,OH fe lh NORA JRE CH, 一 一 让 了 | OH- \ 一 HN 一 CH 一 COOH —HN—CH—C=0 高 丝氨酸 ， 高 丝氨酸 内 脂 ， 图 4-7 CNBr 有 裂解 肽 链 的 甲 硫 氨 酸 羧 基 所 形成 肽 键 的 反应 反应 是 在 酸性 介质 中 进行 。 在 酸性 条 件 下 氨基 质子 化 ， 可 以 避免 一 些 副 反 应 。 如 用 70 色 甲酸 可 以 破坏 状 链 的 卷曲 ,使 甲 硫 氨 酸 侧 链 暴 露 ,有 利于 CNBr 的 裂解 。 甲 硫 氨 酸 的 55 二 氧化 产物 亚 硕 Met(SO) Bi Met(SO,) 不 能 与 CNBr 反应 。 为 防止 甲 硫 氨 酸 被 氧化 ， 整个 反应 应 在 氮气 流 或 充 氮 容 器 中 进行 。 当 甲 硫 氨 酸 在 N 末 端 , 则 产生 游离 的 高 丝氨酸 内 酯 : pe eee O 一 > CH, NH,Met— Ala CNBr vs H,N~CH-——C + NH,Ala— NN O 当 肽 链 中 有 二 个 相 邻 的 甲 硫 氮 酸 ， 则 产生 一 游离 高 丝氨酸 内 酯 和 二 个 新 肽 段 : CH CH CNBr ~~ ea a Ae --Phe—Met—Met-~— Ala————> CH, se O +H,NAla— SS Fi —Phe— NH—CH——C + H,N -CH—C \ \ OD 当 甲 硫 氮 酸 在 C 末端 , 则 C 末端 变 为 高 丝氨酸 内 酯 : CH, SS — Asp —Met———— > CH, CNBr a — Asp—NH—CH ——C fe) 2. 实验 方法 材料 : 70% 甲酸 ,省 化 氨 ( 如 有 黄色 须 纯 化 处 理 ) 快 速 涡 旋 混合 器 ， 冷冻 干燥 装置 等 。 方法 : 称 一 定量 蛋白 质 深 于 一 定 体积 的 70% 甲酸 中 (5 一 50mg 蛋白 /ml 70% 甲酸 ); 加 30—100 倍 过 量 CNBr， 通 N, 充分 混合 后 ， 于 室温 (20%) 黑 暗 处 放置 24 小 时 ,然后 加 10 倍 量 双 蒸 水 稀释 , 冰冻 干燥 。 或 用 70% 三 氟 栈 酸 代替 甲酸 , 25°C 反应 12 小 时 ， 然 后 用 双 蒸 水 稀释 到 5% =a 酸 以 终止 反应 。 注意 ,如 样品 溶解 度 差 ,可 加 大 甲酸 的 浓度 (如 85 一 98 多 ); 省 化 氨 是 剧 毒 而 挥发 性 的 固体 ,操作 时 必须 戴 手 套 在 通风 橱 中 进行 ,用 过 的 器 严 须 用 次 氧 酸 盐 溶液 洗涤 ， 冷 冻 于 爆 ， 时 须 用 固体 所 氧化 钠 吸 收 、 分 解 过 量 的 省 化 氨 。 Bs. FF te HF tA e N ART, RMA TS AA 10% Met 键 保留 下 来 , 不 被 裂解 ， 其 原 因 是 由 于 .O 一 乙酰 基 取 代 了 N 一 乙酰 基 。 S —CH, s —CH, ' | CH, CH, | —— | CH, CH, | | HN,— C —CONH— HO—c —CONH 另外 ,有 一 些 不 完全 反应 , 主要 是 由 于 邻近 某 些 基 团 的 影响 所 致 。 例 如 ， Creep 和 下 4 Preston 《1977)23 在 研究 人 屎 抑 胃 素 的 CNBr 降解 肽 的 顺序 时 , 发 现 一 Cys 一 Met 一 Tyr 一 处 不 裂解 ;Van Beyman 等 人 242 在 研究 葫 攻 花 叶 病 病 毒 的 外 壳 蛋 白质 顺序 时 ,发 现 一 Met” 一 Gin 一 和 一 Met5 一 Glx5 不 裂解 ,而 Met 一 Val 键 却 被 完全 裂解 ; 还 有 人 发 现 Ac 一 Ala 一 Met 一 Thr 一 Gln 一 中 的 Met 残 基 羧 端 键 也 不 被 裂解 ,但 Met 被 转化 成 高 丝氨酸 。 这 是 由 于 邻近 的 苏 氨 酸 羟基 和 中 间 的 亚 胺 基 内 酯 相互 作用 形成 一 个 高 丝 氨 酰 一 0 一 苏 氮 酰 肽 "2, 反 应 式 见 图 4-8。 CH2SCH3 CHs Pak ae te CH, HO—CH CH, ‘9-< —¢u CNB ee Ly =HN—CH-CO—NH—CH—CO— 一 一 ~ 一 HN 一 CH 一 C 三 N 一 —CH- 一 CO OH OH | CH . a CHz CH - CH3 一 — SS ie H 2 HN- CH—CO—O 开 环 O H2N 一 CH 一 CO0 一 “一 一 一 一 一 HN 一 CH \ Co 一 图 4-8 省 化 氢 对 Met-Thr 键 的 作用 另外 , 溴 化 氢 还 可 能 产生 某 些 特殊 裂解 。 如 Simon-Becan 等 人 ”4 用 溴 化 氢 裂 解 非 洲 桶 酒 中 提取 的 细胞 色素 “ 时 ， 发 现 半 胱 氨 酸 残 基 的 六 端 出 现 裂解 。 Scheffer AYER 解 核糖 核酸 酶 时 ,发 现在 若干 酷 氨 酸 残 基 羧 端 所 形成 的 肽 键 处 裂解 。 省 化 氧 不 太 稳定 , 刚 制备 的 试剂 呈 黄 色 ,贮存 一 段 时 期 后 呈 桔 黄色 。 有 颜色 的 溴 化 氢 在 裂解 时 使 酷 氨 酸 和 色 氮 酸 破坏 。 只 有 用 无 色 的 溴 化 氨 , 在 70 多 过 甲酸 溶液 中 ， 反 应 才 能 接近 定量 。 反 应 中 若 遇 到 蛋白 质 (多 肽 链 ) 不 溶 时 ,可 改 用 其 它 溶剂 ,并 加 一 些 盐 酸 县 或 SDS 到 反应 液 中 。 强 酸 溶剂 (如 75 多 三 氟 栈 酸 ) 会 引起 Asp 一 Pro 键 的 经 度 裂 解 ， 使 反 应 后 的 肽 段 复杂 化 。 尽 管 溴 化 氨 裂 解法 有 这 样 或 那样 的 黄 病 ， 伍 在 蛋 百 质 化 学 研究 中 仍 是 首选 的 化 学 裂解 手段 。 (=) 羟 胺 裂解 1. 原理 、 Deselnicu 和 他 的 同事 Za(1973) 发 现 ， 用 NEHOH 能 专 一 性 裂解 一 Asn 一 Gly 一 之 间 的 肽 键 ， 其 反应 的 机 理 是 : 通过 NEHOH 作用 先 形 成 一 个 琥珀 酰 亚 胺 环 状 物 , 最 后 导致 Asn—Gly 键 的 解 裂 ,反应 式 如 下 : CONH, CH, | OH- —HN —CH—CO—NH—CH,—CoO-—- ———> e 57 。 1 yo NH,OH : N --CH,—CO— ———> See cH,—CO—NHOH . wa teed aba PT ee a 1977 年 苏联 生化 学 家 Ovchinnikov” 首先 用 NH,OH 2i#% DNA 依赖 的 RNA 7 SHH c- 亚 基 ( 见 图 4-10), 裂 解 后 用 Sephadex G-100 柱 分 离 得 到 二 个 肽 外 , 一 段 是 wink 1 一 208 残 基 , 另 一 段 是 端 肽 209 一 329 残 基 。 如 没有 这 一 步 裂 解 ,中 间 这 段 师 序 将 329 1 > HN COOH NH,OH pH9.0 1 208 209 829 HN-L .__- COOH+ H,N-Gly LZ-coon A 4-9 很 难 测 定 。 2. 实验 方法 材料 : HEM ABR SAKE DRA Mis. 方法 : 一 先 制备 含 6mol/1l WAY 2moU1 AR. DR 23g 盐酸 县 和 5.5g BATH, 然后 放 于 冰 浴 中 强烈 搅拌 ， 缓 慢 加 入 4.5mol/ILiOH ,溶液 pH 维持 在 7 一 8, 直到 溶质 全 部 深 解 ， 并 使 体积 达到 约 35ml， 这 时 用 LioH 调 pH 到 9%.0， 最 后 加 重 蒸 水 使 体积 为 40ml。 将 此 溶液 转移 到 反应 容器 中 ;在 45°C 保温 ,随后 将 蛋白 质 (或 多 肽 ) 配 成 1 一 5mg/aal 浓度 ， 并 用 4.5mol/1 Lio 调节 pH 到 9.0 (每 隔 15 分 钟 调 一 次 ) 反应 混合 物 一 般 放 重 4 一 5 小 时 (注意 时 间 不 能 太 长 ， 否 则 会 引起 副 反应 )。 然 后 用 9 多 甲酸 将 pH 调 至 2 一 3 以 终止 反应 。 反 应 混合 物 用 Sephadex G-25 或 Bia—Gel P-2 脱盐 。 最 后 在 Sephadex — G-75 柱 上 纯化 。 3. 讨论 以 后 有 人 发 现 ， 当 在 pH2.5 用 NH.OH 裂解 Asp 一 Pro 键 时 产 率 能 达到 80%. A 人 做 过 统计 ， 每 ”841 个 残 基 中 Asp 一 Pro 键 出 现 的 几率 为 1 一 2， 实际 上 负 达到 3-4 对 。 ° 58 。 用 盐酸 羟 胺 有 裂解 Asn—Gly 键 的 产 率 一 般 为 50 一 80%。 在 降解 反应 中 , 即使 有 其 它 副 反 应 ， 也 是 很 低 的 ， 通 常 不 会 对 混合 肽 段 的 纯化 产生 影响 。 在 蛋白 质 氨 基 酸 顺序 中 ， Asn—Gly 键 出 现 的 几率 是 很 低 的 ,平均 每 150 个 肽 键 也 不 一 定 出 现 一 次 。 所 以 用 这 个 方 法 降解 产生 的 片段 肽 都 很 大 , 它 对 分 子 量 大 的 蛋白 质 的 测定 是 十 分 有 用 的 。 (=) 色 和 氢 酸 位 点 的 裂解 - 1. 原理 和 情况 简介 蛋白 质 顺序 测定 中 , 在 色 氮 酸 位 点 裂解 也 是 常用 的 方法 。1970 年 以 前 ， 裂 解 色 氨 酸 的 主要 试剂 是 N- 溴 代 琥珀 酰 亚 胺 (简称 NBS) 或 类 似 的 强 氧化 剂 。 产 生 副 反应 较 多 ， 在 裂解 中 , 除 色 氨 酸 外 ， 邻 近 的 组 氨 酸 、 栈 氨 酸 、 甲 硫 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 也 同时 受到 裂解 。 后 来 改 用 BNPS-Skatole, 其 对 色 氨 酸 裂 解 的 专 一 性 比 NBS 的 高 , 产 率 通常 在 50 一 70 驳 ， 缺点 是 试剂 不 太 稳 定 。 裂 解 反 应 通常 在 醋酸 溶液 中 进行 , 若 用 高 质量 的 新 鲜 试剂 , 副 反应 仅仅 表现 为 对 Met 的 氧化 ， 并 使 半 胱 氨 酸 氧化 成 胱 氨 酸 。 但 如 果 试剂 不 纯 ， 或 贮存 过 入, 试剂 的 颜色 由 淡 黄 变 为 桔 黄 , 除 上 述 副 反应 外 ,对 酷 氨 酸 残 基 的 副作用 特别 明显 。 用 本 酸 /12 盐酸 /二 甲 基 亚 砚 (DMSO) RAM, Hin 43% 的 溴 化 氢 与 蛋白 质 反 应 更 具有 专 一 性 ， 它 对 色 氨 酸 的 裂解 产 率 在 60% , 并 能 限制 甲 硫 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 的 侧 链 氧 化 。 反 应 过 程 是 先 由 DMSO 与 盐酸 作用 形成 MeS*Cl,MeS*Cl RU RHA MB HARIRI, 再 与 DMSO/HBr 作用 形成 省 化 物 , 然后 再 裂解 。 反 应 过 程 如 下 : H-C-R。 NH cg NH o> Op FE y=": sla NH-6-€-R: DMSO/HCI(MezSCl) NH - N NAS O JSABARHEAR NH NH DMSO/HBr 让 让 让 Teen LS 一 一 一 二 ac 一 全 O H,0 NSO Br- H ONHOs O YNHew N~ SO et? H re) si 0_TNH HO N~~O + H.N-C-ce H R2 1979 年 Mahoney 和 Hermodson569 发 现 ， 用 亚 碘 酰基 葵 甲 酸 (简称 IBA) 在 色 氮 酸 凑 端 裂 解 ， 产 率 可 达 70—100% (WLR 4-6)。 其 反应 机 理 也 是 氧化 呵 吕 环 ， 与 上 类 似 。 他 们 用 人 和 和 牛 血清 自 蛋 白 和 人 血红 蛋白 的 e 59 « R46 ”一些 蛋 白质 中 色 氨 酰 肽 链 的 裂解 产 率 蛋白 质 产 率 (9%5) 血红 蛋白 wx 链 Trp'*—Gly Lys Val >95 血红 蛋白 B 链 Trp’ —Gly Lys Val >95 Trp*?—Ghr Gln Arg >95 血红 和 蛋白 7 链 Trp5 一 Gly Lys Val >95 sp —Thr Gln Arg >95 Trp?°—Gln Lys Met >95 Sinveeee Trp**—Gly Lys Tyr >95 Trp? -Ser Val Ala 90 人 血清 白 蛋 白 Trp?%-- Ala Val Ala 90 + p-REA Trp**--Val Val Ser 65 Trp*’—Gly Asn Thr 90 Trp’? —Gly Ser Gly f 90 Trp?*!--Ule Lys Glo 70 WRK Aas Trp**--Val Cys Ala 70 Irp°?—Trp Cys Asn ND* Trp*? —PE—Cys Asn Asp 80 Trp'*—Val Ala Trp , ND Trp'"'\—Arg Asn Arg 90 Trp'%—Ile Arg Gly 70 a. ND 没有 测定 。 ac、8、7 链 作 试验 发 现 , 色 氮 酸 在 Gly、Thr、Gln\Ser、Ala 和 Arg 前 时 ， 有 裂解 产 率 达 90% 或 更 高 ,对 Trp—Val 和 Trp—lle 键 裂 解 的 产 率 约 70% 。 后 来 Walsh 用 鲸鱼 肌 红 蛋 曰 试验 ,获得 完全 相同 的 裂解 产 率 , 但 Tyr —leu'™ 键 也 出 现 30 多 的 裂解 ， 而 这 个 蛋 白 上 的 另 二 个 酷 氨 酸 羧 端 并 不 裂解 。 产 生 对 Tyr 键 的 副 反 应 是 由 于 试剂 不 纯 引 起 的 。 者 用 90 多 硝酸 在 低温 (15%C) 下 小 心 处 理 试 剂 , 并 在 每 mol 试剂 中 加 10 一 20mol P- . 甲 酚 (P-cresol)， 则 鲸鱼 肌 红 蛋白 中 的 Tyr’? AO Bef all Sz hi Al ERE 10% 以下, 而 对 色 BAW FR Tin BEAD Be RARE UPR AH, REBAR in RRA ADE Be 磺 酰 茶 酸 (O-iodoxybenzoic acid)lm。 可 用 薄 层 层 析 或 柱 层 析 分 离 纯化 这 样 ,由 于 IBA. 试剂 对 色 氨 酸 羧 端 肽 键 裂 解 的 高 产 率 和 高 特异 性 ， 目 前 在 蛋白 质 顺 序 测定 中 已 被 广泛 应 用 %。 2. 实验 方法 (1) 二 甲 基 亚 砚 (DMSO) 混合 物 方 法 材料 : DMSO， 冰 酯 酸 ，12N 盐酸 ,HBr- 水 溶液 (48 色 )( 避 光 贮 藏 在 棕色 瓶 中 ,如果 省 分解 必须 重 蒸 ,可 放 少 量 葵 酚 防 止 省 产生 )。 方 靶 : 在 室温 下 将 细胞 色素 “〈17mg) 溶解 于 冰 酷 酸 〈600mD)、12N HC! (300¢l) 和 DMSO (25m) 的 混合 物 中 。 先 加 入 200mg 苯酚 ,30 分 钟 以 后 再 加 人 48 驳 再 Br (100pl) 和 DMSO (25 由 )， 在 室温 放置 30 分 钟 ,然后 加 入 2ml 水 , 用 乙酸 乙 酯 提取 ,以 除去 血红 素 和 它 的 分 解 产物 。 将 水 溶 久 减 压 浓 缩 ; 固 体 用 超 细 聚 Sephadex G-50 (2 X 144cm) 分 离 ， 用 10 甲酸 洗 脱 。 OE (2) IBA 法 材料 : IBA, FERRI, BERR, AER, Cellulose jf, DEAE-Cellulose se 方法 : ' TI. IBA 的 纯化 A. 薄 层 层 析 法 在 Cellulose 板 上 单 向 层 析 ， 用 甲 醇 : 酷 酸 : 水 (6:3:1V/V) 洗 脱 。 结果 .Ri 0.82 斑点 为 IBA，,Ri 0.54 BEE O- BULA FBR. “1 了 B. 用 离子 交换 柱 层 析 ns 村 DEAE-Cellulose 柱 用 梯度 (0.01— 已 de 0.5mol/1) Tris- 醋 酸 缓冲 液 pH9.0 洗 0.23 陪 ,使 IBA 5 O- 碘 酰 葵 甲酸 完全 分 离 三 《图 4-10)。 村 Il. 用 IBA Spc Arig wanna 而 20 30 40 50 -60 70 馆 分 l4mg 蛋白 质 深 于 2.8ml 4mol/1 se ”图 4-10 IBA (o)4 O-RMERE, (OWA TERE 酸 县 中 (用 80 多 醋酸 液 配 制 ), 再 加 15mg 苯酚 于 上 混合 液 中 , 然后 加 28mg IBA， 充 惰性 气体 于 室温 黑暗 处 反应 24 小 时 。 随 后 过 剩 试剂 用 加 过 量 百倍 的 斑 基 乙酸 破坏 。 在 Bio 一 Gel P—2(<400 目 ) 柱 (3.5 X 14cm) 上 用 75 纹 甲酸 脱盐 ,再 在 Bio—Gel P—10(<400 目 ) 柱 (2 X 60cm) 上 用 50% 甲酸 分 离 纯 化 。 (四 ) 部 分 酸 水 解 1. 一般 情况 介绍 、 这 是 Sanger 早年 测定 胰岛 素 顺 序 时 曾 使 用 过 的 方法 。 在 引 和 人 特异 性 酶 胞 解 后 ， 部 分 酸 水 解法 遭 到 了 冷落 ， 人 们 很 少 再 使 用 它 。 但 后 来 又 发 现 部 分 水 解法 还 是 有 一 定 的 专 一 性 ,如 Partridge 和 Davis’) 观察 到 用 0.25mol/1 MRSS A Re, sales Te 天 冬 氮 酸 部 分 水 解 而 被 释放 ,其 反应 式 如 下 : Ht a yi Asp Ww Z a wish auds 3 FOREASRNRE wo 2 se 这 里 x、y、w、z 代表 任何 其 它 氮 基 酸 (Asn SERA Asp, 再 部 分 水 解 )。 还 有 人 人 发现， 在 含有 高 浓度 且 的 甲酸 中 (用 10% BI pH 至 2.5) 40°C 保温 反应 4 天 ,能 专 一 地 裂解 Asp—Pro 键 , 并 且 产 率 高 达 80—90%, 部 分 酸 水 解法 的 副 反 应 较 多 ,往往 发 生 非 专 一 性 降解 ,比较 难 掌握 。 (1) F 25mg 蛋白 质 中 加 0.25mol/1 醋酸 20ml， 在 密封 管 中 于 110°C 下 水 解 86 人 小 时 ,然后 将 盗 液 冷冻 干燥 。 (2) 也 可 将 一 定量 蛋白 质 在 pH2.5〈 用 10% BRI) 或 70 一 90% RAR (CS 有 7mol/1l WM), F 40°C 保温 反应 4 一 5 天 ， 然 后 将 溶液 冷冻 干燥 。 se。 61 。 [1] [2] [3] [4] C5] [6] [10] 2 +s xk R Elzinga, M.: Methods in Protein Sequence Analysis: Strategic Approaches to Sequence Analysis by Walsh, K. 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FERS BT (—) BARB 凝 胶 层 析 是 六 十 年 代 初 瑞典 科学 家 Flodin 首先 提出 的 一 种 简便 有 效 的 分 离 分 析 方 法 ,二 十 余年 来 获得 了 较 大 的 发 展 , 并 已 普遍 应 用 于 生物 大 分 子 物 质 的 分 离 和 分 析 。 凝 胶 层 析 法 亦 称 凝 胶 过 滤 法 或 分 子 筛 方法 ， 其 原理 是 不 同 分 子 量 组 分 的 样品 通过 具 * 65 。 有 分 子 筛 性 质 的 凝 胶 时 , EERO TON AKAMA EI ALO, MA 5-1 可 以 形象 地 看 到 这 个 分 离 过 程 。 图 5-1 ， 凝 胶 层 术 分 离 层 析 图 CG) 样品 (其 中 含有 大 、 小 不 同 的 分 子 ) 溶 液 加 在 层 析 柱 顶 端 ;3 (2) 样品 溶液 流 经 层 析 柱 ? 小 分 子 通过 扩 获 作用 进入 凝 胶 颗 粒 的 微 孔 中 ?而 大 分 子 则 被 排 盟 于 颗 粒 之 外 。 大 、 小 分 子 因 向 下 移动 的 速度 发 生 差异 而 将 大 \ 小 分 子 分 离开 来 ;3) 向 层 析 柱 顶 加 入 洗 脱 六 * 大 \ 小 分 子 分 开 的 距离 增 大 并 4) 大 分 子 已 经 流出 层 析 柱 s 凝 胶 是 一 类 三 维 空间 网 状 结构 的 多 孔 性 物质 ， 当 含有 多 种 物质 的 样品 深 液 缓慢 流 经 凝 胶 层 析 柱 时 ， 各 物质 在 柱 内 同时 进行 着 两 种 不 同 的 运动 : 垂直 向 下 的 移动 和 无 定向 的 扩散 运动 。 大 分 子 物 质 由 于 直径 较 大 ， 不 易 进 入 凝 胶 颗 粒 的 微 孔 ， 只 能 分 布 于 颗粒 间 阶 中 ,所 以 向 下 移动 的 速度 较 快 。 小 分 子 物 质 除 了 可 在 凝 胶 颗 粒 间 隙 中 扩散 之 外 ,还 可 以 进 和信 凝 胶 颗 粒 的 微 孔 中 , 即 进入 凝 胶 相 内 ,因此 在 向 下 移动 的 过 程 中 ， 必 须 等 待 它 们 从 凝 胶 内 扩散 至 颗粒 间隙 后 再 进入 另 一 凝 胶 颗 粒 。 如 此 不 断 地 进入 和 扩散 的 结果 ， 使 小 分 子 物 . 质 的 下 移 速 度 落 后 于 大 分 子 物质 ， 桩 品 中 的 物质 分 子 依 大 小 不 同 有 次 序 地 流出 层 析 柱 而 得 到 分 离 。 为 了 精确 地 衡量 混合 物 中 某 一 被 分 离 成 分 在 一 lacie 可 采用 分 配 系数 Ka 来 度量 。 开 a 的 定义 为 : m= We Vig V; Ah Ve AK-ADVEMENCLREWRKHAR: 7。 为 层 析 柱 内 凝 胶 颗 粒 “ 之 间 空 隙 的 总 体积 ;Fi 为 层 析 柱 内 凝 胶 颗 粒 内 微 孔 的 总 体积 。 当 某 成 分 的 Ka 值 为 0 时 ( 即 Fe 一 7。)，, 意味 着 该 组 分 完全 被 排 阻 于 凝 胶 颗 粒 的 微 孔 之 外 而 最 先 被 洗 脱 。 当 另 一 组 分 的 Ka 值 为 1 时 ( 即 .Fe 一 。 一 Fi)， 意 味 着 这 一 组 分 完全 不 被 排 阻 , 它 可 以 自由 地 扩散 进 和 人 凝 胶 颗 粒 内 部 的 微 孔 中 ,在 洗 脱 过 程 中 它 将 最 后 流出 柱 外 。 处 于 上 述 二 种 组 分 ( 即 最 大 分 子 与 最 小 分 子 ) 之 间 的 那些 组 分 , 它们 的 天 a 值 在 0 一 1 之 间 变 化 。 这 种 从 小 到 大 的 Ka 值 顺序 决定 了 物质 的 流出 顺序 ,Ka 值 小 的 最 先 流出 , Ka 值 大 的 后 流出 。 如 果 物 质 的 Ku AKT 1.0， 说 明 这 一 层 析 过 程 不 是 单纯 的 分 子 筛 作用 ,其 中 可 能 还 夹杂 有 吸附 和 离子 交换 等 过 程 。 * 66 。 不 同型 号 的 Sephadex 干 胶 的 流 床 参数 是 不 同 的 ( 表 5-1)。 表 5-1 不 同型 号 Sephadex 流 床 参 数 (1g 干 胶 测 定 值 ) 型 号 Ta Vo Vi G-25 5 G-50 10 G-75 13 G-100 17 G-200 30 a Ve 为 装 有 凝 胶 柱 的 床 体积 。 Vix Fe 二 Vit Fe 其 中 Fe HRBMLAS MER. 如 果 已 知 某 组 分 的 Ka 值 和 相应 的 柱 参数 , 则 可 算出 它 的 洗 脱 体积 : Fe aaa fA + Ka(¥V;) FAD Ka 值 与 它 的 分 子 量 有 一 定 关 系 ， 图 5-2 是 用 一 log Ku M” 作 的 图 ， 它们 成 线性 关系 。 握 此 可 用 凝 胶 过 滤 法 测 高 分 子 物 质 的 分 子 量 。 wonund N (=) 凝 胶 的 类 型 目前 常用 的 凝 胶 可 分 为 两 大 类 :一 类 是 用 糖 作为 骨架 ， 另 一 类 是 用 有 机 高 聚 物 为 骨 架 。 以 糖 作 为 骨架 的 , 如 Sephadex (RW XS 育 糖 的 商品 名 )、Spharose (琼脂 糖 的 商品 = 名 ) 思 等 。 Sephadex 是 以 葡 聚 糖 巨 分 子 用 交 联 剂 0.25 一 -3- 氧 -1，2- 环 氧 丙 烷 ( 简 称 环 氧 氧 丙烷 ) 按 不 同 的 交 联 度 交 联 在 一 起 ， 形 成 三 维 空间 100Q 2000 3000 4000 5000 WAKA, RADTHER, BREA M27s 氧 氧 丙烷 的 百分比 控制 。 各 种 凝 胶 的 分 离 范 “图 5-? 不 同 蛋白 质 的 -logK。 HM” (ER (Ka: 分 围 见 表 5-2、5-3 和 5-4, 配 系数 ， M: 分 子 量 ) 其 中 G-10 一 G-50 适合 肽 的 分 离 。 Sephadexes 不 溶 于 水 , 在 弱酸 或 弱 碱 性 溶 芒 中 稳定 ，pH 高 于 12 或 低 于 2 时 会 导致 凝 胶 破 坏 。 Sephadex 通常 以 G 表 示 , 即 G-10、\G-15、\G-75...... ,编号 愈 大 , 被 分 离 的 分 子 也 愈 大 。 近 几 年 又 出 现 几 种 新 型 凝 胶 , 如 Sephacry 四 和 Ultragel™, 它们 具有 机 械 强 度 高 、 流 速 好 等 优点 ,适用 于 较 大 分 子 量 物质 的 分 离 。 用 有 机 高 聚 物 作为 骨架 的 ， 如 Bio-gel， 它 是 由 单 体 和 丙烯 酰胺 (acrylamide:CH,= CH -CONH:) 径 过 交 联 剂 N,N'- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 (N, N-methylene Bis acrylamide) 交 联 而 成 的 。 性 能 近似 于 Sephadex, LLP HAR, MM P-2, P-4, P-6 等 ,编号 愈 大 凝 胶 的 孔径 越 大 ， 被 分 离 的 分 子 量 也 愈 大 ( 见 表 5-5)。 * 67 。 Ol sI Se OS 00I< CAM?) [al Rg S$z-—02 0 一 05 CC 了 TS 05 一 02 0c—ST FE IT 一 6 0°7F0°0z S*I-FO°ST 0°I0°OT S 0 十 57 85 0 于 0'5 BERS CA 000002—0001 0000S1—000T 000001 —O00T 00005z 一 0005 000009 一 0005 0000ST—000S “ 00000€—000¢6 000001 —000+ 0000ST—000F 0000Z—000¢ 00005 一 000T 00008—000¢ 00001—00s 0000€ 一 005T 0005 一 001T 0005 一 0001T 005I> oosT> 00L> 00L> ee El 2 TY CHE ERAYL xepeydeg 7-¢ x 0tr 一 0T 0ZI—Or 0r—OI 0ZT 一 0 Or - OT 0CZT- 一 0 0r—OI 0ZT 一 0 0 一 0T 08 一 02 05I 一 05 00€—OOT 0r—OT 08—0z 05I 一 05 0085- OOT 02T 一 0》 O0cI—-0F (ur) +2 Hi "MALAAE Wm * HH 007-9 007-9 Hw 05T-D 0SI-D is H 001-5 001-9 He sL-D ezZ-) Hy 05-9 HR 0S-D th 05-9 Hk 05-9 TMH A 5z-9 TYNGEHG 5z-9D Tylrh $7-D 来 珊 联 5z-9D sI-5 0I-5 xepeydes xopeydeas xopeydas xopeydag xopeydas xopeydes xapeydag xopeydag xepeydas xopeydag xopeydes xeprydas xopeydsg xopeydag xeprydag xopeydag xepeqdag xepeydas i 68 。 RS-3 商品 琼脂 糖 凝 胶 的 技术 数据 es 颗粒 直径 * 分 级 范围 《分 子 量 (um) 以 百 万 为 单位 ) Sepharose 2B 60 一 250 Sepharose 4B 40 一 190 Sepharose 6B 40 一 210 Sepharose CL-2B 60—200 Sepharose CL-4B 60—140 Sepharose CL-6B 45—155 BioGel A-0.5m 50—100 150—300 BioGel A-0.5m 100—200 75—150 <0.010—0.5 BioGel A-0.5m 200—400 40—75 BioGel A-1.5m 50—100 150—-300 BioGel A-1.5m 100—200 75—150 <0.010—1.5 BioGel A-1.5m 200—400 40—75 BioGel A-5m 50 —100 150—300 BioGel A-5m 100 --200 75—150 0.010—5 BioGel A-5m 200—400 40-75 BioGel A-15m 50—100 150 —300 BioGel A-15m 100—200 75—150 BioGel A-15m 200—400 40—75 BioGel A-50m_- 50—100 150—300 BioGel A-50m 100—200 75—150 0.10 一 20 BioGel A-150m 50 一 100 150 一 300 BioGel A-150m 100—200 75—150 vi tare a。 指 湿 的 颗粒 直径 。 表 5-4 Ultrogel 的 技术 数据 GRR 颗粒 直径 琼脂 糖 浓度 丙烯 酰胺 浓度 分 级 范围 (um) (%) (%) (AF) Ultrogel ACA 22 60—140 2 2 100000—1200000 Ultrogel ACA 34 60—140 4 3 20000—350000 Ultrogel ACA 44 60—140 4 4 10000 —130000 Ultrogel ACA 54 60—140 4 5 5000— 70000 其 中 P-2—P-10 较 适 合 肽 的 分 离 纯 化 。 这 些 胶 在 酸 中 稳定 性 较 好 ,如 P-30 在 30% 酷 酸 中 浸泡 一 年 仍 完好 无 损 。P-2，P-4 的 稳定 性 较 差 , 当 绥 冲 液 的 , pH 超过 10 时 , 凝 胶 会 趋向 于 水 解 。 (三 ) 实验 方法 1. 柱 的 选择 柱 最 好 选用 牢固 的 赛 璐 璐 或 玻璃 ,用 一 尼龙 织品 ( 约 400 目 ) 作 柱 垫 (注意 ， 玻 璃 烧结 物 容易 阻塞 ,玻璃 毛 容 易 产生 死 体 积 ), 柱 长 与 直径 的 比 约 100:1, 若 需 用 更 长 的 柱 ， 可 用 若干 柱 串 联 使 用 。 层 析 柱 最 好 带 有 外 套 , 以 便于 控 温 。Bhown 和 他 的 同事 曾 使 两 根 柱 串 ea 69 « or SZ Se os ool< 00lI< - ooI< ool< o0I< ooI< (uro ) CHERYL CHMOD Se CMA 3/7) w 4H 4 Saad (A 3/yer) CHL 7) 围 情 动 工 en - 00000%—00009 00000Z7—0000€ 0000ST—OO00ST 000001—000¢5 00009—000¢ 0000b-—00S2 0000¢—O0SI 0009— 0001 000b-—008 008T 一 00T BRYA Te8-oIq 59-5S 竺 4 0 之 OsI—sZ 005 一 05T 0 之 OSI—SZ 00E—OSI or> OST—SZ 00€—OST 0r> OSsT—SsZ 00€—OsI (+ 之 OST—SZ 00€—OST Or> OSI—SZ 005 一 05[ Or> oZ—0Pr OST—SZ 00€--0ST 01> 5L 一 (0 USL SA 0085 一 05T or> SL—0b OSI—sZ 00€—OST Or> SL—Ob OSI—SZ 00€—OST (wl) 00b> 00z—001 0or—Oos 00> 00c7—00T 00I—Os 00 之 002 —00T 00T—OS 00r> 007—O0T 00I 一 05 00b> 007—O0I 00I 一 05 00# 之 00c—O0I 00T—O0s 00b> 00# 一 002 00c—00T 00f—O0s 00r> 00? 一 007 002 一 00T 00I 一 05 00+ 之 00b—002 00c—O00T 00IT—O0s 00r> 00% —v0z 002— 001 00I 一 05 〈 目 ) OF MS 00£-d 00€-d 00£-d 00¢-d 007-d 00¢-d 05T-d 0ST-d 0SI-d 00I-d 00I-d 00I-d 09-d 09-d 09-d 05-d 085-d 05-d 0I-d OI-d 0I-d 0I-d 1 1 1 Be AA, A, A, By BY Ba AY 1 Ay Ay NAAN A as woww”o op [esorg [Sorf Peed pPsorg [gorg Psorg [of [3ofg gotg Isorg [egorg Pao 301g }Ps01g 195org Peo Te3ofg la5org [3org [agorg Psorg ES 区 Issorg [agofg Tasorg Prog Por pPsorg Psorg PSorg ]Pso1g Psorg Psog asorg fk 70 。 联 [ 每 根 柱 2 X 112(cm)] FM P-10 DEA J BRR HRSA BK, RS REN $6 (Al 5-3)。 光 密度 280 nm 90 110 130 150 170 190 é j 5-3， 用 两 根 P-10 # (Bio-Rad, 200-400 目 ; 2.UX112cm) 分 离 全 链 柠 康 酰 化 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 引 自 Bhowm, A.S., Mole, J. E., and Bonneff, J. c. Biochemistry 16, 3501 (1977), 2. 洗 脱 溶 剂 的 选择 选择 洗 脱 溶剂 的 标准 是 : 能 完全 溶解 谷 分 离 的 肽 ， 不 影响 肽 的 监测 ， 并 能 很 快 被 去 BRo - F 以 下 是 用 于 凝 胶 层 析 分 离 肽 的 常用 洗 脱 溶剂 (1) 0.1ml/1 醋酸 贸 pH8—9, (2) 1% THRRAK (3) Imol/] AA By Imol/L 酷 酸 。 (4) 6mol/1 thei ey 6mol/L RX, (5) 50% Ram AMR, 其 中 (4)、 (5) 常 用 于 分 离 CNB 裂解 肽 和 其 它 大 肽 假 。 洗 脱 碱 性 蛋白 时 ， 洗 脱 液 中 应 含有 一 定 浓度 的 盐 ， 这 样 可 减少 样品 在 柱 上 的 吸附 。 完 全 不 带电 荷 的 物质 可 用 蒸馏 水 洗 脱 。 被 分 离 的 物质 若 有 带电 基 困 ， 洗 脱 流离 子 强 度 至 少 要 在 0.02mol/1 才能 获得 较 好 的 结果 ,因为 Sephadex 含有 少量 羧基 ,会 吸附 阳离子 。 3. 凝 胶 柱 的 制备 与 选择 若 选 用 100 X 1(cm) 的 柱 , 洗 脱 溶剂 为 5 一 10 % 醋酸 、0.07% BH, WEA 25g 的 Sephadex ,在 搅拌 下 慢 慢 加 入 0.1N 和 氢 氧 化 钠 中 ,继续 搅拌 30 分 后 倒 人 沙 芯 漏斗 ,用 蒸 馆 水 和 5 色 栈 酸 洗 , 待 凝 胶 充 分 溶 胀 后 转移 到 21 HR, LEAR, 20 分 钟 后 倾 去 未 下 沉 的 细 颗 粒 。 如 此 重复 几 次 后 ,转移 到 洗 脱 缓冲 波 中 ,并 仔细 除 气 ， 最 后 用 2 倍 床 体 积 的 洗 脱 液 稀释 , 按 下 述 次 序 装 柱 "。 (1) lem 的 玻璃 珠 。 人 (2) 1cm Sephadex G-25 ( 粗 )。 (3) 1/3 床 体积 的 洗 脱 缓冲 液 。 (4) Sephadex (如 G50 超 细 ) 凝 胶 浆 。 (5) 进 样 前 ， 柱 用 洗 脱 液 平 衡 20 小 时 (1 一 2 个 床 体积 )。 平衡 后 取 1 一 5mg 冻 干裂 解 物 , 加 0.3ml 洗 脱 液 溶 解 , 离 心 , 取 上 清 液 上 柱 ， 用 0.1 一 0.2ml 洗 脱 液 洗涤 样品 管 ,离心 ,请 液 再 上 柱 〈 沉 淀 分 开 处 理 , 可 用 200wl 8mol/1 RAR 液 或 30 一 50 % 甲酸 溶解 后 上 到 较 小 的 柱 上 ), 样品 的 体积 约 为 床 体积 的 1 和 注意 ,使 用 凝 胶 过滤 分 离 前 , 一 般 先 用 SDS 凝 胶 、 电 泳 检 查 一 下 少量 蛋白 质 裂解 样 品 ,根据 所 测 的 肽 段 数量 和 大 小 来 确定 凝 胶 的 种 类 、 型 号 以 及 柱 的 大 小 。 北 胶 颗 粒 的 粗细 与 分 离 效 果 直 接 有 关 , 颗 粒 细 的 分 离 效 果 较 好 ,但 流速 较 小 。 凝 胶 的 用 量 与 选用 层 析 柱 的 大 小 有 关 。 当 分 子 量 比较 接近 时 , 宜 采 用 细 而 长 的 柱 ,这 样 可 以 提高 凝 胶 层 析 分 离 的 分 状 率 。 但 是 柱 过 细 有 时 会 产生 管 壁 吸附 效应 ， 同时 流速 过 慢 难 以 操作 ， 值得 注意 。 柱 的 大 小 决定 后 ,可 按 下 列 公 式 计算 凝 胶 的 用 量 : V~=ar'-h r 为 柱子 的 半径 , AEB. MA P, 一 1 克 干 胶 溶 胀 后 所 占 床 体积 X 干 胶 克 数 合并 上 述 两 式 得 : xri+h 干 胶 克 数 一 1H TRIKE GRAB fil: 2 X 20cm Sephadex G-25 柱 ， 因 为 已 知 G-25 的 每 克 干 腕 床 体积 约 为 .5.0( 见 表 5-1)。 所 以 干 胶 克 数 一 art Mig 凝 胶 柱 的 填充 质量 直接 影响 着 分 离 效 能 ,因此 ,使 用 前 须 经 质量 检查 。 通 常 可 采用 二 种 有 色 物 质 的 溶液 (如 铁 蛋 白 液 ,印度 墨水 等 ) ,通过 观察 有 色 区 带 在 柱 上 的 行为 借以 检查 柱 的 均匀 程度 。 若 色 带 狭 罕 、 均 匀 平 整 ,说 明 柱 的 填 装 质量 良好 ;如 果 色 带 稚 曲 、 BL 则 必须 重新 填 装 。 为 了 避免 床 的 污染 ,并 保持 较 高 的 流速 ， eS eee eo 加 样 的 样品 体积 越 小 ,分 离 的 效果 越 好 。 加 样 可 采用 二 种 方法 ,一 是 床 平衡 后 吸 去 床 顶 部 的 液体 盖 用 滴 管 小 心 加 入 ,调整 柱 的 疲 速 , 开 始 收集 流出 液 。 样 品 液 逐 渐 盗 人 床 内 ， 最 后 再 用 少量 洗 Ria BoE Hin boca Aims LBS, HIT. BEE Ae. RAR K. KE, BEAR BADR EAB i AR BOAT Ea Be FE 加 样 ,以 缩短 加 样 时 间 。 4, 2S KW ek ! 洗 脱 时 收集 0.5 一 0.7ml 一 个 流 分 于 lml 塑料 管内 。 对 于 Sephadex G-25 #1 G-50 He 速 可 控制 在 4 一 6ml/ 小 时 ， 对 于 Sephadex G-75 流速 可 控 在 1.5 一 2ml/ 小时。 要求 高 效 分 离 时 , 胶 粒 选 用 细 或 超 细 颗 粒 ,同时 六 速 也 要 尽 可 能 慢 。 如 果 使 用 蠕动 泵 ， 流 速 不 要 超 WHABARR TIAN 90 多。 洗 脱 液 可 用 人 工 或 目 动 收集 器 收集 。 洗 脱 图 谱 在 280mz, e 72. % ace ol 230m 或 215mp 的 用 紫外 监测 器 检测 。 如 果 在 这 些 波 长 中 洗 脱 缓冲 液 本 身 有 吸收 或 某 肽 段 缺乏 特殊 吸收 时 ,可 采用 曹 三 酮 或 菊 光 胺 检 出 只。 图 5-4 为 自动 柱 层 析 装置 ， 图 5-5 为 它 的 流程 图 。 每 隔 十 管 吸 20 一 150pl 洗 脱 物 ,干燥 , 溶 于 10ul 20% 吡啶 中 ， 点 样 到 纤 维 素 薄 膜 上 单 向 层 析 , 用 3 多 曹 三 酮 喷雾 显 色 。 为 了 检 出 肽 和 观测 肽 的 纯度 ， 需 再 进行 酸 人 网 才 四 下 te 图 5-4 LKB 液体 色谱 仪 深 剂 程序 变换 器 | 图 5-5 液体 色谱 仪 流程 图 水 解 作 氨 基 酸 组 成 分 析 ， 经 鉴定 已 经 纯 的 肽 段 可 以 直接 测定 顺序 ， 不 均一 的 流 分 可 根据 所 念 肽 的 数目 和 分 子 量 大 小 ， 选 用 离子 交换 层 析 或 指纹 技术 进一步 分 离 纯 化 。 本 有 =. ATRREM (一 ) 一 般 原理 凝 胶 过 滤 分 离 很 难得 到 很 纯 的 产物 ,一 般 都 需 进一步 纯化 ,离子 交换 层 析 法 是 常用 的 一 种 纯化 方法 。 所 谓 离 子 交换 层 析 是 按 物质 所 带电 荷 的 差异 而 加 以 分 离 的 一 种 方法 。 蛋 白质 多 肽 或 氨基 酸 在 溶液 中 所 带电 荷 不 同 ,它们 进入 离子 交换 柱 后 ， 与 交换 剂 发 生 下 列 不 同 交 换 反 应 。 1. 阳离子 交换 剂 的 交换 作用 以 酸性 CM-Cellulose 为 例 , 它 含有 能 够 离子 化 的 功能 基 团 —OCH,COOH, ,能 与 蛋白 质 (Pr*) 或 肽 的 氨基 进行 交换 吸附 。 由 于 Pr — NH, + H+ = =Pr — NHt Cel — OCH,COOH + OH —=Cel — OCH,COO- + H,0 因此 (1) Cel—OCH,COOH + Pr—NH+—>[Cel—OCH,COO-][Pr—MH#] + H+ (2) [Cel—OCH,COO~][Pr—NH$] + Nat—+>Cel —OCH,COO-Nat* + Pr—NHt 2. 阴离子 交换 剂 的 交换 作用 以 DEAE 一 Cellulose 为 例 ， 它 含有 能 够 离子 化 的 功能 基 团 OCH Ce ae 能 与 蛋白 质 或 多 肽 的 羧基 进行 交换 吸附 。 由 于 Pr — COOH + OH =—Pr — COO” + H,0 CH, DEAE — OCH:CHNC - aH + H,0 == DEAE 一 conic ~ +085 因此 H 2 (1) DEAE—Cel—OcH,CHNC ”+ Pr 一 coo- + H,O 2H, + /Hs 一 >| DEAE-Cel-OCH,CH,N [Pr—COO-] + OHr H C, Beige: & (2) DEAE—Cel—OCH,CH,NC — [Pr—COO-] + e@l- H ‘C,H, + C,H, 二 三- DEAE—Cel—OCH,CH,NC TEL COO H C,H, 在 上 述 反应 式 中 , 如 为 阳离子 交换 层 析 ,第 一 步 反 应 将 带 正 电荷 的 蛋白 质 或 多 肽 交换 到 树脂 上 去 , 然后 改变 条 件 , 利 用 Na* (也 可 以 是 其 它 正 电荷 离子 ) 将 蛋白 质 或 多 肽 置换 下 来 。 不 同 的 蛋白 质 或 多 肽 与 树脂 的 功能 基 团 闻 的 亲和力 是 不 同 的 。 它 们 与 树脂 功能 基 团 间 的 亲和力 , 反 过 来 决定 于 究竟 需要 多 高 的 Nat RE, 才能 进行 第 二 步 反 应 。 蛋 白质 或 多 肽 与 离子 交换 树脂 之 间 的 亲和力 既 决 定 于 交换 基 团 的 性 质 ， 也 决定 于 蛋白 质 或 多 肽 的 带电 状态 。 这 样 两 个 (或 多 个 ) 带 电 状态 不 同 的 蛋白 质 或 多 肽 可 在 不 同 的 Na ”浓度 下 e 74» 进行 上 述 第 二 步 反 应 。 因 此 ,只 要 控制 Nat 浓度 的 连续 变化 , 可 以 先后 分 别 将 带电 状态 不 局 的 蛋白 质 或 多 肽 置换 下 来 ， 达到 分 离 的 目的 。 对 阴离子 交换 层 析 ，[DEAE 一 Cal 一 OCH,CH,NH (CH,);][Pr 一 COO-] 与 Cl” 的 反应 也 可 照样 处 理 , 只 是 控制 反应 逆转 的 是 Cl” iA Nat, 所 以 改变 缓冲 液 的 pH 或 离子 强度 ,降低 物质 的 亲和力 ， SAUER er MoM RR (RRS We) BBE AS RE BTR AS, AEE DEI PK, ASI Bo (SH) 离子 交换 剂 的 种 类 按 载体 可 分 为 无 机 物 离子 交换 剂 和 有 机 物 离子 交换 剂 两 类 。 如 按 离子 交换 基 团 的 己 能 ， 则 可 分 为 阳离子 交换 剂 和 阴离子 交换 剂 。 1 阳离子 交换 齐 表 5-6 一 5-10 列 出 了 各 种 离子 交换 剂 及 其 活性 基 团 。 阳 离子 交换 剂 可 分 为 强酸 型 、 中 强酸 型 和 弱酸 型 三 类 。 强 酸 型 含有 磺 酸 基 团 “( 一 R 一 SO;H )， 中 强酸 型 含有 磷酸 根 (—PO;H,) 、 亚 磷酸 根 〈 一 PO:H2:) 或 磷 酰 基 ( 一 0 一 PO:H2)， 弱 酸 型 含有 羧基 (一 COOH) . 表 5-6 各 种 离子 交换 纤维 宗 及 其 活性 基 团 磷酸 纤维 素 a oO 离 l| AREER SM —O—CH,— $s —O- + | 交 pa re) 换 I LEBRABR SE —O—CH,—CH,— ' OF re) 加 酸 羧 甲 基 纤 维 素 CM | 型 —O—CH,— Cc —O- ag CH BA 碱 三 乙 基 氨基 乙 基 纤维 素 TEAE —O—CH,—CH,— Nt —C,H, B 型 C,H, F C,H, 交 二 乙 基 氨基 乙 基 纤维 素 DEAE —o —CH,—CH,—NH* | 换 C,H, tl 氨基 乙 基 纤维 素 AE 一 O —CH,—CH,—NH¢ Ecteola 纤维 素 (epichlorhydrin 十 三 乙醇 及 CT —N*(CH, - CH; - OH); e 75 e RRB}SIE (—OH), HAHEAE MI ALK AU BRS. HAO PA SEH Pe 树脂 `\ 葡 聚 糖 凝 胶 阳离子 交换 剂 . 阳 离子 交换 纤维 素 等 。 这 些 交 换 剂 的 母体 大 多 是 人 工 合 成 的 聚合 物 , 如 阳离子 交换 树脂 Dowex-So 就 是 由 葵 乙 烯 和 二 乙烯 苯 共 聚 物 磺 北 制 成 ( 见 ， 第 三 章 ), 它 的 官能 团 为 %-SOi。 区 上 这 些 交 换 剂 在 交换 时 的 反应 如 下 : 强酸 型 . R — SO;H*t + Nat =R — SO;Nat + Ht OH OH 中 强酸 型 : R—P + Na+ = 一 = 有 一 了 + Ht BC < OH || \NONa TMs 6) O 弱酸 型 ，R 一 COOH + Nat = =R—COONa + Ht 三 者 中 以 强酸 型 和 弱酸 型 用 得 较 多 。 2. 阴离子 交换 剂 表 5-7 离子 交换 纤维 素 的 种 类 和 特点 5 i ae fe BS 基 交换 当量 。 pK’® 特 点 CM- 羧 甲 基 一 O —CH,—COOH 0.5—1.0 3.6 应 用 广泛 ， 在 pH4 WE P- wR —O—PO.H, 0.77.4 _ PK,1—2 酸性 较 强 ， 用 pK,60—65 iE pH SE- RZ, 3£—-OCH,—CH,—SO,H 2.2 强酸 人 狂 ， 用 于 极 低 pH 阴离子 DEAE- =CACE oy = ois | 应 用 最 广泛 ?在 “ —O—CH,—CH,—N(C,H,), pH8.6 LLF TEAE =CACE 10 碱 性 稍 强 —O—CH,—CH,—+N(C,H,)s MAH ; I pH 仍 有 效 —O—CH,CH,—NH—C —NH, PAB BREE 极 弱 碱 性 9 -ca DN, OLA- 结构 不 详 Ay SAAR BD- 7A BELAY DEAE 适 于 分 离 核 酸 BND- 苯 甲 酰 和 葵 甲 酰 化 的 DEAE 适 于 分 离 核酸 CHW MP ea re -~ 一 一 一 a。 毫克 当量 / 克 。 |b. pK 外 观 解 离 常 数 负 对 数 在 0.5 一 1.5mol/1 NaCl 中 。 sa 7T6 。 R58 商品 离子 交换 纤维 素 的 特性 a 长 度 交换 当量 | 蛋白 吸附 容量 (mg/g) FEAR 《mg/g) ae 纤维 素 ‘Ah: (pm) (mmol /g) Pi x ae pH6.0 pH7 .5 0 pe 同上 ( 除 细 粒 ) 和 1.0+0.1 9.1 “pE-32 | martecrey | 2463 | Loto. 6.3 fest Stereos) boas | oar | is oO ae RTA ys ae : LEER _GM-22 | 改良 纤维 性 | 12400 0 ECM-23 同上 ( 除 细 科 ) 0 | 91 | 9.4 CM-32 微粒 性 (干粉 ) | 0 for) =), pea 6.7 cm-s2 lmeceie) | 24-63 | tot0.1 | 1,260 400 四 El 6.7 a. 英国 Whatman 厂 的 型 号 如 DE-1 ,为 长 纤维 性 ;长 度 10,000um。， 还 有 DE-11, 44EH%50—250pm, WE 清 清 蛋白 的 吸附 容量 仅 为 130mg/g。 阴离子 交换 剂 也 可 分 为 强 碱 性 .中 强 碱 性 和 弱 碱 性 三 类 。 它 们 都 含有 氨基 , Sek fi [—N*(CH3)3] 为 强 碱 性 ; 含 权 胺 [—-N(CH;).], hz (一 NHCH3)、 伯 胺 〈(--NH2) 类 都 属 弱 碱 性 ; ey kB Al SB HA eB IS a RE 换 剂 。 它们 交换 时 的 反应 是 ， 强 碱 性 , RN+(GH)OH- + Cl7- —=R—N*(CH;)sCl~ + OH- R—N(CH;): + H,O —=R—N*(CH;),H + OH™ Siti He: tk —N*(CH;),H - OH™ + Cl7 == R—N*+(CH;),HCl + OH™ 根据 载体 成 分 不 同 ,常用 的 阴离子 交换 剂 有 阴离子 交换 树脂 、 阴 离子 交换 纤维 素 、 葡 聚 糖 凝 胶 阴离子 交换 剂 等 ( 见 表 5-6 一 5-9)。 这 类 交换 剂 的 载体 也 大 多 是 人 工 合 成 的 聚 合 物 ， 如 阴离子 交换 树脂 Dowex | 是 由 交 链 聚 茶 乙 烯 珠 体 上 引 人 季 胺 基 制 成 的 ,其 官能 团 为 @CH,N*(CHs3)s0 高 分 辩 率 的 离子 交换 树脂 已 成 功 地 用 于 分 离 氨基 酸 和 小 肽 ,但 对 大 肽 、 蛋 白质 或 核酸 等 生物 大 分 子 物 质 的 分 离 尚 存在 问题 。 这 是 因为 树脂 载体 有 强 臣 水 性 表面 ， 易 导致 表面 li a a all a ala a i 从 而 降低 了 分 ae, HH Poterson 和 Sober HE fill MWS TFRMAAER UR ARBRE BT 换 作用 又 有 分 子 筛 作用 的 Sephadex 离子 交换 剂 和 Sepharose WARM 等 更 适合 于 大 肽 眉 或 蛋白 质 的 分 离 。 其 中 最 常用 的 是 CM-Cellulose、CM-Sephadex (阴离子 型 ) 和 DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex 〈 阴 离子 型 )。 这 类 交 换 剂 部 采用 亲 水 性 载体 。 如 上 面 提 到 的 .在 适 于 大 肽 段 的 和 咨 剂 中 ,加 些 脲 素 可 增加 大 肽 的 盗 解 度 ， 然后 再 用 上 述 离子 交换 FD BARE RR, KAMPF RS, Mm 8- 半 乳糖 苷 酶 (分 子 量 十 万 以 上 ) ,用 混 化 氰 裂解 切 成 从 23 一 119 个 残 基 不 等 的 16 个 肽 侦 ， 利 用 CM-Cellulose 离子 交换 层 析 © 22's ¢ Ciz-HOD0E | 01 0b —09°08—O0F 007—001 ‘001—0S ("X-ZOV )"'X-7x9M0q Cf&E-19 0ST S7E—ObT S01 —0S 00>—002*002---001 (三 -HO7)08 8 08—0r*0S—02 001 —0S 0S —02 | CX -¢@9V)'x-2_ xemog CfZ-19061 00b LNA (-10 0s! S7E—ObI S01 —08 00r —00Z*007—001 bl z°¢_ | (f-HO)0S| 8 | os—or*os—0z . |. ~~ .S001—0sS0s—02 CX - LOW )PX- 1x8 mog 《三 -197)051 0€Z—OOI 01 —09 006 —00z*007—001 at §“€_| Ge HIO)0S.| oy | 08 —0b £0S—0z 00I 一 -05405 一 02 r CX-1oV)'X- [x2mo0q CfZ-19 0ST 00Z7—-08 00b>—002 og. 820 s*¢ | (三 -HO7205 Ae a 0b i—09°09—02 00Z—O0T £001 —0¢ Ee __ CxX- lov PX-Txemog 〈 配 -ID)051 (三 -HO705 pee t= 092 ee 00T 一 05. Ei C'X=19v )'!X- 1em0q Fe / et fa El 08z--0byT50yIT 一 09 | 00y 一 007500Z 一 001 | ee: 9°2 6 Ost | 91 08 —0b*0S—0Z ie 001 —0s 0s —02 = “Os-S 2K) OC 'X-M0SDV)"'X-05 32mog 00b—-0€7S0E2 一 0yT | 00 -£N/*00b —002 ei helo 4 OSI ral 0b —09*08—O0+ ae 00Z—00T £001 一 05 i | =os-@ a2] C'X-M0s OV)" X-0gxemog | 00b—0€Z 00b bE! | 085z 一 00T40yT 一 09 00y -一 002“00Zz 一 001 com 全 | ae OSI 8 08 一 0y“05 一 0Z | “01 —0S"0s—0z C*X-M0SOV )8X- 05 X9m0q 全 OS" 2 CX-MOSOV )fX-0SxomOg 00y 一 00Z 00f 二 \/ | *00Z—001 ‘01 —09 00h —002*002—001 or We Sass ost ie Gare we a £001 —0s 0S—02 CX-M0SOV)'X-05 x9mM0qg 007—08 00b—002 _t°0 z*s 05T “0010550500 £007 —001 £001 —0S ime | Sos-2 2% CX-M0SDV)X-05 x9mMoqg ee 6 ia 051 I os—02 00[ 一 -05 一-| fos-9 |Z C'X- Mus OV )'X-0¢xem0q 3 a OR Re ee ek ape a ee 应 二 总 出 ur © me | sm] coy | a p 3 = m + a 用 (让 ) X 73° © ZHU +°0 J0< ZHU 1°0 005 一 001T : 6 (z)08ING' [23-01g y0E~S7 ZHU £°0 “0 守信 了 00Z 一 001 Ai at ete ee, a Be C1 )0€Wd 125-org 00Z—00I ‘CH'O)HN'HO—HNOO— zJNG [°3-o1g 00Z—00I (CH OOHN 一 Ho 一 00o 一 zdG |°3-org 0 6 05-V xsepeddaS-TVO SETD >Eo-Ho HO | .5Z-W xepeydes-4VO EDJR DO 一 O 一 8"8Hd ¢ 5"0 于 5"85 0z@1—Ob “ ¢7-V. xepeydas-qyad sors ft 0ZTI 一 0 *(*H"D)HN—"H‘O— O 5Z-V xeprydes-qyvad ea ee A WE EE fe aSy 。 pyZT Hd 0" 少 €°0+0°9 00Z7—O00T HOOO— 00TND [°3-o1g 5 es ee 20h “p 0S LHd 9°T €°0+0° 00z—00I ash HOOO— (Z0EWO Te5-org a5"55 “p89 LHd +°Z €°0-F0°9 007—00I HOOO— C1)0SWO [?8-o1g as*S pp 9S Lud BY €°0+0°9 | 00z 一 00T HOOD 一 Wo. 153-orf 一 天- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 202—S1 eS pS 0a oy del | ES De ee HOSS" Os 0 = Qs-9 xeprydes-as ee em a a ee a ee | a OE fe et ee S2-9 xopendes-as 207—SI S*0-FS"+ Ov See sor 3 HOOD— Bo O= 0s-O xepeydes-WwO 95"0 于 5 省 | Ob HOOO—'*HO— O— 6Z-O xepeydes-wo Sat HE OH ee EB Wt 3/ Oe apse Sng a8 b=) Be 用 | q 4 at YW M WAG BREE SOF a °( By RR GH a EO St 05-V 起 05-9 CMG oo0fo1 fSHLGL °F LUA BAe apet-org BMWS pBorgs iy 00z 一 00[ Ak GE LM 193 org Ok xepeydeg 01-5 ¥ ?8 .9Hd IT9Juq [EH-sIN—|/JoWT0'O 43 ?%/LHd “Is 了 aq aeydsoyg—j/joutp’ 0 *? ° 2H “zs 了 uq 疆 儿 一 [1ToumT0 0 “P "LHd “sfuq 强 狗 一 [1 Touaz 0 *? EY SE Sh ns BG cz-v tk sz7-9 9 INCH OSD PMU SL SA Ye DOING [°5-o1g 一 一 一 ea 79 e FY — 8 B15) BE, Mtn, FY DEAE-Cellulose 分 离 核 糖 体 蛋 白 裂 解 肽 段 吧 , SP-Sephadex 分 离 磷 酸化 酶 裂解 肽 段 上 ,都 是 相当 成 功 的 例子 。 我 们 在 分 离 紫 荣 藻 红 蛋 白 的 2,6 WH 时 ,开始 用 Bio-Rex70 没有 分 开 , 改 用 CM-Celluloss52 ， 然 后 二 次 梯度 洗 脱 , 获 得 了 满意 的 分 离 效果 。 表 5-11 是 利用 不 同 离子 交换 剂 分 离 纯化 肽 的 例子 。 表 5-11 利用 不 同 离子 交换 剂 分 离 纯 化 肽 的 例子 RK 体 型 号 KER BE) 并 脱 参考 文献 ARAL Cie Dowex 71 核糖 体 蛋白 Los 的 胰 | ”吡啶 -甲酸 梯度 : 0.1N (pH2.7) [16] (Polystyrene) Ee A its Bits PF —1.0mol/I1(pH6-.5)411.0mol/1 (pH6 .5)— 2.0mol/I(pH6.5) 纤维 素 DEAE 胰 和 蛋白酶 酶 解 肽 有 选 | 线性 梯度 : 0.025—0.5mol/l (Cellulose) 择 的 纯化 NH,HCO, [9] 线性 梯度 : 0.025 一 2.5mol/1 BER (pH4.5) Phospho-Pll 鸡皮 胶原 蛋白 的 线性 盐 梯 度 : 0~>0.3mol/LNacl, 在 | [18][17] CNBr 肽 再 用 胰 蛋 白 | 0-04mol/l 醋酸 钠 组 种 液 C(DH3 .8) 中 酶 裂解 ee Fe) DEAE-(A25) 胰 和 蛋白 酶 酶 解 肽 的 ,| 线性 神 度 : 0.005—0.3mol/I ~ (19) (Sephadex ) 纯化 NH,HCO,(pH8.5) SP- CNBr 肽 的 分 离 0.17mol/1l 星 啶 - 酷 酸 (pH4.7) [20] 离子 交换 层 析 比 凝 胶 过 滤 分 辩 率 高 ,一 个 氨基 酸 之 差 都 能 分 开 ,但 对 同一 蛋白 质 或 多 肽 ， 也 可 能 出 现 几 个 峰 。 如 肽 链 中 有 一 个 甲 硫 氨 酸 被 氧化 或 某 一 个 氨基 酸 残 基 的 构象 发 生 改 变 ,在 鉴别 时 就 会 出 现 不 同 的 峰 。 离 子 交 换 层 析 虽 然 灵 敏 度 高 ,但 损失 也 大 ， 回 收 率 常 在 70 % 以 下 。 另 外 用 于 离子 交换 层 析 的 试剂 要 求 较 高 ,如 用 于 配制 阴离子 交换 缓冲 液 的 吡啶 ,使 用 前 须 经 严格 处 理 (在 草 三 酮 中 迎 流 再 蒸馏 )。 (=) 实验 方法 1. 离子 交换 剂 的 选择 与 处 理 选择 交换 剂 时 必须 考虑 如 下 几 种 因素 : (1) 被 分 离 物质 (蛋白 质 或 多 肽 ) 带 何 种 电荷 。 (2) 被 分 离 物 质 分 子 的 大 小 。 (3) 被 分 离 物 所 处 的 环境 ， 如 是 否 共存 有 其 它 离子 ， 这 些 离子 为 何 种 电 性 、 数 量 多 少 等 。 (4) 被 分 离 物 的 物理 化 学 性 质 ， 如 是 否 耐酸 、 碱 以 及 溶解 度 等 。 (5) 被 分 离 物 的 大 概 数量 。 一 般 碱 性 肽 (或 蛋白 质 ) 用 阳离子 交换 剂 ， 酸 性 肽 (或 蛋白 质 ) 用 阴离子 交换 剂 。 离 子 交换 剂 一 般 都 含有 色素 和 细 颗 粒 ,使 用 前 必须 进行 浮 选 、 洗 涤 等 处 理 20。 其 方法 是 : 将 新 的 交换 剂 用 水 浸透 使 之 充分 吸水 膨胀 ， 减 压 除 气 ， 然 后 对 一 些 不 溶 于 水 的 杂质 分 别 用 酸 (HCl, HM), HR (NaOH) 处 理 除 去 ， 最 后 用 去 离子 水 洗 到 中 性 备用 。 *。， 80 。 2. 选 柱 与 装 柱 适用 于 纯化 肽 的 离子 交换 柱 与 洗 脱 沪 的 特点 见 下 表 (5-12)22。 % 5-12 ve 脱 体 R Cal) pH3.1 pH5.0 一 一- 一 | 一 -| 一 -| 一 一- | 一 -一 一 55X0.1 90 1 200 ; 200 酶 解 物 的 量 (mg) 应 用 体积 〈ml) 98X0.9 200 2 500 500 上 述 只 是 参考 数据 ， 实 际 使 用 时 应 根据 样品 和 交换 剂 等 不 同 特性 具体 选 定 。 如 需 分 离 的 驮 女性 质 相 似 , 柱 越 细 长 就 越 能 清晰 分 离 ,但 流速 不 宜 过 快 。 交 换 剂 粒度 ( 目 ) 越 小 ， 其 表 面积 就 越 大 ,也 更 容易 和 样品 交换 吸着 。 若 样品 组 分 并 不 复杂 ， 采 用 粗 短 柱 也 是 可 以 的 。 层 析 柱 最 好 有 夹 套 , 以 便 控 制 交换 反应 的 温度 。 交 换 剂 装 柱 时 ， 层 析 柱 应 保持 垂直 。 将 经 过 处 理 转 型 或 再 生 好 的 交换 剂 放 人 烧杯 ,加 少量 水 , 边 搅拌 边 倒 人 柱 管 中 ， 务 使 树脂 缓慢 沉降 。 注 意 ， 交 换 剂 在 柱 内 必须 分 布 均匀 ,严防 有 节 或 气泡 产生 ， 否则 将 严重 影响 交换 性 能 。 所 谓 节 ”" 是 指 交换 剂 在 柱 内 有 明显 的 分 界线 ， 这 是 由 于 装 柱 时 树脂 沉 降 不 均匀 ,使 树脂 在 柱 内 排列 松紧 不 一 引起 的 。 气 钨 则 是 由 于 交换 剂 未 被 溶液 完全 包 右 而 与 空气 接 触 所 造成 的 。 防 止 节 与 气泡 产生 的 方法 是 装 柱 时 在 柱 内 先 保持 一 定 高 度 的 水 分 〈 一 般 为 柱 长 的 1/3), 加 和 交换 剂 时 使 它 借 水 的 重力 而 慢 慢 帝 降 。 如 果 保 持 交换 剂 面 上 水 的 高 度 不 变 《〈 可 用 排泄 口 放水 的 办 法 来 控制 儿 见 图 5-6), 而 且 交换 剂 又 是 连续 地 缓慢 沉降 ,，“ 节 -与 气泡 就 不 会 产生 。 装 柱 完 毕 , 应 用 起 始 缓冲 液 平 衡 流出 流 的 pH， 使 其 与 起 始 缓冲 液 一 致 为 止 (一般 需 一 车 夜 以 上 )。 图 5-6 ”离子 交换 层 析 装置 _3. 上 样 柱 经 平衡 后 即 可 上 样 ,一 定量 的 肽 混合 物 (4 一 6mg) 溶 于 一 定量 (0.1ml) HRA 冲 彼 中 ,用 少量 水 〈0.lml) ee, AREA. ER, 进 样 前 样品 疲 必 须 离 心 ， 去 除 不 深 物 。 4. 洗 脱 通常 有 三 种 方法 : (1) 增加 缓冲 液 离 子 强 度 ; e (81 <= (2) 改变 pH: 用 阴离子 交换 剂 时 ， 降 低 洗 脱 液 的 pH; 用 阳离子 交换 剂 时 , Wt PERLIKAY pH; (3) ARB aks pH; 有 两 种 洗 脱 方式 : (1) 梯度 洗 脱 :， 即 缓冲 液 的 离子 强度 和 pH 改变 是 逐步 的 、 连 续 的 , 图 5-7 是 线性 梯度 洗 脱 的 简单 装置 。 大 致 要 求 是 : @ 洗 脱 总 体积 一 般 要 比 床 体积 大 几 十 倍 ， 才 能 使 各 峰 分 开 ;@@ 梯 度 的 上 限 要 求 足够 高 ,使 吸附 最 紧密 的 物质 能 被 洗 脱 下 来 ; 加 梯度 的 斜 度 要 足够 平缓 ,以 使 各 峰 分 开 ， 但 又 要 有 一 定 的 陡 度 ,以 免 峰 形 过 宽 和 拖 尾 ; 四 梯度 不 要 升 得 KR (2) BRBLYEB: ROFULA RAR IUEBIRE ROMER RSE A BEB GLA SEREDBL ELBE (40°C) ,控制 一 定 的 流速 (6ml/h) , 隔 一 定时 间 (10 分 钟 ) 收 集 一 定量 的 流 分 (1.0ml)s 浓度 (mol/L) (C1) 2 0.2 0.4 0.6 0-8 1.0 流出 体积 比 〈V ) 图 5-7 ”梯度 洗 脱 示意 图 图 5-8 梯度 浓度 曲线 5. 肽 的 监测 此 步 与 凝 胶 过 油层 析 相 同 。 图 5-9 是 > 晶状体 蛋白 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 的 分 离 图 思 。 6. 柱 的 再 生 、 BRAT REM pH 变化 会 使 柱 体 积 改 变 ， 故 使 用 一 次 后 ， 需 再 生 处 理 方 可 使 用 。 7. 微量 柱 的 利用 ”在 六 十 年 代 ， 离 子 交 换 层 析 都 采用 直径 1 一 2em、 长 100cm 左右 的 大 柱 。 在 大 柱 上 用 聚 苯 乙烯 树脂 分 离 肽 常常 损失 很 大 ， 主 要 是 非特 异性 吸附 造成 的 。 后 来 随 着 离子 交换 树脂 质量 的 改进 ,利用 只 装 有 少量 离子 交换 树脂 的 微量 柱 , 虽然 不 能 完全 排除 ， 但 能 提高 回收 率 。 1977 年 Wittanann-Liebold 和 Marziningug 首先 利用 微量 柱 〈0.3 X 10cm) 分 离 核 糖 体 蛋白 La 的 胰 蛋 白 酶 裂解 肽 (填料 是 Dowex M71， 柱 温 55%C， 用 吡啶 -甲酸 梯度 洗 ‘i 2 脱 ， 样 品 用 量 50—100nmole,30ml 洗 脱 缓冲 液 ) 获 得 良好 效果 s 此 后 Chen(1977)Pa 利 用 一 种 更 小 的 柱 〈0.25 x 10cm) 分 离 核糖 休 蛋 白 $% 的 膜 蛋白 酶 裂解 肽 ， 也 获得 良好 效 果 。 现 在 采用 微量 柱 分 离 捧 段 已 越 来 越 普遍 了 。 50 100 150: (206°. “250 300 350 400 Ti 72 7314 TS Té 管 号 〈 每 管 2m1l) 图 5-9 用 Bio-Rad Aminex 50WX2 #:(90X0.9(cm),40C 洗 脱 ) 分 离 ”晶状体 蛋白 的 胰 蛋 白 酶 裂解 肽 PK ei: 从 0.2mol/1 吡啶 /乙酸 缓冲 液 pH3.1 到 2mol/1 吡啶 /乙酸 缓冲 液 pH5.0， OD. KARE TAR (一 ) 基本 原理 和 一 般 情况 介绍 利用 一 向 电泳 和 另 一 向 层 析 分 离 纯化 多 肽 ， 是 一 种 快速 而 灵敏 的 方法 ， 也 很 容易 操 作 。 1956 年 Ingram ”报道 了 用 滤纸 双向 电泳 层 析 作 指 纹 图 谱 , 以 鉴定 和 比较 不 同 来 源 的 蛋白质 有 裂解 后 的 肽 眉 。 这 虽 是 较 老 的 方法 ,但 由 于 纸 层 析 比 较 容 易 掌 握 , 也 比 薄 层 便宜 ， 再 加 上 分 离 的 样品 量 较 多 等 优点 ， 因 此 目前 仍 有 人 使 用 。 缺 点 主要 是 灵敏 度 差 ， 回 收 率 低 。 后 来 有 人 用 纤维 素 薄 膜 双 向 电泳 层 析 分 离 肽 ,结合 荧光 试剂 显 色 ,使 这 个 方法 的 灵敏 度 大 大 提高 ,只 需 几 个 毫 微 摩尔 就 可 分 离 检 出 ,可 用 于 分 析 和 测定 其 氨基 酸 顺 序 。 图 5-10 是 用 微 晶 纤 维 素 薄膜 分 离 的 肽 图 ， 有 五 十 多 个 组 分 基本 上 一 次 分 开 29。1980 年 Fishbein 等 “又 介绍 了 用 硅胶 G 薄膜 做 肽 的 双向 电泳 层 析 指纹 图 谱 。 这 一 方法 更 有 它 的 独特 优 点 ,从 膜 上 刮 下 肽 的 斑点 不 必 洗 脱 ,直接 用 酸 水 解 就 可 以 分 析 其 氨基 酸 组 成 。 另 外 薄膜 上 的 肽 能 定量 洗 脱 , 宜 做 顺序 分 析 。 不 管 是 硅胶 薄膜 ,还 是 纤维 素 薄 膜 ,或 是 聚 酰胺 薄膜 ,都 是 将 作为 固定 相 的 支持 剂 ( 硅 膀 或 纤维 素 等 ) 涂 于 支持 板 上 ,而 进行 的 一 种 层 析 电 泳 技 术 。 支 持 板 通常 是 玻璃 板 或 其 它 塑料 制品 等 。 分 离 的 原理 与 其 对 应 的 柱 层 析 原 理 相 同 。 即 ,如 果 支 持 剂 是 吸附 剂 , 层 析 时 的 主要 依据 是 吸附 力 不 同 ,应 属 吸附 层 析 , 又 因此 种 吸附 层 析 是 在 薄板 上 进行 ， 故 称 为 薄 层 吸 附 层 析 ; 如 果 支 持 剂 是 纤维 素 ( 或 微 晶 纤维 素 )， 其 层 析 的 主要 依据 是 分 配 系数 的 不 同 ,相应 称 为 薄 层 分 配 层 析 ; 同 样 , 如 薄板 上 涂 以 离子 交换 剂 , 分 离 作 用 的 主要 依据 为 离子 交换 , 称 为 薄 层 离子 交换 层 析 。 薄 膜 电泳 的 基本 原理 同 纸 上 电 泳 。 对 于 任 一 物质 的 质点 ， 由 于 其 本 身 的 解 离 作用 或 由 于 表面 吸附 其 它 带 电 质 粒 , 在 电场 作用 下 ,将 向 着 与 其 电 性 相 反 的 电极 泳 动 , 即 称 为 电泳 。 因 为 多 肽 链 分 子 具 有 许多 可 解 离 的 酸性 基 团 和 碱 性 基 团 ,在 一 定 的 pH 条 件 下 ,会 解 离 而 带 不 同 电荷 ,带电 的 性 质 和 多 少 决定 于 肽 链 的 性 质 \ 深 液 的 e 83 。 图 5-10 Asp-tRNA 合成 酶 的 计 蛋 白 酶 酶 解 图 谱 E, ok: (pH4.4) 紫 啶 :醋酸 : 丙 羡 :水 = 50:100:37521875 (V/V), C, 层 析 : MEMES TR 酸 : 水 三 40:60:12:48〈(V/VD) 引 自 BIRR, CHR.: Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, p.189 (1980), pH AAT IRE. AEB BAT, TARR ERK R SRA aS Se 性 相反 的 电极 泳 动 。 泳 动 的 速度 与 本 身 所 带 的 电荷 量 、 分 子 的 大 小 及 形状 有 关 。 用 薄膜 5-11 薄 层 平板 电泳 模 代替 滤纸 作 支持 物 ， 不 仅 省 时 ,分 离 效 果 好 ， 回 收 率 高 ， 而 且 容易 操作 ， 无 需 大 的 装置 。 图 5-11 是 薄 层 平板 电泳 神 。 es $4. (=) 实验 方法 lL. 微 晶 纤 维 素 薄 膜 双 向 电泳 层 析 法 主要 材料 : 微 晶 纤维 素 膜 MNC300 或 MNP300 黄岩 人 民 化 工厂 产品 ;- BR Macherey Nagel, Diiren Polygram Cel300 或 40020 X 20cm， 厚 0.1mmo 平板 电泳 槽 和 电泳 仪 。 电泳 缓冲 液 ， pH4.4 吡啶 : 酷 酸 :丙酮 :水 一 50: 100:375:1875(V/V). pH6.4. Mite: BA BB: 7k = 100:4:900(V/V); 层 析 溶 剂 (PBEM): 吡 啶 : 正 丁 醇 : 酷 酸 : 水 一 40:60:12:48 (V/V) 层 析 和 拭 、\ 荧 光 胺 、\ 茄 三 酮 等 。 方法 : C1) 电泳 与 层 析 第 一 向 电泳 : 经 酶 解 或 化 学 裂解 后 冷冻 干燥 的 多 肽 混合 物 300ug (4 30nmol) ET Sul 水 (如 水 不 溶 , 可 先 加 一 小 滴 甲 酸 ,然后 加 水 溶解 ;3 如 加 酸 不 溶 可 先 加 稀 氨 水, 再 加 水 溶解 )o 离心 ， 取 上 清 液 5 一 10ml 用 毛细 管 点 样 于 膜 的 一 角 距 膜 二 边 3 X 3cm 的 交点 处 〈 靠 阳极 一 边 ) 或 6 X 3cm 交点 处 (酸性 肽 )。 点 样 前 , 先 用 电泳 缓冲 液 均 匀 浸 湿 膜 ,再 用 吸 水 纸 吸 干 。 在 电泳 槽 内 预 电 泳 5 分 钟 。 可 选用 pH4.4 缓冲 波 ,400V，15 一 20mA HAF (进口 膜 电流 12 一 16mA)。 若 发 现 电 流 太 大 , 则 需 将 膜 再 用 滤纸 吸 干 些 , ABRAM AF 要 小 ,电泳 时 间 约 2 一 2.5 小 时 ;或 pH6.4 400V,5 一 12mA ,电泳 时 间 约 1 一 1.5 小 时 。 电 泳 槽 需 通 水 冷却 ,电泳 后 室温 干燥 1 小时， 第 二 向 层 析 : 取 王 燥 后 的 薄膜 与 电泳 垂直 方向 , 用 PBEW 溶剂 进行 层 析 ,直到 层 析 溶剂 展 行 到 膜 的 顶端 为 止 , 大 约 需 6 一 8 小 时 (20%c 左右 ), 取 出 后 , 室温 干燥 2 NA, AR 光 胺 (方法 见 后 ) 显 色 ,在 366nm RIT FRRA RK MAA PF RAM 0.5 一 1 多 曹 三 酮 盗 液 ,在 黑暗 中 放置 1 一 2 天 ,可 见 到 荧光 胺 不 显 色 的 阳 点 ,将 其 刮 下 , Bet 1 一 3 多 曹 三 酮 溶液 ,以 显示 曹 三 酮 显 色 较 弱 的 斑点 。 【《2) 薄膜 上 肽 的 显 色 @ 3% 草 三 酮 溶液 : 3g HSA 100ml 三 甲 基 吡 啶 :醋酸 :乙醇 一 30:100:870 (V/V) 混合 溶剂 中 。 0.5% 草 三 酮 溶液 : 将 上 述 3% 溶液 用 乙醇 稀释 。 @ 菊 光 胺 显 色 : 5% 吡啶 或 3% 三 乙 胺 的 丙酮 溶液 ， FRA, BBE 0.01 一 0.005% 荧光 胺 丙酮 溶液 。 为 了 减少 N 端 氨基 酸 的 损失 , 测 顺序 宜 选用 0.001 % 荧光 胺 溶液 显 色 。 | ) @ MARTA: WR A, 0.02% JER CBA (20mg/ 100ml 乙醇 )。 深 液 B:10% 氢 氧 化 钠 于 60 % 乙醇 溶液 中 。 TASK: 将 A 与 B 按 1:1 CAMA MFR EL. SEF 20 分 钟 ,在 254nm 紫 外 灯 下 SHARK ER EARAS @ 酷 氨 酸 显 色 : 先 喷 0.1 % c- 亚 硝 基 8- 蘑 酚 乙 醇 溶液 ,室温 干燥 后 ， 再 师 10 % Be 酸 水 溶液 ， 于 100%c 烘 3 分 钟 ， 含 酪 氨 酸 肽 显 红色 斑点 ， 底 为 黄色 。 © 色 氨 酸 显 色 : M1S 新 配 的 对 二 甲 基 氮 基 葵 甲醛 丙酮 溶液 (1g 对 二 甲 基 氨 基 茶 . 85 甲醛 深 于 90ml 丙酮 二 10ml 浓 盐 酸 ), 含 色 氨 酸 肽 显 红色 斑点 。 (3) 薄膜 上 肤 的 洗 脱 | YEE te Se BEALE GHA lml SSRN, BORPEVEBL: 洗 脱 液 :21 xi200， 50% 醋酸 , 2 X 200ml 20 儿 吡啶 或 2 X 200ul 0.07% SAH, 加 入 后 用 旋涡 混合 器 将 其 搅 名 ， 再 在 混合 器 上 振 摇 15 分 钟 。10,000 转 / 分 ,离心 5 分 钟 , 取 上 清 液 真 空 干燥 ， 供 测 顺序 用 。 欲 分 析 肽 的 氨基 酸 组 成 可 用 2 X 501 5.7mol/IHCl 洗 脱 。 2. 硅 胶 G 薄膜 双向 电泳 层 析 法 主要 材料 : 层 析 溶剂 : =A Pb: AAR (34 2): CH=2:1:2(V/V)o Hk (pH6.5) :吡啶 : 酷 酸 :水 一 100:32: 897(V/V)o 硅胶 G 384 (250um E. Merck Silica 20 X 20cm, Analtech) HAIR KE Ke 其 它 材料 同 纤维 素 薄 膜 法 。 方法 : (1) 层 析 与 电泳 : 第 一 向 先 层 析 ， 样品 溶解 与 纤维 素 薄膜 法 相同 ， 约 点 样品 hg 5nmol。 样 品 点 直径 应 不 大 于 Imm, Etat 60° 干燥 2 小 时 ， 再 以 与 层 析 垂 直方 向 进 行 电泳 ,电压 900V, 100 分 钟 , 电泳 完毕 ，60%c 干燥 2 小 时 后 显 色 。 (2) 显 色 同 纤 维 素 薄膜 法 。 (3) 硅胶 膜 上 肽 的 洗 脱 。 硅胶 膜 上 肽 斑点 刮 下 后 放 在 1ml 塑料 管内 ， 用 N-GZ WG WK: TE FW OBB: 2k = 42125 (V/V) RABE (34%) TERR: K=4:1:5 (V/V) 混合 物 按 纤维 素 薄 膜 上 肽 的 洗 脱 方法 洗 脱 。 五 、SDS TIRE 随 着 生物 学 研究 的 深信, 微量 顺序 分 析 技 术 愈 来 愈 受 到 研究 者 的 注意 。 近 年 来 SDS 凝 胶 电 泳 分 离 技术 已 引起 人 们 的 重视 吧 。 这 个 技术 过 去 通常 用 于 鉴定 蛋白 质 或 多 肽 的 纯 度 , 今 天 人 们 已 开始 直接 用 于 顺序 测定 。 如 新 近 问 世 的 气相 顺序 仪 就 可 采用 由 SDS 凝 胶 电泳 技术 分 离 纯 化 的 肽 妇 直 接 测定 顺序 20。Knight, E 等 人 只 用 了 20 一 500pmol( 约 0.4 一 27pg) 人 干扰 素 , 测 定 了 N 端 13 一 20 RIF, 而 这 个 干扰 素 正 是 SDS 凝 胶 电泳 直接 分 离 纯化 得 到 的 只 ”。 SDS 凝 胶 电泳 之 所 以 有 效 ， 是 由 于 它 有 很 高 的 分 辩 能 力 。O'Farrell 2” 曾 用 一 维 等 电 聚焦 ， 另 一 维 SDS BEB HERI MA BADE SAH a 1100 不 同 组 分 的 蛋白 质 。 最 近 人 们 用 铜 - 银 染 色 剂 叶 鉴 测 SDS 凝 胶 电泳 的 分 离 结 果 不 仅 避 免 了 消耗 ， 提 高 了 回收 率 ， 而 且 灵 敏 度 比 常 规 的 考 马 斯 蓝 染 色 剂 高 出 一 百倍 。 这 个 结果 完全 可 与 C*- 甲 基 化 蛋白 放 射 自 显 影 相 比 。 AMS Kei A SDS 凝 胶 电泳 分 离 后 , 可 用 电泳 洗 脱 ， 其 回收 率 高 达 90% 以 上 。 但 是 在 操作 时 一 定 要 格外 小 心 ， 各 种 试剂 、 器 严 要 尽 可 能 纯 睁 ,以 避免 可 能 产生 的 ARTs Bo ss 86 。 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] (11) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20]. [21] [22] [23] [24] [25] [26] . [27] [28] S$ + xX Walsh, K. A.: Advances in Protein Sequencing, Annu. Re. Biochem., 50, 261—284(1981). Atassi, M. Z., Habeeb, A. F. S. A.: Methods Enzymol., 25, 546—553, Academic Press New York-London (1972). KL [2], p-616—623, Croft, L. R.: Handbook of Protein Sequence Analysis, p. 31(1980). Determann, H.: Principles of Gel Chromatography. Advances in Chromatography V8 Giddings, J. C. and Keller, R. A. (Eds) (1969). L BBW: 凝 胶 层 析 法 及 其 应 用 ， 科 学 出 版 社 1975). “Gel Filtration: Theory and Practice’, Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175，S-75104 Uppsalal, Swe- den. Fischer, L.: Gel Filtration Chromatography in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, p. 36, Elsevier, Amsterdam (1980). Bhown, A. S., Mole, J. E. and Bennett, J. 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Biochem., 98, 321—237(1979). e 88 @ Ane AmASRREHME 一 、N 末端 测定 (一 ) FDNB 分 析 法 1. 基 本 原理 2,4- 二 硝 基 氟 葵 法 简称 FDNB 法 ， 是 测定 蛋白 质 的 N 末端 氨基 酸 残 基 的 一 种 有 效 方法 。 此 法 由 Sanger 于 1945 年 首先 提出 。 他 发 现 FDNB 试剂 能 在 温和 条 件 下 (pH8 一 9, 室 温 ) 与 蛋白 质 或 多 肽 的 自由 cx- 氨基 定量 地 发 生 反 应 ， 生 成 黄色 的 2,4- 二 硝 基 4 (DNP) 衍生 物 , Bl DNP- 和 蛋白 。 由 于 FONB 与 氨基 生成 的 键 对 酸 水 解 的 稳定 性 大 大 高 于 肽 键 数 ， 经 5.7N HCI 水 解 处 理 后 ， 除 六 末 端 氨基 酸 为 黄色 DNP- 氮 基 酸 衍生 物 外 ,其 余 均 为 游离 氨基 酸 ,鉴别 所 生成 的 DNP- 氮 基 酸 , 便 可 以 知道 蛋白 质 或 多 肽 的 N 未 端 残 基 。 虽 然 FDNB 也 能 与 蛋白 质 中 侧 链 的 s- 氨 基 \ 酚 羟基 、 味 唑 基 、 代 基 等 作用 ”, 但 所 生成 的 侧 链 取 代 DNP 衍生 物 在 用 乙酸 乙 酯 萃取 时 与 游离 氨基 酸 共 存 于 水 相 ， 从 而 易 于 与 xc- 氨 基 DNP 衍生 物 相 区 别 。 用 纸 层 析 、 薄 层 层 析 等 方法 亦 容 易 鉴 别 。 用 高 压 液 。 相 色谱 或 用 溶 被 洗 脱 各 个 DNP- 氮 基 酸 层 析 斑点 (或 区 带 ) 然 后 在 波长 360nm 下 作 比 色 测定 ,可 计算 出 该 蛋白 质 分 子 所 含 的 N 末 端 氨基 酸 残 基数 ， 进 而 推 知 它 由 几 条 肽 链 组 成 。 DNP- 氮 基 酸 见 光 易 分 解 , 所 以 整个 操作 应 在 暗中 进行 。 FDNB 与 蛋白 质 的 反应 如 下 : on-( \- + H,N—CH—CO—NH—CH—CO—NH.---CO—NH—CH—COOH | | | R， R, . R, NO, FDNB_ ae BARC KRAZE) | 1 o.n—¢ 》-Nacn-ooNarom-co aati CO-|-NHCH—COOH + HF 23 | | 1 | R, Y R, v mse Ge R, NO, HY 7K it 105°C o.n—¢ 》-sa-cacooa 十 和 se R, | Run) DNP- 氮 基 酸 (黄色 ) 氨基 酸 反应 是 在 弱 碱 性 介质 中 进行 ， pH 超过 9 时 FDNB 可 分 解 成 二 硝 基 茶 酚 (DNP- OH)。 在 所 采用 实验 条 件 下 ,;FDNB 能 定量 地 和 蛋白 质 反 应 , 不 会 产生 肽 键 的 次 级 裂解 ， 因此 所 测 N 末端 比较 可 靠 。 如 果 没 有 检 出 DNP- 氮 基 酸 ， 那 末 可 能 是 下 列 几 种 原因 : e 89 。 oe 质 ( 肽 或 氨基 酸 ) @ 被 分 析 的 对 象 N 未 端 是 封闭 的 ,如 焦 谷 氨 酸 ;@ N 末 端 基 被 酰 化 ; @ 末端 残 基 很 可 能 是 Val, Ie, 由 于 Val 或 Ile 所 形成 的 肽 键 对 酸 水 解 较 有 耐 受 性 ,从 而 经 酸 水 解 后 不 产生 游离 的 DNP- 氨 基 酸 ， 而 生成 DNP 小 肽 ; @ N 末端 为 Pre BR Gly, A] DNP-Pro, DNP-Gly 对 酸 稳定 性 差 , 酸 水 解 时 易 遭 受 破坏 。 在 上 述 原因 中 ,属于 @@ 的 情况 可 通过 延 长 水 解 时 间 (48 一 72 小 时 ) 来 解决 ,属于 @@ 的 情况 则 要 缩短 水 解 时 间 。 2. 实验 方法 试剂 和 材料 : FDNB( 必 要 时 须 减 压 蒸 馅 纯化 ),5.7N LRABRER, RRS, CB 实验 分 以 下 四 步 : 第 一 步 : 蛋白 质 或 多 肽 的 二 硝 基 葵 化 称 取 10 一 50mg 蛋白 质 (样品 多 少 视 分 子 量 和 检 出 手段 的 灵敏 度 ), 加 .0.5 一 1.0ml10 驳 NaHCO, 溶液 ,搅拌 溶解 ,此 时 该 蛋白 溶液 应 在 pH8.5 一 9.0 左右 , 若 不 到 ,应 用 IN NaOH 调节 。 然 后 加 0.3 一 0.5ml 5% FY FDNB 咨 液 TCH), FT 37% 下 避 光 播 动 反应 4 一 72 小 时 。 注 意 在 反应 中 有 CO, 产生 ， 应 间 于 放 气 以 免 管内 溶 该 溢出 。 反应 时 间 取决 于 该 蛋白 质 的 溶解 度 和 对 FDNB 的 反应 活力 。 E 第 二 步 ， 萃取 过 剩 的 试剂 反应 物 DNP- 蛋 白 通 常 呈 黄色 沉淀 ,反应 完全 以 后 ,溶液 加 几 滴 浓 盐 酸 酸化 , 沉淀 物 © 离心 收集 ,再 分 别 用 稀 酸 水 (pH2 左右 )、 乙 醇 (或 乙醇 : ZR 1: 1V/V)% 3 一 4 次, RA - 乙醚 洗 2 一 3 次 ,每 次 用 量 3 一 5ml。 用 乙醚 洗 后 ,要 不 断 搅拌 沉淀 物 , 使 乙醚 很 快 蒸发 , 待 成 粉 状 后 方 能 置 于 干燥 器 内 干燥 ,否则 DNP- 蛋 白 会 结 成 硬块 , 不 易 完 全 水 解 。 过 剩 试剂 也 可 对 水 透析 除去 ,经 冷冻 干燥 后 保存 。 注意 : 若 DNP- 蛋 白 尤 其 是 DNP- 肽 不 能 被 乙醇 沉淀 或 通过 透析 净化 时 , 则 可 在 碱 性 pH 用 乙醚 直接 抽 提 过 量 的 FDNB， 然 后 再 干燥 。 第 三 步 ， DNP- 蛋 白 的 水 解 及 DNP- 氨 基 酸 的 抽 提 将 上 述 DNP- 和 蛋白 放 人 水 解 管内 ( 见 第 三 章 盐酸 水 解 ), 加 1.0 一 2.0ml (应 大 于 样品 体 积 80 倍 以 上 )5.7V 重 蒸 盐 酸 , 抽 和 气 或 通 氮 气 封 管 , 于 105° 水 解 22 小 时 (注意 : 因为 不 同 的 DNP- 氨 基 酸 在 酸 水 解 时 稳定 程度 不 一 样 , 因此 水 解 时 间 的 长 短 应 随 蛋 白质 及 NI 未 端 氨基 酸性 质 而 异 )。 如 在 上 述 条 件 下 水 解 ，DNP-Gly 的 回收 率 仅 达 60 一 70 匈 ,而 DNP- Pro 完全 分 解 。 一 般 3 一 4 小 时 DNP-Gly 能 释放 完全 。 若是 以 Pro 为 N 未 端 则 必须 采用 其 它 条 件 来 水 解 ,以 防 DNP-Pre 和 破坏， 一般 系 用 12NVHCI， 在 105°C 水 解 4 小 时 ， 即 能 检 出 DNP-Pro。 当 Val, Ie 等 为 N 末 端 时 ， 则 需 延长 水 解 时 间 (如 48 或 72 小 时 ) 方 可 获得 较 高 的 回收 率 。 因 此 在 测定 未 知 样品 时 ,尤其 在 做 定量 测定 时 , 需 做 不 同时 间 的 水 解 或 采用 其 它 纠 正 误差 的 方法 校正 (参见 第 三 章 氨基 酸 组 成 分 析 的 误差 校正 )。DNP- 氨基 酸 在 酸 水 解 时 的 回收 率 见 表 6-1。 水 解 完毕 小 心切 开封 管 口 ,取出 水 解 液 ,用 重 蒸 水 稀释 1 一 2 倍 ,其 中 以 少量 重 燕 水 洗 净 管 壁 ,一 并 倒 人 分 液 漏斗 内 ,溶液 用 乙醚 抽 提 三 次 (每 次 3 一 5ml HA), -合并 醚 层 。 用 少量 (2 一 3ml) 重 蒸 水 洗 乙 醚 层 ,震荡 以 彻底 萃取 残留 的 酸 。 注 意 , 这 步 以 冷水 ,少量 ,快速 操作 为 宜 , 否 则 因 DNP-Ser，DNP-The 在 水 中 有 一 定 溶解 度 将 引起 丢失 。 « 9U 。 6-1 DNP-AEREBRKBH HO 5.7NHCI, #8 BE 12NHCI, 105°C, 16 小 时 DNP- 氨 基 酸 本 时 间 ( 小 时 ) 回收 率 (92) 回收 率 (927 DNP- 丙 氨 酸 12 80 75 DNP- 精 氨 酸 12 90 75 DNP- 天 冬 氨 酸 24 oh 60 75 X-DNP-PEAwB 12 25 0 DNP-G AEE 12 75 75 DNP- Sit 8 40 50 DNP-#3 RB 4 40 50 DNP- 蜡 亮 氨 酸 12 80 75 DNP- 亮 氨 酸 12 80 75 双 -DNP- 赖 氨 酸 8 95 75 6-DNP- 赖 氨 酸 12° . 95 75 DNP- 甲 硫 氨 酸 12 75 75 DNP-# RE 12 - 70 50 DNP-fi§ 58 2 10 50 DNP-#3 ， 12 90 75 DNP- 苏 氨 酸 24 90 75 DNP- 色 氨 酸 12 90 0 双 -DNP- 栈 氨 酸 12 75 50 DNP-4Aia 12 80 75 5| BBR SBA CSR HB 112 页 科学 出 版 社 (1973)。 SGU CB. BISRRYA YEN) DNP- 氨 基 酸 。Im-DNP-His，c-DNP-His，2- N-DNP-lys, DNP-Arg, DNP-Cys, O-DNP-Tyr 等 均 留 在 水 相 中 ;不 被 乙醚 抽 提 ， 故 应 将 水 相 蒸 干 , 分 别 鉴定 。 第 四 步 : DNP- 氨 基 酸 的 鉴定 I. 双向 纸 层 析 鉴 定 预先 用 混合 的 标准 DNP- 氨 基 酸 (有 商品 ) 进 行 双向 层 析 , 得 到 标准 图 谱 。 再 以 同样 条 件 对 未 知 样品 进行 层 析 ; 根 据 Re 值 ( 见 表 6-2) 即 可 判断 该 样品 的 DNP- 未 端 氨基 酸 。 BURGE: Ze LYRA ALR (BRA HE) HI 100ml 无 水 丙酮 溶解 成 黄色 溶液 (注意 ; 如 管 壁 有 残存 物 ,应 多 加 丙酮 ， 后 再 浓缩 )。 用 毛细 管 取样 点 在 层 析 滤纸 的 一 角 上 (2 x 2cm 交点 处 ); 滤 纸 的 大 小 约 为 28 X 32。 斑点 扩散 直径 应 小 于 0.5cm 左右 ,点 样 量 应 适当 ;以 点 在 纸 上 的 瘟 点 显 深 黄色 为 宜 , 颜 色 太 浅 了 , 层 析 后 的 斑点 不 显 , 太 深 了 (如 桔 黄色 ), 层 析 时 会 产生 斑点 拖 尾 和 斑点 间 界 限 不 清 等 现象 。 假 使 在 点 样 时 发 现 黄色 晶体 很 多 , 表示 DNP- OH 过 多 。 会 影响 层 析 的 结果 ,必须 用 升华 法 去 除 。 为 获得 好 的 效果 ,应 将 滤纸 用 线 颖 成 圆 简 状 进行 上 行 层 析 ( 见 图 6-1)。 DNP- 氮 基 酸 的 层 析 溶剂 系统 很 多 , 表 6-2 列 出 的 是 其 中 的 一 部 分 。 现 以 常用 的 甲 节 体系 及 磷酸 缓冲 液 为 例 加 以 叙述 。 第 一 向 (甲苯 溶剂 体系 )， 甲 苯 : 吡 啶 : 氧 乙 醇 :0.8V 氨水 二 5:1.5:3:3(V/V)。 第 二 癌 ， 1.6mol/1 pH6.0 磷酸 盐 缓 冲 液 (138gNaH,PO,-H,0 + 71gNa,HPO, AFR ‘© Ol 。 图 6-1 Eero 蒸 水 ,稀释 至 1 Ft )o 先 将 甲苯 :吡啶 : 氧 乙 醇 按 所 需 量 ( 约 25:7.5:15ml/ 每 张 滤纸 ) 在 分 液 漏斗 内 充分 混 匀 ， 然 后 以 每 张 滤纸 0.8VNH4OH(15ml) 慢 慢 滴 人 ， 注 意 不 可 振 播 。 待 两 相 平衡 4 小 时 % 6-2 DNP- 衍 生物 之 R; 值 TT +: FB i a A % ie 成 a 二 硝 基 苯胺 0.90 0.97 0.96 1.66 0.42 一 双 -DNE- 酷 氨 酸 0.78 0.90 0.33 1.10 0 — DNP-# 0.74 0.71 0.70 1.43 1.35 0.88 DNP-#2= 3 0.73 0.70 0.70 1.43 1.35 一 双 -DNE- 赖 氨 酸 0.72 0.81 0.11 0.92 0.13 i= DNP-# 5 aE 0.71 0.70 0.55 lz29 0.60 0.74 DNP- 0.70 0.68 0.28 1.17 0.27 i DNP-4i 0.68 0.47 0.63 1.25 1.33 0.79 DNP- 甲 硫 氨 酸 0.65 0.48 0.47 0.98 1.03 一 二 硝 基 苯酚 C(DNP-OH) 0.56 0.25 0.99 1.00 1.00 一 DNP- 丙 氨 酸 0.50 0.18 0.28 0.58 1.26 0.46 DNP-/aae 0.48 0.17 0.44 0.68 1.59 一 DNP- 苏 氨 酸 0.43 0.12 0 0.38 1.80 0.36 DNP- 甘 氨 酸 0.36 0.08 0.07 0.22 0.98 0.23 DNP- 丝 氨 酸 0.32 0.06 0 0.16 1.65 0.21 DNP- 谷 氨 酸 0.14 0 0 0.09 1.90 0.04 DNP- 门 冬 氨 酸 0.12 0 0.03 2.09 0 双 -DNP- 组 氨 酸 # 0.35 0.50 0 0.21 0.15 一 DNP- 精 氨 酸 # 0.37 0 0 1.02 1.02 一 2-DNP- 赖 氨 酸 *# 0.32 0.05 0 ” 一 3 一 xc-DNP- 赖 氨 酸 *# 0.33 0 0 一 一 一 双 -DNP- 胱 氨 酸 三， 一 一 0.10 0.24 一 3-DNP- BAR 一 _ = 0.61 0.13 一 a. 在 水 溶液 部 分 。 b. Ry 以 DNP-OH 为 1.00 作 标准 ,再 求 得 各 点 之 值 。 溶剂 体系 : 甲 . ETA KA), CG. 正 丁 醇 ; 乙 酸 正 丁 酯 :196 NH,OH(1:2:3), A. 41% 醋酸 (11)? T- 正成 醇 (以 0.05mol/1 邻 葵 二 甲酸 缓冲 液 pH6.0 饱和 )， 成 1.5mol/L 硫酸 钠 内 含 0.05mol/1 BAH 甲酸 缓冲 液 pH6.0, 0. 第 三 -成 醇 《 以 邻 茉 二 甲酸 组 冲 液 饱 和 之 )。 引 自 潘 家 秀 等 < 蛋白质 化 学 研究 技术 >? 第 107 页 ?科学 出 版 社 (1973)。 后 GEN BI) 放出 下 层 氨 水 作为 平衡 用 溶剂 ， 置 层 析 缸 中 与 滤纸 一 起 平衡 过 夜 ( 约 16 小 时 ) 后 再 加 入 上层 混 合 溶剂 展 层 。 注 意 , 第 一 向 层 析 的 好 坏 往 往 取决 于 平衡 ,所 以 平 上 有 2 « +7 Fe, MU ca tah ie RE AH 层 术 后 (以 溶剂 展 层 接近 滤纸 上 项 为 准 ,一 般 需 4 一 7 小 时 ， 这 与 层 析 温 度 有 关 ) 取 出 滤纸 ， 在 赔 处 晾 干 , 除 尽 溶剂 , 拆 开 滤 纸 乡 线 , 转 90°, 并 在 前 沿 下 1 厘米 处 截 去 纸 条 ,再 颖 成 简 状 , 放 人 另 一 层 析 人 缸 中 进行 第 二 向 层 析 ( 约 40ml 1.6mol/1 fe 酸 缓冲 液 pH6:0)， 层 析 约 4 一 6 小 时 。 取 出 在 暗 “处 吹 千 ， 这 时 将 样品 的 层 析 图 谱 与 标准 DNP- 氨 基 酸 层 析 图 谱 比较 ( 见 图 6-2) 即 可 初步 确定 样品 N 末端 氨基 酸 。 注意 : 层 析 谱 上 常会 出 现 DNP-NH, 和 DNP-OH 两 个 黄色 斑点 ， 为 了 与 DNP- 氨 基 酸 区 别 ， 可 以 把 标准 DNP-NH, .和 DNP- 氮 基 栈 在 图 谱 上 的 位 置 对 照 比 较 。DNP-OH 经 盐酸 蒸 SER, 黄色 斑点 消失 ， 而 DNP- 氨 基 酸 斑点 不 受 影 响 。 上 述 溶 剂 体系 很 难 将 DNP- 谷 氨 酸 与 DNP- 天 冬 氨 酸 分 开 。 对 此 , 采用 2.5mol/] 磷酸 缓冲 液 pH6.0 或 异 成 醇 以 1 多 酮 酸 咨 液 饱 和。 二 个 展 层 系统 单 向 展 层 可 以 得 到 解决 (图 6-3)。 ll. 薄 层 双向 层 析 鉴定 用 薄 层 层 析 鉴 定 DNP- 氨 基 酸 比 纸 层 析 速 度 hh, 灵敏 度 高 ,是 继 纸 层 析 后 发 展 起 来 的 一 项 新 技 ” 衡 后 上 层 湾 剂 须 用 长 颈 漏斗 自 顶 上 小 孔 加 入 ， 加 入 时 必须 迅速 。 加 溶剂 时 算 盖 不 得 径 易 图 6-2“ 醚 溶性 DNP- 氨 基 酸 双向 纸 层 析 图 谱 1. 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 ， 2. 天 冬 酰 胺 ， 3 丝氨酸， 4. FRR, S.A. 6-PERR, 7.DNP-OH， 8. ARAM 9-HRRAR, 10.47, 11. PRAM, 12.488, 13.2ARAFRAR, 14. 葵 丙 氨 花 ，15. 赖 氨 酸 ，16 . 酷 氨 酸 ，17:DNP-NH,，。 注 . I. 甲苯 体系 ; U. 1.6mol/ 磷酸 组 冲 滚 (pH6.0) 本 ,目前 用 于 薄 层 的 材料 很 多 ,其 中 以 聚 酰胺 薄膜 和 硅胶 薄膜 为 最 普遍 A. 聚 酰胺 薄膜 双向 层 析 5 试剂 和 材料 : FRAC 5 X Sem (浙江 黄岩 人 民 化 工厂 或 进口 ) 2.5 mol 磷 酸 缓冲 液 异 友 醇 以 1 % Rae AM 图 6-3 DNP-Asp 和 DNP-Glu 分 离 图 谱 ee93 。 层 析 缸 (可 用 250m! 平底 烧杯 代 ) 层 析 溶剂 1 葵 : 冰 醋酸 一 80:20(VY/V) 层 析 溶 剂 2; 88% 甲酸 :水 一 50:50(V/V) 14 了 3 oD 15 saS8 1068.49) C7, AN OO: ore 1 Al6-4 MAH DNP-AZERRRKBR RAHA L.ARAR, 2.2AM> 3.FRAB> 1-GAM> 5.9 硫 氢 酸 ,6.DNP-OH, 7.]i§33e>, 8. DNP-NH,, 9.5 酸 ，10. 甘 氨 酸 ，11. 谷 氨 酸 ，12. 苏 氨 酸 ，13.8-DNP- 赖 氨 酸 ，14. ABS AGRE = 95:521(V/V)o 方法 : 操作 同上 ,第 一 向 为 溶剂 1， 第 二 向 分 别 为 溶剂 2.3\4( 见 图 6-5)。 据 此 可 以 鉴别 不 同 的 DNP- 氮 基 酸 。 (二 ) DNS 分 析 法 1. 基 本 原理 二 甲 氨 基 茶 磺 酰 氧 (简称 DNS-Cl) 是 一 种 荧光 试剂 ， 用 它 作 为 一 种 标记 试剂 是 由 Hardeyo 在 研究 胰 凝 乳 重 白 酶 时 个 然 发 现 的 。 这 个 试剂 能 专 一 地 与 蛋白 质 信 端的 c- 氮 基 反应 ,形成 的 衍生 物 很 稳定 在 酸 水 解 中 不 受 破坏 ,其 反应 式 如 下 : CH; CH / : N N —— R R' $0,Cl te | Soz-NHCHCO--NHCHCO --- HzNCHCO-NHCHCO--- | | Ri CH; CH; 3 R' | s > HzNCHCOOH 十 ---~ SO2—NHCHCOOH ， Ry 水 解 后 生成 的 DNS- 氮 基 酸 有 荧光 , RAE DNFB 法 高 100 倍 , 并 且 水 解 后 的 水 解 物 不 需 提 取 ， 相 应 的 DNS 氮 基 酸 可 直接 用 电泳 或 色谱 法 鉴定 。 用 薄 层 层 析 鉴定 马 只 需要 0.2 一 1nmol, 用 纸 电 泳 为 1 一 5nmol。 DNS 方法 是 目前 测量 蛋白 质 ( 或 多 肽 )N 未 端 氨基 酸 常 用 的 方法 之 一 。 2. FMF iF, Veto 试剂 和 材料 ; damsyl-Chloride:2.5mg DNS-Cl 溶 于 lml 丙酮 中 ，0.2mol/1 NaHCO; WEAR. 聚 酰胺 薄膜 5 X Sem (浙江 黄岩 人 民 化 工厂 或 F700, Schleicher 和 Schill 出 品 ) 标准 DNS- 氮 基 酸 混合 物 (0.lmg/ml) 丙酮 溶 被 层 析 槽 冰冻 干 燥 装 置 等 。 溶剂 系统 : 溶剂 1: 98% FARR: MARK = 1.5:98.5(V/V)。 溶剂 2; AL VKARRR=921°V/V) 或 甲苯 : 冰 醋 酸 一 10:1(V/V)e ea 95 。 溶剂 3 乙酸 乙 酯 :甲醇 :乙酸 一 20:1:1(V/V)。 溶剂 4: 0.05mol/1 磷酸 销 : 乙 醇 一 3:1(V/V)。 溶剂 5: 1mol/1 氢 氧 化 贸 : 乙 醇 王 1:1(V/V)。 方法 : @ SAR N 末端 氨基 酸 的 DNS 化 称 取 1 一 5amol 蛋白 质 或 多 肽 样品 放 人 一 小 试管 (内 径 0.3—0.5em, 长 3 一 5cm)。 加 10—20,l 0.2mol/1 NaHCO， 摇 动 后 真空 干燥 , 以 去 除 样品 中 的 氨 。 随 后 分 别 加 100zl 0.2mol/1 NaHCO, 和 10041 DNS-Cl ABA RK, Kee PH, 必要 时 可 用 三 乙 胺 调 pH 4 9.5 Axio Fie AMR (Parafilm) 封口 ,摇动 ,混合 于 37°C 反应 30 二 60 Sh, BBA KA BIR. @ DNS 化 蛋白 质 的 水 解 反应 毕 , 将 反应 流转 移 到 水 解 管 中 ( 水 解 处 理 见 第 三 章 盐 酸 水 解法 ), Fe ok PE KR RANK RE EPR. AM 5.7NHC, HEE 105% 水 解 16— 18 小 时 。 水 解 后 小 心切 开 管 口 , 置 于 放 有 固体 NaOH 和 P.O, 粉末 的 干燥 器 中 , BSF ie: (ULI 6-6)。 Al6-6 冰冻 干燥 装置 】 1 .真空 干燥 器 2.P:0， 粉 未 ，3， 待 干 燥 的 样品 ， 4. 氧 氧化 钠 ，5. 油 泵 。 @ DNS- 毛 基 酸 的 聚 酰胺 薄膜 层 析 法 lol 水 解 液 真 空 干燥 后 ,加 1 ACA 10 一 15md) 无 水 乙醇 溶解 ， Pe FG A PEPE 5 x 5cm 薄膜 的 一 角 上 (3 x 3mm 的 交点 处 )。 若是 双 面 膜 ， 在 反面 的 相应 处 点 上 标准 的 DNS- 氨 基 酸 混合 物 (0.21), BIE DNS- 氨 基 酸 图 谱 将 按 同 样 条 件 另 做 。 点 样 量 应 根据 样品 浓度 定 ,每 点 完 一 次 待 干燥 后 再 ARK, UR AMARA 2mm, | RUF cA 1 RR, BAH LIB GY 1—2mm 时 取出 ,用 凉 风 歇 兆 第 二 向 深 剂 后 转 90° WAH 2 中 (第 二 向 ) 展 层 ， 层 析 毕 再 取出 歇 干 。 在 紫外 灯 下 记 下 黄色 荧光 AGE, RAR 向 同 -方向 在 溶剂 3 中 展 层 , 必 要 时 再 在 溶剂 4 或 溶剂 5 中 展开 (ILE 6-7)。 Hl 3 分 离 DNS-NH,, DNS-Ala, DNS-Glu, DNS-Asp, DNS-Thr, DNS-Ser, 溶剂 4 Ow 8-DNS-Lys，c-DNS-His， DNS-Arg, * 96 。 溶剂 5 分 离 DNS-Cys, 鉴定 后 的 聚 酰胺 薄膜 用 含 lmol/l 氨 的 50% 丙酮 溶液 浸泡 (时 常 搅拌 ) 洗 脱 2 小 时 ， 干燥 后 薄膜 可 重复 使 用 ,但 下 次 使 用 时 , 层 析 方向 最 好 与 上 次 的 相同 。 DNS NH， |e 地 Ty @ lle:Val C Phe 24+3 Ala sis @DGly es @ Tyr Thr &S anc 2? Arg ES 1 Al6-7 _ DNS- 氨基酸 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 层 析 图 谱 由 于 DNS 化 后 的 蛋白 质 (或 多 肽 ) 是 在 高 温 下 酸 水 解 ， 所 以 色 氢 酸 全 部 破坏 ， 谷 氮 ， 酰胺 ， 天 冬 酰 氮 转 变 为 相应 的 酸 。lle-X (X 为 任意 氮 基 酸 )，Val-X 是 酸 水 解 的 不 敏感 键 ， 因 此 当 这 些 键 是 蛋白 质 的 N 末端 残 基 时 ， 水 解 后 在 层 析 图 谱 上 会 出 现 DNS-Val-X 或 DNS-lle-X 荧光 肽 干扰 己 , 遇 到 这 种 情况 应 延长 水 解 时 间 , 另外 在 用 聚 酰胺 薄膜 鉴定 时 杂 点 较 多 ， 如 DNS-OH 显 绿色 荧光 等 ,有 时 难以 鉴别 。 (三 ) Edman 降解 法 这 个 方法 是 Edman 于 1950 年 首先 提出 的 ， 其 最 大 优点 是 可 以 连续 降解 , 这 就 为 以 后 测 蛋白 质 顺序 ,特别 为 自动 化 仪器 问世 提供 了 理论 基础 。 在 蛋白 质 顺 序 分 析 中 , Edman 降解 法 是 迄今 最 基本 也 是 最 有 效 的 手段 ， 用 此 法 测 蛋 白质 N 末端 残 基 也 是 当前 有 效 的 方 法 之 一 ， 详 见 第 七 章 。 (四 ) DABITC 法 DABITC 法 是 近 十 年 来 发 展 起 来 的 十 分 有 用 的 方法 ,反应 原理 类 似 于 Edman 降解 反应 。 其 优点 很 多 ,操作 简便 ,设备 简单 ， 检 出 天 敏 可 靠 , 是 值得 推广 的 一 一 种 好 方法 ， 详 细 请 见 第 七 章 。 《五 ) 氨 肽 酶 法 在 蛋白 质 水解 酶 中 有 一 类 是 氮 肽 酶 ,它们 能 从 蛋白 质 或 多 肽 的 六 端 逐个 地 加 里 切 。 根 据 不 同 的 反应 时 间 测 出 酶 水 解 所 释放 的 氮 基 酸 种 类 和 数量 ， 按 反应 时 间 和 残 基 释 放量 作 动力 学 曲线 (如 图 6-8 所 示 ), 就 能 知道 该 蛋白 质 的 人 末端 残 基 排 列 顺序 。 实际 上 用 酶 法 测 N 末 端 和 末端 顺序 有 许多 困难 ,因为 水 解 酶 对 各 肽 键 敏感 性 不 同 , 反 应 又 不 能 控制 在 某 一 点 上 (图 6-8 只 是 简单 的 模式 图 ), 币 常 无 法 分 辨 哪 一 个 残 基 在 前 面 ， ee 97 。 残 基 释 放量 反应 时 间 图 6-8 氨 肽 酶 测定 扩 端 顺序 是 A 一 BE 一 … 上 所 以 不 如 一 般 化 学 方法 方便 。 氮 肽 酶 的 种 类 很 多 ,最 常用 的 是 亮 氨 酸 氨 肽 酶 (LAP) 和 和 氨 肽 酶 .M (# 6-3), KE. 一 金属 酶 ,需要 Mg** 或 Mn 离子 激活 ， 当 IN 端的 第 二 个 氨基 酸 是 且 氨 酸 残 基 时 它 不 AE 7K fe", 6-3 各 种 氨 肽 酶 及 它们 的 专 一 性 ok Be 酶 的 专 一 性 (H,NASB---) ex 源 Fe Ee KS (LAP) A=leu 时 最 快 )A 三 非 极 性 残 基 时 也 很 快 , B = Pro 猪 肾 时 A 不 能 释放 AR RARAKBCHLA) | 同上 ARF za KES M 除 一 般 氨 基 酸 外 ,也 能 水 解 Pro 及 碱 性 氨基 酸 猪 肾 FARA A:Leu>Phe>Val>Ala，A 是 极 性 氨基 酸 时 反应 低 眼球 水 晶体 (A) N 末端 氨基 受 封 闭 时 的 测定 ay os au ER AARSRKHARABMP MEP, WSN 末端 残 基 的 氮 基 被 封闭 5 这 给 化 学 结构 测定 带 来 很 多 困难 ,使 Edman 降解 试剂 失去 作用 , 因而 无 法 用 正常 的 降解 程序 进 行 蛋白 质 或 多 肽 的 顺序 测定 。I 末 端 残 基 受 封闭 的 种 类 很 多 ， 如 乙 ( 甲 ) 酰 化 思 ， 焦 谷 氨 酰 环 化 "9, 羧 甲 基 半 胱 氨 酸 残 基 (在 N 端 ) 脱 氨 形 成 有 六 个 原子 组 成 的 丙 酰 氮 环 化 "2 (图 6-9), 以 及 个 别 多 肽 (如 抗菌 的 短 杆菌 酷 肽 A) 形 成 的 环 状 分 子 (图 6-10) 等 。 其 中 最 常见 L-4.L-#% “ Fig 了 天 二 SO ee LG 1 Jere on / Sco ; 3 OZ SN7 ~CO- i< Kw O H COOH + H,N~~ 少 一 个 残 基 的 肽 键 这 是 目前 发 解 N 未 端 焦 谷 氨 酰 残 基 肽 的 最 有 用 的 办 法 。 此 酶 已 有 商品 出 售 。 @ 实验 方法 试剂 和 材料 : 焦 谷 氨 酰 氨 肤 酶 (SIGMA Chem. co 产品 )， 酷 酸 贸 , 二 硫 苏 糖 醇 ， 甲 醇 等 恒温 水 ” %?, UR-30 树脂 ,2.3 x 20mm 柱 。 方法: PRAY 0.25 umol 蛋白 质 于 一 小 试管 中 ， 加 0.5ml 0.2mol/1 醋酸 贸 缓 冲 液 (内 含 1Immol/l 二 硫 苏 糖 醇 )，pH7.2 , BEIM 100 单位 焦 谷 氨 酰 氨 肽 酶 ， 充分 混合 后 于 37° 保温 反应 24 小 RY. BBR, MAK PERMA. 冰冻 干燥 。 干 燥 物 加 10mmol/1 -甲酸 溶解 ,用 UP-30 树 虽 ( 瑞 ”类 型 ) 柱 (2.3 X 20mm) 分 离 , 先 用 2.0ml, 重 蒸 水 洗 脱 已 降解 下 来 的 吡咯 烷 酮 痊 酸 〈 即 焦 合 氨 酸 ), 随 后 用 2.0ml 0.1mol/l1 NH,OH 洗 脱 蛋白 质 。 如 打 焦 合 氨 酸 和 降解 酶 存在 对 以 后 蛋白 质 顺序 测 定 影响 不 大 , 可 不 必 分 离 。 (2) 化 学 降解 法 四 原理 除 酶 法 降解 焦 谷 氨 酰 残 基 外 ,人 们 曾 尝试 用 化 学 方法 ,但 由 于 这 样 或 那样 的 弊病 ， 未 « 99 。 能 成 功 。 最 近 我 们 在 甲醇 分 解 作 用 的 启示 下 ,用 1XV 盐酸 -甲醇 试剂 ， 在 温和 的 条 件 下 能 打开 焦 合 扫 酰 残 基 的 吡咯 烷 酮 环 , 暴 露 其 w- 氮 基 , 反 应 式 如 下 | | “甲醇 /盐酸 | 7 O7™ nN ~ CONH + 35°C 48 小 时 CON]Jwwwwm H O OCH, NH, 用 甲醇 -盐酸 反应 后 ， 使 谷 氮 酸 残 基带 上 一 个 > - 甲 基 酯 ， 暴露 的 o RM ER . Edman 试剂 偶合 , 然后 按 正 常 方法 降解 。 实验 证 明 , 用 本 方法 降解 焦 谷 氨 酰 残 基 , 操 作 简 便 , 效 率 较 高 , 开 环 产 率 达到 90%, 7K 剂 价 廉 , 来 源 也 很 方便 ,并 能 对 降解 产物 焦 谷 氮 酸 衍生 物 进 行 快速 而 准确 的 鉴别 ， 是 一 条 优 于 酶 法 降解 的 较 好 途径 "9。 @ 实验 方法 试剂 和 材料 : 优 级 纯 浓 盐酸 ,无 水 甲醇 (分 析 纯 重 蒸 处 理 )。 PITC, DABITC, TFA 等 , 均 按 顺序 分 析 要 求 处 理 。 聚 酰胺 薄膜 (浙江 黄岩 人 民 化 工厂 )。 硅胶 薄 层 板 : Art5554，Kieselgel 60, F254, E Mercko 恒温 水 洽 ， 冰 冻 干 燥 装 置 等 。 方法 : I. LVHCI- 甲 醇 的 制备 方法 1 乙酰 氯 在 惰性 气体 下 用 分 饮 柱 重 蒸 ,去 除 颜 色 , 然后 用 漏斗 加 8ml CRA 到 95ml 甲醇 中 [甲醇 用 活性 炭 (19/1) 在 40°C 搅拌 30 一 60 分 钟 后 用 Whatman 5 号 滤纸 过 滤 , 最 后 加 二 硫 苏 糖 醇 〈lmg/100nl)], 置 于 冰 浴 中 搅拌 30 一 60 分 钟 。 方法 225: 盐酸 蒸气 通 人 无 水 甲醇 液 中 , 放置 数 天 ,平衡 后 盐酸 在 甲醇 中 的 浓度 约 从 1.5N 减少 到 1.0 一 1.3N。 Tl. 吡啶 烷 酮 环 的 开 环 处 理 称 取 10 一 20nmol( 约 0.1—0.3mg) &AR+100u1 1VHCI/MeOH (1:11V/V), N，， 封口 ,混合 后 于 35° 保温 反应 48 小 时 ,真空 干燥 。 干燥 后 的 样品 可 分 别 采 用 Edman 降解 法 或 DABITC/PITC RAR MACH) 降解 。 Tl. 降解 产物 的 鉴定 A. 如 用 Edman 法 (PITC 试剂 ) 降解 则 采用 硅胶 薄 层 鉴定 : 层 析 溶剂 : ~ 氯仿 :无 水 乙醇 二 98:2(V/V)。 硅胶 板 裁 成 3 X 6(cm) 大 小 。 如 图 6-11 在 硅胶 板 底 端 0.5cm 处 划一 条 线 ,经 Edman 法 降解 后 的 PTH- 氨 基 酸 衍 生物 在 萃取 、 干 燥 后 ,加 1 C15 —20pl) 乙酸 乙 酯 溶解 , 用 毛细 管 点 样 到 硅胶 板 横 线 上 的 某 一 点 ,在 附近 同时 点 上 标准 PTH- 氨 基 酸 混合 液 , 然后 放 人 盛 有 层 析 溶 剂 缸 中 层 析 , 到 溶剂 展 层 至 离 上 端 0.5cm 时 取出 , 吹 干 , 在 254nm 紫外 灯 下 即 可 检 出 开 环 后 的 谷 氨 酸 衍 s 100° — 生物 。 鉴 定点 的 位 置 与 其 它 氮 基 酸 不 同 ， 落 在 且 氨 酸 和 亮 氨 酸 之 间 , 图 中 4 是 未 经 开 环 的 样品 ,1 是 经 过 开 环 的 样品 ,，“M" 点 是 标准 PTH- 氨 基 酸 的 混合 样品 。 B， 夭 谷 氨 酸 开 环 后 用 5.7NHCI (AZ 0.1% Sncl) 于 150°C 水 解 4 小时， 用 氨基 酸 自动 分 析 仪 即 可 鉴 移 谷 氨 酸 甲 酯 衍生 物 。 我 们 实验 室 用 的 焦 谷 氨 酸 是 由 谷 氨 酰 胺 在 酸性 条 件 下 环 化 生成 的 。 图 6-12 是 未 经 开 环 处 理 的 样品 组 分 的 分 析 图 age < og Spgs 第 二 峰 是 谷 氮 酸 在 环 化 过 程 中 由 谷 氨 酰胺 转变 成 的 图 6-13 是 经 过 开 环 处 理 的 样品 组 分 的 分 析 图 谱 。 从 图 中 《〈 即 第 二 峰 ) 可 以 看 出 , 焦 谷 氨 酸 开 环 后 形成 的 衍生 物 在 氨 基 酸 组 分 分 析 的 图 谱 中 有 自己 独立 的 峰 ， 峰 出 现 的 时 间 刚 好 介 于 葵 丙 氨 酸 (A) 和 赖 氨 酸 (后 ) 之 间 , 图 中 第 一 峰 为 谷 氨 酸 ,是 环 化 和 开 环 过 程 中 形 成 的 。 C. 焦 谷 氨 酸 残 基 开 环 后 ， 如 用 DABITC 试 ints 所 得 DABTH- 毛 基 酸 衍生 物 可 FA BR BE . nei 3 X 3(cm), 图 6-11 PTH-Pyg 在 硅胶 板 上 的 分 离 层 析 溶剂 1 33% 乙酸 。 这 里 的 Pye 是 谷 氢 酸 甲 酯 衍生 物 ( 下 同 ) 层 析 溶剂 2， 甲 葵 : 正 乙 烷 : 冰 酷 酸 一 2:1:1(V/V) 降解 后 的 萃取 物 于 爆 后 加 1 滚 无 水 己 醇 〈10 一 15ml) ,用 毛细 管 在 薄膜 的 一 角 约 3 Xx NH; 6-12 KLARA AR Be TS 3mm ZA. AT RER ORLA bid ELS CE), REA 1.2 进 * 101. Pyg NH; BNE Pyg 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 层 析 图 谱 图 6-13“ 环 化 后 经 过 开 环 的 样品 氨基 酸 分 析 图 谱 行 双向 层 析 , 层 析 毕 吹 干 。 经 盐酸 蒸气 重 后 ， 显 示 红 色 点 即 为 被 鉴定 的 产物 Pye, 蓝 色 点 D, E 为 标记 物 (图 6-14) ,鉴定 点 Pys 的 位 置 在 标记 点 D 的 右上 方 ,下 面 是 两 氨 酸 的 检 出 点 ,左边 是 甲 硫 氨 酸 的 检 出 点 (参看 第 七 章 .DABTH- 氨 基 酸 的 标准 层 析 图 谱 )。 =, © 末端 测定 C 末端 基 的 测定 比 N 末 端 基 的 测定 困难 。 目 前 可 供 选 用 的 方法 也 很 多 ， 有 化 学 法 中 的 肝 解 法 、 乙 内 酰 硫 脲 法 、C 末端 选择 性 氛 标 记 法 \ 减 数 C 未 端 测定 法 和 还 原 法 ,以 及 酶 法 中 的 羧 肽 酶 法 等 ,分 别 介绍 如 下 。 (一 ) Bie 1. 原理 WR ere 1952 年 由 Akabori 等 人 2 提出 的 ， 它 是 目前 化 学 法 测 C 末端 残 基 的 最 重 要 的 方法 。 蛋 白质 和 无 水 有 午 加 热 发 生 肝 解 反应 ， 反 应 中 除 C 末端 氨基 酸 外 其 它 所 有 所 基 酸 都 转变 为 氨基 酰 腓 化 物 , C 末端 残 基 则 以 游离 氮 基 酸 形式 存在 。 经 抽 提 后 ,用 色谱 法 可 迅速 鉴定 ,从 而 知道 该 蛋白 质 的 C 端 氨基 酸 残 基 , 反 应 式 是 : EN —CO4-NH Tao co-}-NH—CH—Co-}-NH—CH—COOH , | ¥ | v | R, Ra-1) Ra 1 H,NNH, 100% H,N—CH—CONHNH, + ...... + H,N—CH—CONHNH, + H,N—CH—COOH | | | Ri Roa-1) Ra °©102¢ BRE FORAY C 端 氨基 酸 借助 FDNB 试剂 及 分 级 抽 提 等 方法 ， 再 以 层 析 技 术 即 可 鉴 定 出 种 类 及 数目 。 H,N—CH—CONHNH, | DNFB O,N— —NH—CH—COOH Byte) eee | COOH ———> | | R。 R, NO, + O,N— VA \ — HN—CHCONHNH— VA NO, 人 | PepCNHCHRC— N=C = S ——>Pep— C -一 N 一 一 一 H | PENS R Ht ——> Pep—CO0OH + HN——|—H BVA Wn ‘ H 要 此 反应 产 率 很 不 理想 ， 不 能 降解 Pro, Asx 的 产 率 很 低 。 2. 实验 方法 主要 试剂 和 材料 : CH, =KCR, 硫 氰 酸 钠 〈 用 热 乙 醇 重 结晶 处 理 )， Sephadex-G-25 柱 .[2 x 50 (cm) ], 旋转 蒸发 器 ,冰冻 干燥 装置 ,恒温 水 浴 , 带 荧光 的 硅胶 板 等 。 方法 : 称 取 约 0.5pmol 蛋白 质 或 多 肽 样品 ， 分 别 加 乙 栈 、 乙 氟 乙 本 和 乙酸 各 0.5ml, 通 No, 搅拌 直至 溶液 由 浊 变 请。 加 入 100mg hi RRA, MAH No, FF 60% 下 保温 反应 6 小 时 ,这 时 咨 液 由 无 色 变 为 黄色 。 反 应 毕 , 在 旋转 节 发 器 上 抽 干 咨 剂 ,再 加 1 一 2ml KB PRED ,透析 脱盐 后 冷冻 干燥 。 然 后 再 加 0.5 一 Iml 12VHCI， 于 25% 下 反应 45 OHH, 反应 后 迅速 抽 去 盐酸 。 随 后 反应 物 加 2ml 50% 醋酸 溶解 ,通过 SephadexG-25 柱 [2 X 50(cm)] 分 离 。 在 260nm 收集 乙 内 栈 硫 有 部 分 , 减 压 浓缩 ,然后 用 带 荧 光 的 硅胶 薄膜 层 析 鉴 定 。 (=) C 末端 选择 性 氛 标 记 法 1966 年 Matsuo 等 om 报道 了 一 个 新 颖 而 有 效 的 方法 , 即将 所 标记 法 51 人 蛋白 质 或 多 肽 的 C 端 测定 。 两 年 后 Croft 应 用 此 法 成 功 地 测定 了 从 抗菌 紫 霉 素 中 分 离 出 的 肽 链 C 端 残 基 。 整个 反应 由 五 步 组 成 : 。104。 © SARRA KE CR ER C Ha RUS A @ 用 吡啶 在 唾 唑 酮 的 Cy 位 引起 碱 催 化 消 旋 ,这 步 反 应 是 在 TO Cim7k) PHEW ERE TS | A ERE AEA 5 图 FTA GYAN , BIE RK C FR in AER (IAN C RA ERR o- fre ELBA A in. (T); @ EAI SHR ATTA) FEE INK MB RARE; © BEB (T) 标记 的 蛋白 样品 水 解 , 氨基 酸 用 色谱 法 分 离 ， 具 有 放射 性 的 氨基 酸 便 是 要 测定 的 C 末 端 残 基 。 整个 反应 式 是 : 下 R: © NH: 一 CH co .1 NH CH CO NH.CH.COOH | rene 下 ECG NH CH 一 人 : men MaTR igs H T 二 2 7,0 水 6 ee ZET 20 PWR — REAL IRE BY alin an rit | | a NH;—CH CO 六 NH cA re) hiv ri i ' NH;CH COOH NH;CHCOOH NH;CTCOOH | 但 此 法 不 适用 于 C tn OH ARK ZS RAN I ho (四 ) 减 数 C 末端 测定 2 此 法 是 1978 年 由 Parham 和 Loudon”) 提出 的 。 其 方法 是 先 将 待 测 多 肽 样品 的 N 端 固定 到 多 和 孔 玻璃 球 上 ,然后 用 二 -p- 硝 基 苯 磷酸 酰 迭 气 化 物 (di-p-nitrophenylphosphory- lazide) 处 理 ,使 C 端 次 酸 基 团 转 为 相应 的 酰 化 物 , 随后 再 将 酰 迭 氮 化 物 热 解 成 异 氰 酸 盐 。 产物 经 酸 水 解 后 ， 使 C 未 端 残 基 破坏 。 这 样 可 通过 测量 反应 前 后 的 氨基 酸 组 成 变化 来 确 认 C 未 端 残 基 。 因 此 它 类 似 于 减 数 Edman 降解 法 ( 见 第 七 章 ); 反 应 式 如 下 : OH | i Fs EK NH“CONH CH.C=0 1 R g | Ns R 全 | NH~CONHCHC=0 =~ NH™CONHCH-N=C=0 1 R es。 105。 本 方法 仅仅 适用 于 简单 的 小 肽 ,对 样品 消耗 很 大 ， 测 一 个 C 未 端 残 基 约 损耗 90% 以 Bs : (A) BRE 方法 : 用 氢 硼 化 锂 将 C 末端 氨基 酸 还 原 成 相应 的 oc - SE LASEK, 水 解 物 中 将 含有 一 个 相当 于 原来 的 C 末端 氨基 酸 的 c- 氮 基 醇 分 子 ， 可 用 色谱 法 鉴别 。 Sanger 早年 就 是 采用 这 个 方法 鉴别 胰岛 素 A、B 链 的 C 末 端 。 (六 ) BAKE 1. 一 般 情 况 介 绍 SAU WUC 末端 残 基 的 诸 方法 中 ， 以 羧 肽 酶 法 最 有 效 , 也 最 常用 。 羧 肽 酶 是 一 类 外 肽 酶 , 它 专 一 地 从 肽 链 的 C 末 端 开始 逐个 降解 ,释放 出 游离 氨基 酸 ,反应 如 下 : 1 H,N—CH—CONH.--+---CONH—CH—CO-|-NH--CH—COOH b | 世 vetonia Ra R, Ra | sks H,N—CH—CONH:-----eCONH—CHCOOH + H,N—CH—COOH R, Ro R, 剩余 肽 链 C 端 氨基 酸 被 释放 的 氨基 酸 数目 和 种 类 随时 间 发 生变 化 。 释 放 的 氢 基 酸 可 用 自动 氨基 酸 分 析 仪 作 定 性 和 定量 测定 ,然后 根据 氮 基 酸 释 放 的 动力 学 曲线 ， 即 以 时 间 为 横 座 标 ,释放 的 氨基 酸 量 (摩尔 数 ) 为 纵 座 标 作 图 , 便 可 确定 该 肽 链 的 C 端 氨基 酸 顺 序 (如 图 6-15， 图 6-16)o 1 we oH = x = : = = 时 间 时 间 6-15 OC 末端 是 Thr 图 6-16 O 端 顺序 是 -Thr-Val-Phe 上 述 只 是 比较 理想 的 情况 ,所 以 很 容易 判别 ,但 实际 应 用 时 是 有 困难 的 ， 因 为 用 羧 肽 si C 端 顺序 时 , 存 有 二 个 缺点 : 其 一 , 当 若 和 干 个 氨基 酸 以 相近 的 速率 释 放 或 二 个 以 上 相 同 氨基 酸 相 毗 邻 时 ,结果 难以 解释 。 其 二 ,由 于 酶 解 反 应 是 连续 的 ， 因 此 实验 不 可 能 将 它 控制 在 某 一 步 上 。 如 图 6-17 所 示 , 该 肽 的 C 端 顺序 第 四 位 上 究竟 是 拔 氮 酸 还 是 苏 氨 酸 就 (RHE HATE TOM 表 6-4 ST BB Ay FS 2S Bhs A eT A i EA. EK, 以 羧 肽 酶 A(CPA) 研究 得 最 多 ， 使 用 也 最 广泛 ， 它 对 肽 链 C 端 氨基 酸 的 作用 范围 较 广 - *。 106。 j ' 7 : ( 26-5)", {224 C 端 氨基 酸 与 Pro， Arg, Lys 和 Hypro 相 毗 邻 时 释放 的 速度 变 慢 。 当 C 未 端 是 Pro、Arg、Lys、Hypro 时 不 释放 。 Bike B(CPB) 与 蛋白 质 (MAK) 作 tan 用 时 只 释放 C 端 Lys 或 Arg aia ecm, 反应 时 所 用 的 缓冲 液 、pH 值 以 及 反应 温度 正好 与 羧 肽 酶 A 相同 。 为 使 酶 解 作 用 范围 更 宽 ， 人 们 常常 将 CPA 和 CPB 混合 起 来 使 用 ， 效 果 很 好 。 二 ” 羧 肽 酶 C(CPC) 作用 范围 比 羧 肽 酶 A 更 宽 ( 表 6-6) 吧 ]。 它 与 蛋白 质 作 用 释放 C 端 Lys, Arg 或 Pro, 几乎 象 释 放 其 它 所 有 中 人 性 的 (芳香 族 、 脂 肪 族 ) 氮 基 酸 和 酸性 氨基 酸 一 HR. EMRIAM (Hypro) 和 D 型 - 氨 基 酸 没有 作用 。 当 C 端 是 连续 几 个 甘氨酸 时 “a (-Gly-Gly-Gly) 也 几乎 没有 作用 。 图 6-17 “端的 顺序 是 -(Val、Thr)-AlacThr-leu Riki Y" 具有 很 宽 的 作用 范围 和 释 放 C 末端 Pre 的 特殊 功能 ， 这 在 蛋白 质 和 多 肽 的 结构 研究 中 是 十 分 有 用 的 。 这 个 酶 与 CPA, CPB 不 同 , 它 的 活性 部 位 很 特别 ,不 含 金 属 ,但 在 活性 部 位 有 一 活泼 的 丝 氮 BO RB 表 6-4 四 种 次 肽 酶 的 性 质 及 其 降解 条 件 释放 的 残 基数 3B AKERS A fe RFK Ke Arg, Lys, Pro, 0.2mol/l N- 乙 基 吗 啉 37 35,300 (CPA) Hypro SATA Be - 酷 酸 缓冲 液 (pH8.0) BKB B 胰 he Lys, Arg 同上 37 34,300 CCPB) RKC 柑橘 叶 除 Hypro 外 的 所 有 和 氨 0:05mol/l 柠檬 酸 钠 组 30 150,000 (CPC) ZEB 冲 液 (pH5.3) RKB Y 面包 酵母 所 有 和 氨基酸 0.05mol/1 吡啶 - 酷 酸 25 6,100 (CPY) 缓冲 液 〈pH5.5) 表 6-5 ARK A 作用 蛋白 质 C 端 时 有 关 氨 基 酸 的 释放 情况 释 ik Tyr, Phe, Trp, Leu, lle, Met Thr，Gla，His，Val， 高 丝氨酸 ,，S- 甲 基 半 胱 氨 酸 释 放 人 慢 Asn, Ser, Lys, Met (SO,) 释放 很 慢 Gly, Asp, Glu CySO5H，S- 凑 甲 基 半 胱 氨 酸 不 释放 Pro，Arg，Hypro 表 6-6 ARK C 作用 蛋白 质 时 C 端 有 关 氨 基 酸 的 释放 情况 释放 很 快 Phe, Tyr, Trp, leu, Ile, Val, His 释放 较 快 Ser，Thr，Met，Ala，Asp，Asno，Glu，Gln，Lys，Arg，Pro，S- 羧 甲 基 半 胱 氨 酸 释 放 & Gly 不 释放 Hypro, D 型 氨基 酸 。107 。 肽 酶 了 在 活性 部 位 和 作用 机 理 方 面 与 胰 凝 乳 蛋 白 酶 十 分 相似 ,只 不 过 前 者 是 一 个 外 切 酶 ， 而 后 者 是 一 个 内 切 酶 商用 的 或 自己 提取 的 羧 肽 酶 中 ,常常 含有 其 它 杂 和 蛋白酶 ， 如 胰 凝 乳 蛋 白 酶 、 胰 和 蛋白酶 等 , 虽 是 很 微量 的 ， 但 会 严重 影响 羧 肽 酶 对 蛋白 质 的 C 端 氨基 酸 残 基 的 正常 降解 , 故 使 用 前 通常 需 作 适当 处 理 。 最 常见 的 处 理 试剂 是 二 异 丙 基 氟 磷 酸 (DFP) (MB. RKB 液 的 处 理 )， 能 抑制 杂 和 蛋白 酶 的 活性 。 但 需 注意 ，DFP KHATRI Y, AHEM 酶 有 抑制 作用 。 | 还 有 一 种 能 从 C HEALER ARORS, PROMIRIARES, MARDER B PR ESE II PGRIKM A REINS, (ARK AE ZK IE AA, 也 和 未 能 水 解 三 Ke | 2. Me Hy it 主要 试剂 和 材料 : PKG A、B、C、Y。 0.2mol/1 N- 己 基 ( 甲 基 ) 吗 啉 -醋酸 姐 冲 液 (pH8.0)。 二 异 丙 基 氟 磷 酸 。 异 丙 醇 ,柠檬 酸 钠 , 优 级 纯 重 蒸 盐 酸 。 自动 氨基 酸 分 析 仪 , 恒 温水 浴 , 快 速 可 调 微 量 吸 液 管 ; 带 塞 的 小 玻璃 试管 等 。 方法 : (1) 酶 液 的 处 理 和 配制 A. 羧 肽 酶 A 溶 液 的 配制 (必须 随 用 随 配 ) 吸取 1.25mg 羧 肽 酶 A 悬 浮 液 (通常 为 25m) ， 移 人 刻度 离心 管内 ， 加 lml MAK 释 , 以 2,000 转 / 分 离心 5 分 钟 ,除去 上 清 液 , 加 100m 1%NaHCO,(W/V) FR RDS UKE Al, id A 0.1V NaOH ,摇动 混合 ,直到 沉淀 物 溶解 为 止 。 然 后 用 0.1V HCl iA pH 至 8.0 左右 ,再 加 入 0.2mol/LN- 乙 基 吗 啉 - 栈 酸 缓冲 液 (pH8.0), 使 总 体积 为 1.25ml。 这 时 酶 的 浓度 为 lmg/ml, 置 酶 液 于 冰 浴 上 备用 。 注意 : 如 果 盐 酸 加 得 太 多 而 出 现 沉 演 时 应 废弃 。 B. 羧 肽 酶 B 盗 液 的 处 理 及 配制 商品 羧 肽 酶 B 溶液 常 含有 游离 氨基 酸 和 其 它 蛋 白水 解 酶 ,用 前 须 用 50 倍 过 量 的 二 蜡 丙 基 氟 磷 酸 ( 按 mol 计算 )/ 异 丙 醇 (无 水 ) 溶液 在 25%c 处 理 1 小时， 以 抑制 其 它 蛋 白水 解 酶 的 活性 ， 而 对 羧 肽 酶 本 身 的 活力 并 无 影响 。 为 了 去 除 游 离 氨 基 酸 ， 使 用 前 还 需 经 过 Sephadex G-25 EK HEHE BLATT, FA 0.01moel/1 Tris-HCl pH8.0 在 0°C 洗 脱 或 透析 。 酶 液 按 ; 原液 :0.2mol/l N- 乙 基 吗 啉 = 醋酸 缓冲 液 (pH8:0) = 1:4 配制 。 C. 羧 肽 酶 C 溶液 的 配制 25mg RAKE C YF 4.75ml 0.05mol/1l 柠檬 酸 钠 (pH5.3) 中 ， 加 入 0.25ml 新 鲜 制 备 的 DFP 水 溶液 -(lml/50ml)， 混 合 物 于 20 一 30"c 反应 30 分 钟 后 备用 。 D. 羧 肽 酶 了 溶液 的 配制 Img 羧 肽 酶 了 加 lml 重 燕 水 溶解 备用 。 (2) 测定 方法 。108。 Ss ‘ 称 取 适 量 蛋白 质 (或 多 肽 )《〈 样 品 量 应 根据 实验 吸取 次 数 和 氨基 酸 分 析 仪 分 析 灵 敏 度 确定 ), 加 酶 的 降解 缓冲 液 ( 表 6-4) 深 解 ,使 溶液 浓度 为 0.2 一 0.5 匈 ， 按 1/20 一 1/200 MLE MARR ma LETRA, RAEN RRM RK 6-4) 保 温 反应 , 并 按 一 定 时 间 间 隔 如 0 分 ,2 分 ;4 分 ;8 分 ;15 分 ,30 分 或 1 小 时 , 2 小 时 ,4 小 时 等 分 别 用 快速 微量 吸 该 管 定 量 吸取 一 份 酶 解 液 (注意 吸取 量 应 满足 氨基 酸 分 § 析 仪 分 析 用 量 ) 放 于 小 型 离心 管 中 , 用 NHC eS 液 酸化 至 PH2 左右 (注意 ,为 使 酶 作用 立即 停止 ， 8s 酸化 的 盐酸 用 量 最 好 预先 确定 ， 先 加 在 离心 管 § .内 ) ,再 加 热 5 分 钟 ,使 羧 肽 酶 彻底 失 活 , 然 后 离心 时 除去 沉淀 ,上 清 液 便 可 进行 氨基 酸 分 析 , 若 不 能 马 = 上 分 析 , 需 将 上 清 液 冷 冻 干 燥 后 ,于 0-4 保存 。 KK 最 后 根据 所 测 得 的 各 个 氨基 酸 的 量 (mol) 与 有 时 间 的 关系 作 图 (如 图 6-20), 就 可 以 推 知 该 蛋白 4 站 全 质 (或 多 肽 ) 的 C 端 氨基 酸 的 排列 次 序 。 并 《3) 内 标 法 校正 误差 1. Tyr, 2. Phe, 3. Asp, 4. Val, 5. Met, 在 测定 蛋白 质 和 多 肽 C 端 氨基 酸 顺 序 时 ， 由 引 自 工 .R。CRoft,: Handbook of Protein 于 操作 上 或 其 它 原因 ， 常 常会 遇 到 各 个 氨基 酸 的 “909 je oa ee ieee 实际 释放 量 与 测量 值 偏离 ， 所 以 为 了 精确 测量 在 给 定时 间 内 所 释放 的 每 个 氨基 酸 摩尔 量 ， 通 常用 内 标 法 来 校正 。 方 法 是 : 在 酶 与 底 物 作 用 混合 物 中 加 入 一 定 摩尔 数 的 已 知 非 蛋白 质 氨 基 酸 (通常 用 正 亮 氨 酸 ) 作 为 内 标 。 以 后 在 每 次 测定 所 释放 的 未 知 氨基 酸 值 时 ,都 要 与 内 标 物 测量 值 相 比较 , 并 按 下 列 公 式 进行 计算 RIE: Pit Rene 二 ae x FEB SIEM ane TD sam te (4) 示例 I. 1971 年 Croft?) 3 AAR A BER *- 晶 状 体 蛋 折 , 测 得 C 末 端 顺序 为 一 Val 一 Met 一 Asp—Phe—Tyr—COOH (图 6-18). Il. FARRAR YS) 于 25°C 0.1mol/| 吡啶 - 酷 酸 缓冲 液 。 pH5 .5 —Met——T yr——Gl y ——Pro——Asp—Ala——Met——Phe—_Ser —G y 3 分 钟 0 0 0 0 0 0.16 0.56 0.64 0.65 0.74 15 4} 4h 0 0 0 oO 0 0.58 0.71 0.91 0.79 0.91 120 分 钟 0 0.05) aD 8 0 0.67 1.00 0.80 0.66 0.94 | 10 小 时 0 0.58 0 0.73 0.62 0.86 1.54 1.12 1.03 1.42 表 中 数值 是 氨基 酸 释 放 值 (nmol/mg HA) 本 [1] Sanger, F.: The Free Amino Groups of Insulin, Biochem. J., 39, 507(1945). [ 2 ] Fraenkel, C. 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D, Method of Biochemical Analysis, Vol. 11, p. 359 (1955). : SCR ”手工 微量 顺序 测定 技术 蛋白 质 多 肽 链 降解 后 所 生成 的 片段 肽 ,一 旦 经 分 离 纯 化 ,就 可 以 进行 肽 的 氨基 酸 顺 序 测定 。 但 这 里 所 指 的 都 是 从 N 端 进行 的 顺序 测定 ,因为 从 C 端 测 顺序 的 方法 尚 不 成 熟 。 从 N 端 测 顺 序 的 方法 很 多 ， 其 中 最 主要 的 是 化 学 方法 ， 常 见 的 有 Edman 降解 法 、DNS- Edman 降解 法 \ 减 数 Edman 法 和 DABITC/PITC 双 偶 合法 Sanger 早年 使 用 的 FDNB 法 ,由 于 灵敏 度 低 、 操 作 较 复杂 和 不 能 连续 降解 等 原因 ， 人 们 一 般 不 再 采用 。 用 酶 学 方法 测 顺 序 虽 有 一 定 意义 ,但 在 实际 应 用 中 尚 有 许多 弊病 ,因此 很 少 有 人 用 。 一 、 手 工 Edman 化 学 降解 法 (一 ) 原理 Edman 化 学 降解 法 中 迄今 仍然 是 蛋白 质 或 多 肽 顺序 测定 技术 中 最 有 效 和 最 基本 的 方 法 ,是 1950 年 由 Edman 首先 提出 并 久 他 的 名 字 命 名 的 一 种 化 学 降解 法 。 降 解 所 用 的 斌 剂 是 异 硫 氰 酸 苯 酯 (简称 PITC)， 它 与 多 肽 或 蛋白 质 的 自由 氨基 作用 ,降解 反应 共 分 三 Ho 第 一 步 : 偶 联 反应 By ,O \ “tye | H —N=C=S +HN,—CH—C—N--fk PITC | a pH9.0—9.5 NH—C—NH—CH—C --N—fk | av a R, 1 PTC- 肽 ( 苯 氨 基 硫 甲 酰 肽 ) PITC 仅仅 与 未 质子 化 的 氨基 (H.N—) 反应 , 当 pH > 10 时 很 不 稳定 ， 因 此 反应 fate pH9.0 一 9.5 之 间 进 行 。 为 保证 反应 的 速度 ,50"c 左右 比较 合适 , 偶 联 反 应 在 40%c 时 ， 需 要 100 分 钟 才 能 完 成 ， 而 在 50°C 仅 需 10 分 钟 。 要 注意 不 同 的 副 反 应 会 干扰 PITC 与 肽 的 反应 ,尤其 要 注意 的 是 空气 中 的 氧 和 试剂 中 含 的 醛 类 杂质 。 氧 会 引起 氧化 脱硫 产生 异 氰 酸 苯 酯 肽 。 Oo : Oo | | | ‘eet ve Pat ee —NH 一 肽 NH—c 一 NH- 一 CH 一 C 一 NH 一 肽 | | O, | 让] R， 一 一 > 让 R, ee NZ *。 111。 Best 7 (RERAU MBE ARE EE AE Ri. BASH a-NH, 起 加 成 反应 ,形成 希 夫 碱 ,以 上 两 种 副 反应 都 封闭 了 c-NH2， 从 而 减少 了 可 反应 的 分 子 数 。 第 二 步 : 环 化 裂解 反应 “e5 O Fr 1 | NH—c —NH—CH— C —NH 一 肽 | 50sC | 0 ¢ 无 水 TFA s—c=9 SS ATZ (Axe BEM MA) R, + Ne, 20, Cee 减少 一 个 残 基 的 肽 PTC- 肽 在 酸性 介质 中 经 重 排 会 被 解 裂 下 来 ,为 避免 肽 链 水 解 ， 反 应 须 在 无 水 酸 中 进 行 。 在 最 初 的 Edman 方法 中 采用 的 无 水 酸 是 也 CUUCHSND,， 由 于 这 个 混合 物 不 能 溶解 大 肽 ,因此 使 用 受到 限制 。 后 来 普遍 采用 三 氟 酷 酸 (TFA)， 近 来 有 人 改 用 七 氟 丁 酸 和 五 拟 丙 酸 ( 表 7-1) , 据 报道 效果 不 错 2。 表 7-1 某 些 裂解 试剂 - 甲醇 盐酸 (Mothanolic HCl) Abderhalden 82 Brockmann(1930) 硝 基 甲烷 /盐酸 〈Mitromethane/HCI) Edman (1950) 二 和 氧 杂 环 已 烷 / 盐酸 CDioxane/HCl) Fox 等 (1951) 水 溶性 柠檬 酸 (Aqueous citric Acid) Linder strom-Lang (1952) 醋酸 /盐酸 蒸气 (Acetic Acid/HCl Vapors) Fraenkel-Conrat (1954) =H (Trifluroacetic acid) Elmora 82 Toseland (1956) 45 X97 BH CHeptaflurobutyric) Edman 82 Begg (1967) Figg, (Peutafluropropionic) Inglis (1976) 第 三 步 : 转化 反应 R, S H | I nd EC 一“ Weis : WA | 1NHCI 人 74 —NH—C 一 一 一 一 iN | 80°C 510’ EN Ss 一 C 一 DO 7 | | § x, ATZ- 氨 基 酸 PIH- 氨 基 酸 ( 葵 乙 内 酰 硫 腺 氨基 酸 ) 因为 ATZ 不 稳定 , 直接 鉴定 比较 困难 ， 因 此 需 先 转化 成 稳定 的 PTH- 氨 基 酸 衍生 物 。 反 应 需 在 酸性 水 溶液 中 进行 ,否则 会 产生 茉 基 氨 硫 甲 酰 -氨基 酸 (PTC- 氨 基 酸 ): H ATZ- 氨 基 酸 一 > 人 \- ig ape es S R, 近年 来 有 人 采用 1—1.5NHCl/MecOH (甲醇 ) 作 为 转化 试剂 ,由 ATZ 转化 成 PTH 、 的 速度 比 1NHCUH2O 的 快 ， 在 转化 过 程 中 生成 的 中 间 产 物 是 PTC- 氮 基 酸 - 甲 基 酯 而 *，112。 不 是 PIC- 氮 基 酸 ,其 效果 不 错 。 反 应 式 是 : S oO baat etal 《 O \ ent 和 Y/ 6G PTC- 人 氨基 酸 - 甲 本 7 —~ A (Op-s-€ COC oN ie NM ATZ- 氨 基 栈 S pam rides) Breet) ©>- 二 | 80°C PTC-AER WERESLE RRA, SARS KWH wa- 氨 基 经 与 PITC 试剂 偶 联 后 , 与 其 紧 挨 的 第 二 残 基 的 键 合力 大 大 减弱 ， 很 容易 断裂 ,所 以 在 无 水 酸 作用 下 ; 仅 只 切 下 与 自 由 -氨基 反应 的 那个 残 基 。 当 切 下 N 末 端 这 个 残 基 后 , 紧 挨 的 那个 残 基 ( 第 二 个 ) 便 暴露 出 来 成 为 自由 c- 氨 基 (HN-), 又 可 与 PITC 进行 偶 联 反应 。 然 后 再 切 下 第 二 个 残 基 , 以 些 循环 。 它 给 顺序 测定 带 来 许多 方便 ， 成 为 Edman 降解 反应 的 最 大 优点 。 液 相 顺 序 仪 和 固 相 顺序 仪 及 新 近 间 世 的 气相 顺序 仪 就 是 根据 Edman 降解 反应 原理 设计 成 的 。 (二 ) 实验 方法 ”主要 试剂 和 材料 : PITC 和 三 氟 西 酸 按 顺 序 级 处 理 。 DMAA 缓冲 液 ， 0.4 mol/l DMAA (顺序 级 ) 于 吡啶 = 水 (3:2,V/V) 中 ,最 后 用 TFA 调 pH 至 9.5 左右 。 葵 、 乙 酸 乙 酯 等 分 析 纯 经 重 蒸 处 理 。 具 玻璃 宣 圆 锥 状 底 的 小 试管 , 约 DS X 0.7(cm)。 人 台式 离心 机 ,快速 混合 器 ,恒温 水 浴 ,高 纯 氮 ,冰冻 干燥 装置 等 。 方法 : 蛋白 质 或 多 肽 样品 50 一 200nmol 于 试管 中 偶合 : 4 十 0.4ml DMAA 缓冲 液 4 + 30 一 50ml PITC { 十 通 Ni, HH, HA. $50, RM 30 分 钟 ， 注 意 经 常 摇动 。 抽 提 过 剩 试剂 | 十 1 一 2.0ml 茶 /4 通 Na， 盖 塞 ， 混 合 ， 离 心 (3500 转 /分 )3 分 钟 4 用 移 沪 管 小 心 移 去 上 层 相 e113 ¢ 上 述 操 作 重 复 三 次 ,最 后 下 层 水 相 减 压 干 燥 或 在 50" 通 Na KTe 裂解 : LRT RD 十 0.3 一 0.4ml = HER 了 通 N?, 盖 塞 ,混合 ， 50scC ,保温 反应 10 一 15 分 钟 1 减 压 干燥 或 50 HON. KF 抽 提 : ) 十 0.4ml ZK Y 十 1ml CR Cis 了 通 Na， 盖 塞 、 混 合 、 离 心 (3500 转 / 分 ) 3 分 钟 了 吸取 上 层 乙 酸 乙 酯 相 做 转化 反应 上 述 操作 重复 2 一 3 次 , 取 前 二 次 的 合并 做 转化 ， 最 后 下 层 水 相干 燥 作 下 一 步 降解。 转化 : 将 上 述 收集 的 上 层 乙 酸 乙 酯 相 减 压 和 干燥 或 通 Ni KF | +0.3—0.4ml 1NHCI +Y 通 Naz, 盖 塞 ,混合 ) 80°C 保温 反应 10 分 钟 抽 提 : 转化 毕 冷却 ) 十 0.7ml 乙酸 乙 酯 + 通 No, REVEAL (3500 转 / 分 ) 3 分 钟 + 小 心 吸取 上 层 有 机 相 上 述 架 作 重 复 一 次 ,最 后 合并 乙酸 乙 酯 相 ,干燥 作 鉴 定 。 水 相 暂时 保留 ,如 果 有 机 相 未 能 检 出 , 则 取水 相干 燥 ， 用 于 检 出 Arg、His、CySO;:H ( 见 下 面 图 解 )。 HY > PTH- 氨 基 酸 AIZ- 氮 基 栈 用 乙酸 乙 酯 抽 提 | 水 相 层 (下 层 ) 乙酸 乙 酯 相 层 (上 层 ) PTH-Arg 大 部 份 PTH-BZER PTH-His PTH-CySO:H © PTH-RERER A (=) PTH- 氧 基 酸 的 鉴定 鉴定 PTH- 氮 基 酸 的 方法 很 多 ， 归 纳 如 表 7-2。 。114 。 7-2 PIH- 氨基酸 分 离 及 鉴定 方法 方 法 | 三 次 操作 检 出 DB 同时 分 析 | 分 析 时 间 | 操 作 温度 | ”定量 ROE | 自动 化 四 除 PTH-Gln, Asn Trp 7 Vik pan atl: — | | |X | 一 一 一 | 一 一 一 一 — — BEAT | AR ”要 | 所 有 PTH-RER 可 以 | 半 小 时 | 室温 不 能 | 0.1nmolLl | 不 可 —— st |__. 气相 色谱 | REAL Fee Cys 外 的 | 不 可 | 25 分 钟 | 高 温 | 能 | lomol | 可 以 名 a 4 不 要 所 有 PTH-S EMR 不 可 30 分 钟 室温 能 0.1lomol/1 可 以 一 -一 | 一 一 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 一 -一 质谱 务 析 | 不。 要 | Te MOP | -不 可 | 很 短 | mm | te | 5pmol/1 | .可 以 除 表 7-2 所 列 主 要 方法 外 ,还 有 几 种 ， 如 光谱 法 ， 在 269nm 能 监测 所 有 的 PIH- 氢 基 酸 ， 在 320nm 监测 脱水 的 -PTH-Sar 和 Thrs. 高 压 电 泳 能 监测 PTH-Arg, His, cySOH; 非 配 试 剂 监测 PTH-Arg; Pauly 试剂 监测 PTH-His, Tyr 等 。 上 述 方法 中 ， 较 普遍 使 用 的 是 薄 层 层 析 和 气相 色谱 法 。 近 年 来 高 效 液 相 色谱 法 用 得 也 很 多 ;并 越 来 越 显 示 出 它 的 优越 性 ; 此 法 速度 快 ,灵敏 度 高 , 既 能 定性 ,也 能 定量 ,而 且 比 较 可 靠 。 高效 液 相 色 谱 法 将 在 第 十 章 介绍 ， 这 里 主要 向 读者 介绍 薄 层 层 析 和 氨基 酸 分 析 两 种 方法 。 用 作 薄 层 的 材料 很 多 ,早先 有 滤纸 层 析 ,以 后 发 展 为 纤维 素 薄膜 、 聚 酰胺 薄膜 和 硅胶 薄膜 等 。 这 里 只 介绍 其 中 的 两 种 , 即 硅胶 薄膜 层 析 和 聚 酰胺 薄膜 层 析 。 必 须 指出 ， 对 Edman 降解 产物 的 鉴定 , 单 舍 一 种 方法 往往 是 不 够 的 , 一 般 需 要 有 两 种 或 两 种 以 上 方 法 。 2. 硅 胶 薄 层 层 析 监 定 PTH- 务 基 酸 名 主要 试剂 和 材料 : 层 析 溶剂 I: 氯仿 : 冰 醋 酸 一 98:2(V:V) 用 于 分 离 ， PTH—Pro, Len, Ile, Val, Phe, Met Ala, Gly, Trp, Lys,Tyro 层 析 溶剂 T: Ah: CR: AR = 88:2:10(V:V), 用 于 分 离 : PTH—Thr, Ser, Gln, Asn, Glu, Asp, 层 析 溶剂 WM: A:B 一 7:3。 其 中 A 为 酷 酸 丁 酯 : 异 丙 醇 一 10:4(V:V)，B 为 吡啶 : 酷 酸 :水 一 4:1:1(V:V) ATOw PTH—His, Arg, Cys, E Merck 5554 硅胶 板 。 标准 PIH- 氮 基 酸 混合 液 。 层 析 人 缸 ,254nm 紫外 灯 。 方法 : 将 转化 后 抽 提 的 PTH- 氨 基 酸 溶液 (大 多 在 有 机 相 ) 干 燥 后 ， 加 1 一 2 % U5—30ul) 乙酸 乙 酯 或 无 水 乙醇 溶液 ， 用 毛细 管 点 适当 量 (4 25—50Pmol) 在 硅胶 板 上 (硅胶 板 的 大 小 应 根据 鉴定 的 份 数 裁 取 ， 并 用 软 质 铅 笔 在 离 下 端 0.5cm 处 划一 直线 , 按 一 定 间 隔 编 ss 115° ES MESIAL), 共 点 二 张 ,然后 在 它 的 附近 (也 在 直线 上 ) 点 上 标准 PTH-S 基 酸 混合 液 ( 见 图 7-1)。 点 样 后 的 二 张 板 分 别 放 人 盛 有 层 析 溶剂 1 和 UE eri Ci 中 溶剂 的 深度 以 不 漫 人 样品 点 为 宜 ) ,进行 上 行 单 向 层 析 ， 当 层 析 溶 剂 展 层 至 离 薄板 上 端 约 0.5cm 时 取出 ,干燥 后 , 在 254nm 紫外 灯 下 即 可 根据 标准 PTH-RABRA RDS 图 谱 确认 被 鉴定 的 点 ， 详 见 图 7-1 层 析 图 谱 。 你 eo @ e ‘© ° 三 @@ e eo ~4 e @ a © 总 e e ® 9 ° e a e SPS. RAS a M123 4567M8 9 1011121314 M Mo 2; 3455.46 7a 230 He 8 eh Val Leu Gly Leu Val Ala Asn Gln Glu 图 7-1 用 固 相 Edman 方法 降解 胰岛 素 B 链 前 十 四 步 产物 PTH- 氨 基 酸 在 硅胶 板 上 的 分 离 图 谱 、 其 中 M 为 标准 PITH- 氨 基 酸 混合 液 。!1 MAM: 氯仿 :乙醇 = 98:2(V1V)。Q AeA: 氯仿 :乙醇 :甲醇 一 88:2:10(V/V)。 若 未 见 检 出 点 ,再 将 转化 抽 提 后 的 水 相干 燥 , 加 1 一 2 1% 丙酮 /水 ， 按 上 法 点 样 于 一 张 硅胶 板 上 ,标准 样品 应 点 PTH—Arg,His 和 Cys， 然 后 放 人 盛 有 层 析 溶剂 的 层 析 缸 中 展 层 。 层 析 毕 取出 ,干燥 后 置 于 盛 有 固体 碘 的 容器 内 ,用 碘 蒸 气 又 片刻， 直至 显露 出 黄色 斑点 , 即 为 检 出 点 。 3. 聚 酰胺 薄膜 双向 层 析 鉴 定 PTH- 乞 基 酸 中 层 析 溶 剂 I: 甲 茶 : 正 戊 尝 :乙酸 一 60:30:35(V/V) (或 60:30:16,V/V)o。 并 使 每 升 混合 溶剂 中 含有 250mg 丁 基 (2-4 - 叔 丁 基 茶 )-5-(4 -2 葵 )1,3,4- 哑 二 只 (简称 butyl PBS, 是 一 种 荧光 指示 剂 )o 层 析 溶剂 MW: 35% 乙酸 /水 (或 25 多 乙酸 /水 )。 其 它 材 料 和 实验 操作 详 见 第 六 章 聚 酰胺 薄膜 双向 层 析 。 用 该 法 可 在 30 分 钟 内 将 16 种 PITH- 氮 基 酸 分 开 , 灵 敏 度 很 高 , 含有 0.05nmol 样品 就 可 检 出 。 图 7-2 是 标准 PTH- 氨基 酸 混合 液 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 双向 分 离 图 谱 。 4. 自动 氨基 酸 分 析 仪 鉴定 PTH-KRAK™ 将 裂解 后 抽 提 的 ATZ- 和 氨基 酸 (未 经 转化 ) 或 PTH- 氮 基 酸 溶液 移 人 水 解 管内 《水 解 管 的 处 理 见 第 三 章 ), 减 压 干 燥 后 ,加 200AL 5.7VH CI 内 含 0.1 多 SnCl), 通 Nr 或 冰冻 抽 真空 后 封 管 ,于 150°C 水 解 4 小时。 水 解 毕 , 小 心切 开封 管 口 , 减 压 干 燥 , 最 后 加 适量 柠檬 * 116° 溶剂 1 Arg, His = 外 7-2 PIH- 氨 基 酸 在 到 酰胺 薄膜 上 的 分 离 引 上 自 Summers, M.R., ez al.: Thin-Layer chromatography of sub-nanomole amounts of PTH-amino Acids on polyamide sheets, Anal. Biochem., 53,624—628(1973). 酸 缓冲 液 (pH2.2) 或 0.02NHCI, EA SERA HIM Ho 5. 讨论 (1) Edman 化 学 降解 的 最 终 产物 PTH- 氮 基 酸 对 鉴定 是 较 理 想 的 。 它 们 除了 PTH- Ser, PTH-Thr 和 PTH-Cys 外 ,所 有 其 它 的 PTH- 氮 基 酸 的 热 稳定 性 和 化 学 稳定 性 都 较 好 ,能 结晶 ,熔点 也 较 高 。 而 PTH 一 Ser、 一 Thr\ 一 Cys 因 分 别 含 有 一 OH 或 一 SH 基 团 , 容易 发 生 8- 消 除 反 应 ,生成 脱水 PTH- 氮 基 酸 如 PTH—Thr, CH, OH CH, )/ 44 \/ Sh ia . | | == CH—NH , “i | | 一 H2O | OFT & Cc C 一 一 3s’, yo aes | | ie [ LU PTH-AThr (Ajax 268nm) (Agax 325nm) ARAKKANT Do 对 PTH-Ser， 更 容易 引起 脱水 反应 : e117 - H OH ea. | CH— NH | 7 C Cc 入 是 O S [ 虽 PTH-Ser PTH-ASer 脱水 后 的 产物 很 容易 聚合 ， 如 PTH-ASer 会 生成 粉红 色 聚 合 物 ， 对 此 ， 可 作为 Edman 降解 后 存在 Ser 残 基 的 一 种 依据 。 脱 水 后 的 PTH—AThr, ASer 的 吸收 峰 移 到 325nm 处 ， 是 由 于 脱水 而 产生 的 双 键 与 乙 内 酰 硫 脲 发 生 共 斩 引 起 的 。PTH- 氮 基 酸 对 光 敏感 ,尤其 是 PITH-Trp ,在 进行 薄 层 层 析 后 ,经 光照 会 逐渐 变 成 黄色 , 据 此 可 证 明 PTH- Trp 的 存在 。 (2) 用 1.0 一 1.5VHCI- 甲 醇 代 替 1VHCI 作为 转换 试剂 ， 各 种 PTH- 氮 基 酸 得 率 较 高 , 表 7-3 是 这 两 种 转化 方法 获得 的 PIH- 氮 基 酸 产 率 的 比较 。 IN HCl, 80% 10 分 手工 转化 产 率 90+10 35425 75 (+25 as Asp) 55-10 70+10 45+10 (+45 as Glu) 45420 35425 90+10 100 50 90+10 90+10 21-410 5 士 5 19+10(+ AT)? 90 65415 100 1.0-—-1.5N HCl- pe 65°C, 5—9 分 表 7-3 用 不 同方 法 转化 得 到 的 PIH- 氨基 酸 的 产 率 (90) 自动 转化 产 率 90 士 10 75 士 10 93 士 5( 十 7* as Asp-OMe) 80b 十 10 100° $8+8(+12° as Glu-OMe) 70415 75415 90+10 100 60 90+10 90+10 50415 27+8 304+15(-+ AT)? 100 6515 95-45 a. 作为 甲 基 酯 的 回收 率 。 b. 在 波长 313nm 监测 到 的 PTH- 脱 水 苏 氨 基 ( 量 不 定 )。 (3) 表 7-4 MR 7-5 是 水 解 PITH- 氮 基 酸 或 ATZ- 氮 基 酸 的 各 种 不 同方 法 及 水 解 后 获得 的 各 种 氨基 酸 的 百 分 回收 率 。 可 以 看 出 ， 其 中 以 5.7VHCI (内 含 0.19 SnCl)) 150°C 水 解 4 小 时 方法 为 佳 。 但 须 注意 ， 水 解 后 Thr 转 为 c- 氮 基 丁 酸 (CH 一 CH 一 CHNH,—COOH );Ser ##% Ala;Trp 转 为 Gly 和 Ala;Asn 转 为 Asp; Gln #% Glug | * 118° 71-4 水 解 PIH- 或 ATZ- 氨 基 酸 的 方法 太 -- 法 条 件 酸 水 解 (1) 6mol/l HCl, 150%, 24 小 时 [9] (2) 57%HI, 127%, 20 小 时 [10] (3) 4mol/l CH;SO;H, 150°C, 4 小 时 [11] (4) 5.7mol/1 HCI(+0.1% w/w SoCl,) 150°C, 4 小 时 [11] (5) 55%HI1, 130%, 18 小 时 [12] Baik ie (1) 0.1mol/l NaOH, 120°C, 12 小 时 (2) 0.1mol/l Na,S,0, 在 0.2mol/l NaOH ,127°C,3.5 小 时 RIS 不 同 水 解 方法 转化 PTH- 和 氨基 酸 为 相应 氨基 酸 的 回收 率 (92) 57% 47% 6mol/1 5.7mol/1 4mol /| 0.2mol/I | 0.1mol/1 | 0.01mol/L 氨基 酸 HI HI Hcl Hcl CH;SO,H| NaOH NaOH NaOH (1)! (3) (2) (3) (3) CI (2) 3)* Asp 80 100 88 97 103 80 89 78 Thr 90> 89" 一 90° 18> 1 67° 20 Ser 50 1 一 684 9 ae 一 1 Glu 80 100 81 97 100 50 66 23 Pro 70 78 88 94 91 70 96 94 Gly 80 95 104 99 99 80 96 118 Ala 90 100 78 99 100 80 86 102 Cys 60° ND ND ND ND 5 ND ND a 70 72 88 61 69 13 98 96 Met = 一 67 92 75 90 84 76 Ilet 70 65 90 60 68 100 100 87 Leu 90 82 59 82 81 90 71 83 Tyr 60 80 76 67 70 100 97 92 Phe 80 72 86 70 72 100 95 88 His 20 100 ND 99 93 20 70 48 Trp 60* ND ND 978 ND 40 ND ND Lys 70 100 ND 92 84 30 72 30 Arg 30 81 ND 99 85 58 538 44 其 中 ND 未 测定 ; a Trp 作为 Gly + Alu 测定 ，b。 Thr (EH a-MI TAME, c. Thr 作为 Gly 测定 ， d. Ser 作为 Ala 测定 ，e. Cys 作为 Ala 测定 ，f. lle GEAR RAMIA eg. Are 作为 岛 氨 栈 测定， h. 包括 O.1%ow/w 的 SnCl,, i. 仅 记 人 最 小 回收 率 ，j. AB Na,S.0,, k. 包含 0.196 的 6- 莹 基 乙 醇 。 5| Croft. L. R.: Handbook of protein sequence Analysis, p.98, John Wiley & Sons(1980). (4) SFA Edman 反应 连续 降解 几 步 甚至 十 几 步 以 后 , 由 于 受 反 应 本 身 的 产 率 限 制 使 相 邻 步 之 间 发 生 重 倒 (或 许 在 蔡 取 过 程 中 造成 ), 加 上 肽 链 的 非特 异 裂解 等 原因 ,在 鉴定 时 PTH- 氨 基 酸 层 析 点 常 受 到 背景 和 杂 点 (俗称 鬼 点 ) (其 中 有 些 是 试剂 不 纯 造 成 ) 的 干扰 ， 使 鉴定 难以 判断 ， 碰 到 这 名 情 况 需要 格外 谨 愤 。 鉴 定 中 遇 到 的 这 样 或 那样 的 问题 ， 往 往 需要 反复 比较 甚至 重复 进行 ,其 中 有 很 多 需 赁 借 经 验 。 当 一 种 方法 鉴定 不 能 确定 时 (这 是 经 常 发 生 的 ) 需 要 采用 其 它 鉴定 方法 加 以 验证 。 另 外 也 可 用 不 同 试剂 进行 显 色 &292( 见 表 7-6 )o ° 119° 7-6 经 TLC } Beh) PTH-SSRTARARARE i= M-TAT lw (Collidine) St SS PY PY PY OS oe =, DNS-Edman_ 测 顺序 法 [46 一 18] DNS-Edman 法 是 将 高 灵敏 度 的 DNS 技术 与 能 连续 降解 的 Edman 降解 反应 有 机 地 结合 起 来 ,用 于 测定 肽 链 氮 基 酸 顺序 的 一 种 方法 。 其 原理 见 图 7-3。 按 图 7-3 示 ，, 先 取 一 小 部 分 肽 与 DNS-Cl 反应 , 按 末端 测定 法 测 出 该 肽 的 第 一 残 基 e 然后 用 Edman 降解 剩余 肽 的 第 一 个 残 基 。 经 抽 提 后 ,再 取 其 中 一 小 部 分 与 DNS-Cl 反 应 ， 酸 水 解 后 ， 得 到 一 个 具有 强 欧 光 的 氨基 酸 衍生 物 ， 通 过 鉴定 可 知 其 第 二 个 氨基 酸 残 基 。 其 余部 分 再 进行 Edman 降解 ,降解 后 的 残余 物 再 取 一 小 部 分 与 DNS 一 Cl 反应 , 经 水 解 后 鉴定 DNS- 氨 基 酸 可 知 该 肽 链 的 第 三 个 氨基 酸 残 基 , 如 此 循环 下 去 。 由 于 水 解 后 的 生成 物 是 带 荧光 的 DNS- 氨基酸， 其 检 出 的 灵敏 度 比 Edman 方法 高 几 倍 甚至 十 几 倍 ,因此 用 样 量 比 手 工 了 dman 法 少 , 而 又 能 连续 进行 ,这 是 上 法 的 优点 。 缺 反 是 因为 妥 用 酸 高 温水 解 , 使 谷 氨 酰 胺 ,天 冬 酰胺 相应 地 变 为 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 ， 色 氮 酸 而 不 能 检 出 。 实验 方法 详 见 第 六 章 DNS-N 末端 测定 法 和 本 章 Edman 降解 法 。 但 需 注 意 ， 用 DNS-Edman 方法 时 ， 在 Edman 降解 反应 的 每 一 步 都 要 很 好 地 干燥 , 尤其 重要 的 是 , 在 ARMA REE RR: 当 残 存 物 中 留 有 酸 时 ， 在 DNS 化 一 步 加 入 碳酸 氢 盐 。120 。 用 PITC 降解 ， (0) Edmaa (1) Edman (2) Edman a (3) Edman NH,-A-B-C-D-E-F-G»+++sCOOH DNS 化 | meth ie Rew DNS-A | ; 4 1. & 解 聚 酰胺 薄膜 抽 提 | RED 弃 去 DNS-B | 1 2. 降 解 或 wee PAs BA 4 PTZ-B + C-D-E-F-G COOH 提取 ba es B ta 3K Ss 3. EM 或 : 转化 聚 酰胺 薄膜 PYZ-C 80° OF D-E-F-G----COOH | 抽 提 im em BEM 弃 去 DNS-D 4. | ie (4) Edman ABTREET Fe 7-3 DNS-Edman 降解 法 测 顺序 过 程 就 不 能 确保 反应 的 适宜 pPH， 从 而 影响 DNS-Cl 5 w- 氮 基 酸 的 反应 。 所 以 在 实验 中 要 特别 注意 pH; 若 反应 物 含 有 残留 酸 , 会 有 气泡 显示 ,这 时 应 立即 检查 反应 液 的 pH, YE AYA) AAR Ea pH 到 最 适 值 。 三 、 减 数 Edman 测 顺序 法 9] 所 谓 减 数 Edman 测 顺序 法 就 是 利用 Edman 降解 法 将 肽 链 中 的 N 末端 氨基 酸 残 基 逐次 从 肽 链 中 除去 ,并 随 之 分 析 相 应 肽 链 的 氨基 酸 组 成 ,从 每 一 循环 中 所 基 酸 的 丢失 或 减 少 可 以 推出 入 末端 氨基 酸 的 排列 顺序 。 例如 ， 假 定 某 一 小 肽 由 AYBYC\D,E 五 个 残 基 组 成 (可 通过 水 解 后 氨基 酸 组 成 测定 得 到 ), 那 末 在 完成 PTC- 肽 降解 并 测定 每 步 降解 后 氨基 酸 组 成 的 短缺 ,可 获得 下 列 结果 。 先 将 某 一 小 肽 水 解 测 出 氨基 酸 组 成 是 A\.B\C\D\、 了 五 个 残 基 , 第 一 次 降解 后 , 经 水 解 测 氨 基 酸 组 成 为 A\C\D\E, 残 基 B 缺 少 。 第 二 次 降解 后 ,经 水 解 ,其 氨基 酸 组 成 为 A.D、 下 ;, 残 基 C 缺少 。 第 三 次 降解 后 ,水 解 ， 氮 基 酸 组 成 为 D`E， 残 基 A 缺 少 。 经 第 四 次 降解 ¢121°¢ 后 ,氨基 酸 组 成 为 E,REDRD, CR, BNKWIF Se B—-C—A—D—E, 进行 减 数 Edman 方法 需要 一 台 目 动 氨基 酸 分析 仪 。 方 法 很 简单 ,速度 也 不 慢 , 但 仅 适用 于 分 析 小 肽 通常 少 于 10 一 15. 个 残 基 儿 见 表 7-6)。 有 关 实 验 细节 可 参见 本 章 Edman 降解 法 和 第 三 章 氮 基 酸 分 析 。 表 7-7 wR Edman 方法 测定 七 肽 〈Cys-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Lys) 的 示例 991 内 “。 肽 的 氨基 酸 组 成 分 析 是 每 步 Edman 降解 后 ， 经 酸 水 解 用 自动 氨基 酸 分 析 仪 测定 。 表 中 的 结果 是 以 Lys 为 Imole 残 基 计算 的 。 _/W, DABITC/PITC 双 偶 合法 [20 一 25] (—) sla 由 于 Edman 降解 反应 产物 PTH- 氮 基 酸 检 出 的 局 限 性 ， 影 响 了 蛋白 质 顺序 测定 的 灵敏 度 和 精确 度 。 因 此 ,在 过 去 十 余年 间 , 人 们 在 提高 顺序 分 析 的 灵敏 度 方面 进行 了 大 量 的 探索 ,归纳 起 来 主要 集中 于 两 方面 : 一 是 采用 放射 性 同位 素 ,荧光 基 团 或 有 色 Edman ix 87-8 ”一些 类 似 于 Edman 试剂 的 偶合 试剂 Bow GM F XH) PITC —-N=c=S Edman (1950》59 _ (Edman 试剂 ) NO, . CH, | N -人 太 N=C=S Reith 和 Waldron**? (1954) CH,” | NO, pena N=c=s Yamashina (1965) CH;—N=C=S Lauren (1966 )528 so;-(\-naoxs Birr 等 (1977 )5291 CH N 一 N=N— -N 一 C 一 S Chang 等 (1976 )[29 cH,” DABITC e122 ¢ 剂 ;二 是 采用 灵敏 的 检测 手段 ,如 微量 薄 层 层 析 、 气 相 色 谱 和 高 效 液 相 色谱 检 出 PTH- 氢 基 酸 。 4-N，N- 对 甲 氨基 偶 氮 苯 4- 异 硫 氰 酸 酯 (简称 DABITC) 就 是 一 种 改进 的 有 色 Edman 降解 试剂 。 它 是 由 外 籍 华人 张 瑞 婚 (Chang Jui-Yue) 于 1976 年 首先 提出 的 。 用 DABITC 降解 蛋白 质 或 多 肽 N 末 端 残 基 生 成 的 二 甲 氨基 偶 氮 苯 - 硫 氰 酯 氨基 酸 (DABTH- (氨基 酸 ) 具 有 显明 的 颜色 ,只 要 用 pmol 水 平 就 可 鉴定 。 它 的 光 吸 收 波长 为 340 一 580nm， 消光 系数 0%, = 34 约 为 PTH- 氨 基 酸 (es — 16) 的 两 倍 , 因 此 大 大 提高 了 灵敏 度 ; 并 能 在 可 见 光 区 检 出 ,而 PTH- 氨 基 酸 需 在 紫外 区 检 出 。 DABTH- 氨 基 酸 在 聚 酰胺 薄膜 上 层 析 后 ;经 盐酸 蒸气 重 即 能 显 出 红色 得 点 ,而 杂质 与 试剂 反应 物 显示 蓝 色 或 紫色 斑点 b) 这 种 颜色 差别 ,给 DABTH- 氨 基 酸 鉴定 工作 带 来 方便 和 准确 性 。 其 它 改 进 的 Edman 试剂 过 去 也 曾 提出 过 几 个 ( 见 表 7-8), 但 都 不 及 DABITC 成 功 。 (=) 原理 用 DABITC 降解 蛋白 质 或 多 肽 的 N 端 氨基 酸 其 原理 类 似 于 Edman 降解 , 反应 原 理 如 下 : R, R, R、 sds | 1 ee N=N— 一 N 一 C 一 S + NH: 一 C 了 一 C —NH—CH— C —NH—CH—C--- Hc” / | i i I R re) re) re) 1)DABITC OH- pH8—9, 40—50% 通 N, me, ar PY HO: N=N— — NH-— a te C —NH—CH—C —NH—CH— C «ree H.C” a 1 上 I DABTC- 肽 [ea 2 TFA, i i 中 Ty OO + NH,—-cH—c—NH—cH-c. aot J J CH—R, ae DABTZ-aa ‘f | Ht 40—50% IFA, iff N, 转化 稀 酸 Om 一 一 N 一 N 一 —N-——C=0O 7 Vi fom eae CH——R, DABTH-aa AN N x DABITC: 4-NN- 二 甲 胺 基 偶 氮 葵 -4'- 异 硫 氛 酸 酯 (4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4’ -isothiocyanate) DABIC: 4-N?N- 二 甲 胺 基 偶 氮 茶 -4 - ae BRE } (4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4’-thiocarbamoyl) : DABTZ-aa; 4-N5N- 二 甲 胺 基 偶 氮 茶 -4'- 喀 唑 啉 酮 -氨基 栈 (4-N?N-dimethylaminoazobenzebe-4"-thiozolinone-aa) DABITIH-aa: 4-N?N- 二 甲 胺 基 偶 氮 苯 -4'- 乙 内 酰 硫 脲 -氨基 酸 (4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4’ -thiohydantoin-aa) 虽然 DABITC 具有 明显 的 优点 , 但 由 于 DABITC 与 氨基 偶合 反应 产 率 较 低 ; 一 般 "3 AE 50% , 不 能 有 效 定 量 地 去 除 N RE, TKS SERA 1978 年 Chang，J.Y.29 和 他 的 同事 巧妙 地 人 牌 决 了 这 个 问题 ,即将 余下 没有 与 DABITC 偶合 的 氨基 再 用 PITC 作 第 二 次 偶合 ， 即 所 谓 双 偶合 法 。 由 于 PITC 与 多 肽 的 偶合 反应 EF 定量 ;从 而 可 以 定量 的 去 除 N 末 端 ,并 暴露 第 二 个 氨基 。 暴 露 的 N 端 氨基 又 能 与 DABITC、 _PITC 作 双 偶合 降解 。 依次 循环 下 去 ， 逐 个 测定 蛋白 质 或 多 肽 的 N HAAR. BB 双 偶 合 方法 已 成 功 地 应 用 于 微量 顺序 分 析 , 无 论 是 用 液 相 还 是 固 相 , 手 工 或 自动 方法 测 顺 序 都 已 获得 较 满 意 的 结果 。 这 个 方法 的 优点 是 : (1) 灵敏 度 高 。 用 2 一 gnmol 样品 能 连续 测定 15 一 30 个 氨基 酸 顺 序 ， 是 一 般 手 工 Edman 方法 的 10 一 20 倍 。 (2) 鉴定 方法 经 济 \ 简 便 、 可 靠 ，20 种 蛋白 质 所 基 酸 的 DABTH- 氨 基 酸 衍生 物 均 可 用 聚 酰胺 薄膜 和 硅胶 板 检 出 (后 者 检 出 Leu 和 Ie), (3) Gln, Asn, Trp 不 受 破 坏 , 可 直接 检 出 。 (4) 整个 操作 比较 简便 ,试剂 消耗 少 ,又 因为 是 有 色 试剂 ,不 需 特殊 设备 , 可 直接 在 可 见 光 下 检 出 ,因此 一 般 的 实验 室 都 能 进行 。 (5) 可 直接 用 到 固 相 法 测 顺序 技术 上 。 缺点 : (1) 萃取 过 程 中 杨 水 性 肽 容易 丢失 。 (2) 对 Thr, Ser, Lys, Trp 等 残 基 副 反应 较 多 ,回收 率 低 ,在 鉴定 时 会 出 现 几 个 不 同 的 点 。 (3) 在 溶液 中 试剂 不 稳定 ,每 次 使 用 需 新 鲜 配 制 。 j (=) 实验 方法 试剂 和 材料 DABITC (Fluka, Peice co. 或 上 海 东 风 试 剂 厂 ,或 自己 合成 ) 用 丙酮 重 结晶 。 吡啶 ，n- 正 庚 烷 ,乙酸 乙 酯 , 酷 酸 丁 酯 ,三 所 醋酸。 PITC 等 都 按 顺序 级 要 求 处 理 ( 见 附录 )。 ko ee A; I [Al 33% Fe yk II RE tn he: GR 一 2:1:1(V/V)。 B; 鉴定 Ile, Len, 7.5 X 4(cm), WH): 10% PR: CB 一 10:9( V/V) | 高 效 硅胶 板 鉴 定 Me, Len, Hl: 氯仿 :甲醇 一 50:2(V/V)。 聚 酰胺 薄膜 (新 江 黄岩 化 工厂 或 进口 )。 FEB (HPTLC 5% 5554 E Merck)。 高 纯 氮 ,恒温 水 浴 , 快 速 混合 器 , 台式 离心 机 ,冷冻 干燥 装置 。 方法 : (1) DABITC WA R244 合成 路 线 : 。124 。 er cH H+_ .NaNO， : eee? SN - SERS, i Oe —NHC—CH, I hw Crh is / Ye I ij , ¢ 》 3 . red al Noles 《中 间 体 I， 在 硅胶 板 上 呈 紫 色 ) Bt. ee fo 一 一 一 N 一 N 一 N — NH, Aes | cH,” a G 《中 间 体 I, ARERR SA fA) 《 \ — \ CH,” 二 一 -一 —=_ (DABITC #ERRL SRE) @ 中 间 体 工 的 合成 : 称 取 3 92 LRRRE ER: (crc-Ne《 >》 -NB ) 加 25ml O 重 蒸 水 后 加 热 溶解 ,冷却 后 加 入 5ml 12VHCI ,此 溶液 在 冰 浴 中 冷却 至 5%c 以 下 ， 再 缓慢 加 1.47g8NaNO:;( 溶 于 3ml 重 蒸 水 中 ) 搅 拌 10 分 钟 (注意 反应 温度 不 得 超过 10%c ) ,随后 加 CH — 一 一 aN Vi VW, Ly 3.2m] N= N—< 》| 继 续 搅拌 20 分 钟 ， 再 加 入 4g 乙酸 钠 ( 用 极 CH,” 一 一 ， 少量 重 蒸 水 溶解 ), 产 生 中 间 体 I 的 沉淀 ,过 滤 后 干燥 。 @ Ai TT 的 合成 :1.0g 中 间 体 工分 别 加 10ml 甲醇 .5ml 重 蒸 水 .5ml 12NHCI, 混合 后 过 流 1 小时。 冷却 后 加 80ml lmolNaOH ， 搅 拌 20 分 钟 ， 产 生 的 沉淀 物 中 间 体 工 经 过 滤 后 ,干燥 过 夜 。 图 DABITC 的 合成 : 1.0g ia I 加 40ml HA, MA 0.12ml 硫 代 光 气 (CSCI,) TBE 1.5 小 时 ,反应 液 冷 却 \. 过滤、 浓缩 。 最 后 用 6 X 12cm FERRE LBA 农场 化 剂 厂 ,粒度 300 目 ) 纯 化 ,以 苯 作 洗 脱 剂 ，DABITC 首先 被 洗 脱 ， 而 中 间 体 工 在 柱 TRB RIE. & DABITC WEARER GEE, HEKLBAR. GRE AMIRER, BA 169*C。 红 外 光谱 测定 在 2150cm-: 有 一 个 —N=C=S 特征 峰 。 元 素 分 析 (DFR: CHiN4S) 计 算 值 C.63.8 ， N:19.9, S:11.3, H:5.00, S468 C:63.0, N-:20.0,S-10.9, H:5.50, (2) DABTH-A# RHI oe 称 取 0.5umol 氨基 酸 于 带 塞 的 小 试管 中 | +100.) 醋酸 缓冲 液 (2mol/L HEHE 2m! 十 1.2ml 人 十 25ml 丙酮 pH10.1) 4 +100u1 DABITC 液 (2umole DABITC/ml 丙酮 ) / 通 N， 盖 塞 ,混合 ) 50sC ,反应 工 少时 | 。 125。 , / 1 REF ERR N; kT | +200u) Ze 7K + 十 400wl 用 HCl 饱和 的 醋酸 小 (用 盐酸 蒸气 通 人 冰 酷 酸 内 直到 饱和 为 止 ) 138 N., GH.IES 1 50sC ,反应 50 分 钟 1 减 压 干燥 或 N: KF 1 +400ul 无 水 己 醇 ,离心 去 沉淀 物 后 待 用 (3) 标记 物 (参考 点 ) 的 制备 在 一 带 塞 的 小 试管 中 14 +500u1 50% ttkme/ zk 1 +30n 二 乙 胺 1 十 30M CHR Vo hes 3C | +1000n mol|DABITC : bi ine HN, EEDA OT 455°C BER 1 MAE 1 1 & — taste) 1 减 压 干燥 或 用 N; 吹 干 { 十 0.5 一 Iml 无 水 乙醇 备用 (4) DABITC/PITC 双 偶 合 降解 反应 | 称 取 2 一 10nmole 蛋白 质 或 多 肽 于 一 圆锥 形 的 小 试管 , 645 X 9.6(cm) 中 偶合 : | + 80u) 50% 吡啶 /水 - 上 + 40ul DABITC/ stb (0.6mg DABITC/260p! 吡啶 新 鲜 配 制 ) “ 通 Nz 盖 塞 , 窟 合 7 150°C 反应 45 分 钟 | 151 PITC wi \iB Ni, HEA 150°C 反应 30 分 钟 抽 提 : 4 +4 x 200ml TEBE he/ CM CHR(2:1)(BERKERK 3:1), BRERA 通 No, 盖 塞 ,混合 ,离心 (4000 B/D) 3 分钟 ,并 小 心 移 去 上 层 有 机 相 。 mua! Sate S Na RF 裂解 : 水 相干 燥 后 { + 50nd 无 水 三 氟 栈 酸 ( 溶 沪 呈 玫瑰 红色 ) / 通 Ni, HWA 150°C 反应 15 分 钟 VON, 吹 干 或 减 压 和 干燥 注意 ,若是 Pro-Pro,Pro-Ile, Pro-Val Ile-Ile, Val-Val 键 重复 裂解 1 一 2 Me Hite: 上述 干 燥 物 | 十 300ml 重 蒸 水 {+2 X 50ml BERT Bs * 126° | 通 Na, HERE. EA, Bt 4000 转 / 分 ) 3 分 钟 4 将 两 次 上 层 酯 相合 并 ,干燥 作 转 化 下 层 水 相干 燥 进 行 下 一 循环 转化 ， 上层 酯 相干 燥 后 4 +30—40 pl 50% 三 氟 酷 酸 / 水 (溶液 旦 玫瑰 红色 ) |) iH NL HHS | 1 50°C 反应 50 分 钟 | REEF RRR ON. ORI 1 滴 无 水 乙醇 溶解 ,用 于 鉴定 。 (5) 降解 后 的 DABTH- 氢 基 酸 的 鉴定 @@ 用 聚 酰胺 薄膜 鉴定 : “ ” 载 取 聚 酰胺 薄膜 2.5 X 2.5em 或 3 X 3cm， 用 毛细 管 吸取 转化 后 的 乙醇 液 点 于 薄膜 的 一 角 ( 约 3 X 3mm 交点 处 ) 上 ,点 子 的 直径 约 为 Inmm， 点 样 量 视 样 品 浓度 而 定 , 一 般 以 点 子 显 淡 黄色 为 止 。 然 后 在 样品 原点 点 上 标记 物 ， 按 层 析 溶 剂 A:I\II 系统 展开 (注意 ， | 相 层 析 后 一 定 要 歇 干 除 尽 溶剂 后 再 进行 U HE). REA. 将 膜 吹 干 ,暴露 在 盐酸 蒸 气 下 ; 即 可 显示 出 蓝 色 的 DLE 标记 物 点 和 红色 的 DABTH- 氢 基 酸 检 出 斑点 。 对 照 标准 层 析 图 谱 上 各 氨基 酸 点 与 参考 点 D、E 的 相对 位 置 ， 不 难 判断 被 鉴定 的 点 ( 见 图 7-4 和 74 Je 图 7-4 标准 DABTH-MERRAKERKREWRLHRAS 图 7-5 DABTH=Giu- 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 检 出 (CD、E 为 标记 点 ) CD、E 为 标记 点 ) 4 wise ye Leu,le WR do eee RRL, 用 氯仿 /甲醇 《50:2V/AV) 单 向 层 析 鉴 定 ( 见 图 Z=6)5 Q@ 用 氨基 酸 分 析 仪 鉴定 : HY DABT2- 氮 基 酸 (未 经 转化 ) 或 DABTH- 毛 基 酸 于 一 小 水 解 管 中 ， 减 压 干 燥 后 加 100ml 5.7VHCI (内 含 0.1% SnCl:) 通 Nz, HOF 150° 水 解 4 小 时 。 水 解 毕 , 小 心切 开封 管 口 , 减 压 干 燥 , 加 适量 pH2.2 柠檬 酸 钠 缓冲 液 上 氨基 酸 分 析 仪 e127 分 析 。 (6) 注意 事项 @ DABITC 与 蛋白 质 或 多 肽 的 作用 与 Edman 试剂 的 降解 一 样 , 需 要 避免 氧 或 醛 化 物 , 加 之 微量 化 操作 ,因此 所 用 试剂 要 按 顺 序 级 要 求 处 理 * 器 严 要 严格 洗涤 ,每 步 反 应 都 应 在 Nz 下 进行 。 令 a 4 2 L LAL I 7-6 DABTH-lIle 和 DAB- TH-Leu 4ERBE LN Se I % DABTH-lle, L 为 DABTH-Leu,I/L 为 二 种 物 质 的 混合 物 。 经 盐酸 蒸气 薰 后 显 红色 斑点 。 @ 每 次 抽 提 需要 小 心 ， 尤 其 蕊 水 性 肽 在 用 庚 烷 -乙酸 乙 酯 抽 提 时 易 产 生 沉淀 或 薄膜 , 它 悬 译 在 有 机 相 和 水 相 中 间 ，, 切 幻 吸 Bo @ 谷 氮 酰 胺 和 天 冬 酰胺 可 能 有 8—15% 水 解 成 谷 氨 酸 和 天 冬 氮 酸 ,在 鉴定 前 者 时 ,在 图 谱 上 往往 会 出 现 后 者 比较 痰 的 斑 Flo @® Leu(Ile), Val, Met, Phe 等 几 个 层 析 点 位 置 接近 人 ( 见 图 7-4) ,需要 小 心 鉴 别 , 当 发 生 困 难 时 ,， 可 于 样品 斑点 上 加 点 标 准 DABTH-Leu,(Ile) Val 或 Met, Phe 等 ， 前 后 斑点 诊 度 的 变化 ,有 助 于 鉴别 。 ® Ser 和 Thr 副 反 应 较 多 ,一 般 可 能 有 3 一 4 个 产物 ;DAB- TH-Ser; DABTH-Ser^( 失 水 产物 ); DABTH-Sera( 失 水 后 再 KAT), DABTH-Ser® 〈 失 水 后 再 加 水 产物 )。Thr 通常 有 二 个 产物 ， 即 DABTH- Thr(T) 与 失 水 产物 (TO) ,它们 在 层 析 图 上 ( 见 图 7-4) 都 有 反映 ， 其 原因 主要 是 由 于 用 无 水 三 氟 醋 酸 处 理 时 ， Ser, Thr 失 水 引起 的 ,其 反应 如 下 : DABTC-Ser- TFA 0 AB HONCNE-DAB oy THN NH-DA H2C > > H.C 5 ear ga (4 CH. HO O O O S a DABTZ-Set er on I/Hs0 bday 三/H20 3 -DAB 以 区 本 HAC .CCNNDA NS a YS 人 cm， HO H Hq HN By DABTH-Ser [DABTZ-Sér JH+/H,0 HOT 一 N-DAB Hye ws . Ha3C、 蕊 DABTH-Ser] DAB-HCNAZNTN 人 "Mare 赖 氮 酸 可 出 现 三 个 不 同 颜色 的 衍生 物 。 I. c-DABTH-s-DABTC-Lys (紫色 ) 结构 式 : “128! O rth a (CH.),-- C= ¢ : | cas i | N N—DAB |; | i poms RE wilhar 一 ios 5° DABTG ae Il. a-PTH-e-DABTC-Lys ( 蓝 色 ) 结构 式 : 8-DABTC a-PTH Ill. a-DABTH-e-PTC-Lys (红色 ) 结构 式 : rae NH—(CH,),-;-C ——C 1 ‘ ne | ' : , Q I 办 乙 Z | 总 > ow Omni) 其 中 DAB 一 N 一 —N=N— CH,” @ 为 保证 R; 值 的 重 现 性 , 层 析 溶 剂 应 不 断 更 新 。 在 聚 酰胺 膜 上 展开 后 ， 如 遇 末 点 拖 尾 、 可 用 120m 水 /乙酸 丁 酯 (2:1) 萃取 DABTH- 氢 基 酸 ,随后 取 酯 相 ( 可 作 适 当 浓 缩 ) 重 新 点 在 薄膜 上 鉴定 。 五 、 氛 肽 酶 降解 法 氨 肽 酶 是 专 一 性 从 N 端 基 逐个 降解 蛋白 质 或 多 肽 的 一 类 外 肽 酶 。 氨 肽 酶 的 种 类 很 多 , 表 7-9 所 列 是 其 中 的 一 部 分 ,最 常用 的 是 亮 氨 酸 氨 肽 酶 (LAP) ,该 酶 是 一 种 金属 酶 ,需要 Mg ”或 Ma 。 表 7-9 各 种 氨 肽 酶 及 它们 的 专 一 性 ” y ak & 酶 的 专 一 性 CNH2:A- 一 B…) 酶 来 - 源 亮 氨 酸 氨 肽 酶 (LAP) Leu RR» A= 非 极 性 残 基 时 也 很 快 B= Pro 时 A 不 能 猪 肾 人 肝 亮 氨 酸 氮 肽 酶 与 上 同 人 肝 (HLA) 氨 肽 酶 一 M 除 一 般 氨 基 酸 外 也 能 水 解 Pro 及 碱 性 氨基 酸 猪 肾 A:Leu>Phe>Val>Ala>Val A 是 极 性 时 反应 低 嗜 热 菌 氮 肽 酶 1 很 不 专 一 > 脂肪 链 及 芳香 旅 侧 链 反应 好 ， 酸 性 ， 碱 性 氨基 酸 及 Pro | Bacillus 也 能 作用 stearothermophilus Aeromonas 具 广 泛 的 专 一 性 *A = Pro REF WRK Aeromonas proteolytica SHR Sh A BABS 广泛 的 专 一 性 *A = Pro 时 也 能 作用 * 肽 与 大 肽 都 能 反应 Clostridium histolyticum 二 肽 氨 肽 酶 -1 B 和 (或 )C 是 酸性 氨基 酸 时 ， 水 解 速度 下 降 ; B 和 人 或 )C 是 Pro 鼠 肝 (DAP-I) aaa > 端 基 A 是 Arg 或 Lys 时 ， 也 不 水 解 。 其 他 不 二 肽 氨 肽 酶 -IV 具 广 泛 专 一 性 BE Pro 时 也 能 水 解 猪 肾 (DAP-IV) a 引 自 鲁 子 贤 < 蛋 白质 化 学 > 第 29 一 31 页 ,科学 出 版 社 (1981)。 用 氨 肽 酶 测 N 端 顺序 与 羧 肽 酶 测 C 端 顺 序 一 样 , 也 存在 某 些 缺点 ,一 是 氨 肽 酶 对 不 同 侧 链 基 团 的 氮 基 酸 残 基 释 放 速 度 不 同 ; 二 是 无 法 控制 反应 点 。 因此 根据 反应 时 间 与 残 基 释放 量 作出 的 动力 学 曲线 图 同 羧 肽 酶 法 一 样 ,有 时 难以 判断 。 还 有 一 类 氨 肽 酶 能 从 N 端 连 续 地 往 里 切 下 二 肽 ， 称 为 二 肽 氨 肽 酶 。 表 7-9 列 出 部 分 二 肽 氨 肽 酶 ， 人 1 对 氨基 酸 侧 链 选 择 性 不 强 ， 下 面 是 用 该 酶 水 解 一 些 肽 的 结果 ( 见 图 7-7)。 25 | RR RBA : SerT yr SerMet GluHis PheArg TrpGly LysProVal-----+ Phe 胰 高 血糖 素 His Ser GlnGly ThrPhe TyrSer AspT yr SerLys TyrLeu AspSer ArRArgAlaGlnAspPhe……IThr By Ve eK HisSer AspGly ThrPhe ThrSer GluLeu SerArg LeuArg AspSer AlaArg LeuGln ArgLeu----- Val NH, 牛 胰岛 素 A 链 (SH HARA) Glylle ValGlu GlnCys CysAla SerVal CysSer LeuTyr GinLeu GluAsn TyrCys Asn 牛 胰岛 素 B 链 ( 磺 酸 型 ) PheVal AsnGln HisLeu CysGly SerHis LeuVal GluAla LeuTyr LeuVal CysGly GiuArg GlyPhe PheTyr ThrProLysAla 血管 紧张 肽 U CAD AspArg ValT yr IleHisProPhe 血管 紧张 肽 UW 酰胺 CCIBA) AsnArg ValTyr ValHisProPhe 图 7-7 ”二 肽 氨 肽 酶 -1 水解 一 些 肽 的 结果 。 排 斜 体 部 分 是 能 被 水 解 产生 的 二 肽 ， 排 正体 者 为 不 能 被 水 解 的 部 分 。 在 上 述 肽 中 ,如 先 从 人 端 切 去 一 个 残 基 , 再 用 该 二 肽 酶 降解 然后 分 离 ， 并 分 别 测 定 它 们 的 二 肽 结构 ,那么 只 要 将 后 一 次 测定 的 一 套 二 肽 与 第 一 次 测定 的 一 套 二 肽 相 比较 ,就 能 得 到 被 测 肽 的 顺序 或 肽 的 N 端 部 分 顺序 。 * 130° 参考 xX BR Edman, P.: Method for the Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides, Acta. 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Peis ee The eeooe NH-- duc eae d. | 载体 (树脂 ) (Oo LE eo a NH NH 由 一 S sets NH : 6 加 NH Na c=s on a ae R, ( cH, Ye | | CH—CO — NH —CH—CO -------- NH--CH —COOH | R, TFA Y Ta 人 | NH C 一 S | | c=s NH | | NH | © 加 | NH | | NH c=s | C NH AS | S N R, (CH), | | | | O=C—-CH—R, NH,—CH—CO-----NH—CH—COOH 图 8-5 用 双 功 能 团 交 联 剂 DITC 固定 肽 或 蛋白 质 到 载体 上 的 示意 力 — 0 BY" 9 gi. ， GRR oss (CHe)3*NHz 蛋白 质 (NHz) ER — Osi H nuc® ) mes CEPR OSS CHa NH-CS-N sn) 质 8-6 用 DITC 将 肽 (或 蛋白 质 ) 固 定 到 多 和 孔 玻璃 载体 (APG) 上 | 而 是 在 肽 链 中 间 位 置 , 当 顺 序 降 解 到 该 赖 氨 酸 键 合 位 点 ,这 个 与 载体 相 键 合 的 赖 氨 酸 残 基 就 不 能 被 检 出 ,而 出 现 缺口 ”, 若 肽 链 在 该 赖 氨 酸 残 基 后 面 还 有 赖 氨 酸 残 基 或 其 它 残 基 侧 链 ( 如 S- 氨 乙 基 半 胱 氨 酸 ) 被 固定 在 载体 上 ， 那 末 该 肽 链 的 顺序 可 继续 测定 下 去 ,否则 整 个 肽 链 将 脱离 载体 ,致使 顺序 测定 终止 。 表 8-2 用 DITC 固定 肽 于 APG 上 的 产 率 来 源 kK 狗 下 颌 腺 抑制 剂 Thr-Leu-Asn-Lys 3-H ES SS Gly-His-Leu-Lys 36) F emi Be ll 7A Asn-Tyr-Ser-Asn-Lys 狗 下 颌 腺 抑制 剂 Cys-Ser-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Lys 3- 磷 酸 甘油 醛 脱 气 酶 Tyr-Leu-Pro-Gly-His-Lys 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 Val-Phe-Glu-Glu-Asp-Ile-Gly-Gly-Lys 3A HT ARE BE 3 Rett HARE SL Ile-Ala-Ser-Glu-Val-Ala-Ala-Asp-Glu-Lys Leu-Pro-Pro-Asn-Val-Val-Ala-Val-Pro Asp-Val-Val-Lys Pro-Phe-Gly-Lys 胰 高 血糖 素 ，AEC- 胰 岛 素 A,B 链 猪 胰 胰 蛋 酶 抑制 剂 , 肌 红 和 蛋白? 溶菌 酶 天 然 肽 天 然 肽 天 然 肽 L, 固定 溶剂 体系 : 吡啶 :水 :三 乙 胺 =15:10:1(V/V)。 , 固定 盗 剂 体系 : 二 甲 基 甲 酰胺 (DMF): 三 乙 胺 = 王 10:1(V1V)。 §| Solid phase Methods in Protein Sequence Analysis, p.41, Pub. Peirce Chemical Co.(1975), 对 于 肽 链 中 的 精 氨 酸 残 基 〈C MaRIEC ta), ASA AK SH Mit S AB 残 基 , 方 可 用 DITC 法 固定 。 精 氮 酸 转化 成 乌 氨 酸 的 反应 是 : © 139 HN, C —NH—(CH,);—CHNH,—COOH H,N H,NNH,(#f)/H,0 H,N—(CH,);—CHNH,—COOH 转化 后 的 乌 氨 酸 比 赖 氨 酸 分 子 少 一 个 碳 原 子 , 其 它 化 学 结构 相似 ,因此 完全 能 按 固定 赖 氨 酸 侧 链 氨基 的 方法 固定 乌 氨 酸 的 侧 链 氨基 ， 但 固定 产 率 不 如 赖 氮 酸 〈 见 表 8-3). 用 肝 处 理 容易 产生 副 反应 ,尤其 当 肽 链 中 含有 天 冬 酰 胺 残 基 时 ， 用 脐 处 理 Asn-x 肽 键 易 产 _ 生 有 裂解 。 此 外 , APOE. me RAR. BM DITC 也 将 和 腊 反 应 ,使 固定 效力 降低 ， 因此 使 用 腊 处 理 需 格外 谦 愤 。 表 8-3 用 DITC 固定 乌 氨 酸 肽 于 APG 上 的 产 率 x EK Anemonia sulcata Phe-Pro-Arg Anemonia sulcata Val-Gly-Arg 53 Anemonia sulcata Val-Cys-Gly-Val-Arg 44 抑制 剂 Anemonia sulcata Phe-Ile-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg 16 抑制 剂 狗 人 氨 下 腺 抑制 剂 Gly-Ser-Glu-Ile-Ala-Cys-Pro-Arg 30 Anemonia sulcata Gly" -Pro-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp 30 毒素 3 e Gly-Pro-Ser-Val-Arg 引 自 ; Solid Phase Methods in Protein Sequence’ Analysis, p.42, Pub. Plirce chemical Co. (1975), 2. 实验 方法 主要 试剂 和 材料 : APG 或 AEAPG (从 LKB 公司 进口 或 自己 制备 )。 DITC (从 Peirce 公司 U. S. A. HE), DMF (二 甲 基 甲 酰胺 ) 按 顺序 级 处 理 ( 见 附录 )。 DMAA 缓冲 液 (配制 见 第 七 章 Edman 降解 法 实验 )。 甲醇 乙醇 胺 ,分 析 纯 重 蒸 处 理 。 小 型 烧结 玻璃 漏斗 \ 减 压 装置 (水 泵 或 油泵 )\ 恒 温水 浴 等 。 方法 : (1) 称 100mg DITC 于 一 小 试管 中 ,加 1.3ml DMF 溶解 ， 通 Ni， 混合 后 加 180mg APG (或 AEAPG) (注意 需 分 批量 在 20 分 钟 内 加 入 , 边 加 边 摇 匀 )， 然 后 放 人 真空 干燥 器 中 除 气 ( 郊 气泡 后 ,关闭 和 泵 ,再 放置 20 Sh), 从 干燥 器 中 取出 ， 通 Na， 混 合 ， 于 室温 (25% 左右 ) 保 温 反应 2 一 3 小 时 ,然后 转移 到 烧结 玻璃 漏斗 中 ,分 别 用 DMF (4 X 2ml)、 甲醇 (4 X 2ml) RAR, RETR BAER LMA AE). KN APG 已 经 键 合 46 °DITC. ; | (2) 称 取 肽 或 蛋白 质 200nmol 于 一 带 塞 的 小 试管 中 ,加 lml DMAA 缓冲 液 溶解 后 ， 。140。 再 慢 慢 加 入 经 上 述 处 理 过 的 DITC-APG (也 是 分 批量 加 入 , 边 加 边 摇 匀 ), 然 后 置 于 50%C 保温 反应 45 一 60 分 钟 。 (3) 向 上 述 处 理 后 的 反应 混合 物 中 加 60AL 乙醇 胺 , 通 Na， 混 合 ， 于 50%c 保温 反应 30 一 60 分 钟 ， 以 封闭 尚未 反应 的 异 硫 氰 基 团 。 反 应 毕 ， 倒 人 烧结 玻璃 漏斗 内 ， 用 甲醇 (5 X 2ml) 洗涤 。 真 空 干燥 后 ,冷藏 保存 供 测 顺 序 用 。 如 果 采 用 微量 化 (如 DABITC/PITC 双 偶 合法 ) 测 顺 序 时 ， 可 将 上 述 材料 减 半 使 A™, (=) B#aRARE 1 原理 用 CNBr (UL SORE PRABREME RMA AOR REA 自身 C 端 肽 外 , C 端 甲 硫 氨 酸 都 转化 为 高 丝氨酸 残 基 。 它 在 酸性 介质 中 转化 为 内 酯 形式 ， 即 高 丝氨酸 内 酯 ( 详 见 第 四 章 蛋 白质 的 化 学 裂解 )， 可 直接 固定 到 载体 上 。 其 原理 如 下 : | R nay if HUN—CH—CONH «olen... NH—CH—COOH 高 丝氨酸 Ht R CH,—CH, | | | H,N—CH—CONH ……………- NH—cH O 高 丝氨酸 内 酯 SC I OD |rera 树脂 或 APG 载体 R | H,N—CH—CONH ………- NH 一 C 一 CONH 一 (载体 ) 因为 肽 链 是 通过 C 末端 高 丝氨酸 内 酯 与 载体 连接 ， 所 以 用 这 种 方法 固定 的 肽 链 所 有 氨基 酸 残 基 原 则 上 都 能 被 检 出 。 用 高 丝氨酸 内 酯 法 固定 肽 链 一 般 比 较 可 靠 ， 固 定 产 率 在 40-90%, 最 高 达到 95% 〈 见 表 8-4 和 8-5)。 缺点 是 仅仅 适用 于 C 末端 是 高 丝氨酸 内 酯 的 肽 链 ， 受 到 很 大 限制 。 CNBr 裂解 法 是 蛋白 质 裂 解法 中 最 常用 的 基本 方法 之 一 ， 甲 硫 氮 酸 残 基 在 蛋白 质 中 的 含 量 一 般 都 不 太 多 ,裂解 后 的 C 末 端 高 丝氨酸 内 酯 肽 的 大 小 常常 比较 适中 ， vl 3 hal al 顺序 中 ,高 丝氨酸 内 酯 固定 法 仍 是 经 常 采用 的 方法 。 1976 年 Herbrinkc4 曾 提出 N-(P- 异 硫 氰 酸 苯 甲 酰基 )-DL 高 丝氨酸 内 酯 (N-(P- isothiocyanatobenzoyl )-D L-homoserinelactone) jA#fl] , GAO AWARE: - 141° | | soan-()-c- NH—| O | Ld O | O ' 它 具有 二 个 不 同类 型 的 功能 团 ,具有 DITC 和 高 丝氨酸 内 酯 二 者 的 活性 ， 因 此 利用 这 个 试剂 不 仅 可 把 DITC 法 和 特殊 的 高 丝氨酸 内 酯 法 结合 起 来 ,也 可 避免 肽 的 交 联 。 男 定 肽 的 原理 如 图 8-7 所 示 。 表 8-4 用 高 丝氨酸 内 酯 法 固定 不 同 的 肽 于 不 同 载体 上 的 相对 产 率 比 较 ASN-ASN-ASP-ASP-THR-GLU-ARG-ILE-ILE-THR VAL-TYR-HSE GDH | cxs-LEU 一 GLN-ASN-HIS-PRO-GLU-HIS-HSE | 30% (10 nmol!) | 一 | 一 一 一 一 一 被 固定 的 肤 ServachromG4 550A Gly-Hse 一 Pro-Hse ie Leu-Hse 0.02 溶菌 酶 1 一 12。 0.41 胰 高 血糖 素 。 < TE 2 Rasa" 0.40 1—55 肌 红 蛋白 。 0.43 56—132 a. CNBr 有 裂解 肽 ? 表 中 的 最 高 产 率 1.00 是 相对 值 * 并 不 等 于 100% 固定 产 率 。 表 8-5 用 不 同 载体 固定 不 同 来 源 的 高 丝氨酸 肽 产 率 比 较 1 | | 来 源 被 AH © WH Kk TEAE | APG |p8-APG | j*28(%) F LYS-GLY-PRO-ALA-GLY-HSE | + 50%(80% AAA) F HPR-GLY-PHE-HPR-GLY-HSE + 未 测定 F GLY-PHE-HPR-GLY-PRO-HPR-GLY-HSE 十 90% F GLN-GLY-PRO-HPR-GLY-GLU-HPR-GLY-GLU- + AWE HPR-GLY-ALA-SER-GLY-PRO-HSE F ARG-GLY-ASN-HPR-GLY-SER-ARG-GLY-LEU- 十 未 测定 HPR-GLY-ALA-ASP-GLY-ARG-ALA-GLY-VAL-HSE R ALA-GLY-VAL-HSE + RR + 90% | + RR + 70% eee SK ASP-TYR-THR-LEU-THR-GLY-LYS-VAL-GLU-ASP | GDH THR-GLY-LYS-SER-ILE-GLU-GLU-LEU-GLU-LYS 40% GLU-HSE M Glucagon 〈 胰 高 血糖 素 )1-27 10% M Glucagon 1-27 709 F. 胶原 蛋白 肽 ，SK. mK. GDH. 3-BMA MRAM. M. 天 然 肽 。 表 8-4,8-5 同 引 自 Laur Sen, R.A.: Solid-phase Methods in Protein sequence Analysis, p.39—40, Pierce chemical co.Rockford (1975), ° 142° HELD BY AE Ta-( heMUE-d)-N FY L-8 图 HOOOHONH 一 ---------- N°H reH) CD ooH?HN'09 cuacannesecerrsneseameereeeee ma stcasetea cette Cis ei ee ea | R—N=C=N—R (DCC) NR WE R’ NR 0 站 二 ae HH I. O-N 酰基 迁移 Tl. 4 RAZA ABB R R’ | Vi CONCONHR N—C | a SA et RENO ESE Ree fea ic aatbion a oetasemes -der die ofertas C H ~ O — TETA 树脂 或 APG \ oO i CONCONHR R’ | | ER CONHCHCONH..-.。 树脂 | ‘TFA CONR—CONHR R’ | | Eig Nfeseee es 本 CONH 一 CHCONH..….。 树脂 图 S-9 用 碳化 二 亚 胺 (DCC) 法 固定 肽 于 载体 上 表 8-6 用 DCC 或 EDC 固定 C 端 有 于 APG (或 6-APG) 的 产 率 比较 | K Hi 载 体 | ws 剂 | 固定 剂 | 产 率 % | 狗 颌 下 腺 抑制 剂 ”| Gly-Pro-Pro-Pro-Ala-Ile-Gly-Arg APG pec | 70 | 狗 颌 下 踪 抑 制剂 Ser-Arg-Gly-Thr-Ile-Phe APG EDC 80 独 颌 下 腺 抑制 剂 Leu-Gln-Asp-Thr-Ala-Cys-Ile-Glu-Glu- APG 55 Cys-Thr-Glu-Tyr ancmonia Sulcata 毒素 I Gly-U, -Pro-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp--- APG 40 RRIK 氧化 型 胰岛 素 A 链 APG I : 40 RRK 氧化 型 胰岛 素 A 链 B-APG 65 天 然 肽 氧化 型 胰岛 索 B 链 APG 55 天 然 肽 氧化 型 胰岛 素 B 链 B-APG 70 MAB I: DMF, 7] U: DMF/ 吡啶 :盐酸 ?pH5.0,1mol/1 9:1(V/V) i] Wl: 二 氧 杂 环 已 烷 / 水 pH4.0。 5| Laursen, R.A., Solid phase Methols in Protein Sequence Analysis, p.43, Pub. Peirce chemical Co. (1975), 。145 。 2. 实验 方法 主要 试剂 和 材料 : EDC， 吡 啶 ( 按 顺 序 级 处 理 ), 其 它 同上 。 方法 : | (1) 称 多 肽 或 蛋白 样品 200nmol 于 一 带 塞 的 玻璃 试管 中 { 约 7 X 1(cm)]， 加 0.4ml DMAA 缓冲 滚 。 溶 解 后 ,再 加 30ml PITC, 通 Na, 盖 塞 ,混合 ,于 50C 保温 反应 30 分 钟 ， 后 用 葵 [5 X 1(ml)] 抽 提 过 剩 试剂 ,每 次 通 NWA. HD 3000 转 / 分 离心 3 分 钟 ,小 心 移 去 上 层 有 机 相 , 下 层 水 相 减 压 于 燥 。 (2) 称 取 180mg APG( 或 AEAPG ) 置 于 烧结 玻璃 漏斗 中 ,先后 用 吡啶 -水 (lmol/l 吡 RE pH5.0) [3 X 2(ml)], BARK [5 X 2(ml)], DMF[1 X 2(ml)] BHR. KAMAE io (3) 在 干燥 后 的 PTC- 肽 的 试管 中 加 入 0.5ml DMF 〈 其 中 含 3mg EDC) 彻底 溶解 后 ,在 室温 (25%c 左右 ) 静 放 5 DH, 然后 分 批 加 和 人 经 过 处 理 的 座 的 APC 载体 ( 边 加 边 摇 动 混合 ) ,最 后 于 37°C 保温 反应 3 小 时 ( 需 时 常 摇动 ,混合 ), 反 应 后 置 于 室温 下 过 夜 。 (4) 在 过 夜 后 的 PITC- 肽 -APG 试管 内 分 别 加 入 0.25ml MITC 和 0.25ml N- 甲 基 吗 啉 , 通 Note IRA. T 45°C 保温 反应 40 分 钟 。 反 应 毕 倒 人 烧结 玻璃 漏斗 中 (试管 用 DMF 洗涤 几 次 ， 一 并 倒 人 )。 然后 分 别 用 DMF [5 x 2¢ml)], FR [5 X 2(ml)] &% 涤 ,洗涤 后 真空 干燥 ,冷藏 保存 待 测 顺序 用 。 三 、 双 偶合 法 在 手工 固 相 顺序 测定 中 的 应 用 [413:17] (一 ) 用 EDC 方法 固定 胰岛 素 A 链 主要 试剂 和 材料 : 胰岛 素 A 链 (一 S 一 S 一 CH 型 )。 APG #%f&, MITC,N-FAZERGM (L.K. B. Biochrom 产品 ),;DMAA 缓冲 液 ;TFA， PITC (Pierce Co. U. S. A. 产 品 顺 序 级 )。 其 它 均 为 国产 分 析 纯 ( 重 蒸 ) 试 剂 。 恒温 水 浴 , 高 纯 氮 ,快速 混合 器 , 减 压 干燥 装置 , 沙 巷 漏斗 等 方法 : (1) 制备 PTC-Ins-A: 称 Ins-A 0.4mg 于 一 带 塞 的 小 试管 中 ， 加 DMAA Bip wR 0.4ml, PITC 30ml (二 滴 ), 然 后 通 N， 盖 塞 , 在 混合 器 上 充分 混合 后 于 50% 反应 30 分 钟 ， 并 随时 摇动 。 反 应 后 用 lml 葵 抽 提 过 量 试剂 五 次 ， 每 次 抽 提 需 通 Na， 混合， 离心 (3000 转 / 分 ) 3 分 钟 , 去 上 层 波 。 下 层 (水 相 ) 真 空 干燥 , 放置 过 夜 。 (2) APG 的 活化 : 称 APG 载体 120mg， 在 烧结 漏斗 上 分 别 用 吡啶 -盐酸 缓冲 液 (lmol/1 PH5.0)、 重 蒸 水 洗 五 次 每 次 各 2ml, DMF 2ml 洗 一 次 。 (3) 将 PIC-Ins-A 国定 到 APG 上 :从 真空 干燥 器 中 取出 PTC-Ins-A， 加 0.5ml DMF (内 含 3m8.EDC)， 通 Na 在 混合 器 上 混合 ,室温 下 放 5 分 钟 ,然后 慢 慢 地 加 人 活化 的 APG ,并 随时 摇动 。 最 后 于 37%c 保温 反应 3 小 时 (注意 时 常 摇动 ) ,反应 后 从 水 浴 中 取 出 并 置 室温 下 过 夜 。 。146 。 (4) 封闭 载体 上 剩余 的 氨基 : 分 别 加 0.25mi MITC 和 N-MALE ae me REA, BN. 盖 塞 ， 混 合 ， 于 45%C 反应 40 分 钟 。 反 应 后 将 试管 内 的 APG- 样品 倒 人 烧结 漏斗 中 ,分 别 用 DMF ,甲醇 每 次 各 2ml 洗 三 次 ,然后 减 压 干燥 , 供 顺 序 分 析 用 。 (=) 双 偶 合 手工 固 相 法 顺序 测定 试剂 和 材料 DABITC (Pierce Co. U. S. A) 用 沸 丙 酮 重 结晶 APG= 肌 红 和 蛋白 ( 工 K. B. Biochrom 提供 ) 带 塞 小 试管 (7 X lcm), 并 备 有 沙 世 的 空心 塞 , 其 它 同 上 。 方法 : (1) 偶合 . 称 APG-Ins-A 和 APG- 肌 红 蛋 白 (LKB Biochrom. 提供 ) 各 20—25mg, 分 别 装 人 带 有 塞 盖 的 小 试管 内 , 约 1X7(cm), 加 400m50 多 吡啶 /水 和 约 0.6mgDABITC/ 200! 吡啶 〈 新 鲜 制 备 ) 通 Naz， 盖 塞 ， 充 分 混合 ， 于 50° 反应 45 分 钟 后 再 加 50 微 升 PITC, 通 No HH, HHA, 50CRM30 分 钟 ,以 完成 双 偶 合 反 应 。 然 后 去 掉 原 瓶 塞 , 换 上 带 有 沙 芯 的 空心 塞 ， 用 减 压 吸 去 液体 ,再 分 别 用 吡啶 ,甲醇 洗 二 次 ， 每 次 各 -2ml， 减 压 干燥 。 (2) Rw: 加 200 微 升 三 氟 酯 酸 , 通 Naz， 盖 瓶 塞 , 混合 ， 于 50%C 反应 15 分 钟 ， 减 EPR. 300ml 甲醇 ,充分 混合 , 静 放 片刻 , 见 颗粒 沉淀 , 用 吸管 小 心 吸 出 上 层 液 于 另 一 小 试管 中 , 通 N: 歇 干 ,用 于 转化 反应 。 剩 下 的 沉淀 物 再 用 2ml 甲醇 洗 二 次 ,干燥 后 用 于 下 一 残 基 的 降解 。 (3) 转化 : 吹 干 后 的 样品 ,加 50m 50% 三 氟 栈 酸 / 水 , 通 Nz, 用 蜡 膜 封口 ,充分 混合 后 ,于 50%C 反 应 50 分 钟 ,真空 干燥 (或 通 N; 吹 干 ), 加 10 一 20 几 〈1 滴 ) 无 水 乙醇 溶解 ， 用 FEE. (=) TLC 鉴定 及 结果 主要 试剂 和 材料 聚 酰胺 薄膜 (Pierce U. S. A 产品 )， 其 它 材 料 和 试剂 均 系 国 产 分 析 纯 ( 重 蒸 )。 方法 : 用 毛细 管 取 上 述 转化 后 的 乙醇 -样品 溶液 约 1/10 一 1/20 点 样 于 聚 酰胺 薄膜 (2.5x 2.5cm) 的 一 角 上 ( 约 3 X 3mm 交点 处 )， 查 点 直径 约 1Imm， 点 样 后 在 原点 再 点 上 标记 物 ， 然 后 分 别 用 溶剂 I (33% CB) 和 溶剂 MW (甲苯 :n- 已 烷 : 乙 酸 一 2:1:1 (V/V/V) 进行 双向 层 析 。 层 析 后 , 吹 干 。 用 盐酸 蒸气 攻 ， 显 示 的 红色 斑点 为 DABTH- 氨 基 酸 ， 与 标准 的 DABTH- 氮 基 酸 斑点 位 置 对 照 ( 它 们 与 标记 点 的 相对 位 置 是 恒定 的 ) 即 可 确认 。 结 果 见 图 8-9 和 8-10, 图 8-10 是 胰岛 素 A 链 顺 序 TLC 层 析 图 谱 , 其 中 6,7,11,20 是 半 胱 氨 酸 残 基 ( 图 中 未 给 出 ), 第 21 残 基 是 该 链 羧 端 连接 APC 载体 上 的 天 冬 酰 氨 残 基 。 图 8-11 是 册 红 蛋白 N 端 片 豚 肽 ( 胰 蛋 白 酶 裂解 ) 顺 序 TLC 层 析 图 谱 , 因为 肽 链 是 用 DITC 方法 连接 ,第 一 残 基 不 能 检 出 。 第 27 残 基 应 为 谷 氨 酸 ,由 于 量 不 大 , 层 析 图 上 显 色 不 明 ,无 法 确认 。 第 31 残 基 是 羧 端 精 毛 酸 残 基 , 通 过 它 与 APC 载体 连接 。 所 以 本 实验 一 e147 . be 8-10 胰岛素 A 链 顺序 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 双 相 层 析 图 谱 经 盐酸 蒸汽 藤 后 ，d、e (1) 为 标记 物 DABTC- 二 乙 胺 和 DABTC- 乙 酵 胺 ， 显 蓝 色 ， 图 中 用 英文 字母 标的 点 为 降解 产物 DABTH- 氨 基 酸 * 呈 红色 。 图 8-11 ， 肌 红 蛋白 N 端 片 疏 肽 顺序 在 聚 酰胺 薄膜 上 的 双 相 层 析 图 谱 BRB AM > d. ¢ (2) 为 标记 物 DABTC- 二 乙 胺 和 DABTC- 乙 醇 胺 , 显 蓝 色 。 用 英文 字母 标的 点 为 降解 产物 DABTA- 氨 基 酸 * 显 红色 。 +1486 次 连续 降解 并 测定 胰岛 素 ARE 2 个 残 基 , 肌 红 蛋 白 片 段 肽 30 个 残 基 , 胰 岛 素 A 链 的 用 量 不 到 100wg， 每 天 能 测定 2 一 3 个 残 基 , 速 度 比 手工 液 相 法 提高 一 倍 。 从 所 得 结果 说 明 固 相 顺 序 法 是 满意 的 。 四 、 固 相 法 测 顺序 的 优 缺 点 (一 ) 固 相 法 的 优 缺 点 固 相 法 入 相 法 一 样 ， 从 理论 上 讲 被 载体 所 固定 的 肽 链 可 以 无 限 连续 地 一 个 个 降解 下 去 ,事实 上 降解 步 数 是 很 有 限 的 ,通常 只 能 连续 降解 20 一 30 步 。 其 原因 除了 Edman 降 解 反应 本 身 的 产 率 影 响 外 ， 还 在 于 : 〈1) 待 测 的 蛋白 质 或 多 肽 样品 固定 到 载体 上 的 产 率 和 它们 的 牢固 程度 。 这 取决 于 样品 的 类 型 〈 包 括 C 末 端 基 团 或 侧 链 基 团 的 类 型 及 肽 链 的 长 短 等 )\ 载 体 和 固定 方法 的 选择 及 实验 操作 的 优 劣 。 由 于 载体 机 械 性 破碎 导致 丢失 或 固 定 肽 不 完全 引起 肽 的 丢失 等 都 会 影响 降解 的 步 数 。(2) 非特 异性 肽 链 有 裂解 不 仅 导 致 已 固 定 肽 链 的 丢失 ,而 且 使 鉴定 时 杂 点 增多 ， 严 重 影响 结果 的 判别 。 Machleidt 和 Hofner 证 BA: 肽 链 的 非特 异 断 裂 多 半 是 在 酸性 氨基 酸 残 基 ( 如 Asp 和 Glu) 或 带 有 羟基 的 氨基 酸 Fee (in Ser 和 Thr) 所 形成 的 肽 键 处 发 生 。 天 冬 氮 酸 引 起 裂解 是 由 于 N 一 0 酰基 转 移 。 (3) Edman PER AAR, 如 氧 硫 交 换 或 微量 醛 的 存在 造成 氨基 的 封闭 ， PIH- 氢 基 酸 衍生 物 鉴 定 方法 的 局 限 性 等 在 固 相 法 中 也 同样 存在 。 加 之 非 均 相 反应 ,反应 和 有 裂解 试剂 需 次 人 载体 孔隙 中 方 能 与 肽 或 蛋白 接触 发 生 反 应 ， 因 此 影响 了 反应 的 定量 进 行 , 这 些 都 限制 了 降解 循环 的 步 数 , 并 增加 了 对 有 裂解 产物 判定 上 的 困难 。 ,- 固 相 法 的 优点 : C1) 一 般 说 来 , 肽 不 会 由 于 洗涤 或 萃取 而 丢失 ; 《2) 固 相 法 对 试剂 要 求 通 常 比 滚 相 法 低 , 因 此 处 理 简 便 , 价 格 便宜 ; (3) 无 论 是 用 手工 固 相 法 测 顺序 还 是 用 自动 固 相 仪 测 顺序 ,操作 都 比 液 相 法 (手工 或 自动 仪 ) 简 便 , 容 易 掌 握 ; (4) 固 相 法 测定 顺序 如 果 战 略 考虑 运用 得 当 , 不 仅 可 延长 连续 降解 的 步 数 ,还 可 大 大 节省 测定 的 时 间 。 (=) 固 相 法 测 顺序 的 战略 运用 示例 1: 含 45 个 残 基 CNBr 有 裂解 肽 的 顺序 测定 。 从 氨基 酸 组 成 分 析 知 道 含 Arg 和 Lys。 第 一 步 : 1 15 30 45 二 全 半生 和 Lys: Hser | 取 一 份 CNBr 裂解 肽 用 高 丝氨酸 内 酯 法 固定 到 载体 (树脂 ) 上 15 30 了 再:NN.……… Al geesrseseeses Lys eeecceccoece CONH---resin H,N teeter reeeee Arg eee eRe Tee © He eeeeeetene Lys seeeeeeee CONH—resin 一 > 一 > 一 > 一 > -> 一 > 一 > 一 > 取 另 一 份 CNBr Zwei ese erie ges ERAS DITC 法 固定 ,这 时 只 有 含 Lys 肽 被 固定 到 载 二 16 30 H,N eseccccccres LyS---resin + H,N----- seeeece Arg 经 过 洗涤 和 萃取 只 留 下 与 载体 相 键 合 的 肽 ,用 Edman 降解 ?连续 降解 15 步 ? 结 合 前 面 的 数据 ? 即 可 知道 该 肽 链 前 30 个 残 基 的 顺序 16 30 H,N Pererrrrr ery) LyS—resip 一 一 一 > 一 > 一 第 三 15 16 30 31 45 HNeoseeeeeeees Arg + H,N seesecececce Lys 十 HN……… Hser | ERROR ROSY FARRAR EME 31 45 1 15 16 30 H,N eeeccccccccs Hser — resin + H,N Cecccccccece Arg oo H,N cvecccccerce LvS 经 洗 脱 只 留 下 与 载体 相 键 合 Hse ERA Edman 降解 ,连续 降解 15 步 即 可 知道 该 肽 链 的 第 31 残 基 到 < 末端 第 45 残 基 的 顺序 31 45 HIN.…………。 Hser— resin > ee eee => 从 上 述 三 步 操作 测 得 的 结果 就 能 确定 45 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 CNBr 22 IKRY SC 顺序 。 整 个 过 程 只 进行 一 次 胰 蛋 白 酶 酶 解 ` 二 次 高 丝氨酸 内 酯 法 和 一 次 DITC Afi 眉 , 省 去 了 分 离 纯化 步骤 。 示例 2: 含有 60 个 氨基 酸 残 基 的 CNB: 裂解 肽 。 从 氮 基 酸 组 成 分 析 知 道 含 Arg 和 Lys。 第 一 步 : 取 一 份 CNBr ik 20 40 60 下 ORAS 本 用 20 25 40 H,N cccvccccccce Arg-………。 ay evccccccccse Lys eceerecccees Hser—$$}]§ PDP vccvcccrevccccccccvescce > 20 40 60 H,N occccccccccs Arg……… Lys oaceaseeesse Hser | 用 棕 康 酸 本 保护 Lys 的 s- 氨 基 后 ,用 胰 蛋 白 酶 酶 解 然 后 再 用 高 丝氨酸 内 醒 法 固定 21 40 60 20 H,N ececcccescce Lys ececcccccece Hser — resin + HIN.………… Arg | vei Are Bias JH Edman 降解 连续 降解 20 一 25 步 21 40 45 百 ;NN……。。。。。 LyS+seseeeseees Hser 一 树脂 te te tte > — 一 -一 -一 = — —— 一 一 一 | FRE AE AE hE BE GR) PR ee 41 HUDN Arg a Hser 一 树脂 21 40 ise : avhvaneedai Lys : | BEBE Arg BEAL Lys 肤 后 ,用 Edman 降解 ?连续 降解 20 步 41 60 HN.………。….Hser 一 树脂 一 > 一 > 一 > > PEM = SMe ES ee AE IK, RMT RD? Lys 的 s- 氨 基 和 二 次 胰 蛋 白 酶 酶 解 ,无 需 分 离 纯化 就 能 确定 一 个 含有 60 氨 基 酸 残 基 的 CNBr 裂解 肤 的 顺序 。 示例 3: 胰 高 血糖 素 的 顺序 测定 ca。 这 是 一 个 含 29 氨基 酸 残 基 的 活性 肽 ， 是 七 十 年 代 初 固 相 法 刚 问世 不 久 测定 的 。 这 个 肽 较 小 ,自动 液 相 仪 无 法 测定 。 用 手工 Edman HHH 法 或 其 它 方法 又 不 能 一 次 连续 测定 全 部 序列 ， 所 以 采用 固 相 法 并 按 下 述 的 战略 设计 测定 了 该 活 竹 肽 的 全 部 氨基 酸 排 列 顺序 。 第 一 步 : 取 二 份 胰 高 血糖 素 1 5 10 15 His 一 Ser 一 Glu 一 Gly 一 Thr 一 Phe 一 Thr 一 Ser 一 Asp 一 Tyr 一 Ser 一 Lys 一 Tyr 一 Len 一 Ser 一 Arg 一 Arg 29 .Ala--Glu 一 Asp 一 Phe 一 Val 一 Gln 一 Trp 一 len 一 Met — Asn—Thr | 用 CNBr 裂解 His 一 Ser 一 …………- Trp—Len—Hser + Asn — Thr | 再 用 胰 蛋 白 酶 裂解 , 共 形 成 Bea lLp ar H 67 —4F = 35 TKR 1 12 His—Ser--+++++-- Ser—Lys 工 一 1 13 17 Thr—len--------- Ser—Arg T-2 18 Alg 下 二 及 19 27 Ala 一 Glu.…………- Len—Hser T-—4 28 29 Aso—Thr T-5 ERE CNBr 裂解 ,然后 真空 干燥 去 掉 CNBr 试剂 ,再 用 胰 蛋 白 酶 酶 解 ,经 干燥 后 用 TPA 酸化 ,将 T-4 肽 的 C 端 转 化 成 高 丝氨酸 内 酯 。 第 二 步 : 取 上 述 混 合 肽 His 一 Ser.…… Ser 一 Lys T-1 Tys 一 Len… ……-Ser- 一 Arg 2 Arg 下 一 3 Ala 一 Glu.…………- Len 一 Hser 工 一 4 Asn 一 Thr T-5 | = Se» FN 2 SP EK TETA 树脂 上 站 Len—Hser—|TETA MARL + T—1+T—2+T—34+T —-—5 | 经 洗 脱 只 留 下 已 固定 到 TETA 树脂 上 的 Heer 肽 ,用 Edman 降解 测 顺 序 27 Ala 一 Glo.………-…-。 Len 一 Hser 一 FTETA 树脂 | 得 出 工 一 4 肽 顺序 一 一 一 一 一 一 一 一 > -一 ~ 。 151° 第 三 步 ， 将 上 述 洗 脱 下 来 的 肽 混合 物 (含有 T-1, T-2, T-3, T5 和 少量 因 固 定 不 完全 留 下 的 _T 一 4 ,因为 量 很 少 不 会 影响 下 面 的 顺序 测定 ) 干 燥 。 Tie T= 2 = Srp TT 5 上 用 PITC WH ARERBAEA TETA 树脂 上 His- 一 Ser-…。。。。。。.。 Ser—Lys—|TETA 树脂 | 4+T—2+T—-—3+T-—5 | 用 三 气 栈 酸 裂解 后 经 洗 脱 ;只 留 下 下 一 1 的 Lys 肽 ,并 用 Edman 法 测 顺 序 1 12 RSS Ser—Lys—|TETA AS] 得 出 工 一 1 其 顺序 一 > soooooeoooo。 一 > 一 > 用 DITC 男 定 法 , 除了 T-1 肽 被 固定 在 TETA 树脂 上 外 ， 其 它 几 个 肽 的 N 末 问 氨基 (HN 一 ) 也 将 共 价 键 合 在 树脂 上 。， 用 三 氟 酶 酸 处 理 后 ， 其 它 肽 裂解 从 树脂 上 掉 下 | NH is | 1 C=S C=S =S | ! f NH NH NH 1 1 4 1 1 4 NH . NH NH 2 { S =S c=S | i Q ; Laie cB Bea .Lys-CO; H CHRCNH( Az (43). ++ COs TFA 1 Cc=S ea C=S | NH NH NH 1 1 4 1 1 t NH a 1 3 Ce 人 Pom x + s N S N ue, ie aay, ef. sr(A) sees .«Lys-CO2H Ye oh Om Hz( As) ae .CO0a8 O RH \ O RH 8-12 ©,)52 来 , 唯 有 T-1 的 C 端 Lys Mitte 基 团 仍 牢固 地 键 合 在 树脂 上 , 因此 洗 脱 后 用 Edman 降 解 即 可 确定 T-1 肽 顺序 ,但 T-1 肽 的 N 端 残 基 仍 未 能 检 出 ,其 反应 原理 如 图 8-12。 第 四 步 ， 将 上 述 洗 脱 下 来 的 肽 混合 物 干燥 后 ,用 肝 处 理 使 Arg 一 Orn (20m), 随 ABANR AH, HA DITC 法 固定 肽 到 TETA 树脂 上 , 这 时 除了 T-2 肽 被 固定 外 ， 还 有 少量 工 -1 肽 ( 约 10% 左右 ) 也 被 固定 在 树脂 上 ， 在 鉴定 时 会 有 杂 s 点 出 现 ， 因 为 量 很 少 , 是 可 以 辨认 的 。 SET Ser 一 Lys T—1 (90% 以 上 去 掉 ) (Tyr)—len............ Ser—Arg T-2 (Arg) ary 3 (Ala) 一 Glu.……… Len 一 Hser T— 4(90% 以 上 已 去 掉 ) (Asn)—Thr T-5 1. NH,NH, 4b## 5 DITC 法 固定 1 se Ma et 树脂 | 得 出 工 一 2 肽 顺序 《括号 内 的 氨基 酸 已 在 第 三 步 中 被 固定 在 树脂 上 。) 到 目前 为 止 , 除 T-5 肽 (只 有 二 个 残 基 ) 以 外 ， 其 余 各 肤 和 顺序 已 基本 确定 ， 但 是 这 些 肽 侦 究 竟 怎 样 排列 还 不 清楚 。 另 外 ,因为 二 次 是 用 DITC 法 固定 ,所 以 T-1 的 N 末端 残 基 、T-2 N 端 的 第 一 二 两 个 残 基 和 T-3 还 不 清楚 。 为 此 需 把 整个 活性 肽 作 另 一 Say 考虑 并 测 它 的 顺序 。 第 五 步 : 取 另 一 份 胰 高 血糖 素 .用 DITC 法 将 该 肽 链 固定 到 TETA 树脂 上 - 用 Edman 降解 法 测 顺序 树脂 DITC a agate 因为 肽 链 是 通过 Lys 侧 链 s AS DITC 键 合 被 固定 在 树脂 上 ，- 所 以 只 能 测 到 第 12 fr Lys 残 基 。 以 后 肽 女将 从 树脂 上 自动 脱落 下 来 ,收集 脱落 后 的 肽 溶液 干燥 , BEF 进行 。 第 六 步 : 13 2 耻 一 29 证 之 一 Ross Asn 一 Thr @ 用 CNBr 裂解 @ 用 TFA 处 理 使 高 丝氨酸 转化 为 内 酯 ® Se ARR TPO Irae 13 28, 29 于 加 pds cee ey hee + Asn—Thr © 153 (15] FAR—-, H-#—S: 久 > /《 夕 质 一 次 构造 决定 法 洗 脱 Asn 一 Thr fit 用 Edman 降解 法 测 顺序 13 27 Fyr—Len....ccsce0es Len—Hser—|TETA 树脂 | 一 ~ 3 > 这 时 只 要 降解 8 步 , 测 到 第 21 位 Gln PHL, PEAK Met 前 的 顺序 就 确定 了 (活性 肽 的 N 未 端 氨基 酸 在 顺序 前 已 鉴定 过 ) ,现在 只 剩 下 T-5 Asn-Thr 二 肽 未 知 。 Sts: DAO AMS HiiS.cccssses Met—Asn—Thr 用 CDI 法 通过 C 端 羧基 将 肽 链 固定 到 树脂 上 再 用 CNBr re OR MS Asn—Thr—|TETA Mg] SB) T —5 顺序 > > 这 样 ， 把 两 组 从 战略 上 考虑 所 测定 的 肽 外 顺 序 合 起 来 分 析 就 可 确定 胰 高 血糖 素 的 氮 基 酸 顺序 。 用 CDI 方法 (类 似 EDC 方法 ) 通 过 的 链 C 端 将 陵 链 固定 到 树脂 上 后 ， 用 CNBr 处 ， 理 , 条 件 是 : 250ul 70% 甲酸 ,内 含 40mg CNBr, 在 充 No 搅拌 下 于 室温 反应 20 小 时 , 反 应 毕 过 滤 并 分 别 用 70% 甲酸 (5 X 2ml) BAK, FRRA, AAR, ea LO Asn-Thr 二 肽 ,很 容易 测定 它们 的 顺序 。 S$ 4+ xX BR ~ [ 1] Laursen, R. A.: Solid-Phase Edman Degradation, An Automatic Peptide Sequencer, Eur. J. Biochem., 20, 89—102(1971). [2] Croft, L. R.: Handbook of Protein Sequence Analysis, p. 69—71, John Wiley & Seny (1980). [3] Birr, Chr.: Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis p. 9—20, Elsevier/North-Holland (1979). [4] @##R,. BA: DABITC/PITC 双 偶 合法 在 蛋白 质 手 工 固 相 顺 序 分 析 中 的 应 用 * 生 物化 学 与 生物 物理 进展 ， 第 1 期 (1984)。 [5] Horn，M. J. and Laursen, R. A.: Solid-Phase Edman Degradation, Attachment of Carboxyl-Terminal Ho- moserine Peptides of an Insoluble Resin, FEBS Letters, 36, 285(1973). [6 ] Laursen, R. A., Horn, M. J. and Bonner, A. G.: Solid-Phase Edman Degradation, The Use of P-Phenyl Diisothiocyanate to Attach Lysine and Arginine Containing Peptides to Insoluble Resins, FEBS ae 21, 67—70(1972). {7] Robinson, P. J., Dunhill, P. and Lilly, M. D.: Porous Glass as a Solid Support for Immobilisation or Affinity Chromatography of Enzymes, Biochem. Biophys. Acta, 242, 659—661(1971). 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[18] 见 [16], p. 51—60. 21546 (一 ) 引言 第 九 章 蛋白质 自 动 顺序 分 析 仪 一 、 上 自动 液 相 顺序 分 析 仪 沪 相 顺序 仪 是 由 Edman，P. 和 Begg, G., F 1967 年 首先 研制 成 功 的 , 他 们 称 它 为 Sequenator。 随 后 Beckman 公司 进行 了 生产 并 于 1969 年 正式 以 商品 出 售 , 目 前 这 种 仪器 已 遍及 世界 各 国 的 蛋白 质 化 学 实验 室 ， 为 蛋白 质 顺 序 测定 起 着 重要 作用 。 当 前 商 售 的 液 相 顺 序 仪 型 号 很 多 ,如 日 本 的 JEOL JAS 47 玫 ， 法 国 的 Socosi P110 和 Socosi P100, 美 国 的 Illitron 和 Backman 890C%, Hr) Backman 公司 生产 的 Backman 890C 顺序 仪 使 用 最 为 广泛 。 表 9-1 和 9-2 是 Backman 顺序 仪 和 其 它 几 种 顺序 仪 测定 部 分 蛋白 质 的 表 9-1 不 同 商品 顺序 仪 (Beckman 型 号 除外 ) 测 顺序 获得 的 部 分 结果 顺序 仪 型 号 JEOL JAS 47K SOCOSI PIIO SOCOSI PS100 llitron i 家 JEOLCO (8 #) SOCOSI (法 国 ) SOCOSI (法 国 ) Illinois Tool Works, Chicago GE) & .A kh GRA) 铁 氧 化 还 原 蛋 白 Bungarus fasciatus Venom jit 马 MSEL- 后 叶 激 素 运 载 蛋 白 §% MSEL- 后 叶 激素 运载 蛋白 Anemonia Sulcata = Ill Naja #epHABS | ABRBEA Bence Jones 蛋白 Dil % 9-2 Beckman 顺序 仪 测 顺序 获得 的 部 分 结果 BA mh x kK C-S828. (6-) C-MBEA (a-) 凝血 酶 (6- 链 ) 6- 凝 血 珠 蛋白 =A BRE Fl (lac) BD BARR 胶原 肽 Bungarotoxin Uteroglobin 豌豆 外 源 凝 集 素 (c- 亚 基 ) om Ai 平均 重复 产 率 (mg) (%) 顺序 的 残 基数 Ke at 出 _ 5 5 给 3 8 4 6 9 2 5 0 6 表 9-1, 9-2 5| Croft, L. R.: Handbook of protein Sequence Analysis, p。48 一 49, John Wiley & Sons(1980 ). e 1556 例子 。 尽管 这 些 仪 器 型 号 不 同 ， 外 型 也 很 不 一 样 ， 但 机 械 构造 是 很 类 似 的 ， 它 们 都 是 根据 Edman 化 学 降解 的 三 步 反应 原理 ， 通 过 巧妙 的 管 路 设计 用 上 自动 化 电子 仪器 控制 来 实现 的 。 液 相 顺序 仪 中 反应 杯 是 该 仪器 的 核心 部 分 ,由 一 马达 带动 可 调 速 控制 。 蛋 白质 或 多 肽 在 特定 的 溶剂 中 溶解 后 ， 通 过 一 导管 注 人 反应 杯 中 。 蛋 自 质 随 着 旋转 的 离心 力 被 均匀 地 涂 在 杯 壁 上 ， 形 成 一 层 薄 膜 ， 膜 的 厚薄 可 由 转速 控制 。 反 应 用 的 试剂 和 溶剂 分 别 通过 导管 进入 反应 杯 , 与 杯 中 的 蛋白 质 N- 末 端 氨基 酸 进行 Edman 降解 反应 。 最 后 把 降解 下 来 的 ATZ 衍生 物 再 通过 另 一 导管 引出 进入 部 分 收集 器 ,或 直接 进入 自动 转换 器 ,将 ATIZ 转换 成 PIH 后 再 进行 鉴定 ,依次 循环 。 (=) 液 相 顺序 仪 的 一 般 构 造 原理 一” 图 9-1 是 该 仪器 的 一 般 设 计 ， 它 的 主要 部 分 反应 室 是 顺序 仪 的 DIE Rete 了 一 个 稳定 的 环境 ,以 利于 降解 反应 。 反 应 室 包括 : 反应 杯 、 旋 转 马 达 、 钟 罩 、 进 出 料 管 等 。 反 应 杯 (A) 通常 由 硬 质 玻璃 制 成 , NH 26mm, 杯 内 部 的 高 是 31Imm， 被 固定 在 一 - 电动 马达 (B) 的 轴 上 。 经 计算 , 杯 内 形成 的 蛋白 质 薄 膜 大 约 100 个 分 子 厚 度 。 试剂 和 溶剂 通过 进 料 线 (R) 进入 杯 内 ， 由 于 杯 壁 上 的 薄膜 是 随 着 转速 的 增加 而 增 厚 ， 样 唱 是 低 速 引入 然 后 增 速 ， 而 每 个 试剂 是 在 高 速 下 引 和 人 ， 人 然后 回 到 低速 。 这 样 就 能 使 样品 薄膜 完 上 图 9-1 RAIL A A. 旋转 杯 ，B. 电动 马达 ，C。 试剂 (溶剂 ) 贮 存 器 ，D. A, E。 输 出 活塞 装置 F. 部 分 收集 器 G, 废 液 容器 五 , Nz 瓶 Je ENR K. 压力 调节 器 M. Si i] N. 二 通 阀 P. 旋转 式 真 空 汞 Q. Hal R. BHR S. Mii. 全 被 连续 不 断 引 和 人 的 试剂 所 履 盖 ,以 保证 进行 Edman 化 学 降解 的 产 率 。 降 解 后 的 产物 和 需要 萃取 的 试剂 和 溶剂 是 通过 流出 线 (S) 排出 反应 杯 , 并 经 由 三 通 阀 (E) 而 进 人 部 分 收 集 器 (F) 或 废 液 容 器 (G) 中 ，Beckman 890C 顺序 仪 的 部 分 收集 器 带 有 88 个 收集 管 ， 足够 收集 降解 下 来 的 样品 。 。 156。 MER ARAMA ERO RCS AY, AEA 0.5mm 和 0.9mm, # AE AAR We, 其 位 置 可 调 , 使 进 料 线 处 于 杯 的 底部 。 中 央 与 底面 留 有 一 点 间隙 ,因而 不 会 影响 被 体 的 流动 。 流 出 线 的 尖端 什 人 凹 沟 中 ( 见 图 9-2)。 反 应 杯 外 有 一 钟 量 〈(Q) RO BELAY 顶部 和 底部 绕 有 银 丝 电极 ,以 保持 反应 杯 内 的 温度 。 整个 系统 用 真空 泵 (P) 抽 真 空 保持 体系 的 一 定 负 压 力 。 Beckman 890C 顺序 仪 带 有 高 低 泵 真空 系统 交 低 真空 对 抽 空 使 其 它 体系 如 贮藏 瓶 等 低 于 反应 杯 中 的 入 体 的 蒸气 压力 。 高 真空 泵 是 用 于 干燥 样品 所 需 的 高 真 空 。 用 高 泵 真空 能 使 反应 杯 的 压力 在 10 一 15 秒 之 内 从 一 个 大 气压 降 到 100wm Ris, 每 分 钟 排 出 气体 量 达到 15 升 。 试剂 和 溶剂 分 别 贮藏 在 各 自 的 贮藏 瓶 (C) 内 ,每 个 瓶 搂 有 四 根 管子 ,一 根 授 到 压力 瓶 通 N; 用 , 另 一 根 作 为 传送 试剂 或 溶剂 管 中 间 经 由 一 阀 (D ) 装置 进入 旋转 杯 中 , 第 三 管 通过 一 限制 器 到 时 发 瓶 ， 第 四 管用 于 手工 向 瓶 内 注入 或 吸出 试剂 或 溶剂 。 贮 藏 瓶 是 由 N, 瓶 (H) 并 通过 压力 调节 器 (CK) BE Na, 使 它 保 持 在 一 恒定 的 低压 条 件 下 。 钟 单 内 的 压 RSA Ls # aon DIA Ret HK HA. CUS ws FEDS, PLEA HOA yah Nem a Ae 剂 可 以 通过 某 种 关系 定量 测 知 。 恒温 维持 反应 室 。D. 圆 形 角 。 9-1 中 的 气体 阀 (M 和 N ) 是 由 螺 线 管 控制 ， 而 输出 阀 (五 ) 和 部 分 收集 器 CF) 则 是 由 电动 马达 控制 , 所 有 这 些 部 件 都 是 由 微型 计算 机 操纵 。 (=) 蛋白 质 和 小 肽 样品 在 液 相 顺序 仪 中 的 降解 蛋 折 质 和 小 肽 样品 的 顺序 分 析 需 要 不 同 的 条 件 ， aa ee 中 进行 降解 反应 ,而 后 者 需 用 挥发 性 的 试剂 。 工 有 蛋白 质 在 Beckman 顺序 仪 中 的 自动 降解 过 程 (1) 用 非 挥 发 性 缓冲 液 如 碱 性 的 Quadrol (N, N. N’, N’. tetrakis-2-hydroxyethyl- ethylene diamine) 溶解 蛋白 质 样品 , 注入 旋转 杯 中 ,形成 薄膜 。 (2) MA PITC 与 蛋白 质 的 N 端 5 氨基 偶合 。 (3) 用 葵 移 去 过 剩 的 PITC 及 其 副 产 物 。 (4) 用 乙酸 乙 酯 洗 去 Quadrol. (5) 加 无 水 七 扎 丁 酸 裂 解 N 末 端 氨基 酸 ， 生 成 ATZ 衍生 物 。 (6) 用 丁 基 毛茶 取 裂解 产物 (AT2Z- 衍 生物 ) 并 把 它 转移 到 部 分 收集 器 中 ， 随 后 将 ATZ 转换 成 PITH， 分 别 进 行 鉴 定 。 图 9-3 是 在 被 相 顺 序 仪 上 双 裂 解 程序 的 大 致 过 程 : e。 157 。 - () 深 剂 HFBA 、( 忆 旋转 Gi) HAL SS 在 杯 中 形成 薄膜 |. (iv) ALMA (v) FW (i) 5 SPITC/IE BE | 你 抽 真 空 移 去 正 庚 烷 (iii) Quadro] 组 冲 液 30 分 钟 55 包 PITC- 蛋 白质 (i) 某 移 去 PITC 副 产物 的 用 乙酸 乙 脂 移 去 Quadrol (ii) FAB ‘ G 加 HFBA 《1.5 分 钟 》 第 一 次 裂解 的 抽 真 空 移 去 HFBA 酸 少 一 个 残 基 的 蛋 自 质 加 加 HFB 人 A 第 二 次 裂解 . (1 分 钟 》 (ii) ZS 少 一 个 残 基 的 蛋白 质 zx 9-3 IE mR 2. 多 肽 的 自动 降解 适用 于 蛋白 质 的 自动 顺序 分 析 方 法 通常 不 适用 于 小 肽 的 顺序 分 析 ， 因 为 小 肽 特别 是 一 些 蕊 水 性 肽 ,在 萃取 时 很 容易 进入 有 机 相 而 遭 到 损失 。 在 多 肽 的 自动 降解 中 ， 样 品 是 溶解 在 挥发 性 缓冲 液 DMAA 中 ， 随 后 用 抽 真 空 代 蔡 乙酸 乙 酯 移 去 过 剩 试剂 ， 用 酸 裂解 时 通常 只 多 解 一 次 。 (四 ) 携带 体 Polybrene 引信 反 应 杯 利用 波 相 顺序 仪 测 多 肽 顺序 过 去 通常 需要 1 一 2mg 量 , 以 形成 一 稳定 的 薄膜 ,这 样 对 于 一 个 含有 50 残 基 的 肽 大 约 需要 200nmol, 这 个 量 远 远 超过 了 用 手工 方法 测 顺序 的 需要 iz, 而 且 仪 器 也 很 难 测 定 小 于 50 氮 基 酸 残 基 的 小 肽 。 为 了 解决 这 个 问题 ，1978 年 Tarr 等 的 将 Polybrene (Polymer 1, 5-dimethy!., 1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide) ° 158° — —-MORARRA Die ASI ARAMA RMA, CREA REM E a wTF 用 而 有 效 地 吸 住 , 这 样 不 仅 防 止 了 萃取 时 反应 杯 中 肽 的 损失 ,而 且 大 大 减少 了 顺序 分 析 中 蛋白 质 或 肽 样品 的 用 量 , 即 从 原来 的 50 一 200nmol 减少 到 1—10nmol™, Bb, EMS | A polybrene 后 , 一 些小 的 芒 水 性 肽 也 能 进行 顺序 分 析 , 大 大 提高 了 仪器 的 利用 率 。 二 、 目 动 固 相 顺序 仪 (一 ) 引言 1971 年 Laursen2529 提出 用 固 相 法 测 蛋 白质 顺序 ,不 久 又 研制 了 自动 固 相 肽 顺序 仪 。 固 相 顺 序 仪 弥补 了 波 相 顺序 仪 的 某 些 不 足 , 它 对 一 般 的 小 肽 甚至 是 疏水 性 肽 (只 要 能 固定 到 载体 上 ) 都 能 进行 顺序 分 析 ,样品 不 会 因 洗 涤 而 受到 损失 。 目 前 商 售 的 固 相 顺序 仪 有 : 美 国 的 Sequemat 10K 和 Sequemat 12 (Sequemat Inc, Massachusetts 生产 ), 法 国 的 Socosi Ps 300 (Socosi 生产 ) 和 英国 的 LKB 4020, LKB 4030 (LKB Biochrom Ltd, Combridge Science Park 4 7*)?97, Hrhb) LKB 的 使 用 较为 广泛 。LKB 4030 固 相 顺序 仪 带 有 自 动 转换 器 , 它 是 在 4020 的 基础 上 改进 而 成 的 。 使 用 固 相 顺 序 仪 在 上 机 分 析 前 需 先 将 样品 共 价 地 键 合 到 一 种 惰性 支持 体 即 载体 上 〈 详 见 第 八 章 )， 然 后 装 人 一 根 小 口径 的 反应 柱 中 ， 随 后 再 将 反应 用 的 试剂 和 溶剂 分 别 按 程序 注 和 人 反应 柱 内 进行 Edman 化 学 降解 反应 。 (=) 固 相 顺 序 仪 的 一 般 构 造 原理 图 9-4 是 固 相 仪 的 结构 管 路 图 。 反应 柱 〈C) 通常 由 硬 质 玻 璃 制 成 ,; KB 4020 (或 4030) 反应 柱 的 尺寸 ; 常规 分 析 2 X 15(mm), 3 X 15(mm); 微量 分 析 2 X 10(mm)。 柱 外 加 有 水 套 , 连接 水 浴 (B) 以 N,(50 PSI) 图 9-4 固 相 顺序 仪 结构 管 路 图 B. 恒温 水 浴 ，C. 反应 柱 ，F. 部 分 收集 器 ，G. 氮气 瓶 P. R> Re. UAB VS. Ro W. Ree © 159° 控制 降解 反应 时 的 温度 (50*C)。 降 解 反应 用 的 试剂 和 溶剂 分 别 贮藏 在 棕色 瓶 (R) 内 ,每 个 瓶 通 有 三 根 细 管 , 它们 是 @ NAHAS: Na 由 钢瓶 通过 分 压 器 (G) 内 直接 进 人 大》 以 维 持 瓶 内 的 压力 和 各 免 试剂 的 氧化 ; 四 出 气管 : 用 于 排出 瓶 内 的 空气 ; ORE: 贮藏 瓶 内 的 试剂 或 溶剂 通过 输液 管 进 入 (P) 内 ,然后 在 泵 的 控制 下 定量 经 由 阀 (V) 注 大 反应 柱 内 。 最 后 将 反应 柱 内 降解 下 来 的 ATZ- 氮 基 酸 衍生 物 引 入 部 分 收集 器 (F) ,经 转换 反应 后 用 于 鉴定 ,而 副 产 物 或 过 剩 试 剂 直接 排 人 废 液 祖 (W) 内 。 这 些 过 程 都 是 通过 阀 (V) 控 制 。 早先 的 因 相 顺序 仪 只 完成 Edman 反应 式 中 的 偶 联 和 肥 解 二 步 反 应 ， 第 三 步 转换 反 | 应 和 最 后 的 PTH 氨基 酸 鉴定 工作 需 另 外 进行 。 近 年 来 ， 有 的 型 号 的 仪器 已 配 有 自动 转 换 装 置 ， 工 KB 4030 面相 顺序 仪 就 是 其 中 之 一 。 自动 转换 器 (LKB 4030 为 例 ) 带 有 自动 转换 宕 装置 的 LKB 4030 aero iat 4020 型 基础 上 发 展 起 来 的 ， 衍生 物 1 eevee PTH- ROR. DAP. 图 9- 7 LKB 4030 固 相 顺 序 仪 上 的 4025 自动 转换 器 的 流程 图 。 Nz 加 液 指示 液 指示 加 液 指示 图 9-5 LKB 4025 自动 转换 器 管 路 图 整个 转换 反应 共 分 五 步 (1) MRE LSE FORAY ATZ- 氨 基 酸 衍生 物 引 入 转换 器 的 反应 杯 内 。 (2) HN, 干燥 。 (3) 加 水 淤 性 酸 到 反应 杯 内 ,进行 转换 反应 。 (4) 再 次 通 N 干燥 。 (5) 加 伴 取 溶剂 ,将 反应 杯 中 转换 后 的 PTH- 氨 基 酸 引出 , 注 人 部 分 收集 器 的 试管 中 用 于 鉴定 。 自动 固 相 顺 序 仪 同 自动 液 相 顺 序 仪 一 样 ， 都 是 在 电子 计算 机 的 控制 下 工作 。 控 制 系 统 由 程序 系统 和 故障 指示 系统 二 部 分 组 成 。 程 序 器 是 由 计算 机 系统 的 微 处 理 器 提供 ， 它 带 有 = 数字 发 光 二 极 管 显示 和 键盘 数字 输入 ,可 以 自动 控制 ,也 可 手动 控制 。 顺 序 仪 的 运 转 是 通过 计算 机 控制 20 个 功能 键 实 现 的 。 操作 除了 手 编 程序 通过 键盘 上 有 关键 码 输 和 人 se。 160° 达到 仪器 运转 控制 外 ,本 计算 机 中 还 存 有 十 余 个 已 经 编 好 的 程序 在 程序 库 中 ,只 要 给 它 一 定 的 指令 便 可 按 所 选 定 的 程序 完成 操作 控制 。 顺序 过 程 中 的 运转 状况 , 在 面板 上 通过 发 光 二 极 管 显示 出 来 ,如 已 经 完成 的 循环 数 ， 某 一 循环 中 的 运行 时 间 , 自动 转换 器 的 反应 慢 度 等 。 故障 指示 系统 通过 显示 某 特 定 的 数码 ( 共 十 四 个 ) 或 发 出 警报 来 指示 某 系统 发 生 的 故 障 或 任何 错误 的 程序 输入 ,如 管 路 中 N: 压低 于 5 巴 就 会 发 出 警报 ,这 时 仪 妖 目 动 停止 。 有 利于 操作 者 的 正确 操作 和 及 时 正确 的 维修 ;也 起 到 保护 仪器 的 作用 。 《三 ) 固 相 顺 序 仪 的 微量 顺序 分 析 目前 商 售 的 固 相 顺序 仪 ,用 常规 Edman 方法 测 顺 序 , 一 次 用 样品 量 需 50 一 200nmol， 可 连续 降解 20 一 30 个 残 基 。 这 样 大 的 样品 量 ， 对 许多 只 能 获得 很 少量 蛋白 质 或 多 肽 样 品 的 生化 工作 者 来 说 无 法 使 用 ， 为 了 能 进行 微量 顺序 分 析 不 少 人 曾 设法 改进 仪器 。 早 先 MIRA “S-PITC 同位 素 标 记 法 , 近年 来 随 着 DABITC/PITC 双 偶 合法 应 用 的 广泛 深 人 ,已 将 它 应 用 于 自动 固 相 顺序 仪 中 ,并 且 取 得 了 良好 的 效果 ””。 下 面 是 在 LKB 4020 或 4030 固 相 顺 序 仪 上 由 常规 Edman 降解 顺序 分 析 改 成 微量 DABITC/PITC 双 偶 合法 顺序 分 析 的 方法 。 改装 后 的 条 件 : 1. 相应 的 系 转 速 ( 即 对 应 的 流 率 ) MeOH RABE, FEA Lul/ 分 一 1ml/ 分 (转速 5.9 秒 /次 ) DCE 3g — buffer 泵 , 流 率 1ml/ 分 一 0.15ml/ 分 (转速 39 F/R) buffer 4% — DABITC , je3% 40ul/4> — 0.075ml/ 分 (转速 23 秒 / 次 ) PITC RABE, BiH 40ul/4 一 0.15ml/ 分 (转速 12 秒 / 次 ) TFA 泵 不 变 ， 流 率 0.15ml/ 分 一 0.15ml/ 分 (转速 39 秒 /次 ) 2. 试剂 DABITC 〈 沸 丙酮 重 结晶 ): 用 DMF 配 成 0.5% DABITC %& (W/V)， 每 天 新 鲜 配制 。 PITC: 用 DMF Apt 5% PITC 液 (V/V)。 buffer: 混合 5.8ml N- 甲 基 吗 啉 和 34ml BK, A TFA 调 pH 到 8.6, 然后 再 加 TIMEIminl0 10 20 30 40 50 60 70 流 率 Imi/min} MeOH fy 到 图 | 1.0 BUFFER SEB SEE Gi eee ee O15 DABITC ME BGD mMEES 0.075 PIT ee ee) * 015 TFA bs] 0.15 COLLECT 8 四 NITROGEN B 是 | 8 a FRACT. COLL. 1 图 9-6 DABITC/PITC 双 侦 合法 在 LKB4020 MAM LOBE °161°¢ 60m! 吡啶 。 3. 程序 (1) 在 LKB 4020 固 相 顺 序 仪 上 使 用 的 程序 见 图 9-6。 (2) 在 LKB 4030 固 相 顺序 仪 上 使 用 的 程序 见 表 9-3。 表 9-3 MH®UE DABITC/PITC 顺序 程序 功能 号 FLX | 程序 库 号 TFA 480 一 520 51.2 DABITC 80—110, 150—180 PITC 220—280 BuFFER 30—110, 150—180, 220—280, 330—409 MeOH 0—29, 410—475, 550—580 CoL SEL 480—520 CoL I 490—563 LENGTH 600 [一 国生 旧作 2 WwW N= © Ww 针对 51.2 程序 的 自动 转换 器 程序 ETAC 260—264, 280—284, 300—304, 320—324 11 12 ACID 40—45 13 BUBBLE 0—40, 46—50, 150—260, 265—270 285—290, 305—310, 325— 330, 480—600 14 FLUSH 0—40, 45—46, 150—250, 264—265 270—275, 284—285, 290— 295, 304—305 15 VENT 0—50, 150—270, 290—300, 310—320, 330—340, 480—600 16 SAMPLE 270—275, 290—295, 310—315, 320—335 17 FAN 0—1, 150—340 江 TEMP % ~~ 1—80° 150—30°, 480—50° 530—80° 599—10° LENGTH 600 =. AMR (—) 5Ie 在 蛋白 质 或 多 肽 顺序 分 析 的 发 展 进程 中 ， 自 动 液 相 顺序 仪 和 自动 固 相 顺序 仪 曾 起 过 积极 作用 ， 但 是 随 着 分 子 生 物 学 的 深入 发 展 ， 近 年 来 人 们 深 感 这 两 种 仪器 已 不 能 满足 蛋 白质 微量 顺序 分 析 的 需要 。1981 年 Hewick R. M. 等 国人 研制 了 一 种 新 型 顺序 仪 , 即 气 相 顺 序 仪 , 亦 称 气 液 固 相 顺序 仪 (Gas-Liquid Sold Phase Sequenator)。 它 的 特点 是 弹 简 型 的 反应 室 [2.5 x 5(cm)] 代替 了 该 相 顺 序 仪 中 的 旋转 玻璃 杯 ， 反 应 试剂 是 在 气态 下 完成 蛋白 质 的 Edman 降解 反应 它 有 以 下 显明 优点 : 〈1) 灵敏 度 很 高 ， 作 为 顺序 测定 的 蛋 白质 或 多 肽 量 最 低 在 Spmol 水 平 ( 表 9-4);(2) 试剂 和 溶剂 消耗 很 低 , 大 约 是 液 相 仪 的 十 分 之 一 ; (3) 缩短 了 每 步 降解 循环 时 间 ， 因 此 提高 了 效率 ; (4) 降低 了 费用 。 目 前 商 售 ”162。 表 9-4 用 气相 顺序 仪 测定 蛋白 质 或 多 肽 顺序 的 例子 样 品 鉴定 的 残 基数 /总 残 基数 血管 紧张 肽 8/8 血管 紧张 肽 6/8 生长 激素 释放 抑制 因子 14114 aS RB 链 30/30 神 A kK B 31/34 (from Aplysia) Dynorphin 14/17 ta 蛋白 90/153 肌 红 蛋白 22/153 Fi Sh oa Fe 1 ET I 55/166 Larval Cuticle Protein ‘) from Drosophila 果 蝇 幼虫 表皮 蛋白 3 36196 Larval Cuticle Protein 3 from Drosophila 22000-dalton membrane 23/200 phosphoprotein from Aplysia 人 组 织 相 容 性 抗原 HLA-DR cx 链 49/300 Humon histocompatibility antigen HLA-DR, a chain 人 组 织 相 容 性 抗原 HLA-DR 6 链 39/240 ( Humon histocompatibility antigen HLA-DR, 6 Chain 人 红血球 蛋白 28/150 ， 人 黑色 素 瘤 细 胞 表面 抗原 13/850 | KF 素 13-20]? a 516: Hewick, R. M. ct al.,: A Gas-Liduid Solid phase Peptide and protein SeQuenator, J. Béiology, Chem., 256, 7994 (1981). 图 9-7 470A 型 气相 蛋白 质 顺 序 仪 的 气相 顺序 仪 有 美国 的 Applied Biosystems Model 470A Gasphase Protein Sequencer (图 0 在 气相 顺序 仪 的 弹 简 状 反应 室内 也 引 人 了 携带 体 Polybrene， 它 能 吸 住 被 测 的 蛋白 es。 163 。 BAB HAMAS 8-6 图 | NC of oC oC C) unclll 一 = | O O11) K) K) ?9 0 去 @ pare Com [EO Sem Geom a. TT TT + 164° 质 或 多 肽 样品 , 因此 防止 了 样品 的 损失 , 并 且 不 受 样 品 的 分 子 量 大 小 限制 ,不 同 于 固 相 顺 序 仪 的 是 它 不 需要 将 样品 共 价 地 固定 到 载体 上 Go。 (=) 气相 顺序 仪 的 一 般 构造 原理 图 9-8 是 Hewick, R. M. 等 人 设计 的 气相 顺序 仪 的 简要 管 路 图 。 从 图 中 可 以 看 出 它 和 沾 相 顺序 仪 有 相似 之 处 : (1) 利用 氧气 并 通过 一 系列 的 过 滤器 ， 加 压 到 试剂 和 溶剂 贮藏 瓶 ; (2) 有 类 似 的 氢 压 力 调节 器 ,贮藏 瓶 加 压 阀 和 贮藏 瓶 出 口 管 ; (3) 有 类 似 的 斌 fil, 溢 剂 贮藏 瓶 ， 其 中 某 些 已 改进 以 利于 输送 燕 气 ;〈4) 利用 Zeroholdup， 气 体 作用 隔 RADARS, BMA: (5) 有 类 似 控制 闽 功 能 的 一 个 完整 的 指令 程序 。 气相 顺序 仪 与 液 相 顺序 仪 的 主要 差 rar | 别 是 反应 杯 的 改进 。 它 由 弹 简 状 的 小 型 这， WE Pyrexatag SH BERLE (ARV BUY 0.050ml) 代替 EARN AY ER BE AB Pyrex 3h TOM. FWHM KEY 25cm, FOR RAEMEMEE, 2M 面 有 一 直径 为 0.05cm 的 小 孔 , 中 央 成 加 锥 状 占 环 ,每 杆 的 孔 和 凹 处 是 同心 的 , 误 差 在 0.0025cm 之 内 ,用 超声 波 机 械 加 工 fill Ko 将 二 根 玻璃 杆 的 止 处 相对 夹 紧 ， ome | ed Teflon abt 并 置 于 一 金属 圆 简 内 ， 就 形成 了 一 个 中 流 路 心 小 室 ， 玻 璃 杆 上 端的 圆锥 腔 有 一 足够 图 9-9 反应 室 示 意图 大 小 的 小 目 处 ,内 男 定 有 玻璃 纤维 盘 , 待 测 的 蛋白 质 或 多 路 样品 就 放 在 里 面 。 二 根 玻璃 杆 间 夹 有 一 纤维 状 的 多 孔 Teflon 薄膜 , HK 璃 纤维 盘 就 用 它 来 固定 , 周围 是 压 紧密 封 的 , 这 个 装置 的 示意 图 见 图 9-9, 弹 简 状 反应 室 是 坎 在 一 绝缘 体内 ,可 通过 程序 器 控制 室内 的 反应 温度 。 所 有 试剂 和 溶剂 通过 Teflen 管 进 到 反应 室 的 顶部 ,并 以 同 祥 方式 从 室 的 底部 排除 , 体积 很 小 , 不 会 造成 死 体 积 。 所 有 的 导管 由 一 组 Kel-F Ril, 以 防止 试剂 和 溶剂 的 交叉 污染 。 从 贮藏 瓶 出 来 , PAW 到 反应 室 的 所 有 连接 管 导 ， 其 长 度 应 尽 可 能 短 ， 以 避免 不 必要 的 损失 和 污染 。 顺 序 仪 配 有 120A 型 PTH AKRAM, Edman 降解 后 的 PITH- 氮 基 酸 衍生 物 可 直接 从 470A 型 顺序 仪 自动 输入 120A 型 PTH- 氮 基 酸 分 析 仪 , 进行 氨基 酸 衍生 物 的 定性 、 定 量 分 析 , 不 仅 快速 可 靠 , 而 且 防 止 了 样品 在 转移 中 损失 2 。120A 型 PTH 分 析 仪 配 有 高 纯度 的 溶液 和 高 精密 度 的 高 效 液 相 色谱 柱 ， 可 测定 少 于 lpmol 的 PTH- 氮 基 酸 ， 其 分 离 度 在 95 狗 以 上 。 整 个 仪器 都 用 电脑 控制 ,自动 化 程度 相当 高 。 $° 43 “xX “SR [1] Croft, L. 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T., Codogno, P., et al.: Phylogeny of the Neurophysins: Complete Amino Acid Sequeuce of Horse MSEL-Neurophysin, FEBS Letters, 80, 374—376(1977). 第 十 章 ， 高效 液 相 色谱 在 蛋白 质 顺序 分 析 中 的 应 用 高 效 液 相 色谱 又 叫 高 速 液 相 色 谱 或 高 压 液 相 色 谱 ， 简 称 HPLC， 是 七 十 年 初 从 普通 蔽 相 色 谱 基础 上 发 展 起 来 的 一 种 新 技术 。 在 分 离 原 理 止 ;高 效 液 相 色 谱 和 经 典 的 液 相 色 谱 (或 液 相 层 析 ) 基 本 和 相同， 由 于 前 者 采用 了 直径 5 一 10wm 微粒 作为 柱 填 充 物 ,使 单位 填充 体积 成 倍增 加 ,也 就 增加 了 有 效 交 换 或 分 配 面积 ,从 而 大 大 提高 了 柱 的 分 离 效率 。 使 用 这 种 填充 料 的 柱 ; 试 样 无 法 在 常 压 下 洗 脱 , 不 得 不 借助 高 压力 泵 来 迫使 液 流 经 过 填充 管 柱 ， 因而 得 名 高 压 液 相 色谱 。 十 多 年 来 ,由 于 在 填充 柱 的 分 离 效率 \ 流 动 相 的 选择 以 及 检测 器 等 方面 的 不 断 改进 和 提高 ， 高 效 液 相 色谱 已 成 为 目前 最 有 用 的 分 离 技术 之 一 ， 是 生物 化 学 研究 中 不 可 缺少 的 强 有 力 的 工具 era 用 高 效 液 相 色谱 分 析 分 离 生物 样品 的 优点 ,除了 ER RAE BORE) MEU PRA: CU) REARS pe, HB ng, 试 样 体积 也 可 少 到 als (2) 除 某 些 蛋白 质 会 在 有 机 溶剂 中 产生 变性 外 ; 可 从 洗 脱 液 中 回 收 具 有 全 部 生物 活力 的 样品 ; (3) 能 分 离 的 化 合 物 范围 很 广 5 咏 “ 与 气相 色谱 比较 了 高效 液 相 色 谱 的 分 辩 率 、 灵 敏 度 以 及 分 离 速度 尚 不 及 气相 色谱 ,但 在 应 用 范围 上 气相 色谱 法 所 不 能 分 离 的 大 量 物质 ,如 非 挥发 性 的 , 极 性 的 、 对 热 不 稳定 的 试 样 组 分 ; 却 适 宜 用 高 效 液 相 色谱 法 分 析 。 高效 液 相 色谱 尖 致 可 分 为 四 大 类 ; (1) 液 - 液 (分 配 ) 色谱 ; 和 用 溶质 在 流动 相 和 固定 相 中 分 配 系数 的 差别 而 达到 分 离 的 目的 :通常 可 分 为 正 相 及 反 相 两 种 ,是 目前 应 用 较 多 的 。 (2) 液 -= 因 吸 附 色谱 ; 利用 溶质 在 固体 吸附 剂 上 吸附 能 力 的 差异 而 达到 分 离 的 目的 。， G) 离子 交换 色谱 ; 利用 不 同 溶质 离子 和 树脂 ( 担 体 ) 交 换 能 力 的 差异 而 达到 分 离 目 的 (4) RBM: 按 溶质 分 子 量 大 小 而 分 离 ( 即 分 子 饰 )e， 二 、 高 效 液 相 色谱 仪 的 三 般 构 造 原理 当前 商 售 的 高 效 液 相 色谱 仪 尽管 型 号 繁多 ， 各 有 特色 , 但 就 仪器 的 基本 结构 来 说 是 基本 相依 的 。 它 的 主要 部 件 包 括 : BERANE a. 进 样 器 * 色谱 管 柱 \ 检 测 器 \ 记 录 仪 (或 数据 处 理 机 ) 等 。 图 10-1 是 高 效 液 相 色谱 仪 的 基本 系统 方 框图 。 (1) BER: 和 泵 是 输送 彼 体 的 动力 。 高 效 液 相 色谱 仪 上 通常 瑟 有 两 台 高 压 泵 ; 它们 大 多 是 多 活塞 式 压 力 泵 或 大 容量 的 注射 式 压 力 泵 ,目的 是 确保 定量 定向 压 送 流动 相 ( 洗 脱 ABR. Pig, Waters M-6000A 和 泵 压力 可 达 420kg/cm’* (6000Psi), GAH 量 选择 \ 溶 剂 选择 和 溶剂 流动 方向 (废弃 \ 收 集 , 再 循环 ) 的 选择 。 (2) 溶剂 程序 器 ， 亦 称 梯 度 洗 脱 器 ， 其 功能 是 将 二 种 或 三 种 以 上 不 同性 质 的 溶剂 在 ° 167° i 溶剂 程序 器 部 分 收集 器 图 10-1 高 效 液 相 色谱 仪 的 基本 系统 方 框图 和 样 来 说 ,有 利于 提高 分 辩 率 。 (3) RE: 有 手工 和 自动 进 样 器 两 种 。 在 高 效 液 相 色 谱 中 , 手工 进 样 通常 采用 微量 注射 器 ， 最 近 已 把 它 系列 化 了 。 通过 双 层 四 通 或 双 层 六 通 阀 组 合 起 来 , 能 把 样品 准确 定量 地 送信 仪器 , 或 者 装 上 小 型 预 处 理 柱 , 试 样 在 进入 层 析 柱 前 先 经 过 预 处 理 柱 ， 用 下 从 方 二 全 民生 相生 二 于 放 入 9 这 个 方法 对 生物 体 牙 分 析 是 极其 有 用 的 。 自动 进 样 器 已 有 商品 出 售 ， 它 能 按 一 定时 间 间 隔 自动 注 人 样品 。 如 和 有 Waters 的 710B 全 自动 进 样 处 理 器 ,一 次 可 连续 分 析 64 个 样品 ， 适 于 昼夜 常规 操作 ,也 可 按 任意 预 先 设计 的 程序 自动 分 析 , 它 还 可 与 730 型 数据 处 理 机 、721 系统 控制 机 协同 工作 。 (4) 色谱 管 柱 : 装 有 填充 剂 的 色谱 管 柱 无 疑 是 色谱 仪 的 核心 部 件 。 高 效 液 相 色 谱 柱 通常 是 不 锈 钢 或 钛 等 金属 柱 管 ， 特 殊 情 况 下 也 有 玻璃 或 氟 塑 料 制 成 的 。 目前 市 售 的 高 效 臣 相 色谱 分 析 用 色谱 柱 有 内 径 2 一 5mm、 长 25 一 100cm《( 适 于 吸附 、 分 配 、 离 子 交换 用 ) 和 内 径 Smm、 长 30 一 50cm《 用 于 凝 胶 透 析 用 ) 等 多 种 规格 ， 视 样品 性 质 和 分 离 要 求 选择 。 当 前 可 供 选 用 的 已 填 装 的 商品 柱 有 : (1) EAE, 如 硅胶 、 氰 基 \ 胺 基 ` 醚 基 硅 胶 等 ， 这 种 填充 剂 颗粒 表面 吸附 一 层 极 性 液 膜 ， 欲 分 离 的 组 分 将 在 该 极 性 液 膜 与 流动 相 之 间 分 配 , 从 而 达到 分 离 目 的 ; (2) 反 相 色谱 柱 , 如 烷 基 《Cu、\Cs)、 葵 基 有 机 高 育 物 等 ,这 种 填充 剂 颗 粒 表面 为 非 极 性 的 液 膜 , 欲 分 离 组 分 将 在 非 极 性 液 膜 与 流动 相 之 间 分 配 ( 亦 称 反 相 型 )， 以 达到 分 离 的 目的 ; (3) 离子 交换 柱 ， 如 乙烯 葵 与 二 乙烯 葵 聚合 物 或 以 硅胶 为 基质 的 键 合 相 ， 采 用 阳离子 或 阴离子 交换 树脂 填充 的 管 柱 ， 第 用 于 分 离 氨基 酸 或 简单 糖 ; 4) 凝 胶 盗 透 色 谱 柱 , 如 茉 乙烯 与 二 乙烯 茉 的 聚合 物 或 以 硅胶 为 基 质 ; 经 过 改 性 的 不 同 孔 径 的 微粒 柱 。 表 10-1、10-2 和 10-3 是 目前 高 效 液 相 色谱 中 常用 的 各 种 填充 物 。 (5) 检测 器 : 2 10-4 是 目前 高 效 液 相 色谱 仪 几 种 常用 的 检测 器 ,工作 者 可 依据 检测 组 分 的 性 质 选 择 使 用 。 由 表 可 见 ， 灵 敏 度 最 高 的 是 荧光 光度 检测 器 ， 常 用 激发 波长 为 360nme 但 是 它 只 适 用 于 检测 洗 脱 组 分 中 能 够 发 射 荧光 的 物质 ， 因 而 受到 限制 。 目 前 商 售 高 效 液 相 色谱 仪 的 标准 组 件 多 为 紫外 吸收 与 可 见 吸收 或 示 差 折光 两 种 检测 器 。 3 5 紫外 吸收 检测 器 : 它们 大 都 是 用 记录 式 紫 外 (或 扩展 到 可 见 光 部 分 ) 分 光 光 度 计 改装 的 。 查 也 有 些 是 采用 价 廉 的 固定 波长 式 光 度 计 作 检 测 的 。 紫 外 吸收 检测 器 的 优点 是 : © 色谱 峰 的 死 体积 小 ;@ 当 高 压 流动 溶剂 不 含有 吸收 紫外 的 物质 时 ,检测 器 对 于 溶剂 的 流动 性 不 敏感 ,这 时 脉动 液 流 不 会 妨碍 样品 检 出 ; @@ 所 需 试 液体 积 较 小 , 并 且 无 须 精 密 严 格 的 温度 控制 。 示 差 折光 检测 器 : 是 借 测 量 溶液 与 纯 溶 剂 两 者 折光 指数 之 差 来 判断 待 测 溶 质 ( 亦 即 被 分 离 的 色谱 组 分 ) 之 浓度 。 表 10-1 _ 液 - 液 分 配 和 液 - 固 色谱 的 填充 物 类 型 名 称 比 表面 (m?/g) | 颗粒 度 (um) | 7B RK 供 应 者 | 薄膜 硅胶 Zipax 1 37 一 44 kG | Du Pont : Corasil I, I (1)7, Ci) 14 37—50 RR | Waters ' Vydac Adrorbent 12 30—44 ER 形 | Separations Group Pellosil HS, HC (HS)4, (HC)8 37 —44 ER JG | Reeve Angel Perisorb A 10 30—40 BR 6 | Vavian . Sil-x-I 12 30—40 BR 9% | Perkin-Elmer MRA es Pellumina HS, HC CHS) 4, CHC)8 37—44 球 | Reeve Angel AES ERK Pellidon 一 1 55—65 BR JZ | Reeve Angel 薄膜 活性 碳 Pell，Carb Reeve Angel ， 全 多 和 孔 硅 胶 | Porasl A. := 350 一 500 37- -55 BR 7G | Waters i Bo 125250 37—55 BR | Waters Cc 50-—100 37-555 | sR 7% | Waters D 25—45 37--55 BR | Waters _E 10—20 37—55 ER. JG | Waters = F 2 一 6 37 一 5 | 球形 | Waters Spherosila 5)1020?30?40 | sR 形 | Rhone-Progil ， Spherosil Xo A600 580 5510520530540] ER FB | Rhone-Progil Lt Porasil 400 10 非 球形 | Water Bio-Sil A 200 20—40 非 球形 | Bio-Rad Lichrosorb® Si-60 500 5510530 非 球形 | Merck® Lichrosorb, Si-100 400 5510,30 | 非 球形 | Merck Spherisorb SSW S10 W, 200 5510520 k 形 Phase Separations ) S20W Partisil 5, 10, 20 400 5520520 4EERIG | Reeve Angel __ Zorbax- Sil 300 4 一 6 Ee 7% Du Pont Porasil T 300 — 15—25 非 球形 | Waters Lichrospher Si-100 250 10 we | Merck Lichrospher Si-500 50 10 ak Merck Lichrospher Si-1000 20 10 k 形 Merck Lichrospher Si-4000 6 10 球 形 Merck Micropak Si-5，Si-10 500 5—10 非 球形 | Ya Vian 全 多 孔 氧 化 铝 | Bio-Rad AG Alumina 200+ <75 非 球形 | Bio Rad Lichrosorb ALOX T 70 30 非 球形 | Merck a. Spherosil 原 有 六 种 型 号 : XOA 400, XOA 200, XOB 75, XOB 030, XOB 015, XOC 005， 分 别 与 PorasilA, B, C, D, E, F 相对 应 。 b. 原名 Mercksorb, a EM. 在 美国 的 实验 室 。 * 169. SIDIE AM OJDIE URLIEA JIU -ULyzI2g pPBuy easoy dnoiy uonriedas dnoip uoneredas QuPIIEA SIDIE AM SIFIEM JeuulJ-uIIsd JourlJ-atJIsd jog nd TouulJ-urlIad SI91P 从 YII9W SIOIEM Ts3uVw sassy log nq dnoin suoneredag dnoiy uoneredeas suoneiedss aseyg qwog nq yrs] JeulIJ-0rITIsd IeuulJ-IrIsd GEIIEA FIO _pesuy sr204 SI9lP 从 SI31PAA EL Ip Or Os—LE (url) BI ik VB ARRVA*R RB RNRAREH ARRA*”R A BE tH PR | Zipax Wax. ， 25—37 DuPont 薄膜 强 阳离子 lon- X -SC 30—40 Perkin-Elmer “Pellicular Cation” 10 一 40 Varian , HC-Pellionex SCX 60 44—53 Reeve Angel HS-Pellionex SCX 8—10 44—53 Reeve Angel Perisorb KAT 1o--* 30—40 Merck Vydac Cation Exchanger 100 30—40 Separations Group Zipax SCX 32 25—37 Du Pont 三 .全 多 我 阴离子 ， |- Aminex A-14 3400 17—23 Bio-Rad ae : Aminex A-25_ 3200 15.5 一 19.5 Bio-Rad MF Mt S21 Aminex A-27 3200 17—15 Bio-Rad PN 4 |. Aminex A-28 3200 711 Bio-Rad 7 DA-X8A 4000 6 一 10 Durrum er DA-x4 ' 2000 15-25 | | Durum ARMAS Pe x2 2000 15—25 Durrum 全 多 孔 阳 离子 Aminex A-4 5000 16—24 Bio-Rad 《聚合 物 载体 ) Aminex A-5 5000 11—15 Bio-Rad Aminex A-6 ~ 5000 5.5 一 19.5 Bio-Rad Aminex A-7 - - 5000 7 Bio-Rad AA-15 5000 16 一 28 Beckman PA-28 5000 16 Beckman PA-35 5000 13 Beckman. DC-IA 5000 15—21 Durrum DC-2A 5000 9—15 Durrum DC-4A 5000 =. |. 610 Durrum AN-90 5200 16—28 Hamilton B-80 5200 10—20 Hamilton H-70 5200 18—30 Hamilton 全 多 孔 阴 离子 Partisil-10-SAX® 10 Reeve Angel 《无 机 载体 ) Vydac Tp Anion Exchange 10 Separation Group 全 多 和 孔 阳 离子 Partisil-10-SCX 10 Reeve Angel 《无 机 载体 ) Vydac Tp Cation Exchange 10 Separation Group a 键 合 相 。 es 1T71。 表 10-4 HPLC 中 几 种 常见 的 检测 器 PS Al | HS Ma 专 三 性 10? 10 10 10? 10 10? 10? 10 10” at dt oH at at MH att | S (6) 记录 仪 能 将 分 析 结 果 自 动 记录 下 来 ; 自动 数据 处 理 机 通过 积分 运算 自动 打出 结 果 , 提 高 了 仪器 的 自动 化 水 平 。 三 、 利 用 高 效 液 相 色 谱 技 术 分 离 纯化 蛋白 质 和 多 肘 (一 ) 一 般 说 明 应 用 高 效 液 相 色谱 技术 分 离 制备 蛋白 质 和 肽 , 虽然 历史 不 长 , 但 发 展 相当 迅速 ,在 蛋 白质 顺序 分 析 中 已 经 成 为 分 离 纯化 蛋白 质 和 肽 段 以 及 鉴定 Edman 降解 反应 产物 诸 方 法 中 最 有 效 的 方法 "。 用 高 效 液 相 色谱 仪 分 离 制备 蛋白 质 和 多 肽 ， 重 要 的 是 要 选用 适当 的 柱 填 料 和 洗 脱 条 件 (包括 洗 陪 溶 剂 )。 早期 用 于 分 离 蛋 白质 的 填料 是 具有 不 同 颗粒 度 与 孔径 的 玻璃 微粒 (CPG)， 虽 然 多 和 孔 玻 璃 微粒 的 机 械 性 能 好 ， 但 对 蛋白 质 的 吸附 性 较 强 。 为 了 克服 上 述 困 难以 及 常规 波 - 液 色谱 所 存在 的 许多 问题 , 发 展 了 化 学 方法 , 即将 固定 相 键 合 到 载体 材料 上 这 种 形式 的 液 相 色谱 称 为 键 合 相 色谱 。 通 常用 于 制备 键 合 型 载体 的 简化 反应 见 图 10-2。 (1) 硅 酸 盐 酯 类 (2) BARA °172¢ @ 格 氏 反 应 10-2 “用 于 制备 键 合 相 色 谱 相 的 简化 反应 ， 使 用 键 合 相 载 体 可 以 大 大 提高 样品 率 ( 见 表 10-5)。 CHER, 捷克 斯 治 伐 克 科学 家 中 在 分 离 蛋白 质 时 曾 采 用 具有 甲 基 丙 烯 酸 乙 二 醇 本 的 高 分 子 聚 合 物 Spheron， 其 亲 水 性 、 机 械 强度 和 化 学 性 能 都 良好 ， 适用 于 疹 透 色 谱 中 采用 不 同 颗 粒度 与 交 联 度 的 这 种 聚合 物 可 分 离 不 同 分 子 量 的 蛋白 质 。 后 来 ， 又 有 人 采用 二 种 凝 胶 一 一 六 Bondagelm， 它 能 键 合 醚 基 ， 可 用 于 以 水 为 介质 的 色谱 分 离 , 它 的 吸 附 迁 较 小 ， 对 蛋白 质 的 分 离 效果 与 分 离 速度 较为 理想 。 表 10-6 是 _w- Bondagal 的 孔径 与 蛋 自 质 分 子 量 的 排 阻 极限 关系 。 & 表 10-5 各 种 蛋白 质 或 酶 在 键 合 与 不 键 合 CPG 载体 的 回 收 率 CPG-Glycophase G 上 的 CPG- 无 键 合 相 上 的 回收 率 (%) 回收 率 〈92) 81 0 94 13 |. CPG-Glycophose G 是 在 多 和 孔 玻璃 微 珠 表 面 的 一 OH 基 上 键 合 甘油 丙 基 。 表 10-6 p-Bondagel 的 孔径 分 子 量 排 阻 极限 a SR ee EEE . 125 2 ,000—50,000 300 3,000—100,000 500 5 ,000—500 ,000 1,000 50 ,000—2000,000 VEAEK, SER) Waters AAEM S AME (Protein Column)” FL ARRE AIR 素 缓 冲 疲 作为 洗 脱 液 ,解决 了 蛋白 质 与 大 肽 的 难 溶解 问题 。 表 10-7 是 该 公司 出 品 的 蛋白 质 柱 的 有 关 型 号 和 它 分 离 生 物 大 分 子 的 范围 。 当前 ,人 们 普遍 采用 反 相 键 合 相 ( 如 CeCe) (EXE ERS SEA eB, CCu 又 名 RPs、RPa， 它 是 在 一 定 孔 径 的 活性 硅胶 表面 键 合 辛 烷 基 或 十 八 烷 基 等 非 极 性 ei73 。 % 10-7 型 号 和 AR 1 一 60 7.8mm(1D)X30cm 1 一 125 7.8mm(1D)X 30cm 1 一 300 7.5mm(1D)X 30cm 分 离 生 物 大 分 子 范 国 RRR DF TERR BRA F CMW) 1,000—20,000 600—-8 ,000 2,000—80,000 1,000— 30,000 10 ,000—500,000 2,000—150,000 基 团 。 反 相 色 谱 对 提高 分 离 蛋白 质 和 肽 的 效力 有 重要 意义 ;与 其 它 分 离 技术 比较 ,更 具有 快速 、 灵 敏和 高 分 辩 率 的 优点 中 LA 10-3)。 在 反 相 色谱 分 离 过 程 中 , 移动 相 的 选择 十 工 凝 胶 过 滤 10-3 HA AMR A Beis HF A Cis fie 50 分钟 ) 的 高 效 疲 相 色 谱 分 离 I， 用 凝 胶 过 滤 柱 CUltropac TSKG 2000SW, 7.5X600mm) 分 离 。II[.(〈 下 图 ) 用 反 相 柱 RP-18 (5m) 4.0X%250mm 分 离 用 凝 胶 过 滤 柱 "GD 所 未 能 分 开 的 肽 妥 。 监测 波长 220nms 分 关键 ， 通 常 移动 相 是 有 机 溶剂 与 水 或 水 溶液 的 混合 体系 。 常 用 的 有 机 深 剂 有 乙 有 睛 、 甲 醇 、 丙 醇 等 。 与 有 机 溶 剂 相配 比 的 溶液 有 TEARS, = Z, 胺 磷酸 、 磷 酸 、 栈 酸 以 及 三 氟 醋 酸 水 溶液 md 等 。 一 般 认 为 TEAP 和 磷酸 缓冲 液 对 肽 段 洗 脱 回收 率 高 。 重 复 性 好 。 用 cu 分 离 小 肽 和 氨基 酸 效 果 更 好 些 。 另外 ，Tempsty P. 等 人 am 报道 采 用 大 孔径 丙烷 (Cs) ERA REE 特别 是 分 离 大 的 和 朴 水 性 蛋白 质 ， 以 及 采用 氰 基 丙 烷 甲 硅 基 (CN 型 ) 填 料 分 离 蛋 白质 和 较 大 的 隐 ( 大 于 5,000)， ”获得 满意 的 效果 。 采 用 改变 有 机 溶剂 梯度 的 方法 也 已 成 功 地 分 离 了 胶原 蛋 白 、 激 素 、 转 移 生长 因子 om 和 后 叶 激 x, BREA 等 。 所 用 的 有 机 深 FECL, EAM. PR CR 酮 ,相配 伍 的 水 溶性 体系 有 磷酸 缓冲 液 、 稀 磷酸 、 氧 化 钠 /盐酸 溶液 . 策 过 氢 有 机 酸 、 三 乙 胺 磷酸 和 甲酸 缓冲 液 . 酷 酸 缓冲 液 等 。 据 说 CN 填料 对 PTH 一 氨基 酸 的 分 析 也 可 获 稳 定 满意 的 结 ° 应 用 反 相 色谱 获得 很 好 分 离 的 蛋白 质 和 肽 的 例子 很 多 ,如 1979 4 O'Hare, M. J. 他 的 同事 2 成 功 地 分 离 了 32 个 激素 多 肽 和 多 种 蛋白 质 ， 大 小 从 -5 一 584 氨基 酸 残 基 ; Rubinsten, M. 等 凹 分 离 纯化 了 人 白血球 的 干扰 素 分子量 18000)。 但 也 不 是 所 有 的 蛋 白质 都 能 用 反 相 色谱 分 离 , WALES, EAS. 有 时 由 于 洗 脱 溶剂 和 缓冲 液 选 择 不 当 , 往 往 造 成 分 离 失 败 。 一 般 反 相 填 料 仅 限于 对 30 个 残 基 以 下 的 小 肽 分 。174。 离 ,大 肽 可 能 会 在 反 相 载 体 表 面 沉积 , 故 有 人 认为 用 分 子 筛 类 型 的 填料 往 分 离 蛋白 质 和 大 肽 较为 合适 。 联邦 德国 分 子 遗 传 研究 所 的 Wittman—Liebold™ 曾 全 面 总 结 过 用 高 效 液 相 色 谱 技术 分 离 蛋 白质 和 多 肤 的 工作 ,认为 使 用 碳 氨 化 合 物 支持 剂 如 Ci 或 Cu (颗粒 直径 为 5pm 或 10wm) 的 反 相 柱 , 温度 30—50°C, 流速 0.5 一 1.5ml/ 分 ,分 离 肽 是 最 适 宣 的 ;对 移动 相 的 选择 ,认为 各 种 水 溶性 缓冲 液 加 盐 制 成 5 一 50nmol 较 好 , 有 机 溶剂 以 己 陋 、\ 正 两 醇 、 异 丙 醇 甲醇 或 乙醇 ,并 采用 梯度 洗 脱 为 好 ;她 还 指出 ; 虽然 磷酸 高 氧 酸 和 三 径 基 胺 盐 或 磷酸 缓冲 液 对 肽 的 溶解 性 较 高 ,但 挥发 性 缓冲 液 如 5 一 10nmal/1 乙酸 胺 、BH4 的 甲酸 、 5.5mmol/1 碳酸 氢 胺 (pH7.5) 或 0.05% 的 三 氟 醋 酸 用 作 进 一 步 纯 化 ， 特 别 是 纯化 小 于 20nmol 的 肽 效果 更 好 , 并 认为 用 高 效 液 相 色 谱 技术 分 离 Pmol 量 的 肽 是 最 理想 的 , MK 量 达到 nmol 或 更 大 时 ， 单 独 用 高 效 液 相 色 谱 常 常 不 能 完全 分 离 一 个 复杂 的 混合 肽 。 遇 到 这 种 情况 可 先 用 常规 液 相 色谱 分 离 技 术 ( 如 Sephadex gel)， 再 用 高 效 液 相 色谱 ， 或 先 用 高 效 液 相 色 谱 ， 随 后 再 把 未 分 开 的 肤 段 用 薄 层 指纹 图 法 分 离 。 她 们 运用 这 样 的 方法 曾 先后 分 离 了 若干 种 核糖 体 蛋白 (S，Lr，Ls 等 ) 的 裂解 肽 段 。 -同时 ,她 也 总 结 了 利用 反 相 色谱 分 离 肽 的 一 些 弊病 : (1) 由 于 被 分 离 的 混合 肽 的 浓度 要 求 有 一 定 范围 ， 因 此 对 溶解 度 较 差 的 肽 来 说 是 很 难 掌握 的 ; (2) 分 离 混 合 肽 需 根据 其 分 子 量 及 组 成 情况 选择 分 离 条 件 , 否 则 容易 丢失 肽 ; (3) 作为 分 离 肽 的 填料 ,目前 一 般 不 能 用 于 碱 性 条 件 , 所 以 对 一 些 在 碱 性 条 件 下 才 溶 解 的 肽 段 ， 它 们 的 分 离 受 到 了 限制 ; (4) 卧 水 性 肽 在 分 离 过 程 中 损失 K, 回收 率 低 《20 一 40 多 ), 含 色 氨 酸 、 茶 丙 氨 酸 和 含 脂 类 的 肽 回收 率 也 很 低 ; 即 使 是 亲 水 性 肽 ,一 般 也 只 有 80% 左右 回收 率 。 | (=) 应 用 示例 例 1; FREES RODS, Ra: 若干 种 混合 蛋白 质 ,每 种 20ug。 填充 柱 : wwBondapakel8 (Waters 公司 ) 移动 相 ， A=0.1% TFA B=CH;CN:H,O & 0.1% ~ “TRA (70: 30) , 洗 脱 梯度 :0.90% B， 曲 线 6( 仪 器 上 的 刻度 值 , 示 梯 度 洗 脱 条 件 , 以 下 同 )。30 分 钟 。 流速 : 2ml/ 分 监测 波长 : 280nm 结果 见 图 10-4, © 例 2:| 马 心脏 细胞 色素 “ 经 胰 蛋 白 酶 酶 解 后 ae a ae aie ls a 8 图 10-4 机 水 性 重 折 质 的 分 元 ;INJEcr RE: 马 心细 胞 色素 的 胰 蛋 白梅 酶 解 物 ( 选 样 )，Ribonuclease A BERBERS A). A. 填充 柱 ，p 一 Boudapak phenyl 柱 Insulin (胰岛 素 )，Trypsin Inhibiltor (i BA eve Bi. vd 1 (0.099% TPA) 蛋白 酶 抑制 剂 ) Myoglobin’ (WATE )o 溶剂 I (AFH) 1: ChF=10:90) PLR: 48ml//\\Y 核糖 核酸 酶 AA 障 蛋 白 酶 抑制 剂 胰岛 素 注入 。175。 监测 波长 : 206nm B .填充 柱 . p-Bondapak phenyl 柱 梯度 洗 脱 : 溶剂 1(0.9mol/1 BEB, 0.25mol/1 吡啶 pH4:0)， 溶 剂 工 ( 溶 剂 1: EA 醇和 40:60) 流速 : 20ml/ 小 时 其 中 159 样品 经 荧光 胺 反应 后 色谱 。 C. 填充 柱 : RPS, 其 它 条 件 同 Be £5 FR UL 10-5, aN 从 13 : X 0.3 acy te eon] 50 fee 40 & 0.2 45 6 yf .sohzil415 30 = oO 0.1 S ese al 9 1617 20 你 和 Use 10 8 0 0 . 20 40 60 80 时 间 【分 ) amets - oem re - acon” wm 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 时 间 (>) 10-5 马 心 脏 细 胞 色素 < 经 胰 蛋 白 酶 裂解 后 在 反 相 柱 上 的 分 离 例 3， 核 糖 体 蛋白 S 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 在 反 相 柱 上 的 分 离 ”。 样品 :核糖 体 蛋 白 S: 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 ，S: 的 分 子 量 为 27, 000， 由 30 个 酶 解 肽 组 填充 柱 ，Lichrosorb (Merck) RP-18 (AL 5um) 不 锈 钢 柱 长 25cm， 内 径 4.6mmo 进 样 量 ; 15ul (EF 400wg/15nmol) 溶解 在 缓冲 液 A 加 24L 申 酸 中 流速 : 2ml/ 分 wae. 40% Fe 2206 仪器 ，Dupont 850 监测 波长 : 220nm | 梯度 洗 脱 : 缓冲 液 A: 0.25ml FABR(98% )+0.4ml BALK (25% )+21 7K pH4.2oe 缓冲 液 B: 80% FARX+20% BIR Ao | KEEFE. 0%B— 50%B, 20 分 钟 50%B 一 > 80%B，20 分 钟 80% B—> 80%B, 15 分 钟 es。 176 。 16,10 B% 8 梯度 181% 19 T2 | 122 io T12 1 T24 | T8 128 30 a 1 0 0 15 35 | 55 分 图 10-6… 核糖 体 蛋白 S: 经 胰 蛋 白 酶 裂解 后 在 反 相 柱 上 的 分 离 80%B—>0%B, 24> 0% B AEF 15 分 钟 结果 见 图 10-6, 在 30 个 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 段 中 ,其 中 70% 由 反 相 柱 一 次 分 离 纯 化 ,其 纯度 可 直接 作 顺 序 分 析 。 ， 例 4: Vs 蛋白酶 酶 解 牛 血 清 蛋白 B 在 1BM -CN BE LAUD BS", 样品 : FSA V;, SEB Bis BF Inmol 填充 柱 : IBM-CN FE 梯度 洗 脱 : 1% B(70% Gise)/DC& HA, 0.12% 三 所 醋酸) 流速 : 1.5ml/ 分 监测 波长 : 212nm， 理 论 上 估计 有 53 VB Ko 结果 见 图 10-7, 例 5: 马 细胞 色素 胰 蛋 白 酶 酶 解 肽 和 非 酶 解 的 若干 蛋白 混合 物 在 RPSC 柱 上 ovo 10 20 30° 40° 506070 8 0 “B (70% ZF) 的 分 离 205 ati] (SP) 样品 : 马 细 胞 色素 胰 蛋 白 酶 酶 解 物 10-7 Vs 蛋白 酶 酶 解 牛 血 清 蛋白 B 后， (1.2nmol) 和 细胞 色素 <(1wg)， 牛 血清 蛋 gp os ad 白 (1.5wg)、 肌 蛋白 (0.3wg)、 鸡 卵 清白 蛋白 (1.5pg)。 样品 用 5 多 三 氟 醋 酸 溶解 , 进 样 10ulo 填充 柱 : Beckman Ultrapore RPSC # (7.5 X 0.46cm) 们 度 洗 脱 : 溶剂 A: 0.12 多 三 氟 醋 酸 / 水 © 177.¢ 溶剂 3: 0.12% 三 氟 栈 酸 /70% Cia 梯度 : 1% B/ 分 (0—40 分 钟 ) 2 和 B/ 分 〈40 一 70 分 钟 ) MeL: 1ml/ 分 鉴定 : KER DABITC 降解 反应 后 鉴定 , 即 作 DABTH 未 端 氨基 酸 和 氨基 酸 分 0.2 et 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 时 间 《〈 分 ) 10-8 Daa ¢ RE ARs ei SR 若 于 种 蛋白 混合 物 在 RPSC 柱 上 的 分 离 表 10-12 ”细胞 色素 e RSRRSUKAEBREFT SA RPSC-C3 和 IBMCN 柱 分 离 的 回收 率 和 洗 脱 特性 RPSC(7.5X0.46cm) IBM CN (25X%0.46em) 号 |B(9%2)N 端 残 基 | 产 率 (95) | 号 | BOM)IN MIE! 产 率 (92) ik 链 [K,GK,HK,NK,GGK,TER, ATNE] 1 0 N.D.* | Average 77 1 GDVEK 2 5 = 80 2 j YIPGTK 3 18 Y 100 3 | 34.5} -y ©} 100 IFVQK 4 19 Ty 82 4 | 37 1/L? 96 GITWK 5a | 21 G 92 7 | 46.5 | sae 89 TGQAPGFT'YTDANK spy iz | 6 | 40 了 56(94) KTGQAPGFTYTDANK | 21 aia is 8 | 49 K 38(94) EDLIAY 6 25 E 52(98) 5 | 38 E 46(93) MIFAGIK 7 | 27 M 90 10 | 58 M 79 TGPNLHGLFGR ge i29 T 68 13. | 73.5 T 63 CAQCHTVEK( +Heme) ¥, 31 = 99 — | N.E co 0 EDLIAYLK ION 82 E 46(98) 9 | 56 E 47(93) EETLMYENPKK 11 35 E 36(91) 12} zies E 37(96) EETLMYENPK 12° “| 36.5 E 55(91) 11 | 59 E.M* 59(96) 马 细 胞 色素 ¢ 13 51 N.D. N.D. ;一 | N.E. - 0 牛 血 清白 蛋白 14 60.5 | N.D. N.D. — |N.E. 一 0 土壤 杆菌 细胞 色素 sac 15) [562 N.D. N.D. — |N.E. aaa Pe 抹香鲸 肌 红 和 蛋白 16 65 N.D. N.D. 一 |N.E. 一 0 鸡 卵 清白 蛋白 17 72 N.D. N.D. 三 | N.E. 一 0 a --- 其 中 : a. 未 测定 ，b。 RRB. c. DABTH-Thr 和 Lys, d. DABTH-Ile 或 -Leu，c.。 DABTH-Glu 和 Met *。178。 析 。 和 蛋白 质 是 用 SDS 凝 胶 电 泳 鉴定 。 结果 见 图 10-8 与 表 10-12。 例 6: 天 花粉 蛋白 在 Protein 1-125 柱 上 分 离 "”。 样品 : A7E A 10el fk 素 甲 酸 溶液 (含量 20wg/ cl) oD 填充 柱 : Protein 1-125 柱 7.6mm(ID) X 30cm 移动 相 : 6mol/1 HRA, 0.2 mol/l 甲酸 溶液 。 : 监测 波长 : 280nm 结果 见 图 10-?。 ，， 例 7 反 相 高 效 液 相 色谱 BGM 仪器 : Waters 公司 产品 ， 由 6000A 型 溶剂 输出 系统 、660 型 洗 脱 程序 和 UGK 注射 器 组 成 , 配 有 440 型 紫外 吸收 检测 仪 、 420 型 英 光 检测 仪 及 Ommiscribe 双 道 记录 仪 亲 Houston Instrument)e HR Waters 生产 的 Bondapak Cu 反 相 柱 ， 内径,3.9mm， 长 30cm， 填料 颗粒 EE 10zmo 洗 脱 溶剂 : 溶剂 A: 40% FB, 60% K, 0.1% 三 氟 酷 酸 溶剂 B: 90% FARE, 10% 7k, 0.1% 三 氟 栈 酸 RM pH 4H 2.5, Be: 样品 溶 于 0.1% 三 氟 酷 酸 水 溶液 ,浓度 约 为 3—5me/ml, # Millipore HA(0.454) 过 10-9 天 花粉 蛋白 在 Proteia 1-125 柱 上 分 离 A280 60 a g 40 1 2 40 A 20 > 20 + ' U 5 10 20 30 分 图 10-10 和 牛 胰岛 素 和 猪 胰 岛 素 的 分 离 "10-11 猪 胰岛 素 与 其 衍生 物 DOI，DPI 的 分 离 (1. 牛 胰岛 素 ，2. 猪 胰岛 素 ) 1. DOL, 去 B 链 QC@ 端 八 肽 (B23 一 30) 胰岛 素 ; 2. DPI, EBROM 五 肽 (B26 一 307 胰岛 素 ; 3. 胰 岛 素 。 °179¢ We vERRE 10—25zyl, 层 析 温度 : # 20°C 流速 : 1.5ml/ 分 AE. 不 超过 2900 Psi 记录 纸 速度 : 0.25em/ 4 监测 波长 : 280nm 结果 见 图 10 一 10, 10 一 11。 四 、Edman 降解 产物 的 高 效 液 相 色 谱 高 效 滚 相 色 谱 在 蛋白 质 或 多 肽 顺序 分 析 中 的 另 一 用 途 是 检测 Edman 降解 反应 的 最 终 产 物 一 -PTH- 氨 基 酸 或 DABTH- 氨 基 酸 或 DNS- 氨 基 酸 等 。 用 它 鉴 定 速度 快 , RK 度 高 ,不 仅 能 定性 也 能 定量 , 鉴定 后 的 产物 还 能 回收 , 是 其 它 方法 所 不 及 的 。 (一 ) PIH- 氢 其 酸 高 效 液 相 色 谱 Ree PTH- 氨 基 酸 的 优点 吧 是 : (1) PTH- 氮 基 酸 可 直接 进 柱 分 析 , 允 需 转 化 为 挥发 性 衍生 物 ; (2) 适用 于 对 热 稳定 性 较 差 、 挥 发 性 较 低 的 PTH= 和 氨基酸， 如 -Asn、-Asp、-Glu、-Trp、-Thr 等 ; (3) PITH- 氮 基 酸 检定 后 可 以 回收 ;《〈4) 灵敏 DE om sO a SH R 100 pmol Q pM te] « Sia ate eae Ors Be: Ww |} orm A mh RY «|| ms V = 人 KL Me R? se | o 11.88x 起 始 10-12 PIH- 氢 基 酸 的 分 离 180。 EB. DEM 40pmd 就 可 进行 有 效 的 分 析 检 定 。 通常 可 采用 吸附 色谱 和 反 相 色谱 鉴定 .PTH- 氮 基 酸 。 极 性 强 的 PTH- 毛 基 酸 被 载 体 吸 附 较 强 , 宜 选 用 反 相 色谱 。 例 1; PTH- 氮 基 酸 分 离 ( 非 梯 度 洗 脱 系统 )296 柱 :; Lichrosorb RP-18 Hibar 5um, 长 度 30cm， 内 径 4.6mm, 不 锈 钢 柱 ， Merck 65000/m 理论 塔 片 数 。 BAH. 68.5% 0.01 mol/l 栈 酸 钠 pH5.4，31% Gi#, 0.5% 1, 2- 二 氯 乙 烷 。 温度 : 62°C 流速 : 1.5 ml/ 分 分 析 一 次 时 间 : 25 分 钟 仪 右 : Hewlett Packard 1084B 结果 见 图 10-12。 . 例 2: PTH- 氮 基 酸 分 离 ( 非 梯度 洗 脱 系统 )27。 KE: Lichrosorb Si60 ( 双 柱 串联 ) 5um, Merck Cat 9388， 柱 长 度 30cm 和 20cm, 内 径 3mm， 由 钥 制 成 : Bante: a. 臣 水 性 化 合 物 — SAE: AMM: LT A (1000:0.8:8) b. 亲 水 性 化 合 物 二 氧 甲 烷 : 三 甲 三 硕 : 水 (8021522) FEA: 2508 WH: 25 流速 a. 1.65 ml/4> b. 0.83 ml/ 分 . MAT: 完成 一 次 分 析 需 7 分 钟 Leu + lleull) Val leu) Met 图 10-13) Hike Rw PIH- 衍 生物 的 分 离 ° 181° 仪器 . Siemens 200 . 监测 波长 : 紫外 波长 260nm, Zeiss PM4 结果 见 图 10-13 和 图 10-14, 例 3: PTH- 氮 基 酸 和 PTC- 氮 基 酸 甲 基 酯 中 间 体 分 离 2a。 ATZ- 氨 基 酸 -ae PTH- 氨 基 酸 + PTC- 氨 基 酸 甲 基 栈 (OMe) Lys 10-14 RKEABK PTH- 衍 生物 的 分 离 介 图 10-15 “用 甲醇 -盐酸 转换 后 的 PTH- 氨 基 酸 ( 含 甲 基 酯 中 间 体 ) 的 分 离 SCMC, 次 甲 基 半 胱 氨 歌 ; e-Succ-K, e-HEPIMEMVALEE; D-OMe， 天 冬 氨 酸 甲 基 醒 ; s-Succ-K-OMe， 8- 琥 珀 栈 赖 氨 酸 甲 基 酯 ; E-OMe， 谷 氨 酸 甲 基 酯 ; AT, 脱 氢 苏 氨 酸 ; SCMC-OMe, #857 39 pe eae FA 基 酯 ;NorV， 正 缚 氢 酸 NorL, ERM, * 182 填充 柱 ， Zorbax-ODS 柱 (Dupont) 长 度 25cm, Af 4.6mm YmEF: 46°C 移动 相 : 起 始 缓冲 液 : 0.044mol/1 AAR, pH4.15, 10% Cio 最 终 缓 冲 液 ，0.044mol/1l BERR, pH4.15, 90% Gio 洗 脱 程序 ， 使 用 Waters M-710 系统 控制 ,斜率 的 变化 为 曲线 6e 流速 ，1.8 一 2.5 ml/ 分 监测 波长 . 254nm. 结果 见 图 10 一 15。 例 4: PTH- 氨 基 酸 分 离 (梯度 洗 脱 )29?。 柱 ， Lichrosorb RP-8 10xm， 长 度 25cm， 内 径 4.6mm， 不 锈 钢 制 ，Mercke aA: A. 2.2mmol/] 醋酸 ，pH4.9 (用 1mol/l AA Wid) B. 甲醇 (分 析 纯 ) Merck 梯度 : 5 一 489% 移动 相 B( 在 25 DHA) WEF: 35°C 流速 : 2.5 ml/ 分 时 间 :-28 分 钟 AL# Hewlett, Packard M1080A 结果 见 图 10-16, 个 1 a" 10 时 间 〈 分 》 图 10-16 PTH- 氨 基 酸 的 分 离 (梯度 洗 脱 ) sa 183 。 例 5: PIH- 氮 基 酸 分 离 ( 分 级 梯度 洗 脱 )2o。 KE: Zorbax CN 分 析 柱 ,5zm, 连 Dupont Permaphase ETH quard 柱 〈50 X 4.6mm), 长 度 25cm， 内 径 4.6mm 不 锈 钢 制 。 移动 相 ，A. 0.024mol/] 酷 酸 钠 缓 冲 液 ，pH 5.4 0， 5 10 15 20 25 30 分 10-17 PTH- 氨 基 酸 的 分 离 ( 分 级 梯度 洗 脱 ) 。184。 B. FAB?/ Giia(17:3) 梯度 : 见 图 10-17 温度 31°C 流速 : 1.0 ml/4> 一 次 分 析 时 间 : 30 分 钟 仪器 : Waters, Associates Model 600A (溶剂 输送 系统 ) Waters，Associates Model 710。 Waters, Associates Model 400 双 模 吸收 检测 器 (254nm, 313nm)~ 结果 见 图 10-17。 (=) DABTH- 氢 基 酸 高 效 液 相 色谱 呈 0 示例 ， 样 品 ， 标 准 DABTH- 毛 基 酸 #: Kanuer RP8 7um 梯度 洗 脱 , 深 剂 A: 8mmol/l RR pHS 溶剂 B: 90% 甲醇 BE: 从 60% BB 85% B20 分 钟 柱 温 . 40° 流速 : 1.5 ml/ 分 监测 波长 436nm 结果 见 图 10-18。 0.02AUFS 0.005AU FS 图 10-18 标准 DABTH- 氮 基 酸 的 分 离 ”185。 (=) DNS- 氨 基 酸 的 超 微 量 高 效 液 相 色谱 "2 进行 超 微 量 分 析 的 高 效 液 相 色谱 仪 配 有 化 学 发 光 反 应 检测 系统 。 经 过 色谱 分 离 的 DNS- 氮 基 酸 在 检测 前 需 用 双 〈2,，4,，6- 三 毛茶 ) 草酸 〈 简 称 TCPO) 和 双氧水 反应 ， 使 DNS- 氨 基 酸 具有 发 光 性 ， 人 DNS- 氨 基 酸 分 析 法 提高 数 十 倍 。DNS- ;氨基 酸 发 光 反 应 的 原理 如 下 : Cl a cl (eth? ma M3 O >.Q \ TN ee ) ol ll a— —o—C—C—o— 一 Cl + H,O, 一 > eo + 2 HO— 一 位 2! UE ¢, Fa Aad (=) 1 了 ¢ C 十 DNS- 氨 基 酸 —> DNS- 氨 基 酸 * + 2CO， o-—oO] DNS- 所 基 酸 # 一 > 激发 光 + DNS-REM- 其 中 DNS- 氨基酸 ?为 强 发 光 性 的 DNS- 氮 基 酸 。 样品 : 标准 DNS- 毛 基 酸 ， 进 样 1 20 吕 用 洗 脱 A 配 成 浓度 约 为 ol/ 每 本 种 DNS- 氨 基 酸 。 ， 和 人 De 填充 性 : TSK-Gel 型 oDs- 120A FE (150 X 4.6mm) (Toyo 这 和 制造 公 al, HA, Tokyo 产品 )。 | 化 学 发 光 检 测 器 为 |&HO 公司 (日 ee 本 Tokyo) 产品 。 是 梯度 洗 脱 : 溶剂 A，0.1mol/1 BRR: Seas 磷酸 缓冲 液 CH7.0): 乙 睛 二 90310(V/V) 保留 时 间 〈 小 时 )， 州 B- 0 PR PEER 图 10-19 DNS $a RRR ECA eal Bee 缓冲 液 (pH7.0) » Lys Ala Val 记录 器 记录 的 峰 局 9 > m ca g ZH S55: 45 (V/V) RGEE: 30% B(70%A) 一 > 99% B(10%A), 250 分 钟 。 注意 : 进 样 前 色谱 柱 先 用 溶剂 B 洗 30 分 钟 ,然后 再 用 溶剂 A 平 衡 3 小 时 。 洗 脱 流速 : 0.3 ml/ 分 DNS- 氮 基 酸 发 光 性 反应 : 试剂 用 乙酸 乙 酯 :丙酮 (1:3V/V) 配 成 0.25mmol/l TCPO 和 75mmol/l H;O， 的 混合 液 , 以 流速 1.8ml/ 分 与 DNS- 氨 基 酸 反应 0.8 秒 ， gals ; 学 发 光 检 测 器 检测 。 结 果 见 图 10-19。 S/F AR [1] Kenneth, A. Ww. et al.; Advances in Protein Sequencing, Annu. Re. Biochem., 50, 261—284(1981). 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Chromatog., 303, 173—176(1984). 188 第 十 一 章 ”顺序 分 析 技 术 在 异常 血红 香 白 结构 研究 中 的 应 用 5 | 全 | 血红 蛋白 (简称 -Hb) 分 子 病 是 一 种 典型 的 遗传 病 , 是 由 于 基因 突变 致使 血红 蛋白 的 珠 蛋 白 分 子 结构 改变 或 珠 蛋 白 合成 障碍 ( 即 合成 速率 降低 或 消失 ) 而 引起 的 。 人 类 的 血红 蛋白 是 由 珠 蛋 白 和 血红 素 结合 而 成 的 四 聚 体 ， 每 一 珠 蛋 白 由 两 对 (四 条 ) 珠 蛋白 链 构成 ， 一 对 是 由 141 个 氮 基 酸 组 成 的 w 链 (a); 另 一 对 是 由 146 个 氨基 酸 组 成 的 非 w 链 ( 如 B2502,7%2) ( 见 表 11-1 和 11-2 两 条 c 链 和 两 条 8 链 或 8 链 组 成 人 血红 蛋白 ， HbA(o82) 和 HbA:(o52); 另 两 条 c 链 与 7 链 组 成 胎儿 血红 蛋白 ， 瑞 bF(ay2)。 由 于 7 链 有 Gr 和 Ar 二 亚 型 ,因而 又 分 成 «Grn AoA, 二 类 型 。 此 外 , 还 有 三 种 胚胎 血红 蛋白 ， HbPortland (2.72), HbGowerI (&¢,) 和 HbGower II (a,6,), HbF 是 胎儿 呼吸 需要 的 ， HbA; 则 认为 是 一 种 返 祖 现象 。 从 胚胎 期 到 成 年 ,人 的 红 血 蛋 白 的 变化 如 表 11-3%, 这 些 都 是 正常 的 变化 。 表 11-1 正常 人 血红 蛋白 肽 链 的 氨基 酸 组 成 比较 Kk 链 qk 酸 数 相同 的 氨基 酸 占 总 数 的 百分数 和 - 141 6 与 7 链 间 有 60 对 氨基 酸 排列 相同 ， 占 42% 6 # 146 6 57 链 间 有 103 对 氨基 酸 排 列 相同 4 7190 7 链 146 5 链 146 6 与 5 链 间 有 136 对 氨基 本 排列 相同 ， 占 94% 血红 蛋白 病 通常 分 成 两 大 类 : 第 一 类 称 为 异常 血红 蛋白 , 因 基 因 突变 ,引起 相应 的 珠 蛋白 链 缺 陷 ， 导 致 珠 蛋白 分 子 结构 改变 。 第 二 类 称 地 中 海 贫血 (简称 地 贫 )， 由 于 基因 突 变 , 致 使 珠 蛋 白 链 合成 减少 或 消失 。 人 类 血红 蛋白 病 分 布 很 广 , 发 病 率 较 高 , 据 世 界 卫生 42 (WHO) 估计 ， 全 世界 约 有 一 亿 多 人 携带 血红 蛋白 病 的 基因 “， 我 国 南方 发 病 率 较 高 ,因此 血红 蛋白 分 子 病 已 成 为 一 种 比较 常见 的 遗传 病 。 血红 蛋白 是 人 体 红细胞 的 主要 蛋白 质 ， 每 个 红细胞 约 含 有 两 亿 八 千 万 个 血红 蛋白 分 子 , 它 是 一 种 呼吸 载体 , 能 把 氧 从 肺 输送 到 身体 各 种 组 织 , 担负 着 重要 的 生理 功能 。 从 生 物化 学 和 分 子 生物 学 的 发 展 历史 看 ， 血 红 蛋 白 具 有 特殊 的 地 位 : 它 是 最 早 结晶 的 蛋白 质 之 一 ;是 第 一 个 与 专 一 的 生理 功能 相 联系 的 蛋白 质 ; 又 是 第 一 个 准确 地 测 出 其 分 子 量 并 弄 清 其 分 子 结构 的 蛋白 质 ; 分 子 病 的 概念 也 是 从 血红 蛋白 的 一 级 结构 研究 中 得 来 的 。 因 此 研究 异常 血红 蛋白 的 意义 ,除了 在 临床 上 有 助 于 疾病 的 诊断 药物 禁忌 \ 计 划 生 育 、 婚 姻 指 导 等 以 外 ,对 于 人 类 学 的 研究 以 及 遗传 的 分 子 基 础 、 分 子 进化 、 发 育 生 物 学 和 基因 开关 等 es 189。 RU-2 正常 人 血红 蛋白 的 肽 链 的 氨基 酸 排列 顺序 。 Bi A, 5.3 10 15 20 a Kis 6 6 MYBNR a RPM AMAFARALMH MF S RLF PADRE ¢ 螺旋 段 * 空 格 表示 和 上 面 的 氨基 酸 相同 。 基本 理论 问题 的 探讨 等 都 具有 特别 重大 的 理论 价值 。 它 吸引 着 医学 和 化 学 、 物 理学 以 及 生物 学 工作 者 的 巨大 兴趣 ,是 近代 医学 遗传 学 和 分 子 遗 传 学 的 一 个 十 分 活跃 的 领域 1957 年 Ingram™ 应 用 高 压 电 泳 合并 层 析 的 双向 分 离 法 ， 即 “指纹 图 谱 法 ”分 离 鉴别 肽 侦 ， 首 先 证 明 镰刀 形 细胞 贫血 是 由 于 血红 蛋白 的 8 链 上 第 六 位 的 谷 氨 酸 被 顷 氨 酸 取代 所 引起 。 此 后 二 十 多 年 来 , 随 着 异常 血红 蛋白 结构 分 析 技术 不 断 改 善 ,在 世界 范围 内 陆续 发 现 了 大 量 的 血红 蛋白 变异 体 。1975 年 是 二 百 余 种 。1978 年 已 是 300 RH, 迄今 已 经 鉴 * 190 « Ril-3 “正常 人 血红 蛋白 的 发 育 情 况 2 Ff hk & ww & & 血红 和 蛋白 名 称 最 早 的 胚胎 期 a8; Hb Gower II 628, Hb Gower I tc te 期 272 HbF, (主要 成 分 ) tee = A We HbBarts〈〔 次 要 成 分 ) 028, _ HbA (RERA) O27 HbF, (RE RA) , &.72 Hb poreland 〈 次 要 成 分 ) BIL AT AA «28, HbA : O27; HbF, 成 年 228, HbA (主要 成 分 ) a5; HbA, (2.5%) Rll-4 人 血红 蛋白 变异 的 类 型 与 数量 Seif Hb 类 型 a. el ee | any | See | Ba | eee 单一 氨基 酸 残 基 取 代 cx 链 116 21 5 19 1 1 B Hf 200 71 23 70 5 1 6 链 '“ 10 7 链 22 多 氨基 酸 残 基 取 代 5 1 1 4 RLMRERE 12 5 KEES 9 . eRe 7 1 1 总 评 ' 381 99 30 91 6 6 定 了 化 学 结构 的 异常 血红 蛋白 达 420 种 ”“， 甚 中 必 链 异 常 者 133 种 ，8 链 异 常 者 232 种 ， 5 链 异 常 者 13 种 , 7 链 异 常 者 33 种 ， 还 有 9 种 是 属于 两 种 珠 蛋 白 链 异常 。 表 11-4 是 国 际 血 红 蛋 白 情 报 中 心 (IHIC) 统计 (截止 1982) 的 381 种 人 血红 蛋白 变异 的 类 型 与 数 BM, AA, HE RH 13 Ao 地 贫 异 质 性 类 型 和 20 多 种 8 地 贫 异 质 性 类 型 吕 。 表 11-5 示 出 在 遗传 密码 中 单个 碱 基 发 生 改 变 时 可 能 出 现 的 取代 氨基 酸 。 我 国 研究 血红 蛋白 病 起 步 较 晚 ， 但 是 近 几 年 来 在 广大 科技 工作 者 的 努力 下 ， 已 取得 了 可 喜 的 成 绩 。'1979 年 冬 , 在 长 沙 成 立 全 国 血 红 蛋 白 病 研究 协作 组 ,迄今 已 有 21 个 省 市 目 治 区 50 多 个 单位 参加 了 协作 组 的 工作 。 通 过 对 21 个 省 市 自治 区 900549 人 的 普查 ,已 初步 查 出 我 国 25 个 民族 中 异常 血红 蛋白 基因 携带 者 2, 872 例 ， 总 检 出 率 为 0.319 多 《与 Vella 调查 我 国 海外 华侨 发 生 率 0.36% 接近 )。 另外 对 549,938 人 作 PURI, 检 出 各 种 类 型 8 地 贫 基 因 携 带 者 2,733 Pl RAE 0.5%), a 497,849 人 作 HbH (一 种 < 地 贫 ) 调查 ， 检 出 319 例 (AA 0.063%), 调查 结果 表明 ， 我 国 血红 蛋白 病 的 分 布 是 广泛 的 ,但 并 不 均匀 ,发生 率 长 江 以 南 高 于 长 江 以 北 ,云南 省 最 高 。 详 见 表 11-6 MR 11-77, 此 外 ,从 1978 年 开始 , SEE LIER, 以 后 在 其 它 许 多 省 市 自治 区 开展 了 血红 蛋白 的 化 学 结构 分 析 实 验 ， 至 今 共 完成 了 552 个 异常 血红 蛋白 标本 的 一 级 结构 分 析 ， 共 检 出 es 191 s 表 11-5 在 遗传 密码 中 单个 碱 基 发 生 改 变 时 可 能 出 现 的 取代 氨基 酸 a &£ 酸 取 代 氮 基 酸 TRP ARG, GLY, SER, LEU, CYS GLN ARG, PRO, LEU, LYS, GLU, HIS PHE LEU, ILE, VAL, SER, TYR, CYS ASN SER, THR, ILE, TYR, HIS, ASP, LYS PRO HIS, ARG, LEU, GLN, THR, ALA, SER ASP GLY, ALA, VAL, ASN, HIS, TYR, GLU MET THR, VAL, LYS, LEU, ARG, ILE Lys ARG, THR, ILE, MET, GLN, GLU, ASN CYS TYR, SER, PHE, ARG, GLY, TRP HIS TYR, GLN, ASN, ASP, ARG, PRO, LEU ALA VAL, ASP, GLY, GLU, THR, PRO, SER GLU GLY, ALA, VAL, ASP, LYS, GLN VAL ALA, MET, ILE, LEU, GLY, GLU, ASP, PHE TYR CYS, SER, PHE, HIS, ASN, ASP THR ILE, ASN, MET, LYS, ARG, SER, ALA, PRO GLY ARG, SER, TRP, CYS, VAL, ALA, ASP, GLU ILE LEU, PHE, VAL, THR, ASN, LYS, SER, ARG, MET LEU ILE, VAL, MET, SER, TRP, PHE, PRO, HIS, GLN, ARG SER PHE, TYR, CYS, LEU, TRP, PRO, THR, ALA, ASN, ILE, GLY, ARG ARG HIS, LYS, CYS, TRP, SER, GLY, LEU, PRO, GLN, THR, MET 表 11-6 18 省 《区 \ 市 ) 异常 血红 蛋白 发 生 率 省 (CK, TH) Wm #2 A B& 发 生 B (%) a 6,958 4.613 a a 11,929 | 0.386 de 15,234 0.302 甘 # 7,563 0.251 ao oil 14,719 0.238 zB 17,300 0.220 ue 11,549 . 0.199 ee 36 ,660 0.180 河 北 6,230 0.161 oe 4,522 0.155 K # 2,016 0.149 f #8 2,765 . 0.145 oy ON Ti 11,355 0.141 陕西 7,070 0.113 河 南 255558 0.110 = 10,902 0.110 Te 3 8,693 0.092 wu 4,947 0.040 205,970 - 0.378 *192¢ RU-7 11 省 (区 ) 6 地 中 海 贫血 的 发 生 率 省 (区 ) 发 、， 生 ， 率 (9%) =z 10.96 f& iW 6.60 ma 3 3.83 四 川 3.62 宁 夏 0.89 uk 苏 0.50 ze 0.48 wm 0.22 河 北 0.19 i 江 he 合 计 名 称 氨基 酸 替 代位 置 民 族 Hb 重庆 a,(NA,)Leu—> Arg ys 川 汉 Hb 武 鸣 一 文昌 @1,( Ag )Lys—>GLn 广西 、 广 东 +, ® Hb 北京 @16( Ay, )Lys—> Asn 北京 、 河 南 、 湖 北 汉 Hb 哈尔滨 ， cie(Ai4)Lys 一 >Met | RTL PN aa 汉 Nb) 塔 什 康 尔 干 - xis(AB;)ALa 一 >~GLn 新 疆 、 四 川 塔吉克 、 汉 CHb 资中 ) Hb 沈阳 @26( 8; )ALa—>Glu 1 辽宁 (原籍 四 川 7 m Hb ie @2,( 8, )GLu—>Lys 1 北京 (原籍 湖南 ) m Hb 都 安 cx7s(EF4)Asp 一 >ALa 4 广西 、 贵 州 壮 、 汉 ,布依 Hb 贵州 a,,(EF, )Pro—> Arg 2 #i Hb KE 63(A; )Lys—>Glu 2 m Hb 珠海 B7,( EF, )Leu—> Arg 1 汉 Hb 江华 8120( GH )Lys—>ILe 1 汉 Hb 上 海 Gree(Eio)Lys 一 > Arg 1 汉 a。 引 自 梁 徐 ? 国 内 外 血红 蛋白 病 研究 进展 概况 ,中 华 血 液 学 杂志 第 6 卷 , 第 8 期 507 (1985), b. 目前 国内 尚 有 争论 。 54 种 异常 血红 蛋白 。 其 中 链 异 常 的 31 种 ,8 链 寞 党 的 21 种 , 7 链 异 常 的 1 种 ，5-8 链 异常 的 工种 , 其 中 包括 在 世界 范围 内 所 发 现 的 异常 血红 蛋白 , 如 Hb MX, Hb 武 鸣 一 文 BSH 13 种 ( 见 表 11-8)", 这 些 研 究 成 果 已 初步 搜集 我 国 异 常 血红 蛋白 的 地 理 分 布 和 发 生 频率 资料 , 为 我 国 异 常 血 红 蛋 白 的 群体 遗传 研究 打下 了 基础 ,同时 对 医学 遗传 学 、 临 床 医学 .优生 学 及 计划 生育 等 方面 都 有 重要 的 理论 和 实践 意义 。 我 国 是 一 个 多 民族 人 口 众多 的 国家 ,进一步 了 解 异 常 血 红 蛋 白 类 型 和 分 布 情 况 ; 探索 其 结构 与 功能 的 关系 , 必然 对 遗传 学 \ 人 类 学 及 医学 作出 重大 的 贡献 。 *193 。 =. FR MAE PSD 异常 血红 蛋白 化 学 结构 分 析 的 一 般 步 又 包 括 : C1) 血 标 本 的 采集 和 血红 蛋白 溶液 的 制备 。 (2) 珠 蛋 白 的 制备 。 G) 异常 血红 蛋白 链 的 分 离 和 氨 乙 基 化 。 (4) 异常 血红 蛋白 链 的 裂解 。 G) FHKRND Bak. (6) 异常 肽 段 的 氨基 酸 组 成 测定 和 氨基 酸 排列 顺序 测定 。 (7) FAWN SE. 土 述 步骤 可 用 图 11-1 AAR”: | 采集 受 检 者 全 血 和 抗 凝 处 理 | | | a | | 珠 蛋 白 的 制备 | 一 一 一 一 SPE BR BEL OF 一 一 一 | 异常 肘 链 氨 乙 基 化 | | Bee aa TS -| BE GRR | [Cassese Pee SB Oa ria Se [sea — ere 异常 肘 的 二 次 降解 | Peer e ee ee [een | Lo REMIT RIE se |__| ansemnae 结构 异常 的 鉴定 | 结 攀 的 是 | 图 11-1 异常 血红 蛋白 结构 分 析 的 步骤 -一 > 表示 基本 途径 ---> 表示 备用 途径 (一 ) 血液 标本 的 采集 和 溶血 液 的 制备 ea 制备 血红 蛋白 溶 流 的 方法 有 四 和 氧化 碳 或 三 氧 甲烷 法 , 甲 茶 法 , 皂 素 法 等 。 下 面 以 四 和 氧 化 碳 法 为 例 加 以 说 明 。 采集 受 检 查 的 静脉 血 ， 首先 用 A. C. D.， EDTA 或 肝素 等 抗 凝 剂 抗 凝 ,然后 根据 需 =“ 194。 要 取 其 中 的 若干 毫升 或 全 部 新 鲜 抗 凝血 ， 离 心 去 血浆 ， 用 8 一 10 倍 量 的 生理 盐水 洗涤 血 球 3 一 4 次 。 再 次 洗涤 后 , 离心 (3000 转 /分 ) 10 分 钟 , 弃 去 上 清 液 , 最 后 一 次 离心 取 压 积 红细胞 ,再 加 入 相当 于 压 积 红细胞 1 一 15 倍 体 积 的 蒸馏 水 和 05 倍 体积 的 四 氧化 碳 , 充分 摇 匀 ,剧烈 震荡 3 一 5 分 钟 , 彻 底 溶 血 后 ,离心 (4000 一 5000 转 / 分 ) 20 Hh Ri EMA 蛋白 溶液 , 置 于 冰箱 中 (4% ) 保存 备用 ,必要 时 取 部 分 溶液 进行 Hb 电泳 鉴定 。 (=) 珠 蛋 白 的 制备 "" 制备 方法 是 : 把 10 多 的 血红 蛋白 溶液 逐 滴 加 入 约 20 倍 体积 预 冷 的 2 和 % 盐酸 丙酮 (一 20%e) 中 , 边 加 边 搅拌 ,加 毕 再 轻 轻 搅拌 5 一 10 分 钟 , 以 去 除 血 红 素 ,离心 (3000 转 / 分 ) DOH, SREB. 然后 用 冷 丙酮 (一 20"C) 洗涤 2 次; CRRA KR, RETR 备用 。 (=) 异常 肽 链 的 分 高 及 其 氨 乙 基 化 1. 异常 肽 链 的 分 离 . /分 离异 常 珠 蛋白 肽 链 有 许多 方法 ,其 中 由 Clegg 和 他 的 同事 ea 于 1966 年 建立 的 一 种 方法 目前 仍 被 普遍 采用 ,具体 步骤 是 : _ EGF 30—40mg 加 到 3ml Siw B IMR (A 8mol/] KAA 0.05mol/] Fi 基 乙 醇 的 缓冲 液 pH6.7) ， 移 人 透析 袋 内 用 150ml 起 始 缓冲 液 在 室温 下 透析 2.5 一 3 小 时 《中 闻 更 换 缓 冲 液 二 次 )。 然 后 将 透析 好 的 珠 蛋 白 溶液 用 滴 管 沿 ; CN (或 CMn) ;纤维 素 层 析 柱 内 壁 加 入 ; 层 析 柱 尺寸 约 1 X 10cm 或 . 2 X 20cm, 先 用 起 始 缓冲 液 平衡 汪 待 深 液 从 柱 项 沉 下 后 ,用 起 始 缓冲 液 按 lml/ 分 的 流速 洗 脱 30 一 40 分 钟 , 此 时 出 现 非 珠 蛋 自 小 峰 ， 然 后 启 开 梯度 仪 活塞 ， 与 另 一 缓冲 液 〈 内 含 , 8 mol/l RAA 0.05 mol/1 综 基 已 醇和 0.03mol/1 磷酸 缓冲 液 ，pH6:.7) 构成 直线 型 浓度 梯度 ,并 按 相同 流速 层 析 洗 脱 , 随 着 离子 梯度 的 增高 ,可 在 记录 仪 (280nm 监测 ) 上 记录 解 离 的 正常 和 异常 肤 链 的 吸收 峰 细 4# 收 集 相应 的 肽 链 流出 液 。 Longote, L. F. 等 ca 于 1979 年 利用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 人 珠 蛋 白 链 a BYGr 和 Ar 链 ,分 析 时 间 只 需 45 分 钟 , 取得 了 良好 的 效果 , 且 能 直接 测 出 'Gr 和 ; Ar 的 值 。Gr/ Ar ,的 值 对 于 多 种 遗传 性 血红 蛋白 病 的 分 类 颇 为 重要 。 具体 的 色谱 条 件 是 : 样品 量 : 0.5—4mg Hb, 色谱 柱 : wBondupak Cis(30cm X 4.6mm), Waters 公司 附件 。 监测 波长 . 280nm。 洗 脱 溶液 : 溶液 As 45%(V/V) Gii/KAL 0.5% (V/V) 三 气 栈 酸 /水 混合 液 8 溶液 B: 45%(V/V) 乙 有 睛 /水 和 0.3%(V/V) 三 氟 栈 酸 /水 混合 液 。 溶液 C: 50%(V/V) Gill/2ko 柱 先 用 溶液 A (BES 1.5ml/ 分 ) 平衡 15 分 钟 ， 上 样 后 用 40ml 溶液 B 和 28mt 溶 液 C ( 流 率 1.5ml/ 分 ) 梯度 洗 脱 。 洗 脱 后 柱 用 80%(V/V) 乙 有 睛 /水 再 生 5 一 10 2 Shaw A 再 生 15 分 钟 。 。 195 。 2.4 REMATCH NY CHW (Ethylencimine) 与 肽 链 中 半 胱 氨 酸 -SH AERM, CRALCRERA 酸 ,其 反应 式 如 下 : CH, + —Cys— + | > NH 一 > Cys— CH, CH,SH CH,— 5 —CH,—CH,—NH, 经 上 述 化 学 改变 后 ;形成 的 S-(8- 氨 己基)- 半 胱 氨 酸 肽 的 肽 链 简 称 AE-TR ECR EENS 氨 乙 基 化 衍生 物 ) 对 胰 蛋 白 酶 作用 敏感 从 而 增加 了 胰 酶 水 解 位 点 。 另 外 ,用 柱 层 析 分 离 得 到 的 凋 红 蛋白 肽 链 含 有 大 约 1/3 左右 的 称 为 “ 核 ” (core) 的 部 分 ， 它 经 胰 蛋 白 酶 水 解 后 仍 不 溶解 。 如 果 蜡 常 血 红 和 蛋白 的 氨基 酸 取代 发 生 在 这 个 部 位 ， 就 很 难 鉴定 。 一 旦 肽 链 形 成 AE- 衍 生物 ,就 能 使 和 8 链 变 为 可 溶性 肽 链 ， 排 除了 不 溶性 <“ 核 ”的 和 干 抗 ,而 对 & 和 7 肽 链 可 以 增加 肽 链 的 可 溶性 ,使 其 不 溶性 肽 链 “ 核 > 缩小。 实验 方法 如 下 : 将 上 述 柱 层 析 收 集 到 的 肽 链 流 出 液 量 体 积 后 ,加 入 固体 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 使 其 最 后 浓度 为 1mol/1， 用 浓 盐 酸 调 pH 至 9.2， 然 后 逐 滴 加 入 乙 撑 亚 胺 ,搅拌 下 使 最 后 浓 度 达 到 0.5mol/1。 在 室温 下 反应 2.5 一 3 小 时 (注意 随时 搅拌 )， 生 成 AE- 肽 链 , 此 时 溶液 ‘ BREE, 上 上 述 生成 的 AE-RHEERA BEE: 在 水 浴 让 边 搅 拌 边 滴 加 浓 盐 酸 , 并 调 pH 至 3.0, 随后 将 此 溶液 用 滴 管 沿 管 壁 加 于 3 X 60cm SephadexG-25 HEA (BIH 05% 甲酸 平衡 )， 待 样 唱 液 全 部 次 人 流 床 内 时 ,用 0.5 色 甲酸 以 lml/ 分 流速 进行 洗 脱 。 流 出 液 通过 紫外 监测 收集 的 第 一 峰 即 为 去 盐 的 AE- 肽 链 ,冷冻 干燥 后 备用 。 (四 ) REAR 胰 蛋 白 酶 具有 高 度 的 专 一 性 ,只 裂解 赖 氨 酸 残 基 和 精 氨 酸 残 基 羧 端 所 形成 的 肽 键 ( 详 见 第 四 章 )。 因 此 , 人 们 在 研究 Hb 化 学 结构 时 ， 一 般 都 选用 胰 蛋 白 酶 为 最 初 的 肽 链 裂 解 试剂 。 当 用 TPCK 处 理 过 的 胰 蛋 白 酶 水 解 血 红 蛋 白 时 , 通常 对 链 能 裂解 成 14 SAB 肽 ， 其 中 Lys 肽 11 个 ，Arg 肽 3 个 ; 1L、12、13 号 肽 为 不 溶性 肽 ( 殉 图 11-2); 6 eB 解 成 15 个 片段 肽 ,其 中 Lys 肽 11 个 ，Arg 肽 3 个 ，His fK1 4, 10, 11,12 号 肽 为 不 深 性 肽 (ULI 11-3)。 实验 方法 是 : 称 取 正常 的 或 异常 的 AE- 肽 链 (未 氨 乙 基 化 亦 可 ) 5 一 10mg 用 双 蒸 水 配 成 1.0% 溶 液 , 加 入 :IECK- 胰 蛋 自 酶 ,使 酶 最 终 浓度 为 0.02 多 ,然后 加 入 等 体积 的 2 允 (NH4)CO; 或 NH,HCO, (用 - 0.5mol/L NaOH 调 pH 8.0 一 8.5)， 或 加 入 等 体积 的 0.2 mol/1 N- 甲 基 吗 WE thee (pH8.1) 摇 匀 , 置 于 37°C 人 恒温 水 浴 中 反应 3 一 5 小 时 ,通常 为 4 小 时 (注意 随时 轻微 摇动 )。 反 应 毕 , SURF, TRF IM 0.5ml 双 蒸 水 溶解 ,然后 离心 (4000 转 / 分 ) 20 分 , 取 上 清 液 冷冻 干燥 待 用 。 ©1966 ©197¢ (AMR 2109) 2 CA Fra OE SS GH BAT z-11 P= Fy shy ZA By tit Oo GEL LEL GEL SEL Set ver cet ZE LEL OEL 62k get ai 7 | EE shy dj ZX 外 At GZ STL VL EL ZZL UL OZL GU GL CML GUL GUL ML ELL ZUL UL OlL GOL BOL L0L 9OL SOL rol EOL" ZOL LOL OO sty] éey] om) Sno COO Be (202) Dx 66 06 46 96 S6 176 £6 (2109) x (9 09 65 .99 45 TY 07 6-06 LE SE SE %E EE 2 ca a BORD OD ooo oe “TK 4% TK 4) Xd 9g ss 48 €S 2G 19 OS 6% 69 2” 97 S997 EP 2 tt 0€ 62 92 C2 92 SZ MW £2 W iW Or H OH Al na ery] "| ew] 0 | v9] mv [ev] Aa] 184 ny 1 St m a at ul obo 6 @& (WHR 2109) 22 Yi G8 Fa Sw AS I VT 和 1 图 9 外 Sit et DCOL GEL SEL CEL Set” Servet eet Sor af a I ~ wo - a m4 中 2EL tel oet 6zt ezt LZ 9zt SZt Zt EZL 220 UL | O2t fll Olt ZU St SUL MEL ELL ZL UL OU GOL QOL zot-9Ot Sol 90 COL ml UL 00 66 sto [oo ovferfeia[ rea] ovafovafoeafovafona] [7] 49] =4a a : m4) (#103) II (2309) Jy 66 96 €6 76 16 06 68 & J8 98 39 "8 5 Z0 618 «608 6 4 Ll 3/ SL WESSEL 02 the ORGS. 的 £9 99 (2303) x 19 09 65.05 292.96 5S Ge 6S: UheelS 0S 676-0929 99 S999. 7. 2) ET。 Ee Kd X4j oie Us D8 LO Sign eet tw 62 02 2 9% $2 和 06 (6 396 © 198 (五 ) 酶 解 片段 肽 的 分 离 肽 链 酶 解 后 生成 的 肽 眉 的 分 离 是 异常 血红 蛋白 化 学 结构 分 析 中 的 关键 步骤 之 一 。 分 离 的 方法 很 多 ,不 过 当前 各 国 仍 采用 经 典 的 指纹 图 谱 法 。 此 法 经 济 ， 简 便 ， 有 效 ， 但 它 比 较 费 时 。 我 国 目前 也 大 多 采用 这 种 技术 。 近年 来 有 人 采用 微 晶 纤 维 素 薄膜 指纹 图 法 ( 见 第 七 章 ), 设 备 比 高 压 电泳 简单 ,也 比较 灵敏， 缺点 是 每 次 分 离 的 样品 量 少 。1979 年 以 来 ， 国外 开始 采用 高 效 液 相 色谱 技术 ,只 需 2 小 时 就 能 完成 异常 肽 的 分 离 提纯 ,不 仅 简化 了 分 析 程 序 , 而 且 分 离 清晰 ,所 得 异常 肽 纯度 高 ,灵敏 度 也 高 。 近 一 二 年 来 ,我 国 也 有 个 别 实验 室 开始 采用 高 效 芒 相 色 谱 法 分 离异 常 肽 ， 并 取得 康 好 效果 ea。 缺点 是 高 效 液 相 层 析 仪 价 格 昂贵 ,实验 试剂 纯度 要 求 高 ,耗费 大 5 四 高 压 纸 电泳 = 层 析 指纹 图 谐 分 ag (3,415) 将 新 华 三 号 (或 Whatman 3MM) 滤纸 裁 成 约 60X30(cm) 大 小 ,在 距 侧 边 15cm, JE 边 3cm 处 作 上 记号 后 ,用 毛细 管 小 心 点 人 酶 解 液 300l( 约 为 1.5mg 酶 解冻 干粉 ,事先 用 双 蒸 水 溶解 ), 点 样 点 直径 严格 控制 在 lcm 以 内 。 电 泳 缓 冲 液 系 统 为 吡啶 : 冰 醋 酸 : 60cm 7k = 100:4:900 (V/V pH 6.4)， 电 压 2500V, 电 泳 时 间 约 1.5 小 时 。 电 泳 后 将 了 滤纸 悬挂 在 通风 柜 中 ， 用 热气 流 尽快 将 其 歇 干 。 吹 千 后 即 可 将 载 样 滤纸 (30 x 60cm) AQ 11-4 所 示 裁 成 30 K 45cm 10cm f 5cm 大小， 并 在 沿 远 离 加 样 点 长 边缘 接 一 张 同型 号 新 滤纸 (10 x 45cm)， 然 后 两 个 4 短 边 相对 将 MB, TBAT 电泳 方向 的 上 行 层 析 。 层 析 溶 剂 系统 为 : Ae es Se eBe sk = 35:35:30 (V/V), 先 平衡 5 一 8 小 时 ， 然 后 于 20° EAE 析 18 小 时 左右 (至 溶剂 前 沿 离 纸 的 上 缘 lem 处 结束 ), 层 析 毕 ,迅速 取出 ,用 热气 流 吹 干 或 置 于 45 一 60sc 干燥 箱 中 烘 于 。 =F 0.5% Ei = M/A A, 即 得 肽 链 的 指纹 图 。 根 据 需 要 有 时 也 进 行 某 些 特殊 氨基 酸 染色 ， 然 后 将 它 与 正 11r4 高 压 纸 电 泳 载 样 涉 纸 形状 常 的 血红 蛋白 肽 表 指 纹 图 《与 异常 肽 图 〈《 上 贺 虚 线 为 切线 ?下 左 图 虚线 为 缝 线 ) 分 析 条 件 相 同 )( 见 图 11-5) 比 较 , 即 可 检 出 异常 的 肽 斑 , 剪 下 该 异常 的 肽 斑 , 并 用 5 多 BS 酸 洗 脱 ,真空 干燥 备用 。 EE: 电泳 及 层 析 的 具体 条 件 是 可 变 的 ,通常 由 实验 者 的 实践 决定 的 。 # 11-9 列 出 一 些 实验 者 使 用 的 条 件 , 供 读者 参考 。 30cm 45cm +1996 4 43 10 fez & 3 10 一 11 9 电 脉 (PH6.4) —¢+ 7—8 图 11-5a “正常 人 血红 蛋白 « 链 经 胰 蛋 白 酶 酶 解 后 的 指 八 图 指纹 图 通常 采用 草 三 酮 染色 ,对 分 别 含 有 Trp, Arg, His, Tyr Met 的 肽 分 别 采 用 特殊 染色 法 染色 。 e 4 4a 2 5 cP 9 5 人 — Om kk 5 全 D5. 5/2 13 ee 6 @ 2 o @: 8 7 @ 136 @ oo 本 e | : kA ik (PH6.4) -$+ 11-5b “正常 人 血红 蛋白 6 链 经 胰 蛋 白 酶 酶 解 后 的 指纹 图 指纹 图 通常 采用 草 三 酮 染色 ,对 分 别 含 有 Trp, Arg, His, Tyr, Met 的 肽 分 别 采 用 特殊 染色 法 染色 。 表 11-9 ok 层 析 HAE CV) 时 间 ( 小 时 7) 平衡 (小 时 7) 层 析 ( 小 时 》 Lehmann。H532] 2500 1 Ingram V。M53] 1,000 2 三 3 15 Clegg J. Bf 33—50V/cm 252365 曾 溢 滔 等 2 2,800 2 1 14 ee ey 3 1,000—1,500 2.5—3 20—24 18 EAs 2,500 i 8 18 es 200 。 2. 微 晶 纤维 素 薄 膜 指纹 图 分 离 详 见 第 五 章 。 3. 高 效 液 相 色 谱 法 分 郧 1979 4£ Wilson, J. B. 等 7 首先 采用 高 效 疲 相 色 谱 法 分 离 Hb SRE ARB, 获得 较 满 意 的 结果 。 其 方法 是 冷冻 干燥 的 酶 解 物 (ae HEY 或 AE-6 链 或 AE-y 链 或 AE-5 链 ) 2 一 3mg 溶解 于 100p 10% 的 醋酸 中 ,离心 人 35600rpm) 10 分 钟 ， 取 上 清 液 加 样 于 # BondapakCys (Part No. 27324, Waters Assoc, Milford, Mass., U. S. A.) #EH, WH 系统 (A), 50% GiRAY 0.01 mol/l 醋酸 铵 溶液 (pH 5.7); (B) 0.01 mol/l HRRAR FSordegra 50 His oAsp 1-6 m2 分 : 图 11-6 用 HPLC 分 离 正常 和 晃 常 人 血红 蛋白 < 链 的 胰 蛋 白 酶 解 肽 上 图 为 一 正常 Hb o BISA RIBAS 下 图 是 在 7 种 异常 Hb o 链 酶 解 色 谱 图 中 选择 迁移 率 有 改变 的 肽 的 色谱 示意 图 。 忽 表示 对 应 于 正常 Hb < CRRA 异 肽 段 (图 中 有 二 个 是 工 -3 蜡 常 肽 一 个 是 工 -4 HK, 四 个 是 T-6 异常 肽 )， | 昌 表 示 各 异常 肽 侦 的 实际 色谱 位 置 (三 个 或 三 个 峰 位 置 )。 Week 7 EA BGK RAN a°*-core A 220nm 图 11-7 TERA Hb - 链 ) 经 胰 蛋 白 酶 酶 解 所 得 的 沉淀 ,可 用 pH6.4 的 吡啶 - 冰 酷 。203。 酸 缓 冲 液 竺 涤 三 次 ， 然 后 用 胰 凝 乳 蛋白 酶 〈( 酶 与 底 物 比例 为 1:100) 在 37°C 下 酶 解 机 小 时 ( 酶 解 条 件 及 缓冲 液 同 胰 蛋 白 酶 ) 或 用 骨 和 蛋白 酶 酶 解 (方法 见 第 四 章 ), 酶 解 液 再 用 指纹 图 法 或 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 出 异常 肽 段 。 CN) 异 常 肽 的 氨基 酸 组 成 分 析 和 氨基 酸 顺序 测定 从 上 述 分 离 得 到 的 异常 肽 段 中 称 取 一 定量 (根据 氨基 酸 分 析 仪 的 分 析 灵敏 度 确定 ) 于 水 解 管 中 , 加 200 ul 恒 沸 点 盐酸 〈5.7N) ZERIT PHO FT 110°C 水 解 18 一 24 小时, 7K iF 物 真 空 干燥 作 氨基 酸 组 成 测定 ( 详 见 第 三 章 )。 通常 情况 下 ,根据 异常 肽 段 氮 基 酸 组 分 的 测定 结果 , 可 以 最 终 确定 异常 血红 蛋白 的 氮 基 酸 取代 。 但 如 果 被 取代 的 某 种 氮 基 酸 在 肽 段 中 不 止 一 个 ,或 者 它 是 天 冬 栈 胺 、 谷 所 酰胺 或 色 氮 酸 等 易 被 酸 破 坏 的 氨基 酸 ， 仅 有 氨基 酸 组 成 分 析 就 无 法 确定 其 氨基 酸 取 代 的 部 位 和 类 型 ,在 这 种 情况 下 必须 进一步 作 顺序 测定 , 可 采用 的 方法 也 很 多 , 如 手工 Edman 降解 法 ，DNS-Edman 降解 法 , 减 数 Edman 降解 法 等 ,近年 来 人 们 多 采用 DABITC/PITC 双 偶合 法 ,在 第 七 章 中 已 有 详细 介绍 ,这 里 不 再 重复 。 = (3 |x mR [ 1] Croft, L. 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Merck 出品, 分 析 纯 ,用 玻璃 器 严重 蒸 过 :再 通过 lba0;， 层 析 柱 。 DABITC 沸 丙 酮 重 结晶 。 乙醇 胺 (ethanolamine) HR bp 77°C/2,000 Pa 二 甲 蔡 甲 酰胺 DMF 分 析 纯 。 按 如 下 处 理 : 在 263ml DMF (250g) ,加 34ml 茶 (30g) 和 12ml WK, HB FERN 60m! B 分 , 直到 150C, ELRAKEES, SHI KBREMP.O., HKARERB, AHO 分 子 筛 保存 。 N-FAZEMGIK (N-methylmorpholine), @ RA, A= MRE, Fava ee 30cm #€ BEB A ERA FRAMED, REE —20TC. ; 对 -二 硫 代 异 氰 酸 葵 酯 DITC， 如 果 制 品 发 黄 ， 则 用 沸 吡 啶 /甲醇 (1:1) 重 结晶 。 硫 代 异 氰 酸 葵 酯 PITC, ELAN FHRMER BR, ce ae 保存 。 吡 吁 (pyridiz)， 分 析 纯 。 MIEKA, RIG, AR, HM, se NR, 本 —20° 保存 。 三 乙 胺 Criethylamine), GRR, BRE N-FRGHK-HREO 三 氟 栈 酸 TFA, CaSO, 0.5 H,0, 100% 干燥 后 ,立即 放 入 TFA 中 蒸馏。 ahi 30cm ARRAN BEBRZ Om 50ml 一 份 装 人 封 管 中 , 于 一 20%C 保存 s 206 。 附录 三 氨基 酸 的 一 些 物理 常数 中 文 名 称 英文 名 称 ( 缩 写 ) 分 子 量 | HAC | wee DL- 两 氨 酸 .| DL-alanine(Ala) 89.09 | 295d | 16.6 L- 丙 氨 酸 L-alanine (Ala) 89.09 297d 16.65 DL-# AE DL-arginine (Arg) 174.20] 238d L- 精 氨 酸 L-arginine (Arg) 174.20 244d 15.07% DL- MRR] DL-asparagine (Asp-NH,) 132.12 | 213 一 215d| 2.16 . (Asn) L- 天 冬 酰 胺 L-asparagine (Asp-NH,) 132.12 (236d 2.989 (Asn ) (ke) L-KS AM |. L-aspartic acid (Asp) 133.10 | 269—271 | 0.5 L- 瓜 氨 酸 L-citrulline (Cit) 175.19 | 234—237d| Bw L- 半 胱 氨 酸 | L-cysteine (Cys) 121.15 Bix DL- DL-cystine (Cyss) 240.29 260 0.0049 L- 联 氢 酸 - 工 -cystine (Cyss) 240.29 | 258—261d} 0.011 DL- 谷 氨 栈 DL-glutamic acid (Glu) 147.13 | 225—227d| 2.054 3.22 L- 谷 氨 酸 L-glutamic acid (Glu) 147.13 |:247—249d| 0.864 429 L- 谷 氨 酰 胺 | L-glutamine (Glu-NH,) (Gln) | 146.15 | 184—185 | 4.25 Ham Glycine (Giy) 75.07 | 292d | 24.99 5,97 DL- 组 氨 酸 DL-histidine (His) 285—286d| Bie L- 组 氨 酸 L-histidine (His) 277d 4.16 L-Eipae L-hydroxyproline (Pro-OH) 270d 36.11 5.83 (Hyp) DL-53 BE) DL-isoleucine (lle) L-F RAR L-isoleucine (Ile) 292d 2.229 6.02 285—286d| 4.12 6.02 pK, (25%) (1) 2.35 (2) 9.69 (1) 2.17 (COOH) (2) 0.04(NH,) (3) 12.48¢B03E) (1) 2.02 (2) 8.8 (1) 2.09(@-COOH) (2) 3.86(8-COOH) (3) 9.82(NH,) (1) 1.71 (2) 8.33 (NH,) (3) 10.78 (SH) (1) 1.65 (2) 2.26 (3) 7.85 (4). 9.85 (1) 2.19 (2) 4.25 (3) 9.67 ———— (1) 2.17 (2) 9.13 (1) 2.34 (2) 9.6 (1) 1.82 (COOH) (2) 6.0 (BKM) (3) 9.17 (NH,) (1) 1.92 (2) 9.73 (1) 2.36 (2) 9.68 * 207+ (SH) 中 文 名 称 英文 名 称 ( 缩 写 ) 分 子 量 | WAC | Wie? | 等 电 点 PK, (25°C) Na: ‘ Ls SS 一 -一 - DL- 亮 氨 酸 ”| DL-leucine (leu) 332d 0.991 || 5:98 | (1) 2.36 (2) 9.60 L- #4 L-leucine (leu) (1) 2.18 9.74] (2) 8.95(a-NH,) (3) 10.53(@-NH,) | DL-#46 | DL-lysine (Lys) L-#i ARR L-lysine (Lys) 146.19 224d Rie 9.74 Se nae Di Smpthdoaide CMe 149.21 | 281 3.38 5.74 | (1) 2.28 (2) 9.21 L- 甲 硫 氨 酸 L-methionine (Mct) 149.21 283d BiB 5.74 ys 165.19 DL- 苯 两 氨 酸 | DL-phenylalanine (Phe) 318—320d| 1.42. 165.19 L- 葵 琴 氨 酸 L-phenylalanine (Phe) 115.13 - (1) 1.99 (2) 10.6 — DLA! |. DL-proline (Pro) 115.13. | 220—222d|162.3 L—}ij aa L-proline (Pro) DL -22 'DL-serine (Ser) 105.09 | 24¢ | 5.02 (1) 2.21 (2) 9415 一 PAYS 38 -t--. Os |S | | Ss SE 105.09 一 -一 一- 一 一 119.12 工 -丝氨酸 L-serine (Ser) 223—2284| 257° emeon ; : 4 et 2 ¥) i (1) 2.63 (2) 10.43 DEL- 苏 氨 酸 DL-threonine (Thr) 16 235 分 解 点 | 20.1 工 = 苏 氨 酸 L-threonine (Thr) 119.12 2534; BY 一 一 | 204.22 | 283 一 285 | 0.25% (1) 2.38 (2) 9.39 DL-#a# DL-tryptophane (Trp) L- 色 氨 酸 L-tryptophane (Trp) | 204.22 | 281—282 | 1.14 vs (1) 2.20(COOH) (2)'9.11 (NAA) (3) 10.07 (OH) © DL-MBAB | DL-tyrosine (Tyr) 181.19 一 | 一 一 - 342.4d Cy L-MAR | L-tyrosine (Tyr) 293d 7.04 DL- 统 氨 酸 ”| DL-valine (Val) (1) 2.32 (7 中 62-3 1315Z 8.857° L- 统 氨 酸 L-valine (Val) a. 2 代表 达到 烷 点 后 分 解 。 b. 在 25°C 于 100g 水 中 溶解 的 g 数 。 特 殊 的 温度 条 件 则 注 明 在 右上 角 。 “208。 附录 四 “缓冲 溶液 的 配制 (—) 几 种 特殊 缓冲 小 的 配制 .， 1.0.2mol/1 N=? 4&3 has MBP HR (pH8.1): “* 5.6ml N= 甲 基 吗 啉 溶 于 250 ml 双 蒸 水 ， 再 加 1.5ml 50 %o 醋酸 双 蒸 水 溶液 2. 醋酸 -三 乙 胺 绥 冲 液 (pH 10.1): 2mol/1 酷 酸 2ml 十 1.2ml 三 乙 胺 十 水 至 25ml， 调 pH 到 '10.1, 再 加 25ml 丙酮 。 13.DMAA 487i (pH 9.5): - | -- 0.4mol/1 dimethylalkylamide rely | 115.18) 溶 于 吡啶 : 水 (3:2 v/v) 中 ,用 1mol/] -TEA 调 .pH 到 ,9:5。 4.Edman iF #22 >} i (4 DMAA eri) (oH 8.4); NE AEN 2.9ml + 17ml 7K, AL TFA ia pH aCe DABITC/PITC 双 偶合 法 pH 8.6)， 再 加 吡啶 30mjle 5. RRM DAR R (pH 2.2): 柠檬 酸 钠 (Sodium citrate-2H,0) 19.7g 浓 盐 酸 (12N HCl) 16.5ml ; SERB (caprylic acid) ‘i! O.lml >. ooo RAZA (Thiodiglycal) th Sars 20ml * FE7K ZF Cethytalcohol) — a iicaaley 5771) 加 去 离子 水 到 总 体积 U a (=) 常用 组 冲 液 的 配制 1. 甘 氨 酸 -盐酸 缓冲 液 (0.05mol11) X ml 0.2moj/1 甘氨酸 十 Y ml 0.2NHCl, RINK MRe 200ml 甘氨酸 分 子 量 一 75.07。 6-2mol/] 甘氨酸 溶液 含 15.01g/I。 。 209 « 2 .磷酸 氢 二 钠 -柠檬 酸 缓冲 液 0.2mol/l Na:HPO,0.1mol/1 FR (ml ) (ml (ml 2:2 0.40 19.60 5.2 9.28 2.4 1.24 18.76 5.4 8.85 2.6 2,16 17.82 5.6 8.40 2.8 3.17 16.83 5.8 7.91 3.0 4.11 15.89 6.0 7.37 3.2 4.94 15.06 6.2 6.78 3.4 5.70. 14.30 6.4 6.15 3.6 6.44 13.56 6.6 5.45 3.8 7.10 12.90 6.8 4.55 4.0 7.71 12.29 7.0 3.53 4.2 8.28 11.72 7.2 2.61 4.4 8.82 11.18 7.4 1.83 4.6 9.35 10.65 7.6 1.27 4.8 9.86 10.14 7.8 0.85 5.0 10.30 9.70 8.0 0.55 Na,HPO, 分 子 量 二 141.98; 0.2mol/l BHA 28.40e/I. Na,HPO,-2H,O 分 子 量 = 王 178.05; 0.2mol/! BMA 35.61g/l. C,H,O,-H,O 分 子 量 二 210.14; 0.1molj 儿 2H 21-01g/l, 3。Tris- 赴 酸 缓 冲 液 (0.05mol/], 25°C) 50ml 0.1mol/] =A RAB he (Tis) BRS xX SH 0.1N ARES MKS 100ml, pH X(ml) pH X(ml) 和 pe HERG Se | Oe ee 7.10 45.7 8.10 26.2 7.20 44.7. 8.20 22.9 7.30 43.4 8.30 19.9 7.40 42.0 8.40 17.2 7.50 40.3 8.50 14.7 7.60 38.5 | 8.60 12.4 a) 36.6 8.70 10.3 7.80 34.5 8.80 8.5 7.90 32.0 8.90 7.0 8.00 29.2 ; 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) HOCH,, /CH,OH C HocH,ANNH O.imol/] BRA 12.1148/1。Tris 溶液 可 从 空气 中 吸收 二 氧化 碳 * 使 用 时 注意 将 瓶 盖 严 。 * 210° 4.48 PB- BA HM (0. 05mol/1) X ml 0,2mol/] 邻 茉 二 甲酸 氧 钾 十 Yi 052NHCI 再 加 水 稀释 到 20m! pH(20%) pH(20°C) Y FA rc 3.2 , 1.470 2.4 3.4 0.990 2.6 3.6 0.597 2.8 3.8 0.263 3.0 SBA — FS FAS} F = 204.23, 0.2mol/l 邻 葵 二 甲酸 气 钾 溶 液 含 40.85g/1, 5. 巴 比 妥 钠 - 盐 酸 缓冲 液 (18YC ) 0.04mol/1l 巴 比 妥 钠 溶液 (ml) Perel =| Yani 5.21 100 7.0 100 3.82 72 100 2.52 7.4 100 1.65 7.6 100 1.13 a 100 0.70 8.0 100 0.35 100 PLE 2 hth 4} FH —206.18; 0.04mol/] 溶液 为 8.25g/1。 6 乙酸 -乙酸 钠 缓冲 液 (0.2mol/!) 0.2mol/1 NaAc 0.2mol/l HAc 0.2mol 朋 NaAc pHEMT) 《ail) (mi) 3.6 0.75 9.25 4.8 4.10 3.8 1.20 8.80 5.0 3.00 4.0 1.80 8.20 (5.2 2.10 4.2 2.65 7.35 5.4 1.40 4.4 3.70 6.30 5.6 0.90 4.6 4.90 5.10 5.8 0.60 NaAc-3H,O 分 子 量 一 136409; 0.2M 溶液 为 27.22 克 / 升 。 7. 柠 檬 酸 - 氢 氧 化 钠 - 盐 酸 缓 冲 液 pH TRON) | TR) ee | BE So | 最 终 体积 (D8 2.2 0.20 210 84 60 * 10 3.1 0.20 210 83 116 10 3.3 0.20 210 83 106 10 4.3 0.20 210 83 45 10 5.3 0.35 245 144 68 10 5.8 0.45 285 186 | 105 10 6.5 0.38 SiG a inl 156 126 10 @ 使 用 时 可 以 每 升 中 加 入 18 酚 若 最 后 pH BABE FAD Hk 50% AML RRR MIA KBR e211 8. 柠 模 酸 -柠檬 酸 钠 缓 冲 液 (0.1mol/1) 0. Lmel/ erage pee eee oH o tool | eee 0. Tio) FRE 3.8 18.6 1.4 5.0 8.2 11.8 3.2 17.2 2.8 5.2 7.3 12.7 3.4 16.0 4.0 5.4 6.4 13.6 3.6 14.9 5.1 5.6 5.5 14.5 3.8 14.0 6.0 5.8 4.7 15.3 4.0 13.1 6.9 6.0 3.8 16.2 CS eee 12.3 i) 6.2 re 17.2 4.4 1.4 8.6 6.4 2.0 18.0 4.6 10.3 > 9.7 6.6 1.4 18.6 10.8 4.8 9.2 FER C.H,0,-H,O 44M 210.145 0.1mol/] 溶液 为 2T.01g/1 #1 Na,C.H,O,-2H,O 分 子 量 一 294.12; 0.1mol/l 溶液 为 29.41g/1。 9. 磷酸 二 氢 钾 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05mol/1) Xml 0.2mol/1 KH,PO,+Yml 0.2N NaOH 加 水 稀释 至 20ml pH(20°C) pH(20°C) a ff | 一 7.0 2 7.4 7.6 7.8 8.0 wm wwwmn ww 10. 碳酸 钠 -碳酸 氢 钠 缓冲 液 (0.1mol1D) Ca?* \Me* 存在 时 不 得 使 用 2.963 ~ 3.500 3.950 4.280 3 4.520 pH 0-1mol/1 Na,CO, (ml)| 0+Imol/] NaHCO, (ml) 20°C 37% u 9.16 8.77 1 9 9.40. 9.12 2 $4 9.51 9.40 3 7 9.78 9.50 4 6 9.90 9.72 5 5 10.14 9.90 6 4 10.28 10.08 7 3 10.53 10.28 8 2 10.83 10.57 9 1 Na,CO,-10H,O 分 子 量 二 286.2; 0.1mol/] WRH 28.62g/lo NaHCO， 分 子 量 三 8426; 0.1molf/l 溶液 为 8.40g 儿 . 212° 11. 磷酸 盐 缓冲 滚 G1) 磷酸 氢 二 钠 - 磷 酸 二 氢 钠 缓冲 液 (0.2mol/1) 0.2mol/1 NaH,PO, 0.2mol/1 Na,HPO, | 0.2mol/l NaH,PO, 0.2mol/1 Na,HPO, (ml) (ml (ml) (ml) 5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0 5.9 10.0 90.0 7.1 67.0 3340 6.0 12.3 87.7 7.2 7200 28.0 ary “15.0 85.0 re ey 5 23.0 6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 19.0 6.3 22.5 77.5 7.5 84.0 16.0 6.4 26.5 73.5 oe 87.0 13.0 Gre 31.5 68.5 3 Alot. 89.5 10.5 6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5 6.7 43.5 56,5 7.9 93.0 7.0 6.8 49.0 51.0 8.0 S4.9. » 5.3 55.0 45.0 Na 2HPO,-2H,0 分 子 量 一 178.05; 0.2mol/l 溶液 为 35.618/1。 Na,HPO,- 12H,O 4}F-8=358.22; 0.2mol/l BWRH 71. 64g/l, NaH,PO,:H,O 4}-$#=138.01; 0.2mol/! ARH 27.6g/l, NaH,PO,-2H,O 分 子 量 王 156.03; 0.2mol/l 溶液 为 31.21g/l. (2) 磷酸 所 二 钠 -磷酸 二 氢 钾 缓冲 液 (1115mol1I mol /1/15 KH,PO, mol/1/15 Na,HPO, | mol/1/15 KH,PO, mol/]/15 Na,HPO, (ml) ml (ml) (ml) AOD > 7 9.10 9.90 7.17 7.00 3.00 5.29 0.50, 9.5 7.38 8.00 «2.00 5.91 1.00 9.00 7.73 9.00 1.00 6.24 2.00 8.00 8.04 9.50 0.50 6.47 3.00 7.00 8.34 9.75 0.25 6.64 4.00 6.00 8.67 9.90 0.10 6.81 5.00 5.00 , 8.18 10.00 0 6.98 6.00 4.00 N:,HPO,-2H,O 分 子 量 王 178.05; 1/15mol/] 溶液 为 11.876g/1。 KH 2PO, 4-*H=136.09; 1/15mol/l WRH 9.078g/I, 12. 甘 氨 酸 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05mo! /1) Xml 0.2mol/1 甘氨酸 十 Yml 0.2NNaOH ARES gmail pH x Y y 8.6 50 4.0 22.4 8.8 50 6.0 27.2 9.0 50 8.8 32.0 9.2 50 12.0 38.6 9.4 50 16.8 45.5 甘氨酸 分 子 量 二 75.07; 0.2mol/l AWS 15.01g/l. 6 213 5 13 .硼砂 - 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 〈6.05mol/1 硼酸 根 ) X ml 0.05mol/1 硼砂 + Ym! 0.2N NaOH 加 水 稀释 至 200m! 硼砂 Na,B,O,-10H,O, 4} k=381.43; 0.05moljl 溶液 为 19.07g/1。 14 .硼酸 -硼砂 缓冲 液 (0.2mol/] 硼酸 根 ) 0.05mol/1 硼砂 | 0.2mol/1 WB 0.05mol/1 硼砂 | 0.2mol/l 硼酸 (ml) (ml) (ml) (ml) 724 1.0 8.2 3.5 6.5 7.6 1.5 8.4 4.5 325 7.8 2.0 8.7 6.0 4.0 8.0 3.0 9.0 -_ 8.0 2.0 硼砂 Na,B,O,-10H,O, 4>$3b=381.433 0.05mol/l 8% ( = 0-2mol/l BBR) 19.07g/1, 硼酸 H5BO,, 4+F-H=—61.84, 0.2mol/l 溶液 为 12.37g/1s 硼砂 易 失去 结晶 水 必须 在 带 塞 的 瓶 中 保存 。 (=) 标准 缓冲 波 的 配制 (1) pH = 4.00(10—20°C) 将 邻 茶 二 甲酸 氢 钾 在 105°C 干燥 工 小 时 后 , 称 取 5.078 加 重 蒸馏 水 溶解 至 500ml, (2) pH = 6.88(20°C) . 称 取 在 130°C 干燥 2 小 时 的 磷酸 二 氢 钊 (KH2PO,)3.401g, PERRA— FA (NaHPO, - 12H,0)8.95¢ 或 无 水 磷酸 氨 二 钠 (NaaHPO,)3.549g， 加 重 蒸馏 水 溶解 至 500ml。 (3) pH = 9.18(25°C) PRAM 3.81449 四 硼酸 钠 (Na2B,O, - 10H,0) 或 2.02 g 无 水 四 硼酸 钠 (Na2B,O,), 加 重 蒸馏 水 咨 解 至 100mls 标准 缓冲 液 储 于 硬 质 玻璃 瓶 或 塑料 瓶 中 能 稳定 1 一 2 月 , 它们 的 pH (hi EA 有 差异 ( 见 下 表 )。 不 同 温度 时 标准 缓冲 液 的 PH 值 酸性 酒石酸 钾 | 0.05mol/l 48 | .0«025mol/l’KH,PO, 0.0087mol /l KH,PO, 0.01mol/] OO) (25%C 时 饱和 ) | 葵 二 甲酸 氢 钾 | 0.025mol/l Na,HPO, | _ 0.0302mol/] Na,HPO, Na,B,O, 0 一 4.01 6.98 Top 9.46 10 一 4.00 6.92 7.47 9.33 15 一 4.00 6.90 7.45 9.27 20 一 4.00 6.88 7.43 9.23 25 3.56 4.01 6 86 7.41 9.18 30 3.55 4.02 6.85 7.40 9.14 38 3.55 4.03 6.84 7.38 9.08 40 3.55 4.04 6.84 7.38 9.07 50 3.55 4.06 6.83 7.37 9.01 SS a LT 附录 五 常用 数据 表 (一 ) 某 些 有 机 溶剂 的 主要 物理 常数 (*H 15°C 时 数值 ) 沸点 或 沸 程 |20%C 时 在 水 中 | 闪光 点 | 爆炸 极限 9 ee > 化 学 item C¢,20/4°) 《体积 ) 杀 . C,H, 0.897 he a 6 : CsH,CHy 0.866 110.8 1.2—7.0 二 p= C.H,(CHs), 0.86—0.87 136 —145 = (4B HAY) : a 酒 二 0.69—0.73 = pF Bg CH,OH 0.7915 6 .0—36.5 2 醇 CazH5OH 0.7893 3.5—18.0 ER & ~C;H,OH 0.8036 2-5 一 38.7- Se C,;H,OH 0.7851 82.5 3.8—10.2 ET # C,H,OH 0.8098, | 117.7 3.7—10.2 Fe T- C,H»OH 0.806%} 107 2.40 Ke C,H,,0H 0.8110(25/4*)4 137.8 三 + ih C;H,(OH); 1.2613 290( 4) fF) 了 Za & C,H,OC,H, 0.7135 34.5 1.85—36.5 CECE CH,COOC,H, 0.901 7.15 8.6(35°C) 一 5 三 乙酸 异 戊 酯 CH;,COOC,H,, 0.876 了 142.5 0.2 25 = 两 “页 CH,COCH, 0.7898 56.5 2.55—12.80 Kom CO(GH:)CH, 0.9478 155.7 ons mx # C,H, NO, 1.2037 210.9 -3 C,H,N 闪光 点 (或 称 内 点 ): 使 物质 的 蒸气 在 移 近 火 焰 时 ,其 表面 上 可 与 空气 生成 内 燃 混 合 物 的 最 低温 度 ( 能 燃烧 并 不 传 RRS XK) AREF 45°C 的 物质 , 按 一 般 分 类 属于 易 燃 物质 s es。 215。 (二 ) 实 验 室 中 常用 酸 碱 的 比重 和 浓度 的 关系 am eee SS ee ee 一 -一 一 一 人 | CH;COOH CH;COOH 14.3 , he H,PO, Case mrtate) 67(A 15N i) 氨 水 NH,OH 15 67 Witt Vii ae. > irae 14.4 (OS 70 coi BAL PRK ae ae (三 ) 常 用 固态 化 合 物 的 当量 浓度 《或 mol RE) 配制 参考 表 -一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 浓 度 名 称 RPO mol/l 或 N g/1 草 酸 H,C,0,-2H,O _ 126.08 1N 63.04 柠 B 酸 H,C,H,O, - H,O 210.14 0.1N 7.00 Zt A KOH 56.10 5N 280.50 氢 - 氧 化 销 NaOH 40.00 1N 40.00 碳 - 酸 锁 Na,CO, 106.00 1N 53.00 磷酸 氢 二 Na,HPO, - 12H;O 858.20 1mol /1 358.20 磷酸 二 氢 钾 KH,PO, 136.10 1/15mol/1 9.08 Bem K,Cr,0, 294.20 0.1N 4.9035 pik KI 166.00 0.5N 83.00 2s eS HE KMn0, 158.00 0.1N "3 ee Z 酸 钠 NaC,H,0O, 82.04 1N 82.04 硫 代 硫 酸 钠 Na,S,0; - 5H,O 248.20 SE 24.82 * 216° 〈 四 ) 常 用 酸 碱 的 强度 名 称 WHR CHCl) RRB CH,SO,) 浓 硝 酸 CHNO,) _”_ ” 冰 酷 酸 〈CH:COOH) WRB 〈HsPO4) 饱和 所 氧化 钠 (NaOH) #& #72 NH,OH ° 217° 附录 六 | GBR AK te 0 ae A (—) ERR RANE HBR (25 ) 硫 Be 铵 终 KK 度 (% 饱 和 度 )， ) 60 65 | 70 | 75 | 80 | 90 | 100 | 10 20 | 25 | 30 | 33 | a5 40 | 45 | 50 | 55 = 1+ Ht #&B KM A Kh KR Be HH 2« HO- FASS SY eR CPA at ) © 在 25 FP MRABKH OKEBARRKEN SHAR MAARBRAN 2 数 。 (=) SRRRIS RA RTRR (0 ) 在 0c hh BKK KR FE (% 人 饱和 E) 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | so | 85 90 95 每 0m FRM A Kh BR BH ec KO 0 29.1| 32.6 | 36-1) 39.8) 43.6] 47.6 | 51.6 | 55-9] 60.3|65-0| 69.7 5 26.2 | 29.6 | 33.1| 36.8. 48.4|52.6|57.0/61.5| 66.2 硫 | 10 23.3|26.6|30.1|33.7 2|45.2|49.3|53.6|58.T| 62.7 酸 |_15 20.4|23.7|27.1|30.6 42.0|46.0|50.3|54.7| 59.2 20 17.5| 20.7| 24.11 27.6 38.7|42.7|46.9 al ELE EE Ss: 35.5] 39.5] 43.6 Daa oe K 度 霹 上 -和 5 5 95 100 Q@ £0C 下 ， 硫 酸 铵 咨 液 由 初 浓 度 调 到 终 浓度 时 ,每 100ml BRAT MA AMBRE & Ko * 218° EES ne ([AR RE THRBARRRS R & fF (tc) 0 10 20 25 30 每 1000g KHARME mol 数 5.35 5.53 5.73 5.82 5.91 重量 百分数 41.42 42.22 43.09 43.47 43.85 1000ml! KARR ee IAAT & BK 706.8 730.5 755.8 766.8 777.5 SF WHERE RAR & 数 514.8 §25.2 536.5 541.2 545.9 HK mol/! 3.90 3.97 4.06 4.10 4.13 er9e 附录 七 一 冷却 剂 和 干燥 齐 (一 ) 冷 却 齐 ah NH,CL.... 30-1 水 100 -}-— 5.4-hKeL- 一 小 一 50- 一 sh she NH,Cl 25 | 雪 或 碎 冰 100 | —15.4]| KCl 30 ok REVK 100 NH,NO, 106 | 水 100 | — 4.0] KI 140 水 100 NH,NO, 83 | x 100 | —14.0 | KNO, 13 雪 或 碎 冰 100 NH,NO, 浅水 100 | 一 17.5 | KCNS 150 水 100 NH,NO, 59 | 雪 或 碎 冰 100 | —18.5 || NaAc 晶体 85 水 100 (NH,),SO, 62 | 雪 或 碎 冰 100 | —19.0 ‖ Nacl +33 雪 或 碎 冰 100 (NH,),SO,-10H,O 9.6 | 雪 或 碎 冰 100 | — 1.2 |} NaNO, 75 水 100 NH4CNS 133 | x 100 | —18.0 | NaNO, 50 雪 或 碎 冰 100 CaCl,-2H,O 晶体 143 | 雪 或 碎 冰 100 | —50.0 |} Na,S,0O,-5H,O 110 水 100 CaCl,-6H,O 晶体 250 | 水 100 | —12.4 ‖ Na:S:0:.5H:O 67.5 | 雪 或 碎 孙 100 CaCl,-6H,O 晶体 204 | 雪 或 碎 冰 “100 中 —19.7 ‖ MgsO,-7H,O 51.3 | 雪 或 碎 冰 一 100 CaCl,-6H,O 晶体 164 | 雪 或 碎 冰 100 | 一 39.0 ‖ H,S0,(66.1%) 91 雪 或 碎 冰 “100 CaCl,-6H,0 te 143 | 雪 或 碎 冰 100 | —54.9 ‖ H,80,(66.1%) 40 | 雪 或 碎 冰 100 CaCl,-6H,O 晶体 124 | 雪 或 碎 冰 100 | —40.3 || H,S0,(66.1%) 23 雪 或 碎 冰 100 CaCl,-6H,O fk 81 | Sacrevk 100 | —21.5 |] H,SO,(66.1%) 13 雪 或 碎 冰 100 |, CaCl,-6H,O 晶体 940 | 雪 或 碎 冰 100 | — 9.01 H2so466.196) 8 雪 或 碎 冰 100 CaCl,-6H,O 晶体 20 | 雪 或 碎 冰 100 | — 4.0 | C,H,OH 105 雪 或 碎 冰 100 (二 ) 干 燥 剂 1. 气 体 的 干燥 剂 干燥 州 名 称 适用 于 干燥 的 气体 石 RB NIHs， 胺 类 Erk BU H,, HCl, CO, CO,, SO,, N,, 02, CHy, RS 五 氧化 二 磷 H,, CO, CO,, SO;, N;, 0}, CH, CR KR 硫 酸 H,, CO, CO,, N,, Cl,, CH, $ ey ee a a AA NHs， 胺 类 * DODn 2. 液 体 的 干燥 剂 + eR WM A 称 五 氧化 二 磷 浓 Tw EARS 气 氧 化 钊 无 永 碳酸 钾 无 水 硫酸 钠 EAD 无 水 硫酸 钙 2k 钠 BAF TRH mR 二 硫化 碳 碳 氢化 合 物 ? 卤 烷 饱和 碳 氢 化 合 物 ， 讽 烷 BAS > Hd HE RL 很 多 液体 均 可 很 多 流体 均 可 很 多 液体 均 可 醚 饱和 碳 氢 化 合 物 2 eres 醇 ? 胺 ? 酚 ， 脂 肪 酸 等 RS 虽 肪 酸 酯 等 3 干燥 器 中 常用 的 吸水 剂 : 五 氧化 二 磷 * 浓 硫酸 ,无 水 氧化 钙 ， 硅 胶 ( 常 放 于 光学 仪器 中 ,定期 炊 烤 可 反复 使 用 )o fs FARR ALIA AAT HR HI: 石蜡 片 。 常用 的 除 酸 性 气体 干燥 剂 : GK UC RS 常用 的 除 碱 性 气体 干燥 剂 : 浓 硫 酸 , 五 氧化 二 磷 等 。 e 221。 paren NS CASS TRIE Re : ++! : $. Lj vy! Oo . —+ : . 图 =— OW $0024646 馆 Ca. -— ’ 7 7 / a Sys rradvoerwev Er 一 ) Pe ee ee ee rr 封面 设计 Ht 性