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Proteomics:from Protein Sequence to Function

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现代 生物 技术 译 丛

从 序列 到 功能

(3)S. R. Pennington M. J. Dunn 等 著

钱 小 红 “等 译

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‘tea. we een Bw 让 2002

内 容 简 介

蛋白 质 鉴定 技术 的 发 展 与 基因 组 测序 计划 的 实施 与 相继 完成 , 使 蛋白 质 组 学 得 以 诞生 和 发 展 。 蛋 白质 组 学 是 在 基因 组 学 的 基础 上 研究 蛋白 质 的 表达 与 功能 的 科学 , 是 建立 在 从 cDNA 阵列 mRNA 表达 谱 的 基因 功能 分 析 , 基因 组 范围 的 酵母 双 杂 交 , 蛋白 质 与 蛋白 质 相 互 作 用 分 析 到 蛋白 质 表 达 \ 测 序 和 结构 分 析 等 诸多 不 同 实验 方法 相互 融合 基础 上 的 科学 。

本 书 着 重 探讨 如 下 内 容 : 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 相互 关系 ;mRNA 表达 谱 现行 的 研究 方法 ;蛋白 质 组 研究 方法 ,如 双向 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 、 蛋白 质 检 测 、 蛋 白质 鉴定 的 质谱 方法 、 蛋 白质 表达 定量 分 析 方 面 质谱 方法 与 图 像 分 析 方 法 的 进展 ;蛋白 质 组 研究 的 自动 化 ;蛋白 质 组 分 析 在 药物 开发 中 的 应 用 ; 鸣 菌 体 抗 体 在 蛋白 质 组 研究 中 的 应 用 ; 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 ; 蛋 白质 组 技术 体系 在 院 校 实 验 室 的 建立 ;和 蛋白质 组 学 应 用 于 植物 遗传 学 与 育 种 。

本 书 适用 于 高 等 院 校生 命 科 学 和 医学 专业 师 生 及 生物 技术 产业 研发 人

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Original edition published in English under the title of Proteomics : from Pro- tein Sequence to Function

©BIOS Scientific Publishers Limited, 2001

图 字 01-2002-1992

图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据

蛋白 质 组 学 :从 序列 到 功能 /( 英 ) 彭 宁 顿 (Pennington, S. R. ) 等 著 ; 钱 小 红 等 译 . 一 北京 :科学 出 版 社 ,2002.9

(现代 生物 技术 译 丛 )

ISBN 7-03-010747-0

1.8: 1.08%--@Ox#-- 0. ZAR HH W.QS51

中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2002) 第 060808 号

mee Be hh 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮 收 编码 :100717 http:// www.sciencep.com

im BL FOE hl 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销 2002 年 9 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 2002 年 9 月 第 一 次 印刷 ”印张 :16 3/4 播 页 :1

印 数 :1 一 3 000 字数 :363 000 定价 :45.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 , 我 社 负责 调 换 ( 新 欣 )

a ae ( 按 汉语 拼音 排序 )

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编者 名 单

Aebersold, Ruedi. Department of Molecular Biotechnology, University of Washing- ton, Box 357730, Seattle, WA 98195, USA

Blakemore, Steve. Genomics Unit, Glaxowellcome Medicine Research Centre, Gunnels Wood Road, Stevenage, SG] 2NY, UK

Cahill, Dolores J. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, D- 14195 Berlin-Dahlem, Germany

Cahill, Michael A. Department of Molecular Biology, Institute for Cell Biology, University of Tuebingen, Auf der Morgenstelle 15, Tuebingen, D-72076, Germany

Davison, Matthew. 13S28 Mereside, Alderley Park, Macclesfield, SK 104TG, UK

Dunn, Michael J. National Heart and Lung Institute, Imperial College of Science, Technology and Medicine, Heart Science Centre, Harefield Hospital, Harefield UB9 6JH, UK

Eickhoff, Holger. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany

Evers, Stefan. F. Hoffmann-La Roche Ltd, PRPI-D, Building 69/16, Basel, CH- 4070, Switzerland

Goodlett, David R. Department of Molecular Biotechnology, University of Washington, Box 357730, Seattle, WA 98195, USA

Gorg, Angelika. Technische Universitat Miinchen, Institut fiir Lebensmitteltechno- logie und Analytische Chemie, FG Protemik, D-85350 Freising, Weihenstephan, Germany

Gray, Christopher. F. Hoffmann-La Roche Ltd, PRPI-D, Building 69/16, Basel, CH-4070, Switzerland

Humphrey-Smith, Ian. Department of Microbiology, Centre for Proteome Research and Gene-Product Mapping, Suite G12, National Innovation Centre, Australian Technology Park, Eveleigh, NSW, Australia

James, Peter. Wallenberg Laboratory, Lund University, Lund, Sweden

Jenkins, Rosalind. Department of Human Anatomy and Cell Biology, New Medical School, Ashton Street, Liverpool L69 3GE, UK

Johnson, Kevin. The Science Park, Melbourne, Cambridge SG8 6JJ, UK

Keatinge, Lucy. Department of Biological Sciences, Division of Environmental and Life Sciences, Maquarie University, NSW 2109, Australia

Klose, Joachim. Humboldt-Universitat, Charité, Virchow-Klinikum, Institiit fiir Humangenetik, Augustenburger Platz, 13353 Berlin, Germany

Lehrach, Hans. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, [hnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany

蛋白 质 组 学

Lopez, Mary. 22 Alpha Road, Chelmsford, MA 01824-4, USA

Nordheim, Alfred. Department of Molecular Biology, Institute for Cell Biology, University of Tuebingen, Auf der Morgenstelle 15, Tuebingen, D-72076, Germany

Nordhoff, Eckhard. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany

O’Brien, John. Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, Berlin, D-14195, Germany

Oswald, Helmut. German Heart Institute, Augustenburger Platz, Berlin, D-13353, Germany

Packer, Nicolle H. Proteome Systems Ltd, 1/3541 Waterloo Road, North Ryde, Sydney, NSW 2113, Australia.

Patterson, Scott D. Amgen Inc., Amgen Centre, MS 14-2-E, One Amgen Centre Drive, Thousand Oaks, California, CA 91320-1789, USA

Patton, Wayne F. Molecular Probes Inc., 4849 Pitchford Avenue, Eugene, OR 97402, USA

Pennington, Stephen R. Department of Human Anatomy & Cell Biology, New Medical School, University of Liverpool, Liverpool L69 3GE, UK

Pleissner, Klaus-Peter. Institute for Plant Genetics and Crop Plant Research, Corrensstr 3, Gatersleben, D-06466, Germany

Plomion, Christophe. Laboratoire de Génétique et Amélioration des Arbres Forest- iers, INRA, France

Pritchard, Kevin. Cambridge Antibody Technology Ltd, The Science Park, Mel- bourne, Cambridge SG8 6JJ, UK

Quadroni, Manfredo. Institute of Biochemistry, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland

Thiellement, Herve. Department de Biologie Vegetale, Universite de Geneve, 3 Place de l'Universite, Geneve 4, CH-1211, Switzerland

Trower, Michael K. Genomics Unit, Medicines Research Centre, Gunnels Wood Road, Stevenage SG] 2NY, UK

Valge-Archer, Viia. Cambridge Antibody Technology Ltd, The Science Park, Melbourne, Cambridge SG8 6JJ, UK

Wallace, Don M. Medicines Research Centre, Glaxo Wellcome Research and Development, Stevenage SG1 2NY, UK

Wegner, Susan. German Heart Institute, Augustenberger Platz 1, Berlin, D-13353, Germany ;

Wilkins, Marc. Proteome Systems Ltd, Locked Bag 2073, North Ryde, Sydney, NSW 1670, Australia

Zivy, Michel. Station de Génétique Vegetale, Gif-sur-Yvette, France

前 ,， 言

蛋白 质 鉴 定 技术 的 发 展 与 基因 组 测序 计划 的 实施 与 相继 完成 , 使 得 “蛋白质 组 学 ” 这 一 全 新 的 研究 领域 得 以 诞生 和 发 展 。 蛋 白质 组 学 是 在 基因 组 学 的 基础 上 研究 蛋白 质 的 表达 与 功能 的 科学 ,是 建立 在 从 cDNA 阵列 mRNA 表达 谱 的 基因 功能 分 析 , 基因 组 范围 的 酵母 双 杂 交 , 蛋白 质 与 蛋白 质 相 互 作用 分 析 到 蛋白 质 表达 测序 和 结构 分 析 等 诸多 不 同 实验 方法 相互 融合 基础 上 的 科学 。 《蛋白 质 组 学 :从 序列 到 功能 一 书包 含 了 多 方面 的 内 容 。 主 要 介绍 了 用 于 和 蛋白质 表 达 谱 分 析 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 , 用 于 蛋白 质 识 别 与 鉴定 的 质谱 技术 以 及 相关 的 信 息 学 。 本 书 的 作者 包括 了 本 领域 的 诸多 领衔 级 人 物 , 其 中 包括 在 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 的 发 展 , 蛋白 质 的 检测 , 凝 胶 图 像 分 析 , 蛋 日 质 的 质谱 分 析 , 噬菌体 展示 抗体 技术 的 产生 与 应 用 以 及 这 些 方法 的 整合 及 其 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 中 起 过 关键 作用 的 科学 家 。 本 书 力图 作为 对 蛋白 质 组 学 研究 感 兴趣 的 人 们 的 一 本 指导 书 ,包括 初学 者 和 有 实际 经 验 的 人 。 本 书 从 两 个 重要 的 篇 章 开 始 , 第 一 章 介 绍 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 相互 关系 , 第 二 章 描述 mRNA 表达 谱 现行 的 研究 方法 。 建 立 在 从 蛋白 质 组 研究 获得 的 信息 与 从 DNA 研究 获得 的 信息 相互 整合 基础 上 的 这 两 章 , 为 接 下 来 有 关 蛋 白质 组 研究 方法 描述 的 几 章 提供 了 必需 的 平台 。 有 关 有 蛋白 质 组 研究 方法 的 几 章 包括 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 、 蛋 白质 检 测 、 蛋 折 质 鉴定 的 质谱 方法 、 蛋 白质 表达 定量 分 析 方 面 质谱 方法 与 图 像 分 析 方 法 的 进展 。 现行 的 蛋 白 质 组 研究 方法 基本 上 还 是 费时 、 费 力 的 ,其 产生 的 数据 达到 了 必须 采用 计算 机 软件 进行 处 理 的 规模 。 因 而 , 接 下 来 两 章 的 主题 是 关于 蛋白 质 组 研究 自动 化 的 问题 。 尽 管 二 维 凝 胶 电 泳 是 目前 最 有 力 的 分 析 简 单 或 复杂 生物 体 蛋白 质 表 达 谱 的 平台 , 但 它 也 确 实 有 局 限 性 , 接 下 来 的 一 章 即 是 有 关 其 他 洪 在 分 离 方法 的 介绍 。 最 后 几 章 分 别 是 关于 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 中 的 应 用 、 叹 菌 体 抗体 在 蛋白 质 组 研究 中 的 应 用 、 糖 生物 学 与 蛋白 RAS 、 蛋 白质 组 技术 体系 在 学 院 实验 室 的 建立 以 及 蛋白 质 组 学 用 于 植物 遗传 学 与 育种 。 — 诸多 人 的 帮助 使 得 本 书 得 以 完成 。 我 们 真诚 地 感谢 他 们 。 我 们 也 感谢 所 有 的 作者 ， 感谢 他 们 的 兴趣 与 热情 。 我 们 特别 感谢 Scott Patterson, Mare Wilkins 和 Peter James, 他 们 为 本 书 提供 了 无 价 的 指导 和 和 帮助。 我 们 也 感谢 BIOS 的 全 体 人 员 以 及 那些 为 我 们 提供 “Fe Bh” FRA AT, 包括 Jenni Brown, Lisa Crimmins 和 Jane Hamlett.

(Rose #)

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2: Sha SOR eI i PCR rors 罕 核 董 酸 指 BH SCAE UR 2.1 ode Tes see cee ces cee sce ceeces ces cescesssscssscccccosesseesccssessssccsecs Q 2.2 FRILL DEH, Fy Be EE ED AE vec ee ee ce cece eee cee cee eee 10 2.3 实验 室 自动 化 和 高 密度 阵列 的 新 进展 pp | 2.4 文库 归 一 化 和 用 守 核 苷 酸 指纹 产生 Unigene 套 pp 12 2.5 通过 在 DNA 微 阵列 上 的 复杂 杂交 获得 不 同 的 差异 表达 谱 pp 12 2.6 自动 化 图 像 分 析 - ad gin a's scones 42

=. es ‘DNA 228 CRE REINS Hee Sur FR aes Ee Re eRe AA ees © 本 ie

4. 通过 高 分 辨 二 维 电泳 (2- DE) 些 定 特定 缅 隐 半 型 或 组 织 在 特定 时 间 的 蛋白

iat oi 4.2 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (2-DE) pp 16 4.3 ”联合 的 2-DE 数 据 库 pp 17 4.4 Suara showin 本 第 二 * 基因 表达 的 检 ee peatehaigumermnnre euecitye--cceook ome tae

3

4,

2.2 RARE -

不 基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法 … 3.1 基于 序列 测定 的 方法 学

Se eer eee POR DEE PCR) rss neo

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第 三 章 . 引言 | eR TERRE ES . . 148 pH #2 (immobilized pH gradient, es 1 . 样品 制备 :… NA 二

请 LN 王

8. 9. 10. 分 辨 雍 ERROR . 展望 .pp

Ramat ARR EE K-

4.2 组 织 样 品 4.3 细胞 cer ece cee cee eee ees 4.4 样品 分 级

站 aS eee ApH EPRICE wih IPG) ;

7.1 IPG BRA -

7.3 加 样 和 运行 ……

7 at IPG TER pH 梯度 的 选择 oo

LAE 2. ee oe —# SDS-PAGE

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4.

引言 有 机 染料 和 银 染 2.1 有 机 染料

2.2 FRYE oo ovvi evb…eoi cen ces cee cseeeeseeweesensen senses seeceseeeuee ans ses nes oen sen eue TAL YL cee ete cee eee eee cee eee eee ences eee ee eee nent ee eee eee tee eee aen tee eee nee see eee aee see eee tee eee 3.1 FEIRBER YER cere ee cee cee cee cee cen tence eee aeeene ees ens cee cee saeco sense eceuee nes ens 3.2 PEDRO YUL cee cee cee cee see ee cee eee ene ces ce cen cen cen cen sen ece ase ueeeesees ens eae see 胶体 扩散 染料 pp 4.1 印度 墨水 染料 ee

= A Ras

27 28 29 32 34 35 38 38 38 39 39 39 40 40 40 41 41 42 42 42 43 45 48 50 50 50 51 51 52 55 55 56 56 57 58 58 59 59 59

5.1 Oo. ee

5.2 非 共 价 结合 荧光 轩 cee cee cee cee cee eee cee cee eee eee eens eee eae aee ees saeaee ces eee eeeees eS Lee ee ert Ske eee Ste fe ee ae

6.2 1 eee 结论 … cles

第 五 章 ae

1. 引言 …… 1.1 蛋白 质 鉴定 途径 -

wuxieoetee «on SBGL PERE BEI 0 dha fe ane

2.1 MALDI-MS 2.2 ESILLMS .………'………. 3. 以 质谱 为 基础 的 相关 鉴定 策略 …

zeit 肽 质量 检索 (peptide- mass searching) ‘*c***tt ttt ttt sts cse see tte cee ceeeee cee cee cee ene

3.2 未 解析 碎片 离子 的 检索 cee cee cee cee eee

4. 用 质谱 数据 对 肽 段 从 头 测序 (ce novo ee

5. 磷酸 化 位 点 分 析 的 各 种 方法 …

OR. ek Yap eS 1 eee eee

6. 目前 及 将 来 面临 的 机 遇 和 挑战 … 参考 文献 - mee

第 六 章 =H ROOST 1. 介绍 …

tN

. 数字 化 图 像 加 工 … BURR ARIA HE . 凝 胶 配 比 …

oo ~ 下 Wi & W

本 Bt: 获取 图 像 设 备 oe cee coe one cee wae oe cee wee eee ook tee ee ee tee oes wee eee eee eee eee eee eee eee

ie i ee ee ae TR RG one os nw cence nn oo Sp EERE Cre Te ah FUP Mille bek Sees eb ee Eo fle dit == + aa 有

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8.2 比较 网 上 分 布 的 2-DE RHE - 9. 结论 … 参考 文献 -

第 七 章 RRS EES 稳定 同位 素 标 记 的 影响 … 0

a

1. 前 言 …

2. 样品 制备 …

3. 二 维 凝 胶 分 离 和 分 析 pe 304 Both — 4 WB ER Bk (2-DE-PAGE) Cee cee eee cee cee toe es eee eee eee ees ves

3.2 蛋白 质 的 扫描 检测 和 定量

3.3 ”通过 稳定 同位 素 标记 定量 2-.DE 凝 胶 中 的 蛋白 质 ee

3.4 2-DE 雍 胶 和 蛋白 点 的 分 离 ， 3.5 蛋白 质 酶 解 / 碎 裂 4. 质谱 :使 用 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 -

4.1 质量 指纹 肽 谱 soseoseoeosoeoeoooseoooeeososoeeoeooooeoovosoooeossosooeooeoeoeoeooeoosssoessnsses

4.2 小 序列 标签 多 肽 指纹 谱 5. 质谱 :使 用 串联 质谱 数据 鉴别 蛋白 质

S53 .: 自 ALARA. 5.4 数据 解释 工具 … 参考 文献 -

第 八 章 爱 白 质 组 学 的 自动 化 高 通 量 自白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径

1. 历史 回顾 …

"2 Aa I aes aint e/a ie sale

2. ZAM 18-85 8 ah; HER UR

2.1 2-DE 胶 的 自动 化 …

2 eae AEE EL HEIR TR ev capes concep raz enncenmen ste veseedaes + p00 SRE a 3.3 AFIS REBT coe ee cee cee scence cence nee eee cee cee seu ces aoe sen ees seecne ees cen edetes

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第 九 章 wa. 自动 化 蛋白质 组 分 析 的 完整 途径 7: 引言 ……………:

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oes cee cee 124

126 128 128 128 129 130 130 131 132 133 134

138 138 138 139 139 140 140 143 144 145 148 149 149 150 155 155

2. 二 维 电 泳 结 合 质谱 :蛋白质 组 的 典型 范例 ? 3 自动 化 概 准 ewes card Wagan 4. 二 维 凝 胶 电 泳 的 显 色 cee eee eee eee teres 4.1 二 维 凝 胶 4.2 富 集 和 分 部 收集 技术 cee cee ee eee eee 4.3 BRERA 4.4 自动 染色

6.1 斑点 切取

7. 质谱 的 接口 策略 …

8. 机 器 人 模块 ,图 像 分 析 软 件 和 信息 数据 库 之 间 的 链接 ppp

结论 … sn 第 十 章 爱 折 所 表达 分 析 新 方法 . 引言 yess eR HEE

WN KF

. 除 二 维 凝 胶 电 泳 以 外 的 蛋白 质 表 达 分 析 方 法 … 4.1 依赖 于 分 离 的 方法 4.2 TREO OES I 3 “A aS Fr”

5. Aim

参考 文献 -

第 十 一 章 到 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 训 理 学 中 的 应 用 1. 引言

i aia, Mid bee edie

2.1 比较 分 析 2.2 生物 标志 物 蛋白 质 的 检测 2.3 详细 的 基因 表达 调控 分 析

Oe Wee 4 = Psi]: cs. EEE Ca eee See ee

结论 与 展望 … 文献

i. 本质 组 学 方法

中 抗体 是 蛋白 质 特 异 分 子 探 针 的 合理 选择 Oe oes coe cee coe oes ee cee eee cee tes cee cee ces

1.3 ”关键 技术 概观 …

. 蛋白 质 组 分 析 : 基 于 2-DE 的 战略 …

164 164 164

170

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vite ° ) 蛋白 质 组 学

2.1 ia 股 在 噬菌体 上 的 展示 … 本 2.4 «chit aria lgo | 2 7 JET MR et PT 性 抗体 . wspaiaasianaaousnaaooieeana sndiodeeteb thas # IE 3. 有 际 恒 人 季 洒 BOADIW 大 汪汪 3.2 .采用 生 禾 信息 学 方法 了 解 EST HORE cece ctece cee ncewereccteraceceeseesesegeaneces 995 3.4 Ae ee ee see secsccleaeisine cate Slond okiieetives BTID 3.5 ”高通 量 的 ICC 分析 . oa 3.6 生物 信息 学 和 3.7 ”ProAbIM 计 划 的 应 用 实例 … MM ee eee re 4. 轻 菌 体 抗体 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 一 ProxiMolTM 技 术 esi 199 4.1 常规 的 选择 抗 膜 蛋 自 的 噬菌体 抗体 pp 4 ProNMol 方 法 及 应 用 ， 本 二 二 4.4 “ProxiMolIM 方 法 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 应 03 2.2 0 -连接 结构 pp 207 2.3 pl neo allan 和 人 WM ee) aa CAP tat eee eee oe es tee Abs oe ea wie nae eager oo DP)

目 录

2、 为 什么 不 在 学 术 环 境 审 进行 蛋 和 音质 组 研 宅 2? cwn ene eee eee cee cee cece enn ens ceeeee aes 3. 为 什么 要 在 学 术 环 壕 捉 进行 蛋白 质 组 研究 ? cee eee eee cee cee cee ece eee een cee cee cneens « zy - ee

3.1 大 学 能 和 否 承担 得 起 蛋白 质 组 的 研究 经 费 ? 3.2 如果 没 有 学 术 机 构 , 企业 能 承担 蛋白 质 组 学 研究 吗 ?

3.3 目前 蛋白 质 组 学 的 研究 尚 不 健全 吗 ? 某 些 人 看 到 局 限 性 eee eee reece eee 3.4 学 术 机 构 的 蛋白 质 组 学 研究 对 企业 是 有 益 的 …………………………… oo 4.1 ACPA ALA ULAR A I, LMP ARIE oon - 225 - 226

4.2 大 学 愿意 与 临床 样本 接近 4.3 大 学 不 仅 研究 医学 应 用

4.5 大 学 培养 学 生 …

6. 结论 … 参考 文献 .

第 十 五 章 fetta AT ANKE MES. ste eee eee eee eeeeeeeeeeeeees JQIQ

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220 220

Bee 225 225 pM

226

5 ELF BIR pin) =) bi A I a MGS Go 4 Se Rae 5

226

Be 4 ~ ao

2.1 PPPS AU PRIA AU RIS RE RR cee eee ee cee cee ccc cee cence nce c ee cee cen ece nee cee ces senses ees 2.2 品种 .品系 和 栽培 品种 酌 区 别 nee eee ee cee cee cee nee cee cee een cen see cence nee cee nee ens - 232 omer AF

3. 基因 组 的 表达 … 3.1 突变 特征 3.2 ”器官 和 发 育 阶 段 的 变异 性

4. 遗传 作 图 和 候选 蛋白 ………………………. 4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白 -

5. 方法 学 进展 和 植物 蛋白 数据 库 … 6. 总 结 、 前景 展 望 .

230 230 ye

3 . 944 a ASE ahaa a Fas fag Sie EA fle aes A ha 000 Sewas noe pundn digas cde see daainwn ann asderess

233

20 BE ide RES HE LE] 804 abe not cor aun adnnntalnlcudnads asmens one soamayinte von var events * 236 - 238

25

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239

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‘bonis sce oo ic

j + ed | 人 yi vig of z i 四

Cam

CCD camera

CDNA CE

abscissic acid amplified fragment length polymorphism 1-anilino-8-napthalene sulphonate

Australian Proteome Analysis Facility

ABA/ water stress/ripening related protein

bis(8-toluidino-1-naphthalene sultonate)

basic local alignment search tool

bovine serum albumin

collision-activated dissociation

Chloramphenical

charge-coupled device camera

complementary DNA

capillary electrophoresis

candidate gene

3 [ (cholamidopropy]) dimethylammonio ]-1- propane sulphonate

collision-induced dissociation

candidate protein

Chinese spring

cerebrospinal fluid

cyclosporine A

capillary zone electrophoresis

expressed sequence tag database

differential display PCR

one-dimensional polyacrylmide gel elec- trophoresis

two-dimensional polyacrylmide gel elec- trophoresis

dihydrofolate reductase

differential gene expression

two-dimensional phosphopeptide

脱落 酸

扩 增 片段 长 度 多 态 性

1 - 葵 胺 基 - 8 - 蔡 快 磺 酸 酯

澳大利亚 蛋白 质 组 分 析 实 验 室

脱落 酸 / 水 分 胁迫 / 催 熟 相关 A

(8 -甲苯 氨基 - 1 - 蔡 磺 酸 盐 )

基本 的 碱 基 配 对 搜索 软件 牛 血 清白 蛋白

碰撞 活化 解 离

ABA

电荷 耦合 照相 装置

互补 DNA

毛细 管 电泳

候选 基因

3-[(3 - 胆 酰 胺 两 基 )- 二 乙 胺 ]- 丙 磺 酸

碰撞 诱导 解 离

候选 蛋白

中 国 春 (小 麦 品种 ) 脑 将 液

a fee A

毛细 管区 带电 泳 表达 序列 标签 数据 库 差异 显示 PCR

一 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳

AER DA es PE HC OE IBS aK = BU BRIE

基因 表达 差异 二 维 磷酸 肽 作 图

FSH

HCl HIS-tagged HIV mre HRP HSP HUVEC ICAT ICE

ICE

ICL,

IEF

IgG IMAC IMAGE

IMS IEF IPG

N, N-dimethyl acrylamide

deoxyribonucleic acid

database spot number

dithiothreitol

ethylenediaminetetraacetic acid

enzyme-linked immunosorbant assay

electrospray ionization

expressed sequence tags

fluorescence-activated cell sorter

fluorescein isothiocyante

formyl peptide receptor

follicle stimulatiting hormome

fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry

fusidic acid

full-width half maximum

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

glycosyl phosphatidylinositol

human chorionic gonadotrophin

hydrochloric acid

histidine-tagged

human immunodeficiency virus

high performance liquid chromatography

horseradish peroxidase

heat shock protein

human umbilical vein endotheilial cells

isotope-coded affinity tagging

immunocytochemistry

interleukin converting enzyme

instrument control language

isoelectric focusing

immunoglobulin G

immobilized metal affinity chromatography

integrated molecular analysis of genomes and their expression

ion mobility spectrometry

isoelectric point

immobilized pH gradiednt

蛋白 质 组 学

N,N -— ER i EH 脱氧 核糖 核酸 数据 库 中 点 数目 二 硫 苏 糖 醇

乙 二 胺 四 乙酸

酶 联 免 疫 吸附 测定

FE, Mig Se FEL Peg

表达 序列 标签 荧光 激活 细胞 分 离 器 异 硫 氰 酸 荧 光 素 甲 酰 肽 受 体

卵泡 刺激 素

傅 里 叶 变换 离子 回旋 共振 质 谱

PR EAR

半 峰 宽

foe EY YH BS Ab 糖 基础 酯 酰 肌 醇

人 绒毛 膜 促 性 腺 激素 盐酸

组 氛 酸 标签

人 类 免疫 缺陷 病毒 高 效 液 相 色谱

辩 根 过 氧 (化 ) 物 酶 热 激 蛋 白 , AK EA 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 同位 素 编码 亲 和 标 签 免疫 细胞 化 学 白细胞 介 素 转换 酶 仪器 控制 语言

等 电 聚 焦 PERE A G

fl +H eee aR 基因 组 及 其 表达 产物 综合 分 析

离子 迁移 谱

等 电 点

固 相 pH 梯度

缩 略语

IPG-DALT

IPTG

IR

IRMPD

ivy

Kan

KCl

LC

LCM LC-MS/MS

LEA LE LIMS LMW LOG m / 之

MALDI-TOF

mRNA MS MS/MS NCBI

NEPHGE NP-40 OD

PBS

P/A PAGE PCR

*xv°

2-D with immobilized pH gradients in the first dimension

isopropyl-8-D-thiogalactopyranoside,

infrared

infrared multiphoton dissociation

ion trap

kanamycin

potassium chloride

liquid chromatography

laser capture microdissection

liquid chromatography tandem mass _ spec- trometry

late embryogenesis-abundant

luteinising hormone

laboratory information management

low molecular weight

Laplacian of Gaussian

mass-to-charge ratio

matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight

mitogen-activated protein

2-methoxy-2, 4-diphenyl-3(2H) furanone

acetonitrile

molecularly imprinted polymer

minimal protein identifier

relative molecular mass

message RNA

mass spectrometry

tandem mass spectrometry

National Center for Biotechnology Informa- tion

non-equilibrium pH gradient electrophoresis

Nonidet P40

optical density

phosphate buffered saline

presence/absence

polyacrylamide gel electrophoresis

polymerase chain reaction

固 相 pH 梯度 为 第 一 向 的 二 维 凝 胶 电 沪

Fe A Ee Gat CAE AL BE

红外

红外 多 光子 解 离

a TBF

BABS HR

氯 化 钾

液 相 色谱

激光 俘获 微 切割

液 相 色谱 -串联 质谱 联 用

胚胎 形成 晚期 丰富 蛋白

黄体 激素

实验 室 信息 管理

低 分 子 质量

高 斯 拉 普 拉 斯

质 核 比

基质 辅助 激光 解吸 飞行 时 间 质谱

有 丝 分 裂 激 活 蛋 白

2- 有 甲 氧 基 - 2, 4 -二 苯 基 啤 OR

Zia

分 子 印记 聚合 物

最 小 蛋白 鉴定 量

相对 分 子 质量

信使 RNA

质谱

串联 质谱

全 美 生物 技术 信息 中 心

非 平 衡 pH 梯度 电泳 非 离子 去 垢 剂 瓦 40 光 密 度 值 磷酸 盐 缓冲 溶液 存在 /缺乏 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 聚合 酶 链 反应 |

RF RFLP rHu G-CSF

RNA RP-HPLC

RT-PCR

SAGE SAM

SB

SCA

scFv

SCX

SDS SDS-PAGE

SELDI SIM

piperazine diacrylamide

parts per million

protein quantity loci

position shift

postsource decay

polyvinylidene difluoride

quartz crystal microbalance

quantitative trait loci

random amplified polymorphic DNA

relative collision energy

radio frequency

restriction fragment length polymorphism

human granulocyte colony-stimulating fac- tors

ribonucleic acid

reversed-phase high performance liquid chromatography

reverse transcriptase polymerase chain reac- tion

serial analysis of gene expression

self-assembled monolayer

sulphobetaine

synthetic carrier ampholytes

single chain variable fragment

cation exchange

sodium dodecyl sulfate

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

eletrophoresis

surface-enhanced laser desorption/ionization

selected ion monitoring

candidate protein

surface plasmon resonance

standard spot number

streptomycin

tributyl phosphine

trichloroacteic acid

triethylamine

N,N,N’, N’-tetramethylethylenediamene

A We A

二 酰基 哌 嗪 百 万 分 之 几

蛋白质 数量 位 点

位 置 迁 移

源 后 裂解

聚 偏 二 氟 乙 烯

石英 结晶 微 平衡 数量 性 状 遗 传 位 点 随机 扩 增 DNA 多 态 性 相对 碰撞 能 量

射频

限制 性 酶 切片 段 长 度 多 态 性 人 粒 细胞 集落 刺激 因子

核糖 核酸 反 相 高 效 液 相 色谱

反 转 录 酶 聚合 酶 链 反应

基因 表达 系列 分 析

自 组 装 单 层 物

磺 基 三 甲 铵 乙 内 酯 合成 载体 两 性 电解 质

单 链 片段 多 样 性

阳离子 交换

十 二 烷 基 硫酸 钠

十 二 烷 基 硫酸 钠 - 聚 丙烯 栈 Fic BE WBS HE, DK

表面 增强 激光 解吸 离子 化

选择 性 离子 检测

候选 蛋白 表面 等 离子 体 共 振 标准 点 数目

SESE

= JT BG

三 氯 乙 酸

=Z28K N,N,N’, N -四 四 其 局 二 胺

缩 略语

Tet TFA TGF THF TIC TIGR TLE ™ Tmp TNF TQ tRNA UV VCAM WST WWw ZP

tetracycline

trifluroracetic acid transforming growth factor tetrahydrofuran

total ion count

The Institute of Genomics Research

thin-layer chromatography transmembrane

trimethoprim

tumor necrosis factor

triple quadrupole

transfer RNA

ultraviolet

vascular cell adhesion molecule watershed transformation World Wide Web

zona pellucida

sa XVil °

四 环 素

=H ZR

转化 生长 因子 PY AK

总 离子 数 基因 组 学 研究 所 WE fis

BS

=F SK mee 肿瘤 坏死 因子 三 级 四 极 杆 转运 RNA

紫外

血管 细胞 黏附 分 子 转化 分 界线

万 维 网

透明 带

( 杨 何 义 HF Rie 校 )

AT

te

概 述 有 蛋白质 组 学 迎接 后 基因 组 时 代 的 挑战

Stephen R. Pennington and Michael J. Dunn

蛋白 质 组 学 的 出 现 ， 为 我 们 进一步 了 解 整个 生物 体系 一 一 从 简单 的 单 细 胞 生物 到 复 杂 的 生物 体 (如 人 类 ) 提供 了 一 种 可 靠 的 方法 。 用 于 检测 蛋 日 表达 的 二 维 电泳 技术 (2- DE) 和 用 于 蛋白 质 鉴 定 的 质谱 技术 对 蛋白 质 组 学 的 产生 起 了 至 关 重 要 的 作用 。 而 对 这 一 领域 越 来 越 多 的 关注 加 速 了 对 全 基因 组 蛋 日 质 表 达 以 及 功能 分 析 方 法 的 不 断 改进 与 完 善 。

蛋白 质 组 学 的 诞生 实质 上 是 依赖 于 基因 组 测序 计划 的 成 功 ， 该 计划 虽 未 对 揭示 生物 体 的 本 质 提供 更 多 的 信息 ， 但 是 它 为 更 加 广泛 而 有 效 的 实验 方法 的 产生 提供 了 基本 的 平 台 ， 而 这 些 实验 方法 将 为 鉴定 基因 组 编码 的 基因 ， 并 最 终 理解 这 些 基 因 产 物 在 生命 活动 中 的 调控 作用 提供 支撑 。 显 然 ， 基 因 组 学 与 蛋白 组 学 的 相互 协调 发 展 将 为 生物 学 家 提供 最 好 的 帮助 。

整个 基因 组 测序 计划 的 成 功 既 令 人 瞩目 又 令 人 兴 香 。1995 年 首次 公布 了 第 一 个 非 寄生 生物 的 全 基因 组 序列 (Fleischmann et wz .，1995)， 而 到 2000 年 7 月 ， 在 公共 数据 库 中 已 经 有 40 个 生物 体 的 全 基因 组 序列 ， 另 外 还 有 127 个 原核 生物 和 95 个 真 核 生 物 的 序列 正在 分 析 中 [ wit. integratedgenomics. com /GOLD/]. 74Hit, AKERADA 5、16、19、21、22 号 染色 体 的 测序 已 经 完成 ， 人 类 基因 组 的 精确 图 谱 预 期 在 2003 年 公布 。 上 述 的 成 就 可 能 开始 对 医学 诊断 产生 影响 ， 一 个 多 国 合作 用 来 建立 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 图 谱 的 计划 已 经 启动 ( 见 表 1 的 网 址 )。 已 完成 全 基因 组 测序 的 生物 体 数 目 正 以 加 速度 持续 增加 ， 公 众 对 数据 库 、 搜 索 工 具 和 相关 电子 信息 资源 的 访问 达到 空前 的 规模 (WLR 1)。 而 这 种 对 序列 信息 的 利用 在 十 年 前 几乎 是 不 可 想像 的 。 例 如 ， 比 较 基 因 组 学 通过 对 某 一 特定 生物 的 全 基因 序列 与 其 他 所 有 生物 的 基因 组 序列 进行 比较 ， 来 鉴 定 两 者 之 间 的 差异 ， 从 而 解释 某 些 特定 和 重要 的 功能 ， 如 病原 性 。 而 结构 基因 组 学 这 一 轩 新 领域 是 通过 X 射线 晶体 衍射 、 核 磁 共 振 和 其 他 方法 来 确定 蛋白 质 的 结构 ， 并 将 结 构 与 基因 的 序列 和 功能 相关 联 。 另 外 ， 基 因 组 测序 及 其 相关 计划 已 经 产生 了 mRNA 表 达 、 转 录 组 学 分 析 的 新 策略 〈( 见 第 二 章 ) (Chee et al., 1996; Eisen et al., 1998; Ger- hold et al., 1999) 以 及 利用 酵母 双 杂 交 分 析 检 测 蛋 白 之 间 相 互 作 用 的 方法 (Fields and Song, 1989; Fromont-Racine et al., 1997; Lecrenier et wd .，1998)。 值 得 注意 的 是 ， 用 于 高 通 量 mRNA 表达 分 析 (这 种 分 析 有 时 是 在 基因 组 规模 上 ) 的 DNA 芯片 和 微 阵列 技 术 对 基因 功能 的 研究 产生 了 显著 的 影响 (Hughes et al., 2000; Young et al., 2000). 微 阵 列 技术 的 不 断 改 进 已 经 使 获取 基因 序列 信息 和 差异 基因 表达 数据 的 速度 大 大 加 快 (Bowtell et al., 1999; Young et al .，2000)。 总 之 ， 这 些 方法 很 可 能 使 人 类 能 识别 和 鉴 定 生物 体 的 各 种 属性 (包括 需 要 的 和 不 需要 的 )。

网 址

ensemble. ebi. ac. uk

genome. wustl. edu/gsc/ www. hgmp. mre. ac. uk/ www. hgsc. bem. tmc. edu/ wit. integratedgenomi cs. com/ GOLD

www. jgi. doe. gov/

Star. scl. genome. ad. jp/

kegg

www. ornl. gov/hgmis/

www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/

seq/

www. sanger. ac. uk/

www. tigr. org/tdb/ snp. cshl. org

www-genome. wi. mit. edu/

#1 机 构

德国 海德 堡 的 欧洲 分 子 生物 学 实验 室 英国 剑桥 桑 格 中 心

美国 圣路易斯 华盛顿 大 学 医学 院 , 基因 组 测序 中 心

人 类 基因 组 图 谱 项 目 资源 中 心 ， 英国 剑桥 Wellcome Trust 基因 组 中 心

美国 得 克 萨 斯 州 休斯敦 Baylor 医学 院 ， 人 类 基因 组 测序 中 心

美国 , 伊利 诺 伊 州 芝加哥 联合 基因 组 公

司

美国 加 利 福 尼 亚 州 Walnut Creek 基因 组 共同 体 研 究 所

日 本 东京 大 学 化 学 研究 所 , 东京 基因 和 与 基因 组 研究 中 心

美国 田纳西 州 Oak Ridge 国家 实验 室 ， 能 源 部 生命 科学 院

美国 马里 兰州 贝斯 达 NIH, 国立 生物 技 术 信 息 中 心

桑 格 中 心 , 英国 剑桥 Wellcome Trust 基 因 组 研究 中 心

美国 马里 兰州 Rockville, 基因 组 研究 所

美国 纽约 州 冷 泉 港 ,冷泉 港 实验 室 ， SNP 有 限 公司

美国 马萨诸塞 州 剑桥 Whitehead 基因 组 研究 中 心

蛋白 质 组 学

基因 系列 数据 库 与 分 析 工 具 网 址

可 获 信息 人 类 小 鼠 \ 虫 基因 组 注释

人 类 、 模 式 生物 测序 计划 、EST 计划 、 操 作 流 程 和 技术 帮助

序列 数据 库 和 搜索 引擎 , 系统 发 生 连 锁 分 析 , 可 进行 友好 链接

KAA RW FIT, 人 类 转录 数 据 库

调控 全 部 基因 组 测序 计划 或 进展 、 链 接 相关 的 网 址 和 公共 数据 库

人 类 、 微 生物 测序 和 作 图 , 功能 基因 组 学 计划

序列 数据 库 和 分 子 相互 作用 的 相关 信 息

链接 相关 研究 进展 报告 公共 数据 库 及 会 议 , 特别 是 关于 人 类 基因 组 计划

序列 ,SNP 和 文献 数据 库 , 数据 分 析 工 具 , 人 小 鼠 的 遗传 和 物理 图 谱

有 关 人 类 基因 测序 计划 及 其 他 原核 、 真 核 生物 测序 计划 的 进展

有 关 微 生物 、 植 物 及 人 类 的 基因 序列 ， 功能 和 分 类 学 数据 库

人 类 基因 组 的 SNP 图 谱

有 关 人 类 、 小 鼠 \ 大 鼠 及 人 类 SNP 数据 库 的 遗传 和 物理 图 谱

应 用 于 转录 组 学 研究 的 cDNA 阵列 具有 下 列 几 个 重要 的 特征 : 对 复杂 体系 的 分 析 变 得 相对 容易 ; 反应 、 杂 交 和 扫描 可 以 自动 化 操作 ; 具备 可 用 于 结果 分 析 的 有 效 软件 。 更 重要 的 是 ， 一 旦 在 实验 条 件 下 mRNA 表达 发 生 改 变 ， 即 可 直接 采用 多 种 简便 的 分 子 生 物 学 工具 来 前 明 所 识别 基因 的 表达 和 功能 。 然 而 ， 这 种 方法 也 有 局 限 : OmRNA 的 丰 度 不 总 是 与 蛋白 的 丰 度 相 一 致 ， @ 现 有 的 检测 高 丰 度 mRNA 的 方法 ， 其 灵敏 性 和 动力 学 范围 不 适 于 检测 低 丰 度 的 mRNA (具有 编码 最 重要 的 调控 蛋白 的 潜力 ); 回 由 mRNA 所 编码 蛋白 活性 的 调控 并 不 取决 于 mRNA 或 蛋白 的 表达 水 平 ， 而 是 受 其 他 因素 的 调节 ， 例如 蛋白 的 亚 细 胞 定位 和 (或 ) 它们 进行 翻译 后 修饰 的 程度 ， 而 这 两 者 均 不 能 通过 mRNA 丰 度 的 测量 来 确定 。 此 外 ， 有 许多 重要 的 生物 标本 ， 特 别 是 那些 可 能 被 用 于 人 RAC Fm, WARM. WAM ALIAS A mRNA。 另 外 ， 对 人 体 活 组 织 和 己 体 解 剖 标 本 的 mRNA 表达 分 析 ， 始 终 受到 标本 采集 时 间 的 拖延 与 mRNA 降解 的 挑战 。

cDNA 阵列 的 应 用 还 有 其 他 的 局 限 。cDNA 阵列 可 被 用 于 基因 组 测序 已 完成 的 模式

概述

生物 ， 但 使 用 该 方法 构建 大 量 非 模式 生物 的 CDNA 阵列 的 可 行 性 还 存在 疑虑 。 有 一 些 生 物 ， 如 镶 状 闪 原 虫 ，cDNA 阵列 的 适用 性 还 有 待 于 确定 。 尽 管 存在 这 些 局 限 ，cDNA 阵 列 以 及 其 他 基于 DNA 序列 的 方法 在 基因 表达 和 功能 分 析 中 的 应 用 ， 即 所 谓 的 功能 基因 组 学 ， 仍 将 大 大 加 强 我 们 对 生物 体 的 了 解 (Alizadeh et al., 2000; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999).

显然 ， 应 用 基因 组 序列 数据 是 一 件 令 人 兴奋 的 事 。 然 而 ， 在 兴奋 之 余 ， 一 种 新 的 认 识 和 看 法 逐渐 产生 ， 即 这 种 以 DNA 序列 为 基础 的 方法 必须 以 直接 分 析 基 因 编 码 的 产 物 一 一 蛋白 质 作 为 补充 。 例 如 已 知 一 个 基因 组 的 序列 并 不 代表 可 以 识别 这 个 基因 组 所 编 码 的 蛋白 。 因 此 ， 尽 管 基因 组 序列 能 够 被 用 于 预测 可 读 框 ， 但 这 些 预测 通常 不 准确 。 同 样 ， 基 于 DNA 序列 数据 的 应 用 以 及 现存 的 有 关 DNA 序列 与 蛋白 质 功 能 关系 的 知识 ， 很 难 单 任 DNA 序列 信息 揭示 基因 编码 的 蛋白 质 的 功能 。 即 使 有 可 能 ， 确 定 每 个 基因 所 对 应 的 蛋白 质 的 数量 仍 是 很 困难 的 。DNA 序列 信息 也 不 能 说 明 蛋 白 质 的 翻译 后 修饰 。 一 个 蛋白 可 能 有 400 多 个 化 学 修饰 来 完成 其 功能 、 定 位 和 活性 。 因 此 ，DNA 序列 信息 在 帮助 我 们 了 解 一 个 基因 组 所 编码 的 全 部 蛋白 质 成 分 一 一 蛋白 质 组 方面 仍 有 明显 的 局 限 性 。 对 人 类 基因 组 来 说 ， 所 预测 的 50 000 一 100 000 个 基因 能 编码 多 达 250 000 ~ 500 000 个 蛋白 质 ， 因 此 所 面临 的 发 现 蛋白 质 的 工作 量 是 巨大 的 。 最 终 ， 和 蛋白 功能 的 揭示 需要 详 细 而 直接 地 分 析 基 因 组 编码 的 蛋白 质 的 表达 、 定 位 (组 织 、 细 胞 和 亚 细 胞 器 ) 和 结构 (Dove et al., 1999; Pennington et al., 1997; Wilkins et al., 1995).

由 于 蛋白 质 组 是 高 度 动 态 的 ， 因 此 很 难 对 它 进 行 定 义 。 一 方面 ， 可 以 认为 蛋白 质 组 学 是 对 基因 组 编码 的 所 有 和 蛋白质 的 鉴定 ; 另 一 方面 ， 可 以 认为 它 是 对 不 同 转录 条 件 下 蛋 和 白 表 达 变 化 的 复杂 分 析 。 在 很 多 方面 ， 基 因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 研究 的 策略 是 相同 的 ， 但 这 两 个 领域 的 研究 结果 确 有 很 大 的 差异 。 目 前 ， 还 没有 一 种 理想 的 方式 能 够 揭示 最 简单 生物 体 的 蛋白 质 组 ， 而 用 于 蛋白 质 表 达 比 较 分 析 的 方法 明显 落后 于 mRNA 表达 的 分 析 方法 。

目前 ， 许 多 研究 工作 的 起 点 是 通过 2-DE 对 复杂 混合 物 中 的 蛋白 质 进 行 分 离 来 观察 蛋 自 质 表 达 的 改变 ( 见 第 三 章 ) (Andersen and Andersen, 1996) 以 及 采用 强 有 力 的 阵列 分 析 方 法 进行 鉴定 ( 见 第 五 章 ) (Andersen et al., 1996; Eckerskorn et al., 1997; Figeys et al., 1998; Pappin et al., 1993; Roepstorff et al., 1997; Scheler et al., 1998; Yates et ol .，1998)。 近 年 来 在 蛋白 质 鉴 定 方面 的 进步 应 归功 于 基质 辅助 激光 解析 /电离 质谱 (MALDI) 和 电 喷 雾 质谱 (ESI) 分 别 应 用 于 肽 质量 指纹 谱 的 分 析 和 序列 分 析 〈( 见 第 五 章 和 七 章 ) (Andersen et al., 1996; Figeys et al., 1998; Pappin et al., 1993; Roepsrorff et al., 1997; Yates et al., 1998), 2-DE 能 同时 分 离 数 千 个 蛋白 〈(Klose 1999)， 尽 管 这 个 方法 本 身 存在 明显 的 局 限 性 〈 第 十 章 )， 但 它 在 构建 大 量 蛋白 质 的 表达 谱 并 用 于 蛋白 质 的 鉴定 方面 有 着 不 可 替代 的 作用 。

蛋 日 质 组 的 方法 已 应 用 于 后 基因 组 研究 ， 如 何 真正 达到 研究 目的 是 需要 解决 的 问 题 。 一 个 平台 技术 已 经 出 现 ， 即 2-DE， 但 它 仍 需要 不 断 的 完善 。 我 们 试图 通过 本 书 各 章 的 介绍 使 读者 对 现 有 方法 及 其 局 限 性 有 一 个 全 面 的 了 解 。 对 现 有 方法 以 及 在 蛋白 质 检 WW 〈 第 四 章 )、 图 像 分 析 〈 第 六 章 )， 定 量 质谱 (第 七 章 )，2-DE 与 蛋白 质 鉴 定 的 自动 化 (第 八 章 、 第 九 章 ) 以 及 与 信息 学 的 整合 (ALE) 方面 的 发 展 和 应 用 均 有 丰富 且 通 俗

。 4 ， 蛋白 质 组 学

易 懂 的 介绍 。 对 和 蛋白质 组 学 在 新 药 开 发 、 毒 理学 (第 十 一 章 )、 植 物 遗 传 学 〈 第 十 五 章 ) 中 的 应 用 以 及 和 蛋白质 组 学 与 糖 生物 学 (第 十 三 章 ) 也 进行 了 阐述 。 对 未 来 可 能 替代 2- DE (第 十 章 ) 的 方法 、 蛋 白质 组 平台 补充 技术 的 发 展 ， 如 鸣 菌 体 展 示 抗 体 技术 【第 十 三 章 ) 也 有 介绍 。

我 们 相信 ， 本 书 既 对 刚刚 涉足 蛋白 质 组 学 研究 领域 的 读者 会 有 所 帮助 ， 同 时 也 为 在 此 领域 已 积累 一 定 经 验 的 读者 进一步 了 解 重 白质 组 这 一 不 断 发 展 的 新 兴 领 域 提供 详细 而 有 价值 的 信息 。 为 此 ， 我 们 向 这 些 读者 表示 真挚 的 谢意 。

(万 晶 宏 译 钱 小 红 校 )

参考 文献

Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., et al. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503-511.

Andersen, J.S., Svensson, B. and Roepstorff, P. (1996) Electrospray ionization and matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Powerful analytical tools in recombinant protein chemistry. Nature Biotechnol. 14: 449-457.

Anderson, N.G. and Anderson, N.L. (1996) Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis 17: 443-453.

Bowtell, D.D.L. (1999) Options available — from start to finish — for obtaining expression data by microarray. Nature Genet. 21: 25-32.

Chee, M., Yang, R., Hubbell, E., et a/. (1996) Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 274: 610-614.

DeRisi, J., Penland, L., Brown, P.O., Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A. and Trent, J.M. (1996) Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genet. 14: 457-460.

Dove, A. (1999) Proteomics: translating genomics into products? Nature Biotechnol. 17: 233-236.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Schleuder, D., Hochstrasser, D., Sanchez, J.C., Lottspeich, F. and Hillenkamp, F. (1997) Analysis of proteins by direct scanning infrared-MALDI mass spectro- metry after 2D PAGE separation and electroblotting. Anal. Chem. 69: 2888-2892.

Eisen, M.B., Spellman, P.T., Brown, P.O. and Botstein, D. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14 863-14 868.

Fields, S. and Song, O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340: 245-246.

Figeys, D., Gygi, S.P., Zhang, Y., Watts, J., Gu, M. and Aebersold, R. (1998) Electrophoresis combined with novel mass spectrometry techniques: powerful tools for the analysis of proteins and proteomes. Electrophoresis 19: 1811-1818.

Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., et al. (1995) Whole-genome random sequencing and assembly of haemophilus-influenzae Rd. Science 269: 496-512.

Fromont-Racine, M., Rain, J.C. and Legrain, P. (1997) Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive two-hybrid screens. Nature Genet. 16: 277-282.

Gerhold, D., Rushmore, T. and Caskey, C.T. (1999) DNA chips: promising toys have become powerful tools. TIBS 24: 168-173.

Hughes, T.R., Marton, M.J., Jones, A.R., et al. (2000) Functional discovery via a compendium of expression ‘profiles. Cell 102: 109-126.

Klose, J. (1999) Large-gel 2D electrophoresis. Meth. Mol. Biol. 112: 147-172.

Lecrenier, N., Foury, F. and Goffeau, A. (1998) Two-hybrid systematic screening of the yeast proteome. Bioessays 20: 1-5.

Pappin, D.J.C., Hojrup, P. and Bleasby, A.J. (1993) Rapid identification of proteins by peptide- mass fingerprinting. Current Biology 3: 327-332.

Pennington, S.R., Wilkins, M.R., Hochstrasser, D.F. and Dunn, M.J. (1997) Proteome analysis: from protein characterisation to biological function. Trends Cell Biol. 7: 168-173.

Perou, C.M., Jeffrey, S.S., van de Rijn, M., et ail. (1999) Distinctive gene expression patterns in

me OB ices

human mammary epithelial cells and breast cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9212-9217.

Roepstorff, P. (1997) Mass spectrometry in protein studies from genome to function. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 6-13.

Scheler, C., Lamer, S., Pan, Z., Li, X.P., Salnikow, J. and Jungblut, P. (1998) Peptide mass fingerprint sequence coverage from differently stained proteins on two-dimensional electro- phoresis patterns by matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI- MS). Electrophoresis 19: 918-927.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1995) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnology 13: 19-50.

Yates, J.R. (1998) Mass spectrometry and the age of the proteome. J. Mass Spectrometry 33: 1-19.

Young, R.A. (2000) Biomedical discovery with DNA arrays. Cell 102: 9-15.

第 一 章 AAAS SRA MAS

Dolores J. Cahill, Eckhard Nordhoff, John O’ Brien, Joachim Klose, Holger Eickhoff and Hans Lehrach

i; Sls

蛋白 质 组 学 可 以 被 广泛 定义 为 生物 样本 中 和 蛋 白 的 系统 分 析 与 存档 。 这 是 一 个 最 近 两 年 才 突 显 重要 的 领域 ， 被 认为 将 对 生物 技术 产生 重要 影响 。Blackstock 和 Weir 最 近 对 此 进行 了 综述 (1999).

蛋白 质 组 学 可 视 为 分 子 生 物 学 的 大 规模 筛选 技术 ， 目 的 在 于 归 类 细胞 中 的 蛋白 的 整 体 分 布 ， 鉴 定 并 分 析 感 兴趣 的 个 别 蛋 白 ， 最 终 阐 明 它 们 的 关系 与 功能 。 由 于 基因 组 学 对 基因 的 研究 不 能 充分 预测 蛋 昌 的 结构 或 动力 学 ， 这 种 在 蛋 捍 水 平 上 的 分 析 显 得 尤为 重 要 ， 因 为 绝 大 多 数 调控 过 程 、 疾 病 的 原 发 过 程 以 及 大 多 数 药物 靶 标 均 是 发 生 在 蛋白 水 平 。 这 两 种 概念 在 互补 的 水 平 上 (蛋白质 与 基因 ) 研究 了 细胞 的 分 子 构架 ， 二 者 又 都 在 各 自 的 水 平 上 提供 了 增强 对 方 效应 的 信息 ， 二 者 存在 着 很 强 的 上 且 带 有 系统 性 的 相互 关 系 。 这 一 章 将 综述 当前 用 于 高 密度 分 析 基 因 和 蛋白 表达 的 技术 ， 以 及 我 们 如 何 运 用 这 些 技术 把 基因 组 学 与 蛋 白 质 组 学 连接 起 来 。 本 章 分 成 如 下 4 个 部 分 :

(i) CDNA 表达 文库 的 产生 ， 它 们 的 机 器 化 (robotic) BI], PCRAIRWWE, HE 核 苷 酸 指纹 产生 的 非 元 余 套 (set) RHE DNA DH EM RAR.

(ii) CDNA 表达 亚 套 (subset) 和 非 元 余 Unigene-Uniprotein 套 的 产生 ， 这 些 和 蛋白 在 大 肠 杆 菌 内 的 高 通 量 表达 及 高 密度 蛋 日 阵列 及 微 阵列 的 产生 。

(iii) 通过 高 分 辩 率 二 维 电泳 描述 一 个 特定 时 间 内 、 特 定 细胞 类 型 或 组 织 内 的 蛋 昌 成 分 的 特征 。

(iv) 连接 目前 的 蛋白 质 组 学 与 基因 组 学 技术 ， 利 用 质谱 技术 鉴定 经 二 维 电泳 分 离 的 天 然 蛋白 质 群 的 组 成 ， 并 且 将 它们 与 Uniprotein 套 与 亚 套 所 含 的 蛋白 相关 联 。

目前 ， 可 以 利用 序列 数据 库 内 质谱 确定 的 肽 谱 、 序 列 标记 或 个 别 蛋 白 酶 切 产物 的 碎 片 - 离 子 指纹 来 鉴定 蛋白 。 显 然 ， 这 种 技术 只 对 少数 已 知 和 蛋白 最 为 可 靠 ， 突 破 这 种 局 限 ， 我 们 提出 一 个 新 的 概念 : 通过 质谱 ， 每 一 个 蛋白 可 特异 地 认为 包含 一 小 套 结构 信 息 ， 这 里 ， 我 们 将 这 一 套 信息 称 作 最 小 蛋白 鉴定 器 (MPI)。MPI 包含 酶 切 产物 的 精确 分 子 质量 、 碎 片 - 离 子 数据 及 利用 MALDI-MS 获得 的 信息 。MPI 可 以 由 切割 的 二 维 电 泳 斑 点 和 重组 蛋白 产生 ， 可 用 于 鉴定 二 维 电泳 胶 上 的 同 源 蛋 白 〈 见 图 1.1)。

一 旦 记录 在 档 ，MPI 容许 对 已 知 和 未 知 的 基因 产物 进行 快速 识别 。 同 时 ，MPI 可 以 容许 蛋白 在 序列 数据 库 中 进行 鉴定 。 具 备 了 这 些 特 征 ，MPI 可 以 对 不 同 的 生物 样品 进行 二 维 电泳 胶 比 较 ， 而 不 依赖 于 这 些 样品 的 形式 、 分 辩 率 及 使 用 的 分 离 技术 。 这 种 技 术 使 得 更 多 蛋白 被 可 靠 地 确定 。 因 为 从 二 维 电泳 胶 点 上 测量 的 MPI 可 与 从 表达 蛋白 测 得 的 MPI 进行 比较 ， 而 不 是 与 DNA 序列 预测 的 MPI 比较 〈 见 图 1.2)。 另 外 ， 重 组 重

第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 ee

a CD

图 1.1 (a) 通过 MALDI-MS 获取 MPI。 和 蛋白 被 一 种 特异 的 蛋白 酶 (RS) 裂解 ， 切 割 产 物 的 分 子 质量 可 被 确定 ， 随 后 ， 每 种 蛋白 的 较 明显 的 切割 肽 段 的 碎片 -离子 谱 被 记录 ， 从 第 一 个 波谱 提取 的 肽 质量 图 谱 提供 了 蛋白 一 级 结构 的 指纹 ， 而 碎片 -离子 峰 列 表 提 供 的 是 肽 氨基 酸 序列 的 指纹 ， 这 些 数据 被 整合 、 贮 存 成 MPI， 每 种 蛋白 一 个 MPI。(b) 建议 采用 的 通过 序列 数据 库 鉴定 蛋白 。 对 一 个 特定 的 肽 质量 图 谱 搜索 数据 库 ， 可 获得 供 候选 蛋白 序 列 的 列表 〈 如 100 条 )， 这 个 列表 再 去 搜索 可 与 记录 下 的 碎片 - 离子 指纹 匹配 的 切割 肽 段 且 排 好 序 。 由 于 第 二 轮 筛选 只 用 于 整个 数据 库 的 一 小 部 分 亚 套 ， 这 种 序列 策略 的 优点 在 于 搜索 特异 性 高 ， 搜 索 时 间 短 。 (c) 建议 的 比 较 二 维 电 泳 胶 的 策略 。 可 以 在 计算 机 上 比较 它们 的 MPI， 这 种 比 对 不 依赖 于 使 用 的 胶 形式 、 应 用 的 分 离 技术 及 随后 的 二 维 电泳 技术 。(d) 二 维 电泳 蛋白 斑点 模式 和 排 好 序 的 蛋白 微 阵 列 相 关 。 将 全 部 重组 蛋白 点 到 阵列 上 ， MPI 已 经 被 记录 并 贮存 在 一 个 数据 库 内 。 由 二 维 电泳 分 离 的 天 然 蛋白 现在 可 以 与 它们 的 重组 衍生 物 进 行 比 对 分 析 ， 通 过 已 知 的 MPI 与 数据 库 比 较 。

折 文库 提供 了 一 种 对 于 质谱 定量 稳定 同位 素 标记 的 二 维 电泳 胶 的 蛋白 非常 好 的 来 源 (如 大 肠 杆菌 生长 在 :SN 标记 的 培养 基 中 )。 这 种 技术 在 第 七 章 中 有 阑 述 。

这 种 方法 需要 产生 一 个 Unigene-Uniprotein 套 (第 3 部 分 ， 见 图 1.3)， 它 不 仅 提 供 了 产生 cDNA 微 阵列 的 永生 化 来 源 ， 并 可 通过 复杂 杂交 (第 2 部 分 ) 估计 mRNA 水 平 。

a

本 蛋白 质 组 学

此 外 ，Umniprotein 套 的 每 种 蛋 白 都 含有 储存 在 数据 库 中 的 MPI.

天 然 的 人 GAPDH 50 ° Hx ae |= 3 vo a 重组 的 GAPDH 50 & id * # * ° * * * * * # 0 1,800 2,300 2,800 m/z

图 1.2 MALDI-TOF-MS 胰 酶 解 天 然 与 重组 人 GAPDH 所 得 的 肽 图 谱 。 天 然 GAPDH 从 人 总 胎 脑 蛋白 抽 提 物 经 大 规模 2-DE 与 原 位 切割 而 分 离 得 到 。 上 半 部 分 是 $ 岂 纯化 的 过 夜 酶 切 上 清 的 图 谱 。 重 组 的 人 GAPDH 由 N 端 带 有 RGSHise 标签 的 基因 在 大 肠 杆菌 内 表达 获得 。 利 用 NTA - 配 基 固 定 的 GRAS (Qiagen, Germany) 在 变性 条 件 下 将 细胞 粗 提 物 进行 金属 鳌 合 层 析 从 而 获得 纯化 的 标记 蛋 自 。 纯 化 的 蛋 白 原 位 酶 切 。 下 半 部 分 是 从 150nl 总 酶 切 上 清 中 取 0.5 吕 进行 分 析 得 到 的 图 谱 。 标 记 的 符号 ，* 天 然 GAPDH 的 酶 切 上 清 中 检测 到 的 胰 酶 切 肽 段 。GAPDH 序列 参考 NCBI 数据 库 注 册 号 120649，1999 年 5 月 5 号 公布 。 所 有 的 肽 段 均 可 在 重组 的 GAPDH 酶 切 上 清 中 检测 到 。# 重组 GAPDH 酶 切 上 清 中 检测 到 的 特异 的 胰 酶 切 肽 段 。 oO 在 两 种 酶 切 上 清 中 均 能 检测 得 到 的 不 能 与 GAPDH 和 任何 胰 酶 自身 降解 产物 比 对 的 肽 段 。

完成 这 种 程序 不 仅 需要 已 有 技术 的 应 用 ， 如 高 效 微 阵 列 、 大 规模 蛋白 表达 及 高 分 关 率 二 维 电泳 ， 而 且 需 要 发 展 新 技术 ， 包 括 自动 化 的 二 维 电 泳 、 样 品 纯化 、 质 谱 分 析 及 封 闭环 数据 采集 与 加 工 的 软件 。

2. cDNA 表达 文库 的 制 取 、 机 器 化 阵列 、PCR RW. BRR 间 纹 非 宛 余 套 的 制备 、DNA 芯片 上 的 复杂 杂交

随 着 人 类 基因 组 计划 顺利 地 进行 ， 终 结 的 日 期 临近 ， 人 们 面临 着 如 何 理解 新 发 现 的 这 些 基 因 的 功能 。 测 定 如 此 大 而 复杂 基因 组 的 初衷 集中 在 表达 区 即 cDNA 序列 。 估 计 整 个 人 类 基因 组 的 基因 总 数 在 60 000 一 140 000 左 右 ， 人 类 基因 的 大 部 分 已 经 体现 在 现 有 的 dbEST 库 内 ， 然 而 只 有 一 小 部 分 被 揭示 出 功能 。 如 2000 年 7 月 公布 的 消息 ， 人 类 的 entries 数量 是 2 121 173 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/dbEST/index. html) (Wolfs- berg and Landsman, 1997), UniGene#=W&@4 81 967 个 复 (cluster) (www. ncbi. nlm. gov/uniGene/Hs. stats.shtml), MAA 13407 个 包含 至 少 一 个 已 知 的 基因 。 最 直接 的 解

第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 oe

基因 表达 分 析

ae i mRNA 总 蛋白 上

DNA 微 阵 列

二 维 电泳 PCR MALDI-MS Unigene-Uni protein MPI ——> MALDI-MS

miz

图 1.3 建议 的 概念 , “ 桥 ” 天 然 蛋白 与 它们 的 基因 与 RNA 水 平 相 关 ， 利 用 由 质谱 确定 的 MPI 从 cDNA 文库 提取 出 的 Unigene-U- niprotein 套 不 但 可 以 通过 方便 的 PCR 扩 增 得 到 单一 基因 而 在 DNA 微 阵 列 上 进行 基因 表达 分 析 ， 而 且 可 以 通过 亲 和 层 析 获 得 相应 的 (His6) 融 合 的 蛋白 产物 。 对 纯化 的 蛋白 酶 解 ， 进 行 MALDI 分 析 。 从 细胞 或 组 织 中 提取 的 天 然 蛋白 群 可 以 分 离 ， 经 2-DE 鉴定 ， 然 后 原 位 蛋白 降解 ，MALDI-MS 测定 。 得 到 的 MPI 与 从 重组 蛋白 文库 得 到 的 MPI 比较 ， 成 和 上 万 的 生物 活性 基因 产物 因此 与 它们 的 基因 联系 起 来 。 这 种 联系 不 依赖 于 任何 序列 信息 。

决 结构 与 功能 脱节 的 方法 看 起 来 是 建立 起 组 织 的 功能 地 位 与 一 套 基因 的 表达 之 间 的 直接 相关 性 。 在 基因 表达 的 最 先 层次 即 转录 水 平 上 ， 最 能 够 直接 反映 基因 的 活性 ， 因 此 给 出 mRNA 的 表达 谱 (profile) 可 以 与 研究 基因 功能 相互 补 。 分 析 基 因 表 达 的 技术 包括 基因 表达 系列 分 析 (SAGE) (Velculescu et al., 1995), BRRRRBA (Herwig et al., 1999; Meier-Ewert et al., 1993, 1998; Poustka, 1999; Radelof et al., 1998), FW 28 探 针 进行 测序 和 杂交 (Schena et al., 1998). Ja AJ WA#E DNA 芯片 上 对 遗传 材料 进行 高 通 量 分 析 ， 研 究 基 因 表 达 和 发 现 新 的 疾病 相关 基因 。 高 密度 的 DNA 和 蛋白 阵列 是 袖 珍 的 自动 化 装置 ， 包 含 小 的 用 于 生物 实验 的 平面 。 目 前 ，DNA 芯片 可 以 通过 将 表达 分 布 图 与 在 健康 的 和 疾病 的 组 织 中 观察 到 的 表达 方式 比较 ， 来 研究 一 种 给 定 组 织 的 全 部 基 因 的 相对 表达 水 平 。

从 基因 组 和 有 蛋白质 组 的 水 平 对 一 种 组 织 与 器 官 的 表达 方式 有 全 面 的 了 解 ， 需 要 尽 可 能 快 地 平行 筛选 许多 样品 。 在 这 个 部 分 ， 在 我 们 实验 室 已 经 被 自动 化 与 小 型 化 的 步骤 可 以 完成 高 通 量 及 高 平行 杂交 。Clark 和 Eickhoff 等 最 近 对 此 作 了 综述 ， 将 在 下 面 介 绍 (Clark et al., 1999; Eickhoff, 1998).

2.1 cDNA 文库 的 构建 分 析 来 自 许 多 不 同 组 织 和 发 育 阶 段 的 大 的 cDNA SCE A] BE ELE HE EE A

apron 蛋白 质 组 学

序 完 成 之 前 让 我 们 了 解 大 多 数 基 因 ， 因 为 在 转录 之 后 mRNA 总 是 在 体内 加 工 (剪接 、 编辑 )，cDNA 总 是 代表 了 决定 正确 剪接 转录 物 的 序列 和 正确 的 蛋白 产物 的 惟一 可 能 性 。 除了 鉴定 新 基因 和 它们 正确 的 前 接 产物 ， 基 于 来 自 每 条 基因 的 cDNA 克隆 的 片段 ， cDNA 库 也 在 分 析 起 始 材料 中 不 同 mRNA 的 丰 度 水 平分 析 中 起 着 重要 的 作用 。 最 近 Clark 等 综述 了 cDNA 库 的 产生 和 分 析 (Clark et wz .，1999)。 虽 然 自动 化 使 处 理 和 分 析 成 百 上 千 的 克隆 容易 了 ， 但 即使 如 此 大 的 库 也 总 不 足以 鉴定 代表 稀有 转录 物 的 所 有 克 隆 。 因 此 使 用 阵列 后 的 cDNA 库 应 能 由 其 他 的 技术 加 以 补充 ， 以 鉴定 代表 稀有 转录 物 的 基因 。 这 些 技术 包括 筛选 非常 大 、 随 机 的 平板 库 ， 通 过 cDNA 选择 或 外 显 子 捕获 和 使 用 细胞 /组 织 特异 的 库 ， 以 及 从 预测 的 外 显 子 设 计 的 引物 进行 RT-PCR 所 得 产物 的 克隆 。 先 不 管 它们 的 缺点 ， 从 一 系列 组 织 /发 育 阶段 制 取 的 足够 大 的 阵列 CDNA 文库 常常 足以 鉴定 和 分 析 有 机 体 的 大 多 数 基 因 。

2.2 大 规模 热 循 环 和 高 密度 阵列 的 构建

对 于 DNA 阵列 ，PCR 技术 得 以 很 好 的 建立 并 在 大 规模 基因 组 分 析 中 扮演 了 重要 角 色 ， 商 品 化 的 循环 设备 能 平行 处 理 达 1536 个 样本 [4x384 孔 的 微量 滴定 板 (MTP)]。 我 们 在 柏林 进行 分 子 遗 传 学 研究 的 Max-Planck 研究 所 已 经 研制 了 实验 用 的 基于 大 量 水 浴 的 热 循 环 样机 可 用 来 高 通 量 扩 增 DNA。 一 个 装 满 133Sx384 孔 MTP (51 840 个 反应 ) WEF (basket) 随 着 空气 驱动 的 x/z -滑动 期 在 三 个 设 定好 温度 的 水 浴 之 间 移 动 。

对 于 蛋白 阵列 的 产生 ， 我 们 已 克隆 cDNA 库 至 组 氨 酸 (His) 标记 的 表达 系统 ， 能 在 PVDF 膜 上 产生 大 的 蛋白 阵列 (Biissow et al., 1998; 第 2 部 分 )。 几 个 分 格 的 机 械 手 也 已 建成 ， 它 能 在 高 密度 格 上 将 克隆 、DNA、 和 蛋白 从 微量 滴定 板 上 转移 到 尼龙 膜 或 PVDF 膜 及 玻璃 片上 。 这 个 点 样 的 小 器 械 在 一 个 servo 控制 的 三 轴 的 线性 驱动 系统 下 载 有 384 钉 (pin) 的 头 ， 能 精确 定位 至 5 wm， 可 达到 近似 300 点 /em2 的 密度 ， 枪 头 的 直 径 取决 于 点 的 应 用 并 在 150 和 450um 之 间 可 变 (Lueking et al., 1999).

对 于 常规 应 用 ，27 648 个 克隆 、PCR 产物 或 蛋白 可 在 单 张 22.2cmx22.2cm 滤纸 上 点 样 为 双 份 。 可 平行 产生 多 达 15 张 滤纸 拷贝 。 这 些 点 以 $Sx5 排列 ， 它 们 每 一 个 由 主导 点 〈 通 常 在 中 心 ) 和 12 对 双 点 组 成 ( 见 图 3)。 对 于 DNA 阵列 ， 链 鱼 精 DNA 总 是 用 来 做 主导 点 ， 而 对 于 蛋白 阵列 用 墨水 ， 这 些 主导 点 和 双 点 消除 了 点 识别 的 错误 ， 也 使 得 图 像 分 析 更 容易 。

克隆 或 PCR 产物 被 分 格 至 尼龙 膜 上 的 DNA 滤 膜 ， 可 重复 使 用 至 少 20 次 而 信号 强 度 不 会 显著 丢失 。PVDF 膜 上 的 蛋白 滤 膜 阵 列 通常 只 能 用 一 次 。

在 DNA 杂交 过 程 中 湿 膜 难处 理 ， 这 样 大 大 增加 了 实验 时 间 ， 它们 也 成 为 大 规模 入 查 过 程 的 障碍 。 为 了 解决 这 一 点 ， 我 们 发 展 了 简化 处 理 高 密度 膜 的 方法 ， 使 用 坚硬 的 塑 料 薄 片 提 供 膜 的 刚性 ， 以 使 这 些 膜 更 容易 处 理 并 反 过 来 提高 了 实验 工作 的 速度 和 效率 (Bancroft et al., 1997).

我 们 通常 有 两 条 途径 点 DNA 或 蛋白 以 制 成 高 密度 阵列 (Clarke et al., 1999). — 个 方法 使 用 针头 或 尖 点 样 ， 含 DNA 片段 的 液体 通过 支持 物 传递 到 无 污染 的 钢 尖 。 第 二 种 方法 应 用 压力 喷 墨 技术 ， 例 如 cDNA 不 接触 表面 而 转移 。 我 们 已 经 应 用 了 多 头 的 压力 喷射 微 阵列 系 统 ， 它 可 以 在 一 系列 表面 构建 大 的 微 阵 列 。 由 于 用 这 个 系统 获得 的 点 的 密

度 大 于 2000 个 克隆 /cm2， 通 过 与 Perkin Elmer 合作 ， 研 制 了 一 种 基于 激光 扫描 原理 的 高 分 辩 率 检测 系统 。 作 为 对 传统 针头 点 样 的 进一步 改进 ， 一 种 称 为 按 需 点 滴 的 技术 建立 起 来 。 基 因 样 品 用 多 道 的 微 处 理 机 械 手 吸取 ， 它 与 喷 墨 式 打 印 机 的 工作 原理 一 样 ， 可 将 杂交 阵列 的 面积 减少 一 到 两 个 数量 级 。 完 整 的 图 像 分 析 程 序 决定 是 否 产生 了 一 个 合适 的 点 (drop)。 如 果 点 形成 的 不 好 ， 喷 嘴 枪 头 将 自动 被 清洗 。 一 个 整合 的 照相 机 决定 自动 处 理 的 位 置 ， 例 如 在 硅 薄 片上 填 洞 。 每 个 可 处 理 单个 或 多 点 的 头 可 容纳 100 pl。 在 处 理 器 内 部 最 近 发 展 了 基于 磁 珠 的 纯化 系统 ， 人 允许 点 样 探 针 在 处 理 之 前 的 浓缩 和 纯化 。 点 样 的 大 小 依赖 于 处 理 液 体 的 表面 可 以 在 直径 100 一 120 pm 之 间 变 化 。 阵 列 的 密度 可 提高 到 3000 点 /cm2。 这 个 微 处 理 系统 能 够 处 理 “on-the-fly” 而 且 不 超过 3 min 即 可 在 一 个 方形 上 处 理 100 x 100 个 直径 100 pm 且 每 两 个 点 中 心 之 间 的 距离 为 230 pm 的 点 。 以 这 种 密度 ， 在 载 玻 片 表面 固定 一 个 由 14 000 个 克隆 组 成 的 小 型 ADNA 文库 是 完全 可 能 的 。 由 于 玻璃 片 比 膜 更 坚固 更 容易 处 理 ， 这 便 提 高 了 自动 化 的 程度 。

另 一 个 微 处 理 技 术 的 应 用 是 在 MALDI-MS 靶 平 板 上 准备 高 密度 阵列 探 针 ， 质 谱 带 来 了 DNA 和 蛋白 分 析 中 的 高 速度 、 高 通 量 应 用 。 在 商品 化 的 MS 设备 中 ，1 s 可 分 析 一 个 样品 ， 理 论 上 每 天 可 详细 地 研究 成 百 上 千 的 样本 。 直 到 目前 ， 只 有 样机 (prototype) 问世 ， 使 用 在 一 张 1 cm? 的 MALDIMS 靶 上 固定 有 几 千 个 DNA 片段 或 蛋白 的 微 处理 阵 列 ( 见 第 4 部 分 )。

2.3 实验 室 自动 化 和 高 密度 阵列 的 新 进展

分 析 大 的 基因 库 的 第 一 步 是 从 凝 胶 平 板 上 挑 出 随机 分 布 的 克隆 并 将 这 些 克 隆 制 成 阵 列 至 微量 滴定 板 上 。 我 们 实验 室 已 发 展 了 挑 取 机 械 手 ， 它 每 小 时 挑 3500 个 克隆 。 这 些 克隆 通过 图 像 分 析 检 测 以 对 挑选 进行 定位 。 发 展 的 软件 可 以 识别 克隆 位 置 并 将 其 翻译 成 机 械 手 的 移动 信息 。 最 新 版 本 的 这 种 软件 可 识别 直径 小 至 0.5 mm 的 克隆 并 且 不 依赖 于 选择 的 算法 ， 蓝 白斑 筛选 的 精确 率 几 乎 可 达 100% 。 在 进一步 小 型 化 和 微 阵列 技术 上 也 有 了 新 的 发 展 〈(Eickhoff，1998) 。 我 们 已 描述 分 析 菊 光标 记 的 生物 分 子 如 DNA 所 用 的 全 自动 多 毛细 管 电泳 系统 的 构建 和 操作 (Behr et az .，1999)。 在 这 个 设备 中 ， 一 个 特殊 的 检测 系统 允许 同时 对 所 有 96 个 毛细 管 进行 光谱 分 析 ， 它 没有 移动 部 分 ， 但 是 自动 的 并 完全 可 与 现 有 系统 相 媲 美 。 这 个 设备 不 需要 人 工 干 预 即 可 处 理 多 达 40 个 微量 滴定 板 (96 和 384 孔 )， 这 意味 着 在 再 次 加 样 之 前 已 经 处 理 了 15 000 FHA.

为 便于 这 些 数 据 的 系统 化 产生 、 收 集 和 重 分配 ， 于 1989 年 本 系 开 始 从 一 些 不 同文 库 中 制备 分 布 滤 膜 分 格 (distribution filter grids) (Lehrach et wz .，1990)。 为 收集 产生 于 这 些 材料 的 数据 ， 建 立 了 一 个 独立 的 数据 库 ， 参 考 文库 数据 库 (Reference Library Database) (Zehetner and Lehrach, 1994), 这 个 系统 继续 发 展 成 人 类 基因 组 计划 的 资源 中 心 并 成 为 其 他 在 阵列 库 上 尝试 系统 化 生成 数据 的 模型 (如 图 像 文库 收集 ) (Lennon et &j.，1996)。 逻 辑 上 ， 下 一 步 将 对 差异 表达 的 CDNA 克隆 编码 的 蛋白 产物 研究 其 分 布 情 况 。 截 至 目前 ， 我 们 发 展 了 与 蛋白 表达 分 析 高 度 平行 的 方法 ， 包 括 在 合适 的 载体 系统 同 时 表达 较 大 数量 的 CDNA 克隆 和 蛋白 产物 的 高 速 阵 列 (Biissow et al .，1998)。 这 些 自 动 化 系统 已 被 用 来 产生 高 密度 DNA 和 蛋白 微 阵列 (Lueking et al., 1999) 并 将 在 第 3 部 分 进一步 描述 。

oe 蛋白质 组 学

2.4 文库 归 一 化 和 用 豪 核 苷 酸 指纹 产生 Unigene 套

高 等 生物 尤其 是 人 类 基因 组 序列 的 确定 ， 现 在 看 来 是 一 个 可 达到 的 目标 ， 但 仅 代 表 了 遗传 学 复杂 性 分 析 的 一 个 层次 。 生 物 学 信息 表达 谱 的 确定 代表 了 复杂 性 的 另 一 个 层 次 ， 它 对 理解 有 机 体 功 能 与 测序 一 样 重要 。 为 了 能 鉴定 这 些 基因 ， 并 计算 它们 的 丰 度 ， 每 个 cDNA 克隆 可 通过 典型 的 测序 途径 对 应 于 特定 的 基因 。 基 于 短 的 守 核 苷 酸 杂 交 的 高 RAY PS ap UE RAR OY EG FPR FRSC (oligonucleotide fingerprinting)， 已 经 发 展 起 来 用 于 cDNA 库 的 鉴定 (Herwig et al., 1999; Meier-Ewert et al., 1998; Poustka et al., 1999; Radelof et wa!.，1998)。 这 相当 于 200 TSE BFF RIK BH HY AY AE EY cDNA 4 A Fr Bd {TAR 20. GARI BRET AY AR CF) FE RY A, EER 交 谱 产生 一 个 基于 DNA FRIIS TESC, TAZA AIA DAA RR. PSE AF DNA 序列 数据 库 的 理论 上 的 指纹 之 后 ， 比 较 每 簇 的 保守 指纹 ， 可 以 鉴定 已 知 和 未 知 基因 的 cDNA。 如 果 在 守 核 苷 酸 指纹 之 前 文库 克隆 在 表达 载体 中 ， 不 仅 可 产生 一 个 Unigene 套 ， 也 可 产生 一 个 Uniprotein 套 。

2.5 通过 在 DNA 微 阵列 上 的 复杂 杂交 获得 不 同 的 差异 表达 谱

基于 产生 Unigene 套 ，PCR 产物 按 2.2 部 分 描述 以 高 密度 阵列 点 于 玻璃 片上 。 这 些 微 阵列 可 以 同时 测量 表达 水 平 ， 因 此 就 表明 所 有 呈现 在 点 阵 上 所 检测 的 任何 组 织 中 的 基 因 样 本 在 某 一 时 间 点 的 活性 水 平 。 当 来 自 于 不 同 组 织 或 发 育 阶 段 的 RNA 或 cDNA 复杂 混合 物 与 这 些 DNA 心 片 杂 交 时 ， 可 能 得 到 差异 的 基因 表达 谱 (Schena et al., 1998). 自动 化 技术 使 得 可 以 通过 分 析 复 杂 的 表达 模式 ， 高 通 量 地 监测 这 些 基 因 的 活性 。 发 展 于 高 密度 滤 膜 的 DNA 微 阵 列 现在 经 常 是 小 而 密 致 足以 称 其 为 基因 芯片 (Lennon and Lehrach, 1991; Jordan, 1998; Ramsay，1998)。 使 用 微 阵列 ， 已 获得 拟 南 芥 (Schena et al .，1995)、 酿 酒 酵母 (Cho et al., 1998; Chu et al., 1998; DeRisi et al., 1997; Shalon et al., 1996), FLA KALMAR HE (Uetz et al., 2000), AME AMMAR 如 骨髓 、 脑 、 前 列 腺 和 心脏 (Schena et al., 1996) 的 基因 表达 谱 。cDNA 微 阵列 已 被 用 来 对 诸如 类 风湿 关节 炎 和 尤文 氏 肉 瘤 等 复杂 疾病 做 分 布 分 析 (DeRisi et al., 1996; Heller et al., 1997; Trent et al., 1997; Welford et al., 1998).

在 我 们 系 进 行 的 复杂 杂交 如 下 进行 : 不 像 在 一 张 玻璃 片 进行 两 个 不 同 标 记 的 mRNA 的 杂交 ， 我 们 的 方法 是 只 用 一 种 标记 mRNA， 在 至 多 4 张 不 同 的 玻璃 片上 进行 每 种 组 织 的 表达 分 析 。 对 于 复杂 杂交 ， 若 不 超过 10 000 个 基因 ， 选 择 的 玻璃 规格 是 2.5Scmx 7.5cm。 如 必须 分 析 更 多 数量 的 基因 ， 玻 璃 片 的 选择 规格 是 8cm x 12cm， 至 多 50 000K 基因 可 被 共 价 吸 附 于 玻璃 表面 。 这 使 重复 利用 DNA 微 阵 列 至 少 5 次 成 为 可 能 。 杂 交 到 每 个 阵列 基因 的 信号 被 用 来 确定 相应 于 每 个 基因 样品 中 mRNA 的 相对 含量 。 内 对 照 包 括 用 短 的 朝 核 苷 酸 的 回复 杂交 、 在 阵列 上 使 用 持家 基因 、 在 阵列 上 使 用 拟 南 芥 对 照 克隆 以 及 用 拟 南 芥 尖 端的 组 织 RNA 探 针 。

2.6 自动 化 图 像 分 析 高 通 量 实 验 室 的 一 个 重要 特点 是 自动 化 大 规模 鉴定 文库 中 的 阳性 克隆 。 这 种 自动 化

第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 ih

分 析 系 统 的 主要 要 求 首 先是 自动 化 在 滤 膜 上 将 点 样 模 式 分 格 ， 其 次 是 确定 阳性 克隆 。 不 幸 的 是 ， 不 同 杂 交 滤 膜 显 示 不 同 的 杂交 特性 。 从 这 些 滤 膜 获 得 的 图 形 特征 受 几 个 因素 影 响 ， 存 在 的 问题 包括 由 于 不 均一 尼龙 膜 或 高 的 杂交 背景 造成 的 图 形 上 点 的 不 平均 分 布 。 虽然 人 的 判断 离 确 定 一 个 克隆 是 否 阳 性 的 最 好 方法 还 很 还， 自动 化 找 点 的 算法 在 我 们 系 已 有 发 展 。 在 当前 阶段 ， 接 近 80% 的 所 有 阳性 克隆 可 被 自动 化 获得 。 用 我 们 的 高 密度 蛋白 阵列 筛选 表达 的 His 标签 蛋白 (27 648 种 蛋白 复制 到 一 张 22.2cmx22.2cm 大 小 的 PVDF 膜 上 )，80% 的 重 阵列 (rearrayed) 表达 亚 套 的 蛋白 显示 表达 。 使 用 相同 的 机 械 手 技 术 和 相同 的 图 像 分 析 软 件 ， 我 们 能 分 析 DNA 蛋白 阵列 和 微 阵 列 ， 并 且 我 们 目前 发 展 的 这 些 系 统 可 分 析 2-DE 电泳 ， 提 供 的 高 度 平 行 的 数据 获取 和 分 析 系 统 可 提高 实验 工 作 的 速度 ， 并 可 进行 诸如 在 RNA 水 平 上 的 基因 表达 和 固定 于 蛋白 芯片 上 的 储 积 在 血清 中 的 抗体 谱 之 间 有 意义 的 比较 ， 并 可 确定 通过 2-DE 模式 所 揭示 的 相对 蛋白 含量 。

3. 蛋白 阵列 .cDNA 表达 库 制 备 , 自动 化 技术 在 重 日 阵列 和 必 片 制备 中 的 应 用 , 及 和 蛋 日 必 片 在 恒 白 质 组 学 中 的 应 用

蛋白 将 基因 组 序列 翻译 为 功能 ， 这 样 使 生物 学 过 程 成 为 可 能 。 因 此 ， 充 分 理解 在 基 因 组 和 和 蛋白 组 水 平 某 种 组 织 或 有 机 体 的 表达 谱 要 求 尽 可 能 快速 地 平行 筛选 许多 样本 。 因 为 即使 在 最 简单 有 机 体 的 自 稳 状 态 中 也 有 大 量 的 蛋 白 参与 ， 这 就 要 求 用 高 通 量 的 自动 化 方法 进行 蛋白 分 析 〈(Uetz et al., 2000). KRM cDNA 库 能 在 高 密度 滤 膜 上 筛选 蛋 日 表达 (Biissow et wz .，1998)， 高 密度 膜 可 用 于 平行 的 DNA 杂交 、 和 蛋白 表达 和 抗体 得 选 。 使 用 机 械 手 技术 〈 见 第 2 部 分 )， 人 胎 脑 cDNA 表达 库 (hExl) 被 阵列 在 微 孔 板 上 ， 且 细菌 克隆 分 格 在 PVDF 膜 上 。 原 位 表达 重组 融合 蛋 白 被 诱导 并 用 抗 含 His 标签 表 位 的 抗体 检测 。 这 个 方法 扩展 到 从 液体 表达 培养 物 中 蛋白 阵列 自动 化 点 样 ， 其 中 使 用 一 个 固定 到 平 床 点 样机 械 手 上 的 转移 标记 (Lueking et al.，1999)， 这 种 方法 显示 ， 午 白 微 阵列 提供 了 非常 敏感 的 基因 表达 和 高 通 量 抗体 特异 性 筛选 的 方法 。 使 用 这 种 直径 为 150 pm 而 不 是 450 pm 的 转移 标记 ，4800 个 样本 可 放置 于 载 玻 片 上 并 同时 筛选 ， 却 应 用 最 少量 的 介质 。 灵 敏 的 和 定位 好 的 信号 可 以 检测 250 x 10 '* mol 或 10pg 的 点 样 测试 蛋白 (GAPDH). cDNA 库 的 蛋白 表达 克隆 可 被 可 靠 地 检测 ， 表 达 不 正确 的 阅读 框 蛋白 的 假 阳 性 克隆 的 比率 可 降 到 11% 的 低 水 平 。 这 些 改进 的 蛋白 微 阵列 可 以 进行 最 敏感 的 蛋白 表达 和 抗体 特异 性 筛选 。 由 于 蛋白 微 阵列 是 在 全 基因 组 水 平 连接 基因 表达 分 析 和 分 子 结合 研究 的 最 有 力 工 具 ， 如 果 差 异 表达 的 基因 可 以 用 cDNA 微 阵 列 识别 ， 相 同 的 克隆 可 被 同时 在 不 同 的 细胞 系统 或 通过 体外 转录 /翻译 做 蛋白 表达 分 析 。 在 相同 的 蛋白 微 阵 列 上 ， 表 达 克 隆 可 被 筛选 ， 用 于 结合 其 他 蛋白 〈 如 抗体 ) 或 结合 从 核酸 到 小 分 子 配 体 的 不 同 分 子 。 这 种 多 功能 性 使 得 蛋白 微 阵 列 成 为 诊断 上 的 多 用 途 工 具 。 最 近 我 们 描述 了 它 们 作为 高 通 量 配 体 - 受 体 相互 作 用 研究 、 诊 断 及 抗体 特异 性 判定 等 有 力 工 具 的 用 途 (Walter et al., 2000).

在 这 部 分 ， 我 们 将 描述 非 宛 余 蛋白 阵列 即 所 谓 的 Uniprotein 阵列 的 产生 ， 它 们 在 基 因 组 学 和 蛋白 质 组 学 的 应 用 将 在 第 $ 部 分 描述 。 高 密度 蛋白 阵列 和 其 他 蛋白 质 组 学 技术 的 应 用 已 被 描述 为 “第 二 代 和 蛋白 质 组 学 ” (Humphery-Smith，1999)。 这 已 经 被 定义 为 ， 阵列 技术 用 于 检测 全 基因 组 的 相应 的 全 蛋白 ， 而 不 依赖 于 分 离 科 学 (如 2-DE， 质 谱 ，

nn 蛋白质 组 学

柱 层 析 或 毛细 管 电泳 )， 但 更 多 应 用 更 传统 的 分 子 生物 学 技术 来 进行 整体 细胞 蛋白 分 析 。 上 述 描写 的 蛋白 阵列 在 蛋白 质 组 学 中 的 应 用 是 有 效 的 ， 它 不 同 于 在 这 儿 描 述 的 蛋白 阵列 在 连接 基因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 方面 的 应 用 。 我 们 的 应 用 包括 针对 Unigene-Uniprotein = 编码 的 全 部 基因 产物 的 MPI 目录 的 产生 ， 和 它 在 连接 高 密度 表达 阵列 与 2-DE 实验 方面 的 用 途 。

3.1 Uniprotein 套 和 蛋白 阵列 的 产生 与 应 用

直到 最 近 ， 仍 然 不 可 能 使 用 同样 的 高 密度 阵列 和 自动 化 的 技术 来 分 析 和 蛋白 。 我 们 通 过 产生 cDNA 表达 文库 、 高 密度 蛋 日 阵列 和 微 阵列 将 自动 化 技术 应 用 到 高 通 量 和 大 规模 蛋白 分 析 中 去 (Biissow et al., 1998; Cahill et al., 1998; Lueking et wz .，1999) 。 我 们 的 方法 是 制备 由 cDNA 克隆 蛋 白 产物 用 于 进一步 的 分 析 和 使 用 ， 如 产生 蛋白 阵列 。 这 需 要 一 个 高 度 平行 的 技术 做 蛋 日 表达 分 析 ， 包 括 大 量 cDNA 克隆 在 一 个 合适 的 载体 系统 内 的 同步 表达 及 高 速度 蛋白 产物 的 排 布 ， 最 近 由 Eichhoff 等 进行 了 综述 (Eichhoff et az .， 2000)。 使 用 机 器 (Lehrach et al .，1997)， 可 把 一 个 人 胎 脑 cDNA 表达 文库 (hEx1) HF 布 在 微量 滴定 板 上 ， 或 把 菌落 网 格 转 到 PVDF 膜 上 。 诱 导 重组 融合 蛋白 的 原 位 表达 ， 用 抗 6x His 标签 的 抗体 进行 检测 。 使 用 我 们 的 方法 ， 文 库 里 的 基因 可 在 DNA 和 和 蛋白 水 平 上 同时 进行 研究 ， 同 时 提供 重组 基因 与 蛋白 以 制备 DNA 与 蛋白 芯片 。 这 种 技术 同样 可 以 通过 制 取 与 排 布 CDNA 表达 文库 、 直 接 建 立 DNA 序列 信息 与 单个 克隆 的 蛋 白 产物 之 间 的 联系 来 获得 重组 蛋白 的 大 规模 、 系 统 化 功能 研究 。 反 过 来 ， 可 以 在 整个 基因 组 水 平 上 同样 操作 (Biissow et 迟 .，1998)。 这 使 得 翻译 的 基因 产物 直接 服从 于 高 通 量 实验 需要 并 且 在 蛋白 表达 与 DNA 序列 数据 之 间 建 立 起 直接 的 联系 。

正如 第 2 部 分 所 描述 的 那样 ， 制 备 一 个 非 元 余 的 单 克隆 (Uniclone) 或 一 个 单 基 因 - 单 蛋白 对 应 组 (Unigene-Uniprotein set) 包含 这 样 一 些 过 程 : 将 已 经 克隆 到 蛋白 表达 载体 (如 Qiagen 公司 生产 的 pQe 载 体 ) 中 的 CDNA KERR RAA “ARP RBD th”, FRR SOC HES! MSE ICA AY Unigene-Uniprotein 对 应 组 [Cahill and Lehrach, 1998 (专利 )]。 这 些 蛋 白 可 以 在 大 肠 杆 菌 内 高 通 量 表达 ， 因 而 产生 一 个 高 密度 的 蛋白 质 阵列 与 微 阵 列 。Unigene 套 可 以 用 于 高 密度 DNA 阵列 的 产生 ， 然 后 是 在 DNA 微 阵列 上 使 用 复杂 杂交 、 消 减 杂交 等 进行 表达 谱 分 析 。 有 了 分 化 表达 谱 ， 就 可 以 通过 分 析 基 因 和 与 基因 网 络 以 及 表达 谱 进行 生物 学 功能 的 复杂 研究 。 全 部 Uniprotein 阵列 的 蛋白 都 可 以 高 通 量 地 得 以 表达 与 纯化 。 它 们 随后 可 以 排 布 在 一 个 MS 靶 上 ， 产 生 每 一 种 蛋白 的 MS 分 布 图 及 它 在 数据 库 中 的 储存 信息 。 同 样 可 以 应 用 2-DE 给 出 蛋白 质 组 的 分 布 图 ， 胶 上 的 蛋白 质点 被 切 下 来 ， 酶 切 ， 质 谱 鉴定 。 它 们 的 DNA 序列 可 以 按 和 常规 方法 确定 ， 即 使 对 大 的 蛋白 复合 物 也 可 以 (Neubauer et al., 1998).

这 种 技术 还 被 用 来 产生 蛋白 阵列 的 第 二 种 类 型 ， 包 含 利用 新 的 固定 到 平 床 点 样机 械 手 上 的 转移 标记 ， 对 从 液体 表达 培养 物 中 纯化 的 蛋白 微 阵 列 进行 自动 化 点 样 (Lueking et al .，1999)。 这 样 的 蛋白 微 阵 列 提供 了 一 种 用 于 高 通 量 的 、 非 常 灵敏 的 基因 表达 与 搞 体 特异 筛选 方法 ， 以 及 提供 了 抗体 鉴定 、 血 清 分 布 〈Cahill，2000)、 高 通 量 配 体 - 受 体 相 互 作 用 研究 以 及 此 处 提 到 的 蛋白 质 组 应 用 的 有 力 工 具 。

在 哺乳 动物 细胞 中 克隆 cDNA 及 表达 和 蛋白 产物 与 胞 内 蛋白 的 2-DE 模式 相 匹 配 已 经

第 一 章 “ 基因组 学 与 蛋白 质 组 学 “53

在 前 描述 。cDNA 文库 中 的 混合 克隆 在 体外 转录 /转译 表达 、 二 维 电泳 分 析 ， 将 在 第 5 部 分 中 描述 。 然 而 ， 我 们 相信 联合 蛋白 阵列 与 质谱 技术 来 产生 MPI 是 一 种 连接 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 的 新 方法 。 4. 通过 高 分 辨 二 维 电 泳 (2-DE) 鉴定 特定 细胞 类 型 或 组 织 在 特定

时 间 的 重 日 组 成

在 某 一 特定 组 织 或 (A) 发 育 的 某 一 阶段 中 蛋白 表达 的 功能 分 析 是 理解 生物 学 过 程 的 关键 步 又。 这些 蛋 白 一 旦 产生 ， 就 能 潜在 地 (potentially) 在 其 承担 细胞 活动 的 功能 之 前 ， 执 行 翻译 后 修饰 。 这 些 修饰 可 能 是 因为 加 了 其 他 分 子 〈 如 磷酸 化 、 糖 基 化 )、 蛋 白 加 工 和 蛋白 分 解 切割 。 由 于 任何 一 个 蛋白 的 结构 修饰 和 任何 量 的 改变 不 都 是 由 相同 的 基因 控制 ， 各 种 蛋白 的 活性 形式 和 不 能 参照 任何 单一 基因 确定 。 因 此 ， 即 使 所 有 基因 组 中 的 基因 已 经 测序 并 翻译 成 蛋白 质 ， 识 别 和 鉴定 在 某 种 条 件 的 特殊 细胞 类 型 中 每 种 蛋白 的 不 同 功能 形式 仍 是 一 个 主要 任务 。 和 蛋白 结构 或 量 的 变化 能 导致 疾病 。 为 了 阐明 疾病 机 制 ， 就 必须 理解 不 同 蛋白 如 何 表达 及 在 特殊 生物 学 背景 下 如 何 发 挥 功能 。 通 过 确定 并 比 较 出 现在 疾病 组 织 和 相应 正常 组 织 的 蛋白 ， 就 可 以 鉴定 与 特殊 疾病 相关 的 特异 蛋白 。 这 些 疾病 特异 蛋白 具有 作为 疾病 标记 或 作为 药物 靶 分 子 的 商业 潜力 。 它 们 的 相应 基因 序列 可 能 在 筛选 易 感 性 方面 具有 重要 价值 。 研 究 和 发 掘 药物 的 主要 前 沿 就 是 研究 和 分 析 和 蛋白 质 组 ， 因 为 使 用 这 种 方法 ， 可 能 鉴定 与 特殊 疾病 相关 的 特异 恒 白 。

4.1 蛋白 质 组 学 与 基因 组 学

蛋白 质 组 学 分 析 一 种 基因 组 或 一 个 细胞 或 组 织 类 型 所 有 蛋白 的 表达 (Wilkins et al.，1996)， 最 近 有 这 方面 的 综述 (Blackstock and Weir，1999)。 由 于 同一 时 间 特 定 的 细胞 、 组 织 或 有 机 体 中 并 非 所 有 的 蛋白 都 表达 ， 因 此 和 蛋白质 组 是 动态 的 。 和 蛋白 质 组 学 这 个 词 来 源 于 蛋白 质 组 ， 蛋 白质 组 与 同类 术语 基因 组 相 一 致 ， 由 澳大利亚 悉尼 Macquarie 大 学 的 Marc Wilkins 和 Keith Williams 于 1994 年 提出 。 和 蛋白 质 组 的 名 称 由 Wasinger 等 于 1995 年 第 一 次 在 出 版 物 中 使 用 ， 他 将 之 定义 为 “一 种 基因 组 的 全 部 蛋白 ”。 相 类 似 的 有 关 和 蛋白 质 组 的 定义 如 “由 基因 组 编码 的 一 整套 蛋白 质 ” 可 能 在 文献 中 更 经 常 看 到 。 然 而 ， 从 严格 的 意义 上 讲 ， 那 些 定 义 蛋 白质 组 为 基因 组 的 蛋白 编码 物 的 所 有 定义 都 不 确 切 ， 因 为 基因 组 不 能 明确 地 编码 有 机 体 中 蛋白 的 整体 结构 和 多 样 性 。 这 一 点 同样 存在 于 其 他 的 有 关 有 蛋白质 组 的 概念 中 ， 例 如 ， 有 机 体 的 整套 蛋白 质 ， 同 样 没 有 给 出 有 机 体 的 DNA 和 和 蛋白 分 布 之 间 简 单 的 线性 关系 。

基因 组 在 几乎 所 有 的 细胞 中 都 是 完整 的 ， 与 之 不 同 ， 蛋 白质 组 具有 很 高 的 细胞 特异 性 : 一 个 有 机 体 的 不 同 细胞 表达 它 的 全 蛋白 的 不 同 亚 套 。 同 时 ， 基 因 组 储存 了 稳定 的 信 息 ， 其 成 分 不 随时 间 变 化 ， 而 蛋白 质 组 是 高 度 动态 的 ， 根 据 细 胞 的 发 育 和 生理 状态 蛋白 表达 的 亚 套 一 刻 不 停 地 变化 。 再 强调 一 下 ， 以 此 类 推 功能 基因 组 学 的 概念 也 是 很 中 肯 的 ， 因 为 功能 基因 组 学 研究 mRNA， 它 像 蛋 白质 一 样 ， 是 细胞 类 型 和 细胞 状态 特异 的 ， 并 且 是 动态 表达 的 。 蛋 白质 组 动态 的 和 细胞 类 型 特异 的 特点 提出 了 系统 分 析 的 主要 挑 战 ， 要 完全 记录 多 细胞 有 机 体 的 蛋白 质 组 ， 就 必须 记录 每 种 细胞 类 型 在 它 可 能 的 生理 状 态 和 发 育 阶段 的 蛋白 分 布 图 。

- 16 . .有 蛋白质 组 学

4.2 二 维 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (2-DE)

复杂 蛋白 质 组 的 鉴定 要 求 分 离 和 检测 成 百 上 千 的 不 同 的 蛋白 种 类 。 这 个 方法 的 目标 是 基于 功能 参数 的 广 谱 的 许多 蛋白 的 鉴定 。 包 括 这 些 和 蛋白 要 正确 地 出 现在 不 同 机 体 、 不 同 胚层 、 出 生 后 和 成 年 阶段 (包括 老年 阶段 ) 、 在 不 同 的 细胞 部 位 和 细胞 的 细胞 器 〈 核 、 线粒体 ) 以 及 在 不 同 的 性 别 中 (Bowden et al., 1996; Dean et al., 1998; Romer et al., 1997)。 通 过 分 析 共 翻译 和 翻译 后 修饰 (如 糖 基 化 蛋白 、 磷 酸化 蛋白 )， 也 需要 单个 蛋白 生化 特征 的 确定 (Janke et wz.，1996)。 蛋 白质 组 分 析 是 通过 高 分 辩 率 的 二 维 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (z2-DE)、 分 析 与 比较 得 到 斑点 的 模式 、 结 合 原 位 蛋白 水 解 和 质谱 技术 鉴 定 候选 蛋白 来 进行 (Gauss et al., 1999; Jungblut et wz .，1998)。 所 需 的 高 分 辨 率 由 大 胶 的 2-DE 技术 产生 ， 它 能 在 一 块 腕 上 显示 多 于 10 000 个 蛋 自 点 〈(Klose and Kobalz, 1995; Klose，1999)。 这 个 技术 基于 最 初 的 2-DE 技术 (Klose, 1975; O’ Farrell, 1975), 并 在 目前 现 有 的 文献 报道 2-DE 技术 中 仍然 显示 了 最 高 的 分 辨 率 。 对 于 样品 制备 ， 一 个 详细 的 高 度 标 准 化 的 操作 手册 已 经 建立 〈(Klose，1999)， 这 个 操作 方法 避免 了 蛋 自 类 种 的 特殊 组 的 任何 丢失 。 根 据 这 个 操作 手册 ， 某 一 特定 组 织 的 蛋白 提取 物 分 成 三 个 部 分 (细胞 质 、 质 膜 、 染 色 质 )， 这 三 个 部 分 的 2-DE 模式 呈现 了 这 个 组 织 (10 000~15 000 个 不 同 的 蛋白 点 ) 的 绝 大 部 分 。 为 了 检测 低 浓度 蛋白 要 加 上 来 自 纯化 的 细胞 器 的 2-DE 模式 并 且 可 能 显示 一 千 或 两 千 个 蛋白 点 以 补充 以 上 三 个 基本 组 合 。

KA 2-DE 模式 的 蛋白 点 从 胶 中 切 下 ， 酶 消化 并 且 用 质谱 分 析 消 化 的 肽 。 每 一 个 点 将 根据 惟一 的 MPI ( 见 图 1.3) 被 特征 化 ; MPI 将 被 储存 在 数据 库 中 。 为 了 将 几 千 个 单 一 蛋白 按照 提 到 的 标准 特征 化 ， 蛋 白 的 不 同 生 物 和 生化 类 型 依据 2-DE 点 的 出 现 与 和 否 而 被 匹配 及 消减 ， 并 且 依 据 蛋白 不 同 的 表达 水 平 ， 一 个 蛋白 可 以 显示 在 不 同 的 组 织 中 。 对 2-DE 模式 的 评估 是 通过 激光 扫描 及 软件 辅助 的 斑点 识别 和 特征 化 进行 (OLA). A 用 高 度 灵敏 的 银 染 技术 进行 蛋白 模式 的 出 现 /缺失 分 析 。 对 于 定量 分 析 ， 可 以 应 用 考 马 斯 亮 蓝 或 新 近 发 展 的 荧光 染色 技术 〈 见 第 四 章 )。 为 检测 翻译 后 修饰 ， 可 用 糖 基 染色 和 Be, DAA iA OL PAA: 四 使 用 来 自 标 准 蛋白 类 型 模式 的 2-DE 图 像 ( 见 4.3 部 分 ); OA MPI 数据 库 ， 它 可 不 依赖 于 胶 模 式 而 进行 蛋白 匹配 。 在 每 个 2-DE 模式 中 ， 蛋 白 点 的 MPI 数据 也 使 检测 容易 ， 它 代表 了 同一 蛋白 的 修饰 情况 。 每 个 2-DE 模式 中 包括 所 有 未 知 蛋白 在 内 的 尽 可 能 多 的 蛋白 点 ， 可 能 通过 使 用 质谱 MPI、 2-DE 的 计算 机 模式 得 以 特征 化 ， 来 自 同 一 模式 的 MPI 数据 是 独立 匹配 和 消减 的 。 通 过 这 种 方法 ， 几 千 种 蛋白 根据 生物 和 生化 参数 得 以 鉴定 。

必须 结合 这 些 数据 和 基因 表达 谱 (第 2 部 分 ) 来 充分 说 明 在 某 一 特殊 细胞 或 组 织 在 正常 、 疾 病 和 激活 (如 药物 处 理 ) 条 件 下 发 生 的 事件 。 这 些 信息 可 通过 比较 测量 的 MPI 和 那些 相应 的 来 自 蛋 白 表达 库 的 数据 ， 与 来 自 同 一 组 织 的 mRNA 表达 谱 (第 2 部 分 ) 相 联系 。 在 MPI 数据 的 基础 上 我 们 可 以 联系 起 2-DE 模式 中 的 各 自 的 蛋白 种 类 与 蛋 白 表 达 阵 列 的 同 源 蛋白 ， 并 且 这 种 方法 可 联系 起 相应 的 EDNA。 结 果 ， 基 因 开 始 与 它们 的 蛋白 相 联系 ， 那 是 功能 特征 化 的 。 然 而 ， 已 经 知道 基因 组 学 、 功 能 基因 组 学 和 蛋白质 组 学 的 结果 之 间 的 相关 性 较 低 (Anderson and Seihamer，1997)。 我 们 认为 此 处 描述 的 方 法 使 用 MPI 可 以 为 蛋白 质 组 学 和 基因 组 学 架 起 桥梁 ， 也 对 解释 和 分 析 那 些 巨 大 的 数据

第 一 章 “基因组 学 与 蛋白 质 组 学 sie

库 和 高 通 量 方法 有 用 。

然而 还 有 一 个 基本 的 问题 ， 即 检测 作用 于 蛋白 调控 和 修饰 的 基因 。 基 因 组 学 针对 此 问题 的 方法 是 基于 出 现在 蛋白 表 型 的 结构 和 量 的 多 态 性 ， 开 展 遗 传 学 连锁 研究 (Breen et al., 1994; Klose, 1999; Klose et wz .， 稿 件 正 在 准备 ; Nock et al., 1999), HRAA 之 间 相 互 作用 的 方法 如 酵母 双 杂 交 系 统 (Wanker et al., 1997) 也 可 发 现 除了 编码 蛋白 的 结构 基因 外 ， 相 关 的 其 他 基因 。

4.3 联合 的 2-DE 数据 库

在 最 近 几 年 ， 联 合 2-DE 数据 库 已 经 建立 ， 使 得 世界 范围 的 实验 室 共 享 2-DE 数据 。 然而 实际 上 ， 在 不 同 的 实验 室 匹 配 2-DE 模式 证 明 很 困难 甚至 不 可 能 ， 因 为 使 用 的 技术 不 同 [载体 两 性 电解 质 、 固 相 pH 梯度 (IPG)、 胶 形式 、 染 色 过 程 和 样品 制备 ]。 然 而 将 来 这 个 问题 将 由 于 更 广泛 的 使 用 不 同 的 质谱 技术 得 到 解决 ， 使 得 各 实验 室 在 MS 数据 水 平 而 不 是 2-DE 图 式 的 匹配 比较 结果 。 尤 其 是 MPI 数据 库 将 成 为 转换 来 自 2-DE 模式 数据 的 平台 〈 见 图 1.1)。 结 果 ， 标 准 化 世界 范围 的 实验 室 使 用 的 2-DE 技术 将 不 再 是 共 享 数据 的 要 求 。

4.4 2-DE 分 析 自 动 化

在 不 和 久 的 将 来 每 个 实验 室 每 天 将 可 能 分 析 成 百 的 蛋白 点 ， 或 者 为 了 分 析 整 块 的 胶 ， 要 将 完整 的 2-DE 胶 分 隔 成 小 片 。 这 个 发 展 迫 切 要 求 2-DE 自动 化 。Pharmacia 在 某 种 范 围 上 简化 了 固定 化 电解 质 技 术 ， 但 它 离 自动 化 还 很 远 。 而 且 ， 我 们 发 现 固定 化 电解 质 胶 不 能 达到 解决 复杂 和 蛋白质 组 所 必须 的 高 分 辨 率 水 平 。

另 一 个 感 兴趣 的 焦点 是 在 蛋 白 质 组 分 析 中 改进 高 通 量 技术 ， 例 如 发 展 从 2-DE BIR 别 和 切取 蛋白 点 的 自动 化 机 械 手 、 酶 消化 和 将 消化 好 的 2-DE 胶 的 点 转移 至 用 于 MS 分 析 和 产生 MPI ARSE 〈 见 第 八 章 和 第 九 章 )。

5. 用 质谱 连接 当前 和 恒 晶 质 组 学 和 基因 组 学 的 方法

我 们 的 策略 旨 在 连接 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 。 可 以 总 结 如 下 : 产生 一 套 Unigene, 每 个 代表 惟一 的 基因 。 作 为 重组 蛋白 表达 ， 它 的 MPI 可 用 质谱 决定 。 另 一 方面 ， 相 应 于 Unigene 套 的 来 自 于 2-DE 模式 的 蛋白 被 MPI 特征 化 。 这 提供 了 由 2-DE 特征 化 蛋白 与 其 相应 mRNA 和 基因 (cDNA) 联系 的 桥梁 。 所 有 2-DE 胶 收 集 的 MPI 将 在 计算 机 上 和 获得 于 重组 蛋白 库 的 MPI 比较 ， 反 之 也 可 。 因 此 ， 成 百 上 千 的 具 生 物 活性 的 基因 产 物 与 它们 的 基因 相 联系 。 这 种 联系 不 依赖 于 任何 序列 信息 并 因此 也 吸引 了 其 他 有 机 体 的 功能 蛋白 质 组 分 析 。 我 们 的 策略 与 现存 策略 相 比 另 一 个 优点 是 蛋白 识别 更 可 靠 ， 因 为 是 质谱 数据 与 质谱 数据 相 比 ， 而 不 是 与 从 DNA 或 蛋白 序列 预测 的 数据 相 比 。 后 一 方法 的 、 主要 缺陷 是 没有 考虑 依赖 于 底 物 的 蛋白 酶 行为 、 肽 的 溶解 性 和 质谱 分 析 信 和 号 抑制 。

正如 已 经 描述 的 ，MPI 包括 酶 切 产 物 的 精确 分 子 质 量 和 离子 碎片 数据 。 将 被 用 于 从 预测 的 蛋白 或 实验 记录 的 MPI 数据 库 鉴 定 蛋白 。 后 者 由 两 个 主要 目录 组 成 : OF 2-DE 分 离 的 体内 表达 和 蛋白; OHA cDNA, AA DNA 表达 产物 。

为 达到 广泛 应 用 ， 将 产生 一 个 Unigene 套 ， 最 初 是 人 类 基因 ， 每 个 成 员 代 表 惟 一 的

和 84 RAR

基因 〈 见 第 2 部 分 )， 这 些 基因 可 表达 为 重组 蛋白 〈 见 第 3 部 分 )， 它 们 的 MPI 将 被 确 定 并 存储 于 中 心 数据 库 。 我 们 预测 这 将 建立 起 一 个 新 的 桥 粱 ， 即 将 天 然 蛋 白 群 体 〈 和 蛋白 RA) 与 mRNA 池 (转录 组 ) 和 它们 隐伏 的 基因 (基因 组 ) 之 间 直 接 联系 。

6. 前 景 和 发 展 6.1 基因 组 学

随 着 生物 技术 微型 化 进程 的 发 展 ， 必 须发 展 新 的 硬件 工具 。 所 有 微型 杂交 方法 必须 的 处 理 步 又 ， 尤 其 是 现存 的 检测 系统 ， 也 要 求 加 以 改进 。 越 小 的 斑点 尺寸 导致 所 需要 的 i 探 针 和 样品 的 数量 的 减少 ， 同 样 也 隐 含 着 : 随 着 空间 分 辩 率 的 增加 ， 需 要 发 展 更 灵 敏 的 检测 系统 。 然 而 在 过 去 ， 放 射 性 标记 的 方法 是 占 主 导 地 位 的 生物 技术 ， 检 测 方法 的 下 一 代 将 基于 光学 的 原理 ， 因 为 用 ?”P、353P 或 :5S 标 记 的 化 合 物 在 放射 自 显影 时 显 出 弥散 的 信号 ， 并 且 发 射 的 射线 释放 (delivered) 大 于 360"。 由 于 这 个 限制 ， 光 学 方法 例如 针 对 大 面积 (22.2cmx22.2cm) 激光 扫描 设备 或 其 他 的 显 微 方 法 ， 包 括 对 于 面积 小 至 几 个 mm? 的 共聚 焦 激 光 扫 描 显 微 镜 ， 都 是 不 远 的 将 来 可 以 选择 的 方法 。

6.2 蛋白 组 学

为 了 获得 通 量 化 ， 每 天 必须 记录 几 千 个 MPI。 为 此 ， 急 需 发 展 一 个 裂解 平行 出 现 在 凝 胶 基 质 (gel matrix) 或 结合 至 颗粒 (重组 融合 蛋白 亲 合 纯化 ) 的 多 种 蛋白 的 完全 自动 化 工作 站 。 这 个 工作 站 应 包括 样品 清洗 、 少 缩 和 随后 的 质谱 样品 准备 。 而 且 ， 质 谱 设备 要 求 每 天 能 产生 几 和 干 个 MPI。 就 通 量化 和 全 部 耗费 而 言 ， MALDI-TOF-MS 是 目前 可 选择 的 质谱 技术 。 另 外 ， 新 的 质谱 方法 将 需要 探索 高 的 产品 输出 ， 包 括 改进 的 PSD 分 析 工 具 及 用 于 离子 捕获 的 MALDI。 然 而 有 一 些 滞后 可 能 限制 MALDI-MS 在 蛋 自 质 组 和 基因 组 计划 中 的 应 用 。 最 引 人 注 目的 是 盐 和 去 污 剂 。 例 如 来 自 SDS-PAGE 电泳 的 SDS 或 染色 试剂 ， 大 大 增加 了 在 测试 过 程 中 的 背景 。 因 此 这 就 要 求 进 行 质谱 之 前 样品 的 清洗 (参阅 第 九 章 )。

6.3 尚 需 发 展 之 处

这 种 方法 的 成 功 需 要 进一步 发 展 一 些 技术 ， 包 括 :

(1) 能 够 大 规模 亚 克 隆 cDNA 的 新 方法 ， 同 时 可 修饰 带 标签 的 表达 载体 ， 例 如 开发 和 改进 用 于 提高 在 酿酒 酵母 (S. cerevisiae) 和 裂 殖 酵母 (S. pombe) 中 表达 和 分 沁 的 载体 系统 ， 以 及 用 于 解决 在 E. coli 中 不 容易 表达 的 蛋白 表达 的 载体 系统 (Lueking et al., 2000).

(2) 一 个 全 自动 的 用 于 纯化 His- 标 记 的 蛋白 的 工作 站 (40 BioRobot 8000, Qiagen).

(3) 2-DE 过 程 及 2-DE 的 学 术 与 工业 研究 中 更 自动 化 的 发 展 ， 作 为 蛋白 组 学 的 中 心 技术 要 求 简化 的 大 规模 2-DE 与 技术 改进 、 集 中 解决 三 个 问题 的 自动 化 仪器 ， 在 长 毛细 管 和 大 的 胶 装 置 中 灌 制 菏 胶 。

其 他 的 关键 问题 包括 : 灌 制 胶 、 清 洗 试管 和 玻璃 板 、 应 用 于 等 电 聚 焦 (IEF) 电泳

的 样品 制备 、 转 IEF 胶 到 SDS 胶 。 包 括 发 展 从 2-DE 胶 取 点 的 机 械 手 ， 它 能 从 2-DE 胶

—_—

第 一 章 基因 组 学 与 蛋白 质 组 学 in

上 自动 切取 成 百 上 千 的 蛋白 点 。 在 研究 分 子 遗 传 学 的 Max-Planck 研究 所 ， 已 经 研制 了 一 个 可 进行 8 个 管 穿 孔 的 胶 取 点 设备 ， 但 需要 进一步 改进 (RRMA) 及 适用 于 20cm X 30cm 胶 的 机 械 手 系统 。

7. Mot

JULY 一 口

来 自 2-DE 的 MPI 与 重组 蛋白 库 的 MPI 的 记录 的 对 比 直 接连 系 了 Unigene-Unipro- tein 库 与 所 有 观察 到 的 基因 产物 ， 反 之 亦 然 。 而 且 ， 蛋 白 鉴 定 更 为 可 靠 ， 因 为 来 自 2-DE 电泳 的 测试 与 来 自 表 达 蛋 白 MPI 的 测试 对 比 ， 代 替 了 DNA 序列 预测 MPI ( 酶 切 产 物 结 合 离子 片段 的 结果 )。 优 势 在 于 这 种 联系 独立 于 任何 序列 信息 ， 因 此 也 吸引 了 其 他 有 机 体 的 功能 蛋白 组 分 析 ， 尤 其 是 那些 还 未 测序 的 生物 。 一 有 旦 被 记录 ，MPI 可 以 用 于 迅速 地 识别 已 知 的 和 未 知 的 基因 产物 。 同 时 利用 MPI 可 以 在 序列 数据 库 中 鉴定 蛋白 。 有 了 这 些 特点 ，MPI 能 够 保存 下 不 同 生 物 样 品 2-DE 电泳 的 比较 结果 ， 而 不 依赖 于 它们 的 形 式 、 分 辨 率 和 应 用 的 分 离 技术 。 来 自 2-DE 的 MPI 与 重组 蛋白 库 记 录 的 MPI 之 间 的 对 比 直接 连 系 了 Unigene-Uniprotein 库 与 所 有 观察 到 的 基因 产物 ， 反 之 亦 然 。 因 此 将 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 连接 起 来 。 此 外 ， 直 接 进入 相应 的 重组 蛋白 表达 文库 打开 了 一 条 从 2-DE 凝 胶 进 行 蛋白 质谱 鉴定 的 完美 的 途径 。 稳 定 同位 素 标记 (如 E.coli 细胞 在 <“N 培 养 基 中 生长 ) 是 这 种 方法 的 关键 ， 第 八 章 将 有 描述 。

3

(KA TR 译 WW iaw 1h) 参考 文献

Anderson, L. and Seilhamer, J. (1997) A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis 18: 533-537.

Aparicio, S.A.J.R. (2000) How to count human genes. Nature Genet. 25: 129-130.

Bancroft, D. R., O’Brien, J. K., Guerasimova, A. and Lehrach, H. (1997) Simplified handling of high-density genetic filters using rigid plastic laminates. Nucleic Acids Res. 25: 4160-4161.

Behr, S., Matzig, M., Levin, A., Eickhoff, H. and Heller, C. (1999) A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. Electrophoresis 20: 1492-507.

Blackstock, W.P. and Weir, M.P. (1999) Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Trends Biotechnol. 17: 121-127.

Bowden, L., Klose, J. and Reik, W. (1996) Search for parent-specific gene expression in early embroyos and embryonic stem cells in the mouse using high-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Int. J. Dev. Biol. 40: 499-506.

Breen, M., Deakin, L., MacDonald, B. et al. (1994) Towards high resolution maps of the mouse and human genomes ~ a facility for ordering markers to 0.1 cM resolution. Human Mol. Genet. 3: 621-628.

Biissow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids. Res. 26: 5007-5008.

Biissow, K., Nordhoff, E., Liibbert, C., Lehrach, H. and Walter, G. (2000) Genomics A human cDNA library for high-throughput protein expression screening.

Cahill, D.J. (2000) In Blackstock, M.M. (Ed.). Proteomics: A Trend Guide, pp. 49-53. Elsevier Science, Oxford.

Cho, R.J., Campbell, M.J., Winzeler, E.A. et al. (1998) A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Mol. Cell. 2: 65-73.

。 20 - . 蛋白质 组 学

Chu, S., DeRisi, J., Eisen, M., Mulholland, J., Botstein, D., Brown, P.O. and Herskowitz, I. (1998) The transcriptional program of sporulation in budding yeast. Science 282: 699-705.

Clark, M. D., Panopoulou, G. D., Cahill, D. J., Bussow, K. and Lehrach, H. (1999) Construction and analysis of arrayed cDNA libraries. Methods Enzymol. 303: 205-233.

Dean, W., Bowden, L., Aitchison, A., Klose, J., Moore, T., Meneses, J.J., Reik, W. and Feil, R. (1998) Altered imprinted gene methylation and expression in completely ES cell-derived mouse fetuses: association with aberrant phenotypes. Development 125: 2273-2282.

DeRisi, J., Penland, L., Brown, P.O., Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A. and Trent, J.M. (1996) Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genet. 14: 457-460.

DeRisi, J.L., Iyer, V.R. and Brown, P.O. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278: 680-686.

Eickhoff, H. (1998) Drug Discovery Today, Vol. 3, pp. 148-149.

Eickhoff, H., Ivanov, I. and Lehrach, H. (2000) In Saluz, H.P. (Ed.). Technical System Management in Microsystem Technology: a powerful tool for biomolecular studies. Birkhauser Verlag.

Gauss, C., Kalkum, M., Lowe, M., Lerhrach, H. and Klose, J. (1999) Analysis of the mouse proteome. (I) — Brain proteins: Separation by two-dimensional electrophoresis and identifica- tion by mass spectrometry and genetic variation. Electrophoresis 20: 575-600.

Heller, R.A., Schena, M., Chai, A., Shalon, D., Bedilion, T., Gilmore, J., Woolley, D.E. and Davis, R.W. (1997) Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155.

Herwig, R., Poustka, A., Miiller, C., Bull, C., Lehrach, H. and O’Brien, J. (1999) Large-scale clusterig of cDNA-fingerprinting data. Genome Res. 9: 1093-1105.

Humphery-Smith, I. (1999) Replication-induced protein synthesis and its importance to prote- omics. Electrophoresis 20: 653-659.

Janke, C., Holzer, M., Klose, J. and Arendt, T. (1996) Distribution of isoforms of the microtube- associated protein tau in gray and white matter areas of human brain — a two-dimensional gel- electrophoretic analysis. FEBS Lett. 379: 222-226. }

Jordan, B.R. (1998) Large-scale expression measurement by hybridization methods: From high- density membranes to ‘DNA chips’. J.. Biochem. 124: 251-258.

Jungblutt, P.R., Otto, A., Favor, J., Lowe, M., Muller, E.C., Kastner, M., Sperling, K. and Klose, J. (1998) Identification of mouse crystallins in 2D protein patterns by sequencing and mass spectrometry. Application to cataract mutants. FEBS Lett. 435: 131-137.

Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. Humangenetik 26: 231-243.

Klose, J. (1999a) Genotypes and phenotypes. Electrophoresis 20: 643-652.

Klose, J. (1999b) Fractionated extraction of total tissue proteins from mouse and human for 2-D electrophoresis. Methods Mol. Biol. 112: 67-85.

Klose, J. (1999c) Large-gel 2-D electrophoresis. Methods Mol. Biol. 112: 147-172.

Klose, J. and Kobalz, U. (1995) Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16: 1034-1059.

Klose, J., Nock, C., Biissow, K., Lowe, M., Schalkwyk, L.C., Rastan, S., Brown, S., Himmbelbauer, H. and Lehrach, H. (2000) Gene mapping by protein mapping. Connecting proteome and genome of the mouse. In preparation.

Lehrach, H., Drmanac, R., Hoheisel, J., Larin, Z., Lennon, G., Monaco, A.P., Nizetic, D., Zehetner G. and Poustka, A. (1990) Hybridisation fingerprinting in genome mapping and sequencing. Genome Anal. Genet. Phys. Map. 1: 39-81.

Lehrach, H., Bancroft, D. and Maier, E. (1997) Robotics, computing, and biology. An inter- disciplinary approach to the analysis of complex genomes. Jnterdisciplinary Science Reviews 22(1): 37-44.

Lennon, G.G. and Lehrach, H. (1991) Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends Genet. 7: 314-317.

Lennon, G., Auffray, C., Polymeropoulus, M. and Soares, M.B. (1996) The IMAGE consortium: An Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression. Genomics 33: 151-152. Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Bussow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein

microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem. 270: 103-111.

第 一 章 ， 基 因 组 学 与 蛋白 质 组 学 本

Meier-Ewert, S., Maier, E., Ahmadi, A., Curtis, J. and Lehrach, H. (1993) An automated approach to generating expressed sequence catalogues Nature 361: 375—376.

Meier-Ewert, S., Lange, J., Gerst, H. et al. (1998) Comparative gene expression profiling by oligonucleotide fingerprinting. Nucleic Acids Res. 26: 2216-2223.

Neubauer, G., King, A., Rappsilber, J., Calvio, C., Watson, M., Ajuh, P., Sleeman, J., Lamond, A. and Mann, M. (1998) Mass spectrometry and EST database searching allows characterisation of the multi-protein spliceosome complex. Nature Genet. 20: 46—S0.

Nock, C., Gauss, C., Schalkwyk, L.C., Klose, J., Lehrach, H. and Himmelbauer, H. (1999) Technology development at the interface of proteome research and genomics: Mapping nonpolymorphic proteins on the physical map of mouse chromosomes. Electrophoresis 20: 1027-1032.

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional gel electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021.

Poustka, A. J., Herwig, R., Krause, A., Hennig, S., Meier-Ewert, S. and Lehrach, H. (1999) Toward the gene catalogue of sea urchin development: The construction and analysis of an unfertilized egg cDNA library highly normalized by oligonucleotide fingerprinting. Genomics 59: 122-

133.

Radelof, U., Hennig, S., Seranski, P., Steinfath, M., Ramser, J., Reinhardt, R., Poustka, A., Francis, F. and Lehrach, H. (1998) Preselection of shotgun clones by oligonucleotide fingerprint- ing: an efficient and high throughput strategy to reduce redundancy in large-scale sequencing projects. Nucleic Acids Res. 26: 5358-5364.

Ramsay, G. (1998) DNA chips: state-of-the-art. Nature Biotechnol. 16: 40-44.

Romer, I., Reik, W., Dean, W. and Klose, J. (1997) Epigenetic inheritance in the mouse. Curr. Biol. 7: 277-280.

Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. and Brown, P.O. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470.

Schena, M., Shalon, D., Heller, R., Chai, A., Brown, P.O. and Davis, R.W. (1996) Parallel humqn genome analysis: Microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619.

Schena, M., Heller, R. A., Theriault, T. P., Konrad, K., Lachenmeier, E. and Davis, R. W. (1998) Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics. Trends Biotechnol. 16: 301-306.

Shalon, D., Smith, S.J. and Brown, P.O. (1996) A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res. 6: 639-645.

Trent, J.M., Bittner, M., Zhang, J. et al. (1997) Use of microgenomic technology for analysis of alterations in DNA copy number and gene expression in malignant melanoma. Clin. Exp. Immunol. 1: 33-40.

Uetz, P., Giot, L., Cagney, G. et al. (2000) A comprehensive analysis of protein-protein inter- actions in Saccharomyces cerevisiae. Nature 403: 623-627.

Velculescu, V.E., Zhang, L., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1995) Serial analysis of gene expression. Science 270: 484-487.

Walter, G., Biissow, K., Cahill, D., Lueking, A. and Lehrach, H. (2000) Protein arrays for gene expression and molecular interaction screening. Curr. Opin. Microbiol. 3: 298-302.

Wanker, E.E., Rovira, C., Scherzinger, E., Hasenbank, R., Walter, S., Tait, D., Colicelli, J. and Lehrach, H. (1997) Hip-I — a Huntingtin interacting protein isolated by the yeast two-hybrid system. Human Mol. Genet. 6: 487-495.

Wasinger, V.C., Cordwell, S.J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J.X., Gooley, A.A., Wilkins, K.L. and Humphery-Smith, I. (1995) Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis 16: 1090-1094.

Welford, S.M., Gregg, J., Chen, E., Garrison, D., Sorensen, P.H., Denny, C.T. and Nelson, S.F. (1998) Detection of differentially expressed genes in primary tumor tissues using representa- tional differences analysis coupled to microarray hybridization. Nucleic Acids Res. 26: 3059- 3065.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1996) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a gneome should be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Engin. Rev. 13: 19-50.

ee ”和 蛋白质 组 学

Wolfsberg, T.G. and Landsman, D. (1997) A comparison of expressed sequence tags (ESTs) to human genomic sequences. Nucleic Acids Res. 25: 1626-1632.

Zehetner, G. and Lehrach, H. (1994) The Reference Library System — sharing biological material and experimental data. Nature 367: 489-491.

第 二 章 ”基因 表达 的 检测 方法 S. J. Blakemore, D. M. Wallace and M. K. Trower

1. 绪论

信使 RNA (messenger RNA, mRNA) —ial 20 世纪 60 年 代 初 期 产生 的 ， 用 来 描 述 一 类 特定 的 细胞 RNA， 它 们 作为 运送 者 ， 将 遗传 信息 从 细胞 核 送 至 细胞 质 的 蛋白 质 amd (RK) 内 ， 在 此 被 翻译 成 蛋白 质 。 长 期 以 来 ， 一 直 认 为 mRNA 在 决定 细胞 产生 的 蛋白 质 的 种 类 和 数量 过 程 中 起 关键 作用 (OLA 2.1)。 事 实 上 ， 不 同 种 类 细胞 中 蛋

2.1 遗传 信息 从 细胞 核 内 的 DNA 传送 到 蛋白 质 合成 的 过 程 。 细胞 质 中 可 以 被 翻译 的 mRNA 决定 了 那些 可 以 在 任何 指定 时 间 由 细胞 及 时 “生产 ”出 来 的 蛋白 质 的 状态 。 此 mRNA 池 的 特性 是 由 特定 的 细胞 生命 过 程

的 效率 决定 的 〈1 一 5)。

- 24 - - 蛋白质 组 学

白质 的 差别 反映 了 细胞 生长 发 育 过 程 中 表达 的 mRNA 的 种 类 和 数量 ( 丰 度 ) 的 差别 。 核酸 杂交 动力 学 研究 提示 了 这 一 点 ， 研 究 发 现 cDNA (与 mRNA 互补 的 DNA 拷贝 ) 与 同一 组 织 来 源 的 EDNA 的 复 性 速度 远 快 于 与 不 同 组 织 来 源 的 CDNA 的 复 性 速度 (Hastie and Bishop，1976) 。 一 且 认 识 到 不 同 组 织 / 细 胞 类 型 的 mRNA 群体 差异 ， 那 么 确定 这 种 差异 到 底 是 什么 就 变 得 重要 了 。 因 此 很 明显 ， 我 们 需要 能 对 生物 样品 中 特定 种 类 的 owndsnSugmtevkaweman 选择 性 (如 Northern 杂交 ) 而 简单 易 行 。 应 用 这 种 一 个 一 个 基因 的 分 析 方 法 发 现 ， 些 转录 物 在 特定 的 组 织 中 高 丰 度 表达 而 在 其 他 组 织 中 不 表达 ， 某 些 基 因 在 许多 、 甚 至 所 有 的 组 织 中 的 表达 量 都 相对 恒定 。 作 为 Northern 杂交 的 补充 ， 后 来 发 展 了 其 他 一 些 mRNA 定量 方法 ， 比 如 核糖 核酸 酶 保护 法 、 定 量 反 转录 酶 PCR (RT-PCR)。 然 而 ， 每 种 方法 都 局 限 在 只 能 针对 相对 少数 的 基因 。 最 近 5 年 中 技术 的 进步 产生 了 一 些 能 在 基因 组 水 平 (大 量 ) 定量 分 析 mRNA 的 方法 ， 与 过 去 一 次 分 析 一 个 基因 相 比 ， 它 们 能 同时 分 析 成 百 上 千 个 基因 。 发 展 这 些 技术 的 初衷 是 希望 能 洞察 生物 学 变化 的 根本 原因 一 一 基 因 组 水 平 的 整体 行为 〈 一 个 典型 的 哺乳 动物 细胞 大 约 表达 15 000 个 不 同 的 mRNA). & 种 高 通 量 mRNA 定量 技术 的 发 展 得 益 于 PCR、 大 规模 cDNA 文库 测序 和 核酸 从 头 合成 等 技术 方法 的 进步 。 差 异 显 示 PCR (DD-PCR)、 基 因 表 达 系 列 分 析 (serial analysis of gene expression, SAGE) 和 DNA 阵列 杂交 等 方法 在 检测 灵敏 度 和 凭借 RNA 量 来 检测 基 因数 等 方面 比 Northern 杂交 具有 明显 的 优势 。 本 章 将 讨论 这 些 方法 的 细节 、 它 们 之 间 相对 的 优 缺 点 。

需要 指出 的 是 ， 目 前 所 有 mRNA 定量 技术 都 只 提供 了 实验 性 的 、 而 非 稳定 状态 下 mRNA 绝对 量 的 信息 ; 不 过 这 对 于 检测 mRNA 表达 水 平 的 变化 来 说 ， 已 经 足够 了 。

在 关于 蛋白 质 组 学 的 论著 中 需要 指出 的 是 ， 检 测 两 个 生物 样品 中 特定 mRNA 表达 丰 度 的 差异 并 不 一 定 决定 于 对 应 的 蛋白 质 的 量 的 差异 。 早 在 20 世纪 60 年 代 ， 人 们 已 经 认识 到 原核 生物 中 几乎 所 有 的 基因 表达 调控 都 发 生 在 转录 水 平 。 尽 管 对 于 真 核 生 物 而 言 ， 通 常情 况 下 伴随 着 mRNA 的 增加 (或 减少 )， 其 编码 的 蛋白 质 也 相应 地 增加 〈 或 减 少 )， 但 是 蛋白 质 改变 的 程度 和 动力 学 常常 是 不 可 预见 的 。 因 此 当 研 究 对 象 是 真 核 生物 时 就 需要 精心 明 辨 ， 不 能 仅仅 以 mRNA 的 数据 为 基础 就 得 出 蛋白 质 水 平 的 结论 。 蛋 息 质 水 平 的 变化 需要 通过 酶 联 免疫 吸附 、Western 杂交 或 蛋白 质 组 学 研究 来 确证 。

2. DNA 阵列 杂交

判定 mRNA 水 平 最 常用 的 方法 是 将 标记 的 核酸 〈 代 表 一 种 mRNA 样品 ) SAREE 相 支持 物 上 的 CDNA 或 寡 核 苷 酸 序列 进行 杂交 。 杂 交 后 每 个 点 的 标记 强度 就 代表 了 特定 序列 的 表达 水 平 。 用 不 同 来 源 的 mRNA 所 制备 的 探 针 与 相同 的 阵列 进行 杂交 后 可 以 比 较 对 应 点 的 杂交 信号 强度 。 这 就 是 检测 某 个 点 的 DNA 序列 (GER) 特异 性 的 mRNA 的 表达 差异 的 方法 。 通 过 比较 两 个 阵列 所 有 对 应 点 的 杂交 信和 号 强度 ， 就 可 以 同时 监测 数 千 个 基因 表达 的 改变 。 用 两 种 可 识别 的 不 同 的 标记 来 标记 需要 研究 的 两 组 mRNA， 就 能 在 同一 个 阵列 上 同时 进行 杂交 ( 见 本 书 彩 插图 2.2); 比较 每 个 点 两 种 信和 号 的 强度 便 是 差 异 杂 交 法 。 阵 列 上 序列 的 覆盖 范围 限制 了 这 些 方法 的 使 用 ， 这 样 如 果 一 个 特定 的 基因 没 有 对 应 序列 来 代表 ， 那 么 显然 它 就 不 可 能 被 检测 到 。 所 以 制作 阵列 时 选择 何 种 DNA 对

第 二 章 “基因 表达 的 检测 方法 sila

于 任何 研究 工作 都 是 至 关 重 要 的 。 这 种 基于 阵列 的 mRNA 定量 方法 称 作 “ 封 闭 体系 ”。

使 用 DNA 阵列 检测 mRNA 丰 度 非常 类 似 于 同时 进行 多 个 闭 向 Northern 杂交 。 Northern 杂交 将 RNA 固定 于 支持 物 上 ， 然 后 与 基因 特异 性 的 被 标记 的 DNA 进行 杂交 ， 而 DNA 阵列 法 是 将 基因 特异 性 的 DNA 固定 在 支持 物 上 ， 然 后 与 来 源 于 RNA 的 被 标记 探 针 杂交 。 阵 列 技术 的 优势 来 源 于 这 样 一 个 事实 ， 即 数 千 个 基因 (点 状 印记 ) 能 同时 检 测 。 具 有 代表 性 的 是 ， 这 数 千 个 基因 是 以 高 密度 自动 化 地 印记 到 尼龙 膜 或 玻璃 片上 的 。 目前 ， 玻 璃 片上 能 实现 的 点 密度 更 高 ， 从 而 在 不 牺牲 检测 灵敏 度 的 前 提 下 ， 增 加 检测 基 因 的 数量 。DNA 阵列 按照 用 以 构建 阵列 的 DNA 的 化 学 本 质 可 分 为 变性 的 PCR 产物 ( 源 自 cDNA 文库 ) 得 核 苷 酸 两 类 。 所 以 构建 阵列 需要 cDNA 克隆 或 序列 信息 〈 用 以 设计 有 代表 性 的 窒 核 苷 酸 )。 因 此 阵列 的 设计 受到 我 们 现 有 的 关于 构成 某 个 物种 基因 组 的 基因 知识 的 限制 〈 杂 交 按 照 物 种 特异 的 方法 进行 )。 对 于 那些 整个 基因 组 都 已 完成 序 列 测定 的 物种 ， 比 如 酵母 、 大 肠 杆菌 、 结 核 杆菌 〈 完 成 序列 测定 的 基因 组 列表 见 基因 与 基因 组 京都 百科 全 书 ，http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html)， 基 于 阵列 的 技术 能 涵盖 整个 基因 组 ， 是 有 效 的 “开放 系统 ”。 应 用 DNA 阵列 技术 对 酵母 (Wodicka et al., 1997), KAG*FR (Richmond et wz .，1999)、 结 核 杆 菌 (Behr et al., 1999) 进行 的 基因 组 范围 的 表达 谱 实 验 结果 已 经 公开 发 表 。 然 而 对 于 人 、 小 鼠 和 大 鼠 等 物种 ， 要 等 它们 各 自 的 基因 组 序列 完成 后 才能 开展 基因 组 范围 的 阵列 研究 。

当 你 计划 开始 基于 DNA 阵列 的 实验 时 ， 另 外 一 个 主要 问题 是 ， 怎 样 将 RNA 转换 成 标记 探 针 并 进行 杂交 。 以 mRNA 或 总 RNA 为 起 始 模板 标记 探 针 的 方法 有 很 多 种 ， 这 其 中 包括 cDNA 第 一 链 合成 〈 以 锚 定 的 oligo-dT 或 随机 十 守 核 苷 酸 为 引物 )， 或 者 结合 进一步 的 用 T7RNA 聚合 酶 或 PCR 进行 核酸 扩 增 。 用 放射 性 同位 素 (如 ?PP 或 3P) Mx 光 素 (如 Cy3 和 Cy5) 标记 的 核 苷 酸 来 标记 探 针 ， 前 者 通常 用 于 尼龙 膜 ;， 后 者 用 于 玻璃 片 阵 列 。 每 种 方法 有 各 自 最 佳 的 RNA 用 量 ， 比 如 cDNA 第 一 链 合成 约 需 2 一 Surg PolyA RNA， 而 PCR 扩 增 法 最 少 用 25 ng 的 总 RNA 就 足够 了 (Gonzalez et al., 1999). BER 关于 目前 的 条 件 或 参数 的 系统 比较 未 见报 道 ， 就 没有 一 种 “标准 方法 ”。PCR 扩 增 法 值 得 关注 ， 包 括 对 高 丰 度 的 转录 物 进行 非 线 性 扩 增 的 可 能 性 ， 可 以 达到 数量 上 的 亚 最 佳 标 记 的 序列 特异 性 扩 增 。 然 而 最 近 的 证 据 显 示 或 许 这 些 关注 是 没有 理由 的 (Endege et 咏 .，1999)。 不 考虑 技巧 问题 ， 不 同 阵 列 的 灵敏 度 看 来 差不多 一 一 使 用 PolyA RNA 为 模 板 ， 能 辨别 10° mRNA 中 的 1 个 ( 约 每 个 细胞 2 一 5 个 mRNA HI).

当 使 用 一 种 标记 来 鉴别 不 同样 品 中 差异 表达 的 基因 mRNA 时 ， 操 作 过 程 相 对 简单 : 标记 后 的 RNA (来 源 于 两 个 或 多 个 样品 ) 用 于 相同 的 DNA 阵列 杂交 ， 然 后 比较 影像 之 间 对 应 点 的 强度 (考虑 到 比 活 的 差异 先 归 一 化 )。 另 一 个 常用 的 技术 是 使 用 两 种 可 辨别 的 不 同 标 记 〈 如 分 别 用 Cy3 和 CyS 标记 两 种 mRNA 样品 )， 在 同一 个 玻璃 片 阵 列 上 用 不 同 标记 制备 的 探 针 进 行 杂 交 。 两 种 有 各 自 特 征 性 发 射 波长 的 荧光 标记 能 彼此 区 分 开 ， 使 在 同一 个 阵列 上 检测 差异 杂交 成 为 可 能 。 每 个 点 的 荧光 比例 给 出 了 序列 特异 的 竞争 性 杂 交 结 果 。 与 以 前 的 方法 相 比 ， 单 一 阵列 技术 主要 的 优势 在 于 可 以 减少 由 于 不 同 阵列 间 细 微 的 差别 产生 的 影响 。 然 而 ， 使 用 单一 阵列 双重 杂交 的 缺点 是 得 到 的 比率 结果 只 在 特定 的 数据 中 有 效 。 比 如 ， 对 于 不 同时 间 点 的 取样 用 Cys 标记 ， 分 别 和 以 Cy3 标记 的 零 时 间 点 的 参照 mRNA 一 起 与 不 同 的 阵列 进行 杂交 。 由 于 不 同 的 研究 使 用 不 同 的 参照 样本 ，

Soa . 蛋白质 组 学

把 不 同 研究 的 结果 整合 起 来 的 能 力 就 打折 扣 了 。

用 单一 或 双重 标记 方法 获得 的 强度 和 (或 ) 比率 值 被 储存 在 数据 库 中 ， 进 行 计算 机 分 析 和 不 同 数 据 组 间 的 比较 。 使 用 特定 的 以 基因 阵列 为 基础 的 技术 其 主要 优势 在 于 对 于 数据 进行 多 元 统计 分 析 时 相对 简单 〈 例 如 时 间 效 应 、 剂 量 效应 和 其 他 多 样本 数据 )。 例 如 在 时 间 效 应 的 情况 下 ， 将 表达 动力 学 近似 的 基因 进行 聚 类 的 方法 能 使 我 们 观察 到 基因 表达 的 协同 调控 〈Iyer et a! .，1999)。 统 计 分 析 应 用 于 多 基因 表达 谱 数据 的 另 一 个 例子 是 用 于 重新 划分 淋巴 癌 的 类 型 和 亚 类 (Golub et wz .，1999)。 对 基因 表达 数据 进行 多 元 分 析 可 能 发 现 基 因 表 达 的 相关 性 ， 而 这 仅仅 通过 比较 二 元 的 杂交 数据 组 是 无 法 实现 的 (例如 疾病 组 织 与 对 应 的 正常 组 织 ， 处 理 和 未 处 理 的 细胞 )。 记 今 为 止 ， 已 经 公开 发 表 的 多 元 基因 表达 分 析 的 例子 主要 是 基于 阵列 分 析 数 据 (Alizadeh et al., 1999; Fambrough et al., 1999; Golub et al., 1999; Heller et al., 1997; Iyer et al., 1999; Perou et al., 1999)， 人 惟一 的 例外 是 应 用 RT-PCR 提取 的 数据 。 事 实 上 ， 与 其 他 技术 平台 (如 SAGE, 数字 基因 表达 谱 分 析 和 差异 显示 PCR) 相 比 ， 基 于 阵列 的 方法 其 优势 是 能 相对 容易 地 对 数据 进行 多 元 统计 分 析 。

随 着 数据 库 中 基因 表达 数据 大 量 累加 ， 人 们 和 希望 对 于 基因 调控 的 发 现 能 够 更 加 准确 和 有 灵敏。 也 就 是 说 这 不 仅 提 供 了 使 人 们 能 更 好 地 理解 基因 表达 调控 的 方法 ， 还 提供 了 基 因 的 生物 学 功能 网 络 的 线索 。 相 似 疾病 (如 炎症 ) 的 基因 表达 谱 的 确定 可 以 对 它们 的 分 子 病理 学 更 精确 得 理解 。 然 而 ， 必 须 先 确定 一 些 标准 化 的 形式 以 便 进行 不 同 组 间 结 果 的 交叉 比较 。 对 于 所 有 不 同 技术 平台 产生 “标准 化 表达 数据 组 ”的 最 佳 方法 仍 在 争论 中 。 最 近 ， 欧 洲 生 物 信息 学 研究 所 (http://www. ebi.ac. uk/arrayexpress/) 和 美国 国家 生物 工程 信息 中 心 (NCBI; Marshall，1999) 都 表示 计划 提供 一 个 公共 数据 库 对 基于 阵列 的 杂交 数据 进行 储存 和 分 析 。

2.1 cDNA 阵列

cDNA 阵列 由 源 自 cDNA 文库 的 PCR 产物 组 成 ， 由 机 器 人 点 到 固体 支持 物 的 CDNA 阵列 可 以 用 不 明确 的 cDNA 文库 (cDNA 序列 未 知 ) 或 明确 的 cDNA 文库 (cDNA 序列 已 知 ) 来 建立 。 使 用 明确 的 CDNA 文库 有 两 个 主要 优势 : 第 一 ， 能 在 阵列 上 检测 是 否 存 在 对 于 某 特定 研究 来 说 “ 感 兴趣 的 基因 ” (如 阳 / 阴 性 对 照 ); 第 二 ， 人 快速 将 杂交 数据 映 射 到 基因 注释 加 速 了 结果 分 析 。 使 用 另 一 种 不 明确 的 CDNA 来 源 需 要 对 那些 表现 出 差异 杂交 的 克隆 进行 测序 来 确定 基因 的 差异 表达 。 此 过 程 费 时 且 效 率 低 ， 因 为 同一 个 基因 可 能 被 重复 检测 (尤其 是 用 “标准 ”的 宛 余 cDNA 文库 作为 阵列 的 原始 材料 )。 当 设计 cDNA 阵列 时 通常 使 用 3"cDNA 序列 来 代表 基因 。 它 们 可 能 源 自 非 蛋 白 编 码 区 ， 在 基因 家 族 的 成 员 之 间 ， 非 蛋白 编码 区 通常 比 编码 区 差别 更 大 。 选 择 这 样 的 3"cDNA 减少 了 基 因 家 族 相关 成 员 交 叉 杂 交 的 可 能 性 ， 尤 其 在 序列 相似 性 很 强 的 情况 下 。

建立 一 个 cDNA 阵列 生产 、 杂 交 和 基因 表达 数据 分 析 的 便捷 流程 需要 相当 的 生物 信 息 学 支持 。 精 确 和 可 靠 的 计算 机 系统 是 整个 过 程 各 个 阶段 的 基础 。 这 包括 选择 用 于 阵列 的 EDNA， 样 品 跟踪 以 确定 cDNA 位 于 正确 的 阵列 对 应 点 上 上， 测量 所 有 点 杂交 信和 号 强

度 ， 把 杂交 结果 保存 到 数据 库 中 〈 把 杂交 信和 号 与 基因 注释 相连 )， 以 及 后 续 的 数据 分 析 。

由 NCBI 开 发 并 正在 用 于 cDNA 阵列 数据 分 析 的 ArrayDB (Ermolaeva et al .，1998)， 就

第 二 章 ”基因 表达 的 检测 方法 - 27>

是 此 类 系统 的 一 个 例子 。 发 展 这 样 一 个 cDNA 阵列 工具 目前 很 少 实验 室 涉 及 ， 因 为 机 器 人 技术 和 生物 信息 学 基础 建设 耗资 巨大 。 因 此 ， 尽 管 cDNA 阵列 技术 原创 的 发 展 主要 在 依托 于 大 学 的 Hans Lehrach 实验 室 (Gress et al., 1996; Maier-Ewett et al., 1993; Ze- hetner and Lehrach, 1994) 和 Pat Brown 实验 室 (Schena et al., 1995, 1996; Shalon et az.，1996)， 目 前 大 多 数 阵列 设备 分 布 于 生物 技术 公司 、 大 型 制药 集团 和 一 些 专门 的 研 FPL, REN, MIRAGE cDNA 阵列 应 用 于 检测 差异 表达 基因 的 潜力 ， 这 意味 着 大 多 数 研 究 人 员 目 前 还 不 能 方便 地 用 到 这 一 技术 。 不 过 ， 这 种 情形 会 改变 ， 伴 随 着 更 多 的 实验 室 应 用 这 一 技术 ， 成 本 可 能 下 降 。 事 实 上 ，Pat Brown 实验 室 的 网 站 (http:// cmgm. stanford.edu/pbrown/) 已 经 提供 了 一 种 阵列 仪 的 产品 信息 ， 价 格 比 DNA 自动 测 序 仪 低 得 多 (US$ 23 000)。 对 于 研究 人 员 来 说 ， 拥 有 一 套 便 捷 的 阵列 工具 的 基本 的 优 势 是 能 根据 需要 构建 阵列 。 另 外 ， 通 过 从 商业 公司 购买 阵列 分 析 软 件 ， 例 如 Research Genetics Inc. (http://www.researchgenetics. comy/ ) . Genome Systems Inc. (http://www. genomesystems. comy/ ) , Clontech( http://www. clontech. com/)#% NEN(Chttp://www.nen- lifesci. comy ) ,或 者 通过 与 商业 的 cDNA 阵列 服务 提供 商 合 作 [ 如 Incyte Pharmaceuticals Inc. (http://gem. incyte. com/gem/index. shtml) 或 Research Genetics Inc. ], 以 cDNA 阵 列 为 基础 的 研究 在 不 用 投资 于 所 有 技术 的 情况 下 仍 可 进行 。

该 领域 论文 数量 的 日 益 增 长 证 明了 cDNA 阵列 在 提供 新 的 生物 学 信息 方面 的 效用 ， 例如 肿瘤 基因 表达 谱 的 研究 (DeRisi et al., 1996, Golub et al., 1999; Moch et al., 1999; Perou et al., 1999), —?PKRBHRG RitEBAN LM (Aitman et al., 1999), 生理 周期 中 神经 系统 基因 表达 变化 的 检测 (DeRisi et al., 1996, Golub et al., 1999; Moch et al., 1999; Perou et al .，1999)， 哮 喘 中 淋巴 细胞 基因 表达 改变 的 检测 ( Syed et al .，1999)。 作 为 这 一 技术 能 提供 新 的 生物 学 洞察 力 的 一 个 证 据 是 ， 利 用 一 个 含有 8613 基因 的 阵列 研究 静止 培养 的 人 成 纤维 细胞 对 于 血清 的 反应 〈 一 种 成 熟 的 细胞 周期 控制 模型 ) (Iyer et wz .，1999)。 许 多 被 发 现 早期 产生 表达 变化 的 是 那些 对 于 血清 产生 增殖 反应 的 相关 基因 〈 如 转录 因子 fosjun)。 然 而 ， 在 较 晚 的 时 间 点 ， 典 型 的 伤口 愈合 反应 的 基因 表达 变化 出 人 意料 地 出 现 了 ， 例 如 诱导 产生 血管 内 皮 生 长 因子 (启动 血管 生 成 ) 和 成 纤维 细胞 生长 因子 7 (刺激 上 皮 再 形成 )。 作 者 推断 这 些 细胞 暴露 于 血清 中 的 主 要 效应 是 伤口 愈合 反应 ， 建 议 以 此 作为 此 类 研究 的 体外 模型 。 因 此 ， 通 过 多 基因 杂交 ， 这 一 研究 在 成 纤维 细胞 对 于 血清 的 生物 学 反应 方面 提供 了 以 往 未 知 的 重要 新 发 现 。，

Mink, cDNA 阵列 能 用 来 构建 任何 物种 的 转录 图 谱 (只 要 有 合适 的 DNA 文 库 )， 同 时 监控 成 千 上 万 个 基因 序列 ， 简 化 完整 的 数据 分 析 ， 建 立 结果 数据 库 。 然 而 cDNA 阵列 仅 能 对 那些 全 基因 组 序列 已 知 的 物种 提供 基因 组 范围 的 检测 。 阵 列 产品 和 建 立 生 物 信息 学 体系 的 成 本 令 大 多 数 实 验 室 望 而 却步 ， 进 而 导致 这 一 技术 使 用 的 限制 。

2.2 BeBe

EVE APACE RET , SEER ES CDNA 阵列 相似 〈 见 2.1 部 分 )。 两 者 都 是 由 以 高 密度 点 在 固体 和 矩阵 〈 如 玻璃 片 ) 上 的 DNA 组 成 ， 用 于 基于 杂交 的 基因 表达 谱 的 分 析 。 与 排列 来 源 于 cDNA 克隆 的 PCR 产物 不 同 的 是 ， 守 核 苷 酸 阵列 由 合成 的 基因 特异 性 的 寡 核 苷 酸 组 成 。 本 章节 重点 分 析 这 两 种 形式 的 EDNA 阵列 之 间 的 优势 和 弱点 。

Ga - 蛋 日 质 组 学

BRP REANNEKRRAAN EKER (通常 20 一 25 个 核 苷 酸 ) 含有 足够 的 序 列 复杂 性 来 实现 选择 性 地 杂交 单一 转录 物 。 在 实际 操作 过 程 中 ， 代 表 一 个 基因 不 同 区 域 的 多 个 究 核 苷 酸 被 点 到 阵列 上 。 显 然 ， 守 核 苷 酸 阵列 的 建立 需要 事先 了 解 表达 的 序列 情 况 ， 这 就 把 它 的 应 用 范围 限制 在 基因 组 表达 序列 测定 完成 的 物种 。cDNA 阵列 则 不 同 ， 一 个 完全 未 知 的 CDNA 文库 可 以 用 来 作 表 达 谱 分 析 。 不 过 守 核 苷 酸 阵列 的 使 用 意味 着 无 须 小 心 翼 翼 地 保存 cDNA 克隆 和 PCR 产物 ， 从 而 简化 了 精确 制作 阵列 的 后 勤 工 作 。 事 实 上 ， 直 接 在 心 片上 合成 齐 核 苷 酸 能 把 阵列 误差 的 风险 降 到 最 低 点 。 有 一 些 辅助 阵列 设 计 的 方法 能 为 一 种 转录 物 提 供 惟 一 的 序列 特异 性 (Wodicka et wz .，1997)。 这 些 程序 能 在 已 有 的 基因 组 序列 信息 基础 上 进行 序列 的 最 佳 选择 ， 从 而 减少 由 于 交叉 杂交 造成 的 假 象 。 交 叉 杂 交 的 影响 在 cDNA 阵列 并 不 容易 去 除 。 ，

一 旦 选 定 了 守 核 苷 酸 来 代表 需要 研究 的 基因 ， 有 两 种 基本 的 方法 制作 阵列 : 与 cDNA 阵列 相似 由 机 器 人 将 预先 合成 的 守 核 苷 酸 点 成 阵列 ; 或 直接 将 DNA 合成 在 阵列 表面 ， 这 一 技术 有 一 家 美国 的 生物 技术 公司 Affymetrix (http://www. affymetrix. com/) (Lockhart et al., 1996) FFA, Affymetrix 的 方法 能 制作 高 点 密度 的 阵列 (10° 点 /cm2) (McGall et al., 1996), REBLAEA RAKARITE (310° A/cm?) (Yershov etal., 1996) 高 。 目 前 ， 用 以 前 的 方法 设计 和 制作 阵列 相当 昂贵 ， 限 制 了 潜在 用 户 的 使 用 ， 此 法 在 以 照相 平版 技术 直接 将 DNA 合成 到 阵列 过 程 中 产生 阵列 特异 性 的 遮盖 物 ， 使 得 该 技术 无 法 灵活 应 用 。 然 而 ， 最 近 一 篇 报道 讲述 了 一 种 能 降低 直接 在 玻璃 片上 合成 守 核 苷 酸 成 本 的 方法 ， 因 为 无 须 产 生 阵 列 特异 性 的 遮盖 物 (Singh-Gasson et al.， 1999), BRAREII KAIF cDNA 阵列 的 一 个 特点 是 能 包括 与 所 要 代表 的 基因 完全 匹 ACAI A SCS LAMAR ER. Affymetrix 的 阵列 应 用 了 这 一 技术 ， 包 括 一 个 单 核 苷 酸 错 配 的 寡 核 苷 酸 和 完全 匹配 的 守 核 苷 酸 。 以 此 来 研究 和 报告 杂交 特异 性 ， 为 每 个 基因 的 检 测 提 供 了 更 高 的 定量 准确 率 。

需要 指出 的 是 ， 朝 核 苷 酸 阵列 直接 提供 了 可 用 于 杂交 的 单 链 模板 ， 而 PCR 产物 必 须 首先 变性 以 提供 可 用 于 杂交 的 单 链 模板 。 为 使 EDNA 阵列 间 有 最 好 的 重复 性 ， 变 性 操 作 过 程 保 持 一 致 很 重要 一 一 这 一 点 在 寡 核 苷 酸 阵列 中 不 必 考 虑 。

用 mRNA 或 总 RNA 标记 探 针 的 方法 与 EDNA 阵列 相同 ， 最 常用 的 是 荧光 标记 线性 扩 增 (如 T7 RNA 聚合 酶 ) 产生 足够 的 具有 高 特异 活性 的 探 针 。 数 据 分 析 和 数据 库 流 程 与 cDNA 阵列 相同 〈 见 2.1 部 分 )。

应 用 守 核 苷 酸 阵 列 实例 包括 同时 检测 所 有 酵母 基因 的 表达 (Holstege et al., 1998; Wodicka et dz .，1997)， 发 现 小 鼠 受 体 酷 氨 酸 激酶 激活 的 信号 转 导 通路 的 元 余 (Fambor- ough et al .，1999)， 以 及 产 热 限制 对 于 小 鼠 骨 骼 肌 衰 老 的 影响 (Lee et al., 1999).

总 的 来 说 ， 宴 核 苷 酸 阵列 提供 了 一 种 与 DNA 阵列 相似 的 技术 ， 虽 然 昂贵 了 点 ， 但 具有 更 高 的 基因 特异 性 杂交 的 准确 率 。 随 着 基因 组 测序 计划 的 完成 ， 设 计 守 核 苷 酸 阵列 时 需要 事先 了 解 的 基因 序列 信息 将 会 变 得 随手 可 及 ， 不 再 成 为 一 个 主要 问题 。

3. 不 基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法

基于 DNA 阵列 的 mRNA 定量 方法 只 能 检测 阵列 上 存在 的 基因 ， 与 此 不 同 的 是 能 够 检测 生物 样品 中 所 有 转录 物 的 技术 通常 被 称 为 “开放 体系 "。 理 论 上 讲 ， 方 法 的 灵敏 度

第 二 章 ”基因 表达 的 检测 方法 。 29 ,2

和 可 供 实验 使 用 的 资源 是 该 方法 的 限制 因素 。 应 用 开放 体系 的 实验 可 以 用 于 任何 物种 而 无 须 事先 了 解 物种 特异 性 的 序列 信息 。

3.1 基于 序列 测定 的 方法 学

cDNA 文库 的 一 过 性 序列 测定 (First-pass sequencing of cDNA libraries) ， 作 为 人 类 基因 组 计划 的 一 部 分 ， 基 因 组 和 表达 产物 综合 分 子 生 物 学 分 析 联 盟 IMAGE (http:// www-bio. llnl. gov/bbrp/image/image. html) 构建 了 数 百 个 来 源 于 不 同 组 织 的 cDNA X 库 ， 并 测定 其 外 源 DNA 片段 序列 。 一 过 性 测定 的 序列 信息 〈 只 读 一 次 的 DNA 序列 通 常 测定 克隆 插入 片段 的 两 端 一 一 平均 读 取 200 ~ 300 bp) 存放 在 公共 数据 库 中 (由 NCBI 管理 的 Genbank 中 dbEST)。 也 有 类 似 的 秋 有 (如 Incyte 制药 有 限 公 司 和 人 类 基 因 组 科学 有 限 公 司 ，http://www.hgsi.com) 数据 库 。 这 些 努力 的 主要 目的 是 尽快 为 所 有 的 人 类 基因 确定 参考 序列 ， 每 个 一 过 性 测定 的 序列 代表 一 个 基因 的 表达 序列 标签 (expressed sequence tag, EST) (与 完整 的 全 序列 相对 )。 小 鼠 和 大 鼠 类 似 的 计划 在 全 球 各 基因 组 中 心 开 展 。 截 至 1999 年 11 月 (GenBank 版 本 号 115), dbEST 中 独立 的 登录 条 目 人 类 有 约 1 300 000， 小 鼠 513 000 AAR 115 000. cDNA 文库 中 每 一 个 被 测定 的 克隆 代表 用 于 构建 文库 的 原始 mRNA 中 的 一 个 独立 取样 。 因 此 ， 通 过 测定 文库 中 数 干 个 这 样 的 克隆 然后 计算 特定 基因 序列 出 现 的 频率 ， 就 有 可 能 估计 出 每 种 转录 物 的 相对 丰 度 。 由 于 这 一 方法 计算 代表 基因 的 EST (或 聚 类 后 的 EST) 数量 ， 因 此 给 出 的 资料 是 数字 化 的 。 理 论 上 讲 ， 精 确 mRNA 定量 中 可 实现 的 线性 范围 是 没有 界限 的 。 转 录 物 丰 度 精确 定量 方法 的 灵敏 度 是 测定 的 CDNA 文库 克隆 数量 的 函数 。 这 个 方法 的 魅力 在 于 它 能 够 用 于 任何 可 以 建立 cDNA 文库 的 生物 样品 ， 并 且 是 任何 有 高 通 量 DNA 测序 能 力 的 实验 室 都 可 以 实现 的 。 当 然 ， 也 有 一 些 缺 点 。 较 难 克隆 的 cDNA 无 法 准确 地 出 现在 cDNA 文库 中 ， 从 而 低估 了 它们 的 丰 度 。 其 次 ， 随 机 取样 使 高 丰 度 基因 被 频繁 地 反复 测 序 ， 甚 至 连 精确 检测 每 个 DNA 文库 中 的 中 丰 度 的 转录 物 也 需要 数 千 个 测序 反应 。 NCBI 提 供 了 基于 网 络 的 分 析 根 据 xProfiler(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ ncicgap/ cgapxpsetup. cgi) 和 数字 差异 显示 (http://www. ncbi. nlm. nih. gowUniGene/ddd. cgi? ORG= Hs)， 可 以 用 来 比较 来 源 于 数 百 个 DNA 文库 的 序列 数据 。 统 计 学 分 析 方 法 也 被 开发 出 来 以 帮助 解释 此 类 比较 的 结果 (Audic and Claverie 1997)。 简 单 地 说 ， 这 些 方法 表明 要 检测 两 个 cDNA 文库 中 转录 物 丰 度 统计 学 上 的 显著 差异 ， 一 个 给 定 的 文库 中 的 特 定 的 转录 物 必 须 被 测序 两 次 以 上 。 所 以 要 检测 一 个 在 20 000 个 转录 物 中 有 一 个 拷贝 的 转录 物 丰 度 统计 学 上 的 显著 差异 ， 至 少 要 对 cDNA 文库 完成 60 000 个 独立 的 测序 反应 。 这 个 测序 量 既 费 时 又 费 钱 ， 而 且 可 能 只 提供 了 中 丰 度 表达 基因 的 信息 (细胞 内 低 丰 度 转 录 物 在 100 000 拷贝 中 只 有 1 个 或 更 少 )。 这 些 实际 因素 限制 了 这 一 用 于 mRNA 定量 和 发 现 差 异 表 达 基 因 的 技术 的 使 用 。 不 过 ， 通 过 对 cDNA 文库 中 EST 频率 分 析 获 得 的 定 量 信 息 的 作用 已 经 被 以 下 研究 工作 证 实 : 人 前 列 腺 特异 基因 表达 的 检测 (Vasmatzis et 4&.，1998)， 神 经 生长 因子 处 理 后 PC-12 细胞 差异 表达 基因 的 确定 (ON A 和 synapsin 2) (Lee et al .，1995)。 在 人 类 造血 梯次 分 化 体系 中 也 得 到 证 实 (Claudio et az .，1998)。 在 所 有 的 事例 中 原始 的 实验 发 现 均 得 到 了 Northern 杂交 的 确认 。

总 之 ， 虽 然 司 始 于 cDNA 文库 的 一 过 性 测序 数据 对 mRNA 定量 确实 有 效 ， 但 因为

- 30 - ` 和 蛋白质 组 学

它 的 高 成 本 和 低 灵 敏 度 ， 在 大 多 数 情 况 下 它 并 不 是 首选 。 假 设 许 多 DNA 文库 的 信息 (dbEST) 以 及 比较 和 解释 此 类 资料 的 根据 都 能 免费 得 到 ， 计 划 要 开展 差异 mRNA 表达 研究 的 人 应 该 把 对 这 些 EST 的 “电子 比较 ”的 应 用 看 作 第 一 个 “沿途 停靠 的 港口 ”。 显 然 ， 只 有 当 序 列 数据 来 源 于 与 研究 者 相关 的 cDNA 文库 ， 这 一 方法 才 有 意义 。 这 一 方法 仅 适 用 于 标准 的 cDNA 信息 ， 而 不 适用 于 归 一 化 的 cDNA 文库 资料 ， 因 为 归 一 化 过 程 造 成 文库 中 cDNA 的 数量 表征 发 生根 本 变化 。

基因 表达 系列 分 析 一 -SAGE 基因 表达 系列 分 析 (serial analysis of gene expres- sion, SAGE) 方法 由 Bert Voglestein 实验 室 (Velculescu et al., 1995) 于 1995 年 首次 发 表 ， 是 一 种 基于 DNA 测序 的 用 于 mRNA 表达 丰 度 定量 的 技术 。SAGE 克服 了 通过 文 库 插入 片段 序列 测定 进行 基因 表达 分 析 技 术 的 主要 缺点 一 一 必须 测定 上 万 个 EDNA 克隆 以 保证 量 值 的 精确 度 〈( 见 前 述 )。SAGE 的 基本 原理 包括 分 离 代 表 每 个 转录 物 特 定 区 域 的 独特 的 短 序列 标签 (9 一 14 个 碱 基 )。 然 后 将 它们 串联 、 克 隆 、 测 序 〈( 见 图 2.3)。 所 有 标签 中 某 种 特定 序列 标签 出 现 的 频率 就 是 原始 材料 中 相应 的 mRNA 频率 的 度量 。 理 论 上 讲 一 个 含有 9 一 14 个 碱 基 的 序列 标签 能 提供 足够 的 序列 信息 来 确定 特定 的 mRNA (Velculescu et wz .，1995)。 比 如 ， 假 设 随 机 分 布 成 立 ，10 个 碱 基 的 排列 〈4") 产生 1 048 576 种 可 能 的 组 合 ，10 倍 于 组 成 人 类 基因 组 的 基因 的 数量 (Fields et al., 1994). 因此 ， 通 过 将 DNA 序列 长 度 降 到 有 信息 量 的 最 低 限 度 ， 使 效率 比 CDNA 文库 测序 方法 有 所 提高 : 测定 每 个 “序列 标签 串联 体 ” 的 序列 得 到 30~50 倍 的 基因 信息 〈(Bertelsen and Velculescu，1998 ) 。

像 EDNA 文 库 测 序 一 样 ，SAGE 资料 是 数字 化 的 ， 理 论 上 线性 范围 是 无 限 的 。 基 于 模拟 (Zhang et al., 1997) 和 统计 分 析 (Audic and Claverie, 1997) 的 方法 已 经 开发 出 来 ， 用 于 评估 来 源 于 两 个 生物 样品 的 序列 标签 丰 度 差异 的 意义 。 使 用 独立 的 方法 证 实 SAGE 序列 标签 频率 在 小 于 0.01% 到 大 于 0.1% 的 范围 内 是 mRNA 转录 物 丰 度 的 能 精 确 度量 (Madden et al., 1997; Velculescu et al .，1995，1997)。SAGE 的 应 用 包括 发 现 结肠 癌 细 胞 系 凋 亡 前 P53 诱导 基因 的 发 现 (Polyak et al., 1997) 和 正常 与 癌 细 胞 基因 表达 谱 的 分 析 (Zhang et al., 1997), BAH SAGE 应 用 实例 能 在 以 下 两 个 网 站 找到 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/SAGE/) 和 Genzyme Oncology (一 个 提供 SAGE 作为 商业 服务 的 生物 技术 公司 ) (http://www. genzyme. com/ prodserv/molecular— oncology/sage/ welcome. htm).

“标准 ”SAGE 方法 需要 近似 于 可 供 cDNA 文库 构建 所 需 的 RNA 量 (2.5~5.0 pg mRNA)。 这 把 SAGE 的 应 用 限制 在 启 始 的 生物 材料 很 多 的 情况 下 : 细胞 培养 体系 和 动 物 模 型 ， 而 非 人 临床 活 组 织 检 查 样品 和 微 切 割 样品 。 不 过 ， 最 近 微 SAGE (Datson et al., 1999) 的 出 现 提供 了 一 种 改良 的 SAGE 技术 ， 能 利用 少 至 5 ng 的 mRNA.

SAGE 技术 有 两 个 主要 的 缺陷 。 第 一 ， 由 于 用 短 序列 标签 辨别 每 个 转录 物 ， 高 质量 是 准确 确认 序列 的 根本 。 在 含有 10 个 核 背 酸 的 标签 中 1 个 碱 基 的 读 取 错 误 对 于 转录 物 确定 的 影响 (通过 BLAST 分 析 ) 远 比 一 个 200 碱 基 、 含 有 10% 错 误 率 的 一 过 性 测定 序 列 产生 的 影响 要 大 。 其 次 ， 用 标签 成 功 确定 原始 转录 物 的 能 力 直接 取决 于 每 个 物种 的 数 据 库 中 存储 序列 〈 特 别 是 3 端的 序列 ) 的 数量 。 因 此 ， 目 前 人 类 样品 的 SAGE 资料 解 释 要 比 小 鼠 或 大 鼠 的 容易 。

第 二 章 ，” 基因 表达 的 检测 方法 Poly A+ RNA 生物 素 标 记 的 AAAAA + mr oligo dT (1) cDNA 合成 i (2) (3) is x Fok | 连接 , PCRP 限制 性 酶 切 消化 ， 纯 化 双 标 签 并 连接 连接 子 (7) | | 克隆 并 测序 CATGCCTAGTCAGGCGACTTCACATGCCAAAGTGCTTTCGAGGACATGGAAGTCCTACGATCATGGCATG 一 一 一 一 一 标签 7 标签 2 标签 3 ”标签 4 标签 5 ”标签 6 ees lf eee ees NYS MERE A 双 标 签 B 双 标 签 C

图 2.3 基因 表达 系列 分 析 (SAGE) 方法 示意 图 步骤 1: 用 生物 素 -oligo dT 引物 将 PolyA+ 的 RNA 转换 为 cDNA。 步骤 2: 合成 的 cDNA 用 高 频 切割 的 限制 性 核酸 内 切 酶 ,“ 锚 定 酶 ”,( 如 Nia 于，4bp 识别 位 点 ， 平 均 256 核 苷 酸 一 个 酶 切 位 点 ) 消化 。 步 又 3: cDNA 的 3“ 端 被 生物 素 包 庄 的 磁 珠 捕获 。cDNA 池 被 一 分 为 二 (“A 池 ” 和 “B 池 ”)， 不 同 的 接头 被 连接 到 每 个 cDNA 池 中 。 步 又 4: 这 些 接头 含有 IIs 型 限制 性 核酸 内 切 RELL; tagging enzyme (如 此 命名 是 因为 它们 的 切割 位 点 离 识别 位 点 有 确定 的 碱 基数 ， 比 如 Fok 工 在 它 的 识别 位 点 下 游 13 个 碱 基 处 切割 ) 被 用 来 切割 EDNA/ 接 头 杂 合子 ， 释 放出 附着 在 接头 上 的 cDNA 短 序 列 标签 。 步 又 5: 接头 -标签 杂 合 分 子 尾 对 尾 相连 ，PCR 扩 增 (通过 接头 序列 ) 。 步 骤 6: 用 锚 定 酶 将 接头 从 双 标 签 上 去 除 , 纯化 双 标 签 并 将 它们 彼此 连接 形成 连接 子 (concatemer), FR7: 连接 子 克 隆 与 测序 ， 发 现 每 个 标签 的 特征 。

mh 人 in。

ene 蛋白 质 组 学

总 之 ，SAGE 被 广泛 应 用 于 任何 生物 学 体系 。 结 合 自 动 DNA 序列 分 析 和 足够 的 生 物 信 息 学 支持 ， 它 是 一 种 用 于 mRNA 丰 度 定量 的 有 效 而 精确 的 方法

3.2 差异 显示 PCR (DD-PCR)

差异 显示 PCR 是 一 种 确定 两 个 生物 学 样品 差异 表达 的 CDNA 片段 的 方法 (Liang and Pardee, 1992) ( 见 图 2.4a)。 这 一 方法 的 基础 是 用 两 个 朝 核 苷 酸 引 物 从 mRNA 产生 cDNA 片段 ， 一 个 是 与 转录 物 的 polyA 尾 互补 [如 oligo-d(T)iiVN]， 另 一 个 是 短 的 随机 核酸 序列 〈 例 如 10 FRR). 4REBHSIMASH, DD-PCR 能 确定 一 个 生物 学 样 品 中 所 有 的 转录 物 。cDNA 合成 后 ， 片 段 在 PCR 扩 增 过 程 中 被 标记 (放射 性 同位 素 或 荧光 标记 )。 产 物 通过 测序 凝 胶 电泳 分 离 ， 扩 增 后 的 cDNA 片段 的 组 成 模式 就 显现 出 来 。

“未 处 理 的 ” PolyA+RNA “处 理 的 ” PoyA+RMN4 AAAAA

Al FASE dT RK CDNA

eee A A A A A SS nL

- MA oligo dT, GA, << 随机 KER DP 物 和 “标记 ”的 dNTP

— en

Te ene

图 2.4 差异 显示 方法 学 示意 图 (a) 反 转 录 PCR 产物 差异 显示 的 标准 方法 (Liang and Pardee，1992 ) 。 来 源 于 两 种 生物 学 样品 的 RNA (如 调节 剂 处 理 与 未 处 理 的 细胞 系 ) 用 oligo-d (T)i2 反 转录 ， 得 到 的 cDNA 分 别 用 一 系列 锚 定 oligo dT 引物 [此 处 用 d (T)pGA] 结合 一 个 10 核 苷 酸 随机 引物 (结合 不 同 cDNA 的 不 同位 置 ) 进行 PCR 扩 增 。 用 测序 胶 电泳 可 观察 PCR 产物 (PCR 过 程 中 实现 放射 性 同位 素 或 荧光 标记 )。 同 样 电泳 迁移 率 的 条 带 的 有 /无 提示 了 条 带 所 代表 的 cDNA 来 源 基因 的 表达 差异 。

第 二 章 “基因 表达 的 检测 方法 niSE- 。

被 标记 条 带 的 强度 反应 了 相应 转录 物 的 相对 丰 度 。 当 使 用 相同 的 引物 对 时 ， 来 源 于 两 个 生物 学 样品 CDNA 条 带 的 主要 差别 显示 出 它们 之 间 差 异 表达 的 转录 物 。 对 cDNA 条 带 进 行 克隆 和 测序 就 能 鉴定 基因 。 早 期 报告 显示 DD-PCR 产生 大 量 的 假 阳性 (Liang et al., 1994; McCleland et al .，1995$)。 显 然 这 大 大 降低 了 它 的 效率 。 因 为 这 些 缺 点 ， 人 们 开 始 尝试 各 种 技术 改进 ， 诸 如 优化 引物 组 合 、 提 高 PCR 引物 复 性 温度 、 反 转录 前 用 DNA 酶 处 理 RNA 和 使 用 非 变性 凝 胶 (Bauer et al., 1993; Liang and Pardee，1995)。 或 许 最 有 意义 的 改进 是 用 限制 性 内 切 核酸 酶 消化 双 链 cDNA (用 mRNA 制备 )， 然 后 通过 连接 接头 介 导 cDNA 片段 3" 端 选择 性 PCR $$ (Prashar and Weissman, 1996; 见 图 2.4b)。 限制 性 内 切 核酸 酶 的 选择 使 用 增加 了 能 显示 的 转录 物 的 覆盖 率 。 这 些 改进 通过 让 引物 在 S$6 人 退火 进行 严格 的 PCR， 实 现 了 比 标准 DD-PCR 条 件 (40C 下 非 严 格 的 引物 退火 ) 显著 的 改良 。 改 良 的 DD-PCR 据说 可 以 提供 基因 表达 的 近似 定量 的 信息 ; 每 个 转录 物

PolyA+RNA AAAAAAAAAAA 3'

AGTTTTTTTTTT cDNA 合成 I ae 3" 5'B 限制 消化 {

37,

AG 3 末端 mRNA 来 源 的 序列 成 功 扩 增 扩 增 产物 经 测序 胶 分 (b) 离 并 成 像 如 图 2.4a 图 2.4 ( 续 )

(b) 为 增强 重复 性 而 对 差异 显示 技术 的 改良 (Prashar and Weissman，1996)。 以 含有 SH (HK) 的 锚 定 AT 引

, 物 ， 就 是 CTCGCAATCGGGGCTCGTCG (T)iazGA 来 驱动 第 一 链 cDNA 的 合成 。 经 过 标准 的 cDNA 第 二 链 合成

后 的 产物 经 限制 性 核酸 内 切 酶 消化 后 与 了 型 的 接头 连接 。PCR 反应 有 选择 地 扩 增 cDNA 片段 的 3" 端 。PCR 产物 能 用 测序 凝 胶 电 泳 分 离 和 鉴定 〈( 如 前 所 述 ) 。

es 。 蛋白 质 组 学

每 种 限制 性 内 切 核酸 酶 产生 单一 条 带 ， 降 低 了 显示 样式 的 复杂 性 。 还 有 ，: 序 列 已 知 的 基 因 产 生 的 条 带 大 小 可 以 预测 ， 能 在 把 条 带 从 凝 胶 上 回收 之 前 临时 确认 基因 (Prashar and Weissman，1996)。 这 一 技术 的 改良 由 几 家 独立 的 生物 技术 公司 完成 【Curagen 公司 ， http://www.curagen. com/ (Shimkets et al., 1999); 数码 基因 技术 公司 ，http://www. dgt. com/index. html 和 显示 系统 生物 技术 公司 , http://www.displaysystem.com/]， 用 来 提供 快速 、 高 通 量 的 DD-PCR 服务 。

DD-PCR 被 用 于 许多 不 同 的 研究 领域 : 比如 新 型 药 靶 的 发 现 (Shiue，1997; Wang and Feuerstein，1997)， 风 湿性 关节 炎 差 异 调控 基因 的 发 现 (White and Petkovich, 1998) 和 环境 刺激 物 对 于 细菌 基因 表达 影响 的 评估 (Fislage，1998)。 事 实 上 ，DD-PCR 是 目前 确定 差异 表达 基因 的 技术 中 最 广泛 发 表 的 一 种 。 这 或 许 反映 了 这 样 一 个 事实 : DD-PCR 不 需要 专门 的 昂贵 设备 或 生物 信息 学 工具 ， 促 使 它 能 进入 许多 实验 室 。DD-PCR 的 一 个 重要 优势 是 相对 较 少 的 RNA 有 用量。 最初 需 要 几 百 纳 克 RNA (Liang and Pardee, 1992). 最 近 的 改良 使 该 技术 能 对 来 源 于 单个 细胞 的 RNA 进行 DD-PCR (Renner et al., 1998). 因此 ，RNA 的 产量 不 会 阻碍 DD-PCR 的 应 用 。 不 过 DD-PCR 也 存在 缺点 。 如 前 所 述 ， 这 一 技术 受 假 阳性 之 苦 。 还 有 ， 一 条 被 确认 是 差异 表达 的 条 带 可 能 并 不 总 是 只 包括 单一 的 分 子 ， 因 为 多 个 转录 物 能 产生 近似 大 小 片段 在 电泳 胶 上 一 起 泳 动 。 造 成 确认 基因 的 困 难 。

总 之 ，DD-PCR 能 成 功 地 用 于 发 现任 何 物种 的 任何 组 织 的 差异 表达 基因 ， 只 要 能 分 离 高 质量 的 RNA。 该 技术 简单 的 操作 和 相对 廉价 使 它 广 为 使 用 。 然 而 结果 通常 更 是 定 性 的 而 非 定量 的 ， 与 其 他 技术 如 阵列 和 SAGE 产生 的 数据 比较 错误 似乎 更 多 。

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分 子 生物 学 和 基因 组 序列 分 析 领 域 技术 的 进步 促使 mRNA 定量 方法 由 一 个 接 一 个 基因 的 手段 向 基因 组 范围 的 检测 发 展 。 在 过 去 的 5 年 里 ， 一 些 彼此 互补 的 技术 同时 发 展 起 来 。 每 一 项 技术 在 以 下 几 方 面 存在 各 自 相 对 的 优 缺 点 : 检测 的 灵敏 度 、 通 量 和 基因 组 的 范围 ， 数 据 分 析 的 可 靠 性 、 成 本 和 简易 性 /能 力 。 所 有 方法 都 需要 有 意义 的 实验 输入 和 后 续 的 工作 来 验证 新 发 现 。 由 于 这 个 原因 ， 目 前 尚 无 公开 发 表 的 例子 对 由 两 种 技术 (如 cDNA 阵列 和 SAGE) 得 到 的 结果 进行 全 方位 的 对 比 。 因 此 ， 很 难 就 每 种 技术 的 效 用 提供 彻底 的 比较 。 不 过 毫 无 疑问 ， 用 于 mRNA 定量 的 SAGE、 基 于 阵列 的 杂交 、DD- PCR 和 电子 差异 基因 表达 等 方法 的 效用 已 经 被 用 独立 的 方法 (RT-PCR BK Northern 杂 交 ) 进行 发 现 的 确认 所 证 实 。 另 外 一 些 确定 差异 表达 基因 的 方法 ， 如 消减 抑制 杂交 (Diatchenko et al., 1996) 和 代表 性 差异 分 析 (Hubank and Schatz，1994) 等 未 在 此 讨 论 ， 因 为 它们 起 初 是 为 确定 mRNA 表达 量 的 差异 (与 SAGE、 阵 列 等 相 比 ) 而 设计 的 ， 或 者 还 未 像 诸 如 DD-PCR 等 定量 方法 那样 被 广泛 使 用 。

(So He Wim i)

第 二 章 ， 基 因 表达 的 检测 方法 oy

参考 文献

Aitman, T.J., Glazier, A.M., Wallace, C.A. et al. (1999) Identification of CD36 (Fat) as an insulin- resistant gene causing defective fatty acid and glucose metabolism in hypertensive rats. Nature Genet. 21: 76-83.

Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E. et al. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403: 503-511.

Audic, S. and Claverie J-M. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7: 986-995.

Bauer, D., Muller, H., Reich, J., Riedel, H., Ahrenkeil, Warthoe, P. and Strauss, M. (1993) Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR). Nucleic Acids Res. 21: 4272-4280.

Behr, M.A., Wilson, M.A., Gill, W.P., Salamon, H., Schoolnik, G.K., Rane, S. and Small, P.M. (1999) Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 284: 1520-1523.

Bertelsen, A.H. and Velculescu, V.E. (1998) High-throughput gene expression analysis using SAGE. Drug Discov. Today 3: 152-158.

Claudio, J.O., Liew, C.C., Dempsey, A.A., Cukerman, E., Stewart, A.K., Na, E., Atkins, H.L., Iscove, N.N. and Hawley, R.G. (1998) Identification of sequence-tagged transcripts differentially expressed within the human hematopoietic hierarchy. Genomics 50: 44-52.

Datson, N.A., van der Perk-de Jong, J., van den Berg, M.P., de Kloet, E.R. and Vreugdenhill, E. (1999) MicroSAGE: a modified procedure for the serial analysis of gene expression in limited amounts of tissue. Nucleic Acids Res. 27: 1300-1307.

DeRisi, J., Penland, L., Brown, P.O., Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A. and Trent, J.M. (1996) Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genet. 14: 457-460.

Diatchenko, L., Lau, Y.F.C., Campbell, A.P., Chenchik, A., Moqadam, F., Huang, B., Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D. and Siebert, P.D. (1996) Suppression subtraction hybridisation — a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 6025-6030.

Endege, W.O., Steinmann, K.E., Boardman, L.A., Thibodeau, S.N. and Schlegel, R. (1999) Representative cDNA libraries and their utility in gene expression profiling. BioTechniques 26: 542-550.

Ermolaeva, O., Rastogi, M., Pruitt K.D., Schuler, G., Bittner, M.L., Chen, Y., Simon, R., Meltzer, P., Trent, J.M. and Boguski, M.S. (1998) Data management and analysis for gene expression arrays. Nature Genet. 20: 19-23:

Fambrough, D., McClure, K., Kazlauskas, A. and Lander, E.S. (1999) Diverse signaling pathways activated by growth factor receptors induce broadly overlapping, rather than independent sets of genes. Cell 97: 727-741.

Fields, C., Adams, M.D., White, O. and Venter, J.C. (1994) How many genes in the human genome? Nature Genet. 7: 345-346.

Fislage, R. (1998) Differential display approach to quantitation of environmental stimuli on bacterial gene expression. Electrophoresis 19: 613-616.

Golub, T.R., Slonim, D.K., Tamayo, P., Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov, J.P., Coller, H., Loh, M.L., Downing, J.R., Caligiuri, M.A., Bloomfield, C.D. and Lander, E.S. (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286: 531-537.

Gonzalez, P., Zigler Jr, J.S., Epstein, D.L. and Borras, T. (1999) Identification and isolation of differentially expressed genes from very small tissue samples. Bio Techniques 26: 884-892.

Gress, T.M., Muller-Pillasch, F., Geng, M., Zimmerhackl, F., Zehetner, G., Friess, H., Buchler, M., Adler, G. and Lehrach, H. (1996) A pancreatic cancer-specific expression profile. Oncogene 13: 1819-1830.

Gygi, S.P., Rochon, Y., Franza, B.R. and Aebersold, R. (1999) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol. Cell. Biol. 19: 1720-1730.

Hastie, N.D. and Bishop, J.O. (1976) The expression of three abundance classes of messenger mRNA in mouse tissues. Cell 9: 761-774.

Heller, R., Schena, M., Chai, A., Shalon, D., Bedilion, T., Gilmore, J., Woolley, D.E. and Davis,

sig ”蛋白质 组 学

R.W. (1997) Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes’ using cDNA microarrays. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 2150-2155.

Holstege, F.C.P., Jennings, E.G., Wyrick, J.J., Lee, T.I., Hengartner C.J., Green, M.R., Golub, T.R., Lander, E.S. and Young, R.A. (1998) Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95: 717-728.

Hubank, M. and Schatz, D.G. (1994) Identifying differences in mRNA expression by representa- tional analysis of cDNA. Nucleic Acids Res. 22: 5640-5648.

Iyer, V.R., Eisen, M.B., Ross, D.T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J.C.F., Trent, J.M., Staudt, L.M., Hudson Jr, J.H., Boguski, M.S., Lashkari, D., Shalon, D., Botstein, D. and Brown, P.O. (1999) The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science 283: 83-87.

Lee, C-K., Klopp, R.G., Weindruch, R. and Prolla, T.A. (1999) Gene expression profile of aging and its retardation by caloric restriction. Science 285: 1390-1393.

Lee, N.H., Weinstock, K.G., Kirkness, E.F., Earle-Hughes, J.A., Fuldner, R.A., Marmaros, S., Glodek, A., Gocayne, J.D., Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fraser, C.M. and Venter, J.C. (1995) Comparative expressed-sequence tag analysis of differential gene expression profiles in PC-12 cells before and after nerve growth factor treatment. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 8303-8307.

Liang, P. and Pardee, A.B. (1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971.

Liang, P. and Pardee, A.B. (1995) Recent advances in differential display. Curr. Opin. Immunol. 7: 274-280.

Liang, P., Zhu, J., Zhang, X., Guo, Z., O’Connell, R.P., Averboukh, L., Wang, F. and Pardee, A.B. (1994) Differential display using one-base anchored oligodT primers. Nucleic Acids Res. 22: 5763-5764.

Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H. and Brown, E.L. (1996) Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnol. 14: 1675—1680.

Madden, S.L., Galella, E.A., Zhu, J., Bertelsen, A.H. and Beaudry, G.A. (1997) SAGE transcript profiles for p53-dependent growth regulation. Oncogene 15: 1079-1085.

Maier-Ewert, S., Maier E., Ahmadi, A., Curtis, J. and Lehrach, H. (1993) An automated approach to generating expressed sequence catalogues. Nature 361: 375-376.

Marshall, E. (1999) Do-it-yourself gene watching. Science 286: 444-447.

McCleland, M., Mathieu-Daude, F. and Welsh, J. (1995) RNA fingerprinting and differential display using arbitrarily primed PCR. Trends Genet. 11: 242-246.

McGall, G., Labadie, J., Brook, P., Wallraff, G., Nguyen, T. and Hinsberg, W. (1996) Light- directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 13 555—13 560.

Moch, H., Schrami, P., Bubendorf, L., Mirlacher, M., Kononen, J., Gasser, T., Mihatsh, M.J., Kallioniemi, O.P. and Sauter, G. (1999) High-throughput tissue microarray analysis to evaluate genes uncovered by cDNA microarray screening in renal carcinoma. Am. J. Pathol. 154: 981— 986.

Patten C., Clayton, C.L., Blakemore, S.J., Trower, M.K., Wallace, D.M. and Hagan, R.M. (1998) Identification of two novel diurnal genes by screening a rat brain cDNA library. Neuroreport 9: 3935-3941.

Perou, C.M., Jeffrey, S.S., van de Rijn, M., Rees, C.A., Eisen, M.B., Ross, D.T., Pergamenshikov, A., Williams, C.F., Lee, J.C.F., Lashkari, D., Shalon, D., Brown, P.O. and Botstein, D. (1999) Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers. Proc. Natl Acad. Sci. USA 16: 9212-9217.

Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J.L., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. (1997) A model for p53 induced apoptosis. Nature 389: 300-305.

Prashar, Y. and Weissman, S. M. (1996) Analysis of differential gene expression by display of 3’ end restriction fragments of cDNA’s. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 659-663.

Renner, C., Trumper, L., Pfitzenmeier, J-P., Loftin, U., Gerlach, G., Stehle, I., Wadle, A. and Pfreundschuh, M. (1998) Differential mRNA display at the single cell level. BioTechniques 24: 720-724.

Richmond, C.S., Glasner, J.D., Mau, R., Jin, H. and Blattner, F.R. (1999) Genome-wide expression profiling in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 27: 3821-3835.

Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. and Brown, P.O. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470.

Schena, M., Shalon, D., Heller, R., Chai, A., Brown, P.O. and Davis, R.W. (1996) Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 10614-10619.

Shalon, D., Smith, S.J. and Brown P.O. (1996) A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridisation. Genome Res. 6: 639-645.

Shimkets, R.A., Lowe, D.G., Tsu-Ning Tai, J., Sehl, P., Jin, H., Yang, R., Predki, P.F., Rothberg, B.E.G., Murtha, M.T., Roth, M.E., Shenoy, S.G., Windemuth, A., Simpson, J.W., Simons, J.W., Daley, M.P., Gold, S.A., McKenna, M.P., Hillan, K., Went, G.T. and Rothberg, J.A. (1999) Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query. Nature Biotechnol. 17: 798-803.

Shiue, L. (1997) Identification of candidate genes for drug discovery by differential display. Drug Devl. Res. 41: 142-159.

Singh-Gasson, S., Green, R.D., Yue, Y., Nelson, C., Blattner, F., Sussman, M.R. and Cerrina, F. (1999) Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnol. 17: 974-978.

Syed, F., Blakemore, S.J., Wallace, D.M., Trower, M.K., Johnson, M., Markham, A.F. and Morrison, J.F.J. (1999) CCR7 (EBI 1) receptor down-regulation in asthma: differential gene expression in human CD4+ T lympocyte. Q. J. Med. 92: 463-471.

Vasmatzis, G., Essand, M., Brinkmann, U., Lee, B. and Pastan, I. (1998) Discovery of three genes specifically expressed in human prostate by expressed sequence tag database analysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 300-304.

Velculescu, V.E., Zhang, L., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1995) Serial analysis of gene

__ expression. Science 270: 484-487.

Velculescu, V.E., Zhang, L., Zhou, W., Vogelstein, J., Basrai, M.A., Bassett, D.E., Hieter, P., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1997) Characterization of the yeast transcriptome. Ce/l 88: 243-251.

Wang X. and Feuerstein G.Z. (1997) The use of mRNA differential display for discovery of novel therapeutic targets in cardiovascular disease. Cardiovasc. Res. 35: 414421.

Wen, X., Fuhrman, S., Michaels, G.S., Carr, D.B., Smith, S., Barker, J.L. and Somogyi, R. (1998) Large-scale gene expression mapping of central nervous system development. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 334-339.

White, J.A. and Petkovich, M. (1998) Identification and cloning of RA-regulated genes by mRNA- differential display. Methods Mol. Biol. 89: 389-404.

Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho., M.H. and Lockhart, D.J. (1997) Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnol. 15: 1359-1367.

Yershov, K., Barsky, V., Belgovisky, A., Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobishev, A., Dubiley, S. and Mirzabekov, A. (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 4913-4198.

Zehetner, G. and Lehrach, H. (1994) The Reference Library System — sharing biological material and experimental data. Nature 367: 489-491.

Zhang, L., Zhou, W., Velculescu, V.E., Kern, S.E., Hruban, R.H., Hamilton, S.R., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1997) Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 276: 1268— 1272.

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳

Michael J. Dunn and Angelika Gorg 1.518

MRAFSA. BARRERA SZHILT RR ARM RAAT, & 测 和 分 析 是 蛋白 质 组 分 析 的 首要 要 求 。 最 近 ， 多 种 用 于 和 蛋白质 组 学 研究 的 蛋白 质 分 离 方 法 得 到 了 发 展 〈 见 第 十 章 )， 如 基于 心 片 技术 的 应 用 (Merchant and Weinberger, 2000; Nelson et a! .，2000)、 和 蛋白 复合 物 的 质谱 直接 分 析 (Link et al., 1999), RAMEHE 用 (Gygi et al., 1999; Rigaut et al., 1999) 以 及 大 规模 酵母 双 杂 交 筛 选 系统 (Uetz et al .，2000)。 但 是 ， 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (two-dimensional polyacrylamide gel elec- trophoresis, 2-DE) 依然 是 大 多 数 蛋 日 质 组 研究 中 分 离 复杂 和 蛋 日 混合 物 所 选择 的 核心 技 术 ， 这 是 由 于 它 在 同时 分 离 成 千 蛋 白质 时 所 具有 的 无 可 比拟 的 分 离 能 力 ， 以 及 随后 的 可 用 于 计算 机 定量 分 析 差 异 表达 蛋白 质 的 高 灵敏 度 的 显 色 技术 ， 还 有 对 2-DE 胶 上 和 蛋白质 用 高 灵敏 度 微量 化 学 方法 进行 鉴定 和 表征 相对 比较 容易 。 本 章 将 要 介绍 的 是 2-DE 方法 的 最 新 进展 ， 这 些 进 展 使 得 2-DE 的 分 辨 能 力 逐 渐 提 高 ， 成 为 操作 相对 简便 的 具有 高 重 复 性 的 分 离 技术 。

2. 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 发 展 史

最 早 的 二 维 电泳 应 归功 于 Smithies 和 Poulik (1956) 的 工作 ， 他 们 将 纸 电 泳 和 淀粉 凝 胶 电 泳 结合 来 分 离 血 清 蛋白 质 ， 随 后 在 电泳 技术 上 的 研究 开发 ， 如 聚 丙 炳 酰胺 支持 介 质 和 聚 丙烯 酰胺 浓度 梯度 ， 很 快 应 用 于 二 维 分 离 (Dunn，1987)。 特 别 是 等 电 聚 焦 (iso- electric focusing, ts 技术 应 用 于 二 维 分 离 使 基于 蛋白 质 电荷 属性 的 一 向 分 离 成 为 可 能 。IEF 和 二 维 十 二 烷 基 硫酸 钠 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (sodium dodecyl dulfate polyacry- lamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 的 结合 形成 了 根据 两 个 独立 参数 (电荷 和 分 子 质 量 大 小 ) 来 分 离 蛋白 质 的 二 维 方法 。 通 过 在 IEF 中 应 用 尿素 和 非 离 子 性 去 污 剂 ， 可 将 该 方法 应 用 于 各 种 溶解 性 能 差别 很 大 的 样品 。 至 此 ， 到 1975 年 ， 正 式 形成 了 应 用 于 全 细胞 或 组 织 蛋 白质 混合 物 分 析 的 二 维 电泳 系统 (Iborra and Buhler, 1976; Klose, 1975; Scheele, 1975).

ZEFU LAE, O'Farrell 发 表 了 用 于 分 离 大 肠 杆菌 的 2-DE 优化 方法 。 该 方法 在 一 维 利用 4%T、5%C 柱 状 PAGE BR, A 8mol/L 尿素 和 2% (m/V) NP-40， 在 二 维 利用 Laemmli (1970) 的 非 连续 SDS-PAGE 凝 胶 系 统 。 这 种 基于 电荷 分 离 〈 等 电 点 ， pl) 和 分 子 质量 大 小 分 离 (相对 分 子 质 量 ，M,.) 的 正 交 组 合 使 得 样品 蛋白 质点 分 布 于 整个 二 维 凝 胶 图 谱 上 。 过 去 25 年 来 大 部 分 2-DE 研究 都 以 该 方法 为 基础 ， 已 有 数 千 篇 相关 的 文献 发 表 。

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 - 39 -

3. 固 相 pH 梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 二 维 电泳

对 于 蛋白 质 组 研究 来 说 ，2-DE 在 分 离 蛋白 质 时 必须 具有 高 的 重复 性 和 分 辨 率 。 不 入 前 这 仍 是 一 个 很 大 的 问题 ， 原 因 在 于 生成 IEF pH 梯度 的 合成 载体 两 性 电解 质 (syn- thetic carrier ampholyte, SCA) 的 特性 。SCA 是 通过 复杂 的 合成 过 程 得 到 的 ， 很 难 控 制 其 重复 性 ， 由 此 产生 相当 大 的 批 次 之 间 变 化 ， 限 制 了 2-DE 分 离 的 重复 性 。 可 能 更 为 重 要 的 是 ，SCA 分 子 相 对 较 小 ， 难 以 固定 在 IEF 胶 内 ， 因 此 在 IEF 过 程 中 由 水 引起 的 电 渗流 将 导致 SCA 分 子 向 阴极 迁移 。 这 种 被 称 为 “阴极 漂移 ”的 现象 将 导致 pH 不 稳定 。 当 利用 管状 IEF 胶 时 ， 由 于 玻璃 毛细 管 壁 上 负电 荷 基 团 的 作用 将 加 剧 阴 极 漂移 。 实 际 上 ， 在 采用 O"Farrell 方法 时 ，pH 梯度 很 少 超出 7 太 多 ， 所 带 来 的 后 果 则 是 碱 性 区 蛋 白 质 的 丢失 。 注 意 到 这 种 现象 ，0'" Farrell 变更 了 方法 ， 引 入 非 平 衡 pH 梯度 电泳 (non-equilibrium pH gradient electrophoresis，NEPHGE )， 用 2-DE 分 离 碱 性 蛋白 质 (O’ Farrell et wz .，1977)。 这 种 方法 在 快速 形成 的 pH 梯度 中 根据 蛋白 质 移动 能 力 进行 分 离 , 但 其 重 现 性 很 难 控 制 。 幸 运 的 是 ， 在 Immobiline 试剂 (Amersham Pharmacia Biotech) 基础 上 开发 的 固 相 pH 梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 技术 (Bijellqvist et al., 1982) 解决 了 这 个 问题 。 虽 然 早期 IPG 技术 在 2-DE 尝试 遇 到 很 多 问题 ， 但 它们 被 逐渐 克服 (Gorg et al., 1988, 2000) 并 使 得 IPG IEF 成 为 目前 在 蛋白 质 组 应 用 中 大 多 数 2-DE 首 选 的 方法 。 这 种 称 为 IPG-DALT 的 2-DE 方法， 将 在 本 章 详细 讨论 ， 最 近 的 一 篇 文章 也 对 SCA IEF 在 2-DE 中 的 应 用 进行 了 详细 讨论 (Monribot and Boucherie, 2000).

4. 样品 制备

由 于 2-DE 所 分 析 样 品 的 多 样 性 ， 没 有 一 种 制备 方法 可 以 普遍 适用 于 各 种 样品 ， 但 有 几 点 考虑 一 定 要 提出 : 很 有 必要 尽量 减少 可 能 在 2-DE BPS BARA (artifactual spot) 的 蛋白 质 修饰 ， 在 实验 中 ， 含 尿素 的 样品 一 定 不 要 加 热 ， 因 为 加 热 后 尿素 分 解 产 生 的 异 氰 酸 盐 可 能 对 蛋白 质 产 生 氨 基 甲 酰 化 修饰 从 而 引起 很 大 的 电荷 不 均一 性 。 此 外 ， 样品 中 的 蛋白 酶 可 以 很 容易 地 生成 假 点 ， 因 此 ， 样 品 处 理 步 又 应 尽量 少 并 保持 冷冻 环 境 。 样 品 中 可 以 加 入 和 蛋白酶 抑制 剂 的 混合 物 ， 但 切记 这 些 试剂 可 修饰 蛋白 ， 导 致电 荷 假 象 。

4.1 可 溶性 样品

可 溶性 液体 样品 如 血清 、 血 浆 、 尿 样 、 脑 脊 液 以 及 细胞 和 组 织 的 水 溶性 提取 物 ， 经 很 少 的 前 处 理 便 可 进行 2-DE 分 析 。 含 蛋白 质 浓度 较 高 的 样品 ， 如 血浆 和 血清 ， 可 用 适 量 样品 溶解 缓冲 液 ( 见 第 $ 部 分 ) 稀释 后 直接 分 析 。 但 是 ， 诸 如 白 蛋 白 和 免疫 球 蛋 白 一 类 的 高 丰 度 蛋白 质 在 2-DE 图 谱 上 常 干扰 其 他 表达 量 少 的 成 分 ， 将 这 些 高 丰 度 蛋白 质 去 除 可 以 克服 这 个 问题 (Dunn，1987; Lollo et wz: .，1999)， 但 同时 可 能 非特 异性 去 除 其 他 = AK.

其 他 类 型 的 液态 样品 可 能 含有 较 低 的 蛋白 质 浓 度 或 较 高 盐 浓 度 ， 将 会 干扰 IEF 时 蛋白 质 的 分 离 ， 这 种 样品 可 在 2-DE 分 离 前 用 透析 或 液 相 色谱 脱盐 ， 样 品 可 以 通过 并

Lin, 蛋白 质 组 学

干 、 对 聚 乙 二 醇 的 透析 或 用 TCA/ 丙 酮 沉 演 的 方法 进行 浓缩 。 研 究 发 现 TCA/ 丙 酮 沉淀 对 导致 重 白 酶 的 失 活 进而 减少 蛋白 质 降 解 非 常 有 用 ， 同 时 可 以 去 除 干扰 化 合 物 ， 富 集 极 碱 性 和 蛋白质， 如 从 全 细胞 裂解 液 中 富 集 核 糖 体 蛋白 (Gorg et al., 1997).

4.2 组 织 样 品

固体 组 织 样品 常 在 溶解 缓冲 液 〈 见 第 $ 部 分 ) 中 破碎 ， 最 好 的 方法 是 在 组 织 冷冻 及 液 氮 温 度 的 条 件 下 破碎 。 包 右 在 铝箔 并 贮存 于 液 氮 中 的 较 小 组 织 样品 ， 可 以 夹 在 两 个 冷 研 块 或 基体 中 间 用 桂 和 研 钵 在 液 氮 环 境 下 压 碎 ， 大 的 组 织 块 可 在 溶解 缓冲 液 中 用 旋转 叶 片 型 匀 浆 器 进行 匀 桨 处理， 但 尽量 避免 加 热 和 起 泡沫 。

组 织 样品 的 一 个 特殊 问题 是 样品 的 异 质 性 ， 组 织 样 品 和 来 源 于 疾病 的 样品 包含 许多 种 不 同类 型 的 细胞 ， 不 太 可 能 分 别 收集 组 织 的 疾病 区 域 和 非 疾 病 区 域 。 几 种 用 于 2-DE 分 析 的 方法 可 以 解决 这 个 问题 ， 通 常用 基于 免疫 亲 和 技 术 的 正 性 或 负 性 选择 ， 可 以 实现 对 特殊 细胞 群 的 富 集 ， 这 些 样品 可 以 直接 应 用 于 2-DE 分 析 或 是 在 2-DE 上 样 前 进行 短 期 培养 以 增加 细胞 数目 。 此 外 ， 微 量 切割 技术 可 用 来 从 组 织 切 片 中 获取 纯 的 细胞 群 ， 其 中 最 受 关 注 的 是 激光 俘获 微 切 割 (laser capture microdissection, LCM) 技术 (Simone et az .，1998)。 在 该 技术 中 ， 在 倒置 显微镜 下 将 激光 束 聚 焦 在 所 选择 的 组 织 切片 区 域 ， 用 激光 束 活 化 与 组 织 切 片 接触 的 转移 膜 来 选择 细胞 。 激 光束 准确 击 中 的 区 域 转移 膜 与 紧 贴 着 的 组 织 结合 在 一 起 ， 因 此 ， 可 以 将 这 些 组 织 中 细胞 从 周围 组 织 中 提取 出 来 。 可 以 用 PCR 技术 扩 增 这 些微 量 标 本 中 所 含 核酸 ， 所 以 LCM 技术 很 容易 地 应 用 到 核酸 分 析 中 。 与 此 对 应 的 ， 缺 乏 相 应 的 蛋白 质 扩 增 手 段 将 是 蛋白 质 组 分 析 中 LCM 分 离 细 胞 所 遇 到 的 主要 挑战 。 而 Banks 等 〈1999) 则 证 实 了 LCM 在 蛋白 质 组 分 析 中 的 应 用 ， 在 他 们 的 研 究 中 ， 通 过 对 一 例 正常 人 宫颈 表皮 组 织 切 割 分 析 ， 与 整个 组 织 切割 分 析 对 比 ， 结 果 显 示 午 出 一 些 蛋 白质 由 LCM 而 得 到 富 集 。

4.3 细胞

对 体外 悬浮 培养 生长 的 细胞 或 周期 性 细胞 样品 〈 如 红细胞 、 淋 巴 细胞 )， 理 想 的 方 法 是 通过 离心 收集 。 用 磷酸 盐 缓 冲 液 清 洗 并 溶 于 样品 缓冲 液 ( 见 第 5 Bot). WER 体 基 质 中 培养 的 细胞 ， 应 首先 去 除 培养 基质 ， 用 PBS 或 等 渗 底 糖 溶液 清洗 细胞 层 ， 后 者 是 减少 可 能 干扰 一 向 IEF 的 盐 的 特别 有 效 的 方法 。 然 后 通过 刮 擦 方法 收获 细胞 ， 但 应 避免 使 用 蛋白 裂解 酶 ， 或 者 ， 加 入 少量 体积 溶解 缓冲 液 ， 将 附着 在 基质 上 的 细胞 直接 裂解 。 如 果 细 胞 核酸 含量 过 高 而 导致 样品 黏度 太 大 时 ， 可 用 不 含 蛋白 质 酶 的 DNase/ RNase 混合 物 来 处 理 样 品 (Garrels, 1979).

4.4 样品 分 级

由 于 真 核 组 织 蛋白 质 表达 的 高 动态 范围 和 多 样 性 ， 有 时 必须 对 蛋白 质 进 行 分 级 处 理 ， 以 降低 样品 的 复杂 性 并 富 集 低 拷贝 蛋白 质 。 蛋 白质 预 分 级 可 以 用 亚 细 胞 分 级 、 液 相 电泳 、 吸 附 色谱 和 选择 性 沉淀 等 方法 来 实现 〈Corthals et ol.，2000)。 此 外 ， 还 有 一 种 方法 是 根据 蛋白 质 在 一 系列 溶解 能 力 逐 渐 增 强 的 缓冲 液 中 溶解 性 能 不 同 ， 而 实现 对 细胞 或 组 织 蛋 白质 的 分 级 提取 (Cordwell et al., 2000; Molloy et al., 1998).

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 “ 41 -

5. 溶解

理想 的 2-DE 溶解 应 能 达到 破坏 所 有 非 共 价 结合 蛋白 质 复 合 物 和 聚积 体 ， 形 成 各 个 多 肽 的 溶解 液 。 如 果 不 能 达到 这 一 点 ， 样 品 中 结合 牢固 的 蛋白 质 复合 物 可 能 使 2-DE 中 出 现 新 的 蛋白 质点 ， 相 应 地 表示 单个 多 肽 的 点 强度 将 下 降 。 此 外 ， 溶 解 方法 必须 允许 可 能 干扰 2-DE 分 离 的 盐 、 脂 类 、 多 糖 和 核酸 等 物质 的 去 除 。 最 后 ， 样 品 中 蛋白 质 在 2-DE 过 程 中 必须 保持 可 溶性 。 鉴 于 上 述 原 因 ， 样 品 溶解 是 2-DE 成 功 分 离 蛋 白 质 的 最 关键 因 Ke =.

最 为 普遍 应 用 的 2-DE 蛋白 质 溶 解 方法 仍然 是 最 早 被 0" Farrell 所 描述 的 以 下 几 种 物 质 的 混合 液 (所 谓 “ 裂 解 缓 冲 液 ”"): 9.5mol/L 尿素 、4% (m/V) 的 NP-40、1% (m/V) 的 还 原 剂 二 硫 苏 糖 醇 (dithiothreitol, DTT) 以 及 2% (m/V) 相应 pH 范围 的 SCA。 该 配方 适用 于 许多 类 型 的 样品 ， 但 并 不 是 一 种 万 能 方法 ， 其 中 在 膜 蛋白 质 的 提取 上 就 对 此 方法 提出 了 挑战 (Santoni et wz .，2000)。 此 后 发 现 两 性 去 污 剂 CHAPS 可 以 有 效 溶 解 膜 蛋 白质 (Perdew et 邮 .，1983)， 特 别 是 在 浓度 为 4% (m/V), 5 2mol/L hit HRA 8mol/L 尿素 混合 物 共 用 时 (Molloy et al., 1998; Rabilloud et wz .，1997)。 硫 脲 是 一 种 比 尿素 具有 更 强 能 力 的 变性 剂 ， 但 由 于 其 水 溶性 差 ， 不 能 单独 使 用 ， 但 在 尿素 浓 溶 液 中 其 可 溶性 更 好 ， 因 此 尿素 - 硫 腺 混合 物 提高 了 溶解 样品 的 能 力 。 线 性 磺 基 三 甲 胺 乙 内 酯 (sulphobetaine) 去 污 剂 ， 如 SB3-10 或 SB3-12， 也 是 有 效 的 溶解 剂 ， 但 这 些 试剂 与 高 浓度 尿素 不 兼容 (Rabilloud et al., 1997), 4SEMILA2% (m/V) MRE Smol/L 尿素 、2mol/L HARA 2% CHAPS 结合 在 一 块 使 用 时 可 以 克服 这 些 困 难 (Herbert, 1999; Rabilloud et al., 1997).

去 污 剂 SDS 能 破坏 大 多 数 非 共 价 蛋 白质 相互 作用 ， 对 于 膜 蛋白 的 溶解 非常 有 效 ，

但 其 阴离子 特性 使 它 不 可 能 应 用 于 IEF 效 胶 。 但 是 ，SDS 可 用 于 2-DE 前 的 前 期 溶解 过 程 ， 在 该 方法 中 ， 样 品 首先 用 1% (m/V) SDS 溶 解 ， 然 后 用 常用 溶解 液 (如 裂解 液 ) 稀释 ， 目 的 是 为 了 用 非 离子 或 两 性 去 污 剂 从 蛋白 质 中 置换 出 SDS， 从 而 使 蛋白 质保 持 在 溶解 状态 。 为 了 有 效 地 溶解 样品 ， 并 减少 SDS 在 IEF 中 的 负 作 用 ， 必 须 认真 控制 蛋白 质 与 非 离子 或 两 性 去 污 剂 的 比例 (1:3) 及 SDS 与 非 离 子 或 两 性 去 污 剂 的 比例 (1:8) (Dunn, 1987). |

核酸 对 于 IEF 可 能 造成 的 问题 ， 是 因为 它 会 导致 样品 黏度 的 增加 且 在 某 些 情况 下 可 与 样品 蛋白 质 形 成 复合 物 ， 进 而 导致 假象 迁移 和 条 纹 的 出 现 。 如 果 怀 疑 上 述 问题 可 能 出 现 ， 最 好 向 样品 溶解 液 中 加 入 适当 纯 的 〈 不 含 蛋 白 酶 ) 内 切 核酸 酶 来 降解 核酸 ， 或 是 利用 SCA 和 核酸 结合 形成 复合 物 的 能 力 通过 超速 离心 来 去 除 复合 物 (Rabilloud et al., 1986).

6. 还 原

蛋白 质 二 硫 键 通常 用 DTT 或 B- 琉 基 乙 醇 等 含 自由 一 基 的 试剂 还 原 。 但 是 ，DTT 之 类 的 试剂 带电 ， 因 此 在 IEF 过 程 中 迁移 到 胶 外 ， 导 致 样品 蛋白 质 的 重 氧化 使 得 电泳 过 程 中 蛋白 质 溶解 性 丧失 ， 最 近 报 道 用 不 带电 荷 的 还 原 剂 如 三 正 丁 基 腾 取代 含 琉 基 试剂 大 大 增强 一 向 IEF 中 蛋白 质 溶解 能 力 ,并 使 得 一 维 到 二 维 转移 效率 提高 (Herbert et

ne 蛋白 质 组 学

al., 1998; Herbert，1999 ) 。

7. 一 维 固 相 pH 梯度 等 电 聚焦 (IEF with IPG)

IPG IEF 胶 用 Immobilines (Amersham Pharmacia Biotech) 制备 。Immobilines 是 拥 有 CH, 一 CH 一 CO 一 NH 一 R 结构 的 8 种 丙烯 酰胺 衍生 物 系 列 ， 其 中 R 包含 羧基 或 叔 氢 ZEA, Elam fae pH3~10 不 同 值 的 缓冲 体系 。 根 据 公 布 的 配方 计算 后 ， 将 适 宜 的 IPG 试剂 添加 至 混合 物 中 用 于 凝 胶 聚 合 ， 在 聚合 中 ， 绥 冲 基 团 通过 乙 烯 键 共 价 聚 合 至 聚 丙烯 酰胺 骨架 中 ， 形 成 pH 梯度 。 通 过 这 种 方式 生成 的 IPG， 不 会 发 生 电 渗透 作 用 ， 因 而 可 以 进行 特别 稳定 的 IEF 分 离 ， 达 到 真正 的 平衡 状态 。 最 初 的 IPG 技术 在 2-DE 分 离 中 的 应 用 遇 到 了 一 些 问题 (Garg et oz .，1988)， 幸 运 的 是 ， 这 些 问 题 现 在 已 经 解决 ， 并 使 IPG IEF 成 为 2-DE 中 一 维 所 选择 的 分 离 方法 (Garg et al., 2000).

7.1 IPG BRS

Gorg (1988) 的 方法 如 图 3.1 所 示 。 首 先 ， 根 据 文献 中 广泛 的 配方 库 〈Garg et al., 2000), Pr pH 范围 的 IPG 平板 胶 在 GelBond PAGfilm (图 3.1b) ER, 后 ， 凝 胶 用 去 离子 水 全 面 冲洗 (6x10min)， 浸 入 在 2% (m/V) 甘油 中 (30min)， 室 温 下 在 洁净 橱 中 干燥 ， 然 后 用 塑料 膜 覆 盖 ， 如 果 凝 胶 不 立即 使 用 ， 可 在 - 20 忆 贮存 一 年 。 用 前 ， 用 切 纸 机 从 IPG 平板 胶 切 下 所 需 数目 的 干 胶 条 (图 3.1lc)。 此 外 ， 各 种 pH 范围 商品 化 的 预制 IPG 胶 条 可 从 Amersham PharmavialBioweh (Immobiline SryPlate 或 Immobiline DryStrip) 和 Bio-Rad (ReadyStrip) JA. ATA ARIK EA IPG 胶 条 ， 但 要 ithe, HRP K BRK, PHN E ARMA. 18 或 24cm MA (Garg et al., 1999) 通常 用 于 高 分 辩 分 离 ， 而 短 胶 条 (4cm，7cm 或 1lzem) 则 应 用 于 快速 筛选 。 有 大 BAF SEE pH 梯度 范围 条 件 可 供 选用 于 IPG IEF， 这 将 在 7.4 中 讨论 。

7.2 IPGREBAk

用 于 2-DE 时 ， 胶 条 应 该 置 于 重 泡 胀 池 (图 3.1d) FER 8mol/L 尿素 的 溶液 〈 或 2mol/L 硫 逐 和 Smol/L 尿素 ) 中 泡 胀 。 溶 液 其 他 成 分 为 0.5% 到 4% 非 离子 (NP-40， Triton X-100) 或 两 性 (CHAPS) #357], 15mmol/L DTT 和 0.5% 适 宜 范 围 的 pH 值 的 SCA。 然 后 将 胶 条 直接 放 在 水 平平 板 电泳 装置 的 冷却 板 表 面 (如 Multiphor，Amersham Pharmacia Biotech) (图 3.1g)。 另 外 一 种 便利 的 方法 是 用 Pharmacia 公司 的 泡 胀 托 架 (图 3.1h)， 这 种 托 架 用 波纹 塑料 板 塑造 ， 上 面 所 含 的 止 槽 正好 适 于 IPG 的 排列 摆 放 。 此 外 ， 该 设备 配备 有 带 有 电极 条 和 框架 (bar) 以 及 配备 加 样 杯 的 支架 ， 可 以 在 胶 条 表 面 任意 位 置 加 样 。 必 要 时 ， 可 以 将 托 架 用 硅油 覆盖 ， 以 在 IEF 时 保护 胶 条 使 之 不 受 大 气 影 响 。 在 2-DE 图 谱 碱 性 端 常 可 以 见 到 水 平 条 纹 ， 特 别 是 当 在 一 向 使 用 碱 性 IPG 梯度 时 ， 在 IPG 胶 表 面 沿 阴极 区 额外 释 加 一 个 用 20mmol/L DTT 浸泡 过 的 电极 条 ， 可 以 解 决 这 个 问题 (Garg et wj .，1995)。 该 方法 的 优点 是 ，IEF 时 胶 内 DTT 向 阳极 迁移 ， 从 阴极 区 外 加 电极 条 释放 出 来 的 DTT 可 以 不 断 进行 补充 。 另 外 一 种 避免 阴极 区 条 纹 的 方 法 是 利用 不 带电 荷 的 还 原 剂 TBP， 它 在 IEF 时 不 发 生 迁 移 ， 已 发 现在 IEF 中 TBP 可 以 大 大 提高 蛋白 质 的 溶解 能 力 ， 特 别 是 羊毛 蛋白 (Herbert et al., 1998; Herbert, 1999).

第 三 章 “蛋白质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 - 43°

图 3.1 IPG-Dalt 的 流程 (Gorg et al., 2000) (a) 在 塑料 支持 膜 上 聚合 IPG 及 SDS 胶 之 前 组 装 聚 合 槽 (SIAM, GelBond PAGfilm 支持 膜 ，0.5mm 厚 的 UH 框 )。(b) IPG -和 (或 ) SDS 梯度 多 孔 胶 的 聚合 。 (c) 清洗 并 干燥 后 的 IPG FARR (SK Immobiline DryPlates) 切 成 单个 的 IPG 胶 条 ， 单 个 IPG 胶 条 的 重 泡 胀 。(d) 在 垂直 重 泡 胀 模 内 泡 胀 。(e) 在 重 泡 胀 托盘 中 泡 胀 ， 以 及 (f) 在 IPGphor 胶 条 泡 胀 池 中 泡 胀 。 单 个 IPG 胶 条 的 IEF。(g) 直接 放置 在 IEF 配件 的 冷却 板 上 ，(h) 在 DryS- trip MF, WAR (i) 在 IPGphor 上 。(k) IEF 后 IPG 胶 条 的 贮存 。(1) SDS-PAGE 前 IPG 胶 条 的 平衡 。 平 衡 后 的 IPG 胶 条 转移 (m) 沿 阴极 电极 条 放置 在 自制 的 水 平 SDS 胶 表 面 (n) 或 沿 阴极 缓冲 条 放置 在 预制 SDS RRA. (o) 平衡 过 的 IPG 胶 条 放置 在 垂直 SDS 胶 上 。

7.3 加 样 和 运行

样品 通常 是 加 在 放置 在 IPG 胶 阳 极 区 或 阴极 区 的 硅 橡 胶 框 内 或 特殊 加 样 杯 内 (图

44 - 蛋白 质 组 学

3.1g，h)， 对 不 同类 型 的 样品 ， 最 好 的 加 样 位 置 由 经 验 值 确定 。 最 初 电 压 应 限制 在 150V、30min， 从 而 使 尽量 多 的 样品 进入 加 样 杯 ， 然 后 逐渐 增加 电压 至 3500 V。 运 行 时 间 决 定 于 几 个 不 同 的 因素 ， 包 括 样品 类 型 、 和 蛋白 上 样 量 、IPG 胶 条 长 度 及 所 用 pH 梯 度 。 因 为 温度 低 时 尿素 可 能 会 结晶 ，IEF 应 当 在 20C 运行 ， 不 同 的 温度 下 在 2-DE 图 谱 中 一 些 蛋 白质 点 的 相对 位 置 会 发 生变 化 (Garg et al., 1991), #3.1 中 列 出 了 一 些 典型 的 运行 条 件 。

表 3.1 利用 Multiphor 的 运行 条 件 (Garg et al., 2000)

胶 条 长 度 180mm

温度 20T = 最 大 电流 每 个 胶 条 0.05mA

最 大 功率 每 个 胶 条 0.2W

最 大 电压 3500V

I 分 析 型 IEF

初始 化 IEF

加 样 杯 上 样 (20~50pl) 胶 内 泡 胀 (350pD)

150V, th 150V, ih

300V, 1~3h 300V, 1~3h

600V, ih

到 达 3500V 稳定 态 后 IEF

1~1.5 4 pH 单位 4 个 pH 单位 7 个 pH # fiz

如 IPGS~6 24h IPG4~8 10h IPG3~10L 6h 如 IPG4~5.5 20h IPG6~10 10h IPG3~10NL 6h 3 个 pH 单位 5~6 4 pH 单位 8~9 4 pH 单位 IPG4~7 12h IPG4~9 8h IPG3~12 6h IPG6~9 12h IPG6~12 8h IPG4~12 8h

TMKABHEA (240mm)

到 达 3500V 稳定 态 后 IEF

IPG3~12 8h

IPG4~12 12h

IPG5 一 6 40h

亚 微 量 制备 IEF

初始 化 IEF

加 样 杯 上 样 (100p1) BEA YAK (350p1) 50V, 12~16h 50V, 12~16h 300V, ih 300V, ih 到 达 3500V 稳定 态 后 IEF

相应 分 析 胶 IEF 时 间 延 长 约 50%

上 面 的 加 样 方法 会 导致 蛋白 质 沉 淀 ， 上 样 量 较 大 时 (lm KES) 更 为 显著 。 将 IPG 胶 条 直接 在 含 所 分 析 样 品 泡 胀 液 中 泡 胀 可 以 克服 这 个 问题 (Rabilloud et al., 1994; Sanchez et al .，1997)。 利 用 该 方法 可 以 成 功 分 离 很 高 样品 量 (>10mg)， 但 可 能 存在 高 分 子 量 蛋 白 、 极 碱 性 和 膜 蛋白 的 选择 性 丢失 。 最 近 研 制 成 功 的 集成 化 设备 IPGpher (Amersham Pharmacia Biotech)， 简 化 了 一 向 IPG IEF。 该 设备 的 特点 是 可 以 在 加 样品 或 不 加 样品 时 在 持 胶 器 (strip holder) 中 对 胶 条 进行 重 泡 胀 、 选 择 上 样 量 以 及 随后 的 IEF，

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 访 45 ，

所 有 这 些 都 可 以 在 胶 条 放 入 容器 后 设置 程序 自动 进行 。 仪 器 可 以 同时 放置 12 个 持 胶 器 ， 并 配备 珀 尔 帖 (Peltier) 电子 晶体管 自动 冷却 装置 、 高 达 8000V 电压 的 程序 化 设置 和 1.5mA 的 电源 供应 (图 3.1i)， 表 3.2 列 出 一 些 利 用 IPGphor 的 典型 的 IPG IEF 运行 条 件 。 在 重 泡 胀 时 加 低 电 压 可 以 提高 高 分 子 质 量 蛋白 质 的 渗入 效率 。 适 用 于 胶 内 泡 胀 上 样 和 运行 一 向 IPG IEF 的 设备 也 可 从 Genomic Solutions (IPGpHaser) 和 Bio-Rad (Protean IEF cell) 获得 。

表 3.2 利用 IPGphor 的 运行 条 件 (Garg et al., 2000)

RAKE 180mm 温度 20T 最 大 电流 每 个 胶 条 0.05mA 最 大 电压 8000V I 工 分析 型 IEF 重 泡 胀 。30V，12 一 16h 初始 化 IEF 。 200V, 1h * 500V, 1h 。 1000V, ih

达到 稳定 态 后 IEF 。 30min 内 由 1000V 梯度 上 升 至 8000V 。 8000V 达到 稳定 态 ， 依 所 用 胶 条 pH 间隔 而 定 1~1.5 4 pH 单位 4 个 pH 单位 7 个 pH 单位 MIPGS~6 8h IPG4~8 4h IPG3~10L 3h 如 IPG4~5.5 8h IPG3~10NL 3h 3 个 pH 单位 5 一 6 个 pH 单位 8 一 9 个 pH 单位 IPG4~7 4h IPG4~9 4h IPG3~12 3h

IPG4~12 3h 开 微 量 制备 IEF 重 泡 胀 。30V，12 一 16h 达到 稳定 态 后 IEF 。 相应 分 析 胶 IEF 时 间 延 长 约 50%

7.4 IPG IEF pH 梯度 的 选择

对 一 新 样品 ， 和 常 最 先 使 用 宽 范 围 、 线 性 pH3.5~10 梯度 。 但 对 大 多 数 样 品 ， 这 样 做 会 丧失 pH4~7 区 域 的 分 辨 率 ， 许 多 蛋白 质 的 pI 值 在 该 区 域 。 利 用 非 线性 pH3.5 一 10 IPG IEF 胶 在 一 定 程 度 上 缓解 了 这 个 问题 (Bjellqvist et al., 1993). pH3.5~10 非 线 性 胶 条 在 pH4 ~7 区 域 的 梯度 要 比 pH7 一 10 更 为 平坦 ， 保 证 在 大 部 分 碱 性 蛋白 质 都 能 得 到 分 辨 的 前 提 下 ，pH4 一 7 区 域 能 得 到 更 好 的 分 离 (图 3.2)。 但 用 pH4~7 & IPG IEF 胶 则 能 在 该 范围 得 到 更 好 的 分 离 效 果 (图 3.3)。 这 些 pH 范围 的 胶 条 目前 已 经 商品 化 (Amersham Pharmacia Biotech，Bio-Rad)。 实 验 室 自 制 pH4~9 AY IPG 胶 也 能 覆盖 来 自 许多 不 同 种 类 样品 的 大 多 数 蛋白 质 。 这 些 梯度 的 IPG 胶 与 加 样 杯 上 样 或 胶 内 泡 胀 兼容 ， 在 Multiphor 和 IPGphor 系统 都 工作 良好 。 均 适用 于 分 析 胶 (上 样 量 50 一 100wg) 或 微 量 制备 胶 (ERE 1Img)。 典 型 运行 条 件 如 表 3.1 和 3.2 所 示 。

当 分 析 真 核 细 胞 提取 物 一 类 复杂 的 样品 时 ， 由 于 空间 分 辩 率 所 限 ， 而 且 高 丰 度 蛋白 质 存在 时 低 拷贝 数 蛋白 质 显 色 困难 ， 使 得 单一 宽 范 围 bH 梯度 IEF 只 能 显示 该 细胞 提取 物 全 蛋白质 组 的 一 小 部 分 。 可 以 克服 真 核 及 组 织 蛋白 质 表 达 高 动态 范围 和 多 样 性 问题 的

‘ibe! 5 蛋白 质 组 学

图 3.2 80wg 心室 蛋白 质 的 2-DE 分 离 一 维 应 用 18cm 非 线性 pH3 一 10 IPG IEF 凝 胶 ， 二 维 为 21cm 12% SDS-PAGE 胶 。 银 染 检 测 。 顶 端 标 尺 显 示 一 维 IPG 胶 条 的 非 线 性 pH 范围 ， 由 此 可 以 估计 出 分 离 蛋 白 的 表 观 等 电 点 。M: 标 尺 用 以 估计 蛋白 分 子 质量 。

包 ia ia

图 3.3 80npg 心室 蛋白 质 的 2-DE 分 离 一 维 为 18cm 线性 pH4~7 IPG IEF SER, —4EA 21cm 12% SDS-PAGE 胶 。 银 染 检 测 。 顶 端 标 尺 显示 一 向 IPG 胶 条 的 线性 pH 范围 ， 由 此 可 以 估计 出 分 离 蛋 白 的 表 观 等 电 点 。M:; 标尺 用 以 估计 蛋白 分 子 质量 。

A=B ZARATH PHAR MR RRR Bik - 47 -

一 种 方法 是 进行 样品 前 期 分 级 (014.4). A>-MRMHA REA RA RSE TH IPG HER, FREE 1~1.5pH Bf, HAVER A “BOK” (zoom gel) (Wildgruber et al., 2000). # ARK EAA (subproteomics) (Cordwell et al., 2000). WK, 也 可 用 24cm 的 宽 胶 条 (Garg et al., 1999). pH4~7 < lea] AY 72 VE El Be FY FD PBN ik BK 加 样 杯 上 样 ， 在 Multiphor 或 IPGphor 仪器 上 运行 (13.4). HERR TUL G2 8 上 样 量 微量 制备 的 理想 选择 ， 但 制备 胶 需 要 加 长 聚焦 时 间 “\ 见 表 3.1 和 表 3.2)。

3.4 鼠 肝 蛋白 质 的 微量 制备 IPG-Dalt 一 维 : IPG 5 一 6〈 预 制 胶 )。 分 离 距离 18cm。 胶 内 泡 胀 法 上 样 (S00ng). IEF 在 IPGphor 上 运行 。 条 件 : 8000V 最 大 电压 下 12h ( 详 见 表 1)。 二 维 : 垂 直 SDS-PAGE(13% T EE). RE.

强 碱 性 蛋白 质 如 核糖 体 和 核 蛋白 的 pl 值 在 10.5 到 11.8 之 间 ， 可 以 用 pH10~12 或 pH9~12 30 IPG (图 3.$; Gorg et al., 1997) 分 离 ， 要 获得 高 重复 性 的 2-DE 图 谱 ， 必 须 对 pH 梯度 生成 和 凝 胶 组 成 进行 不 同 的 优化 ， 如 用 N，N“ -二 甲 基 丙 烯 酰胺 取 RARE, FFE IPG 泡 胀 液 中 加 入 异 丙 醇 ， 从 而 抑制 容易 导致 大 量 胶 上 条 纹 的 反 辐 FAB (Gorg et 迟 .，1997)。 必 须要 用 加 样 杯 在 阴极 上 样 ， 且 IEF 要 在 硅油 下 进行 。

从 基因 组 序列 (Link et al., 1997) 计算 获得 的 理论 2-DE 图 谱 显 示 全 细胞 裂解 所 获得 的 大 部 分 蛋白 质 等 电 点 在 pH4 一 9， 但 同时 相当 一 部 分 蛋白 质 等 电 点 可 以 达到 pH12。 在 经 典 2-DE 中 这 些 蛋 白质 只 能 用 NEPHGE 分 离 ( 见 3)， 但 用 IPG IEF 很 容易 将 这 些 蛋 白质 分 开 。 具 体 作 法 是 用 上 文 所 提 到 的 窗 范 围 pH10 一 12 或 pH9 一 12 的 IPG， (AA ST BREET AMAR ARAN SR, Bscils BR pH3 一 12 pH4~12 的 宽 范 围 IPG (Garg et al .，1998，1999)。 目 前 已 获得 细胞 和 组 织 提取 及 TCA/ 丙 酮 沉淀 蛋白 质 时 通常 在 裂解 缓冲 液 提 取 中 缺失 的 pl 值 大 于 10 的 碱 性 蛋白 质 (Garg et al., 1998, 1999) 以 及 肺 支 原 体 中 不 溶 于 Triton X-100 的 细胞 成 分 (Hermann et al., GT

ie 蛋白 质 组 学

IPG9-12 Da

-30

-20

图 3.5 鼠 肝 极 碱 性 蛋白 (TCA/ 丙 酮 沉淀 ) 的 分 析 型 IPG-DALT (Garg et al., 1997) 一 维 : IPG9-12 (5000V 最 大 电压 8h) 。 分 离 距离 18cm。 在 阳极 端 用 加 样 杯 上 样 。 二 维 : 垂直 SDS-PAGE (13%T ES). BIR.

fa) 的 良好 的 2-DE 图 谱 。 此 外 ， 在 pH9 和 pHI12 间 含 一 个 平缓 区 的 pH4 一 12 IPG 可 以 对 如 核糖 体 和 蛋白 质 类 强 碱 性 蛋白 质 获 得 极 好 分 离 (Garg et al .，1998)。 这 些 宽 梯 度 可 以 在 不 含 异 丙 醇 的 标准 条 件 下 运行 ， 因 为 此 时 超过 pHI10 hs IPG 胶 中 水 合 离子 向 阴极 的 强烈 转移 〈 反 向 电 渗 ) 特性 可 以 忽略 不 计 。 此 外 ， 高 分 子 质量 蛋白 质 的 渗入 和 聚焦 也 得 到 了 明显 改善 (图 3.6)。

利用 经 典 OFarrell 系统 可 以 在 宽 分 离 距离 (每 个 方向 上 超过 30cm) 上 获得 复杂 和 蛋 白质 谱 的 最 大 分 辨 率 (Klose，1999)。 但 是 ， 若 用 IEF 管 胶 技术 ， 其 成 功 则 伴随 着 凝 胶 操作 和 处 理 过 程 中 方便 性 的 丧失 。 与 此 对 比 ， 在 塑料 支持 膜 上 聚合 的 长 IPG 胶 的 处 理 不 需要 特殊 注意 之 处 。 如 覆盖 pH3~12 和 pH4 一 12 范围 的 24cm IPG 胶 条 已 成 功 使 用 (图 3.6; Gorg et al .，1999)。 此 外 ， 利 用 罕 范 围 pH fH (如 pHS~6) 的 24cm 长 IPG 胶 条 可 以 获得 高 分 辨 2-DE 图 谱 (图 3.7)。

7.5 聚焦 时 间 的 优化

理论 上 讲 ， 要 获得 最 好 的 图 谱 质 量 和 重复 性 所 需 最 佳 时 间 是 IEF 分 离 达到 稳定 态 所 需 的 时 间 (Garg et wl .，1988，1997) 。 若 聚焦 时 间 太 短 ， 会 导致 水 平和 垂直 条 纹 ， 但 要 避免 过 度 聚 焦 。 虽 然 与 经 典 O" Farrell 法 相 比 ， 不 会 导致 蛋白 质 向 阴极 的 迁移 (阴极 漂移 )， 但 却 会 因为 活性 水 转运 而 导致 过 多 水 在 IPG 胶 表 面 渗 出 〈( 电 渗 )， 会 造成 蛋 自 图 谱 变 形 。 在 胶 条 碱 性 端 产生 水 平 条 纹 以 及 蛋 白质 丢失 。 最 佳 聚焦 时 间 必 须根 据 不 同 蛋 白质 样品 、 和 蛋白 上 样 量 和 所 用 特定 pH 范围 及 IPG 胶 条 长 度 通 过 经 验 来 确定 。 作 为 指

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 - 49 -

cm 图 3.6 Gérg (1999) 加 长 距离 的 宽 范 围 IPG 鼠 肝 蛋白 质 的 分 析 型 IPG-Dalt (有 裂解 缓冲 液 提 取 )。 一 维 : IPG3 一 12。 分 离 距 离 24cm。

阳极 端 加 样 杯 上 样 。 运 行 条 件 : 3500V 最 大 电压 6h ( 见 表 1)。 二 维 : 垂直 SDS-PAGE (13% 工 连续 胶 )。 银 染 。

IPG 5-6

~ 24cm

图 3.7 MK ERR 72 ve Hl IPG 根据 Gorg F (2000) 的 鼠 肝 蛋白 质 (MRE) 的 分 析 型 IPG-Dalt。 一 维 : IPGS~6 (实验 室 自 制 )。 分 离 距 离 24cm。 阳 极端 加 样 杯 上 样 。 运 行 条 件 : 3500V 最 大 电压 40h ( 见 表 1)。 二 维 : HEH SDS-PAGE (13%T 连 续 胶 )。 银 染 。

- 50 . 蛋白 质 组 学 导 ， 表 3.1 和 表 3.2 Aik FHM ASIA RAZ pH 范围 IPG 的 优化 聚焦 时 间 。 8. 两 维 间 平衡

在 一 维 IPG IEF 后 ， 胶 条 可 马上 用 于 二 维 ， 也 可 保存 在 两 片 塑 料 膜 间 于 - 80YC 存 放 几 个 月 时 间 。 在 二 维 分 离 前 ， 必 须要 平衡 IEF 胶 ， 以 便于 被 分 离 蛋 白质 与 SDS 完整 结合 ， 从 而 在 SDS-PAGE 过 程 中 正常 迁移 (图 3.11)。 建 议 方案 是 将 IPG IEF RE 50mmol/L Tris 缓冲 液 ，pH8.8， 含 2% m/V SDS，1% m/V DTT, 6mol/L 尿素 和 30% 甘 油 中 孵育 1Smin， 尿 素 和 甘油 是 用 于 减缓 电 渗 效 应 ， 否 则 会 使 一 维 到 二 维 的 蛋白 质 转移 率 降低 (Gorg et al! .，1988)。 接 下 来 同样 是 在 缓冲 液 中 平衡 13min， 只 不 过 此 时 用 5% m/V 碘 乙 酰胺 取代 DTT， 这 一 步 是 用 来 烷 基 化 自由 DTT, BMA DTT 在 二 维 SDS-PAGE 胶 迁 移 ， 会 产生 点 条 纹 的 假象 ， 在 银 染 后 可 以 观察 出 来 。 另 外 一 种 方法 ， 可 以 一 步 完 成 平衡 ， 是 在 平衡 液 中 用 Smmol/L TBP 取代 DTT, TBP 不 带电 荷 ， 在 SDS-PAGE 过 程 中 不 迁移 (Herbert et al .，1998)。 平 衡 后 上 二 维 胶 之 前 ，IPG 胶 应 沿 边缘 用 滤纸 吸 干 lmin 以 去 除 多 余 液 体 。

9. 二 维 SDS-PAGE

2-DE 第 二 维 最 常用 的 是 Laemmli (1970) 非 连续 缓冲 体系 ， 二 维 胶 是 单一 浓度 或 含 线性 或 非 线 性 梯度 的 凝 胶 ， 其 覆盖 范围 可 以 使 不 同 分子 质 量 大 小 蛋白 质 得 到 有 效 分 离 。 由 于 IPG 胶 黏 合 在 弹性 塑料 支持 膜 上 ， 其 处 理 要 比 用 经 典 OFarrell 体系 中 脆性 IEF 管 胶 容易 。 平 衡 后 ，IPG 胶 条 可 直接 加 在 二 维 SDS-PAGE 胶 的 表面 ， 其 方式 可 以 是 #26 (3.1m, n) KF (图 3.1lo)。

水 平 SDS-PAGE 可 利用 预制 胶 (ExcelGel, Amersham Pharmacia Biotech) 或 依据 Garg (1988) 所 描述 的 超 薄 孔 状 梯 度 胶 在 GelBond PAGfilm (Amersham Pharmacia Biotech) 上 自制 平板 胶 上 运行 。 必 须要 用 6%T 的 浓缩 胶 ， 然 后 是 均一 (如 12% ) 或 梯 度 (412% ~15%) 分 离 胶 ， 该 方法 在 Garg 等 (2000) 中 有 详细 描述 。 水 平 二 维系 统 的 优点 是 凝 胶 附 着 在 塑料 支持 膜 上 ， 在 染色 过 程 中 可 以 防止 凝 胶 大 小 发 生变 化 。 此 外 ， 由 于 水 平 胶 厚度 减少 (一般 在 0.Smm， 而 垂直 胶 为 1 或 1.Smm)， 因 而 可 以 施加 较 高 电 压 ， 减 短 运行 时 间 ， 减 少 蛋白 质 扩 散 ， 使 得 水 平 胶 分 离 蛋白 质点 的 边缘 要 比 垂直 胶 清 晰 。

大 规模 蛋白 质 组 分 析 通常 需要 成 批 二 维 SDS-PAGE 同时 电泳 以 获得 最 好 的 图 谱 重 复 性 。 此 外 ， 凝 胶 格 式 需 与 计算 机 控制 的 机 器 人 切割 设备 匹配 ， 用 多 块 胶 垂直 二 维 . SDS-PAGE 设备 如 DALT 系统 (Amersham Pharmacia Biotech) (Anderson and Anderson, 1978a, b), Investigator (Genomic Solutions) (Patton et al., 1990) 或 Protean II xi (Bio-Rad) 可 以 满足 大 规模 蛋白 质 组 分 析 的 需求 。 在 垂直 电泳 系统 中 不 需要 浓缩 胶 ， 因 为 在 IPG 胶 条 中 和 蛋白质 区 已 得 到 浓缩 ， 可 以 认为 非 限 制 性 TEP RE 〈 低 浓度 聚 丙烯 酰胺 We) 充当 了 浓缩 胶 (Dunn, 1993).

10. 分 辨 率 2-DE 的 分 离 能 力 取决 于 在 两 维 上 的 长 度 ， 通 常 认为 与 有 效 的 分 离 面积 成 正比 。 利

第 三 章 ”蛋白 质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 St。

用 18cm 长 的 IPG IEF 与 20cm 长 二 维 SDS-PAGE 胶结 合 ， 对 于 全 细胞 和 组 织 裂 解 物 所 获得 的 蛋白 混合 物 ， 可 以 很 轻易 分 离 得 到 2000 个 点 。 利 用 小 胶 只 能 得 到 几 百 个 蛋白 质 点 ， 但 小 胶 运 行 时 间 较 短 ， 可 用 于 快速 盘 选 。 对 特别 复杂 的 样品 ， 要 获得 最 大 分 辩 率 ， 用 特大 胶 可 以 从 全 细胞 裂解 液 中 分 离 得 到 $S000 一 10 000 个 蛋白 质点 〈Klose，1999)。 但 利用 多 块 重 释 窗 范 围 放 大 IPG 胶 来 生成 复杂 样品 的 复合 2-DE 蛋 日 图 谱 具 有 明显 优势 ( 见 7.4).

11. 重复 性

直到 最 近 重 复 性 仍然 是 限制 2-DE 广泛 应 用 的 主要 问题 。 利 用 经 典 O?Farrell 管 胶 技 术 ， 即 使 在 同一 实验 室内 要 获得 特定 类 型 样品 的 重复 性 分 离 也 很 困难 。 在 不 同 实验 室 之 间 所 获得 的 2-DE 图 谱 间 比较 更 不 可 能 。2-DE 的 专门 设备 如 ISO-DALT 和 Investigator 系统 可 以 在 重复 性 控制 条 件 下 同时 运行 大 量 数目 的 电泳 (5 一 20 块 ) 缓解 了 这 个 问题 。 更 为 重要 的 是 ， 不 同类 型 样品 (OOM, KA, BR) 实验 室 间 研究 明确 证 实 利 用 IPG IEF 所 获得 的 2-D 蛋白 分 离 具有 很 高 的 空间 位 置 和 定量 重复 性 (Blomberg et al., 1995; Corbett et al., 1994).

12. 展望

蛋白 混合 物 的 重复 性 高 分 辩 分 离 是 一 个 成 功 的 蛋白 质 组 学 研究 的 关键 。 虽 然 最 近 对 蛋白 质 组 学 中 蛋白 分 离 的 可 替代 方法 的 研究 有 所 进展 〈 见 1 和 第 十 章 )， 但 仍然 没有 实 用 的 方法 可 替代 2-DE 能 同时 分 离 和 显现 混合 物 中 几 千 个 和 蛋白质。 与 基于 SCA 产生 的 pH 梯度 的 经 典 O'Farrell 2-DE 方法 相 比 ，IPG IEF 2-DE 更 加 灵活 ， 能 满足 蛋白 质 组 分 析 的 需求 ， 特 别 是 高 至 pH12 的 碱 性 IPG 方便 了 极 碱 性 蛋白 的 分 析 。 重 用 罕 范围 IPG， 允许 低 丰 度 恒 昌 的 更 高 分 辩 率 的 分 离 分 析 ， 预 制 IPG 胶 条 的 应 用 和 集成 化 运行 设备 如 IPGphor 使 2-DE 向 自动 化 方向 前 进 了 一 步 ， 虽 然 2-DE 的 自动 化 是 蛋白 质 组 学 中 一 个 关 键 问题 ， 但 在 实际 中 要 设计 能 完成 整个 过 程 的 自动 化 系统 是 不 可 能 的 。 实 事 上 ， 和 蛋白 质 组 流程 中 一 个 主要 的 瓶颈 效应 是 2-D 凝 胶 图 像 的 分 析 和 数据 开发 ， 在 该 领域 的 自动 化 和 效率 的 提高 可 能 会 对 蛋白 质 组 项 目 产生 最 大 的 影响 (Lopez，2000)。 目 前 ， 限 制 性 因素 依然 是 朴 水 蛋白 及 膜 蛋白 的 分 析 、 以 及 灵敏 和 可 靠 的 蛋白 质 定 量 方法 的 缺乏 ， 即 使 最 近 在 荧光 染料 技术 的 进展 为 解决 这 个 问题 指出 了 一 个 方向 (Patton，2000)。 总 之 ， 虽 然 2-DE 技 术 并 不 完美 ， 但 在 目前 和 相当 长 的 一 段 时 间 内 ， 它 将 仍然 是 蛋白 质 组 项 目 中 分 离 蛋 白 混 合 物 所 要 选择 的 核心 技术 。

(BA HF Riles 校 )

a 蛋白 质 组 学

参考 文献

Anderson, N.G. and Anderson, N.L. (1978) Analytical techniques for cell fractions. XXI. Two- dimensional analysis of serum and tissue proteins: multiple isoelectric focusing. Anal. Biochem. 85: 331-340.

Anderson, N.G. and Anderson, N.L. (1978) Analytical techniques for cell fractions. XXII. Two- dimensional analysis of serum and tissue proteins: multiple gradient-slab gel electrophoresis. Anal. Biochem. 85: 341-354.

Banks, R.E., Dunn, M.J., Forbes, M.A., Stanley, A., Pappin, D., Naven, T., Gough, M., Harnden, P. and Selby, P.J. (1999) The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis — preliminary findings. Electrophoresis 20: 689-700.

Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P.G., Gianazza, E., Gorg, A., Westermeier, R. and Postel, W. (1982) Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applica- tions. J. Biochem. Biophys. Methods 6: 317-339.

Bjeliqvist, B., Sanchez, J.C., Pasquali, C., Ravier, F., Paquet, N., Frutiger, S., Hughes, G.J. and Hochstrasser, D.F. (1993) A nonlinear wide-range immobilised pH gradient for two-dimen- sional electrophoresis and its definition in a relevant pH scale. Electrophoresis 14: 1357-1365.

Blomberg, A., Blomberg, L., Norbeck, J. et a/. (1995) Interlaboratory reproducibility of yeast protein patterns analyzed by immobilized pH gradient two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 16: 1935-1945.

Corbett, J.M., Dunn, M.J., Posch, A. and Gorg, A. (1994) Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison. Electrophoresis 15: 1205-1211.

Cordwell, S.J., Nouwens, A.S., Verrils, N.M., Basseal, D.J. and Walsh, B.J. (2000) Sub-proteomics based upon protein cellular location and relative solubilities in conjunction with composite two- dimensional gels. Electrophoresis 21: 1094-1103. :

Corthals, G.L., Wasinger, V.C., Hochstrasser, D.F. and Sanchez, J.C. (2000) The dynamic range of protein expression: A challenge for proteomic research. Electrophoresis 21: 1104-1115.

Dunn, M.J. (1987) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: Advances in Electro- phoresis (ed. Chrambach, A., Dunn, M.J. and Radola, B.J.), Vol. 1, VCH, Weinheim, pp. 1-109.

Dunn, M.J. (1993) Gel Electrophoresis: Proteins. BIOS Scientific Publishers, Oxford.

Garrels, J.I. (1979) Two dimensional gel electrophoresis and computer analysis of proteins synthesized by clonal cell lines. J. Biol. Chem. 254: 7961-7977

Garvik, B.M. and Yates, J.R. 3rd. (1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnol. 17: 676-682.

Gorg, A., Postel, W. and Giinther, S. (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9: 531-546.

Gorg, A., Postel, W., Friedrich, C., Kuick, R., Strahler, J.R. and Hanash, S.M. (1991) Tempera- ture-dependent spot positional variability in two-dimensional polypetide patterns. Electro- Phoresis 12: 653-658.

Gorg, A., Boguth, G., Obermaier, C., Posch, A. and Weiss, W. (1995) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG- Dalt): the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems. Electro- Phoresis 16: 1079-1086.

Gorg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Csordas, A., Diaz, J.J. and Madjar, J.J. (1997) Very alkaline immobilized pH gradients for two- dimensional electrophoresis of a and nuclear proteins. Electrophoresis 18: 328-337.

Gorg, A., Boguth, G., Obermaier, C. and Weiss, W. (1998) Two-dimensional electrophoresis of proteits in an immobilized pH 4-12 gradient. Electrophoresis 19: 1516-1519.

Goérg, A., Obermaier, C., Boguth, G. and Weiss, W. (1999) Recent developments in two- dimensional gel electrophoresis with immobilized pH gradients: wide pH gradients up to pH 12, longer separation distances and simplified procedures. Electrophoresis 20: 712-717.

Gorg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe, B., Wildgruber, R. and Weiss, W. (2000)

第 三 章 “蛋白质 组 分 析 中 的 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 « 53.°

The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electro- phoresis 21: 1037-1053.

Gygi, S.P., Rist, B., Gerber, S.A., Turecek, F., Gelb, M.H. and Aebersold, R. (1999) Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnol. 17: 994-999.

Herbert, B., Molloy, M.P., Gooley, A.A., Walsh, B.J., Bryson, W.G. and Williams, K.L. (1998) Improved protein solubility in two-dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as a reducing agent. Electrophoresis 19: 845-851.

Herbert, B. (1999) Advances in protein solubilisation for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 20: 660-663.

Iborra, F., Buhler, J.M. (1976) Protein subunit mapping. A sensitive high-resolution method. Anal. Biochem. 74: 503-511.

Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231-243.

Klose, J. (1999) Genotypes and phenotypes. Electrophoresis 20: 643-652.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 22: 680-685.

Link, A.J., Robison, K. and Church, G.M. (1997) Comparing the predicted and observed properties of proteins encoded in the genome of Escherichia coli K-12. Electrophoresis 18: 1259-1313.

Link, A.J., Eng, J., Schieltz, D.M., Carmack, E., Mize, G.J., Morris, D.R., Garvik, B.M. and Yates, J.R. 3rd. (1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnol. 17: 676-682.

Lollo, B.A., Harvey, S., Liao, J., Stevens, A.C, Wagenknecht, R., Sayen, R., Whaley, J. and Sajjadi,

_F.G. (1999) Improved two-dimensional gel electrophoresis representation of serum proteins by using ProtoClear. Electrophoresis 20: 854-859.

Lopez, M.F. (2000) Better approaches to finding the needle in a haystack: Optimizing proteome analysis through automation. Electrophoresis 21: 1082-1093.

Merchant, M. and Weinberger, S.R. (2000) Recent advances in surface enhanced laser-desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry. Electrophoresis 21: 1165-1177.

Molloy, M.P., Herbert, B., Walsh, B.J., Tyler, M.I., Traini, M., Sanchez, J.C., Hochstrasser, D.F., Williams, K.L. and Gooley, A.A. (1998) Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 19: 837- 844.

Monribot, C. and Boucherie, H. (2000) Two-dimensional electrophoresis with carrier ampholytes. In: Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (ed. Rabilloud, T.), Springer, Berlin, pp. 31—55.

Nelson, R.W., Nedelkov, D. and Tubbs, K.A. (2000) Biosensor chip mass spectrometry: a chip- based approach. Electrophoresis 21: 1155-1163.

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021.

O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M. and O'Farrell, P.H. (1977) High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins. Ce// 12: 1133-1141.

Patton, W.F., Pluskal, M.G., Skea, W.M., Buecker, J.L., Lopez, M.F., Zimmermann, R., Belanger, L.M. and Hatch, P.D. (1990) Development of a dedicated two-dimensional gel electrophoresis system that provides optimal pattern reproducibility and polypeptide resolution. Bio Techniques 8: 518-527.

Patton, W.F. (2000) A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics. Electrophoresis 21: 1123- 1144.

Perdew, G.H., Schaup, H.W. and Selivonchick, D.P. (1983) The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal. Biochem. 135: 453-455. Rabilloud, T., Hubert, M. and Tarroux, P. (1986) Procedures for two-dimensional electrophoretic

analysis of nuclear proteins. J. Chromatogr. 351: 77-89. Rabilloud, T., Valette, C. and Lawrence, J.J. (1994) Sample application by in-gel rehydration

- 54° & A Raa

improves the resolution of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension. Electrophoresis 15: 1552-1558.

Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A. and Lunardi, J. (1997) Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 18: 307-316.

Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M. and Seraphin, B. (1999) A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnol. 17: 1030-1032.

Sanchez, J.C., Rouge, V., Pisteur, M., Ravier, F., Tonella, L., Moosmayer, M., Wilkins, M.R. and Hochstrasser, D.F. (1997) Improved and simplified in-gel sample application using reswelling of dry immobilized pH gradients. Electrophoresis 18: 324-327.

Santoni, V., Molloy, M. and Rabilloud, T. (2000) Membrane proteins and proteomics: Un amour impossible? Electrophoresis 21: 1054-1070.

Scheele, G.A. (1975) Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. Characterization of guinea pig exocrine pancreatic proteins. J. Biol. Chem. 250: 5375-5385. 7

Simone, N.L., Bonner, R.F., Gillespie, J.W., Emmert-Buck, M.R. and Liotta, L.A. (1998) Laser- capture microdissection: opening the microscopic frontier to molecular-.analysis. Trends Genetics 14: 272-276.

Smithies, O. and Poulik, M.D. (1956) Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature W775, 1033.

Uetz, P., Giot, L., Cagney, G. et al. (2000) A comprehensive analysis of protein—protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature 403: 623-627.

Wildgruber, R., Harder, A., Obermaier, C., Boguth, G., Weiss, W., Fet. S.J., Larsen, P.M. and Gorg, A. (2000) Towards higher resolution: 2D-Electrophoresis of Saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping narrow IPGs. Electrophoresis 21: (in press).

1) ate

第 四 章 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测

Wayne F. Patton

本 章 主要 概括 当前 应 用 于 凝 胶 电 泳 和 电 转 印 的 全 蛋白 质 呈 现 技术 ， 特 别 是 这 些 技术

在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 适用 性 ， 蛋 白 质 显 色 技 术 发 展 简 史 如 表 4.1。 已 有 许多 不 同 的 关 于 胶 内 和 膜 上 蛋白 质 显 色 的 精彩 的 综述 性 文章 和 比较 学 研究 ， 有 兴趣 的 读者 也 可 以 参阅 文献 (Brush, 1998; Dunn, 1999; Fernandez-Patron et al., 1998; Fowler, 1994; Li ez al., 1989; Merril, 1987;- Neuhoff et al., 1985; Patton et al., 1999a, b; Rabilloud, 1990; Rabilloud et al., 1994; Wirth and Romano, 1995).

年 代 1950 1952 1063 1965 1967 1969 1971 1972

1972 1974 1978 1979 1980 1980 1981 1982 1983 1985

1985 1985 1987 1988 1988

1991 1992

# 4.1

开发 者 Durrum

Grassman and Hannig

Fazakas de St. Groth et al.

Meyer and Lamberts Chrambach et al.

Hartman and Udenfriend

Talgot and Yphantis Diezel et al.

Kerenyi and Gallyas Wallace et al. Graham et al. Switzer et al. Hager and Burgess Oakley et al. Merril et al. Zapolski et al . Hancock and Tsang Neuhoff et al.

Rohringer and Holden Moeremans et al. Lee et al.

Dzandu et al.

Jackson et al.

Daban et al. Ortiz et al.

凝 胶 电 泳 和 转 膜 蛋白 质 显 色 染色 试剂 50 年 简 史

染料 类 型 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 染料 有 机 荧光 团 有 机 荧光 团 有 机 染料

大 事 记

在 滤纸 上 用 溴 酚 蓝 染色

在 滤纸 上 用 氨基 黑 染 色

醋酸 纤维 素 膜 、 琼 脂 糖 或 淀粉 胶 的 考 马 斯 蓝 R-250 染色 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 (PAGE) 的 考 马 斯 蓝 R-250 染色

PAGE 胶 用 考 马 斯 蓝 R-250 在 三 氯 醋酸 溶液 中 无 背景 染色 利用 苯胺 蔡 磺 酸 盐 对 蛋白 质 琉 水 位 点 的 非 共 价 染色

凝 胶 电 泳 前 用 丹 磺 酰氯 共 价 衍生 蛋白 质

三 氯 醋酸 溶液 中 考 马 斯 蓝 R-250 改善 后 凝 胶 无 背景 染色 。 注意 到 染料 转化 为 胶体

琼脂 糖 胶 中 和 蛋白质 基 于 铁 氨 化 钾 的 组 织 化 学 银 染

SDS 胶 冷 却 以 沉淀 去 污 剂 、 净 化 蛋白 区

凝 胶 的 亚 铁 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 染色

利用 连续 碱 性 和 酸性 银 染 步骤 对 PAGE REE

用 KCI BEAT HER A

基于 组 织 化 学 的 PAGE 胶 银 染 (PRYE/ FRI AK) RELA. EF (SH PAGE RAR (酸性 /硝酸 银 法 ) 凝 胶 的 放射 性 、 亚 铁 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 染 色

转 膜 蛋 白质 的 印度 墨水 染色 〈 胶 体 金 染 色 的 先驱 )

证 实 胶体 考 马 斯 蓝 的 胶体 属性 ， 确 定 多 种 酸 / 乙 醇 混 合 物 的 化 学 式

转 膜 蛋 白质 的 胶体 金 染色

转 膜 蛋白 质 的 高 灵敏 度 胶体 金 、 铁 和 银 染

胶 内 蛋白 质 的 氯 化 铜 负 染

胶 内 蛋白 质 的 氯 化 锌 负 染

在 等 电 聚 焦 胶 内 用 MDPF 共 价 术 生 蛋白 质 ， 进 一 步 二 向 分 离

利用 尼 罗 红 对 PAGE 胶 内 蛋白 - SDS RA WRI

高 灵敏 度 氯 化 锌 /咪唑 负 染

- 56° 蛋白 质 组 学 续 表

年 代 开发 者 染料 类 型 大 事 记

1994 Patton et al. SRBCE 比 色 法 、 锌 铁 - 亚 铁 金属 整合 盐 染 色 (硝酸 纤维 素 ，PVDF)

1996 Steinberg et al. 有 机 荧光 团 利用 SYPRO Red 和 Orange 的 蛋白 - SDS RAW ies R BE Fe Jt

1997 Lim et al. RHERBCH RHADIEAKI BRERA (硝酸 纤维 素 ，PVDF， PAGE 胶 )。SYPRO Rose 染料

1997 Unlu et al. 有 机 荧光 团 两 个 蛋白 样品 用 两 基 -Cy3 和 甲 基 -Cy5 染料 分 别 衍生 并 在 同 一 2-DE 胶 上 同时 显 色

1999 Berggren et al. RHERBBCH BRHERFRHEAMHSRBCREA (硝酸 纤维 素 ，

PVDF, PAGE 胶 )。SYPRO Ruby 染料 ~

2. 有 机 染料 和 银 染

FAP SR Pa Hs Bt ER Hk (PAGE) 分 离 蛋 白质 常规 检测 和 定量 的 最 普遍 方法 是 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 (Brush，1998; Merril, 1987; Wirth and Romano，1995)。 测 序 技术 和 质谱 灵敏 度 的 提高 使 蛋白 质 显 色 的 地 位 从 简单 的 显 色 试 剂 转换 为 集成 化 的 蛋白 质 微 量 化 学 表征 过 程 中 的 关键 步骤 。 随 着 高 灵敏 度 蛋 白质 分 析 方 法 和 电泳 后 鉴定 技术 的 结合 ， 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 用 于 蛋白 质 组 研究 的 局 限 性 日 益 暴 露出 来 。

2.1 有 机 染料

自 20 世纪 60 年 代 早 期 传统 考 马 斯 蓝 染 色 技 术 在 甲醇 和 栈 酸 水 溶液 中 用 于 PAGE 胶 染色 后 ， 即 得 到 广泛 应 用 (Fazekas de St. Groth et al., 1963; Meyer and Lamberts, 1965)。 至 少 已 偿 试 了 600 种 关于 PAGE 胶 考 染 染色 的 线性 和 检测 灵敏 度 的 不 同方 法 (Neuhoff et wz .，1985)。 考 马 斯 蓝 染 料 可 以 检测 到 30~100ng 蛋白 质 ， 但 其 灵敏 度 远 低 于 银 染 或 荧光 检测 (Brush, 1998).

胶体 考 马 斯 蓝 应 用 于 PAGE 胶 分 离 蛋白 质 的 无 背景 检测 可 能 是 考 染 方法 中 最 有 意 义 的 进展 (Chrambach et al., 1967; Diezel et al., 1972; Neuhoff et al., 1985, 1988). 酸性 紫 17、Serva 紫 49 和 坚 牢 绿 PCF 等 相关 染料 也 可 在 强酸 性 溶液 中 形成 胶体 ， 检 测 PAGE 胶 内 和 蛋白质 ， 且 只 产生 很 低 的 背景 (Neuhoff et al., 1990; Patestos et al., 1988)。 估 计 其 染色 机 制 是 因为 在 胶体 染料 和 溶液 中 自由 扩散 的 染料 间 形 成 平衡 态 ， 少 量 溶液 自由 染料 穿 透 凝 胶 基质 ， 有 选择 性 地 对 和 蛋白质 染色 ， 而 胶体 染料 排 阻 在 胶 外 ， 阻 止 了 背景 生成 (Brush, 1998; Neuhoff et wz .，1988)。 胶 体 考 马 斯 蓝 检测 蛋白 质 的 极限 = 8~10ng (Brush，1998)。 染 色 过 程 通常 是 在 高 浓度 的 三 氯 醋酸 、 高 毛 酸 或 磷酸 中 进 行 ， 并 辅 以 甲醇 或 乙醇 。 质 谱 对 蛋白 质 修 饰 的 研究 表明 用 含 三 氯 醋酸 和 乙醇 的 考 马 斯 蓝 染色 的 蛋白 质 易 导 致 谷 氨 酸 羧基 侧 链 的 不 可 逆 酸 催化 酯 基 化 (Haebel et wz .，1998)。 这 样 就 使 所 得 肽 谱 数 据 复杂 化 ， 但 也 可 通过 在 分 析 软 件 中 加 入 算法 来 考虑 这 种 修饰 。

氨基 黑 是 最 早 应 用 于 蛋白 质 电泳 后 显 色 的 有 机 染料 (Grassman and Hannig, 1952). 现在 常用 于 中 度 灵 敏 度 聚 偏 二 氟 乙 烯 (PVDF) 和 硝酸 纤维 素 膜 的 电 转 印 蛋 白质 比 色 检 it] (Dunn，1999)。 虽 然 氮 基 黑 和 考 马 斯 蓝 都 可 用 于 显 色 电 转 印 蛋 白质 ， 但 考 马 斯 蓝 特

第 四 章 “” 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 有 蛋白质 的 检测 “5

异性 地 染色 硝酸 纤维 素 膜 ， 因 而 会 产生 高 背景 ， 但 是 ， 改 进 后 的 硝酸 纤维 素 膜 上 蛋白 质 低 背 景 染 色 程 序 可 能 会 使 考 马 斯 蓝 染料 得 到 有 效 的 利用 (Metkar et al! .，1995)。 两 种 染 色 方 法 都 适用 于 PVDF 膜 上 和 蛋白质 检 测 ， 虽 然 它 们 与 下 游 微量 化 学 表征 兼容 ， 但 常 干 扰 随后 的 免疫 检测 和 照 像 备份 程序 (Eynard and Lauriere, 1998; Pryor et al., 1992). 一 个 方法 是 在 免疫 检测 前 先 脱色 (Pryor et al., 1992), BAG aie we UL Bl — 体 和 比 色 底 物 如 坚 牢 红 / 蔡 酚 AS MX 磷酸 盐 或 5-TR-4-SA M5] ie eR ah / A PRA 马 斯 蓝 染 料 检测 全 蛋白质 可 以 同时 显 色 特 异性 蛋白 质 (Zeindl-Eberhart et al., 1997). 该 方法 特点 是 双向 电泳 时 需要 大 的 上 样 量 (400wg)， 必 须 用 PVDF 膜 进 行 转 印 ， 而 且 所 检测 的 目标 蛋白 质 丰 度 要 相当 的 高 。 目 前 ， 这 种 双色 显 色 程 序 必 须 针 对 每 一 样品 进行 逐一 条 件 摸索 ， 以 确定 是 否 适 用 于 目标 蛋白 质 的 检测 。

2.2 Ra

银 染 的 根源 可 以 追溯 到 19 世纪 初 所 开发 的 照相 术 及 组 织 学 技术 (Merril, 1987; Merril et al., 1984; Rabilloud, 1990). Kerenyi 和 Gallyas (1972) 首先 设计 一 种 通用 的 针对 电泳 、 免 疫 电 泳 和 免疫 扩散 的 蛋白 质 银 染 检测 方案 ， 其 检测 灵敏 度 报道 比 氨基 黑 高 ， 但 该 方案 只 是 优化 用 于 琼脂 糖 而 非 PAGE 胶 。 此 法 随后 得 到 提高 并 在 琼脂 糖 凝 胶 分 离 DNA 和 和 蛋白质 中 均 显 示 良 好 的 灵敏 度 (Peats，1984)。PAGE RTA BARR RE 在 首次 琼脂 糖 胶 方 法 7 年 后 引入 的 (Switzer et wz .，1979)。 据 报道 新 方法 灵敏 度 至 少 比 考 马 斯 蓝 高 100 倍 ， 由 此 使 银 染 成 为 一 项 创新 性 的 蛋白 质 检测 技术 ， 其 动态 线性 范围 -扩展 到 40 倍 浓 度 。 因 此 完全 可 以 和 有 20 倍 线性 范围 的 考 马 斯 蓝 染 色 对 比 (Dunn, 1987)。 银 染 技 术 的 引入 ， 使 蛋白 质 检 测 的 灵敏 度 由 微克 级 升 为 纳 克 级 〈 除 了 早期 胶体 考 马 斯 蓝 高 灵敏 度 染 色 ) 。

已 报道 100 多 种 银 染 方法 (Rabilloud，1992 )， 个 巨大 数字 也 证 明了 一 个 事实 ， 即 没有 一 种 方法 能 集 便 利 、 快 速 和 高 灵敏 度 为 一 体 tt 1992，1999)。 许 多 银 染 方法 所 拥有 的 一 个 缺点 是 对 某 些 种 类 蛋白 质 如 钙 结 合 蛋白 质 和 糖 蛋 白 ， 染 色 效 果 相 当 差 (Jay et al., 1990; Schleicher and Watterson, 1983; Wirth and Romano，1995$)。 研 究 发 了 对 于 糖 蛋白 来 说 ， 银 染 的 强度 与 分 子 质 量 组 成 中 糖 类 所 占 的 比例 负 相关 (Jay et

，1990)。 在 银 染 前 用 阴离子 染料 对 蛋白 质 预 染 色 可 以 很 好 的 改善 糖 蛋 日 的 检测 人 and Bezard, 1982; Jay et al., 1990).

银 染 虽 可 检测 低 纳 克 级 的 蛋白 质 ， 但 银 离子 可 与 半 胱 氨 酸 残 基 相 互 作用 ， 而 且 银 染 中 用 了 成 二 醛 和 甲醛 ， 这 两 者 会 对 蛋白 质 的 和 es -氨基 进行 烷 基 化 。 这 样 妨碍 了 胶 上 蛋白 质 Edman 蛋白 质 测序 的 进一步 分 析 。 虽 然 去 除 成 二 醛 后 ， 蛋 白质 可 用 质谱 分 析 来 鉴定 (Christiansen and Houen, 1992; Shevchenko et al., 1996; Wilm et al., 1996), {BH 这 种 改变 的 程序 也 伴随 着 银 染 灵敏 度 和 均一 性 的 降低 以 及 凝 胶 背 景 的 升 高 。 利 用 这 种 修 改 后 的 银 染 程序 ， 肽 质量 指纹 谱 中 的 低 序 列 覆 盖 率 抵消 了 银 染 相对 于 考 染 和 锌 - 喀 哗 染 色 的 高 检测 灵敏 度 (Scheler et al .，1998)。 估 计 银 染 蛋 白质 的 低 序列 覆盖 率 是 源 于 染色 过 程 中 甲醛 对 蛋白 的 修饰 (Scheler et wz .，1998)， 但 甲醛 还 不 能 从 目前 的 银 染 方案 中 去 除 。

两 种 用 得 最 普遍 的 银 染 方式 是 碱 性 /二 氢 合 银 法 和 酸性 /硝酸 银 法 (Rabilloud，

a 蛋白 质 组 学

1999) 。 酸 性 /硝酸 银 法 的 基础 是 照相 过 程 ， 将 凝 胶 在 酸性 pH 值 下 的 银 离子 中 浸泡 ， 随 后 在 碱 性 pH 下 用 甲醛 将 银 离子 还 原 为 金属 银 显 色 (Wirth and Romano, 1995), H Ay ## 遍 认为 酸性 /硝酸 银 法 与 碱 性 /二 氨 银 法 相 比 ， 对 碱 性 蛋白 质 的 检测 灵敏 度 稍 低 ， 而 对 酸 性 蛋白 质 的 检测 灵敏 度 较 高 (Rabilloud，1999; Rabilloud er wE. ，1994) 。 酸 性 /硝酸 银 法 也 易 产 生 异 染色 假象 ， 但 用 机 械 韧 性 强 的 PAGE 胶 基 质 Duracryl (Genomic Solutions， Ann Arbor, MI) 取代 标准 聚 丙 烯 酰胺 后 可 大 大 降低 这 种 效果 (Patton et al., 1992). 酸性 /硝酸 银 法 适 于 蛋白 质 定 量 ， 效 胶 显 色 过 程 约 限于 10 min (Patton, 1995).

碱 性 /二 氨 银 法 基于 组 织 学 方法 ， 利 用 氢 氧 化 镑 形成 可 溶性 的 二 氨 银 复合 物 〈(Wirth and Romano, 1995), 随后 在 酸性 显 色 液 中 用 甲醛 还 原 自 由 银 离子 使 蛋白 质 显 色 。 用 哌 嗪 双 丙 烯 酰胺 取代 N, N“- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 后 可 优化 碱 性 /二 氨 银 法 Hochstrasser et al., 1988; Rabilloud，1999)。 碱 性 /二 氨 银 法 对 TriyVtricine 或 N -三 (2H) 甘氨酸 缓冲 液体 系 凝 胶 ， 如 商品 化 的 长 贮存 期 预制 胶 以 及 用 于 低 分 子 质量 蛋白 质 分 离 的 凝 胶 ， 染色 效果 较 差 。 用 固 相 pH 梯度 胶 分 离 蛋 白质 碱 性 /二 氨 银 法 染色 效果 也 差 〈Rabilloud， 1999)。 此 外 ， 带 有 塑料 支撑 膜 的 PAGE 胶 常 会 产生 银 镜 假 象 ， 使 蛋白 质 染 色 效 果 大 打 折扣 (Rabilloud，1999)。 由 于 氧气 的 易 挥 发 性 ， 碱 性 /二 所 银 染 色 不 同 批 次 实验 间 重 复 性 差 (Rabilloud，1999)。 非 计量 染色 属性 也 使 得 该 方法 不 太 适 于 定量 分 析 (Rodriguez et al., 1993).

3. Axe

标准 考 染 方法 所 存在 的 一 个 缺点 是 染色 步骤 中 含 蛋 日 质 固定 过 程 ， 银 染 法 除了 固定 过 程 外 ， 还 有 增 敏 步 又， 这 些 步骤 会 将 蛋白 质 提取 至 胶 外 ， 而 减少 蛋白 质 产量 ， 使 得 用 于 随后 微量 化 学 表征 的 样品 量 更 少 了 。 负 染 的 开发 则 是 专门 为 了 提高 PAGERESA 质 的 回收 率 。 这 些 方法 不 能 用 于 对 印 渍 膜 染 色 ， 通 常 也 适 于 进行 准确 的 蛋白 质 定量 。 染 色 结 果 在 凝 胶 表 面 产 生 半 透明 背景 ， 其 中 和 蛋白质 以 透明 的 形式 被 检测 出 来 。 凝 胶 显示 黑 色 背 景 或 相应 的 底 色 (Wirth and Romano，1995)。 染 色 过 程 很 快 ， 约 需 5$ 一 15 min 即 可 完成 ， 蛋 白质 的 生物 学 活性 经 常 得 以 保持 。 一 旦 用 络 合剂 如 EDTA 或 Tris/ 甘 氨 酸 转移 缓冲 液 络 合金 属 离子 ， 就 可 进行 提取 来 转移 蛋白 质 (Castellanos-Serra et al., 1996; Lee ef al .，1987)。 负 染 适 用 于 蛋白 质 显 色 、 完 整 蛋白 质 的 胶 上 被 动 提取 以 及 质谱 分 析 (Cohen and Chait，1997 ) 。

3.1 金属 盐 染 料

目前 已 有 一 系列 SDS-PAGE RARE ARPA A HATH, Ki (Wallace et al., 1974), PAB FHS (Takagi et al., 1977). GRA (Higgins and Dahmus, 1979). KCl (Hager and Burgess, 1980), # (Merril et al., 1984), BEAR (Casero et al., 1985), SA 4¢ #9 (Lee et al., 1987), S46 (Dzandu et al., 1988). GBH (Dzandu et al, 1988), Atk #R (Dzandu et al., 1988), #¥-PKME (Ortiz et al., 1992) 以 及 三 氯 乙酸 甲 酯 法 (Candiano et al., 1996). E—-TRUFHKEREAW SARE 中 ， 平 面 染料 如 若 丹 明 、 叫 啶 橙 、 曙 红 或 荧光 黄 与 金属 盐 如 重 铬 酸 钾 、 铬 酸 钢 、 氧 化 镁 或 氯 化 钙 形成 复合 物 ， 从 而 达到 使 凝 胶 呈 现 可 见 色 ， 和 蛋白 质 仍 保持 透明 的 高 灵敏 度 负 染

第 四 章 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测 “59 -

效果 (Berube, 1990).

三 种 用 得 最 多 的 金属 盐 负 染 法 是 氯 化 钾 法 、 毛 化 铜 法 和 和 氧化 锌 法 。 毛 化 铜 染 色 灵 敏 ER, MARA RM EK Ss Se (Adams and Weaver，1990)。 和 氧化 铜 染 色 对 细胞 色素 C、 组 蛋白 和 其 他 碱 性 蛋白 质 灵 敏 度 低 于 偏 酸性 蛋白 质 (Vanflerteren and Peeters，1990)。 目 前 为 止 ， 氯 化 锌 法 是 最 灵敏 的 负 染 方法 (Fernandez-Patron et al., 1998 ) 。

3.2 锌 -咪唑 染料

利用 特定 的 锌 -咪唑 染色 方法 ， 核 酸 、 糖 脂 和 和 蛋白质 呈现 出 类 似 的 染色 行为 (Fer- nandez-Patron et al .，1998) 。 在 咪唑 存在 时 ， 自 由 或 弱 结合 的 锌 离子 以 锌 -咪唑 形式 很 好 地 沉淀 下 来 ， 而 大 部 分 结合 牢固 的 离子 则 难以 沉淀 下 来 ， 这 就 导致 在 半 透 明 背 景 上 的 空白 区 域 ， 也 就 是 负 染 过 程 特点 。 一 定 要 注意 控制 染色 时 间 ， 因 为 染色 过 度 可 能 掩盖 条 带 ， 且 偶尔 还 会 出 现 负 染 和 阳性 染色 的 复合 图 谱 (Fernandez-Patron et al., 1998). #- 咪唑 对 SDS-PAGE 分 离 蛋白 质 的 检测 限 是 每 条 带 10 一 20ng，SDS-PAGE 分 离 的 脂 多 糖 为 每 条 带 1 一 10ng， 尿 素 变性 PAGE RA BD)AFRRER (28bp 一 1.3kbp) 为 10 一 100ng (Fernandez-Patron et cl .，1998)。 但 对 非 变性 PAGE 胶 分 离 的 牛 血清 白 蛋 白 其 检 测 限 较 差 ， 约 每 条 带 40 一 80ng。

锌 -咪唑 染色 的 凝 胶 可 以 干燥 而 染色 图 谱 并 不 发 生变 化 (Ferreras et al., 1993). & 然 蛋 白质 检测 线性 范围 限制 在 10 一 100ng， 仍 可 通过 光 密 度 仪 来 估计 蛋白 量 (Ferreras et al., 1993; Matsui et al . ，1997) 。 锌 -咪唑 染色 的 凝 胶 可 通过 在 转移 缓冲 液 中 加 入 络 合剂 来 进行 电 转 印 (Fernandez-Patron et al., 1995), 之 后 可 进一步 进行 Edman 测序 (Fernandez-Patron et wa .，1995)。 锌 -咪唑 染色 与 胶 内 酶 切 、 基 质 辅助 激光 解吸 附 -飞行 时 间 质 谱 (MALDI-TOF/MS) 测定 肽 质量 和 序列 的 方法 兼容 (Matsui et al., 1997).

4. 胶体 扩散 染料

胶体 扩散 染料 含有 与 蛋白 质 具 有 高 亲和力 的 精细 颗粒 ， 这 种 染料 主要 是 用 于 高 灵敏 度 检 出 电 转 印 、 点 转 印 或 狭 缝 转 印 至 硝酸 纤维 素 膜 或 PVDF 膜 上 的 和 蛋白质， 虽然 有 文 献 报道 胶体 金 负 染 的 应 用 (Casero et al .，1985)， 但 此 类 染料 通常 不 用 于 PAGE RAS 白质 的 检 出 。 此 外 ， 可 以 在 蛋白 质 混合 物 中 ， 加 入 表面 接 有 有 机 外 壳 的 胶体 包 或 铀 颗 粒 ， 进 行 PAGE 电泳 ， 再 用 一 个 银 增 强 步 又 显 色 (Powell，1998)。 对 印 渍 膜 来 说 ， 最 好 的 胶体 扩散 染料 一 一 胶体 金 染 料 ， 其 灵敏 度 与 PAGE 胶 的 银 染 类 似 。

4.1 印度 墨水 染料

黎 释 的 自来水 笔 印 度 墨 水 是 首次 成 功用 于 电 转 印 蛋 白质 显 色 的 胶体 扩散 染料 (Hancock and Tsang，1983) 。 该 方法 的 首要 优点 是 简单 便宜 。 自 来 水 笔墨 水 是 包含 金属 化 的 酸性 染料 (CREE. AEE, ARR) 以 及 碱 性 染料 盐 的 专用 配方 (Rohde et al.，1998)。 此 外 ， 也 加 入 碳 、 酸 靖 酮 、 甘 醇 、 甘 油 表面 活性 剂 、 抗 氧化 剂 和 黏度 调节 剂 等 精细 分 散剂 以 形成 水 溶性 墨水 (Rohde et wz .，1998)。 常 用 于 电 转 膜 染 色 的 黑 墨 水 (Pelikan, Hannover, Germany) 经 毛细 管 电泳 分 离 ， 并 结合 紫外 /可 见 吸收 和 激光 诱导

ie 蛋白 质 组 学

荧光 检测 表明 ， 在 该 配方 中 至 少 有 7 种 不 同 种 类 的 染料 (Rohde et al., 1998). Han- cock 和 Tsang 声称 Pelikan 自来水 笔墨 水 是 蛋白 质 显 色 最 灵敏 的 墨水 ， 而 其 他 人 则 用 Higgins 黑 墨水 893 (Faber-Castell Corporation, Newark, NJ) 或 Speedball 黑 墨 水 3211 (Hunt Manufacturing Company, Statesville, NC) (Hughes et al., 1988; Lek et al., 1995) 获得 了 更 好 的 结果 。

在 印度 墨水 染色 同期 出 现 了 和 蛋白 质 直接 比 色 法 或 放射 自 显影 免疫 检测 (Glenney, 1986; Mobbs et al., 1989; Ono and Tuan，1990)。 如 果 在 免疫 检测 前 进行 印度 墨水 染 色 ， 染 色 时 间 必 须 限 制 在 2 一 3h， 以 避免 干扰 随后 抗体 结合 步骤 。 用 化 学 发 光 免 疫 检测 与 印度 墨水 染色 相 结合 获得 了 较 好 效果 (Eynard and Lauriere，1998 ) 。 Mobbs 则 将 印度 墨水 和 免疫 检测 结合 进行 染色 ， 而 用 于 Edman WFR RBA SSR RE (Mobbs et al., 1989).

与 有 机 染料 和 胶体 金属 染料 相 比 ， 印 度 墨 水 染色 显示 出 较 高 的 蛋白 间 变 异 (Li et az.，1989)。 很 多 蛋白 质 用 印度 墨水 获得 很 差 的 染色 效果 ， 包 括 B- 乳 球 蛋 白 、 胰 和 蛋白酶 抑制 剂 、 杆 菌 肽 、C- 大 麦 醇 溶 和 蛋白 、 促 甲状 腺 素 释 放 激 素 (TRH)、 卵 白 蛋 白 、 卵 类 黏 蛋白 、 碳 酸 脱氧 酶 铁 蛋 白 和 胰岛 素 (Dunn, 1999; Eynard and Lauriere, 1998; Li et al., 1989; Rohringer and Holden，198$)。 与 其 他 胶体 扩散 染料 类 似 ， 印 度 墨 水 在 染色 膜 片 时 也 须 加 入 Tween-20 来 减 除 背 景 ， 这 是 个 很 大 的 缺点 ， 因 为 去 污 剂 的 加 入 将 从 转 印 膜 上 洗 脱 部 分 蛋白 质 (Li et al., 1988), Feat fe Tween-20 的 加 入 所 带 来 的 相关 问题 将 在 4.2 中 详细 讨论 。 最 后 要 说 明 的 是 ， 自 来 水 笔墨 水 是 设计 用 来 书写 ， 而 不 是 用 来 进 行 与 蛋白 质 染 色 性 能 相关 的 质量 控制 分 析 。 用 印度 墨水 染色 需要 针对 膜 、 狭 缝 膜 类 型 、 印度 墨水 品牌 和 墅 水 进行 实验 室内 优化 (Hughes et al., 1988).

4.2 胶体 金属 染料

印度 墨水 开始 染色 电 转 印 蛋 白质 后 不 久 ， 其 他 同样 用 途 的 分 散 颗粒 即 进行 了 优化 (Moeremans et al., 1985, 1986; Rohringer and Holden, 1985). Janssen Pharmaceuticals (Beerse, Belgium) 先后 开发 了 了 灵敏 的 胶体 金 (AuroDye)、 铁 (FerriDye) 以 及 银 染 方 AF FerriDye 包含 有 毒 的 卡 可 基 酸 并 会 生成 氰 化 物 气体 而 停止 使 用 。 胶 体 银 染 没 有 商品 化 。80 年 代 对 常用 胶体 扩散 染料 的 直接 比较 显示 胶体 金 染 料 的 检测 灵敏 度 要 优 于 印度 墨水 或 胶体 铁 染 料 ， 但 其 有 用 线性 范围 特别 有 限 (1 一 20ng)(Hunter and Hunter, 1987; Li et wz .，1989)， 蛋 白质 浓度 的 对 数 转 换 使 胶体 金 染 料 的 有 用 线性 范围 扩展 至 100ng 左右 (Li et al., 1989).

胶体 金 染 色 可 用 于 传统 的 比 色 免疫 印 溃 或 化 学 发 光 免 疫 检测 (Chevallet et al., 1997; Egger and Bienz, 1987; Schapira and Keir，1988) 。 人 但是， 金属 的 氧化 使 得 在 化 学 发 光 过 程 中 胶体 金 染 色 图 褪色 。 同 时 ， 由 于 图 谱 上 蛋白 质 化 学 发 光 变 弱 ， 带 来 的 问题 就 是 如 何在 反应 较 弱 时 分 辩 非 特异 性 背景 。 从 电 转 印 的 蛋白 质 上 去 除 胶 体 金 是 不 太 可 行 的 ， 可 以 用 10% 的 盐酸 、 重 铬 酸 钾 的 水 溶液 氧化 作用 来 脱色 (Nelson，1993)， 染 色 强 度 也 可 通过 应 用 银 染 增强 步骤 来 加 强 〈Moeremans et al., 1984).

虽然 胶体 金 染色 可 以 获得 特别 高 的 灵敏 度 ， 但 与 其 他 胶体 扩散 染色 方法 一 样 ， 它 需 要 用 诸如 Tween-20 一 类 试剂 对 膜 进行 前 处 理 。 随 后 在 用 去 污 剂 稳定 化 的 胶体 溶液 中 孵

第 四 章 “” 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 有 蛋白质 的 检测 - 61 -

育 2 一 18h (Moeremans et wl .，198$)。 如 先前 所 述 ， 非 离子 表面 活性 剂 去 除了 部 分 膜 上 和 蛋白质， 导致 用 于 随后 表征 的 蛋白 质 回收 率 降 低 (Flanagan and Yost, 1984; Li et al., 1988; Miranda et al .，1993) 。 用 氧 氧 化 钾 或 成 二 醛 一 类 试剂 固定 或 1007 下 烘 烤 会 减少 由 去 污 剂 提 取 作 用 所 引起 的 蛋白 质 丢 失 ， 但 经 常会 致使 蛋白 质 不 适 于 其 他 应 用 (Li et al .，1988) 。 去 污 剂 也 会 影响 MALDI-TOF 和 电 喷 雾 离子 化 (ESI) 质谱 图 谱 的 高 质量 采集 。 因 为 来 源 于 去 污 剂 篮 峰 的 背景 离子 信号 主导 了 质谱 图 ， 去 污 剂 也 抑制 了 来 自 蛋白 质 的 信号 (Gharahdaghi et al., 1996; Loo et al., 1994). fil 40 GH Tween-20 在 ESI- MS 谱 图 中 可 以 产生 聚合 物 背 景 〈( 质 荷 比 在 500~1200) 和 严重 的 信号 抑制 ， 并 和 和 蛋白 质 形成 加 合 物 (Loo et wd .，1994)。 文 献 中 尚 没 有 胶体 金 染 色 用 于 质谱 鉴定 的 成 功 报 道 。 此 外 ， 胶 体 金 染料 一 直 干扰 蛋白 质 Edman 降解 序列 分 析 ， 如 很 低 的 初始 和 重复 序 列 产 率 (Christiansen and Houen，1992)， 脱 色 并 不 能 提高 产 率 (Nelson, 1993).

正 是 由 于 胶体 金 染 料 与 下 游 蛋 白质 微量 化 学 方法 不 兼容 ， 促 使 了 其 他 可 替代 胶体 染 料 研 究 的 进展 。 一 种 不 含 去 污 剂 的 “胶体 ” 银 染 方法 取代 胶体 金 染 色 ， 可 用 来 检测 用 于 液 相 色谱 一 一 电 喷 雾 离子 化 串联 质谱 分 析 的 电 转 膜 蛋 白质 (van Oostveen et al., 1997). 该 染 液 实际 上 并 非 胶体 ， 只 是 微粒 的 混合 浆液 ， 我 们 用 银 浆 液 的 经 验 是 可 以 在 很 高 的 灵 敏 度 对 原始 文献 中 提 及 的 测试 蛋白 质 碳 酸 脱 氢 酶 和 牛 血清 白 蛋 白 进行 检测 ， 但 对 商品 化 的 分 子 质量 标准 中 其 他 蛋白 质 染 色 效 果 相 当 差 。 另 外 一 种 用 于 电 转 膜 蛋 白质 染色 的 悬 浊 胶 是 碱 性 碘 化 铜 溶液 (Root and Reisler, 1989; Root and Wang，1993)。 与 胶体 金 染色 一 样 ， 铜 染 可 以 用 银 增强 步骤 来 加 强 (Root and Wang，1993)。 染 色 可 用 EDTA 轻易 去 除 ， 脱 色 膜 可 用 于 随后 比 色 免疫 检测 (Root and Raisler，1989)， 但 是 ， 该 方法 目前 与 其 他 现代 微量 化 学 方法 仍 不 兼容 。

5. 有 机 荧光 团 染料 电泳 后 对 荧光 检测 蛋白 质 正 获得 普遍 的 应 用 ， 特 别 是 在 致力 于 大 规模 蛋白 质 组 研究

的 实验 室 。 几 种 新 的 荧光 染色 适 于 与 进行 蛋白 质 整体 表达 分 析 的 集成 化 蛋白 质 组 学 平台 相 结合 ， 利 用 荧光 染色 检测 的 动态 线性 范围 通常 优 于 比 色 法 染色 。

5.1 共 价 结合 荧光 团

胶 内 蛋白 质 和 转 膜 蛋白 质 的 荧光 检测 有 多 种 方法 ， 分 别 是 利用 荧光 胺 、 荧 光 素 异 硫 氰 酸 盐 、monobromobimane、2 - 甲 氧 基 -2,4- 二 葵 基 -3 (2H) ROR BR (MDPF)、 Dichlorotriazynlamino-fluorescein EX F} HABER (Houston and Peddie, 1989; Jackson et al., 1988; Ragland et al., 1974; Szewczyk and Summers, 1987, 1992; Talbot and Yphantis, 1971; Urwin and Jackson, 1993; Vandekerckhove et al., 1985; Vera and Rivas, 1988). 最 近 ， 利 用 丙 基 Cy3 和 甲 基 Cys 两 种 染料 分 别 对 两 个 不 同 蛋 白质 样品 进行 荧光 标记 ， 并 在 一 块 2-D 胶 上 同步 显示 两 个 样品 的 差异 (Unlu et al., 1997).

上 述 方法 的 缺点 包括 需要 对 蛋白 质 进 行 共 价 修饰 、 改 变 了 标记 和 蛋白质 的 移动 性 能 和 由 于 奖 光 探 针 光 漂 日 作用 所 引起 的 快速 衰减 。 蛋 白 与 蛋白 之 间 由 于 可 被 荧光 团 修饰 的 功 能 基 团 数目 不 同 而 使 得 灵敏 度 变 化 很 大 ， 荧 光 团 的 加 入 同时 会 降低 蛋白 质 溶 解 性 能 (Unlu et wa .，1997)。 可 以 通过 标记 样品 中 一 小 部 分 功能 基 团 来 补偿 ， 但 标记 蛋白 质 与

paves) 蛋白 质 组 学

未 标记 和 蛋 白 质 之 间 轻 微 的 分 子 质量 差异 可 能 会 导致 分 离 后 蛋白 质 的 Edman 降解 和 质谱 鉴定 出 现 偏差 。 在 运行 2-DE 或 等 电 聚 焦 (IEF) 时 ， 由 前 期 荧光 分 子孙 生 可 能 导致 蜡 #8 2 AXE (Urwin and Jackson，1993)。 通 常情 况 下 ， 样 品 中 衍生 的 氨基 酸 总 数 很 少 ， 对 下 游 Edman 测序 或 肽 谱 研 究 等 氨基 酸 分 析 的 影响 不 大 (Alba and Daban, 1998; Stephens, 1975; Unlu et al., 1997).

研究 开发 的 一 种 转 膜 蛋白 质 检 测 方法 是 用 由 双 (2,4, 6-= ARE) oxylate 和 过 和 氧 化 氢 进 行 非 酶 化 学 荧光 反应 ， 来 显 色 用 MDPF 共 价 标记 的 电 转 印 或 点 印 渍 蛋白 质 (Al- ba and Daban，1997) 。 后 来 发 现 利用 300nm 紫外 透射 仪 对 PVDF 膜 上 MDPF 标记 蛋白 质 进行 直接 荧光 检测 ， 比 原始 化 学 荧光 法 更 简单 、 耗 时 短 、 更 灵敏 (Alba and Daban, 1998)。 直 接 菊 光 法 可 以 实现 5~10ng 蛋白 质 检测 并 与 化 学 荧光 免疫 法 兼容 。 但 是 ， 由 于 干燥 PVDF 膜 会 致使 荧光 信号 降低 500 倍 ， 因 此 用 MDPF 标记 的 蛋白 质 必 须 在 湿 PVDF 膜 上 观察 ， 目 前 没有 适用 于 显 色 转 印 于 硝酸 纤维 素 膜 上 和 蛋白质 的 MDPF 标记 方 法 ， 如 果 和 蛋白 质 要 用 于 N 端 测序 ， 为 了 在 反应 中 尽量 少 的 消耗 一 级 胺 ， 染 色 时 染料 浓 度 要 低 于 最 佳 浓度 ， 染 色 时 间 要 短 ， 在 这 种 条 件 下 荧光 染色 灵敏 度 不 比 标准 考 马 斯 蓝 染 色 高 (Alba and Daban, 1998).

5.2 非 共 价 结合 荧光 团

许多 荧光 团 如 1 -苯胺 基 - 8 - 蔡 磺 酸 盐 (ANS), WM (8 -甲苯 氨基 - 1 - 蔡 磺 酸 盐 ) (bis-ANS)、9 -二 乙 氨基 - 5SH -#FF [a] WAEB- 5 - 酮 (EFA, Nile red)、SYPRO Orange 和 SYPRO Red 染料 可 与 蛋白 质 形成 非 共 价 键 相互 作用 (Aragay et al., 1985; Bermudez et al., 1994; Daban and Aragay, 1984; Daban et &L .，1991a，1991b; Hart- man and Undenfriend, 1969; Horowitz and Bowman, 1987; Pina et al., 1985; Stein- berg et al., 1996a, 1996b, 1997), SERE, KHERSEAEKAMPERAARRICH, Th 在 非 极 性 溶剂 或 与 SDS- 蛋 白质 复合 物 相 互 作用 时 显示 荧光 。SDS 与 蛋白 质 的 结合 计量 常数 比较 稳定 ， 保 持 在 1.4 到 1， 提 示 ， 基 于 与 去 污 剂 的 相互 作用 进行 定量 要 比 基 于 与 一 级 胺 的 作用 更 为 可 靠 。

ANS 可 用 300nm 透射 仪 激 发 ， 并 在 480nm 发 射 ， 已 用 于 检测 SDS-PAGE RASA 质 ， 但 其 灵敏 度 明 显 低 于 考 染 (Aragay et al., 1985; Daban and Aragay, 1984; Pina et a .，1985)。 相 关 染 料 一 一 bis-ANS 4j 2mol/L KCl 组 合 可 以 获得 稍 好 的 灵敏 度 ， 其 检测 限 大 约 100ng 和 蛋白质 (Horowitz and Bowman，1987)。 尼 罗 红 染料 可 在 300 或 540nm 处 激发 ， 在 640nm 处 发 射 (Daban et al., 1991a), He 20~100ng 的 检测 灵敏 度 要 稍 好 于 SOME, MA, BRAS ME Edman 测序 与 免疫 检测 程序 兼容 (Alba and Daban， 1998; Bermudez et al., 1994; Daban et al., 1991b).

SYPRO Red 和 SYPRO Orange 染料 可 对 SDS-PAGE 胶 内 蛋白 质 进 行 简 单 的 一 步 染 色 ， 约 30 一 60min 即 可 完成 ， 可 以 检测 少 至 2 一 10ng 的 蛋白 质 ， 可 与 银 染 相 媲 美 。 染 色 后 胶 的 备份 用 标准 的 实验 室 300nm 紫外 透射 仪 照 相 即 可 轻松 完成 ， 或 者 通过 基于 商品 化 的 CCD 相机 图 像 分 析 工 作 站 或 激光 扫描 仪 进行 定量 ， 可 以 获得 三 个 数量 级 的 线性 范 围 。SYPRO Red、Orange 的 Ruby 染料 是 仅 有 的 商品 化 染料 ， 其 电泳 染色 结果 与 在 酵母 中 通过 基因 表达 序列 分 析 (SAGE) 所 获得 的 基因 表达 水 平 动态 范围 相 匹 配 〈 每 个 细胞

第 四 章 “” 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测 - 63:

0.3~200 个 转录 拷贝 ; Verculescu et al., 1997). SYPRO 染料 可 以 很 好 地 抗 光 淳 灭 作 用 ， 在 Tris/ 甘 氨 酸 转 印 缓冲 液 中 染色 后 ， 蛋 白质 可 被 转 印 至 膜 上 并 进行 免疫 染色 或 Edman 测序 来 鉴定 蛋白 质 (Hamby, 1996, 1997; Steinberg et al., 1996b). e/a B48 出 的 是 ，SYPRO Orange 和 SYPRO Red 染料 可 用 于 对 SDS- 毛 细 管 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白质 的 pmol 定量 检测 (Harvey et al., 1998). 4 SYPRO 染料 相 比 ， 利 用 尼 罗 红 的 检测 灵 MERE, 染色 不 稳定 ， 染 料 在 水 溶液 中 易于 沉淀， 使 随后 处 理 很 困难 ， 尼 罗 红 染色 对 光 不 稳定 的 性 质 也 加 大 了 通过 图 像 分 析 进 行 蛋白 质 定 量 的 难度 。

6. 金属 鳌 合 染料

金属 歼 合 染料 是 与 现代 蛋白 质 组 学 研究 相 兼 容 的 、 相 对 较 新 的 蛋白 质 显 色 试 剂 ， 其 设计 专门 与 常用 微量 化 学 表征 过 程 兼 容 。 这 些 染 色 不 包含 影响 表征 过 程 的 其 他 试剂 如 戊 二 醛 、 甲 醛 或 Tween-20。 发 光 金 属 歼 合 染料 很 容易 和 集成 化 蛋白 质 组 学 平台 相 结合 ， 包括 自动 化 凝 胶 染 色 仪 、 图 像 分 析 工 作 站 、 机 器 人 剪 切 仪器 、 重 日 质 酶 解 工 作 站 和 质谱 仪 。 最 为 灵敏 的 发 光 染 料 一 一 SYPRO Ruby 比 最 好 的 碱 性 二 氨 银 和 酸性 硝酸 银 染 色 的 灵 敏 度 高 ， 且 线性 范围 宽 。

6-1 比 色 金属 束 合 染料

最 早报 道 的 用 于 凝 胶 电 泳 蛋 白质 检测 的 金属 丈 合 剂 为 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 亚 铁 复 合 物 (Graham et wz .，1978)。 报 道 其 灵敏 度 大 约 在 600ng。 由 于 它 较 已 经 实践 应 用 的 考 马 斯 蓝 染色 没有 明显 优势 ， 因 而 没 得 到 广泛 认可 。 将 放射 性 ?Fe 引入 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 复 合 物 可 以 检测 到 10~25ng 蛋白 质 ， 但 按 今天 的 标准 也 只 是 和 胶体 考 马 斯 赣 的 灵敏 度 接 WE (Gersten et al., 1984; Zapolski et al., 1982), 放射 性 环境 下 工作 的 危害 性 和 获准 使 用 放射 性 同位 素 所 增加 的 麻烦 排除 了 其 广泛 使 用 的 可 能 性 。 酌 菁 四 磺 酸 酮 金属 丈 合 物 ， 可 以 在 进行 PAGE 胶 染 色 时 达到 与 标准 考 马 斯 蓝 染色 相同 的 灵敏 度 (Bickar and Reid，1992)。 该 染料 也 可 用 于 固定 在 硝酸 纤维 素 上 蛋白 质 的 染色 ， 其 检测 限 在 10 一 20ng 蛋白 质 。

虽然 灵敏 度 稍 低 ， 氨 基 黑 、 丽 春 红 S 和 考 马 斯 蓝 仍 是 最 常用 的 检测 转 膜 蛋白 质 的 方 法 ， 因 为 它们 与 下 游 微量 化 学 表征 技术 兼容 。 我 们 的 研究 小 组 针对 灵敏 度 问题 设计 了 一 系列 金属 歼 合 染料 以 检测 转 膜 蛋白 质 (Lim et al., 1996; Patton et al., 1994, 1999a， b; Shojaee et al., 1996). #£ Chung 成 功 地 用 ferreneS 检测 PAGE RA A EA RAY 基础 上 ， 我 们 推测 如 果 外 加 的 亚 铁 离子 附着 在 和 蛋白质 上 ， 如 果 遇 到 铁 指 示 剂 如 ferrene S 或 锌 铁 ， 在 转 印 膜 上 即 可 得 到 全 有 蛋 白质 显 色 图 (Chung, 1985; Patton et al., 1994). 我 们 优化 了 方法 ， 简 化 到 只 要 在 转 膜 蛋白 质 孵 育 前 混合 亚 铁 离子 和 鳌 合 剂 即 可 ， 但 直到 发 表 时 我 们 仍 确信 和 与 蛋白 质 的 结合 主要 由 金属 离子 独自 调节 完成 (图 4.1) (Patton et &.，1994)。 在 开发 可 替代 性 金属 歼 合 染料 的 过 程 中 筛选 了 大 量 金属 丈 合 物 后 我 们 才 意 识 到 与 蛋白 质 的 结合 是 由 金属 五 合 物 上 的 磺 酸 基 团 所 介 导 的 (Shojaee et al., 1996), 因此 ， 人 金属 丈 合 染料 与 1978 年 开发 的 红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 亚 铁 染料 属于 同一 家 族 。

锌 铁 / 亚 铁 和 焦 酚 红 / 钼 酸 盐 染 料 的 灵敏 度 和 氨基 黑 不 相 上 下 ， 通 常 可 以 检测 到 20 一 50ng 蛋 白质 。 锌 铁 / 亚 铁 染 色 的 优点 是 通过 增加 溶液 pH 值 可 以 容易 脱色 ， 并 且 可

eo 蛋白 质 组 学

图 4.1 2-DE 凝 胶 染 色 区 域 (a) 蛋白 质 凝 胶 SYPRO Ruby 染色 (Molecular Probes, Eugene, OR); (b) 酸性 /硝酸 银 染 色 试 剂 盒 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) 染色 。 一 维 IEF 胶 上 样 为 鼠 成 纤维 细胞 裂解 蛋白 质 ， 约 Sue. AT 与 银 染 胶 容易 比较 ，SYPRO Ruby 染色 胶 的 灰 度 值 进行 了 转换 。

以 很 容易 地 在 锌 铁 / 亚 铁 溶 液 中 孵育 来 加 强 信号 (Lim et al., 1996; Patton et al., 1994)， 此 时 其 检测 限 可 达到 $ 一 10ng 蛋白 质 (Patton et al., 1994), SRBSRAB 和 上 dman 测序 、 质 谱 和 免疫 印 渍 兼容 (Patton et al., 1994).

6.2 发 光 金 属 束 合 染料

由 于 对 比 色 染料 的 检测 灵敏 度 不 太 满 意 ， 我 们 对 发 光 金 属 鳌 合 染料 进行 了 研究 (Lim et al., 1997; Patton et wz .，1999a，1999b)。 从 原理 上 讲 ， 检 测 光 散射 要 比 检测 光 吸 收 灵敏 一 些 ， 由 于 光 吸 收受 有 色 复 合 物 摩 尔 消光 系数 的 限制 (Gossling，1990)， 因 ”此 ， 利 用 金属 歼 合 物 与 特定 过 渡 金 属 离子 如 销 、 氏 、 钉 、 铁 复合 而 形成 的 发 光 蛋 和 白质 染 料 ， 与 上 述 比 色 法 相 比 可 以 得 到 更 高 灵敏 度 。

红 菲 绕 啉 二 磺 酸 盐 / 销 (SYPRO Rose Protein Blot stain, Molecular Probes, Eugene, OR) 是 一 种 中 等 灵敏 度 的 染料 ， 通 常 可 以 检测 到 由 狭 缝 印 渍 所 得 的 2 一 4ng/mm“ 的 蛋 白质 上 样 量 。 依 据 常规 的 电 转 印 实验 ， 该 数值 转换 成 胶 内 上 样 为 1$ 到 30ng。 该 染料 的 显 色 可 以 用 300nm 紫外 表面 照射 而 在 590nm 和 615nm 发 射 。 在 中 性 或 弱 碱 性 环境 中 孵 育 可 以 洗 脱 染 料 。 由 于 与 免疫 印 渍 、 凝 集 素 印 渍 、Edman 测序 和 质谱 的 兼容 性 ， 使 SYPRO Rose 染料 成 为 近乎 与 丽 春 红 S 染料 一 样 简便 而 优良 的 常规 蛋白 质 检测 试剂 (Lim et o.，1997)。 其 缺陷 是 可 以 对 核酸 像 蛋 日 质 一 样 进 行 染色 ， 脱 色 步 又 很 像 传统 考 马 斯 蓝 染 色 ， 许 多 激光 凝 胶 扫描 仪 不 能 用 ， 因 为 该 染料 不 能 被 可 见 光 激发 。

SYPRO Ruby 是 一 种 专利 的 基于 钉 的 金属 丈 合 染料 ， 其 开发 是 为 了 弥补 SYPRO Rose 染料 的 缺陷 。SYPRO Ruby 蛋白 印 涡 染料 (Molecular Probes, Eugene, OR) 可 以 对 硝酸 纤维 素 或 PVDF 转 膜 蛋白 质 永久 染色 ， 在 狭 颖 印 溃 时 其 检测 灵敏 度 为 0.25 一 Ing/mm’, BAKA 2~8ng 的 蛋白 质 可 通过 电 转 印 检 测 ， 对 照 比 较 实验 证 实 它 具有 和 胶体 金 染色 一 样 的 灵敏 度 (AuroDye，Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)。 而 胶体 金 染色 需要 2~4h, SYPRO Ruby 染料 染色 在 15 min 内 即 可 完成 。SYPRO Ruby 蛋白 印 渍 染色 的 动态 线性 范围 大 大 优 于 胶体 金 染 色 ， 扩 展 了 约 1000 倍 。 该 染料 可 用 300nm 紫外 透射 仪 激活 或 利用 装配 有 450. 473, 488 75% 532nm 激光 的 成 像 系 统 。

第 四 章 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋 晶 质 的 检测 “ 65°

不 像 胶 体 金 染色 ，SYPRO Ruby 染料 不 干扰 质谱 或 免疫 检测 过 程 ， 又 与 SYPRO Rose 不 同 ， 它 对 核酸 不 染色 。

SYPRO Ruby 2-DE 和 IEF 染色 仅 需 一 步 即 可 获得 PAGE 内 和 蛋 日 质 的 低 背 景 染 色 ， 而 且 不 需要 进行 长 时 间 脱 色 步 又。 这 些 染 料 的 线性 动态 范围 扩展 到 超过 三 个 数量 级 之 大 ， 在 性 能 上 超过 了 银 染 和 考 马 斯 蓝 染色 ， 对 等 电 点 从 3.5 到 9.3 范围 的 11 个 蛋白 质 标准 的 评估 表明 SYPRO Ruby IEF 凝 胶 染 色 的 灵敏 度 比 高 灵敏 银 染 要 高 3 一 30 5 (Steinberg et al .，2000)。 用 银 染 效果 很 差 的 蛋白 质 往往 用 SYPRO Ruby 染料 很 容易 检 测 到 〈 图 4.1)。 虽 然 比 SYPRO Orange 和 Red 染料 更 为 灵敏 ， 其 最 佳 染色 要 稍 慢 一 些 ， 约 需 4h。 与 胶体 考 马 斯 蓝 染 料 类 似 ， 但 与 银 染 不 同 ，SYPRO Ruby 染料 的 染色 是 终点 式 (end-point) 染色 ， 因 此 ， 染 色 时 间 不 严格 ， 可 以 过 夜 染 色 且 不 会 显 色 过 度 。

7. 结论

通过 大 规模 基因 组 测序 以 及 基因 芯片 的 辅助 ，DNA 和 mRNA 水 平 上 生物 学 过 程 的 分 析 正 在 迅速 完成 ， 人 们 的 注意 力 正 转向 蛋白 质 的 动态 表达 。 和 蛋白 质 组 研究 致力 于 观察 一 个 特定 基因 组 所 编码 的 全 蛋白 质 组 分 ， 以 解决 不 能 单纯 通过 核酸 序列 来 回答 的 生物 学 问题 (De Francesco，1999)。 随 着 蛋白 质 组 学 发 展 成 为 研究 整体 蛋白 质 调控 的 高 通 量 方 法 ， 对 蛋白 质 显 色 方 法 提出 了 新 的 需求 ( 表 4.2)。 旧 的 蛋白 质 染 色 如 考 马 斯 蓝 和 银 染 已 经 不 能 满足 人 们 的 期 望 。 有 幸 的 是 ， 较 新 的 染料 如 锌 -咪唑 及 非 共 价 荧 光 染 料 (SYPRO 染料 ) 正在 用 来 满足 日 益 增长 的 现代 蛋白 质 微量 表征 技术 的 需求 。

表 4.2 理想 通用 的 蛋白 质 染 料 性 质 ， 优 良 染 色 方 法 应 具备 的 7 个 S

安全 (Safety): 该 染色 方法 不 应 该 含有 害 材 料 如 放射 性 同位 素 或 氰 化 物 气体 、 卡 列 基 酸 等 强 毒 性 化 学 品 。 从 而 保证 人 身 安 全 并 消除 耗 时 的 监控 、 清 洗 和 处 理 等 问题

灵敏 (Sensitivity): 该 染色 方法 可 以 检测 到 亚 纳 克 级 蛋白 质 ， 染 色 的 线性 动态 范围 要 宽 ， 最 少 要 扩展 至 三 个 数量 级

简单 〈Simplicity) :该 染色 方法 只 需 凝 胶 或 膜 在 一 种 溶液 中 简单 的 孵育 过 程 ， 对 显 色 时 间 的 要 求 不 能 太 苛刻 ， 因 为 染色 应 可 以 达到 一 个 终点 而 不 会 显 色 过 度

特异 性 (Specificity): 该 染色 方法 应 该 特异 性 检测 蛋白 质 ， 而 不 检测 脂 类 、 糖 类 或 核酸 ， 对 不 同类 型 蛋白 质 如 钙 结 合 蛋 白 、 脂 蛋白 、 糖 蛋白 和 磷酸 化 蛋白 质 均匀 检测

RH (Speed): 该 染色 方法 可 以 快速 检测 蛋白 ， 不 需 脱 色 。 只 要 不 需 监 控 显 色 过 程 或 是 变换 溶液 ， 采 取 较 长 的 孵育 时 间 往 往 较 为 灵活 ， 如 过 夜 染 色

fe (Stability): 染 液 应 当 具 有 化 学 稳定 性 ， 保 存 期 长 ， 无 需 用 前 新 鲜 配 制 ， 染 液 在 室温 下 贮存 应 该 保持 稳定 。 染 色 后 的 胶 应 可 以 在 几 天 至 几 个 月 时 间 内 保持 稳定 ， 而 染色 信和 号 不 会 变 差

兼容 性 (Synergy): 染色 方法 应 该 和 多 种 电泳 /分 离 技术 (载体 两 性 电解 质 IEF、 固 相 pH HE IEF, Tris HAR SDS 胶 、Tris-tricine 预制 SDS 胶 、 非 变性 凝 胶 、2-DE HER. PVDF 膜 、 硝 酸 纤维 素 膜 、TLC 板 ) 兼容 。 染 色 过 程 不 应 导致 蛋白 质 的 不 可 逆 共 价 修饰 。 染 液 中 不 应 含 通常 会 干扰 Edman 测序 和 质谱 的 外 加 试剂 如 戊 二 醛 、 甲 栈 或 Tween-20

(应 万 涛 译 Re 校 )

sedi 蛋白 质 组 学

参考 文献

Adams, L. and Weaver, K. (1990) Detection and recovery of proteins from gels following zinc chloride staining. App/. Theor. Electrophoresis 1: 279-282.

Alba, F. and Daban, J. (1997) Nonenzymatic chemiluminescent detection and quantitation of total protein on Western and slot blots allowing subsequent immunodetection and sequencing. Electrophoresis 18: 1960-1966.

Alba, F. and Daban, J. (1998) Rapid fluorescent monitoring of total protein patterns on sodium dodecyl] sulfate—polyacrylamide gels and Western blots before immunodetection and sequencing. Electrophoresis 19: 2407-2411.

Aragay, A., Diaz, P. and Daban, J. (1985) A fluorescent method for the rapid staining and quantitation of proteins in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel i 全 Electro- phoresis 6: 527-531.

Bermudez, A., Daban, J., Garcia, J. and Mendez, E. (1994) Direct blotting, seqqnensints and immunodetection of proteins after five-minute staining of SDS and SDS-treated IEF gels with Nile red. Bio Techniques 16: 621-624.

Berggren, K., Steinberg, T., Lauber, W., Carroll, J., Lopez, M., Chernokalskaya, E., Zieske, L., Diwu, Z.. Haugland, R. and Patton, W. (1999) A luminescent ruthenium complex for ultrasensitive detection of proteins immobilized on membrane supports. Anal. biochem. 276: 129-143.

Berube, G. (1990) Visualization of proteins on electrophoresis gels using planar dyes. US patent no. 4,946,749, 7 August.

Bickar, D. and Reid, P. (1992) A high-affinity protein stain for western blots, tissue prints, and electrophoretic gels. Anal. Biochem. 203: 109-115.

Brush, M. (1998) Dye hard; protein gel staining products. Scientist 12: 16—22.

Candiano, G., Porotto, M., Lanciotti, M. and Ghiggeri, G. (1996) Negative staining of proteins in polyacrylamide gels with methyl trichloroacetate. Anal. Biochem. 243: 245-248.

Casero, P., Del Campo, G. and Righetti, P. (1985) Negative Aurodye for polyacrylamide gels: the impossible stain. Electrophoresis 6: 362-372. ;

Castellanos-Serra, L., Fernandez-Patron, C., Hardy, E. and Huerta, V. (1996) A procedure for protein elution from reverse-stained polyacrylamide gels applicable at the low picomole level: an alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electro- Phoresis 17: 1564-1572.

Chevallet, M., Procaccio, V. and Rabilloud, T. (1997) A nonradioactive double detection method for the assignment of spots in two-dimensional blots. Anal. Biochem. 251: 69-72.

Chrambach, A., Reisfeld, R., Wyckhoff, M. and Zaccari, J. (1967) A procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 20: 150-154.

Christiansen, J. and Houen, G. (1992) Comparison of different staining methods for polyvinylidene difluoride membranes. Electrophoresis 13: 179-183.

Chung, M. (1985) A specific iron stain for iron-binding proteins in polyacrylamide gels: application to transferrin and lactoferrin. Anal. Biochem. 148: 498-502.

Cohen, S. and Chait, B. (1997) Mass spectrometry of whole proteins eluted from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gels. Anal. Biochem. 247: 257-267.

Daban, J. and Aragay, A. (1984) Rapid fluorescent staining of histones in sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 138: 223-228.

Daban, J., Samso, M. and Bartolome, S. (1991a) Use of Nile red as a fluorescent probe for the study of the hydtéphobic properties of protein—sodium dodecyl sulfate complexes in solution. Anal. Biochem. 199: 162-168.

Daban, J., Bartolome, S. and Samso, M. (1991b) Use of the hydrophobic probe Nile red for the fluorescent staining of protein bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 199: 169-174.

De Francesco, L. (1999) One step beyond; going beyond genomics with proteomics and two- dimensional gel technology. Scientist 13(1): 16-18.

Diezel, W., Kopperschlager, G. and Hofman, E. (1972) An improved procedure for protein

第 四 章 “ 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 和 蛋白质 的 检测 - 67>

staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie brilliant blue. Anal. Biochem. 48: 617-620.

Dubray, G. and Bezard, G. (1982) A highly sensitive periodic acid-silver stain for 1,2-diol groups of glycoproteins and polysaccharides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 119: 325-329.

Dunn, M. (1987) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: Advances in Electro- phoresis, Vol. 1 (eds A. Chrambach, M. Dunn and B. Radola). VCH Publishers, New York, pp. 4-109.

Dunn, M. (1999) Detection of total proteins on Western blots of 2-D polyacrylamide gels. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 112, 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 319-329.

Durrum, E. (1950) A microelectrophoretic and microionophoretic technique. J. Am. Chem. Soc. 72: 2943-2948.

Dzandu, J., Johnson, J. and Wise, G. (1988) Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis: staining of polypeptides using heavy metal salts. Anal. Biochem. 174: 157-167.

Egger, D. and Bienz, K. (1987) Colloidal gold staining and immunoprobing of proteins on the same nitrocellulose blot. Anal. Biochem. 166: 413-417.

Eynard, L. and Lauriere, M. (1998) The combination of Indian ink with chemiluminescence detection allows precise identification of antigens on blots: application to the study of glycosylated barley storage proteins. Electrophoresis 19: 1394-1396.

Fazekas de St. Groth, S., Webster, R. and Datyner, A. (1963) Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta 71: 377- 391.

Fernandez-Patron, C., Calero, M., Garcia, J., Madrazo, J., Musacchio, A., Soriano, F., Estrada, R., Frank, R., Castellanos-Serra, L. and Mendez, E. (1995) Protein reverse staining: high-efficiency microanalysis of unmodified proteins detected on electrophoresis gels. Anal. Biochem. 224: 203-— Zi 1.

Fernandez-Patron, C., Castellanos-Serra, L., Hardy, E., Guerra, M., Estevez, E., Mehl, E. and Frank, R. (1998) Understanding the mechanism of the zinc-ion stains of biomacromolecules in electrophoresis gels: generalization of the reverse-staining technique. Electrophoresis 19: 2398- 2406.

Ferreras, M., Gavilanes, J. and Garcia-Segura, J. (1993) A permanent Zn reverse staining method for the detection and quantification of proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 213: 206-212.

Flanagan, S. and Yost, B. (1984) Calmodulin-binding proteins: visualization by '*°I-calmodulin overlay on blots quenched with Tween 20 or bovine serum albumin and poly(ethylene oxide). Anal. Biochem. 140: 510-519

Fowler, S. (1994) The detection of proteins on blots using gold or immunogold. Methods Mol. Biol. 32: 239-255.

Gersten, D., Zapolski, E. and Ledley, R. (1984) Radioactive staining of gels to identify proteins. US Patent no. 4,459,356, 10 July.

Gharahdaghi, F., Kirchner, M., Fernandez, J. and Mische, S. (1996) Peptide-mass profiles of polyvinylidene difluoride-bound proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization time- of-flight mass spectrometry in the presence of nonionic detergents.. Ana/. Biochem. 233: 94-99.

Glenney, J. (1986) Antibody probing of western blots which have been stained with India ink. Anal. Biochem. 156: 315-319.

Gossling, J. (1990) A decade of development in immunoassay methodology. Clin. Chem. 36: 1408- 1427.

Graham, G., Nairn, R. and Bates, G. (1978) Polyacrylamide gel staining with Fe * -bathophenan- throline sulfonate. Anal. Biochem. 88: 434-441.

Grassman, W. and Hannig, K. (1952) Ein quantitatives verfahren zur analyse der serumproteine durch papierelektrophorese. Hoppe-Seylev's Z. Physiol. Chem. 290: 1-27.

Haebel, S., Albrecht, T., Sparbier, K., Walden, P., Korner, R. and Steup, M. (1998) Electrophoresis- related protein modification: alkylation of carboxy residues revealed by mass spectrometry. Electrophoresis 19: 679-686.

Hager, D. and Burgess, R. (1980) Elution of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels, removal of sodium dodecyl sulfate, and renaturation of enzymatic activity: results with

.68 . 蛋白 质 组 学

sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase, wheat germ DNA wa ati eb and other enzymes. Anal. Biochem. 109: 76-86.

Hamby, R. (1996) A sensitive fluorescent gel stain. Am. Biotechnol. Lab. 14: 12.

Hamby, R. (1997) A fluorescent gel stain for detection of proteins following 1-D, 2-D and native polyacrylamide gel electrophoresis. Biotechnol. Int. 1: 339-343.

Hancock, K. and Tsang, V. (1983) India ink staining of proteins on nitrocellulose paper. Anal. Biochem. 133: 157-162.

Hartman, B. and Udenfriend, S. (1969) A method for immediate visualization of proteins in acrylamide gels and its use for preparation of antibodies to enzymes. Anal. Biochem. 30: 391- 394.

Harvey, M., Bandilla, D. and Banks, P. (1998) Subnanomolar detection limit for sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis using a fluorogenic, noncovalent dye. Electrophoresis 19: 2169-2174.

Higgins, R. and Dahmus, M. (1979) Rapid visualization of protein bands in preparative SDS- polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 93: 257-260.

Hochstrasser, D., Patchornik, A. and Merril, C. (1988) Development of polyacrylamide gels that improve the separation of proteins and their detection by silver staining. Anal. Biochem. 173: 412-423.

Horowitz, P. and Bowman, S. (1987) Ion-enhanced fluorescence staining of sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gels using bis(8-p-toluidino-1-naphthalenesulfonate). Anal. Biochem. 165: 430— 434.

Houston, B. and Peddie, D. (1989) A method for detecting proteins immobilized on nitrocellulose membranes by in situ derivatization with fluorescein isothiocyanate. Anal. Biochem. 177: 263— 267.

Hughes, J., Mack, K. and Hamparian, V. (1988) India ink staining of proteins on nylon and hydrophobic membranes. Anal. Biochem. 173: 18-25.

Hunter, J. and Hunter, S. (1987) Quantification of proteins in the low nanogram range by staining with the colloidal gold stain AuroDye. Anal. Biochem. 164: 430-433.

Jackson, P., Urwin, V. and Mackay, C. (1988) Rapid imaging, using a cooled charge-coupled- device, of fluorescent two-dimensional polyacrylamide gels produced by labelling proteins in the first-dimensional isoelectric focusing gel with fluorophore 2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)fur- anone. Electrophoresis 9: 330-339.

Jay, G., Culp, D. and Jahnke, M. (1990) Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: enhancement by carbohydrate-binding dyes. Anal. Biochem. 185: 324-330.

Kerenyi, L. and Gallyas, F. (1972) A highly sensitive method for demonstrating proteins in electrophoretic, immunoelectrophoretic and immunodiffusion preparations. Clin. Chem. Acta 38: 465-467.

Lee, C., Levin, A. and Branton, D. (1987) Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 166: 308-312.

Lek, L., Yang, E., Wang, D. and Cheng, L. (1995) Comparison of the sensitivity of different India inks staining of electro-blotted proteins on filter membranes. J. Biochem. Biophys. Methods 30: 9-20.

Li, K., Geraerts, W., van Elk, R. and Joose, J. (1988) Fixation increases sensitivity of India ink staining of proteins and peptides on nitrocellulose paper. Anal. Biochem. 174: 97-100.

Li, K., Geraerts, W., van Elk, R. and Joose, J. (1989) Quantification of proteins in the subnanogram and nanogram range: comparison of the AuroDye, FerriDye and India ink staining methods. Anal. Biochem. 182: 44-47.

Lim, M., Patton, W., Shojaee, N. and Shepro, D. (1996) Solid-phase metal chelate assay for quantifying total protein: resistance to chemical interference. BioTechniques 21: 888-897.

Lim, M., Patton, W., Shojaee, N., Lopez, M., Spofford, K. and Shepro, D. (1997) A luminescent europium complex for the sensitive detection of proteins and nucleic acids immobilized on membrane supports. Anal. Biochem. 245: 184-195.

Loo, R., Dales, N. and Andrews, P. (1994) Surfactant effects on protein structure examined by electrospray ionization mass spectrometry. Protein Sci. 3: 1975-1983.

Matsui, N., Smith, D., Clausner, K., Fichmann, J., Andrews, L., Sullivan, C., Burlingame, A. and

AU RAMANA RES A ey ill - 69 ，

Epstein, L. (1997) Immobilized pH gradient two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometric identification of cytokine-regulated proteins in ME-180 cervical carcinoma cells. Electrophoresis 18: 409-417.

Merril, C. (1987) Detection of proteins separated by electrophoresis. In: Advances in Electro- phoresis, Vol. 1 (eds A. Chrambach, M. Dunn and B. Radola). VCH Publishers, New York, pp. 111-140.

Merril, C., Goldman, D., Sedman, S. and Ebert, M. (1981) Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science 211: 1437— 1438.

Merril, C., Goldman, D. and Van Keuren, M. (1984) Gel protein stains: silver stain. Methods Enzymol. 104: 441-447. ,'

Metkar, S., Mahajan, S. and Sainis, J. (1995) Modified procedure for nonspecific protein staining on nitrocellulose paper using Coomassie Brilliant Blue R-250. Anal. Biochem. 227: 389-391. Meyer, T. and Lamberts, B. (1965) Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of paratoid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochim. Biophys.

Acta 107: 144-145.

Miranda, P., Brandelli, A. and Tezon, J. (1993) Instantaneous blocking for immunoblots. Anal. Biochem. 209: 376-377.

Mobbs, C., Berman, J., Marquardt, M. and Pfaff, D. (1989) Comprehensive polypeptide analysis of microdissected rat brain areas; combining 2-dimensional gel electrophoresis with 2-dimensional HPLC and immunoanalysis and sequencing procedures. J. Neurosci. Methods 29: 5-15.

Moeremans, M., Daneels, G., Van Dijck, A., Langanger, G. and De Mey, J. (1984) Sensitive visualization of antigen—antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining. J. Immunol. Methods 74: 353-360.

Moeremans, M., Daneels, G. and De May, J. (1985) Sensitive colloidal (gold or silver) staining of protein blots on nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 145: 315-321.

Moeremans, M., De Raeymaeker, M., Daneels, G. and De Mey, J. (1986) Ferridye: colloidal iron binding followed by Perls’ reaction for the staining of proteins transferred from sodium dodecyl sulfate gels to nitrocellulose and positively charged nylon membranes. Anal. Biochem. 153: 18- 2

Nelson, T. (1993) Destaining of nitrocellulose blots after staining with silver or colloidal gold. Anal. Biochem. 214: 325-328.

Neuhoff, V., Stamm, R. and Eibl, H. (1985) Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels. Electrophoresis 6: 427-448.

Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D. and Ehrhardt, W. (1988) Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis 9: 255-262.

Neuhoff, V., Stamm, R., Pardowitz, I., Arold, N., Ehrhardt, W. and Taube, D. (1990) Essential problems in quantification of proteins following colloidal staining with Coomassie Brilliant Blue dyes in polyacrylamide gels, and their solution. Electrophoresis 11: 101-117.

Oakley, B., Kirsch, D. and Morris, N. (1980) Simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 105: 361-363.

Ono, T. and Tuan, R. (1990) Double staining of immunoblot using enzyme histochemistry and India ink. Anal. Biochem. 187: 324-327.

Ortiz, M., Calero, M., Fernandez-Patron, C., Patron, C., Castellanos, L. and Mendez, E. (1992) Imidazole-SDS-Zn reverse staining of proteins in gels containing or not SDS and micro- sequence of individual unmodified electroblotted proteins. FEBS Lett. 296: 300-304.

Patestos, N., Fauth, M. and Radola, B. (1988) Fast and sensitive protein staining with colloidal Acid Violet 17 followed by isoelectric focusing in carrier ampholyte generated and immobilized pH gradients. Electrophoresis 9: 488-496.

Patton, W. (1995) Biologist’s perspective on analytical imaging systems as applied to protein gel electrophoresis. J. Chromatogr. A 698: 55-87.

Patton, W., Lopez, M., Barry, P. and Skea, W. (1992) A mechanically strong matrix fer protein electrophoresis with enhanced silver staining properties. BioTechniques 12: 580-585.

Patton, W., Lam, L., Su, Q., Lui, M., Erdjument-Bromage, H. and Tempst, P. (1994) Metal

- 70: & A ee

chelates as reversible stains for detection of electroblotted proteins: application to protein microsequencing and immunoblotting. Anal. Biochem. 220: 324-335.

Patton, W., Lim, M. and Shepro, D. (1999a) Protein detection using reversible metal chelate stains. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 112, 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 331-339.

Patton, W., Lim, M. and Shepro, D. (1999b) Image acquisition in 2-D electrophoresis. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 112, 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 353-362.

Peats, S. (1984) Quantitation of protein and DNA in silver-stained agarose gels. Anal. Biochem. 140: 178-182.

Pina, B., Aragay, A., Suau, P. and Daban, J. (1985) Fluorescent properties of histone-1- anilinonaphthalene 8-sulfonate complexes in the presence of denaturant agents: application to the rapid staining of histones in urea and Triton—urea—polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 146: 431-433.

Powell, R. (1998) Small organometallic probes. US patent no. 5,728,590, 17 March. ~

Pryor, J., Xu, W. and Hamilton, D. (1992) Immunodetection after complete destaining of Coomassie blue-stained proteins on immobilon-PVDF membrane. Anal. Biochem. 202: 100— 104.

Rabilloud, T. (1990) Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis 11: 785—794.

Rabilloud, T. (1992) A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis 13: 429-439.

Rabilloud, T. (1999) Silver staining of 2-D electrophoresis gels. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 112, 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 297- 305.

Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C. and Lawrence, J. (1994) Silver staining ， of proteins in polyacrylamide gels: a seneral overview. Cell. Mol. Biol. 40: S7—75.

Ragland, W., Pace, J. and Kemper, D. (1974) Fluorimetric scanning of fluorescamine-labeled proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 59: 24-33.

Rodriguez, L., Gersten, D., Ramagli, L. and Johnston, D. (1993) Towards stoichiometric silver staining of proteins resolved in complex two-dimensional electrophoresis gels: real-time analysis of pattern development. Electrophoresis 14: 628-637.

Rohde, E., Vogt, C. and Heineman, W. (1998) The analysis of fountain pen inks by capillary electrophoresis with ultraviolet/visible absorbance and laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis 19: 31-41.

Rohringer, R. and Holden, D. (1985) Protein blotting: detection of proteins with colloidal gold, and of glycoproteins and lectins with biotin-conjugated and enzyme probes. Anal. Biochem. 144: 118-127.

Root, D. and Reisler, E. (1989) Copper iodide staining of protein blots on nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 181: 250-253.

Root, D. and Wang, K. (1993) Silver-enhanced copper staining of protein blots. Anal. Biochem. 209: 15-19.

Schapira, A. and Keir, G. (1988) Two-dimensional] protein mapping by gold stain and immuno- blotting. Anal. Biochem. 169: 167-171.

Scheler, C., Lamer, S., Pan, Z., Li, X., Salnikow, J. and Jungblut, P. (1998) Peptide mass fingerprint sequence coverage from differently stained proteins on two-dimensional electro- phoresis patterns by matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI- MS). Electrophoresis 19: 918-927.

Schleicher, M. and Watterson, D. (1983) Analysis of differences between Coomassie blue stain and silver stain procedures in polyacrylamide gels: conditions for the detection of calmodulin and troponin C. Anal. Biochem. 131: 312-317.

Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68: 850-858.

Shojaee, N., Patton, W., Lim, M. and Shepro, D. (1996) Pyrogallol red-molybdate: a reversible, metal chelate stain for detection of proteins immobilized on membrane supports. Electro- phoresis 17: 687-693.

第 四 章 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 转 印 膜 上 蛋白 质 的 检测 2

Steinberg, T., Jones, L., Haugland, R. and Singer, V. (1996a) SYPRO Orange and SYPRO Red protein gel stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem. 239: 223-237.

Steinberg, T., Haugland, R. and Singer, V. (1996b) Applications of SYPRO Orange and SYPRO Red protein gel stains. Anal. Biochem. 239: 238-245.

Steinberg, T., White, H. and Singer, V. (1997) Optimal filter combinations for photographing SYPRO Orange or Red dye-stained gels. Anal. Biochem. 248: 168-172.

Steinberg, T., Chernokalskaya, E., Berggren, K., Lopez, M., Diwu, Z., Haugland, R. and Patton, W. (2000) Ultrasensitive fluorescence protein detection in isoelectric focusing gels using a ruthe- nium metal chelate stain. Electrophoresis 21: 486-496.

Stephens, R. (1975) High-resolution preparative SDS—polyacrylamide gel electrophoresis: fluor- escent visualization and electrophoretic elution-concentration of protein bands. Anal. Biochem. 65: 369-379.

Switzer, R., Merril, C. and Shifrin, S. (1979) A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98: 231-237.

Szewczyk, B. and Summers, D. (1987) Fluorescent staining of proteins transferred to nitrocellulose allowing for subsequent probing with antisera. Anal. Biochem. 164: 303-306.

Szewezyk, B. and Summers, D. (1992) Fluorescent protein staining on nitrocellulose with subsequent immunodetection of antigen. In: Methods in Molecular Biology, vol. 10: Immuno- chemical Protocols (ed. M. Manson). Humana Press, Totowa, NJ.

Takagi, T., Kubo, K. and Isemura, T. (1977) Simple visualization of protein bands in SDS-— polyacrylamide gel electrophoresis by the insoluble complex formation between SDS and a cationic surfactant. Anal. Biochem. 79: 104-109.

Talbot, D. and Yphantis, D. (1971) Fluorescent monitoring of SDS gel electrophoresis. Anal.

- Biochem. 44: 246-253.

Unlu, M., Morgan, M. and Minden, J. (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071-2077.

Urwin, V. and Jackson, P. (1993) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins labeled with the fluorophore monobromobimane prior to first-dimensional isoelectric focusing: imaging of the fluorescent protein spot patterns using a cooled charge-coupled device. Anal. Biochem. 209: 57-62.

Vandekerckhove, J., Bawn, G., Puype, M., Van Damme, J. and Van Montagu, M. (1985) Protein- blotting on Polybrene-coated glass-fiber sheets. A basis for acid hydrolysis and gas-phase sequencing of picomole quantities of protein previously separated on sodium dodecyl sulfate/ polyacrylamide gel. Eur. J. Biochem. 152: 9-19.

Vanfleteren, J. and Peeters, K. (1990) Chromatographic recovery of polypeptides from copper- stained sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. J. Biochem. Biophys. Methods 20: 227-235.

van Oostveen, I., Ducret, A. and Aebersold, R. (1997) Colloidal silver staining of electroblotted proteins for high sensitivity peptide mapping by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 247: 310-318.

Velculescu, V., Zhang, L., Zhou, W., Vogelstein, J., Basrai, M., Bassett, D., Hieter, P., Vogelstein, B. and Kinzler, K. (1997) Characterization of the yeast transcriptome. Ce// 88: 243-251.

Vera, J. and Rivas, C. (1988) Fluorescent labeling of nitrocellulose-bound proteins at the nanogram level without changes in immunoreactivity. Anal. Biochem. 173: 399-404.

Wallace, R., Yu, P., Dieckert, J. and Dieckert, J. (1974) Visualization of protein—SDS complexes in polyacrylamide gels by chilling. Anal. Biochem. 59: 24.

Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T. and Mann, M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature 379: 466-469.

Wirth, P. and Romano, A. (1995) Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection methods. J. Chromatogr. A 698: 123-143.

Zapolski, E., Gersten, D. and Ledley, R. (1982) [S9Fe]Ferrous bathophenanthroline sulfonate: a radioactive stain for labeling proteins in situ in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 123: 325— 328.

Zeindl-Eberhart, E., Jungblut, P. and Rabes, H. (1997) A new method to assign immunodetected spots in the complex two-dimensional electrophoresis pattern. Electrophoresis 18: 799-801.

第 五 章 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 Scott D. Patterson, Ruedi Aebersold and David R. Goodlett

1.5/8

在 形成 和 蛋白质 组 学 领域 的 过 程 中 ， 质 谱 已 经 成 为 一 个 有 重要 意义 的 推动 技术 。 先 进 的 质谱 仪 的 发 明 使 质谱 具有 电离 多 肽 、 和 蛋 日 质 及 其 他 一 些 生物 大 分 子 的 能 办 ， 同 时 还 有 极 高 的 灵敏 度 。 更 多 的 科学 家 可 以 接触 到 质谱 仪 ， 并 进一步 扩展 了 其 应 用 范围 。 现 已 开 发 出 的 计算 机 算法 可 以 用 质谱 数据 〈 肽 或 碎片 离子 的 质量 ) 通过 相关 分 析 途 径 〈correl- ative-based approache) 在 蛋白 序列 数据 库 中 鉴定 和 蛋白质。 公共 数据 库 中 有 越 来 越 多 的 来 自 于 包括 人 在 内 的 各 个 种 属 的 核酸 序列 信息 ， 这 些 核 酸 序列 信息 与 质谱 仪 的 新 功能 结合 起 来 ， 显 而 易 见 ， 加 快 了 发 现 / 鉴 定 蛋白 质 组 成 分 的 步伐 。

本 章 将 讲述 质谱 在 以 下 分 析 方 面 的 应 用 : 利用 质谱 产生 的 数据 鉴定 蛋白 质 的 计算 手 段 ， 蛋 白质 的 翻译 后 修饰 位 点 鉴定 ， 特 别 是 磷酸 化 修饰 。 本 章 重 点 将 不 会 放 在 对 质谱 数 据 产 生 步 又 的 细节 描述 上 ， 因 为 这 些 内 容 在 最 近 的 许多 综述 和 专著 中 均 有 论述 (Acher- sold and Patterson, 1998; Courchesne and Patterson; 1998; Lamond and Mann, 1997; Moritz et al., 1995).

1.1 蛋白 质 鉴 定 途径

科学 的 许多 方面 都 是 由 技术 进步 来 推动 的 ， 蛋 白质 的 鉴定 就 是 一 个 很 好 的 例 于 。 目 20 世纪 80 年 代 中 期 自动 化 的 蛋白 测序 仪 问 世 以 来 ，Edman WER MAE Se 主要 方法 (Hewick et al., 1981). Edman 测序 法 对 蛋白 质 从 N 末端 开始 实施 逐步 的 化 学 降解 ， 并 对 每 一 步 释放 出 的 衍生 化 氨基 酸 ， 用 反 相 HPLC 分 离 ， 紫 外 检测 锋 检 测 ， 根据 其 保留 时 间 与 标准 氨基 酸 的 保留 时 间 相 比较 来 鉴定 。 许 多 蛋白 质 的 N 末端 氨基 被 修饰 (封闭 )， 与 Edman 化 学 试剂 不 反应 ， 所 以 分 析 完 整 蛋 白 时 没有 数据 产生 (Brown, 1979; Brown and Robert，1976)。 凝 胶 电 泳 是 蛋白 质 分 离 的 最 佳 选择 方法 ， 应 用 二 维 将 胶 电 泳 可 以 对 复杂 混合 物 的 分 离 达到 非常 高 的 分 辨 率 。 将 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 电 转 印 到 PVDF 膜 上 ， 可 以 直接 用 于 Edman 测序 化 学 反应 ， 电 转 印 方法 使 电泳 和 Edman 测序 方 法 直接 联系 起 来 (Aebersold et al., 1986; Matsudaira, 1987; Pluskal et al., 1986). 2 20 世纪 80 年 代 末 ， 开 始 用 各 种 化 学 或 酶 的 方法 降解 凝 胶 分 离 后 转 印 到 各 种 膜 上 的 微量 蛋白 ， 降 解 产物 经 分 离 及 纯化 后 用 于 Edman 测序 分 析 (Aebersold et al., 1986, 1987; Vandekerckhove et al .，1985)。 如 果 和 蛋白 质 的 N 末端 封闭 ， 不 适用 于 Edman 测序 ， 上 述 方法 可 以 提供 机 会 选择 蛋白 质 中 间 部 分 肽 段 用 于 氨基 酸 序 列 分 析 ， 而 且 中 间 肽 段 测序 的 序列 覆盖 率 明 显 高 于 单独 使 用 N 末端 序列 法 。 使 用 蛋白 质 不 同 区 域 的 氨基 酸 序列 设 HEH S| Wt EF PCR 反应 进行 基因 克隆 (Tempst et al., 1990). 7£ 90 年 代 初 期 ， 开 始 致力 于 凝 胶 分 离 蛋白 质 鉴定 方法 的 改进 ， 例 如 转 膜 和 水 解 过 程 中 获取 蛋 日 和 释

ALE ”蛋白 质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 5 93 2

放 多 肽 等 步骤 (Abersold and Leavitt, 1990; Patterson, 1994; )， 以 及 提高 Edman 测序 仪 的 灵敏 度 。Edman 测序 法 是 对 氨基 酸 序列 从 头 测 定 ， 因 此 在 蛋白 质 鉴 定 过 程 中 不 需 要 从 实验 数据 到 氨基 酸 序列 的 相关 分 析 ， 而 从 质谱 途径 鉴定 蛋 白 质 需要 从 实验 数据 到 氢 基 酸 序列 相关 分 析 的 辅助 ， 这 也 是 本 章 的 主题 内 容 。 因 此 ，Edman 测序 法 仍 将 在 种 属 基因 组 未 明了 的 蛋白 质 鉴定 中 发 挥 重要 作用 。

以 对 全 部 人 基因 组 测序 为 目标 的 人 类 基因 组 计划 的 出 现 ， 促 进 了 对 其 他 许多 种 属 基 因 组 的 测序 。 通 过 政府 及 私人 公司 两 方面 的 努力 ， 已 完成 了 许多 与 临床 和 基础 研究 相关 的 物种 的 基因 组 测序 ， 例 如 21 种 细菌 [ 见 Fraser and Fleischmann (1997) 的 综述 和 基 因 组 研究 所 微生物 数据 网 站 (The Institute for Genomics Research (TIGR) Microbial Database web site: http://www. tigr. org/tdb/mdb. html]. EY BH 8 ( Saccharomyces cerevisiae), 7 BN #r /)) FF 2 HH ( Caenorhabidopsis elegans ), 3 48 ( Drosophila melanogaster) 的 全 基因 测序 已 经 完成 。 公 共 数 据 库 中 已 经 公布 了 超过 200 万 个 人 和 100 万 个 鼠 的 表达 序列 标志 (expressed sequence tag, EST: 从 不 同 组 织 或 细胞 中 分 离 出 的 mRNA 反 转 录 成 的 cDNA 序列 ， 大 约 有 300~ 500 个 碱 基 对 长 度 )， 政 府 和 私人 公司 的 EST 序列 都 已 经 涵盖 了 至 少 3 倍 的 人 基因 组 全 序列 。 已 经 有 了 能 够 利用 质谱 测定 的 蛋白 质 一 级 结构 数据 在 蛋 白 质 序列 数据 库 〈 从 核酸 序列 翻译 成 的 蛋 白 质 序 列 ) 中 迅速 鉴 定 蛋 白质 的 软件 算法 。 这 种 蛋白 质 鉴定 新 技术 在 90 年 代 中 期 建立 ， 伴 随 着 技术 发 展 的 新 浪潮 ， 还 建立 了 用 于 Edman 测序 的 凝 胶 分 离 蛋 白质 产生 肽 段 的 纯化 、 分 离 技术 (La- mond and Mann, 1997; Patterson and Aebersold，1995)。 质 谱 及 其 接口 技术 也 在 这 一 阶 段 及 后 来 的 时 期 得 到 发 展 ， 例 如 纳 喷 技术 (nanospray) (Wilm and Mann, 1994, 1996) 和 微 流 控 技 术 (microfabricated devices ) (Figeys et ww .，1998)， 可 参见 相关 综述 (Figeys and Aebersold，1998)。 这 些 技术 上 的 进步 已 经 汇聚 成 了 一 个 成 熟 、 自 动 化 、 灵 敏 并 且 快 速 的 技术 方法 ， 极 大 地 提高 了 鉴定 蛋白 质 的 能 力 ， 并 构成 了 正在 形成 中 的 蛋白 质 组 学 领域 的 基础 。

2. 质谱 基础 知识

通过 质谱 数据 与 序列 数据 库 相 关 分 析 的 方法 鉴定 蛋白 质 的 基础 在 于 能 够 得 到 一 些 限 制 参数 ， 利 用 这 些 参 数 可 以 从 数据 库 中 所 有 的 序列 中 特异 地 识别 与 这 些 参数 相关 的 序 列 ， 这 些 参 数 包括 : 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 、 氮 基 酸 序列 、 蛋 白质 和 肽 段 的 质量 以 及 肽 碎 片 的 质量 。 参 数 可 以 单独 使 用 或 与 其 他 参数 结合 使 用 ， 其 中 分 子 的 精确 质量 特别 具有 吸 引力 ， 因 为 这 一 参数 具有 高 度 的 限制 性 ， 并 且 能 够 利用 质谱 仪 (MS) 快速 、 灵 敏 、 高 精度 地 测定 。MS 只 限于 检测 能 够 形成 离子 并 且 离 子 能 够 被 传送 入 真空 系统 的 分 子 的 质 量 ， 随 着 80 年 代 末 两 种 软 电 离 技术 : 电 喷雾 电离 (ESI) (Fenn et al., 1989) 和 基质 辅助 激光 解吸 /电离 (MALDI) (Karas and Hillenkamp, 1998) 的 发 明 ， 质 谱 变 得 更 适 用 于 分 析 生 物 大 分 子 聚 合 物 ， 蛋 白质 、 核 酸 和 糖 类 。 这 两 种 方法 之 所 以 被 称 为 “ 软 ” 电 离 技术 ， 是 因为 它们 在 离子 化 过 程 中 不 会 〈 最 多 只 部 分 ) 破坏 分 子 结构 ， 因 此 ， 就 能 实 现 分 子 质量 大 于 10 000 质量 单位 〈u) 的 生物 大 分 子 的 质量 分 析 。

质谱 仪 由 三 部 分 组 成 : 离子 源 、 质 量 分 析 器 、 检 测 器 。 质 谱 仪 在 真空 状态 下 分 析 离 子 的 质 荷 比 (mm/z)， 有 多 种 不 同 的 离子 源 与 质量 分 析 器 (检测 器 ) 的 结构 组 合 。 三 种

esi 蛋白 质 组 学

常用 于 蛋白 质 和 多 肽 分 析 的 商业 化 仪器 类 型 是 : MALDI -飞行 时 间 (TOF) 质谱 仪 、 Se ge dy chav vietnam 这 三 种 类 型 的 质谱 仪 将 在 下 文 详 述 。 2.1 MALDI-MS

线性 MALDI-MS: MALDI-MS 质谱 仪 慌 怕 是 概念 上 和 设计 上 都 最 简单 的 质谱 仪 ， 分 子 (AD) 2 ee 离子 的 质 荷 比 (m/z) 由 飞行 时 间 质 量 分 rast) 〈 见 图 $.1)。 测 量 的 质量 精确 度 与 m/z 有 关 ，25Sku 以 下 可 达到 约 0.01% ~ 0.05% 的 精确 度 ， 到 300ku 精确 度 达 到 +0.05% ~0.3%. MALDI 也 能 分 析 溶 解 在 磷 酸 盐 ，Tris 等 生物 缓冲 液 中 的 分 析 样 品 ， 或 含有 少量 腺 、 非 离子 变性 剂 及 一 些 碱 金属 盐

蛋白 质 和 多 肽 的 MALDI 分 析 包 括 以 下 一 系列 步骤 :

(1) 被 分 析 物 与 基质 (小 分 子 芳香 化 合 物 ) 混合 。 基 质 通常 溶解 在 酸性 有 机 溶剂

中 ， 以 超过 样品 1000 倍 的 量 与 样品 混合 ， 将 样品 和 基质 加 到 金属 片 / 靶 上 ， as 剂 在 空气 中 挥发 后 ， 形 成 了 样品 -基质 共 结 唱 。

(2) 将 加 有 样品 -基质 混合 结晶 的 靶 送 入 质谱 仪 的 真空 s 室 (10-5~10-8 Torr).

(3) 在 金属 片 / 靶 上 加 +20 一 30kvV 的 高 电压 (产生 正 离子 )， 同 时 有 短 的 激光 脉冲

照射 在 干燥 的 样品 上 。 (4) 基质 晶体 吸收 特定 波长 的 激光 能 量 (紫外 激光 337nm， 红 外 激光 2.94pm)， 又 以 热 的 形式 将 能 量 释放 ， 引 发 了 解吸 附 。 这 一 迅速 的 放 热 过 程 又 使 基质 晶体 升 上 基质 和 样品 分 子 气 化 进入 质谱 仪 的 气相 。

(5) 通过 在 气相 中 发 生 质 子 化 /去 质子 化 ， 附 着 阳离子 /脱离 阳离子 ， 或 氧化 /还 原 等 过 程 实现 离子 化 。 产 生 的 离子 从 靶 表 面 (保持 +20~30kV 高 电压 ) 被 推 斥 并 加 速 进 入 一 系列 的 离子 透镜 (保持 接地 电压 )， 离 子 透镜 聚焦 离子 进入 飞行 时 间 质 量 分 析 器 的 无 场 漂 移 区 ($0 一 300cm)。 检 测 器 安装 在 无 场 漂移 区 末端 ， 通过 飞行 管道 的 离子 被 检测 器 记录 。 (6) MALDI 离子 化 过 程 送 入 质量 分 析 器 的 离子 实质 上 具有 相同 的 终 动能 。 在 动能 一 定时 ， 离 子 的 速度 与 离子 的 质 荷 比 mm/z 成 反比 。 因 此 ， 在 线性 检测 器 中 ， 离子 到 达 飞 行 管道 另 一 端 检 测 器 的 时 间 反 映 了 被 检测 离子 的 m/z.

(7) 离子 通过 无 场 漂 移 区 的 飞行 时 间 由 激光 脉冲 触发 检测 器 记录 。 因 此 ， 每 一 离子 化 过 程 产生 的 每 一 批 离子 到 达 检 测 器 的 飞行 时 间 都 被 记录 下 ， 并 被 换算 为 质 人 荷 比 m/z (Carr and Annan, 1997).

BB), KTR RR, AWA m/z 可 用 已 知 质量 和 电荷 状态 的 化 合 物 的 飞行 时 间作 校正 并 用 经 验 公式 计算 出 来 (通常 用 一 个 基质 离子 和 一 个 蛋白 质 或 多 肽 离子 作 校 正 ， 被 分 析 物 的 质量 包括 在 此 质量 范围 内 )。 离 子 动能 (LE) 与 其 质量 (m) 和 速 BE (v) 的 关系 可 被 表述 为 正 = 芭 zu2?， 因 此 ， 对 于 一 个 单 电 荷 离子 ， 其 飞行 时 间 (由 REE) 与 分 子 质量 的 平方 根 成 反比 。

MALDI 离子 化 过 程 本 身 存 在 一 个 问题 ， 即 离子 化 过 程 中 动能 有 微小 的 分 散 。 由 单 个 激光 脉冲 产生 的 离子 的 动能 的 微小 差别 削弱 了 MALDI-MS 的 分 辨 力 。 多 肽 的 质量 分

第 五 章 ” 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 75°

(a) HER F=O@

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(b)

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图 $.1 基质 辅助 激光 解吸 /电离 质谱 仪 (a)MALDIMS;(b) 反 射 MALDI-MS;(c) 环 形 电场 反射 MALDILMS。 具 体 细 节 见 文中 。

HE (m/Am) 通常 为 40 一 800 FWHM ( 峰 高 一 半 处 的 峰 宽 )， 蛋 白质 的 质量 分 辩 率 通 # A 50~400 FWHM， 这 样 的 质量 分 辩 率 即使 是 多 肽 的 同位 素 分 布 也 不 能 测定 。 初 始 能 量 的 分 散 是 与 质量 有 关 的 ， 离 子 质 量 越 大 ， 峰 越 宽 。 现 已 发 展 了 两 种 技术 以 提高 MALDIMS 的 质量 分 辨 率 : 使 用 离子 镜 (ion mirror) / (反射 器 reflectron) 和 (或 ) 采 用 时 间 延 迟 聚 焦 (time-lag-focusing) 处 理 (图 $.1b 和 $.1lc)。 如 图 所 示 ， 离 子 镜 / 反 射 怖 在 一 个 特定 区 域内 将 离子 反射 回 检测 右 。 这 通过 以 下 步骤 实现 : 在 飞行 管 末 端 放置 的 反射 器 上 施加 高 电压 ， 其 电压 值 比 离子 源 的 电压 值 稍 高 ， 进 入 反射 器 的 离子 在 电场 作用 下 方向 偏转 ， 直 至 停止 飞行 ， 然 后 在 反射 器 内 被 重新 加 速 飞 出 反射 器 进入 第 二 检测 器 (图 5.1b)。 反 射 右 充当 了 一 个 能 量 聚 焦 装 置 ， 因 为 动能 稍 小 的 离子 (速度 慢 )， 进 入 反

“ 译 者 注 : 这 条 线 应 该 去 掉 ; 原文 插图 有 误 。

ins, 蛋白 质 组 学

射 器 的 距离 得， 折返 较 早 ， 动 能 稍 大 的 离子 进入 反射 器 的 距离 长 ， 折 返 较 晚 ， 所 以 速度 慢 的 离子 赶 上 了 速度 快 的 离子 : 反射 器 的 应 用 减少 了 离子 初始 动能 的 分 散 ， 因 此 提高 了 质量 分 辨 率 。

第 二 种 用 来 修正 MALDI 离子 化 过 程 中 初始 能 量 分 散 的 技术 是 在 离子 源 内 实现 的 ， 由 Wiley 和 McLaren 在 1953 年 提出 (Wiley and McLaren，1953 )， 称 为 时 间 延 迟 聚 焦 (time-lag-focusing)， 最 近 被 称 为 延迟 提取 (delayed extraction) (Vestal et al., 1995). 在 图 $.1b 和 ec 中 看 到 ， 相 对 于 连续 离子 提取 (图 $.1a)， 延 迟 提取 是 在 样品 靶 和 接地 的 连续 离子 提取 透镜 之 间 又 加 了 二 级 离子 透镜 (施加 电压 )， 和 延迟 提取 时 ，MALDI RE 无 电场 区 域 产 生 离 子 ， 在 施加 提取 电压 使 离子 加 速 进入 飞行 管道 之 前 ， 离 子 可 以 四 处 分 散 。 这 样 显著 降低 了 离子 的 能 量 分 散 ， 同 时 也 限制 了 峰 的 展 宽 ， 峰 的 展 宽 通 常 是 由 于 在 连续 离子 提取 模式 下 源 内 离子 碰撞 产生 不 稳定 的 解 离 所 致 。 延 迟 提 取 使 线性 MALDI JR 谱 仪 分 析 多 肽 的 质量 分 辨 率 达 到 2000 一 4000， 使 反射 MALDI 质谱 仪 分 析 多 肽 的 质量 分 辩 率 达到 3000 一 6000 (Brown and Lennon, 1995; Vestal et al., 1995).

PSD-MALDI-MS: ”为 了 在 MALDI- MS 仪器 上 获取 一 级 结构 信息 ， 必 须 选 择 分 析 某 一 离子 及 其 碎片 离子 的 质量 。 这 一 过 程 发 生 在 源 内 离子 化 之 后 ， 所 以 被 称 为 源 后 衰 AK (post source decay, PSD) (Chaurand et al. 1999)。 对 多 肽 进行 PSD 分 析 时 ， 其 碎片 离子 主要 是 沿 多肽 骨架 断裂 形成 ， 产 生 的 一 系列 碎片 离子 在 理论 上 包含 着 这 一 肽 段 的 氢 基 序 列 信息 (Kaufmann et al .，1994)。 离 子 源 内 产生 的 离子 被 加 速 后 在 飞行 过 程 中 产 生 的 碎片 离子 是 亚 稳 离 子 ， 所 有 的 碎片 离子 都 具有 与 其 前 体 离子 相同 的 速度 ， 但 只 具有 前 体 离子 动能 的 一 部 分 。 所 有 的 离子 ， 包 括 前 体 离子 和 碎片 离子 ， 由 于 具有 相同 的 表 观 质 荷 比 ， 都 将 在 同一 时 间 到 达 线 性 检测 器 ， 所 以 在 线性 TOF 分 析 器 中 ， 不 能 分 辨 碎片 离子 与 前 体 离子 。 但 是 使 用 离子 镜 (反射 器 ) 可 以 分 辨 碎片 离子 与 前 体 离子 的 动能 差 异 ， 现 在 有 两 种 反射 器 : 双 程 (dual-stage) 反射 器 和 环 场 (curved-field) Rit. WE 反射 器 只 能 在 有 限 的 动能 范围 内 聚焦 离子 ， 为 了 使 较 宽 动能 范围 的 离子 都 被 聚焦 ， 反 射 器 电压 要 逐步 减少 ， 连 续 降 7 一 14 步 ， 聚 焦 动 能 越 来 越 小 的 离子 ， 收 集 到 最 后 一 张 谱 图 时 ， 反 射 器 电压 大 致 是 初始 电压 的 5% 一 10%。 由 数据 系统 整合 出 连续 、 完 整 的 碎片 离 子 谱 图 ， 并 根据 每 一 反射 电压 下 的 碎片 离子 校正 谱 图 进行 校正 。 环 场 反 射 器 由 Cornish 和 Cotter (1994) 最 先 提出 ， 能 在 一 次 试验 中 分 辨 出 所 有 的 雁 片 离子 。 环 场 反 射 句 是 由 一 系列 电压 逐渐 减 小 的 离子 透镜 组 成 的 长 反射 器 (图 5.1c)， 因 此 聚焦 不 同 质 荷 比 的 碎 片 离子 所 需 的 电压 一 直 存 在 ， 但 是 在 空间 上 是 可 以 分 辨 的 。 在 同一 激光 脉冲 下 如 果 产 生 多 个 肽 段 离 子 ， 在 没有 质量 过 滤器 时 ， 不 能 区 分 不 同 肽 段 产 生 的 碎片 离子 ， 也 不 能 区 分 碎片 离子 与 未 断裂 的 肽 段 离子 。 因 此 ， 装 备 有 以 上 任 一 种 反射 器 的 质谱 仪 都 安装 了 一 个 离子 门 (ion gate)， 可 以 在 低 分 辩 率 情况 下 (42.5%) (图 5.1b、c) 选择 前 体 离子 / 碎 片 离子 。 所 以 ， 在 一 个 未 经 分 离 的 肽 混合 物 中 ， 可 以 选择 多 个 肽 段 得 到 其 序列 特异 的 碎 片 离子 信息 。

2.2 ESI-MS

在 ESI 源 中 ， 含 有 被 分 析 样 品 〈 多 肽 /蛋白 质 ) 的 溶液 流 经 一 个 细 细 的 进 样 针 ， 针 头 上 加 高 电压 (+1000~5000V) 用 来 产生 正 离子 ， 见 图 $.2a。 高 电压 导致 样品 液 流 分

第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 -77-

散 为 呈 喷 雾 状 的 带 高 电荷 的 微小 液 滴 ， 质 谱 仪 入 口 端的 有 和 孔 平 板 上 加 有 + 100 ~ 1000V 的 低 电 压 ， 引 导 离 子 通 过 入 口 (orifice)， 这 一 入 口 是 离子 源 和 质谱 仪 的 连接 处 ， 离 子 源 处 于 大 气压 环境 ， 质 谱 仪 处 于 真空 系统 内 。 当 液 滴 从 针尖 通 往 入 口 时 ， 在 定向 惰性 气体 ie CARINII) 的 作用 下 溶剂 蒸发 ， 使 液 滴 缩小 ， 液 滴 电荷 密度 增加 ， 最 终 导致 液 滴 爆 裂 ， 离 子 从 液 相 中 释放 出 来 进入 气相 (Carr and Annan，1997)。 离子 通过 入 口 后 ， 在 一 个 只 加 有 射频 场 (radio frequency, RF) 的 四 极 杆 控制 下 进入 质量 分 析 上 磊 ， 可 以 是 四 极 杆 、 四 极 杆 -飞行 时 间 、 或 离子 阱 质量 分 析 器 。ESI 产生 的 多 肽 离子 的 特征 是 带 多 电荷 ， 电荷 数 与 肽 分 子 中 可 电离 的 基 团 数目 有 关 。 如 果 用 ESI-MS 正 离子 模式 分 析 胰 酶 酶 切 肽 段 ， 大 多 数 肽 段 都 会 带 至 少 两 个 电荷 ， 一 个 在 N 末端 的 NH, 基 团 上 ， 另 一 个 在 胰 酶 酶 切 位 点 ， 肽 段 C 末 端 碱 性 氨基 酸 的 侧 链 上 。

(a)

FRA 喷雾 MAD OV

Seds: . ——s

HV ar | 四 极 杆 (在 电 喷雾 针 上 ) (射频 模式 ) (b) 裂解 气 入 口

Ql RE) 质量 分 析 器 ais) nae

(c)

环形 电极 号 三 让 ba ia 射频 模式 tN 四 极 杆 oy" 端 盖 电极

图 5.2 电 喷 雾 离子 化 质谱 仪 (a) ESI-MS; (b) ESI-TQ-MS; (c) ESI-IT-MS。 具 体 细 节 见 文中 。

ESI- 三 级 四 极 质谱 仪 ”如 其 名 所 述 ， 三 级 四 极 质 谱 仪 由 三 套 四 极 杆 组 成 (A 5.2b)。 四 极 杆 滤 质 器 既 可 以 传送 混合 物 中 所 有 的 离子 (Li RF-only 方式 工作 )， 又 可 以 充当 质量 过 滤器 ， 只 人 允许 特定 质 荷 比 的 离子 通过 。 四 极 杆 由 4 个 平行 的 圆 棒 构 成 ， 相向 的 一 对 圆 棒 上 施加 电极 相反 的 直流 和 交流 电压 。 当 离子 漂移 通过 四 极 杆 圆 棒 的 中 间 区 域 时 ， 改 变 四 极 杆 上 施加 的 电压 ， 使 具有 特定 m/z 质 荷 比 的 离子 才能 通过 ， 所 有 其

i eel’ 蛋白 质 组 学

他 质 荷 比 的 离子 改变 了 线性 飞行 路 径 ， 从 分 析 器 中 消失 。 如 果 四 极 杆 上 施加 的 电压 连续 变化 (扫描 )， 由 通道 -电子 倍增 吉 记 录 通 过 波 质 器 的 离子 数目 ， 并 与 特定 的 离子 m/z 质 荷 比 建立 函数 关系 ， 就 得 到 一 张 质谱 图 。 四 极 质量 分 析 髓 通常 可 分 析 的 质量 范围 是 2500 一 4000u， 因 为 记录 的 是 盖 />， 而 不 是 多 肽 质量 本 身 ， 而 且 ESI 通常 产生 带 多 电荷 的 肽 离子 ， 所 以 ， 使 用 ESI 源 的 四 极 质量 分 析 器 能 用 来 分 析 远 远 超 出 其 质量 分 析 范 围 Me A it.

在 三 级 四 极 质谱 中 ， 第 一 级 Q1 和 第 三 级 Q3 四 极 杆 是 质量 过 滤器 ， 第 二 级 四 极 杆 Q2 仅 施加 射频 电压 ， 充 当 产 生 碎 片 离子 的 碰撞 室 ， 从 Q1 传送 来 的 肽 离子 在 碰撞 室内 经 重 的 惰性 气体 如 Ar AN, 的 碰撞 诱导 ， 产 生 正 离子 ， 这 一 HE (collision-induced dissociation, CID).

三 级 四 极 质谱 仪 有 S 种 工作 模式 :

(1) MS 模式 ”这 种 模式 用 于 分 析 未 解 离 的 离子 质量 。 扫 描 Q1，Q2 中 未 引入 裂解

气体 ，Q3 为 射频 电场 模式 。 也 可 以 使 Ql 处 于 射频 模式 ， 扫 描 Q3 电场 实现 质 量 测 定 。

(2) MS/MS 模式 〈 也 称 为 产物 离子 扫描 法 ，product ion scan) “在 一 个 给 定 的 时 间 点 ，Ql 设 定 为 仅 传输 某 一 选 定 质 荷 比 的 离子 ， 此 离子 进入 Q2 后 ， 经 碰撞 诱 导 解 离 ， 产 生 的 碎片 离子 通过 扫描 Q3 进行 检测 。 这 样 得 到 与 QI 选择 的 初始 肽 段 离 子 相 关 的 碎片 离子 质谱 图 。Q1l 选择 母 离 子 ， 在 Q2 内 进行 CID，Qa3 分 析 碎 片 离子 ， 这 一 分 析 过 程 不 断 循环 ， 用 以 选择 分 析 不 同 质量 的 肽 段 离 子 。 实 际 上 ， 某 些 仪器 如 TSQ 7000 (Finnigan, MAT, San Jose, CA) 可 以 设 定 程序 自 动 在 MS 和 MS/MS 模式 间 切 换 ， 将 MS 检测 到 的 离子 进行 CID 分 析 ， 并 记录 碎片 离子 的 谱 图 ， 整 个 过 程 不 需要 用 户 介 入 [Ducret et al., 1998; Stahl et al., 1996; ICL procedure on our web site (http://depts. washington. edu / ~ ruedilab/aebersold. html) ]。 这 一 过 程 称 为 数据 依赖 的 CID (data-depen- dent CID)。 产 物 离子 扫描 法 可 用 来 测定 肽 段 的 氨基 酸 序列 。 (3) 中 性 丢失 扫描 模式 (neutral loss scan mode) ”此 模式 中 Q1l Q3 的 电压 同步 扫描 ， 但 保持 一 个 特定 m/z 值 的 电压 差 (offset) 。Q2 是 碰撞 室 ，Ql 和 Q3 的 电压 差 值 与 Q2 内 碰撞 消除 的 一 个 特定 中 性 分 子 的 质量 一 致 。 因 此 ， 在 离子 混 合 物 中 ， 只 有 碰撞 裂解 后 能 丢失 这 一 特定 基 团 的 离子 才 会 被 Q3 传输 到 检测 器 。 例 如 ， 在 磷酸 肽 与 非 磷酸 肽 混合 物 中 ， 通 过 对 50 m/z 的 HPO "的 中 性 丢 失 扫 描 ， 可 以 检测 出 磷酸 肽 的 双 电 荷 峰 (Covey et wz.，1991)。 在 离子 被 传送 到 检测 器 时 ， 已 经 知道 Q1 和 Q3 上 各 自 施加 的 特定 电压 ， 所 以 可 以 确定 发 生 中 性 丢失 的 肽 段 质量 。

(4) 前 体 离 子 ( 母 离 子 ) 扫描 (precursor/parent ion scanning) ”此 模式 中 扫描 QI 电压 ，Q3 设 定 为 只 传输 某 一 特定 质 荷 比 离子 ，Q2 为 碰撞 室 。 与 中 性 丢失 扫描 相似 ， 前 体 离子 扫描 检测 离子 混合 物 中 在 Q2 碰撞 室 丢 失 特 定 基 团 的 离子 。 与 中 性 丢失 扫描 不 同 的 是 ， 前 体 离子 扫描 模式 直接 检测 断裂 的 基 团 RAF,

“HAE: 原文 有 误 ; 应 为 49 m/z 的 HaPO4。

ALE ”蛋白 质 鉴 定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 79 +

reporter ion) 。 检 测 器 检测 到 报告 离子 时 ， 已 知 Ql 的 电压 ， 所 以 可 以 确定 产生 这 一 特定 碎片 的 前 体 离 子 的 质量 。 因 此 前 体 离子 扫描 模式 被 用 来 检测 肽 混合 物 中 某 些 含有 特定 结构 特征 的 肽 段 。

(5) YEA CID (in-source CID) RAAT ESI 源 内 由 大 气压 气体 碰撞 产生 的 高 压 区 内 。 可 以 选择 碰撞 条 件 使 肽 链 骨 架 断 裂 (Katta et al., 1991) 或 使 一 些 相 对 不 稳定 的 基 团 如 磷酸 基 团 选择 性 断裂 (Huddleston et al .，1993)。 所 带电 和 荷 数 大 于 1 的 肽 段 离 子 更 容易 断裂 ， 因 为 在 这 些 离子 上 分 配 的 动能 远大 于 仅仅 将 这 些 离子 聚焦 到 Q1 分 析 器 所 需 的 动能 。 这 一 方法 提供 了 在 三 级 四 极 质谱 仪 中 实现 MS/MS/MS 分 析 的 机 会 ， 及 在 单 级 四 极 质 谱 仪 中 实现 MS/MS 分 析 的 机 会 (Loo et w.，1990)。 以 上 任 一 种 扫描 类 型 都 适用 于 源 内 CID 产生 的 离子 。

为 了 鉴定 蛋白 及 对 肽 段 从 头 测 序 ， 仪 器 通常 以 MS/MS 模式 运行 。 对 选择 离子 施加 的 碰撞 能 量 可 以 通过 改变 碰撞 气体 的 压力 而 变化 ,如 果 时 间 人 允许 ， 可 以 对 有 裂解 过 程 实现 很 好 的 控制 。 在 数据 依赖 操作 模式 (data-dependent operation) 中 ， 质 谱 仪 由 程序 控制 ， 对 MS 模式 检测 到 的 超过 一 预先 设 定 的 离子 流 冰 值 的 离子 自动 进行 碰撞 诱导 解 离 ， 碰 撞 Ae RAL 〈ramped)， 以 期 在 不 同 碰撞 能 量 下 得 到 的 谱 图 中 至 少 得 到 一 张 最 佳 裂 解 碎片 谱 (Stahl er ol .，1996)。 但 是 ， 当 样品 量 极 少 ， 样 品 溶液 通过 微量 或 纳 喷 (nano- spray) 装置 引入 源 内 ， 且 样品 未 脱盐 时 ， 得 所 质谱 图 的 化 学 背景 和 杂质 峰 占 据 主导 地 位 (Wilm and Mann，1996)。 因 此 ， 为 了 在 这 样 的 混合 物 中 找到 肽 段 离子 ， 质 谱 仪 可 以 前 体 离子 扫描 模式 运行 ， 将 Q3 分 析 器 设 定 为 86 m/z, SAR Leu WHRAR lle 的 WABF (immonium ion) 质量 ， 通 常 在 许多 肽 段 序列 中 都 存在 这 两 种 氨基 酸 (Wilm etal., 1996).

ESI- 离子 阱 质谱 仪 ”离子 阱 质谱 仪 是 一 种 串联 质谱 仪 ， 在 分 析 前 先 将 离子 聚集 ， 储存 。 离 子 阱 是 仪器 的 核心 部 分 ， 既 可 以 作为 质量 分 析 器 ， 又 可 以 作为 碰撞 室 。 四 极 离 子 阱 使 用 射频 方式 工作 的 四 极 杆 引导 离子 从 离子 源 进 入 离子 阱 。 离 子 阱 由 两 种 电极 构 成 ， 一 个 环形 电极 ， 两 个 端 盖 (end-cap) 电极 〈 图 $.2c)， 离 子 进出 离子 阱 都 经 过 端 盖 电极 上 的 小 孔 。 环 形 电 极 上 施加 的 高 射频 (RF) 电压 将 离子 捕获 在 其 产生 的 电场 中 ， 此 射频 电压 的 大 小 决定 了 被 捕获 离子 的 频率 及 运动 。 大 于 某 一 特定 m/z 值 的 离子 留 在 离子 阱 中 ， 被 残留 氨 气 碰撞 冷却 ， 使 离子 的 正弦 振 功夫 缩 ， 在 很 短 时 间 内 ， 运 动 轨道 由 大 变 小 。 通 过 线性 变化 (ramp) RF 电压， 同时 对 端 盖 电极 施 以 一 小 电压 ， 使 连续 质 荷 比 的 离子 共振 发 射 ， 得 到 完整 的 质谱 图 。 共 振 发 射 是 指 在 离子 阱 中 变 得 不 稳定 的 离子 被 发 射 到 端 盖 电极 的 同 轴 方 向 ， 穿 过 端 盖 电 极 并 被 电子 倍增 检测 器 的 转换 电极 检测 ， 转 换 电极 采用 离 轴 (off-axis) 位 置 ， 是 为 了 除去 中 性 物质 的 背景 (Jonscher and Yates, 1997; Schwartz and Jardine，1996 ) 。

通过 离子 捕获 和 离子 选择 发 射 的 过 程 ， 具 特定 质 荷 比 的 离子 可 以 从 离子 阱 中 分 离 出 来 。 如 果 这 一 离子 在 离子 阱 中 裂解 ， 而 且 碎 片 离子 也 被 共振 发 射 ， 就 得 到 了 MSV/MS 串 联 质谱 图 。 如 果 碎 片 离子 中 除 某 一 特定 质 荷 比 的 离子 外 ， 其 他 所 有 碎片 离子 均 被 共振 发 射 ， 这 一 雁 片 离子 可 以 重复 进行 裂解 /共振 发 射 过 程 ， 这 样 就 得 到 了 多 级 串联 质谱 (MS?)。 曾 有 文献 报告 做 到 MS” (Louris et al., 1990), MMS 已 成 为 常规 实验 ， 特 别 是 在 糖 肽 的 结构 分 析 中 〈Reinhold et wz .，1995)。 在 离子 阱 中 对 某 一 特定 m/z 比值 离

- 80 - 蛋白 质 组 学

子 的 分 离 和 裂解 包括 : 共振 发 射 所 有 质 荷 比 大 于 和 小 于 这 一 比值 的 所 有 离子 ， 这 样 在 离 子 阱 中 只 剩 下 选 定 m/z 比值 的 离子 (被 分 离 的 离子 )， 这 时 改变 电极 电压 使 离子 能 量 增加 ， 这 样 离子 就 会 与 残留 的 中 性 气体 (He) 碰撞 而 裂解 ， 产 生 的 碎片 离子 用 上 文 所 述 的 扫描 方式 测定 。 被 捕获 离子 上 所 加 的 能 量 大 小 可 通过 改变 参数 而 调节 ， 在 某 些 仪器 中 这 一 参数 被 称 为 相对 碰撞 能 量 (relative collision energy，RCE)。 如 上 文 PSD-MALDI- MS 所 述 ， 单 电荷 离子 的 裂解 比 双 电荷 离子 裂解 需要 更 多 的 能 量 。 在 某 些 离子 阱 实验 中 ，RCE 可 以 手动 调节 产生 非常 好 的 效果 (Davis and Lee，1997)。 离 子 阱 质谱 仪 的 其 他 一 些 可 以 改变 并 影响 仪器 性 能 的 参数 包括 在 任何 一 次 捕获 中 允许 进入 离子 阱 的 离子 数 目 ， 以 及 这 种 捕获 超过 多 少 次 后 信号 将 被 平均 以 增加 信 噪 比 。 如 果 有 太 多 m/z 比值 非 常 接 近 的 离子 被 捕获 ， 会 观察 到 被 称 为 空间 电荷 效应 (space charging) 的 现象 。 由 于 m/z 比值 非常 接近 的 离子 之 间 运 动 轨道 相互 影响 ， 所 以 空间 电荷 效应 降低 了 实验 测量 质量 的 精确 度 。 因 此 在 设置 参数 时 必须 注意 不 会 对 数据 起 负面 影响 (Courchesne et al., 1998)。 商 业 化 的 离子 阱 质谱 仪 的 仪器 控制 软件 支持 数据 依赖 裂解 (data-dependent frag- mentation) 功能 ， 因 此 非常 适用 于 LC-MS/MS 分 析 。

3. 以 质谱 为 基础 的 相关 鉴定 策略 3.1 肽 质量 检索 (peptide-mass searching)

MACDI-MS 质谱 仪 商品 化 后 ， 表 现 出 其 分 析 混 合 物 中 肽 段 质量 的 能 力 ， 尤 其 是 对 凝 胶 分 离 蛋 白质 的 酶 切 肽 段 的 分 析 能 力 ， 很 快 有 许多 研究 小 组 开始 研发 蛋白 质 鉴定 的 软 件 算法 ， 这 些 算法 都 是 基于 用 实验 测 得 的 肽 质量 与 蛋白 序列 数据 库 中 蛋白质 的 肽 质量 计 算 值 进行 相关 性 分 析 (图 $.3) (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Pappin et al., 1993; Yates et ; .，1993)。 这 一 途径 已 经 成 为 凝 胶 分 离 蛋白 质 鉴

实验 方法 计算 方法 完整 蛋白 质 〈 如 凝 胶 分 离 或 色谱 纯化 蛋白 质 ? 蛋白 质 序列 数据 库 〈+ 核 酸 序列 翻译 数据 库 )

" | 肽 质量 检索 : (a) 计算 数据 库 中 每 一 个 序列 在 给 定 的 酶 切 条 件 下 产生 的 肽 段 质量 数 。 肽 混合 物 (b) 实验 测 得 的 肽 质量 数 与 计算 值 进行 相关 性 比较 。 (c) 将 相关 性 最 好 的 结果 排序 ， 或 仅 列 出 有 显著 相关 的 结果 { (匹配 的 肽 段 数目 )。 未 解析 碎片 离子 检索 : 质谱 测定 肽 质量 (a) 计算 数据 库 中 每 一 个 序列 在 给 定 的 酶 切 条 件 下 产生 的 (MALDI-MS, ESI-MS) 肽 段 质量 数 。 人 b) 找 出 每 一 个 与 实验 测 得 质量 数 一 致 的 肽 段 ， 产 生 其 理论 碎片 离子 列表 。 选择 肽 段 裂 解 (c) 实验 测 得 的 碎片 离子 质量 数 与 理论 碎片 离子 质量 数 计 (PSD-MALDI-MS, ESI-MS/MS) 算 值 进行 相关 性 比较 。 (d) 将 匹配 最 好 的 结果 排序 , 或 仅 列 出 有 显著 相关 的 结果 ( 匹 配 的 离子 数目 )。

图 5$.3 质谱 鉴定 蛋白 质

第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 81 .

定 的 最 常用 手段 (Aebersold and Patterson，1998 ) 。

鉴 鉴定 数据 库 中 已 有 序列 的 蛋白 质 的 算法 基于 以 下 一 些 理念 。

(1) 肽 段 是 由 切 点 专 一 的 试剂 水 解 蛋 白质 产生 的 ， 通 常用 已 知 切 点 专 一 的 蛋 白 酶 。

(2) 这 些 肽 段 的 质量 由 MALDI-MS 或 ESI-MS 精确 测定 。

(3) 计算 蛋白 序列 数据 库 中 的 每 一 序列 被 实验 中 所 用 水 解 试 剂 水 解 后 产生 的 理论 肽

段 的 质量 。

(4) 用 试验 得 到 的 肽 质量 与 数据 库 中 的 肽 质量 计算 值 相 匹 配 ， 计 算得 分 或 排序 值 。

许多 做 开创 性 工作 的 小 组 及 后 来 加 入 进来 的 研究 小 组 已 将 他 们 的 检索 软件 放 在 因 特 网 上 供 大 家 使 用 ， 并 有 例子 予以 说 明 ( 见 表 $.1)。 这 种 检索 途径 有 一 个 明显 的 限制 ， 就 是 被 鉴定 的 蛋白 质 必 须 已 经 在 序列 数据 库 (翻译 的 核酸 序列 或 蛋白 序列 数据 库 ) 中 存 在 。 因 此 ， 这 一 手段 非常 适用 那些 基因 特性 非常 清楚 的 物种 ， 特 别 是 全 基因 组 已 知 的 物 种 〈 例 如 见 TIGR 数据 库 ，http://www'.tigr.org/tdb)， 亦 适用 那些 已 经 建立 详尽 的 蛋 白质 或 cDNA 序列 数据 库 的 物种 。 肽 质量 检索 鉴定 蛋白 质 方法 的 依据 是 实验 中 获得 的 蛋 白质 的 多 个 肽 段 的 质量 数据 与 同一 蛋白 质 肽 段 质 量 计算 值 之 间 的 相关 性 。 因 此 ， 这 一 技 术 既 不 适用 于 检索 表达 序列 标 鉴 数据 库 (EST) 翻译 序列 ， 也 不 适用 于 鉴定 2 个 以 上 的 蛋白 混合 物 。 但 是 ， 对 某 些 蛋白 质 可 进行 种 属 间 鉴 定 ， 已 经 有 了 为 这 一 特殊 目的 而 编写 的 程序 (Wilkins er al., 1998). EST 仅 代表 蛋白 编码 序列 的 一 部 分 ， 其 长 度 不 足以 产 生 供 肽 质量 鉴定 实验 所 需 的 足够 的 肽 数目 。 如 果 水 解 蛋白 质 混合 物 ， 只 产生 其 中 部 分 特 定 肽 质量 的 蛋白 质 的 鉴定 就 不 明显 。 但 如 果 每 一 个 观察 到 的 肽 段 都 能 与 序列 数据 库 中 的 某 一 蛋白 精确 相关 ， 混 合 物 中 蛋白 质 的 鉴定 仍然 可 行 。 方 法 是 从 测 得 的 肽 质量 中 去 掉 与 已 被 鉴定 的 蛋白 质 相 关 的 所 有 肽 段 ， 用 剩余 的 质量 数 检索 数据 库 ， 将 这 一 步骤 重复 循环 进行 。 但 是 ， 由 于 下 面 将 要 提 到 的 一 些 原 因 ， 所 有 检测 到 的 肽 质量 都 与 蛋白 质 的 序列 相

表 5.1 用 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 的 检索 工具 网 址 资源 网 址 特点 CBRG, ETH-Zurich, Switzerland 。 cbrg.inf. ethz. ch/MassSearch. html 肽 质量 检索 软件 EMBL，Heidelberg, Germany www. mann. embl-heidelberg. de/Ser- “ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件

vices/PeptideSearch/Pep- tideSearchlntro. html

ExPasy www. expasy. ch/tools/ # proteome Ak AE He KE

Mascot www. matrix-science. com/cgi/index. pl? AM BAR HBT RARE page = /home. html

Rockefeller University New York, prowl. rockefeller. edu/ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件

USA

SEQNET, Daresbury, UK www. seqnet. dl. ac. uk/ 肽 质量 和 碎片 离子 检索 软件 Bioinformatics/ welapp/ mowse

University of California，San prospector. ucsf .edu 肽 质量 检索 软件 (MS-Fit) 和 碎片 离子

Francsico, USA 检索 软件 (MS-Tag)

University of Washington thompson. mbt. washington. edu/sequest/ ”碎片 离子 检索 软件 SEQUEST 应 用 指

导

ee 蛋白 质 组 学

符 的 情况 很 少 发 生 ， 这 不 仅 使 混合 物 中 各 组 分 的 鉴定 变 得 复杂 ， 还 使 单一 的 纯 蛋 白质 的 鉴定 也 复杂 化 ， 因 此 ， 了 解 那些 未 匹配 的 肽 质量 数 的 性 质 非 常 重要 。 下 面 将 讲述 与 匹配 EMS BAKA KRW HR (spurious masses) 存在 的 可 能 原因 (Jensen et al., 1997, 1998; Patterson and Abersold, 1995). (1) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 是 由 于 翻译 后 修饰 或 人 为 修饰 及 翻译 后 加 工 (如 N 或 C 末端 加 工 ) 产生 了 另外 的 质量 。 尽 管 某 些 质量 的 差异 可 能 与 这 些 修饰 情况 相 符 ， 但 除非 经 实验 证 明 ， 和 否则 仅仅 是 假设 。 (2) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 存在 非特 异性 的 和 蛋 日 水 解 ， 或 有 杂 有 蛋白 酶 存在 。 通 过 排 除 酶 切 位 点 专 一 的 假设 ， 确 定 候选 蛋白 质 是 否 会 产生 具有 那些 质量 数 的 肽 段 ， 这 样 可 以 接受 这 种 可 能 性 。 (3) 蛋白 质 被 正确 鉴定 ， 但 有 部 分 杂质 蛋白 质 混在 其 中 ， 如 2-DE 胶 上 的 蛋 自 点 可 能 由 多 个 蛋 昌 质 组 成 。 如 果 有 足够 多 的 未 匹配 肽 质量 数 ， 就 可 以 用 这 些 数据 单 独 进 行 肽 质量 检索 ， 以 证 实 存 在 另外 的 蛋白 质 。 当 然 要 做 酶 自 切 的 对 照 实验 ， 以 鉴别 所 有 的 酶 和 目 切 产物 。 (4) 被 鉴定 的 蛋白 质 或 许 是 数据 库 中 已 登录 和 旱 和 白 的 同 源 序 列 ， 或 者 是 其 序列 的 剪 切 变异 体 。 某 些 检索 程序 允许 实现 跨 种 间 检 索 ， 如 果 能 得 到 另外 确实 的 数据 ， 这 一 方法 还 是 很 有 用 的 。 因 为 从 基因 特征 不 清楚 的 种 属 得 到 的 蛋白 质 也 许可 以 在 基因 特征 清楚 的 种 属 的 蛋白 序列 库 中 得 到 匹配 鉴定 (Cordwell et al., 1995). (5) 蛋白 质 的 鉴定 结果 是 假 阳性 。 如 果 没 有 其 他 数据 ， 特 别 是 实验 数据 的 质量 数 精 确 度 不 高 时 ， 这 一 糟糕 的 结果 很 难 被 证 实 或 证 伪 。 如 果 所 用 检索 程序 是 用 鉴定 结果 的 得 分 值 排序 ， 而 所 得 检索 结果 得 分 值 又 比较 低 时 ， 该 结果 的 证 实 就 更 加 困难 了 。 在 某 些 例子 中 ， 通 过 比较 检索 结果 中 排序 第 一 和 第 二 位 〈 及 后 面 ) 的 得 分 值 之 差 ， 得 到 进一步 确认 。 此 蛋白质 也 可 能 在 蛋白 数据 库 中 不 存在 。

用 肽 质量 数据 鉴定 蛋白 质 所 控制 的 实验 参数 中 ， 最 具 决 定性 的 参数 是 肽 质量 测量 的 精确 度 (Fenyo et al., 1998; Jensen et al .，1996a，1997)。 质 量 精 确 度 越 高 ， 结 果 判 定 越 可 信 。 另 一 决定 性 参数 是 所 用 酶 (或 化 学 试剂 ) 的 专 一 性 。 酶 越 纯 ， 专 一 性 越 高 ， 检索 结果 越 可 信 。 最 常用 的 酶 是 胰 蛋 白 酶 。 但 是 要 注意 的 是 ， 即 便 是 高 纯度 的 胰 蛋 白 酶 也 会 在 非 Lys 或 Arg 的 氨基 酸 残 基 C 端 酶 切 〈 其 后 不 是 Pro)。 所 有 蛋白酶 都 存在 的 问 题 是 ， 如 果 和 蛋白 序 列 中 有 2 个 或 更 多 个 连续 氨基 酸 残 基 是 酶 的 切 点 ， 蛋 白 酶 会 对 底 物 酶 切 不 完全 ， 留 下 漏 切 的 位 点 和 不 完全 的 末端 ， 许 多 检索 程序 把 漏 切 的 位 点 数目 作为 输入 的 一 个 检索 参数 。 内 肽 酶 LysC 是 另 一 个 具 高 度 专 一 性 的 酶 ， 此 酶 产生 的 自 切 产物 比 胰 蛋白 酶 少 ， 但 同样 也 会 有 漏 切 位 点 ， 也 会 在 非 Lys 位 点 酶 切 (其 后 不 是 Pro)。 同 样 也 要 注意 ， 不 是 所 有 的 蛋白 质 ， 不 论 是 否 经 凝 胶 分 离 ， 都 适用 于 胰 蛋 日 酶 或 其 他 专 一 性 重 白 酶 切 ， 但 是 ， 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 ， 由 于 其 处 于 变性 状态 ， 通 常 酶 切 十 分 有 效 。

蛋白 酶 的 性 能 很 难 改变 ， 与 之 不 同 的 是 肽 质量 测量 精确 度 依赖 于 所 使 用 的 仪 右 及 其 操作 。 最 佳 的 肽 质量 检索 应 该 用 内 标 校 正 的 单 同位 素质 量 。 在 MALDI-MS 质谱 仪 中 ， 通常 只 有 安装 时 间 延 迟 聚 焦 / 延 迟 提取 (〈 见 前 文 ) 的 仪器 ， 能 够 达到 肽 质量 的 同位 素 分 布 分 辨 率 。 这 种 仪器 达到 Sppm 的 质量 准确 度 ， 可 确定 单 同位 素质 量 ， 并 在 肽 质量 检索 程序 中 设立 非常 小 的 质量 误差 ， 这 样 高 精度 的 数据 减少 了 错误 匹配 的 可 能 性 (Jensen et

第 五 章 ，” 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 83 -

al., 1996a, 1997; Takach et al .，1997)。 如 果 没 有 安装 延迟 提取 选 件 ， 质 谱 仪 应 该 用 内 标 校 正 ， 且 内 标 质 量 范围 应 包含 被 检测 肽 段 的 质量 。 没 有 延迟 提取 装置 的 仪器 不 能 分 辩 同 位 素 峰 ， 仅 得 到 平均 分 子 质 量 。 单 同位 素质 量 比 平均 分 子 质量 更 精确 ， 因 为 单 同位 素质 量 是 由 单一 同位 素 C12 决定 的 ， 而 平均 质量 是 由 C12 和 不 同 数目 的 同位 素 Cl13 质 量 的 平均 值 决定 的 〈 其 他 元 素 的 同位 素 相 似 )。

为 了 进一步 增加 肽 质量 的 可 信和 度 ， 开 发 了 “ 正 交 法 ”对 单个 肽 段 的 氨基 酸 序列 或 组 成 提供 额外 的 ， 或 限制 性 的 信息 。 这 种 方法 中 ， 样 品 除 用 于 原始 质量 测量 外 ， 还 分 出 一 部 分 用 于 正 交 分 析 。 正 交 分 析 信息 限制 了 用 肽 质量 在 数据 库 中 检索 鉴定 蛋 白 质 产生 的 多 个 肽 段 与 同一 质量 匹配 的 情况 。 正 交 方 法 可 分 为 以 下 几 类 。

(1) 特异 位 点 的 化 学 修饰 ” 甲 酯 化 ， 在 每 个 羧基 基 团 上 增加 14 个 质量 单位 [如 酸 性 氨基 酸 残 基 (Asp, Glu ) 侧 链 或 肽 的 C 末 端 (Pappin et al., 1995)]; BAIL RM, CRAM EM I 126 个 质量 单位 (Craig et al., 1995); 及 用 1:1 混合 的 乙酰 氨 / 所 代 乙酰 氨 在 每 个 半 胱 氨 残 基 上 进行 同位 素 标 记 (Sechi and Chait, 1998 ) 。

(2) 测定 肽 段 的 部 分 氨基 酸 组 成 ”有 两 种 方法 : 如 果 肽 段 中 的 可 交换 氢 在 所 溶液 中 被 交换 ， 那 么 每 一 个 氨基 酸 有 其 特定 的 交换 数目 ， 每 个 残 基 为 0 至 5 个 质量 单 位 。 因 此 ， 肽 质量 增加 的 总 数 就 反映 了 肽 的 氨基 酸 组 成 (James et al., 1994). 肽 段 部 分 氨基 酸 组 成 也 可 通过 鉴别 MS/MS 质谱 图 中 的 所 离子 (immonium ion) 峰 来 确定 。

(3) SEN 末端 氨基 酸 残 基 ”混合物 中 肽 段 的 N 末端 氨基 酸 确定 可 用 化 学 法 ， 一 步 Edman 反应 (Jensen et al., 1996b); 或 酶 法 ， 用 氨 肽 酶 除去 末端 氨基 酸 残 基 (Woods et al., 1995).

(4) 肽 内 不 同 酶 切 位 点 的 鉴定 ”为 了 确定 段 肽 中 一 个 特定 残 基 的 存在 及 相对 位 置 ， 有 人 和 采用 酶 切 位 点 不 同 的 酶 对 一 级 水 解 产 物 进 行 二 次 水 解 (次 级 水 解 ) (Pap- pin et al .，1995)。 同 样 也 可 把 一 份 样品 分 为 两 等 分 用 切 点 不 同 的 酶 平行 水 解 (James et al., 1994).

(5) Be CHa AN 末端 残 基 鉴 定 相 似 ， 用 羚 肽 酶 除去 C 末 端 氨基 酸 残 基 ， 某 些 情况 下 ， 会 有 一 个 或 多 个 额外 的 残 基 被 水 解 了 (Patterson et al., 1995; Woods et wl .，1995)。 但 是 当 使 用 高 度 专 一 性 的 酶 时 ， 除 去 一 个 残 基 不 能 提供 太 多 信息 。

Fenyo et al. (1998) 做 了 出 色 的 研究 来 评价 正 交 信息 在 肽 质量 检索 中 的 好 处 ， 检 索

中 使 用 的 数据 库 是 酵母 全 基因 组 数据 库 ， 读 者 可 以 参考 这 篇 文章 以 了 解 此 方法 的 优点 的 详细 内 容 。

3.2 未 解析 碎片 离子 的 检索

正如 数据 库 中 可 以 检索 肽 质量 一 样 ， 数 据 库 同样 可 以 检索 一 个 单个 肽 段 及 其 碎片 离 子 的 质量 。 肽 段 质量 同 它 的 碎片 离子 质量 一 起 提供 了 非常 具有 鉴别 力 的 判断 标准 ， 可 用 于 在 序列 数据 库 中 检索 ， 包 括 由 表达 序列 标签 翻译 的 序列 数据 库 (图 $.3)。 这 一 手段 已 被 广泛 用 于 凝 胶 分 离 蛋 白质 酶 水 解 后 产生 的 肽 段 鉴定 (Aebersold and Patterson,

- 84- 蛋白 质 组 学

1998; Lamond and Mann, 1997; Patterson，1997)。 肽 段 通常 用 上 文 所 述 的 一 些 方法 ， 在 质谱 仪 气相 中 被 诱导 产生 碎片 离子 ， 例 如 PSD-MALDI-MS， 或 三 级 四 极 质谱 及 离子 BRAY CID。 在 这 些 仪器 中 ， 肽 段 离 子 断 裂 的 方式 具有 序列 特异 性 ， 主 要 是 沿 肽 骨架 的 肽 键 断 裂 ， 见 图 $.4 所 示 。 如 果 肽 离子 的 正 电 荷 保 留 在 碎片 离子 的 N 末端 ， 此 离子 被 称 为 ! 系列 离子 ， 用 下 标 数字 代表 这 一 碎片 离子 中 的 氨基 酸 残 基数 目 ， 从 N 末端 起 为 1。 因 此 ，2 离子 代表 C 末端 缺失 ，N 末端 完整 的 碎片 离子 。 如 果 电 荷 保留 在 C 末端 ， 离子 被 称 为 y 系列 离子 (与 六 系列 离子 一 样 有 下 标 数字 ， 但 从 C 末端 数 起 )。 因 此 > 离 子 代表 N 末端 缺失 ，C 末端 完整 的 碎片 离子 (Bieman 命名 法 ，1990)。CID 谱 图 是 由 几 千 种 独立 的 裂解 过 程 产生 数据 的 混合 图 ， 即 系列 和 >y 系列 离子 的 混合 图 。 谱 图 中 也 存 在 一 些 其 他 离子 : 氨基酸 侧 链 (Gln, Lys, Arg) 中 性 丢失 氨 ， 产 生 少 17 个 质量 数 的 离 子 ; 氨基 酸 侧 链 (Ser, Thr, Asp, Glu) 中 性 丢失 H2O 产生 少 18 个 质量 单位 的 离子 ; 以 及 从 五 系列 离子 中 性 丢失 COMED 28 个 质量 单位 的 离子 ， 即 a 系列 离子 ; 另外 ， 如 果 一 个 肽 段 离 子 发 生 多 次 裂解 ， 就 会 产生 中 间 雁 片 ， 包 括 酰 基 离子 (acyl， 由 至 少 2 个 氨基 酸 残 基 组 成 ， 见 图 5.4b) AAAS ( 见 图 5.4c 和 表 5.2)。 亚 所 离子 代表 单个 氢 基 酸 的 质量 ， 因 此 提供 了 肽 段 的 部 分 氨基 酸 组 成 。 并 不 是 所 有 的 肽 键 在 CID 条 件 下 都 具有 相同 的 断裂 倾向 ， 在 同一 张 MS/MS 谱 图 中 产生 的 碎片 离子 的 强度 也 有 显著 差异 。 RR EMRE EAB (prolyl) 键 上 ， 通 常 产 生 CID 谱 图 中 的 最 强 离子 峰 。 另 外 ， Rae RAR (prolyl) 键 断 裂 还 导致 产生 了 最 常见 的 中 间 和 碎片 酰基 离子 (acyl)， 并 从 有 睛 氨 酸 残 基 延 伸 到 C 未 端 。 |

(a) NA al bi ae be as bs

Ri 9 Re O ag

HoN-CHICIN-CHICIN-CH

H

CAWRF y yp (b)

ry 工 一 < O=9O 2 工 一 之 GQ=7J a oe 〇 O nN aks

Ri tact Ri Re (b) H2N-CH-C-N-CH-C=O + H

RiRz-28 (a) H)N-CH-

(c)

图 5.4 常见 的 带 正 电 荷 的 碎片 离子 命名 (a)N 末端 和 C 末 端 离子 ;(b) 中 间 酰 基 离子 (internal acyl ions);(c) 中 间 亚 氨 离 子 (internal immonium ions) 。

ALE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 85 .

表 5.2 20 种 常见 氨基 酸 的 残 基 和 亚 氨 离子 质量 ”

氨基 酸 名 称 3 字母 简称 残 基质 量 " WAR i? AAR Ala (A) 71 44

RABE Asn (N) 114 87

天 冬 氢 酸 Asp (D) 115 88

MAR Arg (R) 156 129, 112, 100, 87, 70, 43° RAR Cys (C) 103 76

BK Gln (Q) 128 101 (w/o 84)

BR Glu (E) 129 102

HAR Gly (G) 57 30

AAR His (H) 137 110

FEAR lle (1) 113 86

AR Leu (L) 113 86

MAR Lys (K) 128 101, 84, 129°

甲 硫 氨 酸 Met (M) 131 104

AAR Phe (F) 147 120

i AR Pro (P) 97 70 (w/o 112, 100 and 87) 丝氨酸 Ser (S) 87 60

HAR Thr (T) 101 74

AR Trp (W) 186 159

MAR Tyr (Y) 163 136

SAR Val (V) 99 72

“此 值 来 自 于 Jardine (1990); "给 出 的 所 有 质量 值 均 为 整数 ， 划 线 的 值 表明 其 丰 度 较 高 ; w/o= without 无 ;“ 精 氨 酸 和 赖 氨 酸 显示 有 多 个 亚 氨 离 子 ， 均 耶 以 列 出 。

如 上 所 述 ， 肽 段 裂 解 可 由 PSD-MALDI-MS 产生 ， 也 可 由 三 级 四 极 或 离子 阱 质谱 的 CID 诱导 产生 。 这 三 种 方法 中 ， 由 PSD-MALDIMS 导致 的 裂解 最 不 易 控 制 ， 在 PSD- MALDIMS 中 仅 有 的 可 变 参 数 是 激光 通 量 和 基质 。 另 外 ， 在 MALDI-MS 中 只 产生 单 电 荷 离子 ， 与 电 喷雾 离子 化 产生 的 双 电 荷 和 三 电荷 离子 相 比 ， 需 要 更 多 的 能 量 使 其 断裂 。 因此 PSD-MALDI-MS 的 成 功率 很 低 ， 在 很 多 情况 下 ， 同 一 样品 的 PSD 谱 图 质量 比 ESI 仪器 的 CID 分 析 谱 图 差 很 多 。

碎片 离子 谱 图 包含 有 重复 的 信息 ， 例 如 重 和 至 的 上 和 >y 系列 离子 以 及 同一 肽 段 的 多 个 中 间 离 子 。 这 种 重复 使 碎片 离子 谱 成 为 极 丰 富 的 序列 特异 信息 来 源 ， 但 也 使 序列 的 解析 更 加 复杂 ， 因 为 通常 不 能 直接 判断 某 一 离子 归属 于 哪 一 种 离子 系列 。 除 了 人 工 解 析 碎 片 离子 谱 (在 下 文 的 从 头 测序 中 要 讲 到 ) 外 ， 还 有 两 种 基本 检索 手段 用 于 匹配 数据 库 中 序 列 产生 的 碎片 离子 谱 。 第 一 种 方法 依靠 人 工 解 析 部 分 谱 图 来 鉴别 某 一 特定 系列 (2 或 y) 离子 的 连续 离子 元 素 (例如 鉴别 出 相互 之 间 相 差 一 个 氨基 酸 残 基质 量 的 碎片 离子 )， 解析 出 部 分 序列 信息 ， 再 结合 以 下 参数 : @ 鉴 定 出 的 系列 中 第 一 个 离子 的 质量 数 ; @ 肽 段 质量 与 最 后 一 个 离子 质量 之 差 (这 两 个 质量 数 限 制 了 此 序列 两 端 未 知 残 基 的 总 质量 ); 图 此 完整 肽 段 的 质量 ; @@ 所 用 蛋白 水 解 酶 的 酶 切 特 性 (在 N 端 、C 端 都 切 还 是 只 切 一 端 )。 这 五 种 信息 组 成 了 肽 序列 标签 “PST” (peptide sequence tag, PST) (Mann and Wilm，1994)。 在 序列 数据 库 中 可 以 检索 出 符合 PST 各 元 素 内 容 的 肽 序列 。 第 二 种 类 型 的 碎片 离子 检索 程序 是 由 Yates 及 其 合作 者 开发 的 (Eng et al., 1994), BAIEM AR

“fia 蛋白 质 组 学

:解析 的 碎片 离子 信息 检索 的 程序 ， 称 为 SEQUEST。 其 检索 手段 首先 是 在 数据 库 中 的 每 一 个 序列 中 寻找 与 实验 测 得 肽 离子 质量 一 致 的 肽 段 (在 一 定 误差 范围 以 内 )， 肽 段 质量 计算 值 是 其 连续 氨基 酸 质量 之 和 ， 在 检索 时 如 有 必要 ， 还 要 利用 蛋白 酶 的 酶 切 位 点 特性 言 息 。 对 检索 到 的 每 一 个 候选 肽 ， 程 序 计算 出 其 在 相同 CID 实验 条 件 下 预期 产生 的 碎 片 离子 质量 数 。 然 后 用 簇 分 析 算 法 (cluster-analysis algorithms) 将 前 500 个 计算 值 与 实 验 测 得 的 碎片 离子 谱 比 较 。 每 一 个 比较 结果 都 有 一 个 得 分 值 ， 报 告 出 得 分 最 高 的 结果 ， 如 果 得 分 值 有 显著 性 意义 ， 则 蛋 晶 质 鉴定 成 功 。 此 方法 的 鉴定 基础 是 未 经 任何 解析 的 肽 段 碎片 离子 质谱 图 。 在 数据 依赖 的 〈data-dependent) LC-MS/MS 分 析 中 可 以 自动 化 地 应 用 这 一 技术 。 分 析 过 程 中 ， 肽 段 经 反 相 HPLC 分 离 ， 电 喷雾 进入 联机 质谱 仪 ， 此 质 谱 仪 可 进行 数据 依赖 的 MS/MS 分 析 ， 即 将 离子 流 超过 一 定 阔 值 的 所 有 离子 打 碎 进行 MS/MS 分 析 ， 并 记录 所 有 的 CID 谱 ， 自 动 提交 检索 。

这 种 自动 化 手段 有 许多 优点 ，Patterson 和 Aebersold (Patterson and Aebersold, 1995) 曾经 综述 如 下 :

(1) 复杂 的 蛋 白 质 混 合 物 可 以 被 逐个 鉴定 ， 因 为 每 一 个 做 MS/MS 分 析 的 肽 段 产生 的 碎片 离子 数据 都 独立 进入 数据 库 检 索 (McCormark et al., 1997).

(2) 在 这 种 类 型 的 分 析 中 ， 来 自 于 每 一 个 肽 段 的 碎片 离子 谱 都 代表 一 个 独立 的 数据 库 检索 。 如 果 一 个 单一 的 蛋白 质 被 酶 解 ， 蛋 白质 鉴定 结论 基本 上 能 够 自动 确 定 。 因 为 在 多 肽 段 检 索 结 果 中 ， 应 该 是 同一 个 蛋白 位 于 最 高 排 位 (Ducret et al., 1998).

(3) 如 上 所 述 ， 这 一 方法 的 自动 化 程度 高 (Yates et al., 1995b).

(4) 通过 指导 程序 可 以 预测 某 一 特定 残 基 上 的 特定 修饰 ， 此 方法 适用 于 寻找 有 特定 翻译 后 修饰 的 肽 段 ， 同 样 可 以 鉴定 产生 这 一 翻译 后 修饰 肽 段 的 蛋白 质 (Yates et al., 1995a, 1995b).

(5) 以 上 这 些 研究 者 及 其 他 研究 者 开发 的 蛋白 质 鉴定 资源 的 网 址 见 表 1。

4. 用 质谱 数据 对 肽 段 从 头 测 序 (de novo sequencing)

前 面 两 部 分 已 经 讲述 了 利用 质谱 或 串联 质谱 数据 鉴定 蛋白 质 的 相关 手段 。 这 些 方法 适用 于 鉴定 那些 数据 库 中 已 有 其 序列 的 蛋白 质 。 用 MS 和 MS/MS 方法 从 头 测序 的 方法 已 经 开发 出 来 。 单 级 质谱 测序 是 分 析 肽 段 的 阶梯 序列 ， 即 相 邻 肽 段 间 相差 一 个 氨基 酸 残 基 ， 用 质谱 分 析 肽 阶梯 ， 通 常用 MALDI-TOF-MS 分 析 。MS/MS 测序 用 的 是 上 文 所 述 用 于 数据 库 检 索 的 CID 谱 ， 但 碎片 离子 由 人 工 完全 解析 。

用 于 MS 序列 分 析 的 肽 阶梯 是 由 化 学 或 酶 法 降解 肽 段 产 生 ， 由 C 末端 或 N 末端 断 Be WE N 末端 序列 的 化 学 方法 应 用 Edman 化 学 反应 ， 用 MALDI-MS 读 出 产生 的 变 短 的 肽 。 这 一 方法 通常 被 称 为 “阶梯 测序 "”。 在 这 种 方法 上 发 展 了 两 种 变化 方式 。 第 一 种 方法 是 在 每 一 测序 循环 开始 时 ， 在 多 肽 /蛋白 质 底 物 内 加 Edman 试剂 。 每 一 个 循环 中 有 一 小 部 分 的 底 物 被 N 末端 封闭 ， 末 端 封闭 后 的 肽 在 下 一 个 循环 中 不 会 参加 反应 ， 这 样 就 产生 了 序列 阶梯 。 最 终 反 应 产物 混合 物 经 MALDLMS 分 析 ， 其 质量 数 之 差 反 映 了 和 氢 基 酸 残 基 的 质量 数 (Chait et al., 1993; Wang et wL .，1994)。 第 二 种 方法 ， 也 称 为 “nested peptide sequencing”， 是 在 每 一 个 Edman 降解 循环 中 多 次 加 入 多 肽 /蛋白 质 底 物 。

PRE ”和 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 87:

在 此 法 中 加 入 过 量 易 挥发 的 Edman 试剂 以 使 反应 完全 ， 每 一 循环 中 的 过 量 试剂 可 通过 蒸发 被 除去 。 经 MALDI-MS 分 析 得 到 肽 序列 阶梯 ， 实 现 阶 梯 测 序 (Bartlet-Jones et al., 1994)。 这 两 种 方法 都 需要 底 物 蛋 白质 为 自由 N 末端 ， 并 且 不 能 分 辩 同 质 异 核 氨基 酸 残 基 亮 氢 酸 和 蜡 亮 氨 酸 。 谷 所 酰胺 PALME 128.13) MMAR ( 残 基质 量 128.17)， 在 CID 谱 中 很 难 分 辨 但 在 这 两 种 方法 中 可 轻易 分 辨 。 因 为 赖 氨 酸 侧 链 的 氨基 会 被 反应 试 剂 修饰 。 理 论 上 讲 ， 这 两 种 方法 都 能 分 析 肽 混合 物 ， 只 要 肽 段 之 间 质 量 差 异 明显 ， 不 会 与 降解 产物 质量 重 亚 (Wang et ol .，1994)。 除 了 逐步 化 学 降解 法 ， 氨 肽 酶 和 羧 肽 酶 也 可 以 截 短 肽 段 产 生 肽 阶梯 序列 。 此 方法 的 好 处 是 可 以 将 很 少量 的 起 始 反应 物 直 接 放 在 MALDI 样品 靶 的 表面 反应 ， 只 要 加 入 基质 就 可 以 终止 反应 (Patterson et al., 1995; Woods et ol.，1995)。 通 过 控制 反应 时 间 可 以 读 出 较 长 的 序列 ， 此 方法 不 能 分 辨 Gln 和 Lys & Ile 和 Leu.

如 果 CID 能 产生 高 质量 的 谱 ， 例 如 谱 图 含有 完整 的 > 和 2 系列 离子 ， 那 么 ， 通 过 对 碎片 离子 的 从 头 解析 可 以 确定 肽 段 的 序列 ， 可 从 Yates 的 文章 了 解 其 概要 (Yates et al., 1994), {Aéé, HRPM > 和 2 离子 的 判断 具有 很 低 的 置信 度 ， 使 得 读 出 最 终 序 列 很 困难 。 使 CID 谱 图 解析 变 得 复杂 的 主要 因素 包括 四 碎片 离子 丢失 ， 如 产生 不 完整 的 离 子 系列 ;四 将 观察 到 的 信号 归属 为 某 一 特定 离子 系列 较 困 难 。 通 过 在 酶 切 过 程 中 对 C 末端 离子 的 特异 性 同位 素 标记 ， 可 以 使 > 系列 离子 的 鉴别 变 得 较为 容易 。 这 一 方法 利 用 了 胰 和 蛋白酶 的 水 解 特性 ， 即 在 C 末端 新 生成 的 羧基 中 从 水 分 子 中 结合 了 一 个 氧 。 因 此 ， 如 果 在 胰 蛋 白 酶 水 解 缓冲 液 中 含有 HO, AAPA AKER (BRT C 末端 肽 段 ) 都 会 有 一 个 同位 素 标记 的 C 末端 羧基 团 (Schnolzer et al., 1996). HUE 50% H2 O/H22O 的 缓冲 液 中 进行 胰 蛋 白 酶 酶 切 反 应 ， 所 有 的 新 生 肽 段 (除了 C 末端 肽 段 ) 都 将 表现 为 一 对 峰 ， 两 峰 质量 数 相差 2 个 质量 单位 ， 同 时 他 们 的 离子 强度 也 只 有 在 Hz OO 溶液 中 正常 水 解 产 生 肽 段 离子 强度 的 一 半 。 胰 和 蛋白酶 切 点 在 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 之 后 的 肽 键 ， 通 过 激活 胰 蛋 白 酶 195 位 丝氨酸 的 OH 基 团 ， 与 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 的 羧基 形成 共 价 结 合 的 键 ， 同 时 释放 新 形成 的 N 末端 。 活 性 水 分 子 攻击 过 渡 态 使 酯 键 断 裂 ， 释 放 新 生 肽 段 ， 肽 段 的 羧基 上 含有 一 个 从 溶剂 水 中 获取 的 氧 ， 溶 剂 水 为 HO RHO 的 机 率 相 等 。 这 样 ， 当 这 两 种 离子 都 被 质谱 仪 选择 为 母 离子 时 ， 只 有 具 完 整 C 末端 的 离子 系列 (y 系列 离子 及 其 中 性 丢失 离子 ) 会 以 相差 2u 的 双 峰 存在 。 这 样 就 区 别 出 了 y 系列 离子 并 可 计算 出 序列 差异 ， 对 肽 段 进 行 从 头 测序 。 虽 然 这 种 方法 简化 了 对 特定 离子 系列 的 确 认 ， 但 也 减 小 了 每 一 个 y 离子 的 信号 强度 ， 因 此 使 高 灵敏 度 的 测序 更 为 困难 。 使 用 高 分 辨 的 质谱 仪 如 四 极 杆 -飞行 时 间 串 联 质谱 仪 可 以 实现 在 单 次 实验 中 对 肽 段 谱 图 的 完全 解析 (Shevchenko et wy .，1997)， 同 时 这 种 方法 已 成 功 应 用 于 离子 阱 质谱 仪 (Qin et alL.，1998)。 另 外 一 种 便于 人 工 解 析 CID 谱 及 从 头 测序 的 化 学 方法 是 对 肽 段 的 羧基 实行 甲 酯 化 。 这 个 反应 使 肽 段 每 一 个 羧基 质量 增加 14u， 包 括 未 修饰 的 C 末 端 、Asp 和 Glu 上 的 羧基 (Hunt et al .，1986)。 如 果 肽 段 中 没有 酸性 残 基 ， 同 时 C 末端 没有 被 修饰 ， 那么 只 有 y 系列 离子 及 其 中 性 丢失 离子 会 表现 出 质量 数 的 变化 ， 比 较 衍 生化 与 未 衍生 化 两 份 样品 的 碎片 离子 谱 就 会 鉴定 出 > 系列 离子 。 如 果 肽 段 中 存在 酸性 残 基 ， 这 个 方 法 的 价值 就 极其 有 限 了 ， 因 为 只 能 鉴定 中 间 碎 片 。 对 N 末端 残 基 特 异性 标记 从 而 鉴定 0 系列 离子 的 方法 也 有 尝试 。 在 这 些 实验 中 肽 段 的 氨基 被 衍生 化 ， 衍 生化 试剂 在 气相 中

"8 蛋白 质 组 学

含有 永久 正 电荷 (Huang et al., 1999; Roth et wz .，1998)。 虽 然 这 些 方法 在 概念 上 引 人 注目 ， 但 在 实践 上 遇 到 困难 ， 主 要 由 于 在 质谱 分 析 衍 生化 物 之 前 必须 先 除 去 过 量 的 试 剂 ， 同 时 这 个 反应 不 能 区 别 N 末端 氨基 和 和 赖 氨 酸 侧 链 上 的 氨基 。

5. 磷酸 化 位 点 分 析 的 各 种 方法 5.1 磷酸 化 分 析 的 原理

在 Krishna 和 Wold (Krishna and Wold, 1998) 所 述 的 上 面 几 种 蛋白 质 修 饰 类 型 中 ， 至 今 只 发 现 少数 几 种 是 可 道 的 或 在 生命 活动 中 具有 重要 的 调控 作用 。 其 中 研究 最 为 详细 HEE AHR. BARR EAR ZT, AURA RRA Bt Bee LMA RR ha ei, WR Aa. RE Ea PEAY Za (Charbon- neau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter, 1987). HRA RELY RR LARA EHAR. HARARBARMN REL. CHKENRRILMARAR,. AAR 和 赖 氨 酸 的 亚 酰 胺 化 ， 以 及 天 冬 氨 酸 和 谷 氨 酸 的 酰 化 。 这 些 修 饰 中 的 其 中 一 些 是 化 学 不 稳定 的 ， 通 常 观察 不 到 ， 除 非 采 取 特 殊 的 保护 措施 防止 他 们 在 蛋白 质 分 离 过 程 中 消失 (Duclos et oz.，1991)。 举 例 来 说 ， 组 氨 酸 磷酸 化 是 一 个 相对 常见 的 修饰 ， 至 少 在 原核 生物 中 是 这 样 ， 但 是 ， 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 常用 的 酸性 染色 条 件 下 ， 磷 酸化 组 氨 酸 完全 消 失 。 因 此 ， 在 凝 胶 分 离 的 蛋白 质 中 通常 观察 不 到 磷酸 化 组 氨 酸 ， 其 在 细胞 中 出 现 的 频率 也 很 难 估 计 。

蛋白 质 磷 酸化 水 平 是 由 两 个 作用 相反 的 酶 系 一 一 磷酸 酶 和 激酶 来 调控 的 。 这 些 酶 中 大 部 分 的 结构 、 专 一 性 、 调 控 已 被 深 入 研究 过 ， 已 经 有 相关 综述 (Charbonneau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter, 1987). ##(hit@JLG SAA / eR 酶 ， 它 们 有 不 同 的 底 物 、 动 力学 特性 、 组 织 分 布 及 其 与 调控 通路 的 关系 。 通 过 对 酿酒 醇 母 全 基因 组 DNA 序列 中 被 认为 代表 蛋白 激酶 (和 磷酸 酶 ) 的 序列 基 元 (motif) HAT 表明 ， 酵 母 能 够 表达 123 种 不 同 的 蛋白 激酶 (40 种 蛋 日 磷酸 酶 )， 这 就 暗示 2% 的 酵母 蛋白 参与 了 蛋白 质 磷 酸化 过 程 。 读 者 可 以 参看 许多 综述 以 了 解 蛋白 质 磷 酸化 /去 磷酸 化 在 许多 受 调控 的 生命 系统 中 的 重要 性 (Charbonneau and Tonks, 1992; Fischer and Krebs, 1989; Hunter，1987)。 了 解 蛋 白质 磷酸 化 对 功能 的 影响 可 以 深入 理解 生命 系统 如 何在 分 子 水 平 进行 调控 ， 例 如 ， 一 个 单一 的 磷酸 化 过 程 可 以 调节 糖 原 磷 酸化 酶 的 活性 (Johnson and Barford，1990)。 对 和 蛋 白质 酷 氨 酸 激酶 p561lck 的 研究 工作 表明 ， 在 单个 丝 氨 酸 上 的 磷酸 化 [可 能 是 由 促 分 裂 原 活化 蛋白 (MAP) 激酶 所 致 (Watts et al., 1993)]， 能 够 改变 一 个 酶 的 底 物 专 一 性 (Joung et al., 1995). MAMBR RASH & 白质 相互 作用 已 经 表明 其 提供 了 稳定 蛋白 质 复合 物 所 需 的 支架 ， 这 种 蛋白 质 复合 物 表 现 出 复杂 的 生物 功能 ， 特 别 是 在 细胞 间 的 信号 传导 过 程 中 (Wange et al., 1995; Watts et al .，1994)。 因 此 可 以 明显 看 出 可 逆 的 蛋白 质 磷酸 化 是 一 种 非常 重要 的 蛋白 质 修饰 ， 它 能 改变 酶 的 催化 活性 和 底 物 的 专 一 性 ， 调 节 具 有 调控 功能 的 蛋 日 质 复合 物 的 稳定 性 和 亚 细胞 定位 ， 从 而 扩展 生物 活性 和 功能 。

5.2 磷酸 化 分 析 策 略 蛋白 质 磷酸 化 研究 的 主要 目的 有 三 点 : 第 一 ， 定 位 一 个 给 定 蛋白 质 在 体内 的 磷酸 化

SLE ”蛋白 质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 89 .

氨基 酸 残 基 位 点 ， 此 给 定 蛋白 质 位 于 某 一 特定 状态 下 的 细胞 内 ; 第 二 ， 鉴 定 与 此 磷酸 化 过 程 有 关 的 激酶 ; 第 三 ， 分 析 所 观察 到 的 磷酸 化 现象 对 功能 的 影响 。 在 这 些 目的 中 ， 第 一 个 可 以 直接 用 质谱 分 析 ， 因 此 是 本 章 的 主题 。 第 二 和 第 三 个 目标 需要 应 用 各 种 不 同 的 生化 、 遗 传 及 药理 学 方法 ， 由 于 篇 幅 所 限 ， 有 关 这 些 的 详细 情况 就 不 再 详 述 了 。

细胞 内 的 许多 磷酸 化 蛋白 的 含量 非常 少 ， 几 乎 不 可 见 。 即 使 蛋白 质 的 表达 量 处 于 相 对 较 高 的 水 平 ， 磷 蛋白 的 分 析 也 很 困难 ， 因 为 重 白 磷酸 化 的 化 学 计量 值 常 常 很 低 ， 某 一 个 蛋白 质 中 仅 有 一 少 部 分 被 磷酸 化 ， 同 一 个 蛋白 质 中 也 会 存在 多 种 不 同 的 磷酸 化 类 型 。 由 于 这 些 原 因 ， 即 使 用 当前 最 灵敏 的 分 析 方 法 ， 也 很 难 分 离 到 足够 量 用 于 分 析 的 体内 磷 酸化 和 蛋白质。 因此 许多 蛋白 质 的 磷酸 化 研究 是 在 体外 利用 激酶 反应 使 蛋白 质 被 磷酸 化 修 饰 ， 通 常 能 够 扩大 反应 规模 以 产生 大 量 的 磷酸 化 蛋白 。 在 体外 研究 确定 的 磷酸 化 位 点 被 认为 具有 生物 学 意义 之 前 ， 必 须 证 实在 体内 存在 相同 的 磷酸 化 位 点 。 通 常 通过 比较 体内 和 体外 的 同一 磷酸 化 蛋白 质 的 二 维 磷 酸 肽 图 得 知 (图 5.5)。 体 外 磷酸 肽 产生 的 量 大 ， 经 化 学 或 质谱 分 析 作为 参考 证 实体 内 微量 磷酸 肽 的 鉴定 。 当 各 自 的 磷酸 肽 在 谱 图 中 共 迁 移 时 则 可 认为 体内 、 体 外 磷 蛋 白 有 相同 的 磷酸 化 位 点 (例如 Watts et al., 1994, 1996b)。 因 此 ， 这 个 方法 通过 与 一 个 结构 清楚 的 参考 样品 肽 共 迁 移 在 某 种 程度 上 间接 证 实 了 一 个 体内 磷酸 化 位 点 的 确定 。

体 ie pmlo 体 内 fmol PPA mR (°P) 4a aR 蛋白 质 分 离 磷酸 氨基 酸 。 4 _ samy 蛋白 酶 切 分 析 | \ 相关 分 析 / 2DPP 作 图 Nga 2DPP * / | | / wLC-ESE-Ms \ ; a MALDI-MS Ny hnHPLC { IMAC

全 ILCESLMS 47 图 $.5 磷酸 化 位 点 分 析 策 略 ，

即使 在 体内 能 够 产生 足够 量 的 磷酸 肽 用 于 质谱 分 析 的 情况 下 ， 实 验 成 功 的 关键 也 依 赖 与 所 用 的 样品 制备 方法 。 因 此 ， 以 下 部 分 简要 介绍 一 下 常用 的 ， 从 非 磷酸 化 多 肽 占 主 要 成 分 的 多 肽 混合 物 中 检测 和 分 离 磷酸 化 蛋白 及 多 肽 的 方法 。 因 为 这 些 方法 与 质谱 没有 直接 关系 ， 所 以 只 是 简单 讨论 一 下 。 读 者 可 以 从 Aebersold 的 文章 中 得 到 这 一 主题 内 容

~ 2)" 蛋白 质 组 学 的 更 详细 的 论述 (Aebersold and Patterson，1998 ) 。 5.3 磷 蛋 白 的 检测 和 分 离

本 质 上 ， 任 何 分 析 蛋 白质 磷酸 化 位 点 的 方法 都 要 依靠 对 所 研究 酸 化 蛋白 质 的 纯 化 ， 用 酶 或 化 学 方法 水 解 磷 蛋 白 ， 分 离 、 分 析 产 生 的 磷酸 肽 。 幸 运 的 是 ， 前 面部 分 所 述 的 用 于 处 理 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 分 离 蛋白 质 的 方法 ， 同 样 适用 于 磷 蛋 白 的 分 析 。 所 以 ， 用 于 产生 磷酸 肽 样品 的 方法 是 : ARRAS A, KRRARATREARA, # 取 产 生 的 磷酸 肽 混合 物 作 进一步 分 析 。 虽 然 磷 蛋 白 在 SDS-PAGE 上 的 迁移 通常 比 其 非 磷酸 化 的 蛋白 慢 ， 但 是 ， 在 一 维 胶 上 看 到 两 条 迁移 非常 接近 的 条 带 ， 或 在 2-DE 上 观察 到 一 系列 有 相同 分 子 质 量 但 不 同等 电 点 的 斑点 ， 这 样 的 现象 并 不 足以 确定 某 一 个 蛋白 是 磷酸 化 蛋白 。 用 ?P 标记 后 放射 自 显 影 ， 或 磷 储 屏 分 析 (storage phosphorimaging)， 或 用 Western 印迹 方法 鉴定 磷 蛋 日 的 结果 较为 确定 、 可 信 。 用 现 有 的 方法 在 常规 实验 中 就 可 将 ”P 放 射 标记 物 挫 入 体内 或 体外 磷酸 蛋白 质 中 (Patterson and Garrels，1994)。 分 子 放射 标记 方法 用 于 体内 磷酸 化 蛋白 质 标记 ， 要 标记 的 细胞 或 组 织 与 *PO4 孵 育 一 段 时 间 ， 使 细胞 ATP 库 与 :2P 平 衡 。 放 射 标记 的 ATP 被 蛋白 激酶 用 于 磷酸 化 其 底 物 。 体 外 蛋白 质 磷酸 化 的 激酶 反应 用 [7-“P] ATP 作为 放射 标记 物 来 源 ， 粗 分 的 细胞 裂解 液 或 纯化 的 激酶 作为 激酶 活性 来 源 。Western PER MBRARRRILE AH HAI KA, AA 已 经 开发 出 了 一 系列 非常 灵敏 的 酷 氨 酸 -磷酸 盐 特 异性 抗体 ， 例 如 4g10 ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); py2 和 RC10 (Transduction Laboratories, Lexington, KY)， 同 时 也 因为 此 方法 没有 放射 性 同位 素 标记 。 泛 磷酸 -特异 性 抗体 或 磷酸 -丝氨酸 和 磷酸 - 苏 氨 酸 特异 性 抗体 的 开发 还 不 太 成 功 。

5.4 磷酸 肽 的 分 离

即使 纳 喷 MS/MS 技术 已 经 成 功用 于 直接 分 析 和 蛋白 酶 解 产 生 的 磷酸 肽 ， 但 是 出 于 以 下 一 些 原因 ， 通 常 建议 在 质谱 分 析 前 作 一 些 分 离 。 (1) 磷酸 肽 在 蛋白 酶 切 产物 中 通常 只 占 少 数 ， 因 此 容易 淹没 在 低 丰 度 离 子 产生 的 总 背景 中 ， 肽 分 离 技术 可 浓缩 分 析 物 ， 因 此 会 提高 信 噪 比 。 (2) 如 果 磷 酸 肽 被 放射 性 标记 ， 并 具有 相同 比 活 度 ， 那 么 每 一 个 被 分 离 的 肽 段 相应 的 活 度 计 数 就 表明 这 一 组 分 中 磷酸 肽 的 相对 量 。 如 果 已 知 所 用 放射 性 标记 物 的 比 活 ， 就 能 容易 地 算出 磷酸 肽 的 绝对 量 。 (3) 放射 性 标记 的 磷酸 肽 的 分 离谱 可 以 用 来 定量 检测 不 同时 间或 细胞 状态 下 蛋白质 磷酸 化 状态 的 变化 。 (4) 肽 分 离 方法 也 有 效 地 除去 了 非 肽 类 杂质 ， 更 有 利于 检测 和 分 析 低 丰 度 酸 肽 。 在 现 有 的 分 离 技术 中 ，2D-PP，RP-HPLC， 高 分 辨 凝 胶 电 泳 和 固 相 化 金属 亲 和 色 谱 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 被 优先 选择 用 于 分 离 磁 酸 肽 。 虽 然 要 阐明 一 个 明确 的 策略 用 于 鉴定 所 有 磷 蛋 白 很 困难 (图 5.53)， 但 做 一 个 一 般 性 策略 的 论述 还 是 有 价值 的 。 但 即使 是 图 5.5 策略 中 的 内 容 也 没有 包含 所 有 可 能 的 途径 。 任 何 一 个 鉴定 方案 的 细节 都 与 许多 因素 相关 ， 例 如 个 人 对 检测 和 分 离 模 式 的 喜好 ， 可 得 到 的 样 品 及 可 用 的 仪器 。 因 为 是 一 个 简要 的 讨论 ， 我 们 假设 要 着 重 表 明 体内 、 体 外 2D-PP if

第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 “ 91 :

之 间 的 相似 性 ， 并 成 功 进 行 证 明 。 总 规则 是 先 要 得 到 序列 信息 ， 可 通过 MS 或 MS/MS 方法 对 体外 2D-PP 上 的 点 直接 分 析 ， 两 者 都 能 得 到 有 用 的 信息 。 如 果 某 些 点 或 全 部 点 的 序列 分 析 不 成 功 ， 那 么 重新 水 解 蛋 白质 ， 肽 段 经 HPLC 分 段 收 集 ， 然 后 用 MS/MS 分 析 含 ?2P 的 组 分 ， 可 用 自动 或 直接 分 析 方 法 。 如 果 由 于 MS 信 噪 比 粳 糕 而 不 能 得 到 2D- PP 上 的 点 的 序列 信息 ， 那 么 HPLC 收集 的 组 分 本 质 上 会 更 和 干净， 也 许 会 得 到 好 的 数据 。 如 果 磷 酸化 的 化 学 计量 值 非常 低 ， 这 种 HPLC 制备 方法 也 许 会 失败 ， 可 能 会 观察 到 磷 酸 肽 ， 但 是 柱 上 浓度 会 很 低 ， 以 致 不 能 产生 可 用 于 解析 的 碎片 离子 。 这 种 情况 下 再 重复 水 解 蛋白 质 ， 用 IMAC 富 集 磷酸 肽 ， 用 IMAC 的 收集 组 分 做 MS/MS 实验 。 不 管 第 一 步 使 用 了 什么 方法 ， 通 常 从 蛋白 点 到 蛋白 水 解 这 一 步 都 要 进行 多 次 重复 ， 直 到 所 有 感 兴趣 的 磷酸 肽 都 被 测序 。 要 记 住 ， 某 些 肽 序列 不 会 以 易于 解析 的 方式 断裂 ， 为 了 证 实 确切 的 磷酸 化 位 点 ， 有 必要 使 用 合成 肽 。 这 一 标准 品 用 于 比较 研究 以 证 实 确切 的 雁 酸化 位 点 。 当 22P 不 能 挫 入 蛋白 质 时 ， 要 用 下 面 提 到 的 诊断 离子 扫描 来 检测 用 于 序列 分 析 的 磁 酸 肽 。 这 里 提 到 的 及 图 $.5 所 示 的 每 一 个 分 离 技 术 都 与 下 面 提 到 的 肽 的 进一步 化 学 、 酶 及 质谱 分 析 方 法 相 适 用 。

2D-PP 分 离 磷 酸 肽 ”在 2D-PP 谱 中 ， 肽 段 的 一 维 分 离 是 在 薄 层 纤维 板 上 进行 电泳 ， 二 维 分 离 是 在 相同 的 板 上 进行 薄 层 色谱 (Boyle et al .，1991)。 分 离 到 的 磷酸 肽 经 放射 自 显影 或 磷 储 屏 检测 。 放 射 自 显影 看 到 的 点 的 数目 可 用 来 估计 磷酸 化 位 点 的 最 大 数目 ， 点 的 强度 可 用 来 指示 肽 之 间 磷 酸化 的 相对 化 学 计量 值 。 此 外 ， 即 使 并 非 能 够 分 辨 所 有 的 肽 ， 但 样品 中 每 一 个 磷酸 肽 都 被 计数 。 观 察 到 的 点 的 数目 没 必要 与 磷酸 化 位 点 的 数目 直 接 相 联系 ， 因 为 磷 蛋 白 中 经 常 可 观察 到 不 完全 的 蛋白 水 解 。 但 是 ，2D-PP 图 谱 也 提供 了 从 其 他 方法 中 得 不 到 的 有 关 和 蛋白 质 磷酸 化 位 点 的 重要 信息 ， 包 括 ;

(1) 磷酸 化 位 点 的 最 大 数目 。 由 于 蛋白 酶 水 解 差 异 ， 谱 图 产生 的 点 通常 多 于 磷酸 化

位 点 。

(2) 放射 自 显影 强度 提供 了 在 所 有 磷酸 肽 中 磷酸 化 的 相对 化 学 计量 。

(3) 电泳 和 TLC 的 正 交 分 离 提供 了 磷酸 肽 之 间 亲 水 性 的 相对 状态 。

2D-PP 作 图 的 另 一 个 优点 是 能 产生 纯化 的 磷酸 肽 ， 从 平板 上 提取 后 可 用 MS 分 析 (Affolter et al .，1994)。 如 果 试 图 用 2D-PP 作 图 法 作为 MS/MS 分 析 的 样品 制备 方法 ， 那么 所 加 和 蛋白酶 的 量 要 少 ， 只 要 能 发 挥 作 用 即 可 。 如 使 用 过 量 的 蛋白 酶 ， 在 MS OR 酸 肽 时 ， 和 蛋白 酶 的 自 切 产物 会 占据 图 谱 的 主导 ， 抑 制 了 磷酸 肽 的 分 析 。 此 外 ，2D-PP 作 图 法 的 灵 人 敏 高 且 重 现 性 好 ， 因 为 检测 磷酸 肽 是 通过 整合 相当 长 时 间 内 的 放射 性 训 变 ， 所 以 方法 非常 灵敏 ， 并 且 灵 敏 度 只 依赖 于 放射 性 标记 物 的 比 活 。2D-PP 所 获得 图 谱 的 高 度 重 现 性 使 其 被 选择 用 于 分 析 不 同 环境 ， 例 如 不 同时 间 过 程 ， 不 同 活性 诱导 状态 下 蛋白 质 的 磷酸 化 状态 。

RP-HPLC 4% AGRA KFA HPLC 分 段 收集 磷酸 肽 重 现 性 好 ， 简 单 ， 且 不 需要 特 殊 装 备 。 在 RP-HPLC 中 ， 磷 酸 肽 根据 其 疏水 性 被 分 离 。 分 离 后 收集 的 组 分 经 Cerenkov 计数 检测 。 对 Cerenkov 计数 和 时 间作 图 ， 显 示 具 放射 性 活性 的 组 分 的 计数 。 纯 化 的 磷 酸 肽 用 MS 分 析 ， 可 用 2.2 部 分 所 述 不同 的 MS 和 MS/MS 方法 。 相 对 于 2D-PP，RP- HPLC 的 缺点 是 高 亲 水 性 的 磷酸 肽 不 会 在 柱 上 停留 ， 而 是 直接 流 过 柱子 。 相 反 ， 高 疏水 性 的 肽 直到 最 高 梯度 才 会 被 洗 脱 ， 甚 至 不 会 被 洗 脱 。 因 此 ， 有 可 能 样品 中 有 些 磷 酸 肽 不

Ladi 蛋白 质 组 学

会 被 检测 到 。 总 体 上 说 ，RP-HPLC 的 分 辩 力 不 如 2D-PP 作 图 法 的 分 辩 力 好 。 需 要 注意 的 另 一 点 是 ， 磷 酸 肽 会 附着 在 金属 表面 ， 因 此 ， 如 果 用 标准 的 金属 注射 器 ， 会 发 生 明 显 的 样品 丢失 。 使 用 RP-HPLC 分 析 磷 酸 肽 的 一 个 很 大 的 吸引 力 是 RP-HPLC 系统 可 以 与 ESI 质谱 方便 地 在 线 连接 。 使 用 在 线 连接 到 HPLC 系统 的 质谱 仪 使 样品 混合 物 中 磷酸 肽 的 检测 和 鉴定 成 为 可 能 ， 即 使 分 析 样 品 没 有 被 放射 性 标记 也 可 分 析 ， 这 需要 质谱 仪 具 有 特定 的 扫描 功能 ， 如 上 文 所 述 包括 前 体 离 子 扫 描 、 中 性 丢失 及 源 内 解 离 。 因 此 ， 用 LC- MS/MS 分 析 磷 酸 肽 适用 于 非 同位 素 标记 样品 ， 在 分 析 人 组 织 中 分 离 的 磷酸 肽 时 ， 具 有 明显 的 优势 。

DDPHRRBRKD BRB FER MBER LAA 2-DE 纯化 磷酸 肽 是 最 近 发 表 的 很 有 前 途 的 制备 技术 ， 其 结果 与 2D-PP 结果 相似 (Gatti and Traugh，1999)。 非 变性 凝 胶 等 电 聚 焦 结合 碱 性 40% PAGE 胶 用 于 磷酸 肽 分 离 及 比较 分 析 。:P 标记 样品 用 放射 自 显影 或 磷 储 屏 检测 。 用 Eedman 测序 方法 鉴定 蛋白 质 并 确定 磷酸 化 位 点 ， 但 也 许 更 适 于 用 MS 鉴定 。 同 HPLC 一 样 ， 但 出 于 不 同 的 原因 ， 此 方法 也 会 丢失 特异 的 磷酸 肽 。 但 是 ， 因 为 凝 胶 电泳 装置 很 普通 ， 所 以 此 方法 对 于 缺乏 2D-PP 作 图 装置 的 人 来 说 还 是 非 常 有 吸引 力 的 。

IMAC 分 离 / 富 集 磷酸 肽 ”磷酸 肽 分 析 的 常见 困难 是 由 磷酸 化 的 低 化 学 计量 值 导 致 的 ， 样 品 中 相同 序列 肽 段 的 磷酸 肽 的 含量 要 比 非 磷酸 化 肽 段 含 量 少 得 多 ， 这 种 情况 下 即 使 2P 标 记 的 2D-PP 上 的 点 ， 经 全 蛋白 质 水 解 及 HPLC 组 分 收集 ， 已 经 确定 磷酸 肽 存在 ， 用 质谱 技术 也 难以 鉴定 磷酸 肽 。 数 据 依 赖 (data-dependent) 的 MS/MS 方法 不 能 鉴定 样 品 中 含量 少 的 成 分 ， 因 为 CID 优先 选择 丰 度 高 的 离子 进行 分 析 ， 为 了 解决 这 一 问题 ， 常用 IMAC 选择 性 富 集 磷酸 肽 。 这 一 技术 将 Fe “或 Ga 等 金属 离子 鳌 合 到 含有 亚 氨基 二 乙酸 (iminodiacetic acid) 或 次 氮 基 三 醋酸 (nitrilotriacetic acid) 的 色谱 固定 相 上 (Neville et al., 1997; Nuwaysir and Stults, 1993; Tempst et w .，1998) 。 磷 酸 肽 与 固定 相 有 高 亲和力 ， 被 选择 性 地 吸附 在 上 面 。 用 磷酸 盐 或 高 pH 溶液 洗 脱 ， 洗 脱 组 分 即 为 富 集 的 磷酸 肽 。 虽 然 这 一 方法 对 磷酸 肽 有 选择 性 ， 但 其 他 肽 ， 特 别 是 那些 富 含 酸性 氨基 酸 链 的 肽 段 也 容易 被 富 集 。IMAC 柱 上 洗 脱 下 的 组 分 可 用 本 章 所 述 的 不 同 的 MSS 方式 分 析 。 本 方法 的 优点 是 每 一 个 可 溶 磷酸 肽 ， 不 管 其 长 度 如 何 ， 都 能 被 富 集 ， 而 且 IMAC 柱 洗 脱 下 的 样品 可 直接 用 于 RP-HPLC 分 析 。 可 以 建立 串联 的 IMAC/RP 柱 结构 ， 将 肽 的 富 集 和 分 离 整合 到 一 起 (Affolter et al., 1994).

5.5 确定 磷酸 化 氨基 酸 类 型

了 解 肽 或 蛋白 质 中 磷酸 化 氨基 酸 的 类 型 ， 可 以 限定 可 能 的 磷酸 化 位 点 ， 并 因此 简化 了 对 多 肽 链 中 磷酸 化 残 基 的 确认 。 磷 酸化 残 基 类 型 通常 由 磷酸 氨基 酸 分 析 或 棍 酸 氢 基本 特异 性 免疫 检测 确定 。

磷酸 氨基 酸 分 析 是 对 肽 键 进行 气相 或 液 相 水 解 ， 此 水 解 条 件 下 要 至 少 保留 一 段 磷酸 酯 键 完整 。”P 标 记 的 磷酸 蛋白 质 或 磷酸 肽 的 水 解 产物 与 磷酸 氨基 酸 标准 品 混合 ， 并 用 TLC 分 离 。 未 标记 的 标准 品 由 茹 三 酮 (ninhydrin) 染色 检测 ，?P 标 记 氢 基 酸 由 放射 自 显影 检测 。 蛋 白质 中 存在 的 磷酸 氨基 酸 类 型 通过 染色 标准 品 与 放射 标记 种 类 的 相关 分 析 确定 (Hildebrandt and Fried，1989)。 如 果 能 得 到 大 量 样品 ， 磷 酸 氢 基 酸 类 型 可 以 通过

ARE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 93 -

Fi — AR Bee. FA 2D-PP 图 谱 上 提取 的 磷酸 肽 进行 磷酸 氨基 酸 分 析 尤 其 有 用 ， 因为 这 些 肽 段 通 常 只 含有 一 种 磷酸 氨基 酸 类 型 。 了 解 磷酸 化 氨基 酸 的 性 质 及 其 他 参数 ， 例如 肽 段 分 子 质量 ， 裂 解 蛋白 质 所 用 的 酶 的 特性 ， 在 某 些 情况 下 可 以 鉴定 ， 或 至 少 可 以 推测 蛋白 质 中 的 磷酸 化 位 点 。

利用 特殊 磷 酸 氨基 酸 的 抗体 特异 性 可 以 确定 地 鉴别 磷酸 化 氨基 酸 的 类 型 ， 但 是 这 种 方法 并 不 能 代替 磷酸 氨基 酸 分 析 。 酷 氨 酸 磷酸 化 蛋 日 质 经 凝 胶 分 离 后 ， 很 容易 通过 与 栈 氨 酸 磷酸 盐 抗 血清 的 免疫 印记 实验 检测 ， 抗 血清 包括 : 4g10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 和 py20， 也 有 如 RC10 一 样 的 细菌 片段 抗体 (Transduction Laborato- ries，Lexington，KY)。 这 些 抗体 已 经 商业 化 ， 提 供 了 一 个 快速 、 灵 人 敏 地 检测 蛋白 质 栈 氨 酸 磷酸 化 的 方法 。 磷 酸化 丝氨酸 和 苏 氨 酸 的 特异 性 抗体 已 有 叙述 (Heffetz et al., 1989) 并 已 商业 化 。 用 这 些 试剂 得 到 的 实验 结果 在 某 种 程度 上 是 不 确定 的 ， 建 议 在 使 用 他 们 的 时 候 要 注意 ， 但 是 最 近 的 研究 表明 其 质量 已 有 所 提高 (Soskic et al., 1999).

5.6 磷酸 化 位 点 的 确定

磷酸 化 位 点 的 确定 也 使 用 一 些 通用 方法 : 克 酸 化 蛋白 质 被 纯化 ， 如 果 可 能 蛋白 质 要 均一 ; 磷 蛋 白 被 特异 性 的 化 学 或 酶 反应 切断 ， 产 生 肽 混合 物 ， 其 中 含有 一 到 两 个 磷酸 肽 。 不 同 之 处 在 于 其 分 离 磷酸 肽 的 策略 是 为 了 确定 氨基 酸 序列 ， 定 位 肽 段 内 磷酸 化 的 残 基 。 上 面 所 述 的 分 离 方法 ，2D-PP 作 图 、HPLC 或 IMAC 方法 ， 也 同样 适宜 于 微量 制备 磷酸 肽 用 于 确定 磷酸 化 位 点 。

磷酸 肽 的 化 学 测序 过 去 确定 磷酸 化 位 点 测序 最 常用 的 是 逐步 化 学 降解 法 ， 如 Wettenhall 等 的 丝氨酸 和 苏 氨 酸 磷酸 化 分 析 方 法 (Wettenhall et al., 1991), Aebersold 等 的 酷 氨 酸 磷酸 化 分 析 方 法 (Aebersold et az .，1991)。 最 近 ， 此 方法 已 经 主要 被 质谱 方 法 所 取代 。 虽 然 本 章 主要 集中 于 质谱 方法 ， 但 仍然 有 必要 提 一 下 非 放 射 活性 和 放射 活性 酸 肽 测序 的 方法 ， 这 两 种 方法 可 以 补充 ， 在 某 些 情况 下 可 以 替代 质谱 方法 来 确定 磷酸 (hi (Watts et al .，1996a) 。 非 放射 活性 方法 是 由 Meyer 等 发 展 并 综述 的 (Meyer et ai.，1993)， 用 于 检测 磷酸 丝氨酸 和 磷酸 苏 氨 酸 ， 包 括 B- 消 除 ， 与 琉 基 乙醇 反应 形成 S- 乙 基 化 半 胱 氨 酸 或 B- 甲 基 - S- 乙 基 半 胱 氨 酸 ， 它 们 很 容易 以 PTH 衍生 物 的 形式 从 自 动 测序 仪 中 提取 出 来 。 放 射 活 性 方法 是 由 Ceerenkov 计数 检测 器 检测 在 Edman 化 学 降解 测序 循环 中 释放 出 的 放射 性 活 度 (Aebersold et al., 1991; Wettenhall er cl .，1991)。 如 果 测 丝氨酸 或 苏 氨 酸 磷酸 盐 残 基 ， 磷 酸 盐 被 除去 ， 可 观察 到 ”P- 磷 酸 盐 和 各 自 的 PTH 本 生物 (Wettenhall，1991) 。 在 酷 氨 酸 磷 酸 盐 情况 下 ， 磷 酸 酯 键 更 稳定 ， 分 析 的 提取 物 是 PTH 磷酸 酷 氨 酸 。 如 果 得 到 的 磷酸 肽 的 量 非 常 有 限 ， 也 许 不 可 能 用 化 学 降解 法 测 肽 序列 ， 但 是 在 降解 循环 后 ， 放 射 活 性 从 肽 中 释放 ， 通 常 有 可 能 确定 肽 内 磷酸 化 位 点 。

磷酸 肽 的 质谱 分 析 已 经 发 展 了 许多 不 同 的 策略 和 方法 用 质谱 确定 磷酸 肽 中 的 磷酸 化 位 点 ， 其 区 别 在 于 质谱 与 肽 分 离 技术 的 接口 方式 ， 以 及 所 用 的 质谱 方法 。 如 果 一 个 磷 酸 肽 有 lpmol 或 更 多 的 量 ， 磷 酸 肽 就 能 够 从 2D-PP 谱 中 提取 出 来 ， 并 用 数据 依赖 的 自 BAGH thE ANE LC-MS/MS 分 析 (Watts et al, 1994; Whalen et wl .，1996)。 此 方法 快 速 ， 可 以 初步 估计 一 个 2D-PP 斑点 中 磷酸 肽 的 相对 量 ， 通 过 对 2D-PP 谱 图 的 配 比 ， 有 可 能 定性 、 定 量 地 了 解 细 胞 或 组 织 在 不 同 状态 下 分 离 的 磷酸 化 蛋白 在 特定 位 点 的 磷酸 化

sai 蛋白 质 组 学

过 程 。 对 于 样品 量 大 大 低 于 1pmol 量 的 样品 ， 磷 酸 肽 信号 通常 被 平板 中 提取 的 杂质 所 干 扰 而 看 不 到 ， 这 种 情况 下 建议 用 毛细 管 液 相 色谱 或 凝 胶 电 泳 分 离 肽 段 。

用 于 确定 磷酸 肽 中 磷酸 化 位 点 的 质谱 方法 有 两 种 不 同 的 基本 原理 ， 第 一 种 方法 依赖 于 在 质谱 仪 条 件 下 ， 如 在 ESI 质谱 仪 的 碰撞 室 或 离子 源 中 ， 或 在 MALDI-MS 的 PSD 过 程 中 ， 磷 酸 酯 键 的 化 学 稳定 性 。 因 此 ， 磷 酸 肽 可 通过 磷酸 酯 键 断 裂 产生 的 诊断 离子 鉴 定 。 第 二 种 方式 依靠 检测 磷酸 酯 基 团 使 肽 段 增 加 的 质量 数 。 通 常 ， 在 蛋白 质 磷酸 化 研究 中 ， 所 研究 的 蛋白 质 序列 是 已 知 的 ， 因 此 ， 从 理论 上 可 以 通过 对 磷酸 基 团 加 合 在 丝 氮 酸 、 苏 氨 酸 或 酷 氨 酸 残 基 上 引起 的 80u 的 质量 数 差 的 分 析 而 检测 蛋白 产生 的 磷酸 肽 。 因 此 ， 得 到 磷酸 化 蛋白 质 的 酶 切 肽 质量 后 ， 通 常 由 MALDLMS 分 析 ， 如 果 质 量 测 定 值 与 预期 值 一 致 ， 就 可 鉴定 混合 物 中 的 磷酸 肽 。 这 两 种 方法 不 能 鉴定 出 肽 内 的 磷酸 化 位 点 。 磷酸 化 位 点 的 确定 要 人 靠 能 够 有 效 测 序 的 串联 质谱 的 产物 离子 扫描 技术 。 但 是 ， 在 肽 序列 中 只 有 一 个 可 能 的 磷酸 化 位 点 情况 下 ， 如 果 能 确实 证 明 此 肽 段 为 磷酸 肽 ， 磷 酸化 残 基 也 能 有 效 定位 。 如 果 磷 酸化 氨基 酸 类 型 已 用 $.5 部 分 所 述 方法 确定 ， 无 须 离 子 扫描 即 能 鉴 定 磷 酸化 位 点 的 机 会 也 会 大 大 提高 。

TRAN MS 扫描 方式 ， 在 前 文 已 大 概 叙 述 过 ， 已 经 成 功用 于 磷酸 肽 的 分 析 。 这 里 我 们 具体 讲 一 下 他 们 在 磷酸 肽 分 析 中 的 应 用 ， 并 评价 一 下 其 各 自 的 优 缺 点 。 总 之 ， 在 不 能 挫 入 ?2P 或 标记 物 已 经 衰变 到 检测 限 以 下 的 情况 下 ， 产 生 磷 酸 盐 特 异 离子 (例如 一 个 诊断 离子 ) 的 方法 是 很 有 用 的 。 如 果 和 希望 的 话 这 种 扫描 模式 也 能 用 于 分 析 放 射 性 标记 的 磷酸 肽 ， 因 为 由 放射 性 同位 素 磷 酸 盐 对 磷酸 肽 贡献 的 质量 非常 小 ， 可 忽略 不 计 。 需 要 注 意 的 是 ， 虽 然 有 些 研 究 者 担心 质谱 仪 会 被 ?2P 样 品 污染 ， 但 这 种 可 能 性 可 以 避免 ， 只 要 在 质谱 实验 之 前 等 候 足 够 数量 的 半衰期 (>P 的 半衰期 为 两 周 )。 需 要 标记 的 实验 ， 例 如 2D-PP 作 图 ， 可 以 在 放射 性 活 度 足 够 强 的 时 候 做 。

源 内 CID 可 用 ESI RA CID 产生 的 负离子 形式 的 诊断 离子 ，HPO+ (97u), PO; (79u), POy (〈63u)， 来 检测 鉴定 磷酸 肽 (Huddleston et al., 1993; Hunter and Games, 1994), JA CID 与 在 线 HPLC 结合 ， 既 可 鉴别 磷酸 肽 的 洗 脱 时 间 ， 得 到 其 色 谱 标识 ， 又 能 得 到 其 分 子 质量 (Huddleston et wz.，1993)。 具 体 做 法 是 ， 在 Ql 之 前 的 两 个 skimmer 上 施加 高 的 锥 孔 (cone) 电压 ， 扫 描 低 质 荷 比 的 诊断 离子 。 然 后 将 cone 电 压 恢 复 正 常 值 (不 会 诱导 产生 解 离 ) 扫描 高 质 荷 比 的 离子 。 仪 器 的 第 一 个 skimmer 位 置 使 用 加 热 的 毛细 管 的 质谱 仪 也 能 做 类 似 的 实验 (Aebersold et wy .，1998)。 这 个 方法 使 用 了 交替 扫描 技术 ， 即 在 高 八 极 杆 补偿 电压 下 进行 诊断 离子 的 选择 性 离子 监测 (selected ion monitoring，SIM)， 之 后 进行 两 个 全 扫描 。 第 一 个 全 扫描 使 用 与 SIM 实验 相同 的 高 补偿 电压 ， 产 生 去 质子 化 的 磷酸 肽 分 子 离子 及 去 磷酸 的 磷酸 肽 分 子 离 子 。 最 后 在 正常 八 极 杆 补偿 电压 下 进行 第 二 次 全 扫描 ， 产 生 一 个 参考 图 ， 与 高 八 极 杆 补偿 电压 下 的 全 扫描 比较 。 在 LC 分 离 过 程 中 ， 这 种 二 次 质谱 扫描 系列 连续 地 重复 进行 。 这 个 实验 与 Carr 及 其 合作 者 的 实验 方法 提供 了 相同 的 信息 , 但 是 因为 使 用 了 SIM, 而 不 是 扫描 来 检测 诊断 离子 ,每 一 个 扫描 循环 更 快速 ,也 可 能 更 灵敏 。 高 八 极 杆 补 偿 电压 下 的 第 一 次 全 扫描 与 低 补偿 电压 下 的 全 扫描 相 比 较 ,在 多 个 肽 段 被 共 洗 脱 时 , 可 以 提供 线索 找到 磷酸 肽 离子 , 肽 混合 物 被 微 毛 细 管 柱 分 离 时 , 经 常会 有 肽 段 共 洗 脱 。 这 一 技术 分 析 磷 酸 肽 标准 品 通常 可 低 至 几 个 fmol 上 柱 量 的 样品 , 但 对 于 体内 、 体 外 的 实际 样品 , 灵敏 度 通 常 在 pmol 范围 。

SLE ”蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 95 -

因为 负离子 的 CID 谱 通常 不 能 产生 足够 用 于 序列 分 析 的 碎片 离子 ， 如 果 能 用 微 毛 细 管 柱 分 离 ， 在 线 连接 ESI-MS 系统 ， 以 负离子 形式 检测 磷酸 肽 ， 然 后 切换 到 正 离子 模 式 的 CID 分 析 ， 当 然 会 非常 方便 。 目 前 采用 诊断 离子 扫描 模式 的 质谱 仪 这 样 做 在 技术 上 还 有 困难 ， 也 许 将 来 使 用 非 扫 描 模式 的 质谱 仪 可 以 达到 这 一 目的 。 在 四 极 杆 这 样 的 扫 描 质 谱 仪 上 做 这 一 实验 的 困难 在 于 不 能 达到 正 、 负 离子 模式 转换 所 要 求 时 间 。

中 性 丢失 扫描 ， 用 于 磷酸 肽 检测 和 分 析 的 中 性 丢失 扫描 最 早 见于 Covey 等 所 述 (Covey et al .，1991)， 后 来 被 Huddleston 等 进一步 发 展 (Huddleston etal., 1993), # 在 三 级 四 极 质谱 仪 上 用 ESI 正 离子 模式 分 析 的 。Ql 没有 用 来 为 Q2 中 的 裂解 选择 离子 ， 而 是 用 来 扫描 。Q3 也 用 来 扫描 ， 但 质量 扫描 范围 与 Ql 不 同 。 确 切 地 说 ， 两 个 四 极 杆 以 不 同 的 质量 范围 扫描 ， 它 们 之 间 的 差 值 与 丢失 的 中 性 分 子 质 人 荷 比 一 致 。 对 于 从 [M+ 2H]2 磷酸 肽 上 丢失 的 中 性 磷酸 盐 ， 其 质量 差 值 为 m/z49。 从 机 理 上 看 ， 只 有 磷酸 丝 氨 酸 和 磷酸 苏 氨 酸 会 发 生 B- 消 除 ， 产 生 98 的 中 性 丢失 (Gibson and Cohen，1990)。 此 方法 的 应 用 并 不 如 上 面 提 到 的 源 内 CID 方法 普遍 ， 因 为 会 出 现 假 阳 性 ， 而 且 还 必须 知 道 丢 失 磷 酸 盐 的 离子 带电 荷 的 状态 。 此 方法 的 优点 是 以 正 离子 模式 进行 分 析 ， 可 以 在 同 一 次 实验 中 通过 检测 磷酸 盐 的 中 性 丢失 启动 CID， 得 到 数据 依赖 的 CID 扫描 。

前 体 离子 扫描 ”此 方法 是 在 ESI 负离子 模式 下 对 Ql 进行 连续 扫描 。 所 有 的 离子 都 在 Q2 PRK, QO 中 仅 能 通过 一 种 离子 ， 对 磷酸 肽 来 说 通常 是 丢失 的 PO; HA ( 允 /z79)。 因 此 ， 质 谱 结 果 仅 显示 会 丢失 m/z79 的 离子 的 谱 峰 (Wilm et al., 1996). 这 大 大 简化 了 混合 物 的 分 析 ， 在 纳 喷 离子 源 直接 进 样 过 程 中 可 以 分 析 得 很 好 。 如 磷酸 肽 的 诊断 离子 扫描 一 节 所 述 ， 此 方法 还 是 存在 测序 的 问题 ， 即 负离子 模式 检测 磷酸 丢失 后 ， 立 即 切 换 为 正 离子 模式 测序 。

产物 离子 扫描 ， 由 上 文 所 述 的 特定 扫描 法 得 到 的 信息 通常 还 不 足以 鉴定 磷酸 肽 中 的 磷酸 化 残 基 。 实 际 上 ， 以 上 方法 如 源 内 CID， 中 性 丢失 和 和 母 离子 扫描 ， 是 用 来 将 磷酸 肽 从 非 磷酸 肽 中 区 别 出 来 ， 而 不 是 提供 序列 信息 。 只 有 在 肽 序列 已 知 ， 且 三 种 含 羟基 氨基 酸 只 有 一 种 存在 的 情况 下 ， 以 上 三 种 方法 才能 成 功 鉴定 磷酸 化 残 基 。 此 外 ， 只 有 在 肽 序 列 中 只 含有 一 个 丝氨酸 、 苏 氨 酸 或 酷 氨 酸 残 基 的 情况 下 ， 这 种 预先 设 定 对 答案 的 简化 才 起 作用 。 在 另 一 种 情况 下 也 可 以 提供 肽 序列 中 磷酸 化 位 点 的 答案 ， 即 序列 已 知 ， 磷 酸化 的 氨基 酸 分 析 表 明 在 此 磷酸 蛋白 中 只 含有 三 种 羟基 氮 基 酸 的 一 种 时 ， 再 次 简化 了 答案 。 当 这 两 种 情况 都 不 存在 时 ， 通 常 需要 产生 CID 谱 ， 并 子 以 解析 以 确定 磷酸 肽 的 共 价 结 构 。 观 察 磷酸 肽 的 低能 CID 过 程 ， 其 一 般 趋 势 是 ， 磷 酸 丝氨酸 上 的 磷酸 比 磷酸 苏 氨 酸 更 易 丢 失 ， 磷 酸 苏 氨 酸 比 磷酸 酷 氨 酸 更 易 丢 失 磷 酸 。

较 短 的 磷酸 肽 比较 长 的 磷酸 肽 更 易于 丢失 磷酸 ， 大 概 是 由 于 在 相同 碰撞 能 量 下 ， 短 肽 的 化 学 键 上 分 布 了 更 多 的 能 量 。 有 趣 的 是 ， 很 少 能 观察 到 磷酸 氨基 酸 的 亚 氨 离子 ， 磷 BARBY immonium 离子 是 由 磷酸 丢失 后 形成 的 脱 羟基 丙 氨 酸 和 脱 羟基 - 2 - 丁 酸 的 断 裂 形 成 的 。 然 而 ， 用 离子 阱 质谱 (DeGnore and Qin, 1998) 监测 磷酸 肽 的 CID 谱 ， 在 肽 碎片 离子 谱 中 观察 到 脱 羟 氢 - 2 - 丁 酸 取代 了 苏 所 酸 的 位 置 。

源 后 衰变 ”这 种 实验 在 MALDI-TOF 质谱 仪 上 进行 ， 在 前 文 已 讲述 了 在 single-stage 型 仪器 中 ， 通 过 观察 亚 稳 裂 解 提供 肽 段 序列 信息 。 这 一 方法 已 成 功用 于 磷酸 肽 的 序列 分 析 (Annan and carr, 1996; Neville et al., 1997).

- 96 - 蛋白 质 组 学

用 酶 和 化 学 方法 去 磷酸 化 ”这 种 方法 并 未 得 到 特别 关注 ， 但 它 能 提供 磷酸 肽 中 磷酸 - 化 氨基 酸 的 定位 ， 可 以 在 非 磷酸 肽 占 主导 地 位 的 混合 物 中 鉴别 磷酸 肽 ， 此 方法 使 用 的 是 磷酸 酶 (Zhang et al., 1998). FA fei 5489 MALDI-TOF 仪器 就 可 以 得 到 磷酸 化 蛋白 水 解 后 产生 肽 段 的 质量 ， 同 样 的 样品 用 磷酸 酶 处 理 后 ， 除 去 了 丝氨酸 、 苏 氨 酸 和 酷 氨 酸 上 的 磷酸 ， 再 分 析 其 质量 。 任 一 个 减少 了 80u 的 质量 数 ， 都 将 预示 着 这 一 肽 段 被 人 奋 酸化 了 。 MALDI 做 这 一 实验 的 优点 是 产生 的 肽 段 离子 更 倾向 于 单质 子 化 ， 使 谱 图 解析 比 ESI 更 容易 。 用 不 同 的 化 学 方法 处 理 丝 氨 酸 或 苏 氨 酸 磷酸 肽 ， 既 除去 了 磷酸 又 使 发 生 磷 酸化 修 饰 的 丝氨酸 或 苏 氨 酸 残 基 脱 水 ， 实 际 上 标记 了 先前 的 修饰 位 点 (Patterson，1998)。 磷 酸 肽 用 碱 处 理 后 发 生 磷酸 的 B- 消 除 ， 同 时 伴随 氨基 酸 侧 链 的 脱水 ， 使 氨基 酸 残 基 表 现 出 独特 的 质量 ( 比 正常 值 少 18u)。 这 一 手段 结合 MS/MS 技术 ， 已 应 用 于 高 磷酸 化 的 profilaggrin 磷酸 化 位 点 的 鉴定 (Resing et al., 1995).

5.7 酶 分 析 法 及 磷 蛋 白 分 析 的 未 来 方向

目前 磷酸 化 蛋白 质 分 析 的 局 限 性 围绕 在 体内 ”P 标 记 和 蛋白 的 直接 分 析 困 难 ， 有 两 个 问题 造成 这 些 困 难 。 第 一 是 磷酸 化 通常 是 低 化 学 计量 值 ， 要 求 在 质谱 分 析 前 对 磷酸 肽 进 行 一 定 程 度 的 富 集 。 第 二 是 不 能 产生 足够 的 体内 ”P 标 记 肽 用 于 质谱 鉴定 。 第 二 种 情况 必须 使 用 体外 ”P 标 记 肽 ， 要 求 体 内 和 体外 磷酸 蛋白 在 2D-PP 作 图 中 表现 一 致 。 这 就 使 磷 蛋 白 从 纯化 到 磷酸 肽 测序 这 一 全 过 程 耗 时 太 长 。 而 且 是 假设 激酶 在 已 知 条 件 下 可 以 在 体外 重 现 体内 磷酸 化 过 程 的 。 因 此 ， 还 是 需要 能 直接 分 析 体内 磷酸 化 蛋白 质 的 方法 。

虽然 产生 足够 量 体 内 ”P 标记 蛋白 这 一 问题 目前 还 不 可 能 直接 解决 ， 但 越 来 越 灵 敏 的 质谱 仪 可 以 减少 样品 的 消耗 量 。 例 如 使 用 MALDI 或 ESI 源 的 FT-ICR-MS， 对 多 肽 的 检测 灵敏 度 已 证 明 远 大 于 标准 的 三 级 四 极 和 离子 阱 技术 。 这 一 技术 可 常规 分 析 MALDISE EJL+ fmol 的 多 肽 样品 ， 精 确 测定 其 分 子 质量 (Solouki et al., 1995), BM 在 ICR 室 中 实际 样品 的 MS/MS 实验 灵敏 度 在 fmol 范围 ， 但 对 HPLC 柱 上 洗 脱 的 单个 肽 用 宽带 解吸 法 (broad-band dissociation) 可 以 做 到 amol 水 平 。 例 如 一 个 50um 内 径 的 微 毛细 管 HPLC 柱 可 将 9amol 的 磷酸 化 血管 紧张 素 开 导入 ESI 离子 源 ， 此 ESI 源 连 接 7T 的 FT-ICR-MS， 可 以 用 宽带 解吸 法 裂解 并 鉴定 此 标准 肽 〈Bruce J. E., Goodlett, D. R., Smith, R. D. and Abersold，R.，1998。 未 发 表 数 据 ， 来 自 Battelle Memorial 研 究 所 ， 环 境 与 分 子 科 学 实验 室 ，Richland，WA)。 这 种 灵敏 度 为 体内 有 限 样品 的 处 理 提 供 了 方便 。

仪器 控制 能 力 的 提高 对 磷酸 化 蛋白 质 分 析 性 能 的 提高 也 有 贡献 。 举 例 来 说 ， 如 果 自 动 化 的 LC-MS/MS 的 单 次 实验 操作 中 能 够 检测 样品 中 存在 的 磷酸 肽 ， 确 定 肽 段 质量 ， 还 能 够 得 到 CID 谱 ， 这 样 将 非常 理想 。 串 联 质谱 仪 如 果 能 实现 从 负离子 MS 到 正 离子 MS/MS 模式 快速 切换 的 功能 ， 上 面 的 想法 也 许 能 够 实现 。 在 这 种 质谱 仪 中 ， 可 用 前 面 提 到 的 其 中 一 种 负离子 检测 方式 如 源 内 CID 法 检测 磷酸 肽 并 测定 其 质量 数 。 检 测 到 的 磷酸 肽 信号 触发 仪器 转向 正 离子 模式 并 选择 检测 到 的 磷酸 肽 离子 作 CID 分 析 。 我 们 和 希 望 将 来 这 种 仪器 能 成 为 现实 。

新 兴 的 蛋白 质 组 学 领域 中 一 个 重要 的 部 分 就 是 需要 鉴定 混合 物 样 品 中 所 有 蛋白质 的 修饰 状态 。 因 此 ， 磷 酸化 蛋白 质 分 析 的 一 个 重要 延伸 及 今后 方向 是 有 关 样 品 中 磷酸 化 蛋

ALE 蛋白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 97 -

白 的 总 体 及 定量 分 析 。 目 前 ， 所 有 用 于 磷酸 化 蛋白 分 析 的 方法 都 集中 于 对 单一 蛋白 质 的 分 析 。 将 来 有 必要 对 目前 方法 加 以 简化 和 自动 化 以 适应 高 通 量 研究 ， 或 者 开发 完全 不 同 的 仪器 和 方法 以 适用 于 蛋白 质 组 范围 的 磷酸 化 研究 。

6. 目前 及 将 来 面临 的 机 遇 和 挑战

蛋白 质 的 鉴定 和 结构 确认 是 任何 一 个 蛋白 质 组 学 努力 探索 的 领域 中 必 不 可 少 的 部 分 。 为 了 使 蛋白 质 鉴定 更 有 效 ， 必 须 采 用 高 通 量 手段 ， 具 有 高 效率 ， 高 准确 度 和 灵敏 度 。 如 果 是 2-DE 分 离 的 蛋白 质 ， 实 现 这 一 目标 的 设想 是 采用 机 器 人 系统 。 此 系统 具有 专门 设计 的 切 胶 工 具 ， 用 于 从 胶 上 切 下 指定 的 蛋白 点 ， 还 具有 计算 机 控制 的 蛋白 质 酶 切 模具 。 图 像 分 析 系 统 检测 胶 上 或 转 印 到 膜 上 被 染色 的 蛋白 质 ， 图 像 系 统 还 具有 模式 消减 功能 ， 因 此 能 够 标 出 两 个 不 同样 品 之 间 有 定量 或 定性 差别 的 蛋白 质 。 有 分 析 价 值 的 斑点 被 标记 上 ， 切 点 工具 被 自动 引导 到 指定 的 坐标 ， 切 下 和 蛋白质 斑 点 。 切 下 来 的 斑点 被 转移 到 容器 中 用 于 酶 切 反 应 。 全 部 的 酶 切 过 程 至 少 要 包括 胶片 清洗 ， 加 入 酶 解 缓 冲 液 ， 肽 段 提取 及 样品 脱盐 ， 这 一 过 程 通常 是 由 独立 的 液体 输送 机 器 人 完成 的 ， 可 以 自动 平行 处 理 多 个 样品 (Traini et wz .，1998)。 同 一 机 器 人 还 能 从 每 一 样品 的 酶 切 液 中 取样 ， 点 到 MALDI 的 靶 上， 然后 进行 自动 化 的 MALDIMS 分 析 ， 分 析 过 程 也 不 需要 人 工 参 与 (Onnerfjord et al., 1999; Traini et al., 1998), MALDI-MS 分 析 得 出 的 质量 同样 也 可 实现 自动 高 通 量 肽 质量 检索 。 任 何 未 被 这 一 策略 鉴定 出 的 蛋白 质 ， 取 其 剩余 的 酶 切 产物 用 于 较 低 通 量 (但 仍然 是 自动 化 ) 的 技术 分 析 ， 例 如 LC-MS/MS， 用 数据 依赖 方式 产 生 碎 片 离子 谱 ， 并 自动 在 序列 数据 库 中 进行 检索 (Ducret et wz .，1998)。 剩 余 的 酶 切 溶 液 还 可 用 纳 喷 ESLMS/MS 分 析 ， 这 一 技术 仍然 是 较 低 通 量 的 ， 但 是 灵敏 度 很 高 (Shevchenko et al., 1996). LC-MS/MS 和 nano-ESI-MS/SM 都 能 从 MALDI-MS 分 析 已 经 确定 存在 的 质量 数 中 受益 。 这 里 反复 强调 的 一 个 策略 是 ， 首 先 用 高 通 量 手 段 鉴定 尽 可 能 多 的 蛋白 质 ， 然 后 再 使 用 低 通 量 (并 且 更 贵 ) 的 技术 手段 。MALDI-MS 分 析 也 能 够 将 那些 在 标准 酶 切 条 件 下 不 能 产生 肽 段 的 蛋白 排除 在 进一步 分 析 之 外 。 这 种 模式 的 系统 非常 昂贵 ， 需 要 大 量 样品 才 能 体现 其 价值 ， 所 以 只 限于 安装 在 核心 实验 室 或 专门 的 实验 室 。 另 外 ， 它 们 特别 适用 于 分 析 全 基因 组 测序 已 经 完成 的 物种 (MED) 中 的 蛋白 质 。 FA MALDI-MS 数据 在 EST 数据 库 中 鉴定 蛋白 质 还 存在 困难 ， 目 前 限制 了 这 一 系统 对 高 级 真 核 生物 ， 特 别 是 人 和 鼠 蛋 白质 的 鉴定 。

高 通 量 MS/MS 鉴定 蛋白 质 方法 的 进展 还 很 慢 ， 主 要 是 由 于 仪器 和 数据 处 理 过 程 的 复杂 性 。ESILMS/MS 仪器 的 微 流 控 (microfabricate) 样品 输送 系统 的 发 展 (Figeys et &E.，1998)， 以 及 MS/MS 无 需 纯 化 分 离 就 能 鉴定 较 复 杂 蛋 白质 混 合 物 各 组 分 的 可 能 (McCormack et wz .，1997)， 是 很 有 和 希望 的 技术 进展 ， 表 明 用 MS/MS 路 线 大 规模 鉴定 蛋 和 白质 的 技术 正在 迅速 进步 。

如 果 蛋 白质 能 从 胶 上 直接 分 析 ， 或 转 到 膜 上 后 直接 分 析 (用 MALDI-MS 分 析 )， 这 样 也 可 实现 高 通 量 ， 并 且 不 需要 从 胶 上 切 下 蛋白 点 及 大 量 的 液体 输送 系统 。 但 是 这 种 方 法 需要 在 MALDI-MS 分 析 之 前 将 酶 解 液 和 基质 液 运送 到 胶 上 / 膜 上 ， 并 且 不 能 牺牲 凝 胶 电泳 分 离 的 空间 分 辨 力 。 有 许多 小 组 已 经 在 这 一 构想 上 有 了 进展 ， 他 们 用 UV-MALDLI- MS 从 胶 上 直接 分 析 凝 胶 分 离 的 和 蛋白质 (Loo et wz .，1996)， 另 一 些小 组 用 UV 或 IR-

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MALDI-MS (Eckerskorn et al., 1997; Patterson, 1995; Strupat et al., 1994; Vestling and Fenselau, 1995) 直接 分 析 转 到 膜 上 的 蛋白 质 。 在 一 系列 proof-of-concept 实验 中 ， Loo, et al. (1996) 生成 了 真正 的 二 维 凝 胶 ， 他 们 用 UV-MALDI-MS 从 IEF 胶 上 直接 分 析 经 等 电 聚 焦 分 离 的 和 蛋白质， 生成 了 分 子 质量 二 维 谱 。 基 质点 在 凝 胶 表 面 ， 并 将 分 散 度 减少 到 最 小 程度 ， 因 此 保持 了 空间 分 辩 力 。 这 种 分 析 法 必须 采用 超 菏 胶 (0.35Smm) 以 保持 有 效 的 离子 化 。 同 一 小 组 还 报道 了 CNBr 水 解 的 和 蛋白质 也 适用 于 这 种 分 析 方 法 (Loo et al., 1997). {BJ PSD-MALDI-MS 通常 要 求 被 分 析 肽 段 小 于 CNBr 裂解 产生 的 AE, Pee eG PSD-MALDI-MS 可 直接 用 于 胶 上 分 析 。

许多 有 离子 化 抑制 效应 的 污染 物 通过 将 蛋白 质 转移 到 膜 上 可 以 被 洗 脱 ， 因 此 有 很 多 小 组 评估 了 凝 胶 分 离 转 膜 后 蛋白 质 的 离子 化 状态 。 采 用 这 一 技术 时 ， 在 引入 基质 溶液 时 要 特别 小 心 ， 因 为 有 机 溶剂 (在 基质 溶液 中 常用 ) 会 导致 重 日 质 分 散 ， 损 失 空间 分 辩 力 (如 上 所 述 ，Vestling and Fenselau，1994a，1994b)。 系 统 评价 不 同 的 膜 后 发 现 ，PVDF 膜 或 其 衍生 物 最 适用 此 类 实验 (Vestling and Fenselau，1995)。UV 和 IR 激光 都 被 用 于 膜 上 和 蛋白 的 离子 化 ， 两 者 都 已 成 功 ， 但 是 IR 激光 对 埋 在 膜 内 的 蛋白 质 的 提取 显得 更 有 效 (Schreiner et al., 1996; Strupat et al., 1994). Eckerskorn (1997) 已 经 报道 了 . 用 IR-MALDI-MS Xt B€ Be Ha Uk 37 BS FF EDS] PVDF 膜 上 的 蛋白 质 的 离子 化 是 可 能 的 ， 他 们 将 数据 转化 为 轮廓 线 来 反应 每 种 蛋白 质 的 丰 度 ， 因 此 在 MALDI-MS 分 析 前 不 需 将 和 蛋 白 显 像 。 但 是 ， 在 这 种 分 析 方 法 用 于 整个 2-DE 胶 上 斑点 之 前 ， 还 需要 解决 数据 处 理 方 面 的 重要 问题 。 另 外 ， 凝 胶 分 离 蛋白 质点 的 完整 分 子 质 量 的 测定 是 研究 蛋白 质 特 性 的 重 要 方面 ， 但 是 对 于 和 蛋白质 鉴 定 并 没有 明显 帮助 。 为 了 鉴定 ， 蛋 白质 必须 被 酶 解 〈 肽 质量 检索 策略 )， 并 且 / 或 产生 的 肽 段 必须 裂解 (未 解析 碎片 离子 检索 策略 )。 膜 上 蛋白 的 肽 水 解 也 已 实施 ， 并 用 UV 和 IR-MALDI-MS 都 分 析 过 (Eckerskorn et al., 1997; Vestling and Fenselau，1994b)。 但 是 ， 目 前 为 止 仅 有 UV-MALDI-MS 的 PSD 数据 发 表 (Fabris et al., 1995), 2%%# PSD-(IR)-MALDI-MS 的 数据 。

Hochstrasser (1998) 引入 了 “分 子 扫 描 ” (molecular scanner) 的 概念 ， 即 2-DE 分 离 的 蛋白 质 电 转 印 到 膜 上 ， 用 MALDI-MS 以 自动 化 模式 分 析 膜 上 所 有 的 点 。 最 终 ， Hochstrasser 的 小 组 发 明了 对 2-DE 胶 上 所 有 的 点 进行 大 规模 平行 酶 切 的 技术 。 他 们 将 胰 蛋 白 酶 固定 化 到 膜 上 ， 再 将 此 膜 放 在 凝 胶 和 PVDF 膜 之 间 ， 在 电 转 印 过 程 中 施加 一 个 脉冲 电场 ， 蛋 白质 从 胶 上 被 慢 慢 转 移 ， 并 通过 覆盖 有 胰 和 蛋白酶 的 膜 被 水 解 。 水 解 剩余 的 完整 蛋白 同 此 蛋白 质 的 酶 切 肽 段 一 起 被 PVDF 膜 吸 附 ， 并 由 MALDI-MS 分 析 ， 用 UV BK IR 激光 都 获 成 功 (Hochstrasser，1998)。 尽 管 所 有 这 些 技 术 都 处 于 开发 的 早期 阶 段 ， 但 它们 仍 显 示 出 这 种 分 析 方式 是 可 行 的 。 一 旦 膜 上 肽 段 的 PSD-MALDI-MS 分 析 的 所 有 难题 都 被 解决 ， 最 重要 的 是 这 一 过 程 的 自动 化 问题 的 解决 ， 这 一 整体 策略 的 力量 就 能 被 充分 证 明 。 目 前 这 一 技术 的 最 大 问题 是 ， 产 生 的 肽 段 的 数目 有 限 ， 这 些 肽 段 在 进行 PSD 分 析 时 必须 能 够 产生 足够 数量 的 碎片 离子 并 能 成 功 进行 数据 库 检 索 。 但 是 ， 通 过 使 用 化 学 修饰 步骤 来 增强 离子 化 和 肽 段 的 裂解 ， 这 一 问题 将 会 被 很 好 地 解决 (Spengler et al., 1997).

尽管 由 于 2-DE 具有 高 分 辨 力 ， 是 蛋白 质 组 研究 最 常 使 用 的 蛋白 质 分 离 技术 ， 但 是 以 色谱 为 基础 的 分 离 技术 的 研究 也 正在 开发 中 ， 因 为 色谱 技术 更 易 与 MS/MS 在 线 整

ALE ”蛋白 质 鉴 定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 99 -

合 。Opiteck 等 已 经 用 2-D 色谱 (阳离子 交换 - 反 相 ， 用 两 套 独立 的 液 相 和 泵 ) 分 离 了 如 大 肠 杆 菌 裂 解 液 中 的 蛋白 质 混 合 物 ， 并 进行 在 线 ESLMS 分 析 ， 所 有 过 程 在 两 小 时 内 完成 (Opiteck et w.，1997b)。 他 们 对 诱导 和 非 诱 导 大 肠 杆 菌 裂 解 液 分 别 分 析 ， 鉴 定 出 一 个 过 度 表达 的 蛋白 质 。 同 一 小 组 还 报道 使 用 这 一 技术 分 离 了 肽 混合 物 (Opiteck et al., 1997a) 。Hsieh 等 (Hsieh et al., 1996) 使 用 了 由 计算 机 控制 的 配件 ， 包 括 一 个 自动 进 样 器 ，5 个 柱子 ，3 个 10 通 阀 ， 使 一 系列 步骤 在 线 进 行 ， 避 免 任 何 用 手工 操作 进行 的 物 质 转 移 。 这 一 策略 用 于 从 混合 物 中 免疫 亲 和 提 取 鉴 定 蛋白 质 ， 包 括 以 下 一 系列 步骤 : 免 疫 亲 和 色谱 ; 在 一 混合 填充 的 强 离子 交换 吸附 柱 上 进行 脱盐 和 缓冲 液 交 换 ; 在 一 个 固定 化 胰 和 蛋白酶 柱 上 进行 酶 切 ; 在 一 短 毛 细 管 灌注 反 相 柱 上 提取 肽 段 ; 最 后 在 一 个 分 析 型 的 反 相 柱 上 进行 分 离 并 与 MS/MS 在 线 连接 分 析 (Hsieh et al., 1996).

不 管 最 初 的 蛋白质 分 离 采 用 2-DE 还 是 靶 向 色谱 技术 ， 为 了 最 准确 地 鉴定 蛋白 质 ， 还 是 需要 生成 序列 特异 性 的 碎片 离子 谱 。 在 这 一 点 上 ， 尽 管 未 解析 碎片 离子 检索 程序 在 目前 格式 下 的 作用 很 大 ， 但 它们 并 没有 利用 碎片 离子 谱 中 包含 的 另外 的 信息 : 碎片 离子 的 相对 丰 度 信息 。 目 前 的 检索 程序 是 将 实验 测 得 的 质量 值 与 预期 值 进行 比较 ， 当 一 个 科 学 家 在 评价 一 个 图 谱 时 ， 要 考虑 各 种 肽 键 裂解 的 倾向 大 小 ， 因 为 碎片 离子 谱 可 被 看 作 每 一 肽 键 裂 解 的 特性 曲线 ， 某 些 氨基 酸 残 基 旁 的 肽 键 在 气相 中 更 易于 断裂 。 当 检索 程序 能 利用 碎片 离子 相对 强度 信息 时 ， 鉴 定 的 置信 水 平 会 提高 ， 使 其 能 真正 实现 自动 化 。 这 是 任何 大 规模 蛋白 质 组 学 研究 要 努力 达到 的 一 个 重要 目标 。

， 致 谢 ;

作者 D. R. G. AR. A. 感谢 国家 科学 基金 会 分 子 生 物 技 术科 学 和 技术 中 心 和 Kinetek Pharmaceuticals 的 基金 资助 ， 感 谢 国 立 卫生 研究 院 对 作者 RR. A. 的 研究 基金 资 助 (No. 1RO1 Al 41109-01). {EA D. R. G. RAJ. D. Watts 博士 帮助 讨论 磷酸 化 蛋 白质 分 析 。

参考 文献

Aebersold, R. and Leavitt, J. (1990) Sequence analysis of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis: towards an integrated protein database. Electrophoresis 11: 517-527.

Aebersold, R. and Patterson, S.D. (1998) Current problems and technical solutions in protein biochemistry. In: Proteins: Analysis and Design (ed. R.H. Angeletti). Academic Press, San Diego, CA, pp. 3-120. :

Aebersold, R.H., Teplow, D.B., Hood, L.E. and Kent, S.B.H. (1986) Electroblotting onto activated glass. High efficiency preparation of proteins from analytical sodium dodecy! sulfate-poly- acrylamide gels for direct sequence analysis. J. Biol. Chem. 261: 4229-4238.

Aebersold, R.H., Leavitt, J., Saavedra, R.A., Hood, L.E. and Kent, S.B. (1987) Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 6970-6974.

Aebersold, R., Watts, J.D., Morrison, H.D. and Bures, E.J. (1991) Determination of the site of tyrosine phosphorylation at the low picomole level by automated solid-phase sequence analysis. Anal. Biochem. 199: 51-60.

Aebersold, R., Figeys, D., Gygi, S., Corthals, G., Haynes, P., Rist, B., Sherman, J., Shang, Y. and

。 100 - 蛋白 质 组 学

Goodlett, D. (1998) Towards an integrated technology for the generation of multidimensional protein expression maps. J. Protein Chem. 17: 533-535.

Affolter, M., Watts, J.D., Krebs, D.L. and Aebersold, R. (1994) Evaluation of 2-dimensional phosphopeptide maps by electrospray-ionization mass-spectrometry of recovered peptides. Anal. Biochem. 223: 74-81.

Annan, R.S. and Carr, S.A. (1996) Phosphopeptide analysis by matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 68: 3413-3421.

Bartlet-Jones, M., Jeffery, W.A., Hansen, H.F. and Pappin, D.J.C. (1994) Peptide ladder sequencing by mass-spectrometry using a novel, volatile degradation reagent. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 737-742.

Biemann, K. (1990) Nomenclature for peptide fragment ions (positive ions). [Appendix 5]. Methods Enzymol. 193: 886-887.

Boyle, W.J., van der Geer, P. and Hunter, T. (1991) Phosphopeptide mapping and phosphoamino acid analysis by two-dimensional separation on thin-layer cellulose plates. Methods Enzymol. 201: 110-149.

Brown, J.L. (1979) A comparison of the turnover of amino-terminally acetylated and non- acetylated mouse L-cell proteins. J. Biol. Chem. 254: 1447-1449.

Brown, J.L. and Roberts, W.K. (1976) Evidence that approximately eighty percent of the soluble proteins from Ehrlich ascites cells are amino-terminally acetylated. J. Biol. Chem. 251: 1009- 1014.

Brown, R.S. and Lennon, J.J. (1995) Mass resolution improvement by incorporation of pulsed ion extraction/ionization linear time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 67: 1998-2003.

Carr, S.A. and Annan, R.S. (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology (eds F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Struhl). Wiley, New York, pp. 10.21.1—10.21.27.

Chait, B.T., Wang, R., Beavis, R.C. and Kent, S.B.H. (1993) Protein ladder sequencing. Science 262: 89-92.

Charbonneau, H. and Tonks, N.K. (1992) 1002 Protein phosphatases? Annu. Rey. Cell Biol. 8: 463- 493.

Chaurand, P., Luetzenkirchen, F. and Spengler, B. (1999) Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10: 91-103.

Cordwell, S.J., Wilkins, M.R., Cerpa-Poljak, A., Gooley, A.A., Duncan, M., Williams, K.L. and Humphery-Smith, I. (1995) Cross-species identification of proteins separated by two-dimen- sional gel electrophoresis using matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight mass spectrometry and amino acid composition. Electrophoresis 16: 438-443.

Cornish, T.J. and Cotter, R.J. (1994) A curved field reflectron time-of-flight mass-spectrometer for the simultaneous focusing of metastable product ions. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 781\— 785.

Courchesne, P.L. and Patterson, S.D. (1998) Identification of proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using peptide and fragment-ion masses. Methods Mol. Biol. 112: 487-511.

Courchesne, P.L., Jones, M.D., Robinson, J.R., Spahr, C.S., McCracken, S., Bentley, D.L., Luethy, R. and Patterson, S.D. (1998) Optimization of capillary chromatography ion-trap mass spectrometry for identification of gel-separated proteins. Electrophoresis 19: 956-967.

Covey, T.R., Huang, E.C. and Henion, J.D. (1991) Structural characterization of protein tryptic peptides via liquid chromatography/mass spectrometry and collision induced dissociation of their doubly charged molecular ions. Anal. Chem. 63: 1193-1200.

Craig, A.G., Fischer, W.H., Rivier, J.E., McIntosh, J.M. and Gray, W.R. (1995) MS based scanning methodologies applied to Conus venom. In: Techniques in Protein Chemistry VI (ed. J.W. Crabb). Academic Press, San Diego, CA, pp. 31-38.

Davis, M.T. and Lee, T.D. (1997) Variable flow liquid chromatography-tandem mass spectrometry and the comprehensive analysis of complex protein digest mixtures. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8: 1059-1069.

DeGnore, J.P. and Qin, J. (1998) Fragmentation of phosphopeptides in an ion trap mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9: 1175-1188.

FRE ”蛋白 质 鉴 定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 101 -

Duclos, B., Marcandier, S. and Cozzone, A.J. (1991) Chemical properties and separation of phosphoamino acids by thin-layer chromatography and/or electophoresis. Methods Enzymol. 201: 10-21.

Ducret, A., van Oostveen, I., Eng, J.K., Yates, J.R. JU and Aebersold, R. (1998) High throughput protein characterization by automated reverse-phase chromatography/electrospray tandem mass spectrometry. Protein Sci. 7: 706-719.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Schleuder, D., Hochstrasser, D., Sanchez, J.-C., Lottspeich, F. and Hillenkamp, F. (1997) Analysis of proteins by direct-scanning infrared-MALDI mass spectro- metry after 2D-PAGE separation and electroblotting. Anal. Chem. 69: 2888-2892.

Eng, J.K., McCormack, A.L. and Yates, J.R. III (1994) An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5: 976-989.

Fabris, D., Vestling, M.M., Cordero, M.M., Doroshenko, V.M., Cotter, R.J. and Fenselau, C. (1995) Sequencing electroblotted proteins by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1051-1055.

Fenn, J.B., Mann, M., Meng, C.K., Wong, S.F. and Whitehouse, C.M. (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246: 64-71.

Fenyo, D., Qin, J. and Chait, B.T. (1998) Protein identification using mass spectrometric information. Electrophoresis 19: 998-1005.

Figeys, D. and Aebersold, R. (1998) High sensitivity analysis of proteins and peptides by capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry: recent devlopments in technology and applications. Electrophoresis 19: 885-892.

Figeys, D., Gygi, S.P., McKinnon, G. and Aebersold, R. (1998) An integrated microfluidics-tandem mass spectrometry system for automated protein analysis. Anal. Chem. 70: 3728-3734.

‘Fischer, E.H. and Krebs, E.G. (1989) Commentary on “the phosphorylase b to a converting enzyme of rabbit skeletal muscle”. Biochim. Biophys. Acta 1000: 297-301.

Fraser, C.M. and Fleischmann, R.D. (1997) Strategies for whole microbial genome sequencing and analysis. Electrophoresis 18: 1207-1216.

Gatti, A. and Traugh, J.A. (1999) A two-dimensional peptide gel electrophoresis system for phosphopeptide mapping and amino acid sequencing. Anal. Biochem. 266: 198-204.

Gibson, B.W. and Cohen, P. (1990) Liquid secondary ion mass spectrometry of phosphorylated and sulfated peptides and proteins. Methods Enzymol. 193: 480—S01.

Heffetz, D., Fridkin, M. and Zick, Y. (1989) Antibodies directed against phosphothreonine residues as potent tools for studying protein phosphorylation. Eur. J. Biochem. 182: 343-348. Henzel, W.J., Billeci, T.M., Stults, J.T., Wong, S.C., Grimley, C. and Watanabe, C. (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide

fragments in protein sequence databases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5011-5015.

Hewick, R.M., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E. and Dreyer, W.J. (1981) A gas-liquid solid phase peptide and protein sequenator. J. Biol. Chem. 256: 7990-7997.

Hildebrandt, E. and Fried, V.A. (1989) Phosphoamino acid analysis of protein immobilized on polyvinylidene difluoride membrane. Anal. Biochem. 177: 407-412.

Hochstrasser, D.F. (1998) Proteome in perspective. Clin. Chem. Lab. Med. 36: 825-836.

Hsieh, Y.L., Wang, H., Elicone, C., Mark, J., Martin, S.A. and Regnier, F. (1996) Automated analytical system for the examination of protein primary structure. Anal. Chem. 68: 455-462. Huang, Z.-H., Shen, T., Wu, J., Gage, D.A. and Watson, J.T. (1999) Protein sequencing by matrix- assisted laser desorption ionization-postsource decay-mass spectrometry analysis of the N- Tris(2,4,6-trimethoxypheny]l)phosphine-acetylated tryptic digests. Anal. Biochem. 268: 305-317.

Huddleston, M.J., Annan, R.S., Bean, M.F. and Carr, S.A. (1993) Selective detection of phosphopeptides in complex mixtures by electrospray liquid chromatography/mass spectro- metry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 4: 710-717.

Hunt, D.F., Yates, J.R. III, Shabanowitz, J., Winston, S. and Hauer, C.R. (1986) Protein sequencing by tandem mass spectrometry. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 6233-6237.

Hunter, A.P. and Games, D.E. (1994) Chromatographic and mass spectrometric methods for the identification of phosphorylation sites in phosphoproteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 559-570.

Hunter, T. (1987) 1001 protein kinases. Ce// 50: 823-829.

- 102 - 蛋白 质 组 学

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. and Gonnet, G. (1993) Protein identification by mass profile fingerprinting. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 58-64.

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. and Gonnet, G. (1994) Protein identification in DNA databases by peptide mass fingerprinting. Protein Sci. 3: 1347-1350.

Jardine, I. (1990) Molecular weight analysis of proteins. Methods Enzymol. 193: 441-455.

Jensen, O.N., Podtelejnikoy, A. and Mann, M. (1996a) Delayed extraction improves specificity in database searches by matrix-assisted laser desorption/ionization peptide maps. Rapid Commun. Mass Spectrom. 10: 1371-1378.

Jensen, O.N., Vorm, O. and Mann, M. (1996b) Sequence patterns produced by incomplete enzymatic digestion or one-step Edman degradation of peptide mixtures as probes for protein database searches. Electrophoresis 17: 938-944.

Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V. and Mann, M. (1997) Identification of the components of simple protein mixtures by high accuracy peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 69: 4741-4750. ‘

Jensen, O.N., Larsen, M.R. and Roepstorff, P. (1998) Mass spectrometric identification and microcharacterization of proteins from electrophoretic gels: strategies and applications. Proteins 2 (Suppl.): 74-89.

Johnson, L.N. and Barford, D. (1990) Glycogen phosphorylase. The structural basis of the allosteric response and comparison with other allosteric proteins. J. Biol. Chem. 265: 2409-— 2412.

Jonscher, K.R. and Yates, J.R. III (1997) The quadupole ion trap mass spectrometer — a small solution to a big challenge. Anal. Biochem. 244: 1-15.

Joung, I., Kim, T., Stolz, L.A., Payne, G., Winkler, D.G., Walsh, C.T., Strominger, J.L. and Shin, J. (1995) Modification of Ser59 in the unique N-terminal region of tyrosine kinase pS6lck regulates specificity of its Src homology 2 domain. Proc. Nati Acad. Sci. USA 92: 5778-5782.

Karas, M. and Hillenkamp, F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10 000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301.

Katta, V., Chowdhury, S.K. and Chait, B.T. (1991) Use of a single-quadrupole mass spectrometer for collision-induced dissociation studies of multiply charged peptide ions produced by electrospray ionization. Anal. Chem. 63: 174-178.

Kaufmann, R., Kirsch, D. and Spengler, B. (1994) Sequencing of peptides in a time-of-flight mass spectrometer: evaluation of postsource decay following matrix-assisted laser desorption ioniza- tion (MALDI). Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 131: 355-385.

Krishna, R.G. and Wold, F. (1998) Posttranslational modifications. In: Proteins: Analysis and Design (ed. R.H. Angeletti). Academic Press, San Diego, CA, pp. 121-206.

Lamond, A.I. and Mann, M. (1997) Cell biology and the genome projects — a concerted strategy for characterizing multiprotein complexes by using mass spectrometry. Trends Cell Biol. 7: 139- 142.

Loo, J.A., Edmonds, C.G. and Smith, R.D. (1990) Primary sequence information from intact proteins by electrospray ionization tandem mass spectrometry. Science 248: 201-204.

Loo, R.R.O., Stevenson, T.I., Mitchell, C., Loo, J.A. and Andrews, P.C. (1996) Mass-spectrometry of proteins directly from polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68: 1910-1917.

Loo, R.R.O., Mitchell, C., Stevenson, T.I., Martin, S.A., Hines, W., Juhasz, P., Patterson, D., Peltier, J., Loo, J.A. and Andrews, P.C. (1997) Sensitivity and mass accuracy for proteins analyzed directly from polyacrylamide gels: implications for proteome mapping. Electrophoresis 18: 382-390.

Louris, J.N., Brodbelt-Lustig, J.S., Cooks, R.G., Glish, G.L., van Berkel, G.J. and McLuckey, S.A. (1990) Ion isolation and sequential stages of mass spectrometry in a quadrupole ion trap mass spectrometer. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 96: 117-137.

Mann, M. and Wilm, M. (1994) Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal. Chem. 66: 4390-4399.

Mann, M., Hojrup, P. and Roepstorff, P. (1993) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. Biol. Mass Spectrom. 22: 338-345.

Matsudaira, P. (1987) Sequence analysis from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262: 10035-10038.

第 五 章 ， 蛋 白质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 103°:

McCormack, A.L., Schieltz, D.M., Goode, B., Yang, S., Barnes, G., Drubin, D. and Yates, J.R. III (1997) Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level. Anal. Chem. 69: 767-776.

Meyer, H.E., Eisermann, B., Heber, M., Hoffmann-Posorske, E., Korte, H., Weigt, C., Wegner, A., Hutton, T., Donella-Deana, A. and Perich, J.W. (1993) Strategies for nonradioactive methods in the localization of phosphorylated amino acids in proteins. FASEB J. 7: 776-782.

Moritz, R.L., Eddes, J., Ji, H., Reid, G.E. and Simpson, R.J. (1995) Rapid separation of proteins and peptides using conventional silica-based supports: identification of 2-D gel proteins following in-gel proteolysis. In: Techniques in Protein Chemistry VI (ed. J.W. Crabb). Academic Press, San Diego, CA, pp. 311-319.

Neville, D.C., Rozanas, C.R., Price, E.M., Gruis, D.B., Verkman, A.S. and Townsend, R.R. (1997) Evidence for phosphorylation of serine 753 in CFTR using a novel metal-ion affinity resin and matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Protein Sci. 6: 2436-2445.

Nuwaysir, L.M. and Stults, J.T. (1993) Electrospray ionization mass sepctrometry of phospho- peptides isolated by on-line immobilized metal-ion affinity chromatography. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 4: 662-669.

Onnerfjord, P., Ekstrom, S., Bergquist, J., Nilson, J., Laurell, T. and Marko-Varga, G. (1999) Homogenous sample preparation for automated high throughput analysis with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13: 315-322.

Opiteck, G.J., Jorgenson, J.W. and Anderegg, R.J. (1997a) Two-dimensional SEC/RPLC coupled to mass spectrometry for the analysis of peptides. Anal. Chem. 69: 2283-2291.

Opiteck, G.J., Lewis, K.C., Jorgenson, J.W. and Anderegg, R.J. (1997b) Comprehensive on-line

_ LC/LC/MS of proteins. Anal. Chem. 69: 1518-1524.

Pappin, D.J.C., Hojrup, P. and Bleasby, A.J. (1993) Rapid identification of proteins by peptide- mass fingerprinting. Curr. Biol. 3: 327-332.

Pappin, D.J.C., Rahman, D., Hansen, H.F., Bartlet-Jones, M., Jeffery, W. and Bleasby, A.J. (1995) Chemistry, mass spectrometry and peptide-mass databases: Evolution of methods for the rapid identification and mapping of cellular proteins. In: Mass Spectrometry in the Biological Sciences (eds A.L. Burlingame and S.A. Carr). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 135-150.

Patterson, D.H., Tarr, G.E., Regnier, F.E. and Martin, S.A. (1995) C-Terminal! ladder sequencing via matrix-assisted laser-desorption mass-spectrometry coupled with carboxypeptidase-Y time- dependent and concentration-dependent digestions. Anal. Chem. 67: 3971-3978.

Patterson, S.D. (1994) From electrophoretically separated protein to identification: strategies for sequence and mass analysis. Anal. Biochem. 221: 1 一 15.

Patterson, S.D. (1995) Matrix-assisted laser-desorption/ionization mass spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins in the 5-50 pmol range. Electrophoresis 16: 1104— 1114. -

Patterson, S.D. (1997) Identification of low to subpicomolar quantities of electrophoretically separated proteins: towards protein chemistry in the post-genome era. Biochem. Soc. Trans. 25: 255-262.

Patterson, S.D. (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology (eds F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Struhl). Wiley, New York, pp. 10.22.1—10.22.24.

Patterson, S.D. and Aebersold, R. (1995) Mass spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. Electrophoresis 16: 1791-1814.

Patterson, S.D. and Garrels, J.I. (1994) Two-dimensional gel electrophoresis of post-translational modifications. In: Cell Biology: a Laboratory Handbook (ed. J.E. Celis). Academic Press, New York, pp. 249-257.

Pluskal, M.G., Przekop, M.B., Kavonian, M.R., Vecoli, C. and Hicks, D.A. (1986) Immobilon™ PVDF transfer membrane: a new membrane substrate for western blotting of proteins. BioTechniques 4: 272-283.

Qin, J., Herring, C.J. and Zhang, X. (1998) De novo peptide sequencing in an ion-trap mass spectrometer with '*O labeling. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12: 209-216.

Reinhold, V.N., Reinhold, B.B. and Costello, C.E. (1995) Carbohydrate molecular weight profiling,

eee 蛋白 质 组 学

sequence, linkage, and branching data: ES-MS and CID. Anal. Chem. 67: 1772-1784.

Resing, K.A., Johnson, R.S. and Walsh, K.A. (1995) Mass spectrometric analysis of 21 phosphoryl- ation sites in the internal repeat of rat profilaggrin, precursor of an intermediate filament associated protein. Biochemistry 34: 9477-9487.

Roth, K.D.W., Huang, Z.H., Sadagopan, N. and Watson, J.T. (1998) Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 17: 255-274.

Schnolzer, M., Jedrzejewski, P. and Lehmann, W.D. (1996) Protease-catalyzed incorporation of O- 18 into peptide-fragments and its application for protein sequencing by electrospray and matrix- assisted laser desorption/ionization mass-spectrometry. Electrophoresis 17: 945-953.

Schreiner, M., Strupat, K., Lottspeich, F. and Eckerskorn, C. (1996) Ultraviolet matrix-assisted laser-desorption ionization-mass spectrometry of electroblotted proteins. Electrophoresis 17: 954-961.

Schwartz, J.C. and Jardine, I. (1996) Quadrupole ion trap mass spectrometry. Methods Enzymol. 270: 552-586. f

Sechi, S. and Chait, B.T. (1998) Modification of cysteine residues by alkylation. A tool in peptide mapping and protein identification. Anal. Chem. 70: 5150-5158.

Shevchenko, A., Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V., Sagliocco, F., Wilm, M., Vorm, O., Mortensen, P., Shevchenko, A., Boucherie, H. and Mann, M. (1996) Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proc. Natl Acad. Sci USA 93: 14440-14445.

Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standin, K.G., Thomson, B., Wilm, M. and Mann, M. (1997) Rapid ‘de novo’ peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1015-1024.

Solouki, T., Marto, J.A., White, F.M., Guan, S. and Marshall, A.G. (1995) Attomole biomolecule mass analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance. Anal. Chem. 67: 4139-4144.

Soskic, V., Gorlach, M., Poznanovic, S., Boehmer, F.D. and Godovac-Zimmerman, J. (1999) Functional proteomics analysis of signal transduction pathways of the platelet-derived growth factor B receptor. Biochemistry 38: 1757-1764.

Spengler, B., Luetzenkirchen, F., Metzger, S., Chaurand, P., Kaufmann, R., Jeffery, W., Bartlet- Jones, M. and Pappin, D.J.C. (1997) Peptide sequencing of charged derivatives by postsource decay MALDI mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 169/170: 127-140.

Stahl, D.C., Swiderek, K.M., Davis, M.T. and Lee, T.D. (1996) Data-controlled automation of liquid-chromatography tandem mass-spectrometry analysis of peptide mixtures. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 7: 532-540.

Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F., Eckerskorn, C. and Lottspeich, F. (1994) Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of proteins electroblotted after polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Chem. 66: 464-470.

Takach, E.J., Hines, W.M., Patterson, D.H., Juhasz, P., Falick, A.M., Vestal, M.L. and Martin, S.A. (1997) Accurate mass measurements using MALDI-TOF with delayed extraction. J. Protein Chem. 16: 363-369.

Tempst, P., Link, A.J., Riviere, L.R., Fleming, M. and Elicone, C. (1990) Internal sequence analysis of proteins separated on polyacrylamide gels at the submicrogram level: improved methods, applications and gene cloning strategies. Electrophoresis 11: 537-553.

Tempst, P., Posewitz, M.C. and Erdjument-Bromage, H. (1998) Micro-sample handling as a front- end to mass spectrometry. In: Proceedings of the 46th American Society for Mass Spectrometry Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, FL, 31 May—4 June, 1998, p. 437.

Traini, M., Gooley, A.A., Ou, K., Wilkins, M.R., Tonella, L., Sanchez, J.-C., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1998) Towards an automated approach for protein identification in proteome projects. Electrophoresis 19: 1941-1949.

Vandekerckhove, J., Bauw, G., Puype, M., Van Damme, J. and Van Montagu, M. (1985) Protein- blotting on polybrene-coated glass-fiber sheets. Eur. J. Biochem. 152: 9-19.

Vestal, M.L., Juhasz, P. and Martin, S.A. (1995) Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1044-1050.

Vestling, M.M. and Fenselau, C. (1994a) Poly(vinylidene difluoride) membranes as the interface

PRE .蛋白 质 鉴定 和 磷酸 化 位 点 分 析 的 质谱 方法 - 105 -

between laser desorption mass spectrometry, gel electrophoresis, and in situ proteolysis. Anal. Chem. 66: 471-477.

Vestling, M.M. and Fenselau, C.C. (1994b) Protease digestions on PVDF membranes for matrix- assisted laser desorption mass spectrometry. In: Techniques in Protein Chemistry V (ed. J.W. Crabb). Academic Press, San Diego, CA, pp. 59-67.

Vestling, M.M. and Fenselau, C. (1995) Surfaces for interfacing protein gel electrophoresis directly with mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 14: 169-178.

Wang, R., Chait, B.T. and Kent, S.B.H. (1994) Protein ladder sequencing: towards automation. In: Techniques in Protein Chemistry V (ed. J.W. Crabb). Academic Press, San Diego, CA, pp. 19- 26.

Wange, R.L., Isakov, N., Burke, T.R., Otaka, A., Roller, P.P., Watts, J.D., Aebersold, R. and Samelson, L.E. (1995) F-2(Pmp)(2)-Tam-Zeta(3), a novel competitive inhibitor of the binding of Zap-70 to the T-cell antigen receptor, blocks early T-cell signaling. J. Biol. Chem. 270: 944— 948.

Watts, J.D., Welham, M.J., Kalt, L., Schrader, J.W. and Aebersold, R. (1993) IL-2 stimulation of T lymphocytes induces sequential activation of mitogen-activated protein kinases and phos- phorylation of p56lck at serine-59. J. Immunol. 151: 6862-6871.

Watts, J.D., Affolter, M., Krebs, D.L., Wange, R.L., Samelson, L.E. and Aebersold, R. (1994) Identification by electrospray ionization mass spectrometry of the sites of tyrosine phosphory]- ation induced in activated Jurkat T cells on the protein tyrosine kinase ZAP-70. J. Biol. Chem. 269: 29 520-29 529.

Watts, J.D., Brabb, T., Bures, E.J., Wange, R.L., Samelson, L.E. and Aebersold, R. (1996a) Identification and characterization of a substrate specific for the T cell protein tyrosine kinase Zap-70. FEBS Lett. 398: 217-222.

Watts, J.D., Affolter, M., Krebs, D.L., Wange, R.L., Samelson, L.E. and Aebersold, R. (1996b) Electrospray ionization mass spectrometric investigation of signal transduction pathways: determination of sites of inducible protein phosphorylation in activated T-cells. In: Biochemical and Biotechnological Applications of Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ed. A.P. Snyder), ACS Symposium Series. American Chemical Society, Washington, DC, pp. 381-407.

Wettenhall, R.E., Aebersold, R.H. and Hood, L.E. (1991) Solid-phase sequencing of 32P-labeled phosphopeptides at picomole and subpicomole levels. Methods Enzymol. 201: 186-199.

Whalen, S.G., Gingras, A.C., Amankwa, L., Mader, S., Branton, P.E., Aebersold, R. and Sonenberg, N. (1996) Phosphorylation of eIF-4E on serine 209 by protein kinase C is inhibited by the translational repressors, 4E-binding proteins. J. Biol. Chem. 271: 11 831-11 837.

Wiley, W.C. and McLaren, I.H. (1953) Time-of-flight mass spectrometer with improved resolu- tion. Rev. Sci. Instrum. 26: 1150-1157.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Wheeler, C.H., Lindskog, I., Sanchez, J.-C., Bairoch, A., Appel, R.D., Dunn, M.J. and Hochstrasser, D.F. (1998) Multiple parameter cross-species protein identifica- tion using Multildent — a World Wide Web accessible tool. Electrophoresis 19: 3199-3206.

Wilm, M.S. and Mann, M. (1994) Electrospray and Taylor—Cone theory, Dole’s beam of macromolecules at last? /nt. J. Mass Spectrom. Ion Processes 136: 167-180.

Wilm, M. and Mann, M. (1996) Analytical properties of the nanoelectrospray ion-source. Anal. Chem. 68: 1-8.

Wilm, M., Neubauer, G. and Mann, M. (1996) Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Anal. Chem. 68: 527-533.

Woods, A.S., Huang, A.Y.C., Cotter, R.J., Pasternack, G.R., Pardoll, D.M. and Jaffee, E.M. (1995) Simplified high-sensitivity sequencing of a major histocompatibility complex class I- associated immunoreactive peptide using matrix-assisted laser-desorption ionization mass- spectrometry. Anal. Biochem. 226: 15-25.

Yates, J.R. III, Speicher, S., Griffin, P.R. and Hunkapiller, T. (1993) Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214: 397-408.

Yates, J.R. III, McCormack, A.L., Hayden, J.B. and Davey, M.P. (1994) Sequencing peptides derived from the Class II major histocompatibility complex by tandem mass spectrometry. In: Cell Biology: a Laboratory Handbook (ed. J.E. Celis). Academic Press, New York, pp. 380-388.

Yates, J.R. Il, Eng, J.K. and McCormack, A.L. (1995a) Mining genomes -- correlating tandem

mass-spectra of modified and unmodified peptides to sequences in nucleotide databases. Anal. Chem. 67: 3202-3210.

- 106 . 蛋白 质 组 学

Yates, J.R. III, Eng, J.K., McCormack, A.L. and Schieltz, D. (1995b) Method to correlate tandem mass-spectra of modified peptides to amino-acid-sequences in the protein database. Anal. Chem. 672 1426-1436.

Zhang, X., Herring, C.J., Romano, P.R., Szezepanowska, J., Brzeska, H., Hinnebusch, A.G. and Qin, J. (1998) Identification of phosphorylation sites in proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Chem. 70: 2050-2059.

BNE ARERR HK AR a OT Klaus-Peter Pleissner, Helmut Oswald and Susan Wegner 1. 介绍

二 维 电 泳 技术 可 根据 蛋白 质 的 等 电 点 和 分 子 质 量 从 一 个 复杂 的 蛋白 质 溶液 中 分 离 成 百 上 千 的 多 肽 。 我 们 利用 染色 的 方法 ， 在 胶 上 可 通过 大 小 、 明 暗 度 和 位 置 等 各 异 (LS 四 章 ) 的 蛋白 斑点 检测 到 蛋白 质 。 几 种 类 型 的 凝 胶 和 染色 方法 是 可 行 的 ， 但 在 实验 室 之 间 存 在 差异 。 通 常 的 结果 是 获得 二 维 电泳 的 凝 胶 图 谱 ， 并 开始 进一步 加 工 以 揭示 图 像 所 含有 的 上 千 个 蛋白 质 的 信息 。 大 量 的 数据 以 及 在 客观 性 、 重 复 性 、 定 量 分 析 的 需要 使 计 算 机 辅助 的 图 像 分 析 方 法 成 为 必需 。 这 些 特殊 性 质 〈 即 蛋白 斑点 的 凝 胶 图 像 ) 可 利用 常 规 和 特殊 的 图 像 分 析 技 术 加 工 。2-DE 凝 胶 图 像 分 析 的 典型 流程 包括 以 下 几 个 步骤 : © 凝 胶 图 像 的 扫描 (数据 的 获取 ); @ 图 像 加 工 ，@ 斑 点 检测 和 定量 ; @ 凝 胶 配 比 ; OF 据 分 析 ;，@@ 数 据 呈 递 和 解释 ， CD2-DE 数据 库 的 建立 。 为 进一步 进行 以 计算 机 为 基础 的 图 像 加 工 ， 通 过 扫描 ， 可 将 凝 胶 图 像 的 “类 似 物 ”转换 为 数字 化 形式 。 明 确 从 蛋白 斑点 中 提取 内 在 信息 所 需 的 参数 是 很 重要 的 。 随 后 图 像 加 工 的 整体 目标 是 检测 胶 上 斑点 的 精 确 位 置 和 决定 以 蛋白 丰 度 为 测量 标准 的 蛋白 斑点 形状 和 强度 。 计 算 机 图 像 和 2-DE BR 图 像 的 分 析 就 这 样 作 为 一 种 工具 来 提供 某 些 信息 。 这 种 计算 机 图 像 包 括 : @ 去 除 噪 音 和 人 工 假象 的 图 像 预 加 工 ;@ 每 个 蛋白 斑点 的 检测 和 定量 。 除 了 从 一 块 凝 胶 上 获得 的 蛋白 斑点 信息 外 ， 同 一 蛋白 斑点 在 一 组 凝 胺 上 可 能 发 生 的 变化 对 于 生物 学 分 析 意 义 重 大 。 如 果 进 行 比较 ， 那 么 要 求 通过 设 定 足 够 标志 物 的 图 像 注 册 以 完成 比较 。 标 志 物 被 用 来 确定 蛋白 斑点 几何 转化 的 多 型 性 ， 进 而 蛋白 斑点 可 以 进行 相互 配 比 。 以 这 种 方式 ， 可 以 搜索 到 一 组 凝 胶 上 相应 的 蛋白 斑点 。 密 度 谱 显示 胶 内 斑点 强度 的 变化 。 通 过 分 析 密 度 谱 后 ， 可 以 推测 斑点 变化 的 趋势 。 谱 可 以 用 图 、 表 、 散 点 图 和 图 形 表 示 。 之 后 ， 分 析 的 结果 保 存在 数据 库 中 ， 并 与 原始 图 像 的 信息 链接 。

对 于 以 蛋白 质 组 研究 小 组 间 的 合作 促进 协同 数据 的 共享 和 交换 ， 根 据 其 开放 和 联合 的 原则 ， 应 用 软件 和 数据 库 系统 是 必需 的 。 凝 胶 及 其 图 像 ， 甚 至 从 中 提取 的 信息 数据 库 务必 以 一 定 可 接近 和 整合 的 格式 存在 。 这 里 ， 与 国际 互联 网 接触 能 帮助 克服 每 个 实验 室 的 界线 。

目前 存在 的 所 有 计算 机 辅助 的 凝 胶 分 析 系 统 ， 多 数 发 展 起 步 于 70 年 代 末 ， 依 据 上 述 所 提出 的 策略 来 提取 2-DE 凝 胶 图 像 的 数据 。 今 天 ， 许 多 非 商品 化 和 商品 化 的 系统 ， 如 QUEST/QUEST II/PDQUEST, TYCHO/KEPLER, GELLAB II， BioImage， HERMeS，PHORETIX 和 ELSIE/MELANIE II， 都 是 可 以 应 用 的 ， 它 们 已 在 2-DE 这 一 科学 领域 被 众多 人 等 所 接受 。 支 持 这 些 系统 的 相关 硬件 在 过 去 20 多 年 间 经 历 了 戏剧 性 的 变化 ， 并 且 仍 旧 迅 速 演 变 ， 但 其 应 用 的 基本 算法 是 一 致 的 。 计 算 机 凝 胶 分 析 前 人 已 提 到 (Anderson and Anderson, 1996; Anderson et al., 1981; Appel et al., 1991, 1997a,

- 108 - 蛋白 质 组 学

b; Bossinger et al., 1979; Collins and Blose, 1992; Garrels, 1979, 1983, 1989; Lemkin and Lipkin, 198la~c; Lemkin et al., 1979, 1982; Miller et al., 1982; Olson and Miller, 1988; Prehm et al., 1987; Serpico and Vernazza, 1987; Skolnick, 1982; Vincens and Tarroux, 1987a, b; Vo et al .，1981)。 本 章节 主要 描述 2-DE 图 像 分 析 的 概况 及 其 主要 的 特征 ， 对 于 更 好 的 理解 图 像 分 析 是 重要 的 。

2. 数据 获取 2.1 获取 图 像 设 备

通过 扫描 2-DE 凝 胶 来 获取 数据 ， 并 将 其 转换 成 一 个 数字 化 的 文件 呈 递 。 很 明显 ， 数据 获取 明显 预示 最 终 的 分 析 质 量 。 两 个 技术 参数 对 于 得 到 令 人 满意 的 转换 至 关 重 要 ， 四 数字化 的 空间 分 辨 率 ; @ 灰 度 值 的 密度 分 辨 率 。 一 些 图 像 的 获取 设备 可 将 凝 胶 转换 成 数据 ， 并 可 获得 较 好 的 质量 ， 例 如 数码 相机 、 扫 描 仪 、 磷 储 屏 和 荧光 图 像 分 析 仪 〈 见 表 6 到 这

表 6.1 用 于 二 维 电 泳 的 主要 图 像 获取 设备

扫描 装置 AeA X 光 片 (放射 标记 的 样品 ) x x F x Be fie BE x 银 染 或 彩 染 凝 胶 X X x 荧光 标记 的 凝 胶 x

各 种 类 型 的 照相 机 ,大 多 数 情况 下 不 但 用 于 凝 胶 的 “文件 化 ”, 而 且 用 于 扫描 。 照 相机 的 质量 依靠 其 输入 和 输出 的 特性 。 以 白光 和 激光 来 区 分 的 密度 仪 或 扫描 仪 多数 情 况 下 适 合 于 获取 从 2-DE 凝 胶 图 像 的 数字 化 数据 。 它 们 具有 高 密度 高 空间 分 辨 率 及 线性 特征 ， 并 可 用 于 银 染 或 考 马 斯 亮 蓝 染 色 的 干 . 湿 凝 胶 。 放 射 性 标记 (25S，H,”C, ”2P) 样 品 的 二 维 电泳 图 谱 通过 X 光 片 或 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 获取 。 当 应 用 X 光 片 的 时 候 , 在 密度 或 灰 度 分 辩 率 上 必须 扩展 观察 其 动态 变化 , 即 通 过 同一 凝 胶 的 多 次 曝光 来 获得 尽 可 能 多 的 蛋 上 白 斑 点 。 不 同 曝光 的 片子 可 融合 成 一 个 数字 化 的 2-DE 凝 胶 图 像 。 每 一 组 灰 度 值 以 线性 方式 结合 以 增加 动态 的 密度 范围 。 为 获得 与 放射 性 相关 的 光 密 度 (disintegration/min，d. p. m. ), 需 要 同时 测量 放置 在 X 光 片上 的 校正 条 , 并 产生 标准 曲线 。 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 提供 了 一 种 代替 X 光 片 和 各 种 曝光 底片 融合 的 方法 , 因为 它们 具有 高 动态 范围 , 跨越 Ss 个 数 BR, 进行 自 显影 (Patterson and Latter，1993) 。 磷 储 屏 图 像 分 析 系 统 联合 QUEST II 系 统 的 应 用 前 述 已 提 及 (Amess and Tolkovsky, 1995)。 然 而 , 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 受 限 于 放射 性 标记 的 蛋白 混合 物 。

3. 数字 化 图 像 加 工 图 像 增强 被 广泛 应 用 于 计算 机 图 像 领域 , 平滑 操作 、 增 强 对 比 度 、 边 缘 检 测 和 背景 消

NE HEBER HK A A ot ot - 109 -

减 是 图 像 加工 最 熟悉 的 工具 。 这 些 操作 的 重要 性 依赖 于 所 应 用 的 领域 。 然 而 , 在 某 些 领 域 , 这 些 操作 主要 用 于 图 像 增 强 , 以 提高 图 像 的 光学 质量 , 分 析 科 学 可 依靠 这 些 操作 提供 明确 的 数据 。 例 如 ,在 2-DE 凝 胶 的 数字 化 图 像 上 分 析 和 蛋白 斑点。 这 里 , 平滑 操作 、 增 强 对 比 度 .边缘 检测 和 背景 消减 可 允许 以 一 种 精确 的 方式 来 决定 蛋 日 斑点 的 形状 和 大 小 。

不 同 的 操作 正常 定义 在 一 个 图 像 点 或 像素 "邻居 "区 域 。 通 常 所 应 用 的 邻居 是 3x3、 5x5 或 7x7 个 像素 。 例 如 , 在 一 个 代表 数字 化 图 像 的 有 规律 格子 基础 上 , 一 个 3x3 的 邻居 是 由 界定 图 像 中心 点 的 那些 像素 组 成 。

平滑 操作 被 用 来 清除 图 像 中 的 统计 噪音 。 主 要 策略 是 在 一 个 图 像 点 所 定义 的 邻近 区

a

图 6.1 利用 "滚动 圆 盘 "的 几何 模型 进行 背景 消减 和 条 纹 清除 球 的 半径 与 斑点 的 大 小 相 适 应 。 本 图 的 上 部 显示 沿 着 选 定 线 上 斑点 的 背景 和 密度 踪迹 。 下 部 说 明 背 景 消减 后 同样 的 特征 。

- 110 . 蛋白 质 组 学

域内 , 高 斯 平滑 、 平 均值 或 中 数 的 确定 。 增 强 对 比 度 重新 定义 一 个 图 像 的 灰 度 , 以 获得 斑 点 和 背景 之 间 较 高 的 对 比 。 边 缘 检 测 的 目的 是 限定 某 一 图 像 中 的 灰 度 值 变 化 。

通常 ,图 像 功 能 的 第 一 或 第 二 代 衍 生物 是 计算 机 化 的 。 各 种 操作 被 用 在 图 像 点 周围 的 小 邻近 区 域 居 以 决定 衍生 物 。 典 型 技术 是 ,在 第 一 代 中 应 用 梯度 操作 , 而 在 第 二 代 衍 生 物 中 应 用 拉 普 拉 斯 (Laplace) 操作 。 衡 生 系列 对 于 噪声 敏感 性 好 , 因此 , 通常 与 高 斯 平滑 联合 应 用 。

背景 消减 常用 于 清除 背景 的 无 意义 变化 , 例如 图 像 中 不 同 区 域 的 不 均一 或 各 种 背景 水 平 。 一 个 策略 是 取 背 景 最 黑 和 最 亮 区 域 的 平均 值 ,并 应 用 于 整个 图 像 。 另 一 个 比较 复 杂 的 方法 被 称 为 “滚动 的 圆 盘 " (Sternberg, 1986), 可 以 除去 图 像 中 的 背景 和 条 纹 ( 见 图 6.1)。 因 此 一 个 小 半径 不 但 可 产生 很 清晰 的 图 像 , 而 且 还 可 除去 最 弱 的 斑点 , 从 而 影响 这 种 清除 效率 是 可 能 的 。

4. 蛋 昌 质 斑点 检测 和 定量

请 记 住 这 次 练习 的 主要 目的 是 分 析 2-DE 蛋白 凝 胶 、 斑 点 检测 及 其 形状 模 建 ,这 是 一 个 重要 任务 。 斑 点 检测 产生 z/y 位 置 的 ”数组 形状 参数 和 整合 的 斑点 强度 。 蛋 白斑 点 有 几 个 光学 特征 。 它 们 可 能 分 别 出 现 , 但 在 原始 凝 胶 图 谱 及 其 随后 的 计算 机 图 像 中 是 互 相 接 触 或 重 到 的 。 它 们 也 可 能 出 现在 由 于 二 维 电 泳 和 凝 胶 染 色 所 导致 的 技术 问题 或 背景 不 同 所 致 的 条 纹 和 污点 内 。 它 们 可 能 没有 清晰 的 轮廓 , 因此 看 来 是 一 种 圆 形 或 椭圆 形 的 连续 分 布 。 斑 点 形态 依靠 于 凝 胶 制 备 、 染 色 步 骤 和 凝 胶 分析 系 统 的 数字 化 误差 。 每 一 个 斑点 \ 背景 的 灰 度 变异 和 缺乏 同 质 性 要 求 令 人 满意 的 算法 来 进行 斑点 检测 和 定量。 确实 存在 这 种 应 用 广泛 的 算法 , 并 被 分 为 高 斯 拟 合 (Gaussian fitting) 和 高 斯 拉 普 拉 斯 (Lapla- cian of Gaussian , LOG) 变换 斑点 检测 (Anderson and Anderson, 1981; Appel et al., 1997b; Lemkin and Lipkin, 1981la, b; Wu et al., 1994),

另 一 种 斑点 检测 的 方法 是 由 Garrels 最 先 提 出 的 线性 分 析 和 链 式 分 析 算 法 而 完成 (1979)。 在 这 个 方法 中 , 每 一 个 垂直 的 扫描 线 被 用 来 细 察 密度 高 峰 。 邻 近 扫 描 线 的 峰值 可 组 装 成 “ 链 状 ”, 并 且 可 决定 斑点 的 中 心 位 置 。 定 位 斑点 之 后 ,其 丰 度 (整合 的 斑点 强度 ) 可 通过 对 斑点 形状 进行 数学 模型 拟 合 来 决定 。 二 维 的 高 斯 模 建 经 常 被 应 用 。 显 著 偏离 单 一 高 斯 图 形 的 斑点 可 以 被 认为 一 组 高 斯 形状 的 重 琶 。

另外 一 种 主要 应 用 于 数码 相机 图 像 分 析 的 斑点 检测 方法 已 经 被 描述 (Prehm et al., 1987)。 预 加 工 包 括 底 纹 校 正和 非 回归 的 、 分 离 的 、 低 流通 的 平滑 滤 镜 。 一 个 分 割 的 步骤 假定 斑点 属于 具有 凸 出 曲率 的 灰 度 表面 区 域 。 当 应 用 分 割 模板 (9x9 凸 面 检测 磊 ) 时 , 如 果 中 心 像素 9x9 附近 的 曲率 大 于 零 , 则 像素 描述 了 一 个 斑点 的 中 心 。 否 则 , 图 像 上 的 斑 ， 点 属于 背景 。

相互 位 置 极端 靠近 的 斑点 、 或 者 那些 肩 靠 肩 、 或 背包 样 ( 一 个 小 斑点 附着 在 大 斑点 上 ) 的 斑点 ,通常 难以 分 离 , 因为 斑点 间 的 灰 度 区 域 不 能 表明 止 面 曲率 。 然 而 ,在 这 些 区 域 的 曲率 大 小 低 于 斑点 区 域 的 曲率 。 因 此 , 为 了 分 离 这 些 斑点 ,一 个 7x7 像素 的 模板 被 应 用 ， 并 且 可 计算 在 中 心 像素 和 以 3x3 邻近 的 8 个 方向 7x7 模板 边缘 的 像素 之 间 的 曲率 大 小 的 差异 。 如 果 两 个 曲率 大 小 之 差 小 于 至 少 一 个 方向 上 的 固定 阔 值 ,那么 , 中心 的 像素 则 被 认为 是 背景 。 通 过 这 个 分 割 过 程 所 发 现 的 斑点 中 心 通过 两 个 像素 加 以 扩大 。 斑 点 丰 度 取

第 六 章 AER KA Ro - 111:

决 于 扩大 斑点 中 心 内 所 有 像素 的 光 密 度 之 和 。

其 他 进行 斑点 检测 的 方法 基于 转化 分 界线 (Watershed transformation, WST) (Bettens et al., 1997; Meyer and Beucher, 1990; Pleissner et al., 1999; Vincent, 1993; Wegner et al., 1998). EAP 7K UG IX — Hh SE AY EO ER, FREE RU AS EH, 由 数值 代表 着 某 一 点 的 升 高 。 在 计算 算法 中 , 我 们 的 解释 是 一 种 浸入 过 程 。 这 可 以 假设 为 在 地 瑶 的 每 个 最 小 区 域 进行 钻 孔 ,并且 将 表面 浸入 湖泊 中 , 并 确保 在 山谷 中 所 有 灰 度 水 平 峰值 有 一 个 恒定 的 水 平面 。 从 最 低 海 拔 开 始 , 水 将 充满 不 同 的 山谷 。 在 这 个 浸入 过 程 结束 的 时 候 , 每 一 个 最 小 值 完 全 被 分 水 岭 所 包围 , 以 划 界 相关 的 山谷 。 这 山谷 相 对 应 的 区 域 ,也 就 是 分 水 岭 定义 某 一 图 像 的 最 佳 轮廓 。 在 图 像 中 用 来 进行 梯度 分 割 的 分 水 岭 必 须 以 地 瑶 来 解释 。 假 设 图 像 中 均一 的 区 域 以 低 对 比 度 , 即 低 梯 度 为 特征 ;反之 梯度 图 像 的 高 数值 是 由 原始 图 像 高 对 比 度 的 轮廓 产生 。 这 些 区 域 可 以 利用 WST 在 梯度 图 像 上 产生 。 随后 , 每 一 区 域 是 以 完成 一 个 马赛 克 图 像 的 特征 来 描述 。 所 选择 的 特征 应 该 与 原始 图 像 的 灰 度 水 平一 致 , 例如 原始 图 像 上 区 域 灰 度 值 的 平均 值 。

WSI 产生 封闭 的 轮廓 。 每 一 个 最 小 值 ( 峰 底 ) 描 绘 一 个 由 局 部 最 高 点 (汇流 ) 所 围 成 的 区 域 。 这 样 一 种 分 割 的 结果 很 可 能 是 一 种 过 度 分 割 。 那 意味 着 , 与 相关 区 域 的 轮廓 一 样 ,主要 由 图 像 噪 音 所 致 的 轮廓 也 会 被 发 现 。

在 过 度 分 割 的 马赛 克 图 像 内 , 以 下 两 种 类 型 斑点 区 域 将 被 用 来 鉴定 所 要 求 的 蛋白 斑 点 :与 一 完整 斑点 相对 应 的 区 域 或 者 部 分 不 完整 斑点 的 区 域 。 为 了 减少 在 马赛 克 图 像 内 候选 蛋白 斑点 的 数目 ,应 用 了 两 个 姜 值 ,这 基于 以 下 假设 ,斑点 区 域 的 灰 度 值 显 著 高 于 背 景 的 灰 度 值 , 并 且 它 们 与 背景 区 域 有 一 个 界线 。 所 要 求 的 冰 值 可 自动 适应 每 一 个 新 的 图

班 点 检测 的 步 双 fg lben

图 6.2 利用 分 水 岭 转化 进行 斑点 检测 的 主要 步 又

: 412 - 蛋白 质 组 学

像 。

应 用 这 些 标准 后 , 仍 存在 一 些 区 域 , 既 不 是 斑点 区 域 , 也 不 是 部 分 斑点 区 域 。 把 一 凝 胶 图 像 认 为 是 一 个 表面 时 , 斑点 的 形状 是 明显 凸 起 的 , 部 分 斑点 区 域 也 是 如 此 。 由 于 第 三 代 计 算 机 衍生 系列 描述 了 分 水 怜 拓 扑 地 够 的 曲率 , 斑点 和 部 分 斑点 区 域 就 可 以 采用 数学 方法 求解 。 斑 点 区 域 和 部 分 斑点 区 域 具有 相同 的 凸 起 曲率 。 最 后 , 如 果 它 们 来 源 于 同一 斑点 , 邻近 斑点 组 的 所 有 部 分 斑点 区 域 被 检查 、 融合 。 斑 点 形状 应 类 似 于 椭圆 ,并且 一 个 斑点 的 部 分 斑点 区 域 在 其 分 水 岭 线 的 邻近 区 域内 应 有 相应 的 凸 起 曲率 。 这 些 斑 点 特征 的 结合 被 用 来 作为 融合 的 标准 。 这 种 斑点 检测 算法 的 主要 步骤 见 图 6.2。

5. Be We AC te

除了 每 一 块 凝 胶 图 像 的 斑点 检测 和 定量 外 , 一 组 凝 胶 上 同一 斑点 的 比较 是 重要 的 。 因此 , 在 各 种 实验 条 件 下 和 蛋 日 表达 的 比较 性 分 析 成 为 一 个 重要 的 问题 。 凝 胶 的 不 均一 性 发 生 是 由 于 以 下 差异 所 导致 的 ,如 样品 制备 .电泳 条 件 或 温度 的 变化 以 及 在 不 同 凝 胶 上 电 泳 的 不 同 迁 移 率 。 上 述 原 因 导 致 无 法 产生 完美 无 暇 的 凝 胶 图 谱 。 因 此 , 为 了 分 析 蛋 自 的 变化 ,斑点 图 谱 必 须 配 比 。

进行 电泳 或 斑点 图 谱 配 比 的 前 提 是 注册 。 注 册 是 一 种 通过 转化 的 方式 使 数据 进行 比 较 的 步骤 。 正 常情 况 下 ,一块 凝 胶 上 和 晶 日 斑点 的 位 置 很 大 程度 依赖 于 各 种 可 变 的 参数 , 如 凝 胶 的 质地 和 密度 。 尽 管 许 多 研究 者 雄心 勃勃 以 获得 “完美 "的 凝 胶 , 但 这 些 凝 胶 在 化 学 和 物理 特征 上 仍 有 变化 。 因 此 , 当 进 行 凝 胶 配 比 的 时 候 , 蛋白 位 置 并 不 十 分 相同 , 因此 它 们 的 信息 值 不 是 直接 可 比 的 。 使 图 像 变 形 的 参数 需要 从 图 像 中 清除 , 将 其 转变 成 可 比较 的 图 像 。 这 已 通过 转化 的 方式 完成 ,并 且 随 后 可 进行 配 比 。

配 比 有 两 种 方式 :@O 在 像素 水 平 ;@ 在 斑点 水 平 。 在 第 一 种 情况 下 , 两 种 凝 胶 图 像 的 像素 绘 成 图 形 ; 在 第 二 种 情况 下 , 仅 对 两 块 或 多 块 凝 胶 上 的 蛋白 斑点 进行 配 比 , 以 达到 整 个 凝 胶 的 配 比 。 上 述 两 种 方法 , 即 局 部 或 全 局 的 , 多项式 的 转化 被 用 来 绘 成 一 个 源 图 像 或 源 斑 点 图 案 , 或 者 被 用 来 绘 成 缀 图 像 或 靶 斑 点 图 案 。

利用 标志 物 ( 或 passpoints) 在 图 像 和 亲 合 转化 上 进行 注册 , 如 调整 大 小 、 伸 展 、 旋 转 和 变换 。 例 如 标志 物 是 在 两 张 凝 胶 上 都 被 鉴定 的 特征 性 斑点 。 转 化 的 方法 对 整个 图 像 的 应 用 可 为 两 块 凝 胶 图 像 在 像素 水 平 上 的 定量 差异 提供 可 视 化 的 比较 (Appel et al., 1997b; Lemkin, 1997a; Pleissner et al., 1997a).

TE BEA KOE OY EF BS Ra ee RA BE HE“ BE UR” PRK 现 。 斑 点 水 平 的 配 比 策略 见 图 6.3。 正 确 配 比 的 前 提 是 图 像 或 图 像 的 区 域 具有 很 高 的 相 似 性 。 配 比 的 算法 主要 首先 假定 为 在 一 个 比较 性 研究 中 凝 胶 图 像 属于 同一 条 件 下 产生 的 — 2A BEBE, 许多 算法 可 用 于 这 种 凝 胶 的 配 比 ,它们 是 建立 在 几何 、 统 计 \ 图 形 理论 和 错 列 组 合 图 谱 识别 法 的 基础 之 上 。

正 像 上 面 所 提 到 的 ,几何 方法 将 特征 性 的 蛋白 斑点 作为 标志 物 , 是 一 个 特殊 的 方式 通 过 扩散 来 配 比 。 这 里 , 从 标志 物 而 来 的 配 比 信息 在 它们 附近 延伸 到 邻近 的 斑点 。 对 任何 一 对 凝 胶 而 言 , 在 标志 物 附近 发 现 最 近 的 邻居 是 可 能 的 , 对 邻近 的 斑点 , 其 相对 于 标志 物 的 在 z, y 轴 上 的 位 移 是 可 确定 的 。 随 后 , 在 其 他 的 凝 胶 上 利用 与 相应 的 标志 物 相 关 的 同 样 位 移 进行 搜索 。 如 果 一 个 斑点 在 这 个 位 置 被 发 现 , 即 配 比 成 功 。 通 过 扩散 进行 的 配 比

第 六 章 “三维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 - 113 -

斑点 | 斑点 2 斑点 ; 斑点 N

图 6.3 配 比 的 原理 (在 斑点 水 平 上 )

是 可 回归 的 , 这 意味 着 通过 扩散 所 配 比 的 斑点 能 成 为 进一步 扩散 的 中 心 。

配 比 的 质量 可 通过 两 块 凝 胶 之 间 进 行 直 接 配 比 的 结果 与 所 有 凝 胶 的 间接 配 比 所 进行 的 交叉 配 比 来 提高 。 此 外 , 加 入 斑点 也 可 以 提高 配 比 的 精确 度 和 质量 。 如 果 一 个 斑点 出 现在 源 图 像 , 但 在 靶 图 像 中 消失 ,那么 这 一 斑点 将 被 加 入 到 靶 图 像 的 相应 位 置 上 (Garrels， 1979, 1989).

在 统计 学 方法 基础 上 利用 相似 性 原则 的 一 种 强 有 力 的 配 比 算法 已 由 Olson 和 Miller (1988) 提 出 ,并 且 在 MELANIE II(Appel er al .，1997b) 这 种 软件 中 得 到 提高 和 完成 。 进 一 步 的 配 比 方法 是 以 图 形 为 基础 (Kuick et al., 1991; Skolnick, 1982; Skolnick and Neel，1986) 和 利用 错 列 组 合 图 案 识 别 方式 的 语法 为 基础 的 技术 (Tarroux et al., 1987; Vincens and Tarroux，1987a, 1987b).

对 于 实际 的 配 比方 法 , EBC is BE Mh RR Se HE — 2 EMRE A (match sets)。 配 比 的 过 程 导 致 单个 斑点 的 追溯 。 斑 点 及 其 强度 的 变化 可 以 通过 一 系列 凝 胶 进 行 追寻 。 凝 胶 配 比 在 凝 胶 的 图 像 分 析 中 是 最 关键 的 步骤 之 一 。 只 要 凝 胶 很 相似 , 即 当 它们 在 同一 条 件 下 产生 于 同一 实验 室 , 多 数 的 算法 是 成 功 的 。 从 不 同 来 源 的 凝 胶 图 像 的 比较 经 常 导 致 不 相 容 性 。

在 某 些 系统 中 , 数据 分 析 通 过 配 比 组 得 以 支持 , 它 由 几 组 凝 胶 组 成 (对 照 组 、 实 验 组 )， 它们 已 经 通过 配 比 的 加 工 。 有 时 候 附加 的 特征 通过 衍生 于 模板 图 像 的 标准 图 像 来 提供 。 包括 高 斯 模 建 斑点 的 标准 图 像 含 有 所 有 系列 凝 胶 的 斑点 和 数据 ( 均 包 含 于 配 比 组 中 )。

- 114 A RAs

6. 数据 分 析

数据 分 析 主 要 由 3 个 问题 所 驱动 :@ 质 的 确证 性 的 评估 ;@ 量 的 确定 ;@ 和 蛋白 表达 中 定量 变化 的 决定 。 每 块 凝 胶 中 有 效 的 重 白 斑点 数目 、 强 度 饱 和 的 斑点 数目 和 配 比 的 斑点 数目 的 信息 在 质量 评估 中 是 基本 的 。 应 在 所 有 凝 胶 中 存在 斑点 总 数 和 配 比 斑 点 之 间 的 关 FR, 以 明确 定义 质 的 原则 ;斑点 的 总 数 越 高 , 某 一 特殊 的 重 日 斑点 不 能 在 所 有 凝 胶 中 发 现 的 重要 性 就 越 小 。

为 了 确定 蛋白 表达 中 的 量变 和 质变 , 在 一 个 可 见 的 N x M 的 矩阵 表 中 列 出 了 一 组 凝 胶 中 所 有 单个 斑点 的 强度 值 ( 图 6.4). N 代表 斑点 的 数目 ( 行 ), M 代表 配 比 的 凝 胶 斑点 数目 ( 列 )。 在 最 初 N x M 矩阵 上 的 原始 数据 以 斑点 的 强度 来 代表 。 因 为 凝 胶 图 像 的 平 均 强 度 不 同 , 例如 不 同 的 曝光 时 间 , 所 以 在 定量 分 析 中 必须 进行 校正 (Burstin et al., 1993) 。 单 个 斑点 强度 的 校正 基于 相关 的 凝 胶 图 像 的 平均 强度 。

图 6.4 配 比 之 后 的 数据 分 析 表 (和 矩阵 ) 斑点 的 原始 数据 (整合 的 光 密 度 ) 在 Nx MPEG FF, 在 此 N 代表 斑点 的 数目 ( 行 数 ), 而 M 代表 凝 胶 的 数目 ( 列 数 )。

为 了 决定 蛋白 斑点 定量 变化 , 人们 搜寻 在 强度 上 增高 下降 或 不 变 的 斑点 。 定 量 分 析 可 利用 不 同 的 统计 方法 进行 ,例如 通过 平均 值 计 数 的 组 间 参 数 变化 和 斑点 强度 的 偏离 。 进而 ,组 间 的 变化 可 以 通过 单方 差 的 形式 进行 统计 检验 (例如 Student’s t-test, Log t-test 和 Mann-Whitney tset) 或 者 多 方差 的 方式 (相关 分 析 ) 。 )

然而 , 单方 差 检验 考虑 每 一 行 ,并 不 依赖 于 N x M 数据 阵列 ;而 多 方差 方法 考虑 斑点 的 相关 性 ( 行 ), 相关 分 析 能 检测 凝 胶 间 的 相似 性 , 并 鉴定 其 典型 的 斑点 特征 。 用 于 2-DE 的 相关 分 析 的 数学 背景 首先 由 Pun 等 (1988) 提出 。 这 个 方法 目的 是 决定 最 代表 这 一 凝

第 六 章 ”二 维 凝 胶 电泳 的 图 像 分 析 - 115 -

胶 特征 的 斑点 。Schmid 等 (1995) 已 在 细节 上 描述 了 相关 分 析 , 利用 2-DE 蛋白 图 谱 , 将 之 应 用 到 细胞 分 类 。 我 们 已 经 对 从 PDQUEST 系统 中 所 产生 的 数据 进行 了 额外 的 相关 分 析 (Pleissner et al .，1998)。 整 体 上 , 单方 差 和 多 方差 的 统计 方法 对 于 2-DE 凝 胶 中 的 蛋 白 表达 变化 的 分 析 是 重要 的 工具 。

对 凝 胶 组 之 间 蛋 白 表达 的 定性 分 析 通 过 寻找 仅 在 一 个 组 中 出 现 的 斑点 即 可 。 这 些 班 点 经 常 被 称 为 “ 开 / 关 "斑点 ,因为 这 些 斑 点 在 某 些 特定 的 实验 条 件 下 开 与 关 , 并 且 它 们 是 表明 蛋白 变化 的 明显 候选 者 , 所 以 非常 重要 。

一 个 凝 胶 分 析 系 统 分 析 能 力 的 重要 特征 是 使 用 者 的 数据 处 理 , 这 是 使 用 者 定义 的 斑 点 的 集合 。 此 外 ,不同 的 分 析 步 豫 的 结果 可 以 被 联合 , 例如 交集 操作 (boolean operators) 。 以 这 种 方式 ,在 所 有 的 凝 胶 中 ,决定 可 被 发 现 和 被 配 比 上 的 非 饱和 斑点 是 可 能 的 。 此 外 ， 在 使 用 者 中 已 配 比 的 斑点 由 于 蛋白 的 变化 可 能 增加 或 降低 , 很 可 能 被 发 现 具有 统计 意义 。 这 种 数据 分 析 工 具 的 应 用 已 经 在 人 心脏 疾病 的 分 析 中 描述 (Pleissner et al., 1997b).

7. BOR SB

为 了 精确 呈 递 结果 , 需要 考虑 一 些 前 提 条 件 。 首 先 , 每 个 被 检测 的 蛋白 斑点 应 该 有 一 个 分 子 量 (M.) 和 等 电 点 (pI)。 因 此 , 利用 某 些 特征 的 蛋白 斑点 (参考 胶 上 的 斑点 ), 一 种 M,/pl 晶 格 形式 就 覆盖 在 凝 胶 上 , 从 而 推测 MypI 值 。 这 些 参考 蛋白 斑点 是 已 知 蛋白 ， 并 易 在 胶 上 检测 。 通 常 , MyVpI 值 在 供应 者 目录 排列 , 只 要 蛋白 名 称 或 蛋白 注册 号 已 知 ， 它们 也 能 从 SWISS-PROT (ExPASy 分 子 生 物 学 服务 器 ) 上 获得 。 例 如 :在 人 心脏 样品 的 二 维 凝 胶 中 , 血清 和 蛋白、 肌 动 蛋白 、. 肌 球 重 白 和 肌 动 蛋白 轻 链 1 和 肌 红 蛋白 明显 易 被 识别 ， 并 且 可 作为 产生 M/pI 晶 格 的 标志 物 ( Knecht et al., 1994).

利用 这 些 标志 物 蛋白 ,所 有 其 他 蛋白 的 My/pI 值 可 以 通过 假设 沿 着 pl 轴 ( 水 平 轴 ) 的 一 种 线性 外 推 和 沿 着 M, 轴 ( 垂 直 轴 ) 的 一 种 指数 外 推 得 到 评估 。 很 清楚 , MypI 值 的 精确 性 主要 依赖 于 用 于 计算 M,/pl 晶 格 的 算法 。

曲线 图 或 条 形 图 表 常 被 用 来 比较 斑点 的 量变 ,反应 斑点 变化 的 趋势 。 理 想 上 , 这 种 变 化 应 来 源 于 基本 的 蛋白 表达 变化 。 此 外 , 在 检测 非 配 比 斑点 和 在 定量 上 可 疑 高 于 平均 值 的 斑点 , 曲线 图 或 条 形 图 表 也 是 有 用 的 。 条 形 图 表 在 zx 轴 上 代表 凝 胶 的 斑点 数目 ,在 y 轴 上 代表 斑点 强度 ( 丰 度 )。 此 外 , 如 果 凝 胶 形 成 了 复制 (replicate) 组 , 组 内 平均 强度 值 和 标准 偏离 可 以 条 形 图 表 的 形式 说 明 。 利 用 这 种 数据 呈 递 ,组 间 的 变化 趋势 可 以 清晰 识别 。 因此 , 这 些 图 表 能 提供 一 个 有 力 的 图 形 工 具 , 以 代表 储存 于 配 比 表格 中 的 数据 。 这 些 图 形 中 的 某 些 类 型 , 显示 对 照 组 和 实验 组 间 的 斑点 差异 在 图 6.5 中 说 明 。 此 外 , 以 表格 形式 的 斑点 强度 输出 , 通常 以 EXCEL、Stat View、SSP、SAS 或 其 他 形式 应 用 而 进一步 评估 。

为 了 评估 斑点 强度 间 的 相似 性 , 散 点 图 经 常 被 用 来 显示 两 块 凝 胶 或 两 组 凝 胶 间 的 强 度 相 关 性 。 应 用 这 种 图 表 ， 依 据 强度 的 相关 性 , 相关 系数 可 以 被 计算 。 例 如 , 10 个 对 照 组 与 实验 组 凝 胶 被 分 析 , 可 组 建 一 个 研究 高 血压 影响 的 散 点 图 (Pleissner et al., 1998). 当 比 较 两 组 中 所 有 已 配 比 斑点 的 平均 强度 时 , 可 确定 两 组 的 明显 相似 性 (图 6.6)。

is

图 6.5 ” 某 些 类 用 来 表达 蛋白 变化 的 图 表 每 组 (对 照 、 实 验 ) 由 几 块 凝 胶 组 成 , 例如 :条 形 图 代表 组 内 斑点 强度 的 平均 值 和 标准 差 。

强度 平均 值 (高 血压 组 )

ppm

1000 10000 强度 平均 值 ( 对 照 组 )

图 6.6 表示 实验 组 (高 血压 ) 和 对 照 组 间 斑 点 强度 平均 值 依 赖 性 的 散 点 图 已 配 比 的 每 块 凝 胶 的 斑点 数目 为 269; 凝 胶 的 数目 为 20。

蛋白 质 组 学

第 六 章 “” 二 维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 -117-

8. 数据 库 8.1 2-DE 数据 库 的 构建

前 面 所 描述 的 分 析 提 供 了 关于 蛋白 与 凝 胶 图 像 中 重 白 斑点 间 的 许多 描述 性 信息 , 即 蛋白 名 称 、.MvpI 值 和 目录 性 信息 和 其 他 文献 。 通 常 , 信息 在 2-DE 数据 库 中 储存 。 数 据 库 正常 情况 下 对 所 分 析 的 一 组 图 像 的 代表 图 像 给 予 明确 的 注释 .这 个 代表 性 图 像 能 成 为 被 分 析 的 凝 胶 图 像 之 一 或 者 是 产生 一 块 综合 性 的 标准 图 谱 。 这 种 图 像 -数据 库 和 数据 库 -图 像 的 链接 提示 :@ 如 果 一 个 蛋白 斑点 在 图 像 中 标 出 , 应 该 出 现 其 相应 的 描述 信息 ;@ 如 果 这 个 蛋白 的 名 称 或 其 他 描述 性 信息 已 知 ,那么 必须 显示 这 个 斑点 在 图 像 上 的 位 置 并 加 以 解释 。

一 些 凝 胶 分 析 系 统 包 括 它 们 自己 的 内 部 数据 库 。 例 如 在 PDQuest 系统 中 , 除了 标准 斑点 号 (SSP) 以 外 , 通常 一 个 数据 库 的 斑点 号 (DSN) 表 明了 这 个 斑点 的 位 置 ,因为 这 个 号 码 基 于 M,/pI 唱 格 所 排序 。 可 每 个 斑点 归于 不 同 的 注释 类 别 (annotation category)。 这 种 注释 是 直接 与 标准 胶 上 斑点 的 位 置 有 关 , 并 能 通过 简单 查询 检索 得 到 。 尽 管 这 些 内 部 的 数据 库 (Lipkin，1980; Jungblut et 必 .，1994) 是 有 帮助 的 ,但 它们 是 系统 特异 的 , 并 不 允许 凝 胶 图 像 和 描述 信息 共享 。

通过 网 络 技术 的 接触 可 帮助 克服 实验 室 的 界限 。 在 WWW(Cworld wide web) 网 上 所 产生 的 2-DE 数据 库 已 描述 (Appel et al., 1993; Boutell et al., 1994; Evans et al., 1997; Latter et al., 1995; Lemkin, 1997b; Monardo et al., 1994; Miller et al., 1996; Pleissner et al., 1996). Hat, K29 30 个 WWW 可 及 的 2-DE 数据 库 可 在 ExPASy 服务 器 的 WORLD-2DPAGE 上 检索 到 (http://www.expasy. ch/ ch2d/2d-index.html)。 对 于 2-DE WWW 数据 库 的 构建 交互 界面 和 整合 的 概况 已 由 Appel 描述 (1997c) 。

目前 , 某 些 组 建 2-DE 数据 库 的 软件 包 可 免费 应 用 , 如 Make2dbb (Hoogland et al., 1997)。 这 个 软件 包 可 以 不 依赖 MELANE II 系统 而 应 用 , 还 有 一 个 新 工具 , 它 使 凝 胶 的 TIFF FRSA z/y 参数 坐标 的 蛋 日 斑点 的 text 文件 和 SWISS-PROT 的 注册 号 转换 成 特定 的 图 像 格式 (http://www.expasy. ch/ch2d/tiff2mel.html)。

8.2 比较 网 上 分 布 的 2-DE 数据 库

伴随 着 信息 转换 , 通过 因特网 进行 的 凝 胶 图 像 比 较 在 蛋白 质 组 研究 中 是 一 项 重要 的 任务 , 并 可 支持 或 替代 昂贵 的 蛋白 质 鉴 定 。 产 生 数 据 库 的 master BER, 并 利用 某 一 蛋白 的 SWISS-PROT 注册 号 , 这 些 斑点 能 在 联邦 2- DE 数据 库 中 定位 和 鉴定 (Appel et al., 1996)。 在 2-DE 中 间 数 据 库 中 , 以 两 块 凝 胶 图 像 间 可 视 化 的 实验 室 间 比较 为 特征 , 利用 普 曲 (warping) 转 换 ( 如 配 比 )、 增 强 对 比 、 平 滑 过 滤 和 颜 动 (flickering) 技 术 得 以 在 Flicker 服务 右上 实现 (http://www-lmnb. ncifcrf. gov/flicker; Lemkin, 1997a)。 颜 动 意味 着 可 以 交替 看 见 两 块 图 像 ( 源 与 靶 图 像 )。

Pleissner 等 已 详细 描述 在 WWW 数据 库 中 可 利用 的 自动 化 比较 / 配 比 的 2-DE Be Re 图 像 的 问题 (1999)。 在 这 种 情况 下 , 当 利用 一 种 被 称 为 计算 几何 学 的 方法 时 , 斑点 参数 (斑点 位 置 和 强度 ) 被 用 来 作为 点 图 谱 的 配 比 。 此 外 , 通过 用 户 界面 的 方式 ,求助 于 任何 一

= 118 - 蛋白 质 组 学

个 具有 Java 能 力 的 因特网 浏览 器 , 斑点 检测 和 配 比 策略 可 直接 在 网 上 进行 。 这 种 配 比 方 法 通过 检查 两 图 像 间 点 的 边缘 斜率 和 长 度 ,也 考虑 斑点 的 强度 关系 ,来 比较 源 图 像 和 轰 图 像 的 点 图 。 配 比 算法 的 一 个 中 心目 标 来 源 于 利用 增 量 德 劳 内 (Delaunay) 三 角 测 量 , 即 从 计算 几何 学 而 知 (Alt and Guibas，2000)。 将 强度 绝对 值 向 不 连续 强度 整数 的 转化 和 不 连 续 阔 值 的 应 用 , 使 这 种 较 弱 地 依赖 于 灰 度 值 的 配 比方 法 成 为 可 能 (绝对 的 密度 分 辩 率 )。 这 种 配 比 方法 已 经 在 CAROL 软件 系统 得 以 完成 (http://gelmatchy. inf. fu-berlin. de)。 这 个 程序 能 够 通过 整个 因特网 配 比 2-DE 数据 库 中 的 凝 胶 图 像 。 使 用 者 从 任何 一 个 2-DE 数据 库 中 打开 GIF 图 像 , 进行 斑点 检测 , 并 在 源 与 靶 图 像 中 进行 局 域 的 配 比 。 6.7 展示 在 比较 从 WORLD-2 DPAGE 检索 的 2-DE 数据 库 HEART-2DPAGE ( 左 , 源 ) 和 HSC-2DPAGE( 右 , 靶 ) 而 来 的 凝 胶 图 像 时 ，CAROL 用 户 界 面 的 应 用 。

t a ¢¢

pena

图 6.7 被 用 来 比较 HEART-2DPAGE( 源 ) 和 HSC-2DPAGE (#2) SHE EH) CAROL 用 户 界面 搜索 图 案 ( + ) 在 源 图 像 中 设 定 , 相应 的 图 案 在 配 比 后 设 定 。 当 进行 配 比 时 , 在 两 个 数据 库 发 现 的 SWISS-PROT AC 被 显示 出 来 以 说 明 配 比 结果 的 正确 性 。

9. 结论

本 章 已 概括 了 计算 机 图 像 分 析 2-DE 凝 胶 的 主要 原理 , 以 及 2_DE 数据 库 的 建立 和 在

ee SSE ee

第 六 章 ”二 维 凝 胶 电 泳 的 图 像 分 析 “ 119 -

WWW 网 上 的 比较 。 毫 无 疑问 , 如 果 没 有 计算 机 图 像 分 析 , A BES BY Ae iB] Be HE 的 评估 很 难 进行 。 各 种 各 样 的 商品 化 凝 胶 分 析 系 统 目前 是 可 应 用 的 ,用 来 决定 在 特定 状 况 下 的 蛋白 斑点 变化 。 一 旦 在 蛋白 变化 方面 具有 足够 的 实验 数据 , 即 可 检测 特定 的 蛋白 标志 物 , 并 进行 进一步 研究 。 数 据 库 的 构建 和 比较 的 概念 也 被 描述 , OE PA EE 可 通过 网 络 被 储存 .共享 和 比较 。 在 这 个 背景 下 , 数字 化 的 图 像 加 工 和 分 析 提 高 了 不 同 2-DE 数据 库 的 可 比 性 。

感谢

作者 感谢 德国 柏林 心脏 研究 所 的 Vera Regitz-Zagrosek、Bernhard Krudewagen 、 Eckart Fleck 和 柏林 自由 大 学 的 Frank Hoffmann, Klaus Kreigel、Carola Wenk , Helmut Alt 的 科研 协作 和 支持 。

(Fm xe Wiaw 1%)

参考 文献

-Alt, H. and Guibas, L. (2000) Discrete geometric shapes: matching, interpolation, and approxima- tion, a survey. In: Handbook for Computational Geometry (ed. J. Urrutia and J.-R. Sack). North Holland, Amsterdam, pp. 121-154.

Amess, B. and Tolkovsky, A.M. (1995) Programmed cell death in sympathetic neurons: a study by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using computer image analysis. Electro- Phoresis 16: 1255-1267.

Anderson, N.G. and Anderson, N.L. (1996) Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past, present and future. Electrophoresis 17: 443-453.

Anderson, N.L., Taylor, J., Scandora, A.E., Coulter, B.P. and Anderson, N.G. (1981) The TYCHO system for computer analysis of two-dimensional gel electrophoresis patterns. Clin. Chem. 27: 1807-1820.

Appel, R.D. (1997) Interfacing and integrating databases. In: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (eds M-R. Wilkins, K.L. Williams, R.D. Appel and D.F. Hochstrasser). Springer, Berlin, pp. 149-175.

Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., Funk, M., Vargas, J.R., Pellegrini, C., Muller, A.F. and Scherer, J.-R. (1991) The MELANIE project: from a biopsy to automatic protein map interpretation by computer. Electrophoresis 12: 722-735.

Appel, R.D., Sanchez, J.-C., Bairoch, A., Golaz, O., Miu, M., Vargas, J.R. and Hochstrasser D.F. (1993) SWISS-2DPAGE: a database of two-dimensional electrophoresis images. Electro- phoresis 12: 1232-1238.

Appel, R.D., Bairoch, A., Sanchez, J.-C., Vargas J.R., Golaz, O., Pasquali, C. and Hochstrasser, D.F. (1996) Federated two-dimensional electrophoresis database: a simple means of publishing two-dimensional electrophoresis data. Electropharesis 17: 540-546.

Appel R.D., Palagi, P.M., Walther, D., Vargas, J.R, Sanchez, J.-C., Ravier, F., Pasquali, C. and Hochstrasser, D.F. (1997a) Melanie II —a third-generation software package for analysis of two- dimensional electrophoresis images: I. Features and user interface. Electrophoresis 18: 2724— 2734.

Appel, R.D., Vargas, J.R., Palagi, P.M., Walther, D. and Hochstrasser, D.F. (1997b) Melanie II—a third-generation software package for analysis of two-dimensional electrophoresis images: II. Algorithms. Electrophoresis 18: 2735-2748.

Bettens, E., Scheunders, P., VanDyck, D., Moens, L. and Van Osta, P. (1997) Automatic segmentation and modelling of two-dimensional electrophoresis gels. Electrophoresis 18: 792- 798.

Bossinger, J., Miller, M.J., Vo, K.-P., Geiduschek, P. and Xuong, N. (1979) Quantitative analysis of two-dimensional electrophoretograms. J. Biol. Chem. 254: 7986-7998.

Boutell, T., Garrels, J.I., Franza, B.R., Monardo, P.J. and Latter, G.I. (1994) REFS2 on the global

- 120 > 蛋白 质 组 学

gel navigator: an internet accessible two-dimensional gel electrophoresis database. Electro- phoresis 15: 1487-1490.

Burstin, J., Zivy, M., de Vienne, D. and Damerval C. (1993) Analysis of scaling methods to minimize experimental variations in two-dimensional electrophoresis quantitative data: appli- cation to the comparison of maize inbred lines. Electrophoresis 14: 1067-1073.

Collins, P.J. and Blose, S.H. (1992) Todays densitometer — multi-application densitometry for biotechnology. Jnt. J. Biotechnol. 9: 202-205.

Evans, G., Wheeler, C.H., Corbett, J.M. and Dunn, M.J. (1997) Construction of HSC-2DPAGE: a two-dimensional gel electrophoresis database of heart proteins. Electrophoresis 18: 471-479. Garrels, J.I. (1979) Two-dimensional gel electrophoresis and computer analysis of proteins

synthesized by clonal cell lines. J. Biol. Chem. 254: 7961-7977.

Garrels, J.I. (1983) Quantitative two-dimensional gel electrophoresis of proteins. Methods Enzymol. 100: 411-423.

Garrels, J.I. (1989) The QUEST system for quantitative analysis of two-dimensional gels. J. Biol. Chem. 264: 5259-5282.

Hoogland, C., Baujard, V., Sanchez, J.-C., Hochstrasser, D.F. and Appel, R.D. (1997) Make2ddb: a simple package to set up a two-dimensional electrophoresis database for the World Wide Web. Electrophoresis 18: 2755-2758.

Jungblut, P., Otto, A., Zeindl-Eberhart, E., Pleissner, K.-P., Knecht, M., Regitz-Zagrosek, V., Fleck, E. and Wittmann-Liebold, B. (1994) Protein composition of human heart: the construc- tion of a two-dimensional electrophoresis database. Electrophoresis 15: 685-707.

Knecht, M., Regitz-Zagrosek, V., Pleissner, K.-P., Emig, S., Jungblut, P., Hildebrandt, A. and Fleck, E. (1994) Computer-assisted analysis of endomyocardial biopsy protein patterns by two- dimensional gel electrophoresis. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 32: 615-624.

Kuick, R.D., Skolnick, M.M., Hanash, S. and Neel, J.V. (1991) A two-dimensional electrophoresis- related laboratory information processing system: spot matching. Electrophoresis 12: 736-746.

Latter, G. I., Boutell, T., Monardo, P.J., Kobayashi, R., Futcher, B., Mclaughlin, C.S. and Garrels J.I. (1995) A Saccharomyces cerevisiae Internet protein resource now available. Electrophoresis 16: 1170-1174. ;

Lemkin, P.F. (1997a) Comparing two-dimensional electrophoretic gel images across the Internet. Electrophoresis 18: 461-470.

Lemkin, P.F. (1997b) The 2DWG meta-database of two-dimensional electrophoretic gel images on the Internet. Electrophoresis 18: 2759-2773.

Lemkin, P.F. and Lipkin, L.E. (1981a) GELLAB: a computer system for 2D gel electrophoresis analysis I. Segmentation of spots and system preliminaries. Comput. Biomed. Res. 14: 272-297.

Lemkin, P.F. and Lipkin, L.E. (1981b) GELLAB: a computer system for 2D gel electrophoresis analysis. II. Pairing spots. Comput. Biomed. Res. 14: 355-380.

Lemkin, P.F. and Lipkin, L.E. (1981c) GELLAB: a computer system for two-dimensional gel electrophoresis analysis. III. Multiple two-dimensional gel analysis. Comput. Biomed. Res. 14: 407-446.

Lemkin, P., Merril, C., Lipkin, L., Van Keuren, M., Oertel, W., Shapiro, B., Wade, M., Schultz, M. and Smith, E. (1979) Software aids for the analysis of 2D gel electrophoresis images. Comput. Biomed. Res. 12: 517-544.

Lemkin, P.F., Lipkin, L.E. and Lester E.P. (1982) Some extensions to the GELLAB two- dimensional electrophoretic gel analysis system. Clin. Chem. 28: 840-849.

Lipkin, L.E. (1980) Data-base techniques for multiple two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analyses. Clin. Chem. 26: 1403-1412.

Meyer, F. and Beucher, S. (1990) Morphological segmentation. J. Visual Commun. Image Repres. 1: 21-46.

Miller, M.J., Vo, K.-P., Nielsen, C., Geiduschek, E.P., Xuong, N.H. (1982) Computer analysis of two-dimensional gels: semi-automatic matching. Clin. Chem. 28: 867-875.

Monardo, P.J., Boutell, T., Garrels, J.1. and Latter, G.I. (1994) A distributed system for two- dimensional gel analysis. Comput. Appl. Biosci. 10: 137-143.

Miiller, E.-C., Thiede, B., Zimny-Arndt, U., Scheler, C., Prehm, J., Miiller-Werdan, U., Wittmann- Liebold, B., Otto, A. and Jungblut, P. (1996) High-performance human myocardial two- dimensional electrophoresis database: edition 1996. Electrophoresis 17: 1700-1712.

BAM AER BKM A Ra - 121°

Olson, A.D. and Miller, M.J. (1988) Elsie4: quantitative computer analysis of sets of two- dimensional gel electrophoretograms. Anal. Biochem. 169: 49-70.

Patterson, S.D. and Latter, G.I. (1993) Evaluation of storage phosphor imaging for quantitative analysis of 2-D gels using the Quest II system. Bio Techniques 15: 1076-1083.

Pleissner, K.-P., Sander, S., Oswald, H., Regitz-Zagrosek, V. and Fleck, E. (1996) The construction of the World Wide Web-accessible myocardial two-dimensional gel electrophoresis protein database ‘HEART-2DPAGE’: a practical approach. Electrophoresis 17: 1386-1392.

Pleissner, K.-P., Sander, S., Oswald, H., Regitz-Zagrosek, V. and Fleck, E. (1997a) Towards design and comparison of World Wide Web-accessible myocardial two-dimensional gel electrophoresis protein databases. Electrophoresis 18: 480-483.

Pleissner, K.-P., Soding, P., Sander, S., Oswald, H., Neuss, M., Regitz-Zagrosek, V. and Fleck, E. (1997b) Dilated cardiomyopathy-associated proteins and their presentation in a WWW- accessible two-dimensional gel protein database. Electrophoresis 18: 802-808.

Pleissner, K.-P., Regitz-Zagrosek, V., Kriidewagen, B., Trenkner, J., Hocher, B. and Fleck, E. (1998) Effects of renovascular hypertension on myocardial protein patterns — analysis by computer-assisted two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 19: 2043-2050.

Pleissner, K.-P., Hoffmann, F., Kriegel, K., Wenk, C., Wegner, S., Sahlstrom, A., Oswald, H., Alt, H. and Fleck, E. (1999) New algorithmic approaches to protein spot detection and pattern matching in 2-DE gel databases. Electrophoresis 20: 255-265.

Prehm, J., Jungblut, P. and Klose, J. (1987) Analysis of two-dimensional electrophoretic protein patterns using a video camera and a computer II. Adaptation of automatic spot detection to visual evaluation. Electrophoresis 8; 562—572.

Pun, T., Hochstrasser, D., Appel, R., Funk, M., Villars-Augsburger, V. and Pellegrini C. (1988) Computerized classification of two-dimensional gel electrophoretograms by correspondence analysis and ascendant hierarchical clustering. Appl. Theor. Electrophoresis 1: 3-9.

Schmid, H.-R., Schmitter, D., Blum, P., Miller, M. and Vonderschmitt, D. (1995) Lung tumor cells: a multivariate approach to cell classification using two-dimensional protein pattern. Electro- phoresis 16: 1961-1968.

Serpico, S.B. and Vernazza, G. (1987) Problems and prospects in image processing of two- dimensional gel electrophoresis. Opt. Engng 26: 661-668.

Skolnick, M.M. (1982) An approach to completely automatic comparison of two-dimensional electrophoresis gels. Clin. Chem. 28: 979-986.

Skolnick, M.M. and Neel, J.V. (1986) An algorithm for comparing two-dimensional electrophore- tic gels with particular reference to the study of mutation. Adv. Hum. Genet. 15: 55—160.

Sternberg, S.R. (1986) Gray scale morphology. Comput. Vision Graph. Image Processing 35: 333- 355.

Tarroux, P., Vincens, P. and Rabilloud, T. (1987) HERMeS: a second generation approach to the automatic analysis of two-dimensional electrophoresis gels. Part V: data analysis. Electro- phoresis 8: 187-199.

Vincens, P. and Tarroux, P. (1987a) HERMeS: a second generation approach to the automatic analysis of two-dimensional electrophoresis gels. Part III: spot list matching. Electrophoresis 8: 100-107.

Vincens, P. and Tarroux, P. (1987b) HERMeS: a second generation approach to the automatic analysis of two-dimensional electrophoresis gels. Part IV: data base organization and manage- ment. Electrophoresis 8: 173-186.

Vincent, L. (1993) Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and effective algorithms. JEEE Trans. Image Processing 22: 176-201.

Vo, K.-P., Miller, M.J., Geiduschek, P., Nielsen, C., Olson, A. and Xuong, N. (1981) Compute1 analysis of two-dimensional gel. Anal. Biochem. 112: 258-271.

Wegner, S., Sahistr6m, A., Pleissner, K.-P., Oswald, H. and Fleck, E. (1998) Eine hierarchische Wasserscheidentransformation fiir die Spotdetektion in 2D Gel-elektrophorese-Bildern. In Informatik Fachberichte Heft 10, Bildverarbeitung in der Medizin. Springer, Berlin, pp. 134-138

Wu, Y., Lemkin, P.F. and Upton, K. (1994) A fast spot detection algorithm for 2D electrophoresis analysis. Electrophoresis 14: 1341-1356.

第 七 章 ”增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 : 稳定 同位 素 标 记 的 影响 Manfredo Quadroni and Peter James 1. 前 言

蛋 昌 质 组 分 析 所 关注 的 问题 是 蛋白 质 表 达 的 整体 变化 , 实现 这 种 分 析 最 常用 的 技术 是 二 维 电泳 和 质谱 分 析 技 术 。 最 近 , 商业 利益 促使 了 几 种 集成 化 系统 的 发 展 , 即 意图 建立 从 2-DE 样品 分 离 到 质谱 重 白 质 鉴定 的 工作 流水 线 。 在 界面 友好 、 适 用 性 强 的 基础 上 使 步骤 简化 和 标准 化 可 能 会 为 更 多 的 实验 室 成 功 运用 这 项 技术 开辟 一 条 道路 。 同 时 , 新 型 标记 方法 的 引入 能 大 大 地 简化 定量 和 数据 的 解释 ,也 可 能 会 使 凝 胶 电泳 的 步骤 被 省 略 掉 而 代 之 以 简单 的 色谱 步骤 。 本 章 中 , 我 们 将 概述 一 种 独特 的 蛋白 质 组 分 析 方 法 的 各 个 阶 段 ,并 概括 1998 年 末 我 们 对 这 一 领域 进行 综述 以 来 的 新 进展 (Quadroni and James, 1999 ) 。

全 基因 组 序列 (Devine and Wolfe，199$) 和 大 量 表 达 序 列 标签 库 (EST，Adams et a.，1991) 的 应 用 使 定义 生物 体内 全 部 可 能 的 蛋白 质 成 分 (和 蛋白质 组 ) 成 为 可 能 。 现 在 的 兴趣 集中 在 努力 去 解释 大 量 涌现 的 新 序列 数据 ,以 了 解 细胞 中 大 批 化 学 分 子 在 建立 细胞 的 分 子 机 器 过 程 中 是 怎样 相互 作用 的 。 因 而 解答 生物 学 问题 的 中 心 也 必须 从 一 个 简化 论 者 向 全 局 性 方法 转移 。 可 以 开展 基于 监测 整个 基因 组 表达 的 更 为 细微 的 分 析 方 法 , 而 不 是 分 割 开 整个 过 程 去 鉴定 一 个 可 能 的 效应 子 。 这 样 一 种 通过 mRNA 表达 的 定性 和 定量 分 析 来 描述 生物 学 系统 成 为 可 能 (Lashkari et al., 1997; Velculescu et al., 1997), 原因 是 由 于 各 种 DNA 表达 分 析 方 法 和 全 基因 组 范围 (genome-wide) 研 究 的 发 展 。 大 规模 的 mRNA 表达 研究 和 基因 组 DNA 测序 的 前 提 是 高 度 自动 化 操作 。 可 重复 性 是 对 这 些 复杂 的 数据 集 (datasets) 的 统计 分 析 的 基础 , 而 自动 化 和 高 通 量 的 数据 积累 对 这 样 大 的 工作 来 说 必 不 可 少 。DNA 和 mRNA 物化 性 质 很 一 致 ,易于 操作 , 可 通过 聚合 酶 链 反 应 方法 扩 增 , 因此 适 于 自动 化 。 与 核酸 相反 ,和 蛋白质 多 种 多 样 ,不 可 能 找到 通用 的 蛋白 质 处 理 方法 。 当前 惟一 系统 分 析 细 胞 中 多 数 蛋白 质 表 达 状 态 的 方法 是 基于 2-DE 的 方法 (Klose，1975; O’ Farrell, 1975; O’ Farrell et al .，1977)。 最 近 , 同位 素 标记 技术 (Gygi et al., 1999; Oda et al .，1999) 被 开发 出 来 ,从 而 使 2-DE 分 离 蛋白 质 的 定量 更 加 可 靠 。 这 些 方法 为 开 发 可 替代 2-DE 的 技术 开辟 了 道路 , 并 大 大 拓宽 了 蛋白 质 表 达 检 测 的 动态 范围 。 本 章 我 们 将 概述 在 复杂 有 蛋白质 组 分 析 中 所 尝试 使 用 的 自动 化 蛋 白 质 鉴定 和 定量 的 方法 及 其 缺 陷 。

2. 样品 制备

可 重复 的 样品 制备 可 能 是 获得 有 效 的 蛋白 质 组 分 析 中 最 重要 的 一 点 。 为 了 得 到 有 代 表 性 的 蛋白 质 样品 , 细胞 或 组 织 必须 进行 有 效 破 碎 , 细胞 内 成 分 的 溶解 要 具有 重复 性 。 在

第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋白 质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 4 和，

使 用 基于 尿素 的 混合 溶液 (其 中 含有 非 离 子 去 污 剂 、. 还 原 剂 和 蛋白 酶 抑制 剂 HET BE 提取 前 , 常 使 用 物理 破碎 法 碎 裂 细胞 或 组 织 , 比如 超声 法 、 机 械 驱 动 急 剧 压 力 变 化 法 、 匀 浆 和 剪 切 技术 。 细 胞 膜 和 细胞 骨架 蛋白 质 的 回收 率 不 稳定 , 在 一 些 蛋 白质 可 能 完全 被 提取 ， 而 仍 有 高 达 10% 的 蛋白 质 在 提取 后 残留 在 沉淀 颗粒 中 。 可 使 样品 在 一 天 内 运行 完成 (从 上 样 到 胶 的 染色 和 扫描 ) 的 小 2-DE 凝 胶 的 开发 是 很 重要 的 一 步 。 这 就 可 以 同时 快速 评 价 多 种 不 同 的 样品 制备 方法 。 为 了 降低 被 分 析 的 真 核 生 物 组 织 蛋 白质 混合 物 的 高 度 复 杂 性 , 使 得 其 中 含量 较 少 的 组 分 可 以 被 分 辨 和 分 析 , 常 要 求 对 样品 进行 预 分 离 。 处 理 类 似 组 织 这 样 的 混合 细胞 组 分 时 , 使 用 荧光 活化 细胞 分 类 器 (FACS)(Madsen et az .，1988) 对 细 胞 进行 预 分 离 能 获得 小 的 亚 细 胞 群 , 从 而 大 大 提高 分 析 的 灵敏 度 。 更 重要 的 进展 是 自由 流动 电泳 分 离 细 胞 器 /组 件 方法 的 开发 (Anderson，1967; Burggraf et al., 1995). XE 白质 表达 谱 研 究 的 重要 进展 , 它 将 显示 蛋白 质 是 在 细胞 的 哪个 部 分 、 在 何 种 条 件 下 发 现 的 (Blackstock and Weir，1999)。 这 就 使 我 们 可 以 去 开发 一 个 理论 模型 , 通过 该 模型 , 细胞 状态 可 以 根据 一 套 相 互 作 用 的 分 子 机 器 来 定义 。

3. AE REE op BS FO BT 3:1 自动 化 二 维 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (2-DE-PAGE )

自 20 多 年 前 建立 以 来 , 标准 的 变性 2-DE 凝 胶 系 统 仍然 保持 其 必要 的 手工 操作 , 而 且 具有 相同 动态 范围 与 分 辨 能 力 的 蛋白 质 分 离 技术 也 没有 有 效 改 变 。 一 个 使 用 半自动 化 仪 器 样机 的 详细 研究 显示 了 机 械 操 作 的 可 重复 性 优点 (Harrington et al., 1993), 但 是 , 直 到 最 近 ,2-DE 胶 的 大 规模 的 自动 化 产品 研制 开发 才 由 商业 企业 开始 进行 ,如 Large Scale Biology 和 Oxford Glycosciences。 目 前 已 有 三 家 公司 宣布 了 其 在 蛋白质 组 分 析 集 成 化 系统 的 发 展 :Amersham-Pharmacia\BioRad 和 Genomic Solutions。 我 们 将 在 本 节 的 最 后 概述 这 些 , 但 必须 强调 , 这 些 是 非常 新 的 系统 , 有 时 仅 部 分 完成 , 对 这 些 系统 的 体验 非常 有 限 。

3.2 蛋白 质 的 扫描 检测 和 定量

通常 蛋白 质 可 以 通过 其 UV 吸收 呈现 , 不 过 , 聚 丙烯 酰 胺 在 同一 紫外 范围 有 吸收 ,所 以 必须 对 蛋白 质 进行 染色 。 为 保持 蛋白 定量 和 进一步 分 析 步 又 的 一 致 性 , 使 用 的 染色 方 法 应 该 对 全 部 蛋白 质 都 有 效 。 到 目前 为 止 ,最 常用 的 蛋白 染色 方法 是 考 马 斯 亮 蓝 染 色 和 银 染 。 两 种 方法 的 灵敏 度 都 与 蛋白 质 的 序列 有 关 ( 尤 其 是 银 染 ), 对 大 多 数 蛋白 质 来 说 , 二 者 都 有 较 宽 的 动态 线性 范围 。 另 一 个 选择 是 使 用 荧光 标记 , 可 以 在 一 向 到 二 向 的 平衡 步 又 利用 与 蛋白 共 价 结合 ,也 可 以 使 用 荧光 标记 SDS 类 似 物 或 荧光 染色 (Steinberg et al., 1996)。 尽 管 荧光 染料 具有 非常 高 的 甚至 在 亚 attomol 水 平 的 灵敏 度 , 但 响应 的 线性 和 通 用 性 仍然 是 限制 其 应 用 的 因素 。 任 何 染色 方法 都 不 会 有 干扰 进一步 分 析 的 副作用 ,即使 是 银 染 也 只 有 很 少 的 化 学 修饰 ( 见 第 四 章 )(Shevchenko et al., 1996), 1H #, Ht MOS 度 仪 在 吸光 模式 下 扫描 , 所 得 到 的 线性 响应 范围 是 0 一 3.5 个 光 密 度 单位 (OD)。 基 于 放 射 性 同位 素 标记 的 检测 方法 非常 灵敏 ( 优 于 attomole), 但 并 不 适合 于 自动 化 操作 , 因为 很 难 将 胶片 (或 者 来 自 BaFBr:Eu2 + 储 屏 图 像 的 计算 机 打印 输出 ) 上 点 的 位 置 与 凝 胶 基体 相 互 关联 。

(eaab 蛋白 质 组 学

除 受 所 使 用 的 显现 方法 影响 外 ,2-DE 凝 胶 分 离 还 受到 几 个 限制 因素 的 干扰 。 超 高 灵 敏 度 的 质谱 蛋白质 鉴 定 技术 的 出 现 使 宽 pH 范围 的 2-DE 凝 胶 分 离 的 缺点 显露 无 余 , 这 种 BAAS BE CRE HE EE ARRAS, 但 很 多 蛋 日 质 得 不 到 充分 的 分 离 。 部 分 重重 的 蛋白 点 可 以 通过 计算 机 处 理 的 方法 分 辨 , 但 现在 逐渐 明确 了 很 多 均匀 的 蛋白 点 也 包含 有 两 个 以 上 的 蛋白 质 。 对 于 原核 生物 , KA 20% 的 蛋白 点 包含 一 个 以 上 的 蛋白 质 (Link et al., 1997), 而 对 于 真 核 细胞 来 说 , 这 一 数字 接近 40% 。Proteome Inc. 与 Perseptive Biosystems 的 合作 研究 (Parker et wz .，1998) 详 细 说 明了 酵母 提取 物 2-DE BRO RHE 白 点 的 交叉 污染 程度 和 实质 。 很 多 和 蛋 日 点 包含 了 3 个 甚至 更 多 蛋白质 。 尽 管 质谱 技术 足 以 对 蛋白 质 混合 物 进行 分 辨 (Arnott et al., 1998), 但 每 个 蛋白 点 含有 多 个 蛋白 质 使 得 很 多 实验 结果 难以 解释 。

3.3 通过 稳定 同位 素 标 记 定量 2-DE 凝 胶 中 的 恒 白 质

体内 标记 蛋白 质 分 析 中 常用 的 技术 是 使 用 放射 标记 的 氨基 酸 ( 如 ”>S-Met 和 较 少 用 的 ”>S-Cys) 增 加 2-DE 的 检测 灵敏 度 , 并 利用 脉冲 示 踪 实验 测定 蛋白 质 合 成 和 降解 速率 。 最 近 稳 定 同 位 素 在 蛋白 质 质谱 分 析 中 的 应 用 引起 人 们 的 巨大 兴趣 。 一 种 方法 是 使 用 同位 素 缺 乏 介质 ( 重 同位 素 丰 度 较 低 的 介质 如 2N\、H 和 ”"H 以 及 3C)。 这 使 得 一 个 离子 的 同位 素 复 峰 衰减 成 一 个 单 峰 , 以 增加 灵敏 度 和 准确 度 (Marshall et al., 1997). MER ARRAY IA

细胞 状态 1 细胞 状态 2 GP 生长 在 言 含 5N 的 介质 中

混合 ， 提 取 和 蛋白 ， 分 离

foc oe

ee ew? ie ge ae ee

切 下 蛋白 点 ， 酶 切 ， 提 取 多 肽

RAMA: 表达 量 不 变 相对 离子 丰 度

蛋白 质 B: 在 状态 2 下 增加 3 倍

质量 质谱 分 析 鉴 定 蛋白 质 ， 并 通过 测定 “NSN 质谱 峰 的 比率 相对 定量 蛋白 质

图 7.1 2-DE 凝 胶 分 析 的 体内 稳定 同位 素 标记 细胞 分 别 在 生长 正常 的 修饰 条 件 和 富 含 SN 的 介质 中 。 蛋 白质 从 细胞 中 提取 ， 并 在 2-DE 分 离 前 混合 。 和 蛋白 点 被 切 下 \ 酶 解 ,再 进行 MALDI-MS 分 析 。 离 子 对 的 X4N 与 SN 同位 素 之 比 可 以 定量 两 种 状态 之 间 的 表达 水 平 变化 。

Ste ”增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 "25 。

位 素 标记 已 经 用 于 蛋白 质 表 达 和 修饰 相对 变化 的 定量 (图 7.1)(Oda et al., 1999). AHA 生长 在 由 正常 同位 素 组 成 的 “ 轻 的 "化合物 介质 中 , 或 是 富 含 N 的 “ 重 的 ”介质 中 ;合并 从 生长 在 不 同 条 件 下 的 细胞 中 得 到 的 蛋白 质 提 取 物 , 一 部 分 通过 2-DE 分 离 。 切 下 重要 的 蛋白 点 , 酶 解 后 使 用 质谱 分 析 提 取 的 肽 。5SN 结 合 的 肽 比 正常 肽 大 一 个 质量 单位 , 使 得 来 自 两 个 细胞 混合 物 中 的 肽 得 到 区 分 。 这 样 肽 质谱 峰 就 会 成 对 出 现 , 可 以 根据 峰 的 相对 高 度 加 以 定量 。 研 究 发 现 二 者 比率 的 线性 值 跨越 两 个 数量 级 。 这 个 步骤 也 可 很 好 地 用 于 确定 翻 译 后 修饰 水 平 的 变化 (图 7.2)。 实 际 上 , 这 种 方法 受到 材料 成 本 的 限制 ,不 可 能 对 整个 动物 进行 标记 , 而 且 它 需 要 来 自 小 牛 胚胎 血清 的 血清 衍生 因子 ,通常 不 用 于 真 核 细 胞 培养 。 细胞 状态 1 细胞 状态 2 生长 在 正常 介质 中 国 欧 生长 在 富 含 SN 的 介质 中

酶 解 ， 提 取 多 肽 质谱 分 析

XP 相对 离子 丰 度 X 质量

未 磷酸 化 的 多 肽 X | 磷酸 化 多 肽 XP | 质谱 峰 的 比率 使 位 点 专 一 的 磷酸 化 程度 得 到 相对 定量

图 7.2 同位 素 标记 和 翻译 后 修饰 的 鉴定 能 用 于 测定 翻译 后 修饰 (如 磷酸 化 ) 的 变化 水 平 的 同位 素 标记 和 表达 定量 的 基本 方法 。

胶 后 标记 “另外 可 以 选择 使 用 分 离 后 同位 素 标记 的 方法 进行 相对 定量 (图 7.3)。 最 UE Aebersold 小 组 描述 了 一 种 称 为 同位 素 编 码 亲 和 标签 (ICAT) 的 方法 ,非常 有 望 成 为 蔡 代 2-DE 凝 胶 分 析 的 比较 蛋白 质 组 全 面 方 法 (Gygi et al .，1999)。 它 是 标记 经 2-DE 分 离 所 得 到 的 不 同 条 件 下 的 细胞 提取 物 的 蛋白 质 , 选 出 单个 蛋白 点 , 切 下 后 Lys 残 基 被 琥珀 栈 化 ,随后 蛋白 质 用 Asp/GluC 和 蛋白酶 酶 解 。 从 状态 1 得 到 的 蛋白 质 N 末端 用 正常 的 试剂 H4NicNHSL1-(H4 - 烟 酰 氧 基 ) 琥 珀 酰 亚 胺 ] 专 一 标记 ,来 自 状 态 2 的 和 蛋白质 用 气 代 试剂 D4NicNHS 了 予以 标记 。 基 质 辅助 激光 解吸 飞行 时 间 质 谱 (MALDI-MS) 分 析 结 合 酶 解 可 以 通过 单个 肽 的 D4/H4. 比 率 进 行 蛋白 质 的 相对 定量 (图 7.4)。 这 种 方法 的 优点 是 它 能 用 于 全 部 类 型 的 蛋白 质 提 取 物 , 与 细胞 培养 同位 素 缺 乏 或 富 集 介 质 方法 相 比 , 费用 低廉 。 这

。 126° 蛋白 质 组 学

种 技术 的 一 项 重要 应 用 是 对 1-D 胶 条 和 2-D 未 能 完全 分 离 的 含 多 个 蛋白 质 的 点 进行 蛋白 质 的 相对 定量 。 这 对 只 能 在 ]DE 上 简单 地 部 分 分 离 而 不 能 在 2-DE 上 运行 的 膜 蛋 白质 研 究 非常 有 用 。 标 记 也 有 助 于 简化 标记 多 肽 的 串联 质谱 图 谱 的 解释 。

细胞 状态 1 细胞 状态 ?

* » 5 > *< ae we a

人 os ial ; 切 下 蛋白 点 ， 琥 珀 酰 化 ， Asp/Glu-C 蛋白 酶 酶 解 H AH 9 | | aa 用 H4 sais Hs 用 Dashing tie 一/ 肽 的 N ok pace! sa D

酶 解 与 MALDI-MS 分 析 结 合

B2

ica 通过 H4D4 峰 高 比率 相对 二 5 at 定量 蛋白 质 的 量 本 质 荷 比 通过 串联 质谱 分 析 和 蛋白 B 的 多 肽 片段 aa4 aa3 aa2 aal1 二 通过 相差 4 个 质量 单位 的 z b 离子 系列 测定 序列 训 二 质 荷 比

图 7.3 2-DE 凝 胶 分 析 的 提取 后 蛋白 质 标 记 为 了 解决 体内 蛋白 质 标记 的 问题 ,蛋白 质 可 以 在 2-DE 分 离 后 进行 同位 素 标记 。 多 肽 的 N 末端 被 标 记 后 , 这 种 方法 可 以 简化 串联 质谱 图 谱 的 解释 。

3.4 2-DE 凝 胶 蛋 白 点 的 分 离

如 果 分 析 一 系列 的 凝 胶 ,用 于 进一步 分 析 的 蛋白 点 可 以 用 自动 切 胶 系 统 (robotic spot picking system ) 进 行 单个 蛋白 点 的 后 处 理 (Walsh et wz .，1998)。 澳 大 利 亚 和 蛋白 质 组 分 析 机 构 (The Australian Proteome Analysis Facility, APAF) 已 经 与 ARRM(Advanced Rapid Robotics Manufacturing, Kent Town, South Australia) 合 作 开 发 了 这 种 商业 化 的 系统 。 机 KF UF SERB PVDF 膜 上 的 蛋白 点 , BT AE BOS AY 96 孔 板 中 酶 解 , 后 者 由 第 二 台 自 动 化 系统 (由 Canberra Packard, Downer’s Grove, II, USA 销售 ) 完 成 , 它 随 后

第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋白 质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 = K27e

1823 1953 1877* 1857 1873"

丰 度

18191) 1853

1,000 ali

1750

1950 2000 质 荷 比

1850 1900

图 7.4 在 单个 点 中 发 现 的 两 种 蛋白 质 的 MALDI-MS 图 谱 酶 解 和 标记 后 , 不同 条 件 下 的 蛋白 质 相 对 表达 水 平 可 被 测定 。 在 本 图 谱 中 , 星 号 标记 的 峰 表 示 表 达 水 平 保 持 一 致 的 蛋白 质 。 但 同一 蛋白 点 中 , 另 一 蛋白 质 (未 标 星 号 的 多 肽 ) 的 表达 水 平 随 三 因 素 之 一 增加 。

数据 收集 ， 质 量 控制 ， 数 据 储存 数据 整合 数据 集成 和 显示 工具 GUI

图 7.5 标准 的 蛋白 质 组 分 析 系 统 两 级 蛋白 质 组 分 析 工 作 站 软件 控制 类 似 2-DE 运行 、 蛋 白 点 切割 . 酶 解 和 包括 数据 分 析 和 样品 跟踪 的 质谱 分 析 机 械 装 置 。

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« $28 - 蛋白 质 组 学

将 酶 解 液 与 基质 混合 后 在 多 样品 盘 上 点 靶 。 在 10 个 工作 日 内 成 功 地 完成 了 来 自 单个 2-DE 膜 的 288 个 蛋白 点 的 分 析 (Walsh et al., 1998), PERU PF, 2-DE 分 析 软 件 应 该 FOTN RA, 并 与 机 器 人 后 来 切 下 的 点 相 匹配 。 这 对 PVDF 膜 来 说 比较 简单 ， 但 凝 胶 容 易 变形 , 尤其 是 在 点 切割 时 容易 发 干 ,难于 操作 。 因 此 用 于 切割 的 凝 胶 或 膜 必 须 具有 机 械 稳 定性 。 此 外 也 有 其 他 一 些 自动 酶 解 装 置 (Davis et al., 1995a; Houthaeve et a/.，1997)。 最 近 三 种 商用 "蛋白质 组 系统 ”已 分 别 由 Amersham-Pharmacia, BioRad 和 Genomic Solutions 发 布 。 这 三 种 系统 的 基本 组 成 部 分 非常 相似 , 其 中 包括 一 个 胶 切 割 机 ，

它 根据 用 户 定 义 的 标准 (如 可 见 点 和 不 可 见 点 ) 得 到 的 计算 机 辅助 2-DE 胶 分 析 结 果 切 下 染色 胶 中 有 意义 的 点 。 这 种 “完全 的 "系统 的 基本 结构 如 图 7.5 所 示 。

3.5 蛋白 质 酶 解 / 碎 和 裂

当前 生物 和 蛋白质 和 多 肽 分 析 的 主要 制约 因素 是 样品 的 处 理 。 和 蛋白 质 浓度 低 至 500 fmol/ 岂 时 , 酶 解 效 率 很 低 。 这 是 因为 和 蛋白酶 在 $ 一 50 pmoly 几 范围 内 仅 表 现 $S0% 的 最 高 活 性 .50pmol/20pl BSA 酶 解 得 到 约 60 个 主要 的 多 肽 ,摩尔 回收 百分比 约 为 95%。 而 100fmol/20pl BSA 仅 得 到 6 个 多 肽 ,摩尔 回收 百分比 约 为 5% 。 可 以 选择 开展 化 学 方法 (但 仍 存 在 样品 处 理 损失 ) 或 直接 用 质谱 完成 。 完 整 蛋 白 的 串联 质谱 分 析 可 通过 多 种 质谱 技术 进行 ,如 碰撞 诱导 解 离 (collision-induced dissociation, CID) (Senko et wz .，1994)， 红 外 多 光子 解 离 (infrared multiphoton dissociation, IRMPD) (Little et wz .，1994)， 紫 外 激光 诱导 雁 裂 (ultraviolet laser-induced fragmentation) 和 表面 诱 导 碎 裂 等 (surface-induced fragmen- tation) (Williams et al .，1990)。 这 些 技术 都 能 用 傅立叶 变换 离子 回旋 加 速 共 振 (FT-ICR ) 完成 , 其 高 质量 准确 度 、 分 辨 率 和 能 进行 上 级 串联 质谱 实验 的 能 力 使 得 人 们 可 以 理解 质 谱 复 杂 的 碎 裂 方式 。 已 经 证 实 , 与 精确 质量 和 ”级 质谱 外 推 的 系列 序列 标签 结合 , 完整 蛋 白质 能 通过 FT-ICR 的 碎 裂 加 以 鉴定 (Mortz et al., 1996). HUE Li 和 Marshall 用 LC/ ESI FT-ICR 质 谱 示范 了 蛋白质 的 在 线 鉴 定 。 常 规 扫 描 首 先 用 于 提取 完整 蛋 日 质 的 精确 质 量 , 接 下 来 选择 扫描 IRMPD 用 于 选择 蛋白 质 的 /> 离子 。 完 整 的 质量 是 用 于 宽 分 子 质 量 范围 的 数据 库 子 集 的 选择 。 通 常 5 Aly -碎片 离子 和 从 IRMPD 获得 的 小 序列 标签 与 这 一 套 方法 相 匹 配 识 别 蛋 白质 .FT-ICR-MS 仪器 极其 昂贵 , 而 且 还 未 完成 自动 化 运行 。

4. 质谱 :使 用 质谱 数据 八 定 蛋 日 质

为 完成 高 通 量 蛋 白质 鉴定 , 必须 采取 分 阶段 的 步骤 。 第 一 阶段 是 非常 快速 , 鉴别 大 批 量 蛋 白质 的 低 信息 含量 的 数据 采集 , 接 下 来 的 第 二 阶段 是 详细 说 明 其 余 蛋 白质 的 低 通 量 、 高 信息 含量 的 数据 产生 阶段 。 最 后 的 第 三 阶段 是 完成 说 明 翻 译 后 修饰 的 大 工作 量 的 数据 积累 。 在 实际 的 操作 中 , 基于 MALDI 的 多 肽 质量 指纹 谱 是 理想 的 第 一 步 , 紧 接 着 的 串联 质谱 肽 片段 指纹 谱 部 分 测序 是 第 二 步 。

4.1 质量 指纹 肽 谱

1993 年 , 5 个 研究 小 组 分 别提 出 质量 指纹 肽 谱 的 概念 (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Pappin et al., 1993; Yates et wdl .，1993) 。 这 个 概念 是 指 特定 的 蛋白 酶 对 蛋白 质 进行 酶 解 后 的 质谱 分 析 得 到 一 套 多 肽 质量 , 这 种 特性 像 指纹 一 样 ，

第 七 章 ” 增 强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同位 素 标记 的 影响 “129 。

每 种 蛋白 都 具有 特定 的 质量 肽 谱 。 因 此 , 一 套 质 量 数据 能 用 来 查寻 序列 已 被 计算 的 指纹 质量 替换 的 蛋白 质数 据 库 , 从 而 发 现 相似 的 模式 。 得 到 酶 解 肽 质量 最 快 的 方法 是 通常 与 飞行 时 间 (TOF) 结 合 的 MALDILMS。 商 业 化 的 MALDI-TOF 仪器 装 有 最 多 1024 个 的 样 品 靶 位 ,软件 可 在 无 人 时 进行 数据 采集 。 样 品 制备 对 这 项 技术 的 成 功 与 否 相 当 重 要 。 如 果 样 品 同 源 , 使 用 最 佳 的 肽 、 底 物 比 例 , 几 次 激光 发 射 完 全 可 以 不 搜寻 样品 位 置 而 获得 较 好 的 谱 图 。 最 近 一 项 使 用 基质 晶体 沉淀 的 母 型 结晶 层 的 样品 制备 技术 推进 了 MALDI- MS #9 (#8 (Onnerfjord et al. 1999)。 样 品 均 质 性 使 得 每 个 样品 在 15s 内 使 用 16 次 激光 发 射 就 可 获得 质谱 。 使 用 流动 高 压 电 动 微量 分 布 器 在 高 密度 靶 盘 点 靶 , 用 唱 种 层 方法 点 样 约 100 pl 样品 , 得 到 直径 为 S00x 的 样品 点 。 事 实 上 ,所 有 1000 以 上 的 峰 都 是 单个 带电 肽 , 容易 得 到 数据 , 也 能 获得 较 高 的 信 噪 比 。 现 在 使 用 在 800~3000 m/z 质量 范围 的 “ 自 然 的 "内 标 ( 如 胰 蛋 白 酶 的 自 切 峰 ) 能 将 误差 保持 在 Sppm 以 下 。 如 果 数 据 库 中 提供 指纹 肽 谱 , 那 就 能 很 快 鉴定 蛋白 质 , 但 在 检索 基因 组 或 EST 数据 库 时 , 这 种 技术 就 不 太 成 功 。 使 用 两 种 以 上 数据 库 交 叉 检 索 可 以 减少 随机 的 噪音 因素 (James et al., 1994), th ay 445 合 来 自 不 同 特性 的 蛋白 酶 的 酶 解数 据 ( 如 AspN 和 LysC)。 单 个 酶 解 可 在 自然 状态 下 测 定 , 再 在 样品 靶 上 完成 化 学 修饰 (如 甲 基 化 、 乙 酰 化 或 气 代 )。 这 大 大 地 增加 可 信和 度 , 但 需 要 双 倍 的 分 析 时 间 。

4.2 小 序列 标签 多 肽 指纹 谱

使 用 双重 酶 解 , 或 自然 状态 和 化 学 修饰 酶 解 可 以 开发 已 存在 于 简单 肽 指纹 谱 中 的 序列 信息 。 胰 蛋白 酶 在 Lys 和 Arg 残 基 位 酶 解 ,二 者 都 是 蛋白 质 中 存在 最 丰富 的 氨基 酸 。 因 此 蛋 自 质 中 存在 大 量 的 重复 序列 ,如 KK、RR 和 KKR。 胰 和 蛋白酶 随机 地 切 开 这 些 位 点 ,还 有 固 有 的 较 低 的 蛋白 外 切 酶 活性 ,也 就 产生 不 规则 的 C 末 端 。 平 均 每 个 肽 质量 谱 可 以 找到 2.5 个 这 样 的 序列 标签 (Jensen et 必 .，1996)。 连 续 的 肽 链 内 切 酶 和 肽 链 外 切 酶 酶 解 能 有 效 得 到 不 规则 的 N 或 C 末 端 序列 ,产生 的 数据 可 用 于 检索 序列 数据 库 (Korostensky et al., 1998), 蛋 和 白质 鉴 别 的 可 信 度 远 比 简单 的 指纹 谱 高 。 不 过 , 这 种 方法 有 酶 解 同 样 的 缺点 , 随 着 肽 浓度 的 降低 和 肽 数量 的 增加 , 肽 链 端 解 酶 的 活性 也 很 快 下 降 。 另 外 , 由 于 肽 链 端 解 酶 酶 解 的 不 可 预测 性 , 序列 标签 可 能 对 应 于 母 离子 或 开始 的 5 个 氨基 酸 之 后 的 序列 , 使 得 在 复杂 的 酶 解 中 难于 将 序列 归属 给 特定 的 母 离子 , 很 难得 到 序列 标签 。

使 用 连续 的 化 学 降解 步骤 可 以 替代 产生 不 规则 N 或 C 末端 序 列 的 肽 链 内 切 酶 和 肽 链 外 切 酶 酶 解 。 已 经 证 明 多 肽 混合 物 的 一 步 手 工 Edman 降解 得 到 单个 N 末端 氨基 酸 标 签 的 方法 的 有 效 性 (Jensen et al., 1996), 但 衍生 化 导致 灵敏 度 降 低 (降低 因子 约 为 10)， 洗 脱 步骤 也 会 导致 大 量 的 样品 流失 。 实 际 上 “阶梯 测序 ”是 这 种 方法 的 简略 形式 , 使 用 异 硫 氰 酸 葵 酯 的 自动 Edman 降解 是 在 低 浓 度 的 序列 终止 剂 ( 硫 氰 酸 葵 酯 ) 的 存在 下 完成 BY, 得 到 的 阶梯 肽 片段 用 MALDI-MS 进行 分 析 (Chait et al .，1993)。 这 种 方法 的 改进 形 式 不 用 序列 终止 剂 ,通过 在 每 个 循环 加 入 等 量 的 起 始 肽 完成 偶 联 和 有 裂解 反应 产生 多 肽 阶 梯 (Bartlet-Jones et wl .，1994)。 多 肽 末端 氨基 的 保留 使 得 随后 的 碱 性 四 级 铵 NHS 酯 化 可 以 提高 灵敏 度 , 但 它 的 主要 缺点 是 额外 增加 了 处 理 步 又 。

已 经 开发 了 替代 的 使 用 水 溶性 试剂 的 化 学 降解 方法 , 它 是 将 多 肽 吸附 在 固定 于 聚 四 CRRA C-18 反 相 颗粒 上 , 进行 基于 硫 酯 的 降解 。 这 种 方法 能 在 固定 在 MALDI 靶 的

| CORRUUEM Gee MoS Be TELE Tt 二

- 130 - 蛋白 质 组 学

单个 聚 四 所 乙烯 膜 上 同时 完成 100 个 蛋白 质 的 降解 ,随后 可 直接 进入 质谱 仪 进行 分 析 。 实际 上 和 蛋白质 首 先 经 过 化 学 降解 或 蛋白 酶 解 , 再 固定 在 植 入 C-18 PRL RO 上 。 降 解 液 分 成 两 部 分 , 一 部 分 进行 完整 肽 混合 物 的 MALDI-TOF-MS 分 析 ( 图 7.6a)。 另 一 部 分 进行 是 化 学 降解 后 的 测定 (图 7.6b)。 降 解 是 基于 使 用 类 似 硫 代 乙 酰 殖 基 乙 酸 的 硫 代 酰 基 硫 酯 (图 7.6c)。 三 甲 胺 蒸汽 首先 通过 膜 以 建立 碱 性 条 件 , 然后 N - 乙 基 吗啡 啉 缓冲 液 中 的 硫 代 乙酰 琉 基 乙酸 再 透 过 膜 , 与 多 肽 反应 形成 N - 硫 代 乙酰 衍生 物 。 在 通 过 三 氟 乙 酸 蒸汽 切 下 第 一 个 氨基 酸 前 , Teflon 膜 先 用 水 洗 , 再 用 0.1% 三 氟 乙 酸 /水 洗涤 。 通过 小 心 选择 水 蒸汽 的 量 ,使 仅 25% 的 氨基 酸 裂解 , 另外 75% 进行 硫 代 乙 酰基 水 解 。 重 复数 次 ,序列 标签 和 和 母 离 子 组 成 的 肽 阶梯 产品 可 通过 MALDI 分 析 读 取 , 并 用 于 数据 库 检 索 。 这 种 方法 的 优点 是 数据 收集 速度 快 , 肽 降解 物 在 降解 后 立即 被 固定 , 样品 损失 降低 ， 反应 也 可 平行 完成 。 另 外 非 序列 专 一 酶 酶 解 和 化 学 降解 可 以 产生 用 于 数据 库 检 索 的 数 据 。 这 样 MALDI-MS 与 自动 化 酶 解 和 其 他 多 肽 修饰 化 学 结合 给 蛋白 质 鉴 定 提供 了 高 通 量 的 手段 。 现 在 大 多 数 商 业 化 质谱 仪 都 包括 多 个 步骤 , 如 样品 靶 的 装载 、 样 品 定位 、 图 谱 采集 和 质谱 峰 数 据 的 数据 库 检 索 等 。

oO a ee 20000 、 8 15126, 1703.8 2 <| _ a oe 9 de £ Be ml 0 上 a & 20000 8 ++ 10000 1454.7 g a a a fe a [-0 8445 19927 _— iu 本 5000 1756.0 1131.61387 800 1200 1600" 2000 2400 1200 1600 2000 2400 质 荷 比 (c) i HO NGC_S-CHCOO- + NH,—C—C—Gly-Asp-Phe-Arg CH,” | : 个 联 | CH, T CH; C-NH-C-C-Gily-Asp-Phe-Arg 裂解 | i

CH, 里 唑 酮 衍生 Doe + CH,—Gly-Asp-Phe-Arg 0 图 7.6 Chemtag 化 学 和 MALDI-MS (a) 胰 蛋 白 酶 酶 解 从 2-DE 凝 胶 分 离 的 蛋白 点 的 MALDI-MS 谱 图 。 尽 管 只 有 几 种 多 肽 存在 , 而 且 蛋白 点 中 只 有 两 个 蛋白 质 , 质量 指纹 肽 谱 仍 不 能 鉴定 存在 的 蛋白 质 。(b) 使 用 硫 代 乙 酰 琉 基 乙酸 (thioacetylthioglycollic acid) 降 解 3 个 循环 后 酶 解 。 序 列 标签 及 其 母 离子 如 图 所 示 , 它们 可 用 来 鉴

定 蛋白 点 中 的 两 个 蛋白 质 。 5. 质谱 :使 用 串联 质谱 数据 鉴别 蛋 昌 质 5.1 串联 质谱 数据 采集 使 用 串联 质谱 碎 盈 方 式 进行 单个 多 肽 鉴定 的 概念 1994 年 被 提出 (Eng et al., 1994,

第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 : 稳 定 同位 素 标记 的 影响 - 131 -

Mann and Wilm, 1994), 它 类 似 于 质量 指纹 肽 谱 的 蛋白 质 鉴 定 方法 。20 世纪 80 年 代 Don Hunt 小 组 提出 的 低能 量 、 三 级 四 级 杆 质谱 仪 和 Klaus Biemann (1990) 提 出 的 高 能 量 、 四 个 扇形 的 磁 质 谱 开 创 了 多 肽 串联 质谱 的 历史 。 第 一 个 质量 扫描 阶段 用 于 离子 通过 含有 碰撞 气体 (如 氨 气 ) 的 高 压 区 加 速 前 分 离 单个 多 肽 离子 , 第 二 个 质量 扫描 阶段 用 来 测定 碰撞 诱 导 / 活 化 解 离 (CID) 产 生 的 多 肽 碎片 质量 。 利 用 装 有 离子 闸门 和 反射 简 的 TOF 仪器 , 增 加 激光 能 量 (获得 正常 质谱 所 需 的 两 种 因素 之 一 ) 可 获得 源 后 衰变 (PSD) 谱 。 在 股 流 膨 胀 (plume expansion) 和 离子 加 速 阶段 多 肽 离子 与 基质 多 次 碰撞 的 结果 是 ,大 部 分 MALDI 解 吸 离子 到 达 检 测 器 前 要 经 受 “ 延 迟 " 碎 裂 。 其 中 任 一 种 技术 产生 的 一 组 离子 都 能 用 于 测定 多 肽 的 序列 。 多 肽 的 碎片 质量 组 扮演 着 多 肽 指纹 的 角色 , 能 用 来 在 序列 数据 库 中 搜寻 类 WAI ZAK. PSD 分 析 应 易于 自动 化 操作 , 并 使 场 反射 曲线 化 , 使 得 更 简单 地 在 一 次 扫描 中 可 以 收集 全 部 碎 裂 谱 。 不 过 它 的 缺点 是 很 难 从 多 肽 混合 物 得 到 PSD 谱 , 而 且 一 些 分 级 分 离 形 式 应 该 在 分 析 之 前 完成 (Gevaert et al., 1996).

虽然 CID-MS/MS 碎 裂 可 获得 信息 量 较 大 的 数据 ,但 其 数据 收集 比 简 单 的 质量 指纹 肽 谱 要 费时 。 事 实 上 , 两 种 获得 高 灵敏 度 串联 质谱 数据 的 方法 可 通过 使 用 电 喷雾 接口 到 三 级 四 级 杆 、 离 子 阱 或 四 级 杆 - TOF 质谱 实现 : 酶 解 液 作 为 混合 物 从 毛细 管 1~10pum 的 出 口 未 端 以 非常 低 的 流速 直接 喷雾 (< 50 nl/min, Andren et al., 1994; Gale and Smith, 1993; Valaskovic et al., 1995; Wahl et al., 1993; Wilm and Mann, 1994), 或 纳 升 电 喷 雾 在 线 分 离 方法 如 电泳 毛细 管区 带电 泳 (CZE) 或 HPLC。 可 通过 程序 将 离子 挑选 出 来 自 动 对 多 肽 混合 物 进 行 串联 质谱 分 析 , 其 优点 是 使 用 查询 表 可 以 滤 出 自 切 碎 片 和 来 自 凝 胶 污染 物 的 杂质 (Davis et wa .，1995b)。 这 种 方法 已 成 功 地 用 于 完整 蛋白 质 的 测序 (Piccinni et ll .，1994)。 动 态 的 CZE/HPLC 方法 比 静态 的 纳 升 电 喷 雾 方法 灵敏 度 要 高 得 多 , 前 者 的 多 肽 会 浓缩 SO 倍 甚至 更 高 (Davis and Lee，1997)。 两 种 方法 的 共同 优点 是 , 他 们 都 能 与 母 离子 扫描 相 结合 。 当 这 些 离子 在 质谱 中 的 信 噪 比 为 1 时 ,多 肽 的 共同 碎 裂 片段 如 immonium 或 磷酸 盐 离 子 的 母 离子 扫描 仍 可 确定 多 肽 离子 的 质量 。 不 过 动态 方法 的 最 大 的 优点 是 能 与 自动 进 样 峰 接 口 , 完 成 自动 进 样 。

5.2 串联 质谱 数据 库 检索

使 用 未 经 解析 的 串联 质谱 谱 图 的 自动 数据 库 序列 检索 的 运算 法 则 已 在 过 去 的 4 年 里 得 到 发 展 。 也 许 应 用 范围 最 广 的 是 由 西雅图 华盛顿 大 学 的 John Yates 和 Jimmy Eng FF 发 的 SEQUEST 数据 库 (Eng et w.，1994)。 其 最 初 的 目的 是 搜索 未 修饰 的 多 肽 串联 质 谱 碎 裂 片段 的 蛋白 质数 据 库 , 但 后 来 扩展 到 搜索 翻译 后 修饰 的 多 肽 (Yates et al., 1995b)、DNA 数据 库 (Yates et al., 1995a) 和 高 能 量 CID 或 PSD 数据 (Griffin er al., 1995, Yates et wl .，1996)。 事 实 上 程序 搜寻 数据 库 ( 可 以 但 不 一 定 明 确 蛋 白 酶 ) 中 所 有 与 母 离子 (在 定义 的 质量 范围 内 ) 有 相同 质量 的 多 肽 , 然后 将 预测 的 串联 质谱 谱 图 和 实验 测 得 的 谱 图 相 匹配 , 最 终 对 得 分 最 高 的 多 肽 进行 交叉 相关 分 析 以 获得 最 好 的 比较 。 现 在 万 维 网 还 有 其 他 一 些 用 未 经 解析 的 谱 图 数据 检索 的 数据 库 检索 程序 , 如 纽约 洛克 菲 勒 研 究 所 的 Fragfit(Prowl 软件 组 的 一 部 分 ;http://prowl.rockefeller.edu/ ) ,加州 大 学 旧金山 分 校 的 MS-Tag(ProteinProspector 组 的 一 部 分 ;http://prospector. ucsfedu/eduy/ ) 。

另 一 个 序列 数据 库 中 香 白 质 鉴 定 的 算法 Peptide-Search 是 由 Matthias Mann 开发 的

。 132 - 和 蛋白质 组 学

(Mann and Wilm，1994)。 串 联 质谱 谱 图 必须 用 手工 检查 发 现 一 组 离子 ,用 完整 的 多 肽 质 量 ` 从 N 末端 到 标签 序列 的 起 始点 的 质量 和 从 标签 的 末端 到 C 末端 的 质量 得 到 的 小 序列 (标签 ) 形 成 系列 ,用 于 数据 库 检 索 。 仅 用 序列 标签 和 N 末端 的 质量 就 能 完成 检索 , 比如 这 种 算法 能 鉴定 携带 未 明确 的 翻译 后 修饰 的 多 肽 。 另 外 , 这 种 程序 也 能 完成 混合 检索 , 如 多 肽 质量 查找 和 序列 标签 查找 , 然后 组 合 检 索 结 果 。 其 他 与 SEQUEST 和 PeptideSearch 的 各 种 要 素 结 合 的 程序 已 被 开发 ,如 MassFrag (Gevaert et al., 1996), No-name (Patterson et al., 1996), Fragfit (Arnott et al., 1998) 和 Matrix Science 的 MASCOT

(http// www. matnxscience. com/ ) 。 5.3 自动 化 串联 质谱 解释 和 数据 库 检 索

最 初 蛋 白质 的 鉴定 是 通过 人 工 解释 串联 质谱 谱 图 , 再 在 BLASTA 或 TFASTA 等 数 据 库 中 进行 同 源 性 检索 (Altschul et al .,1990, 1994), 如 今 这 一 方法 正在 更 新 。 早 期 曾 尝 试用 部 分 相关 的 方法 将 越 来 越 长 的 序列 与 谱 图 相 适 应 (如 SEQPEP, Johnson and Biemann, 1989), 或 像 Hines 等 (1992 ) 描 述 的 使 用 图 谱 匹 配 的 方法 进行 自动 化 串联 质谱 图 谱 的 解释 。 最 近 用 可 能 的 序列 解释 SEQPEP 得 到 的 串联 质谱 谱 图 , 以 使 用 改进 的 FASTA 方法 搜索 序列 数据 库 的 程序 Lutkefisk (Taylor and Johnson，1997) 已 经 被 开发 。 另 一 种 方法 是 产生 含有 同位 素 信 号 的 串联 质谱 序列 离子 使 得 它们 立即 被 确认 为 N 末端 得 到 的 或 C 末 端的 > 系列 离子 。 蛋 白质 在 “0O/2%O 标 记 的 水 混合 物 (50:50) 中 的 酶 解 产物 在 质谱 中 形成 质量 相差 2Da 的 成 对 质谱 峰 , 这 是 因为 在 肽 键 水 解 过程 中 作为 溶剂 的 水 分 子 介 入 所 致 (Takao et wz .，1991)。 这 样 串 联 质谱 谱 图 中 2 离子 是 单 峰 ; 而 y 离子 出 现成 对 的 质谱 峰 。 这 已 经 作为 使 用 高 分 辩 四 级 杆 / 飞 行 时间 质 谱 数 据 库 检 索 的 自动 化 “de novo" 序 列 标签 的 根据 。 另 外 还 有 几 种 化 学 方法 专 一 地 用 同位 素 标签 标记 多 肽 的 N 末

100 b8 988.3 90 859.3 80 b9 2+ b6 ar 674.2 70 492.2 y7 711.3 60 a b7 = 50 527.2 y6 731.3 i 598.3 a6 40 646.3 855.3 0 y4 984.3 470.3| | 45 y7 | |b7+NH yg 642.2 20 b3 oa} 372 ne， 10 409.1 y f 300 900 1000 0 质 荷 比

400 500 600 700 800 y8 — y/ -y6 —y> —y4 -—.y5 -y2 ,y! wa Aa wf ne ay nsf Gly | Gln \ Glu bl 一 b2— b3— b4—b5 — b6— b7— b8 图 7.7 D4H4 标记 的 多 肽 串联 质谱

图 示 的 是 多 肽 ADIAGHGQE 的 串联 质谱 图 。2 离子 出 现 质量 相差 4 的 成 对 质谱 峰 , 而 y 离子 只 有 单 峰 。 半 数 的 烟 酸 存在 于 N 末端 容易 形成 ! 离子 , 使 得 从 图 谱 中 推论 出 肽 的 序列 更 容易 。

Soe “增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同 位 素 标记 的 影响 “88 >

端 ,因为 难以 区 分 肽 的 e 氨基 (N 末端 ) 和 e 氨基 (Lys), 而 且 去 除 基 本 位 点 后 检测 灵敏 度 下 降 , 所 以 并 没有 完全 成 功 。 我 们 最 近 介绍 了 一 种 很 容易 从 串联 质谱 中 推导 序列 的 方法 。 标记 的 方法 已 在 前 面 的 “ 胶 后 标记 ”部 分 讨论 。 简 单 说 来 , 使 用 50:50 的 H4 或 D4 的 烟 酸 混合 物 标记 和 蛋白质, 其 中 的 赖 氨 酸 侧 链 s 氨基 在 衍生 前 被 琥珀 酰 化 ,所 以 N 末端 的 o - 氢 基 反 应 绝对 专 一 。MALDI 图 谱 表 明 酶 解 得 到 的 全 部 多 肽 都 有 质量 相差 4Da 的 成 对 质谱 峰 出 现 。 必 须 选 择 足 够 宽 的 质量 范围 以 包括 全 部 的 母 离子 同位 素 峰 , 产生 的 串联 质谱 图 以 成 对 质谱 峰 出 现 的 来 自 N 末端 的 离子 为 主 (2 和 一 些 a 离子 )( 图 7.7)。 所 有 从 C 末 端 得 到 的 离子 (> 离子 或 中 间 的 离子 ) 都 是 单 峰 。 所 以 相当 容易 就 获取 到 和 蛋白质 的 序列 。 即 使 存在 未 知 的 翻译 后 修饰 ,也 不 影响 用 序列 (包括 在 适当 的 位 置 的 X) 在 (T)FASTA 中 进 行 序列 同 源 性 搜索 的 能 力 。 自 动 化 序列 推 朵 相 当 容 易 ,使 得 和 蛋白质 的 鉴定 非常 快速 , 而 且 具有 很 高 的 可 信和 度 。

5.4 数据 解释 工具

一 旦 数据 库 检 索 开 始 执行 , 自动 化 处 理 就 不 停 。 高 通 量 的 蛋白 质 分 析 要 求 开 发 工具 软件 帮助 实验 者 解释 数据 得 到 有 意义 的 倾向 和 结论 。 就 HPLC 或 CZE -自动 串联 质谱 来 说 ,其 产生 的 数据 文件 量 非常 庞大 , 而 人 工 查看 只 能 获得 很 少 的 一 部 分 。 为 了 比较 各 种 的 文件 , 强大 的 数据 分 析 软 件 包 是 必 不 可 少 的 。Terry Lee 的 实验 室 为 了 解释 从 蛋白 质 的 质 谱 分 析 中 得 到 的 数据 ,开发 出 Macpro-Mass (Lee and Vemuri, 1990) fF, EMA WZ 便 用 户 , 是 最 早 开发 的 程序 之 一 。 第 二 代 程 序 Sherpa 是 在 西雅图 华盛顿 大 学 由 Alex Taylor (Taylor et al .，1996) 开 发 的 。 程 序 能 同时 搜索 多 个 蛋白 质 序 列 , 同时 比较 两 个 LC-MS 文件 ,搜索 糖 基 化 和 磷酸 化 多 肽 ,给 予 数据 和 预测 之 间 的 匹配 程度 简单 的 评价 。 这 种 分 析 工 具 给 分 析 带 来 巨大 的 帮助 。 最 近 John Yates 已 经 描述 的 一 种 不 同 的 SEQUEST 程 序 , 用 于 比较 多 肽 的 碰撞 诱导 解 离谱 库 检 索 和 LC-MS/MS 实验 得 到 的 串联 质谱 差 减 分 析 (Yates et al.; 1998).

因此 大 部 分 蛋白 质 组 分 析 领 域 已 经 实现 部 分 自动 化 。 还 需要 给 予 格外 重视 的 主要 领 域 有 : 极 小 量 的 原料 (>10fmol) 酶 解 鉴别 翻译 后 修饰 的 通用 方法 , 尤其 是 糖 基 化 的 复杂 和 领 域 ; 样 品 酶 解 经 快速 高 效 地 浓缩 后 可 进行 肽 指纹 质谱 分 析 , 如 果 需 要 , 还 可 进行 相同 样品 的 串联 质谱 分 析 (MALDI 离子 阱 应 该 是 非常 理想 的 )。 但 不 幸 的 是 缺少 一 个 能 以 简单 可 行 的 方式 将 各 种 形式 的 所 有 数据 结合 在 一 起 , 进行 高 级 (high-order) 数 据 分 析 的 完整 的 实 验 室 信 息 管 理 系统 。 稳 定 的 同位 素 标记 简化 了 很 多 难题 , 如 单个 蛋白 点 中 含有 多 个 蛋白 质 及 其 定量 问题 , 它 也 是 简化 串联 质谱 数据 文件 里 信息 内 容 的 简单 方法 。 这 一 领域 内 需 要 做 的 还 很 多 , 但 大 部 分 问题 无 足 轻 重 , 纳米 技术 (nanotechnology) 和 更 好 的 数据 开发 工 具 不 和 久 将 革新 这 一 领域 。

( 刘 尚 义 HE Ree 校 )

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。 134+ 蛋白 质 组 学

参考 文献

Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M.H., Xiao, H., Merril, C.R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R.F. et al. (1991) Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science 252: 1651-1656.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Altschul, S.F., Boguski, M.S., Gish, W. and Wootton, J.C. (1994) Issues in searching molecular sequence databases. Nature Genet. 6: 119-129.

Anderson, N.G. (1967) Preparative zonal centrifugation. Methods Biochem. Anal. 15: 271-310.

Andren, P.E., Emmet, M.R. and Caprioli, R.M. (1994) Micro-electrospray: zeptomole/attomole per microliter sensitivity for peptides. J. Am. Mass Spectrom. 5: 867-869.

Arnott, D., Henzel, W.J. and Stults, J.T. (1998) Rapid identification of comigrating gel-isolated proteins by ion trap-mass spectrometry. Electrophoresis 19: 968-980.

Bartlet-Jones, M., Jeffery, W.A., Hansen, H.F. and Pappin, D.J. (1994) Peptide ladder sequencing by mass spectrometry using a novel, volatile degradation reagent. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 737-742.

Biemann, K. (1990) Sequencing of peptides by tandem mass spectrometry and high-energy © collision-induced dissociation. Methods Enzymol. 193: 455-479.

Blackstock, W.P. and Weir, M.P. (1999) Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Trends Biotechnol. 17: 121-127.

Burggraf, D., Weber, G. and Lottspeich, F. (1995) Free flow-isoelectric focusing of human cellular lysates as sample preparation for protein analysis. Electrophoresis 16: 1010-1015.

Chait, B.T., Wang, R., Beavis, R.C. and Kent, S.B. (1993) Protein ladder sequencing. Science 262: 89-92.

Davis, M.T. and Lee, T.D. (1997) Variable flow liquid chromatography tandem mass spectrometry and the comprehensive analysis of complex protein digest mixtures. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8: 1059-1069.

Davis, M.T., Lee, T.D., Ronk, M. and Hefta, S.A. (1995a) Microscale immobilized protease reactor columns for peptide mapping by liquid chromatography/mass spectral analyses. Anal. Biochem. 224: 235-244.

Davis, M.T., Stahl, D.C., Hefta, S.A. and Lee, T.D. (1995b) A microscale electrospray interface for on-line, capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometry of complex peptide mixtures. Anal. Chem. 67: 4549-4556.

Devine, K.M. and Wolfe, K. (1995) Bacterial genomes: a TIGR in the tank. Trends Genet. 11: 429- 431.

Eng, J.K., McCormack, A.L. and Yates, J.R. (1994) Correlating tandem mass spectral data of peptides to sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5: 976-989.

Gale, D.C. and Smith, R.D. (1993) Small volume and low flow rate electrospray ionisation mass spectrometry of aqueous solutions. Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 1017-1021.

Gevaert, K., Verschelde, J.L., Puype, M., Van Damme, J., Goethals, M., De Boeck, S. and Vandekerckhove, J. (1996) Structural analysis and identification of gel-purified proteins, available in the femtomole range, using a novel computer program for peptide sequence assignment, by matrix-assisted laser desorption ionization-reflectron time-of-flight-mass spec- trometry. Electrophoresis 17: 918-924.

Griffin, P.R., MacCoss, M.J., Eng, J.K., Blevins, R.A., Aaronson, J.S. and Yates, J.R. III (1995) Direct database searching with MALDI-PSD spectra of peptides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1546-1551.

Gygi, S.P., Rist, B., Gerber, S.A., Turecek, F., Gelb, M.H. and Aebersold, R. (1999) Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnol. 17: 994-999.

Harrington, M.G., Lee, K.H., Yun, M., Zewert, T., Bailey, J.E. and Hood, L. (1993) Mechanical precision in two-dimensional electrophoresis can improve protein spot positional reproduci- bility. Appl. Theor. Electrophoresis 3: 347-353.

Henzel, W.J., Billeci, T.M., Stults, J.T., Wong, S.C., Grimley, C. and Watanabe, C. (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5011-5015.

第 七 章 ， 增强 高 通 量 蛋白 质 组 分 析 : 稳 定 同位 素 标记 的 影 啊 oe

Hines, W.M., Falick, A.M., Burlingame, A.L. and Gibson, B.W. (1992) Pattern based algorithm for peptide sequencing from tandem high energy collision induced dissociation mass spectra. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3: 326-336.

Houthaeve, T., Gausepohl, H., Ashman, K., Nillson, T. and Mann, M. (1997) Automated protein preparation techniques using a digest robot. J. Protein Chem. 16: 343-348.

Hunt, D.F., Yates, J.R. III., Shabanowitz, J., Winston, S. and Hauer, C.R. (1986) Protein sequencing by tandem mass spectrometry. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 6233-6237.

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. and Gonnet, G. (1993) Protein identification by mass profile fingerprinting. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 58-64.

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. and Gonnet, G. (1994) Protein identification in DNA daiabases by peptide mass fingerprinting. Protein Sci. 3: 1347-1350.

Jensen, O.N., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Sequence patterns produced by incomplete enzymatic digestion or one-step Edman degradation of peptide mixtures as probes for protein database searches. Electrophoresis 17: 938-944.

Johnson, R.S. and Biemann, K. (1989) Computer program (SEQPEP) to aid in the interpretation of high-energy collision tandem mass spectra of peptides. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 18: 945-957.

Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231-243.

Korostensky, C., Staudenmann, W., Dainese, P., Hoving, S., Gonnet, G. and James, P. (1998) An algorithm for the identification of proteins using peptides with ragged N- or C-termini generated by sequential endo- and exopeptidase digestions. Electrophoresis 19: 1933-1940.

Lashkari, D.A., DeRisi, J.L., McCusker, J.H., Namath, A.F., Gentile, C., Hwang, S.Y., Brown, P.O. and Davis, R.W. (1997) Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 13 057-13 062.

Lee, T.D. and Vemuri, S. (1990) MacProMass: a computer program to correlate mass spectral data to peptide and protein structures. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19: 639-645.

Link, A.J., Hays, L.G., Carmack, E.B. and Yates, J.R. III (1997) Identifying the major proteome components of Haemophilus influenzae type-strain NCTC 8143. Electrophoresis 18: 1314-1334.

Little, D.P., Speir, J.P., Senko, M.W., O’Connor, P.B. and McLafferty, F.W. (1994) Infrared multiphoton dissociation of large multiply charged ions for biomolecule sequencing. Anal. Chem. 66: 2809-2815.

Madsen, P.S., Hokland, M., Ellegaard, J., Hokland, P., Ratz, G.P., Celis, A. and Celis, J.E. (1988) Major proteins in normal human lymphocyte subpopulations separated by fluorescence- activated cell sorting and analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Leukemia 2: 602- 615.

Mann, M., Hojrup, P. and Roepstorff, P. (1993) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. Biol. Mass Spectrom. 22: 338-345.

Mann, M. and Wilm, M. (1994) Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal. Chem. 66: 4390-4399.

Marshall, A.G., Senko, M.W., Li, W., Li, M., Dillon, S., Guan, S. and Logan, T.M. (1997) Protein molecular mass to 1 Da by 13C 15N double depletion and FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 119: 433-434.

Mortz, E., O’Connor, P.B., Roepstorff, P., Kelleher, N.L., Wood, T.D., McLafferty, F.W. and Mann, M. (1996) Sequence tag identification of intact proteins by matching tanden mass spectral data against sequence data bases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 8264-8267.

Oda, Y., Huang, K., Cross, F.R., Cowburn, D. and Chait, B.T. (1999) Accurate quantification of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 6591-6596.

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021.

O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M. and O’Farrell, P.H. (1977) High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins. Ce// 12: 1133-1141.

Onnerfjord, P., Ekstrom, S., Bergquist, J., Nilsson, J., Laurell, T. and Marko-Varga, G. (1999) Homogeneous sample preparation for automated high throughput analysis with matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom.

- 136 - 蛋白 质 组 学

13: 315-322.

Pappin, D.J.C., Hojrup, P. and Bleasby, A.J. (1993) Rapid identification of proteins by peptide- mass fingerprinting. Curr. Biol. 3: 327-332.

Parker, K.C., Garrels, J.1., Hines, W., Butler, E.M., McKee, A.H., Patterson, D. and Martin, S. (1998) Identification of yeast proteins from two-dimensional gels: working out spot cross- contamination. Electrophoresis 19: 1920-1932.

Patterson, S.D., Thomas, D. and Bradshaw, R.A. (1996) Application of combined mass spectro- metry and partial amino acid sequence to the identification of gel-separated proteins. Electro- phoresis 17: 877-891.

Piccinni, E., Staudenmann, W., Albergoni, V., De Gabrieli, R. and James, P. (1994) Purification and primary structure of metallothioneins induced by cadmium in the protists Tetrahymena pigmentosa and Tetrahymena pyriformis. Eur. J. Biochem. 226: 853-859.

Quadroni, M. and James, P. (1999) Proteomics and automation. Electrophoresis 20: 664-677.

Senko, M.W., Speir, J.P. and McLafferty, F.W. (1994) Collisional activation of large multiply charged ions using Fourier transform mass spectrometry. Anal. Chem. 66: 2801-2808.

Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68: 850-858.

Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K.G., Thomson, B., Wilm, M. and Mann, M. (1997) Rapid ‘de novo’ peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1015-1024.

Steinberg, T.H., Haugland, R.P. and Singer, V.L. (1996) Applications of SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains. Anal. Biochem. 239: 238-245.

Takao, T., Hori, H., Okamoto, K., Harada, A., Kamachi, M. and Shimonishi, Y. (1991) Facile assignment of sequence ions of a peptide labelled with '*O at the carboxyl terminus. Rapid Commun. Mass Spectrom. 5: 312-315.

Taylor, J.A. and Johnson, R.S. (1997) Sequence database searches via de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1067-1075.

Taylor, J.A., Walsh, K.A. and Johnson, R.S. (1996) Sherpa: a Macintosh-based expert system for the interpretation of electrospray ionization LC/MS and MS/MS data from protein digests. Rapid Commun. Mass Spectrom. 10: 679-687.

Valaskovic, G.A., Kelleher, N.L., Little, D.P., Aaserud, D.J. and McLafferty, F.W. (1995) Attomole-sensitivity electrospray source for large-molecule mass spectrometry. Anal. Chem. 67: 3802-3805.

Velculescu, V.E., Zhang, L., Zhou, W., Vogelstein, J., Basrai, M.A., Bassett, D.E. Jr, Hieter, P., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1997) Characterization of the yeast transcriptome. Cell 88: 243-251.

Wahl, J.H., Goodlett, D.R., Udseth, H.R. and Smith, R.D. (1993) Use of small-diameter capillaries for increasing peptide and protein detection sensitivity in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Electrophoresis 14: 448-457.

Walsh, B.J., Molloy, M.P. and Williams, K.L. (1998) The Australian Proteome Analysis Facility (APAF): assembling large scale proteomics through integration and automation. Electro- phoresis 19: 1883-1890.

Williams, E.R:, Henry, K.D., McLafferty, F., Shabanowitz, J. and Hunt, D.F. (1990) Surface- induced dissociation of peptide ions in Fourier-transform mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1: 413-416.

Wilm, M. and Mann, M. (1994) Electrospray and Taylor—Cone theory, Dole’s beam of macromolecules at last. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 136: 167-180.

Wilm, M., Neubauer, G. and Mann, M. (1996) Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Anal. Chem. 68: 527-533.

Yates, J.R. HI., Speicher, S., Griffin, P.R. and Hunkapiller, T. (1993) Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214: 397-408.

Yates, J.R. III., Eng, J.K. and McCormack, A.L. (1995a) Mining genomes: correlating tandem mass spectra of modified and unmodified peptides to sequences in nucleotide databases. Anal. Chem. 67: 3202-3210.

Yates, J.R. II., Eng, J.K., McCormack, A.L. and Schieltz, D. (1995b) Method to correlate tandem

第 七 章 ”增强 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 :稳定 同 位 素 标 记 的 影响 - 137 -

mass spectra of modified peptides to amino acid sequences in the protein database. Anal. Chem. 67: 1426-1436.

Yates, J.R. III., Eng, J., Clauser, K.R. and Burlingame, A.L. (1996) Searching sequence databases with uninterpreted high-energy CID spectra of peptides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 7: 1089- 1098.

Yates, J.R. II., Morgan, S.F., Gatlin, C.L., Griffin, P.R. and Eng, J.K. (1998) Method to compare collision-induced dissociation spectra of peptides: potential for library searching and subtrac- tive analysis. Anal. Chem. 70: 3557-3565.

P/E ”蛋白质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径

Marc R. Wilkins

1. 历史 回顾

BEEF 20 世纪 70 年 代 中 期 的 二 维 电泳 (2-DE) 描述 了 以 等 电 聚 焦 为 基础 的 一 相 电泳 和 根据 分 子 质量 进行 分 离 的 二 相 电 泳 的 结合 (Kenrich and Margolis, 1970; Klose, 1975; O'Farrell，1975; Scheele，1975)， 其 分 辨 能 力 之 强 ， 可 以 在 一 医 胶 上 分 离 出 1000 多 个 大 肠 杆 菌 蛋白 〈(O'Farrell，1975)， 这 就 给 研究 者 提示 可 以 通过 用 2-DE 技术 对 生物 系统 内 的 复杂 和 蛋 日 进行 定性 和 定量 分 析 ， 因 此 这 一 研究 技术 的 巨大 潜力 迅速 被 一 些 人 接受 ， 用 于 有 机 体 的 多 种 蛋 日 的 研究 。 此 外 ， 差 异 显示 2-DE 技术 也 被 用 于 寻找 和 蛋 白 的 氨基 酸 改 变 或 蛋白 的 转移 后 修饰 (Goodman, 1976; Steinberg et al .，1977)。

介绍 完 2-DE 和 蛋白 分 离 技 术 后 ， 将 介绍 针对 不 同类 型 样品 及 不 同 分 析 目 的 的 2-DE 的 应 用 。 通 过 制备 不 同 条 件 下 的 样品 可 反应 基因 表达 水 平 的 差异 〈O'Farrell and Ivarie , 1979); 另外 ， 通 过 比较 生物 体 的 正常 和 突变 株 也 可 反应 基因 表达 水 平 的 差异 (Reeh et al.，1976)。 也 有 一 些 研 究 者 利用 2-DE 技术 寻找 蛋白 复合 物 中 蛋白 间 的 相互 作用 (Brigggs and Capaldi，1977)。1981 年 ， 出 现 了 第 一 个 用 于 2-DE 胶 分 析 的 软件 包 (An- derson et al .，1981)。 因 此 ， 从 许多 方面 来 讲 ，2-DE 作为 研究 复杂 样品 的 手段 在 20 年 前 就 已 经 是 可 行 的 了 。 如 今 ， 随 着 对 组 织 的 2-DE 电泳 分 离 为 基础 的 蛋白 质 组 概念 的 提 出 ， 这 些 想 法 得 到 了 进一步 的 发 挥 (Anderson and Anderson, 1982).

1.1 蛋白 化 学 家 面临 的 困难

2-DE 的 分 离 技 术 在 80 年 代 还 未 得 到 实现 的 原因 有 以 下 几 方 面 : 首先 ， 数 据 库 中 没 有 足够 的 核酸 和 和 蛋白 序列 信息 ， 因 此 就 无 法 通过 数据 库 中 序列 信息 很 好 地 了 解 各 种 生物 体 的 多 种 物理 和 生理 活动 。 这 是 因为 当时 分 子 生 物 学 技术 还 处 于 幼稚 期 ， 其 后 诞生 了 一 些 新 技术 ， 如 用 手工 操作 测 核酸 序列 的 双 脱 氧 链 终止 法 (Sanger et al., 1977), FA PCR 技术 扩 增 DNA (Saiki et al., 1985) 等 。 而 依赖 于 荧光 染料 化 学 技术 的 全 自动 测 序 仪 (Prober et al., 1987) 于 1992 年 首次 完成 了 对 真 核 生物 染色 体 的 成 功 测序 (Oli- ver et al., 1992).

其 次 ，2-DE 的 潜力 还 未 得 到 充分 发 挥 的 重要 原因 在 于 该 技术 在 蛋白 鉴定 方面 的 应 用 的 有 限 性 。Towbin (Towbin et al., 1979) 建立 的 将 蛋白 转 印 至 尼龙 膜 的 方法 以 及 Burnette (Burnette ，1981) 建立 的 用 抗体 检测 转 印 和 蛋白 的 方法 不 失 为 一 个 灵敏 的 鉴定 方法 。 然 而 ， 这 些 方法 的 不 足 之 处 在 于 只 有 少数 蛋白 具有 相应 的 抗体 ， 此 外 单 抗 或 多 抗 的 制备 是 一 个 漫长 且 费 时 的 工作 。 全 自动 Edman 降解 测序 (Edman and Begg, 1967)

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 :89 外

要 么 直接 测定 新 蛋白 的 序列 ， 要 么 同 数据 库 中 的 基因 序列 相 比较 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 。 然 而 ， 早 期 的 液 相 测序 仪 所 需 的 蛋白 量 是 2-DE 胶 上 纯化 蛋白 的 几 百倍 。 直 到 1987 年 Matsudaira (1987) 将 蛋白 转 印 至 PVDF 膜 的 技术 和 气相 测序 技术 相 结合 ， 使 得 蛋白 分 析 的 灵敏 度 达 到 了 pmol 水 平 。 就 拿 模式 生物 来 讲 ， 蛋 白 鉴定 的 最 有 效 的 方法 仍然 是 将 未 知 蛋白 同 已 知 的 纯 蛋 白 在 2-DE 胶 上 共 分 离 (Philips et al., 1980).

由 于 蛋白 鉴定 的 复杂 性 ， 许 多 科学 家 在 20 世纪 80 年 代 就 将 研究 重点 转移 到 了 研究 在 不 同 条 件 下 蛋白 表达 量 的 改变 ， 建 立 了 大 量 的 共 刺 激 和 共 调 节 的 蛋白 数据 库 ， 如 大 肠 杆菌 (Van Bogelen et al., 1990), 4 REF5S2 细胞 株 (Garrels and Franza，1989) 及 小 鼠 的 胚胎 (Latham et al., 1991) 等 。 同 理 ， 通 过 监测 在 多 种 毒剂 作用 下 小 鼠 肝 蛋白 的 改变 可 进行 毒 理 学 研究 (Anderson et al .，1987)。 在 这 些 实验 中 ， 通 过 不 同 的 处 理 ， 可 观察 到 300 一 1600 个 相关 和 相 匹 配 的 蛋白 ， 更 关键 的 是 这 些 研 究 反 应 了 和 蛋 日 质 组 群 间 的 相互 作用 ， 且 早 于 同类 的 微 阵列 核酸 杂交 技术 才干 年 (Schena et al., 1995; Wodic- ka et al .，1997)。 然 而 ， 共 调节 和 共 抑 制 蛋白 的 科学 价值 的 实现 还 必须 依赖 于 这 些 组 群 中 蛋白 的 鉴定 ， 若 做 不 到 这 一 点 ， 这 些 和 蛋白 也 仅仅 是 胶 上 的 一 些 点 而 已 。

(1.2 蛋白 质 组 学 的 发 展 史

20 世纪 90 年 代 在 不 同 领域 出 现 的 各 种 进展 相互 结合 形成 了 一 门 新 学 科 ， 伴 随 者 IPG 胶 条 的 广 谤 应 用 ，2-DE 技术 才 真正 成 为 了 一 种 微量 制备 技术 (Bijellqvist et al., 1993)， 随 着 模式 生物 和 其 他 生物 体 基因 组 序列 的 完成 ，( 如 支原体 、 大 肠 杆菌 、 酵 母 、 线虫 )， 使 得 基因 和 和 蛋 白 序列 的 数据 库 迅 速 增 加 。 而 质谱 也 从 一 种 专门 的 工具 变 成 了 一 种 每 个 蛋白 化 学 实验 室 的 常规 仪器 。 肽 质 指纹 图 技术 (Henzel et wz .，1993)， 因 其 简化 了 数据 库 中 基因 序列 和 蛋白 序列 的 联系 ， 大 大 提高 了 和 蛋白 鉴定 的 灵敏 度 和 速度 (Kuster and Mann，1998; Yates ，1998 a，1998 b)。 伴 随 着 以 上 技术 的 发 展 ，1995 年 由 Wilkins 提出 的 蛋白 质 组 的 概念 应 运 而 生 (Wilkins et wz .，1995)。 同 分 子 生 物 学 取得 的 进展 相 比 ， 蛋 白质 组 这 一 概念 主要 强调 和 证 实 以 前 未 获得 足够 重视 的 科学 。

新 千年 伊始 ， 蛋 白质 组 学 获得 了 前 所 未 有 的 发 展 。 随 着 果 蝇 基因 组 的 完成 及 2000 年 人 类 基因 组 计划 的 即将 完成 ， 其 他 的 一 些 模式 生物 的 测序 任务 也 即将 开始 ， 如 小 鼠 和 拟 南 芥 。 为 了 充分 利用 这 些 生 物体 的 基因 组 序列 提供 的 价值 ， 就 有 必要 制订 生物 学 的 下 一 个 大 的 目标 ， 即 功能 基因 组 学 或 功能 蛋白 质 组 学 。 功 能 基因 组 学 着 重 依赖 于 高 密度 的 微 阵 列 技术 (Schena et al., 1995; Wodicka et al., 1997), BRRKHRKAEFR SI 量 的 分 析 能 力 ， 且 可 同时 检测 mRNA 的 表达 水 平 。 而 蛋白 质 组 学 则 主要 解决 蛋白 的 表 达 水 平 、 加 工 和 修饰 、 蛋 白 间 的 相互 作用 及 蛋白 的 功能 (Wilkins et al., 1997a). B 前 ， 蛋 白质 组 学 面临 的 挑战 有 以 下 两 点 : 第 一 ， 全 自动 、 高 通 量 的 蛋白 质 组 技术 的 完 成 ; 第 二 ， 建 立 大 量 的 蛋白 数据 库 和 能 够 有 效 分 析 处 理 蛋 白质 组 数据 的 分 析 软 件 。 本 综 述 主要 介绍 以 上 两 点 。

2. 生日 质 组 学 的 目 动 化 一 一 技术 解决 途径

直到 最 近 ， 和 蛋白 的 研究 仍然 停留 在 一 次 解决 一 个 蛋白 的 基础 上 。 研 究 者 的 研究 重点 往往 局 限 在 单个 蛋白 ， 通 常 是 一 个 一 个 地 纯化 蛋白 ， 再 一 个 一 个 地 研究 。 而 蛋白 质 组 学

se

- 140 - 蛋白 质 组 学

同 传统 的 研究 方法 有 所 不 同 ， 无 论 是 蛋 折 复合 物 的 鉴定 也 好 (Rigaut et al., 1999), & 是 生物 体 所 表达 的 全 蛋白 也 好 (Fountoulakis et al., 1997, 1998a, 1998b; Langen et al .，1997)， 通 常 是 同时 研究 多 个 蛋白 ， 但 前 提 是 要 满足 蛋白 鉴定 的 速度 、 灵 人 敏 度 和 精 密度 。 这 就 使 得 蛋白 研究 者 可 充分 利用 2-DE 技术 ， 同 时 平行 地 纯化 多 个 蛋白 。

最 近 对 蛋白 质 组 学 影响 最 大 的 当 属 质谱 ， 其 中 ESI 或 MALDI-TOF 结合 四 极 管 、 离子 有 午 或 飞行 时 间 质 量 检测 器 等 ， 使 得 蛋白 的 分 析 变 得 简单 易 行 (Yates，1998b)。 更 重要 的 是 ， 质 谱 技 术 使 2-DE KR ERR NRA HAGE OR Se (Willms et al., 1996)。 但 目前 仍 困 扰 研 究 者 的 问题 是 ， 尽 管 可 通过 平行 的 2-DE 胶 分 离 纯化 成 百 上 千 的 蛋白 ， 但 仍然 无 法 采取 一 种 简单 易 行 的 办 法 来 解决 质谱 鉴定 前 大 量 蛋 白 的 制备 。 况 且 ， 对 于 质谱 来 讲 ， 每 天 分 析 的 样品 是 有 限 的 ， 尤 其 是 ESI 质谱 。 面 临 着 这 些 挑战 ， 蛋白 分 析 的 自动 化 已 经 得 到 了 一 定 发 展 ， 可 分 为 三 组 技术 : 2-DE 胶 技 术 、1-DE MRA 和 不 以 胶 为 基础 的 分 离 技术 。 我 们 将 依次 讨论 这 些 技术 以 及 为 实现 2-DE 分 离 过 程 的 自 动 化 所 做 的 努力 。

2.1 2-DE 胶 的 自动 化

考虑 到 2-DE 仍然 是 蛋 日 分 离 的 首选 方法 ， 故 实现 2-DE 的 自动 化 对 于 高 通 量 蛋 自 质 组 学 是 必需 的 。 在 过 去 的 几 年 内 ， 已 经 实现 了 多 种 形式 的 自动 化 ， 如 小 胶 的 分 离 (50mm X 43mm) 已 完全 自动 化 (Brewer et al., 1986), 但 我 们 认为 这 种 分 离 方 式 还 不 能 满足 蛋白 质 组 分 析 所 需要 的 蛋白 量 。 因 此 人 们 致力 于 实现 大 胶 的 自动 化 〈(Harrington et al., 1993; Nokihara et al., 1992). —##H Large Scale Biology Corporation 花 了 多 年 时 间 建 立 的 名 叫 BioMetreIY 的 平台 有 望 实 现 整个 2-DE 过 程 的 自动 化 。 并 且 ， 连 接 一 相 和 二 相 分 离 的 方法 已 获 专 利 保 护 (Hochstrasser，1989，1998)， 该 方法 可 产生 二 维 一 体 的 具有 自动 化 潜力 的 2-DE 胶 。 尽 管 作出 了 多 种 努力 ， 但 目前 还 不 能 实现 2-DE 的 全 自 动 。 相 反 ， 制 造 商 和 研究 人 员 把 主要 精力 放 在 了 实现 单 步骤 的 自动 化 上 (如 银 染 )， 或 通过 平行 方法 提高 通 量 ， 而 不 是 把 重点 放 在 整个 步骤 的 全 自动 ， 因 此 就 产生 了 用 于 一 相 和 二 相 胶 的 分 离 装 置 ， 可 同时 制备 、 分 离 多 个 一 相 或 二 相 的 胶 ， 从 而 提高 了 分 离 的 重复 TEs

2.2 2-DE 胶 的 全 自动

蛋白 质 组 经 2-DE 分 离 后 ， 可 获得 成 百 上 千 感 兴趣 的 蛋白 点 去 作 质 谱 分析 。 针 对 2-DE 胶 上 蛋白 或 多 肽 进行 的 质谱 分 析 的 自动 化 研究 ， 已 有 多 种 不 同 的 解决 办 法 ， 有 的 已 商业 化 。

用 机 器 人 取 点 进行 MALDI-TOF 鉴定 ”以 前 由 人 工 操作 的 蛋白 鉴定 步骤 ， 现 在 已 实现 了 自动 化 的 流水 线 (图 8.1)。 文 献 中 已 有 报道 采用 机 器 人 装置 从 胶 上 获取 蛋白 点 (Traini et cl .，1998)， 也 有 商品 化 的 产品 供应 (40 Flexys Robotic Workstation from Ge- nomic Solutions) 。 一 般 的 ， 机 器 人 通过 数码 相机 给 胶 照 相 ， 用 剪 头 切 胶 ， 并 将 胶 块 送 入 96 孔 板 ， 紧 接着 液 相 处 理 装置 开始 洗 胶 块 并 加 入 蛋白 内 切 酶 ， 这 也 可 以 通过 改进 的 液 相处 理工 作 站 完成 (Packard Multiprobe 104 in Traini et al., 1998), MI HARI—pLaeA 将 酶 解 后 的 肽 段 送 到 MALDI 样品 板 进行 分 析 或 由 新 的 机 器 人 完成 (如 ProGest robot

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 “141 -

from Genomeic Solutions， 已 由 Houthaeve 等 商业 化 ，1997)。ProGest 机 器 人 与 称 为 ProMS 的 第 二 组 机 器 人 联合 ， 主 要 完成 肽 的 脱盐 ， 并 送 至 MALDI 样品 板 。 目 前 的 MALDI 质谱 对 多 个 样品 的 分 析 则 相对 较 容 易 ， 因 为 大 多 数 生产 三 家 已 完成 该 方法 的 自 动 化 。 根 据 仪器 的 不 同 ，MALDI 样品 板 可 放 100 一 384 个 样品 ， 可 以 一 直 不 间断 地 进行 大 量 样品 的 分 析 。 早 期 的 自动 化 MALDLMS 的 分 析 可 参见 Schevchenko 等 (1996).

2-D PAGE, 染色 ,图 像 捕获

机 器 人 将 2-DE 胶 上 的 蛋白 点 切 下 送 入 96 或 384 孔 板

蛋白 的 自动 降解 , 并 将 肽 和 基质 运 到 MS 样品 板

MS 上 的 自动 样品 分 析

质谱 峰 的 自动 获取 , 数据 库 匹 配 ,2-D 数据 库 的 解释

图 8.1 和 蛋白质 组 学 的 自动 化 流水 线 进 程 该 方法 实现 了 手工 操作 和 技术 的 自动 化

以 上 方法 的 优点 在 于 质谱 的 数据 获取 简单 易 行 。 胶 上 和 蛋白 点 的 zx，y 坐标 首先 用 TIF 或 其 他 图 像 格式 记录 下 来 ， 然 后 将 图 像 上 的 点 与 96 孔 板 中 的 特定 位 置 依次 对 应 ， 96 孔 板 的 编号 又 可 作为 MALDI 分 析 时 样品 号 。 我 所 在 的 实验 室 所 采用 的 技术 与 上 面 介 绍 的 相似 ， 作 用 强大 且 可 实现 高 通 量 。 用 两 天 的 时 间 ， 一 台 MALDI-TOF 就 可 完成 300 个 蛋 自 的 制备 和 分 析 鉴 定 ， 这 样 的 高 通 量 是 其 他 的 自动 化 系统 所 无 法 比拟 的 。

用 于 MALDI-MS & @ #8 4) 2-DE 胶 的 网 划 Hoffmann-La Roche 的 科学 家 对 以 上 的 方法 作 了 一 些 改进 (Langen et ww .，1998)。 该 方法 不 是 采用 一 个 一 个 蛋白 点 分 别 切 的 方法 ， 而 是 将 整 块 2-DE 胶 用 网 格 工 具 切 割 成 小 块 ， 如 lmm x lmm 大 小 ， 胶 块 随后 被 自动 送 到 MS 分 析 前 的 96 或 384 孔 板 作 酶 解 ， 该 技术 从 哲学 角度 讲 ， 具 有 完整 性 ， 因为 不 管 胶 块 上 有 无 蛋白 ， 每 一 块 都 得 到 了 酶 解 和 分 析 ， 因 此 即便 是 机 器 人 无 法 检测 或 切 到 的 低 峰 度 点 也 能 进行 质谱 分 析 。 但 不 足 之 处 在 于 ， 通 过 网 格 切割 的 胶 块 往往 会 出 现 多 个 蛋白 出 现在 一 块 腕 上 或 者 一 个 蛋白 出 现在 多 块 腕 上 的 情况 ， 这 就 给 数据 分 析 提 出 了 挑战 ， 需 将 单个 蛋白 点 的 数据 进行 正确 编辑 。 然 而 ， 由 此 引出 了 一 个 有 意思 的 问题 ， 可 将 每 一 丙烯 酰胺 胶 块 上 的 光谱 总 离子 数 (TIC) 绘制 成 2-DE RA Bis, Rit, HA 辩 率 取决 于 切 下 的 丙烯 酰胺 胶 块 的 大 小 。

通过 膜 和 MALDI-MS 进行 2-DE 分 离 有 蛋白 的 鉴定 ”尽管 该 方法 被 证 明 是 切实 可 行 的 ， 但 以 上 两 种 蛋白 鉴定 的 自动 化 方法 对 胶 块 的 处 理 复杂 ， 且 这 些 技术 在 某 种 程度 上 对 所 需 步 又 的 选择 不 够 精练 。 基 于 此 ， 一 些 研究 组 试 着 用 膜 为 基质 来 吸附 并 分 析 和 蛋白 (A 8.2)。 早 期 的 研究 表明 ， 当 蛋白 从 PVDF 膜 上 解吸 下 来 后 ， 可 通过 MALDIMS 测定 所 有 和 蛋白 的 质量 ， 包 括 将 膜 贴 到 样品 孔 ， 加 入 基质 ， 通 过 紫外 或 红外 线 激 光 将 膜 表 面 的 蛋

| |: oe re ase ae rR ays

- 142+ 蛋白 质 组 学

白 解吸 下 来 (Eckerskorn et al., 1992; Vestling and Fenselau，1994)。 然 后 将 膜 在 MS 内 进行 高 精度 扫描 ， 如 30 x 30 RA, Wit KRHA HAAN 2-DE 图 谱 (Eckerskron et al:, 1997; Stoeckli et al! .，1999)。 随 着 蛋白 降解 技术 的 发 展 ， 可 使 酶 解 后 的 肽 段 集中 出 现 于 膜 上 (Bienvenut et wz .，1999)， 然 后 对 膜 进 行 扫 描 就 可 获得 2-DE 胶 上 蛋白 点 的 真实 图 谱 ， 并 且 所 获得 的 肽 质量 有 助 于 蛋白 鉴定 (Binz et al., 1999), HH MALDI- MSF AAR, Mite RASCH.

— 将 2-DE 胶 转 移 到 惰性 膜 上 | 蛋白 在 膜 上 的 原 位 酶 解 | | 自动 获取 峰 , 数据 库 查 询 , 获得 真实 的 2.DE A

图 8.2 和 蛋白质 组 学 的 自动 化 包括 将 2-DE 胶 转 移 到 膜 上 ， 酶 解 成 肽 段 ，MALDI-TOF 质谱 扫 擅 与 图 8.1 表述 的 手工 操作 步骤 的 简单 自动 化 有 所 不 同

膜 扫 描 技术 的 优点 在 于 可 平行 地 将 膜 上 的 蛋白 进行 原 位 消化 (Binz et al., 1999; Schleuder et al .，1999)， 只 有 在 样品 处 理 时 需 将 膜 放 到 质谱 板 上 ， 此 外 ， 吸 附 到 膜 上 的 蛋白 稳定 时 间 长 ， 膜 容易 保存 。 然 而 ， 目 前 扫描 技术 的 缺点 在 于 : 第 一 ， 速 度 慢 ， 举 个 例子 来 讲 ， 目 前 分 析 一 块 16cmx 16cm 的 2-DE 胶 要 花 36 天 (Binz et wl .，1999)。 第 二 ， 蛋 白 从 膜 上 消化 和 扫描 MALDITOF-MS 技术 所 得 到 的 肽 片段 数 均 低 于 标准 的 消化

方法 和 MALDI-TOF-MS 技术 ， 这 就 限制 了 蛋白 鉴定 的 效率 和 和 蛋白 转移 后 的 修饰 的 鉴 定 。 然 而 ， 可 通过 改进 计算 机 和 质谱 的 软件 和 硬件 ， 提 高 该 方法 的 效率 。

LC-MS 对 2-DE 胶 上 分 离 蛋白 的 自动 化 鉴定 2-DE 胶 上 的 蛋白 经 消化 后 ， 除 了 可 用 MALDLTOF-MS 分 析 外 ， 还 可 以 采用 液 相 色谱 质谱 (LC-MS) 技术 ， 后 者 不 仅 可 检 测 肽 质量 ， 还 可 用 诱导 碰撞 解 离 (CID) 技术 提供 断裂 的 可 能 性 ， 从 而 产生 用 于 蛋白 鉴 定 的 肽 序列 标签 (Mann and Wilm，1994)， 而 肽 段 只 有 经 过 有 效 的 断裂 才 可 产生 肽 序 列 (Qin et al., 1998).

一 旦 样品 送 入 LC-MS， 就 能 有 效 地 产生 并 分 析 数 据 ， 已 有 多 篇 报道 涉及 到 2-DE 胶 上 和 蛋白 的 LC-MS 分 析 (Gygi et wl .，1999)。 然 而 ， 该 方法 的 通 量 比 MALDI-TOF-MS 至 少 低 一 个 数量 级 ， 每 天 只 能 分 析 20 个 样品 (Link et wy .，1997)。 这 是 因为 该 技术 需 要 与 毛细 管 电 散射 或 称 之 为 纳 流散 射 的 仪器 相 结合 以 提高 分 析 的 灵敏 度 和 样品 的 数据 量 (Wilm and Mann，1996)， 毛 细 管 和 纳 流散 射 装 置 易 引起 堵塞 ， 并 且 难 以 实现 自动 化 。 然而 ， 位 于 9%6 孔 板 和 LC 系统 间 的 自动 加 样 器 接口 已 商业 化 ， 可 显著 提高 样品 通 量 。 更 令 人 兴奋 的 是 ， 研 究 者 已 研制 出 了 用 微 纤 维 装 置 生产 出 的 与 离子 捕获 或 四 极 质谱 相连 接 的 电 渗 泵 (Figeys et al .，1997，1998)， 这 有 助 于 实现 从 胶 到 LC-MS 的 自动 化 ， 但 目前 还 不 清楚 该 系统 究竟 有 多 大 潜能 。

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 - 143 -

2.3 2-DE 自动 化

对 蛋白 质 组 学 的 关注 ， 使 得 研究 者 开始 寻找 单 细胞 或 组 织 蛋 白质 组 的 最 佳 分离 鉴 定 方法 。2-DE 是 目前 蛋白 分 离 技术 中 分 辩 率 最 高 的 ， 无 论 采 用 大 尺寸 的 胶 还 是 采用 守 的 IPG 胶 条 多 次 分 离 ， 目 前 可 分 离 接近 10 000 个 蛋白 〈Klose，1999)， 样 品 的 分 步 提 取 技 术 把 朴 水 性 作为 分 析 的 第 三 相 (Herbert, 1999; Klose，1999)， 该 技术 对 蛋白 的 鉴定 可 增加 20% 。 除 了 这 些 特点 ，2-DE 胶 作为 一 种 平行 的 分 离 技术 ， 有 其 局 限 性 ， 最 值得 注 意 的 是 对 低 丰 度 蛋 白 ， 极 玻 水 的 蛋白 和 极 碱 性 和 蛋白 的 无 能 为 力 (Wilkins et al., 1996, 1998a)。 即 便 是 数据 结果 显示 具有 高 重复 性 ， 许 多 实验 者 仍旧 关注 实验 室内 和 实验 室 间 分 离 的 重复 性 (Corbett et al., 1994; Lopez and Patton，1997)。 这 些 问 题 已 经 激 起 对 2-DE 胶 替 代 分 离 技术 的 研究 ， 这 些 技 术 可 分 为 两 大 类 : 1-DE 胶 ; 以 非 胶 为 基础 的 分 离 技术 。

与 1-DE 胶 联 用 的 自动 化 技术 MALDILTOF-MS 用 于 等 电 聚 焦 胶 表 面 的 直接 扫描 可 产生 真实 的 2-DE 图 谱 (Ogorzalek Loo et al., 1997; Loo et al., 1999). 1-DE 的 一 相 分 离 通 过 计算 蛋白 的 等 电 点 在 IPG 胶 条 上 的 位 置 而 得 以 实现 ， 以 分 子 质 量 为 基础 的 二 相 分 离 则 由 MS 完成 ， 从 而 取代 了 SDS-PAGE 分 离 。 该 技术 的 优点 在 于 IPG 胶 条 是 以 平衡 为 基础 进行 的 分 离 ， 而 MS 显然 比 非 平 衡 的 SDS-PAGE 二 相 分 离 更 准确 。 一 且 数据 的 获取 和 分 析 实 现 了 自动 化 ，1-DE 就 可 产生 大 量 和 蛋白 高 准确 度 的 分 子 质 量 数据 和 真实 的 2-DE 图 谱 。

从 技术 上 讲 ，1-DE 首先 在 IPG 胶 条 上 用 标准 的 等 电 聚 焦 技 术 分 离 重 白 ， 然 后 进行 洗涤 、 在 白 芥 子 酸 基质 中 浸泡 、 风 干 ， 然 后 将 IPG 胶 条 直接 送 入 MALDI-TOF-MS, i# 择 与 IPG 胶 条 间隔 距离 相近 的 扫描 间距 (如 30wm)， 各 种 蛋白 离子 化 后 ， 在 不 同 的 位 置 检测 到 其 分 子 质量 ， 扫 描 胶 条 产生 的 系列 光谱 可 提供 同 2-DE 相似 的 图 谱 (Ogorzalek Loo et al., 1999).

目前 很 难 比 较 IPG 胶 条 直接 扫描 的 结果 和 2-DE 分 离 的 结果 ， 因 为 2-DE 胶 图 谱 的 结果 来 源 于 整个 IPG 胶 条 ， 但 1-DE 也 有 一 些 缺 陷 。 首 先 ， 只 有 一 些 特定 的 蛋白 才能 在 MALDI-TOF 中 很 好 离子 化 ， 一 些 高 分 子 质量 的 蛋白 则 很 难 离子 化 ， 这 就 影响 了 和 蛋白 的 定量 。 其 次 ， 无 法 判定 直接 MALDI-TOF 的 分 辨 能 力 是 否 能 与 SDS-PAGE 胶 比 美 。 最 后 ， 由 于 扫描 技术 可 产生 高 准确 度 的 2-DE 图 谱 ， 但 无 法 通过 肽 质 指 纹 图 鉴定 感 兴趣 的 蛋白 ， 只 能 将 蛋白 从 IPG 胶 上 切 下 来 后 ， 用 省 化 所 消化 成 肽 段 (Loo et al., 1999), (A 蛋白 混合 物 可 出 现在 IPG 胶 条 的 任何 位 置 。 此 外 ， 可 通过 小 型 生物 的 基因 组 信息 及 IPG 扫描 技术 的 参数 准确 鉴定 蛋白 的 分 子 质 量 和 等 电 点 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 (Cavalconi et al., 1997; Wilkins et al., 1998b).

不 以 胶 为 基础 的 蛋白 质 组 分 离 的 自动 化 ”目前 出 现 的 一 些 新 的 可 取代 以 胶 为 基础 的 分 离 技术 指 的 是 一 相 或 二 相 色谱 结合 紫外 和 (或 ) 电 散 射 质谱 。 一 些 研究 者 结合 自动 化 的 大 小 排 阻 色谱 和 反 向 色谱 ， 根 据 一 相 的 蛋白 大 小 和 二 相 的 蛋白 疏 水 性 分 离 蛋 白 而 获得 紫外 色谱 图 (Opiteck et al .，1998)， 从 而 分 离 蛋 白 ， 甚 至 是 全 和 蛋白质 组 (Opiteck et al., 1998; Isobe et ol .，1991)。 该 技术 分 离 过 程 根 据 操作 条 件 不 同 需 6 一 17h。 用 该 方 法 的 目的 就 是 为 了 获得 蛋白 质 组 成 分 ， 在 大 肠 杆 菌 的 细胞 裂解 液 可 分 离 出 250 种 蛋白 组

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- 144 - A RA

分 ， 比 银 染 的 2-DE 分 辨 率 低 一 个 数量 级 (Tonella et al., 1998). (RIAD, BERT 第 三 相 的 分 离 才能 满足 蛋白 质 组 分 析 的 目的 。

一 些 研究 者 以 样品 中 蛋白 的 肽 为 分 析 目 的 ， 丰 富 了 以 蛋白 为 分 析 目 的 2-D 色谱 的 应 用 (图 8.3)。 该 技术 利用 三 级 、 离 子 肝 或 四 级 飞行 时 间 质 谱 使 肽 裂解 ， 然 后 将 所 获 信 息 同 序列 数据 库 比 较 ， 从 而 鉴定 该 蛋白 (Yates，1998b)。 此 方法 可 鉴定 相对 简单 的 样 品 ， 如 蛋白 复合 物 (Link et al., 1999) 或 全 和 蛋白质 组 (S. D. Patterson, KKH) 中 的 蛋白 成 分 。 该 方法 首先 用 胰 和 蛋白 酶 等 消化 样品 中 的 所 有 和 蛋白， 然后 将 肽 上 样 到 反 向 色 谱 柱 中 进行 分 离 ， 最 后 将 肽 雁 片 直接 收集 到 电 散 射 质谱 中 。 质 谱 能 够 从 肽 混合 物 中 选择 感 兴趣 的 离子 ， 将 其 自动 打 断 ， 产 生 序列 标签 或 完整 序列 ， 如 此 反复 将 其 他 离子 打 断 。 一 次 液 相 色谱 运行 即 可 断裂 数 以 百 计 的 肽 ， 然 后 自动 地 用 SEQUEST 等 软件 将 数 以 百 计 的 肽 同 序列 相 联系 (Yates et al .，1995)。 目 前 ， 在 这 一 领域 作 得 比较 出 色 的 当 属 Amgen Inc 对 人 尿 的 分 析 (S. D. Patterson， 未 发 表 )， 一 次 实验 可 鉴定 约 100 个 蛋 自 的 肽 。 该 技术 的 优点 在 于 其 高 通 量 和 内 在 的 抑 余 使 得 可 观察 每 个 蛋白 的 多 个 肽 段 ， 但 该 技术 产生 了 大 量 的 数据 ， 这 就 给 实验 结果 的 数据 分 析 带 来 了 肪 烦 。 而 且 ， 由 于 该 技术 是 建立 在 对 肽 而 非 蛋 日 的 基础 上 ， 就 使 得 该 技术 无 法 鉴别 结构 相近 的 异 构 体 ， 也 无 法 对 一 个 单一 的 蛋 日 进行 进行 详细 鉴定 。

用 胰 酶 消化 组 织 或 样品 , 获得 肽

|

1-D 或 2-D 色 谱 分 离 肽

| |

数据 库 查 询 鉴定 肽 或 蛋白

8.3 自动 化 蛋白 质 组 的 分 析 将 全 部 样品 消化 成 且 ， 然 后 通过 HPLC 分 离 样品 中 的 所 有 肽 ， 最 后 用 MS 或 MS-MS 分 析 。 然而 ， 该 技术 提供 的 样品 信息 不 如 2-D 胶 技术 。

3. 和 蛋 昌 质 组 学 的 信息 解决 途径

蛋白 质 组 学 从 许多 方面 来 讲 都 是 一 门 信息 科学 。 就 蛋白 自身 而 言 ， 蛋 白质 组 学 涉及 到 序列 信息 、 加 工 和 修饰 的 信息 、 表 达 信 息 、 功 能 信息 、 结 构 信 息 及 蛋白 如 何 同 其 他 蛋 白 形成 小 的 或 大 的 蛋白 复合 物 的 信息 。 重 要 的 是 ， 蛋 白质 组 学 考虑 到 了 时 间 和 环境 的 影 响 ， 因 此 可 以 在 不 同 的 发 育 时 间 点 和 不 同 的 环境 条 件 下 观察 以 上 的 蛋白 参数 。 从 更 广泛 的 角度 讲 ， 有 关 样 品 的 记录 和 结果 的 分 类 是 蛋白 质 组 研究 的 另 一 重要 内 容 。 高 通 量 的 得 选 需要 实验 室 信息 管理 系统 (LIMS) 来 记录 样品 的 分 析 进 程 及 其 分 析 结 果 ， 然 后 将 相 关 的 结果 建立 成 有 效 的 数据 库 以 便于 将 来 的 查询 。 和 蛋白 质 组 工具 在 蛋白 质 组 大 量 数据 的 分 析 中 发 挥 重 要 作用 ， 有 助 于 蛋白 的 鉴定 。 我 们 都 知道 ， 即 便 是 酵母 这 样 小 的 生物 也 能

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 - 145 。

合成 6000 多 种 蛋白 ， 那 么 更 复杂 的 生物 可 能 有 200 种 不 同 的 组 织 型 ， 每 一 种 合成 10 000 种 蛋白 。 因 此 ， 从 这 方面 来 讲 ， 蛋 白质 组 学 面临 的 任务 是 艰巨 的 。 故 我 们 在 本 综 述 后 续 部 分 写 了 有 关 蛋 白质 组 信息 资源 的 种 类 ， 分 为 蛋白 质 组 数据 库 和 蛋白质 组 工具 ， 我 们 将 介绍 一 些 在 目前 对 研究 者 有 用 的 知识 ， 其 他 的 以 后 陆续 讨论 。

3.1 蛋白 质 组 数据 库

从 某 种 程度 上 来 讲 ， 基 因 组 比较 好 定义 ， 指 的 是 全 部 基因 的 碱 基 序列 。 根 据 基 因 组 序列 就 可 以 推导 出 可 读 框 、 外 显 子 、 内 含 子 、 启 动 子 、 增 强 子 和 染色 体 的 结构 区 域 (如 中 心 粒 和 端 粒 )。 相 反 ， 由 于 涉及 到 的 数据 类 型 不 同和 生物 系统 的 蛋 白 的 动态 变化 ， 就 使 得 很 难 给 蛋白 质 组 下 一 个 定义 。 完 整 蛋 白质 组 资源 可 来 源 于 数据 库 中 核酸 序列 编码 的 蛋白 序列 。 因 此 ， 目 前 没有 一 个 数据 库 能 包含 蛋白 质 组 学 的 各 个 领域 ， 但 出 现 了 和 蛋白质 组 学 相关 领域 的 各 种 数据 库 。

目前 在 蛋白 质 组 学 领域 用 得 最 广泛 的 数据 库 当 属 SWISS-PROT (Bairoch and Ap- weiler, 2000; http://www.expasy.ch/)， 这 是 一 个 由 日 内 瓦 的 瑞士 生物 信息 学 研究 所 、 瑞典 和 欧洲 生物 信息 学 研究 所 建立 的 蛋白 注释 性 的 数据 库 。 该 数据 库 除 了 含 蛋白 序列 信 息 外 ， 还 包含 了 大 量 的 注释 (图 8.4)， 如 蛋白 表达 、 功 能 、 结 构 域 、 突 变 体 、 蛋 日 加

SWISSPROT PGO0D1 - Netscape

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FASTA format J (Se eS SS 图 8.4 人 细胞 色素 C (注册 号 P00001) 的 部 分 SWISSPROT 入 口 ， 显 示 了 特征 表 和 蛋白 序列 注意 ， 该 蛋白 的 特征 表 提 供 了 蛋白 的 翻译 后 修饰 、 金 属 结合 位 点 和 一 个 已 知 的 突变 体 。 在 较 早 的 入 口中 显示 了 和 蛋白 的 功能 信息 。

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ye 蛋白 质 组 学

工 和 转移 后 的 修饰 等 信息 。 该 数据 库 同 其 他 数据 库 ， 如 Medline、GeneBank、PDB 结构 数据 库 及 其 他 专业 性 的 数据 库 ， 如 图 谱 数 据 库 、 代 谢 或 生物 体 特异 的 数据 库 间 可 超级 链 接 。 由 于 该 数据 库 有 大 约 84 000 个 入 口 ， 同 GeneBank 这 样 的 序列 储藏 所 相 比 ， 就 显得 太 小 了 ， 但 由 于 其 信息 的 高 质量 ， 就 使 之 成 为 了 蛋白 数据 库 的 金 标准 。 但 目前 SWISS-PROT 面临 着 挑战 ， 即 基因 组 测序 和 发 表 的 速度 制约 了 SWISS- PROT 无 法 即时 收录 所 有 生物 所 发 表 的 相关 信息 ， 更 不 要 说 SWISS-PROT 内 成 千 上 万 的 物种 包含 的 一 些 信 息 。 因 此 ，Proteome Inc. 公司 采取 了 一 个 补救 措施 以 弥补 SWISS- PROT 的 不 足 ， 即 重点 关注 一 些 模式 生物 或 有 商业 价值 的 生物 。Proteome Inc. 公司 建 立 的 酵母 蛋白 质 组 数据 库 (YPD); (http://www.proteome.com/) 是 目前 最 完善 的 酿 酒 酵母 的 数据 库 ， 蛋 白 质 组 内 的 所 有 蛋白 均 可 通过 SWISS-PROT 的 格式 进行 解释 。 此 外 ， 还 可 提供 其 他 信息 ， 如 密码 子 偏 傈 、 染 色 体 定位 、 基 因 结 构 。 该 数据 库 还 提供 了 有 关 酵 母 知 识 的 广泛 的 综述 和 参考 文献 及 有 关 的 蛋白 功能 和 验证 实验 的 详尽 信息 ， 转 录 图 谱 ， 表 达 图 谱 的 搜寻 和 分 析 及 每 个 蛋白 的 序列 相似 性 报告 。Proteome Inc 还 建立 了 一 些 与 酵母 相似 的 数据 库 ， 如 白色 念珠 菌 生物 ， 秀 丽 线虫 ， 并 获得 了 资助 以 进一步 研究 建立 AR AMAT HEH, HH RRA RRA EWR, TEN RB RAR RSH RE 库 。 从 大 众 化 的 角度 讲 ， 一 些 生物 特异 性 的 数据 库 资 源 的 完整 性 和 实用 性 通常 反应 了 一 个 生物 研究 团体 的 组 织 有 效 性 。 一 些 比较 好 的 大 众 化 的 生物 数据 库 包括 FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu) 及 Arabidopsis thaliana 数据 库 AAtDB (http:// genome-www.stanford.edu/ Arabidopsis/ ) 。 一 种 不 同类 型 的 蛋白 质 组 数据 库 就 是 2-DE 蛋白 表达 数据 库 (图 8.5)， 此 类 数据 库 以 生物 、 细 胞 或 组 织 的 2-DE 胶 分 离 为 基础 ， 数 据 库 中 包含 了 2-DE RAB, HRA 究 样品 及 胶 上 鉴定 的 蛋白 的 信息 。 大 多 数 2-DE 蛋白 表达 数据 库 的 网 址 如 下 : http: // www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html.MS， 此 类 网 址 的 出 现 使 得 2-DE REKBEAR | 的 鉴定 成 为 可 能 ， 多 数 2-DE 数据 库 包 含 了 数 百 个 鉴定 的 蛋白 。 某 些 数 据 库 ， 如 | SWISS-2DPAGE 数据 库 ， 涉 及 到 2-DE 胶 上 每 个 鉴定 的 蛋白 点 的 大 量 文本 信息 ， 包 括 蛋 白 的 分 子 质 量 、 等 电 点 、 鉴 定 方法 、 蛋 白 在 其 他 组 织 表 达 的 资料 及 病理 信息 。 最 近 ， 2-DE 和 蛋白 表达 数据 库 已 经 开始 反应 出 一 个 样品 采用 多 块 胶 分 离 的 必要 性 ， 一 些 数 据 库 现在 开始 对 样品 采取 不 同 的 分 离 方 法 ， 如 窄 等 电 点 范围 分 析 。 但 目前 2-DE 胶 数据 库 面 临 的 主要 挑战 在 于 其 可 靠 性 ， 体 现在 2-DE 分 离 水 平和 数据 处 理 方法 两 方面 。 由 于 近 几 | 年 在 2-DE 样品 制备 和 电泳 条 件 的 标准 化 方面 做 出 了 诸多 努力 ， 且 对 蛋白 质 组 学 兴趣 的 增长 使 得 人 们 采取 了 前 所 未 有 的 多 种 多 样 的 技术 用 于 制备 2-DE 参考 图 谱 。 这 些 技术 在 实验 室内 具有 高 重复 性 ， 但 在 其 他 实验 室 的 重复 性 值得 商检 。 由 于 应 用 于 2-DE 数据 库 的 图 谱 、 文 本 和 超级 连接 的 贮存 和 描述 方法 有 一 定 的 一 致 性 (Appel et al., 1996), BE 具备 了 一 定 的 实用 性 。 但 只 要 数据 库 中 2-DE 胶 采 用 不 同 的 分 离 方 法 ， 就 无 法 进行 实验 室 间 的 比较 ，2-DE 数据 库 资 源 的 应 用 就 会 受到 限制 。 然 而 ， 值 得 注意 的 是 广泛 应 用 于 鉴定 2-DE 分 离 蛋白 的 肽 质谱 信息 提供 了 不 依赖 于 实验 室 的 蛋白 质 参数 ， 并 且 这 些 信息 对 建立 数据 库 非 常 有 用 。 对 蛋白 质 组 来 说 ， 它 还 有 许多 其 他 重要 的 数据 库 。 由 于 数据 库 日 新 月 异 ， 在 此 不 可 能 全 部 作 评价 。 然 而 理论 上 它们 可 包括 在 下 面 几 个 方面 的 数据 库 内 : 核酸 序列 ， 蛋 白 序

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 "147

Sub2D

i Bacillus subtilis strain 168 10 min after imposition to 4 % ethanol stress

图 中 的 交叉 点 代表 可 点 击 链接 至 特定 蛋白 质 的 详细 说 明 页 面 ， 如 蛋白 质 序列 、 表 达 水 平等 。 大 多 数 2-D 胶 数 据 库 都 使 用 类 似 的 点 击 链接 系统 。

列 ， 和 蛋白 图 谱 、 表 达 谱 和 结构 域 ， 蛋 白 翻 译 后 修饰 ， 蛋 白质 的 三 维 结构 ， 蛋 白质 代谢 数 据 库 。 由 Amos Bairoch 管理 的 网 站 毫 无 争议 地 是 最 好 的 蛋白 质数 据 库 网 站 ， 它 对 蛋白 质数 据 库 进行 分 门 别 类 ， 其 目录 下 有 1000 多 个 相关 网 站 ， 网 址 为 http:， //

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www. expasy.ch/alinks. html. 3.2 蛋白 质 组 学 工具

随 着 许多 相关 的 蛋白 质 组 数据 库 的 建立 ， 近 年 来 出 现 了 许多 和 蛋白质 组 辅助 分 析 的 信 息 化 工具 。 这 些 工具 解释 和 注释 了 2-DE 电泳 图 谱 ， 并 且 可 以 对 从 MS-MS 质谱 中 产生 的 多 肽 从 头 测 序 。 我 们 将 简短 讨论 一 下 这 些 工 具 并 且 评 价 它们 对 高 通 量 蛋 白质 组 筛选 的 应 用 。

2-DE 胶 成 像 分 析 软 件 “1981 年 起 ， 已 经 有 辅助 分 析 胶 图 像 的 软件 。 这 些 软件 需要 执行 大 量 的 核心 任务 ， 包 括 消减 背景 ， 对 点 进行 检测 和 定量 ， 比 对 胶 与 胶 之 间 的 图 像 ， 通过 图 像 和 统计 来 进行 胶 与 胶 的 匹配 ， 通 过 一 个 或 更 多 的 胶 重 合 产 生 一 个 系统 精细 的 图 像 ， 构 建 能 够 存 取 蛋 日 质点 的 数据 库 ， 许 多 的 2-DE 图 像 分 析 软 件 包 开始 是 由 学 术 研 究 机 构 开 发 的 〈 例 如 ELSIE, TYCHO, MELANIE 和 QUEST)， 其 中 大 多 数 软件 包 现在 性 能 大 大 提高 了 ， 并 且 已 商品 化 ， 运 用 于 PC 平台 上 (例如 KEPLAR，MELANIE I ff PDQUEST)。 同 时 ， 基 于 internet 网 和 内 联网 的 分 析 软 件 也 得 到 进一步 发 展 (Lemkin et al .，1999)。 然 而 ， 值 得 注意 的 是 尽管 商业 化 软件 包 已 升级 ， 但 自动 化 的 胶 分 析 软 件 还 不 能 令 人 满意 ，2-DE 胶 的 复杂 性 意味 着 精确 的 图 像 分 析 耗 时 、 耗 力 ， 但 是 如 果 首 先 把 精力 放 在 胶 的 制备 、 样 品 的 准备 、 电 泳 分 离 和 染色 上 ， 可 以 节省 许多 分 析 时 间 。 如 需 要 详细 地 解释 计算 机 分 析 图 像 问题 可 以 参看 Appel 和 Hochstrasser 的 文献 (1999 )。

蛋白 鉴定 分 析 软 件 ”由 分 析 产 生 的 大 量 蛋白 参数 可 用 于 鉴定 蛋白 质 。 这 些 包 括 蛋 白 质量 大 小 、 等 电 点 、 蛋 白质 序列 标签 、 肽 质 指 纹 图 、 肽 序列 标签 和 和 蛋白质 氨基 酸 组 成 。 通常 在 网 上 可 获得 单 参 数 和 多 参数 相 结合 的 软件 ， 但 是 在 某 些 情况 下 ， 可 作为 独立 的 软 {FEE 〈 例 如 Micromass 公司 的 ProteinLynx 质谱 分 析 软 件 包 )。

随 着 质谱 在 蛋白 质 组 的 广泛 应 用 ， 大 量 的 软件 包 服 务 于 此 种 类 型 的 研究 。 它 们 通常 包括 下 列 软 件 : 通过 肽 质 指纹 图 和 不 同 的 种 属 、 蛋 日 质 分 子 质量 大 小 、 等 电 点 来 鉴定 蛋 白质 ; 通过 MS/MS 来 鉴定 蛋白 质 (MS 来 源 于 CID 或 MALDI-TOF PSD 技术 ); 预测 通过 内 源 性 蛋 白 酶 消化 肽 片段 或 MS/MS 的 肽 片段 大 小 的 工具 ; 从 头 预 测 来 自 MS/MS 数据 的 肽 序列 的 工具 。 下 列 工 具 包 就 是 这 些 软件 的 典范 ; Protein Prospector (http:// prospector. ucsf.edu ); PROWL (http://prowl.reckefeller.edu ); MASCOT ( http:// www. matrixscience. com) ;来 自 华 盛 顿 大 学 的 SEQUEST (Yates et al., 1995) 和 在 Ex- PASy 服务 器 上 的 蛋白 质 组 工具 (http://www.expasy.ch/tools/ # proteome) ; (Wilkins et al.，1999a)。 所 有 这 些 软件 在 鉴定 一 个 蛋白 质 时 是 有 效 的 ， 但 是 怎样 应 用 于 鉴定 大 量 的 样本 ， 作 到 存在 一 定 仍 困难 。 看 起 来 更 复杂 的 是 ， 如 何 自动 挑 取 质 谱 峰 送 到 蛋白 质 鉴 定 处 ， 将 结果 存 到 其 他 数据 库 如 二 维 电泳 图 数据 库 。 一 些 研究 小 组 已 部 分 或 全 部 解决 此 问题 (如 Berndt et al., 1999; Gras et al., 1999; Link et al., 1999; Traini et al., 1998)。 很 明显 。 随 着 硬件 的 发 展 ， 这 些 软件 的 出 现 意 味 着 蛋白 质 鉴 定 的 自动 化 几乎 完 成 。

蛋白 特征 化 软件 ”尽管 蛋白 质 鉴定 越 来 越 自 动 化， 但 检测 蛋白 同 工 聚 体 、 和 蛋白 加 工 过 程 、 翻 译 后 修饰 仍 存在 很 多 难题 。 然 而 研究 者 开始 认识 到 ，2-DE 胶 的 分 辨 率 和 质谱 的 准确 度 与 解析 度 可 应 用 于 蛋白 质 性 质 分 析 和 鉴定 。SWISS-PROT 提供 的 蛋白 质 处 理

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 ”149 -

和 修饰 数据 库 也 可 用 来 分 析 蛋 白质 的 性 质 。PeptideMass 软件 〈 预 测 内 源 性 蛋白 酶 消化 的 肽 质谱 大 小 的 工具 ) 涉及 到 来 自 SWISS-PROT 的 蛋白 质 加工 和 修饰 的 信息 ， 给 出 氢 基 酸 修饰 位 置 和 修饰 后 肽 的 合适 分 子 质量 (Wilkins et al., 1997b). PeptIdent 工具 (http://www.expasy.ch/tools/peptides.html);(Wilkins et wd .， 未 发 表 ) 是 一 个 肽 质 指 纹 鉴定 引擎 ， 它 能 使 使 用 者 输入 肽 序列 ， 在 SWISS-PROT 的 修饰 肽 库 和 未 修饰 的 肽 库 中 搜寻 ， 从 而 鉴定 出 蛋白 的 可 能 修饰 的 肽 段 。 其 他 肽 质 指 纹 引 擎 也 有 相似 的 功能 但 只 搜 寻 质 量 大 小 而 没有 考虑 到 现在 库 中 存在 的 蛋 白 质 修 饰 。 一 个 在 肽 质谱 数据 库 中 预测 新 的 翻译 后 修饰 的 工具 已 被 报道 (Wilkins et w .，1999b)， 使 用 者 指明 蛋白 序列 和 它 的 质谱 数据 ， 这 个 程序 能 搜寻 对 应 于 某 一 特定 修饰 的 不 同 大 小 的 蛋白 质 。 那 么 就 可 以 运用 一 系 列 规则 去 预测 潜在 的 修饰 肽 序列 中 哪 一 个 氨基 酸 可 能 被 修饰 。 现 有 多 于 20 种 预测 修饰 的 规则 ， 一 些 规则 非常 简单 ， 而 另 一 些 却 是 复杂 的 序列 。GlycoMod 是 ExPASy 服务 器 上 很 好 的 蛋白 质 性 质 分 析 工 具 (N. Packer ， 私 人 通信 )， 它 能 预测 蛋白 质 糖 基 化 位 点 。 由 于 它 与 糖 蛋白 结构 数据 库 相 连 ， 提 供 了 一 种 研究 糖 蛋 日 的 有 力 工 具 。

3.3 生物 信息 学 展望

上述 章 节 对 蛋白 质 组 生物 信息 资源 作 了 概括 ， 显 然 ， 这 些 资源 在 短 时 间 内 的 发 展 令 人 惊奇 ， 然 而 ， 研 究 者 们 面 对 的 主要 挑战 是 在 重 日 质 组 中 需要 的 数据 库 和 工具 如 何 能 被 有 机 结合 ， 并 且 重 要 的 是 在 某 一 方面 允许 我 们 提出 相关 的 生物 学 问题 。 例 如 ， 就 像 疾病 状态 经 常 是 困难 所 在 ， 我 们 需要 追踪 表达 水 平 ， 以 及 在 同一 时 间 内 修饰 和 拥有 大 量 蛋 自 。 这 些 可 能 在 一 个 有 机 体 的 一 种 组 织 里 〈 如 肝脏 )， 也 可 能 存在 于 一 种 以 上 的 组 织 (如 肝 和 肾 )。 并 且 ， 我 们 需要 筛选 成 千 上 万 种 微生物 ， 检 查 与 病原 有 关 的 和 蛋白。 这些 需 要 基于 mRNA 必 片 的 研究 看 是 否 表达 了 新 蛋白 ， 或 者 已 经 表达 的 蛋 日 是 否 经 过 不 同 的 修饰 或 加 工 。 另 一 个 主要 的 挑战 是 大 量 的 蛋白 质 组 数据 如 何 能 被 最 好 地 显现 。 显 然 ， 一 万 或 者 200 种 不 同人 类 组 织 的 蛋白 不 能 在 一 张 2-DE 电泳 上 展示 。 代 替 的 是 需要 多 维 可 视 化 软件 ， 对 有 序 及 有 颜色 的 排列 是 必需 的 ， 就 像 Weinstein 等 在 一 个 人 类 细胞 库 中 规 模 化 筛选 大 量 复合 物 所 显示 的 那样 〈1997)， 提 高 数据 库 和 软件 的 标准 化 是 获得 以 上 结 果 的 必要 条 件 ， 也 是 研究 功能 基因 组 的 必要 条 件 ， 有 人 提倡 大 规模 RNA 的 分 析 可 能 是 解决 重 白 质 组 中 的 基本 问题 。

4. 结语

上 述 总 结 包括 了 和 蛋白质 组 的 许多 方面 ， 但 实际 上 只 涉及 到 自动 化 领域 及 蛋白 质 组 信 息 学 ， 守 无 疑问 ， 它 的 重点 在 于 技术 领域 。 然 而 ， 我 们 必须 时 刻 记 住 任何 一 种 软件 仅仅 应 用 于 某 一 研究 领域 才能 产生 预想 的 效果 。 乌 枪 克隆 法 证 实 ， 没 有 哪 一 种 软件 是 绝对 正 确 的 ， 而 许多 技术 的 结合 才能 产生 生物 学 突破 性 的 结果 ， 蛋 白质 组 现在 正 处 于 研究 的 中 心地 位 ， 但 我 们 必须 问 这 样 的 问题 ， 蛋 白质 组 技术 能 够 产生 这 样 的 效果 吗 ? 对 于 这 个 问 题 ， 我 们 不 得 不 等 待 。

( 薪 代 凤 译 贺 福 初 校 )

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- 150 - 蛋白 质 组 学

参考 文献

Anderson, N.G. and Anderson, L. (1982) The human protein index. Clin. Chem. 28: 739-748.

Anderson, N.L., Taylor, J., Scandora, A.E., Coulter, B.P. and Anderson, N.G. (1981) The TYCHO system for computer analysis of two-dimensional gel electrophoresis patterns. Clin. Chem. 27: 1807-1820.

Anderson, N.L., Giere, F.A., Nance, S.L., Gemmell, M.A., Tollaksen, S.L. and Anderson, N.G. (1987) Effects of toxic agents at the protein level: quantitative measurement of 213 mouse liver proteins following xenobiotic treatment. Fundam. Appl. Toxicol. 8: 39-50.

Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (1999) Computer analysis of 2-D images. Methods Mol. Biol. 112: 363-381.

Appel, R.D., Bairoch, A., Sanchez, J.-C., Vargas, J.R., Golaz, O., Pasquali, C. and Hochstrasser, D.F. (1996) Federated two-dimensional electrophoresis database: a simple means of publishing two-dimensional electrophoresis data. Electrophoresis 17: 540-546.

Bairoch, A. and Apweiler, R. (2000) The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. Nucleic Acids Res. 28: 45-48.

Berndt, P., Hobohm, U. and Langen, H. (1999) Reliable automatic protein identification from matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric peptide fingerprints. Electro- Phoresis 20: 3521-3526.

Bienvenut, W.V., Sanchez, J.-C., Karmime, A., Rouge, V., Rose, K., Binz, P.-A. and Hochstrasser, D.F. (1999) Toward a clinical molecular scanner for proteome research: parallel protein chemical processing before and during western blot. Anal. Chem. 71: 4800-4807.

Binz, P.-A., Muller, M., Walther, D., Bienvenut, W., Gras, R., Hoogland, C., Bouchet, G., Gasteiger, E., Fabbretti, R., Gay, S., Palagi, P., Wilkins, M.R., Rouge, V., Tonella, L., Paesano, S., Rossellat, G., Karmime, A., Bairoch, A., Sanchez, J.-C., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (1999) A molecular scanner to automate proteomic research and to display proteome images. Anal. Chem. 71: 4981-4988. :

Bjellqvist, B., Sanchez, J.C., Pasquali, C., Ravier, F., Paquet, N., Frutiger, S., Hughes, G.J. and Hochstrasser, D. (1993) Micropreparative two-dimensional electrophoresis allowing the separa- tion of samples containing milligram amounts of proteins. Electrophoresis 14: 1375-1378.

Brewer, J., Grund, E., Hagerlid, P., Olsson, I. and Lizana, J. (1986) Electrophoresis ‘86 (ed. M.J. Dunn). VCH, Weinheim, pp. 226-229.

Briggs, M.M. and Capaldi, R.A. (1977) Near-neighbor relationships of the subunits of cytochrome c oxidase. Biochemistry 16: 73-77.

Burnette, W.N. (1981) “Western Blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112: 195-203.

Cayalcoli, J.D., VanBogelen, R.A., Andrews, P.C. and Moldover, B. (1997) Unique identification of proteins from small genome organisms: theoretical feasibility of high throughput proteome analysis. Electrophoresis 18: 2703-2708.

Cooper, C.A., Wilkins, M.R., Williams, K.L. and Packer, N.H. (1999) BOLD—a biological O- linked glycan database. Electrophoresis 20: 3589-3598.

Corbett, J.M., Dunn, M.J., Posch, A. and Gorg, A. (1994) Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison. Electrophoresis 15: 1205-1211.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. and Lottspeich, F. (1992) Mass spectro- metric analysis of blotted proteins after gel electrophoretic separation by matrix-assisted laser desorption/ionization. Electrophoresis 13: 664-665.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Schleuder, D., Hochstrasser, D., Sanchez, J.C., Lottspeich, F. and Hillenkamp, F. (1997) Analysis of proteins by direct-scanning infrared-MALDI mass spectro- metry after 2-D PAGE separation and electroblotting. Anal. Chem. 69: 2888-2892.

Edman, P. and Begg, G. (1967) A protein sequenator. Eur. J. Biochem. 1: 80-91.

Figeys, D., Ning, Y. and Aebersold, R. (1997) A microfabricated device for rapid protein identification by microelectrospray ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 69: 3153-3160.

Figeys, D., Lock, C., Taylor, L. and Aebersold, R. (1998) Microfabricated device coupled with an

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 蛋 白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 S461: -

electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometer: protein identifications based on enhanced-resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry data. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12: 1435-1444.

Fountoulakis, M., Langen, H., Evers, S., Gray, C. and Takacs, B. (1997) Two-dimensional map of Haemophilus influenzae following protein enrichment by heparin chromatography. Electro- phoresis 18: 1193-1202.

Fountoulakis, M., Takacs, B. and Langen, H. (1998a) Two-dimensional map of basic proteins of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 19: 761—766.

Fountoulakis, M., Juranville, J.F., Roder, D., Evers, S., Berndt, P. and Langen, H. (1998b) Reference map of the low molecular mass proteins of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 19: 1819-1827.

Garrels, J.I. and Franza, B.R. (1989) The REFS52 protein database. Methods of database construction and analysis using the QUEST system and characterizations of protein patterns from proliferating and quiescent REFS2 cells. J. Biol. Chem. 264: 5283-5298.

Gras, R., Muller, M., Gasteiger, E., Gay, S., Binz, P.-A., Bienvenut, W., Hoogland, C., Sanchez, J.- C., Bairoch, A., Hochstrasser, D.F. and Appel, R.D. (1999) Improving protein identification from peptide mass fingerprinting through a parameterized multi-level scoring algorithm and an optimized peak detection. Electrophoresis 20: 3535-3550.

Gygi, S.P., Rochon, Y., Franza, B.R. and Aebersold, R. (1999) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol. Cell. Biol. 19: 1720-1730.

Harrington, M.G., Lee, K.H., Yun, M., Zewert, T., Bailey, J.E. and Hood, L.E. (1993) Mechanical precision in two-dimensional electrophoresis can improve spot positional reproducibility. App. Theor. Electrophor. 3: 347-353.

Henzel, W.J., Billeci, T.M., Stults, J.T., Wong, S.C., Grimley, C. and Watanabe, C. (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5011-5015.

Herbert, B. (1999) Advances in protein solubilisation for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 20: 660-663.

Hochstrasser, D.F. (1989) Pre-cast gel systems for two-dimensional electrophoresis. US patent no. US4874490.

Hochstrasser, D.F. (1998) Two-dimensional electrophoresis device. US patent no. US5773645.

Houthaeve, T., Gausepohl, H., Ashman, K., Nillson, T. and Mann, M. (1997) Automated protein preparation techniques using a digest robot. J. Protein Chem. 16: 343-348.

Isobe, T., Uchida, K., Taoka, M., Shinkai, F., Manabe, T. and Okuyama, T. (1991) Automated two- dimensional liquid chromatographic system for mapping proteins in highly complex mixtures. J. Chromatogr. 588: 115-123.

Kenrick, K.G. and Margolis, J. (1970) Isoelectric focusing and gradient gel electrophoresis: a two- dimensional technique. Anal. Biochem. 33: 204-207.

Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231-243.

Klose, J. (1999) Genotypes and phenotypes. Electrophoresis 20: 643-652.

Kuster, B. and Mann, M. (1998) Identifying proteins and post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 393-400.

Langen, H., Gray, C., Roder, D., Juranville, J.F., Takacs, B. and Fountoulakis, M. (1997) From genome to proteome: protein map of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 18: 1184-1192. Langen, H., Fountoulakis, M. and Berndt, P. (1998) Modified in-gel protein digestion procedure allows high throughput MS analysis following 2-D gel gridding. Abstract from the 3rd Siena 2-

D Electrophoresis Meeting ‘From Genome to Proteome’, 31 August—3 September, 1998.

Latham, K.E., Garrels, J.I., Chang, C. and. Solter, D. (1991) Quantitative analysis of protein synthesis in mouse embryos. I. Extensive reprogramming at the one- and two-cell stages. Development 112: 921-932.

Lemkin, P.F., Myrick, J.M., Lakshmanan, Y., Shue, M.J., Patrick, J.L., Hornbeck, P.V., Thornwal, G.C. and Partin, A.W. (1999) Exploratory data analysis groupware for qualitative

and quantitative electrophoretic gel analysis over the Internet-WebGel. Electrophoresis 20: 3492-3507.

ee

"AS2- - 蛋白 质

An fo

学

Link, A.J., Hays, L.G., Carmack, E.B. and Yates, J.R. III (1997) Identifying the major proteome components of Haemophilus influenzae type-strain NCTC 8143. Electrophoresis 18: 1314-1334.

Link, A.J., Eng, J., Schieltz, D.M., Carmack, E., Mize, G.J., Morris, D.R., Garvik, B.M. and Yates, J.R. II (1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnol. 17: 676-682.

Loo, J.A., Brown, J., Critchley, G., Mitchell, C., Andrews, P.C. and Ogorzalek Loo, R.R. (1999) High sensitivity mass spectrometric methods for obtaining intact molecular weights from gel- separated proteins. Electrophoresis 20: 743-748.

Lopez, M.F. and Patton, W.F. (1997) Reproducibility of polypeptide spot positions in two- dimensional gels run using carrier ampholytes in the isoelectric focusing dimension. Electro- Phoresis 18: 338-343.

Mann, M. and Wilm, M. (1994) Error tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal. Chem. 66: 4390-4399.

Matsudaira, P. (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262: 10035-10038.

Nokihara, K., Morita, N. and Kuriki, T. (1992) Applications of an automated apparatus for two- dimensional electrophoresis, Model TEP-1, for microsequence analysis of proteins. Electro- Phoresis 13: 701-707.

O’Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021.

O’Farrell, P.Z. and Goodman, H.M. (1976) Resolution of simian virus 40 proteins in whole cell extracts by two-dimensional electrophoresis: heterogeneity of the major capsid protein. Cell 9: 289-298.

O’Farrell, P.H. and Ivarie, R.D. (1979) The glucocorticoid domain of response: measurement of pleiotropic cellular responses by two-dimensional gel electrophoresis. Monogr. Endocrinol. 12: 189-201.

Ogorzalek Loo, R.R., Mitchell, C., Stevenson, T.I., Martin, S.A., Hines, W.M., Juhasz, P., Patterson, D.H., Peltier, J.M., Loo, J.A. and Andrews, P.C. (1997) Sensitivity and mass accuracy for proteins analyzed directly from polyacrylamide gels: implications for proteome mapping. Electrophoresis 18: 382-390.

Ogorzalek Loo, R.R., Loo, J.A. and Andrews, P.C. (1999) Obtaining molecular weights of proteins and their cleavage products by directly combining gel electrophoresis with mass spectrometry. Methods. Mol. Biol. 112: 473-485.

Oliver, S.G., van der Aart, Q.J., Agostoni-Carbone, M.L., Aigle, M., Alberghina, L., Alexandraki, D., Antoine, G., Anwar, R., Ballesta, J.P. and Benit, P. (1992) The complete DNA sequence of yeast chromosome III. Nature 357: 38-46.

Opiteck, G.J., Ramirez, S.M., Jorgenson, J.W. and Moseley, M.A. III (1998) Comprehensive two- dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and proteome mapping. Anal. Biochem. 258: 349-361.

Phillips, T.A., Bloch, P.L. and Neidhardt, F.C. (1980) Protein identifications on O’Farrell two- dimensional gels: locations of 55 additional Escherichia coli proteins. Bacteriology 144: 1024— 1033.

Prober, J.M., Trainor, G.L., Dam, R.J., Hobbs, F.W., Robertson, C.W., Zagursky, R.J., Cocuzza, A.J., Jensen, M.A. and Baumeister, K. (1987) A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science 238: 336-341.

Qin, J., Herring, C.J. and Zhang, X. (1998) De novo peptide sequencing in an ion trap mass spectrometer with '*O labeling. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12: 209-216.

Reeh, S., Pedersen, S. and Friesen, J.D. (1976) Biosynthetic regulation of individual proteins in relA+ and relA strains of Escherichia coli during amino acid starvation. Mol. Gen. Genet. 149: 279-289.

Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M. and Seraphin, B. (1999) A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnol. 17: 1030-1032.

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.

第 八 章 ”蛋白 质 组 学 的 自动 化 : 高 通 量 和 蛋白 分 析 的 技术 和 信息 学 途径 +053. °

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 74: 5463--5467.

Scheele, G.A. (1975) Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. Characterization of guinea pig exocrine pancreatic proteins. J. Biol. Chem. 250: 5375-5385.

Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. and Brown, P.O. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470.

Schleuder, D., Hillenkamp, F. and Strupat, K. (1999) IR-MALDI-mass analysis of electroblotted proteins directly from the membrane: comparison of different membranes, application to on- membrane digestion, and protein identification by database searching. Anal. Chem. 71: 3238— 3247.

Shevchenko, A., Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V., Sagliocco, F., Wilm, M., Vorm, O., Mortensen, P., Shevchenko, A., Boucherie, H. and Mann, M. (1996) Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 14440-14445.

Steinberg, R.A., O’Farrell, P.H., Friedrich, U. and Coffino, P. (1977) Mutations causing charge alterations in regulatory subunits of the cAMP-dependent protein kinase of cultured S49 lymphoma cells. Ce// 10: 381-391.

Stoeckli, M., Farmer, T.B. and Caprioli, R.M. (1999) Automated mass spectrometry imaging with a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight instrument. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10: 67-71.

Tonella, L., Walsh, B.J., Sanchez, J.C., Ou, K., Wilkins, M.R., Tyler, M., Frutiger, S., Gooley, A.A., Pescaru, I., Appel, R.D., Yan, J.X., Bairoch, A., Hoogland, C., Morch, F.S., Hughes, G.J., Williams, K.L. and Hochstrasser, D.F. (1998) °98 Escherichia coli SWISS-2DPAGE database update. Electrophoresis 19: 1960-1971.

Towbin, H., Staehlin, T. and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.

Traini, M., Gooley, A.A., Ou, K., Wilkins, M.R., Tonella, L., Sanchez, J.-C., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1998) Towards an automated approach for protein identification in proteome projects. Electrophoresis 19: 1941-1949.

VanBogelen, R.A., Hutton, M.E. and Neidhardt, F.C. (1990) Gene-protein database of Escherichia coli K-12: edition 3. Electrophoresis 11: 1131-1166.

Vestling, M.M. and Fenselau, C. (1994) Polyvinylidene difluoride (PVDF): an interface for gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 22: 547-551.

Weinstein, J.N., Myers, T.G., O’Connor, P.M., Friend, S.H., Fornace, A.J. Jr, Kohn, K.W., Fojo, T., Bates, S.E., Rubinstein, L.V., Anderson, N.L., Buolamwini, J.K., van Osdol, W.W., Monks, A.P., Scudiero, D.A., Sausville, E.A., Zaharevitz, D.W., Bunow, B., Viswanadhan, V.N., Johnson, G.S., Wittes, R.E. and Paull, K.D. (1997) An information-intensive approach to the molecular pharmacology of cancer. Science 275: 343-349.

Wilkins, M.R. and Gooley, A.A. (1997) Protein identification in proteome projects. In: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (eds M.R. Wilkins, R.D. Appel, K.L. Williams and D.F. Hochstrasser). Springer, Berlin, pp. 35-64.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphrey-Smith, I., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1995) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13: 19-50.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Williams, K.L. and Hochstrasser, D.F. (1996) Current challenges and future applications for protein maps and post-translational vector maps in proteome projects. Electrophoresis 17: 830-838.

Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (eds) (1997a) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer, Berlin.

Wilkins, M.R., Lindskog, I., Gasteiger, E., Bairoch, A., Sanchez, J.C., Hochstrasser, D.F. and Appel, R.D. (1997b) Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS — a World-Wide- Web-accessible tool. Electrophoresis 18: 403-408.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Sanchez, J.-C., Bairoch, A. and Hochstrasser, D.F. (1998a) The limitations of two-dimensional gel electrophoresis for proteome projects: the effects of protein

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- 154: = Ama

copy number and hydrophobicity. Electrophoresis 19: 1501-1505.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Tonella, L., Ou, K., Sanchez, J.-C., Tyler, M., Gooley, A.A., Williams, K.L., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (1998b) Protein identification with N- and C-terminal sequence tags in proteome projects. J. Mol. Biol. 278: 599-608.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Bairoch, A., Sanchez, J.-C., Williams, K.L., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (1999a) Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol. Biol. 112: 531-552.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Gooley, A.A., Herbert, B.R., Molloy, M.P., Binz, P.A., Ou, K., Sanchez, J.-C., Bairoch, A., Williams, K.L. and Hochstrasser, D.F. (1999b) High-throughput mass spectrometric discovery of protein post-translational modifications. J. Mol. Biol. 289: 645— 657.

Wilm, M. and Mann, M. (1996) Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Anal. Chem. 68: 1-8.

Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T. and Mann, M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature 379: 466-469.

Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, M.H. and Lockhart, D.J. (1997) Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Biotechnol. 15: 1359-1367.

Yates, J.R. III (1998a) Mass spectrometry and the age of the proteome. J. Mass. Spectrom. 33: 1- 19.

Yates, J.R. III (1998b) Database searching using mass spectrometry data. Electrophoresis 19: 893- 900.

Yates, J.R. IIH., Eng, J.K. and McCormack, A.L. (1995) Mining genomes: correlating tandem mass spectra of modified and unmodified peptides to sequences in nucleotide databases. Anal. Chem. 67: 3202-3210.

SIL JAM: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 Mary F. Lopez

le She

蛋白 质 组 分 析 (Wasinger et wy/ .，1995) 是 一 个 正在 迅速 发 展 的 领域 ， 已 经 成 为 致力 于 药物 开发 的 制药 公司 和 生物 技术 公司 关注 的 焦点 (Blackstock and Weir，1999; Lopez 1998，1999a)， 与 蛋白 质 组 学 相关 的 出 版 物 数量 以 指数 级 数 增长 (图 9.1)， 可 以 反映 出 其 受 关注 的 程度 。 最 近 的 研究 表明 ， 细 胞 中 实际 蛋白 质 水 平 与 转录 水 平 之 间 缺 乏 相关 人 性 (Anderson and Anderson, 1998; Gygi et al .，1999)， 这 一 结论 刺激 了 大 部 分 蛋白 质 组 领 域内 的 研究 兴趣 。 这 些 研究 使 人 们 清楚 了 ， 对 细胞 中 蛋白 质 的 分 析 是 对 其 基因 组 分 析 的 补充 ， 如 果 不 结合 蛋 白质 组 学 平台 ， 药 物 开 发 计划 就 不 会 成 功 。 许 多 疾病 都 与 蛋白 质 的

翻译 后 修饰 (如 糖 基 化 ) 机 能 障碍 有 关 ， 这 是 促使 人 们 监测 蛋白 质谱 的 另 一 个 原因 ， 这 些

生物 学 上 的 错误 发 生 在 代谢 水 平 上 ， 在 基因 组 水 平 上 找 不 到 线索 。

400 350 300 250 200 150 100

50

在 题目 或 摘要 中 出 现 “ Proteome ”一 词 的 文献 数目

1995 1996 1997 1998 2000 9.1 8 1995 年 以 来 题目 和 摘要 中 出 现 “proteome” 一 词 的 文献 数量 增长 情况

2. 二 维 电泳 结合 质谱 : 蛋 日 质 组 的 典型 范例 ? 全 面 的 蛋白 质 组 分 析 可 以 用 各 种 方法 来 进行 。 但 是 ， 目 前 人 们 更 喜欢 的 手段 包括 了

- 156 . 蛋白 质 组 学

以 下 这 些 技术 的 结合 : = AERE RE HK (2-DE)(O’ Farrel 1975; Patton et al., 1990), 随后 BETIS RAMA, SANA Deen, HAMSARMREDE, XK 解 ， 提 取 肽 片断 用 质谱 测定 肽 质量 指纹 谱 鉴 定 (Henzel, 1993; James et al., 1993; Mann et al., 1993; Yate et al .，1993)， 或 用 串联 质谱 对 单个 肽 段 测序 (Hunt et al., 1986; Jonsher et al., 1997; Yates et al., 1999) (HAE),

不 幸 的 是 ， 由 于 蛋白 质 固有 的 复杂 性 ， 使 蛋白 质 的 分 析 不 能 像 核酸 那样 易于 高 通 量 分 析 ， 研 究 复杂 蛋白质 混合 物 的 方法 ， 例 如 2-DE， 很 难 或 不 可 能 成 功 地 实现 自动 化 (Lopez et al., 1999a Nakihara et al., 1992; Quardroni and James，1999)。 人 们 曾经 满 怀 热情 地 寻找 蛋 日 质 组 研究 中 双向 电泳 技术 的 蔡 代 技术 ， 但 是 都 没有 获得 成 功 〈Lopez etal., 1999a; Skipp，1999)。 最 主要 的 问题 是 2-DE 凝 胶 分 离 具 有 出 色 的 并 行 〈paral- lel) 特性 ， 用 大 的 2-DE 凝 胶 配 合 灵敏 的 染色 方法 ， 一 块 2-DE 凝 胶 能 很 容易 地 同时 分 #1000 个 ， 多 至 10 000 个 不 同 的 和 蛋白质 (Klose, 1999; Kobalz，1995)。 目 前 发 展 的 技 术 中 没有 别 的 技术 或 技术 的 结合 能 够 在 相同 的 时 间 段 内 用 同样 量 的 起 始 物质 传达 出 如 此 详细 的 内 容 。 除 了 高 分 辨 外 ，2-DE 凝 胶 还 能 够 定量 ， 尽 管 心 片 技术 有 可 能 取代 2-DE 胶 (第 十 章 )， 但 是 仍然 有 许多 问题 有 待 于 解决 ， 如 非 变 性 结合 及 磷酸 化 现象 等 〈Carr， 1999)。

3. Bohs

令 人 惊异 的 是 ， 尽 管 跑 2-DE 胶 是 一 种 劳动 密集 型 的 ， 大 部 分 需 人 工 操作 的 过 程 ， 但 它 却 不 是 典型 的 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 的 瓶颈 (Table 1 in Lopez，2000)。2-DE 胶 的 分 析 仍 然 有 一 定 程度 的 主观 性 ， 需 要 人 参与 编辑 。 对 于 获取 得 到 的 海量 数据 进行 生物 信息 学 处 理 是 耗 时 的 ， 而 且 不 是 很 有 效 。 但 是 ， 蛋 白质 组 分 析 过 程 中 许 步 又 能 够 被 全 部 或 半 自动 化 。 这 样 就 能 显著 地 提高 效率 和 产 率 ， 也 随 之 提高 了 鉴定 出 靶 标 蛋白 的 可 能 性 (Lopez，2000)。 尽 管 某 些 核心 蛋 白 质 组 实验 室 正在 将 自动 化 技术 整合 到 其 中 一 些 分 析 步骤 中 去 ， 就 在 最 近 已 经 有 了 商业 化 的 蛋白 质 组 分 析 系统 。 许 多 公司 正在 积极 发 展 蛋白 质 组 分 析 技 术 平台 和 组 件 ， 用 于 支持 药物 和 靶 标 的 开发 ， 如 BioRad, APB, PE Biosys- tem，GSI，Proteome Systems，Teca 等 其 他 公司 。

蛋白 质 组 学 理想 的 高 通 量 全 系统 方法 应 该 包括 以 下 部 分 : 样品 收集 技术 、 高 分 辩 电 泳装 置 、 自 动 化 凝 胶 染 色 仪 、 半 自动 化 图 像 分 析 软 件 、 机 器 人 模式 的 蛋白 斑点 处 理 过 程 、MALDI- TOF 和 串联 质谱 仪 ， 并 且 具 有 整合 的 生物 信息 学 软件 ， 可 以 链接 到 单个 模块 并 进行 畅通 的 样品 处 理 ， 追 踪 ， 数 据 分 析 和 数据 归档 。 图 9.2 的 例子 说 明了 这 样 一 种 系统 ， 其 部 件 都 是 目前 商业 可 得 的 。 在 理想 状态 下 ， 每 一 个 部 件 都 应 该 与 其 他 部 件 相

合 ， 以 在 开发 路 径 中 实现 有 效 的 数据 和 样品 信息 传递 。 理 论 上 ， 各 个 部 件 都 应 该 能 与

一 个 相关 数据 库 链 接 ， 以 整合 过 程 中 每 一 步 的 追踪 信息 〈 例 如 用 条 形 码 )。 以 这 种 方式 ， 每 一 个 样品 获得 的 所 有 信息 最 终 都 会 链接 到 最 初 胶 上 的 恒 日 斑点 。

在 下 面 的 部 分 将 大 概 描述 一 下 一 些 系 统 部 件 各 自 的 特性 ， 这 些 特性 都 是 为 满足 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 而 设计 的 。

SLE HM: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 57: -

图 9.2 由 目前 商业 化 的 各 部 件 装 配 出 的 完整 的 蛋白 质 组 研究 系统 (a) IPGphore, Hofer DALT SDS-PAGR 凝 胶 电 泳 系 统 ，APB; (b) Investigator Gel Processor, GSI; (c) LAS-1000 ARR AB, Fujimed; (d) Investigator HT 2-D 图 像 分 析 软 件 系统 ，GSI; (e) Protean 2-DSpot Cutter, BioRad; (f) Genesis RSP 酶 切 和 MALDI 3 plas A ABE, Tecan; (g) Axima-CFR MALDI-TOF 质谱 仪 ，Kratos。

4. ABBE RCE Uk AY we 4.1 二 维 凝 胶

2-DE 凝 胶 电泳 的 质量 直接 影响 到 任何 蛋白质 组 计划 的 结果 。 完 美的 二 维 电泳 系统 将 会 产生 出 大 型 、 高 重复 性 的 凝 胶 。 等 电 聚 焦 对 离子 和 其 他 污染 物 极度 灵敏 ， 所 以 要 使 用 高 质量 的 试剂 和 预制 胶 将 变异 减 小 到 最 小 程度 (Lopez et al., 1991; Patton et al., 1991a; Walsh et oz .，1998)。 大 型 胶 系 统 是 一 个 典型 的 2-DE 胶 专 用 系统 ， 并 可 被 调整 为 高 通 量 。 每 一 个 单元 都 应 具有 同时 运行 10 一 12 块 大 型 胶 的 能 力 ， 多 系统 模式 的 加 入 可 适应 更 高 通 量 的 实验 。 迷 你 胶 同 样 可 成 功用 于 2-DE 分 离 ， 只 要 在 2-DE 运行 之 前 对 样品 预先 分 离 收 集 以 减少 样品 的 复杂 性 (Harry et az.，2000)。 由 于 迷你 胶 电 泳 时 操作 更 方便 ， 所 以 比 大 型 胶 更 适合 于 自动 化 操作 。

第 一 维和 第 二 维 电泳 都 使 用 预制 胶 会 提高 分 离 的 一 致 性 。 选 择 固定 化 或 载体 两 性 电 解 质 作为 一 维 化 学 物质 使 等 电 聚 焦 过 程 更 具 灵 活性 。 载 体 两 性 电解 质 管 胶 更 适用 与 疏水

a on ，

NBS 蛋 日 质 组 学

性 或 膜 蛋 折 的 分 离 ， 而 固定 化 梯度 胶 条 更 方便 ， 常 规 使 用 更 容易 (Lopez，1999b; Pat- ton et Ql .，1999b)。 所 有 这 些 参数 结合 起 来 使 胶 与 胶 之 间 的 斑点 位 置 相关 性 很 好 ， 不 管 是 在 IEF (等 电 聚 焦 ) 还 是 分 子 质量 分 离 ， 变 异 都 小 于 1% (Fishmann, 1999; Lopez and Patton，1997)。 图 9.3 显示 的 是 6 块 不 同 的 血清 2-DE 胶 在 同一 区 域 的 放大 照片 ， 在 疾病 样品 中 可 看 到 出 现 了 在 对 照样 品 中 没有 的 新 斑点 。 除 非 胶 与 胶 之 间 的 模式 (pat- tern) 重 现 性 非常 好 ， 否 则 是 不 可 能 进行 这 种 比较 的 。

(a) (b)

(d) 疾病 组 时

图 9.3 血清 蛋白 2-DE 凝 胶 图 像 配 比 区 域 放 大 图 (a-c) 对 照样 品 。(d-f) 疾病 样品 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton，1997， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-DE 分 析 软 件 6.2 版 (GSI)。 箭 头 所 指 处 为 在 疾病 样品 中 差异 表达 的 蛋白 质 。 ( 蒙 S，Rasheed，UCLA 惠 允 )

4.2 富 集 和 分 部 收集 技术

尽管 2-DE 是 目前 分 离 蛋 白质 混合 物 的 具 最 高 分 辩 率 的 技术 ， 它 仍然 不 能 分 辨 在 任 一 细胞 中 所 有 表达 的 和 蛋白质 (>10 万 个 )， 大 多 数 研究 者 用 富 集 或 预 分 布 收集 技术 来 寻 求解 决 这 一 问题 的 办 法 ， 如 亲 和 色 谱 ， 溶 液 中 分 部 收集 或 在 2-DE 前 进行 亚 细 胞 分 部 收 集 (Harry et al., 2000; Lopez, 1999a; Lopez et al., 2000a; Quadroni and James, 1999), ABFA AY i — PRD BB Mt 8 FB ee HE — 2h iE RB OP SA 92 Yd) TE 化 pH 梯度 胶 (1~2 4+ pH (2) (Harry et al., 2000; APB, BioRad, Proteome Sys- tems, GSI).

4.3 显 像 技术

目前 2-DE 胶 上 蛋白质 的 显 像 技术 只 有 有 限 的 几 种 。 因 为 有 越 来 越 多 的 实验 室 不 能 使 用 放射 性 同位 素 ， 所 以 最 灵敏 并 可 定量 的 发 射 活性 标记 法 已 经 变 得 相当 没有 吸引 力

PLE HAR: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 159 -

了 。 放 射 性 标记 法 还 要 求 待 研究 的 活 细胞 和 组 织 在 分 析 前 与 放射 性 同位 素 共 培 养 ， 因 此 许多 重要 的 样品 明显 不 能 采用 这 个 方法 ， 如 人 的 组 织 和 体液 。 最 常用 的 染色 方法 是 考 马 斯 蓝 染 色 和 银 染 (Merril，1987; Patton et al., 1999; Ramsby and Makowski, 1998; Wirth and Romano，1995)。 考 马 斯 蓝 的 灵敏 度 很 低 ， 使 其 仅 限 于 研究 丰 度 最 高 的 看 家 蛋白 。 尽 管 银 染 和 蛋白 的 胶 上 酶 切 肽 质量 指纹 谱 的 肽 序列 覆盖 率 要 相对 低 一 些 (Gharahdaghi et al., 1999), (EAA WHER RM 〈 定 量 到 ng 级 )， 在 一 些 例 子 中 可 定量 (Patton，1995)， 并 能 与 质谱 和 测序 技术 相配 合 ， 因 此 银 染 通常 是 最 好 的 选择 。 不 幸 的 是 ， 银 染 也 有 一 些 非常 严重 的 缺点 。 通 常 银 染 定量 的 动力 学 范围 (dynamic range) 不

(a) (b)

(c) (d)

9.4 银 染 和 SYPRO Ruby 染色 的 2-DE 凝 胶 相 同 区 域内 象 素 强度 表面 轮廓 线 (a) 2-DE 凝 胶 银 染 放 大 图 ; (b) 2-DE SEB SYPRO Ruby 染色 放大 图 ， 与 (a) 的 区 域 相 同 。 取 直线 所 标 处 的 蛋白 斑点 的 表面 轮廓 线 ; (ec) 图 (a) 中 直线 所 标 区 域 的 表面 轮廓 线 ; (d) 图 (b) 中 直线 所 标 区 域 的 表面 轮廓 线 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and patton，1997， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-DE 分 析 软 件 6.2 版 (GSI)， 及 使 用 银 染 或 SYPRO Ruby Protein gel stain (Molecular probes) 染色 。

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- 160 - 蛋白 质 组 学

大 ， 较 高 表达 的 丰 度 的 蛋白 质 非常 容易 达到 饱和 。 银 染 不 是 一 个 终点 染色 方法 ， 这 一 事 实说 明 其 定量 是 不 准确 的 。 另 一 种 染色 方法 是 荧光 染色 。 市 场 上 有 许多 非常 好 的 荧光 染 色 剂 ， 灵 敏 度 与 银 染 相当 ， 但 还 没有 被 广泛 接受 使 用 。 最 近 ， 一 种 新 的 荧光 染色 剂 ， SYPROR Ruby Protein Gel Stain (Molecular Probes) 被 引入 蛋白 质 组 分 析 应 用 。SYPRO Ruby Protein Gel Stan 的 灵敏 度 有 所 提高 ， 有 更 广泛 的 动力 学 (线性 ) 范围 ， 用 于 质谱 分 析 的 胶 上 肽 段 的 回收 率 比 银 染 高 (Berggren et al., 2000; Lopez et al., 2000a; Pat- ton 2000，2000a)。 图 9.4 显示 的 例子 是 成 纤维 细胞 2-DE 胶 ， 上 样 量 相同 ， 分 别 用 银 染 和 SYPRO Ruby 染色 ， 用 图 示 的 方式 表现 出 在 相同 区 域内 象 素 强度 的 表面 轮廓 线 ， 表明 了 两 种 染色 方式 的 线性 差异 ， 显 示 出 荧光 染色 用 于 定量 比较 的 优势 。

4.4 自动 染色

不 管 选用 什么 染色 方法 ， 使 用 自动 化 的 染色 系统 将 会 减少 人 工 劳 动 ， 并 提高 实验 的 一 致 性 。 目 前 有 少量 商业 化 的 2-DE 胶 上 自动 染色 系统 可 供 选择 ， 如 APB, GSI. iF 高 通 量 重 昌 质 组 分 析 的 系统 应 该 能 够 按照 不 同 使 用 者 设 定 的 步骤， 同时 染 多 块 电 泳 胶 。

5. 图 像 分 析

图 像 分 析 或 许 是 高 通 量 蛋 日 质 组 分 析 程 序 中 作 重 要 的 元 素 了 了 ， 因 为 它 决定 了 从 2-DE 胶 的 谱 图 数据 库 中 提取 的 数据 的 质量 ， 并 指导 着 疾病 特异 蛋白 标志 物 搜 寻 的 路 径 (Wirth and Romano, 1995; 参考 第 六 章 )。 在 蛋白 质 组 学 开发 路 径 中 ， 图 像 分 析 似乎 越 来 越 成 为 了 重要 的 瓶颈 步骤 ( 见 Lopez，2000 中 表 1)。 第 一 步 是 用 数字 的 形式 获取 凝 胶 图 像 。 市 场 上 有 许多 可 用 于 获取 凝 胶 图 像 的 高 分 辨 CCD 照相 系统 (Perkin Elmer, Fuji, APB, BioRad, Boehringer Mannheim), CCD 照相 系统 的 优点 是 方便 ， 灵 活 ， 与 包 括 荧 光 染 色 在 内 的 许多 染色 步骤 相 适 用 (Patton，2000，2000a)。 激 光 扫 描 仪 同样 能 成 功用 于 从 白光 可 见 染 色 (white light visible stains) 的 凝 胶 中 获取 图 像 。 这 方面 发 表 了 许 多 综述 (Patton, 1995, 2000).

在 UNIX 基础 上 的 软件 通常 更 适用 ， 因 为 2-DE 胶 的 模式 分 析 是 计算 性 很 强 的 工 作 。 软 件 必 须 能 够 分 析 复 杂 的 包含 1300 一 10 000 个 蛋白 质 斑点 的 凝 胶 ， 同 时 也 能 够 处 理 包 含 几 百 凝 胶 数据 的 数据 库 。 强 大 的 数据 库 碍 询 系统 应 该 能 够 筛选 出 已 有 斑点 的 信 上 ， 已 匹配 斑点 的 定量 比 、 已 整合 的 斑点 强度 、 分 子 质 量 、 等 电 点 、 面 积 以 及 用 户 限定 的 斑点 或 图 像 的 特性 。UNIX 平台 的 多 线程 (multi-threading) 功能 使 其 能 够 迅速 处 理 复杂 的 、 多 水 平 的 查询 和 非常 大 的 凝 胶 数据 库 。 在 对 每 一 个 新 加 入 数据 库 的 凝 胶 谱 图 之 间 判 定 差 异 点 的 配 比 编辑 处 理 中 加 入 决定 点 (decision point), 是 可 以 提高 分 析 效 率 和 速度 的 一 个 策略 (图 9.53)。 有 许多 商业 化 的 高 级 的 2-DE 凝 胶 图 像 分 析 软 件 包 ， 例 如 ， Imagemaster, APB; Advanced 2-D Software, Phoretix; MELANIE [I], Swiss Institute of Bioinformatics, GenBio; PDQUEST, BioRad; HT Investigator, GSI. AiR at tT KEYS 的 一 个 特性 是 与 完整 蛋白 质 组 系统 中 其 他 部 件 整合 ， 精 确切 下 并 处 理 指 定 的 和 蛋白质 斑 点

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PILE MR: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 161:

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图 9.5 Investigator 2-D 分 析 软 件 (GSI) 配 比 分 辩 率 选 件 图 示 此 选 件 可 以 提高 效率 ， 也 即 提高 了 ( 凝 胶 ) 配 比 编辑 的 速度 ， 这 是 2-DE 凝 胶 图 像 分 析 的 一 个 重要 瓶颈 。

6. 自动 化 机 器 人 6.1 斑点 切取

一 且 图 像 分 析 鉴 别 出 了 2-DE 胶 上 有 潜在 研究 价值 的 蛋白 质 斑点 ， 那 他 们 必须 被 鉴 定 。 通 常 ， 斑 点 从 凝 胶 上 被 切 下 ， 并 进行 腕 上 和 蛋白 质 酶 切 (如 用 胰 和 蛋白 酶 )。 很 明显 ， 这 一 过 程 是 非常 费事 的 ， 如 果 完 全 由 手工 处 理 大 量 样品 ， 则 非常 有 可 能 从 皮肤 上 污染 角 蛋白 。 现 在 已 经 开发 出 了 多 种 能 从 2-DE 胶 上 自动 切 点 的 机 器 人 ， 并 且 已 经 商品 化 (BioRad; APB; GSI; Proteome Systems)。 有 些 公司 正 在 开发 多 项 合 一 (all-in-one) 的 平 台 ， 将 斑点 切取 ， 酶 切 和 MALDI-TOF R#%4 A—({# (Proteome Systems) 。 一 个 完全 自动 化 的 斑点 切取 系统 要 包括 一 个 CCD 照相 机 ， 用 于 从 2-DE 胶 上 检测 和 切取 斑点 。 切 点 机 吉 人 应 该 与 2-DE 分 析 软 件 整合 ， 以 指导 其 从 2-DE 胶 上 切取 目标 斑点 或 全 部 斑点 。 机 器 人 应 该 有 最 大 程度 的 灵活 性 ， 能 够 适用 于 银 染 ， 考 马 斯 蓝 染 色 或 荧光 染色 的 胶 。 目 前 最 高 通 量 的 系统 大 约 每 小 时 可 以 切 下 200 个 斑点 。 应 该 使 用 没有 反应 活性 的 塑料 或 不 锈 钢 的 采集 头 来 切取 斑点 ， 并 将 切 下 的 斑点 放 入 微 升 板 内 传送 到 酶 切 机 器 人 处 〈 见 下 文 )， 图 9.6 显示 的 是 自动 化 斑点 切取 机 器 人 切取 的 2-DE 凝 胶 分 离 的 血浆 蛋白 斑点 。

- 162 - 蛋白 质 组 学

(a) (b)

图 9.6 用 Flexys 斑点 切取 机 器 人 (GSI) 处 理 前 后 的 银 染 凝 胶 放 大 图 (a) 处 理 前 的 凝 胶 ; (b) 斑点 切 下 之 后 的 凝 胶 。Flexys 机 器 人 从 2-D 分 析 软 件 产生 的 报告 中 选择 要 切 斑点 的 位 置 。 斑 点 切取 使 用 2mm 的 塑料 收集 头 。 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton, 1997, 不 同 之 处 在 于 使 用 了 BioImage 2-DE 分 析 软 件 6.2 I (GSI).

6.2 斑点 酶 切 和 肽 提取

蛋白 斑点 从 2-DE 凝 胶 上 切 下 来 后 ， 用 蛋白 酶 水 解 (通常 用 胰 蛋 白 酶 )， 产 生 的 肽 混合 物 从 凝 胶 中 提取 出 来 。 同 样 ， 对 这 一 过 程 也 进行 了 自动 化 处 理 的 努力 。 一 个 完全 自 动 化 的 酶 切 机 器 人 应 该 自动 进行 从 酶 切 到 肽 提取 过 程 中 的 所 有 步骤 ， 使 用 高 通 量 的 胶 上 蛋白 胰 和 蛋白 酶 酶 切 ， 最 多 需要 8h。 所 有 样品 的 清洗 和 提取 步骤 都 应 该 在 微 升 板 中 自动 进行 ， 以 易于 处 理 并 减少 样品 的 交叉 污染 。 并 且 全 过 程 结 束 后 ， 提 取 的 肽 段 应 该 很 容易 传送 到 下 一 步 的 MALDI-TOF 自动 点 靶 机 器 人 处 ， 或 传送 到 串联 质谱 仪 的 自动 进 样 器 上 。 如 果 能 用 一 个 PC 网 络 远程 控制 多 个 酶 切 机 器 人 ， 或 许 能 够 实现 超 高 通 量 。 用 户 应 该 能 够 按照 自己 的 要 求 制定 酶 切 步 又 ， 并 在 开始 操作 前 将 其 下 载 到 每 一 台 仪器 。

6.3 肽 脱盐 、 纯 化 ， 在 MALDI# ERE

肽 段 从 凝 胶 中 提取 出 来 后 ， 必 须 除 去 盐 和 去 污 剂 这 样 的 污染 物 ， 在 进行 质谱 分 析 前 ， 肽 还 要 被 浓缩 。 如 果 用 MALDI-TOF-MS 分 析 肽 段 ， 则 需 与 基质 混合 (通常 用 CCA) 后 在 MALDI 靶 上 点 样 。 有 多 种 商业 化 的 机 器 人 可 以 完成 这 一 过 程 中 的 部 分 或 全 部 任务 (PE Biosystems; GSI; BioRad; Tecan; Proteome Systems)， 其 中 一 些 机 器 人 平台 可 以 使 用 装 有 芯 水 性 树脂 填料 的 ZipTip (Millipore) 来 纯化 肽 段 (Courchesne and Pat- terson, 1997; Jensen et wz .，1999)。 很 重要 的 一 点 是 机 器 人 要 将 0.$ 一 1nwl 或 更 少 体积 的 样品 排列 精确 地 点 在 MALDI 靶 上 ， 而 且 此 机 器 人 平台 还 要 能 与 大 多 数 制造 商 生 产 的 MALDI-TOF 样品 靶 相 适用 。 能 通过 PC 网 络 远程 控制 MALDI-TOF 机 器 人 同样 是 一 个 令 人 满意 的 特性 。 图 9.7 显示 的 是 用 上 述 处 理 达 到 的 从 2-DE 胶 上 切 下 的 斑点 的 肽 混合 物质 谱 图 ， 通 过 检索 SWISS PROT 数据 库 ， 此 斑点 被 鉴定 为 50S 核糖 体重 日 L9。

SLE MM. 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 - 163 -

DE RP PRO Serial# 2032 Method: ROE2001 Laser : 2480

Genomic Solutions, Inc. Mode: Ret lector Bean Ateeges Accelerating Vonage: 20000 Pressure 3.41¢-07 Grid Vottage: 74.500 % Low Mass Gate’ 600.0

10/2) masses matched Protein Molecular weighVpI 15769.1 / 6.17 Species ECOLI

Swiss Prot Accession No. 50S RIBOSOMAL PROTEIN L9 Protein name

1025.53

Mass submitted Mass matched Delta ppm Peptide sequence

768.4524 768.4732 -27.0639 (R)LPNGVLR(T)

842.5099 842.4987 13.2179 (K)VIVNVVAE(-)

850.4801

850.4787 1.6847 (R)NFLVPQGK(A) (K)NIEFFEAR(R)

(K)LAEVLAAANAR(A)

1025.5359 1025.5056 29.5266

1098.6737 1098.6271 42.3871

1153,6581 1153.6006 49.8584 (K)NIEFFEARR(A)

1239.7173 58.8485

1239.7903 (K)SEVRLPNGVLR(T)

1407.8283

1407.7232 74.6470 (K)AGDEGKLFGSIGTR(D)

Mass (m/z)

图 9.7 从 2-DE 胶 上 切 下 斑点 的 胶 上 酶 切 肽 质谱 图 斑点 用 ProGest 及 proMS MALDI 机 器 人 (GSI) 酶 切 处 理 。 蛋 白质 大 约 1pmol， 考 马 斯 蓝 染 色 。 质 谱 图 由 Voyager DE-RP Pro MALDI-TOF 质谱 仪 (PE BioSystems) 分 析 ( 见 Parker et al., 1998). FA Protein prospector 程序 在 万 维 网 上 检索 SWISS PROT SUE (http: //prospector.ucsf.edu)， 插 图 显示 的 是 质量 精 确 度 及 每 一 个 匹配 肽 段 的 序列 ， 也 显示 了 蛋白 鉴定 的 可 能 结果 。 和 蛋白 凝 胶 分 离 和 分 析 条 件 见 Lopez and Patton，1999， 不 同 之 处 在 于 使 用 了 Biolmage 2-D 分 析 软 件 6.2 MK (GSI).

7. 质谱 的 接口 策略 ，

目前 有 两 种 将 质谱 整合 入 蛋白 质 组 研究 程序 的 方法 。 为 了 鉴定 那些 在 各 种 基因 组 和 蛋白 质 组 数据 库 中 不 存在 的 和 蛋白质 ， 必 须要 确定 其 氨基 酸 序列 。 以 往 是 用 蛋白 质 序列 仪 通过 Edman 化 学 降解 方法 来 实现 的 。 这 一 步骤 耗 时 长 ， 且 需要 相当 大 量 的 蛋白 质 (Tempst et wz .，1999)。 最 近 多 数 研 究 者 已 经 采用 四 极 杆 或 电 喷 雾 串联 质谱 仪 (Micro- mass, SxiEX/Perkin Elmer, Finnigan, Bruker) 来 确定 单个 肽 段 的 氨基 酸 序 列 ， 并 用 这 些 短 的 序列 标签 在 公共 或 私营 EST 库 和 序列 数据 库 中 检索 (Yate et al., 1993, 1999). 这 些 测序 技术 很 准确 ， 但 是 仍然 需要 相对 大 量 的 样品 〈picomole)， 并 且 速 度 慢 ， 限 制 了 他 的 高 通 量 。 为 了 高 通 量 鉴定 2-DE 胶 上 的 蛋白 质 ， 用 MALDI-TOF 质谱 仪 测 肽 质量 指 纹 谱 是 更 适合 的 技术 (Henzel et al., 1993; James et al., 1993; Pappin et al., 1993). 4G MALDI-TOF 不 能 定量 ， 但 它 是 一 个 非常 灵敏 ， 具 高 分 辨 力 的 技术 ， 灵 敏 度 达 到 fmol 一 amol。 同 时 也 非常 适合 于 自动 化 和 高 通 量 操 作 。 另 外 ， 因 为 许多 物种 的 基因 组 测 序 正 以 惊人 的 速度 在 进行 ， 所 以 在 万 维 网 上 的 公共 数据 库 中 有 丰富 的 序列 数据 可 用 于 质 HPT (mass profiling) 检索 (Lopez，1998，1999a)。 这 些 技术 在 有 效 的 ， 自 动 化 系统 控制 下 ， 可 以 每 天 迅速 鉴定 几 十 到 几 百 个 蛋白 质 斑 点 。 在 过 去 几 年 中 ， 许 多 厂家 已 经 制 造 出 了 精密 的 台式 MALDI-TOF 仪器 ， 如 PE Biosystems, Bruker, Ciphergen, Micro-

Te

- 164 - 和 蛋白质 组 学

mass, Kratos.

8. HlarA wer, AR ia PPA fa STE Z | AY BER

用 上 面 几 段 所 述 的 一 整套 系统 处 理 大量 的 样品 将 会 产生 大 量 的 数据 ， 这 对 样品 的 追 踪 是 一 个 挑战 。 因 此 ， 自 动 化 蛋白 质 组 分 析 程 序 中 最 重要 的 是 对 软件 的 整合 ， 在 分 析 过 程 中 各 种 仪器 使 用 的 软件 及 样品 信息 和 数据 管理 所 用 软件 的 整合 。 开 发 满足 这 一 需求 的 生物 信息 学 系统 是 高 通 量 蛋 白质 组 研究 计划 首先 要 考虑 的 问题 。 一 个 生物 信息 学 解决 方 案 应 该 建立 在 相关 数据 库 的 基础 上 ， 以 进行 各 系统 部 件 间 样品 追踪 和 信息 数据 的 交换 。 样品 追踪 应 该 使 用 条 形 码 ， 淘 汰 人 工 追 踪 ， 因 为 人 工 追 踪 常 常会 引入 误差 。 中 央 数 据 库 是 核心 部 分 ， 应 该 能 使 其 他 系统 部 件 ， 如 图 像 分 析 软 件 、 斑 点 切取 机 器 人 、 酶 切 器 、 质 谱 仪 等 存储 和 读 取信 息 。 数 据 库 还 应 该 能 使 用 户 在 查询 和 报告 时 方便 地 读 取 数据 。 此 外 ， 样 品 制备 信息 和 2-DE 凝 胶 运 行 参数 都 应 该 有 记录 。 最 后 ， 从 质谱 仪 得 到 的 数据 信

妃 应 该 再 链接 回 到 凝 胶 图 像 ， 这 样 ， 只 要 鼠标 一 点 击 ， 就 能 得 到 每 一 个 斑点 的 制备 、 处 理 及 鉴定 数据 。 网 络 浏览 喜 应 该 是 这 种 类 型 的 生物 信息 学 软件 包 理 想 的 使 用 界面 。 目 前 有 许多 公司 正在 开发 用 于 蛋白质 组 分 析 的 生物 信息 学 软件 包 。

9. 4K

要 解释 复杂 的 生物 学 系统 需要 理解 其 表达 的 蛋白 质 及 其 基因 组 结构 图 。 蛋 和 白质 组 分

析 试 图 获取 任 一 时 刻 机 体 或 组 织 的 蛋白 表达 谱 。 对 蛋白 表达 谱 的 比较 能 够 提供 一 些 与 鉴

定 潜 在 的 药物 或 诊断 试剂 相关 的 特殊 信息 。 对 蛋白 质 组 分 析 各 种 步骤 进行 自动 化 及 整合

对 提高 效率 并 进而 促进 靶 标 鉴定 非常 有 必要 ， 高 通 量 蛋 白质 组 分 析 策 略 中 瓶颈 问题 的 解

决 正 在 使 药物 和 诊断 标志 物 开发 的 途径 更 便利 。 未 来 蛋白 质 组 学 的 挑战 将 是 基因 组 学 和

小 分 子 代谢 信息 的 整合 ， 这 种 整合 产生 的 最 终结 果 将 对 细胞 代谢 过 程 有 更 深入 和 广泛 的

| 理解 。 显 而 易 见 ， 蛋 白质 组 学 的 出 现 已 经 鼓励 了 许多 生物 学 家 的 思想 跳出 了 基因 组 学 的 框框 。

(ERE GF Re KR) 参考 文献

Anderson, N.L. and Anderson, N.G. (1998) Proteome and proteomics: New technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis, 19: 1853-1861.

Berggren, K, Steinberg, T.H., Lauber, W.M. el a/. (1999) A luminescent ruthenium complex for ultrasensitive detection of proteins immobilized on membrane supports. Anal. Biochem. 276: 129-143.

Blackstock, W. and Weir, M. (1999) Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Trends in Biotech. 17: 121-127.

Carr, F. (1999) Proteins on chips. Presentation to IBC Conf., London, Feb. 17-19.

Courchesne, P.L. and Patterson, S.D. (1997) Manual microcolumn chromatography for sample clean-up prior to mass spectrometry. Biotechniques 22: 244-250.

Fischmann, J. (1999) Advantages of immobilized pH gradients. In: 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 173-174.

Gharahdaghi, F., Weinberg, C.R., Meagher, D.A., Imal, B.S. and Mische, S.M. (1999) Mass spectrometric identification of proteins from silver- stained polyacrylamide gel: a metho for the removal of silver ions to enhance sensitivity. Electrophoresis 20: 601-605.

PILE MRM: 自动 化 蛋白 质 组 分 析 的 完整 途径 “5 -

Gygi, S.P., Rochon, Y., Franza, R. and Aebersold, R. (1999) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol. Cell. Biol. 19: 1720-1730.

Harry, J.L., Wilkins, M.R., Herbert, B.R., Packer, N.H., Gooley, A.A. and Williams, K.L. (2000) Proteomics: Capacity versus utility. Electrophoresis 21: 1071-1081.

Henzel, W.J., Billeci, T.M., Stults, J.T., Wong, S.C., Grimley, C. and Watanabe, C. (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011-5015.

Hunt, D.F., Yates, J.R. IL Shabanowitz, J., Winston, S. and Hauer, C.R. (1986) Protein sequencing by tandem mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6233-8238.

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. and Gonnet, G. (1993) Protein identification by mass profile finger printing. Biochem. Biophys., Res. Commun. 195: 58-64.

Jensen, O.N., Wilm, M., Shevchenko, A. and Mann, M. (1999) Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels. In: 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 513-530.

Jonscher, K.R., Yates, I. and John R. (1997) The quadrupole ion trap mass spectrometer-a small solution to a big challenge. Anal. Biochem. 244: 1-15.

Klose, J. (1999) Genotypes and phenotypes. Electrophoresis 20: 643-652.

Klose, J. and Kobalz, U. (1995) Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16: 1034-1059.

Lopez, M.F. (1998) Proteomic databases: roadmaps for drug discovery. Am. Biotechnol. Lab. July.

Lopez, M.F. (1999a) Advantages of carrier ampholyte IEF. In: 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 109-110.

Lopez, M.F. (1999b) Proteome analysis I. Gene products are where the biological action 1s. J. Chromatogr. B. 722: 191-202.

Lopez, M.F., (2000) Better approaches to finding the needle in a haystack: Optimizing Proteome analysis through automation. Electrophoresis 21: 1082-1093.

Lopez, M.F. and Patton, W.F. (1997) Reproducibility of polypeptide spot positions in two- dimensional gels run using carrier ampholytes in the isoelectric focusing dimension. Electro- Phoresis 18: 338-343.

Lopez, M.F., Patton, W.F., Utterback, B.L., Chung-Welch, N., Barry, P., Skea, W.M. and Cambria, R.P. (1991) Effect of various detergents on protein migration in the second dimension of two-dimensional gels. Analytical Biochem. 199: 35-44.

Lopez, M.F., Kristal, B.S., Chernokalskaya, E., Lazarev, A., Shestopalov, A.I., Bogdanova, A. and Robinson, M. (2000a) High-throughput profiling of the mitochondrial proteome using affinity fractionation and automation. Electrophoresis (in press).

Lopez, M.F., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarey, A., Robinson, M. and Patton, W.F. (2000b) A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electro- phoresis (in press).

Lopez, M.F., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarey, A., Robinson, M. and Patton, W.F. (2000c) A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis (in press).

Mann, M., Hojrup, P. and Roepstorff, P. (1993) Use of mass specctrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. Biol Mass. Spectrom. 22: 338-345.

Merril, C. (1987) Detection of proteins separated by electrophoresis. In: Advances in Electro- phoresis, vol. I (eds. A. Chrambach, M. Dunn and B. Radola). VCH, Federal Republic of Germany, pp. 111-139.

Nokihara, K., Morita, N. and Kuriki, T. (1992) Applications of an automated apparatus for two- dimensional electrophoresis. Electrophoresis 13: 701-707.

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021. Orntoft, T.F. and Vestergaard, E.M. (1999) Clinical aspects of altered glycosylation of glycopro-

teins in cancer. Electrophoresis 20: 362-371. Packer, N.H. and Harrison, M.J. (1998) Glycobiology and proteomics: is mass spectrometry the

Rc tr en eee en eee ape Fasc

- 166 + 蛋白 质 组 学

holy grail? Electrophoresis 19: 1872-1882. Parker, K.C., Garrels, J.I., Hines, W., Butler, E.M., McKee, A.H.Z., Patterson, D. and Martin, S. (1998) Identification of yeast proteins from two-dimensional gels: Working out spot cross- contamination. Electrophoresis 19: 1920-1922. Pappin, D.J.C., Hojrup, P. and Bleasby, A.J. (1993) Rapid identification of proteins by peptide- mass fingerprinting. Curr. Biol. 3: 327-332. Patton, W.F. (1995) Biologist’s perspective on analytical imaging systems as applied to protein gel electrophoresis. J. Chromatogr. A. 698: 55-87. Patton, W.F. (2000) A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two dimensional gel electrophoresis and proteomics. Biotechniques 28: 944-957. Patton, W.F. (2000a) Making blind robots ‘see’; the synergy between fluorescent dyes and imaging devices in automated proteomics. Electrophoresis 21: 1123-1144. Patton, W.F., Pluskal, M.G., Skea, W.M., Buecker, J.L., Lopez, M.F., Zimmermann, R., Belanger, L.M. and Hatch, P.D. (1990) Development of a dedicated two-dimensional gel electrophoresis system that provides optimal pattern reproducibility and polypeptide resolution. Biotechniques 8: 518-524. Patton, W.F., Lopez, M.F., Barry, P. and Skea, W.M. (1991a) A mechanically strong matrix for protein electrophoresis with enhanced silver staining properties. Biotechniques 12:580-S85. Patton, W.F., Chung-Welch, N., Lopez, M.F., Cambria, R.P., Utterback, B.L. and Skea, W.M. (1991b) Tris-tricine and tris-borate buffer systems provide better estimates of human meso- thelial cell intermediate filament protein molecular weights than the standard tris-glycine system. Anal. Biochem. 197: 24-29. Patton, W.F., Lim, M.J. and Shepro, D. (1999) Protein detection: using reversible metal chelate stains. In: 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 331-339. Quadroni, M. and James, P. (1999) Proteomics and automation. Electrophoresis 20: 664-667. Ramsby, M.L. and Makowski, G.S. (1999) Differential detergent fractionation of eukaryotic cells: analysis by two-dimensional gel electrophoresis. In: 2-D Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 53-66. Scheler, C. (1998) Peptide mass fingerprint sequence coverage from differently stained proteins on two-dimensional electrophoresis patterns by matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS). Electrophoresis 19: 918-927. Skipp, P. (1999) Proteome analysis without gels: current status of capilllary isoelectric focusing- electrospray ionization (CIEF-ESI)-MS. Biochemical Soc. Trans. 27: 68. Tempst, P., Link, A.J., Riviere, L.R., Fleming, M. and Elicone, C. (1990) Internal sequence analysis of proteins separated on polyacrylamide gels at the sub-microgram level: improved methods, applications and gene cloning strategies. Electrophoresis 11: 537-553. Walsh, B.J., Molloy, M.P. and Williams, K.L. (1998) The Australian proteome analysis facility (APAF): assembling large scale proteomics through integration and automation. Electro- . phoresis 19: 1883-1890. Wasinger, V.C., Cordwell, S.J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J.X., Gooley, A.A., Wilkins, M.R., Duncan, M.W., Harris, R., Williams, K.L. and Humphery-Smith, I. (1995) Progress with gene-product " mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis 16: 1090-1094. - Wirth, P. and Romano, A. (1995) Staining methods in gel electrophoresis, including the use of ) multiple detection methods. J. Chromatogr. A. 698: 123-143. | Yates, J.R. III，Carmack，E.，Hays，L.，Link，A.J. and Eng, J.K. (1999) Automated protein | identification using microcolumn liquid chromatography-tandem mass spectrometry. In: 2-D . Proteome Analysis Protocols (ed. A.J. Link). Humana Press, Totowa, NJ, pp. 553-558. Yates, J.R. III, Speicher, S., Griffin, P.R. and Hunkapiller, T. (1993) Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214: 397-408.

第 十 章 ”和 蛋白质 表达 分 析 新 方法

Rosalind E. Jenkins and Stephen R. Pennington 1. 引言

基因 组 测序 方法 已 取得 了 巨大 进步 , 而 且 这 些 新 方法 对 全 世界 研究 者 完全 开放 (http://www.tigr.org/tdb/ 和 http://www.ornl.gow/ TechResources/Human_Genome/ home.html) 。 一 个 完整 的 基因 组 序列 对 人 们 了 解 这 种 生物 体 的 生命 过 程 提供 了 一 个 很 好 的 机 会 。 基 因 组 测序 方法 还 衍生 出 一 些 新 的 方法 和 技术 ， 如 对 表达 mRNA 的 分 析 方 法 (Chee et al., 1996; Eisen et al., 1998; Gerhold et al., 1999) 和 用 双 杂 交 方 法 来 综合 分 析 蛋 白质 间 的 相互 作用 。 运 用 这 些 方法 人 们 获得 了 海量 的 不 同 生物 体 的 信息 ， 包 括 酵 母 (Dujon，1996; Goffeau et al., 1996; Uetz et al., 2000), 2 (Chalfie, 1998; C.elegans consortium, 1998; Plasterk, 1999) 和 人 类 (Chee et al., 1996). HRI, 于 微 陈列 技术 的 发 展 ， 更 进一步 加 快 了 人 们 获得 基因 序列 和 基因 差异 表达 分 析 的 步伐 (Bowtell，1999)。 这 些 方法 的 综合 运用 使 人 们 得 到 了 许多 功能 基因 组 学 的 信息 ， 并 且 正在 把 这 些 信息 转化 为 对 生命 过 程 的 研究 (Alizadeh et al., 2000; Alon et al., 1999; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999; Pollack et al., 1999; Wang et al., 1999). 然而 ， 随 着 这 些 技术 的 广泛 应 用 ， 它 们 逐渐 变 为 一 种 常规 技术 。 现 在 人 们 已 逐渐 认识 到 上 述 这 些 技术 将 成 为 对 基因 或 mRNA 产物 一 一 和 蛋白质 直接 分 析 的 一 种 补充 手段 。 最 终 ， 对 基因 组 表达 产物 蛋白 质量 的 分 析 、 细 胞 定位 、 空 间 结 构 分 析 将 决定 一 个 细胞 或 生物 体 活性 (Dove, 1999; Parekh，1999; Pennington et al., 1997; Wilkins et al., 1995). 然而 ， 蛋 白质 从 本 质 上 比 其 相对 应 的 mRNA BK DNA 序列 复杂 得 多 。 因 此 ， 在 基因 组 水 平分 析 蛋 白质 方法 落后 于 飞速 发 展 的 核酸 的 分 析 方 法 ， 这 不 足 为 怪 。

2. 功能 蛋 日 质 组 研究 范围

功能 蛋白 质 组 学 包含 有 几 个 重要 却 又 相互 补充 的 方面 。 截 止 到 现在 ， 对 蛋白 质 组 研 究 的 注意 力主 要 集中 于 试图 分 析 整 个 蛋白 质 表 达 变 化 特别 是 在 一 些 特殊 条 件 下 蛋白 质 组 表达 变化 ， 如 在 疾病 状态 下 ， 单 个 基因 疝 除 后 、 药 物 治 疗 或 在 改变 细胞 外 界 环 境 的 状况 下 。 单 个 基因 表达 的 mRNA 水 平常 与 其 表达 的 蛋白 质 水 平 不 相关 。 因 此 ， 这 样 的 分 析 是 合理 的 。 然 而 ， 在 一 个 细胞 、 器 官 和 组 织 中 ， 单 个 蛋白 质 表 达 水 平 同样 也 不 反映 这 种 蛋白 质 生物 活性 ， 这 种 现象 也 是 普遍 存在 的 。 蛋 白质 活 性 是 一 个 复杂 的 综合 过 程 ， 它 涉 及 到 和 蛋白质 翻 译 后 修饰 、 在 组 织 、 细 胞 和 亚 细 胞 中 的 定位 以 及 它 与 别 的 蛋白 质 间 的 相互 作用 。 因 此 ， 分 析 蛋 白质 活性 必须 考虑 每 个 方面 并 把 所 得 各 部 分 的 数据 综合 起 来 。 当 然 ， 对 每 个 方面 现 有 各 种 方法 的 讨论 在 一 章 中 是 不 可 能 完成 的 。 因 此 在 本 章 我 们 讨论 以 下 几 个 方面 : 中 介绍 一 下 现行 通用 蛋白 质 表达 分 析 法 的 局 限 性 ; @ 介 绍 一 些 正 在 发 展 的 新 方法 ; 加 讨论 一 些 分 析 蛋 白质 表达 谱 的 新 方法 。 在 讨论 之 前 ， 我 们 有 必要 再 重 述 一

i ma a mR TE | Rc emg Be art BT Se

- 168 - 蛋白 质 组 学

下 ， 那 就 是 对 蛋白质 定位 〈 第 十 二 章 )、 蛋 白 结构 分 析 (Briinger, 1997; Cusack et al., 1998;Gerstein and Hegyi, 1998; Robson, 1999; Sali and Kuriyan, 1999; Swindells et al., 1998;Wery and Schevitz, 1997). & A Jt DH BE AY FHM (Bork et al., 1998; Marcotte et al., 199 1a, b; Pellegrini et al., 1999) #0 & AA VE ee eh AOR YS 很 大 的 进展 , 如 二 维 杂 交 法 (Utez et al . ,2000) 和 一 些 计 算 机 分 析 法 (Enright et al., 1999)。 另 外 , 还 包括 一 些 在 基因 组 范围 内 对 基因 功能 分 析 的 方法 (RossMacdonald et al., 1999 ) 。

3. 蛋白 质 组 分 析 : 基于 2-DE 的 战略

目前 ， 大 部 分 和 蛋白质 组 分 析 计 划 起 初 都 是 用 二 维 电 泳 分 离 蛋 白质 复合 物 (第 三 章 )。 这 包括 基于 等 电 点 对 和 蛋白质 混合 物 的 一 向 分 离 ， 紧 接着 依赖 于 蛋白 质 分 子 质量 进行 垂直 分 离 。 在 一 块 二 维 凝 胶 上 ， 将 有 近 10 000 个 蛋白 质点 ， 利 用 几 块 胶 ， 可 以 得 到 有 关 和 蛋 白质 不 同 表达 的 数据 。 值 得 指出 的 是 ， 一 个 单一 蛋白 质 可 以 在 二 维 胶 上 呈现 几 个 点 ， 这 种 多 样 性 至 少 代 表 该 蛋白 质 几 种 不 同 翻译 后 修饰 方式 。 一 段 时 间 以 来 ， 由 于 不 能 够 鉴定 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋白 质点 ， 这 大 大 限制 了 三 维 凝 胶 电泳 的 潜在 应 用 。 尽 管 如 此 ， 还 是 有 少数 研究 者 ， 如 著名 的 Celis 和 他 的 同事 ， 在 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋白 质点 的 鉴定 、 二 维 凝 胶 电泳 图 及 其 数据 库 的 制作 方面 取得 了 巨大 的 进展 (Celis et al., 1994, 1995), 但 是 这 些 只 是 个 别 的 例子 。 依 赖 于 质谱 的 蛋白 质 鉴 定 方法 (包括 从 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 蛋 白质 点 和 利用 其 他 方法 所 分 离 的 蛋白 质点 〈 图 10.1 和 第 五 章 )) 的 发 展 ， 使 得 以 二 维 凝 胶 电泳 作为 分 析 重 白质 表达 谱 的 工具 得 到 了 很 大 的 发 展 (Celis et al., 19985; Futcher et al.,1999;Li et al.,1999;Shevchenko et al.,1996).

应 用 于 蛋白 质 分 离 的 二 维 凝 胶 电 泳 技术

蛋白 质 检测

蛋白 质 鉴定 匹配 分 析 SH, DTH, WR, AERA, 序列 标签 从 头 测序 串联 质谱 ， 微 测序 二 维 凝 胶 电 泳 图 谱 和 数据 库

图 10.1 用 二 维 凝 胶 电泳 进行 蛋白 质 表 达 分 析 和 鉴定

二 维 凝 胶 电泳 作为 分 析 蛋 白质 谱 的 技术 平台 能 和 否 持续 发 展 下 去 ， 这 个 问题 一 直 在 争 论 之 中 。 二 维 凝 胶 电泳 技术 本 身 所 具有 的 缺点 和 局 限 性 ， 使 得 这 种 讨论 更 为 热烈 。 其 中 最 为 明显 的 缺点 如 图 10.2 所 示 。 即 使 在 最 先进 的 实验 室 ， 对 胶 的 控制 包括 单一 蛋白 质 点 在 空间 的 重复 性 和 所 染色 蛋白 质点 的 量 的 重复 性 ， 是 很 难 达 到 的 。 对 于 在 同一 个 实验 室 和 不 同 实验 室 之 间 的 凝 胶 所 分 离 的 点 的 一 致 性 ， 更 是 有 许多 争论 。 但 是 ， 具 有 一 定 的

第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法

经 验 上 且 仔 细 操 作 ， 能 够 取得 很 好 的 重复 性 ， 这 一 点 是 不 容 怀 疑 的 〈Corbett et al., 1994)。 然 而 ， 还 是 有 许多 人 在 评估 获得 好 的 二 维 凝 胶 电泳 重复 性 的 艰难 性 及 对 所 显示 单个 蛋白 质点 在 统计 学 上 有 明显 差异 所 需 二 维 凝 胶 的 数目 。 此 外 ， 目 前 通用 的 二 维 凝 胶 电泳 方法 在 其 二 维 凝 胶 电 泳 图 上 所 显示 大 多 是 那些 高 丰 度 和 中 等 丰 度 的 蛋白 质 (第 四 章 )。 这 儿 列 出 了 二 维 凝 胶 电 泳 所 有 的 局 限 性 ， 但 有 的 局 限 性 是 可 以 被 克服 的 ， 如 在 进 行 二 维 凝 胶 电泳 以 前 富 集 样品 可 以 检测 到 一 些 低 丰 度 蛋 白质 。 可 以 预测 ， 人 们 可 以 发 现 一 些 新 荧光 染料 来 检测 蛋白 质 。 最 感 兴趣 的 是 用 不 同 的 荧光 染料 分 别 标记 两 种 样品 ， 混 合 后 ， 进 行 二 维 凝 胶 电 泳 (Unlii er wy .，1997)。 根 据 单 一 蛋白 质 所 发 出 的 不 同 的 荧光 量 可 以 测 得 这 个 蛋白 质 在 两 种 样品 中 的 相对 丰 度 。 虽 然 这 种 方法 具有 许多 内 在 的 局 限 性 ， 但 是 它 有 一 个 很 重要 的 优点 就 是 它 克 服 了 “不 同 凝 胶 间 重 复 性 ”问题 。 应 用 于 蛋白 质 组 分 析 的 二 维 凝 胶 电泳 技术 平台 应 用 于 蛋白 质 组 分 析 的 二 维 凝 胶 电 泳 技术 平台 重复 性 灵敏 度

显示 范围

数目

对 照 “困难 ”蛋白 质 -难于 在 二 维 凝 胶 电泳 图 谱 显 示 的 蛋白 质 数据 分 析

需要 热 练 的 技术 ， 花 费 较 多 的 时 间 和 精力 难于 自动 化 图 10.2 ”作为 蛋白 质 表达 分 析 二 维 凝 胶 电泳 技术 局 限 性

尽管 有 许多 文献 报道 一 块 胶 上 能 够 显示 20 000~50 000 个 点 ， 但 是 一 块 胶 最 多 可 检 测 到 10 000 个 蛋白 质点 〈Klose，1999)。 这 是 由 于 许多 蛋白 质 在 二 维 凝 胶 电 泳 图 上 可 以 有 好 几 个 点 。 二 维 凝 胶 电泳 图 上 实际 含有 和 蛋白质 数目 少 于 所 显示 的 “和 蛋白 质点 ”的 数 目 。 值 得 注意 的 是 ， 每 块 胶 不 能 够 显示 样品 中 所 有 的 蛋白 质点 。 有 的 蛋白 质 ， 包 括 膜 蛋 白 ， 在 “正常 条 件 下 ”不 能 显示 在 凝 胶 电泳 图 谱 上 。 同 样 可 以 采取 多 种 办 法 克服 这 个 缺 ， 点 : 可 以 跑 多 块 窗 pH 范围 和 窜 分 子 质 量 范 围 的 凝 胶 ; 可 以 改变 变性 剂 的 浓度 提高 膜 蛋 白质 的 溶解 度 ; 可 以 采取 分 步 抽 提 的 方法 来 制备 样品 。 但 是 这 些 方法 都 需要 较 多 的 样品 量 。 对 一 些 样品 ， 包 括 人 类 活 组 织 ， 样 品 量 不 足以 用 来 做 多 次 电泳 。 因 此 ， 二 维 凝 胶 电 泳 更 适合 分 析 一 些 简 单 的 生物 体 ， 可 以 在 二 维 凝 胶 电 泳 合 适 的 范围 内 用 它 分 析 总 “蛋白 质 组 ”中 的 主要 部 分 。

二 维 凝 胶 电 泳 得 到 的 图 像 含 有 复杂 的 3-D 信息 ， 对 它 的 分 析 是 对 研究 人 员 一 种 巨大 的 挑战 〈 第 六 章 )。 目 前 对 二 维 凝 胶 电 泳 图 像 的 有 效 分 析 费 时 较 多 ， 因 此 需要 进一步 改 进 。 总 的 来 说 ， 对 一 个 运用 二 维 凝 胶 电泳 方法 的 研究 人 员 ， 二 维 凝 胶 电 泳 过 程 和 对 凝 胶 分 析 过 程 不 仅 需要 技术 ， 而 且 工 作 密度 较 大 ， 费 时 较 多 。 这 个 过 程 的 自动 化 能 克服 这 些 缺点 ， 因 此 将 成 为 这 个 领域 研究 者 所 需 解 决 的 首要 问题 。 目 前 ， 仅 仅 只 在 跑 胶 和 图 像 分

- 170 . 和 蛋白质 组 学

析 过 程 实现 了 部 分 自动 化 ， 这 还 远 和 还 不 够 。

完全 自动 化 包括 对 二 维 凝 胶 电 泳 图 像 分 析 、 蛋 白质 点 的 切割 和 用 质谱 鉴定 蛋白 质 的 过 程 ， 其 正在 发 展 过 程 中 。 几 家 商业 公司 正在 研制 或 对 已 有 的 技术 进行 改进 ， 包 括 凝 胶 分 析 软 件 包 、 用 机 械 臂 来 切割 蛋白 质点 和 一 些 可 用 于 自动 化 操作 的 质谱 仪 (包括 能 够 获 得 肽 指纹 图 谱 (PMF) 的 MALDI-TOF 和 可 进行 复杂 分 析 的 电 喷雾 (ESI) 串联 质 仪 (第 五 章 和 第 八 章 ))。 现 对 所 选择 二 维 凝 胶 电泳 点 质谱 分 析 数 据 收 集 能 力 (Traini et al., 1998) 和 对 和 蛋白质 库 序列 自动 化 搜索 的 能 力 都 已 得 到 提高 (Jensen et al., 1997; Nicola., 1998; 第 八 章 )。

4. 除 二 维 凝 胶 电泳 以 外 的 蛋 日 质 表 达 分 析 方 法

重 昌 质 组 分 析 对 我 们 了 解 生 物体 具有 很 大 的 潜在 影响 ， 这 是 加 快 发 展 一些 可 用 来 分 析 研 究 蛋 白质 表达 功能 新 技术 的 动力 。 这 些 新 技术 大 体 上 可 分 为 两 大 类 : 一 种 是 依赖 于 分 离 的 ， 像 二 维 凝 胶 电泳 一 样 ; 另 一 种 是 不 依赖 于 分 离 来 检测 蛋白 质 表 达 。

4.1 依赖 于 分 离 的 方法

在 这 里 描写 的 方法 都 需要 在 分 析 一 个 蛋白 质 混合 物 以 前 ， 对 它 进 行 不 同 程度 的 分 离 和 纯化 。 二 维 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白质 在 于 它 运 用 两 种 相互 独立 的 物理 化 学 特性 一 一 pI 和 M:， 来 进行 垂直 分 离 。 在 叙述 一 些 已 经 存在 的 别 的 利用 垂直 分 离 方 法 之 前 ， 先 讨论 两 种 依赖 于 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 方法 。 利 用 红外 MALDI-TOF-MS 来 替代 常用 的 紫外 MS, 其 已 被 应 用 于 对 样品 的 高 能 量 分 析 。 二 维 凝 胶 电泳 分 离 的 和 蛋白质 被 转移 到 .PVDF FRE 后 ， 泡 在 基质 溶液 中 ， 然 后 用 红外 MALDITOF-MS 进行 扫描 〈(Eckerskorn et al., 1997a) 。 另 一 个 方法 与 上 述 方法 极其 相似 ， 它 是 用 “分 子 扫描 ”的 办 法 直接 分 析 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 蛋白 质 (Bienvenut et al., 1999; Bin et al., 1999). FEIXX PREP, B 个 二 维 凝 胶 电泳 胶 被 电 转 印 到 PVDF 膜 上 ， 在 电 转 过 程 中 ， 用 蛋白酶 来 消化 蛋白 ， 然 后 用 MS 来 扫描 PVDF 膜 。 它 不 需要 对 和 蛋白质 染色 ， 分 析 凝 胶 电泳 图 像 和 对 单个 蛋白 点 进行 酶 解 反 应 。 但 是 它 要 求 质谱 仪 具 有 较 高 的 灵敏 度 和 分 析 能 力 。 这 个 方法 尚 处 于 孕育 阶段 ， 但 是 如 果 商 家 对 其 产业 化 (Buter，2000)， 将 能 使 其 得 到 飞速 发 展 。

一 步 分 离 法 ”由 于 电 喷 雾 质谱 能 够 分 析 蛋 白质 混合 物 ， 使 得 这 种 方法 具有 可 行 性 ， 并 引起 研究 人 员 很 大 兴趣 。Lamond 和 Mann (1997) 提出 了 这 种 想法 ， 即 对 蛋白 质 混 合 物 初 步 分 离 后 ， 对 蛋白 质 复 合 物 进行 快速 分 析 ， 并 已 取得 了 很 大 的 成 功 (Neubauer et al.,1998;Rappsilber et al. ,2000;Rigaut et al.,1999;Rout et al . ,2000; Wigge et al., 1998; Zachariae et al .,1998)。 在 这 种 方法 中 ， 利 用 1-D 纯化 得 到 一 些 蛋 白质 复合 体 ， 如 剪接 体 ， 然 后 对 相应 的 带 〈 可 能 含有 几 种 蛋白 ) 进行 酶 解 ， 用 质谱 分 析 。 对 这 类 蛋白 复 合 物 进 行 快速 和 详细 的 鉴定 。 已 证 明 这 种 方法 是 可 行 的 。 并 且 用 这 种 方法 已 获得 了 一 些 新 的 以 前 不 被 认识 的 成 分 。 对 一 些 少 数 蛋白 质 组 成 的 复合 物 ， 如 由 免疫 亲 和 方 法 得 到 的 复合 物 ， 也 可 以 用 这 种 方法 进行 分 析 。Ciphergen 公司 提出 了 一 种 新 蛋白 分 析 法 ， 运 用 特定 的 抗体 获取 目标 蛋白 ， 可 以 达到 fmol 级 (10 8 级)， 然 后 运用 表面 增强 激光 解吸 电离 质谱 来 检测 它们 的 分 子 质 量 (www.ciphergen.com)。 该 公司 还 推出 了 一 系列 蛋 自 质 “ 芯 片 ”， 其 实 就 是 在 MALDI 靶 上 涂 了 一 层 色谱 树脂 〈 如 阳离子 交换 树脂 )， 使 其 可

第 十 章 ”蛋白 质 表 达 分 析 新 方法 « Pts

以 用 于 蛋白 质 表达 谱 实验 。 该 方法 主要 过 程 包括 先 使 复杂 的 蛋白 质 混合 物 与 靶 结合 ， 然 后 在 不 同 的 条 件 下 清洗 ， 最 后 用 质谱 获得 剩余 蛋白 分 子 质量 ， 由 此 来 表征 蛋白 。 虽 然 这 种 方法 有 很 多 局 限 性 ， 但 是 已 可 以 得 到 感 兴趣 的 “ 必 片 ” 板 。

垂直 分 离 法 ”为 了 避免 使 用 二 维 凝 胶 电 泳 ， 现 在 正在 检测 一 些 新 的 方法 ， 综 合 运用 两 种 或 多 种 已 经 使 用 的 分 离 方 法 ， 使 其 能 够 达到 二 维 凝 胶 电 泳 的 分 离 能 力 与 通 量 。 由 于 液 相 色谱 与 毛细 管 电泳 易 实现 自动 化 ， 引 起 了 人 们 特殊 的 兴趣 ， 现 在 正在 实验 其 潜在 的 “高 通 量 ”能 力 。

Link 和 他 的 同事 用 二 维 色谱 的 方法 ， 对 酵母 核糖 体 中 蛋白 质 成 分 进行 了 研究 (Link et wz .，1999)。 先 用 蛋白 酶 消化 纯化 的 酵母 80S 核糖 体 ， 用 阳离子 交换 (SCX) 柱 进行 纯化 ， 采 用 12 步 分 步 洗涤 液 ， 再 进入 反 相 色谱 柱 中 进行 纯化 ， 最 后 对 抽 提 液 用 串联 质谱 进行 分 析 。 在 一 个 简单 的 循环 中 ， 所 预测 的 78 个 核糖 体 蛋 白 中 的 75 个 被 鉴定 出 来 了 。 令 人 感 兴 趣 的 是 ， 用 同样 的 方法 对 整个 酵母 细胞 抽 提 物 进行 分 析 时 ， 鉴 定 出 了 78 个 蛋白 中 的 71 个 。 运 用 一 种 新 的 毛细 管 柱 ， 对 用 胰 和 蛋白 酶 酶 解 的 蛋白 质 ， 这 种 方法 的 灵敏 度 可 达 10fmol 级 水 平 。

一 段 时 间 以 来 ， 高 效 液 相 色谱 (HPLC) 被 用 于 作为 分 离 蛋 白质 和 肽 的 一 种 方法 。 最 近 ， 由 于 使 用 毛细 管 柱 ， 这 种 方法 在 微量 化 和 自动 化 方面 得 到 了 改进 。 人 们 一 直 试图 把 反 相 毛细 管 HPLC 和 成 分 收集 结合 起 来 ， 然 后 直接 加 到 MALDI-TOF #8, Edman 测序 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 上 (Grimm and Grasser，1998)。 超 高 压 毛 细 管 液 相 色谱 可 以 使 HPLC 的 分 析 速 度 提 高 2~3 倍 ， 同 时 在 流量 相同 的 情况 下 ， 可 以 提高 被 鉴定 分 析 物 的 数目 (MacNair et al., 1999).

有 报道 对 上 面 所 提 到 的 红外 -MALDI-MS 49d FRET SF PE (Eckerskorn et al., 1997b)。 用 HPLC 分 离 蛋 白质 复合 物 ， 按 照 流出 时 间 ， 把 洗 液 直接 收集 到 PVDF RE Avy, PVDF 膜 放 在 基质 溶液 中 ， 然 后 取出 进行 红外 -MALDI-MS 扫描 。 有 报道 说 用 冰 作为 基质 ， 能 够 得 到 较 好 的 图 谱 。 这 为 运用 扫描 红外 -MALDIMS， 对 冰冻 组 织 进行 原 位 蛋 自分 析 开 辟 了 一 条 道路 (Berkenkamp et al., 1996).

Opiteck 等 人 (1998) 一 直 在 寻求 对 二 维 -HPLC 改进 并 且 已 经 研制 出 一 套 自动 化 程 度 很 高 的 二 维 -HPLC 方法 ， 其 分 离 原理 与 二 维 凝 胶 电泳 相似 。 在 他 们 的 方法 中 ， 先 根 据 和 蛋白 质 大 小 用 排 阻 色谱 分 离 蛋 白 ， 馏 分 自动 进入 反 相 液 相 色谱 ， 这 样 就 得 到 了 二 维 色 谱 图 。 分 析 物 被 转移 到 96 孔 板 上 ， 然 后 自动 加 到 MALDI-MS 靶 上 进行 鉴定 。 一 个 典型 的 分 离 过 程 可 以 得 到 576 个 组 分 ， 同 时 可 以 在 线 分 析 MS 结果 。 因 此 ， 在 这 种 分 析 过 程 中 ， 人 的 干预 是 很 少 的 。 利 用 这 种 方法 在 转基因 的 大 肠 杆 菌 裂 解 液 中 成 功 鉴定 出 两 种 基 因 产 物 ， 非 受 体 酷 胺 酸 激酶 和 8- 内 醋 胺 酶 src 同 源 结 构 域 (Opiteck et al .，1998)。 这 种 方法 有 许多 优点 ， 样 品 分 离 可 以 重复 多 次 、 加 样 过 程 、 分 离 过 程 和 馏分 收集 都 可 以 自动 化 ， 洗 涤 液 中 的 蛋白 可 以 直接 用 质谱 分 析 。 目 前 ， 这 种 方法 的 分 离 能 力 还 不 高 ， 还 有 一 段 很 长 的 路 要 走 。 但 是 ， 通 过 不 断 的 改进 和 电 喷 雾 串 联 质谱 分 辨 能 力 的 提高 ， 最 终 这 些 馏分 中 的 蛋白 可 能 被 逐步 鉴定 。

对 于 临床 蛋白 样品 的 检查 ， 毛 细 管 电泳 由 于 它 上 具有 快速 、 高 度 重 复 性 、 灵 敏 度 高 等 优点 ， 被 证 明 是 一 种 非常 有 效 的 方法 。 例 如 ， 它 已 被 应 用 于 诊断 腺 苷 基 琥 珀 酸 裂解 酶 (adenylosuccinase ) 缺乏 证 、 肾 病 综合 征 (nephrotic syndrome) 和 癌症 恶 病 质 (Choud-

ne

172: 蛋白 质 组 学

hary et al .，1999)。 运 用 CE 和 MALDI-TOF 质谱 在 癌症 亚 病 质 病 人 尿 样 中 ， 鉴 定 出 一 种 糖 重 白 ， 它 在 与 恶 病 质 相关 肌肉 蛋白 的 酶 解 中 起 重要 的 作用 。MS 的 灵敏 性 使 得 它 能 与 CE RA.

还 有 一 些 研究 人 员 运 用 二 维 液 相 电泳 结合 质谱 对 人 类 脑 脊 椎 液 中 低 拷 贝 蛋 白 进 行 了 研究 (Davidsson et wz .，1999)。 这 种 方法 需要 大 量 的 蛋白质 混 合 物 加 到 一 维 上 以 便于 在 流出 液 中 有 足够 的 低 拷 贝 蛋白 ， 可 用 作 MALDI 分 析 。 对 于 血清 和 脑 兰 椎 这 类 的 样 品 ， 由 于 它们 中 含有 大 量 的 血清 蛋白 和 免疫 球 重 白 ， 在 许多 分 析 中 ， 可 能 屏蔽 一 些 别 的 重要 蛋 白 的 出 现 。 所 以 ， 检 测 低 拷贝 蛋白 时 ， 更 要 加 大 样品 量 。

由 于 “芯片 ”的 使 用 ， 毛 细 管 电泳 在 微小 化 方面 正在 取得 重大 的 进展 (Becker et al., 1998; Kopp et al., 1997; Yao et al., 1999). 4 Yao 等 人 (1999) 通过 运用 一 个 te 4~S5em, RA 40nm IRB “OH”, SA BASRA, Mee 们 在 214nm 光 吸 收 值 或 激光 激发 荧光 量 (对 于 能 衍生 出 荧光 的 样品 )。 并 预言 微 阵 列 和 芯片 形式 的 二 维 凝 胶 电泳 不 久 将 变 为 可 能 (Yao et al., 1999).

在 将 这 种 微型 分 离 与 基于 质谱 和 白 质 鉴定 连接 在 一 起 时 ， 一 个 主要 的 障碍 是 怎样 才 能 将 分 离 的 蛋白 充分 转移 进入 质谱 。 低 浓度 少量 蛋白质 由 于 被 吸收 到 表面 上 而 易于 丢 失 。 如 果 人 工 过 多 干预 又 易 被 污染 。 由 于 这 些 原因 人 们 设计 了 一 种 装置 ， 通 过 它 可 以 直 接 将 微量 制备 液 相 系 统 与 ESI-MS 直接 联系 起 来 。 以 减少 液体 向 表面 吸附 过 程 中 损失 及 人 对 少量 样品 的 控制 (Figcys and Aebersold, 1999). 同样 还 设计 出 一 种 装置 ， 它 可 以 在 样品 进入 ESI-MS 以 前 ， 通 过 C18 反 相 柱头 ， 对 样品 进行 富 集 ， 这 种 装置 可 把 灵敏 度 提 高 到 fmol 级 水 平 (Figcys and Aebersold, 1999).

4.2 不 依赖 分 离 的 方法 :“ 蛋 白质 芯片 ”

| 尽管 在 微型 化 和 运用 多 种 方法 综合 起 来 鉴定 蛋白 方面 取得 了 进展 ， 但 是 上 面 描述 的 | 依靠 分 离 的 技术 相对 来 说 仍 需要 较 多 的 蛋白 质 样品 。 并 在 一 系列 过 程 中 需要 多 步 操作 。 | 运用 “分 子 识 别 ” 是 一 种 很 好 的 方法 ， 它 不 仅 能 用 于 这 类 分 析 ， 并 且 能 减少 分 析 时 所 需 样品 的 量 。 其 原理 是 用 分 子 间 特定 的 识别 机 制 ， 来 分 离 、 检 测 和 确定 目标 分 子 。 利用 分 子 识别 最 成 功 的 例子 是 “DNA 芯片 ”技术 的 使 用 ， 它 利用 固定 在 靶 上 的 碱 基 与 荧光 标记 核酸 探 针 上 碱 基 间 相互 作用 来 快速 分 析 成 千 上 万 的 不 同 序 列 〈Bowtell， 1999; Cheung et al., 1999). cDNA 或 合成 的 寡 核 苷 酸 序列 紧密 排列 在 玻璃 芯片 上 。 个 3.6cm2 芯片 可 以 容纳 10 000 个 基因 (Gerhold et wg .，1999)。 运 用 不 同 的 颜色 来 标记 cDNA 探 针 ， 同 时 与 相应 的 必 片 杂交 ， 可 以 比较 健康 组 织 与 疾病 组 织 间 的 RNA 表达 谱 ， 现在 这 种 方法 已 经 应 用 于 诸多 方面 的 研究 (Alizadeh et al., 2000; Alon et al., 1999; DeRisi et al., 1996; Perou et al., 1999; Pollack et al., 1999; Wang et al., 1999). 依赖 于 分 子 识别 的 “蛋白 质 芯 片 ” 类 似 于 “DNA 芯片 ”， 将 在 蛋白 质 表 达 谱 方面 产 生 重 大 的 影响 。 所 以 ， 人 们 在 发 展 “ 和 蛋白 质 芯 片 ”方面 有 很 大 的 兴趣 。“ 和 蛋白 质 世 片 ” 技术 有 两 个 关键 因素 : 个 空间 上 固定 能 辨别 单一 蛋白 成 分 的 分 子 ; @ 具 有 检测 混合 物 中 单个 蛋白 与 它们 相对 应 的 识别 分 子 间 相互 作用 的 方法 。 像 人 们 所 预料 的 那样 ， 有 几 个 实 验 室 已 经 开始 发 展 类 似 这 样 的 方法 。 然 而 ， 直 接 效仿 “DNA 芯片 ”的 方法 有 许多 困难 。 例如 ， 用 不 同 的 荧光 ， 像 标记 cDNA 那样 来 标记 蛋白 质 有 好 多 内 在 的 困难 。 首 先 ， 莹 光

第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 mes

染料 与 蛋白 质 的 结合 过 程 没 有 像 核 酸 分 子 结合 的 那样 易于 控制 ， 不 同 的 荧光 染料 与 不 同 样品 中 同一 蛋白 结合 效率 的 微小 差别 将 导致 定量 比较 的 失败 。 用 单一 位 点 标记 特异 性 位 点 虽然 能 克服 上 述 缺 点 ， 但 是 将 导致 灵敏 度 的 降低 。 而 且 ， 与 核酸 结合 可 以 预测 杂交 后 荧光 染料 的 变化 ， 可 是 却 不 能 预测 与 蛋白 质 结合 后 荧光 染料 的 变化 。 这 样 ， 固 定 的 分 子 识别 目标 蛋白 的 能 力 可 能 受到 结合 的 荧光 集团 的 影响 ， 而 这 种 影响 很 难 预测 或 很 难 控 制 ， 这 意味 着 固定 在 空间 特定 位 置 用 以 识别 单一 蛋白 的 蛋白 质 忌 片 序 列 需要 新 的 方法 来 产生 信号 分 子 ， 通 过 它 来 检测 与 目标 分 子 蛋白 间 的 相互 作用 。 下 面 我 们 列 出 一 些 正在 发 展 的 替代 方法 ， 这 些 方法 有 的 已 经 得 到 了 很 好 的 发 展 ， 但 是 在 蛋白 质 表 达 分 析 应 用 方面 还 不 能 与 “蛋白 质 芯片 ”相提并论 〈 例 如 ， 同 时 分 析 成 千 上 万 种 蛋白 )， 仅 可 以 用 于 一 些 中 等 的 蛋白 质 表 达 分 析 ， 其 他 的 方法 处 于 原始 阶段 ， 仅 可 潜在 应 用 于 “和 蛋 日 质 芯 片 ” WE.

蛋白 质 识 别 分 子 ” 最 明显 的 能 够 有 效 作为 识别 蛋白 的 分 子 是 抗体 ， 这 种 分 子 识别 方 式 已 被 广泛 应 用 于 许多 方面 。 已 使 用 的 抗体 有 单 抗 和 多 抗 。 如 果 用 抗体 作 “ 和 蛋白 质心 片 ” 必 须 遵 循 以 下 几 个 重要 原则 : 首先 ， 必 须 有 支持 获得 和 选择 单个 蛋白 的 方法 ， 这 个 蛋白 甚至 是 经 翻译 后 修饰 的 。 这 个 抗体 必须 是 高 度 特异 的 ， 这 意味 着 它们 能 够 在 一 个 复 杂 混 合 物 中 识别 和 区 分 单个 蛋白 。 其 次 ， 混 合 物 是 单个 蛋白 与 它们 的 抗体 结合 必须 在 相 似 的 条 件 下 ， 后 者 在 一 定 程 度 上 可 以 通过 仔细 控制 抗体 产生 过 程 中 筛选 步骤 (screening step) 来 达到 。 很 明显 ， 现 行 的 这 套 产生 抗体 的 方法 不 适用 于 基因 组 范围 “和 蛋白 质心 片 ”技术 的 发 展 ， 然 而 ， 它 适用 于 中 等 程度 蛋白 质 表 达 分 析 。 例 如 ， 诊 断 蛋白 质心 片 能 够 用 于 检测 几 十 种 蛋白 表达 和 翻译 后 修饰 ， 这 是 对 现行 诊断 技术 的 一 个 重大 改进 。

嗜 菌 体 显示 抗体 技术 的 产生 能 够 在 大 范围 内 获得 蛋白 质 识别 分 子 ， 促 进 了 “和 蛋白质 尾 片 ”技术 的 发 展 。 目 前 利用 这 项 技术 产生 抗体 的 应 用 参看 第 十 二 章 。

现在 有 多 种 方法 应 用 于 量 昌 质 (包括 抗体 ) 的 排列 方面 ， 有 文章 综述 了 这 方面 的 进 展 (Blawas and Reichert，1998)。 最 近 ，Rowe 等 人 提出 了 一 种 具有 应 用 洪 力 的 排列 方 法 ， 他 们 将 抗体 以 足够 的 间隔 点 在 显 微 带 上 上， 以便 能 够 检测 多 价 抗原 (multi-bound antigens)。 简单 地 说 ， 他 们 在 一 个 经 过 硅烷 化 和 了 酯 化 的 玻璃 表面 上 ， 涂 了 一 层 NeutrA- vidin， 这 就 形成 了 一 个 流动 微型 组 件 ， 把 标记 了 生物 素 的 俘获 性 抗体 点 在 6 个 垂直 的 道 上 ， 然 后 按照 正确 的 角度 把 样品 加 到 抗体 上 ， 这 样 可 以 同时 检测 6 个 样品 中 的 分 析 物 。 对 俘获 的 分 析 物 可 以 用 “夹层 ”分 析 法 检测 出 来 ， 即 用 荧光 标记 抗体 检测 器 和 基于 CCD 的 读数 计 (Rowe et al., 1999).

另 一 种 方法 用 玻 水 胶 作 为 模子 ， 把 蛋白 质 分 子 膜 放 到 镀金 表面 上 或 把 蛋白 质 固定 排 列 在 硅化 的 玻璃 面 上 的 聚 丙 烯 酰胺 垫上 (Guschin et wz .，1997)。 后 者 使 用 3% 酰 胺 溶 液 ， 其 中 含有 甘油 、 亚 甲 基 蓝 、N, N,N',N -四 甲 基 乙 二 胺 ， 光 照 使 其 聚合 ， 然 后 在 其 表面 覆盖 一 层 不 透明 的 铬 膜 后 ， 在 其 表面 形成 格子 。 用 镀金 的 光学 显 微 针 给 每 一 个 胶 垫上 加 上 1lnl RRA ERR EA (IgG1)、 免 子 免疫 球 蛋白 或 牛 血 清 蛋白 溶液 ， 使 基 质 活 化 。 作 者 已 经 用 荧光 标记 鼠 IgG1 抗体 特定 鉴定 出 在 细小 的 玻璃 条 上 排列 的 鼠 IgGl.

抗体 并 不 是 惟一 地 用 在 “和 蛋白质 芯 片 ” 上 的 蛋白 质 识别 分 子 。 任 何 分 子 集团 只 要 它 具有 相应 的 亲 合 力 并 能 特定 辨认 出 单个 蛋白 质 分 子 ， 都 可 以 固定 起 来 ， 形 成 “蛋白 质 世

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片 "。 运 用 抗体 作为 重 昌 质 识别 分 子 有 许多 缺点 。 最 大 的 缺点 是 芯片 保存 期 不 能 太 长 ， 且 在 分 析 的 蛋白 质 混合 样 中 ， 任 何 具 有 蛋白 酶 活性 的 物质 可 能 “降解 ”芯片 。 运 用 组 合 化 学 获得 许多 化 合 物 组 成 的 大 型 文库 为 找到 更 好 的 蛋白 质 识别 分 子 提供 了 源泉 ， 但 是 切 记 还 需要 得 到 一 个 有 效 的 扫描 蛋 折 质 识 别 分 子 与 单个 蛋白 分 子 相 结合 的 方法 。

“Aptamers” 是 单 链 窒 核 苷 酸 ， 它 对 于 一 些 具 有 三 维 构象 的 分 子 〈 例 如 蛋白 质 ) 具 有 高 的 亲人 合力 。 长 度 上 将 近 有 几 百 个 核 昔 酸 组 成 的 Aptamers 的 文库 固定 在 合适 的 表面 上 ， 对 加 和 蛋 日 进行 扫描 ， 可 得 到 一 些 有 关 靶 和 蛋 昌 的 构象 、 氢 键 的 位 置 和 其 他 一 些 有 助 于 构建 靶 和 蛋白 三 维 结构 的 数据 (Brody et al., 1999; Ellington and Szostak, 1990; Her- mann and Patel, 2000; Roming et al .，1999)， 这 个 方法 具有 很 大 的 应 用 潜力 。 最 近 运 用 分 子 印迹 聚合 物 (molecularly sien polymers) 得 到 了 一 些 人 造 受 体 或 抗原 结合 位 点 。

分 子 印 迹 聚 合 物 (molecularly imprinted polymer) ”分 子 印 迹 (molecularly imprint- ing) 通过 模仿 聚合 模 上 模板 分 子 的 形状 在 其 表面 上 形成 了 人 造 识 别 位 点 ， 这 样 就 形成 了 分 子 印迹 聚合 物 。 推 测 任何 通过 形状 起 作用 的 生化 位 点 ， 如 抗体 -抗原 相互 作用 、 底 物 - 酶 的 结合 和 受 体 - 配 体 结合 ， 都 可 以 被 分 子 印迹 聚合 物 来 模仿 (Ansell and Mosbach, 1998; Hauptand Mosbach, 1998; Ye et al., 1998)

现 用 于 构建 分 子 印迹 聚合 物 有 两 种 通用 方法 。 第 一 种 方法 首先 混合 模板 分 子 形成 聚 合 物 单 体 ， 然 后 硬化 基质 并 用 溶剂 把 模板 洗 掉 ， 这 使 得 聚合 物 表 面 凹 凸 不 平 与 模板 分 子 表面 相 吻 合 ， 能 够 用 来 俘获 样品 中 靶 分 子 。 目 前 ， 可 用 于 制作 聚合 物 的 单 体 与 交 联 剂 有 多 种 ， 不 仅 能 够 符合 聚合 物 所 要 求 的 特异 性 和 亲 合 性 ， 而 且 还 能 有 一 定 的 柔韧 性 ， 耐 高 温和 高 压 ， 与 酸 、 碱 还 有 一 些 活 性 溶剂 不 反应 (Owens et al., 1999). fi) 4N Takeuchi 和 同事 通过 保持 除草 剂 含量 不 变 ， 改变 异 丁 基 酸 和 三 氟 甲 基 乙酸 的 比例 ， 合成 出 tri- azine 除草 剂 组 合 文库 。 加 入 乙 且 ， 释 放出 除草 剂 ， 就 合成 出 了 分 子 印迹 聚合 物 (Takeuchi et cl .，1999)。 通 过 比较 分 子 腐 合 聚合 物 孵育 前 后 自由 herbicide 浓度 来 评价 形成 的 分 子 印 迹 聚 合 物 的 好 坏 。 同 样 的 ， 别 的 研究 人 员 在 1, 3- 二 甲 基 黄 味 叭 (theo- phylline) 存在 的 情况 下 ， 使 异 丁 基 酸 聚合 ， 得 到 了 另外 一 种 分 子 印 迹 聚 合 物 ， 将 该 聚 合 物 碾 成 粉末 ， 用 甲醇 -乙酸 抽 提 除去 1, 3- 二 甲 基 黄 味 吟 ， 用 很 小 的 分 子 印迹 聚合 物 颗 粒 来 装 制 成 柱子 ， 这 种 柱子 能 特异 结合 1, 3- 二 甲 基 黄 味 哈 。 有 人 建议 用 磁性 的 氧化 铁 来 修饰 这 些 分 子 印 迹 聚 合 物 ， 那 么 在 一 定 的 磁场 强度 下 可 把 这 些 分 子 印迹 聚合 物 从 溶液 中 SAH HE (Ansell and Mosbach, 1998).

另 一 种 制备 MIP 的 方法 是 用 云母 作为 吸收 底 物 ， 云 母 是 一 种 自动 展 平 的 物质 (Shi et al .，1999)。 把 蛋白 质 涂 在 云母 的 表面 上 ， 再 在 其 上 覆盖 一 层 双 糖 ， 它 能 够 模仿 蛋白 质 表面 构象 。 随 着 辉 光 放电 等 离子 体 沉 积 ， 六 氟 丙 烯 多 聚 膜 沉 积 在 糖 表 面 上 ， 然 后 除去 云母 和 蛋白质 层 ， 留 下 了 表面 镀 糖 的 该 蛋白 印 迹 物 (Shi et wd .，1999)。 用 此 方法 合成 出 了 抗 生 蛋 白 链 菌 素 (streptavidin) 的 MIP， 在 牛 血 清 蛋 白 与 生物 素 形成 混合 物 中 ， 它 主要 与 生物 素 结合 。

很 明显 ， 如 果 这 些 MIP 要 发 展 成 为 真正 适合 蛋白 质心 片 认 知 表 面 ， 还 需要 做 大 量 的 工作 。 有 三 个 关键 问题 。 第 一 ， 包 含有 识别 单一 蛋白 独立 的 区 域 的 MIP 表面 是 否 完 整 ， 第 二 是 没有 一 种 好 的 方法 来 检测 蛋白 质 与 MIP 结合 的 方法 不 明确 。 最 后 一 个 也 是 最 重要 的 一 个 问题 是 模仿 一 个 完整 蛋白 而 产生 的 MIP 直接 对 应 于 这 个 蛋白 中 的 所 有 的

第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 + aes

构象 表 位 。 然 而 人 们 正 逐 渐 认 识 到 ， 由 于 蛋白 质 的 空间 结构 是 它们 自己 “设计 ”的 模 型 。 因 此 ，MIP 是 否 能 有 效 地 与 单一 蛋白 特异 的 结合 ， 这 个 问题 并 不 清楚 。

检测 方法 ”快速 、 平 行 和 灵敏 地 检测 蛋白 质 与 “ 蛋 日 质心 片 ” 上 认 知 分 子 间 相互 作 用 的 方法 ， 也 是 对 人 们 一 个 重大 的 挑战 。 现 在 发 展 的 许多 方法 非常 有 效 并 且 也 不 需要 复 杂 的 装置 ， 但 是 并 不 适用 于 “和 蛋白质 芯 片 ”。 如 下 面 所 示 ， 例 如 ， 如 上 所 述 的 用 第 二 种 荧光 标记 认 知 分 子 检测 俘获 的 蛋白 的 方法 并 不 适用 。 对 基于 荧光 的 光学 纤维 传 感 磊 ， 尽 管 有 其 潜在 的 缺点 ， 但 人 们 还 是 很 感 兴趣 的 。 这 当中 俘获 抗体 直接 被 光学 纤维 探 针 所 围 绕 (Tempelman et al., 1996). Tempelman 和 他 的 同事 发 展 了 一 个 体系 ， 能 同时 检测 4 个 样品 中 单一 分 析 物 ， 对 葡萄 球菌 肠 毒素 ， 其 最 佳 检 测 范围 是 5 一 200 ng/ml， 别 的 研 究 者 提出 了 不 同 于 上 述 的 另外 一 种 依赖 荧光 的 检测 方法 ， 抗 体 被 基质 所 覆盖 ， FF AA 光标 记 的 抗原 充分 结合 。 测 试 样品 中 未 被 标记 的 抗原 可 以 取代 荧光 标记 的 抗原 ， 然 后 检 测 释 放 的 荧光 量 。 美 国联 邦 药 物 管理 局 用 这 种 方法 定量 分 析 尿 中 可 卡 因 (cocaine) 的 代 谢 物 (Yu et w.，1996)， 而 海军 研究 院 用 它 来 分 析 爆 炸 物 (Marang et al., 1998). 3% 些 研 究 所 报告 的 最 小 检测 量 在 fmol 一 pmol (10° '~10°'*) 水 平 。 尽 管 目前 这 些 方法 并 不 能 称 作 “和 蛋白质 忌 片 ”， 人 们 可 以 预测 一 套 体系 ， 将 设计 好 的 蛋白 质 识 别 分 子 排列 在 一 个 支持 面 上 ， 它 们 都 结合 等 量 荧 光 ， 当 其 结合 单一 蛋白 时 释放 所 结合 的 荧光 ， 单 一 位 点 上 所 剩 的 荧光 量 与 样品 混合 物 相应 的 蛋 日 量 成 反比 。

生物 传感器 ， 包 括 等 离子 体 共振 (SPR) 成 像 生物 传感器 ， 能 够 对 蛋白 质 与 别 的 蛋 和 白 或 配 体 间 相互 作用 进行 实时 检测 (Gizeli and Lowe，1996)， 这 些 装置 有 一 层 镀 有 人 金 BHR, BRAS, BER LBR-EERMAARE (SAM), WPA KBR (Laricchia Robbil et al., 1996), #@ RAE HIF HE (Vikinge et al., 1998; Watts et al., - 1994) 或 硫 代 烷 烃 混 合 物 (Dubrovsky et al., 1999; Lahiri et al., 1999), HERA 1k 学 性 质 要 求 是 能 把 蛋白 质 和 配 体 固 定 在 传 感 夯 上 ， 当 目标 蛋白 结合 上 后 ， 基 质 的 反射 指 数 发 生变 化 ， 同 时 用 一 些 二 进 制 检测 器 反映 这 些 变化 (Lahiri et al., 1999). (BAA Se, 如 果 把 这 些 装 置 表面 积 扩 大 化 ， 意 味 着 它 能 容 有 更 多 的 蛋白 质 识 别 位 点 ， 而 且 将 其 微小 化 ， 这 些 都 意味 着 生物 传感器 具有 更 大 的 应 用 潜力 。

石英 结 唱 微 平衡 〈quartz crystal microbanlance) 装置 也 是 一 种 检测 抗体 一 抗原 相互 作用 的 微妙 方法 。 在 这 个 方法 中 ， 抗 体 通 过 氨基 与 乙 二 胺 高 聚 膜 与 石英 晶体 相 结合 (Nakanishi et wy .，1996)， 然 后 ， 置 于 样品 溶液 中 ， 催 化 ， 使 抗体 与 目标 抗原 相 结合 ， 导致 唱 体 表面 质量 微小 变化 ， 这 些 变化 可 以 通过 检测 两 根 金 电极 间 振 动 频率 的 变化 来 检测 出 来 ， 这 个 方法 的 灵敏 度 使 得 它 可 以 用 于 检测 单个 蛋白 分 子 与 单个 抗体 分 子 间 相 互 作 用 。

别 的 能 用 于 检测 单个 分 子 间 相互 作用 的 方法 包括 扩 增 力 生 物 传 感 器 (force-amplified biological sensor), FH Colton 和 他 的 同事 发 明 (Baselt et al .，1997)。 它 是 由 原子 力 显 微 镜 改造 过 来 的 ， 运 用 微小 化 磁 珠 与 微型 压 阻 悬 臂 结合 起 来 检测 抗体 抗原 相互 作用 。 最 后 ， 通 过 结合 在 微 电 循环 中 的 生物 传感器 来 检测 ， 这 种 生物 传感器 是 用 分 子 离子 通道 作 为 检测 装置 (Cornell et wz .，1997)。 在 这 个 方法 中 ， 以 合成 脂 膜 为 离子 通道 ， 在 其 下 层 一 个 金 电极 与 一 个 短 杆菌 肽 分 子 相 接触 ， 在 其 上 层 有 流动 的 短 杆菌 肽 分 子 ， 流 动 的 短 杆菌 肽 分 子 与 抗体 结合 。 如 果 抗 原 与 抗体 结合 则 改变 了 该 通道 的 电阻 。 这 种 方法 有 许多 优点 ， 包 括 可 以 把 检测 信号 进行 放大 ; 这 样 单 一 抗原 一 抗体 反应 导致 了 每 秒 钟 上 万 的 离 子 流 的 移动 (Turner, 1997).

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ae 结语

尽管 二 维 凝 胶 电 泳 有 它 本 身 的 局 限 性 ， 但 是 到 目前 为 止 ， 就 分 辩 率 而 言 ， 任 何 一 种 别 的 方法 都 不 能 同 它 相 提 并 论 ， 即 能 同时 分 析 几 千 个 蛋白 质 (Abbott，1999)， 这 一 点 没有 人 怀疑 。 而 且 ， 已 经 有 了 一 些 半 自动 和 高 通 量 的 方法 来 鉴定 2-DE 分 离 的 蛋白 质 并 上 且 这 种 方法 还 在 一 直 提 高 。 因 此 ， 这 意味 着 2-DE 技术 和 它 的 一 些 支持 技术 在 很 长 一 段 时 间 内 将 得 到 广泛 应 用 。 但 是 这 个 技术 的 局 限 性 使 得 人 们 有 理由 去 发 展 一 些 新 的 技术 来 研究 蛋白质 表达 谱 。 我 们 综述 了 这 方面 的 一 些 进展 ， 并 且 认 识 到 未 来 的 高 通 量 研究 蛋白 质 表 达 技 术 必 须 有 多 方面 的 方法 ， 一 些 新 的 技术 还 需 进 一 步 发 展 。 目 前 ， 研 究 机 构 和 商 业 企 业 对 快速 增长 的 “和 蛋白质 组 学 ”表现 出 了 浓厚 的 兴趣 ， 这 些 将 加 快 一 些 新 技术 发 展 的 进程 。

(HIT X H Rel e 校 ) 参考 文献

Abbott, A. (1999) A post-genomic challenge: learning to read patterns of protein synthesis. Nature 402: 715-720.

Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., Ma, C., Lossos, I.S., Rosenwald, A., Boldrick, J.G., Sabet, H., Tran, T., Yu, X., Powell, J.I., Yang, L.M., Marti, G.E., Moore, T., Hudson, J., Lu, L.S., Lewis, D.B., Tibshirani, R., Sherlock, G., Chan, W.C., Greiner, T.C., Weisenburger, D.D., Armitage, J.O., Warnke, R., Levy, R., Wilson, W., Grever, M.R., Byrd, J.C., Botstein, D., Brown, P.O. and Staudt, L.M. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell iymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503-511.

Alon, U., Barkai, N., Notterman, D.A., Gish, K., Ybarra, S., Mack, D. and Levine, A.J. (1999) Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 6745-6750.

Ansell, R.J. and Mosbach, K. (1998) Magnetic molecularly imprinted polymer beads for drug radioligand binding assay. Analyst 123: 1611-1616.

Baselt, D.R., Lee, G.U., Hanse, K.M., Chrisey, L.A. and Colton, R.J. (1997) A high-sensitivity micromachined biosensor. Proc. [EEE 85: 672-680.

Becker, H., Lowack, K. and Manz, A. (1998) Planar quartz chips with submicron channels for two- dimensional capillary electrophoresis applications. J. Micromech. Microengng 8: 24-28.

Berkenkamp, S., Karas, M. and Hillenkamp, F. (1996) Ice as a matrix for I[R-matrix-assisted laser desorption/ionisation: mass spectra from a protein single crystal. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 7003-7007.

_ Bienvenut, W.V., Sanchez, J.C., Karmine, A., Rouge, V., Rose, K., Binz, P.A. and Hochstrasser, D.F. (1999) Toward a clinical molecular scanner for proteome research: parallel protein chemical processing before and during western blot. Anal. Chem. 71: 4800-4807.

Binz, P.A., Muller, M., Walther, D., Bienvenut, W.V., Gras, R., Hoogland, C., Bouchet, G., Gasteiger, E., Fabbretti, R., Gay, S., Palagi, P., Wilkins, M.R., Rouge, V., Tonella, L., Paesano, S., Rossellat, G., Karmine, A., Bairoch, A., Sanchez, J.C., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F. (1999) A molecular scanner to automate proteomic research and to display proteome images. Anal. Chem. 71: 4981-4988.

Blawas, A.S. and Reichert, W.M. (1998) Protein patterning. Biomaterials 19: 595-609.

Bork, P., Dandekar, T., Diaz-Lazcoz, Y., Eisenhaber, F., Huynen, M. and Yuan, Y. (1998) Predicting function: from genes to genomes and back. J. Mol. Biol. 283: 707-725.

Bowtell, D.D.L. (1999) Options available — from start to finish — for obtaining expression data by microarray. Nature Genet. 21: 25-32.

Brody, E.N., Willis, M.C., Smith, J.D., Jayasena, S., Zichi, D. and Gold, L. (1999) The use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics. Mol. Diagnostics 4: 381-388.

Bringer, A.T. (1997) X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure

第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法

and dynamics. Nature Struct. Biol. 4 (Suppl.): 862-865.

Buter, D. (2000) Celera in talks to launch private sector human proteome project. Nature 403: 815— 816.

C. elegans consortium (1998) Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. The C. elegans Sequencing Consortium. Science 282: 2012-2018.

Celis, J.E., Rasmussen, H.H., Olsen, E., Madsen, P., Leffers, H., Honore, B., Dejgaard, K., Gromoy, P., Vorum, H., Vassilev, A. et a/. (1994) The human keratinocyte two-dimensional protein database (update 1994): towards an integrated approach to the study of cell prolifera- tion, differentiation and skin diseases. Electrophoresis 15: 1349-1458.

Celis, J.E., Rasmussen, H.H., Gromoy, P., Olsen, E., Madsen, P., Leffers, H., Honore, B., Dejgaard, K., Vorum, H., Kristensen, D.B. et al. (1995) The human keratinocyte two- dimensional gel protein database (update 1995): mapping components of signal transduction pathways. Electrophoresis 16: 2177-2240.

Celis, J.E., Ostergaard, M., Jensen, N.A., Gromova, I., Rasmussen, H.H. and Gromoy, P. (1998) Human and mouse proteomic databases: novel resources in the protein universe. FEBS Lett. 430: 64-72.

Chalfie, M. (1998) Genome sequencing. The worm revealed. Nature 396: 620-621.

Chee, M., Yang, R., Hubbell, E., Berno, A., Huang, X.C., Stern, D., Winkler, J., Lockhart, D.J., Morris, M.S. and Fodor, S.P.A. (1996) Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 274: 610-614.

Cheung, V.G., Morley, M., Aguilar, F., Massimi, A., Kucherlapati, R. and Childs, G. (1999) Making and reading microarrays. Nature Genet. 21: 15-19.

Choudhary, G., Chakel, J., Hancock, W., Torres-Duarte, A., McMahon, G. and Wainer, I. (1999) Investigation of the potential of capillary electrophoresis with off-line matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for clinical analysis: examination of a glycoprotein factor associated with cancer cachexia. Anal. Chem. 71: 855-859.

Corbett, J.M., Dunn, M.J., Posch, A. and Goérg, A. (1994) Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison. Electrophoresis 15: 1205-1211.

Cornell, B.A., Braach-Maksvytis, V.L.B., King, L.G., Osman, P.D.J., Raguse, B., Wieczorek, L. and Pace, R.J. (1997) A biosensor that uses ion-channel switches. Nature 387: 580-583.

Cusack, S., Belrhali, H., Bram, A., Burghammer, M., Perrakis, A. and Riekel, C. (1998) Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Struct. Biol. 5 (Suppl.): 634-637.

Davidsson, P., Westman, A., Puchades, M., Nilsson, C.L. and Blennow, K. (1999) Characterization of proteins from human cerebrospinal fluid by a combination of preparative two-dimensional liquid-phase electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 71: 642-647.

DeRisi, J., Penland, L., Brown, P.O., Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A. and Trent, J.M. (1996) Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. [See comments.] Nature Genet. 14: 457-460.

Dove, A. (1999) Proteomics: translating genomics into products? Nature Biotechnol. 17: 233-236.

Dubrovsky, T.B., Hou, Z., Stroeve, P. and Abbott, N.L. (1999) Self-assembled monolayers formed on electroless gold deposited on silica gel: a potential stationary phase for biological assays. Anal. Chem. 71: 327-332.

Dujon, B. (1996) The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet. 12: 263-270.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Schleuder, D., Hochstrasser, D., Sanchez, J.C., Lottspeich, F. and Hillenkamp, F. (1997a) Analysis of proteins by direct scanning infrared-MALDI mass spectro-. metry after 2D PAGE separation and electroblotting. Anal. Chem. 69: 2888-2892.

Eckerskorn, C., Strupat, K., Kellermann, J., Lottspeich, F. and Hillenkamp, F. (1997b) High sensitivity peptide mapping by micro-LC with on-line membrane blotting and subsequent detection by scanning IR-MALDI mass spectrometry. J. Protein Chem. 16: 349-362.

Eisen, M.B., Spellman, P.T., Brown, P.O. and Botstein, D. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 14 863-14 868.

Ellington, A.D. and Szostak, J.W. (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822.

a ER Reoarasaeaeeemeeaaoaummmnaanoprry

AYR, * 蛋白 质 组 学

Enright, A.J., [liopoulos, I., Kyrpides, N.C. and Ouzounis, C.A. (1999) Protein interaction maps for complete genomes based on gene fusion events. Nature 402: 86-90.

Fields, S. and Song, O. (1989) A novel genetic system to detect protein—protein interactions. Nature 340: 245-246.

Figeys, D. and Aebersold, R. (1999) Microfabricated modules for sample handling, sample concentration and flow mixing: application to protein analysis by tandem mass spectrometry. J. Biomech. Engng 121: 7-12.

Fromont-Racine, M., Rain, J.C. and Legrain, P. (1997) Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive two-hybrid screens. Nature Genet. 16: 277-282.

Futcher, B., Latter, G.I., Monardo, P., McLaughlin, C.S. and Garrels, J.I. (1999) A sampling of the yeast proteome. Mol. Cell. Biol. 19: 7357-7368.

Gaber, B.P., Martin, B.D. and Turner, D.C. (1999) Create a protein microarray using a hydrogel

‘stamper’. Chemtech 29: 29-24. Gerhold, D., Rushmore, T. and Caskey, C.T. (1999) DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends Biochem. Sci. 24: 168-173.

tein M. and Hegyi, H. (1998) Comparing genomes in terms of protein structure: surveys of a finite parts list. FEMS Microbiol. Rev. 22: 277-304.

Gizeli, E. and Lowe, C.R. (1996) Immunosensors. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 66-71.

Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W., Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J.D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E.J., Mewes, H.W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H. and Oliver, S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science 274: 562-567.

Grimm, R. and Grasser, K.D. (1998) Nanogram scale separations of proteins using capillary high- performance liquid chromatography with fully-automated on-line microfraction collection followed by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry, protein sequencing and Western blot analysis. J. Chromatogr. A 800: 83-88.

Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P. and Mirzabekov, A. (1997) Manual manufacturing of ‘oligonucleotide, DNA, and protein micro- chips. Anal. Biochem. 250: 203-211.

Haupt, K. and Mosbach, K. (1998) Plastic antibodies: developments and applications. Trends Biotechnol. 16: 468-475. ,

Hermann, T. and Patel, D.J. (2000) Biochemistry-adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287: 820-825.

Jensen, O.N., Mortensen, P., Vorm, O. and Mann, M. (1997) Automation of matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using fuzzy logic feedback control. Anal. Chem. 69: 1706-1714.

Klose, J. (1999) Large-gel 2D electrophoresis. Methods Mol. Biol. 112 (2-D Proteome Analysis Protocols): 147-172.

Kopp, M.U., Crabtree, H.J. and Manz, A. (1997) Developments in technology and applications of microsystems. Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 410-419.

Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J. and Whitesides, G.M. (1999) A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: a surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 71: 777-790.

Lamond, A.I. and Mann, M. (1997) Cell biology and the genome projects — a concerted strategy for characterizing multiprotein complexes by using mass spectrometry. Trends Cell Biol. 7: 139- 142.

Laricchia-Robbio, L., Liedberg, B., Platou-Vikinge, T., Rovero, P., Beffy, P. and Revoltella, R.P. (1996) Mapping of monoclonal antibody- and receptor-binding domains on human granulo- cyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) using a surface plasmon resonance based biosensor. Hybridoma 15: 343-350.

Lecrenier, N., Foury, F. and Goffeau, A. (1998) Two-hybrid systematic screening of the yeast proteome. BioEssays 20: |—S.

Li, X.P., Pleissner, K.P., Scheler, C., Regitz-Zagrosek, V., Salnikow, J. and Jungblut, P.R. (1999) A two-dimensional electrophoresis database of rat heart proteins. Electrophoresis 20: 891-897. Link, A.J., Eng, J., Schieltz, D.M., Carmack, E., Mize, G.J., Morris, D.R., Garvik, B.M. and Yates, J.R. (1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature

Biotechnol. 17: 676-682.

第 十 章 ， 蛋 白质 表达 分 析 新 方法 ea

MacNair, J.E., Patel, K.D. and Jorgenson, J.W. (1999) Ultrahigh-pressure reversed-phase capillary liquid chromatography: isocratic and gradient elution using columns packed with 1.0 um particles. Anal. Chem. 71: 700-708.

Marcotte, E.M., Pellegrini, M., Ng, H.L., Rice, D.W., Yeates, T.O. and Eisenberg, D. (1999a) Detecting protein function and protein-protein interactions from genome sequences. Science 285: 751-753.

Marcotte, E.M., Pellegrini, M., Thompson, M.J., Yeates, T.O. and Eisenberg, D. (1999b) A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function. Nature 402: 83-86.

Mullett, W.M. and Lai, E.P.C. (1999) Molecularly imprinted solid phase extraction microcolumn with differential pulsed elution for theophylline determination. Microchem. J. 61: 143-155.

Nakanishi, K., Muguruma, H. and Karube, I. (1996) A novel method of immobilising antibodies on a quartz crystal microbalance using plasma-polymerized films for immunosensors. Anal. Chem. 68: 1695-1700.

Narang, U., Gauger, P.R., Kusterbeck, A.W. and Ligler, F.S. (1998) Multianalyte detection using a capillary-based flow immunosensor. Anal. Biochem. 255: 13-19.

Neubauer, G., King, A., Rappsilber, J., Calvio, C., Watson, M., Ajuh, P., Sleeman, J., Lamond, A. and Mann, M. (1998) Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex. Nature Genet. 20: 46—S0.

Nicola, A.J., Gusev, A.I., Proctor, A. and Hercules, D.M. (1998) Automation of data collection for matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using a correlative analysis algorithm. Anal. Chem. 70: 3213-3219.

Opiteck, G.J., Ramirez, S.M., Jorgenson, J.W. and Moseley, M.A. III (1998) Comprehensive two- dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and proteome mapping. Anal. Biochem. 258: 349-361.

Owens, P.K., Karlsson, L., Lutz, E.S.M. and Andersson, L.I. (1999) Molecular imprinting for bio- and pharmaceutical analysis. Trends Anal. Chem. 18: 146-154.

Parekh, R. (1999) Proteomics and molecular medicine. Nature Biotechnol. 17 (Suppl.): BV19- BV20.

Pellegrini, M., Marcotte, E.M., Thompson, M.J., Eisenberg, D. and Yeates, T.O. (1999) Assigning protein functions by comparative genome analysis: protein phylogenetic profiles. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 4285-4288.

Pennington, S.R., Wilkins, M.R., Hochstrasser, D.F. and Dunn, M.J. (1997) Proteome analysis: from protein characterisation to biological function. Trends Cell Biol. 7: 168-173.

Perou, C.M., Jeffrey, S.S., van de Rijn, M., Rees, C.A., Eisen, M.B., Ross, D.T., Pergamenschikov, A., Williams, C.F., Zhu, S.X., Lee, J.C., Lashkari, D., Shalon, D., Brown, P.O. and Botstein, D. (1999) Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers. Proc. Nail Acad. Sci. USA 96: 9212-9217.

Plasterk, R.H. (1999) The year of the worm. BioEssays 21: 105-109.

Pollack, J.R., Perou, C.M., Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Pergamenschikov, A., Williams, C.F., Jeffrey, S.S., Botstein, D. and Brown, P.O. (1999) Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nature Genet. 23: 41-46.

Rappsilber, J., Siniossoglou, S., Hurt, E.C. and Mann, M. (2000) A generic strategy to analyze the spatial organization of multi-protein complexes by cross-linking and mass spectrometry. Ana. Chem. 72: 267-275.

Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M. and Seraphin, B. (1999) A generic protein purification method for protein complex characterisation and proteome exploration. Nature Biotechnol. 17: 1030-1032.

Robson, B. (1999) Beyond proteins. Trends Biotechnol. 17: 311-315.

Romig, T.S., Bell, C. and Drolet, D.W. (1999) Aptamer affinity chromatography: combinatorial chemistry applied to protein purification. J. Chromatogr. B 731: 275-284.

RossMacdonald, P., Coelho, P.S.R., Roemer, T., Agarwal, S., Kumar, A., Jansen, R., Cheung, K.H., Sheehan, A., Symoniatis, D., Umansky, L., Heldtman, M., Nelson, F.K., Iwasaki, H., Hager, K., Gerstein, M., Miller, P., Roeder, G.S. and Snyder, M. (1999) Large-scale analysis of the yeast genome by transposon tagging and gene disruption. Nature 402: 413-418.

Rout, M.P., Aitchison, J.D., Suprapto, A., Hjertaas, K., Zhao, Y.M. and Chait, B.T. (2000) The

yeast nuclear pore complex: composition, architecture, and transport mechanism. J. Cell Biol. 148: 635-651.

yaaa ee ee ii ，

- 180 - & A RAS

Rowe, C.A., Scruggs, S.B., Feldstein, M.J., Golden, J.P. and Ligler, F.S. (1999) An array immunosensor for simultaneous detection of clinical analytes. Anal. Chem. 71: 433-439.

Sali, A. and Kuriyan, J. (1999) Challenges at the frontiers of structural biology. Trends Genet. 15: M20-M 24.

Shevchenko, A., Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V., Sagliocco, F., Wilm, M., Vorm, O., Mortensen, P., Shevchenko, A., Boucherie, H. and Mann, M. (1996) Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 14440-14445.

Shi, H., Tsai, W.-B., Garrison, M.D., Ferrari, S. and Ratner, B.D. (1999) Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition. Nature 398: 593-597.

Swindells, M.B., Orengo, C.A., Jones, D.T., Hutchinson, E.G. and Thornton, J.M. (1998) Contemporary approaches to protein structure classification. BioEssays 20: 884-891.

Takeuchi, T., Fukuma, D. and Matsui, J. (1999) Combinatorial molecular imprinting: an approach to synthetic polymer receptors. Anal. Chem. 71: 285-290.

Tempelman, L.A., King, K.D., Anderson, G.P. and Ligler, F.S. (1996) Quantitating Staphylococcal enterotoxin B ih diverse media using a portable fibre-optic biosensor. Anal. Biochem. 233: 50- 7

Traini, M., Gooley, A.A., Ou, K., Wilkins, M.R., Tonella, L., Sanchez, J.C., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1998) Towards an automated approach for protein identification in proteome projects. Electrophoresis 19: 1941-1949.

Turner, A.P.F. (1997) Switching channels makes sense. Nature 387: 555-557.

Uetz, P., Giot, L., Cagney, G., Mansfield, T.A., Judson, R.S., Knight, J.R., Lockshon, D., Narayan, V., Srinivasan, M., Pochart, P., QureshiEmili, A., Li, Y., Godwin, B., Conover, D., Kalbfleisch, T., Vijayadamodar, G., Yang, M.J., Johnston, M., Fields, S. and Rothberg, J.M. (2000) A comprehensive analysis of protein—protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature 403: 623-627.

Unlii, M., Morgan, M.E. and Minden, J.S. (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel

. method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071-2077.

Vikinge, T.P., Askendal, A., Liedberg, B., Lindahl, T. and Tengvall, P. (1998) Immobilized chicken antibodies improve the detection of serum antigens with surface plasmon resonance (SPR). Biosens. Bioelectron, 13: 1257-1262.

Wang, K., Gan, L., Jeffery, E., Gayle, M., Gown, A.M., Skelly, M., Nelson, Ps. Ng, W.V., Schummer, M., Hood, L. and Mulligan, J. (1999) Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray. Gene 229: 101--108.

Watts, H.J., Lowe, C.R. and Pollard-Knight, D.V. (1994) Optical biosensor for monitoring microbial cells. Anal. Chem. 66: 2465-2470.

Wery, J.P. and Schevitz, R.W. (1997) New trends in macromolecular X-ray crystallography. Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 365-369.

Wigge, P.A., Jensen, O.N., Holmes, S., Soués, S., Mann, M. and Kilmartin, J.V. (1998) Analysis of the Saccharomyces spindle pole by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. J. Cell Biol. 141: 967-977.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D.F. and Williams, K.L. (1995) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnology 13: 19-S0.

Yao, S., Anex, D.S., Caldwell, W.B., Arnold, D.W., Smith, K.B. and Schultz, P.G. (1999) SDS capillary gel electrophoresis of proteins in microfabricated channels. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 5372-5377.

Ye, L., Ramstrom, O., Mansson, M.O. and Mosbach, K. (1998) A new application of molecularly imprinted materials. J. Mol. Recog. 11: 75-78.

Yu, H., Kusterbeck, A.W., Hale, M.J., Ligler, F.S. and Whelan, J.P. (1996) Use of the USDT flow immunosensor for quantification of benzoylecgonine in urine. Biosens. Bioelectron. 11: 725-734.

Zachariae, W., Shevchenko, A., Andrews, P.D., Ciosk, R., Galova, M., Stark, M.J., Mann, M. and Nasmyth, K. (1998) Mass spectrometric analysis of the anaphase-promoting complex from yeast: identification of a subunit related to cullins. Science 279: 1216-1219.

第 十 一 章 蛋白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理学 中 的 应 用

Stefan Evers and Christopher P. Gray 1. 518

良好 的 药物 应 该 具有 有 效 性 和 专 一 性 。 一 般 来 说 ， 它 们 应 该 首先 与 其 靶 标 相互 作用 而 对 其 他 任何 分 子 仅 产 生 最 低 限 度 的 效应 。 药 物 研 发 的 主要 要 求 之 一 就 是 确证 候选 化 合 物 对 潜在 靶 标 的 抑制 作用 〈 目 标 有 效 性 )， 而 不 产生 预计 之 外 的 效应 。 药 物 发 展 和 毒 理 学 分 析 研 究 中 共同 存在 的 缺点 是 : 只 注重 表 型 的 观察 和 单个 大 分 子 或 酶 解 活性 。 对 毒性 或 药理 活性 的 观测 常 维持 在 分 子 水 平 上 的 简单 理解 ， 而 除 被 检测 的 效应 外 ， 候 选 药物 作 用 于 洪 在 靶 分 子 上 的 直接 或 间接 的 效应 依然 未 知 。 为 了 弥补 药理 效应 或 毒性 观察 与 分 子 水 平 上 对 效应 理解 之 间 的 差距 ， 完 全 有 必要 发 展 能 更 大 规模 提出 生物 学 问题 的 技术 。 与 迄今 为 止 通过 传统 测试 得 到 的 结果 相 比 ， 这 些 技术 应 该 更 深 乏 地 洞察 疾病 和 药理 学 或 毒 理学 效应 的 分 子 过 程 。 理 解 这 些 机 理 能 改善 在 药物 发 展 重大 进程 中 决策 的 作出 ， 同 时 能 提高 研发 过 程 的 工作 效率 。 在 这 些 技 术 的 发 展 中 ，DNA 测序 方法 的 发 展 是 一 个 重要 的 进展 ， 这 一 进展 揭示 了 原核 生物 和 真 核 生 物 的 基因 和 相应 蛋白 质 的 全 部 功能 。 基 因 组 全 序列 的 间 世 揭 开 了 生物 学 研究 领域 的 新 篇 章 。 但 是 ， 特 定 生 物体 的 基因 组 序列 本 身 的 价 值 毕竟 有 限 。“ 功 能 基因 ”这 个 词 涉及 一 个 新 的 研究 领域 ， 这 一 领域 使 用 蛋白 质 组 分 析 和 高 密度 的 DNA 阵列 等 技术 ， 并 充分 使 用 在 基因 序列 中 所 包含 的 丰富 信息 。

在 单 次 实验 中 ， 蛋 白质 组 分 析 可 以 检测 并 定量 分 析 成 百 上 千 个 蛋白 质 。 这 为 定量 和 定性 评价 具有 不 同 表 型 或 基因 型 的 组 织 细胞 之 间 、 正 常 与 病理 状态 、 给 药 与 不 给 药 时 蛋 白质 的 表达 差异 提供 了 可 能 。 根 据 所 使 用 的 模型 系统 ， 对 不 同 的 处 治 方法 或 疾病 的 不 同 阶段 的 反应 可 以 随时 跟踪 ， 可 以 实现 对 药 效 动力 学 研究 或 对 疾病 进程 相关 的 变化 特征 进 行 有 效 识 别 。

表面 上 看 ， 蛋 白 组 学 研究 似乎 是 多 余 的 技术 。 在 mRNA 水 平 研 究 基 因 表达 似乎 是 一 种 比 蛋白 质 组 更 简单 而 且 更 灵敏 的 手段 。 但 是 ， 在 生物 学 样品 的 鉴定 中 有 大 量 的 证 据 说 明 蛋 白质 组 分 析 的 重要 人 性:

(1) 通过 mRNA 浓度 的 测定 得 到 的 基因 调控 研究 是 间接 的 ， 仅 能 代表 一 种 间接 的 测量 ， 还 有 很 多 现象 未 能 检测 。

(2) 在 翻译 水 平 的 基因 表达 调控 在 多 数 情况 下 是 起 决定 性 作用 的 ， 如 核糖 体 蛋 白 、 密码 子 使 用 和 E.coli 中 氨基 酸 生 物 合成 酶 的 调节 衰减 机 理 。 这 类 调控 通过 mRNA 的 定 量 分 析 检测 不 到 。

(3) 测定 细胞 中 蛋白 的 浓度 时 ， 一 个 常 被 忽视 的 因素 是 它 的 降解 速度 ， 而 蛋白 质 的 降解 可 能 受 调 控 的 影响 (Tobias et al., 1991).

(4) 有 一 点 很 重要 ， 翻 译 中 和 翻译 后 的 共 价 修饰 (如 磷酸 化 、 酰 基 化 或 糖 基 化 ) 扮 演 重要 的 生物 学 的 角色 ， 通 常 完 全 改变 蛋白 质 的 性 质 〈 见 第 五 章 和 第 十 三 章 )。 若 干 研

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- 182 - 蛋白 质 组 学

究 结果 显示 ， 毒 性 效应 可 以 通过 和 蛋白质 修 饰 的 方式 显示 出 来 (Anderson et al., 1992; Witzmann et al .，1998)， 很 多 修饰 的 蛋白 质 异 构 体 可 以 通过 二 维 凝 胶 电泳 分 开 ， 例 如 凝 胶 中 成 串 的 蛋白 点 代表 具有 不 同 糖 基 化 状态 的 蛋白 质 。 因 而 蛋白 质 组 为 研究 人 员 提 供 了 独特 而 强大 的 检测 和 研究 这 些 修饰 (比如 在 疾病 过 程 中 ) 的 工具 。

对 于 药物 发 展 ， 应 该 认识 到 在 绝 大 多 数 情 况 下 基因 编码 的 功能 高 分 子 都 是 蛋白 质 ， 而 且 药物 的 靶 标 几乎 全 都 是 蛋白 质 。 最 近 的 研究 证 实 ， 转 录 组 与 蛋白 质 组 的 结合 能 够 全 面 理 解 细胞 内 的 分 子 过 程 。 和 蛋白 质 组 实验 表明 ， 作 为 致癌 基因 转 染 的 结果 ， 未 被 加 工 的 无 活性 ICE3 聚集 在 转 染 的 恶性 细胞 中 (图 11.1)。 其 后 的 mRNA 定量 分 析 显 示 ， 活 化 ICE3 的 蛋白 酶 合成 在 这 些 细胞 中 剧烈 下 调 (Wang et al .，1996)， 这 也 就 解释 了 2-DE 胶 上 所 观察 到 的 现象 (Certa et al., 1999).

(b)

图 11.1 上 图 分 别 选 自 正 常 老鼠 乳 突 细 胞 (图 左 ) PAA ras 转 染 细胞 (AA) BES 白质 和 mRNA 提取 物 的 2DE-PAGE 胶 (a) 和 Affymetrix 基因 芯片 IM (b) 2-DE 胶 上 的 箭头 表示 未 被 加 工 ICE3 的 位 置 。 世 片区 域 表 示 粒 酶 B 基因 被 包 埋 。 粒 酶 B 使 ICE3 水 解 激 活 (Wang et ol .，1996)。 这 些 结果 显示 在 H-ras 致癌 基因 的 存在 下 ， 粒 酶 B 的 产生 被 抑制 ， 导 致 未 被 加 工 的 ICE3 前 体 的 聚集 。 似 乎 蛋白 酶 与 凋 亡 通 路 有 关 ， 没 有 蛋白 酶 时 细胞 就 会 亚 性 地 无 控制 地 生长 (Certa et al., 1999),

蛋白 质 合 成 速度 的 调控 是 细胞 对 外 界 环境 条 件 改变 后 产生 反应 的 一 部 分 。 另 外 ， 通 过 细胞 循环 和 分 化 的 细胞 成 熟 也 由 基因 表达 的 调控 所 决定 。 复 杂 的 调控 网 络 多 级 控制 重 白质 的 浓度 和 酶 活性 (Go mRNA 合成 ， 翻 译 ， 修 饰 ， 转 运 ， 和 蛋白 水解 过 程 和 降解 )。 这 样 ， 蛋 白 组 反映 了 环境 条 件 的 变化 。 蛋 白质 组 的 比较 研究 有 助 于 理解 细胞 的 调控 网 络 。 因而 它 是 药物 靶 标 识别 和 确认 、 药 物 的 行为 机 理 研 究 和 药理 学 或 毒性 效应 的 检测 和 推断 的 有 用 工具 。

2. 数据 的 使 用

通过 和 蛋白质 组 实验 得 到 的 数据 量 需 要 借助 计算 机 分 析 。 为 了 验证 观测 资料 ， 使 得 预 测 可 靠 ， 必 须 进 行 重复 样品 的 重复 凝 胶 试 验 ， 同 时 得 到 储存 、 分 析 。 实 验 的 变化 可 能 非 常 大 ， 特 别 是 在 引入 遗传 变异 的 情况 下 ， 比 如 使 用 远 系 杂交 种 动物 的 毒 理 学 研究 (Steiner et dl .，1995)。 很 明显 ， 统 计 学 对 阐明 从 二 维 凝 胶 电泳 得 到 的 大 量 数据 〈 常 有 错误 倾向 ) 极其 重要 。 除 标准 二 维 凝 胶 电泳 分 析 工 具 的 传统 统计 分 析 〈 平 均值 ， 标 准

第 十 一 章 ， 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理 学 中 的 应 用 - 183 -

差 ， 可 信 度 ) 外 ， 还 有 两 种 基本 方法 可 以 检查 从 这 些 实验 得 到 的 数据 ;

(1) 蛋白 质 组 在 整体 上 可 被 看 作 是 反映 环境 变化 的 生物 传感器 。 像 “化 合 物 A 的 行为 是 否 与 化 合 物 B 类 似 ” 这 样 的 问题 可 以 通过 这 种 方法 解决 。

(2) 从 更 细致 的 分 析 可 以 得 知 ， 化 合 物 作 用 于 单个 蛋 上 质 或 一 组 重 日 的 效应 与 其 代 谢 途 径 或 不 同 的 功能 类 别 有 关 。 这 使 得 观察 到 的 药 效 更 合理 ， 疾 病 、 药 理学 活性 或 毒性 的 潜在 诊断 标记 更 准确 。

下 面 ， 将 详细 地 讨论 说 明 两 种 方法 的 实例 ， 尤 其 着 重 于 药物 研发 和 毒物 学 方面 。

2.1 比较 分 析

可 以 假定 两 种 具有 相同 性 质 的 化 合 物 在 细胞 中 引发 相似 的 反应 。 摄 药 (响应 ) 下 的 蛋白 质数 量 与 未 摄 药 (空白 ) 的 相对 比值 可 以 用 一 系列 数值 代表 (" 摄 药 比 ")。 最 后 得 到 的 表达 谱 可 以 通过 各 种 条 件 来 评价 ， 提 供 所 研究 化 合 物性 质 的 有 价值 信息 。 这 种 方法 可 以 通过 抗菌 研究 的 实例 加 以 验证 。

筛选 二 氧 叶酸 还 原 酶 (DHFR) 抑制 剂 时 得 到 一 种 类 似 三 甲 氧 蔷 二 氨 喀 啶 (Tmp) 的 2，4- 二 氨基 喀 啶 的 衍生 物 Ro-64-1874。 使 用 流感 嗜 血 杆菌 〈 了 Haemzopjilus influen- zae) 作为 模型 系统 的 蛋白 质 组 分 析 得 到 一 套 较 好 表现 抗菌 效果 的 数据 库 比 较 的 数据 。 按 以 下 方法 对 Ro-64-1874 的 响应 与 标准 的 抗生素 响应 加 以 比较 : 根据 摄 药 比 ， 蛋 日 点 分 成 三 组 四 增加 的 点 〈 摄 药 比 > 1.25) 加 减少 的 点 〈 摄 药 比 < 0.8) 加 不 变 的 点 (0.8 < 摄 药 比 < 1.25$)。 选 择 摄 药 比 增加 或 者 减少 的 点 作为 进一步 分 析 的 目标 。 通 过 两 种 条 件 下 诱导 /抑制 的 蛋白 点 数 与 总 的 点 数 比值 、 每 种 条 件 下 的 诱导 /抑制 的 蛋白 点 数 来 衡量 两 种 响应 的 相似 程度 (图 11.2)。 这 些 值 的 比率 是 衡量 两 种 效应 相似 程度 和 重要 性 的 较 好 标准 。 将 Ro-64-1874 显示 的 结果 表达 谱 与 数据 库 (包括 转录 、 翻 译 ， 四 氢 叶 酸 合成 ， tRNA 合成 ， 脂 肪 酸 合成 和 DNA 促 旋 酶 的 抑制 反应 ) 中 的 其 他 表达 谱 ，Q 得 到 与 Tmp 和 fii — FAWEMA (sulfamethoxazole, Smz) 的 较 好 的 相关 性 。 预 想 的 Ro-64-1874 的 行为 模 式 就 被 证 实 。 我 们 最 近 选 择 一 种 体外 活性 能 对 抗 促 旋 酶 引发 的 体内 次 级 反应 的 化 合 物 ， 通过 样品 的 比较 ， 显 示 和 蛋白 质 合成 的 抑制 。 这 种 活性 可 以 通过 体外 转录 /翻译 分 析 证 实 。 研究 结果 显示 一 些 化 合 物 的 响应 是 依赖 于 时 间 和 浓度 的 (VanBogelen et al., 1987).

因此 ， 加 入 抗生素 后 ， 需 要 在 不 同时 间 点 和 多 个 浓度 下 检查 行为 模式 尚 不 清楚 的 化 合 物 的 响应 。

这 种 方法 应 当成 为 抗菌 研究 、 药 学 和 毒物 学 、 特 别 是 结构 -功能 关系 研究 领域 中 不 同 的 应 用 手段 之 一 〈 如 Myers et al .，1997)。 对 于 这 种 比较 ， 蛋 白质 点 的 鉴别 并 不 重 要 。 这 种 比较 成 功 的 前 提 是 有 一 个 来 自行 为 方式 已 知 的 化 合 物 的 响应 数据 库 ， 但 这 一 般 是 不 可 能 实现 的 。 具 有 新 颖 行 为 模式 的 化 合 不 会 与 任何 标准 物质 有 意义 的 相关 值 ， 对 于 这 些 化 合 物 更 详细 的 分 析 要 求 对 它们 的 性 质 有 更 好 的 理解 。 一 种 有 趣 的 靶 标 确 认 方 法 是 将 用 药 后 引起 的 基因 表达 谱 的 变化 与 药物 靶 标 编码 的 基因 失 活 或 下 调 引 起 的 变化 相 比 较 。cyclosporine A (CyA) 和 FK506 在 酵母 细胞 上 的 效应 与 编码 其 靶 蛋 白质 的 cal- cineurin 和 FPR1 基因 的 失调 效应 有 关 ， 证 实 使 用 DNA 微分 析 这 种 方法 的 有 效 性 (Mar- ton etal., 1998).

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第 十 一 章 ” 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理 学 中 的 应 用 “185 ，

2.2 生物 标志 物 蛋 白质 的 检测

蛋白 质 组 数据 库 能 根据 蛋白 质点 的 强度 反映 一 种 疾病 的 过 程 变化 或 对 一 组 药物 反应 的 变化 。 这 样 ， 蛋 白质 可 以 用 作 特 定 反应 或 疾病 的 奉 代 标 志 物 。 也 许 蛋 白质 组 在 毒 理学 领域 成 功 应 用 最 好 的 例子 是 CyA 效应 的 研究 。 通 过 检查 诱导 方式 ， 可 以 假定 CyA 的 毒 性 机 制 。CyA 是 一 种 应 用 广泛 的 免疫 抑制 剂 ， 但 应 用 中 也 伴随 着 许多 副作用 ， 其 中 最 值得 注意 的 是 肾 毒 。 用 CyA 处 治 后 最 明显 的 结果 是 ， 部 分 蛋白 点 消失 ， 这 些 蛋 白 点 后 来 从 大 鼠 肾 脏 蛋 白质 模式 中 被 鉴定 为 calbindin-D 的 28 kDa 蛋白 (Benito et al., 1995; Steiner et wl . )。 使 用 酶 联 免疫 吸附 分 析 的 进一步 研究 证 实 ， 大 鼠 明 脏 中 calbindin-D 的 28kDa 蛋白 量 持续 减少 (Steiner et al., 1996). ix FH TEE RES HED A 管内 石灰 化 的 增加 (Aicher et al .，1997)。 就 像 以 前 提出 的 那样 (Feher, 1983), WR calbindin-D 28kDa 蛋白 扮演 钙 运 输 的 促进 器 和 和 钙 缓 冲 器 的 角色 ， 观 察 到 的 效应 就 能 得 到 解释 。CyA 毒性 标志 物 的 鉴定 ， 为 其 毒 效 提 供 了 可 靠 的 说 明 ， 这 是 蛋白 质 组 与 其 他 的 技术 结合 的 成 功 应 用 结果 。 第 二 个 生物 标记 蛋白 质 的 成 功 鉴 别 的 例子 来 自 膀 胱 鳞 状 细胞 癌 进 程 的 长 期 研究 (综述 见 Celis et 必 .，1998)。 在 此 研究 中 ， 定 义 蛋 白质 标志 物 和 癌 损害 的 分 化 程度 能 被 监测 (Celis et al., 1996; Ostergaard et al., 1997).

这 种 生物 标记 物 识 别 的 方法 在 制药 产业 的 不 同 领域 ， 从 临床 前 研究 到 诊断 、 药 理学 和 毒物 学 等 领域 都 有 巨大 的 应 用 潜力 。 蛋 白质 组 在 检测 一 个 蛋白 质 表达 谱 是 否 可 以 用 于 疾病 诊断 方面 ， 主 要 依赖 于 用 来 提取 信息 的 数据 库 的 规模 和 质量 。 因 此 ， 几 个 存储 从 2-DE 胶 产 生 的 大 量 表达 谱 和 质谱 数据 的 公共 数据 库 已 经 构建 (LBA). FARAH 多 元 统计 分 析 ， 如 主要 组 分 分 析 或 模型 预测 ， 均 可 用 于 阐述 生物 标志 物 和 蛋白 。

2.3 详细 的 基因 表达 调控 分 析

对 胶 上 蛋白 质点 的 识别 鉴定 匹配 越 多 ， 对 实验 数据 的 详尽 分 析 就 越 有 可 能 。 与 特定 的 通路 或 调控 子 有 关 的 大 多 数 蛋 白质 的 蛋白 水 平 都 可 以 定量 。 目 前 ， 仅 仅 从 微生物 的 蛋 白质 识别 中 获得 了 足够 的 信息 ， 可 以 详细 地 分 析 不 同 生 长 条 件 和 抗生素 作用 下 对 微生物 基因 表达 的 影响 。F.C.Neidhardt 小 组 最 先 建立 了 大 肠 杆 菌 的 2-DE 谱 并 开始 对 这 些 细 菌 对 不 同 环境 条 件 的 反应 进行 系统 的 研究 、 分 类 (VanBogelen et al .，1997)。 这 样 ， 大 量 不 同 的 调控 子 已 经 被 发 现 并 表征 (VanBogelen et wz .，1997)。 几 种 微生物 ， 如 枯草 杆 fA (Bacillus subtilis) (Antelmann et al .，1997)， 流 感 哮 血 杆 菌 ( Haemophilus influen- zae) (Cash et al., 1997; Langen et al .，1997)， 以 及 酿酒 酵母 ( Saccharomyces cere- visiae ) (Boucherie et al., 1996; Hodges et al., 1999) 的 蛋白 质 组 表达 谱 已 经 发 表 。 微 生物 全 基因 序列 的 完成 大 大 促进 了 和 蛋白质 的 识别 进程 ， 并 使 代谢 途径 的 构建 成 为 可 能 。 但 应 该 记 住 ， 在 大 多 数 情 况 下 ， 功 能 的 指认 是 以 序列 同 源 为 基础 ， 传 统 的 生物 化 学 对 这 些 途 径 的 完成 和 确认 至 关 重 要 。 我 们 小 组 已 经 报道 了 一 个 生物 化 学 途径 详尽 分 析 的 例子 (Evers et al .，1998)。 如 上 所 述 ， 我 们 已 经 研究 了 流感 嗜 血 杆 菌 〈 互 . 加 juenzxae) 对 四 氧 叶酸 合成 抑制 剂 Tmp 和 Smz 的 反应 。 其 中 最 重要 的 变化 是 代表 与 蛋氨酸 合成 有 关 的 酶 蛋白 点 的 强度 增加 。 这 些 结果 显示 编码 这 些 蛋 白质 的 基因 以 E.coli 中 配对 物 类 似 的 方式 被 调控 (Weissbach and Brot，1991)。 因 为 2-DE 胶 上 很 多 相关 的 蛋白 质 还 未 被 鉴

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定 ， 现 在 还 不 可 能 研究 Tmp 和 Smz fF ATES A EB AY OY, ETT ES 四 氢 叶 酸 合成 抑制 影响 。 在 对 酵母 的 类 似 研究 中 ， 进 行 了 味 叭 和 组 氨 酸 生物 合成 蛋白 的 合成 率 调 控 研 究 (Denis et wz: .，1998)， 结 果 证 实 了 这 种 方法 在 真 核 细 胞 中 的 可 行 性 。

这 种 详尽 的 分 析 有 助 于 对 数据 库 中 没有 类 似 物 的 化 合 物 建 立行 为 模式 假说 。 因 而 有 助 于 发 现 药理 学 活性 物质 的 新 靶 标 。 另 外 ， 在 这 些 分 析 中 观察 到 的 次 要 效应 也 有 助手 识 别 药物 介入 的 潜在 靶 标 。 结 合 其 他 方法 〈 例 如 重组 基因 失 活 )， 可 以 更 完整 地 描述 药物 效应 。 结 合 正在 进行 的 基因 组 项 目 产 生 的 大 量 信 息 ， 这 个 方法 将 可 能 扩展 到 更 复杂 的 有 机 体 中 去 。

2.4 蛋白 质 功能 预测

对 许多 和 蛋 日 质 来 说 ， 以 序列 比较 为 基础 指认 和 蛋白质 的 功能 是 不 可 能 的 。 这 些 蛋 和 白质 代表 了 未 被 利用 的 药物 潜在 的 靶 标 ， 因 此 是 医药 工业 的 特殊 兴趣 所 在 。“ 调 控 同 源 ” (regulatory homology) 的 概念 是 由 Anderson 和 Anderson (1998) 最 近 提 出 的 : 当面 临 环境 条 件 的 改变 时 ， 以 相似 的 方式 变化 的 蛋白 质 相 对 丰 度 也 许 参 与 共同 的 过 程 。 这 个 概 OM WS ARREARS. BOP, RS RIA“ MI” (orphan) 基因 的 重组 生物 (RAS 3 AURA Ee kA BURA A REDE. FERRER E.coli 基因 表达 效 果 的 研究 实验 中 ， 通 过 2-DE wMRA MH, SET 8 个 与 硫酸 盐 调 控 有 关 的 蛋白 质 (Dainese et dj .，1997)。 对 其 中 一 个 蛋白 Taub 的 基因 重组 失 活 的 实验 结果 显示 ， 细 菌 在 惟一 的 硫磺 源 一 一 牛 磺 酸 上 生长 不 足 (Dainese et al., 1997). 3X, HURARA 技术 鉴定 了 与 硫酸 盐 同化 作用 有 关 的 和 蛋白质， 而 重组 技术 证 明了 其 中 一 个 蛋白 ，TauD 在 牛 磺 酸 的 去 磺 化 中 的 作用 。

3. 结论 与 展望

目前 蛋白 质 组 对 药物 的 研究 和 开发 十 分 有 用 的 观点 已 被 广泛 地 接受 。 大 多 数 药物 公 司 为 改善 与 药物 行为 相关 的 生物 学 材料 的 表征 ， 发 现 相关 生物 标志 物 和 潜在 的 靶 标 ， 已 经 纷纷 建立 了 有 蛋白 质 组 分 析 小 组 。Large Scale Biology Corp， 现 在 是 Biosource Technolo- gies Inc. 的 分 部 ， 是 分 子 药理 学 和 毒 理 学 的 2-DE 应 用 领域 的 先驱 ， 构 建 了 全 面 的 药物 的 分 子 效 应 (Molecular Effects of DrugsIM) 数据 库 (Anderson and Anderson，1998)， 为 药物 产业 提供 2-DE 服务 ， 为 公众 提供 他 们 所 拥有 的 蛋白 质谱 数据 库 和 2-DE 谱 图 。 几 个 其 他 的 公司 随即 跟 进 ， 也 为 药物 发 现 和 发 展 提供 这 些 服务 或 开发 相应 的 蛋 昌 质 组 研究 项 目 〈 见 第 十 一 章 “ 商 业 蛋 白质 组 ”) 。

蛋白 质 组 被 用 于 药物 发 现 和 发 展 过 程 中 的 各 个 阶段 。 如 上 所 述 ， 它 对 于 早期 靶 标 的 识别 和 确认 非常 有 用 。 在 发 展 的 后 期 ， 其 实用 性 已 经 在 药理 学 和 毒 理 学 领域 中 得 到 证 明 。 尤 其 在 后 两 个 领域 ， 从 蛋白 质 组 研究 结果 的 重要 意义 以 及 与 传统 生理 学 和 组 织 学 试 验 得 到 的 观测 资料 的 相关 性 需要 细心 评价 。 这 些 研究 有 和 希望 鉴别 新 型 的 生物 标志 物 ， 有 助 于 发 展 更 迅速 、 更 经 济 的 诊断 试验 。 这 些 生物 标志 物 的 检测 应 用 于 药物 发 展 的 早期 阶 段 ， 可 减少 对 动物 实验 的 需求 。

为 了 充分 地 开发 蛋白 质 组 的 潜力 ， 目 前 技术 发 展 仍 需 与 方法 学 结合 ， 以 解决 其 局 限 性 。2-DE 的 使 用 是 众多 不 满意 的 因素 之 一 ， 它 操作 不 方便 而 且 耗 时 ， 阻 碍 了 和 蛋白质 组

第 十 一 章 “ 蛋 白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理学 中 的 应 用 ‘i

作为 高 通 量 技术 的 使 用 。 在 巧妙 的 技术 结合 中 ，2-DE 可 用 于 鉴别 标志 物 蛋 白 ， 而 使 用 别 的 更 适当 的 方法 进行 高 通 量 检 测 (例如 ELISA， 基 因 系 统 报告 ， 生 物化 学 试验 )。 2-DE 的 研究 重点 是 自动 操作 和 图 像 分 析 的 改善 ， 这 样 就 能 加 速 数据 的 获得 。 医 药 产 业 对 高 通 量 的 需求 可 能 使 得 2-DE 胶 最 终 被 别 的 更 易于 自动 化 分 离 的 系统 所 取代 。 现 在 ， 仅 能 对 含量 丰富 的 可 溶性 蛋白 质 进行 研究 ， 较 大 的 下 水 蛋白 因 其 灵敏 度 较 低 、 难 于 溶解 而 难以 研究 。 因 此 和 蛋白质 组 研究 也 就 必须 偏向 于 这 些 通常 是 结构 蛋白 质 或 代谢 酶 的 蛋白 质 ( 表 11.1)。 用 于 和 蛋白质 修饰 的 检测 、 鉴 别 、 定 量 的 蛋白 质 组 技术 正在 开发 中 。 目 前 仅 有 极 少数 蛋白 质 修 饰 被 完全 识别 、 表 征 的 例子 。 技 术 发 展 加 大 了 前 进 的 步伐 ， 也 期 望 质谱 分 析 的 灵敏 度 和 准确 度 的 增加 。 随 着 分 析 软 件 的 改进 ， 将 允许 进行 蛋白 质 修饰 的 常 规 分 析 并 拓宽 蛋白质 组 研究 的 范围 。

表 11.1 流感 嗜 血 杆菌 可 溶性 蛋白 质 提 取 物 的 2-DE 凝 胶 制 备 蛋白 质 的 不 同 功能 类 型

功能 分 类 。 每 种 类 别 的 鉴别 百分比 /% 氨基 酸 生物 合成 44 辅助 因子 ， 非 肝 基 基 团 和 载体 的 生物 合成 27 细胞 膜 22 细胞 内 加 工 30 主要 中 间 物 代谢 37 能 量 代 谢 41 提 肪 酸 和 磷脂 代谢 40 假定 的 功能 19 其 他 类 别 23 mrs, ete, KREMER 40 调控 功能 16 复制 25 转录 33 翻译 49 转运 和 结合 蛋白 20 合计 29

* According to Fleischmann et al. (1995).

KS BUE A RA FEM mRNA 分 析 观 察 到 的 现象 难于 解释 。 因 为 调控 通路 是 相互 关联 的 ， 一 种 效应 可 能 发 生 在 表面 上 无 关联 的 、 不 同 功能 类 别 的 蛋白 质 中 。 一 级 、 二 级 或 三 级 效应 相互 交错 ， 形 成 非常 复杂 的 表达 方式 。 在 生物 学 研究 中 ， 这 些 方 法 适合 产生 一 些 假说 ， 而 这 些 假说 需要 用 其 他 技术 验证 。 另 外 ， 来 自 不 同 来 源 的 信息 ， 如 代谢 物 的 定量 信息 ， 有 助 于 对 细胞 生物 化 学 的 基本 理解 。 生 物 信息 学 在 数据 储存 和 分 析 中 扮演 着 必 不 可 少 的 角色 ， 把 我 们 目前 对 基因 调控 方面 的 知识 与 从 蛋白 质 组 及 其 他 来 源 的 发 现 有 机 结合 起 来 ， 形 成 对 生物 体 的 更 全 面 `、“ 整 体 的 ”看 法 ， 并 且 得 到 易于 理解 的 数据 。

致谢 感谢 Hanno Langen and Uli Certa 提供 图 11.1， 感 谢 W.Keck 对 原稿 建设 性 的 阅读 。

(HHL HE Rode 校 )

- 188 - 蛋白 质 组 学

参考 文献

Aicher, L., Meier, G., Norcross, A., Jakubowski, J., Varela, M., Cordier, A. and Steiner, S. (1997) Decrease in kidney calbindin-D 28 kDa as a possible mechanism mediating cyclosporine A- and FK-506-induced calciuria and tubular mineralization. Biochem. Pharmac. 53: 723-731.

Anderson, N.L. and Anderson, N.G. (1998) Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis 19: 1853-1861.

Anderson, N.L., Copple, D.C., Bendele, R.A., Probst, G.S. and Richardson, F.C. (1992) Covalent protein modifications and gene expression changes in rodent liver following administration of methapyrilene: a study using two-dimensional electrophoresis. Fundam. Appl. Toxicol. 18: 570— 580.

Antelmann, H., Bernhardt, J., Schmid, R., Mach, H., Volker, U. and Hecker, M. (1997) First steps from a two-dimensional protein index towards a response-regulation map for Bacillus subtilis. Electrophoresis 18: 1451-1463.

Benito, B., Wahl, D., Steudel, N., Cordier, A. and Steiner, S. (1995) Effects of cyclosporine A on the rat liver and kidney protein pattern, and the influence of vitamin E and C coadministration. Electrophoresis 16: 1273-1283.

Boucherie, H., Sagliocco, F., Joubert, R., Maillet, I., Labarre, J. and Perrot, M. (1996) Two- dimensional gel protein database of Saccharomyces cerevisiae. Electrophoresis 17: 1683-1699. Cash, P., Argo, E., Langford, P.R. and Kroll, J.S. (1997) Development of a Haemophilus two-

dimensional protein database. Electrophoresis 18: 1472-1482.

Celis, J.E., Rasmussen, H.H., Vorum, H., Madsen, P., Honore, B., Wolf, H. and Orntoft, T.F. (1996) Bladder squamous cell carcinomas express psoriasin and externalize it to the urine. J. Urol. 155: 2105-2112.

Celis, J.E., Ostergaard, M., Jensen, N.A., Gromova, I., Rasmussen, H.H. and Gromoy, P. (1998) Human and mouse proteomic databases: novel resources in the protein universe. FEBS Lett. 430: 64-72.

Certa, U., Hochstrasser, R., Langen, H., Buess, M. and Moroni, C. (1999) a in biomedical research: development and application of gene chips. Chimia 53: 57-61.

Dainese, P., Staudenmann, W., Quadroni, M., Korostensky, C., Gonnet, G., Kertesz, M. and James, P. (1997) Probing protein function using a combination of gene knockout and proteome analysis by mass spectrometry. Electrophoresis 18: 432-442.

Denis, V., Boucherie, H., Monribot, C. and Daignan-Fornier, B. (1998) Role of the myb-like protein baslp in Saccharomyces cerevisiae: a proteome analysis. Mol. Microbiol. 30: 557-566.

Evers, S., Di Padova, K., Meyer, M., Fountoulakis, M., Keck, W. and Gray, C.P. (1998) Strategies towards a better understanding of antibiotic action: folate pathway inhibition in Haemophilus influenzae as an example. Electrophoresis 19: 1980-1988.

Feher, J.J. (1983) Facilitated calcium diffusion by intestinal calcium-binding protein. Am. J. Physiol. 244; C303-307.

Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O. et al. (1995) Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269: 496-512.

Hodges, P.E., McKee, A.H.Z., Davis, B.P., Payne, W.E. and Garrels, J.I. (1999) The Yeast Proteome Database (YPD): a model for the organization and presentation of genome-wide functional data. Nucleic Acids Res. 27: 69-73.

Langen, H., Gray, C., Roder, D., Juranville, J.-F., Takacs, B. and Fountoulakis, M. (1997) From genome to proteome: protein map of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 18: 1184-1192. Marton, M.J., DeRisi, J.L., Bennett, H.A., Vishwanath, I.R., Meyer, M.R., Roberts, C.J., Stoughton, R., Burchard, J., Slade, D., Dai, H., Bassett, D.E.J., Hartwell, L.H., Brown, P.O. and Griend, S.H. (1998) Drug target validation and identification of secondary drug target

effects using DNA microarrays. Nature Med. 4: 1293-1301.

Myers, T.G., Anderson, N.L., Waltham, M., Li, G., Buolamwini, J.K., Scudiero, D.A., Paull, K.D., Sausville, E.A. and Weinstein, J.N. (1997) A protein expression database for the molecular pharmacology of cancer. Electrophoresis 18: 647-653.

Ostergaard, M., Rasmussen, H.H., Nielsen, H.V., Vorum, H., Orntoft, T.F., Wolf, H. and Celis, J.E. (1997) Proteome profiling of bladder squamous cell carcinomas: identification of markers that define their degree of differentiation. Cancer Res. 57: 4111-4117.

Steiner, S., Wahl, D., Varela, M.C., Aicher, L. and Prieto, P. (1995) Protein variability in male and female Wistar rat liver proteins. Electrophoresis 16: 1969-1976.

第 十 一 章 ”蛋白质 组 分 析 在 药物 开发 和 毒 理 学 中 的 应 用 189 -

Steiner, S., Aicher, L., Raymackers, J., Meheus, L., Esquer-Blasco, R., Anderson, N. and Cordier, A. (1996) Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein calbindin-D 18 kDa in rat kidney. Biochem. Pharmac. 51: 253-258.

Tobias, J.W., Shrader, T.E., Rocap, G. and Varshavysky, A. (1991) The N-end rule in bacteria. Science 254: 1374-1377.

VanBogelen, R.A., Kelley, P.M. and Neidhardt, F.C. (1987) Differential induction of heat shock, SOS, and oxidation stress regulons and accumulation of nucleotides in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 26—32.

VanBogelen, R.A., Abshire, K.Z., Moldover, B., Olson, E.R. and Neidhardt, F.C. (1997) Escherichia coli proteome analysis using the gel-protein database. Electrophoresis 18: 1243-1251.

Wang, S., Miura, M., Jung, Y., Zhu, H., Gagliardini, V., Shi, L., Greenberg, A.H. and Yuan, J. (1996) Identification and characterization of Ich-3, a member of the interleukin-| beta convert- ing enzyme (ICE)/Ced-3 family and an upstream regulator of ICE. J. Biol. Chem. 271: 20 580- 20 587.

Weissbach, H. and Brot, N. (1991) Regulation of methionine synthesis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5: 1593-1597.

Witzmann, F.A., Daggett, D.A., Fultz, C.D., Nelson, S.A., Wright, L.S., Kornguth, S.E. and Siegel, F.L. (1998) Glutathione S-transferases: two-dimensional electrophoretic protein markers of lead exposure. Electrophoresis 19: 1332-1335.

第 十 二 音 ”只 苗 体 抗体 作为 和 蛋白质 组 学 研究 工具

Kevin Pritchard, Kevin S. Johnson and Ulla Valge-Archer 1. HAMAS ATE 1.1 HT EST 数据 库 的 蛋白 质数 据

为 了 更 详尽 地 理解 基因 的 生物 学 功能 ， 人 们 在 基因 组 测序 方面 付出 了 巨大 的 努力 。 尽管 全 长 序列 数据 库 在 不 断 增 长 ， 但 更 多 的 有 用 信息 来 源 于 被 称 为 表达 序列 标签 (EST) 的 短 DNA 序列 (Adams et oz .，1991)， 尽 管 是 一 些 片段 ， 但 它们 却 可 能 代表 了 人 类 表达 基因 组 的 大 部 分 。 解 释 这 些 数据 的 生物 学 相关 性 是 一 个 挑战 ， 它 远 比 DNA 序 列 测定 的 难度 大 。 很 明显 ， 我 们 需要 了 解 EST 所 编码 的 蛋白 质 的 表达 谱 ， 以 作为 功能 研究 的 线索 。 因 而 ， 现 在 基因 组 测序 的 努力 与 建立 和 描述 更 为 复杂 的 蛋白 质 组 目录 的 努 力 同 时 进行 。

当前 ， 蛋 昌 质 组 学 着 重 依赖 于 两 项 互补 的 的 技术 ， 即 二 维 凝 胶 电 泳 和 质谱 ， 从 选择 的 组 织 和 器 官 中 显示 、 鉴 定 代表 部 分 蛋白 质 组 的 蛋白 质 ， 并 编 算 蛋白 质 目录 。 按 照 这 一 途径 ， 研 究 者 从 级 分 的 蛋白 质 找 到 其 相应 的 DNA 序列 。 这 一 方法 的 局 限 性 在 于 建立 的 数据 库 具 有 严重 的 偏 性 ， 其 中 高 丰 度 的 蛋白 质 出 现 频率 高 。 和 DNA 和 RNA 不 同 ， 蛋 ARERR He. RA BRAKE SAR RM AS, We, BARE MTS 全 的 蛋白 质 组 。

还 有 另外 一 种 基于 DNA 序列 数据 而 制备 蛋 日 质 特 异 探 针 的 方法 ， 利 用 这 些 探 针 可 以 鉴定 特定 的 和 蛋白， 研究 其 在 细胞 提取 物 、 完 整 细胞 、 组 织 以 及 活 的 有 机 体 中 的 功能 。 与 传统 的 方法 相 比 ， 这 种 靶 向 性 的 方法 很 可 能 可 以 更 快 地 产生 全 面 、 有 用 、 可 解释 的 数 据 。 利 用 靶 癌 分 子 探 针 进行 蛋白 质 组 的 分 析 依 赖 于 与 基因 组 计划 相 匹 配 的 制备 特异 性 探 针 的 速度 和 规模 。 下 面 我 们 将 描述 如 何 通过 鸣 菌 体 抗体 库 实 现 这 一 想法 。

鸣 菌 体 展 示 技 术 (Barbas et al., 1991; McCafferty et al., 1990) 是 惟一 一 种 在 数 量 和 速度 上 有 能 力 产生 满足 能 处 理 基 因 组 测序 计划 所 产生 的 信息 流 的 特异 性 抗体 制备 技 术 。 传 统 的 方法 ， 如 二 维 电 泳 ， 是 利用 一 般 的 染色 剂 检 测 和 蛋白质， 而 特异 性 的 探 针 ， 如 eB ASA, WU ATLA EM Western 印迹 到 完整 生物 体 的 几乎 任何 生物 学 环境 中 揭示 和 量 化 特异 蛋白 。 我 们 将 描述 如 何 高 通 量 地 实现 这 一 想法 的 计划 ， 即 ProAbIY 计 划 。 其 独特 之 处 在 于 ProAbI 方 法 不 像 斑 点 印迹 和 二 维 电泳 那样 从 提取 物 中 分 析 蛋 白质 的 表达 ， 而 是 从 组 织 学 水 平 上 直接 分 析 蛋 白质 的 表达 ， 因 此 ， 可 以 积累 组 织 、 细 胞 及 亚 细 胞 水 平 上 fe FEE A AY oP A A

蛋白 质 并 不 是 孤立 地 起 作用 ， 而 是 与 其 他 蛋白 及 小 分 子 配 体 相 互 作 用 而 发 挥 功能 。 从 关联 蛋白 及 多 分 子 蛋白 复合 体 拓 扑 学 得 到 的 信息 常常 是 了 解 蛋白 质 功 能 的 关键 。 我 们 将 描述 一 种 被 称 之 为 ProxiMolIX 的 技术 ， 通 过 这 项 技术 可 以 获得 针对 靶 分 子 的 特异 抗

第 十 二 章 ， 噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 is

体 ， 而 此 项 技术 的 关键 是 识别 靶 分 子 的 导向 分 子 ， 这 些 导向 分 子 可 以 是 任何 一 种 类 型 的 配 体 分 子 (Osbourn et al .，1998) 。ProxiMolIM 技 术 为 我 们 提供 了 获得 一 种 蛋白 质 特异 抗体 的 方法 ， 这 种 方法 并 不 需要 从 其 天 然 状 态 中 纯化 和 克隆 靶 和 蛋白 。 而 且 ， 识 别 蛋 白质 表 位 的 一 种 抗体 原则 上 可 被 用 作 导 向 分 子 ， 进 而 获得 一 组 新 抗体 ， 其 中 一 些 抗体 分 子 其 至 具有 针对 抗原 的 直接 功能 ， 如 中 和 配 体 的 结合 作用 。 这 一 项 技术 具有 巨大 的 潜力 ， 因 为 目标 蛋白 分 布 的 原始 数据 很 快 就 可 以 得 到 来 自 于 细胞 和 组 织 功能 分 析 数 据 的 印证 。

1.2 抗体 是 蛋白 质 特异 分 子 探 针 的 合理 选择

数 十 年 来 ， 从 动物 中 获得 的 抗体 是 生物 化 学 研究 中 不 可 缺少 的 工具 ， 并 且 是 多 功能 的 试剂 ， 它 们 可 用 于 特异 、 灵 敏 、 定 量 地 检测 组 织 和 提取 物 中 的 蛋白质 。 它 们 可 以 揭示 特定 蛋白 在 组 织 中 的 亚 细 胞 定位 ; 并 且 通 过 阻止 它 所 识别 的 目标 蛋白 与 其 天 然 配 体 的 结 合 可 以 证 实 这 些 目标 蛋白 特异 的 生物 学 功能 。 从 功能 基因 组 学 到 蛋白质 组 学 ， 抗 体 都 具 有 巨大 的 应 用 潜力 ， 因 为 基于 叭 菌 体 展示 (McCafferty et al., 1990) 而 产生 抗体 的 新 技术 可 以 高 通 量 、 自 动 化 地 产生 高 质量 的 抗体 试剂 ， 以 满足 对 基因 组 计划 所 产生 的 大 量 潜在 靶 和 蛋白 研 究 的 需要 。 下 一 节 将 概述 这 些 方法 ， 它 们 将 构成 基于 抗体 的 功能 基因 组 学 研究 平台 的 基础 。

1.3 关键 技术 概观

噬菌体 展示 抗体 ”抗体 的 功能 结构 域 可 以 被 展示 在 丝 状 叹 菌 体 的 表面 (McCafferty et al., 1990; Winter and Milstein ，1991)。 大 的 叭 菌 体 抗体 库 (>10!! sequences) 包 含 能 结合 任何 给 定 抗 原 的 高 亲和力 抗体 (Vaughan et wz .，1996)。 编 码 抗体 的 基因 被 包 庄 在 唆 菌 体 颗粒 中 ， 这 样 就 将 抗体 的 特异 性 与 其 基因 序列 联系 起 来 。 通 过 目标 抗原 的 亲 和 作用 从 叹 菌 体 抗 体 库 中 筛选 所 要 的 特异 性 抗体 。 因 此 ， 叹 菌 体 库 相 当 于 一 个 体外 免疫 系统 。 而 传统 的 免疫 方法 则 需要 整体 动物 (每 种 抗原 至 少 一 只 动物 )， 用 数 周 的 时 间 ， 通过 多 次 免疫 才能 使 免疫 系统 产生 出 有 用 的 抗体 。 与 传统 的 免疫 方法 相 比 ， 叭 菌 体 展 示 系统 是 一 种 体外 系统 ， 产 生 抗 体 只 需要 几 天 的 时 间 。 因 此 ， 鸣 菌 体 展 示 技 术 是 一 种 最 有 效 的 制备 抗体 的 方法 。

噬菌体 作为 试剂 ”展示 抗体 功能 结构 域 的 噬菌体 颗粒 被 常规 地 用 于 ELISA 检测 、 免疫 细胞 化 学 (ICC)、 流 式 细 胞 术 及 其 他 的 一 些 筛选 技术 。 由 于 不 需要 进行 蛋白 质 纯 , Ak, AKO YT HEME.

高 通 量 地 产生 抗体 ”利用 叭 菌 体 展示 技术 ， 抗 体 的 分 离 可 以 在 一 个 工作 周 中 完成 。 将 抗原 排列 在 微 孔 板 中 ， 可 以 手工 完成 针对 数 百 种 不 同 抗原 的 抗体 筛选 。 叭 菌 体 展示 技 术 易 于 自动 化 ， 其 产生 抗体 的 速度 完全 可 以 应 付 DNA 序列 数据 库 中 现存 的 大 量 DNA 序列 。

抗原 在 ProAbry 技 术 中 联系 着 基因 序列 和 和 蛋白质 经 过 筛选 从 EST 序列 中 找 出 感 兴趣 的 序列 。 肽 序列 由 特定 的 可 读 框 所 决定 ， 其 相应 的 抗原 肽 在 96 孔 板 中 由 自动 合 成 仪 自动 全 成。 之后， 这些 抗 原 被 用 于 所 期 望 的 特异 性 抗体 的 筛选 。 来 源 于 DNA 数据 库 中 的 信息 被 直接 用 于 产生 表达 序列 的 抗体 探 针 ， 而 不 需要 全 长 DNA 序列 ， 也 不 需要 和 蛋 白 质 抗原 的 表达 。

te ER DR ER RE ER ee ee ni。

ee | 蛋白 质 组 学

抗原 : 通过 ProximolIY 技 术 探测 未 克隆 的 蛋白 质 及 其 关联 者 。 特 异 识别 完整 细胞 或 组 织 中 蛋白 质 的 叹 菌 体 抗 体 可 以 被 分 离 出 来 ， 但 是 ， 如 何 进 行 针 对 完整 细胞 或 其 他 多 蛋 白 分 子 复合 物 中 的 一 种 特定 靶 分 子 的 筛选 ? 只 要 存在 任何 一 种 导向 分 子 ， 一 种 被 成 为 ProximolIX 的 技术 就 可 以 拯救 特异 识别 导向 分 子 结合 的 靶 分 子 或 其 关联 者 的 噬菌体 。

抗原 : 解决 自身 耐 受 问题 鸣 菌 体 展示 系统 绕 过 免疫 系统 。 那 些 针对 自身 抗原 (a 括 序 列 完全 保守 的 抗原 ) 的 抗体 都 可 以 直接 从 噬菌体 抗体 库 中 分 离 出 来 (Griffiths et - aj .，1993)。 从 我 们 的 人 源 抗体 库 中 分 离 识 别人 蛋白 的 抗体 还 从 来 没有 失败 过 。

检测 蛋白 表达 及 其 细胞 分 布 ICC 能 够 展示 蛋白 质 在 细胞 和 组 织 中 分 布 的 精细 画 面 。 而 目前 面临 的 挑战 是 如 何 高 通 量 地 进行 ICC 分 析 ， 因 为 要 解释 这 些 数据 需要 专门 的 知识 ， 并 且 可 视 的 结果 和 解释 必须 被 存放 于 易于 进入 且 用 户 界 面 友好 的 数据 库 中 。

生物 信息 学 推动 这 一 进程 ”在 过 去 ， 个 别 的 科学 家 很 容易 理解 和 解释 低 通 量 的 技术 所 产生 的 信息 流 。 而 现在 ， 没 有 复杂 的 生物 信息 学 工具 ， 没 有 人 能 够 处 理 大 量 而 复杂 的 数据 。 从 EST 到 ICC 图 ， 整 个 发 现 过 程 都 需要 生物 信息 学 的 专门 知识 。

2. 噬菌体 抗体 库 的 构建 和 应 用 2.1 抗体 片段 在 噬菌体 上 的 展示

功能 抗体 片段 可 融合 于 叹 菌 体 次 要 外 壳 蛋 日 g3p 的 N 末端 而 展示 于 丝 状 叹 菌 体 的 表面 。 大 多 数 的 噬菌体 颗粒 仅 展 示 不 超过 一 种 的 抗体 拷贝 (McCaffery et al., 1990). MAKE RnR RA BRA SA (SC-Fv)， 由 IgG 的 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 (Va 和 Vi) 构成 ， 中 间 通 过 柔性 的 连接 肽 连接 。 编 码 抗体 结构 域 的 DNA 序 列 可 以 被 克隆 到 喉 菌 体 基 因 组 中 (一 种 喉 菌 体 载体 ); 然而 ， 人 们 一 般 更 喜欢 选用 鸣 菌 粒 载体 ， 因 为 噬 菌 粒 载体 易于 操作 ， 并 且 转 化 效率 高 。( 鸣 菌 粒 是 一 种 质粒 ， 带 有 质粒 和 噬菌体 两 种 复制 起 点 。) 这 一 章 描述 的 工作 采用 鸣 菌 粒 载体 PCANTAB6 (McCafferty etal., 1994) 和 M13 噬菌体 (Yanisch et al .，1985)。 具 体操 作 可 参考 更 好 的 操作 手 Wt (Kay et al., 1996; McCaffery et al., 1996).

2.2 抗体 库 的 构建

人 淋巴 细胞 是 理想 的 IgGs 的 Va 和 Vi DNA 序列 的 来 源 (图 12.1)。 利 用 引物 家 族 ， 通 过 PCR 方法 扩 增 抗体 的 可 变 区 结构 域 (Marks et al., 1991). Vo 和 Vi 基因 序 列 再 通过 组 装 PCR 连接 成 完整 的 scFv 抗体 DNA 序列 。Va 和 Vi 随机 配对 ， 非 天 然 的 配对 增加 了 抗体 库 的 功能 多 样 性 。scFv 抗体 DNA 序列 通过 PCR 进行 扩 增 ， 同 时 在 引 ” 物 中 引入 限制 酶 切 位 点 ， 以 利于 将 其 克隆 到 噬 菌 粒 载体 中 。 连 接 到 噬 菌 粒 载体 中 后 ， 通 过 电 穿 孔 法 转化 E. coli. EHD RAR, MRA DNA RAR, KM FEMA PAY Ue Ba ALAR 7B ek ARSE (McCaffery et al., 1996).

2.3 库 的 大 小 和 多 样 性

特异 性 和 亲 和 人 性 是 任何 抗体 都 有 的 品质 。 库 越 大 ， 它 包含 一 种 具有 高 亲和力 、 高 特 异性 抗体 的 几率 越 大 (Perelson and Oster，1979)。 尽 管用 于 抗体 库 构 建 的 供 体 细胞 被

第 十 二 章 ” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 "193 ，

构建 102 库 容量 的 抗体 库

全 ee oD 33)

— = PCR #34 VH 43 个 未 免疫 的 i 7~70 岁 供 者 D> avian bug ' i Se @ @ VH Tv VL 基 因 抗体 展示 库 分 离 的 B 细 胞 的 组 装

12.1 构建 吗 菌 体 抗体 库 的 原理 编码 人 抗体 抗原 结合 域 的 DNA 被 包装 于 噬菌体 颗粒 中 ， 这 种 噬菌体 颗粒 能 够 在 其 末端 展示 具有 功能 的 抗体 蛋白 。 这 种 抗体 的 抗原 结合 特异 性 和 亲和力 可 用 于 分 离 其 相应 的 抗原 。

描述 为 非 免疫 的 ， 但 人 具有 的 巨大 的 V- 基 因 库 仍然 是 经 过 繁殖 剔除 的 ， 这 些 细胞 一 直 接触 许多 不 同 种 类 的 抗原 。 人 B 细胞 可 以 产生 针对 自身 抗原 的 抗体 ， 而 这 些 抗原 是 人 正常 的 蛋白 ， 这 些 细 胞 克隆 在 免疫 系统 监视 下 被 剔除 ， 但 是 这 种 局 限 性 在 噬菌体 抗体 技 术 中 并 不 存在 。 人 源 抗 体 库 能 够 产生 至 今 为 止 所 试验 的 针对 任何 一 种 抗原 的 抗体 。 一 个 库容 量 超过 10° 克隆 的 抗体 库 (Vaughan et al., 1996) 被 用 于 制备 针对 各 种 不 同 种 类 PUR scFv, FFA ARH RAPER A RAD. RAE, KPA SA 亲和力 超过 108M AVES PPA el PPAR TRAY sFv， 有 的 甚至 达到 10°M', KML 作 表 明 ， 通 过 叭 菌 体 抗 体 技术 产生 的 抗体 的 亲和力 和 通常 通过 免疫 方法 制备 的 抗体 的 亲 和 力 一 样 高 (Foote and Eisen，1995)。 尽 管 随 着 库容 量 的 增 大 ， 从 统计 学 角度 验证 抗体 品质 的 提高 将 更 加 费力 ， 但 经 验证 明 ， 与 一 个 小 库 相 比 ， 从 一 个 更 大 的 库 中 更 容易 筛选 到 高 亲和力 的 抗体 。 此 外 ， 检 测 高 于 100M-:I! 的 亲和力 从 技术 上 变 得 更 具 挑 战 性 。 当 前 ， 作 者 所 知道 的 最 大 的 库 包含 有 102 以 上 不 同 序列 。 但 构建 这 样 一 个 库 可 不 是 一 项 简 单 的 工作 。

2.4 从 鸣 菌 体 抗体 库 中 筛选 特异 抗体

最 基本 的 原则 就 是 亲 和 捕 获 。 被 包 庄 在 叹 菌 体 颗 粒 中 编码 抗体 的 基因 序列 决定 所 展 示 的 scFv 的 特异 性 ， 通 过 亲 和 捕 获 ， 蛋 白质 和 基因 被 同时 选择 。

对 纯化 抗原 进行 的 萍 选 ”被 广泛 采用 的 筛选 技术 是 淘 洗 。 抗 原 被 包 被 在 固 相 表 面 ， 如 微 孔 板 ， 然 后 ， 加 入 鸣 菌 体 抗体 库 与 抗原 温 育 。 经 淘 洗 之 后 ， 留 下 那些 表面 展示 有 能 力 结合 目标 抗原 的 抗体 的 噬菌体 。 将 特异 噬菌体 感染 的 E.coli 进行 繁殖 ; 将 细菌 培养 在 培养 板 上 使 之 形成 克隆 ， 每 个 克隆 来 源 于 一 个 细胞 ， 产 生 一 种 单 克 隆 抗 体 。

对 抗原 复合 物 进 行 的 簿 选 ” 叭 菌 体 抗体 库 常 被 用 于 对 整个 细胞 或 亚 细 胞 组 份 如 膜 制 备 物 进行 抗体 筛选 ， 也 能 够 获得 单 克 隆 的 sFv， 但 是 ， 这 种 使 用 抗原 复合 物 进行 的 筛 选 将 导致 难以 确定 筛选 抗体 的 特异 性 。ProxiMolIy 技术 〈 见 后 ) 的 出 现 克服 了 这 一 困 难 。

。 194 + 和 蛋白质 组 学

2.5 高 通 量 的 筛选

从 叭 菌 体 抗 体 库 中 筛选 抗体 的 程序 很 简单 ， 操 作 的 体积 也 很 小 (100w)， 并 且 可 在 多 孔 微 板 中 并 行进 行 。 不 同 的 抗原 分 别 被 包 被 在 不 同 的 微 孔 中 ， 一 些 早 期 的 手工 实验 可 ”在 一 个 微 孔 板 中 同时 筛选 针对 83 种 不 同 抗原 的 抗体 。 大 多 数 的 药物 研究 实验 室 采 用 96 孔 或 是 384 孔 板 ， 用 机 器 人 进行 自动 化 操作 。 同 样 地 ， 商 业 化 的 现货 供应 类 的 生产 工厂 (如 Tecan 和 GRI) 一 周 能 够 分 离 多 达 针 对 200 种 不 同 抗原 的 抗体 。

2.6 作为 试剂 的 噬菌体 抗体

展示 scFv 的 叹 菌 体 颗粒 是 研究 的 有 用 工具 。 在 基因 组 水 平 上 ， 研 究 和 发 现 大 量 靶 蛋白 需要 尽 可 能 高 通 量 地 制备 相应 的 试剂 ， 而 噬菌体 抗体 就 满足 了 这 种 需要 。 下 面 我 们 将 描述 如 何 从 鸣 菌 体 抗体 库 中 方便 地 获得 可 溶性 的 抗体 蛋白 ; 然而 ， 我 们 要 强调 的 是 ， 在 所 有 的 上 游 检 测 分 析 中 ， 这 种 噬菌体 形式 的 抗体 都 具有 较 好 的 应 用 。 鸣 菌 体 抗体 已 被 成 功用 于 蛋 白 质 、 多 肽 、 完 整 细胞 及 亚 细 胞 组 份 的 ELISA 检测 、 流 式 分 析 和 免疫 细胞 化 学 分 析 (ICC). Mit ba AR BU EB bse EA g8p Air 3000 多 个 拷贝 ， 因 此 ， 抗 噬菌体 的 抗 血清 可 以 高 灵敏 度 地 检测 结合 到 目标 抗原 上 的 喉 菌 体 。 在 接种 辅助 吹 菌 体 后 ，96 孔 板 中 的 E.coli 培养 上 清 可 被 直接 用 作 试 剂 (McCafferty et al., 1996 )。

2.7 来 源 于 鸣 菌 体 库 中 的 可 溶性 抗体

scFv 的 应 用 ”一般 地 ， 最 快 的 获得 数据 的 方式 就 是 采用 鸣 菌 体 颗粒 直接 进行 检测 。 然而 ， 在 目的 蛋白 的 下 游 研 究 实 验 中 ， 最 好 还 是 采用 可 溶性 的 scFv 蛋白。 如 亲和力 和 动力 学 的 测定 、 细 胞 中 和 实验 以 及 活体 研究 。 也 许 还 有 一 些 其 他 的 过 程 ， 在 这 些 过 程 中 应 用 大 的 叭 菌 体 颗粒 将 会 阻碍 它 向 抗原 的 扩散 。 而 且 ， 鸣 菌 体 的 大 小 限制 了 抗体 的 最 大 浓度 约 为 10nmolML (6 x 102 phage/ml)。 不 论 在 活体 还 是 体外 ，scFv 被 证 明 是 主要 的 细胞 生物 学 研究 的 良好 试剂 。 下 面 的 部 分 将 会 说 明 如 何 制 备 可 以 满足 实验 需要 的 scFv (ug>mg )。

大 量 地 制备 scFv ”满足 检测 用 量 的 scFv 可 以 在 不 离开 多 孔 板 的 情况 下 直接 表达 。 为 了 诱导 可 溶性 scFv 表达 到 细菌 的 外 周 腔 中 ， 含 有 pCANTAB 质粒 的 细胞 克隆 用 IPTG 诱导 表达 ， 表 达 的 scFv 将 会 部 分 地 泄漏 到 培养 液 中 ， 特 别 是 在 过 夜 诱 导 表 达 之 后 。 多 年 的 经 验证 明 ， 这 一 简单 方案 适合 于 检测 分 析 (McCafferty et al., 1996).

更 多 的 scFv 可 通过 标准 程序 裂解 细胞 ， 从 细菌 的 外 周 质 中 获得 。 细 菌 的 外 周 质 提 取 物 可 直接 用 于 许多 分 析 工 作 。 而 且 ，pCANTAB 质粒 载体 在 scFv 的 C 末端 还 加 了 一 个 含 6 个 组 氨 酸 残 基 的 小 肽 标签 ， 因 此 ， 表 达 的 scFv 很 容易 通过 固 相 金属 亲 和 层 析 (IMAC) 进行 纯化 。 而 IMAC 磁 珠 (Qiagen) 使 得 从 96- 孔 板 中 分 离 scFv 变 得 更 加 方 便 、 快 捷 。

若 需要 100pg 到 mg 级 的 scFv 〈 如 体外 研究 )， 则 需要 扩大 到 摇 瓶 进行 培养 。 通 过 IMAC 纯化 的 scFv 的 量 可 以 适合 于 大 多 数 的 分 析 ; 如 果 需 要 ， 通 过 简单 的 凝 胶 过 滤 可 以 得 到 纯度 90% 的 scFv.

第 十 二 章 ”噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 195 -

“2.8 LA IgG 的 形式 表达

完整 的 IgG 分 子 比 scFv 具有 更 长 的 药 代 动 力学 半衰期 ， 并 且 是 非常 稳定 的 蛋白 质 。 因此 ，IgG 也 许 是 体内 或 体外 用 于 长 期 研究 较 合适 的 抗体 形式 。 鸣 菌 体 形式 展示 的 抗体 很 容易 被 克隆 到 IgG 载体 中 ， 因 此 ， 研 究 用 的 IgG 可 以 直接 用 于 生产 治疗 用 的 IgG。 已 经 证 明 ， 有 许多 方法 可 用 于 从 哺乳 动物 细胞 中 表达 区 克 到 克 级 的 人 源 IgG。 这 使 得 “从 基因 到 临床 ”的 计划 变 为 现实 。

3. 喉 菌 体 抗体 在 功能 基因 组 研究 中 的 应 用 3.1 “ProAb™” 方法

维持 基因 组 测序 计划 的 巨大 资源 和 巨大 的 蛋白 质 组 数据 库 的 出 现 ， 主 要 是 由 于 人 们 认为 为 下 一 代 药 物 计 划 而 发 现 新 的 靶 蛋 白 将 会 很 快 获 利 。 从 制药 企业 和 医学 研究 的 观点 看 ， 对 任何 新 蛋白 最 有 兴趣 的 信息 就 是 在 某 种 疾病 状态 下 ， 在 某 些 特殊 的 组 织 中 ， 它 的 丰 度 有 明显 的 变化 。 合 乎 理想 的 情况 是 研究 者 喜欢 通过 高 通 量 的 方法 将 基因 的 表达 和 疾 病 的 指 征 相 联系 。 这 就 是 ProAb 计划 的 主题 思想 。 这 一 过 程 的 示意 图 见 图 12.2。 其 策 略 是 将 EST 序列 翻译 成 多 肽 抗原 ， 用 这 些 多 肽 抗原 筛选 噬菌体 抗体 ， 这 些 抗体 可 用 于 在 ICC 中 检测 相应 的 蛋白 质 抗 原 。

这 样 ，ProAb 计划 就 成 为 从 EST 到 疾病 相关 性 的 可 能 的 最 直接 途径 。 下 面 的 说 明 描述 了 高 通 量 实 现 这 一 过 程 的 技术 步骤 。

ProAbIM 概 览

人 基因 组

TYR

12.2) MA ProAbIY 方 法 到 功能 基因 组 的 原理 从 EST 数据 库 中 发 掘 出 来 的 感 兴趣 的 DNA 片段 被 翻译 成 蛋 白质 。 通 过 化 学 合成 法 合成 一 些 肽 段 来 代表 这 种 蛋白 质 的 序 列 。 作 为 抗原 ， 这 些 肽 段 被 用 于 筛选 噬菌体 抗体 。 这 些 被 科 选 出 来 的 抗体 可 用 作 免 疫 细胞 化 学 检测 试剂 以 显示 正常 或 疾 病 组 织 中 这 种 基因 表达 产物 的 分 布 和 丰 度 。

3.2 采用 生物 信息 学 方法 了 解 EST 的 意义

EST 是 当今 最 丰富 的 DNA 序列 资源 。 如 在 dbEST 数据 库 (Boguski et al., 1993) 中 ， 有 超过 105 的 EST 序列 ， 因 此 ， 理 论 上 ， 从 统计 学 的 角度 看 ， 在 EST 数据 库 中 应 该 包含 有 几 倍 元 余 的 开放 阅读 框架 。 然 而 ， 很 明显 提高 这 一 发 现 过 程 的 产量 应 该 优先 选

aga Se Tc

- 196 - A RA

择 一 些 EST 序列 进入 该 程序 。 最 好 的 策略 就 是 瞄准 一 种 具有 令 人 感 兴趣 的 生物 学 功能 的 已 知 蛋白 〈 并 且 ， 最 好 结构 已 知 )， 去 寻找 这 一 家 族 的 其 他 成 员 〈( 见 3.6)。 如 果 已 经 、 找到 感 兴趣 的 EST， 就 应 该 选择 其 抗原 有 天。 有效 的 选择 方法 能 提高 成 功率 。 抗 原 肽 的 决定 取决 于 设计 用 于 预测 抗原 肽 可 能 性 的 算法 而 得 来 的 权重 指数 ， 包 括 天 然 样 结构 ， 天 然 蛋白 的 溶剂 可 接近 程度 和 抗体 易 结 合 的 序列 特征 。 生 物 信息 学 参与 这 一 过 程 的 第 一 步 ， 即 确定 哪 一 段 EST 序列 所 翻译 的 特异 肽 段 能 代表 这 一 蛋白 质 。

3.3 合成 抗原

预测 的 抗原 肽 序列 可 以 采用 上 自动 % 孔 固 相 多 肽 合成 仪 (Advanced Chem Tech) 进 行 合成 ， 此 合成 仪器 采用 fmoc 化 学 法 在 微 摩 尔 水 平 上 (5 一 100mg 产物 ) 进行 。 这 一 步 ， 应 该 寻找 那些 少数 的 合成 有 疑问 的 肽 序列 (基于 经 验 )。 通 常 ，15 个 氨基 酸 残 基 的 肽 段 是 合适 的 ， 但 是 ， 事 实 上 ， 更 长 的 肽 〈 如 30 ARBRE) 也 可 以 通过 自动 合成 仪 高 产量 的 合成 。 一 些 翻译 后 的 修饰 (如 磷酸 化 )， 也 可 以 在 合成 肽 中 实现 。 合 成 结束 后 ， 合成 的 肽 被 去 保护 ， 并 被 从 珠 体 上 切 下 ， 然 后 ， 通 过 沉 深 法 使 之 与 合成 试剂 分 离 。 洗 涤 后 的 沉淀 被 重新 溶解 ， 每 一 合成 肽 再 通过 反 相 色谱 和 电 喷 雾 质 谱 进行 质量 控制 ， 以 确保 用 作 抗 原 的 合成 肽 纯度 大 于 85% 。 将 液 一 质 系统 与 生物 信息 系统 相连 ， 根 据 预 测 的 肽 的 分 子 量 检查 合成 肽 的 氨基 酸 序 列 。 合 成 的 抗原 肽 的 N 端 常常 为 半 胱 氨 酸 残 基 ， 以 便 使 其 可 以 方便 地 连接 到 载体 蛋 日 质 上 。 这 样 有 利于 截断 的 合成 产物 不 会 污染 抗原 肽 〈 肽 的 合成 从 C 末端 开始 )。N 端的 生物 素 化 也 是 基于 同样 的 原因 。 载 体 蛋 白 常 常 是 牛 血清 白 和 蛋白， 其 赖 氨 酸 残 基 可 以 被 双 功 能 交 联 剂 (succinimide maleimide ) 所 活化 。SDS- PAGE 和 MALDI 质谱 常用 于 检查 蛋白 质 的 交 联 效率 。 一 般 地 ， 每 个 蛋白 交 联 20 一 30 肽 是 理想 的 。 值 得 提 及 的 是 ， 一 个 商业 用 途 的 机 器 可 以 合成 高 质量 肽 的 数量 是 空前 的 (每 周 多 达 300 个 )。 这 一 成 果 是 通过 优化 软件 、 优 化 交 联 时 间 以 及 精心 选择 化 学 方法 及 | 高 质量 的 化 学 合成 试剂 而 取得 的 。

3.4 高 通 量 筛 选 识别 肽 抗原 的 噬菌体 抗体

最 基本 的 筛选 方法 就 是 上 面 所 描述 的 (〈 见 2.4) 淘 洗 。 肽 -蛋白 质 交 联 物 被 包 被 到 96 孔 微 板 上 ， 特 异 抗体 的 筛选 程序 如 上 面 所 述 ( 见 2.4 ,2.5)， 但 不 同 的 是 高 通 量 筛选 过 程 ， 包 括 筛选 、 结 合 叹 菌 体 的 洗 脱 、 感 染 、 克 隆 挑选 、 克 隆 在 96 孔 板 中 的 排列 、 抗 原 肽 特异 抗体 的 ELISA 检测 等 过 程 全 部 由 商用 机 器 人 自动 完成 。 这 意味 抗体 的 产生 不 再 是 限 速 步骤 。 一 般 地 ， 每 个 肽 序列 挑选 12 个 抗体 克隆 。 由 线性 编码 ， 通 过 生物 信息 学 系统 将 阳性 克隆 和 EST 序列 联系 起 来 。 在 抗体 选择 的 最 后 阶段 ，ELISA 检测 阳性 的 E.coli 被 置 于 甘油 中 ， 在 - 707 保存 。

3.5 高 通 量 的 ICC 分 析

ICC 分 析 是 阑 明 抗原 与 疾病 相关 性 的 理想 技术 。 与 斑点 印迹 和 二 维 电泳 不 同 ， 这 两 项 技术 必须 将 组 织 磨 碎 并 溶解 ， 而 ICC 技术 则 保持 了 和 蛋白质 在 细胞 中 的 分 布 。 与 将 所 有 细胞 匀 浆 而 产生 的 平均 效果 不 同 ，ICC 技术 可 以 显示 蛋白 质 在 细胞 水 平 上 的 差别 。 也 许 有 人 会 问 ， 这 样 一 项 能 够 提供 丰富 信息 的 技术 为 什么 没有 被 广泛 采用 ? 问题 可 能 在 于 高

第 十 二 章 ， 只 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 aati

通 量 地 进行 此 项 技术 操作 存在 明显 的 困难 。 当 然 ， 要 想 每 月 完成 1000 个 样品 ， 有 许多 困难 需要 克服 。 在 下 面 一 些 领域 应 付出 特别 的 努力 。

获取 组 织 ”与 保存 各 种 不 同 组 织 的 临床 中 心 保 持 联 系 是 非常 重要 的 ; 这 些 组 织 在 取 材 之 后 必须 立即 进行 保存 。 然 而 ， 当 组 织 中 目标 mRNA 序列 所 剩 无 几时 ， 应 时 常用 蛋 白质 试剂 检测 组 织 中 的 抗原 。

理想 的 过 程 ”为 了 提高 产量 ， 被 仔细 挑选 出 来 的 各 种 不 同 的 组 织 在 被 切片 之 前 ， 被 切割 并 被 包装 起 来 。 除 提高 速度 之 外 ， 还 增加 了 过 程 的 一 致 性 ， 由 于 确保 了 一 批 中 不 同 的 组 织 被 进行 完全 相同 的 处 理 ， 使 得 不 同 组 织 间 易 于 比较 。 为 了 保持 抗原 性 ， 在 切 法 和 石蜡 包 埋 切 片 法 时 常常 优先 采用 王 切 法 ; 用 冷 丙 酮 的 温和 固定 方法 优先 于 交 联 固定 方 we

在 ICC 中 使 用 噬菌体 抗体 ICC H, MAKKAH RE AZ lal OH %, 96 孔 板 中 的 克隆 上 清 可 直接 用 于 标记 组 织 切片 。

me ICC 样本 ”当前 还 没有 什么 可 以 替代 人 类 的 专门 知识 来 解释 染色 的 图 案 。 团 队 的 方式 是 必须 的 。 在 预 筛 选中 ， 引 起 注意 的 图 案 被 挑选 出 来 ， 必 须 再 经 过 有 经 验 的 组 织 化 学 家 作 进 一 步 的 检查 ; 必须 有 一 个 可 交互 检查 解释 的 可 追踪 的 系统 。 记录 数据 与 显微镜 相连 的 数字 相机 可 以 拍摄 很 好 的 图 像 ， 这 些 图 像 被 存 于 数据 库 中 。 如 果 没 有 专家 的 解释 所 拍摄 的 图 像 几乎 没有 什么 用 处 ， 只 有 有 经 验 的 细胞 病理 学 家 才能 给 出 专门 的 解释 。

3.6 生物 信息 学 我 们 始终 强调 生物 信息 学 在 ProAbIMi 计 划 的 各 个 阶段 都 非常 重要 。 没 有 一 个 现成 的 软件 是 合适 的 ， 必 须 由 内 部 人 士 自 己 写 专门 的 软件 。 能 概括 所 发 现 的 各 个 方面 的 要 点 是 非常 有 用 的 。 在 发 现 阶 段 生 物 信息 学 的 作用 ”上面 我 们 简要 概括 了 如 何 利 用 生物 信息 学 系统 在 实 验 策 略 中 的 每 一 个 阶段 进行 控制 和 检测 。 下 面 是 流程 : 选择 和 设计 肽 抗原 y 控制 肽 合成 AK -A Fi Jon (BK 从 高 通 量 的 选择 中 记录 阳性 克隆 保存 阳性 抗体 克隆 追踪 抗体 DNA 序列 YY 样本 进行 细胞 免疫 化 学 分 析 记录 图 像 并 进行 语言 描述

- 198 - 和 蛋白质 组 学

选择 和 设计 肤 抗 原 利用 搜索 引擎 ， 由 统计 学 给 出 的 一 个 相关 序列 家 族 的 代表 序列 可 被 用 作 搜 索 EST 数据 库 的 模板 。 这 是 一 种 灵敏 的 发 现 一 个 家 族 中 新 EST 序列 的 方 法 。 这 种 应 用 就 是 Prolemy。

从 ICC 中 记录 图 像 和 进行 语言 解释 ”通过 数字 相机 存储 图 像 。 组 织 病 理学 家 的 解 释 被 记录 下 来 ， 并 由 声音 识别 软件 进行 转录 (Plato)， 然 后 被 编辑 到 注释 系统 中 ， 与 数 据 库 中 的 图 像 一 起 存放 。

生物 信息 学 和 数据 分 析 ProAbIYi 计 划 的 产品 是 一 个 数据 库 ， 在 数据 库 中 研究 者 可 以 从 EST 序列 与 细胞 病理 学 的 相关 模式 中 获得 生物 学 洞察 力 。 这 些 信息 必须 被 组 织 成 一 个 对 非 专 业 人 士 也 是 一 个 界面 友好 的 数据 库 。

应 用 体制 Java 软件 〈 被 称 为 可 移植 性 软件 ) 确保 数据 库 中 各 个 部 分 的 信 息 和 程序 能 够 在 任何 硬件 平台 上 进行 存 取 。 在 可 移植 性 软件 所 提供 的 外 壳 中 ， 各 个 部 分 可 以 通过 CORBA 进行 通讯 。

用 户 界 面 ProAbryw 数 据 库 的 界面 叫 做 Voyager。 一 般 用户 可 以 在 Voyager 界面 中 通过 询问 方式 获取 特定 的 数据 。 要 想 更 深入 地 挖掘 数据 ， 必 须 有 一 个 交互 性 更 好 的 界 面 。 一 种 有 用 的 策略 是 将 ICC 数据 还 原 为 真实 组 织 的 点 印迹 。 组 织 染 色 后 常常 被 分 为 四 个 区 域 ， 即 膜 、 细 胞 质 、 结 缔 组 织 和 非 结缔 组 织 。 这 些 区 域 表 现 为 不 同 颜色 的 点 ， 颜 色 的 深度 被 分 级 ， 反 映 出 组 织 学 家 对 染色 深度 的 评判 。

ProAbIM 数 据 库 在 可 移植 性 软件 框架 内 ， 通过 友好 的 Voyager 用 户 界 面 进行 存 取 是 ProAbIM 数 据 库 所 特有 的 。 这 就 是 Oracle 8 数据 库 ， 它 整合 了 所 有 的 实验 数据 ， 包 括 数字 图 像 文件 、 染 色 图 像 分 析 、 组 织 学 解释 、 从 EST 到 肽 设计 的 数据 追踪 、 每 一 特定 序列 的 合成 和 质量 控制 数据 、 抗 体 分 离 数 据 以 及 与 SWISS-PROT 和 EST 数据 库 的 链 接 。

3.7 “ProAbIM 计 划 的 应 用 实例

在 ProAb 过 程 中 ， 一 些 深入 了 解 的 蛋白 质 被 用 做 内 对 照 ， 这 被 证 实 可 以 有 效 地 鉴 别 正确 的 EST 表达 谱 。

实例 1 一 个 EST 片段 (dbEST number 845032) 被 翻译 成 VRSSSRTPSDKP; 针 对 相应 的 合成 肽 抗原 的 噬菌体 抗体 被 选择 出 来 ; ICC ka CE KAP RARER (A 12.3 (a))。 通 过 Blast 程序 搜索 EST 数据 库 发 现 与 此 肽 序列 匹配 的 CDNA 序列 来 源 于 人 扁桃 体 细 胞 文库 ， 通 过 流 式 分 选 证 明 ， 此 序列 在 生发 中 心 的 B 细胞 中 含量 丰富 。 注 册 人 推定 此 序列 为 人 肿瘤 坏死 因子 前 体 (TNFa)。ELISA 检测 证 明 ， 抗 此 肽 的 抗体 确 实 能 特异 识别 人 天 然 TNFa

实例 2 ” 肽 序列 ESRKLEKGIQVEIY 被 用 于 代表 人 内 皮 细 胞 黏附 分 子 (VCAM-1)， 它 对 应 于 从 脾 cDNA 文库 中 得 到 的 EST 序列 -EST20523。 此 ESTs 序列 被 注释 为 内 皮 细 胞 黏附 分 子 -1 类 似 序列 。 用 选择 得 到 的 抗 此 肽 的 吧 菌 体 抗体 染色 扁桃 体 生发 中 心 ， 结 果 与 报道 的 VCAM-1 在 树 突 状 细胞 上 的 分 布 一 致 (图 12.3 (b))。

第 十 二 章 “” 噬菌体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 * 199 ， 二 EE — _—___

在 扁桃 体 中 TNF-c 特异 染色 在 扁桃 体 中 VCAM 特异 染色

图 12.3 ”利用 ProAbI 方 法 得 到 的 代表 性 结果 通过 利用 针对 代表 已 知 蛋白 抗 原 的 多 肽 片段 的 抗体 在 免疫 细胞 化 学 中 的 应 用 ， 这 一 过 程 得 到 了 证 实 。 免 疫 细胞 组 化 得 到 的 抗原 的 组 织 和 细胞 分 布 与 已 有 的 文献 报道 的 一 致 。(a) 利用 抗 多 肽 VRSSSRTPSDKP fy Mt 菌 体 抗 体 进行 的 TNF-a 特异 染色 ; (b) 利用 抗 多 肽 ESRKLEKGIQVEIY 的 噬菌体 抗体 进行 的 VCAM 特异 染色

4. HC EE 28 =e BY DA 4.1 常规 的 选择 抗 膜 蛋白 的 噬菌体 抗体

不 论 是 用 体内 方法 还 是 用 鸣 菌 体 展 示 技 术 ， 筛 选 针 对 膜 蛋白 的 抗体 都 是 一 种 挑战 。 这 主要 是 因为 被 用 作 免 疫 原 的 这 些 蛋 白质 非常 难以 纯化 。 简 单 的 跨 膜 蛋白 常 能 可 溶性 表 达 而 被 成 功用 于 鸣 菌 体 抗 体 的 筛选 。 对 于 那些 没有 可 溶性 表达 形式 的 膜 蛋白 ， 则 必须 纯 化 天 然 的 膜 重 白 ， 而 众所周知 ， 想 在 没有 一 些 蛋 白质 降解 的 情况 下 完成 纯化 很 困难 。 整 合 膜 重 白 ， 如 7 次 跨 膜 的 趋 化 因子 受 体 ， 则 代表 了 另 一 种 难度 : 它们 不 可 能 被 以 可 溶性 的 形式 表达 ， 不 论 是 天 然 的 还 是 重组 的 ， 要 纯化 一 定数 量 的 此 种 蛋白 且 不 变性 很 难 。 而 当前 的 方法 认为 至 少 蛋 白质 的 生物 化 学 信息 是 可 用 的 ， 而 不 是 恒 日 质 本 身 。

利用 未 纯化 的 抗原 混合 物 来 制备 抗体 有 时 是 可 能 的 ， 并 且 常 常 有 人 尝试 。 完 整 的 细 胞 可 以 被 直接 用 作 免 疫 原 ， 这 样 问题 就 转移 到 下 游 的 筛选 上 。 必 须 筛 选 大 量 的 抗体 ， 而 不 能 保证 其 目的 抗原 特异 性 ， 因 为 这 些 抗 体 是 被 随机 选择 出 来 的 。 一 种 提高 针对 细胞 表 面 特异 分 子 导 向 性 的 方法 是 用 一 般 细 胞 表面 蛋白 进行 反 盘 。 这 可 以 通过 采用 将 少量 表达 所 硕 望 细胞 表面 蛋白 的 细胞 与 大 量 不 表达 所 希望 细胞 表面 蛋白 的 细胞 混合 来 实现 。 通 过 加 一 种 细胞 特异 的 抗体 将 感 兴趣 的 目的 细胞 进行 标记 。 将 鸣 菌 体 抗体 库 加 入 细胞 混合 物 ， 训 细胞 将 结合 一 些 叭 菌 体 ， 然 后 ， 采 用 细胞 特异 的 抗体 将 靶 细 胞 从 细胞 混合 物 中 分 离 出 来 。 这 种 方法 采用 靶 细 胞 群 的 特异 抗体 ， 当 然 ， 最 好 是 被 用 于 那些 已 经 进行 了 很 好 的 细胞 亚 群 分 类 的 细胞 ， 如 血细胞 。

4.2 提高 膜 蛋白 筛选 的 导向 选择 如 果 叭 菌 体 抗体 库 中 的 抗体 可 被 导向 那些 感 兴趣 的 蛋白 ， 那 么 ， 筛 选 针 对 那些 只 能

ProxiMolIM 技 术

- 200 - 蛋白 质 组 学

在 混合 物 中 存在 的 蛋白 质 的 抗体 ， 成 功 的 机 会 更 大 ， 特 别 是 细胞 膜 蛋白 ， 如 受 体 。 一 种 理想 的 方式 就 是 采用 受 体 的 同 种 配 体 ， 同 时 也 是 一 种 证 明 靶 分 子 具 有 活性 构象 的 方法 。 结合 到 导向 分 子 附 近 的 叭 菌 体 可 以 被 分 离 出 来 ， 从 而 富 集 那 些 被 选择 出 来 的 带 有 特异 识 别 靶 受 体 的 鸣 菌 体 群体 。 这 就 是 ProxiMolzy 的 方法 原理 。

4.3 ”ProxiMolIM 方 法 及 应 用

酶 催化 沉淀 报告 法 ”在 ICC 和 一 些 其 他 的 技术 中 ， 常 常 通过 报告 酶 催化 产生 的 沉 淀 物 将 信号 进行 放大 (Bobrow et al., 1989, 1992). PRA AL WAS (HRP) 试剂 被 直接 或 间接 地 结合 到 靶 抗 原 上 。 在 过 氧化 所 和 生物 素 酷 胺 存在 下 ，HRP 将 催化 产生 短 命 的 生物 素 酷 胺 自由 基 ， 它 将 共 价 结合 并 生物 素 化 靠近 藻 根 过 氧化 物 酶 的 蛋白 质 。 沉 积 于 蛋白 质 上 的 生物 素 分 子 可 通过 链 亲 和 素 偶 联 试剂 检测 ， 如 藻 根 过 氧化 物 酶 ， 这 样 初始 的 信号 被 放大 ， 因 为 新 沉淀 的 生物 素 分 子 远 超 过 了 原始 靶 分 子 或 辣 根 过 氧化 物 酶 分 子 的 数目 。

ProxiMolIM 方 法 的 原理 “在 ProxiMolIY 方 法 中 ， 催 化 报告 沉淀 法 被 用 于 分 离 靠近 生 物 素 化 导 疝 分 子 的 鸣 菌 体 抗 体 (Osbourn et wz .，1998)。 接 触 导 向 分 子 有 两 个 条 件 。 第 一 ， 它 必须 与 靶 分 子 具 有 一 定 的 亲和力 或 是 与 靠近 靶 分 子 的 分 子 有 亲和力 。 第 二 ， 它 必 须 能 够 直接 或 间接 偶 联 HRP。 间 接 偶 联 HRP 包括 将 偶 联 HRP 的 抗体 结合 到 导向 分 子 上 ， 或 是 生物 素 化 导向 分 子 ， 然 后 将 导向 分 子 结合 到 链 亲 和 素 化 的 HRP 上 。 导 向 分 子 必须 保持 足够 的 生物 学 活性 ， 以 保持 它 与 靶 分 子 的 结合 。 然 而 ， 与 导向 配 体 竞争 结合 受 体 的 叭 菌 体 抗体 不 能 被 附着 在 偶 联 于 配 体 上 的 HRP 附近 。

实 或 中 的 ProxiMolIM 方 法 ”用 ProxiMolIXM 方 法 进行 针对 原 位 靶 抗 原 的 筛选 很 简单 (图 12.4)。 对 于 细胞 表面 抗原 ， 导 向 分 子 (通常 是 生物 素 化 的 靶 分 子 配 体 或 是 偶 联 HRP 的 抗体 ) 与 人 抗体 库 中 的 叭 菌 体 一 起 被 加 入 到 完整 的 细胞 中 。 温 育 之 后 ， 没 有 结 Ah ABR. URE, WIA HRP 标记 的 第 二 种 试剂 ， 温 育 ， 然 后 洗涤 。 加 入 生物 素 酷 胺 和 过 氧化 氨 ， 温 育 10min， 然 后 再 洗涤 。 通 常用 TEA RAR AE 脱 下 来 ， 生 物 素 化 的 叹 菌 体 通 过 链 亲 和 素 磁 珠 进行 分 离 ， 然 后 ， 感 染 大 肠 杆菌 。 通 过 得 选 ， 选 择 出 那些 特异 结合 靶 分 子 的 叹 菌 体 抗 体 及 结合 靶 分 子 附 近 蛋 白质 分 子 或 导 疝 分 子 EY) Baik Ba (A

ProxiMolIM 方 法 的 应 用 范围 ProxiMolTM 方 法 可 被 应 用 于 各 种 不 同 的 靶 分 子 及 不 同 形式 的 蛋白 质 。 导 向 分 子 除 抗体 或 天 然 的 蛋白 质 配 体 如 细胞 因子 外 ， 还 包括 糖 类 和 脂肪 酸 配 体 。 存 在 于 完整 的 细胞 上 (附着 的 或 可 溶 的 )， 冷 冻 的 组 织 切片 中 或 分 离 的 细胞 腊 上 的 靶 抗 原 不 需要 进行 蛋白 质 的 分 离 。

生物 素 沉淀 的 范围 ”由 于 生物 素 酷 胺 自由 基 的 半衰期 很 短 ， 生 物 素 分 子 被 沉 演 在 附 近 的 HRP 分 子 上 。 为 了 了 解 生 物 素 沉淀 的 范围 ， 抗 基因 3 的 抗体 被 用 作 导 向 分 子 去 生 物 素 化 M13 RR. FA Som 的 链 亲 和 素 包 被 的 金 珠 ， 通 过 电子 显微镜 探测 了 沉 演 的 生 物 素 分 子 。 生 物 素 沉淀 的 范围 可 达到 2Snm， 平 均 在 10 一 1Snm。 这 使 我 们 相信 生物 素 沉 淀 的 范围 在 几 个 导向 分 子 直径 范围 内 。

ProxiMolIM 技 术 用 于 抗原 表 位 步 移 ;扩大 结合 TGF-B 克隆 库 以 前 选择 到 的 针对 TGF-B 的 主要 抗原 表 位 或 克隆 被 称 为 31G9。ProxiMolIY 方 法 被 用 于 扩大 抗 TGF-B Ay le

第 十 二 章 ” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 201 -

(a) (b)

@ = 7 me + te

图 12.4 导向 筛选 噬菌体 抗体 的 ProxiMolIY 方 法 (a) 在 细胞 表面 处 于 正常 环境 条 件 中 的 感 兴 趣 抗原 ; (b) 导向 配 体 被 偶 联 了 HRP， 并 特异 结合 到 其 相应 的 靶 蛋 白 上 ; (c) 加 入 鸣 菌 体 抗 体 库 ， 不 同 的 抗体 分 别 特异 结合 到 导向 配 体 、 驾 蛋白 及 其 他 的 细胞 表面 抗原 上 ; '(d) 加 入 生物 素 化 的 酷 胺 试剂 ， 产 生活 化 生物 素 ; 结合 到 导向 配 体 周围 25nm 范围 之 内 的 叹 菌 体 被 共 价 标 记 上 生物 素 。 这 些 识别 靶 蛋 白 及 其 周围 蛋白 的 噬菌体 抗 体 可 通过 包 被 链 亲 和 素 的 磁 珠 进行 分 离 。

菌 体 抗体 库 ， 导 向 新 的 抗原 表 位 。 采 用 ProxiMolIY 方 法 进行 的 选择 在 固定 有 TGF-8 的 BIAcore 芯片 上 进行 ， 导 向 分 子 为 HRP 偶 联 的 31G9。 鸣 菌 体 的 结合 和 非 结合 叹 菌 体 的 洗 脱 如 前 所 述 ， 然 后 ， 加 入 过 氧化 氢 和 生物 素 酷 胺 。 被 生物 素 化 的 叭 菌 体 被 分 离 出 来 ， 然后 侵 染 大 肠 杆菌 。 经 过 两 轮 的 筛选 ， 分 离 出 来 的 13.$5% 的 克隆 是 TGF-B PATE see, 并 且 均 为 新 克隆 。 与 此 对 照 ， 在 没有 导向 分 子 存在 下 筑 选 到 的 所 有 阳性 克隆 均 为 31G9 (Osbourn et wd .，1998)。 因 此 ，ProxiMolIX 方 法 通过 对 非 主 要 抗原 表 位 的 叭 菌 体 抗体 的 筛 选 ， 扩 大 了 针对 纯化 抗原 的 抗体 库 。

ProxiMolIXM 方 法 用 于 筛选 针对 细胞 表面 特异 黏附 分 子 的 抗体 ProxiMolIM 技 术 最 大 的 应 用 是 在 筛选 针对 细胞 表面 特异 分 子 的 抗体 方面 。 为 了 靶 向 选择 素 (表达 于 活化 的 内 皮 细 胞 表面 的 黏附 分 子 )， 采 用 了 选择 素 的 配 体 和 抗体 。

用 TNF-a 活 化 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 ， 以 诱导 细胞 表达 PETRA A EER. RAP 选择 素 和 下 选择 素 的 配 体 sialyl Lewis X 作为 导向 分 子 ， 利 用 ProxiMolIY 方 法 ， 在 完整 的 单 层 培养 的 细胞 上 进行 筛选 。 经 过 两 轮 的 筛选 ，13.7% 的 克隆 为 下 选择 素 阳 性 克隆 ，

。 202 - 蛋白 质 组 学

6.3% 的 克隆 为 P 选 择 素 阳性 克隆 (Osbourn et wz .，1998)。 与 此 对 照 ， 用 HRP 标记 的 抗 下 选择 素 的 抗体 作为 导向 分 子 ， 只 筛选 到 下 选择 素 特异 的 叹 菌 体 。 因 此 ， 通 过 配 体 特异 的 导向 筛选 ， 有 可 能 在 完整 细胞 上 进行 原 位 天 然 膜 结合 抗原 的 抗体 筛选 。

采用 ProxiMolI 方 法 获得 抗 细胞 表面 7-TM 受 体 的 抗体 ， 深 埋 于 细胞 膜 中 的 穿 膜 蛋 白 ， 如 7 次 穿 膜 的 蛋白 (7TM)， 很 难以 天 然 状态 进行 纯化 ， 它 们 是 原 位 筛选 的 理想 况 标 。 趋 化 因子 CC5R 表达 于 工 淋 巴 细胞 上 ， 并 被 认为 是 HIV 感染 的 辅助 受 体 。 利 用 生 物 素 化 的 CCSR 的 配 体 MIP-1la 作为 导向 分 子 ， 采 用 ProxiMolIY 方 法 对 人 工 淋巴 细胞 进 行 筛选 。 将 生物 素 化 的 MIP-1c 和 噬菌体 与 细胞 进行 温 育 ， 然 后 ， 加 入 链 亲 和 素 标 记 的 HRP， 采 用 上 面 所 述 的 ProxiMolIY 方 法 进行 筛选 。 第 一 轮 筛 选 的 产物 通过 基于 完整 细 胞 及 蛋白 质 的 ELISA 方法 进行 了 分 析 。 随 机 挑选 的 95 个 克隆 中 ，30 个 克隆 可 以 识别 工 细胞 ， 其 中 ，13 个 克隆 结合 CCRS， 剩 下 的 17 个 克隆 结合 工 细 胞 表面 的 与 CCRS 相关

(a) FITC 标记 对 照 MV2 .MIP-1a 结 合 +FITC 标记 的 链 酶 亲 和 素 对 照 MV2 scFv 抑 制 MIP-1cw 与 CD4 细 胞 的 结合

细胞 数

荧光 强度 tay ‘ 荧光 强度 MV3 MVS MV3 scFv 抑 制 MIP-1c 与 CD4 细 胞 的 结合 MV5 scFv 抑 制 MIP-1c 与 CD4 细 胞 的 结合

细胞 数 ，

(b)

*—| MIP-I alpha —ea— MV5

荧光 计数

0 50 100 150 时 间 / 秒

图 12.5 iat 9 ProxiMolIM 方 法 得 到 的 活性 抗体

(a) 通过 流 式 细胞 术 ， 回 得 得 到 的 scFv 能 抑制 MIP-la 结合 到 CD4 阳性 细胞 上 。 每 个 峰 的 阴影

部 分 代表 MIP-1la 结合 到 细胞 上 (将 生物 素 化 的 MIP-la 加 入 细胞 中 ， 然 后 加 入 FITC 标记 的 链

亲 和 素 )。 每 个 峰 的 非 阴影 部 分 代表 不 加 生物 素 标记 的 MIP-la， 只 加 FITC 标记 的 链 亲 和 素 得 到

的 信号 。 与 对 照 比 (上面 左 图 )， 三 种 sFv-MV2，MV3 和 MVS 均 能 抑制 MIP-le 的 结合 ; (b)

scFv-MV5 封闭 了 由 MIP-1a 结合 到 其 受 体 CCRS 上 而 产生 的 Ca? 信号 ; 将 SOnmMIP-1a 加 入 CCR5 转 染 的 CHO 细胞 中 ， 利 用 2- 哮 喃 的 荧光 ， 通 过 标准 方法 检测 细胞 内 自由 Ca 流 度 的 升 高 。

第 十 二 章 “” 鸣 菌 体 抗体 作为 蛋白 质 组 学 研究 工具 - 203 -

Ay BITE PRE. HOTA RAF HE CDNA 表达 文库 ， 得 到 了 几 个 洪 在 的 令 人 感 兴趣 的 蛋白 质 ， 其 中 包括 磷酸 酷 氨 酸 磷酸 酶 。 因 此 ，ProxiMolIY 方 法 不 仅 可 使 我 们 定向 特异 的 细胞 表面 受 体 ， 而 且 ， 还 能 用 于 鉴定 一 些 可 能 与 此 受 体 相关 的 蛋白 质 。

回 得 ”在 ProxiMolIM 筛 选 方法 中 ， 用 受 体 的 配 体 作 为 导向 分 子 的 盘 选 ， 只 能 筛选 到 那些 与 配 体 识别 不 同位 点 的 抗体 ， 这 些 抗体 不 能 中 和 配 体 与 受 体 的 相互 作用 。 为 了 克 服 这 种 局 限 性 ， 采 用 两 步 筛 选 法 。 以 受 体 的 配 体 分 子 为 导向 分 子 ， 按 常规 ProxiMol™ 方法 进行 筛选 ， 生 物 素 化 的 噬菌体 被 分 离 出 来 。 这 些 被 分 离 出 来 的 鸣 菌 体 不 是 被 用 于 感 染 大 肠 杆菌 ， 而 是 被 用 于 利用 新 的 抗体 库 进 行 第 二 轮 ProxiMolIMY 筛 选 的 导向 分 子 。 这 使 得 那些 与 原始 指导 分 子 / 配 体 识 别 相 同位 点 的 只 菌 体 被 分 离 出 来 。 当 然 ， 这 必 将 产生 各 种 不 同 的 产物 ， 因 为 那些 与 第 一 轮 全 部 筛选 产物 所 识别 的 和 蛋白质 附近 所 有 结合 的 鸣 菌 体 均 被 分 离 出 来 。 先 检测 第 一 轮 盘 选 产物 ， 鉴 别 出 受 体 特异 的 噬菌体 ， 然 后 ， 用 这 些 特 异 的 噬菌体 作为 指导 分 子 进行 第 二 轮 的 回 算 ， 可 以 增加 筛选 的 特异 性 。

CCRS 的 回 筛 策略 是 第 一 轮 的 ProxiMol iit, SAA MIP-la 作为 导向 分 子 ， 筛 选 的 产物 作为 回 得 的 导向 分 子 。 那 些 识别 CCRS 的 克隆 被 通过 ELISA 方法 鉴别 出 来 。 利 用 生物 素 化 的 MIP-1lac 和 sceFv， 通 过 流 式 细胞 仪 将 抑制 MIP-1lc 结合 的 喉 菌 体 克 隆 鉴别 出 来 (图 12.$a) 。 其 中 ， 一 个 具有 抑制 MIP-lu 结合 活性 的 克隆 同时 能 抑制 MIP-1o 诱 导 的 CCRS 表达 细胞 的 钙 离 子 流 (图 12.$Sb)。 因 此 ， 经 过 简单 的 两 步 筛选 策略 ， 特 异 结合 细胞 表面 7-TM 受 体 的 配 体 结合 位 点 的 抗体 被 分 离 出 来 。

4.4 ProxiMolIM 方 法 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 应 用

用 来 源 于 ProAbIXM 的 抗体 作 标 签 指导 新 的 筛选 ”在 ProAbIXY 筛 选中 得 到 的 令 人 感 兴 趣 的 噬菌体 抗体 不 可 能 在 生物 学 分 析 中 表现 出 活性 。 但 这 些 抗体 是 疾病 特异 的 抗原 或 表 位 的 有 用 标签 ， 可 被 用 于 在 ProxiMolIY 筛 选中 的 导向 分 子 。 因 为 ProAbIXY 数 据 库 已 显示 了 鸣 菌 体 抗体 的 组 织 特异 性 ， 合 适 的 组 织 切 片 就 可 成 为 ProAbi 筛 选 的 间 抗 原 的 来 源 。 作为 导向 分 子 ， 最 简单 的 就 是 生物 素 化 的 ProAbIXY 叭 菌 体 抗体 ， 还 有 一 种 就 是 scFv。

筛选 ProxiMolIY 方 法 得 到 的 产物 ， 可 以 找到 满足 所 期 望 生物 学 活性 的 抗体 。 低 通 量 的 染色 筛选 是 在 组 织 切片 上 进行 ; 然而， 必须 鉴别 与 原始 ProAbIY 抗 体 染 色 图 案 匹 配 的 图 案 。 高 通 量 的 筛选 策略 是 利用 ELISA 方法 ， 或 是 用 对 特定 细胞 的 流 式 细 胞 术 。 这 种 筛选 方法 也 可 以 用 特定 激活 状态 的 细胞 ， 这 样 有 可 能 深入 了 解 在 原始 组 织 切 片 中 细胞 的 状态 。 鸣 菌 体 或 scFv 可 直接 用 于 离 体 的 细胞 分 析 。 这 样 ，ProAbIM 抗 体 就 可 被 用 于 分 离 具有 生物 学 活性 的 抗体 ， 并 有 可 能 被 用 于 界定 靶 细胞 的 活化 状态 。

用 ProxiMolIM 技 术 鉴 定 新 的 有 蛋白质 成 员 或 蛋白 质 /DNA 复合 物 FE ProxiMolIM 技 术 中 的 生物 素 标 记 步 又 中 ， 生 物 素 沉淀 的 范围 在 3 一 4 个 蛋白 质 分 子 直径 范围 内 。 这 样 ProxiMoliY 技 术 将 产生 结合 靶 分 子 附近 其 他 蛋白 质 的 反应 物 。 对 CCRS 的 工作 就 是 一 个 很 好 的 例子 ; 当 MIP-o 被 用 作 导 向 分 子 时 ， 得 到 了 一 些 并 不 针对 CCRS 的 喉 菌 体 抗体 。 这 其 中 的 一 些 抗体 被 用 于 和 划 选 表达 文库 ， 发 现 这 些 抗体 所 识别 的 一 些 蛋白 质 ， 它 们 被 认 为 存在 于 膜 中 ， 靠 近 CCR5。 这 导致 发 现 了 一 些 可 能 令 人 感 兴 趣 的 和 蛋白质， 包括 磷酸 栈 氨 酸 磷酸 酶 。 因 此 ，ProxiMolIyY 技 术 不 仅 使 我 们 能 定向 细胞 表面 特异 受 体 ， 而 且 ， 还 可 使 我 们 鉴定 可 能 与 受 体 相关 的 其 他 和 蛋白质。 这 导致 了 一 种 可 能 性 ， 那 就 是 通过 连续 几 轮

- 204 ， 蛋白 质 组 学

的 ProxiMolIXM 筛 选 和 检测 ， 将 可 描绘 出 蛋白 质 多 分 子 复合 物 的 轮廓 。 致谢

上 面 所 描述 的 工作 依赖 于 团体 的 努力 ， 这 些 努 力 远 不 止 来 自 于 剑桥 抗体 技术 方面 的 科学 家 ， 还 要 感谢 以 下 个 人 对 著述 本 书 所 提供 的 专门 技术 。 他 们 是 Simon Brocklehurst 及 生物 信息 小 组 的 全 体 成 员 ， 在 肽 合成 方面 作出 杰出 成 就 的 George Masih, John Mc- Cafferty, Tony Pope 及 MAb 分 离 小 组 的 全 体 成 员 ， 以 及 在 ICC 方面 提供 专门 指导 的 Tony Warford。

(Ln VE Wim ik)

参考 文献

Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M.H., Xiao, H., Merril, C.R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R.F. et a/. (1991) Complementary DNA sequencing, expressed sequence tags and human genome project. Science 252: 1651-1656.

Barbas, C.F., Kang, A.S., Lerner, R.A. and Benkovic, S.J. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.

Bobrow, M.N., Harris, T.D., Shaughnessy, K.J. and Litt, G.J. (1989) Catalyzed reporter deposi- tion, a novel method of signal transduction. Application to immunoassays. J. Jmmunol. Methods 125: 279-285.

Bobrow, M.N., Litt, G.J., Shaughnessy, K.J., Mayer, P.C. and Conlon, J. (1992) The use of catalysed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. J. Immunol. Methods 150: 145-149.

Boguski, M.S., Lowe, T.M. and Tolstoshev, C.M. (1993) dbEST — database for “expressed sequence tags”. Nature Genet. 4: 332-333.

Foote, J. and Eisen, H.N. (1995) Kinetic and affinity limits on antibodies produced during immune responses. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 1254-1256.

Griffiths, A.D., Malmqvist, M., Marks, J.D., Bye, J.M., Embleton, M.J., McCafferty, J., Baier, M., Holliger, K.P., Gorick, B.D., Hughes-Jones, N.C., Hoogenboom, H.R. and Winter, G. (1993) Human anti-self antibodies with high specificity from phage display libraries. EMBO J. 12: 725— 734.

Kay, B., Winter, J. and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: a Laboratory Manual. Academic Press, London.

Marks, J.D., Hoogenboom, H.R., Bonnert, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D. and Winter, G. (1991) By-passing immunization: human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J. Mol. Biol. 222: 581-597. >

McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348: 552-554.

McCafferty, J., FitzGerald, K.J., Earnshaw, J., Chiswell, D.J., Link, J., Smith, R. and Kenten, J. (1994) Selection and rapid purification of murine antibody fragments that bind a transition- state analog by phage display. App/. Biochem. Biotechnol. 47: 157-173.

McCafferty, J., Hoogenboom, H.R. and Chiswell, D.J. (1996) Antibody Engineering — a Practical Approach. IRL Press, Oxford.

Osbourn, J.K., Derbyshire, E.J., Vaughan, T.J., Field, A.W. and Johnson, K.S. (1998) Pathfinder (ProxiMol) selection: in situ isolation of novel antibodies. Jmmunotechnology 3: 293-302.

Perelson, A.S. and Oster, G.F. (1979) Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self non-self discrimination. J. Theor. Biol. 81: 645-670.

Vaughan, T.J., Williams, A.W., Pritchard, K., Osbourn, J.K., Pope, A.R., Earnshaw, J.C., McCafferty, J., Hodits, R., Wilton, J. and Johnson, K.S. (1996) Human antibodies with sub- nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage-display library. Nature Biotechnol. 14: 309-314.

Winter, G. and Milstein, C. (1991) Man-made antibodies. Nature 349: 293-299.

Yanisch, P.C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103-119.

第 十 三 章 ” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 Nicolle H. Packer and Lucy Keatinge

1. 515

BARAT HRENSHEDAAD HR CAH AER MIRC A, — AER 胶 电 泳 作为 探索 细胞 中 蛋白 质 组 分 变化 的 平行 效应 的 一 种 有 效 方法 已 经 形成 。 目 前 ， 从 胶 及 膜 上 快速 、 准 确 以 高 通 量 方式 在 fmol 数量 级 上 鉴定 及 定性 蛋白 质 已 成 为 可 能 ， 但 是 当 这 种 方法 被 延伸 至 分 析 细 胞 中 糖 蛋 白 时 ， 结 果 并 不 令 人 乐观 。 真 核 细胞 的 基因 组 与 蛋白 质 组 间 的 特征 区 别 之 一 就 是 绝 大 多 数 基因 产品 是 经 过 翻译 后 修饰 的 ， 其 中 糖 基 化 是 最 重要 的 修饰 方式 。 从 已 知 的 DNA 序列 导出 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 ， 并 以 此 来 确定 其 特 殊 的 功能 通常 是 不 够 的 ， 这 一 点 已 日 趋 明 朗 ， 发 生 在 蛋白 表达 之 中 或 之 后 的 修饰 对 蛋白 质 的 功能 影响 较 大 ， 因 此 ， 分 析 这 些 修饰 对 不 同 蛋白 表达 模型 的 理解 是 至 关 重 要 的 ， 目 前 ， 这 一 需求 可 以 通过 和 蛋白质 组 技术 加 以 实现 。

我 们 所 观察 到 的 糖 基 化 变化 是 糖 基 转 移 酶 活性 的 反映 ， 糖 基 转 移 酶 合成 寡 糖 并 将 其 附着 于 和 蛋白质， 糖苷 酶 修整 及 降解 多 糖 。 糖 蛋白 质 组 学 研究 的 目的 就 是 鉴定 作为 特定 表 型 标志 的 糖 蛋 白 ， 鉴 定 与 表 型 变化 相关 的 特定 的 糖 基 化 的 改变 ， 以 及 追踪 与 这 些 变化 相 对 应 的 代谢 过 程 。

比较 考 马 斯 亮 蓝 染 色 及 一 种 新 的 荧光 糖 和 蛋白 染色 技术 用 二 维 凝 胶 电 泳 分 离 的 人 血清 蛋白 〈 图 13.1)， 我 们 发 现 许 多 丰 度 高 的 蛋白 是 糖 基 化 的 ， 并 且 依 糖 基 形式 不 同 它们 的 等 电 点 及 分 子 量 不 同 。 普 遍 认为 我 们 应 该 研究 为 什么 在 蛋白 质 的 糖 基 化 过 程 中 有 如 此 多 的 不 均一 性 以 及 对 于 这 些 不 均一 性 必须 加 以 分 析 。 尽 管 如 此 ， 相 对 而 言 在 蛋白 质 组 学 研 究 中 ， 用 上 述 提 到 的 平行 进程 的 方法 分 析 蛋 白质 中 的 糖 组 分 这 一 领域 并 未 得 到 足够 的 重 视 。

我 们 相信 ， 在 细胞 中 糖 蛋 白 组 分 研究 方面 的 延误 有 两 个 原因 : 第 一 ， 尽 管 有 大 量 文 献 报导 在 疾病 的 发 生 、 发 展 过 程 中 糖 基 化 的 变化 ， 我 们 也 只 是 停留 在 对 这 些 糖 基 化 变化 如 何 对 有 机 体 产 生生 物 学 效应 方面 的 了 解 。 其 次 ， 研 究 多 糖 的 分 析 方 法 传统 地 被 认为 是 基于 糖化 学 家 的 实验 室 工作 ， 这 就 造成 了 一 种 印象 ， 即 分 析 糖 蛋白 需要 蛋白质 化 学 家 们 所 难以 胜任 的 特殊 知识 与 技术 。 本 章 将 在 蛋白 质 组 学 的 论述 中 阐述 这 两 个 问题 。

为 了 建立 有 机 体 新 陈 代 谢 中 糖 基 化 的 规律 ， 仅 仅 对 蛋白 质 中 多 糖 结构 定性 是 不 够 的 。 因 此 ， 尽 管 分 析 蛋 白质 的 糖 基 化 变化 有 利于 新 陈 代谢 变化 〈 如 疾病 的 发 生 ) 的 诊断 和 监测 ， 但 这 些 变化 并 不 足以 描述 糖 基 赋 子 蛋 白质 的 功能 。 此 外 ， 糖 链 的 丢失 对 蛋白 质 活性 的 影响 并 不 总 是 可 以 观察 到 的 ， 一 些 重组 糖 蛋白 在 其 天 然 糖 基 化 被 丢失 后 仍 具 有 活 性 。 普 遍 认 为 ， 在 许多 情况 下 ， 特 定 的 糖 基 化 对 于 蛋白 的 正确 折 释 及 作用 是 至 关 重 要 的 ; 或 者 ， 由 于 糖 基 化 的 多 样 性 使 蛋白 质 的 功能 表现 为 不 规律 性 ， 二 者 必 具 其 一 。Var- ki (1993) 的 综述 对 这 些 明 显 矛 盾 的 观点 予以 了 论述 。

- 206 - 蛋白 质 组 学

pH4 pH7

图 13.1 PVDF 膜 上 糖 蛋 白 的 荧光 染色 法 (a) 考 马 斯 蓝 染色 ; (b+) 糖 荧光 素 染色 。1lpl 血清 样品 经 重 泡 胀 上 样 ， 经 2-DE 分 离 在 PVDF 膜 上 显 出 斑点 ， 用 Bio-Red 糖 蛋白 检测 试剂 盒 ,， 即 高 碘 酸 盐 氧 化 糖 的 荧光 染色 法 代替 夹层 抗体 染色 法 ， 改 进 方 法 为 用 0.05mg/ml AER 50% (V/V) 甲醇 ，100mM 醋酸 钠 溶液 。

糖 蛋白 糖 基 组 分 固有 的 多 样 性 能 导致 蛋白 质 在 形状 、 电 荷 及 体积 等 方面 发 生 微妙 的 变化 ， 这 种 变化 有 可 能 暂时 性 或 者 在 空间 上 修饰 蛋白 质 的 功能 。 这 种 多 样 性 需要 有 相关 复杂 的 物理 及 化 学 技术 对 其 组 成 、 连 接 、 分 支 、 异 构 体 及 连接 位 点 等 进行 确定 。 由 于 仅 限于 单 糖 残 基 结 构 及 多 糖 连接 方式 的 研究 ， 糖 蛋白 的 分 析 过 于 简单 化 ， 通 常 碳水 化 合 物 分 析 化 学 被 发 展 成 为 复杂 多 糖 的 结构 测定 ， 蛋 白质 中 多 糖 的 分 析 就 是 从 这 些 技术 中 选择 性 地 开发 的 。 这 就 促使 一 些 商业 性 的 分 析 多 糖 结构 的 工具 出 现 (Oxford GlycoSciences, UK; Glyko Inc, USA; Bio-Rad, USA; Beckman，USA)。 综 合 糖苷 外 切 酶 、 商 业 化 的 生物 毛细 管 电泳 及 质谱 ， 目 前 已 能 够 定性 分 析 蛋 白质 中 多 糖 的 微 不 均 一 性 ， 而 蛋白 质 组 技术 接受 了 综合 这 些 技术 从 而 适应 大 量 糖 蛋 白 分 析 的 挑战 。

本 章 我 们 给 出 一 些 领域 中 的 例子 ， 说 明 糖 基 化 有 其 重要 的 规律 ， 同 时 可 以 有 力 地 使 读者 确信 蛋白 质 糖 基 形 式 的 分 析 是 理解 细胞 蛋白 质 组 的 基础 。 下 面 我 们 描述 糖分 析 技 术 ， 它 使 适应 糖 蛋白 质 组 研究 的 高 通 量 分 析 成 为 可 能 。

2. AeA?

糖 蛋白 是 由 酶 将 一 个 或 多 个 糖 元 加 合 在 最 初 的 多 肽 链 上 ， 修 饰 范围 从 蛋白 质 上 连接 单 糖 (比如 胶原 糖 蛋白 及 核糖 蛋白 ); 到 密集 、 复 杂 、 有 侧 链 结构 的 多 糖 (如 黏液 素 ); 以 及 具有 复杂 的 氨基 葡 聚 糖 侧 链 的 蛋白 多 糖 。 多 糖 与 蛋白 质 相 联 有 三 种 形式 : N- 连 接 、 O- 连 接 及 糖 基础 酯 酰基 醇 固 定 结构 。 在 同样 一 个 蛋白 质 上 可 以 发 现 这 三 种 修饰 方式 共 存 。 具 有 相同 氨基 酸 序列 但 不 同 糖 基 侧 链 的 蛋白 质 异 构 形 式 通常 可 以 在 二 维 凝 胶 电泳 分 离 上 看 到 ， 由 于 它们 的 等 电 点 及 分 子 质 量 不 同 表 现 为 斑点 的 拖 尾 。

2.1 N- 糖 链 结构 N- 糖 链 结构 通常 发 生 于 内 质 网 及 高 尔 基体 上 ， 在 这 里 GleNAc)ManoGle3 为 普遍 结

入

第 十 三 章 “” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 - 207 -

构 ， 在 此 基础 上 ， 由 糖苷 酶 及 糖 基 转移 酶 将 其 进行 多 样 化 整理 和 修饰 ， 几 乎 所 有 的 N- 连接 多 糖 内 侧 都 具有 GlcNAczMans 的 核心 结构 ， 它 与 出 现在 特定 序列 Asn-Xaa-Ser/Thr (Xaa 是 除 Pro 以 外 的 任何 氨基 酸 ) 中 的 天 冬 酰 胺 残 基 相 连接 。 按 照 单 糖 的 位 置 可 将 N- 连接 结构 分 为 高 甘露 糖 型 、 混 合 型 或 复杂 型 多 糖 。 不 同 的 糖 链 可 连 于 同一 位 点 〈 微 不 均 一 性 )， 同 时 在 同一 蛋白 质 上 也 可 有 不 同 的 位 点 连接 糖 链 (显著 不 均一 性 )。

所 有 定性 的 糖 蛋白 都 具有 相同 的 N- 连 接 五 糖 核心 ， 与 此 同时 多 糖 链 内 或 链 间 的 整 理 与 修复 使 它 在 位 置 、 侧 链 、 大 小 及 异 构 配 置 上 发 生变 化 。

2.2 0O- 连 接 结构

O- 连 接 守 糖 通常 与 丝氨酸 或 苏 氨 酸 的 羟基 部 分 连接 ， 有 时 也 与 产 赖 氨 酸 及 羟 甫 氨 酸 连 接 。 尽 管 Hansen 等 (1998) 已 经 建立 了 一 种 神经 网 络 可 以 预测 黏 蛋 白 型 糖 基 化 ， 但 并 无 一 个 简单 的 规律 认为 含 羟基 残 基 可 以 作为 连接 位 点 。 黏 蛋 白 型 O- 连 接 糖 基 化 最 初 是 由 完全 折 和 的 蛋白 质 中 丝氨酸 或 苏 氨 酸 与 GalNAc 残 基 连 接 ， 这 是 由 糖 蛋 白 的 一 级 、 二 级 甚至 三 级 结构 所 决定 的 ， 由 特殊 转移 酶 来 实现 的 单 糖 残 基 继 续 延 伸 是 被 高 度 控 制 的 (Van den Steen et al .，1998a)， 与 较 普 通 的 黏 蛋白 型 O- 连 接 糖 基 化 相 比 ， 一 些 特 殊 的 O- 糖 基 化 形式 ， 如 0O- 连 接 的 岩 藻 糖 及 和 葡萄糖， 是 依赖 于 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 以 及 八 个 不 同 的 还 原型 末端 与 如 前 所 述 的 丝氨酸 与 苏 氨 酸 相连 (Hounsell et al., 1996). &

RRA DDH AWE AEA ARR O- 糖 基 化 ， 但 是 单一 的 GleNAc 组 分 在 细胞 质 及 核 膜 孔

A (Hart et al., 1996) 上 发 现 ， 而 糖 部 分 与 蛋 白 质 之 间 的 磷 酰 二 酯 连接 方式 在 黏 物 质 及 一 些 寄生 动物 或 者 更 为 广 谤 的 一 些 生物 体 上 可 以 见 到 (Hanynes, 1998).

2.3 糖 基础 脂 酰 肌 醇 (GPI) 固定 结构

糖 基础 脂 酰 肌 醇 结 构 具 有 将 细胞 膜 的 朴 水 性 磷酸 双 分 子 层 固定 于 不 同 蛋 白质 的 功能 (Kinoshita et wd .，1997)。 它 们 具有 相同 的 MansGlcNH2 糖 核 ， 它 是 细胞 膜 内 磷脂 与 蛋 白质 之 间 的 桥梁 ， 这 一 翻译 后 修饰 行为 发 生 在 内 质 网 中 信号 肽 C 末端 切割 之 后 。

3. 为 什么 量 日 质 组 对 糖 蛋 日 感 兴趣 ?

蛋白 质 组 学 是 一 个 以 蛋白 质 为 基础 的 整体 生物 学 方法 ， 这 种 方法 是 对 DNA 及 mRNA 的 表达 产物 而 不 是 DNA 和 mRNA 本 身 进 行 分 析 。 绝 大 多 数 情况 下 ， 一 个 成 熟 蛋 自 的 生物 学 活性 是 被 翻译 后 修饰 的 ， 而 这 些 修 饰 又 是 高 度 动态 的 。 对 哺乳 动物 来 说 ， 蛋 白质 的 多 糖 组 分 的 作用 包括 免疫 反应 的 修饰 、 蛋 白 识别 及 定位 、 蛋 白质 折 和 至 、 血 清 清除 率 及 信和 号 调控 。 讨 论 碳 水 化 合 物体 内 功能 的 详细 综述 见 文献 (Dwek，1995; Kukuruzin- ska and Lennon，1998; Lis and Sharon，1993; Varki，1993 ) 。

人 类 生物 学 最 感 兴趣 的 实验 体系 包括 在 受精 及 疾病 的 发 生 过 程 中 糖 蛋白 的 涉 入 。 我 们 在 此 对 这 两 个 例子 进行 讨论 目的 在 于 揭示 理解 那些 被 表达 的 基因 产品 ， 其 翻译 后 修饰 功能 的 重要 性 。

3.1 糖 蛋白 与 受精 对 于 动物 体 ， 从 卵 母 细胞 与 精子 细胞 之 间 的 识别 开始 ， 到 一 个 成 熟 的 有 机 体 发 展 到

eee |

- 208 - 蛋白 质 组 学

顶点 ， 在 此 进程 中 糖 蛋 白 起 着 至 关 重 要 的 作用 。 对 于 哺乳 动物 的 受精 ， 包 围 在 卵子 周转 的 细胞 外 糖 蛋 日 外 衣 [透明 带 (ZP)] 是 关键 部 分 。 在 渗透 过 滤 泡 细胞 之 后 ， 精 子 捆绑 于 透明 带 (ZP)， 它 是 由 三 种 硫酸 化 糖 蛋白 ZP1、ZP2 及 ZP3 组 成 的 ， 这 些 糖 蛋白 对 识 别 与 捆绑 是 关键 性 的 (Zara and Naz，1998) 。 在 精子 表面 的 B-1, 4- 半 乳糖 转移 酶 是 研究 卵 壳 ZP3 的 最 佳 受 体 。 对 于 转基因 小 鼠 ， 这 种 酶 的 过 表达 可 在 许多 方面 对 精 - 卵 相 互 作 用 产生 影响 (Youakim et al .，1994)， 此 外 ， 在 B-1，4- 半 乳糖 转移 酶 基因 丢失 中 幸存 下 来 的 一 些小 鼠 的 精子 ， 仅 能 艰难 地 渗透 过 透明 带 ， 在 体外 不 能 与 卵 母 细胞 受精 (Lu and Shur，1997)。 在 避孕 与 受精 的 研究 中 ， 糖 蛋白 质 组 学 方法 可 以 监测 和 定位 受精 过 程 中 糖 蛋 白 的 变化 。 在 避孕 研究 中 令 人 感 兴趣 的 一 种 糖 蛋白 是 调节 黄体 酮 的 子宫 gly- codelins， 它 的 氨基 酸 序列 与 B- 乳 球 蛋 白 完 全 相同 ， 所 不 同 的 只 是 其 独一无二 的 多 糖 结 构 。 源 于 子宫 内 膜 的 glycodelin A 阻 止 精 卵 结 合 ， 同 时 ， 与 其 糖 基 化 不 同 的 源 于 血浆 的 精液 中 glycodelin S 却 无 此 功能 (Seppala et al., 1998). Glycodelin A 与 S$ 的 基因 相同 (胎盘 蛋白 14)， 但 是 由 于 翻译 后 糖 基 化 的 不 同 导致 了 蛋白 质 的 功能 及 组 织 定 位 不 同 。

3.2 糖 蛋白 与 疾病

在 疾病 的 最 初 阶 段 ， 糖 蛋白 通常 在 结构 与 功能 上 显示 出 变化 ， 而 这 些 变化 涉及 到 与 蛋白 相连 的 多 糖 结构 。 这 种 变化 能 够 描绘 疾病 的 进程 ， 在 这 一 领域 有 大 量 文献 及 两 本 书 发 表 (Brockhausen and Kuhns, 1997; Montreuil et wz .，1996)， 其 中 描述 了 糖 蛋 和 白 在 人 类 疾病 进程 中 的 作用 。 最 近 Brockhausen 等 (1998) 的 综述 讨论 了 在 人 类 疾病 过 程 中 糖 基 转 移 酶 缺失 情况 下 这 些 糖 蛋白 交互 作用 的 机 理 。 我 们 所 缺乏 的 是 对 于 疾病 相关 或 疾病 导致 的 糖 基 化 变化 与 真正 引起 疾病 的 糖 基 化 变化 二 者 之 间 差 异 的 理解 。 很 清楚 ， 后 者 是 我 们 感 兴趣 的 ， 因 为 它们 是 干涉 治疗 的 位 点 。

蛋白 质 组 方法 测定 包括 疾病 进程 初期 ， 疾 病 与 正常 组 织 之 间 所 表现 出 来 的 差异 蛋白 质 的 鉴定 。 这 些 蛋 白 以 后 可 作为 诊断 及 控制 疾病 的 靶 点 。 许 多 糖 蛋 白 ， 特 别 是 在 糖 基 化 方面 发 生变 化 的 糖 蛋白 已 经 用 于 反应 人 类 疾病 的 过 程 ( 表 13.1)。 表 13.1 的 例 举 虽然 并 不 完全 ， 但 从 中 也 可 以 看 到 一 些 异 常 新 陈 代谢 与 糖 基 化 变化 之 间 的 联系 。 由 于 血清 通 常用 作 临 床 诊断 的 对 象 ， 同 时 易于 获得 ， 因 此 ， 有 许多 报导 是 关于 在 疾病 过 程 中 ， 血 清 中 糖 蛋白 的 糖 基 化 变化 的 ， 我 们 推断 在 固体 病变 组 织 中 表现 出 的 糖 基 化 变化 也 会 有 相 类 似 的 差异 性 。

糖 基 化 差异 也 被 用 于 构建 多 糖 类 癌症 疫苗 。 例 如 ， 正 常 上 皮 细 胞 上 的 黏 蛋白 表面 就 密集 地 包围 着 混合 型 多 糖 结构 ， 在 癌 细 胞 上 ， 隐 藏 的 糖 基 抗原 决定 基 (Tn 及 唾液 酸化 Tn 抗原 ) 暴露 于 黏 蛋 白 上 ， 同 时 ， 成 为 了 抗 癌 治 疗 疫苗 的 靶 点 。 这 些 以 特殊 的 多 糖 与 合成 多 肽 结合 ， 用 于 和 任 疫 治疗 的 不 同 策略 已 在 临床 试用 (Kudryashov et al., 1998; Lo- Man et al .，1999)， 同 时 ， 它 已 经 成 为 这 一 领域 的 研究 兴 香 点 。

普遍 认为 二 维 凝 胶 电泳 是 展示 蛋白 质 差 异 表达 的 首选 方法 。 许 多 蛋白 质 被 同时 展 示 ， 而 所 观察 到 的 差异 可 与 其 表 型 差异 相关 联 。 蛋 白质 组 并 不 需要 以 显示 单个 蛋白 为 目 的 ， 而 是 要 观察 对 任何 所 选择 的 生物 体系 的 网 络 途径 的 影响 ， 所 以 蛋白 质 组 要 求 对 多 种 种 属 群体 成 员 进行 筛选 ， 以 揭示 那些 发 生 在 蛋白 表达 中 与 个 体 水 平 相 类 似 的 群体 水 平 上 的 变化 ， 如 果 一 个 糖 蛋白 对 表 型 变化 有 影响 ， 那 么 它 可 以 用 作 疾 病 的 诊断 标记 ; 或 者 直

第 十 三 章 “ 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 。 209 -

接 采 用 凝 胶 电泳 分 析 方 法 ; 或 者 利用 其 他 分 析 方 法 对 其 进行 分 析 ， 在 对 成 骨 细胞 原始 细 胞 系 分 泌 的 细胞 外 胶原 酶 (Hankey et wz .，1992)、 糖 缺乏 综合 症 的 多 重 血 清和 蛋白 (Yuasa et al., 1995) 及 胰腺 癌 病 人 的 血清 及 黏 和 蛋白 的 分 析 中 ，2-DE 已 经 成 功 地 用 于 鉴 定 糖 蛋白 差异 ， 已 报导 众多 的 血清 糖 蛋 白 做 为 肾 细 胞 癌 的 标记 物 (Delahunt et al., 1996).

13.1 糖 基 化 类 型 的 变化 与 人 类 疾病 的 关系

疾病 糖 蛋白 组 织 变化 参考 文献 碳水 化 合 物 缺 乏 症 ” 转 铁 蛋 白 ， 抗 凝血 血清 N- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Winchester et al. (1995) 酶 ，o- 酸 性 蛋白 肝 瘤 a- AGERE A 血清 N- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Seregin et al. (1995) Taketa (1998) iE, H, BRI al- 酸性 糖 蛋白 血清 N-RBE ALAA Van Dijk etal. ( 1995 );

Mackiewicz and Mackiewicz

(1995)

免疫 紊乱 CD43 工 细胞 O- 连 接 糖 蛋白 形式 不 同 Ellies et al. (1996)

类 风湿 关节 炎 IgG 血清 N- 连 接 端 基 半 乳 糖 降低 ”Delves (1998)

Creutzfeldt-Jakob 证 tA CSF 糖 基 化 程度 不 同 Furakawa et al. (1998)

血吸虫 病 循环 阴 / 阳 抗原 血清 ， 尿 0- 连接 糖 蛋白 形式 不 同 Van Dam et al. (1996)

ERIK te, SL hCG 尿 N- 及 0- 连 接 糖 链 过 多 分 Elliott et al. (1997)

ARIE x

醒酒 转 铁 蛋白 血清 脱 唾液 酸 Tagliaro et al. (1998)

癌症 黏 蛋 白 肿瘤 特殊 短 O- 连 接 多 糖 的 过 = Taylor-Papadi Mitriou and 表达 或 暴露 Epenetos (1994); Kim et

al. (1996) 溶菌 酶 储藏 症 溶菌 酶 类 多 糖 尿 异常 碳水 化 合 物 的 分 泌 Starr et al. (1994) 绝经 FSH，LH 血清 酸性 增加 ， 复 杂 人 性 降低 ”Anobile et al. (1998)

从 表 13.1 可 以 看 出 ， 许 多 发 生 在 目标 蛋白 糖 基 化 中 的 变化 ， 有 些 是 由 于 糖 基 化 程 度 不 同 而 导致 分 子 量 的 变化 ， 有 的 是 由 于 相应 的 唾液 酸化 而 引起 等 电 点 变化 ， 同 时 ， 多 糖 的 磷 酰 化 及 硫酸 化 也 会 使 糖 蛋白 的 等 电 点 发 生变 化 。 糖 蛋白 的 这 些 固有 属性 使 它们 在 2-DE 上 理想 地 排列 ， 这 一 阵列 非常 适合 检测 糖 基 化 过 程 中 的 特征 性 变化 ， 目 前 还 没有 其 他 技术 能 够 以 这 种 形式 展示 糖 蛋白 的 不 同 。

4. BARA ay eo oT

糖分 析 最 初 是 以 复杂 的 、 大 分 子 质量 的 多 糖 的 化 学 及 物理 结构 测定 为 焦点 的 。 这 些 技术 从 前 非常 适 于 对 于 那些 分 子 量 较 小 ， 结 构 较 简单 的 多 糖 的 分 析 ， 而 至 今 已 逐渐 成 为 蛋 白 质 生物 化 学 家 手中 的 一 种 更 快 、 更 简易 的 分 析 方 法 。 能 够 完成 小 分 子 多 糖 及 糖 肽 的 质量 分 析 的 质谱 仪 的 到 来 ， 加 之 许多 专 一 的 外 切 糖 苷 酶 的 克隆 ， 促 使 我 们 能 够 分 析 许 多 PEA ESR SERN OA HERE AT SR REP (Packer and Harrison，1998)， 由 于 经 纯化 过 的 被 表达 的 重组 糖 蛋白 在 样品 量 的 提供 方面 占有 优势 ， 所 以 通过 对 它们 的 分 析 ， 使 得 绝 大 多 数 分 析 方 法 得 以 优化 。 (10nmol 或 100ng BAM) 相对 而 言 ， 分 析 2-DE 分 离 的 糖 蛋白 所 需 的 样品 量 日 益 减 小 (通常 10 pmol 或 100ng).

由

。 210 ， SARA

4.1 重组 糖 蛋 白 分 析

由 重组 DNA 生产 蛋 日 质 的 方法 是 生物 技术 产业 中 日 益 增 长 的 领域 。 许 多 治疗 及 诊 断 蛋 白质 都 是 糖 基 化 的 ， 因 此 糖 基 化 形式 的 快速 分 离 及 鉴定 就 十 分 必要 ， 由 于 多 糖 链 的 变化 能 够 诱导 不 良 的 免疫 学 反应 ， 导 致 越 来 越 多 的 官方 法 规 要 求 对 糖 蛋 白 的 多 糖 部 分 进 行 严 格 的 测定 。

对 于 细胞 系 和 培养 条 件 的 依赖 ， 使 表达 体系 不 可 能 完全 控制 蛋白 的 糖 基 化 ， 从 而 产 生 了 如 此 多 的 差异 (Lifely et al., 1995; Wright and Morrison，1997) 。 发 酵 过 程 的 条 件 可 监测 不 同 糖 基 结 构 是 怎样 及 何 时 产生 的 。 液 相 色谱 是 监测 批 次 间 差 异 及 下 游 进程 的 有 效 方 法 ， 而 电泳 技术 由 于 其 高 通 量 、 对 比 性 分 析 及 分 辩 率 等 方面 的 优势 ， 应 用 越 来 越 广 7 (Taverna et dl .，1998)。 应 用 电泳 技术 如 等 电 聚 焦 (IEF). BAB (CE) 及 二 维 凝 胶 电泳 (2-DE) 等 使 快速 常规 分 析 及 产品 监测 日 益 简 单 化 了 。

糖 基 化 的 出 现 与 缺失 也 能 调节 一 些 重 组 蛋白 的 功能 ， 比 如 人 粒 细 胞 集落 刺激 因子 (rHG-CSF; Hoglund，1998)、 人 淋巴 细胞 毒素 (Funahashi et wo .，1993)、 上 白细胞 介 素 2 (Voshol et wd .，1996)、 甲 状 腺 过 氧化 物 酶 (Fayadat et al., 1998) 及 al- 酸 性 糖 蛋 白 (Shiyan and Bovin, 1997) 都 是 糖 基 化 后 而 具有 生物 活性 的 重组 和 蛋白。 其 他 一 些 重组 蛋 白天 然 就 存在 糖 基 化 ， 如 白细胞 介 素 -3 (Zitener et al., 1994), M/)AAMA (Jager- schmidt et al., 1998) 及 人 生长 激素 (Becker and Hsiung，1986)， 它 们 甚至 于 在 无 糖 基 化 时 也 有 活性 。 蛋 白质 组 学 方法 可 以 监测 这 些 和 蛋白 的 体内 变化 ， 提 供 对 天 然 糖 基 形式 不 均一 性 及 功能 方面 的 了 解 。 一 个 具有 生物 学 意义 的 糖 蛋白 在 体外 重组 和 表达 之 前 ， 了 解 相关 的 知识 是 相当 重要 的 。

4.2 经 分 离 的 胶 上 糖 蛋白

由 于 纯化 蛋白 所 提供 的 量 是 有 限 的 ， 所 以 用 一 维 或 二 维 凝 胶 电泳 分 离 蛋 白 从 而 实现 糖 基 化 结构 变化 检测 的 方法 受到 了 挑战 。 质 谱 (包括 基质 辅助 激光 解吸 电离 质谱 一 一 MALDLMS， 及 电 喷 雾 电 离 质谱 一 ESLMS) 及 毛细 管区 带电 泳 (CIE)， 是 两 种 用 于 解决 出 现在 糖 蛋白 异 构 体 中 糖 链 结构 的 不 均一 性 问题 的 最 有 前 途 的 技术 。

糖 蛋白 物理 及 化 学 特性 造成 了 用 目前 蛋白 质 组 技术 对 其 进行 分 析 的 困难 ， 这 一 点 已 越 来 越 清楚 了 ， 糖 链 的 连接 ， 特 别 是 大 型 的 N- 连 接 糖 链 ， 由 于 其 庞大 的 分 子 量 及 亲 水 性 ， 赋 了 予 了 蛋白 质 不 同 的 特性 ， 为 了 分 析 2-DE 分 离 的 糖 蛋白 ， 蛋 白质 组 研究 需要 在 空 THF (阵列 )、 定 性 及 生物 信息 学 方面 加 以 优化 。

空间 分 辩 (阵列 ) ”血浆 糖 蛋 白 的 2-DE 已 做 为 血清 蛋白 图 谱 发 表 于 网 上 (Sanchez et ll/ .，1995)。 在 我 们 的 工作 中 发 现 ， 采 用 重 泡 胀 技术 将 纯化 的 糖 蛋 日 在 一 维 固 相 pH 梯度 (IPG) 胶 条 上 上 样 ， 导 致 进入 胶 条 的 样品 量 较 低 ， 杯 状 进 样 法 可 以 使 糖 蛋白 进入 IPG 胶 条 的 量 大 大 增加 ， 小 量 大 肠 杆 菌 蛋 白 抽 提 物 与 重组 糖 蛋 白 经 重 泡 胀 上 样 产生 同样 的 结果 。 图 13.2 显示 了 用 标准 糖 蛋白 一 一 牛 胎 球 蛋白 所 表现 的 这 种 效果 ， 而 对 非 糖 基 化 的 蛋白 上 样 时 无 此 类 困难 。 糖 蛋白 这 种 效应 的 原因 只 能 如 上 推断 ， 但 是 它 确实 能 够 反 映 多 糖 对 蛋白 质 表面 积 大 小 ， 电 荷 等 方面 的 影响 ， 同 时 ， 它 也 有 助 于 揭示 糖 蛋 白 物 理 特 性 的 不 同 。

第 十 三 章 ， 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 chee:

pH 4 pH 7 pH 4 pH 7 a a ie Ee = ——— 一 = d 号 ae es a c (c) pH4 pH 7

图 13.2 纯化 糖 蛋白 的 二 维 电泳 糖 蛋白 溶 于 Smol/L 尿素 ，2mol/L Fisk, 2m mol/L TBP，2%CHAPS，2% 硫 代 甜 菜 碱 3- 10，0.5% 两 性 电解 质 3-10, 40 mmol/L Tris, LK##F pH4~7 的 IPG 胶 条 ，2-DE 分 离 ， 考 马 斯 蓝 染 色 。(a) 10pg FR 胎 球 蛋 白 一 维 重 泡 胀 上 样 (Rabilloud et al., 1994); (b) 10pg 牛 胰 胎 球 蛋白 一 维 阳 极 加 样 杯 上 样 + 1% pH 2.5~5 两 性 电解 质 (Pharacia); (c) 10pg 牛 胰 胎 球 蛋白 + Sug E.coli 全 蛋白 一 维 重 泡 胀 技术 加 样 。

糖 蛋 白 一 经 分 离 ， 下 一 步 是 将 其 显 色 ， 许 多 用 考 马 斯 亮 兰 染色 和 银 染 方法 来 染 糖 蛋 白 的 人 们 发 现 ， 糖 蛋白 的 染色 非常 不 理想 ， 或 者 根本 染 不 上 色 。 为 了 对 2-DE 胶 上 和 蛋 日 质 混合 物 中 的 糖 蛋白 着 色 ， 最 好 的 办 法 是 染色 其 特殊 的 多 糖 部 分 ， 那 么 ， 灵 敏 的 凝集 素 (Golaz et al., 1995) 及 半 抗 原 识别 法 可 以 实现 这 一 过 程 ， 目 前 市 场 上 (Bio-Rad 多 糖 检 测试 剂 盒 ，Boehringer-Mannheim DIG 检测 试剂 盒 ) 已 经 出 现 了 许多 基于 糖 的 高 碘 酸 盐 氧化 作用 ， 以 及 夹心 抗体 或 生物 素 / 链 霉 亲 合 素 等 显 色 方法 发 展 的 产品 。 我 们 对 染色 方 法 加 以 改进 ， 采 用 荧光 蔡 代 氧化 糖 上 的 颜色 标签 ， 从 而 使 PVDF 膜 上 的 糖 蛋 白 快 速 ， 灵敏 地 显现 。 :

定性 “多糖 的 不 均一 性 是 导致 2-DE 胶 上 单个 糖 类 型 分 离 不 明显 的 原因 ， 重 组 的 截 短 的 免疫 球 蛋 昌 超 家 族 糖 蛋白 CD4， 它 包括 一 个 N- 糖 基 化 位 点 ， 在 2-DE 胶 上 分 离 为 三 个 不 同 的 糖 型 式 (图 13.3)， 通 常 我 们 以 唾液 酸化 的 不 同 来 解释 这 种 在 等 电 点 上 的 差 异 。 但 是 ， 在 分 离 实 验 中 ，N- 连 接 糖 蛋白 的 质谱 分 析 对 另 一 个 糖 蛋白 一 人 ol RE 白 酶 的 解释 显示 ， 这 并 非 是 直接 原因 。 而 其 真正 的 原因 是 由 于 在 不 同 的 点 上 ， 糖 基 化 是 不 均一 的 (Packer et al .，1998)。 在 对 al- 抗 胰 蛋 白 酶 的 单 糖 分 析 中 ， 我 们 发 现在 每 个 糖 基 形 式 中 ， 中 性 糖 的 唾液 酸化 有 相同 的 比率 ， 糖 基 化 的 明显 增加 导致 了 等 电 点 的 降低 (Packer et al., 1996).

- 212: 和 蛋白质 组 学

pH4 pH7

kDa 250 =

98

50 =

36 2

30

16. = x

.-

图 13.3 CD4.c 截 型 糖 蛋 白 异 构 体 的 二 维 电泳 2-DE 分 离 CD4.c 截 型 糖 蛋白 ， 一 维 用 pH4 一 7 的 IPG 胶 条 ， 和 蛋白 以 阳极 杯 上 样 于 1% (pH 2.5~5) 的 两 性 电解 质 ， 二 维 用 10% ~20%SDS-PAGE 分 离 ， 未 修饰 蛋白 具有 理论 分 子 量 20 429Da， 等 电 点 5.66。

ESI 与 MALDI 的 快速 发 展 已 经 给 蛋白 质 的 分 析 带 来 了 革命 性 变化 ， 同 时 ， 对 多 糖 的 分 析 也 存在 着 同样 的 应 用 潜力 (Costello, 1997; Packer and Harrison, 1998 )， 脱 糖 基 化 、 衍 生化 释放 的 多 糖 正 相 HPLC、 酶 切 测序 以 及 ESI 和 MALDI 等 各 种 技术 已 经 发 展 到 对 重组 糖 蛋白 进行 分 析 的 阶段 ， 同 时 目标 已 经 指向 了 对 胶 上 分 离 的 糖 蛋 白 完 全 结构 鉴 定 。

N- 连 接 多 糖 的 糖 肽 ， 由 于 其 质量 (包括 多 肽 部 分 ) 通常 大 于 3500Da， 在 MALDI 上 难以 看 到 ， 加 之 以 不 均一 化 的 趋势 ， 最 多 只 能 在 线性 方式 下 看 到 一 个 宽 的 信号 峰 。 O- 连 接 多 糖 在 总 的 趋势 上 比 N- 连 接 多 糖分 子 要 小 ， 做 为 胶 上 酶 解 糖 恒 白 的 胰 酶 糖 肽 碎 A, eS EA RY Ry WA (Packer and Harrison，1998)。 将 胶 上 电泳 分 离 并 用 PVDF 膜 转 印 的 血型 糖 蛋 白 A (Packer et al., 1998) 以 及 胶 上 荧光 标记 病毒 蛋白 (Medina et al., 1998) 进行 碱 性 B- 消 除 释放 糖 链 ， 也 可 对 O- 连 接 多 糖 进行 定性 分 析 。 胶 上 糖 蛋白 的 分 析 还 有 脐 解 及 胶 上 分 离 的 明胶 酶 B 变 体 的 O- 糖 链 质 谱 分 析 (Van den Steen et al., 1986b)。O5 标 记 的 N- 连 接 位 点 谱 及 肽 质量 指纹 谱 分 析 (Kuster and Mann, 1999).

在 重组 糖 蛋 日 异 构 型 的 高 通 量 监测 方面 ， 毛 细 管 区 带电 泳 也 是 十 分 有 用 的 ， 这 一 技 术 可 以 解决 等 电 点 及 结构 上 的 微小 差异 ， 同 时 对 这 些 差异 的 定性 可 以 通过 与 MS 连接 来 实现 。 这 一 技术 及 其 在 重组 多 糖 及 糖 肽 谱 图 方面 的 应 用 由 Susuk 和 Honda (1998) 以 及 Taverna 等 (1998) 的 两 篇 详细 综述 报导 。 用 这 一 技术 分 析 2-DE TANKS A HE 点 在 于 它 要 求 被 分 析 物 有 一 定 的 浓度 (pmoML)。

首先 ， 我 们 对 蛋白 质 高 通 量 分 析 方 法 的 选择 ， 是 应 用 灵敏 ， 快 速 ， 简 单 的 MALDI

第 十 三 章 ” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 “213; >

自动 方法 从 一 个 已 知 基因 组 对 蛋白 进行 鉴定 ， 这 种 方法 已 用 于 只 有 一 些小 的 考 染 蛋白 斑 点 的 胰 酶 降解 碎片 。 一 旦 蛋白 在 数据 库 上 鉴定 ， 许 多 被 修饰 的 蛋白 的 微小 特性 也 就 相应 显现 (图 13.4)。 接 下 来 我 们 用 较 慢 一 点 的 ESI-MS-MS 技术 做 为 第 二 梯队 ， 对 我 们 感 趣 于 其 修饰 的 特殊 蛋白 加 以 定性 分 析 。 为 了 彻底 确定 糖 基 化 性 质 ， 微 不 均一 性 及 宏观 差 异 理论 上 都 应 该 进行 测定 。

蛋白 酶 解 产物

样品 的 10% MALDI-TOF

样品 的 90%

PE ILA Bie 肽 质量 指纹 谱 糖 质量 指纹 谱

图 13.4 糖 蛋白 组 策略 2-DE 分 离 糖 蛋白 结合 自动 化 高 通 量 质谱 分 析

我 们 认为 ESI 在 糖 蛋 白 或 糖 肽 一 一 严格 地 说 是 那些 具有 微 不 均一 性 的 N- 连 接 糖 基 化 的 糖 蛋白 一 一 的 离子 化 方面 比 MALDI-TOF 更 为 成 功 ， 这 可 能 是 由 于 在 MALDI FY 须 应 用 基质 造成 的 ， 那 些 具 有 微 不 均 一 性 的 多 糖 、 大 分 子 的 N- 连 接 糖 链 以 及 难以 观察 的 多 糖 唾液 酸化 ， 使 它们 与 基质 难以 发 生 衍生 化 (Powell and Harvey，1996)。 我 们 对 不 完全 的 、CHO 表达 的 重组 大 鼠 CD4 (未 修饰 MDa= 20 429.31Da) 进行 分 析 ， 它 包含 一 个 N- 糖 基 化 位 点 ， 图 13.5 列 出 了 这 两 种 质谱 在 糖 蛋白 分 析 方 面 的 不 同 ， 在 全 部 分 子 被 脱 唾液 酸 后 ， 具 有 8 个 支 链 的 N- 连 接 多 糖 可 以 被 定性 分 析 (Ashford et al., 1993), 而 它们 是 包括 在 2 个 N- 连 接 糖 基 化 位 点 上 的 ， 在 MALDI-MS 图 上 ， 由 于 其 广泛 的 不 均 一 性 ， 在 如 此 高 的 质量 范围 内 ， 没 有 个 别 质量 能 被 分 开 (图 13.$a)。ESI-MS 可 以 分 辩 单一 位 点 上 9 个 可 能 的 糖 基 化 形式 (图 13.$Sb)， 由 于 我 们 用 的 是 未 加 修饰 的 蛋白 质量 ， 因此 ， 主 要 的 宽 峰 可 被 视 为 杂 合 形 多 糖 结构 [22 497 Da= 核心 (GlcNAc), (Man); + (Gal); (GleNAc); (Man);] 及 混合 形 多 糖 结构 [22 489Da = 核心 (GlcNAc);(Man)3 + (Gal)>(GlcNAc)>(Fuc)i;(NeuAc)1] 的 混合 体 ， 质 量 偏差 是 由 相关 的 微 不 均 一 性 造成 的 。

质谱 可 以 测定 不 同 糖 基 化 形式 中 单 糖 位 点 。 通 过 碰撞 诱导 解 离 的 特殊 方式 ， 这 一 技 术 还 可 以 提供 各 个 残 基 的 序列 、 连 接 方式 方面 的 信息 ， 文 献 中 报导 的 绝 大 多 数 碎 片 的 数

083, 蛋白 质 组 学

22000 22100 22200 22300 22400 22500 22600 22700 22800 质 荷 比

| 22494

(b)

162

22000 22100 22200 22300 22400 22500 22600 22700 22800

图 13.5 CD4.c 糖 蛋白 的 质谱 图 (a) MALDI-TOF (Perseptive Voyager): 20pmol CD4.c 糖 蛋白 ， 用 Poros 50R1 (相当 于 C4 反 相 性 质 ) 清洗 (Kussman 4, 1997), FA 2ul2% TFA 洗 脱 ，80% MeCN & 10mg/ml 芥子 酸 直接 上 和 靶 ; (b) ESI-TOF-MS (Micromass), 100pmol CD4.c ( 同 批 ) 脱盐 用 HPLC C4 柱 (Aquapore Bu-300 A 100x2.1mm，PE Brownlee), #34 0.05% TFA % 80% Zfa& 0.05%TFA, 30min, BAKAZE 22min 洗 脱 ， 检 测 波长 214nm (主峰 加 合 TFA).

据 是 由 单 甲 基 化 的 多 糖 的 快 原子 又 击 (FAB) 质谱 获得 的 。MALDI 及 ESI 这 两 种 技术 适合 于 在 高 灵敏 度 地 对 大 分 子 量 范围 内 的 生物 分 子 进行 测定 ， 因 而 它们 可 用 于 探索 打 碎 糖 复合 物 ， 目 前 已 经 获得 了 在 对 蛋白 或 多 肽 释放 的 非 衍 生化 多 糖 结构 分 析 方 面 的 较 好 数 #2, MALDI-TOF WYSE (PSD) (Naven et al., 1997) 或 CIO-ESI-TOF MR A ak 撞 - 诱 导 解 离 (Packer and Harrison, 1998) 或 ESI-MS-MS (Oxley, 1998) 等 技术 可 以 打 碎 糖苷 键 。 由 于 微 孔 及 毛细 管 液 相 谱 的 接口 适合 于 被 分 离 的 糖 基 化 形式 的 碰撞 诱导 碎 片 分 析 ， 目 前 电 喷 雾 电 离 技术 已 成 为 蛋白 糖 基 化 结构 分 析 的 最 佳 选 择 (Bulingame， 1996)， 不 同 离子 化 技术 与 更 好 的 检测 方法 之 间 结 合 是 质谱 的 发 展 方向 ， 我 们 感到 在 恒

第 十 三 章 ，” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 « 245, «

白糖 基 化 形式 的 分 析 方 面 ， 这 一 方法 将 比 别 的 方法 出 色 。

糖 蛋白 质 组 的 质谱 常规 应 用 还 存在 大 量 有 待 于 解决 的 问题 。 对 于 MALDI-MS 分 析 ， 未 来 的 工作 是 需要 发 现 一 些 适 合 于 大 分 子 亲 水 性 糖 肽 的 特殊 基质 ， 同 时 ，MALDI 分 析 对 于 糖 肽 的 上 游 富 集 的 选择 将 证 明 是 有 帮助 的 。 对 于 ESIMS， 经 由 源 内 CID， 糖 肽 可 以 在 LC 上 分 离 ， 而 肽 上 的 多 糖 碎片 则 难以 被 解释 ， 对 这 种 不 带电 荷 的 多 糖 的 检测 灵敏 度 需 要 进一步 提高 ， 同 时 ， 需 要 一 个 易 离子 化 基 团 对 目标 糖 进行 衍生 化 。 这 种 化 学 反应 ”必须 是 反应 完全 并 简单 的 ， 同 时 能 够 适应 高 通 量 的 分 析 ， 在 质谱 之 前 被 采用 的 柱 分 离 及 电泳 分 离 步 又 需要 加 快速 度 及 自动 化 进程 。

可 是 ， 对 蛋白 质 上 糖 类 型 的 完全 结构 分 析 ， 其 要 求 远 远 超过 仅仅 对 糖 进 行 分 子 质量 测定 。 与 用 于 肽 质量 指纹 谱 中 的 氨基 酸 质量 相 比 ， 许 多 单 糖 残 基 有 着 相同 的 分 子 质量 ， 同时 ， 连 接 方式 及 序列 难以 用 质谱 测定 。 尽 管 如 此 ， 由 于 各 种 单 糖 在 其 结构 和 框架 范围 内 有 一 定 的 守恒 性 ， 使 糖 蛋白 的 分 析 简 化 。 因 此 ， 可 以 通过 对 一 些 已 知 的 特殊 组 织 或 种 属 方面 的 知识 ， 来 约束 可 能 的 具有 某 种 特定 质量 的 多 糖 结构 。

信息 学 ”基因 组 及 蛋白 质 组 领域 所 获得 的 大 量 数据 给 生物 信息 学 领域 带 来 了 巨大 的 冲击 ， 数 据 及 开发 数据 库 的 工具 广 证 地 应 用 于 DNA 的 翻译 和 和 蛋 日 序列 以 及 修饰 ， 在 分 析 不 断 进展 的 同时 ， 需 要 构建 数据 库 及 信息 工具 适应 糖 基 化 数据 的 翻译 。 wa (http://128.192.9.29/Carbbank/Carbbank. html) 自 1995 年 来 未 收 到 输入 数据 的 基金 ，O-Glycbase (http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/) 以 神经 网 络 预测 O- 糖 基 化 位 点 ， 至 今 也 仅仅 发 表 了 一 些 有 限 的 糖 蛋 白 守 糖 链 信 息 的 数据 库 。 我 们 最 近 已 经 整理 了 一 个 糖 蛋 日 O- 连 接 位 点 的 数据 库 (Cooper et al., 1999) 并 且 正 在 准备 更 加 广泛 的 生物 信息 学 工具 及 数据 库 ， 以 用 于 糖 蛋 白质 组 学 研究 。

SWISS-PROT 及 相 类 似 的 许多 数据 库 已 经 给 生物 化 学 家 们 提供 了 信息 的 贮藏 地 及 开发 的 工具 ， 我 们 也 需要 类 似 于 它 的 完整 的 信息 库 ， 以 适应 糖分 析 的 发 展 。 糖 肽 或 被 释 放 的 糖 的 质量 测定 ， 可 以 较 容 易 地 转化 成 单 糖 构架 ， 这 些 构 架 与 先前 报导 的 结构 相 匹 配 ， 同 时 通过 设计 特殊 的 糖苷 外 切 酶 实验 ， 可 以 检测 结构 的 可 能 性 。 从 特殊 结构 质谱 碎 片 模型 ( 糖 质量 指纹 谱 ) 的 知识 还 可 以 推测 序列 ， 我 们 需要 综合 糖 蛋白 中 大 量 有 价值 的 知识 ， 以 便 用 它们 来 分 析 从 糖 蛋 白质 组 分 析 中 获取 的 数据 。

5. 结论

蛋 白 的 翻译 后 修饰 ， 包 括 糖 基 化 ， 将 证 明 是 对 于 发 生 在 生物 学 体系 中 新 陈 代谢 的 “ 极 好 控制 "， 当 基因 产品 在 蛋白 活性 组 织 中 被 修饰 时 ， 这 一 点 尤为 明显 。 多 糖 结构 中 可 利用 的 广泛 的 差异 性 使 其 成 为 微调 新 陈 代谢 的 最 佳 部 分 。Clark 等 (1997) 已 将 这 种 糖 基 化 的 特殊 功能 假定 为 从 母体 免疫 应 答 的 人 胚胎 的 保护 基础 。 并 且 ， 这 些 特 殊 多 糖 的 获 得 也 许 意味 着 ， 病 原 体 能 够 搅乱 宿主 的 免疫 应 答 。2-DE 展示 的 糖 蛋白 阵列 提供 一 个 谱 图 ， 由 它 我 们 可 以 探索 疾病 发 生 、 发 展 过 程 中 的 变化 。 重 组 糖 蛋 白 由 于 其 能 够 提供 足够 的 样品 量 ， 对 于 它们 的 分 析 工 具 已 经 较 完 善 了 。 目 前 要 求 这些 可 达到 pmol 灵敏 度 的 检 测 方 法 ， 能 够 象 蛋白 质 的 鉴定 及 定性 的 一 些 方法 一 样 ， 适 应 高 通 量 的 糖 蛋白 的 鉴定 与 定 性 。 从 已 开发 的 数据 形式 我 们 可 以 获得 延伸 的 信息 ， 这 将 依赖 于 改进 的 、 更 加 灵敏 的 方 法 学 的 继续 发 展 ， 以 及 生物 信息 特别 是 糖 生物 信息 工具 的 构建 。

。 216 - SARA

致谢 感谢 Neily Barclay 友好 提供 纯化 的 重组 截 形 CD4，Ben Herbert 提供 2-DE 方面 的 帮

助 ， 以 及 Keith Williams And rew Gooley 共同 整理 。

(Bie Ee Re 校 )

参考 文献

Anobile, C.J., Talbot, J.A., McCann, S.J., Padmanabhan, V. and Robertson, W.R. (1998) Glyco- form composition of serum gonadotrophins through the normal menstrual cycle and in the post-menopausal state. Mol. Hum. Reprod. 4: 631-639.

Ashford, D.A., Alafi, C.D., Gamble, V.M., MacKay, D.J.G., Rademacher, T.W., Williams, P.J., Dwek, R.A., Barclay, A.N., Davis, S.J., Somaoza, C., Ward, H.A. and Williams, A.F. (1993) Site- specific glycosylation of recombinant rat and human soluble CD4 variants expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 268: 3260-3267.

Becker, G.W. and Hsiung, H.M. (1986) Expression secretion and folding of human growth hormone in Escherichia coli. Purification and characterization. FEBS. 204: 145-150. Brockhausen, I. and Kuhns, W. (1997) Glycoproteins and Human Disease. R.G. Landes, New York. Brockhausen, I., Schutzbach, J. and Kuhns, W. (1998) Glycoproteins and their relationship to human disease. Acta Anat. 161: 36-78.

Burlingame, A.L. (1996) Characterization of protein glycosylation by mass spectrometry. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 4-10.

Ching, C.K. and Rhodes, J.M. (1988) Identification and partial characterization of a new pancreatic cancer-related serum glycoprotein by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and lectin blotting. Gastroenterology 95: 137-142.

Clark, G.F., Dell, A., Morris, H.R., Patankar, M., Oehninger, S. and Seppala, M. (1997) Viewing AIDS from a glycobiological perspective: potential linkages to the human fetoembryonic defence system hypothesis. Mol. Hum. Reprod. 3: 5—13.

Cooper, C.A., Wilkins, M.R., Williams, K.L and Packer, N.H. (1999) Electophoresis 20 (in press). Costello, C.E. (1997) Time, life ... and mass spectrometry. New techniques to address biological questions. Biophys. Chem. 68: 173-188.

Delahunt, B., Maxwell, J.,. Moroni-Rawson, P., Renner, R. M., Nacey, J.N. and Jordan, T.W. (1996) Serum protein variation in patients with renal cell carcinoma. J. Urol. Pathol. 5: 97-107. Delves, P.J. (1998) The role of glycosylation in autoimmune disease. Autoimmunology 27: 239-253. Dwek, R.A. (1995) Glycobiology: towards understanding the function of sugars. Biochem. Soc. Trans. 23: 1-25.

Ellies, L.G., Jones, A.T., Williams, M.J. and Ziltener, H. J. (1994) Differential regulation of CD43 glycoforms on CD4+ and CD8+ T lymphocytes in graft-versus-host disease. Glycobiology 6: 885-893.

Elliott, M., Kardana, A., Lustbader, J. and Cole, L. (1997) Carbohydrate and peptide structure of the alpha- and beta-subunits of human chorionic gonadotrophin from normal and aberrant pregnancy and choriocarcinoma. Endocrine 15-32.

Fayadat, L., Niccoli-Sire, P., Lanet, J. and Franc, J.L. (1998) Human thyroperoxidase is largely retained and rapidly degraded in the endoplasmic reticulum. Its N-glycans are required for folding and intracellular trafficking. Endocrine 139: 4277-4285.

Funahashi, I., Wantanabe, H., Abo, T., Indo, K. and Miyaji, H. (1993) Tumour growth inhibition in mice by glycosylated recombinant human lymphotoxin: analysis of tumour-regional mono- nuclear ceils involved with its action. Br. J. Cancer 67: 447-455.

Furakawa, H., Doh-ura, K., Kikuchi, H., Tateishi, J. and Iwaki, T. (1998) A comparative study of abnormal prion protein isoforms between Gerstmann-—Straussler—Scheinker syndrome and Creutzfeldt-Jakob disease. J. Neurol. Sci. 158: 71-75.

Golaz, O., Gravel, P., Walzer, C., Turler, H., Balant, L. and Hochstrasser, D. F. (1995) Rapid detection of the main human plasma glycoproteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis lectin affinoblotting. Electrophoresis 16: 1187-1189.

Hankey, D.P., Nicholas, R.M. and Hughes, A.E. (1992) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis reveals differences between osteoblast and fibroblast extracellular proteins. Electrophoresis 13: 329-332.

第 十 三 章 ” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 - 217 -

Hansen, J.E., Lund, O., Tolstrup, N., Gooley, A.A., Williams, K L. and Brunak, S. (1998) NetOglyc: prediction of mucin type O-glycosylation sites based on sequence context and surface accessibility. G/ycoconj. J. 15: 115-130.

Hart, G.W., Kreppel, L.K., Comer, F.I., Arnold, C.S., Snow, D.M., Ye, Z., Cheng, X., Della Manna, D., Caine, D.S., Earles, B.J., Akimoto, Y., Cole, R.N. and Hayes, B.K. (1996) O-GlcNAcylation of key nuclear and cytoskeletal proteins: reciprocity with O-phosphorylation and putative roles in protein multimerization. Glycobiology 7: 711-716.

Haynes, P.A. (1998) Phosphoglycosylation: a new structural class of glycosylation? Glycobiology 8: 1-5.

Hoglund, M. (1998) Glycosylated and non-glycosylated recombinant human granulocyte colony- stimulating factor (rhG-CSF) - What is the difference? Med. Oncol. 15: 229-233.

Hounsell, E.F., Davies, M.J. and Renouf, D.V. (1996) O-linked protein glycosylation structure and function. G/ycoconj. J. 13: 19-26.

Jagerschmidt, A., Fleury, V., Anger-Leroy, M., Thomas, C., Agnel, M. and O’Brein, D.P. (1998) Human thrombopoietin structure-function relationships: identification of functionally impor- tant residues. Biochem. J. 333: 729-734.

Kim, Y.S., Gum, J.R. and Brockhausen, I. (1996) Mucin glycoproteins in neoplasia. Glycoconj. J. 13: 693-707.

Kinoshita, T., Ohishi, K. and Takeda, J. (1997) GPI-anchor synthesis in mammalian cells: genes, their products, and a deficiency. J. Biochem. (Tokyo) 122: 251-257.

Kudryashov, V., Kim, H.M., Ragupathi, G., Danishefsky, S.J., Livingston, P.O. and Lloyd, K.O. (1998) Immunogenicity of synthetic conjugates of Lewis(y) oligosaccharide with proteins in mice: towards the design of anticancer vaccines. Cancer. Immunol. Immunother. 45: 281-286.

Kukuruzinska, M.A. and Lennon, K. (1998) Protein N-glycosylation: molecular genetics and functional significance. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 9: 415-448.

Kussman, M., Nordhoff, E., Rahbek-Nielsen, H., Haebel, S., Rossel-Larsen, M., Jakobsen, L., Gobom, J., Mirgorodskaya, E., Kroll-Kristensen, A., Palm, L. and Roepstorff, P. (1997) Matrix- assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry sample preparation techniques designed for various peptide and protein analytes. J. Mass Spec. 32: 593-601.

Kuster, B. and Mann, M. (1999) 180-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71: 1431-1440.

Kuster, B., Wheeler, S.F., Hunter, A.P., Dwek, R.A. and Harvey, D.J. (1997) Sequencing of N- linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix- assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250: 82-101.

Kuster, B., Hunter, A.P., Wheeler, S.F., Dwek, R.A. and Harvey, D.J. (1998) Structural determination of N-linked carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry following enzymatic release within sodium dodecyl sulphate—polyacrylamide electrophoresis gels: application to species-specific glycosylation of alphal-acid glycoprotein. Electrophoresis 19: 1950-1959.

Lifely, M.R., Hale, C., Boyce, S., Keen, M.J. and Phillips, J. (1995) Glycosylation and biological activity of CAMPATH-1IH expressed in different cell lines and grown under different culture conditions. Glycobiology 5: 813-822.

Lis, H. and Sharon, N. (1993) Protein glycosylation: structural and functional aspects. Eur. J. Biochem. 218: 1-27.

Lo-Man, R., Bay, S., Vichier-Guerre, S., Deriaud, E., Cantacuzene, D. and Leclerc, C. (1999) A fully synthetic immunogen carrying a carcinoma-associated carbohydrate for active specific immunotherapy. Cancer Res. 59: 1520-1524.

Lu, Q. and Shur, B.D. (1997) Sperm from beta 1 ,4-galactosyltransferase-null mice are refractory to ZP3-induced acrosome reactions and penetrate the zona pellucida poorly. Development 124: 4121-4131.

Mackiewicz, A. and Mackiewicz, K. (1995) Glycoforms of serum alpha 1-acid glycoprotein as markers of inflammation and cancer. Glycoconj. J. 12: 241-247.

Medina, L., Grove, K. and Haltiwanger, R. S. (1998) SV40 large T antigen is modified with O- linked N-acetylglucosamine but not with other forms of glycosylation. Glycobiology 8: 383-391.

- 218 ， 蛋白 质 组 学

Montreuil, J., Vliegenthart, J.F.G. and Schachter, H. (1996) Glycoproteins and disease. In: New Comprehensive Biochemistry, Vol. 30. Elsevier, New York.

Naven, T.J., Harvey, D.J., Brown, J. and Critchley, G. (1997) Fragmentation of complex

“carbohydrates following ionisation by matrix-assisted laser desorption with an instrument fitted with time-lag focusing. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1681-1686.

Oxley, D., Munro, S.L., Craik, D.J. and Bacic, A. (1998) Structure and distribution of N-glycans on the S7-allele stylar self-incompatibility ribonuclease of Nicotiana alata. J. Biochem. (Tokyo). 123: 978-983.

Packer, N.H. and Harrison, M.J. (1998) Glycobiology and proteomics: is mass spectrometry the holy grail? Electrophoresis 19: 1872-1882.

Packer, N.H., Wilkins, M.R., Golaz, O., Lawson, M.A., Gooley, A.A., Hochstrasser, D.F., Redmond, J.W. and Williams, K.L. (1996) Characterization of human plasma glycoproteins separated by two-dimensional gel electrophoresis. Bio/Technology 14: 66—70.

Packer, N.H., Lawson, M.A., Jardine, D.R., Sanchez, J.-C. and Gooley, A.A. (1998) Analysing glycoproteins separated by two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 19: 981-988. Powell, A.K. and Harvey, D.J. (1996) Stabilization of sialic acids in N-linked oligosaccharides and gangliosides for analysis by positive ion matrix-assisted laser desorption/ionization mass

spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 10: 1027-1032.

Rabilloud, T., Valette, C. and Lawrence, J.J. (1994) Sample application by in-gel rehydration improves the resolution of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension. Electrophoresis 15: 1552-1558.

Sanchez, J.-C., Appel, R.D., Golaz, O., Pasquali, C., Ravier, F., Bairoch, A. and Hochstrasser, D.F. (1995) Inside SWISS-2DPAGE database. Electrophoresis 16: 1131-1151.

Seppala, M., Koistinen, H., Koistinen, R., Mandelin, E., Oehninger, S., Clark, G.F., Dell, A. and Morris, H.R. (1998) Glycodelins: role in regulation of reproduction, potential for contraceptive development and diagnosis of male infertility. Hum. Reprod. 13(Suppl. 3): 262-291.

Seregni, E., Botti, C. and Bombardieri, E. (1995) Biochemical characteristics and clinical applica- tions of alpha-fetoprotein isoforms. Anticancer Res. 15: 1491-1499.

Shiyan, S. D. and Bovin, N.V. (1997) Carbohydrate composition and immunomodulatory activity of different glycoforms of alphal-acid glycoprotein. Glycoconj. J. 14: 631-638.

Starr, C.M., Klock, J.C., Skop, E., Masada, I. and Giudici, T. (1994) Fluorophore-assisted electrophoresis of urinary carbohydrates for the identification of patients with oligo- saccharidosis- and mucopolysaccharidosis-type lysosomal storage diseases. G/ycosyl. Dis. 1: 165-176.

Susuki, S. and Honda, S. (1998) A tabulated review of capillary electrophoresis of carbohydrates. Electrophoresis 19: 2539-2560.

Tagliaro, F., Crivellente, F., Manetto, G., Puppi, I., Deyl, Z. and Marigo, M. (1998) Optimized determination of carbohydrate-deficient transferrin isoforms in serum by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis 19: 3033-3039.

Taketa, K. (1998) Characterization of sugar chain structures of human alpha-fetoprotein by lectin affinity electrophoresis. Electrophoresis 19: 2595-2602.

Taverna, M., Tran, N.T., Merry, T., Hovarth, E. and Ferrier, D. (1998) Electrophoretic methods for process monitoring and the quality assessment of recombinant glycoproteins. Electro- phoresis 19: 2572-2594.

Taylor-Papadimitriou, J.J. and Epenetos, A.A. (1994) Exploiting altered glycosylation patterns in cancer: progress and challenges in diagnosis and therapy. TiBTech. 12: 227-233.

van Dam, G., Bogitsh, B., van Zeyl, R., Rotmans, J. and Deelder, A. (1996) Schistosoma mansoni: in vitro and in vivo excretion of CAA and CCA by developing schistosomula and adult worms. J. Parasitol. 82: 557-564.

Van den Steen, P., Rudd, P.M., Proost, P., Martens, E., Paemen, L., Kuster, B., van Damme, J., Dwek, R.A. and Opdenakker, G. (1998a) Oligosaccharides of recombinant mouse gelatinase B variants. Biochim. Biophys. Acta 1425; 587-598.

Van den Steen, P., Rudd, P.M., Dwek, R.A. and Opdenakker, G. (1998b) Concepts and principles of O-linked glycosylation. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33: 151-208.

van Dijk, W., Havenaar, E.C. and Brinkman-van der Linden, E.C. (1995) Alpha 1-acid glycoprotein

第 十 三 章 ，” 糖 生物 学 与 蛋白 质 组 学 。 219 ，

4 (orosomucoid): pathophysiological changes in glycosylation in relation to its function. Glyco- conj. J. 12: 227-233.

Varki, A. (1993) Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology 3: 97-130.

Voshol, H., Dullens, H.F., Otter, W.D. and Vliegenthart, J.F. (1996) The glycosylation profile of interleukin-2 activated human lymphocytes correlates to their anti-tumour activity. Anticancer Res. 16: 155-159.

Winchester, B., Clayton, P., Mian, N., di-Tomaso, E., Dell, A., Reason, A. and Keir, G. (1995) The carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome: an experiment of nature in glycosylation. Biochem. Soc. Trans. 23: 185-188.

Wright, A. and Morrison, S.L. (1997) Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering. 7iBTech. 15: 26-32.

Youakim, A., Hathaway, H., Miller, D., Gong, X. and Shur, B. (1994) Overexpressing sperm surface beta 1,4-galactosyltransferase in transgenic mice affects multiple aspects of sperm-egg inter- actions. J. Cell Biol. 126: 1573-1583.

Yuasa, I., Ohno, K., Hashimoto, K., Iijima, K., Yamashita, K. and Takeshita, K. (1995) Carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome: electrophoretic study of multiple serum glyco- proteins. Brain Devi. 17: 13-19.

Zara, J. and Naz, R.K. (1998) The role of carbohydrates in mammalian sperm-egg interactions: how important are the carbohydrate epitopes? Front. Biosci. 3: d1028—1038.

Ziltener, H.J., Clark-Lewis, I., Jones, A.T. and Dy, M. (1994) Carbohydrate does not modulate the in vivo effects of injected interleukin-3. Exp. Hematol. 22: 1070-1075.

第 十 四 章 ”学术 环境 中 的 和 蛋白质 组 学

Michael A. Cahill and Alfred Nordheim

1. 引言

这 本 书 的 作者 人 数 在 学 院 和 企业 中 大 致 分布 相 等 。 但 用 于 学 术 研 究 的 预算 仅 相 当 于 同类 企业 支出 的 很 小 一 部 分 。 既 然 新 技术 的 引进 是 昂贵 的 ， 像 支持 蛋白 质 组 学 所 要 求 的 那样 ， 一 些 人 已 指出 学 术 性 的 蛋 白 质 组 学 不 可 能 具有 竞争 性 。 尽 管 如 此 ， 我 们 和 其 他 的 许多 同行 正 打 算 建 立 一 个 蛋 白 质 组 的 基本 设施 ， 即 匆 细 上 马 组 建 的 Tuebingen 大 学 的 细 胞 生物 学 研究 所 。 我 们 实验 室 在 哺乳 类 转录 调节 和 信和 号 传导 方面 的 建树 得 到 一 致 公认 (Arsenian et al., 1998; Cahill et al., 1996; Heidenreich et al., 1999; Hipskind et al., 1991)。 蛋 白质 组 学 在 这 一 领域 的 应 用 潜力 促使 我 们 全 身心 地 接受 这 种 技术 。 蛋 白质 组 学 设施 的 建立 在 我 们 研究 所 至 今 已 有 30 个 月 ， 并 且 筹 建 蛋白 质 组 研究 小 组 的 时 候 ， 已 经 有 两 个 博士 后 ， 两 个 研究 生 和 两 个 技术 助教 。 我 们 正 同心 协力 提高 技术 ， 并 实施 适合 我 们 研究 所 现状 的 临床 和 生物 学 科 的 计划 。 我 们 已 经 成 功 地 获得 了 资金 ， 用 于 购买 等 电 聚焦 仪 、 磷 储 屏 图 像 分 析 仪 、MALDI-TOF、 将 酶 解 的 蛋白 转 到 MALDI 样品 阶段 的 机 器 人 和 四 级 杆 飞 行 时 间 串 联 质 谱 。 我 们 已 经 与 临床 和 商业 密切 接触 ， 已 申请 几 个 蛋白 质 组 学 相关 的 专利 ， 并 且 已 投稿 正在 审查 的 论文 。

2. 为 什么 不 在 学 术 环 境 中 进行 恒 日 质 组 研究 ?

蛋白 质 组 分 析 是 一 项 有 洪 力 改变 医学 面 角 的 技术 。 一 些 观点 认为 ， 由 于 高 额 的 研究 费用 ， 蛋 白质 组 的 研究 不 宜 在 学 院 开 展 。 当 人 们 意识 到 蛋白 分 析 中 昂贵 的 设备 和 药品 的 消耗 ， 尤 其 是 高 流通 量 的 自动 化 流程 都 往往 自然 地 认为 大 量 与 药物 相关 的 蛋白 质 组 的 研 究 工 作 应 由 商业 组 织 开展 ; 但 实际 上 在 学 术 机 构 内 建立 蛋白 质 组 研究 体系 及 技术 仍 具 有 可 观 的 潜力 和 价值 。

另 一 种 论点 认为 ， 高 流通 量 的 流程 是 重复 的 、 自 动 化 和 智能 化 低 的 ， 而 学 术 研 究 应 具有 创新 性 。 对 于 学 术 研 究 人 员 ， 如 果 曾 经 准备 并 筛选 过 100 个 质粒 DNA 微量 制备 以 鉴定 正确 DNA 载体 构建 从 而 使 关键 实验 得 以 进行 的 话 ， 这 一 观点 的 廖 误 之 处 显而易见 了 。

学 术 机 构 中 蛋白 质 组 体系 的 发 展 面临 的 一 个 重要 问题 是 人 才 向 企业 界 的 流失 ， 因 为 企业 上 急需 训练 有 素 的 蛋白 质 组 研究 人 员 ， 并 且 企 业界 能 提供 更 高 的 薪金 和 瑶 似 更 强 的 安全 感 。 这 一 问题 在 包括 德国 在 内 的 一 些 国家 中 尤为 突出 ， 由 于 在 这 些 国家 学 术 机 构 的 薪金 水 准 是 预先 设 定 和 不 能 更 改 的， 这 就 使 得 学 术 机 构 很 难保 留 一 支 高 水 准 的 研究 队伍 。

3. 为 什么 要 在 学 术 环 境 中 进行 蛋 日 质 组 研究 ?

总 体 考虑 ， 许 多 方面 都 有 力 支 持 大 学 和 非 盈利 机 构 参与 蛋白 质 组 领域 的 研究 ， 并 认 为 是 很 有 价值 的 。 下 面 首 先 考虑 这 样 一 种 争论 : 大 学 和 非 盈 利 机 构 不 具有 从 事 蛋 白质 组

第 十 四 章 “学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 221 -

研究 的 经 济 实力 。 3.1 大 学 能 否 承 担 得 起 蛋白 质 组 的 研究 经 费 ?

当 建立 一 个 适当 的 研究 小 组 的 费用 满足 后 ， 目 前 的 蛋白 质 组 分 析 费 用 并 不 比 其 他 研 究 的 费用 高 ， 如 小 鼠 分 子 遗 传 学 。 甚 至 研究 小 组 的 组 建 费用 与 其 他 研究 相 比 也 并 未 高 出 许多 。 我 们 曾 在 三 个 方面 比较 了 相同 人 数 的 蛋白 质 组 实验 室 与 传统 的 分 子 生 物 学 实验 室 的 组 建 费 用 。 显 然 ， 蛋 白质 鉴定 设备 花费 较 大 ; 然而 考虑 到 蛋 白 质 组 研究 所 得 数据 的 质 量 和 容量 ， 以 及 数据 潜在 的 价值 ， 这 些 将 有 力 表明 : 蛋白 质 组 研究 的 花费 比 生命 科学 研 究 中 的 其 他 领域 更 物 有 所 值 。

二 维 电 泳 凝 胶 的 费用 图 14.1 是 我 们 的 蛋白 质 组 实验 室 从 1998 年 3 一 12 月 的 费用 情况 〈 以 欧元 为 单位 )。 在 此 期 间 制 备 和 运转 了 约 1300 块 由 浓度 为 13% 的 、 标 准 斥 二 为 20cmx20cm、 含 哌 嗪 双 丙 烯 酰胺 (PDA) 作为 交 联 剂 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。 绝 大 多 数 的 凝 胶 采 用 银 氨 进行 染色 (Hochstrasser et al., 1988; Rabilloud，1992 ) 。 由 于 多 数 PDA ( 属 主要 消费 项 目 ) 是 在 1998 年 3 月 以 前 购买 的 ， 这 将 使 3 一 12 月 间 的 实际 花费 增加 约 2000 欧元 。 总 花费 约 40 000 欧元 中 的 大 部 分 用 于 购置 ， 这 是 任何 一 个 新 建 实验 室 所 必 需 的 。 在 消费 高 峰 的 6 月 至 12 月 中 ， 实 验 室 的 平均 流动 花费 相对 稳定 在 2500 欧元 /月 。 这 笔 费 用 供 两 名 博士 后 、 两 名 学 生 和 一 名 技师 使 用 ， 平 均 每 人 每 月 500 欧元 ， 完 全 在 基 金 资助 项 目 研 究 花费 的 正常 范围 内 。 因 此 ， 我 们 可 以 认为 二 维 电泳 凝 胶 费 用 与 其 他 研究 项 目的 花费 相差 无 几 。

三 维 电泳 数据 分 析 费 用 “采用 常规 的 、 已 公布 的 蛋白 质 组 分 析 技 术 时 ， 实 验 室 中 最 晶 贵 的 消费 品 就 是 雇员 的 时 间 。 蛋 昌 质 组 目前 是 一 项 劳动 密集 型 的 工作 。 由 于 凝 胶 间 存 在 差异 ， 对 某 一 特定 样品 有 必要 重复 3 一 6 次 实验 ， 最 好 采用 双 份 样品 。 采 用 商品 化 二 维 电泳 图 像 分 析 软 件 ， 这 些 凝 胶 图 像 随后 成 为 数字 化 文件 并 排列 。 我 们 采用 的 分 析 软 件 有 Image Master 2-D Elite 软件 (从 Amersham Pharmacia 生物 技术 公司 购买 ) 和

17500 ee 设备

15000 ea 试剂 含有 2D 软件 和 PC 机 |_] “一 次 性 耗材

12500

10000

支出 /欧元

包含 Min 型 凝 胶 系 统 7500 + 含有 Iso-Dalt 和 电源

5000 2500

0

3 月 4 月 5A 65 in io Se 10H 1 月 1248

图 14.1 从 1998 年 3 月 到 12 A, Tubingen 大 学 分 子 生 物 学 系 蛋白 质 组 学 实验 所 消耗 费用 (设备 、 试 剂 和 一 次 性 用 品 )

« 222 - 和 蛋白质 组 学

MELANIE II 软件 (瑞士 2D PAGE 集团 ， 从 Bio-Rad 公司 购买 )。 软 件 运行 环境 : 双 处 理 器 奔腾 II 型 PC HL, CPU 主 频 350MHz, 10G 硬盘 ， 内 存 $S00M， 实 际 内 存 设 置 为 3000M， 操 作 系 统 为 Windows NT 4.0。 在 该 配置 中 图 像 处 理 时 间 是 可 接受 的 。 但 根据 我 们 的 经 验 ， 上 述 两 种 软件 都 不 令 人 满意 。 一 些 用 户 声称 ， 这 些 缺 陷 不 幸 正 好 位 于 一 些 公司 所 给 予 的 技术 支持 服务 之 列 。 其 他 一 些 用 户 也 曾 向 我 们 表达 了 类 似 的 看 法 ， 因 此 购 买 者 一 定 要 小 心 ! 不 论 购买 了 其 中 哪 一 种 软件 ， 用 户 都 将 在 每 张 凝 胶 上 耗费 数 小 时 的 时 间 去 将 凝 胶 上 的 蛋白 进行 对 齐 和 配 比 ， 才 能 获得 满意 的 结果 。 例 如 : 我 们 研究 组 利用 脑 BREATH RMA, ee pH 范围 4~7 的 固 相 pH 梯度 干 胶 条 (IPG)， 并 观察 到 每 块 BER E244 1000 一 1400 个 斑点 。 斑 点 自动 检测 可 识别 凝 胶 间 许 多 对 蛋白 作为 一 个 斑点 ， 但 不 幸 的 是 在 不 同 的 凝 胶 间 并 不 一 致 。 因 此 ， 研 究 人 员 必 须 经 手工 证 实 或 使 每 一 个 斑点 有 效 ， 以 确保 其 准确 性 。 在 我 们 实验 室 里 这 个 利用 自动 斑点 检测 的 系统 经 过 编辑 后 ， 每 块 凝 胶 需 花 4h 的 时 间 ， 这 仅仅 比 手工 增加 斑点 快 一 点 ， 它 需要 每 块 胶 4.Sh。 在 进行 脑 BE (CSF) 的 研究 中 ， 有 15 个 作为 对 照 组 的 成 员 ，5 个 明确 诊断 为 有 某 种 疾病 。 每 个 病人 的 样品 需要 进行 $ 次 电泳 以 产生 总 数 达 100 块 凝 胶 的 实验 。 这 要 求 计 算 机 分 析 400h。 到 目前 为 止 ， 这 是 分 析 中 最 昂贵 的 成 分 。 同 样 的 方法 也 被 其 他 研究 人 员 采 用 (Andersen et al., 1997) 。

的 确 ， 在 企业 代表 们 的 讨论 中 ， 我 们 感到 这 种 劳动 耗费 ， 商 业 机 构 与 学 术 单位 明显 不 同 ， 它 是 防 碍 蛋白 质 组 学 工业 化 发 展 的 主要 因素 。 有 几 种 并 未 公布 的 应 用 软件 程序 ， 运行 比 商业 软件 好 ， 并 且 ， 几 个 组 织 正 力图 制定 策略 来 突破 图 像 分 析 的 瓶颈 。 然 而 ， 就 目前 所 公布 的 几 种 技术 的 应 用 而 言 ， 大 学 与 企业 相 比 ， 在 蛋白 质 组 凝 胶 分 析 方 面 处 于 明 显 的 优势 。 而 由 于 这 些 研究 所 内 部 具有 多 种 专业 人 员 ， 他 们 可 能 较 好 地 提高 已 有 的 软件 或 开发 新 软件 。

蛋白 鉴定 的 花费 。 和 蛋白 鉴定 所 要 求 的 特殊 酶 价格 不 菲 ， 但 并 不 比 所 需要 的 常规 分 子 生物 学 试剂 贵 。 至 今 ， 最 大 的 花费 是 购买 精致 的 蛋白 鉴定 仪器 。 质 谱 则 被 公认 为 最 好 的 选择 (Burlbyame et al., 1998; Gygi et al., 1999; James, 1997; Yates, 1998). MALDI-TOF 质谱 特别 提供 了 为 高 流通 量 筛选 的 潜力 。 从 Hoffman-La Roche 公司 来 的 科学 家 在 1998 年 9 月 召开 的 第 3 届 2-DE 会 议 上 报告 了 他 们 利用 MALDI-MS 在 一 天 内 可 以 鉴定 500 个 蛋白 质 。 大 多 数 的 质谱 在 将 来 可 以 提供 这 种 常规 水 平 的 测试 。 这 样 一 种 自动 化 系统 〈( 即 从 胶 上 斑点 切割 到 MALDI-MS)， 将 会 花费 约 500 000 欧元 。 此 外 ， 需 要 一 个 通风 良好 、 完 全 和 干净 的 实验 室 和 至 少 两 个 专家 小 组 比较 合理 。 如 果 某 一 特定 蛋白 的 cDNA 序列 存在 于 一 个 数据 库 内 ， 那 么 它 将 可 能 被 鉴定 。 很 快 所 有 的 人 类 蛋白 都 将 满 足 此 前 提 。

对 于 那些 未 知 序列 的 蛋白 ， 例 如 ， 对 于 鲜 为 人 知 的 生物 或 从 许多 低 丰 度 人 类 mRNA 翻译 的 蛋白 而 言 ， 此 类 蛋白 的 部 分 氨基 酸 序 列 则 必须 进行 从 头 合成 。 这 对 于 具有 源 后 衰 变 (PSD) 功能 的 现代 MALDI-MS 是 可 能 的 (Chaurond et al .，1999)， 或 者 另外 的 电 喷雾 质谱 可 被 应 用 。 如 三 级 四 极 杆 (quadruplole )， 离 子 阱 ， 或 QTOF 质谱 (Burlingame et al., 1998; Kuster and Man, 1998; Rates, 1998; 请 见 第 五 章 )。 另 外 一 种 经 常 被 低估 ， 但 明显 有 用 的 选择 是 应 用 微量 -HPLC 进行 多 肽 分 级 ， 随 后 进行 Edman 降解 。 现 代 的 毛细 管 HPLC Edman 测序 仪 其 灵敏 度 已 达 10 一 20fmol; 然而 ， 真 正 的 问

第 十 四 章 ”学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 223 -

题 在 于 ， 当 在 HPLC 分 离 过 程 中 混合 物 酶 解 成 能 被 测序 的 单个 肽 片段 时 样品 的 丢失 。 因此 ， 和 蛋白 质 鉴 定 要求 可 能 的 系列 仪器 价格 在 50 000 到 400 000 欧元 之 间 。 此 方面 要 具 有 高 度 风险 性 ， 因 为 这 些 仪 器 会 迅速 过 时 。 表 面 上 看 这 一 定 是 无 可 奈何 的 事情 ， 即 这 样 一 个 “机 器 公园 ”应 该 成 为 一 种 集中 的 设施 来 从 资本 投资 中 获取 最 大 的 到 利 。 但 如 果 对 一 件 仪 器 投资 50 万 欧元 ， 可 能 建成 一 个 高 性 能 、 竞 争 性 的 设备 ， 如 果 投 资 超过 100 万 欧元 或 更 多 ， 可 能 建成 一 个 很 优秀 的 平台 。 反 对 大 学 蛋白 质 组 学 研究 的 批评 家 们 会 将 这 种 水 平 的 支出 能 香 承 担 作为 问题 来 请 难 。 然 而 ， 当 利用 非 自 动 化 的 蛋白 酶 解 、 价 廉 的 MALDEMS 仪器 时 ， 蛋 白质 组 设施 也 能 有 效 建 立 ; 并 且 这 对 某 些 实验 室 已 足够 (Zubritsky，1998)。 依 我 们 之 见 ， 完 全 有 理由 提出 一 个 象 德国 大 小 的 国家 支撑 学 术 圈 内 拥有 上 述 实力 的 的 多 中 心 。 对 于 科学 社区 和 医学 、 生 物 技 术 研 究 的 利益 将 远大 于 论证 这 些 耗费 。

信息 管理 的 花费 ”大 而 复杂 数据 组 的 产生 随 之 而 来 要 求 完 成 复杂 的 数据 库 和 分 析 软 件 ， 更 不 用 说 强大 的 计算 机 。 理 论 上 ， 蛋 白质 组 数据 一 定 要 以 数据 库 的 形式 产生 ， 文 件 化 和 档案 化 。 几 个 大 公司 正 开发 自己 的 软件 和 数据 库 。 这 些 生 物 信 息 学 引擎 被 设计 为 令 人 信服 的 文件 ， 并 以 数据 库 的 格式 尽 可 能 的 连接 许多 相关 的 参数 。 随 后 ， 强 有 力 的 算法 试图 从 原始 数据 中 提取 图 谱 ， 并 用 来 作 数据 解释 。 进 而 应 该 允许 模 建 和 模拟 ， 并 最 终 会 产生 实验 上 可 证 实 的 预测 并 揭示 这 个 系统 的 真正 复杂 性 。

尽管 上 面 已 提 到 特殊 的 、 商 品 化 的 2-DE 分 析 软 件 包 ， 但 是 它们 的 表现 远 远 落 在 了 这 些 企业 化 产品 的 后 面 。 就 我 们 的 知识 而 言 ， 在 开发 过 程 中 根本 没有 相似 的 数据 库 管 理 和 分 析 系 统 。 一 种 涉及 数 百 万 欧元 支出 的 整合 程序 被 要 求 来 生产 这 样 一 种 产品 。 目 前 ， 似乎 仅 有 几 家 大 企业 乐意 开始 这 样 的 贡献 。 在 此 领域 有 一 种 可 能 、 也 最 有 理由 值得 争论 的 是 : 如 果 没 有 企业 上 的 协助 ， 大 学 机 构 不 能 表现 出 优秀 的 蛋白 质 组 分 析 。

3.2 如果 没有 学 术 机 构 ， 企 业 能 承担 蛋白 质 组 学 研究 吗 ?

尽管 大 制药 公司 的 研究 和 开发 预算 是 相当 乐观 的 ， 但 是 它们 不 是 无 限 的 ， 且 压力 日 益 增 加 。 例 如 ， 制 药 公 司 目前 在 美国 必须 产生 大 约 15% 一 20% 的 盈利 (p.a.) 才能 跟 上 道琼斯 指数 。 事 实 上 投资 者 期 望 能 够 年 年 实现 利润 回报 ， 和 否则 ， 他 们 将 撤销 其 投资 而 转投 其 他 地 方 。 董 事 会 成 员 必须 通过 研究 和 开发 决定 将 来 的 投资 ， 以 及 投资 多 少 会 使 股 东 满 意 。 在 这 种 财政 状况 下 ， 制 药 公 司 的 有 限 研 究 经 费 也 必须 广泛 分 配 到 许多 其 他 的 可 与 蛋 自 质 组 竞争 的 高 成 本 技术 上 。 与 之 相关 的 是 ， 蛋 白质 组 学 在 各 商业 机 构 内 的 分 配 是 否 可 能 足够 用 来 支撑 这 门 目 前 需要 大 力 优 化 的 技术 的 发 展 。 如 果 他 们 利用 更 有 效 的 技 术 ， 将 提高 企业 投资 的 有 效 性 。 历 史上 ， 许 多 新 的 技术 是 由 学 术 机 构 最 初 启动 和 开发 的 。 新 技术 被 转 到 企业 环境 ， 在 那里 ， 它 们 被 优化 并 用 于 专门 的 领域 。 尤 其 可 能 的 是 学 术 机 构 将 开发 出 能 提高 企业 效率 的 创新 性 技术 和 工艺 ， 但 前 提 条 件 是 他 们 必须 与 合适 的 机 构 进行 合作 。 为 了 实现 这 种 转化 过 程 ， 至 关 重 要 的 是 建立 和 维持 大 量 的 具有 专业 能 力 的 学 术 中 心 。 这 些 中 心 额外 的 优势 在 于 能 提供 有 价值 的 公共 信息 。

3.3 目前 蛋白 质 组 学 的 研究 尚 不 健全 吗 ? 某 些 人 看 到 局 限 性 就 目前 蛋白 质 组 技术 而 言 ， 我 们 看 到 有 许多 缺点 。 并 且 在 以 下 的 部 分 ， 我 们 将 详细

ica, 蛋白 质 组 学

描述 其 阻碍 蛋白 质 组 研究 的 主要 技术 挑战 。 其 他 人 也 意识 到 这 些 问 题 (Herbert el al., 1997; Jungblut et al., 1996; Wilkins et al .，1996)。 就 我 们 目前 的 知识 而 言 ， 蛋 白质 组 学 的 限制 因素 还 未 得 到 完全 评估 和 充分 认识 。

蛋白 的 溶解 性 ”如 前 所 述 ， 许 多 朴 水 性 蛋白 和 高 分 子 量 蛋 白 难 以 在 2-DE 凝 胶 图 谱 上 出 现 (Wilkins et al :，1996，1998)。 近 来 在 离 液 剂 和 表面 活性 剂 的 进步 已 经 大 大 改 变 了 这 种 状况 ; 然而 问题 远 未 解决 (Blisnick et al., 1998; Chevallet et al., 1998; Ra- billoud, 1998, 1999; Rabilloud et wj .，1997)。 下 述 观点 适用 于 大 约 8$% 的 可 溶 蛋白 。

流通 量 由 于 2-DE 凝 胶 的 内 在 变异 性 ， 同 一 样品 必须 进行 多 次 实验 。 此 外 ， 如 前 所 述 2-DE 的 商业 分 析 软 件 在 自动 模式 下 仅 能 部 分 有 效 地 鉴定 斑点 和 进行 凝 胶 间 的 交叉 配 比 。 由 于 进行 2-DE 实验 是 耗 时 的 ， 这 是 达到 高 流通 量 的 另 一 个 主要 的 瓶颈 。 我 们 注 意 到 ， 利 用 不 同样 品 在 同一 凝 胶 上 电泳 后 得 到 的 蛋白 进行 多 颜色 显示 处 理 ， 可 大 大 减少 这 种 瓶颈 。 差 异同 位 素 标 记 蛋 白 的 应 用 前 景 也 很 乐观 (Langen et al., 1998).

RKE 目前 除了 像 临床 标本 分 析 这 一 类 材料 来 源 有 限 的 情况 外 ， 大 多 数 蛋 白质 组 研究 不 是 因 敏 感性 而 受 限 ， 而 是 受 限 于 2-DE 凝 胶 分 离 和 宽 范 围 蛋 白 丰 度 的 检测 (+E 的 动态 范围 见 下 )。 当 对 样品 量 为 2mg 的 全 细胞 蛋白 进行 考 马 斯 亮 蓝 染 色 ， 对 样品 量 为 100wg 蛋白 进行 银 氮 染色 ， 或 者 对 样品 量 为 Sng 的 高 特异 活性 3S- 和 蛋氨酸 代谢 标记 的 蛋 白 ， 通 过 磷 储 屏 图 像 分 析 所 得 的 2-DE 图 谱 是 相似 的 。 然 而 ， 利 用 ”2S- 蛋 氢 酸 标记 2mg 蛋白 ， 却 没有 优势 。 因 为 实际 上 ， 整 个 凝 胶 提供 了 一 种 信号 ， 并 且 ， 每 个 蛋白 斑点 间 的 差异 消失 了 。 因 此 ， 敏 感性 在 多 数 情况 下 是 不 受 限 的 。 实 际 上 ， 蛋 白 的 上 样 量 可 因 在 一 定 敏 感性 下 的 凝 胶 分 辩 率 的 能 力 来 优化 ， 这 受 限于 和 蛋白 丰 度 的 线性 动态 变化 ， 也 受 限 于 凝 胶 系 统 的 分 辩 率 窗口 的 数目 。 为 了 评估 这 种 概念 的 有 效 性 ， 应 该 考虑 蛋白 丰 度 的 动态 范围 和 凝 胶 分 辩 率 的 相关 问题 。

丰 度 的 动态 范围 ”一 个 中 心 问题 在 于 ， 根 据 实 验 和 样品 类 型 的 不 同 ， 目 前 用 于 蛋白 质 组 研究 的 2-DE 凝 胶 系 统 通常 分 离 大 约 2 000 一 10 000 个 蛋白 斑点 (Fey et al., 1997; Gurg et al., 1988; Jungblut et al., 1996; Klose and Kobalz，1995)。 据 预测 ， 人 类 基 因 组 可 编码 65 000~ 100 000 个 功能 基因 (borrebaeck, 1998), HFA 5000~15 000 被 | 认为 是 以 具有 多 种 mRNA 的 剪 切 形 式 和 翻译 后 修饰 的 单 细 胞 类 型 表达 ， 从 一 个 细胞 蛋 白质 组 中 所 期 望 的 不 同 斑点 数目 是 50 000 左右 。 这 已 经 通过 观察 在 一 张 2-DE 凝 胶 上 最 多 达 10 000 个 蛋白 来 得 以 证 实 ， 它 们 主要 是 看 家 蛋白 和 结构 蛋白 (Jungblut et al., 1996)。 通 常 认为 ， 细 胞 内 蛋白 丰 度 的 动态 变化 范围 可 能 达 10" 之 高 。 也 许 ， 每 个 细胞 内 仅 有 某 些 蛋白 的 几 个 分 子 (如 : 端 粒 酶 ?) 用 来 提供 相应 的 生物 学 功能 。 而 2000 AW: 上 的 蛋白 分 子 仅 组 成 整个 蛋白 的 1% 。 因 此 ， 一 个 理想 的 分 析 系 统 必 须 能 够 处 理 跨 越 7 个 数量 级 或 更 多 的 动态 范围 ， 并 且 超 过 50 000 个 分 离 层 次 。 我 们 估计 ， 目 前 仅 有 5% 一 20% (2000~10 000/50 000) 的 多 数 可 溶性 蛋白 可 通过 2-DE 分 离 和 染色 检测 。

蛋白 分 辨 率 如 果 5S0 000 个 斑点 均匀 分 布 在 20cm x 20cm WERE, FABER 均 占 据 2mm2， 和 那么 每 平方 毫米 将 出 现 $ 个 斑点 。 因 为 根据 分 子 量 和 等 电 点 分 配 蛋 自 可 以 准确 模拟 倾斜 曲线 〈Cavalcoli et az .，1997)， 所 以 显然 凝 胶 的 某 一 区 域 将 会 被 分 辩 率 较 差 的 丰 度 蛋白 斑点 聚集 。 这 个 问题 可 以 用 窄 范围 的 pH 进行 等 电 聚 焦 而 部 分 解决 ; A 而 ， 这 种 策略 不 能 解决 线性 动态 问题 ， 并 且 加 重 流通 量 的 问题 。

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第 十 四 章 ”学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 - 225 -

蛋白 鉴定 问题 ”利用 传统 的 技术 ， 许 多 实验 室 通常 要 求 picomolar (10° mol) FR 百 个 femtomole 的 蛋白 量 ， 以 完成 蛋白 的 鉴定 。 很 明显 ， 假设 每 个 细胞 含 50 000 4 BE 点 ， 那 么 对 于 S% 丰 度 的 蛋白 斑点 是 可 能 的 。 最 近 的 一 些 参考 文献 上 某 些 实验 室 声 称 ， 已 经 对 40 fmol 或 50 amol 为 起 始 量 成 功 进行 常规 的 分 析 。 然 而 ， 得 到 的 图 谱 很 不 典型 。

与 “基因 组 学 ”方法 比较 ”在 前 述 了 蛋白 质 组 的 缺点 后 ， 将 之 与 基因 组 学 技术 进行 简单 的 比较 是 合适 的 。 很 大 程度 上 由 于 PCR 技术 的 扩 增 能 力 使 得 核酸 分 析 在 灵敏 性 上 超过 蛋白 质 研究 。 然 而 ， 应 当 注意 到 ， 高 流通 量 的 筛选 研究 也 因 在 EST 和 SAGE 研究 中 需 检测 低 丰 度 的 mRNA 而 受 限 。 当 与 放射 性 方法 相 比 时 ， 微 阵列 研究 通常 所 用 的 欧 光 分 子 的 检测 灵敏 性 也 受 限 。 目 前 ， 仍 不 清楚 多 少 比例 的 基因 中 可 以 通过 芯片 技术 观察 (Bowtell, 1999; Carulli et al., 1998; DeRisi and Iyer, 1999; Drmanac el al., 1998; Iyer et al., 1999; Lipshutz et al., 1999; Watson et al., 1998). i HARA AEM RAH 地 测定 mRNA 的 丰 度 ; 然而 ， 它 不 能 提供 蛋白 质 丰 度 的 信息 。 预 期 将 基因 组 和 和 蛋白质 组 两 种 研究 策略 联合 起 来 ， 对 于 获得 认识 细胞 和 整个 有 机 生物 的 全 局 观点 是 必需 的 。 很 明显 ， 将 必须 显著 提高 蛋白 质 组 学 技术 。

3.4 学 术 机 构 的 蛋白 质 组 学 研究 对 企业 是 有 益 的

前 述 提 到 和 蛋白质 组 学 的 局 限 性 ， 可 能 有 理由 争论 : 在 蛋白 质 组 学 达到 一 定 阶 段 之 前 ， 因 为 企业 能 迅速 而 高 效 地 筛选 大 量 的 细胞 蛋白 ， 就 像 目 前 他 们 筛选 细胞 的 mRNA 一 样 ， 所 以 是 否 需要 相当 多 的 蛋白 质 组 技术 进步 。 大 实现 这 个 目标 ， 将 提供 较 现 代 基 因 组 学 技术 多 得 多 的 建设 性 的 生物 学 信息 。 然 而 ， 每 个 商业 组 织 必 须 为 这 种 技术 提高 进行 投资 是 不 可 能 的 。 这 任务 最 可 能 由 公共 基金 支持 的 研究 中 心 和 一 些 研 究 所 内 的 多 学 科研 究 部 门 来 执行 。

4. 大 学 的 蛋白 质 组 学 研究 提供 许多 优势 4.1 大 学 能 对 企业 的 资源 进行 迅速 而 灵活 的 反应 ， 且 价格 合理

在 财政 革新 的 现代 国际 化 氛围 内 ， 大 公司 持续 地 寻求 与 大 学 签订 开发 计划 。 企 业已 经 认识 到 ， 大 学 能 够 从 小 到 中 等 程度 的 资本 投资 中 产生 更 多 的 效益 。 如 果 不 建立 一 个 全 新 的 实验 室 及 其 相关 设施 ， 公 司 能 给 大 学 的 短期 、 高 风险 的 计划 提供 资金 ， 并 且 若 没有 遭受 过 多 的 财政 损失 ， 则 在 某 一 合适 的 时 间 退 出 〈 如 果 必 须 的 话 )。 建 立 合适 的 研究 机 构 和 培 养 合适 专家 的 大 学 要 对 由 企业 而 来 的 无 论 技术 还 是 资金 方面 的 流动 利润 待机 而 动 。

4.2 大 学 愿意 与 临床 样本 接近

许多 大 学 与 世界 级 的 临床 研究 部 门 有 联系 ， 可 以 使 企业 合作 者 愿意 与 生物 学 、 医 学 专家 进行 前 所 未 有 的 接近 。 优 秀 的 病历 和 经 验 丰富 的 标本 处 理 以 确保 高 质量 的 结果 ， 使 相关 的 样品 得 以 直接 比较 成 为 可 能 。 对 与 临床 医学 的 空间 接近 和 一 个 可 依赖 的 拥有 临床 专家 的 交流 基地 意味 着 : 样品 能 在 离开 手术 台数 分 钟 内 转 到 学 术 机 构 的 实验 室 ， 或 者 被 有 效 和 系统 地 冻 存 以 备 后 用 。 与 医学 专家 的 个 人 接触 使 精确 的 专业 化 要 求 成 为 可 能 ， 并 且 连 续 确 保 获 得 令 人 满意 的 质 控 。 企 业 寻 找 的 正 是 这 种 类 型 的 机 构 ， 对 于 潜在 的 投资 者

eye ee

。 226 - 和 蛋白质 组 学

或 合作 伙伴 而 言 以 最 低 消 耗 来 维持 。 在 劳动 密集 型 的 靶 分 子 开发 领域 ， 企 业 与 大 学 竞争 确 有 可 能 。 然 而 ， 无 论 应 用 在 观察 试验 药物 对 临床 [和 试验 的 影响 时 进行 迅速 的 现场 评 估 ， 还 是 应 用 在 组 织 学 家 能 检测 的 时 间 点 之 前 组 织 移植 排斥 的 启动 ， 附 属于 专业 临床 医院 的 蛋 昌 质 组 机 构 为 企业 合作 者 提供 了 一 个 理想 的 切入 点 。 这 种 考虑 的 重要 性 显而易见 。

4.3 ”大 学 不 仅 研究 医学 应 用

值得 人 注意 的 是 蛋白 质 组 学 的 主要 目的 有 可 能 使 健康 保险 系统 破产 。 除 此 之 外 ， 大 学 还 提供 仅 有 的 手段 ， 使 得 一 些 基本 的 生物 能 通过 和 蛋 日 质 组 学 进行 检查 。 例 如 ， 通 过 直 接应 用 先进 的 蛋 白 质 组 和 基因 组 研究 模式 生物 来 获得 对 于 胚胎 和 发 育 的 更 多 理解 。 目 前 主要 的 制药 企业 认为 用 来 研究 这 些 系统 的 模式 生物 ， 例 如 果 蝇 、 斑 马 鱼 或 蟾 。 这 类 计划 可 能 成 为 学 院 蛋 白质 组 中 心 的 长 处 ， 并 扩展 和 完全 互补 于 人 类 生物 学 计划 。

4.4 大 学 的 基础 研究 将 被 公众 接近

生物 数据 管理 系统 在 今天 存在 的 一 个 结果 是 值钱 。 生 物 信息 能 被 转化 为 市 场 化 的 制 药 产品 。 这 与 公共 数据 库 的 信息 沉淀 不 相 容 。 企 业 所 关注 的 是 下 载 整个 公共 资源 的 内 容 ， 并 利用 它 作为 基础 ， 依 据 它 来 扩大 私人 公司 的 数据 库 。 由 于 蛋白 质 组 分 析 是 大 规模 盘 选 、 快 速 流通 量 的 主要 部 分 ， 则 基本 上 可 能 由 企业 界 执行 ， 因 而 许多 有 价值 的 生物 信 息 将 不 能 为 公共 所 利用 。

4.5 大 学 培养 学 生

基本 的 经 济 信条 表明 ， 任 何 高 科技 企业 成 功 生 存 ， 一 个 合适 的 训练 有 素 的 工作 组 是

必须 的 。 这 种 培训 的 耗费 相当 可 观 ， 因 此 ， 对 于 公司 能 够 招募 合格 的 员工 是 有 很 大 的 优

| 势 的 。 教 学 是 大 学 的 主要 任务 ， 要 将 蛋白 质 组 领域 的 技能 熟练 地 传授 给 学 生 ， 大 学 必须

积极 参与 蛋白 质 组 领域 的 研究 中 来 。 的 确 ， 大 学 已 经 具有 大 量 必需 的 基本 设备 和 条 件 ，

并 需要 蛋白 化 学 、 细 胞 生物 学 和 生物 信息 学 间 的 直接 合作 ， 以 面 对 共 同 的 目标 一 一 蛋 息 质 组 学 。

5. 大 学 的 “让 产 易 股 (spin-off)” 2a]

历史 上 ， 德 国 的 大 学 并 不 擅长 于 将 其 专利 成 果 转 化 为 商业 上 的 利益 。 现 在 已 认识 到 这 种 状况 必须 改变 。 学 院 蛋 白质 组 的 另 一 方面 是 ， 我 们 在 准备 这 部 手稿 的 过 程 中 ， 已 经 有 了 第 一 手 的 经 验 。 因 为 蛋白 质 组 潜在 的 经 济 重要 性 ， 所 以 在 技术 发 展 上 存在 强大 的 经 济 利益 ， 正 是 这 样 ， 许 多 学 院 研 究 组 产生 “让 产 易 股 ”公司 ， 使 他 们 获得 的 专长 商品 化 。 当 考虑 到 某 些 基因 组 公司 时 ， 例 如 支撑 这 些 公 司 (如 Hyseq，Affymetrix 和 Incyte) 的 技术 都 从 学 院 研究 组 而 出 ， 这 种 活动 的 潜在 经 济 意义 变 得 很 明显 。 我 们 看 到 同样 的 现 象 将 在 蛋白 质 组 上 发 生 ， 并 且 这 本 书 的 几 个 作者 (包括 我 自己 ，ProteoMed GmbH 公 司 ) 正在 尽力 实现 这 个 目标 。

6. 结论

总 之 ， 与 某 些 意 见 相 反 ， 我 们 相信 学 院 的 蛋白 质 组 研究 既 值得 做 也 是 必须 的 ， 对 于

第 十 四 章 “学术 环境 中 的 蛋白 质 组 学 = 297 «

企业 和 学 院 都 能 提供 许多 益处 。 从 我 们 这 方面 看 ， 如 果 已 经 提供 了 大 部 分 研究 并 使 其 不 断 发 展 的 欧洲 的 大 学 放弃 对 这 一 强 有 力 的 技术 的 合适 和 连续 的 投资 将 是 不 幸 的 。 企 业界 已 经 认识 到 蛋白 质 组 研究 提供 了 巨大 、 难 以 预测 的 潜在 价值 。 至 少 其 中 部 分 必需 技术 的 发 展 将 可 能 由 学 术 机 构 进 行 。 这 是 学 术 机 构 为 何 要 支持 重 日 质 组 研究 项 目的 最 引 人 注 目 的 原因 。

(万 晶 宏 译 Kiam Kh) 参考 文献

Andersen, H.U., Fey, S.J., Larsen, P.M., Nawrocki, A., Hejnaes, K.R., Mandrup-Poulsen, T. and Nerup, J. (1997) Interleukin-1beta induced changes in the protein expression of rat islets: a computerized database. Electrophoresis 18: 2091-2103.

Arsenian, S., Weinhold, B., Oelgeschlager, M., Ruther, U. and Nordheim, A. (1998) Serum response factor is essential for mesoderm formation during mouse embryogenesis. Embo J. 17: 6289- 6299.

Blisnick, T., Morales-Betoulle, M.E., Vuillard, L., Rabilloud, T. and Braun Breton, C. (1998) Non- detergent sulphobetaines enhance the recovery of membrane and/or cytoskeleton-associated proteins and active proteases from erythrocytes infected by Plasmodium falciparum. Eur. J. Biochem. 252: 537-541.

Borrebaeck, C.A. (1998) Tapping the potential of molecular libraries in functional genomics. Immunol. Today 19: 524-527.

Bowtell, D.D. (1999) Options available - from start to finish — for obtaining expression data by microarray. Nature Genet. 21: 25-32.

Burlingame, A.L., Boyd, R.K. and Gaskell, S.J. (1998) Mass spectrometry. Anal. Chem. 70: 647R-— 716R.

Cahill, M.A., Janknecht, R. and Nordheim, A. (1996) Signalling pathways: jack of all cascades. Curr. Biol. 6: 16—9.

Carulli, J.P., Artinger, M., Swain, P.M., Root, C.D., Chee, L., Tulig, C., Guerin, J., Osborne, M., Stein, G., Lian, J. and Lomedico, P.T. (1998) High throughput analysis of differential gene expression. J. Cell Biochem. 30-31 (Suppl.): 286-296.

Cavalcoli, J.D., VanBogelen, R.A., Andrews, P.C. and Moldover, B. (1997) Unique identification of proteins from small genome organisms: theoretical feasibility of high throughput proteome analysis. Electrophoresis 18: 2703-2708.

Chaurand, P., Luetzenkirchen, F. and Spengler, B. (1999) Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of- flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10: 91-103.

Chevallet, M., Santoni, V., Poinas, A., Rouquie, D., Fuchs, A., Kieffer, S., Rossignol, M., Lunardi, J., Garin, J. and Rabilloud, T. (1998) New zwitterionic detergents improve the analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 19: 1901-1909.

DeRisi, J.L. and Iyer, V.R. (1999) Genomics and array technology. Curr. Opin. Oncol. 11: 76-79.

Drmanac, S., Kita, D., Labat, I., Hauser, B., Schmidt, C., Burczak, J.D. and Drmanac, R. (1998) Accurate sequencing by hybridization for DNA diagnostics and individual genomics. Nature Biotechnol. 16: 54-S8.

Fey, S.J., Nawrocki, A., Larsen, M.R., Gorg, A., Roepstorff, P., Skews, G.N., Williams, R. and Larsen, P.M. (1997) Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae: a methodological outline. Electrophoresis 18: 1361-1372.

Gorg, A., Postel, W. and Giinther, S. (1988) The current state of two dimensional electrophoresis with immobilised pH gradients. Electrophoresis 9: 531-546.

Gygi, S.P., Han, D.K.M., Gingras, A.-C., Sonenberg, N. and Aebersold, R. (1999) Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post- genomic era. Electrophoresis 20: 310-319.

Heidenreich, O., Neininger, A., Schratt, G., Zinck, R., Cahill, M.A., Engel, K., Kotlyarov, A., Kraft, R., Kostka, S., Gaestel, M. and Nordheim, A. (1999) MAPKAP kinase 2 phosphorylates serum response factor in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 274: 14434-14443.

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Herbert, B.R., Sanchez, J.-C. and Bini, L. (1997). Two-dimensional electrophoresis: the state of the art and future directions. In: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (ed. M.R. Wilkins, K.L. Williams, R.D. Appel, and D.F. Hochstrasser). Springer, Berlin, pp. 13-33.

Hipskind, R.A., Rao, V.N., Mueller, C.G., Reddy, E.S. and Nordheim, A. (1991) Ets-related protein Elk-l is homologous to the c-fos regulatory factor p62TCF. Nature 354: 531-544.

Hochstrasser, D.F., Patchornik, A. and Merril, C.R. (1988) Development of polyacrylamide gels that improve the separation of proteins and their detection by silver staining. Anal. Biochem. 173: 412-423.

Iyer, V.R., Eisen, M.B., Ross, D.T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J.C.F., Trent, J.M., Staudt, L.M., Hudson, J., Jr., Boguski, M.S., Lashkari, D., Shalon, D., Botstein, D. and Brown, P.O. (1999) The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science 283: 83-87.

James, P. (1997) Of genomes and proteomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 1-6.

Jungblut, P., Thiede, B., Zimny-Arndt, U., Muller, E.C., Scheler, C., Wittmann-Liebold, B. and Otto, A. (1996) Resolution power of two- dimensional electrophoresis and identification of proteins from gels. Electrophoresis 17: 839-847.

Klose, J. and Kobalz, U. (1995) Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16: 1034-1059.

Kuster, B. and Mann, M. (1998) Identifying proteins and post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 393-400.

Langen, H., Fountalakis, M., Evers, S., Wipf, B. and Berndt, P. (1998). SN- and 3C- labeling of cells for identification and "quantification of proteins on 2D gels. In: From Genome to Proteome: 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting, Siena, Italy.

Lipshutz, R.J., Fodor, S.P., Gingeras, T.R. and Lockhart, D.J. (1999) High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genet. 21: 20-24.

Rabilloud, T. (1992) A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis 13: 429-439.

Rabilloud, T. (1998) Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two- dimensional electrophoresis. Electrophoresis 19: 758-760.

Rabilloud, T. (1999) Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis. An outline. Methods Mol. Biol. 112: 9-19.

Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A. and Lunardi, J. (1997) Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 18: 307-316.

Watson, A., Mazumder, A., Stewart, M. and Balasubramanian, S. (1998) Technology for micro- array analysis of gene expression. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 609-614.

Wilkins, M.R., Sanchez, J.C., Williams, K.L. and Hochstrasser, D.F. (1996) Current challenges and future applications for protein maps and post-translational vector maps in proteome projects. Electrophoresis 17: 830-838.

Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Sanchez, J.C., Bairoch, A. and Hochstrasser, D.F. (1998) Two- dimensional gel electrophoresis for proteome projects: the effects of protein hydrophobicity and copy number. Electrophoresis 19: 1501—150S.

Yates, J.R. II (1998) Mass spectrometry and the age of the proteome. J. Mass Spectrom. 33: 1-19.

Zubritsky, E. (1998) MALDI-TOFMS: biomolecules and beyond. Anal. Chem. 70: 733A—737A.

第 十 五 章 ”作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 Hervé Thiellement, Christophe Plomion and Michel Zivy

1.315

自从 O’ Farrell (1975) 和 Klose (1975) Ret tHIR EA AER YK (2-DE) 技术 以 来 ， 植 物 生 物 学 家 已 经 用 于 包括 遗传 和 生理 学 的 多 种 研究 。 在 一 块 腕 上 (A 15.1) 显 示 几 百 种 基因 产物 允许 以 蛋白 方式 检测 基因 型 之 间 的 差异 ， 并 且 以 这 种 方式 能 够 估计 遗 传 距离 ， 建 立 系 统 发 育 关 系 。 在 发 育 和 对 各 种 处 理 反应 中 也 研究 了 基因 表达 的 差异 ， 而 此 过 程 中 能 够 鉴定 出 受 这 些 条 件 调 控 蛋 白 的 表达 。 基 因 突 变 在 蛋白 水 平 上 进行 了 分 类 并 估计 了 多 效 性 。 编 码 鉴 定 出 来 的 蛋白 的 基因 被 作 图 ， 它 们 的 蛋白 显示 出 等 电 点 或 分 子 量 的 变异 〈 例 如 位 置 移 动 或 PS 变异 ， 图 15.2)。 表 达 的 基因 能 被 加 到 以 核酸 为 标记 建立 起 来 的 遗传 图 谱 中 。 另 外 ， 由 于 软件 的 贡献 (Appel et al: .，1997)， 一 种 蛋白 的 数量 可 以 作为 一 种 数量 性 状 ， 适 合 于 在 遗传 图 谱 上 定位 控制 这 些 数 量变 异 的 因素 数量 性 状 位 点 (QTL).

Pl 15.1 拟 南 芥 叶 蛋白 的 2-DE 胶 图 15.2 一 维 在 pH3.5 到 10 非 线 性 梯度 的 IPG REA = (a) 2-DE 胶 的 一 部 分 ， 显 示 海 岸 松 F2 代 针 叶 的 位 移 (position 中 ; 三 维 SDS 胶 为 丙烯 酰胺 /PDA HAR, shift, PS) 变异 。al， 纯 合 基因 型 “a/a”; a2， 纯 合 基因 型 12%T; 蛋白 点 用 银 染 方法 染色 。 “b/b"; a3， 杂 合 基因 型 “a/p”"。(b) 2-DE 胶 的 一 部 分 ， 显 示 海岸 松 F2 代 针 叶 的 有 /无 (presence/absence, P/A) 变异 。bl， RAW ‘A’, BAW P/-; b2， 表 现 型 “无 '， 纯 合 缺 失 基因 型 “A/A"”。 第 一 维 IEF; 第 二 维 SDS.

在 植物 生物 学 中 ， 描 述 2-DE 胶 中 的 蛋白 点 的 技术 目前 正在 发 展 中 。 而 且 ， 几 种 植 物 和 蛋白 的 数据 库 正 在 建立 过 程 中 。 这 种 植物 蛋白 质 组 学 的 开端 将 具有 重要 的 意义 ， 因 为

pag a a 上

- 230 - 蛋白 质 组 学

第 一 个 植物 〈 拟 南 芥 ) 的 基因 组 测序 将 于 2000 年 底 全 部 完成 ， 蛋 白质 组 与 基因 组 数据 的 整合 将 是 非常 重要 的 。 近 来 发 展 起 来 的 “转录 组 ”工具 ， 如 高 密度 cDNA 膜 、cDNA 微 阵 列 或 DNA 心 片 (Castellino, 1997; Lemieux et al., 1998; Marshall and Hodgson, 1998), 5SRARASASHEIERAHN, SSRARHREAECH mRNA 经 常 不 相 关 也 是 值得 注意 的 (Anderdon and Anderson, 1998; Anderson and Seilhammer, 1997; Haynes et al .，1998)。 另 外 ， 既 然 蛋 白 的 更 新 和 翻译 后 修饰 不 能 在 CDNA 和 mRNA 水 平 研究 ， 将 来 的 和 蛋白质 组 学 是 并 将 持续 是 非常 重要 的 。

最 近 出 版 了 几 篇 关于 植物 量 昌 质 组 学 的 综述 (de Vienne et al., 1996, 1999; Thiellement et al! .，1999)， 这 里 将 描述 蛋白 质 组 学 在 植物 生物 学 中 几 种 应 用 的 范例 ， 并 重点 讲述 植物 蛋 日 质 组 学 导致 的 植物 遗传 学 的 进展 。

2. 遗传 多 样 性 分 析 2.1 ”种 内 和 种 间 的 遗传 差异

自然 群体 中 遗传 变异 的 程度 总 是 群体 遗传 学 家 ， 进 化 学 家 和 植物 育种 家 最 感 兴趣 的 主题 。 尽 管 同 工 酶 和 DNA 为 基础 的 标记 已 经 并 正在 被 广泛 使 用 ，2-DE 显示 的 蛋 自 很 少 被 用 于 群体 遗传 学 的 研究 。 但 是 ，2-DE 能 发 现 比 同 工 酶 电泳 更 多 的 标记 ，Vienne et al. (1996) 报道 2-DE 在 每 个 多 态 性 位 点 能 够 揭示 与 同 工 酶 相同 的 等 位 变异 。 与 DNA 标记 相 比 ，2-DE 揭示 的 遗传 变异 性 只 涉及 表达 的 基因 。 在 最 近 的 20 年 中 ， 人 们 做 了 许 多 用 2-DE 方式 在 多 种 分 类 水 平 评 价 遗 传 差异 的 实验 ， 下 面 详细 氢 述 几 个 范例 。

种 问 的 变异 性 栽培 小 麦 是 多 倍 体 ， 有 两 个 (REAL, Triticum tugidum , AABB) 或 三 个 (&/)#, Triticum aestivum, AABBDD) 基因 组 。 这 些 基 因 组 起 源 于 从 那 时 起 已 经 趋 异 的 一 个 共同 祖先 ， 现 在 仍然 存在 许多 二 倍 体 或 多 倍 体 的 野生 品种 ， 它 们 具有 不 同 的 所 谓 “ 部 分 同 源 ” 的 基因 组 ， 且 能 够 程度 不 同 地 杂交 。 小 麦 遗传 学 家 根据 减 数 分 裂 中 二 价 染 色 体 的 数目 推测 栽培 小 麦 不 同 的 基因 组 可 能 起 源 于 哪 一 种 现 有 品种 。 A 基 因 组 起 源 于 Trizacw urartu, D 基因 组 起 源 于 人 iavs1iz (Kerby and Kuspira, 1987)。 但 是 ， 对 于 哪 一 个 品种 的 Sitopsis 区 段 有 贡献 于 B 基因 组 及 栽培 小 麦 的 细胞 质 现在 仍然 存在 争议 。 为 了 解决 这 个 问题 ， 对 不 同 品 种 的 这 一 区 段 在 2-DE 水 平 上 (T.longissimum, T.sharonense, T.bicorne, T. searsii 和 T . speltoides ) wEFT SF 2E ML | | | | |

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Xt FF Ss De eS F}—M— F El # (Chinese spring, CS) 进行 了 比较 。 通 过 分 析 共 有 的 蛋白 点 的 数量 计算 出 了 每 对 基因 型 间 的 相似 性 指数 。 从 相似 性 结果 绘制 出 反应 在 Sitopsis 区 段 系 统 发 育 关系 的 树 状 图 。 不 仅 以 2-DE 为 基础 的 树 状 图 和 传统 的 分 类 学 近 乎 完美 一 致 ， 而 且 还 发 现 T.szelioides 是 与 栽培 小 麦 吾 基因 组 最 为 相近 的 野生 品种 (Bahrman et al., 1988a) 这 个 发 现 通过 分 析 细 胞 质 蛋 白 得 到 了 进一步 验证 : 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 的 大 亚 基 和 两 种 形式 的 BATP 酶 在 中 国 春 和 OT. speltoides 中 有 相同 的 等 位 形式 ， 而 其 他 的 Sitopsis 品种 则 具有 其 他 的 这 些 叶 绿 体 基 因 的 等 位 位 点 (Bahrman et al., 1988b).

通过 比较 2-DE 方式 对 系统 发 育 关系 的 研究 已 经 延伸 到 携带 不 同 基因 组 的 小 麦 属 品 种 (Thiellement et al., 1989). 4£ Triticeae 属 不 同 品种 间 的 另 一 个 实验 中 ， 也 就 是 小

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 “ 231 -

#i A AD AA, KAW H 基因 组 和 黑 麦 的 S 基因 组 之 间 得 到 的 树 状 图 很 好 地 反映 了 已 知 的 系统 发 育 关 系 (Zivy et al.，1995)， 但 是 小 麦 和 大 麦 间 共 有 的 蛋白 点 数目 降 到 30%， 说 明 已 达到 了 这 种 方法 的 极限 。

在 欧洲 候 麦 中 ，Barreneche 等 (1996) 检测 了 两 个 非常 相近 的 品种 Quercus petraea 和 Quercus robur 之 间 的 关系 。 他 们 用 2-DE 的 方法 ， 通 过 比较 部 分 覆盖 欧洲 白 优 麦 自然 地 理 范 围 的 来 自 6 个 欧洲 国家 的 23 种 候 麦 来 研究 遗传 差异 。 评 价 了 来 自 幼苗 总 蛋白 中 的 530 个 点 ， 其 中 101 个 是 多 态 性 的 。 两 个 品种 的 差异 性 是 0.36， 而 Quercus petraea 种 内 差异 性 是 0.35， Quercus robur 为 0.33。 这 种 非常 相近 的 种 间 和 种 内 距离 进一步 证 实 了 这 两 个 品种 之 间 较 低 水 平 的 遗传 差异 性 ， 正 如 在 同 工 酶 、 随 机 扩 增 多 态 性 DNA (RAPD) 和 叶绿体 DNA 中 所 报道 的 。

种 内 的 变异 性 ”在 海岸 松 中 ，Bahrman 等 (1994) 用 2-DE 的 方法 研究 自然 地 域 7 个 群体 RPh) 之 间 的 关系 ， 评 价 在 不 同 地 理 起 源 内 或 之 间 存 在 的 遗传 变异 性 。 利 用 峻 配子 体 〈 一 种 包 被 针 叶 松 种 子 胚胎 的 单 倍 体 营养 组 织 ) PRAM REN ARS 位 形式 ， 共 评价 了 968 个 蛋白 位 点 ， 其 中 84% 是 变异 性 的 。 在 这 些 信息 的 基础 上 ， 三 个 主要 的 松树 群体 ( 即 大 西洋 、 地 中 海 和 北非 群体 ) 可 以 被 区 分 出 来 ， 遗 传 结构 与 桩 糊 数据 相符 。 在 另外 一 个 研究 中 ，Petit 等 (1995) DESO M Dy Mi Ale] CBS. 2-DE 揭示 的 蛋 白 三 者 在 群体 中 的 遗传 差异 是 相同 的 ， 说 明 在 三 种 类 型 的 位 点 中 均 缺 乏 (KF) 选 择 。

Burstin 等 (1994) 通过 用 2-DE， 同 工 酶 和 RFLP 标记 研究 21 个 玉米 近 交 系 间 的 遗

`、 传 多 样 性 。 从 21 个 酶 位 点 、59 个 RFLP 探 针 、70 个 位 置 移 动 位 点 (PS) 计算 了 距离 ，

比较 了 103 个 蛋白 的 数量 变异 及 共 祖 率 系数 的 相关 性 。 在 PS 和 同 工 酶 位 点 间 每 个 多 态 性 位 点 的 等 位 位 点 没有 差异 -( 各 为 2.2 和 2.4)，RFLP 位 点 的 稍 高 (4.6)。 在 相关 的 品 系 中 ， 根 据 同 工 酶 位 点 ， 除 了 一 个 ， 其 余 所 有 的 距离 都 与 共 祖 率 系数 高 度 相 关 。 这 很 有 可 能 是 因为 只 检测 了 较 小 数量 的 同 工 酶 位 点 : 当 把 所 有 的 PS、 同 工 酶 和 RFLP 位 点 都 考虑 进去 时 的 共 祖 率 系数 相关 性 (0.85) 比 单独 考虑 某 一 项 时 要 高 。 在 不 相关 的 品系 中 ， 多 肽 的 数量 变异 与 其 他 标记 之 间 的 相关 性 下 降 到 0.14。 几 种 原因 可 以 用 说 明 这 个 oR. @ 进 化 的 压力 在 控制 蛋白 数量 的 基因 上 和 其 他 位 点 有 所 不 同 ，@ 上 位 性 和 多 效 性 相互 作用 能 导致 变异 蛋白 的 数量 与 控制 它们 数量 的 多 态 性 基因 间 存 在 非 线性 相关 ; OY 只 考虑 相关 品系 时 ， 单 基因 标记 的 重要 相关 性 可 能 因为 连锁 不 平衡 。

David 等 . (1987) 研究 来 自 于 一 个 小 麦 群体 在 不 同 地 点 经 过 8 年 栽培 独立 进化 的 11 个 群体 间 的 遗传 差异 。 在 这 个 分 析 中 ，162 个 多 肽 中 的 39 个 被 证 明 在 群体 间 存 在 多 态 性 。 多 变异 分 析 表 明 ， 不 同 地 点 进化 的 群体 起 源 于 同一 个 群体 ， 造 成 这 些 差异 的 根源 是 自然 选择 而 不 是 随机 漂移 。

2.2 品种 、 品 系 和 栽培 品种 的 区 别

20 世纪 80 年 代 ，Zivy (1983, 1984) 通过 2-DE 用 蛋白 间 质 量 和 数量 的 差异 区 分 出 来 3 个 不 同 的 小 麦 品 种 。 用 异 质 品系 (通过 外 来 细胞 质 的 连续 回 交 得 到 的 同 核 基 因 组 ) 揭示 细胞 质 编码 基因 〈 例 如 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 的 大 亚 基 ) 的 差异 。 二 维 电泳 技术 的 改进 ， 尤 其 是 从 植物 组 织 中 提取 蛋白 过 程 的 改进 〈Bahrman et al., 1985;

« 73% - 蛋白 质 组 学

Colas des Francs et al., 1985) 以 及 大 一 些 尺 寸 胶 的 使 用 提高 了 遗传 变异 的 检 出 数 (Damerval et cg .，1986)。 在 2-DE 电泳 胶 中 尽管 只 有 部 分 编码 区 的 突变 是 可 检 出 的 ， 大 量 的 基因 产物 还 是 允许 研究 者 准确 地 分 析 及 分 辨 基因 型 ， 即 使 它们 属于 相关 的 群体 。 这 在 小 麦 (Anderson et al., 1985; Dunbar et al., 1985; Picard et al., 1997), K# (Gorg et al., 1988, 1992). 7K#§ (Abe a al., 1996; Saruyama and Shinbashi, 1992), 甘蔗 (Ramagopal, 1990) #U#KHL (Poch et al., 1992, 1994) 中 均 有 报道 。 在 木 本 植 物 中 ，Bon (1989) 应 用 2-DE 进行 分 生 组 织 培养 分 离 巨 杉 、 北 美 红 杉 、 花 旗 松 、 欧 洲 云 杉 、 海 岸 松 、 核 树 和 Populus nigra 的 克隆 。

当 用 2-DE 检测 遗传 差异 时 ， 研 究 者 可 找到 足够 的 差异 点 来 实现 其 的 目标 。 在 许多 情况 下 ， 获 得 的 数据 允许 建立 与 用 其 他 基于 分 子 或 表 型 特征 估计 的 相 一 致 的 遗传 距离 。

3. 基因 组 的 表达 3.1 突变 特征

比较 野生 型 与 突变 型 2-DE 的 模式 可 提供 对 突变 效果 的 评价 。 例 如 ， 它 能 够 检测 前 面 述 及 的 一 个 突变 的 多 效 性 。 而 且 ， 它 能 够 鉴定 出 突变 基因 编码 或 受 其 影响 的 蛋白 。 在 模式 植物 拟 南 芥 中 ， 用 2-DE 方式 检测 了 一 系列 影响 第 一 阶段 发 育 相 关 的 突变 (Santoni et al .，1994)。 一 种 蛋白 的 数量 ， 即 肌 动 蛋白 的 同型 ， 与 下 胚 轴 的 长 度 相 关 。 在 番茄 中 ， 野 生 型 和 铁 缺 乏 突变 型 二 维 电泳 方式 的 比较 导致 了 几 种 数量 不 同 的 酶 的 鉴定 ， 这 几 种 酶 参与 无 氧 代 谢 和 胁迫 防御 (Herbik et al., 1996), EMARAWHLM+H, Kasten 等 . (1997) 比较 叶绿体 突变 与 野生 型 之 间 的 蛋 日 差异 ， 是 否 与 细胞 分 裂 素 互 补 。 结 论 是 激素 对 胞 核 和 胞 质 编码 的 蛋白 均 有 影响 。 对 一 系列 影响 拟 南 芥 早 期 发 育 的 突变 和 激素 处 理 野 生 型 蛋白 方式 的 分 析 ， 阐 明了 一 种 与 预期 非常 相符 的 生化 分 类 法 ， 未 分 类 的 突变 可 能 导致 细胞 分 裂 素 的 超 量 表达 (Santoni et wz .，1997)。 这 种 假设 后 来 被 细胞 分 裂 素 的 剂量 进一步 证 实 (Faure et w.，1998)。 比 较 几 种 晚 花 期 拟 南 芥 的 突变 发 现 ， 几 个 蛋 白 点 相对 于 野生 型 出 现 或 消失 (Tacchini et 履 .，1995)。 但 是 ， 在 野生 型 和 突变 型 杂交 的 F2 代 群 体 中 ， 没 有 一 个 变异 蛋白 点 与 花 的 表现 型 共 分 离 。 除 了 遗传 证 实 的 必要 性 ， 这 些 实验 说 明 2-DE 分 析 能 够 揭示 用 于 突变 产生 实验 中 的 生态 型 或 品系 的 遗传 异 质 性 。 但 是 ， 必 须 注意 蛋白 质 组 分 析 的 蛋白 只 是 总 蛋白 的 一 部 分 。 | 蛋白 质 组 检测 突变 的 能 力 进一步 被 研究 突变 的 多 效 性 证 实 。Gottlieb 和 de Vienne (1988) 比较 了 葛 豆 的 两 个 近 等 基因 系 ， 它 们 携带 的 决定 圆 粒 和 皱 粒 的 r 基因 不 同 。 在 “成熟 种 子 的 蛋白 质 组 中 ， 近 10% 的 蛋白 点 在 数量 上 不 同 ， 证 实 了 这 两 种 类 型 的 种 子 之 闻 的 许多 已 知 的 生理 差异 。 在 玉米 中 ，Damerval 和 de Vienne (1993) 研究 了 Opaque2 (02) 基因 的 多 效 性 ， 该 基因 编码 一 种 转录 因子 。 通 过 对 在 几 个 无 关 背 景 中 的 O2 MEF 生 型 玉米 品系 2-DE 结果 的 比较 ， 鉴 定 出 了 0O2 基因 特异 的 靶 点 。 几 种 属于 不 同 途 径 代 谢 酶 的 发 现 进一步 证 实 O2 是 一 种 连接 不 同 谷物 代谢 途径 的 调控 基因 (Damerval and Le Guilloux，1998 ) 。 因此 ， 很 明显 蛋白 质 组 学 确实 是 区 分 基因 型 的 强 有 力 工 具 ， 即 使 是 在 遗传 背景 相差 无 几 的 情况 下 。 因 为 这 种 分 析 与 DNA 序列 并 非 紧密 相关 ， 在 遗传 差异 非常 小 的 时 候 也

sr 一

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 233 -

可 能 观察 到 许多 差异 。 同 时 ， 这 能 允许 人 们 去 解释 单个 突变 的 多 种 效应 。 另 外 ， 只 有 在 蛋白 水 平 才 适 合 观察 翻译 后 的 修饰 ， 而 这 也 是 遗传 变异 的 主题 。

3.2 器官 和 发 育 阶 段 的 变异 性

几 个 研究 表明 ， 器 官 特异 的 蛋白 比 非 器 官 特异 的 蛋白 有 更 大 的 变异 性 ， 并 且 遗 传 变 异 的 水 平 依赖 于 组 织 或 器 官 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 检测 了 18 个 不 相 关 树 种 的 3 个 器 官 〈 针 叶 ， 芽 和 花粉 ) 蛋白 的 遗传 变异 性 。 在 902 个 多 肽 中 ， 通 过 评价 有 无 变异 ， 染 色 强 度 和 位 置 移 动 变异 ，27.2% 是 多 态 性 的 。 在 3 个 器 官 共 有 的 点 中 ， 只 有 18.1% 是 变异 性 的 ， 而 器 官 特异 的 多 肽 有 很 高 水 平 的 多 态 性 (平均 55%， 针 叶 特 异 的 点 44.4%， 花 粉 58.1%， 芽 70.4% )。

器 官 特异 的 高 水 平 变异 性 也 在 玉米 中 有 所 发 现 。 通 过 比较 两 个 近 交 系 间 3 Sa (中 胚 轴 、 第 二 叶 的 叶鞘 和 三 周 龄 幼苗 的 叶 耳 )，Leonardi 等 (1988) 发 现 357 种 蛋白 中 遗传 数量 和 质量 的 变异 为 3.6%， 器 官 间 没有 变异 性 ， 而 629 种 蛋白 中 22.6% 表 现 为 器 官 特异 的 变异 。 然 后 ， 这 种 比较 延伸 到 两 种 另外 的 基因 型 (de Vienne et al., 1988): 59% 的 表现 为 器 官 间 差异 的 蛋白 是 遗传 变异 的 ，18% 为 稳定 的 蛋白 。 这 个 假设 也 被 海岸 松 的 结果 证 实 : 吉 官 特异 的 点 位 置 移 动 变 异 的 频率 是 分 析 每 一 种 器 官 的 两 倍 ， 而 数量 则 为 五 倍 (Bahrma and Petit, 1995).

降低 的 “功能 约束 ” (Kimura, 1983), 4 Klose (1982) 所 说 ， 可 能 也 解释 了 与 “管家 ” 泛 在 蛋白 相 比 ， 在 单 细 胞 环境 中 表达 的 器 官 特 异性 多 肽 其 等 位 基因 变异 水 平 的 提高 。

3.3 非 生物 胁迫 反应 蛋白 的 鉴定 与 分 析

植物 对 非 生物 胁迫 的 反应 引起 了 人 们 极 大 的 关注 ， 主 要 因为 应 用 于 栽培 品种 的 可 能 性 。

热 休克 有 蛋白 ”在 植物 中 ， 象 其 他 有 机 体 一 样 ， 升 高 温度 能 诱导 热 休 克 和 蛋白 (HSP) 的 合成 。 它 们 的 合成 对 耐 热 性 的 获得 是 相关 的 ， 也 就 是 忍耐 较 高 温度 的 能 力 。 植 物 不 同 于 其 他 有 机 体 之 处 在 于 它们 能 合成 大 量 的 低 分 子 质量 HSP (LMW-HSP)， 例 如 ，Nover 和 Scharf (1984) 发 现 了 在 番茄 细胞 培养 中 48 种 HSP 的 诱导 。 人 们 通过 比较 不 同 处 理 的 效果 或 研究 在 发 育 过 程 中 的 诱导 ， 研 究 耐 热 性 与 HSP 合成 的 关系 : Albernathy et al. (1989) 认为 HSP 的 合成 与 第 一 阶段 小 麦 种 子 吸 涨 过 程 中 耐 热 性 的 演变 相关 。 人 们 也 研 究 了 不 同 细胞 器 HSP 的 合成 : Lund 等 (1998) 证 实在 玉米 线粒体 中 一 种 特殊 的 LMW- HSP (HSP22) 被 强烈 诱导 合成 。

鉴于 HSP 具有 如 下 特征 : OHS 处 理 诱 导 后 很 容易 鉴定 (鉴定 它们 不 需要 测序 ); @QH 2-DE 方式 检测 ， 可 以 放射 性 标记 ， 也 可 以 银 染 ; @ 一 个 优先 知道 的 与 耐 热 性 相关 的 蛋白 ， 就 早 用 遗传 研究 调查 HSP 多 态 性 与 耐 高 温 遗 传 变异 的 关系 ，Zivy (1987) 调 查 了 小 麦 中 HSP 的 遗传 变异 性 ， 检 测 出 了 很 高 水 平 的 多 态 性 : 在 3 个 近 交 系 35 个 被 检 测 的 HSP 中 ， 超 过 三 分 之 一 属于 质量 或 数量 变异 ， 而 同一 基因 型 只 有 13% 的 其 他 蛋白 是 多 态 性 的 。 然 后 ，El Madidi 和 Zivy (1993) 发 现 热 耐 受 不 与 HSP 的 质量 变异 相关 ， 而 与 两 种 LMW-HSP 的 数量 变异 相关 ， 且 后 者 普遍 存在 于 7 个 检测 的 基因 型 中 。

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een 蛋白 质 组 学

人 们 为 了 寻找 特定 HSP 的 表达 与 耐 热 性 遗传 变异 的 合理 关系 进行 了 遗传 研究 (Kr ishnan et al., 1989; Vierling and Nguyen, 1990). Vierling 和 Nguyen (1992) 只 检测 了 单 粒 小 麦 耐 热 和 热 敏 株 系 之 间 的 数量 变异 。 然 后 ，Jorgensen 和 Nguyen (1995) 研究 了 LMW-HSP 在 玉米 幼苗 中 的 遗传 特征 ， 结 果 检 测 出 很 高 水 平 的 多 态 性 : 在 这 两 系 中 ， 29 个 被 检测 的 LMW-HSP 中 有 15 个 属于 质量 变异 ，3 个 表现 为 数量 变异 。 冷 适 应 蛋白 ”暴露 在 寒冷 条 件 下 能 够 诱导 冻结 耐 受 ， 但 是 这 种 生化 机 制 可 能 与 高 温 耐 受 的 机 制 不 同 ， 因 为 没有 特异 的 已 知 蛋白 是 被 寒冷 诱导 的 。 因 此 ，2-DE 被 用 于 描述 寒冷 反应 蛋白 ， 鉴 定 与 寒冷 适应 相关 的 调控 蛋白 : Meza-Basso 等 (1986) 发 现 了 在 油菜 幼苗 中 受 低 温 诱导 的 和 蛋白。 然后 Guy 和 Haskell (1988) 检测 了 菠菜 幼苗 中 与 冷 适 应 相 关 的 和 蛋白， 发 现 这 些 蛋 白 的 合成 在 获得 冻结 耐 受 性 期 间 有 所 升 高 ， 而 在 再 适应 过 程 中 减 少 。Cabane (1993) 在 大 豆 中 鉴定 了 冷 适 应 相关 和 蛋白， 其 中 一 个 是 热 休 克 和 蛋白 (HSP70)。Van Berkel et al. (1994) 检测 了 马铃薯 块 荃 冷 处 理 反 应 过 程 中 26 HEAR 量 的 改变 。Sabehat 等 (1996) 证 明 番 茄 的 果实 通过 热 休克 处 理 获 得 的 长 期 冷 耐 受 与 HSP 的 持久 性 相关 。Danyluk 等 (1991) 首先 用 遗传 途径 研究 了 3 个 小 麦 品 种 对 冷 处理 的 反应 : 18 种 蛋白 被 瞬时 诱导 ， 另 外 有 53 种 蛋白 在 诱导 冻结 耐 受 所 需 的 四 周 时 间 内 持 续 高 水 平 表达 。 而 后 者 中 的 34 种 在 冻结 耐 受 最 好 的 品系 中 也 有 较 高 水 平 的 表达 。 抗旱 相关 蛋白 ”和 缺 水 引起 植物 许多 形态 学 、 生 理学 和 生物 化 学 反应 ， 例 如 ， 减 少 气 生 部 分 的 生长 ， 气 孔 关 闭 ， 叶 子 卷 曲 ， 叶 衰亡 和 渗透 调整 。 这 些 反 应 至 少 部 分 受 脱落 酸 (ABA) 控制 ， 即 一 种 当 植 物 遭 受 干旱 时 浓度 升 高 的 植物 激素 。 许 多 细胞 的 功能 都 受 影 响 ， 并 发 现 该 胁迫 诱导 出 了 不 同类 型 的 蛋白 。 其 中 一 些 的 功能 直接 与 水 胁迫 有 关 (OK 孔 蛋 白 )， 一 些 与 细胞 损伤 有 关 (如 HSP， 与 氧化 胁迫 、 和 蛋白 酶 和 抑 蛋白 酶 相关 )， 还 有 一 些 与 不 同 的 代谢 功能 相关 (Ingram and Bartels，1996)。 第 一 个 被 鉴定 出 来 的 水 分 胁迫 蛋白 来 自 于 干燥 的 豚 胎 (Aspart et al., 1989; Dure et al., 1981; Sanchez-Mar- | tinez et al., 1986), KKRARKMAMIRE RRS REA (LEA)。 它 们 的 功能 未 | 知 ， 但 高 度 亲 水 ， 并 根据 重复 区 段 的 排列 分 成 不 同 的 组 (Dure et al., 1989), H— 些 后 来 被 证 明 是 不 同 器 官 受 干 旱 、ABA 或 盐 度 胁迫 诱导 的 结果 。 其 中 的 一 人 个， 玉米 的 RAB17 (组 2 ABA 反应 性 LEA 蛋白 ) 被 证 明 在 核 内 和 胞 质 内 磷酸 化 的 方式 不 同 (Jensen et al., 1998; Goday et al., 1994). | 在 一 些 情况 下 ，2-DE 不 是 用 来 鉴定 蛋白 ， 而 是 观察 不 同 条 件 下 蛋白 改变 的 首选 途 径 (Chen and Tabaeizadeh, 1992; Hurkman and Tanaka, 1988; Ramani and Apte, . 1997). Ramagopal (1987) wEAA A #é oh FH AY HR A SY Eh EA A EAN TAI HY. Leone . (1994) 证 明 在 马铃薯 细胞 悬浮 时 严重 的 渗透 胁迫 诱导 出 不 同系 列 的 蛋 日 。Leymarie etal. (1996) 用 植物 生长 素 不 敏感 突变 体 研 究 了 植物 生长 素 对 拟 南 芥 干 旱 反应 性 蛋白 的 效应 。 在 其 他 的 一 些 研 究 中 鉴定 了 诱导 出 的 蛋白 。 例 如 ，Claes (1990) 根据 水 稻 中 盐 胁迫 诱导 的 多 肽 段 微 测序 的 结果 设计 DNA 引物 ， 分 离 出 了 一 个 富 含 甘 氢 酸 蛋白 的 -cDNA 序列 。 同 样 地 ，Reviron (1992) 在 菠菜 叶子 中 鉴定 出 了 一 种 受 干旱 诱导 的 蛋白 酶 抑制 剂 ，Moons (1995, 1997) 在 水 稻 中 通过 微 测序 和 Western blotting 鉴定 出 了 一 种 新 型 的 富 含 甘 氢 酸 的 蛋白 ， 组 3 LEA 蛋白 ， 一 系列 的 组 2 LEA 蛋白 〈 也 叫 脱水 素 ， 如

第 十 五 章 “作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 = AS

RAB17)。 在 3 PRM HHH, WHREMLEREBAMGRAMEH KHEA.] Rey (1998) 证 明 在 马铃薯 叶绿体 中 通过 水 分 胁迫 诱导 出 一 种 硫 氧 还 蛋白 - 样 蛋白 ， Moons 等 (1998) 从 水 稻 根 中 诱导 出 丙酮 酸 正 磷酸 双 激 酶 。Costa 等 (1998) 发 现在 海 岸 松针 叶 中 通过 干旱 诱导 出 38 种 蛋白 。 其 中 包括 涉及 氧化 胁迫 反应 ， 热 休克 反应 和 木 质 素 生 物 合 成 的 酶 类 。Riccardi 等 (1998) 在 玉米 叶子 的 生长 部 分 发 现 受 干旱 影响 的 78 种 蛋白 ， 其 中 50 种 是 上 调 的 (图 15.3)。19 种 蛋白 得 到 了 部 分 序列 信息 ， 使 涉及 几 种 代谢 途径 蛋白 的 鉴定 成 为 可 能 。

水 胁迫

IO

图 15.3， 在 两 个 玉米 近 交 系 F2 和 Io 根 中 受 水 分 胁迫 诱导 的 蛋白 小 箭头 指示 一 串 被 诱导 的 蛋白 ， 在 Io 中 这 一 串 蛋 白质 的 表 观 分 子 量 要 比 F2 中 的 稍 高 些 ， 显 示 所 有 的 这 些 蛋 白 可 能 都 被 一 个 多 态 性 基因 编码 ， 只 是 翻译 后 修

饰 不 同 。 大 箭头 指示 非 诱导 蛋白 的 位 移 。

4. 遗传 作 图 和 候选 蛋 日

近 几 年 分 子 遗 传 方法 在 遗传 作 图 和 数量 性 状 分 离 分 析 (QTL 作 图 ) (Kearsey and Farquhar，1998) 中 的 应 用 有 了 巨大 的 进步 。 尽 管用 DNA 为 基础 的 技术 能 够 快速 遍及 基因 组 ，2-DE 则 不 但 提供 表达 基因 组 作 图 的 有 效 分 子 标 记 ， 还 可 能 为 理解 QTL 生物 功 能 提供 “候选 蛋白 ”。

4.1 蛋白 标记 的 遗传 作 图

代表 质量 变异 的 点 ， 或 是 位 置 移动 (PS) 或 有 无 (P/A) (图 2)， 已 被 证 明 是 受 单 基因 控制 的 (de Vienne et al., 1996), PS 变异 是 指 两 个 有 相同 特征 和 染色 强度 的 点 ， 可 用 以 下 的 标准 来 鉴定 : @@ 它 们 在 2-DE 胶 上 的 位 置 较 近 ， 有 相近 的 pbI 和 (或 ) 表 观 分 子 质量 ; @ 它 们 在 分 离谱 系 中 以 单 基 因 共 显 性 的 孟 德 尔 方 式 遗 传 [在 单 倍 体 和 双 单 倍 体 品系 中 以 1:1 分离 (Plomion et al., 1995; Zivy et al., 1992); 在 F2 自 交 群体 中 以

- 236 - 和 蛋白质 组 学

1:2:1 分 离 (Costa，1999; Damerval, 1994; Plomion, 1997)]; @@ 它 们 对 应 于 同一 个 蛋 白 。 最 后 一 条 标准 已 在 玉米 和 松 中 一 对 等 位 位 点 的 微量 测序 得 到 进一步 证 实 (Plomion, 1997; Touzet，1995a)。 如 果 PS 变异 对 应 于 蛋白 初级 结构 的 等 位 基因 变异 已 经 很 明了 ， 这 种 显示 P/A 变异 的 点 的 平行 性 就 不 是 很 直接 了 。 在 F2 代 的 2-DE 胶 中 ， 这 种 蛋白 显 示 明 显 的 单 基 因 显 性 遗传 方式 〈 一 个 点 的 有 无 以 3:1 的 比例 分 离 )， 说 明 这 种 多 态 性 是 单 基因 引起 的 。 如 果 P/A 变异 与 PS 变异 (许多 等 位 变异 是 检测 不 到 的 ) 相对 应 ， 那 么 P/A 位 点 就 对 应 于 蛋白 的 结构 基因 。 反 过 来 ， 如 果 一 个 P/A 变异 对 应 于 一 个 不 能 检测 的 点 的 数量 差异 ， 那 么 P/A 位 点 对 应 一 个 控制 蛋白 表达 水 平 的 主要 调控 基因 。

在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 证 实 PS 位 点 变异 的 水 平 与 分 子 量 成 正 相 关 ， 也 就 是 说 高 分 子 量 蛋 白 的 变异 性 要 比 低 分 子 量 的 变异 性 大 的 多 。 这 样 ， 大 的 一 些 蛋 白 就 会 出 现 较 高 水 平 的 多 态 性 ， 因 为 “每 个 多 肽 的 替换 率 的 变异 取决 于 氨基 酸 数目 或 每 个 位 点 蔡 换 率 的 不 同 ” (Nei，1987)。 但 是 ， 没 有 发 现 P/A 变异 的 水 平 与 分 子 量 相 关 。 这 两 个 研究 〈 单 基因 方式 的 遗传 以 及 与 分 子 量 的 不 相关 ) 暗示 P/A 变异 可 能 来 自 于 主 效 调 控 元 件 的 多 态 性 。

蛋白 标记 的 遗传 定位 主要 在 小 麦 、 玉 米 和 海岸 松 中 有 报道 ， 尽 管 也 有 几 个 PS 位 点 在 其 他 作物 中 有 所 报道 ， 包 括 大 麦 (Zivy et al., 1992) 和 更 豆 (de Vienne et al., 1996)。 在 小 麦 中 ，Colas des Francs 和 Thiellement (1985) 报道 了 对 比 整 倍 体 和 双 末 端 体 35 种 蛋白 的 染色 体 定 位 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Damerval (1989) VA Gerber et al. (1993) 各 自 报道 了 119 和 OS 个 位 点 的 连锁 分 析 。 近 来 用 来 自 于 该 物种 第 三 代 近 交 谱系 单 倍 体 (Plomion et al., 1995) 和 二 倍 体 (Costa et al., 1999; Plomion et al., 1997) 组 织 的 68 种 蛋白 进行 作 图 。 在 玉米 中 ，de Vienne et al. (1996) 提供 了 显示 65 个 PS 位 点 分 布 的 多 系 连锁 图 。 在 松树 和 玉米 中 ， 能 在 每 一 条 染色 体 上 找到 蛋 自 位 点 (图 1$.4)， 与 其 他 标记 〈 玉 米 中 的 RFLP， 松树 中 的 RAPDs 和 AFLP) 散在 分 布 。

RFLP 标记 由 cDNA 文库 发 展 而 来 ， 一 般 揭示 数 个 不 连锁 位 点 (Devey et al., 1994; Helentjaris et al., 1988; Song et wl .，1991)， 鉴 定 表 达 的 基因 ， 而 对 于 沉默 的 基因 和 假 基 因 的 鉴定 是 非常 困难 的 。 因 此 ， 对 于 构建 表达 基因 图 谱 和 建立 在 不 同 组 织 或 不 同 发 展 阶段 哪 一 个 cDNA 位 点 在 表达 ， 用 2-DE 方法 分 离 蛋 白 是 非常 有 趣 的 技术 。 例 如 ， 一 个 玉米 蛋白 表现 为 叶 、 种 子 和 胚芽 鞘 的 PS 变异 ， 用 微量 测序 和 蛋白 成 分 分 析 鉴 定 为 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 。 用 于 RFLP 分 析 的 cDNA 探 针 作 图 到 3 条 染色 体 上 4 个 不 同 的 位 点 。 每 个 器 官 中 的 PS 位 点 只 与 其 中 的 一 个 〈 也 许 为 表 达 的 一 个 ) HEL (de Vienne etal., 1999).

到 现在 为 止 ， 单 个 植物 品种 中 作 图 的 蛋白 位 点 不 超过 100 个 。 这 种 标记 的 数目 将 在 以 后 随 着 分 析 同 一 个 体 一 些 生 理学 上 对 照 的 器 官 或 组 织 〈( 根 、 叶 、 芽 、 花 粉 和 木质 部 等 ) 而 增加 ， 直 到 遍及 整个 基因 组 。 这 种 表达 基因 图 谱 将 是 QTL 分 析 中 候选 基因 /和 蛋 白 策 略 的 无 以 比拟 的 支撑 。

4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白

候选 基因 。 在 近 10 年 中 ， 鉴 定 出 有 重要 农学 性 状 遗 传 变异 的 基因 主要 是 通过 在 分 离 群体 中 用 无 名 标记 做 的 连锁 图 分 析 ， 这 种 图 的 连锁 不 平衡 能 被 最 大 化 〈Tanksley，

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 * 237 -

图 15.4 来 自 与 松树 肉 配子 体 和 针 叶 2-DE 胶 的 15 个 位 置 变异 (-) 和 53 个 有 /无 变异 (-) 在 图 谱 上 的 位 置 模式 图 该 图 用 RAPD 和 AFLP 标记 构建 ， 可 通过 因特网 查询 (http: //www. pierroton.

inra. fr/genetics/ pinus/ ) .

1993)。 尽 管 很 成 功 ， 但 应 指出 这 种 QTL 检测 分 析 存 在 一 定 的 局 限 性 。QTL 只 能 被 大 致 定 位 ， 也 就 是 说 遗传 图 谱 上 的 QTL 的 置信 区 间 是 很 大 的 (Mangen et al., 1994). 这 意味 着 QTL 作 图 不 允许 鉴定 潜在 基因 。 因此 ， 人 性 状 分 割 分 析 ， 尽 管 已 应 用 于 标记 辅 助 育种 程序 中 ， 可 以 被 认为 是 鉴定 控制 部 分 数量 性 状 变异 的 第 一 步 。 另 外 ， 在 总 基因 组 长 度 和 DNA 含 量 的 基础 上 上， 相当 于 1B (cM) 的 平均 物理 图 距 是 变化 的 ， 如 拟 南 芥 、 核 树 、 玉 米 、 小 麦 和 松树 分 别 是 : 230、460、2500 和 12000Kb。 这 意味 着 在 大 部 分 一 年 生 植 物 森 林 树 种 中 用 定位 克隆 (Rommens et al., 1998) 鉴定 QTL 是 非常 困难

的 。 从 生物 学 角度 ， 可 以 从 候选 基因 (CG) AERA (CP) 途径 获得 QTL.

“功能 CG” 是 指 可 能 影响 性 状 表 达 并 且 测 序 的 基因 ， 可 以 基于 已 知 影响 目标 性 状 的 生化 和 发 育 途径 标准 来 推断 。 另 外 ， 任 何 一 个 产生 很 大 影响 的 突变 位 点 可 以 被 认为 是 一 个 CG， 而 这 个 CG 的 等 位 位 点 的 效应 较 小 ， 可 能 影响 自然 发 生 的 数量 变异 。 例 如 ， Touzet 等 〈1995b) 推测 一 个 矮 化 基因 涉及 赤 霉 酸 生 物 合成 途径 ， 作 为 高 秆 生长 的 QTL. QTL 和 这 个 突变 质量 性 状 的 共 定 位 已 有 报道 (Beavis et al., 1991; Doebley and Stec，1993)。 这 种 “功能 CG” 的 主要 局 限 性 在 于 目前 只 有 一 小 部 分 基因 影响 的 性 状 是 已 知 的 。

“位 置 CG” 可 以 推测 所 有 与 目标 性 状 QTL 定位 在 同一 位 置 的 基因 。 但 是 ， 该 策略 是 以 比较 完善 的 基因 图 谱 为 基础 的 ， 只 可 以 应 用 于 少数 几 个 物种 。QTL 和 已 知 基 因 的 共 定 位 以 前 曾 有 报道 (Byrne et al., 1996; Causse et al., 1995; Goldman et al., 1994; Prioul et al., 1997, 1999), “fit CG” AYER REET CG 和 QTL 的 共 定 位 纯 属 偶然 。 2

有 蛋白 数量 位 点 作为 正式 候选 基因 的 可 能 的 方法 “CG 的 证 实在 这 种 信息 应 用 于 育种 程序 以 前 是 非常 必要 的 。 其 证 实 依赖 于 功能 基因 组 学 工具 (Borchez and Hofte, 1998), 其 中 CP 途径 是 必 不 可 少 的 步 又。 确实 ， 如 果 一 个 CG 的 产物 不 显示 数量 和 (或 ) 活性

eS ef

- 236 - 蛋白 质 组 学

1:2:1 分 离 (Costa, 1999; Damerval, 1994; Plomion，1997)];，@@ 它 们 对 应 于 同一 个 蛋 和 白 。 最 后 一 条 标准 已 在 玉米 和 松 中 一 对 等 位 位 点 的 微量 测序 得 到 进一步 证 实 (Plomion, 1997; Touzet，1995a)。 如 果 PS 变异 对 应 于 蛋白 初级 结构 的 等 位 基因 变异 已 经 很 明了 ， 这 种 显示 P/A 变异 的 点 的 平行 性 就 不 是 很 直接 了 。 在 F2 代 的 2-DE 胶 中 ， 这 种 蛋白 显 示 明 显 的 单 基 因 显 性 遗传 方式 〈 一 个 点 的 有 无 以 3:1 的 比例 分 离 )， 说 明 这 种 多 态 性 是 单 基 因 引 起 的 。 如 果 P/A 变异 与 PS 变异 (许多 等 位 变异 是 检测 不 到 的 ) FM, BA P/A 位 点 就 对 应 于 蛋白 的 结构 基因 。 反 过 来 ， 如 果 一 个 P/A 变异 对 应 于 一 个 不 能 检测 的 点 的 数量 差异 ， 那 么 P/A 位 点 对 应 一 个 控制 蛋白 表达 水 平 的 主要 调控 基因 。

在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Petit (1995) 证 实 PS 位 点 变异 的 水 平 与 分 子 量 成 正 相 关 ， 也 就 是 说 高 分 子 量 蛋 白 的 变异 性 要 比 低 分 子 量 的 变异 性 大 的 多 。 这 样 ， 大 的 一 些 蛋 白 就 会 出 现 较 高 水 平 的 多 态 性 ， 因 为 “每 个 多 肽 的 蔡 换 率 的 变异 取决 于 氨基 酸 数目 或 每 个 位 点 替换 率 的 不 同 ” (Nei，1987)。 但 是 ， 没 有 发 现 P/A 变异 的 水 平 与 分 子 量 相关 。 这 两 个 研究 〈 单 基因 方式 的 遗传 以 及 与 分 子 量 的 不 相关 ) 暗示 P/A 变异 可 能 来 自 于 主 效 调控 元 件 的 多 态 性 。

蛋 日 标记 的 遗传 定位 主要 在 小 麦 、 玉 米 和 海岸 松 中 有 报道 ， 尽 管 也 有 几 个 PS 位 点 在 其 他 作物 中 有 所 报道 ， 包括 大 麦 (Zivy et al., 1992) FBG (de Vienne et al., 1996) 。 在 小 麦 中 ，Colas des Francs 和 Thiellement (1985) 报道 了 对 比 整 倍 体 和 双 来 端 体 35 种 蛋白 的 染色 体 定 位 。 在 海岸 松 中 ，Bahrman 和 Damerval (1989) 以 及 Gerber et al. (1993) 各 自 报道 了 119 和 65 个 位 点 的 连锁 分 析 。 近 来 用 来 自 于 该 物种 第 三 代 近 交 谱系 单 倍 体 (Plomion et al., 1995) 和 二 倍 体 (Costa et al., 1999; Plomion et al., 1997) 组 织 的 68 种 蛋白 进行 作 图 。 在 玉米 中 ，de Vienne et al. (1996) 提供 了 显示 65 个 PS 位 点 分 布 的 多 系 连锁 图 。 在 松树 和 玉米 中 ， 能 在 每 一 条 染色 体 上 找到 蛋 自 位 点 (图 15.4)， 与 其 他 标记 〈 玉 米 中 的 RFLP， 松树 中 的 RAPDs 和 AFLP) 散在 分 布 。

RFLP 标记 由 cDNA 文库 发 展 而 来 ， 一 般 揭 示 数 个 不 连锁 位 点 (Devey et al., 1994; Helentjaris et al., 1988; Song et wd .，1991)， 鉴 定 表 达 的 基因 ， 而 对 于 沉默 的 基因 和 假 基 因 的 鉴定 是 非常 困难 的 。 因 此 ， 对 于 构建 表达 基因 图 谱 和 建立 在 不 同 组 织 或 | 不 同 发 展 阶段 哪 一 个 cDNA 位 点 在 表达 ， 用 2-DE 方法 分 离 蛋 白 是 非常 有 趣 的 技术 。 例 如 ， 一 个 玉米 蛋 自 表 现 为 叶 、 种 子 和 且 芽 精 的 PS 变异 ， 用 微量 测序 和 和 蛋白 成 分 分 析 监

一 一 一 一 -一

KE Ay oe RY eh PRE ED FA RFLP 分 析 的 cDNA 探 针 作 图 到 3 条 染色 体 上 4 个 不 同 的 位 点 。 每 个 器 官 中 的 PS 位 点 只 与 其 中 的 一 个 〈 也 许 为 表 达 的 一 个 ) 共 定 位 (de Vienne etal., 1999),

到 现在 为 止 ， 单 个 植物 品种 中 作 图 的 蛋白 位 点 不 超过 100 个 。 这 种 标记 的 数目 将 在 以 后 随 着 分 析 同 一 个 体 一 些 生理 学 上 对 照 的 器 官 或 组 织 〈( 根 、 叶 、 芽 、 花 粉 和 木质 部 等 ) 而 增加 ， 直 到 遍及 整个 基因 组 。 这 种 表达 基因 图 谱 将 是 QTL 分 析 中 候选 基因 /和 蛋 白 策 略 的 无 以 比拟 的 支撑 。

4.2 蛋白 数量 位 点 (PQL) 和 候选 蛋白

候选 基因 。 在 近 10 年 中 ， 鉴 定 出 有 重要 农学 性 状 遗 传 变异 的 基因 主要 是 通过 在 分 离 群体 中 用 无 名 标记 做 的 连锁 图 分 析 ， 这 种 图 的 连锁 不 平衡 能 被 最 大 化 〈Tanksley，

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 237 +

图 15.4 来 自 与 松树 肉 配 子 体 和 针 叶 2-DE 胶 的 15 个 位 置 变异 〈-) 和 53 个 有 /无 变异 (-) 在 图 谱 上 的 位 置 模 式 图 该 图 用 RAPD 和 AFLP 标记 构建 ， 可 通过 因特网 查询 (http: //www. pierroton.

inra. fr/genetics/pinus/ ) .

1993)。 尽 管 很 成 功 ， 但 应 指出 这 种 QTL 检测 分 析 存 在 一 定 的 局 限 性 。QTL 只 能 被 大 Sew, Wee ie eA LA QTL 的 置信 区 间 是 很 大 的 (Mangen et al., 1994), 这 意味 着 QTL 作 图 不 允许 鉴定 潜在 基因 。 因 此 ， 人 性 状 分 割 分 析 ， 尽 管 已 应 用 于 标记 辅 助 育 种 程序 中 ， 可 以 被 认为 是 鉴定 控制 部 分 数量 性 状 变异 的 第 一 步 。 另 外 ， 在 总 基因 组 长 度 和 DNA 含量 的 基础 上 ， 相 当 于 1 JE (cM) 的 平均 物理 图 距 是 变化 的 ， 如 拟 南 芥 、 核 树 、 玉 米 、 小 麦 和 松树 分 别 是 : 230、460、2500 和 12000Kb。 这 意味 着 在 大 部 分 一 年 生 植 物 森 林 树 种 中 用 定位 克隆 (Rommens et al., 1998) 鉴定 QTL 是 非常 困难 的 。 从 生物 学 角度 ， 可 以 从 候选 基因 〈(CG) 和 候选 蛋白 (CP) 途径 获得 QTL.

“功能 CG” 是 指 可 能 影响 性 状 表达 并 且 测 序 的 基因 ， 可 以 基于 已 知 影响 目标 性 状 的 生化 和 发 育 途 径 标准 来 推断 。 另 外 ， 任 何 一 个 产生 很 大 影响 的 突变 位 点 可 以 被 认为 是 一 个 CG， 而 这 个 CG 的 等 位 位 点 的 效应 较 小 ， 可 能 影响 自然 发 生 的 数量 变异 。 例 如 ， Touzet 等 〈1995b) 推测 一 个 矮 化 基因 涉及 赤 霉 酸 生 物 合成 途径 ， 作 为 高 秆 生长 的 QTL. QTL 和 这 个 突变 质量 性 状 的 共 定 位 已 有 报道 (Beavis et al., 1991; Doebley and Stec，1993)。 这 种 “功能 CG” 的 主要 局 限 性 在 于 目前 只 有 一 小 部 分 基因 影响 的 性 状 是 GAA.

“位 置 CG” 可 以 推测 所 有 与 目标 性 状 QTL 定位 在 同一 位 置 的 基因 。 但 是 ， 该 策略 是 以 比较 完善 的 基因 图 谱 为 基础 的 ， 只 可 以 应 用 于 少数 几 个 物种 。QTL 和 已 知 基因 的 共 定 位 以 前 曾 有 报道 (Byrne et al., 1996; Causse et al., 1995; Goldman et al., 1994; Prioul et al., 1997, 1999), “{Z# CG” HEB ARHEF CGM QTL 的 共 定 位 纯 属 偶然 。

蛋白 数量 位 点 作为 正式 候选 基因 的 可 能 的 方法 “CG 的 证 实在 这 种 信息 应 用 于 育种 程序 以 前 是 非常 必要 的 。 其 证 实 依赖 于 功能 基因 组 学 工具 (Borchez and Hofte, 1998), 其 中 CP 途径 是 必 不 可 少 的 步 又。 确实 ， 如 果 一 个 CG 的 产物 不 显示 数量 和 (或 ) 活性

2 蛋白 质 组 学

的 多 态 性 ， 也 就 是 说 如 果 一 个 CG 和 一 个 QTL 的 共 定 位 不 与 另外 一 个 控制 其 活性 和 (或 ) 数量 的 QTL 共 定 位 ， 那 么 这 个 CG 是 不 能 被 证 实 的 。

Damerval 等 (1994) 率先 用 QTL 策略 调查 2-DE 分 离 蛋白 的 数量 变异 的 遗传 确定 性 。 他 们 用 玉米 F2 中 分 离 的 RFLPs 和 PS 位 点 构建 的 连锁 图 谱 通过 对 调控 因子 或 解释 点 强度 变异 的 PQL 的 区 间作 图 (Lander and Botstein, 1989) 进行 定位 。 在 分 析 的 72 个 蛋白 中 ，42 个 蛋白 检测 到 70 个 PQL， 其 中 20 含有 不 只 一 个 PQL， 分 布 在 整个 基因 组 中 。 近 来 ，PQLs 控制 海岸 松针 叶 蛋 白 的 积累 也 在 F2 代 (Costa et al., 1999) 检测 到 ， 并 得 出 了 相同 的 结论 。 这 种 途径 在 玉米 中 (de Vienne et al., 1999) 近来 也 给 出 一 | 个 范例 ， 一 个 定位 在 10 号 染色 体 上 的 干旱 反应 性 CG (ASR1 基因 ,，ABA/ 水 分 胁迫 / 催 熟 相关 蛋白 ) 与 木质 部 树 液 、ABA 含量 、 叶 子 衰 老 和 花丝 间隔 【一 种 干旱 反应 性 性 状 ) 的 QTL、 一 个 在 干旱 条 件 下 控制 ASR1 蛋白 有 /无 变异 的 主 效 PQL 共 定 位 。

PQL 策略 也 能 鉴定 出 C， 也 就 是 控制 数量 和 (或 ) 活性 的 遗传 因子 蛋白 与 已 知 农 艺 性 状 的 QTL 共 定 位 ， 而 结构 基因 则 不 能 。 在 此 前 提 下 ，de Vienne 等 (1999) 在 玉米 中 证 实 了 3 个 控制 单 叶 和 蛋白 数量 的 PQL 与 3 个 高 秆 QTL 共 定 位 。

5. FEF ERA OC

近来 对 2-DE 和 和 蛋白 分 析 的 改进 使 植物 蛋白 质 组 分 析 有 了 相当 大 的 进展 。 技 术 的 改 进 ， 如 IPG 预制 条 ， 使 得 2-DE 的 可 重复 性 有 所 改善 ， 跑 大 量 的 样品 变 得 容易 ， 这 些 代 表 了 使 PQL 途径 更 加 可 行 的 主要 进步 。 现 在 通过 微量 测序 、 电 喷雾 电离 MS/MS 或 MALDI-TOF 质谱 随后 在 蛋 白 或 基因 数据 库 中 进行 序列 同 源 性 搜寻 (Li et al., 1997), 鉴定 和 分 析 多 肽 点 已 相对 较为 容易 。 而 且 ， 近 几 年 ， 在 软件 和 图 像 分 析 方 面 的 进步 允许 分 析 和 比较 大 量 样品 中 的 大 量 的 点 (Appel et al., 1997). ix SHAE AA 2-DE 是 一 种 功能 强大 的 蛋白 方式 的 技术 ， 能 够 联系 生理 学 和 遗传 学 方面 的 问题 。

表 15.1 植物 基因 组 数据 库 鉴定 的 蛋白 数目

a 品种 (已 鉴 定 出 的 百分数 ) 参考 文献 WWW 地 址 水 稻 50 (58% ) Komatzu et al. (1993) http: //www.rs.noda.sut.ac.jp/~kamom/2-DE/ 59 (56% ) Tsugita et al. (1994) 2d.html* 51 (53%) Tsugita et al. (1996) 拟 南 芥 57 (63% ) Kamo et al. (1995) http: //www.rs.noda.sut.ac.jp/~ kamom/2-DE/ 62 (56.5% ) Tsugita et al. (1996) 2d.html* 150 (50% ) Santoni et al. (1998) http: //sphinx.rug.ac.be: 8080/ppmdb/ index. html 玉米 74 (48.5%) Touzet et al. (1996) http: //moulon. inra. fr/imgd 80 (67.5%) Zivy (私人 通讯 ) 松树 65 (90% ) Costa et al. (1999) http: //www.pierroton. inra. fr/genetics/2D/ “该 数据 库 已 不 再 使 用 。

尽管 量 白质 组 学 在 越 来 越 多 的 微生物 以 及 人 类 中 广泛 研究 (Humphery-Smith et al., 1997; Wilkins et az .，1997)， 蛋 白质 组 在 植物 中 还 没有 得 到 很 大 的 关注 。 表 15.1

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 239 -

中 列 出 了 目前 网 上 可 用 的 植物 蛋白 数据 库 的 特征 。 现 在 可 用 的 数据 库 有 : 双子 叶 的 拟 南 芥 、 单 子叶 的 水 稻 、 重 要 的 农作物 如 玉米 、 裸 子 植物 海岸 松 。 这 些 数据 库 提 供 扫 描 的 胶 和 可 点 击 的 图 像 ， 特 征 点 以 超级 链接 强调 。 单 个 蛋白 入 口 通过 激活 的 交叉 文献 与 其 他 蛋 白 数据 库 如 SWISS-PROT 或 TrEMBL 链接 。 在 基因 组 表达 分 析 方 面 ， 所 有 这 些 数据 库 都 包括 在 各 种 植物 器 官 OB Ob. SR RT) 或 组 织 MAA, ARM, OK 部 ) 或 基因 型 间 多 态 方式 的 比较 。 有 时 候 也 提供 其 他 的 信息 如 亚 细 胞 定位 、 生 理学 数据 (海岸 松针 叶 蛋 白 季 节 变 异 或 水 分 缺乏 效果 ) 和 遗传 学 数据 (对 应 于 海岸 松 和 玉米 连锁 图 谱 中 基因 的 定位 )。

6. 总 结 、 前 景 展望

关于 群体 遗传 学 研究 ， 选 择 分 子 筛选 技术 分 析 自 然 群体 中 遗传 多 样 性 的 程度 和 分 布 将 依赖 于 许多 因素 (Karp et al., 1995) 是 广泛 接受 的 观点 。 因 为 每 种 类 型 的 标记 都 具 有 优点 和 局 限 性 ， 需 要 应 用 多 种 技术 ， 其 中 包括 2-DE。 这 种 技术 的 优点 在 于 蛋白 位 点 从 基因 组 取样 区 别 于 许多 基于 PCR 的 技术 ， 因 此 对 于 多 样 性 问题 ， 它 提供 不 同 水 平 的 差异 。 目 前 ，2-DE 没有 被 用 于 系统 发 生 关 系 的 建立 。 但 是 ， 如 在 Triticeae 中 展示 的 ， 在 传统 的 细胞 和 分 子 途 径 不 能 区 分 的 物种 间 的 比较 方面 似乎 具有 相当 大 的 价值 。 而 且 ， 当 研 究 属 于 同一 个 家 族 的 相关 物种 时 发 现 了 共有 的 蛋白 。 如 果 一 个 蛋白 是 栽培 品种 如 油 菜 的 育种 的 目标 ， 而 且 如 果 编 码 电泳 中 同一 蛋白 的 基因 已 经 在 拟 南 芥 中 〈 另 一 个 十 字 花 科 植 物 ) 测序 ， 这 可 以 极 大 地 缩短 建立 该 基因 为 目标 农艺 基因 的 时 间 。 可 以 乐观 地 展望 将 来 这 种 比较 基因 组 学 的 发 展 。 在 候选 基因 途径 中 使 用 蛋白 分 析 的 方法 刚刚 起 步 ， 因 为 植物 育种 家 的 获 益 将 很 快 发 展 起 来 。

2-DE 只 能 揭示 1000 或 2000 多 丰富 蛋白 的 相对 局 限 性 ， 如 本 书 的 其 他 音节 中 描述 的 ， 可 以 通过 改进 提取 方法 和 应 用 多 步 技 术 ， 提 高 每 个 样品 2-DE 胶 的 数目 和 斥 寸 ( 变 案 和 拓宽 pH WHS) 等 方法 来 解决 。 像 在 医学 和 微生物 学 中 一 样 ， 蛋 白质 组 学 将 很 快 成 为 植物 生物 学 中 破译 基因 功能 和 贡献 于 育种 程序 的 主要 途径 ， 如 前 面 农作物 品种 和 条 林 树 种 示例 。

致谢

感谢 我 们 在 Réseau I.N.R.A. Protéomes Végétaux 的 同事 帮助 收集 文献 和 丰富 讨 论 。 在 Pierroton (I.N.R.A.， 法 国 ) 森林 树种 的 工作 部 分 由 欧 kat A FAIR-CT9S- 0781 和 FAIR-CT98-3953 赞助 。

(SRA Haw tr) 参考 文献

Abe, T., Gusti, R.S., Ono, M. and Sasahara, T. (1996) Variations in glutelin and high molecular weight endosperm proteins among subspecies of rice (Oryza sativa L.) detected by two- dimensional gel electrophoresis. Genes Genet. Syst. 71: 63-68.

Albernathy, R.H., Thiel, D.S., Petersen, N.S. and Helm, K. (1989) Thermotolerance is devel- opmentally dependent in germinating wheat seed. Plant Physiol. 89: 576-596.

一 一 一 -一 一 一 一 一 -一 ce 一 一 一 一 一 -一

- 240 ， 蛋白 质 组 学

Anderson，N.L. and Anderson，N.G. (1998) Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new world. Electrophoresis 19: 1853-1861.

Anderson, L. and Seilhammer, J. (1997) A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis 18: 533-537.

Anderson, N.G., Tollaksen, S.L., Pascoe, F.H. and Anderson, L. (1985) Two-dimensional electro- phoresis of wheat seed proteins. Crop Sci. 25: 667-674.

Appel, R.D., Palagi, P.M., Walther, D., Vargas, J.R., Sanchez, J-C., Ravier, F., Pasquali, C. and Hochstrasser, D.F. (1997) Melanie II — a third-generation software package for analysis of two- dimensional electrophoresis images: 1. Features and user interface. Electrophoresis 18: 2724— 2734.

Aspart, L., Meyer, Y., Laroche, M. and Penon, P. (1984) Developmental regulation of the synthesis of proteins encoded by stored mRNA in radish embryos. Plant Physiol. 76: 664-673.

Bahrman, N. and Damerval, C. (1989) Linkage relationships of loci controlling protein amounts in maritime pine (Pinus pinaster Ait). Heredity 63: 267-274. .

Bahrman, N. and Petit, R. (1995) Genetic polymorphisms in maritime pine (Pinus pinaster Ait) assessed by two-dimensional gel electrophoresis of needle, bud and pollen proteins. J. Mol. Evol. 41: 231-237.

Bahrman, N., Zivy, M., Damerval, C. and Baradat, P. (1994) Organisation of the variability of abundant proteins in seven geographical origins of maritime pine (Pinus pinaster Ait). Theor. Appl. Genet. 88: 407-411.

Bahrman, N., de Vienne, D., Thiellement, H. and Hofmann, J.P. (1985) Two-dimensional gel electrophoresis of proteins for genetic studies in Douglas fir (Pseudotsuga mensiesii). Biochem. Genet. 23: 247-255.

Bahrman, N., Zivy, M. and Thiellement, H. (1988a) Genetic relationships in the Sitopsis section of Triticum and the origin of the B genome of the polyploid wheats. Heredity 61: 473-480.

Bahrman, N., Cardin, M-L., Seguin, M., Zivy, M. and Thiellement, H. (1988b) Variability of 3 cytoplasmically encoded proteins in the Triticum genus. Heredity 60: 87-90.

Barreneche, T., Bahrman, N. and Kremer, A. (1996) Two dimensional gel electrophoresis confirms the low level of genetic differentiation between Quercus robur L and Quercus petraea (Matt) Liebl. For. Genet. 3: 89-92.

Beavis, W.D., Grant, D., Albertsen, M. and Fincher, R. (1991) Quantitative trait loci for plant height in four maize populations and their associations with qualitative genetic loci. Theor. Appl. Genet. 83: 141-145.

Bon, M.C. (1989) A two-dimensional electrophoresis procedure for single meristems of different forest species. Electrophoresis 10: 530-532.

Bouchez, D. and Hofte, H. (1998) Functional genomics in plants. Plant Physiol. 118: 725—732.

Burstin, J., de Vienne, D., Dubreuil, P. and Damerval, C. (1994) Molecular markers and protein quantities as genetic descriptors in maize. I. Genetic diversity among 21 inbred lines. Theor. Appl. Genet. 89: 943-950.

Byrne, P.F., McMullen, M.D., Snooks, M.E., Musket, T.A., Theuri, J.M., Widstrom, N.W., Wiseman, B.R. and Coe, E.H. (1996) Quantitative trait loci and metabolic pathways: genetic control of a concentration of maysin, a corn earworn resistance factor, in maize silks. Proc. Natl Acad. Sci. 93: 8820-8825.

Cabane, M., Calvet, P., Vincens, P. and Boudet, A. M. (1993) Characterization of chilling- acclimation-related proteins in soybean and identification of one as a member of the heat shock protein (HSP 70) family. Planta 190: 346-353.

Castellino, A. (1997) When the chips are down. Genome Res. 7: 943-946.

Causse, M., Rocher, J.P., Henry, A.M., Charcosset, A., Prioul, J.L. and de Vienne, D. (1995) Genetic dissection of the relationship between carbon metabolism and early growth in maize, with emphasis on key-enzyme loci. Mol. Breed. 3: 259-272.

Chen, R. D. and Tabaeizadeh, Z. (1992). Expression and molecular cloning of drought-induced genes in the wild tomato Lycopersicon chilense. Biochem. Cell Biol. 70, 199-206.

Claes B., Dekeyser R., Villaroel R, van den Bulke M., Bauw G., van Montagu M. and Caplan A. (1990) Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought. Plant Cell 2: 19-27.

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 241 - ‘

Colas des Francs, C. and Thiellement, H. (1985). Chromosomal localization of structural genes and regulators in wheat by 2D electrophoresis of ditelosomic lines. Theor. Appl. Genet. 71: 31-38. Colas des Francs, C., de Vienne, D. and Thiellement, H. (1985) Analysis of leaf proteins by two- dimensional gel electrophoresis: protease action as examplified by ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase degradation and procedure to avoid proteolyse during extraction.

Plant Physiol. 78: 178-182.

Costa, P., Bahrman, N., Frigerio, J. M., Kremer, A. and Plomion, C. (1998) Water-deficit- responsive proteins in maritime pine. Plant Mol. Biol. 38: 587-596.

Costa, P., Pot, D., Dubos, C., Frigerio, J-M., Pionneau, C., Bodenés, C., Bertocchi, E., Cervera, M- T., Remington, D.L. and Plomion, C. (2000) A genetic map of Maritime pine based on AFLP, RAPD and protein markers. Theor. Appl. Genet. 100: 39-48.

Damerval, C. and de Vienne, D. (1993) Quantification of dominance for proteins pleiotropically affected by Opaque-2 in maize. Heredity 70: 38-S1.

Damerval, C. and Le Guilloux, M. (1998) Characterization of novel proteins affected by the 02 mutation and expressed during maize endosperm development Mol. Genes Genet. 257: 354-361.

Damerval C., de Vienne D., Zivy M. and Thiellement, H. (1986) Technical improvements in two- dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis 7: 52-54.

Damerval, C., Maurice, A., Josse, J.M. and de Vienne, D. (1994) Quantitative trait loci underlying gene product variation: a novel perspective for analyzing regulation of genome expression. Genetics 137: 289-301.

Danyluk, J., Rassart, E. and Sarhan, F. (1991) Gene expression during cold and heat shock in wheat. Biochem. Cell Biol. 69: 383-391.

David J.L., Zivy M., Cardin M.L. and Brabant, P. (1997) Protein evolution in dynamically managed populations of wheat: adaptative responses to macro-environmental conditions. Theor. Appl. Genet., 95: 932-941.

de Vienne, D., Leonardi, A. and Damerval, C. (1988) Genetic aspects of variation of protein amounts in maize and pea. Electrophoresis 9: 742-750.

de Vienne, D., Burstin, J., Gerber, S., Leonardi, A., Le Guilloux, M., Murigneux, A., Beckert, M., Bahrman, N., Damerval, C. and Zivy, M. (1996) Two-dimensional electrophoresis of proteins as a source of monogenic and codominant markers for population genetics and mapping the expressed genome. Heredity 76: 166-177.

de Vienne, D., Leonardi, A., Damerval, C. and Zivy, M. (1999) Genetics of proteome variation as a tool for QTL characterization. Application to drought stress responses in maize. J. Exp. Bot. 50: 303-309.

Devey, M.E., Fiddler, T.A., Liu, B.-H., Knapp, S.J. and Neale, B.D. (1994) An RFLP linkage map for loblolly pine based on a three-generation outbred pedigree. Theor. Appl. Genet. 88: 273-278.

Doebley, J. and Stec, A. (1993) Inheritance of the morphological differences between maize and teosinte: comparison of the results for two F2 populations. Genetics 134: 559-570.

Dunbar, B.D., Bundman, D.S. and Dunbar, B.S. (1985) Identification of cultivar-specific proteins of winter wheat (Triticum aestivum L.) by high resolution two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and color-based silver stain. Electrophoresis 6: 39-43.

Dure, L. III, Greenway, S.C. and Galau, G.A. (1981) Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination: changing messenger ribonucleic acid populations as shown by in vitro and in vivo protein synthesis. Biochemistry 20: 4162-4168.

Dure, L. [11, Crouch, M., Harada, J., Ho, T.H.D., Mundy, J., Quatrano, R.S., Thomas, T. and Sung, Z.R. (1989) Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants. Plant Mol. Biol. 12: 475-486.

El Madidi, S. and Zivy, M. (1993) Variabilité genétique des protéines de choc thermique et thermo- tolerance chez le blé. In: Le progrés génétique passe-t-il par le repérage et l’inventaire des génes? (eds. H. Chlyah and Y. Demarly). John Wiley Eurotext, London, pp. 173-184.

Faure, J.-D., Vittorioso, P., Santoni, V., Fraisier, V., Prinsen, E., Barlier, I., Van Onckelen H., Caboche, M. and Bellini, C. (1998) The PASTICCINO genes of Arabidopsis thaliana are involved in the control of cell division and differentiation. Development 125: 909-918.

Gerber, S., Rodolphe, F., Bahrman, N. and Baradat, P. (1993) Seed-protein variation in maritime

ee

oe 蛋白 质 组 学

pine (Pinus pinaster Ait) revealed by two-dimensional electrophoresis: genetic determinism and construction of a linkage map. Theor. Appl. Genet. 85: 521-528. Goday, A., Jensen, A.B., Culianez-Macia, F.A., Mar Alba, M., Figueras, M., Serratosa, J., Torrent, . M. and Pages, M. (1994) The maize abscisic acid-responsive protein Rabl7 is located in the nucleus and interacts with nuclear localization signals. Plant Cell 6: 351-360.

Goldman I.L., Rocheford, T.R. and Dudley, J.W. (1994) Quantitative trait loci influencing protein and starch concentration in the Illinois long term selection maize strains. Theor. Appl. Genet. 87: 217-224.

Gorg, A., Postel, W., Domscheit, A. and Gunther, S. (1988) Two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients of leaf proteins from barley (Hordeum vulgare): method, reproduci- bility and genetic aspects. Electrophoresis 9: 681-692.

Gorg, A., Postel, W., Baumer, M. and Weiss, W. (1992) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, with immobilized pH gradients in the first dimension, of barley seed proteins: discrimination of cultivars with different malting grades. Electrophoresis 13: 192-203.

Gottieib, L.D. and de Vienne, D. (1988) Assessment of pleiotropic effects of a gene substitution in Pea by two-dimensionai polyacrylamide gel electrophoresis. Genetics 119: 705-710.

Guy, C.L. and Haskell, D. (1988) Detection of polypeptides associated with the cold acclimation process in spinach. Electrophoresis 9: 787-796.

Haynes, P.A., Gygi, S.P., Figeys, D. and Aebersold, R. (1998) Proteome analysis: biological assay or data archive? Electrophoresis 19: 1862-1871.

Helentjaris, T., Weber, D. and Wright, S. (1988) Identification of the genomic locations of duplicate nucleotide sequences in maize by analysis of restriction fragment length poly- morphisms. Genetics 118: 353-363.

Herbik, A., Giritch, A., Horstmann, C., Becker, R., Balzer, H.-J., Baulmein, H. and Stephan, U.W. (1996) Iron and copper nutrition-dependent changes in protein expression in a tomato wild type and the nicotianamine-free mutant ch/oronerva. Plant Physiol. 111: 533-540.

Humphery-Smith, I., Cordwell, S.J. and Blackstock, W.P. (1997) Proteome research: complemen- tarity and limitations with respect to the RNA and RNA worlds. Electrophoresis 18: 1217-1242.

Hurkman, W.J. and Tanaka, C.K. (1988). Polypeptide changes induced by salt stress, water deficit, and osmotic stress in barley roots: a comparison using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 9: 781-787.

Ingram, J. and Bartels, D. (1996) The molecular basis of dehydratation tolerance in plants. Annu. Rey. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 377-403.

Jensen, A.B., Goday, A., Figueras, M., Jessop, A.C. and Pages, M. (1998) Phosphorylation mediates the nuclear targeting of the maize Rab17 protein. Plant J. 13: 691-697.

Jorgensen, J.A. and Nguyen, H.T. (1995) Genetic analysis of heat shock proteins in maize. Theor. Appl. Genet. 91: 38-46.

Kamo, M., Kawakami, T., Miyatake, N. and Tsugita, A. (1995) Separation and characterization of Arabidopsis thaliana proteins by two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 16: 423— 430.

Karp, A., Kresovich, S., Bhat, K.V., Ayad, W.G. and Hodgkin, T. (1995) Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI Technical bulletin no. 82, Rome, Italy, 47pp.

Kasten, B., Buck, F., Nuske, J. and Reski, R. (1997) Cytokinin affects nuclear- and plastome- encoded energy-converting plastid enzymes. Planta 201: 261-272.

Kearsey, M.J. and Farquhar, A.G.L. (1998) QTL analysis in plants; where are we now? Heredity 80: 137-142.

Kerby, K. and Kuspira, J. (1987) The phylogeny of the polyploid wheats Triticum aestivum (bread wheat) and Triticum turgidum (macaroni wheat). Genome 29: 722-737.

Kimura, M. (1983) The Neutral Theory of Molecular Evolution. Cambridge University Press, Cambridge.

Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231-243.

Klose, J. (1982) Genetic variability of soluble proteins studied by two-dimensional electrophoresis on different inbred mouse strains and on different mouse organs. J. Mol. Evol. 18: 315-328.

第 十 五 章 ，” 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 。 243 -

Komatsu, S., Kajiwara, H. and Hirano, H. (1993) A rice protein library: a data-file of rice proteins separated by two-dimensional electrophoresis. Theor. Appl. Genet. 86: 935-942.

Krishnan, M., Nguyen, H.T. and Burke, J.J. (1989) Heat shock protein synthesis and thermal tolerance in wheat. Plant Physiol. 90: 140-145.

Lander, E.S. and Botstein, D. (1989) Mapping-mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-199.

Lemieux, B., Aharoni, A. and Schena, M. (1998) Overview of DNA chip technology. Mol. Breed. 4: 277-289.

Leonardi, A., Damerval, D and de Vienne, D. (1988) Organ-specific variability and inheritance of maize proteins revealed by two-dimensional electrophoresis. Genet. Res. Camb. 52: 97-103.

Leone, A., Costa, A., Tucci, M. and Grillo, S. (1994) Comparative analysis of short- and long-term changes in gene expression caused by low water potential in potato (Solanum tuberosum) cell- suspension cultures. Plant Physiol. 106: 703-712.

Leymarie, J., Damerval, C., Marcotte, L., Combes, V. and Vartanian, N. (1996) Two-dimensional protein patterns of Arabidopsis wild-type and auxin insensitive mutants, axrl, axr2, reveal interactions between drought and hormonal responses. Plant Cell Physiol. 37: 966-975.

Li, G., Waltham, M., Anderson, N.L., Unsworth, E., Treston, A. and Weinstein, J.N. (1997) Rapid mass spectrometric identification of proteins from two-dimensional polyacrylamide gels after in gel proteolytic digestion. Electrophoresis 18: 382-390.

Lund, A.A., Blum, P.H., Bhattramakki, D. and Elthon, T.E. (1998) Heat-stress response of maize mitochondria. Plant Physiol. 116: 1097-1110.

Mangin, B., Goffinet, B. and Rebai, A. (1994) Constructing confidence intervals for QTL location. Genetics 138: 1301-1308.

Marshall, A. and Hodgson, J. (1998) DNA chips: an array of possibilities. Nature Biotechnol. 16: 27-31.

Meza-Basso, L., Alberdi, M., Raynal, M., Ferrero-Cadinanos, M.L. and Delseny, M. (1986) Changes in protein synthesis in rapeseed (Brassica napus) seedlings during a low temperature treatment. Plant Physiol. 82: 733-738.

Moons, A., Bauw, G., Prinsen, E., Van Montagu, M. and Van der Straeten, D. (1995) Molecular and physiological responses to abscisic acid and salts in roots of salt-sensitive and salt-tolerant Indica rice varieties. Plant Physiol. 107: 177-186.

‘Moons, A., Bauw, G., Prinsen, E., Van Montagu, M. and Van der Straeten, D. (1995) Molecular and physiological responses to abscisic acid and salts in roots of salt-sensitive and salt-tolerant Indica rice varieties. Plant Physiol. 107: 177-186.

Moons, A., Gielen, J., Vandekerckhove, J., Van der Straeten, D., Gheysen, G. and Van Montagu, M. (1997) An abscisic-acid- and salt-stress-responsive rice CDNA from a novel plant gene family. Planta 202: 443-454.

Nei, M. (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press.

Nover, L. and Scharf, K.D. (1984) Synthesis, modification and structural binding of heat-shock proteins in tomato cell cultures. Eur. J. Biochem. 139: 303-313. °

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021.

Petit, R.J., Bahrman, N. and Baradat, P. (1995) Comparison of genetic differentiation in maritime pine (Pinus pinaster Ait) estimated using isozyme, total protein and terpenic loci. Heredity 75: 382-389.

Picard, P., Bourgoin-Grenéche, M. and Zivy, M. (1997) Potential of two-dimensional electrophor- esis in routine identification of closely related durum wheat lines. Electrophoresis 18: 174-181.

Plomion, C., Bahrman, N., Durel, C.-E. and O’Malley, D.M. (1995) Genomic mapping in Pinus pinaster (maritime pine) using RAPD and protein markers. Heredity 74: 661-668.

Plomion, C., Costa, P. and Bahrman, N. (1997) Genetic analysis of needle protein in Maritime pine. 1. Mapping dominant and codominant protein markers assayed on diploid tissue, in a haploid- based genetic map. Silvae Genet. 46: 161-165.

Posch, A., van den Berg, B.M., Postel, W. and Gorg, A. (1992) Genetic variability of pepper (Capsicum annuum L.) seed proteins studied by 2-D electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 13: 774-777.

Posch, A., van den Berg, B.M., Duranton, C. and Gorg, A. (1994) Polymorphism of pepper

tii 蛋白 质 组 学

(Capsicum annuum L.) seed proteins studied by two-dimensional electrophoresis with immobi- lized pH gradients: methodical and genetic aspects. Electrophoresis 15: 297-304.

Prioul, J.L., Quarrie, S., Causse, M. and de Vienne, D. (1997) Dissecting complex physiological functions into elementary components through the use of molecular quantitative genetics. J. Exp. Bot. 48: 1151-1163.

Prioul, J.L., Pelleschi, S., Sene, M., Théevenot, C., Causse, M., de Vienne, D. and Leonardi, A. (1999) From QTLs for enzyme activity to candidate genes in maize. J. Exp. Bot. 50: 1281-1288.

Ramagopal, S. (1987) Salinity stress induces tissue-specific proteins in barley seedlings. Plant Physiol. 84: 324-331.

Ramagopal, S. (1990) Protein polymorphism in sugarcane revealed by two-dimensional gel analysis. Theor. Appl. Genet. 79: 297-304.

Ramani, S. and Apte, S. K. (1997) Transient expression of multiple genes in salinity-stressed young seedlings of rice (Oryza sativa L.) cv. bura rata. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233: 663-667.

Reviron, M.P., Vartanian, N., Sallantin, M., Huet, J.C., Pernollet, J.C. and de Vienne, D. (1992) Characterization of a novel protein induced by progressive or rapid drought and salinity in Brassica napus leaves. Plant Physiol. 100: 1486-1493.

Rey, P., Pruvot, G., Becuwe, N., Eymery, F., Rumeau, D. and Peltier, G. (1998) A novel thioredoxin-like protein located in the chloroplast is induced by water deficit in Solanum tuberosum L. plants. Plant J. 13: 97-101.

Riccardi, F., Gazeau, P., de Vienne, D. and Zivy, M. (1998) Protein changes in response to progressive water deficit in maize. Quantitative variation and polypeptide identification. Plant Physiol. 117: 1253-1263.

Rommens, J.M., lannuzzi, M.C., Kerem, B.S., Drumm, M.L., Melmer, G., Dean, M., Rozmahel, R., Cole, J.L., Kennedy, D., Hidaka, N., Zsiga, M., Buchwald, M., Riordan, J.R., Tsui, L.C. and Collins, F.S. (1989) Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 245: 1059-1065.

Sabehat, A., Weiss, D. and Lurie, S. (1996) The correlation between heat-shock protein accumula- tion and persistence and chilling tolerance in tomato fruit. Plant Physiol. 110: 531-537.

Sanchez-Martinez, D., Puigdoménech and Pagés, M. (1986) Regulation of gene expression in developing Zea mays embryos. Protein synthesis during embryogenesis and early germination of maize. Plant Physiol. 82: 543-549.

Santoni, V., Bellini, C. and Caboche, M. (1994) Use of two-dimensional protein-pattern analysis for the characterization of Arabidopsis thaliana mutants. Planta 192: 557-566.

Santoni, V., Delarue, M., Caboche, M. and Bellini, C. (1997) A comparaison of two-dimensional electrophoresis data with phenotypical traits in Arabidopsis leads to the identification of a mutant (cril) that accumulates cytokinins. Planta 202: 62-69.

Santoni, V., Rouquieé, D., Doumas, P., Mansion, M., Boutry, M., Deéhais, P., Sahnoun, I. and Rossignol, M. (1998) Use of proteome strategy for tagging proteins present at the plasma membrane. Plant J. 16: 633-641.

Saruyama, H. and Shinbashi, N. (1992) Identification of specific proteins from seed embryos by two-dimensional gel electrophoresis for the discrimination between indica and japonica rice. Theor. Appl. Genet., 84, 947-951.

Song, K.M., Suzuki, J.Y., Slocum, M.K., Williams, P.H. and Osborn, T.C. (1991) A linkage map of Brassica rapa (syn. campestris) based on restriction fragment length polymorphism loci. Theor. Appl. Genet. 82: 296-304.

Tacchini, P., Fink, A., Thiellement, H. and Greppin, H. (1995) Analysis of leaf proteins in late flowering mutants of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 93: 312-316.

Tanksley, S.D. (1993) Mapping polygenes. Annu. Rev. Genet. 27: 205-233.

Thiellement H., Seguin M., Bahrman N. and Zivy M. (1989). Homoeology and phylogeny of the A, S and D genomes of the Triticinae. J. Mol. Evol. 29: 89-94.

Thiellement, H., Bahrman, N., Damerval, C., Plomion, C., Rossignol, M., Santoni, V., de Vienne, D. and Zivy, M. (1999) Proteomics for genetical and physiological studies in plants. Electrophoresis 20: 2013-2026.

Touzet, P., Morin, C., Damerval, C., Le Guilloux, M., Zivy, M. and de Vienne, D. (1995a) Characterizing allelic proteins for genome mapping in maize. Electrophoresis 16: 1289-1294.

第 十 五 章 ， 作为 植物 遗传 和 育种 工具 的 蛋白 质 组 学 - 245 -

Touzet, P., Winkler, R.G. and Helentjaris, T. (1995b) Combined genetic and physiological analysis of a locus contributing to quantitative variation. Theor. Appl. Genet. 91: 200-205.

Touzet, P., Riccardi, F., Morin, C., Damerval, C., Huet, J-C., Pernollet, J-C., Zivy, M. and de Vienne D. (1996) The maize two-dimensional gel protein database: toward an integrated genome analysis program. Theor. Appl. Genet. 93: 997-1005.

Tsugita, A., Kawakami, T., Uchiyama, Y., Kamo, M., Miyatake, N. and Nozu, Y. (1994) Separation and characterization of rice proteins. Electrophoresis 15: 708-720.

Tsugita, A., Kamo, M., Kawakami, T. and Ohki, Y. (1996) Two-dimensional electrophoresis of plant proteins and standardization of gel patterns. Electrophoresis 17: 855-865.

van Berkel, J., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1994) Transcripts accumulating during cold storage of potato (Solanum tuberosum L.) tubers are sequence related to stress-responsive genes. Plant Physiol. 104: 445-452.

Vierling, R.A. and Nguyen, H.T. (1990) Heat-shock protein synthesis and accumulation in diploid wheat. Crop Sci. 30: 1337-1342.

Vierling, R.A. and Nguyen, H.T. (1992) Heat-shock protein gene expression in diploid wheat genotypes differing in thermal tolerance. Crop Sci. 32: 370-377.

Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel, R.D., and Hochstrasser, D.F. (1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer, Berlin, p. 243.

Zivy, M. (1987) Genetic variability for heat shock proteins in common wheat. Theor. Appl. Genet. 74: 209-213.

Zivy, M., Thiellement, H., de Vienne, D. and Hofmann, J.-P. (1983) Study on nuclear and cytoplasmic genome expression in wheat by two-dimensional gel electrophoresis. I. First results on 18 alloplasmic lines. Theor. Appl. Genet. 66: 1—7. ‘

Zivy, M., Thiellement, H., de Vienne, D. and Hofmann, J.-P. (1984) Study on nuclear and cytoplasmic genome expression in wheat by two-dimensional gel electrophoresis. II. Genetic differences between two lines and two groups of i ra at five developmental stages or organs. Theor. Appl. Genet. 68: 335-345.

Zivy, M., Devaux, P., Blaisonneau, J., Jean, R. and Thiellement, H. (1992) Segregation distortion and linkage studies i in microspore derived doubled haploid lines of Hordeum vulgare L. Theor. Appl. Genet. 83: 919-924.

Zivy, M., El Madidi, S. and Thiellement, H. (1995) Distance indices in a comparison between the A, D, and R genomes of the Triticeae tribe. Electrophoresis 16: 1295-1300.

图 2.2 ”用 分 离 标签 区 分 的 两 个 mRNA 家 族 共 同 杂 交 后 的 典型 玻璃 微 阵列 ， 微 阵列 的 一 部 分 包含 与 来 源 于 无 血清 (Cy3) 和 血清 刺激 (CyS) 成 纤维 细胞 的 RNA 衍生 物 杂 交 的 人 cDNA。 (1) 黄 点 代表 两 个 样品 间 表 达 量 变化 不 大 的 基因 。(2 和 4) 在 血清 刺激 的 成 纤维 细胞 中 表达 丰 度 高 的 mRNAS 显 红 色 。(3) 在 无 血清 成 纤维 细胞 中 表达 丰 度 高 的 mRNAS 显 绿色 。( 了 Repririted with permission from lyer et al., The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum, Science, volume 283, copyright 1999 American Association for the Advancement of Sciences) .

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