BL 1 HE Ok AN HE, mm Proteomics:from Protein Sequence to Function GORE: MUSE = > * [2 7 a , : ~ ;: . pry as ee x LI 现代 生物 技术 译 丛 从 序列 到 功能 (3)S. R. Pennington M. J. Dunn 等 著 钱 小 红 “等 译 。 fx aN (: | 4a ‘tea. we een Bw 让 2002 内 容 简 介 蛋白 质 鉴定 技术 的 发 展 与 基因 组 测序 计划 的 实施 与 相继 完成 , 使 蛋白 质 组 学 得 以 诞生 和 发 展 。 蛋 白质 组 学 是 在 基因 组 学 的 基础 上 研究 蛋白 质 的 表达 与 功能 的 科学 , 是 建立 在 从 cDNA 阵列 mRNA 表达 谱 的 基因 功能 分 析 , 基因 组 范围 的 酵母 双 杂 交 , 蛋白 质 与 蛋白 质 相 互 作 用 分 析 到 蛋白 质 表 达 \ 测 序 和 结构 分 析 等 诸多 不 同 实验 方法 相互 融合 基础 上 的 科学 。 本 书 着 重 探讨 如 下 内 容 : 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 相互 关系 ;mRNA 表达 谱 现行 的 研究 方法 ;蛋白 质 组 研究 方法 ,如 双向 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 、 蛋白 质 检 测 、 蛋 白质 鉴定 的 质谱 方法 、 蛋 白质 表达 定量 分 析 方 面 质谱 方法 与 图 像 分 析 方 法 的 进展 ;蛋白 质 组 研究 的 自动 化 ;蛋白 质 组 分 析 在 药物 开发 中 的 应 用 ; 鸣 菌 体 抗 体 在 蛋白 质 组 研究 中 的 应 用 ; 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 ; 蛋 白质 组 技术 体系 在 院 校 实 验 室 的 建立 ;和 蛋白质 组 学 应 用 于 植物 遗传 学 与 育 种 。 本 书 适用 于 高 等 院 校生 命 科 学 和 医学 专业 师 生 及 生物 技术 产业 研发 人 0 ° Original edition published in English under the title of Proteomics : from Pro- tein Sequence to Function ©BIOS Scientific Publishers Limited, 2001 图 字 01-2002-1992 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 蛋白 质 组 学 :从 序列 到 功能 /( 英 ) 彭 宁 顿 (Pennington, S. R. ) 等 著 ; 钱 小 红 等 译 . 一 北京 :科学 出 版 社 ,2002.9 (现代 生物 技术 译 丛 ) ISBN 7-03-010747-0 1.8: 1.08%--@Ox#-- 0. ZAR HH W.QS51 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2002) 第 060808 号 mee Be hh 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮 收 编码 :100717 http:// www.sciencep.com im BL FOE hl 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销 2002 年 9 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 2002 年 9 月 第 一 次 印刷 ”印张 :16 3/4 播 页 :1 印 数 :1 一 3 000 字数 :363 000 定价 :45.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 , 我 社 负责 调 换 ( 新 欣 ) a ae ( 按 汉语 拼音 排序 ) Be) ERR 刘 尚 义 钱 小 红 Amma ERS 杨 何 义 应 万 涛 ” 鱼 咏 涛 rei nasal . _ ial if + a 7 wy if a $s es t 全 »~ pepe in * i 人 i 5 q 一 8 和 dos 4 Sy i a ug @ 编者 名 单 Aebersold, Ruedi. Department of Molecular Biotechnology, University of Washing- ton, Box 357730, Seattle, WA 98195, USA Blakemore, Steve. Genomics Unit, Glaxowellcome Medicine Research Centre, Gunnels Wood Road, Stevenage, SG] 2NY, UK Cahill, Dolores J. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, D- 14195 Berlin-Dahlem, Germany Cahill, Michael A. Department of Molecular Biology, Institute for Cell Biology, University of Tuebingen, Auf der Morgenstelle 15, Tuebingen, D-72076, Germany Davison, Matthew. 13S28 Mereside, Alderley Park, Macclesfield, SK 104TG, UK Dunn, Michael J. National Heart and Lung Institute, Imperial College of Science, Technology and Medicine, Heart Science Centre, Harefield Hospital, Harefield UB9 6JH, UK Eickhoff, Holger. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany Evers, Stefan. F. Hoffmann-La Roche Ltd, PRPI-D, Building 69/16, Basel, CH- 4070, Switzerland Goodlett, David R. Department of Molecular Biotechnology, University of Washington, Box 357730, Seattle, WA 98195, USA Gorg, Angelika. Technische Universitat Miinchen, Institut fiir Lebensmitteltechno- logie und Analytische Chemie, FG Protemik, D-85350 Freising, Weihenstephan, Germany Gray, Christopher. F. Hoffmann-La Roche Ltd, PRPI-D, Building 69/16, Basel, CH-4070, Switzerland Humphrey-Smith, Ian. Department of Microbiology, Centre for Proteome Research and Gene-Product Mapping, Suite G12, National Innovation Centre, Australian Technology Park, Eveleigh, NSW, Australia James, Peter. Wallenberg Laboratory, Lund University, Lund, Sweden Jenkins, Rosalind. Department of Human Anatomy and Cell Biology, New Medical School, Ashton Street, Liverpool L69 3GE, UK Johnson, Kevin. The Science Park, Melbourne, Cambridge SG8 6JJ, UK Keatinge, Lucy. Department of Biological Sciences, Division of Environmental and Life Sciences, Maquarie University, NSW 2109, Australia Klose, Joachim. Humboldt-Universitat, Charité, Virchow-Klinikum, Institiit fiir Humangenetik, Augustenburger Platz, 13353 Berlin, Germany Lehrach, Hans. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, [hnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany 蛋白 质 组 学 Lopez, Mary. 22 Alpha Road, Chelmsford, MA 01824-4, USA Nordheim, Alfred. Department of Molecular Biology, Institute for Cell Biology, University of Tuebingen, Auf der Morgenstelle 15, Tuebingen, D-72076, Germany Nordhoff, Eckhard. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany O’Brien, John. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany Oswald, Helmut. German Heart Institute, Augustenburger Platz, Berlin, D-13353, Germany Packer, Nicolle H. Proteome Systems Ltd, 1/3541 Waterloo Road, North Ryde, Sydney, NSW 2113, Australia. Patterson, Scott D. Amgen Inc., Amgen Centre, MS 14-2-E, One Amgen Centre Drive, Thousand Oaks, California, CA 91320-1789, USA Patton, Wayne F. Molecular Probes Inc., 4849 Pitchford Avenue, Eugene, OR 97402, USA Pennington, Stephen R. Department of Human Anatomy & Cell Biology, New Medical School, University of Liverpool, Liverpool L69 3GE, UK Pleissner, Klaus-Peter. Institute for Plant Genetics and Crop Plant Research, Corrensstr 3, Gatersleben, D-06466, Germany Plomion, Christophe. Laboratoire de Génétique et Amélioration des Arbres Forest- iers, INRA, France Pritchard, Kevin. Cambridge Antibody Technology Ltd, The Science Park, Mel- bourne, Cambridge SG8 6JJ, UK Quadroni, Manfredo. Institute of Biochemistry, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland Thiellement, Herve. Department de Biologie Vegetale, Universite de Geneve, 3 Place de l'Universite, Geneve 4, CH-1211, Switzerland Trower, Michael K. Genomics Unit, Medicines Research Centre, Gunnels Wood Road, Stevenage SG] 2NY, UK Valge-Archer, Viia. Cambridge Antibody Technology Ltd, The Science Park, Melbourne, Cambridge SG8 6JJ, UK Wallace, Don M. Medicines Research Centre, Glaxo Wellcome Research and Development, Stevenage SG1 2NY, UK Wegner, Susan. German Heart Institute, Augustenberger Platz 1, Berlin, D-13353, Germany ; Wilkins, Marc. Proteome Systems Ltd, Locked Bag 2073, North Ryde, Sydney, NSW 1670, Australia Zivy, Michel. Station de Génétique Vegetale, Gif-sur-Yvette, France 前 ,， 言 蛋白 质 鉴 定 技术 的 发 展 与 基因 组 测序 计划 的 实施 与 相继 完成 , 使 得 “蛋白质 组 学 ” 这 一 全 新 的 研究 领域 得 以 诞生 和 发 展 。 蛋 白质 组 学 是 在 基因 组 学 的 基础 上 研究 蛋白 质 的 表达 与 功能 的 科学 ,是 建立 在 从 cDNA 阵列 mRNA 表达 谱 的 基因 功能 分 析 , 基因 组 范围 的 酵母 双 杂 交 , 蛋白 质 与 蛋白 质 相 互 作用 分 析 到 蛋白 质 表达 测序 和 结构 分 析 等 诸多 不 同 实验 方法 相互 融合 基础 上 的 科学 。 《蛋白 质 组 学 :从 序列 到 功能 一 书包 含 了 多 方面 的 内 容 。 主 要 介绍 了 用 于 和 蛋白质 表 达 谱 分 析 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 , 用 于 蛋白 质 识 别 与 鉴定 的 质谱 技术 以 及 相关 的 信 息 学 。 本 书 的 作者 包括 了 本 领域 的 诸多 领衔 级 人 物 , 其 中 包括 在 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 的 发 展 , 蛋白 质 的 检测 , 凝 胶 图 像 分 析 , 蛋 日 质 的 质谱 分 析 , 噬菌体 展示 抗体 技术 的 产生 与 应 用 以 及 这 些 方法 的 整合 及 其 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 中 起 过 关键 作用 的 科学 家 。 本 书 力图 作为 对 蛋白 质 组 学 研究 感 兴趣 的 人 们 的 一 本 指导 书 ,包括 初学 者 和 有 实际 经 验 的 人 。 本 书 从 两 个 重要 的 篇 章 开 始 , 第 一 章 介 绍 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 相互 关系 , 第 二 章 描述 mRNA 表达 谱 现行 的 研究 方法 。 建 立 在 从 蛋白 质 组 研究 获得 的 信息 与 从 DNA 研究 获得 的 信息 相互 整合 基础 上 的 这 两 章 , 为 接 下 来 有 关 蛋 白质 组 研究 方法 描述 的 几 章 提供 了 必需 的 平台 。 有 关 有 蛋白 质 组 研究 方法 的 几 章 包括 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 、 蛋 白质 检 测 、 蛋 折 质 鉴定 的 质谱 方法 、 蛋 白质 表达 定量 分 析 方 面 质谱 方法 与 图 像 分 析 方 法 的 进展 。 现行 的 蛋 白 质 组 研究 方法 基本 上 还 是 费时 、 费 力 的 ,其 产生 的 数据 达到 了 必须 采用 计算 机 软件 进行 处 理 的 规模 。 因 而 , 接 下 来 两 章 的 主题 是 关于 蛋白 质 组 研究 自动 化 的 问题 。 尽 管 二 维 凝 胶 电 泳 是 目前 最 有 力 的 分 析 简 单 或 复杂 生物 体 蛋白 质 表 达 谱 的 平台 , 但 它 也 确 实 有 局 限 性 , 接 下 来 的 一 章 即 是 有 关 其 他 洪 在 分 离 方法 的 介绍 。 最 后 几 章 分 别 是 关于 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 中 的 应 用 、 叹 菌 体 抗体 在 蛋白 质 组 研究 中 的 应 用 、 糖 生物 学 与 蛋白 RAS 、 蛋 白质 组 技术 体系 在 学 院 实验 室 的 建立 以 及 蛋白 质 组 学 用 于 植物 遗传 学 与 育种 。 — 诸多 人 的 帮助 使 得 本 书 得 以 完成 。 我 们 真诚 地 感谢 他 们 。 我 们 也 感谢 所 有 的 作者 ， 感谢 他 们 的 兴趣 与 热情 。 我 们 特别 感谢 Scott Patterson, Mare Wilkins 和 Peter James, 他 们 为 本 书 提供 了 无 价 的 指导 和 和 帮助。 我 们 也 感谢 BIOS 的 全 体 人 员 以 及 那些 为 我 们 提供 “Fe Bh” FRA AT, 包括 Jenni Brown, Lisa Crimmins 和 Jane Hamlett. (Rose #) oe ge, Rill ; a0 My ey Wwe: re | ny Oe st 本 四 wilphoawee: a Oh 人 oI ay, ; ~S 2: Sha SOR eI i PCR rors 罕 核 董 酸 指 BH SCAE UR 2.1 ode Tes see cee ces cee sce ceeces ces cescesssscssscccccosesseesccssessssccsecs Q 2.2 FRILL DEH, Fy Be EE ED AE vec ee ee ce cece eee cee cee eee 10 2.3 实验 室 自动 化 和 高 密度 阵列 的 新 进展 pp | 2.4 文库 归 一 化 和 用 守 核 苷 酸 指纹 产生 Unigene 套 pp 12 2.5 通过 在 DNA 微 阵列 上 的 复杂 杂交 获得 不 同 的 差异 表达 谱 pp 12 2.6 自动 化 图 像 分 析 - ad gin a's scones 42 =. es ‘DNA 228 CRE REINS Hee Sur FR aes Ee Re eRe AA ees © 本 ie 4. 通过 高 分 辨 二 维 电泳 (2- DE) 些 定 特定 缅 隐 半 型 或 组 织 在 特定 时 间 的 蛋白 iat oi 4.2 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (2-DE) pp 16 4.3 ”联合 的 2-DE 数 据 库 pp 17 4.4 Suara showin 本 第 二 * 基因 表达 的 检 ee peatehaigumermnnre euecitye--cceook ome tae 3 4, 2.2 RARE - 不 基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法 … 3.1 基于 序列 测定 的 方法 学 Se eer eee POR DEE PCR) rss neo sex 第 三 章 . 引言 | eR TERRE ES . . 148 pH #2 (immobilized pH gradient, es 1 . 样品 制备 :… NA 二 请 LN 王 8. 9. 10. 分 辨 雍 ERROR . 展望 .pp Ramat ARR EE K- 4.2 组 织 样 品 4.3 细胞 cer ece cee cee eee ees 4.4 样品 分 级 站 aS eee ApH EPRICE wih IPG) ; 7.1 IPG BRA - 7.3 加 样 和 运行 …… 7 at IPG TER pH 梯度 的 选择 oo LAE 2. ee oe —# SDS-PAGE ee eee. AER AORREDML EES REBIBI i. Lie a 4. 引言 有 机 染料 和 银 染 2.1 有 机 染料 2.2 FRYE oo ovvi evb…eoi cen ces cee cseeeeseeweesensen senses seeceseeeuee ans ses nes oen sen eue TAL YL cee ete cee eee eee cee eee eee ences eee ee eee nent ee eee eee tee eee aen tee eee nee see eee aee see eee tee eee 3.1 FEIRBER YER cere ee cee cee cee cee cen tence eee aeeene ees ens cee cee saeco sense eceuee nes ens 3.2 PEDRO YUL cee cee cee cee see ee cee eee ene ces ce cen cen cen cen sen ece ase ueeeesees ens eae see 胶体 扩散 染料 pp 4.1 印度 墨水 染料 ee = A Ras 27 28 29 32 34 35 38 38 38 39 39 39 40 40 40 41 41 42 42 42 43 45 48 50 50 50 51 51 52 55 55 56 56 57 58 58 59 59 59 5.1 Oo. ee 5.2 非 共 价 结合 荧光 轩 cee cee cee cee cee eee cee cee eee eee eens eee eae aee ees saeaee ces eee eeeees eS Lee ee ert Ske eee Ste fe ee ae 6.2 1 eee 结论 … cles 第 五 章 ae 1. 引言 …… 1.1 蛋白 质 鉴定 途径 - wuxieoetee «on SBGL PERE BEI 0 dha fe ane 2.1 MALDI-MS 2.2 ESILLMS .………'………. 3. 以 质谱 为 基础 的 相关 鉴定 策略 … zeit 肽 质量 检索 (peptide- mass searching) ‘*c***tt ttt ttt sts cse see tte cee ceeeee cee cee cee ene 3.2 未 解析 碎片 离子 的 检索 cee cee cee cee eee 4. 用 质谱 数据 对 肽 段 从 头 测序 (ce novo ee 5. 磷酸 化 位 点 分 析 的 各 种 方法 … OR. ek Yap eS 1 eee eee 6. 目前 及 将 来 面临 的 机 遇 和 挑战 … 参考 文献 - mee 第 六 章 =H ROOST 1. 介绍 … tN . 数字 化 图 像 加 工 … BURR ARIA HE . 凝 胶 配 比 … oo ~ 下 Wi & W 本 Bt: 获取 图 像 设 备 oe cee coe one cee wae oe cee wee eee ook tee ee ee tee oes wee eee eee eee eee eee eee eee ie i ee ee ae TR RG one os nw cence nn oo Sp EERE Cre Te ah FUP Mille bek Sees eb ee Eo fle dit == + aa 有 oe? Oe 8.2 比较 网 上 分 布 的 2-DE RHE - 9. 结论 … 参考 文献 - 第 七 章 RRS EES 稳定 同位 素 标 记 的 影响 … 0 a 1. 前 言 … 2. 样品 制备 … 3. 二 维 凝 胶 分 离 和 分 析 pe 304 Both — 4 WB ER Bk (2-DE-PAGE) Cee cee eee cee cee toe es eee eee eee ees ves 3.2 蛋白 质 的 扫描 检测 和 定量 3.3 ”通过 稳定 同位 素 标记 定量 2-.DE 凝 胶 中 的 蛋白 质 ee 3.4 2-DE 雍 胶 和 蛋白 点 的 分 离 ， 3.5 蛋白 质 酶 解 / 碎 裂 4. 质谱 :使 用 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 - 4.1 质量 指纹 肽 谱 soseoseoeosoeoeoooseoooeeososoeeoeooooeoovosoooeossosooeooeoeoeoeooeoosssoessnsses 4.2 小 序列 标签 多 肽 指纹 谱 5. 质谱 :使 用 串联 质谱 数据 鉴别 蛋白 质 S53 .: 自 ALARA. 5.4 数据 解释 工具 … 参考 文献 - 第 八 章 爱 白 质 组 学 的 自动 化 高 通 量 自白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 1. 历史 回顾 … "2 Aa I aes aint e/a ie sale 2. ZAM 18-85 8 ah; HER UR 2.1 2-DE 胶 的 自动 化 … 2 eae AEE EL HEIR TR ev capes concep raz enncenmen ste veseedaes + p00 SRE a 3.3 AFIS REBT coe ee cee cee scence cence nee eee cee cee seu ces aoe sen ees seecne ees cen edetes 4, _ 第 九 章 wa. 自动 化 蛋白质 组 分 析 的 完整 途径 7: 引言 ……………: A i 117 117 118 119 122 122 122 123 123 123 oes cee cee 124 126 128 128 128 129 130 130 131 132 133 134 138 138 138 139 139 140 140 143 144 145 148 149 149 150 155 155 2. 二 维 电 泳 结 合 质谱 :蛋白质 组 的 典型 范例 ? 3 自动 化 概 准 ewes card Wagan 4. 二 维 凝 胶 电 泳 的 显 色 cee eee eee eee teres 4.1 二 维 凝 胶 4.2 富 集 和 分 部 收集 技术 cee cee ee eee eee 4.3 BRERA 4.4 自动 染色 6.1 斑点 切取 7. 质谱 的 接口 策略 … 8. 机 器 人 模块 ,图 像 分 析 软 件 和 信息 数据 库 之 间 的 链接 ppp 结论 … sn 第 十 章 爱 折 所 表达 分 析 新 方法 . 引言 yess eR HEE WN KF . 除 二 维 凝 胶 电 泳 以 外 的 蛋白 质 表 达 分 析 方 法 … 4.1 依赖 于 分 离 的 方法 4.2 TREO OES I 3 “A aS Fr” 5. Aim 参考 文献 - 第 十 一 章 到 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 训 理 学 中 的 应 用 1. 引言 i aia, Mid bee edie 2.1 比较 分 析 2.2 生物 标志 物 蛋白 质 的 检测 2.3 详细 的 基因 表达 调控 分 析 Oe Wee 4 = Psi]: cs. EEE Ca eee See ee 结论 与 展望 … 文献 i. 本质 组 学 方法 中 抗体 是 蛋白 质 特 异 分 子 探 针 的 合理 选择 Oe oes coe cee coe oes ee cee eee cee tes cee cee ces 1.3 ”关键 技术 概观 … . 蛋白 质 组 分 析 : 基 于 2-DE 的 战略 … 164 164 164 170 —— ee ee aa vite ° ) 蛋白 质 组 学 2.1 ia 股 在 噬菌体 上 的 展示 … 本 2.4 «chit aria lgo | 2 7 JET MR et PT 性 抗体 . wspaiaasianaaousnaaooieeana sndiodeeteb thas # IE 3. 有 际 恒 人 季 洒 BOADIW 大 汪汪 3.2 .采用 生 禾 信息 学 方法 了 解 EST HORE cece ctece cee ncewereccteraceceeseesesegeaneces 995 3.4 Ae ee ee see secsccleaeisine cate Slond okiieetives BTID 3.5 ”高通 量 的 ICC 分析 . oa 3.6 生物 信息 学 和 3.7 ”ProAbIM 计 划 的 应 用 实例 … MM ee eee re 4. 轻 菌 体 抗体 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 一 ProxiMolTM 技 术 esi 199 4.1 常规 的 选择 抗 膜 蛋 自 的 噬菌体 抗体 pp 4 ProNMol 方 法 及 应 用 ， 本 二 二 4.4 “ProxiMolIM 方 法 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 应 03 2.2 0 -连接 结构 pp 207 2.3 pl neo allan 和 人 WM ee) aa CAP tat eee eee oe es tee Abs oe ea wie nae eager oo DP) 目 录 2、 为 什么 不 在 学 术 环 境 审 进行 蛋 和 音质 组 研 宅 2? cwn ene eee eee cee cee cece enn ens ceeeee aes 3. 为 什么 要 在 学 术 环 壕 捉 进行 蛋白 质 组 研究 ? cee eee eee cee cee cee ece eee een cee cee cneens « zy - ee 3.1 大 学 能 和 否 承担 得 起 蛋白 质 组 的 研究 经 费 ? 3.2 如果 没 有 学 术 机 构 , 企业 能 承担 蛋白 质 组 学 研究 吗 ? 3.3 目前 蛋白 质 组 学 的 研究 尚 不 健全 吗 ? 某 些 人 看 到 局 限 性 eee eee reece eee 3.4 学 术 机 构 的 蛋白 质 组 学 研究 对 企业 是 有 益 的 …………………………… oo 4.1 ACPA ALA ULAR A I, LMP ARIE oon - 225 - 226 4.2 大 学 愿意 与 临床 样本 接近 4.3 大 学 不 仅 研究 医学 应 用 4.5 大 学 培养 学 生 … 6. 结论 … 参考 文献 . 第 十 五 章 fetta AT ANKE MES. ste eee eee eee eeeeeeeeeeeeees JQIQ i aiet *" xi 220 220 Bee 225 225 pM 226 5 ELF BIR pin) =) bi A I a MGS Go 4 Se Rae 5 226 Be 4 ~ ao 2.1 PPPS AU PRIA AU RIS RE RR cee eee ee cee cee ccc cee cence nce c ee cee cen ece nee cee ces senses ees 2.2 品种 .品系 和 栽培 品种 酌 区 别 nee eee ee cee cee cee nee cee cee een cen see cence nee cee nee ens - 232 omer AF 3. 基因 组 的 表达 … 3.1 突变 特征 3.2 ”器官 和 发 育 阶 段 的 变异 性 4. 遗传 作 图 和 候选 蛋白 ………………………. 4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白 - 5. 方法 学 进展 和 植物 蛋白 数据 库 … 6. 总 结 、 前景 展 望 . 230 230 ye 3 . 944 a ASE ahaa a Fas fag Sie EA fle aes A ha 000 Sewas noe pundn digas cde see daainwn ann asderess 233 20 BE ide RES HE LE] 804 abe not cor aun adnnntalnlcudnads asmens one soamayinte von var events * 236 - 238 25 Ste teen ee eee eee eee eee nee nen see see cesses see sesecesessessseses DBO 239 人 _ RTE Fe ae Rae es Te. in ee, Ree SEBS octet tHe 5 PN OR re pepe ES alist i aa age vt a Be bak rao | wane we Se eeacaciaenayan mg i embitale Li shies iy 4 上 eS Sa Mis ala ese ch sph 信介 RL AAG Te ota ut = ; ue ti * Wit a) ae x D = > on ce cupteiyaatr “ wm eae” Tecan a DT AN, Wee i 9. ee 上 ; | 和 站 Ach aut a 有 有 所 村 ‘i Fe, 中 wi fp a > a ies: AU ene ee ba bin n't 4 YY 和 wt ee) cee easy ‘bonis sce oo ic j + ed | 人 yi vig of z i 四 Cam CCD camera CDNA CE abscissic acid amplified fragment length polymorphism 1-anilino-8-napthalene sulphonate Australian Proteome Analysis Facility ABA/ water stress/ripening related protein bis(8-toluidino-1-naphthalene sultonate) basic local alignment search tool bovine serum albumin collision-activated dissociation Chloramphenical charge-coupled device camera complementary DNA capillary electrophoresis candidate gene 3 [ (cholamidopropy]) dimethylammonio ]-1- propane sulphonate collision-induced dissociation candidate protein Chinese spring cerebrospinal fluid cyclosporine A capillary zone electrophoresis expressed sequence tag database differential display PCR one-dimensional polyacrylmide gel elec- trophoresis two-dimensional polyacrylmide gel elec- trophoresis dihydrofolate reductase differential gene expression two-dimensional phosphopeptide 脱落 酸 扩 增 片段 长 度 多 态 性 1 - 葵 胺 基 - 8 - 蔡 快 磺 酸 酯 澳大利亚 蛋白 质 组 分 析 实 验 室 脱落 酸 / 水 分 胁迫 / 催 熟 相关 A (8 -甲苯 氨基 - 1 - 蔡 磺 酸 盐 ) 基本 的 碱 基 配 对 搜索 软件 牛 血 清白 蛋白 碰撞 活化 解 离 ABA 电荷 耦合 照相 装置 互补 DNA 毛细 管 电泳 候选 基因 3-[(3 - 胆 酰 胺 两 基 )- 二 乙 胺 ]- 丙 磺 酸 碰撞 诱导 解 离 候选 蛋白 中 国 春 (小 麦 品种 ) 脑 将 液 a fee A 毛细 管区 带电 泳 表达 序列 标签 数据 库 差异 显示 PCR 一 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 AER DA es PE HC OE IBS aK = BU BRIE 基因 表达 差异 二 维 磷酸 肽 作 图 FSH HCl HIS-tagged HIV mre HRP HSP HUVEC ICAT ICE ICE ICL, IEF IgG IMAC IMAGE IMS IEF IPG N, N-dimethyl acrylamide deoxyribonucleic acid database spot number dithiothreitol ethylenediaminetetraacetic acid enzyme-linked immunosorbant assay electrospray ionization expressed sequence tags fluorescence-activated cell sorter fluorescein isothiocyante formyl peptide receptor follicle stimulatiting hormome fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry fusidic acid full-width half maximum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase glycosyl phosphatidylinositol human chorionic gonadotrophin hydrochloric acid histidine-tagged human immunodeficiency virus high performance liquid chromatography horseradish peroxidase heat shock protein human umbilical vein endotheilial cells isotope-coded affinity tagging immunocytochemistry interleukin converting enzyme instrument control language isoelectric focusing immunoglobulin G immobilized metal affinity chromatography integrated molecular analysis of genomes and their expression ion mobility spectrometry isoelectric point immobilized pH gradiednt 蛋白 质 组 学 N,N -— ER i EH 脱氧 核糖 核酸 数据 库 中 点 数目 二 硫 苏 糖 醇 乙 二 胺 四 乙酸 酶 联 免 疫 吸附 测定 FE, Mig Se FEL Peg 表达 序列 标签 荧光 激活 细胞 分 离 器 异 硫 氰 酸 荧 光 素 甲 酰 肽 受 体 卵泡 刺激 素 傅 里 叶 变换 离子 回旋 共振 质 谱 PR EAR 半 峰 宽 foe EY YH BS Ab 糖 基础 酯 酰 肌 醇 人 绒毛 膜 促 性 腺 激素 盐酸 组 氛 酸 标签 人 类 免疫 缺陷 病毒 高 效 液 相 色谱 辩 根 过 氧 (化 ) 物 酶 热 激 蛋 白 , AK EA 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 同位 素 编码 亲 和 标 签 免疫 细胞 化 学 白细胞 介 素 转换 酶 仪器 控制 语言 等 电 聚 焦 PERE A G fl +H eee aR 基因 组 及 其 表达 产物 综合 分 析 离子 迁移 谱 等 电 点 固 相 pH 梯度 缩 略语 IPG-DALT IPTG IR IRMPD ivy Kan KCl LC LCM LC-MS/MS LEA LE LIMS LMW LOG m / 之 MALDI-TOF mRNA MS MS/MS NCBI NEPHGE NP-40 OD PBS P/A PAGE PCR *xv° 2-D with immobilized pH gradients in the first dimension isopropyl-8-D-thiogalactopyranoside, infrared infrared multiphoton dissociation ion trap kanamycin potassium chloride liquid chromatography laser capture microdissection liquid chromatography tandem mass _ spec- trometry late embryogenesis-abundant luteinising hormone laboratory information management low molecular weight Laplacian of Gaussian mass-to-charge ratio matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mitogen-activated protein 2-methoxy-2, 4-diphenyl-3(2H) furanone acetonitrile molecularly imprinted polymer minimal protein identifier relative molecular mass message RNA mass spectrometry tandem mass spectrometry National Center for Biotechnology Informa- tion non-equilibrium pH gradient electrophoresis Nonidet P40 optical density phosphate buffered saline presence/absence polyacrylamide gel electrophoresis polymerase chain reaction 固 相 pH 梯度 为 第 一 向 的 二 维 凝 胶 电 沪 Fe A Ee Gat CAE AL BE 红外 红外 多 光子 解 离 a TBF BABS HR 氯 化 钾 液 相 色谱 激光 俘获 微 切割 液 相 色谱 -串联 质谱 联 用 胚胎 形成 晚期 丰富 蛋白 黄体 激素 实验 室 信息 管理 低 分 子 质量 高 斯 拉 普 拉 斯 质 核 比 基质 辅助 激光 解吸 飞行 时 间 质谱 有 丝 分 裂 激 活 蛋 白 2- 有 甲 氧 基 - 2, 4 -二 苯 基 啤 OR Zia 分 子 印记 聚合 物 最 小 蛋白 鉴定 量 相对 分 子 质量 信使 RNA 质谱 串联 质谱 全 美 生物 技术 信息 中 心 非 平 衡 pH 梯度 电泳 非 离子 去 垢 剂 瓦 40 光 密 度 值 磷酸 盐 缓冲 溶液 存在 /缺乏 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 聚合 酶 链 反应 | RF RFLP rHu G-CSF RNA RP-HPLC RT-PCR SAGE SAM SB SCA scFv SCX SDS SDS-PAGE SELDI SIM piperazine diacrylamide parts per million protein quantity loci position shift postsource decay polyvinylidene difluoride quartz crystal microbalance quantitative trait loci random amplified polymorphic DNA relative collision energy radio frequency restriction fragment length polymorphism human granulocyte colony-stimulating fac- tors ribonucleic acid reversed-phase high performance liquid chromatography reverse transcriptase polymerase chain reac- tion serial analysis of gene expression self-assembled monolayer sulphobetaine synthetic carrier ampholytes single chain variable fragment cation exchange sodium dodecyl sulfate sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eletrophoresis surface-enhanced laser desorption/ionization selected ion monitoring candidate protein surface plasmon resonance standard spot number streptomycin tributyl phosphine trichloroacteic acid triethylamine N,N,N’, N’-tetramethylethylenediamene A We A 二 酰基 哌 嗪 百 万 分 之 几 蛋白质 数量 位 点 位 置 迁 移 源 后 裂解 聚 偏 二 氟 乙 烯 石英 结晶 微 平衡 数量 性 状 遗 传 位 点 随机 扩 增 DNA 多 态 性 相对 碰撞 能 量 射频 限制 性 酶 切片 段 长 度 多 态 性 人 粒 细胞 集落 刺激 因子 核糖 核酸 反 相 高 效 液 相 色谱 反 转 录 酶 聚合 酶 链 反应 基因 表达 系列 分 析 自 组 装 单 层 物 磺 基 三 甲 铵 乙 内 酯 合成 载体 两 性 电解 质 单 链 片段 多 样 性 阳离子 交换 十 二 烷 基 硫酸 钠 十 二 烷 基 硫酸 钠 - 聚 丙烯 栈 Fic BE WBS HE, DK 表面 增强 激光 解吸 离子 化 选择 性 离子 检测 候选 蛋白 表面 等 离子 体 共 振 标准 点 数目 SESE = JT BG 三 氯 乙 酸 =Z28K N,N,N’, N -四 四 其 局 二 胺 缩 略语 Tet TFA TGF THF TIC TIGR TLE ™ Tmp TNF TQ tRNA UV VCAM WST WWw ZP tetracycline trifluroracetic acid transforming growth factor tetrahydrofuran total ion count The Institute of Genomics Research thin-layer chromatography transmembrane trimethoprim tumor necrosis factor triple quadrupole transfer RNA ultraviolet vascular cell adhesion molecule watershed transformation World Wide Web zona pellucida sa XVil ° 四 环 素 =H ZR 转化 生长 因子 PY AK 总 离子 数 基因 组 学 研究 所 WE fis BS =F SK mee 肿瘤 坏死 因子 三 级 四 极 杆 转运 RNA 紫外 血管 细胞 黏附 分 子 转化 分 界线 万 维 网 透明 带 ( 杨 何 义 HF Rie 校 ) AT te 概 述 有 蛋白质 组 学 迎接 后 基因 组 时 代 的 挑战 Stephen R. Pennington and Michael J. Dunn 蛋白 质 组 学 的 出 现 ， 为 我 们 进一步 了 解 整个 生物 体系 一 一 从 简单 的 单 细 胞 生物 到 复 杂 的 生物 体 (如 人 类 ) 提供 了 一 种 可 靠 的 方法 。 用 于 检测 蛋 日 表达 的 二 维 电泳 技术 (2- DE) 和 用 于 蛋白 质 鉴 定 的 质谱 技术 对 蛋白 质 组 学 的 产生 起 了 至 关 重 要 的 作用 。 而 对 这 一 领域 越 来 越 多 的 关注 加 速 了 对 全 基因 组 蛋 日 质 表 达 以 及 功能 分 析 方 法 的 不 断 改进 与 完 善 。 蛋白 质 组 学 的 诞生 实质 上 是 依赖 于 基因 组 测序 计划 的 成 功 ， 该 计划 虽 未 对 揭示 生物 体 的 本 质 提供 更 多 的 信息 ， 但 是 它 为 更 加 广泛 而 有 效 的 实验 方法 的 产生 提供 了 基本 的 平 台 ， 而 这 些 实验 方法 将 为 鉴定 基因 组 编码 的 基因 ， 并 最 终 理解 这 些 基 因 产 物 在 生命 活动 中 的 调控 作用 提供 支撑 。 显 然 ， 基 因 组 学 与 蛋白 组 学 的 相互 协调 发 展 将 为 生物 学 家 提供 最 好 的 帮助 。 整个 基因 组 测序 计划 的 成 功 既 令 人 瞩目 又 令 人 兴 香 。1995 年 首次 公布 了 第 一 个 非 寄生 生物 的 全 基因 组 序列 (Fleischmann et wz .，1995)， 而 到 2000 年 7 月 ， 在 公共 数据 库 中 已 经 有 40 个 生物 体 的 全 基因 组 序列 ， 另 外 还 有 127 个 原核 生物 和 95 个 真 核 生 物 的 序列 正在 分 析 中 [ wit. integratedgenomics. com /GOLD/]. 74Hit, AKERADA 5、16、19、21、22 号 染色 体 的 测序 已 经 完成 ， 人 类 基因 组 的 精确 图 谱 预 期 在 2003 年 公布 。 上 述 的 成 就 可 能 开始 对 医学 诊断 产生 影响 ， 一 个 多 国 合作 用 来 建立 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 图 谱 的 计划 已 经 启动 ( 见 表 1 的 网 址 )。 已 完成 全 基因 组 测序 的 生物 体 数 目 正 以 加 速度 持续 增加 ， 公 众 对 数据 库 、 搜 索 工 具 和 相关 电子 信息 资源 的 访问 达到 空前 的 规模 (WLR 1)。 而 这 种 对 序列 信息 的 利用 在 十 年 前 几乎 是 不 可 想像 的 。 例 如 ， 比 较 基 因 组 学 通过 对 某 一 特定 生物 的 全 基因 序列 与 其 他 所 有 生物 的 基因 组 序列 进行 比较 ， 来 鉴 定 两 者 之 间 的 差异 ， 从 而 解释 某 些 特定 和 重要 的 功能 ， 如 病原 性 。 而 结构 基因 组 学 这 一 轩 新 领域 是 通过 X 射线 晶体 衍射 、 核 磁 共 振 和 其 他 方法 来 确定 蛋白 质 的 结构 ， 并 将 结 构 与 基因 的 序列 和 功能 相关 联 。 另 外 ， 基 因 组 测序 及 其 相关 计划 已 经 产生 了 mRNA 表 达 、 转 录 组 学 分 析 的 新 策略 〈( 见 第 二 章 ) (Chee et al., 1996; Eisen et al., 1998; Ger- hold et al., 1999) 以 及 利用 酵母 双 杂 交 分 析 检 测 蛋 白 之 间 相 互 作 用 的 方法 (Fields and Song, 1989; Fromont-Racine et al., 1997; Lecrenier et wd .，1998)。 值 得 注意 的 是 ， 用 于 高 通 量 mRNA 表达 分 析 (这 种 分 析 有 时 是 在 基因 组 规模 上 ) 的 DNA 芯片 和 微 阵列 技 术 对 基因 功能 的 研究 产生 了 显著 的 影响 (Hughes et al., 2000; Young et al., 2000). 微 阵 列 技术 的 不 断 改 进 已 经 使 获取 基因 序列 信息 和 差异 基因 表达 数据 的 速度 大 大 加 快 (Bowtell et al., 1999; Young et al .，2000)。 总 之 ， 这 些 方法 很 可 能 使 人 类 能 识别 和 鉴 定 生物 体 的 各 种 属性 (包括 需 要 的 和 不 需要 的 )。 网 址 ensemble. ebi. ac. uk genome. wustl. edu/gsc/ www. hgmp. mre. ac. uk/ www. hgsc. bem. tmc. edu/ wit. integratedgenomi cs. com/ GOLD www. jgi. doe. gov/ Star. scl. genome. ad. jp/ kegg www. ornl. gov/hgmis/ www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/ seq/ www. sanger. ac. uk/ www. tigr. org/tdb/ snp. cshl. org www-genome. wi. mit. edu/ #1 机 构 德国 海德 堡 的 欧洲 分 子 生物 学 实验 室 英国 剑桥 桑 格 中 心 美国 圣路易斯 华盛顿 大 学 医学 院 , 基因 组 测序 中 心 人 类 基因 组 图 谱 项 目 资源 中 心 ， 英国 剑桥 Wellcome Trust 基因 组 中 心 美国 得 克 萨 斯 州 休斯敦 Baylor 医学 院 ， 人 类 基因 组 测序 中 心 美国 , 伊利 诺 伊 州 芝加哥 联合 基因 组 公 司 美国 加 利 福 尼 亚 州 Walnut Creek 基因 组 共同 体 研 究 所 日 本 东京 大 学 化 学 研究 所 , 东京 基因 和 与 基因 组 研究 中 心 美国 田纳西 州 Oak Ridge 国家 实验 室 ， 能 源 部 生命 科学 院 美国 马里 兰州 贝斯 达 NIH, 国立 生物 技 术 信 息 中 心 桑 格 中 心 , 英国 剑桥 Wellcome Trust 基 因 组 研究 中 心 美国 马里 兰州 Rockville, 基因 组 研究 所 美国 纽约 州 冷 泉 港 ,冷泉 港 实验 室 ， SNP 有 限 公司 美国 马萨诸塞 州 剑桥 Whitehead 基因 组 研究 中 心 蛋白 质 组 学 基因 系列 数据 库 与 分 析 工 具 网 址 可 获 信息 人 类 小 鼠 \ 虫 基因 组 注释 人 类 、 模 式 生物 测序 计划 、EST 计划 、 操 作 流 程 和 技术 帮助 序列 数据 库 和 搜索 引擎 , 系统 发 生 连 锁 分 析 , 可 进行 友好 链接 KAA RW FIT, 人 类 转录 数 据 库 调控 全 部 基因 组 测序 计划 或 进展 、 链 接 相关 的 网 址 和 公共 数据 库 人 类 、 微 生物 测序 和 作 图 , 功能 基因 组 学 计划 序列 数据 库 和 分 子 相互 作用 的 相关 信 息 链接 相关 研究 进展 报告 公共 数据 库 及 会 议 , 特别 是 关于 人 类 基因 组 计划 序列 ,SNP 和 文献 数据 库 , 数据 分 析 工 具 , 人 小 鼠 的 遗传 和 物理 图 谱 有 关 人 类 基因 测序 计划 及 其 他 原核 、 真 核 生物 测序 计划 的 进展 有 关 微 生物 、 植 物 及 人 类 的 基因 序列 ， 功能 和 分 类 学 数据 库 人 类 基因 组 的 SNP 图 谱 有 关 人 类 、 小 鼠 \ 大 鼠 及 人 类 SNP 数据 库 的 遗传 和 物理 图 谱 应 用 于 转录 组 学 研究 的 cDNA 阵列 具有 下 列 几 个 重要 的 特征 : 对 复杂 体系 的 分 析 变 得 相对 容易 ; 反应 、 杂 交 和 扫描 可 以 自动 化 操作 ; 具备 可 用 于 结果 分 析 的 有 效 软件 。 更 重要 的 是 ， 一 旦 在 实验 条 件 下 mRNA 表达 发 生 改 变 ， 即 可 直接 采用 多 种 简便 的 分 子 生 物 学 工具 来 前 明 所 识别 基因 的 表达 和 功能 。 然 而 ， 这 种 方法 也 有 局 限 : OmRNA 的 丰 度 不 总 是 与 蛋白 的 丰 度 相 一 致 ， @ 现 有 的 检测 高 丰 度 mRNA 的 方法 ， 其 灵敏 性 和 动力 学 范围 不 适 于 检测 低 丰 度 的 mRNA (具有 编码 最 重要 的 调控 蛋白 的 潜力 ); 回 由 mRNA 所 编码 蛋白 活性 的 调控 并 不 取决 于 mRNA 或 蛋白 的 表达 水 平 ， 而 是 受 其 他 因素 的 调节 ， 例如 蛋白 的 亚 细 胞 定位 和 (或 ) 它们 进行 翻译 后 修饰 的 程度 ， 而 这 两 者 均 不 能 通过 mRNA 丰 度 的 测量 来 确定 。 此 外 ， 有 许多 重要 的 生物 标本 ， 特 别 是 那些 可 能 被 用 于 人 RAC Fm, WARM. WAM ALIAS A mRNA。 另 外 ， 对 人 体 活 组 织 和 己 体 解 剖 标 本 的 mRNA 表达 分 析 ， 始 终 受到 标本 采集 时 间 的 拖延 与 mRNA 降解 的 挑战 。 cDNA 阵列 的 应 用 还 有 其 他 的 局 限 。cDNA 阵列 可 被 用 于 基因 组 测序 已 完成 的 模式 概述 生物 ， 但 使 用 该 方法 构建 大 量 非 模式 生物 的 CDNA 阵列 的 可 行 性 还 存在 疑虑 。 有 一 些 生 物 ， 如 镶 状 闪 原 虫 ，cDNA 阵列 的 适用 性 还 有 待 于 确定 。 尽 管 存在 这 些 局 限 ，cDNA 阵 列 以 及 其 他 基于 DNA 序列 的 方法 在 基因 表达 和 功能 分 析 中 的 应 用 ， 即 所 谓 的 功能 基因 组 学 ， 仍 将 大 大 加 强 我 们 对 生物 体 的 了 解 (Alizadeh et al., 2000; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999). 显然 ， 应 用 基因 组 序列 数据 是 一 件 令 人 兴奋 的 事 。 然 而 ， 在 兴奋 之 余 ， 一 种 新 的 认 识 和 看 法 逐渐 产生 ， 即 这 种 以 DNA 序列 为 基础 的 方法 必须 以 直接 分 析 基 因 编 码 的 产 物 一 一 蛋白 质 作 为 补充 。 例 如 已 知 一 个 基因 组 的 序列 并 不 代表 可 以 识别 这 个 基因 组 所 编 码 的 蛋白 。 因 此 ， 尽 管 基因 组 序列 能 够 被 用 于 预测 可 读 框 ， 但 这 些 预测 通常 不 准确 。 同 样 ， 基 于 DNA 序列 数据 的 应 用 以 及 现存 的 有 关 DNA 序列 与 蛋白 质 功 能 关系 的 知识 ， 很 难 单 任 DNA 序列 信息 揭示 基因 编码 的 蛋白 质 的 功能 。 即 使 有 可 能 ， 确 定 每 个 基因 所 对 应 的 蛋白 质 的 数量 仍 是 很 困难 的 。DNA 序列 信息 也 不 能 说 明 蛋 白 质 的 翻译 后 修饰 。 一 个 蛋白 可 能 有 400 多 个 化 学 修饰 来 完成 其 功能 、 定 位 和 活性 。 因 此 ，DNA 序列 信息 在 帮助 我 们 了 解 一 个 基因 组 所 编码 的 全 部 蛋白 质 成 分 一 一 蛋白 质 组 方面 仍 有 明显 的 局 限 性 。 对 人 类 基因 组 来 说 ， 所 预测 的 50 000 一 100 000 个 基因 能 编码 多 达 250 000 ~ 500 000 个 蛋白 质 ， 因 此 所 面临 的 发 现 蛋白 质 的 工作 量 是 巨大 的 。 最 终 ， 和 蛋白 功能 的 揭示 需要 详 细 而 直接 地 分 析 基 因 组 编码 的 蛋白 质 的 表达 、 定 位 (组 织 、 细 胞 和 亚 细 胞 器 ) 和 结构 (Dove et al., 1999; Pennington et al., 1997; Wilkins et al., 1995). 由 于 蛋白 质 组 是 高 度 动 态 的 ， 因 此 很 难 对 它 进 行 定 义 。 一 方面 ， 可 以 认为 蛋白 质 组 学 是 对 基因 组 编码 的 所 有 和 蛋白质 的 鉴定 ; 另 一 方面 ， 可 以 认为 它 是 对 不 同 转录 条 件 下 蛋 和 白 表 达 变 化 的 复杂 分 析 。 在 很 多 方面 ， 基 因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 研究 的 策略 是 相同 的 ， 但 这 两 个 领域 的 研究 结果 确 有 很 大 的 差异 。 目 前 ， 还 没有 一 种 理想 的 方式 能 够 揭示 最 简单 生物 体 的 蛋白 质 组 ， 而 用 于 蛋白 质 表 达 比 较 分 析 的 方法 明显 落后 于 mRNA 表达 的 分 析 方法 。 目前 ， 许 多 研究 工作 的 起 点 是 通过 2-DE 对 复杂 混合 物 中 的 蛋白 质 进 行 分 离 来 观察 蛋 自 质 表 达 的 改变 ( 见 第 三 章 ) (Andersen and Andersen, 1996) 以 及 采用 强 有 力 的 阵列 分 析 方 法 进行 鉴定 ( 见 第 五 章 ) (Andersen et al., 1996; Eckerskorn et al., 1997; Figeys et al., 1998; Pappin et al., 1993; Roepstorff et al., 1997; Scheler et al., 1998; Yates et ol .，1998)。 近 年 来 在 蛋白 质 鉴 定 方面 的 进步 应 归功 于 基质 辅助 激光 解析 /电离 质谱 (MALDI) 和 电 喷 雾 质谱 (ESI) 分 别 应 用 于 肽 质量 指纹 谱 的 分 析 和 序列 分 析 〈( 见 第 五 章 和 七 章 ) (Andersen et al., 1996; Figeys et al., 1998; Pappin et al., 1993; Roepsrorff et al., 1997; Yates et al., 1998), 2-DE 能 同时 分 离 数 千 个 蛋白 〈(Klose 1999)， 尽 管 这 个 方法 本 身 存在 明显 的 局 限 性 〈 第 十 章 )， 但 它 在 构建 大 量 蛋白 质 的 表达 谱 并 用 于 蛋白 质 的 鉴定 方面 有 着 不 可 替代 的 作用 。 蛋 日 质 组 的 方法 已 应 用 于 后 基因 组 研究 ， 如 何 真正 达到 研究 目的 是 需要 解决 的 问 题 。 一 个 平台 技术 已 经 出 现 ， 即 2-DE， 但 它 仍 需要 不 断 的 完善 。 我 们 试图 通过 本 书 各 章 的 介绍 使 读者 对 现 有 方法 及 其 局 限 性 有 一 个 全 面 的 了 解 。 对 现 有 方法 以 及 在 蛋白 质 检 WW 〈 第 四 章 )、 图 像 分 析 〈 第 六 章 )， 定 量 质谱 (第 七 章 )，2-DE 与 蛋白 质 鉴 定 的 自动 化 (第 八 章 、 第 九 章 ) 以 及 与 信息 学 的 整合 (ALE) 方面 的 发 展 和 应 用 均 有 丰富 且 通 俗 。 4 ， 蛋白 质 组 学 易 懂 的 介绍 。 对 和 蛋白质 组 学 在 新 药 开 发 、 毒 理学 (第 十 一 章 )、 植 物 遗 传 学 〈 第 十 五 章 ) 中 的 应 用 以 及 和 蛋白质 组 学 与 糖 生物 学 (第 十 三 章 ) 也 进行 了 阐述 。 对 未 来 可 能 替代 2- DE (第 十 章 ) 的 方法 、 蛋 白质 组 平台 补充 技术 的 发 展 ， 如 鸣 菌 体 展 示 抗 体 技术 【第 十 三 章 ) 也 有 介绍 。 我 们 相信 ， 本 书 既 对 刚刚 涉足 蛋白 质 组 学 研究 领域 的 读者 会 有 所 帮助 ， 同 时 也 为 在 此 领域 已 积累 一 定 经 验 的 读者 进一步 了 解 重 白质 组 这 一 不 断 发 展 的 新 兴 领 域 提供 详细 而 有 价值 的 信息 。 为 此 ， 我 们 向 这 些 读者 表示 真挚 的 谢意 。 (万 晶 宏 译 钱 小 红 校 ) 参考 文献 Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., et al. 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Yates, J.R. (1998) Mass spectrometry and the age of the proteome. J. Mass Spectrometry 33: 1-19. Young, R.A. (2000) Biomedical discovery with DNA arrays. Cell 102: 9-15. 第 一 章 AAAS SRA MAS Dolores J. Cahill, Eckhard Nordhoff, John O’ Brien, Joachim Klose, Holger Eickhoff and Hans Lehrach i; Sls 蛋白 质 组 学 可 以 被 广泛 定义 为 生物 样本 中 和 蛋 白 的 系统 分 析 与 存档 。 这 是 一 个 最 近 两 年 才 突 显 重要 的 领域 ， 被 认为 将 对 生物 技术 产生 重要 影响 。Blackstock 和 Weir 最 近 对 此 进行 了 综述 (1999). 蛋白 质 组 学 可 视 为 分 子 生 物 学 的 大 规模 筛选 技术 ， 目 的 在 于 归 类 细胞 中 的 蛋白 的 整 体 分 布 ， 鉴 定 并 分 析 感 兴趣 的 个 别 蛋 白 ， 最 终 阐 明 它 们 的 关系 与 功能 。 由 于 基因 组 学 对 基因 的 研究 不 能 充分 预测 蛋 昌 的 结构 或 动力 学 ， 这 种 在 蛋 捍 水 平 上 的 分 析 显 得 尤为 重 要 ， 因 为 绝 大 多 数 调控 过 程 、 疾 病 的 原 发 过 程 以 及 大 多 数 药物 靶 标 均 是 发 生 在 蛋白 水 平 。 这 两 种 概念 在 互补 的 水 平 上 (蛋白质 与 基因 ) 研究 了 细胞 的 分 子 构架 ， 二 者 又 都 在 各 自 的 水 平 上 提供 了 增强 对 方 效应 的 信息 ， 二 者 存在 着 很 强 的 上 且 带 有 系统 性 的 相互 关 系 。 这 一 章 将 综述 当前 用 于 高 密度 分 析 基 因 和 蛋白 表达 的 技术 ， 以 及 我 们 如 何 运 用 这 些 技术 把 基因 组 学 与 蛋 白 质 组 学 连接 起 来 。 本 章 分 成 如 下 4 个 部 分 : (i) CDNA 表达 文库 的 产生 ， 它 们 的 机 器 化 (robotic) BI], PCRAIRWWE, HE 核 苷 酸 指纹 产生 的 非 元 余 套 (set) RHE DNA DH EM RAR. (ii) CDNA 表达 亚 套 (subset) 和 非 元 余 Unigene-Uniprotein 套 的 产生 ， 这 些 和 蛋白 在 大 肠 杆 菌 内 的 高 通 量 表达 及 高 密度 蛋 日 阵列 及 微 阵列 的 产生 。 (iii) 通过 高 分 辩 率 二 维 电泳 描述 一 个 特定 时 间 内 、 特 定 细胞 类 型 或 组 织 内 的 蛋 昌 成 分 的 特征 。 (iv) 连接 目前 的 蛋白 质 组 学 与 基因 组 学 技术 ， 利 用 质谱 技术 鉴定 经 二 维 电泳 分 离 的 天 然 蛋白 质 群 的 组 成 ， 并 且 将 它们 与 Uniprotein 套 与 亚 套 所 含 的 蛋白 相关 联 。 目前 ， 可 以 利用 序列 数据 库 内 质谱 确定 的 肽 谱 、 序 列 标记 或 个 别 蛋 白 酶 切 产物 的 碎 片 - 离 子 指纹 来 鉴定 蛋白 。 显 然 ， 这 种 技术 只 对 少数 已 知 和 蛋白 最 为 可 靠 ， 突 破 这 种 局 限 ， 我 们 提出 一 个 新 的 概念 : 通过 质谱 ， 每 一 个 蛋白 可 特异 地 认为 包含 一 小 套 结构 信 息 ， 这 里 ， 我 们 将 这 一 套 信息 称 作 最 小 蛋白 鉴定 器 (MPI)。MPI 包含 酶 切 产物 的 精确 分 子 质量 、 碎 片 - 离 子 数据 及 利用 MALDI-MS 获得 的 信息 。MPI 可 以 由 切割 的 二 维 电 泳 斑 点 和 重组 蛋白 产生 ， 可 用 于 鉴定 二 维 电泳 胶 上 的 同 源 蛋 白 〈 见 图 1.1)。 一 旦 记录 在 档 ，MPI 容许 对 已 知 和 未 知 的 基因 产物 进行 快速 识别 。 同 时 ，MPI 可 以 容许 蛋白 在 序列 数据 库 中 进行 鉴定 。 具 备 了 这 些 特 征 ，MPI 可 以 对 不 同 的 生物 样品 进行 二 维 电泳 胶 比 较 ， 而 不 依赖 于 这 些 样品 的 形式 、 分 辩 率 及 使 用 的 分 离 技术 。 这 种 技 术 使 得 更 多 蛋白 被 可 靠 地 确定 。 因 为 从 二 维 电泳 胶 点 上 测量 的 MPI 可 与 从 表达 蛋白 测 得 的 MPI 进行 比较 ， 而 不 是 与 DNA 序列 预测 的 MPI 比较 〈 见 图 1.2)。 另 外 ， 重 组 重 第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 ee a CD 图 1.1 (a) 通过 MALDI-MS 获取 MPI。 和 蛋白 被 一 种 特异 的 蛋白 酶 (RS) 裂解 ， 切 割 产 物 的 分 子 质量 可 被 确定 ， 随 后 ， 每 种 蛋白 的 较 明显 的 切割 肽 段 的 碎片 -离子 谱 被 记录 ， 从 第 一 个 波谱 提取 的 肽 质量 图 谱 提供 了 蛋白 一 级 结构 的 指纹 ， 而 碎片 -离子 峰 列 表 提 供 的 是 肽 氨基 酸 序列 的 指纹 ， 这 些 数据 被 整合 、 贮 存 成 MPI， 每 种 蛋白 一 个 MPI。(b) 建议 采用 的 通过 序列 数据 库 鉴定 蛋白 。 对 一 个 特定 的 肽 质量 图 谱 搜索 数据 库 ， 可 获得 供 候选 蛋白 序 列 的 列表 〈 如 100 条 )， 这 个 列表 再 去 搜索 可 与 记录 下 的 碎片 - 离子 指纹 匹配 的 切割 肽 段 且 排 好 序 。 由 于 第 二 轮 筛选 只 用 于 整个 数据 库 的 一 小 部 分 亚 套 ， 这 种 序列 策略 的 优点 在 于 搜索 特异 性 高 ， 搜 索 时 间 短 。 (c) 建议 的 比 较 二 维 电 泳 胶 的 策略 。 可 以 在 计算 机 上 比较 它们 的 MPI， 这 种 比 对 不 依赖 于 使 用 的 胶 形式 、 应 用 的 分 离 技术 及 随后 的 二 维 电泳 技术 。(d) 二 维 电泳 蛋白 斑点 模式 和 排 好 序 的 蛋白 微 阵 列 相 关 。 将 全 部 重组 蛋白 点 到 阵列 上 ， MPI 已 经 被 记录 并 贮存 在 一 个 数据 库 内 。 由 二 维 电泳 分 离 的 天 然 蛋白 现在 可 以 与 它们 的 重组 衍生 物 进 行 比 对 分 析 ， 通 过 已 知 的 MPI 与 数据 库 比 较 。 折 文库 提供 了 一 种 对 于 质谱 定量 稳定 同位 素 标记 的 二 维 电泳 胶 的 蛋白 非常 好 的 来 源 (如 大 肠 杆菌 生长 在 :SN 标记 的 培养 基 中 )。 这 种 技术 在 第 七 章 中 有 阑 述 。 这 种 方法 需要 产生 一 个 Unigene-Uniprotein 套 (第 3 部 分 ， 见 图 1.3)， 它 不 仅 提 供 了 产生 cDNA 微 阵列 的 永生 化 来 源 ， 并 可 通过 复杂 杂交 (第 2 部 分 ) 估计 mRNA 水 平 。 a 本 蛋白 质 组 学 此 外 ，Umniprotein 套 的 每 种 蛋 白 都 含有 储存 在 数据 库 中 的 MPI. 天 然 的 人 GAPDH 50 ° Hx ae |= 3 vo a 重组 的 GAPDH 50 & id * # * ° * * * * * # 0 1,800 2,300 2,800 m/z 图 1.2 MALDI-TOF-MS 胰 酶 解 天 然 与 重组 人 GAPDH 所 得 的 肽 图 谱 。 天 然 GAPDH 从 人 总 胎 脑 蛋白 抽 提 物 经 大 规模 2-DE 与 原 位 切割 而 分 离 得 到 。 上 半 部 分 是 $ 岂 纯化 的 过 夜 酶 切 上 清 的 图 谱 。 重 组 的 人 GAPDH 由 N 端 带 有 RGSHise 标签 的 基因 在 大 肠 杆菌 内 表达 获得 。 利 用 NTA - 配 基 固 定 的 GRAS (Qiagen, Germany) 在 变性 条 件 下 将 细胞 粗 提 物 进行 金属 鳌 合 层 析 从 而 获得 纯化 的 标记 蛋 自 。 纯 化 的 蛋 白 原 位 酶 切 。 下 半 部 分 是 从 150nl 总 酶 切 上 清 中 取 0.5 吕 进行 分 析 得 到 的 图 谱 。 标 记 的 符号 ，* 天 然 GAPDH 的 酶 切 上 清 中 检测 到 的 胰 酶 切 肽 段 。GAPDH 序列 参考 NCBI 数据 库 注 册 号 120649，1999 年 5 月 5 号 公布 。 所 有 的 肽 段 均 可 在 重组 的 GAPDH 酶 切 上 清 中 检测 到 。# 重组 GAPDH 酶 切 上 清 中 检测 到 的 特异 的 胰 酶 切 肽 段 。 oO 在 两 种 酶 切 上 清 中 均 能 检测 得 到 的 不 能 与 GAPDH 和 任何 胰 酶 自身 降解 产物 比 对 的 肽 段 。 完成 这 种 程序 不 仅 需要 已 有 技术 的 应 用 ， 如 高 效 微 阵 列 、 大 规模 蛋白 表达 及 高 分 关 率 二 维 电泳 ， 而 且 需 要 发 展 新 技术 ， 包 括 自动 化 的 二 维 电 泳 、 样 品 纯化 、 质 谱 分 析 及 封 闭环 数据 采集 与 加 工 的 软件 。 2. cDNA 表达 文库 的 制 取 、 机 器 化 阵列 、PCR RW. BRR 间 纹 非 宛 余 套 的 制备 、DNA 芯片 上 的 复杂 杂交 随 着 人 类 基因 组 计划 顺利 地 进行 ， 终 结 的 日 期 临近 ， 人 们 面临 着 如 何 理解 新 发 现 的 这 些 基 因 的 功能 。 测 定 如 此 大 而 复杂 基因 组 的 初衷 集中 在 表达 区 即 cDNA 序列 。 估 计 整 个 人 类 基因 组 的 基因 总 数 在 60 000 一 140 000 左 右 ， 人 类 基因 的 大 部 分 已 经 体现 在 现 有 的 dbEST 库 内 ， 然 而 只 有 一 小 部 分 被 揭示 出 功能 。 如 2000 年 7 月 公布 的 消息 ， 人 类 的 entries 数量 是 2 121 173 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/dbEST/index. html) (Wolfs- berg and Landsman, 1997), UniGene#=W&@4 81 967 个 复 (cluster) (www. ncbi. nlm. gov/uniGene/Hs. stats.shtml), MAA 13407 个 包含 至 少 一 个 已 知 的 基因 。 最 直接 的 解 第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 oe 基因 表达 分 析 ae i mRNA 总 蛋白 上 DNA 微 阵 列 二 维 电泳 PCR MALDI-MS Unigene-Uni protein MPI ——> MALDI-MS miz 图 1.3 建议 的 概念 , “ 桥 ” 天 然 蛋白 与 它们 的 基因 与 RNA 水 平 相 关 ， 利 用 由 质谱 确定 的 MPI 从 cDNA 文库 提取 出 的 Unigene-U- niprotein 套 不 但 可 以 通过 方便 的 PCR 扩 增 得 到 单一 基因 而 在 DNA 微 阵 列 上 进行 基因 表达 分 析 ， 而 且 可 以 通过 亲 和 层 析 获 得 相应 的 (His6) 融 合 的 蛋白 产物 。 对 纯化 的 蛋白 酶 解 ， 进 行 MALDI 分 析 。 从 细胞 或 组 织 中 提取 的 天 然 蛋白 群 可 以 分 离 ， 经 2-DE 鉴定 ， 然 后 原 位 蛋白 降解 ，MALDI-MS 测定 。 得 到 的 MPI 与 从 重组 蛋白 文库 得 到 的 MPI 比较 ， 成 和 上 万 的 生物 活性 基因 产物 因此 与 它们 的 基因 联系 起 来 。 这 种 联系 不 依赖 于 任何 序列 信息 。 决 结构 与 功能 脱节 的 方法 看 起 来 是 建立 起 组 织 的 功能 地 位 与 一 套 基因 的 表达 之 间 的 直接 相关 性 。 在 基因 表达 的 最 先 层次 即 转录 水 平 上 ， 最 能 够 直接 反映 基因 的 活性 ， 因 此 给 出 mRNA 的 表达 谱 (profile) 可 以 与 研究 基因 功能 相互 补 。 分 析 基 因 表 达 的 技术 包括 基因 表达 系列 分 析 (SAGE) (Velculescu et al., 1995), BRRRRBA (Herwig et al., 1999; Meier-Ewert et al., 1993, 1998; Poustka, 1999; Radelof et al., 1998), FW 28 探 针 进行 测序 和 杂交 (Schena et al., 1998). Ja AJ WA#E DNA 芯片 上 对 遗传 材料 进行 高 通 量 分 析 ， 研 究 基 因 表 达 和 发 现 新 的 疾病 相关 基因 。 高 密度 的 DNA 和 蛋白 阵列 是 袖 珍 的 自动 化 装置 ， 包 含 小 的 用 于 生物 实验 的 平面 。 目 前 ，DNA 芯片 可 以 通过 将 表达 分 布 图 与 在 健康 的 和 疾病 的 组 织 中 观察 到 的 表达 方式 比较 ， 来 研究 一 种 给 定 组 织 的 全 部 基 因 的 相对 表达 水 平 。 从 基因 组 和 有 蛋白质 组 的 水 平 对 一 种 组 织 与 器 官 的 表达 方式 有 全 面 的 了 解 ， 需 要 尽 可 能 快 地 平行 筛选 许多 样品 。 在 这 个 部 分 ， 在 我 们 实验 室 已 经 被 自动 化 与 小 型 化 的 步骤 可 以 完成 高 通 量 及 高 平行 杂交 。Clark 和 Eickhoff 等 最 近 对 此 作 了 综述 ， 将 在 下 面 介 绍 (Clark et al., 1999; Eickhoff, 1998). 2.1 cDNA 文库 的 构建 分 析 来 自 许 多 不 同 组 织 和 发 育 阶 段 的 大 的 cDNA SCE A] BE ELE HE EE A apron 蛋白 质 组 学 序 完 成 之 前 让 我 们 了 解 大 多 数 基 因 ， 因 为 在 转录 之 后 mRNA 总 是 在 体内 加 工 (剪接 、 编辑 )，cDNA 总 是 代表 了 决定 正确 剪接 转录 物 的 序列 和 正确 的 蛋白 产物 的 惟一 可 能 性 。 除了 鉴定 新 基因 和 它们 正确 的 前 接 产物 ， 基 于 来 自 每 条 基因 的 cDNA 克隆 的 片段 ， cDNA 库 也 在 分 析 起 始 材料 中 不 同 mRNA 的 丰 度 水 平分 析 中 起 着 重要 的 作用 。 最 近 Clark 等 综述 了 cDNA 库 的 产生 和 分 析 (Clark et wz .，1999)。 虽 然 自动 化 使 处 理 和 分 析 成 百 上 千 的 克隆 容易 了 ， 但 即使 如 此 大 的 库 也 总 不 足以 鉴定 代表 稀有 转录 物 的 所 有 克 隆 。 因 此 使 用 阵列 后 的 cDNA 库 应 能 由 其 他 的 技术 加 以 补充 ， 以 鉴定 代表 稀有 转录 物 的 基因 。 这 些 技术 包括 筛选 非常 大 、 随 机 的 平板 库 ， 通 过 cDNA 选择 或 外 显 子 捕获 和 使 用 细胞 /组 织 特异 的 库 ， 以 及 从 预测 的 外 显 子 设 计 的 引物 进行 RT-PCR 所 得 产物 的 克隆 。 先 不 管 它们 的 缺点 ， 从 一 系列 组 织 /发 育 阶段 制 取 的 足够 大 的 阵列 CDNA 文库 常常 足以 鉴定 和 分 析 有 机 体 的 大 多 数 基 因 。 2.2 大 规模 热 循 环 和 高 密度 阵列 的 构建 对 于 DNA 阵列 ，PCR 技术 得 以 很 好 的 建立 并 在 大 规模 基因 组 分 析 中 扮演 了 重要 角 色 ， 商 品 化 的 循环 设备 能 平行 处 理 达 1536 个 样本 [4x384 孔 的 微量 滴定 板 (MTP)]。 我 们 在 柏林 进行 分 子 遗 传 学 研究 的 Max-Planck 研究 所 已 经 研制 了 实验 用 的 基于 大 量 水 浴 的 热 循 环 样机 可 用 来 高 通 量 扩 增 DNA。 一 个 装 满 133Sx384 孔 MTP (51 840 个 反应 ) WEF (basket) 随 着 空气 驱动 的 x/z -滑动 期 在 三 个 设 定好 温度 的 水 浴 之 间 移 动 。 对 于 蛋白 阵列 的 产生 ， 我 们 已 克隆 cDNA 库 至 组 氨 酸 (His) 标记 的 表达 系统 ， 能 在 PVDF 膜 上 产生 大 的 蛋白 阵列 (Biissow et al., 1998; 第 2 部 分 )。 几 个 分 格 的 机 械 手 也 已 建成 ， 它 能 在 高 密度 格 上 将 克隆 、DNA、 和 蛋白 从 微量 滴定 板 上 转移 到 尼龙 膜 或 PVDF 膜 及 玻璃 片上 。 这 个 点 样 的 小 器 械 在 一 个 servo 控制 的 三 轴 的 线性 驱动 系统 下 载 有 384 钉 (pin) 的 头 ， 能 精确 定位 至 5 wm， 可 达到 近似 300 点 /em2 的 密度 ， 枪 头 的 直 径 取决 于 点 的 应 用 并 在 150 和 450um 之 间 可 变 (Lueking et al., 1999). 对 于 常规 应 用 ，27 648 个 克隆 、PCR 产物 或 蛋白 可 在 单 张 22.2cmx22.2cm 滤纸 上 点 样 为 双 份 。 可 平行 产生 多 达 15 张 滤纸 拷贝 。 这 些 点 以 $Sx5 排列 ， 它 们 每 一 个 由 主导 点 〈 通 常 在 中 心 ) 和 12 对 双 点 组 成 ( 见 图 3)。 对 于 DNA 阵列 ， 链 鱼 精 DNA 总 是 用 来 做 主导 点 ， 而 对 于 蛋白 阵列 用 墨水 ， 这 些 主导 点 和 双 点 消除 了 点 识别 的 错误 ， 也 使 得 图 像 分 析 更 容易 。 克隆 或 PCR 产物 被 分 格 至 尼龙 膜 上 的 DNA 滤 膜 ， 可 重复 使 用 至 少 20 次 而 信号 强 度 不 会 显著 丢失 。PVDF 膜 上 的 蛋白 滤 膜 阵 列 通常 只 能 用 一 次 。 在 DNA 杂交 过 程 中 湿 膜 难处 理 ， 这 样 大 大 增加 了 实验 时 间 ， 它们 也 成 为 大 规模 入 查 过 程 的 障碍 。 为 了 解决 这 一 点 ， 我 们 发 展 了 简化 处 理 高 密度 膜 的 方法 ， 使 用 坚硬 的 塑 料 薄 片 提 供 膜 的 刚性 ， 以 使 这 些 膜 更 容易 处 理 并 反 过 来 提高 了 实验 工作 的 速度 和 效率 (Bancroft et al., 1997). 我 们 通常 有 两 条 途径 点 DNA 或 蛋白 以 制 成 高 密度 阵列 (Clarke et al., 1999). — 个 方法 使 用 针头 或 尖 点 样 ， 含 DNA 片段 的 液体 通过 支持 物 传递 到 无 污染 的 钢 尖 。 第 二 种 方法 应 用 压力 喷 墨 技术 ， 例 如 cDNA 不 接触 表面 而 转移 。 我 们 已 经 应 用 了 多 头 的 压力 喷射 微 阵列 系 统 ， 它 可 以 在 一 系列 表面 构建 大 的 微 阵 列 。 由 于 用 这 个 系统 获得 的 点 的 密 度 大 于 2000 个 克隆 /cm2， 通 过 与 Perkin Elmer 合作 ， 研 制 了 一 种 基于 激光 扫描 原理 的 高 分 辩 率 检测 系统 。 作 为 对 传统 针头 点 样 的 进一步 改进 ， 一 种 称 为 按 需 点 滴 的 技术 建立 起 来 。 基 因 样 品 用 多 道 的 微 处 理 机 械 手 吸取 ， 它 与 喷 墨 式 打 印 机 的 工作 原理 一 样 ， 可 将 杂交 阵列 的 面积 减少 一 到 两 个 数量 级 。 完 整 的 图 像 分 析 程 序 决定 是 否 产生 了 一 个 合适 的 点 (drop)。 如 果 点 形成 的 不 好 ， 喷 嘴 枪 头 将 自动 被 清洗 。 一 个 整合 的 照相 机 决定 自动 处 理 的 位 置 ， 例 如 在 硅 薄 片上 填 洞 。 每 个 可 处 理 单个 或 多 点 的 头 可 容纳 100 pl。 在 处 理 器 内 部 最 近 发 展 了 基于 磁 珠 的 纯化 系统 ， 人 允许 点 样 探 针 在 处 理 之 前 的 浓缩 和 纯化 。 点 样 的 大 小 依赖 于 处 理 液 体 的 表面 可 以 在 直径 100 一 120 pm 之 间 变 化 。 阵 列 的 密度 可 提高 到 3000 点 /cm2。 这 个 微 处 理 系统 能 够 处 理 “on-the-fly” 而 且 不 超过 3 min 即 可 在 一 个 方形 上 处 理 100 x 100 个 直径 100 pm 且 每 两 个 点 中 心 之 间 的 距离 为 230 pm 的 点 。 以 这 种 密度 ， 在 载 玻 片 表面 固定 一 个 由 14 000 个 克隆 组 成 的 小 型 ADNA 文库 是 完全 可 能 的 。 由 于 玻璃 片 比 膜 更 坚固 更 容易 处 理 ， 这 便 提 高 了 自动 化 的 程度 。 另 一 个 微 处 理 技 术 的 应 用 是 在 MALDI-MS 靶 平 板 上 准备 高 密度 阵列 探 针 ， 质 谱 带 来 了 DNA 和 蛋白 分 析 中 的 高 速度 、 高 通 量 应 用 。 在 商品 化 的 MS 设备 中 ，1 s 可 分 析 一 个 样品 ， 理 论 上 每 天 可 详细 地 研究 成 百 上 千 的 样本 。 直 到 目前 ， 只 有 样机 (prototype) 问世 ， 使 用 在 一 张 1 cm? 的 MALDIMS 靶 上 固定 有 几 千 个 DNA 片段 或 蛋白 的 微 处理 阵 列 ( 见 第 4 部 分 )。 2.3 实验 室 自动 化 和 高 密度 阵列 的 新 进展 分 析 大 的 基因 库 的 第 一 步 是 从 凝 胶 平 板 上 挑 出 随机 分 布 的 克隆 并 将 这 些 克 隆 制 成 阵 列 至 微量 滴定 板 上 。 我 们 实验 室 已 发 展 了 挑 取 机 械 手 ， 它 每 小 时 挑 3500 个 克隆 。 这 些 克隆 通过 图 像 分 析 检 测 以 对 挑选 进行 定位 。 发 展 的 软件 可 以 识别 克隆 位 置 并 将 其 翻译 成 机 械 手 的 移动 信息 。 最 新 版 本 的 这 种 软件 可 识别 直径 小 至 0.5 mm 的 克隆 并 且 不 依赖 于 选择 的 算法 ， 蓝 白斑 筛选 的 精确 率 几 乎 可 达 100% 。 在 进一步 小 型 化 和 微 阵列 技术 上 也 有 了 新 的 发 展 〈(Eickhoff，1998) 。 我 们 已 描述 分 析 菊 光标 记 的 生物 分 子 如 DNA 所 用 的 全 自动 多 毛细 管 电泳 系统 的 构建 和 操作 (Behr et az .，1999)。 在 这 个 设备 中 ， 一 个 特殊 的 检测 系统 允许 同时 对 所 有 96 个 毛细 管 进行 光谱 分 析 ， 它 没有 移动 部 分 ， 但 是 自动 的 并 完全 可 与 现 有 系统 相 媲 美 。 这 个 设备 不 需要 人 工 干 预 即 可 处 理 多 达 40 个 微量 滴定 板 (96 和 384 孔 )， 这 意味 着 在 再 次 加 样 之 前 已 经 处 理 了 15 000 FHA. 为 便于 这 些 数 据 的 系统 化 产生 、 收 集 和 重 分配 ， 于 1989 年 本 系 开 始 从 一 些 不 同文 库 中 制备 分 布 滤 膜 分 格 (distribution filter grids) (Lehrach et wz .，1990)。 为 收集 产生 于 这 些 材料 的 数据 ， 建 立 了 一 个 独立 的 数据 库 ， 参 考 文库 数据 库 (Reference Library Database) (Zehetner and Lehrach, 1994), 这 个 系统 继续 发 展 成 人 类 基因 组 计划 的 资源 中 心 并 成 为 其 他 在 阵列 库 上 尝试 系统 化 生成 数据 的 模型 (如 图 像 文库 收集 ) (Lennon et &j.，1996)。 逻 辑 上 ， 下 一 步 将 对 差异 表达 的 CDNA 克隆 编码 的 蛋白 产物 研究 其 分 布 情 况 。 截 至 目前 ， 我 们 发 展 了 与 蛋白 表达 分 析 高 度 平行 的 方法 ， 包 括 在 合适 的 载体 系统 同 时 表达 较 大 数量 的 CDNA 克隆 和 蛋白 产物 的 高 速 阵 列 (Biissow et al .，1998)。 这 些 自 动 化 系统 已 被 用 来 产生 高 密度 DNA 和 蛋白 微 阵列 (Lueking et al., 1999) 并 将 在 第 3 部 分 进一步 描述 。 oe 蛋白质 组 学 2.4 文库 归 一 化 和 用 豪 核 苷 酸 指纹 产生 Unigene 套 高 等 生物 尤其 是 人 类 基因 组 序列 的 确定 ， 现 在 看 来 是 一 个 可 达到 的 目标 ， 但 仅 代 表 了 遗传 学 复杂 性 分 析 的 一 个 层次 。 生 物 学 信息 表达 谱 的 确定 代表 了 复杂 性 的 另 一 个 层 次 ， 它 对 理解 有 机 体 功 能 与 测序 一 样 重要 。 为 了 能 鉴定 这 些 基因 ， 并 计算 它们 的 丰 度 ， 每 个 cDNA 克隆 可 通过 典型 的 测序 途径 对 应 于 特定 的 基因 。 基 于 短 的 守 核 苷 酸 杂 交 的 高 RAY PS ap UE RAR OY EG FPR FRSC (oligonucleotide fingerprinting)， 已 经 发 展 起 来 用 于 cDNA 库 的 鉴定 (Herwig et al., 1999; Meier-Ewert et al., 1998; Poustka et al., 1999; Radelof et wa!.，1998)。 这 相当 于 200 TSE BFF RIK BH HY AY AE EY cDNA 4 A Fr Bd {TAR 20. GARI BRET AY AR CF) FE RY A, EER 交 谱 产生 一 个 基于 DNA FRIIS TESC, TAZA AIA DAA RR. PSE AF DNA 序列 数据 库 的 理论 上 的 指纹 之 后 ， 比 较 每 簇 的 保守 指纹 ， 可 以 鉴定 已 知 和 未 知 基因 的 cDNA。 如 果 在 守 核 苷 酸 指纹 之 前 文库 克隆 在 表达 载体 中 ， 不 仅 可 产生 一 个 Unigene 套 ， 也 可 产生 一 个 Uniprotein 套 。 2.5 通过 在 DNA 微 阵列 上 的 复杂 杂交 获得 不 同 的 差异 表达 谱 基于 产生 Unigene 套 ，PCR 产物 按 2.2 部 分 描述 以 高 密度 阵列 点 于 玻璃 片上 。 这 些 微 阵列 可 以 同时 测量 表达 水 平 ， 因 此 就 表明 所 有 呈现 在 点 阵 上 所 检测 的 任何 组 织 中 的 基 因 样 本 在 某 一 时 间 点 的 活性 水 平 。 当 来 自 于 不 同 组 织 或 发 育 阶 段 的 RNA 或 cDNA 复杂 混合 物 与 这 些 DNA 心 片 杂 交 时 ， 可 能 得 到 差异 的 基因 表达 谱 (Schena et al., 1998). 自动 化 技术 使 得 可 以 通过 分 析 复 杂 的 表达 模式 ， 高 通 量 地 监测 这 些 基 因 的 活性 。 发 展 于 高 密度 滤 膜 的 DNA 微 阵 列 现在 经 常 是 小 而 密 致 足以 称 其 为 基因 芯片 (Lennon and Lehrach, 1991; Jordan, 1998; Ramsay，1998)。 使 用 微 阵列 ， 已 获得 拟 南 芥 (Schena et al .，1995)、 酿 酒 酵母 (Cho et al., 1998; Chu et al., 1998; DeRisi et al., 1997; Shalon et al., 1996), FLA KALMAR HE (Uetz et al., 2000), AME AMMAR 如 骨髓 、 脑 、 前 列 腺 和 心脏 (Schena et al., 1996) 的 基因 表达 谱 。cDNA 微 阵列 已 被 用 来 对 诸如 类 风湿 关节 炎 和 尤文 氏 肉 瘤 等 复杂 疾病 做 分 布 分 析 (DeRisi et al., 1996; Heller et al., 1997; Trent et al., 1997; Welford et al., 1998). 在 我 们 系 进 行 的 复杂 杂交 如 下 进行 : 不 像 在 一 张 玻璃 片 进行 两 个 不 同 标 记 的 mRNA 的 杂交 ， 我 们 的 方法 是 只 用 一 种 标记 mRNA， 在 至 多 4 张 不 同 的 玻璃 片上 进行 每 种 组 织 的 表达 分 析 。 对 于 复杂 杂交 ， 若 不 超过 10 000 个 基因 ， 选 择 的 玻璃 规格 是 2.5Scmx 7.5cm。 如 必须 分 析 更 多 数量 的 基因 ， 玻 璃 片 的 选择 规格 是 8cm x 12cm， 至 多 50 000K 基因 可 被 共 价 吸 附 于 玻璃 表面 。 这 使 重复 利用 DNA 微 阵 列 至 少 5 次 成 为 可 能 。 杂 交 到 每 个 阵列 基因 的 信号 被 用 来 确定 相应 于 每 个 基因 样品 中 mRNA 的 相对 含量 。 内 对 照 包 括 用 短 的 朝 核 苷 酸 的 回复 杂交 、 在 阵列 上 使 用 持家 基因 、 在 阵列 上 使 用 拟 南 芥 对 照 克隆 以 及 用 拟 南 芥 尖 端的 组 织 RNA 探 针 。 2.6 自动 化 图 像 分 析 高 通 量 实 验 室 的 一 个 重要 特点 是 自动 化 大 规模 鉴定 文库 中 的 阳性 克隆 。 这 种 自动 化 第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 ih 分 析 系 统 的 主要 要 求 首 先是 自动 化 在 滤 膜 上 将 点 样 模 式 分 格 ， 其 次 是 确定 阳性 克隆 。 不 幸 的 是 ， 不 同 杂 交 滤 膜 显 示 不 同 的 杂交 特性 。 从 这 些 滤 膜 获 得 的 图 形 特征 受 几 个 因素 影 响 ， 存 在 的 问题 包括 由 于 不 均一 尼龙 膜 或 高 的 杂交 背景 造成 的 图 形 上 点 的 不 平均 分 布 。 虽然 人 的 判断 离 确 定 一 个 克隆 是 否 阳 性 的 最 好 方法 还 很 还， 自动 化 找 点 的 算法 在 我 们 系 已 有 发 展 。 在 当前 阶段 ， 接 近 80% 的 所 有 阳性 克隆 可 被 自动 化 获得 。 用 我 们 的 高 密度 蛋白 阵列 筛选 表达 的 His 标签 蛋白 (27 648 种 蛋白 复制 到 一 张 22.2cmx22.2cm 大 小 的 PVDF 膜 上 )，80% 的 重 阵列 (rearrayed) 表达 亚 套 的 蛋白 显示 表达 。 使 用 相同 的 机 械 手 技 术 和 相同 的 图 像 分 析 软 件 ， 我 们 能 分 析 DNA 蛋白 阵列 和 微 阵 列 ， 并 且 我 们 目前 发 展 的 这 些 系 统 可 分 析 2-DE 电泳 ， 提 供 的 高 度 平 行 的 数据 获取 和 分 析 系 统 可 提高 实验 工 作 的 速度 ， 并 可 进行 诸如 在 RNA 水 平 上 的 基因 表达 和 固定 于 蛋白 芯片 上 的 储 积 在 血清 中 的 抗体 谱 之 间 有 意义 的 比较 ， 并 可 确定 通过 2-DE 模式 所 揭示 的 相对 蛋白 含量 。 3. 蛋白 阵列 .cDNA 表达 库 制 备 , 自动 化 技术 在 重 日 阵列 和 必 片 制备 中 的 应 用 , 及 和 蛋 日 必 片 在 恒 白 质 组 学 中 的 应 用 蛋白 将 基因 组 序列 翻译 为 功能 ， 这 样 使 生物 学 过 程 成 为 可 能 。 因 此 ， 充 分 理解 在 基 因 组 和 和 蛋白 组 水 平 某 种 组 织 或 有 机 体 的 表达 谱 要 求 尽 可 能 快速 地 平行 筛选 许多 样本 。 因 为 即使 在 最 简单 有 机 体 的 自 稳 状 态 中 也 有 大 量 的 蛋 白 参与 ， 这 就 要 求 用 高 通 量 的 自动 化 方法 进行 蛋白 分 析 〈(Uetz et al., 2000). KRM cDNA 库 能 在 高 密度 滤 膜 上 筛选 蛋 日 表达 (Biissow et wz .，1998)， 高 密度 膜 可 用 于 平行 的 DNA 杂交 、 和 蛋白 表达 和 抗体 得 选 。 使 用 机 械 手 技术 〈 见 第 2 部 分 )， 人 胎 脑 cDNA 表达 库 (hExl) 被 阵列 在 微 孔 板 上 ， 且 细菌 克隆 分 格 在 PVDF 膜 上 。 原 位 表达 重组 融合 蛋 白 被 诱导 并 用 抗 含 His 标签 表 位 的 抗体 检测 。 这 个 方法 扩展 到 从 液体 表达 培养 物 中 蛋白 阵列 自动 化 点 样 ， 其 中 使 用 一 个 固定 到 平 床 点 样机 械 手 上 的 转移 标记 (Lueking et al.，1999)， 这 种 方法 显示 ， 午 白 微 阵列 提供 了 非常 敏感 的 基因 表达 和 高 通 量 抗体 特异 性 筛选 的 方法 。 使 用 这 种 直径 为 150 pm 而 不 是 450 pm 的 转移 标记 ，4800 个 样本 可 放置 于 载 玻 片 上 并 同时 筛选 ， 却 应 用 最 少量 的 介质 。 灵 敏 的 和 定位 好 的 信号 可 以 检测 250 x 10 '* mol 或 10pg 的 点 样 测试 蛋白 (GAPDH). cDNA 库 的 蛋白 表达 克隆 可 被 可 靠 地 检测 ， 表 达 不 正确 的 阅读 框 蛋白 的 假 阳 性 克隆 的 比率 可 降 到 11% 的 低 水 平 。 这 些 改进 的 蛋白 微 阵列 可 以 进行 最 敏感 的 蛋白 表达 和 抗体 特异 性 筛选 。 由 于 蛋白 微 阵列 是 在 全 基因 组 水 平 连接 基因 表达 分 析 和 分 子 结合 研究 的 最 有 力 工 具 ， 如 果 差 异 表达 的 基因 可 以 用 cDNA 微 阵 列 识别 ， 相 同 的 克隆 可 被 同时 在 不 同 的 细胞 系统 或 通过 体外 转录 /翻译 做 蛋白 表达 分 析 。 在 相同 的 蛋白 微 阵 列 上 ， 表 达 克 隆 可 被 筛选 ， 用 于 结合 其 他 蛋白 〈 如 抗体 ) 或 结合 从 核酸 到 小 分 子 配 体 的 不 同 分 子 。 这 种 多 功能 性 使 得 蛋白 微 阵 列 成 为 诊断 上 的 多 用 途 工 具 。 最 近 我 们 描述 了 它 们 作为 高 通 量 配 体 - 受 体 相互 作 用 研究 、 诊 断 及 抗体 特异 性 判定 等 有 力 工 具 的 用 途 (Walter et al., 2000). 在 这 部 分 ， 我 们 将 描述 非 宛 余 蛋白 阵列 即 所 谓 的 Uniprotein 阵列 的 产生 ， 它 们 在 基 因 组 学 和 蛋白 质 组 学 的 应 用 将 在 第 $ 部 分 描述 。 高 密度 蛋白 阵列 和 其 他 蛋白 质 组 学 技术 的 应 用 已 被 描述 为 “第 二 代 和 蛋白 质 组 学 ” (Humphery-Smith，1999)。 这 已 经 被 定义 为 ， 阵列 技术 用 于 检测 全 基因 组 的 相应 的 全 蛋白 ， 而 不 依赖 于 分 离 科 学 (如 2-DE， 质 谱 ， nn 蛋白质 组 学 柱 层 析 或 毛细 管 电泳 )， 但 更 多 应 用 更 传统 的 分 子 生物 学 技术 来 进行 整体 细胞 蛋白 分 析 。 上 述 描写 的 蛋白 阵列 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 是 有 效 的 ， 它 不 同 于 在 这 儿 描 述 的 蛋白 阵列 在 连接 基因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 方面 的 应 用 。 我 们 的 应 用 包括 针对 Unigene-Uniprotein = 编码 的 全 部 基因 产物 的 MPI 目录 的 产生 ， 和 它 在 连接 高 密度 表达 阵列 与 2-DE 实验 方面 的 用 途 。 3.1 Uniprotein 套 和 蛋白 阵列 的 产生 与 应 用 直到 最 近 ， 仍 然 不 可 能 使 用 同样 的 高 密度 阵列 和 自动 化 的 技术 来 分 析 和 蛋白 。 我 们 通 过 产生 cDNA 表达 文库 、 高 密度 蛋 日 阵列 和 微 阵列 将 自动 化 技术 应 用 到 高 通 量 和 大 规模 蛋白 分 析 中 去 (Biissow et al., 1998; Cahill et al., 1998; Lueking et wz .，1999) 。 我 们 的 方法 是 制备 由 cDNA 克隆 蛋 白 产物 用 于 进一步 的 分 析 和 使 用 ， 如 产生 蛋白 阵列 。 这 需 要 一 个 高 度 平行 的 技术 做 蛋 日 表达 分 析 ， 包 括 大 量 cDNA 克隆 在 一 个 合适 的 载体 系统 内 的 同步 表达 及 高 速度 蛋白 产物 的 排 布 ， 最 近 由 Eichhoff 等 进行 了 综述 (Eichhoff et az .， 2000)。 使 用 机 器 (Lehrach et al .，1997)， 可 把 一 个 人 胎 脑 cDNA 表达 文库 (hEx1) HF 布 在 微量 滴定 板 上 ， 或 把 菌落 网 格 转 到 PVDF 膜 上 。 诱 导 重组 融合 蛋白 的 原 位 表达 ， 用 抗 6x His 标签 的 抗体 进行 检测 。 使 用 我 们 的 方法 ， 文 库 里 的 基因 可 在 DNA 和 和 蛋白 水 平 上 同时 进行 研究 ， 同 时 提供 重组 基因 与 蛋白 以 制备 DNA 与 蛋白 芯片 。 这 种 技术 同样 可 以 通过 制 取 与 排 布 CDNA 表达 文库 、 直 接 建 立 DNA 序列 信息 与 单个 克隆 的 蛋 白 产物 之 间 的 联系 来 获得 重组 蛋白 的 大 规模 、 系 统 化 功能 研究 。 反 过 来 ， 可 以 在 整个 基因 组 水 平 上 同样 操作 (Biissow et 迟 .，1998)。 这 使 得 翻译 的 基因 产物 直接 服从 于 高 通 量 实验 需要 并 且 在 蛋白 表达 与 DNA 序列 数据 之 间 建 立 起 直接 的 联系 。 正如 第 2 部 分 所 描述 的 那样 ， 制 备 一 个 非 元 余 的 单 克隆 (Uniclone) 或 一 个 单 基 因 - 单 蛋白 对 应 组 (Unigene-Uniprotein set) 包含 这 样 一 些 过 程 : 将 已 经 克隆 到 蛋白 表达 载体 (如 Qiagen 公司 生产 的 pQe 载 体 ) 中 的 CDNA KERR RAA “ARP RBD th”, FRR SOC HES! MSE ICA AY Unigene-Uniprotein 对 应 组 [Cahill and Lehrach, 1998 (专利 )]。 这 些 蛋 白 可 以 在 大 肠 杆 菌 内 高 通 量 表达 ， 因 而 产生 一 个 高 密度 的 蛋白 质 阵列 与 微 阵 列 。Unigene 套 可 以 用 于 高 密度 DNA 阵列 的 产生 ， 然 后 是 在 DNA 微 阵列 上 使 用 复杂 杂交 、 消 减 杂交 等 进行 表达 谱 分 析 。 有 了 分 化 表达 谱 ， 就 可 以 通过 分 析 基 因 和 与 基因 网 络 以 及 表达 谱 进行 生物 学 功能 的 复杂 研究 。 全 部 Uniprotein 阵列 的 蛋白 都 可 以 高 通 量 地 得 以 表达 与 纯化 。 它 们 随后 可 以 排 布 在 一 个 MS 靶 上 ， 产 生 每 一 种 蛋白 的 MS 分 布 图 及 它 在 数据 库 中 的 储存 信息 。 同 样 可 以 应 用 2-DE 给 出 蛋白 质 组 的 分 布 图 ， 胶 上 的 蛋白 质点 被 切 下 来 ， 酶 切 ， 质 谱 鉴定 。 它 们 的 DNA 序列 可 以 按 和 常规 方法 确定 ， 即 使 对 大 的 蛋白 复合 物 也 可 以 (Neubauer et al., 1998). 这 种 技术 还 被 用 来 产生 蛋白 阵列 的 第 二 种 类 型 ， 包 含 利用 新 的 固定 到 平 床 点 样机 械 手 上 的 转移 标记 ， 对 从 液体 表达 培养 物 中 纯化 的 蛋白 微 阵 列 进行 自动 化 点 样 (Lueking et al .，1999)。 这 样 的 蛋白 微 阵 列 提供 了 一 种 用 于 高 通 量 的 、 非 常 灵敏 的 基因 表达 与 搞 体 特异 筛选 方法 ， 以 及 提供 了 抗体 鉴定 、 血 清 分 布 〈Cahill，2000)、 高 通 量 配 体 - 受 体 相 互 作 用 研究 以 及 此 处 提 到 的 蛋白 质 组 应 用 的 有 力 工 具 。 在 哺乳 动物 细胞 中 克隆 cDNA 及 表达 和 蛋白 产物 与 胞 内 蛋白 的 2-DE 模式 相 匹 配 已 经 第 一 章 “ 基因组 学 与 蛋白 质 组 学 “53 在 前 描述 。cDNA 文库 中 的 混合 克隆 在 体外 转录 /转译 表达 、 二 维 电泳 分 析 ， 将 在 第 5 部 分 中 描述 。 然 而 ， 我 们 相信 联合 蛋白 阵列 与 质谱 技术 来 产生 MPI 是 一 种 连接 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 新 方法 。 4. 通过 高 分 辨 二 维 电 泳 (2-DE) 鉴定 特定 细胞 类 型 或 组 织 在 特定 时 间 的 重 日 组 成 在 某 一 特定 组 织 或 (A) 发 育 的 某 一 阶段 中 蛋白 表达 的 功能 分 析 是 理解 生物 学 过 程 的 关键 步 又。 这些 蛋 白 一 旦 产生 ， 就 能 潜在 地 (potentially) 在 其 承担 细胞 活动 的 功能 之 前 ， 执 行 翻译 后 修饰 。 这 些 修饰 可 能 是 因为 加 了 其 他 分 子 〈 如 磷酸 化 、 糖 基 化 )、 蛋 白 加 工 和 蛋白 分 解 切割 。 由 于 任何 一 个 蛋白 的 结构 修饰 和 任何 量 的 改变 不 都 是 由 相同 的 基因 控制 ， 各 种 蛋白 的 活性 形式 和 不 能 参照 任何 单一 基因 确定 。 因 此 ， 即 使 所 有 基因 组 中 的 基因 已 经 测序 并 翻译 成 蛋白 质 ， 识 别 和 鉴定 在 某 种 条 件 的 特殊 细胞 类 型 中 每 种 蛋白 的 不 同 功能 形式 仍 是 一 个 主要 任务 。 和 蛋白 结构 或 量 的 变化 能 导致 疾病 。 为 了 阐明 疾病 机 制 ， 就 必须 理解 不 同 蛋白 如 何 表达 及 在 特殊 生物 学 背景 下 如 何 发 挥 功能 。 通 过 确定 并 比 较 出 现在 疾病 组 织 和 相应 正常 组 织 的 蛋白 ， 就 可 以 鉴定 与 特殊 疾病 相关 的 特异 蛋白 。 这 些 疾病 特异 蛋白 具有 作为 疾病 标记 或 作为 药物 靶 分 子 的 商业 潜力 。 它 们 的 相应 基因 序列 可 能 在 筛选 易 感 性 方面 具有 重要 价值 。 研 究 和 发 掘 药物 的 主要 前 沿 就 是 研究 和 分 析 和 蛋白 质 组 ， 因 为 使 用 这 种 方法 ， 可 能 鉴定 与 特殊 疾病 相关 的 特异 恒 白 。 4.1 蛋白 质 组 学 与 基因 组 学 蛋白 质 组 学 分 析 一 种 基因 组 或 一 个 细胞 或 组 织 类 型 所 有 蛋白 的 表达 (Wilkins et al.，1996)， 最 近 有 这 方面 的 综述 (Blackstock and Weir，1999)。 由 于 同一 时 间 特 定 的 细胞 、 组 织 或 有 机 体 中 并 非 所 有 的 蛋白 都 表达 ， 因 此 和 蛋白质 组 是 动态 的 。 和 蛋白 质 组 学 这 个 词 来 源 于 蛋白 质 组 ， 蛋 白质 组 与 同类 术语 基因 组 相 一 致 ， 由 澳大利亚 悉尼 Macquarie 大 学 的 Marc Wilkins 和 Keith Williams 于 1994 年 提出 。 和 蛋白 质 组 的 名 称 由 Wasinger 等 于 1995 年 第 一 次 在 出 版 物 中 使 用 ， 他 将 之 定义 为 “一 种 基因 组 的 全 部 蛋白 ”。 相 类 似 的 有 关 和 蛋白 质 组 的 定义 如 “由 基因 组 编码 的 一 整套 蛋白 质 ” 可 能 在 文献 中 更 经 常 看 到 。 然 而 ， 从 严格 的 意义 上 讲 ， 那 些 定 义 蛋 白质 组 为 基因 组 的 蛋白 编码 物 的 所 有 定义 都 不 确 切 ， 因 为 基因 组 不 能 明确 地 编码 有 机 体 中 蛋白 的 整体 结构 和 多 样 性 。 这 一 点 同样 存在 于 其 他 的 有 关 有 蛋白质 组 的 概念 中 ， 例 如 ， 有 机 体 的 整套 蛋白 质 ， 同 样 没 有 给 出 有 机 体 的 DNA 和 和 蛋白 分 布 之 间 简 单 的 线性 关系 。 基因 组 在 几乎 所 有 的 细胞 中 都 是 完整 的 ， 与 之 不 同 ， 蛋 白质 组 具有 很 高 的 细胞 特异 性 : 一 个 有 机 体 的 不 同 细胞 表达 它 的 全 蛋白 的 不 同 亚 套 。 同 时 ， 基 因 组 储存 了 稳定 的 信 息 ， 其 成 分 不 随时 间 变 化 ， 而 蛋白 质 组 是 高 度 动态 的 ， 根 据 细 胞 的 发 育 和 生理 状态 蛋白 表达 的 亚 套 一 刻 不 停 地 变化 。 再 强调 一 下 ， 以 此 类 推 功能 基因 组 学 的 概念 也 是 很 中 肯 的 ， 因 为 功能 基因 组 学 研究 mRNA， 它 像 蛋 白质 一 样 ， 是 细胞 类 型 和 细胞 状态 特异 的 ， 并 且 是 动态 表达 的 。 蛋 白质 组 动态 的 和 细胞 类 型 特异 的 特点 提出 了 系统 分 析 的 主要 挑 战 ， 要 完全 记录 多 细胞 有 机 体 的 蛋白 质 组 ， 就 必须 记录 每 种 细胞 类 型 在 它 可 能 的 生理 状 态 和 发 育 阶段 的 蛋白 分 布 图 。 - 16 . .有 蛋白质 组 学 4.2 二 维 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (2-DE) 复杂 蛋白 质 组 的 鉴定 要 求 分 离 和 检测 成 百 上 千 的 不 同 的 蛋白 种 类 。 这 个 方法 的 目标 是 基于 功能 参数 的 广 谱 的 许多 蛋白 的 鉴定 。 包 括 这 些 和 蛋白 要 正确 地 出 现在 不 同 机 体 、 不 同 胚层 、 出 生 后 和 成 年 阶段 (包括 老年 阶段 ) 、 在 不 同 的 细胞 部 位 和 细胞 的 细胞 器 〈 核 、 线粒体 ) 以 及 在 不 同 的 性 别 中 (Bowden et al., 1996; Dean et al., 1998; Romer et al., 1997)。 通 过 分 析 共 翻译 和 翻译 后 修饰 (如 糖 基 化 蛋白 、 磷 酸化 蛋白 )， 也 需要 单个 蛋白 生化 特征 的 确定 (Janke et wz.，1996)。 蛋 白质 组 分 析 是 通过 高 分 辩 率 的 二 维 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (z2-DE)、 分 析 与 比较 得 到 斑点 的 模式 、 结 合 原 位 蛋白 水 解 和 质谱 技术 鉴 定 候选 蛋白 来 进行 (Gauss et al., 1999; Jungblut et wz .，1998)。 所 需 的 高 分 辨 率 由 大 胶 的 2-DE 技术 产生 ， 它 能 在 一 块 腕 上 显示 多 于 10 000 个 蛋 自 点 〈(Klose and Kobalz, 1995; Klose，1999)。 这 个 技术 基于 最 初 的 2-DE 技术 (Klose, 1975; O’ Farrell, 1975), 并 在 目前 现 有 的 文献 报道 2-DE 技术 中 仍然 显示 了 最 高 的 分 辨 率 。 对 于 样品 制备 ， 一 个 详细 的 高 度 标 准 化 的 操作 手册 已 经 建立 〈(Klose，1999)， 这 个 操作 方法 避免 了 蛋 自 类 种 的 特殊 组 的 任何 丢失 。 根 据 这 个 操作 手册 ， 某 一 特定 组 织 的 蛋白 提取 物 分 成 三 个 部 分 (细胞 质 、 质 膜 、 染 色 质 )， 这 三 个 部 分 的 2-DE 模式 呈现 了 这 个 组 织 (10 000~15 000 个 不 同 的 蛋白 点 ) 的 绝 大 部 分 。 为 了 检测 低 浓度 蛋白 要 加 上 来 自 纯化 的 细胞 器 的 2-DE 模式 并 且 可 能 显示 一 千 或 两 千 个 蛋白 点 以 补充 以 上 三 个 基本 组 合 。 KA 2-DE 模式 的 蛋白 点 从 胶 中 切 下 ， 酶 消化 并 且 用 质谱 分 析 消 化 的 肽 。 每 一 个 点 将 根据 惟一 的 MPI ( 见 图 1.3) 被 特征 化 ; MPI 将 被 储存 在 数据 库 中 。 为 了 将 几 千 个 单 一 蛋白 按照 提 到 的 标准 特征 化 ， 蛋 白 的 不 同 生 物 和 生化 类 型 依据 2-DE 点 的 出 现 与 和 否 而 被 匹配 及 消减 ， 并 且 依 据 蛋白 不 同 的 表达 水 平 ， 一 个 蛋白 可 以 显示 在 不 同 的 组 织 中 。 对 2-DE 模式 的 评估 是 通过 激光 扫描 及 软件 辅助 的 斑点 识别 和 特征 化 进行 (OLA). A 用 高 度 灵敏 的 银 染 技术 进行 蛋白 模式 的 出 现 /缺失 分 析 。 对 于 定量 分 析 ， 可 以 应 用 考 马 斯 亮 蓝 或 新 近 发 展 的 荧光 染色 技术 〈 见 第 四 章 )。 为 检测 翻译 后 修饰 ， 可 用 糖 基 染色 和 Be, DAA iA OL PAA: 四 使 用 来 自 标 准 蛋白 类 型 模式 的 2-DE 图 像 ( 见 4.3 部 分 ); OA MPI 数据 库 ， 它 可 不 依赖 于 胶 模 式 而 进行 蛋白 匹配 。 在 每 个 2-DE 模式 中 ， 蛋 白 点 的 MPI 数据 也 使 检测 容易 ， 它 代表 了 同一 蛋白 的 修饰 情况 。 每 个 2-DE 模式 中 包括 所 有 未 知 蛋白 在 内 的 尽 可 能 多 的 蛋白 点 ， 可 能 通过 使 用 质谱 MPI、 2-DE 的 计算 机 模式 得 以 特征 化 ， 来 自 同 一 模式 的 MPI 数据 是 独立 匹配 和 消减 的 。 通 过 这 种 方法 ， 几 千 种 蛋白 根据 生物 和 生化 参数 得 以 鉴定 。 必须 结合 这 些 数据 和 基因 表达 谱 (第 2 部 分 ) 来 充分 说 明 在 某 一 特殊 细胞 或 组 织 在 正常 、 疾 病 和 激活 (如 药物 处 理 ) 条 件 下 发 生 的 事件 。 这 些 信息 可 通过 比较 测量 的 MPI 和 那些 相应 的 来 自 蛋 白 表达 库 的 数据 ， 与 来 自 同 一 组 织 的 mRNA 表达 谱 (第 2 部 分 ) 相 联系 。 在 MPI 数据 的 基础 上 我 们 可 以 联系 起 2-DE 模式 中 的 各 自 的 蛋白 种 类 与 蛋 白 表 达 阵 列 的 同 源 蛋白 ， 并 且 这 种 方法 可 联系 起 相应 的 EDNA。 结 果 ， 基 因 开 始 与 它们 的 蛋白 相 联系 ， 那 是 功能 特征 化 的 。 然 而 ， 已 经 知道 基因 组 学 、 功 能 基因 组 学 和 蛋白质 组 学 的 结果 之 间 的 相关 性 较 低 (Anderson and Seihamer，1997)。 我 们 认为 此 处 描述 的 方 法 使 用 MPI 可 以 为 蛋白 质 组 学 和 基因 组 学 架 起 桥梁 ， 也 对 解释 和 分 析 那 些 巨 大 的 数据 第 一 章 “基因组 学 与 蛋白 质 组 学 sie 库 和 高 通 量 方法 有 用 。 然而 还 有 一 个 基本 的 问题 ， 即 检测 作用 于 蛋白 调控 和 修饰 的 基因 。 基 因 组 学 针对 此 问题 的 方法 是 基于 出 现在 蛋白 表 型 的 结构 和 量 的 多 态 性 ， 开 展 遗 传 学 连锁 研究 (Breen et al., 1994; Klose, 1999; Klose et wz .， 稿 件 正 在 准备 ; Nock et al., 1999), HRAA 之 间 相 互 作用 的 方法 如 酵母 双 杂 交 系 统 (Wanker et al., 1997) 也 可 发 现 除了 编码 蛋白 的 结构 基因 外 ， 相 关 的 其 他 基因 。 4.3 联合 的 2-DE 数据 库 在 最 近 几 年 ， 联 合 2-DE 数据 库 已 经 建立 ， 使 得 世界 范围 的 实验 室 共 享 2-DE 数据 。 然而 实际 上 ， 在 不 同 的 实验 室 匹 配 2-DE 模式 证 明 很 困难 甚至 不 可 能 ， 因 为 使 用 的 技术 不 同 [载体 两 性 电解 质 、 固 相 pH 梯度 (IPG)、 胶 形式 、 染 色 过 程 和 样品 制备 ]。 然 而 将 来 这 个 问题 将 由 于 更 广泛 的 使 用 不 同 的 质谱 技术 得 到 解决 ， 使 得 各 实验 室 在 MS 数据 水 平 而 不 是 2-DE 图 式 的 匹配 比较 结果 。 尤 其 是 MPI 数据 库 将 成 为 转换 来 自 2-DE 模式 数据 的 平台 〈 见 图 1.1)。 结 果 ， 标 准 化 世界 范围 的 实验 室 使 用 的 2-DE 技术 将 不 再 是 共 享 数据 的 要 求 。 4.4 2-DE 分 析 自 动 化 在 不 和 久 的 将 来 每 个 实验 室 每 天 将 可 能 分 析 成 百 的 蛋白 点 ， 或 者 为 了 分 析 整 块 的 胶 ， 要 将 完整 的 2-DE 胶 分 隔 成 小 片 。 这 个 发 展 迫 切 要 求 2-DE 自动 化 。Pharmacia 在 某 种 范 围 上 简化 了 固定 化 电解 质 技 术 ， 但 它 离 自动 化 还 很 远 。 而 且 ， 我 们 发 现 固定 化 电解 质 胶 不 能 达到 解决 复杂 和 蛋白质 组 所 必须 的 高 分 辨 率 水 平 。 另 一 个 感 兴趣 的 焦点 是 在 蛋 白 质 组 分 析 中 改进 高 通 量 技术 ， 例 如 发 展 从 2-DE BIR 别 和 切取 蛋白 点 的 自动 化 机 械 手 、 酶 消化 和 将 消化 好 的 2-DE 胶 的 点 转移 至 用 于 MS 分 析 和 产生 MPI ARSE 〈 见 第 八 章 和 第 九 章 )。 5. 用 质谱 连接 当前 和 恒 晶 质 组 学 和 基因 组 学 的 方法 我 们 的 策略 旨 在 连接 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 。 可 以 总 结 如 下 : 产生 一 套 Unigene, 每 个 代表 惟一 的 基因 。 作 为 重组 蛋白 表达 ， 它 的 MPI 可 用 质谱 决定 。 另 一 方面 ， 相 应 于 Unigene 套 的 来 自 于 2-DE 模式 的 蛋白 被 MPI 特征 化 。 这 提供 了 由 2-DE 特征 化 蛋白 与 其 相应 mRNA 和 基因 (cDNA) 联系 的 桥梁 。 所 有 2-DE 胶 收 集 的 MPI 将 在 计算 机 上 和 获得 于 重组 蛋白 库 的 MPI 比较 ， 反 之 也 可 。 因 此 ， 成 百 上 千 的 具 生 物 活性 的 基因 产 物 与 它们 的 基因 相 联系 。 这 种 联系 不 依赖 于 任何 序列 信息 并 因此 也 吸引 了 其 他 有 机 体 的 功能 蛋白 质 组 分 析 。 我 们 的 策略 与 现存 策略 相 比 另 一 个 优点 是 蛋白 识别 更 可 靠 ， 因 为 是 质谱 数据 与 质谱 数据 相 比 ， 而 不 是 与 从 DNA 或 蛋白 序列 预测 的 数据 相 比 。 后 一 方法 的 、 主要 缺陷 是 没有 考虑 依赖 于 底 物 的 蛋白 酶 行为 、 肽 的 溶解 性 和 质谱 分 析 信 和 号 抑制 。 正如 已 经 描述 的 ，MPI 包括 酶 切 产 物 的 精确 分 子 质 量 和 离子 碎片 数据 。 将 被 用 于 从 预测 的 蛋白 或 实验 记录 的 MPI 数据 库 鉴 定 蛋白 。 后 者 由 两 个 主要 目录 组 成 : OF 2-DE 分 离 的 体内 表达 和 蛋白; OHA cDNA, AA DNA 表达 产物 。 为 达到 广泛 应 用 ， 将 产生 一 个 Unigene 套 ， 最 初 是 人 类 基因 ， 每 个 成 员 代 表 惟 一 的 和 84 RAR 基因 〈 见 第 2 部 分 )， 这 些 基因 可 表达 为 重组 蛋白 〈 见 第 3 部 分 )， 它 们 的 MPI 将 被 确 定 并 存储 于 中 心 数据 库 。 我 们 预测 这 将 建立 起 一 个 新 的 桥 粱 ， 即 将 天 然 蛋 白 群 体 〈 和 蛋白 RA) 与 mRNA 池 (转录 组 ) 和 它们 隐伏 的 基因 (基因 组 ) 之 间 直 接 联系 。 6. 前 景 和 发 展 6.1 基因 组 学 随 着 生物 技术 微型 化 进程 的 发 展 ， 必 须发 展 新 的 硬件 工具 。 所 有 微型 杂交 方法 必须 的 处 理 步 又 ， 尤 其 是 现存 的 检测 系统 ， 也 要 求 加 以 改进 。 越 小 的 斑点 尺寸 导致 所 需要 的 i 探 针 和 样品 的 数量 的 减少 ， 同 样 也 隐 含 着 : 随 着 空间 分 辩 率 的 增加 ， 需 要 发 展 更 灵 敏 的 检测 系统 。 然 而 在 过 去 ， 放 射 性 标记 的 方法 是 占 主 导 地 位 的 生物 技术 ， 检 测 方法 的 下 一 代 将 基于 光学 的 原理 ， 因 为 用 ?”P、353P 或 :5S 标 记 的 化 合 物 在 放射 自 显影 时 显 出 弥散 的 信号 ， 并 且 发 射 的 射线 释放 (delivered) 大 于 360"。 由 于 这 个 限制 ， 光 学 方法 例如 针 对 大 面积 (22.2cmx22.2cm) 激光 扫描 设备 或 其 他 的 显 微 方 法 ， 包 括 对 于 面积 小 至 几 个 mm? 的 共聚 焦 激 光 扫 描 显 微 镜 ， 都 是 不 远 的 将 来 可 以 选择 的 方法 。 6.2 蛋白 组 学 为 了 获得 通 量 化 ， 每 天 必须 记录 几 千 个 MPI。 为 此 ， 急 需 发 展 一 个 裂解 平行 出 现 在 凝 胶 基 质 (gel matrix) 或 结合 至 颗粒 (重组 融合 蛋白 亲 合 纯化 ) 的 多 种 蛋白 的 完全 自动 化 工作 站 。 这 个 工作 站 应 包括 样品 清洗 、 少 缩 和 随后 的 质谱 样品 准备 。 而 且 ， 质 谱 设备 要 求 每 天 能 产生 几 和 干 个 MPI。 就 通 量化 和 全 部 耗费 而 言 ， MALDI-TOF-MS 是 目前 可 选择 的 质谱 技术 。 另 外 ， 新 的 质谱 方法 将 需要 探索 高 的 产品 输出 ， 包 括 改进 的 PSD 分 析 工 具 及 用 于 离子 捕获 的 MALDI。 然 而 有 一 些 滞后 可 能 限制 MALDI-MS 在 蛋 自 质 组 和 基因 组 计划 中 的 应 用 。 最 引 人 注 目的 是 盐 和 去 污 剂 。 例 如 来 自 SDS-PAGE 电泳 的 SDS 或 染色 试剂 ， 大 大 增加 了 在 测试 过 程 中 的 背景 。 因 此 这 就 要 求 进 行 质谱 之 前 样品 的 清洗 (参阅 第 九 章 )。 6.3 尚 需 发 展 之 处 这 种 方法 的 成 功 需 要 进一步 发 展 一 些 技术 ， 包 括 : (1) 能 够 大 规模 亚 克 隆 cDNA 的 新 方法 ， 同 时 可 修饰 带 标签 的 表达 载体 ， 例 如 开发 和 改进 用 于 提高 在 酿酒 酵母 (S. cerevisiae) 和 裂 殖 酵母 (S. pombe) 中 表达 和 分 沁 的 载体 系统 ， 以 及 用 于 解决 在 E. coli 中 不 容易 表达 的 蛋白 表达 的 载体 系统 (Lueking et al., 2000). (2) 一 个 全 自动 的 用 于 纯化 His- 标 记 的 蛋白 的 工作 站 (40 BioRobot 8000, Qiagen). (3) 2-DE 过 程 及 2-DE 的 学 术 与 工业 研究 中 更 自动 化 的 发 展 ， 作 为 蛋白 组 学 的 中 心 技术 要 求 简化 的 大 规模 2-DE 与 技术 改进 、 集 中 解决 三 个 问题 的 自动 化 仪器 ， 在 长 毛细 管 和 大 的 胶 装 置 中 灌 制 菏 胶 。 其 他 的 关键 问题 包括 : 灌 制 胶 、 清 洗 试管 和 玻璃 板 、 应 用 于 等 电 聚 焦 (IEF) 电泳 的 样品 制备 、 转 IEF 胶 到 SDS 胶 。 包 括 发 展 从 2-DE 胶 取 点 的 机 械 手 ， 它 能 从 2-DE 胶 —_— 第 一 章 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 in 上 自动 切取 成 百 上 千 的 蛋白 点 。 在 研究 分 子 遗 传 学 的 Max-Planck 研究 所 ， 已 经 研制 了 一 个 可 进行 8 个 管 穿 孔 的 胶 取 点 设备 ， 但 需要 进一步 改进 (RRMA) 及 适用 于 20cm X 30cm 胶 的 机 械 手 系统 。 7. Mot JULY 一 口 来 自 2-DE 的 MPI 与 重组 蛋白 库 的 MPI 的 记录 的 对 比 直 接连 系 了 Unigene-Unipro- tein 库 与 所 有 观察 到 的 基因 产物 ， 反 之 亦 然 。 而 且 ， 蛋 白 鉴 定 更 为 可 靠 ， 因 为 来 自 2-DE 电泳 的 测试 与 来 自 表 达 蛋 白 MPI 的 测试 对 比 ， 代 替 了 DNA 序列 预测 MPI ( 酶 切 产 物 结 合 离子 片段 的 结果 )。 优 势 在 于 这 种 联系 独立 于 任何 序列 信息 ， 因 此 也 吸引 了 其 他 有 机 体 的 功能 蛋白 组 分 析 ， 尤 其 是 那些 还 未 测序 的 生物 。 一 有 旦 被 记录 ，MPI 可 以 用 于 迅速 地 识别 已 知 的 和 未 知 的 基因 产物 。 同 时 利用 MPI 可 以 在 序列 数据 库 中 鉴定 蛋白 。 有 了 这 些 特点 ，MPI 能 够 保存 下 不 同 生 物 样 品 2-DE 电泳 的 比较 结果 ， 而 不 依赖 于 它们 的 形 式 、 分 辨 率 和 应 用 的 分 离 技术 。 来 自 2-DE 的 MPI 与 重组 蛋白 库 记 录 的 MPI 之 间 的 对 比 直接 连 系 了 Unigene-Uniprotein 库 与 所 有 观察 到 的 基因 产物 ， 反 之 亦 然 。 因 此 将 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 连接 起 来 。 此 外 ， 直 接 进入 相应 的 重组 蛋白 表达 文库 打开 了 一 条 从 2-DE 凝 胶 进 行 蛋白 质谱 鉴定 的 完美 的 途径 。 稳 定 同位 素 标记 (如 E.coli 细胞 在 <“N 培 养 基 中 生长 ) 是 这 种 方法 的 关键 ， 第 八 章 将 有 描述 。 3 (KA TR 译 WW iaw 1h) 参考 文献 Anderson, L. and Seilhamer, J. (1997) A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis 18: 533-537. Aparicio, S.A.J.R. 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Trower 1. 绪论 信使 RNA (messenger RNA, mRNA) —ial 20 世纪 60 年 代 初 期 产生 的 ， 用 来 描 述 一 类 特定 的 细胞 RNA， 它 们 作为 运送 者 ， 将 遗传 信息 从 细胞 核 送 至 细胞 质 的 蛋白 质 amd (RK) 内 ， 在 此 被 翻译 成 蛋白 质 。 长 期 以 来 ， 一 直 认 为 mRNA 在 决定 细胞 产生 的 蛋白 质 的 种 类 和 数量 过 程 中 起 关键 作用 (OLA 2.1)。 事 实 上 ， 不 同 种 类 细胞 中 蛋 2.1 遗传 信息 从 细胞 核 内 的 DNA 传送 到 蛋白 质 合成 的 过 程 。 细胞 质 中 可 以 被 翻译 的 mRNA 决定 了 那些 可 以 在 任何 指定 时 间 由 细胞 及 时 “生产 ”出 来 的 蛋白 质 的 状态 。 此 mRNA 池 的 特性 是 由 特定 的 细胞 生命 过 程 的 效率 决定 的 〈1 一 5)。 - 24 - - 蛋白质 组 学 白质 的 差别 反映 了 细胞 生长 发 育 过 程 中 表达 的 mRNA 的 种 类 和 数量 ( 丰 度 ) 的 差别 。 核酸 杂交 动力 学 研究 提示 了 这 一 点 ， 研 究 发 现 cDNA (与 mRNA 互补 的 DNA 拷贝 ) 与 同一 组 织 来 源 的 EDNA 的 复 性 速度 远 快 于 与 不 同 组 织 来 源 的 CDNA 的 复 性 速度 (Hastie and Bishop，1976) 。 一 且 认 识 到 不 同 组 织 / 细 胞 类 型 的 mRNA 群体 差异 ， 那 么 确定 这 种 差异 到 底 是 什么 就 变 得 重要 了 。 因 此 很 明显 ， 我 们 需要 能 对 生物 样品 中 特定 种 类 的 owndsnSugmtevkaweman 选择 性 (如 Northern 杂交 ) 而 简单 易 行 。 应 用 这 种 一 个 一 个 基因 的 分 析 方 法 发 现 ， 些 转录 物 在 特定 的 组 织 中 高 丰 度 表达 而 在 其 他 组 织 中 不 表达 ， 某 些 基 因 在 许多 、 甚 至 所 有 的 组 织 中 的 表达 量 都 相对 恒定 。 作 为 Northern 杂交 的 补充 ， 后 来 发 展 了 其 他 一 些 mRNA 定量 方法 ， 比 如 核糖 核酸 酶 保护 法 、 定 量 反 转录 酶 PCR (RT-PCR)。 然 而 ， 每 种 方法 都 局 限 在 只 能 针对 相对 少数 的 基因 。 最 近 5 年 中 技术 的 进步 产生 了 一 些 能 在 基因 组 水 平 (大 量 ) 定量 分 析 mRNA 的 方法 ， 与 过 去 一 次 分 析 一 个 基因 相 比 ， 它 们 能 同时 分 析 成 百 上 千 个 基因 。 发 展 这 些 技术 的 初衷 是 希望 能 洞察 生物 学 变化 的 根本 原因 一 一 基 因 组 水 平 的 整体 行为 〈 一 个 典型 的 哺乳 动物 细胞 大 约 表达 15 000 个 不 同 的 mRNA). & 种 高 通 量 mRNA 定量 技术 的 发 展 得 益 于 PCR、 大 规模 cDNA 文库 测序 和 核酸 从 头 合成 等 技术 方法 的 进步 。 差 异 显 示 PCR (DD-PCR)、 基 因 表 达 系 列 分 析 (serial analysis of gene expression, SAGE) 和 DNA 阵列 杂交 等 方法 在 检测 灵敏 度 和 凭借 RNA 量 来 检测 基 因数 等 方面 比 Northern 杂交 具有 明显 的 优势 。 本 章 将 讨论 这 些 方法 的 细节 、 它 们 之 间 相对 的 优 缺 点 。 需要 指出 的 是 ， 目 前 所 有 mRNA 定量 技术 都 只 提供 了 实验 性 的 、 而 非 稳定 状态 下 mRNA 绝对 量 的 信息 ; 不 过 这 对 于 检测 mRNA 表达 水 平 的 变化 来 说 ， 已 经 足够 了 。 在 关于 蛋白 质 组 学 的 论著 中 需要 指出 的 是 ， 检 测 两 个 生物 样品 中 特定 mRNA 表达 丰 度 的 差异 并 不 一 定 决定 于 对 应 的 蛋白 质 的 量 的 差异 。 早 在 20 世纪 60 年 代 ， 人 们 已 经 认识 到 原核 生物 中 几乎 所 有 的 基因 表达 调控 都 发 生 在 转录 水 平 。 尽 管 对 于 真 核 生 物 而 言 ， 通 常情 况 下 伴随 着 mRNA 的 增加 (或 减少 )， 其 编码 的 蛋白 质 也 相应 地 增加 〈 或 减 少 )， 但 是 蛋白 质 改变 的 程度 和 动力 学 常常 是 不 可 预见 的 。 因 此 当 研 究 对 象 是 真 核 生物 时 就 需要 精心 明 辨 ， 不 能 仅仅 以 mRNA 的 数据 为 基础 就 得 出 蛋白 质 水 平 的 结论 。 蛋 息 质 水 平 的 变化 需要 通过 酶 联 免疫 吸附 、Western 杂交 或 蛋白 质 组 学 研究 来 确证 。 2. DNA 阵列 杂交 判定 mRNA 水 平 最 常用 的 方法 是 将 标记 的 核酸 〈 代 表 一 种 mRNA 样品 ) SAREE 相 支持 物 上 的 CDNA 或 寡 核 苷 酸 序列 进行 杂交 。 杂 交 后 每 个 点 的 标记 强度 就 代表 了 特定 序列 的 表达 水 平 。 用 不 同 来 源 的 mRNA 所 制备 的 探 针 与 相同 的 阵列 进行 杂交 后 可 以 比 较 对 应 点 的 杂交 信号 强度 。 这 就 是 检测 某 个 点 的 DNA 序列 (GER) 特异 性 的 mRNA 的 表达 差异 的 方法 。 通 过 比较 两 个 阵列 所 有 对 应 点 的 杂交 信和 号 强度 ， 就 可 以 同时 监测 数 千 个 基因 表达 的 改变 。 用 两 种 可 识别 的 不 同 的 标记 来 标记 需要 研究 的 两 组 mRNA， 就 能 在 同一 个 阵列 上 同时 进行 杂交 ( 见 本 书 彩 插图 2.2); 比较 每 个 点 两 种 信和 号 的 强度 便 是 差 异 杂 交 法 。 阵 列 上 序列 的 覆盖 范围 限制 了 这 些 方法 的 使 用 ， 这 样 如 果 一 个 特定 的 基因 没 有 对 应 序列 来 代表 ， 那 么 显然 它 就 不 可 能 被 检测 到 。 所 以 制作 阵列 时 选择 何 种 DNA 对 第 二 章 “基因 表达 的 检测 方法 sila 于 任何 研究 工作 都 是 至 关 重 要 的 。 这 种 基于 阵列 的 mRNA 定量 方法 称 作 “ 封 闭 体系 ”。 使 用 DNA 阵列 检测 mRNA 丰 度 非常 类 似 于 同时 进行 多 个 闭 向 Northern 杂交 。 Northern 杂交 将 RNA 固定 于 支持 物 上 ， 然 后 与 基因 特异 性 的 被 标记 的 DNA 进行 杂交 ， 而 DNA 阵列 法 是 将 基因 特异 性 的 DNA 固定 在 支持 物 上 ， 然 后 与 来 源 于 RNA 的 被 标记 探 针 杂交 。 阵 列 技术 的 优势 来 源 于 这 样 一 个 事实 ， 即 数 千 个 基因 (点 状 印记 ) 能 同时 检 测 。 具 有 代表 性 的 是 ， 这 数 千 个 基因 是 以 高 密度 自动 化 地 印记 到 尼龙 膜 或 玻璃 片上 的 。 目前 ， 玻 璃 片上 能 实现 的 点 密度 更 高 ， 从 而 在 不 牺牲 检测 灵敏 度 的 前 提 下 ， 增 加 检测 基 因 的 数量 。DNA 阵列 按照 用 以 构建 阵列 的 DNA 的 化 学 本 质 可 分 为 变性 的 PCR 产物 ( 源 自 cDNA 文库 ) 得 核 苷 酸 两 类 。 所 以 构建 阵列 需要 cDNA 克隆 或 序列 信息 〈 用 以 设计 有 代表 性 的 窒 核 苷 酸 )。 因 此 阵列 的 设计 受到 我 们 现 有 的 关于 构成 某 个 物种 基因 组 的 基因 知识 的 限制 〈 杂 交 按 照 物 种 特异 的 方法 进行 )。 对 于 那些 整个 基因 组 都 已 完成 序 列 测定 的 物种 ， 比 如 酵母 、 大 肠 杆菌 、 结 核 杆菌 〈 完 成 序列 测定 的 基因 组 列表 见 基因 与 基因 组 京都 百科 全 书 ，http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html)， 基 于 阵列 的 技术 能 涵盖 整个 基因 组 ， 是 有 效 的 “开放 系统 ”。 应 用 DNA 阵列 技术 对 酵母 (Wodicka et al., 1997), KAG*FR (Richmond et wz .，1999)、 结 核 杆 菌 (Behr et al., 1999) 进行 的 基因 组 范围 的 表达 谱 实 验 结果 已 经 公开 发 表 。 然 而 对 于 人 、 小 鼠 和 大 鼠 等 物种 ， 要 等 它们 各 自 的 基因 组 序列 完成 后 才能 开展 基因 组 范围 的 阵列 研究 。 当 你 计划 开始 基于 DNA 阵列 的 实验 时 ， 另 外 一 个 主要 问题 是 ， 怎 样 将 RNA 转换 成 标记 探 针 并 进行 杂交 。 以 mRNA 或 总 RNA 为 起 始 模板 标记 探 针 的 方法 有 很 多 种 ， 这 其 中 包括 cDNA 第 一 链 合成 〈 以 锚 定 的 oligo-dT 或 随机 十 守 核 苷 酸 为 引物 )， 或 者 结合 进一步 的 用 T7RNA 聚合 酶 或 PCR 进行 核酸 扩 增 。 用 放射 性 同位 素 (如 ?PP 或 3P) Mx 光 素 (如 Cy3 和 Cy5) 标记 的 核 苷 酸 来 标记 探 针 ， 前 者 通常 用 于 尼龙 膜 ;， 后 者 用 于 玻璃 片 阵 列 。 每 种 方法 有 各 自 最 佳 的 RNA 用 量 ， 比 如 cDNA 第 一 链 合成 约 需 2 一 Surg PolyA RNA， 而 PCR 扩 增 法 最 少 用 25 ng 的 总 RNA 就 足够 了 (Gonzalez et al., 1999). BER 关于 目前 的 条 件 或 参数 的 系统 比较 未 见报 道 ， 就 没有 一 种 “标准 方法 ”。PCR 扩 增 法 值 得 关注 ， 包 括 对 高 丰 度 的 转录 物 进行 非 线 性 扩 增 的 可 能 性 ， 可 以 达到 数量 上 的 亚 最 佳 标 记 的 序列 特异 性 扩 增 。 然 而 最 近 的 证 据 显 示 或 许 这 些 关注 是 没有 理由 的 (Endege et 咏 .，1999)。 不 考虑 技巧 问题 ， 不 同 阵 列 的 灵敏 度 看 来 差不多 一 一 使 用 PolyA RNA 为 模 板 ， 能 辨别 10° mRNA 中 的 1 个 ( 约 每 个 细胞 2 一 5 个 mRNA HI). 当 使 用 一 种 标记 来 鉴别 不 同样 品 中 差异 表达 的 基因 mRNA 时 ， 操 作 过 程 相 对 简单 : 标记 后 的 RNA (来 源 于 两 个 或 多 个 样品 ) 用 于 相同 的 DNA 阵列 杂交 ， 然 后 比较 影像 之 间 对 应 点 的 强度 (考虑 到 比 活 的 差异 先 归 一 化 )。 另 一 个 常用 的 技术 是 使 用 两 种 可 辨别 的 不 同 标 记 〈 如 分 别 用 Cy3 和 CyS 标记 两 种 mRNA 样品 )， 在 同一 个 玻璃 片 阵 列 上 用 不 同 标记 制备 的 探 针 进 行 杂 交 。 两 种 有 各 自 特 征 性 发 射 波长 的 荧光 标记 能 彼此 区 分 开 ， 使 在 同一 个 阵列 上 检测 差异 杂交 成 为 可 能 。 每 个 点 的 荧光 比例 给 出 了 序列 特异 的 竞争 性 杂 交 结 果 。 与 以 前 的 方法 相 比 ， 单 一 阵列 技术 主要 的 优势 在 于 可 以 减少 由 于 不 同 阵列 间 细 微 的 差别 产生 的 影响 。 然 而 ， 使 用 单一 阵列 双重 杂交 的 缺点 是 得 到 的 比率 结果 只 在 特定 的 数据 中 有 效 。 比 如 ， 对 于 不 同时 间 点 的 取样 用 Cys 标记 ， 分 别 和 以 Cy3 标记 的 零 时 间 点 的 参照 mRNA 一 起 与 不 同 的 阵列 进行 杂交 。 由 于 不 同 的 研究 使 用 不 同 的 参照 样本 ， Soa . 蛋白质 组 学 把 不 同 研究 的 结果 整合 起 来 的 能 力 就 打折 扣 了 。 用 单一 或 双重 标记 方法 获得 的 强度 和 (或 ) 比率 值 被 储存 在 数据 库 中 ， 进 行 计算 机 分 析 和 不 同 数 据 组 间 的 比较 。 使 用 特定 的 以 基因 阵列 为 基础 的 技术 其 主要 优势 在 于 对 于 数据 进行 多 元 统计 分 析 时 相对 简单 〈 例 如 时 间 效 应 、 剂 量 效应 和 其 他 多 样本 数据 )。 例 如 在 时 间 效 应 的 情况 下 ， 将 表达 动力 学 近似 的 基因 进行 聚 类 的 方法 能 使 我 们 观察 到 基因 表达 的 协同 调控 〈Iyer et a! .，1999)。 统 计 分 析 应 用 于 多 基因 表达 谱 数据 的 另 一 个 例子 是 用 于 重新 划分 淋巴 癌 的 类 型 和 亚 类 (Golub et wz .，1999)。 对 基因 表达 数据 进行 多 元 分 析 可 能 发 现 基 因 表 达 的 相关 性 ， 而 这 仅仅 通过 比较 二 元 的 杂交 数据 组 是 无 法 实现 的 (例如 疾病 组 织 与 对 应 的 正常 组 织 ， 处 理 和 未 处 理 的 细胞 )。 记 今 为 止 ， 已 经 公开 发 表 的 多 元 基因 表达 分 析 的 例子 主要 是 基于 阵列 分 析 数 据 (Alizadeh et al., 1999; Fambrough et al., 1999; Golub et al., 1999; Heller et al., 1997; Iyer et al., 1999; Perou et al., 1999)， 人 惟一 的 例外 是 应 用 RT-PCR 提取 的 数据 。 事 实 上 ， 与 其 他 技术 平台 (如 SAGE, 数字 基因 表达 谱 分 析 和 差异 显示 PCR) 相 比 ， 基 于 阵列 的 方法 其 优势 是 能 相对 容易 地 对 数据 进行 多 元 统计 分 析 。 随 着 数据 库 中 基因 表达 数据 大 量 累加 ， 人 们 和 希望 对 于 基因 调控 的 发 现 能 够 更 加 准确 和 有 灵敏。 也 就 是 说 这 不 仅 提 供 了 使 人 们 能 更 好 地 理解 基因 表达 调控 的 方法 ， 还 提供 了 基 因 的 生物 学 功能 网 络 的 线索 。 相 似 疾病 (如 炎症 ) 的 基因 表达 谱 的 确定 可 以 对 它们 的 分 子 病理 学 更 精确 得 理解 。 然 而 ， 必 须 先 确定 一 些 标准 化 的 形式 以 便 进行 不 同 组 间 结 果 的 交叉 比较 。 对 于 所 有 不 同 技术 平台 产生 “标准 化 表达 数据 组 ”的 最 佳 方法 仍 在 争论 中 。 最 近 ， 欧 洲 生 物 信息 学 研究 所 (http://www. ebi.ac. uk/arrayexpress/) 和 美国 国家 生物 工程 信息 中 心 (NCBI; Marshall，1999) 都 表示 计划 提供 一 个 公共 数据 库 对 基于 阵列 的 杂交 数据 进行 储存 和 分 析 。 2.1 cDNA 阵列 cDNA 阵列 由 源 自 cDNA 文库 的 PCR 产物 组 成 ， 由 机 器 人 点 到 固体 支持 物 的 CDNA 阵列 可 以 用 不 明确 的 cDNA 文库 (cDNA 序列 未 知 ) 或 明确 的 cDNA 文库 (cDNA 序列 已 知 ) 来 建立 。 使 用 明确 的 CDNA 文库 有 两 个 主要 优势 : 第 一 ， 能 在 阵列 上 检测 是 否 存 在 对 于 某 特定 研究 来 说 “ 感 兴趣 的 基因 ” (如 阳 / 阴 性 对 照 ); 第 二 ， 人 快速 将 杂交 数据 映 射 到 基因 注释 加 速 了 结果 分 析 。 使 用 另 一 种 不 明确 的 CDNA 来 源 需 要 对 那些 表现 出 差异 杂交 的 克隆 进行 测序 来 确定 基因 的 差异 表达 。 此 过 程 费 时 且 效 率 低 ， 因 为 同一 个 基因 可 能 被 重复 检测 (尤其 是 用 “标准 ”的 宛 余 cDNA 文库 作为 阵列 的 原始 材料 )。 当 设计 cDNA 阵列 时 通常 使 用 3"cDNA 序列 来 代表 基因 。 它 们 可 能 源 自 非 蛋 白 编 码 区 ， 在 基因 家 族 的 成 员 之 间 ， 非 蛋白 编码 区 通常 比 编码 区 差别 更 大 。 选 择 这 样 的 3"cDNA 减少 了 基 因 家 族 相关 成 员 交 叉 杂 交 的 可 能 性 ， 尤 其 在 序列 相似 性 很 强 的 情况 下 。 建立 一 个 cDNA 阵列 生产 、 杂 交 和 基因 表达 数据 分 析 的 便捷 流程 需要 相当 的 生物 信 息 学 支持 。 精 确 和 可 靠 的 计算 机 系统 是 整个 过 程 各 个 阶段 的 基础 。 这 包括 选择 用 于 阵列 的 EDNA， 样 品 跟踪 以 确定 cDNA 位 于 正确 的 阵列 对 应 点 上 上， 测量 所 有 点 杂交 信和 号 强 度 ， 把 杂交 结果 保存 到 数据 库 中 〈 把 杂交 信和 号 与 基因 注释 相连 )， 以 及 后 续 的 数据 分 析 。 由 NCBI 开 发 并 正在 用 于 cDNA 阵列 数据 分 析 的 ArrayDB (Ermolaeva et al .，1998)， 就 第 二 章 ”基因 表达 的 检测 方法 - 27> 是 此 类 系统 的 一 个 例子 。 发 展 这 样 一 个 cDNA 阵列 工具 目前 很 少 实验 室 涉 及 ， 因 为 机 器 人 技术 和 生物 信息 学 基础 建设 耗资 巨大 。 因 此 ， 尽 管 cDNA 阵列 技术 原创 的 发 展 主要 在 依托 于 大 学 的 Hans Lehrach 实验 室 (Gress et al., 1996; Maier-Ewett et al., 1993; Ze- hetner and Lehrach, 1994) 和 Pat Brown 实验 室 (Schena et al., 1995, 1996; Shalon et az.，1996)， 目 前 大 多 数 阵列 设备 分 布 于 生物 技术 公司 、 大 型 制药 集团 和 一 些 专门 的 研 FPL, REN, MIRAGE cDNA 阵列 应 用 于 检测 差异 表达 基因 的 潜力 ， 这 意味 着 大 多 数 研 究 人 员 目 前 还 不 能 方便 地 用 到 这 一 技术 。 不 过 ， 这 种 情形 会 改变 ， 伴 随 着 更 多 的 实验 室 应 用 这 一 技术 ， 成 本 可 能 下 降 。 事 实 上 ，Pat Brown 实验 室 的 网 站 (http:// cmgm. stanford.edu/pbrown/) 已 经 提供 了 一 种 阵列 仪 的 产品 信息 ， 价 格 比 DNA 自动 测 序 仪 低 得 多 (US$ 23 000)。 对 于 研究 人 员 来 说 ， 拥 有 一 套 便 捷 的 阵列 工具 的 基本 的 优 势 是 能 根据 需要 构建 阵列 。 另 外 ， 通 过 从 商业 公司 购买 阵列 分 析 软 件 ， 例 如 Research Genetics Inc. (http://www.researchgenetics. comy/ ) . Genome Systems Inc. (http://www. genomesystems. comy/ ) , Clontech( http://www. clontech. com/)#% NEN(Chttp://www.nen- lifesci. comy ) ,或 者 通过 与 商业 的 cDNA 阵列 服务 提供 商 合 作 [ 如 Incyte Pharmaceuticals Inc. (http://gem. incyte. com/gem/index. shtml) 或 Research Genetics Inc. ], 以 cDNA 阵 列 为 基础 的 研究 在 不 用 投资 于 所 有 技术 的 情况 下 仍 可 进行 。 该 领域 论文 数量 的 日 益 增 长 证 明了 cDNA 阵列 在 提供 新 的 生物 学 信息 方面 的 效用 ， 例如 肿瘤 基因 表达 谱 的 研究 (DeRisi et al., 1996, Golub et al., 1999; Moch et al., 1999; Perou et al., 1999), —?PKRBHRG RitEBAN LM (Aitman et al., 1999), 生理 周期 中 神经 系统 基因 表达 变化 的 检测 (DeRisi et al., 1996, Golub et al., 1999; Moch et al., 1999; Perou et al .，1999)， 哮 喘 中 淋巴 细胞 基因 表达 改变 的 检测 ( Syed et al .，1999)。 作 为 这 一 技术 能 提供 新 的 生物 学 洞察 力 的 一 个 证 据 是 ， 利 用 一 个 含有 8613 基因 的 阵列 研究 静止 培养 的 人 成 纤维 细胞 对 于 血清 的 反应 〈 一 种 成 熟 的 细胞 周期 控制 模型 ) (Iyer et wz .，1999)。 许 多 被 发 现 早期 产生 表达 变化 的 是 那些 对 于 血清 产生 增殖 反应 的 相关 基因 〈 如 转录 因子 fosjun)。 然 而 ， 在 较 晚 的 时 间 点 ， 典 型 的 伤口 愈合 反应 的 基因 表达 变化 出 人 意料 地 出 现 了 ， 例 如 诱导 产生 血管 内 皮 生 长 因子 (启动 血管 生 成 ) 和 成 纤维 细胞 生长 因子 7 (刺激 上 皮 再 形成 )。 作 者 推断 这 些 细胞 暴露 于 血清 中 的 主 要 效应 是 伤口 愈合 反应 ， 建 议 以 此 作为 此 类 研究 的 体外 模型 。 因 此 ， 通 过 多 基因 杂交 ， 这 一 研究 在 成 纤维 细胞 对 于 血清 的 生物 学 反应 方面 提供 了 以 往 未 知 的 重要 新 发 现 。， Mink, cDNA 阵列 能 用 来 构建 任何 物种 的 转录 图 谱 (只 要 有 合适 的 DNA 文 库 )， 同 时 监控 成 千 上 万 个 基因 序列 ， 简 化 完整 的 数据 分 析 ， 建 立 结果 数据 库 。 然 而 cDNA 阵列 仅 能 对 那些 全 基因 组 序列 已 知 的 物种 提供 基因 组 范围 的 检测 。 阵 列 产品 和 建 立 生 物 信息 学 体系 的 成 本 令 大 多 数 实 验 室 望 而 却步 ， 进 而 导致 这 一 技术 使 用 的 限制 。 2.2 BeBe EVE APACE RET , SEER ES CDNA 阵列 相似 〈 见 2.1 部 分 )。 两 者 都 是 由 以 高 密度 点 在 固体 和 矩阵 〈 如 玻璃 片 ) 上 的 DNA 组 成 ， 用 于 基于 杂交 的 基因 表达 谱 的 分 析 。 与 排列 来 源 于 cDNA 克隆 的 PCR 产物 不 同 的 是 ， 守 核 苷 酸 阵列 由 合成 的 基因 特异 性 的 寡 核 苷 酸 组 成 。 本 章节 重点 分 析 这 两 种 形式 的 EDNA 阵列 之 间 的 优势 和 弱点 。 Ga - 蛋 日 质 组 学 BRP REANNEKRRAAN EKER (通常 20 一 25 个 核 苷 酸 ) 含有 足够 的 序 列 复杂 性 来 实现 选择 性 地 杂交 单一 转录 物 。 在 实际 操作 过 程 中 ， 代 表 一 个 基因 不 同 区 域 的 多 个 究 核 苷 酸 被 点 到 阵列 上 。 显 然 ， 守 核 苷 酸 阵列 的 建立 需要 事先 了 解 表达 的 序列 情 况 ， 这 就 把 它 的 应 用 范围 限制 在 基因 组 表达 序列 测定 完成 的 物种 。cDNA 阵列 则 不 同 ， 一 个 完全 未 知 的 CDNA 文库 可 以 用 来 作 表 达 谱 分 析 。 不 过 守 核 苷 酸 阵列 的 使 用 意味 着 无 须 小 心 翼 翼 地 保存 cDNA 克隆 和 PCR 产物 ， 从 而 简化 了 精确 制作 阵列 的 后 勤 工 作 。 事 实 上 ， 直 接 在 心 片上 合成 齐 核 苷 酸 能 把 阵列 误差 的 风险 降 到 最 低 点 。 有 一 些 辅助 阵列 设 计 的 方法 能 为 一 种 转录 物 提 供 惟 一 的 序列 特异 性 (Wodicka et wz .，1997)。 这 些 程序 能 在 已 有 的 基因 组 序列 信息 基础 上 进行 序列 的 最 佳 选择 ， 从 而 减少 由 于 交叉 杂交 造成 的 假 象 。 交 叉 杂 交 的 影响 在 cDNA 阵列 并 不 容易 去 除 。 ， 一 旦 选 定 了 守 核 苷 酸 来 代表 需要 研究 的 基因 ， 有 两 种 基本 的 方法 制作 阵列 : 与 cDNA 阵列 相似 由 机 器 人 将 预先 合成 的 守 核 苷 酸 点 成 阵列 ; 或 直接 将 DNA 合成 在 阵列 表面 ， 这 一 技术 有 一 家 美国 的 生物 技术 公司 Affymetrix (http://www. affymetrix. com/) (Lockhart et al., 1996) FFA, Affymetrix 的 方法 能 制作 高 点 密度 的 阵列 (10° 点 /cm2) (McGall et al., 1996), REBLAEA RAKARITE (310° A/cm?) (Yershov etal., 1996) 高 。 目 前 ， 用 以 前 的 方法 设计 和 制作 阵列 相当 昂贵 ， 限 制 了 潜在 用 户 的 使 用 ， 此 法 在 以 照相 平版 技术 直接 将 DNA 合成 到 阵列 过 程 中 产生 阵列 特异 性 的 遮盖 物 ， 使 得 该 技术 无 法 灵活 应 用 。 然 而 ， 最 近 一 篇 报道 讲述 了 一 种 能 降低 直接 在 玻璃 片上 合成 守 核 苷 酸 成 本 的 方法 ， 因 为 无 须 产 生 阵 列 特异 性 的 遮盖 物 (Singh-Gasson et al.， 1999), BRAREII KAIF cDNA 阵列 的 一 个 特点 是 能 包括 与 所 要 代表 的 基因 完全 匹 ACAI A SCS LAMAR ER. Affymetrix 的 阵列 应 用 了 这 一 技术 ， 包 括 一 个 单 核 苷 酸 错 配 的 寡 核 苷 酸 和 完全 匹配 的 守 核 苷 酸 。 以 此 来 研究 和 报告 杂交 特异 性 ， 为 每 个 基因 的 检 测 提 供 了 更 高 的 定量 准确 率 。 需要 指出 的 是 ， 朝 核 苷 酸 阵列 直接 提供 了 可 用 于 杂交 的 单 链 模板 ， 而 PCR 产物 必 须 首先 变性 以 提供 可 用 于 杂交 的 单 链 模板 。 为 使 EDNA 阵列 间 有 最 好 的 重复 性 ， 变 性 操 作 过 程 保 持 一 致 很 重要 一 一 这 一 点 在 寡 核 苷 酸 阵列 中 不 必 考 虑 。 用 mRNA 或 总 RNA 标记 探 针 的 方法 与 EDNA 阵列 相同 ， 最 常用 的 是 荧光 标记 线性 扩 增 (如 T7 RNA 聚合 酶 ) 产生 足够 的 具有 高 特异 活性 的 探 针 。 数 据 分 析 和 数据 库 流 程 与 cDNA 阵列 相同 〈 见 2.1 部 分 )。 应 用 守 核 苷 酸 阵 列 实例 包括 同时 检测 所 有 酵母 基因 的 表达 (Holstege et al., 1998; Wodicka et dz .，1997)， 发 现 小 鼠 受 体 酷 氨 酸 激酶 激活 的 信号 转 导 通路 的 元 余 (Fambor- ough et al .，1999)， 以 及 产 热 限制 对 于 小 鼠 骨 骼 肌 衰 老 的 影响 (Lee et al., 1999). 总 的 来 说 ， 宴 核 苷 酸 阵列 提供 了 一 种 与 DNA 阵列 相似 的 技术 ， 虽 然 昂贵 了 点 ， 但 具有 更 高 的 基因 特异 性 杂交 的 准确 率 。 随 着 基因 组 测序 计划 的 完成 ， 设 计 守 核 苷 酸 阵列 时 需要 事先 了 解 的 基因 序列 信息 将 会 变 得 随手 可 及 ， 不 再 成 为 一 个 主要 问题 。 3. 不 基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法 基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法 只 能 检测 阵列 上 存在 的 基因 ， 与 此 不 同 的 是 能 够 检测 生物 样品 中 所 有 转录 物 的 技术 通常 被 称 为 “开放 体系 "。 理 论 上 讲 ， 方 法 的 灵敏 度 第 二 章 ”基因 表达 的 检测 方法 。 29 ,2 和 可 供 实验 使 用 的 资源 是 该 方法 的 限制 因素 。 应 用 开放 体系 的 实验 可 以 用 于 任何 物种 而 无 须 事先 了 解 物种 特异 性 的 序列 信息 。 3.1 基于 序列 测定 的 方法 学 cDNA 文库 的 一 过 性 序列 测定 (First-pass sequencing of cDNA libraries) ， 作 为 人 类 基因 组 计划 的 一 部 分 ， 基 因 组 和 表达 产物 综合 分 子 生 物 学 分 析 联 盟 IMAGE (http:// www-bio. llnl. gov/bbrp/image/image. html) 构建 了 数 百 个 来 源 于 不 同 组 织 的 cDNA X 库 ， 并 测定 其 外 源 DNA 片段 序列 。 一 过 性 测定 的 序列 信息 〈 只 读 一 次 的 DNA 序列 通 常 测定 克隆 插入 片段 的 两 端 一 一 平均 读 取 200 ~ 300 bp) 存放 在 公共 数据 库 中 (由 NCBI 管理 的 Genbank 中 dbEST)。 也 有 类 似 的 秋 有 (如 Incyte 制药 有 限 公 司 和 人 类 基 因 组 科学 有 限 公 司 ，http://www.hgsi.com) 数据 库 。 这 些 努力 的 主要 目的 是 尽快 为 所 有 的 人 类 基因 确定 参考 序列 ， 每 个 一 过 性 测定 的 序列 代表 一 个 基因 的 表达 序列 标签 (expressed sequence tag, EST) (与 完整 的 全 序列 相对 )。 小 鼠 和 大 鼠 类 似 的 计划 在 全 球 各 基因 组 中 心 开 展 。 截 至 1999 年 11 月 (GenBank 版 本 号 115), dbEST 中 独立 的 登录 条 目 人 类 有 约 1 300 000， 小 鼠 513 000 AAR 115 000. cDNA 文库 中 每 一 个 被 测定 的 克隆 代表 用 于 构建 文库 的 原始 mRNA 中 的 一 个 独立 取样 。 因 此 ， 通 过 测定 文库 中 数 干 个 这 样 的 克隆 然后 计算 特定 基因 序列 出 现 的 频率 ， 就 有 可 能 估计 出 每 种 转录 物 的 相对 丰 度 。 由 于 这 一 方法 计算 代表 基因 的 EST (或 聚 类 后 的 EST) 数量 ， 因 此 给 出 的 资料 是 数字 化 的 。 理 论 上 讲 ， 精 确 mRNA 定量 中 可 实现 的 线性 范围 是 没有 界限 的 。 转 录 物 丰 度 精确 定量 方法 的 灵敏 度 是 测定 的 CDNA 文库 克隆 数量 的 函数 。 这 个 方法 的 魅力 在 于 它 能 够 用 于 任何 可 以 建立 cDNA 文库 的 生物 样品 ， 并 且 是 任何 有 高 通 量 DNA 测序 能 力 的 实验 室 都 可 以 实现 的 。 当 然 ， 也 有 一 些 缺 点 。 较 难 克隆 的 cDNA 无 法 准确 地 出 现在 cDNA 文库 中 ， 从 而 低估 了 它们 的 丰 度 。 其 次 ， 随 机 取样 使 高 丰 度 基因 被 频繁 地 反复 测 序 ， 甚 至 连 精确 检测 每 个 DNA 文库 中 的 中 丰 度 的 转录 物 也 需要 数 千 个 测序 反应 。 NCBI 提 供 了 基于 网 络 的 分 析 根 据 xProfiler(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ ncicgap/ cgapxpsetup. cgi) 和 数字 差异 显示 (http://www. ncbi. nlm. nih. gowUniGene/ddd. cgi? ORG= Hs)， 可 以 用 来 比较 来 源 于 数 百 个 DNA 文库 的 序列 数据 。 统 计 学 分 析 方 法 也 被 开发 出 来 以 帮助 解释 此 类 比较 的 结果 (Audic and Claverie 1997)。 简 单 地 说 ， 这 些 方法 表明 要 检测 两 个 cDNA 文库 中 转录 物 丰 度 统计 学 上 的 显著 差异 ， 一 个 给 定 的 文库 中 的 特 定 的 转录 物 必 须 被 测序 两 次 以 上 。 所 以 要 检测 一 个 在 20 000 个 转录 物 中 有 一 个 拷贝 的 转录 物 丰 度 统计 学 上 的 显著 差异 ， 至 少 要 对 cDNA 文库 完成 60 000 个 独立 的 测序 反应 。 这 个 测序 量 既 费 时 又 费 钱 ， 而 且 可 能 只 提供 了 中 丰 度 表达 基因 的 信息 (细胞 内 低 丰 度 转 录 物 在 100 000 拷贝 中 只 有 1 个 或 更 少 )。 这 些 实际 因素 限制 了 这 一 用 于 mRNA 定量 和 发 现 差 异 表 达 基 因 的 技术 的 使 用 。 不 过 ， 通 过 对 cDNA 文库 中 EST 频率 分 析 获 得 的 定 量 信 息 的 作用 已 经 被 以 下 研究 工作 证 实 : 人 前 列 腺 特异 基因 表达 的 检测 (Vasmatzis et 4&.，1998)， 神 经 生长 因子 处 理 后 PC-12 细胞 差异 表达 基因 的 确定 (ON A 和 synapsin 2) (Lee et al .，1995)。 在 人 类 造血 梯次 分 化 体系 中 也 得 到 证 实 (Claudio et az .，1998)。 在 所 有 的 事例 中 原始 的 实验 发 现 均 得 到 了 Northern 杂交 的 确认 。 总 之 ， 虽 然 司 始 于 cDNA 文库 的 一 过 性 测序 数据 对 mRNA 定量 确实 有 效 ， 但 因为 - 30 - ` 和 蛋白质 组 学 它 的 高 成 本 和 低 灵 敏 度 ， 在 大 多 数 情 况 下 它 并 不 是 首选 。 假 设 许 多 DNA 文库 的 信息 (dbEST) 以 及 比较 和 解释 此 类 资料 的 根据 都 能 免费 得 到 ， 计 划 要 开展 差异 mRNA 表达 研究 的 人 应 该 把 对 这 些 EST 的 “电子 比较 ”的 应 用 看 作 第 一 个 “沿途 停靠 的 港口 ”。 显 然 ， 只 有 当 序 列 数据 来 源 于 与 研究 者 相关 的 cDNA 文库 ， 这 一 方法 才 有 意义 。 这 一 方法 仅 适 用 于 标准 的 cDNA 信息 ， 而 不 适用 于 归 一 化 的 cDNA 文库 资料 ， 因 为 归 一 化 过 程 造 成 文库 中 cDNA 的 数量 表征 发 生根 本 变化 。 基因 表达 系列 分 析 一 -SAGE 基因 表达 系列 分 析 (serial analysis of gene expres- sion, SAGE) 方法 由 Bert Voglestein 实验 室 (Velculescu et al., 1995) 于 1995 年 首次 发 表 ， 是 一 种 基于 DNA 测序 的 用 于 mRNA 表达 丰 度 定量 的 技术 。SAGE 克服 了 通过 文 库 插入 片段 序列 测定 进行 基因 表达 分 析 技 术 的 主要 缺点 一 一 必须 测定 上 万 个 EDNA 克隆 以 保证 量 值 的 精确 度 〈( 见 前 述 )。SAGE 的 基本 原理 包括 分 离 代 表 每 个 转录 物 特 定 区 域 的 独特 的 短 序列 标签 (9 一 14 个 碱 基 )。 然 后 将 它们 串联 、 克 隆 、 测 序 〈( 见 图 2.3)。 所 有 标签 中 某 种 特定 序列 标签 出 现 的 频率 就 是 原始 材料 中 相应 的 mRNA 频率 的 度量 。 理 论 上 讲 一 个 含有 9 一 14 个 碱 基 的 序列 标签 能 提供 足够 的 序列 信息 来 确定 特定 的 mRNA (Velculescu et wz .，1995)。 比 如 ， 假 设 随 机 分 布 成 立 ，10 个 碱 基 的 排列 〈4") 产生 1 048 576 种 可 能 的 组 合 ，10 倍 于 组 成 人 类 基因 组 的 基因 的 数量 (Fields et al., 1994). 因此 ， 通 过 将 DNA 序列 长 度 降 到 有 信息 量 的 最 低 限 度 ， 使 效率 比 CDNA 文库 测序 方法 有 所 提高 : 测定 每 个 “序列 标签 串联 体 ” 的 序列 得 到 30~50 倍 的 基因 信息 〈(Bertelsen and Velculescu，1998 ) 。 像 EDNA 文 库 测 序 一 样 ，SAGE 资料 是 数字 化 的 ， 理 论 上 线性 范围 是 无 限 的 。 基 于 模拟 (Zhang et al., 1997) 和 统计 分 析 (Audic and Claverie, 1997) 的 方法 已 经 开发 出 来 ， 用 于 评估 来 源 于 两 个 生物 样品 的 序列 标签 丰 度 差异 的 意义 。 使 用 独立 的 方法 证 实 SAGE 序列 标签 频率 在 小 于 0.01% 到 大 于 0.1% 的 范围 内 是 mRNA 转录 物 丰 度 的 能 精 确 度量 (Madden et al., 1997; Velculescu et al .，1995，1997)。SAGE 的 应 用 包括 发 现 结肠 癌 细 胞 系 凋 亡 前 P53 诱导 基因 的 发 现 (Polyak et al., 1997) 和 正常 与 癌 细 胞 基因 表达 谱 的 分 析 (Zhang et al., 1997), BAH SAGE 应 用 实例 能 在 以 下 两 个 网 站 找到 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/SAGE/) 和 Genzyme Oncology (一 个 提供 SAGE 作为 商业 服务 的 生物 技术 公司 ) (http://www. genzyme. com/ prodserv/molecular— oncology/sage/ welcome. htm). “标准 ”SAGE 方法 需要 近似 于 可 供 cDNA 文库 构建 所 需 的 RNA 量 (2.5~5.0 pg mRNA)。 这 把 SAGE 的 应 用 限制 在 启 始 的 生物 材料 很 多 的 情况 下 : 细胞 培养 体系 和 动 物 模 型 ， 而 非 人 临床 活 组 织 检 查 样品 和 微 切 割 样品 。 不 过 ， 最 近 微 SAGE (Datson et al., 1999) 的 出 现 提供 了 一 种 改良 的 SAGE 技术 ， 能 利用 少 至 5 ng 的 mRNA. SAGE 技术 有 两 个 主要 的 缺陷 。 第 一 ， 由 于 用 短 序列 标签 辨别 每 个 转录 物 ， 高 质量 是 准确 确认 序列 的 根本 。 在 含有 10 个 核 背 酸 的 标签 中 1 个 碱 基 的 读 取 错 误 对 于 转录 物 确定 的 影响 (通过 BLAST 分 析 ) 远 比 一 个 200 碱 基 、 含 有 10% 错 误 率 的 一 过 性 测定 序 列 产生 的 影响 要 大 。 其 次 ， 用 标签 成 功 确定 原始 转录 物 的 能 力 直接 取决 于 每 个 物种 的 数 据 库 中 存储 序列 〈 特 别 是 3 端的 序列 ) 的 数量 。 因 此 ， 目 前 人 类 样品 的 SAGE 资料 解 释 要 比 小 鼠 或 大 鼠 的 容易 。 第 二 章 ，” 基因 表达 的 检测 方法 Poly A+ RNA 生物 素 标 记 的 AAAAA + mr oligo dT (1) cDNA 合成 i (2) (3) is x Fok | 连接 , PCRP 限制 性 酶 切 消化 ， 纯 化 双 标 签 并 连接 连接 子 (7) | | 克隆 并 测序 CATGCCTAGTCAGGCGACTTCACATGCCAAAGTGCTTTCGAGGACATGGAAGTCCTACGATCATGGCATG 一 一 一 一 一 标签 7 标签 2 标签 3 ”标签 4 标签 5 ”标签 6 ees lf eee ees NYS MERE A 双 标 签 B 双 标 签 C 图 2.3 基因 表达 系列 分 析 (SAGE) 方法 示意 图 步骤 1: 用 生物 素 -oligo dT 引物 将 PolyA+ 的 RNA 转换 为 cDNA。 步骤 2: 合成 的 cDNA 用 高 频 切割 的 限制 性 核酸 内 切 酶 ,“ 锚 定 酶 ”,( 如 Nia 于，4bp 识别 位 点 ， 平 均 256 核 苷 酸 一 个 酶 切 位 点 ) 消化 。 步 又 3: cDNA 的 3“ 端 被 生物 素 包 庄 的 磁 珠 捕获 。cDNA 池 被 一 分 为 二 (“A 池 ” 和 “B 池 ”)， 不 同 的 接头 被 连接 到 每 个 cDNA 池 中 。 步 又 4: 这 些 接头 含有 IIs 型 限制 性 核酸 内 切 RELL; tagging enzyme (如 此 命名 是 因为 它们 的 切割 位 点 离 识别 位 点 有 确定 的 碱 基数 ， 比 如 Fok 工 在 它 的 识别 位 点 下 游 13 个 碱 基 处 切割 ) 被 用 来 切割 EDNA/ 接 头 杂 合子 ， 释 放出 附着 在 接头 上 的 cDNA 短 序 列 标签 。 步 又 5: 接头 -标签 杂 合 分 子 尾 对 尾 相连 ，PCR 扩 增 (通过 接头 序列 ) 。 步 骤 6: 用 锚 定 酶 将 接头 从 双 标 签 上 去 除 , 纯化 双 标 签 并 将 它们 彼此 连接 形成 连接 子 (concatemer), FR7: 连接 子 克 隆 与 测序 ， 发 现 每 个 标签 的 特征 。 mh 人 in。 ene 蛋白 质 组 学 总 之 ，SAGE 被 广泛 应 用 于 任何 生物 学 体系 。 结 合 自 动 DNA 序列 分 析 和 足够 的 生 物 信 息 学 支持 ， 它 是 一 种 用 于 mRNA 丰 度 定量 的 有 效 而 精确 的 方法 3.2 差异 显示 PCR (DD-PCR) 差异 显示 PCR 是 一 种 确定 两 个 生物 学 样品 差异 表达 的 CDNA 片段 的 方法 (Liang and Pardee, 1992) ( 见 图 2.4a)。 这 一 方法 的 基础 是 用 两 个 朝 核 苷 酸 引 物 从 mRNA 产生 cDNA 片段 ， 一 个 是 与 转录 物 的 polyA 尾 互补 [如 oligo-d(T)iiVN]， 另 一 个 是 短 的 随机 核酸 序列 〈 例 如 10 FRR). 4REBHSIMASH, DD-PCR 能 确定 一 个 生物 学 样 品 中 所 有 的 转录 物 。cDNA 合成 后 ， 片 段 在 PCR 扩 增 过 程 中 被 标记 (放射 性 同位 素 或 荧光 标记 )。 产 物 通过 测序 凝 胶 电泳 分 离 ， 扩 增 后 的 cDNA 片段 的 组 成 模式 就 显现 出 来 。 “未 处 理 的 ” PolyA+RNA “处 理 的 ” PoyA+RMN4 AAAAA Al FASE dT RK CDNA eee A A A A A SS nL - MA oligo dT, GA, << 随机 KER DP 物 和 “标记 ”的 dNTP — en Te ene 图 2.4 差异 显示 方法 学 示意 图 (a) 反 转 录 PCR 产物 差异 显示 的 标准 方法 (Liang and Pardee，1992 ) 。 来 源 于 两 种 生物 学 样品 的 RNA (如 调节 剂 处 理 与 未 处 理 的 细胞 系 ) 用 oligo-d (T)i2 反 转录 ， 得 到 的 cDNA 分 别 用 一 系列 锚 定 oligo dT 引物 [此 处 用 d (T)pGA] 结合 一 个 10 核 苷 酸 随机 引物 (结合 不 同 cDNA 的 不 同位 置 ) 进行 PCR 扩 增 。 用 测序 胶 电泳 可 观察 PCR 产物 (PCR 过 程 中 实现 放射 性 同位 素 或 荧光 标记 )。 同 样 电泳 迁移 率 的 条 带 的 有 /无 提示 了 条 带 所 代表 的 cDNA 来 源 基因 的 表达 差异 。 第 二 章 “基因 表达 的 检测 方法 niSE- 。 被 标记 条 带 的 强度 反应 了 相应 转录 物 的 相对 丰 度 。 当 使 用 相同 的 引物 对 时 ， 来 源 于 两 个 生物 学 样品 CDNA 条 带 的 主要 差别 显示 出 它们 之 间 差 异 表达 的 转录 物 。 对 cDNA 条 带 进 行 克隆 和 测序 就 能 鉴定 基因 。 早 期 报告 显示 DD-PCR 产生 大 量 的 假 阳性 (Liang et al., 1994; McCleland et al .，1995$)。 显 然 这 大 大 降低 了 它 的 效率 。 因 为 这 些 缺 点 ， 人 们 开 始 尝试 各 种 技术 改进 ， 诸 如 优化 引物 组 合 、 提 高 PCR 引物 复 性 温度 、 反 转录 前 用 DNA 酶 处 理 RNA 和 使 用 非 变性 凝 胶 (Bauer et al., 1993; Liang and Pardee，1995)。 或 许 最 有 意义 的 改进 是 用 限制 性 内 切 核酸 酶 消化 双 链 cDNA (用 mRNA 制备 )， 然 后 通过 连接 接头 介 导 cDNA 片段 3" 端 选择 性 PCR $$ (Prashar and Weissman, 1996; 见 图 2.4b)。 限制 性 内 切 核酸 酶 的 选择 使 用 增加 了 能 显示 的 转录 物 的 覆盖 率 。 这 些 改进 通过 让 引物 在 S$6 人 退火 进行 严格 的 PCR， 实 现 了 比 标准 DD-PCR 条 件 (40C 下 非 严 格 的 引物 退火 ) 显著 的 改良 。 改 良 的 DD-PCR 据说 可 以 提供 基因 表达 的 近似 定量 的 信息 ; 每 个 转录 物 PolyA+RNA AAAAAAAAAAA 3' AGTTTTTTTTTT cDNA 合成 I ae 3" 5'B 限制 消化 { 37, AG 3 末端 mRNA 来 源 的 序列 成 功 扩 增 扩 增 产物 经 测序 胶 分 (b) 离 并 成 像 如 图 2.4a 图 2.4 ( 续 ) (b) 为 增强 重复 性 而 对 差异 显示 技术 的 改良 (Prashar and Weissman，1996)。 以 含有 SH (HK) 的 锚 定 AT 引 , 物 ， 就 是 CTCGCAATCGGGGCTCGTCG (T)iazGA 来 驱动 第 一 链 cDNA 的 合成 。 经 过 标准 的 cDNA 第 二 链 合成 后 的 产物 经 限制 性 核酸 内 切 酶 消化 后 与 了 型 的 接头 连接 。PCR 反应 有 选择 地 扩 增 cDNA 片段 的 3" 端 。PCR 产物 能 用 测序 凝 胶 电 泳 分 离 和 鉴定 〈( 如 前 所 述 ) 。 es 。 蛋白 质 组 学 每 种 限制 性 内 切 核酸 酶 产生 单一 条 带 ， 降 低 了 显示 样式 的 复杂 性 。 还 有 ，: 序 列 已 知 的 基 因 产 生 的 条 带 大 小 可 以 预测 ， 能 在 把 条 带 从 凝 胶 上 回收 之 前 临时 确认 基因 (Prashar and Weissman，1996)。 这 一 技术 的 改良 由 几 家 独立 的 生物 技术 公司 完成 【Curagen 公司 ， http://www.curagen. com/ (Shimkets et al., 1999); 数码 基因 技术 公司 ，http://www. dgt. com/index. html 和 显示 系统 生物 技术 公司 , http://www.displaysystem.com/]， 用 来 提供 快速 、 高 通 量 的 DD-PCR 服务 。 DD-PCR 被 用 于 许多 不 同 的 研究 领域 : 比如 新 型 药 靶 的 发 现 (Shiue，1997; Wang and Feuerstein，1997)， 风 湿性 关节 炎 差 异 调控 基因 的 发 现 (White and Petkovich, 1998) 和 环境 刺激 物 对 于 细菌 基因 表达 影响 的 评估 (Fislage，1998)。 事 实 上 ，DD-PCR 是 目前 确定 差异 表达 基因 的 技术 中 最 广泛 发 表 的 一 种 。 这 或 许 反映 了 这 样 一 个 事实 : DD-PCR 不 需要 专门 的 昂贵 设备 或 生物 信息 学 工具 ， 促 使 它 能 进入 许多 实验 室 。DD-PCR 的 一 个 重要 优势 是 相对 较 少 的 RNA 有 用量。 最初 需 要 几 百 纳 克 RNA (Liang and Pardee, 1992). 最 近 的 改良 使 该 技术 能 对 来 源 于 单个 细胞 的 RNA 进行 DD-PCR (Renner et al., 1998). 因此 ，RNA 的 产量 不 会 阻碍 DD-PCR 的 应 用 。 不 过 DD-PCR 也 存在 缺点 。 如 前 所 述 ， 这 一 技术 受 假 阳性 之 苦 。 还 有 ， 一 条 被 确认 是 差异 表达 的 条 带 可 能 并 不 总 是 只 包括 单一 的 分 子 ， 因 为 多 个 转录 物 能 产生 近似 大 小 片段 在 电泳 胶 上 一 起 泳 动 。 造 成 确认 基因 的 困 难 。 总 之 ，DD-PCR 能 成 功 地 用 于 发 现任 何 物种 的 任何 组 织 的 差异 表达 基因 ， 只 要 能 分 离 高 质量 的 RNA。 该 技术 简单 的 操作 和 相对 廉价 使 它 广 为 使 用 。 然 而 结果 通常 更 是 定 性 的 而 非 定量 的 ， 与 其 他 技术 如 阵列 和 SAGE 产生 的 数据 比较 错误 似乎 更 多 。 A ee 分 子 生物 学 和 基因 组 序列 分 析 领 域 技术 的 进步 促使 mRNA 定量 方法 由 一 个 接 一 个 基因 的 手段 向 基因 组 范围 的 检测 发 展 。 在 过 去 的 5 年 里 ， 一 些 彼此 互补 的 技术 同时 发 展 起 来 。 每 一 项 技术 在 以 下 几 方 面 存在 各 自 相 对 的 优 缺 点 : 检测 的 灵敏 度 、 通 量 和 基因 组 的 范围 ， 数 据 分 析 的 可 靠 性 、 成 本 和 简易 性 /能 力 。 所 有 方法 都 需要 有 意义 的 实验 输入 和 后 续 的 工作 来 验证 新 发 现 。 由 于 这 个 原因 ， 目 前 尚 无 公开 发 表 的 例子 对 由 两 种 技术 (如 cDNA 阵列 和 SAGE) 得 到 的 结果 进行 全 方位 的 对 比 。 因 此 ， 很 难 就 每 种 技术 的 效 用 提供 彻底 的 比较 。 不 过 毫 无 疑问 ， 用 于 mRNA 定量 的 SAGE、 基 于 阵列 的 杂交 、DD- PCR 和 电子 差异 基因 表达 等 方法 的 效用 已 经 被 用 独立 的 方法 (RT-PCR BK Northern 杂 交 ) 进行 发 现 的 确认 所 证 实 。 另 外 一 些 确定 差异 表达 基因 的 方法 ， 如 消减 抑制 杂交 (Diatchenko et al., 1996) 和 代表 性 差异 分 析 (Hubank and Schatz，1994) 等 未 在 此 讨 论 ， 因 为 它们 起 初 是 为 确定 mRNA 表达 量 的 差异 (与 SAGE、 阵 列 等 相 比 ) 而 设计 的 ， 或 者 还 未 像 诸 如 DD-PCR 等 定量 方法 那样 被 广泛 使 用 。 (So He Wim i) 第 二 章 ， 基 因 表达 的 检测 方法 oy 参考 文献 Aitman, T.J., Glazier, A.M., Wallace, C.A. et al. 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BARRERA SZHILT RR ARM RAAT, & 测 和 分 析 是 蛋白 质 组 分 析 的 首要 要 求 。 最 近 ， 多 种 用 于 和 蛋白质 组 学 研究 的 蛋白 质 分 离 方 法 得 到 了 发 展 〈 见 第 十 章 )， 如 基于 心 片 技术 的 应 用 (Merchant and Weinberger, 2000; Nelson et a! .，2000)、 和 蛋白 复合 物 的 质谱 直接 分 析 (Link et al., 1999), RAMEHE 用 (Gygi et al., 1999; Rigaut et al., 1999) 以 及 大 规模 酵母 双 杂 交 筛 选 系统 (Uetz et al .，2000)。 但 是 ， 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (two-dimensional polyacrylamide gel elec- trophoresis, 2-DE) 依然 是 大 多 数 蛋 日 质 组 研究 中 分 离 复杂 和 蛋 日 混合 物 所 选择 的 核心 技 术 ， 这 是 由 于 它 在 同时 分 离 成 千 蛋 白质 时 所 具有 的 无 可 比拟 的 分 离 能 力 ， 以 及 随后 的 可 用 于 计算 机 定量 分 析 差 异 表达 蛋白 质 的 高 灵敏 度 的 显 色 技术 ， 还 有 对 2-DE 胶 上 和 蛋白质 用 高 灵敏 度 微量 化 学 方法 进行 鉴定 和 表征 相对 比较 容易 。 本 章 将 要 介绍 的 是 2-DE 方法 的 最 新 进展 ， 这 些 进 展 使 得 2-DE 的 分 辨 能 力 逐 渐 提 高 ， 成 为 操作 相对 简便 的 具有 高 重 复 性 的 分 离 技术 。 2. 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 发 展 史 最 早 的 二 维 电泳 应 归功 于 Smithies 和 Poulik (1956) 的 工作 ， 他 们 将 纸 电 泳 和 淀粉 凝 胶 电 泳 结合 来 分 离 血 清 蛋白 质 ， 随 后 在 电泳 技术 上 的 研究 开发 ， 如 聚 丙 炳 酰胺 支持 介 质 和 聚 丙烯 酰胺 浓度 梯度 ， 很 快 应 用 于 二 维 分 离 (Dunn，1987)。 特 别 是 等 电 聚 焦 (iso- electric focusing, ts 技术 应 用 于 二 维 分 离 使 基于 蛋白 质 电荷 属性 的 一 向 分 离 成 为 可 能 。IEF 和 二 维 十 二 烷 基 硫酸 钠 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (sodium dodecyl dulfate polyacry- lamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 的 结合 形成 了 根据 两 个 独立 参数 (电荷 和 分 子 质 量 大 小 ) 来 分 离 蛋白 质 的 二 维 方法 。 通 过 在 IEF 中 应 用 尿素 和 非 离 子 性 去 污 剂 ， 可 将 该 方法 应 用 于 各 种 溶解 性 能 差别 很 大 的 样品 。 至 此 ， 到 1975 年 ， 正 式 形成 了 应 用 于 全 细胞 或 组 织 蛋 白质 混合 物 分 析 的 二 维 电泳 系统 (Iborra and Buhler, 1976; Klose, 1975; Scheele, 1975). ZEFU LAE, O'Farrell 发 表 了 用 于 分 离 大 肠 杆菌 的 2-DE 优化 方法 。 该 方法 在 一 维 利用 4%T、5%C 柱 状 PAGE BR, A 8mol/L 尿素 和 2% (m/V) NP-40， 在 二 维 利用 Laemmli (1970) 的 非 连续 SDS-PAGE 凝 胶 系 统 。 这 种 基于 电荷 分 离 〈 等 电 点 ， pl) 和 分 子 质量 大 小 分 离 (相对 分 子 质 量 ，M,.) 的 正 交 组 合 使 得 样品 蛋白 质点 分 布 于 整个 二 维 凝 胶 图 谱 上 。 过 去 25 年 来 大 部 分 2-DE 研究 都 以 该 方法 为 基础 ， 已 有 数 千 篇 相关 的 文献 发 表 。 第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 - 39 - 3. 固 相 pH 梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 二 维 电泳 对 于 蛋白 质 组 研究 来 说 ，2-DE 在 分 离 蛋白 质 时 必须 具有 高 的 重复 性 和 分 辨 率 。 不 入 前 这 仍 是 一 个 很 大 的 问题 ， 原 因 在 于 生成 IEF pH 梯度 的 合成 载体 两 性 电解 质 (syn- thetic carrier ampholyte, SCA) 的 特性 。SCA 是 通过 复杂 的 合成 过 程 得 到 的 ， 很 难 控 制 其 重复 性 ， 由 此 产生 相当 大 的 批 次 之 间 变 化 ， 限 制 了 2-DE 分 离 的 重复 性 。 可 能 更 为 重 要 的 是 ，SCA 分 子 相 对 较 小 ， 难 以 固定 在 IEF 胶 内 ， 因 此 在 IEF 过 程 中 由 水 引起 的 电 渗流 将 导致 SCA 分 子 向 阴极 迁移 。 这 种 被 称 为 “阴极 漂移 ”的 现象 将 导致 pH 不 稳定 。 当 利用 管状 IEF 胶 时 ， 由 于 玻璃 毛细 管 壁 上 负电 荷 基 团 的 作用 将 加 剧 阴 极 漂移 。 实 际 上 ， 在 采用 O"Farrell 方法 时 ，pH 梯度 很 少 超出 7 太 多 ， 所 带 来 的 后 果 则 是 碱 性 区 蛋 白 质 的 丢失 。 注 意 到 这 种 现象 ，0'" Farrell 变更 了 方法 ， 引 入 非 平 衡 pH 梯度 电泳 (non-equilibrium pH gradient electrophoresis，NEPHGE )， 用 2-DE 分 离 碱 性 蛋白 质 (O’ Farrell et wz .，1977)。 这 种 方法 在 快速 形成 的 pH 梯度 中 根据 蛋白 质 移动 能 力 进行 分 离 , 但 其 重 现 性 很 难 控 制 。 幸 运 的 是 ， 在 Immobiline 试剂 (Amersham Pharmacia Biotech) 基础 上 开发 的 固 相 pH 梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 技术 (Bijellqvist et al., 1982) 解决 了 这 个 问题 。 虽 然 早期 IPG 技术 在 2-DE 尝试 遇 到 很 多 问题 ， 但 它们 被 逐渐 克服 (Gorg et al., 1988, 2000) 并 使 得 IPG IEF 成 为 目前 在 蛋白 质 组 应 用 中 大 多 数 2-DE 首 选 的 方法 。 这 种 称 为 IPG-DALT 的 2-DE 方法， 将 在 本 章 详细 讨论 ， 最 近 的 一 篇 文章 也 对 SCA IEF 在 2-DE 中 的 应 用 进行 了 详细 讨论 (Monribot and Boucherie, 2000). 4. 样品 制备 由 于 2-DE 所 分 析 样 品 的 多 样 性 ， 没 有 一 种 制备 方法 可 以 普遍 适用 于 各 种 样品 ， 但 有 几 点 考虑 一 定 要 提出 : 很 有 必要 尽量 减少 可 能 在 2-DE BPS BARA (artifactual spot) 的 蛋白 质 修饰 ， 在 实验 中 ， 含 尿素 的 样品 一 定 不 要 加 热 ， 因 为 加 热 后 尿素 分 解 产 生 的 异 氰 酸 盐 可 能 对 蛋白 质 产 生 氨 基 甲 酰 化 修饰 从 而 引起 很 大 的 电荷 不 均一 性 。 此 外 ， 样品 中 的 蛋白 酶 可 以 很 容易 地 生成 假 点 ， 因 此 ， 样 品 处 理 步 又 应 尽量 少 并 保持 冷冻 环 境 。 样 品 中 可 以 加 入 和 蛋白酶 抑制 剂 的 混合 物 ， 但 切记 这 些 试剂 可 修饰 蛋白 ， 导 致电 荷 假 象 。 4.1 可 溶性 样品 可 溶性 液体 样品 如 血清 、 血 浆 、 尿 样 、 脑 脊 液 以 及 细胞 和 组 织 的 水 溶性 提取 物 ， 经 很 少 的 前 处 理 便 可 进行 2-DE 分 析 。 含 蛋白 质 浓度 较 高 的 样品 ， 如 血浆 和 血清 ， 可 用 适 量 样品 溶解 缓冲 液 ( 见 第 $ 部 分 ) 稀释 后 直接 分 析 。 但 是 ， 诸 如 白 蛋 白 和 免疫 球 蛋 白 一 类 的 高 丰 度 蛋白 质 在 2-DE 图 谱 上 常 干扰 其 他 表达 量 少 的 成 分 ， 将 这 些 高 丰 度 蛋白 质 去 除 可 以 克服 这 个 问题 (Dunn，1987; Lollo et wz: .，1999)， 但 同时 可 能 非特 异性 去 除 其 他 = AK. 其 他 类 型 的 液态 样品 可 能 含有 较 低 的 蛋白 质 浓 度 或 较 高 盐 浓 度 ， 将 会 干扰 IEF 时 蛋白 质 的 分 离 ， 这 种 样品 可 在 2-DE 分 离 前 用 透析 或 液 相 色谱 脱盐 ， 样 品 可 以 通过 并 Lin, 蛋白 质 组 学 干 、 对 聚 乙 二 醇 的 透析 或 用 TCA/ 丙 酮 沉 演 的 方法 进行 浓缩 。 研 究 发 现 TCA/ 丙 酮 沉淀 对 导致 重 白 酶 的 失 活 进而 减少 蛋白 质 降 解 非 常 有 用 ， 同 时 可 以 去 除 干扰 化 合 物 ， 富 集 极 碱 性 和 蛋白质， 如 从 全 细胞 裂解 液 中 富 集 核 糖 体 蛋白 (Gorg et al., 1997). 4.2 组 织 样 品 固体 组 织 样品 常 在 溶解 缓冲 液 〈 见 第 $ 部 分 ) 中 破碎 ， 最 好 的 方法 是 在 组 织 冷冻 及 液 氮 温 度 的 条 件 下 破碎 。 包 右 在 铝箔 并 贮存 于 液 氮 中 的 较 小 组 织 样品 ， 可 以 夹 在 两 个 冷 研 块 或 基体 中 间 用 桂 和 研 钵 在 液 氮 环 境 下 压 碎 ， 大 的 组 织 块 可 在 溶解 缓冲 液 中 用 旋转 叶 片 型 匀 浆 器 进行 匀 桨 处理， 但 尽量 避免 加 热 和 起 泡沫 。 组 织 样品 的 一 个 特殊 问题 是 样品 的 异 质 性 ， 组 织 样 品 和 来 源 于 疾病 的 样品 包含 许多 种 不 同类 型 的 细胞 ， 不 太 可 能 分 别 收集 组 织 的 疾病 区 域 和 非 疾 病 区 域 。 几 种 用 于 2-DE 分 析 的 方法 可 以 解决 这 个 问题 ， 通 常用 基于 免疫 亲 和 技 术 的 正 性 或 负 性 选择 ， 可 以 实现 对 特殊 细胞 群 的 富 集 ， 这 些 样品 可 以 直接 应 用 于 2-DE 分 析 或 是 在 2-DE 上 样 前 进行 短 期 培养 以 增加 细胞 数目 。 此 外 ， 微 量 切割 技术 可 用 来 从 组 织 切 片 中 获取 纯 的 细胞 群 ， 其 中 最 受 关 注 的 是 激光 俘获 微 切 割 (laser capture microdissection, LCM) 技术 (Simone et az .，1998)。 在 该 技术 中 ， 在 倒置 显微镜 下 将 激光 束 聚 焦 在 所 选择 的 组 织 切片 区 域 ， 用 激光 束 活 化 与 组 织 切 片 接触 的 转移 膜 来 选择 细胞 。 激 光束 准确 击 中 的 区 域 转移 膜 与 紧 贴 着 的 组 织 结合 在 一 起 ， 因 此 ， 可 以 将 这 些 组 织 中 细胞 从 周围 组 织 中 提取 出 来 。 可 以 用 PCR 技术 扩 增 这 些微 量 标 本 中 所 含 核酸 ， 所 以 LCM 技术 很 容易 地 应 用 到 核酸 分 析 中 。 与 此 对 应 的 ， 缺 乏 相 应 的 蛋白 质 扩 增 手 段 将 是 蛋白 质 组 分 析 中 LCM 分 离 细 胞 所 遇 到 的 主要 挑战 。 而 Banks 等 〈1999) 则 证 实 了 LCM 在 蛋白 质 组 分 析 中 的 应 用 ， 在 他 们 的 研 究 中 ， 通 过 对 一 例 正常 人 宫颈 表皮 组 织 切 割 分 析 ， 与 整个 组 织 切割 分 析 对 比 ， 结 果 显 示 午 出 一 些 蛋 白质 由 LCM 而 得 到 富 集 。 4.3 细胞 对 体外 悬浮 培养 生长 的 细胞 或 周期 性 细胞 样品 〈 如 红细胞 、 淋 巴 细胞 )， 理 想 的 方 法 是 通过 离心 收集 。 用 磷酸 盐 缓 冲 液 清 洗 并 溶 于 样品 缓冲 液 ( 见 第 5 Bot). WER 体 基 质 中 培养 的 细胞 ， 应 首先 去 除 培养 基质 ， 用 PBS 或 等 渗 底 糖 溶液 清洗 细胞 层 ， 后 者 是 减少 可 能 干扰 一 向 IEF 的 盐 的 特别 有 效 的 方法 。 然 后 通过 刮 擦 方法 收获 细胞 ， 但 应 避免 使 用 蛋白 裂解 酶 ， 或 者 ， 加 入 少量 体积 溶解 缓冲 液 ， 将 附着 在 基质 上 的 细胞 直接 裂解 。 如 果 细 胞 核酸 含量 过 高 而 导致 样品 黏度 太 大 时 ， 可 用 不 含 蛋白 质 酶 的 DNase/ RNase 混合 物 来 处 理 样 品 (Garrels, 1979). 4.4 样品 分 级 由 于 真 核 组 织 蛋白 质 表达 的 高 动态 范围 和 多 样 性 ， 有 时 必须 对 蛋白 质 进 行 分 级 处 理 ， 以 降低 样品 的 复杂 性 并 富 集 低 拷贝 蛋白 质 。 蛋 白质 预 分 级 可 以 用 亚 细 胞 分 级 、 液 相 电泳 、 吸 附 色谱 和 选择 性 沉淀 等 方法 来 实现 〈Corthals et ol.，2000)。 此 外 ， 还 有 一 种 方法 是 根据 蛋白 质 在 一 系列 溶解 能 力 逐 渐 增 强 的 缓冲 液 中 溶解 性 能 不 同 ， 而 实现 对 细胞 或 组 织 蛋 白质 的 分 级 提取 (Cordwell et al., 2000; Molloy et al., 1998). 第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 “ 41 - 5. 溶解 理想 的 2-DE 溶解 应 能 达到 破坏 所 有 非 共 价 结合 蛋白 质 复 合 物 和 聚积 体 ， 形 成 各 个 多 肽 的 溶解 液 。 如 果 不 能 达到 这 一 点 ， 样 品 中 结合 牢固 的 蛋白 质 复合 物 可 能 使 2-DE 中 出 现 新 的 蛋白 质点 ， 相 应 地 表示 单个 多 肽 的 点 强度 将 下 降 。 此 外 ， 溶 解 方法 必须 允许 可 能 干扰 2-DE 分 离 的 盐 、 脂 类 、 多 糖 和 核酸 等 物质 的 去 除 。 最 后 ， 样 品 中 蛋白 质 在 2-DE 过 程 中 必须 保持 可 溶性 。 鉴 于 上 述 原 因 ， 样 品 溶解 是 2-DE 成 功 分 离 蛋 白 质 的 最 关键 因 Ke =. 最 为 普遍 应 用 的 2-DE 蛋白 质 溶 解 方法 仍然 是 最 早 被 0" Farrell 所 描述 的 以 下 几 种 物 质 的 混合 液 (所 谓 “ 裂 解 缓 冲 液 ”"): 9.5mol/L 尿素 、4% (m/V) 的 NP-40、1% (m/V) 的 还 原 剂 二 硫 苏 糖 醇 (dithiothreitol, DTT) 以 及 2% (m/V) 相应 pH 范围 的 SCA。 该 配方 适用 于 许多 类 型 的 样品 ， 但 并 不 是 一 种 万 能 方法 ， 其 中 在 膜 蛋白 质 的 提取 上 就 对 此 方法 提出 了 挑战 (Santoni et wz .，2000)。 此 后 发 现 两 性 去 污 剂 CHAPS 可 以 有 效 溶 解 膜 蛋 白质 (Perdew et 邮 .，1983)， 特 别 是 在 浓度 为 4% (m/V), 5 2mol/L hit HRA 8mol/L 尿素 混合 物 共 用 时 (Molloy et al., 1998; Rabilloud et wz .，1997)。 硫 脲 是 一 种 比 尿素 具有 更 强 能 力 的 变性 剂 ， 但 由 于 其 水 溶性 差 ， 不 能 单独 使 用 ， 但 在 尿素 浓 溶 液 中 其 可 溶性 更 好 ， 因 此 尿素 - 硫 腺 混合 物 提高 了 溶解 样品 的 能 力 。 线 性 磺 基 三 甲 胺 乙 内 酯 (sulphobetaine) 去 污 剂 ， 如 SB3-10 或 SB3-12， 也 是 有 效 的 溶解 剂 ， 但 这 些 试剂 与 高 浓度 尿素 不 兼容 (Rabilloud et al., 1997), 4SEMILA2% (m/V) MRE Smol/L 尿素 、2mol/L HARA 2% CHAPS 结合 在 一 块 使 用 时 可 以 克服 这 些 困 难 (Herbert, 1999; Rabilloud et al., 1997). 去 污 剂 SDS 能 破坏 大 多 数 非 共 价 蛋 白质 相互 作用 ， 对 于 膜 蛋白 的 溶解 非常 有 效 ， 但 其 阴离子 特性 使 它 不 可 能 应 用 于 IEF 效 胶 。 但 是 ，SDS 可 用 于 2-DE 前 的 前 期 溶解 过 程 ， 在 该 方法 中 ， 样 品 首先 用 1% (m/V) SDS 溶 解 ， 然 后 用 常用 溶解 液 (如 裂解 液 ) 稀释 ， 目 的 是 为 了 用 非 离子 或 两 性 去 污 剂 从 蛋白 质 中 置换 出 SDS， 从 而 使 蛋白 质保 持 在 溶解 状态 。 为 了 有 效 地 溶解 样品 ， 并 减少 SDS 在 IEF 中 的 负 作 用 ， 必 须 认真 控制 蛋白 质 与 非 离子 或 两 性 去 污 剂 的 比例 (1:3) 及 SDS 与 非 离 子 或 两 性 去 污 剂 的 比例 (1:8) (Dunn, 1987). | 核酸 对 于 IEF 可 能 造成 的 问题 ， 是 因为 它 会 导致 样品 黏度 的 增加 且 在 某 些 情况 下 可 与 样品 蛋白 质 形 成 复合 物 ， 进 而 导致 假象 迁移 和 条 纹 的 出 现 。 如 果 怀 疑 上 述 问题 可 能 出 现 ， 最 好 向 样品 溶解 液 中 加 入 适当 纯 的 〈 不 含 蛋 白 酶 ) 内 切 核酸 酶 来 降解 核酸 ， 或 是 利用 SCA 和 核酸 结合 形成 复合 物 的 能 力 通过 超速 离心 来 去 除 复合 物 (Rabilloud et al., 1986). 6. 还 原 蛋白 质 二 硫 键 通常 用 DTT 或 B- 琉 基 乙 醇 等 含 自由 一 基 的 试剂 还 原 。 但 是 ，DTT 之 类 的 试剂 带电 ， 因 此 在 IEF 过 程 中 迁移 到 胶 外 ， 导 致 样品 蛋白 质 的 重 氧化 使 得 电泳 过 程 中 蛋白 质 溶解 性 丧失 ， 最 近 报 道 用 不 带电 荷 的 还 原 剂 如 三 正 丁 基 腾 取代 含 琉 基 试剂 大 大 增强 一 向 IEF 中 蛋白 质 溶解 能 力 ,并 使 得 一 维 到 二 维 转移 效率 提高 (Herbert et ne 蛋白 质 组 学 al., 1998; Herbert，1999 ) 。 7. 一 维 固 相 pH 梯度 等 电 聚焦 (IEF with IPG) IPG IEF 胶 用 Immobilines (Amersham Pharmacia Biotech) 制备 。Immobilines 是 拥 有 CH, 一 CH 一 CO 一 NH 一 R 结构 的 8 种 丙烯 酰胺 衍生 物 系 列 ， 其 中 R 包含 羧基 或 叔 氢 ZEA, Elam fae pH3~10 不 同 值 的 缓冲 体系 。 根 据 公 布 的 配方 计算 后 ， 将 适 宜 的 IPG 试剂 添加 至 混合 物 中 用 于 凝 胶 聚 合 ， 在 聚合 中 ， 绥 冲 基 团 通过 乙 烯 键 共 价 聚 合 至 聚 丙烯 酰胺 骨架 中 ， 形 成 pH 梯度 。 通 过 这 种 方式 生成 的 IPG， 不 会 发 生 电 渗透 作 用 ， 因 而 可 以 进行 特别 稳定 的 IEF 分 离 ， 达 到 真正 的 平衡 状态 。 最 初 的 IPG 技术 在 2-DE 分 离 中 的 应 用 遇 到 了 一 些 问题 (Garg et oz .，1988)， 幸 运 的 是 ， 这 些 问 题 现 在 已 经 解决 ， 并 使 IPG IEF 成 为 2-DE 中 一 维 所 选择 的 分 离 方法 (Garg et al., 2000). 7.1 IPG BRS Gorg (1988) 的 方法 如 图 3.1 所 示 。 首 先 ， 根 据 文献 中 广泛 的 配方 库 〈Garg et al., 2000), Pr pH 范围 的 IPG 平板 胶 在 GelBond PAGfilm (图 3.1b) ER, 后 ， 凝 胶 用 去 离子 水 全 面 冲洗 (6x10min)， 浸 入 在 2% (m/V) 甘油 中 (30min)， 室 温 下 在 洁净 橱 中 干燥 ， 然 后 用 塑料 膜 覆 盖 ， 如 果 凝 胶 不 立即 使 用 ， 可 在 - 20 忆 贮存 一 年 。 用 前 ， 用 切 纸 机 从 IPG 平板 胶 切 下 所 需 数目 的 干 胶 条 (图 3.1lc)。 此 外 ， 各 种 pH 范围 商品 化 的 预制 IPG 胶 条 可 从 Amersham PharmavialBioweh (Immobiline SryPlate 或 Immobiline DryStrip) 和 Bio-Rad (ReadyStrip) JA. ATA ARIK EA IPG 胶 条 ， 但 要 ithe, HRP K BRK, PHN E ARMA. 18 或 24cm MA (Garg et al., 1999) 通常 用 于 高 分 辩 分 离 ， 而 短 胶 条 (4cm，7cm 或 1lzem) 则 应 用 于 快速 筛选 。 有 大 BAF SEE pH 梯度 范围 条 件 可 供 选用 于 IPG IEF， 这 将 在 7.4 中 讨论 。 7.2 IPGREBAk 用 于 2-DE 时 ， 胶 条 应 该 置 于 重 泡 胀 池 (图 3.1d) FER 8mol/L 尿素 的 溶液 〈 或 2mol/L 硫 逐 和 Smol/L 尿素 ) 中 泡 胀 。 溶 液 其 他 成 分 为 0.5% 到 4% 非 离子 (NP-40， Triton X-100) 或 两 性 (CHAPS) #357], 15mmol/L DTT 和 0.5% 适 宜 范 围 的 pH 值 的 SCA。 然 后 将 胶 条 直接 放 在 水 平平 板 电泳 装置 的 冷却 板 表 面 (如 Multiphor，Amersham Pharmacia Biotech) (图 3.1g)。 另 外 一 种 便利 的 方法 是 用 Pharmacia 公司 的 泡 胀 托 架 (图 3.1h)， 这 种 托 架 用 波纹 塑料 板 塑造 ， 上 面 所 含 的 止 槽 正好 适 于 IPG 的 排列 摆 放 。 此 外 ， 该 设备 配备 有 带 有 电极 条 和 框架 (bar) 以 及 配备 加 样 杯 的 支架 ， 可 以 在 胶 条 表 面 任意 位 置 加 样 。 必 要 时 ， 可 以 将 托 架 用 硅油 覆盖 ， 以 在 IEF 时 保护 胶 条 使 之 不 受 大 气 影 响 。 在 2-DE 图 谱 碱 性 端 常 可 以 见 到 水 平 条 纹 ， 特 别 是 当 在 一 向 使 用 碱 性 IPG 梯度 时 ， 在 IPG 胶 表 面 沿 阴极 区 额外 释 加 一 个 用 20mmol/L DTT 浸泡 过 的 电极 条 ， 可 以 解 决 这 个 问题 (Garg et wj .，1995)。 该 方法 的 优点 是 ，IEF 时 胶 内 DTT 向 阳极 迁移 ， 从 阴极 区 外 加 电极 条 释放 出 来 的 DTT 可 以 不 断 进行 补充 。 另 外 一 种 避免 阴极 区 条 纹 的 方 法 是 利用 不 带电 荷 的 还 原 剂 TBP， 它 在 IEF 时 不 发 生 迁 移 ， 已 发 现在 IEF 中 TBP 可 以 大 大 提高 蛋白 质 的 溶解 能 力 ， 特 别 是 羊毛 蛋白 (Herbert et al., 1998; Herbert, 1999). 第 三 章 “蛋白质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 - 43° 图 3.1 IPG-Dalt 的 流程 (Gorg et al., 2000) (a) 在 塑料 支持 膜 上 聚合 IPG 及 SDS 胶 之 前 组 装 聚 合 槽 (SIAM, GelBond PAGfilm 支持 膜 ，0.5mm 厚 的 UH 框 )。(b) IPG -和 (或 ) SDS 梯度 多 孔 胶 的 聚合 。 (c) 清洗 并 干燥 后 的 IPG FARR (SK Immobiline DryPlates) 切 成 单个 的 IPG 胶 条 ， 单 个 IPG 胶 条 的 重 泡 胀 。(d) 在 垂直 重 泡 胀 模 内 泡 胀 。(e) 在 重 泡 胀 托盘 中 泡 胀 ， 以 及 (f) 在 IPGphor 胶 条 泡 胀 池 中 泡 胀 。 单 个 IPG 胶 条 的 IEF。(g) 直接 放置 在 IEF 配件 的 冷却 板 上 ，(h) 在 DryS- trip MF, WAR (i) 在 IPGphor 上 。(k) IEF 后 IPG 胶 条 的 贮存 。(1) SDS-PAGE 前 IPG 胶 条 的 平衡 。 平 衡 后 的 IPG 胶 条 转移 (m) 沿 阴极 电极 条 放置 在 自制 的 水 平 SDS 胶 表 面 (n) 或 沿 阴极 缓冲 条 放置 在 预制 SDS RRA. (o) 平衡 过 的 IPG 胶 条 放置 在 垂直 SDS 胶 上 。 7.3 加 样 和 运行 样品 通常 是 加 在 放置 在 IPG 胶 阳 极 区 或 阴极 区 的 硅 橡 胶 框 内 或 特殊 加 样 杯 内 (图 44 - 蛋白 质 组 学 3.1g，h)， 对 不 同类 型 的 样品 ， 最 好 的 加 样 位 置 由 经 验 值 确定 。 最 初 电 压 应 限制 在 150V、30min， 从 而 使 尽量 多 的 样品 进入 加 样 杯 ， 然 后 逐渐 增加 电压 至 3500 V。 运 行 时 间 决 定 于 几 个 不 同 的 因素 ， 包 括 样品 类 型 、 和 蛋白 上 样 量 、IPG 胶 条 长 度 及 所 用 pH 梯 度 。 因 为 温度 低 时 尿素 可 能 会 结晶 ，IEF 应 当 在 20C 运行 ， 不 同 的 温度 下 在 2-DE 图 谱 中 一 些 蛋 白质 点 的 相对 位 置 会 发 生变 化 (Garg et al., 1991), #3.1 中 列 出 了 一 些 典型 的 运行 条 件 。 表 3.1 利用 Multiphor 的 运行 条 件 (Garg et al., 2000) 胶 条 长 度 180mm 温度 20T = 最 大 电流 每 个 胶 条 0.05mA 最 大 功率 每 个 胶 条 0.2W 最 大 电压 3500V I 分 析 型 IEF 初始 化 IEF 加 样 杯 上 样 (20~50pl) 胶 内 泡 胀 (350pD) 150V, th 150V, ih 300V, 1~3h 300V, 1~3h 600V, ih 到 达 3500V 稳定 态 后 IEF 1~1.5 4 pH 单位 4 个 pH 单位 7 个 pH # fiz 如 IPGS~6 24h IPG4~8 10h IPG3~10L 6h 如 IPG4~5.5 20h IPG6~10 10h IPG3~10NL 6h 3 个 pH 单位 5~6 4 pH 单位 8~9 4 pH 单位 IPG4~7 12h IPG4~9 8h IPG3~12 6h IPG6~9 12h IPG6~12 8h IPG4~12 8h TMKABHEA (240mm) 到 达 3500V 稳定 态 后 IEF IPG3~12 8h IPG4~12 12h IPG5 一 6 40h 亚 微 量 制备 IEF 初始 化 IEF 加 样 杯 上 样 (100p1) BEA YAK (350p1) 50V, 12~16h 50V, 12~16h 300V, ih 300V, ih 到 达 3500V 稳定 态 后 IEF 相应 分 析 胶 IEF 时 间 延 长 约 50% 上 面 的 加 样 方法 会 导致 蛋白 质 沉 淀 ， 上 样 量 较 大 时 (lm KES) 更 为 显著 。 将 IPG 胶 条 直接 在 含 所 分 析 样 品 泡 胀 液 中 泡 胀 可 以 克服 这 个 问题 (Rabilloud et al., 1994; Sanchez et al .，1997)。 利 用 该 方法 可 以 成 功 分 离 很 高 样品 量 (>10mg)， 但 可 能 存在 高 分 子 量 蛋 白 、 极 碱 性 和 膜 蛋白 的 选择 性 丢失 。 最 近 研 制 成 功 的 集成 化 设备 IPGpher (Amersham Pharmacia Biotech)， 简 化 了 一 向 IPG IEF。 该 设备 的 特点 是 可 以 在 加 样品 或 不 加 样品 时 在 持 胶 器 (strip holder) 中 对 胶 条 进行 重 泡 胀 、 选 择 上 样 量 以 及 随后 的 IEF， 第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 访 45 ， 所 有 这 些 都 可 以 在 胶 条 放 入 容器 后 设置 程序 自动 进行 。 仪 器 可 以 同时 放置 12 个 持 胶 器 ， 并 配备 珀 尔 帖 (Peltier) 电子 晶体管 自动 冷却 装置 、 高 达 8000V 电压 的 程序 化 设置 和 1.5mA 的 电源 供应 (图 3.1i)， 表 3.2 列 出 一 些 利 用 IPGphor 的 典型 的 IPG IEF 运行 条 件 。 在 重 泡 胀 时 加 低 电 压 可 以 提高 高 分 子 质 量 蛋白 质 的 渗入 效率 。 适 用 于 胶 内 泡 胀 上 样 和 运行 一 向 IPG IEF 的 设备 也 可 从 Genomic Solutions (IPGpHaser) 和 Bio-Rad (Protean IEF cell) 获得 。 表 3.2 利用 IPGphor 的 运行 条 件 (Garg et al., 2000) RAKE 180mm 温度 20T 最 大 电流 每 个 胶 条 0.05mA 最 大 电压 8000V I 工 分析 型 IEF 重 泡 胀 。30V，12 一 16h 初始 化 IEF 。 200V, 1h * 500V, 1h 。 1000V, ih 达到 稳定 态 后 IEF 。 30min 内 由 1000V 梯度 上 升 至 8000V 。 8000V 达到 稳定 态 ， 依 所 用 胶 条 pH 间隔 而 定 1~1.5 4 pH 单位 4 个 pH 单位 7 个 pH 单位 MIPGS~6 8h IPG4~8 4h IPG3~10L 3h 如 IPG4~5.5 8h IPG3~10NL 3h 3 个 pH 单位 5 一 6 个 pH 单位 8 一 9 个 pH 单位 IPG4~7 4h IPG4~9 4h IPG3~12 3h IPG4~12 3h 开 微 量 制备 IEF 重 泡 胀 。30V，12 一 16h 达到 稳定 态 后 IEF 。 相应 分 析 胶 IEF 时 间 延 长 约 50% 7.4 IPG IEF pH 梯度 的 选择 对 一 新 样品 ， 和 常 最 先 使 用 宽 范 围 、 线 性 pH3.5~10 梯度 。 但 对 大 多 数 样 品 ， 这 样 做 会 丧失 pH4~7 区 域 的 分 辨 率 ， 许 多 蛋白 质 的 pI 值 在 该 区 域 。 利 用 非 线性 pH3.5 一 10 IPG IEF 胶 在 一 定 程 度 上 缓解 了 这 个 问题 (Bjellqvist et al., 1993). pH3.5~10 非 线 性 胶 条 在 pH4 ~7 区 域 的 梯度 要 比 pH7 一 10 更 为 平坦 ， 保 证 在 大 部 分 碱 性 蛋白 质 都 能 得 到 分 辨 的 前 提 下 ，pH4 一 7 区 域 能 得 到 更 好 的 分 离 (图 3.2)。 但 用 pH4~7 & IPG IEF 胶 则 能 在 该 范围 得 到 更 好 的 分 离 效 果 (图 3.3)。 这 些 pH 范围 的 胶 条 目前 已 经 商品 化 (Amersham Pharmacia Biotech，Bio-Rad)。 实 验 室 自 制 pH4~9 AY IPG 胶 也 能 覆盖 来 自 许多 不 同 种 类 样品 的 大 多 数 蛋白 质 。 这 些 梯度 的 IPG 胶 与 加 样 杯 上 样 或 胶 内 泡 胀 兼容 ， 在 Multiphor 和 IPGphor 系统 都 工作 良好 。 均 适用 于 分 析 胶 (上 样 量 50 一 100wg) 或 微 量 制备 胶 (ERE 1Img)。 典 型 运行 条 件 如 表 3.1 和 3.2 所 示 。 当 分 析 真 核 细 胞 提取 物 一 类 复杂 的 样品 时 ， 由 于 空间 分 辩 率 所 限 ， 而 且 高 丰 度 蛋白 质 存在 时 低 拷贝 数 蛋白 质 显 色 困难 ， 使 得 单一 宽 范 围 bH 梯度 IEF 只 能 显示 该 细胞 提取 物 全 蛋白质 组 的 一 小 部 分 。 可 以 克服 真 核 及 组 织 蛋白 质 表 达 高 动态 范围 和 多 样 性 问题 的 ‘ibe! 5 蛋白 质 组 学 图 3.2 80wg 心室 蛋白 质 的 2-DE 分 离 一 维 应 用 18cm 非 线性 pH3 一 10 IPG IEF 凝 胶 ， 二 维 为 21cm 12% SDS-PAGE 胶 。 银 染 检 测 。 顶 端 标 尺 显 示 一 维 IPG 胶 条 的 非 线 性 pH 范围 ， 由 此 可 以 估计 出 分 离 蛋 白 的 表 观 等 电 点 。M: 标 尺 用 以 估计 蛋白 分 子 质量 。 包 ia ia 图 3.3 80npg 心室 蛋白 质 的 2-DE 分 离 一 维 为 18cm 线性 pH4~7 IPG IEF SER, —4EA 21cm 12% SDS-PAGE 胶 。 银 染 检 测 。 顶 端 标 尺 显示 一 向 IPG 胶 条 的 线性 pH 范围 ， 由 此 可 以 估计 出 分 离 蛋 白 的 表 观 等 电 点 。M:; 标尺 用 以 估计 蛋白 分 子 质量 。 A=B ZARATH PHAR MR RRR Bik - 47 - 一 种 方法 是 进行 样品 前 期 分 级 (014.4). A>-MRMHA REA RA RSE TH IPG HER, FREE 1~1.5pH Bf, HAVER A “BOK” (zoom gel) (Wildgruber et al., 2000). # ARK EAA (subproteomics) (Cordwell et al., 2000). WK, 也 可 用 24cm 的 宽 胶 条 (Garg et al., 1999). pH4~7 < lea] AY 72 VE El Be FY FD PBN ik BK 加 样 杯 上 样 ， 在 Multiphor 或 IPGphor 仪器 上 运行 (13.4). HERR TUL G2 8 上 样 量 微量 制备 的 理想 选择 ， 但 制备 胶 需 要 加 长 聚焦 时 间 “\ 见 表 3.1 和 表 3.2)。 3.4 鼠 肝 蛋白 质 的 微量 制备 IPG-Dalt 一 维 : IPG 5 一 6〈 预 制 胶 )。 分 离 距离 18cm。 胶 内 泡 胀 法 上 样 (S00ng). IEF 在 IPGphor 上 运行 。 条 件 : 8000V 最 大 电压 下 12h ( 详 见 表 1)。 二 维 : 垂 直 SDS-PAGE(13% T EE). RE. 强 碱 性 蛋白 质 如 核糖 体 和 核 蛋白 的 pl 值 在 10.5 到 11.8 之 间 ， 可 以 用 pH10~12 或 pH9~12 30 IPG (图 3.$; Gorg et al., 1997) 分 离 ， 要 获得 高 重复 性 的 2-DE 图 谱 ， 必 须 对 pH 梯度 生成 和 凝 胶 组 成 进行 不 同 的 优化 ， 如 用 N，N“ -二 甲 基 丙 烯 酰胺 取 RARE, FFE IPG 泡 胀 液 中 加 入 异 丙 醇 ， 从 而 抑制 容易 导致 大 量 胶 上 条 纹 的 反 辐 FAB (Gorg et 迟 .，1997)。 必 须要 用 加 样 杯 在 阴极 上 样 ， 且 IEF 要 在 硅油 下 进行 。 从 基因 组 序列 (Link et al., 1997) 计算 获得 的 理论 2-DE 图 谱 显 示 全 细胞 裂解 所 获得 的 大 部 分 蛋白 质 等 电 点 在 pH4 一 9， 但 同时 相当 一 部 分 蛋白 质 等 电 点 可 以 达到 pH12。 在 经 典 2-DE 中 这 些 蛋 白质 只 能 用 NEPHGE 分 离 ( 见 3)， 但 用 IPG IEF 很 容易 将 这 些 蛋 白质 分 开 。 具 体 作 法 是 用 上 文 所 提 到 的 窗 范 围 pH10 一 12 或 pH9 一 12 的 IPG， (AA ST BREET AMAR ARAN SR, Bscils BR pH3 一 12 pH4~12 的 宽 范 围 IPG (Garg et al .，1998，1999)。 目 前 已 获得 细胞 和 组 织 提取 及 TCA/ 丙 酮 沉淀 蛋白 质 时 通常 在 裂解 缓冲 液 提 取 中 缺失 的 pl 值 大 于 10 的 碱 性 蛋白 质 (Garg et al., 1998, 1999) 以 及 肺 支 原 体 中 不 溶 于 Triton X-100 的 细胞 成 分 (Hermann et al., GT ie 蛋白 质 组 学 IPG9-12 Da -30 -20 图 3.5 鼠 肝 极 碱 性 蛋白 (TCA/ 丙 酮 沉淀 ) 的 分 析 型 IPG-DALT (Garg et al., 1997) 一 维 : IPG9-12 (5000V 最 大 电压 8h) 。 分 离 距离 18cm。 在 阳极 端 用 加 样 杯 上 样 。 二 维 : 垂直 SDS-PAGE (13%T ES). BIR. fa) 的 良好 的 2-DE 图 谱 。 此 外 ， 在 pH9 和 pHI12 间 含 一 个 平缓 区 的 pH4 一 12 IPG 可 以 对 如 核糖 体 和 蛋白 质 类 强 碱 性 蛋白 质 获 得 极 好 分 离 (Garg et al .，1998)。 这 些 宽 梯 度 可 以 在 不 含 异 丙 醇 的 标准 条 件 下 运行 ， 因 为 此 时 超过 pHI10 hs IPG 胶 中 水 合 离子 向 阴极 的 强烈 转移 〈 反 向 电 渗 ) 特性 可 以 忽略 不 计 。 此 外 ， 高 分 子 质量 蛋白 质 的 渗入 和 聚焦 也 得 到 了 明显 改善 (图 3.6)。 利用 经 典 OFarrell 系统 可 以 在 宽 分 离 距离 (每 个 方向 上 超过 30cm) 上 获得 复杂 和 蛋 白质 谱 的 最 大 分 辨 率 (Klose，1999)。 但 是 ， 若 用 IEF 管 胶 技术 ， 其 成 功 则 伴随 着 凝 胶 操作 和 处 理 过 程 中 方便 性 的 丧失 。 与 此 对 比 ， 在 塑料 支持 膜 上 聚合 的 长 IPG 胶 的 处 理 不 需要 特殊 注意 之 处 。 如 覆盖 pH3~12 和 pH4 一 12 范围 的 24cm IPG 胶 条 已 成 功 使 用 (图 3.6; Gorg et al .，1999)。 此 外 ， 利 用 罕 范 围 pH fH (如 pHS~6) 的 24cm 长 IPG 胶 条 可 以 获得 高 分 辨 2-DE 图 谱 (图 3.7)。 7.5 聚焦 时 间 的 优化 理论 上 讲 ， 要 获得 最 好 的 图 谱 质 量 和 重复 性 所 需 最 佳 时 间 是 IEF 分 离 达到 稳定 态 所 需 的 时 间 (Garg et wl .，1988，1997) 。 若 聚焦 时 间 太 短 ， 会 导致 水 平和 垂直 条 纹 ， 但 要 避免 过 度 聚 焦 。 虽 然 与 经 典 O" Farrell 法 相 比 ， 不 会 导致 蛋白 质 向 阴极 的 迁移 (阴极 漂移 )， 但 却 会 因为 活性 水 转运 而 导致 过 多 水 在 IPG 胶 表 面 渗 出 〈( 电 渗 )， 会 造成 蛋 自 图 谱 变 形 。 在 胶 条 碱 性 端 产生 水 平 条 纹 以 及 蛋 白质 丢失 。 最 佳 聚焦 时 间 必 须根 据 不 同 蛋 白质 样品 、 和 蛋白 上 样 量 和 所 用 特定 pH 范围 及 IPG 胶 条 长 度 通 过 经 验 来 确定 。 作 为 指 第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 - 49 - cm 图 3.6 Gérg (1999) 加 长 距离 的 宽 范 围 IPG 鼠 肝 蛋白 质 的 分 析 型 IPG-Dalt (有 裂解 缓冲 液 提 取 )。 一 维 : IPG3 一 12。 分 离 距 离 24cm。 阳极 端 加 样 杯 上 样 。 运 行 条 件 : 3500V 最 大 电压 6h ( 见 表 1)。 二 维 : 垂直 SDS-PAGE (13% 工 连续 胶 )。 银 染 。 IPG 5-6 ~ 24cm 图 3.7 MK ERR 72 ve Hl IPG 根据 Gorg F (2000) 的 鼠 肝 蛋白 质 (MRE) 的 分 析 型 IPG-Dalt。 一 维 : IPGS~6 (实验 室 自 制 )。 分 离 距 离 24cm。 阳 极端 加 样 杯 上 样 。 运 行 条 件 : 3500V 最 大 电压 40h ( 见 表 1)。 二 维 : HEH SDS-PAGE (13%T 连 续 胶 )。 银 染 。 - 50 . 蛋白 质 组 学 导 ， 表 3.1 和 表 3.2 Aik FHM ASIA RAZ pH 范围 IPG 的 优化 聚焦 时 间 。 8. 两 维 间 平衡 在 一 维 IPG IEF 后 ， 胶 条 可 马上 用 于 二 维 ， 也 可 保存 在 两 片 塑 料 膜 间 于 - 80YC 存 放 几 个 月 时 间 。 在 二 维 分 离 前 ， 必 须要 平衡 IEF 胶 ， 以 便于 被 分 离 蛋 白质 与 SDS 完整 结合 ， 从 而 在 SDS-PAGE 过 程 中 正常 迁移 (图 3.11)。 建 议 方案 是 将 IPG IEF RE 50mmol/L Tris 缓冲 液 ，pH8.8， 含 2% m/V SDS，1% m/V DTT, 6mol/L 尿素 和 30% 甘 油 中 孵育 1Smin， 尿 素 和 甘油 是 用 于 减缓 电 渗 效 应 ， 否 则 会 使 一 维 到 二 维 的 蛋白 质 转移 率 降低 (Gorg et al! .，1988)。 接 下 来 同样 是 在 缓冲 液 中 平衡 13min， 只 不 过 此 时 用 5% m/V 碘 乙 酰胺 取代 DTT， 这 一 步 是 用 来 烷 基 化 自由 DTT, BMA DTT 在 二 维 SDS-PAGE 胶 迁 移 ， 会 产生 点 条 纹 的 假象 ， 在 银 染 后 可 以 观察 出 来 。 另 外 一 种 方法 ， 可 以 一 步 完 成 平衡 ， 是 在 平衡 液 中 用 Smmol/L TBP 取代 DTT, TBP 不 带电 荷 ， 在 SDS-PAGE 过 程 中 不 迁移 (Herbert et al .，1998)。 平 衡 后 上 二 维 胶 之 前 ，IPG 胶 应 沿 边缘 用 滤纸 吸 干 lmin 以 去 除 多 余 液 体 。 9. 二 维 SDS-PAGE 2-DE 第 二 维 最 常用 的 是 Laemmli (1970) 非 连续 缓冲 体系 ， 二 维 胶 是 单一 浓度 或 含 线性 或 非 线 性 梯度 的 凝 胶 ， 其 覆盖 范围 可 以 使 不 同 分子 质 量 大 小 蛋白 质 得 到 有 效 分 离 。 由 于 IPG 胶 黏 合 在 弹性 塑料 支持 膜 上 ， 其 处 理 要 比 用 经 典 OFarrell 体系 中 脆性 IEF 管 胶 容易 。 平 衡 后 ，IPG 胶 条 可 直接 加 在 二 维 SDS-PAGE 胶 的 表面 ， 其 方式 可 以 是 #26 (3.1m, n) KF (图 3.1lo)。 水 平 SDS-PAGE 可 利用 预制 胶 (ExcelGel, Amersham Pharmacia Biotech) 或 依据 Garg (1988) 所 描述 的 超 薄 孔 状 梯 度 胶 在 GelBond PAGfilm (Amersham Pharmacia Biotech) 上 自制 平板 胶 上 运行 。 必 须要 用 6%T 的 浓缩 胶 ， 然 后 是 均一 (如 12% ) 或 梯 度 (412% ~15%) 分 离 胶 ， 该 方法 在 Garg 等 (2000) 中 有 详细 描述 。 水 平 二 维系 统 的 优点 是 凝 胶 附 着 在 塑料 支持 膜 上 ， 在 染色 过 程 中 可 以 防止 凝 胶 大 小 发 生变 化 。 此 外 ， 由 于 水 平 胶 厚度 减少 (一般 在 0.Smm， 而 垂直 胶 为 1 或 1.Smm)， 因 而 可 以 施加 较 高 电 压 ， 减 短 运行 时 间 ， 减 少 蛋白 质 扩 散 ， 使 得 水 平 胶 分 离 蛋白 质点 的 边缘 要 比 垂直 胶 清 晰 。 大 规模 蛋白 质 组 分 析 通常 需要 成 批 二 维 SDS-PAGE 同时 电泳 以 获得 最 好 的 图 谱 重 复 性 。 此 外 ， 凝 胶 格 式 需 与 计算 机 控制 的 机 器 人 切割 设备 匹配 ， 用 多 块 胶 垂直 二 维 . SDS-PAGE 设备 如 DALT 系统 (Amersham Pharmacia Biotech) (Anderson and Anderson, 1978a, b), Investigator (Genomic Solutions) (Patton et al., 1990) 或 Protean II xi (Bio-Rad) 可 以 满足 大 规模 蛋白 质 组 分 析 的 需求 。 在 垂直 电泳 系统 中 不 需要 浓缩 胶 ， 因 为 在 IPG 胶 条 中 和 蛋白质 区 已 得 到 浓缩 ， 可 以 认为 非 限 制 性 TEP RE 〈 低 浓度 聚 丙烯 酰胺 We) 充当 了 浓缩 胶 (Dunn, 1993). 10. 分 辨 率 2-DE 的 分 离 能 力 取决 于 在 两 维 上 的 长 度 ， 通 常 认为 与 有 效 的 分 离 面积 成 正比 。 利 第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 St。 用 18cm 长 的 IPG IEF 与 20cm 长 二 维 SDS-PAGE 胶结 合 ， 对 于 全 细胞 和 组 织 裂 解 物 所 获得 的 蛋白 混合 物 ， 可 以 很 轻易 分 离 得 到 2000 个 点 。 利 用 小 胶 只 能 得 到 几 百 个 蛋白 质 点 ， 但 小 胶 运 行 时 间 较 短 ， 可 用 于 快速 盘 选 。 对 特别 复杂 的 样品 ， 要 获得 最 大 分 辩 率 ， 用 特大 胶 可 以 从 全 细胞 裂解 液 中 分 离 得 到 $S000 一 10 000 个 蛋白 质点 〈Klose，1999)。 但 利用 多 块 重 释 窗 范 围 放 大 IPG 胶 来 生成 复杂 样品 的 复合 2-DE 蛋 日 图 谱 具 有 明显 优势 ( 见 7.4). 11. 重复 性 直到 最 近 重 复 性 仍然 是 限制 2-DE 广泛 应 用 的 主要 问题 。 利 用 经 典 O?Farrell 管 胶 技 术 ， 即 使 在 同一 实验 室内 要 获得 特定 类 型 样品 的 重复 性 分 离 也 很 困难 。 在 不 同 实验 室 之 间 所 获得 的 2-DE 图 谱 间 比较 更 不 可 能 。2-DE 的 专门 设备 如 ISO-DALT 和 Investigator 系统 可 以 在 重复 性 控制 条 件 下 同时 运行 大 量 数目 的 电泳 (5 一 20 块 ) 缓解 了 这 个 问题 。 更 为 重要 的 是 ， 不 同类 型 样品 (OOM, KA, BR) 实验 室 间 研究 明确 证 实 利 用 IPG IEF 所 获得 的 2-D 蛋白 分 离 具有 很 高 的 空间 位 置 和 定量 重复 性 (Blomberg et al., 1995; Corbett et al., 1994). 12. 展望 蛋白 混合 物 的 重复 性 高 分 辩 分 离 是 一 个 成 功 的 蛋白 质 组 学 研究 的 关键 。 虽 然 最 近 对 蛋白 质 组 学 中 蛋白 分 离 的 可 替代 方法 的 研究 有 所 进展 〈 见 1 和 第 十 章 )， 但 仍然 没有 实 用 的 方法 可 替代 2-DE 能 同时 分 离 和 显现 混合 物 中 几 千 个 和 蛋白质。 与 基于 SCA 产生 的 pH 梯度 的 经 典 O'Farrell 2-DE 方法 相 比 ，IPG IEF 2-DE 更 加 灵活 ， 能 满足 蛋白 质 组 分 析 的 需求 ， 特 别 是 高 至 pH12 的 碱 性 IPG 方便 了 极 碱 性 蛋白 的 分 析 。 重 用 罕 范围 IPG， 允许 低 丰 度 恒 昌 的 更 高 分 辩 率 的 分 离 分 析 ， 预 制 IPG 胶 条 的 应 用 和 集成 化 运行 设备 如 IPGphor 使 2-DE 向 自动 化 方向 前 进 了 一 步 ， 虽 然 2-DE 的 自动 化 是 蛋白 质 组 学 中 一 个 关 键 问题 ， 但 在 实际 中 要 设计 能 完成 整个 过 程 的 自动 化 系统 是 不 可 能 的 。 实 事 上 ， 和 蛋白 质 组 流程 中 一 个 主要 的 瓶颈 效应 是 2-D 凝 胶 图 像 的 分 析 和 数据 开发 ， 在 该 领域 的 自动 化 和 效率 的 提高 可 能 会 对 蛋白 质 组 项 目 产生 最 大 的 影响 (Lopez，2000)。 目 前 ， 限 制 性 因素 依然 是 朴 水 蛋白 及 膜 蛋白 的 分 析 、 以 及 灵敏 和 可 靠 的 蛋白 质 定 量 方法 的 缺乏 ， 即 使 最 近 在 荧光 染料 技术 的 进展 为 解决 这 个 问题 指出 了 一 个 方向 (Patton，2000)。 总 之 ， 虽 然 2-DE 技 术 并 不 完美 ， 但 在 目前 和 相当 长 的 一 段 时 间 内 ， 它 将 仍然 是 蛋白 质 组 项 目 中 分 离 蛋 白 混 合 物 所 要 选择 的 核心 技术 。 (BA HF Riles 校 ) a 蛋白 质 组 学 参考 文献 Anderson, N.G. and Anderson, N.L. 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Patton 本 章 主要 概括 当前 应 用 于 凝 胶 电 泳 和 电 转 印 的 全 蛋白 质 呈 现 技术 ， 特 别 是 这 些 技术 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 适用 性 ， 蛋 白 质 显 色 技 术 发 展 简 史 如 表 4.1。 已 有 许多 不 同 的 关 于 胶 内 和 膜 上 蛋白 质 显 色 的 精彩 的 综述 性 文章 和 比较 学 研究 ， 有 兴趣 的 读者 也 可 以 参阅 文献 (Brush, 1998; Dunn, 1999; Fernandez-Patron et al., 1998; Fowler, 1994; Li ez al., 1989; Merril, 1987;- Neuhoff et al., 1985; Patton et al., 1999a, b; Rabilloud, 1990; Rabilloud et al., 1994; Wirth and Romano, 1995). 年 代 1950 1952 1063 1965 1967 1969 1971 1972 1972 1974 1978 1979 1980 1980 1981 1982 1983 1985 1985 1985 1987 1988 1988 1991 1992 # 4.1 开发 者 Durrum Grassman and Hannig Fazakas de St. Groth et al. Meyer and Lamberts Chrambach et al. Hartman and Udenfriend Talgot and Yphantis Diezel et al. Kerenyi and Gallyas Wallace et al. Graham et al. Switzer et al. Hager and Burgess Oakley et al. Merril et al. Zapolski et al . Hancock and Tsang Neuhoff et al. Rohringer and Holden Moeremans et al. Lee et al. Dzandu et al. Jackson et al. Daban et al. Ortiz et al. 凝 胶 电 泳 和 转 膜 蛋白 质 显 色 染色 试剂 50 年 简 史 染料 类 型 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 荧光 团 有 机 荧光 团 有 机 染料 大 事 记 在 滤纸 上 用 溴 酚 蓝 染色 在 滤纸 上 用 氨基 黑 染 色 醋酸 纤维 素 膜 、 琼 脂 糖 或 淀粉 胶 的 考 马 斯 蓝 R-250 染色 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 (PAGE) 的 考 马 斯 蓝 R-250 染色 PAGE 胶 用 考 马 斯 蓝 R-250 在 三 氯 醋酸 溶液 中 无 背景 染色 利用 苯胺 蔡 磺 酸 盐 对 蛋白 质 琉 水 位 点 的 非 共 价 染色 凝 胶 电 泳 前 用 丹 磺 酰氯 共 价 衍生 蛋白 质 三 氯 醋酸 溶液 中 考 马 斯 蓝 R-250 改善 后 凝 胶 无 背景 染色 。 注意 到 染料 转化 为 胶体 琼脂 糖 胶 中 和 蛋白质 基 于 铁 氨 化 钾 的 组 织 化 学 银 染 SDS 胶 冷 却 以 沉淀 去 污 剂 、 净 化 蛋白 区 凝 胶 的 亚 铁 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 染色 利用 连续 碱 性 和 酸性 银 染 步骤 对 PAGE REE 用 KCI BEAT HER A 基于 组 织 化 学 的 PAGE 胶 银 染 (PRYE/ FRI AK) RELA. EF (SH PAGE RAR (酸性 /硝酸 银 法 ) 凝 胶 的 放射 性 、 亚 铁 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 染 色 转 膜 蛋 白质 的 印度 墨水 染色 〈 胶 体 金 染 色 的 先驱 ) 证 实 胶体 考 马 斯 蓝 的 胶体 属性 ， 确 定 多 种 酸 / 乙 醇 混 合 物 的 化 学 式 转 膜 蛋 白质 的 胶体 金 染色 转 膜 蛋白 质 的 高 灵敏 度 胶体 金 、 铁 和 银 染 胶 内 蛋白 质 的 氯 化 铜 负 染 胶 内 蛋白 质 的 氯 化 锌 负 染 在 等 电 聚 焦 胶 内 用 MDPF 共 价 术 生 蛋白 质 ， 进 一 步 二 向 分 离 利用 尼 罗 红 对 PAGE 胶 内 蛋白 - SDS RA WRI 高 灵敏 度 氯 化 锌 /咪唑 负 染 - 56° 蛋白 质 组 学 续 表 年 代 开发 者 染料 类 型 大 事 记 1994 Patton et al. SRBCE 比 色 法 、 锌 铁 - 亚 铁 金属 整合 盐 染 色 (硝酸 纤维 素 ，PVDF) 1996 Steinberg et al. 有 机 荧光 团 利用 SYPRO Red 和 Orange 的 蛋白 - SDS RAW ies R BE Fe Jt 1997 Lim et al. RHERBCH RHADIEAKI BRERA (硝酸 纤维 素 ，PVDF， PAGE 胶 )。SYPRO Rose 染料 1997 Unlu et al. 有 机 荧光 团 两 个 蛋白 样品 用 两 基 -Cy3 和 甲 基 -Cy5 染料 分 别 衍生 并 在 同 一 2-DE 胶 上 同时 显 色 1999 Berggren et al. RHERBBCH BRHERFRHEAMHSRBCREA (硝酸 纤维 素 ， PVDF, PAGE 胶 )。SYPRO Ruby 染料 ~ 2. 有 机 染料 和 银 染 FAP SR Pa Hs Bt ER Hk (PAGE) 分 离 蛋 白质 常规 检测 和 定量 的 最 普遍 方法 是 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 (Brush，1998; Merril, 1987; Wirth and Romano，1995)。 测 序 技术 和 质谱 灵敏 度 的 提高 使 蛋白 质 显 色 的 地 位 从 简单 的 显 色 试 剂 转换 为 集成 化 的 蛋白 质 微 量 化 学 表征 过 程 中 的 关键 步骤 。 随 着 高 灵敏 度 蛋 白质 分 析 方 法 和 电泳 后 鉴定 技术 的 结合 ， 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 用 于 蛋白 质 组 研究 的 局 限 性 日 益 暴 露出 来 。 2.1 有 机 染料 自 20 世纪 60 年 代 早 期 传统 考 马 斯 蓝 染 色 技 术 在 甲醇 和 栈 酸 水 溶液 中 用 于 PAGE 胶 染色 后 ， 即 得 到 广泛 应 用 (Fazekas de St. Groth et al., 1963; Meyer and Lamberts, 1965)。 至 少 已 偿 试 了 600 种 关于 PAGE 胶 考 染 染色 的 线性 和 检测 灵敏 度 的 不 同方 法 (Neuhoff et wz .，1985)。 考 马 斯 蓝 染 料 可 以 检测 到 30~100ng 蛋白 质 ， 但 其 灵敏 度 远 低 于 银 染 或 荧光 检测 (Brush, 1998). 胶体 考 马 斯 蓝 应 用 于 PAGE 胶 分 离 蛋白 质 的 无 背景 检测 可 能 是 考 染 方法 中 最 有 意 义 的 进展 (Chrambach et al., 1967; Diezel et al., 1972; Neuhoff et al., 1985, 1988). 酸性 紫 17、Serva 紫 49 和 坚 牢 绿 PCF 等 相关 染料 也 可 在 强酸 性 溶液 中 形成 胶体 ， 检 测 PAGE 胶 内 和 蛋白质 ， 且 只 产生 很 低 的 背景 (Neuhoff et al., 1990; Patestos et al., 1988)。 估 计 其 染色 机 制 是 因为 在 胶体 染料 和 溶液 中 自由 扩散 的 染料 间 形 成 平衡 态 ， 少 量 溶液 自由 染料 穿 透 凝 胶 基质 ， 有 选择 性 地 对 和 蛋白质 染色 ， 而 胶体 染料 排 阻 在 胶 外 ， 阻 止 了 背景 生成 (Brush, 1998; Neuhoff et wz .，1988)。 胶 体 考 马 斯 蓝 检测 蛋白 质 的 极限 = 8~10ng (Brush，1998)。 染 色 过 程 通常 是 在 高 浓度 的 三 氯 醋酸 、 高 毛 酸 或 磷酸 中 进 行 ， 并 辅 以 甲醇 或 乙醇 。 质 谱 对 蛋白 质 修 饰 的 研究 表明 用 含 三 氯 醋酸 和 乙醇 的 考 马 斯 蓝 染色 的 蛋白 质 易 导 致 谷 氨 酸 羧基 侧 链 的 不 可 逆 酸 催化 酯 基 化 (Haebel et wz .，1998)。 这 样 就 使 所 得 肽 谱 数 据 复杂 化 ， 但 也 可 通过 在 分 析 软 件 中 加 入 算法 来 考虑 这 种 修饰 。 氨基 黑 是 最 早 应 用 于 蛋白 质 电泳 后 显 色 的 有 机 染料 (Grassman and Hannig, 1952). 现在 常用 于 中 度 灵 敏 度 聚 偏 二 氟 乙 烯 (PVDF) 和 硝酸 纤维 素 膜 的 电 转 印 蛋 白质 比 色 检 it] (Dunn，1999)。 虽 然 氮 基 黑 和 考 马 斯 蓝 都 可 用 于 显 色 电 转 印 蛋 白质 ， 但 考 马 斯 蓝 特 第 四 章 “” 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 有 蛋白质 的 检测 “5 异性 地 染色 硝酸 纤维 素 膜 ， 因 而 会 产生 高 背景 ， 但 是 ， 改 进 后 的 硝酸 纤维 素 膜 上 蛋白 质 低 背 景 染 色 程 序 可 能 会 使 考 马 斯 蓝 染料 得 到 有 效 的 利用 (Metkar et al! .，1995)。 两 种 染 色 方 法 都 适用 于 PVDF 膜 上 和 蛋白质 检 测 ， 虽 然 它 们 与 下 游 微量 化 学 表征 兼容 ， 但 常 干 扰 随后 的 免疫 检测 和 照 像 备份 程序 (Eynard and Lauriere, 1998; Pryor et al., 1992). 一 个 方法 是 在 免疫 检测 前 先 脱色 (Pryor et al., 1992), BAG aie we UL Bl — 体 和 比 色 底 物 如 坚 牢 红 / 蔡 酚 AS MX 磷酸 盐 或 5-TR-4-SA M5] ie eR ah / A PRA 马 斯 蓝 染 料 检测 全 蛋白质 可 以 同时 显 色 特 异性 蛋白 质 (Zeindl-Eberhart et al., 1997). 该 方法 特点 是 双向 电泳 时 需要 大 的 上 样 量 (400wg)， 必 须 用 PVDF 膜 进 行 转 印 ， 而 且 所 检测 的 目标 蛋白 质 丰 度 要 相当 的 高 。 目 前 ， 这 种 双色 显 色 程 序 必 须 针 对 每 一 样品 进行 逐一 条 件 摸索 ， 以 确定 是 否 适 用 于 目标 蛋白 质 的 检测 。 2.2 Ra 银 染 的 根源 可 以 追溯 到 19 世纪 初 所 开发 的 照相 术 及 组 织 学 技术 (Merril, 1987; Merril et al., 1984; Rabilloud, 1990). Kerenyi 和 Gallyas (1972) 首先 设计 一 种 通用 的 针对 电泳 、 免 疫 电 泳 和 免疫 扩散 的 蛋白 质 银 染 检测 方案 ， 其 检测 灵敏 度 报道 比 氨基 黑 高 ， 但 该 方案 只 是 优化 用 于 琼脂 糖 而 非 PAGE 胶 。 此 法 随后 得 到 提高 并 在 琼脂 糖 凝 胶 分 离 DNA 和 和 蛋白质 中 均 显 示 良 好 的 灵敏 度 (Peats，1984)。PAGE RTA BARR RE 在 首次 琼脂 糖 胶 方 法 7 年 后 引入 的 (Switzer et wz .，1979)。 据 报道 新 方法 灵敏 度 至 少 比 考 马 斯 蓝 高 100 倍 ， 由 此 使 银 染 成 为 一 项 创新 性 的 蛋白 质 检测 技术 ， 其 动态 线性 范围 -扩展 到 40 倍 浓 度 。 因 此 完全 可 以 和 有 20 倍 线性 范围 的 考 马 斯 蓝 染 色 对 比 (Dunn, 1987)。 银 染 技 术 的 引入 ， 使 蛋白 质 检 测 的 灵敏 度 由 微克 级 升 为 纳 克 级 〈 除 了 早期 胶体 考 马 斯 蓝 高 灵敏 度 染 色 ) 。 已 报道 100 多 种 银 染 方法 (Rabilloud，1992 )， 个 巨大 数字 也 证 明了 一 个 事实 ， 即 没有 一 种 方法 能 集 便 利 、 快 速 和 高 灵敏 度 为 一 体 tt 1992，1999)。 许 多 银 染 方法 所 拥有 的 一 个 缺点 是 对 某 些 种 类 蛋白 质 如 钙 结 合 蛋白 质 和 糖 蛋 白 ， 染 色 效 果 相 当 差 (Jay et al., 1990; Schleicher and Watterson, 1983; Wirth and Romano，1995$)。 研 究 发 了 对 于 糖 蛋白 来 说 ， 银 染 的 强度 与 分 子 质 量 组 成 中 糖 类 所 占 的 比例 负 相关 (Jay et ，1990)。 在 银 染 前 用 阴离子 染料 对 蛋白 质 预 染 色 可 以 很 好 的 改善 糖 蛋 日 的 检测 人 and Bezard, 1982; Jay et al., 1990). 银 染 虽 可 检测 低 纳 克 级 的 蛋白 质 ， 但 银 离子 可 与 半 胱 氨 酸 残 基 相 互 作用 ， 而 且 银 染 中 用 了 成 二 醛 和 甲醛 ， 这 两 者 会 对 蛋白 质 的 和 es -氨基 进行 烷 基 化 。 这 样 妨碍 了 胶 上 蛋白 质 Edman 蛋白 质 测序 的 进一步 分 析 。 虽 然 去 除 成 二 醛 后 ， 蛋 白质 可 用 质谱 分 析 来 鉴定 (Christiansen and Houen, 1992; Shevchenko et al., 1996; Wilm et al., 1996), {BH 这 种 改变 的 程序 也 伴随 着 银 染 灵敏 度 和 均一 性 的 降低 以 及 凝 胶 背 景 的 升 高 。 利 用 这 种 修 改 后 的 银 染 程序 ， 肽 质量 指纹 谱 中 的 低 序 列 覆 盖 率 抵消 了 银 染 相对 于 考 染 和 锌 - 喀 哗 染 色 的 高 检测 灵敏 度 (Scheler et al .，1998)。 估 计 银 染 蛋 白质 的 低 序列 覆盖 率 是 源 于 染色 过 程 中 甲醛 对 蛋白 的 修饰 (Scheler et wz .，1998)， 但 甲醛 还 不 能 从 目前 的 银 染 方案 中 去 除 。 两 种 用 得 最 普遍 的 银 染 方式 是 碱 性 /二 氢 合 银 法 和 酸性 /硝酸 银 法 (Rabilloud， a 蛋白 质 组 学 1999) 。 酸 性 /硝酸 银 法 的 基础 是 照相 过 程 ， 将 凝 胶 在 酸性 pH 值 下 的 银 离子 中 浸泡 ， 随 后 在 碱 性 pH 下 用 甲醛 将 银 离子 还 原 为 金属 银 显 色 (Wirth and Romano, 1995), H Ay ## 遍 认为 酸性 /硝酸 银 法 与 碱 性 /二 氨 银 法 相 比 ， 对 碱 性 蛋白 质 的 检测 灵敏 度 稍 低 ， 而 对 酸 性 蛋白 质 的 检测 灵敏 度 较 高 (Rabilloud，1999; Rabilloud er wE. ，1994) 。 酸 性 /硝酸 银 法 也 易 产 生 异 染色 假象 ， 但 用 机 械 韧 性 强 的 PAGE 胶 基 质 Duracryl (Genomic Solutions， Ann Arbor, MI) 取代 标准 聚 丙 烯 酰胺 后 可 大 大 降低 这 种 效果 (Patton et al., 1992). 酸性 /硝酸 银 法 适 于 蛋白 质 定 量 ， 效 胶 显 色 过 程 约 限于 10 min (Patton, 1995). 碱 性 /二 氨 银 法 基于 组 织 学 方法 ， 利 用 氢 氧 化 镑 形成 可 溶性 的 二 氨 银 复合 物 〈(Wirth and Romano, 1995), 随后 在 酸性 显 色 液 中 用 甲醛 还 原 自 由 银 离子 使 蛋白 质 显 色 。 用 哌 嗪 双 丙 烯 酰胺 取代 N, N“- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 后 可 优化 碱 性 /二 氨 银 法 Hochstrasser et al., 1988; Rabilloud，1999)。 碱 性 /二 氨 银 法 对 TriyVtricine 或 N -三 (2H) 甘氨酸 缓冲 液体 系 凝 胶 ， 如 商品 化 的 长 贮存 期 预制 胶 以 及 用 于 低 分 子 质量 蛋白 质 分 离 的 凝 胶 ， 染色 效果 较 差 。 用 固 相 pH 梯度 胶 分 离 蛋 白质 碱 性 /二 氨 银 法 染色 效果 也 差 〈Rabilloud， 1999)。 此 外 ， 带 有 塑料 支撑 膜 的 PAGE 胶 常 会 产生 银 镜 假 象 ， 使 蛋白 质 染 色 效 果 大 打 折扣 (Rabilloud，1999)。 由 于 氧气 的 易 挥 发 性 ， 碱 性 /二 所 银 染 色 不 同 批 次 实验 间 重 复 性 差 (Rabilloud，1999)。 非 计量 染色 属性 也 使 得 该 方法 不 太 适 于 定量 分 析 (Rodriguez et al., 1993). 3. Axe 标准 考 染 方法 所 存在 的 一 个 缺点 是 染色 步骤 中 含 蛋 日 质 固定 过 程 ， 银 染 法 除了 固定 过 程 外 ， 还 有 增 敏 步 又， 这 些 步骤 会 将 蛋白 质 提取 至 胶 外 ， 而 减少 蛋白 质 产量 ， 使 得 用 于 随后 微量 化 学 表征 的 样品 量 更 少 了 。 负 染 的 开发 则 是 专门 为 了 提高 PAGERESA 质 的 回收 率 。 这 些 方法 不 能 用 于 对 印 渍 膜 染 色 ， 通 常 也 适 于 进行 准确 的 蛋白 质 定量 。 染 色 结 果 在 凝 胶 表 面 产 生 半 透明 背景 ， 其 中 和 蛋白质 以 透明 的 形式 被 检测 出 来 。 凝 胶 显示 黑 色 背 景 或 相应 的 底 色 (Wirth and Romano，1995)。 染 色 过 程 很 快 ， 约 需 5$ 一 15 min 即 可 完成 ， 蛋 白质 的 生物 学 活性 经 常 得 以 保持 。 一 旦 用 络 合剂 如 EDTA 或 Tris/ 甘 氨 酸 转移 缓冲 液 络 合金 属 离子 ， 就 可 进行 提取 来 转移 蛋白 质 (Castellanos-Serra et al., 1996; Lee ef al .，1987)。 负 染 适 用 于 蛋白 质 显 色 、 完 整 蛋白 质 的 胶 上 被 动 提取 以 及 质谱 分 析 (Cohen and Chait，1997 ) 。 3.1 金属 盐 染 料 目前 已 有 一 系列 SDS-PAGE RARE ARPA A HATH, Ki (Wallace et al., 1974), PAB FHS (Takagi et al., 1977). GRA (Higgins and Dahmus, 1979). KCl (Hager and Burgess, 1980), # (Merril et al., 1984), BEAR (Casero et al., 1985), SA 4¢ #9 (Lee et al., 1987), S46 (Dzandu et al., 1988). GBH (Dzandu et al, 1988), Atk #R (Dzandu et al., 1988), #¥-PKME (Ortiz et al., 1992) 以 及 三 氯 乙酸 甲 酯 法 (Candiano et al., 1996). E—-TRUFHKEREAW SARE 中 ， 平 面 染料 如 若 丹 明 、 叫 啶 橙 、 曙 红 或 荧光 黄 与 金属 盐 如 重 铬 酸 钾 、 铬 酸 钢 、 氧 化 镁 或 氯 化 钙 形成 复合 物 ， 从 而 达到 使 凝 胶 呈 现 可 见 色 ， 和 蛋白 质 仍 保持 透明 的 高 灵敏 度 负 染 第 四 章 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测 “59 - 效果 (Berube, 1990). 三 种 用 得 最 多 的 金属 盐 负 染 法 是 氯 化 钾 法 、 毛 化 铜 法 和 和 氧化 锌 法 。 毛 化 铜 染 色 灵 敏 ER, MARA RM EK Ss Se (Adams and Weaver，1990)。 和 氧化 铜 染 色 对 细胞 色素 C、 组 蛋白 和 其 他 碱 性 蛋白 质 灵 敏 度 低 于 偏 酸性 蛋白 质 (Vanflerteren and Peeters，1990)。 目 前 为 止 ， 氯 化 锌 法 是 最 灵敏 的 负 染 方法 (Fernandez-Patron et al., 1998 ) 。 3.2 锌 -咪唑 染料 利用 特定 的 锌 -咪唑 染色 方法 ， 核 酸 、 糖 脂 和 和 蛋白质 呈现 出 类 似 的 染色 行为 (Fer- nandez-Patron et al .，1998) 。 在 咪唑 存在 时 ， 自 由 或 弱 结合 的 锌 离子 以 锌 -咪唑 形式 很 好 地 沉淀 下 来 ， 而 大 部 分 结合 牢固 的 离子 则 难以 沉淀 下 来 ， 这 就 导致 在 半 透 明 背 景 上 的 空白 区 域 ， 也 就 是 负 染 过 程 特点 。 一 定 要 注意 控制 染色 时 间 ， 因 为 染色 过 度 可 能 掩盖 条 带 ， 且 偶尔 还 会 出 现 负 染 和 阳性 染色 的 复合 图 谱 (Fernandez-Patron et al., 1998). #- 咪唑 对 SDS-PAGE 分 离 蛋白 质 的 检测 限 是 每 条 带 10 一 20ng，SDS-PAGE 分 离 的 脂 多 糖 为 每 条 带 1 一 10ng， 尿 素 变性 PAGE RA BD)AFRRER (28bp 一 1.3kbp) 为 10 一 100ng (Fernandez-Patron et cl .，1998)。 但 对 非 变性 PAGE 胶 分 离 的 牛 血清 白 蛋 白 其 检 测 限 较 差 ， 约 每 条 带 40 一 80ng。 锌 -咪唑 染色 的 凝 胶 可 以 干燥 而 染色 图 谱 并 不 发 生变 化 (Ferreras et al., 1993). & 然 蛋 白质 检测 线性 范围 限制 在 10 一 100ng， 仍 可 通过 光 密 度 仪 来 估计 蛋白 量 (Ferreras et al., 1993; Matsui et al . ，1997) 。 锌 -咪唑 染色 的 凝 胶 可 通过 在 转移 缓冲 液 中 加 入 络 合剂 来 进行 电 转 印 (Fernandez-Patron et al., 1995), 之 后 可 进一步 进行 Edman 测序 (Fernandez-Patron et wa .，1995)。 锌 -咪唑 染色 与 胶 内 酶 切 、 基 质 辅助 激光 解吸 附 -飞行 时 间 质 谱 (MALDI-TOF/MS) 测定 肽 质量 和 序列 的 方法 兼容 (Matsui et al., 1997). 4. 胶体 扩散 染料 胶体 扩散 染料 含有 与 蛋白 质 具 有 高 亲和力 的 精细 颗粒 ， 这 种 染料 主要 是 用 于 高 灵敏 度 检 出 电 转 印 、 点 转 印 或 狭 缝 转 印 至 硝酸 纤维 素 膜 或 PVDF 膜 上 的 和 蛋白质， 虽然 有 文 献 报道 胶体 金 负 染 的 应 用 (Casero et al .，1985)， 但 此 类 染料 通常 不 用 于 PAGE RAS 白质 的 检 出 。 此 外 ， 可 以 在 蛋白 质 混合 物 中 ， 加 入 表面 接 有 有 机 外 壳 的 胶体 包 或 铀 颗 粒 ， 进 行 PAGE 电泳 ， 再 用 一 个 银 增 强 步 又 显 色 (Powell，1998)。 对 印 渍 膜 来 说 ， 最 好 的 胶体 扩散 染料 一 一 胶体 金 染 料 ， 其 灵敏 度 与 PAGE 胶 的 银 染 类 似 。 4.1 印度 墨水 染料 黎 释 的 自来水 笔 印 度 墨 水 是 首次 成 功用 于 电 转 印 蛋 白质 显 色 的 胶体 扩散 染料 (Hancock and Tsang，1983) 。 该 方法 的 首要 优点 是 简单 便宜 。 自 来 水 笔墨 水 是 包含 金属 化 的 酸性 染料 (CREE. AEE, ARR) 以 及 碱 性 染料 盐 的 专用 配方 (Rohde et al.，1998)。 此 外 ， 也 加 入 碳 、 酸 靖 酮 、 甘 醇 、 甘 油 表面 活性 剂 、 抗 氧化 剂 和 黏度 调节 剂 等 精细 分 散剂 以 形成 水 溶性 墨水 (Rohde et wz .，1998)。 常 用 于 电 转 膜 染 色 的 黑 墨 水 (Pelikan, Hannover, Germany) 经 毛细 管 电泳 分 离 ， 并 结合 紫外 /可 见 吸收 和 激光 诱导 ie 蛋白 质 组 学 荧光 检测 表明 ， 在 该 配方 中 至 少 有 7 种 不 同 种 类 的 染料 (Rohde et al., 1998). Han- cock 和 Tsang 声称 Pelikan 自来水 笔墨 水 是 蛋白 质 显 色 最 灵敏 的 墨水 ， 而 其 他 人 则 用 Higgins 黑 墨水 893 (Faber-Castell Corporation, Newark, NJ) 或 Speedball 黑 墨 水 3211 (Hunt Manufacturing Company, Statesville, NC) (Hughes et al., 1988; Lek et al., 1995) 获得 了 更 好 的 结果 。 在 印度 墨水 染色 同期 出 现 了 和 蛋白 质 直接 比 色 法 或 放射 自 显影 免疫 检测 (Glenney, 1986; Mobbs et al., 1989; Ono and Tuan，1990)。 如 果 在 免疫 检测 前 进行 印度 墨水 染 色 ， 染 色 时 间 必 须 限 制 在 2 一 3h， 以 避免 干扰 随后 抗体 结合 步骤 。 用 化 学 发 光 免 疫 检测 与 印度 墨水 染色 相 结合 获得 了 较 好 效果 (Eynard and Lauriere，1998 ) 。 Mobbs 则 将 印度 墨水 和 免疫 检测 结合 进行 染色 ， 而 用 于 Edman WFR RBA SSR RE (Mobbs et al., 1989). 与 有 机 染料 和 胶体 金属 染料 相 比 ， 印 度 墨 水 染色 显示 出 较 高 的 蛋白 间 变 异 (Li et az.，1989)。 很 多 蛋白 质 用 印度 墨水 获得 很 差 的 染色 效果 ， 包 括 B- 乳 球 蛋 白 、 胰 和 蛋白酶 抑制 剂 、 杆 菌 肽 、C- 大 麦 醇 溶 和 蛋白 、 促 甲状 腺 素 释 放 激 素 (TRH)、 卵 白 蛋 白 、 卵 类 黏 蛋白 、 碳 酸 脱氧 酶 铁 蛋 白 和 胰岛 素 (Dunn, 1999; Eynard and Lauriere, 1998; Li et al., 1989; Rohringer and Holden，198$)。 与 其 他 胶体 扩散 染料 类 似 ， 印 度 墨 水 在 染色 膜 片 时 也 须 加 入 Tween-20 来 减 除 背 景 ， 这 是 个 很 大 的 缺点 ， 因 为 去 污 剂 的 加 入 将 从 转 印 膜 上 洗 脱 部 分 蛋白 质 (Li et al., 1988), Feat fe Tween-20 的 加 入 所 带 来 的 相关 问题 将 在 4.2 中 详细 讨论 。 最 后 要 说 明 的 是 ， 自 来 水 笔墨 水 是 设计 用 来 书写 ， 而 不 是 用 来 进 行 与 蛋白 质 染 色 性 能 相关 的 质量 控制 分 析 。 用 印度 墨水 染色 需要 针对 膜 、 狭 缝 膜 类 型 、 印度 墨水 品牌 和 墅 水 进行 实验 室内 优化 (Hughes et al., 1988). 4.2 胶体 金属 染料 印度 墨水 开始 染色 电 转 印 蛋 白质 后 不 久 ， 其 他 同样 用 途 的 分 散 颗粒 即 进行 了 优化 (Moeremans et al., 1985, 1986; Rohringer and Holden, 1985). Janssen Pharmaceuticals (Beerse, Belgium) 先后 开发 了 了 灵敏 的 胶体 金 (AuroDye)、 铁 (FerriDye) 以 及 银 染 方 AF FerriDye 包含 有 毒 的 卡 可 基 酸 并 会 生成 氰 化 物 气体 而 停止 使 用 。 胶 体 银 染 没 有 商品 化 。80 年 代 对 常用 胶体 扩散 染料 的 直接 比较 显示 胶体 金 染 料 的 检测 灵敏 度 要 优 于 印度 墨水 或 胶体 铁 染 料 ， 但 其 有 用 线性 范围 特别 有 限 (1 一 20ng)(Hunter and Hunter, 1987; Li et wz .，1989)， 蛋 白质 浓度 的 对 数 转 换 使 胶体 金 染 料 的 有 用 线性 范围 扩展 至 100ng 左右 (Li et al., 1989). 胶体 金 染 色 可 用 于 传统 的 比 色 免疫 印 溃 或 化 学 发 光 免 疫 检测 (Chevallet et al., 1997; Egger and Bienz, 1987; Schapira and Keir，1988) 。 人 但是， 金属 的 氧化 使 得 在 化 学 发 光 过 程 中 胶体 金 染 色 图 褪色 。 同 时 ， 由 于 图 谱 上 蛋白 质 化 学 发 光 变 弱 ， 带 来 的 问题 就 是 如 何在 反应 较 弱 时 分 辩 非 特异 性 背景 。 从 电 转 印 的 蛋白 质 上 去 除 胶 体 金 是 不 太 可 行 的 ， 可 以 用 10% 的 盐酸 、 重 铬 酸 钾 的 水 溶液 氧化 作用 来 脱色 (Nelson，1993)， 染 色 强 度 也 可 通过 应 用 银 染 增强 步骤 来 加 强 〈Moeremans et al., 1984). 虽然 胶体 金 染色 可 以 获得 特别 高 的 灵敏 度 ， 但 与 其 他 胶体 扩散 染色 方法 一 样 ， 它 需 要 用 诸如 Tween-20 一 类 试剂 对 膜 进行 前 处 理 。 随 后 在 用 去 污 剂 稳定 化 的 胶体 溶液 中 孵 第 四 章 “” 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 有 蛋白质 的 检测 - 61 - 育 2 一 18h (Moeremans et wl .，198$)。 如 先前 所 述 ， 非 离子 表面 活性 剂 去 除了 部 分 膜 上 和 蛋白质， 导致 用 于 随后 表征 的 蛋白 质 回收 率 降 低 (Flanagan and Yost, 1984; Li et al., 1988; Miranda et al .，1993) 。 用 氧 氧 化 钾 或 成 二 醛 一 类 试剂 固定 或 1007 下 烘 烤 会 减少 由 去 污 剂 提 取 作 用 所 引起 的 蛋白 质 丢 失 ， 但 经 常会 致使 蛋白 质 不 适 于 其 他 应 用 (Li et al .，1988) 。 去 污 剂 也 会 影响 MALDI-TOF 和 电 喷 雾 离子 化 (ESI) 质谱 图 谱 的 高 质量 采集 。 因 为 来 源 于 去 污 剂 篮 峰 的 背景 离子 信号 主导 了 质谱 图 ， 去 污 剂 也 抑制 了 来 自 蛋白 质 的 信号 (Gharahdaghi et al., 1996; Loo et al., 1994). fil 40 GH Tween-20 在 ESI- MS 谱 图 中 可 以 产生 聚合 物 背 景 〈( 质 荷 比 在 500~1200) 和 严重 的 信号 抑制 ， 并 和 和 蛋白 质 形成 加 合 物 (Loo et wd .，1994)。 文 献 中 尚 没 有 胶体 金 染 色 用 于 质谱 鉴定 的 成 功 报 道 。 此 外 ， 胶 体 金 染料 一 直 干扰 蛋白 质 Edman 降解 序列 分 析 ， 如 很 低 的 初始 和 重复 序 列 产 率 (Christiansen and Houen，1992)， 脱 色 并 不 能 提高 产 率 (Nelson, 1993). 正 是 由 于 胶体 金 染 料 与 下 游 蛋 白质 微量 化 学 方法 不 兼容 ， 促 使 了 其 他 可 替代 胶体 染 料 研 究 的 进展 。 一 种 不 含 去 污 剂 的 “胶体 ” 银 染 方法 取代 胶体 金 染 色 ， 可 用 来 检测 用 于 液 相 色谱 一 一 电 喷 雾 离子 化 串联 质谱 分 析 的 电 转 膜 蛋 白质 (van Oostveen et al., 1997). 该 染 液 实际 上 并 非 胶体 ， 只 是 微粒 的 混合 浆液 ， 我 们 用 银 浆 液 的 经 验 是 可 以 在 很 高 的 灵 敏 度 对 原始 文献 中 提 及 的 测试 蛋白 质 碳 酸 脱 氢 酶 和 牛 血清 白 蛋 白 进行 检测 ， 但 对 商品 化 的 分 子 质量 标准 中 其 他 蛋白 质 染 色 效 果 相 当 差 。 另 外 一 种 用 于 电 转 膜 蛋 白质 染色 的 悬 浊 胶 是 碱 性 碘 化 铜 溶液 (Root and Reisler, 1989; Root and Wang，1993)。 与 胶体 金 染色 一 样 ， 铜 染 可 以 用 银 增强 步骤 来 加 强 (Root and Wang，1993)。 染 色 可 用 EDTA 轻易 去 除 ， 脱 色 膜 可 用 于 随后 比 色 免疫 检测 (Root and Raisler，1989)， 但 是 ， 该 方法 目前 与 其 他 现代 微量 化 学 方法 仍 不 兼容 。 5. 有 机 荧光 团 染料 电泳 后 对 荧光 检测 蛋白 质 正 获得 普遍 的 应 用 ， 特 别 是 在 致力 于 大 规模 蛋白 质 组 研究 的 实验 室 。 几 种 新 的 荧光 染色 适 于 与 进行 蛋白 质 整体 表达 分 析 的 集成 化 蛋白 质 组 学 平台 相 结合 ， 利 用 荧光 染色 检测 的 动态 线性 范围 通常 优 于 比 色 法 染色 。 5.1 共 价 结合 荧光 团 胶 内 蛋白 质 和 转 膜 蛋白 质 的 荧光 检测 有 多 种 方法 ， 分 别 是 利用 荧光 胺 、 荧 光 素 异 硫 氰 酸 盐 、monobromobimane、2 - 甲 氧 基 -2,4- 二 葵 基 -3 (2H) ROR BR (MDPF)、 Dichlorotriazynlamino-fluorescein EX F} HABER (Houston and Peddie, 1989; Jackson et al., 1988; Ragland et al., 1974; Szewczyk and Summers, 1987, 1992; Talbot and Yphantis, 1971; Urwin and Jackson, 1993; Vandekerckhove et al., 1985; Vera and Rivas, 1988). 最 近 ， 利 用 丙 基 Cy3 和 甲 基 Cys 两 种 染料 分 别 对 两 个 不 同 蛋 白质 样品 进行 荧光 标记 ， 并 在 一 块 2-D 胶 上 同步 显示 两 个 样品 的 差异 (Unlu et al., 1997). 上 述 方法 的 缺点 包括 需要 对 蛋白 质 进 行 共 价 修饰 、 改 变 了 标记 和 蛋白质 的 移动 性 能 和 由 于 奖 光 探 针 光 漂 日 作用 所 引起 的 快速 衰减 。 蛋 白 与 蛋白 之 间 由 于 可 被 荧光 团 修饰 的 功 能 基 团 数目 不 同 而 使 得 灵敏 度 变 化 很 大 ， 荧 光 团 的 加 入 同时 会 降低 蛋白 质 溶 解 性 能 (Unlu et wa .，1997)。 可 以 通过 标记 样品 中 一 小 部 分 功能 基 团 来 补偿 ， 但 标记 蛋白 质 与 paves) 蛋白 质 组 学 未 标记 和 蛋 白 质 之 间 轻 微 的 分 子 质量 差异 可 能 会 导致 分 离 后 蛋白 质 的 Edman 降解 和 质谱 鉴定 出 现 偏差 。 在 运行 2-DE 或 等 电 聚 焦 (IEF) 时 ， 由 前 期 荧光 分 子孙 生 可 能 导致 蜡 #8 2 AXE (Urwin and Jackson，1993)。 通 常情 况 下 ， 样 品 中 衍生 的 氨基 酸 总 数 很 少 ， 对 下 游 Edman 测序 或 肽 谱 研 究 等 氨基 酸 分 析 的 影响 不 大 (Alba and Daban, 1998; Stephens, 1975; Unlu et al., 1997). 研究 开发 的 一 种 转 膜 蛋白 质 检 测 方法 是 用 由 双 (2,4, 6-= ARE) oxylate 和 过 和 氧 化 氢 进 行 非 酶 化 学 荧光 反应 ， 来 显 色 用 MDPF 共 价 标记 的 电 转 印 或 点 印 渍 蛋白 质 (Al- ba and Daban，1997) 。 后 来 发 现 利用 300nm 紫外 透射 仪 对 PVDF 膜 上 MDPF 标记 蛋白 质 进行 直接 荧光 检测 ， 比 原始 化 学 荧光 法 更 简单 、 耗 时 短 、 更 灵敏 (Alba and Daban, 1998)。 直 接 菊 光 法 可 以 实现 5~10ng 蛋白 质 检测 并 与 化 学 荧光 免疫 法 兼容 。 但 是 ， 由 于 干燥 PVDF 膜 会 致使 荧光 信号 降低 500 倍 ， 因 此 用 MDPF 标记 的 蛋白 质 必 须 在 湿 PVDF 膜 上 观察 ， 目 前 没有 适用 于 显 色 转 印 于 硝酸 纤维 素 膜 上 和 蛋白质 的 MDPF 标记 方 法 ， 如 果 和 蛋白 质 要 用 于 N 端 测序 ， 为 了 在 反应 中 尽量 少 的 消耗 一 级 胺 ， 染 色 时 染料 浓 度 要 低 于 最 佳 浓度 ， 染 色 时 间 要 短 ， 在 这 种 条 件 下 荧光 染色 灵敏 度 不 比 标准 考 马 斯 蓝 染 色 高 (Alba and Daban, 1998). 5.2 非 共 价 结合 荧光 团 许多 荧光 团 如 1 -苯胺 基 - 8 - 蔡 磺 酸 盐 (ANS), WM (8 -甲苯 氨基 - 1 - 蔡 磺 酸 盐 ) (bis-ANS)、9 -二 乙 氨基 - 5SH -#FF [a] WAEB- 5 - 酮 (EFA, Nile red)、SYPRO Orange 和 SYPRO Red 染料 可 与 蛋白 质 形成 非 共 价 键 相互 作用 (Aragay et al., 1985; Bermudez et al., 1994; Daban and Aragay, 1984; Daban et &L .，1991a，1991b; Hart- man and Undenfriend, 1969; Horowitz and Bowman, 1987; Pina et al., 1985; Stein- berg et al., 1996a, 1996b, 1997), SERE, KHERSEAEKAMPERAARRICH, Th 在 非 极 性 溶剂 或 与 SDS- 蛋 白质 复合 物 相 互 作用 时 显示 荧光 。SDS 与 蛋白 质 的 结合 计量 常数 比较 稳定 ， 保 持 在 1.4 到 1， 提 示 ， 基 于 与 去 污 剂 的 相互 作用 进行 定量 要 比 基 于 与 一 级 胺 的 作用 更 为 可 靠 。 ANS 可 用 300nm 透射 仪 激 发 ， 并 在 480nm 发 射 ， 已 用 于 检测 SDS-PAGE RASA 质 ， 但 其 灵敏 度 明 显 低 于 考 染 (Aragay et al., 1985; Daban and Aragay, 1984; Pina et a .，1985)。 相 关 染 料 一 一 bis-ANS 4j 2mol/L KCl 组 合 可 以 获得 稍 好 的 灵敏 度 ， 其 检测 限 大 约 100ng 和 蛋白质 (Horowitz and Bowman，1987)。 尼 罗 红 染料 可 在 300 或 540nm 处 激发 ， 在 640nm 处 发 射 (Daban et al., 1991a), He 20~100ng 的 检测 灵敏 度 要 稍 好 于 SOME, MA, BRAS ME Edman 测序 与 免疫 检测 程序 兼容 (Alba and Daban， 1998; Bermudez et al., 1994; Daban et al., 1991b). SYPRO Red 和 SYPRO Orange 染料 可 对 SDS-PAGE 胶 内 蛋白 质 进 行 简 单 的 一 步 染 色 ， 约 30 一 60min 即 可 完成 ， 可 以 检测 少 至 2 一 10ng 的 蛋白 质 ， 可 与 银 染 相 媲 美 。 染 色 后 胶 的 备份 用 标准 的 实验 室 300nm 紫外 透射 仪 照 相 即 可 轻松 完成 ， 或 者 通过 基于 商品 化 的 CCD 相机 图 像 分 析 工 作 站 或 激光 扫描 仪 进行 定量 ， 可 以 获得 三 个 数量 级 的 线性 范 围 。SYPRO Red、Orange 的 Ruby 染料 是 仅 有 的 商品 化 染料 ， 其 电泳 染色 结果 与 在 酵母 中 通过 基因 表达 序列 分 析 (SAGE) 所 获得 的 基因 表达 水 平 动态 范围 相 匹 配 〈 每 个 细胞 第 四 章 “” 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测 - 63: 0.3~200 个 转录 拷贝 ; Verculescu et al., 1997). SYPRO 染料 可 以 很 好 地 抗 光 淳 灭 作 用 ， 在 Tris/ 甘 氨 酸 转 印 缓冲 液 中 染色 后 ， 蛋 白质 可 被 转 印 至 膜 上 并 进行 免疫 染色 或 Edman 测序 来 鉴定 蛋白 质 (Hamby, 1996, 1997; Steinberg et al., 1996b). e/a B48 出 的 是 ，SYPRO Orange 和 SYPRO Red 染料 可 用 于 对 SDS- 毛 细 管 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白质 的 pmol 定量 检测 (Harvey et al., 1998). 4 SYPRO 染料 相 比 ， 利 用 尼 罗 红 的 检测 灵 MERE, 染色 不 稳定 ， 染 料 在 水 溶液 中 易于 沉淀， 使 随后 处 理 很 困难 ， 尼 罗 红 染色 对 光 不 稳定 的 性 质 也 加 大 了 通过 图 像 分 析 进 行 蛋白 质 定 量 的 难度 。 6. 金属 鳌 合 染料 金属 歼 合 染料 是 与 现代 蛋白 质 组 学 研究 相 兼 容 的 、 相 对 较 新 的 蛋白 质 显 色 试 剂 ， 其 设计 专门 与 常用 微量 化 学 表征 过 程 兼 容 。 这 些 染 色 不 包含 影响 表征 过 程 的 其 他 试剂 如 戊 二 醛 、 甲 醛 或 Tween-20。 发 光 金 属 歼 合 染料 很 容易 和 集成 化 蛋白 质 组 学 平台 相 结合 ， 包括 自动 化 凝 胶 染 色 仪 、 图 像 分 析 工 作 站 、 机 器 人 剪 切 仪器 、 重 日 质 酶 解 工 作 站 和 质谱 仪 。 最 为 灵敏 的 发 光 染 料 一 一 SYPRO Ruby 比 最 好 的 碱 性 二 氨 银 和 酸性 硝酸 银 染 色 的 灵 敏 度 高 ， 且 线性 范围 宽 。 6-1 比 色 金属 束 合 染料 最 早报 道 的 用 于 凝 胶 电 泳 蛋 白质 检测 的 金属 丈 合 剂 为 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 亚 铁 复 合 物 (Graham et wz .，1978)。 报 道 其 灵敏 度 大 约 在 600ng。 由 于 它 较 已 经 实践 应 用 的 考 马 斯 蓝 染色 没有 明显 优势 ， 因 而 没 得 到 广泛 认可 。 将 放射 性 ?Fe 引入 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 复 合 物 可 以 检测 到 10~25ng 蛋白 质 ， 但 按 今天 的 标准 也 只 是 和 胶体 考 马 斯 赣 的 灵敏 度 接 WE (Gersten et al., 1984; Zapolski et al., 1982), 放射 性 环境 下 工作 的 危害 性 和 获准 使 用 放射 性 同位 素 所 增加 的 麻烦 排除 了 其 广泛 使 用 的 可 能 性 。 酌 菁 四 磺 酸 酮 金属 丈 合 物 ， 可 以 在 进行 PAGE 胶 染 色 时 达到 与 标准 考 马 斯 蓝 染色 相同 的 灵敏 度 (Bickar and Reid，1992)。 该 染料 也 可 用 于 固定 在 硝酸 纤维 素 上 蛋白 质 的 染色 ， 其 检测 限 在 10 一 20ng 蛋白 质 。 虽然 灵敏 度 稍 低 ， 氨 基 黑 、 丽 春 红 S 和 考 马 斯 蓝 仍 是 最 常用 的 检测 转 膜 蛋白 质 的 方 法 ， 因 为 它们 与 下 游 微量 化 学 表征 技术 兼容 。 我 们 的 研究 小 组 针对 灵敏 度 问题 设计 了 一 系列 金属 歼 合 染料 以 检测 转 膜 蛋白 质 (Lim et al., 1996; Patton et al., 1994, 1999a， b; Shojaee et al., 1996). #£ Chung 成 功 地 用 ferreneS 检测 PAGE RA A EA RAY 基础 上 ， 我 们 推测 如 果 外 加 的 亚 铁 离子 附着 在 和 蛋白质 上 ， 如 果 遇 到 铁 指 示 剂 如 ferrene S 或 锌 铁 ， 在 转 印 膜 上 即 可 得 到 全 有 蛋 白质 显 色 图 (Chung, 1985; Patton et al., 1994). 我 们 优化 了 方法 ， 简 化 到 只 要 在 转 膜 蛋白 质 孵 育 前 混合 亚 铁 离子 和 鳌 合 剂 即 可 ， 但 直到 发 表 时 我 们 仍 确信 和 与 蛋白 质 的 结合 主要 由 金属 离子 独自 调节 完成 (图 4.1) (Patton et &.，1994)。 在 开发 可 替代 性 金属 歼 合 染料 的 过 程 中 筛选 了 大 量 金属 丈 合 物 后 我 们 才 意 识 到 与 蛋白 质 的 结合 是 由 金属 五 合 物 上 的 磺 酸 基 团 所 介 导 的 (Shojaee et al., 1996), 因此 ， 人 金属 丈 合 染料 与 1978 年 开发 的 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 亚 铁 染料 属于 同一 家 族 。 锌 铁 / 亚 铁 和 焦 酚 红 / 钼 酸 盐 染 料 的 灵敏 度 和 氨基 黑 不 相 上 下 ， 通 常 可 以 检测 到 20 一 50ng 蛋 白质 。 锌 铁 / 亚 铁 染 色 的 优点 是 通过 增加 溶液 pH 值 可 以 容易 脱色 ， 并 且 可 eo 蛋白 质 组 学 图 4.1 2-DE 凝 胶 染 色 区 域 (a) 蛋白 质 凝 胶 SYPRO Ruby 染色 (Molecular Probes, Eugene, OR); (b) 酸性 /硝酸 银 染 色 试 剂 盒 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) 染色 。 一 维 IEF 胶 上 样 为 鼠 成 纤维 细胞 裂解 蛋白 质 ， 约 Sue. AT 与 银 染 胶 容易 比较 ，SYPRO Ruby 染色 胶 的 灰 度 值 进行 了 转换 。 以 很 容易 地 在 锌 铁 / 亚 铁 溶 液 中 孵育 来 加 强 信号 (Lim et al., 1996; Patton et al., 1994)， 此 时 其 检测 限 可 达到 $ 一 10ng 蛋白 质 (Patton et al., 1994), SRBSRAB 和 上 dman 测序 、 质 谱 和 免疫 印 渍 兼容 (Patton et al., 1994). 6.2 发 光 金 属 束 合 染料 由 于 对 比 色 染料 的 检测 灵敏 度 不 太 满 意 ， 我 们 对 发 光 金 属 鳌 合 染料 进行 了 研究 (Lim et al., 1997; Patton et wz .，1999a，1999b)。 从 原理 上 讲 ， 检 测 光 散射 要 比 检测 光 吸 收 灵敏 一 些 ， 由 于 光 吸 收受 有 色 复 合 物 摩 尔 消光 系数 的 限制 (Gossling，1990)， 因 ”此 ， 利 用 金属 歼 合 物 与 特定 过 渡 金 属 离子 如 销 、 氏 、 钉 、 铁 复合 而 形成 的 发 光 蛋 和 白质 染 料 ， 与 上 述 比 色 法 相 比 可 以 得 到 更 高 灵敏 度 。 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 销 (SYPRO Rose Protein Blot stain, Molecular Probes, Eugene, OR) 是 一 种 中 等 灵敏 度 的 染料 ， 通 常 可 以 检测 到 由 狭 缝 印 渍 所 得 的 2 一 4ng/mm“ 的 蛋 白质 上 样 量 。 依 据 常规 的 电 转 印 实验 ， 该 数值 转换 成 胶 内 上 样 为 1$ 到 30ng。 该 染料 的 显 色 可 以 用 300nm 紫外 表面 照射 而 在 590nm 和 615nm 发 射 。 在 中 性 或 弱 碱 性 环境 中 孵 育 可 以 洗 脱 染 料 。 由 于 与 免疫 印 渍 、 凝 集 素 印 渍 、Edman 测序 和 质谱 的 兼容 性 ， 使 SYPRO Rose 染料 成 为 近乎 与 丽 春 红 S 染料 一 样 简便 而 优良 的 常规 蛋白 质 检测 试剂 (Lim et o.，1997)。 其 缺陷 是 可 以 对 核酸 像 蛋 日 质 一 样 进 行 染色 ， 脱 色 步 又 很 像 传统 考 马 斯 蓝 染 色 ， 许 多 激光 凝 胶 扫描 仪 不 能 用 ， 因 为 该 染料 不 能 被 可 见 光 激发 。 SYPRO Ruby 是 一 种 专利 的 基于 钉 的 金属 丈 合 染料 ， 其 开发 是 为 了 弥补 SYPRO Rose 染料 的 缺陷 。SYPRO Ruby 蛋白 印 涡 染料 (Molecular Probes, Eugene, OR) 可 以 对 硝酸 纤维 素 或 PVDF 转 膜 蛋白 质 永久 染色 ， 在 狭 颖 印 溃 时 其 检测 灵敏 度 为 0.25 一 Ing/mm’, BAKA 2~8ng 的 蛋白 质 可 通过 电 转 印 检 测 ， 对 照 比 较 实验 证 实 它 具有 和 胶体 金 染色 一 样 的 灵敏 度 (AuroDye，Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)。 而 胶体 金 染色 需要 2~4h, SYPRO Ruby 染料 染色 在 15 min 内 即 可 完成 。SYPRO Ruby 蛋白 印 渍 染色 的 动态 线性 范围 大 大 优 于 胶体 金 染 色 ， 扩 展 了 约 1000 倍 。 该 染料 可 用 300nm 紫外 透射 仪 激活 或 利用 装配 有 450. 473, 488 75% 532nm 激光 的 成 像 系 统 。 第 四 章 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋 晶 质 的 检测 “ 65° 不 像 胶 体 金 染色 ，SYPRO Ruby 染料 不 干扰 质谱 或 免疫 检测 过 程 ， 又 与 SYPRO Rose 不 同 ， 它 对 核酸 不 染色 。 SYPRO Ruby 2-DE 和 IEF 染色 仅 需 一 步 即 可 获得 PAGE 内 和 蛋 日 质 的 低 背 景 染 色 ， 而 且 不 需要 进行 长 时 间 脱 色 步 又。 这 些 染 料 的 线性 动态 范围 扩展 到 超过 三 个 数量 级 之 大 ， 在 性 能 上 超过 了 银 染 和 考 马 斯 蓝 染色 ， 对 等 电 点 从 3.5 到 9.3 范围 的 11 个 蛋白 质 标准 的 评估 表明 SYPRO Ruby IEF 凝 胶 染 色 的 灵敏 度 比 高 灵敏 银 染 要 高 3 一 30 5 (Steinberg et al .，2000)。 用 银 染 效果 很 差 的 蛋白 质 往往 用 SYPRO Ruby 染料 很 容易 检 测 到 〈 图 4.1)。 虽 然 比 SYPRO Orange 和 Red 染料 更 为 灵敏 ， 其 最 佳 染色 要 稍 慢 一 些 ， 约 需 4h。 与 胶体 考 马 斯 蓝 染 料 类 似 ， 但 与 银 染 不 同 ，SYPRO Ruby 染料 的 染色 是 终点 式 (end-point) 染色 ， 因 此 ， 染 色 时 间 不 严格 ， 可 以 过 夜 染 色 且 不 会 显 色 过 度 。 7. 结论 通过 大 规模 基因 组 测序 以 及 基因 芯片 的 辅助 ，DNA 和 mRNA 水 平 上 生物 学 过 程 的 分 析 正 在 迅速 完成 ， 人 们 的 注意 力 正 转向 蛋白 质 的 动态 表达 。 和 蛋白 质 组 研究 致力 于 观察 一 个 特定 基因 组 所 编码 的 全 蛋白 质 组 分 ， 以 解决 不 能 单纯 通过 核酸 序列 来 回答 的 生物 学 问题 (De Francesco，1999)。 随 着 蛋白 质 组 学 发 展 成 为 研究 整体 蛋白 质 调控 的 高 通 量 方 法 ， 对 蛋白 质 显 色 方 法 提出 了 新 的 需求 ( 表 4.2)。 旧 的 蛋白 质 染 色 如 考 马 斯 蓝 和 银 染 已 经 不 能 满足 人 们 的 期 望 。 有 幸 的 是 ， 较 新 的 染料 如 锌 -咪唑 及 非 共 价 荧 光 染 料 (SYPRO 染料 ) 正在 用 来 满足 日 益 增长 的 现代 蛋白 质 微量 表征 技术 的 需求 。 表 4.2 理想 通用 的 蛋白 质 染 料 性 质 ， 优 良 染 色 方 法 应 具备 的 7 个 S 安全 (Safety): 该 染色 方法 不 应 该 含有 害 材 料 如 放射 性 同位 素 或 氰 化 物 气体 、 卡 列 基 酸 等 强 毒 性 化 学 品 。 从 而 保证 人 身 安 全 并 消除 耗 时 的 监控 、 清 洗 和 处 理 等 问题 灵敏 (Sensitivity): 该 染色 方法 可 以 检测 到 亚 纳 克 级 蛋白 质 ， 染 色 的 线性 动态 范围 要 宽 ， 最 少 要 扩展 至 三 个 数量 级 简单 〈Simplicity) :该 染色 方法 只 需 凝 胶 或 膜 在 一 种 溶液 中 简单 的 孵育 过 程 ， 对 显 色 时 间 的 要 求 不 能 太 苛刻 ， 因 为 染色 应 可 以 达到 一 个 终点 而 不 会 显 色 过 度 特异 性 (Specificity): 该 染色 方法 应 该 特异 性 检测 蛋白 质 ， 而 不 检测 脂 类 、 糖 类 或 核酸 ， 对 不 同类 型 蛋白 质 如 钙 结 合 蛋 白 、 脂 蛋白 、 糖 蛋白 和 磷酸 化 蛋白 质 均匀 检测 RH (Speed): 该 染色 方法 可 以 快速 检测 蛋白 ， 不 需 脱 色 。 只 要 不 需 监 控 显 色 过 程 或 是 变换 溶液 ， 采 取 较 长 的 孵育 时 间 往 往 较 为 灵活 ， 如 过 夜 染 色 fe (Stability): 染 液 应 当 具 有 化 学 稳定 性 ， 保 存 期 长 ， 无 需 用 前 新 鲜 配 制 ， 染 液 在 室温 下 贮存 应 该 保持 稳定 。 染 色 后 的 胶 应 可 以 在 几 天 至 几 个 月 时 间 内 保持 稳定 ， 而 染色 信和 号 不 会 变 差 兼容 性 (Synergy): 染色 方法 应 该 和 多 种 电泳 /分 离 技术 (载体 两 性 电解 质 IEF、 固 相 pH HE IEF, Tris HAR SDS 胶 、Tris-tricine 预制 SDS 胶 、 非 变性 凝 胶 、2-DE HER. PVDF 膜 、 硝 酸 纤维 素 膜 、TLC 板 ) 兼容 。 染 色 过 程 不 应 导致 蛋白 质 的 不 可 逆 共 价 修饰 。 染 液 中 不 应 含 通常 会 干扰 Edman 测序 和 质谱 的 外 加 试剂 如 戊 二 醛 、 甲 栈 或 Tween-20 (应 万 涛 译 Re 校 ) sedi 蛋白 质 组 学 参考 文献 Adams, L. and Weaver, K. (1990) Detection and recovery of proteins from gels following zinc chloride staining. App/. Theor. Electrophoresis 1: 279-282. Alba, F. and Daban, J. (1997) Nonenzymatic chemiluminescent detection and quantitation of total protein on Western and slot blots allowing subsequent immunodetection and sequencing. Electrophoresis 18: 1960-1966. Alba, F. and Daban, J. (1998) Rapid fluorescent monitoring of total protein patterns on sodium dodecyl] sulfate—polyacrylamide gels and Western blots before immunodetection and sequencing. Electrophoresis 19: 2407-2411. Aragay, A., Diaz, P. and Daban, J. (1985) A fluorescent method for the rapid staining and quantitation of proteins in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel i 全 Electro- phoresis 6: 527-531. 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Goodlett 1.5/8 在 形成 和 蛋白质 组 学 领域 的 过 程 中 ， 质 谱 已 经 成 为 一 个 有 重要 意义 的 推动 技术 。 先 进 的 质谱 仪 的 发 明 使 质谱 具有 电离 多 肽 、 和 蛋 日 质 及 其 他 一 些 生物 大 分 子 的 能 办 ， 同 时 还 有 极 高 的 灵敏 度 。 更 多 的 科学 家 可 以 接触 到 质谱 仪 ， 并 进一步 扩展 了 其 应 用 范围 。 现 已 开 发 出 的 计算 机 算法 可 以 用 质谱 数据 〈 肽 或 碎片 离子 的 质量 ) 通过 相关 分 析 途 径 〈correl- ative-based approache) 在 蛋白 序列 数据 库 中 鉴定 和 蛋白质。 公共 数据 库 中 有 越 来 越 多 的 来 自 于 包括 人 在 内 的 各 个 种 属 的 核酸 序列 信息 ， 这 些 核 酸 序列 信息 与 质谱 仪 的 新 功能 结合 起 来 ， 显 而 易 见 ， 加 快 了 发 现 / 鉴 定 蛋白 质 组 成 分 的 步伐 。 本 章 将 讲述 质谱 在 以 下 分 析 方 面 的 应 用 : 利用 质谱 产生 的 数据 鉴定 蛋白 质 的 计算 手 段 ， 蛋 白质 的 翻译 后 修饰 位 点 鉴定 ， 特 别 是 磷酸 化 修饰 。 本 章 重 点 将 不 会 放 在 对 质谱 数 据 产 生 步 又 的 细节 描述 上 ， 因 为 这 些 内 容 在 最 近 的 许多 综述 和 专著 中 均 有 论述 (Acher- sold and Patterson, 1998; Courchesne and Patterson; 1998; Lamond and Mann, 1997; Moritz et al., 1995). 1.1 蛋白 质 鉴 定 途径 科学 的 许多 方面 都 是 由 技术 进步 来 推动 的 ， 蛋 白质 的 鉴定 就 是 一 个 很 好 的 例 于 。 目 20 世纪 80 年 代 中 期 自动 化 的 蛋白 测序 仪 问 世 以 来 ，Edman WER MAE Se 主要 方法 (Hewick et al., 1981). Edman 测序 法 对 蛋白 质 从 N 末端 开始 实施 逐步 的 化 学 降解 ， 并 对 每 一 步 释放 出 的 衍生 化 氨基 酸 ， 用 反 相 HPLC 分 离 ， 紫 外 检测 锋 检 测 ， 根据 其 保留 时 间 与 标准 氨基 酸 的 保留 时 间 相 比较 来 鉴定 。 许 多 蛋白 质 的 N 末端 氨基 被 修饰 (封闭 )， 与 Edman 化 学 试剂 不 反应 ， 所 以 分 析 完 整 蛋 白 时 没有 数据 产生 (Brown, 1979; Brown and Robert，1976)。 凝 胶 电 泳 是 蛋白 质 分 离 的 最 佳 选择 方法 ， 应 用 二 维 将 胶 电 泳 可 以 对 复杂 混合 物 的 分 离 达到 非常 高 的 分 辨 率 。 将 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 电 转 印 到 PVDF 膜 上 ， 可 以 直接 用 于 Edman 测序 化 学 反应 ， 电 转 印 方法 使 电泳 和 Edman 测序 方 法 直接 联系 起 来 (Aebersold et al., 1986; Matsudaira, 1987; Pluskal et al., 1986). 2 20 世纪 80 年 代 末 ， 开 始 用 各 种 化 学 或 酶 的 方法 降解 凝 胶 分 离 后 转 印 到 各 种 膜 上 的 微量 蛋白 ， 降 解 产物 经 分 离 及 纯化 后 用 于 Edman 测序 分 析 (Aebersold et al., 1986, 1987; Vandekerckhove et al .，1985)。 如 果 和 蛋白 质 的 N 末端 封闭 ， 不 适用 于 Edman 测序 ， 上 述 方法 可 以 提供 机 会 选择 蛋白 质 中 间 部 分 肽 段 用 于 氨基 酸 序 列 分 析 ， 而 且 中 间 肽 段 测序 的 序列 覆盖 率 明 显 高 于 单独 使 用 N 末端 序列 法 。 使 用 蛋白 质 不 同 区 域 的 氨基 酸 序列 设 HEH S| Wt EF PCR 反应 进行 基因 克隆 (Tempst et al., 1990). 7£ 90 年 代 初 期 ， 开 始 致力 于 凝 胶 分 离 蛋白 质 鉴定 方法 的 改进 ， 例 如 转 膜 和 水 解 过 程 中 获取 蛋 日 和 释 ALE ”蛋白 质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 5 93 2 放 多 肽 等 步骤 (Abersold and Leavitt, 1990; Patterson, 1994; )， 以 及 提高 Edman 测序 仪 的 灵敏 度 。Edman 测序 法 是 对 氨基 酸 序列 从 头 测 定 ， 因 此 在 蛋白 质 鉴 定 过 程 中 不 需 要 从 实验 数据 到 氨基 酸 序列 的 相关 分 析 ， 而 从 质谱 途径 鉴定 蛋 白 质 需要 从 实验 数据 到 氢 基 酸 序列 相关 分 析 的 辅助 ， 这 也 是 本 章 的 主题 内 容 。 因 此 ，Edman 测序 法 仍 将 在 种 属 基因 组 未 明了 的 蛋白 质 鉴定 中 发 挥 重要 作用 。 以 对 全 部 人 基因 组 测序 为 目标 的 人 类 基因 组 计划 的 出 现 ， 促 进 了 对 其 他 许多 种 属 基 因 组 的 测序 。 通 过 政府 及 私人 公司 两 方面 的 努力 ， 已 完成 了 许多 与 临床 和 基础 研究 相关 的 物种 的 基因 组 测序 ， 例 如 21 种 细菌 [ 见 Fraser and Fleischmann (1997) 的 综述 和 基 因 组 研究 所 微生物 数据 网 站 (The Institute for Genomics Research (TIGR) Microbial Database web site: http://www. tigr. org/tdb/mdb. html]. EY BH 8 ( Saccharomyces cerevisiae), 7 BN #r /)) FF 2 HH ( Caenorhabidopsis elegans ), 3 48 ( Drosophila melanogaster) 的 全 基因 测序 已 经 完成 。 公 共 数 据 库 中 已 经 公布 了 超过 200 万 个 人 和 100 万 个 鼠 的 表达 序列 标志 (expressed sequence tag, EST: 从 不 同 组 织 或 细胞 中 分 离 出 的 mRNA 反 转 录 成 的 cDNA 序列 ， 大 约 有 300~ 500 个 碱 基 对 长 度 )， 政 府 和 私人 公司 的 EST 序列 都 已 经 涵盖 了 至 少 3 倍 的 人 基因 组 全 序列 。 已 经 有 了 能 够 利用 质谱 测定 的 蛋白 质 一 级 结构 数据 在 蛋 白 质 序列 数据 库 〈 从 核酸 序列 翻译 成 的 蛋 白 质 序 列 ) 中 迅速 鉴 定 蛋 白质 的 软件 算法 。 这 种 蛋白 质 鉴定 新 技术 在 90 年 代 中 期 建立 ， 伴 随 着 技术 发 展 的 新 浪潮 ， 还 建立 了 用 于 Edman 测序 的 凝 胶 分 离 蛋 白质 产生 肽 段 的 纯化 、 分 离 技术 (La- mond and Mann, 1997; Patterson and Aebersold，1995)。 质 谱 及 其 接口 技术 也 在 这 一 阶 段 及 后 来 的 时 期 得 到 发 展 ， 例 如 纳 喷 技术 (nanospray) (Wilm and Mann, 1994, 1996) 和 微 流 控 技 术 (microfabricated devices ) (Figeys et ww .，1998)， 可 参见 相关 综述 (Figeys and Aebersold，1998)。 这 些 技术 上 的 进步 已 经 汇聚 成 了 一 个 成 熟 、 自 动 化 、 灵 敏 并 且 快 速 的 技术 方法 ， 极 大 地 提高 了 鉴定 蛋白 质 的 能 力 ， 并 构成 了 正在 形成 中 的 蛋白 质 组 学 领域 的 基础 。 2. 质谱 基础 知识 通过 质谱 数据 与 序列 数据 库 相 关 分 析 的 方法 鉴定 蛋白 质 的 基础 在 于 能 够 得 到 一 些 限 制 参数 ， 利 用 这 些 参 数 可 以 从 数据 库 中 所 有 的 序列 中 特异 地 识别 与 这 些 参数 相关 的 序 列 ， 这 些 参 数 包括 : 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 、 氮 基 酸 序列 、 蛋 白质 和 肽 段 的 质量 以 及 肽 碎 片 的 质量 。 参 数 可 以 单独 使 用 或 与 其 他 参数 结合 使 用 ， 其 中 分 子 的 精确 质量 特别 具有 吸 引力 ， 因 为 这 一 参数 具有 高 度 的 限制 性 ， 并 且 能 够 利用 质谱 仪 (MS) 快速 、 灵 敏 、 高 精度 地 测定 。MS 只 限于 检测 能 够 形成 离子 并 且 离 子 能 够 被 传送 入 真空 系统 的 分 子 的 质 量 ， 随 着 80 年 代 末 两 种 软 电 离 技术 : 电 喷雾 电离 (ESI) (Fenn et al., 1989) 和 基质 辅助 激光 解吸 /电离 (MALDI) (Karas and Hillenkamp, 1998) 的 发 明 ， 质 谱 变 得 更 适 用 于 分 析 生 物 大 分 子 聚 合 物 ， 蛋 白质 、 核 酸 和 糖 类 。 这 两 种 方法 之 所 以 被 称 为 “ 软 ” 电 离 技术 ， 是 因为 它们 在 离子 化 过 程 中 不 会 〈 最 多 只 部 分 ) 破坏 分 子 结构 ， 因 此 ， 就 能 实 现 分 子 质量 大 于 10 000 质量 单位 〈u) 的 生物 大 分 子 的 质量 分 析 。 质谱 仪 由 三 部 分 组 成 : 离子 源 、 质 量 分 析 器 、 检 测 器 。 质 谱 仪 在 真空 状态 下 分 析 离 子 的 质 荷 比 (mm/z)， 有 多 种 不 同 的 离子 源 与 质量 分 析 器 (检测 器 ) 的 结构 组 合 。 三 种 esi 蛋白 质 组 学 常用 于 蛋白 质 和 多 肽 分 析 的 商业 化 仪器 类 型 是 : MALDI -飞行 时 间 (TOF) 质谱 仪 、 Se ge dy chav vietnam 这 三 种 类 型 的 质谱 仪 将 在 下 文 详 述 。 2.1 MALDI-MS 线性 MALDI-MS: MALDI-MS 质谱 仪 慌 怕 是 概念 上 和 设计 上 都 最 简单 的 质谱 仪 ， 分 子 (AD) 2 ee 离子 的 质 荷 比 (m/z) 由 飞行 时 间 质 量 分 rast) 〈 见 图 $.1)。 测 量 的 质量 精确 度 与 m/z 有 关 ，25Sku 以 下 可 达到 约 0.01% ~ 0.05% 的 精确 度 ， 到 300ku 精确 度 达 到 +0.05% ~0.3%. MALDI 也 能 分 析 溶 解 在 磷 酸 盐 ，Tris 等 生物 缓冲 液 中 的 分 析 样 品 ， 或 含有 少量 腺 、 非 离子 变性 剂 及 一 些 碱 金属 盐 蛋白 质 和 多 肽 的 MALDI 分 析 包 括 以 下 一 系列 步骤 : (1) 被 分 析 物 与 基质 (小 分 子 芳香 化 合 物 ) 混合 。 基 质 通常 溶解 在 酸性 有 机 溶剂 中 ， 以 超过 样品 1000 倍 的 量 与 样品 混合 ， 将 样品 和 基质 加 到 金属 片 / 靶 上 ， as 剂 在 空气 中 挥发 后 ， 形 成 了 样品 -基质 共 结 唱 。 (2) 将 加 有 样品 -基质 混合 结晶 的 靶 送 入 质谱 仪 的 真空 s 室 (10-5~10-8 Torr). (3) 在 金属 片 / 靶 上 加 +20 一 30kvV 的 高 电压 (产生 正 离子 )， 同 时 有 短 的 激光 脉冲 照射 在 干燥 的 样品 上 。 (4) 基质 晶体 吸收 特定 波长 的 激光 能 量 (紫外 激光 337nm， 红 外 激光 2.94pm)， 又 以 热 的 形式 将 能 量 释放 ， 引 发 了 解吸 附 。 这 一 迅速 的 放 热 过 程 又 使 基质 晶体 升 上 基质 和 样品 分 子 气 化 进入 质谱 仪 的 气相 。 (5) 通过 在 气相 中 发 生 质 子 化 /去 质子 化 ， 附 着 阳离子 /脱离 阳离子 ， 或 氧化 /还 原 等 过 程 实现 离子 化 。 产 生 的 离子 从 靶 表 面 (保持 +20~30kV 高 电压 ) 被 推 斥 并 加 速 进 入 一 系列 的 离子 透镜 (保持 接地 电压 )， 离 子 透镜 聚焦 离子 进入 飞行 时 间 质 量 分 析 器 的 无 场 漂 移 区 ($0 一 300cm)。 检 测 器 安装 在 无 场 漂移 区 末端 ， 通过 飞行 管道 的 离子 被 检测 器 记录 。 (6) MALDI 离子 化 过 程 送 入 质量 分 析 器 的 离子 实质 上 具有 相同 的 终 动能 。 在 动能 一 定时 ， 离 子 的 速度 与 离子 的 质 荷 比 mm/z 成 反比 。 因 此 ， 在 线性 检测 器 中 ， 离子 到 达 飞 行 管道 另 一 端 检 测 器 的 时 间 反 映 了 被 检测 离子 的 m/z. (7) 离子 通过 无 场 漂 移 区 的 飞行 时 间 由 激光 脉冲 触发 检测 器 记录 。 因 此 ， 每 一 离子 化 过 程 产生 的 每 一 批 离子 到 达 检 测 器 的 飞行 时 间 都 被 记录 下 ， 并 被 换算 为 质 人 荷 比 m/z (Carr and Annan, 1997). BB), KTR RR, AWA m/z 可 用 已 知 质量 和 电荷 状态 的 化 合 物 的 飞行 时 间作 校正 并 用 经 验 公式 计算 出 来 (通常 用 一 个 基质 离子 和 一 个 蛋白 质 或 多 肽 离子 作 校 正 ， 被 分 析 物 的 质量 包括 在 此 质量 范围 内 )。 离 子 动能 (LE) 与 其 质量 (m) 和 速 BE (v) 的 关系 可 被 表述 为 正 = 芭 zu2?， 因 此 ， 对 于 一 个 单 电 荷 离子 ， 其 飞行 时 间 (由 REE) 与 分 子 质量 的 平方 根 成 反比 。 MALDI 离子 化 过 程 本 身 存 在 一 个 问题 ， 即 离子 化 过 程 中 动能 有 微小 的 分 散 。 由 单 个 激光 脉冲 产生 的 离子 的 动能 的 微小 差别 削弱 了 MALDI-MS 的 分 辨 力 。 多 肽 的 质量 分 第 五 章 ” 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 75° (a) HER F=O@ Wanda ctete sentation dia ante Rai a te tn Ade asintett onli: | 线性 检测 器 (b) 样品 ‘Th A ee ant) 线性 检测 器 Th ie BY ek aR HV HV (9) | | Te 样品 ， ee a 二 {ven lan } HV BF < HV 一 一 一 HV 图 $.1 基质 辅助 激光 解吸 /电离 质谱 仪 (a)MALDIMS;(b) 反 射 MALDI-MS;(c) 环 形 电场 反射 MALDILMS。 具 体 细 节 见 文中 。 HE (m/Am) 通常 为 40 一 800 FWHM ( 峰 高 一 半 处 的 峰 宽 )， 蛋 白质 的 质量 分 辩 率 通 # A 50~400 FWHM， 这 样 的 质量 分 辩 率 即使 是 多 肽 的 同位 素 分 布 也 不 能 测定 。 初 始 能 量 的 分 散 是 与 质量 有 关 的 ， 离 子 质 量 越 大 ， 峰 越 宽 。 现 已 发 展 了 两 种 技术 以 提高 MALDIMS 的 质量 分 辨 率 : 使 用 离子 镜 (ion mirror) / (反射 器 reflectron) 和 (或 ) 采 用 时 间 延 迟 聚 焦 (time-lag-focusing) 处 理 (图 $.1b 和 $.1lc)。 如 图 所 示 ， 离 子 镜 / 反 射 怖 在 一 个 特定 区 域内 将 离子 反射 回 检测 右 。 这 通过 以 下 步骤 实现 : 在 飞行 管 末 端 放置 的 反射 器 上 施加 高 电压 ， 其 电压 值 比 离子 源 的 电压 值 稍 高 ， 进 入 反射 器 的 离子 在 电场 作用 下 方向 偏转 ， 直 至 停止 飞行 ， 然 后 在 反射 器 内 被 重新 加 速 飞 出 反射 器 进入 第 二 检测 器 (图 5.1b)。 反 射 右 充当 了 一 个 能 量 聚 焦 装 置 ， 因 为 动能 稍 小 的 离子 (速度 慢 )， 进 入 反 “ 译 者 注 : 这 条 线 应 该 去 掉 ; 原文 插图 有 误 。 ins, 蛋白 质 组 学 射 器 的 距离 得， 折返 较 早 ， 动 能 稍 大 的 离子 进入 反射 器 的 距离 长 ， 折 返 较 晚 ， 所 以 速度 慢 的 离子 赶 上 了 速度 快 的 离子 : 反射 器 的 应 用 减少 了 离子 初始 动能 的 分 散 ， 因 此 提高 了 质量 分 辨 率 。 第 二 种 用 来 修正 MALDI 离子 化 过 程 中 初始 能 量 分 散 的 技术 是 在 离子 源 内 实现 的 ， 由 Wiley 和 McLaren 在 1953 年 提出 (Wiley and McLaren，1953 )， 称 为 时 间 延 迟 聚 焦 (time-lag-focusing)， 最 近 被 称 为 延迟 提取 (delayed extraction) (Vestal et al., 1995). 在 图 $.1b 和 ec 中 看 到 ， 相 对 于 连续 离子 提取 (图 $.1a)， 延 迟 提取 是 在 样品 靶 和 接地 的 连续 离子 提取 透镜 之 间 又 加 了 二 级 离子 透镜 (施加 电压 )， 和 延迟 提取 时 ，MALDI RE 无 电场 区 域 产 生 离 子 ， 在 施加 提取 电压 使 离子 加 速 进入 飞行 管道 之 前 ， 离 子 可 以 四 处 分 散 。 这 样 显著 降低 了 离子 的 能 量 分 散 ， 同 时 也 限制 了 峰 的 展 宽 ， 峰 的 展 宽 通 常 是 由 于 在 连续 离子 提取 模式 下 源 内 离子 碰撞 产生 不 稳定 的 解 离 所 致 。 延 迟 提 取 使 线性 MALDI JR 谱 仪 分 析 多 肽 的 质量 分 辨 率 达 到 2000 一 4000， 使 反射 MALDI 质谱 仪 分 析 多 肽 的 质量 分 辩 率 达到 3000 一 6000 (Brown and Lennon, 1995; Vestal et al., 1995). PSD-MALDI-MS: ”为 了 在 MALDI- MS 仪器 上 获取 一 级 结构 信息 ， 必 须 选 择 分 析 某 一 离子 及 其 碎片 离子 的 质量 。 这 一 过 程 发 生 在 源 内 离子 化 之 后 ， 所 以 被 称 为 源 后 衰 AK (post source decay, PSD) (Chaurand et al. 1999)。 对 多 肽 进行 PSD 分 析 时 ， 其 碎片 离子 主要 是 沿 多肽 骨架 断裂 形成 ， 产 生 的 一 系列 碎片 离子 在 理论 上 包含 着 这 一 肽 段 的 氢 基 序 列 信息 (Kaufmann et al .，1994)。 离 子 源 内 产生 的 离子 被 加 速 后 在 飞行 过 程 中 产 生 的 碎片 离子 是 亚 稳 离 子 ， 所 有 的 碎片 离子 都 具有 与 其 前 体 离子 相同 的 速度 ， 但 只 具有 前 体 离子 动能 的 一 部 分 。 所 有 的 离子 ， 包 括 前 体 离子 和 碎片 离子 ， 由 于 具有 相同 的 表 观 质 荷 比 ， 都 将 在 同一 时 间 到 达 线 性 检测 器 ， 所 以 在 线性 TOF 分 析 器 中 ， 不 能 分 辨 碎片 离子 与 前 体 离子 。 但 是 使 用 离子 镜 (反射 器 ) 可 以 分 辨 碎片 离子 与 前 体 离子 的 动能 差 异 ， 现 在 有 两 种 反射 器 : 双 程 (dual-stage) 反射 器 和 环 场 (curved-field) Rit. WE 反射 器 只 能 在 有 限 的 动能 范围 内 聚焦 离子 ， 为 了 使 较 宽 动能 范围 的 离子 都 被 聚焦 ， 反 射 器 电压 要 逐步 减少 ， 连 续 降 7 一 14 步 ， 聚 焦 动 能 越 来 越 小 的 离子 ， 收 集 到 最 后 一 张 谱 图 时 ， 反 射 器 电压 大 致 是 初始 电压 的 5% 一 10%。 由 数据 系统 整合 出 连续 、 完 整 的 碎片 离 子 谱 图 ， 并 根据 每 一 反射 电压 下 的 碎片 离子 校正 谱 图 进行 校正 。 环 场 反 射 器 由 Cornish 和 Cotter (1994) 最 先 提出 ， 能 在 一 次 试验 中 分 辨 出 所 有 的 雁 片 离子 。 环 场 反 射 句 是 由 一 系列 电压 逐渐 减 小 的 离子 透镜 组 成 的 长 反射 器 (图 5.1c)， 因 此 聚焦 不 同 质 荷 比 的 碎 片 离子 所 需 的 电压 一 直 存 在 ， 但 是 在 空间 上 是 可 以 分 辨 的 。 在 同一 激光 脉冲 下 如 果 产 生 多 个 肽 段 离 子 ， 在 没有 质量 过 滤器 时 ， 不 能 区 分 不 同 肽 段 产 生 的 碎片 离子 ， 也 不 能 区 分 碎片 离子 与 未 断裂 的 肽 段 离子 。 因 此 ， 装 备 有 以 上 任 一 种 反射 器 的 质谱 仪 都 安装 了 一 个 离子 门 (ion gate)， 可 以 在 低 分 辩 率 情况 下 (42.5%) (图 5.1b、c) 选择 前 体 离子 / 碎 片 离子 。 所 以 ， 在 一 个 未 经 分 离 的 肽 混合 物 中 ， 可 以 选择 多 个 肽 段 得 到 其 序列 特异 的 碎 片 离子 信息 。 2.2 ESI-MS 在 ESI 源 中 ， 含 有 被 分 析 样 品 〈 多 肽 /蛋白 质 ) 的 溶液 流 经 一 个 细 细 的 进 样 针 ， 针 头 上 加 高 电压 (+1000~5000V) 用 来 产生 正 离子 ， 见 图 $.2a。 高 电压 导致 样品 液 流 分 第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 -77- 散 为 呈 喷 雾 状 的 带 高 电荷 的 微小 液 滴 ， 质 谱 仪 入 口 端的 有 和 孔 平 板 上 加 有 + 100 ~ 1000V 的 低 电 压 ， 引 导 离 子 通 过 入 口 (orifice)， 这 一 入 口 是 离子 源 和 质谱 仪 的 连接 处 ， 离 子 源 处 于 大 气压 环境 ， 质 谱 仪 处 于 真空 系统 内 。 当 液 滴 从 针尖 通 往 入 口 时 ， 在 定向 惰性 气体 ie CARINII) 的 作用 下 溶剂 蒸发 ， 使 液 滴 缩小 ， 液 滴 电荷 密度 增加 ， 最 终 导致 液 滴 爆 裂 ， 离 子 从 液 相 中 释放 出 来 进入 气相 (Carr and Annan，1997)。 离子 通过 入 口 后 ， 在 一 个 只 加 有 射频 场 (radio frequency, RF) 的 四 极 杆 控制 下 进入 质量 分 析 上 磊 ， 可 以 是 四 极 杆 、 四 极 杆 -飞行 时 间 、 或 离子 阱 质量 分 析 器 。ESI 产生 的 多 肽 离子 的 特征 是 带 多 电荷 ， 电荷 数 与 肽 分 子 中 可 电离 的 基 团 数目 有 关 。 如 果 用 ESI-MS 正 离子 模式 分 析 胰 酶 酶 切 肽 段 ， 大 多 数 肽 段 都 会 带 至 少 两 个 电荷 ， 一 个 在 N 末端 的 NH, 基 团 上 ， 另 一 个 在 胰 酶 酶 切 位 点 ， 肽 段 C 末 端 碱 性 氨基 酸 的 侧 链 上 。 (a) FRA 喷雾 MAD OV Seds: . ——s HV ar | 四 极 杆 (在 电 喷雾 针 上 ) (射频 模式 ) (b) 裂解 气 入 口 Ql RE) 质量 分 析 器 ais) nae (c) 环形 电极 号 三 让 ba ia 射频 模式 tN 四 极 杆 oy" 端 盖 电极 图 5.2 电 喷 雾 离子 化 质谱 仪 (a) ESI-MS; (b) ESI-TQ-MS; (c) ESI-IT-MS。 具 体 细 节 见 文中 。 ESI- 三 级 四 极 质谱 仪 ”如 其 名 所 述 ， 三 级 四 极 质 谱 仪 由 三 套 四 极 杆 组 成 (A 5.2b)。 四 极 杆 滤 质 器 既 可 以 传送 混合 物 中 所 有 的 离子 (Li RF-only 方式 工作 )， 又 可 以 充当 质量 过 滤器 ， 只 人 允许 特定 质 荷 比 的 离子 通过 。 四 极 杆 由 4 个 平行 的 圆 棒 构 成 ， 相向 的 一 对 圆 棒 上 施加 电极 相反 的 直流 和 交流 电压 。 当 离子 漂移 通过 四 极 杆 圆 棒 的 中 间 区 域 时 ， 改 变 四 极 杆 上 施加 的 电压 ， 使 具有 特定 m/z 质 荷 比 的 离子 才能 通过 ， 所 有 其 i eel’ 蛋白 质 组 学 他 质 荷 比 的 离子 改变 了 线性 飞行 路 径 ， 从 分 析 器 中 消失 。 如 果 四 极 杆 上 施加 的 电压 连续 变化 (扫描 )， 由 通道 -电子 倍增 吉 记 录 通 过 波 质 器 的 离子 数目 ， 并 与 特定 的 离子 m/z 质 荷 比 建立 函数 关系 ， 就 得 到 一 张 质谱 图 。 四 极 质量 分 析 髓 通常 可 分 析 的 质量 范围 是 2500 一 4000u， 因 为 记录 的 是 盖 />， 而 不 是 多 肽 质量 本 身 ， 而 且 ESI 通常 产生 带 多 电荷 的 肽 离子 ， 所 以 ， 使 用 ESI 源 的 四 极 质量 分 析 器 能 用 来 分 析 远 远 超 出 其 质量 分 析 范 围 Me A it. 在 三 级 四 极 质谱 中 ， 第 一 级 Q1 和 第 三 级 Q3 四 极 杆 是 质量 过 滤器 ， 第 二 级 四 极 杆 Q2 仅 施加 射频 电压 ， 充 当 产 生 碎 片 离子 的 碰撞 室 ， 从 Q1 传送 来 的 肽 离子 在 碰撞 室内 经 重 的 惰性 气体 如 Ar AN, 的 碰撞 诱导 ， 产 生 正 离子 ， 这 一 HE (collision-induced dissociation, CID). 三 级 四 极 质谱 仪 有 S 种 工作 模式 : (1) MS 模式 ”这 种 模式 用 于 分 析 未 解 离 的 离子 质量 。 扫 描 Q1，Q2 中 未 引入 裂解 气体 ，Q3 为 射频 电场 模式 。 也 可 以 使 Ql 处 于 射频 模式 ， 扫 描 Q3 电场 实现 质 量 测 定 。 (2) MS/MS 模式 〈 也 称 为 产物 离子 扫描 法 ，product ion scan) “在 一 个 给 定 的 时 间 点 ，Ql 设 定 为 仅 传输 某 一 选 定 质 荷 比 的 离子 ， 此 离子 进入 Q2 后 ， 经 碰撞 诱 导 解 离 ， 产 生 的 碎片 离子 通过 扫描 Q3 进行 检测 。 这 样 得 到 与 QI 选择 的 初始 肽 段 离 子 相 关 的 碎片 离子 质谱 图 。Q1l 选择 母 离 子 ， 在 Q2 内 进行 CID，Qa3 分 析 碎 片 离子 ， 这 一 分 析 过 程 不 断 循环 ， 用 以 选择 分 析 不 同 质量 的 肽 段 离 子 。 实 际 上 ， 某 些 仪器 如 TSQ 7000 (Finnigan, MAT, San Jose, CA) 可 以 设 定 程序 自 动 在 MS 和 MS/MS 模式 间 切 换 ， 将 MS 检测 到 的 离子 进行 CID 分 析 ， 并 记录 碎片 离子 的 谱 图 ， 整 个 过 程 不 需要 用 户 介 入 [Ducret et al., 1998; Stahl et al., 1996; ICL procedure on our web site (http://depts. washington. edu / ~ ruedilab/aebersold. html) ]。 这 一 过 程 称 为 数据 依赖 的 CID (data-depen- dent CID)。 产 物 离子 扫描 法 可 用 来 测定 肽 段 的 氨基 酸 序列 。 (3) 中 性 丢失 扫描 模式 (neutral loss scan mode) ”此 模式 中 Q1l Q3 的 电压 同步 扫描 ， 但 保持 一 个 特定 m/z 值 的 电压 差 (offset) 。Q2 是 碰撞 室 ，Ql 和 Q3 的 电压 差 值 与 Q2 内 碰撞 消除 的 一 个 特定 中 性 分 子 的 质量 一 致 。 因 此 ， 在 离子 混 合 物 中 ， 只 有 碰撞 裂解 后 能 丢失 这 一 特定 基 团 的 离子 才 会 被 Q3 传输 到 检测 器 。 例 如 ， 在 磷酸 肽 与 非 磷酸 肽 混合 物 中 ， 通 过 对 50 m/z 的 HPO "的 中 性 丢 失 扫 描 ， 可 以 检测 出 磷酸 肽 的 双 电 荷 峰 (Covey et wz.，1991)。 在 离子 被 传送 到 检测 器 时 ， 已 经 知道 Q1 和 Q3 上 各 自 施加 的 特定 电压 ， 所 以 可 以 确定 发 生 中 性 丢失 的 肽 段 质量 。 (4) 前 体 离 子 ( 母 离 子 ) 扫描 (precursor/parent ion scanning) ”此 模式 中 扫描 QI 电压 ，Q3 设 定 为 只 传输 某 一 特定 质 荷 比 离子 ，Q2 为 碰撞 室 。 与 中 性 丢失 扫描 相似 ， 前 体 离子 扫描 检测 离子 混合 物 中 在 Q2 碰撞 室 丢 失 特 定 基 团 的 离子 。 与 中 性 丢失 扫描 不 同 的 是 ， 前 体 离子 扫描 模式 直接 检测 断裂 的 基 团 RAF, “HAE: 原文 有 误 ; 应 为 49 m/z 的 HaPO4。 ALE ”蛋白 质 鉴 定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 79 + reporter ion) 。 检 测 器 检测 到 报告 离子 时 ， 已 知 Ql 的 电压 ， 所 以 可 以 确定 产生 这 一 特定 碎片 的 前 体 离 子 的 质量 。 因 此 前 体 离子 扫描 模式 被 用 来 检测 肽 混合 物 中 某 些 含有 特定 结构 特征 的 肽 段 。 (5) YEA CID (in-source CID) RAAT ESI 源 内 由 大 气压 气体 碰撞 产生 的 高 压 区 内 。 可 以 选择 碰撞 条 件 使 肽 链 骨 架 断 裂 (Katta et al., 1991) 或 使 一 些 相 对 不 稳定 的 基 团 如 磷酸 基 团 选择 性 断裂 (Huddleston et al .，1993)。 所 带电 和 荷 数 大 于 1 的 肽 段 离 子 更 容易 断裂 ， 因 为 在 这 些 离子 上 分 配 的 动能 远大 于 仅仅 将 这 些 离子 聚焦 到 Q1 分 析 器 所 需 的 动能 。 这 一 方法 提供 了 在 三 级 四 极 质谱 仪 中 实现 MS/MS/MS 分 析 的 机 会 ， 及 在 单 级 四 极 质 谱 仪 中 实现 MS/MS 分 析 的 机 会 (Loo et w.，1990)。 以 上 任 一 种 扫描 类 型 都 适用 于 源 内 CID 产生 的 离子 。 为 了 鉴定 蛋白 及 对 肽 段 从 头 测 序 ， 仪 器 通常 以 MS/MS 模式 运行 。 对 选择 离子 施加 的 碰撞 能 量 可 以 通过 改变 碰撞 气体 的 压力 而 变化 ,如 果 时 间 人 允许 ， 可 以 对 有 裂解 过 程 实现 很 好 的 控制 。 在 数据 依赖 操作 模式 (data-dependent operation) 中 ， 质 谱 仪 由 程序 控制 ， 对 MS 模式 检测 到 的 超过 一 预先 设 定 的 离子 流 冰 值 的 离子 自动 进行 碰撞 诱导 解 离 ， 碰 撞 Ae RAL 〈ramped)， 以 期 在 不 同 碰撞 能 量 下 得 到 的 谱 图 中 至 少 得 到 一 张 最 佳 裂 解 碎片 谱 (Stahl er ol .，1996)。 但 是 ， 当 样品 量 极 少 ， 样 品 溶液 通过 微量 或 纳 喷 (nano- spray) 装置 引入 源 内 ， 且 样品 未 脱盐 时 ， 得 所 质谱 图 的 化 学 背景 和 杂质 峰 占 据 主导 地 位 (Wilm and Mann，1996)。 因 此 ， 为 了 在 这 样 的 混合 物 中 找到 肽 段 离子 ， 质 谱 仪 可 以 前 体 离子 扫描 模式 运行 ， 将 Q3 分 析 器 设 定 为 86 m/z, SAR Leu WHRAR lle 的 WABF (immonium ion) 质量 ， 通 常 在 许多 肽 段 序列 中 都 存在 这 两 种 氨基 酸 (Wilm etal., 1996). ESI- 离子 阱 质谱 仪 ”离子 阱 质谱 仪 是 一 种 串联 质谱 仪 ， 在 分 析 前 先 将 离子 聚集 ， 储存 。 离 子 阱 是 仪器 的 核心 部 分 ， 既 可 以 作为 质量 分 析 器 ， 又 可 以 作为 碰撞 室 。 四 极 离 子 阱 使 用 射频 方式 工作 的 四 极 杆 引导 离子 从 离子 源 进 入 离子 阱 。 离 子 阱 由 两 种 电极 构 成 ， 一 个 环形 电极 ， 两 个 端 盖 (end-cap) 电极 〈 图 $.2c)， 离 子 进出 离子 阱 都 经 过 端 盖 电极 上 的 小 孔 。 环 形 电 极 上 施加 的 高 射频 (RF) 电压 将 离子 捕获 在 其 产生 的 电场 中 ， 此 射频 电压 的 大 小 决定 了 被 捕获 离子 的 频率 及 运动 。 大 于 某 一 特定 m/z 值 的 离子 留 在 离子 阱 中 ， 被 残留 氨 气 碰撞 冷却 ， 使 离子 的 正弦 振 功夫 缩 ， 在 很 短 时 间 内 ， 运 动 轨道 由 大 变 小 。 通 过 线性 变化 (ramp) RF 电压， 同时 对 端 盖 电极 施 以 一 小 电压 ， 使 连续 质 荷 比 的 离子 共振 发 射 ， 得 到 完整 的 质谱 图 。 共 振 发 射 是 指 在 离子 阱 中 变 得 不 稳定 的 离子 被 发 射 到 端 盖 电极 的 同 轴 方 向 ， 穿 过 端 盖 电 极 并 被 电子 倍增 检测 器 的 转换 电极 检测 ， 转 换 电极 采用 离 轴 (off-axis) 位 置 ， 是 为 了 除去 中 性 物质 的 背景 (Jonscher and Yates, 1997; Schwartz and Jardine，1996 ) 。 通过 离子 捕获 和 离子 选择 发 射 的 过 程 ， 具 特定 质 荷 比 的 离子 可 以 从 离子 阱 中 分 离 出 来 。 如 果 这 一 离子 在 离子 阱 中 裂解 ， 而 且 碎 片 离子 也 被 共振 发 射 ， 就 得 到 了 MSV/MS 串 联 质谱 图 。 如 果 碎 片 离子 中 除 某 一 特定 质 荷 比 的 离子 外 ， 其 他 所 有 碎片 离子 均 被 共振 发 射 ， 这 一 雁 片 离子 可 以 重复 进行 裂解 /共振 发 射 过 程 ， 这 样 就 得 到 了 多 级 串联 质谱 (MS?)。 曾 有 文献 报告 做 到 MS” (Louris et al., 1990), MMS 已 成 为 常规 实验 ， 特 别 是 在 糖 肽 的 结构 分 析 中 〈Reinhold et wz .，1995)。 在 离子 阱 中 对 某 一 特定 m/z 比值 离 - 80 - 蛋白 质 组 学 子 的 分 离 和 裂解 包括 : 共振 发 射 所 有 质 荷 比 大 于 和 小 于 这 一 比值 的 所 有 离子 ， 这 样 在 离 子 阱 中 只 剩 下 选 定 m/z 比值 的 离子 (被 分 离 的 离子 )， 这 时 改变 电极 电压 使 离子 能 量 增加 ， 这 样 离子 就 会 与 残留 的 中 性 气体 (He) 碰撞 而 裂解 ， 产 生 的 碎片 离子 用 上 文 所 述 的 扫描 方式 测定 。 被 捕获 离子 上 所 加 的 能 量 大 小 可 通过 改变 参数 而 调节 ， 在 某 些 仪器 中 这 一 参数 被 称 为 相对 碰撞 能 量 (relative collision energy，RCE)。 如 上 文 PSD-MALDI- MS 所 述 ， 单 电荷 离子 的 裂解 比 双 电荷 离子 裂解 需要 更 多 的 能 量 。 在 某 些 离子 阱 实验 中 ，RCE 可 以 手动 调节 产生 非常 好 的 效果 (Davis and Lee，1997)。 离 子 阱 质谱 仪 的 其 他 一 些 可 以 改变 并 影响 仪器 性 能 的 参数 包括 在 任何 一 次 捕获 中 允许 进入 离子 阱 的 离子 数 目 ， 以 及 这 种 捕获 超过 多 少 次 后 信号 将 被 平均 以 增加 信 噪 比 。 如 果 有 太 多 m/z 比值 非 常 接 近 的 离子 被 捕获 ， 会 观察 到 被 称 为 空间 电荷 效应 (space charging) 的 现象 。 由 于 m/z 比值 非常 接近 的 离子 之 间 运 动 轨道 相互 影响 ， 所 以 空间 电荷 效应 降低 了 实验 测量 质量 的 精确 度 。 因 此 在 设置 参数 时 必须 注意 不 会 对 数据 起 负面 影响 (Courchesne et al., 1998)。 商 业 化 的 离子 阱 质谱 仪 的 仪器 控制 软件 支持 数据 依赖 裂解 (data-dependent frag- mentation) 功能 ， 因 此 非常 适用 于 LC-MS/MS 分 析 。 3. 以 质谱 为 基础 的 相关 鉴定 策略 3.1 肽 质量 检索 (peptide-mass searching) MACDI-MS 质谱 仪 商品 化 后 ， 表 现 出 其 分 析 混 合 物 中 肽 段 质量 的 能 力 ， 尤 其 是 对 凝 胶 分 离 蛋 白质 的 酶 切 肽 段 的 分 析 能 力 ， 很 快 有 许多 研究 小 组 开始 研发 蛋白 质 鉴定 的 软 件 算法 ， 这 些 算法 都 是 基于 用 实验 测 得 的 肽 质量 与 蛋白 序列 数据 库 中 蛋白质 的 肽 质量 计 算 值 进行 相关 性 分 析 (图 $.3) (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Pappin et al., 1993; Yates et ; .，1993)。 这 一 途径 已 经 成 为 凝 胶 分 离 蛋白 质 鉴 实验 方法 计算 方法 完整 蛋白 质 〈 如 凝 胶 分 离 或 色谱 纯化 蛋白 质 ? 蛋白 质 序列 数据 库 〈+ 核 酸 序列 翻译 数据 库 ) " | 肽 质量 检索 : (a) 计算 数据 库 中 每 一 个 序列 在 给 定 的 酶 切 条 件 下 产生 的 肽 段 质量 数 。 肽 混合 物 (b) 实验 测 得 的 肽 质量 数 与 计算 值 进行 相关 性 比较 。 (c) 将 相关 性 最 好 的 结果 排序 ， 或 仅 列 出 有 显著 相关 的 结果 { (匹配 的 肽 段 数目 )。 未 解析 碎片 离子 检索 : 质谱 测定 肽 质量 (a) 计算 数据 库 中 每 一 个 序列 在 给 定 的 酶 切 条 件 下 产生 的 (MALDI-MS, ESI-MS) 肽 段 质量 数 。 人 b) 找 出 每 一 个 与 实验 测 得 质量 数 一 致 的 肽 段 ， 产 生 其 理论 碎片 离子 列表 。 选择 肽 段 裂 解 (c) 实验 测 得 的 碎片 离子 质量 数 与 理论 碎片 离子 质量 数 计 (PSD-MALDI-MS, ESI-MS/MS) 算 值 进行 相关 性 比较 。 (d) 将 匹配 最 好 的 结果 排序 , 或 仅 列 出 有 显著 相关 的 结果 ( 匹 配 的 离子 数目 )。 图 5$.3 质谱 鉴定 蛋白 质 第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 81 . 定 的 最 常用 手段 (Aebersold and Patterson，1998 ) 。 鉴 鉴定 数据 库 中 已 有 序列 的 蛋白 质 的 算法 基于 以 下 一 些 理念 。 (1) 肽 段 是 由 切 点 专 一 的 试剂 水 解 蛋 白质 产生 的 ， 通 常用 已 知 切 点 专 一 的 蛋 白 酶 。 (2) 这 些 肽 段 的 质量 由 MALDI-MS 或 ESI-MS 精确 测定 。 (3) 计算 蛋白 序列 数据 库 中 的 每 一 序列 被 实验 中 所 用 水 解 试 剂 水 解 后 产生 的 理论 肽 段 的 质量 。 (4) 用 试验 得 到 的 肽 质量 与 数据 库 中 的 肽 质量 计算 值 相 匹 配 ， 计 算得 分 或 排序 值 。 许多 做 开创 性 工作 的 小 组 及 后 来 加 入 进来 的 研究 小 组 已 将 他 们 的 检索 软件 放 在 因 特 网 上 供 大 家 使 用 ， 并 有 例子 予以 说 明 ( 见 表 $.1)。 这 种 检索 途径 有 一 个 明显 的 限制 ， 就 是 被 鉴定 的 蛋白 质 必 须 已 经 在 序列 数据 库 (翻译 的 核酸 序列 或 蛋白 序列 数据 库 ) 中 存 在 。 因 此 ， 这 一 手段 非常 适用 那些 基因 特性 非常 清楚 的 物种 ， 特 别 是 全 基因 组 已 知 的 物 种 〈 例 如 见 TIGR 数据 库 ，http://www'.tigr.org/tdb)， 亦 适用 那些 已 经 建立 详尽 的 蛋 白质 或 cDNA 序列 数据 库 的 物种 。 肽 质量 检索 鉴定 蛋白 质 方法 的 依据 是 实验 中 获得 的 蛋 白质 的 多 个 肽 段 的 质量 数据 与 同一 蛋白 质 肽 段 质 量 计算 值 之 间 的 相关 性 。 因 此 ， 这 一 技 术 既 不 适用 于 检索 表达 序列 标 鉴 数据 库 (EST) 翻译 序列 ， 也 不 适用 于 鉴定 2 个 以 上 的 蛋白 混合 物 。 但 是 ， 对 某 些 蛋白 质 可 进行 种 属 间 鉴 定 ， 已 经 有 了 为 这 一 特殊 目的 而 编写 的 程序 (Wilkins er al., 1998). EST 仅 代表 蛋白 编码 序列 的 一 部 分 ， 其 长 度 不 足以 产 生 供 肽 质量 鉴定 实验 所 需 的 足够 的 肽 数目 。 如 果 水 解 蛋白 质 混合 物 ， 只 产生 其 中 部 分 特 定 肽 质量 的 蛋白 质 的 鉴定 就 不 明显 。 但 如 果 每 一 个 观察 到 的 肽 段 都 能 与 序列 数据 库 中 的 某 一 蛋白 精确 相关 ， 混 合 物 中 蛋白 质 的 鉴定 仍然 可 行 。 方 法 是 从 测 得 的 肽 质量 中 去 掉 与 已 被 鉴定 的 蛋白 质 相 关 的 所 有 肽 段 ， 用 剩余 的 质量 数 检索 数据 库 ， 将 这 一 步骤 重复 循环 进行 。 但 是 ， 由 于 下 面 将 要 提 到 的 一 些 原 因 ， 所 有 检测 到 的 肽 质量 都 与 蛋白 质 的 序列 相 表 5.1 用 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 的 检索 工具 网 址 资源 网 址 特点 CBRG, ETH-Zurich, Switzerland 。 cbrg.inf. ethz. ch/MassSearch. html 肽 质量 检索 软件 EMBL，Heidelberg, Germany www. mann. embl-heidelberg. de/Ser- “ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件 vices/PeptideSearch/Pep- tideSearchlntro. html ExPasy www. expasy. ch/tools/ # proteome Ak AE He KE Mascot www. matrix-science. com/cgi/index. pl? AM BAR HBT RARE page = /home. html Rockefeller University New York, prowl. rockefeller. edu/ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件 USA SEQNET, Daresbury, UK www. seqnet. dl. ac. uk/ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件 Bioinformatics/ welapp/ mowse University of California，San prospector. ucsf .edu 肽 质量 检索 软件 (MS-Fit) 和 碎片 离子 Francsico, USA 检索 软件 (MS-Tag) University of Washington thompson. mbt. washington. edu/sequest/ ”碎片 离子 检索 软件 SEQUEST 应 用 指 导 ee 蛋白 质 组 学 符 的 情况 很 少 发 生 ， 这 不 仅 使 混合 物 中 各 组 分 的 鉴定 变 得 复杂 ， 还 使 单一 的 纯 蛋 白质 的 鉴定 也 复杂 化 ， 因 此 ， 了 解 那些 未 匹配 的 肽 质量 数 的 性 质 非 常 重要 。 下 面 将 讲述 与 匹配 EMS BAKA KRW HR (spurious masses) 存在 的 可 能 原因 (Jensen et al., 1997, 1998; Patterson and Abersold, 1995). (1) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 是 由 于 翻译 后 修饰 或 人 为 修饰 及 翻译 后 加 工 (如 N 或 C 末端 加 工 ) 产生 了 另外 的 质量 。 尽 管 某 些 质量 的 差异 可 能 与 这 些 修饰 情况 相 符 ， 但 除非 经 实验 证 明 ， 和 否则 仅仅 是 假设 。 (2) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 存在 非特 异性 的 和 蛋 日 水 解 ， 或 有 杂 有 蛋白 酶 存在 。 通 过 排 除 酶 切 位 点 专 一 的 假设 ， 确 定 候选 蛋白 质 是 否 会 产生 具有 那些 质量 数 的 肽 段 ， 这 样 可 以 接受 这 种 可 能 性 。 (3) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 有 部 分 杂质 蛋白 质 混在 其 中 ， 如 2-DE 胶 上 的 蛋 自 点 可 能 由 多 个 蛋 昌 质 组 成 。 如 果 有 足够 多 的 未 匹配 肽 质量 数 ， 就 可 以 用 这 些 数据 单 独 进 行 肽 质量 检索 ， 以 证 实 存 在 另外 的 蛋白 质 。 当 然 要 做 酶 自 切 的 对 照 实验 ， 以 鉴别 所 有 的 酶 和 目 切 产物 。 (4) 被 鉴定 的 蛋白 质 或 许 是 数据 库 中 已 登录 和 旱 和 白 的 同 源 序 列 ， 或 者 是 其 序列 的 剪 切 变异 体 。 某 些 检索 程序 允许 实现 跨 种 间 检 索 ， 如 果 能 得 到 另外 确实 的 数据 ， 这 一 方法 还 是 很 有 用 的 。 因 为 从 基因 特征 不 清楚 的 种 属 得 到 的 蛋白 质 也 许可 以 在 基因 特征 清楚 的 种 属 的 蛋白 序列 库 中 得 到 匹配 鉴定 (Cordwell et al., 1995). (5) 蛋白 质 的 鉴定 结果 是 假 阳性 。 如 果 没 有 其 他 数据 ， 特 别 是 实验 数据 的 质量 数 精 确 度 不 高 时 ， 这 一 糟糕 的 结果 很 难 被 证 实 或 证 伪 。 如 果 所 用 检索 程序 是 用 鉴定 结果 的 得 分 值 排序 ， 而 所 得 检索 结果 得 分 值 又 比较 低 时 ， 该 结果 的 证 实 就 更 加 困难 了 。 在 某 些 例子 中 ， 通 过 比较 检索 结果 中 排序 第 一 和 第 二 位 〈 及 后 面 ) 的 得 分 值 之 差 ， 得 到 进一步 确认 。 此 蛋白质 也 可 能 在 蛋白 数据 库 中 不 存在 。 用 肽 质量 数据 鉴定 蛋白 质 所 控制 的 实验 参数 中 ， 最 具 决 定性 的 参数 是 肽 质量 测量 的 精确 度 (Fenyo et al., 1998; Jensen et al .，1996a，1997)。 质 量 精 确 度 越 高 ， 结 果 判 定 越 可 信 。 另 一 决定 性 参数 是 所 用 酶 (或 化 学 试剂 ) 的 专 一 性 。 酶 越 纯 ， 专 一 性 越 高 ， 检索 结果 越 可 信 。 最 常用 的 酶 是 胰 蛋 白 酶 。 但 是 要 注意 的 是 ， 即 便 是 高 纯度 的 胰 蛋 白 酶 也 会 在 非 Lys 或 Arg 的 氨基 酸 残 基 C 端 酶 切 〈 其 后 不 是 Pro)。 所 有 蛋白酶 都 存在 的 问 题 是 ， 如 果 和 蛋白 序 列 中 有 2 个 或 更 多 个 连续 氨基 酸 残 基 是 酶 的 切 点 ， 蛋 白 酶 会 对 底 物 酶 切 不 完全 ， 留 下 漏 切 的 位 点 和 不 完全 的 末端 ， 许 多 检索 程序 把 漏 切 的 位 点 数目 作为 输入 的 一 个 检索 参数 。 内 肽 酶 LysC 是 另 一 个 具 高 度 专 一 性 的 酶 ， 此 酶 产生 的 自 切 产物 比 胰 蛋白 酶 少 ， 但 同样 也 会 有 漏 切 位 点 ， 也 会 在 非 Lys 位 点 酶 切 (其 后 不 是 Pro)。 同 样 也 要 注意 ， 不 是 所 有 的 蛋白 质 ， 不 论 是 否 经 凝 胶 分 离 ， 都 适用 于 胰 蛋 日 酶 或 其 他 专 一 性 重 白 酶 切 ， 但 是 ， 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 ， 由 于 其 处 于 变性 状态 ， 通 常 酶 切 十 分 有 效 。 蛋白 酶 的 性 能 很 难 改变 ， 与 之 不 同 的 是 肽 质量 测量 精确 度 依赖 于 所 使 用 的 仪 右 及 其 操作 。 最 佳 的 肽 质量 检索 应 该 用 内 标 校 正 的 单 同位 素质 量 。 在 MALDI-MS 质谱 仪 中 ， 通常 只 有 安装 时 间 延 迟 聚 焦 / 延 迟 提取 (〈 见 前 文 ) 的 仪器 ， 能 够 达到 肽 质量 的 同位 素 分 布 分 辨 率 。 这 种 仪器 达到 Sppm 的 质量 准确 度 ， 可 确定 单 同位 素质 量 ， 并 在 肽 质量 检索 程序 中 设立 非常 小 的 质量 误差 ， 这 样 高 精度 的 数据 减少 了 错误 匹配 的 可 能 性 (Jensen et 第 五 章 ，” 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 83 - al., 1996a, 1997; Takach et al .，1997)。 如 果 没 有 安装 延迟 提取 选 件 ， 质 谱 仪 应 该 用 内 标 校 正 ， 且 内 标 质 量 范围 应 包含 被 检测 肽 段 的 质量 。 没 有 延迟 提取 装置 的 仪器 不 能 分 辩 同 位 素 峰 ， 仅 得 到 平均 分 子 质 量 。 单 同位 素质 量 比 平均 分 子 质量 更 精确 ， 因 为 单 同位 素质 量 是 由 单一 同位 素 C12 决定 的 ， 而 平均 质量 是 由 C12 和 不 同 数目 的 同位 素 Cl13 质 量 的 平均 值 决定 的 〈 其 他 元 素 的 同位 素 相 似 )。 为 了 进一步 增加 肽 质量 的 可 信和 度 ， 开 发 了 “ 正 交 法 ”对 单个 肽 段 的 氨基 酸 序列 或 组 成 提供 额外 的 ， 或 限制 性 的 信息 。 这 种 方法 中 ， 样 品 除 用 于 原始 质量 测量 外 ， 还 分 出 一 部 分 用 于 正 交 分 析 。 正 交 分 析 信息 限制 了 用 肽 质量 在 数据 库 中 检索 鉴定 蛋 白 质 产生 的 多 个 肽 段 与 同一 质量 匹配 的 情况 。 正 交 方 法 可 分 为 以 下 几 类 。 (1) 特异 位 点 的 化 学 修饰 ” 甲 酯 化 ， 在 每 个 羧基 基 团 上 增加 14 个 质量 单位 [如 酸 性 氨基 酸 残 基 (Asp, Glu ) 侧 链 或 肽 的 C 末 端 (Pappin et al., 1995)]; BAIL RM, CRAM EM I 126 个 质量 单位 (Craig et al., 1995); 及 用 1:1 混合 的 乙酰 氨 / 所 代 乙酰 氨 在 每 个 半 胱 氨 残 基 上 进行 同位 素 标 记 (Sechi and Chait, 1998 ) 。 (2) 测定 肽 段 的 部 分 氨基 酸 组 成 ”有 两 种 方法 : 如 果 肽 段 中 的 可 交换 氢 在 所 溶液 中 被 交换 ， 那 么 每 一 个 氨基 酸 有 其 特定 的 交换 数目 ， 每 个 残 基 为 0 至 5 个 质量 单 位 。 因 此 ， 肽 质量 增加 的 总 数 就 反映 了 肽 的 氨基 酸 组 成 (James et al., 1994). 肽 段 部 分 氨基 酸 组 成 也 可 通过 鉴别 MS/MS 质谱 图 中 的 所 离子 (immonium ion) 峰 来 确定 。 (3) SEN 末端 氨基 酸 残 基 ”混合物 中 肽 段 的 N 末端 氨基 酸 确定 可 用 化 学 法 ， 一 步 Edman 反应 (Jensen et al., 1996b); 或 酶 法 ， 用 氨 肽 酶 除去 末端 氨基 酸 残 基 (Woods et al., 1995). (4) 肽 内 不 同 酶 切 位 点 的 鉴定 ”为 了 确定 段 肽 中 一 个 特定 残 基 的 存在 及 相对 位 置 ， 有 人 和 采用 酶 切 位 点 不 同 的 酶 对 一 级 水 解 产 物 进 行 二 次 水 解 (次 级 水 解 ) (Pap- pin et al .，1995)。 同 样 也 可 把 一 份 样品 分 为 两 等 分 用 切 点 不 同 的 酶 平行 水 解 (James et al., 1994). (5) Be CHa AN 末端 残 基 鉴 定 相 似 ， 用 羚 肽 酶 除去 C 末 端 氨基 酸 残 基 ， 某 些 情况 下 ， 会 有 一 个 或 多 个 额外 的 残 基 被 水 解 了 (Patterson et al., 1995; Woods et wl .，1995)。 但 是 当 使 用 高 度 专 一 性 的 酶 时 ， 除 去 一 个 残 基 不 能 提供 太 多 信息 。 Fenyo et al. (1998) 做 了 出 色 的 研究 来 评价 正 交 信息 在 肽 质量 检索 中 的 好 处 ， 检 索 中 使 用 的 数据 库 是 酵母 全 基因 组 数据 库 ， 读 者 可 以 参考 这 篇 文章 以 了 解 此 方法 的 优点 的 详细 内 容 。 3.2 未 解析 碎片 离子 的 检索 正如 数据 库 中 可 以 检索 肽 质量 一 样 ， 数 据 库 同样 可 以 检索 一 个 单个 肽 段 及 其 碎片 离 子 的 质量 。 肽 段 质量 同 它 的 碎片 离子 质量 一 起 提供 了 非常 具有 鉴别 力 的 判断 标准 ， 可 用 于 在 序列 数据 库 中 检索 ， 包 括 由 表达 序列 标签 翻译 的 序列 数据 库 (图 $.3)。 这 一 手段 已 被 广泛 用 于 凝 胶 分 离 蛋 白质 酶 水 解 后 产生 的 肽 段 鉴定 (Aebersold and Patterson, - 84- 蛋白 质 组 学 1998; Lamond and Mann, 1997; Patterson，1997)。 肽 段 通常 用 上 文 所 述 的 一 些 方法 ， 在 质谱 仪 气相 中 被 诱导 产生 碎片 离子 ， 例 如 PSD-MALDI-MS， 或 三 级 四 极 质谱 及 离子 BRAY CID。 在 这 些 仪器 中 ， 肽 段 离 子 断 裂 的 方式 具有 序列 特异 性 ， 主 要 是 沿 肽 骨架 的 肽 键 断 裂 ， 见 图 $.4 所 示 。 如 果 肽 离子 的 正 电 荷 保 留 在 碎片 离子 的 N 末端 ， 此 离子 被 称 为 ! 系列 离子 ， 用 下 标 数字 代表 这 一 碎片 离子 中 的 氨基 酸 残 基数 目 ， 从 N 末端 起 为 1。 因 此 ，2 离子 代表 C 末端 缺失 ，N 末端 完整 的 碎片 离子 。 如 果 电 荷 保留 在 C 末端 ， 离子 被 称 为 y 系列 离子 (与 六 系列 离子 一 样 有 下 标 数字 ， 但 从 C 末端 数 起 )。 因 此 > 离 子 代表 N 末端 缺失 ，C 末端 完整 的 碎片 离子 (Bieman 命名 法 ，1990)。CID 谱 图 是 由 几 千 种 独立 的 裂解 过 程 产生 数据 的 混合 图 ， 即 系列 和 >y 系列 离子 的 混合 图 。 谱 图 中 也 存 在 一 些 其 他 离子 : 氨基酸 侧 链 (Gln, Lys, Arg) 中 性 丢失 氨 ， 产 生 少 17 个 质量 数 的 离 子 ; 氨基 酸 侧 链 (Ser, Thr, Asp, Glu) 中 性 丢失 H2O 产生 少 18 个 质量 单位 的 离子 ; 以 及 从 五 系列 离子 中 性 丢失 COMED 28 个 质量 单位 的 离子 ， 即 a 系列 离子 ; 另外 ， 如 果 一 个 肽 段 离 子 发 生 多 次 裂解 ， 就 会 产生 中 间 雁 片 ， 包 括 酰 基 离子 (acyl， 由 至 少 2 个 氨基 酸 残 基 组 成 ， 见 图 5.4b) AAAS ( 见 图 5.4c 和 表 5.2)。 亚 所 离子 代表 单个 氢 基 酸 的 质量 ， 因 此 提供 了 肽 段 的 部 分 氨基 酸 组 成 。 并 不 是 所 有 的 肽 键 在 CID 条 件 下 都 具有 相同 的 断裂 倾向 ， 在 同一 张 MS/MS 谱 图 中 产生 的 碎片 离子 的 强度 也 有 显著 差异 。 RR EMRE EAB (prolyl) 键 上 ， 通 常 产 生 CID 谱 图 中 的 最 强 离子 峰 。 另 外 ， Rae RAR (prolyl) 键 断 裂 还 导致 产生 了 最 常见 的 中 间 和 碎片 酰基 离子 (acyl)， 并 从 有 睛 氨 酸 残 基 延 伸 到 C 未 端 。 | (a) NA al bi ae be as bs Ri 9 Re O ag HoN-CHICIN-CHICIN-CH H CAWRF y yp (b) ry 工 一 < O=9O 2 工 一 之 GQ=7J a oe 〇 O nN aks Ri tact Ri Re (b) H2N-CH-C-N-CH-C=O + H RiRz-28 (a) H)N-CH- (c) 图 5.4 常见 的 带 正 电 荷 的 碎片 离子 命名 (a)N 末端 和 C 末 端 离子 ;(b) 中 间 酰 基 离子 (internal acyl ions);(c) 中 间 亚 氨 离 子 (internal immonium ions) 。 ALE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 85 . 表 5.2 20 种 常见 氨基 酸 的 残 基 和 亚 氨 离子 质量 ” 氨基 酸 名 称 3 字母 简称 残 基质 量 " WAR i? AAR Ala (A) 71 44 RABE Asn (N) 114 87 天 冬 氢 酸 Asp (D) 115 88 MAR Arg (R) 156 129, 112, 100, 87, 70, 43° RAR Cys (C) 103 76 BK Gln (Q) 128 101 (w/o 84) BR Glu (E) 129 102 HAR Gly (G) 57 30 AAR His (H) 137 110 FEAR lle (1) 113 86 AR Leu (L) 113 86 MAR Lys (K) 128 101, 84, 129° 甲 硫 氨 酸 Met (M) 131 104 AAR Phe (F) 147 120 i AR Pro (P) 97 70 (w/o 112, 100 and 87) 丝氨酸 Ser (S) 87 60 HAR Thr (T) 101 74 AR Trp (W) 186 159 MAR Tyr (Y) 163 136 SAR Val (V) 99 72 “此 值 来 自 于 Jardine (1990); "给 出 的 所 有 质量 值 均 为 整数 ， 划 线 的 值 表明 其 丰 度 较 高 ; w/o= without 无 ;“ 精 氨 酸 和 赖 氨 酸 显示 有 多 个 亚 氨 离 子 ， 均 耶 以 列 出 。 如 上 所 述 ， 肽 段 裂 解 可 由 PSD-MALDI-MS 产生 ， 也 可 由 三 级 四 极 或 离子 阱 质谱 的 CID 诱导 产生 。 这 三 种 方法 中 ， 由 PSD-MALDIMS 导致 的 裂解 最 不 易 控 制 ， 在 PSD- MALDIMS 中 仅 有 的 可 变 参 数 是 激光 通 量 和 基质 。 另 外 ， 在 MALDI-MS 中 只 产生 单 电 荷 离子 ， 与 电 喷雾 离子 化 产生 的 双 电 荷 和 三 电荷 离子 相 比 ， 需 要 更 多 的 能 量 使 其 断裂 。 因此 PSD-MALDI-MS 的 成 功率 很 低 ， 在 很 多 情况 下 ， 同 一 样品 的 PSD 谱 图 质量 比 ESI 仪器 的 CID 分 析 谱 图 差 很 多 。 碎片 离子 谱 图 包含 有 重复 的 信息 ， 例 如 重 和 至 的 上 和 >y 系列 离子 以 及 同一 肽 段 的 多 个 中 间 离 子 。 这 种 重复 使 碎片 离子 谱 成 为 极 丰 富 的 序列 特异 信息 来 源 ， 但 也 使 序列 的 解析 更 加 复杂 ， 因 为 通常 不 能 直接 判断 某 一 离子 归属 于 哪 一 种 离子 系列 。 除 了 人 工 解 析 碎 片 离子 谱 (在 下 文 的 从 头 测序 中 要 讲 到 ) 外 ， 还 有 两 种 基本 检索 手段 用 于 匹配 数据 库 中 序 列 产生 的 碎片 离子 谱 。 第 一 种 方法 依靠 人 工 解 析 部 分 谱 图 来 鉴别 某 一 特定 系列 (2 或 y) 离子 的 连续 离子 元 素 (例如 鉴别 出 相互 之 间 相 差 一 个 氨基 酸 残 基质 量 的 碎片 离子 )， 解析 出 部 分 序列 信息 ， 再 结合 以 下 参数 : @ 鉴 定 出 的 系列 中 第 一 个 离子 的 质量 数 ; @ 肽 段 质量 与 最 后 一 个 离子 质量 之 差 (这 两 个 质量 数 限 制 了 此 序列 两 端 未 知 残 基 的 总 质量 ); 图 此 完整 肽 段 的 质量 ; @@ 所 用 蛋白 水 解 酶 的 酶 切 特 性 (在 N 端 、C 端 都 切 还 是 只 切 一 端 )。 这 五 种 信息 组 成 了 肽 序列 标签 “PST” (peptide sequence tag, PST) (Mann and Wilm，1994)。 在 序列 数据 库 中 可 以 检索 出 符合 PST 各 元 素 内 容 的 肽 序列 。 第 二 种 类 型 的 碎片 离子 检索 程序 是 由 Yates 及 其 合作 者 开发 的 (Eng et al., 1994), BAIEM AR “fia 蛋白 质 组 学 :解析 的 碎片 离子 信息 检索 的 程序 ， 称 为 SEQUEST。 其 检索 手段 首先 是 在 数据 库 中 的 每 一 个 序列 中 寻找 与 实验 测 得 肽 离子 质量 一 致 的 肽 段 (在 一 定 误差 范围 以 内 )， 肽 段 质量 计算 值 是 其 连续 氨基 酸 质量 之 和 ， 在 检索 时 如 有 必要 ， 还 要 利用 蛋白 酶 的 酶 切 位 点 特性 言 息 。 对 检索 到 的 每 一 个 候选 肽 ， 程 序 计算 出 其 在 相同 CID 实验 条 件 下 预期 产生 的 碎 片 离子 质量 数 。 然 后 用 簇 分 析 算 法 (cluster-analysis algorithms) 将 前 500 个 计算 值 与 实 验 测 得 的 碎片 离子 谱 比 较 。 每 一 个 比较 结果 都 有 一 个 得 分 值 ， 报 告 出 得 分 最 高 的 结果 ， 如 果 得 分 值 有 显著 性 意义 ， 则 蛋 晶 质 鉴定 成 功 。 此 方法 的 鉴定 基础 是 未 经 任何 解析 的 肽 段 碎片 离子 质谱 图 。 在 数据 依赖 的 〈data-dependent) LC-MS/MS 分 析 中 可 以 自动 化 地 应 用 这 一 技术 。 分 析 过 程 中 ， 肽 段 经 反 相 HPLC 分 离 ， 电 喷雾 进入 联机 质谱 仪 ， 此 质 谱 仪 可 进行 数据 依赖 的 MS/MS 分 析 ， 即 将 离子 流 超过 一 定 阔 值 的 所 有 离子 打 碎 进行 MS/MS 分 析 ， 并 记录 所 有 的 CID 谱 ， 自 动 提交 检索 。 这 种 自动 化 手段 有 许多 优点 ，Patterson 和 Aebersold (Patterson and Aebersold, 1995) 曾经 综述 如 下 : (1) 复杂 的 蛋 白 质 混 合 物 可 以 被 逐个 鉴定 ， 因 为 每 一 个 做 MS/MS 分 析 的 肽 段 产生 的 碎片 离子 数据 都 独立 进入 数据 库 检 索 (McCormark et al., 1997). (2) 在 这 种 类 型 的 分 析 中 ， 来 自 于 每 一 个 肽 段 的 碎片 离子 谱 都 代表 一 个 独立 的 数据 库 检索 。 如 果 一 个 单一 的 蛋白 质 被 酶 解 ， 蛋 白质 鉴定 结论 基本 上 能 够 自动 确 定 。 因 为 在 多 肽 段 检 索 结 果 中 ， 应 该 是 同一 个 蛋白 位 于 最 高 排 位 (Ducret et al., 1998). (3) 如 上 所 述 ， 这 一 方法 的 自动 化 程度 高 (Yates et al., 1995b). (4) 通过 指导 程序 可 以 预测 某 一 特定 残 基 上 的 特定 修饰 ， 此 方法 适用 于 寻找 有 特定 翻译 后 修饰 的 肽 段 ， 同 样 可 以 鉴定 产生 这 一 翻译 后 修饰 肽 段 的 蛋白 质 (Yates et al., 1995a, 1995b). (5) 以 上 这 些 研究 者 及 其 他 研究 者 开发 的 蛋白 质 鉴定 资源 的 网 址 见 表 1。 4. 用 质谱 数据 对 肽 段 从 头 测 序 (de novo sequencing) 前 面 两 部 分 已 经 讲述 了 利用 质谱 或 串联 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 的 相关 手段 。 这 些 方法 适用 于 鉴定 那些 数据 库 中 已 有 其 序列 的 蛋白 质 。 用 MS 和 MS/MS 方法 从 头 测序 的 方法 已 经 开发 出 来 。 单 级 质谱 测序 是 分 析 肽 段 的 阶梯 序列 ， 即 相 邻 肽 段 间 相差 一 个 氨基 酸 残 基 ， 用 质谱 分 析 肽 阶梯 ， 通 常用 MALDI-TOF-MS 分 析 。MS/MS 测序 用 的 是 上 文 所 述 用 于 数据 库 检 索 的 CID 谱 ， 但 碎片 离子 由 人 工 完全 解析 。 用 于 MS 序列 分 析 的 肽 阶梯 是 由 化 学 或 酶 法 降解 肽 段 产 生 ， 由 C 末端 或 N 末端 断 Be WE N 末端 序列 的 化 学 方法 应 用 Edman 化 学 反应 ， 用 MALDI-MS 读 出 产生 的 变 短 的 肽 。 这 一 方法 通常 被 称 为 “阶梯 测序 "”。 在 这 种 方法 上 发 展 了 两 种 变化 方式 。 第 一 种 方法 是 在 每 一 测序 循环 开始 时 ， 在 多 肽 /蛋白 质 底 物 内 加 Edman 试剂 。 每 一 个 循环 中 有 一 小 部 分 的 底 物 被 N 末端 封闭 ， 末 端 封闭 后 的 肽 在 下 一 个 循环 中 不 会 参加 反应 ， 这 样 就 产生 了 序列 阶梯 。 最 终 反 应 产物 混合 物 经 MALDLMS 分 析 ， 其 质量 数 之 差 反 映 了 和 氢 基 酸 残 基 的 质量 数 (Chait et al., 1993; Wang et wL .，1994)。 第 二 种 方法 ， 也 称 为 “nested peptide sequencing”， 是 在 每 一 个 Edman 降解 循环 中 多 次 加 入 多 肽 /蛋白 质 底 物 。 PRE ”和 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 87: 在 此 法 中 加 入 过 量 易 挥发 的 Edman 试剂 以 使 反应 完全 ， 每 一 循环 中 的 过 量 试剂 可 通过 蒸发 被 除去 。 经 MALDI-MS 分 析 得 到 肽 序列 阶梯 ， 实 现 阶 梯 测 序 (Bartlet-Jones et al., 1994)。 这 两 种 方法 都 需要 底 物 蛋 白质 为 自由 N 末端 ， 并 且 不 能 分 辩 同 质 异 核 氨基 酸 残 基 亮 氢 酸 和 蜡 亮 氨 酸 。 谷 所 酰胺 PALME 128.13) MMAR ( 残 基质 量 128.17)， 在 CID 谱 中 很 难 分 辨 但 在 这 两 种 方法 中 可 轻易 分 辨 。 因 为 赖 氨 酸 侧 链 的 氨基 会 被 反应 试 剂 修饰 。 理 论 上 讲 ， 这 两 种 方法 都 能 分 析 肽 混合 物 ， 只 要 肽 段 之 间 质 量 差 异 明显 ， 不 会 与 降解 产物 质量 重 亚 (Wang et ol .，1994)。 除 了 逐步 化 学 降解 法 ， 氨 肽 酶 和 羧 肽 酶 也 可 以 截 短 肽 段 产 生 肽 阶梯 序列 。 此 方法 的 好 处 是 可 以 将 很 少量 的 起 始 反应 物 直 接 放 在 MALDI 样品 靶 的 表面 反应 ， 只 要 加 入 基质 就 可 以 终止 反应 (Patterson et al., 1995; Woods et ol.，1995)。 通 过 控制 反应 时 间 可 以 读 出 较 长 的 序列 ， 此 方法 不 能 分 辨 Gln 和 Lys & Ile 和 Leu. 如 果 CID 能 产生 高 质量 的 谱 ， 例 如 谱 图 含有 完整 的 > 和 2 系列 离子 ， 那 么 ， 通 过 对 碎片 离子 的 从 头 解析 可 以 确定 肽 段 的 序列 ， 可 从 Yates 的 文章 了 解 其 概要 (Yates et al., 1994), {Aéé, HRPM > 和 2 离子 的 判断 具有 很 低 的 置信 度 ， 使 得 读 出 最 终 序 列 很 困难 。 使 CID 谱 图 解析 变 得 复杂 的 主要 因素 包括 四 碎片 离子 丢失 ， 如 产生 不 完整 的 离 子 系列 ;四 将 观察 到 的 信号 归属 为 某 一 特定 离子 系列 较 困 难 。 通 过 在 酶 切 过 程 中 对 C 末端 离子 的 特异 性 同位 素 标记 ， 可 以 使 > 系列 离子 的 鉴别 变 得 较为 容易 。 这 一 方法 利 用 了 胰 和 蛋白酶 的 水 解 特性 ， 即 在 C 末端 新 生成 的 羧基 中 从 水 分 子 中 结合 了 一 个 氧 。 因 此 ， 如 果 在 胰 蛋 白 酶 水 解 缓冲 液 中 含有 HO, AAPA AKER (BRT C 末端 肽 段 ) 都 会 有 一 个 同位 素 标记 的 C 末端 羧基 团 (Schnolzer et al., 1996). HUE 50% H2 O/H22O 的 缓冲 液 中 进行 胰 蛋 白 酶 酶 切 反 应 ， 所 有 的 新 生 肽 段 (除了 C 末端 肽 段 ) 都 将 表现 为 一 对 峰 ， 两 峰 质量 数 相差 2 个 质量 单位 ， 同 时 他 们 的 离子 强度 也 只 有 在 Hz OO 溶液 中 正常 水 解 产 生 肽 段 离子 强度 的 一 半 。 胰 和 蛋白酶 切 点 在 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 之 后 的 肽 键 ， 通 过 激活 胰 蛋 白 酶 195 位 丝氨酸 的 OH 基 团 ， 与 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 的 羧基 形成 共 价 结 合 的 键 ， 同 时 释放 新 形成 的 N 末端 。 活 性 水 分 子 攻击 过 渡 态 使 酯 键 断 裂 ， 释 放 新 生 肽 段 ， 肽 段 的 羧基 上 含有 一 个 从 溶剂 水 中 获取 的 氧 ， 溶 剂 水 为 HO RHO 的 机 率 相 等 。 这 样 ， 当 这 两 种 离子 都 被 质谱 仪 选择 为 母 离子 时 ， 只 有 具 完 整 C 末端 的 离子 系列 (y 系列 离子 及 其 中 性 丢失 离子 ) 会 以 相差 2u 的 双 峰 存在 。 这 样 就 区 别 出 了 y 系列 离子 并 可 计算 出 序列 差异 ， 对 肽 段 进 行 从 头 测序 。 虽 然 这 种 方法 简化 了 对 特定 离子 系列 的 确 认 ， 但 也 减 小 了 每 一 个 y 离子 的 信号 强度 ， 因 此 使 高 灵敏 度 的 测序 更 为 困难 。 使 用 高 分 辨 的 质谱 仪 如 四 极 杆 -飞行 时 间 串 联 质谱 仪 可 以 实现 在 单 次 实验 中 对 肽 段 谱 图 的 完全 解析 (Shevchenko et wy .，1997)， 同 时 这 种 方法 已 成 功 应 用 于 离子 阱 质谱 仪 (Qin et alL.，1998)。 另 外 一 种 便于 人 工 解 析 CID 谱 及 从 头 测序 的 化 学 方法 是 对 肽 段 的 羧基 实行 甲 酯 化 。 这 个 反应 使 肽 段 每 一 个 羧基 质量 增加 14u， 包 括 未 修饰 的 C 末 端 、Asp 和 Glu 上 的 羧基 (Hunt et al .，1986)。 如 果 肽 段 中 没有 酸性 残 基 ， 同 时 C 末端 没有 被 修饰 ， 那么 只 有 y 系列 离子 及 其 中 性 丢失 离子 会 表现 出 质量 数 的 变化 ， 比 较 衍 生化 与 未 衍生 化 两 份 样品 的 碎片 离子 谱 就 会 鉴定 出 > 系列 离子 。 如 果 肽 段 中 存在 酸性 残 基 ， 这 个 方 法 的 价值 就 极其 有 限 了 ， 因 为 只 能 鉴定 中 间 碎 片 。 对 N 末端 残 基 特 异性 标记 从 而 鉴定 0 系列 离子 的 方法 也 有 尝试 。 在 这 些 实验 中 肽 段 的 氨基 被 衍生 化 ， 衍 生化 试剂 在 气相 中 "8 蛋白 质 组 学 含有 永久 正 电荷 (Huang et al., 1999; Roth et wz .，1998)。 虽 然 这 些 方法 在 概念 上 引 人 注目 ， 但 在 实践 上 遇 到 困难 ， 主 要 由 于 在 质谱 分 析 衍 生化 物 之 前 必须 先 除 去 过 量 的 试 剂 ， 同 时 这 个 反应 不 能 区 别 N 末端 氨基 和 和 赖 氨 酸 侧 链 上 的 氨基 。 5. 磷酸 化 位 点 分 析 的 各 种 方法 5.1 磷酸 化 分 析 的 原理 在 Krishna 和 Wold (Krishna and Wold, 1998) 所 述 的 上 面 几 种 蛋白 质 修 饰 类 型 中 ， 至 今 只 发 现 少数 几 种 是 可 道 的 或 在 生命 活动 中 具有 重要 的 调控 作用 。 其 中 研究 最 为 详细 HEE AHR. BARR EAR ZT, AURA RRA Bt Bee LMA RR ha ei, WR Aa. RE Ea PEAY Za (Charbon- neau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter, 1987). HRA RELY RR LARA EHAR. HARARBARMN REL. CHKENRRILMARAR,. AAR 和 赖 氨 酸 的 亚 酰 胺 化 ， 以 及 天 冬 氨 酸 和 谷 氨 酸 的 酰 化 。 这 些 修 饰 中 的 其 中 一 些 是 化 学 不 稳定 的 ， 通 常 观察 不 到 ， 除 非 采 取 特 殊 的 保护 措施 防止 他 们 在 蛋白 质 分 离 过 程 中 消失 (Duclos et oz.，1991)。 举 例 来 说 ， 组 氨 酸 磷酸 化 是 一 个 相对 常见 的 修饰 ， 至 少 在 原核 生物 中 是 这 样 ， 但 是 ， 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 常用 的 酸性 染色 条 件 下 ， 磷 酸化 组 氨 酸 完全 消 失 。 因 此 ， 在 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 中 通常 观察 不 到 磷酸 化 组 氨 酸 ， 其 在 细胞 中 出 现 的 频率 也 很 难 估 计 。 蛋白 质 磷 酸化 水 平 是 由 两 个 作用 相反 的 酶 系 一 一 磷酸 酶 和 激酶 来 调控 的 。 这 些 酶 中 大 部 分 的 结构 、 专 一 性 、 调 控 已 被 深 入 研究 过 ， 已 经 有 相关 综述 (Charbonneau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter, 1987). ##(hit@JLG SAA / eR 酶 ， 它 们 有 不 同 的 底 物 、 动 力学 特性 、 组 织 分 布 及 其 与 调控 通路 的 关系 。 通 过 对 酿酒 醇 母 全 基因 组 DNA 序列 中 被 认为 代表 蛋白 激酶 (和 磷酸 酶 ) 的 序列 基 元 (motif) HAT 表明 ， 酵 母 能 够 表达 123 种 不 同 的 蛋白 激酶 (40 种 蛋 日 磷酸 酶 )， 这 就 暗示 2% 的 酵母 蛋白 参与 了 蛋白 质 磷 酸化 过 程 。 读 者 可 以 参看 许多 综述 以 了 解 蛋白 质 磷 酸化 /去 磷酸 化 在 许多 受 调控 的 生命 系统 中 的 重要 性 (Charbonneau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter，1987)。 了 解 蛋 白质 磷酸 化 对 功能 的 影响 可 以 深入 理解 生命 系统 如 何在 分 子 水 平 进行 调控 ， 例 如 ， 一 个 单一 的 磷酸 化 过 程 可 以 调节 糖 原 磷 酸化 酶 的 活性 (Johnson and Barford，1990)。 对 和 蛋 白质 酷 氨 酸 激酶 p561lck 的 研究 工作 表明 ， 在 单个 丝 氨 酸 上 的 磷酸 化 [可 能 是 由 促 分 裂 原 活化 蛋白 (MAP) 激酶 所 致 (Watts et al., 1993)]， 能 够 改变 一 个 酶 的 底 物 专 一 性 (Joung et al., 1995). MAMBR RASH & 白质 相互 作用 已 经 表明 其 提供 了 稳定 蛋白 质 复合 物 所 需 的 支架 ， 这 种 蛋白 质 复合 物 表 现 出 复杂 的 生物 功能 ， 特 别 是 在 细胞 间 的 信号 传导 过 程 中 (Wange et al., 1995; Watts et al .，1994)。 因 此 可 以 明显 看 出 可 逆 的 蛋白 质 磷酸 化 是 一 种 非常 重要 的 蛋白 质 修饰 ， 它 能 改变 酶 的 催化 活性 和 底 物 的 专 一 性 ， 调 节 具 有 调控 功能 的 蛋 日 质 复合 物 的 稳定 性 和 亚 细胞 定位 ， 从 而 扩展 生物 活性 和 功能 。 5.2 磷酸 化 分 析 策 略 蛋白 质 磷酸 化 研究 的 主要 目的 有 三 点 : 第 一 ， 定 位 一 个 给 定 蛋白 质 在 体内 的 磷酸 化 SLE ”蛋白 质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 89 . 氨基 酸 残 基 位 点 ， 此 给 定 蛋白 质 位 于 某 一 特定 状态 下 的 细胞 内 ; 第 二 ， 鉴 定 与 此 磷酸 化 过 程 有 关 的 激酶 ; 第 三 ， 分 析 所 观察 到 的 磷酸 化 现象 对 功能 的 影响 。 在 这 些 目的 中 ， 第 一 个 可 以 直接 用 质谱 分 析 ， 因 此 是 本 章 的 主题 。 第 二 和 第 三 个 目标 需要 应 用 各 种 不 同 的 生化 、 遗 传 及 药理 学 方法 ， 由 于 篇 幅 所 限 ， 有 关 这 些 的 详细 情况 就 不 再 详 述 了 。 细胞 内 的 许多 磷酸 化 蛋白 的 含量 非常 少 ， 几 乎 不 可 见 。 即 使 蛋白 质 的 表达 量 处 于 相 对 较 高 的 水 平 ， 磷 蛋白 的 分 析 也 很 困难 ， 因 为 重 白 磷酸 化 的 化 学 计量 值 常 常 很 低 ， 某 一 个 蛋白 质 中 仅 有 一 少 部 分 被 磷酸 化 ， 同 一 个 蛋白 质 中 也 会 存在 多 种 不 同 的 磷酸 化 类 型 。 由 于 这 些 原 因 ， 即 使 用 当前 最 灵敏 的 分 析 方 法 ， 也 很 难 分 离 到 足够 量 用 于 分 析 的 体内 磷 酸化 和 蛋白质。 因此 许多 蛋白 质 的 磷酸 化 研究 是 在 体外 利用 激酶 反应 使 蛋白 质 被 磷酸 化 修 饰 ， 通 常 能 够 扩大 反应 规模 以 产生 大 量 的 磷酸 化 蛋白 。 在 体外 研究 确定 的 磷酸 化 位 点 被 认为 具有 生物 学 意义 之 前 ， 必 须 证 实在 体内 存在 相同 的 磷酸 化 位 点 。 通 常 通过 比较 体内 和 体外 的 同一 磷酸 化 蛋白 质 的 二 维 磷 酸 肽 图 得 知 (图 5.5)。 体 外 磷酸 肽 产生 的 量 大 ， 经 化 学 或 质谱 分 析 作为 参考 证 实体 内 微量 磷酸 肽 的 鉴定 。 当 各 自 的 磷酸 肽 在 谱 图 中 共 迁 移 时 则 可 认为 体内 、 体 外 磷 蛋 白 有 相同 的 磷酸 化 位 点 (例如 Watts et al., 1994, 1996b)。 因 此 ， 这 个 方法 通过 与 一 个 结构 清楚 的 参考 样品 肽 共 迁 移 在 某 种 程度 上 间接 证 实 了 一 个 体内 磷酸 化 位 点 的 确定 。 体 ie pmlo 体 内 fmol PPA mR (°P) 4a aR 蛋白 质 分 离 磷酸 氨基 酸 。 4 _ samy 蛋白 酶 切 分 析 | \ 相关 分 析 / 2DPP 作 图 Nga 2DPP * / | | / wLC-ESE-Ms \ ; a MALDI-MS Ny hnHPLC { IMAC 全 ILCESLMS 47 图 $.5 磷酸 化 位 点 分 析 策 略 ， 即使 在 体内 能 够 产生 足够 量 的 磷酸 肽 用 于 质谱 分 析 的 情况 下 ， 实 验 成 功 的 关键 也 依 赖 与 所 用 的 样品 制备 方法 。 因 此 ， 以 下 部 分 简要 介绍 一 下 常用 的 ， 从 非 磷酸 化 多 肽 占 主 要 成 分 的 多 肽 混合 物 中 检测 和 分 离 磷酸 化 蛋白 及 多 肽 的 方法 。 因 为 这 些 方法 与 质谱 没有 直接 关系 ， 所 以 只 是 简单 讨论 一 下 。 读 者 可 以 从 Aebersold 的 文章 中 得 到 这 一 主题 内 容 ~ 2)" 蛋白 质 组 学 的 更 详细 的 论述 (Aebersold and Patterson，1998 ) 。 5.3 磷 蛋 白 的 检测 和 分 离 本 质 上 ， 任 何 分 析 蛋 白质 磷酸 化 位 点 的 方法 都 要 依靠 对 所 研究 酸 化 蛋白 质 的 纯 化 ， 用 酶 或 化 学 方法 水 解 磷 蛋 白 ， 分 离 、 分 析 产 生 的 磷酸 肽 。 幸 运 的 是 ， 前 面部 分 所 述 的 用 于 处 理 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 分 离 蛋白 质 的 方法 ， 同 样 适用 于 磷 蛋 白 的 分 析 。 所 以 ， 用 于 产生 磷酸 肽 样品 的 方法 是 : ARRAS A, KRRARATREARA, # 取 产 生 的 磷酸 肽 混合 物 作 进一步 分 析 。 虽 然 磷 蛋 白 在 SDS-PAGE 上 的 迁移 通常 比 其 非 磷酸 化 的 蛋白 慢 ， 但 是 ， 在 一 维 胶 上 看 到 两 条 迁移 非常 接近 的 条 带 ， 或 在 2-DE 上 观察 到 一 系列 有 相同 分 子 质 量 但 不 同等 电 点 的 斑点 ， 这 样 的 现象 并 不 足以 确定 某 一 个 蛋白 是 磷酸 化 蛋白 。 用 ?P 标记 后 放射 自 显 影 ， 或 磷 储 屏 分 析 (storage phosphorimaging)， 或 用 Western 印迹 方法 鉴定 磷 蛋 日 的 结果 较为 确定 、 可 信 。 用 现 有 的 方法 在 常规 实验 中 就 可 将 ”P 放 射 标记 物 挫 入 体内 或 体外 磷酸 蛋白 质 中 (Patterson and Garrels，1994)。 分 子 放射 标记 方法 用 于 体内 磷酸 化 蛋白 质 标记 ， 要 标记 的 细胞 或 组 织 与 *PO4 孵 育 一 段 时 间 ， 使 细胞 ATP 库 与 :2P 平 衡 。 放 射 标记 的 ATP 被 蛋白 激酶 用 于 磷酸 化 其 底 物 。 体 外 蛋白 质 磷酸 化 的 激酶 反应 用 [7-“P] ATP 作为 放射 标记 物 来 源 ， 粗 分 的 细胞 裂解 液 或 纯化 的 激酶 作为 激酶 活性 来 源 。Western PER MBRARRRILE AH HAI KA, AA 已 经 开发 出 了 一 系列 非常 灵敏 的 酷 氨 酸 -磷酸 盐 特 异性 抗体 ， 例 如 4g10 ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); py2 和 RC10 (Transduction Laboratories, Lexington, KY)， 同 时 也 因为 此 方法 没有 放射 性 同位 素 标记 。 泛 磷酸 -特异 性 抗体 或 磷酸 -丝氨酸 和 磷酸 - 苏 氨 酸 特异 性 抗体 的 开发 还 不 太 成 功 。 5.4 磷酸 肽 的 分 离 即使 纳 喷 MS/MS 技术 已 经 成 功用 于 直接 分 析 和 蛋白 酶 解 产 生 的 磷酸 肽 ， 但 是 出 于 以 下 一 些 原因 ， 通 常 建议 在 质谱 分 析 前 作 一 些 分 离 。 (1) 磷酸 肽 在 蛋白 酶 切 产物 中 通常 只 占 少 数 ， 因 此 容易 淹没 在 低 丰 度 离 子 产生 的 总 背景 中 ， 肽 分 离 技术 可 浓缩 分 析 物 ， 因 此 会 提高 信 噪 比 。 (2) 如 果 磷 酸 肽 被 放射 性 标记 ， 并 具有 相同 比 活 度 ， 那 么 每 一 个 被 分 离 的 肽 段 相应 的 活 度 计 数 就 表明 这 一 组 分 中 磷酸 肽 的 相对 量 。 如 果 已 知 所 用 放射 性 标记 物 的 比 活 ， 就 能 容易 地 算出 磷酸 肽 的 绝对 量 。 (3) 放射 性 标记 的 磷酸 肽 的 分 离谱 可 以 用 来 定量 检测 不 同时 间或 细胞 状态 下 蛋白质 磷酸 化 状态 的 变化 。 (4) 肽 分 离 方法 也 有 效 地 除去 了 非 肽 类 杂质 ， 更 有 利于 检测 和 分 析 低 丰 度 酸 肽 。 在 现 有 的 分 离 技术 中 ，2D-PP，RP-HPLC， 高 分 辨 凝 胶 电 泳 和 固 相 化 金属 亲 和 色 谱 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 被 优先 选择 用 于 分 离 磁 酸 肽 。 虽 然 要 阐明 一 个 明确 的 策略 用 于 鉴定 所 有 磷 蛋 白 很 困难 (图 5.53)， 但 做 一 个 一 般 性 策略 的 论述 还 是 有 价值 的 。 但 即使 是 图 5.5 策略 中 的 内 容 也 没有 包含 所 有 可 能 的 途径 。 任 何 一 个 鉴定 方案 的 细节 都 与 许多 因素 相关 ， 例 如 个 人 对 检测 和 分 离 模 式 的 喜好 ， 可 得 到 的 样 品 及 可 用 的 仪器 。 因 为 是 一 个 简要 的 讨论 ， 我 们 假设 要 着 重 表 明 体内 、 体 外 2D-PP if 第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 “ 91 : 之 间 的 相似 性 ， 并 成 功 进 行 证 明 。 总 规则 是 先 要 得 到 序列 信息 ， 可 通过 MS 或 MS/MS 方法 对 体外 2D-PP 上 的 点 直接 分 析 ， 两 者 都 能 得 到 有 用 的 信息 。 如 果 某 些 点 或 全 部 点 的 序列 分 析 不 成 功 ， 那 么 重新 水 解 蛋 白质 ， 肽 段 经 HPLC 分 段 收 集 ， 然 后 用 MS/MS 分 析 含 ?2P 的 组 分 ， 可 用 自动 或 直接 分 析 方 法 。 如 果 由 于 MS 信 噪 比 粳 糕 而 不 能 得 到 2D- PP 上 的 点 的 序列 信息 ， 那 么 HPLC 收集 的 组 分 本 质 上 会 更 和 干净， 也 许 会 得 到 好 的 数据 。 如 果 磷 酸化 的 化 学 计量 值 非常 低 ， 这 种 HPLC 制备 方法 也 许 会 失败 ， 可 能 会 观察 到 磷 酸 肽 ， 但 是 柱 上 浓度 会 很 低 ， 以 致 不 能 产生 可 用 于 解析 的 碎片 离子 。 这 种 情况 下 再 重复 水 解 蛋白 质 ， 用 IMAC 富 集 磷酸 肽 ， 用 IMAC 的 收集 组 分 做 MS/MS 实验 。 不 管 第 一 步 使 用 了 什么 方法 ， 通 常 从 蛋白 点 到 蛋白 水 解 这 一 步 都 要 进行 多 次 重复 ， 直 到 所 有 感 兴趣 的 磷酸 肽 都 被 测序 。 要 记 住 ， 某 些 肽 序列 不 会 以 易于 解析 的 方式 断裂 ， 为 了 证 实 确切 的 磷酸 化 位 点 ， 有 必要 使 用 合成 肽 。 这 一 标准 品 用 于 比较 研究 以 证 实 确切 的 雁 酸化 位 点 。 当 22P 不 能 挫 入 蛋白 质 时 ， 要 用 下 面 提 到 的 诊断 离子 扫描 来 检测 用 于 序列 分 析 的 磁 酸 肽 。 这 里 提 到 的 及 图 $.5 所 示 的 每 一 个 分 离 技 术 都 与 下 面 提 到 的 肽 的 进一步 化 学 、 酶 及 质谱 分 析 方 法 相 适 用 。 2D-PP 分 离 磷 酸 肽 ”在 2D-PP 谱 中 ， 肽 段 的 一 维 分 离 是 在 薄 层 纤维 板 上 进行 电泳 ， 二 维 分 离 是 在 相同 的 板 上 进行 薄 层 色谱 (Boyle et al .，1991)。 分 离 到 的 磷酸 肽 经 放射 自 显影 或 磷 储 屏 检测 。 放 射 自 显影 看 到 的 点 的 数目 可 用 来 估计 磷酸 化 位 点 的 最 大 数目 ， 点 的 强度 可 用 来 指示 肽 之 间 磷 酸化 的 相对 化 学 计量 值 。 此 外 ， 即 使 并 非 能 够 分 辨 所 有 的 肽 ， 但 样品 中 每 一 个 磷酸 肽 都 被 计数 。 观 察 到 的 点 的 数目 没 必要 与 磷酸 化 位 点 的 数目 直 接 相 联系 ， 因 为 磷 蛋 白 中 经 常 可 观察 到 不 完全 的 蛋白 水 解 。 但 是 ，2D-PP 图 谱 也 提供 了 从 其 他 方法 中 得 不 到 的 有 关 和 蛋白 质 磷酸 化 位 点 的 重要 信息 ， 包 括 ; (1) 磷酸 化 位 点 的 最 大 数目 。 由 于 蛋白 酶 水 解 差 异 ， 谱 图 产生 的 点 通常 多 于 磷酸 化 位 点 。 (2) 放射 自 显影 强度 提供 了 在 所 有 磷酸 肽 中 磷酸 化 的 相对 化 学 计量 。 (3) 电泳 和 TLC 的 正 交 分 离 提供 了 磷酸 肽 之 间 亲 水 性 的 相对 状态 。 2D-PP 作 图 的 另 一 个 优点 是 能 产生 纯化 的 磷酸 肽 ， 从 平板 上 提取 后 可 用 MS 分 析 (Affolter et al .，1994)。 如 果 试 图 用 2D-PP 作 图 法 作为 MS/MS 分 析 的 样品 制备 方法 ， 那么 所 加 和 蛋白酶 的 量 要 少 ， 只 要 能 发 挥 作 用 即 可 。 如 使 用 过 量 的 蛋白 酶 ， 在 MS OR 酸 肽 时 ， 和 蛋白 酶 的 自 切 产物 会 占据 图 谱 的 主导 ， 抑 制 了 磷酸 肽 的 分 析 。 此 外 ，2D-PP 作 图 法 的 灵 人 敏 高 且 重 现 性 好 ， 因 为 检测 磷酸 肽 是 通过 整合 相当 长 时 间 内 的 放射 性 训 变 ， 所 以 方法 非常 灵敏 ， 并 且 灵 敏 度 只 依赖 于 放射 性 标记 物 的 比 活 。2D-PP 所 获得 图 谱 的 高 度 重 现 性 使 其 被 选择 用 于 分 析 不 同 环境 ， 例 如 不 同时 间 过 程 ， 不 同 活性 诱导 状态 下 蛋白 质 的 磷酸 化 状态 。 RP-HPLC 4% AGRA KFA HPLC 分 段 收集 磷酸 肽 重 现 性 好 ， 简 单 ， 且 不 需要 特 殊 装 备 。 在 RP-HPLC 中 ， 磷 酸 肽 根据 其 疏水 性 被 分 离 。 分 离 后 收集 的 组 分 经 Cerenkov 计数 检测 。 对 Cerenkov 计数 和 时 间作 图 ， 显 示 具 放射 性 活性 的 组 分 的 计数 。 纯 化 的 磷 酸 肽 用 MS 分 析 ， 可 用 2.2 部 分 所 述 不同 的 MS 和 MS/MS 方法 。 相 对 于 2D-PP，RP- HPLC 的 缺点 是 高 亲 水 性 的 磷酸 肽 不 会 在 柱 上 停留 ， 而 是 直接 流 过 柱子 。 相 反 ， 高 疏水 性 的 肽 直到 最 高 梯度 才 会 被 洗 脱 ， 甚 至 不 会 被 洗 脱 。 因 此 ， 有 可 能 样品 中 有 些 磷 酸 肽 不 Ladi 蛋白 质 组 学 会 被 检测 到 。 总 体 上 说 ，RP-HPLC 的 分 辩 力 不 如 2D-PP 作 图 法 的 分 辩 力 好 。 需 要 注意 的 另 一 点 是 ， 磷 酸 肽 会 附着 在 金属 表面 ， 因 此 ， 如 果 用 标准 的 金属 注射 器 ， 会 发 生 明 显 的 样品 丢失 。 使 用 RP-HPLC 分 析 磷 酸 肽 的 一 个 很 大 的 吸引 力 是 RP-HPLC 系统 可 以 与 ESI 质谱 方便 地 在 线 连接 。 使 用 在 线 连接 到 HPLC 系统 的 质谱 仪 使 样品 混合 物 中 磷酸 肽 的 检测 和 鉴定 成 为 可 能 ， 即 使 分 析 样 品 没 有 被 放射 性 标记 也 可 分 析 ， 这 需要 质谱 仪 具 有 特定 的 扫描 功能 ， 如 上 文 所 述 包括 前 体 离 子 扫 描 、 中 性 丢失 及 源 内 解 离 。 因 此 ， 用 LC- MS/MS 分 析 磷 酸 肽 适用 于 非 同位 素 标记 样品 ， 在 分 析 人 组 织 中 分 离 的 磷酸 肽 时 ， 具 有 明显 的 优势 。 DDPHRRBRKD BRB FER MBER LAA 2-DE 纯化 磷酸 肽 是 最 近 发 表 的 很 有 前 途 的 制备 技术 ， 其 结果 与 2D-PP 结果 相似 (Gatti and Traugh，1999)。 非 变性 凝 胶 等 电 聚 焦 结合 碱 性 40% PAGE 胶 用 于 磷酸 肽 分 离 及 比较 分 析 。:P 标记 样品 用 放射 自 显影 或 磷 储 屏 检测 。 用 Eedman 测序 方法 鉴定 蛋白 质 并 确定 磷酸 化 位 点 ， 但 也 许 更 适 于 用 MS 鉴定 。 同 HPLC 一 样 ， 但 出 于 不 同 的 原因 ， 此 方法 也 会 丢失 特异 的 磷酸 肽 。 但 是 ， 因 为 凝 胶 电泳 装置 很 普通 ， 所 以 此 方法 对 于 缺乏 2D-PP 作 图 装置 的 人 来 说 还 是 非 常 有 吸引 力 的 。 IMAC 分 离 / 富 集 磷酸 肽 ”磷酸 肽 分 析 的 常见 困难 是 由 磷酸 化 的 低 化 学 计量 值 导 致 的 ， 样 品 中 相同 序列 肽 段 的 磷酸 肽 的 含量 要 比 非 磷酸 化 肽 段 含 量 少 得 多 ， 这 种 情况 下 即 使 2P 标 记 的 2D-PP 上 的 点 ， 经 全 蛋白 质 水 解 及 HPLC 组 分 收集 ， 已 经 确定 磷酸 肽 存在 ， 用 质谱 技术 也 难以 鉴定 磷酸 肽 。 数 据 依 赖 (data-dependent) 的 MS/MS 方法 不 能 鉴定 样 品 中 含量 少 的 成 分 ， 因 为 CID 优先 选择 丰 度 高 的 离子 进行 分 析 ， 为 了 解决 这 一 问题 ， 常用 IMAC 选择 性 富 集 磷酸 肽 。 这 一 技术 将 Fe “或 Ga 等 金属 离子 鳌 合 到 含有 亚 氨基 二 乙酸 (iminodiacetic acid) 或 次 氮 基 三 醋酸 (nitrilotriacetic acid) 的 色谱 固定 相 上 (Neville et al., 1997; Nuwaysir and Stults, 1993; Tempst et w .，1998) 。 磷 酸 肽 与 固定 相 有 高 亲和力 ， 被 选择 性 地 吸附 在 上 面 。 用 磷酸 盐 或 高 pH 溶液 洗 脱 ， 洗 脱 组 分 即 为 富 集 的 磷酸 肽 。 虽 然 这 一 方法 对 磷酸 肽 有 选择 性 ， 但 其 他 肽 ， 特 别 是 那些 富 含 酸性 氨基 酸 链 的 肽 段 也 容易 被 富 集 。IMAC 柱 上 洗 脱 下 的 组 分 可 用 本 章 所 述 的 不 同 的 MSS 方式 分 析 。 本 方法 的 优点 是 每 一 个 可 溶 磷酸 肽 ， 不 管 其 长 度 如 何 ， 都 能 被 富 集 ， 而 且 IMAC 柱 洗 脱 下 的 样品 可 直接 用 于 RP-HPLC 分 析 。 可 以 建立 串联 的 IMAC/RP 柱 结构 ， 将 肽 的 富 集 和 分 离 整合 到 一 起 (Affolter et al., 1994). 5.5 确定 磷酸 化 氨基 酸 类 型 了 解 肽 或 蛋白 质 中 磷酸 化 氨基 酸 的 类 型 ， 可 以 限定 可 能 的 磷酸 化 位 点 ， 并 因此 简化 了 对 多 肽 链 中 磷酸 化 残 基 的 确认 。 磷 酸化 残 基 类 型 通常 由 磷酸 氨基 酸 分 析 或 棍 酸 氢 基本 特异 性 免疫 检测 确定 。 磷酸 氨基 酸 分 析 是 对 肽 键 进行 气相 或 液 相 水 解 ， 此 水 解 条 件 下 要 至 少 保留 一 段 磷酸 酯 键 完整 。”P 标 记 的 磷酸 蛋白 质 或 磷酸 肽 的 水 解 产物 与 磷酸 氨基 酸 标准 品 混合 ， 并 用 TLC 分 离 。 未 标记 的 标准 品 由 茹 三 酮 (ninhydrin) 染色 检测 ，?P 标 记 氢 基 酸 由 放射 自 显影 检测 。 蛋 白质 中 存在 的 磷酸 氨基 酸 类 型 通过 染色 标准 品 与 放射 标记 种 类 的 相关 分 析 确定 (Hildebrandt and Fried，1989)。 如 果 能 得 到 大 量 样品 ， 磷 酸 氢 基 酸 类 型 可 以 通过 ARE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 93 - Fi — AR Bee. FA 2D-PP 图 谱 上 提取 的 磷酸 肽 进行 磷酸 氨基 酸 分 析 尤 其 有 用 ， 因为 这 些 肽 段 通 常 只 含有 一 种 磷酸 氨基 酸 类 型 。 了 解 磷酸 化 氨基 酸 的 性 质 及 其 他 参数 ， 例如 肽 段 分 子 质量 ， 裂 解 蛋白 质 所 用 的 酶 的 特性 ， 在 某 些 情况 下 可 以 鉴定 ， 或 至 少 可 以 推测 蛋白 质 中 的 磷酸 化 位 点 。 利用 特殊 磷 酸 氨基 酸 的 抗体 特异 性 可 以 确定 地 鉴别 磷酸 化 氨基 酸 的 类 型 ， 但 是 这 种 方法 并 不 能 代替 磷酸 氨基 酸 分 析 。 酷 氨 酸 磷酸 化 蛋 日 质 经 凝 胶 分 离 后 ， 很 容易 通过 与 栈 氨 酸 磷酸 盐 抗 血清 的 免疫 印记 实验 检测 ， 抗 血清 包括 : 4g10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 和 py20， 也 有 如 RC10 一 样 的 细菌 片段 抗体 (Transduction Laborato- ries，Lexington，KY)。 这 些 抗体 已 经 商业 化 ， 提 供 了 一 个 快速 、 灵 人 敏 地 检测 蛋白 质 栈 氨 酸 磷酸 化 的 方法 。 磷 酸化 丝氨酸 和 苏 氨 酸 的 特异 性 抗体 已 有 叙述 (Heffetz et al., 1989) 并 已 商业 化 。 用 这 些 试剂 得 到 的 实验 结果 在 某 种 程度 上 是 不 确定 的 ， 建 议 在 使 用 他 们 的 时 候 要 注意 ， 但 是 最 近 的 研究 表明 其 质量 已 有 所 提高 (Soskic et al., 1999). 5.6 磷酸 化 位 点 的 确定 磷酸 化 位 点 的 确定 也 使 用 一 些 通用 方法 : 克 酸 化 蛋白 质 被 纯化 ， 如 果 可 能 蛋白 质 要 均一 ; 磷 蛋 白 被 特异 性 的 化 学 或 酶 反应 切断 ， 产 生 肽 混合 物 ， 其 中 含有 一 到 两 个 磷酸 肽 。 不 同 之 处 在 于 其 分 离 磷酸 肽 的 策略 是 为 了 确定 氨基 酸 序列 ， 定 位 肽 段 内 磷酸 化 的 残 基 。 上 面 所 述 的 分 离 方法 ，2D-PP 作 图 、HPLC 或 IMAC 方法 ， 也 同样 适宜 于 微量 制备 磷酸 肽 用 于 确定 磷酸 化 位 点 。 磷酸 肽 的 化 学 测序 过 去 确定 磷酸 化 位 点 测序 最 常用 的 是 逐步 化 学 降解 法 ， 如 Wettenhall 等 的 丝氨酸 和 苏 氨 酸 磷酸 化 分 析 方 法 (Wettenhall et al., 1991), Aebersold 等 的 酷 氨 酸 磷酸 化 分 析 方 法 (Aebersold et az .，1991)。 最 近 ， 此 方法 已 经 主要 被 质谱 方 法 所 取代 。 虽 然 本 章 主要 集中 于 质谱 方法 ， 但 仍然 有 必要 提 一 下 非 放 射 活性 和 放射 活性 酸 肽 测序 的 方法 ， 这 两 种 方法 可 以 补充 ， 在 某 些 情况 下 可 以 替代 质谱 方法 来 确定 磷酸 (hi (Watts et al .，1996a) 。 非 放射 活性 方法 是 由 Meyer 等 发 展 并 综述 的 (Meyer et ai.，1993)， 用 于 检测 磷酸 丝氨酸 和 磷酸 苏 氨 酸 ， 包 括 B- 消 除 ， 与 琉 基 乙醇 反应 形成 S- 乙 基 化 半 胱 氨 酸 或 B- 甲 基 - S- 乙 基 半 胱 氨 酸 ， 它 们 很 容易 以 PTH 衍生 物 的 形式 从 自 动 测序 仪 中 提取 出 来 。 放 射 活 性 方法 是 由 Ceerenkov 计数 检测 器 检测 在 Edman 化 学 降解 测序 循环 中 释放 出 的 放射 性 活 度 (Aebersold et al., 1991; Wettenhall er cl .，1991)。 如 果 测 丝氨酸 或 苏 氨 酸 磷酸 盐 残 基 ， 磷 酸 盐 被 除去 ， 可 观察 到 ”P- 磷 酸 盐 和 各 自 的 PTH 本 生物 (Wettenhall，1991) 。 在 酷 氨 酸 磷 酸 盐 情况 下 ， 磷 酸 酯 键 更 稳定 ， 分 析 的 提取 物 是 PTH 磷酸 酷 氨 酸 。 如 果 得 到 的 磷酸 肽 的 量 非 常 有 限 ， 也 许 不 可 能 用 化 学 降解 法 测 肽 序列 ， 但 是 在 降解 循环 后 ， 放 射 活 性 从 肽 中 释放 ， 通 常 有 可 能 确定 肽 内 磷酸 化 位 点 。 磷酸 肽 的 质谱 分 析 已 经 发 展 了 许多 不 同 的 策略 和 方法 用 质谱 确定 磷酸 肽 中 的 磷酸 化 位 点 ， 其 区 别 在 于 质谱 与 肽 分 离 技术 的 接口 方式 ， 以 及 所 用 的 质谱 方法 。 如 果 一 个 磷 酸 肽 有 lpmol 或 更 多 的 量 ， 磷 酸 肽 就 能 够 从 2D-PP 谱 中 提取 出 来 ， 并 用 数据 依赖 的 自 BAGH thE ANE LC-MS/MS 分 析 (Watts et al, 1994; Whalen et wl .，1996)。 此 方法 快 速 ， 可 以 初步 估计 一 个 2D-PP 斑点 中 磷酸 肽 的 相对 量 ， 通 过 对 2D-PP 谱 图 的 配 比 ， 有 可 能 定性 、 定 量 地 了 解 细 胞 或 组 织 在 不 同 状态 下 分 离 的 磷酸 化 蛋白 在 特定 位 点 的 磷酸 化 sai 蛋白 质 组 学 过 程 。 对 于 样品 量 大 大 低 于 1pmol 量 的 样品 ， 磷 酸 肽 信号 通常 被 平板 中 提取 的 杂质 所 干 扰 而 看 不 到 ， 这 种 情况 下 建议 用 毛细 管 液 相 色谱 或 凝 胶 电 泳 分 离 肽 段 。 用 于 确定 磷酸 肽 中 磷酸 化 位 点 的 质谱 方法 有 两 种 不 同 的 基本 原理 ， 第 一 种 方法 依赖 于 在 质谱 仪 条 件 下 ， 如 在 ESI 质谱 仪 的 碰撞 室 或 离子 源 中 ， 或 在 MALDI-MS 的 PSD 过 程 中 ， 磷 酸 酯 键 的 化 学 稳定 性 。 因 此 ， 磷 酸 肽 可 通过 磷酸 酯 键 断 裂 产生 的 诊断 离子 鉴 定 。 第 二 种 方式 依靠 检测 磷酸 酯 基 团 使 肽 段 增 加 的 质量 数 。 通 常 ， 在 蛋白 质 磷酸 化 研究 中 ， 所 研究 的 蛋白 质 序列 是 已 知 的 ， 因 此 ， 从 理论 上 可 以 通过 对 磷酸 基 团 加 合 在 丝 氮 酸 、 苏 氨 酸 或 酷 氨 酸 残 基 上 引起 的 80u 的 质量 数 差 的 分 析 而 检测 蛋白 产生 的 磷酸 肽 。 因 此 ， 得 到 磷酸 化 蛋白 质 的 酶 切 肽 质量 后 ， 通 常 由 MALDLMS 分 析 ， 如 果 质 量 测 定 值 与 预期 值 一 致 ， 就 可 鉴定 混合 物 中 的 磷酸 肽 。 这 两 种 方法 不 能 鉴定 出 肽 内 的 磷酸 化 位 点 。 磷酸 化 位 点 的 确定 要 人 靠 能 够 有 效 测 序 的 串联 质谱 的 产物 离子 扫描 技术 。 但 是 ， 在 肽 序列 中 只 有 一 个 可 能 的 磷酸 化 位 点 情况 下 ， 如 果 能 确实 证 明 此 肽 段 为 磷酸 肽 ， 磷 酸化 残 基 也 能 有 效 定位 。 如 果 磷 酸化 氨基 酸 类 型 已 用 $.5 部 分 所 述 方法 确定 ， 无 须 离 子 扫描 即 能 鉴 定 磷 酸化 位 点 的 机 会 也 会 大 大 提高 。 TRAN MS 扫描 方式 ， 在 前 文 已 大 概 叙 述 过 ， 已 经 成 功用 于 磷酸 肽 的 分 析 。 这 里 我 们 具体 讲 一 下 他 们 在 磷酸 肽 分 析 中 的 应 用 ， 并 评价 一 下 其 各 自 的 优 缺 点 。 总 之 ， 在 不 能 挫 入 ?2P 或 标记 物 已 经 衰变 到 检测 限 以 下 的 情况 下 ， 产 生 磷 酸 盐 特 异 离子 (例如 一 个 诊断 离子 ) 的 方法 是 很 有 用 的 。 如 果 和 希望 的 话 这 种 扫描 模式 也 能 用 于 分 析 放 射 性 标记 的 磷酸 肽 ， 因 为 由 放射 性 同位 素 磷 酸 盐 对 磷酸 肽 贡献 的 质量 非常 小 ， 可 忽略 不 计 。 需 要 注 意 的 是 ， 虽 然 有 些 研 究 者 担心 质谱 仪 会 被 ?2P 样 品 污染 ， 但 这 种 可 能 性 可 以 避免 ， 只 要 在 质谱 实验 之 前 等 候 足 够 数量 的 半衰期 (>P 的 半衰期 为 两 周 )。 需 要 标记 的 实验 ， 例 如 2D-PP 作 图 ， 可 以 在 放射 性 活 度 足 够 强 的 时 候 做 。 源 内 CID 可 用 ESI RA CID 产生 的 负离子 形式 的 诊断 离子 ，HPO+ (97u), PO; (79u), POy (〈63u)， 来 检测 鉴定 磷酸 肽 (Huddleston et al., 1993; Hunter and Games, 1994), JA CID 与 在 线 HPLC 结合 ， 既 可 鉴别 磷酸 肽 的 洗 脱 时 间 ， 得 到 其 色 谱 标识 ， 又 能 得 到 其 分 子 质量 (Huddleston et wz.，1993)。 具 体 做 法 是 ， 在 Ql 之 前 的 两 个 skimmer 上 施加 高 的 锥 孔 (cone) 电压 ， 扫 描 低 质 荷 比 的 诊断 离子 。 然 后 将 cone 电 压 恢 复 正 常 值 (不 会 诱导 产生 解 离 ) 扫描 高 质 荷 比 的 离子 。 仪 器 的 第 一 个 skimmer 位 置 使 用 加 热 的 毛细 管 的 质谱 仪 也 能 做 类 似 的 实验 (Aebersold et wy .，1998)。 这 个 方法 使 用 了 交替 扫描 技术 ， 即 在 高 八 极 杆 补偿 电压 下 进行 诊断 离子 的 选择 性 离子 监测 (selected ion monitoring，SIM)， 之 后 进行 两 个 全 扫描 。 第 一 个 全 扫描 使 用 与 SIM 实验 相同 的 高 补偿 电压 ， 产 生 去 质子 化 的 磷酸 肽 分 子 离子 及 去 磷酸 的 磷酸 肽 分 子 离 子 。 最 后 在 正常 八 极 杆 补偿 电压 下 进行 第 二 次 全 扫描 ， 产 生 一 个 参考 图 ， 与 高 八 极 杆 补偿 电压 下 的 全 扫描 比较 。 在 LC 分 离 过 程 中 ， 这 种 二 次 质谱 扫描 系列 连续 地 重复 进行 。 这 个 实验 与 Carr 及 其 合作 者 的 实验 方法 提供 了 相同 的 信息 , 但 是 因为 使 用 了 SIM, 而 不 是 扫描 来 检测 诊断 离子 ,每 一 个 扫描 循环 更 快速 ,也 可 能 更 灵敏 。 高 八 极 杆 补 偿 电压 下 的 第 一 次 全 扫描 与 低 补偿 电压 下 的 全 扫描 相 比 较 ,在 多 个 肽 段 被 共 洗 脱 时 , 可 以 提供 线索 找到 磷酸 肽 离子 , 肽 混合 物 被 微 毛 细 管 柱 分 离 时 , 经 常会 有 肽 段 共 洗 脱 。 这 一 技术 分 析 磷 酸 肽 标准 品 通常 可 低 至 几 个 fmol 上 柱 量 的 样品 , 但 对 于 体内 、 体 外 的 实际 样品 , 灵敏 度 通 常 在 pmol 范围 。 SLE ”蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 95 - 因为 负离子 的 CID 谱 通常 不 能 产生 足够 用 于 序列 分 析 的 碎片 离子 ， 如 果 能 用 微 毛 细 管 柱 分 离 ， 在 线 连接 ESI-MS 系统 ， 以 负离子 形式 检测 磷酸 肽 ， 然 后 切换 到 正 离子 模 式 的 CID 分 析 ， 当 然 会 非常 方便 。 目 前 采用 诊断 离子 扫描 模式 的 质谱 仪 这 样 做 在 技术 上 还 有 困难 ， 也 许 将 来 使 用 非 扫 描 模式 的 质谱 仪 可 以 达到 这 一 目的 。 在 四 极 杆 这 样 的 扫 描 质 谱 仪 上 做 这 一 实验 的 困难 在 于 不 能 达到 正 、 负 离子 模式 转换 所 要 求 时 间 。 中 性 丢失 扫描 ， 用 于 磷酸 肽 检测 和 分 析 的 中 性 丢失 扫描 最 早 见于 Covey 等 所 述 (Covey et al .，1991)， 后 来 被 Huddleston 等 进一步 发 展 (Huddleston etal., 1993), # 在 三 级 四 极 质谱 仪 上 用 ESI 正 离子 模式 分 析 的 。Ql 没有 用 来 为 Q2 中 的 裂解 选择 离子 ， 而 是 用 来 扫描 。Q3 也 用 来 扫描 ， 但 质量 扫描 范围 与 Ql 不 同 。 确 切 地 说 ， 两 个 四 极 杆 以 不 同 的 质量 范围 扫描 ， 它 们 之 间 的 差 值 与 丢失 的 中 性 分 子 质 人 荷 比 一 致 。 对 于 从 [M+ 2H]2 磷酸 肽 上 丢失 的 中 性 磷酸 盐 ， 其 质量 差 值 为 m/z49。 从 机 理 上 看 ， 只 有 磷酸 丝 氨 酸 和 磷酸 苏 氨 酸 会 发 生 B- 消 除 ， 产 生 98 的 中 性 丢失 (Gibson and Cohen，1990)。 此 方法 的 应 用 并 不 如 上 面 提 到 的 源 内 CID 方法 普遍 ， 因 为 会 出 现 假 阳 性 ， 而 且 还 必须 知 道 丢 失 磷 酸 盐 的 离子 带电 荷 的 状态 。 此 方法 的 优点 是 以 正 离子 模式 进行 分 析 ， 可 以 在 同 一 次 实验 中 通过 检测 磷酸 盐 的 中 性 丢失 启动 CID， 得 到 数据 依赖 的 CID 扫描 。 前 体 离子 扫描 ”此 方法 是 在 ESI 负离子 模式 下 对 Ql 进行 连续 扫描 。 所 有 的 离子 都 在 Q2 PRK, QO 中 仅 能 通过 一 种 离子 ， 对 磷酸 肽 来 说 通常 是 丢失 的 PO; HA ( 允 /z79)。 因 此 ， 质 谱 结 果 仅 显示 会 丢失 m/z79 的 离子 的 谱 峰 (Wilm et al., 1996). 这 大 大 简化 了 混合 物 的 分 析 ， 在 纳 喷 离子 源 直接 进 样 过 程 中 可 以 分 析 得 很 好 。 如 磷酸 肽 的 诊断 离子 扫描 一 节 所 述 ， 此 方法 还 是 存在 测序 的 问题 ， 即 负离子 模式 检测 磷酸 丢失 后 ， 立 即 切 换 为 正 离子 模式 测序 。 产物 离子 扫描 ， 由 上 文 所 述 的 特定 扫描 法 得 到 的 信息 通常 还 不 足以 鉴定 磷酸 肽 中 的 磷酸 化 残 基 。 实 际 上 ， 以 上 方法 如 源 内 CID， 中 性 丢失 和 和 母 离子 扫描 ， 是 用 来 将 磷酸 肽 从 非 磷酸 肽 中 区 别 出 来 ， 而 不 是 提供 序列 信息 。 只 有 在 肽 序列 已 知 ， 且 三 种 含 羟基 氨基 酸 只 有 一 种 存在 的 情况 下 ， 以 上 三 种 方法 才能 成 功 鉴定 磷酸 化 残 基 。 此 外 ， 只 有 在 肽 序 列 中 只 含有 一 个 丝氨酸 、 苏 氨 酸 或 酷 氨 酸 残 基 的 情况 下 ， 这 种 预先 设 定 对 答案 的 简化 才 起 作用 。 在 另 一 种 情况 下 也 可 以 提供 肽 序列 中 磷酸 化 位 点 的 答案 ， 即 序列 已 知 ， 磷 酸化 的 氨基 酸 分 析 表 明 在 此 磷酸 蛋白 中 只 含有 三 种 羟基 氮 基 酸 的 一 种 时 ， 再 次 简化 了 答案 。 当 这 两 种 情况 都 不 存在 时 ， 通 常 需要 产生 CID 谱 ， 并 子 以 解析 以 确定 磷酸 肽 的 共 价 结 构 。 观 察 磷酸 肽 的 低能 CID 过 程 ， 其 一 般 趋 势 是 ， 磷 酸 丝氨酸 上 的 磷酸 比 磷酸 苏 氨 酸 更 易 丢 失 ， 磷 酸 苏 氨 酸 比 磷酸 酷 氨 酸 更 易 丢 失 磷 酸 。 较 短 的 磷酸 肽 比较 长 的 磷酸 肽 更 易于 丢失 磷酸 ， 大 概 是 由 于 在 相同 碰撞 能 量 下 ， 短 肽 的 化 学 键 上 分 布 了 更 多 的 能 量 。 有 趣 的 是 ， 很 少 能 观察 到 磷酸 氨基 酸 的 亚 氨 离子 ， 磷 BARBY immonium 离子 是 由 磷酸 丢失 后 形成 的 脱 羟基 丙 氨 酸 和 脱 羟基 - 2 - 丁 酸 的 断 裂 形 成 的 。 然 而 ， 用 离子 阱 质谱 (DeGnore and Qin, 1998) 监测 磷酸 肽 的 CID 谱 ， 在 肽 碎片 离子 谱 中 观察 到 脱 羟 氢 - 2 - 丁 酸 取代 了 苏 所 酸 的 位 置 。 源 后 衰变 ”这 种 实验 在 MALDI-TOF 质谱 仪 上 进行 ， 在 前 文 已 讲述 了 在 single-stage 型 仪器 中 ， 通 过 观察 亚 稳 裂 解 提供 肽 段 序列 信息 。 这 一 方法 已 成 功用 于 磷酸 肽 的 序列 分 析 (Annan and carr, 1996; Neville et al., 1997). - 96 - 蛋白 质 组 学 用 酶 和 化 学 方法 去 磷酸 化 ”这 种 方法 并 未 得 到 特别 关注 ， 但 它 能 提供 磷酸 肽 中 磷酸 - 化 氨基 酸 的 定位 ， 可 以 在 非 磷酸 肽 占 主导 地 位 的 混合 物 中 鉴别 磷酸 肽 ， 此 方法 使 用 的 是 磷酸 酶 (Zhang et al., 1998). FA fei 5489 MALDI-TOF 仪器 就 可 以 得 到 磷酸 化 蛋白 水 解 后 产生 肽 段 的 质量 ， 同 样 的 样品 用 磷酸 酶 处 理 后 ， 除 去 了 丝氨酸 、 苏 氨 酸 和 酷 氨 酸 上 的 磷酸 ， 再 分 析 其 质量 。 任 一 个 减少 了 80u 的 质量 数 ， 都 将 预示 着 这 一 肽 段 被 人 奋 酸化 了 。 MALDI 做 这 一 实验 的 优点 是 产生 的 肽 段 离子 更 倾向 于 单质 子 化 ， 使 谱 图 解析 比 ESI 更 容易 。 用 不 同 的 化 学 方法 处 理 丝 氨 酸 或 苏 氨 酸 磷酸 肽 ， 既 除去 了 磷酸 又 使 发 生 磷 酸化 修 饰 的 丝氨酸 或 苏 氨 酸 残 基 脱 水 ， 实 际 上 标记 了 先前 的 修饰 位 点 (Patterson，1998)。 磷 酸 肽 用 碱 处 理 后 发 生 磷酸 的 B- 消 除 ， 同 时 伴随 氨基 酸 侧 链 的 脱水 ， 使 氨基 酸 残 基 表 现 出 独特 的 质量 ( 比 正常 值 少 18u)。 这 一 手段 结合 MS/MS 技术 ， 已 应 用 于 高 磷酸 化 的 profilaggrin 磷酸 化 位 点 的 鉴定 (Resing et al., 1995). 5.7 酶 分 析 法 及 磷 蛋 白 分 析 的 未 来 方向 目前 磷酸 化 蛋白 质 分 析 的 局 限 性 围绕 在 体内 ”P 标 记 和 蛋白 的 直接 分 析 困 难 ， 有 两 个 问题 造成 这 些 困 难 。 第 一 是 磷酸 化 通常 是 低 化 学 计量 值 ， 要 求 在 质谱 分 析 前 对 磷酸 肽 进 行 一 定 程 度 的 富 集 。 第 二 是 不 能 产生 足够 的 体内 ”P 标 记 肽 用 于 质谱 鉴定 。 第 二 种 情况 必须 使 用 体外 ”P 标 记 肽 ， 要 求 体 内 和 体外 磷酸 蛋白 在 2D-PP 作 图 中 表现 一 致 。 这 就 使 磷 蛋 白 从 纯化 到 磷酸 肽 测序 这 一 全 过 程 耗 时 太 长 。 而 且 是 假设 激酶 在 已 知 条 件 下 可 以 在 体外 重 现 体内 磷酸 化 过 程 的 。 因 此 ， 还 是 需要 能 直接 分 析 体内 磷酸 化 蛋白 质 的 方法 。 虽然 产生 足够 量 体 内 ”P 标记 蛋白 这 一 问题 目前 还 不 可 能 直接 解决 ， 但 越 来 越 灵 敏 的 质谱 仪 可 以 减少 样品 的 消耗 量 。 例 如 使 用 MALDI 或 ESI 源 的 FT-ICR-MS， 对 多 肽 的 检测 灵敏 度 已 证 明 远 大 于 标准 的 三 级 四 极 和 离子 阱 技术 。 这 一 技术 可 常规 分 析 MALDISE EJL+ fmol 的 多 肽 样品 ， 精 确 测定 其 分 子 质量 (Solouki et al., 1995), BM 在 ICR 室 中 实际 样品 的 MS/MS 实验 灵敏 度 在 fmol 范围 ， 但 对 HPLC 柱 上 洗 脱 的 单个 肽 用 宽带 解吸 法 (broad-band dissociation) 可 以 做 到 amol 水 平 。 例 如 一 个 50um 内 径 的 微 毛细 管 HPLC 柱 可 将 9amol 的 磷酸 化 血管 紧张 素 开 导入 ESI 离子 源 ， 此 ESI 源 连 接 7T 的 FT-ICR-MS， 可 以 用 宽带 解吸 法 裂解 并 鉴定 此 标准 肽 〈Bruce J. E., Goodlett, D. R., Smith, R. D. and Abersold，R.，1998。 未 发 表 数 据 ， 来 自 Battelle Memorial 研 究 所 ， 环 境 与 分 子 科 学 实验 室 ，Richland，WA)。 这 种 灵敏 度 为 体内 有 限 样品 的 处 理 提 供 了 方便 。 仪器 控制 能 力 的 提高 对 磷酸 化 蛋白 质 分 析 性 能 的 提高 也 有 贡献 。 举 例 来 说 ， 如 果 自 动 化 的 LC-MS/MS 的 单 次 实验 操作 中 能 够 检测 样品 中 存在 的 磷酸 肽 ， 确 定 肽 段 质量 ， 还 能 够 得 到 CID 谱 ， 这 样 将 非常 理想 。 串 联 质谱 仪 如 果 能 实现 从 负离子 MS 到 正 离子 MS/MS 模式 快速 切换 的 功能 ， 上 面 的 想法 也 许 能 够 实现 。 在 这 种 质谱 仪 中 ， 可 用 前 面 提 到 的 其 中 一 种 负离子 检测 方式 如 源 内 CID 法 检测 磷酸 肽 并 测定 其 质量 数 。 检 测 到 的 磷酸 肽 信号 触发 仪器 转向 正 离子 模式 并 选择 检测 到 的 磷酸 肽 离子 作 CID 分 析 。 我 们 和 希 望 将 来 这 种 仪器 能 成 为 现实 。 新 兴 的 蛋白 质 组 学 领域 中 一 个 重要 的 部 分 就 是 需要 鉴定 混合 物 样 品 中 所 有 蛋白质 的 修饰 状态 。 因 此 ， 磷 酸化 蛋白 质 分 析 的 一 个 重要 延伸 及 今后 方向 是 有 关 样 品 中 磷酸 化 蛋 ALE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 97 - 白 的 总 体 及 定量 分 析 。 目 前 ， 所 有 用 于 磷酸 化 蛋白 分 析 的 方法 都 集中 于 对 单一 蛋白 质 的 分 析 。 将 来 有 必要 对 目前 方法 加 以 简化 和 自动 化 以 适应 高 通 量 研究 ， 或 者 开发 完全 不 同 的 仪器 和 方法 以 适用 于 蛋白 质 组 范围 的 磷酸 化 研究 。 6. 目前 及 将 来 面临 的 机 遇 和 挑战 蛋白 质 的 鉴定 和 结构 确认 是 任何 一 个 蛋白 质 组 学 努力 探索 的 领域 中 必 不 可 少 的 部 分 。 为 了 使 蛋白 质 鉴定 更 有 效 ， 必 须 采 用 高 通 量 手段 ， 具 有 高 效率 ， 高 准确 度 和 灵敏 度 。 如 果 是 2-DE 分 离 的 蛋白 质 ， 实 现 这 一 目标 的 设想 是 采用 机 器 人 系统 。 此 系统 具有 专门 设计 的 切 胶 工 具 ， 用 于 从 胶 上 切 下 指定 的 蛋白 点 ， 还 具有 计算 机 控制 的 蛋白 质 酶 切 模具 。 图 像 分 析 系 统 检测 胶 上 或 转 印 到 膜 上 被 染色 的 蛋白 质 ， 图 像 系 统 还 具有 模式 消减 功能 ， 因 此 能 够 标 出 两 个 不 同样 品 之 间 有 定量 或 定性 差别 的 蛋白 质 。 有 分 析 价 值 的 斑点 被 标记 上 ， 切 点 工具 被 自动 引导 到 指定 的 坐标 ， 切 下 和 蛋白质 斑 点 。 切 下 来 的 斑点 被 转移 到 容器 中 用 于 酶 切 反 应 。 全 部 的 酶 切 过 程 至 少 要 包括 胶片 清洗 ， 加 入 酶 解 缓 冲 液 ， 肽 段 提取 及 样品 脱盐 ， 这 一 过 程 通常 是 由 独立 的 液体 输送 机 器 人 完成 的 ， 可 以 自动 平行 处 理 多 个 样品 (Traini et wz .，1998)。 同 一 机 器 人 还 能 从 每 一 样品 的 酶 切 液 中 取样 ， 点 到 MALDI 的 靶 上， 然后 进行 自动 化 的 MALDIMS 分 析 ， 分 析 过 程 也 不 需要 人 工 参 与 (Onnerfjord et al., 1999; Traini et al., 1998), MALDI-MS 分 析 得 出 的 质量 同样 也 可 实现 自动 高 通 量 肽 质量 检索 。 任 何 未 被 这 一 策略 鉴定 出 的 蛋白 质 ， 取 其 剩余 的 酶 切 产物 用 于 较 低 通 量 (但 仍然 是 自动 化 ) 的 技术 分 析 ， 例 如 LC-MS/MS， 用 数据 依赖 方式 产 生 碎 片 离子 谱 ， 并 自动 在 序列 数据 库 中 进行 检索 (Ducret et wz .，1998)。 剩 余 的 酶 切 溶 液 还 可 用 纳 喷 ESLMS/MS 分 析 ， 这 一 技术 仍然 是 较 低 通 量 的 ， 但 是 灵敏 度 很 高 (Shevchenko et al., 1996). LC-MS/MS 和 nano-ESI-MS/SM 都 能 从 MALDI-MS 分 析 已 经 确定 存在 的 质量 数 中 受益 。 这 里 反复 强调 的 一 个 策略 是 ， 首 先 用 高 通 量 手 段 鉴定 尽 可 能 多 的 蛋白 质 ， 然 后 再 使 用 低 通 量 (并 且 更 贵 ) 的 技术 手段 。MALDI-MS 分 析 也 能 够 将 那些 在 标准 酶 切 条 件 下 不 能 产生 肽 段 的 蛋白 排除 在 进一步 分 析 之 外 。 这 种 模式 的 系统 非常 昂贵 ， 需 要 大 量 样品 才 能 体现 其 价值 ， 所 以 只 限于 安装 在 核心 实验 室 或 专门 的 实验 室 。 另 外 ， 它 们 特别 适用 于 分 析 全 基因 组 测序 已 经 完成 的 物种 (MED) 中 的 蛋白 质 。 FA MALDI-MS 数据 在 EST 数据 库 中 鉴定 蛋白 质 还 存在 困难 ， 目 前 限制 了 这 一 系统 对 高 级 真 核 生物 ， 特 别 是 人 和 鼠 蛋 白质 的 鉴定 。 高 通 量 MS/MS 鉴定 蛋白 质 方法 的 进展 还 很 慢 ， 主 要 是 由 于 仪器 和 数据 处 理 过 程 的 复杂 性 。ESILMS/MS 仪器 的 微 流 控 (microfabricate) 样品 输送 系统 的 发 展 (Figeys et &E.，1998)， 以 及 MS/MS 无 需 纯 化 分 离 就 能 鉴定 较 复 杂 蛋 白质 混 合 物 各 组 分 的 可 能 (McCormack et wz .，1997)， 是 很 有 和 希望 的 技术 进展 ， 表 明 用 MS/MS 路 线 大 规模 鉴定 蛋 和 白质 的 技术 正在 迅速 进步 。 如 果 蛋 白质 能 从 胶 上 直接 分 析 ， 或 转 到 膜 上 后 直接 分 析 (用 MALDI-MS 分 析 )， 这 样 也 可 实现 高 通 量 ， 并 且 不 需要 从 胶 上 切 下 蛋白 点 及 大 量 的 液体 输送 系统 。 但 是 这 种 方 法 需要 在 MALDI-MS 分 析 之 前 将 酶 解 液 和 基质 液 运送 到 胶 上 / 膜 上 ， 并 且 不 能 牺牲 凝 胶 电泳 分 离 的 空间 分 辨 力 。 有 许多 小 组 已 经 在 这 一 构想 上 有 了 进展 ， 他 们 用 UV-MALDLI- MS 从 胶 上 直接 分 析 凝 胶 分 离 的 和 蛋白质 (Loo et wz .，1996)， 另 一 些小 组 用 UV 或 IR- - 98 - 蛋白 质 组 学 MALDI-MS (Eckerskorn et al., 1997; Patterson, 1995; Strupat et al., 1994; Vestling and Fenselau, 1995) 直接 分 析 转 到 膜 上 的 蛋白 质 。 在 一 系列 proof-of-concept 实验 中 ， Loo, et al. (1996) 生成 了 真正 的 二 维 凝 胶 ， 他 们 用 UV-MALDI-MS 从 IEF 胶 上 直接 分 析 经 等 电 聚 焦 分 离 的 和 蛋白质， 生成 了 分 子 质量 二 维 谱 。 基 质点 在 凝 胶 表 面 ， 并 将 分 散 度 减少 到 最 小 程度 ， 因 此 保持 了 空间 分 辩 力 。 这 种 分 析 法 必须 采用 超 菏 胶 (0.35Smm) 以 保持 有 效 的 离子 化 。 同 一 小 组 还 报道 了 CNBr 水 解 的 和 蛋白质 也 适用 于 这 种 分 析 方 法 (Loo et al., 1997). {BJ PSD-MALDI-MS 通常 要 求 被 分 析 肽 段 小 于 CNBr 裂解 产生 的 AE, Pee eG PSD-MALDI-MS 可 直接 用 于 胶 上 分 析 。 许多 有 离子 化 抑制 效应 的 污染 物 通过 将 蛋白 质 转移 到 膜 上 可 以 被 洗 脱 ， 因 此 有 很 多 小 组 评估 了 凝 胶 分 离 转 膜 后 蛋白 质 的 离子 化 状态 。 采 用 这 一 技术 时 ， 在 引入 基质 溶液 时 要 特别 小 心 ， 因 为 有 机 溶剂 (在 基质 溶液 中 常用 ) 会 导致 重 日 质 分 散 ， 损 失 空间 分 辩 力 (如 上 所 述 ，Vestling and Fenselau，1994a，1994b)。 系 统 评价 不 同 的 膜 后 发 现 ，PVDF 膜 或 其 衍生 物 最 适用 此 类 实验 (Vestling and Fenselau，1995)。UV 和 IR 激光 都 被 用 于 膜 上 和 蛋白 的 离子 化 ， 两 者 都 已 成 功 ， 但 是 IR 激光 对 埋 在 膜 内 的 蛋白 质 的 提取 显得 更 有 效 (Schreiner et al., 1996; Strupat et al., 1994). Eckerskorn (1997) 已 经 报道 了 . 用 IR-MALDI-MS Xt B€ Be Ha Uk 37 BS FF EDS] PVDF 膜 上 的 蛋白 质 的 离子 化 是 可 能 的 ， 他 们 将 数据 转化 为 轮廓 线 来 反应 每 种 蛋白 质 的 丰 度 ， 因 此 在 MALDI-MS 分 析 前 不 需 将 和 蛋 白 显 像 。 但 是 ， 在 这 种 分 析 方 法 用 于 整个 2-DE 胶 上 斑点 之 前 ， 还 需要 解决 数据 处 理 方 面 的 重要 问题 。 另 外 ， 凝 胶 分 离 蛋白 质点 的 完整 分 子 质 量 的 测定 是 研究 蛋白 质 特 性 的 重 要 方面 ， 但 是 对 于 和 蛋白质 鉴 定 并 没有 明显 帮助 。 为 了 鉴定 ， 蛋 白质 必须 被 酶 解 〈 肽 质量 检索 策略 )， 并 且 / 或 产生 的 肽 段 必须 裂解 (未 解析 碎片 离子 检索 策略 )。 膜 上 蛋白 的 肽 水 解 也 已 实施 ， 并 用 UV 和 IR-MALDI-MS 都 分 析 过 (Eckerskorn et al., 1997; Vestling and Fenselau，1994b)。 但 是 ， 目 前 为 止 仅 有 UV-MALDI-MS 的 PSD 数据 发 表 (Fabris et al., 1995), 2%%# PSD-(IR)-MALDI-MS 的 数据 。 Hochstrasser (1998) 引入 了 “分 子 扫 描 ” (molecular scanner) 的 概念 ， 即 2-DE 分 离 的 蛋白 质 电 转 印 到 膜 上 ， 用 MALDI-MS 以 自动 化 模式 分 析 膜 上 所 有 的 点 。 最 终 ， Hochstrasser 的 小 组 发 明了 对 2-DE 胶 上 所 有 的 点 进行 大 规模 平行 酶 切 的 技术 。 他 们 将 胰 蛋 白 酶 固定 化 到 膜 上 ， 再 将 此 膜 放 在 凝 胶 和 PVDF 膜 之 间 ， 在 电 转 印 过 程 中 施加 一 个 脉冲 电场 ， 蛋 白质 从 胶 上 被 慢 慢 转 移 ， 并 通过 覆盖 有 胰 和 蛋白酶 的 膜 被 水 解 。 水 解 剩余 的 完整 蛋白 同 此 蛋白 质 的 酶 切 肽 段 一 起 被 PVDF 膜 吸 附 ， 并 由 MALDI-MS 分 析 ， 用 UV BK IR 激光 都 获 成 功 (Hochstrasser，1998)。 尽 管 所 有 这 些 技 术 都 处 于 开发 的 早期 阶 段 ， 但 它们 仍 显 示 出 这 种 分 析 方式 是 可 行 的 。 一 旦 膜 上 肽 段 的 PSD-MALDI-MS 分 析 的 所 有 难题 都 被 解决 ， 最 重要 的 是 这 一 过 程 的 自动 化 问题 的 解决 ， 这 一 整体 策略 的 力量 就 能 被 充分 证 明 。 目 前 这 一 技术 的 最 大 问题 是 ， 产 生 的 肽 段 的 数目 有 限 ， 这 些 肽 段 在 进行 PSD 分 析 时 必须 能 够 产生 足够 数量 的 碎片 离子 并 能 成 功 进行 数据 库 检 索 。 但 是 ， 通 过 使 用 化 学 修饰 步骤 来 增强 离子 化 和 肽 段 的 裂解 ， 这 一 问题 将 会 被 很 好 地 解决 (Spengler et al., 1997). 尽管 由 于 2-DE 具有 高 分 辨 力 ， 是 蛋白 质 组 研究 最 常 使 用 的 蛋白 质 分 离 技术 ， 但 是 以 色谱 为 基础 的 分 离 技术 的 研究 也 正在 开发 中 ， 因 为 色谱 技术 更 易 与 MS/MS 在 线 整 ALE ”蛋白 质 鉴 定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 99 - 合 。Opiteck 等 已 经 用 2-D 色谱 (阳离子 交换 - 反 相 ， 用 两 套 独立 的 液 相 和 泵 ) 分 离 了 如 大 肠 杆 菌 裂 解 液 中 的 蛋白 质 混 合 物 ， 并 进行 在 线 ESLMS 分 析 ， 所 有 过 程 在 两 小 时 内 完成 (Opiteck et w.，1997b)。 他 们 对 诱导 和 非 诱 导 大 肠 杆 菌 裂 解 液 分 别 分 析 ， 鉴 定 出 一 个 过 度 表达 的 蛋白 质 。 同 一 小 组 还 报道 使 用 这 一 技术 分 离 了 肽 混合 物 (Opiteck et al., 1997a) 。Hsieh 等 (Hsieh et al., 1996) 使 用 了 由 计算 机 控制 的 配件 ， 包 括 一 个 自动 进 样 器 ，5 个 柱子 ，3 个 10 通 阀 ， 使 一 系列 步骤 在 线 进 行 ， 避 免 任 何 用 手工 操作 进行 的 物 质 转 移 。 这 一 策略 用 于 从 混合 物 中 免疫 亲 和 提 取 鉴 定 蛋白 质 ， 包 括 以 下 一 系列 步骤 : 免 疫 亲 和 色谱 ; 在 一 混合 填充 的 强 离子 交换 吸附 柱 上 进行 脱盐 和 缓冲 液 交 换 ; 在 一 个 固定 化 胰 和 蛋白酶 柱 上 进行 酶 切 ; 在 一 短 毛 细 管 灌注 反 相 柱 上 提取 肽 段 ; 最 后 在 一 个 分 析 型 的 反 相 柱 上 进行 分 离 并 与 MS/MS 在 线 连接 分 析 (Hsieh et al., 1996). 不 管 最 初 的 蛋白质 分 离 采 用 2-DE 还 是 靶 向 色谱 技术 ， 为 了 最 准确 地 鉴定 蛋白 质 ， 还 是 需要 生成 序列 特异 性 的 碎片 离子 谱 。 在 这 一 点 上 ， 尽 管 未 解析 碎片 离子 检索 程序 在 目前 格式 下 的 作用 很 大 ， 但 它们 并 没有 利用 碎片 离子 谱 中 包含 的 另外 的 信息 : 碎片 离子 的 相对 丰 度 信息 。 目 前 的 检索 程序 是 将 实验 测 得 的 质量 值 与 预期 值 进行 比较 ， 当 一 个 科 学 家 在 评价 一 个 图 谱 时 ， 要 考虑 各 种 肽 键 裂解 的 倾向 大 小 ， 因 为 碎片 离子 谱 可 被 看 作 每 一 肽 键 裂 解 的 特性 曲线 ， 某 些 氨基 酸 残 基 旁 的 肽 键 在 气相 中 更 易于 断裂 。 当 检索 程序 能 利用 碎片 离子 相对 强度 信息 时 ， 鉴 定 的 置信 水 平 会 提高 ， 使 其 能 真正 实现 自动 化 。 这 是 任何 大 规模 蛋白 质 组 学 研究 要 努力 达到 的 一 个 重要 目标 。 ， 致 谢 ; 作者 D. R. G. AR. A. 感谢 国家 科学 基金 会 分 子 生 物 技 术科 学 和 技术 中 心 和 Kinetek Pharmaceuticals 的 基金 资助 ， 感 谢 国 立 卫生 研究 院 对 作者 RR. A. 的 研究 基金 资 助 (No. 1RO1 Al 41109-01). {EA D. R. G. RAJ. D. Watts 博士 帮助 讨论 磷酸 化 蛋 白质 分 析 。 参考 文献 Aebersold, R. and Leavitt, J. (1990) Sequence analysis of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis: towards an integrated protein database. Electrophoresis 11: 517-527. Aebersold, R. and Patterson, S.D. (1998) Current problems and technical solutions in protein biochemistry. In: Proteins: Analysis and Design (ed. R.H. Angeletti). Academic Press, San Diego, CA, pp. 3-120. : Aebersold, R.H., Teplow, D.B., Hood, L.E. and Kent, S.B.H. (1986) Electroblotting onto activated glass. High efficiency preparation of proteins from analytical sodium dodecy! sulfate-poly- acrylamide gels for direct sequence analysis. J. Biol. Chem. 261: 4229-4238. Aebersold, R.H., Leavitt, J., Saavedra, R.A., Hood, L.E. and Kent, S.B. 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BNE ARERR HK AR a OT Klaus-Peter Pleissner, Helmut Oswald and Susan Wegner 1. 介绍 二 维 电 泳 技术 可 根据 蛋白 质 的 等 电 点 和 分 子 质 量 从 一 个 复杂 的 蛋白 质 溶液 中 分 离 成 百 上 千 的 多 肽 。 我 们 利用 染色 的 方法 ， 在 胶 上 可 通过 大 小 、 明 暗 度 和 位 置 等 各 异 (LS 四 章 ) 的 蛋白 斑点 检测 到 蛋白 质 。 几 种 类 型 的 凝 胶 和 染色 方法 是 可 行 的 ， 但 在 实验 室 之 间 存 在 差异 。 通 常 的 结果 是 获得 二 维 电泳 的 凝 胶 图 谱 ， 并 开始 进一步 加 工 以 揭示 图 像 所 含有 的 上 千 个 蛋白 质 的 信息 。 大 量 的 数据 以 及 在 客观 性 、 重 复 性 、 定 量 分 析 的 需要 使 计 算 机 辅助 的 图 像 分 析 方 法 成 为 必需 。 这 些 特殊 性 质 〈 即 蛋白 斑点 的 凝 胶 图 像 ) 可 利用 常 规 和 特殊 的 图 像 分 析 技 术 加 工 。2-DE 凝 胶 图 像 分 析 的 典型 流程 包括 以 下 几 个 步骤 : © 凝 胶 图 像 的 扫描 (数据 的 获取 ); @ 图 像 加 工 ，@ 斑 点 检测 和 定量 ; @ 凝 胶 配 比 ; OF 据 分 析 ;，@@ 数 据 呈 递 和 解释 ， CD2-DE 数据 库 的 建立 。 为 进一步 进行 以 计算 机 为 基础 的 图 像 加 工 ， 通 过 扫描 ， 可 将 凝 胶 图 像 的 “类 似 物 ”转换 为 数字 化 形式 。 明 确 从 蛋白 斑点 中 提取 内 在 信息 所 需 的 参数 是 很 重要 的 。 随 后 图 像 加 工 的 整体 目标 是 检测 胶 上 斑点 的 精 确 位 置 和 决定 以 蛋白 丰 度 为 测量 标准 的 蛋白 斑点 形状 和 强度 。 计 算 机 图 像 和 2-DE BR 图 像 的 分 析 就 这 样 作 为 一 种 工具 来 提供 某 些 信息 。 这 种 计算 机 图 像 包 括 : @ 去 除 噪 音 和 人 工 假象 的 图 像 预 加 工 ;@ 每 个 蛋白 斑点 的 检测 和 定量 。 除 了 从 一 块 凝 胶 上 获得 的 蛋白 斑点 信息 外 ， 同 一 蛋白 斑点 在 一 组 凝 胺 上 可 能 发 生 的 变化 对 于 生物 学 分 析 意 义 重 大 。 如 果 进 行 比较 ， 那 么 要 求 通过 设 定 足 够 标志 物 的 图 像 注 册 以 完成 比较 。 标 志 物 被 用 来 确定 蛋白 斑点 几何 转化 的 多 型 性 ， 进 而 蛋白 斑点 可 以 进行 相互 配 比 。 以 这 种 方式 ， 可 以 搜索 到 一 组 凝 胶 上 相应 的 蛋白 斑点 。 密 度 谱 显示 胶 内 斑点 强度 的 变化 。 通 过 分 析 密 度 谱 后 ， 可 以 推测 斑点 变化 的 趋势 。 谱 可 以 用 图 、 表 、 散 点 图 和 图 形 表 示 。 之 后 ， 分 析 的 结果 保 存在 数据 库 中 ， 并 与 原始 图 像 的 信息 链接 。 对 于 以 蛋白 质 组 研究 小 组 间 的 合作 促进 协同 数据 的 共享 和 交换 ， 根 据 其 开放 和 联合 的 原则 ， 应 用 软件 和 数据 库 系统 是 必需 的 。 凝 胶 及 其 图 像 ， 甚 至 从 中 提取 的 信息 数据 库 务必 以 一 定 可 接近 和 整合 的 格式 存在 。 这 里 ， 与 国际 互联 网 接触 能 帮助 克服 每 个 实验 室 的 界线 。 目前 存在 的 所 有 计算 机 辅助 的 凝 胶 分 析 系 统 ， 多 数 发 展 起 步 于 70 年 代 末 ， 依 据 上 述 所 提出 的 策略 来 提取 2-DE 凝 胶 图 像 的 数据 。 今 天 ， 许 多 非 商品 化 和 商品 化 的 系统 ， 如 QUEST/QUEST II/PDQUEST, TYCHO/KEPLER, GELLAB II， BioImage， HERMeS，PHORETIX 和 ELSIE/MELANIE II， 都 是 可 以 应 用 的 ， 它 们 已 在 2-DE 这 一 科学 领域 被 众多 人 等 所 接受 。 支 持 这 些 系统 的 相关 硬件 在 过 去 20 多 年 间 经 历 了 戏剧 性 的 变化 ， 并 且 仍 旧 迅 速 演 变 ， 但 其 应 用 的 基本 算法 是 一 致 的 。 计 算 机 凝 胶 分 析 前 人 已 提 到 (Anderson and Anderson, 1996; Anderson et al., 1981; Appel et al., 1991, 1997a, - 108 - 蛋白 质 组 学 b; Bossinger et al., 1979; Collins and Blose, 1992; Garrels, 1979, 1983, 1989; Lemkin and Lipkin, 198la~c; Lemkin et al., 1979, 1982; Miller et al., 1982; Olson and Miller, 1988; Prehm et al., 1987; Serpico and Vernazza, 1987; Skolnick, 1982; Vincens and Tarroux, 1987a, b; Vo et al .，1981)。 本 章节 主要 描述 2-DE 图 像 分 析 的 概况 及 其 主要 的 特征 ， 对 于 更 好 的 理解 图 像 分 析 是 重要 的 。 2. 数据 获取 2.1 获取 图 像 设 备 通过 扫描 2-DE 凝 胶 来 获取 数据 ， 并 将 其 转换 成 一 个 数字 化 的 文件 呈 递 。 很 明显 ， 数据 获取 明显 预示 最 终 的 分 析 质 量 。 两 个 技术 参数 对 于 得 到 令 人 满意 的 转换 至 关 重 要 ， 四 数字化 的 空间 分 辨 率 ; @ 灰 度 值 的 密度 分 辨 率 。 一 些 图 像 的 获取 设备 可 将 凝 胶 转换 成 数据 ， 并 可 获得 较 好 的 质量 ， 例 如 数码 相机 、 扫 描 仪 、 磷 储 屏 和 荧光 图 像 分 析 仪 〈 见 表 6 到 这 表 6.1 用 于 二 维 电 泳 的 主要 图 像 获取 设备 扫描 装置 AeA X 光 片 (放射 标记 的 样品 ) x x F x Be fie BE x 银 染 或 彩 染 凝 胶 X X x 荧光 标记 的 凝 胶 x 各 种 类 型 的 照相 机 ,大 多 数 情况 下 不 但 用 于 凝 胶 的 “文件 化 ”, 而 且 用 于 扫描 。 照 相机 的 质量 依靠 其 输入 和 输出 的 特性 。 以 白光 和 激光 来 区 分 的 密度 仪 或 扫描 仪 多数 情 况 下 适 合 于 获取 从 2-DE 凝 胶 图 像 的 数字 化 数据 。 它 们 具有 高 密度 高 空间 分 辨 率 及 线性 特征 ， 并 可 用 于 银 染 或 考 马 斯 亮 蓝 染 色 的 干 . 湿 凝 胶 。 放 射 性 标记 (25S，H,”C, ”2P) 样 品 的 二 维 电泳 图 谱 通过 X 光 片 或 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 获取 。 当 应 用 X 光 片 的 时 候 , 在 密度 或 灰 度 分 辩 率 上 必须 扩展 观察 其 动态 变化 , 即 通 过 同一 凝 胶 的 多 次 曝光 来 获得 尽 可 能 多 的 蛋 上 白 斑 点 。 不 同 曝光 的 片子 可 融合 成 一 个 数字 化 的 2-DE 凝 胶 图 像 。 每 一 组 灰 度 值 以 线性 方式 结合 以 增加 动态 的 密度 范围 。 为 获得 与 放射 性 相关 的 光 密 度 (disintegration/min，d. p. m. ), 需 要 同时 测量 放置 在 X 光 片上 的 校正 条 , 并 产生 标准 曲线 。 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 提供 了 一 种 代替 X 光 片 和 各 种 曝光 底片 融合 的 方法 , 因为 它们 具有 高 动态 范围 , 跨越 Ss 个 数 BR, 进行 自 显影 (Patterson and Latter，1993) 。 磷 储 屏 图 像 分 析 系 统 联合 QUEST II 系 统 的 应 用 前 述 已 提 及 (Amess and Tolkovsky, 1995)。 然 而 , 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 受 限 于 放射 性 标记 的 蛋白 混合 物 。 3. 数字 化 图 像 加 工 图 像 增强 被 广泛 应 用 于 计算 机 图 像 领域 , 平滑 操作 、 增 强 对 比 度 、 边 缘 检 测 和 背景 消 NE HEBER HK A A ot ot - 109 - 减 是 图 像 加工 最 熟悉 的 工具 。 这 些 操作 的 重要 性 依赖 于 所 应 用 的 领域 。 然 而 , 在 某 些 领 域 , 这 些 操作 主要 用 于 图 像 增 强 , 以 提高 图 像 的 光学 质量 , 分 析 科 学 可 依靠 这 些 操作 提供 明确 的 数据 。 例 如 ,在 2-DE 凝 胶 的 数字 化 图 像 上 分 析 和 蛋白 斑点。 这 里 , 平滑 操作 、 增 强 对 比 度 .边缘 检测 和 背景 消减 可 允许 以 一 种 精确 的 方式 来 决定 蛋 日 斑点 的 形状 和 大 小 。 不 同 的 操作 正常 定义 在 一 个 图 像 点 或 像素 "邻居 "区 域 。 通 常 所 应 用 的 邻居 是 3x3、 5x5 或 7x7 个 像素 。 例 如 , 在 一 个 代表 数字 化 图 像 的 有 规律 格子 基础 上 , 一 个 3x3 的 邻居 是 由 界定 图 像 中心 点 的 那些 像素 组 成 。 平滑 操作 被 用 来 清除 图 像 中 的 统计 噪音 。 主 要 策略 是 在 一 个 图 像 点 所 定义 的 邻近 区 a 图 6.1 利用 "滚动 圆 盘 "的 几何 模型 进行 背景 消减 和 条 纹 清除 球 的 半径 与 斑点 的 大 小 相 适 应 。 本 图 的 上 部 显示 沿 着 选 定 线 上 斑点 的 背景 和 密度 踪迹 。 下 部 说 明 背 景 消减 后 同样 的 特征 。 - 110 . 蛋白 质 组 学 域内 , 高 斯 平滑 、 平 均值 或 中 数 的 确定 。 增 强 对 比 度 重新 定义 一 个 图 像 的 灰 度 , 以 获得 斑 点 和 背景 之 间 较 高 的 对 比 。 边 缘 检 测 的 目的 是 限定 某 一 图 像 中 的 灰 度 值 变 化 。 通常 ,图 像 功 能 的 第 一 或 第 二 代 衍 生物 是 计算 机 化 的 。 各 种 操作 被 用 在 图 像 点 周围 的 小 邻近 区 域 居 以 决定 衍生 物 。 典 型 技术 是 ,在 第 一 代 中 应 用 梯度 操作 , 而 在 第 二 代 衍 生 物 中 应 用 拉 普 拉 斯 (Laplace) 操作 。 衡 生 系列 对 于 噪声 敏感 性 好 , 因此 , 通常 与 高 斯 平滑 联合 应 用 。 背景 消减 常用 于 清除 背景 的 无 意义 变化 , 例如 图 像 中 不 同 区 域 的 不 均一 或 各 种 背景 水 平 。 一 个 策略 是 取 背 景 最 黑 和 最 亮 区 域 的 平均 值 ,并 应 用 于 整个 图 像 。 另 一 个 比较 复 杂 的 方法 被 称 为 “滚动 的 圆 盘 " (Sternberg, 1986), 可 以 除去 图 像 中 的 背景 和 条 纹 ( 见 图 6.1)。 因 此 一 个 小 半径 不 但 可 产生 很 清晰 的 图 像 , 而 且 还 可 除去 最 弱 的 斑点 , 从 而 影响 这 种 清除 效率 是 可 能 的 。 4. 蛋 昌 质 斑点 检测 和 定量 请 记 住 这 次 练习 的 主要 目的 是 分 析 2-DE 蛋白 凝 胶 、 斑 点 检测 及 其 形状 模 建 ,这 是 一 个 重要 任务 。 斑 点 检测 产生 z/y 位 置 的 ”数组 形状 参数 和 整合 的 斑点 强度 。 蛋 白斑 点 有 几 个 光学 特征 。 它 们 可 能 分 别 出 现 , 但 在 原始 凝 胶 图 谱 及 其 随后 的 计算 机 图 像 中 是 互 相 接 触 或 重 到 的 。 它 们 也 可 能 出 现在 由 于 二 维 电 泳 和 凝 胶 染 色 所 导致 的 技术 问题 或 背景 不 同 所 致 的 条 纹 和 污点 内 。 它 们 可 能 没有 清晰 的 轮廓 , 因此 看 来 是 一 种 圆 形 或 椭圆 形 的 连续 分 布 。 斑 点 形态 依靠 于 凝 胶 制 备 、 染 色 步 骤 和 凝 胶 分析 系 统 的 数字 化 误差 。 每 一 个 斑点 \ 背景 的 灰 度 变异 和 缺乏 同 质 性 要 求 令 人 满意 的 算法 来 进行 斑点 检测 和 定量。 确实 存在 这 种 应 用 广泛 的 算法 , 并 被 分 为 高 斯 拟 合 (Gaussian fitting) 和 高 斯 拉 普 拉 斯 (Lapla- cian of Gaussian , LOG) 变换 斑点 检测 (Anderson and Anderson, 1981; Appel et al., 1997b; Lemkin and Lipkin, 1981la, b; Wu et al., 1994), 另 一 种 斑点 检测 的 方法 是 由 Garrels 最 先 提 出 的 线性 分 析 和 链 式 分 析 算 法 而 完成 (1979)。 在 这 个 方法 中 , 每 一 个 垂直 的 扫描 线 被 用 来 细 察 密度 高 峰 。 邻 近 扫 描 线 的 峰值 可 组 装 成 “ 链 状 ”, 并 且 可 决定 斑点 的 中 心 位 置 。 定 位 斑点 之 后 ,其 丰 度 (整合 的 斑点 强度 ) 可 通过 对 斑点 形状 进行 数学 模型 拟 合 来 决定 。 二 维 的 高 斯 模 建 经 常 被 应 用 。 显 著 偏离 单 一 高 斯 图 形 的 斑点 可 以 被 认为 一 组 高 斯 形状 的 重 琶 。 另外 一 种 主要 应 用 于 数码 相机 图 像 分 析 的 斑点 检测 方法 已 经 被 描述 (Prehm et al., 1987)。 预 加 工 包 括 底 纹 校 正和 非 回归 的 、 分 离 的 、 低 流通 的 平滑 滤 镜 。 一 个 分 割 的 步骤 假定 斑点 属于 具有 凸 出 曲率 的 灰 度 表面 区 域 。 当 应 用 分 割 模板 (9x9 凸 面 检测 磊 ) 时 , 如 果 中 心 像素 9x9 附近 的 曲率 大 于 零 , 则 像素 描述 了 一 个 斑点 的 中 心 。 否 则 , 图 像 上 的 斑 ， 点 属于 背景 。 相互 位 置 极端 靠近 的 斑点 、 或 者 那些 肩 靠 肩 、 或 背包 样 ( 一 个 小 斑点 附着 在 大 斑点 上 ) 的 斑点 ,通常 难以 分 离 , 因为 斑点 间 的 灰 度 区 域 不 能 表明 止 面 曲率 。 然 而 ,在 这 些 区 域 的 曲率 大 小 低 于 斑点 区 域 的 曲率 。 因 此 , 为 了 分 离 这 些 斑点 ,一 个 7x7 像素 的 模板 被 应 用 ， 并 且 可 计算 在 中 心 像素 和 以 3x3 邻近 的 8 个 方向 7x7 模板 边缘 的 像素 之 间 的 曲率 大 小 的 差异 。 如 果 两 个 曲率 大 小 之 差 小 于 至 少 一 个 方向 上 的 固定 阔 值 ,那么 , 中心 的 像素 则 被 认为 是 背景 。 通 过 这 个 分 割 过 程 所 发 现 的 斑点 中 心 通过 两 个 像素 加 以 扩大 。 斑 点 丰 度 取 第 六 章 AER KA Ro - 111: 决 于 扩大 斑点 中 心 内 所 有 像素 的 光 密 度 之 和 。 其 他 进行 斑点 检测 的 方法 基于 转化 分 界线 (Watershed transformation, WST) (Bettens et al., 1997; Meyer and Beucher, 1990; Pleissner et al., 1999; Vincent, 1993; Wegner et al., 1998). EAP 7K UG IX — Hh SE AY EO ER, FREE RU AS EH, 由 数值 代表 着 某 一 点 的 升 高 。 在 计算 算法 中 , 我 们 的 解释 是 一 种 浸入 过 程 。 这 可 以 假设 为 在 地 瑶 的 每 个 最 小 区 域 进行 钻 孔 ,并且 将 表面 浸入 湖泊 中 , 并 确保 在 山谷 中 所 有 灰 度 水 平 峰值 有 一 个 恒定 的 水 平面 。 从 最 低 海 拔 开 始 , 水 将 充满 不 同 的 山谷 。 在 这 个 浸入 过 程 结束 的 时 候 , 每 一 个 最 小 值 完 全 被 分 水 岭 所 包围 , 以 划 界 相关 的 山谷 。 这 山谷 相 对 应 的 区 域 ,也 就 是 分 水 岭 定义 某 一 图 像 的 最 佳 轮廓 。 在 图 像 中 用 来 进行 梯度 分 割 的 分 水 岭 必 须 以 地 瑶 来 解释 。 假 设 图 像 中 均一 的 区 域 以 低 对 比 度 , 即 低 梯 度 为 特征 ;反之 梯度 图 像 的 高 数值 是 由 原始 图 像 高 对 比 度 的 轮廓 产生 。 这 些 区 域 可 以 利用 WST 在 梯度 图 像 上 产生 。 随后 , 每 一 区 域 是 以 完成 一 个 马赛 克 图 像 的 特征 来 描述 。 所 选择 的 特征 应 该 与 原始 图 像 的 灰 度 水 平一 致 , 例如 原始 图 像 上 区 域 灰 度 值 的 平均 值 。 WSI 产生 封闭 的 轮廓 。 每 一 个 最 小 值 ( 峰 底 ) 描 绘 一 个 由 局 部 最 高 点 (汇流 ) 所 围 成 的 区 域 。 这 样 一 种 分 割 的 结果 很 可 能 是 一 种 过 度 分 割 。 那 意味 着 , 与 相关 区 域 的 轮廓 一 样 ,主要 由 图 像 噪 音 所 致 的 轮廓 也 会 被 发 现 。 在 过 度 分 割 的 马赛 克 图 像 内 , 以 下 两 种 类 型 斑点 区 域 将 被 用 来 鉴定 所 要 求 的 蛋白 斑 点 :与 一 完整 斑点 相对 应 的 区 域 或 者 部 分 不 完整 斑点 的 区 域 。 为 了 减少 在 马赛 克 图 像 内 候选 蛋白 斑点 的 数目 ,应 用 了 两 个 姜 值 ,这 基于 以 下 假设 ,斑点 区 域 的 灰 度 值 显 著 高 于 背 景 的 灰 度 值 , 并 且 它 们 与 背景 区 域 有 一 个 界线 。 所 要 求 的 冰 值 可 自动 适应 每 一 个 新 的 图 班 点 检测 的 步 双 fg lben 图 6.2 利用 分 水 岭 转化 进行 斑点 检测 的 主要 步 又 : 412 - 蛋白 质 组 学 像 。 应 用 这 些 标准 后 , 仍 存在 一 些 区 域 , 既 不 是 斑点 区 域 , 也 不 是 部 分 斑点 区 域 。 把 一 凝 胶 图 像 认 为 是 一 个 表面 时 , 斑点 的 形状 是 明显 凸 起 的 , 部 分 斑点 区 域 也 是 如 此 。 由 于 第 三 代 计 算 机 衍生 系列 描述 了 分 水 怜 拓 扑 地 够 的 曲率 , 斑点 和 部 分 斑点 区 域 就 可 以 采用 数学 方法 求解 。 斑 点 区 域 和 部 分 斑点 区 域 具有 相同 的 凸 起 曲率 。 最 后 , 如 果 它 们 来 源 于 同一 斑点 , 邻近 斑点 组 的 所 有 部 分 斑点 区 域 被 检查 、 融合 。 斑 点 形状 应 类 似 于 椭圆 ,并且 一 个 斑点 的 部 分 斑点 区 域 在 其 分 水 岭 线 的 邻近 区 域内 应 有 相应 的 凸 起 曲率 。 这 些 斑 点 特征 的 结合 被 用 来 作为 融合 的 标准 。 这 种 斑点 检测 算法 的 主要 步骤 见 图 6.2。 5. Be We AC te 除了 每 一 块 凝 胶 图 像 的 斑点 检测 和 定量 外 , 一 组 凝 胶 上 同一 斑点 的 比较 是 重要 的 。 因此 , 在 各 种 实验 条 件 下 和 蛋 日 表达 的 比较 性 分 析 成 为 一 个 重要 的 问题 。 凝 胶 的 不 均一 性 发 生 是 由 于 以 下 差异 所 导致 的 ,如 样品 制备 .电泳 条 件 或 温度 的 变化 以 及 在 不 同 凝 胶 上 电 泳 的 不 同 迁 移 率 。 上 述 原 因 导 致 无 法 产生 完美 无 暇 的 凝 胶 图 谱 。 因 此 , 为 了 分 析 蛋 自 的 变化 ,斑点 图 谱 必 须 配 比 。 进行 电泳 或 斑点 图 谱 配 比 的 前 提 是 注册 。 注 册 是 一 种 通过 转化 的 方式 使 数据 进行 比 较 的 步骤 。 正 常情 况 下 ,一块 凝 胶 上 和 晶 日 斑点 的 位 置 很 大 程度 依赖 于 各 种 可 变 的 参数 , 如 凝 胶 的 质地 和 密度 。 尽 管 许 多 研究 者 雄心 勃勃 以 获得 “完美 "的 凝 胶 , 但 这 些 凝 胶 在 化 学 和 物理 特征 上 仍 有 变化 。 因 此 , 当 进 行 凝 胶 配 比 的 时 候 , 蛋白 位 置 并 不 十 分 相同 , 因此 它 们 的 信息 值 不 是 直接 可 比 的 。 使 图 像 变 形 的 参数 需要 从 图 像 中 清除 , 将 其 转变 成 可 比较 的 图 像 。 这 已 通过 转化 的 方式 完成 ,并 且 随 后 可 进行 配 比 。 配 比 有 两 种 方式 :@O 在 像素 水 平 ;@ 在 斑点 水 平 。 在 第 一 种 情况 下 , 两 种 凝 胶 图 像 的 像素 绘 成 图 形 ; 在 第 二 种 情况 下 , 仅 对 两 块 或 多 块 凝 胶 上 的 蛋白 斑点 进行 配 比 , 以 达到 整 个 凝 胶 的 配 比 。 上 述 两 种 方法 , 即 局 部 或 全 局 的 , 多项式 的 转化 被 用 来 绘 成 一 个 源 图 像 或 源 斑 点 图 案 , 或 者 被 用 来 绘 成 缀 图 像 或 靶 斑 点 图 案 。 利用 标志 物 ( 或 passpoints) 在 图 像 和 亲 合 转化 上 进行 注册 , 如 调整 大 小 、 伸 展 、 旋 转 和 变换 。 例 如 标志 物 是 在 两 张 凝 胶 上 都 被 鉴定 的 特征 性 斑点 。 转 化 的 方法 对 整个 图 像 的 应 用 可 为 两 块 凝 胶 图 像 在 像素 水 平 上 的 定量 差异 提供 可 视 化 的 比较 (Appel et al., 1997b; Lemkin, 1997a; Pleissner et al., 1997a). TE BEA KOE OY EF BS Ra ee RA BE HE“ BE UR” PRK 现 。 斑 点 水 平 的 配 比 策略 见 图 6.3。 正 确 配 比 的 前 提 是 图 像 或 图 像 的 区 域 具有 很 高 的 相 似 性 。 配 比 的 算法 主要 首先 假定 为 在 一 个 比较 性 研究 中 凝 胶 图 像 属于 同一 条 件 下 产生 的 — 2A BEBE, 许多 算法 可 用 于 这 种 凝 胶 的 配 比 ,它们 是 建立 在 几何 、 统 计 \ 图 形 理论 和 错 列 组 合 图 谱 识别 法 的 基础 之 上 。 正 像 上 面 所 提 到 的 ,几何 方法 将 特征 性 的 蛋白 斑点 作为 标志 物 , 是 一 个 特殊 的 方式 通 过 扩散 来 配 比 。 这 里 , 从 标志 物 而 来 的 配 比 信息 在 它们 附近 延伸 到 邻近 的 斑点 。 对 任何 一 对 凝 胶 而 言 , 在 标志 物 附近 发 现 最 近 的 邻居 是 可 能 的 , 对 邻近 的 斑点 , 其 相对 于 标志 物 的 在 z, y 轴 上 的 位 移 是 可 确定 的 。 随 后 , 在 其 他 的 凝 胶 上 利用 与 相应 的 标志 物 相 关 的 同 样 位 移 进行 搜索 。 如 果 一 个 斑点 在 这 个 位 置 被 发 现 , 即 配 比 成 功 。 通 过 扩散 进行 的 配 比 第 六 章 “三维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 - 113 - 斑点 | 斑点 2 斑点 ; 斑点 N 图 6.3 配 比 的 原理 (在 斑点 水 平 上 ) 是 可 回归 的 , 这 意味 着 通过 扩散 所 配 比 的 斑点 能 成 为 进一步 扩散 的 中 心 。 配 比 的 质量 可 通过 两 块 凝 胶 之 间 进 行 直 接 配 比 的 结果 与 所 有 凝 胶 的 间接 配 比 所 进行 的 交叉 配 比 来 提高 。 此 外 , 加 入 斑点 也 可 以 提高 配 比 的 精确 度 和 质量 。 如 果 一 个 斑点 出 现在 源 图 像 , 但 在 靶 图 像 中 消失 ,那么 这 一 斑点 将 被 加 入 到 靶 图 像 的 相应 位 置 上 (Garrels， 1979, 1989). 在 统计 学 方法 基础 上 利用 相似 性 原则 的 一 种 强 有 力 的 配 比 算法 已 由 Olson 和 Miller (1988) 提 出 ,并 且 在 MELANIE II(Appel er al .，1997b) 这 种 软件 中 得 到 提高 和 完成 。 进 一 步 的 配 比 方法 是 以 图 形 为 基础 (Kuick et al., 1991; Skolnick, 1982; Skolnick and Neel，1986) 和 利用 错 列 组 合 图 案 识 别 方式 的 语法 为 基础 的 技术 (Tarroux et al., 1987; Vincens and Tarroux，1987a, 1987b). 对 于 实际 的 配 比方 法 , EBC is BE Mh RR Se HE — 2 EMRE A (match sets)。 配 比 的 过 程 导 致 单个 斑点 的 追溯 。 斑 点 及 其 强度 的 变化 可 以 通过 一 系列 凝 胶 进 行 追寻 。 凝 胶 配 比 在 凝 胶 的 图 像 分 析 中 是 最 关键 的 步骤 之 一 。 只 要 凝 胶 很 相似 , 即 当 它们 在 同一 条 件 下 产生 于 同一 实验 室 , 多 数 的 算法 是 成 功 的 。 从 不 同 来 源 的 凝 胶 图 像 的 比较 经 常 导 致 不 相 容 性 。 在 某 些 系统 中 , 数据 分 析 通 过 配 比 组 得 以 支持 , 它 由 几 组 凝 胶 组 成 (对 照 组 、 实 验 组 )， 它们 已 经 通过 配 比 的 加 工 。 有 时 候 附加 的 特征 通过 衍生 于 模板 图 像 的 标准 图 像 来 提供 。 包括 高 斯 模 建 斑点 的 标准 图 像 含 有 所 有 系列 凝 胶 的 斑点 和 数据 ( 均 包 含 于 配 比 组 中 )。 - 114 A RAs 6. 数据 分 析 数据 分 析 主 要 由 3 个 问题 所 驱动 :@ 质 的 确证 性 的 评估 ;@ 量 的 确定 ;@ 和 蛋白 表达 中 定量 变化 的 决定 。 每 块 凝 胶 中 有 效 的 重 白 斑点 数目 、 强 度 饱 和 的 斑点 数目 和 配 比 的 斑点 数目 的 信息 在 质量 评估 中 是 基本 的 。 应 在 所 有 凝 胶 中 存在 斑点 总 数 和 配 比 斑 点 之 间 的 关 FR, 以 明确 定义 质 的 原则 ;斑点 的 总 数 越 高 , 某 一 特殊 的 重 日 斑点 不 能 在 所 有 凝 胶 中 发 现 的 重要 性 就 越 小 。 为 了 确定 蛋白 表达 中 的 量变 和 质变 , 在 一 个 可 见 的 N x M 的 矩阵 表 中 列 出 了 一 组 凝 胶 中 所 有 单个 斑点 的 强度 值 ( 图 6.4). N 代表 斑点 的 数目 ( 行 ), M 代表 配 比 的 凝 胶 斑点 数目 ( 列 )。 在 最 初 N x M 矩阵 上 的 原始 数据 以 斑点 的 强度 来 代表 。 因 为 凝 胶 图 像 的 平 均 强 度 不 同 , 例如 不 同 的 曝光 时 间 , 所 以 在 定量 分 析 中 必须 进行 校正 (Burstin et al., 1993) 。 单 个 斑点 强度 的 校正 基于 相关 的 凝 胶 图 像 的 平均 强度 。 图 6.4 配 比 之 后 的 数据 分 析 表 (和 矩阵 ) 斑点 的 原始 数据 (整合 的 光 密 度 ) 在 Nx MPEG FF, 在 此 N 代表 斑点 的 数目 ( 行 数 ), 而 M 代表 凝 胶 的 数目 ( 列 数 )。 为 了 决定 蛋白 斑点 定量 变化 , 人们 搜寻 在 强度 上 增高 下降 或 不 变 的 斑点 。 定 量 分 析 可 利用 不 同 的 统计 方法 进行 ,例如 通过 平均 值 计 数 的 组 间 参 数 变化 和 斑点 强度 的 偏离 。 进而 ,组 间 的 变化 可 以 通过 单方 差 的 形式 进行 统计 检验 (例如 Student’s t-test, Log t-test 和 Mann-Whitney tset) 或 者 多 方差 的 方式 (相关 分 析 ) 。 ) 然而 , 单方 差 检验 考虑 每 一 行 ,并 不 依赖 于 N x M 数据 阵列 ;而 多 方差 方法 考虑 斑点 的 相关 性 ( 行 ), 相关 分 析 能 检测 凝 胶 间 的 相似 性 , 并 鉴定 其 典型 的 斑点 特征 。 用 于 2-DE 的 相关 分 析 的 数学 背景 首先 由 Pun 等 (1988) 提出 。 这 个 方法 目的 是 决定 最 代表 这 一 凝 第 六 章 ”二 维 凝 胶 电泳 的 图 像 分 析 - 115 - 胶 特征 的 斑点 。Schmid 等 (1995) 已 在 细节 上 描述 了 相关 分 析 , 利用 2-DE 蛋白 图 谱 , 将 之 应 用 到 细胞 分 类 。 我 们 已 经 对 从 PDQUEST 系统 中 所 产生 的 数据 进行 了 额外 的 相关 分 析 (Pleissner et al .，1998)。 整 体 上 , 单方 差 和 多 方差 的 统计 方法 对 于 2-DE 凝 胶 中 的 蛋 白 表达 变化 的 分 析 是 重要 的 工具 。 对 凝 胶 组 之 间 蛋 白 表达 的 定性 分 析 通 过 寻找 仅 在 一 个 组 中 出 现 的 斑点 即 可 。 这 些 班 点 经 常 被 称 为 “ 开 / 关 "斑点 ,因为 这 些 斑 点 在 某 些 特定 的 实验 条 件 下 开 与 关 , 并 且 它 们 是 表明 蛋白 变化 的 明显 候选 者 , 所 以 非常 重要 。 一 个 凝 胶 分 析 系 统 分 析 能 力 的 重要 特征 是 使 用 者 的 数据 处 理 , 这 是 使 用 者 定义 的 斑 点 的 集合 。 此 外 ,不同 的 分 析 步 豫 的 结果 可 以 被 联合 , 例如 交集 操作 (boolean operators) 。 以 这 种 方式 ,在 所 有 的 凝 胶 中 ,决定 可 被 发 现 和 被 配 比 上 的 非 饱和 斑点 是 可 能 的 。 此 外 ， 在 使 用 者 中 已 配 比 的 斑点 由 于 蛋白 的 变化 可 能 增加 或 降低 , 很 可 能 被 发 现 具有 统计 意义 。 这 种 数据 分 析 工 具 的 应 用 已 经 在 人 心脏 疾病 的 分 析 中 描述 (Pleissner et al., 1997b). 7. BOR SB 为 了 精确 呈 递 结果 , 需要 考虑 一 些 前 提 条 件 。 首 先 , 每 个 被 检测 的 蛋白 斑点 应 该 有 一 个 分 子 量 (M.) 和 等 电 点 (pI)。 因 此 , 利用 某 些 特征 的 蛋白 斑点 (参考 胶 上 的 斑点 ), 一 种 M,/pl 晶 格 形式 就 覆盖 在 凝 胶 上 , 从 而 推测 MypI 值 。 这 些 参考 蛋白 斑点 是 已 知 蛋白 ， 并 易 在 胶 上 检测 。 通 常 , MyVpI 值 在 供应 者 目录 排列 , 只 要 蛋白 名 称 或 蛋白 注册 号 已 知 ， 它们 也 能 从 SWISS-PROT (ExPASy 分 子 生 物 学 服务 器 ) 上 获得 。 例 如 :在 人 心脏 样品 的 二 维 凝 胶 中 , 血清 和 蛋白、 肌 动 蛋白 、. 肌 球 重 白 和 肌 动 蛋白 轻 链 1 和 肌 红 蛋白 明显 易 被 识别 ， 并 且 可 作为 产生 M/pI 晶 格 的 标志 物 ( Knecht et al., 1994). 利用 这 些 标志 物 蛋白 ,所 有 其 他 蛋白 的 My/pI 值 可 以 通过 假设 沿 着 pl 轴 ( 水 平 轴 ) 的 一 种 线性 外 推 和 沿 着 M, 轴 ( 垂 直 轴 ) 的 一 种 指数 外 推 得 到 评估 。 很 清楚 , MypI 值 的 精确 性 主要 依赖 于 用 于 计算 M,/pl 晶 格 的 算法 。 曲线 图 或 条 形 图 表 常 被 用 来 比较 斑点 的 量变 ,反应 斑点 变化 的 趋势 。 理 想 上 , 这 种 变 化 应 来 源 于 基本 的 蛋白 表达 变化 。 此 外 , 在 检测 非 配 比 斑点 和 在 定量 上 可 疑 高 于 平均 值 的 斑点 , 曲线 图 或 条 形 图 表 也 是 有 用 的 。 条 形 图 表 在 zx 轴 上 代表 凝 胶 的 斑点 数目 ,在 y 轴 上 代表 斑点 强度 ( 丰 度 )。 此 外 , 如 果 凝 胶 形 成 了 复制 (replicate) 组 , 组 内 平均 强度 值 和 标准 偏离 可 以 条 形 图 表 的 形式 说 明 。 利 用 这 种 数据 呈 递 ,组 间 的 变化 趋势 可 以 清晰 识别 。 因此 , 这 些 图 表 能 提供 一 个 有 力 的 图 形 工 具 , 以 代表 储存 于 配 比 表格 中 的 数据 。 这 些 图 形 中 的 某 些 类 型 , 显示 对 照 组 和 实验 组 间 的 斑点 差异 在 图 6.5 中 说 明 。 此 外 , 以 表格 形式 的 斑点 强度 输出 , 通常 以 EXCEL、Stat View、SSP、SAS 或 其 他 形式 应 用 而 进一步 评估 。 为 了 评估 斑点 强度 间 的 相似 性 , 散 点 图 经 常 被 用 来 显示 两 块 凝 胶 或 两 组 凝 胶 间 的 强 度 相 关 性 。 应 用 这 种 图 表 ， 依 据 强度 的 相关 性 , 相关 系数 可 以 被 计算 。 例 如 , 10 个 对 照 组 与 实验 组 凝 胶 被 分 析 , 可 组 建 一 个 研究 高 血压 影响 的 散 点 图 (Pleissner et al., 1998). 当 比 较 两 组 中 所 有 已 配 比 斑点 的 平均 强度 时 , 可 确定 两 组 的 明显 相似 性 (图 6.6)。 is 图 6.5 ” 某 些 类 用 来 表达 蛋白 变化 的 图 表 每 组 (对 照 、 实 验 ) 由 几 块 凝 胶 组 成 , 例如 :条 形 图 代表 组 内 斑点 强度 的 平均 值 和 标准 差 。 强度 平均 值 (高 血压 组 ) ppm 1000 10000 强度 平均 值 ( 对 照 组 ) 图 6.6 表示 实验 组 (高 血压 ) 和 对 照 组 间 斑 点 强度 平均 值 依 赖 性 的 散 点 图 已 配 比 的 每 块 凝 胶 的 斑点 数目 为 269; 凝 胶 的 数目 为 20。 蛋白 质 组 学 第 六 章 “” 二 维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 -117- 8. 数据 库 8.1 2-DE 数据 库 的 构建 前 面 所 描述 的 分 析 提 供 了 关于 蛋白 与 凝 胶 图 像 中 重 白 斑点 间 的 许多 描述 性 信息 , 即 蛋白 名 称 、.MvpI 值 和 目录 性 信息 和 其 他 文献 。 通 常 , 信息 在 2-DE 数据 库 中 储存 。 数 据 库 正常 情况 下 对 所 分 析 的 一 组 图 像 的 代表 图 像 给 予 明确 的 注释 .这 个 代表 性 图 像 能 成 为 被 分 析 的 凝 胶 图 像 之 一 或 者 是 产生 一 块 综合 性 的 标准 图 谱 。 这 种 图 像 -数据 库 和 数据 库 -图 像 的 链接 提示 :@ 如 果 一 个 蛋白 斑点 在 图 像 中 标 出 , 应 该 出 现 其 相应 的 描述 信息 ;@ 如 果 这 个 蛋白 的 名 称 或 其 他 描述 性 信息 已 知 ,那么 必须 显示 这 个 斑点 在 图 像 上 的 位 置 并 加 以 解释 。 一 些 凝 胶 分 析 系 统 包 括 它 们 自己 的 内 部 数据 库 。 例 如 在 PDQuest 系统 中 , 除了 标准 斑点 号 (SSP) 以 外 , 通常 一 个 数据 库 的 斑点 号 (DSN) 表 明了 这 个 斑点 的 位 置 ,因为 这 个 号 码 基 于 M,/pI 唱 格 所 排序 。 可 每 个 斑点 归于 不 同 的 注释 类 别 (annotation category)。 这 种 注释 是 直接 与 标准 胶 上 斑点 的 位 置 有 关 , 并 能 通过 简单 查询 检索 得 到 。 尽 管 这 些 内 部 的 数据 库 (Lipkin，1980; Jungblut et 必 .，1994) 是 有 帮助 的 ,但 它们 是 系统 特异 的 , 并 不 允许 凝 胶 图 像 和 描述 信息 共享 。 通过 网 络 技术 的 接触 可 帮助 克服 实验 室 的 界限 。 在 WWW(Cworld wide web) 网 上 所 产生 的 2-DE 数据 库 已 描述 (Appel et al., 1993; Boutell et al., 1994; Evans et al., 1997; Latter et al., 1995; Lemkin, 1997b; Monardo et al., 1994; Miller et al., 1996; Pleissner et al., 1996). Hat, K29 30 个 WWW 可 及 的 2-DE 数据 库 可 在 ExPASy 服务 器 的 WORLD-2DPAGE 上 检索 到 (http://www.expasy. ch/ ch2d/2d-index.html)。 对 于 2-DE WWW 数据 库 的 构建 交互 界面 和 整合 的 概况 已 由 Appel 描述 (1997c) 。 目前 , 某 些 组 建 2-DE 数据 库 的 软件 包 可 免费 应 用 , 如 Make2dbb (Hoogland et al., 1997)。 这 个 软件 包 可 以 不 依赖 MELANE II 系统 而 应 用 , 还 有 一 个 新 工具 , 它 使 凝 胶 的 TIFF FRSA z/y 参数 坐标 的 蛋 日 斑点 的 text 文件 和 SWISS-PROT 的 注册 号 转换 成 特定 的 图 像 格式 (http://www.expasy. ch/ch2d/tiff2mel.html)。 8.2 比较 网 上 分 布 的 2-DE 数据 库 伴随 着 信息 转换 , 通过 因特网 进行 的 凝 胶 图 像 比 较 在 蛋白 质 组 研究 中 是 一 项 重要 的 任务 , 并 可 支持 或 替代 昂贵 的 蛋白 质 鉴 定 。 产 生 数 据 库 的 master BER, 并 利用 某 一 蛋白 的 SWISS-PROT 注册 号 , 这 些 斑点 能 在 联邦 2- DE 数据 库 中 定位 和 鉴定 (Appel et al., 1996)。 在 2-DE 中 间 数 据 库 中 , 以 两 块 凝 胶 图 像 间 可 视 化 的 实验 室 间 比较 为 特征 , 利用 普 曲 (warping) 转 换 ( 如 配 比 )、 增 强 对 比 、 平 滑 过 滤 和 颜 动 (flickering) 技 术 得 以 在 Flicker 服务 右上 实现 (http://www-lmnb. ncifcrf. gov/flicker; Lemkin, 1997a)。 颜 动 意味 着 可 以 交替 看 见 两 块 图 像 ( 源 与 靶 图 像 )。 Pleissner 等 已 详细 描述 在 WWW 数据 库 中 可 利用 的 自动 化 比较 / 配 比 的 2-DE Be Re 图 像 的 问题 (1999)。 在 这 种 情况 下 , 当 利用 一 种 被 称 为 计算 几何 学 的 方法 时 , 斑点 参数 (斑点 位 置 和 强度 ) 被 用 来 作为 点 图 谱 的 配 比 。 此 外 , 通过 用 户 界面 的 方式 ,求助 于 任何 一 = 118 - 蛋白 质 组 学 个 具有 Java 能 力 的 因特网 浏览 器 , 斑点 检测 和 配 比 策略 可 直接 在 网 上 进行 。 这 种 配 比 方 法 通过 检查 两 图 像 间 点 的 边缘 斜率 和 长 度 ,也 考虑 斑点 的 强度 关系 ,来 比较 源 图 像 和 轰 图 像 的 点 图 。 配 比 算法 的 一 个 中 心目 标 来 源 于 利用 增 量 德 劳 内 (Delaunay) 三 角 测 量 , 即 从 计算 几何 学 而 知 (Alt and Guibas，2000)。 将 强度 绝对 值 向 不 连续 强度 整数 的 转化 和 不 连 续 阔 值 的 应 用 , 使 这 种 较 弱 地 依赖 于 灰 度 值 的 配 比方 法 成 为 可 能 (绝对 的 密度 分 辩 率 )。 这 种 配 比 方法 已 经 在 CAROL 软件 系统 得 以 完成 (http://gelmatchy. inf. fu-berlin. de)。 这 个 程序 能 够 通过 整个 因特网 配 比 2-DE 数据 库 中 的 凝 胶 图 像 。 使 用 者 从 任何 一 个 2-DE 数据 库 中 打开 GIF 图 像 , 进行 斑点 检测 , 并 在 源 与 靶 图 像 中 进行 局 域 的 配 比 。 6.7 展示 在 比较 从 WORLD-2 DPAGE 检索 的 2-DE 数据 库 HEART-2DPAGE ( 左 , 源 ) 和 HSC-2DPAGE( 右 , 靶 ) 而 来 的 凝 胶 图 像 时 ，CAROL 用 户 界 面 的 应 用 。 t a ¢¢ pena 图 6.7 被 用 来 比较 HEART-2DPAGE( 源 ) 和 HSC-2DPAGE (#2) SHE EH) CAROL 用 户 界面 搜索 图 案 ( + ) 在 源 图 像 中 设 定 , 相应 的 图 案 在 配 比 后 设 定 。 当 进行 配 比 时 , 在 两 个 数据 库 发 现 的 SWISS-PROT AC 被 显示 出 来 以 说 明 配 比 结果 的 正确 性 。 9. 结论 本 章 已 概括 了 计算 机 图 像 分 析 2-DE 凝 胶 的 主要 原理 , 以 及 2_DE 数据 库 的 建立 和 在 ee SSE ee 第 六 章 ”二 维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 “ 119 - WWW 网 上 的 比较 。 毫 无 疑问 , 如 果 没 有 计算 机 图 像 分 析 , A BES BY Ae iB] Be HE 的 评估 很 难 进行 。 各 种 各 样 的 商品 化 凝 胶 分 析 系 统 目前 是 可 应 用 的 ,用 来 决定 在 特定 状 况 下 的 蛋白 斑点 变化 。 一 旦 在 蛋白 变化 方面 具有 足够 的 实验 数据 , 即 可 检测 特定 的 蛋白 标志 物 , 并 进行 进一步 研究 。 数 据 库 的 构建 和 比较 的 概念 也 被 描述 , OE PA EE 可 通过 网 络 被 储存 .共享 和 比较 。 在 这 个 背景 下 , 数字 化 的 图 像 加 工 和 分 析 提 高 了 不 同 2-DE 数据 库 的 可 比 性 。 感谢 作者 感谢 德国 柏林 心脏 研究 所 的 Vera Regitz-Zagrosek、Bernhard Krudewagen 、 Eckart Fleck 和 柏林 自由 大 学 的 Frank Hoffmann, Klaus Kreigel、Carola Wenk , Helmut Alt 的 科研 协作 和 支持 。 (Fm xe Wiaw 1%) 参考 文献 -Alt, H. and Guibas, L. 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Electrophoresis 14: 1341-1356. 第 七 章 ”增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 : 稳定 同位 素 标 记 的 影响 Manfredo Quadroni and Peter James 1. 前 言 蛋 昌 质 组 分 析 所 关注 的 问题 是 蛋白 质 表 达 的 整体 变化 , 实现 这 种 分 析 最 常用 的 技术 是 二 维 电泳 和 质谱 分 析 技 术 。 最 近 , 商业 利益 促使 了 几 种 集成 化 系统 的 发 展 , 即 意图 建立 从 2-DE 样品 分 离 到 质谱 重 白 质 鉴定 的 工作 流水 线 。 在 界面 友好 、 适 用 性 强 的 基础 上 使 步骤 简化 和 标准 化 可 能 会 为 更 多 的 实验 室 成 功 运用 这 项 技术 开辟 一 条 道路 。 同 时 , 新 型 标记 方法 的 引入 能 大 大 地 简化 定量 和 数据 的 解释 ,也 可 能 会 使 凝 胶 电泳 的 步骤 被 省 略 掉 而 代 之 以 简单 的 色谱 步骤 。 本 章 中 , 我 们 将 概述 一 种 独特 的 蛋白 质 组 分 析 方 法 的 各 个 阶 段 ,并 概括 1998 年 末 我 们 对 这 一 领域 进行 综述 以 来 的 新 进展 (Quadroni and James, 1999 ) 。 全 基因 组 序列 (Devine and Wolfe，199$) 和 大 量 表 达 序 列 标签 库 (EST，Adams et a.，1991) 的 应 用 使 定义 生物 体内 全 部 可 能 的 蛋白 质 成 分 (和 蛋白质 组 ) 成 为 可 能 。 现 在 的 兴趣 集中 在 努力 去 解释 大 量 涌现 的 新 序列 数据 ,以 了 解 细胞 中 大 批 化 学 分 子 在 建立 细胞 的 分 子 机 器 过 程 中 是 怎样 相互 作用 的 。 因 而 解答 生物 学 问题 的 中 心 也 必须 从 一 个 简化 论 者 向 全 局 性 方法 转移 。 可 以 开展 基于 监测 整个 基因 组 表达 的 更 为 细微 的 分 析 方 法 , 而 不 是 分 割 开 整个 过 程 去 鉴定 一 个 可 能 的 效应 子 。 这 样 一 种 通过 mRNA 表达 的 定性 和 定量 分 析 来 描述 生物 学 系统 成 为 可 能 (Lashkari et al., 1997; Velculescu et al., 1997), 原因 是 由 于 各 种 DNA 表达 分 析 方 法 和 全 基因 组 范围 (genome-wide) 研 究 的 发 展 。 大 规模 的 mRNA 表达 研究 和 基因 组 DNA 测序 的 前 提 是 高 度 自动 化 操作 。 可 重复 性 是 对 这 些 复杂 的 数据 集 (datasets) 的 统计 分 析 的 基础 , 而 自动 化 和 高 通 量 的 数据 积累 对 这 样 大 的 工作 来 说 必 不 可 少 。DNA 和 mRNA 物化 性 质 很 一 致 ,易于 操作 , 可 通过 聚合 酶 链 反 应 方法 扩 增 , 因此 适 于 自动 化 。 与 核酸 相反 ,和 蛋白质 多 种 多 样 ,不 可 能 找到 通用 的 蛋白 质 处 理 方法 。 当前 惟一 系统 分 析 细 胞 中 多 数 蛋白 质 表 达 状 态 的 方法 是 基于 2-DE 的 方法 (Klose，1975; O’ Farrell, 1975; O’ Farrell et al .，1977)。 最 近 , 同位 素 标记 技术 (Gygi et al., 1999; Oda et al .，1999) 被 开发 出 来 ,从 而 使 2-DE 分 离 蛋白 质 的 定量 更 加 可 靠 。 这 些 方法 为 开 发 可 替代 2-DE 的 技术 开辟 了 道路 , 并 大 大 拓宽 了 蛋白 质 表 达 检 测 的 动态 范围 。 本 章 我 们 将 概述 在 复杂 有 蛋白质 组 分 析 中 所 尝试 使 用 的 自动 化 蛋 白 质 鉴定 和 定量 的 方法 及 其 缺 陷 。 2. 样品 制备 可 重复 的 样品 制备 可 能 是 获得 有 效 的 蛋白 质 组 分 析 中 最 重要 的 一 点 。 为 了 得 到 有 代 表 性 的 蛋白 质 样品 , 细胞 或 组 织 必须 进行 有 效 破 碎 , 细胞 内 成 分 的 溶解 要 具有 重复 性 。 在 第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋白 质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 4 和， 使 用 基于 尿素 的 混合 溶液 (其 中 含有 非 离 子 去 污 剂 、. 还 原 剂 和 蛋白 酶 抑制 剂 HET BE 提取 前 , 常 使 用 物理 破碎 法 碎 裂 细胞 或 组 织 , 比如 超声 法 、 机 械 驱 动 急 剧 压 力 变 化 法 、 匀 浆 和 剪 切 技术 。 细 胞 膜 和 细胞 骨架 蛋白 质 的 回收 率 不 稳定 , 在 一 些 蛋 白质 可 能 完全 被 提取 ， 而 仍 有 高 达 10% 的 蛋白 质 在 提取 后 残留 在 沉淀 颗粒 中 。 可 使 样品 在 一 天 内 运行 完成 (从 上 样 到 胶 的 染色 和 扫描 ) 的 小 2-DE 凝 胶 的 开发 是 很 重要 的 一 步 。 这 就 可 以 同时 快速 评 价 多 种 不 同 的 样品 制备 方法 。 为 了 降低 被 分 析 的 真 核 生 物 组 织 蛋 白质 混合 物 的 高 度 复 杂 性 , 使 得 其 中 含量 较 少 的 组 分 可 以 被 分 辨 和 分 析 , 常 要 求 对 样品 进行 预 分 离 。 处 理 类 似 组 织 这 样 的 混合 细胞 组 分 时 , 使 用 荧光 活化 细胞 分 类 器 (FACS)(Madsen et az .，1988) 对 细 胞 进行 预 分 离 能 获得 小 的 亚 细 胞 群 , 从 而 大 大 提高 分 析 的 灵敏 度 。 更 重要 的 进展 是 自由 流动 电泳 分 离 细 胞 器 /组 件 方法 的 开发 (Anderson，1967; Burggraf et al., 1995). XE 白质 表达 谱 研 究 的 重要 进展 , 它 将 显示 蛋白 质 是 在 细胞 的 哪个 部 分 、 在 何 种 条 件 下 发 现 的 (Blackstock and Weir，1999)。 这 就 使 我 们 可 以 去 开发 一 个 理论 模型 , 通过 该 模型 , 细胞 状态 可 以 根据 一 套 相 互 作 用 的 分 子 机 器 来 定义 。 3. AE REE op BS FO BT 3:1 自动 化 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (2-DE-PAGE ) 自 20 多 年 前 建立 以 来 , 标准 的 变性 2-DE 凝 胶 系 统 仍然 保持 其 必要 的 手工 操作 , 而 且 具有 相同 动态 范围 与 分 辨 能 力 的 蛋白 质 分 离 技术 也 没有 有 效 改 变 。 一 个 使 用 半自动 化 仪 器 样机 的 详细 研究 显示 了 机 械 操 作 的 可 重复 性 优点 (Harrington et al., 1993), 但 是 , 直 到 最 近 ,2-DE 胶 的 大 规模 的 自动 化 产品 研制 开发 才 由 商业 企业 开始 进行 ,如 Large Scale Biology 和 Oxford Glycosciences。 目 前 已 有 三 家 公司 宣布 了 其 在 蛋白质 组 分 析 集 成 化 系统 的 发 展 :Amersham-Pharmacia\BioRad 和 Genomic Solutions。 我 们 将 在 本 节 的 最 后 概述 这 些 , 但 必须 强调 , 这 些 是 非常 新 的 系统 , 有 时 仅 部 分 完成 , 对 这 些 系统 的 体验 非常 有 限 。 3.2 蛋白 质 的 扫描 检测 和 定量 通常 蛋白 质 可 以 通过 其 UV 吸收 呈现 , 不 过 , 聚 丙烯 酰 胺 在 同一 紫外 范围 有 吸收 ,所 以 必须 对 蛋白 质 进行 染色 。 为 保持 蛋白 定量 和 进一步 分 析 步 又 的 一 致 性 , 使 用 的 染色 方 法 应 该 对 全 部 蛋白 质 都 有 效 。 到 目前 为 止 ,最 常用 的 蛋白 染色 方法 是 考 马 斯 亮 蓝 染 色 和 银 染 。 两 种 方法 的 灵敏 度 都 与 蛋白 质 的 序列 有 关 ( 尤 其 是 银 染 ), 对 大 多 数 蛋白 质 来 说 , 二 者 都 有 较 宽 的 动态 线性 范围 。 另 一 个 选择 是 使 用 荧光 标记 , 可 以 在 一 向 到 二 向 的 平衡 步 又 利用 与 蛋白 共 价 结合 ,也 可 以 使 用 荧光 标记 SDS 类 似 物 或 荧光 染色 (Steinberg et al., 1996)。 尽 管 荧光 染料 具有 非常 高 的 甚至 在 亚 attomol 水 平 的 灵敏 度 , 但 响应 的 线性 和 通 用 性 仍然 是 限制 其 应 用 的 因素 。 任 何 染色 方法 都 不 会 有 干扰 进一步 分 析 的 副作用 ,即使 是 银 染 也 只 有 很 少 的 化 学 修饰 ( 见 第 四 章 )(Shevchenko et al., 1996), 1H #, Ht MOS 度 仪 在 吸光 模式 下 扫描 , 所 得 到 的 线性 响应 范围 是 0 一 3.5 个 光 密 度 单位 (OD)。 基 于 放 射 性 同位 素 标记 的 检测 方法 非常 灵敏 ( 优 于 attomole), 但 并 不 适合 于 自动 化 操作 , 因为 很 难 将 胶片 (或 者 来 自 BaFBr:Eu2 + 储 屏 图 像 的 计算 机 打印 输出 ) 上 点 的 位 置 与 凝 胶 基体 相 互 关联 。 (eaab 蛋白 质 组 学 除 受 所 使 用 的 显现 方法 影响 外 ,2-DE 凝 胶 分 离 还 受到 几 个 限制 因素 的 干扰 。 超 高 灵 敏 度 的 质谱 蛋白质 鉴 定 技术 的 出 现 使 宽 pH 范围 的 2-DE 凝 胶 分 离 的 缺点 显露 无 余 , 这 种 BAAS BE CRE HE EE ARRAS, 但 很 多 蛋 日 质 得 不 到 充分 的 分 离 。 部 分 重重 的 蛋白 点 可 以 通过 计算 机 处 理 的 方法 分 辨 , 但 现在 逐渐 明确 了 很 多 均匀 的 蛋白 点 也 包含 有 两 个 以 上 的 蛋白 质 。 对 于 原核 生物 , KA 20% 的 蛋白 点 包含 一 个 以 上 的 蛋白 质 (Link et al., 1997), 而 对 于 真 核 细胞 来 说 , 这 一 数字 接近 40% 。Proteome Inc. 与 Perseptive Biosystems 的 合作 研究 (Parker et wz .，1998) 详 细 说 明了 酵母 提取 物 2-DE BRO RHE 白 点 的 交叉 污染 程度 和 实质 。 很 多 和 蛋 日 点 包含 了 3 个 甚至 更 多 蛋白质 。 尽 管 质谱 技术 足 以 对 蛋白 质 混合 物 进行 分 辨 (Arnott et al., 1998), 但 每 个 蛋白 点 含有 多 个 蛋白 质 使 得 很 多 实验 结果 难以 解释 。 3.3 通过 稳定 同位 素 标 记 定量 2-DE 凝 胶 中 的 恒 白 质 体内 标记 蛋白 质 分 析 中 常用 的 技术 是 使 用 放射 标记 的 氨基 酸 ( 如 ”>S-Met 和 较 少 用 的 ”>S-Cys) 增 加 2-DE 的 检测 灵敏 度 , 并 利用 脉冲 示 踪 实验 测定 蛋白 质 合 成 和 降解 速率 。 最 近 稳 定 同 位 素 在 蛋白 质 质谱 分 析 中 的 应 用 引起 人 们 的 巨大 兴趣 。 一 种 方法 是 使 用 同位 素 缺 乏 介质 ( 重 同位 素 丰 度 较 低 的 介质 如 2N\、H 和 ”"H 以 及 3C)。 这 使 得 一 个 离子 的 同位 素 复 峰 衰减 成 一 个 单 峰 , 以 增加 灵敏 度 和 准确 度 (Marshall et al., 1997). MER ARRAY IA 细胞 状态 1 细胞 状态 2 GP 生长 在 言 含 5N 的 介质 中 混合 ， 提 取 和 蛋白 ， 分 离 foc oe ee ew? ie ge ae ee 切 下 蛋白 点 ， 酶 切 ， 提 取 多 肽 RAMA: 表达 量 不 变 相对 离子 丰 度 蛋白 质 B: 在 状态 2 下 增加 3 倍 质量 质谱 分 析 鉴 定 蛋白 质 ， 并 通过 测定 “NSN 质谱 峰 的 比率 相对 定量 蛋白 质 图 7.1 2-DE 凝 胶 分 析 的 体内 稳定 同位 素 标记 细胞 分 别 在 生长 正常 的 修饰 条 件 和 富 含 SN 的 介质 中 。 蛋 白质 从 细胞 中 提取 ， 并 在 2-DE 分 离 前 混合 。 和 蛋白 点 被 切 下 \ 酶 解 ,再 进行 MALDI-MS 分 析 。 离 子 对 的 X4N 与 SN 同位 素 之 比 可 以 定量 两 种 状态 之 间 的 表达 水 平 变化 。 Ste ”增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 "25 。 位 素 标记 已 经 用 于 蛋白 质 表 达 和 修饰 相对 变化 的 定量 (图 7.1)(Oda et al., 1999). AHA 生长 在 由 正常 同位 素 组 成 的 “ 轻 的 "化合物 介质 中 , 或 是 富 含 N 的 “ 重 的 ”介质 中 ;合并 从 生长 在 不 同 条 件 下 的 细胞 中 得 到 的 蛋白 质 提 取 物 , 一 部 分 通过 2-DE 分 离 。 切 下 重要 的 蛋白 点 , 酶 解 后 使 用 质谱 分 析 提 取 的 肽 。5SN 结 合 的 肽 比 正常 肽 大 一 个 质量 单位 , 使 得 来 自 两 个 细胞 混合 物 中 的 肽 得 到 区 分 。 这 样 肽 质谱 峰 就 会 成 对 出 现 , 可 以 根据 峰 的 相对 高 度 加 以 定量 。 研 究 发 现 二 者 比率 的 线性 值 跨越 两 个 数量 级 。 这 个 步骤 也 可 很 好 地 用 于 确定 翻 译 后 修饰 水 平 的 变化 (图 7.2)。 实 际 上 , 这 种 方法 受到 材料 成 本 的 限制 ,不 可 能 对 整个 动物 进行 标记 , 而 且 它 需 要 来 自 小 牛 胚胎 血清 的 血清 衍生 因子 ,通常 不 用 于 真 核 细 胞 培养 。 细胞 状态 1 细胞 状态 2 生长 在 正常 介质 中 国 欧 生长 在 富 含 SN 的 介质 中 酶 解 ， 提 取 多 肽 质谱 分 析 XP 相对 离子 丰 度 X 质量 未 磷酸 化 的 多 肽 X | 磷酸 化 多 肽 XP | 质谱 峰 的 比率 使 位 点 专 一 的 磷酸 化 程度 得 到 相对 定量 图 7.2 同位 素 标记 和 翻译 后 修饰 的 鉴定 能 用 于 测定 翻译 后 修饰 (如 磷酸 化 ) 的 变化 水 平 的 同位 素 标记 和 表达 定量 的 基本 方法 。 胶 后 标记 “另外 可 以 选择 使 用 分 离 后 同位 素 标记 的 方法 进行 相对 定量 (图 7.3)。 最 UE Aebersold 小 组 描述 了 一 种 称 为 同位 素 编 码 亲 和 标签 (ICAT) 的 方法 ,非常 有 望 成 为 蔡 代 2-DE 凝 胶 分 析 的 比较 蛋白 质 组 全 面 方 法 (Gygi et al .，1999)。 它 是 标记 经 2-DE 分 离 所 得 到 的 不 同 条 件 下 的 细胞 提取 物 的 蛋白 质 , 选 出 单个 蛋白 点 , 切 下 后 Lys 残 基 被 琥珀 栈 化 ,随后 蛋白 质 用 Asp/GluC 和 蛋白酶 酶 解 。 从 状态 1 得 到 的 蛋白 质 N 末端 用 正常 的 试剂 H4NicNHSL1-(H4 - 烟 酰 氧 基 ) 琥 珀 酰 亚 胺 ] 专 一 标记 ,来 自 状 态 2 的 和 蛋白质 用 气 代 试剂 D4NicNHS 了 予以 标记 。 基 质 辅助 激光 解吸 飞行 时 间 质 谱 (MALDI-MS) 分 析 结 合 酶 解 可 以 通过 单个 肽 的 D4/H4. 比 率 进 行 蛋白 质 的 相对 定量 (图 7.4)。 这 种 方法 的 优点 是 它 能 用 于 全 部 类 型 的 蛋白 质 提 取 物 , 与 细胞 培养 同位 素 缺 乏 或 富 集 介 质 方法 相 比 , 费用 低廉 。 这 。 126° 蛋白 质 组 学 种 技术 的 一 项 重要 应 用 是 对 1-D 胶 条 和 2-D 未 能 完全 分 离 的 含 多 个 蛋白 质 的 点 进行 蛋白 质 的 相对 定量 。 这 对 只 能 在 ]DE 上 简单 地 部 分 分 离 而 不 能 在 2-DE 上 运行 的 膜 蛋 白质 研 究 非常 有 用 。 标 记 也 有 助 于 简化 标记 多 肽 的 串联 质谱 图 谱 的 解释 。 细胞 状态 1 细胞 状态 ? * » 5 > *< ae we a 人 os ial ; 切 下 蛋白 点 ， 琥 珀 酰 化 ， Asp/Glu-C 蛋白 酶 酶 解 H AH 9 | | aa 用 H4 sais Hs 用 Dashing tie 一/ 肽 的 N ok pace! sa D 酶 解 与 MALDI-MS 分 析 结 合 B2 ica 通过 H4D4 峰 高 比率 相对 二 5 at 定量 蛋白 质 的 量 本 质 荷 比 通过 串联 质谱 分 析 和 蛋白 B 的 多 肽 片段 aa4 aa3 aa2 aal1 二 通过 相差 4 个 质量 单位 的 z b 离子 系列 测定 序列 训 二 质 荷 比 图 7.3 2-DE 凝 胶 分 析 的 提取 后 蛋白 质 标 记 为 了 解决 体内 蛋白 质 标记 的 问题 ,蛋白 质 可 以 在 2-DE 分 离 后 进行 同位 素 标记 。 多 肽 的 N 末端 被 标 记 后 , 这 种 方法 可 以 简化 串联 质谱 图 谱 的 解释 。 3.4 2-DE 凝 胶 蛋 白 点 的 分 离 如 果 分 析 一 系列 的 凝 胶 ,用 于 进一步 分 析 的 蛋白 点 可 以 用 自动 切 胶 系 统 (robotic spot picking system ) 进 行 单个 蛋白 点 的 后 处 理 (Walsh et wz .，1998)。 澳 大 利 亚 和 蛋白 质 组 分 析 机 构 (The Australian Proteome Analysis Facility, APAF) 已 经 与 ARRM(Advanced Rapid Robotics Manufacturing, Kent Town, South Australia) 合 作 开 发 了 这 种 商业 化 的 系统 。 机 KF UF SERB PVDF 膜 上 的 蛋白 点 , BT AE BOS AY 96 孔 板 中 酶 解 , 后 者 由 第 二 台 自 动 化 系统 (由 Canberra Packard, Downer’s Grove, II, USA 销售 ) 完 成 , 它 随 后 第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋白 质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 = K27e 1823 1953 1877* 1857 1873" 丰 度 18191) 1853 1,000 ali 1750 1950 2000 质 荷 比 1850 1900 图 7.4 在 单个 点 中 发 现 的 两 种 蛋白 质 的 MALDI-MS 图 谱 酶 解 和 标记 后 , 不同 条 件 下 的 蛋白 质 相 对 表达 水 平 可 被 测定 。 在 本 图 谱 中 , 星 号 标记 的 峰 表 示 表 达 水 平 保 持 一 致 的 蛋白 质 。 但 同一 蛋白 点 中 , 另 一 蛋白 质 (未 标 星 号 的 多 肽 ) 的 表达 水 平 随 三 因 素 之 一 增加 。 数据 收集 ， 质 量 控制 ， 数 据 储存 数据 整合 数据 集成 和 显示 工具 GUI 图 7.5 标准 的 蛋白 质 组 分 析 系 统 两 级 蛋白 质 组 分 析 工 作 站 软件 控制 类 似 2-DE 运行 、 蛋 白 点 切割 . 酶 解 和 包括 数据 分 析 和 样品 跟踪 的 质谱 分 析 机 械 装 置 。 | 9" IES ne amma TE « $28 - 蛋白 质 组 学 将 酶 解 液 与 基质 混合 后 在 多 样品 盘 上 点 靶 。 在 10 个 工作 日 内 成 功 地 完成 了 来 自 单个 2-DE 膜 的 288 个 蛋白 点 的 分 析 (Walsh et al., 1998), PERU PF, 2-DE 分 析 软 件 应 该 FOTN RA, 并 与 机 器 人 后 来 切 下 的 点 相 匹配 。 这 对 PVDF 膜 来 说 比较 简单 ， 但 凝 胶 容 易 变形 , 尤其 是 在 点 切割 时 容易 发 干 ,难于 操作 。 因 此 用 于 切割 的 凝 胶 或 膜 必 须 具有 机 械 稳 定性 。 此 外 也 有 其 他 一 些 自动 酶 解 装 置 (Davis et al., 1995a; Houthaeve et a/.，1997)。 最 近 三 种 商用 "蛋白质 组 系统 ”已 分 别 由 Amersham-Pharmacia, BioRad 和 Genomic Solutions 发 布 。 这 三 种 系统 的 基本 组 成 部 分 非常 相似 , 其 中 包括 一 个 胶 切 割 机 ， 它 根据 用 户 定 义 的 标准 (如 可 见 点 和 不 可 见 点 ) 得 到 的 计算 机 辅助 2-DE 胶 分 析 结 果 切 下 染色 胶 中 有 意义 的 点 。 这 种 “完全 的 "系统 的 基本 结构 如 图 7.5 所 示 。 3.5 蛋白 质 酶 解 / 碎 和 裂 当前 生物 和 蛋白质 和 多 肽 分 析 的 主要 制约 因素 是 样品 的 处 理 。 和 蛋白 质 浓度 低 至 500 fmol/ 岂 时 , 酶 解 效 率 很 低 。 这 是 因为 和 蛋白酶 在 $ 一 50 pmoly 几 范围 内 仅 表 现 $S0% 的 最 高 活 性 .50pmol/20pl BSA 酶 解 得 到 约 60 个 主要 的 多 肽 ,摩尔 回收 百分比 约 为 95%。 而 100fmol/20pl BSA 仅 得 到 6 个 多 肽 ,摩尔 回收 百分比 约 为 5% 。 可 以 选择 开展 化 学 方法 (但 仍 存 在 样品 处 理 损失 ) 或 直接 用 质谱 完成 。 完 整 蛋 白 的 串联 质谱 分 析 可 通过 多 种 质谱 技术 进行 ,如 碰撞 诱导 解 离 (collision-induced dissociation, CID) (Senko et wz .，1994)， 红 外 多 光子 解 离 (infrared multiphoton dissociation, IRMPD) (Little et wz .，1994)， 紫 外 激光 诱导 雁 裂 (ultraviolet laser-induced fragmentation) 和 表面 诱 导 碎 裂 等 (surface-induced fragmen- tation) (Williams et al .，1990)。 这 些 技术 都 能 用 傅立叶 变换 离子 回旋 加 速 共 振 (FT-ICR ) 完成 , 其 高 质量 准确 度 、 分 辨 率 和 能 进行 上 级 串联 质谱 实验 的 能 力 使 得 人 们 可 以 理解 质 谱 复 杂 的 碎 裂 方式 。 已 经 证 实 , 与 精确 质量 和 ”级 质谱 外 推 的 系列 序列 标签 结合 , 完整 蛋 白质 能 通过 FT-ICR 的 碎 裂 加 以 鉴定 (Mortz et al., 1996). HUE Li 和 Marshall 用 LC/ ESI FT-ICR 质 谱 示范 了 蛋白质 的 在 线 鉴 定 。 常 规 扫 描 首 先 用 于 提取 完整 蛋 日 质 的 精确 质 量 , 接 下 来 选择 扫描 IRMPD 用 于 选择 蛋白 质 的 /> 离子 。 完 整 的 质量 是 用 于 宽 分 子 质 量 范围 的 数据 库 子 集 的 选择 。 通 常 5 Aly -碎片 离子 和 从 IRMPD 获得 的 小 序列 标签 与 这 一 套 方法 相 匹 配 识 别 蛋 白质 .FT-ICR-MS 仪器 极其 昂贵 , 而 且 还 未 完成 自动 化 运行 。 4. 质谱 :使 用 质谱 数据 八 定 蛋 日 质 为 完成 高 通 量 蛋 白质 鉴定 , 必须 采取 分 阶段 的 步骤 。 第 一 阶段 是 非常 快速 , 鉴别 大 批 量 蛋 白质 的 低 信息 含量 的 数据 采集 , 接 下 来 的 第 二 阶段 是 详细 说 明 其 余 蛋 白质 的 低 通 量 、 高 信息 含量 的 数据 产生 阶段 。 最 后 的 第 三 阶段 是 完成 说 明 翻 译 后 修饰 的 大 工作 量 的 数据 积累 。 在 实际 的 操作 中 , 基于 MALDI 的 多 肽 质量 指纹 谱 是 理想 的 第 一 步 , 紧 接 着 的 串联 质谱 肽 片段 指纹 谱 部 分 测序 是 第 二 步 。 4.1 质量 指纹 肽 谱 1993 年 , 5 个 研究 小 组 分 别提 出 质量 指纹 肽 谱 的 概念 (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Pappin et al., 1993; Yates et wdl .，1993) 。 这 个 概念 是 指 特定 的 蛋白 酶 对 蛋白 质 进行 酶 解 后 的 质谱 分 析 得 到 一 套 多 肽 质量 , 这 种 特性 像 指纹 一 样 ， 第 七 章 ” 增 强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 “129 。 每 种 蛋白 都 具有 特定 的 质量 肽 谱 。 因 此 , 一 套 质 量 数据 能 用 来 查寻 序列 已 被 计算 的 指纹 质量 替换 的 蛋白 质数 据 库 , 从 而 发 现 相似 的 模式 。 得 到 酶 解 肽 质量 最 快 的 方法 是 通常 与 飞行 时 间 (TOF) 结 合 的 MALDILMS。 商 业 化 的 MALDI-TOF 仪器 装 有 最 多 1024 个 的 样 品 靶 位 ,软件 可 在 无 人 时 进行 数据 采集 。 样 品 制备 对 这 项 技术 的 成 功 与 否 相 当 重 要 。 如 果 样 品 同 源 , 使 用 最 佳 的 肽 、 底 物 比 例 , 几 次 激光 发 射 完 全 可 以 不 搜寻 样品 位 置 而 获得 较 好 的 谱 图 。 最 近 一 项 使 用 基质 晶体 沉淀 的 母 型 结晶 层 的 样品 制备 技术 推进 了 MALDI- MS #9 (#8 (Onnerfjord et al. 1999)。 样 品 均 质 性 使 得 每 个 样品 在 15s 内 使 用 16 次 激光 发 射 就 可 获得 质谱 。 使 用 流动 高 压 电 动 微量 分 布 器 在 高 密度 靶 盘 点 靶 , 用 唱 种 层 方法 点 样 约 100 pl 样品 , 得 到 直径 为 S00x 的 样品 点 。 事 实 上 ,所 有 1000 以 上 的 峰 都 是 单个 带电 肽 , 容易 得 到 数据 , 也 能 获得 较 高 的 信 噪 比 。 现 在 使 用 在 800~3000 m/z 质量 范围 的 “ 自 然 的 "内 标 ( 如 胰 蛋 白 酶 的 自 切 峰 ) 能 将 误差 保持 在 Sppm 以 下 。 如 果 数 据 库 中 提供 指纹 肽 谱 , 那 就 能 很 快 鉴定 蛋白 质 , 但 在 检索 基因 组 或 EST 数据 库 时 , 这 种 技术 就 不 太 成 功 。 使 用 两 种 以 上 数据 库 交 叉 检 索 可 以 减少 随机 的 噪音 因素 (James et al., 1994), th ay 445 合 来 自 不 同 特性 的 蛋白 酶 的 酶 解数 据 ( 如 AspN 和 LysC)。 单 个 酶 解 可 在 自然 状态 下 测 定 , 再 在 样品 靶 上 完成 化 学 修饰 (如 甲 基 化 、 乙 酰 化 或 气 代 )。 这 大 大 地 增加 可 信和 度 , 但 需 要 双 倍 的 分 析 时 间 。 4.2 小 序列 标签 多 肽 指纹 谱 使 用 双重 酶 解 , 或 自然 状态 和 化 学 修饰 酶 解 可 以 开发 已 存在 于 简单 肽 指纹 谱 中 的 序列 信息 。 胰 蛋白 酶 在 Lys 和 Arg 残 基 位 酶 解 ,二 者 都 是 蛋白 质 中 存在 最 丰富 的 氨基 酸 。 因 此 蛋 自 质 中 存在 大 量 的 重复 序列 ,如 KK、RR 和 KKR。 胰 和 蛋白酶 随机 地 切 开 这 些 位 点 ,还 有 固 有 的 较 低 的 蛋白 外 切 酶 活性 ,也 就 产生 不 规则 的 C 末 端 。 平 均 每 个 肽 质量 谱 可 以 找到 2.5 个 这 样 的 序列 标签 (Jensen et 必 .，1996)。 连 续 的 肽 链 内 切 酶 和 肽 链 外 切 酶 酶 解 能 有 效 得 到 不 规则 的 N 或 C 末 端 序列 ,产生 的 数据 可 用 于 检索 序列 数据 库 (Korostensky et al., 1998), 蛋 和 白质 鉴 别 的 可 信 度 远 比 简单 的 指纹 谱 高 。 不 过 , 这 种 方法 有 酶 解 同 样 的 缺点 , 随 着 肽 浓度 的 降低 和 肽 数量 的 增加 , 肽 链 端 解 酶 的 活性 也 很 快 下 降 。 另 外 , 由 于 肽 链 端 解 酶 酶 解 的 不 可 预测 性 , 序列 标签 可 能 对 应 于 母 离子 或 开始 的 5 个 氨基 酸 之 后 的 序列 , 使 得 在 复杂 的 酶 解 中 难于 将 序列 归属 给 特定 的 母 离子 , 很 难得 到 序列 标签 。 使 用 连续 的 化 学 降解 步骤 可 以 替代 产生 不 规则 N 或 C 末端 序 列 的 肽 链 内 切 酶 和 肽 链 外 切 酶 酶 解 。 已 经 证 明 多 肽 混合 物 的 一 步 手 工 Edman 降解 得 到 单个 N 末端 氨基 酸 标 签 的 方法 的 有 效 性 (Jensen et al., 1996), 但 衍生 化 导致 灵敏 度 降 低 (降低 因子 约 为 10)， 洗 脱 步骤 也 会 导致 大 量 的 样品 流失 。 实 际 上 “阶梯 测序 ”是 这 种 方法 的 简略 形式 , 使 用 异 硫 氰 酸 葵 酯 的 自动 Edman 降解 是 在 低 浓 度 的 序列 终止 剂 ( 硫 氰 酸 葵 酯 ) 的 存在 下 完成 BY, 得 到 的 阶梯 肽 片段 用 MALDI-MS 进行 分 析 (Chait et al .，1993)。 这 种 方法 的 改进 形 式 不 用 序列 终止 剂 ,通过 在 每 个 循环 加 入 等 量 的 起 始 肽 完成 偶 联 和 有 裂解 反应 产生 多 肽 阶 梯 (Bartlet-Jones et wl .，1994)。 多 肽 末端 氨基 的 保留 使 得 随后 的 碱 性 四 级 铵 NHS 酯 化 可 以 提高 灵敏 度 , 但 它 的 主要 缺点 是 额外 增加 了 处 理 步 又 。 已 经 开发 了 替代 的 使 用 水 溶性 试剂 的 化 学 降解 方法 , 它 是 将 多 肽 吸附 在 固定 于 聚 四 CRRA C-18 反 相 颗粒 上 , 进行 基于 硫 酯 的 降解 。 这 种 方法 能 在 固定 在 MALDI 靶 的 | CORRUUEM Gee MoS Be TELE Tt 二 - 130 - 蛋白 质 组 学 单个 聚 四 所 乙烯 膜 上 同时 完成 100 个 蛋白 质 的 降解 ,随后 可 直接 进入 质谱 仪 进行 分 析 。 实际 上 和 蛋白质 首 先 经 过 化 学 降解 或 蛋白 酶 解 , 再 固定 在 植 入 C-18 PRL RO 上 。 降 解 液 分 成 两 部 分 , 一 部 分 进行 完整 肽 混合 物 的 MALDI-TOF-MS 分 析 ( 图 7.6a)。 另 一 部 分 进行 是 化 学 降解 后 的 测定 (图 7.6b)。 降 解 是 基于 使 用 类 似 硫 代 乙 酰 殖 基 乙 酸 的 硫 代 酰 基 硫 酯 (图 7.6c)。 三 甲 胺 蒸汽 首先 通过 膜 以 建立 碱 性 条 件 , 然后 N - 乙 基 吗啡 啉 缓冲 液 中 的 硫 代 乙酰 琉 基 乙酸 再 透 过 膜 , 与 多 肽 反应 形成 N - 硫 代 乙酰 衍生 物 。 在 通 过 三 氟 乙 酸 蒸汽 切 下 第 一 个 氨基 酸 前 , Teflon 膜 先 用 水 洗 , 再 用 0.1% 三 氟 乙 酸 /水 洗涤 。 通过 小 心 选择 水 蒸汽 的 量 ,使 仅 25% 的 氨基 酸 裂解 , 另外 75% 进行 硫 代 乙 酰基 水 解 。 重 复数 次 ,序列 标签 和 和 母 离 子 组 成 的 肽 阶梯 产品 可 通过 MALDI 分 析 读 取 , 并 用 于 数据 库 检 索 。 这 种 方法 的 优点 是 数据 收集 速度 快 , 肽 降解 物 在 降解 后 立即 被 固定 , 样品 损失 降低 ， 反应 也 可 平行 完成 。 另 外 非 序列 专 一 酶 酶 解 和 化 学 降解 可 以 产生 用 于 数据 库 检 索 的 数 据 。 这 样 MALDI-MS 与 自动 化 酶 解 和 其 他 多 肽 修饰 化 学 结合 给 蛋白 质 鉴 定 提供 了 高 通 量 的 手段 。 现 在 大 多 数 商 业 化 质谱 仪 都 包括 多 个 步骤 , 如 样品 靶 的 装载 、 样 品 定位 、 图 谱 采集 和 质谱 峰 数 据 的 数据 库 检 索 等 。 oO a ee 20000 、 8 15126, 1703.8 2 <| _ a oe 9 de £ Be ml 0 上 a & 20000 8 ++ 10000 1454.7 g a a a fe a [-0 8445 19927 _— iu 本 5000 1756.0 1131.61387 800 1200 1600" 2000 2400 1200 1600 2000 2400 质 荷 比 (c) i HO NGC_S-CHCOO- + NH,—C—C—Gly-Asp-Phe-Arg CH,” | : 个 联 | CH, T CH; C-NH-C-C-Gily-Asp-Phe-Arg 裂解 | i CH, 里 唑 酮 衍生 Doe + CH,—Gly-Asp-Phe-Arg 0 图 7.6 Chemtag 化 学 和 MALDI-MS (a) 胰 蛋 白 酶 酶 解 从 2-DE 凝 胶 分 离 的 蛋白 点 的 MALDI-MS 谱 图 。 尽 管 只 有 几 种 多 肽 存在 , 而 且 蛋白 点 中 只 有 两 个 蛋白 质 , 质量 指纹 肽 谱 仍 不 能 鉴定 存在 的 蛋白 质 。(b) 使 用 硫 代 乙 酰 琉 基 乙酸 (thioacetylthioglycollic acid) 降 解 3 个 循环 后 酶 解 。 序 列 标签 及 其 母 离子 如 图 所 示 , 它们 可 用 来 鉴 定 蛋白 点 中 的 两 个 蛋白 质 。 5. 质谱 :使 用 串联 质谱 数据 鉴别 蛋 昌 质 5.1 串联 质谱 数据 采集 使 用 串联 质谱 碎 盈 方 式 进行 单个 多 肽 鉴定 的 概念 1994 年 被 提出 (Eng et al., 1994, 第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 : 稳 定 同位 素 标记 的 影响 - 131 - Mann and Wilm, 1994), 它 类 似 于 质量 指纹 肽 谱 的 蛋白 质 鉴 定 方法 。20 世纪 80 年 代 Don Hunt 小 组 提出 的 低能 量 、 三 级 四 级 杆 质谱 仪 和 Klaus Biemann (1990) 提 出 的 高 能 量 、 四 个 扇形 的 磁 质 谱 开 创 了 多 肽 串联 质谱 的 历史 。 第 一 个 质量 扫描 阶段 用 于 离子 通过 含有 碰撞 气体 (如 氨 气 ) 的 高 压 区 加 速 前 分 离 单个 多 肽 离子 , 第 二 个 质量 扫描 阶段 用 来 测定 碰撞 诱 导 / 活 化 解 离 (CID) 产 生 的 多 肽 碎片 质量 。 利 用 装 有 离子 闸门 和 反射 简 的 TOF 仪器 , 增 加 激光 能 量 (获得 正常 质谱 所 需 的 两 种 因素 之 一 ) 可 获得 源 后 衰变 (PSD) 谱 。 在 股 流 膨 胀 (plume expansion) 和 离子 加 速 阶段 多 肽 离子 与 基质 多 次 碰撞 的 结果 是 ,大 部 分 MALDI 解 吸 离子 到 达 检 测 器 前 要 经 受 “ 延 迟 " 碎 裂 。 其 中 任 一 种 技术 产生 的 一 组 离子 都 能 用 于 测定 多 肽 的 序列 。 多 肽 的 碎片 质量 组 扮演 着 多 肽 指纹 的 角色 , 能 用 来 在 序列 数据 库 中 搜寻 类 WAI ZAK. PSD 分 析 应 易于 自动 化 操作 , 并 使 场 反射 曲线 化 , 使 得 更 简单 地 在 一 次 扫描 中 可 以 收集 全 部 碎 裂 谱 。 不 过 它 的 缺点 是 很 难 从 多 肽 混合 物 得 到 PSD 谱 , 而 且 一 些 分 级 分 离 形 式 应 该 在 分 析 之 前 完成 (Gevaert et al., 1996). 虽然 CID-MS/MS 碎 裂 可 获得 信息 量 较 大 的 数据 ,但 其 数据 收集 比 简 单 的 质量 指纹 肽 谱 要 费时 。 事 实 上 , 两 种 获得 高 灵敏 度 串联 质谱 数据 的 方法 可 通过 使 用 电 喷雾 接口 到 三 级 四 级 杆 、 离 子 阱 或 四 级 杆 - TOF 质谱 实现 : 酶 解 液 作 为 混合 物 从 毛细 管 1~10pum 的 出 口 未 端 以 非常 低 的 流速 直接 喷雾 (< 50 nl/min, Andren et al., 1994; Gale and Smith, 1993; Valaskovic et al., 1995; Wahl et al., 1993; Wilm and Mann, 1994), 或 纳 升 电 喷 雾 在 线 分 离 方法 如 电泳 毛细 管区 带电 泳 (CZE) 或 HPLC。 可 通过 程序 将 离子 挑选 出 来 自 动 对 多 肽 混合 物 进 行 串联 质谱 分 析 , 其 优点 是 使 用 查询 表 可 以 滤 出 自 切 碎 片 和 来 自 凝 胶 污染 物 的 杂质 (Davis et wa .，1995b)。 这 种 方法 已 成 功 地 用 于 完整 蛋白 质 的 测序 (Piccinni et ll .，1994)。 动 态 的 CZE/HPLC 方法 比 静态 的 纳 升 电 喷 雾 方法 灵敏 度 要 高 得 多 , 前 者 的 多 肽 会 浓缩 SO 倍 甚至 更 高 (Davis and Lee，1997)。 两 种 方法 的 共同 优点 是 , 他 们 都 能 与 母 离子 扫描 相 结合 。 当 这 些 离子 在 质谱 中 的 信 噪 比 为 1 时 ,多 肽 的 共同 碎 裂 片段 如 immonium 或 磷酸 盐 离 子 的 母 离子 扫描 仍 可 确定 多 肽 离子 的 质量 。 不 过 动态 方法 的 最 大 的 优点 是 能 与 自动 进 样 峰 接 口 , 完 成 自动 进 样 。 5.2 串联 质谱 数据 库 检索 使 用 未 经 解析 的 串联 质谱 谱 图 的 自动 数据 库 序列 检索 的 运算 法 则 已 在 过 去 的 4 年 里 得 到 发 展 。 也 许 应 用 范围 最 广 的 是 由 西雅图 华盛顿 大 学 的 John Yates 和 Jimmy Eng FF 发 的 SEQUEST 数据 库 (Eng et w.，1994)。 其 最 初 的 目的 是 搜索 未 修饰 的 多 肽 串联 质 谱 碎 裂 片段 的 蛋白 质数 据 库 , 但 后 来 扩展 到 搜索 翻译 后 修饰 的 多 肽 (Yates et al., 1995b)、DNA 数据 库 (Yates et al., 1995a) 和 高 能 量 CID 或 PSD 数据 (Griffin er al., 1995, Yates et wl .，1996)。 事 实 上 程序 搜寻 数据 库 ( 可 以 但 不 一 定 明 确 蛋 白 酶 ) 中 所 有 与 母 离子 (在 定义 的 质量 范围 内 ) 有 相同 质量 的 多 肽 , 然后 将 预测 的 串联 质谱 谱 图 和 实验 测 得 的 谱 图 相 匹配 , 最 终 对 得 分 最 高 的 多 肽 进行 交叉 相关 分 析 以 获得 最 好 的 比较 。 现 在 万 维 网 还 有 其 他 一 些 用 未 经 解析 的 谱 图 数据 检索 的 数据 库 检索 程序 , 如 纽约 洛克 菲 勒 研 究 所 的 Fragfit(Prowl 软件 组 的 一 部 分 ;http://prowl.rockefeller.edu/ ) ,加州 大 学 旧金山 分 校 的 MS-Tag(ProteinProspector 组 的 一 部 分 ;http://prospector. ucsfedu/eduy/ ) 。 另 一 个 序列 数据 库 中 香 白 质 鉴 定 的 算法 Peptide-Search 是 由 Matthias Mann 开发 的 。 132 - 和 蛋白质 组 学 (Mann and Wilm，1994)。 串 联 质谱 谱 图 必须 用 手工 检查 发 现 一 组 离子 ,用 完整 的 多 肽 质 量 ` 从 N 末端 到 标签 序列 的 起 始点 的 质量 和 从 标签 的 末端 到 C 末端 的 质量 得 到 的 小 序列 (标签 ) 形 成 系列 ,用 于 数据 库 检 索 。 仅 用 序列 标签 和 N 末端 的 质量 就 能 完成 检索 , 比如 这 种 算法 能 鉴定 携带 未 明确 的 翻译 后 修饰 的 多 肽 。 另 外 , 这 种 程序 也 能 完成 混合 检索 , 如 多 肽 质量 查找 和 序列 标签 查找 , 然后 组 合 检 索 结 果 。 其 他 与 SEQUEST 和 PeptideSearch 的 各 种 要 素 结 合 的 程序 已 被 开发 ,如 MassFrag (Gevaert et al., 1996), No-name (Patterson et al., 1996), Fragfit (Arnott et al., 1998) 和 Matrix Science 的 MASCOT (http// www. matnxscience. com/ ) 。 5.3 自动 化 串联 质谱 解释 和 数据 库 检 索 最 初 蛋 白质 的 鉴定 是 通过 人 工 解释 串联 质谱 谱 图 , 再 在 BLASTA 或 TFASTA 等 数 据 库 中 进行 同 源 性 检索 (Altschul et al .,1990, 1994), 如 今 这 一 方法 正在 更 新 。 早 期 曾 尝 试用 部 分 相关 的 方法 将 越 来 越 长 的 序列 与 谱 图 相 适 应 (如 SEQPEP, Johnson and Biemann, 1989), 或 像 Hines 等 (1992 ) 描 述 的 使 用 图 谱 匹 配 的 方法 进行 自动 化 串联 质谱 图 谱 的 解释 。 最 近 用 可 能 的 序列 解释 SEQPEP 得 到 的 串联 质谱 谱 图 , 以 使 用 改进 的 FASTA 方法 搜索 序列 数据 库 的 程序 Lutkefisk (Taylor and Johnson，1997) 已 经 被 开发 。 另 一 种 方法 是 产生 含有 同位 素 信 号 的 串联 质谱 序列 离子 使 得 它们 立即 被 确认 为 N 末端 得 到 的 或 C 末 端的 > 系列 离子 。 蛋 白质 在 “0O/2%O 标 记 的 水 混合 物 (50:50) 中 的 酶 解 产物 在 质谱 中 形成 质量 相差 2Da 的 成 对 质谱 峰 , 这 是 因为 在 肽 键 水 解 过程 中 作为 溶剂 的 水 分 子 介 入 所 致 (Takao et wz .，1991)。 这 样 串 联 质谱 谱 图 中 2 离子 是 单 峰 ; 而 y 离子 出 现成 对 的 质谱 峰 。 这 已 经 作为 使 用 高 分 辩 四 级 杆 / 飞 行 时间 质 谱 数 据 库 检 索 的 自动 化 “de novo" 序 列 标签 的 根据 。 另 外 还 有 几 种 化 学 方法 专 一 地 用 同位 素 标签 标记 多 肽 的 N 末 100 b8 988.3 90 859.3 80 b9 2+ b6 ar 674.2 70 492.2 y7 711.3 60 a b7 = 50 527.2 y6 731.3 i 598.3 a6 40 646.3 855.3 0 y4 984.3 470.3| | 45 y7 | |b7+NH yg 642.2 20 b3 oa} 372 ne， 10 409.1 y f 300 900 1000 0 质 荷 比 400 500 600 700 800 y8 — y/ -y6 —y> —y4 -—.y5 -y2 ,y! wa Aa wf ne ay nsf Gly | Gln \ Glu bl 一 b2— b3— b4—b5 — b6— b7— b8 图 7.7 D4H4 标记 的 多 肽 串联 质谱 图 示 的 是 多 肽 ADIAGHGQE 的 串联 质谱 图 。2 离子 出 现 质量 相差 4 的 成 对 质谱 峰 , 而 y 离子 只 有 单 峰 。 半 数 的 烟 酸 存在 于 N 末端 容易 形成 ! 离子 , 使 得 从 图 谱 中 推论 出 肽 的 序列 更 容易 。 Soe “增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同 位 素 标记 的 影响 “88 > 端 ,因为 难以 区 分 肽 的 e 氨基 (N 末端 ) 和 e 氨基 (Lys), 而 且 去 除 基 本 位 点 后 检测 灵敏 度 下 降 , 所 以 并 没有 完全 成 功 。 我 们 最 近 介绍 了 一 种 很 容易 从 串联 质谱 中 推导 序列 的 方法 。 标记 的 方法 已 在 前 面 的 “ 胶 后 标记 ”部 分 讨论 。 简 单 说 来 , 使 用 50:50 的 H4 或 D4 的 烟 酸 混合 物 标记 和 蛋白质, 其 中 的 赖 氨 酸 侧 链 s 氨基 在 衍生 前 被 琥珀 酰 化 ,所 以 N 末端 的 o - 氢 基 反 应 绝对 专 一 。MALDI 图 谱 表 明 酶 解 得 到 的 全 部 多 肽 都 有 质量 相差 4Da 的 成 对 质谱 峰 出 现 。 必 须 选 择 足 够 宽 的 质量 范围 以 包括 全 部 的 母 离子 同位 素 峰 , 产生 的 串联 质谱 图 以 成 对 质谱 峰 出 现 的 来 自 N 末端 的 离子 为 主 (2 和 一 些 a 离子 )( 图 7.7)。 所 有 从 C 末 端 得 到 的 离子 (> 离子 或 中 间 的 离子 ) 都 是 单 峰 。 所 以 相当 容易 就 获取 到 和 蛋白质 的 序列 。 即 使 存在 未 知 的 翻译 后 修饰 ,也 不 影响 用 序列 (包括 在 适当 的 位 置 的 X) 在 (T)FASTA 中 进 行 序列 同 源 性 搜索 的 能 力 。 自 动 化 序列 推 朵 相 当 容 易 ,使 得 和 蛋白质 的 鉴定 非常 快速 , 而 且 具有 很 高 的 可 信和 度 。 5.4 数据 解释 工具 一 旦 数据 库 检 索 开 始 执行 , 自动 化 处 理 就 不 停 。 高 通 量 的 蛋白 质 分 析 要 求 开 发 工具 软件 帮助 实验 者 解释 数据 得 到 有 意义 的 倾向 和 结论 。 就 HPLC 或 CZE -自动 串联 质谱 来 说 ,其 产生 的 数据 文件 量 非常 庞大 , 而 人 工 查看 只 能 获得 很 少 的 一 部 分 。 为 了 比较 各 种 的 文件 , 强大 的 数据 分 析 软 件 包 是 必 不 可 少 的 。Terry Lee 的 实验 室 为 了 解释 从 蛋白 质 的 质 谱 分 析 中 得 到 的 数据 ,开发 出 Macpro-Mass (Lee and Vemuri, 1990) fF, EMA WZ 便 用 户 , 是 最 早 开发 的 程序 之 一 。 第 二 代 程 序 Sherpa 是 在 西雅图 华盛顿 大 学 由 Alex Taylor (Taylor et al .，1996) 开 发 的 。 程 序 能 同时 搜索 多 个 蛋白 质 序 列 , 同时 比较 两 个 LC-MS 文件 ,搜索 糖 基 化 和 磷酸 化 多 肽 ,给 予 数据 和 预测 之 间 的 匹配 程度 简单 的 评价 。 这 种 分 析 工 具 给 分 析 带 来 巨大 的 帮助 。 最 近 John Yates 已 经 描述 的 一 种 不 同 的 SEQUEST 程 序 , 用 于 比较 多 肽 的 碰撞 诱导 解 离谱 库 检 索 和 LC-MS/MS 实验 得 到 的 串联 质谱 差 减 分 析 (Yates et al.; 1998). 因此 大 部 分 蛋白 质 组 分 析 领 域 已 经 实现 部 分 自动 化 。 还 需要 给 予 格外 重视 的 主要 领 域 有 : 极 小 量 的 原料 (>10fmol) 酶 解 鉴别 翻译 后 修饰 的 通用 方法 , 尤其 是 糖 基 化 的 复杂 和 领 域 ; 样 品 酶 解 经 快速 高 效 地 浓缩 后 可 进行 肽 指纹 质谱 分 析 , 如 果 需 要 , 还 可 进行 相同 样品 的 串联 质谱 分 析 (MALDI 离子 阱 应 该 是 非常 理想 的 )。 但 不 幸 的 是 缺少 一 个 能 以 简单 可 行 的 方式 将 各 种 形式 的 所 有 数据 结合 在 一 起 , 进行 高 级 (high-order) 数 据 分 析 的 完整 的 实 验 室 信 息 管 理 系统 。 稳 定 的 同位 素 标记 简化 了 很 多 难题 , 如 单个 蛋白 点 中 含有 多 个 蛋白 质 及 其 定量 问题 , 它 也 是 简化 串联 质谱 数据 文件 里 信息 内 容 的 简单 方法 。 这 一 领域 内 需 要 做 的 还 很 多 , 但 大 部 分 问题 无 足 轻 重 , 纳米 技术 (nanotechnology) 和 更 好 的 数据 开发 工 具 不 和 久 将 革新 这 一 领域 。 ( 刘 尚 义 HE Ree 校 ) ee ee eT me ce. aces ae ae ee 。 134+ 蛋白 质 组 学 参考 文献 Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M.H., Xiao, H., Merril, C.R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R.F. et al. 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Wilkins 1. 历史 回顾 BEEF 20 世纪 70 年 代 中 期 的 二 维 电泳 (2-DE) 描述 了 以 等 电 聚 焦 为 基础 的 一 相 电泳 和 根据 分 子 质量 进行 分 离 的 二 相 电 泳 的 结合 (Kenrich and Margolis, 1970; Klose, 1975; O'Farrell，1975; Scheele，1975)， 其 分 辨 能 力 之 强 ， 可 以 在 一 医 胶 上 分 离 出 1000 多 个 大 肠 杆 菌 蛋白 〈(O'Farrell，1975)， 这 就 给 研究 者 提示 可 以 通过 用 2-DE 技术 对 生物 系统 内 的 复杂 和 蛋 日 进行 定性 和 定量 分 析 ， 因 此 这 一 研究 技术 的 巨大 潜力 迅速 被 一 些 人 接受 ， 用 于 有 机 体 的 多 种 蛋 日 的 研究 。 此 外 ， 差 异 显示 2-DE 技术 也 被 用 于 寻找 和 蛋 白 的 氨基 酸 改 变 或 蛋白 的 转移 后 修饰 (Goodman, 1976; Steinberg et al .，1977)。 介绍 完 2-DE 和 蛋白 分 离 技 术 后 ， 将 介绍 针对 不 同类 型 样品 及 不 同 分 析 目 的 的 2-DE 的 应 用 。 通 过 制备 不 同 条 件 下 的 样品 可 反应 基因 表达 水 平 的 差异 〈O'Farrell and Ivarie , 1979); 另外 ， 通 过 比较 生物 体 的 正常 和 突变 株 也 可 反应 基因 表达 水 平 的 差异 (Reeh et al.，1976)。 也 有 一 些 研 究 者 利用 2-DE 技术 寻找 蛋白 复合 物 中 蛋白 间 的 相互 作用 (Brigggs and Capaldi，1977)。1981 年 ， 出 现 了 第 一 个 用 于 2-DE 胶 分 析 的 软件 包 (An- derson et al .，1981)。 因 此 ， 从 许多 方面 来 讲 ，2-DE 作为 研究 复杂 样品 的 手段 在 20 年 前 就 已 经 是 可 行 的 了 。 如 今 ， 随 着 对 组 织 的 2-DE 电泳 分 离 为 基础 的 蛋白 质 组 概念 的 提 出 ， 这 些 想 法 得 到 了 进一步 的 发 挥 (Anderson and Anderson, 1982). 1.1 蛋白 化 学 家 面临 的 困难 2-DE 的 分 离 技 术 在 80 年 代 还 未 得 到 实现 的 原因 有 以 下 几 方 面 : 首先 ， 数 据 库 中 没 有 足够 的 核酸 和 和 蛋白 序列 信息 ， 因 此 就 无 法 通过 数据 库 中 序列 信息 很 好 地 了 解 各 种 生物 体 的 多 种 物理 和 生理 活动 。 这 是 因为 当时 分 子 生 物 学 技术 还 处 于 幼稚 期 ， 其 后 诞生 了 一 些 新 技术 ， 如 用 手工 操作 测 核酸 序列 的 双 脱 氧 链 终止 法 (Sanger et al., 1977), FA PCR 技术 扩 增 DNA (Saiki et al., 1985) 等 。 而 依赖 于 荧光 染料 化 学 技术 的 全 自动 测 序 仪 (Prober et al., 1987) 于 1992 年 首次 完成 了 对 真 核 生物 染色 体 的 成 功 测序 (Oli- ver et al., 1992). 其 次 ，2-DE 的 潜力 还 未 得 到 充分 发 挥 的 重要 原因 在 于 该 技术 在 蛋白 鉴定 方面 的 应 用 的 有 限 性 。Towbin (Towbin et al., 1979) 建立 的 将 蛋白 转 印 至 尼龙 膜 的 方法 以 及 Burnette (Burnette ，1981) 建立 的 用 抗体 检测 转 印 和 蛋白 的 方法 不 失 为 一 个 灵敏 的 鉴定 方法 。 然 而 ， 这 些 方法 的 不 足 之 处 在 于 只 有 少数 蛋白 具有 相应 的 抗体 ， 此 外 单 抗 或 多 抗 的 制备 是 一 个 漫长 且 费 时 的 工作 。 全 自动 Edman 降解 测序 (Edman and Begg, 1967) 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 :89 外 要 么 直接 测定 新 蛋白 的 序列 ， 要 么 同 数据 库 中 的 基因 序列 相 比较 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 。 然 而 ， 早 期 的 液 相 测序 仪 所 需 的 蛋白 量 是 2-DE 胶 上 纯化 蛋白 的 几 百倍 。 直 到 1987 年 Matsudaira (1987) 将 蛋白 转 印 至 PVDF 膜 的 技术 和 气相 测序 技术 相 结合 ， 使 得 蛋白 分 析 的 灵敏 度 达 到 了 pmol 水 平 。 就 拿 模式 生物 来 讲 ， 蛋 白 鉴定 的 最 有 效 的 方法 仍然 是 将 未 知 蛋白 同 已 知 的 纯 蛋 白 在 2-DE 胶 上 共 分 离 (Philips et al., 1980). 由 于 蛋白 鉴定 的 复杂 性 ， 许 多 科学 家 在 20 世纪 80 年 代 就 将 研究 重点 转移 到 了 研究 在 不 同 条 件 下 蛋白 表达 量 的 改变 ， 建 立 了 大 量 的 共 刺 激 和 共 调 节 的 蛋白 数据 库 ， 如 大 肠 杆菌 (Van Bogelen et al., 1990), 4 REF5S2 细胞 株 (Garrels and Franza，1989) 及 小 鼠 的 胚胎 (Latham et al., 1991) 等 。 同 理 ， 通 过 监测 在 多 种 毒剂 作用 下 小 鼠 肝 蛋白 的 改变 可 进行 毒 理 学 研究 (Anderson et al .，1987)。 在 这 些 实验 中 ， 通 过 不 同 的 处 理 ， 可 观察 到 300 一 1600 个 相关 和 相 匹 配 的 蛋白 ， 更 关键 的 是 这 些 研 究 反 应 了 和 蛋 日 质 组 群 间 的 相互 作用 ， 且 早 于 同类 的 微 阵列 核酸 杂交 技术 才干 年 (Schena et al., 1995; Wodic- ka et al .，1997)。 然 而 ， 共 调节 和 共 抑 制 蛋白 的 科学 价值 的 实现 还 必须 依赖 于 这 些 组 群 中 蛋白 的 鉴定 ， 若 做 不 到 这 一 点 ， 这 些 和 蛋白 也 仅仅 是 胶 上 的 一 些 点 而 已 。 (1.2 蛋白 质 组 学 的 发 展 史 20 世纪 90 年 代 在 不 同 领域 出 现 的 各 种 进展 相互 结合 形成 了 一 门 新 学 科 ， 伴 随 者 IPG 胶 条 的 广 谤 应 用 ，2-DE 技术 才 真正 成 为 了 一 种 微量 制备 技术 (Bijellqvist et al., 1993)， 随 着 模式 生物 和 其 他 生物 体 基因 组 序列 的 完成 ，( 如 支原体 、 大 肠 杆菌 、 酵 母 、 线虫 )， 使 得 基因 和 和 蛋 白 序列 的 数据 库 迅 速 增 加 。 而 质谱 也 从 一 种 专门 的 工具 变 成 了 一 种 每 个 蛋白 化 学 实验 室 的 常规 仪器 。 肽 质 指纹 图 技术 (Henzel et wz .，1993)， 因 其 简化 了 数据 库 中 基因 序列 和 蛋白 序列 的 联系 ， 大 大 提高 了 和 蛋白 鉴定 的 灵敏 度 和 速度 (Kuster and Mann，1998; Yates ，1998 a，1998 b)。 伴 随 着 以 上 技术 的 发 展 ，1995 年 由 Wilkins 提出 的 蛋白 质 组 的 概念 应 运 而 生 (Wilkins et wz .，1995)。 同 分 子 生 物 学 取得 的 进展 相 比 ， 蛋 白质 组 这 一 概念 主要 强调 和 证 实 以 前 未 获得 足够 重视 的 科学 。 新 千年 伊始 ， 蛋 白质 组 学 获得 了 前 所 未 有 的 发 展 。 随 着 果 蝇 基因 组 的 完成 及 2000 年 人 类 基因 组 计划 的 即将 完成 ， 其 他 的 一 些 模式 生物 的 测序 任务 也 即将 开始 ， 如 小 鼠 和 拟 南 芥 。 为 了 充分 利用 这 些 生 物体 的 基因 组 序列 提供 的 价值 ， 就 有 必要 制订 生物 学 的 下 一 个 大 的 目标 ， 即 功能 基因 组 学 或 功能 蛋白 质 组 学 。 功 能 基因 组 学 着 重 依赖 于 高 密度 的 微 阵 列 技术 (Schena et al., 1995; Wodicka et al., 1997), BRRKHRKAEFR SI 量 的 分 析 能 力 ， 且 可 同时 检测 mRNA 的 表达 水 平 。 而 蛋白 质 组 学 则 主要 解决 蛋白 的 表 达 水 平 、 加 工 和 修饰 、 蛋 白 间 的 相互 作用 及 蛋白 的 功能 (Wilkins et al., 1997a). B 前 ， 蛋 白质 组 学 面临 的 挑战 有 以 下 两 点 : 第 一 ， 全 自动 、 高 通 量 的 蛋白 质 组 技术 的 完 成 ; 第 二 ， 建 立 大 量 的 蛋白 数据 库 和 能 够 有 效 分 析 处 理 蛋 白质 组 数据 的 分 析 软 件 。 本 综 述 主要 介绍 以 上 两 点 。 2. 生日 质 组 学 的 目 动 化 一 一 技术 解决 途径 直到 最 近 ， 和 蛋白 的 研究 仍然 停留 在 一 次 解决 一 个 蛋白 的 基础 上 。 研 究 者 的 研究 重点 往往 局 限 在 单个 蛋白 ， 通 常 是 一 个 一 个 地 纯化 蛋白 ， 再 一 个 一 个 地 研究 。 而 蛋白 质 组 学 se - 140 - 蛋白 质 组 学 同 传统 的 研究 方法 有 所 不 同 ， 无 论 是 蛋 折 复合 物 的 鉴定 也 好 (Rigaut et al., 1999), & 是 生物 体 所 表达 的 全 蛋白 也 好 (Fountoulakis et al., 1997, 1998a, 1998b; Langen et al .，1997)， 通 常 是 同时 研究 多 个 蛋白 ， 但 前 提 是 要 满足 蛋白 鉴定 的 速度 、 灵 人 敏 度 和 精 密度 。 这 就 使 得 蛋白 研究 者 可 充分 利用 2-DE 技术 ， 同 时 平行 地 纯化 多 个 蛋白 。 最 近 对 蛋白 质 组 学 影响 最 大 的 当 属 质谱 ， 其 中 ESI 或 MALDI-TOF 结合 四 极 管 、 离子 有 午 或 飞行 时 间 质 量 检测 器 等 ， 使 得 蛋白 的 分 析 变 得 简单 易 行 (Yates，1998b)。 更 重要 的 是 ， 质 谱 技 术 使 2-DE KR ERR NRA HAGE OR Se (Willms et al., 1996)。 但 目前 仍 困 扰 研 究 者 的 问题 是 ， 尽 管 可 通过 平行 的 2-DE 胶 分 离 纯化 成 百 上 千 的 蛋白 ， 但 仍然 无 法 采取 一 种 简单 易 行 的 办 法 来 解决 质谱 鉴定 前 大 量 蛋 白 的 制备 。 况 且 ， 对 于 质谱 来 讲 ， 每 天 分 析 的 样品 是 有 限 的 ， 尤 其 是 ESI 质谱 。 面 临 着 这 些 挑战 ， 蛋白 分 析 的 自动 化 已 经 得 到 了 一 定 发 展 ， 可 分 为 三 组 技术 : 2-DE 胶 技 术 、1-DE MRA 和 不 以 胶 为 基础 的 分 离 技术 。 我 们 将 依次 讨论 这 些 技术 以 及 为 实现 2-DE 分 离 过 程 的 自 动 化 所 做 的 努力 。 2.1 2-DE 胶 的 自动 化 考虑 到 2-DE 仍然 是 蛋 日 分 离 的 首选 方法 ， 故 实现 2-DE 的 自动 化 对 于 高 通 量 蛋 自 质 组 学 是 必需 的 。 在 过 去 的 几 年 内 ， 已 经 实现 了 多 种 形式 的 自动 化 ， 如 小 胶 的 分 离 (50mm X 43mm) 已 完全 自动 化 (Brewer et al., 1986), 但 我 们 认为 这 种 分 离 方 式 还 不 能 满足 蛋白 质 组 分 析 所 需要 的 蛋白 量 。 因 此 人 们 致力 于 实现 大 胶 的 自动 化 〈(Harrington et al., 1993; Nokihara et al., 1992). —##H Large Scale Biology Corporation 花 了 多 年 时 间 建 立 的 名 叫 BioMetreIY 的 平台 有 望 实 现 整个 2-DE 过 程 的 自动 化 。 并 且 ， 连 接 一 相 和 二 相 分 离 的 方法 已 获 专 利 保 护 (Hochstrasser，1989，1998)， 该 方法 可 产生 二 维 一 体 的 具有 自动 化 潜力 的 2-DE 胶 。 尽 管 作出 了 多 种 努力 ， 但 目前 还 不 能 实现 2-DE 的 全 自 动 。 相 反 ， 制 造 商 和 研究 人 员 把 主要 精力 放 在 了 实现 单 步骤 的 自动 化 上 (如 银 染 )， 或 通过 平行 方法 提高 通 量 ， 而 不 是 把 重点 放 在 整个 步骤 的 全 自动 ， 因 此 就 产生 了 用 于 一 相 和 二 相 胶 的 分 离 装 置 ， 可 同时 制备 、 分 离 多 个 一 相 或 二 相 的 胶 ， 从 而 提高 了 分 离 的 重复 TEs 2.2 2-DE 胶 的 全 自动 蛋白 质 组 经 2-DE 分 离 后 ， 可 获得 成 百 上 千 感 兴趣 的 蛋白 点 去 作 质 谱 分析 。 针 对 2-DE 胶 上 蛋白 或 多 肽 进行 的 质谱 分 析 的 自动 化 研究 ， 已 有 多 种 不 同 的 解决 办 法 ， 有 的 已 商业 化 。 用 机 器 人 取 点 进行 MALDI-TOF 鉴定 ”以 前 由 人 工 操作 的 蛋白 鉴定 步骤 ， 现 在 已 实现 了 自动 化 的 流水 线 (图 8.1)。 文 献 中 已 有 报道 采用 机 器 人 装置 从 胶 上 获取 蛋白 点 (Traini et cl .，1998)， 也 有 商品 化 的 产品 供应 (40 Flexys Robotic Workstation from Ge- nomic Solutions) 。 一 般 的 ， 机 器 人 通过 数码 相机 给 胶 照 相 ， 用 剪 头 切 胶 ， 并 将 胶 块 送 入 96 孔 板 ， 紧 接着 液 相 处 理 装置 开始 洗 胶 块 并 加 入 蛋白 内 切 酶 ， 这 也 可 以 通过 改进 的 液 相处 理工 作 站 完成 (Packard Multiprobe 104 in Traini et al., 1998), MI HARI—pLaeA 将 酶 解 后 的 肽 段 送 到 MALDI 样品 板 进行 分 析 或 由 新 的 机 器 人 完成 (如 ProGest robot 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 “141 - from Genomeic Solutions， 已 由 Houthaeve 等 商业 化 ，1997)。ProGest 机 器 人 与 称 为 ProMS 的 第 二 组 机 器 人 联合 ， 主 要 完成 肽 的 脱盐 ， 并 送 至 MALDI 样品 板 。 目 前 的 MALDI 质谱 对 多 个 样品 的 分 析 则 相对 较 容 易 ， 因 为 大 多 数 生产 三 家 已 完成 该 方法 的 自 动 化 。 根 据 仪器 的 不 同 ，MALDI 样品 板 可 放 100 一 384 个 样品 ， 可 以 一 直 不 间断 地 进行 大 量 样品 的 分 析 。 早 期 的 自动 化 MALDLMS 的 分 析 可 参见 Schevchenko 等 (1996). 2-D PAGE, 染色 ,图 像 捕获 机 器 人 将 2-DE 胶 上 的 蛋白 点 切 下 送 入 96 或 384 孔 板 蛋白 的 自动 降解 , 并 将 肽 和 基质 运 到 MS 样品 板 MS 上 的 自动 样品 分 析 质谱 峰 的 自动 获取 , 数据 库 匹 配 ,2-D 数据 库 的 解释 图 8.1 和 蛋白质 组 学 的 自动 化 流水 线 进 程 该 方法 实现 了 手工 操作 和 技术 的 自动 化 以 上 方法 的 优点 在 于 质谱 的 数据 获取 简单 易 行 。 胶 上 和 蛋白 点 的 zx，y 坐标 首先 用 TIF 或 其 他 图 像 格式 记录 下 来 ， 然 后 将 图 像 上 的 点 与 96 孔 板 中 的 特定 位 置 依次 对 应 ， 96 孔 板 的 编号 又 可 作为 MALDI 分 析 时 样品 号 。 我 所 在 的 实验 室 所 采用 的 技术 与 上 面 介 绍 的 相似 ， 作 用 强大 且 可 实现 高 通 量 。 用 两 天 的 时 间 ， 一 台 MALDI-TOF 就 可 完成 300 个 蛋 自 的 制备 和 分 析 鉴 定 ， 这 样 的 高 通 量 是 其 他 的 自动 化 系统 所 无 法 比拟 的 。 用 于 MALDI-MS & @ #8 4) 2-DE 胶 的 网 划 Hoffmann-La Roche 的 科学 家 对 以 上 的 方法 作 了 一 些 改进 (Langen et ww .，1998)。 该 方法 不 是 采用 一 个 一 个 蛋白 点 分 别 切 的 方法 ， 而 是 将 整 块 2-DE 胶 用 网 格 工 具 切 割 成 小 块 ， 如 lmm x lmm 大 小 ， 胶 块 随后 被 自动 送 到 MS 分 析 前 的 96 或 384 孔 板 作 酶 解 ， 该 技术 从 哲学 角度 讲 ， 具 有 完整 性 ， 因为 不 管 胶 块 上 有 无 蛋白 ， 每 一 块 都 得 到 了 酶 解 和 分 析 ， 因 此 即便 是 机 器 人 无 法 检测 或 切 到 的 低 峰 度 点 也 能 进行 质谱 分 析 。 但 不 足 之 处 在 于 ， 通 过 网 格 切割 的 胶 块 往往 会 出 现 多 个 蛋白 出 现在 一 块 腕 上 或 者 一 个 蛋白 出 现在 多 块 腕 上 的 情况 ， 这 就 给 数据 分 析 提 出 了 挑战 ， 需 将 单个 蛋白 点 的 数据 进行 正确 编辑 。 然 而 ， 由 此 引出 了 一 个 有 意思 的 问题 ， 可 将 每 一 丙烯 酰胺 胶 块 上 的 光谱 总 离子 数 (TIC) 绘制 成 2-DE RA Bis, Rit, HA 辩 率 取决 于 切 下 的 丙烯 酰胺 胶 块 的 大 小 。 通过 膜 和 MALDI-MS 进行 2-DE 分 离 有 蛋白 的 鉴定 ”尽管 该 方法 被 证 明 是 切实 可 行 的 ， 但 以 上 两 种 蛋白 鉴定 的 自动 化 方法 对 胶 块 的 处 理 复杂 ， 且 这 些 技术 在 某 种 程度 上 对 所 需 步 又 的 选择 不 够 精练 。 基 于 此 ， 一 些 研究 组 试 着 用 膜 为 基质 来 吸附 并 分 析 和 蛋白 (A 8.2)。 早 期 的 研究 表明 ， 当 蛋白 从 PVDF 膜 上 解吸 下 来 后 ， 可 通过 MALDIMS 测定 所 有 和 蛋白 的 质量 ， 包 括 将 膜 贴 到 样品 孔 ， 加 入 基质 ， 通 过 紫外 或 红外 线 激 光 将 膜 表 面 的 蛋 | |: oe re ase ae rR ays - 142+ 蛋白 质 组 学 白 解吸 下 来 (Eckerskorn et al., 1992; Vestling and Fenselau，1994)。 然 后 将 膜 在 MS 内 进行 高 精度 扫描 ， 如 30 x 30 RA, Wit KRHA HAAN 2-DE 图 谱 (Eckerskron et al:, 1997; Stoeckli et al! .，1999)。 随 着 蛋白 降解 技术 的 发 展 ， 可 使 酶 解 后 的 肽 段 集中 出 现 于 膜 上 (Bienvenut et wz .，1999)， 然 后 对 膜 进 行 扫 描 就 可 获得 2-DE 胶 上 蛋白 点 的 真实 图 谱 ， 并 且 所 获得 的 肽 质量 有 助 于 蛋白 鉴定 (Binz et al., 1999), HH MALDI- MSF AAR, Mite RASCH. — 将 2-DE 胶 转 移 到 惰性 膜 上 | 蛋白 在 膜 上 的 原 位 酶 解 | | 自动 获取 峰 , 数据 库 查 询 , 获得 真实 的 2.DE A 图 8.2 和 蛋白质 组 学 的 自动 化 包括 将 2-DE 胶 转 移 到 膜 上 ， 酶 解 成 肽 段 ，MALDI-TOF 质谱 扫 擅 与 图 8.1 表述 的 手工 操作 步骤 的 简单 自动 化 有 所 不 同 膜 扫 描 技术 的 优点 在 于 可 平行 地 将 膜 上 的 蛋白 进行 原 位 消化 (Binz et al., 1999; Schleuder et al .，1999)， 只 有 在 样品 处 理 时 需 将 膜 放 到 质谱 板 上 ， 此 外 ， 吸 附 到 膜 上 的 蛋白 稳定 时 间 长 ， 膜 容易 保存 。 然 而 ， 目 前 扫描 技术 的 缺点 在 于 : 第 一 ， 速 度 慢 ， 举 个 例子 来 讲 ， 目 前 分 析 一 块 16cmx 16cm 的 2-DE 胶 要 花 36 天 (Binz et wl .，1999)。 第 二 ， 蛋 白 从 膜 上 消化 和 扫描 MALDITOF-MS 技术 所 得 到 的 肽 片段 数 均 低 于 标准 的 消化 方法 和 MALDI-TOF-MS 技术 ， 这 就 限制 了 蛋白 鉴定 的 效率 和 和 蛋白 转移 后 的 修饰 的 鉴 定 。 然 而 ， 可 通过 改进 计算 机 和 质谱 的 软件 和 硬件 ， 提 高 该 方法 的 效率 。 LC-MS 对 2-DE 胶 上 分 离 蛋白 的 自动 化 鉴定 2-DE 胶 上 的 蛋白 经 消化 后 ， 除 了 可 用 MALDLTOF-MS 分 析 外 ， 还 可 以 采用 液 相 色谱 质谱 (LC-MS) 技术 ， 后 者 不 仅 可 检 测 肽 质量 ， 还 可 用 诱导 碰撞 解 离 (CID) 技术 提供 断裂 的 可 能 性 ， 从 而 产生 用 于 蛋白 鉴 定 的 肽 序列 标签 (Mann and Wilm，1994)， 而 肽 段 只 有 经 过 有 效 的 断裂 才 可 产生 肽 序 列 (Qin et al., 1998). 一 旦 样品 送 入 LC-MS， 就 能 有 效 地 产生 并 分 析 数 据 ， 已 有 多 篇 报道 涉及 到 2-DE 胶 上 和 蛋白 的 LC-MS 分 析 (Gygi et wl .，1999)。 然 而 ， 该 方法 的 通 量 比 MALDI-TOF-MS 至 少 低 一 个 数量 级 ， 每 天 只 能 分 析 20 个 样品 (Link et wy .，1997)。 这 是 因为 该 技术 需 要 与 毛细 管 电 散射 或 称 之 为 纳 流散 射 的 仪器 相 结合 以 提高 分 析 的 灵敏 度 和 样品 的 数据 量 (Wilm and Mann，1996)， 毛 细 管 和 纳 流散 射 装 置 易 引起 堵塞 ， 并 且 难 以 实现 自动 化 。 然而 ， 位 于 9%6 孔 板 和 LC 系统 间 的 自动 加 样 器 接口 已 商业 化 ， 可 显著 提高 样品 通 量 。 更 令 人 兴奋 的 是 ， 研 究 者 已 研制 出 了 用 微 纤 维 装 置 生产 出 的 与 离子 捕获 或 四 极 质谱 相连 接 的 电 渗 泵 (Figeys et al .，1997，1998)， 这 有 助 于 实现 从 胶 到 LC-MS 的 自动 化 ， 但 目前 还 不 清楚 该 系统 究竟 有 多 大 潜能 。 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 - 143 - 2.3 2-DE 自动 化 对 蛋白 质 组 学 的 关注 ， 使 得 研究 者 开始 寻找 单 细胞 或 组 织 蛋 白质 组 的 最 佳 分离 鉴 定 方法 。2-DE 是 目前 蛋白 分 离 技术 中 分 辩 率 最 高 的 ， 无 论 采 用 大 尺寸 的 胶 还 是 采用 守 的 IPG 胶 条 多 次 分 离 ， 目 前 可 分 离 接近 10 000 个 蛋白 〈Klose，1999)， 样 品 的 分 步 提 取 技 术 把 朴 水 性 作为 分 析 的 第 三 相 (Herbert, 1999; Klose，1999)， 该 技术 对 蛋白 的 鉴定 可 增加 20% 。 除 了 这 些 特点 ，2-DE 胶 作为 一 种 平行 的 分 离 技术 ， 有 其 局 限 性 ， 最 值得 注 意 的 是 对 低 丰 度 蛋 白 ， 极 玻 水 的 蛋白 和 极 碱 性 和 蛋白 的 无 能 为 力 (Wilkins et al., 1996, 1998a)。 即 便 是 数据 结果 显示 具有 高 重复 性 ， 许 多 实验 者 仍旧 关注 实验 室内 和 实验 室 间 分 离 的 重复 性 (Corbett et al., 1994; Lopez and Patton，1997)。 这 些 问 题 已 经 激 起 对 2-DE 胶 替 代 分 离 技术 的 研究 ， 这 些 技 术 可 分 为 两 大 类 : 1-DE 胶 ; 以 非 胶 为 基础 的 分 离 技术 。 与 1-DE 胶 联 用 的 自动 化 技术 MALDILTOF-MS 用 于 等 电 聚 焦 胶 表 面 的 直接 扫描 可 产生 真实 的 2-DE 图 谱 (Ogorzalek Loo et al., 1997; Loo et al., 1999). 1-DE 的 一 相 分 离 通 过 计算 蛋白 的 等 电 点 在 IPG 胶 条 上 的 位 置 而 得 以 实现 ， 以 分 子 质 量 为 基础 的 二 相 分 离 则 由 MS 完成 ， 从 而 取代 了 SDS-PAGE 分 离 。 该 技术 的 优点 在 于 IPG 胶 条 是 以 平衡 为 基础 进行 的 分 离 ， 而 MS 显然 比 非 平 衡 的 SDS-PAGE 二 相 分 离 更 准确 。 一 且 数据 的 获取 和 分 析 实 现 了 自动 化 ，1-DE 就 可 产生 大 量 和 蛋白 高 准确 度 的 分 子 质 量 数据 和 真实 的 2-DE 图 谱 。 从 技术 上 讲 ，1-DE 首先 在 IPG 胶 条 上 用 标准 的 等 电 聚 焦 技 术 分 离 重 白 ， 然 后 进行 洗涤 、 在 白 芥 子 酸 基质 中 浸泡 、 风 干 ， 然 后 将 IPG 胶 条 直接 送 入 MALDI-TOF-MS, i# 择 与 IPG 胶 条 间隔 距离 相近 的 扫描 间距 (如 30wm)， 各 种 蛋白 离子 化 后 ， 在 不 同 的 位 置 检测 到 其 分 子 质量 ， 扫 描 胶 条 产生 的 系列 光谱 可 提供 同 2-DE 相似 的 图 谱 (Ogorzalek Loo et al., 1999). 目前 很 难 比 较 IPG 胶 条 直接 扫描 的 结果 和 2-DE 分 离 的 结果 ， 因 为 2-DE 胶 图 谱 的 结果 来 源 于 整个 IPG 胶 条 ， 但 1-DE 也 有 一 些 缺 陷 。 首 先 ， 只 有 一 些 特定 的 蛋白 才能 在 MALDI-TOF 中 很 好 离子 化 ， 一 些 高 分 子 质量 的 蛋白 则 很 难 离子 化 ， 这 就 影响 了 和 蛋白 的 定量 。 其 次 ， 无 法 判定 直接 MALDI-TOF 的 分 辨 能 力 是 否 能 与 SDS-PAGE 胶 比 美 。 最 后 ， 由 于 扫描 技术 可 产生 高 准确 度 的 2-DE 图 谱 ， 但 无 法 通过 肽 质 指 纹 图 鉴定 感 兴趣 的 蛋白 ， 只 能 将 蛋白 从 IPG 胶 上 切 下 来 后 ， 用 省 化 所 消化 成 肽 段 (Loo et al., 1999), (A 蛋白 混合 物 可 出 现在 IPG 胶 条 的 任何 位 置 。 此 外 ， 可 通过 小 型 生物 的 基因 组 信息 及 IPG 扫描 技术 的 参数 准确 鉴定 蛋白 的 分 子 质 量 和 等 电 点 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 (Cavalconi et al., 1997; Wilkins et al., 1998b). 不 以 胶 为 基础 的 蛋白 质 组 分 离 的 自动 化 ”目前 出 现 的 一 些 新 的 可 取代 以 胶 为 基础 的 分 离 技术 指 的 是 一 相 或 二 相 色谱 结合 紫外 和 (或 ) 电 散 射 质谱 。 一 些 研究 者 结合 自动 化 的 大 小 排 阻 色谱 和 反 向 色谱 ， 根 据 一 相 的 蛋白 大 小 和 二 相 的 蛋白 疏 水 性 分 离 蛋 白 而 获得 紫外 色谱 图 (Opiteck et al .，1998)， 从 而 分 离 蛋 白 ， 甚 至 是 全 和 蛋白质 组 (Opiteck et al., 1998; Isobe et ol .，1991)。 该 技术 分 离 过 程 根 据 操作 条 件 不 同 需 6 一 17h。 用 该 方 法 的 目的 就 是 为 了 获得 蛋白 质 组 成 分 ， 在 大 肠 杆 菌 的 细胞 裂解 液 可 分 离 出 250 种 蛋白 组 ee - 144 - A RA 分 ， 比 银 染 的 2-DE 分 辨 率 低 一 个 数量 级 (Tonella et al., 1998). (RIAD, BERT 第 三 相 的 分 离 才能 满足 蛋白 质 组 分 析 的 目的 。 一 些 研究 者 以 样品 中 蛋白 的 肽 为 分 析 目 的 ， 丰 富 了 以 蛋白 为 分 析 目 的 2-D 色谱 的 应 用 (图 8.3)。 该 技术 利用 三 级 、 离 子 肝 或 四 级 飞行 时 间 质 谱 使 肽 裂解 ， 然 后 将 所 获 信 息 同 序列 数据 库 比 较 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 (Yates，1998b)。 此 方法 可 鉴定 相对 简单 的 样 品 ， 如 蛋白 复合 物 (Link et al., 1999) 或 全 和 蛋白质 组 (S. D. Patterson, KKH) 中 的 蛋白 成 分 。 该 方法 首先 用 胰 和 蛋白 酶 等 消化 样品 中 的 所 有 和 蛋白， 然后 将 肽 上 样 到 反 向 色 谱 柱 中 进行 分 离 ， 最 后 将 肽 雁 片 直接 收集 到 电 散 射 质谱 中 。 质 谱 能 够 从 肽 混合 物 中 选择 感 兴趣 的 离子 ， 将 其 自动 打 断 ， 产 生 序列 标签 或 完整 序列 ， 如 此 反复 将 其 他 离子 打 断 。 一 次 液 相 色谱 运行 即 可 断裂 数 以 百 计 的 肽 ， 然 后 自动 地 用 SEQUEST 等 软件 将 数 以 百 计 的 肽 同 序列 相 联系 (Yates et al .，1995)。 目 前 ， 在 这 一 领域 作 得 比较 出 色 的 当 属 Amgen Inc 对 人 尿 的 分 析 (S. D. Patterson， 未 发 表 )， 一 次 实验 可 鉴定 约 100 个 蛋 自 的 肽 。 该 技术 的 优点 在 于 其 高 通 量 和 内 在 的 抑 余 使 得 可 观察 每 个 蛋白 的 多 个 肽 段 ， 但 该 技术 产生 了 大 量 的 数据 ， 这 就 给 实验 结果 的 数据 分 析 带 来 了 肪 烦 。 而 且 ， 由 于 该 技术 是 建立 在 对 肽 而 非 蛋 日 的 基础 上 ， 就 使 得 该 技术 无 法 鉴别 结构 相近 的 异 构 体 ， 也 无 法 对 一 个 单一 的 蛋 日 进行 进行 详细 鉴定 。 用 胰 酶 消化 组 织 或 样品 , 获得 肽 | 1-D 或 2-D 色 谱 分 离 肽 | | 数据 库 查 询 鉴定 肽 或 蛋白 8.3 自动 化 蛋白 质 组 的 分 析 将 全 部 样品 消化 成 且 ， 然 后 通过 HPLC 分 离 样品 中 的 所 有 肽 ， 最 后 用 MS 或 MS-MS 分 析 。 然而 ， 该 技术 提供 的 样品 信息 不 如 2-D 胶 技术 。 3. 和 蛋 昌 质 组 学 的 信息 解决 途径 蛋白 质 组 学 从 许多 方面 来 讲 都 是 一 门 信息 科学 。 就 蛋白 自身 而 言 ， 蛋 白质 组 学 涉及 到 序列 信息 、 加 工 和 修饰 的 信息 、 表 达 信 息 、 功 能 信息 、 结 构 信 息 及 蛋白 如 何 同 其 他 蛋 白 形成 小 的 或 大 的 蛋白 复合 物 的 信息 。 重 要 的 是 ， 蛋 白质 组 学 考虑 到 了 时 间 和 环境 的 影 响 ， 因 此 可 以 在 不 同 的 发 育 时 间 点 和 不 同 的 环境 条 件 下 观察 以 上 的 蛋白 参数 。 从 更 广泛 的 角度 讲 ， 有 关 样 品 的 记录 和 结果 的 分 类 是 蛋白 质 组 研究 的 另 一 重要 内 容 。 高 通 量 的 得 选 需要 实验 室 信息 管理 系统 (LIMS) 来 记录 样品 的 分 析 进 程 及 其 分 析 结 果 ， 然 后 将 相 关 的 结果 建立 成 有 效 的 数据 库 以 便于 将 来 的 查询 。 和 蛋白 质 组 工具 在 蛋白 质 组 大 量 数据 的 分 析 中 发 挥 重 要 作用 ， 有 助 于 蛋白 的 鉴定 。 我 们 都 知道 ， 即 便 是 酵母 这 样 小 的 生物 也 能 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 - 145 。 合成 6000 多 种 蛋白 ， 那 么 更 复杂 的 生物 可 能 有 200 种 不 同 的 组 织 型 ， 每 一 种 合成 10 000 种 蛋白 。 因 此 ， 从 这 方面 来 讲 ， 蛋 白质 组 学 面临 的 任务 是 艰巨 的 。 故 我 们 在 本 综 述 后 续 部 分 写 了 有 关 蛋 白质 组 信息 资源 的 种 类 ， 分 为 蛋白 质 组 数据 库 和 蛋白质 组 工具 ， 我 们 将 介绍 一 些 在 目前 对 研究 者 有 用 的 知识 ， 其 他 的 以 后 陆续 讨论 。 3.1 蛋白 质 组 数据 库 从 某 种 程度 上 来 讲 ， 基 因 组 比较 好 定义 ， 指 的 是 全 部 基因 的 碱 基 序列 。 根 据 基 因 组 序列 就 可 以 推导 出 可 读 框 、 外 显 子 、 内 含 子 、 启 动 子 、 增 强 子 和 染色 体 的 结构 区 域 (如 中 心 粒 和 端 粒 )。 相 反 ， 由 于 涉及 到 的 数据 类 型 不 同和 生物 系统 的 蛋 白 的 动态 变化 ， 就 使 得 很 难 给 蛋白 质 组 下 一 个 定义 。 完 整 蛋 白质 组 资源 可 来 源 于 数据 库 中 核酸 序列 编码 的 蛋白 序列 。 因 此 ， 目 前 没有 一 个 数据 库 能 包含 蛋白 质 组 学 的 各 个 领域 ， 但 出 现 了 和 蛋白质 组 学 相关 领域 的 各 种 数据 库 。 目前 在 蛋白 质 组 学 领域 用 得 最 广泛 的 数据 库 当 属 SWISS-PROT (Bairoch and Ap- weiler, 2000; http://www.expasy.ch/)， 这 是 一 个 由 日 内 瓦 的 瑞士 生物 信息 学 研究 所 、 瑞典 和 欧洲 生物 信息 学 研究 所 建立 的 蛋白 注释 性 的 数据 库 。 该 数据 库 除 了 含 蛋白 序列 信 息 外 ， 还 包含 了 大 量 的 注释 (图 8.4)， 如 蛋白 表达 、 功 能 、 结 构 域 、 突 变 体 、 蛋 日 加 SWISSPROT PGO0D1 - Netscape | INIT_MET MOD_RES o> i ACETYLATION. _ BINDING Re HEME (COVALENT) . BINDING 和 HEME (COVALENT) . | METAL é 18 IRON (HEME AXIAL LIGAND). METAL 8G BE (HEME AXIAL LIGAND). VARIANT és ES M -> L (IN 10% OF HUMAN). /ETIdG=VAR_002204. none -nahgmemesscee sc e in informatic on Lech tos AA Molecular ae 11617 Re- CRceh D47CORSISDFICSC2 Ties Sa sc on fa sequenc seat a 20 30 40 50 60 ir i ii | | | | | | | GDVEKGKKIF IMKCSQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGYSYTA ANKNKGIIWG 70 80 90 100 i {-- | | -EDTLMEYLEN PKKYIPGTKM IFVGIKKKEE RADLIAYLKK ATNE ; oh gpg m FASTA format J (Se eS SS 图 8.4 人 细胞 色素 C (注册 号 P00001) 的 部 分 SWISSPROT 入 口 ， 显 示 了 特征 表 和 蛋白 序列 注意 ， 该 蛋白 的 特征 表 提 供 了 蛋白 的 翻译 后 修饰 、 金 属 结合 位 点 和 一 个 已 知 的 突变 体 。 在 较 早 的 入 口中 显示 了 和 蛋白 的 功能 信息 。 eS ee ye 蛋白 质 组 学 工 和 转移 后 的 修饰 等 信息 。 该 数据 库 同 其 他 数据 库 ， 如 Medline、GeneBank、PDB 结构 数据 库 及 其 他 专业 性 的 数据 库 ， 如 图 谱 数 据 库 、 代 谢 或 生物 体 特异 的 数据 库 间 可 超级 链 接 。 由 于 该 数据 库 有 大 约 84 000 个 入 口 ， 同 GeneBank 这 样 的 序列 储藏 所 相 比 ， 就 显得 太 小 了 ， 但 由 于 其 信息 的 高 质量 ， 就 使 之 成 为 了 蛋白 数据 库 的 金 标准 。 但 目前 SWISS-PROT 面临 着 挑战 ， 即 基因 组 测序 和 发 表 的 速度 制约 了 SWISS- PROT 无 法 即时 收录 所 有 生物 所 发 表 的 相关 信息 ， 更 不 要 说 SWISS-PROT 内 成 千 上 万 的 物种 包含 的 一 些 信 息 。 因 此 ，Proteome Inc. 公司 采取 了 一 个 补救 措施 以 弥补 SWISS- PROT 的 不 足 ， 即 重点 关注 一 些 模式 生物 或 有 商业 价值 的 生物 。Proteome Inc. 公司 建 立 的 酵母 蛋白 质 组 数据 库 (YPD); (http://www.proteome.com/) 是 目前 最 完善 的 酿 酒 酵母 的 数据 库 ， 蛋 白 质 组 内 的 所 有 蛋白 均 可 通过 SWISS-PROT 的 格式 进行 解释 。 此 外 ， 还 可 提供 其 他 信息 ， 如 密码 子 偏 傈 、 染 色 体 定位 、 基 因 结 构 。 该 数据 库 还 提供 了 有 关 酵 母 知 识 的 广泛 的 综述 和 参考 文献 及 有 关 的 蛋白 功能 和 验证 实验 的 详尽 信息 ， 转 录 图 谱 ， 表 达 图 谱 的 搜寻 和 分 析 及 每 个 蛋白 的 序列 相似 性 报告 。Proteome Inc 还 建立 了 一 些 与 酵母 相似 的 数据 库 ， 如 白色 念珠 菌 生物 ， 秀 丽 线虫 ， 并 获得 了 资助 以 进一步 研究 建立 AR AMAT HEH, HH RRA RRA EWR, TEN RB RAR RSH RE 库 。 从 大 众 化 的 角度 讲 ， 一 些 生物 特异 性 的 数据 库 资 源 的 完整 性 和 实用 性 通常 反应 了 一 个 生物 研究 团体 的 组 织 有 效 性 。 一 些 比较 好 的 大 众 化 的 生物 数据 库 包括 FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu) 及 Arabidopsis thaliana 数据 库 AAtDB (http:// genome-www.stanford.edu/ Arabidopsis/ ) 。 一 种 不 同类 型 的 蛋白 质 组 数据 库 就 是 2-DE 蛋白 表达 数据 库 (图 8.5)， 此 类 数据 库 以 生物 、 细 胞 或 组 织 的 2-DE 胶 分 离 为 基础 ， 数 据 库 中 包含 了 2-DE RAB, HRA 究 样品 及 胶 上 鉴定 的 蛋白 的 信息 。 大 多 数 2-DE 蛋白 表达 数据 库 的 网 址 如 下 : http: // www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html.MS， 此 类 网 址 的 出 现 使 得 2-DE REKBEAR | 的 鉴定 成 为 可 能 ， 多 数 2-DE 数据 库 包 含 了 数 百 个 鉴定 的 蛋白 。 某 些 数 据 库 ， 如 | SWISS-2DPAGE 数据 库 ， 涉 及 到 2-DE 胶 上 每 个 鉴定 的 蛋白 点 的 大 量 文本 信息 ， 包 括 蛋 白 的 分 子 质 量 、 等 电 点 、 鉴 定 方法 、 蛋 白 在 其 他 组 织 表 达 的 资料 及 病理 信息 。 最 近 ， 2-DE 和 蛋白 表达 数据 库 已 经 开始 反应 出 一 个 样品 采用 多 块 胶 分 离 的 必要 性 ， 一 些 数 据 库 现在 开始 对 样品 采取 不 同 的 分 离 方 法 ， 如 窄 等 电 点 范围 分 析 。 但 目前 2-DE 胶 数据 库 面 临 的 主要 挑战 在 于 其 可 靠 性 ， 体 现在 2-DE 分 离 水 平和 数据 处 理 方法 两 方面 。 由 于 近 几 | 年 在 2-DE 样品 制备 和 电泳 条 件 的 标准 化 方面 做 出 了 诸多 努力 ， 且 对 蛋白 质 组 学 兴趣 的 增长 使 得 人 们 采取 了 前 所 未 有 的 多 种 多 样 的 技术 用 于 制备 2-DE 参考 图 谱 。 这 些 技术 在 实验 室内 具有 高 重复 性 ， 但 在 其 他 实验 室 的 重复 性 值得 商检 。 由 于 应 用 于 2-DE 数据 库 的 图 谱 、 文 本 和 超级 连接 的 贮存 和 描述 方法 有 一 定 的 一 致 性 (Appel et al., 1996), BE 具备 了 一 定 的 实用 性 。 但 只 要 数据 库 中 2-DE 胶 采 用 不 同 的 分 离 方 法 ， 就 无 法 进行 实验 室 间 的 比较 ，2-DE 数据 库 资 源 的 应 用 就 会 受到 限制 。 然 而 ， 值 得 注意 的 是 广泛 应 用 于 鉴定 2-DE 分 离 蛋白 的 肽 质谱 信息 提供 了 不 依赖 于 实验 室 的 蛋白 质 参数 ， 并 且 这 些 信息 对 建立 数据 库 非 常 有 用 。 对 蛋白 质 组 来 说 ， 它 还 有 许多 其 他 重要 的 数据 库 。 由 于 数据 库 日 新 月 异 ， 在 此 不 可 能 全 部 作 评价 。 然 而 理论 上 它们 可 包括 在 下 面 几 个 方面 的 数据 库 内 : 核酸 序列 ， 蛋 白 序 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 "147 Sub2D i Bacillus subtilis strain 168 10 min after imposition to 4 % ethanol stress 图 中 的 交叉 点 代表 可 点 击 链接 至 特定 蛋白 质 的 详细 说 明 页 面 ， 如 蛋白 质 序列 、 表 达 水 平等 。 大 多 数 2-D 胶 数 据 库 都 使 用 类 似 的 点 击 链接 系统 。 列 ， 和 蛋白 图 谱 、 表 达 谱 和 结构 域 ， 蛋 白 翻 译 后 修饰 ， 蛋 白质 的 三 维 结构 ， 蛋 白质 代谢 数 据 库 。 由 Amos Bairoch 管理 的 网 站 毫 无 争议 地 是 最 好 的 蛋白 质数 据 库 网 站 ， 它 对 蛋白 质数 据 库 进行 分 门 别 类 ， 其 目录 下 有 1000 多 个 相关 网 站 ， 网 址 为 http:， // - 148 - = A RAS www. expasy.ch/alinks. html. 3.2 蛋白 质 组 学 工具 随 着 许多 相关 的 蛋白 质 组 数据 库 的 建立 ， 近 年 来 出 现 了 许多 和 蛋白质 组 辅助 分 析 的 信 息 化 工具 。 这 些 工具 解释 和 注释 了 2-DE 电泳 图 谱 ， 并 且 可 以 对 从 MS-MS 质谱 中 产生 的 多 肽 从 头 测 序 。 我 们 将 简短 讨论 一 下 这 些 工 具 并 且 评 价 它们 对 高 通 量 蛋 白质 组 筛选 的 应 用 。 2-DE 胶 成 像 分 析 软 件 “1981 年 起 ， 已 经 有 辅助 分 析 胶 图 像 的 软件 。 这 些 软件 需要 执行 大 量 的 核心 任务 ， 包 括 消减 背景 ， 对 点 进行 检测 和 定量 ， 比 对 胶 与 胶 之 间 的 图 像 ， 通过 图 像 和 统计 来 进行 胶 与 胶 的 匹配 ， 通 过 一 个 或 更 多 的 胶 重 合 产 生 一 个 系统 精细 的 图 像 ， 构 建 能 够 存 取 蛋 日 质点 的 数据 库 ， 许 多 的 2-DE 图 像 分 析 软 件 包 开始 是 由 学 术 研 究 机 构 开 发 的 〈 例 如 ELSIE, TYCHO, MELANIE 和 QUEST)， 其 中 大 多 数 软件 包 现在 性 能 大 大 提高 了 ， 并 且 已 商品 化 ， 运 用 于 PC 平台 上 (例如 KEPLAR，MELANIE I ff PDQUEST)。 同 时 ， 基 于 internet 网 和 内 联网 的 分 析 软 件 也 得 到 进一步 发 展 (Lemkin et al .，1999)。 然 而 ， 值 得 注意 的 是 尽管 商业 化 软件 包 已 升级 ， 但 自动 化 的 胶 分 析 软 件 还 不 能 令 人 满意 ，2-DE 胶 的 复杂 性 意味 着 精确 的 图 像 分 析 耗 时 、 耗 力 ， 但 是 如 果 首 先 把 精力 放 在 胶 的 制备 、 样 品 的 准备 、 电 泳 分 离 和 染色 上 ， 可 以 节省 许多 分 析 时 间 。 如 需 要 详细 地 解释 计算 机 分 析 图 像 问题 可 以 参看 Appel 和 Hochstrasser 的 文献 (1999 )。 蛋白 鉴定 分 析 软 件 ”由 分 析 产 生 的 大 量 蛋白 参数 可 用 于 鉴定 蛋白 质 。 这 些 包 括 蛋 白 质量 大 小 、 等 电 点 、 蛋 白质 序列 标签 、 肽 质 指 纹 图 、 肽 序列 标签 和 和 蛋白质 氨基 酸 组 成 。 通常 在 网 上 可 获得 单 参 数 和 多 参数 相 结合 的 软件 ， 但 是 在 某 些 情况 下 ， 可 作为 独立 的 软 {FEE 〈 例 如 Micromass 公司 的 ProteinLynx 质谱 分 析 软 件 包 )。 随 着 质谱 在 蛋白 质 组 的 广泛 应 用 ， 大 量 的 软件 包 服 务 于 此 种 类 型 的 研究 。 它 们 通常 包括 下 列 软 件 : 通过 肽 质 指纹 图 和 不 同 的 种 属 、 蛋 日 质 分 子 质量 大 小 、 等 电 点 来 鉴定 蛋 白质 ; 通过 MS/MS 来 鉴定 蛋白 质 (MS 来 源 于 CID 或 MALDI-TOF PSD 技术 ); 预测 通过 内 源 性 蛋 白 酶 消化 肽 片段 或 MS/MS 的 肽 片段 大 小 的 工具 ; 从 头 预 测 来 自 MS/MS 数据 的 肽 序列 的 工具 。 下 列 工 具 包 就 是 这 些 软件 的 典范 ; Protein Prospector (http:// prospector. ucsf.edu ); PROWL (http://prowl.reckefeller.edu ); MASCOT ( http:// www. matrixscience. com) ;来 自 华 盛 顿 大 学 的 SEQUEST (Yates et al., 1995) 和 在 Ex- PASy 服务 器 上 的 蛋白 质 组 工具 (http://www.expasy.ch/tools/ # proteome) ; (Wilkins et al.，1999a)。 所 有 这 些 软件 在 鉴定 一 个 蛋白 质 时 是 有 效 的 ， 但 是 怎样 应 用 于 鉴定 大 量 的 样本 ， 作 到 存在 一 定 仍 困难 。 看 起 来 更 复杂 的 是 ， 如 何 自动 挑 取 质 谱 峰 送 到 蛋白 质 鉴 定 处 ， 将 结果 存 到 其 他 数据 库 如 二 维 电泳 图 数据 库 。 一 些 研究 小 组 已 部 分 或 全 部 解决 此 问题 (如 Berndt et al., 1999; Gras et al., 1999; Link et al., 1999; Traini et al., 1998)。 很 明显 。 随 着 硬件 的 发 展 ， 这 些 软件 的 出 现 意 味 着 蛋白 质 鉴 定 的 自动 化 几乎 完 成 。 蛋白 特征 化 软件 ”尽管 蛋白 质 鉴定 越 来 越 自 动 化， 但 检测 蛋白 同 工 聚 体 、 和 蛋白 加 工 过 程 、 翻 译 后 修饰 仍 存在 很 多 难题 。 然 而 研究 者 开始 认识 到 ，2-DE 胶 的 分 辨 率 和 质谱 的 准确 度 与 解析 度 可 应 用 于 蛋白 质 性 质 分 析 和 鉴定 。SWISS-PROT 提供 的 蛋白 质 处 理 第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 ”149 - 和 修饰 数据 库 也 可 用 来 分 析 蛋 白质 的 性 质 。PeptideMass 软件 〈 预 测 内 源 性 蛋白 酶 消化 的 肽 质谱 大 小 的 工具 ) 涉及 到 来 自 SWISS-PROT 的 蛋白 质 加工 和 修饰 的 信息 ， 给 出 氢 基 酸 修饰 位 置 和 修饰 后 肽 的 合适 分 子 质量 (Wilkins et al., 1997b). PeptIdent 工具 (http://www.expasy.ch/tools/peptides.html);(Wilkins et wd .， 未 发 表 ) 是 一 个 肽 质 指 纹 鉴定 引擎 ， 它 能 使 使 用 者 输入 肽 序列 ， 在 SWISS-PROT 的 修饰 肽 库 和 未 修饰 的 肽 库 中 搜寻 ， 从 而 鉴定 出 蛋白 的 可 能 修饰 的 肽 段 。 其 他 肽 质 指 纹 引 擎 也 有 相似 的 功能 但 只 搜 寻 质 量 大 小 而 没有 考虑 到 现在 库 中 存在 的 蛋 白 质 修 饰 。 一 个 在 肽 质谱 数据 库 中 预测 新 的 翻译 后 修饰 的 工具 已 被 报道 (Wilkins et w .，1999b)， 使 用 者 指明 蛋白 序列 和 它 的 质谱 数据 ， 这 个 程序 能 搜寻 对 应 于 某 一 特定 修饰 的 不 同 大 小 的 蛋白 质 。 那 么 就 可 以 运用 一 系 列 规则 去 预测 潜在 的 修饰 肽 序列 中 哪 一 个 氨基 酸 可 能 被 修饰 。 现 有 多 于 20 种 预测 修饰 的 规则 ， 一 些 规则 非常 简单 ， 而 另 一 些 却 是 复杂 的 序列 。GlycoMod 是 ExPASy 服务 器 上 很 好 的 蛋白 质 性 质 分 析 工 具 (N. Packer ， 私 人 通信 )， 它 能 预测 蛋白 质 糖 基 化 位 点 。 由 于 它 与 糖 蛋白 结构 数据 库 相 连 ， 提 供 了 一 种 研究 糖 蛋 日 的 有 力 工 具 。 3.3 生物 信息 学 展望 上述 章 节 对 蛋白 质 组 生物 信息 资源 作 了 概括 ， 显 然 ， 这 些 资源 在 短 时 间 内 的 发 展 令 人 惊奇 ， 然 而 ， 研 究 者 们 面 对 的 主要 挑战 是 在 重 日 质 组 中 需要 的 数据 库 和 工具 如 何 能 被 有 机 结合 ， 并 且 重 要 的 是 在 某 一 方面 允许 我 们 提出 相关 的 生物 学 问题 。 例 如 ， 就 像 疾病 状态 经 常 是 困难 所 在 ， 我 们 需要 追踪 表达 水 平 ， 以 及 在 同一 时 间 内 修饰 和 拥有 大 量 蛋 自 。 这 些 可 能 在 一 个 有 机 体 的 一 种 组 织 里 〈 如 肝脏 )， 也 可 能 存在 于 一 种 以 上 的 组 织 (如 肝 和 肾 )。 并 且 ， 我 们 需要 筛选 成 千 上 万 种 微生物 ， 检 查 与 病原 有 关 的 和 蛋白。 这些 需 要 基于 mRNA 必 片 的 研究 看 是 否 表达 了 新 蛋白 ， 或 者 已 经 表达 的 蛋 日 是 否 经 过 不 同 的 修饰 或 加 工 。 另 一 个 主要 的 挑战 是 大 量 的 蛋白 质 组 数据 如 何 能 被 最 好 地 显现 。 显 然 ， 一 万 或 者 200 种 不 同人 类 组 织 的 蛋白 不 能 在 一 张 2-DE 电泳 上 展示 。 代 替 的 是 需要 多 维 可 视 化 软件 ， 对 有 序 及 有 颜色 的 排列 是 必需 的 ， 就 像 Weinstein 等 在 一 个 人 类 细胞 库 中 规 模 化 筛选 大 量 复合 物 所 显示 的 那样 〈1997)， 提 高 数据 库 和 软件 的 标准 化 是 获得 以 上 结 果 的 必要 条 件 ， 也 是 研究 功能 基因 组 的 必要 条 件 ， 有 人 提倡 大 规模 RNA 的 分 析 可 能 是 解决 重 白 质 组 中 的 基本 问题 。 4. 结语 上 述 总 结 包括 了 和 蛋白质 组 的 许多 方面 ， 但 实际 上 只 涉及 到 自动 化 领域 及 蛋白 质 组 信 息 学 ， 守 无 疑问 ， 它 的 重点 在 于 技术 领域 。 然 而 ， 我 们 必须 时 刻 记 住 任何 一 种 软件 仅仅 应 用 于 某 一 研究 领域 才能 产生 预想 的 效果 。 乌 枪 克隆 法 证 实 ， 没 有 哪 一 种 软件 是 绝对 正 确 的 ， 而 许多 技术 的 结合 才能 产生 生物 学 突破 性 的 结果 ， 蛋 白质 组 现在 正 处 于 研究 的 中 心地 位 ， 但 我 们 必须 问 这 样 的 问题 ， 蛋 白质 组 技术 能 够 产生 这 样 的 效果 吗 ? 对 于 这 个 问 题 ， 我 们 不 得 不 等 待 。 ( 薪 代 凤 译 贺 福 初 校 ) "ng gga cc ec-A - 150 - 蛋白 质 组 学 参考 文献 Anderson, N.G. and Anderson, L. 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Lopez le She 蛋白 质 组 分 析 (Wasinger et wy/ .，1995) 是 一 个 正在 迅速 发 展 的 领域 ， 已 经 成 为 致力 于 药物 开发 的 制药 公司 和 生物 技术 公司 关注 的 焦点 (Blackstock and Weir，1999; Lopez 1998，1999a)， 与 蛋白 质 组 学 相关 的 出 版 物 数量 以 指数 级 数 增长 (图 9.1)， 可 以 反映 出 其 受 关注 的 程度 。 最 近 的 研究 表明 ， 细 胞 中 实际 蛋白 质 水 平 与 转录 水 平 之 间 缺 乏 相关 人 性 (Anderson and Anderson, 1998; Gygi et al .，1999)， 这 一 结论 刺激 了 大 部 分 蛋白 质 组 领 域内 的 研究 兴趣 。 这 些 研究 使 人 们 清楚 了 ， 对 细胞 中 蛋白 质 的 分 析 是 对 其 基因 组 分 析 的 补充 ， 如 果 不 结合 蛋 白质 组 学 平台 ， 药 物 开 发 计划 就 不 会 成 功 。 许 多 疾病 都 与 蛋白 质 的 翻译 后 修饰 (如 糖 基 化 ) 机 能 障碍 有 关 ， 这 是 促使 人 们 监测 蛋白 质谱 的 另 一 个 原因 ， 这 些 生物 学 上 的 错误 发 生 在 代谢 水 平 上 ， 在 基因 组 水 平 上 找 不 到 线索 。 400 350 300 250 200 150 100 50 在 题目 或 摘要 中 出 现 “ Proteome ”一 词 的 文献 数目 1995 1996 1997 1998 2000 9.1 8 1995 年 以 来 题目 和 摘要 中 出 现 “proteome” 一 词 的 文献 数量 增长 情况 2. 二 维 电泳 结合 质谱 : 蛋 日 质 组 的 典型 范例 ? 全 面 的 蛋白 质 组 分 析 可 以 用 各 种 方法 来 进行 。 但 是 ， 目 前 人 们 更 喜欢 的 手段 包括 了 - 156 . 蛋白 质 组 学 以 下 这 些 技术 的 结合 : = AERE RE HK (2-DE)(O’ Farrel 1975; Patton et al., 1990), 随后 BETIS RAMA, SANA Deen, HAMSARMREDE, XK 解 ， 提 取 肽 片断 用 质谱 测定 肽 质量 指纹 谱 鉴 定 (Henzel, 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Yate et al .，1993)， 或 用 串联 质谱 对 单个 肽 段 测序 (Hunt et al., 1986; Jonsher et al., 1997; Yates et al., 1999) (HAE), 不 幸 的 是 ， 由 于 蛋白 质 固有 的 复杂 性 ， 使 蛋白 质 的 分 析 不 能 像 核酸 那样 易于 高 通 量 分 析 ， 研 究 复杂 蛋白质 混合 物 的 方法 ， 例 如 2-DE， 很 难 或 不 可 能 成 功 地 实现 自动 化 (Lopez et al., 1999a Nakihara et al., 1992; Quardroni and James，1999)。 人 们 曾经 满 怀 热情 地 寻找 蛋 日 质 组 研究 中 双向 电泳 技术 的 蔡 代 技术 ， 但 是 都 没有 获得 成 功 〈Lopez etal., 1999a; Skipp，1999)。 最 主要 的 问题 是 2-DE 凝 胶 分 离 具 有 出 色 的 并 行 〈paral- lel) 特性 ， 用 大 的 2-DE 凝 胶 配 合 灵敏 的 染色 方法 ， 一 块 2-DE 凝 胶 能 很 容易 地 同时 分 #1000 个 ， 多 至 10 000 个 不 同 的 和 蛋白质 (Klose, 1999; Kobalz，1995)。 目 前 发 展 的 技 术 中 没有 别 的 技术 或 技术 的 结合 能 够 在 相同 的 时 间 段 内 用 同样 量 的 起 始 物质 传达 出 如 此 详细 的 内 容 。 除 了 高 分 辨 外 ，2-DE 凝 胶 还 能 够 定量 ， 尽 管 心 片 技术 有 可 能 取代 2-DE 胶 (第 十 章 )， 但 是 仍然 有 许多 问题 有 待 于 解决 ， 如 非 变 性 结合 及 磷酸 化 现象 等 〈Carr， 1999)。 3. Bohs 令 人 惊异 的 是 ， 尽 管 跑 2-DE 胶 是 一 种 劳动 密集 型 的 ， 大 部 分 需 人 工 操作 的 过 程 ， 但 它 却 不 是 典型 的 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 的 瓶颈 (Table 1 in Lopez，2000)。2-DE 胶 的 分 析 仍 然 有 一 定 程度 的 主观 性 ， 需 要 人 参与 编辑 。 对 于 获取 得 到 的 海量 数据 进行 生物 信息 学 处 理 是 耗 时 的 ， 而 且 不 是 很 有 效 。 但 是 ， 蛋 白质 组 分 析 过 程 中 许 步 又 能 够 被 全 部 或 半 自动 化 。 这 样 就 能 显著 地 提高 效率 和 产 率 ， 也 随 之 提高 了 鉴定 出 靶 标 蛋白 的 可 能 性 (Lopez，2000)。 尽 管 某 些 核心 蛋 白 质 组 实验 室 正在 将 自动 化 技术 整合 到 其 中 一 些 分 析 步骤 中 去 ， 就 在 最 近 已 经 有 了 商业 化 的 蛋白 质 组 分 析 系统 。 许 多 公司 正在 积极 发 展 蛋白 质 组 分 析 技 术 平台 和 组 件 ， 用 于 支持 药物 和 靶 标 的 开发 ， 如 BioRad, APB, PE Biosys- tem，GSI，Proteome Systems，Teca 等 其 他 公司 。 蛋白 质 组 学 理想 的 高 通 量 全 系统 方法 应 该 包括 以 下 部 分 : 样品 收集 技术 、 高 分 辩 电 泳装 置 、 自 动 化 凝 胶 染 色 仪 、 半 自动 化 图 像 分 析 软 件 、 机 器 人 模式 的 蛋白 斑点 处 理 过 程 、MALDI- TOF 和 串联 质谱 仪 ， 并 且 具 有 整合 的 生物 信息 学 软件 ， 可 以 链接 到 单个 模块 并 进行 畅通 的 样品 处 理 ， 追 踪 ， 数 据 分 析 和 数据 归档 。 图 9.2 的 例子 说 明了 这 样 一 种 系统 ， 其 部 件 都 是 目前 商业 可 得 的 。 在 理想 状态 下 ， 每 一 个 部 件 都 应 该 与 其 他 部 件 相 合 ， 以 在 开发 路 径 中 实现 有 效 的 数据 和 样品 信息 传递 。 理 论 上 ， 各 个 部 件 都 应 该 能 与 一 个 相关 数据 库 链 接 ， 以 整合 过 程 中 每 一 步 的 追踪 信息 〈 例 如 用 条 形 码 )。 以 这 种 方式 ， 每 一 个 样品 获得 的 所 有 信息 最 终 都 会 链接 到 最 初 胶 上 的 恒 日 斑点 。 在 下 面 的 部 分 将 大 概 描述 一 下 一 些 系 统 部 件 各 自 的 特性 ， 这 些 特性 都 是 为 满足 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 而 设计 的 。 SLE HM: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 57: - 图 9.2 由 目前 商业 化 的 各 部 件 装 配 出 的 完整 的 蛋白 质 组 研究 系统 (a) IPGphore, Hofer DALT SDS-PAGR 凝 胶 电 泳 系 统 ，APB; (b) Investigator Gel Processor, GSI; (c) LAS-1000 ARR AB, Fujimed; (d) Investigator HT 2-D 图 像 分 析 软 件 系统 ，GSI; (e) Protean 2-DSpot Cutter, BioRad; (f) Genesis RSP 酶 切 和 MALDI 3 plas A ABE, Tecan; (g) Axima-CFR MALDI-TOF 质谱 仪 ，Kratos。 4. ABBE RCE Uk AY we 4.1 二 维 凝 胶 2-DE 凝 胶 电泳 的 质量 直接 影响 到 任何 蛋白质 组 计划 的 结果 。 完 美的 二 维 电泳 系统 将 会 产生 出 大 型 、 高 重复 性 的 凝 胶 。 等 电 聚 焦 对 离子 和 其 他 污染 物 极度 灵敏 ， 所 以 要 使 用 高 质量 的 试剂 和 预制 胶 将 变异 减 小 到 最 小 程度 (Lopez et al., 1991; Patton et al., 1991a; Walsh et oz .，1998)。 大 型 胶 系 统 是 一 个 典型 的 2-DE 胶 专 用 系统 ， 并 可 被 调整 为 高 通 量 。 每 一 个 单元 都 应 具有 同时 运行 10 一 12 块 大 型 胶 的 能 力 ， 多 系统 模式 的 加 入 可 适应 更 高 通 量 的 实验 。 迷 你 胶 同 样 可 成 功用 于 2-DE 分 离 ， 只 要 在 2-DE 运行 之 前 对 样品 预先 分 离 收 集 以 减少 样品 的 复杂 性 (Harry et az.，2000)。 由 于 迷你 胶 电 泳 时 操作 更 方便 ， 所 以 比 大 型 胶 更 适合 于 自动 化 操作 。 第 一 维和 第 二 维 电泳 都 使 用 预制 胶 会 提高 分 离 的 一 致 性 。 选 择 固定 化 或 载体 两 性 电 解 质 作为 一 维 化 学 物质 使 等 电 聚 焦 过 程 更 具 灵 活性 。 载 体 两 性 电解 质 管 胶 更 适用 与 疏水 a on ， NBS 蛋 日 质 组 学 性 或 膜 蛋 折 的 分 离 ， 而 固定 化 梯度 胶 条 更 方便 ， 常 规 使 用 更 容易 (Lopez，1999b; Pat- ton et Ql .，1999b)。 所 有 这 些 参数 结合 起 来 使 胶 与 胶 之 间 的 斑点 位 置 相关 性 很 好 ， 不 管 是 在 IEF (等 电 聚 焦 ) 还 是 分 子 质量 分 离 ， 变 异 都 小 于 1% (Fishmann, 1999; Lopez and Patton，1997)。 图 9.3 显示 的 是 6 块 不 同 的 血清 2-DE 胶 在 同一 区 域 的 放大 照片 ， 在 疾病 样品 中 可 看 到 出 现 了 在 对 照样 品 中 没有 的 新 斑点 。 除 非 胶 与 胶 之 间 的 模式 (pat- tern) 重 现 性 非常 好 ， 否 则 是 不 可 能 进行 这 种 比较 的 。 (a) (b) (d) 疾病 组 时 图 9.3 血清 蛋白 2-DE 凝 胶 图 像 配 比 区 域 放 大 图 (a-c) 对 照样 品 。(d-f) 疾病 样品 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton，1997， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-DE 分 析 软 件 6.2 版 (GSI)。 箭 头 所 指 处 为 在 疾病 样品 中 差异 表达 的 蛋白 质 。 ( 蒙 S，Rasheed，UCLA 惠 允 ) 4.2 富 集 和 分 部 收集 技术 尽管 2-DE 是 目前 分 离 蛋 白质 混合 物 的 具 最 高 分 辩 率 的 技术 ， 它 仍然 不 能 分 辨 在 任 一 细胞 中 所 有 表达 的 和 蛋白质 (>10 万 个 )， 大 多 数 研究 者 用 富 集 或 预 分 布 收集 技术 来 寻 求解 决 这 一 问题 的 办 法 ， 如 亲 和 色 谱 ， 溶 液 中 分 部 收集 或 在 2-DE 前 进行 亚 细 胞 分 部 收 集 (Harry et al., 2000; Lopez, 1999a; Lopez et al., 2000a; Quadroni and James, 1999), ABFA AY i — PRD BB Mt 8 FB ee HE — 2h iE RB OP SA 92 Yd) TE 化 pH 梯度 胶 (1~2 4+ pH (2) (Harry et al., 2000; APB, BioRad, Proteome Sys- tems, GSI). 4.3 显 像 技术 目前 2-DE 胶 上 蛋白质 的 显 像 技术 只 有 有 限 的 几 种 。 因 为 有 越 来 越 多 的 实验 室 不 能 使 用 放射 性 同位 素 ， 所 以 最 灵敏 并 可 定量 的 发 射 活性 标记 法 已 经 变 得 相当 没有 吸引 力 PLE HAR: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 159 - 了 。 放 射 性 标记 法 还 要 求 待 研究 的 活 细胞 和 组 织 在 分 析 前 与 放射 性 同位 素 共 培 养 ， 因 此 许多 重要 的 样品 明显 不 能 采用 这 个 方法 ， 如 人 的 组 织 和 体液 。 最 常用 的 染色 方法 是 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 (Merril，1987; Patton et al., 1999; Ramsby and Makowski, 1998; Wirth and Romano，1995)。 考 马 斯 蓝 的 灵敏 度 很 低 ， 使 其 仅 限 于 研究 丰 度 最 高 的 看 家 蛋白 。 尽 管 银 染 和 蛋白 的 胶 上 酶 切 肽 质量 指纹 谱 的 肽 序列 覆盖 率 要 相对 低 一 些 (Gharahdaghi et al., 1999), (EAA WHER RM 〈 定 量 到 ng 级 )， 在 一 些 例 子 中 可 定量 (Patton，1995)， 并 能 与 质谱 和 测序 技术 相配 合 ， 因 此 银 染 通常 是 最 好 的 选择 。 不 幸 的 是 ， 银 染 也 有 一 些 非常 严重 的 缺点 。 通 常 银 染 定量 的 动力 学 范围 (dynamic range) 不 (a) (b) (c) (d) 9.4 银 染 和 SYPRO Ruby 染色 的 2-DE 凝 胶 相 同 区 域内 象 素 强度 表面 轮廓 线 (a) 2-DE 凝 胶 银 染 放 大 图 ; (b) 2-DE SEB SYPRO Ruby 染色 放大 图 ， 与 (a) 的 区 域 相 同 。 取 直线 所 标 处 的 蛋白 斑点 的 表面 轮廓 线 ; (ec) 图 (a) 中 直线 所 标 区 域 的 表面 轮廓 线 ; (d) 图 (b) 中 直线 所 标 区 域 的 表面 轮廓 线 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and patton，1997， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-DE 分 析 软 件 6.2 版 (GSI)， 及 使 用 银 染 或 SYPRO Ruby Protein gel stain (Molecular probes) 染色 。 ES ee - 160 - 蛋白 质 组 学 大 ， 较 高 表达 的 丰 度 的 蛋白 质 非常 容易 达到 饱和 。 银 染 不 是 一 个 终点 染色 方法 ， 这 一 事 实说 明 其 定量 是 不 准确 的 。 另 一 种 染色 方法 是 荧光 染色 。 市 场 上 有 许多 非常 好 的 荧光 染 色 剂 ， 灵 敏 度 与 银 染 相当 ， 但 还 没有 被 广泛 接受 使 用 。 最 近 ， 一 种 新 的 荧光 染色 剂 ， SYPROR Ruby Protein Gel Stain (Molecular Probes) 被 引入 蛋白 质 组 分 析 应 用 。SYPRO Ruby Protein Gel Stan 的 灵敏 度 有 所 提高 ， 有 更 广泛 的 动力 学 (线性 ) 范围 ， 用 于 质谱 分 析 的 胶 上 肽 段 的 回收 率 比 银 染 高 (Berggren et al., 2000; Lopez et al., 2000a; Pat- ton 2000，2000a)。 图 9.4 显示 的 例子 是 成 纤维 细胞 2-DE 胶 ， 上 样 量 相同 ， 分 别 用 银 染 和 SYPRO Ruby 染色 ， 用 图 示 的 方式 表现 出 在 相同 区 域内 象 素 强度 的 表面 轮廓 线 ， 表明 了 两 种 染色 方式 的 线性 差异 ， 显 示 出 荧光 染色 用 于 定量 比较 的 优势 。 4.4 自动 染色 不 管 选用 什么 染色 方法 ， 使 用 自动 化 的 染色 系统 将 会 减少 人 工 劳 动 ， 并 提高 实验 的 一 致 性 。 目 前 有 少量 商业 化 的 2-DE 胶 上 自动 染色 系统 可 供 选择 ， 如 APB, GSI. iF 高 通 量 重 昌 质 组 分 析 的 系统 应 该 能 够 按照 不 同 使 用 者 设 定 的 步骤， 同时 染 多 块 电 泳 胶 。 5. 图 像 分 析 图 像 分 析 或 许 是 高 通 量 蛋 日 质 组 分 析 程 序 中 作 重 要 的 元 素 了 了 ， 因 为 它 决定 了 从 2-DE 胶 的 谱 图 数据 库 中 提取 的 数据 的 质量 ， 并 指导 着 疾病 特异 蛋白 标志 物 搜 寻 的 路 径 (Wirth and Romano, 1995; 参考 第 六 章 )。 在 蛋白 质 组 学 开发 路 径 中 ， 图 像 分 析 似乎 越 来 越 成 为 了 重要 的 瓶颈 步骤 ( 见 Lopez，2000 中 表 1)。 第 一 步 是 用 数字 的 形式 获取 凝 胶 图 像 。 市 场 上 有 许多 可 用 于 获取 凝 胶 图 像 的 高 分 辨 CCD 照相 系统 (Perkin Elmer, Fuji, APB, BioRad, Boehringer Mannheim), CCD 照相 系统 的 优点 是 方便 ， 灵 活 ， 与 包 括 荧 光 染 色 在 内 的 许多 染色 步骤 相 适 用 (Patton，2000，2000a)。 激 光 扫 描 仪 同样 能 成 功用 于 从 白光 可 见 染 色 (white light visible stains) 的 凝 胶 中 获取 图 像 。 这 方面 发 表 了 许 多 综述 (Patton, 1995, 2000). 在 UNIX 基础 上 的 软件 通常 更 适用 ， 因 为 2-DE 胶 的 模式 分 析 是 计算 性 很 强 的 工 作 。 软 件 必 须 能 够 分 析 复 杂 的 包含 1300 一 10 000 个 蛋白 质 斑点 的 凝 胶 ， 同 时 也 能 够 处 理 包 含 几 百 凝 胶 数据 的 数据 库 。 强 大 的 数据 库 碍 询 系统 应 该 能 够 筛选 出 已 有 斑点 的 信 上 ， 已 匹配 斑点 的 定量 比 、 已 整合 的 斑点 强度 、 分 子 质 量 、 等 电 点 、 面 积 以 及 用 户 限定 的 斑点 或 图 像 的 特性 。UNIX 平台 的 多 线程 (multi-threading) 功能 使 其 能 够 迅速 处 理 复杂 的 、 多 水 平 的 查询 和 非常 大 的 凝 胶 数据 库 。 在 对 每 一 个 新 加 入 数据 库 的 凝 胶 谱 图 之 间 判 定 差 异 点 的 配 比 编辑 处 理 中 加 入 决定 点 (decision point), 是 可 以 提高 分 析 效 率 和 速度 的 一 个 策略 (图 9.53)。 有 许多 商业 化 的 高 级 的 2-DE 凝 胶 图 像 分 析 软 件 包 ， 例 如 ， Imagemaster, APB; Advanced 2-D Software, Phoretix; MELANIE [I], Swiss Institute of Bioinformatics, GenBio; PDQUEST, BioRad; HT Investigator, GSI. AiR at tT KEYS 的 一 个 特性 是 与 完整 蛋白 质 组 系统 中 其 他 部 件 整合 ， 精 确切 下 并 处 理 指 定 的 和 蛋白质 斑 点 weno PILE MR: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 161: ineostiqaine 2-0 Keview VIR E0062 wi # pe Onty bn rezai bee Tat i New Spots: 65), Thin New Spat Oeiete “= _— eee 区 0 生 对 上 6 性 See” ve P Back wt ct RE AID AN New Speers: Owiate Liha: # of Spots & 就 ‘Add Darkest 4 of Spot ™ Pig gprs oe I SRE, BEM TY 图 9.5 Investigator 2-D 分 析 软 件 (GSI) 配 比 分 辩 率 选 件 图 示 此 选 件 可 以 提高 效率 ， 也 即 提高 了 ( 凝 胶 ) 配 比 编辑 的 速度 ， 这 是 2-DE 凝 胶 图 像 分 析 的 一 个 重要 瓶颈 。 6. 自动 化 机 器 人 6.1 斑点 切取 一 且 图 像 分 析 鉴 别 出 了 2-DE 胶 上 有 潜在 研究 价值 的 蛋白 质 斑点 ， 那 他 们 必须 被 鉴 定 。 通 常 ， 斑 点 从 凝 胶 上 被 切 下 ， 并 进行 腕 上 和 蛋白 质 酶 切 (如 用 胰 和 蛋白 酶 )。 很 明显 ， 这 一 过 程 是 非常 费事 的 ， 如 果 完 全 由 手工 处 理 大 量 样品 ， 则 非常 有 可 能 从 皮肤 上 污染 角 蛋白 。 现 在 已 经 开发 出 了 多 种 能 从 2-DE 胶 上 自动 切 点 的 机 器 人 ， 并 且 已 经 商品 化 (BioRad; APB; GSI; Proteome Systems)。 有 些 公司 正 在 开发 多 项 合 一 (all-in-one) 的 平 台 ， 将 斑点 切取 ， 酶 切 和 MALDI-TOF R#%4 A—({# (Proteome Systems) 。 一 个 完全 自动 化 的 斑点 切取 系统 要 包括 一 个 CCD 照相 机 ， 用 于 从 2-DE 胶 上 检测 和 切取 斑点 。 切 点 机 吉 人 应 该 与 2-DE 分 析 软 件 整合 ， 以 指导 其 从 2-DE 胶 上 切取 目标 斑点 或 全 部 斑点 。 机 器 人 应 该 有 最 大 程度 的 灵活 性 ， 能 够 适用 于 银 染 ， 考 马 斯 蓝 染 色 或 荧光 染色 的 胶 。 目 前 最 高 通 量 的 系统 大 约 每 小 时 可 以 切 下 200 个 斑点 。 应 该 使 用 没有 反应 活性 的 塑料 或 不 锈 钢 的 采集 头 来 切取 斑点 ， 并 将 切 下 的 斑点 放 入 微 升 板 内 传送 到 酶 切 机 器 人 处 〈 见 下 文 )， 图 9.6 显示 的 是 自动 化 斑点 切取 机 器 人 切取 的 2-DE 凝 胶 分 离 的 血浆 蛋白 斑点 。 - 162 - 蛋白 质 组 学 (a) (b) 图 9.6 用 Flexys 斑点 切取 机 器 人 (GSI) 处 理 前 后 的 银 染 凝 胶 放 大 图 (a) 处 理 前 的 凝 胶 ; (b) 斑点 切 下 之 后 的 凝 胶 。Flexys 机 器 人 从 2-D 分 析 软 件 产生 的 报告 中 选择 要 切 斑点 的 位 置 。 斑 点 切取 使 用 2mm 的 塑料 收集 头 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton, 1997, 不 同 之 处 在 于 使 用 了 BioImage 2-DE 分 析 软 件 6.2 I (GSI). 6.2 斑点 酶 切 和 肽 提取 蛋白 斑点 从 2-DE 凝 胶 上 切 下 来 后 ， 用 蛋白 酶 水 解 (通常 用 胰 蛋 白 酶 )， 产 生 的 肽 混合 物 从 凝 胶 中 提取 出 来 。 同 样 ， 对 这 一 过 程 也 进行 了 自动 化 处 理 的 努力 。 一 个 完全 自 动 化 的 酶 切 机 器 人 应 该 自动 进行 从 酶 切 到 肽 提取 过 程 中 的 所 有 步骤 ， 使 用 高 通 量 的 胶 上 蛋白 胰 和 蛋白 酶 酶 切 ， 最 多 需要 8h。 所 有 样品 的 清洗 和 提取 步骤 都 应 该 在 微 升 板 中 自动 进行 ， 以 易于 处 理 并 减少 样品 的 交叉 污染 。 并 且 全 过 程 结 束 后 ， 提 取 的 肽 段 应 该 很 容易 传送 到 下 一 步 的 MALDI-TOF 自动 点 靶 机 器 人 处 ， 或 传送 到 串联 质谱 仪 的 自动 进 样 器 上 。 如 果 能 用 一 个 PC 网 络 远程 控制 多 个 酶 切 机 器 人 ， 或 许 能 够 实现 超 高 通 量 。 用 户 应 该 能 够 按照 自己 的 要 求 制定 酶 切 步 又 ， 并 在 开始 操作 前 将 其 下 载 到 每 一 台 仪器 。 6.3 肽 脱盐 、 纯 化 ， 在 MALDI# ERE 肽 段 从 凝 胶 中 提取 出 来 后 ， 必 须 除 去 盐 和 去 污 剂 这 样 的 污染 物 ， 在 进行 质谱 分 析 前 ， 肽 还 要 被 浓缩 。 如 果 用 MALDI-TOF-MS 分 析 肽 段 ， 则 需 与 基质 混合 (通常 用 CCA) 后 在 MALDI 靶 上 点 样 。 有 多 种 商业 化 的 机 器 人 可 以 完成 这 一 过 程 中 的 部 分 或 全 部 任务 (PE Biosystems; GSI; BioRad; Tecan; Proteome Systems)， 其 中 一 些 机 器 人 平台 可 以 使 用 装 有 芯 水 性 树脂 填料 的 ZipTip (Millipore) 来 纯化 肽 段 (Courchesne and Pat- terson, 1997; Jensen et wz .，1999)。 很 重要 的 一 点 是 机 器 人 要 将 0.$ 一 1nwl 或 更 少 体积 的 样品 排列 精确 地 点 在 MALDI 靶 上 ， 而 且 此 机 器 人 平台 还 要 能 与 大 多 数 制造 商 生 产 的 MALDI-TOF 样品 靶 相 适用 。 能 通过 PC 网 络 远程 控制 MALDI-TOF 机 器 人 同样 是 一 个 令 人 满意 的 特性 。 图 9.7 显示 的 是 用 上 述 处 理 达 到 的 从 2-DE 胶 上 切 下 的 斑点 的 肽 混合 物质 谱 图 ， 通 过 检索 SWISS PROT 数据 库 ， 此 斑点 被 鉴定 为 50S 核糖 体重 日 L9。 SLE MM. 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 163 - DE RP PRO Serial# 2032 Method: ROE2001 Laser : 2480 Genomic Solutions, Inc. Mode: Ret lector Bean Ateeges Accelerating Vonage: 20000 Pressure 3.41¢-07 Grid Vottage: 74.500 % Low Mass Gate’ 600.0 10/2) masses matched Protein Molecular weighVpI 15769.1 / 6.17 Species ECOLI Swiss Prot Accession No. 50S RIBOSOMAL PROTEIN L9 Protein name 1025.53 Mass submitted Mass matched Delta ppm Peptide sequence 768.4524 768.4732 -27.0639 (R)LPNGVLR(T) 842.5099 842.4987 13.2179 (K)VIVNVVAE(-) 850.4801 850.4787 1.6847 (R)NFLVPQGK(A) (K)NIEFFEAR(R) (K)LAEVLAAANAR(A) 1025.5359 1025.5056 29.5266 1098.6737 1098.6271 42.3871 1153,6581 1153.6006 49.8584 (K)NIEFFEARR(A) 1239.7173 58.8485 1239.7903 (K)SEVRLPNGVLR(T) 1407.8283 1407.7232 74.6470 (K)AGDEGKLFGSIGTR(D) Mass (m/z) 图 9.7 从 2-DE 胶 上 切 下 斑点 的 胶 上 酶 切 肽 质谱 图 斑点 用 ProGest 及 proMS MALDI 机 器 人 (GSI) 酶 切 处 理 。 蛋 白质 大 约 1pmol， 考 马 斯 蓝 染 色 。 质 谱 图 由 Voyager DE-RP Pro MALDI-TOF 质谱 仪 (PE BioSystems) 分 析 ( 见 Parker et al., 1998). FA Protein prospector 程序 在 万 维 网 上 检索 SWISS PROT SUE (http: //prospector.ucsf.edu)， 插 图 显示 的 是 质量 精 确 度 及 每 一 个 匹配 肽 段 的 序列 ， 也 显示 了 蛋白 鉴定 的 可 能 结果 。 和 蛋白 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton，1999， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-D 分 析 软 件 6.2 MK (GSI). 7. 质谱 的 接口 策略 ， 目前 有 两 种 将 质谱 整合 入 蛋白 质 组 研究 程序 的 方法 。 为 了 鉴定 那些 在 各 种 基因 组 和 蛋白 质 组 数据 库 中 不 存在 的 和 蛋白质 ， 必 须要 确定 其 氨基 酸 序列 。 以 往 是 用 蛋白 质 序列 仪 通过 Edman 化 学 降解 方法 来 实现 的 。 这 一 步骤 耗 时 长 ， 且 需要 相当 大 量 的 蛋白 质 (Tempst et wz .，1999)。 最 近 多 数 研 究 者 已 经 采用 四 极 杆 或 电 喷 雾 串联 质谱 仪 (Micro- mass, SxiEX/Perkin Elmer, Finnigan, Bruker) 来 确定 单个 肽 段 的 氨基 酸 序 列 ， 并 用 这 些 短 的 序列 标签 在 公共 或 私营 EST 库 和 序列 数据 库 中 检索 (Yate et al., 1993, 1999). 这 些 测序 技术 很 准确 ， 但 是 仍然 需要 相对 大 量 的 样品 〈picomole)， 并 且 速 度 慢 ， 限 制 了 他 的 高 通 量 。 为 了 高 通 量 鉴定 2-DE 胶 上 的 蛋白 质 ， 用 MALDI-TOF 质谱 仪 测 肽 质量 指 纹 谱 是 更 适合 的 技术 (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Pappin et al., 1993). 4G MALDI-TOF 不 能 定量 ， 但 它 是 一 个 非常 灵敏 ， 具 高 分 辨 力 的 技术 ， 灵 敏 度 达 到 fmol 一 amol。 同 时 也 非常 适合 于 自动 化 和 高 通 量 操 作 。 另 外 ， 因 为 许多 物种 的 基因 组 测 序 正 以 惊人 的 速度 在 进行 ， 所 以 在 万 维 网 上 的 公共 数据 库 中 有 丰富 的 序列 数据 可 用 于 质 HPT (mass profiling) 检索 (Lopez，1998，1999a)。 这 些 技术 在 有 效 的 ， 自 动 化 系统 控制 下 ， 可 以 每 天 迅速 鉴定 几 十 到 几 百 个 蛋白 质 斑 点 。 在 过 去 几 年 中 ， 许 多 厂家 已 经 制 造 出 了 精密 的 台式 MALDI-TOF 仪器 ， 如 PE Biosystems, Bruker, Ciphergen, Micro- Te - 164 - 和 蛋白质 组 学 mass, Kratos. 8. HlarA wer, AR ia PPA fa STE Z | AY BER 用 上 面 几 段 所 述 的 一 整套 系统 处 理 大量 的 样品 将 会 产生 大 量 的 数据 ， 这 对 样品 的 追 踪 是 一 个 挑战 。 因 此 ， 自 动 化 蛋白 质 组 分 析 程 序 中 最 重要 的 是 对 软件 的 整合 ， 在 分 析 过 程 中 各 种 仪器 使 用 的 软件 及 样品 信息 和 数据 管理 所 用 软件 的 整合 。 开 发 满足 这 一 需求 的 生物 信息 学 系统 是 高 通 量 蛋 白质 组 研究 计划 首先 要 考虑 的 问题 。 一 个 生物 信息 学 解决 方 案 应 该 建立 在 相关 数据 库 的 基础 上 ， 以 进行 各 系统 部 件 间 样品 追踪 和 信息 数据 的 交换 。 样品 追踪 应 该 使 用 条 形 码 ， 淘 汰 人 工 追 踪 ， 因 为 人 工 追 踪 常 常会 引入 误差 。 中 央 数 据 库 是 核心 部 分 ， 应 该 能 使 其 他 系统 部 件 ， 如 图 像 分 析 软 件 、 斑 点 切取 机 器 人 、 酶 切 器 、 质 谱 仪 等 存储 和 读 取信 息 。 数 据 库 还 应 该 能 使 用 户 在 查询 和 报告 时 方便 地 读 取 数据 。 此 外 ， 样 品 制备 信息 和 2-DE 凝 胶 运 行 参数 都 应 该 有 记录 。 最 后 ， 从 质谱 仪 得 到 的 数据 信 妃 应 该 再 链接 回 到 凝 胶 图 像 ， 这 样 ， 只 要 鼠标 一 点 击 ， 就 能 得 到 每 一 个 斑点 的 制备 、 处 理 及 鉴定 数据 。 网 络 浏览 喜 应 该 是 这 种 类 型 的 生物 信息 学 软件 包 理 想 的 使 用 界面 。 目 前 有 许多 公司 正在 开发 用 于 蛋白质 组 分 析 的 生物 信息 学 软件 包 。 9. 4K 要 解释 复杂 的 生物 学 系统 需要 理解 其 表达 的 蛋白 质 及 其 基因 组 结构 图 。 蛋 和 白质 组 分 析 试 图 获取 任 一 时 刻 机 体 或 组 织 的 蛋白 表达 谱 。 对 蛋白 表达 谱 的 比较 能 够 提供 一 些 与 鉴 定 潜 在 的 药物 或 诊断 试剂 相关 的 特殊 信息 。 对 蛋白 质 组 分 析 各 种 步骤 进行 自动 化 及 整合 对 提高 效率 并 进而 促进 靶 标 鉴定 非常 有 必要 ， 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 策 略 中 瓶颈 问题 的 解 决 正 在 使 药物 和 诊断 标志 物 开发 的 途径 更 便利 。 未 来 蛋白 质 组 学 的 挑战 将 是 基因 组 学 和 小 分 子 代谢 信息 的 整合 ， 这 种 整合 产生 的 最 终结 果 将 对 细胞 代谢 过 程 有 更 深入 和 广泛 的 | 理解 。 显 而 易 见 ， 蛋 白质 组 学 的 出 现 已 经 鼓励 了 许多 生物 学 家 的 思想 跳出 了 基因 组 学 的 框框 。 (ERE GF Re KR) 参考 文献 Anderson, N.L. and Anderson, N.G. 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Pennington 1. 引言 基因 组 测序 方法 已 取得 了 巨大 进步 , 而 且 这 些 新 方法 对 全 世界 研究 者 完全 开放 (http://www.tigr.org/tdb/ 和 http://www.ornl.gow/ TechResources/Human_Genome/ home.html) 。 一 个 完整 的 基因 组 序列 对 人 们 了 解 这 种 生物 体 的 生命 过 程 提供 了 一 个 很 好 的 机 会 。 基 因 组 测序 方法 还 衍生 出 一 些 新 的 方法 和 技术 ， 如 对 表达 mRNA 的 分 析 方 法 (Chee et al., 1996; Eisen et al., 1998; Gerhold et al., 1999) 和 用 双 杂 交 方 法 来 综合 分 析 蛋 白质 间 的 相互 作用 。 运 用 这 些 方法 人 们 获得 了 海量 的 不 同 生物 体 的 信息 ， 包 括 酵 母 (Dujon，1996; Goffeau et al., 1996; Uetz et al., 2000), 2 (Chalfie, 1998; C.elegans consortium, 1998; Plasterk, 1999) 和 人 类 (Chee et al., 1996). HRI, 于 微 陈列 技术 的 发 展 ， 更 进一步 加 快 了 人 们 获得 基因 序列 和 基因 差异 表达 分 析 的 步伐 (Bowtell，1999)。 这 些 方法 的 综合 运用 使 人 们 得 到 了 许多 功能 基因 组 学 的 信息 ， 并 且 正在 把 这 些 信息 转化 为 对 生命 过 程 的 研究 (Alizadeh et al., 2000; Alon et al., 1999; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999; Pollack et al., 1999; Wang et al., 1999). 然而 ， 随 着 这 些 技术 的 广泛 应 用 ， 它 们 逐渐 变 为 一 种 常规 技术 。 现 在 人 们 已 逐渐 认识 到 上 述 这 些 技术 将 成 为 对 基因 或 mRNA 产物 一 一 和 蛋白质 直接 分 析 的 一 种 补充 手段 。 最 终 ， 对 基因 组 表达 产物 蛋白 质量 的 分 析 、 细 胞 定位 、 空 间 结 构 分 析 将 决定 一 个 细胞 或 生物 体 活性 (Dove, 1999; Parekh，1999; Pennington et al., 1997; Wilkins et al., 1995). 然而 ， 蛋 白质 从 本 质 上 比 其 相对 应 的 mRNA BK DNA 序列 复杂 得 多 。 因 此 ， 在 基因 组 水 平分 析 蛋 白质 方法 落后 于 飞速 发 展 的 核酸 的 分 析 方 法 ， 这 不 足 为 怪 。 2. 功能 蛋 日 质 组 研究 范围 功能 蛋白 质 组 学 包含 有 几 个 重要 却 又 相互 补充 的 方面 。 截 止 到 现在 ， 对 蛋白 质 组 研 究 的 注意 力主 要 集中 于 试图 分 析 整 个 蛋白 质 表 达 变 化 特别 是 在 一 些 特殊 条 件 下 蛋白 质 组 表达 变化 ， 如 在 疾病 状态 下 ， 单 个 基因 疝 除 后 、 药 物 治 疗 或 在 改变 细胞 外 界 环 境 的 状况 下 。 单 个 基因 表达 的 mRNA 水 平常 与 其 表达 的 蛋白 质 水 平 不 相关 。 因 此 ， 这 样 的 分 析 是 合理 的 。 然 而 ， 在 一 个 细胞 、 器 官 和 组 织 中 ， 单 个 蛋白 质 表 达 水 平 同样 也 不 反映 这 种 蛋白 质 生物 活性 ， 这 种 现象 也 是 普遍 存在 的 。 蛋 白质 活 性 是 一 个 复杂 的 综合 过 程 ， 它 涉 及 到 和 蛋白质 翻 译 后 修饰 、 在 组 织 、 细 胞 和 亚 细 胞 中 的 定位 以 及 它 与 别 的 蛋白 质 间 的 相互 作用 。 因 此 ， 分 析 蛋 白质 活性 必须 考虑 每 个 方面 并 把 所 得 各 部 分 的 数据 综合 起 来 。 当 然 ， 对 每 个 方面 现 有 各 种 方法 的 讨论 在 一 章 中 是 不 可 能 完成 的 。 因 此 在 本 章 我 们 讨论 以 下 几 个 方面 : 中 介绍 一 下 现行 通用 蛋白 质 表达 分 析 法 的 局 限 性 ; @ 介 绍 一 些 正 在 发 展 的 新 方法 ; 加 讨论 一 些 分 析 蛋 白质 表达 谱 的 新 方法 。 在 讨论 之 前 ， 我 们 有 必要 再 重 述 一 i ma a mR TE | Rc emg Be art BT Se - 168 - 蛋白 质 组 学 下 ， 那 就 是 对 蛋白质 定位 〈 第 十 二 章 )、 蛋 白 结构 分 析 (Briinger, 1997; Cusack et al., 1998;Gerstein and Hegyi, 1998; Robson, 1999; Sali and Kuriyan, 1999; Swindells et al., 1998;Wery and Schevitz, 1997). & A Jt DH BE AY FHM (Bork et al., 1998; Marcotte et al., 199 1a, b; Pellegrini et al., 1999) #0 & AA VE ee eh AOR YS 很 大 的 进展 , 如 二 维 杂 交 法 (Utez et al . ,2000) 和 一 些 计 算 机 分 析 法 (Enright et al., 1999)。 另 外 , 还 包括 一 些 在 基因 组 范围 内 对 基因 功能 分 析 的 方法 (RossMacdonald et al., 1999 ) 。 3. 蛋白 质 组 分 析 : 基于 2-DE 的 战略 目前 ， 大 部 分 和 蛋白质 组 分 析 计 划 起 初 都 是 用 二 维 电 泳 分 离 蛋 白质 复合 物 (第 三 章 )。 这 包括 基于 等 电 点 对 和 蛋白质 混合 物 的 一 向 分 离 ， 紧 接着 依赖 于 蛋白 质 分 子 质量 进行 垂直 分 离 。 在 一 块 二 维 凝 胶 上 ， 将 有 近 10 000 个 蛋白 质点 ， 利 用 几 块 胶 ， 可 以 得 到 有 关 和 蛋 白质 不 同 表达 的 数据 。 值 得 指出 的 是 ， 一 个 单一 蛋白 质 可 以 在 二 维 胶 上 呈现 几 个 点 ， 这 种 多 样 性 至 少 代 表 该 蛋白 质 几 种 不 同 翻译 后 修饰 方式 。 一 段 时 间 以 来 ， 由 于 不 能 够 鉴定 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋白 质点 ， 这 大 大 限制 了 三 维 凝 胶 电泳 的 潜在 应 用 。 尽 管 如 此 ， 还 是 有 少数 研究 者 ， 如 著名 的 Celis 和 他 的 同事 ， 在 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋白 质点 的 鉴定 、 二 维 凝 胶 电泳 图 及 其 数据 库 的 制作 方面 取得 了 巨大 的 进展 (Celis et al., 1994, 1995), 但 是 这 些 只 是 个 别 的 例子 。 依 赖 于 质谱 的 蛋白 质 鉴 定 方法 (包括 从 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋 白质 点 和 利用 其 他 方法 所 分 离 的 蛋白 质点 〈 图 10.1 和 第 五 章 )) 的 发 展 ， 使 得 以 二 维 凝 胶 电泳 作为 分 析 重 白质 表达 谱 的 工具 得 到 了 很 大 的 发 展 (Celis et al., 19985; Futcher et al.,1999;Li et al.,1999;Shevchenko et al.,1996). 应 用 于 蛋白 质 分 离 的 二 维 凝 胶 电 泳 技术 蛋白 质 检测 蛋白 质 鉴定 匹配 分 析 SH, DTH, WR, AERA, 序列 标签 从 头 测序 串联 质谱 ， 微 测序 二 维 凝 胶 电 泳 图 谱 和 数据 库 图 10.1 用 二 维 凝 胶 电泳 进行 蛋白 质 表 达 分 析 和 鉴定 二 维 凝 胶 电泳 作为 分 析 蛋 白质 谱 的 技术 平台 能 和 否 持续 发 展 下 去 ， 这 个 问题 一 直 在 争 论 之 中 。 二 维 凝 胶 电泳 技术 本 身 所 具有 的 缺点 和 局 限 性 ， 使 得 这 种 讨论 更 为 热烈 。 其 中 最 为 明显 的 缺点 如 图 10.2 所 示 。 即 使 在 最 先进 的 实验 室 ， 对 胶 的 控制 包括 单一 蛋白 质 点 在 空间 的 重复 性 和 所 染色 蛋白 质点 的 量 的 重复 性 ， 是 很 难 达 到 的 。 对 于 在 同一 个 实验 室 和 不 同 实验 室 之 间 的 凝 胶 所 分 离 的 点 的 一 致 性 ， 更 是 有 许多 争论 。 但 是 ， 具 有 一 定 的 第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 经 验 上 且 仔 细 操 作 ， 能 够 取得 很 好 的 重复 性 ， 这 一 点 是 不 容 怀 疑 的 〈Corbett et al., 1994)。 然 而 ， 还 是 有 许多 人 在 评估 获得 好 的 二 维 凝 胶 电泳 重复 性 的 艰难 性 及 对 所 显示 单个 蛋白 质点 在 统计 学 上 有 明显 差异 所 需 二 维 凝 胶 的 数目 。 此 外 ， 目 前 通用 的 二 维 凝 胶 电泳 方法 在 其 二 维 凝 胶 电 泳 图 上 所 显示 大 多 是 那些 高 丰 度 和 中 等 丰 度 的 蛋白 质 (第 四 章 )。 这 儿 列 出 了 二 维 凝 胶 电 泳 所 有 的 局 限 性 ， 但 有 的 局 限 性 是 可 以 被 克服 的 ， 如 在 进 行 二 维 凝 胶 电泳 以 前 富 集 样品 可 以 检测 到 一 些 低 丰 度 蛋 白质 。 可 以 预测 ， 人 们 可 以 发 现 一 些 新 荧光 染料 来 检测 蛋白 质 。 最 感 兴趣 的 是 用 不 同 的 荧光 染料 分 别 标记 两 种 样品 ， 混 合 后 ， 进 行 二 维 凝 胶 电 泳 (Unlii er wy .，1997)。 根 据 单 一 蛋白 质 所 发 出 的 不 同 的 荧光 量 可 以 测 得 这 个 蛋白 质 在 两 种 样品 中 的 相对 丰 度 。 虽 然 这 种 方法 具有 许多 内 在 的 局 限 性 ， 但 是 它 有 一 个 很 重要 的 优点 就 是 它 克 服 了 “不 同 凝 胶 间 重 复 性 ”问题 。 应 用 于 蛋白 质 组 分 析 的 二 维 凝 胶 电泳 技术 平台 应 用 于 蛋白 质 组 分 析 的 二 维 凝 胶 电 泳 技术 平台 重复 性 灵敏 度 显示 范围 数目 对 照 “困难 ”蛋白 质 -难于 在 二 维 凝 胶 电泳 图 谱 显 示 的 蛋白 质 数据 分 析 需要 热 练 的 技术 ， 花 费 较 多 的 时 间 和 精力 难于 自动 化 图 10.2 ”作为 蛋白 质 表达 分 析 二 维 凝 胶 电泳 技术 局 限 性 尽管 有 许多 文献 报道 一 块 胶 上 能 够 显示 20 000~50 000 个 点 ， 但 是 一 块 胶 最 多 可 检 测 到 10 000 个 蛋白 质点 〈Klose，1999)。 这 是 由 于 许多 蛋白 质 在 二 维 凝 胶 电 泳 图 上 可 以 有 好 几 个 点 。 二 维 凝 胶 电泳 图 上 实际 含有 和 蛋白质 数目 少 于 所 显示 的 “和 蛋白 质点 ”的 数 目 。 值 得 注意 的 是 ， 每 块 胶 不 能 够 显示 样品 中 所 有 的 蛋白 质点 。 有 的 蛋白 质 ， 包 括 膜 蛋 白 ， 在 “正常 条 件 下 ”不 能 显示 在 凝 胶 电泳 图 谱 上 。 同 样 可 以 采取 多 种 办 法 克服 这 个 缺 ， 点 : 可 以 跑 多 块 窗 pH 范围 和 窜 分 子 质 量 范 围 的 凝 胶 ; 可 以 改变 变性 剂 的 浓度 提高 膜 蛋 白质 的 溶解 度 ; 可 以 采取 分 步 抽 提 的 方法 来 制备 样品 。 但 是 这 些 方法 都 需要 较 多 的 样品 量 。 对 一 些 样品 ， 包 括 人 类 活 组 织 ， 样 品 量 不 足以 用 来 做 多 次 电泳 。 因 此 ， 二 维 凝 胶 电 泳 更 适合 分 析 一 些 简 单 的 生物 体 ， 可 以 在 二 维 凝 胶 电 泳 合 适 的 范围 内 用 它 分 析 总 “蛋白 质 组 ”中 的 主要 部 分 。 二 维 凝 胶 电 泳 得 到 的 图 像 含 有 复杂 的 3-D 信息 ， 对 它 的 分 析 是 对 研究 人 员 一 种 巨大 的 挑战 〈 第 六 章 )。 目 前 对 二 维 凝 胶 电 泳 图 像 的 有 效 分 析 费 时 较 多 ， 因 此 需要 进一步 改 进 。 总 的 来 说 ， 对 一 个 运用 二 维 凝 胶 电泳 方法 的 研究 人 员 ， 二 维 凝 胶 电 泳 过 程 和 对 凝 胶 分 析 过 程 不 仅 需要 技术 ， 而 且 工 作 密度 较 大 ， 费 时 较 多 。 这 个 过 程 的 自动 化 能 克服 这 些 缺点 ， 因 此 将 成 为 这 个 领域 研究 者 所 需 解 决 的 首要 问题 。 目 前 ， 仅 仅 只 在 跑 胶 和 图 像 分 - 170 . 和 蛋白质 组 学 析 过 程 实现 了 部 分 自动 化 ， 这 还 远 和 还 不 够 。 完全 自动 化 包括 对 二 维 凝 胶 电 泳 图 像 分 析 、 蛋 白质 点 的 切割 和 用 质谱 鉴定 蛋白 质 的 过 程 ， 其 正在 发 展 过 程 中 。 几 家 商业 公司 正在 研制 或 对 已 有 的 技术 进行 改进 ， 包 括 凝 胶 分 析 软 件 包 、 用 机 械 臂 来 切割 蛋白 质点 和 一 些 可 用 于 自动 化 操作 的 质谱 仪 (包括 能 够 获 得 肽 指纹 图 谱 (PMF) 的 MALDI-TOF 和 可 进行 复杂 分 析 的 电 喷雾 (ESI) 串联 质 仪 (第 五 章 和 第 八 章 ))。 现 对 所 选择 二 维 凝 胶 电泳 点 质谱 分 析 数 据 收 集 能 力 (Traini et al., 1998) 和 对 和 蛋白质 库 序列 自动 化 搜索 的 能 力 都 已 得 到 提高 (Jensen et al., 1997; Nicola., 1998; 第 八 章 )。 4. 除 二 维 凝 胶 电泳 以 外 的 蛋 日 质 表 达 分 析 方 法 重 昌 质 组 分 析 对 我 们 了 解 生 物体 具有 很 大 的 潜在 影响 ， 这 是 加 快 发 展 一些 可 用 来 分 析 研 究 蛋 白质 表达 功能 新 技术 的 动力 。 这 些 新 技术 大 体 上 可 分 为 两 大 类 : 一 种 是 依赖 于 分 离 的 ， 像 二 维 凝 胶 电泳 一 样 ; 另 一 种 是 不 依赖 于 分 离 来 检测 蛋白 质 表 达 。 4.1 依赖 于 分 离 的 方法 在 这 里 描写 的 方法 都 需要 在 分 析 一 个 蛋白 质 混合 物 以 前 ， 对 它 进 行 不 同 程度 的 分 离 和 纯化 。 二 维 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白质 在 于 它 运 用 两 种 相互 独立 的 物理 化 学 特性 一 一 pI 和 M:， 来 进行 垂直 分 离 。 在 叙述 一 些 已 经 存在 的 别 的 利用 垂直 分 离 方 法 之 前 ， 先 讨论 两 种 依赖 于 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 方法 。 利 用 红外 MALDI-TOF-MS 来 替代 常用 的 紫外 MS, 其 已 被 应 用 于 对 样品 的 高 能 量 分 析 。 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 和 蛋白质 被 转移 到 .PVDF FRE 后 ， 泡 在 基质 溶液 中 ， 然 后 用 红外 MALDITOF-MS 进行 扫描 〈(Eckerskorn et al., 1997a) 。 另 一 个 方法 与 上 述 方法 极其 相似 ， 它 是 用 “分 子 扫描 ”的 办 法 直接 分 析 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 蛋白 质 (Bienvenut et al., 1999; Bin et al., 1999). FEIXX PREP, B 个 二 维 凝 胶 电泳 胶 被 电 转 印 到 PVDF 膜 上 ， 在 电 转 过 程 中 ， 用 蛋白酶 来 消化 蛋白 ， 然 后 用 MS 来 扫描 PVDF 膜 。 它 不 需要 对 和 蛋白质 染色 ， 分 析 凝 胶 电泳 图 像 和 对 单个 蛋白 点 进行 酶 解 反 应 。 但 是 它 要 求 质谱 仪 具 有 较 高 的 灵敏 度 和 分 析 能 力 。 这 个 方法 尚 处 于 孕育 阶段 ， 但 是 如 果 商 家 对 其 产业 化 (Buter，2000)， 将 能 使 其 得 到 飞速 发 展 。 一 步 分 离 法 ”由 于 电 喷 雾 质谱 能 够 分 析 蛋 白质 混合 物 ， 使 得 这 种 方法 具有 可 行 性 ， 并 引起 研究 人 员 很 大 兴趣 。Lamond 和 Mann (1997) 提出 了 这 种 想法 ， 即 对 蛋白 质 混 合 物 初 步 分 离 后 ， 对 蛋白 质 复 合 物 进行 快速 分 析 ， 并 已 取得 了 很 大 的 成 功 (Neubauer et al.,1998;Rappsilber et al. ,2000;Rigaut et al.,1999;Rout et al . ,2000; Wigge et al., 1998; Zachariae et al .,1998)。 在 这 种 方法 中 ， 利 用 1-D 纯化 得 到 一 些 蛋 白质 复合 体 ， 如 剪接 体 ， 然 后 对 相应 的 带 〈 可 能 含有 几 种 蛋白 ) 进行 酶 解 ， 用 质谱 分 析 。 对 这 类 蛋白 复 合 物 进 行 快速 和 详细 的 鉴定 。 已 证 明 这 种 方法 是 可 行 的 。 并 且 用 这 种 方法 已 获得 了 一 些 新 的 以 前 不 被 认识 的 成 分 。 对 一 些 少 数 蛋白 质 组 成 的 复合 物 ， 如 由 免疫 亲 和 方 法 得 到 的 复合 物 ， 也 可 以 用 这 种 方法 进行 分 析 。Ciphergen 公司 提出 了 一 种 新 蛋白 分 析 法 ， 运 用 特定 的 抗体 获取 目标 蛋白 ， 可 以 达到 fmol 级 (10 8 级)， 然 后 运用 表面 增强 激光 解吸 电离 质谱 来 检测 它们 的 分 子 质 量 (www.ciphergen.com)。 该 公司 还 推出 了 一 系列 蛋 自 质 “ 芯 片 ”， 其 实 就 是 在 MALDI 靶 上 涂 了 一 层 色谱 树脂 〈 如 阳离子 交换 树脂 )， 使 其 可 第 十 章 ”蛋白 质 表 达 分 析 新 方法 « Pts 以 用 于 蛋白 质 表达 谱 实验 。 该 方法 主要 过 程 包括 先 使 复杂 的 蛋白 质 混合 物 与 靶 结合 ， 然 后 在 不 同 的 条 件 下 清洗 ， 最 后 用 质谱 获得 剩余 蛋白 分 子 质量 ， 由 此 来 表征 蛋白 。 虽 然 这 种 方法 有 很 多 局 限 性 ， 但 是 已 可 以 得 到 感 兴趣 的 “ 必 片 ” 板 。 垂直 分 离 法 ”为 了 避免 使 用 二 维 凝 胶 电 泳 ， 现 在 正在 检测 一 些 新 的 方法 ， 综 合 运用 两 种 或 多 种 已 经 使 用 的 分 离 方 法 ， 使 其 能 够 达到 二 维 凝 胶 电 泳 的 分 离 能 力 与 通 量 。 由 于 液 相 色谱 与 毛细 管 电泳 易 实现 自动 化 ， 引 起 了 人 们 特殊 的 兴趣 ， 现 在 正在 实验 其 潜在 的 “高 通 量 ”能 力 。 Link 和 他 的 同事 用 二 维 色谱 的 方法 ， 对 酵母 核糖 体 中 蛋白 质 成 分 进行 了 研究 (Link et wz .，1999)。 先 用 蛋白 酶 消化 纯化 的 酵母 80S 核糖 体 ， 用 阳离子 交换 (SCX) 柱 进行 纯化 ， 采 用 12 步 分 步 洗涤 液 ， 再 进入 反 相 色谱 柱 中 进行 纯化 ， 最 后 对 抽 提 液 用 串联 质谱 进行 分 析 。 在 一 个 简单 的 循环 中 ， 所 预测 的 78 个 核糖 体 蛋 白 中 的 75 个 被 鉴定 出 来 了 。 令 人 感 兴 趣 的 是 ， 用 同样 的 方法 对 整个 酵母 细胞 抽 提 物 进行 分 析 时 ， 鉴 定 出 了 78 个 蛋白 中 的 71 个 。 运 用 一 种 新 的 毛细 管 柱 ， 对 用 胰 和 蛋白 酶 酶 解 的 蛋白 质 ， 这 种 方法 的 灵敏 度 可 达 10fmol 级 水 平 。 一 段 时 间 以 来 ， 高 效 液 相 色谱 (HPLC) 被 用 于 作为 分 离 蛋 白质 和 肽 的 一 种 方法 。 最 近 ， 由 于 使 用 毛细 管 柱 ， 这 种 方法 在 微量 化 和 自动 化 方面 得 到 了 改进 。 人 们 一 直 试图 把 反 相 毛细 管 HPLC 和 成 分 收集 结合 起 来 ， 然 后 直接 加 到 MALDI-TOF #8, Edman 测序 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 上 (Grimm and Grasser，1998)。 超 高 压 毛 细 管 液 相 色谱 可 以 使 HPLC 的 分 析 速 度 提 高 2~3 倍 ， 同 时 在 流量 相同 的 情况 下 ， 可 以 提高 被 鉴定 分 析 物 的 数目 (MacNair et al., 1999). 有 报道 对 上 面 所 提 到 的 红外 -MALDI-MS 49d FRET SF PE (Eckerskorn et al., 1997b)。 用 HPLC 分 离 蛋 白质 复合 物 ， 按 照 流出 时 间 ， 把 洗 液 直接 收集 到 PVDF RE Avy, PVDF 膜 放 在 基质 溶液 中 ， 然 后 取出 进行 红外 -MALDI-MS 扫描 。 有 报道 说 用 冰 作为 基质 ， 能 够 得 到 较 好 的 图 谱 。 这 为 运用 扫描 红外 -MALDIMS， 对 冰冻 组 织 进行 原 位 蛋 自分 析 开 辟 了 一 条 道路 (Berkenkamp et al., 1996). Opiteck 等 人 (1998) 一 直 在 寻求 对 二 维 -HPLC 改进 并 且 已 经 研制 出 一 套 自动 化 程 度 很 高 的 二 维 -HPLC 方法 ， 其 分 离 原理 与 二 维 凝 胶 电泳 相似 。 在 他 们 的 方法 中 ， 先 根 据 和 蛋白 质 大 小 用 排 阻 色谱 分 离 蛋 白 ， 馏 分 自动 进入 反 相 液 相 色谱 ， 这 样 就 得 到 了 二 维 色 谱 图 。 分 析 物 被 转移 到 96 孔 板 上 ， 然 后 自动 加 到 MALDI-MS 靶 上 进行 鉴定 。 一 个 典型 的 分 离 过 程 可 以 得 到 576 个 组 分 ， 同 时 可 以 在 线 分 析 MS 结果 。 因 此 ， 在 这 种 分 析 过 程 中 ， 人 的 干预 是 很 少 的 。 利 用 这 种 方法 在 转基因 的 大 肠 杆 菌 裂 解 液 中 成 功 鉴定 出 两 种 基 因 产 物 ， 非 受 体 酷 胺 酸 激酶 和 8- 内 醋 胺 酶 src 同 源 结 构 域 (Opiteck et al .，1998)。 这 种 方法 有 许多 优点 ， 样 品 分 离 可 以 重复 多 次 、 加 样 过 程 、 分 离 过 程 和 馏分 收集 都 可 以 自动 化 ， 洗 涤 液 中 的 蛋白 可 以 直接 用 质谱 分 析 。 目 前 ， 这 种 方法 的 分 离 能 力 还 不 高 ， 还 有 一 段 很 长 的 路 要 走 。 但 是 ， 通 过 不 断 的 改进 和 电 喷 雾 串 联 质谱 分 辨 能 力 的 提高 ， 最 终 这 些 馏分 中 的 蛋白 可 能 被 逐步 鉴定 。 对 于 临床 蛋白 样品 的 检查 ， 毛 细 管 电泳 由 于 它 上 具有 快速 、 高 度 重 复 性 、 灵 敏 度 高 等 优点 ， 被 证 明 是 一 种 非常 有 效 的 方法 。 例 如 ， 它 已 被 应 用 于 诊断 腺 苷 基 琥 珀 酸 裂解 酶 (adenylosuccinase ) 缺乏 证 、 肾 病 综合 征 (nephrotic syndrome) 和 癌症 恶 病 质 (Choud- ne 172: 蛋白 质 组 学 hary et al .，1999)。 运 用 CE 和 MALDI-TOF 质谱 在 癌症 亚 病 质 病 人 尿 样 中 ， 鉴 定 出 一 种 糖 重 白 ， 它 在 与 恶 病 质 相关 肌肉 蛋白 的 酶 解 中 起 重要 的 作用 。MS 的 灵敏 性 使 得 它 能 与 CE RA. 还 有 一 些 研究 人 员 运 用 二 维 液 相 电泳 结合 质谱 对 人 类 脑 脊 椎 液 中 低 拷 贝 蛋 白 进 行 了 研究 (Davidsson et wz .，1999)。 这 种 方法 需要 大 量 的 蛋白质 混 合 物 加 到 一 维 上 以 便于 在 流出 液 中 有 足够 的 低 拷 贝 蛋白 ， 可 用 作 MALDI 分 析 。 对 于 血清 和 脑 兰 椎 这 类 的 样 品 ， 由 于 它们 中 含有 大 量 的 血清 蛋白 和 免疫 球 重 白 ， 在 许多 分 析 中 ， 可 能 屏蔽 一 些 别 的 重要 蛋 白 的 出 现 。 所 以 ， 检 测 低 拷贝 蛋白 时 ， 更 要 加 大 样品 量 。 由 于 “芯片 ”的 使 用 ， 毛 细 管 电泳 在 微小 化 方面 正在 取得 重大 的 进展 (Becker et al., 1998; Kopp et al., 1997; Yao et al., 1999). 4 Yao 等 人 (1999) 通过 运用 一 个 te 4~S5em, RA 40nm IRB “OH”, SA BASRA, Mee 们 在 214nm 光 吸 收 值 或 激光 激发 荧光 量 (对 于 能 衍生 出 荧光 的 样品 )。 并 预言 微 阵 列 和 芯片 形式 的 二 维 凝 胶 电泳 不 久 将 变 为 可 能 (Yao et al., 1999). 在 将 这 种 微型 分 离 与 基于 质谱 和 白 质 鉴定 连接 在 一 起 时 ， 一 个 主要 的 障碍 是 怎样 才 能 将 分 离 的 蛋白 充分 转移 进入 质谱 。 低 浓度 少量 蛋白质 由 于 被 吸收 到 表面 上 而 易于 丢 失 。 如 果 人 工 过 多 干预 又 易 被 污染 。 由 于 这 些 原因 人 们 设计 了 一 种 装置 ， 通 过 它 可 以 直 接 将 微量 制备 液 相 系 统 与 ESI-MS 直接 联系 起 来 。 以 减少 液体 向 表面 吸附 过 程 中 损失 及 人 对 少量 样品 的 控制 (Figcys and Aebersold, 1999). 同样 还 设计 出 一 种 装置 ， 它 可 以 在 样品 进入 ESI-MS 以 前 ， 通 过 C18 反 相 柱头 ， 对 样品 进行 富 集 ， 这 种 装置 可 把 灵敏 度 提 高 到 fmol 级 水 平 (Figcys and Aebersold, 1999). 4.2 不 依赖 分 离 的 方法 :“ 蛋 白质 芯片 ” | 尽管 在 微型 化 和 运用 多 种 方法 综合 起 来 鉴定 蛋白 方面 取得 了 进展 ， 但 是 上 面 描述 的 | 依靠 分 离 的 技术 相对 来 说 仍 需要 较 多 的 蛋白 质 样品 。 并 在 一 系列 过 程 中 需要 多 步 操作 。 | 运用 “分 子 识 别 ” 是 一 种 很 好 的 方法 ， 它 不 仅 能 用 于 这 类 分 析 ， 并 且 能 减少 分 析 时 所 需 样品 的 量 。 其 原理 是 用 分 子 间 特定 的 识别 机 制 ， 来 分 离 、 检 测 和 确定 目标 分 子 。 利用 分 子 识别 最 成 功 的 例子 是 “DNA 芯片 ”技术 的 使 用 ， 它 利用 固定 在 靶 上 的 碱 基 与 荧光 标记 核酸 探 针 上 碱 基 间 相互 作用 来 快速 分 析 成 千 上 万 的 不 同 序 列 〈Bowtell， 1999; Cheung et al., 1999). cDNA 或 合成 的 寡 核 苷 酸 序列 紧密 排列 在 玻璃 芯片 上 。 个 3.6cm2 芯片 可 以 容纳 10 000 个 基因 (Gerhold et wg .，1999)。 运 用 不 同 的 颜色 来 标记 cDNA 探 针 ， 同 时 与 相应 的 必 片 杂交 ， 可 以 比较 健康 组 织 与 疾病 组 织 间 的 RNA 表达 谱 ， 现在 这 种 方法 已 经 应 用 于 诸多 方面 的 研究 (Alizadeh et al., 2000; Alon et al., 1999; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999; Pollack et al., 1999; Wang et al., 1999). 依赖 于 分 子 识别 的 “蛋白 质 芯 片 ” 类 似 于 “DNA 芯片 ”， 将 在 蛋白 质 表 达 谱 方面 产 生 重 大 的 影响 。 所 以 ， 人 们 在 发 展 “ 和 蛋白 质 芯 片 ”方面 有 很 大 的 兴趣 。“ 和 蛋白 质 世 片 ” 技术 有 两 个 关键 因素 : 个 空间 上 固定 能 辨别 单一 蛋白 成 分 的 分 子 ; @ 具 有 检测 混合 物 中 单个 蛋白 与 它们 相对 应 的 识别 分 子 间 相互 作用 的 方法 。 像 人 们 所 预料 的 那样 ， 有 几 个 实 验 室 已 经 开始 发 展 类 似 这 样 的 方法 。 然 而 ， 直 接 效仿 “DNA 芯片 ”的 方法 有 许多 困难 。 例如 ， 用 不 同 的 荧光 ， 像 标记 cDNA 那样 来 标记 蛋白 质 有 好 多 内 在 的 困难 。 首 先 ， 莹 光 第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 mes 染料 与 蛋白 质 的 结合 过 程 没 有 像 核 酸 分 子 结合 的 那样 易于 控制 ， 不 同 的 荧光 染料 与 不 同 样品 中 同一 蛋白 结合 效率 的 微小 差别 将 导致 定量 比较 的 失败 。 用 单一 位 点 标记 特异 性 位 点 虽然 能 克服 上 述 缺 点 ， 但 是 将 导致 灵敏 度 的 降低 。 而 且 ， 与 核酸 结合 可 以 预测 杂交 后 荧光 染料 的 变化 ， 可 是 却 不 能 预测 与 蛋白 质 结合 后 荧光 染料 的 变化 。 这 样 ， 固 定 的 分 子 识别 目标 蛋白 的 能 力 可 能 受到 结合 的 荧光 集团 的 影响 ， 而 这 种 影响 很 难 预测 或 很 难 控 制 ， 这 意味 着 固定 在 空间 特定 位 置 用 以 识别 单一 蛋白 的 蛋白 质 忌 片 序 列 需要 新 的 方法 来 产生 信号 分 子 ， 通 过 它 来 检测 与 目标 分 子 蛋白 间 的 相互 作用 。 下 面 我 们 列 出 一 些 正在 发 展 的 替代 方法 ， 这 些 方法 有 的 已 经 得 到 了 很 好 的 发 展 ， 但 是 在 蛋白 质 表 达 分 析 应 用 方面 还 不 能 与 “蛋白 质 芯片 ”相提并论 〈 例 如 ， 同 时 分 析 成 千 上 万 种 蛋白 )， 仅 可 以 用 于 一 些 中 等 的 蛋白 质 表 达 分 析 ， 其 他 的 方法 处 于 原始 阶段 ， 仅 可 潜在 应 用 于 “和 蛋 日 质 芯 片 ” WE. 蛋白 质 识 别 分 子 ” 最 明显 的 能 够 有 效 作为 识别 蛋白 的 分 子 是 抗体 ， 这 种 分 子 识别 方 式 已 被 广泛 应 用 于 许多 方面 。 已 使 用 的 抗体 有 单 抗 和 多 抗 。 如 果 用 抗体 作 “ 和 蛋白 质心 片 ” 必 须 遵 循 以 下 几 个 重要 原则 : 首先 ， 必 须 有 支持 获得 和 选择 单个 蛋白 的 方法 ， 这 个 蛋白 甚至 是 经 翻译 后 修饰 的 。 这 个 抗体 必须 是 高 度 特异 的 ， 这 意味 着 它们 能 够 在 一 个 复 杂 混 合 物 中 识别 和 区 分 单个 蛋白 。 其 次 ， 混 合 物 是 单个 蛋白 与 它们 的 抗体 结合 必须 在 相 似 的 条 件 下 ， 后 者 在 一 定 程 度 上 可 以 通过 仔细 控制 抗体 产生 过 程 中 筛选 步骤 (screening step) 来 达到 。 很 明显 ， 现 行 的 这 套 产生 抗体 的 方法 不 适用 于 基因 组 范围 “和 蛋白 质心 片 ”技术 的 发 展 ， 然 而 ， 它 适用 于 中 等 程度 蛋白 质 表 达 分 析 。 例 如 ， 诊 断 蛋白 质心 片 能 够 用 于 检测 几 十 种 蛋白 表达 和 翻译 后 修饰 ， 这 是 对 现行 诊断 技术 的 一 个 重大 改进 。 嗜 菌 体 显示 抗体 技术 的 产生 能 够 在 大 范围 内 获得 蛋白 质 识别 分 子 ， 促 进 了 “和 蛋白质 尾 片 ”技术 的 发 展 。 目 前 利用 这 项 技术 产生 抗体 的 应 用 参看 第 十 二 章 。 现在 有 多 种 方法 应 用 于 量 昌 质 (包括 抗体 ) 的 排列 方面 ， 有 文章 综述 了 这 方面 的 进 展 (Blawas and Reichert，1998)。 最 近 ，Rowe 等 人 提出 了 一 种 具有 应 用 洪 力 的 排列 方 法 ， 他 们 将 抗体 以 足够 的 间隔 点 在 显 微 带 上 上， 以便 能 够 检测 多 价 抗原 (multi-bound antigens)。 简单 地 说 ， 他 们 在 一 个 经 过 硅烷 化 和 了 酯 化 的 玻璃 表面 上 ， 涂 了 一 层 NeutrA- vidin， 这 就 形成 了 一 个 流动 微型 组 件 ， 把 标记 了 生物 素 的 俘获 性 抗体 点 在 6 个 垂直 的 道 上 ， 然 后 按照 正确 的 角度 把 样品 加 到 抗体 上 ， 这 样 可 以 同时 检测 6 个 样品 中 的 分 析 物 。 对 俘获 的 分 析 物 可 以 用 “夹层 ”分 析 法 检测 出 来 ， 即 用 荧光 标记 抗体 检测 器 和 基于 CCD 的 读数 计 (Rowe et al., 1999). 另 一 种 方法 用 玻 水 胶 作 为 模子 ， 把 蛋白 质 分 子 膜 放 到 镀金 表面 上 或 把 蛋白 质 固定 排 列 在 硅化 的 玻璃 面 上 的 聚 丙 烯 酰胺 垫上 (Guschin et wz .，1997)。 后 者 使 用 3% 酰 胺 溶 液 ， 其 中 含有 甘油 、 亚 甲 基 蓝 、N, N,N',N -四 甲 基 乙 二 胺 ， 光 照 使 其 聚合 ， 然 后 在 其 表面 覆盖 一 层 不 透明 的 铬 膜 后 ， 在 其 表面 形成 格子 。 用 镀金 的 光学 显 微 针 给 每 一 个 胶 垫上 加 上 1lnl RRA ERR EA (IgG1)、 免 子 免疫 球 蛋白 或 牛 血 清 蛋白 溶液 ， 使 基 质 活 化 。 作 者 已 经 用 荧光 标记 鼠 IgG1 抗体 特定 鉴定 出 在 细小 的 玻璃 条 上 排列 的 鼠 IgGl. 抗体 并 不 是 惟一 地 用 在 “和 蛋白质 芯 片 ” 上 的 蛋白 质 识别 分 子 。 任 何 分 子 集团 只 要 它 具有 相应 的 亲 合 力 并 能 特定 辨认 出 单个 蛋白 质 分 子 ， 都 可 以 固定 起 来 ， 形 成 “蛋白 质 世 - 174 - 蛋白 质 组 学 片 "。 运 用 抗体 作为 重 昌 质 识别 分 子 有 许多 缺点 。 最 大 的 缺点 是 芯片 保存 期 不 能 太 长 ， 且 在 分 析 的 蛋白 质 混合 样 中 ， 任 何 具 有 蛋白 酶 活性 的 物质 可 能 “降解 ”芯片 。 运 用 组 合 化 学 获得 许多 化 合 物 组 成 的 大 型 文库 为 找到 更 好 的 蛋白 质 识别 分 子 提供 了 源泉 ， 但 是 切 记 还 需要 得 到 一 个 有 效 的 扫描 蛋 折 质 识 别 分 子 与 单个 蛋白 分 子 相 结合 的 方法 。 “Aptamers” 是 单 链 窒 核 苷 酸 ， 它 对 于 一 些 具 有 三 维 构象 的 分 子 〈 例 如 蛋白 质 ) 具 有 高 的 亲人 合力 。 长 度 上 将 近 有 几 百 个 核 昔 酸 组 成 的 Aptamers 的 文库 固定 在 合适 的 表面 上 ， 对 加 和 蛋 日 进行 扫描 ， 可 得 到 一 些 有 关 靶 和 蛋 昌 的 构象 、 氢 键 的 位 置 和 其 他 一 些 有 助 于 构建 靶 和 蛋白 三 维 结构 的 数据 (Brody et al., 1999; Ellington and Szostak, 1990; Her- mann and Patel, 2000; Roming et al .，1999)， 这 个 方法 具有 很 大 的 应 用 潜力 。 最 近 运 用 分 子 印迹 聚合 物 (molecularly sien polymers) 得 到 了 一 些 人 造 受 体 或 抗原 结合 位 点 。 分 子 印 迹 聚 合 物 (molecularly imprinted polymer) ”分 子 印 迹 (molecularly imprint- ing) 通过 模仿 聚合 模 上 模板 分 子 的 形状 在 其 表面 上 形成 了 人 造 识 别 位 点 ， 这 样 就 形成 了 分 子 印迹 聚合 物 。 推 测 任何 通过 形状 起 作用 的 生化 位 点 ， 如 抗体 -抗原 相互 作用 、 底 物 - 酶 的 结合 和 受 体 - 配 体 结合 ， 都 可 以 被 分 子 印迹 聚合 物 来 模仿 (Ansell and Mosbach, 1998; Hauptand Mosbach, 1998; Ye et al., 1998) 现 用 于 构建 分 子 印迹 聚合 物 有 两 种 通用 方法 。 第 一 种 方法 首先 混合 模板 分 子 形成 聚 合 物 单 体 ， 然 后 硬化 基质 并 用 溶剂 把 模板 洗 掉 ， 这 使 得 聚合 物 表 面 凹 凸 不 平 与 模板 分 子 表面 相 吻 合 ， 能 够 用 来 俘获 样品 中 靶 分 子 。 目 前 ， 可 用 于 制作 聚合 物 的 单 体 与 交 联 剂 有 多 种 ， 不 仅 能 够 符合 聚合 物 所 要 求 的 特异 性 和 亲 合 性 ， 而 且 还 能 有 一 定 的 柔韧 性 ， 耐 高 温和 高 压 ， 与 酸 、 碱 还 有 一 些 活 性 溶剂 不 反应 (Owens et al., 1999). fi) 4N Takeuchi 和 同事 通过 保持 除草 剂 含量 不 变 ， 改变 异 丁 基 酸 和 三 氟 甲 基 乙酸 的 比例 ， 合成 出 tri- azine 除草 剂 组 合 文库 。 加 入 乙 且 ， 释 放出 除草 剂 ， 就 合成 出 了 分 子 印迹 聚合 物 (Takeuchi et cl .，1999)。 通 过 比较 分 子 腐 合 聚合 物 孵育 前 后 自由 herbicide 浓度 来 评价 形成 的 分 子 印 迹 聚 合 物 的 好 坏 。 同 样 的 ， 别 的 研究 人 员 在 1, 3- 二 甲 基 黄 味 叭 (theo- phylline) 存在 的 情况 下 ， 使 异 丁 基 酸 聚合 ， 得 到 了 另外 一 种 分 子 印 迹 聚 合 物 ， 将 该 聚 合 物 碾 成 粉末 ， 用 甲醇 -乙酸 抽 提 除去 1, 3- 二 甲 基 黄 味 吟 ， 用 很 小 的 分 子 印迹 聚合 物 颗 粒 来 装 制 成 柱子 ， 这 种 柱子 能 特异 结合 1, 3- 二 甲 基 黄 味 哈 。 有 人 建议 用 磁性 的 氧化 铁 来 修饰 这 些 分 子 印 迹 聚 合 物 ， 那 么 在 一 定 的 磁场 强度 下 可 把 这 些 分 子 印迹 聚合 物 从 溶液 中 SAH HE (Ansell and Mosbach, 1998). 另 一 种 制备 MIP 的 方法 是 用 云母 作为 吸收 底 物 ， 云 母 是 一 种 自动 展 平 的 物质 (Shi et al .，1999)。 把 蛋白 质 涂 在 云母 的 表面 上 ， 再 在 其 上 覆盖 一 层 双 糖 ， 它 能 够 模仿 蛋白 质 表面 构象 。 随 着 辉 光 放电 等 离子 体 沉 积 ， 六 氟 丙 烯 多 聚 膜 沉 积 在 糖 表 面 上 ， 然 后 除去 云母 和 蛋白质 层 ， 留 下 了 表面 镀 糖 的 该 蛋白 印 迹 物 (Shi et wd .，1999)。 用 此 方法 合成 出 了 抗 生 蛋 白 链 菌 素 (streptavidin) 的 MIP， 在 牛 血 清 蛋 白 与 生物 素 形成 混合 物 中 ， 它 主要 与 生物 素 结合 。 很 明显 ， 如 果 这 些 MIP 要 发 展 成 为 真正 适合 蛋白 质心 片 认 知 表 面 ， 还 需要 做 大 量 的 工作 。 有 三 个 关键 问题 。 第 一 ， 包 含有 识别 单一 蛋白 独立 的 区 域 的 MIP 表面 是 否 完 整 ， 第 二 是 没有 一 种 好 的 方法 来 检测 蛋白 质 与 MIP 结合 的 方法 不 明确 。 最 后 一 个 也 是 最 重要 的 一 个 问题 是 模仿 一 个 完整 蛋白 而 产生 的 MIP 直接 对 应 于 这 个 蛋白 中 的 所 有 的 第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 + aes 构象 表 位 。 然 而 人 们 正 逐 渐 认 识 到 ， 由 于 蛋白 质 的 空间 结构 是 它们 自己 “设计 ”的 模 型 。 因 此 ，MIP 是 否 能 有 效 地 与 单一 蛋白 特异 的 结合 ， 这 个 问题 并 不 清楚 。 检测 方法 ”快速 、 平 行 和 灵敏 地 检测 蛋白 质 与 “ 蛋 日 质心 片 ” 上 认 知 分 子 间 相互 作 用 的 方法 ， 也 是 对 人 们 一 个 重大 的 挑战 。 现 在 发 展 的 许多 方法 非常 有 效 并 且 也 不 需要 复 杂 的 装置 ， 但 是 并 不 适用 于 “和 蛋白质 芯 片 ”。 如 下 面 所 示 ， 例 如 ， 如 上 所 述 的 用 第 二 种 荧光 标记 认 知 分 子 检测 俘获 的 蛋白 的 方法 并 不 适用 。 对 基于 荧光 的 光学 纤维 传 感 磊 ， 尽 管 有 其 潜在 的 缺点 ， 但 人 们 还 是 很 感 兴趣 的 。 这 当中 俘获 抗体 直接 被 光学 纤维 探 针 所 围 绕 (Tempelman et al., 1996). Tempelman 和 他 的 同事 发 展 了 一 个 体系 ， 能 同时 检测 4 个 样品 中 单一 分 析 物 ， 对 葡萄 球菌 肠 毒素 ， 其 最 佳 检 测 范围 是 5 一 200 ng/ml， 别 的 研 究 者 提出 了 不 同 于 上 述 的 另外 一 种 依赖 荧光 的 检测 方法 ， 抗 体 被 基质 所 覆盖 ， FF AA 光标 记 的 抗原 充分 结合 。 测 试 样品 中 未 被 标记 的 抗原 可 以 取代 荧光 标记 的 抗原 ， 然 后 检 测 释 放 的 荧光 量 。 美 国联 邦 药 物 管理 局 用 这 种 方法 定量 分 析 尿 中 可 卡 因 (cocaine) 的 代 谢 物 (Yu et w.，1996)， 而 海军 研究 院 用 它 来 分 析 爆 炸 物 (Marang et al., 1998). 3% 些 研 究 所 报告 的 最 小 检测 量 在 fmol 一 pmol (10° '~10°'*) 水 平 。 尽 管 目前 这 些 方法 并 不 能 称 作 “和 蛋白质 忌 片 ”， 人 们 可 以 预测 一 套 体系 ， 将 设计 好 的 蛋白 质 识 别 分 子 排列 在 一 个 支持 面 上 ， 它 们 都 结合 等 量 荧 光 ， 当 其 结合 单一 蛋白 时 释放 所 结合 的 荧光 ， 单 一 位 点 上 所 剩 的 荧光 量 与 样品 混合 物 相应 的 蛋 日 量 成 反比 。 生物 传感器 ， 包 括 等 离子 体 共振 (SPR) 成 像 生物 传感器 ， 能 够 对 蛋白 质 与 别 的 蛋 和 白 或 配 体 间 相互 作用 进行 实时 检测 (Gizeli and Lowe，1996)， 这 些 装置 有 一 层 镀 有 人 金 BHR, BRAS, BER LBR-EERMAARE (SAM), WPA KBR (Laricchia Robbil et al., 1996), #@ RAE HIF HE (Vikinge et al., 1998; Watts et al., - 1994) 或 硫 代 烷 烃 混 合 物 (Dubrovsky et al., 1999; Lahiri et al., 1999), HERA 1k 学 性 质 要 求 是 能 把 蛋白 质 和 配 体 固 定 在 传 感 夯 上 ， 当 目标 蛋白 结合 上 后 ， 基 质 的 反射 指 数 发 生变 化 ， 同 时 用 一 些 二 进 制 检测 器 反映 这 些 变化 (Lahiri et al., 1999). (BAA Se, 如 果 把 这 些 装 置 表面 积 扩 大 化 ， 意 味 着 它 能 容 有 更 多 的 蛋白 质 识 别 位 点 ， 而 且 将 其 微小 化 ， 这 些 都 意味 着 生物 传感器 具有 更 大 的 应 用 潜力 。 石英 结 唱 微 平衡 〈quartz crystal microbanlance) 装置 也 是 一 种 检测 抗体 一 抗原 相互 作用 的 微妙 方法 。 在 这 个 方法 中 ， 抗 体 通 过 氨基 与 乙 二 胺 高 聚 膜 与 石英 晶体 相 结合 (Nakanishi et wy .，1996)， 然 后 ， 置 于 样品 溶液 中 ， 催 化 ， 使 抗体 与 目标 抗原 相 结合 ， 导致 唱 体 表面 质量 微小 变化 ， 这 些 变化 可 以 通过 检测 两 根 金 电极 间 振 动 频率 的 变化 来 检测 出 来 ， 这 个 方法 的 灵敏 度 使 得 它 可 以 用 于 检测 单个 蛋白 分 子 与 单个 抗体 分 子 间 相 互 作 用 。 别 的 能 用 于 检测 单个 分 子 间 相互 作用 的 方法 包括 扩 增 力 生 物 传 感 器 (force-amplified biological sensor), FH Colton 和 他 的 同事 发 明 (Baselt et al .，1997)。 它 是 由 原子 力 显 微 镜 改造 过 来 的 ， 运 用 微小 化 磁 珠 与 微型 压 阻 悬 臂 结合 起 来 检测 抗体 抗原 相互 作用 。 最 后 ， 通 过 结合 在 微 电 循环 中 的 生物 传感器 来 检测 ， 这 种 生物 传感器 是 用 分 子 离子 通道 作 为 检测 装置 (Cornell et wz .，1997)。 在 这 个 方法 中 ， 以 合成 脂 膜 为 离子 通道 ， 在 其 下 层 一 个 金 电极 与 一 个 短 杆菌 肽 分 子 相 接触 ， 在 其 上 层 有 流动 的 短 杆菌 肽 分 子 ， 流 动 的 短 杆菌 肽 分 子 与 抗体 结合 。 如 果 抗 原 与 抗体 结合 则 改变 了 该 通道 的 电阻 。 这 种 方法 有 许多 优点 ， 包 括 可 以 把 检测 信号 进行 放大 ; 这 样 单 一 抗原 一 抗体 反应 导致 了 每 秒 钟 上 万 的 离 子 流 的 移动 (Turner, 1997). - 176° 蛋白 质 组 学 ae 结语 尽管 二 维 凝 胶 电 泳 有 它 本 身 的 局 限 性 ， 但 是 到 目前 为 止 ， 就 分 辩 率 而 言 ， 任 何 一 种 别 的 方法 都 不 能 同 它 相 提 并 论 ， 即 能 同时 分 析 几 千 个 蛋白 质 (Abbott，1999)， 这 一 点 没有 人 怀疑 。 而 且 ， 已 经 有 了 一 些 半 自动 和 高 通 量 的 方法 来 鉴定 2-DE 分 离 的 蛋白 质 并 上 且 这 种 方法 还 在 一 直 提 高 。 因 此 ， 这 意味 着 2-DE 技术 和 它 的 一 些 支持 技术 在 很 长 一 段 时 间 内 将 得 到 广泛 应 用 。 但 是 这 个 技术 的 局 限 性 使 得 人 们 有 理由 去 发 展 一 些 新 的 技术 来 研究 蛋白质 表达 谱 。 我 们 综述 了 这 方面 的 一 些 进展 ， 并 且 认 识 到 未 来 的 高 通 量 研究 蛋白 质 表 达 技 术 必 须 有 多 方面 的 方法 ， 一 些 新 的 技术 还 需 进 一 步 发 展 。 目 前 ， 研 究 机 构 和 商 业 企 业 对 快速 增长 的 “和 蛋白质 组 学 ”表现 出 了 浓厚 的 兴趣 ， 这 些 将 加 快 一 些 新 技术 发 展 的 进程 。 (HIT X H Rel e 校 ) 参考 文献 Abbott, A. 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Gray 1. 518 良好 的 药物 应 该 具有 有 效 性 和 专 一 性 。 一 般 来 说 ， 它 们 应 该 首先 与 其 靶 标 相互 作用 而 对 其 他 任何 分 子 仅 产 生 最 低 限 度 的 效应 。 药 物 研 发 的 主要 要 求 之 一 就 是 确证 候选 化 合 物 对 潜在 靶 标 的 抑制 作用 〈 目 标 有 效 性 )， 而 不 产生 预计 之 外 的 效应 。 药 物 发 展 和 毒 理 学 分 析 研 究 中 共同 存在 的 缺点 是 : 只 注重 表 型 的 观察 和 单个 大 分 子 或 酶 解 活性 。 对 毒性 或 药理 活性 的 观测 常 维持 在 分 子 水 平 上 的 简单 理解 ， 而 除 被 检测 的 效应 外 ， 候 选 药物 作 用 于 洪 在 靶 分 子 上 的 直接 或 间接 的 效应 依然 未 知 。 为 了 弥补 药理 效应 或 毒性 观察 与 分 子 水 平 上 对 效应 理解 之 间 的 差距 ， 完 全 有 必要 发 展 能 更 大 规模 提出 生物 学 问题 的 技术 。 与 迄今 为 止 通过 传统 测试 得 到 的 结果 相 比 ， 这 些 技术 应 该 更 深 乏 地 洞察 疾病 和 药理 学 或 毒 理学 效应 的 分 子 过 程 。 理 解 这 些 机 理 能 改善 在 药物 发 展 重大 进程 中 决策 的 作出 ， 同 时 能 提高 研发 过 程 的 工作 效率 。 在 这 些 技 术 的 发 展 中 ，DNA 测序 方法 的 发 展 是 一 个 重要 的 进展 ， 这 一 进展 揭示 了 原核 生物 和 真 核 生 物 的 基因 和 相应 蛋白 质 的 全 部 功能 。 基 因 组 全 序列 的 间 世 揭 开 了 生物 学 研究 领域 的 新 篇 章 。 但 是 ， 特 定 生 物体 的 基因 组 序列 本 身 的 价 值 毕竟 有 限 。“ 功 能 基因 ”这 个 词 涉及 一 个 新 的 研究 领域 ， 这 一 领域 使 用 蛋白 质 组 分 析 和 高 密度 的 DNA 阵列 等 技术 ， 并 充分 使 用 在 基因 序列 中 所 包含 的 丰富 信息 。 在 单 次 实验 中 ， 蛋 白质 组 分 析 可 以 检测 并 定量 分 析 成 百 上 千 个 蛋白 质 。 这 为 定量 和 定性 评价 具有 不 同 表 型 或 基因 型 的 组 织 细胞 之 间 、 正 常 与 病理 状态 、 给 药 与 不 给 药 时 蛋 白质 的 表达 差异 提供 了 可 能 。 根 据 所 使 用 的 模型 系统 ， 对 不 同 的 处 治 方法 或 疾病 的 不 同 阶段 的 反应 可 以 随时 跟踪 ， 可 以 实现 对 药 效 动力 学 研究 或 对 疾病 进程 相关 的 变化 特征 进 行 有 效 识 别 。 表面 上 看 ， 蛋 白 组 学 研究 似乎 是 多 余 的 技术 。 在 mRNA 水 平 研 究 基 因 表达 似乎 是 一 种 比 蛋白 质 组 更 简单 而 且 更 灵敏 的 手段 。 但 是 ， 在 生物 学 样品 的 鉴定 中 有 大 量 的 证 据 说 明 蛋 白质 组 分 析 的 重要 人 性: (1) 通过 mRNA 浓度 的 测定 得 到 的 基因 调控 研究 是 间接 的 ， 仅 能 代表 一 种 间接 的 测量 ， 还 有 很 多 现象 未 能 检测 。 (2) 在 翻译 水 平 的 基因 表达 调控 在 多 数 情况 下 是 起 决定 性 作用 的 ， 如 核糖 体 蛋 白 、 密码 子 使 用 和 E.coli 中 氨基 酸 生 物 合成 酶 的 调节 衰减 机 理 。 这 类 调控 通过 mRNA 的 定 量 分 析 检测 不 到 。 (3) 测定 细胞 中 蛋白 的 浓度 时 ， 一 个 常 被 忽视 的 因素 是 它 的 降解 速度 ， 而 蛋白 质 的 降解 可 能 受 调 控 的 影响 (Tobias et al., 1991). (4) 有 一 点 很 重要 ， 翻 译 中 和 翻译 后 的 共 价 修饰 (如 磷酸 化 、 酰 基 化 或 糖 基 化 ) 扮 演 重要 的 生物 学 的 角色 ， 通 常 完 全 改变 蛋白 质 的 性 质 〈 见 第 五 章 和 第 十 三 章 )。 若 干 研 Rg weeeeaeeeee - 182 - 蛋白 质 组 学 究 结果 显示 ， 毒 性 效应 可 以 通过 和 蛋白质 修 饰 的 方式 显示 出 来 (Anderson et al., 1992; Witzmann et al .，1998)， 很 多 修饰 的 蛋白 质 异 构 体 可 以 通过 二 维 凝 胶 电泳 分 开 ， 例 如 凝 胶 中 成 串 的 蛋白 点 代表 具有 不 同 糖 基 化 状态 的 蛋白 质 。 因 而 蛋白 质 组 为 研究 人 员 提 供 了 独特 而 强大 的 检测 和 研究 这 些 修饰 (比如 在 疾病 过 程 中 ) 的 工具 。 对 于 药物 发 展 ， 应 该 认识 到 在 绝 大 多 数 情 况 下 基因 编码 的 功能 高 分 子 都 是 蛋白 质 ， 而 且 药物 的 靶 标 几乎 全 都 是 蛋白 质 。 最 近 的 研究 证 实 ， 转 录 组 与 蛋白 质 组 的 结合 能 够 全 面 理 解 细胞 内 的 分 子 过 程 。 和 蛋白 质 组 实验 表明 ， 作 为 致癌 基因 转 染 的 结果 ， 未 被 加 工 的 无 活性 ICE3 聚集 在 转 染 的 恶性 细胞 中 (图 11.1)。 其 后 的 mRNA 定量 分 析 显 示 ， 活 化 ICE3 的 蛋白 酶 合成 在 这 些 细胞 中 剧烈 下 调 (Wang et al .，1996)， 这 也 就 解释 了 2-DE 胶 上 所 观察 到 的 现象 (Certa et al., 1999). (b) 图 11.1 上 图 分 别 选 自 正 常 老鼠 乳 突 细 胞 (图 左 ) PAA ras 转 染 细胞 (AA) BES 白质 和 mRNA 提取 物 的 2DE-PAGE 胶 (a) 和 Affymetrix 基因 芯片 IM (b) 2-DE 胶 上 的 箭头 表示 未 被 加 工 ICE3 的 位 置 。 世 片区 域 表 示 粒 酶 B 基因 被 包 埋 。 粒 酶 B 使 ICE3 水 解 激 活 (Wang et ol .，1996)。 这 些 结果 显示 在 H-ras 致癌 基因 的 存在 下 ， 粒 酶 B 的 产生 被 抑制 ， 导 致 未 被 加 工 的 ICE3 前 体 的 聚集 。 似 乎 蛋白 酶 与 凋 亡 通 路 有 关 ， 没 有 蛋白 酶 时 细胞 就 会 亚 性 地 无 控制 地 生长 (Certa et al., 1999), 蛋白 质 合 成 速度 的 调控 是 细胞 对 外 界 环境 条 件 改变 后 产生 反应 的 一 部 分 。 另 外 ， 通 过 细胞 循环 和 分 化 的 细胞 成 熟 也 由 基因 表达 的 调控 所 决定 。 复 杂 的 调控 网 络 多 级 控制 重 白质 的 浓度 和 酶 活性 (Go mRNA 合成 ， 翻 译 ， 修 饰 ， 转 运 ， 和 蛋白 水解 过 程 和 降解 )。 这 样 ， 蛋 白 组 反映 了 环境 条 件 的 变化 。 蛋 白质 组 的 比较 研究 有 助 于 理解 细胞 的 调控 网 络 。 因而 它 是 药物 靶 标 识别 和 确认 、 药 物 的 行为 机 理 研 究 和 药理 学 或 毒性 效应 的 检测 和 推断 的 有 用 工具 。 2. 数据 的 使 用 通过 和 蛋白质 组 实验 得 到 的 数据 量 需 要 借助 计算 机 分 析 。 为 了 验证 观测 资料 ， 使 得 预 测 可 靠 ， 必 须 进 行 重复 样品 的 重复 凝 胶 试 验 ， 同 时 得 到 储存 、 分 析 。 实 验 的 变化 可 能 非 常 大 ， 特 别 是 在 引入 遗传 变异 的 情况 下 ， 比 如 使 用 远 系 杂交 种 动物 的 毒 理 学 研究 (Steiner et dl .，1995)。 很 明显 ， 统 计 学 对 阐明 从 二 维 凝 胶 电泳 得 到 的 大 量 数据 〈 常 有 错误 倾向 ) 极其 重要 。 除 标准 二 维 凝 胶 电泳 分 析 工 具 的 传统 统计 分 析 〈 平 均值 ， 标 准 第 十 一 章 ， 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理 学 中 的 应 用 - 183 - 差 ， 可 信 度 ) 外 ， 还 有 两 种 基本 方法 可 以 检查 从 这 些 实验 得 到 的 数据 ; (1) 蛋白 质 组 在 整体 上 可 被 看 作 是 反映 环境 变化 的 生物 传感器 。 像 “化 合 物 A 的 行为 是 否 与 化 合 物 B 类 似 ” 这 样 的 问题 可 以 通过 这 种 方法 解决 。 (2) 从 更 细致 的 分 析 可 以 得 知 ， 化 合 物 作 用 于 单个 蛋 上 质 或 一 组 重 日 的 效应 与 其 代 谢 途 径 或 不 同 的 功能 类 别 有 关 。 这 使 得 观察 到 的 药 效 更 合理 ， 疾 病 、 药 理学 活性 或 毒性 的 潜在 诊断 标记 更 准确 。 下 面 ， 将 详细 地 讨论 说 明 两 种 方法 的 实例 ， 尤 其 着 重 于 药物 研发 和 毒物 学 方面 。 2.1 比较 分 析 可 以 假定 两 种 具有 相同 性 质 的 化 合 物 在 细胞 中 引发 相似 的 反应 。 摄 药 (响应 ) 下 的 蛋白 质数 量 与 未 摄 药 (空白 ) 的 相对 比值 可 以 用 一 系列 数值 代表 (" 摄 药 比 ")。 最 后 得 到 的 表达 谱 可 以 通过 各 种 条 件 来 评价 ， 提 供 所 研究 化 合 物性 质 的 有 价值 信息 。 这 种 方法 可 以 通过 抗菌 研究 的 实例 加 以 验证 。 筛选 二 氧 叶酸 还 原 酶 (DHFR) 抑制 剂 时 得 到 一 种 类 似 三 甲 氧 蔷 二 氨 喀 啶 (Tmp) 的 2，4- 二 氨基 喀 啶 的 衍生 物 Ro-64-1874。 使 用 流感 嗜 血 杆菌 〈 了 Haemzopjilus influen- zae) 作为 模型 系统 的 蛋白 质 组 分 析 得 到 一 套 较 好 表现 抗菌 效果 的 数据 库 比 较 的 数据 。 按 以 下 方法 对 Ro-64-1874 的 响应 与 标准 的 抗生素 响应 加 以 比较 : 根据 摄 药 比 ， 蛋 日 点 分 成 三 组 四 增加 的 点 〈 摄 药 比 > 1.25) 加 减少 的 点 〈 摄 药 比 < 0.8) 加 不 变 的 点 (0.8 < 摄 药 比 < 1.25$)。 选 择 摄 药 比 增加 或 者 减少 的 点 作为 进一步 分 析 的 目标 。 通 过 两 种 条 件 下 诱导 /抑制 的 蛋白 点 数 与 总 的 点 数 比值 、 每 种 条 件 下 的 诱导 /抑制 的 蛋白 点 数 来 衡量 两 种 响应 的 相似 程度 (图 11.2)。 这 些 值 的 比率 是 衡量 两 种 效应 相似 程度 和 重要 性 的 较 好 标准 。 将 Ro-64-1874 显示 的 结果 表达 谱 与 数据 库 (包括 转录 、 翻 译 ， 四 氢 叶 酸 合成 ， tRNA 合成 ， 脂 肪 酸 合成 和 DNA 促 旋 酶 的 抑制 反应 ) 中 的 其 他 表达 谱 ，Q 得 到 与 Tmp 和 fii — FAWEMA (sulfamethoxazole, Smz) 的 较 好 的 相关 性 。 预 想 的 Ro-64-1874 的 行为 模 式 就 被 证 实 。 我 们 最 近 选 择 一 种 体外 活性 能 对 抗 促 旋 酶 引发 的 体内 次 级 反应 的 化 合 物 ， 通过 样品 的 比较 ， 显 示 和 蛋白 质 合成 的 抑制 。 这 种 活性 可 以 通过 体外 转录 /翻译 分 析 证 实 。 研究 结果 显示 一 些 化 合 物 的 响应 是 依赖 于 时 间 和 浓度 的 (VanBogelen et al., 1987). 因此 ， 加 入 抗生素 后 ， 需 要 在 不 同时 间 点 和 多 个 浓度 下 检查 行为 模式 尚 不 清楚 的 化 合 物 的 响应 。 这 种 方法 应 当成 为 抗菌 研究 、 药 学 和 毒物 学 、 特 别 是 结构 -功能 关系 研究 领域 中 不 同 的 应 用 手段 之 一 〈 如 Myers et al .，1997)。 对 于 这 种 比较 ， 蛋 白质 点 的 鉴别 并 不 重 要 。 这 种 比较 成 功 的 前 提 是 有 一 个 来 自行 为 方式 已 知 的 化 合 物 的 响应 数据 库 ， 但 这 一 般 是 不 可 能 实现 的 。 具 有 新 颖 行 为 模式 的 化 合 不 会 与 任何 标准 物质 有 意义 的 相关 值 ， 对 于 这 些 化 合 物 更 详细 的 分 析 要 求 对 它们 的 性 质 有 更 好 的 理解 。 一 种 有 趣 的 靶 标 确 认 方 法 是 将 用 药 后 引起 的 基因 表达 谱 的 变化 与 药物 靶 标 编码 的 基因 失 活 或 下 调 引 起 的 变化 相 比 较 。cyclosporine A (CyA) 和 FK506 在 酵母 细胞 上 的 效应 与 编码 其 靶 蛋 白质 的 cal- cineurin 和 FPR1 基因 的 失调 效应 有 关 ， 证 实 使 用 DNA 微分 析 这 种 方法 的 有 效 性 (Mar- ton etal., 1998). = A Ra - 184 = © fess KATY LL ese aad SY ° SB GBA EF 4) ola Bl GC YJ for 8° TEA GH Ll 29 fh Eh AY Bi OEE ° A pL81-9-ON BY GA % TE Be X) ‘tal. — £6 “HA PL8T-p9-ON WAY Bs MHL GH % 8S* HTM YAM GAYS DOC BE SA ( BY FG SE EY TULL Ik PL8I-P9-ON 1/848 AL HERA GARY CHT 42R Th lel AIRE OU dd Ly 09 BOM PLT-9-OM SL IBH Hy MERE ° (1/BUT ) ln ay ely “AUN § (1/8 2) 3 sg Bd °° 5(T/3u pZ) ME Be RS IS (1/3 OZT) FaBe ey — AH MH ZS * (1/3 TE) eM es suey! (1/3W Ze) BM Wpisny sng! (7 /Fw 7) ye Beye wey * y ty BW GH EAS toy Se By GSE UGG EM} (BO > ME STD < She BSA) she A a see BY WY SE LIB ( — Dre +) ° Be HG ETA GHAR [ME I HE GA Se CT) eel 2 2 OY I tk (7) BAM AY WNC S(T) AS WN CL) set BS (7) 3 3 * (7) AS (WL Hh ooh Bl ) (UE ie A - LF EY ES A TBH (avzuanpfur* Fy) BA AY TY Ba UR GE Sp PL8T-P9-ON GH 7/3 OST iy 1/848 TIT UIWIQE UIWIQE (-)urur (ing (-)wre5 cue (-)18wy'g [I (+)T3Suy 8 fo (-)7/swos| 国有 (+)Tau05T Mi FAa 第 十 一 章 ” 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理 学 中 的 应 用 “185 ， 2.2 生物 标志 物 蛋 白质 的 检测 蛋白 质 组 数据 库 能 根据 蛋白 质点 的 强度 反映 一 种 疾病 的 过 程 变化 或 对 一 组 药物 反应 的 变化 。 这 样 ， 蛋 白质 可 以 用 作 特 定 反应 或 疾病 的 奉 代 标 志 物 。 也 许 蛋 白质 组 在 毒 理学 领域 成 功 应 用 最 好 的 例子 是 CyA 效应 的 研究 。 通 过 检查 诱导 方式 ， 可 以 假定 CyA 的 毒 性 机 制 。CyA 是 一 种 应 用 广泛 的 免疫 抑制 剂 ， 但 应 用 中 也 伴随 着 许多 副作用 ， 其 中 最 值得 注意 的 是 肾 毒 。 用 CyA 处 治 后 最 明显 的 结果 是 ， 部 分 蛋白 点 消失 ， 这 些 蛋 白 点 后 来 从 大 鼠 肾 脏 蛋 白质 模式 中 被 鉴定 为 calbindin-D 的 28 kDa 蛋白 (Benito et al., 1995; Steiner et wl . )。 使 用 酶 联 免疫 吸附 分 析 的 进一步 研究 证 实 ， 大 鼠 明 脏 中 calbindin-D 的 28kDa 蛋白 量 持续 减少 (Steiner et al., 1996). ix FH TEE RES HED A 管内 石灰 化 的 增加 (Aicher et al .，1997)。 就 像 以 前 提出 的 那样 (Feher, 1983), WR calbindin-D 28kDa 蛋白 扮演 钙 运 输 的 促进 器 和 和 钙 缓 冲 器 的 角色 ， 观 察 到 的 效应 就 能 得 到 解释 。CyA 毒性 标志 物 的 鉴定 ， 为 其 毒 效 提 供 了 可 靠 的 说 明 ， 这 是 蛋白 质 组 与 其 他 的 技术 结合 的 成 功 应 用 结果 。 第 二 个 生物 标记 蛋白 质 的 成 功 鉴 别 的 例子 来 自 膀 胱 鳞 状 细胞 癌 进 程 的 长 期 研究 (综述 见 Celis et 必 .，1998)。 在 此 研究 中 ， 定 义 蛋 白质 标志 物 和 癌 损害 的 分 化 程度 能 被 监测 (Celis et al., 1996; Ostergaard et al., 1997). 这 种 生物 标记 物 识 别 的 方法 在 制药 产业 的 不 同 领域 ， 从 临床 前 研究 到 诊断 、 药 理学 和 毒物 学 等 领域 都 有 巨大 的 应 用 潜力 。 蛋 白质 组 在 检测 一 个 蛋白 质 表达 谱 是 否 可 以 用 于 疾病 诊断 方面 ， 主 要 依赖 于 用 来 提取 信息 的 数据 库 的 规模 和 质量 。 因 此 ， 几 个 存储 从 2-DE 胶 产 生 的 大 量 表达 谱 和 质谱 数据 的 公共 数据 库 已 经 构建 (LBA). FARAH 多 元 统计 分 析 ， 如 主要 组 分 分 析 或 模型 预测 ， 均 可 用 于 阐述 生物 标志 物 和 蛋白 。 2.3 详细 的 基因 表达 调控 分 析 对 胶 上 蛋白 质点 的 识别 鉴定 匹配 越 多 ， 对 实验 数据 的 详尽 分 析 就 越 有 可 能 。 与 特定 的 通路 或 调控 子 有 关 的 大 多 数 蛋 白质 的 蛋白 水 平 都 可 以 定量 。 目 前 ， 仅 仅 从 微生物 的 蛋 白质 识别 中 获得 了 足够 的 信息 ， 可 以 详细 地 分 析 不 同 生 长 条 件 和 抗生素 作用 下 对 微生物 基因 表达 的 影响 。F.C.Neidhardt 小 组 最 先 建立 了 大 肠 杆 菌 的 2-DE 谱 并 开始 对 这 些 细 菌 对 不 同 环境 条 件 的 反应 进行 系统 的 研究 、 分 类 (VanBogelen et al .，1997)。 这 样 ， 大 量 不 同 的 调控 子 已 经 被 发 现 并 表征 (VanBogelen et wz .，1997)。 几 种 微生物 ， 如 枯草 杆 fA (Bacillus subtilis) (Antelmann et al .，1997)， 流 感 哮 血 杆 菌 ( Haemophilus influen- zae) (Cash et al., 1997; Langen et al .，1997)， 以 及 酿酒 酵母 ( Saccharomyces cere- visiae ) (Boucherie et al., 1996; Hodges et al., 1999) 的 蛋白 质 组 表达 谱 已 经 发 表 。 微 生物 全 基因 序列 的 完成 大 大 促进 了 和 蛋白质 的 识别 进程 ， 并 使 代谢 途径 的 构建 成 为 可 能 。 但 应 该 记 住 ， 在 大 多 数 情 况 下 ， 功 能 的 指认 是 以 序列 同 源 为 基础 ， 传 统 的 生物 化 学 对 这 些 途 径 的 完成 和 确认 至 关 重 要 。 我 们 小 组 已 经 报道 了 一 个 生物 化 学 途径 详尽 分 析 的 例子 (Evers et al .，1998)。 如 上 所 述 ， 我 们 已 经 研究 了 流感 嗜 血 杆 菌 〈 互 . 加 juenzxae) 对 四 氧 叶酸 合成 抑制 剂 Tmp 和 Smz 的 反应 。 其 中 最 重要 的 变化 是 代表 与 蛋氨酸 合成 有 关 的 酶 蛋白 点 的 强度 增加 。 这 些 结果 显示 编码 这 些 蛋 白质 的 基因 以 E.coli 中 配对 物 类 似 的 方式 被 调控 (Weissbach and Brot，1991)。 因 为 2-DE 胶 上 很 多 相关 的 蛋白 质 还 未 被 鉴 - 186 - & A na 定 ， 现 在 还 不 可 能 研究 Tmp 和 Smz fF ATES A EB AY OY, ETT ES 四 氢 叶 酸 合成 抑制 影响 。 在 对 酵母 的 类 似 研究 中 ， 进 行 了 味 叭 和 组 氨 酸 生物 合成 蛋白 的 合成 率 调 控 研 究 (Denis et wz: .，1998)， 结 果 证 实 了 这 种 方法 在 真 核 细 胞 中 的 可 行 性 。 这 种 详尽 的 分 析 有 助 于 对 数据 库 中 没有 类 似 物 的 化 合 物 建 立行 为 模式 假说 。 因 而 有 助 于 发 现 药理 学 活性 物质 的 新 靶 标 。 另 外 ， 在 这 些 分 析 中 观察 到 的 次 要 效应 也 有 助手 识 别 药物 介入 的 潜在 靶 标 。 结 合 其 他 方法 〈 例 如 重组 基因 失 活 )， 可 以 更 完整 地 描述 药物 效应 。 结 合 正在 进行 的 基因 组 项 目 产 生 的 大 量 信 息 ， 这 个 方法 将 可 能 扩展 到 更 复杂 的 有 机 体 中 去 。 2.4 蛋白 质 功能 预测 对 许多 和 蛋 日 质 来 说 ， 以 序列 比较 为 基础 指认 和 蛋白质 的 功能 是 不 可 能 的 。 这 些 蛋 和 白质 代表 了 未 被 利用 的 药物 潜在 的 靶 标 ， 因 此 是 医药 工业 的 特殊 兴趣 所 在 。“ 调 控 同 源 ” (regulatory homology) 的 概念 是 由 Anderson 和 Anderson (1998) 最 近 提 出 的 : 当面 临 环境 条 件 的 改变 时 ， 以 相似 的 方式 变化 的 蛋白 质 相 对 丰 度 也 许 参 与 共同 的 过 程 。 这 个 概 OM WS ARREARS. BOP, RS RIA“ MI” (orphan) 基因 的 重组 生物 (RAS 3 AURA Ee kA BURA A REDE. FERRER E.coli 基因 表达 效 果 的 研究 实验 中 ， 通 过 2-DE wMRA MH, SET 8 个 与 硫酸 盐 调 控 有 关 的 蛋白 质 (Dainese et dj .，1997)。 对 其 中 一 个 蛋白 Taub 的 基因 重组 失 活 的 实验 结果 显示 ， 细 菌 在 惟一 的 硫磺 源 一 一 牛 磺 酸 上 生长 不 足 (Dainese et al., 1997). 3X, HURARA 技术 鉴定 了 与 硫酸 盐 同化 作用 有 关 的 和 蛋白质， 而 重组 技术 证 明了 其 中 一 个 蛋白 ，TauD 在 牛 磺 酸 的 去 磺 化 中 的 作用 。 3. 结论 与 展望 目前 蛋白 质 组 对 药物 的 研究 和 开发 十 分 有 用 的 观点 已 被 广泛 地 接受 。 大 多 数 药物 公 司 为 改善 与 药物 行为 相关 的 生物 学 材料 的 表征 ， 发 现 相关 生物 标志 物 和 潜在 的 靶 标 ， 已 经 纷纷 建立 了 有 蛋白 质 组 分 析 小 组 。Large Scale Biology Corp， 现 在 是 Biosource Technolo- gies Inc. 的 分 部 ， 是 分 子 药理 学 和 毒 理 学 的 2-DE 应 用 领域 的 先驱 ， 构 建 了 全 面 的 药物 的 分 子 效 应 (Molecular Effects of DrugsIM) 数据 库 (Anderson and Anderson，1998)， 为 药物 产业 提供 2-DE 服务 ， 为 公众 提供 他 们 所 拥有 的 蛋白 质谱 数据 库 和 2-DE 谱 图 。 几 个 其 他 的 公司 随即 跟 进 ， 也 为 药物 发 现 和 发 展 提供 这 些 服务 或 开发 相应 的 蛋 昌 质 组 研究 项 目 〈 见 第 十 一 章 “ 商 业 蛋 白质 组 ”) 。 蛋白 质 组 被 用 于 药物 发 现 和 发 展 过 程 中 的 各 个 阶段 。 如 上 所 述 ， 它 对 于 早期 靶 标 的 识别 和 确认 非常 有 用 。 在 发 展 的 后 期 ， 其 实用 性 已 经 在 药理 学 和 毒 理 学 领域 中 得 到 证 明 。 尤 其 在 后 两 个 领域 ， 从 蛋白 质 组 研究 结果 的 重要 意义 以 及 与 传统 生理 学 和 组 织 学 试 验 得 到 的 观测 资料 的 相关 性 需要 细心 评价 。 这 些 研究 有 和 希望 鉴别 新 型 的 生物 标志 物 ， 有 助 于 发 展 更 迅速 、 更 经 济 的 诊断 试验 。 这 些 生物 标志 物 的 检测 应 用 于 药物 发 展 的 早期 阶 段 ， 可 减少 对 动物 实验 的 需求 。 为 了 充分 地 开发 蛋白 质 组 的 潜力 ， 目 前 技术 发 展 仍 需 与 方法 学 结合 ， 以 解决 其 局 限 性 。2-DE 的 使 用 是 众多 不 满意 的 因素 之 一 ， 它 操作 不 方便 而 且 耗 时 ， 阻 碍 了 和 蛋白质 组 第 十 一 章 “ 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理学 中 的 应 用 ‘i 作为 高 通 量 技术 的 使 用 。 在 巧妙 的 技术 结合 中 ，2-DE 可 用 于 鉴别 标志 物 蛋 白 ， 而 使 用 别 的 更 适当 的 方法 进行 高 通 量 检 测 (例如 ELISA， 基 因 系 统 报告 ， 生 物化 学 试验 )。 2-DE 的 研究 重点 是 自动 操作 和 图 像 分 析 的 改善 ， 这 样 就 能 加 速 数据 的 获得 。 医 药 产 业 对 高 通 量 的 需求 可 能 使 得 2-DE 胶 最 终 被 别 的 更 易于 自动 化 分 离 的 系统 所 取代 。 现 在 ， 仅 能 对 含量 丰富 的 可 溶性 蛋白 质 进行 研究 ， 较 大 的 下 水 蛋白 因 其 灵敏 度 较 低 、 难 于 溶解 而 难以 研究 。 因 此 和 蛋白质 组 研究 也 就 必须 偏向 于 这 些 通常 是 结构 蛋白 质 或 代谢 酶 的 蛋白 质 ( 表 11.1)。 用 于 和 蛋白质 修饰 的 检测 、 鉴 别 、 定 量 的 蛋白 质 组 技术 正在 开发 中 。 目 前 仅 有 极 少数 蛋白 质 修 饰 被 完全 识别 、 表 征 的 例子 。 技 术 发 展 加 大 了 前 进 的 步伐 ， 也 期 望 质谱 分 析 的 灵敏 度 和 准确 度 的 增加 。 随 着 分 析 软 件 的 改进 ， 将 允许 进行 蛋白 质 修饰 的 常 规 分 析 并 拓宽 蛋白质 组 研究 的 范围 。 表 11.1 流感 嗜 血 杆菌 可 溶性 蛋白 质 提 取 物 的 2-DE 凝 胶 制 备 蛋白 质 的 不 同 功能 类 型 功能 分 类 。 每 种 类 别 的 鉴别 百分比 /% 氨基 酸 生物 合成 44 辅助 因子 ， 非 肝 基 基 团 和 载体 的 生物 合成 27 细胞 膜 22 细胞 内 加 工 30 主要 中 间 物 代谢 37 能 量 代 谢 41 提 肪 酸 和 磷脂 代谢 40 假定 的 功能 19 其 他 类 别 23 mrs, ete, KREMER 40 调控 功能 16 复制 25 转录 33 翻译 49 转运 和 结合 蛋白 20 合计 29 * According to Fleischmann et al. (1995). KS BUE A RA FEM mRNA 分 析 观 察 到 的 现象 难于 解释 。 因 为 调控 通路 是 相互 关联 的 ， 一 种 效应 可 能 发 生 在 表面 上 无 关联 的 、 不 同 功能 类 别 的 蛋白 质 中 。 一 级 、 二 级 或 三 级 效应 相互 交错 ， 形 成 非常 复杂 的 表达 方式 。 在 生物 学 研究 中 ， 这 些 方 法 适合 产生 一 些 假说 ， 而 这 些 假说 需要 用 其 他 技术 验证 。 另 外 ， 来 自 不 同 来 源 的 信息 ， 如 代谢 物 的 定量 信息 ， 有 助 于 对 细胞 生物 化 学 的 基本 理解 。 生 物 信息 学 在 数据 储存 和 分 析 中 扮演 着 必 不 可 少 的 角色 ， 把 我 们 目前 对 基因 调控 方面 的 知识 与 从 蛋白 质 组 及 其 他 来 源 的 发 现 有 机 结合 起 来 ， 形 成 对 生物 体 的 更 全 面 `、“ 整 体 的 ”看 法 ， 并 且 得 到 易于 理解 的 数据 。 致谢 感谢 Hanno Langen and Uli Certa 提供 图 11.1， 感 谢 W.Keck 对 原稿 建设 性 的 阅读 。 (HHL HE Rode 校 ) - 188 - 蛋白 质 组 学 参考 文献 Aicher, L., Meier, G., Norcross, A., Jakubowski, J., Varela, M., Cordier, A. and Steiner, S. (1997) Decrease in kidney calbindin-D 28 kDa as a possible mechanism mediating cyclosporine A- and FK-506-induced calciuria and tubular mineralization. Biochem. Pharmac. 53: 723-731. Anderson, N.L. and Anderson, N.G. (1998) Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. 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HAMAS ATE 1.1 HT EST 数据 库 的 蛋白 质数 据 为 了 更 详尽 地 理解 基因 的 生物 学 功能 ， 人 们 在 基因 组 测序 方面 付出 了 巨大 的 努力 。 尽管 全 长 序列 数据 库 在 不 断 增 长 ， 但 更 多 的 有 用 信息 来 源 于 被 称 为 表达 序列 标签 (EST) 的 短 DNA 序列 (Adams et oz .，1991)， 尽 管 是 一 些 片段 ， 但 它们 却 可 能 代表 了 人 类 表达 基因 组 的 大 部 分 。 解 释 这 些 数据 的 生物 学 相关 性 是 一 个 挑战 ， 它 远 比 DNA 序 列 测定 的 难度 大 。 很 明显 ， 我 们 需要 了 解 EST 所 编码 的 蛋白 质 的 表达 谱 ， 以 作为 功能 研究 的 线索 。 因 而 ， 现 在 基因 组 测序 的 努力 与 建立 和 描述 更 为 复杂 的 蛋白 质 组 目录 的 努 力 同 时 进行 。 当前 ， 蛋 昌 质 组 学 着 重 依赖 于 两 项 互补 的 的 技术 ， 即 二 维 凝 胶 电 泳 和 质谱 ， 从 选择 的 组 织 和 器 官 中 显示 、 鉴 定 代表 部 分 蛋白 质 组 的 蛋白 质 ， 并 编 算 蛋白 质 目录 。 按 照 这 一 途径 ， 研 究 者 从 级 分 的 蛋白 质 找 到 其 相应 的 DNA 序列 。 这 一 方法 的 局 限 性 在 于 建立 的 数据 库 具 有 严重 的 偏 性 ， 其 中 高 丰 度 的 蛋白 质 出 现 频率 高 。 和 DNA 和 RNA 不 同 ， 蛋 ARERR He. RA BRAKE SAR RM AS, We, BARE MTS 全 的 蛋白 质 组 。 还 有 另外 一 种 基于 DNA 序列 数据 而 制备 蛋 日 质 特 异 探 针 的 方法 ， 利 用 这 些 探 针 可 以 鉴定 特定 的 和 蛋白， 研究 其 在 细胞 提取 物 、 完 整 细胞 、 组 织 以 及 活 的 有 机 体 中 的 功能 。 与 传统 的 方法 相 比 ， 这 种 靶 向 性 的 方法 很 可 能 可 以 更 快 地 产生 全 面 、 有 用 、 可 解释 的 数 据 。 利 用 靶 癌 分 子 探 针 进行 蛋白 质 组 的 分 析 依 赖 于 与 基因 组 计划 相 匹 配 的 制备 特异 性 探 针 的 速度 和 规模 。 下 面 我 们 将 描述 如 何 通过 鸣 菌 体 抗体 库 实 现 这 一 想法 。 鸣 菌 体 展 示 技 术 (Barbas et al., 1991; McCafferty et al., 1990) 是 惟一 一 种 在 数 量 和 速度 上 有 能 力 产生 满足 能 处 理 基 因 组 测序 计划 所 产生 的 信息 流 的 特异 性 抗体 制备 技 术 。 传 统 的 方法 ， 如 二 维 电 泳 ， 是 利用 一 般 的 染色 剂 检 测 和 蛋白质， 而 特异 性 的 探 针 ， 如 eB ASA, WU ATLA EM Western 印迹 到 完整 生物 体 的 几乎 任何 生物 学 环境 中 揭示 和 量 化 特异 蛋白 。 我 们 将 描述 如 何 高 通 量 地 实现 这 一 想法 的 计划 ， 即 ProAbIY 计 划 。 其 独特 之 处 在 于 ProAbI 方 法 不 像 斑 点 印迹 和 二 维 电泳 那样 从 提取 物 中 分 析 蛋 白质 的 表达 ， 而 是 从 组 织 学 水 平 上 直接 分 析 蛋 白质 的 表达 ， 因 此 ， 可 以 积累 组 织 、 细 胞 及 亚 细 胞 水 平 上 fe FEE A AY oP A A 蛋白 质 并 不 是 孤立 地 起 作用 ， 而 是 与 其 他 蛋白 及 小 分 子 配 体 相 互 作 用 而 发 挥 功能 。 从 关联 蛋白 及 多 分 子 蛋白 复合 体 拓 扑 学 得 到 的 信息 常常 是 了 解 蛋白 质 功 能 的 关键 。 我 们 将 描述 一 种 被 称 之 为 ProxiMolIX 的 技术 ， 通 过 这 项 技术 可 以 获得 针对 靶 分 子 的 特异 抗 第 十 二 章 ， 噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 is 体 ， 而 此 项 技术 的 关键 是 识别 靶 分 子 的 导向 分 子 ， 这 些 导向 分 子 可 以 是 任何 一 种 类 型 的 配 体 分 子 (Osbourn et al .，1998) 。ProxiMolIM 技 术 为 我 们 提供 了 获得 一 种 蛋白 质 特异 抗体 的 方法 ， 这 种 方法 并 不 需要 从 其 天 然 状 态 中 纯化 和 克隆 靶 和 蛋白 。 而 且 ， 识 别 蛋 白质 表 位 的 一 种 抗体 原则 上 可 被 用 作 导 向 分 子 ， 进 而 获得 一 组 新 抗体 ， 其 中 一 些 抗体 分 子 其 至 具有 针对 抗原 的 直接 功能 ， 如 中 和 配 体 的 结合 作用 。 这 一 项 技术 具有 巨大 的 潜力 ， 因 为 目标 蛋白 分 布 的 原始 数据 很 快 就 可 以 得 到 来 自 于 细胞 和 组 织 功能 分 析 数 据 的 印证 。 1.2 抗体 是 蛋白 质 特异 分 子 探 针 的 合理 选择 数 十 年 来 ， 从 动物 中 获得 的 抗体 是 生物 化 学 研究 中 不 可 缺少 的 工具 ， 并 且 是 多 功能 的 试剂 ， 它 们 可 用 于 特异 、 灵 敏 、 定 量 地 检测 组 织 和 提取 物 中 的 蛋白质 。 它 们 可 以 揭示 特定 蛋白 在 组 织 中 的 亚 细 胞 定位 ; 并 且 通 过 阻止 它 所 识别 的 目标 蛋白 与 其 天 然 配 体 的 结 合 可 以 证 实 这 些 目标 蛋白 特异 的 生物 学 功能 。 从 功能 基因 组 学 到 蛋白质 组 学 ， 抗 体 都 具 有 巨大 的 应 用 潜力 ， 因 为 基于 叭 菌 体 展示 (McCafferty et al., 1990) 而 产生 抗体 的 新 技术 可 以 高 通 量 、 自 动 化 地 产生 高 质量 的 抗体 试剂 ， 以 满足 对 基因 组 计划 所 产生 的 大 量 潜在 靶 和 蛋白 研 究 的 需要 。 下 一 节 将 概述 这 些 方法 ， 它 们 将 构成 基于 抗体 的 功能 基因 组 学 研究 平台 的 基础 。 1.3 关键 技术 概观 噬菌体 展示 抗体 ”抗体 的 功能 结构 域 可 以 被 展示 在 丝 状 叹 菌 体 的 表面 (McCafferty et al., 1990; Winter and Milstein ，1991)。 大 的 叭 菌 体 抗体 库 (>10!! sequences) 包 含 能 结合 任何 给 定 抗 原 的 高 亲和力 抗体 (Vaughan et wz .，1996)。 编 码 抗体 的 基因 被 包 庄 在 唆 菌 体 颗粒 中 ， 这 样 就 将 抗体 的 特异 性 与 其 基因 序列 联系 起 来 。 通 过 目标 抗原 的 亲 和 作用 从 叹 菌 体 抗 体 库 中 筛选 所 要 的 特异 性 抗体 。 因 此 ， 叹 菌 体 库 相 当 于 一 个 体外 免疫 系统 。 而 传统 的 免疫 方法 则 需要 整体 动物 (每 种 抗原 至 少 一 只 动物 )， 用 数 周 的 时 间 ， 通过 多 次 免疫 才能 使 免疫 系统 产生 出 有 用 的 抗体 。 与 传统 的 免疫 方法 相 比 ， 叭 菌 体 展 示 系统 是 一 种 体外 系统 ， 产 生 抗 体 只 需要 几 天 的 时 间 。 因 此 ， 鸣 菌 体 展 示 技 术 是 一 种 最 有 效 的 制备 抗体 的 方法 。 噬菌体 作为 试剂 ”展示 抗体 功能 结构 域 的 噬菌体 颗粒 被 常规 地 用 于 ELISA 检测 、 免疫 细胞 化 学 (ICC)、 流 式 细 胞 术 及 其 他 的 一 些 筛选 技术 。 由 于 不 需要 进行 蛋白 质 纯 , Ak, AKO YT HEME. 高 通 量 地 产生 抗体 ”利用 叭 菌 体 展示 技术 ， 抗 体 的 分 离 可 以 在 一 个 工作 周 中 完成 。 将 抗原 排列 在 微 孔 板 中 ， 可 以 手工 完成 针对 数 百 种 不 同 抗原 的 抗体 筛选 。 叭 菌 体 展示 技 术 易 于 自动 化 ， 其 产生 抗体 的 速度 完全 可 以 应 付 DNA 序列 数据 库 中 现存 的 大 量 DNA 序列 。 抗原 在 ProAbry 技 术 中 联系 着 基因 序列 和 和 蛋白质 经 过 筛选 从 EST 序列 中 找 出 感 兴趣 的 序列 。 肽 序列 由 特定 的 可 读 框 所 决定 ， 其 相应 的 抗原 肽 在 96 孔 板 中 由 自动 合 成 仪 自动 全 成。 之后， 这些 抗 原 被 用 于 所 期 望 的 特异 性 抗体 的 筛选 。 来 源 于 DNA 数据 库 中 的 信息 被 直接 用 于 产生 表达 序列 的 抗体 探 针 ， 而 不 需要 全 长 DNA 序列 ， 也 不 需要 和 蛋 白 质 抗原 的 表达 。 te ER DR ER RE ER ee ee ni。 ee | 蛋白 质 组 学 抗原 : 通过 ProximolIY 技 术 探测 未 克隆 的 蛋白 质 及 其 关联 者 。 特 异 识别 完整 细胞 或 组 织 中 蛋白 质 的 叹 菌 体 抗 体 可 以 被 分 离 出 来 ， 但 是 ， 如 何 进 行 针 对 完整 细胞 或 其 他 多 蛋 白 分 子 复合 物 中 的 一 种 特定 靶 分 子 的 筛选 ? 只 要 存在 任何 一 种 导向 分 子 ， 一 种 被 成 为 ProximolIX 的 技术 就 可 以 拯救 特异 识别 导向 分 子 结合 的 靶 分 子 或 其 关联 者 的 噬菌体 。 抗原 : 解决 自身 耐 受 问题 鸣 菌 体 展示 系统 绕 过 免疫 系统 。 那 些 针对 自身 抗原 (a 括 序 列 完全 保守 的 抗原 ) 的 抗体 都 可 以 直接 从 噬菌体 抗体 库 中 分 离 出 来 (Griffiths et - aj .，1993)。 从 我 们 的 人 源 抗体 库 中 分 离 识 别人 蛋白 的 抗体 还 从 来 没有 失败 过 。 检测 蛋白 表达 及 其 细胞 分 布 ICC 能 够 展示 蛋白 质 在 细胞 和 组 织 中 分 布 的 精细 画 面 。 而 目前 面临 的 挑战 是 如 何 高 通 量 地 进行 ICC 分 析 ， 因 为 要 解释 这 些 数据 需要 专门 的 知识 ， 并 且 可 视 的 结果 和 解释 必须 被 存放 于 易于 进入 且 用 户 界 面 友好 的 数据 库 中 。 生物 信息 学 推动 这 一 进程 ”在 过 去 ， 个 别 的 科学 家 很 容易 理解 和 解释 低 通 量 的 技术 所 产生 的 信息 流 。 而 现在 ， 没 有 复杂 的 生物 信息 学 工具 ， 没 有 人 能 够 处 理 大 量 而 复杂 的 数据 。 从 EST 到 ICC 图 ， 整 个 发 现 过 程 都 需要 生物 信息 学 的 专门 知识 。 2. 噬菌体 抗体 库 的 构建 和 应 用 2.1 抗体 片段 在 噬菌体 上 的 展示 功能 抗体 片段 可 融合 于 叹 菌 体 次 要 外 壳 蛋 日 g3p 的 N 末端 而 展示 于 丝 状 叹 菌 体 的 表面 。 大 多 数 的 噬菌体 颗粒 仅 展 示 不 超过 一 种 的 抗体 拷贝 (McCaffery et al., 1990). MAKE RnR RA BRA SA (SC-Fv)， 由 IgG 的 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 (Va 和 Vi) 构成 ， 中 间 通 过 柔性 的 连接 肽 连接 。 编 码 抗体 结构 域 的 DNA 序 列 可 以 被 克隆 到 喉 菌 体 基 因 组 中 (一 种 喉 菌 体 载体 ); 然而 ， 人 们 一 般 更 喜欢 选用 鸣 菌 粒 载体 ， 因 为 噬 菌 粒 载体 易于 操作 ， 并 且 转 化 效率 高 。( 鸣 菌 粒 是 一 种 质粒 ， 带 有 质粒 和 噬菌体 两 种 复制 起 点 。) 这 一 章 描述 的 工作 采用 鸣 菌 粒 载体 PCANTAB6 (McCafferty etal., 1994) 和 M13 噬菌体 (Yanisch et al .，1985)。 具 体操 作 可 参考 更 好 的 操作 手 Wt (Kay et al., 1996; McCaffery et al., 1996). 2.2 抗体 库 的 构建 人 淋巴 细胞 是 理想 的 IgGs 的 Va 和 Vi DNA 序列 的 来 源 (图 12.1)。 利 用 引物 家 族 ， 通 过 PCR 方法 扩 增 抗体 的 可 变 区 结构 域 (Marks et al., 1991). Vo 和 Vi 基因 序 列 再 通过 组 装 PCR 连接 成 完整 的 scFv 抗体 DNA 序列 。Va 和 Vi 随机 配对 ， 非 天 然 的 配对 增加 了 抗体 库 的 功能 多 样 性 。scFv 抗体 DNA 序列 通过 PCR 进行 扩 增 ， 同 时 在 引 ” 物 中 引入 限制 酶 切 位 点 ， 以 利于 将 其 克隆 到 噬 菌 粒 载体 中 。 连 接 到 噬 菌 粒 载体 中 后 ， 通 过 电 穿 孔 法 转化 E. coli. EHD RAR, MRA DNA RAR, KM FEMA PAY Ue Ba ALAR 7B ek ARSE (McCaffery et al., 1996). 2.3 库 的 大 小 和 多 样 性 特异 性 和 亲 和 人 性 是 任何 抗体 都 有 的 品质 。 库 越 大 ， 它 包含 一 种 具有 高 亲和力 、 高 特 异性 抗体 的 几率 越 大 (Perelson and Oster，1979)。 尽 管用 于 抗体 库 构 建 的 供 体 细胞 被 第 十 二 章 ” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 "193 ， 构建 102 库 容量 的 抗体 库 全 ee oD 33) — = PCR #34 VH 43 个 未 免疫 的 i 7~70 岁 供 者 D> avian bug ' i Se @ @ VH Tv VL 基 因 抗体 展示 库 分 离 的 B 细 胞 的 组 装 12.1 构建 吗 菌 体 抗体 库 的 原理 编码 人 抗体 抗原 结合 域 的 DNA 被 包装 于 噬菌体 颗粒 中 ， 这 种 噬菌体 颗粒 能 够 在 其 末端 展示 具有 功能 的 抗体 蛋白 。 这 种 抗体 的 抗原 结合 特异 性 和 亲和力 可 用 于 分 离 其 相应 的 抗原 。 描述 为 非 免疫 的 ， 但 人 具有 的 巨大 的 V- 基 因 库 仍然 是 经 过 繁殖 剔除 的 ， 这 些 细胞 一 直 接触 许多 不 同 种 类 的 抗原 。 人 B 细胞 可 以 产生 针对 自身 抗原 的 抗体 ， 而 这 些 抗原 是 人 正常 的 蛋白 ， 这 些 细 胞 克隆 在 免疫 系统 监视 下 被 剔除 ， 但 是 这 种 局 限 性 在 噬菌体 抗体 技 术 中 并 不 存在 。 人 源 抗 体 库 能 够 产生 至 今 为 止 所 试验 的 针对 任何 一 种 抗原 的 抗体 。 一 个 库容 量 超过 10° 克隆 的 抗体 库 (Vaughan et al., 1996) 被 用 于 制备 针对 各 种 不 同 种 类 PUR scFv, FFA ARH RAPER A RAD. RAE, KPA SA 亲和力 超过 108M AVES PPA el PPAR TRAY sFv， 有 的 甚至 达到 10°M', KML 作 表 明 ， 通 过 叭 菌 体 抗 体 技术 产生 的 抗体 的 亲和力 和 通常 通过 免疫 方法 制备 的 抗体 的 亲 和 力 一 样 高 (Foote and Eisen，1995)。 尽 管 随 着 库容 量 的 增 大 ， 从 统计 学 角度 验证 抗体 品质 的 提高 将 更 加 费力 ， 但 经 验证 明 ， 与 一 个 小 库 相 比 ， 从 一 个 更 大 的 库 中 更 容易 筛选 到 高 亲和力 的 抗体 。 此 外 ， 检 测 高 于 100M-:I! 的 亲和力 从 技术 上 变 得 更 具 挑 战 性 。 当 前 ， 作 者 所 知道 的 最 大 的 库 包含 有 102 以 上 不 同 序列 。 但 构建 这 样 一 个 库 可 不 是 一 项 简 单 的 工作 。 2.4 从 鸣 菌 体 抗体 库 中 筛选 特异 抗体 最 基本 的 原则 就 是 亲 和 捕 获 。 被 包 庄 在 叹 菌 体 颗 粒 中 编码 抗体 的 基因 序列 决定 所 展 示 的 scFv 的 特异 性 ， 通 过 亲 和 捕 获 ， 蛋 白质 和 基因 被 同时 选择 。 对 纯化 抗原 进行 的 萍 选 ”被 广泛 采用 的 筛选 技术 是 淘 洗 。 抗 原 被 包 被 在 固 相 表 面 ， 如 微 孔 板 ， 然 后 ， 加 入 鸣 菌 体 抗体 库 与 抗原 温 育 。 经 淘 洗 之 后 ， 留 下 那些 表面 展示 有 能 力 结合 目标 抗原 的 抗体 的 噬菌体 。 将 特异 噬菌体 感染 的 E.coli 进行 繁殖 ; 将 细菌 培养 在 培养 板 上 使 之 形成 克隆 ， 每 个 克隆 来 源 于 一 个 细胞 ， 产 生 一 种 单 克 隆 抗 体 。 对 抗原 复合 物 进 行 的 簿 选 ” 叭 菌 体 抗体 库 常 被 用 于 对 整个 细胞 或 亚 细 胞 组 份 如 膜 制 备 物 进行 抗体 筛选 ， 也 能 够 获得 单 克 隆 的 sFv， 但 是 ， 这 种 使 用 抗原 复合 物 进行 的 筛 选 将 导致 难以 确定 筛选 抗体 的 特异 性 。ProxiMolIy 技术 〈 见 后 ) 的 出 现 克服 了 这 一 困 难 。 。 194 + 和 蛋白质 组 学 2.5 高 通 量 的 筛选 从 叭 菌 体 抗 体 库 中 筛选 抗体 的 程序 很 简单 ， 操 作 的 体积 也 很 小 (100w)， 并 且 可 在 多 孔 微 板 中 并 行进 行 。 不 同 的 抗原 分 别 被 包 被 在 不 同 的 微 孔 中 ， 一 些 早 期 的 手工 实验 可 ”在 一 个 微 孔 板 中 同时 筛选 针对 83 种 不 同 抗原 的 抗体 。 大 多 数 的 药物 研究 实验 室 采 用 96 孔 或 是 384 孔 板 ， 用 机 器 人 进行 自动 化 操作 。 同 样 地 ， 商 业 化 的 现货 供应 类 的 生产 工厂 (如 Tecan 和 GRI) 一 周 能 够 分 离 多 达 针 对 200 种 不 同 抗原 的 抗体 。 2.6 作为 试剂 的 噬菌体 抗体 展示 scFv 的 叹 菌 体 颗粒 是 研究 的 有 用 工具 。 在 基因 组 水 平 上 ， 研 究 和 发 现 大 量 靶 蛋白 需要 尽 可 能 高 通 量 地 制备 相应 的 试剂 ， 而 噬菌体 抗体 就 满足 了 这 种 需要 。 下 面 我 们 将 描述 如 何 从 鸣 菌 体 抗体 库 中 方便 地 获得 可 溶性 的 抗体 蛋白 ; 然而 ， 我 们 要 强调 的 是 ， 在 所 有 的 上 游 检 测 分 析 中 ， 这 种 噬菌体 形式 的 抗体 都 具有 较 好 的 应 用 。 鸣 菌 体 抗体 已 被 成 功用 于 蛋 白 质 、 多 肽 、 完 整 细胞 及 亚 细 胞 组 份 的 ELISA 检测 、 流 式 分 析 和 免疫 细胞 化 学 分 析 (ICC). Mit ba AR BU EB bse EA g8p Air 3000 多 个 拷贝 ， 因 此 ， 抗 噬菌体 的 抗 血清 可 以 高 灵敏 度 地 检测 结合 到 目标 抗原 上 的 喉 菌 体 。 在 接种 辅助 吹 菌 体 后 ，96 孔 板 中 的 E.coli 培养 上 清 可 被 直接 用 作 试 剂 (McCafferty et al., 1996 )。 2.7 来 源 于 鸣 菌 体 库 中 的 可 溶性 抗体 scFv 的 应 用 ”一般 地 ， 最 快 的 获得 数据 的 方式 就 是 采用 鸣 菌 体 颗粒 直接 进行 检测 。 然而 ， 在 目的 蛋白 的 下 游 研 究 实 验 中 ， 最 好 还 是 采用 可 溶性 的 scFv 蛋白。 如 亲和力 和 动力 学 的 测定 、 细 胞 中 和 实验 以 及 活体 研究 。 也 许 还 有 一 些 其 他 的 过 程 ， 在 这 些 过 程 中 应 用 大 的 叭 菌 体 颗粒 将 会 阻碍 它 向 抗原 的 扩散 。 而 且 ， 鸣 菌 体 的 大 小 限制 了 抗体 的 最 大 浓度 约 为 10nmolML (6 x 102 phage/ml)。 不 论 在 活体 还 是 体外 ，scFv 被 证 明 是 主要 的 细胞 生物 学 研究 的 良好 试剂 。 下 面 的 部 分 将 会 说 明 如 何 制 备 可 以 满足 实验 需要 的 scFv (ug>mg )。 大 量 地 制备 scFv ”满足 检测 用 量 的 scFv 可 以 在 不 离开 多 孔 板 的 情况 下 直接 表达 。 为 了 诱导 可 溶性 scFv 表达 到 细菌 的 外 周 腔 中 ， 含 有 pCANTAB 质粒 的 细胞 克隆 用 IPTG 诱导 表达 ， 表 达 的 scFv 将 会 部 分 地 泄漏 到 培养 液 中 ， 特 别 是 在 过 夜 诱 导 表 达 之 后 。 多 年 的 经 验证 明 ， 这 一 简单 方案 适合 于 检测 分 析 (McCafferty et al., 1996). 更 多 的 scFv 可 通过 标准 程序 裂解 细胞 ， 从 细菌 的 外 周 质 中 获得 。 细 菌 的 外 周 质 提 取 物 可 直接 用 于 许多 分 析 工 作 。 而 且 ，pCANTAB 质粒 载体 在 scFv 的 C 末端 还 加 了 一 个 含 6 个 组 氨 酸 残 基 的 小 肽 标签 ， 因 此 ， 表 达 的 scFv 很 容易 通过 固 相 金属 亲 和 层 析 (IMAC) 进行 纯化 。 而 IMAC 磁 珠 (Qiagen) 使 得 从 96- 孔 板 中 分 离 scFv 变 得 更 加 方 便 、 快 捷 。 若 需要 100pg 到 mg 级 的 scFv 〈 如 体外 研究 )， 则 需要 扩大 到 摇 瓶 进行 培养 。 通 过 IMAC 纯化 的 scFv 的 量 可 以 适合 于 大 多 数 的 分 析 ; 如 果 需 要 ， 通 过 简单 的 凝 胶 过 滤 可 以 得 到 纯度 90% 的 scFv. 第 十 二 章 ”噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 195 - “2.8 LA IgG 的 形式 表达 完整 的 IgG 分 子 比 scFv 具有 更 长 的 药 代 动 力学 半衰期 ， 并 且 是 非常 稳定 的 蛋白 质 。 因此 ，IgG 也 许 是 体内 或 体外 用 于 长 期 研究 较 合适 的 抗体 形式 。 鸣 菌 体 形式 展示 的 抗体 很 容易 被 克隆 到 IgG 载体 中 ， 因 此 ， 研 究 用 的 IgG 可 以 直接 用 于 生产 治疗 用 的 IgG。 已 经 证 明 ， 有 许多 方法 可 用 于 从 哺乳 动物 细胞 中 表达 区 克 到 克 级 的 人 源 IgG。 这 使 得 “从 基因 到 临床 ”的 计划 变 为 现实 。 3. 喉 菌 体 抗体 在 功能 基因 组 研究 中 的 应 用 3.1 “ProAb™” 方法 维持 基因 组 测序 计划 的 巨大 资源 和 巨大 的 蛋白 质 组 数据 库 的 出 现 ， 主 要 是 由 于 人 们 认为 为 下 一 代 药 物 计 划 而 发 现 新 的 靶 蛋 白 将 会 很 快 获 利 。 从 制药 企业 和 医学 研究 的 观点 看 ， 对 任何 新 蛋白 最 有 兴趣 的 信息 就 是 在 某 种 疾病 状态 下 ， 在 某 些 特殊 的 组 织 中 ， 它 的 丰 度 有 明显 的 变化 。 合 乎 理想 的 情况 是 研究 者 喜欢 通过 高 通 量 的 方法 将 基因 的 表达 和 疾 病 的 指 征 相 联系 。 这 就 是 ProAb 计划 的 主题 思想 。 这 一 过 程 的 示意 图 见 图 12.2。 其 策 略 是 将 EST 序列 翻译 成 多 肽 抗原 ， 用 这 些 多 肽 抗原 筛选 噬菌体 抗体 ， 这 些 抗体 可 用 于 在 ICC 中 检测 相应 的 蛋白 质 抗 原 。 这 样 ，ProAb 计划 就 成 为 从 EST 到 疾病 相关 性 的 可 能 的 最 直接 途径 。 下 面 的 说 明 描述 了 高 通 量 实 现 这 一 过 程 的 技术 步骤 。 ProAbIM 概 览 人 基因 组 TYR 12.2) MA ProAbIY 方 法 到 功能 基因 组 的 原理 从 EST 数据 库 中 发 掘 出 来 的 感 兴趣 的 DNA 片段 被 翻译 成 蛋 白质 。 通 过 化 学 合成 法 合成 一 些 肽 段 来 代表 这 种 蛋白 质 的 序 列 。 作 为 抗原 ， 这 些 肽 段 被 用 于 筛选 噬菌体 抗体 。 这 些 被 科 选 出 来 的 抗体 可 用 作 免 疫 细胞 化 学 检测 试剂 以 显示 正常 或 疾 病 组 织 中 这 种 基因 表达 产物 的 分 布 和 丰 度 。 3.2 采用 生物 信息 学 方法 了 解 EST 的 意义 EST 是 当今 最 丰富 的 DNA 序列 资源 。 如 在 dbEST 数据 库 (Boguski et al., 1993) 中 ， 有 超过 105 的 EST 序列 ， 因 此 ， 理 论 上 ， 从 统计 学 的 角度 看 ， 在 EST 数据 库 中 应 该 包含 有 几 倍 元 余 的 开放 阅读 框架 。 然 而 ， 很 明显 提高 这 一 发 现 过 程 的 产量 应 该 优先 选 aga Se Tc - 196 - A RA 择 一 些 EST 序列 进入 该 程序 。 最 好 的 策略 就 是 瞄准 一 种 具有 令 人 感 兴趣 的 生物 学 功能 的 已 知 蛋白 〈 并 且 ， 最 好 结构 已 知 )， 去 寻找 这 一 家 族 的 其 他 成 员 〈( 见 3.6)。 如 果 已 经 、 找到 感 兴趣 的 EST， 就 应 该 选择 其 抗原 有 天。 有效 的 选择 方法 能 提高 成 功率 。 抗 原 肽 的 决定 取决 于 设计 用 于 预测 抗原 肽 可 能 性 的 算法 而 得 来 的 权重 指数 ， 包 括 天 然 样 结构 ， 天 然 蛋白 的 溶剂 可 接近 程度 和 抗体 易 结 合 的 序列 特征 。 生 物 信息 学 参与 这 一 过 程 的 第 一 步 ， 即 确定 哪 一 段 EST 序列 所 翻译 的 特异 肽 段 能 代表 这 一 蛋白 质 。 3.3 合成 抗原 预测 的 抗原 肽 序列 可 以 采用 上 自动 % 孔 固 相 多 肽 合成 仪 (Advanced Chem Tech) 进 行 合成 ， 此 合成 仪器 采用 fmoc 化 学 法 在 微 摩 尔 水 平 上 (5 一 100mg 产物 ) 进行 。 这 一 步 ， 应 该 寻找 那些 少数 的 合成 有 疑问 的 肽 序列 (基于 经 验 )。 通 常 ，15 个 氨基 酸 残 基 的 肽 段 是 合适 的 ， 但 是 ， 事 实 上 ， 更 长 的 肽 〈 如 30 ARBRE) 也 可 以 通过 自动 合成 仪 高 产量 的 合成 。 一 些 翻译 后 的 修饰 (如 磷酸 化 )， 也 可 以 在 合成 肽 中 实现 。 合 成 结束 后 ， 合成 的 肽 被 去 保护 ， 并 被 从 珠 体 上 切 下 ， 然 后 ， 通 过 沉 深 法 使 之 与 合成 试剂 分 离 。 洗 涤 后 的 沉淀 被 重新 溶解 ， 每 一 合成 肽 再 通过 反 相 色谱 和 电 喷 雾 质 谱 进行 质量 控制 ， 以 确保 用 作 抗 原 的 合成 肽 纯度 大 于 85% 。 将 液 一 质 系统 与 生物 信息 系统 相连 ， 根 据 预 测 的 肽 的 分 子 量 检查 合成 肽 的 氨基 酸 序 列 。 合 成 的 抗原 肽 的 N 端 常常 为 半 胱 氨 酸 残 基 ， 以 便 使 其 可 以 方便 地 连接 到 载体 蛋 日 质 上 。 这 样 有 利于 截断 的 合成 产物 不 会 污染 抗原 肽 〈 肽 的 合成 从 C 末端 开始 )。N 端的 生物 素 化 也 是 基于 同样 的 原因 。 载 体 蛋 白 常 常 是 牛 血清 白 和 蛋白， 其 赖 氨 酸 残 基 可 以 被 双 功 能 交 联 剂 (succinimide maleimide ) 所 活化 。SDS- PAGE 和 MALDI 质谱 常用 于 检查 蛋白 质 的 交 联 效率 。 一 般 地 ， 每 个 蛋白 交 联 20 一 30 肽 是 理想 的 。 值 得 提 及 的 是 ， 一 个 商业 用 途 的 机 器 可 以 合成 高 质量 肽 的 数量 是 空前 的 (每 周 多 达 300 个 )。 这 一 成 果 是 通过 优化 软件 、 优 化 交 联 时 间 以 及 精心 选择 化 学 方法 及 | 高 质量 的 化 学 合成 试剂 而 取得 的 。 3.4 高 通 量 筛 选 识别 肽 抗原 的 噬菌体 抗体 最 基本 的 筛选 方法 就 是 上 面 所 描述 的 (〈 见 2.4) 淘 洗 。 肽 -蛋白 质 交 联 物 被 包 被 到 96 孔 微 板 上 ， 特 异 抗体 的 筛选 程序 如 上 面 所 述 ( 见 2.4 ,2.5)， 但 不 同 的 是 高 通 量 筛选 过 程 ， 包 括 筛选 、 结 合 叹 菌 体 的 洗 脱 、 感 染 、 克 隆 挑选 、 克 隆 在 96 孔 板 中 的 排列 、 抗 原 肽 特异 抗体 的 ELISA 检测 等 过 程 全 部 由 商用 机 器 人 自动 完成 。 这 意味 抗体 的 产生 不 再 是 限 速 步骤 。 一 般 地 ， 每 个 肽 序列 挑选 12 个 抗体 克隆 。 由 线性 编码 ， 通 过 生物 信息 学 系统 将 阳性 克隆 和 EST 序列 联系 起 来 。 在 抗体 选择 的 最 后 阶段 ，ELISA 检测 阳性 的 E.coli 被 置 于 甘油 中 ， 在 - 707 保存 。 3.5 高 通 量 的 ICC 分 析 ICC 分 析 是 阑 明 抗原 与 疾病 相关 性 的 理想 技术 。 与 斑点 印迹 和 二 维 电泳 不 同 ， 这 两 项 技术 必须 将 组 织 磨 碎 并 溶解 ， 而 ICC 技术 则 保持 了 和 蛋白质 在 细胞 中 的 分 布 。 与 将 所 有 细胞 匀 浆 而 产生 的 平均 效果 不 同 ，ICC 技术 可 以 显示 蛋白 质 在 细胞 水 平 上 的 差别 。 也 许 有 人 会 问 ， 这 样 一 项 能 够 提供 丰富 信息 的 技术 为 什么 没有 被 广泛 采用 ? 问题 可 能 在 于 高 第 十 二 章 ， 只 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 aati 通 量 地 进行 此 项 技术 操作 存在 明显 的 困难 。 当 然 ， 要 想 每 月 完成 1000 个 样品 ， 有 许多 困难 需要 克服 。 在 下 面 一 些 领域 应 付出 特别 的 努力 。 获取 组 织 ”与 保存 各 种 不 同 组 织 的 临床 中 心 保 持 联 系 是 非常 重要 的 ; 这 些 组 织 在 取 材 之 后 必须 立即 进行 保存 。 然 而 ， 当 组 织 中 目标 mRNA 序列 所 剩 无 几时 ， 应 时 常用 蛋 白质 试剂 检测 组 织 中 的 抗原 。 理想 的 过 程 ”为 了 提高 产量 ， 被 仔细 挑选 出 来 的 各 种 不 同 的 组 织 在 被 切片 之 前 ， 被 切割 并 被 包装 起 来 。 除 提高 速度 之 外 ， 还 增加 了 过 程 的 一 致 性 ， 由 于 确保 了 一 批 中 不 同 的 组 织 被 进行 完全 相同 的 处 理 ， 使 得 不 同 组 织 间 易 于 比较 。 为 了 保持 抗原 性 ， 在 切 法 和 石蜡 包 埋 切 片 法 时 常常 优先 采用 王 切 法 ; 用 冷 丙 酮 的 温和 固定 方法 优先 于 交 联 固定 方 we 在 ICC 中 使 用 噬菌体 抗体 ICC H, MAKKAH RE AZ lal OH %, 96 孔 板 中 的 克隆 上 清 可 直接 用 于 标记 组 织 切片 。 me ICC 样本 ”当前 还 没有 什么 可 以 替代 人 类 的 专门 知识 来 解释 染色 的 图 案 。 团 队 的 方式 是 必须 的 。 在 预 筛 选中 ， 引 起 注意 的 图 案 被 挑选 出 来 ， 必 须 再 经 过 有 经 验 的 组 织 化 学 家 作 进 一 步 的 检查 ; 必须 有 一 个 可 交互 检查 解释 的 可 追踪 的 系统 。 记录 数据 与 显微镜 相连 的 数字 相机 可 以 拍摄 很 好 的 图 像 ， 这 些 图 像 被 存 于 数据 库 中 。 如 果 没 有 专家 的 解释 所 拍摄 的 图 像 几乎 没有 什么 用 处 ， 只 有 有 经 验 的 细胞 病理 学 家 才能 给 出 专门 的 解释 。 3.6 生物 信息 学 我 们 始终 强调 生物 信息 学 在 ProAbIMi 计 划 的 各 个 阶段 都 非常 重要 。 没 有 一 个 现成 的 软件 是 合适 的 ， 必 须 由 内 部 人 士 自 己 写 专门 的 软件 。 能 概括 所 发 现 的 各 个 方面 的 要 点 是 非常 有 用 的 。 在 发 现 阶 段 生 物 信息 学 的 作用 ”上面 我 们 简要 概括 了 如 何 利 用 生物 信息 学 系统 在 实 验 策 略 中 的 每 一 个 阶段 进行 控制 和 检测 。 下 面 是 流程 : 选择 和 设计 肽 抗原 y 控制 肽 合成 AK -A Fi Jon (BK 从 高 通 量 的 选择 中 记录 阳性 克隆 保存 阳性 抗体 克隆 追踪 抗体 DNA 序列 YY 样本 进行 细胞 免疫 化 学 分 析 记录 图 像 并 进行 语言 描述 - 198 - 和 蛋白质 组 学 选择 和 设计 肤 抗 原 利用 搜索 引擎 ， 由 统计 学 给 出 的 一 个 相关 序列 家 族 的 代表 序列 可 被 用 作 搜 索 EST 数据 库 的 模板 。 这 是 一 种 灵敏 的 发 现 一 个 家 族 中 新 EST 序列 的 方 法 。 这 种 应 用 就 是 Prolemy。 从 ICC 中 记录 图 像 和 进行 语言 解释 ”通过 数字 相机 存储 图 像 。 组 织 病 理学 家 的 解 释 被 记录 下 来 ， 并 由 声音 识别 软件 进行 转录 (Plato)， 然 后 被 编辑 到 注释 系统 中 ， 与 数 据 库 中 的 图 像 一 起 存放 。 生物 信息 学 和 数据 分 析 ProAbIYi 计 划 的 产品 是 一 个 数据 库 ， 在 数据 库 中 研究 者 可 以 从 EST 序列 与 细胞 病理 学 的 相关 模式 中 获得 生物 学 洞察 力 。 这 些 信息 必须 被 组 织 成 一 个 对 非 专 业 人 士 也 是 一 个 界面 友好 的 数据 库 。 应 用 体制 Java 软件 〈 被 称 为 可 移植 性 软件 ) 确保 数据 库 中 各 个 部 分 的 信 息 和 程序 能 够 在 任何 硬件 平台 上 进行 存 取 。 在 可 移植 性 软件 所 提供 的 外 壳 中 ， 各 个 部 分 可 以 通过 CORBA 进行 通讯 。 用 户 界 面 ProAbryw 数 据 库 的 界面 叫 做 Voyager。 一 般 用户 可 以 在 Voyager 界面 中 通过 询问 方式 获取 特定 的 数据 。 要 想 更 深入 地 挖掘 数据 ， 必 须 有 一 个 交互 性 更 好 的 界 面 。 一 种 有 用 的 策略 是 将 ICC 数据 还 原 为 真实 组 织 的 点 印迹 。 组 织 染 色 后 常常 被 分 为 四 个 区 域 ， 即 膜 、 细 胞 质 、 结 缔 组 织 和 非 结缔 组 织 。 这 些 区 域 表 现 为 不 同 颜色 的 点 ， 颜 色 的 深度 被 分 级 ， 反 映 出 组 织 学 家 对 染色 深度 的 评判 。 ProAbIM 数 据 库 在 可 移植 性 软件 框架 内 ， 通过 友好 的 Voyager 用 户 界 面 进行 存 取 是 ProAbIM 数 据 库 所 特有 的 。 这 就 是 Oracle 8 数据 库 ， 它 整合 了 所 有 的 实验 数据 ， 包 括 数字 图 像 文件 、 染 色 图 像 分 析 、 组 织 学 解释 、 从 EST 到 肽 设计 的 数据 追踪 、 每 一 特定 序列 的 合成 和 质量 控制 数据 、 抗 体 分 离 数 据 以 及 与 SWISS-PROT 和 EST 数据 库 的 链 接 。 3.7 “ProAbIM 计 划 的 应 用 实例 在 ProAb 过 程 中 ， 一 些 深入 了 解 的 蛋白 质 被 用 做 内 对 照 ， 这 被 证 实 可 以 有 效 地 鉴 别 正确 的 EST 表达 谱 。 实例 1 一 个 EST 片段 (dbEST number 845032) 被 翻译 成 VRSSSRTPSDKP; 针 对 相应 的 合成 肽 抗原 的 噬菌体 抗体 被 选择 出 来 ; ICC ka CE KAP RARER (A 12.3 (a))。 通 过 Blast 程序 搜索 EST 数据 库 发 现 与 此 肽 序列 匹配 的 CDNA 序列 来 源 于 人 扁桃 体 细 胞 文库 ， 通 过 流 式 分 选 证 明 ， 此 序列 在 生发 中 心 的 B 细胞 中 含量 丰富 。 注 册 人 推定 此 序列 为 人 肿瘤 坏死 因子 前 体 (TNFa)。ELISA 检测 证 明 ， 抗 此 肽 的 抗体 确 实 能 特异 识别 人 天 然 TNFa 实例 2 ” 肽 序列 ESRKLEKGIQVEIY 被 用 于 代表 人 内 皮 细 胞 黏附 分 子 (VCAM-1)， 它 对 应 于 从 脾 cDNA 文库 中 得 到 的 EST 序列 -EST20523。 此 ESTs 序列 被 注释 为 内 皮 细 胞 黏附 分 子 -1 类 似 序列 。 用 选择 得 到 的 抗 此 肽 的 吧 菌 体 抗体 染色 扁桃 体 生发 中 心 ， 结 果 与 报道 的 VCAM-1 在 树 突 状 细胞 上 的 分 布 一 致 (图 12.3 (b))。 第 十 二 章 “” 噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 * 199 ， 二 EE — _—___ 在 扁桃 体 中 TNF-c 特异 染色 在 扁桃 体 中 VCAM 特异 染色 图 12.3 ”利用 ProAbI 方 法 得 到 的 代表 性 结果 通过 利用 针对 代表 已 知 蛋白 抗 原 的 多 肽 片段 的 抗体 在 免疫 细胞 化 学 中 的 应 用 ， 这 一 过 程 得 到 了 证 实 。 免 疫 细胞 组 化 得 到 的 抗原 的 组 织 和 细胞 分 布 与 已 有 的 文献 报道 的 一 致 。(a) 利用 抗 多 肽 VRSSSRTPSDKP fy Mt 菌 体 抗 体 进行 的 TNF-a 特异 染色 ; (b) 利用 抗 多 肽 ESRKLEKGIQVEIY 的 噬菌体 抗体 进行 的 VCAM 特异 染色 4. HC EE 28 =e BY DA 4.1 常规 的 选择 抗 膜 蛋白 的 噬菌体 抗体 不 论 是 用 体内 方法 还 是 用 鸣 菌 体 展 示 技 术 ， 筛 选 针 对 膜 蛋白 的 抗体 都 是 一 种 挑战 。 这 主要 是 因为 被 用 作 免 疫 原 的 这 些 蛋 白质 非常 难以 纯化 。 简 单 的 跨 膜 蛋白 常 能 可 溶性 表 达 而 被 成 功用 于 鸣 菌 体 抗 体 的 筛选 。 对 于 那些 没有 可 溶性 表达 形式 的 膜 蛋白 ， 则 必须 纯 化 天 然 的 膜 重 白 ， 而 众所周知 ， 想 在 没有 一 些 蛋 白质 降解 的 情况 下 完成 纯化 很 困难 。 整 合 膜 重 白 ， 如 7 次 跨 膜 的 趋 化 因子 受 体 ， 则 代表 了 另 一 种 难度 : 它们 不 可 能 被 以 可 溶性 的 形式 表达 ， 不 论 是 天 然 的 还 是 重组 的 ， 要 纯化 一 定数 量 的 此 种 蛋白 且 不 变性 很 难 。 而 当前 的 方法 认为 至 少 蛋 白质 的 生物 化 学 信息 是 可 用 的 ， 而 不 是 恒 日 质 本 身 。 利用 未 纯化 的 抗原 混合 物 来 制备 抗体 有 时 是 可 能 的 ， 并 且 常 常 有 人 尝试 。 完 整 的 细 胞 可 以 被 直接 用 作 免 疫 原 ， 这 样 问题 就 转移 到 下 游 的 筛选 上 。 必 须 筛 选 大 量 的 抗体 ， 而 不 能 保证 其 目的 抗原 特异 性 ， 因 为 这 些 抗 体 是 被 随机 选择 出 来 的 。 一 种 提高 针对 细胞 表 面 特异 分 子 导 向 性 的 方法 是 用 一 般 细 胞 表面 蛋白 进行 反 盘 。 这 可 以 通过 采用 将 少量 表达 所 硕 望 细胞 表面 蛋白 的 细胞 与 大 量 不 表达 所 希望 细胞 表面 蛋白 的 细胞 混合 来 实现 。 通 过 加 一 种 细胞 特异 的 抗体 将 感 兴趣 的 目的 细胞 进行 标记 。 将 鸣 菌 体 抗体 库 加 入 细胞 混合 物 ， 训 细胞 将 结合 一 些 叭 菌 体 ， 然 后 ， 采 用 细胞 特异 的 抗体 将 靶 细 胞 从 细胞 混合 物 中 分 离 出 来 。 这 种 方法 采用 靶 细 胞 群 的 特异 抗体 ， 当 然 ， 最 好 是 被 用 于 那些 已 经 进行 了 很 好 的 细胞 亚 群 分 类 的 细胞 ， 如 血细胞 。 4.2 提高 膜 蛋白 筛选 的 导向 选择 如 果 叭 菌 体 抗体 库 中 的 抗体 可 被 导向 那些 感 兴趣 的 蛋白 ， 那 么 ， 筛 选 针 对 那些 只 能 ProxiMolIM 技 术 - 200 - 蛋白 质 组 学 在 混合 物 中 存在 的 蛋白 质 的 抗体 ， 成 功 的 机 会 更 大 ， 特 别 是 细胞 膜 蛋白 ， 如 受 体 。 一 种 理想 的 方式 就 是 采用 受 体 的 同 种 配 体 ， 同 时 也 是 一 种 证 明 靶 分 子 具 有 活性 构象 的 方法 。 结合 到 导向 分 子 附 近 的 叭 菌 体 可 以 被 分 离 出 来 ， 从 而 富 集 那 些 被 选择 出 来 的 带 有 特异 识 别 靶 受 体 的 鸣 菌 体 群体 。 这 就 是 ProxiMolzy 的 方法 原理 。 4.3 ”ProxiMolIM 方 法 及 应 用 酶 催化 沉淀 报告 法 ”在 ICC 和 一 些 其 他 的 技术 中 ， 常 常 通过 报告 酶 催化 产生 的 沉 淀 物 将 信号 进行 放大 (Bobrow et al., 1989, 1992). PRA AL WAS (HRP) 试剂 被 直接 或 间接 地 结合 到 靶 抗 原 上 。 在 过 氧化 所 和 生物 素 酷 胺 存在 下 ，HRP 将 催化 产生 短 命 的 生物 素 酷 胺 自由 基 ， 它 将 共 价 结合 并 生物 素 化 靠近 藻 根 过 氧化 物 酶 的 蛋白 质 。 沉 积 于 蛋白 质 上 的 生物 素 分 子 可 通过 链 亲 和 素 偶 联 试剂 检测 ， 如 藻 根 过 氧化 物 酶 ， 这 样 初始 的 信号 被 放大 ， 因 为 新 沉淀 的 生物 素 分 子 远 超 过 了 原始 靶 分 子 或 辣 根 过 氧化 物 酶 分 子 的 数目 。 ProxiMolIM 方 法 的 原理 “在 ProxiMolIY 方 法 中 ， 催 化 报告 沉淀 法 被 用 于 分 离 靠近 生 物 素 化 导 疝 分 子 的 鸣 菌 体 抗 体 (Osbourn et wz .，1998)。 接 触 导 向 分 子 有 两 个 条 件 。 第 一 ， 它 必须 与 靶 分 子 具 有 一 定 的 亲和力 或 是 与 靠近 靶 分 子 的 分 子 有 亲和力 。 第 二 ， 它 必 须 能 够 直接 或 间接 偶 联 HRP。 间 接 偶 联 HRP 包括 将 偶 联 HRP 的 抗体 结合 到 导向 分 子 上 ， 或 是 生物 素 化 导向 分 子 ， 然 后 将 导向 分 子 结合 到 链 亲 和 素 化 的 HRP 上 。 导 向 分 子 必须 保持 足够 的 生物 学 活性 ， 以 保持 它 与 靶 分 子 的 结合 。 然 而 ， 与 导向 配 体 竞争 结合 受 体 的 叭 菌 体 抗体 不 能 被 附着 在 偶 联 于 配 体 上 的 HRP 附近 。 实 或 中 的 ProxiMolIM 方 法 ”用 ProxiMolIXM 方 法 进行 针对 原 位 靶 抗 原 的 筛选 很 简单 (图 12.4)。 对 于 细胞 表面 抗原 ， 导 向 分 子 (通常 是 生物 素 化 的 靶 分 子 配 体 或 是 偶 联 HRP 的 抗体 ) 与 人 抗体 库 中 的 叭 菌 体 一 起 被 加 入 到 完整 的 细胞 中 。 温 育 之 后 ， 没 有 结 Ah ABR. URE, WIA HRP 标记 的 第 二 种 试剂 ， 温 育 ， 然 后 洗涤 。 加 入 生物 素 酷 胺 和 过 氧化 氨 ， 温 育 10min， 然 后 再 洗涤 。 通 常用 TEA RAR AE 脱 下 来 ， 生 物 素 化 的 叹 菌 体 通 过 链 亲 和 素 磁 珠 进行 分 离 ， 然 后 ， 感 染 大 肠 杆菌 。 通 过 得 选 ， 选 择 出 那些 特异 结合 靶 分 子 的 叹 菌 体 抗 体 及 结合 靶 分 子 附 近 蛋 白质 分 子 或 导 疝 分 子 EY) Baik Ba (A ProxiMolIM 方 法 的 应 用 范围 ProxiMolTM 方 法 可 被 应 用 于 各 种 不 同 的 靶 分 子 及 不 同 形式 的 蛋白 质 。 导 向 分 子 除 抗体 或 天 然 的 蛋白 质 配 体 如 细胞 因子 外 ， 还 包括 糖 类 和 脂肪 酸 配 体 。 存 在 于 完整 的 细胞 上 (附着 的 或 可 溶 的 )， 冷 冻 的 组 织 切片 中 或 分 离 的 细胞 腊 上 的 靶 抗 原 不 需要 进行 蛋白 质 的 分 离 。 生物 素 沉淀 的 范围 ”由 于 生物 素 酷 胺 自由 基 的 半衰期 很 短 ， 生 物 素 分 子 被 沉 演 在 附 近 的 HRP 分 子 上 。 为 了 了 解 生 物 素 沉淀 的 范围 ， 抗 基因 3 的 抗体 被 用 作 导 向 分 子 去 生 物 素 化 M13 RR. FA Som 的 链 亲 和 素 包 被 的 金 珠 ， 通 过 电子 显微镜 探测 了 沉 演 的 生 物 素 分 子 。 生 物 素 沉淀 的 范围 可 达到 2Snm， 平 均 在 10 一 1Snm。 这 使 我 们 相信 生物 素 沉 淀 的 范围 在 几 个 导向 分 子 直径 范围 内 。 ProxiMolIM 技 术 用 于 抗原 表 位 步 移 ;扩大 结合 TGF-B 克隆 库 以 前 选择 到 的 针对 TGF-B 的 主要 抗原 表 位 或 克隆 被 称 为 31G9。ProxiMolIY 方 法 被 用 于 扩大 抗 TGF-B Ay le 第 十 二 章 ” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 201 - (a) (b) @ = 7 me + te 图 12.4 导向 筛选 噬菌体 抗体 的 ProxiMolIY 方 法 (a) 在 细胞 表面 处 于 正常 环境 条 件 中 的 感 兴 趣 抗原 ; (b) 导向 配 体 被 偶 联 了 HRP， 并 特异 结合 到 其 相应 的 靶 蛋 白 上 ; (c) 加 入 鸣 菌 体 抗 体 库 ， 不 同 的 抗体 分 别 特异 结合 到 导向 配 体 、 驾 蛋白 及 其 他 的 细胞 表面 抗原 上 ; '(d) 加 入 生物 素 化 的 酷 胺 试剂 ， 产 生活 化 生物 素 ; 结合 到 导向 配 体 周围 25nm 范围 之 内 的 叹 菌 体 被 共 价 标 记 上 生物 素 。 这 些 识别 靶 蛋 白 及 其 周围 蛋白 的 噬菌体 抗 体 可 通过 包 被 链 亲 和 素 的 磁 珠 进行 分 离 。 菌 体 抗体 库 ， 导 向 新 的 抗原 表 位 。 采 用 ProxiMolIY 方 法 进行 的 选择 在 固定 有 TGF-8 的 BIAcore 芯片 上 进行 ， 导 向 分 子 为 HRP 偶 联 的 31G9。 鸣 菌 体 的 结合 和 非 结合 叹 菌 体 的 洗 脱 如 前 所 述 ， 然 后 ， 加 入 过 氧化 氢 和 生物 素 酷 胺 。 被 生物 素 化 的 叭 菌 体 被 分 离 出 来 ， 然后 侵 染 大 肠 杆菌 。 经 过 两 轮 的 筛选 ， 分 离 出 来 的 13.$5% 的 克隆 是 TGF-B PATE see, 并 且 均 为 新 克隆 。 与 此 对 照 ， 在 没有 导向 分 子 存在 下 筑 选 到 的 所 有 阳性 克隆 均 为 31G9 (Osbourn et wd .，1998)。 因 此 ，ProxiMolIX 方 法 通过 对 非 主 要 抗原 表 位 的 叭 菌 体 抗体 的 筛 选 ， 扩 大 了 针对 纯化 抗原 的 抗体 库 。 ProxiMolIXM 方 法 用 于 筛选 针对 细胞 表面 特异 黏附 分 子 的 抗体 ProxiMolIM 技 术 最 大 的 应 用 是 在 筛选 针对 细胞 表面 特异 分 子 的 抗体 方面 。 为 了 靶 向 选择 素 (表达 于 活化 的 内 皮 细 胞 表面 的 黏附 分 子 )， 采 用 了 选择 素 的 配 体 和 抗体 。 用 TNF-a 活 化 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 ， 以 诱导 细胞 表达 PETRA A EER. RAP 选择 素 和 下 选择 素 的 配 体 sialyl Lewis X 作为 导向 分 子 ， 利 用 ProxiMolIY 方 法 ， 在 完整 的 单 层 培养 的 细胞 上 进行 筛选 。 经 过 两 轮 的 筛选 ，13.7% 的 克隆 为 下 选择 素 阳 性 克隆 ， 。 202 - 蛋白 质 组 学 6.3% 的 克隆 为 P 选 择 素 阳性 克隆 (Osbourn et wz .，1998)。 与 此 对 照 ， 用 HRP 标记 的 抗 下 选择 素 的 抗体 作为 导向 分 子 ， 只 筛选 到 下 选择 素 特异 的 叹 菌 体 。 因 此 ， 通 过 配 体 特异 的 导向 筛选 ， 有 可 能 在 完整 细胞 上 进行 原 位 天 然 膜 结合 抗原 的 抗体 筛选 。 采用 ProxiMolI 方 法 获得 抗 细胞 表面 7-TM 受 体 的 抗体 ， 深 埋 于 细胞 膜 中 的 穿 膜 蛋 白 ， 如 7 次 穿 膜 的 蛋白 (7TM)， 很 难以 天 然 状态 进行 纯化 ， 它 们 是 原 位 筛选 的 理想 况 标 。 趋 化 因子 CC5R 表达 于 工 淋 巴 细胞 上 ， 并 被 认为 是 HIV 感染 的 辅助 受 体 。 利 用 生 物 素 化 的 CCSR 的 配 体 MIP-1la 作为 导向 分 子 ， 采 用 ProxiMolIY 方 法 对 人 工 淋巴 细胞 进 行 筛选 。 将 生物 素 化 的 MIP-1c 和 噬菌体 与 细胞 进行 温 育 ， 然 后 ， 加 入 链 亲 和 素 标 记 的 HRP， 采 用 上 面 所 述 的 ProxiMolIY 方 法 进行 筛选 。 第 一 轮 筛 选 的 产物 通过 基于 完整 细 胞 及 蛋白 质 的 ELISA 方法 进行 了 分 析 。 随 机 挑选 的 95 个 克隆 中 ，30 个 克隆 可 以 识别 工 细胞 ， 其 中 ，13 个 克隆 结合 CCRS， 剩 下 的 17 个 克隆 结合 工 细 胞 表面 的 与 CCRS 相关 (a) FITC 标记 对 照 MV2 .MIP-1a 结 合 +FITC 标记 的 链 酶 亲 和 素 对 照 MV2 scFv 抑 制 MIP-1cw 与 CD4 细 胞 的 结合 细胞 数 荧光 强度 tay ‘ 荧光 强度 MV3 MVS MV3 scFv 抑 制 MIP-1c 与 CD4 细 胞 的 结合 MV5 scFv 抑 制 MIP-1c 与 CD4 细 胞 的 结合 细胞 数 ， (b) *—| MIP-I alpha —ea— MV5 荧光 计数 0 50 100 150 时 间 / 秒 图 12.5 iat 9 ProxiMolIM 方 法 得 到 的 活性 抗体 (a) 通过 流 式 细胞 术 ， 回 得 得 到 的 scFv 能 抑制 MIP-la 结合 到 CD4 阳性 细胞 上 。 每 个 峰 的 阴影 部 分 代表 MIP-1la 结合 到 细胞 上 (将 生物 素 化 的 MIP-la 加 入 细胞 中 ， 然 后 加 入 FITC 标记 的 链 亲 和 素 )。 每 个 峰 的 非 阴影 部 分 代表 不 加 生物 素 标记 的 MIP-la， 只 加 FITC 标记 的 链 亲 和 素 得 到 的 信号 。 与 对 照 比 (上面 左 图 )， 三 种 sFv-MV2，MV3 和 MVS 均 能 抑制 MIP-le 的 结合 ; (b) scFv-MV5 封闭 了 由 MIP-1a 结合 到 其 受 体 CCRS 上 而 产生 的 Ca? 信号 ; 将 SOnmMIP-1a 加 入 CCR5 转 染 的 CHO 细胞 中 ， 利 用 2- 哮 喃 的 荧光 ， 通 过 标准 方法 检测 细胞 内 自由 Ca 流 度 的 升 高 。 第 十 二 章 “” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 203 - Ay BITE PRE. HOTA RAF HE CDNA 表达 文库 ， 得 到 了 几 个 洪 在 的 令 人 感 兴趣 的 蛋白 质 ， 其 中 包括 磷酸 酷 氨 酸 磷酸 酶 。 因 此 ，ProxiMolIY 方 法 不 仅 可 使 我 们 定向 特异 的 细胞 表面 受 体 ， 而 且 ， 还 能 用 于 鉴定 一 些 可 能 与 此 受 体 相关 的 蛋白 质 。 回 得 ”在 ProxiMolIM 筛 选 方法 中 ， 用 受 体 的 配 体 作 为 导向 分 子 的 盘 选 ， 只 能 筛选 到 那些 与 配 体 识别 不 同位 点 的 抗体 ， 这 些 抗体 不 能 中 和 配 体 与 受 体 的 相互 作用 。 为 了 克 服 这 种 局 限 性 ， 采 用 两 步 筛 选 法 。 以 受 体 的 配 体 分 子 为 导向 分 子 ， 按 常规 ProxiMol™ 方法 进行 筛选 ， 生 物 素 化 的 噬菌体 被 分 离 出 来 。 这 些 被 分 离 出 来 的 鸣 菌 体 不 是 被 用 于 感 染 大 肠 杆菌 ， 而 是 被 用 于 利用 新 的 抗体 库 进 行 第 二 轮 ProxiMolIMY 筛 选 的 导向 分 子 。 这 使 得 那些 与 原始 指导 分 子 / 配 体 识 别 相 同位 点 的 只 菌 体 被 分 离 出 来 。 当 然 ， 这 必 将 产生 各 种 不 同 的 产物 ， 因 为 那些 与 第 一 轮 全 部 筛选 产物 所 识别 的 和 蛋白质 附近 所 有 结合 的 鸣 菌 体 均 被 分 离 出 来 。 先 检测 第 一 轮 盘 选 产物 ， 鉴 别 出 受 体 特异 的 噬菌体 ， 然 后 ， 用 这 些 特 异 的 噬菌体 作为 指导 分 子 进行 第 二 轮 的 回 算 ， 可 以 增加 筛选 的 特异 性 。 CCRS 的 回 筛 策略 是 第 一 轮 的 ProxiMol iit, SAA MIP-la 作为 导向 分 子 ， 筛 选 的 产物 作为 回 得 的 导向 分 子 。 那 些 识别 CCRS 的 克隆 被 通过 ELISA 方法 鉴别 出 来 。 利 用 生物 素 化 的 MIP-1lac 和 sceFv， 通 过 流 式 细胞 仪 将 抑制 MIP-1lc 结合 的 喉 菌 体 克 隆 鉴别 出 来 (图 12.$a) 。 其 中 ， 一 个 具有 抑制 MIP-lu 结合 活性 的 克隆 同时 能 抑制 MIP-1o 诱 导 的 CCRS 表达 细胞 的 钙 离 子 流 (图 12.$Sb)。 因 此 ， 经 过 简单 的 两 步 筛选 策略 ， 特 异 结合 细胞 表面 7-TM 受 体 的 配 体 结合 位 点 的 抗体 被 分 离 出 来 。 4.4 ProxiMolIM 方 法 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 应 用 用 来 源 于 ProAbIXM 的 抗体 作 标 签 指导 新 的 筛选 ”在 ProAbIXY 筛 选中 得 到 的 令 人 感 兴 趣 的 噬菌体 抗体 不 可 能 在 生物 学 分 析 中 表现 出 活性 。 但 这 些 抗体 是 疾病 特异 的 抗原 或 表 位 的 有 用 标签 ， 可 被 用 于 在 ProxiMolIY 筛 选中 的 导向 分 子 。 因 为 ProAbIXY 数 据 库 已 显示 了 鸣 菌 体 抗体 的 组 织 特异 性 ， 合 适 的 组 织 切 片 就 可 成 为 ProAbi 筛 选 的 间 抗 原 的 来 源 。 作为 导向 分 子 ， 最 简单 的 就 是 生物 素 化 的 ProAbIXY 叭 菌 体 抗体 ， 还 有 一 种 就 是 scFv。 筛选 ProxiMolIY 方 法 得 到 的 产物 ， 可 以 找到 满足 所 期 望 生物 学 活性 的 抗体 。 低 通 量 的 染色 筛选 是 在 组 织 切片 上 进行 ; 然而， 必须 鉴别 与 原始 ProAbIY 抗 体 染 色 图 案 匹 配 的 图 案 。 高 通 量 的 筛选 策略 是 利用 ELISA 方法 ， 或 是 用 对 特定 细胞 的 流 式 细 胞 术 。 这 种 筛选 方法 也 可 以 用 特定 激活 状态 的 细胞 ， 这 样 有 可 能 深入 了 解 在 原始 组 织 切 片 中 细胞 的 状态 。 鸣 菌 体 或 scFv 可 直接 用 于 离 体 的 细胞 分 析 。 这 样 ，ProAbIM 抗 体 就 可 被 用 于 分 离 具有 生物 学 活性 的 抗体 ， 并 有 可 能 被 用 于 界定 靶 细胞 的 活化 状态 。 用 ProxiMolIM 技 术 鉴 定 新 的 有 蛋白质 成 员 或 蛋白 质 /DNA 复合 物 FE ProxiMolIM 技 术 中 的 生物 素 标 记 步 又 中 ， 生 物 素 沉淀 的 范围 在 3 一 4 个 蛋白 质 分 子 直径 范围 内 。 这 样 ProxiMoliY 技 术 将 产生 结合 靶 分 子 附近 其 他 蛋白 质 的 反应 物 。 对 CCRS 的 工作 就 是 一 个 很 好 的 例子 ; 当 MIP-o 被 用 作 导 向 分 子 时 ， 得 到 了 一 些 并 不 针对 CCRS 的 喉 菌 体 抗体 。 这 其 中 的 一 些 抗体 被 用 于 和 划 选 表达 文库 ， 发 现 这 些 抗体 所 识别 的 一 些 蛋白 质 ， 它 们 被 认 为 存在 于 膜 中 ， 靠 近 CCR5。 这 导致 发 现 了 一 些 可 能 令 人 感 兴 趣 的 和 蛋白质， 包括 磷酸 栈 氨 酸 磷酸 酶 。 因 此 ，ProxiMolIyY 技 术 不 仅 使 我 们 能 定向 细胞 表面 特异 受 体 ， 而 且 ， 还 可 使 我 们 鉴定 可 能 与 受 体 相关 的 其 他 和 蛋白质。 这 导致 了 一 种 可 能 性 ， 那 就 是 通过 连续 几 轮 - 204 ， 蛋白 质 组 学 的 ProxiMolIXM 筛 选 和 检测 ， 将 可 描绘 出 蛋白 质 多 分 子 复合 物 的 轮廓 。 致谢 上 面 所 描述 的 工作 依赖 于 团体 的 努力 ， 这 些 努 力 远 不 止 来 自 于 剑桥 抗体 技术 方面 的 科学 家 ， 还 要 感谢 以 下 个 人 对 著述 本 书 所 提供 的 专门 技术 。 他 们 是 Simon Brocklehurst 及 生物 信息 小 组 的 全 体 成 员 ， 在 肽 合成 方面 作出 杰出 成 就 的 George Masih, John Mc- Cafferty, Tony Pope 及 MAb 分 离 小 组 的 全 体 成 员 ， 以 及 在 ICC 方面 提供 专门 指导 的 Tony Warford。 (Ln VE Wim ik) 参考 文献 Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M.H., Xiao, H., Merril, C.R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R.F. et a/. 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(1991) Man-made antibodies. Nature 349: 293-299. Yanisch, P.C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103-119. 第 十 三 章 ” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 Nicolle H. Packer and Lucy Keatinge 1. 515 BARAT HRENSHEDAAD HR CAH AER MIRC A, — AER 胶 电 泳 作为 探索 细胞 中 蛋白 质 组 分 变化 的 平行 效应 的 一 种 有 效 方法 已 经 形成 。 目 前 ， 从 胶 及 膜 上 快速 、 准 确 以 高 通 量 方式 在 fmol 数量 级 上 鉴定 及 定性 蛋白 质 已 成 为 可 能 ， 但 是 当 这 种 方法 被 延伸 至 分 析 细 胞 中 糖 蛋 白 时 ， 结 果 并 不 令 人 乐观 。 真 核 细胞 的 基因 组 与 蛋白 质 组 间 的 特征 区 别 之 一 就 是 绝 大 多 数 基因 产品 是 经 过 翻译 后 修饰 的 ， 其 中 糖 基 化 是 最 重要 的 修饰 方式 。 从 已 知 的 DNA 序列 导出 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 ， 并 以 此 来 确定 其 特 殊 的 功能 通常 是 不 够 的 ， 这 一 点 已 日 趋 明 朗 ， 发 生 在 蛋白 表达 之 中 或 之 后 的 修饰 对 蛋白 质 的 功能 影响 较 大 ， 因 此 ， 分 析 这 些 修饰 对 不 同 蛋白 表达 模型 的 理解 是 至 关 重 要 的 ， 目 前 ， 这 一 需求 可 以 通过 和 蛋白质 组 技术 加 以 实现 。 我 们 所 观察 到 的 糖 基 化 变化 是 糖 基 转 移 酶 活性 的 反映 ， 糖 基 转 移 酶 合成 寡 糖 并 将 其 附着 于 和 蛋白质， 糖苷 酶 修整 及 降解 多 糖 。 糖 蛋白 质 组 学 研究 的 目的 就 是 鉴定 作为 特定 表 型 标志 的 糖 蛋 白 ， 鉴 定 与 表 型 变化 相关 的 特定 的 糖 基 化 的 改变 ， 以 及 追踪 与 这 些 变化 相 对 应 的 代谢 过 程 。 比较 考 马 斯 亮 蓝 染 色 及 一 种 新 的 荧光 糖 和 蛋白 染色 技术 用 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 人 血清 蛋白 〈 图 13.1)， 我 们 发 现 许 多 丰 度 高 的 蛋白 是 糖 基 化 的 ， 并 且 依 糖 基 形式 不 同 它们 的 等 电 点 及 分 子 量 不 同 。 普 遍 认为 我 们 应 该 研究 为 什么 在 蛋白 质 的 糖 基 化 过 程 中 有 如 此 多 的 不 均一 性 以 及 对 于 这 些 不 均一 性 必须 加 以 分 析 。 尽 管 如 此 ， 相 对 而 言 在 蛋白 质 组 学 研 究 中 ， 用 上 述 提 到 的 平行 进程 的 方法 分 析 蛋 白质 中 的 糖 组 分 这 一 领域 并 未 得 到 足够 的 重 视 。 我 们 相信 ， 在 细胞 中 糖 蛋 白 组 分 研究 方面 的 延误 有 两 个 原因 : 第 一 ， 尽 管 有 大 量 文 献 报导 在 疾病 的 发 生 、 发 展 过 程 中 糖 基 化 的 变化 ， 我 们 也 只 是 停留 在 对 这 些 糖 基 化 变化 如 何 对 有 机 体 产 生生 物 学 效应 方面 的 了 解 。 其 次 ， 研 究 多 糖 的 分 析 方 法 传统 地 被 认为 是 基于 糖化 学 家 的 实验 室 工作 ， 这 就 造成 了 一 种 印象 ， 即 分 析 糖 蛋白 需要 蛋白质 化 学 家 们 所 难以 胜任 的 特殊 知识 与 技术 。 本 章 将 在 蛋白 质 组 学 的 论述 中 阐述 这 两 个 问题 。 为 了 建立 有 机 体 新 陈 代 谢 中 糖 基 化 的 规律 ， 仅 仅 对 蛋白 质 中 多 糖 结构 定性 是 不 够 的 。 因 此 ， 尽 管 分 析 蛋 白质 的 糖 基 化 变化 有 利于 新 陈 代谢 变化 〈 如 疾病 的 发 生 ) 的 诊断 和 监测 ， 但 这 些 变化 并 不 足以 描述 糖 基 赋 子 蛋 白质 的 功能 。 此 外 ， 糖 链 的 丢失 对 蛋白 质 活性 的 影响 并 不 总 是 可 以 观察 到 的 ， 一 些 重组 糖 蛋白 在 其 天 然 糖 基 化 被 丢失 后 仍 具 有 活 性 。 普 遍 认 为 ， 在 许多 情况 下 ， 特 定 的 糖 基 化 对 于 蛋白 的 正确 折 释 及 作用 是 至 关 重 要 的 ; 或 者 ， 由 于 糖 基 化 的 多 样 性 使 蛋白 质 的 功能 表现 为 不 规律 性 ， 二 者 必 具 其 一 。Var- ki (1993) 的 综述 对 这 些 明 显 矛 盾 的 观点 予以 了 论述 。 - 206 - 蛋白 质 组 学 pH4 pH7 图 13.1 PVDF 膜 上 糖 蛋 白 的 荧光 染色 法 (a) 考 马 斯 蓝 染色 ; (b+) 糖 荧光 素 染色 。1lpl 血清 样品 经 重 泡 胀 上 样 ， 经 2-DE 分 离 在 PVDF 膜 上 显 出 斑点 ， 用 Bio-Red 糖 蛋白 检测 试剂 盒 ,， 即 高 碘 酸 盐 氧 化 糖 的 荧光 染色 法 代替 夹层 抗体 染色 法 ， 改 进 方 法 为 用 0.05mg/ml AER 50% (V/V) 甲醇 ，100mM 醋酸 钠 溶液 。 糖 蛋白 糖 基 组 分 固有 的 多 样 性 能 导致 蛋白 质 在 形状 、 电 荷 及 体积 等 方面 发 生 微妙 的 变化 ， 这 种 变化 有 可 能 暂时 性 或 者 在 空间 上 修饰 蛋白 质 的 功能 。 这 种 多 样 性 需要 有 相关 复杂 的 物理 及 化 学 技术 对 其 组 成 、 连 接 、 分 支 、 异 构 体 及 连接 位 点 等 进行 确定 。 由 于 仅 限于 单 糖 残 基 结 构 及 多 糖 连接 方式 的 研究 ， 糖 蛋白 的 分 析 过 于 简单 化 ， 通 常 碳水 化 合 物 分 析 化 学 被 发 展 成 为 复杂 多 糖 的 结构 测定 ， 蛋 白质 中 多 糖 的 分 析 就 是 从 这 些 技术 中 选择 性 地 开发 的 。 这 就 促使 一 些 商业 性 的 分 析 多 糖 结构 的 工具 出 现 (Oxford GlycoSciences, UK; Glyko Inc, USA; Bio-Rad, USA; Beckman，USA)。 综 合 糖苷 外 切 酶 、 商 业 化 的 生物 毛细 管 电泳 及 质谱 ， 目 前 已 能 够 定性 分 析 蛋 白质 中 多 糖 的 微 不 均 一 性 ， 而 蛋白 质 组 技术 接受 了 综合 这 些 技术 从 而 适应 大 量 糖 蛋 白 分 析 的 挑战 。 本 章 我 们 给 出 一 些 领域 中 的 例子 ， 说 明 糖 基 化 有 其 重要 的 规律 ， 同 时 可 以 有 力 地 使 读者 确信 蛋白 质 糖 基 形 式 的 分 析 是 理解 细胞 蛋白 质 组 的 基础 。 下 面 我 们 描述 糖分 析 技 术 ， 它 使 适应 糖 蛋白 质 组 研究 的 高 通 量 分 析 成 为 可 能 。 2. AeA? 糖 蛋白 是 由 酶 将 一 个 或 多 个 糖 元 加 合 在 最 初 的 多 肽 链 上 ， 修 饰 范围 从 蛋白 质 上 连接 单 糖 (比如 胶原 糖 蛋白 及 核糖 蛋白 ); 到 密集 、 复 杂 、 有 侧 链 结构 的 多 糖 (如 黏液 素 ); 以 及 具有 复杂 的 氨基 葡 聚 糖 侧 链 的 蛋白 多 糖 。 多 糖 与 蛋白 质 相 联 有 三 种 形式 : N- 连 接 、 O- 连 接 及 糖 基础 酯 酰基 醇 固 定 结构 。 在 同样 一 个 蛋白 质 上 可 以 发 现 这 三 种 修饰 方式 共 存 。 具 有 相同 氨基 酸 序列 但 不 同 糖 基 侧 链 的 蛋白 质 异 构 形 式 通常 可 以 在 二 维 凝 胶 电泳 分 离 上 看 到 ， 由 于 它们 的 等 电 点 及 分 子 质 量 不 同 表 现 为 斑点 的 拖 尾 。 2.1 N- 糖 链 结构 N- 糖 链 结构 通常 发 生 于 内 质 网 及 高 尔 基体 上 ， 在 这 里 GleNAc)ManoGle3 为 普遍 结 入 第 十 三 章 “” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 - 207 - 构 ， 在 此 基础 上 ， 由 糖苷 酶 及 糖 基 转移 酶 将 其 进行 多 样 化 整理 和 修饰 ， 几 乎 所 有 的 N- 连接 多 糖 内 侧 都 具有 GlcNAczMans 的 核心 结构 ， 它 与 出 现在 特定 序列 Asn-Xaa-Ser/Thr (Xaa 是 除 Pro 以 外 的 任何 氨基 酸 ) 中 的 天 冬 酰 胺 残 基 相 连接 。 按 照 单 糖 的 位 置 可 将 N- 连接 结构 分 为 高 甘露 糖 型 、 混 合 型 或 复杂 型 多 糖 。 不 同 的 糖 链 可 连 于 同一 位 点 〈 微 不 均 一 性 )， 同 时 在 同一 蛋白 质 上 也 可 有 不 同 的 位 点 连接 糖 链 (显著 不 均一 性 )。 所 有 定性 的 糖 蛋白 都 具有 相同 的 N- 连 接 五 糖 核心 ， 与 此 同时 多 糖 链 内 或 链 间 的 整 理 与 修复 使 它 在 位 置 、 侧 链 、 大 小 及 异 构 配 置 上 发 生变 化 。 2.2 0O- 连 接 结构 O- 连 接 守 糖 通常 与 丝氨酸 或 苏 氨 酸 的 羟基 部 分 连接 ， 有 时 也 与 产 赖 氨 酸 及 羟 甫 氨 酸 连 接 。 尽 管 Hansen 等 (1998) 已 经 建立 了 一 种 神经 网 络 可 以 预测 黏 蛋 白 型 糖 基 化 ， 但 并 无 一 个 简单 的 规律 认为 含 羟基 残 基 可 以 作为 连接 位 点 。 黏 蛋 白 型 O- 连 接 糖 基 化 最 初 是 由 完全 折 和 的 蛋白 质 中 丝氨酸 或 苏 氨 酸 与 GalNAc 残 基 连 接 ， 这 是 由 糖 蛋 白 的 一 级 、 二 级 甚至 三 级 结构 所 决定 的 ， 由 特殊 转移 酶 来 实现 的 单 糖 残 基 继 续 延 伸 是 被 高 度 控 制 的 (Van den Steen et al .，1998a)， 与 较 普 通 的 黏 蛋白 型 O- 连 接 糖 基 化 相 比 ， 一 些 特 殊 的 O- 糖 基 化 形式 ， 如 0O- 连 接 的 岩 藻 糖 及 和 葡萄糖， 是 依赖 于 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 以 及 八 个 不 同 的 还 原型 末端 与 如 前 所 述 的 丝氨酸 与 苏 氨 酸 相连 (Hounsell et al., 1996). & RRA DDH AWE AEA ARR O- 糖 基 化 ， 但 是 单一 的 GleNAc 组 分 在 细胞 质 及 核 膜 孔 A (Hart et al., 1996) 上 发 现 ， 而 糖 部 分 与 蛋 白 质 之 间 的 磷 酰 二 酯 连接 方式 在 黏 物 质 及 一 些 寄生 动物 或 者 更 为 广 谤 的 一 些 生物 体 上 可 以 见 到 (Hanynes, 1998). 2.3 糖 基础 脂 酰 肌 醇 (GPI) 固定 结构 糖 基础 脂 酰 肌 醇 结 构 具 有 将 细胞 膜 的 朴 水 性 磷酸 双 分 子 层 固定 于 不 同 蛋 白质 的 功能 (Kinoshita et wd .，1997)。 它 们 具有 相同 的 MansGlcNH2 糖 核 ， 它 是 细胞 膜 内 磷脂 与 蛋 白质 之 间 的 桥梁 ， 这 一 翻译 后 修饰 行为 发 生 在 内 质 网 中 信号 肽 C 末端 切割 之 后 。 3. 为 什么 量 日 质 组 对 糖 蛋 日 感 兴趣 ? 蛋白 质 组 学 是 一 个 以 蛋白 质 为 基础 的 整体 生物 学 方法 ， 这 种 方法 是 对 DNA 及 mRNA 的 表达 产物 而 不 是 DNA 和 mRNA 本 身 进 行 分 析 。 绝 大 多 数 情况 下 ， 一 个 成 熟 蛋 自 的 生物 学 活性 是 被 翻译 后 修饰 的 ， 而 这 些 修 饰 又 是 高 度 动态 的 。 对 哺乳 动物 来 说 ， 蛋 白质 的 多 糖 组 分 的 作用 包括 免疫 反应 的 修饰 、 蛋 白 识别 及 定位 、 蛋 白质 折 和 至 、 血 清 清除 率 及 信和 号 调控 。 讨 论 碳 水 化 合 物体 内 功能 的 详细 综述 见 文献 (Dwek，1995; Kukuruzin- ska and Lennon，1998; Lis and Sharon，1993; Varki，1993 ) 。 人 类 生物 学 最 感 兴趣 的 实验 体系 包括 在 受精 及 疾病 的 发 生 过 程 中 糖 蛋白 的 涉 入 。 我 们 在 此 对 这 两 个 例子 进行 讨论 目的 在 于 揭示 理解 那些 被 表达 的 基因 产品 ， 其 翻译 后 修饰 功能 的 重要 性 。 3.1 糖 蛋白 与 受精 对 于 动物 体 ， 从 卵 母 细胞 与 精子 细胞 之 间 的 识别 开始 ， 到 一 个 成 熟 的 有 机 体 发 展 到 eee | - 208 - 蛋白 质 组 学 顶点 ， 在 此 进程 中 糖 蛋 白 起 着 至 关 重 要 的 作用 。 对 于 哺乳 动物 的 受精 ， 包 围 在 卵子 周转 的 细胞 外 糖 蛋 日 外 衣 [透明 带 (ZP)] 是 关键 部 分 。 在 渗透 过 滤 泡 细胞 之 后 ， 精 子 捆绑 于 透明 带 (ZP)， 它 是 由 三 种 硫酸 化 糖 蛋白 ZP1、ZP2 及 ZP3 组 成 的 ， 这 些 糖 蛋白 对 识 别 与 捆绑 是 关键 性 的 (Zara and Naz，1998) 。 在 精子 表面 的 B-1, 4- 半 乳糖 转移 酶 是 研究 卵 壳 ZP3 的 最 佳 受 体 。 对 于 转基因 小 鼠 ， 这 种 酶 的 过 表达 可 在 许多 方面 对 精 - 卵 相 互 作 用 产生 影响 (Youakim et al .，1994)， 此 外 ， 在 B-1，4- 半 乳糖 转移 酶 基因 丢失 中 幸存 下 来 的 一 些小 鼠 的 精子 ， 仅 能 艰难 地 渗透 过 透明 带 ， 在 体外 不 能 与 卵 母 细胞 受精 (Lu and Shur，1997)。 在 避孕 与 受精 的 研究 中 ， 糖 蛋白 质 组 学 方法 可 以 监测 和 定位 受精 过 程 中 糖 蛋 白 的 变化 。 在 避孕 研究 中 令 人 感 兴趣 的 一 种 糖 蛋白 是 调节 黄体 酮 的 子宫 gly- codelins， 它 的 氨基 酸 序列 与 B- 乳 球 蛋 白 完 全 相同 ， 所 不 同 的 只 是 其 独一无二 的 多 糖 结 构 。 源 于 子宫 内 膜 的 glycodelin A 阻 止 精 卵 结 合 ， 同 时 ， 与 其 糖 基 化 不 同 的 源 于 血浆 的 精液 中 glycodelin S 却 无 此 功能 (Seppala et al., 1998). Glycodelin A 与 S$ 的 基因 相同 (胎盘 蛋白 14)， 但 是 由 于 翻译 后 糖 基 化 的 不 同 导致 了 蛋白 质 的 功能 及 组 织 定 位 不 同 。 3.2 糖 蛋白 与 疾病 在 疾病 的 最 初 阶 段 ， 糖 蛋白 通常 在 结构 与 功能 上 显示 出 变化 ， 而 这 些 变化 涉及 到 与 蛋白 相连 的 多 糖 结构 。 这 种 变化 能 够 描绘 疾病 的 进程 ， 在 这 一 领域 有 大 量 文献 及 两 本 书 发 表 (Brockhausen and Kuhns, 1997; Montreuil et wz .，1996)， 其 中 描述 了 糖 蛋 和 白 在 人 类 疾病 进程 中 的 作用 。 最 近 Brockhausen 等 (1998) 的 综述 讨论 了 在 人 类 疾病 过 程 中 糖 基 转 移 酶 缺失 情况 下 这 些 糖 蛋白 交互 作用 的 机 理 。 我 们 所 缺乏 的 是 对 于 疾病 相关 或 疾病 导致 的 糖 基 化 变化 与 真正 引起 疾病 的 糖 基 化 变化 二 者 之 间 差 异 的 理解 。 很 清楚 ， 后 者 是 我 们 感 兴趣 的 ， 因 为 它们 是 干涉 治疗 的 位 点 。 蛋白 质 组 方法 测定 包括 疾病 进程 初期 ， 疾 病 与 正常 组 织 之 间 所 表现 出 来 的 差异 蛋白 质 的 鉴定 。 这 些 蛋 白 以 后 可 作为 诊断 及 控制 疾病 的 靶 点 。 许 多 糖 蛋 白 ， 特 别 是 在 糖 基 化 方面 发 生变 化 的 糖 蛋白 已 经 用 于 反应 人 类 疾病 的 过 程 ( 表 13.1)。 表 13.1 的 例 举 虽然 并 不 完全 ， 但 从 中 也 可 以 看 到 一 些 异 常 新 陈 代谢 与 糖 基 化 变化 之 间 的 联系 。 由 于 血清 通 常用 作 临 床 诊断 的 对 象 ， 同 时 易于 获得 ， 因 此 ， 有 许多 报导 是 关于 在 疾病 过 程 中 ， 血 清 中 糖 蛋白 的 糖 基 化 变化 的 ， 我 们 推断 在 固体 病变 组 织 中 表现 出 的 糖 基 化 变化 也 会 有 相 类 似 的 差异 性 。 糖 基 化 差异 也 被 用 于 构建 多 糖 类 癌症 疫苗 。 例 如 ， 正 常 上 皮 细 胞 上 的 黏 蛋白 表面 就 密集 地 包围 着 混合 型 多 糖 结构 ， 在 癌 细 胞 上 ， 隐 藏 的 糖 基 抗原 决定 基 (Tn 及 唾液 酸化 Tn 抗原 ) 暴露 于 黏 蛋 白 上 ， 同 时 ， 成 为 了 抗 癌 治 疗 疫苗 的 靶 点 。 这 些 以 特殊 的 多 糖 与 合成 多 肽 结合 ， 用 于 和 任 疫 治疗 的 不 同 策略 已 在 临床 试用 (Kudryashov et al., 1998; Lo- Man et al .，1999)， 同 时 ， 它 已 经 成 为 这 一 领域 的 研究 兴 香 点 。 普遍 认为 二 维 凝 胶 电泳 是 展示 蛋白 质 差 异 表达 的 首选 方法 。 许 多 蛋白 质 被 同时 展 示 ， 而 所 观察 到 的 差异 可 与 其 表 型 差异 相关 联 。 蛋 白质 组 并 不 需要 以 显示 单个 蛋白 为 目 的 ， 而 是 要 观察 对 任何 所 选择 的 生物 体系 的 网 络 途径 的 影响 ， 所 以 蛋白 质 组 要 求 对 多 种 种 属 群体 成 员 进行 筛选 ， 以 揭示 那些 发 生 在 蛋白 表达 中 与 个 体 水 平 相 类 似 的 群体 水 平 上 的 变化 ， 如 果 一 个 糖 蛋白 对 表 型 变化 有 影响 ， 那 么 它 可 以 用 作 疾 病 的 诊断 标记 ; 或 者 直 第 十 三 章 “ 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 。 209 - 接 采 用 凝 胶 电泳 分 析 方 法 ; 或 者 利用 其 他 分 析 方 法 对 其 进行 分 析 ， 在 对 成 骨 细胞 原始 细 胞 系 分 泌 的 细胞 外 胶原 酶 (Hankey et wz .，1992)、 糖 缺乏 综合 症 的 多 重 血 清和 蛋白 (Yuasa et al., 1995) 及 胰腺 癌 病 人 的 血清 及 黏 和 蛋白 的 分 析 中 ，2-DE 已 经 成 功 地 用 于 鉴 定 糖 蛋白 差异 ， 已 报导 众多 的 血清 糖 蛋 白 做 为 肾 细 胞 癌 的 标记 物 (Delahunt et al., 1996). 13.1 糖 基 化 类 型 的 变化 与 人 类 疾病 的 关系 疾病 糖 蛋白 组 织 变化 参考 文献 碳水 化 合 物 缺 乏 症 ” 转 铁 蛋 白 ， 抗 凝血 血清 N- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Winchester et al. (1995) 酶 ，o- 酸 性 蛋白 肝 瘤 a- AGERE A 血清 N- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Seregin et al. (1995) Taketa (1998) iE, H, BRI al- 酸性 糖 蛋白 血清 N-RBE ALAA Van Dijk etal. ( 1995 ); Mackiewicz and Mackiewicz (1995) 免疫 紊乱 CD43 工 细胞 O- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Ellies et al. (1996) 类 风湿 关节 炎 IgG 血清 N- 连 接 端 基 半 乳 糖 降低 ”Delves (1998) Creutzfeldt-Jakob 证 tA CSF 糖 基 化 程度 不 同 Furakawa et al. (1998) 血吸虫 病 循环 阴 / 阳 抗原 血清 ， 尿 0- 连接 糖 蛋白 形式 不 同 Van Dam et al. (1996) ERIK te, SL hCG 尿 N- 及 0- 连 接 糖 链 过 多 分 Elliott et al. (1997) ARIE x 醒酒 转 铁 蛋白 血清 脱 唾液 酸 Tagliaro et al. (1998) 癌症 黏 蛋 白 肿瘤 特殊 短 O- 连 接 多 糖 的 过 = Taylor-Papadi Mitriou and 表达 或 暴露 Epenetos (1994); Kim et al. (1996) 溶菌 酶 储藏 症 溶菌 酶 类 多 糖 尿 异常 碳水 化 合 物 的 分 泌 Starr et al. (1994) 绝经 FSH，LH 血清 酸性 增加 ， 复 杂 人 性 降低 ”Anobile et al. (1998) 从 表 13.1 可 以 看 出 ， 许 多 发 生 在 目标 蛋白 糖 基 化 中 的 变化 ， 有 些 是 由 于 糖 基 化 程 度 不 同 而 导致 分 子 量 的 变化 ， 有 的 是 由 于 相应 的 唾液 酸化 而 引起 等 电 点 变化 ， 同 时 ， 多 糖 的 磷 酰 化 及 硫酸 化 也 会 使 糖 蛋白 的 等 电 点 发 生变 化 。 糖 蛋白 的 这 些 固有 属性 使 它们 在 2-DE 上 理想 地 排列 ， 这 一 阵列 非常 适合 检测 糖 基 化 过 程 中 的 特征 性 变化 ， 目 前 还 没有 其 他 技术 能 够 以 这 种 形式 展示 糖 蛋白 的 不 同 。 4. BARA ay eo oT 糖分 析 最 初 是 以 复杂 的 、 大 分 子 质量 的 多 糖 的 化 学 及 物理 结构 测定 为 焦点 的 。 这 些 技术 从 前 非常 适 于 对 于 那些 分 子 量 较 小 ， 结 构 较 简单 的 多 糖 的 分 析 ， 而 至 今 已 逐渐 成 为 蛋 白 质 生物 化 学 家 手中 的 一 种 更 快 、 更 简易 的 分 析 方 法 。 能 够 完成 小 分 子 多 糖 及 糖 肽 的 质量 分 析 的 质谱 仪 的 到 来 ， 加 之 许多 专 一 的 外 切 糖 苷 酶 的 克隆 ， 促 使 我 们 能 够 分 析 许 多 PEA ESR SERN OA HERE AT SR REP (Packer and Harrison，1998)， 由 于 经 纯化 过 的 被 表达 的 重组 糖 蛋白 在 样品 量 的 提供 方面 占有 优势 ， 所 以 通过 对 它们 的 分 析 ， 使 得 绝 大 多 数 分 析 方 法 得 以 优化 。 (10nmol 或 100ng BAM) 相对 而 言 ， 分 析 2-DE 分 离 的 糖 蛋白 所 需 的 样品 量 日 益 减 小 (通常 10 pmol 或 100ng). 由 。 210 ， SARA 4.1 重组 糖 蛋 白 分 析 由 重组 DNA 生产 蛋 日 质 的 方法 是 生物 技术 产业 中 日 益 增 长 的 领域 。 许 多 治疗 及 诊 断 蛋 白质 都 是 糖 基 化 的 ， 因 此 糖 基 化 形式 的 快速 分 离 及 鉴定 就 十 分 必要 ， 由 于 多 糖 链 的 变化 能 够 诱导 不 良 的 免疫 学 反应 ， 导 致 越 来 越 多 的 官方 法 规 要 求 对 糖 蛋 白 的 多 糖 部 分 进 行 严 格 的 测定 。 对 于 细胞 系 和 培养 条 件 的 依赖 ， 使 表达 体系 不 可 能 完全 控制 蛋白 的 糖 基 化 ， 从 而 产 生 了 如 此 多 的 差异 (Lifely et al., 1995; Wright and Morrison，1997) 。 发 酵 过 程 的 条 件 可 监测 不 同 糖 基 结 构 是 怎样 及 何 时 产生 的 。 液 相 色谱 是 监测 批 次 间 差 异 及 下 游 进程 的 有 效 方 法 ， 而 电泳 技术 由 于 其 高 通 量 、 对 比 性 分 析 及 分 辩 率 等 方面 的 优势 ， 应 用 越 来 越 广 7 (Taverna et dl .，1998)。 应 用 电泳 技术 如 等 电 聚 焦 (IEF). BAB (CE) 及 二 维 凝 胶 电泳 (2-DE) 等 使 快速 常规 分 析 及 产品 监测 日 益 简 单 化 了 。 糖 基 化 的 出 现 与 缺失 也 能 调节 一 些 重 组 蛋白 的 功能 ， 比 如 人 粒 细 胞 集落 刺激 因子 (rHG-CSF; Hoglund，1998)、 人 淋巴 细胞 毒素 (Funahashi et wo .，1993)、 上 白细胞 介 素 2 (Voshol et wd .，1996)、 甲 状 腺 过 氧化 物 酶 (Fayadat et al., 1998) 及 al- 酸 性 糖 蛋 白 (Shiyan and Bovin, 1997) 都 是 糖 基 化 后 而 具有 生物 活性 的 重组 和 蛋白。 其 他 一 些 重组 蛋 白天 然 就 存在 糖 基 化 ， 如 白细胞 介 素 -3 (Zitener et al., 1994), M/)AAMA (Jager- schmidt et al., 1998) 及 人 生长 激素 (Becker and Hsiung，1986)， 它 们 甚至 于 在 无 糖 基 化 时 也 有 活性 。 蛋 白质 组 学 方法 可 以 监测 这 些 和 蛋白 的 体内 变化 ， 提 供 对 天 然 糖 基 形式 不 均一 性 及 功能 方面 的 了 解 。 一 个 具有 生物 学 意义 的 糖 蛋白 在 体外 重组 和 表达 之 前 ， 了 解 相关 的 知识 是 相当 重要 的 。 4.2 经 分 离 的 胶 上 糖 蛋白 由 于 纯化 蛋白 所 提供 的 量 是 有 限 的 ， 所 以 用 一 维 或 二 维 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白 从 而 实现 糖 基 化 结构 变化 检测 的 方法 受到 了 挑战 。 质 谱 (包括 基质 辅助 激光 解吸 电离 质谱 一 一 MALDLMS， 及 电 喷 雾 电 离 质谱 一 ESLMS) 及 毛细 管区 带电 泳 (CIE)， 是 两 种 用 于 解决 出 现在 糖 蛋白 异 构 体 中 糖 链 结构 的 不 均一 性 问题 的 最 有 前 途 的 技术 。 糖 蛋白 物理 及 化 学 特性 造成 了 用 目前 蛋白 质 组 技术 对 其 进行 分 析 的 困难 ， 这 一 点 已 越 来 越 清楚 了 ， 糖 链 的 连接 ， 特 别 是 大 型 的 N- 连 接 糖 链 ， 由 于 其 庞大 的 分 子 量 及 亲 水 性 ， 赋 了 予 了 蛋白 质 不 同 的 特性 ， 为 了 分 析 2-DE 分 离 的 糖 蛋白 ， 蛋 白质 组 研究 需要 在 空 THF (阵列 )、 定 性 及 生物 信息 学 方面 加 以 优化 。 空间 分 辩 (阵列 ) ”血浆 糖 蛋 白 的 2-DE 已 做 为 血清 蛋白 图 谱 发 表 于 网 上 (Sanchez et ll/ .，1995)。 在 我 们 的 工作 中 发 现 ， 采 用 重 泡 胀 技术 将 纯化 的 糖 蛋 日 在 一 维 固 相 pH 梯度 (IPG) 胶 条 上 上 样 ， 导 致 进入 胶 条 的 样品 量 较 低 ， 杯 状 进 样 法 可 以 使 糖 蛋白 进入 IPG 胶 条 的 量 大 大 增加 ， 小 量 大 肠 杆 菌 蛋 白 抽 提 物 与 重组 糖 蛋 白 经 重 泡 胀 上 样 产生 同样 的 结果 。 图 13.2 显示 了 用 标准 糖 蛋白 一 一 牛 胎 球 蛋白 所 表现 的 这 种 效果 ， 而 对 非 糖 基 化 的 蛋白 上 样 时 无 此 类 困难 。 糖 蛋白 这 种 效应 的 原因 只 能 如 上 推断 ， 但 是 它 确实 能 够 反 映 多 糖 对 蛋白 质 表面 积 大 小 ， 电 荷 等 方面 的 影响 ， 同 时 ， 它 也 有 助 于 揭示 糖 蛋 白 物 理 特 性 的 不 同 。 第 十 三 章 ， 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 chee: pH 4 pH 7 pH 4 pH 7 a a ie Ee = ——— 一 = d 号 ae es a c (c) pH4 pH 7 图 13.2 纯化 糖 蛋白 的 二 维 电泳 糖 蛋白 溶 于 Smol/L 尿素 ，2mol/L Fisk, 2m mol/L TBP，2%CHAPS，2% 硫 代 甜 菜 碱 3- 10，0.5% 两 性 电解 质 3-10, 40 mmol/L Tris, LK##F pH4~7 的 IPG 胶 条 ，2-DE 分 离 ， 考 马 斯 蓝 染 色 。(a) 10pg FR 胎 球 蛋 白 一 维 重 泡 胀 上 样 (Rabilloud et al., 1994); (b) 10pg 牛 胰 胎 球 蛋白 一 维 阳 极 加 样 杯 上 样 + 1% pH 2.5~5 两 性 电解 质 (Pharacia); (c) 10pg 牛 胰 胎 球 蛋白 + Sug E.coli 全 蛋白 一 维 重 泡 胀 技术 加 样 。 糖 蛋 白 一 经 分 离 ， 下 一 步 是 将 其 显 色 ， 许 多 用 考 马 斯 亮 兰 染色 和 银 染 方法 来 染 糖 蛋 白 的 人 们 发 现 ， 糖 蛋白 的 染色 非常 不 理想 ， 或 者 根本 染 不 上 色 。 为 了 对 2-DE 胶 上 和 蛋 日 质 混合 物 中 的 糖 蛋白 着 色 ， 最 好 的 办 法 是 染色 其 特殊 的 多 糖 部 分 ， 那 么 ， 灵 敏 的 凝集 素 (Golaz et al., 1995) 及 半 抗 原 识别 法 可 以 实现 这 一 过 程 ， 目 前 市 场 上 (Bio-Rad 多 糖 检 测试 剂 盒 ，Boehringer-Mannheim DIG 检测 试剂 盒 ) 已 经 出 现 了 许多 基于 糖 的 高 碘 酸 盐 氧化 作用 ， 以 及 夹心 抗体 或 生物 素 / 链 霉 亲 合 素 等 显 色 方法 发 展 的 产品 。 我 们 对 染色 方 法 加 以 改进 ， 采 用 荧光 蔡 代 氧化 糖 上 的 颜色 标签 ， 从 而 使 PVDF 膜 上 的 糖 蛋 白 快 速 ， 灵敏 地 显现 。 : 定性 “多糖 的 不 均一 性 是 导致 2-DE 胶 上 单个 糖 类 型 分 离 不 明显 的 原因 ， 重 组 的 截 短 的 免疫 球 蛋 昌 超 家 族 糖 蛋白 CD4， 它 包括 一 个 N- 糖 基 化 位 点 ， 在 2-DE 胶 上 分 离 为 三 个 不 同 的 糖 型 式 (图 13.3)， 通 常 我 们 以 唾液 酸化 的 不 同 来 解释 这 种 在 等 电 点 上 的 差 异 。 但 是 ， 在 分 离 实 验 中 ，N- 连 接 糖 蛋白 的 质谱 分 析 对 另 一 个 糖 蛋白 一 人 ol RE 白 酶 的 解释 显示 ， 这 并 非 是 直接 原因 。 而 其 真正 的 原因 是 由 于 在 不 同 的 点 上 ， 糖 基 化 是 不 均一 的 (Packer et al .，1998)。 在 对 al- 抗 胰 蛋 白 酶 的 单 糖 分 析 中 ， 我 们 发 现在 每 个 糖 基 形 式 中 ， 中 性 糖 的 唾液 酸化 有 相同 的 比率 ， 糖 基 化 的 明显 增加 导致 了 等 电 点 的 降低 (Packer et al., 1996). - 212: 和 蛋白质 组 学 pH4 pH7 kDa 250 = 98 50 = 36 2 30 16. = x .- 图 13.3 CD4.c 截 型 糖 蛋 白 异 构 体 的 二 维 电泳 2-DE 分 离 CD4.c 截 型 糖 蛋白 ， 一 维 用 pH4 一 7 的 IPG 胶 条 ， 和 蛋白 以 阳极 杯 上 样 于 1% (pH 2.5~5) 的 两 性 电解 质 ， 二 维 用 10% ~20%SDS-PAGE 分 离 ， 未 修饰 蛋白 具有 理论 分 子 量 20 429Da， 等 电 点 5.66。 ESI 与 MALDI 的 快速 发 展 已 经 给 蛋白 质 的 分 析 带 来 了 革命 性 变化 ， 同 时 ， 对 多 糖 的 分 析 也 存在 着 同样 的 应 用 潜力 (Costello, 1997; Packer and Harrison, 1998 )， 脱 糖 基 化 、 衍 生化 释放 的 多 糖 正 相 HPLC、 酶 切 测序 以 及 ESI 和 MALDI 等 各 种 技术 已 经 发 展 到 对 重组 糖 蛋白 进行 分 析 的 阶段 ， 同 时 目标 已 经 指向 了 对 胶 上 分 离 的 糖 蛋 白 完 全 结构 鉴 定 。 N- 连 接 多 糖 的 糖 肽 ， 由 于 其 质量 (包括 多 肽 部 分 ) 通常 大 于 3500Da， 在 MALDI 上 难以 看 到 ， 加 之 以 不 均一 化 的 趋势 ， 最 多 只 能 在 线性 方式 下 看 到 一 个 宽 的 信号 峰 。 O- 连 接 多 糖 在 总 的 趋势 上 比 N- 连 接 多 糖分 子 要 小 ， 做 为 胶 上 酶 解 糖 恒 白 的 胰 酶 糖 肽 碎 A, eS EA RY Ry WA (Packer and Harrison，1998)。 将 胶 上 电泳 分 离 并 用 PVDF 膜 转 印 的 血型 糖 蛋 白 A (Packer et al., 1998) 以 及 胶 上 荧光 标记 病毒 蛋白 (Medina et al., 1998) 进行 碱 性 B- 消 除 释放 糖 链 ， 也 可 对 O- 连 接 多 糖 进行 定性 分 析 。 胶 上 糖 蛋白 的 分 析 还 有 脐 解 及 胶 上 分 离 的 明胶 酶 B 变 体 的 O- 糖 链 质 谱 分 析 (Van den Steen et al., 1986b)。O5 标 记 的 N- 连 接 位 点 谱 及 肽 质量 指纹 谱 分 析 (Kuster and Mann, 1999). 在 重组 糖 蛋 日 异 构 型 的 高 通 量 监测 方面 ， 毛 细 管 区 带电 泳 也 是 十 分 有 用 的 ， 这 一 技 术 可 以 解决 等 电 点 及 结构 上 的 微小 差异 ， 同 时 对 这 些 差异 的 定性 可 以 通过 与 MS 连接 来 实现 。 这 一 技术 及 其 在 重组 多 糖 及 糖 肽 谱 图 方面 的 应 用 由 Susuk 和 Honda (1998) 以 及 Taverna 等 (1998) 的 两 篇 详细 综述 报导 。 用 这 一 技术 分 析 2-DE TANKS A HE 点 在 于 它 要 求 被 分 析 物 有 一 定 的 浓度 (pmoML)。 首先 ， 我 们 对 蛋白 质 高 通 量 分 析 方 法 的 选择 ， 是 应 用 灵敏 ， 快 速 ， 简 单 的 MALDI 第 十 三 章 ” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 “213; > 自动 方法 从 一 个 已 知 基因 组 对 蛋白 进行 鉴定 ， 这 种 方法 已 用 于 只 有 一 些小 的 考 染 蛋白 斑 点 的 胰 酶 降解 碎片 。 一 旦 蛋白 在 数据 库 上 鉴定 ， 许 多 被 修饰 的 蛋白 的 微小 特性 也 就 相应 显现 (图 13.4)。 接 下 来 我 们 用 较 慢 一 点 的 ESI-MS-MS 技术 做 为 第 二 梯队 ， 对 我 们 感 趣 于 其 修饰 的 特殊 蛋白 加 以 定性 分 析 。 为 了 彻底 确定 糖 基 化 性 质 ， 微 不 均一 性 及 宏观 差 异 理论 上 都 应 该 进行 测定 。 蛋白 酶 解 产物 样品 的 10% MALDI-TOF 样品 的 90% PE ILA Bie 肽 质量 指纹 谱 糖 质量 指纹 谱 图 13.4 糖 蛋白 组 策略 2-DE 分 离 糖 蛋白 结合 自动 化 高 通 量 质谱 分 析 我 们 认为 ESI 在 糖 蛋 白 或 糖 肽 一 一 严格 地 说 是 那些 具有 微 不 均一 性 的 N- 连 接 糖 基 化 的 糖 蛋白 一 一 的 离子 化 方面 比 MALDI-TOF 更 为 成 功 ， 这 可 能 是 由 于 在 MALDI FY 须 应 用 基质 造成 的 ， 那 些 具 有 微 不 均 一 性 的 多 糖 、 大 分 子 的 N- 连 接 糖 链 以 及 难以 观察 的 多 糖 唾液 酸化 ， 使 它们 与 基质 难以 发 生 衍生 化 (Powell and Harvey，1996)。 我 们 对 不 完全 的 、CHO 表达 的 重组 大 鼠 CD4 (未 修饰 MDa= 20 429.31Da) 进行 分 析 ， 它 包含 一 个 N- 糖 基 化 位 点 ， 图 13.5 列 出 了 这 两 种 质谱 在 糖 蛋白 分 析 方 面 的 不 同 ， 在 全 部 分 子 被 脱 唾液 酸 后 ， 具 有 8 个 支 链 的 N- 连 接 多 糖 可 以 被 定性 分 析 (Ashford et al., 1993), 而 它们 是 包括 在 2 个 N- 连 接 糖 基 化 位 点 上 的 ， 在 MALDI-MS 图 上 ， 由 于 其 广泛 的 不 均 一 性 ， 在 如 此 高 的 质量 范围 内 ， 没 有 个 别 质量 能 被 分 开 (图 13.$a)。ESI-MS 可 以 分 辩 单一 位 点 上 9 个 可 能 的 糖 基 化 形式 (图 13.$Sb)， 由 于 我 们 用 的 是 未 加 修饰 的 蛋白 质量 ， 因此 ， 主 要 的 宽 峰 可 被 视 为 杂 合 形 多 糖 结构 [22 497 Da= 核心 (GlcNAc), (Man); + (Gal); (GleNAc); (Man);] 及 混合 形 多 糖 结构 [22 489Da = 核心 (GlcNAc);(Man)3 + (Gal)>(GlcNAc)>(Fuc)i;(NeuAc)1] 的 混合 体 ， 质 量 偏差 是 由 相关 的 微 不 均 一 性 造成 的 。 质谱 可 以 测定 不 同 糖 基 化 形式 中 单 糖 位 点 。 通 过 碰撞 诱导 解 离 的 特殊 方式 ， 这 一 技 术 还 可 以 提供 各 个 残 基 的 序列 、 连 接 方式 方面 的 信息 ， 文 献 中 报导 的 绝 大 多 数 碎 片 的 数 083, 蛋白 质 组 学 22000 22100 22200 22300 22400 22500 22600 22700 22800 质 荷 比 | 22494 (b) 162 22000 22100 22200 22300 22400 22500 22600 22700 22800 图 13.5 CD4.c 糖 蛋白 的 质谱 图 (a) MALDI-TOF (Perseptive Voyager): 20pmol CD4.c 糖 蛋白 ， 用 Poros 50R1 (相当 于 C4 反 相 性 质 ) 清洗 (Kussman 4, 1997), FA 2ul2% TFA 洗 脱 ，80% MeCN & 10mg/ml 芥子 酸 直接 上 和 靶 ; (b) ESI-TOF-MS (Micromass), 100pmol CD4.c ( 同 批 ) 脱盐 用 HPLC C4 柱 (Aquapore Bu-300 A 100x2.1mm，PE Brownlee), #34 0.05% TFA % 80% Zfa& 0.05%TFA, 30min, BAKAZE 22min 洗 脱 ， 检 测 波长 214nm (主峰 加 合 TFA). 据 是 由 单 甲 基 化 的 多 糖 的 快 原子 又 击 (FAB) 质谱 获得 的 。MALDI 及 ESI 这 两 种 技术 适合 于 在 高 灵敏 度 地 对 大 分 子 量 范围 内 的 生物 分 子 进行 测定 ， 因 而 它们 可 用 于 探索 打 碎 糖 复合 物 ， 目 前 已 经 获得 了 在 对 蛋白 或 多 肽 释放 的 非 衍 生化 多 糖 结构 分 析 方 面 的 较 好 数 #2, MALDI-TOF WYSE (PSD) (Naven et al., 1997) 或 CIO-ESI-TOF MR A ak 撞 - 诱 导 解 离 (Packer and Harrison, 1998) 或 ESI-MS-MS (Oxley, 1998) 等 技术 可 以 打 碎 糖苷 键 。 由 于 微 孔 及 毛细 管 液 相 谱 的 接口 适合 于 被 分 离 的 糖 基 化 形式 的 碰撞 诱导 碎 片 分 析 ， 目 前 电 喷 雾 电 离 技术 已 成 为 蛋白 糖 基 化 结构 分 析 的 最 佳 选 择 (Bulingame， 1996)， 不 同 离子 化 技术 与 更 好 的 检测 方法 之 间 结 合 是 质谱 的 发 展 方向 ， 我 们 感到 在 恒 第 十 三 章 ，” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 « 245, « 白糖 基 化 形式 的 分 析 方 面 ， 这 一 方法 将 比 别 的 方法 出 色 。 糖 蛋白 质 组 的 质谱 常规 应 用 还 存在 大 量 有 待 于 解决 的 问题 。 对 于 MALDI-MS 分 析 ， 未 来 的 工作 是 需要 发 现 一 些 适 合 于 大 分 子 亲 水 性 糖 肽 的 特殊 基质 ， 同 时 ，MALDI 分 析 对 于 糖 肽 的 上 游 富 集 的 选择 将 证 明 是 有 帮助 的 。 对 于 ESIMS， 经 由 源 内 CID， 糖 肽 可 以 在 LC 上 分 离 ， 而 肽 上 的 多 糖 碎片 则 难以 被 解释 ， 对 这 种 不 带电 荷 的 多 糖 的 检测 灵敏 度 需 要 进一步 提高 ， 同 时 ， 需 要 一 个 易 离子 化 基 团 对 目标 糖 进行 衍生 化 。 这 种 化 学 反应 ”必须 是 反应 完全 并 简单 的 ， 同 时 能 够 适应 高 通 量 的 分 析 ， 在 质谱 之 前 被 采用 的 柱 分 离 及 电泳 分 离 步 又 需要 加 快速 度 及 自动 化 进程 。 可 是 ， 对 蛋白 质 上 糖 类 型 的 完全 结构 分 析 ， 其 要 求 远 远 超过 仅仅 对 糖 进 行 分 子 质量 测定 。 与 用 于 肽 质量 指纹 谱 中 的 氨基 酸 质量 相 比 ， 许 多 单 糖 残 基 有 着 相同 的 分 子 质量 ， 同时 ， 连 接 方式 及 序列 难以 用 质谱 测定 。 尽 管 如 此 ， 由 于 各 种 单 糖 在 其 结构 和 框架 范围 内 有 一 定 的 守恒 性 ， 使 糖 蛋白 的 分 析 简 化 。 因 此 ， 可 以 通过 对 一 些 已 知 的 特殊 组 织 或 种 属 方面 的 知识 ， 来 约束 可 能 的 具有 某 种 特定 质量 的 多 糖 结构 。 信息 学 ”基因 组 及 蛋白 质 组 领域 所 获得 的 大 量 数据 给 生物 信息 学 领域 带 来 了 巨大 的 冲击 ， 数 据 及 开发 数据 库 的 工具 广 证 地 应 用 于 DNA 的 翻译 和 和 蛋 日 序列 以 及 修饰 ， 在 分 析 不 断 进展 的 同时 ， 需 要 构建 数据 库 及 信息 工具 适应 糖 基 化 数据 的 翻译 。 wa (http://128.192.9.29/Carbbank/Carbbank. html) 自 1995 年 来 未 收 到 输入 数据 的 基金 ，O-Glycbase (http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/) 以 神经 网 络 预测 O- 糖 基 化 位 点 ， 至 今 也 仅仅 发 表 了 一 些 有 限 的 糖 蛋 白 守 糖 链 信 息 的 数据 库 。 我 们 最 近 已 经 整理 了 一 个 糖 蛋 日 O- 连 接 位 点 的 数据 库 (Cooper et al., 1999) 并 且 正 在 准备 更 加 广泛 的 生物 信息 学 工具 及 数据 库 ， 以 用 于 糖 蛋 白质 组 学 研究 。 SWISS-PROT 及 相 类 似 的 许多 数据 库 已 经 给 生物 化 学 家 们 提供 了 信息 的 贮藏 地 及 开发 的 工具 ， 我 们 也 需要 类 似 于 它 的 完整 的 信息 库 ， 以 适应 糖分 析 的 发 展 。 糖 肽 或 被 释 放 的 糖 的 质量 测定 ， 可 以 较 容 易 地 转化 成 单 糖 构架 ， 这 些 构 架 与 先前 报导 的 结构 相 匹 配 ， 同 时 通过 设计 特殊 的 糖苷 外 切 酶 实验 ， 可 以 检测 结构 的 可 能 性 。 从 特殊 结构 质谱 碎 片 模型 ( 糖 质量 指纹 谱 ) 的 知识 还 可 以 推测 序列 ， 我 们 需要 综合 糖 蛋白 中 大 量 有 价值 的 知识 ， 以 便 用 它们 来 分 析 从 糖 蛋 白质 组 分 析 中 获取 的 数据 。 5. 结论 蛋 白 的 翻译 后 修饰 ， 包 括 糖 基 化 ， 将 证 明 是 对 于 发 生 在 生物 学 体系 中 新 陈 代谢 的 “ 极 好 控制 "， 当 基因 产品 在 蛋白 活性 组 织 中 被 修饰 时 ， 这 一 点 尤为 明显 。 多 糖 结构 中 可 利用 的 广泛 的 差异 性 使 其 成 为 微调 新 陈 代谢 的 最 佳 部 分 。Clark 等 (1997) 已 将 这 种 糖 基 化 的 特殊 功能 假定 为 从 母体 免疫 应 答 的 人 胚胎 的 保护 基础 。 并 且 ， 这 些 特 殊 多 糖 的 获 得 也 许 意味 着 ， 病 原 体 能 够 搅乱 宿主 的 免疫 应 答 。2-DE 展示 的 糖 蛋白 阵列 提供 一 个 谱 图 ， 由 它 我 们 可 以 探索 疾病 发 生 、 发 展 过 程 中 的 变化 。 重 组 糖 蛋 白 由 于 其 能 够 提供 足够 的 样品 量 ， 对 于 它们 的 分 析 工 具 已 经 较 完 善 了 。 目 前 要 求 这些 可 达到 pmol 灵敏 度 的 检 测 方 法 ， 能 够 象 蛋白 质 的 鉴定 及 定性 的 一 些 方法 一 样 ， 适 应 高 通 量 的 糖 蛋白 的 鉴定 与 定 性 。 从 已 开发 的 数据 形式 我 们 可 以 获得 延伸 的 信息 ， 这 将 依赖 于 改进 的 、 更 加 灵敏 的 方 法 学 的 继续 发 展 ， 以 及 生物 信息 特别 是 糖 生物 信息 工具 的 构建 。 。 216 - SARA 致谢 感谢 Neily Barclay 友好 提供 纯化 的 重组 截 形 CD4，Ben Herbert 提供 2-DE 方面 的 帮 助 ， 以 及 Keith Williams And rew Gooley 共同 整理 。 (Bie Ee Re 校 ) 参考 文献 Anobile, C.J., Talbot, J.A., McCann, S.J., Padmanabhan, V. and Robertson, W.R. 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Cahill and Alfred Nordheim 1. 引言 这 本 书 的 作者 人 数 在 学 院 和 企业 中 大 致 分布 相 等 。 但 用 于 学 术 研 究 的 预算 仅 相 当 于 同类 企业 支出 的 很 小 一 部 分 。 既 然 新 技术 的 引进 是 昂贵 的 ， 像 支持 蛋白 质 组 学 所 要 求 的 那样 ， 一 些 人 已 指出 学 术 性 的 蛋 白 质 组 学 不 可 能 具有 竞争 性 。 尽 管 如 此 ， 我 们 和 其 他 的 许多 同行 正 打 算 建 立 一 个 蛋 白 质 组 的 基本 设施 ， 即 匆 细 上 马 组 建 的 Tuebingen 大 学 的 细 胞 生物 学 研究 所 。 我 们 实验 室 在 哺乳 类 转录 调节 和 信和 号 传导 方面 的 建树 得 到 一 致 公认 (Arsenian et al., 1998; Cahill et al., 1996; Heidenreich et al., 1999; Hipskind et al., 1991)。 蛋 白质 组 学 在 这 一 领域 的 应 用 潜力 促使 我 们 全 身心 地 接受 这 种 技术 。 蛋 白质 组 学 设施 的 建立 在 我 们 研究 所 至 今 已 有 30 个 月 ， 并 且 筹 建 蛋白 质 组 研究 小 组 的 时 候 ， 已 经 有 两 个 博士 后 ， 两 个 研究 生 和 两 个 技术 助教 。 我 们 正 同心 协力 提高 技术 ， 并 实施 适合 我 们 研究 所 现状 的 临床 和 生物 学 科 的 计划 。 我 们 已 经 成 功 地 获得 了 资金 ， 用 于 购买 等 电 聚焦 仪 、 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 、MALDI-TOF、 将 酶 解 的 蛋白 转 到 MALDI 样品 阶段 的 机 器 人 和 四 级 杆 飞 行 时 间 串 联 质 谱 。 我 们 已 经 与 临床 和 商业 密切 接触 ， 已 申请 几 个 蛋白 质 组 学 相关 的 专利 ， 并 且 已 投稿 正在 审查 的 论文 。 2. 为 什么 不 在 学 术 环 境 中 进行 恒 日 质 组 研究 ? 蛋白 质 组 分 析 是 一 项 有 洪 力 改变 医学 面 角 的 技术 。 一 些 观点 认为 ， 由 于 高 额 的 研究 费用 ， 蛋 白质 组 的 研究 不 宜 在 学 院 开 展 。 当 人 们 意识 到 蛋白 分 析 中 昂贵 的 设备 和 药品 的 消耗 ， 尤 其 是 高 流通 量 的 自动 化 流程 都 往往 自然 地 认为 大 量 与 药物 相关 的 蛋白 质 组 的 研 究 工 作 应 由 商业 组 织 开展 ; 但 实际 上 在 学 术 机 构 内 建立 蛋白 质 组 研究 体系 及 技术 仍 具 有 可 观 的 潜力 和 价值 。 另 一 种 论点 认为 ， 高 流通 量 的 流程 是 重复 的 、 自 动 化 和 智能 化 低 的 ， 而 学 术 研 究 应 具有 创新 性 。 对 于 学 术 研 究 人 员 ， 如 果 曾 经 准备 并 筛选 过 100 个 质粒 DNA 微量 制备 以 鉴定 正确 DNA 载体 构建 从 而 使 关键 实验 得 以 进行 的 话 ， 这 一 观点 的 廖 误 之 处 显而易见 了 。 学 术 机 构 中 蛋白 质 组 体系 的 发 展 面临 的 一 个 重要 问题 是 人 才 向 企业 界 的 流失 ， 因 为 企业 上 急需 训练 有 素 的 蛋白 质 组 研究 人 员 ， 并 且 企 业界 能 提供 更 高 的 薪金 和 瑶 似 更 强 的 安全 感 。 这 一 问题 在 包括 德国 在 内 的 一 些 国家 中 尤为 突出 ， 由 于 在 这 些 国家 学 术 机 构 的 薪金 水 准 是 预先 设 定 和 不 能 更 改 的， 这 就 使 得 学 术 机 构 很 难保 留 一 支 高 水 准 的 研究 队伍 。 3. 为 什么 要 在 学 术 环 境 中 进行 蛋 日 质 组 研究 ? 总 体 考虑 ， 许 多 方面 都 有 力 支 持 大 学 和 非 盈利 机 构 参与 蛋白 质 组 领域 的 研究 ， 并 认 为 是 很 有 价值 的 。 下 面 首 先 考虑 这 样 一 种 争论 : 大 学 和 非 盈 利 机 构 不 具有 从 事 蛋 白质 组 第 十 四 章 “学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 221 - 研究 的 经 济 实力 。 3.1 大 学 能 否 承 担 得 起 蛋白 质 组 的 研究 经 费 ? 当 建立 一 个 适当 的 研究 小 组 的 费用 满足 后 ， 目 前 的 蛋白 质 组 分 析 费 用 并 不 比 其 他 研 究 的 费用 高 ， 如 小 鼠 分 子 遗 传 学 。 甚 至 研究 小 组 的 组 建 费用 与 其 他 研究 相 比 也 并 未 高 出 许多 。 我 们 曾 在 三 个 方面 比较 了 相同 人 数 的 蛋白 质 组 实验 室 与 传统 的 分 子 生 物 学 实验 室 的 组 建 费 用 。 显 然 ， 蛋 白质 鉴定 设备 花费 较 大 ; 然而 考虑 到 蛋 白 质 组 研究 所 得 数据 的 质 量 和 容量 ， 以 及 数据 潜在 的 价值 ， 这 些 将 有 力 表明 : 蛋白 质 组 研究 的 花费 比 生命 科学 研 究 中 的 其 他 领域 更 物 有 所 值 。 二 维 电 泳 凝 胶 的 费用 图 14.1 是 我 们 的 蛋白 质 组 实验 室 从 1998 年 3 一 12 月 的 费用 情况 〈 以 欧元 为 单位 )。 在 此 期 间 制 备 和 运转 了 约 1300 块 由 浓度 为 13% 的 、 标 准 斥 二 为 20cmx20cm、 含 哌 嗪 双 丙 烯 酰胺 (PDA) 作为 交 联 剂 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。 绝 大 多 数 的 凝 胶 采 用 银 氨 进行 染色 (Hochstrasser et al., 1988; Rabilloud，1992 ) 。 由 于 多 数 PDA ( 属 主要 消费 项 目 ) 是 在 1998 年 3 月 以 前 购买 的 ， 这 将 使 3 一 12 月 间 的 实际 花费 增加 约 2000 欧元 。 总 花费 约 40 000 欧元 中 的 大 部 分 用 于 购置 ， 这 是 任何 一 个 新 建 实验 室 所 必 需 的 。 在 消费 高 峰 的 6 月 至 12 月 中 ， 实 验 室 的 平均 流动 花费 相对 稳定 在 2500 欧元 /月 。 这 笔 费 用 供 两 名 博士 后 、 两 名 学 生 和 一 名 技师 使 用 ， 平 均 每 人 每 月 500 欧元 ， 完 全 在 基 金 资助 项 目 研 究 花费 的 正常 范围 内 。 因 此 ， 我 们 可 以 认为 二 维 电泳 凝 胶 费 用 与 其 他 研究 项 目的 花费 相差 无 几 。 三 维 电泳 数据 分 析 费 用 “采用 常规 的 、 已 公布 的 蛋白 质 组 分 析 技 术 时 ， 实 验 室 中 最 晶 贵 的 消费 品 就 是 雇员 的 时 间 。 蛋 昌 质 组 目前 是 一 项 劳动 密集 型 的 工作 。 由 于 凝 胶 间 存 在 差异 ， 对 某 一 特定 样品 有 必要 重复 3 一 6 次 实验 ， 最 好 采用 双 份 样品 。 采 用 商品 化 二 维 电泳 图 像 分 析 软 件 ， 这 些 凝 胶 图 像 随后 成 为 数字 化 文件 并 排列 。 我 们 采用 的 分 析 软 件 有 Image Master 2-D Elite 软件 (从 Amersham Pharmacia 生物 技术 公司 购买 ) 和 17500 ee 设备 15000 ea 试剂 含有 2D 软件 和 PC 机 |_] “一 次 性 耗材 12500 10000 支出 /欧元 包含 Min 型 凝 胶 系 统 7500 + 含有 Iso-Dalt 和 电源 5000 2500 0 3 月 4 月 5A 65 in io Se 10H 1 月 1248 图 14.1 从 1998 年 3 月 到 12 A, Tubingen 大 学 分 子 生 物 学 系 蛋白 质 组 学 实验 所 消耗 费用 (设备 、 试 剂 和 一 次 性 用 品 ) « 222 - 和 蛋白质 组 学 MELANIE II 软件 (瑞士 2D PAGE 集团 ， 从 Bio-Rad 公司 购买 )。 软 件 运行 环境 : 双 处 理 器 奔腾 II 型 PC HL, CPU 主 频 350MHz, 10G 硬盘 ， 内 存 $S00M， 实 际 内 存 设 置 为 3000M， 操 作 系 统 为 Windows NT 4.0。 在 该 配置 中 图 像 处 理 时 间 是 可 接受 的 。 但 根据 我 们 的 经 验 ， 上 述 两 种 软件 都 不 令 人 满意 。 一 些 用 户 声称 ， 这 些 缺 陷 不 幸 正 好 位 于 一 些 公司 所 给 予 的 技术 支持 服务 之 列 。 其 他 一 些 用 户 也 曾 向 我 们 表达 了 类 似 的 看 法 ， 因 此 购 买 者 一 定 要 小 心 ! 不 论 购买 了 其 中 哪 一 种 软件 ， 用 户 都 将 在 每 张 凝 胶 上 耗费 数 小 时 的 时 间 去 将 凝 胶 上 的 蛋白 进行 对 齐 和 配 比 ， 才 能 获得 满意 的 结果 。 例 如 : 我 们 研究 组 利用 脑 BREATH RMA, ee pH 范围 4~7 的 固 相 pH 梯度 干 胶 条 (IPG)， 并 观察 到 每 块 BER E244 1000 一 1400 个 斑点 。 斑 点 自动 检测 可 识别 凝 胶 间 许 多 对 蛋白 作为 一 个 斑点 ， 但 不 幸 的 是 在 不 同 的 凝 胶 间 并 不 一 致 。 因 此 ， 研 究 人 员 必 须 经 手工 证 实 或 使 每 一 个 斑点 有 效 ， 以 确保 其 准确 性 。 在 我 们 实验 室 里 这 个 利用 自动 斑点 检测 的 系统 经 过 编辑 后 ， 每 块 凝 胶 需 花 4h 的 时 间 ， 这 仅仅 比 手工 增加 斑点 快 一 点 ， 它 需要 每 块 胶 4.Sh。 在 进行 脑 BE (CSF) 的 研究 中 ， 有 15 个 作为 对 照 组 的 成 员 ，5 个 明确 诊断 为 有 某 种 疾病 。 每 个 病人 的 样品 需要 进行 $ 次 电泳 以 产生 总 数 达 100 块 凝 胶 的 实验 。 这 要 求 计 算 机 分 析 400h。 到 目前 为 止 ， 这 是 分 析 中 最 昂贵 的 成 分 。 同 样 的 方法 也 被 其 他 研究 人 员 采 用 (Andersen et al., 1997) 。 的 确 ， 在 企业 代表 们 的 讨论 中 ， 我 们 感到 这 种 劳动 耗费 ， 商 业 机 构 与 学 术 单位 明显 不 同 ， 它 是 防 碍 蛋白 质 组 学 工业 化 发 展 的 主要 因素 。 有 几 种 并 未 公布 的 应 用 软件 程序 ， 运行 比 商业 软件 好 ， 并 且 ， 几 个 组 织 正 力图 制定 策略 来 突破 图 像 分 析 的 瓶颈 。 然 而 ， 就 目前 所 公布 的 几 种 技术 的 应 用 而 言 ， 大 学 与 企业 相 比 ， 在 蛋白 质 组 凝 胶 分 析 方 面 处 于 明 显 的 优势 。 而 由 于 这 些 研究 所 内 部 具有 多 种 专业 人 员 ， 他 们 可 能 较 好 地 提高 已 有 的 软件 或 开发 新 软件 。 蛋白 鉴定 的 花费 。 和 蛋白 鉴定 所 要 求 的 特殊 酶 价格 不 菲 ， 但 并 不 比 所 需要 的 常规 分 子 生物 学 试剂 贵 。 至 今 ， 最 大 的 花费 是 购买 精致 的 蛋白 鉴定 仪器 。 质 谱 则 被 公认 为 最 好 的 选择 (Burlbyame et al., 1998; Gygi et al., 1999; James, 1997; Yates, 1998). MALDI-TOF 质谱 特别 提供 了 为 高 流通 量 筛选 的 潜力 。 从 Hoffman-La Roche 公司 来 的 科学 家 在 1998 年 9 月 召开 的 第 3 届 2-DE 会 议 上 报告 了 他 们 利用 MALDI-MS 在 一 天 内 可 以 鉴定 500 个 蛋白 质 。 大 多 数 的 质谱 在 将 来 可 以 提供 这 种 常规 水 平 的 测试 。 这 样 一 种 自动 化 系统 〈( 即 从 胶 上 斑点 切割 到 MALDI-MS)， 将 会 花费 约 500 000 欧元 。 此 外 ， 需 要 一 个 通风 良好 、 完 全 和 干净 的 实验 室 和 至 少 两 个 专家 小 组 比较 合理 。 如 果 某 一 特定 蛋白 的 cDNA 序列 存在 于 一 个 数据 库 内 ， 那 么 它 将 可 能 被 鉴定 。 很 快 所 有 的 人 类 蛋白 都 将 满 足 此 前 提 。 对 于 那些 未 知 序列 的 蛋白 ， 例 如 ， 对 于 鲜 为 人 知 的 生物 或 从 许多 低 丰 度 人 类 mRNA 翻译 的 蛋白 而 言 ， 此 类 蛋白 的 部 分 氨基 酸 序 列 则 必须 进行 从 头 合成 。 这 对 于 具有 源 后 衰 变 (PSD) 功能 的 现代 MALDI-MS 是 可 能 的 (Chaurond et al .，1999)， 或 者 另外 的 电 喷雾 质谱 可 被 应 用 。 如 三 级 四 极 杆 (quadruplole )， 离 子 阱 ， 或 QTOF 质谱 (Burlingame et al., 1998; Kuster and Man, 1998; Rates, 1998; 请 见 第 五 章 )。 另 外 一 种 经 常 被 低估 ， 但 明显 有 用 的 选择 是 应 用 微量 -HPLC 进行 多 肽 分 级 ， 随 后 进行 Edman 降解 。 现 代 的 毛细 管 HPLC Edman 测序 仪 其 灵敏 度 已 达 10 一 20fmol; 然而 ， 真 正 的 问 第 十 四 章 ”学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 223 - 题 在 于 ， 当 在 HPLC 分 离 过 程 中 混合 物 酶 解 成 能 被 测序 的 单个 肽 片段 时 样品 的 丢失 。 因此 ， 和 蛋白 质 鉴 定 要求 可 能 的 系列 仪器 价格 在 50 000 到 400 000 欧元 之 间 。 此 方面 要 具 有 高 度 风险 性 ， 因 为 这 些 仪 器 会 迅速 过 时 。 表 面 上 看 这 一 定 是 无 可 奈何 的 事情 ， 即 这 样 一 个 “机 器 公园 ”应 该 成 为 一 种 集中 的 设施 来 从 资本 投资 中 获取 最 大 的 到 利 。 但 如 果 对 一 件 仪 器 投资 50 万 欧元 ， 可 能 建成 一 个 高 性 能 、 竞 争 性 的 设备 ， 如 果 投 资 超过 100 万 欧元 或 更 多 ， 可 能 建成 一 个 很 优秀 的 平台 。 反 对 大 学 蛋白 质 组 学 研究 的 批评 家 们 会 将 这 种 水 平 的 支出 能 香 承 担 作为 问题 来 请 难 。 然 而 ， 当 利用 非 自 动 化 的 蛋白 酶 解 、 价 廉 的 MALDEMS 仪器 时 ， 蛋 白质 组 设施 也 能 有 效 建 立 ; 并 且 这 对 某 些 实验 室 已 足够 (Zubritsky，1998)。 依 我 们 之 见 ， 完 全 有 理由 提出 一 个 象 德国 大 小 的 国家 支撑 学 术 圈 内 拥有 上 述 实力 的 的 多 中 心 。 对 于 科学 社区 和 医学 、 生 物 技 术 研 究 的 利益 将 远大 于 论证 这 些 耗费 。 信息 管理 的 花费 ”大 而 复杂 数据 组 的 产生 随 之 而 来 要 求 完 成 复杂 的 数据 库 和 分 析 软 件 ， 更 不 用 说 强大 的 计算 机 。 理 论 上 ， 蛋 白质 组 数据 一 定 要 以 数据 库 的 形式 产生 ， 文 件 化 和 档案 化 。 几 个 大 公司 正 开发 自己 的 软件 和 数据 库 。 这 些 生 物 信 息 学 引擎 被 设计 为 令 人 信服 的 文件 ， 并 以 数据 库 的 格式 尽 可 能 的 连接 许多 相关 的 参数 。 随 后 ， 强 有 力 的 算法 试图 从 原始 数据 中 提取 图 谱 ， 并 用 来 作 数据 解释 。 进 而 应 该 允许 模 建 和 模拟 ， 并 最 终 会 产生 实验 上 可 证 实 的 预测 并 揭示 这 个 系统 的 真正 复杂 性 。 尽管 上 面 已 提 到 特殊 的 、 商 品 化 的 2-DE 分 析 软 件 包 ， 但 是 它们 的 表现 远 远 落 在 了 这 些 企业 化 产品 的 后 面 。 就 我 们 的 知识 而 言 ， 在 开发 过 程 中 根本 没有 相似 的 数据 库 管 理 和 分 析 系 统 。 一 种 涉及 数 百 万 欧元 支出 的 整合 程序 被 要 求 来 生产 这 样 一 种 产品 。 目 前 ， 似乎 仅 有 几 家 大 企业 乐意 开始 这 样 的 贡献 。 在 此 领域 有 一 种 可 能 、 也 最 有 理由 值得 争论 的 是 : 如 果 没 有 企业 上 的 协助 ， 大 学 机 构 不 能 表现 出 优秀 的 蛋白 质 组 分 析 。 3.2 如果 没有 学 术 机 构 ， 企 业 能 承担 蛋白 质 组 学 研究 吗 ? 尽管 大 制药 公司 的 研究 和 开发 预算 是 相当 乐观 的 ， 但 是 它们 不 是 无 限 的 ， 且 压力 日 益 增 加 。 例 如 ， 制 药 公 司 目前 在 美国 必须 产生 大 约 15% 一 20% 的 盈利 (p.a.) 才能 跟 上 道琼斯 指数 。 事 实 上 投资 者 期 望 能 够 年 年 实现 利润 回报 ， 和 否则 ， 他 们 将 撤销 其 投资 而 转投 其 他 地 方 。 董 事 会 成 员 必须 通过 研究 和 开发 决定 将 来 的 投资 ， 以 及 投资 多 少 会 使 股 东 满 意 。 在 这 种 财政 状况 下 ， 制 药 公 司 的 有 限 研 究 经 费 也 必须 广泛 分 配 到 许多 其 他 的 可 与 蛋 自 质 组 竞争 的 高 成 本 技术 上 。 与 之 相关 的 是 ， 蛋 白质 组 学 在 各 商业 机 构 内 的 分 配 是 否 可 能 足够 用 来 支撑 这 门 目 前 需要 大 力 优 化 的 技术 的 发 展 。 如 果 他 们 利用 更 有 效 的 技 术 ， 将 提高 企业 投资 的 有 效 性 。 历 史上 ， 许 多 新 的 技术 是 由 学 术 机 构 最 初 启动 和 开发 的 。 新 技术 被 转 到 企业 环境 ， 在 那里 ， 它 们 被 优化 并 用 于 专门 的 领域 。 尤 其 可 能 的 是 学 术 机 构 将 开发 出 能 提高 企业 效率 的 创新 性 技术 和 工艺 ， 但 前 提 条 件 是 他 们 必须 与 合适 的 机 构 进行 合作 。 为 了 实现 这 种 转化 过 程 ， 至 关 重 要 的 是 建立 和 维持 大 量 的 具有 专业 能 力 的 学 术 中 心 。 这 些 中 心 额外 的 优势 在 于 能 提供 有 价值 的 公共 信息 。 3.3 目前 蛋白 质 组 学 的 研究 尚 不 健全 吗 ? 某 些 人 看 到 局 限 性 就 目前 蛋白 质 组 技术 而 言 ， 我 们 看 到 有 许多 缺点 。 并 且 在 以 下 的 部 分 ， 我 们 将 详细 ica, 蛋白 质 组 学 描述 其 阻碍 蛋白 质 组 研究 的 主要 技术 挑战 。 其 他 人 也 意识 到 这 些 问 题 (Herbert el al., 1997; Jungblut et al., 1996; Wilkins et al .，1996)。 就 我 们 目前 的 知识 而 言 ， 蛋 白质 组 学 的 限制 因素 还 未 得 到 完全 评估 和 充分 认识 。 蛋白 的 溶解 性 ”如 前 所 述 ， 许 多 朴 水 性 蛋白 和 高 分 子 量 蛋 白 难 以 在 2-DE 凝 胶 图 谱 上 出 现 (Wilkins et al :，1996，1998)。 近 来 在 离 液 剂 和 表面 活性 剂 的 进步 已 经 大 大 改 变 了 这 种 状况 ; 然而 问题 远 未 解决 (Blisnick et al., 1998; Chevallet et al., 1998; Ra- billoud, 1998, 1999; Rabilloud et wj .，1997)。 下 述 观点 适用 于 大 约 8$% 的 可 溶 蛋白 。 流通 量 由 于 2-DE 凝 胶 的 内 在 变异 性 ， 同 一 样品 必须 进行 多 次 实验 。 此 外 ， 如 前 所 述 2-DE 的 商业 分 析 软 件 在 自动 模式 下 仅 能 部 分 有 效 地 鉴定 斑点 和 进行 凝 胶 间 的 交叉 配 比 。 由 于 进行 2-DE 实验 是 耗 时 的 ， 这 是 达到 高 流通 量 的 另 一 个 主要 的 瓶颈 。 我 们 注 意 到 ， 利 用 不 同样 品 在 同一 凝 胶 上 电泳 后 得 到 的 蛋白 进行 多 颜色 显示 处 理 ， 可 大 大 减少 这 种 瓶颈 。 差 异同 位 素 标 记 蛋 白 的 应 用 前 景 也 很 乐观 (Langen et al., 1998). RKE 目前 除了 像 临床 标本 分 析 这 一 类 材料 来 源 有 限 的 情况 外 ， 大 多 数 蛋 白质 组 研究 不 是 因 敏 感性 而 受 限 ， 而 是 受 限 于 2-DE 凝 胶 分 离 和 宽 范 围 蛋 白 丰 度 的 检测 (+E 的 动态 范围 见 下 )。 当 对 样品 量 为 2mg 的 全 细胞 蛋白 进行 考 马 斯 亮 蓝 染 色 ， 对 样品 量 为 100wg 蛋白 进行 银 氮 染色 ， 或 者 对 样品 量 为 Sng 的 高 特异 活性 3S- 和 蛋氨酸 代谢 标记 的 蛋 白 ， 通 过 磷 储 屏 图 像 分 析 所 得 的 2-DE 图 谱 是 相似 的 。 然 而 ， 利 用 ”2S- 蛋 氢 酸 标记 2mg 蛋白 ， 却 没有 优势 。 因 为 实际 上 ， 整 个 凝 胶 提供 了 一 种 信号 ， 并 且 ， 每 个 蛋白 斑点 间 的 差异 消失 了 。 因 此 ， 敏 感性 在 多 数 情况 下 是 不 受 限 的 。 实 际 上 ， 蛋 白 的 上 样 量 可 因 在 一 定 敏 感性 下 的 凝 胶 分 辩 率 的 能 力 来 优化 ， 这 受 限于 和 蛋白 丰 度 的 线性 动态 变化 ， 也 受 限 于 凝 胶 系 统 的 分 辩 率 窗口 的 数目 。 为 了 评估 这 种 概念 的 有 效 性 ， 应 该 考虑 蛋白 丰 度 的 动态 范围 和 凝 胶 分 辩 率 的 相关 问题 。 丰 度 的 动态 范围 ”一 个 中 心 问题 在 于 ， 根 据 实 验 和 样品 类 型 的 不 同 ， 目 前 用 于 蛋白 质 组 研究 的 2-DE 凝 胶 系 统 通常 分 离 大 约 2 000 一 10 000 个 蛋白 斑点 (Fey et al., 1997; Gurg et al., 1988; Jungblut et al., 1996; Klose and Kobalz，1995)。 据 预测 ， 人 类 基 因 组 可 编码 65 000~ 100 000 个 功能 基因 (borrebaeck, 1998), HFA 5000~15 000 被 | 认为 是 以 具有 多 种 mRNA 的 剪 切 形 式 和 翻译 后 修饰 的 单 细 胞 类 型 表达 ， 从 一 个 细胞 蛋 白质 组 中 所 期 望 的 不 同 斑点 数目 是 50 000 左右 。 这 已 经 通过 观察 在 一 张 2-DE 凝 胶 上 最 多 达 10 000 个 蛋白 来 得 以 证 实 ， 它 们 主要 是 看 家 蛋白 和 结构 蛋白 (Jungblut et al., 1996)。 通 常 认为 ， 细 胞 内 蛋白 丰 度 的 动态 变化 范围 可 能 达 10" 之 高 。 也 许 ， 每 个 细胞 内 仅 有 某 些 蛋白 的 几 个 分 子 (如 : 端 粒 酶 ?) 用 来 提供 相应 的 生物 学 功能 。 而 2000 AW: 上 的 蛋白 分 子 仅 组 成 整个 蛋白 的 1% 。 因 此 ， 一 个 理想 的 分 析 系 统 必 须 能 够 处 理 跨 越 7 个 数量 级 或 更 多 的 动态 范围 ， 并 且 超 过 50 000 个 分 离 层 次 。 我 们 估计 ， 目 前 仅 有 5% 一 20% (2000~10 000/50 000) 的 多 数 可 溶性 蛋白 可 通过 2-DE 分 离 和 染色 检测 。 蛋白 分 辨 率 如 果 5S0 000 个 斑点 均匀 分 布 在 20cm x 20cm WERE, FABER 均 占 据 2mm2， 和 那么 每 平方 毫米 将 出 现 $ 个 斑点 。 因 为 根据 分 子 量 和 等 电 点 分 配 蛋 自 可 以 准确 模拟 倾斜 曲线 〈Cavalcoli et az .，1997)， 所 以 显然 凝 胶 的 某 一 区 域 将 会 被 分 辩 率 较 差 的 丰 度 蛋白 斑点 聚集 。 这 个 问题 可 以 用 窄 范围 的 pH 进行 等 电 聚 焦 而 部 分 解决 ; A 而 ， 这 种 策略 不 能 解决 线性 动态 问题 ， 并 且 加 重 流通 量 的 问题 。 at 第 十 四 章 ”学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 225 - 蛋白 鉴定 问题 ”利用 传统 的 技术 ， 许 多 实验 室 通常 要 求 picomolar (10° mol) FR 百 个 femtomole 的 蛋白 量 ， 以 完成 蛋白 的 鉴定 。 很 明显 ， 假设 每 个 细胞 含 50 000 4 BE 点 ， 那 么 对 于 S% 丰 度 的 蛋白 斑点 是 可 能 的 。 最 近 的 一 些 参考 文献 上 某 些 实验 室 声 称 ， 已 经 对 40 fmol 或 50 amol 为 起 始 量 成 功 进行 常规 的 分 析 。 然 而 ， 得 到 的 图 谱 很 不 典型 。 与 “基因 组 学 ”方法 比较 ”在 前 述 了 蛋白 质 组 的 缺点 后 ， 将 之 与 基因 组 学 技术 进行 简单 的 比较 是 合适 的 。 很 大 程度 上 由 于 PCR 技术 的 扩 增 能 力 使 得 核酸 分 析 在 灵敏 性 上 超过 蛋白 质 研究 。 然 而 ， 应 当 注意 到 ， 高 流通 量 的 筛选 研究 也 因 在 EST 和 SAGE 研究 中 需 检测 低 丰 度 的 mRNA 而 受 限 。 当 与 放射 性 方法 相 比 时 ， 微 阵列 研究 通常 所 用 的 欧 光 分 子 的 检测 灵敏 性 也 受 限 。 目 前 ， 仍 不 清楚 多 少 比例 的 基因 中 可 以 通过 芯片 技术 观察 (Bowtell, 1999; Carulli et al., 1998; DeRisi and Iyer, 1999; Drmanac el al., 1998; Iyer et al., 1999; Lipshutz et al., 1999; Watson et al., 1998). i HARA AEM RAH 地 测定 mRNA 的 丰 度 ; 然而 ， 它 不 能 提供 蛋白 质 丰 度 的 信息 。 预 期 将 基因 组 和 和 蛋白质 组 两 种 研究 策略 联合 起 来 ， 对 于 获得 认识 细胞 和 整个 有 机 生物 的 全 局 观点 是 必需 的 。 很 明显 ， 将 必须 显著 提高 蛋白 质 组 学 技术 。 3.4 学 术 机 构 的 蛋白 质 组 学 研究 对 企业 是 有 益 的 前 述 提 到 和 蛋白质 组 学 的 局 限 性 ， 可 能 有 理由 争论 : 在 蛋白 质 组 学 达到 一 定 阶 段 之 前 ， 因 为 企业 能 迅速 而 高 效 地 筛选 大 量 的 细胞 蛋白 ， 就 像 目 前 他 们 筛选 细胞 的 mRNA 一 样 ， 所 以 是 否 需要 相当 多 的 蛋白 质 组 技术 进步 。 大 实现 这 个 目标 ， 将 提供 较 现 代 基 因 组 学 技术 多 得 多 的 建设 性 的 生物 学 信息 。 然 而 ， 每 个 商业 组 织 必 须 为 这 种 技术 提高 进行 投资 是 不 可 能 的 。 这 任务 最 可 能 由 公共 基金 支持 的 研究 中 心 和 一 些 研 究 所 内 的 多 学 科研 究 部 门 来 执行 。 4. 大 学 的 蛋白 质 组 学 研究 提供 许多 优势 4.1 大 学 能 对 企业 的 资源 进行 迅速 而 灵活 的 反应 ， 且 价格 合理 在 财政 革新 的 现代 国际 化 氛围 内 ， 大 公司 持续 地 寻求 与 大 学 签订 开发 计划 。 企 业已 经 认识 到 ， 大 学 能 够 从 小 到 中 等 程度 的 资本 投资 中 产生 更 多 的 效益 。 如 果 不 建立 一 个 全 新 的 实验 室 及 其 相关 设施 ， 公 司 能 给 大 学 的 短期 、 高 风险 的 计划 提供 资金 ， 并 且 若 没有 遭受 过 多 的 财政 损失 ， 则 在 某 一 合适 的 时 间 退 出 〈 如 果 必 须 的 话 )。 建 立 合适 的 研究 机 构 和 培 养 合适 专家 的 大 学 要 对 由 企业 而 来 的 无 论 技术 还 是 资金 方面 的 流动 利润 待机 而 动 。 4.2 大 学 愿意 与 临床 样本 接近 许多 大 学 与 世界 级 的 临床 研究 部 门 有 联系 ， 可 以 使 企业 合作 者 愿意 与 生物 学 、 医 学 专家 进行 前 所 未 有 的 接近 。 优 秀 的 病历 和 经 验 丰富 的 标本 处 理 以 确保 高 质量 的 结果 ， 使 相关 的 样品 得 以 直接 比较 成 为 可 能 。 对 与 临床 医学 的 空间 接近 和 一 个 可 依赖 的 拥有 临床 专家 的 交流 基地 意味 着 : 样品 能 在 离开 手术 台数 分 钟 内 转 到 学 术 机 构 的 实验 室 ， 或 者 被 有 效 和 系统 地 冻 存 以 备 后 用 。 与 医学 专家 的 个 人 接触 使 精确 的 专业 化 要 求 成 为 可 能 ， 并 且 连 续 确 保 获 得 令 人 满意 的 质 控 。 企 业 寻 找 的 正 是 这 种 类 型 的 机 构 ， 对 于 潜在 的 投资 者 eye ee 。 226 - 和 蛋白质 组 学 或 合作 伙伴 而 言 以 最 低 消 耗 来 维持 。 在 劳动 密集 型 的 靶 分 子 开发 领域 ， 企 业 与 大 学 竞争 确 有 可 能 。 然 而 ， 无 论 应 用 在 观察 试验 药物 对 临床 [和 试验 的 影响 时 进行 迅速 的 现场 评 估 ， 还 是 应 用 在 组 织 学 家 能 检测 的 时 间 点 之 前 组 织 移植 排斥 的 启动 ， 附 属于 专业 临床 医院 的 蛋 昌 质 组 机 构 为 企业 合作 者 提供 了 一 个 理想 的 切入 点 。 这 种 考虑 的 重要 性 显而易见 。 4.3 ”大 学 不 仅 研究 医学 应 用 值得 人 注意 的 是 蛋白 质 组 学 的 主要 目的 有 可 能 使 健康 保险 系统 破产 。 除 此 之 外 ， 大 学 还 提供 仅 有 的 手段 ， 使 得 一 些 基本 的 生物 能 通过 和 蛋 日 质 组 学 进行 检查 。 例 如 ， 通 过 直 接应 用 先进 的 蛋 白 质 组 和 基因 组 研究 模式 生物 来 获得 对 于 胚胎 和 发 育 的 更 多 理解 。 目 前 主要 的 制药 企业 认为 用 来 研究 这 些 系统 的 模式 生物 ， 例 如 果 蝇 、 斑 马 鱼 或 蟾 。 这 类 计划 可 能 成 为 学 院 蛋 白质 组 中 心 的 长 处 ， 并 扩展 和 完全 互补 于 人 类 生物 学 计划 。 4.4 大 学 的 基础 研究 将 被 公众 接近 生物 数据 管理 系统 在 今天 存在 的 一 个 结果 是 值钱 。 生 物 信息 能 被 转化 为 市 场 化 的 制 药 产品 。 这 与 公共 数据 库 的 信息 沉淀 不 相 容 。 企 业 所 关注 的 是 下 载 整个 公共 资源 的 内 容 ， 并 利用 它 作为 基础 ， 依 据 它 来 扩大 私人 公司 的 数据 库 。 由 于 蛋白 质 组 分 析 是 大 规模 盘 选 、 快 速 流通 量 的 主要 部 分 ， 则 基本 上 可 能 由 企业 界 执行 ， 因 而 许多 有 价值 的 生物 信 息 将 不 能 为 公共 所 利用 。 4.5 大 学 培养 学 生 基本 的 经 济 信条 表明 ， 任 何 高 科技 企业 成 功 生 存 ， 一 个 合适 的 训练 有 素 的 工作 组 是 必须 的 。 这 种 培训 的 耗费 相当 可 观 ， 因 此 ， 对 于 公司 能 够 招募 合格 的 员工 是 有 很 大 的 优 | 势 的 。 教 学 是 大 学 的 主要 任务 ， 要 将 蛋白 质 组 领域 的 技能 熟练 地 传授 给 学 生 ， 大 学 必须 积极 参与 蛋白 质 组 领域 的 研究 中 来 。 的 确 ， 大 学 已 经 具有 大 量 必需 的 基本 设备 和 条 件 ， 并 需要 蛋白 化 学 、 细 胞 生物 学 和 生物 信息 学 间 的 直接 合作 ， 以 面 对 共 同 的 目标 一 一 蛋 息 质 组 学 。 5. 大 学 的 “让 产 易 股 (spin-off)” 2a] 历史 上 ， 德 国 的 大 学 并 不 擅长 于 将 其 专利 成 果 转 化 为 商业 上 的 利益 。 现 在 已 认识 到 这 种 状况 必须 改变 。 学 院 蛋 白质 组 的 另 一 方面 是 ， 我 们 在 准备 这 部 手稿 的 过 程 中 ， 已 经 有 了 第 一 手 的 经 验 。 因 为 蛋白 质 组 潜在 的 经 济 重要 性 ， 所 以 在 技术 发 展 上 存在 强大 的 经 济 利益 ， 正 是 这 样 ， 许 多 学 院 研 究 组 产生 “让 产 易 股 ”公司 ， 使 他 们 获得 的 专长 商品 化 。 当 考虑 到 某 些 基因 组 公司 时 ， 例 如 支撑 这 些 公 司 (如 Hyseq，Affymetrix 和 Incyte) 的 技术 都 从 学 院 研究 组 而 出 ， 这 种 活动 的 潜在 经 济 意义 变 得 很 明显 。 我 们 看 到 同样 的 现 象 将 在 蛋白 质 组 上 发 生 ， 并 且 这 本 书 的 几 个 作者 (包括 我 自己 ，ProteoMed GmbH 公 司 ) 正在 尽力 实现 这 个 目标 。 6. 结论 总 之 ， 与 某 些 意 见 相 反 ， 我 们 相信 学 院 的 蛋白 质 组 研究 既 值得 做 也 是 必须 的 ， 对 于 第 十 四 章 “学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 = 297 « 企业 和 学 院 都 能 提供 许多 益处 。 从 我 们 这 方面 看 ， 如 果 已 经 提供 了 大 部 分 研究 并 使 其 不 断 发 展 的 欧洲 的 大 学 放弃 对 这 一 强 有 力 的 技术 的 合适 和 连续 的 投资 将 是 不 幸 的 。 企 业界 已 经 认识 到 蛋白 质 组 研究 提供 了 巨大 、 难 以 预测 的 潜在 价值 。 至 少 其 中 部 分 必需 技术 的 发 展 将 可 能 由 学 术 机 构 进 行 。 这 是 学 术 机 构 为 何 要 支持 重 日 质 组 研究 项 目的 最 引 人 注 目 的 原因 。 (万 晶 宏 译 Kiam Kh) 参考 文献 Andersen, H.U., Fey, S.J., Larsen, P.M., Nawrocki, A., Hejnaes, K.R., Mandrup-Poulsen, T. and Nerup, J. 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Chem. 70: 733A—737A. 第 十 五 章 ”作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 Hervé Thiellement, Christophe Plomion and Michel Zivy 1.315 自从 O’ Farrell (1975) 和 Klose (1975) Ret tHIR EA AER YK (2-DE) 技术 以 来 ， 植 物 生 物 学 家 已 经 用 于 包括 遗传 和 生理 学 的 多 种 研究 。 在 一 块 腕 上 (A 15.1) 显 示 几 百 种 基因 产物 允许 以 蛋白 方式 检测 基因 型 之 间 的 差异 ， 并 且 以 这 种 方式 能 够 估计 遗 传 距离 ， 建 立 系 统 发 育 关 系 。 在 发 育 和 对 各 种 处 理 反应 中 也 研究 了 基因 表达 的 差异 ， 而 此 过 程 中 能 够 鉴定 出 受 这 些 条 件 调 控 蛋 白 的 表达 。 基 因 突 变 在 蛋白 水 平 上 进行 了 分 类 并 估计 了 多 效 性 。 编 码 鉴 定 出 来 的 蛋白 的 基因 被 作 图 ， 它 们 的 蛋白 显示 出 等 电 点 或 分 子 量 的 变异 〈 例 如 位 置 移 动 或 PS 变异 ， 图 15.2)。 表 达 的 基因 能 被 加 到 以 核酸 为 标记 建立 起 来 的 遗传 图 谱 中 。 另 外 ， 由 于 软件 的 贡献 (Appel et al: .，1997)， 一 种 蛋白 的 数量 可 以 作为 一 种 数量 性 状 ， 适 合 于 在 遗传 图 谱 上 定位 控制 这 些 数 量变 异 的 因素 数量 性 状 位 点 (QTL). Pl 15.1 拟 南 芥 叶 蛋白 的 2-DE 胶 图 15.2 一 维 在 pH3.5 到 10 非 线 性 梯度 的 IPG REA = (a) 2-DE 胶 的 一 部 分 ， 显 示 海 岸 松 F2 代 针 叶 的 位 移 (position 中 ; 三 维 SDS 胶 为 丙烯 酰胺 /PDA HAR, shift, PS) 变异 。al， 纯 合 基因 型 “a/a”; a2， 纯 合 基因 型 12%T; 蛋白 点 用 银 染 方法 染色 。 “b/b"; a3， 杂 合 基因 型 “a/p”"。(b) 2-DE 胶 的 一 部 分 ， 显 示 海岸 松 F2 代 针 叶 的 有 /无 (presence/absence, P/A) 变异 。bl， RAW ‘A’, BAW P/-; b2， 表 现 型 “无 '， 纯 合 缺 失 基因 型 “A/A"”。 第 一 维 IEF; 第 二 维 SDS. 在 植物 生物 学 中 ， 描 述 2-DE 胶 中 的 蛋白 点 的 技术 目前 正在 发 展 中 。 而 且 ， 几 种 植 物 和 蛋白 的 数据 库 正 在 建立 过 程 中 。 这 种 植物 蛋白 质 组 学 的 开端 将 具有 重要 的 意义 ， 因 为 pag a a 上 - 230 - 蛋白 质 组 学 第 一 个 植物 〈 拟 南 芥 ) 的 基因 组 测序 将 于 2000 年 底 全 部 完成 ， 蛋 白质 组 与 基因 组 数据 的 整合 将 是 非常 重要 的 。 近 来 发 展 起 来 的 “转录 组 ”工具 ， 如 高 密度 cDNA 膜 、cDNA 微 阵 列 或 DNA 心 片 (Castellino, 1997; Lemieux et al., 1998; Marshall and Hodgson, 1998), 5SRARASASHEIERAHN, SSRARHREAECH mRNA 经 常 不 相 关 也 是 值得 注意 的 (Anderdon and Anderson, 1998; Anderson and Seilhammer, 1997; Haynes et al .，1998)。 另 外 ， 既 然 蛋 白 的 更 新 和 翻译 后 修饰 不 能 在 CDNA 和 mRNA 水 平 研究 ， 将 来 的 和 蛋白质 组 学 是 并 将 持续 是 非常 重要 的 。 最 近 出 版 了 几 篇 关于 植物 量 昌 质 组 学 的 综述 (de Vienne et al., 1996, 1999; Thiellement et al! .，1999)， 这 里 将 描述 蛋白 质 组 学 在 植物 生物 学 中 几 种 应 用 的 范例 ， 并 重点 讲述 植物 蛋 日 质 组 学 导致 的 植物 遗传 学 的 进展 。 2. 遗传 多 样 性 分 析 2.1 ”种 内 和 种 间 的 遗传 差异 自然 群体 中 遗传 变异 的 程度 总 是 群体 遗传 学 家 ， 进 化 学 家 和 植物 育种 家 最 感 兴趣 的 主题 。 尽 管 同 工 酶 和 DNA 为 基础 的 标记 已 经 并 正在 被 广泛 使 用 ，2-DE 显示 的 蛋 自 很 少 被 用 于 群体 遗传 学 的 研究 。 但 是 ，2-DE 能 发 现 比 同 工 酶 电泳 更 多 的 标记 ，Vienne et al. (1996) 报道 2-DE 在 每 个 多 态 性 位 点 能 够 揭示 与 同 工 酶 相同 的 等 位 变异 。 与 DNA 标记 相 比 ，2-DE 揭示 的 遗传 变异 性 只 涉及 表达 的 基因 。 在 最 近 的 20 年 中 ， 人 们 做 了 许 多 用 2-DE 方式 在 多 种 分 类 水 平 评 价 遗 传 差异 的 实验 ， 下 面 详细 氢 述 几 个 范例 。 种 问 的 变异 性 栽培 小 麦 是 多 倍 体 ， 有 两 个 (REAL, Triticum tugidum , AABB) 或 三 个 (&/)#, Triticum aestivum, AABBDD) 基因 组 。 这 些 基 因 组 起 源 于 从 那 时 起 已 经 趋 异 的 一 个 共同 祖先 ， 现 在 仍然 存在 许多 二 倍 体 或 多 倍 体 的 野生 品种 ， 它 们 具有 不 同 的 所 谓 “ 部 分 同 源 ” 的 基因 组 ， 且 能 够 程度 不 同 地 杂交 。 小 麦 遗传 学 家 根据 减 数 分 裂 中 二 价 染 色 体 的 数目 推测 栽培 小 麦 不 同 的 基因 组 可 能 起 源 于 哪 一 种 现 有 品种 。 A 基 因 组 起 源 于 Trizacw urartu, D 基因 组 起 源 于 人 iavs1iz (Kerby and Kuspira, 1987)。 但 是 ， 对 于 哪 一 个 品种 的 Sitopsis 区 段 有 贡献 于 B 基因 组 及 栽培 小 麦 的 细胞 质 现在 仍然 存在 争议 。 为 了 解决 这 个 问题 ， 对 不 同 品 种 的 这 一 区 段 在 2-DE 水 平 上 (T.longissimum, T.sharonense, T.bicorne, T. searsii 和 T . speltoides ) wEFT SF 2E ML | | | | | eee Xt FF Ss De eS F}—M— F El # (Chinese spring, CS) 进行 了 比较 。 通 过 分 析 共 有 的 蛋白 点 的 数量 计算 出 了 每 对 基因 型 间 的 相似 性 指数 。 从 相似 性 结果 绘制 出 反应 在 Sitopsis 区 段 系 统 发 育 关系 的 树 状 图 。 不 仅 以 2-DE 为 基础 的 树 状 图 和 传统 的 分 类 学 近 乎 完美 一 致 ， 而 且 还 发 现 T.szelioides 是 与 栽培 小 麦 吾 基因 组 最 为 相近 的 野生 品种 (Bahrman et al., 1988a) 这 个 发 现 通过 分 析 细 胞 质 蛋 白 得 到 了 进一步 验证 : 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 的 大 亚 基 和 两 种 形式 的 BATP 酶 在 中 国 春 和 OT. speltoides 中 有 相同 的 等 位 形式 ， 而 其 他 的 Sitopsis 品种 则 具有 其 他 的 这 些 叶 绿 体 基 因 的 等 位 位 点 (Bahrman et al., 1988b). 通过 比较 2-DE 方式 对 系统 发 育 关系 的 研究 已 经 延伸 到 携带 不 同 基因 组 的 小 麦 属 品 种 (Thiellement et al., 1989). 4£ Triticeae 属 不 同 品种 间 的 另 一 个 实验 中 ， 也 就 是 小 第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 “ 231 - #i A AD AA, KAW H 基因 组 和 黑 麦 的 S 基因 组 之 间 得 到 的 树 状 图 很 好 地 反映 了 已 知 的 系统 发 育 关 系 (Zivy et al.，1995)， 但 是 小 麦 和 大 麦 间 共 有 的 蛋白 点 数目 降 到 30%， 说 明 已 达到 了 这 种 方法 的 极限 。 在 欧洲 候 麦 中 ，Barreneche 等 (1996) 检测 了 两 个 非常 相近 的 品种 Quercus petraea 和 Quercus robur 之 间 的 关系 。 他 们 用 2-DE 的 方法 ， 通 过 比较 部 分 覆盖 欧洲 白 优 麦 自然 地 理 范 围 的 来 自 6 个 欧洲 国家 的 23 种 候 麦 来 研究 遗传 差异 。 评 价 了 来 自 幼苗 总 蛋白 中 的 530 个 点 ， 其 中 101 个 是 多 态 性 的 。 两 个 品种 的 差异 性 是 0.36， 而 Quercus petraea 种 内 差异 性 是 0.35， Quercus robur 为 0.33。 这 种 非常 相近 的 种 间 和 种 内 距离 进一步 证 实 了 这 两 个 品种 之 间 较 低 水 平 的 遗传 差异 性 ， 正 如 在 同 工 酶 、 随 机 扩 增 多 态 性 DNA (RAPD) 和 叶绿体 DNA 中 所 报道 的 。 种 内 的 变异 性 ”在 海岸 松 中 ，Bahrman 等 (1994) 用 2-DE 的 方法 研究 自然 地 域 7 个 群体 RPh) 之 间 的 关系 ， 评 价 在 不 同 地 理 起 源 内 或 之 间 存 在 的 遗传 变异 性 。 利 用 峻 配子 体 〈 一 种 包 被 针 叶 松 种 子 胚胎 的 单 倍 体 营养 组 织 ) PRAM REN ARS 位 形式 ， 共 评价 了 968 个 蛋白 位 点 ， 其 中 84% 是 变异 性 的 。 在 这 些 信息 的 基础 上 ， 三 个 主要 的 松树 群体 ( 即 大 西洋 、 地 中 海 和 北非 群体 ) 可 以 被 区 分 出 来 ， 遗 传 结构 与 桩 糊 数据 相符 。 在 另外 一 个 研究 中 ，Petit 等 (1995) DESO M Dy Mi Ale] CBS. 2-DE 揭示 的 蛋 白 三 者 在 群体 中 的 遗传 差异 是 相同 的 ， 说 明 在 三 种 类 型 的 位 点 中 均 缺 乏 (KF) 选 择 。 Burstin 等 (1994) 通过 用 2-DE， 同 工 酶 和 RFLP 标记 研究 21 个 玉米 近 交 系 间 的 遗 `、 传 多 样 性 。 从 21 个 酶 位 点 、59 个 RFLP 探 针 、70 个 位 置 移 动 位 点 (PS) 计算 了 距离 ， 比较 了 103 个 蛋白 的 数量 变异 及 共 祖 率 系数 的 相关 性 。 在 PS 和 同 工 酶 位 点 间 每 个 多 态 性 位 点 的 等 位 位 点 没有 差异 -( 各 为 2.2 和 2.4)，RFLP 位 点 的 稍 高 (4.6)。 在 相关 的 品 系 中 ， 根 据 同 工 酶 位 点 ， 除 了 一 个 ， 其 余 所 有 的 距离 都 与 共 祖 率 系数 高 度 相 关 。 这 很 有 可 能 是 因为 只 检测 了 较 小 数量 的 同 工 酶 位 点 : 当 把 所 有 的 PS、 同 工 酶 和 RFLP 位 点 都 考虑 进去 时 的 共 祖 率 系数 相关 性 (0.85) 比 单独 考虑 某 一 项 时 要 高 。 在 不 相关 的 品系 中 ， 多 肽 的 数量 变异 与 其 他 标记 之 间 的 相关 性 下 降 到 0.14。 几 种 原因 可 以 用 说 明 这 个 oR. @ 进 化 的 压力 在 控制 蛋白 数量 的 基因 上 和 其 他 位 点 有 所 不 同 ，@ 上 位 性 和 多 效 性 相互 作用 能 导致 变异 蛋白 的 数量 与 控制 它们 数量 的 多 态 性 基因 间 存 在 非 线性 相关 ; OY 只 考虑 相关 品系 时 ， 单 基因 标记 的 重要 相关 性 可 能 因为 连锁 不 平衡 。 David 等 . (1987) 研究 来 自 于 一 个 小 麦 群体 在 不 同 地 点 经 过 8 年 栽培 独立 进化 的 11 个 群体 间 的 遗传 差异 。 在 这 个 分 析 中 ，162 个 多 肽 中 的 39 个 被 证 明 在 群体 间 存 在 多 态 性 。 多 变异 分 析 表 明 ， 不 同 地 点 进化 的 群体 起 源 于 同一 个 群体 ， 造 成 这 些 差异 的 根源 是 自然 选择 而 不 是 随机 漂移 。 2.2 品种 、 品 系 和 栽培 品种 的 区 别 20 世纪 80 年 代 ，Zivy (1983, 1984) 通过 2-DE 用 蛋白 间 质 量 和 数量 的 差异 区 分 出 来 3 个 不 同 的 小 麦 品 种 。 用 异 质 品系 (通过 外 来 细胞 质 的 连续 回 交 得 到 的 同 核 基 因 组 ) 揭示 细胞 质 编码 基因 〈 例 如 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 的 大 亚 基 ) 的 差异 。 二 维 电泳 技术 的 改进 ， 尤 其 是 从 植物 组 织 中 提取 蛋白 过 程 的 改进 〈Bahrman et al., 1985; « 73% - 蛋白 质 组 学 Colas des Francs et al., 1985) 以 及 大 一 些 尺 寸 胶 的 使 用 提高 了 遗传 变异 的 检 出 数 (Damerval et cg .，1986)。 在 2-DE 电泳 胶 中 尽管 只 有 部 分 编码 区 的 突变 是 可 检 出 的 ， 大 量 的 基因 产物 还 是 允许 研究 者 准确 地 分 析 及 分 辨 基因 型 ， 即 使 它们 属于 相关 的 群体 。 这 在 小 麦 (Anderson et al., 1985; Dunbar et al., 1985; Picard et al., 1997), K# (Gorg et al., 1988, 1992). 7K#§ (Abe a al., 1996; Saruyama and Shinbashi, 1992), 甘蔗 (Ramagopal, 1990) #U#KHL (Poch et al., 1992, 1994) 中 均 有 报道 。 在 木 本 植 物 中 ，Bon (1989) 应 用 2-DE 进行 分 生 组 织 培养 分 离 巨 杉 、 北 美 红 杉 、 花 旗 松 、 欧 洲 云 杉 、 海 岸 松 、 核 树 和 Populus nigra 的 克隆 。 当 用 2-DE 检测 遗传 差异 时 ， 研 究 者 可 找到 足够 的 差异 点 来 实现 其 的 目标 。 在 许多 情况 下 ， 获 得 的 数据 允许 建立 与 用 其 他 基于 分 子 或 表 型 特征 估计 的 相 一 致 的 遗传 距离 。 3. 基因 组 的 表达 3.1 突变 特征 比较 野生 型 与 突变 型 2-DE 的 模式 可 提供 对 突变 效果 的 评价 。 例 如 ， 它 能 够 检测 前 面 述 及 的 一 个 突变 的 多 效 性 。 而 且 ， 它 能 够 鉴定 出 突变 基因 编码 或 受 其 影响 的 蛋白 。 在 模式 植物 拟 南 芥 中 ， 用 2-DE 方式 检测 了 一 系列 影响 第 一 阶段 发 育 相 关 的 突变 (Santoni et al .，1994)。 一 种 蛋白 的 数量 ， 即 肌 动 蛋白 的 同型 ， 与 下 胚 轴 的 长 度 相 关 。 在 番茄 中 ， 野 生 型 和 铁 缺 乏 突变 型 二 维 电泳 方式 的 比较 导致 了 几 种 数量 不 同 的 酶 的 鉴定 ， 这 几 种 酶 参与 无 氧 代 谢 和 胁迫 防御 (Herbik et al., 1996), EMARAWHLM+H, Kasten 等 . (1997) 比较 叶绿体 突变 与 野生 型 之 间 的 蛋 日 差异 ， 是 否 与 细胞 分 裂 素 互 补 。 结 论 是 激素 对 胞 核 和 胞 质 编码 的 蛋白 均 有 影响 。 对 一 系列 影响 拟 南 芥 早 期 发 育 的 突变 和 激素 处 理 野 生 型 蛋白 方式 的 分 析 ， 阐 明了 一 种 与 预期 非常 相符 的 生化 分 类 法 ， 未 分 类 的 突变 可 能 导致 细胞 分 裂 素 的 超 量 表达 (Santoni et wz .，1997)。 这 种 假设 后 来 被 细胞 分 裂 素 的 剂量 进一步 证 实 (Faure et w.，1998)。 比 较 几 种 晚 花 期 拟 南 芥 的 突变 发 现 ， 几 个 蛋 白 点 相对 于 野生 型 出 现 或 消失 (Tacchini et 履 .，1995)。 但 是 ， 在 野生 型 和 突变 型 杂交 的 F2 代 群 体 中 ， 没 有 一 个 变异 蛋白 点 与 花 的 表现 型 共 分 离 。 除 了 遗传 证 实 的 必要 性 ， 这 些 实验 说 明 2-DE 分 析 能 够 揭示 用 于 突变 产生 实验 中 的 生态 型 或 品系 的 遗传 异 质 性 。 但 是 ， 必 须 注意 蛋白 质 组 分 析 的 蛋白 只 是 总 蛋白 的 一 部 分 。 | 蛋白 质 组 检测 突变 的 能 力 进一步 被 研究 突变 的 多 效 性 证 实 。Gottlieb 和 de Vienne (1988) 比较 了 葛 豆 的 两 个 近 等 基因 系 ， 它 们 携带 的 决定 圆 粒 和 皱 粒 的 r 基因 不 同 。 在 “成熟 种 子 的 蛋白 质 组 中 ， 近 10% 的 蛋白 点 在 数量 上 不 同 ， 证 实 了 这 两 种 类 型 的 种 子 之 闻 的 许多 已 知 的 生理 差异 。 在 玉米 中 ，Damerval 和 de Vienne (1993) 研究 了 Opaque2 (02) 基因 的 多 效 性 ， 该 基因 编码 一 种 转录 因子 。 通 过 对 在 几 个 无 关 背 景 中 的 O2 MEF 生 型 玉米 品系 2-DE 结果 的 比较 ， 鉴 定 出 了 0O2 基因 特异 的 靶 点 。 几 种 属于 不 同 途 径 代 谢 酶 的 发 现 进一步 证 实 O2 是 一 种 连接 不 同 谷物 代谢 途径 的 调控 基因 (Damerval and Le Guilloux，1998 ) 。 因此 ， 很 明显 蛋白 质 组 学 确实 是 区 分 基因 型 的 强 有 力 工 具 ， 即 使 是 在 遗传 背景 相差 无 几 的 情况 下 。 因 为 这 种 分 析 与 DNA 序列 并 非 紧密 相关 ， 在 遗传 差异 非常 小 的 时 候 也 sr 一 第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 233 - 可 能 观察 到 许多 差异 。 同 时 ， 这 能 允许 人 们 去 解释 单个 突变 的 多 种 效应 。 另 外 ， 只 有 在 蛋白 水 平 才 适 合 观察 翻译 后 的 修饰 ， 而 这 也 是 遗传 变异 的 主题 。 3.2 器官 和 发 育 阶 段 的 变异 性 几 个 研究 表明 ， 器 官 特异 的 蛋白 比 非 器 官 特异 的 蛋白 有 更 大 的 变异 性 ， 并 且 遗 传 变 异 的 水 平 依赖 于 组 织 或 器 官 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 检测 了 18 个 不 相 关 树 种 的 3 个 器 官 〈 针 叶 ， 芽 和 花粉 ) 蛋白 的 遗传 变异 性 。 在 902 个 多 肽 中 ， 通 过 评价 有 无 变异 ， 染 色 强 度 和 位 置 移 动 变异 ，27.2% 是 多 态 性 的 。 在 3 个 器 官 共 有 的 点 中 ， 只 有 18.1% 是 变异 性 的 ， 而 器 官 特异 的 多 肽 有 很 高 水 平 的 多 态 性 (平均 55%， 针 叶 特 异 的 点 44.4%， 花 粉 58.1%， 芽 70.4% )。 器 官 特异 的 高 水 平 变异 性 也 在 玉米 中 有 所 发 现 。 通 过 比较 两 个 近 交 系 间 3 Sa (中 胚 轴 、 第 二 叶 的 叶鞘 和 三 周 龄 幼苗 的 叶 耳 )，Leonardi 等 (1988) 发 现 357 种 蛋白 中 遗传 数量 和 质量 的 变异 为 3.6%， 器 官 间 没有 变异 性 ， 而 629 种 蛋白 中 22.6% 表 现 为 器 官 特异 的 变异 。 然 后 ， 这 种 比较 延伸 到 两 种 另外 的 基因 型 (de Vienne et al., 1988): 59% 的 表现 为 器 官 间 差异 的 蛋白 是 遗传 变异 的 ，18% 为 稳定 的 蛋白 。 这 个 假设 也 被 海岸 松 的 结果 证 实 : 吉 官 特异 的 点 位 置 移 动 变 异 的 频率 是 分 析 每 一 种 器 官 的 两 倍 ， 而 数量 则 为 五 倍 (Bahrma and Petit, 1995). 降低 的 “功能 约束 ” (Kimura, 1983), 4 Klose (1982) 所 说 ， 可 能 也 解释 了 与 “管家 ” 泛 在 蛋白 相 比 ， 在 单 细 胞 环境 中 表达 的 器 官 特 异性 多 肽 其 等 位 基因 变异 水 平 的 提高 。 3.3 非 生物 胁迫 反应 蛋白 的 鉴定 与 分 析 植物 对 非 生物 胁迫 的 反应 引起 了 人 们 极 大 的 关注 ， 主 要 因为 应 用 于 栽培 品种 的 可 能 性 。 热 休克 有 蛋白 ”在 植物 中 ， 象 其 他 有 机 体 一 样 ， 升 高 温度 能 诱导 热 休 克 和 蛋白 (HSP) 的 合成 。 它 们 的 合成 对 耐 热 性 的 获得 是 相关 的 ， 也 就 是 忍耐 较 高 温度 的 能 力 。 植 物 不 同 于 其 他 有 机 体 之 处 在 于 它们 能 合成 大 量 的 低 分 子 质量 HSP (LMW-HSP)， 例 如 ，Nover 和 Scharf (1984) 发 现 了 在 番茄 细胞 培养 中 48 种 HSP 的 诱导 。 人 们 通过 比较 不 同 处 理 的 效果 或 研究 在 发 育 过 程 中 的 诱导 ， 研 究 耐 热 性 与 HSP 合成 的 关系 : Albernathy et al. (1989) 认为 HSP 的 合成 与 第 一 阶段 小 麦 种 子 吸 涨 过 程 中 耐 热 性 的 演变 相关 。 人 们 也 研 究 了 不 同 细胞 器 HSP 的 合成 : Lund 等 (1998) 证 实在 玉米 线粒体 中 一 种 特殊 的 LMW- HSP (HSP22) 被 强烈 诱导 合成 。 鉴于 HSP 具有 如 下 特征 : OHS 处 理 诱 导 后 很 容易 鉴定 (鉴定 它们 不 需要 测序 ); @QH 2-DE 方式 检测 ， 可 以 放射 性 标记 ， 也 可 以 银 染 ; @ 一 个 优先 知道 的 与 耐 热 性 相关 的 蛋白 ， 就 早 用 遗传 研究 调查 HSP 多 态 性 与 耐 高 温 遗 传 变异 的 关系 ，Zivy (1987) 调 查 了 小 麦 中 HSP 的 遗传 变异 性 ， 检 测 出 了 很 高 水 平 的 多 态 性 : 在 3 个 近 交 系 35 个 被 检 测 的 HSP 中 ， 超 过 三 分 之 一 属于 质量 或 数量 变异 ， 而 同一 基因 型 只 有 13% 的 其 他 蛋白 是 多 态 性 的 。 然 后 ，El Madidi 和 Zivy (1993) 发 现 热 耐 受 不 与 HSP 的 质量 变异 相关 ， 而 与 两 种 LMW-HSP 的 数量 变异 相关 ， 且 后 者 普遍 存在 于 7 个 检测 的 基因 型 中 。 ee een 蛋白 质 组 学 人 们 为 了 寻找 特定 HSP 的 表达 与 耐 热 性 遗传 变异 的 合理 关系 进行 了 遗传 研究 (Kr ishnan et al., 1989; Vierling and Nguyen, 1990). Vierling 和 Nguyen (1992) 只 检测 了 单 粒 小 麦 耐 热 和 热 敏 株 系 之 间 的 数量 变异 。 然 后 ，Jorgensen 和 Nguyen (1995) 研究 了 LMW-HSP 在 玉米 幼苗 中 的 遗传 特征 ， 结 果 检 测 出 很 高 水 平 的 多 态 性 : 在 这 两 系 中 ， 29 个 被 检测 的 LMW-HSP 中 有 15 个 属于 质量 变异 ，3 个 表现 为 数量 变异 。 冷 适 应 蛋白 ”暴露 在 寒冷 条 件 下 能 够 诱导 冻结 耐 受 ， 但 是 这 种 生化 机 制 可 能 与 高 温 耐 受 的 机 制 不 同 ， 因 为 没有 特异 的 已 知 蛋白 是 被 寒冷 诱导 的 。 因 此 ，2-DE 被 用 于 描述 寒冷 反应 蛋白 ， 鉴 定 与 寒冷 适应 相关 的 调控 蛋白 : Meza-Basso 等 (1986) 发 现 了 在 油菜 幼苗 中 受 低 温 诱导 的 和 蛋白。 然后 Guy 和 Haskell (1988) 检测 了 菠菜 幼苗 中 与 冷 适 应 相 关 的 和 蛋白， 发 现 这 些 蛋 白 的 合成 在 获得 冻结 耐 受 性 期 间 有 所 升 高 ， 而 在 再 适应 过 程 中 减 少 。Cabane (1993) 在 大 豆 中 鉴定 了 冷 适 应 相关 和 蛋白， 其 中 一 个 是 热 休 克 和 蛋白 (HSP70)。Van Berkel et al. (1994) 检测 了 马铃薯 块 荃 冷 处 理 反 应 过 程 中 26 HEAR 量 的 改变 。Sabehat 等 (1996) 证 明 番 茄 的 果实 通过 热 休克 处 理 获 得 的 长 期 冷 耐 受 与 HSP 的 持久 性 相关 。Danyluk 等 (1991) 首先 用 遗传 途径 研究 了 3 个 小 麦 品 种 对 冷 处理 的 反应 : 18 种 蛋白 被 瞬时 诱导 ， 另 外 有 53 种 蛋白 在 诱导 冻结 耐 受 所 需 的 四 周 时 间 内 持 续 高 水 平 表达 。 而 后 者 中 的 34 种 在 冻结 耐 受 最 好 的 品系 中 也 有 较 高 水 平 的 表达 。 抗旱 相关 蛋白 ”和 缺 水 引起 植物 许多 形态 学 、 生 理学 和 生物 化 学 反应 ， 例 如 ， 减 少 气 生 部 分 的 生长 ， 气 孔 关 闭 ， 叶 子 卷 曲 ， 叶 衰亡 和 渗透 调整 。 这 些 反 应 至 少 部 分 受 脱落 酸 (ABA) 控制 ， 即 一 种 当 植 物 遭 受 干旱 时 浓度 升 高 的 植物 激素 。 许 多 细胞 的 功能 都 受 影 响 ， 并 发 现 该 胁迫 诱导 出 了 不 同类 型 的 蛋白 。 其 中 一 些 的 功能 直接 与 水 胁迫 有 关 (OK 孔 蛋 白 )， 一 些 与 细胞 损伤 有 关 (如 HSP， 与 氧化 胁迫 、 和 蛋白 酶 和 抑 蛋白 酶 相关 )， 还 有 一 些 与 不 同 的 代谢 功能 相关 (Ingram and Bartels，1996)。 第 一 个 被 鉴定 出 来 的 水 分 胁迫 蛋白 来 自 于 干燥 的 豚 胎 (Aspart et al., 1989; Dure et al., 1981; Sanchez-Mar- | tinez et al., 1986), KKRARKMAMIRE RRS REA (LEA)。 它 们 的 功能 未 | 知 ， 但 高 度 亲 水 ， 并 根据 重复 区 段 的 排列 分 成 不 同 的 组 (Dure et al., 1989), H— 些 后 来 被 证 明 是 不 同 器 官 受 干 旱 、ABA 或 盐 度 胁迫 诱导 的 结果 。 其 中 的 一 人 个， 玉米 的 RAB17 (组 2 ABA 反应 性 LEA 蛋白 ) 被 证 明 在 核 内 和 胞 质 内 磷酸 化 的 方式 不 同 (Jensen et al., 1998; Goday et al., 1994). | 在 一 些 情况 下 ，2-DE 不 是 用 来 鉴定 蛋白 ， 而 是 观察 不 同 条 件 下 蛋白 改变 的 首选 途 径 (Chen and Tabaeizadeh, 1992; Hurkman and Tanaka, 1988; Ramani and Apte, . 1997). Ramagopal (1987) wEAA A #é oh FH AY HR A SY Eh EA A EAN TAI HY. Leone . (1994) 证 明 在 马铃薯 细胞 悬浮 时 严重 的 渗透 胁迫 诱导 出 不 同系 列 的 蛋 日 。Leymarie etal. (1996) 用 植物 生长 素 不 敏感 突变 体 研 究 了 植物 生长 素 对 拟 南 芥 干 旱 反应 性 蛋白 的 效应 。 在 其 他 的 一 些 研 究 中 鉴定 了 诱导 出 的 蛋白 。 例 如 ，Claes (1990) 根据 水 稻 中 盐 胁迫 诱导 的 多 肽 段 微 测序 的 结果 设计 DNA 引物 ， 分 离 出 了 一 个 富 含 甘 氢 酸 蛋白 的 -cDNA 序列 。 同 样 地 ，Reviron (1992) 在 菠菜 叶子 中 鉴定 出 了 一 种 受 干旱 诱导 的 蛋白 酶 抑制 剂 ，Moons (1995, 1997) 在 水 稻 中 通过 微 测序 和 Western blotting 鉴定 出 了 一 种 新 型 的 富 含 甘 氢 酸 的 蛋白 ， 组 3 LEA 蛋白 ， 一 系列 的 组 2 LEA 蛋白 〈 也 叫 脱水 素 ， 如 第 十 五 章 “作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 = AS RAB17)。 在 3 PRM HHH, WHREMLEREBAMGRAMEH KHEA.] Rey (1998) 证 明 在 马铃薯 叶绿体 中 通过 水 分 胁迫 诱导 出 一 种 硫 氧 还 蛋白 - 样 蛋白 ， Moons 等 (1998) 从 水 稻 根 中 诱导 出 丙酮 酸 正 磷酸 双 激 酶 。Costa 等 (1998) 发 现在 海 岸 松针 叶 中 通过 干旱 诱导 出 38 种 蛋白 。 其 中 包括 涉及 氧化 胁迫 反应 ， 热 休克 反应 和 木 质 素 生 物 合 成 的 酶 类 。Riccardi 等 (1998) 在 玉米 叶子 的 生长 部 分 发 现 受 干旱 影响 的 78 种 蛋白 ， 其 中 50 种 是 上 调 的 (图 15.3)。19 种 蛋白 得 到 了 部 分 序列 信息 ， 使 涉及 几 种 代谢 途径 蛋白 的 鉴定 成 为 可 能 。 水 胁迫 IO 图 15.3， 在 两 个 玉米 近 交 系 F2 和 Io 根 中 受 水 分 胁迫 诱导 的 蛋白 小 箭头 指示 一 串 被 诱导 的 蛋白 ， 在 Io 中 这 一 串 蛋 白质 的 表 观 分 子 量 要 比 F2 中 的 稍 高 些 ， 显 示 所 有 的 这 些 蛋 白 可 能 都 被 一 个 多 态 性 基因 编码 ， 只 是 翻译 后 修 饰 不 同 。 大 箭头 指示 非 诱导 蛋白 的 位 移 。 4. 遗传 作 图 和 候选 蛋 日 近 几 年 分 子 遗 传 方法 在 遗传 作 图 和 数量 性 状 分 离 分 析 (QTL 作 图 ) (Kearsey and Farquhar，1998) 中 的 应 用 有 了 巨大 的 进步 。 尽 管用 DNA 为 基础 的 技术 能 够 快速 遍及 基因 组 ，2-DE 则 不 但 提供 表达 基因 组 作 图 的 有 效 分 子 标 记 ， 还 可 能 为 理解 QTL 生物 功 能 提供 “候选 蛋白 ”。 4.1 蛋白 标记 的 遗传 作 图 代表 质量 变异 的 点 ， 或 是 位 置 移动 (PS) 或 有 无 (P/A) (图 2)， 已 被 证 明 是 受 单 基因 控制 的 (de Vienne et al., 1996), PS 变异 是 指 两 个 有 相同 特征 和 染色 强度 的 点 ， 可 用 以 下 的 标准 来 鉴定 : @@ 它 们 在 2-DE 胶 上 的 位 置 较 近 ， 有 相近 的 pbI 和 (或 ) 表 观 分 子 质量 ; @ 它 们 在 分 离谱 系 中 以 单 基 因 共 显 性 的 孟 德 尔 方 式 遗 传 [在 单 倍 体 和 双 单 倍 体 品系 中 以 1:1 分离 (Plomion et al., 1995; Zivy et al., 1992); 在 F2 自 交 群体 中 以 - 236 - 和 蛋白质 组 学 1:2:1 分 离 (Costa，1999; Damerval, 1994; Plomion, 1997)]; @@ 它 们 对 应 于 同一 个 蛋 白 。 最 后 一 条 标准 已 在 玉米 和 松 中 一 对 等 位 位 点 的 微量 测序 得 到 进一步 证 实 (Plomion, 1997; Touzet，1995a)。 如 果 PS 变异 对 应 于 蛋白 初级 结构 的 等 位 基因 变异 已 经 很 明了 ， 这 种 显示 P/A 变异 的 点 的 平行 性 就 不 是 很 直接 了 。 在 F2 代 的 2-DE 胶 中 ， 这 种 蛋白 显 示 明 显 的 单 基 因 显 性 遗传 方式 〈 一 个 点 的 有 无 以 3:1 的 比例 分 离 )， 说 明 这 种 多 态 性 是 单 基因 引起 的 。 如 果 P/A 变异 与 PS 变异 (许多 等 位 变异 是 检测 不 到 的 ) 相对 应 ， 那 么 P/A 位 点 就 对 应 于 蛋白 的 结构 基因 。 反 过 来 ， 如 果 一 个 P/A 变异 对 应 于 一 个 不 能 检测 的 点 的 数量 差异 ， 那 么 P/A 位 点 对 应 一 个 控制 蛋白 表达 水 平 的 主要 调控 基因 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 证 实 PS 位 点 变异 的 水 平 与 分 子 量 成 正 相 关 ， 也 就 是 说 高 分 子 量 蛋 白 的 变异 性 要 比 低 分 子 量 的 变异 性 大 的 多 。 这 样 ， 大 的 一 些 蛋 白 就 会 出 现 较 高 水 平 的 多 态 性 ， 因 为 “每 个 多 肽 的 替换 率 的 变异 取决 于 氨基 酸 数目 或 每 个 位 点 蔡 换 率 的 不 同 ” (Nei，1987)。 但 是 ， 没 有 发 现 P/A 变异 的 水 平 与 分 子 量 相 关 。 这 两 个 研究 〈 单 基因 方式 的 遗传 以 及 与 分 子 量 的 不 相关 ) 暗示 P/A 变异 可 能 来 自 于 主 效 调 控 元 件 的 多 态 性 。 蛋白 标记 的 遗传 定位 主要 在 小 麦 、 玉 米 和 海岸 松 中 有 报道 ， 尽 管 也 有 几 个 PS 位 点 在 其 他 作物 中 有 所 报道 ， 包 括 大 麦 (Zivy et al., 1992) 和 更 豆 (de Vienne et al., 1996)。 在 小 麦 中 ，Colas des Francs 和 Thiellement (1985) 报道 了 对 比 整 倍 体 和 双 末 端 体 35 种 蛋白 的 染色 体 定 位 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Damerval (1989) VA Gerber et al. (1993) 各 自 报道 了 119 和 OS 个 位 点 的 连锁 分 析 。 近 来 用 来 自 于 该 物种 第 三 代 近 交 谱系 单 倍 体 (Plomion et al., 1995) 和 二 倍 体 (Costa et al., 1999; Plomion et al., 1997) 组 织 的 68 种 蛋白 进行 作 图 。 在 玉米 中 ，de Vienne et al. (1996) 提供 了 显示 65 个 PS 位 点 分 布 的 多 系 连锁 图 。 在 松树 和 玉米 中 ， 能 在 每 一 条 染色 体 上 找到 蛋 自 位 点 (图 1$.4)， 与 其 他 标记 〈 玉 米 中 的 RFLP， 松树 中 的 RAPDs 和 AFLP) 散在 分 布 。 RFLP 标记 由 cDNA 文库 发 展 而 来 ， 一 般 揭示 数 个 不 连锁 位 点 (Devey et al., 1994; Helentjaris et al., 1988; Song et wl .，1991)， 鉴 定 表 达 的 基因 ， 而 对 于 沉默 的 基因 和 假 基 因 的 鉴定 是 非常 困难 的 。 因 此 ， 对 于 构建 表达 基因 图 谱 和 建立 在 不 同 组 织 或 不 同 发 展 阶段 哪 一 个 cDNA 位 点 在 表达 ， 用 2-DE 方法 分 离 蛋 白 是 非常 有 趣 的 技术 。 例 如 ， 一 个 玉米 蛋白 表现 为 叶 、 种 子 和 胚芽 鞘 的 PS 变异 ， 用 微量 测序 和 蛋白 成 分 分 析 鉴 定 为 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 。 用 于 RFLP 分 析 的 cDNA 探 针 作 图 到 3 条 染色 体 上 4 个 不 同 的 位 点 。 每 个 器 官 中 的 PS 位 点 只 与 其 中 的 一 个 〈 也 许 为 表 达 的 一 个 ) HEL (de Vienne etal., 1999). 到 现在 为 止 ， 单 个 植物 品种 中 作 图 的 蛋白 位 点 不 超过 100 个 。 这 种 标记 的 数目 将 在 以 后 随 着 分 析 同 一 个 体 一 些 生 理学 上 对 照 的 器 官 或 组 织 〈( 根 、 叶 、 芽 、 花 粉 和 木质 部 等 ) 而 增加 ， 直 到 遍及 整个 基因 组 。 这 种 表达 基因 图 谱 将 是 QTL 分 析 中 候选 基因 /和 蛋 白 策 略 的 无 以 比拟 的 支撑 。 4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白 候选 基因 。 在 近 10 年 中 ， 鉴 定 出 有 重要 农学 性 状 遗 传 变异 的 基因 主要 是 通过 在 分 离 群体 中 用 无 名 标记 做 的 连锁 图 分 析 ， 这 种 图 的 连锁 不 平衡 能 被 最 大 化 〈Tanksley， 第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 * 237 - 图 15.4 来 自 与 松树 肉 配子 体 和 针 叶 2-DE 胶 的 15 个 位 置 变异 (-) 和 53 个 有 /无 变异 (-) 在 图 谱 上 的 位 置 模式 图 该 图 用 RAPD 和 AFLP 标记 构建 ， 可 通过 因特网 查询 (http: //www. pierroton. inra. fr/genetics/ pinus/ ) . 1993)。 尽 管 很 成 功 ， 但 应 指出 这 种 QTL 检测 分 析 存 在 一 定 的 局 限 性 。QTL 只 能 被 大 致 定 位 ， 也 就 是 说 遗传 图 谱 上 的 QTL 的 置信 区 间 是 很 大 的 (Mangen et al., 1994). 这 意味 着 QTL 作 图 不 允许 鉴定 潜在 基因 。 因此 ， 人 性 状 分 割 分 析 ， 尽 管 已 应 用 于 标记 辅 助 育种 程序 中 ， 可 以 被 认为 是 鉴定 控制 部 分 数量 性 状 变异 的 第 一 步 。 另 外 ， 在 总 基因 组 长 度 和 DNA 含 量 的 基础 上 上， 相当 于 1B (cM) 的 平均 物理 图 距 是 变化 的 ， 如 拟 南 芥 、 核 树 、 玉 米 、 小 麦 和 松树 分 别 是 : 230、460、2500 和 12000Kb。 这 意味 着 在 大 部 分 一 年 生 植 物 森 林 树 种 中 用 定位 克隆 (Rommens et al., 1998) 鉴定 QTL 是 非常 困难 的 。 从 生物 学 角度 ， 可 以 从 候选 基因 (CG) AERA (CP) 途径 获得 QTL. “功能 CG” 是 指 可 能 影响 性 状 表 达 并 且 测 序 的 基因 ， 可 以 基于 已 知 影响 目标 性 状 的 生化 和 发 育 途径 标准 来 推断 。 另 外 ， 任 何 一 个 产生 很 大 影响 的 突变 位 点 可 以 被 认为 是 一 个 CG， 而 这 个 CG 的 等 位 位 点 的 效应 较 小 ， 可 能 影响 自然 发 生 的 数量 变异 。 例 如 ， Touzet 等 〈1995b) 推测 一 个 矮 化 基因 涉及 赤 霉 酸 生 物 合成 途径 ， 作 为 高 秆 生长 的 QTL. QTL 和 这 个 突变 质量 性 状 的 共 定 位 已 有 报道 (Beavis et al., 1991; Doebley and Stec，1993)。 这 种 “功能 CG” 的 主要 局 限 性 在 于 目前 只 有 一 小 部 分 基因 影响 的 性 状 是 已 知 的 。 “位 置 CG” 可 以 推测 所 有 与 目标 性 状 QTL 定位 在 同一 位 置 的 基因 。 但 是 ， 该 策略 是 以 比较 完善 的 基因 图 谱 为 基础 的 ， 只 可 以 应 用 于 少数 几 个 物种 。QTL 和 已 知 基 因 的 共 定 位 以 前 曾 有 报道 (Byrne et al., 1996; Causse et al., 1995; Goldman et al., 1994; Prioul et al., 1997, 1999), “fit CG” AYER REET CG 和 QTL 的 共 定 位 纯 属 偶然 。 2 有 蛋白 数量 位 点 作为 正式 候选 基因 的 可 能 的 方法 “CG 的 证 实在 这 种 信息 应 用 于 育种 程序 以 前 是 非常 必要 的 。 其 证 实 依赖 于 功能 基因 组 学 工具 (Borchez and Hofte, 1998), 其 中 CP 途径 是 必 不 可 少 的 步 又。 确实 ， 如 果 一 个 CG 的 产物 不 显示 数量 和 (或 ) 活性 eS ef - 236 - 蛋白 质 组 学 1:2:1 分 离 (Costa, 1999; Damerval, 1994; Plomion，1997)];，@@ 它 们 对 应 于 同一 个 蛋 和 白 。 最 后 一 条 标准 已 在 玉米 和 松 中 一 对 等 位 位 点 的 微量 测序 得 到 进一步 证 实 (Plomion, 1997; Touzet，1995a)。 如 果 PS 变异 对 应 于 蛋白 初级 结构 的 等 位 基因 变异 已 经 很 明了 ， 这 种 显示 P/A 变异 的 点 的 平行 性 就 不 是 很 直接 了 。 在 F2 代 的 2-DE 胶 中 ， 这 种 蛋白 显 示 明 显 的 单 基 因 显 性 遗传 方式 〈 一 个 点 的 有 无 以 3:1 的 比例 分 离 )， 说 明 这 种 多 态 性 是 单 基 因 引 起 的 。 如 果 P/A 变异 与 PS 变异 (许多 等 位 变异 是 检测 不 到 的 ) FM, BA P/A 位 点 就 对 应 于 蛋白 的 结构 基因 。 反 过 来 ， 如 果 一 个 P/A 变异 对 应 于 一 个 不 能 检测 的 点 的 数量 差异 ， 那 么 P/A 位 点 对 应 一 个 控制 蛋白 表达 水 平 的 主要 调控 基因 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 证 实 PS 位 点 变异 的 水 平 与 分 子 量 成 正 相 关 ， 也 就 是 说 高 分 子 量 蛋 白 的 变异 性 要 比 低 分 子 量 的 变异 性 大 的 多 。 这 样 ， 大 的 一 些 蛋 白 就 会 出 现 较 高 水 平 的 多 态 性 ， 因 为 “每 个 多 肽 的 蔡 换 率 的 变异 取决 于 氨基 酸 数目 或 每 个 位 点 替换 率 的 不 同 ” (Nei，1987)。 但 是 ， 没 有 发 现 P/A 变异 的 水 平 与 分 子 量 相关 。 这 两 个 研究 〈 单 基因 方式 的 遗传 以 及 与 分 子 量 的 不 相关 ) 暗示 P/A 变异 可 能 来 自 于 主 效 调控 元 件 的 多 态 性 。 蛋 日 标记 的 遗传 定位 主要 在 小 麦 、 玉 米 和 海岸 松 中 有 报道 ， 尽 管 也 有 几 个 PS 位 点 在 其 他 作物 中 有 所 报道 ， 包括 大 麦 (Zivy et al., 1992) FBG (de Vienne et al., 1996) 。 在 小 麦 中 ，Colas des Francs 和 Thiellement (1985) 报道 了 对 比 整 倍 体 和 双 来 端 体 35 种 蛋白 的 染色 体 定 位 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Damerval (1989) 以 及 Gerber et al. (1993) 各 自 报道 了 119 和 65 个 位 点 的 连锁 分 析 。 近 来 用 来 自 于 该 物种 第 三 代 近 交 谱系 单 倍 体 (Plomion et al., 1995) 和 二 倍 体 (Costa et al., 1999; Plomion et al., 1997) 组 织 的 68 种 蛋白 进行 作 图 。 在 玉米 中 ，de Vienne et al. (1996) 提供 了 显示 65 个 PS 位 点 分 布 的 多 系 连锁 图 。 在 松树 和 玉米 中 ， 能 在 每 一 条 染色 体 上 找到 蛋 自 位 点 (图 15.4)， 与 其 他 标记 〈 玉 米 中 的 RFLP， 松树 中 的 RAPDs 和 AFLP) 散在 分 布 。 RFLP 标记 由 cDNA 文库 发 展 而 来 ， 一 般 揭 示 数 个 不 连锁 位 点 (Devey et al., 1994; Helentjaris et al., 1988; Song et wd .，1991)， 鉴 定 表 达 的 基因 ， 而 对 于 沉默 的 基因 和 假 基 因 的 鉴定 是 非常 困难 的 。 因 此 ， 对 于 构建 表达 基因 图 谱 和 建立 在 不 同 组 织 或 | 不 同 发 展 阶段 哪 一 个 cDNA 位 点 在 表达 ， 用 2-DE 方法 分 离 蛋 白 是 非常 有 趣 的 技术 。 例 如 ， 一 个 玉米 蛋 自 表 现 为 叶 、 种 子 和 且 芽 精 的 PS 变异 ， 用 微量 测序 和 和 蛋白 成 分 分 析 监 一 一 一 一 -一 KE Ay oe RY eh PRE ED FA RFLP 分 析 的 cDNA 探 针 作 图 到 3 条 染色 体 上 4 个 不 同 的 位 点 。 每 个 器 官 中 的 PS 位 点 只 与 其 中 的 一 个 〈 也 许 为 表 达 的 一 个 ) 共 定 位 (de Vienne etal., 1999), 到 现在 为 止 ， 单 个 植物 品种 中 作 图 的 蛋白 位 点 不 超过 100 个 。 这 种 标记 的 数目 将 在 以 后 随 着 分 析 同 一 个 体 一 些 生理 学 上 对 照 的 器 官 或 组 织 〈( 根 、 叶 、 芽 、 花 粉 和 木质 部 等 ) 而 增加 ， 直 到 遍及 整个 基因 组 。 这 种 表达 基因 图 谱 将 是 QTL 分 析 中 候选 基因 /和 蛋 白 策 略 的 无 以 比拟 的 支撑 。 4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白 候选 基因 。 在 近 10 年 中 ， 鉴 定 出 有 重要 农学 性 状 遗 传 变异 的 基因 主要 是 通过 在 分 离 群体 中 用 无 名 标记 做 的 连锁 图 分 析 ， 这 种 图 的 连锁 不 平衡 能 被 最 大 化 〈Tanksley， 第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 237 + 图 15.4 来 自 与 松树 肉 配 子 体 和 针 叶 2-DE 胶 的 15 个 位 置 变异 〈-) 和 53 个 有 /无 变异 (-) 在 图 谱 上 的 位 置 模 式 图 该 图 用 RAPD 和 AFLP 标记 构建 ， 可 通过 因特网 查询 (http: //www. pierroton. inra. fr/genetics/pinus/ ) . 1993)。 尽 管 很 成 功 ， 但 应 指出 这 种 QTL 检测 分 析 存 在 一 定 的 局 限 性 。QTL 只 能 被 大 Sew, Wee ie eA LA QTL 的 置信 区 间 是 很 大 的 (Mangen et al., 1994), 这 意味 着 QTL 作 图 不 允许 鉴定 潜在 基因 。 因 此 ， 人 性 状 分 割 分 析 ， 尽 管 已 应 用 于 标记 辅 助 育 种 程序 中 ， 可 以 被 认为 是 鉴定 控制 部 分 数量 性 状 变异 的 第 一 步 。 另 外 ， 在 总 基因 组 长 度 和 DNA 含量 的 基础 上 ， 相 当 于 1 JE (cM) 的 平均 物理 图 距 是 变化 的 ， 如 拟 南 芥 、 核 树 、 玉 米 、 小 麦 和 松树 分 别 是 : 230、460、2500 和 12000Kb。 这 意味 着 在 大 部 分 一 年 生 植 物 森 林 树 种 中 用 定位 克隆 (Rommens et al., 1998) 鉴定 QTL 是 非常 困难 的 。 从 生物 学 角度 ， 可 以 从 候选 基因 〈(CG) 和 候选 蛋白 (CP) 途径 获得 QTL. “功能 CG” 是 指 可 能 影响 性 状 表达 并 且 测 序 的 基因 ， 可 以 基于 已 知 影响 目标 性 状 的 生化 和 发 育 途 径 标准 来 推断 。 另 外 ， 任 何 一 个 产生 很 大 影响 的 突变 位 点 可 以 被 认为 是 一 个 CG， 而 这 个 CG 的 等 位 位 点 的 效应 较 小 ， 可 能 影响 自然 发 生 的 数量 变异 。 例 如 ， Touzet 等 〈1995b) 推测 一 个 矮 化 基因 涉及 赤 霉 酸 生 物 合成 途径 ， 作 为 高 秆 生长 的 QTL. QTL 和 这 个 突变 质量 性 状 的 共 定 位 已 有 报道 (Beavis et al., 1991; Doebley and Stec，1993)。 这 种 “功能 CG” 的 主要 局 限 性 在 于 目前 只 有 一 小 部 分 基因 影响 的 性 状 是 GAA. “位 置 CG” 可 以 推测 所 有 与 目标 性 状 QTL 定位 在 同一 位 置 的 基因 。 但 是 ， 该 策略 是 以 比较 完善 的 基因 图 谱 为 基础 的 ， 只 可 以 应 用 于 少数 几 个 物种 。QTL 和 已 知 基因 的 共 定 位 以 前 曾 有 报道 (Byrne et al., 1996; Causse et al., 1995; Goldman et al., 1994; Prioul et al., 1997, 1999), “{Z# CG” HEB ARHEF CGM QTL 的 共 定 位 纯 属 偶然 。 蛋白 数量 位 点 作为 正式 候选 基因 的 可 能 的 方法 “CG 的 证 实在 这 种 信息 应 用 于 育种 程序 以 前 是 非常 必要 的 。 其 证 实 依赖 于 功能 基因 组 学 工具 (Borchez and Hofte, 1998), 其 中 CP 途径 是 必 不 可 少 的 步 又。 确实 ， 如 果 一 个 CG 的 产物 不 显示 数量 和 (或 ) 活性 2 蛋白 质 组 学 的 多 态 性 ， 也 就 是 说 如 果 一 个 CG 和 一 个 QTL 的 共 定 位 不 与 另外 一 个 控制 其 活性 和 (或 ) 数量 的 QTL 共 定 位 ， 那 么 这 个 CG 是 不 能 被 证 实 的 。 Damerval 等 (1994) 率先 用 QTL 策略 调查 2-DE 分 离 蛋白 的 数量 变异 的 遗传 确定 性 。 他 们 用 玉米 F2 中 分 离 的 RFLPs 和 PS 位 点 构建 的 连锁 图 谱 通过 对 调控 因子 或 解释 点 强度 变异 的 PQL 的 区 间作 图 (Lander and Botstein, 1989) 进行 定位 。 在 分 析 的 72 个 蛋白 中 ，42 个 蛋白 检测 到 70 个 PQL， 其 中 20 含有 不 只 一 个 PQL， 分 布 在 整个 基因 组 中 。 近 来 ，PQLs 控制 海岸 松针 叶 蛋 白 的 积累 也 在 F2 代 (Costa et al., 1999) 检测 到 ， 并 得 出 了 相同 的 结论 。 这 种 途径 在 玉米 中 (de Vienne et al., 1999) 近来 也 给 出 一 | 个 范例 ， 一 个 定位 在 10 号 染色 体 上 的 干旱 反应 性 CG (ASR1 基因 ,，ABA/ 水 分 胁迫 / 催 熟 相关 蛋白 ) 与 木质 部 树 液 、ABA 含量 、 叶 子 衰 老 和 花丝 间隔 【一 种 干旱 反应 性 性 状 ) 的 QTL、 一 个 在 干旱 条 件 下 控制 ASR1 蛋白 有 /无 变异 的 主 效 PQL 共 定 位 。 PQL 策略 也 能 鉴定 出 C， 也 就 是 控制 数量 和 (或 ) 活性 的 遗传 因子 蛋白 与 已 知 农 艺 性 状 的 QTL 共 定 位 ， 而 结构 基因 则 不 能 。 在 此 前 提 下 ，de Vienne 等 (1999) 在 玉米 中 证 实 了 3 个 控制 单 叶 和 蛋白 数量 的 PQL 与 3 个 高 秆 QTL 共 定 位 。 5. FEF ERA OC 近来 对 2-DE 和 和 蛋白 分 析 的 改进 使 植物 蛋白 质 组 分 析 有 了 相当 大 的 进展 。 技 术 的 改 进 ， 如 IPG 预制 条 ， 使 得 2-DE 的 可 重复 性 有 所 改善 ， 跑 大 量 的 样品 变 得 容易 ， 这 些 代 表 了 使 PQL 途径 更 加 可 行 的 主要 进步 。 现 在 通过 微量 测序 、 电 喷雾 电离 MS/MS 或 MALDI-TOF 质谱 随后 在 蛋 白 或 基因 数据 库 中 进行 序列 同 源 性 搜寻 (Li et al., 1997), 鉴定 和 分 析 多 肽 点 已 相对 较为 容易 。 而 且 ， 近 几 年 ， 在 软件 和 图 像 分 析 方 面 的 进步 允许 分 析 和 比较 大 量 样品 中 的 大 量 的 点 (Appel et al., 1997). ix SHAE AA 2-DE 是 一 种 功能 强大 的 蛋白 方式 的 技术 ， 能 够 联系 生理 学 和 遗传 学 方面 的 问题 。 表 15.1 植物 基因 组 数据 库 鉴定 的 蛋白 数目 a 品种 (已 鉴 定 出 的 百分数 ) 参考 文献 WWW 地 址 水 稻 50 (58% ) Komatzu et al. (1993) http: //www.rs.noda.sut.ac.jp/~kamom/2-DE/ 59 (56% ) Tsugita et al. (1994) 2d.html* 51 (53%) Tsugita et al. (1996) 拟 南 芥 57 (63% ) Kamo et al. (1995) http: //www.rs.noda.sut.ac.jp/~ kamom/2-DE/ 62 (56.5% ) Tsugita et al. (1996) 2d.html* 150 (50% ) Santoni et al. (1998) http: //sphinx.rug.ac.be: 8080/ppmdb/ index. html 玉米 74 (48.5%) Touzet et al. (1996) http: //moulon. inra. fr/imgd 80 (67.5%) Zivy (私人 通讯 ) 松树 65 (90% ) Costa et al. (1999) http: //www.pierroton. inra. fr/genetics/2D/ “该 数据 库 已 不 再 使 用 。 尽管 量 白质 组 学 在 越 来 越 多 的 微生物 以 及 人 类 中 广泛 研究 (Humphery-Smith et al., 1997; Wilkins et az .，1997)， 蛋 白质 组 在 植物 中 还 没有 得 到 很 大 的 关注 。 表 15.1 第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 239 - 中 列 出 了 目前 网 上 可 用 的 植物 蛋白 数据 库 的 特征 。 现 在 可 用 的 数据 库 有 : 双子 叶 的 拟 南 芥 、 单 子叶 的 水 稻 、 重 要 的 农作物 如 玉米 、 裸 子 植物 海岸 松 。 这 些 数据 库 提 供 扫 描 的 胶 和 可 点 击 的 图 像 ， 特 征 点 以 超级 链接 强调 。 单 个 蛋白 入 口 通过 激活 的 交叉 文献 与 其 他 蛋 白 数据 库 如 SWISS-PROT 或 TrEMBL 链接 。 在 基因 组 表达 分 析 方 面 ， 所 有 这 些 数据 库 都 包括 在 各 种 植物 器 官 OB Ob. SR RT) 或 组 织 MAA, ARM, OK 部 ) 或 基因 型 间 多 态 方式 的 比较 。 有 时 候 也 提供 其 他 的 信息 如 亚 细 胞 定位 、 生 理学 数据 (海岸 松针 叶 蛋 白 季 节 变 异 或 水 分 缺乏 效果 ) 和 遗传 学 数据 (对 应 于 海岸 松 和 玉米 连锁 图 谱 中 基因 的 定位 )。 6. 总 结 、 前 景 展望 关于 群体 遗传 学 研究 ， 选 择 分 子 筛选 技术 分 析 自 然 群体 中 遗传 多 样 性 的 程度 和 分 布 将 依赖 于 许多 因素 (Karp et al., 1995) 是 广泛 接受 的 观点 。 因 为 每 种 类 型 的 标记 都 具 有 优点 和 局 限 性 ， 需 要 应 用 多 种 技术 ， 其 中 包括 2-DE。 这 种 技术 的 优点 在 于 蛋白 位 点 从 基因 组 取样 区 别 于 许多 基于 PCR 的 技术 ， 因 此 对 于 多 样 性 问题 ， 它 提供 不 同 水 平 的 差异 。 目 前 ，2-DE 没有 被 用 于 系统 发 生 关 系 的 建立 。 但 是 ， 如 在 Triticeae 中 展示 的 ， 在 传统 的 细胞 和 分 子 途 径 不 能 区 分 的 物种 间 的 比较 方面 似乎 具有 相当 大 的 价值 。 而 且 ， 当 研 究 属 于 同一 个 家 族 的 相关 物种 时 发 现 了 共有 的 蛋白 。 如 果 一 个 蛋白 是 栽培 品种 如 油 菜 的 育种 的 目标 ， 而 且 如 果 编 码 电泳 中 同一 蛋白 的 基因 已 经 在 拟 南 芥 中 〈 另 一 个 十 字 花 科 植 物 ) 测序 ， 这 可 以 极 大 地 缩短 建立 该 基因 为 目标 农艺 基因 的 时 间 。 可 以 乐观 地 展望 将 来 这 种 比较 基因 组 学 的 发 展 。 在 候选 基因 途径 中 使 用 蛋白 分 析 的 方法 刚刚 起 步 ， 因 为 植物 育种 家 的 获 益 将 很 快 发 展 起 来 。 2-DE 只 能 揭示 1000 或 2000 多 丰富 蛋白 的 相对 局 限 性 ， 如 本 书 的 其 他 音节 中 描述 的 ， 可 以 通过 改进 提取 方法 和 应 用 多 步 技 术 ， 提 高 每 个 样品 2-DE 胶 的 数目 和 斥 寸 ( 变 案 和 拓宽 pH WHS) 等 方法 来 解决 。 像 在 医学 和 微生物 学 中 一 样 ， 蛋 白质 组 学 将 很 快 成 为 植物 生物 学 中 破译 基因 功能 和 贡献 于 育种 程序 的 主要 途径 ， 如 前 面 农作物 品种 和 条 林 树 种 示例 。 致谢 感谢 我 们 在 Réseau I.N.R.A. Protéomes Végétaux 的 同事 帮助 收集 文献 和 丰富 讨 论 。 在 Pierroton (I.N.R.A.， 法 国 ) 森林 树种 的 工作 部 分 由 欧 kat A FAIR-CT9S- 0781 和 FAIR-CT98-3953 赞助 。 (SRA Haw tr) 参考 文献 Abe, T., Gusti, R.S., Ono, M. and Sasahara, T. (1996) Variations in glutelin and high molecular weight endosperm proteins among subspecies of rice (Oryza sativa L.) detected by two- dimensional gel electrophoresis. Genes Genet. Syst. 71: 63-68. Albernathy, R.H., Thiel, D.S., Petersen, N.S. and Helm, K. (1989) Thermotolerance is devel- opmentally dependent in germinating wheat seed. Plant Physiol. 89: 576-596. 一 一 一 -一 一 一 一 一 -一 ce 一 一 一 一 一 -一 - 240 ， 蛋白 质 组 学 Anderson，N.L. and Anderson，N.G. (1998) Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new world. Electrophoresis 19: 1853-1861. Anderson, L. and Seilhammer, J. (1997) A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis 18: 533-537. Anderson, N.G., Tollaksen, S.L., Pascoe, F.H. and Anderson, L. 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Electrophoresis 16: 1295-1300. 图 2.2 ”用 分 离 标签 区 分 的 两 个 mRNA 家 族 共 同 杂 交 后 的 典型 玻璃 微 阵列 ， 微 阵列 的 一 部 分 包含 与 来 源 于 无 血清 (Cy3) 和 血清 刺激 (CyS) 成 纤维 细胞 的 RNA 衍生 物 杂 交 的 人 cDNA。 (1) 黄 点 代表 两 个 样品 间 表 达 量 变化 不 大 的 基因 。(2 和 4) 在 血清 刺激 的 成 纤维 细胞 中 表达 丰 度 高 的 mRNAS 显 红 色 。(3) 在 无 血清 成 纤维 细胞 中 表达 丰 度 高 的 mRNAS 显 绿色 。( 了 Repririted with permission from lyer et al., The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum, Science, volume 283, copyright 1999 American Association for the Advancement of Sciences) . cpp23.1.3 | amex ie | AZ. 00 _ | Mp7ahi7Pz | [II 27481 58.1742] 二 加 从 序列 到 功能 | 2002 有 者 单位 | 借 者 姓名 | 借 出 日 期 | 还 > UL YLT. § HT | 4h & 2 oy: ‘ “Ri OD: 4 | Ear cae . ‘< Y y | POA NIN eee Se es 责任 编辑 : Se 王 静 m F 封面 设计 : 重 华 丽 生命 科学 编辑 部 联系 电话 : 010-64012501 http://www.lifescience.com.cn _email:info @lifescience.com.cn 1 C 全 国 高 技术 重点 图 书 , 生物 技术 领域 二 人 i lasiolpieis woe deeo ibe g eas 组 学 : 从 序列 到 功能 ) 集中 阐述 了 蛋白 质 组 学 的 最 新 进展 并 将 之 与 当前 基 FALL Be. ey ee 以 准确 而 通俗 的 风格 多 eA KOEI, 科研 人 员 和 研究 生 人 参考 HAH EH (Genomes) T. A. Brown, ERI, 周 严 、 强 伯 勤 过 = 科学 出 版 社 2002 年 8 月 出 版 ， 定 价 : 4 元 本 书 以 清晰 而 简明 的 写作 风格 将 基因 组 学 的 新 观点 与 研究 : 统 方法 相 结合 ， 为 基因 组 作为 生命 蓝图 所 起 的 重要 作用 拓 全 书 从 三 个 方面 论述 了 基因 组 学 的 核心 主题 : 基因 组 的 研 : 组 的 功能 、 基 因 组 的 复制 和 进化 .全 书 采用 大 量 的 图 而 适合 各 层次 的 学 生 使 用 ， 是 一 本 必 备 的 现代 分 子 生物 学 教材 ISBN 7-03-010747-0 9"787030'107473 ISBN peak? Sy oan