7 SF re bg ICIS KSI DNA 及 RNA 基 本 实验 技术 4 + De . AS] «> i 用 了 * . % §& } oo Lo 人 a A | 4 . i. Ca 本 a 六 | mel SE PR 盛 祖 嘉 等 校 TLL > at + 外 社 4 www. a com 和 ak (sh : Pe) + 3 中 科 院 植物 所 图 书包 ¢ Weed, AMMA ge S0003528 DNA & RNA 基本 实验 技术 [ 英 ]A.J. 哈 伍德 ”主编 盛 小 高 等 译 BALA F 校 “a ek Kh # FA :01-1999-3196 Af 简 介 本 书包 括 基因 工程 中 一 些 最 基本 的 实验 方法 ,例如 DNA 分 析 、RNA 分 析 、 克 隆 与 亚 克 隆 方法 PCR 等 ,同时 也 介绍 了 诸如 银 染 \ 非 放射 性 标记 、 自 BAL DNA 序列 分 析 等 新 技术 。 本 书 对 于 专业 科研 人 员 来 说 可 提供 较 新 的 技术 参考 材料 , 对 于 生物 学 、 医 学 药学 等 专业 的 本 科 生 、 研 究 生 来 说 也 是 一 本 非常 好 的 实验 技术 参考 书 , 使 读者 在 学 习 基因 工程 常规 操作 的 同时 能 全 面 了 解 当前 新 技术 的 进展 情况 。 The original English language work has been published by HUMANA PRESS Totowa, New Jersey, U.S.A. All rights reserved. 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 DNA 及 RNA 基本 实验 技术 /( 英 ) 哈 伍德 (Harwood,A. J.) = 4a ; B/N 等 译 . 一 北京 :科学 出 版 社 ,2002.6 (现代 生物 技术 译 丛 ) 书 名 原文 :Basic DNA and RNA Protocols ISBN 7-03-009186-8 I.D: 1.0%: @ 盛 … 焉 . 引 脱 氧 核糖 核酸 -生物 化 学 -技术 @ 核 糖 核 酸 -生物 化 学 -技术 W .Q520.3 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2001) 第 05033 号 责任 编辑 : 韩 学 哲 责任 印 制 : 刘 士 平 / 封 面 设 计 : 王 ” 浩 mek BR HK 北京 东 黄 城 恨 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http:// www.sciencep.com Re hh pr HR Az 8) EP 刷 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销 2002 年 6 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 2004 年 1 月 第 二 次 印刷 ”印张 :24 印 数 :4 001 一 6 000 字数 :545 000 定价 :47.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ,我 社 负 责 调换 ( 环 伟 ?) 译 者 序 笔者 自 1985 年 加 入 基因 工程 实验 教学 的 行列 以 来 已 有 多 年 , 在 长 期 的 实验 教学 过 程 中 深 感 要 找到 一 本 合适 的 参考 书 之 不 易 。 对 于 基因 工程 的 基础 实验 教学 而 言 , 能 找到 一 本 既 介绍 如 核酸 抽 提 、\ 酶 切 \ 电 泳 、. 连 接 、 转 化 杂交 、PCR 定点 突变 与 DNA 测序 等 基本 技 术 , 同时 还 介绍 如 非 放射 性 标记 、 银 当 和 自动 化 测序 等 最 新 进展 的 综合 性 书籍 尤其 困难 。 1997 年 偶然 看 到 Humana 公司 出 版 的 Basic DNA and RNA Protocols 一 书 ,阅读 之 后 认为 此 书 无 论 在 内 容 、 深 度 等 方面 都 适合 于 作为 实验 教学 的 参考 书 , 并 且 书 的 篇 幅 也 并 不 庞 大 。 尤 其 值得 推荐 的 是 每 章 末 尾 的 注释 部 分 , 其 中 描述 了 实验 中 常 出 现 的 问题 和 解决 这 些 问题 的 途径 。 由 于 本 书 的 每 一 章 都 是 由 对 本 章 内 容 富 有 实验 经 验 或 对 于 有 关 实 验 技 术 的 早期 发 展 曾 做 出 贡献 的 作者 所 写 , 所 以 这 些 内 容 都 是 有 价值 的 经 验 之 谈 。 本 书 中 译本 的 出 版 像 一 个 难产 的 婴儿 。 英 文 原作 1996 年 出 版 , 1997 年 购 得 , 直到 1998 年 才 确 定 了 出 版 社 并 组 织 人 员 开 始 翻译 。 以 后 的 审 校 工作 也 遇 到 了 不 少 困难 , 更 值 得 一 提 的 是 本 书 审 校 者 之 一 盛 祖 嘉 先生 在 身 患 癌症 住院 之 日 起 已 在 为 本 书 工作 , 令 人 深 感 忱 惜 的 是 另 一 审 校 者 王 顺德 先生 未 能 看 到 本 书 , 离 我 们 而 去 。 所 幸 今天 终于 到 了 交 稿 的 日 子 , 真 可 以 说 是 如 释 重负 了 。 最 后 还 要 感谢 科学 出 版 社 使 本 书 得 以 问世 , 其 中 特别 要 感谢 责任 编辑 的 细致 工作 。 此 外 还 要 感谢 所 有 译 者 和 审 校 者 , 感谢 为 本 书 文 字 的 录入 做 了 大 量 工 作 的 同志 , 正 是 众人 的 努力 才 使 读者 终于 能 看 到 这 本 书 。 Hels & 2001.4.13 [路 前 分 子 遗传 学 有 时 被 称 为 “遗传 工程 ”, 它 对 生物 学 研究 有 巨大 影响 。 现 在 离 ( 分 子 生物 学 方法 ?第 二 卷 (核酸 》 的 出 版 已 经 12 年 , 该 书 中 包括 当时 通用 的 分 子 生 物 学 和 分 子 遗 传 学 技术 。 这 些 技术 发 展 很 快 ,任何 一 本 涉及 其 中 基本 技术 的 书 都 需要 经 常 更 新 。 最 近 一 次 修订 是 在 1988 年 (《 核 酸 新 技术 》 第 四 卷 )。 在 这 以 后 许多 新 的 、 却 是 很 基本 的 技术 被 写 进 《 分 子 生 物 学 方法 》 系 列 的 某 些 分 册 中 。《DNA & RNA 基本 实验 技术 ?这 部 书 旨 在 把 所 有 这 些 基本 技术 包含 在 一 本 书 中 。 在 过 去 的 8 年 里 ,已 有 的 技术 经 历 了 许多 重大 的 创新 和 次 要 的 改进 。 例 如 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR ) 为 基因 克隆 和 重组 DNA 带 来 全 新 的 方法 。 另 一 方面 ,一 些 较为 次 要 的 改 进 , 例如 测序 酶 习 使 DNA 测 序 变 得 更 为 平常 。 本 书 既 包含 这 些 正 在 修改 中 的 新 的 技术 ， 也 包括 老 技 术 的 及 时 更 新 。 由 于 我 们 仍然 处 在 一 个 快速 更 新 的 时 代 , 本 书 中 也 包括 一 些 虽 已 足够 成 熟 , 但 仍 有 待 于 进一步 改进 的 技术 , 特别 是 像 非 同位 素 检 测 以 及 日 渐变 得 重要 的 非 同位 素 DNA 标记 、 银 染 和 自动 化 测序 等 。 在 新 技术 的 开发 方面 ,公司 从 来 没有 像 现 在 这 样 起 着 重要 的 作用 。 有 一 些 技术 创新 的 公司 为 本 书 做 出 贡献 ,就 此 我 们 对 他 们 表示 感谢 。 商 品 化 的 试剂 为 我 们 的 研究 工作 带 来 方便 。 可 是 也 存在 着 一 种 危险 , 即 令 初 学 者 忽略 了 这 些 技术 中 的 原理 。 为 了 补偿 这 一 倾向 ,我 们 把 某 些 常 由 厂商 提供 的 试剂 的 制备 方法 写 入 书 中 。 本 书 按照 以 往 的 (分 子 生 物 学 方法 》 所 采用 的 原则 编写 。 每 一 章 由 一 位 或 几 位 对 于 所 写 的 一 章 富 于 实验 室 经 验 或 者 做 出 开创 性 贡献 的 学 者 撰写 。 每 一 章 都 以 菜谱 的 格式 表 达 , 以 便于 在 实验 室 中 直接 应 用 ,非但 包括 基本 方法 的 详细 描述 , 而 且 在 注释 一 节 中 讨论 了 可 能 遭遇 的 问题 (以 及 解决 问题 的 方法 ) 和 一 些 可 提供 尝试 的 变化 。 本 书 分 为 7 个 部 分 :DNA 分 析 、RNA 分 析 、 基 因 克 隆 技术 、 亚 克隆 方法 `PCR 技术 、 DNA 序列 测定 、 定 点 诱 变 与 蛋白 质 合成 。 这 是 为 了 使 用 方便 而 这 样 设置 的 ,不 应 该 把 它 们 看 成 是 固定 的 单元 。 所 有 这 些 方法 都 是 相互 关联 并 相互 促进 的 。 在 各 章 之 间 文 献 的 交 又 就 足以 显示 它们 的 相互 关系 。 本 书 基本 上 是 为 初步 接触 这 些 技术 的 成 熟 的 科学 工作 者 所 写 。 可 是 我 也 希望 即使 最 有 经 验 的 科学 家 在 书 中 也 可 以 发 现 一 些 他 (她 ) 们 所 感 兴趣 的 建议 或 提示 。 我 感谢 《分 子 生 物 学 方法 》 各 分 册 的 编辑 先生 , 我 借用 了 其 中 许多 有 用 的 章节 。 为 了 能 对 某 一 专门 问题 了 解 更 多 的 方法 ,我 向 读者 推荐 叙述 更 为 详尽 的 原 书 。 我 也 对 所 有 对 本 书 做 出 贡献 和 提出 修改 意见 者 特别 表示 感谢 。 最 后 还 向 为 本 书 的 出 版 提供 多 方面 帮助 的 Janet 女士 表示 感谢 。 Adrian J. Harwood i ae 作 者 ALAN T. BANKIER * MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK ALAN N. BaTEsoN * Department of Pharmacology, University of Alberta, Edmonton, Canada DoMINIQUE BELIN * Department of Pathology, University of Geneva Medical School, Geneva, Switzerland LaurA J. BLoEM * Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN ANGELIKA BoDENTEICH * Laboratory of Biochemical Genetics, NIMH Neuroscience Center at St. Elizabeth’s Hospital, Washington, DC CHARLES D. Boyp « University of Medicine and Dentistry of New Jersey, New Brunswick, NJ MICHAEL M. BurrELL * Advanced Technologies, Cambridge, UK DENISE CLARK * Department of Biology, University of New Brunswick, Fredericton, Canada JOANNE CROWE * QIAGEN GmbH, Hilden, Germany MARTIN CUNNINGHAM * Research and Development, Amersham International, Amersham, Bucks, UK JEREMY W. DALE * School of Biological Sciences, University of Surrey, UK BEVERLY C. DELIDOw * Department of Anatomy, University of Connecticut Health Center, Farmington, UK Win-Pinc DENG ¢ Department of Cancer Biology, Harvard University School of Public Health, Boston, MA Lucy Drury ¢ JCRF Clare Hall Laboratories, South Mimms, UK ZHUIN Du * Genome Sequencing Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO TAN DurRANT * Research and Development, Amersham International, Amersham, Bucks, UK Gre S. ELGAR * Molecular Genetics Unit, MRC Centre, Cambridge, UK Car W. FULLER ¢ Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, UK PETER J. GREENAWAY * Department of Health, London, UK ANNETTE M. GriFFIN * Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, UK HUuGH G. GriFFIN ¢ Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, UK ANNE GROBLER-RABIE * MRC Unit for Molecular and Cellular Cardiology, University of Stellenbosch Medical School, Tygerberg, South Africa MARTIN Harris * Research and Development, Amersham International, Amersham, Bucks, UK DANIEL L. HARTL ¢ Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, Cambridge, UK BRONWEN Harvey ¢ Research and Development, Amersham International, Amersham, Bucks, UK ApRIAN J. HARWooD * MRC Laboratory for Molecular Cell Biology and Department of Biology, University College, London, UK Janet C. Harwoop « Imperial Cancer Research Fund, Clare Hall Laboratories, South Mimms, UK TIM HELENTIARIS * Pioneer Hi-Bred Institute, Inc., Johnston, IA STEVEN HENIKOFF * Howard Hughes Medical Institute, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA ETIENNE JoLy * Department of Immunology, AFRC Babraham Institute, Cambridge, UK Rosemary E. KELSELL ¢ Jnstitute of Ophthalmology, Department of Molecular Genetics, London, UK JANE Kirk * Imperial Cancer Research Fund, Clare Hall Laboratories, Potters Bar, UK Ross KRUMLAUF * National Institute for Medical Research, Laboratory of Eukaryotic Molecular Genetics, London, UK Mark W. LEONARD * Genetics Institute, Andover, MA PAUL LITTLEBuRY * Department of Biology, University of York, UK JOHN P. LyNcH * Department of Anatomy, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT ‘vi Laura Macuesky * MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, Cambridge, UK RoBERTO MANTOVANI * Faculté de Médecine, DOI/LGME, Strasbourg Cedex, France BRIGITTE STEUDE MASONE * Qiagen, Inc., Chatsworth, CA STEVE MAYALL ¢ Imperial Cancer Research Fund, Clare Hall Laboratories, Potters Bar, UK BERNARD F. MCARDLE * United States Biochemical Corp., Cleveland, OH Tom McCreery * Department of Plant Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ Tim McDaniel ¢ University of Maryland Hospital, Baltimore, MD STEPHEN J. MELTZER * University of Maryland Hospital, Baltimore, MD FRANK MERANTE * Department of Genetics, Research Institute, The Hospital for Sick Children, Toronto, Ontario, Canada Car R. Merrit * Laboratory of Biochemical Genetics, NIMH Neuroscience Center at St. Elizabeth’s Hospital, Washington, DC ELIZABETH M. MILLER * Department of Cancer Biology, Harvard University School of Public Health, Boston, MA LLoyp G. MiTcHELL ¢ Laboratory of Biochemical Genetics, NIMH Neuroscience Center at St. Elizabeth’s Hospital, Washington, DC Davip Murphy * Neuropeptide Laboratory, Institute of Molecular and Cell Biology, National University of Singapore, Republic of Singapore Jac A. NickoLorF * Department of Cancer Biology, Harvard University School of Public Health, Boston, MA HowarD OcHMAN * Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO LoUISE OLLIVER * MRC Unit for Molecular and Cellular Cardiology, University of Stellenbosch Medical School, Tygerberg, South Africa ROGER PaTIENT ¢ Developmental Biology Research Centre, Kings College, University of London, UK JouN J. PELuso * Department of Anatomy, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT GERALDINE A. PHEAR * Department of Radiation Oncology, Health Sciences Center, University of Utah, Salt Lake City, UT ERAN PicHERSKY * Department of Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI JEFFREY W. POLLarD * Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, Bronx, NY Grecory M. PresTon * Department of Medicine and Biological — Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD GERALD PROTEAU * College Universitaire de Saint-Boniface, Canada SANDEEP RaHA * Department of Genetics Research Institute, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canada F. ANDREW Ray ° Life Sciences Division, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM JUTA K. REED * Departments of Biochemistry and Chemistry, Erindale College, University of Toronto, Ontario, Canada JOACHIM RIBBE * Qiagen GmbH, Hilden, Germany BARTON E. SLATKO ¢ New England Biolabs, Inc., Beverly, MA DuncaN R. SMITH ¢ Department of Colorectal Surgery, Singapore General Hospital, Republic of Singapore DANIELLE GIOIOSO TAGHIAN * Department of Cancer Biology, Harvard University School of Public Health, Boston, MA FIONA M. ToMLey ¢ Institute of Animal Health, Compton, UK MICHAEL K. TROWER * Molecular Pathology Department, Glaxo Research and Development Inc., Greenford, UK STEPHANE VIVILLE *¢ Faculty of Medicine, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology, University of Louis Pasteur, CNRS/INSERM, France Bruce A. WHITE * Department of Anatomy, University of Connecticut Health Center, Framington, CT RICHARD K. WILSON * Genome Sequencing Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO LEI Yu * Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN QINGZHONG Yu * Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, AL * wii 第 二 部 分 第 三 部 分 第 四 部 分 第 五 部 分 第 六 部 分 第 七 部 分 BRE i. LH 沈 仁 权 沈 仁 权 沈 仁 权 AL He Bi FL Be 沈 仁 权 焉 顺德 a & i itz 4 a 全 H DNA 447, - sl eens te ea i: 从 组 织 或 培养 细胞 同时 分 离 DNA 45 RNA … DNA 的 限制 性 内 切 酶 消化 … vines 应 用 随机 引物 的 ?P 标记 DNA 探 针 的 制备 … Southern 印迹 的 杂交 和 竞争 性 杂交 Southern 杂交 中 地 高 辛 修饰 的 核 昔 酸 标记 DNA 探 针 的 应 用 …… 荧光 素 标 记 核 酸 探 针 的 制备 及 其 碱 性 磷酸 酯 酶 催化 的 二 氧 杂 环 烷 化 学 发 光 反 应 检测 - .监测 核酸 探 针 中 荧光 素 标 记 水 平 的 快速 检测 - 0 辣 根 过 氧化 物 酶 标记 的 核酸 探 针 制备 及 其 强化 的 化 学 发 光 反 应 第 十 一 章 _ 究 核 音 酸 3 端的 荧光 素 - 1 11- AUTP 标记 及 其 强化 的 化 学 发 光 反应 检测 - 第 十 二 章 “RNA 探 针 的 制备 … 第 二 部 分 ES eae 第 三 部 分 —T- BFE. DNA Fy BE ARBEIT no PE+FSBE Northern 印迹 分 析 coe cee cee cee cee cee cence net tee cee eee eon eeneee cen eeenee ees PIV EE RNase FEA FE De wor cers en pe cre nts ane cat tap cop eeu natne ncomteyines cnninaeie FA FLEE mRNA YS By BEAD HT. 人 Se et FA EEAGE DNA PREPAD S1 G8 ALG nsec rr nme one cos nee csrreptnes eainewenniens ee ade ea i ta hie Se aks ligt =e BF RL BCMIARER HRB SONALI SCI amen nnn - DNA 的 体外 包装 … 第 二 十 四 章 ， 用 于 构建 文库 的 双 链 cDNA 制备 - 第 二 于 五 章 ..IDNA 记 库 的 构建 二. 汪汪 BS APB. A SOE AS GRU te + xe ane on — iD 一 全 CN wm Fe ee ce ee ee | i) Na Na Nat et ee See Na 。 xi’ 第 四 部 分 “ 亚 克 隆 方法 … 第 二 十 二 至 第 二 十 八 章 第 二 十 九 章 第 三 趟 章 a= Toe A-—t_e ig gee 亚 克 隆 的 策略 与 方法 . 大 肠 杆 菌 的 转化 - 多 菌 的 电击 穿孔 转化 应 用 碱 裂 解法 制备 质粒 DNA 应 用 快速 煮沸 法 制备 小 量 质粒 DNA 应 用 硅 藻 土 制备 质粒 DNA 第 五 部 分 “PCR 技术 第 三 十 四 章 第 三 十 五 章 第 三 十 六 章 S=+te AL=TtAS S—+he 聚合 酶 链 式 反 应 :基本 方法 … 反 向 聚合 酶 链 式 反 应 . pen eer PCR 产物 的 直接 放射 性 标记 … 第 四 十 章 WA PCR 技术 筛选 只 菌 体 文 库 … 第 六 部 分 “DNA 序列 测定 -- 第 四 十 一 章 第 四 十 二 章 第 四 十 三 章 第 四 十 四 章 第 四 十 五 章 第 四 十 六 章 第 四 十 七 章 第 四 十 八 章 第 四 十 九 章 第 五 十 一 章 第 五 十 二 章 第 五 十 三 章 应 用 M13 叭 菌 体 作为 载体 克隆 DNA 片段 . 应 用 外 切 核 酸 酶 下 制备 有 序 缺 失 系 列 . 从 噬 粒 载体 制备 ssDNA … 用 于 双 腊 氧 测序 的 快速 质粒 纯 化 法 ， vibe tee ater IOUS Voces 2.077 DNASE RED OK tah; -- (284) 线性 和 梯度 缓冲 液 测序 胶 的 灌注 ， 测序 反应 样品 的 电泳 ， ， 自动 DNA 测序 仪 的 使 用 DNA 的 化 学 测序 … 第 七 部 分 定点 诱 变 与 蛋白 质 合成 第 五 十 四 章 第 五 十 五 章 第 五 十 六 章 第 五 十 七 章 第 五 十 八 章 双 链 质粒 的 定点 诱 变 、 结 构 域 置换 以 及 标记 获救 … 应 用 含 尿 喀 啶 的 鸣 粒 为 模板 的 定点 诱 变法 无 细胞 系统 中 的 mRNA 翻译 pa … (1638) Te … (184 ) … (190) -- (196 ) … (198 ) - (201 ) … (203 ) AP FADL GSS eFRRy SL) POR BOR WE CHR ( 176 ) = nas) ~~ (230) 应 用 PCR 技术 快速 筛选 含 克隆 片段 的 菌落 … et … (249 ) 2 2ae (0 256 ) « (266 ) ( 242 ) ( 263 ) vera) POR Foy Ee pss ae eas ST +-BE “应 用 热 循 环 - 双 脱氧 法 进行 DNA 测序 ppp 用 于 Maxam-Gilbert DNA 测序 法 中 的 DNA 末端 标记 oe i. SG3Er9 -- (329 ) Are ( 339 ) 无 细胞 系统 中 的 mRNA 翻译 一 一 免 网 织 红细胞 裂解 液 ……… … (350) ( 293 ) ( 300 ) (319 ) ( 344 ) … (354) 5 — Bb 5) DNA 分 析 SR WA a ae FE ae Da Ty BS DNA § RNA Frank Merante, Sandeep Raha, Juta K. Reed, Gerald Proteau 1. 引 Ul 分 离 纯 化 DNAU-7] 或 RNAL8-23] 的 方法 已 有 很 多 ， 但 往往 只 能 纯化 一 种 核酸 而 浪 费 了 另 一 种 。 当 细胞 材料 有 限时 ， 人 们 经 常 希 望 从 一 种 材料 中 同时 分 离 出 DNA 和 RNA， 例 如 从 活检 样品 中 、 从 原始 细胞 系 中 以 及 从 经 过 处 理 的 胚胎 干细胞 中 分 离 核 酸 。 已 发 表 的 几 种 方法 尽管 可 以 同时 从 一 种 材料 中 抽 提 DNA 与 RNAB4-3， 但 仍 不 过 是 Chirgwin 等 6] 原始 方法 的 修改 而 已 。 这 些 方法 利用 硫 代 氰 酸 肌 与 三 氟 栈 酸 饮 eS 强 促 溶性 试剂 破坏 细胞 膜 并 同时 使 细胞 内 RNA 酶 失 活 126,2?.30]。 这 些 方法 的 不 利之 处 是 须要 用 到 超 离 心 技术 !2-28,30 并 且 实 验 过 程 太 长 (16 一 44 h)。 不 用 超 离 心 技 术 而 用 酚 同 时 分 离 DNA 与 RNA 的 方法 是 利用 酚 是 高 效 的 蛋白 质变 性 剂 旦 323， 它 可 以 很 快 地 破坏 细胞 的 完整 性 并 且 使 蛋白 质变 性 4-311。 这 里 所 介绍 的 是 在 酚 抽 提 过 程 中 利用 合适 的 抽 提 缓冲 液 以 及 选择 性 地 从 RNA 中 分 离 出 高 相对 分 子 质量 的 DNA 的 方法 6B1 。 这 个 方法 用 了 一 次 酚 抽 提 与 两 次 酚 / 氯 仿 抽 提 ， 从 核酸 溶液 中 同时 去 除 蛋白 质 与 脂 质 类 杂质 。 就 像 Wallace033] 讨 论 过 的 那样 ， 水 相 抽 提 缓冲 液 的 组 成 已 调整 到 最 适 于 回收 核酸 的 状态 ， 例 如 低 pH 值 (pPH7.$)， 含 有 表面 活性 剂 (0.2%SDS) 和 相对 低 盐 的 条 件 (100 mmol/L LiCl) 都 有 利于 蛋白 质 的 分 离 并 使 核酸 分 配 于 水 相 中 。 此 外 100 mmol/LAY EDTA 能 防止 蛋白 质 集聚 并 且 能 鳌 合 Mg" ， 这 样 就 抑制 了 依赖 于 Mg 的 核酸 酶 的 作 用 [4] 。 这 一 方法 与 Krieg 等 人 的 方法 52 不同， 前 者 裂解 与 抽 提 的 步骤 十 分 温和 ， 能 在 乙 醇 沉淀 后 用 带 钧 玻璃 棒 将 高 相对 分 子 质量 的 DNA 选择 性 地 缠绕 出 来 咏 3431， 这 样 就 避 免 了 将 所 有 核酸 沉淀 出 来 之 后 再 用 LiCl 沉淀 的 步骤 。 此 外 此 法 可 放大 或 缩小 到 针对 不 同 量 的 样品 处 理 ， 并 且 可 以 同时 处 理 多 个 样品 .分 离 全 部 的 细胞 DNA 与 RNA 约 需 2 ho 用 这 一 方法 曾 顺 利 地 分 离 了 PC12 细胞 的 核酸 并 用 于 Southern 与 Northern 印迹 分 析 中 [31] 。 2. 材 料 如 果 可 能 的 话 最 好 使 用 分 子 生 物 学 级 的 试剂 和 一 次 性 的 灭 菌 聚 两 烽 管 。 如 使 用 玻璃 av LY AH FE LE 280°C 烘 烤 至 少 3 h 方 可 。 2.1 JPSAP BY a9 2h Rte ee Pe A the 1 Ld PBS: 0.137 mol/L NaCl, 2.68 mmol/L KCl, 7.98 mmol/L Na,HPO,, 1.47 mmol/L KH>PQ,, pH 7.2. 2) 二 乙 基 焦 碳酸 盐 (diethylpyrocarbonate, DEPC) 处 理 的 水 : 1 ml DEPC 加 入 到 1E 的 重 蒸 水 中 (0.1%DEPC v/v) 后 搅拌 过 夜 。20 psi (lpsi=6.89x10? Pa) 高 压 灭 菌 20 min 可 使 DEPC 失 活 〈 人 参见 注释 1)。 STEL 缓冲 液 : 0.2% SDS, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 10 mmol/L EDTA, 100 mmol/L LiCl, 72 DEPC 处 理 过 的 水 中 加 入 Tris-HCl, EDTA 和 LiCl, mEKRE 后 再 加 入 适量 的 10% SDS. 10 g SDS 溶 于 DEPC 处 理 过 的 水 中 配制 成 10% SDS 贮存 液 ， 使 用 前 65°C 保温 2 h。 4) 酚 : 酚 的 平衡 如 前 所 述 641]。 先 用 pH 8.0 的 0.5 mol/L Tris-HCl 抽 提 含有 0.1%8- Fee (FA) 的 超 纯 重 蒸 酚 一 次 ， 然 后 用 pH 8.0 的 0.1 mol/L Tris-HCl 反复 抽 提 直到 液 相 的 pH 值 至 8.0 为 止 。 使 用 前 再 用 STEL 抽 提 缓冲 液 平 衡 二 次 。 经 平 衡 处 理 的 酚 至 少 可 于 4 亿 贮 藏 两 个 月 。 酚 / 氯 仿 混合 物 : 将 等 体积 的 氯仿 加 入 到 STEL 平衡 过 的 酚 中 混 匀 ， 混 合 物 至 少 能 在 AC 保存 两 个 月 。 处 理 酚 时 必须 戴 上 手套 并 在 通风 橱 中 进行 。 6) 5 mol/L LiCl: 用 DEPC 处 理 过 的 水 配制 并 进行 高 压 灭 菌 。 7) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0， 用 DEPC 处 理 过 的 水 配制 并 进行 高 压 灭 菌 。 RNA 保护 剂 : 例如 RNA 酶 抑制 剂 RNasin (Promega; Madison, WI). 3 A 5 —— 8 SS 2.2 ”上述 方 法 的 变化 ， 用 于 黏附 型 的 细胞 培养 物 和 组 织 9) FES AB: 以 0.12$% 的 少 度 深 于 PBS， 短 时 间 可 保存 于 4 如 冰箱 ， 长 时 间 则 应 保存 FURR 5.59 5 3.1 非 黏附 型 的 组 织 培养 细 胞 中 核酸 的 抽 提 下 面 是 从 非 黏附 型 的 组 织 培养 细胞 中 抽 提 核酸 的 具体 步骤 。3.2 节 则 是 用 此 法 抽 提 黏附 型 细胞 培养 与 组 织 中 核酸 的 方法 。 为 了 防止 皮肤 上 的 RNA 酶 的 污染 ， 应 在 抽 提 过 程 中 戴 上 一 次 性 手套 。 此 外 ， 分 离 与 分 析 RNA 的 器 血 最 好 专用 ， 例 如 玻璃 器 血 、 移 液 管 与 电泳 槽 等 。 1) 细胞 培养 液 (1x 10’) 应 置 于 冰 水 浴 中 (参见 注释 2)。 倒 入 15 ml RAMS, VW 100 g 离心 5 min， 用 10 ml 冰冷 却 的 PB 缓冲 液 洗 涤 沉 淀 后 再 次 离心 。 处 理 其 他 样 品 时 可 将 沉淀 细胞 置 于 冰 水 浴 中 。 em 2) 同时 向 管 中 加 入 5 ml STEL 平衡 过 的 酚 与 $ ml 冰冷 却 的 STEL 缓冲 液 ， 轻 轻 倒转 3~5 min 使 沉淀 细胞 彻底 悬浮 (参见 注释 3 和 4)。 3) 20C 中 以 100 000 g 离心 S min 使 两 相 分 离 ， 用 灭 菌 的 聚 丙 烯 移 液 管 将 水 相 (上 层 ) 移 至 一 个 新 的 管 中 ， 再 用 等 体积 的 酚 / 氯 仿 抽 提 两 次 (参见 注释 5)。 4) 将 水 相 移 至 一 个 50 ml 的 Falcon 管 中 ， 加 入 0.1 倍 体积 的 S mol/L 冰冷 却 的 LiCl 与 2 倍 体积 冰冷 却 的 无 水 乙醇 使 高 相对 分 子 质 量 的 DNA 从 RNA 中 分 步 沉 演出 来 ， 这 时 的 DNA 会 立刻 以 线 团 状 沉淀 出 来 。 5) 轻 轻 用 带 钩 玻璃 棒 缠 绕 DNA 使 其 呈 结 构 紧 密 状 态 。 将 玻璃 棒 靠 在 管子 的 壁 上 以 除 去 残留 的 乙醇 ， 用 1 ml 70% 冰 冷却 的 乙醇 淋 洗 缠绕 在 玻璃 棒 上 的 DNA 以 除去 其 中 的 盐分 。 小 心地 用 冰冷 却 的 TE(pH 8.0) 淋 洗 DNA 以 除去 残留 的 乙醇 (参见 注释 6) 。 6) 玻璃 棒 上 的 DNA 溶 解 于 适当 体积 的 TE (pH 8.0) 中 并 于 4ORF. 7) 将 剩余 溶液 置 于 - 70 冰箱 或 乙醇 /干冰 浴 中 30 min 使 RNA 沉淀 出 来 。 8) 10 000g 离心 13 min 沉淀 RNA 并 小 心地 抽 气 除去 残余 的 上 清 液 。 用 冰冷 却 的 70% 的 乙醇 淋 洗 沉淀 ， 再 次 离心 5 min 并 除去 上 清 液 。RNA 沉淀 真空 干燥 后 用 DEPC 处 理 过 的 水 溶解 。 9) 对 于 以 水 溶液 保存 的 样品 可 按 制造 商 所 提供 的 资料 加 入 S~10 U 的 RNasin (RNA 酶 抑制 剂 )。 另 外 ，RNA 也 可 以 安全 地 保存 在 乙醇 / LiCl 溶液 中 〈 人 参见 注释 7 和 8)。 3.2 ”上述 方法 的 变化 ， 用 于 黏附 型 的 细胞 培养 物 或 组 织 的 核酸 抽 提 3.2.1 黏附 型 细胞 的 核酸 抽 提 1) 用 抽 和 气 法 去 除 相 当 于 1x 107 细胞 的 培养 液 ， 用 10 ml 37C 的 PBS 将 细胞 洗涤 一 次 。 2) 加 入 1 ml RE ABW Wat 37C 保温 直至 细胞 脱落 。 这 步 操作 约 需 10 min。 加 入 冰 冷却 的 PBS 溶液 稀释 胰 蛋 白 酶 。 3) 按照 3.1 节 步骤 2 一 9 继续 操作 。 3.2.2 ”组织 的 核酸 抽 提 1) AAA PBS 缓冲 液 淋 洗 约 500 mg 的 无 血 组 织 ， 冷 却 后 用 灭 菌 刀片 切 成 约 3 一 5 cm 的 小 块 。 2) 将 块 状 组 织 逐 渐 加 到 装 有 液 氮 的 研 钵 中 研 碎 至 细 粉 末 状 。 3) 缓慢 地 将 粉碎 的 组 织 加 到 已 混 匀 的 5 ml MAS ml STEL 溶液 中 。 操 作 时 最 好 用 经 烘 烤 的 玻璃 棒 逐 渐 将 粉碎 的 组 织 搅 入 酚 /STEL 的 乳 浊 液 中 ， 直 至 组 分 彻底 混 匀 。 继 续 轻 轻 上 下 倒转 离心 管 5 min. 4) 按照 3.1 节 步骤 3 一 9 继续 操作 。 4. 35 释 (1) DEPC 是 可 疑 的 致癌 剂 ， 取 用 时 应 戴 手 套 并 在 通风 橱 中 操作 。 由 于 DEPC 可 作为 酰 四 5 e (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 化 剂 作用 于 和 蛋白质 中 的 组 氨 酸 与 酷 氨 酸 ， 所 以 像 Tris 溶液 等 敏感 材料 不 能 直接 用 它 进行 处 理 ， 但 可 以 用 DEPC 处 理 过 的 水 来 配制 敏感 的 试剂 。 使 收集 到 的 细胞 与 组 织 处 于 低温 状态 下 有 利于 保持 核酸 的 完整 性 。 此 法 成 功 的 关键 取决 于 是 否 能 在 温和 条 件 下 破碎 细胞 的 同时 使 DNA 保持 高 相对 分 子 质量 的 完整 状态 。 用 STEILV/ 酚 处 理 时 应 缓慢 地 将 管 上 下 倒转 ， 这 样 可 以 减少 DNA 分 子 所 受到 剪 切 力 的 作用 。 首次 酚 抽 提 时 (第 3.1 WAR 3) 分 配 于 水 相 (上 层 ) 与 酚 相 界面 上 的 含 蛋 自 质 水 溶液 可 用 酚 / 毛 仿 再 次 抽 提 以 提高 DNA 的 回收 效率 。 氯仿 中 通常 以 24:1 (v/v) 的 比例 加 入 异 成 醇 ， 后 者 是 一 种 消 泡 剂 。 我 们 发 现 当 用 温和 的 手法 倒转 或 在 转 轮 上 转动 管子 时 不 存在 产生 泡沫 问题 ， 所 以 在 常规 的 操作 中 就 可 以 省 略 异 成 醇 了 。 DNA 可 以 空气 干燥 ， 但 再 溶解 时 就 要 花费 较 长 的 时 间 。 当 用 上 述 方法 选择 性 地 除去 高 相对 分 子 质量 DNA 后 ， 剩 余 RNA 中 的 DNA 已 不 能 被 EB 染色 检 出 611。 如 果 抽 提纯 化 的 RNA 是 被 用 在 PCR 反应 中 ， 则 必须 用 RNase 处 理 过 的 样品 作为 对 照 ， 保 证 其 中 没有 DNA 的 污染 。 实 际 上 这 一 处 理 对 任何 RNA 纯化 步骤 都 适用 ， 特 别 是 对 于 那些 在 操作 步骤 开始 时 就 将 DNA 剪 切 的 实验 更 为 必 要 。 所 用 细胞 数 为 1.$x 10 一 20x10"，Azio/Azso 约 1.86 时 RNA 的 典型 产量 为 60 ~ 170 pg?!) HORE SE SE RRS CsCl 法 抽 提 的 结果 相 接近 [8 。 参考 文 献 — . Graham, D. E. (1978) The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms of large tissue masses. Anal. Biochem. 85, 609-613. 2. Bowtell, D. D. (1987) Rapid isolation of eukaryotic DNA. Anal. Biochem. 162, 463-465. 3. Longmire, J. L., Albright, K. L., Meincke, L. J., and Hildebrand, C. E. (1987) A rapid and simple method for the isolation of high molecular weight cellular and chromosome-specific DNA in solution without the use of organic solvents. Nucleic Acids Res. 15, 859. 4. Owen, R. J. and Borman, P. (1987) A rapid biochemical method for purifying high molecular weight bacterial chromosomal DNA for restriction enzyme analysis. Nucleic Acids Res. 15, 3631. 5. Reymond, C. D. (1987) A rapid method for the preparation of multiple samples of eukaryotic DNA. Nucleic Acids Res. 15, 8118. 6. Miller, S. A. and Polesky, H. F. (1988) A simple salting out procedure for extract- ing DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 16, 1215. 7. Grimberg, J., Nawoschik, S., Belluscio, L., McKee, R., Turck, A., and Eisenberg, A. (1989) A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390. 8. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., and Rutter, W. J. (1979) Isola- tion of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18, 5294-5299. 28. 29. . Auffray, C. and Rougeon, F. (1980) Purification of mouse immunoglobulin heavy- chain messenger RNAs from total myeloma tumour RNA. Eur. J. Biochem. 107, 303-314. . Elion, E. A. and Warner, J. R. (1984) The major promoter element of rRNA tran- scription in yeast lies 2 Kb upstream. Cell 39, 663-673. . Chomezynski, P. and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA extraction by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159. . Hatch, C. L. and Bonner, W. M. (1987) Direct analysis of RNA in whole cell and cytoplasmic extracts by gel electrophoresis. Anal. Biochem. 162, 283—290. . Emmett, M. and Petrack, B. (1988) Rapid isolation of total RNA from mammalian tissues. Anal. Biochem. 174, 658-661. . Gough, N. M. (1988) Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells. Anal. Biochem. 173, 93-95. . Meier, R. (1988) A universal and efficient protocol for the isolation of RNA from tissues and cultured cells. Nucleic Acids Res. 16, 2340. . Wilkinson, M. (1988) RNA isolation: a mini-prep method. Nucleic Acids Res. 16, 10,933. . Wilkinson, M. (1988) A rapid and convenient method for isolation of nuclear, cyto- plasmic and total cellular RNA. Nucleic Acids Res. 16, 10,934. . Ferre, F. and Garduno, F. (1989) Preparation of crude cell extract suitable for amplification of RNA by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17,2141. . McEntee, C. M. and Hudson, A. P. (1989) Preparation of RNA from unsphero- plasted yeast cells (Saccharomyces cerevisiae). Anal. Biochem. 176, 303-306. . Nemeth, G. G., Heydemann, A., and Bolander, M. E. (1989) Isolation and analysis of ribonucleic acids from skeletal tissues. Anal. Biochem. 183, 301-304. . Verwoerd, T. C., Dekker, B. M. M., and Hoekema, A. (1989) A small-scale proce- dure for the rapid isolation of plant RNAs. Nucleic Acids Res. 17, 2362. . Schmitt, M. E., Brown, T. A., and Trumpower, B. L. (1990) A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091. . Tavangar, K., Hoffman, A. R., and Kraemer, F. B. (1990) A micromethod for the isolation of total RNA from adipose tissue. Anal. Biochem. 186, 60-63. . Krieg, P., Amtmann, E., and Sauer, G. (1983) The simultaneous extraction of high- molecular-weight DNA and of RNA from solid tumours. Anal. Biochem. 134, 288-294. . Mirkes, P. E. (1985) Simultaneous banding of rat embryo DNA, RNA and protein in cesium trifluroracetate gradients. Anal. Biochem. 148, 376-383. . Meese, E. and Blin, N. (1987) Simultaneous isolation of high molecular weight RNA and DNA from limited amounts of tissues and cells. Gene Anal. Tech. 4, 4549. . Zarlenga, D. S. and Gamble, H. R. (1987) Simultaneous isolation of preparative amounts of RNA and DNA from Trichinella spiralisby cesium trifluoroacetate isopycnic centrifugation. Anal. Biochem. 162, 569-574. Chan, V. T.-W., Fleming, K. A., and McGee, J. O. D. (1988) Simultaneous extrac- tion from clinical biopsies of high-molecular-weight DNA and RNA: comparative characterization by biotinylated and 32P-labeled probes on Southern and Northern blots. Anal. Biochem. 168, 16—24. Karlinsey, J., Stamatoyannopoulos, G., and Enver, T. (1989) Simultaneous purifi- cation of DNA and RNA from small numbers of eukaryotic cells. Anal. Biochem. 180, 303-306. 30. ca 32. 33. 34. 35. Coombs, L. M.., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J., and Knowles, M. A. (1990) Simultaneous isolation of DNA, RNA and antigenic protein exhibiting kinase activity from small tumour samples using guanidine isothiocyanate. Anal. Biochem. 188, 338-343. Raha, S., Merante, F., Proteau, G., and Reed, J. K. (1990) Simultaneous isolation of total cellular RNA and DNA from tissue culture cells using phenol and lithium chloride. Gene Anal. Tech. 7, 173-177. Kirby, K. S. (1957) A new method for the isolation of deoxyribonucleic acids: evidence on the nature of bonds between deoxyribonucleic acid and protein. Biochem. J. 66, 495—504. Wallace, D. M. (1987) Large and small scale phenol extractions, in Methods in Enzymology, vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berger, S. L. and Kimmel, A. R., eds.), Academic, Orlando, FL, pp. 33-41. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Harbor, NY. é Davis, L. G., Dibner, M. D., and Battey, J. F. (1986) Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier, New York. 第 二 章 DNA HYP PEN DA 1 Duncan R. Smith Tl 1. 4 在 特定 位 点 切割 DNA HAKAS RNB Te eT BM. PR EN DORE HA, AEX NSE DNA 的 特定 目标 序列 进行 切割 从 而 产生 特定 的 片段 ， 这 些 酶 可 以 从 大 多 数 生物 工程 制品 公司 购 得 。 酶 的 命名 是 按照 Smith 与 Nathans AY, WBA LE (例如 BamHI、EcoRI 等 ) 可 以 知道 酶 的 来 源 ， 但 不 能 知道 任何 有 关于 酶 的 切割 特性 (参见 注释 1)， 而 切割 特性 恰恰 是 因 酶 而 异 的 。 大 部 分 常用 酶 的 切割 位 点 具有 短 的 回 文 对 称 序列 ， 通 常 是 4、5 或 6 个 碱 基 的 长 度 ， 例 如 AGCT (Alul )、GAATTC (EcoRI ) 等 。 每 一 种 酶 在 特定 的 回 文 对 称 位 点 上 切割 ， 但 也 有 两 种 不 同 的 酶 识别 同一 种 序列 ， 却 切割 识别 序列 内 的 不 同位 置 。 酶 的 切 点 可 以 分 为 三 类 : 一 类 是 切割 位 点 位 于 中 间 而 产生 平 末端 ， 另 外 两 类 则 在 5’ BK 3 突出 末端 产生 不 配对 的 碱 基 。 有 关 限 制 性 内 切 酶 的 全 面 综述 可 参考 Fuchs 与 Blakesleyl2] 的 资料 。 2. 材 料 1) 适当 的 限制 酶 缓冲 液 : 10x 贮 存 液 (人 参见 注释 2)。 2) 待 切 的 DNA 溶 于 水 或 TE (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3, 1 mmol/L EDTA) 中 (参见 注释 3 和 4)。 3) 浓度 为 1 mg/ml 的 牛 血 清白 蛋白 (BSA) (参见 注释 $)。 4) 灭 菌 蒸馏 水 (BWIEF 6). 5) 正确 选择 的 酶 (参见 注释 7)。 6) $X 点 样 液 : 50% (v/v) 甘油 ，100 mmol/L NazEDTA、pH 8.0, 0.125% (w/v) WROTE (6pb), 0.125% (w/v) — ARF. 7) 100 mmol/L WARK (4 IEF 8). Yo Bit 7 法 1) 除 酶 以 外 的 所 有 溶液 解冻 后 置 于 冰 水 浴 中 。 2) 确定 酶 切 反 应 的 最 终 体积 ， 通 常 是 10 一 50 pl (BIER 9)。 在 灭 菌 的 Eppendorf 管 中 加 入 1/10 终 体积 的 酶 切 缓冲 液 、1/10 终 体积 的 BSA，0.5 一 1 pe WHF DNA (参见 注释 3)， 最 后 再 加 灭 菌 蒸 馏 水 至 反应 终 体 积 。 Hae — 20C 冰箱 中 取出 酶 。 用 干净 的 灭 菌 吸 管 吸 取 所 需要 的 单位 数 (BERT . 3 ~~ #10) JR SZEPRARMIRG RAPHE 〈 人 参见 注释 11)。 4) 将 管子 放 在 合适 的 温度 中 (参见 注释 12) 保温 约 1h， 基 因 组 DNA 可 以 酶 切 过 夜 。 5) 取出 部 分 酶 切 样品 (通常 1 一 2 由) 与 Sx 点 样 液 混 合 后 进行 电泳 分 析 ( 参 见 第 三 章 )。 4. 注 iE (1) 酶 的 命名 是 按照 Smith 与 Nathanst 所 建议 的 ， 即 根据 首次 分 离 到 该 酶 的 细菌 而 得 (2 (3 (4 ) YA ) 名 。 限 制 酶 名 称 的 第 一 个 字母 是 属 名 ， 后 两 个 是 种 名 ， 从 而 构成 酶 名 的 三 字母 缩 写 形式 。 例 如 从 Providencia stuartii 中 分 离 的 酶 定名 为 Pt， 从 这 一 种 细菌 分 离 得 到 的 第 一 种 酶 定名 为 PxzI， 第 二 种 酶 为 PszIE， 余 类 推 。 但 要 注意 的 是 酶 的 命名 中 并 未 给 出 任何 关于 酶 切 位 点 的 信息 ， 而 这 些 必 须 从 酶 的 切割 特性 表 中 方 能 查 到 。 大 多 数 提供 酶 的 公司 的 产品 目录 中 载 有 详细 的 酶 切 特性 资料 ， 这 些 特 性 包括 酶 的 切割 特性 、 酶 的 最 适 反应 条 件 以 及 在 常用 DNA 模板 上 的 切割 位 点 数 等 。 这 些 产 品目 录 都 应 该 认为 是 有 价值 的 信息 来 源 。 每 一 种 酶 都 有 最 适 反应 缓冲 液 ， 这 些 推荐 的 反应 条 件 通常 都 包括 在 制造 商 提供 的 测试 表格 中 。 实 际 上 很 多 酶 反应 都 可 以 使 用 一 种 共同 的 条 件 ， 这 就 可 以 配制 一 种 适用 于 大 多 数 酶 反应 的 通用 缓冲 液 。 绝 大 多 数 酶 能 在 三 种 缓冲 液 的 任何 一 种 中 进 行 切割 反应 。 它 们 分 别 是 高 盐 、 中 盐 与 低 盐 缓冲 液 ， 配 方 列 在 下 面 。 这 些 缓冲 液 通常 是 配 成 10x 的 浓度 ， 使 用 时 在 待 消化 样品 中 加 入 终 体积 的 /10 即 可 。 必 须 注 意 的 是 使 用 的 缓冲 液 必 须 与 酶 匹配 ， 用 错 绥 冲 液 会 导致 酶 活力 剧 降 ， 酶 切 特异 性 改变 甚至 出 现 酶 活力 完全 丧失 的 现象 。 有 些 制造 商 还 会 额外 提供 合适 的 缓冲 液 以 示 优 惠 ， 建 议 使 用 这 些 酶 时 应 同时 使 用 该 厂商 所 提供 的 酶 切 缓冲 液 。 a. 高 盐 缓 冲 液 (1X): 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCI、pH 7.5， 10 mmol/L MgCh, 1 mmol/L DTT b. 中 盐 缓 冲 液 (1x): 50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 10 mmol/L MgCl, 1 mmol/L DTT c. 低 盐 缓冲 液 (1x ): 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 10 mmol/L MgCh, 1 mmol/L DTT | 除 此 之 外 还 有 两 种 有 时 采用 的 “通用 缓冲 液 ”， 在 通用 缓冲 液 中 所 有 的 限制 酶 都 有 活力 ， 但 在 有 些 情 况 下 酶 活力 会 下 降 到 最 大 活力 的 20% 。 这 种 通用 缓 神 液 是 谷 氨 酸 钾 盐 531 和 醋酸 钾 盐 史 缓冲 液 。 这 两 种 缓冲 系统 特别 适用 于 须 用 两 种 完全 不 同 的 缓冲 系统 进行 DNA 切割 的 实验 中 。 FEM) Fl DNA 的 量 取 决 于 以 后 的 实验 步 又。 如 果 是 为 了 鉴定 质粒 DNA FA ABA 片段 ， 那 么 合适 的 酶 切 DNA 量 约 为 500 ng 至 1 wg， 当 然 酶 切 的 DNA 量 还 与 插入 片段 的 大 小 有 关 。 插 入 片段 愈 小 酶 切 的 DNA 量 应 愈 大 ， 只 有 这 样 才能 在 以 后 的 电泳 中 观察 到 插入 的 片段 。 所 切割 的 DNA 应 该 有 较 高 的 纯度 , DNA 样品 中 不 能 存在 如 酚 、 氯 仿 、 乙 醇 、 盐 去 污 剂 以 及 束 合 剂 等 杂质 ,即使 是 痕 量 的 这 类 化 学 物质 也 会 抑制 酶 的 反应 或 是 使 酶 失 活 。 (5) 为 了 稳定 低 和 蛋白 浓 度 的 酶 制剂 以 及 防止 变性 ， 酶 的 反应 体系 中 通常 须 加 入 BSA。 . 10 . (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) 酶 切 时 必须 选用 高 质量 的 灭 菌 蒸馏 水 ， 水 中 不 可 含有 无 机 离子 、 有 机 化 合 物 以 及 去 污 剂 。 1 个 酶 单位 的 定义 为 : 在 最 适 的 温度 与 缓冲 液 的 条 件 下 ，1 h 内 完全 切割 1 pg 的 标准 DNA (ADNA) 所 需 的 酶 量 。AXDNA 上 有 5 个 EcoRI 切 点 ， 如 果 用 1 个 单位 的 EcoRI 来 切割 只 含 一 个 切 点 的 质粒 pPBR322， 作 用 时 间 为 1 h， 这 样 就 相当 于 用 了 5 倍 过 量 的 酶 了 。 切割 基因 组 DNA 时 加 入 的 亚 精 胺 至 终 浓度 为 1 mmol/L 能 显著 提高 酶 切 效 率 ， 因 为 带 正 电荷 的 亚 精 胺 会 与 带 负 电荷 的 杂质 结合 。 须 注意 低温 条 件 下 亚 精 胺 可 使 DNA 沉淀 ， 所 以 当 反应 物 置 于 冰 浴 中 时 不 可 加 入 亚 精 胺 。 实际 使 用 中 最 小 的 酶 切 体积 是 10 由 ， 少 于 这 个 体积 时 吸 量 可 以 造成 显著 的 误差 。 10 岂 的 酶 切 体积 也 使 得 加 入 终止 /点 样 液 后 可 以 全 部 加 到 不 大 的 电泳 凝 胶 的 点 样 孔 中 。 如 果 DNA 贮存 液 的 浓度 太 稀 ，5 一 6 ul ANS BAZ O.5~1 pg, WAH 反应 体积 按 比例 放大 到 20~50 wl 。 如 果 进 行 双 酶 切 反应 〈 即 用 两 种 不 同 的 酶 进 行 切割 ) 则 推荐 使 用 的 最 小 体积 为 20 已 ， 这 时 两 种 酶 各 加 1 风 便 可 将 甘油 浓度 控制 在 较 低 的 范围 内 〈 人 参见 注释 10)。 不 少 酶 对 甘油 是 敏感 的 。 大 多 数 的 酶 是 贮存 在 50% (v/v) 甘油 中 供应 的 。 反 应 体系 中 如 果 甘 油 的 浓度 超过 10 % 时 会 造成 非特 异性 位 点 的 切割 ( 称 为 星 号 活性 ， star activity)。 为 了 避免 这 种 情况 的 发 生 应 将 加 酶 量 控制 在 与 反应 总 体积 的 比例 为 1:10 或 更 低 。 同 样 ， 盐 泊 度 的 异常 也 会 造成 酶 的 星 号 反应 。 酶 对 热 是 非常 不 稳定 的 ， 所 以 从 - 20 冰箱 中 取出 的 时 间 应 越 短 越 好 ， 取 出 后 也 应 立即 置 于 冰 浴 中 。 大 多 数 的 酶 在 37Y 保温 进行 反应 ,但 并 不 是 所 有 的 酶 都 如 此 。 例 如 TaqI 为 65 忆 、 Sma 1 A25C , 所 以 使 用 前 应 先 核 对 一 下 那些 新 的 或 是 不 熟悉 的 酶 反应 温度 。 当 进 行 制 备 型 酶 切 时 (100 一 500 pl 反应 总 体积 ) 可 按 比 例 放 大 ， 但 必须 注意 保证 各 反应 组 分 混 匀 ， 特 别 是 对 于 黏度 较 大 的 反应 成 分 如 DNA 溶液 与 酶 的 贮存 液 等 。 无 论 对 于 什么 体积 的 酶 切 反应 来 说 都 应 避免 使 用 涡 旋 振 功 器 进行 混合 ， 因 为 这 种 操作 会 显著 影响 酶 的 活性 。 对 于 小 体积 来 说 可 以 轻 轻 地 用 手指 弹 管 壁 进行 混合 ， 然后 放 在 Eppendorf 离心 机 中 离心 1-S$s 使 所 有 的 液体 都 集中 到 管子 的 底部 。 对 于 较 大 的 酶 反应 体积 则 可 借助 于 微量 移 液 器 ， 将 底部 的 液体 吸 至 上 层 处 混合 直至 各 组 分 混 匀 为 止 。 参考 文 献 1. Smith, H. O. and Nathans, D. (1973) A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. J. Mol. Biol. 81, 419-423. . Fuchs, R. and Blakesley, R. (1983) Guide to the use of Type II restriction endonu- cleases. Methods Enzymol. 100, 3-38. . McClelland, M., Hanish, J., Nelson, M., and Patel, Y. (1988) KGB: a single buffer for all restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 16, 364. 4. O’Farrell, P. H., Kutter, E., and Nakanishe, M. (1980) A restriction map of the bacteriophage T4 genome. Mol. Gen. Genet. 170, 411-435. N Ww =F DH BE Bee BS HL Dk Duncan R. Smith Tl jee 无 论 是 出 于 制备 还 是 出 于 分 析 的 目的 ， 酶 切 后 的 DNA 样品 〈 参 见 第 二 章 ) 往往 须 分 离 切割 产物 并 观察 酶 切 结果 。 绝 大 多 数 情况 下 这 些 片段 的 长 度 在 200 一 20 000 bp 之 间 ， 通 常 可 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 测定 片段 的 长 度 。 琼 脂 糖 是 一 种 从 海藻 中 提取 的 、 分 子 为 线 状 的 多 聚 物 ， 出 售 的 产品 呈 白 色 粉 末 状 ， 粉 末 溶 化 在 缓冲 液 中 冷却 后 由 于 氢 键 的 形成 而 呈 胶 状 。 北 胶 中 的 孔径 与 胶 的 浓度 有 关 ， 胶 的 浓度 可 以 用 琼脂 糖 在 电泳 缓冲 液 中 的 百 分 数 表 示 (w/v)， 常 用 浓度 为 0.3% 一 3% 。 电 泳 的 装置 也 有 多 种 ， 例 如 有 些 可 进行 垂 直 胶 电泳 或 是 进行 水 平 胶 电 泳 ， 电 流 可 经 灯芯 或 电泳 缓冲 液 导 通 。 但 是 将 胶 浸 入 缓冲 液 中 进行 电泳 几乎 是 目前 最 通用 的 方法 。 在 这 种 方法 中 先 将 胶 制 于 胶 模 上 ， 然 后 浸入 合适 的 电泳 缓冲 液 中 。 点 样 孔 则 用 “梳子 ” 揪 入 到 尚未 固化 的 胶 中 形成 。 点 样 时 要 在 样品 中 混入 比重 较 大 的 液体 〈 点 样 液 )， 使 样品 的 比重 增 大 ， 保 证 其 沉 到 点 样 孔 的 底部 。 电泳 仪 甚至 可 认为 是 实验 室 设 备 中 最 重要 的 仪器 。 电 访 仪 由 四 个 主要 部 分 组 成 : 电 源 (至 少 有 100 V 与 100 mA 的 直流 输出 )、 电 泳 槽 、 胶 模 以 及 一 个 能 形成 点 样 孔 的 杭 子 。 电 泳装 置 可 以 从 许多 公司 购买 ， 但 是 价格 都 很 贵 。 除 购买 外 电泳 仪 也 可 以 自制 ， 只 需要 几 块 有 机 玻璃 板 与 一 些小 型 的 电器 。 制 造 电 泳 仪器 的 方法 已 不 属于 本 章 讨论 的 范 围 ， 但 可 以 从 参考 资料 Q -3] 中 找到 。 电泳 的 原理 是 当 胶 中 的 DNA 分 子 处 在 一 个 稳定 的 电场 中 时 ， 它 们 首先 一 端 向 前 地 排列 好 !#5， 然 后 以 反比 于 碱 基 对 数目 的 lg 的 速度 向 前 移动 ， 这 是 因为 大 分 子 受 到 更 大 的 摩擦 阻力 使 它 更 难于 通过 胶 孔 ， 因 此 比 小 分 子 移动 得 更 慢 。 这 种 迁移 速率 与 相对 分 子 质量 之 间 的 关系 仅 适 用 于 线 型 分 子 。 环 状 质粒 分 子 的 迁移 速率 远 远 快 于 它 相 对 分 子 质量 所 应 有 的 迁移 速率 ， 说 明 环 状 分 子 在 胶 中 具有 比 实际 相对 分 子 质量 小 的 表现 相对 分 子 质 量 。 迁 移 速 率 还 与 其 他 因素 有 关 ， 诸 如 电泳 缓冲 液 的 组 成 、 离 子 强度 以 及 琼脂 糖 凝 胶 的 浓度 等 。 胶 浓度 是 控制 分 辩 率 的 最 佳 手 段 (参见 表 3.1)。 关 于 效 胶 电泳 的 理论 可 参阅 Sambrook 等 人 的 著作 6 。 2. 料 1) 分 子 生物 学 级 的 琼脂 糖 (高 熔点 ， 人 参见 表 3.1)。 2) 1x 和 10x 的 电泳 缓冲 液 (选择 时 参见 表 3.2)。 3) 灭 菌 蒸馏 水 。 4) 电热 板 或 是 微波 炉 。 yn i Ja 表 3.1 琼脂 糖 凝 胶 的 分 离 效果 琼脂 糖 浓度 /% “| 相对 分 子 质量 范围 /kb 说 A 0.4 倍加 小 心 的 情况 下 可 使 用 低 熔 点 胶 。 0.6 基本 同上 但 有 较 大 的 机 械 强度 。 胶 非 常 易 碎 ， 分 离 20 一 40 kb 的 片段 时 增加 电泳 缓冲 液 离子 的 强度 0.2 (就 是 用 Loenings 下 缓冲 液 ) 可 以 改进 分 离 效 果 ， 但 只 能 用 高 熔点 胶 进 行 制 胶 。 这 是 一 般 电泳 常用 的 凝 胶 浓 度 ， 选 用 不 同 的 缓冲 液 时 不 会 有 很 大 影 响 。 省 酚 蓝 在 胶 中 泳 动 的 速率 相当 于 1 kb 的 DNA 片段 。 1 | 0%.5-5 | 性 质 与 0.8% 的 胶 类 似 。 0.8 USS ~40 ~30 ~7 5~5 3~3 同上 ， 溴 酚 蓝 在 胶 中 泳 动 速率 相当 于 500 bp 的 DNA 片段 。 5 5 1 0. 0. 2 0.2~1.5 倒 胶 时 胶 的 温度 不 应 低 于 SOC 。 ee 可 以 分 离 相 对 分 子 质量 彼此 相差 不 多 的 小 分 子 DNA， 倒 胶 时 必须 很 快 地 倒 在 预 热 过 的 玻璃 板 上 。 表 3.2 常用 琼脂 糖 凝 胶 的 电泳 缓冲 液 5L10x 洲 液 中 含有 : 218 g Tris 碱 ，234 g 是 高 离子 强度 ， 不 适用 于 制备 型 电泳 NaH,PO,*2H,O, 18.6 g NaEDTA.2H2O 2L10x 深 液 中 含有 : 300 g HAR, 300 ml HAR ee. ae 也 可 1 mol/L NaOH (或 是 12 g 固 体 )，80 ml 0.5 9 mol/L EDTA, pH 8.0 Tris -硼酸 - EDTA 4 5L10X#MPAA; 545 g Tris, 278 g 而 (TBE) 低 离子 强度 ， 可 用 于 制备 型 或 分 析 型 电泳 。 酸 ，46.5 g EDTA 1L50x 的 溶液 中 含有 : 242 g Tris M, x 特别 适用 于 分 析 型 和 用 玻璃 珠 法 纯化 DNA Tris -醋酸 (TAE) 片段 的 制备 型 电泳 〈 参 见 第 二 十 八 章 ) 。 100 ml 0.5 mol/L EDTA, 5) 合适 的 电泳 仪 与 电源 (参见 第 一 部 分 )。 6) WALA (EB): 10 mg/ml 的 EB 母液 〈 人 参见 注释 1)。EB 既是 诱 变 剂 又 是 致癌 剂 ， 所 以 用 时 必须 非常 小 心 。 7) 紫外 (UV) 透射 装置 (长 波 紫外 线 、365 nm). 8) SX RRM (SER 2): 点 样 液 的 配方 有 多 种 ， 下 面 介 绍 的 是 比较 标准 的 一 种 : 50% (v/v) 甘油 ，50 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.125% (w/v) 省 酚 蓝 ，0.125% (w/v) 用 来 青 。 9) 相对 分 子 质量 标准 : SEA DNA 经 限制 酶 切割 后 产生 已 知 相对 分 子 质量 的 片段 作为 相对 分 子 质 量 标准 。 许 多 这 类 标准 有 商品 供应 。 1. 蔗 法 1) 在 锥 形 瓶 中 小 心地 称 取 所 需 量 的 粉 状 琼脂 糖 (参见 表 3.1)。 2) 加 入 1/10 终 体 积 的 10 x 电泳 缓冲 液 后 加 入 蒸馏 水 至 终 体 积 。 和 2) 4) 5) 6) f! =", 8 YA 9 YA (1) (2) (3 YA (4) 摇动 锥 形 瓶 混 匀 琼 脂 糖 粉 ， 置 于 电热 板 上 或 微波 炉 中 加 热 至 刚 沸 使 琼脂 糖 粉 溶化 。 冷却 到 SOC 时 加 入 EB BARBED 5 pg/ml， 将 胶 倒 入 胶 模 中 。 将 梳子 插入 胶 中 待 凝 胶 固 化 后 形成 加 样 孔 。 待 胶 凝 固 后 小 心地 拔 出 梳子 并 将 胶 模 放 到 电泳 槽 中 。 倒 入 1x 电泳 缓冲 液 刚 好 淹没 点 样 孔 。 在 DNA 样品 中 (参见 注释 3) RAS 点 样 液 并 加 到 点 样 孔 中 ， 所 有 的 样品 要 同时 点 上 。 通 常 还 要 在 另 一 个 点 样 孔 中 加 上 相对 分 子 质量 标准 。 盖 上 盖子 并 接 通 电源 (参见 注释 4)。 电 泳 的 时 间 根 据 不 同 的 胶 浓 与 胶 长 而 异 ， 通 常 为 1 一 3 h。 电泳 结束 后 取出 胶 模 ， 酶 切 的 结果 可 在 紫外 线 灯 下 观察 。 42 注 释 很 多 人 不 喜欢 将 EB 加 在 胶 中 或 是 缓冲 液 中 进行 电泳 ， 而 乐于 在 电泳 后 将 胶 染 色 ， 这 是 因为 EB 加 入 到 胶 中 后 会 影响 DNA 的 迁移 ， 特 别 是 当 分子 中 有 环 状 构 型 ( 超 螺旋 或 是 开 环 ) 的 质粒 时 。 不 过 当 有 或 无 EB 的 条 件 一 致 时 那 就 不 会 有 什么 困难 了 。 使 用 EB 时 遇 到 的 第 二 个 问题 是 EB 会 促进 紫外 线 照射 下 DNA 的 损伤 〈 光 切 口 )， 所 以 对 于 胶 中 或 是 缓冲 液 中 含有 EB 的 电泳 ， 最 好 减少 观察 时 间 以 防止 DNA 的 损伤 及 以 后 的 再 电泳 过 程 中 形成 模糊 的 条 带 。 点 样 液 是 一 种 比重 很 大 的 溶液 (通常 含 甘油 或 聚 蔗糖 )， 当 与 DNA 溶液 〈 或 限制 酶 切割 的 反应 液 ) 混合 时 会 使 样品 具有 较 大 的 比重 而 易于 沉 到 已 灌 有 电泳 缓冲 液 的 点 样 孔 的 底部 。 点 样 液 中 通常 含有 一 至 二 种 与 DNA 分 子 在 电场 中 具有 相同 泳 动 方 向 的 指示 染料 ， 这 两 种 常用 的 染料 是 溴 酚 蓝 与 二 甲苯 青 。 这 些 染料 具有 彼此 不 同 的 迁移 速率 ， 以 用 来 监测 电泳 的 进程 ， 保 证 DNA 分 子 不 至 于 走出 胶 的 终端 。 在 0.8% (w/v) 琼脂 糖 凝 胶 中 溴 酚 蓝 的 迁移 速率 相当 于 1 kb AY DNA, — HAE RUA 当 于 4 kb 的 DNA。 在 理想 的 情况 下 EB 染色 时 能 观察 到 的 单一 DNA 条 带 量 可 低 至 10 ng， 在 一 般 的 情 况 下 100 ng 的 单一 条 带 是 很 容易 被 看 到 的 。 对 产生 大 量 条 带 的 酶 切 样品 则 要 加 入 较 多 的 DNA 才能 观察 到 所 有 的 条 带 。 进行 分 析 胶 电泳 时 产生 最 佳 分 辨 率 的 电场 强度 约 为 10 V/cm， 如 果 DNA 片段 为 5 kb 或 是 更 大 则 采用 S V/Vcm 才能 得 到 最 佳 分 辨 率 。 当 DNA 片段 小 于 1 kb 时 和 采用 较 高 的 电场 强度 通常 也 能 得 到 较 好 的 分 辩 率 。 2 5 xX 献 1. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 2. Sealey, P. G. and Southern, E. M. (1982) Electrophoresis of DNA, in Gel Electro- phoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach (Rickwood, D. and Hames, B. D., eds.), IRL, Oxford and Washington, pp. 39-76. - 14 - Ww . Boffey, S. A. (1984) Agarose gel electrophoresis of DNA, in Methods in Molecu- lar Biology Vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Clifton, NJ, pp. 43—S0. Fisher, M. P. and Dingman, C. W. (1971) Role of molecular conformation in deter- mining the electrophoretic properties of polynucleotides in agarose-acrylamide composite gels. Biochemistry 10, 895. . Aaij, C. and Borst, P. (1972) The gel electrophoresis of DNA. Biochem. Biophys. Acta 269, 192. Helling, R. B., Goodman, H. M., and Boyer, H. W. (1974) Analysis of R.EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244. 第 四 章 ”琼脂 糖 凝 胶 电泳 的 印迹 转移 - Duncan R. Smith, David Murphy Ul ro Southern 杂交 是 大 家 都 已 熟知 的 技术 0J。DNA 经 限制 性 内 切 酶 (参见 第 二 章 ) 切 割 后 通过 琼脂 糖 凝 胶 电泳 〈 人 参见 第 三 章 ) 分 离 成 大 小 不 同 的 片段 。 然 后 将 DNA 通过 脱 味 叭 达到 部 分 降解 (使 较 大 片段 的 DNA 便于 转移 )， 并 将 胶 依次 浸泡 在 HCl 5 NaOH | 溶液 中 进行 碱 变性 。 然 后 将 变性 的 DNA 片段 转移 到 固体 基质 上 或 是 滤 膜 上 (通常 用 尼 龙 膜 ) 对 特定 标记 的 探 针 进行 杂交 (参见 第 六 章 )。 2. # 料 1) 尼龙 杂交 膜 〈 例 如 Amersham [UK] 公司 的 Hybond-N， 参 见 注释 1) 2) 毛细 管 转移 系统 (参见 注释 2)。 3) 脱 味 叭 缓冲 液 : 0.25 mol/L HCl. 4) 变性 缓冲 液 : 1.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L NaOH. 5) 转移 缓冲 液 : 1.5 mol/L NaCl, 0.25 mol/L NaOH. 6) 20XSSC : 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 、pH 7.0. 7) 312 nm 透射 紫外 线 灯 。 二 法 1) BEY) DNA 并 进行 电泳 分 离 〈 参 见 第 二 、 三 章 ; 注释 3、4)。 2) 用 干净 的 刀片 切 去 无 用 的 凝 胶 。 3) 将 凝 胶 浸 泡 在 约 3 倍 胶体 积 的 脱 野 叭 缓冲 液 中 ， 于 室温 中 缓慢 摇动 30 min RE 胶 中 的 省 酚 蓝 变 为 黄色 为 止 。 4 4) 倾 兹 除去 脱 味 叭 缓冲 液 , 加 入 3 倍 胶体 积 的 变性 缓冲 液 ,室温 下 轻 轻 地 揪 动 30 min。 5) 倾 准 除 去 变性 缓冲 液 ， 加 入 3 倍 胶体 积 的 转移 缓冲 液 ， 室 温 下 轻 轻 地 播 动 30 min 以 利于 平衡 。 6) 将 胶 放 在 灌 有 转移 缓冲 液 的 毛细 管 转移 装置 ”的 平台 上 ， 转 移 装 置 如 图 4.1 所 示 。 装置 由 装 有 转移 缓冲 液 的 贮 液 槽 与 位 于 其 上 的 平台 组 成 ，“ 灯 芯 ” 由 四 层 厚 的 =’ 1) 题目 原文 为 Capillary blotting， 这 里 译作 印迹 转移 。 一 -一 译 者 注 2) 即 通过 毛细 管 现象 吸引 液体 的 装置 ， 也 即 常 称 的 Southern 印迹 装置 。 一 一 译 者 注 - 16° 3 MM 滤 纸 构成 ， 纸 的 一 端 附着 在 平台 上 ， 另 一 端 浸 于 转移 缓冲 液 中 ， 滤 纸 中 所 有 气泡 都 应 去 除 干净 。 平 台 的 长 度 与 宽度 与 胶 相 当 ， 灯 芯 应 切 成 同样 的 宽度 。 平 台 的 高 度 与 贮 液 槽 的 高 度 相等 。 塑料 架 灯芯 一 4 层 3MM 滤纸 图 4.1 典型 的 毛细 管 作用 Southern 转移 系统 。 7) 剪 下 一 块 与 胶 同 样 大 小 的 尼龙 膜 漂浮 于 重 蒸 水 水 面 上 使 之 湿润 ， 然 后 用 转移 缓冲 液 淋 洗 。 将 膜 覆 盖 于 胶 上 并 赶 出 所 有 的 气泡 。 8) 将 四 张 3 MM 滤纸 剪 成 与 胶 同 样 的 大 小 ， 其 中 两 张 浸 于 转移 缓冲 液 后 覆盖 于 膜 上 ， 9 10 11 (1 (2 A ~ eS Se YA 赶 出 所 有 的 气泡 。 另 外 两 张 干 的 置 于 两 张 湿 的 滤纸 上 部 ， 然 后 在 上 层 滤纸 上 放 一 春 于 的 纸巾 。 在 纸巾 的 顶部 压 1 kg 的 重 物 ， 转 移 至 少 12 h。 外 下 转移 装置 。 在 将 凝 胶 与 膜 分 离 之 前 先 在 点 样 孔 的 位 置 做 上 记号 ， 如 果 是 用 铅笔 做 记号 的 话 就 会 在 以 后 的 放射 自 显影 底片 上 出 现 此 记号 。 用 2 x SSC 缓冲 液 淋 洗 腊 后 放 在 80°C 烘箱 中 烘 烤 20 一 60 min. 用 312 nm 的 紫外 线 透射 灯 照 射 可 使 DNA 共 价 交 联 于 膜 上 。 将 膜 的 含 DNA 的 一 面 回 下 放 在 一 片 保鲜 膜 (如 Saran Wrap™) 上 于 紫外 线 下 照射 2 一 3 min (参见 注释 50 做 好 的 膜 可 以 立即 进行 杂交 (参见 第 六 章 ) 或 烘 干 贮存 备用 。 4. 注 释 注意 以 上 这 些 方法 是 在 中 性 尼龙 膜 〈 例 如 Amersham 公司 的 Hybond-N) 基础 上 发 展 起 来 的 ， 但 在 带 正 电荷 尼龙 膜 〈 例 如 Amersham 公司 的 Hybond-N*, Bio-Rad [Richmond, CA] 公司 的 Zetaprobe 以 及 NEN-Du Pont [ Boston, MA] 公司 的 GeneScreen™-Plus 等 ) 上 未 经 试用 过 。 以 上 介绍 的 毛细 管 转移 法 虽然 很 有 效 但 却 比 较 费 时 。 有 些 公 司 发 展 了 其 他 系统 〈 例 如 Pharmacia-LKB [Uppsala, Sweden] 公司 与 Hybaid [Twickenham, UK] 公司 的 空 印迹 系统 以 及 Stratagene [La Jolla, CA]) 公司 的 正 压 印迹 系统 都 能 将 印迹 时 间 缩 短 至 1 h。 (3) 与 标准 的 DNA 片段 对 照 可 以 定 出 杂交 条 带 所 显示 分 子 的 大 小 〈 例 如 用 EcoRI 与 (4 (5 We YA Hin di PR il BSBA 2 WEE AS DNA 或 是 Life Technologies [Gaithersburg，MO] 公 司 提供 的 1 kb 阶梯 状 相 对 分 子 质量 标 准 )。 最 好 是 使 用 经 放射 性 同位 素 末端 标记 的 相对 分 子 质量 标 准 〈 人 参见 第 十 五 章 )， 这 样 在 最 后 的 放射 自 显影 底片 上 就 会 在 相对 应 的 位 置 出 现 条 带 。 基因 拷贝 数 可 以 通过 Southern 印迹 法 比较 基因 组 杂交 信和 号 强度 与 拷贝 数 标准 的 强 度 (可 通过 定量 稀释 未 标记 的 克隆 DNA 片段 获得 ) 而 测定 。 前 者 的 数据 还 须 参 照 探 针 对 标准 宿主 基因 的 杂交 结果 进行 校正 。 最 适 强度 的 紫外 线 照射 能 使 DNA 有 效 地 交 联 在 尼龙 膜 上 ， 一 旦 超过 这 一 强度 再 行 照射 反而 会 使 交 联 效率 下 降 。 由 于 这 一 原因 最 好 在 使 用 前 对 紫外 线 源 进行 标定 : 将 SW DNA 点 在 几 张 膜 上 ， 置 于 紫外 线 灯 下 照射 不 同 的 时 间 后 与 同一 个 探 针 杂 交 ， 杂 交 信 和 号 的 强 弱 可 以 指示 最 适 照射 强度 。 注 意 此 外线 的 输出 强度 与 灯 管 已 用 时 间 有 关 ， 所 以 有 必要 对 紫外 线 灯 进行 常规 标定 。 有 些 厂 商 〈 例 如 Stratagene) 生产 的 交 联 型 紫外 线 灯 可 自动 调节 输出 能 量 ， 使 膜 得 到 最 佳 的 照射 时 间 。 参考 文 献 1. Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-517. She ”应 用 随机 引物 的 ”了 标记 DNA 探 针 的 制 和 省 Duncan R. Smith nile 1. 4 用 随机 引物 标记 DNA 的 方法 现在 已 经 差不多 完全 取代 了 切口 平移 (nick transla- tion) 标记 法 。 建 立 在 Feinberg 导 Vogelsteint] 方 法 基础 上 的 随机 引物 法 是 一 种 将 放射 HEN KH = ERB AFIT DNA 链 中 去 的 方法 。 随 机 引物 法 标记 DNA 时 能 得 到 2X10? 一 5$X10?dpm/pg (参见 注释 1) 的 比 活 。 下 面 介绍 的 方法 基本 上 来 自 Feinberg 与 Vogelsteint2]。 首先 将 DNA 片段 放 在 水 浴 中 煮沸 使 之 变性 ， 接 着 将 随机 的 宴 核 苷 酸 序列 复 性 到 两 条 链 上 ，DNA 聚合 酶 的 Klenow 片段 使 朝 核 苷 酸 延 伸 ， 所 使 用 四 种 核 苷 三 磷酸 中 的 三 种 是 无 放射 性 的 核 苷 酸 ， 另 外 一 种 是 有 放射 性 的 核 苷 酸 ， 延 伸 反应 的 结果 是 形成 均一 放射 性 标记 的 双 链 DNA 探 针 。 每 一 批 随 机 合成 的 引物 都 含有 所 有 可 能 的 序列 ( 例 如 最 常用 的 六 核 苷 酸 中 就 含有 4096 种 不 同 寡 核 苷 酸 的 组 合 )， 所 以 任何 模板 DNA 都 可 以 用 这 种 方法 进行 标记 。 2. 材料 〈 参 见 注释 2) 1) 溶 于 水 或 1xTE (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA、pH8.0， 参 见 注释 3) 中 的 待 标记 DNA. 2) OLB 缓冲 液 。 配 制 下 列 溶液 : 溶液 0: 1.25 mol/L Tris-HCl, pH 8.0, 0.125 mol/L MgCl (贮存 于 4T )。 YAM A: 1 ml 溶液 0，18 pl B-HAETB, 5 pl dATP”, 5 wl dTTP”, 5 pl dGTP”. 溶液 B: 2 mol/L HEPES, fi 4 mol/L NaOH ¥ pH 值 调 成 6.6 (HF 4T). 溶液 C: 均匀 悬浮 于 pH 值 为 8.0 的 TE PHAKHRIESD (ASEH), OD. U/ml 为 90 (贮存 于 -207 )。 配制 OLB 缓冲 液 : 将 溶液 A、B、C 以 100:250:150 的 比例 混合 ， 贮 存 于 -20T。 3) o MB hid’? Pe HM KH= RR, lM P-dCTP: SA 3000 Ci mmol/L, LAF -207 。 4) Klenow 片段 : DNA 聚合 酶 I 的 大 片段 (1 UV/ )， 贮 存 于 -207 。 5) 10 mg/ml 的 牛 血清 白 蛋 白 (BSA)， 溶 于 水 中 。 1) 这 里 每 一 种 核 苷 酸 已 经 湾 解 于 3 mmol/L Tris-HCI，0.2 mmol/L EDTA, pH7.0, # 0.1 mol/L, —— 译 者 注 3. 方法 (参见 注释 4) 1) 取 大 约 30 ng 待 标 记 DNA ( 探 针 ) 溶 于 灭 菌 蒸馏 水 中 至 终 体积 为 31 yl. 2) 者 沸 大 约 3 min 后 立即 置 于 冰 浴 中 。 3) 按 顺 序 加 入 下 列 各 试剂 : 10 pl OLB 缓冲 液 ，2 pl 10 mg/ml 的 BSA, 5 pl 标记 的 核 苷 三 磷酸 ，2 pl Klenow 片段 。 用 吸管 吹 吸 ， 缓 慢 地 将 加 入 的 各 种 试剂 混 匀 。 4) 室温 放置 4 一 16 h (参见 注释 $)。 探 针 标记 完毕 后 即 可 使 用 。 记 住 杂 交 前 须 再 次 将 探 针 变性 (参见 注释 6 和 7)。 4. 注 释 用 不 止 一 种 带 有 放射 性 磷 的 核 昔 三 磷酸 进行 标记 可 以 得 到 较 高 比 活 的 探 针 。 当 然 如 果 使 用 四 种 放射 性 的 核 苷 酸 进行 标记 也 是 可 以 的 ， 不 过 用 本 方法 已 经 能 得 到 较 高 比 活 的 探 针 ， 只 有 在 极 少数 的 情况 下 才 须 考虑 用 4 种 放射 性 标记 的 核 苷 三 磷酸 。 现在 很 多 厂商 都 提供 随机 引物 法 标记 DNA 的 试剂 盒 ， 这 些 试 剂 盒 使 用 起 来 既 方便 (1 YA (2 YA 又 高 效 。 以 上 步骤 是 对 已 纯化 的 DNA 而 言 的 。 大 多 数 实验 中 从 制备 胶 中 回收 的 部 分 可 以 不 必 再 次 进行 纯化 ， 在 这 种 情况 下 可 在 每 克 含 DNA 片段 的 胶片 中 加 入 3 ml RRB 水 并 者 沸 7 min 使 其 变性 ， 同 时 胶 亦 熔化 。 分 装 成 数 小 管 后 于 -20 人 贮存 〈 临 用 前 须 再 次 煮沸 3 min) 或 立即 使 用 。 制备 探测 高 丰 度 DNA 的 探 针 时 随机 引物 法 标记 反应 的 量 可 比 以 上 介绍 的 量 减 少 一 半 。 为 了 操作 方便 可 以 标记 过 夜 (12 一 16 h)， 但 实际 上 反应 进行 到 4 h 时 已 有 70% 的 放射 活性 挫 入 到 DNA 链 中 去 了 。 探 针 通常 不 用 纯化 。 如 果 反 应 进行 得 较 好 约 有 70% 被 标记 上 。 探 针 虽 然 可 用 葡 聚 BEEBE (Sephadex) 离心 柱 纯化 ， 但 未 挫 入 的 标记 物 并 不 会 影响 以 后 的 杂交 反应 (参见 第 四 十 九 章 )。 挫 入 放射 性 的 比 活 可 按 下 法 测定 : 将 一 部 分 标记 反应 物 稀释 成 每 1 一 10 pl PAA 104 一 105 dpm 的 溶液 (50 kxCi=1.1x108 dpm)， 然 后 点 样 在 两 张 Whatman DE81 fiz 上 。 其 中 的 一 张 依 次 用 0.5 mol/L NazHPO4 洗涤 五 次 ， 水 洗 二 次 ，95% 的 乙醇 洗 涤 一 次 。 两 张 膜 待 干 后 放 在 液 闪 溶 液 中 在 液 办 计数 器 上 计数 。 未 洗涤 一 张 所 计 的 数 值 是 全 部 的 放射 性 强度 〈 因 此 可 用 于 校正 液 闪 仪 的 计数 效率 )， 洗 涤 过 的 一 张 便 是 挫 入 到 探 针 中 的 放射 性 强度 。 (3 = (4 YA (5 —— (6 a i YA = 人 从 = 5X 献 1. Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13. 2. Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1984) A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity (Addendum). Anal. Biochem. 137, 266,267. ° 2h * 4 第 六 章 Southern 印迹 的 杂交 SE Fe PEAR 8 Rosemary E. Kelsell Ul 1. 4] AX DNA 的 酶 切 产 物 经 电泳 分 离 后 转移 到 固 相 支撑 物 (或 膜 ) 上 的 详细 内 容 已 载 在 第 三 、 四 章 中 ， 本 章 的 内 容 是 用 互补 的 标记 探 针 检测 特异 性 的 DNA。 这 个 方法 可 检 测 不 同 浓度 的 DNA， 甚 至 可 以 检测 到 哺乳 动物 基因 组 中 的 单 拷贝 基因 (DNA BEA 10 wg 中 含有 略 多 于 1 pg 的 可 杂交 DNA). 从 理论 上 讲 杂 交 包 括 标记 的 单 链 DNA 探 针 与 固定 于 膜 上 的 变性 DNA 的 复 性 过 程 。 在 实际 操作 中 须要 取得 最 大 杂交 信和 号 与 最 小 非特 异性 背景 的 一 个 平衡 点 。 很 多 因素 会 影 响 杂 交 信 和 号 的 强度 ， 探 针 的 长 度 与 杂交 液 的 离子 强度 对 于 决定 复 性 速率 是 极为 重要 的 ， 当 探 针 的 长 度 约 为 200 bp 并 且 杂 交 液 的 离子 强度 较 高 时 ， 可 以 得 到 最 佳 结果 。 最 重要 的 因素 是 DNA 浓度 (Co) 和 复 性 时 间 (ti)， 按 照 Co 关系 很 难 预 测 到 精确 的 杂交 动力 学 ， 尽 管 在 膜 上 杂交 时 复 性 反应 中 的 一 方 是 固定 的 。 从 理论 上 来 说 高 的 探 针 少 度 与 长 的 杂交 时 间 能 得 到 最 强 的 杂交 信号 ， 但 不 幸 的 是 这 样 的 条 件 也 同时 会 使 背景 加 深 ， 所 以 必 须 有 一 个 折 囊 的 办 法 。 杂 交 液 的 体积 必须 控制 得 越 小 越 好 ， 但 同时 必须 使 膜 在 任何 时 间 都 浸泡 在 溶液 中 。 加 入 10% 的 硫酸 萄 聚 糖 也 能 增加 探 针 的 有 效 浓 度 ， 从 而 使 杂交 速率 提高 10 倍 。 但 要 注意 使 硫酸 萄 聚 糖 彻底 溶解 ， 否 则 反而 会 造成 高 本 底 。 杂 交 时 间 应 控制 得 尽 可 能 地 短 。 合 适 的 杂交 时 间 大 约 是 3 倍 Cot 的 时 间 ， 检 测 基 因 组 中 单 找 贝 组 分 时 须 杂 交 12 一 16 h。 用 双 链 DNA 片段 制备 探 针 时 ， 即 使 再 延长 时 间作 用 也 不 大 ， 因 为 自我 复 性 作用 使 得 在 这 样 长 时 间 后 杂交 液 中 只 剩 下 极 少 量 的 游离 探 针 。 和 杂交 时 加 入 一 些 封 阻 剂 可 抑制 非特 异性 背景 的 产生 ， 例 如 以 下 三 种 试剂 ， 但 往往 组 合 应 用 : ® 润 湿 剂 ， 常 用 SDS. @ 阻止 膜 表 面 非 特异 性 结合 的 试剂 ， 最 常用 的 是 Denhardt RM! . @ 抑制 非特 异性 复 性 试剂 ， 通 常用 变性 的 DNA 片段 。 为 了 进一步 抑制 背景 的 产生 ， 在 用 探 针 进行 杂交 之 前 先 要 进行 预 杂 交 。 背景 的 产生 也 可 以 是 非常 特异 性 的 ， 原 因 可 能 是 探 针 中 混 有 其 他 的 序列 ， 但 更 重要 的 是 基因 组 DNA 杂交 时 的 探 针 中 含有 重复 序列 。 这 些 序列 以 不 同 的 大 小 与 频 度 广 证 分 布 在 所 有 的 真 核 生物 的 基因 组 中 。 例 如 人 类 基因 组 中 Alu 重复 序列 平均 每 隔 $ kb 出 现 一 次 31， 这 说 明 如 果 从 完整 和 或 黏 粒 所 克隆 的 基因 组 DNA 制备 长 的 探 针 ， 它 将 与 基因 组 的 许多 部 位 杂交 ， 造 成 一 片 模 糊 而 将 单 拷贝 序列 的 信号 掩盖 掉 。 解 决 这 个 问题 的 一 个 方法 是 采用 DNA 片段 的 亚 克 隆 制备 探 针 ， 这 样 能 保证 对 独特 DNA 序列 的 杂交 ， 只 是 . 亚 克 隆 操作 既 困难 又 费时 。 竞 争 杂 交 技 术 能 直接 除去 重复 序列 ， 该 技术 须要 预先 在 溶液 中 使 标记 探 针 与 已 剪 切 的 基因 组 DNA 进行 预 复 性 ， 这 时 探 针 DNA 中 所 有 的 重复 序列 AGO SEARED DNA 发 生 复 性 ， 使 得 Southern 杂交 时 只 剩 下 独特 的 序列 与 膜 上 的 DNA 进行 杂交 。 竞争 杂交 对 于 研究 基因 组 DNA 中 的 大 片段 是 非常 有 用 的 ， 例 如 使 用 长 探 针 可 以 加 速 鉴 定 与 疾病 有 关 基 因 的 限制 性 片段 长 度 多 态 性 (restriction fragment length polymor- phism, RFLP) 标记 !#5， 对 于 黏 粒 和 入 克隆 的 更 为 快速 的 鉴定 在 制作 长 距离 物理 图 谱 方面 尼 7 都 是 有 用 的 ， 不 论 是 分 析 野 生 型 基因 组 的 结构 还 是 对 大 范围 的 染色 体重 排 ， 例 如 缺失 589] 所 形成 的 交界 片段 的 鉴定 都 适用 。 此 外 利用 生物 素 标记 的 黏 粒 克隆 进行 荧 光 原 位 杂交 对 染色 体 水 平 的 基因 扩 增 机 制 研 究 的 结果 ， 说 明 这 一 技术 显然 已 经 达到 在 细 胞 分 裂 中 期 检测 单 拷贝 的 灵敏 度 00]。 预 复 性 步骤 的 条 件 与 温度 、 时 间 、 离 子 强度 以 及 DNA 的 复杂 程度 有 关 ， 已 经 研究 出 多 种 预 复 性 条 件 纺 2.2。 本 章 所 介绍 的 方法 是 根据 Sealey 等 人 的 工作 031。 第 3.2 节 中 所 载 的 实验 步骤 已 成 功 地 用 于 竞争 各 种 入 克隆 制备 的 探 针 中 的 重复 序列 ， 对 不 论 是 用 脉冲 电泳 还 是 用 常规 的 琼脂 糖 电泳 所 制备 的 印迹 膜 进行 探测 。 2. 材 料 所 有 常规 的 分 子 生 物 学 级 试剂 均 可 从 BDH 化 学 药品 有 限 公 司 (UK) 或 Fisons 公 司 (UK) 采购 。 所 有 的 溶液 用 灭 菌 蒸馏 水 并 按 分 子 生 物 学 的 要 求 配制 。 2.1 杂交 (BREF 1) 1) 20xSSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 、pH 7.0， 贮 存 于 室温 。 2) 100 X Denhardt 氏 溶液 : 2% (w/v) BSA (组 分 V，Sigma [UK]), 2% (w/v) ® 蔗糖 (Sigma), 2% (w/v) 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 (Sigma)， 贮 存 于 -20T7 。 3) 10%SDS: 贮存 于 室温 。 4) 10 mg/ml 链 鱼 精子 DNA (Sigma): 将 DNA 溶 于 水 中 ， 通 过 超声 波 法 或 连续 12 次 地 通过 一 个 17 SAE EAB DNA, APH 15 min 后 贮存 于 -20? 。 5) 预 杂 交 溶 液 : 3x SSC，10 x Denhardt 氏 溶 液 ，0.1% (w/v) SDS 4 50 pg/ml 的 多 鱼 精子 DNA。 预 杂交 液 可 配 成 母液 并 贮存 于 -20?7 。 6) 标记 探 针 (参见 第 五 、 七 、 八 、 十 一 、 十 二 章 ): 100 ng 标记 的 探 针 (BREF 2~4) 在 3x SSC 溶液 中 平衡 过 的 Sephadex GSO 离心 柱 中 纯化 〈 人 参见 注释 $)。 7) 杂交 液 : 预 杂 交 液 中 溶 入 10% (w/v) 的 硫酸 葡 聚 糖 (Pharmacia，UK)。 将 硫酸 萄 聚 糖 溶 于 OST 的 预 杂交 液 中 ， 不 时 剧烈 地 摇动 数 次 。 杂 交 液 要 在 杂交 进行 前 几 小 时 配制 ， 以 留 有 足够 的 时 间 使 硫酸 葡 聚 糖 溶解 ， 未 溶解 的 硫酸 葡 聚 糖 会 造成 点 状 背景 。 杂 交 液 可 配 成 浓缩 液 于 -20C 贮存 。 8) 杂交 炉 与 杂交 管 : 作者 发 现 使 用 杂交 管 进 行 实验 十 分 方便 。 在 这 个 装置 中 将 膜 铺 在 玻璃 管 的 内 壁 ， 管 子 置 于 杂交 炉 中 的 旋转 圆 简 上 ， 用 这 个 装置 可 以 很 方便 地 更 换 溶 ae. 液 并 且 可 以 将 杂交 液 的 体积 控制 得 非常 之 小 。 这 些 装置 可 以 购买 到 (例如 Hybaid Ltd, UK 与 Techne, UK ) 或 是 自制 .其 他 的 一 些 系 统 也 能 很 好 地 用 于 杂交 但 却 较 难 装 置 。 另 一 种 常用 的 方法 是 在 浸 于 水 浴 中 的 封闭 杂交 袋 中 进行 杂交 (参见 注释 6)。 洗涤 液 : 用 贮存 液 配制 3 L #9 3x SSC, 0.1% (w/v) SDS, #1 3 L 0.1 SSC, 0.1% (w/v) SDS. 10) 合适 的 放射 自 显影 胶卷 : 例如 柯达 X-OMAT AR. 11) 探 针 洗涤 液 a. 500 ml 的 0.4 mol/L NaOH. b. 0.1XSSC, 0.5%SDS, 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 7.5. 9 SS 2.2 竞争 杂交 RK Bip icd A 1k BP RK: 20 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.25% (w/v) SDS, 1 pmol/L dCTP. 竞争 物 DNA: 20 mg/ml 溶 于 TE 的 剪 切 过 的 基因 组 DNA (合适 品种 或 合适 类 型 的 DNA)， 可 用 下 法 制备 : 基因 组 DNA 溶解 于 适量 的 体积 后 以 $ s 的 间隔 超声 振荡 20 一 30 次 ， 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 相 对 分 子 质 量 的 大 小 ， 合 适 DNA 片段 的 大 小 应 是 平均 500 bp。 用 酚 / 和 氯仿 与 氯仿 各 抽 提 一 次 后 乙醇 沉淀 。 用 分 光 光 度 计 测 定 浓度 ， 最 后 将 浓度 调节 至 20 mg/ml. 1 =" 2 Na 3.1 #& 交 1) 2x SSC 淋 洗 膜 后 置 于 合适 的 容器 中 (例如 杂交 管 中 ) 并 加 入 10 ml LAM HARK (参见 注释 7)， 于 65SY 转动 或 揪 动 3 一 4 h (参见 注释 8)。 临 用 前 将 探 针 煮 沸 5 一 10 min 使 探 针 变 性 〈 参 见 注 释 4)， 立 即 加 入 到 6SY MAN 10 ml] 左右 的 杂交 液 中 (参见 注释 9)。 倒 去 预 杂交 液 并 加 入 完成 的 杂交 液 ， 如 果 使 用 杂交 管 ， 那 么 这 两 步 操作 都 很 方便 。 65C 旋转 〈 用 杂交 管 ) 或 摇动 过 夜 。 杂交 结束 时 取出 膜 (BLUE FE 10)， 放 入 500 ml 3xSSC，0.1% SDS 的 溶液 中 于 室 温 洗 涤 1 min 以 洗 去 未 杂交 上 的 探 针 DNA. BRAK. 将 膜 放 入 500 ml 6SY 预 热 的 3xSSC，0.1%SDS 溶液 中 洗涤 10 min。 重 复 二 次 〈 参 见 注释 11)。 将 膜 放 在 500 ml 65°C 预 热 的 0.1x SSC，0.1% SDS 溶液 中 洗涤 15 min。 重 复 一 次 (人 参见 注释 12). 从 洗涤 液 中 取出 膜 置 于 聚 乙烯 膜 上 或 聚 乙烯 袋 中 ， 如 果 可 能 的 话 将 袋 封 住 。 纪 令 膜 干燥 ， 和 否则 从 膜 上 取 下 探 针 再 次 杂交 或 洗涤 将 是 非常 困难 的 。 如 果 使 用 ?2P 标记 的 探 针 ， 令 膜 放 射 显 影 2 一 24 h (参见 注释 13)， 如 需 长 时 间 曝 光 ， 2 sa 3 Na 4 YA 5 YA 6 — y 8 =’ 可 将 膜 放 置 两 周 。 9) 同一 张 膜 上 的 第 一 个 探 针 经 洗涤 除去 后 可 用 第 二 个 探 针 进行 杂交 。 将 膜 于 42?Y 中 在 500 ml 0.4 mol/L 的 NaOH 中 放置 30 min 后 转移 到 0.1 x SSC, 0.5% SDS, 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 7.5 的 溶液 中 再 放置 30 min。 膜 可 以 再 次 进行 射线 底片 的 曝光 ， 用 以 检测 是 否 除 尽 了 探 针 ， 最 后 贮存 于 4% 的 预 杂 交 液 中 备用 。 本 文 作 者 在 下 一 次 使 用 此 膜 前 通常 加 入 新 鲜 的 预 杂 交 液 。 3.2 探 针 的 竞争 杂交 1) 用 朝 核 苷 酸 标 记 的 终止 缓冲 液 将 标记 探 针 的 体积 调节 到 200 pl, MA 150 pl BRE 酸 标记 的 终止 缓冲 液 后 ， 探 针 经 过 Sephadex G50 离心 柱 一 般 能 回收 约 50 pl (BI TERE 5), DNA 50 pl 20 mg/ml 的 竞争 物 DNA 4 50 由 的 20 x SSC. 2) 混合 物 放 入 沸水 浴 中 10 min 进行 变性 ， 然 后 立即 置 于 冰 浴 中 1 min. 3) 反应 液 在 65C 中 放置 10 min (参见 注释 14 与 图 6.1)。 (A) (B) PRET 8 8.4 kb 6.8 kb 5.6 kb fake 2.7 kb 1.2 kb 1.5 kb Hind Il BamH | 图 6.1 (A) WP 标记 的 约 15 kb 长 的 入 克隆 为 探 针 ， 用 3.2 节 中 介绍 的 竞争 杂交 ， WE Hind BVH CHO 基因 组 DNA 杂交 。 在 这 探 针 所 覆盖 的 DNA 区 域内 至 少 可 见 4 个 等 同 于 Alu 的 重复 序列 (GRE 8，Davis 与 Meuth， 参 考 文献 9)。 (B) 用 另外 一 个 2P 标记 的 入 克隆 作为 探 针 与 BamH I BAY CHO 基因 组 DNA 杂交 ( 探 针 6，Davis 与 Meuth， 参 考 文献 9) 。 在 这 一 实例 中 重复 序列 与 探 针 的 竞争 并 不 像 前 一 个 实例 中 那样 成 功 。 sa 25 - 4) 在 杂交 液 中 加 入 这 一 经 竞争 处 理 过 的 探 针 ， 接 着 按 3.1 节 第 三 步 进行 操作 (BIE FE 15 与 16)。 (1) (2) (3) (4) (S) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 4. 35 iE 其 他 的 溶液 同样 能 很 好 地 用 来 进行 杂交 (例如 10% HY SDS 45 7% HY PEG 6000 无 论 对 尼龙 膜 的 预 杂 交还 是 杂交 都 适合 David Kelsell， 未 发 表 )。 作 者 所 用 的 膜 是 质量 很 高 的 尼龙 膜 (例如 Genescreen 或 Genescreen plus, NEN DuPont, UK), 膜 上 的 探 针 去 除 后 ， 可 用 于 其 他 探 针 的 重复 杂交 。 使 用 随机 引物 法 能 方便 地 得 到 比 活 大 于 10° cpm/pg 的 DNA 双 链 标记 探 针 。 通常 在 制备 探 针 DNA 时 不 必 将 载体 序列 除去 ， 只 要 在 进行 毛细 管 转 移 前 将 能 与 相对 分 子 质量 标准 进行 交叉 杂交 的 泳 道 从 胶 上 切除 。 例如 入 克隆 的 臂 在 杂交 时 会 与 入 相对 分 子 质量 标准 杂交 ， 质 粒 中 的 某 些 序列 则 会 与 1 kb 的 梯度 相对 分 子 质 量 标准 (Gibco-BRL, UK) 中 的 某 些 条 带 发 生 杂 交 。 当 使 用 放射 性 标记 的 探 针 时 要 多 加 小 心 。 作 者 在 处 理 放 射 性 标记 的 探 针 时 使 用 1.5 ml 的 螺 口 盖 离 心 管 ， 以 防止 变性 过 程 中 盖子 弹 开 。 可 以 使 用 商品 的 离心 过 滤 柱 ， 但 实际 上 Sephadex G50 离心 柱 既 便宜 又 便于 制作 。 柱 的 制备 可 按 第 四 十 九 章 所 介绍 的 ， 不 同 的 是 用 3 x SSC 而 不 是 用 TE 来 平衡 柱 。 装 柱 必 须 在 临 用 前 进行 ， 并 且 不 能 让 柱 中 的 缓冲 液 流 干 。 在 袋 中 进行 杂交 时 须 将 膜 封 入 袋 内 ， 但 注意 要 将 封口 处 做 成 漏斗 状 。 含 探 针 的 杂 交 混 合 液 可 以 通过 这 个 漏斗 状 的 口 倒 入 袋 中 。 用 一 根 10 ml 的 一 次 性 移 液 管 将 气 泡 赶 到 袋 的 顶部 ， 这 样 可 以 比较 容易 地 将 气泡 从 漏斗 中 赶 出 。 用 这 个 方法 可 以 在 最 少 洲 出 的 情况 下 将 袋 封 牢 。 可 以 先 用 装 水 的 空 袋 进行 练习 。 按 一 般 准 则 ， 每 平方 厘米 的 膜 至 少 要 用 0.2 ml 的 预 杂 交 液 。 预 杂 交 可 以 进行 过 夜 ， 但 是 会 降低 膜 的 强度 并 有 可 能 使 信号 减弱 。 浓度 为 1 一 10 ng/ml 的 探 针 杂交 时 信 噪 比 最 佳 。 如 果 用 10 ng/ml 的 探 针 杂交 产生 高 背景 时 可 以 将 探 针 浓度 稀释 10 倍 后 再 试行 杂交 。 探 针 可 以 贮存 起 来 再 次 使 用 。 放 射 性 同位 素 标记 的 探 针 贮存 时 间 与 半衰期 有 关 ， ”“P 的 贮存 时 间 为 两 个 星期 。 对 于 非 放射 性 标记 的 探 针 来 说 就 不 存在 贮存 时 间 的 问 题 了 。 由 于 探 针 分 子 在 杂交 时 会 自我 复 性 ， 所 以 再 次 使 用 前 须 煮 沸 1$ min。 这 是 低 严 格 性 的 洗涤 ， 探 针 可 以 与 相似 的 〈 同 源 的 ) 以 及 完全 一 样 的 序列 结合 。 这 时 可 以 进行 放射 自 显影 以 检测 这 些 相 关 序列 。 低 盐 溶液 的 连续 洗涤 可 以 提高 洗 淋 的 严格 性 。 这 是 严格 的 洗涤 ， 只 能 检测 到 与 探 针 全 同 的 序列 。 放射 自 显影 的 灵敏 度 与 曝光 的 条 件 有 关 。 用 装 有 橙色 滤 色 片 的 闪光 枪 预先 对 底片 进行 一 次 曝光 (<1 ms) 可 使 底片 的 灵敏 度 提 高 二 倍 ， 并 且 与 放射 性 的 强度 呈 线 性 关系 。 此 外 在 底片 的 后 面 放 上 增 感 屏 并 在 - 70°C 进行 放射 自 显影 时 可 使 灵敏 度 提高 10 倍 ， 但 分 辨 率 有 所 下 降 04.1551。 10 min 的 预 复 性 时 间 已 经 足够 。 但 是 如 果 放 和 自 显 影 后 仍然 出 现 重 复 序列 的 条 带 ， 如 图 6.1(B)， 就 须 核实 所 用 前 切 的 基因 组 DNA 是 否 足 够 。 过 高 地 估计 剪 切 sa 26° 基因 组 DNA 的 浓度 是 产生 这 一 问题 的 常见 原因 ， 如 果 仍 不 能 解决 问题 的 话 ， 可 将 预 复 性 时 间 延 长 至 1 h。 (15) 本 文 作 者 和 别人 都 发 现 Southern 杂交 时 竞争 探 针 会 产生 比 单 拷贝 探 针 更 强 的 信 号 ， 原 因 可 能 是 探 针 过 长 所 引起 。 (16) 本 文 作者 用 这 个 方法 曾 观察 到 过 600 一 7000 bp 长 的 片段 。 参考 文 献 1. Wahl, G. M., Stern, M., and Stark, G. R. (1979) Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridiza- tion by dextran sulphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3683-3687. 2. Denhardt, D. T. (1966) A membrane filter technique for the detection of comple- mentary DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646. 3. Deininger, P. L. (1989) SINES: short interspersed repeated DNA elements in higher eukaryotes, in Mobile DNA (Berg, D. E. and Howe, M. M., eds.), American Soci- ety for Microbiology, Washington, DC, pp. 619-636. 4. Litt, M. and White, R. L. (1985) A highly polymorphic locus in human DNA revealed by cosmid-derived probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6206-6210. 5. Blonden, L. A. J., den Dunnen, J. T., van Paassen, H. M. B., Wapenaar, M. C., Grootscholten, P. M., Ginjaar, H. B., Bakker, E., Pearson, P. L., and van Ommen, G. J. B. (1989) High resolution deletion breakpoint mapping in the DMD gene by whole cosmid hybridization. Nucleic Acids Res. 17, 5611-5621. 6. Compton, D. A., Weil, M. M., Jones, C., Riccardi, V. M., Strong, L. C., and Saunders, G. F. (1988) Long-range physical map of the Wilms’ tumor-aniridia region on human chromosome 11. Cell 55, 827-836. 7. Compton, D. A., Weil, M. M., Bonetta, L., Huang, A., Jones, C., Yeger, H., Will- iams, B. R. G., Strong, L. C., and Saunders, G. F. (1990) Definition of the limits of the Wilms tumor locus on human chromosome 11p13. Genomics 6, 309-315. 8. Blonden, L. A. J., et al. (1991) 242 breakpoints in the 200-kb deletion-prone p20 region of the DMD gene are widely spread. Genomics 10, 631-639. 9. Davis, R. E. and Meuth, M. (1994) Molecular characterization of multilocus dele- tions at a diploid locus in CHO cells: association with an intracisternal-A particle gene. Somat. Cell. Mol. Genet. 20, 287-300. 10. Smith, K. A., Gorman, P. A., Stark, M. B., Groves, R. P., and Stark, G. R. (1990) Distinctive chromosomal structures are formed very early in the amplification of CAD genes in Syrian hamster cells. Ce// 63, 1219-1227. 11. Ardeshir, F., Giulotto, E., Zieg, J., Brison, O., Liao, W. S. L., and Stark, G. R. (1983) Structure of amplified DNA in different Syrian hamster cell lines resistant to Mphosphonacetyl)-L-aspartate. Mol. Cell. Biol. 3, 2076-2088. 12. Djabali, M., Nguyen, C., Roux, D., Demengeot, J., Yang, H. M., and Jordan, B. R. (1990) A simple method for the direct use of total cosmid clones as hybridization probes. Nucleic Acids Res. 18, 6166. 13. Sealey, P. G., Whittaker, P. A., and Southern, E. M. (1985) Removal of repeated sequences from hybridization probes. Nucleic Acids Res. 13, 1905—1922. 14. Laskey, R. A. and Mills, A. D. (1975) Quantitative film detection of 7H and 14C in polyacrylamide gels by fluorography. Eur. J. Biochem. 56, 335-341. 15. Laskey, R. A. and Mills, A. D. (1977) Enhanced autoradiographic detection of 32P and 125I using intensifying screens and hypersensitive film. FEBS Lett. 82, 314-316. > By ， 第 七 章 ” Southern 4420 Hh 74 (AY 核 苷 酸 标 记 DNA 探 针 的 应 用 Tim Helentjaris, Tom McCreery QU 1. 引 无 论 是 用 地 高 辛 还 是 生物 素 标记 的 探 针 都 可 以 用 来 进行 Southern 印迹 杂交 以 检测 目标 核 苷 酸 序 列 ， 这 些 方法 在 安全 性 、 价 格 与 效率 等 方面 都 优 于 放射 性 同位 素 标 记 的 方 法 。 以 前 使 用 的 非 同位 素 标 记 方 法 大 多 是 利用 偶 联 有 抗体 或 抗 生 物 素 蛋 白 (avidin) 的 磷酸 酯 酶 来 检测 经 修饰 的 碱 基 ， 用 氮 蓝 四 只 (Nitro Blue Tetrazolium, NBT) Bf, A 蓝 四 唑 转变 成 不 溶 于 水 的 有 色 物 质 ， 沉 淀 在 杂交 的 原 位 。 用 化 学 发 光 物 质 取 代 这 种 颜色 反应 能 提高 检测 灵敏 度 ， 并 且 更 便于 将 膜 再 次 用 于 杂交 。 发 光 化 合 物 例如 (adamantyl 1, 2 dioxetane phosphatase, AMPPD)!"! 2 — Fh i ET EME, AWE ROEDER 酯 酶 分 解 发 出 光线 ， 直 接 使 标准 的 X TAR RG. ABU NBT 检测 法 制备 的 探 针 A FI FIX HTK. ZEA AE ER AY RI EA AMPPD 的 稀 溶 液 中 后 即 可 于 室温 或 37 ， 而 不 是 -707 进行 曝光 。 对 于 检测 甚至 是 器 官 中 提取 的 大 基因 组 DNA 中 的 单 拷贝 ， 曝 光 时 间 都 只 需 从 45 min 至 几 个 小 时 不 等 。 现 在 又 有 了 具有 更 高 灵敏 度 与 更 长 发 光 时 间 的 底 物 ， 例 如 CSPD、CDP 与 CDP*™ (〈Tropix，Bedford，MA)。 这 些 底 物 的 使 用 方法 与 AMPPD 完全 相同 。 本 方法 所 需要 的 探 针 很 容易 用 两 种 方法 中 的 一 种 来 制备 。 尽 管 以 前 的 各 种 方法 都 是 利用 放射 性 挫 入 的 机 制 来 修饰 核 昔 酸 ， 但 是 现在 用 随机 六 核 苷 酸 引物 标记 守 核 苷 酸 却 是 得 到 高 度 特异 性 的 DNA 杂交 探 针 的 有 效 方法 器 。 早 期 的 研究 报道 DNA 聚合 酶 TI 可 以 将 地 高 辛 - 11 - dUTP 作为 底 物 摊 入 到 DNA 双 链 中 去 B]。 我 们 同样 发 现 只 要 对 我 们 以 前 的 方法 稍 加 改进 就 能 使 地 高 辛 摊 入 的 探 针 在 Southern 杂交 中 检测 到 极 少 量 的 目标 DNA (1 pg 或 更 少 )。 这 个 技术 尤其 能 有 效 地 标记 从 低 熔点 琼脂 糖 凝 胶 中 分 离 出 来 的 DNA 片 段 以 及 对 于 不 适用 PCR 方法 的 DNA 片段 进行 标记 〈 人 参见 注 释 1)。 DNA 聚合 酶 链 式 反应 (polymerase chain reaction, PCR)! 是 利用 位 于 两 侧 的 引物 有 效 地 拷贝 出 DNA 片段 的 一 种 有 效 方法 。 大 部 分 克隆 载体 都 利用 带 有 多 克隆 位 点 6] 的 lacZ 基因 ， 所 以 只 需要 一 对 引物 就 可 以 扩 增 插入 到 a BK KF BK pUC 质粒 系列 及 其 衍生 物 中 的 很 多 序列 。 我 们 在 扩 增 大 于 3000 bp 长 度 的 插入 片段 时 几乎 没有 什么 困难 ， 因此 我 们 现在 认为 在 定位 和 测序 的 工作 中 ， 可 以 用 这 一 方法 来 代替 通过 细菌 培养 和 纯化 来 提供 这 样 长 度 的 DNA 的 方法 。 由 于 Tag DNA 聚合 酶 能 在 产物 中 挫 入 地 高 辛 - 11 = dUTP， 所 以 PCR 法 是 一 个 制备 探 针 的 首选 方法 ， 它 具有 以 下 优点 : @ 只 需 少量 的 模板 DNA 就 能 产生 大 量 的 产物 ; @ 模板 DNA 可 以 从 已 纯化 的 DNA ( 超 螺旋 或 线 型 分 子 ) 或 者 是 含有 质粒 的 细菌 ae 。 FFE AD NRE Ay UE al (AR BY) An a 22 PS 2 ; 7 @ 通过 标准 的 琼脂 糖 凝 胶 电泳 监察 双 链 DNA 的 形成 ， 很 容易 判断 标记 反应 的 进行 程度 。 PCR 标记 法 也 有 以 下 缺点 : D 目标 序列 必须 克隆 到 某 种 载体 上 ， 这 种 载体 的 两 侧 引 物 或 基因 专 一 的 引物 都 是 可 以 得 到 的 ; @ 在 扩 增 大 于 3000 bp 的 长 度 时 经 常会 碰 到 困难 ; @ 即使 当 长 度 小 于 3000 bp 时 也 可 能 因 高 GC 比 或 是 形成 折 和 结构 而 造成 扩 增 困 难 。 不 过 我 们 发 现 这 个 方法 尤其 适用 于 朝 核 苷 酸 的 标记 ， 并 且 我 们 经 常会 尝试 应 用 于 任 ff] DNA 模板 ， 直 到 在 实验 中 碰 到 困难 为 止 。 非 放射 性 物质 修饰 碱 基 的 方法 要 比 放射 性 物质 修饰 的 方法 价格 低廉 ， 并 且 产 物 的 稳定 期 也 大 大 长 于 ”P 标记 的 探 针 。 通 过 以 上 提 供 的 两 种 经 济 而 又 安全 的 标记 方法 都 能 制备 出 足以 检测 出 非常 复杂 的 基因 组 中 的 单 拷贝 FRI BIER ET 2. 材 料 2.1 BRARiIC HARB RricikAyee -20C, ART EKA PRR. 1) WMO: 44.52 g Tris, 7.47 g MgCl WF 150 ml 水中， 用 HCl pH 值 调 节 到 8.0 后 定 容 至 25$0 ml. 2) 溶液 A: 18 pl B-RiZE ZB, 25 wl 100 mmol/L dATP, 25 pl 100 mmol/L dCTP, 25 wl 100 mmol/L dGTP, 4 pl 100 mmol/L dTTP, ¥¥ 899 pl HARROP (BILE fF 1). 3) 溶液 B (2 mol/L HEPES ): 119.15 g HEPES 溶 于 100 ml 水 中 ， 用 4 mol/L NaOH 将 pH 值 调节 到 6.6 REA Z 250 ml。 4) YMC: 将 55$ 岂 的 水 加 到 50 U 的 随机 六 核 苷 酸 混合 物 中 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 5) SX RRPRABM: 将 溶液 A，B 与 C 以 1.0:2.5:1.5 的 比例 混合 。 6) BSA: 10 mg/ml， 贮 存 于 -20? 。 7) 地 高 辛 - 11 - dUTP: 将 37.5 pl 的 水 加 到 25 pl 1 mmol/L 的 母液 中 (Boehringer Mannheim，Mannheim,，Germany)， 使 其 形成 400 pmol/L 的 浓度 。 8) 从 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 I 中 得 到 的 Klenow 片段 : 用 7 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 7 mmol/L MgCl, 50 mmol/L NaCl，50% 的 甘油 将 酶 的 母液 稀释 至 1 U/nwl。 - 29 - 1) 2) 3) 4) 5) 6 YA i SS 2 ~~ 3) 4) 3 — 6 Ye 7) 8) 9) 10) 2.2 PCR 法 标记 10 X PCR 缓冲 液 : 将 3.7 ml 灭 菌 蒸馏水 ，$.0 ml 500 mmol/L KCl, 1.0 ml 1 mol/ L Tris-HCl, pH 8.2, 0.2 ml 1 mol/L MgCl, 和 0.1 ml1% 的 明胶 混合 。 dXTPs: 配制 含有 2.5 mmol/L dATP, dGTP, dCTP 与 dTTP 的 混合 溶液 。 引物 : 对 每 一 个 反应 引物 可 以 是 特异 的 (通常 是 随 载体 而 异 ， 参 见 注释 2)， 但 是 我 们 在 扩 增 pUC 载体 中 的 插入 片段 或 是 其 他 带 有 具 多 克隆 位 点 的 /acZ 的 载体 时 ， 使 用 了 同一 对 引物 。 100 pmol/L PCRFSEQ: $' TTGTA AAACG ACGGC CAGTG 3’ 100 pmol/L PCRRSEQ: 5’ GGAAA CAGCT ATGAC CATGA T 3’ 将 这 些 引 物 以 1:1 的 比例 混合 ， 得 到 每 个 引物 浓度 为 $S0 umol/L 的 溶液 。 Taq DNA 聚合 酶 : 厂商 以 $ U/ 岂 的 浓度 供应 。 1X 标 记 反 应 液 : 每 个 样品 需要 24 已 的 这 种 混合 液 。 将 19 由 灭 菌 蒸馏 水 、2.5 pl 10xPCR 缓冲 液 、0.5 pl 2.5 mmol/L dXTP、1.0 凡 稀 释 的 地 高 辛 -11-dUTP ( 参 见 注释 3)、0.5 岂 混 合 的 引物 与 0.1 pl Taq 聚合 酶 混合 。 矿物 油 : 我 们 使 用 的 是 从 市 场 上 购买 的 USP 级 的 重 矿物 油 。 2.3 KFA 转移 膜 : 像 放 射 性 标记 检测 法 那样 准备 膜 ， 非 常 重要 的 一 点 是 必须 戴 上 手套 或 用 狂 子 处 理 胶 或 膜 ， 因 为 膜 上 的 指 痕 不 能 被 除去 并 且 会 在 以 后 的 显 色 过 程 中 造成 明显 的 污 迹 。 当 使 用 AMPPD 显 色 时 只 能 使 用 尼龙 膜 ， 因 为 AMPPD 在 尼龙 膜 内 是 稳定 的 ， 如 果 使 用 硝酸 纤维 素 膜 或 PVDF 膜 就 会 达 不 到 同样 的 检测 灵敏 度 。 预 杂交 /杂交 缓冲 液 :, SX SSC，0.1% ”=- 十 二 烷 酰 肌 氨 酸 钠 (粉末 型 )，0.02% 十 二 烷 基 硫酸 钠 (sodium lauryl sulfate，SDS)，0.1% 封 阻 试剂 〈(Tropix 或 Boehringer Mannheim 出 品 )，100 pg/ml 甸 鱼 精子 DNA. 洗涤 液 : 0.1xSSC、0.1% SDS. 缓冲 液 I: 0.05 mol/L Tris-HCI、pH7.5，0.15 mol/L NaCl。10x 的 母液 要 提前 配 制 并 经 高 压 灭 菌 ， 临 用 前 稀释 。 SAR (SA): BPM [中 含有 0.1% 的 封 阻 剂 。 绥 冲 液 I 早 一 天 配制 对 工作 有 利 。 将 配制 溶液 的 一 部 分 于 6ST 保温 过 夜 以 保证 封 阻 剂 彻底 溶解 。 抗 地 高 辛 溶液 : 含有 2.5 岂 的 抗 地 高 辛 抗体 / 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 物 (Boehringer Mannhein # 1093 274) 与 50 由 的 封 阻 缓 冲 液 。 溶 液 必须 在 临 用 前 配制 。 1 mol/L Tris-HCI，pH 9.$， 高 压 灭 菌 。 1 mol/L MgCL, mIEKE. 5 mol/L NaCl, MIEKA. wh WM: 0.1 mol/L 二 乙醇 胺 (2.4 ml/250 ml 终 溶 液 )、1 mmol/L MgCh, 0.02% A LH, FAY HCI pH 值 调 节 到 10.0。 - 30 - 11 SN AMPPD 溶液 : 每 毫升 缓冲 液 开 中 加 入 2 pl Tropix AMPPD。 估 计 大 约 2.5 ml 足够 对 10 cmx10 cm 的 印迹 膜 显 色 ， 按 比例 配制 所 需 的 量 。 未 稀释 AMPPD 的 保质 期 约 为 3 个 月 。 12) 脱色 溶液 : 同 洗涤 液 。 13) 标记 的 相对 分 子 质 量 标准 〈 人 参见 注释 4)。 3. 方 法 3.1 寡 核 苷 酸 标记 1) 50~500 ng DNA (从 载体 上 切 下 ， 用 合适 的 方法 从 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 得 到 ， 参 见 注释 $) 加 入 到 装 有 18 pl KH 0.65 ml 的 微型 离心 管 中 。 2) 将 DNA 在 9SY 热 变 性 10 min. 3) 立即 将 变性 DNA 的 小 管 放 在 冰 上 冷却 。 4) 立即 加 入 下 列 试剂 并 充分 混合 : 5 ol SX CRAP RBPM, 0.5 pl BSA, 0.5 pl Hh 高 洗 =11=dOTP，1 pl Klenow 片段 5 37 保温 90 min 一 18 h (看 来 3 h 的 标记 已 经 充分 )。 ~~ 5 Se 探 针 可 立即 使 用 或 贮存 后 备用 。 如 在 数 周 内 使 用 可 保存 于 4C ， 如 长 期 中 使 用 则 可 4E-20C HR (参见 注释 6 和 7)。 3.2 PCR 标 ic PCR 扩 增 的 条 件 随 着 使 用 引物 的 不 同 而 异 。 我 们 发 现 提 高 复 性 温度 有 利于 富 含 GC 的 模板 的 扩 增 ， 为 此 推荐 应 用 复 性 温度 至 少 为 COT 或 更 高 的 引物 。PCR 循环 包含 有 三 步 : 第 一 步 是 变性 ， 即 将 双 链 DNA 分 离 成 二 条 单 链 ; 第 二 步 是 复 性 ， 引 物 与 单 链 模板 DNA 相互 结合 ; 第 三 步 才 真正 是 扩 增 ， 即 Taq DNA 聚合 酶 复制 模板 DNA 序列 。 典 型 的 扩 增 程序 是 9SC 、2 min，60C 、30 s 与 72C 3 min。 这 个 循环 过 程 中 OST 的 时 间 较 长 ， 目 的 是 对 模板 DNA 在 开始 时 就 进行 高 效 变性 。 接 下 来 是 18 个 下 列 循环 : 95ST, 30s, 60C. 30s 72C. 3 ming RI—TIADN 95T. 30s, 600. 30s 5 720, 10 min， 目 的 是 提供 一 个 长 时 间 的 扩 增 步骤 ， 有 助 于 最 后 完成 那些 以 前 已 经 起 始 〈 但 尚 未 完成 ) 的 反应 产物 。 完 成 反应 后 在 热 循 环 仪 中 6 保温 18 h， 这 样 便于 放置 过 夜 于 开 晨 继续 操作 。 1) 1 ml 过 夜 培养 的 感染 有 入 喉 菌 体 的 裂解 液 (人 参见 注释 8) 或 是 1 一 10 ng 的 模板 DNA (参见 注释 9) 加 入 到 65 pl 的 微型 离心 管 中 或 是 能 在 热 循 环 仪 中 使 用 的 96 FL 板 的 一 个 孔 中 。 2) 全 部 所 需 的 混合 液 一 次 配制 ， 然 后 每 次 取出 24 岂 与 每 个 小 管 中 的 液体 混合 。 用 微 量 移 液 器 吸 放 数 次 借以 混 匀 。 3) 在 混合 物 置 于 管 中 后 加 入 2 滴 矿 物 油 以 防止 在 热 循 环 仪 中 进行 扩 增 过 程 中 液体 的 蒸 中 发 。 4) 将 小 管 或 孔 板 放 在 热 循 环 仪 内 开始 执行 程序 。 5) 在 最 后 的 72YC 延伸 步 又 完成 后 即 可 取出 小 管 ， 也 可 于 仪器 上 67 保存 过 夜 。 取 下 小 管 后 用 微量 移 液 器 将 下 层 的 水 相 吸出 ， 转 移 到 干净 的 小 管 中 。 随 着 目标 DNA 片段 大 小 的 不 同 ，PCR 反应 的 预期 产量 也 在 500 一 1000 ng 之 间 变 动 。 如 须 准 确 测定 这 个 反应 的 产量 可 取 4 由 产物 进行 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 析 ， 如 需 更 多 产物 只 要 将 规模 放大 便 可 。 用 本 方法 标记 的 探 针 贮存 于 - 200 可 保持 稳定 数 月 甚至 更 XK ° 3.3 化 学 发 光 法 检测 1) 以 每 100 cm? 膜 面积 使 用 3 ml 预 杂交 液 计 算 ， 在 塑料 盒 或 杂交 炉 中 于 60 一 65C HE 2 3 ) SS 行 1h 或 更 长 时 间 的 预 杂 交 。 将 探 针 进 行 9SC 、10 min 的 变性 处 理 。 杂 交 液 中 加 入 终 浓 度 为 5~20 ng/ml HR 针 DNA， 通 常 每 毫升 杂交 液 中 含有 2 ul 的 探 针 时 能 产生 很 好 的 结果 。 用 含有 变性 探 针 的 新 鲜 杂 交 液 代替 预 杂交 液 ，6S 保温 6 h 或 过 夜 。 除 非 同 一 容器 中 有 几 张 膜 同时 杂交 ， 不 须 在 杂交 过 程 中 进行 混 匀 。 4) 倒 出 杂交 液 。 (杂交 液 可 于 4Y 保存 并 重复 使 用 数 次 而 几乎 不 影响 杂交 信和 号 的 强 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ) ) SA ) ) ) 4 Ye YA FE). 用 至 少 200 ml 洗涤 液 在 良好 的 搅动 条 件 下 于 室温 洗涤 二 次 ， 每 次 3 min. 用 至 少 200 ml 洗涤 液 在 良好 的 搅动 条 件 下 于 6SC 洗涤 30 min。 这 步 的 目的 是 除去 任何 未 结合 在 膜 上 的 探 针 DNA。 用 缓冲 液 工 在 室温 条 件 下 洗涤 $ min (这 步 及 以 后 的 洗涤 均 在 室温 进行 并 且 须 剧烈 摇动 )。 这 步 的 目的 是 洗 去 膜 上 的 洗涤 液 为 封 阻 剂 的 作用 做 好 准备 。 用 200 ml 封 阻 剂 处 理 30 min。 这 步 的 目的 是 防止 膜 表 面 与 非特 异性 的 抗体 结合 。 用 200 ml 抗 地 高 辛 溶液 处 理 30 min。 在 这 个 过 程 中 抗体 / 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 物 与 膜 上 的 地 高 辛 标记 的 探 针 结 合 。 用 200 ml 缓冲 液 I 洗 涤 3 次 ， 每 次 $ min。 这 步 的 目的 是 洗 去 未 结合 的 抗体 / 碱 性 BER BREE AD 用 缓冲 液 开 洗涤 10 min 一 次 。 这 步 的 目的 是 保证 pH 值 适合 于 酶 与 底 物 AMPPD 作 用 。 从 缓冲 液 开 中 取出 膜 ， 置 于 与 X 线 片 盒 大 小 一 致 的 有 机 玻璃 板 上 (不 须要 用 增 感 屏 )。 小 心地 向 每 张 膜 上 加 上 2.5 ml 的 AMPPD 溶液 ， 用 Saran WrapIM 或 mylar0) 膜 包 好 防止 干 泗 。 无 论 哪 种 方法 都 可 用 ， 只 要 方便 。 37 放置 3 h 或 室温 放置 曝光 过 夜 。 曝 光 的 时 间 取 决 于 目标 DNA 序列 的 量 、 探 针 的 标记 强度 以 及 探 针 的 加 入 量 。 1) 疑 是 nylon 之 误 。 一 一 译 者 注 多 二 2 = 杂交 的 结果 应 该 是 出 现 于 干净 背景 上 的 清晰 黑色 条 带 (CBS LEE 10 和 11)。 如 须 再 次 使 用 这 张 膜 可 将 其 置 于 沸腾 的 脱色 液 中 洗涤 10 min 以 除去 探 针 DNA. Fl TE 洗涤 除去 脱色 液 后 可 于 4Y 中 短 时 间 贮 存 ， 空 气 干 燥 后 则 可 于 4Y 中 贮存 数 月 〈 参 见 注释 12)。 4. jE 释 (1) 标记 反应 中 修饰 碱 基 的 量 从 dTTP 总 浓度 的 20% 下 降 到 SOM AT MERA SR, GFA 这 样 做 还 能 增加 标记 反应 的 效率 ， 充 分 利用 最 终 产物 。 我 们 发 现 地 高 注 标 记 的 控 针 在 化 学 性 质 上 与 放射 性 标记 的 探 针 略 有 不 同 ， 原 因 可 能 在 探 针 DNA 的 碱 基 上 引入 了 长 的 侧 链 。 在 较 低 的 杂交 温度 时 它们 能 形成 更 加 稳定 的 杂交 产物 ， 并 且 一 且 杂 交 上 后 它们 更 难于 从 膜 上 除去 。 当 dUTP 的 浓度 小 于 10% 时 上 述 特性 将 受到 极 大 的 影响 。 如 果 使 用 长 的 引物 ，PCR 反应 的 复 性 温度 可 以 调 得 更 高 一 些 ， 我 们 曾 尝试 过 用 于 lacZ-MCS 载体 的 其 他 引物 ， 发 现下 面 这 对 引物 能 有 效 地 进行 扩 增 并 且 能 使 用 较 高 的 复 性 温度 (高达 68C ) 这 样 做 还 能 增加 PCR 扩 增 序列 的 百分数 。 FREERMNM 5 ATGTG CTGCA’ AGEGTRTARA .GTTGG 从 号 : RDNSTRM: 5° CACAC AGGAA ACAGC TATGA CCATG 3 以 上 所 介绍 的 操作 步骤 中 要 求 标记 碱 基 百 分 比 为 5%。 在 这 样 的 标记 程度 时 大 多 数 放射 自 显 影 谱 都 表现 出 低 本 底 的 强 信号 。 标 记 浓 度 小 于 2.5% 或 大 于 20% 都 可 用 。 这 个 系统 的 与 众 不 同 之 处 是 可 以 方便 地 在 琼脂 糖 凝 胶 上 使 用 地 高 辛 标记 的 相对 分 子 质量 标准 。 我 们 认为 用 DNA 聚合 酶 I 的 Klenow 片段 对 限制 酶 切割 的 黏 性 末端 进行 补 平 是 制备 相对 分 子 质量 标准 极 有 效 的 方法 ， 这 样 就 在 用 碱 性 磷酸 酯 酶 - 抗 地 高 辛 结合 物 处 理 的 过 程 中 随时 都 可 以 看 到 相对 分 子 质量 标准 。 我 们 认为 使 用 Gib- co BRL 公司 (Gaithersburg, MD) 的 1 kb 阶梯 相对 分 子 质量 标准 较 好 ， 因 为 这 一 相对 分 子 质量 标准 已 经 具备 了 可 以 利用 的 末端 并 且 产 生 每 隔 1000 bp 一 个 条 带 的 一 组 相对 分 子 质量 标准 。 也 可 参照 下 列 方法 ! 从 低 熔 点 胶 中 分 离 得 到 DNA 片段 。 在 4 人 制备 一 块 低 熔 点 琼 脂 糖 凝 胶 ， 点 上 样品 后 即 于 4Y 进行 电泳 分 离 以 防止 低 熔 点 胶 熔 化 。EB 溶液 染色 后 ， 用 手持 长 波 紫 外 线 灯 确定 回收 片段 的 位 置 (长 波 紫 外 线 可 减少 对 DNA 的 损 伤 作 用 )。 用 刀片 或 吸管 将 胶 取 出 ， 加 入 2~3 APA TE 后 于 6SY RES min 使 凝 胶 熔 化 。 此 溶液 可 用 酚 / 和 氯仿 抽 提 一 次 ， 但 通常 我 们 认为 这 一 操作 并 无 必要 。 我 们 认为 纯化 标记 的 探 针 并 非 必需 ， 不 过 也 许 能 使 Southern 印迹 膜 上 的 背景 和 消 有 降低 。 我 们 认为 乙醇 沉淀 是 纯化 地 高 辛 标记 探 针 的 有 效 方法 。 加 入 3 mol/L 的 NaOAc 使 终 浓 度 为 0.2 mol/L 并 加 入 3 倍 体积 的 乙醇 〈100% )， 混 匀 后 于 -70T 放置 15 min。 台 式微 型 离心 机 离心 S min 后 弃 上 清 液 ， 用 700 岂 70% 的 乙醇 洗涤 沉淀 并 离心 2 min。 空 气 干 燥 沉 淀 。 待 彻底 干燥 后 悬浮 于 100 pl TE. (7) 不 幸 的 是 没有 一 个 检测 探 针 中 地 高 辛 挫 入 程度 的 定量 方法 ， 缺 乏 用 少量 探 针 点 在 Pere (2 a (3 4 4 YA (5 So (6 4 (8) (9) (10) (11) (12) 膜 上 后 经 抗 地 高 辛 — 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 物 来 检测 的 方法 。 用 以 下 介绍 的 方法 可 以 对 入 叭 菌 体 的 裂解 液 用 PCR 法 直接 标记 。 制 备 噬 菌 体 的 方 法 与 常规 一 样 ， 不 过 倒 平 血 时 上 下 层 均 用 琼脂 糖 而 不 是 琼脂 ， 因 为 琼脂 中 的 杂质 会 抑制 PCR 反应 。 挑 取 单 个 的 鸣 菌 斑 转 接 到 0.65 ml 的 小 离心 管 或 是 96 孔 板 中 。 eS BE PDA 100 pl AY LB 培养 液 ，37Y 振 功 培养 过 夜 。 在 PCR 小 管 或 板 孔 中 加 入 1 岂 上 述 裂解 液 后 按照 标准 PCR 步骤 进 行 扩 增 反应 。 模板 DNA 浓度 对 于 标记 反应 来 说 是 起 着 决定 性 作用 的 ， 模 板 过 量 肯 定 是 不 好 的 。 将 模板 DNA 的 浓度 控制 在 接近 1 ng 时 能 得 到 具有 高 度 特异 性 的 最 大 量 的 标记 控 村 各 如 果 最 后 的 胶卷 上 的 信和 号 很 弱 或 甚至 是 根本 没有 信号 时 ， 可 能 有 以 下 几 种 原因 : a. 探 针 未 制备 好 或 是 加 入 量 过 少 。 可 以 将 探 针 在 胶 上 检查 标记 是 否 成 功 以 及 产量 如 何 。 b. 膜 上 基因 组 DNA 浓度 过 低 或 是 已 经 降解 ， 这 是 一 个 相当 常见 的 问题 ， 可 以 尝 试 增加 点 样 量 ， 此 外 可 以 在 低 浓 度 的 琼脂 糖 凝 胺 上 电泳 检查 未 经 切割 的 DNA 的 质量 。 c. AMPPD 放置 过 久 或 是 已 经 降解 。 但 如 果 相 对 分 子 质 量 标准 可 以 观察 到 ， 那 就 不 是 这 个 问题 了 ， 应 考虑 存在 其 他 的 可 能 性 。 d. 未 加 抗体 或 是 抗体 已 坏 。 但 如 果 相 对 分 子 质量 标 准 可 以 显 色 的 话 也 不 是 这 个 问 题 。 如 果 相 对 分 子 质量 标准 同样 不 能 看 到 ， 那 就 应 该 同时 检查 抗体 结合 物 与 AMPPD 是 否 正常 。 高 背景 也 是 这 个 技术 中 更 经 常 碰 到 的 问题 ， 可 能 的 情况 有 以 下 几 种 : a. 膜 上 被 污染 了 不 易 除 去 的 指 印 。 b. 如 果 整 张 膜 上 出 现 均 匀 的 灰色 或 是 非常 黑色 的 背景 ， 通 常 是 AMPPD 过 早 分 解 所 造成 。 如 果 是 缓冲 液 开 制备 不 当 或 是 AMPPD 的 母液 已 经 分 解 ， 则 会 在 整 张 膜 上 造成 均一 的 本 底 ， 并 且 伴 随 着 杂交 信和 号 的 减弱 。 c. 在 不 加 探 针 的 泳 道上 经 常 出 现 的 点 状 污染 物 可 能 有 不 同 的 来 源 ， 这 种 现象 说 明 抗体 结合 物 与 膜 产生 了 非特 异性 的 结合 所 致 。 我 们 发 现 曝 光 时 如 果 膜 放置 在 脏 的 有 机 玻璃 上 ， 就 可 能 由 于 外 源 碱 性 磷酸 酯 酶 或 其 他 的 污染 物 而 使 AMPPD 分 解 。 除 此 以 外 ， 这 问题 还 经 常 与 缓冲 液 上 有关， 如 果 封 阻 剂 没 有 充分 溶解 的 话 也 会 造成 同样 现象 。 d. 如 果 在 膜 的 其 他 部 位 背景 清晰 而 在 泳 道上 则 背景 极 高 ， 掩 盖 了 所 有 的 条 带 ， 说 明 问 题 出 在 探 针 的 性 质 上 而 不 用 考虑 反应 的 条 件 。 解 决 这 个 问题 的 惟一 实用 方 法 是 提高 洗 脱 的 严格 程度 (68T, 0.1 SSC). e. 处 理 膜 时 必须 小 心 ， 不 能 用 狠 子 刮 擦 膜 的 表面 。 这 一 点 在 使 用 放射 性 标记 的 探 针 时 是 不 成 问题 的 ， 但 任何 粗鲁 的 操作 都 会 在 膜 上 造成 深 色 的 背景 。 前 一 次 杂交 时 留 下 的 “ 鬼 带 ”: 造成 鬼 带 的 原因 是 脱色 过 程 进行 得 不 彻底 ， 可 尝试 再 次 进行 脱色 。 如 果 仍 无 效 ， 可 能 是 杂交 过 程 中 使 膜 干 酒 所 致 。 当 探 针 仍 与 膜 结 合 时 不 要 使 膜 干 泗 ， 这 样 会 使 探 针 难于 洗 去 而 永远 留 在 膜 上 。 在 曝光 时 注意 封 住 袋 口 ， 当 曝光 结束 立即 从 胶卷 上 取 下 杂交 膜 进 行 脱色 处 理 。 - 34° ax #6 本 工作 部 分 受 USDA Hatch 项 目 (ARZT-136440-H-25-042) 和 USDA NRI 竞争 项 BH (91-37300-6453) 所 资助 。 许 多 方法 由 Tropix 和 Boehringer Mannheim 提供 ， 此 外 我 们 还 得 感谢 D. Hoisington 和 其 他 许多 人 的 建议 。 = 5 文 献 1. Voyta, J. C. and Bronstein, I. (1988) Ultra sensitive detection of alkaline phos- phatase activity. Clin. Chem. 34, 1157. 2. Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13. 3. Kreike, C. M., de Koning, J. R. A., and Krens, F. A. (1990) Nonradioactive detec- tion of single-copy DNA-DNA hybrids. Plant Mol. Biol. Rep. 8, 172-179. 4. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F. A., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., and Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction sites analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354. 5. Vieira, J. and Messing, J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259-268. 6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. o 5 *= BIE VTC RR bw WA ATR TY bl 4 BS SA Wk PH Bote BS a Wa Te 1 — AS re MEF ASE I Me Her Martin Cunningham, Martin Harris Ul i. 3 1.1 荧光 素 半 抗 原 标记 探 针 非 放 射 性 物质 标记 核酸 探 针 的 方法 通常 是 在 核酸 分 子 中 引入 诸如 半 抗 原 、 生 物 素 等 惰性 小 分 子 。 这 些小 分 子 一 般 通过 接头 连接 到 dUTP SRR =RRE, KHPAECMHH 核 苷 三 磷酸 再 通过 酶 促 反 应 摊 入 到 探 针 中 ， 例 如 用 于 随机 引物 法 标记 长 链 探 针 或 是 通过 末端 转移 酶 标记 寡 核 苷 酸 的 3 端 。 杂 交 后 用 与 一 种 酶 相连 接 的 抗体 (或 者 如 果 是 生物 素 ， 则 用 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 ，streptavidin) 来 检测 。 这 种 酶 ， 如 碱 性 磷酸 酯 酶 或 辣 根 过 氧化 物 酶 是 用 来 催化 所 检测 的 反应 的 。 可 使 用 的 半 抗 原 有 多 种 ， 最 常用 的 是 地 高 辛 、 生 物 素 与 荧光 素 。 本 方法 比 直接 酶 标 法 (参见 第 十 章 ) 步骤 更 多 ， 因 为 其 中 包括 膜 的 封 阻 、 抗 体 的 结合 以 及 膜 的 洗涤 等 额外 操作 。 但 是 它 可 以 用 在 通过 碱 性 磷酸 酯 酶 催化 底 物 二 氧 杂 环 烷 (dioxetane) 的 高 灵敏 度 化 学 发 光 检 测 上 。 还 能 用 于 窒 核 苷 酸 探 针 上 ， 即 通 过 偶 联 在 探 针 上 的 辣 根 过 氧化 物 酶 催化 的 强化 化 学 发 光 进 行 检 测 ， 利 用 了 它 的 低 本 底 与 快速 光 输 出 的 优点 。 方 法 详 见 第 十 一 章 。 荧光 素 作为 半 抗 原 用 于 核酸 标记 中 有 以 下 优点 : D 荧光 素 在 杂交 中 很 稳定 ， 甚 至 在 较 高 温度 下 。 @ 荧光 素 核 苷 三 磷酸 可 在 DNA 聚合 酶 作用 下 挫 入 到 探 针 中 去 。 © 针对 结合 物 中 的 荧光 素 部 分 可 以 制备 高 亲和力 的 抗体 。 ® 标记 的 探 针 不 用 纯化 ， 因 为 当 使 用 合适 的 封 阻 剂 时 这 种 探 针 与 膜 的 亲和力 很 低 。 © 使 用 本 系统 时 被 抗体 识别 的 内 源 性 物质 所 干扰 的 机 会 很 小 ， 但 在 原 位 杂交 中 如 用 生物 素 则 有 干扰 。 © 荧光 素 用 作 半 抗原 的 最 后 一 个 重要 的 优点 是 在 杂交 开始 之 前 就 可 以 知道 探 针 标 记 反 应 能 否 成 功 ， 即 通过 快速 (20 min) 透射 测定 法 测定 所 发 出 的 天 然 获 光 。 监测 探 针 标 记 的 进程 与 用 8B -计数 器 对 ”“P 标记 的 探 针 进行 检测 相 类 似 ， 具 体 测 定 方法 载 在 第 九 章 中 。 荧光 素 基 因 显 影 系 统 (fluorecein gene image system, Amersham International, Bucks, UK) 就 是 用 荧光 素 作 为 半 抗 原 ， 通 过 碱 性 磷酸 酯 酶 催化 二 氧 杂 环 烷 的 化 学 发 光 ° 36 . 反应 进行 检测 。 通 过 由 大 肠 杆 菌 的 DNA 聚合 酶 的 Klenow Fr Be Br fe 10 89 BE OL SI tric: 反应 上 使 荧光 素 - 11 - dUTP BAF DNA 链 中 。 在 这 个 反应 中 Klenow 片段 特别 有 效 ， 所 以 标记 过 程 可 以 认为 是 一 个 净 合 成 过 程 ， 例 如 50 ng 的 探 针 经 1 h 合成 后 可 以 得 到 300 ng 的 探 针 。 标 记 的 探 针 不 经 纯化 即 可 直接 用 于 杂交 实验 中 (先进 行 变性 处 理 )。 杂 交 的 严格 性 可 通过 杂 交 过 程 中 盐 离子 浓度 或 温度 的 调节 来 控制 ， 或 /及 通过 严格 性 洗涤 来 控制 。 所 推荐 的 探 针 浓度 与 ECL 直接 标记 系统 (ATE) 相同 : 目标 DNA 较 少 时 使 用 10 ng/ml 的 浓度 ; 目标 DNA 较 多 时 使 用 2 一 5 ng/ml 的 浓度 。 如 果 在 杂交 阶段 中 以 及 在 随后 加 入 抗体 结合 物 前 的 膜 封 阻 步骤 中 使 用 的 封 阻 剂 是 固 体 ， 就 可 能 因 封 阻 剂 难于 溶解 而 造成 程度 不 同 的 各 种 背景 。 但 也 有 封 阻 剂 的 浓缩 液 供 应 ， 这 样 就 能 保证 试剂 的 一 致 性 与 杂交 结果 的 低 本 底 。 使 用 这 个 系统 时 仔细 配制 抗体 结 合 物 能 进一步 降低 本 底 ， 其 中 包括 用 优化 的 方法 制备 抗体 结合 物 以 及 利用 抗 荧光 素 的 单 克隆 抗体 ， 这 样 的 系统 具有 较 高 信 噪 比 。 1.2 碱 性 磷酸 酯 酶 催化 的 二 氧 杂 环 烷 化 学 发 光 反 应 碱 性 磷酸 酯 酶 催化 二 氧 杂 环 烷 的 衍生 物 分 解 所 产生 的 化 学 发 光 为 本 系统 提供 了 高 灵 lie aia lamianaeal i Sy. HPPA MA ERS MIERA, 4A PRAM RAR, SAKE 刚 基 的 葵 基 础 酸 盐 取 代 的 二 氧 杂 环 烷 (4 - [ 苯 基 - 3 -磷酸 ] -4- 甲 氧 基 螺旋 [1，2 -二 氧 杂 环 烷 - 3，2“ -金刚 烷 ]) (4 - [phenyl - 3 - phosphate] -4 - methoxyspiro [1, 2 - dioxetane~3, 2’-adamantane]) 已 被 证 明 在 各 种 测定 方法 中 具有 特别 的 作用 BJ。 一 般 情况 下 它 非 常 稳 定 ， 但 在 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 的 存在 下 ， 会 很 快 通 过 不 稳定 的 二 氧 杂 环 烷 的 芳 基 氧化 物 转变 为 发 光 物 质 。 这 一 反应 最 大 的 光 输 出 在 470 ~ 480 nm。 在 某 些 情况 下 ， 例 如 在 溶液 中 测定 时 由 于 混杂 有 荧光 基 团 (MFCR) 的 表面 活性 剂 或 高 聚 物 ， 光 输出 就 会 大 大 加 强 。 这 是 因为 它们 可 以 被 获 光 中 间 体 转移 的 能 量 所 激活 。 如 果 使 用 从 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 包 (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 和 5-(N)- 四 且 酰 -氨基 效 光 素 所 形成 的 荧光 微 困 时 ， 化 学 光 发 效率 至 少 提高 400 倍 已， 最 大 光 输 出 为 520 一 530 nm。 直 到 近来 才 发 现 有 些 印迹 膜 ， 包 括 尼 龙 膜 在 内 都 能 加 强 光 的 输出 。 含有 二 氧 杂 环 烷 基 团 的 化 学 荧光 物质 在 杂交 检测 中 具有 特别 高 的 灵敏 度 。 尽 管 检测 过 程 中 用 到 的 多 种 试剂 都 须 优 化 ， 特 别 是 抗体 结合 物 与 封 阻 剂 ， 但 仍 能 达到 低 本 底 的 目 的 。 此 外 溶液 很 容易 被 细菌 碱 性 磷酸 酯 酶 所 污染 ， 造 成 杂交 膜 上 的 污染 斑点 ， 所 以 无 论 何 时 在 可 能 的 情况 下 都 应 使 用 灭 菌 的 溶液 与 干净 的 器 严 。 与 辣 根 过 氧化 物 酶 催化 的 光化学 反应 相反 ， 标 准 的 二 氧 杂 环 烷 荧 光 反 应 开始 时 光 输 出 很 小 ， 最 大 输出 出 现在 几 个 小 时 之 后 。 这 一 延迟 是 由 于 有 着 较 短 半 训 期 的 芳 氧 中 间 产 物 的 积累 较 慢 的 缘故 ， 但 是 光 输 出 可 以 在 几 天 内 都 维持 较 高 的 水 平 而 只 有 很 少 的 衰减 ， 这 样 就 能 在 底片 上 进行 最 强 的 信号 积累 ， 这 时 灵敏 度 往往 由 曝光 的 背景 干扰 所 限制 。 有 需要 ， 利 用 光 输 出 时 间 的 延长 可 以 进行 多 张 底片 的 曝光 。 由 于 方法 的 高 灵敏 度 与 二 氧 杂 环 烷 化 学 发 光 物 质 的 长 时 间 发 光 特 性 ， 与 辣 根 过 氧化 o* 和 大。 POR ECA LAF AEA AR LL, HD ONE, RUA RKO KR. (EIA 统 做 基因 组 杂交 ， 人 基因 组 DNA 的 电泳 点 样 量 为 0.2 ve 和 探 针 为 1 kb 时 ， 检 测 灵 敏 度 至 少 可 达 100 fg。 这 个 系统 也 可 用 于 许多 Northern 印迹 中 。 作 为 一 个 粗放 的 准则 : PRICE ACSF 48 h 的 曝光 应 该 就 可 以 得 到 可 接受 的 结果 。 当 然 这 个 系统 也 能 用 于 只 要 求 低 灵敏 度 的 检测 反应 中 。 2. # 料 欧 光 素 基 因 标 记 与 显影 检测 试剂 盒 (Amersham International, ple) 提供 标记 和 二 和 氧 杂 环 烷 化 学 发 光 检 测 所 需 的 组 分 。 下 面 列 出 试剂 盒 中 的 各 种 组 分 以 及 须要 配制 的 各 种 溶 液 。 2.1 标记 探 针 的 制备 1 YA 核 苷 酸 混合 物 的 5Sx 贮 存 液 : 300 mmol/L Tris-HCl, pH 7.8, 50 mmol/L 2 -iZ€Z 醇 ，$0 mmol/L MgCh 的 溶液 中 含有 5 x 荧光 素 - 11 - dUTP (FLdUTP)，dATP， dCTP，dGTP，dTTP。 这 一 混合 物 作为 荧光 素 基 因 标 记 系 统 试剂 盒 供应 。 它 已 优化 以 得 到 高 产量 的 探 针 和 较 高 的 荧光 素 挫 入 程度 。 引物 : 随机 九 聚 宾 核 苷 酸 。 这 些 引物 也 由 该 系统 提供 ， 使 用 它 所 得 到 的 探 针 DNA 产量 大 于 随机 六 聚 守 苷 酸 引 物 。 3) 酶 溶液 : 5 U/pl Klenow 片段 。 也 由 该 系统 提供 ， 可 产生 两 倍 于 标准 Klenow 片段 所 产生 的 探 针 。 4) TE 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCl 、pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. 5) 0.2 % 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0. 2 a 2.2 杂交 与 严格 性 洗涤 液体 封 阻 剂 : 由 上 述 试剂 盒 提 供 ， 用 于 推荐 的 杂交 缓冲 液 以 及 用 于 加 入 抗体 结合 物 前 膜 的 封 阻 。 2) 20xSSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 ，pH 7.0。 3) 10% 或 20% (w/v) SDS. 4) 硫酸 葡 聚 糖 : 相对 分 子 质 量 为 S00 000， 例 如 Sigma 的 产品 D - 6001。 如 果 要 达到 杂 交 最 大 灵敏 度 则 须 用 硫酸 葡 聚 糖 作为 加 速 剂 。 5) 杂交 缓冲 液 : Sx SSC，20 倍 稀释 的 杂交 封 阻 剂 ，0.1 % (w/v) 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS), 5 % (w/v) 硫酸 葡 聚 糖 ，100 pg/ml 经 剪 切 并 变性 的 非 同 源 DNA, fi) SE 鱼 精 子 DNA (自由 选择 )。 1 ~~ - 38 - 2.3 封 阻 、 抗 体 保 温 与 洗涤 1) 抗 荧光 素 - 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 物 : 上 述 系统 提供 的 $S000 x 的 贮存 液 。 该 结合 物 已 经 2) 缓冲 液 A: 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 300 mmol/L NaCl. VA 500ml 的 缓冲 液 分 装 在 1E 的 瓶 中 ， 以 105 kPa 高 压 灭 菌 1$ min， 灭 菌 后 一 旦 开 瓶 使 用 不 可 超过 一 - 3) +M3$A HA (bovine serum albumin, BSA) 组 分 V: 例如 Sigma 产品 A- 2153 或 BDH 产品 44 155. 4) Tween-20 (2RAZ Mi WR REA ERR BR): 例如 Sigma 产品 P- 1379 或 BDH 产品 66 368. 2.4 SHES 1) 贮存 于 喷雾 瓶 中 的 二 氧 杂 环 丙烷 检测 试剂 : 由 上 述 系 统 提供 ， 可 直接 用 于 膜 杂 交 实 验 中 。 使 用 这 些 试 剂 时 最 好 在 通风 橱 中 进行 。 2) WW: 由 上 述 系 统 提供 的 光学 透明 袋 ， 用 于 使 用 检测 试剂 以 及 以 后 的 底片 曝光 中 。 此 外 还 可 以 用 Saran Wrap MAR, 3) MARDI: 大 多 数 标准 的 放射 自 显影 底片 都 适用 于 二 氧 杂 环 丙烷 化 学 发 光 反 应 的 检测 ， 例 如 Hyperfilm-MPIM (Amersham International, plc) #% Kodak X-AR. B87 SAAR 3.1 标记 探 针 的 制备 以 下 操作 步骤 可 供 标 记 50 ng 的 模板 DNA。 标 准 的 反应 可 用 于 标记 20 ng 一 2 pg 的 模板 DNA。 当 模板 DNA 的 量 为 S0 ng 时 标记 探 针 的 合成 效率 最 高 ， 不 过 净 合 成 仍 随 着 模板 DNA 的 增加 而 增加 。 1) 用 蒸馏 水 或 TE 将 模板 DNA 稀释 成 浓度 为 2 一 25$ ng/ 岂 (参见 注释 1)。 2) 将 核 苷 酸 混合 物 、 引 物 与 水 置 于 冰 浴 中 化 冻 。 酶 在 使 用 时 方 能 从 - 20C 取出 ， 用 后 立即 放 回 冰柜 中 。 3) 置 DNA 于 沸水 浴 中 保温 $ min 使 DNA 变性 ， 然 后 立即 置 于 冰 水 中 。DNA 变性 时 的 体积 至 少 要 达到 20 yl. 4) 将 1.5 ml 的 微型 离心 管 置 于 冰 浴 中 ， 依 次 向 管 中 加 入 下 列 组 分 : 核 苷 酸 混合 物 10 vl, 51S pl, BHEDNA 50 ng， 浓 度 为 5 U/ul A Klenow 片段 1 由， 加 水 至 终 体 FAA 50 pl. 5S) 用 吸 嘴 缓 慢 吸 放 数 次 混 匀 ， 盖 上 盖子 后 在 微型 离心 机 中 稍 事 离心 ， 使 内 容 物 集中 到 底部 。 es 6) 将 反应 混合 物 于 37C 保温 1 h (参见 注释 2)。 7) 如 果 探 针 须 要 贮存 而 不 是 立即 使 用 时 ， 反 应 混合 物 中 须 加 入 终 浓 度 为 20 mmol/L 的 EDTA 以 终止 合成 反应 。 探 针 于 - 20Y 暗中 保存 至 少 可 达 6 个 月 〈 参 见 注 释 3)， 切 不 可 放 入 自动 化 霜 的 冰箱 。 25 ng 或 50 ng 的 模板 DNA 经 标记 反应 后 ， 比 较 典 型 的 探 针 得 率 为 6 一 8 ng/pl, 4 使 用 较 多 的 模板 时 探 针 的 总 量 虽 会 增加 ， 但 标记 的 效率 却 不 高 。 这 时 可 用 快速 标记 检测 法 检测 探 针 是 否 标记 成 功 (参见 第 九 章 )。 3.2 杂交 与 严格 性 洗涤 下 面 介 绍 的 杂交 与 洗涤 条 件 适 用 于 大 多 数 探 针 ， 可 以 用 来 检测 到 哺乳 动物 基因 组 中 单 拷贝 基因 ， 而 不 发 生 与 非 同 源 性 序列 明显 的 交叉 杂交 反应 。 但 是 如 果 这 些 洗涤 条 件 对 于 某 些 特定 的 探 针 还 不 够 严格 ， 可 以 将 杂交 膜 置 于 60 人 的 0.2x 或 0.1xSSC 中 洗涤 。 此 外 将 杂交 或 洗涤 温度 提高 到 6SC 也 可 以 提高 严格 性 。 尽 管 这 样 改变 可 以 使 总 的 信和 号 的 信 噪 比 增加 ， 但 也 会 导致 某 些 特定 信和 号 的 减弱 。 1) 配制 杂交 缓冲 液 : Sx SSC，0.1% (w/v) SDS, 5% (w/v) 硫酸 葡 聚 糖 ，20 倍 稀 释 的 液体 封 阻 剂 〈 由 荧光 基因 系统 提供 )，100 pg/ml 的 变性 非 同 源 DNA (自由 选 择 )。 将 所 有 的 组 分 溶 在 一 起 并 调整 到 所 需 的 体积 ， 边 搅拌 边 稍 加 温 有 利于 硫酸 葡 聚 糖 的 彻底 溶解 (参见 注释 4)。 预 热 所 需 体 积 的 杂交 缓冲 液 (对 于 较 小 的 膜 杂 交 用 0.3 l/c? 的 杂交 液 ， 对 于 较 大 的 膜 杂 交 可 减 小 比例 至 0.125 ml/cm? 或 更 少 ) 至 60C ， 将 膜 放 入 607 缓冲 液 中 进 AT HALAS B/S 30 min, FDRG (SEF 5). 将 所 需 探 针 放 入 干净 的 小 离心 管 中 〈 人 参见 注释 6)。 如 果 体 积 小 于 20 由 时 可 加 入 水 或 TE 缓冲 液 使 终 体 积 达到 此 值 。 者 沸 5$ min 使 DNA 变性 后 浸入 冰 水 浴 中 速 冷 。 变性 的 探 针 稍 事 离 心 后 加 入 到 预 杂 交 缓 冲 液 中 ， 不 可 直接 加 到 膜 上 ， 轻 轻 地 混 匀 (参见 注释 6). FEM F 60T 杂交 过 夜 。 配制 两 种 严格 性 洗涤 溶液 :一 种 是 1 x SSC, 0.1% (w/v) SDS; 另 一 种 是 0.5x SSC, 0.1% (w/v) SDS。 将 两 种 溶液 预 热 到 60C 。 小 心地 将 膜 转 移 至 1XxSSC，0.1% (w/v) SDS 溶液 中 ，60? 中 轻 轻 振荡 洗涤 15 min. 60T 预 热 的 0.$SxXSSC，0.1% (w/v) SDS 溶 液 中 再 次 洗涤 15 min。 在 进行 洗涤 时 洗涤 液 要 过 量 (2 一 5 ml/cm’) (参见 注释 7)。 2 YA S YA 4 YA Ss ~~" 3.3 封 阻 、 抗 体 保温 和 洗涤 以 下 操作 均 在 室温 进行 ， 并 且 所 有 的 处 理 过 程 都 须 轻微 振荡 。 1) 在 杂交 洗涤 后 用 过 量 的 (2 mi/cm*) RMA 于 室温 淋 洗 膜 〈 人 参见 注释 8)。 2) FEKA 0.75~1 ml/cm* 的 比例 在 室温 用 10 倍 稀释 的 、 以 缓冲 液 A 配制 的 封 阻 剂 处 理 1h (参见 注释 9)。 ii 3) 用 缓冲 液 A 按照 第 一 步 操作 那样 淋 洗 膜 。 4) 用 新 制备 的 、 含 有 0.5% (w/v) BSA 的 缓冲 液 A 将 抗 荧光 素 - 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 YE 5000 倍 稀释 ， 将 膜 置 于 稀释 的 混合 物 溶 液 中 (0.3 ml/cm’), FRR 1h, 轻 轻 地 振 功 (ZB LIE 10). 5) 用 稀释 缓冲 液 配 制 的 0.3% (v/v) Tween - 20 室温 洗 膜 三 次 ， 每 次 10 min， 除 去 未 与 膜 结合 的 抗体 复合 物 ， 洗 膜 时 要 不 断 地 振荡 。 洗 涤 液 应 过 量 (2~5 ml/cm’). 6) 按照 第 一 步 操作 用 缓冲 液 A 淋 洗 膜 。 3.4 ESE 在 操作 前 应 通读 本 节 。 如 有 条 件 ， 应 戴 上 无 粉 手套 ， 使 用 二 氧 杂 环 烷 试剂 时 必须 在 通风 橱 中 进行 。 1) 将 荧光 素 基 因 标 记 系 统 所 提供 的 检测 袋 剪 开 一 边 ， 大 小 以 能 覆盖 住 膜 并 在 边 上 留 出 1 cm 为 度 ， 另 一 边 不 剪 开 并 将 袋 打开 。 2) 抗体 结合 物 保温 和 洗涤 步骤 完成 后 ， 将 膜 的 一 角 贴 在 干净 的 用 于 洗涤 膜 的 盆 或 其 他 清洁 物体 表面 ， 使 过 量 的 洗涤 液 沥 干 ， 然 后 将 有 样品 的 面向 上 放 在 打开 的 袋 的 一 半 Mh, WAAR (SB LIER 11)。 3) 在 通风 橱 中 打开 袋 以 暴露 膜 ， 用 装 有 二 氧 杂 环 烷 的 喷雾 瓶 在 膜 的 上 方 2 一 3 cm 处 喷 酒 液体 。 喷 酒 一 次 可 以 对 付 14 cm2，50 cm? 的 膜 须 喷 4 次 。 4) 喷洒 试剂 后 将 袋 口 折 麦 并 立即 将 膜 上 的 显 色 液 抹 匀 。 可 以 用 $ ml 的 移 管 在 表面 滚动 或 用 戴 手 套 的 手 将 表面 的 液体 抹 勺 。 5) 如 要 得 到 最 佳 结果 ， 可 将 膜 转 移 至 干净 的 袋 中 并 放 在 底片 盒 中 (参见 注释 12)， 应 保证 曝光 之 前 袋 的 外 部 是 干燥 的 。 将 装 有 膜 的 袋 (有 样品 的 面向 上 ) 放 在 底片 盒 中 并 置 于 暗室 中 。 6) 关 灯 后 取 一 张 自 显影 底片 放 在 膜 上 ， 关 上 盒子 。 对 于 目标 DNA 较 多 而 不 需 高 灵敏 度 的 检测 可 曝光 〈 自 显影 ) 1 一 2 h， 对 于 需 高 灵敏 度 的 检测 则 可 曝光 〈 自 显影 ) 4 一 16 h。 取 出 底片 后 进行 冲洗 (参见 注释 13)。 4. 3F aE (1) 如 果 待 标记 的 DNA 因 过 稀 而 不 能 直接 使 用 时 可 采用 乙醇 沉淀 法 浓缩 ， 然 后 再 溶 于 合适 体积 的 水 或 TE 缓冲 液 中 。 如 果 用 完整 的 质粒 作为 探 针 时 务必 按 质粒 序列 在 杂交 中 所 占 的 比例 校正 杂交 的 条 件 。 闭 合 环 状 双 链 DNA 先 切割 成 线 状 可 以 防 止 变 性 后 过 快 的 复 性 ， 但 这 一 点 通常 并 不 必需 。 (2) 从 低 熔 点 胶 中 回收 的 DNA 片段 的 体积 多 至 25 pl 时 仍 能 用 于 标记 反应 中 。 反 应 的 时 间 与 温度 可 以 根据 方便 与 和 否 自行 选择 ， 因 为 在 反应 的 最 后 阶段 会 维持 在 一 定 水 平 上 ， 在 室温 放置 过 夜 并 不 会 使 产物 显著 减少 。 但 是 反应 的 速率 在 一 定 程度 上 依 RMF DNA 的 纯度 ， 因 此 对 于 低 纯度 的 样品 ， 例 如 小 量 制备 的 DNA 或 是 从 琼脂 糖 凝 胶 中 回收 的 DNA 可 以 延长 反应 时 间 。 对 于 纯化 的 DNA 样品 ， 延 长 反应 时 间 人 (3) (4 YA (5 a (6 ~~ (7) (8) (9 YA (10) (11) (12) (37C, 24h) 可 以 增加 探 针 的 产量 。 合成 的 探 针 在 变性 后 即 可 用 于 杂交 ， 不 必 除 去 未 挫 入 的 核 苷 酸 。 如 果 和 希望 长 期 保 存 探 针 则 应 置 于 暗 处， 因为 荧光 素 分 子 对 光 是 敏感 的 。 封 阻 液 中 核酸 酶 的 活力 已 低 至 可 以 用 于 Northern 印迹 中 。 但 是 如 果 需 要 ， 仍 可 进 行 高 压 灭 菌 ， 但 必须 分 装 在 可 以 高 压 灭 菌 的 容器 内 。 分 装 的 杂交 缓冲 液 在 -207 至 少 可 保存 12 个 月 。 杂 交 液 中 加 入 经 剪 切 并 变性 的 非 同 源 DNA 能 减少 非特 异性 杂交 ， 不 过 这 样 做 时 会 使 灵敏 度 有 所 降低 。 杂交 可 以 在 含有 探 针 的 盒 中 、 袋 中 或 管 中 进 行 ， 只 要 有 足够 的 缓冲 液 使 探 针 易 于 与 膜 接 触 。 如 果 膜 比较 大 (>50 cm’) 或 是 在 袋 中 或 管 中 用 最 小 体积 的 杂交 液 杂 交 时 ， 膜 必须 用 S x SSC 先行 湿润 。 有 时 可 以 在 同一 杂交 液 中 进行 数 张 膜 的 杂交 ， 但 也 必须 用 足够 的 体积 ， 使 缓冲 液 在 膜 上 可 以 流通 。 一 个 袋 中 最 多 可 以 同时 进行 两 张 膜 的 杂交 ， 当 一 个 管 中 的 杂交 膜 多 于 一 张 时 ， 注 意 不 能 使 膜 相 互 重 琶 ， 如 果 杂交 液 过 少 或 是 膜 不 能 够 完全 浸入 溶液 中 时 都 会 造成 高 背景 。 搅 拌 能 增加 杂交 组 冲 液 与 膜 的 接触 ， 特 别 当 溶液 中 同时 进行 多 张 膜 的 杂交 时 。 在 目标 DNA 的 量 较 少 的 情况 下 ， 推 荐 使 用 的 探 针 浓度 为 10 一 20 ng/ml (对 于 50 ng 模板 的 反应 来 讲 ， 这 相当 于 每 毫升 杂交 缓冲 液 中 约 有 1 一 2 由 的 反应 产物 )。 目标 DNA 的 量 较 多 的 情况 下 ， 推 荐 使 用 的 探 针 泊 度 为 1 一 5 ng/ml。 为 了 避免 控 针 直 接 加 到 膜 上 ， 可 取出 一 小 部 分 杂交 缓冲 液 先 与 探 针 混合 ， 然 后 再 加 到 其 余 杂 交 液 中 。 对 于 DNA 量 较 多 的 情况 下 杂交 时 间 人 允许 短 一 些 ， 但 有 时 会 造成 灵敏 度 降低 ， 必 要 时 可 提高 探 针 浓度 进行 补偿 。 在 进行 第 二 次 严格 性 洗涤 时 SCC 的 浓度 可 调节 在 0.1x 一 1x 之 间 以 达到 所 需 的 严 格 程度 51。 也 可 以 通过 升 高 温度 来 调节 洗涤 的 严格 性 。 几 张 膜 放 在 同一 洗涤 液 中 也 能 进行 很 好 的 洗涤 ， 但 它们 必须 能 够 自由 活动 。 高 压 灭 菌 的 瓶 一 旦 打开 ， 未 用 完 的 缓冲 液 A 应 丢弃 ， 这 样 可 防止 外 源 性 碱 性 磷酸 酯 酶 的 污染 。 稀释 后 的 封 阻 液 可 冷冻 贮存 〈 分 成 小 部 分 ) 几 个 星期 ， 需 用 时 化 冻 很 容易 ， 不 过 不 能 使 用 反复 冻 融 的 试剂 。 但 为 了 便于 工作 ， 可 将 未 稀释 的 封 阻 剂 小 份 分 装 后 冰 冻 。 稀释 后 的 抗体 结合 物 必 须 立 即使 用 。 稀 释 后 的 抗体 结合 物 经 贮存 或 经 过 冻 融 循 环 灵敏 度 要 降低 。 几 张 膜 可 以 同时 保温 ， 但 要 使 膜 能 够 充分 接触 到 溶液 。 当 处 理 大 块 膜 时 可 以 在 杂交 人 袋 或 管 中 进 行 ， 这 样 有 利于 减少 使 用 的 液体 : 20 cm X 20 cm 的 膜 可 以 用 SO ml 的 液体 。 操 作 中 还 可 能 发 现 抗体 结合 物 的 稀释 可 进一步 优化 : 过 大 的 稀释 会 导致 信号 强度 的 减弱 ， 但 同时 也 降低 了 背景 ; 流 度 过 大 时 则 会 造成 相 反 的 结果 。 稀 释 缓冲 液 中 必须 用 BSA 组 分 V (例如 Sigma 产品 号 A-2153)。 杂交 膜 可 以 在 通风 橱 中 直接 转移 到 检测 袋 中 ， 如 果 正 在 实验 桌 上 操作 时 可 用 塑料 薄膜 哲 时 盖 在 杂交 膜 上 后 拿 进 通风 橱 中 。 尽 管用 检测 袋 能 得 到 最 满意 的 结果 ， 但 可 以 用 一 张 Saran Wrap (Dow 化 学 公司 ) 来 代替 检测 袋 。 加 入 检测 试剂 后 将 膜 换 入 另 一 个 袋 可 以 避免 将 过 多 的 液体 带 到 曝光 盒 中 。 如 果 不 换 袋 则 应 将 过 量 的 液体 从 袋 中 挤 出 ， 这 样 做 也 就 可 以 达到 要 求 了 。 如 果 使 用 Saran - 42° (13) Wrap 膜 必 须 保 证 液体 不 漏出 。 如 果 需 要 ， 可 以 在 第 一 张 底片 曝光 后 对 第 二 张 底片 进行 适时 的 上 曝光。 这 个 系统 的 高 灵敏 度 可 能 在 过 夜 曝光 后 造成 过 深 的 影像 ， 可 根据 需要 决定 。 第 二 天 的 光 输 出 维持 在 比 刚 加 入 检测 试剂 后 的 几 个 小 时 内 的 光 输 出 明显 高 得 多 的 水 平 上 ， 这 时 可 以 使 用 较 短 的 最 适 曝 光 时 间 。 一 旦 光 输 出 稳定 后 ， 判 断 最 适 曝 光 时 间 还 是 比较 容 易 的 。 一 一 We 考 XM 献 . Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13. . Reguero, M., Bernardi, F., Bottoni, A., Olivucci, M., and Robb, M. (1991) Chemi- luminescent decomposition of 1,2-dioxetanes: an MC-SCF/MP2 study with VB analysis. J. Am. Chem. Soc. 113, 1566-1571. . Schaap, A. P. (1988) Chemical and enzymatic triggering of 1,2-dioxetanes. Photochem. Photobiol. 47, 50. . Schaap, A. P., Akhavan-Tafti, H., and Romano, L. J. (1989) Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes. Clin. Chem. 35, 1863,1864. . Meinkoth, J. and Wahl, G. (1984) Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138, 267-284. 第 九 章 监测 核酸 探 针 中 灾 光 素 标记 水 平 的 快速 检测 Martin Cunningham | tl 无 论 是 用 随机 引物 法 标记 长 探 针 (BA) 还 是 用 3 末端 法 标记 寡 核 苷 酸 AT 一 章 )， 荧 光 素 -11- dUTP 的 挫 入 都 可 用 下 述 的 快速 法 进行 检测 。 这 里 所 介绍 的 基本 步 骤 适 用 于 随机 引物 标记 的 长 控 针 ， 用 于 朝 核 苷 酸 标 记 物 检测 的 改进 方法 则 详 述 于 注释 中 。 如 果 样 品 需 要 鉴定 ， 应 该 用 铅笔 在 膜 上 做 好 记号 ， 因 为 有 些 墨 水 会 干扰 测定 。 2wr 厅 料 1) 20xSSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 。 根 据 需 要 进行 稀释 。 2) 10% (w/v) 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS) 贮存 液 ， 根 据 需要 进行 稀释 。 3) TE 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. 4) 尼龙 膜 〈 例 如 Hybond-N*, Amersham International, Amersham, UK) BK DE 81 4K (Whatman, Maidstone, UK). 5) 3 MM 滤纸 (Whatman). YA ae | 法 1 YA 将 荧光 素 基 因 成 像 系统 (fluorescein gene images system) 中 ( 详 见 第 八 章 ) 的 $X 核 RK GA TE fir FE a JR BE AY «1/5, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1000 (BREF 1). 5 岂 标 记 的 探 针 与 $ ol 1/5 稀释 度 的 核 苷 酸 混合 物 (阴性 对 照 ) 点 样 在 一 条 Hy- bond-N* 膜 上 ， 膜 放置 在 一 张 不 具 吸 收 作用 的 衬 垫上 使 液体 吸收 于 膜 中 (但 不 能 王 )， 然 后 用 过 量 的 预 热 至 60C 的 2 x SSC 在 轻 轻 摇 动 的 条 件 下 洗涤 15 min (参见 注 释 2 和 3)。 制作 参照 试 样 条 时 用 $ el ABR 1/5 稀释 度 外 的 其 他 稀释 核 苷 酸 混合 物 点 样 在 另外 一 条 Hybond-N* 膜 上 。 参 照 试 样 条 用 Saran Wrap MRA Ba, F-20C 中 可 在 黑暗 处 保存 几 个 星期 以 备 再 用 。 将 参照 试 样 条 与 已 经 洗涤 的 样品 条 放 在 用 TE 略 加 湿润 的 Whatman 3 MM 滤纸 上 ， 然后 放 入 暗室 (参见 注释 4)。 点 样 面 向 下 置 于 透射 紫外 线 灯 下 进行 观察 ， 使 用 254 nm 的 短波 透射 进行 紫外 线 灯 检测 时 能 得 到 最 佳 的 对 比 度 。 在 标记 探 针 的 点 样 位 *。， 44 ， 2 AS 3 4 4 AS BEWDU WAC BER, RCN TWH FSR ERR 1/25 到 1/250 之 间 (参见 注释 $)。 这 样 的 结果 表示 荧光 素 已 经 成 功 地 挫 入 到 探 针 中 去 了 。 标 记 探 针 的 荧光 强度 越 是 接近 稀释 得 较 少 的 参照 (1/25 PRE) 时 说 明 标 记 反 应 的 效率 越 高 。 经 洗涤 的 阴性 对 照 参考 条 应 只 有 极 少量 或 根本 没有 荧光 ， 这 才 说 明 探 针 的 荧光 是 由 于 荧光 素 挫 入 所 致 ， 而 并 非 未 标记 上 的 FLUTP PRR. BRA RY BR EA HA BAY 光 ， 可 以 再 次 洗涤 15 min， 这 种 情况 只 有 在 对 照 条 没有 干燥 时 才 可 能 出 现 。 5) 若 需 要 永久 性 的 硬 拷贝 时 ， 可 将 膜 照相 。 柯 达 Wratten No.9 波光 镜 (或 类 似 的 黄色 滤 光 镜 ) 应 与 Polaroid 667 黑白 胶卷 联合 使 用 。 4. 3E 释 (1) 使 用 ECL 3 BRAPRARMICHRERREAN (人 参见 第 十 一 章 )，TE 稀释 荧光 素 -11-dUTP (Fl-dUTP) 的 稀释 度 推荐 用 1/16, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1000, 1/2000。 (2) 使 用 3 一 寡 核 苷 酸 标记 系统 时 ， 每 个 标记 探 针 的 点 样 量 为 vl, FR ES pl 1/16 稀 释 度 的 FLdUTP 作为 阴性 对 照 。 (3) 除了 Hybond-N* 外 可 使 用 Whatman DE 81 纸 ， 后 者 特别 推荐 用 于 守 核 苷 酸 标记 的 检测 反应 中 。 在 这 种 情况 下 必须 用 2XxSSC，0.1% (w/v) SDS 洗 涤 点 样 条 。 纸 的 周围 要 留 出 1 cm 宽 以 防止 洗涤 过 程 中 受到 损坏 。 洗 涤 后 再 用 水 洗 ， 并 在 进一步 处 理 前 再 用 乙醇 进行 淋 洗 (AL DE 81 纸 在 水 溶液 中 很 脆 )。 (4) 如 果 使 用 DE 81 纸 ， 参 照 条 可 依次 用 水 与 乙醇 润 湿 一 下 〈 点 上 样品 后 )， 这 样 处 理 可 以 减少 纸 的 变形 ， 此 外 还 必须 使 用 干 的 Whatman 3 MM 纸 将 样品 转移 到 暗室 中 = (5) SAHRA R hice 1/500 至 1/2000 稀释 度 之 间 可 以 看 到 荧光 斑点 。 可 45 二 第 十 音 ” 辣 根 过 氧化 物 酶 标记 的 核酸 探 针 制备 及 其 强化 的 化 学 发 光 反 应 检测 Bronwen Harvey, Ian Durrant, Martin Cunningham 1. 引 mill 目前 已 有 很 多 核酸 标记 与 检测 系统 可 供 研 究 人 员 使 用 ， 其 中 不 少 在 某 些 特定 的 应 用 方面 具有 特别 的 优点 。 通 和 常 将 标记 的 方法 分 为 两 类 : 初级 标记 法 ， 就 是 将 可 检测 的 信 号 ， 如 同位 素 或 荧光 基 团 ， 直 接 标记 到 探 针 上 去 ; 另 一 类 是 酶 标 法 ， 利 用 酶 催化 一 个 能 产生 信号 的 反应 。 在 后 一 种 方法 中 信和 号 可 以 是 荧光 、 有 色 化 合 物 (AAR) 或 是 能 产 生 光 的 化 学 发 光 反 应 。 酶 可 以 被 直接 偶 联 到 探 针 上 (直接 标记 法 ) ， 也 可 以 用 一 种 抗体 - 酶 或 链 霉 抗 生 物 素 和 蛋白- 酶 复合 物 的 方法 引入 到 探 针 上 ， 以 便 检 测 半 抗 原 或 生物 素 标记 的 探 针 〈 间 接 标记 法 )。 间 接 标记 的 方法 被 广泛 用 于 探 针 制备 中 ， 其 中 标记 分 子 可 以 是 荧光 素 、 生 物 素 或 是 地 高 辛 。 第 八 章 叙 述 了 这 个 系统 中 用 荧光 素 标 记 探 针 的 一 个 例子 ， 标记 的 探 针 用 效 光 素 抗 体 - 碱 性 磷酸 酯 酶 结合 物 进 行 检 测 ， 碱 性 磷酸 酯 酶 (alkaline phosphatase, AP) 又 进一步 催化 高 灵敏 度 的 化 学 发 光 反 应 。 核酸 探 针 的 直接 酶 标 法 能 更 快 地 完成 非 放 射 性 的 检测 ， 因 为 这 里 省 略 掉 了 与 抗体 有 关 的 步 又。 用 状 根 过 氧化 物 酶 (horseradish peroxidase, HRP) 直接 标记 的 方法 是 Renz 和 Kurz[ 报 道 的 。 杂 交 后 HRP 用 于 催化 一 个 强化 的 化 学 发 光 反 应 并 且 能 很 快 地 得 到 信 号 局 。 这 个 方法 已 被 用 于 ECLIM 直 接 标 记 系 统 (Amersham International, Amersham, UK)， 它 为 中 等 至 高 含量 的 目标 DNA 提供 了 一 个 方便 而 快速 的 非 放 射 性 标记 检测 方 法 。 标记 步骤 包括 单 链 核酸 探 针 与 带 正 电 荷 的 HRP - - 苯 醒 - 聚 乙烯 亚 胺 复合 物 的 反 应 ， 后 者 作为 标记 反应 试剂 盒 供 应 。 它 首先 通过 电荷 的 作用 与 带 负 电荷 的 核酸 发 生 反 应 ， 随 后 加 入 的 成 二 醛 又 将 复合 物 共 价 交 联 在 核酸 探 针 上 。 这 个 标记 反应 进行 得 很 快 ， 室温 下 20 min 即 能 完成 ， 并 且 对 于 探 针 的 长 度 在 50 bp 至 50 kb 内 都 适用 。 标 记 后 的 探 针 可 在 30% 的 甘油 中 于 - 20 贮存 几 个 月 。 变 性 的 DNA 或 RNA 探 针 都 能 用 这 个 方法 标记 ， 并 且 标 记 量 可 以 缩小 至 100 ng 或 放大 至 1.$ wg。 在 60~70C 非 变 性 条 件 下 ， 杂 交 的 最 大 速率 出 现在 比 探 针 的 Tu 值 低 25C AY. 于 HRP 标记 的 探 针对 高 温 敏 感 ， 所 以 必须 用 T。 修饰 剂 ， 使 杂交 能 在 较 低 的 温度 下 进 行 。 本 系统 提供 的 金牌 缓冲 液 (Gold buffer) 中 含有 6 mol/L 尿素 ， 使 杂交 可 以 在 42T 进行 3,41。 这 些 条 件 等 同 于 放射 性 标记 的 探 针 在 65°C 杂交 或 是 在 50% (v/v) 甲 酰胺 存 在 的 条 件 下 于 427 进行 杂交 。 过 氧化 物 酶 在 这 些 条 件 下 至 少 稳定 24 h。 金 牌 缓冲 液 中 含有 一 种 新 的 加 速 剂 ， 它 既 能 使 信号 达到 最 强 又 能 使 背景 降低 。 在 杂交 与 严格 性 洗涤 的 过 程 中 通过 对 盐 浓度 的 调节 可 以 达到 严格 控制 的 目的 。 ae « 由 于 酶 是 直接 标记 在 探 针 上 的 ， 所 以 在 杂交 与 严格 性 洗涤 后 不 须 进 行 费 时 的 抗体 封 阻 、 保 温 、 洗 涤 等 操作 。 在 严格 性 洗涤 之 后 即 可 通过 强化 的 化 学 发 光 反 应 进行 检测 ， 产 生 的 光 信 号 可 以 捕获 在 放射 自 显 影 底 片上 ， 形 成 硬 拷贝 。 反 应 包括 在 过 氧化 物 存 在 时 过 氧化 物 酶 催化 鲁 米 诺 (RS) 的 氧化 5651。 过 氧化 物 以 稳定 的 过 酸 盐 (peracid) 状态 提供 。 该 盐 与 强化 剂 / 鲁 米 诺 混合 物 在 用 前 方 能 混合 以 避免 逐渐 发 生化 学 降解 。 鲁 米 诺 通过 内 过 氧化 物 (endo-peroxide) 转变 成 电子 激活 态 的 3 -氨基 - 邻 共 二 甲酸 盐 ， 当 回 到 基态 时 便 放 出 光 。 强 化 剂 在 酶 、 过 氧化 物 与 鲁 米 诺 分 子 之 间 进 行 调 节 ， 使 光 辐 射 比 未 用 强化 剂 时 增加 了 约 1000 倍 品 。 在 这 个 反应 中 最 大 光 输 出 的 波长 为 428 nm， 大 约 相 当 于 底片 对 于 蓝光 的 灵敏 度 。 强化 了 的 化 学 发 光 反 应 的 光 输 出 发 生得 很 快 ， 没 有 可 察觉 的 延迟 期 ， 光 输出 的 峰值 在 5 一 10 min， 之 后 以 半 训 期 约 为 1 h 的 速度 递减 。 误 减 被 认为 是 由 于 自由 基 所 造成 的 酶 活力 的 逐渐 损失 而 导致 。 除 了 可 以 进行 快速 检测 外 ， 这 些 动力 学 特性 对 于 再 次 探测 也 是 有 利 的 ， 因 为 酶 在 检测 过 程 中 已 经 失 活 ， 再 次 杂交 与 检测 时 不 会 出 现 最 初探 针 杂 交 时 所 出 现 的 条 带 ， 所 以 不 用 除去 原来 的 探 针 就 能 在 同一 张 膜 上 再 次 进行 与 新 探 针 的 杂交 。 由 于 这 个 系统 的 快速 标记 ， 不 用 抗体 封 阻 、 保 温 、 洗 涤 等 和 发 光 的 快速 动力 学 特 性 ， 使 它 适 用 于 快速 地 进行 高 产量 、 大 规模 的 筛选 工作 !6-s1。 建 立 在 过 氧化 物 酶 和 强 化 的 化 学 发 光 基 础 上 的 杂交 通常 只 产生 较 低 的 背景 ， 而 且 与 碱 性 磷酸 酯 酶 显 色 法 相 比 ， 检测 结果 产生 较 少 斑点 ， 可 是 在 碱 性 磷酸 酯 酶 系统 中 则 只 要 溶液 不 是 非常 清洁 便 会 产生 斑点 。 本 系统 还 能 得 到 高 水 平 的 信号 。 例 如 用 浓度 为 10 ng/ml 的 探 针 进行 过 夜 杂 交 能 检测 到 低 至 500 fg 的 目标 DNA， 相 当 于 用 1 kb 的 探 针 探测 1 wg 哺乳 动物 基因 组 样品 中 的 单 拷贝 DNA。 当 用 于 高 含量 的 目标 检测 时 ， 例 如 菌落 或 噬 菌 斑 的 筛选 以 及 PCR 产物 的 检测 中 ， 只 须 用 2 ng/ml 浓度 的 探 针 杂交 2 h 就 能 得 到 非常 强 的 杂交 信和 号， 从 而 大 大 提高 了 检测 的 效率 。 2. 材 料 标记 、 杂 交 以 及 强化 的 化 学 发 光 检 测 的 各 种 试剂 均 来 自 ECL 直接 标记 检测 试剂 盒 (RPN3000, RPN3001, RPN3005, Amersham International，plc)。 每 一 试剂 盒 中 都 有 详细 说 明 ， 试 剂 盒 在 合适 的 条 件 下 至 少 可 稳定 贮存 3 个 月 。 但 是 标记 试剂 对 光敏 感 ， 保 存 时 应 避免 强 光 照射 或 长 时 间 暴 露 于 光线 中 。 这 些 试剂 以 及 实验 中 用 到 的 其 他 溶液 与 试 剂 罗 列 于 下 。 2.1 探 针 标记 1) 标记 试剂 : 包括 与 聚 乙 烯 亚 腕 (PEI) 交 联 的 辣 根 过 氧化 物 酶 ， 它 的 合成 方法 详 见 BAe RR 也 可 以 购买 成 品 (Amersham)。 使 用 方法 见 下 文 。 2) 成 二 醛 溶液 (1.$% 的 水 溶液 ): 1.5% (v/v) 的 成 二 醛 溶 于 去 离子 水 中 。 尽 管 戊 二 醛 是 一 种 有 害 的 试剂 ， 但 在 ECL 系统 中 所 用 仅 为 1.5% (wv)， 在 这 样 的 低 浓度 下 可 以 不 列 入 有 害 物 一 类 ， 不 过 仍 须 像 其 他 一 切 化 学 药品 那样 按照 规范 的 实验 室 操 作 s 7 = “使 用 。 1 ~~” 2) 3) 1) 2) 3) 4) 1) 2) 3) 4 a 1 Ye 2) 3) P20) 汐 交 金牌 杂交 缓冲 液 : 可 以 购 得 缓冲 液 成 品 (Amersham)。 绥 冲 液 中 除了 6 mol/L 尿素 外 还 含有 去 污 剂 、pH 稳定 剂 与 新 型 的 加 速 系统 。 与 早期 的 ECL 直接 检测 系统 相 比 ， 新 的 加 速 剂 还 直接 使 检测 灵敏 度 显著 提高 。 新 的 杂交 缓冲 液 保 证 了 较 高 水 平 的 目标 DNA 检测 ， 并 在 杂交 过 程 中 增强 酶 标的 稳定 性 。 封 阻 剂 。 氧化 钠 (分 析 纯 )。 2.3 严格 性 洗涤 20xSSC : 0.3 mol/L 柠檬 酸 三 钠 ，3.0 mol/L ALAM. pH7.0. 含 尿素 的 初级 洗涤 缓冲 液 : 360 g 尿素 ，4 g 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS), 25 ml 20x SSC) SEA S-1.L. 不 含 尿素 的 初级 洗涤 缓冲 液 : 4 g SDS, 25 ml 20xSSC， 定 容 至 1 L。 次 级 洗涤 缓冲 液 : 2x SSC。 244 KE 测 ECL 检测 试剂 I: 硼酸 缓冲 液 中 含有 特别 纯化 过 的 鲁 米 诺 和 ECL 促进 剂 。 ECL WAAL: 硼酸 缓冲 液 中 含有 过 酸 盐 。 Saran Wrap’ (Dow 化 学 公司 ) 膜 : 推荐 用 于 本 操作 的 各 个 步骤 中 ， 特 别 适 用 于 分 子 生物 学 各 方面 的 应 用 中 ， 因 为 此 膜 不 吸收 紫外 线 或 蓝 色 光线 。Saran Wrap 可 以 从 当地 供应 商 处 购 得 。 蓝光 敏感 的 放射 自 显影 底片 是 最 适用 于 ECL 系统 的 底片 (Hyperfilm ECL，Amer- sham)， 但 是 也 可 用 其 他 XXX 射线 底 片 ， 例 如 Hyperfilm-MP，Kodak-AR。 膜 上 的 发 光 也 可 以 用 具备 电荷 偶 联 装置 的 相机 进行 检测 。 外 法 3.1 探 针 标记 在 1.5 ml 微型 离心 管 中 将 待 标 记 的 核酸 稀释 成 10 ng/pl 的 浓度 (参见 注释 1)， 盖 上 盖子 后 将 管子 置 于 沸水 中 5 min 使 核酸 变性 (参见 注释 2 和 3)。 将 管子 取出 立即 置 于 冰 浴 中 5 min， 然 后 稍 事 离心 (10 s) 使 液体 集中 在 管 底部 。 管 中 加 入 与 样品 等 体积 的 标记 试剂 ， 用 微量 移 液 器 吸 放 液 体 借 以 混 匀 ， 注 意 吸 放 液 体 时 须 缓 慢 地 进行 操作 (人 参见 注释 4)。 - 48 。 4) 加 入 与 标记 试剂 等 体积 的 戊 二 醛 溶液 ， 再 次 用 移 液 器 缓慢 地 混 匀 。 5) 37C Rik 10 min。 这 时 探 针 已 被 HRP 标记 上 ， 如 不 立即 使 用 可 于 冰 上 保存 长 达 15 min (人 参见 注释 5). 杂交 液 的 配制 如 下 : BCH Par ap AAS RS ae WR AR RH Ya FF A Td A a 1k BRR BE 0.5 mol/L (B WEF 6). 880.5 mol/L 的 NaCl 对 于 大 多 数 标 记 反 应 都 可 以 得 到 满意 的 效果 ， 但 它 的 浓度 仍 可 随 标记 探 针 的 不 同 而 改变 。 加 入 封 阻 试剂 至 终 浓度 为 5% (w/v)。 人 快速 将 封 阻 试剂 与 缓冲 液 混合 以 避免 生成 凝 块 。 用 磁力 搅拌 句 在 42°C 继续 搅拌 混合 30 一 60 min， 封 阻 试剂 中 少量 未 溶解 的 颗粒 不 会 影响 杂交 效果 。 将 有 目标 DNA 的 膜 放 在 准备 好 的 42°C 预 热 杂 交 液 的 表面 (人 参见 注释 7)。 杂 交 缓 冲 液 与 膜 的 比例 为 0.25 ml/cm? 时 大 多 数 杂 交 都 能 得 到 满意 的 结果 。 (参见 注释 8 和 9)。 在 膜 浸 入 杂交 缓冲 液 前 先 使 其 充分 湿润 ， 预 杂交 在 427 KIA PHT, RSH 动 15 一 60 min。 3) 按照 实验 需要 (参见 注释 10) 在 预 杂 交 液 中 加 入 终 浓度 为 10 ng/ml 或 是 2 一 5 ng/ml 的 探 针 (3.1 节 第 $ 步 中 标记 的 探 针 )， 并 且 缓 慢 地 混 匀 ， 注 意 切 纪 将 探 针 直 接 加 到 膜 上 。 继 续 于 42? 缓慢 揪 动 2 h SUK. 1 YA 2 SS 3.3 严格 性 洗涤 1) 将 足 量 的 初级 洗涤 缓冲 液 预 热 至 428， 以 2 mlcm2 的 缓冲 液 洗涤 两 次 (BRIER tHe 小 心地 将 膜 从 杂交 容器 中 转移 到 干净 容器 中 ， 其 中 装 有 半 量 的 预 热 的 初级 洗涤 缓冲 液 。 在 42C 水 浴 中 振荡 20 min 后 倒 去 洗涤 液 ， 换 上 剩 下 的 缓冲 液 ， 在 缓慢 的 摇动 下 于 42C 再 振荡 保温 20 min. 倒 去 洗涤 液 ， 将 膜 放 在 干净 的 容器 中 ， 加 入 过 量 的 次 级 洗涤 缓冲 液 (至 少 2 ml/cm2)。 室 温 下 缓慢 地 摇动 S min， 倒 出 液体 后 换 上 新 的 次 级 洗涤 缓冲 液 ， 重 复 这 步 操 作 〈 人 参见 注释 12)。 必 要 时 膜 可 于 此 步 操 作 后 暂时 保存 (参见 注释 13)。 ~~” 2 A 3 YA 3.4 检 ml) 1 ~ 混合 等 体积 的 检测 试剂 T SiN MT, iC atl HE AR O.125 ml/cm? 比例 的 足够 量 的 混合 液 (参见 注释 14). 用 钵 子 小 心地 将 膜 从 最 后 一 次 的 次 级 洗涤 液 中 取出 ， 将 膜 的 底 边 靠 在 纸巾 上 吸 去 过 多 的 液体 。 膜 正面 向 上 放 在 置 于 工作 台 上 的 Saran Wrap 膜 上 。 将 新 配制 的 检测 混合 试剂 均匀 地 覆盖 于 膜 上 ， 放 置 1 min。 从 这 步 起 进行 得 越 快 越 好 ， 使 尽量 缩短 从 加 入 底 物 起 至 底片 曝光 这 段 时 间 。 用 凶 子 取出 膜 ， 将 底 边 靠 在 纸巾 上 吸 去 过 多 的 检测 剂 。 将 杂交 膜 正 面向 下 放 在 底片 。149 。 2 3 YA 4 YA & FW Saran Wrap 膜 上 。 5 ~~, FA Saran Wrap FRO AR 36 AR Se SE, (AE PR UEAR AY IE A i — BR Saran Wrap. 膜 倒 转 使 样品 面向 上 。 6 a 在 暗室 的 红 光 中 将 一 张 对 蓝光 敏感 的 底片 放 在 膜 上 ， 盖 上 盒 盖 后 在 室温 “曝光 ” 适 当 的 时 间 (参见 注释 15) 。 按 稼 规 方法 冲洗 底片 。 (1) (2 Na (3) (4 YA (S) (6) (7) (8) (9 ~~ (10) (11) A TE 释 每 个 管 中 可 标记 核酸 10 pl (100 ng) 至 150 ul (1.5 wg)， 当 管 中 核 酸 的 体积 超过 150 pl 时 标记 效率 就 会 下 降 。 标记 双 链 探 针 时 必须 完全 变性 方 能 得 到 最 大 标记 效率 。 在 使 用 电热 板 进行 操作 时 应 考虑 延长 时 间 ， 这 是 因为 电热 板 的 变性 效果 不 如 沸水 浴 。 变 性 步骤 对 于 单 链 探 针 并 不 必须 ， 但 为 了 防止 RNA 形成 二 级 结构 ， 变 性 步骤 也 仍然 是 可 取 的 。 因为 标记 反应 部 分 地 通过 带 负 电荷 的 核酸 与 带 正 荷 的 标记 试剂 之 间 的 离子 作用 来 完成 的 ， 所 以 样品 中 的 盐 浓 度 不 能 超过 10 mmol/L. 若 要 得 到 最 大 标记 效率 ， 使 用 等 体积 的 核酸 与 标记 试剂 是 很 重要 的 。 精 确 估 计 探 针 的 浓度 (10 ng/pl) 对 于 达到 最 大 检测 灵敏 度 是 必要 的 。 探 针 一 旦 被 标记 上 就 成 为 单 链 ， 能 用 于 任何 形式 的 膜 杂 交 中 。 如 果 期 望 贮 存 的 时 间 超 过 15 min 就 应 加 入 灭 菌 甘 油 使 甘油 终 浓 度 达 到 50%， 并 于 -205 保存 。 这 种 条 件 下 探 针 可 保存 12 个 月 ， 在 这 期 间 内 用 于 杂交 没有 明显 的 灵敏 度 损 失 。 尽管 在 某 些 情况 下 由 于 严格 性 的 要 求 须要 对 NaCl 的 浓度 进行 调整 ， 但 0.5 mol/L 的 NaCl 还 是 适用 于 各 类 探 针 。 当 膜 的 面积 大 于 100 cm? 时 ， 在 加 入 杂交 液 前 须 先 用 S x SSC 润 湿 膜 。 使 用 带电 荷 的 尼龙 膜 例 如 Hybond-N* (Amersham International) 能 达到 最 高 的 检测 灵敏 度 ， 但 是 大 多 数 情 况 下 使 用 不 带电 荷 的 尼龙 膜 (例如 Hybond-N) 或 硝酸 纤维 素 膜 (例如 Hybond-ECL) 也 能 得 到 满意 的 结果 。 如 果 杂 交 在 盒 中 进行 ， 应 使 用 0.25 ml/cenm2 的 缓冲 液 ， 当 盒 的 面积 明显 大 于 膜 时 ， 杂交 液 的 体积 应 与 盒 底 的 面积 相当 。 如 果 盒 中 的 缓冲 液 足够 并 且 膜 能 自由 活动 ， 也 可 数 张 膜 同时 进行 杂交 ， 和 否则 易 导 致 高 背景 。 杂交 可 在 袋 中 或 杂交 管 中 进 行 。 在 这 种 情况 下 0.125 ml/cm” 的 缓冲 液 就 已 足够 。 使 用 杂交 管 时 特别 重要 的 一 点 是 须 将 杂交 管 与 膜 之 间 的 气泡 排除 和 干净， 因为 气泡 会 在 检测 后 造成 膜 上 斑 片 状 高 背景 。 如 果 膜 有 显著 的 重 码 现 象 时 可 使 用 尼龙 网 ， 以 保证 膜 能 很 好 地 与 探 针 接 触 。 探 针 的 终 浓 度 为 10 ng/ml 并 且 杂 交 过 夜 时 检测 灵敏 度 最 高 ， 足 以 在 Southern 印迹 中 检测 哺乳 动物 基因 组 中 的 单 拷贝 基因 ， 但 是 对 于 诸如 菌落 、 鸣 菌 斑 以 及 细菌 基 因 或 PCR 产物 等 的 检测 只 需 低 灵敏 度 ， 使 用 浓度 为 2 一 $ ng/ml 的 探 针 与 2 h 的 杂 交 条 件 就 已 经 足够 了 。 严格 性 可 以 通过 调节 初级 洗涤 时 SSC 的 浓度 来 控制 。 初 级 洗涤 时 所 用 SSC 的 浓度 为 SxSSC。 但 是 使 用 低 浓 度 的 SSC， 例 如 0.1 x SSC 时 严格 性 更 高 ， 从 而 可 获得 « 90 + (12) (13) (14) (15) 更 加 特异 性 的 杂交 信号。 通常 这 样 的 洗涤 液 中 含有 6 molL 尿素 ， 在 420 进行 。 但 是 用 不 含 尿 素 的 初级 洗涤 液 ， 在 SSY 进行 洗涤 也 能 得 到 同样 的 效果 。 在 这 样 的 情况 下 总 的 洗涤 时 间 应 限于 20 min 内 完成 ， 以 保留 过 氧化 物 酶 的 活力 。 次 级 洗涤 应 保证 将 SDS 洗 净 ， 因 为 SDS 对 强化 的 化 学 发 光 反 应 可 能 有 干扰 。 杂交 膜 用 次 级 洗涤 液 润 湿 并 用 Saran Wrap 包 庄 后 可 于 4 中 保存 24 h。 经 保存 的 膜 在 检测 前 应 用 新 鲜 的 次 级 洗涤 液 稍 加 淋 洗 。 检测 试剂 最 好 分 开 保存 ， 于 临 用 前 混合 ， 这 样 可 以 避免 底 物 发 生 缓 慢 的 分 解 。 但 是 如 果 配 好 后 并 不 立即 使 用 则 应 置 于 冰 浴 中 ， 最 多 也 只 能 放置 30 min. 在 开始 时 的 几 次 实验 中 ， 对 于 较 少 的 目标 DNA 的 检测 反应 推荐 曝光 30 一 60 min。 另 一 种 办 法 是 先进 行 1 一 2 min 的 短暂 曝光 ， 用 此 作为 参照 以 估计 以 后 的 曝光 时 间 。 在 菌落 与 喉 菌 斑 的 算 选 中 ， 非 常 重要 的 一 点 是 曝光 的 时 间 应 尽 可 能 地 短 ， 因 为 在 这 种 情况 下 阳性 的 菌落 或 唆 菌 斑 可 以 清楚 地 被 分 辨 出 来 ， 从 而 避免 假 阳 性 的 结果 。 Se = XM 献 1. Renz, M. and Kurz, C. (1984) A colorimetric method for DNA hybridization. Nucleic Acids Res. 12, 3435-3444. 2. Whitehead, T. P., Thorpe, G. H. G., Carter, T. J. N., Groucutt, C., and Kricka, L. J. (1983) Enhanced chemiluminescence procedure for sensitive determination of per- oxidase-labelled conjugates in immunoassay. Nature 305, 158,159. 3. Hutton, J. R. (1977) Renaturation kinetics and thermal stability of DNA in aqueous solutions of formamide and urea. Nucleic Acids Res. 4, 3537-3555. 4. Stone, T. (1992) ECL direct system: an analysis of filter hybridization kinetics. Life Sci. (Amersham International) 7, 8-10. 5. Roswell, D. F. and White, E. H. (1978) The chemiluminescence of luminol and related hydrazides. Methods Enzymol. 57, 409-423. 6. Durrant, I., Benge, L. A. C., Sturrock, C., Devenish, A. T., Howe, R., Roe, S., Moore, M., Scozzafava, G., Proudfoot, L. M. F., Richardson, T. C., and McFarthing, K. G. (1990) The application of enhanced chemiluminescence to membrane-based nucleic acid detection. Biotechniques 8, 564-570. 7. Cohn, D., Chumakov, I., and Weissenbach, J. (1993) A first-generation physical map of the human genome. Nature 366, 698-701. 8. Sorg, R., Enczmann, J., Sorg, U., Kogler, G., Schneider, E. M., and Wermet, I. (1990) Specific non-radioactive detection of PCR-amplified sequences with enhanced chemiluminescence labeling. Life Sci. 2, 3,4. - 51> Btw THR 3 MN DEER 11 — dUTP tric Heo HEY 化 学 发 光 反 应 检测 Martin Cunningham, Ian Durrant, Bronwen Harvey Tl 1. Z| 本 章 标题 中 的 反应 包括 用 AR in FS BS BE RG BIG RK AT PR | A BSE RAY 3’ Sarg) DA Be Bi Jes FH SBR HA ak AL 1 YW AE HS ALS 1 ETE PAY RAS TE AB 方法 用 ECL 3’ Fe sin EK FPR tid 5 eM KBE (Amersham Internatinal, Amersham, UK) *FREARX, HHRKERREATRKRREN MMA, 4S ROGR 标记 以 及 强化 的 化 学 荧光 法 联合 应 用 时 ， 曝 光 时 间 在 1 h 以 内 可 以 检测 到 低 至 20 x 107 Bap 2) a) 18 mol 的 同 源 序列 。 2., 材 料 标记 与 强化 的 化 学 荧光 检测 所 需 试 剂 可 用 ECL 3 “ 端 窒 核 苷 酸 标记 与 检测 系统 试剂 (Amersham International，plc)。 这 些 组 分 以 及 其 他 溶液 和 试剂 的 配制 见 下 文 。 2.1 穴 核 苷 酸 标记 荧光 素 - 11 - dUTP: 这 一 核 苷 酸 由 ECL 3 MAKE Ric Ss MARAE. 末端 转移 酶 : 由 上 述 系统 提供 2 U/l 的 末端 转移 酶 。 二 甲 肿 酸 盐 缓 冲 液 : 该 系统 提供 10x 的 浓缩 缓冲 液 、pH 7.2。 注 意 二 甲 肿 酸 盐 是 剧 毒 的 化 合 物 ， 使 用 时 须 遵 守 安 全 规定 。 TE 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCl. pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. 2.2. 32 液体 封 阻 剂 : 由 ECL 3 sme tric A teil Ke, AAR cR PU RR 封 阻 溶液 中 。 杂交 缓冲 液 : 由 上 述 系 统 提供 ， 在 杂交 中 可 得 到 最 大 的 信 噪 比 。 20% (w/v) SDS 贮存 液 。 20 SSC: 0.3 mol/L fr, 3 mol/L NaCl. ° #§2 as 1) 2) 1) 2) 3) 4) 1) 2) 3) 4) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 2.3 膜 的 洗涤 20% (w/ v) SDS 贮存 液 20xSSC: 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 ，3 mol/L NaCl. 2.4 FRET, AHR S TR 抗 荧光 素 - HRP AAW: ECL 3 -HKFRhricHwwmMAReE 1000 x HEAR. 抗体 结合 物 经 制备 并 调节 到 使 在 膜 杂 交 中 出 现 本 底 很 低 的 背景 。 缓冲 液 I: 0.15 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris. pH 7.5. Bub 1: 0.4 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris. pH 7.5. 牛 血 清白 蛋白 (BSA) 组 分 V: 例如 Sigma (St. Louis, MO) 产品 号 A- 2153. 2.5 信号 的 产生 与 检测 ECL 检测 试剂 1: 硼酸 缓冲 液 中 含有 特别 纯化 过 的 鲁 米 诺 与 ECL 强化 剂 。 ECL PW: 硼酸 缓冲 液 中 含有 过 酸 盐 。 Saran Wrap™ (Dow 化 学 公司 ) : 用 于 不 同 的 操作 阶段 ， 不 吸收 紫外 线 或 蓝 色 光线 。 蓝光 敏感 的 放射 自 显影 底片 : 合适 的 底片 由 厂商 供应 (Hyperfilm™-ECL, Amer- sham)， 但 是 其 他 X 射 线 底片 也 可 以 用 ， 例 如 Hyperfilm-MP，Kodak-AR。 光 输出 也 可 以 用 电荷 耦合 装置 的 摄影 机 检测 。 3. A 法 3.1 BBRARinic 本 方法 可 以 标记 带 有 3- OH ARR HE, 将 除 酶 以 外 的 所 须 标 记 试 剂 的 各 种 组 分 放 在 冰 浴 中 解冻 〈 人 参见 注释 1)。 BTR PH 1.5 ml 聚 丙 烯 离心 管 中 依 次 加 入 下 列 标记 反应 的 各 种 组 分 : 100 pmol BOR R, 10 荧光 素 - 11 - dUTP，16 岂 二 甲 肿 酸 盐 缓冲 液 ， 加 水 至 144 pl, 后 加 入 16 pl 的 末端 转移 酶 ， 使 终 体 积 达 到 160 pl (参见 注释 2)。 用 微量 移 液 器 的 尖端 缓慢 地 吸 放样 品 ， 混 匀 溶 液 中 的 各 个 组 分 。 反应 混合 物 于 37C 保温 60 一 90 min. 如 果 需 要 ， 可 用 快速 标记 检测 法 (SALE) 检查 标记 效果 。 对 于 立即 使 用 的 探 针 可 放 在 冰 上 暂时 保存 ， 如 果 需 长 时 间 保 存 可 于 - 20°C 暗中 放置 (参见 注释 3)。 可 535 * 杂交 温度 是 由 所 使 用 探 针 的 序列 所 决定 的 。 理 想 情 况 下 杂交 的 严格 性 可 由 杂交 后 的 洗涤 条 件 控制 ， 对 于 大 多 数 系 统 可 以 使 用 427 的 杂交 温度 。 通 常 杂 交 温 度 必须 比 守 核 苷 酸 探 针 的 解 链 温度 (T。) 1K 5~10C?) (BRPBH 3 尾 的 存在 并 不 显著 影响 T。 值 )。 1) 推荐 使 用 的 杂交 缓冲 液 中 含有 下 列 组 分 : Sx SSC，0.1% (w/v) 的 杂交 缓冲 液 组 分 ，0.02% (w/v) 的 SDS 以 及 20 倍 稀释 的 液体 封 阻 试剂 。 将 所 有 组 分 加 入 后 调整 到 所 需要 的 体积 ， 搅 拌 混 匀 (参见 注释 4 和 5S)。 2) 将 膜 放 在 杂交 缓冲 液 中 ， 于 水 浴 中 振 功 进行 预 杂 交 至 少 30 min. 3) 预 杂 交 后 在 缓冲 液 中 加 入 终 浓 度 为 $ 一 10 ng/ml HICH RKHBREH (GREE 6). 4) GK PF SME PRE 1~-2h (参见 注释 7)。 3.3 膜 的 洗涤 杂交 的 严格 性 可 以 通过 洗涤 步骤 来 控制 。3 端的 加 尾 并 不 改变 未 标记 顺序 所 需 的 洗 涤 严 格 性 。 严 格 性 可 以 通过 改变 洗涤 过 程 中 的 温度 与 SSC 的 浓度 来 控制 (参见 注释 8)。 1) 从 杂交 缓冲 液 中 取出 膜 置 于 干净 的 容器 中 ， 加 入 过 量 的 Sx SSC，0.1% (w/v) SDS， 履 盖 过 膜 。 用 量 相 当 于 2 ml/cm-。 膜 必须 能 在 溶液 中 自由 移动 。 2) 室温 下 经 常 摇动 保温 $ min. 3) 倒 出 洗涤 液 后 加 入 新 的 5Sx SSC，0.1% (w/v) SDS， 再 次 保温 5 min. 4) 倒 去 洗涤 液 。 取 出 膜 放 在 干净 的 容器 中 ， 倒 入 经 过 预 热 的 合适 的 严格 性 洗涤 缓冲 液 ， 体积 以 能 盖 过 膜 并 且 稍 稍 过 量 为 度 。 含 有 1X SSC. 0.1% (w/v) SDS 的 洗涤 液 对 于 大 多 数 系 统 是 合适 的 。 5) 在 所 需 的 温度 下 (通常 42 一 50YC )， 在 振荡 水 浴 中 保温 15 min. 6) 倒 出 严格 性 洗涤 缓冲 液 后 再 次 倒 入 新 的 洗涤 液 ( 同 第 4 步 ) 并 在 第 $ 步 所 用 温度 下 放置 15 min。 3.4 FR. WAR ESHA 下 列 操 作 均 在 室温 进行 ， 并 且 膜 的 所 有 处 理 过 程 均 须 经 常 振 功 。 1) 将 膜 放 在 一 个 干净 的 容器 中 ， 用 缓冲 液 工 淋 洗 1 min， 绥 冲 液 的 用 量 为 2 ml/cm?*. 2) 倒 出 缓冲 液 I， 并 按 0.25 ml/cm? 的 用 量 换 入 封 阻 液 (用 缓冲 液 I 将 液体 封 阻 剂 稀 FE 20 倍 )， 至 少 保 温 30 min. 3) 用 缓冲 液 工 以 2 ml/cm? 膜 的 用 量 淋 洗 膜 1 min。 4) 用 含有 0.5% (w/v) BSA (组 分 V) 的 缓冲 液 I 工 将 抗 荧光 素 - HRP 结合 物 稀释 1000 倍 。 配 制 的 量 必须 相当 于 0.25 ml/cm?. ste. 5) 将 膜 放 在 稀释 的 抗体 结合 物 溶液 中 保温 30 min。 6) 将 膜 放 在 干净 的 容器 中 ， 用 过 量 的 缓冲 液 贡 淋 洗 膜 5 min， 所 用 体积 与 第 1 步 相 同 。 7) MAR 6 步 重复 洗涤 三 次 ， 以 保证 彻底 洗 去 非特 异性 结合 的 抗体 〈 参 见 注释 9)。 3.5 信号 的 产生 与 检测 本 节 按 照 ECL 直接 检测 法 进行 操作 (人 参见 第 十 章 )。 曝 光 时 间 随 靶 物 质 的 量 而 不 同 ， 标 记 DNA 的 量 较 大 时 ， 典 型 的 曝光 时 间 为 1 一 10 min， 标 记 DNA 的 量 较 少 时 ， 曝 光 时 间 为 10 一 60 min。 对 于 目标 DNA 的 量 较 大 的 系统 还 可 以 进行 多 次 曝光 。 4. 注 释 (1) 临 用 前 迅速 将 未 端 转移 酶 取出 置 于 冰 上 ， 取 出 所 需 的 部 分 后 原 管 应 尽快 放 回 - 20°C 冰箱 中 。 (2) 待 标记 的 宴 聚 核 苷 酸 最 好 溶 于 灭 菌 蒸 馏 水 中 。 根 据 DNA 序列 的 长 度 不 同 100 pmol 寡 聚 核 苷 酸 的 质量 也 不 同 : 碱 基数 质量 (ng) 3 500 20 660 30 1000 50 1660 如 果 待 标记 的 探 针 量 与 上 列 的 不 同 ， 反 应 物 的 体积 与 反应 终 体 积 都 要 根据 探 针 DNA 的 用 量 进行 相同 比例 的 调整 。25 一 250 pmol 之 间 的 探 针 都 能 成 功 地 进行 标记 。 (3) 标记 后 的 探 针 并 不 必须 纯化 。 (4) 为 了 实验 方便 建议 多 配 一 些 杂 交 缓 冲 液 ， 然 后 分 装 保 存 于 -207C 。 在 这 种 情况 下 杂 交 缓 冲 液 至 少 稳定 3 个 月 。 (5) 杂交 缓冲 液 与 膜 的 比例 必须 是 0.25 ml/cm-， 若 大 片 膜 在 塑料 袋 中 进行 杂交 或 在 炉 中 进行 杂交 时 此 比例 可 以 降低 至 0.125 ml/cm2。 当 杂交 容器 的 大 小 不 同 或 杂交 膜 的 张 数 不 同时 也 应 调整 缓冲 液 的 用 量 ， 但 必须 使 膜 在 杂交 液 中 能 够 自由 活动 。 (6) 杂交 开始 时 要 避免 将 探 针 直接 加 到 膜 上 。 可 以 先 用 少量 的 缓冲 液 将 探 针 稀释 ， 然 后 再 加 入 到 大 量 的 杂交 缓冲 液 混合 。 (7) 杂交 时 间 可 增加 到 17 h， 检 测 灵 敏 度 没 有 明显 的 改变 。 (8) 如 果 室 温 贮 存 的 严格 性 洗涤 液 有 任何 沉淀 时 应 在 使 用 前 稍 加 热 ， 直 至 沉淀 溶解 。 洗 涤 液 中 的 SSC ANKE BT WE 0.1~1 SSC 之 间 调 节 以 达到 所 需 的 洗涤 严格 性 ， 而 SDS 的 浓度 则 应 保持 在 0.1% (w/v)。 在 低 于 探 针 Tu 值 3 一 SC 时 ， 上 述 的 洗涤 条 件 下 可 以 从 错 配 的 DNA 序列 中 区 别 出 完 全 配对 的 序列 来 2 。 严 格 的 洗涤 温度 可 高 达 6S$C ， 但 是 如 果 同 时 改变 SSC 浓度 便 不 一 定 要 超过 50C 就 能 达到 所 需 的 严格 性 。 a daa (9) 可 以 在 检测 反应 前 将 膜 贮 存 于 最 后 一 步 洗涤 液 中 达 30 min， 如 需 更 长 时 间 保 存 则 要 将 膜 取 出 ， 包 在 Saran Wrap RP RT 2~SCKBPEE, ERARILE TI. 参考 文 献 1. Bollum, F. J. (1974) Terminal deoxynucleotidyl transferase, in The Enzymes, vol. 10 (Boyer, P. D., ed.), Academic, New York, pp. 145—171. 2. Wallace, R. B. and Miyada, C. G. (1990) Oligonucleotide probes for the screening of recombinant DNA libraries. Methods Enzymol 152, 432-442. « 55° Bt RNA 探 针 的 制备 Dominique Belin Tl 1. 引 HUTT Bae aR SPO 和 大 肠 杆菌 噬菌体 T7、T3 中 分 离 并 鉴定 出 RNA 聚合 酶 的 成 就 革新 了 RNA 代谢 研究 的 各 个 方面 4-6。 事 实 上 现在 已 经 能 够 生产 出 化 学 纯 的 、 不 论 多 大 量 的 任何 RNA 分 子 ， 这 项 技术 是 建立 在 病毒 转录 单位 的 种 种 性 质 的 基础 上 的 。 首先 ， 不 同 于 细胞 中 RNA 聚合 酶 ， 唆 菌 体 的 酶 是 单 链 的 蛋白 ， 容 易 从 被 噬菌体 感染 的 细菌 中 分 离 出 来 ， 并 且 现 在 已 经 能 用 DNA 重组 技术 制造 。 其 次 ， 它 们 能 非常 特异 性 地 识别 自己 的 启动 子 ， 这 些 启动 子 是 由 17 一 20 个 连续 碱 基 所 组 成 ， 很 少 出 现在 细菌 质粒 (A) RHR O min 2 min 5 min es hese Peng | hss 285: i e- «= PAI-2~ q g 2 SR Ng eae VER GRE RSH Me 70 LATE 7¥O'c Pio & WP Wb 2 Bo ALT AB 45S- 285- FOS-— 18S” = 12.1 (A) 紫外 线 照 射 交 联 效果 。 小 鼠 细 胞 全 部 RNA 中 的 PAI- 2 mRNA 与 同 源 CRNA 探 针 的 Northern 印迹 杂交 。 第 一 与 第 二 泳 道 分 别 为 妊娠 15.5 d 518.5 d 的 5 pe 胎盘 RNA， 其 中 不 含有 可 检测 量 的 PAI - 2 mRNA; 第 三 泳 道 为 1 pe 经 LPS 诱导 的 巨 叭 细胞 RNA， 它 是 PAI- 2 mRNA 的 丰富 来 源 05]。 所 有 的 样品 同时 电泳 与 转 移 。 膜 经 切割 后 ， 每 一 张 膜 都 用 紫外线 照射 ， 时 间 如 图 上 所 示 。 所 有 的 膜 同时 置 于 58Y 进行 杂交 ，70 洗涤 并 且 同 时 上 曝光。 经 紫外 线 照 射 后 探 针 与 28S rRNA 的 杂交 更 为 明显 ， 特 异性 的 杂交 在 紫外 线 照射 5 min 后 减少 。 (B) 杂交 温度 效应 。 大 鼠 细 胞 全 部 RNA 中 的 c-fos mRNA 与 小 鼠 的 v- jos CRNA 探 针 的 Northern 印迹 杂交 。 第 一 泳 道 为 未 诱导 的 细胞 ; 第 二 泳 道 为 部 分 诱导 的 细胞 ;第 三 泳 道 为 充分 诱导 的 细胞 (M.Prentki 和 D.B., RR 表 )。 所 有 样品 同时 电泳 与 转移 ， 未 用 紫外 线 照射 交 联 的 膜 在 标明 的 温度 进行 平行 的 杂交 与 洗 光 ， 四 张 膜 同时 曝 光 。 探 针对 28S rRNA 的 交叉 杂交 在 O8T 杂交 时 基本 上 已 消除 。 在 755 的 严格 性 洗涤 中 有 些 特异 性 的 信号 消失 。 Sy « 或 真 核 生物 的 DNA 中 。 第 三 ， 该 酶 具有 高 度 的 持续 性 ， 能 有 效 地 从 DNA 模板 上 合成 长 串 的 转录 物 。 本 章 将 讨论 DNA 模板 的 制备 以 及 从 模板 上 合成 ”P 标 记 的 RNA 分 子 的 转录 过 程 。 这 种 标记 的 RNA 通常 称 为 RNA 探 针 (riboprobe). 使 用 RNA 探 针 的 原理 与 DNA 探 针 相同 ， 可 用 于 Southern 或 Northern 杂交 中 。 RNA 探 针 能 避免 双 链 DNA 探 针 所 产生 的 自我 复 性 的 问题 ， 自 我 复 性 导致 与 膜 上 固定 的 目标 DNA 杂交 的 探 针 的 减少 ， 特 别 是 当 探 针 与 目标 DNA 的 同 源 程度 不 高 时 ， 再 一 次 复 性 的 探 针 可 能 取代 不 完全 配对 的 杂交 物 。 使 用 单 链 的 RNA 探 针 时 不 会 发 生 自 身 复 性 的 现象 ， 但 是 遇 到 最 困难 的 问题 是 由 于 RNA:RNA 更 为 热 稳定 。 于 是 富 含 GC 的 探 针 与 rRNAs 之 间 的 交叉 杂交 将 造成 不 能 接受 的 高 本 底 。 这 个 问题 经 常用 提高 杂交 条 件 的 严 格 性 来 解决 ， 如 图 12.1 中 所 示 。 此 外 也 可 以 将 模板 中 富 含 GC 的 区 段 除去 。 2. 材 料 进行 亚 克 隆 、 聚 合 酶 链 式 反应 (PCR) 和 凝 胶 电 泳 时 所 需 的 材料 也 和 下 面 列 出 的 一 样 ， 都 须 用 标准 的 分 子 生 物 学 材料 与 方法 。 操 作 RNA 时 比 操作 DNA 时 更 要 小 心 ， 因 为 消除 RNase 的 污染 是 非常 重要 的 。RNase 有 两 个 主要 来 源 : 实验 者 的 皮肤 和 溶液 中 的 微生物 污染 。 大 多 数 RNase 不 需要 二 价 阳 离子 ， 并 且 高 压 灭 菌 也 不 能 使 它 不 可 逆 地 变 性 。 实 验 时 必须 戴 上 手套 并 且 经 常 更 换 。 尽 管 某 些 机 械 制 造 的 管子 与 吸管 头 未 经 灭 菌 也 能 取得 实验 的 成 功 ， 但 还 是 必须 使 用 经 灭 菌 的 塑料 制品 ， 玻 璃 器 严 必 须 放 在 180°C 干 热 烘 烤 数 小 时 。 限制 酶 切割 与 PCR 扩 增 分 别 载 于 第 二 与 第 三 十 四 章 中 。 1) 水 : 尽管 不 少 实验 书 中 推荐 用 二 乙 基 焦 碳酸 盐 处 理 的 水 来 配制 所 有 溶液 ， 但 笔者 却 认为 并 无 必要 。 耐 高 压 灭 菌 (121C, 15~30 min) MERA AMA Ka, A 应 用 灭 菌 水 配制 。 2) TE: 10 mmol/L Tris-HCl . pH 8.1, 1 mmol/L EDTA. 3) 10 X TB: 0.4 mol/L Tris-HCl , pH 7.4, 0.2 mol/L NaCl, 60 mmol/L MgCh, 20 mmol/L 亚 精 胺 。 当 所 使 用 的 每 种 核糖 核 苷 酸 的 浓度 大 于 0.5 mmol/L 时 ， 就 应 该 增加 MgCl, 的 浓度 以 使 游离 Mg 的 浓度 达到 4 mmol/L. 0.2 mol/L DTT: 溶液 分 小 份 贮 存 于 -20C ， 每 管 只 能 使 用 一 次 。 溶 液 中 可 以 加 入 0.5 mmol/L 的 EDTA 以 稳定 DTT WK. 核糖 核 苷 酸 溶液 : 中 和 的 核 苷 酸 溶液 有 成 品 供应 ， 也 可 以 用 干粉 配制 〈 人 参见 注释 1)。 核 糖 核 苷 酸 溶液 可 于 -207C 贮存 数 月 。 6) BSA: 2 mg/ml 的 牛 血 清白 蛋白 ， 贮 存 于 -207 。 7) RNase 抑制 剂 : U/l AAR AE RNase 抑制 剂 ， 贮 存 于 -20?7 。 8) RNA #4 Her: FR: T3、T7 与 SPO 三 种 RNA 聚合 酶 有 商品 供应 。 贮 存 于 - 20Y RNA 聚合 酶 稀释 缓冲 液 ， 5$0 mmol/L Tris-HCl, pH 8.1, 1 mmol/L DTT, 0.1 mmol/L EDTA, 500 pg/ml BSA, 5% 甘油 。 稀 释 后 的 酶 不 稳定 ， 在 冰 浴 中 贮 存 不 可 超过 几 小 时 。 ice 4 3 9 YA 10) 7G RNase #Y DNase. 11) 终止 液 : 1% SDS, 10 mmol/L EDTA, 1 mg/ml tRNA. tRNA 可 省 去 。 12) TEN: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.1, 1 mmol/L EDTA 和 100 mmol/L NaCl. 2 WF 法 3.1 线性 化 的 质粒 模板 供 进行 到 底 的 转录 1) 将 所 需 的 基因 片段 亚 克 隆 到 合适 的 转录 载体 上 (人 参见 注释 2)。 2) 用 碱 裂 解法 从 30 一 100 ml 生长 达到 饱和 的 培养 物 中 分 离 质粒 DNA。 用 CsCU 溴 化 乙 锭 超 离心 法 或 用 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 纯化 质粒 DNA (人 参见 注释 3)。 3) 选用 合适 的 限制 酶 消化 2 一 20 ug 的 质粒 DNA 使 成 线形 (参见 注释 4)。 取 一 小 部 分 (0.2~0.5 pg) DNA 在 含有 省 化 乙 锭 (0.5 ug/ml) 的 琼脂 糖 微型 胶 上 电泳 以 检查 酶 切 程度 (SME 5). 4) 用 酚 / 氯 仿 抽 提 经 酶 切 的 DNA 两 次 ， 然 后 用 氯仿 抽 提 一 次 除去 残留 的 酚 。 用 乙醇 沉淀 DNA。 如 果 只 有 少量 DNA (FF 5 wg)， 可 以 加 入 10 pe 的 糖 原作 为 载体 ， 这 种 载体 对 转录 不 会 造成 不 利 影响 。 用 乙醇 洗涤 沉淀 后 空气 干燥 ， 然 后 悬浮 于 TE 中 ， 使 浓度 为 1 pe/ plo 3.2 合成 的 模板 和 从 PCR 法 制备 的 模板 用 限制 性 内 切 酶 克隆 插入 片段 和 使 质粒 模板 线性 化 的 最 大 限制 因素 是 不 一 定常 有 合 适 的 酶 切 位 点 。 此 外 ， 转 录 物 总 是 含有 与 内 源 性 RNA 不 同 的 S 端 或 3 端的 部 分 。 解 决 这 些 问题 的 一 个 方法 是 用 合成 的 寡 聚 脱氧 核 苷 酸 复 性 所 形成 的 DNA 小 片段 来 转录 [71。 另外 一 个 更 为 常用 的 方法 是 通过 PCR 法 扩 增 质粒 所 产生 的 模板 来 转录 。 从 理论 上 来 说 这 些 模 板 可 以 指导 任何 RNA 序列 的 合成 。 1) 具有 一 个 复合 序列 的 $ 端 引物 的 设计 : 5$ 端 是 由 小 的 T7 启动 子 组 成 ，3“ 端 相当 于 转录 物 的 起 始 部 分 (参见 注释 6)。 通 常 6 一 10 个 核 苷 酸 已 经 足够 在 质粒 模板 上 启 动 DNA 的 合成 。 2) 3 端 引物 的 设计 : 通常 是 17 一 20 个 核 苷 酸 的 长 度 ， 并 能 确定 转录 物 的 3" 端 (参见 注释 7)。 3) 用 PCR 法 扩 增 总 体积 为 100 pl FAY 2~50 ng 的 质粒 DNA。 验 证 所 需 大 小 的 DNA 片段 是 否 已 被 扩 增 ， 并 与 已 知 标准 比较 以 估计 DNA 的 量 。 4) 按照 3.1 节 第 4 步 的 方法 纯化 DNA 并 以 合适 的 浓度 悬浮 于 TE。 用 PCR 法 扩 增 的 模板 进行 转录 时 的 浓度 比 质粒 模板 为 低 ， 以 维持 酶 与 启动 子 之 间 的 摩尔 比 。 对 于 100 bp 长 度 的 片段 笔者 使 用 的 浓度 为 3 pg/ml. aa 3.3 ”放射 性 探 针 的 基本 转录 步骤 1) 在 总 体积 为 20 岂 的 转录 混合 物 中 依次 加 入 下 列 组 分 : 水 (所 需 的 体积 )，2 pl 10xTB，1 pl BSA, 1 pl 0.2 mol/L DTT, 0.5 pl RNase 抑制 剂 ，2 pl 5 mmol/L 的 三 种 核 苷 酸 (BI ATP, GTP, CTP), 10 pl a[*?P]-UTP (400 Ci mmol/L, 10 mCi/ ml), 1 岂 限 制 酶 消化 过 的 质粒 DNA PAR LAR 0.25~0.75 pl KY RNA KAM (BR 注释 8 与 9)。 2) T3 与 T7 RNA 聚合 酶 需 37Y 保温 40 min, SP6 RNA 聚合 酶 需 40 人 保温 40 min, 加 入 相同 单位 的 酶 后 (参见 注释 9) 继续 保温 40 min. 用 不 含 RNase 的 DNase (1 U/ng DNA) 4 37C 降解 模板 DNA 20 min， 然 后 加 入 40 pl 终止 液 终止 反应 。. 用 酚 / 氧 仿 抽 提 二 次 ， 有 机 相 用 50 pl TEN 回 抽 一 次 ， 合 并 水 相 抽 提 物 后 用 离心 过 柱 法 去 除 未 摊 入 的 核 苷 酸 。 离 心 柱 通过 下 列 方法 制备 : 用 TEN 配制 成 $S0% 的 糊 状 的 G-50 Sephadex (Pharmacia), 灭 菌 后 装 入 一 次 性 柱 (QS-Q, Isolab) 中 ， 然 后 以 200 g 离 心 S min。 小 心 将 样品 放 在 干 树脂 的 上 面 ， 然 后 将 柱 放 在 灭 过 菌 的 锥 形 离心 管内 。 以 200 g 离心 5 min 后 将 200 pl TEN 置 于 树脂 上 面 并 继续 离心 。 洗 脱 的 RNA 溶液 大 约 有 200~400 pl, ACR RBREKE 〈 人 参见 注释 10)。 取出 部 分 溶液 用 计数 器 测定 挫 入 效率 (参见 注释 11)。 转 录 产 物 的 大 小 可 以 通过 聚 丙烯 酰胺 /尿素 凝 胶 电泳 来 鉴定 〈 见 第 四 十 七 章 与 注释 12)。 3 Se 4 “—S 5 ~~ 4. JE 释 (1) 粉末 状 的 核糖 核 苷 酸 必 须 先 悬浮 于 水 中 ， 用 1 mol/L NaOH 或 HCl 将 溶液 的 pH 值 调 整 到 6 一 8， 然 后 通过 测定 紫外 线 吸收 再 调节 至 所 需要 的 浓度 。 100 mmol/L 的 ATP: 259 nm 时 吸收 单位 为 1540， 100 mmol/L 的 GTP: 253 nm 时 吸收 单位 为 1370， 100 mmol/L CTP: 271 nm 时 吸收 单位 为 910， 100 mmol/L #J UTP: 262 nm 时 吸收 单位 为 1000。 POE RAY 5e EE BY Witt PEI -纤维 素 (PEI-CEL 300) 薄 层 层 析 来 鉴定 。 树 脂 先 通过 上 行 层 析 用 水 洗涤 以 除去 原来 残留 的 紫外 线 吸 收 物质 ， 然 后 防 干 。 在 树脂 上 加 样 10 一 30 nmol 的 核糖 核 苷 酸 ， 通 过 上 行 层 析 使 核 苷 酸 分 开 。 用 于 层 析 的 0.5 mol/L KHPO4 以 H3PO, 调节 pH 值 至 3.$S。 干 后 用 254 nm 的 紫外 线 检测 核糖 核 苷 酸 。 可 以 购买 到 的 载体 都 是 从 大 肠 杆 菌 质粒 ColE1 衍生 的 高 拷贝 质粒 。 最 初 的 质粒 (pSP64 和 pSP65, Promega) 只 是 在 多 克隆 位 点 (mnultiple cloning sites, MCS) 的 上 游 含有 惟一 的 SP6 启动 子 51; 第 二 代 质 粒 在 多 克隆 位 点 的 两 端 各 有 一 个 方向 相 反 的 启动 子 Ce ML HAW DNA 片段 都 能 进行 转录 。pGEM 系列 (Promega) 含有 SP6 与 T7 启动 子 5]，pBluescriptIM 系 列 (Stratagene, La Jolla, ae (2 AS (3 (4 ) ) (S) (6 (7 (8 ) a ~~” CA) N&2A T7 与 T3 启动 子 。 选择 何 种 质粒 主要 依据 各 人 的 偏爱 ， 尽 管 个 别 序 列 的 性 质 会 影响 转录 ， 如 SP6 转录 时 经 常 发 现 过 早 终止 的 转录 产物 。 关 于 终止 信号 的 性 质 目前 还 不 是 完全 清楚 以 8]， 但 是 当 其 中 一 种 核 苷 酸 低 于 最 适 浓度 时 ， 转 录 终 止 的 效应 就 特别 明显 。 解决 这 一 难题 通常 将 插入 片段 重 行 克 隆 在 T7 或 T3 启动 子 的 前 面 。 当 酶 与 启动 子 的 比例 没有 严格 控制 时 ，T3 RNA 聚合 酶 局 部 识别 T7 启动 子 的 结果 可 能 导致 两 条 链 同时 转录 ， 这 可 能 是 形成 矫 作物 的 原因 之 一 ， 特 别 是 当 模 板 线性 化 的 位 置 正好 落 在 插入 片段 的 内 部 时 。 尽管 转录 效率 有 所 降低 ， 特 别 是 使 用 SP6 RNA 聚合 酶 时 ， 但 是 用 小 量 抽 提 法 抽 提 的 质粒 DNA 仍 可 使 用 。 小 量 抽 提 物 中 的 RNA 可 用 胰 RNase 消化 (20 pg/ml), 然后 在 纯化 线性 化 的 模板 的 过 程 中 除去 。 酶 切 后 的 小 量 抽 提 样品 经 离心 柱 处 理 可 提高 转录 效率 。 由 于 RNA 聚合 酶 可 以 非特 异性 地 从 3 “突出 端 进行 转录 ， 所 以 酶 切 时 应 选用 那些 能 造成 $“ 突 出 或 是 平 端的 酶 扩 91。 如 果 在 合适 的 位 点 上 只 能 产生 3“ 突 出 端 ， 那 么 可 以 利用 T4 DNA 聚合 酶 或 DNA 聚合 酶 I 的 Klenow 片段 的 外 切 活 力 切 成 平 末端 。 将 质粒 切割 不 止 一 处 的 酶 也 可 以 使 用 ， 只 要 不 使 启动 子 与 插入 片段 分 开 。 质粒 的 线性 化 越 彻 底 越 好 。 因 为 环 状 质粒 是 转录 效率 非常 高 的 模板 ， 所 产生 的 RNA 分 子 可 以 长 达 20 kb， 从 而 消耗 了 大 量 可 利用 的 核糖 核 苷 酸 。 还 存在 其 他 影响 转录 物 的 $ 端 序 列 的 因素 ， 因 为 已 经 证 明 紧 接 在 起 始 位 点 下 游 的 序列 可 以 影响 转录 延长 的 方式 。 前 面 的 6 个 核 苷 酸 对 启动 子 的 效率 具有 强烈 的 影 响 。 特 别 是 存在 着 尿 喀 喧 残 基 时 往往 更 为 不 利 !%71。 所 以 在 转录 模板 $" 端 引入 5 一 6 个 与 天 然 RNA 中 不 同 的 核 苷 酸 可 能 是 有 必要 的 。 也 曾 有 报道 在 用 SP6 聚合 酶 转 录 时 碰 到 过 同样 的 现象 "2 。 笔 者 比较 了 一 些 复合 的 T7 启动 子 的 效率 ， 总 结 如 下 : 除了 5 端的 启动 子 序 列 (5$-TAATACGACTCACTATA) 外 ， 模 板 上 紧 接 的 六 核 苷 酸 序 列 是 : 高 效 启动 子 低 效 启动 子 GGGAGA (T7 保守 区 ) GTTGGG (5$% 效 率 ) GGGCGA (pBS 质粒 ) GCTTTG (1% 效 率 ) GCCGAA 转录 模板 3 端的 序列 应 该 根据 下 游 引 物 $ 端的 序列 来 确定 。 但 是 在 转录 过 程 中 往往 会 在 3 端 出 现 不 依赖 于 模板 的 1 一 2 个 额外 的 核 苷 酸 , 因而 转录 的 结果 通常 是 一 个 有 着 不 同 3 端的 RNA 和 群体。 群体 中 3 ” 端 增 加 的 各 种 碱 基 的 比例 可 能 由 序列 的 组 成 所 决定 并 且 也 与 每 一 种 核 苷 酸 的 浓度 有 关 , SEL BREA MRR? 712), 各 组 分 加 入 的 次 序 可 以 改变 ， 必 须 记 住 若 没有 DTT 存在 时 稀释 的 RNase 抑制 剂 是 非常 不 稳定 的 ， 并 且 DNA 切 不 可 加 入 到 未 经 稀释 的 10XTB 中 ， 所 有 的 组 分 都 必须 放 在 不 低 于 2SC ， 目 的 是 防止 DNA - 亚 精 胺 复合 物 形 成 沉淀 。 由 于 放射 性 的 核 苷 酸 是 放 在 一 个 绝缘 得 很 好 的 小 管 中 提 供 的 ， 所 以 可 能 在 化 冻 后 放置 10 一 15 min 才 能 达到 所 需要 的 温度 。 笔 者 经 常 将 除了 RNase 抑制 剂 与 聚合 酶 外 的 各 组 SF 30C KH 15~20 min。 若 要 合成 不 止 一 种 探 针 ， 可 将 所 有 组 分 的 反应 混合 物 “os (9 ~~ (10) (11) (12) 加 到 DNA 模板 中 去 。 可 以 将 总 体积 减少 到 8 岂 以 便 保 存 。 但 是 因为 酶 对 表面 活 性 剂 的 作用 很 敏感 ， 所 以 保温 应 在 400 pl 的 管 中 进 行 。 对 于 SP6 聚合 酶 用 4 一 6 U/ug 的 质粒 DNA (大 小 为 3 一 4 kb), MF T7 或 T3 RNA 聚合 酶 可 使 用 10 一 20 UVwg 的 质粒 DNA。 纯化 步骤 (第 3.3 节 ， 第 4 步 ) 并 不 一 定 必需 ， 并 且 实 际 上 有 些 研 究 人 员 直 接 将 转录 混合 物 用 于 杂交 分 析 。 但 是 从 低 背 景 、 一 致 性 以 及 新 合成 的 RNA 的 定量 性 来 看 说 明 额 外 所 花 的 时 间 与 精力 并 不 是 白费 的 。 KF $0% 的 标记 核 苷 酸 的 挫 入 是 经 常 性 的 ， 但 一 般 则 大 于 80% 。 因 而 转录 时 加 入 50 pwCi 的 RNA 产量 可 达 4 x 107 Cerenkov-cpm。 这 表示 125 pmol 的 UMP， 并 且 假 定 在 没有 序列 偏爱 时 (BY 25% BY EAE A DRE) 可 以 产生 130 ng 的 RNA (SA: 3 x 108 Cerenkov-cpm/pwg)。 尽管 GTP 在 贮存 过 程 中 很 快 失去 摊 入 活性 ， 但 是 当 使 用 标记 的 CTP. GTP 时 仍 能 得 到 相似 的 结果 。ATP 则 由 于 具有 较 高 的 玉 ,。 值 名 而 不 常 使 用 。UTP 特别 稳定 ， 即 使 把 衰变 考虑 在 内 也 能 使 用 几 个 星期 。 每 一 种 标记 核 苷 酸 的 起 始 浓度 都 应 大 于 12.5 wmol/L， 这 样 才能 保证 有 效 地摊 入 并 防止 聚合 酶 延伸 的 停顿 。"H 标 记 的 探 针 也 可 制备 后 用 于 原 位 杂交 (参考 文献 13) 。 模板 DNA 中 加 入 10 pg/ng 的 T4 MR RAE 32 编码 的 蛋白 可 提高 转录 的 效 率 (D.Caput， 私 人 通讯 )。 最 近 的 研究 表明 在 室温 或 30Y 进行 转录 时 能 防止 转录 物 的 提早 终止 ， 并 且 能 增加 全 长 转录 物 (>1 kb) HARK, 不 能 进入 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 中 的 大 分 子 转录 物 的 出 现 ， 说 明 模 板 未 能 全 部 线性 化 ; 小 分 子 的 转录 物 的 出 现 则 表明 停顿 过 多 或 是 转录 物 尚未 成 熟 即 已 终止 。 re 感谢 P. Vassalli 在 用 RNA 探 针 探测 稀有 mRNA 的 早期 工作 中 所 给 予 的 鼓励 。 在 过 去 几 年 中 ， 很 多 同事 、 学 生 和 技术 员 对 本 章 所 写 的 实验 方法 作出 过 许多 贡献 ， 包 括 M.Collart, N.Busso, J.-D. Vassalli, H.Krisch, S. Clarkson, J. Huarte, S. Strickland, P. ~ Sappino, M. Pepper, A. Stutz, G. Moreau, D. Caput, M. Prentki, P. Gubler, F. Silva, V. Mon- ney, D.Gay-Ducrest, #1 N.Sappino。 本 项 研究 工作 受到 瑞士 国家 科学 基金 的 资助 。 参考 文 献 1. Butler, E. T. and Chamberlin, M. J. (1984) Bacteriophage SP6-specific RNA polymerase. J. Biol. Chem. 257, 5772-5788. 2. Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., and Green, M. R. (1984) Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridisation probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res. 12, 7035—7056. 3. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., and Studier, F. W. (1984) Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2035-2039. * 62 2 . Krieg, P. A. and Melton, D. A. (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Methods Enzymol. 155, 397-415. . Yisraeli, J. K. and Melton, D. A. (1989) Synthesis of long, capped transcripts in vitro by SP6 and T7 RNA polymerases. Methods Enzymol. 180, 42-50. . Milligan, J. F. and Uhlenbeck, O. C. (1989) Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62. . Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., and Uhlenbeck, O. C. (1987) Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA pidlymerasé and synthetic DNA tem- plates. Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798. . Roitsch, T. and Lehle, L. (1989) Requirements for efficient in vitro transcription and translation: a study using yeast invertase as a probe. Biochim. Biophys. Acta 1009, 19-26. . Schenbon, E. T. and Mierendorf, R. C. (1985) A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Res. 13, 6223-6234. . Nam, S. C. and Kang, C. (1988) Transcription initiation site selection and abortive initiation cycling of phage SP6 RNA polymerase. J. Biol. Chem. 263, 18,123—18,127. . Solazzo, M., Spinelli, L., and Cesareni, G. (1987) SP6 RNA polymerase: sequence requirements downstream from the transcription start site. Focus 10, 11,12. . Moreau, G. (1991) RNA binding properties of the Xenopus La proteins. Ph.D. the- sis, University of Geneva. . Sappino, A.-P., Huarte, J., Belin, D., and Vassalli, J.-D. (1989) Plasminogen acti- vators in tissue remodeling and invasion: mRNA localisation in mouse ovaries and implanting embryos. J. Cel/ Biol. 109, 2471-2479. . Krieg, P. A. (1991) Improved synthesis of full length RNA probes at reduced incu- bation temperatures. Nucleic Acids Res. 18, 6463. . Belin, D.,Wohlwend, A., Schleuning, W.-D., Kruithof, E. K. O., and Vassalli, J.- D. (1989) Facultative polypeptide translocation allows a single mRNA to encode the secreted and cytosolic forms of plasminogen activators inhibitor 2. EMBO J. 8, 3287-3294. * 63 ， SB Ba ARSE PEAS Da Weir Bc Hee aE He HL ok Adrian J. Harwood Ul fo Sr AS Os se BBS AS KG A a SMA 100 个 核 苷 酸 至 10 一 1S kb 的 核酸 片段 ， 小 于 这 一 范围 的 DNA 由 于 在 胶 中 的 扩散 而 难于 分 离 与 观察 。 这 些 问 题 可 以 用 非 变性 的 聚 丙 烯 Bt He Hee BS Hk «(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 解雇 。 非 变性 的 PAGE 分 离 的 片段 可 以 小 至 10 bp 大 至 1 kb， 可 分 辨 500 bp 中 的 1 bp. 非 变性 的 PAGE 还 具有 其 他 优点 : 它 具 有 相当 高 的 上 样 容 量 ， 当 在 一 个 孔 〈1 cm xl mm) 中 加 入 多 至 10 ng DNA 时 分 辩 率 不 会 有 明显 的 下 降 。 聚 丙烯 酰胺 胶 中 含有 酶 反应 的 几 种 抑制 剂 ， 所 以 对 于 亚 克 隆 以 及 其 他 分 子 生 物 学 技术 所 产生 的 片段 的 分 离 是 一 个 理想 的 胶 系 统 。 但 是 它 有 两 个 缺点 : 片段 的 碱 基 组 成 会 影响 它 的 迁移 率 ， 使 得 精确 测 定 片段 的 大 小 成 为 问题 ; 此 外 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 会 使 荧光 湾 灭 ， 从 而 使 条 带 中 的 DNA 少 于 25 ng 时 经 EB 染色 也 很 难看 到 ， 观 察 DNA 片段 的 其 他 方法 在 第 十 四 与 十 五 章 和 注释 1 中 讨论 。 本 章 介绍 非 变 性 PAGE 胶 的 配制 与 使 用 以 及 在 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 切片 中 进行 纯化 的 方法 。 2. 材 料 2.1 _ DNA 片段 的 分 离 电泳 胶 装 置 : 各 种 设计 的 电泳 装置 都 有 成 品 供应 。 胶 倾倒 在 以 隔 条 为 界 的 两 块 垂直 板 之 间 (参见 注释 2)。 去 离子 水 : 在 配制 胶 与 电泳 缓冲 液 时 不 一 定 要 用 高 压 灭 菌 的 水 ， 但 在 稀释 样品 或 是 在 胶 条 的 纯化 中 则 一 定 要 用 灭 菌 水 。 10xTBE: 108 g Trizma 碱 (Tris), 55 g 硼酸 ，9.3 g EDTA (二 钠 盐 )， 用 去 离子 水 加 至 1 L。 出 现 沉 淀 时 就 不 能 再 用 。 丙烯 酰胺 母液 : 30% 丙 烯 酰 腕 ，1% N，N“- 甲 又 双 丙 烯 酰胺 ， 贮 存 于 4C 。 母 液 能 购买 到 ， 也 可 自行 配制 : 将 丙烯 酰胺 与 双 丙 烯 酰胺 溶 于 水 中 后 过 滤 。 丙 炳 酰胺 具有 神经 毒性 所 以 取 用 必须 小 心 。 称 取 时 必须 戴 上 手套 与 口 置 。 5) APS (ammonium persulfate: 10% 过 硫酸 铵 (w/v)， 可 于 4 人 贮存 几 个 月 。 6) TEMED: N, N, N, N -G2e-1, 2-~ABAE. MAF AT. 7) 5x 上 样 缓冲 液 : 15% KH (Ficoll), 2.5 TBE, 0.25% (w/v) 二 甲苯 至， aes 1 a 多 Nae 3 ~~" 4 A 0.025% (w/v) RK. 8) EB:10 mg/ml EB 溶液 。EB 是 高 效 的 诱 变 剂 , OAR FE BV, ACU AE FA. 2.2 DNA 片段 的 纯化 9) MERAH: 0.5 mol/L BRE, 1 mmol/L EDTA , pH 8.0。 10) TE: 10 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, MEK. 11) 醋酸 钠 : 3 mol/L BARA. pHS.2. 30 法 3.1 DNA 片段 的 分 离 1) 依照 表 13.1 将 10xTBE、 丙 烯 酰胺 、 水 和 APS 混合 成 足够 浇灌 18 cm x 14 cm x 0.15 cm 柱 的 胶 50 ml. 2) 临 倒 胶 前 加 入 50 pl TEMED 并 且 转 动 混 匀 。 3) 立即 将 胶 倒 入 两 块 板 间 并 捅 好 梳子 。 放 置 待 凝固 约 需 30 min. 4) 向 电泳 槽 中 加 入 0.5xTBE， 拔 除 梳子 并 用 注射 针 简 多 次 洗涤 点 样 孔 。 尽 可 能 除去 未 聚合 的 丙烯 酰胺 是 非常 重要 的 ， 因 为 它 会 妨碍 样品 的 泳 动 (参见 注释 3)。 表 13.1 3.5%, 5%, 12% ARES RRR AE al 丙烯 酰胺 浓度 3.5% 5% 12% 10 X TBE 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 丙烯 酸 胺 母液 5.8 ml 8.3 ml 20.0 ml dH,0 41.3 ml 38.8 ml 27.1 ml APS 350.0 pl 350.0 pl 350.0 pl 有 效 分 离 范围 100 一 2000 bp 80 一 500 bp 40 一 200 bp 5) 样品 通常 溶 在 10 一 20 岂 的 TE、 水 或 酶 切 缓冲 液 中 ， 每 一 样品 中 加 入 1/5 倍 体积 的 5x 点 样 液 ， 混 匀 并 稍 事 离心 使 内 容 物 集中 在 管 底部 (参见 注释 4)。 6) 将 样品 加 到 点 样 孔 中 ， 以 200~300 V (大 约 10 V/cm) 进行 电泳 直至 溴 酚 蓝 走 到 靠近 底部 的 1/3 处 。 这 一 过 程 大 约 需 要 2.5 h (参见 注释 $)。 7) 拆 开 电 泳装 置 ， 将 胶 浸 入 1 mg/ml 的 EB 溶液 中 染色 30 min。 在 透射 紫外 线 灯 下 观 察 条 带 。 其 他 的 观察 方法 将 在 第 十 四 章 和 注释 1 与 6 中 介绍 。 3.2 DNA 片段 的 纯化 不 少 方法 可 用 来 从 聚 丙烯 酰胺 胶 中 回收 DNA， 笔 者 认为 破碎 浸泡 法 口 可 以 简便 而 有 效 地 从 非 变性 聚 丙烯 酰胺 或 变性 聚 丙烯 酰胺 胶 中 纯化 DNA. 1) 用 新 的 解剖 刀片 将 含有 DNA 的 聚 丙烯 酰胺 胶 条 切 下 ， 放 在 1.5 ml 的 离心 管内 。 > 65 + 2 3 4 S 6 7 8 (1 (2 (3 (4 (5 (6 ) ) ~~’ ) ) ) ) SS YA ~ ) a YA 用 黄色 的 吸 嘴 将 胶 条 捣 碎 后 加 入 1~2 倍 体积 的 洗 脱 缓冲 液 。 用 Para-film 封 住 管 口 后 放 在 4°C 的 转 轮 上 保温 ，DNA 片段 小 于 500 bp 时 保温 3 ~4h, DNA 片段 较 大 时 须 保 温 过 夜 。 以 10 000 g 离心 10 mn 除去 碎 胶 块 后 小 心地 吸取 上 清 液 ， 沉 淀 中 加 入 0.5 FAR 的 洗 脱 缓冲 液 ， 涡 旋 振 功 器 上 轻微 振荡 后 再 次 离心 。 合 并 两 次 上 清 液 。 上 清 液 中 加 入 2 倍 体积 的 乙醇 ， 在 冰 浴 中 放置 10 min, VA 12 000 g 离心 1$ min. 将 沉淀 溶 于 200 pl TE 中 并 加 入 25 pl 3 mol/L 的 醋酸 钠 。 加 入 400 由己 醇 后 和 第 5 步 一 样 再 行 沉淀 。 沉淀 用 70% 的 乙醇 淋 洗 后 空气 干燥 。 沉淀 溶 于 合适 体积 的 TE 中 ， 用 电泳 法 检测 回收 DNA 片段 的 量 。 43 注 1 ERA LABRET, BEN DNA 不 用 EB 染色 就 能 在 紫外 线 灯 下 看 见 。 用 可 以 透 过 UV 的 塑料 薄膜 诸如 Saran Wrap RE RAB RRESA UV 奖 光 指 示 剂 (Merck 60F254, Cat. no.5554) 的 薄 层 层 析 板 上 观察 。 长 波 紫 外 线 可 以 透 过 胶 照 在 层 析 板 上 使 之 发 光 。DNA 浓度 高 的 区 域 由 于 吸收 了 透射 紫外 线 而 在 板 上 留 下 了 阴影 ， 可 用 细 钢 笔 将 DNA 条 带 的 位 置 标记 在 Saran Wrap 膜 上 以 便于 切 割 。 在 倒 胶 时 板 上 的 油脂 与 污 物 可 以 造成 气泡 ， 所 以 倒 胶 前 必须 彻底 清洗 玻璃 板 并 用 乙 醇 擦洗 。 为 了 保证 拆卸 时 使 胶 只 贴 附 于 一 块 板 上 ， 可 在 未 装配 前 对 一 块 板 进行 硅化 处 理 。 硅 化 手续 很 容易 : 可 用 沾 有 二 甲 基 二 氯 硅烷 溶液 的 卷 简 纸 擦 涂 玻璃 板 ， 然后 依次 用 蒸馏 水 与 乙醇 洗涤 。 如 果 再 将 板 置 于 100C 烘 烤 30 min 则 硅化 可 保留 以 供 4 一 5 次 使 用 。 如 果 分 离 的 片段 非常 小 ， 小 于 50 bp， 则 在 正式 电泳 前 先 要 进行 30 min WRK, 这 样 能 使 前 沿 分 子 的 分 辩 率 增加 。 高 盐 (KF 50 mmol/L NaCl) 会 影响 样品 的 迁移 ， 还 会 使 条 带 破坏 ， 在 这 样 的 情 - 况 下 必须 用 乙醇 沉淀 除 盐 。 电泳 时 电压 不 要 超过 10 V/em， 因 为 高 电压 会 造成 胶 过 热 ， 影 响 分 辨 率 。 可 以 慢 慢 地 进行 电泳 ， 例 如 使 用 75$V 电泳 过 夜 。 如 果 样 品 是 放射 性 标记 的 话 〈 见 第 十 五 章 )， 胶 须 先 在 10% 的 醋酸 中 国定 ， 然 后 转 移 到 3 MM 纸 (Whatman, Maidstone, UK) EL, FRR RUTGERS. FREE BEF ODS Re, FBS ie 2 J ae ET HB a, PRO 底片 与 胶 对 齐 ， 割 下 胶 上 条 带 并 按照 3.2 节 的 方法 纯化 。 参考 文 献 1. Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 668-671. - 66° Ss VUE | ARAVA Bete all Lloyd G. Mitchell, Angelika Bodenteich, Carl R. Merril Til 1. 引 银 染 是 一 种 在 丙烯 酰胺 胶 上 或 者 其 他 膜 上 检测 纳 克 (ng) 级 蛋白 质 或 核酸 的 有 效 方 法 。 在 检测 蛋白 质 与 核酸 的 方法 中 它 显 示 了 比 有 机 染料 更 高 的 灵敏 度 ， 银 染 足以 检测 低 至 0.03 ng/mm? 的 DNAIHI。 此 外 银 染 避免 了 像 EB 与 放射 性 检测 那样 的 诱 变 剂 的 公害 。 13 世纪 中 期 时 炼金 师 Count Albert von Bollstadt 首次 记录 了 硝酸 银 可 使 有 机 材料 包 括 人 的 皮肤 染色 。 但 是 直到 1844 年 Krause 才 在 科学 研究 中 开始 用 银 来 染 生物 组 织 ， 接 着 又 被 解剖 学 家 Golgi 与 Cajal 进一步 发 展 了 。 银 染 首 次 使 用 在 聚 丙 烯 酰胺 胶 上 是 由 组 织 学 的 染色 法 改造 而 来 的 。 它 非常 繁琐 ， 需 要 多 步 操作 与 多 种 试剂 ， 并 且 整 个 过 程 需 3 ht， 在 银 染 检测 聚 丙烯 酰 胺 胶 上 分 离 的 蛋白 质 或 核酸 的 继续 研究 中 产生 了 许多 简单 的 方法 ， 也 同时 使 我 们 扩展 了 染色 机 制 的 知识 。 蛋白 质 与 核酸 的 影像 是 由 于 蛋白 质 或 核酸 在 胶 上 或 膜 上 所 占 部 位 与 周围 的 胶 或 膜 的 氧化 -还 原 势 不 同 而 产生 9,41。 氧 化 还 原 势 催化 了 银 离子 变 为 金属 银 的 还 原 反 应 。 当 核 酸 或 蛋白 所 占 的 部 位 具有 上 比 周 围 环 境 较 高 的 氧化 还 原 势 时 产生 正 像 (暗色 )， 如 果 情 况 相反 则 产生 负 像 。 氧 化 还 原 势 可 以 通过 改变 染色 液 的 化 学 组 成 来 改变 。 用 核酸 及 其 组 分 的 实验 表明 味 叭 是 银 当 反应 中 的 活性 亚 基 [5 。 银 染 法 利用 三 种 不 同 的 化 学 反应 : 二 元 胺 或 氨 化 物 法 、 非 二 元 胺 化 学 还 原 法 以 及 光 化 学 法 。 二 元 胺 银 染 法 最 初 是 为 了 观察 神经 纤维 而 发 展 起 来 的 ![， 也 是 首次 用 在 聚 丙 烯 酰胺 胶 上 对 分 离 的 生物 大 分 子 进行 检测 。 二 元 胺 法 染色 是 建立 在 氢 氧 化 贸 存 在 时 形成 银 、 二 元 胺 复合 物 的 基础 上 。 为 了 产生 影像 ， 含 有 银 、 二 元 胺 复合 物 的 溶液 必须 酸化 ， 最 普通 的 是 在 甲醛 存在 条 件 下 用 柠檬 酸 进行 酸化 。 匀 离 子 的 减少 使 银 、 二 元 胺 复合 物 中 银 离子 得 以 释放 ， 这 样 有 利于 甲醛 将 银 离子 还 原 为 金属 银 。 在 显影 液 中 柠檬 酸 浓度 必须 精确 控制 以 减少 背景 中 银 的 沉积 。 光 显 影 染 色 法 建立 在 光线 将 银 离子 转变 为 金属 银 基 础 上 ， 这 种 染色 法 简单 而 快速 ， 并 且 只 需 少 数 几 种 试剂 ， 但 灵敏 度 较 其 他 方法 为 低 吕 。 绝 大 部 分 非 二 元 胺 化 学 还 原 染 色 法 是 从 光化学 方法 发 展 起 来 的 B]。 它 们 使 用 了 在 酸性 条 件 下 能 与 生物 大 分 子 发 生 反应 的 硝酸 银 ， 然 后 通过 在 碱 性 条 件 下 甲醛 对 银 离子 进 行 选择 性 还 原 。 往 往 加 入 碳酸 钠 使 显 色 过 程 维 持 碱 性 ， 因 为 甲醛 能 被 氧化 成 为 甲酸 。 非 二 元 胺 的 化 学 染色 法 既 快 速 又 容易 操作 ， 这 个 方法 对 于 厚度 在 1 mm 以 下 的 胶 都 能 很 好 地 染色 ， 这 里 所 介绍 的 非 二 元 胺 银 染 色 方 法 能 在 40 min 内 完成 ， 所 用 的 试剂 可 放置 几 个 月 保持 稳定 。 2. 材 料 所 有 的 试剂 都 必须 用 电导 小 于 1 pmho 的 超 纯 去 离子 水 配制 。 水 中 不 能 含有 无 机 离 子 或 有 机 污染 物 ， 因 为 这 些 污染 物 经 常 使 背景 染色 。 由 于 银 染 液 是 一 种 非常 好 的 蛋白 检 测 剂 ， 所 以 必须 注意 防止 皮肤 上 的 蛋白 质 或 是 其 他 的 污染 源 与 胶 或 试剂 接触 。 银 可 以 用 来 染色 非 变性 的 和 变性 的 丙烯 酰胺 胶 ， 也 能 用 于 不 连续 缓冲 系统 的 和 不 同 交 联 程度 的 脱水 的 胶 [81。 我 们 推荐 使 用 厚度 为 0.4 mm 的 胶 (参见 注释 1)。 银 染 溶液 易于 配制 ， 除 了 显 色 剂 外 其 余 的 试剂 可 稳定 贮存 6 个 月 。 它 们 也 可 以 在 实 验 过 程 中 配制 。 1) 固定 剂 : 10% CB (v/v) (参见 注释 2)。 2) 氧化 剂 : 0.0034 mol/L HERR (1 g/L) 与 0.0032 mol/L 的 硝酸 (或 0.2 ml 16 mol/L 的 浓 硝 酸 ) (参见 注释 3)。 硝 酸 溶液 有 刺激 性 ， 应 防止 接触 皮肤 。 并 且 这 溶 液 是 强 氧化 剂 ， 所 以 放置 时 必须 远离 还 原 剂 ; 它 还 是 一 个 光敏 试剂 ， 所 以 必须 贮存 在 棕色 瓶 或 是 避 光 的 瓶 中 。 3) 银 盐 溶液 : 20% 的 硝酸 银 (2 g/L) (参见 注释 3)。 硝 酸 银 溶液 可 腐蚀 眼睛 与 黏膜 ， 也 可 使 皮肤 或 衣服 染色 。 应 贮存 在 棕色 瓶 或 避 光 的 瓶 中 。 4) 显影 剂 : 0.28 mol/L 的 碳酸 钠 (30 g/L) 加 上 0.5 ml/L 的 37% 的 甲醛 水 溶液 〈 参 见 注 释 4)。 临 用 前 混合 。 此 溶液 必须 在 4 使 用 并 且 也 贮存 于 这 一 温度 。 由 于 甲醛 的 蒸气 可 能 是 致癌 剂 ， 所 以 须 在 通风 橱 中 进行 操作 。 5) 终止 液 : 5% (v/v) BR. 6 法 核酸 经 电泳 分 离 后 ， 将 每 一 块 聚 丙 烯 酰胺 胶 分 别 放 在 一 个 干净 的 玻璃 或 塑料 盘 中 。. 戴 上 洗 去 粉末 的 聚 乙烯 或 乳胶 手套 ， 穿 上 实验 衣 可 减少 胶 污染 的 危险 性 ， 并 能 防止 使 实 验 人 员 染 上 颜色 。 除 了 显 色 剂 外 其 余 的 溶液 都 能 于 室温 保存 ， 显 色 剂 使 用 前 要 放 在 AC 预 冷 ， 实 验 室 中 柔和 的 背景 光线 有 利于 降低 背景 染色 。 并 且 显 色 也 不 能 在 透 光 的 盒子 中 进行 。 处 理 胶 时 必须 动作 温和 ， 避 免 因 胶 的 破损 而 造成 矫 作 物 。 溶 液 不 能 直接 倒 在 胶 上 面 ， 应 使 盘 倾 斜 后 将 溶液 倒 在 盘 的 角 上 ， 或 者 将 每 种 溶液 各 放 一 盘 ， 然 后 将 胶 从 一 个 盘 转 到 另 一 个 盘 。 溶 液 的 体积 必须 足够 将 胶 全 部 浸没 。 在 显 色 过 程 中 盘子 须 轻 轻 地 摇动 。 1) 电泳 分 离 结束 后 将 胶 浸 泡 在 固定 液 中 10 min, (参见 注释 S)， 固 定 液 的 体积 须 比 恰 好 浸没 胶 时 再 多 一 倍 (参见 注释 6)， 如 果 显 色 反 应 不 能 立即 进行 ， 胶 可 放 在 固定 液 中 无 限期 地 保存 下 去 。 将 胶 放 在 重 铬 酸 盐 氧化 剂 中 浸泡 3 一 5 min (BOYER 7), MABEL, FEB 子 水 洗 三 次 ， 每 次 3 一 5 min (人 参见 注释 7 与 8)。 将 胶 放 在 硝酸 银 溶 液 中 浸泡 15 一 20 min (参见 注释 9)。 用 去 离子 水 洗涤 一 次 (20~ 30 s) 以 除去 胶 表 面 的 硝酸 银 (参见 注释 10)。 在 均匀 摇动 中 用 预 冷 的 显影 液 洗涤 胶 块 约 30 s 以 促使 影像 出 现 〈 参 见 注释 11)。 仔 Bees 2 ~~ 3 ~~ 4 —— 细 观 察 显影 进程 ， 当 溶液 开始 混浊 时 尽快 倒 出 显影 液 (参见 注释 12)。 倒 入 新 鲜 的 显影 液 ， 同 样 在 开始 混浊 时 尽快 倒 出 显影 液 。 重 复 这 一 过 程 直到 影像 出 现 或 者 背景 已 染色 较 深 为 止 。 5) 当 DNA 条 带 与 背景 相 比 出 现 令 人 满意 的 深度 时 将 胶 浸 在 5% 的 醋酸 溶液 中 终止 反应 (参见 注释 13 与 14)。DNA 条 带 通常 以 深 棕 色 或 黑色 出 现在 浅黄 至 棕色 的 背景 上 (参见 图 14.1)。 固定 在 聚 酯 薄膜 上 的 已 染色 的 胶 可 在 微波 炉 中 干燥 或 放 在 空气 中 防 干 。 没 有 烘 干 的 胶 可 放 在 玻璃 纸 或 是 滤纸 上 稍 加 热 并 抽 真 空 干燥 。 如 果 需 要 永久 性 的 图 像 ， 可 摄影 保 存 ， 因 为 用 本 法 进行 银 染 的 条 带 随 着 时 间 的 推移 而 变 深 。 图 14.1 典型 的 银 染 胶 。 胶 上 含有 从 不 同 个 体 得 来 的 富 含 AC 重复 序列 的 部 分 线粒体 DNA。DNA 经 PCR 扩 增 并 从 每 一 反应 产物 中 取 1 由 (8 一 35 ng/pl), DA 3 岂 含 有 甲 酰 胺 的 点 样 液 后 96T 保温 1 min 进行 变性 。DNA 在 含有 6 mol/L 尿素 的 6% 聚 丙烯 酰胺 凝 胺 上 于 OSS 进行 电泳 。 凝 胶 是 固定 在 GelBond PAG (FMC, Rockland, ME) 上 的 。 图 中 同时 显示 出 用 这 种 技术 可 能 发 生 的 胶 表 面 矫 作物 的 情况 。 4. 注 释 (1) 胶 越 薄 染 色 越 快 ， 但 薄 的 胶 易 碎 不 便于 操作 ， 而 厚度 大 于 0.7 mm 的 胶 染 色 需 较 长 时 间 。 为 了 增加 胶 的 耐久 性 ， 对 于 厚度 在 0.7 mm 以 下 的 胶 我 们 建议 将 它 固定 在 聚 酯 膜 (例如 GelBond PAG, FMC, Rockland, ME 或 Gel-Fix, Serva, Heidel- berg, Germany) 上 。 或 者 ， 胶 也 可 以 固定 在 硅化 的 玻璃 板 上 (Bind-Silane, Phar- macia-LKB，Piscataway，NJ)。 固 定 在 聚 酯 膜 上 的 优点 是 电泳 后 可 以 对 不 含 DNA 的 部 分 修剪 掉 以 减 少 染 色 溶 液 的 用 量 。 如 果 利 用 聚 酯 膜 固 定 凝 胶 ， 则 必须 在 固定 前 将 聚 酯 膜 平整 好 并 通过 毛细 管 吸 引 使 膜 紧 贴 在 电泳 仪 的 玻璃 板 上 。 为 了 完成 这 一 操作 先 将 几 毫 升 蒸馏 水 或 $% 甘 油 滴 到 板 上 然后 再 放 上 聚 酯 膜 。 必 须 注 意 使 不 固定 凝 胶 的 一 面 与 玻 板 接触 。 聚 酯 膜 可 用 印刷 橡胶 棍 或 移 液 管 开平 ， 除 去 所 有 的 气泡 和 不 平整 之 处 方 能 使 凝 胶 厚 度 一 致 ， 这 是 非常 重要 的 。 为 了 防止 移 液 管 滚动 时 聚 酯 膜 的 移动 ， 可 在 胶 底部 的 薄 - 69 - (2) (3) (4) (S) (6) (7) (8) (9 4 (10) (11) (12) (13) (14) 膜 与 玻璃 板 之 间 加 上 一 滴 硅 油 使 它 形成 一 层 菏 膜 。 聚 酯 膜 必 须 大 到 足以 能 盖 住 胶 、 点 样 孔 以 及 在 膜 的 顶部 的 隔 条 。 聚 酯 膜 与 隔 条 就 位 后 便 可 像 平时 那样 操作 了 。 甲醇 可 以 代替 乙醇 ， 但 通过 皮肤 接触 或 呼吸 甲醇 可 使 操作 人 员 中 毒 。 聚 丙烯 酰胺 胶 分 离 DNA 或 蛋白 质 所 用 的 许多 其 他 固定 液 中 都 含有 醋酸 ， 但 是 这 里 所 用 的 固 定 液 中 不 含 醋 酸 ， 不 含 醋酸 时 条 带 会 更 深 一 些 。 这 一 溶液 也 可 以 配 成 10x 的 母液 。 浓 的 甲醛 母液 通常 是 37% 。 厚度 大 于 0.7 mm 的 胶 固定 时 间 需 要 20 min, WERE AMMA 40~SOCHHMER 时 固定 时 间 可 以 缩短 。 固定 的 作用 除了 能 减少 DNA 在 胶 中 的 扩散 外 ， 还 能 除去 可 能 干扰 染色 的 缓冲 液 离子 与 胶 中 的 其 他 化 学 物质 〈 例 如 尿素 )。 厚度 小 于 00.7 mm 的 凝 胶 浸 泡 10 min. 洗涤 时 重要 的 一 点 是 要 将 胶 中 重 铬 酸 盐 的 浓度 降 得 很 低 ， 直 到 看 不 出 黄 颜 色 为 止 。 如 果 胶 中 的 重 铬 酸 盐 氧 化 剂 仍 呈 黄色 或 是 转变 成 红色 ， 应 用 0.01 mol/L 的 硝酸 洗 涤 脱 色 。 如 果 胶 的 厚度 大 于 0.7 mm 时 须 浸 泡 25 一 30 min， 如 果 这 步 操作 中 存在 任何 污染 物 ， 特 别 是 氯 化 物 ， 就 可 能 产生 银 沉 淀 。 这 种 沉淀 往往 使 银 染 的 灵敏 度 降 低 并 且 使 背景 增加 。 如 果 这 步 洗 涤 时 间 过 长 则 会 使 银 扩散 到 胶 外 去 反而 降低 了 灵敏 度 。 使 用 冷 的 显影 剂 便于 控制 显影 的 进程 。 当 银 离子 从 胶 中 逸 出 时 会 形成 棕色 的 碳酸 银 沉 淀 。 如 果 溶 液 调 换 不 及 时 ， 沉 淀 便 沉积 在 胶 的 表面 。 如 果 显 影 过 度 或 是 由 于 银 在 胶 表 面 的 沉积 而 形成 银 镜 时 可 用 下 法 进行 脱色 处 理 ; 取 37 g 无 水 硫酸 铜 与 37 g 氧化 钠 溶 在 850 ml 的 去 离子 水 中 。 在 不 断 的 搅拌 下 加 入 浓 的 氢 氧 化 贸 直 到 溶液 变 成 深蓝 色 并 且 没 有 沉 省 为 止 ， 再 将 溶液 的 体积 调节 到 . 1 L。 另 外 须 配制 第 二 种 溶液 : 在 1L 去 离子 水 中 含有 436 g 的 五 水 合 硫 代 硫 酸 钠 。 临 用 前 将 两 种 溶液 等 体积 混合 ， 胶 浸 在 这 个 溶液 中 直至 几乎 完全 清澈 。 用 10% 的 栈 酸 浸泡 15 min 使 脱色 反应 终止 ， 然 后 用 去 离子 水 洗涤 至 少 1 h， 几 次 更 换洗 涤 液 。 胶 可 以 从 硝酸 银 步骤 开始 重新 染色 (第 3 步 )， 重 新 染色 时 不 需要 重 铬 酸 钾 盐 步骤 。 脱 色 步 又 也 可 用 于 去 除 衣 服 上 染 上 的 银 。 胶 表 面 有 些 矫 作物 条 带 或 沉淀 可 在 胶 干 后 用 湿润 的 药 棉 扩 去 ， 此 处 理应 该 先 在 不 重要 的 区 域 试 用 ， 当 擦拭 到 胶 表 面 有 些 黏 糊 时 即 应 停止 擦拭 ， 但 胶 干 后 仍 可 继续 进行 。 1) RMAKF. —PAIE 人， Wh 考 XM 献 . Goldman, D. and Merril, C. R. (1982) Silver staining of DNA in polyacrylamide gels: linearity and effect of fragment size. Electrophoresis 3, 24-32. . Merril, C. R., Switzer, R. C., and Van Keuren, M. L. (1979) Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two dimensional electrophore- sis and a highly sensitive silver stain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4335-4339. . Merril, C. R. (1987) Development and mechanisms of silver stains for electro- phoresis. Acta Histochem. Cytochem. 19, 655-667. . Merril, C. R. (1990) Silver staining of proteins and DNA. Nature 343, 779-780. . Merril, C. R. and Pratt, M. E. (1986) A silver stain for the rapid quantitative detec- tion of proteins nucleic acids on membranes or thin layer plates. Anal. Biochem. 156, 96—110. . Bielschowsky, M. (1904) Die silberimpragnation der neurofibrillen. J. Psychol. Neurol. 3, 169-189. . Merril, C. R., Harrington, M., and Alley, V. (1984) A photodevelopment silver stain for the rapid visualization of proteins separated on polyacrylamide gels. Electrophoresis 5, 289-297. . Allen, R. C., Graves, G., and Budowle, B. (1989) Polymerase chain reaction ampli- fication products separated on rehydratable polyacrylamide gels and stained with silver. Biotechniques 7(7), 736—744. o yt Sth DNA 片段 的 末端 标记 Adrian J. Harwood 1. 引 Ul 末端 标记 无 论 是 对 于 DNA 片段 的 放射 性 或 是 非 放 射 性 标记 而 言 都 是 快速 与 灵敏 的 方法 ， 对 于 EB 染色 不 能 看 到 的 少量 DNA 也 可 以 用 这 种 方法 进行 标记 ， 而 这 是 用 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 分 离 小 片段 DNA 时 一 个 困难 的 问题 (参见 第 十 三 章 )。 未 端 标记 的 第 二 个 优点 是 能 够 产生 标记 在 DNA 片段 的 一 个 末端 的 片段 。 由 于 所 有 使 用 的 酶 不 是 对 DNA 的 3 端 就 是 对 DNA 的 5 端 有 特异 性 ， 所 以 每 次 只 能 在 DNA 的 一 条 链 上 标记 。 对 使 用 限制 性 内 切 酶 切割 的 双 链 DNA 进行 标记 时 挫 入 反应 发 生 在 链 的 两 端 ， 但 可 以 用 第 二 次 酶 切 的 方法 将 一 端 除去 。 当 DNA 片段 克隆 到 多 位 点 接头 (polylinker) 上 时 进行 这 种 操 作 就 很 方便 ， 因 为 切 去 一 小 段 DNA 就 能 去 除 一 个 末端 ， 使 以 后 的 纯化 步骤 易 于 进行 。 这 些 一 端 标记 的 分 子 有 助 于 限制 性 酶 切片 段 的 排列 ， 并 且 是 Maxam-Gilbert DNA 测序 法 的 先决 条 件 〈 人 参见 第 五 十 三 章 )。 末 端 标记 的 合成 的 守 核 苷 酸 应 用 很 多 ， 例 如 DNA 短 序列 -特异 性 探 针 可 用 于 突变 的 筛选 4， 用 于 胶 阻 滞 测 定 和 Southwestern 测定 已 ， 以 及 用 于 被 其 他 朝 核 苷 酸 污染 了 的 样品 的 PCR 产物 的 测序 工作 (参见 四 十 九 章 )。 末端 标记 有 两 种 常用 的 方法 : 填 入 法 与 激酶 反应 法 。 使 用 末端 转移 酶 也 可 以 标记 (A) Klenow + dGTP, dATP, dTTP + dCTP* ATATG-3' tii—-, AltA lGGAEC*=2- TATACCTAG-5' TATACCTAG-5 ' 限制 栈 消 化 的 DNA 。 三 标记 的 dcTP ”起 保温 (B) i) 去 除 5 HP eee. oe > 4 5'ATATG. . TAC. . TAC.. 与 CIP 一 起 保温 ii) 在 5" 端 加 上 标记 的 ”P 5'ATATG.. —— p + 5'*pATATG.. TAC.. TAC.. 与 3zp-yY-ATP 和 T4 激 酶 一 起 保温 图 15.1 (A) 填 入 反应 法 。 (B) 激酶 反应 法 。 Se 3“ 端 81， 但 这 种 方法 现在 已 很 少 使 用 了 。 填 入 标记 用 的 是 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 的 Klenow 片段 [4j。 这 个 片段 是 DNA 聚合 酶 经 酶 切 后 产生 的 ， 它 保持 了 聚合 活性 与 3 一 5 的 外 切 活 性 ， 但 去 除了 $ 一 3 的 外 切 活性 。 须 进行 末端 标记 的 DNA 片段 首先 要 用 限制 酶 进行 切割 以 产生 $ 突出 端 ， 然 后 用 DNA 聚合 酶 的 Klenow 片段 以 5 突出 部 分 为 模板 对 3“ 缩 进 端 进行 延伸 ， 如 图 1$5.1(A)。 由 于 这 种 方法 易于 进行 ， 所 以 党 被 用 于 标记 双 链 DNA。 当 DNA 片段 没有 合适 的 末端 或 是 需要 标记 的 DNA 是 单 链 时 就 必须 用 激酶 法 了 。 激酶 反应 是 利用 T4 多 核 背 酸 激酶 (T4 polynucleotide kinase, T4 激酶 ) Kenic ay Bei 盐 转 移 到 DNA 分 子 的 5 端 ， 如 图 15.1(B)。 这 个 方法 对 于 标记 守 核 苷 酸 非常 理想 ， 因 AGMA SABA S HALT A BEAT. RPK i HEB AY DNA 片段 进行 标记 时 先 要 用 磷 酸 酯 酶 除去 未 端的 磷酸 根 ， 例 如 用 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 (Calf Intestinal Alkaline Phos- phatase，CIP)。 所 有 这 些 反 应 也 都 可 以 用 不 标记 核 苷 酸 来 进行 ， 用 以 修饰 DNA 片段 以 便 进 一 步 进 行 DNA 重组 操作 。 2. 料 可 能 条 件 下 应 使 用 分 子 生 物 学 级 的 试剂 。 操 作 应 在 1.5 ml 灭 菌 的 一 次 性 聚 丙烯 管 中 进行 ， 螺 口 盖子 可 以 防止 放射 性 物质 的 泄漏 。 当 使 用 放射 性 物质 时 必须 遵守 本 地 的 安 全 条 例 。 2.1 用 Klenow 片段 进行 末端 标记 1) 10 X Klenow 片段 缓冲 液 : 200 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCh, 15 mmol/L 8 -3t2é ARES 25 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT). 2) 标记 的 核 苷 酸 : °P-a-dNTP, ih#W dATP 或 dCTP 供应 ， 但 是 dGTP 与 dTTP 也 可 以 购 得 。 它 们 也 可 以 用 非 放 射 标 记 物 取代 ， 例 如 荧光 素 -11- dUTP 与 地 高 辛 - 11 - dUTP. 不 标记 的 dNTPs: a: dNTP 混合 物 : 混合 物 中 含有 除了 标记 核 苷 酸 之 外 的 0.25 mmol/L 的 各 种 非 标 记 核 苷 酸 (参见 注释 1)。 b: 非 放 射 性 标记 的 dNTP: 0.25 mmol/L 的 dNTP， 相 当 于 标记 核 苷 酸 (参见 注释 区 4) Klenow 片段 : 1 U/pl DNA GBI AY Klenow (大 ) 片段 。 贮 存 于 -20?7 。 5) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，1 mmol/L EDTA。 高 压 灭 菌 后 贮存 于 室温 。 6) 酚 : 含有 0.1% 8 -羟基 唆 啉 〈 抗 氧化 剂 ) 的 Tirs-HCI 平衡 过 的 酚 。 使 用 重 蒸 过 的 超 纯 酚 ， 用 0.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 的 溶液 反复 抽 提 直至 水 相 的 pH 值 达 到 8.0， 然 后 再 用 pH 8.0 的 0.1 mol/L Tris-HCl 抽 提 一 次 ， 这 样 处 理 的 酚 在 4 至少 可 贮存 两 个 月 。 酚 既 有 腐蚀 性 又 有 毒性 ， 所 以 使 用 时 必须 非常 小 心 。 7) AT. 8) 酚 / 氧 仿 混 合 物 : 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 溶液 平衡 过 的 酚 中 加 入 等 体积 的 氧 | YA 仿 ，4 中 至 少 可 以 贮存 两 个 月 。 9) 乙醇 和 70% 的 乙醇 〈(v/v 深 于 水 中 )。 10) 5 mol/L BRE, pH7.5, CAFSA. 2.2 用 T4 激酶 进行 末端 标记 11) 10 xCIP 缓冲 液 : 10 mmol/L ZnCl, 10 mmol/L MgCl, 100 mmol/L Tris-HCl, pli &.95 12) CIP: 1 U/pl 89) 4 i BRE BR BE BE (Bochringer Mannhiem Gmbh, Mannheim, Germany), JCF 4T. 13) 10x 激 酶 缓冲 液 : 700 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 100 mmol/L MgCl, 50 mmol/L DTT; 14) *P-y-ATP: 比 活 >3000 Ci/mmol. 15) T4 激酶 : 1 U/l 14 SRR. MRF -20C. 16) 非 放 射 性 标记 的 ATP: 1.0 mmol/L ATP ( 临 用 前 从 20 mmol/L JO FER BT EAC Hil ) : ees 法 3.1 用 Klenow 片段 进行 末端 标记 1) 将 1~1000 ng 的 DNA 溶 于 42 的 蒸馏水 中 〈 人 参见 注释 2) 加 入 5 yl 10 x Klenow 片段 缓冲 液 ，1 pl*P-a-dNTP, 1 pl dNTPJ/REA WA 1 pl Klenow 片段 。 室 温 放 置 15 min (人 参见 注释 3)。 2) 追加 1 岂非 放射 性 标记 的 dNTP， 室 温 再 次 放置 15 min (参见 注释 1)。 3) 760050 pl TE， 再 加 100 I 酚 / 氯 仿 。 短 暂 涡 旋 振 功 后 在 台式 微型 离心 机 上 以 12 000 g 离 心 (参见 注释 4 和 5)。 将 水 相 (上 层 ) 转移 到 干净 管子 中 并 加 入 100 由 酚 / 氯 仿 。 按 第 3 步 操 作 使 溶液 分 层 ， 然 后 将 上 层 水 相 转 移 到 干净 的 管子 中 。 必 须 注意 丢弃 的 试剂 中 尚 污染 有 未 摊 入 的 2P- a- dNTP. 加 入 60 pl 5 mol/L (0.6 倍 体积 ) WARES 200 pl (2 FAR) 的 乙醇 (BRE FE 6) 后 在 冰 上 放置 S min。 以 12 000 g 离心 1$ min, POA LIAM 〈 记 住 这 是 含 放 射 性 物质 的 )， 用 70% CRAVE ILE. 空气 干燥 沉淀 10 min 后 悬浮 于 适量 的 TE 中 (10 一 100 pl). 4 YA 5 YA 6 Se 标记 的 DNA 可 以 立即 用 凝 胶 电 泳 法 分 离 ， 并 用 放射 自 显影 法 进行 检测 (SBME 释 7)， 或 者 用 第 二 种 限制 性 内 切 酶 再 作 切 割 。 不 论 是 哪 一 种 情况 ， 建 议 用 工 由 样品 在 液 闪 计数 器 中 进行 计数 。 用 放射 自 显影 检测 DNA 片段 时 放射 活性 必须 达到 5000 ~ 10 000 cpm。 标 记 效 率 不 高 的 原因 和 可 能 的 解决 方法 在 注释 8 一 10 中 讨论 。 can 3.2 用 T4 激酶 进行 末端 标记 1) #1~2 ug 经 限制 酶 切割 的 DNA 溶解 在 44 pl ARIK, MAS pl 10 x CIP 缓冲 液 后 再 加 入 0.05~1U 的 CIP (参见 注释 11)。37? 保温 30 min (参见 注释 12 和 13) 2) 60C. 10min KI} CIP。 酚 抽 提 后 按 3.1 节 中 第 3 一 5 步 同 样 进 行 沉淀 〈 人 参见 注释 14 fil 15). 3) 4 DNA BiP4 17.5 pl WRK, MA2.5 pl 10x 激 酶 缓冲 液 ，5 pl *P-y-ATP U1 pl T4 HBF, 37C 保温 30 min. 4) 加 1 岂非 放射 性 标记 的 ATP 并 继续 保温 30 min (参见 注释 16). 5) 酚 抽 提 后 按 3.1 PPB 4 一 6 步 进行 沉淀 〈 参 见 注释 17)。 4. 注 释 (1) 须要 加 入 非 标记 的 dNTPs 理由 有 两 个 。 第 一 ， 因 为 标记 的 核 苷 酸 可 能 不 是 酶 切 位 点 中 须要 填补 的 第 一 个 核 苷 酸 ， 例 如 图 15.1A 是 BazHI 的 酶 切 位 点 ， 标 记 的 dCTP* 相当 于 第 四 个 核 苷 酸 ， 所 以 在 标记 核 苷 酸 挫 入 前 必须 由 其 他 三 个 非 标 记 的 核 苷 酸 填 补 进去 。 实 际 上 为 了 方便 ， 不 管 酶 切 位 点 如 何 ， 都 使 用 7.5 mmoyL 的 不 标记 的 dNTPs 混合 物 。 第 二 ， 为 了 得 到 平 末端 ， 需 要 追加 dNTPs, AAMiCKH 酸 的 浓度 极 低 时 DNA 聚合 酶 的 合成 就 会 停止 。 但 是 当 末 端 大 小 不 同 不 成 为 问题 时 这 一 步 也 可 以 省 略 ， 例 如 在 标记 大 片段 DNA 后 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 的 实验 中 。 填 入 反应 是 非常 粗放 的 ， 在 Mg 存在 时 填 入 反应 几乎 能 在 任何 缓冲 液 中 进行 。 这 意味 着 只 要 向 限制 酶 作用 后 的 反应 系统 中 加 入 标记 的 dNTP、 不 标记 的 dNTPs 以 及 KKIenovw 片段 就 能 进行 标记 反应 了 。 (3) 由 于 标记 反应 仅仅 发 生 在 DNA 片段 的 一 个 小 区 域 中 ， 反 应 进行 得 很 快 ， 所 以 在 室 温 放置 即 可 。 除 非 使 用 ”S- dNTP， 标 记 反 应 才 须 在 370 中 进行 ， 但 过 份 延长 保温 时 间 可 导致 DNA 末端 的 降解 。 标记 的 DNA 可 以 用 来 进行 凝 胶 电 泳 ， 但 必须 记 住 DNA 溶 液 中 尚 留 有 未 挫 入 的 2P- a=-dNTP， 这 就 增加 了 电泳 操作 人 员 和 与 放射 性 物质 的 接触 危害 性 。 (5) 另 一 个 方法 是 将 DNA 通过 Sephadex G50 离心 柱 进 行 纯化 〈 见 第 四 十 九 章 )。 (6) 如 果 DNA 的 量 很 少 可 能 须 加 入 载体 ， 例 如 10 pe tRNA 或 是 糖 原 。 (7) 为 了 防止 污染 胶 干 燥 器 ， 在 胶 干 燥 前 必须 放 在 10% 的 醋酸 或 三 氯 醋酸 (TCA) 中 固定 。 Klenow 片段 很 少 受 到 抑制 剂 的 影响 ， 但 无 底 物 时 的 保温 却 很 快 使 它 失 活 。 它 可 能 是 常用 酶 中 首先 失 活 的 一 种 。 如 果 对 酶 活 存 有 疑问 ， 可 先 标 记 对 照 DNA 进行 检 查 。 通 常用 相对 分 子 质量 标 准 DNA 即 可 ， 但 进行 反应 前 应 先 核对 未 端的 结构 。 (9) 末端 的 结构 非常 重要 ， 因 为 酶 只 能 填补 那些 存在 于 这 些 位 点 中 的 碱 基 。 须 再 次 核对 限制 性 内 切 酶 切割 所 产生 单 链 示 端的 序列 。 也 可 能 须 用 另 一 种 高 比 活 的 dNTP 代替 (2 ~S (4 YA (8 ~~ (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) 32p- qg@- dNTP. Klenow 片段 填补 反应 仅仅 在 每 个 DNA 分 子 中 挫 入 少数 的 2”P 标 记 的 核 苷 酸 分 子 。 如 果 须 要 大 量 地 摊 入 时 ， 可 选用 T4 DNA 聚合 酶 。T4 DNA 聚合 酶 具有 比 Klenow 片段 高 200 倍 的 3 一 5 外 切 活 力 。 如 果 DNA 片段 在 无 dNTP 时 保温 ， 此 酶 将 使 它 产生 一 个 单 链 DNA 的 区 域 ， 这 个 区 域 可 以 在 以 后 的 标记 反应 中 被 加 入 的 2P=- au- dNTP 和 非 放 射 性 标记 的 dNTPs KAMAE tric”), 一 个 单位 的 CIP 在 1 h 内 去 除 50 pmol 的 末端 磷 (对 于 $ kb 的 片段 ，1 pmol HA 端 大 约 相 当 于 2 ug)o 为 了 提高 平 末端 和 5S “ 缩 进 端 脱 磷 的 效率 ， 反 应 可 在 SSC 进行 。 磷酸 酯 酶 反应 可 以 在 限制 酶 缓冲 液 中 进行 ， 在 该 缓冲 液 中 加 入 0.1 倍 体积 的 500 mmol/L Tris-HCl, pH 8.9, 1 mmol/L J EDTA 和 适量 的 酶 即 可 。 防止 新 挫 入 的 标记 磷 被 去 除 ， 非 常 重 要 的 一 点 是 在 反应 结束 后 灭 活 所 有 的 磷酸 酯 ate T4 激酶 的 催化 反应 对 抑制 剂 如 琼脂 糖 中 存在 的 某 些 物质 非常 敏感 ， 所 以 必须 非常 小 心地 确保 DNA 中 没有 抑制 剂 。 此 外 ， 由 于 T4 激酶 很 容易 使 RNA RRL, 所 以 必须 避免 样品 中 存在 RNA 分 子 ， 以 防止 ”P 挫 入 DNA 分 子 的 效率 严重 降低 。 标记 反应 的 效率 大 约 为 10%， 为 了 使 所 有 的 分 子 都 能 磷酸 化 必须 追加 过 量 的 非 放 射 性 标记 的 ATP。 这 是 一 个 不 高 明 的 纯化 守 核 苷 酸 的 方法 ， 笔 者 推荐 用 Sephadex G25 HOH 〈 人 参见 BILE). Wh 考 xX 献 — . Wallace, R. B., Shaffer, J., Murphy, R. F., Bonner, J., Hirose, T., and Itakura, K. (1979) Hybridisation of synthetic oligodeoxyribonucleotides to ¢¥174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucliec Acid Res. 6, 3543-. Harwood, A. J., ed. (1994) Protocols for Gene Analysis. Methods in Molecular Biology, vol. 31. Humana, Totowa, NJ. . Walker, J. M., ed. (1984) Nucleic Acids. Methods in Molecular Biology, vol. 2. Humana, Clifton, NJ. Klenow, H., Overgaard-Hansen, K., and Patkar, S. A. (1971) Proteolytic cleavage of native DNA polymerase into two different catalytic fragments. Eur J. Biochem. 22, 371-381. . Challberg, M. D. and Englund, P. T. (1980) Specific labelling of 3' termini with T4 DNA polymerase. Methods Enzymol. 65, 39-43. = Ww = oA) * 76° 第 二 部 分 RNA 分 析 AR AUR” pe er a - wiles G25, ~~ a es ‘ hi 化 必需 3 " A 第 十 六 章 Northern 印迹 分 析 Robb Krumlauf 地 1. 引 在 基因 表达 的 分 析 中 ，RNA 转录 的 稳 态 水 平 是 监测 细胞 株 和 组 织 的 基因 表达 活性 的 最 方便 的 参数 之 一 。 有 多 种 方法 可 用 于 测定 RNA 水 平 ， 诸 如 S1 杂交 、RNase 保护 法 和 Northern 印迹 。 选 择 何 种 检测 系统 最 佳 主 要 取决 于 需要 哪 一 种 形式 的 信息 、 检 测 的 灵敏 度 以 及 在 活体 系统 中 特殊 的 限制 因素 等 。 本 章 将 详细 介绍 应 用 Northern 印迹 分 析 RNA 的 方法 ， 其 中 主要 包括 RNA 提取 、 电 泳 分 离 、 膜 转移 、 核 酸 杂 交 检 测 和 放射 自 显 Northen 印迹 有 许多 优点 。 基 因 的 转录 模式 往往 是 复杂 的 ， 同 一 基因 可 产生 多 种 RNA 774], Northern 印迹 可 提供 来 自 一 个 基因 的 RNA 种 类 的 数目 、 分 子 大 小 及 丰 度 等 信息 ， 这 是 其 他 方法 所 不 能 做 到 的 。 这 一 技术 还 可 将 RNA 保留 在 膜 上 供 反复 检测 。 因 此 几 个 基因 的 表达 可 以 在 同一 份 RNA 样品 中 进行 检测 ， 只 要 使 用 多 种 探 针 与 膜 再 杂交 即 可 。Northern 印迹 有 两 个 缺点 ， 一 是 从 组 织 或 细胞 提取 的 RNA 必须 是 高 质量 的 和 未 降解 的 ， 从 某 些 组 织 中 提取 RNA 或 是 对 于 没有 经 验 的 操作 人 员 来 讲 ， 这 可 能 是 困难 的 。 但 是 这 对 于 S1 杂交 或 RNase 保护 法 则 不 成 问题 ， 因 为 在 这 些 方法 中 用 酶 降解 RNA 是 其 过 程 的 一 部 分 。 与 这 两 个 方法 相 比 ，Northern 印迹 法 通常 被 认为 是 灵敏 度 较 低 而 且 操作 步骤 较 多 的 ， 所 以 要 用 大 量 的 起 始 样品 或 RNA 以 及 更 多 的 时 间 才 能 得 到 结果 。 Northern 印迹 法 的 许多 问题 可 以 通过 优化 将 RNA 转移 和 结合 到 膜 支 持 物 上 的 条 件 以 及 使 用 高 灵敏 度 的 单 链 探 针 等 得 到 改善 。 尼 龙 膜 如 GeneScreenIM (杜邦 公司 产品 ) 是 韧性 好 、 抗 据 裂 的 支持 物 ，RNA 经 紫外 线 交 联 后 可 永久 结合 于 膜 上 。 经 紫外 线 交 联 后 的 RNA 膜 的 一 大 优点 是 可 以 使 用 严格 度 非 常 高 的 杂交 条 件 ， 这 样 可 提高 灵敏 度 ， 降 低 背景 以 及 方便 地 多 次 重复 使 用 同一 张 膜 。 在 许多 可 以 获得 高 浓度 的 RNA 样品 或 大 量 的 样品 的 情况 下 ， 这 些 可 能 不 是 关键 的 因素 。 不 过 经 常 要 从 一 些 非常 难得 的 小 量 组 织 或 细 Al 〈 例 如 转基因 鼠 、 临 床 标本 、 胚 胎 材 料 ) 中 分 离 RNA。 在 转 染 实验 中 ， 也 应 尽量 节 省 用 于 RNA 分 析 的 量 ， 以 便 能 够 检验 更 多 的 DNA 结构 ， 并 减少 培养 细胞 的 量 。 在 这 些 情况 下 ， 优 化 实验 条 件 是 很 必要 的 。 使 用 单 链 探 针 能 够 大 大 提高 灵敏 度 ， 但 可 能 产生 很 高 的 背景 ， 这 是 由 于 它 与 各 种 rRNA 可 以 发 生 非 特异 性 杂交 ， 尤 其 是 在 使 用 总 RNA 时 。 因 此 即使 在 总 RNA 量 很 少时 ， 分 离 polyA* RNA 也 是 有 利 的 。 只 分 析 polyA* RNA 可 改善 信 噪 比 ， 避 免 上 样 RNA 过 多 导致 RNA 与 膜 结合 不 完全 。 RNA: RNA 杂种 分 子 是 非常 稳定 的 ， 杂 交 时 往往 不 使 用 一 般 的 严格 条 件 ， 因 为 那 将 导致 高 背景 或 对 其 他 种 类 的 RNA 的 交叉 杂交 。 提 高 杂交 和 洗涤 的 严格 度 可 使 非特 异性 信和 号 大 为 减少 甚至 消失 。 但 如 果 RNA 没有 通过 紫外 线 交 联 到 滤 膜 上 ， 这 些 严格 的 条 件 79 - tHE CEB ot FF ts DA BR RS. REA ARE FOB RE RR i at FRY, 导致 膜 变 脆 和 碎 裂 。 这 也 说 明 为 什么 必须 使 用 尼龙 膜 方 能 获得 理想 的 和 可 重复 的 结果 。 杂交 液 的 选择 不 必 十 分 严格 ， 但 尽 可 能 降低 杂交 和 洗涤 的 温度 可 以 减少 RNA 降解 和 增 加 滤 膜 的 重复 使 用 寿命 ， 也 可 以 在 缓冲 液 中 加 入 甲 酰胺 以 降低 杂种 分 子 的 解 链 温度 。 按 上 述 方法 优化 的 Northern 印迹 法 可 达到 RNase 保护 法 或 S1 分 析 法 的 灵敏 度 ， 并 上 且 对 重要 样品 提供 长 期 保存 的 记录 ， 从 而 可 以 反复 进行 分 析 。 本 章 详 述 高 灵敏 度 的 Northern 印迹 法 步 又， 这 些 方法 已 成 功 地 用 于 检测 早期 豚 胎 组 织 和 转基因 鼠 等 样品 中 表达 程度 极 低 、 表 达 量 极 少 的 那些 基因 0 -3]。 总 的 来 说 ， 这 一 实验 步骤 与 已 有 的 Northern 方法 并 无 很 大 差别 ， 除 了 紫外 灯 之 外 也 不 需 特殊 仪器 。 本 方法 基于 这 样 一 些 简 便 的 步骤 : 分 离 提取 高 质量 的 polyA* RNA， 紫 外 线 交 联 RNA 到 尼龙 膜 上 ， 与 单 链 RNA 探 针 杂交 。 它 同样 适用 于 各 种 类 型 的 或 具有 种 种 困难 的 Northern 印迹 分 析 上 ， 并 上 且 其 他 的 RNA 分 离 和 杂交 方法 也 可 以 替代 应 用 于 本 方法 中 ， 对 效率 和 结果 几乎 没有 影 响 。 在 多 数 情况 下 DNA 探 针 也 可 用 ， 但 灵敏 度 低 于 单 链 RNA 探 针 。 2. 材 料 RNA 的 分 离 提 纯 要 求 高 纯度 的 试剂 和 小 心 操作 以 免 RNA 降解 。 建 议 在 全 过 程 中 戴 手套 。 重 金属 或 其 他 污染 物 可 导致 RNA 的 化 学 裂解 ， 因 此 必须 使 用 去 离子 蒸馏 水 和 高 级 别 的 分 析 试 剂 ， 仅 高 压 灭 菌 不 足以 灭 活 污染 进来 的 RNase， 因 为 在 热 变 性 之 后 可 以 复 性 。 二 乙 基 焦 碳 酸 盐 (diethylpyrocarbonate, DEPC) 可 与 RNase 结合 ， 从 而 使 灭 活 不 By, Al DEPC 处 理 成 为 制备 无 RNase 溶液 的 最 方便 方法 GER: DEPC 为 致癌 剂 ， 应 戴 手 套 ) 。 2.1 RNA 的 分 离 2 Led Att Be DEPC 处 理 的 水 : BAAB LK PI 1~2 98 DEPC, HBR, SRK. MRK 菌 可 将 DEPC ot fA CB. CO, 和 水 。 匀 浆 用 缓冲 液 : 3 mol/L LiCl, 6 mol/L 尿素 。 将 126 g LiCl 和 360 g 尿素 溶 于 1 L 灭 菌 的 DEPC 水 中 ， 用 厚度 为 0.2 mm 的 滤纸 过 滤 。 2 mol/L Tris-HCl, pH 7.6: 用 DEPC 处 理 的 水 制备 缓冲 液 ， 调 节 pH 值 至 7.6， 置 FRA, D1 1~2 滴 DEPC, BIRD, WER RA. DEPC 可 破坏 Tris， 所 以 在 高 压 灭 菌 后 应 核实 pH 值 。 稀 释 的 Tris 缓冲 液 切 不 可 用 高 压 灭 菌 。 4) 0.5 mol/L EDTA: 配制 EDTA 贮存 液 ， 加 入 1~2 滴 DEPC， 高 压 灭 菌 。 5) 10%SDS: 配制 SDS 贮存 液 ， 加 入 1~2 i DEPC，68? 保温 过 夜 ， 不 要 高 压 灭 菌 。 6) 3 mol/L 醋酸 钠 ，pH 5$.2: 调节 醋酸 钠 贮 存 液 至 pH $5.2， 加 DEPC1~2 i, mH 灭 菌 。 7) 95% 乙醇 。 8) 重 蒸 酚 (Gibco-BRL): 65S 熔 化， 用 等 体积 TES 饱和 ， 静 置 过 夜 ， 加 5 ml m - 甲 区 ， 1 YA 2 YA 3 YA SS YA SA SA YA YA Se — 酚 、0.2 ml 的 2 - 琉 基 乙醇 、0.1 g 8 HERZ 100 ml 酚 中 。 混 合 至 完全 溶解 ， 然 后 尽量 移 去 水 相 层 。 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 (24:24:1): 用 处 理 过 的 酚 (第 8 步 )、AR RH AGAR BAC 制 。 置 避 光 处 ， 不 宜 久 藏 。 TES: 10 mmol/L Tris-HCI、pH7.6，1 mmol/L EDTA，0.5%SDS。 用 DEPC 处 理 的 水 、DEPC 处 理 的 2 mol/L Tris-HCl. pH 7.6 #10.5 mol/L EDTA 贮存 液 配制 。 TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 1 mmol/L EDTA。 用 DEPC 处 理 的 水 、DEPC 处 理 的 2 mol/L Tris-HCl #1 0.5 mol/L EDTA 贮存 液 配制 。 灭 菌 的 无 RNase 的 一 次 性 离心 管 : 小 量 制备 时 用 标准 的 1.5 ml Eppendorf. AR 手套 可 直接 从 盒 中 取 用 。Falcon 公司 还 提供 $ ml (#2063). 15 ml (#2059) 以 及 50 ml (#2070) 灭 菌 的 聚 丙烯 管 。 2 50 mmol/L 醋酸 钠 、pH 5$.2: D1~2 i DEPC, BERK. 5 mol/L NaCl: J 1~2 i DEPC, MEKE. 饱和 酚 : 熔化 重 蒸 酚 (Gibco-BRL), Jl 0.25 fF(K FAWN 50 mmol/L BREA, pH 5.2， 混 匀 ， 静 置 使 其 分 相 ， 尽 量 除去 水 相 。 小 份 分 装 贮存 于 -2CHH. 2B RNA 后 未 用 完 的 酚 宜 再 次 冷冻 。 NaCl/7K#4: 加 NaCl 至 冰 中 ， 混 合 至 温度 降 到 - 10 一 -137 。 2.2 polyA* RNA 的 分 离 BR dT AHA: 用 T3 级 (Collaborative Research Labs, USA). 0.1 mol/L NaOH: 用 Analar 级 10 mol/L NaOH 贮备 液 加 DEPC 处 理 的 水 稀释 。 6 mol/L LiCl: 252 g LiClWF1L XK, 加 1~2 滴 DEPC， 高 压 灭 菌 。 结合 缓冲 液 : 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 0.6 mol/L LiCl, 1 mmol/L EDTA, 0.2%SDS (用 无 RNase 的 贮存 液 和 DEPC 处 理 的 水 制备 )。 低 盐 结合 缓冲 液 : 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6，0.1 mol/L LiCl, 1 mmol/L ED- TA，0.2%SDS (用 无 RNase 的 贮存 液 和 DEPC 处 理 的 水 制备 )。 洗 脱 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 1 mmol/L EDTA，0.1%SDS (用 无 RNase 的 贮存 液 和 DEPC 处 理 的 水 制备 )。 BRA SER dT 柱 ， 顶 端 和 底部 塞 子 和 能 放置 20 根 柱 的 架子 : Isolabs (Cleveland, OH) (Quicksep # QS-P) 或 Advanced Labs Techniques (Tunbridge Wells, Kent, UK) #25] "ih. 2.3 Fk, BARK 20 X MOPS 贮存 液 : 0.4 mol/L MOPS, 0.1 mol/L BERR, 20 mmol/L EDTA. DEPC Ab 3# 4 7K il] 1 L 溶液 时 溶解 83.6 g MOPS, 8.2 g 醋酸 钠 , 40 ml 0.5 mol/L ° 81 ae EDTA 贮 存 液 。 2) 琼脂 糖 : Seakeem 牌号 。 3) FA ERE : RYE Fo 4) 37% 甲 醛 ， 有 液体 贮存 液 供应 。 5) 蓝 色 液 体 染 料 : 0.1% — FAB, 0.1% MH, 1x MOPS, 50% 甘油， 用 DEPC 处 理 的 水 和 高 压 灭 菌 的 甘油 配制 。 6) 0.1 mol/L BERK. 7) 20 x SSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 。 用 高 压 灭 菌 的 蒸馏水 稀释 至 6XxSSC 和 2 x SSC. 8) 变性 用 缓冲 液 : SO mmol/L NaOH, 0.1 mol/L NaCl. 9) 中 和 用 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl. pH 7.6, FA DEPC 处 理 的 水 稀释 。 10) 尼龙 膜 : 200 mmx200 mm， 例 如 Gene Screen (人 参见 注释 1)。 11) Whatman 3 MM 滤纸 ， 吸 水 纸巾 ， 塑 料 薄膜 (Saran WrapIM)。 2.4 #% 32 1) 50 X Denhardt 氏 溶 液 : 0.05% (w/v) BSA, 0.05% (w/v) 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 ， 0.05% (w/v) 聚 蔗糖 400 (Ficoll 400). 2) 预 杂交 缓冲 液 : 50% ~60% ARH, 5xSSC, 5X Denhardt 氏 溶 液 ，50 mmol/L B BBR, pH 6.8, 250 pg/ml BBY YAY EE HE HAF DNA, 100 pg/ml 酵母 tRNA, 1% SDS. JA DEPC 处 理 的 水 配制 。 3) 杂交 缓冲 液 : 50% 一 60% 甲 酰胺 ，5x SSC，5 x Denhardt 氏 溶 液 ，50 mmol/L 磷酸 钠 缓 冲 液 、pH 6.8, 250 pg/ml 经 剪 切 的 变性 钾 鱼 精子 DNA，100 pg/ml 酵母 tRNA, 1%SDS (v/v), 10% 硫酸 葡 聚 糖 (w/v)， 合 适 的 标记 探 针 (SRA, 七 ， 八 ， 十 章 )。 用 DEPC 处 理 的 水 配制 。 se 法 3.1 总 RNA 的 分 离 3 本 法 可 用 于 小 量 或 大 量 新 鲜 的 或 冻 存 的 组 织 ， 也 可 用 于 培养 的 细胞 。 它 对 核酸 酶 的 抑制 有 效 ， 从 而 可 获得 高 质量 的 有 生物 活性 的 RNA。 本 法 根据 Auffray 和 Rougenon 的 方法 (， 整 个 过 程 中 不 需要 超速 离心 的 步骤 ， 只 需 用 一 台 配 备 甩 平 转子 、 能 运转 标准 的 一 次 性 灭 菌 塑料 离心 管 (1.5~50 ml) 的 冷冻 台式 离心 机 。 这 样 就 不 须 使 用 特殊 处 理 的 玻璃 器 血 ， 而 且 本 方法 可 以 用 来 从 许多 样品 中 同时 分 离 RNA。 1) 称 取 新 鲜 或 冰冻 组 织 ， 放 入 适当 大 小 的 灭 菌 的 一 次 性 塑料 离心 管 中 。 2) 每 克 起 始 材 料 中 加 入 匀 浆 缓冲 液 5 一 10 ml. 3) 用 Polyton, Ultra-turrax 或 类 似 的 电动 匀 浆 器 将 塑料 管 中 的 样品 在 OT COKE) 与 . 82 . 2 min (参见 注释 2)。 4) 将 样品 置 冰 上 超声 处 理 1 一 2 min 以 彻底 切断 DNA 链 。 当 小 量 样品 放 入 1.5 ml Ep- pendorf 离心 管 中 时 应 使 用 微量 吸 嘴 。 5) 用 小 型 台式 离心 机 于 OC 以 低速 (1000 r/min) 离心 2 一 Smin， 沉 淀 未 被 匀 浆 的 物 质 和 细胞 膜 碎片 。 6) 上 清 液 倾 入 新 的 离心 管 ， 置 0 一 4 人 过夜 〈 人 参见 注释 3)。 7) DNA 应 在 溶液 中 ， 而 RNA 则 被 离心 沉 证 。 可 用 Sorvall HB4 转子 于 9000 r/min 在 OC 离心 10 min， 或 用 冷冻 台式 离心 机 于 2000 一 4000 r/min (用 最 大 转速 ) £ OT 离心 30 min， 可 根据 样品 量 大 小 和 离心 管 的 类 型 决定 。 8) FLAM, MMSE 40H 0.1 FAR LiCl -尿素 匀 浆 缓冲 液 ， 涡 旋 振 蔓 后 置 冰 上 30 min. 9) 离心 ， 弃 上 清 液 〈 参 见 注 释 4)。 将 沉淀 按 每 克 原 始 组 织 对 5 ml 的 比例 溶解 于 TES， 或 以 0.5 倍 体积 开始 时 所 用 的 勺 浆 缓冲 液 代 替 TES. Pen HUE SET eT 和 溶解 。 加 等 体积 的 酚 / 氯 仿 / 异 成 醇 (24:24:1) 抽 提 样品 ， 剧 烈 振 功 $~10 min ，( 人 参见 注 FES). 11) 室温 下 用 台式 离心 机 3000 一 4000 r/min 离心 分 相 ， 小 心 移出 上 层 液 相 置 于 另 一 新 管 中 。 如 果 交 界面 很 厚 ， 可 加 入 0.5 倍 体积 的 TES 再 次 抽 提 有 机 相 后 离心 。 合并 水 相 ， 加 等 体积 酚 / 氯 仿 / 异 成 醇 再 次 抽 提 。 人 台式 离 心机 3000 一 4000 r/min 离 心 分 相 ， 小 心 吸 出 上 层 水 相 置 于 新 管 ， 重 复 以 上 抽 提 步 又 直至 界面 清晰 。 加 0.1 倍 体积 的 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 5.2， 和 2 倍 体积 95$% 乙醇 ， 混 合 后 置 于 —20T. RNA 在 此 阶段 能 长 久 稳定 。 14) 离心 收集 RNA 沉淀 〈 同 步骤 7)， 弃 上 清 液 ， 用 等 体积 的 70% 乙醇 淋 洗 RNA it 淀 ， 再 离心 。 将 RNA 溶 于 TE， 于 260 nm 测 吸 光度 (40 pg/ml=1 AioU)， 调 整 溶液 体积 至 所 BRE, WRF -20C (人 参见 注释 6 和 7)。 10 Se 12 — 13 A 15 SS 用 此 法 制备 的 总 RNA 相当 纯 ， 可 直接 用 于 多 种 测定 (S1, RNase 保护 法 和 North- ern 印迹 ) 或 用 于 制备 poly AT RNA. < ae) ae ae ASE HY M28 AFA A PRE RNA, CREE RIE AY EINER AR. Fein FAY DNA 因为 可 溶 于 60C 、pH 5.2 的 热 酚 中 而 被 除去 。 1) 于 50 ml 塑料 管 中 离 心 沉 淀 细胞 。 重 悬 细胞 于 PBS 后 再 离心 沉淀 。 再 用 PBS 洗 一 次 。 目 的 是 除去 所 有 培养 液 和 血清 。 2) 细胞 沉淀 重 悬 于 1 ml 50 mmol/L 醋酸 钠 中 、pH 5$.2。 涡 旋 振 功 器 上 混合 使 所 有 细 胞 团 块 分 散 。 3) 加 10 ml 50 mmol/L 醋酸 钠 、pH 5.2, AB1%SDS, MIRA (eae 4) 加 等 体积 (11 ml) 酚 (用 50 mmol/L 醋酸 钠 、pH 5.2 饱和 ， 预 热 到 6OC). ie was 混合 后 放 入 60C KY 15 min。 在 保温 过 程 中 ， 经 常 取 出 试管 涡 旋 振 功 数秒 钟 。 5) 取出 试管 立即 浸入 NaCl 冰 糊 (-10T) 5 min. 6) 在 冷冻 台式 离心 机 中 以 3000 r/min £20 中 离心 10 min。 揪 入 移 液 管 ， 吸 除 底层 酚 相 ， 保 留 交 界 层 。 7) 加 入 10 ml COC HHA, HERG. OC KA Rik 15 min， 并 重复 涡 旋 振 功 。 8) 取出 试管 ， 浸 入 NaCl/i A Smin, 2C 中 3000 r/min 离心 10 min. 9) 小 心 吸出 上 层 液 相 ， 加 入 0.1 倍 体积 的 mol/L NaCl fl 2 倍 体 积 93% 乙 醇 ， 置 于 -20T7 。 10) 用 Sorval HB-4 甩 平 转子 4° 中 9000 r/min 离心 1 min 以 沉淀 总 RNA. FEAR, 70% CBE, BRE DUE. 11) 再 次 溶解 RNA FTE 中 ， 分 光 光 度 计 Az6o 测 浓度 。 贮 存 于 -207 。 3.2 polyA* RNA 的 分 离 polyA* RNA FJ #2 dT 纤维 素 上 用 层 析 法 进行 批量 分 离 ， 纤 维 素 可 以 装 于 离心 管内 ， 也 可 像 放 射 免疫 测定 所 用 的 装置 那样 ， 装 在 灭 菌 的 无 RNase 的 塑料 柱 中 。 层 析 柱 安 装 到 架子 上 ， 可 同时 处 理 20 个 样品 。 本 方法 对 大 量 或 小 量 的 总 RNA 都 能 适用 ， ABRBIBR dT 的 结合 力 。 当 总 RNA 量 非常 小 时 ， 可 加 入 载体 RNA 以 减少 损失 。 这 样 就 很 容易 从 小 至 10 一 100 pg 总 RNA 中 分 离 出 polyA* RNA6G]。 本 法 根据 Aviv 和 Lederl5] 的 方法 。 1) HSER dT 纤维 素 悬 于 水 中 数 小 时 ， 使 其 充分 膨胀 。 2) 缓和 地 混合 纤维 素 ， 静 置 20 min HHH. KARE RK, URE, 加 入 灭 菌 水 ， 重 悬 纤维 素 。 3) BERBER dT 纤维 素 于 0.1 mol/L NaOH 中 ， 将 纤维 素 浆 注入 柱 内 。 待 液体 流出 直 至 纤维 素 在 柱 底 部 堆积 成 S~7 mm 厚 。 小 心 用 移 液 管 加 $ ml 结合 缓冲 液 到 每 个 柱 上 并 令 其 全 部 流出 以 淋 洗 纤维 素 。 重 复 “ 淋 洗 纤维 素 三 次 除去 全 部 痕 量 NaOH。 洗 脱 液 应 用 pH 试纸 测试 。 至 此 柱子 即 可 使 用 (参见 注释 8)。 溶解 总 RNA FTES, i684 1~2 ml 溶解 小 样品 ， 大 样品 (5 一 10 mg RNA) 则 用 5~10 ml, 当 样 品 非常 小 时 (小 于 100 wg 总 RNA), 加 入 100 ng/ml 的 polyA* RNA 载 f£5 pl. RNA © 60C KAUN 10 min。 取 出 后 加 入 0.1 倍 体积 的 6 mol/L LiCl 贮存 液 调 整 盐 浓度 到 0.6 mol/L LiCl. 涡 旋 混 匀 后 立即 将 样品 小 心 注 入 已 制备 好 的 朝 聚 dT 柱 内 。 尽 可 能 不 要 搅动 纤维 素 层 。 收集 洗 脱 液 ， 重 新 注入 柱 上 以 确保 polyA* RNA 完全 结合 于 柱 上 。 再 次 收集 洗 脱 W, VEN polyA* RNA RF. 加 $ ml 结合 缓冲 液 ， 小 心 不 要 搅动 纤维 素 层 ， 待 结合 缓冲 液 流 过 柱子 后 用 S ml 4 合 缓冲 液 再 重复 三 遍 。 4 A 5 od 6 ~ 7 — 8 YA 9 — 10) 用 5 ml 低 盐 结合 缓冲 液 淋 洗 三 次 可 从 柱 上 除去 痕 量 的 核糖 体 RNA。 11) 待 柱子 中 液体 流 干 ， 加 洗 脱 缓冲 液 : a. 如 果 柱 上 结合 的 RNA 量 大 时 ， 用 1 ml 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 5 一 10 次 ， 用 1.5 ml K 菌 离心 管 收 集 (参见 注释 9)。 通 过 测定 各 部 分 洗 脱 液 的 Azso 吸 光度 〈 洗 脱 缓冲 液 做 空白 ) 来 判断 哪 一 管 含 有 RNA。 通 常 在 第 3 一 4 EHF. b. 如 果 RNA 量 小 ， 加 75 pl 洗 脱 缓冲 液 ， 使 全 部 流 过 柱 。 用 150 pl EARP UE 柱 ， 重 复 四 次 ， 每 次 间隔 1 一 2 min 使 RNA 洗 脱 。 将 RNA 收集 到 一 个 1.5 ml 灭 菌 小 离心 管 中 。 同 样 再 用 150 pl 洗 脱 缓冲 液 洗 四 次 ， 收 集 于 另 一 管 中 。 一 般 情况 下 全 部 polyA* RNA 都 在 第 一 管 中 。 12) FA 0.1 倍 体积 的 3 mol/L 醋酸 钠 (pH 5.2) 和 2 倍 体积 的 95% 乙醇 沉淀 RNA. 于 -20C 。 在 微型 离心 机 上 40 离心 15 一 20 min， 或 用 Sorval HB-4 转子 9000 r/min4C 离心 10 min。 奔 上 清 液 ， 用 等 体积 的 70% 乙 醇 淋 洗 沉淀 后 离心 。 弃 上 清 W, HRNAYWFTE, H-20CKRF. 3.3 凝 胶 电 泳 、 转 移 和 紫外 线 交 联 电泳 和 根据 毛细 管 作用 转移 核酸 的 方法 在 许多 方法 学 书籍 中 有 详细 介绍 。 下 面 所 介 绍 的 是 根据 标准 操作 [6-s] 略 加 修改 的 内 容 。 紫 外 线 交 联 方法 是 根据 RNA 永久 结合 于 Gene Screen 膜 的 优化 试验 而 设计 的 59]。 Ce oe ee: ik 1) 用 温和 的 去 污 剂 小 心 清 洗 电泳 槽 、 成 胶 槽 〈 板 ) 和 梳子 。 然 后 用 洁净 的 蒸 饮 水 淋 洗 ， 最 后 用 灭 菌 的 蒸 饮水 淋 洗 。 每 一 步 操 作 都 须 戴 手 套 以 免 RNase 的 污染 。 2) FRU PRE KRAMER, AA TERA MRE PA ARATE 放出 来 ， 刺 激 眼 睛 。 3) 配 200 ml 1.4% 的 胶 时 加 2.89 g 琼脂 糖 于 156 ml 灭 菌 的 蒸 馅 水 中 。 置 于 500 ml 烧 瓶 中 煮沸 至 琼脂 糖 熔化 ， 冷 却 至 OOC (BUEF 10). 4) 加 10 ml 20xMOPS 贮存 液 和 34 ml 37% 的 甲醛 。 绥 缓 旋转 混合 后 立即 灌 胶 。 纪 使 胶 表面 形成 气泡 。 如 果 已 有 气泡 ， 可 用 灭 菌 的 注射 针头 在 胶 冷 却 前 刺 破 。 5) RRA OR Pitt. SPR SIR Re, DM, RNA) Do RNA 样品 置 于 1.5 ml 离心 管 中 与 染料 -变性 混合 液 混 合 。 混 合 液 的 成 分 如 下 : 1 yl 20xMOPS，10 pl BERK, 3.5 ul 37% FRB, 2 pl RMA S pl @ RNAW TER 液 。 通 常 1~2 pg polyA* 即 够 。 如 果 RNA 过 稀 ， 可 以 先 干燥 然 后 重 溶 于 5 pl TE 中 。 样 品 可 于 临 用 前 数 小 时 或 隔夜 制备 好 ， 置 于 4 中 。 7) RNA 样品 置 于 60T AKA 10~15 min 进行 热 变 性 ， 然 后 置 于 冰 上 冷却 后 立即 上 样 。 8) 60~70 V 电泳 $S 一 7 h， 电 泳 缓 冲 液 1x MOPS 中 不 含 甲醛 (人 参见 注释 11 一 13)。 ie aR = 移 按 胶 的 大 小 切 尼 龙 膜 。 先 漂 于 水 上 ， 然 后 浸入 水 中 使 完全 湿润 。10 min 后 ， 浸 于 . 85 . 6 ~~ 1 a 2XxSSC 中 ， 直 至 使 用 。 2) 将 胶 浸 泡 于 变性 缓冲 液 中 20 min， 轻 轻 摇动 (参见 注释 14)。 3) 将 胶 浸 于 中 和 缓冲 液 中 20 min 使 其 中 和 ， 然 后 置 于 2 x SSC 中 轻 轻 摇动 20 min (人 参 WIE FE 15). 安装 印迹 装置 时 将 浸 过 20 x SSC AY 3 MM 滤纸 铺 于 架 在 贮 有 20 x SSC 的 槽 上 的 玻 璃 板 上 。 滤 纸 两 端 浸 于 槽 中 作为 吸取 SSC 的 灯芯。 将 胶 置 于 湿 的 3 MM 滤纸 上 ， 带 加 样 孔 的 一 面向 下 ， 使 光滑 、 平 整 的 一 面 与 尼龙 膜 接触 。 在 3 MM 滤纸 灯芯 的 暴露 部 分 上 用 晴 膜 (parafilm) 将 胶 围 住 ， 以 确保 20 x SSC 只 能 通过 胶 流 动 。 用 20 x SSC 将 胶 的 表面 湿润 ， 小 心 将 湿润 的 尼龙 膜 放 在 胶 的 上 面 。 避 免 有 气泡 存 在 于 膜 与 胶 之 间 。 将 三 层 切 成 与 胶 大 小 一 致 的 、 事 先 用 20 x SSC 湿润 的 3 MM 滤纸 覆盖 在 膜 上 。 小 心 避 免 气泡 进入 尼龙 膜 与 滤纸 之 间 。 放 几 英寸 厚 的 一 和 至 纸 巾 于 3 MM 滤纸 上 。 压 上 一 块 玻璃 板 并 加 重 物 (MAR) 于 其 上 ， 转 移 过 夜 。 如 纸巾 完全 湿 透 ， 可 换 新 的 纸巾 。 10) 转移 完成 后 除去 纸巾 ， 用 墨水 笔 标记 各 泳 道 的 位 置 和 胶 在 膜 上 的 方向 。 11) 用 解剖 刀片 修 齐 尼龙 膜 的 边缘 ， 将 尼龙 膜 从 胶 上 揭 下 。 将 尼龙 膜 浸 于 6x SSC 中 i~2 aning 4 ~~ 5 ~~" 6 wa 7 =" 8 YA 9 YA 3.3.3 ”紫外线 交 联 1) 将 一 大 张 Saran Wrap 铺 在 工作 台 上 ， 吸 2 一 4 ml 6XSSC 置 于 Saran Wrap 中 央 。 2) 从 6xScCC 中 取出 膜 ， 小 心 放 在 Saran 塑料 薄膜 上 (接触 胶 的 一 面向 下 )， 避 免 在 膜 和 Saran 塑料 薄膜 之 间 出 现 气泡 。 faa AAA Saran Wrap， 将 尼龙 膜 全 部 包 住 ， 放 在 玻璃 板 上 。 曾 接触 胶 的 一 面 必须 向 上 。 将 尼龙 膜 放 在 波长 234 nm、600 pW/cm? 的 紫外 线 灯 下 (参见 注释 16 一 20)， 曝 光 3 mino 从 紫外 线 灯 下 取出 尼龙 膜 ， 打 开 Saran Wrap， 将 尼龙 膜 放 在 两 张 3 MM 滤纸 中 ， 80°C 烘 烤 60 min. 3 a 4 ~~ 5 ~— 现在 ， 尼 龙 膜 可 以 用 于 杂交 了 。 3.4 滤 膜 杂交 目前 有 多 种 杂交 缓冲 液 和 杂交 系统 同样 成 功 地 用 于 膜 杂 交 。 本 文 所 述 方法 根据 Wa- hal 等 人 的 报道 001。 用 尼龙 膜 时 不 管 哪 种 方法 都 会 有 很 高 的 背景 。 通 常 在 杂交 和 洗 膜 的 步骤 中 采用 高 浓度 的 SDS 以 改善 背景 。 紫 外 线 交 联 可 防止 高 浓度 的 SDS 将 RNA 从 膜 上 洗 脱 下 来 ， 典 型 的 Northern 印迹 最 终结 果 见 图 16.1 所 示 ， 此 图 还 显示 特殊 的 RNase YE a8 涤 处 理 所 起 的 作用 。 六 (A) £ : ar BS & oC # 2 & Mo) an) ~~ a “ w LO a oe ee a ee a a 28S- ee Re 18S- (B) 28S- ea g - e y 图 16.1 以 同 源 框 探 针对 小 鼠 胚 胎 组 织 进行 Northern 印迹 的 例子 。 每 一 泳 道 含 有 1 一 2 yg polyA* RNA, RNA 来 源 注 明 在 泳 道 的 上 端 。(A) 用 0.1xSSC，0.5% SDS 在 80Y 中 洗涤 的 结果 ， 可 见 略 有 与 同 源 框 家 族 中 其 他 成 员 的 交叉 杂交 痕迹 。 同 一 膜 若 用 RNase 处 理 ， 交 叉 杂 交 即 被 消除 。(B) 可 以 看 到 许多 条 带 没 有 改变 ， 这 些 便 是 单个 基因 的 转录 物 。 但 一 些 密切 相关 基因 的 转录 物 则 在 高 严格 度 的 处 理 后 消失 T. Set: 32P- 单 链 Hox-2.1 RNA， 从 一 质粒 模板 通过 SP6 KHER BS", 1) 将 膜 放 入 三 面 封口 的 塑料 袋 中 ， 注 入 预 杂交 液 ， 用 封口 机 封 住 袋 口 。 2) 将 袋 放 入 水 浴 中 。 水 浴 的 温度 应 根据 探 针 的 种 类 而 定 (SUL 16.1)。 探 针 为 单 链 RNA FY, im A 60~65C. #2 16.1 DNA #0 RNA 的 杂交 和 洗涤 条 件 iS 杂交 时 甲 栈 探 针 ee RELIC a 洗涤 条 件 RNA RNA 60 ~65 60 0. UX SSC, OlS Ss, 275 c DNA RNA S095 50 0.1XSSC, 0.5%SDS, 65T RNA DNA Su—S5 50 1X SSC, 0.5%SDS, 65T DNA DNA 42 50 1xSSC, 0.5%SDS, 55T - 87° 3) 预 杂交 2 一 4 h ， 取 出 袋子 ， 剪 去 一 角 ， 倾 出 预 杂 交 液 (SEF 21). 4) 将 探 针 加 至 10~15 ml 杂交 缓冲 液 中 ， 在 杂交 温度 下 预 温 20 min. 5) 小 心 将 探 针 和 杂交 缓冲 液 注入 塑料 袋 中 并 封闭 袋 口 ， 封 口 时 尽量 避免 气泡 。 杂 交 过 夜 (12~24h) (参见 注释 22)。 6) 剪 开 袋子 ， 倾 出 杂交 液 ， 取 出 膜 。 用 500 ml 2 x SSC 在 室温 下 淋 洗 三 遍 。 7) 用 700 ml 0.1 SSC #1 0.5% SDS 4 70~80C ER 1h, PRAM, BR —ik. 用 手持 式 监 测 器 有 助 于 检测 背景 。 如 有 必要 可 洗 第 三 遍 。 8) 从 洗涤 缓冲 液 中 取出 膜 ， 在 膜 仍 湿 润 时 用 塑料 膜 包 封 。 用 增 感 屏 和 Kodak XAR-5 软片 〈 人 参见 注释 23~25) 于 -70Y7 进行 放射 目 显 影 。 9) 获得 结果 后 用 70% 甲 酰胺 于 80~90C 洗涤 10~15 min WE RRA PRB. WA 必要 可 重复 以 上 步骤 。 洗 脱 过 的 膜 可 作 放 射 自 显影 以 保证 探 针 已 被 除去 。 4. E 释 (1) 多 种 尼龙 膜 都 曾 试用 过 ， 在 某 种 程度 上 一 般 都 适用 。 带 电荷 的 膜 ， 诸 如 Gene- Screen Plus 或 Hybond-N - ， 效 果 不 是 很 好 。 根 据 我 们 的 经 验 ，GeneScreen 膜 能 重 复 获 得 最 高 RNA 结合 力 和 低 背 景 。 尽 可 能 避免 产生 泡沫 ， 很 重要 的 一 点 是 样品 须 彻 底 匀 浆 化 以 打 断 核 DNA。 如 果 样 品 过 于 黏稠 ， 可 多 加 匀 浆 缓冲 液 。 (3) 取出 上 清 液 时 ， 要 确保 样品 不 黏稠 而 且 不 混 有 未 匀 浆 化 物质 的 凝 块 。 进 行 到 这 一 步 的 样品 可 以 存放 数 月 之 久 。 (4) 用 灭 菌 卷 简 纸 控 干 管 壁 ， 尽 量 吸 去 上 清 液 。 这 可 以 减少 样品 被 DNA 污染 。 在 大 样品 中 建议 重复 一 次 氯 化 锂 -尿素 洗涤 以 彻底 清除 DNA. (5) 如 果 RNA WEARER, DAR / 氯仿 ， 涡 旋 振荡 或 置 于 摇 床 上 振 功 直至 溶解 。 (6) 如 果 测 定 许多 样品 ， 常 用 灭 菌 的 一 次 性 紫外 小 杯 以 减少 RNA 样品 间 的 交叉 污染 并 减少 操作 的 时 间 。 (7) 处 理 大 样品 时 ，DNA 有 可 能 未 被 完全 打 断 或 未 被 氢化 锂 -尿素 洗涤 所 清除 。 尽 可 能 彻底 地 清除 DNA 很 重要 ， 因 为 夹杂 的 DNA (#2 polyA* RNA Pr AAR dT 柱 的 流速 大 幅度 降低 。 假 如 在 最 后 的 乙醇 沉淀 步骤 之 后 DNA 依然 存在 ， 可 以 将 RNA 重 溶 于 TE， 并 调整 样品 至 2 mol/L LiCl 以 除去 DNA。4f 过 夜 可 沉淀 RNA 而 使 DNA 留 在 溶液 中 。RNA 经 离心 沉淀 ， 重 溶 于 TE， 再 进行 乙醇 沉淀 ， 操 作 同 3.1.10, HR 13. 如 果 上 柱 的 RNA 样品 量 很 小 〈 小 于 100 pg), 应 加 含 酵 母 tRNA 5 ng/ml 的 结合 组 冲 液 2 ml。 待 缓冲 液 流 过 柱 后 ， 再 用 $ ml 正常 的 结合 缓冲 液 淋 洗 。 (9) SE dT 柱 经 5 ml TES fil 5 ml 0.1 mol/L NaOH 相继 淋 洗 后 可 以 复 用 。 将 柱 置 于 室温 下 10~15 min 以 破坏 残留 的 痕 量 RNA。 若 要 保存 柱子 ， 应 先 注 入 TES 或 0.1 mol/L NaOH 并 盖 住 两 端 柱 口 。 该 柱 可 置 于 4C 长 期 保存 ， 并 可 反复 使 用 而 不 致 造成 以 后 的 RNA 损失 或 污染 。 长 期 保存 在 NaOH 溶液 中 可 能 造成 柱 底 玻 璃 纤 维 过 滤 层 的 一 定 程度 的 降解 ， 如 果 发 生 这 一 情况 ， 应 将 柱 内 窒 聚 dT 纤维 素 转 移 (2 ~ (8 =’ (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) 到 一 根 新 柱 内 。 凝 胶 的 浓度 可 根据 需要 变动 。 如 果 所 分 离 的 RNA 片段 在 1.5 一 8 kb 左右 ，1.4% 是 理想 浓度 。 高 电压 可 获得 最 佳 效果 ， 而 且 缩短 电泳 时 间 。 电泳 过 程 中 缓冲 液 的 pH 值 可 能 改变 ， 因 此 建议 在 电泳 进行 中 使 用 循环 泵 或 徒手 混合 数 次 ， 使 缓冲 液 得 以 循环 流动 ， 如 果 使 用 循环 条 ， 就 可 以 用 更 高 的 电压 以 缩 短 电 泳 时 间 。 用 pH 试纸 可 以 方便 地 监测 缓冲 液 的 pH 值 变 化 。 在 胶 上 可 以 放 上 相对 分 子 质量 标准 ， 但 必须 电泳 后 即行 染色 。 为 此 可 切 下 相对 分 子 质 量 标准 的 泳 道 用 于 染色 ， 用 蒸 饮水 淋 洗 两 次 、20 min， 用 0.1 mol/L BARK 淋 洗 两 次 、20 min。 淋 洗 对 除去 甲醛 很 必要 ， 因 甲醛 可 结合 省 化 乙 锭 。 将 这 些 切 片 置 于 0.1 mol/L BRE ( 含 0.2 pg/ml 溴 化 乙 锭 ) 中 浸润 13 min。 用 0.1 mol/L MRE PIKE 25 min, WRAR TARR, AREA T 0.1 mol/L BRET 再 脱色 数 小 时 或 4 人 过 夜 ，RNA 条 带 一 般 不 至 于 扩散 。 在 标准 的 紫外 线 透射 照明 装置 下 摄影 记录 。 染色 能 阻止 RNA 有 效 转移 至 膜 ， 因 此 用 于 杂交 的 那 部 分 胶 不 可 以 染色 。 polyA RNA 中 的 核糖 体 RNA 或 商品 RNA 分 子 阶梯 (HH Gibco-BRL 提供 ) 都 可 用 作 相 对 分 子 质量 标准 。 这 一 步 可 部 分 降解 RNA， 有 助 于 大 片段 的 转移 ， 但 浸泡 不 宜 超过 20 min， 如 果 所 要 转移 的 RNA 片段 小 于 800 bp， 须 使 用 DEPC 处 理 的 水 。 这 些 步骤 可 除去 甲醛 ， 甲 醛 能 抑制 有 效 的 转移 。 重要 的 是 使 用 254 nm 波长 的 灯泡 ， 不 要 用 偏振 滤 片 。 企 图 用 标准 的 透射 照明 灯 (通常 为 305 nm) 往往 失败 。 偏 振 滤 片 一 般 会 大 大 减弱 有 效 交 联 所 需 的 能 量 。 许多 手持 式 紫 外 灯 也 能 用 ， 但 须 除 去 保护 置 。 我 们 建议 将 无 偏振 滤 片 的 四 个 标准 灯泡 的 透射 照明 装置 固定 于 带 有 保护 四 的 盒子 或 箱 中 ， 使 灯光 自 上 向 下 照射 ， 这 样 可 防止 紫外 线 照 射 操 作 人 员 。 光 的 剂量 很 重要 。 光 源 至 样品 的 距离 在 操作 方法 中 常 有 注 明 。 但 各 人 所 用 的 紫外 光源 应 测定 它 特 定 的 距离 。 使 用 标准 的 紫外 线 安全 测试 仪 所 测量 单位 是 W/cm’, 波长 为 2534 nm。 这 些 仪器 并 不 昂贵 ; 而 且 很 容易 从 实验 仪器 供应 商 处 购 得 。 找 出 能 使 样品 表面 能 量 为 600 pW/cm? 的 距离 ， 然 后 将 紫外 灯 源 固定 于 这 一 高 度 。 Stratagene 公司 现在 可 提供 紫外 线 交 联 仪 (StrataLinker™) 商品 ， 按 厂商 的 说 明 使 用 时 对 GeneScreen 膜 进行 交 联 很 有 效 。 有 些 作 者 报道 用 干燥 的 滤 膜 进行 此 外 线 交 联 ， 这 一 方法 也 能 成 功 ， 优 点 是 大 大 减 少 所 需 时 间 ， 一 般 为 10 一 30 s。 但 有 可 能 使 RNA 过 度 交 联 于 膜 上 ， 从 而 降低 了 膜 上 有 用 的 RNA。 对 于 湿 的 或 干 的 膜 的 最 适 交 联 时 间 很 容易 直接 测定 。 制 备 一 个 带 有 单一 的 大 的 加 样 孔 的 测试 胶 ， 然 后 转移 RNA 到 膜 上 。 将 膜 的 大 部 分 用 黑 纸 覆盖 ， 然 后 进行 紫外 线 交 联 。 设 定 不 同 的 时 间 点 ， 逐 渐 增 加 膜 的 紫外 线 曝 光 面 积 。 这 就 提供 了 紫外 线 交 联 的 时 间 进 程 。 杂 交 之 后 ， 最 适 交 联 时 间 和 有 效 交 联 时 间 范 围 可 直接 自 膜 上 读 出 。 有 效 交 联 时 间 范 围 在 湿 膜 交 联 中 往往 很 宽 ， 并 且 实 验 一 般 有 很 好 的 可 重复 性 。 在 干 膜 交 联 中 ， 有 效 交 联 时 间 范 围 往 往 仅 有 数秒 ， 并 且 难 以 - 89 - (21) (22) (23) (24) (25) 重复 。 这 就 是 为 什么 我 们 要 推荐 湿 膜 交 联 的 原因 。 预 杂 交 缓 冲 液 和 杂交 缓冲 液 可 事先 配制 ， 在 4C 中 可 长 期 保存 。 以 上 所 有 转移 、 紫 外 线 交 联 、 以 及 杂交 的 方法 均 适 用 于 Southern 和 Northern 分 析 。 只 是 杂交 温度 须根 据 所 用 核酸 及 探 针 的 情况 而 定 。 表 16.1 列举 分 别 适 用 于 RNA 及 DNA 的 一 些 条 件 。 纪 使 滤 膜 完全 和 干燥， 干燥 的 膜 将 导致 无 法 完全 洗 脱 已 结合 的 探 针 。 如 果 背 景 很 高 或 由 于 交叉 杂交 而 必须 采用 高 严格 度 条 件 时 ， 可 先 用 100 ml 0.1 x SSC、10% ~ 30% 甲 酰胺 , 65°C HERR 30 min， 然 后 用 0.1 x SSC、0.5% SDS, 70C ERR 30 min 后 再 次 曝光 。 或 者 可 将 膜 用 RNase 处 理 以 消除 高 背景 J， 但 有 可 能 使 膜 不 能 重复 使 用 。RNase 处 理 的 步骤 : 将 膜 放 在 2 x SSC, 0.1 pg/ml RNase A 液 中 ， 室 温 下 放置 20 min. 然后 用 500 ml 2xSSC，0.5% SDS, 40~50°C ##f% 30 min， 重 新 显影 。 这 一 处 理 与 RNase 保护 试验 类 似 。 图 16.1 A RNase 处 理 的 例子 。 参考 文 献 — . Krumlauf, R., Holland, P. W. H., McVey, J. H., and Hogan, B. L. M. (1987) Devel- opmental and spatial patterns of expression ofthe mouse homeobox gene, Hox- 2.1. Development 99, 603-618. 2. Graham, A., Papalopulu, N., Lorimer, J., McVey, J. H., Tuddenham, E. G. D., and Krumlauf, R. (1988) Characterization of a murine homeobox gene, Hox-2.6, related to the Drosophila deformed gene. Genes Dev. 2, 1424-1438. 3. Graham, A., Papalopulu, N., and Krumlauf, R. (1989) The murine and Drosophila homeobox gene complexes have common features of organization and expression. Cell 57, 367-378. 4. Auffray, C. and Rougeon, F. (1980) Purification of mouse immuno:globulin heavy- chain RNAs from total myeloma tumor RNA. Eur. J. Biochem. 107, 303-324. 5. Krumlauf, R., Hammer, R., Tilghman, S. M., and Brinster, R. (1985) Developmen- tal regulation of alpha-fetoprotein in transgenic mice. Mol. Cell Biol. 5, 163—168. 6. Aviv, H. and Leder, P. (1972) Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412. 7. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 8. Southern, E. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments sepa- rated by gel electrophoresis. Mol. Biol. 98, 503-512. 9. Krumlauf, R. (1989) GeneScreen hybridization transfer membrane: UV- crosslinking protocols. Dupont Manufacturers Instruction Booklet, Du Pont, Wilmington, DE. 10. Wahal, G. M., Stern, M., and Stark, G. R. (1979) Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzloxymethal-paper and rapid hybridiza- tion by using dextran sulfate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3683-3688. + 90 * 第 十 七 章 RNA JRRER WE OT David Murphy Tl 1. 4 在 狭 颖 印迹 法 中 ，RNA 不 经 分 离 直 接 施放 在 固体 支持 物 上 ， 因 此 这 一 方法 对 分 析 生物 在 发 育 过 程 或 生理 变化 中 所 出 现 的 RNA 数量 的 变化 既 快 速 又 灵敏 。 不 利之 处 是 当 样品 中 含有 其 他 同 源 序列 时 不 能 使 用 ， 因 为 这 些 同 源 物 也 可 与 探 针 结 合 以 至 得 出 错误 结 果 。 2. 材 料 jw ) 3:1 上 样 缓冲 液 : 5 ml 甲 酰胺 (Fluka [Buchs，Switzerland]; 参见 注释 1)，1.7 ml 甲醛 (Fluka), DEPC 处 理 过 的 水 ，0.5 ml 20 x MAE (20 X MAE: 0.4 mol/L MOPS, pH 7.0, 0.1 mol/L 醋酸 钠 ，0.02 mol/L EDTA). DEPC 处 理 过 的 20 x SSPE: 3.6 mol/L Atk MH, 200 mmol/L BRA. pH 6.8, 20 mmol/L EDTA. 3) 与 真空 系统 相连 的 狭 颖 印迹 加 样 装置 (如 Schleicher and Schuell Dassel, Germany). 4) 尼龙 杂交 支持 物 (如 Amersham [UK] Hybond-N); 参见 注释 2。 5) 紫外 线 交 联 仪 : 参见 第 十 六 章 。 6) RNA 样品 : 参见 注释 3 一 5。 到 YA 3. 方法 〈 参 见 注释 4) 1 A 加 3 倍 体积 的 3:1 上 样 缓冲 液 至 RNA 样品 中 (RNA AZ 50 ng 细胞 总 RNA)。 65°C 保温 15 min 使 其 变性 。 2) 加 SSPE 至 样品 中 ， 使 最 终 浓度 为 2x ， 最 终 体 积 达 500 pl. 3) 用 狭 缝 印迹 加 样 装置 将 样品 施放 于 尼龙 膜 上 。 4) 拆 御 狭 颖 印迹 系统 ， 用 2xSSPE (DEPC 处 理 的 ) 冲洗 滤 膜 。 5) 于 80°C HUG AR 1 h 使 膜 干 燥 ， 这 有 助 于 RNA 固定 于 支持 物 上 。 6) 用 紫外 线 交 联 仪 处 理 膜 ， 使 RNA 以 共 价 键 结 合 于 支持 物 上 (参见 第 十 六 章 )。 7) 如 第 十 六 章 所 述 进行 杂交 。 - O1 - 4. 释 (1) 甲 酰胺 在 使 用 前 须 进 行 去 离子 化 处 理 。 先 将 甲 酰胺 与 混合 床 树脂 Dowex XG8 混合 并 搅拌 1 h， 然 后 用 3 MM 滤纸 过 滤 。 若 用 Fluka 甲 酰胺 〈 目 录 编 号 47 670) 无 须 去 离子 处 理 。 (2) 这 些 方法 曾 用 于 中 性 尼龙 膜 (如 Amersham Hybond-N)。 作者 未 曾 试 过 带 正 电 和 荷 的 ffi (如 Amersham [UK] Hybond-N*, Bio-Rad [Richmond, CA] Zeta-Probe, NEN- Du Pont [Boston, MA] Genescreen™ Plus) 。 使 用 快速 制备 法 获得 的 细胞 总 RNA 有 可 能 污染 有 基因 组 DNA， 因 此 难以 用 分 光 光 度 计 来 精确 测定 RNA 含量 。 此 外 还 必须 防止 上 样 矫 作物 的 出 现 。 对 半 定 量 分 析 来 说 ， 每 一 样品 须 作 两 次 狭 缝 印迹， 一 张 膜 与 所 要 检测 的 RNA 的 探 针 杂交 ， 另 一 张 则 与 另 一 种 RNA 的 探 针 杂交 ， 这 种 RNA 在 各 个 样品 中 的 表达 都 一 样 。 或 者 也 可 以 对 一 个 样品 只 作 一 次 印迹 ， 但 同一 张 膜 须 进行 重复 杂交 。 RNA 的 狭 颖 印迹 可 用 于 快速 定量 测定 生物 发 育 过 程 中 或 生理 变化 中 发 生 的 某 种 RNA 的 稳 态 水 平 的 变化 。 探 针 与 各 种 稀释 度 的 待 测 RNA 样品 杂交 产生 的 信号 和 同 一 探 针 与 各 种 稀释 度 的 特定 的 RNA 标准 杂交 产生 信和 号 相 比 较 ， 这 种 RNA 标准 由 Wi AK RNA 聚合 酶 催化 克隆 的 cDNA 通过 体外 转录 所 产生 (参见 第 十 二 章 )。 众所周知 ， 狭 颖 杂交 很 容易 出 现 假 阳性 信号 。 这 可 通过 以 下 手段 尽 可 能 地 避免 : a. 用 Northern 印迹 方法 严格 鉴定 探 针 的 特异 性 ; b. 在 所 有 测试 中 均 须 有 适当 的 阴性 对 照 ; c. 须 非 常 细心 地 制备 所 有 探 针 、 溶 液 、RNA 等 以 避免 污染 。 (3 A (4 ~ (5 ~~ - 92 。 第 十 八 章 ”RNase 保护 测定 法 Dominique Belin nie 1. 引 RNase 保护 检测 法 根据 的 原理 是 : RNA 与 互补 的 ?2P 标 记 的 RNA 探 针 在 溶液 中 复 性 后 形成 的 RNA:RNA 杂种 分 子 对 单 链 专 一 的 RNase 具有 抗 性 。 此 法 可 以 对 RNA 分 子 末端 进行 定位 或 对 内 含 子 -外 显 子 的 交界 定位 。 与 Northern 印迹 相 比 ， 它 是 另 一 种 十 分 _ 有 效 而 且 灵 人 敏 度 很 高 的 、 可 用 于 测定 mRNA 丰 度 的 方法 。 杂 交 过 程 中 加 入 过 量 泊 度 的 : 探 针 能 使 所 有 互补 序列 形成 标记 的 杂种 分 子 。 未 杂交 的 探 针 和 已 杂交 的 探 针 的 单 链 部 分 则 被 RNase 消化 而 清除 。“ 被 保护 的 ” 探 针 通过 变性 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 来 检测 并 定量 。 当初 是 用 DNA 单 链 作为 探 针 的 册 ， 但 是 单 链 DNA 探 针 的 制备 费时 。 标 记 RNA 非常 容 易 (核糖 核酸 探 针 ， 参 见 第 十 二 章 )， 所 以 根据 RNA:RNA 杂交 进行 测定 ， 这 就 十 分 有 Fil 7 3] RNase 保 护法 的 优点 很 多 。 第 一 ， 溶 液 杂 交 可 以 处 理 大 量 RNA (多 达 60 pg 总 RNA)， 而 不 受 转 膜 效 率 或 与 膜 结 合 的 RNA 多 少 的 影响 。 第 二 ， 信 噪 比 明显 改善 ， 因 为 交叉 杂交 的 RNA 只 产生 短 的 保护 片段 。 第 三 ， 相 当 大 的 一 部 分 mRNA 往往 在 分 离 过 程 中 部 分 降解 ; 在 Northern 印迹 法 中 这 就 产生 了 由 若干 种 杂交 分 子 组 成 的 拖 尾 现象 ， 从 而 降低 了 检测 的 灵敏 度 。 最 后 一 点 ， 在 测序 胶 上 检测 杂交 后 的 探 针 更 为 灵敏 ， 因 为 条 带 的 宽度 为 琼脂 糖 胶 上 的 1/10. Northern 印迹 法 的 特点 中 只 有 两 个 特点 是 酶 保护 法 所 不 具备 的 ， 即 目标 RNA 的 全 长 测定 和 同一 样品 的 反复 使 用 。 2. 材 料 1) P 标记 的 探 针 : 核糖 核酸 探 针 的 制备 方法 见 第 十 二 章 (参见 注释 1 一 3)， 将 探 针 重 eI, REA 1~2 ng/pl. 杂交 混合 液 : 80% 去 离子 甲 酰胺 (人 参见 注释 4)，0.4 mol/L NaCl, 40 mmol/L Na- PIPES, pH 6.8, 1 mmol/L EDTA. RNase 消化 缓冲 液 : 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 4 mmol/L EDTA. 胰 RNase: 将 酶 溶 于 含 10 mmol/L NaCl 的 TE 溶液 中 使 其 浓度 为 10 mg/ml, A RNase 冻 干 粉 的 管子 应 在 通风 橱 中 小 心 开启 以 免 污 染 ， 者 沸 15 min， 缓 慢 冷 却 到 室 温 。 溶 液 分 装 小 份 于 -20 贮 存 。 T1 RNase: 溶 于 TE 中， 浓度 为 1 mg/ml。 调 pH 至 7.0。 溶 液 分 装 小 份 于 = 20T 保 存 。 2 a 3 YA 4 SA — 。 O38 + 6) HARK: 将 酶 溶 于 水 ， 浓 度 为 20 mg/ ml 溶液 分 装 小 份 于 - 20°C 保存 。 ay 法 1) 对 每 份 样品 ， 加 1 pl REP 29 pl 杂交 混合 液 。 探 针 重 溶 于 水 ， 为 最 终 体 积 的 3% 。 探 针 的 实际 数量 并 不 严格 ， 因为 探 针 对 特定 的 目标 片段 而 言 是 过 量 的 〈 参 见 注 释 5)o 2) 冻 干 或 用 乙醇 沉淀 10 pg RNA 样品 ， 重 悬 于 30 由 完全 的 杂交 液 〈 含 探 针 )。90 忆 加 热 2 min， 然 后 保温 过 夜 ， 一 般 为 45C (参见 注释 6 一 7)。 3) 将 样品 置 冰 上 冷却 ， 加 300 pl RNase 消化 缓冲 液 。 可 用 胰 RNase 或 T1 RNase 或 两 酶 共同 于 25°C 消化 1 ho HE RNase 切割 尿 喀 喧 或 胞 喀 啶 后面 的 残 基 ，T1 RNase 切割 岛 味 叭 后 面 的 残 基 (参见 注释 8 和 9)。 4) 加 20 pl 10% SDS, 用 0.5 wl (10 pg) RAB K F 37T 消化 10 ~ 20 min 除去 RNase。 用 酚 / 氯 仿 抽 提 两 次 。 加 10 pe RA tRNA 后 ， 用 乙醇 沉淀 RNA。 5) 重 悬 RNA 于 样品 缓冲 液 中 。90C 加 热 2 min 使 杂种 分 子 变 性 。 在 适当 浓度 的 聚 两 炳 酰胺 /尿素 测序 胶 上 电泳 〈 参 见 第 四 十 七 章 )。 用 20% 乙 醇 将 胶 固定 ， 用 10% 醋酸 除 去 尿素 ， 干 后 作 放 射 自 显影 (参见 注释 10)。 4. 注 FE (1) 探 针 长 度 应 为 100 一 400 个 核 苷 酸 ， 而 且 其 中 应 至 少 有 10 个 核 苷 酸 不 和 靶 RNA 互 补 。 残 存 的 DNA 模板 常常 会 产生 痕 量 的 全 长 的 被 保护 探 针 ， 它 们 必须 能 与 靶 RNA 所 保护 的 片段 相 区 别 〈 图 18.1)。 (2) 降低 探 针 的 比 活 往往 是 有 用 的 ， 因 为 当 核 苷 酸 浓度 高 时 ，RNA 的 合成 增加 ， 探 针 就 不 容易 训 变 ， 放 射 性 物质 也 可 少 用 一 些 。 下 列 准 则 有 助 于 根据 灵敏 度 的 不 同 要 求 而 调整 探 针 的 比 活 。 RNA 靶 序 列 的 丰 度 未 标记 的 UTP 2p_UTP 探 针 /样品 * 高 100 pmol/L 2.5 pmol/L, 10 pCi 6 一 12 kcpm 中 10 pmol/L 2.5 pmol/L, 10 pCi 60~120 kepm 低 一 12.5 pmol/L, 50 pCi 300~ 600 kcpm a 检测 靶 RNA 时 每 一 样品 所 需 的 探 针 量 (参见 注释 $)。 (3 — 如 果 要 达到 最 高 的 灵敏 度 或 做 定位 分 析 则 往往 须要 进行 纯化 。 对 模板 进行 DNase 消化 后 ， 全 部 样品 可 直接 上 样 到 5% 一 6% 聚 丙烯 酰胺 /尿素 的 制备 型 凝 胶 上 【( 胶 的 厚度 为 0.4 一 1.5 mm)， 但 在 样品 的 溶液 中 须 有 足 量 的 EDTA 以 整合 所 有 的 镁 Bt. Wikia, FARR YEAR (Saran Wrap™) 盖 住 湿 胶 ， 置 室温 曝光 0.5 一 5 min 对 全 长 的 转录 产物 定位 。 用 刀片 切 去 底片 上 已 曝光 的 条 带 ， 将 切除 过 条 带 的 底片 对 应 地 放 在 凝 胺 上， 用 消毒 过 的 刀片 将 有 条 带 的 凝 胶 割 下 来 。 被 割 过 的 凝 胶 应 再 - 94 - 次 曝光 以 确定 所 割 去 的 胶 是 否 正 是 所 需 的 条 带 部 分 。 用 电 洗 脱 (a) 或 浸泡 (b) 的 方法 将 凝 胶 上 的 RNA 洗 脱 。 a. 在 装 有 0.1x Tris/ 硼 酸 盐 /EDTA 溶液 的 灭 菌 透 析 袋 中 30 V/cm 进行 电 洗 脱 1 一 2 h， 然 后 倒转 电极 方向 电泳 30 s 使 洗 脱 的 RNA 的 从 膜 上 脱离 。 洗 脱 液 中 加 入 已 知 量 的 tRNA RA 〈 参 见 注释 6)， 然 后 作 两 次 酚 / 氯 仿 抽 提 和 乙醇 沉淀 。 此 过 程 对 RNase 降解 十 分 敏感 。 b. 将 切 下 的 凝 胶片 放 在 盛 有 500 yl 0.5 mol/L BRR, 1% SDS, WR 20 pg/ml tRNA 的 小 离心 管 中 ，377 保温 1 一 3 h。 洗 脱 液 和 残留 的 凝 胶 分 别 通过 放射 记 数 以 确定 60% 以 上 的 RNA 已 被 洗 脱 下 来 。 酚 /氯仿 抽 提 两 次 ， 乙 醇 沉 淀 回收 RNA。 (4) 甲 酰胺 的 去 离子 化 : 置 于 -80C ， 直 至 75% 一 90% 的 液体 析出 结晶 。 弃 去 液 相 部 分 。 融 化 后 与 混合 床 树 脂 〈(AGS501-X8，Bio-Rad 产品 [Richmond，CA]) 一 起 (B) t23 45 6.7 ee 全 346- i @eeee 236- @ % Lt ae aa 165 @ ~ 135-@ < ee 59-@ is ~45- ae ‘i lies 图 18.1 RNase 保护 测定 。(A) 靶 专 一 信号 与 被 残余 DNA 完全 保护 的 探 针 之 间 的 区 别 。 从 鼠 的 各 种 组 织 的 总 RNA 中 检测 PN-I mRNAIG。 探 针 (长 度 为 310 个 核 苷 酸 ) 用 凝 胶 电 泳 纯化 过 。 泳 道 1: 相对 分 子 质 量 标准 。 泳 道 2: 纯化 的 探 针 。 泳 道 3: 杂交 的 探 针 ， 但 没有 用 RNase 消化 。 泳 道 4: 用 10 pg tRNA 杂交 所 做 的 对 照 ， 仍 可 见 痕 量 的 完全 保护 的 探 针 。 泳 道 5: 10 pe HE RNA， 其 中 富 含 PN-I mRNA; 被 专 一 性 保护 的 片段 长 度 为 260 个 核 苷 酸 。 泳 道 6: 10 pe 肝脏 RNA， 其 中 不 含有 可 检测 量 的 PN-I mRNA。 泳 道 7: 10 pe #AL RNA, HP AIRE PN-I mRNA。(B) 杂交 温 度 对 检测 短 的 互补 RNA 链 的 影响 。 从 带 有 T4 RAE 32 表达 结构 的 细菌 取得 它 的 总 RNA， 将 其 中 的 基因 32 转录 物 的 $ 端 与 含有 基因 32 上 游 的 400 个 核 苷 酸 片段 的 CRNA 探 针 进行 杂交 作 定 位 分 析 史 。 所 用 探 针 未 经 凝 胶 纯化 ， 杂 交 在 注 明 的 温度 下 进行 。 由 于 DNase 对 DNA 模板 消化 不 完全 ， 可 见 痕 量 被 保护 的 探 针 ; 在 没有 靶 RNA 的 杂交 对 照 组 中 也 可 见 到 同样 的 结果 。 被 保护 的 44 个 核 苷 酸 片段 在 高 于 300 时 不 被 检测 到 。 05 > (S ~~ (6) (7 Se (8 ~~ (9 (10) 4f RIBS) Et. MER RAR AZ Bs (Teflon™) MEW BR. AREBKE 的 RNase, 36/9 0.1 mol/L NaOH 处 理 10 min, 再 用 水 和 粗 制 的 甲 酰胺 淋 洗 。 检 Se, 务 使 其 低 于 20 wS。 用 灭 菌 漏 斗 和 滤纸 (Whatman, LS-14) 过 滤 该 深 液 。270 nm 的 吸光 度 应 低 于 0.2。 探 针 的 量 必须 超过 靶 RNA 的 量 。 由 于 一 开始 不 可 能 知道 靶 RNA 的 丰 度 ， 只 好 根 据 以 往 的 经 验 大 致 计算 。 注 释 2 所 列 数 据 可 作为 参考 。 对 于 丰 度 非常 低 的 加 RNA, RNA 样品 可 增 至 60 pg. 在 30 岂 总 反应 体积 中 加 1 一 2 ng 的 300 个 核 苷 酸 长 度 的 探 针 可 使 肢 RNA 的 杂交 在 16 h 内 完成 (4 一 8 Ti )。 如 要 缩短 杂交 时 间 ， 则 须 增 加 探 针 投入 量 (R,)， 以 获得 同样 的 饱和 度 ， 即 保持 Rox Ti 值 。 每 个 样品 须 含 有 相同 量 的 总 RNA 以 利于 RNase 消化 的 进行 。 不 足 的 部 分 可 用 tRNA 补足 ， 但 必须 有 一 个 只 含 tRNA 的 阴性 对 照 ， 如 图 18.1 (A) 第 4 泳 道 ， 图 18.1 (B) 第 3 泳 道 。 杂交 温度 必须 降低 ， 以 便 检 测 短 的 或 富 含 AU 碱 基 的 被 保护 片段 。 例 如 ， 一 个 44 个 核 苷 酸 长 度 的 T4 WR ARE 32 转录 物 (4 35 A/U 和 9 C/G), RA 25~ 30C 中 进行 杂交 才能 被 保护 史 0 ;如 图 18.1 (B)。 RNase 的 用 量 取 决 于 样品 中 所 含 的 RNA 总 量 ， 包 括 探 针 在 内 。 本 文 作 者 通常 加 0.5~1.0 pg ARK RNase 和 /或 0.25 ng 的 TI RNase/ug RNA。 在 多 数 情 况 下 ， 单 用 胰 RNase 消化 已 足够 。 当 探 针 与 靶 RNA 来 自 不 同 物种 时 ， 其 同 源 程度 足以 产 生 不 连续 的 被 保护 片段 ， 尤 其 是 当 只 用 T1 RNase 消化 时 。 消 化 的 温度 可 提高 到 30~37C, RBiXHAAH SRM RNA: RNA 杂种 分 子 的 部 分 降解 。 要 保证 探 针 在 杂交 过 程 中 仍 保持 完整 ， 做 一 个 平行 的 对 照 很 有 帮助 ， 即 在 杂交 及 其 他 处 理 过 程 中 不 加 RNase， 如 图 18.1 (A)， 泳 道 2，3。 常 可 检测 到 少量 被 保护 的 短片 段 ， 这 就 使 对 定位 分 析 结 果 的 解释 复杂 化 。 为 区 分 这 些 片 段 究 竟 是 消化 所 产生 的 矫 作 物 ， 还 是 部 分 互补 于 探 针 的 稀有 的 靶 RNA， 可 用 一 段 合成 的 完全 互补 于 探 针 的 有 义 转录 物 作为 靶 RNA 的 对 照 5] 。 xa 感谢 P. Vassalli, & {th He 76 SR Wah FK {11 (EF OKT RE OE A mRNA。 在 过 去 的 几 年 中 ,许多 同事 、 学 生 、 技 术 员 都 对 本 章 所 述 的 方法 做 出 了 贡献 , 他 们 是 M，Collart， N. Busso, J.-D. Vassalli, H. Krisch, S. Clarkson, J. Huarte, S. Strickland, P. Sappino, M. Pepper , A. Stutz, G. Moreau, D. Caput, M. Prentki, P. Gubler, F. Silva, V. Monney, D. Gay- Ducrest, 和 N. Sappino。 本 研究 由 瑞士 国家 科学 基金 资助 。 * 96 ， — Wh 考 xX 献 . Williams, D. L., Newman, T. C., Shelnes, G. S., and Gordon, D. A. (1986) Mea- surements of apolipoprotein mRNA by DNA-excess solution hybridization with single-stranded probes. Methods Enzymol. 128, 671-689. . Belin, D. (1994) The use of riboprobes for the analysis of gene expression. Meth- ods Mol. Biol. 31, 257-272. . Srivastava, R. A. K. and Schonfeld, G. (1994) Quantification of absolute amounts of cellular messenger RNA by RNA-excess solution hybridization. Methods Mol. Biol. 31, 273-281. Belin, D., Mudd, E. A., Prentki, P., Yi-Yi, Y., and Krisch, H. M. (1987) Sense and antisense transcription of bacteriophage T4 gene 32. J. Mol. Biol. 194, 231-243. . Belin, D., Wohlwend, A., Schleuning, W.-D., Kruithof, E. K. O., and Vassalli, J.-D. (1989) Facultative polypeptide translocation allows a single mRNA to encode the secreted and cytosolic forms of plasminogen activators inhibitor 2. EMBO J. 8, 3287-3294. . Vassalli, J.-D., Huarte, J., Bosco, D., Sappino, A.-P., Sappino, N., Velardi, A., Wohlwend, A., Erno, H., Monard, D., and Belin, D. (1993) Protease-nexin I as an androgen-dependent secretory product of the murine seminal vesicle. EMBO J. 12, 1871-1878. - 97 - 第 十 九 音 ”mRNA 的 引物 延伸 分 析 Mark W. Leonard, Roger K. Patient ul 1. 3] 引物 延伸 分 析 是 一 种 相当 快捷 而 方便 的 方法 ， 可 用 它 对 基因 转录 进行 监测 。 这 一 技 术 可 用 于 准确 地 测定 转录 起 始 位 置 或 用 于 定量 测定 帽 位 点 专 一 的 信息 。 这 一 技术 的 基本 原理 见 图 19.1。 简 而 言 之 ， 用 放射 性 标记 的 探 针 〈 最 好 是 单 链 片 段 ) 与 靠近 mRNA 3“ 端的 互补 序列 杂交 。 利 用 逆转 录 酶 反应 将 这 一 引物 延伸 返回 到 转 录 的 起 始点 。 在 变性 聚 丙 烯 酰胺 凝 腕 上 电泳 分 离 5 端 反应 产物 ， 然 后 放射 自 显影 。 1. 将 野生 型 基因 和 做 上 标记 的 基因 转 染 入 细胞 Gene A™ Gene A™_ 2. 基因 在 组 织 培 养 细 胞 核 内 转录 RNA™ AAA RNAm AAA 3. 标记 的 引物 与 mRNA 杂交 4. 引物 通过 逆转 录 酶 延伸 AAA 2 ak, AAA 5. 沉淀 并 在 变性 的 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 图 19.1 引物 延伸 法 示意 图 。 用 引物 延伸 法 区 别 大 小 不 同 的 转录 物 : 爪 蟾 的 野生 型 B- 珠 蛋白 的 基因 转录 物 和 做 上 标记 的 B - 珠 蛋 白 的 基因 拷贝 的 转录 物 。 引物 延伸 法 用 于 mRNA 分 析 的 主要 优点 是 方便 (与 S1 定位 或 RNase 定位 相 比 )。 此 技术 能 够 准确 地 测定 转录 起 始 位 点 。 由 于 可 获得 非常 清晰 的 结果 ， 可 在 同一 反应 中 定 量 分 析 数 条 mRNA。 例 如 ， 可 以 区 分 转 染 的 标记 基因 的 转录 产物 与 细胞 内 源 性 基因 转 录 产 物 ， 或 者 通过 精心 选择 引物 ， 使 被 检测 的 基因 转录 产物 与 共 转 染 的 〈 内 部 标准 ) 对 照 基 因 可 以 在 同一 反应 中 进行 监测 (参见 图 19.2)。 最 后 ， 对 于 具有 多 个 帽 位 点 的 基 因 ， 从 每 一 帽 位 点 上 开始 的 转录 产物 的 多 少 可 在 同一 反应 中 分 别 得 以 检测 。 以 上 许多 设想 也 同样 适用 于 S1 定位 或 RNase 定位 分 析 (参见 第 十 八 章 和 第 三 十 HM). SH Sl 定位 及 RNase 定位 法 往往 比较 灵敏 ， 但 由 于 引物 延伸 法 方便 ， 常 成 为 RNA 分 析 的 首选 方法 。 2. 材 料 如 同 所 有 涉及 RNA 的 操作 过 程 一 样 ， 须 十 分 小 心 避免 RNase 的 污染 及 样品 的 降 98 . fel, THEGH A, He PURFE. CARRRB MY AA RNase 抑制 剂 二 乙 基 焦 碳 酸 盐 (diethylpyrocarbonate, DEPC) 处 理 (0.1%, 37C #30 min 或 更 和 久 )。 DEPC 不 可 用 于 处 理 含 有 Tris 的 溶液 ， 因 为 DEPC 在 这 种 溶液 中 不 稳定 。Tris 缓冲 液 须 FA DEPC 处 理 的 高 压 灭 菌 水 配制 ， 然 后 再 次 高 压 灭 菌 。 在 使 用 溶液 之 前 必须 清除 所 有 残 留 的 痕 量 DEPC (用 高 压 灭 菌 ) 以 防止 RNA 和 和 蛋白质 发 生 羧 甲 基 化 。 亦 可 按 同 样 方法 处 理 灭 菌 的 一 次 性 塑料 器 血 ， 但 一 般 来 讲 已 经 基本 上 没有 RNase 的 污染 ， 因 此 不 必 再 作 这 种 预 处理 了 。RNA 实验 用 的 塑料 器 严 及 试剂 必须 专用 。 杂交 反应 用 的 玻璃 毛细 管 应 经 硅化 处 理 (塑料 器 亚 不 一 定 硅 化 )。 须 硅化 处 理 的 物 品 用 5% 的 二 氯 二 甲 基 硅 烷 的 氯仿 溶液 淋 洗 (〈 须 在 通风 橱 中 操作 ， 因 为 这 种 溶液 有 毒 且 具 高 挥发 性 ) 。 硅 化 过 的 物品 在 用 DEPC 处 理 之 前 应 用 DEPC 处 理 的 水 淋 洗 几 次 ， 并 在 100°C 烘 烤 2 ho BA ES AY Be TT EA RR ELS EKER (参见 注释 1). BRR 须 18 个 核 苷 酸 或 更 长 些 ， 最 理想 的 是 位 于 mRNA 加 帽 区 域 中 100 个 碱 基 的 范围 内 ， 须 注意 所 选 窒 核 苷 酸 片段 中 不 应 有 可 使 其 相互 之 间或 自身 内 发 生 杂 交 的 重复 序列 ， 因 为 这 将 降低 探 针 与 靶 mRNA 复 性 的 效率 。 2 3 ee — 位 = 一 Mtz 多 一 Mt 多 区 一 Wi 92 @ : 图 19.2 引物 延伸 反应 举例 : 用 单一 的 Sty RS aT SATE B ERE A Ea YS A 的 细胞 质 RNA。 泳 道 3: 只 含有 野生 型 的 B- 珠 蛋白 基因 ; 泳 道 4 和 5: 野生 型 基因 ， 外 加 在 该 基因 的 第 一 个 外 显 子 中 插入 不 同 大 小 的 寡 核 苷 酸 片 段 的 基因 。 样 品 与 标记 的 DNA 相对 分 子 质量 标准 〈 泳 道 1) 以 及 来 自 非洲 扑 AY ZT AAA AY SO ng 总 细胞 质 RNA ( 泳 道 2) 同时 电泳 以 表明 在 活体 内 所 用 的 帽 位 点 。 ie, SIO Ss mimic?) (参见 注释 2), WHEY Maxam 和 Gilbert 方法 6,5] 测定 引物 延伸 产物 的 序列 时 。 标 记 的 引物 应 先 除 去 未 挫 入 的 核 苷 酸 (用 Sephadex G-25 柱 离心 )， 然 后 用 Cerenkov 记 数 法 测定 比 活 。 引 物 的 比 活 (SA) 应 大 于 $x 105 dpm/ pmol, 1) 10x 激 酶 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCl, 50 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT), 1 mmol/L WARK, 1 mmol/L EDTA. 2) 5X RRR: 2 mol/L NaCl, 50 mmol/L PIPES, pH 6.4. 3) 1X RE He PK: 5 pl 1 mol/L Tris-HCl, pH 8.3, 5 pl 200 mmol/L DTT, 5 ul - 99 - 120 mmol/L MgCl, 2.5 pl 1 mg/ml 放 线 菌 素 D，10 mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP & 5 pl, 1 pl (£940 U) RNase 抑制 剂 RNasin， 用 DEPC 处 理 过 的 水 加 至 89 pl. 甲 酰胺 上 样 染料 :80% 去 离子 甲 酰胺 ，45 mmol/L Tris-HCl 硼酸 盐 ，45 mmol/L HH 酸 ，1.25 mmol/L EDTA, 0.02% —F#F. 5) G25 葡 聚 糖 凝 胶 , 将 葡 聚 糖 凝 胶 混 悬 于 50 倍 体积 的 TE 中 (10 mmol/L Tris-HCl, pH7.5，1 mmol/L EDTA)。 高 压 灭 菌 15 min ( 葡 聚 糖 凝 胶 将 会 溶 胀 )， 冷 却 至 室 温 。 用 有 盖 瓶 子 贮存 于 4Y 。 6) 载体 (BEBE) tRNA: 用 DEPC 水 配制 25 mg/ml。 称 重 时 宜 用 原装 的 瓶子 以 避免 RNase 污染 。- 20Y 保存 于 灭 菌 塑料 管内 。 3 mol/L 醋酸 钠 (NaOAc)， 用 冰 醋 酸 调 至 pH 5.4， 用 DEPC 处 理 ， 然 后 高 压 灭 菌 15 min. 8) 70% Z.B2/DEPC 7K: 70 ml 无 水 乙醇 内 加 入 30 ml DEPC 处 理 过 的 水 。 4 — 7 ~~ NaCl, MgCl, EDTA 和 PIPES 均 须 照 上 述 方法 进行 DEPC 处 理 。 缓 冲 液 中 的 其 他 成 分 则 须 用 DEPC 处 理 过 的 高 压 灭 菌 水 配制 ， 而 不 是 用 DEPC 直接 处 理 。 放 线 菌 素 D 对 光敏 感 而 且 有 毒 ， 不 可 高 压 灭 菌 。DTT 对 热 不 稳定 ， 不 可 高 压 灭 菌 (1 mol/L DTT 贮存 液 应 用 DEPC 处 理 的 10 mmol/L NaOAc 配制 ， 过 滤 除 菌 ， 分 装 后 -208 保 存 )。dNTPs 贮存 液 应 过 滤 灭 菌 。 这 些 缓冲 液 分 装 后 贮存 于 - 20°C 。 如 使 用 RNase 抑制 剂 RNasin, 应 在 使 用 的 当天 加 入 延伸 缓冲 液 中 。 逆 转录 酶 (分 装 保存 于 -70TC ) 也 同样 应 在 临 用 前 加 入 延伸 混合 液 中 。 3.. 2 法 下 面 介绍 标记 、 杂 交 、 延 伸 反 应 中 所 用 的 方法 。 杂 交 反 应 经 常 是 在 前 述 的 密封 的 毛 细 管 中 进行 。 不 过 ， 用 了 注释 3 改进 的 办 法 后 ， 操 作 步 又 可 大 为 简化 。 3.1 用 激酶 对 引物 进行 磷酸 化 1 — 在 塑料 微型 离心 管 中 ， 加 1 一 50 pmol SER R (5 ABR LAY), 2 局 10x 激 酶 组 冲 液 ，70 pCi *P-y ATP (3000 Ci/mmol), 10~20 U T4 多 聚 核 苷 酸 激酶 ，DEPC 水 加 至 20 yl. 2) 37C 保温 30 min. 3) 加 4 pl 250 mmol/L EDTA. 4) 通过 G25 葡 聚 糖 凝 胶 柱 离心 除去 未 摊 入 的 标记 核 苷 酸 (参见 注释 4), 5) 用 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 (25:24:1) (v/v) 抽 提 。 6) 加 入 10 pl tRNA (作为 沉淀 的 载体 ) 。 7) 加 1/10 体积 的 3 mol/L 醋酸 钠 ， 加 2 倍 体积 的 100% 乙醇 ， 离心 沉淀 15 min。 用 70% CREE, AAAS. - 100 - 8) Fa DEPC 7K ##& RNA (0.25~2.5 fmol/pl). 3.2 杂交 反应 1) 在 塑料 微型 离心 管 (BEL) 中 加 入 2 ul (0.5~5 fmol) 标记 的 引物 (参见 注释 5)，2 岂 SX 杂 交 缓 冲 液 ，0.1 一 1 fmol 目标 mRNA (总 RNA 可 多 至 20 pg), MM DEPC 水 至 10 pl. 2) 将 上 述 混合 物 移 至 硅化 的 玻璃 毛细 管 中 (参见 注释 3)。 3) 用 煤气 灯 封 住 毛细 管 两 端 ， 在 样品 上 标 上 不 易 氛 掉 的 记号 (如 有 必要 可 标 在 防水 胶 带 上 )。 4) 样品 浸入 70 水 浴 加 热 3 min (B WEF 6). 5) 浸入 最 适 温度 的 水 浴 中 杂交 3 一 6 h (参见 注释 7 一 11)。 3.3 延伸 反应 1) 控 干 毛细 管 ， 用 切割 玻璃 的 刀 切 割 两 端 。 2) 去 掉 毛 细 管 两 端 ， 接 上 吸管 ， 将 杂交 混合 液 转移 至 一 装 有 89 ol 延伸 反应 液 的 微型 离心 管内 (如 必要 ， 可 加 1 工 品 [24940 U] RNasin， 参 见 注释 12)。 3) M1 pl (420 U) AMV 逆转 录 酶 于 每 一 样品 管 中 。 4) 延伸 反应 混合 液 420 保温 1 h (参见 注释 13)。 5) #11 pl 3 mol/L NaOAc, 按 3.1 节 步骤 7， 用 乙醇 沉淀 全 部 核酸 ，70% 乙醇 洗涤 沉 淀 ， 真 空 抽 王 。 6) 在 沉淀 中 加 5 一 10 pl 甲 酰 胺 上 样 染 液 。 7) 907 热 变性 3 min， 置 冰 上 冷却 。 8) 在 合适 百分比 的 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 ， 和 大 小 合适 的 相对 分 子 质 量 标准 或 DNA 测序 阶梯 同时 电泳 。 标记 的 延伸 产物 在 标准 的 尿素 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 〈 胶 浓度 取决 于 引物 至 mRNA 5 端的 距离 )， 使 不 同 帽 位 点 的 转录 物 得 到 很 好 的 分 离 。 这 对 于 转录 起 始点 的 测 定 尤为 重要 ， 对 于 多 起 始点 的 基因 的 定量 测定 也 同样 重要 (参见 注释 14 一 16)。 A. 注 FE (1) REN SERHR (SARL) 是 引物 的 最 方便 的 来 源 。 此 外 ， 引 物 也 可 从 相 应 的 克隆 的 基因 通过 限制 酶 消化 而 获得 。 利 用 一 对 相距 20 一 100 bp 并 产生 不 同 长 度 的 黏 性 末端 的 稀有 酶 切 的 位 点 ， 经 酶 切 后 产生 不 同 长 度 的 一 条 编码 链 和 一 条 非 编码 链 。 对 两 次 切割 位 点 之 间 的 片段 作 放射 性 标记 可 产生 一 个 独一无二 的 末端 标 记 片 段 ， 在 变性 的 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 3 和 放射 自 显影 (9 后 可 以 与 非 编码 链 分 开 。 两 条 链 的 长 度 相差 愈 大 ， 限 制 酶 切 的 片段 愈 小 ， 探 针 的 分 离 也 就 愈 好 。 也 可 ee (2 (3 (4 (S (6 (7 (8 (9 ~~ ~~ YA ~~ — — — 用 一 个 独一无二 的 末端 标记 的 双 链 引物 ， 因 为 RNA-DNA 杂种 分 子 比 DNA-DNA 杂种 分 子 更 加 稳定 (大约 高 SC )。 不 过 用 双 链 引物 时 须要 精确 测定 杂交 温度 ， 这 就 降低 了 这 一 技术 的 效率 。 理想 的 情况 是 引物 应 该 标记 在 $" 端 。 限 制 酶 切片 段 的 5 端 磷酸 必 须 在 激酶 处 理 之 前 先 用 碱 性 磷酸 酯 酶 除去 [4]。 应 该 购买 不 含 末 端 磷酸 基 团 的 守 核 苷 酸 ， 这 样 就 可 省 略 碱 性 磷酸 酯 酶 处 理 了 。 采 用 Maxam 和 Gilbert 方法 测序 时 ，5 端 标 记 就 特别 重要 。 不 过 ， 如 果 仅 仅 用 作对 某 个 mRNA 的 定量 测定 ， 那 么 3 端 标 记 也 是 可 以 的 tk 7 了。 实际 上 ， 应 用 限制 酶 所 产生 的 探 针 可 能 更 为 简单 一 些 ，( 例 如 ， 对 于 产生 . 不 同 大 小 的 链 标 记 可 能 是 重要 的 )。 采 用 均匀 标记 的 (MI13 载体 产生 的 ) 探 针 时 引物 延伸 分 析 法 的 灵敏 度 可 以 得 到 改进 路 7。 杂交 反应 经 常 在 硅化 的 毛细 管 中 进 行 ， 但 这 步 操 作 也 可 以 大 大 简化 为 直接 在 塑料 微型 离心 管 中 进 行 。 重 要 的 是 必须 把 离心 管 全 部 浸没 在 水 浴 中 防止 蒸发 ， 因 为 薰 发 可 使 盐 浓 度 改 变 ， 从 而 影响 杂交 。 必 须 注意 离心 管 一 定 要 封 好 ， 最 好 用 螺 帽 离 心 管 。 延 伸 反 应 于 是 就 可 以 在 同一 管 中 进 行 。 G25 葡 聚 糖 凝 胶 柱 的 制备 : 2 ml 灭 菌 塑料 针 简 的 隆起 的 一 端 用 多 聚 羊 毛 塞 牢 ， 将 浓 的 葡 聚 糖 糊 加 至 针 简 内 ， 将 针 简 放 在 一 只 灭 菌 的 塑料 离心 管内 ， 在 甩 平 转 头 上 离心 min, #1500 rmin， 弃 去 离心 管 及 内 盛 的 缓冲 液 ， 针 简 转 移 到 另 一 洁净 的 离心 管内 。 将 标记 的 引物 加 入 到 柱 的 项 部， 用 50 pl TE 淋 洗 引物 管 ， 一 并 加 到 柱 上 ， 保 证 标记 物 全 部 上 柱 。1500 r/min 离心 S min。 标 记 的 引物 存在 于 洗 脱 液 内 ， 未 挫 入 的 标记 物 则 留 在 柱 的 顶部 。 成 功 的 标记 探 针 在 盖 氏 计数 器 上 测试 时 ， 指针 偏向 满 度 。 如 果 没 有 达到 满 度 ， 则 须 用 50 一 100 pl TE HEHE —K. M1 pl 探 针 作 Cerenkov 计数 测定 比 活 。 探 针 比 活 (SA) BF 2~5~x 109 dpm/pmol 便 不 能 使 用 。 若 将 标记 引物 与 正在 制备 的 待 分 析 的 RNA 先行 混合 ， 可 能 更 方便 一 些 。 引 物 与 RNA 于 是 便 可 以 共 沉 淀 ， 沉 淀 可 悬 于 DEPC 处 理 过 的 水 中 ， 杂交 反应 所 需 的 其 他 成 分 便 可 直接 加 入 此 重新 悬浮 的 沉淀 中 。 引物 和 符 分 析 的 RNA 与 杂交 缓冲 液 混 合 ， 加 热 至 70C 破坏 RNA (或 引物 ) 的 三 级 结构 ， 然 后 再 行 复 性 。 杂交 时 引物 浓度 约 为 互补 的 RNA 摩尔 浓度 的 10 倍 ， 如 果 超过 太 多 (特别 是 当 杂 交 严 格 度 低 于 最 适时 ) 可 以 造成 非特 异性 的 启动 。 杂交 的 最 适 温度 取决 于 引物 的 长 度 及 其 碱 基 组 成 。 计 算 RNA-DNA 杂种 分 子 的 解 链 温度 的 公式 芭 '9 对 于 短 链 的 DNA 引物 是 不 精确 的 。 大 多 数 探 针 的 解 链 温度 在 指 定 的 缓冲 液 中 为 45 一 6ST 。 应 该 用 这 一 范围 内 的 温度 进行 小 规模 的 试验 性 实验 ， 对 专 一 的 引物 - mRNA 的 结合 定 出 最 适 杂 交 温 度 。 监测 杂交 效率 的 一 个 简单 办 法 是 对 RNA -引物 杂种 分 子 做 一 个 修正 的 Sl TTB 定位 实验 (BB+). MMH, RR REA RNA 在 温度 范围 内 进 {TASK 3 一 6 hb， 用 S1 核酸 酶 消化 杂种 分 子 ， 然 后 在 变性 的 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 ， 测定 被 保护 的 〈 杂 交 的 ) 寡 核 苷 酸 量 。 产 生 最 大 量 的 抗 元 S1 核酸 酶 的 标记 引物 的 温 度 应 该 用 作 以 后 正式 的 杂交 反应 温度 。 “awe 。 (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) 或 许 还 须要 对 目标 mRNA 的 用 量 优化 ， 即 通过 用 不 同 量 的 RNA 制备 物 进行 一 个 典型 的 杂交 反应 。 这 里 可 以 用 细胞 质 总 RNA， 不 过 用 polyA* RNA 可 以 得 到 灵敏 度 更 高 和 更 清晰 的 结果 。 杂交 反应 进行 3 一 6 h。 在 高 温 中 RNA 对 热 敏感 〈 但 在 本 实验 的 pH 值 条 件 下 ， 这 一 效应 减弱 )， 因 此 最 适 杂交 温度 高 的 引物 复 性 时 间 愈 短 愈 好 。 核糖 核酸 酶 抑制 剂 RNasin 可 以 用 在 延伸 反应 中 (1 pl, 47 40 U)， 但 在 杂交 反 应 中 效果 较 小 ， 因 为 在 70Y 保温 消除 二 级 结构 以 及 在 高 温 进 行 的 复 性 反应 ， 都 同 样 能 使 RNasin 的 蛋白 质变 性 。 此 外 ，RNasin 的 活性 严格 地 依赖 于 最 低 量 的 1 mmolyL 二 硫 苏 糖 醇 ， 而 二 硫 苏 糖 醇 在 高 温 中 也 不 稳定 。 核 糖 核 苷 - 钒 氧 复合 物 RNase 抑制 剂 (ribonucleoside-vanadyl complex RNase inhibitor) 在 某 些 条 件 下 (在 {RYE BE [1 mmol/L] 的 dNTPs 中 当 抑 制剂 的 量 大 于 2 mmol/L AY) 可 以 降低 延伸 的 效率 。 延伸 反应 在 42° 进行 以 减少 mRNA 的 二 级 结构 的 形成 ， 后 者 可 使 道 转录 过 早 终 nee 引物 离 帽 位 点 愈 远 ， 则 逆转 录 酶 在 RNA 二 级 结构 的 部 位 上 或 在 RNA 降解 〈 例 如 被 RNase 降解 ) 的 部 位 上 过 早 终 止 的 可 能 性 就 愈 大 。 这 些 不 连续 的 “早熟 的 ” 带 使 帽 位 点 信和 号 减弱 。 如 将 引物 的 位 点 移 到 对 延伸 有 强大 阻碍 作用 的 二 级 结构 的 S7 端 处 ， 可 以 改进 帽 位 产物 的 得 率 。 延伸 反应 往往 在 帽 位 邻近 处 形成 不 止 一 条 带 (SILA 19.2 )。 这 可 能 代表 真正 的 转录 多 起 始点 。 此 外 ， 认 为 如 果 mRNA 的 帽 位 上 或 邻接 的 核 苷 酸 上 发 生 甲 基 化 ， 可 使 逆转 录 酶 的 作用 在 一 部 分 分 子 中 过 早 终止 。 在 精确 测定 转录 起 始点 时 ， 这 些 影响 都 应 加 以 考虑 。 在 不 同型 的 转 染 细胞 中 的 几 种 帽 位 点 条 带 之 间 的 比例 有 所 不 同 ， 但 对 一 定 来 源 的 mRNA 则 保持 恒定 不 变 。 额外 的 条 带 可 以 由 于 逆转 录 酶 催化 的 CDNA 回 折合 成 所 造成 ， 尽 管 在 延伸 缓冲 液 中 已 经 加 入 的 放 线 菌 素 D 应 该 减弱 这 一 活性 。 焦 磷酸 钠 (80 mmol/L) 似乎 效果 更 好 ， 但 它 对 某 些 来 源 的 逆转 录 酶 可 能 有 抑制 作用 。 引 物 与 组 织 培养 细胞 的 内 源 性 RNA 或 与 载体 tRNA 之 间 的 交叉 杂交 有 时 可 以 导致 出 现 假 带 。 从 不 表达 该 基因 的 细胞 中 分 离 RNA 做 引物 延伸 反应 作为 对 照 ， 就 可 以 鉴定 出 这 些 假 带 。 参考 文 献 — . Blumberg, D. (1987) Creating a ribonuclease-free environment, in Methods in Enzymology, vol. 152 (Berger, S. L. and Kimmel, A. R., eds.), Academic, London, New York, pp. 20—24. . Richardson, C. C. (1965) Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage infected E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54, 158-165. . Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavages, in Methods in Enzymology, vol. 65 (Grossman, L. and Moldave, K., eds.), Academic, London, New York, pp. 499-560. N Ww > MB 4. a ge Arrand, J. E. (1985) Preparation of nucleic acid probes, in Nucleic Acid Hybridiza- tion—A Practical Approach (Hames, B. D. and Higgins, S. J.), IRL, Oxford, Wash- ington, DC, pp. 139-160. . Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564. Boffey, S. (1987) Autoradiography and fluorography, in Techniques in Molecular Biology, vol. 2 (Walker, J. M. and Gaastra, W., eds.), Croom and Helm, London, Sydney, pp. 288-295. Tsang, A. S., Mahbubani, H., and Williams, J. G. (1982) Cell-type-specific actin mRNA populations in dictyostelium discoideum. Cel/ 31, 375—382. Schildkraut, C. and Lifson, S. (1965) Dependence of the melting temperature of DNA upon salt concentration. Biopolymers 3, 195-208. Britten, R. J. and Davidson, E. H. (1985) Hybridization strategy, in Nucleic Acid Hybridization—A Practical Approach (Hames, B. D. and Higgins, S. J., eds.), IRL, Oxford, Washington, DC, pp. 3 一 15. - 104 。 第 二 十 章 “ 应 用 单 链 DNA 探 针 的 S1 定位 法 Stéphane Viville, Roberto Mantovani Ul 1. 引 S1 核酸 酶 是 一 种 内 切 核 酸 酶 ， 从 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae) 分 离 得 到 。 它 能 降 解 单 链 核酸 ， 但 不 能 降解 双 链 核酸 。 此 外 ， 它 能 降解 局 部 错 配 的 双 链 分 子 。 灵 敏 度 如 此 之 高 ， 即 使 只 有 一 对 碱 基 的 错 配 ， 也 能 被 切割 而 被 检测 出 来 。 在 实际 工作 中 ， 先 将 末端 标记 的 双 链 DNA 探 针 变性 ， 再 与 互补 的 RNA 分 子 进行 杂交 。S1 被 用 来 识别 和 切割 错 配 或 未 复 性 的 区 域 。 切 割 产物 在 变性 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 分 析 。 根 据 Sl 核酸 酶 的 这 一 性 质 ， 已 有 多 种 应 用 S1 核酸 酶 分 析 mRNA 的 方法 问世 已 2。 在 同一 实验 中 可 以 获得 定 性 和 定量 的 资料 6]。 定性 方面 ， 可 以 测定 mRNA 的 起 始 位 点 ， 可 以 建立 某 一 基因 的 内 含 子 / 外 显 子 图 谱 (参考 文献 史 和 图 20.1)， 以 及 定 出 polyA 的 位 置 。 定 量 方面 ， 可 以 用 来 研究 基因 调控 ， 人 的 实验 ， 如 研究 Ea SAARI”. oo. OS 杂交 eee DONA P a 3000 Ci mmol). SiHMRRAR (参见 注释 1): WRK, WEA 10 pmol/pl, -20CKhF. PNK (polynucleotide kinase): 多 核 苷 酸 激酶 ， 贮 存 液 浓度 为 10 U/ul, - 200K 存 。 10 x 复 性 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100 mmol/L MgCl, 500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L DDT (二 硫 苏 糖 醇 )。 DNA 模板 : 1 mg/ml (人 参见 注释 2)。 10 x dNTP 混合 物 : 5 mmol/L dATP, 5 mmol/L dCTP, 5 mmol/L dGTP, 5 mmol/L dTTP. Klenow 片段 : 大 肠 杆 菌 DNARGBINKAER, RHA 10 U/pl, -—20CKF. 合适 的 限制 性 内 切 酶 (人 参见 注释 3)。 6% 聚 丙烯 酰胺 /8 mol/L 尿素 溶液 ( 溶 于 0.5SxTBE) 及 甲 酰胺 染料 (参见 第 四 十 八 章 )。 X 射 线 胶 片 : 需 具 有 合适 的 灵敏 度 (如 Kodak XAR). 洗 脱 缓冲 液 : 50 mmol/L Tris-HCI、pH 7.5，0.5 mmol/L EDTA. 3 mol/L BARREN, pH 7.4。 tRNA: 10 mg/ml CAR, AF -20T. 2.2 杂交 和 S1 分 析 4Xx 杂 交 缓 冲 液 : 1.6 mol/L NaCl, 40 mmol/L PIPES [ 哌 暑 -N，N'- 双 (2 - 乙 磺 酸 )]，pH 6.4。 去 离子 甲 酰胺 。 A BYE S1 缓冲 液 : 300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L BARN, pH 4.5, 4.5 mmol/L MRE. S1 酶 : 贮存 液 浓度 为 10 U/l, -20CKh#F. S1 终止 缓冲 液 : 2.5 mol/L MRR, 50 mmol/L EDTA. 异 丙 醇 。 - Dn * 1) 之 3 ~~ 4 ~~ 5 To 6 Na 7 ~~ 8 9 ~~ — ol 2 — 3 al ce oT 法 3.1 从 单 链 DNA 模板 制备 单 链 DNA 探 针 SCRE HO RIC: WL 1 pl ER CHAAR, 10 pl [2P] -y-ATP, 2 pl 10 X AGEN, 6 ul dH,O, 1 pl SRA RMBHEA, F37C 保温 45 min U pics 核 苷 酸 探 针 ，9SC 、2 mn WN KISKARBE. 加 入 2 pl AEE DNA 模板 ，4 pl 10 x 复 性 缓冲 液 ，14 pl HO， 依 次 在 65C、10 min, 55. 10 min, 37C, 10 min i. . MA 4 pl dNTP 混合 物 ，1 pl Klenow 片段 ， 室 温 作 用 10 min 后 于 65CT. 15 min K 活 Klenow 片段 。 加 入 适量 的 NaCl 或 通过 稀释 校正 混合 物 的 浓度 。 加 入 20 U Pei Cs amy 37 CH 温 60 min (参见 注释 3)。 加 入 2 pl tRNA JCEM, 0.1 倍 体积 的 3 mol/L 醋酸 钠 ，3 倍 体积 的 乙醇 。 置 于 干冰 中 10 min, 12 000 g 离心 1$ min 沉淀 样品 。 加 入 20 pl 甲 酰胺 染料 重 悬 沉淀 ， 于 OSC HAS ming LFF 6% RAM BE RAGE 胶 上 ， 电 泳 直至 溴 酚 蓝 达到 凝 胶 底 端 。 BEBO X 射线 感光 片 曝 光 5 min， 定 出 单 链 DNA 片段 的 位 置 。 切 下 相应 的 条 带 ， 置 于 500 由 洗 脱 缓冲 液 中 过 夜 。 加 入 50 pl BARA, 20 pg tRNA, 1 ml 乙醇 。 置 于 - 20C 中 2 h，12 000g 离心 20 min. 将 沉淀 作 放 射 性 活性 计数 后 重 悬 于 甲 酰胺 中 ( 按 105 cpm/pl), WEF - 200. WR 针 即 可 用 于 杂交 和 S1 分 析 。 3.2 MU DNA 模板 制备 单 链 DNA 探 针 除 下 列 步骤 外 ( 见 图 20.2B)， 其 余 步 又 均 同 3.1 节 。 先 用 所 选 的 限制 性 内 切 酶 切割 双 链 质粒 (20 wg)， 沉 淀 并 重 悬 于 水 中 ， 演 度 为 1 mg/ml. 复 性 步骤 (3.1 节 步 又 2) 须 快速 进行 。 加 热 灭 活 多 核 童 酸 激酶 后 加 入 2 一 5 pe BEET 的 质粒 ，4 pl 10x 复 性 缓冲 液 ，14 wl 7K. 95°C 保温 5 min， 立 即 置 于 冰 水 中 ， 然 后 按 步骤 3 进行 。 省 去 限制 性 酶 切 (第 4 步 )。 3.3 杂交 和 S1 分 析 于 0.5 ml Eppendorf 管 中 加 入 10 pl 探 针 ( 共 10 000 cpm), 5 ul 4x AACR, 5 yl RNAC& poly AT RNA 或 离 体 合 成 的 )，20 pl 4 BE at (以 防止 蒸发 )。 于 37C 保温 - ive 4 一 16 h (人 参见 注释 4)。 2) 加 200 pl S1 缓冲 液 ( 含 S1 核 酸 酶 100 U)， 充 分 混 匀 ， 置 37 人 中 5 一 30 min (参见 注 FES). MA 50 pl Sl 终止 缓冲 液 终止 反应 ， 并 加 入 40 pe tRNA, 300 pL RAR. 于 干冰 中 15 min, 12 000 g 离心 1$ min. 3) 用 80% 乙 醇 洗 沉淀 物 ， 并 晾 干 。 将 沉淀 物 重 悬 于 3 ol 甲 酰 胺 染料 中 ，9SY 加 热 Smin, LF 6% RAMRR/ RARE, Hk PRM RAD Rem, KER 曝光 8 一 48 h (SILA 20.3). 20.3 S1 分 析 的 时 间 过 程 。 离 体 合 成 的 RNA 与 Ea 探 针 杂交 后 置 于 37C， 与 100 U 的 SI 核酸 酶 一 起 保温 ， 时 间 如 图 中 所 示 。 (1) FRFREEMYA 20~25 个 核 苷 酸 ， 并 应 与 所 分 析 的 DNA 互补 。 (2) 单 链 或 双 链 DNA 模板 均 按 标准 方法 制备 。 与 从 双 链 DNA 模板 制备 探 针 相 比 ， 用 单 链 DNA 模板 制备 探 针 的 优点 主要 是 探 针 的 得 率 更 高 ， 用 单 链 模板 制备 时 比 活 可 1K 1x 10°~1.5X10° cpm， 而 用 双 链 模板 的 预期 值 为 4x105 一 6Xx105 cpm. (3) 为 提高 片段 的 回收 率 ， 限 制 性 内 切 酶 应 于 朝 核 苷 酸 杂 交 处 3" 端 200 一 600 HK TF BR "1 109 。 的 位 置 上 进行 酶 切 ， 更 长 的 片段 难于 从 丙 聚 酰胺 胶 中 回收 。 如 果 所 用 的 限制 性 内 切 酶 切割 DNA 模板 不 止 一 个 位 点 ， 只 要 它们 位 于 探 针 序列 以 外 ， 就 没有 妨碍 (4) 所 分 析 的 RNA 种 类 不 同 ， 杂 交 时 间 亦 不 同 。 若 用 细胞 质 总 RNA 或 polyA” RNA, 样品 应 于 37 民 至 少 杂 交 12 hs 而 用 离 体 转录 的 RNA 则 杂交 2 一 4 h 已 足够 。 (5) 分 析 离 体 转录 的 RNA Bt, SL 核酸 酶 作用 时 间 选 择 须 按 图 20.3 中 一 样 进行 ， 这 样 可 以 决定 将 所 有 的 单 链 核酸 ， 包 括 游离 的 探 针 ， 均 被 完全 消化 所 需 的 条 件 。 分 析 细 胞 质 总 RNA BK poly A* RNA 时 ，S1 核酸 酶 的 最 佳 消化 时 间 为 30 min， 往 往 比 消 化 离 体 转录 的 RNA 所 需 的 时 间 (15 min) 要 长 一 些 。 eX 献 . Berk, A. J. and Sharp, P. A. (1977) Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of S1 endonuclease digested hybrids. Cell 12, 721—732. 2. Favaloro, J., Treisman, R., and Kamen, R. (1980) Transcription maps of polyoma virus-specific RNA: analysis by two-dimensional nuclease S1 gel mapping. Meth. Enzymol. 65, 718-749. 3. Weaver, R. F. and Weissmann, C. (1979) Mapping of RNA by a modification of Berk-Sharp procedure: the 5' termini of 15 S B-gilobin mRNA precursor and mature 10 S b-globin mRNA have identical map coordinates. Nucleic Acids Res. 7, 1175-1193. 4. Lopata, M. A., Sollner-Webb, B., and Cleveland, D. W. (1985) Surprising S1- resistant trimolecular hybrids: potential complication in interpretation of S1 map- ping analysis. Mol. Cell. Biol. 5, 2842-2846. 5. Viville, S., Jongeneel, V., Koch, W., Mantovani, R., Benoist, C., and Mathis, D. (1991) The Ea promoter: a linker-scanning analysis. J. Immunol. 146, 3211—3217. 6. Dean, M. (1987) Determining the hybridization temperature for S1 nuclease map- ping. Nucleic Acids Res. 15, 6754. 一 e 第 二 十 一 童 ” 细 胞 及 组 织 的 非 放射 性 VR DL AS AS Ian Durrant 和 Ul 引 原 位 杂交 (in situ hybridization, ISH) 是 一 项 广泛 应 用 的 技术 。 它 在 许多 方面 都 十 分 有 用 ， 如 用 于 诊断 病毒 感染 0 、 染 色 体 分 析 呈 及 mRNA 分 析 B1。 研 究 人 员 传 统 上 使 用 放射 性 物质 制备 用 于 ISH 的 探 针 [。 这 些 探 针 可 以 是 标记 的 DNA, RNA RK. RNA 及 守 核 苷 酸 探 针 是 最 为 常用 的 ， 因 为 用 于 ISH 时 具有 许多 优点 (参见 表 21.1)。 探 针 类 型 RNA 探 针 PE BRET DNA 探 针 表 21.1 用 于 原 位 杂交 的 各 类 探 针 的 特点 优点 Rm 点 RNA 杂种 分 子 很 稳定 须 进行 亚 克 隆 单 链 可 能 被 RNase 降解 不 含 载体 序列 杂交 条 件 严格 对 照 容易 设置 低 本 底 灵敏 度 高 单 链 标记 水 平 低 特异 性 高 须 优 化 序列 易 接 近 靶 序列 可 能 需要 多 种 探 针 混 合 稳定 易于 大 量 制备 不 须 亚 克 隆 探 针 须 变性 标记 方法 容易 、 可 靠 杂交 反应 中 探 针 再 次 复 性 杂交 条 件 较 不 严格 难以 除去 载体 序列 特别 是 由 于 这 些 探 针 都 是 单 链 ， 可 提供 更 高 的 灵敏 度 (RNA) 和 更 高 的 特异 性 ( 守 核 苷 酸 )。 近 来 ， 非 放射 性 探 针 愈 来 愈 常用 ， 它 们 亦 具 有 同样 的 特点 。 这 一 章 中 ， 通 过 用 RNA 探 针 检测 组 织 切片 中 mRNA 为 例 ， 来 说 明 ISH 的 过 程 ， 但 这 一 系统 同样 可 用 于 细 胞 株 或 用 于 DNA 的 检测 。 此 外 ， 这 里 所 氢 述 的 原 位 检测 方案 对 RNA、DNA BK SER 酸 探 针 均 可 应 用 。 用 于 分 析 染 色 体 和 细胞 核 的 操作 步骤 显然 不 同 于 应 用 非 放 射 性 DNA 探 针 或 荧光 检测 。 1.1 探 针 标记 用 非 放射 性 物质 标记 核酸 探 针 由 来 已 久 ， 非 放射 性 物质 主要 有 生物 素 ""J 和 地 高 “aaa * ae(7) (fist — 7 Te EE dUTP 或 UTP 的 碱 基 上 。 不 过 ， 杂 交 本 底 可 能 较 高 ， 尤 其 当 用 生物 素 标记 的 探 针 时 ， 由 于 许多 生物 体内 存在 高 水 平 的 内 源 性 生物 素 和 生 物 素 结合 位 点 。 近年 来 所 采用 的 荧光 素 是 另 一 种 标记 物 [&1。 生 物体 内 不 含 这 一 化 合 物 ， 并 且 它 能 高 效 地 摊 入 到 核酸 探 针 中 ， 同 时 又 可 得 到 高 度 特异 性 、 高 亲和力 的 抗体 ， 所 以 ISH 的 本 底 较 低 。 各 种 类 型 的 探 针 制备 如 下 : @ DNA 探 针 ， 通过 随机 引物 标记 法 挫 入 荧光 素 标记 的 dUTP 制备 DNA 探 针 。 这 一 反应 在 第 八 章 中 已 有 详细 叙述 。 荧 光 素 标记 的 dUTP 亦 可 通过 切口 平移 法 ] 和 PCR 反应 挫 入 DNA FRET, © 诊 核 苷 酸 探 针 : 于 守 核 苷 酸 3 端 加 上 一 段 由 荧光 素 标记 的 dUTP 短 尾 便 成 探 针 。 这 一 反应 在 第 十 一 章 中 已 有 详 述 ， 或 可 参阅 文献 11。 反应 产生 的 短 尾 可 使 探 针 具有 较 高 的 灵敏 度 而 又 不 影响 杂交 的 严格 性 。 @ RNA tit: 通过 使 用 RNA 聚合 酶 和 含有 对 此 聚合 酶 专 一 性 的 启动 子 构建 成 的 质粒 〈 或 其 他 合适 的 载体 ) 来 制备 RNA 探 针 。 这 一 质粒 作为 模板 ， 以 双 链 的 形 式 供应 ， 聚 合 酶 仅 能 对 其 中 的 一 条 链 进行 转 录 而 产生 单 链 RNA (图 21.1)。 如 果 使 用 的 质粒 在 克隆 的 模板 序列 的 两 条 链 上 均 带 有 启动 子 ， 由 此 产生 的 反 义 链 探 针 可 与 mRNA 杂交 ， 而 有 义 链 探 针 不 应 显示 杂交 信号 ， 故 可 作为 对 照 ， 从 而 证 明 杂 交 过 程 的 专 一 性 。 模板 序列 限制 酶 切 位 点 2 Vv 限制 酶 切 位 点 1 RMA 聚 合 酶 启动 子 1 pe RNA 聚 合 酶 启动 子 2 切 在 位 点 1 上 切 在 位 点 2 上 质粒 > 有 义 链 启动 了 2 T x 启动 子 1 RYE “~K-— eee ys PRE 使 荣光 素 —UTP 入 的 RNA 转 录 反 应 41 反 义 链 图 21.1 RNA 转录 探 针 标记 反应 示意 图 。 通 过 使 用 带 有 双 启 动 子 的 载体 产生 有 义 链 探 针 〈 阴 性 ) 和 反 义 链 探 针 ( 阳 性 ) 。 * tae * 有 三 种 常用 的 RNA RABE, ESE A T3、T7 和 SP6 中 分 离 得 来 02]。 三 种 RNA 聚合 酶 的 启动 子 序列 都 彼此 不 同 ， 从 而 使 每 一 种 酶 的 转录 反应 具有 专 一 性 。 整 个 标记 反应 简单 易 行 、 可 靠 ， 惟 一 须 注 意 的 是 使 反应 混合 物 与 外 源 RNase 的 接触 减少 到 最 低 程 度 。 建 议 使 用 灭 菌 的 吸 嘴 、 反 应 管 和 溶液 ， 并 戴 防 护 手 套 。 这 一 标记 反应 最 初 用 于 放射 性 标记 探 针 的 标记 ， 现 已 被 采用 于 非 放 射 性 标记 探 针 的 制备 。 修 改 后 的 反应 是 很 高 效 的 ， 可 使 荧光 标记 的 核 苷 酸 挫 入 率 及 探 针 的 得 率 均 有 明显 的 提高 ( 见 表 21.2)。 表 21.2 用 不 同 的 聚合 酶 制备 莞 光 素 标记 的 RNA 探 针 的 得 率 得 /pe, RABKA 载体 /转录 物 片段 大 小 /kb SP6 T7 T3 pAM19/- SS 4.5 pAM19/lysozyme 0.27 4.5 2.5 pAM18/Nras 0.5 Se 12 pSP65/Nras i Ws 3.0 pAM18/ Actin 1.8 1.8 pSP64/POMC 1.4 4.0 pSP65/POMC 1.4 4.0 pGEM/- 4.0 4.5 y ey 6.2 平均 得 率 3.9 2.4 6.2 1.2 原 位 杂交 与 进行 膜 杂 交 相 比 ， 原 位 杂交 在 技术 上 并 无 多 大 的 不 同 。 用 于 膜 杂 交 的 动力 学 及 理 论 5] 均 适用 于 ISH. ISH 与 膜 杂 交 最 大 的 不 同 之 处 在 于 进行 杂交 之 前 对 样品 的 制备 过 程 及 预 处 理 有 一 些 特殊 的 要 求 :425 。 每 一 杂交 系统 中 ， 各 种 条 件 均 须 优 化 ， 因 为 处 理 的 成 败 取决 于 固定 、 固 定 剂 、 组 织 类 型 、 探 针 类 型 、 甚 至 标记 物 ( 放 射 性 的 或 非 放 射 性 的 )。 为 使 ISH 顺利 进行 ， 所 花 的 时 间 是 值得 的 ， 对 非 放射 性 方法 可 能 尤其 重要 。 虽 然 应 用 非 放 射 性 系统 一 般 也 能 得 到 较 好 的 分 离 效果 ， 但 毕竟 非 放 射 性 ISH 的 灵敏 度 无 法 与 放射 性 ISH 相 比 。 另 外 ， 从 总 体 上 讲 ， 非 放射 性 ISH 可 能 更 为 娇嫩 ， 所 有 的 步骤 似 和 卑 都 需要 精确 的 优化 和 准确 的 操作 。ISH 的 灵敏 度 取 决 于 这 样 一 些 因 素 ， 包 括 固定 、 预 处 理 、 探 针 的 标记 、 检 测 以 及 杂交 。 以 上 几 点 ， 随 同 这 些 系统 中 预 杂交 的 优化 、 有 效 的 标记 、 高 亲和力 、 专 一 性 的 抗体 检测 等 条 件 的 优化 以 及 通过 一 个 杂交 缓冲 液 的 设计 而 体 现 。 2. 材 料 DNA 探 针 及 寡 核 苷 酸 探 针 的 标记 另 有 叙述 。 以 下 介绍 的 标记 方法 用 于 荧光 素 标 记 的 RNA 探 针 的 制备 。 其 他 有 关 步 又 如 样品 的 处 理 、 对 照 的 设 定 、 杂 交 及 信和 号 的 检测 ， 同样 适用 于 三 种 类 型 探 针 。 在 ISH 实验 中 以 及 后 续 的 检测 中 ， 用 荧光 素 标记 的 核 苷 酸 - 113 > 对 DNA, RNA 或 寡 核 苷 酸 进行 标记 时 ， 所 需 的 各 种 试剂 Amersham 公司 都 以 试剂 盒 的 形式 整套 供应 ， 如 DNA, RNAURERRES (目录 编号 分 别 为 RPN3200，3300， 3400。Amersham International, Amersham, UK)"617] 2.1 探 针 标记 1) 转录 缓冲 液 ， 200 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 30 mmol/L MgCh, 10 mmol/L WF He, 0.5% (w/v) BSA(4- ILI AEA). 2) 人 胎盘 核糖 核酸 酶 抑制 剂 (human placental ribonuclease inhibitor, HPRI): 20 U/pl. 3) 0.2 mmol/L DTT: 新 鲜 配 制 ， 过 滤 除 菌 。 4) 线性 DNA 模板 : 通常 0.5 一 1 pe/pl. 5) SP6、T7 或 T3 RNA 聚合 酶 都 可 购 得 ， 如 Amersham International( Amersham, UK) 有 售 。 6) 核 苷 酸 溶液 : 1.25 mmol/L ATP, 1.25 mmol/L GTP, 1.25 mmol/L CTP, 0.312 mmol/L UTP, 0.312 mmol/L 荧光 素 -11 - UTP (可 从 Amersham 购 得 )。 溶 于 灭 菌 水 (参见 注释 1)。 2.2 探 针 标记 后 的 纯化 和 加 工 1) 无 RNase 的 DNase I: (Amersham E2210) 用 灭 菌 水 新 鲜 配 制 ， 稀 释 至 10 U/80pL. 2) 0.4 mol/L NaHCO;， 高 压 灭 菌 。 3) 0.6 mol/L NazCO3， 高 压 灭 菌 。 4) KER. 5) 3 mol/L 醋酸 钠 、pH $.2， 高 压 灭 菌 。 6) 10 mg/ml 酵母 tRNA: 例如 Sigma(St. Louis, MO)R8759. 2.3 杂交 与 严格 洗涤 1) 杂交 缓冲 液 : 可 用 标准 杂交 缓冲 液 (参见 注释 2)。 这 里 推荐 一 种 优化 缓冲 液 成 品 ， 可 从 Amersham 购 得 。 缓 冲 液 由 以 下 成 分 组 成 ， 4xSSC，600 pg/ml 鲁 鱼 奎 丸 DNA, 2XDenhardt 氏 溶液 。 此 杂交 缓冲 液 还 含有 一 种 用 于 提高 杂交 效率 的 专利 化 合 物 ， 在 使 用 前 ， 这 一 缓冲 液 须 用 去 离子 甲 酰胺 按 1:1 稀释 ， 稀 释 后 的 溶液 可 贮存 于 ~20C 。 2) 20xSSC 凡 存 液 : 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 三 钠 、pH 7.0。 3) 10%(w/v)SDS。 2.4 封闭 、 抗 体 保温 和 洗涤 1) TBS: 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 400 mmol/L NaCl. 2) 封闭 缓冲 液 : 0.5% (w/v) st AFI (RPN3023. Amersham International), ¥ TBS. * 114 - 3) PLRIER-PKE BSR BAA GD: 可 从 Amersham 购 得 。 2.5 & il 1) 检测 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 9.5, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl. 2) NBT ¥#¥K: 50 mg/ml 硝 基 兰 四 唑 (nitroblue tetrazolium, NBT) 溶 于 二 甲 基 甲 酰胺 。 3) BCIP WK: 75 mg/ml 溴 - 毛 - 叫 唆 磷 酸 (bromo-chloro-indolyl phosphate, BCIP ) 溶 于 70% (v/v) 二 甲 基 甲 酰胺 。 at 法 3.1 探 针 标记 1) 室温 下 于 1.5 ml 微量 离心 管 中 依 次 加 入 下 列 试剂 〈 人 参见 注释 3): 4 pl 转录 缓冲 液 ， 1 pl 0.2 mol/L DTT, 20 U HPRI, 8 pl 核 苷 酸 溶液 ，1 pg 线性 DNA 模板 ，25 U RNA 聚合 酶 ， 加 水 使 终 体 积 为 20 pl, LFRERK, BRIRD. 至 少 保温 2 h。 不 同 的 RNA 聚合 酶 的 保温 温度 不 同 ，SP6 为 40 TC, T3 和 T7 均 为 how 标记 的 RNA REC AF -20C (BME 4). 2 Ye 3 4 3.2 标记 探 针 的 纯化 及 加 工 1) 于 RNA 探 针 混合 液 中 加 入 10 U 无 RNase 的 DNaseI( 人 参见 注释 5),377 保温 10 min. 2) 加 入 20 pl 0.4 mol/L NaHCO;, 20 pl 0.6 mol/L NazCO3，60 岂 灭 菌 水 。 轻 轻 混 匀 ， 于 607 保温 进行 碱 水 解 。 保 温 时 间 依 转录 物 的 长 度 及 所 需 探 针 的 大 小 而 定 (参见 注 FE 6)。 加 入 1.3 同 冰 醋酸 ，20 pl 3 mol/L MARA, pH 5.2, 2 pl 10 mg/ml 酵母 tRNA， 500 pI. F-20C BORE 2 h 以 沉淀 RNA. 4) 于 微型 离心 机 上 用 最 高 速度 离心 15 min 沉淀 RNA。 弃 上 清 液 。 5) 用 70% 乙 醇 淋 洗 沉 证 ， 保 持 -207 离心 S min, FEM. 6) 用 灭 菌 水 溶解 RNA 探 针 ， 并 调整 RNA 探 针 浓度 为 杂交 所 需 浓 度 的 10 一 20 倍 。 于 —20C RFF. 3 A 3.3 组 织 及 细胞 的 预 处理 对 于 任何 ISH 实验 ， 为 取得 成 功 的 结果 ， 此 步 最 为 重要 (参见 注释 7)。 每 一 个 杂交 系统 ， 均 需要 它 自 己 的 最 佳 预 处 理 方案 。 预 处 理 的 设计 根据 这 样 一 个 原则 : 使 探 针 与 搞 体 的 结合 物 便于 接触 到 靶 分 子 ， 又 能 使 组 织 保持 原 有 的 形态 结构 ， 并 使 靶 分 子 保持 它 原 + BS 有 的 位 置 。 另 外 ， 预 处 理 方案 还 可 用 于 设置 ISH 所 必需 的 一 些 对 照 实验 ( 参 见 注 8 和 图 21.2)。 图 21.2 大 鼠 垂体 中 的 鸦片 样 肽 - 促 黑 激素 - 促 皮 质 激素 原 mRNA 的 原 位 杂交 检 测 。 冰 冻 新 鲜 的 大 鼠 垂体 用 冰冻 切片 机 切片 后 置 于 VectaBond (Vector Labs) 包 被 的 玻 片 上 。 探 针 标 记 、 杂 交 和 检测 方法 已 于 正文 中 详 述 。(A) 用 反 义 链 探 针 进 行 杂交 。(B) 用 有 义 链 探 针 进行 杂交 。 3.4 杂交 和 严格 性 洗涤 杂交 的 严格 性 的 控制 可 通过 杂交 步骤 中 的 温度 、 盐 浓度 和 甲 酰 胺 的 浓度 来 控制 。 但 是 更 方便 的 控制 是 将 这 些 参数 应 用 到 杂交 后 的 严格 洗涤 上 。 1) 杂交 缓冲 液 于 37C 预 热 5 min， 按 1:1 比例 用 去 离子 甲 酰 胺 稀释 ， 充 分 混 匀 。 2) 于 杂交 缓冲 液 中 加 入 所 需 量 经 55°C 预 热 的 探 针 。300 一 600 ng/ml 的 探 针 浓 度 适 用 于 7 iG. * 大 多 数 杂 交 ( 人 参见 注释 9)。 3) 用 适当 体积 的 杂交 缓冲 液 / 探 针 混 合 物 覆 盖 切 片 〈 人 参见 注释 10)。 4) 将 切片 放 在 9SC 的 电热 板 上 ， 放 置 3 一 6 ming RIND RRR HK (SRE iry: 5) ROA FIRBHEa+, RARE WH E5SC) RNA AR (人 参见 注释 12)。 6) 按 所 需 的 严格 程度 洗涤 玻 片 。 典 型 的 洗涤 程序 包括 : 1X SSC. 0.1% (v/v) SDS 于 室温 洗 两 次 ， 每 次 S min; 0.2 x SSC、0.1% (v/v) SDS 于 SSY 洗 两 次 ， 每 次 10 min. 7) 为 降低 本 底 ， 可 用 RNase A 对 RNA 探 针 进一步 处 理 。 此 步 仅 仅 除 去 未 杂交 的 单 链 Ret. AARON: BAF 2x SSC 中 淋 洗 2 min 后 ， 于 预 热 的 2xSSC 液 ( 含 RNase A 10 pg/ml) 37°C 保温 20 一 30 min。 在 进行 下 一 步骤 之 前 ， 于 2X SSC 中 淋 洗 玻 片 。 3.5 Eth, MARR AER EWU TAA il PH RERBROR, PRR RAHA, SPR PT. HER: 此 处 所 用 的 TBS 比 标准 TBS 所 含 的 盐 浓度 更 高 。 1) BHF TBS 中 洗 5 min, 2) 置 玻 片 于 封闭 溶液 (0.5% [w/v], HARA TBS) 中 保温 1 h。 3) 于 TBS 中 淋 洗 玻 片 1 min， 沥 干 玻 片 上 的 缓冲 液 ， 如 有 必要 ， 了 吸 干 每 张 玻 片 表面 切 片 周 围 的 液体 。 4) 按 1:1000 比例 ， 用 含 0.5% (w/v) BSA 组 分 V 的 TBS 稀释 抗体 (参见 注释 14)。 用 抗体 溶液 覆盖 玻 片 (每 张 玻 片 通常 用 100 pl), EPR 1 h。 5) RAF TBS 中 洗 三 次 ， 每 次 $ min。 3.6 检 iil) 1) 玻 片 于 检测 缓冲 液 中 洗 S min， 沥 干 每 一 张 玻 片 上 的 液体 ， 如 有 必要 ， 吸 干 玻 片 表 面 切片 周围 的 液体 (BS LIE RE 15). 2) 取 45 ANBT 贮 存 液 和 35 pl BCIP 贮存 液 加 至 10 ml 检测 缓冲 液 中 。 每 张 切片 加 500 检测 试剂 ， 置 于 暗 处 显 色 4 一 24 h (参见 注释 16)。 3) 用 蒸馏 水 淋 洗 玻 片 两 次 ， 每 次 2 min。 4) 如 需要 ， 进 行 复 染 。 加 上 封 片 剂 ， 并 盖 上 盖 玻 片 〈 参 见 注 释 17)。 5) 于 光学 显微镜 下 观察 结果 (参见 注释 18)。 457 注 yes (1) 亦 可 用 半 抗 原 标记 的 核 苷 酸 ， 如 生物 素 - UTP(Sigma B8280)、 地 高 辛 - UTP (Boehringer 1209 2$6)。 反 应 混合 物 中 CTP. GTP. ATP 的 终 浓 度 为 0.5 一 7 (2 ~ (3) (4) (5 (6 ~~ (7 (8) 1 wmal/L 标记 及 未 标记 的 UTP 总 的 终 浓度 应 为 0.25 一 1 mmoML。 根 据 标 记 物 的 不 同 ， 优 化 反应 体系 中 各 种 核 苷 酸 的 比例 可 能 提高 RNA 探 针 的 得 率 。 Amersham 提供 的 杂交 缓冲 液 是 2x 的 贮存 液 ， 须 用 去 离子 甲 酰胺 按 1:1 的 比例 称 释 。 杂 交 缓 冲 液 的 工作 溶液 的 标准 配方 应 包括 下 列 成 分 的 最 佳 组 合 ”: 2 一 4x SSC.1 一 5xDenhardt 氏 溶液 、 非 特异 性 DNA、 非 特异 性 RNA、 25% 一 50% 去 离子 甲 酰胺 、5% ~ 10% 硫酸 葡 聚 糖 。 为 防止 反应 缓冲 液 中 的 亚 精 胺 使 模板 DNA 发 生 沉 淀 ， 标 记 反 应 在 室温 进行 。 用 非 放 射 性 标记 物 标 记 探 针 时 ， 通 常 难以 监测 探 针 的 得 率 。 若 用 荧光 素 作为 标记 物 时 ， 根 据 荧光 素 的 特性 09]， 仍 有 可 能 设计 一 简便 而 快速 的 方法 指示 探 针 已 经 开 始 合成 并 估算 其 产 率 (参见 第 九 章 )。 这 一 试验 应 从 体外 转录 混合 物 中 取出 的 一 小 部 分 上 进行 。 转 录 物 的 进一步 加 工 ， 尤 其 是 碱 消化 可 能 减少 标记 物 的 荧光 性 ， 但 这 并 不 影响 其 抗原 性 。 这 一 点 是 很 重要 的 ， 因 为 检测 系统 是 根据 对 于 抗 荧光 素 抗 体 的 识别 。 当 使 用 荧光 素 标记 的 RNA 探 针 时 ， 只 要 转录 物 大 小 对 原 位 杂交 已 经 合适 ， 就 没 有 必要 对 探 针 进一步 纯化 。 在 这 一 杂交 系统 中 ， 未 摊 入 的 核 苷 酸 对 本 底 并 无 任何 重要 的 影响 。 但 是 通过 酶 切 去 除 模板 DNA 对 杂交 仍然 有 利 。 如 果 不 须 做 碱 水 解 ， 那么 在 此 步骤 后 ， 探 针 可 用 乙醇 沉淀 。 如 果 须 要 碱 水 解 ， 菊 光标 记 物 的 存在 并 不 干扰 碱 水 解 。 经 碱 水 解 后 大 部 分 未 挫 入 的 核 苷 酸 亦 被 清除 ， 但 这 并 不 是 碱 水 解 的 主要 目的 。 初 级 转录 产物 的 有 限 碱 水 解 所 需 时 间 按 以 下 公式 计算 [201 an 式 中 : 工 。= 初 级 转录 物 长 度 (kb); Lf= 所 需 探 针 平 均 长 度 (kb); k (速度 常数 ) =0.11 次 切割 /kb/min。 ISH 探 针 的 最 适 长 度 为 200 一 400 bp. 杂交 前 标本 必须 进行 预 处 理 C2]， 包 括 玻 片 涂 层 、 标 本 的 制备 及 固定 。 通 常 有 以 下 a. 快速 固定 或 快速 冰冻 生物 标本 。 b. 将 组 织 切 片 置 于 涂 层 的 玻 片 上 。 c. 标本 预 处 理 包 括 联合 使 用 酸 、 去 污 剂 及 蛋白 酶 与 标本 一 起 保温 。 尤 以 蛋 自 酶 K 的 处 理 最 为 重要 ， 和 蛋白 酶 K 的 浓度 和 保温 时 间 须 按 经 验 优化 ， 且 不 同 组 织 可 能 需要 不 同 的 处 理 条 件 。 细 胞 可 能 根本 不 须 任 何 处 理 。 d. 进行 处 理 以 除去 内 源 性 碱 性 磷酸 酯 酶 活性 。 在 ISH 的 主要 反应 进行 时 ， 必 须 同 时 进行 一 些 阴性 对 照 ?22]。 阴 性 对 照 可 有 多 种 形 式 ， 例 如 : a. 保温 时 仅 用 杂交 缓冲 液 ( 不 含 探 针 )， 以 评估 来 自 杂 交 液 中 各 种 组 分 及 抗体 的 非 特异 性 结合 所 产生 信号 的 水 平 。 b. 人 杂交 前 分 别 用 DNase 或 RNase 处 理 玻 片 以 降解 靶 DNA 或 RNA， 从 而 表明 探 针 是 与 期 望 的 靶 序 列 结合 。 = 113 » (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) c. 用 绝对 非特 异性 探 针 进 行 杂 交 ， 表 明 所 用 的 条 件 的 严格 程度 足以 除去 非特 异性 的 探 针 。 d. 对 于 RNA 探 针 ， 标 记 的 转录 物 有 两 种 类 型 : SH mRNA 序列 相同 或 互补 的 探 针 。 用 前 者 进行 杂交 应 该 显示 所 用 条 件 的 严格 程度 足以 除去 与 专 一 性 的 互补 链 具有 相同 长 度 和 相同 GC 含量 的 探 针 。 e. 如 有 疑问 ， 探 针 可 用 Northern 印迹 进一步 证 实 。 杂交 时 间 与 探 针 浓 度 有 关 。 如 探 针 洲 度 高 (600 一 1000 ng/ml)， 杂 交 时 间 可 短 些 ; 如 探 针 浓度 低 (200 一 400 ng/ml)， 则 须 杂 交 过 夜 。 杂交 缓冲 液 的 用 量 视 切 片 大 小 以 及 是 否 用 盖 玻 片 而 定 。 对 于 小 切片 ， 不 用 盖 玻 片 时 加 25 一 50 岂 杂 交 组 冲 液 便 能 轻易 覆盖 切片 。 如 用 盖 玻 片 ，10 pl 杂交 缓冲 液 可 能 足够 覆盖 切片 。 We FAA DNA, WHARF MRE 95T 变性 5 一 6 ming GFA RNA, 尽管 这 一 步 并 不 严格 要 求 ， 却 也 可 取 。 建 议 标 本 于 OSC 变性 3 一 4 min WIRE mRNA 的 二 级 结构 ， 从 而 提高 杂交 效率 。 在 整个 杂交 过 程 中 ， 为 避免 杂交 缓冲 液 蒸发 ， 保 持 湿度 的 盒子 须 密封 好 以 保持 高 湿度 。 这 样 ， 玻 片上 的 盖 玻 片 或 许可 以 不 必 密 封 ， 甚 至 可 以 完全 不 用 盖 玻 片 。 目 前 ， 大 多 数 的 实验 都 置 于 温 箱 内 的 密封 盒 中 进行 。 近 来 ， 用 智能 加 热 块 技术 设计 的 一 些 装置 可 以 满足 这 一 需要 (如 OmniSlideIM Hybaid)。 典 型 的 杂交 反应 通常 须 进行 过 夜 。 不 过 ， 如 果 探 针 浓 度 及 靶 序 列 丰 度 均 较 高 时 ， 杂 交 反 应 可 只 进行 2 一 4 h。 避免 切片 周围 残留 过 多 的 缓冲 液 ， 这 很 重要 ， 因 这 可 能 使 抗体 的 浓度 过 度 稀 释 。 在 大 多 数 的 应 用 中 ，1:1000 的 抗体 连接 物 稀释 度 已 合适 。 加 到 切片 上 的 稀释 的 抗 体 的 体积 须 随 着 切片 大 小 及 是 否 使 用 盖 玻 片 而 改变 。 至 于 如 何 改变 则 须 赁 经 验 决 定 。 避免 切片 周围 残留 过 多 的 缓冲 液 ， 这 很 重要 ， 因 为 这 可 能 使 底 物 过 于 稀释 。 检测 试剂 必须 完全 覆盖 整 块 切片 。 获 得 结果 所 需 的 保温 时 间 取 决 于 靶 序 列 的 量 。 但 为 达到 最 高 的 灵敏 度 , 通常 须 保 温 过 夜 。 亦 可 用 碱 性 磷酸 酶 的 其 他 底 物 , 如 固 红 (Fast Red)” 。 不 过 在 作者 的 实验 室 中 用 NBT/BCIP 系统 可 产生 最 好 的 信 噪 比 。 在 封 片 前 ， 可 进行 组 织 化 学 复 染 使 组 织 切片 造成 反差 。 但 必须 注意 的 是 ， 复 染 不 可 影响 已 沉积 于 玻 片 上 的 显 色 反应 产物 。 用 NBT/BCIP 作为 底 物 时 ， 可 选择 浅 绿 色 染 料 复 染 ， 例 如 0.$5% (w/v) 的 甲 基 绿 或 0.5% (w/v) 固 绿 (Fast green) 水 溶液 中 染色 1 min。 有 多 种 标准 的 封 片 液 适 合 于 这 一 系统 。 水 溶性 封 片 剂 包括 PBS/ 甘 油 (CitiFlour) 及 甘油 /明胶 (Sigma)， 但 这 些 封 片 剂 不 能 与 复 染 一 起 应 用 ， 因为 复 染 的 颜色 会 褪 掉 ， 时 间 长 了 NBT/BCIP 显 色 产物 也 渐渐 消 褪 。 非 水 溶性 封 片 剂 包括 DPX(BDHV/Merck) 和 Histotech(Serotec)。 用 非 水 溶性 封 片 剂 封 片 前 ， 非 常 重要 的 是 ， 须 确保 标本 已 用 乙醇 进行 梯度 脱水 处 理 ， 最 后 一 次 脱水 用 100% 乙 醇 ， 而 且 在 使 用 非 水 溶性 封闭 片 剂 前 玻 片 必须 凉 干 ， 若 切片 内 有 水 存在 颜色 会 随 1) 固 红 是 染料 ， 不 能 单独 用 作 酶 的 底 物 。 想 必 原 文 有 笔 误 。 一 一 译 者 注 RS 时 间 而 消退 。Histotech 封 片 剂 因 烤 入 切片 ， 故 不 须 盖 玻 片 。 (18) 建议 用 一 台 高 质量 光学 显微镜 ， 配 备 透 射 的 白色 光源 和 10x, 40x 的 两 个 接 物 镜 。 作者 的 实验 室 中 所 用 的 显微镜 上 还 装 有 35 mm 相机 和 柯达 EktarIM25 彩 卷 ， 可 供 摄 下 结果 。 参考 文 mM jn . McQuaid, S., Allan, G. M., Taylor, M. J., Todd, D., Smith, J., Cosby, S. L., and Allen, I. V. (1991) Comparison of reporter molecules for viral in situ hybridiza- tion. J. Virol. Methods 31, 1—10. 2. Price, C. M. (1993) Fluorescence in situ hybridization. Blood Rev. 7, 127-134. 3. Mitchell, V., Gambiez, A., and Beauvillain, J. C. (1993) Fine structural localiza- tion of proenkephalin mRNAs in the hypothalamic magnocellular dorsal nucleus of the guinea pig: a comparison of radioisotopic and enzymatic in situ hybridiza- tion methods at the light- and electron-microscope levels. Cell Tissue Res. 274, 219-228. 4. Brady, M. A. W. and Finlan, M. F. (1990) Radioactive labels: autoradiography and choice of emulsions for in situ hybridization, in Jn Situ Hybridization: Principles and Practice (Polak, J. M. and McGee, J. O.’D., eds.), Oxford University Press, Oxford, pp. 31—57. 5. Viegas-Pequignot, E. (1992) In situ hybridization to chromosomes with biotinylated probes, in Jn Situ Hybridization: A Practical Approach (Wilkinson, D. G., ed.), IRL, Oxford, pp. 137—158. 6. Langer, P. R., Waldrop, A. A., and Ward, D. C. (1981) Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6633-6637. . Holtke, H.-J. and Kessler, C. (1990) Non-radioactive labeling of RNA transcripts in vitro with the hapten digoxigenin (DIG): hybridization and ELISA-based detec- tion. Nucleic Acids Res. 18, 5843-5851. Cunningham, M. W. (1991) Nucleic acid detection with light. Life Sci. 6, 1-5. Wiegant, J., Wiesmeijer, C. C., Hoovers, J. M. N., Schuuring, E., d’Azzo, A., Vrolijk, J., Tanke, H. J., and Raap, A. K. (1993) Multiple and sensitive fluores- cence in situ hybridization with rhodamine-, fluorescein-, and coumarin-labeled DNAs. Cytogenet. Cell Genet., 63, 73—76. 10. Harvey, B. and Ellis, P. (1992) Nonradioactive labelling of DNA probes during PCR. Life Sci. 9, 3,4. 11. Chadwick, P. M. E. and Durrant, I. (1994) Labeling of oligonucleotides with fluo- rescein, in Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Isaac, P. G., ed.), Humana, Totowa, NJ, pp. 101-105. 12. Melton, D., Kreig, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., and Green, M. R. (1984) Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybrid- ization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res. 12, 7035—7056. 13. Keller, G. H. and Manak, M. M. (1989) Molecular hybridization technology, in DNA Probes, Stockton, New York, pp. 1—27. 14. Wilkinson, D. G. (1992) The theory and practice of in situ hybridization, in Jn Situ Hybridization: A Practical Approach (Wilkinson, D. G.., ed.), IRL, Oxford, pp. 1-14. ~— 0:90 - G20 “ i. 16. a2. Moorman, A. M., de Boer, P. A. J., Vermeulen, J. L. M., and Lamers, W. H. (1993) Practical aspects of radio-isotopic in situ hybridization on RNA. Histochem. J. 25, 251-266. Durrant, I., Brunning, S., and Eccleston, L. (1993) DNA and RNA colour kits for nonradioactive in situ hybridization. Life Sci. 12, 7,8. . Brunning, S. and Durrant, I. (1994) Oligo colour kit: a new probe labelling kit for nonradioactive in situ hybridization. Life Sci. 14, 19. . Angerer, L. M. and Angerer, R. C. (1992) In situ hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes, in Jn Situ Hybridization: A Practical Approach (Wilkinson, D. G., ed.), IRL, Oxford, pp. 15—32. . Cunningham, M. and Harvey, B. (1992) A rapid method for monitoring nonradio- active labelling of DNA with fluorescein-11-dUTP. Highlights, 4, 8,9. . Cox, K. H., DeLeon, D. V., Angerer, L. M., and Angerer, R. C. (1984) Detection of mRNAs in sea urchin embryos by in situ hybridization using asymmetric RNA probes. Develop. Biol. 101, 485—S02. . Brunning, S., Cresswell, L., Durrant, I., and Eccleston, L. (1993) General introduction to in situ hybridization techniques, in A Guide to Radioactive and Nonradioactive In Situ Hybridization Systems. Amersham International, Amersham, pp. 5—12. Terenghi, G. and Fallon, R. A. (1990) Techniques and applications of in situ hybridization, in Curent Topics in Pathology: Pathology of the Nucleus (Underwood, J. C. E., ed.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 290-337. ‘Ear > 7 a4 » = 5 可 é Tk : ‘4 - : ae ee eo J +) er a 7 ; » iz | 二 而 = Rel 7 ( f ; ye - x tal aa: ty - - 1 «a ) 6 = ’ ¢ 了 人 a4 4 % my 第 三 部 分 基因 克隆 技术 第 二 十 二 章 DNA 的 体外 包装 Jeremy W. Dale, Peter J. Greenaway Ul 1. 引 FE) Wek BS PR AY TE AS Ee J, Be PR A a Sa A Ha Sk YB J BR 2B ic Bl] — 4 2S 的 头 部 前 体 ( 前 头 部 ) 中 ， 叹 菌 体 DNA 复制 后 插入 空头 部 颗粒 中 一 一 此 过 程 称 作 包装 。 在 包装 过 程 中 某 些 噬 菌 体 基 因 产 物 具 有 重要 的 作用 。 其 中 有 : @ 下 蛋白: 它 是 噬菌体 头 部 的 主要 组 分 ， 编 码 下 蛋白 的 基因 发 生 突变 的 入 i {4 3S AR AY AR BE Be CT SK, FH PH BR RL ft AS eS a PAR a BS 与 包装 的 其 他 蛋白 质 。 @D 和 蛋白 和 A 和 蛋白 : 它们 参与 包装 过 程 ， 编 码 这 两 个 蛋白 的 基因 发 生 突变 的 入 噬 菌 体 突 变型 能 形成 前 头 部 ， 但 不 能 包装 DNA， 这 会 导致 空 的 前 头 部 的 积累 。 体外 包装 须 用 到 两 种 细菌 抽 提 物 : 一 种 来 源 于 被 入 叭 菌 体 D 突变 株 感染 的 细胞 ， 另 一 种 来 源 于 被 入 叭 菌 体 下 突变 株 感 染 的 细胞 。 混 合 这 两 种 提取 物 可 体外 互补 ， 并 因此 具有 装配 成 熟 鸣 菌 体 颗粒 的 能 力 。 可 是 ， 包 装 反 应 仅仅 针对 具有 某 种 特性 的 DNA 有 Lo AMER DNA 是 以 多 倍 长 度 的 线 状 分 子 复 制 的 。 与 包装 有 关 的 酶 (特别 是 A 蛋 日 ) 识别 该 DNA 上 的 特定 位 点 〈cos 位 点 )， 在 该 点 切 开 DNA 并 开始 将 DNA 包装 进 唆 菌 体 头 部 。 包 装 一 直 进 行 到 第 二 个 cos 位 点 ， 在 这 位 点 上 切 开 ， 于 是 便 在 喉 菌 体 头 部 中 形成 一 个 单一 的 完整 的 入 鸣 菌 体 DNA AEF. (cos 位 点 上 的 切口 是 不 对 称 的 ， 从 而 产生 成 熟 的 线性 入 MRR DNA 的 单 链 黏 性 未 端 )。 因 此 ， 只 有 带 有 cos 位 点 的 DNA 分 子 才 被 包 装 。 此 外 ， 为 了 产生 能 感染 细菌 细胞 的 唆 菌 体 颗粒 ， 两 个 cos 位 点 间 的 DNA 长 度 须 在 一 定 的 限度 内 (包装 限度 )。 如 果 DNA 长 度 大 于 入 噬菌体 DNA 大 小 的 105% (KF 53 kb)， 在 第 二 个 cos 位 点 到 达 前 ， 头 部 已 填 满 而 使 第 二 个 切口 不 能 形成 。 如 果 DNA 长 度 小 于 入 WERK DNA 长 度 的 80%， 当 第 二 个 cos 位 点 到 达 时 切口 才 形 成 ， 于 是 鸣 菌 体 头 部 内 的 DNA 将 不 足以 维持 颗粒 的 结构 完整 性 。 包装 限度 的 存在 ， 在 一 定 意义 上 降低 了 入 鸣 菌 体 载 体 的 实用 性 ， 这 是 因为 它 限 制 了 能 被 克隆 的 插入 片段 的 大 小 ， 然 而 ， 这 也 可 以 作为 它 的 优点 ， 因 为 它 允 许 我 们 在 所 需要 的 大 小 范围 内 选择 要 用 的 插入 片段 。 另外 ， 体 外 包装 还 可 应 用 于 一 种 称 为 黏 粒 (cosmid) 的 特殊 类 型 的 克隆 载体 局 ?31， 一 种 带 有 cos 序列 的 质粒 。 包 装 反应 依赖 于 间隔 有 适当 长 度 DNA 的 cos 位 点 的 存 在 ， 但 对 于 这 些 cos 位 点 间 的 DNA 的 性 质 是 无 所 谓 的 。 黏 粒 载体 本 身 太 小 所 以 不 能 包 装 成 为 一 个 可 生存 的 颗粒 ， 因 而 只 有 在 一 个 大 的 外 源 DNA 片段 插入 之 后 ， 才 能 获得 用 ** P25 - 于 包装 的 适当 大 小 的 DNA 分 子 。 所 以 ， 作 为 一 个 介 导 DNA 进入 细菌 细胞 的 方法 ， 体 外 包装 和 转化 / 转 染 相 比 ， 它 有 了 两 个 优点 。 首 先 ， 这 种 方法 更 为 有 效 ， 尤 其 是 在 使 用 大 DNA 分 子 如 入 载体 或 带 有 大 的 插入 片段 的 黏 粒 时 。 其 次 ， 在 有 大 的 插入 片段 时 ， 它 提供 了 一 种 选择 这 些 大 的 插入 片 段 的 方法 。 应 当 注意 本 章 只 不 过 是 对 这 一 复杂 问题 作 一 个 简单 的 介绍 ， 在 具体 运用 和 或 黏 粒 载 体 或 体外 包装 前 ， 建 议 查看 有 关 的 专门 书籍 。 本 章 介绍 的 步骤 包括 制备 包装 混合 物 的 方 法 〈 参 见 注释 1)， 这 些 包装 混合 物 在 市 场 上 也 有 商品 供应 。 2. 材 料 1) 包装 菌株 : BHB2688: 2 cl,,b2 red3 Eam4 Sam7 的 溶 原 菌 BHB2690: 3 cl,,b2 red3 Dam15 Sam7 的 溶 原 菌 cl 突变 使 溶 原 菌 可 为 热 所 诱导 而 进入 裂解 性 生长 ， 因 为 突变 型 产生 的 入 鸣 菌 体 阻 过 物 不 耐 热 。b2 缺失 和 red3 突变 可 减少 因 包装 提取 物 中 存在 内 源 DNA 而 引起 的 ASE. Sam7 突变 使 鸣 菌 体形 失 裂解 能 力 ， 因 而 在 诱导 溶 原 菌 后 ， 使 噬菌体 产物 在 HHA, DAE 基因 突变 的 作用 在 引言 中 已 有 和 似 述 ，D、 和 3S 突变 都 是 琥珀 突 变 ， 因 而 噬菌体 能 在 琥珀 抑制 型 宿主 中 正常 生长 。 2) L 肉 汤 培 养 基 : 15 ¢ RAK, 5 g 酵母 提取 物 ，$ g NaCl， 以 上 成 分 溶解 在 约 600 ml 水 中 ， 用 NaOH 调 pH 值 到 7.2， 加 水 到 总 体积 1L， 以 $00 ml 分 装 在 两 个 5 烧瓶 中 高 压 灭 菌 。 3) 蔗糖 - Tris 缓冲 液 : 10% KEKE, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5. 4) 溶菌 酶 : 溶菌 酶 溶解 在 0.25 mol/L Tris-HCl #, KEE 2 mg/ml, pH7.5; 现 配 。 5) MA. 6) 包装 缓冲 液 : 5 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 30 mmol/L WAH, 60 mmol/L T= - fi, 20 mmol/L MgCl, 15 mmol/L ATP, 3 mmol/L 2 - 琉 基 乙醇 。 7) 超声 处 理 缓 冲 液 : 20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 3 mmol/L MgCl, 5 mmol/L 2 -3it JE 7, BE, 1 mmol/L EDTA. 8) 噬菌体 缓冲 液 : 7 g NagHPO,, 3 g KHPO4:，5 g NaCl, 0.25 g MgSO, - 7H20, 0.015 gCaCh, 0.01 g 明胶 ， 加 水 到 1 L。 小 体积 分 装 并 高 压 灭 菌 。 9) 敏感 的 E.coli BR. : Pee 法 3.1 包装 混合 物 A (包装 蛋白 ) 的 制备 1) 将 世 肉 汤 培 养 基 中 的 BHB2688 在 30 中 培养 过 夜 。 2) 将 过 夜 培养 物 接种 到 500 ml 的 工 肉 汤 培 养 基 中 ，30% 振荡 培养 ， 当 OD6so 达 到 0.3 *. 126 - 时 从 摇 床 上 取 下 烧瓶 并 在 45 KIA PAK 15 min, FAG. AW PAS ME. 3) 将 烧瓶 转移 到 旋转 式 振 蔓 器 上 ，37C 培养 1 h。 4) 9000 g (6Xx250 ml 转 头 ，8000 r/min) 离心 10 min 以 回收 细胞 。 5) 尽 可 能 移 去 上 清 液 ， 倒 置 试 管 至 少 $ min 以 便 流 干 上 清 液 。 6) 在 约 2 ml 的 蔗糖 - Tris 缓冲 液 中 重新 悬浮 细胞 。 以 0.5 ml 分 装 悬 浮 液 ， 癌 每 管 中 加 入 50 岂 的 现 配 的 溶菌 酶 溶液 ， 轻 轻 倒 转 使 混合 。 7) ERA PREY RRM. 8) MRA PRR ES: ART), OC 中 放置 至 少 1$ min 以 使 细胞 解冻 。 9) 合并 已 解冻 细胞 ， 加 50 pl 包装 缓 冲 液 ， 以 48 000 g (8x50 转 头 ，20 000 r/min) 离心 30 min。 吸 取 上 清 液 ， 以 50 由 分 装 在 预 冷 的 微型 离心 管 中 。 液 氮 中 谎 结 试管 ， 然后 -707C 冷藏 ， 备 用 。. 3.2 包装 混合 物 B (噬菌体 头 部 ) 的 制备 1) 将 菌株 BHB 2690 进行 3.1 AH 1~5 BARE. 2) 把 细胞 重新 悬浮 于 5 ml 冷 的 超声 处 理 缓冲 液 中 ， 超 声 处 理 细 胞 直到 悬浮 液 不 黏 为 止 ， 整 个 操作 过 程 中 都 须 将 装 有 巧 浮 液 的 试管 放 在 订 水 浴 中 ， 用 短 阵 超声 处 理 (3 一 $ s)， 避 免 产 生 泡沫 。 3) 以 15 000 g(6x250 ml 转 头 ,10 000 rmin) 将 悬浮 液 离心 10 min。 4) 吸取 上 清 液 ， 以 50 凡 分 装 到 预 冷 的 微型 离心 管 中 。 在 液 所 中 迅速 冻结 ， 然 后 于 — 10C 保存 备用 。 3.3 BRAM 1) 解冻 已 制备 好 的 包装 提取 物 A 和 了 B 各 一 管 。 2) 在 含有 7 器 超 声 处 理 缓冲 液 的 微型 离心 管 中 ， 加 入 待 包装 的 DNA 1~2 pl (BRS FEA +e); 3) M1 pW BERR, 10 pl MER AA 6 LHR B. 25C 保温 60 min. 4 取 0.5 ml 的 叹 菌 体 缓冲 液 稀 释 ， 与 适当 的 入 敏感 的 宿主 混合 接种 在 BBL Ris FO (适用 于 和 载体) 上， 或 在 含有 抗生素 的 选择 平 亚 (适用 于 黏 粒 ) 上 培养 。 记 下 所 产生 的 鸣 菌 斑 数 或 转化 子 数 ， 并 用 如 杂交 或 免疫 筛选 方法 (参见 第 二 十 六 章 ) 对 特定 的 插入 DNA 序列 进行 检测 。 § Yo 4. 注 4 (1) 制备 包装 提取 物 还 有 几 个 可 供 选择 的 方法 ， 其 他 方法 的 实例 可 参看 文献 3 -4]。 - 127 -一 We = xX 献 . Collins, J. and Hohn, E. (1978) Cosmids: a type of plasmid gene cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage heads. Proc. Natl. Acad. Sci. USA T5, 4242-4246. . Hayley, J. D. (1985) Cosmid library construction, in Methods in Molecular Biol- ogy, vol. 4: New Nucleic Acid Techniques (Walker, J. M., ed.), Humana, Clifton, NJ. . Enquist, L. and Sternberg, N. (1979) Jn vitro packaging of lambda Dam vectors and their use in cloning DNA fragments. Meth. Enzymol. 68, 281-298. Hohn, B. (1979) Jn vitro packaging of lambda and cosmid DNA. Meth. Enzymol. 68, 299-309. . Hohn, B. and Murray, K. (1977) Packaging recombinant DNA molecules into bac- teriophage particles in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3259-3263. . Sternberg, N., Tiemeier, D., and Enquist, L. (1977) In vitro packaging of a lambda dam vector containing EcoRI DNA fragments of Escherichia coli and phage P1. Gene 1, 255—280. * lee * 第 二 十 三 章 应 用 入 置换 型 载体 构建 哺乳 动物 基因 组 文库 Alan N. Bateson, Jeffrey W. Pollard 1. 引 ile 基因 组 文库 是 克隆 基因 ， 尤 其 是 那些 与 遗传 性 疾病 有 关 的 突变 基因 所 必须 的 ， 且 最 终 为 测定 整个 基因 组 的 序列 提供 手段 。 理 想 的 基因 文库 应 由 足够 的 覆盖 整个 基因 组 的 重 释 序 列 的 克隆 组 成 。 通 过 将 基因 组 DNA 随机 打 断 ， 再 把 各 个 片段 克隆 到 适当 的 载体 上 便 可 实现 L。 最 先 用 来 构建 文库 的 第 一 类 载体 是 和 叭 菌 体 载体 。 用 这 些 入 载体 构建 的 基 因 组 文库 容易 导入 宿主 细菌 ， 而 且 它 可 接纳 长 达 25 kb 的 基因 组 DNA 插入 片段 。 此 外 ， 业已 构建 的 黏 粒 (和 叭 菌 体 / 质 粒 的 杂种 载体 ) 能 接纳 长 达 40 kb 大 的 基因 组 插入 片段 ， 且 文库 经 平 严 培养 后 ， 能 用 与 处 理 质粒 相同 的 方式 加 以 处 理 2J。 也 可 用 细菌 的 质粒 载体 构建 基因 组 文库 。 不 过 由 于 受 质粒 转化 效率 的 限制 使 它们 只 能 用 于 构建 小 的 基因 组 文 库 ， 如 病毒 、 酵 母 和 黏 菌 的 。 克 隆基 因 组 DNA 大 的 区 段 ， 必 须 利 用 克隆 中 的 重大 序 列 将 许多 基因 组 克隆 进行 排序 。 这 里 须要 进行 多 次 克隆 分 离 ， 然 后 用 从 克隆 的 DNA 片段 末端 得 到 的 探 针 对 文库 进行 筛选 以 挑选 出 相关 的 克隆 ， 这 一 过 程 称 为 " 步 移 ” (walking )， 如 此 循环 下 去 便 可 实现 排序 。 为 了 提高 “ 步 移 ”的 速度 ， 已 开发 了 P1 MRK, PAC, BAC 和 YAC 载体 ， 以 克隆 大 小 范围 为 100 一 1000 kb 的 DNA 大 片段 01。 这 些 载体 是 构 建 大 基因 组 原始 文库 的 首选 载体 。 然 而 在 这 些 情 况 下 ， 仍 须 用 入 叭 菌 体 和 黏 粒 文库 制备 亚 文库 ， 以 便 把 这 些 较 大 的 克隆 分 解 成 较 小 的 更 易 处 理 的 片段 ， 以 及 克隆 在 其 他 形式 的 文库 中 不 易 被 克隆 的 小 片段 。 本 章 介绍 和 置换 型 载体 的 使 用 ， 但 同样 的 原理 也 可 应 用 于 黏 粒 载体 中 基因 组 文库 的 构建 。 和 鸣 菌 体 有 一 个 线性 基因 组 ， 它 可 分 为 三 个 部 分 。 左 臂 和 右 臂 是 裂解 性 生长 所 必 需 的 ， 但 中 央 部 分 是 可 省 略 的 (4 。 因 此 这 个 被 称 作 “ 填 充 ” 片 段 的 中 央 片 段 可 以 被 外 源 DNA 置换 。 由 于 入 可 高 效 地 包装 的 基因 组 大 小 是 野生 型 基因 组 的 78% 到 105%， 所 以 能 接纳 7 一 24.2 kb 的 基因 组 DNA 片段 ， 这 些 基 因 组 DNA 片段 可 以 通过 机 械 前 切 也 可 以 通过 限制 性 内 切 酶 的 酶 解 产生 。 机 械 剪 切 能 形成 真正 的 随机 DNA 片段 ， 但 由 于 这 些 片 段 是 平 末端 的 ， 所 以 它们 的 连接 效率 很 低 。 拟 随机 切割 可 通过 用 识别 4 bp 识别 序 列 的 限制 性 内 切 酶 进行 不 完全 消化 取得 , 理论 上 在 一 般 的 基因 组 中 每 2$56 bp 有 一 个 这 种 切 点 。 适 当 大 小 范围 内 的 DNA 片段 可 通过 大 小 分 级 分 离开 来 ， 然 后 能 有 效 地 连接 到 适 当 酶 切 的 入 臂 上 。 限 制 性 内 切 酶 Sax3A 及 与 其 有 相同 识别 位 点 的 如 Mbo 工 和 Dpn I Xt 拟 随机 切割 特别 有 用 ， 因 为 它们 产生 的 黏 性 末端 与 存在 于 众多 载体 中 的 Ba HI 位 点 可 配对 。 也 可 采用 酶 切 6 bp 识别 序列 的 内 切 酶 ， 但 它 的 酶 切 频 率 的 降低 将 减 小 获得 重 释 克隆 的 可 能 性 。 ~ Bs 。 Fob a Wi A — ik) 22 RT (~ 40 kb), 所 以 消除 了 由 不 含 基因 组 插入 片段 的 互相 连接 的 入 臂 所 形成 的 本 底 。 可 是 ， 由 于 与 填充 片段 的 重新 连接 ， 包 装 反应 的 本 底 还 会 出 现 。 这 种 本 底 可 以 用 几 种 方法 使 之 降低 。 ® 多 数 载体 含有 位 于 填充 片段 两 侧 的 合成 的 多 克隆 位 点 序列 。 大 多 数 情况 下 用 双 酶 酶 切 可 从 填充 片段 中 消除 可 配对 的 黏 性 末端 。 此 外 ， 一 些 载体 在 它们 的 填充 片段 上 含有 一 个 惟一 的 限制 酶 酶 切 位 点 ， 利用 此 位 点 可 将 填充 片段 消化 成 较 小 的 片段 。 例 如 EMBL4 含有 一 Sal 工 位 点 而 Charon 40 有 一 能 被 内 切 酶 Nae I 切 割 成 许多 小 片段 的 合成 的 “多 聚 填充 片段 ”。 @ 实际 上 ， 甚 至 在 多 重 消化 后 ， 用 物理 方法 去 除 填 充 片段 也 可 提高 文库 的 构建 效 率 。 用 蘑 糖 梯度 离心 是 达到 这 一 目的 的 最 好 方法 。 @ Spi wee RAT MRS A A AS), OTE a, 因为 含有 red 和 gam 基因 的 叹 菌 体 在 携带 P2 的 溶 原 菌 菌株 的 平 血 上 面 不 能 形成 叹 BE. red 和 gam 基因 位 于 填充 片段 中 ， 所 以 重组 噬菌体 是 Spi ， 可 以 自由 生 长 。 然 而 ， 这 种 选择 同时 带 来 了 两 个 麻烦 。 第 一 ， 载 体 中 须要 有 chi 位 点 以 维 持 高 的 复制 率 ， 如 果 缺 少 cui 序列 ， 在 一 些 基 因 组 插入 片段 中 的 隐藏 位 点 的 存 在 可 能 导致 具有 较 高 复制 率 的 重组 和 叭 菌 体 分 子 出 现 ， 因 而 使 它 在 群体 中 以 过 高 的 比例 出 现 55,6]。 第 二 ，gam ~ WERK ALTE recA+ 宿主 细胞 中 有 效 地 复制 ， 可 是 DNA 中 某 些 重组 基因 序列 的 存在 可 能 须要 用 一 个 recA- 宿主 。 这 时 ， 可 利用 red 和 gam+ 载 体 ， 这 种 载体 中 cam 基因 已 被 转移 到 入 Ky— ee El 已 经 构建 了 许多 具有 上 述 特性 的 入 置换 型 载体 ， 这 些 载 体 可 用 于 文库 的 构建 。 ADASH, AFIX, 22001 #1 EMBL 载体 有 不 同 的 多 克隆 位 点 序列 ， 并 且 都 可 进行 Spi Si 选 。 MDASH 和 FIX 还 含有 T7 和 T3 RNA 聚合 酶 启动 子 ， 从 而 可 以 产生 核糖 探 针 ( 参 见 第 十 二 章 ) 而 使 基因 组 的 步 移 更 容易 进行 。 载 体 Charon 32~35 和 40 都 是 red” 和 gam+ ， 因 此 有 利于 克隆 较 难 克隆 的 DNA 序列 。 为 了 简明 起 见 ， 本 章 介绍 用 EMBL4 载 体 构 建文 库 ， 该 方法 可 应 用 于 上 述 所 有 载体 。 2. 材 料 使 用 优质 的 化 学 药品 和 试剂 ， 除 另外 说 明 外 ， 所 有 溶液 都 是 室温 贮存 ， 酶 ， 如 BamHI, Sal1l, Mbol, T4 DNA 连接 酶 和 DNaseI 及 随 之 供应 的 相应 的 缓冲 液 都 应 在 —20C 存放 。 2.1 喉 菌 体 原 种 的 制备 1) PARRA. 下 列 宿主 适用 于 XEMBL456] : QR48: 供 亲 本 载体 生长 的 recA THE. NM538: 用 作 第 二 次 筛选 和 测 EMBL4 亲本 效 价 用 的 重组 喉 菌 体 的 生长 的 宿主 。 NM539: 用 在 原始 文库 中 检测 spi 重组 子 。 + 0 * LE392; #EEPA HY MRR AEK RM. L 肉 汤 培养 基 : Bt 1 中 溶解 10 g MMAR, SoM S g NaCl， 调 pH 值 到 7.2， 高 压 灭 菌 ， 培 养 入 则 加 10 mmol/L MgSO4。 CY 培养 基 : 总 量 1 中 溶解 10 g 酷 蛋白 水 解 物 ，5 g 酵母 提取 物 ，3 g NaCl，2 g KCl 和 2.46 g MgSO,:7H,O, if pH 值 到 7.5 并 高 压 灭 菌 。 4) 10 mmol/L MgSO4。 5) 入 梯度 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgSO4、 pH 7.4. 6) Abe: 按 3.1 人 小节 步骤 17 的 指导 配 溶液 。 7) 入 透析 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCI，25 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgSO4、 pH 8.0. 2 Yo 3 ~~ 2.2 Ee DNA 的 制备 8) 0.5 mol/L EDTA, pH7.0. 9) 10%SDS (w/v). 10) 蛋白 酶 K: 10 mg/ml WR, WF 10 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA, 0.5% (w/v) SDS, pH 7.8. 11) B: BAB ESAAMRE NH 0.1 mol/L TrisHCl, pH 8.0, KH 0.5 mol/L Tris- HCl 平衡 以 确保 pH 值 达 到 8.0。 酚 有 腐蚀 性 并 有 毒 ， 必 须 小 心 处 理 。 2.3. 入 和 臂 的 制备 12) 蔗糖 梯度 缓冲 液 : 配制 从 135% 到 35% (w/v) 梯 度 的 蔗糖 溶液 (在 1 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA、pH 8.0 溶 液 中 )。 13) 酚 / 氧 仿 : 1:1 混合 酚 和 氯仿。 14) 3 mol/L BARA. pH 6.0。 15) FAR. 16) 0.01 mol/L MgCh. 17) TE 缓冲 液 ， 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.5. 2.4 基因 组 DNA 的 不 完全 消化 18) 加 样 缓冲 液 : 4%(w/v) 芒 糖 ，0.25% (w/v) 溴 酚 蓝 和 0.25%(w/v) 二 甲 茶 青 的 水 溶 液 。 19) 终止 液 : 28 mmol/L EDTA, pH 8.0， 溶 于 25$% (v/v) 加 样 缓冲 液 中 。 2.5 文库 的 构建 20) 包装 混合 物 : 可 购买 或 自制 〈 人 参见 第 二 十 二 章 )。 131 . 21 — 22) 23) 24) 1) 2) 3) 4 YA 5 ~~ 6 Ye 7) 8) 9) 10 11) 12) 13) 14) SM 培养 基 ; 总 量 1L 中 溶解 5.8 g NaCl, 2 g MgSO,:7H)O 和 20 g 明胶 于 950 ml 水 和 50 ml 1 mol/L Tris-HCI、pH 7.5， 高 压 灭 菌 。 氯仿 。 上 层 琼 脂 : 7 g 细菌 培养 用 琼脂 溶 于 补充 有 10 mmol/L MgSO, M4 1 L L -A@saze 基 中 ， 高 压 灭 菌 。 底层 琼脂 ,15 g 细菌 培养 用 琼脂 溶 于 补充 有 10 mmol/L MgSO, 的 1 工 工 - 肉 汤 培养 基 中 ， 高 压 灭 菌 。 3 aay 法 3.1 BERRA AIS 取 冷 冻 的 细菌 QR48 的 原 种 ， 接 种 到 10 ml 的 世 - 肉 汤 培 养 基 中 ，37 培养。 将 1 ml 过夜 培养 物 接种 到 含有 50 ml CY 培养 基 的 锥 形 烧 瓶 (至 少 4 倍 于 培养 基体 积 )， 并 在 37C HRY (250 r/min) 培 养 2 一 2.5 h， 直 到 ODes— A 0.4. 在 47 中 以 3000 g 离心 10 min 收集 细胞 ， 倒 去 上 清 液 ， 用 25 ml 的 10 mmol/L MgSO, RiP ie i, BMF 4 中 可 保存 10 天 ， 但 出 斑 率 最 高 的 是 0 一 2 天 内 的 细胞 。 为 获得 叭 菌 体 的 最 大 收获 量 ， 须 计算 噬菌体 感染 细菌 的 最 适 比率 一 一 感染 比 。 这 是 在 大 规模 的 喉 菌 体制 备 之 前 的 小 规模 实验 中 测定 的 (参见 注释 1)。 实 验 前 一 天 ， 测定 宿主 细菌 QR48 和 鸣 菌 体 溶菌 产物 两 者 的 效 价 [81 (参见 注释 1)。 | 在 各 支 灭 菌 的 1.5 ml 小 管 中 接 种 0.1 ml 含有 2 10° 个 宿主 细菌 与 0.1 ml 下 列 效 Gray mea: 10°, 5x10’, 10’, 5x 10°, 10° 和 5$x 105pfu。 室 温 培 养 15 min EME 菌 体 颗粒 吸附 到 细菌 上 。 小 心 将 每 管 培养 物 分 别 转移 到 含有 10 ml 预 热 到 37S 的 CY 培养 基 的 100 ml 的 锥 形 烧 瓶 中 ， 在 旋转 式 摇 床上 37C 中 以 140 r/min 振荡 培养 过 夜 。 4C 中 以 12 000 g 离心 10 min 以 澄清 溶菌 产物 ， 滴 定 上 清 液 效 价 ， 并 测定 最 适 感染 Bes 接着 进行 大 规模 噬菌体 的 制备 ， 将 4 x 10? 宿主 细菌 与 最 适 感染 比 的 叹 菌 体 一 起 接 种 到 一 个 1.5 ml 的 灭 菌 的 塑料 试管 中 。 室 温 培养 15 min, 将 培养 物 小 心地 转移 到 一 个 含有 预 热 到 377 的 200 ml CY 培养 基 的 2 L HH RL 中 ， 置 旋转 式 摇 床上 ， 在 370 中 以 140 r/min HBR, 培养 过 夜 的 培养 物 应 仍 是 浑浊 的 ， 但 随 着 大 量 的 裂解 ， 呈 现 出 细菌 细胞 碎片 的 纤维 状 固 块 。 如 果 不 是 这 样 ， 可 把 烧瓶 在 4°C A 1~2 h 以 增加 细胞 的 裂解 。 V5 000 g FE4T PRL 20 min 以 去 除 细胞 碎片 。 转移 上 清 液 到 50 ml 多 聚 碳酸 酯 的 超 离心 管 中 以 75 000 ¢ 在 4C 中 离心 1 he 倒 去 上 清 液 ， 沉 演 物 中 央 会 呈 黄 褐色 (碎片 )， 周 围 为 浅 蓝 色 半 透明 叹 菌 体 环 。 每 管 加 0.48 ml 4 的 入 梯度 缓冲 液 ， 重 新 悬浮 沉淀， 倾斜 试管 使 缓冲 液 浸没 沉淀 ， 让 叭 菌 体 扩散 过 夜 。 “> 15) 轻 轻 地 转移 到 一 个 硅化 的 15 ml 的 玻璃 离心 管 中 ，4 中 以 12 000 g 离心 min 除去 细胞 碎片 。 16) 转移 上 清 液 到 一 洁净 的 1$ ml 玻璃 离心 管 中 ， 加 100 pg DNase I， 室 温 放置 1 h。 17) 在 入 梯度 缓冲 液 中 配备 三 级 氯 化 饱 梯度， 浓度 分 别 是 1.7 g/cm? (75 ml 中 加 95 g; 1 为 1.3990)，1.5 g/cm (82 ml 中 加 67 g, 1 为 1.381$) 和 1.30 g/cm® (90 ml 中 加 40 g; ?为 1.3621)。 用 蠕动 泵 将 2 ml 1.7 g/cm’, 3 ml 1.5 g/cm’ 和 2 ml 1.3 g/ em? 小 心地 依次 铺 层 到 12 ml 透明 的 超速 离心 管 中 。 标 出 每 层 的 界面 。 18) 用 蠕动 泵 小 心地 铺 噬菌体 悬浮 液 层 ， 并 用 梯度 缓冲 液 加 满 离 心 管 。 19) 用 超速 离心 机 的 “ 慢 加 速 " 和 “不 用 和 刹车 ”模式 ， 以 160 000 g 在 207 中 离心 上 小 时 40 分 钟 。 20) 图 23.1 表示 预期 的 分 带 格局 (参见 注释 2)。 用 带 21 号 针头 的 注射 器 小 心地 取出 吹 菌 体 区 带 。 方 法 是 在 区 带 上 贴 一 小 块 透明 胶 纸 ， 然 后 在 区 带 的 下 方 刺 穿 试 管 ， 针 头 的 斜 口 边 朝 上 。 当 心 别 让 针头 穿 透 离心 管 而 刺 破 手指 。 CsCI 浓 度 石蜡 油 /(g/cm?) ih 带 针 头 的 针 简 1.5 斜 口 向 上 图 23.1 图 示 在 氧化 铭 分 级 梯度 超 离 心 后 ， 预 期 的 噬菌体 制备 物 的 分 带 格局 。 紧 靠 在 1.3 一 1.5 g/em 氧化 钨 交界 面 下 面 的 是 完整 的 噬菌体 区 带 ， 如 图 所 示 用 带 针 头 的 注射 器 从 梯度 中 抽出 这 一 区 带 。 21) 在 4C 中 用 透析 缓冲 液 透 析 叭 菌 体 ， 换 液 两 次 ， 每 次 用 2 L。 22) Tae MERAY 〈 人 参见 注释 3)。 3.2 TEA DNA 的 制备 1) 在 噬菌体 制备 物 中 加 1/50 (v/v) #9 0.5 mol/L EDTA. . $38 * 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ~’ Yo Yo ~ Yo ) ) ) ) Yo Ye Se 加 1/50 (v/v) 的 10% SDS 溶液 并 在 65°C FPR 15 min。 冷却 到 45C ， 加 有 蛋白酶 K 到 终 浓度 为 50 pg/ml， 并 在 AST 中 保温 1 h。 用 酚 抽 提 ， 小 心地 倒转 试管 几 次 。 7E 4 PLL 7800 g 离心 5 min， 使 分 成 两 相 。 重复 上 述 过 程 三 次 ， 每 次 用 酚 抽 提 水 相 。 用 氨 仿 抽 提 水 相 两 次 以 去 除 酚 ， 每 次 以 7800 g 离心 5 min 使 分 成 两 相 。 用 水 饱和 的 乙醚 抽 提 水 相 三 次 以 去 除 毛 仿 ， 每 次 以 1000 g 离心 min 使 分 成 两 相 。 真空 中 放置 片刻 以 去 除 乙 醚 。 最 终 的 上 清 液 作 梯度 稀释 后 在 0.5% (w/v) 的 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 用 已 知 浓度 的 入 作 标 准 。 根据 琼脂 糖 凝 胶 的 电泳 结果 估计 DNA 浓度 ， 或 在 260 nm 和 280 nm 下 测 吸光 率 以 求 更 为 准确 ，OD 260/280 比 应 是 1.8。1 OD=50 pg/ml (参见 注释 4)。 3.3 Bis 在 着 手 进行 臂 的 大 规模 制备 之 前 ， 要 确保 小 规模 制备 的 DNA 能 被 Bam HI 完全 酶 切 。 取 0.5wgDNA 加 2U 的 BamHI 在 适当 的 缓冲 液 (由 厂商 提供 ) 中 组 成 10 yl 反应 体系 ，37 保温 1 h。 DNA ZE 65°C 保温 10 min (以 解 开 cos 末端 )， 冷 却 ， 在 0.5% (w/v) 琼脂 糖 凝 胶 上 进行 电泳 分 析 酶 切 结果 。 如 果 电 泳 结 果 显 示 已 完全 酶 切 ， 则 进行 大 规模 酶 切 ， 如 尚未 完全 酶 切 ， 则 用 酚 进 一 步 抽 提 DNA. 在 500 局 体积 中 用 300 U 的 BamHI 和 适当 的 缓冲 液 酶 切 150 ng 的 载体 DNA， 37C 保温 过 液 。 0.5 pg AY DNA ZE 68°C 中 热处理 10 min 后 与 适当 的 标准 物 一 起 在 0.8% (w/v) HR 脂 糖 凝 胺 上 电泳 以 检查 酶 切 是 否 完全 。 如 反应 不 完全 则 加 大 酶 量 ， 调 整 缓冲 液 和 酶 切 体 积 ， 继 续 保 温 。 一 旦 酶 切 完 全 ， 加 300 UM Sal I 并 适当 地 调整 缓冲 液 ，37? 酶 切 过 夜 以 切 割 填充 片段 (参见 注释 $)。 制备 12 ml 15% 一 35% 的 蔗糖 梯度 (参见 注释 6)。 用 等 体积 的 酚 /氯仿 抽 提 酶 切 过 的 DNA 一 次 ， 在 微型 离心 机 上 离心 5 min 使 之 分 层 ， 再 用 等 体积 的 氯仿 抽 提 以 再 次 分 层 ， 用 300 mmol/L 的 醋酸 钠 和 0.6 倍 体 积 的 异 丙 醇 沉淀 DNA (参见 注释 $)。 在 微型 离心 机 上 离心 以 沉淀 DNA， 在 Speed-Vac 中 干燥 DNA, FH 200 pl TE 缓冲 液 重新 悬浮 DNA。 在 0.01 mol/L MgCl 中 ， 于 42 (Ri 1 h f# DNA AY BATE 末端 复 性 ， 然 后 取 一 份 含 0.5 pg DNA 的 样品 进行 电泳 检测 分 析 。 如 果 DNA 是 完整 的 ， 将 剩余 的 DNA 铺 层 于 梯度 上， 用“ 慢 加 速 ” 和 “不 用 刹车 ” 模式 在 15T 中 以 140 000 g 离心 19 h。 用 21 号 针头 插入 试管 的 底部 收集 管内 溶液 ， 每 管 收集 0.5 ml。( 管 口 可 以 封 上 封口 . 134 . 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 & Se ) ) Yo Yo A ) ) ) ) ) ~ Ye ) ) — 膜 以 阻止 管内 溶液 的 涌 出 ， 在 封口 膜 上 开 一 个 非常 小 的 孔 ， 管 内 溶液 便 开 始 流出 ， 不 然 ， 可 以 用 购 得 的 梯度 分 离 仪 。) 每 隔 一 管 取 出 10 wl, FA 35 pl 的 水 稀释 并 加 8 内 的 上 样 缓冲 液 ，68Y 加 热 10 min, 在 20 cmx20 cm 0.5%(w/v) 琼 脂 糖 凝 胺 上 进行 电泳 ， 将 经 适当 的 限制 酶 酶 切 的 入 作为 标准 ， 标 准 中 盐 和 芒 糖 浓度 要 调整 到 与 样品 一 致 。 确定 含有 入 臂 (20 kb 和 8.9 kb) 的 一 些 收集 管 ， 将 它们 合并 。 如 果 收 集 的 样品 体积 大 时 ， 用 TE 缓冲 液 透 析 ， 或 者 用 TE 缓冲 液 三 倍 稀释 ， 然 后 用 二 倍 体积 的 95% 乙醇 沉淀 过 夜 ， 沉 淀 时 不 另外 加 盐 。 通 过 离心 再 度 回收 沉淀 物 ， 用 70% 的 乙醇 洗涤 ， 于 Speed-Vac 中 干燥 后 溶解 在 适当 体积 的 TE 缓冲 液 中 (使 达 300 一 500 pg/ml). 用 260 nm 处 的 吸光 率 测定 其 确切 浓度 ，5 ug 分 装 样品 并 保存 在 -207 中 。 3.4 基因 组 DNA 的 不 完全 酶 切 (参见 注释 8) 开始 大 量 酶 切 之 前 进行 试验 性 酶 切 ， 取 10 pg DNA, 3 pl Moo 工 缓冲 液 (10x 贮 存 液 ) 和 水 至 终 体 积 27 ul, 37C Ril. 4ES HE O~60 min 范围 内 各 个 预定 反应 时 间 用 的 13 MAS, BoE, BOS yl 终止 液 。 用 冰冷 的 灭 菌 水 稀释 Mobo I 内 切 酶 母液 到 0.5 U/Al， 置 于 冰 上 。 快速 地 加 稀释 过 的 酶 3 pl FIC MRA DNA 中 ， 混 合并 开始 计时 。 立即 取出 2 岂 加 到 第 一 个 定时 试管 中 ， 然 后 每 S min 取 2 pl, HI he。 每 个 定时 样品 都 在 一 块 大 的 (20 cm X 20 cm)0.3%(w/v) 琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 用 入 和 经 Xho 1 BK 下 xzd 开 酶 切 的 入 做 标准 ， 电 泳 后 染色 并 摄影 。 确定 在 15 一 22 kb 范围 内 产生 最 强 菊 光 所 需 的 酶 切 时 间 ， 理 想 的 情况 下 大 约 为 30 min, 扩大 规模 到 在 450 凡 总 体积 中 酶 切 150 pg DNA。 不 过 这 一 酶 切 反 应 仅 需 相应 酶 浓 度 的 一 半 ， 便 可 产生 最 大 量 的 所 需 大 小 范围 的 分 子 风 。 用 小 规模 实验 的 最 适时 间 +5 min 来 确定 确切 的 时 间 ， 在 每 个 预定 反应 时 间 加 150 岂 的 反应 混合 物 到 一 含 EDTA、pH 8.0， 终 浓度 为 20 mmolL 的 冰冷 的 微型 离心 管 中 以 终止 实验 。 将 这 三 份 酶 切 过 的 样品 合并 ， 然 后 按 在 入 臂 的 制备 中 描述 的 那样 加 在 15% 一 35% (w/v) 蔗糖 梯度 上 (人 参见 注释 6)。 离 必 后 ， 分 级 收集 梯度 ， 从 每 隔 一 管 的 收集 物 中 取 10 ul E0.3% (w/v) 的 琼脂 糖 凝 胶 上 连同 适当 的 标准 作对 照 一 起 进行 电泳 。 按 琼 脂 糖 凝 胶 上 测定 的 大 小 在 各 收集 管 上 贴 上 标签 〈 参 见 注释 9)。 将 收集 的 每 一 部 分 稀释 三 倍 ， 用 二 倍 体积 的 953% (v/v) CHE, FE Speed-Vac 中 干燥 后 再 悬浮 于 20 LW KRA TE 缓冲 液 中 。 在 0.8%(w/v) 琼 脂 糖 凝 胶 上 ， 用 已 知 浓度 的 标准 作对 照 电泳 检测 DNA WYRE. “得 85: » 1 YA 2 we 3 Yo 4) 5) 6 Ye 7 ~~ 8 Yo 9 YA 10 YA 11) 12) 13) 14) 15) 16) 3.5 文库 的 构建 DNA 总 量 为 1 pg 的 连接 反应 先 以 和 臂 与 插入 片段 分 别 为 4:1，2:1，1:1 0.5512 比 进行 预 试验 (参见 注释 10)。 用 1 U 的 T4 DNA 连接 酶 连接 150 ug/ml DNA 的 反 应 于 4 进行 过 夜 。 另 外 在 相似 的 条 件 下 单独 进行 0.5 pe 载体 臂 的 连接 以 便 估 计 被 填充 片段 污染 的 载体 所 造成 的 本 底 (SS LIE RE 11 和 12)。 用 购 得 的 包装 试剂 盒 或 用 按 第 二 十 二 章 以 "中 介绍 的 方法 目 制 的 包装 组 分 包装 250 ng 连接 过 的 DNA。 同 时 还 应 包装 天 然 的 入 以 便 确 定 提取 物 的 包装 效率 〈 销 售 的 包装 试剂 盒 总 是 提供 这 个 对 照 )。 从 -70C 冷 藏 柜 中 取出 冻 融 过 的 裂解 物 和 超声 处 理 过 的 提取 物 ， 放 在 冰 上 融化 。 冻 融 过 的 裂解 产物 将 首先 融化 ， 把 它 加 到 仍 处 于 冻结 状态 的 超声 处 理 过 的 提取 物 中 ， 轻 轻 地 混合 。 当 它们 几乎 完全 ， 但 还 未 完全 融化 时 ， 加 入 竺 包装 的 DNA, 混 匀 并 于 室温 中 保温 1 h。 加 0.5 ml 的 SM HAMA, IRA. 在 微型 离心 机 上 离心 30 s 以 去 除 碎片 ， 用 下 列 菌 株 测定 被 包装 DNA 的 效 价 : ) 一 一 LE392 臂 + 插 入 片段 一 -NM539 (spi 选择 ) = ——NM538 和 NM539 it AVA A EE (参见 注释 13)。 和 的 包装 效率 应 比重 新 连接 物 高 约 100 倍 。 在 连接 试验 中 如 果 某 一 组 反应 的 包装 效率 相当 高 ， 那 么 选择 这 一 比率 并 扩大 反应 规 模 以 产生 一 个 完整 的 文库 〈 参 见 注释 13 一 15)。 测 试 一 小 样 。 一 旦 制 成 文库 ， 应 按 注释 14 中 介绍 的 方法 测试 文库 的 完整 性 ， 文 库 在 有 氯仿 时 可 以 无 限期 地 贮存 。 此 后 文库 便 可 根据 需要 先行 扩 增 或 直接 筛选 避 51 (参见 第 三 十 六 型 时 文库 可 像 培 养 平 严 原 种 一 样 进 行 扩 增 ， 应 确保 叭 菌 斑 不 相互 覆盖 生长 以 减少 不 同 的 重组 邑 菌 体 之 间 重 组 的 可 能 性 。 为 了 制备 平 血 原 种 ， 将 50 pl AA PAA 2x 10° 个 重组 子 的 包装 反应 的 样品 与 0.2 ml 的 宿主 细菌 混 匀 ， 在 37C 中 保温 20 mine 分 别 把 每 一 样品 加 入 6.5 ml 熔化 的 上 层 琼 脂 中 ， 混 义 后 倒 入 150 mm 平 亚 中 已 二 燥 的 底层 琼脂 上 。 保温 8 一 10 h， 确 保 这 些 平 阵 是 绝对 水 平 的 ， 以 尽量 减少 克隆 的 扩散 可 能 性 。 将 12 ml 的 SM 培养 基 铺 在 平 了 上， 于 4 中 放置 过 夜 。 取出 噬菌体 悬浮 液 并 将 它 转移 到 一 个 灭 菌 的 聚 丙 烯 管 中 ， 用 4 ml 的 SM 培养 基 剖 洗 平 血 ， 合 并 到 原 悬 浮 液 中 。 加 入 氯仿 至 终 浓度 为 5% (wv)， 并 于 室温 中 放置 153 min， 不 时 摇动 。 以 4000 g 在 4C 中 离心 1$ min 以 去 除 细胞 和 琼脂 碎片 并 回收 叹 菌 体 。 取出 上 清 液 ， 加 氯仿 至 终 浓度 为 0.3% (wv)， 至 此 文库 可 于 4 中 存放 多 年 。 如 果 需 要 的 话 ， 可 用 前 面 介 绍 的 CsCl 梯度 离心 法 将 文库 浓缩 。 9， 4.4 E (1) 为 要 得 到 大 量 的 喉 菌 体 ， 玻 璃 器 严 必 须 非常 清洁 。 用 铬 酸 浸泡 后 再 用 蒸馏 水 彻底 冲洗 才能 达到 这 一 要 求 。 同 时 必须 保持 严格 的 无 菌 控制 ， 因 为 入 的 单 链 cos 末端 是 极度 脆弱 的 而 它 的 完整 性 是 必 不 可 少 的 。 值 得 一 试 的 是 在 10 mmol/L MgCl 中 于 427 保 温 1 h， 然 后 在 0.3% (w/v) 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 以 分 析 cos 末端 是 否 会 复 性 。 显 然 ， 妥 善 管理 喉 菌 体 和 细菌 原 种 的 保存 和 检验 也 是 必要 的 。 详 见 参 考 文 mo) 。 (2) 如 果 氧 化 饮 梯 度 中 最 低 的 区 带 比 叭 菌 体 带 大 ， 这 说 明 在 混合 和 吸取 时 力量 太 大 。 如 果 顶 端 区 带 太 大 ， 将 会 污染 唆 菌 体制 备 物 。 因 此 ， 可 能 须要 在 另 一 个 梯度 上 再 度 离 心 噬菌体 制备 物 。 如 果 产 量 低 ， 可 能 须要 在 制备 的 每 一 步 测 效 价 ， 和 弄 清 损 失 发 生 哪 一 步 以 便 改 进 。 (3) 必须 始终 维持 Mg 的 浓度 ， 否 则 叹 菌 体 颗粒 将 会 解体 。 (4) 1010pfu 的 喉 菌 体 约 产 生 0.44 we DNA。 因 此 ， 从 得 率 为 6x 100pfu/ml 的 200 ml 清除 了 碎片 的 裂解 液 将 得 到 500 pg DNA， 这 时 的 DNA 应 是 无 杂质 的 。 如 果 DNA 的 260/280 比值 较 低 ， 不 管 什么 原因 都 应 返回 到 3.2 小 节 的 第 4 步 从 新 开始 。 断 裂 DNA 的 存在 通常 说 明 吸 取 过 猛 或 酚 的 质量 差 ， 这 时 削 去 吸管 的 尖端 和 重 蒸 酚 的 应 用 都 属 必 要 。 (5) EMBL3 和 4 两 者 的 设计 都 是 为 了 用 Sa 工 切 下 填充 片段 而 使 臂 不 受 损伤 。 由 于 EMBL4 的 Sal 工 位 点 位 于 BamHI 位 点 和 填充 片段 之 间 (EMBL3 则 相反 ， 其 BamHI fiat Sal 工 位 点 和 填充 片段 之 间 ， 所 以 Sal 工 酶 切 将 不 会 克隆 到 Bam HI 位 点 )。 所 以 用 两 种 酶 进行 酶 切 会 明显 地 减 小 因 自 连 而 出 现 完整 的 鸣 菌 体 基因 组 的 可 能 性 。 事 实 上 ， 因 为 Sal 工 酶 切 产 生 的 多 克隆 片段 在 异 丙 醇 沉淀 时 由 于 太 小 不 被 沉淀 而 丢失 ， 因 而 自 连 的 可 能 性 更 小 了 t。 这 阻止 那些 逃 过 由 Spi 筛选 施 加 的 遗传 选择 的 假 重组 子 的 出 现 ， 因 而 进一步 提高 了 文库 的 质量 。 载体 臂 和 供 体 DNA 两 者 都 可 在 低 熔 点 的 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 。 但 这 类 凝 胶 比 蔗糖 梯度 的 容量 小 ， 且 琼脂 糖 中 任何 杂质 都 严重 抑制 连接 反应 。 因 此 ， 实 际 上 我 们 并 不 认为 这 是 一 个 合适 的 分 离 DNA 的 方法 。 如 果 使 黏 性 末端 在 10 mmol/L MgCl, 存在 情况 下 420 中 复 性 1 h， 则 分 离 臂 这 一 步 可 以 进一步 改进 。 这 样 可 以 从 蔗糖 梯度 中 分 离 单一 片段 的 DNA 并 同时 得 以 验 iE DNA 的 大 小 是 产生 一 个 完整 的 文库 中 最 为 重要 的 决定 因素 。 尽 管 一 些 断 裂 是 不 可 避免 的 ， 但 DNA 应 大 于 100 kb， 且 越 大 越 好 ; 否则 ， 当 由 限制 性 内 切 酶 不 完全 酶 切 产 生 一 系列 的 随机 片段 时 ， 这 些 片段 中 将 会 有 很 大 比例 的 非 黏 性 末端 ， 由 于 这 些 片段 只 能 与 两 个 臂 中 的 一 个 结合 ， 因 而 与 载体 DNA 连接 而 形成 不 能 复制 的 片段 ， 从 而 明显 地 降低 了 包装 效率 。 此 外 ， 由 于 用 于 包装 的 叭 菌 体 颗粒 通常 是 多 联 体 ， 所 以 这 些 非 竺 性 末端 将 导致 包装 过 程 的 终止 。 因 此 ， 如 果 供 体 DNA 制备 物 在 凝 胶 上 模糊 一 片 时 ， 还 是 重新 制备 为 好 而 不 是 继续 进行 文库 的 构建 。DNA 质 - 37 (6 YA (7 ~~ (8 — (9 df (10) (11) (12) (13) (14) 量 差 的 原因 通常 是 由 于 机 械 切割 〈( 用 未 削 去 尖端 的 吸管 吸 放 过 猛 ， 或 剧烈 地 混合 ) 或 由 于 溶液 和 玻璃 器 严 的 无 菌 控制 较 差 而 引起 DNase 的 污染 。 不 要 扔 掉 这 些 试管 ， 其 中 的 收集 物 十 分 珍贵 ， 以 后 或 可 作为 不 同 的 载体 或 用 于 稍 大 或 稍 小 的 插入 片段 的 包装 之 用 。 将 它们 于 - 20Y 保存 。 用 下 面 公式 计算 所 需 载体 和 供 体 DNA 量 : 假定 插入 片段 的 大 小 为 20 kb， 其 相对 分 子 质量 约 为 1.27x 107。 臂 是 30 kb， 相 对 分 子 质量 为 1.9x10"， 因 此 ， 就 1:1 比 来 说 : (ug B)/(1.9x 10’) = (pg 插入 片段 )/(1.27X10”) 因此 : po =1.496X pe ARR. MF 1 peg 的 反应 需 0.6 wg WA 0.4 ng 的 插入 片段 。 这 须要 根据 插入 片段 的 平均 大 小 和 臂 与 插入 片段 之 比 进行 调整 品 。 臂 与 插入 片段 之 比 理论 上 应 是 2:1， 但 有 些 分 子 可 能 没有 黏 性 末端 〈 见 注释 8)， 因 而 DNA 的 有 效 浓度 不 同 于 通过 测定 DNA 浓度 而 计算 得 来 的 浓 么 。 所 以 在 大 规模 包装 之 前 有 必要 做 一 系列 比率 的 试验 。 连 接 前 ， 可 用 碱 性 磷酸 酯 酶 处 理 供 体 DNA 以 防止 自 连 ， 这 将 增加 可 用 末端 的 有 效 浓 度 和 连接 的 效率 。 注 意 应 检测 碱 性 磷酸 酯 酶 的 质量 ， 因 为 许多 制品 中 含有 一 些 核 酸 酶 活性 (参见 第 二 十 五 章 )。 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 能 检测 连接 是 否 成 功 。 也 可 在 10 mmol/L MgCh 存在 的 情况 下 ， 将 载体 在 427 中 保温 1 h 使 载体 的 cos 末端 复 性 ， 这 也 是 个 好 办 法 。 入 的 DNA 得 率 至 少 应 是 108pfu/wg DNA， 若 少 于 该 得 率 ， 则 包装 提取 物 本 身 (或 者 对 包装 提取 物 的 处 理 ) 质量 不 好 ， 不 应 进行 大 量 样品 包装 。 记 住 包 装 时 不 要 一 次 解冻 许多 管 包 装 提取 物 ， 而 且 应 将 它们 放置 于 冰 上 。 我 们 还 发 现 分 几 次 进行 小 规模 的 包装 比 只 做 一 次 大 规模 的 包装 为 好 ， 这 与 对 提取 物 的 处 理 有 关 ， 每 次 我 们 AFL 2~3 小 管 。 载 体 臂 单独 在 NM538 上 平 亚 培养 时 DNA 得 率 应 小 于 104pfu/pg， 在 NM539 上 得 率 更 低 。 如 果 包 装 是 高 效 的 ， 而 载体 臂 + 插入 片段 的 得 率 低 于 106 pfu/wg， 则 应 通过 连接 商品 A Exzd 开 酶 切 产物 并 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检测 连接 效果 ， 用 以 鉴定 连接 酶 的 活力 。 如 果 连 接 酶 活力 高 的 话 ， 则 只 用 臂 重复 第 3.5 小 节 的 第 . 1 和 2 步 ， 如 果 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 检测 结果 说 明 连 接 是 高 效 的 ， 那 么 插 六 DNA 的 质 量 有 问题 。 正 如 注释 8 中 提 到 的 ， 这 是 不 能 构建 一 个 高 质量 文库 的 一 个 最 为 常见 的 原因 。 我 们 的 理想 是 构建 一 个 尽 可 能 完整 的 文库 ， 使 得 哺乳 动物 基因 组 中 的 每 个 序列 至 少 在 文库 中 出 现 一 次 ， 应 用 下 列 公 式 可 以 计算 得 到 文库 中 包含 所 需 序列 的 概率 为 99% 时 所 需 的 叭 菌 斑 数 0L4] 。 N=([In(1- P)]/(In(Q1- x/y)] LAP 已 是 所 要 求 的 概率 ，z 是 插入 片段 的 大 小 ，y 是 单 倍 体 基 因 组 的 大 小 ，N 是 必要 的 重组 子 数 。 因 此 ， 假 定 插 入 片段 是 20 kb， 要 得 到 99% 被 克隆 的 概率 在 单个 包装 反应 中 约 需 8x 10° 个 噬 菌 班 。 文 库 的 有 效 程度 可 按 下 列 方法 检测 ， 随 机 挑 取 约 100 个 叭 菌 斑 以 点 阵 方式 点 种 在 涂 满 细菌 的 上 层 琼 脂 上 ， 生 长 后 印迹 到 硝 酸 纤维 素 膜 上 ， 用 标记 的 宿主 细菌 的 完整 的 基因 组 DNA 做 探 针 进行 杂交 。 因 为 在 哺乳 动物 基因 组 中 有 大 量 的 重复 序列 ， 与 探 针 杂 交 后 约 80% 的 克隆 会 产生 杂交 » as - 信号。 (15) 我 们 经 常 发 现在 放大 规模 时 效率 有 所 丧失 。 这 应 在 最 后 的 包装 反应 中 加 以 补 途 。 记 住 加 一 滴 和 氯仿 使 提取 物 澄 净 。 包 装 提 取 物 可 阻止 细菌 的 生长 并 降低 效 价 。 这 一 x 文 时 作者 接受 NIH DK48 960 以 及 爱 因 斯 坦 癌 症 中心 CA 13 330 的 资助 。 oo = 5 xX 献 . Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Haley, J. D. (1988) Cosmid library construction, in Methods in Molecular Biology, vol. 4: New Nucleic Acid Techniques (Walker, J. M., ed.), Humana, Clifton, NJ, pp. 257-283. . Schalkwyk, L. C, Francis, F., and Lehrach, H. (1995) Techniques in mammalian genome mapping. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 37-43. . Hendrix, R. W., Roberts, J. W., Stahl, F., and Weisberg, R. A., eds. (1983) Lambda 11. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. . Kaiser, K. and Murray, N. (1985) The use of phage lambda replacement vectors in the construction of representative genomic DNA libraries, in DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 (Glover, D. M., ed.), IRL, Oxford, Washington. . Frischauf, A. M., Lehrach, H., Poustka, A., and Murray, N. (1983) Lambda replace- ment vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol. 170, 827-842. . Burt, D. and Brammer, W. J. (1985) Bacteriophage 入 as a vector, in Basic Cloning Techniques: A Manual of Experimental Procedures (Pritchard, R. H. and Holland, I. B., eds.) Blackwell Scientific, Oxford. . Loenen, W. A. M. and Blattner, F. R. (1983) Lambda charon vectors (32,33,34, and 35) adapted for DNA cloning in recombination-deficient hosts. Gene 26, 171-179. . Dale, J. W. and Greenaway, P. J. (1984) Preparation and assay of phage A, in Methods in Molecular Biology, vol. 2. Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Clifton, NJ, pp. 201-209. 5 109 - 章 的 内 容 根据 首次 在 《分 子 生物 学 方法 》 第 四 卷 上 发 表 的 一 篇 论文 。 写 上 述 论 第 二 十 四 章 ” 用 于 构建 文库 的 双 链 cDNA 制备 Steve Mayall, Jane Kirk Ti ber] 通过 逆转 录 酶 (reverse transcriptase, RTase) VA mRNA 为 模板 合成 CDNA 是 分 子 克 隆 中 的 基本 技术 。 首 先 应 考虑 的 是 取得 大 量 的 长 EDNA 拷贝 。cDNA 产物 的 长 度 和 质量 主 要 依赖 于 用 作 初 始 物 的 mRNA 的 质量 ， 且 必须 充分 注意 避免 降解 。 合 成 中 所 选用 的 引 物 和 逆转 录 酶 对 最 终 产物 也 有 影响 。 引物 通过 复 性 结合 到 mRNA 上 产生 一 短 的 双 链 区 域 (A 24.1), Rae aw 胞 病毒 (avian myeloblastosis virus, AMV) if $4 3¢ Bi BK Moloney KAA If 病 Ta Be (Moloney murine leukemia virus, MoMuLV) 逆转 录 酶 作用 下 产生 与 RNA 互补 的 DNA 链 。 第 一 条 链 合成 一 个 短 的 发 夹 环 ， 以 前 的 方法 是 利用 这 一 发 夹 环 为 第 二 条 链 合成 反应 3' MENA ee art ee ER mum 5K dT y +dNTP's - 引物 (1) ». NAW ERM SSS 随机 六 核 音 酸 (2) CMEC LT A TEE A BC CONA EERIE ELA EET EE RNase H y Re SE SSS A Sa OD ee ee ee ees | CONA RRA RPETTATT RE TEE DNA 聚合 酶 1 y +dNTP's Oem D NAM NN LANA EINES NS NEE NINE I NEN ig cDNA T4 DNA 聚合 酶 Y T4 DNA 连接 酶 y RARE REL °° 9) Ra eT aE 图 24.1 双 链 cDNA 的 合成 过 程 示 意图 。 OO， 提供 引物 。 随 即 需要 S1 核酸 酶 的 酶 切 来 去 除 这 一 单 链 发 夹 区 。 现 在 蔡 代 它 的 方法 是 利 FA DNA 聚合 酶 I 配 合 RNase H 的 作用 由 小 段 新 合 成 的 DNA 将 mRNA 从 杂种 分 子 中 置 换 出 来 凡 21。cDNA 合成 的 规模 可 用 挫 入 到 第 一 条 链 和 第 二 条 链 的 放射 性 核 苷 酸 进行 检 测 。 一 连 串 的 小 片段 双 链 DNA 经 T4 DNA 连接 酶 的 作用 连接 成 为 一 个 长 链 。 同 时 ， 含 有 EcoRI 位 点 的 接头 被 连接 到 cDNA 的 平 末端 上 ， 然 后 用 EcoRI 切 割 使 之 能 克隆 到 任 何 经 同样 切割 的 载体 上 。cDNA 自身 中 的 EcoRI 位 点 由 于 事先 甲 基 化 而 不 被 酶 解 。 在 有 盐 的 情况 下 精 胺 沉淀 可 除去 大 部 分 未 结合 的 接头 B1。 剩 下 的 接头 可 在 凝 胶 纯 化 这 一 步 中 除去 。 凝 胶 纯化 也 可 用 于 cDNA 大 小 的 选择 。 这 一 cDNA 便 可 被 进一步 用 来 连接 到 所 选用 的 载体 上 。 2. 材 料 所 有 溶液 应 高 压 灭 菌 ， 并 且 可 能 的 话 ， 在 高 压 灭 菌 前 先 用 0.01% 焦 碳 酸 二 乙 酯 (DEPC)37C 处 理 过 夜 。 不 要 把 DEPC 加 到 含有 Tris-HCI 的 溶液 中 。 所 有 玻璃 器 严 应 用 DEPC 处 理 和 /或 180 人 CC 烘 3 hs 只 要 可 能 ， 应 尽量 使 用 经 灭 菌 的 一 次 性 的 塑料 器 阵 。 单 链 核酸 非常 容易 粘 到 塑料 上 ， 因 此 塑料 试管 在 使 用 前 应 当 硅 化 。 无 论 何 时 必须 戴 手 套 以 防止 引入 RNase 污染 ， 同 时 也 要 充分 注意 避免 外 源 DNA 的 污 染 。 除 非特 别 指 出 ， 所 有 酶 及 缓冲 液 都 应 贮存 于 -20Y 中 。 2.1 cDNA 合成 反应 1) 10 关 第 一 条 链 合成 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3, 500 mmol/L KCl, 100 mmol/L MgCl, 10 mmol/L DTT, —20C 保存 。 2) 焦 磷 酸 钠 (NaPPi, 150 mmol/L): Sigma (St.Louis, MO) 公司 有 售 。 3) 人 胎盘 RNase 抑制 物 (100 U/pl): Amersham Life Sciences (Amersham, UK) 公司 有 售 ，- 207 保存 。 10 x dNTP 混合 物 : dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP (每 种 10 mmol/L) 溶液 。 Pharmacia (Uppsala, Sweden) 公司 有 售 ， 于 -207 保存 。 SER — dT 2-195) WM REHLA KA RS| (1 mg/ml): Promega (Madison.WI) 公司 AG, —20CRF. 6) [ou-32P] dCTP (3000 Ci/ mmol): Amersham Life Sciences 7 4] 4 7) polyA* RNA (200 pg/ml): DEPC 2be8at 7k — 70C 保存 。 8) AMV iSeae8 (20 U/l): Amersham Life Sciences 公司 有 售 ， 保 存 于 -20?7 中 。 9) 2x 第 二 条 链 合成 缓冲 液 : 50 mmol/L Tris-HCI、pH 8.3, 200 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgC1,, 10 mmol/L DTT，-207 保存 。 10) RNase H (5 U/pl): Amersham Life Sciences 24] A, —20T 保存 。 11) DNA 聚合 酶 I (5 U/l): Amersham Life Sciences A] A, -—20C 保存 。 12) T4 DNA 聚合 酶 (4 U/pl): Amersham Life Sciences 24] AFF, —20C 保存 。 ~ TAF s 4 a 5 Ne 13) 14 ~~ 5 16 ~~ 17) 18 19 20) 21) 22) 23 ~~ 24 25 — 26 27 28 —— 1) 2) M5. BAe SCAR eH FIR, DN 100 mmol/L Tris-HCl 到 饱和 、pH 8.0, MAH (1:1 ww) 混 合并 保存 于 4°. Rathbone (Walkerburn, Scotland) 公司 有 售 。 饱和 的 氯仿 : 加 TE 缓冲 液 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA) 到 饱和 ， 于 室温 保存 。 DE-81 圆 形 滤纸 : Whatman (Maidstone, UK) 公司 有 售 。 2.2 cDNA 末端 加 接 EcoR I 接 头 5X 绥 冲 液 M: 500 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, S00 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, -207 RFF. 10 x 缓冲 液 SAM: 800 pmol/L S - 腺 苷 甲 硫 氨 酸 ，Sigma 公司 有 售 ，- 207C 保存 。 EcoRI 甲 基 化 酶 (20 U/pl): NEB Labs (Beverly.MA) 或 Amersham Life Sciences 公司 有 售 ，- 20Y 保存 。 10 x 连接 酶 缓冲 液 : 200 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5, 150 mmol/L MgCh, 100 mmol/L DTT, 5 mmol/L ATP. —20C 保存 。 磷酸 化 的 EcoRI #& (150 pmol/pl): NEB Labs Af. —20C RF. T4 DNA 连接 酶 (400 U/ul): NEB Labs SAA. —20C 保存 。 10 x EcoR | 缓冲 液 : 500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100 mmol/L MgCh,10 mmol/L DTT, -20T 保存 。 EcoRI (20 U/pl): NEB Labs 或 Amersham Life Sciences A]. —20T 保存 。 2.3 未 掺 人 的 接头 的 去 除 和 cDNA 大 小 的 选择 精 胺 洗涤 缓冲 液 : 70% 乙 醇 ，10 mmol/L MgCb，0.3 mol/L NaOAc, pH7.0, 4 保存 。 低 熔 点 琼脂 糖 : FMC SeaPlaque 琼脂 糖 ，Flowgen Bioscience (Sittingbourne, UK) - 公司 有 售 。 50xTAE 缓冲 液 : 2 mol/L Tris -醋酸 盐 ，0.05 mol/L EDTA. DNA 相对 分 子 质量 标准 样品 : 0.5 pg 大 小 不 等 的 DNA 梯度 片段 溶 于 5% 的 甘油 ， 内 含 0.04% 溴 酚 蓝 。NEB labs 有 售 。 STE: 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. ee 法 3.1 cDNA 合成 反应 EZ 24.1 中 的 次 序 混 合 第 一 条 链 合成 所 需 的 组 分 〈 参 见 注释 yrs 取出 1 pl 作 挫 入 试验 (参见 注释 8)。 加 1 pl AY AMV 道 转录 酶 〈 参 见 注释 4) 混 合并 于 420 保温 60 min， 置 于 冰 浴 中 并 再 取 1 ul FEB AME - 142 - 24.1 第 一 条 链 合 成 混合 物 10 x 第 一 条 链 合成 缓冲 液 ， 2 pl NaPPi 1 pl HP RNase 抑制 物 1 pl 10 x dNTP 混合 液 2 ul BK dT 或 随机 引物 (SIE 2) 1 yl [a-*P] dCTP 0.5 yl polyA* RNA (参见 注释 3) 5 pl H,0 7.5 yl 3) HR 24.2 混合 第 二 条 链 合 成 所 需 的 组 分 。12Y 保温 60 min, RE 220 保温 60 min， 最 后 70TC 保温 10 min. 表 24.2 第 二 条 链 合成 混合 物 完成 了 第 一 条 链 反 应 的 混合 液 19 yl .2Xx 第 二 条 链 合成 缓冲 液 50 pl [a-**P] dCTP 1 pl RNase H 1 pl DNA # af I 6 pl H,0 23 ul 4) 在 微型 离心 机 上 离心 几 秒 钟 ， 然 后 置 于 冰 上 ， 再 加 1 pl T4 DNA 聚合 酶 补 平 EDNA 的 末端 。 混 合 ， 于 37°C 保温 10 min。 5) 加 2 岂 的 0.5 mol/L EDTA、pH 8.0。 置 于 冰 上 并 取出 1 pl FBAME. 6) 用 等 体积 的 平 衔 酚 / 氯 仿 抽 提 两 次 ， 然 后 用 等 体积 的 饱和 氯仿 再 抽 提 一 次 (BME FE 5). ERAEBAW AHR: 加 100 pl 4 mol/L BREA 200 MIKO, RBG BTTRKE 15 min， 然 后 让 样品 回 温 到 4 ， 在 微型 离心 机 上 4 离心 153 min, B 去 上 清 液 并 用 冰冷 的 70% 乙醇 洗涤 。 再 47 离心 5 min， 移 去 上 清 液 ， 空 气 干 燥 ， 然后 再 次 溶 在 10 pl AY TE 中 (参见 注释 6)。 测定 cDNA 中 放射 性 核 苷 酸 的 挫 入 量 : 将 剩余 的 部 分 以 1 ul OS RES SK DE-81 滤纸 上 且 让 其 干燥 ， 用 200 ml 的 0.5 mol/L NazHPO， (pH 7.0) 溶液 洗 5 次 ， 洗 时 要 非常 轻 地 转动 ， 再 用 200 ml 的 HO 洗 2 一 3 次 直到 清晰 为 止 。 最 后 用 100 ml 的 甲醇 洗涤 并 空气 干燥 。 在 闪烁 计数 器 上 用 甲 葵 配 制 的 闪烁 液 对 滤 膜 计数 ， 并 计算 ?2P 挫 入 量 。 7 a 8 So 3.2 cDNA 末端 加 接 EcoR | 接头 1 YA cDNA 中 的 EcoRI 位 点 的 甲 基 化 〈 参 见 注释 7): D4 pl Sx Be M, 2 pl 10x 冲 液 SAM 和 3 pl HO 到 cDNA 中 ， 混 合 后 于 微型 离心 机 上 离心 几 秒 钟 ， 加 工 品 EcoRI 甲 基 化 酶 ， 混 合 ， 于 37C 保温 60 min. 2) 70°C 保温 10 min 使 甲 基 化 酶 失 活 ， 然 后 置 于 冰 上 。 = 3) 4) 5) 1 Yo 2 Yo 3) 4 4 5 Ye 6 YA i Yo 8 Yo 9 Yo 10 Yo (1) (2) 将 接头 加 接 到 CDNA 末端 : 加 3 pl 10x 连 接 酶 缓冲 液 ，2 pl 磷酸 化 的 EcoRI EX, 2 wl T4 DNA 连接 酶 和 3 pl HzO。 混 合并 于 12T 保温 16 ho 65C 加 热 10 min 使 连接 酶 失 活 后 置 于 冰 上 。 酶 切 带 有 接头 的 CDNA: JN9 pl 10 EcoRI 绥 冲 液 ，49.5 岂 LEHO 和 1.5 风 EcoRI ， 混合 后 于 37 保温 5 h， 然 后 70 加 热 10 min 使 酶 失 活 后 置 于 冰 浴 中 。 3.3 ”未 摊 人 的 接头 的 去 除 和 cDNA 的 大 小 选择 HN 5 pl 2 mol/L KCl fil Spl 100 mmol/L 精 胺 到 90 各 的 已 酶 切 的 带 有 接头 的 CDNA 反应 体系 中 (参见 注释 8)， 涡 旋 振 功 后 置 于 冰 上 30min。 在 47 微型 离心 机 上 离心 153 min， 小 心地 移 去 上 清 液 后 加 1 ml 精 胺 洗涤 缓冲 液 ， 置 于 冰 上 30 min 后 小 心地 移 去 上 清 液 并 再 洗 一 次 。 用 70% 乙 醇 洗涤 一 次 ， 空 气 干 燥 后 将 沉淀 物 溶 于 9 由 的 TE 中 。 用 含有 0.5 pg/ml EB 的 1xTAE 配 制 一 个 1% 低 熔点 琼脂 糖 凝 胶 ， 放 在 4C、 30 min 使 凝 胶 凝 固 ， 在 电泳 槽 中 加 1 x TAE 缓冲 液 到 凝 胶 的 高 度 ， 但 不 要 浸没 凝 胶 。 于 cDNA 样品 中 加 工 由 S0% 的 甘油 ， 上 样 。 若 不 加 上 样 染 料 则 较 难 上 样 ， 但 在 紫 外 线 灯 下 较 易 看 见 少 量 的 DNA。 在 一 邻近 的 泳 道中 上 样 含 染料 的 DNA 相对 分 子 质 量 标准 。 4°C 中 人 恒 压 电泳 到 溴 酚 蓝 到 达 凝 胶 的 中 部 为 止 ， 在 长 波 紫外 线 灯 (用 长 波 的 目的 是 使 紫外 线 对 DNA 的 损伤 降 到 最 低 程 度 ) 下 观察 ， 并 切 下 相当 于 大 小 在 700 一 7000 bp 之 间 的 cDNA 的 一 条 凝 胶 。 如 果 此 凝 胶 块 较 大 ， 可 能 有 利于 浓缩 cDNA， 将 这 块 凝 胶 反 向 插入 到 另 一 低 熔 点 凝 胶 中 并 同 前 次 一 样 电 泳 ， 直 到 cDNA 被 浓缩 在 一 罕 带 中 。 每 100 mg 凝 胶 块 加 400 wl STE. 65 保温 10 min， 用 等 体积 的 平衡 酚 抽 提 一 次 ， 再 用 平衡 的 酚 / 氧 仿 抽 提 一 次 ， 最 后 用 饱和 氯仿 抽 提 一 次 。 吸 液 时 避 开 分 界面 ， 其 - 中 含有 白色 琼脂 糖 粉 未 。 FA 0.1 倍 体积 的 4 mol/L 醋酸 铵 和 2.5 倍 体积 的 无 水 乙醇 沉淀 。 置 于 冰 上 30 min, 4C 离心 30 min, AN 70% 乙醇 洗 涤 沉 淀 。 FX Spl TE 重 悬 沉淀 物 ， 取 0.5 ul 与 已 知 浓度 的 相对 分 子 质 量 标准 样品 二 起 在 1% 的 琼脂 糖 凝 胺 上 电泳 ， 以 测定 CDNA 的 大 小 和 浓度 。 剩 余 的 CDNA 以 工 岂 等 量 分 装 后 于 -707 保存 。 保 存 的 CDNA 应 能 在 几 个 月 中 保持 稳定 。 4. 35 释 反应 规模 可 放大 到 cDNA 的 大 量 合成 。 所 有 反应 组 分 应 在 冰 上 轻 轻 混 匀 。 SER dT 或 随机 六 核 苷 酸 引 物 可 用 于 cDNA 合成 ， 最 常用 的 守 聚 - dT 引物 可 复 性 到 mRNA 的 poly (A)* 尾 上 ， 这 样 产生 的 大 部 分 是 全 长 的 cDNA， 尽 管 大 的 mRNA 的 5 端的 反 转 录 将 有 所 从 缺 。 随 机 引物 常用 于 某 种 目的 ， 如 表达 型 文库 的 制备 ， .144 - (3 =—_Z (4) (S S (6 — (7 (8) 非常 长 的 转录 物 的 S mHN BR, a RRR SER dT 引物 时 因 mRNA 二 级 结构 所 产生 的 难题 。 有 时 mRNA 的 二 级 结构 影响 cDNA 的 合成 ， 这 类 问题 可 以 通过 在 cDNA 合成 前 将 polyA* RNA 加 热 到 70C . 1 min 后 立即 置 于 冰 上 冷却 而 得 以 避免 。 AMV 和 MoMuLV 二 者 的 逆转 录 酶 都 可 用 于 cDNA WARK, AMV 逆转 录 酶 由 于 只 须 用 很 少 几 个 单位 ， 故 使 用 较为 普遍 。 可 是 有 报道 认为 在 一 定 条 件 下 用 MoMuLV 逆转 录 酶 可 以 合成 长 达 10 kb 的 cDNA. 这 一 步 及 其 随后 各 步 中 cDNA 的 回收 可 用 手持 式微 型 监测 器 监控 ， 预 计 初 始 读数 是 100 一 200 cps. 这 个 阶段 的 材料 可 保存 在 -20C， 建 议 在 继续 进行 其 他 步骤 前 取 一 小 部 分 双 链 cDNA (0.5 pl) 在 1% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 用 以 指明 cDNA 产物 的 大 小 范围 。 克隆 的 效率 应 首先 用 模拟 cDNA 来 检测 ， 而 不 应 冒 丢 失 珍贵 的 CDNA 的 风险 。 模 拟 cDNA 应 由 类 似 于 cDNA 大 小 的 平 末端 的 磷酸 化 的 片段 组 成 。 cDNA 的 最 大 损失 发 生 在 精 胺 沉淀 和 凝 胶 纯化 这 两 个 步 又 。 这 些 损 失 是 不 可 避免 的 ， 因 为 除去 反应 液 中 过 多 的 短 cDNA 和 所 有 痕 量 的 未 结合 的 接头 是 绝对 必要 的 。 在 反应 液 中 残留 的 少量 接头 分 子 的 末端 与 连接 到 载体 上 的 带 有 接头 的 CDNA 的 末端 相 比 ， 前 者 的 物质 的 量 将 大 为 超过 后 者 。 这 将 导致 文库 中 大 部 分 克隆 不 含有 可 检测 的 擂 入 片段 ， 即 基本 上 是 一 个 空 文库 。 这 一 问题 可 以 通过 把 胶 纯化 后 对 接 上 接头 的 -cDNA 再 一 次 用 精 胺 沉淀 而 得 到 解决 。 参考 文 献 — . Gubler, U. and Hoffman, B. (1983) A simple and very efficient method for gener- ating cDNA libraries. Gene 25, 263-269. 2. Okayama, H. and Berg, P. (1982) High-efficiency cloning of full-length cDNA. Mol. Cell. Biol. 2, 161-170. . Elledge, S. J., Mulligan, J. T., Ramer, S. W., Spottswood, M., and Davis, R. W. (1991) AYES: a multifunctional cDNA expression vector for the isolation of genes by complementation of yeast and Escherichia coli mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1731-1735. 4. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. WwW > PS = 第 二 十 五 章 cDNA 文库 的 构建 Michael M. Burrell ill 1. 引 要 获得 一 个 mRNA 的 cDNA 克隆 ，DNA ASCH UL mRNA, H cDNA 文库 必 须 大 到 足以 代表 目的 mRNA 所 属 的 丰 度 类 。 例 如 Goldbergi 已 证 明 在 烟草 中 全 部 mRNA 群体 可 分 为 三 级 ， 多 数 mRNA (11 300) 属于 最 低 丰 度 类 ， 占 多 核糖 体 mRNA 的 39% 。 要 想 获 得 至 少 含 有 这 个 丰 度 类 中 每 一 种 mRNA 的 一 个 克隆 的 CDNA 文库， 就 需要 约 2x 105 个 克隆 [2 。 使 用 构建 双 链 CDNA 的 高 效 的 RNase HW! (参见 第 二 十 四 章 ) 以 及 把 体外 包装 的 叹 菌 体 导 入 大 肠 杆 菌 的 方法 ， 只 要 用 几 微 克 的 mRNA 便 可 以 实现 这 一 目的 。 选 择 适 当 的 入 载体 非常 重要 ， 因 为 如 果 外 源 DNA 的 择 入 使 该 重组 的 入 基因 组 大 于 野生 型 长 度 的 105% ， 包 装 的 噬菌体 的 生存 力 就 会 降低 。 mRNA 分 子 的 大 小 在 几 百 个 碱 基 到 几 千 个 碱 基 之 间 。 适 合 这 一 长 度 的 DNA 的 载体 是 Xgtl10， 因 为 它 能 接纳 长 达 7.6 kb 的 DNA 片段 。 如 果 目 的 mRNA 接近 或 超出 这 一 长 度 ， 那 么 应 选择 别 的 载体 。 合理 的 克隆 策略 是 当 文库 在 进行 平 严 培养 时 亲本 喉 菌 体 应 受到 抑制 。Xgt1l0 可 以 完 成 这 一 任务 ， 因 为 其 亲本 噬菌体 是 cI+ imm™, EEE. coli 的 hflAl0 菌 株 中 〈 如 C600 hf1) 受到 有 效 的 抑制 。cDNA 插入 该 基因 的 EcoRI 位 点 产生 cl 表 型 ， 这 些 叭 菌 体能 形成 噬 菌 斑 。 在 非 Cgl 菌株 (4 C600) 上 ，cI 产 生 表 型 混浊 的 喉 菌 斑 ， 而 cl 则 产生 透明 的 喉 菌 斑 。 如 果 想 用 抗体 来 筛选 CDNA 文库 ， 则 另 一 合适 的 载体 是 Xgtl1。)gtll 作为 表达 型 载 “ 体 具 有 若干 个 有 用 的 特征 : EcoRI 克 隆 位 点 处 在 lacZ 基因 的 3“ 端 ， 一 般 认 为 它 对 所 表 达 的 蛋白 质 有 稳定 作用 。》gtll 能 接纳 大 到 7.2 kb 的 插入 片段 ， 并 产生 一 个 温度 敏感 的 溶菌 阻 过 物 (1857), TARE TE 427 时 失效 ， 此 外 它 包 含 一 个 琥珀 突变 S100, 该 突 变 使 吹 菌 体 在 不 含 抑制 基因 SupF 的 宿主 中 不 能 溶菌 。 这 些 特征 于 是 可 与 带 有 对 lacZ 的 表达 具 强 烈 阻 遇 作用 的 pMC9 质粒 的 宿主 细胞 相 结合 。 这 类 宿主 细胞 同时 也 是 on BA 酶 缺失 的 ， 这 将 使 克隆 和 扩 增 过 程 中 插入 片段 所 编码 的 任 一 蛋白 质 的 副作用 降 到 最 低 程 度 。 不 过 当 用 抗 血 清 筛 选 时 ， 利 用 IPTG 灭 活 lac 阻 遏 物 仍 可 得 到 高 水 平 的 表达 。 尽管 用 这 些 载 体 有 许多 优点 ， 但 在 使 用 前 有 几 点 应 该 值得 考虑 。)gt10 长 43.34 kb, 因而 一 个 1 kb 的 插入 片段 只 是 整个 DNA 的 一 小 部 分 。 这 样 ， 要 获 同样 量 的 插入 DNA 的 话 ， 从 选用 的 入 克隆 中 制备 的 DNA 总 量 要 比 从 选用 的 质粒 克隆 中 制备 的 多 得 多 。 高 效 的 克隆 需要 好 的 包装 提取 物 ， 而 要 制备 包装 提取 物 很 费事 ， 不 过 好 在 它们 也 有 商品 出 售 。 将 克隆 保持 在 Xgtl0 和 Xgtll 中 并 不 可 取 ， 除 非 已 经 知道 它们 是 稳定 的 。 用 抗体 进 行 筛选 似乎 很 好 ， 但 是 需要 能 识别 目的 肽 的 特定 的 抗体 ， 该 目的 肽 是 融合 产物 而 未 必 以 =。 146 - HRBRRKASTE. Ab, FSIERA cDNA 克隆 被 以 错误 的 阅读 框 插入 到 Xgtll +, A 此 不 能 产生 正确 的 蛋白 质 。 AZAP (Stratagene 公司 生产 ) EA ABA, ERIE a Hb sz a CDNA fff A 段 的 亚 克 隆 多 。 该 载体 含有 Bluescript 质粒 ， 所 以 当 细 胞 被 fl 辅助 鸣 菌 体 超 感 染 后 ， 质 粒 便 被 切割 并 以 共 价 闭合 单 链 环 的 形式 进行 包装 。 包 装 的 “ 噬 粒 ” (phagemid) 可 用 来 感染 新 的 宿主 并 在 宿主 中 像 Bluescript 质粒 一 样 复制 。 在 文库 构建 中 ，cDNA 被 克隆 到 Bluescript 多 克隆 片段 中 ， 所 以 XZAP 有 众多 的 克隆 位 点 可 供 克 隆 ， 且 可 像 Xgtll 一 样 能 利用 蓝 和 白斑 选 择 。 该 载体 也 可 以 用 来 构成 表达 型 文库 。 本 章 叙 述 Xgtl0 和 Agtl 1 文库 的 构建 ， 这 些 方法 同样 适用 于 XZAP， 但 读者 应 根据 制造 商 的 建议 作 适 当 的 更 改 。 用 Agt10 或 Agtl1 构建 cDNA 文库 过 程 中 有 许多 步 又。 本 章 从 Xgtl0 与 Xgtll 的 培养 Fil st bal AKA DNA 的 制备 的 方法 开始 ， 随 后 介绍 由 载体 DNA 制备 入 臂 的 方法 和 cDNA 连接 到 这 些 臂 上 的 方法 。 因 此 ， 这 里 假定 读者 有 已 制备 好 的 合适 的 DNA (参见 第 二 十 四 章 )。 本 章 最 后 介绍 将 DNA 包装 成 为 活 的 叭 菌 体 并 感染 E. coli 形成 文库 的 方法 。 下 面 介 绍 的 操作 程序 在 我 们 这 里 做 得 很 顺利 。 可 能 还 有 其 他 的 方法 和 变化 同样 也 能 成 功 。 至 于 更 深层 次 的 内 容 ， 读 者 可 查阅 Glover[5] 和 Sambrook 等 加 的 著作 。 2. 材料 (参见 注释 1) 酶 可 以 购 得 ， 这 些 酶 可 与 随 之 提供 的 缓冲 液 一 起 使 用 ， 不 过 在 某 些 情况 下 ， 正 如 人参 考 文献 [9 所 指出 的 ， 用 自己 配制 的 缓冲 液 更 合适 。 2.1 供 和 gtl0 或 Xgtll 感染 的 宿主 细菌 的 制备 1) 世 - 肉 汤 培 养 基 : 总 量 1L 中 加 10 g 细菌 培养 用 胰 和 蛋白 肪 ，$ g 细菌 培养 用 酵母 提取 物 ，10 g NaCl， 调 pH 值 到 7.5。 2) 底层 琼脂 : L - 肉 汤 培 养 基 中 加 1.$% 的 琼脂 ， 高 压 灭 菌 后 保存 。 3) 20%: 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 4) HEAR: AgtlO 的 宿主 细菌 : C600(F ,el4 ,[McrA ], thr-1, leuB6, thi”, lacY1, supE44, rflbD1, fhuA21); % Bnn93(F , e14°, [McrA” ], hsdR [r,m; ], thr-1, leuB6, thi, lacY1, supE44, fhuA21, mcrB); 或 C600 hfl. Agtl1 的 宿主 细菌 Y1088(F , dlacU169, supE, supF, hsdR [r, m; J, met, trpR, fhuA21, proC:: Tns [pMC9; tet", amp™]); 8% Y1089(F~ , AlacU169, lon-100, araD139, strA, hflA'™, proC:: Tn10 [ pMC9; ter’, amp"]); 8 Y1090(F , AlacU169, lon-100, araD139, rps1[Str']supF, mcr A, trpC22 ::Tnl0 [pMC9; tet', amp"]). AZAP #5 74 = 4 Ba : XL-1 blue (F-, proAB*, lacI* lacZ AM15, supE, hsdR). + 147 - 5) 10 mmol/L MgSO4: 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 YA 2.2 AgtlO 原 种 的 效 价 测 定 和 鸣 菌 斑 纯 化 6) ABA. 整个 DNA 或 制备 好 的 和 臂 都 有 商品 出 售 ，3.2 一 3.6 小 节 介 绍 入 臂 的 制备 。 7) 和 稀释 剂 ， 10 mmol/L Tris-HCLI、pH 7.5，10 mmol/L MgCh, 0.1 mmol/L EDTA. 8) 上 层 琼脂 : L - 肉 汤 培 养 基 中 加 0.7% 的 了 琼脂， 高压 灭 菌 后 贮存 。 注 意 XNDNA 纯化 时 用 琼脂 糖 代 替 琼脂 。 9) Ati: 供 细菌 裂解 用 的 氯仿 应 尽 可 能 新 鲜 ， 否 则 会 导致 \ 叹 菌 体 失 活 。 2.3 AgtlO #0 AgtlIDNA 的 制备 10) FRR: 甲 酰胺 的 质量 要 好 ， 确 保 其 纯度 很 高 ， 和 否则 通过 重 结晶 使 其 纯化 。 11) T;sE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EDTA. 12) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA. 2.4 入 的 EcoR1 HY 13 a 适当 的 限制 性 内 切 酶 和 缓冲 液 : 就 Mgtl0 和 Agtl1 来 说 ，EcoRI 是 克隆 所 常用 的 ， 至 于 其 他 的 入 载体 ， 别 的 限制 性 内 切 酶 可 能 更 适合 。 酶 的 使 用 见 参考 文献 6。 14) 0.5 mol/L EDTA: 调 pH 值 至 8.0 以 利于 溶解 ， 高 压 灭 菌 。 15) &: 用 100 mmol/L Tris-HCl 平衡 的 重 蒸 酚 。 16) 氯仿 / 丁 醇 : 50:1 的 氯仿 / 丁 醇 混合 液 。 17) 4 mol/L BAR. pH 7.5。 2.5 和 的 磷酸 酶 解 18) 10x CIP 缓冲 液 : 0.5 mol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.5。 19) CIP: 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 (Boehringer), 4C 保存 ，CIP 较 细 菌 碱 性 磷酸 酯 酶 不 易 被 核酸 酶 污染 。 2.6 cDNA 和 载体 的 连接 20) 10 x 连接 缓冲 液 : 0.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mol/L MgCl, 100 mmol/L DTT. -2CR#. 21) 1 mmol/L WAKE: 加 热 到 80OC 、10 min, —20C 保存 。 22) 5 mmol/L ATP: —20C 保存。 23) T4 DNA 连接 酶 : -—20T 保存 。 - 148 。 2.7 体外 包装 24) 包装 混合 物 :， 可 购 得 或 实验 室 自制 (参见 第 二 十 二 章 )。 2.8 供 选 择 用 入 文库 的 平 严 培养 25) X-gal: 2%5 -省 -4 - 氯 -3 - 吗 吕 -8B-D- 半 乳糖 苷 深 于 二 甲 基 甲 酰胺 中 ， 于 -207 保存 。 26) 1 mol/L 异 丙 基 硫 代 -B-D - 半 乳 糖苷 (isopropylthiogalactoside, IPTG) 溶 于 灭 菌 蒸 饮水 中 ， a ‘Li 20T 保存 。 Bis Bain AS 本 节 假 定 实验 者 已 制备 了 准备 插入 EcoRI 位 点 的 双 链 cDNA。 3.1 宿主 细菌 的 制备 1) ESA 0.2%#F EH L-ABisRE EO LMS EL. coli BHR (PREY 株 的 选择 )，37 培养 过 夜 。 2) 在 含有 50 ml L - 肉 汤 培 养 基 和 0.2% RFR 250 ml 三 角 人 烧瓶 中 接种 单个 菌落 ， 37C 振 划 培养 (220 r/min) 过 夜 ， 避 免 泡 沫 产生 。 3) 取 40 ml 的 培养 细胞 ，3000 g 离心 10 min。 4) 4247 中 用 20 ml 10 mmol/L MgSO, 重 悬 浮 细 胞 (参见 注释 2)。 5) 用 10 mmol/L MgSO, 将 ODioo 调 到 2.0. 3.2 和 gtl0 原 种 的 效 价 测定 和 鸣 菌 斑 纯化 为 要 高 效 地 制备 供 克 隆 用 的 优质 的 Xgtl0 DNA, BEAM EM AR PHA, FF 检查 原 种 中 是 否 被 形成 透明 吹 菌 斑 的 突变 型 所 污染 ， 这 种 突变 型 的 存在 会 使 后 面 筛选 文 库 的 工作 复杂 化 。 1) 将 0.1ml 和 稀释 液 中 的 噬菌体 和 0.1 ml 的 平 严 培养 宿主 细胞 〈C600) 一 起 于 37T 培养 20 min 以 测 叹 菌 体 原 种 的 效 价 ， 培 养 时 轻 轻 播 动 。 2) 加 3 ml 顶层 琼脂 ， 转 动 混合 后 倒 在 补充 有 0.20 FN LEME (参见 注释 3)。 3) 37 培养 过 夜 。 4) 如 有 透明 的 噬 菌 斑 出 现 ， 用 灭 菌 的 细 滴 管 或 毛细 管 将 一 混浊 鸣 菌 斑 转移 到 含有 1 ml 和 稀释 液 的 Eppendorf 管 中 ， 加 一 滴 (S0~100 pl) 氯仿 终止 细菌 生长 ， 如 果 马 上 要 用 ， 室 温 放 置 1 h， 和 否则 4 过夜 。 5) 假定 吻 菌 体 数 为 106 个 ， 连 续 稀释 以 测定 效 价 。 "49 - 6) tA EBA AY Oe BBE BL 则 重复 第 44. 7) 当 没有 透明 叭 菌 斑 出 现时 ， 以 2000 吻 菌 斑 生 成 单位 (plaque forming unit, pfu)/82 mm *F UL#E TIFF, WIE 15 000 Av Wie BE PE BS FF TE TE BO BBE 8) We — AE A Ae BE / 10° 则 继续 纯化 ， 直到 克隆 非常 纯 且 稳定 为 止 。 3.3 AgtlO DNA 的 制备 1) 准备 充足 的 用 于 制备 DNA 的 叹 菌 体 原 种 ， 以 1x 10° pfu/ 亚 接种 15~30 个 82 mm ML 〈 人 参见 注释 4)。 2) 制备 新 鲜 的 平 严 培养 宿主 细菌 〈C600): 倒 15 一 30 个 工 - 肉 汤 培 养 基 + 0.2% 葡 萄 糖 2M (BIER 5)。 在 3 ml 的 上 层 琼脂 中 加 0.1 ml 宿主 细菌 和 1 x 10° 噬菌体 。 作为 对 照 ， 一 个 亚 中 不 加 Xgtl0， 另 一 个 亚 中 不 加 入 和 细菌 。 也 可 用 较 大 的 平 亚 ， 但 操作 前 须 多 加 练习 。 3) 37C 中 培养 4 一 6 h 后 平 严 将 显露 出 斑点 ， 如 果 值 得 怀疑 ， 则 不 宣 培 养 太 久 ， 和 否则 效 价 会 降低 ; 如 平 严 一 片 混浊 则 说 明 培 养 过 头 。 4) 4f 中 或 于 冰 上 冷却 30 min， 加 上 4.5 ml 冰冷 的 入 稀释 液 和 几 滴 氯仿 (用 滴 管 )， 4 过 夜 以 便 噬菌体 扩散 到 和 稀释 液 中 。 5) 小 心地 将 平 血 中 的 入 稀释 液 转移 到 聚 丙烯 离心 管 中 ， 不 要 弄 碎 上 层 琼脂 。 6) 10 000 g 离心 20 min 以 沉淀 细胞 和 琼脂 ， 将 上 清 液 小 心地 转移 到 适合 于 甩 平 式 转 子 的 洁净 的 离心 管 中 。 7) 70 000 g 离心 90 min。 8) 用 5 ml 和 稀释 液 重新 悬浮 噬菌体 沉淀 ， 加 8.5 g CsCl， 再 用 14 ml 密度 为 1.47 g/ml 的 CsCl 在 上 面 铺 加 。 用 Beckman 70Ti 转子 以 5000 r/min (184 000 g) 离心 过 夜 ， 慢 慢 地 加 速 。 在 最 后 40 min 中 将 速度 降低 到 40 000 r/min 〈 见 注释 6)。 9) 吸取 稍 带 蓝 色 的 白色 噬菌体 条 带 ， 吸 取 的 体积 越 小 越 好 ， 再 加 至 少 是 等 体积 的 含有 密度 为 1.5 g/ml 的 CsCl 的 入 MERE 4 ml。 在 Kontron 80.4Ti 转子 EW - 60 000 r/min 离 心 4 h。 10) 以 尽 可 能 小 的 体积 吸取 叭 菌 体 带 ， 加 入 稀释 液 到 1 ml。 11) 加 1 ml PRK, HARA MAR 2h. 12) 加 1 ml SDW #1 6 ml 无 水 乙醇 ，DNA 应 立即 得 以 沉 省 。 13) 在 台式 离心 机 上 稍 作 离心 后 吸 去 上 清 液 。 14) 用 TsE 重 新 溶解 DNA， 并 再 用 乙醇 沉淀 两 次 〈 参 见 注释 7)。 15) 最 后 ， 将 DNA 溶 于 TE 缓冲 液 中 。 3.4 Agtll DNA 的 制备 Agtl1 DNA 制备 的 前 几 步 不 同 于 上 述 制备 AgtlO DNA 的 方法 ， 因 为 在 这 里 可 以 利 用 温度 敏感 的 溶菌 阻 过 这 一 特性 。 例 如 可 首先 在 32°C 中 增殖 细胞 ， 然 后 在 440 中 诱导 溶菌 。 “SSD - 1) 将 Y1088 和 aAgtll 混合 ， 于 32C HM 42CHTEODBRUBIEME 2CHRERE. 2) 将 一 单 菌落 中 的 细菌 接种 在 含有 10 ml L - 肉 汤 培 养 基 + 10 mmol/L MgCh 的 Mc- Cartney 瓶 中 ， 转 动 ， 拧 松 瓶 盖 于 32Y 培养 过 夜 。 3) 取 10 ml 过夜 培养 物 加 入 到 含 1L 已 预 热 到 327 的 世 - 肉 汤 培 养 基 的 3 世 三 角 烧 瓶 中 ， 于 旋转 式 摇 床 上 在 327 中 以 280 r/min 培养 至 ODioo =0.6 (2 一 3 h)。 4) 在 烧瓶 中 放置 一 灭 过 菌 的 温度 计 ， 并 在 OOCHKAE PRHRIE, HERA FK 温度 达 440 Wik, RAF 44 中 充分 通气 培养 153 min. 5) 在 37Y 中 充分 通气 培养 3 h。( 温 度 不 可 以 降 到 37 人 以下， 否则 将 很 少 有 裂解 )。 6) 将 约 2 ml 的 培养 液 和 几 滴 氯仿 混合 于 一 小 试管 中 以 便 检 查 裂 解 情况 ， 培 养 液 应 在 3~5 min 内 变 清 。 7) 加 10 ml 氧 仿 到 培养 液 中 并 于 37C 振 功 10 min. 8) 在 6x300 ml 转子 (MSE. 21 或 同类 转子 ) 上 ， 用 带 螺 旋 盖 的 聚 丙 烯 离心 瓶 以 5000 r/min (300 g) 在 45 中 离心 10 min 将 细菌 碎片 沉淀 。 9) 10 000 r/min (15 500 g) Be RV UE ASEH 3.3 小 节 中 步骤 8 继续 处 理 (人 参见 注释 8)。 3.5 AH EcoRI 8) 这 一 步 和 下 一 步 涉 及 Xgt10 和 gtll 臂 的 制备 ， 从 而 使 EDNA 能 连接 到 它们 的 两 辟 之 间 。 两 个 载体 都 仅 有 一 个 EcoRI 位 点 。 在 Xgt10 中 此 位 点 在 cI 基 因 中 ， 外 源 DNA 的 揪 入 将 产生 cl” Re (AAW BABE); 在 Xgtll 中 此 位 点 位 于 IacZ 基因 中 。 因 而 ， 当 Ngtll ERAS A X-gal 的 培养 基 的 平 秋 上 培养 时 ， 带 有 揪 入 片段 的 叹 菌 体 将 形成 白 色 的 噬 菌 斑 ， 而 野生 型 噬菌体 将 则 形成 蓝 色 叭 菌 斑 。 1) 在 100 岂 的 总 体积 中 混合 下 列 物质 : 10 pgDNA, 10 ml10x EcoRI RHRMAKAR 馏 水 ， 要 考虑 到 第 3 步 中 第 一 次 加 入 30 U 酶 的 体积 。 2) 离心 使 液体 集中 到 管 底 。 3) 加 30 TU 的 EcoRI， 和 体积 要 <20 pl. 4) 混 匀 后 37C 保温 2 h。 5) 加 30 U EcoRI 并 再 保温 30 min. 6) 加 2 pl 0.5 mol/L EDTA. 7) 加 50 I RMUERE AR, BRIS (AA RRS, BIE RT). 050 pl A/ ET (50:1). 8) 离心 并 吸取 水 相 。 9) 加 等 体积 的 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0， 回 抽 酚 /氯仿 层 。 10) 氯仿 〈 用 和 氯仿/ 正 丁 醇 ，5$0:1) 抽 提 合并 的 水 相 。 11) 2.5 倍 体积 的 乙醇 和 1/40 总 体积 的 4 mol/L ARR, F-20C 沉淀 。 * $52 - 3.6 》 的 磷酸 酶 解 严格 说 来 ， 对 Xgtl0 来 说 这 一 步 并 非 必要 ， 我 们 之 所 以 要 这 样 做 ， 是 因为 它 对 结果 不 但 没有 害处 而 且 还 会 使 C600 上 的 cDNA 克隆 更 易 检 测 。 1) 在 180 岂 的 水 中 重新 悬浮 已 酶 切 的 和 载体， 加 20 pl 10 x CIP 缓冲 液 。 2) 0.1 UM CIP, ¥F 37C 保温 15 min。 3) 加 2.5 pl AY 0.5 mol/L EDTA， 混 匀 后 加 热 到 S6C 保温 10 min。 4) 用 125 pl AVM, HED, FEIN 125 几 氧 仿 / 正 丁 醇 (50:1)， 轻 轻 混 匀 后 于 370 保 温 10 min。 5) 按 上 面 的 方法 重 抽水 相 。 6) 用 125 pl TE 缓冲 液 回 抽 有 机 相 ，377 保温 10 min。 7) 与 水 相合 并 。 8) 用 氯仿 / 正 丁 醇 (50:1) 抽 提 两 次 。 9) 在 -20C 中 用 2.5 倍 体积 的 无 水 乙醇 和 1/40 总 体积 的 4 二 MARR RYE, JLo Bh 后 DNA 即将 沉淀 。 3.7 cDNA 和 载体 的 连接 重要 的 是 要 能 确定 在 包装 和 感染 这 两 步 以 后 的 哪 一 步 的 效果 还 不 够 理想 ， 为 此 要 进 行 下列 连 接 反应 作为 对 照 。 D 未 酶 切 的 和。 @ EcoRI 酶 切 的 、 未 磷酸 酶 解 的 和 。 @ EcoRI 酶 切 的 、 磷 酸 酶 解 的 和。 ® EcoRI 酶 切 的 、 未 磷酸 酶 解 的 ， 加 EcoRI 酶 切 的 2 一 3 kb 的 测试 DNA. © EcoRI 酶 切 的 、 未 磷酸 酶 解 的 X， 加 cDNA (参见 注释 9)。 1) 适当 量 的 CDNA 与 1 pe 适当 的 载体 混合 。 同 时 设 连接 的 对 照 组 。 用 水 补足 至 90 yl, 加 10 pl 2 mol/L NaCl， 混 匀 并 加 2.1 倍 体积 的 乙醇 ， 冷 却 。 2) 在 4C 中 离心 20 min 以 沉淀 CDNA 和 载体 ， 小 心地 倒 去 上 面 的 乙醇 。 3) 用 0.5 ml 的 乙醇 〈( 预 冷 到 -20C ) 洗涤 沉淀 。 在 微量 离心 机 上 离心 S min。 4) 去 除 乙醇 ， 再 用 乙醇 ( 预 冷 到 - 20 ) 洗 一 次 。 将 沉淀 冷冻 干燥 5 一 10 min。 S) 用 3 由 的 灭 菌 双 蒸 水 溶解 沉淀 。 加 1 pl 混合 液 (5 pl 10 x 连接 缓冲 液 +5 pl 1 mmol/L WZ). 6) 6ST 加 热 min, FRYE OPEB 30 s。 7) 于 46C 保温 20 min. 8) HN 0.5 wl S mmol/L rATP fil 1.0 pl AY T4 DNA 连接 酶 ， 充 分 混 匀 但 不 用 涡 旋 振 功 ， 离心 30 s。 9) 于 127 保温 24 h。 | 3.8 体外 包装 要 以 极 少 量 的 CDNA 建立 大 的 cDNA 文库 ， 就 必须 进行 好 连接 有 DNA 插入 片段 的 叭 菌 体 的 包装 。 可 是 ， 新 手 通常 不 能 进行 有 效 的 包装 ， 因 此 ， 在 作 cDNA 包装 之 前 总 是 先 用 一 些 对 照 DNA 来 检验 包装 提取 物 。 我 们 使 用 的 包装 过 程 与 第 二 十 二 章 介 绍 的 稍 有 不 同 。 1) NS pl BERRA DNA 中 ， 用 吸管 头 混 匀 。 2) BH FME 15 min. 3) DN 10 pl Pl aR ay RA BD 4) 室温 培养 1 h。 5) 加 180 pl A HPEMIFIES 6) MRAW HHT ELI, MATE ACRE. 3.9 供 筛选 用 的 入 文库 的 平 血 培养 在 开始 大 规模 的 文库 筛选 之 前 ， 必 须 先 确定 文库 的 效 价 〈 即 一 定数 量 的 包装 好 的 入 SCRE Ar P= AE AY a BA BER) 1) 稀释 1% 包 装 好 的 入 文库 到 0.1 ml 和 稀释 液 中 ， 加 0.1 ml 宿主 细菌 (rgtl0 用 C600, Agtl1 用 Y1088, AZAP 用 XL~-1 blue), 37C 轻 摇 培 养 20 min. 2) 培养 期 间 ， 熔 化 足够 的 供 平 严 培 养 用 的 上 层 琼 脂 并 冷却 到 47. 3) 培养 结束 时 加 3 ml 上 层 琼脂 ， 转 动 混 匀 后 倒 在 补充 有 0.2%KRF EH L-ABEM (参见 注释 3) 上 。 对 于 Agtl1 和 XZAP 须 用 刚刚 混合 的 40 pl X-gal 与 20 pl IPTG 补 充 到 上 层 琼脂 中 。 4) 倒置 平 阵 ，37Y 培养 过 夜 。 5) 统计 喉 菌 斑 数 以 确定 文库 效 价 。 对 于 Xgtl0 根据 透明 鸣 菌 斑 数 确定 重组 噬 菌 斑 BY SAAR ER) 的 百分比 ， 对 于 Xgtll 和 和 XZAP WREATH AR (BOE FE 10). 6) 扩大 规模 ， 平 严 培 养 足够 的 噬菌体 以 筛选 所 需 的 CDNA (参见 注释 11 一 14)。 记 住 应 在 C600 Afl 细胞 上 培养 Xgtll。 4. 释 (1) 用 于 核酸 工作 的 所 有 溶液 都 应 灭 菌 ， 并 保证 没有 核酸 酶 。 除 特别 指明 外 ， 溶 液 都 在 室温 保存 。 所 有 玻璃 和 塑料 器 亚都 应 硅化 。 (2) 重新 悬浮 细菌 时 ， 起 初 总 是 用 小 体积 的 液体 ， 当 出 现 乳 浆 状 时 ， 再 加 剩 下 的 重 悬 浮 液 体 。 (3) 平 亚 培养 叭 菌 体 时 ， 用 充分 干燥 的 或 保藏 两 天 的 平 血 。 当 加 上 层 琼脂 和 叭 菌 体 时， 上 层 琼 脂 温 度 应 为 45 一 50C ， 依 次 操作 每 个 样品 ， 避 免 产 生气 泡 ， 并 将 平 严 放 在 - 153 - (4 — (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 水 平 的 工作 台 上 30 min, HFM FOV AE. AgtlO 可 从 溶菌 液 中 制备 ， 但 不 能 识别 出 噬菌体 的 cI- 回 复 突变 型 ， 从 而 使 对 带 有 插入 片段 噬菌体 的 确定 容易 出 错 。 | 制备 Xgtl0 DNA RY, L-A 汤 培养 基 平 严 中 的 葡萄 糖 可 使 效 价 增 加 10 倍 。 关于 这 个 梯度 的 背景 知识 参看 参考 文献 7。 处 理 高 相对 分 子 质量 的 DNA 动作 要 轻 ， 避 免 产 生 剪 切 力 ， 否 则 DNA 容易 降解 。 如 果 不 具 备 适 用 于 过 夜 离心 的 离心 机 ， 可 用 聚 乙 二 醇 〈PEG) 沉淀 噬菌体 。 于 室 温 的 250 ml 上 清 液 中 加 15 g NaCl, 25 g PEG - 6000，1.5 ml 10 mg/ml 的 RNase A 和 1 mg/ml ff) DNase I。4Y 中 搅拌 至 少 3 h， 最 好 是 过 夜 。 然 后 10 000 r/min 离 心 30 min 以 收集 噬菌体 。 再 次 悬浮 于 5 ml 的 入 稀释 液 中 ， 并 加 氧 仿 于 室温 抽 提 除 去 PEG。 可 是 ， 作 者 发 现 用 此 方法 回收 叹 菌 体 似 乎 结果 不 很 稳定 。 所 用 的 cDNA 量 完 全 取决 于 它 的 长 度 和 质量 。1 一 5 ng 的 DNA 已 可 用 来 构建 大 的 文库 。 不 要 扩 增 多 于 所 需要 的 量 ， 因 为 即使 没有 IPTG， 鸣 菌 斑 大 小 的 变化 也 相当 大 。 记 住 用 50 wg/ 岂 的 氨 革 青霉素 以 维持 产生 阻 过 物 的 质粒 。 含有 8- 半 乳糖 苷 酶 融合 蛋白 的 Xgtll 和 XZAP AY PA BE AY BE Se LR 所 需 叹 菌 斑 的 数量 依赖 于 cDNA 在 整个 文库 中 的 可 能 的 丰 度 ， 范 围 大 约 应 为 10*~5 x 10°. AgtlO IK ME BER URS E—* 82 mm APE ML ELAN 1000 个 叹 菌 斑 可 供 筛选 ， 宿主 细菌 密度 增加 一 倍 时 鸣 菌 斑 便 缩 小 ， 这 将 有 利于 大 文库 的 筛选 。 随 着 Agtl0 数 的 增加 ，6 h 后 就 可 进行 筛选 而 不 需 过 夜 。 平 严 培养 筛选 Mgtll 和 AZAP 文库 时 ， 省 去 X-gal 和 IPTG. 参考 文 献 . Goldberg, R. B., Hoschek, G., and Kamalay, J. C. (1978) Sequence complexity of nuclear and polysomal RNA in leaves of the tobacco plant. Cell 14, 123-131. . Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1982) Molecular Cloning. A Labo- ratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Harbor, NY. . Gubler, E. and Hoffman, B. J. (1983) A simple and very efficient method for gen- erating cDNA libraries. Gene 25, 263-269. . Short, J. M., Fernandez, J. M., Sorge, J. A., and Huse, W. D. (1988) Lambda ZAP: a bacteriophage lambda expression vector with in vivo excision properties. Nucleic Acids Res. 16, 7583—7600. . Glover, D. M. (1985) DNA Cloning, vol. 1: A Practical Approach, IRL, Oxford, UK. . Burrell, M. M. (1993) Enzymes of Molecular Biology. Methods in Molecular Biol- ogy, vol. 16. Humana, Totowa, NJ. . Garger, S. J., Griffith, O. M., and Grill, L. K. (1983) Rapid purification of plasmid DNA by a single centrifugation in a two step cesium chloride-ethidium bromide gradient. Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, 835-842. 一 No Ww > vn CN ~— * 254.* 第 二 十 六 章 SCR AY iii ae Janet C. Harwood, Adrian J. Harwood Ul 1. 引 前 面 几 章 介绍 了 基因 组 和 cDNA 的 入 文库 的 构建 。 本 章 我 们 介绍 筛选 文库 的 两 种 方 法 。 第 一 种 方法 是 通过 序列 同 源 性 原理 进行 筛选 ， 适 用 于 筛选 基因 组 文库 和 CDNA XC 库 。 具 体 方 法 是 : 先 用 平 亚 培养 文库 ， 然 后 在 平 阵 上 覆盖 一 张 如 硝化 纤维 素 之 类 的 膜 ， 将 文库 影印 在 膜 上 。 将 每 一 叭 菌 斑 内 重组 和 噬菌体 DNA 变性 并 固定 到 膜 上 。 这 样 ， 原 始 平 亚 上 的 鸣 菌 斑 的 位 置 在 膜 上 得 以 准确 地 表示 ， 然 后 用 标记 核酸 杂交 以 鉴定 特定 的 克 隆 ， 将 杂交 产生 的 放射 自 显影 片 与 琼脂 平 血 相 比 就 可 以 分 离 出 阳性 克隆 。 通 过 连续 的 平 亚 培 养 和 杂交 便 能 纯化 克隆 。 筛选 入 文库 的 第 二 种 方法 是 通过 和 蛋白质 表达 而 进行 的 。 具 体 方法 是 : 将 cDNA 克隆 在 入 表达 型 载体 如 Xgtll 上 以 ?1。 再 将 表达 型 文库 进行 平 严 培养 并 诱导 蛋白 表达 ， 最 后 转移 到 膜 上 。 最 常用 的 筛选 方法 是 用 表达 蛋白 的 抗体 〈 免 疫 筛 选 )， 但 也 可 用 有 蛋 日 质 :DNA， 蛋 和 白质: 蛋白质 ， 甚 至 蛋白 质 : 配 体 的 相互 作用 进行 筛选 ,4。 最 简单 的 免疫 筛选 法 是 用 盖 工 直接 标记 一 级 抗体 。 然 而 ， 放 射 性 标记 的 抗体 易 产生 高 的 背景 而 且 具 有 较 大 的 公害 ， 同 时 未 必 比 现 有 的 酶 法 更 灵敏 。 多 数 方法 是 使 用 结合 有 一 种 酶 ， 如 藻 根 过 氧化 物 酶 (HRP) 或 碱 性 磷酸 酯 酶 (AP) 的 二 级 抗体 ， 对 于 这 些 酶 都 有 非常 灵敏 的 检 测 方法 。 酶 促 检 测 的 另 一 优点 是 可 以 在 膜 上 直接 产生 出 信号 ， 使 得 与 唆 菌 斑 对 齐 比较 更 为 准确 。 最 灵敏 的 免疫 筛选 法 是 用 抗 生 物 素 蛋 白 - 生 物 素 检测 系统 5 4， 这 种 检测 系统 的 生物 学 基础 是 四 分 子 的 生物 素 非 常 牢 固 地 结合 到 一 分 子 的 抗 生 物 素 蛋 白 上 ， 使 检测 系 统 具 有 放大 能 力 ， 从 而 提高 系统 的 灵敏 度 。 通 过 生物 素 标记 的 二 级 抗体 与 生物 素 标记 的 HRP 和 抗 生 物 素 蛋白 复合 体 之 间 的 反应 可 达到 最 大 程度 的 放大 。 本 章 我 们 介绍 供 核 酸 杂 交 和 免疫 筛选 用 的 影印 膜 的 制备 方法 ， 同 时 也 介绍 用 二 级 搞 体 的 简单 免疫 筛选 的 方法 。 最 后 ， 我 们 还 介绍 小 规模 入 DNA 制备 〈 小 量 制备 ) 的 方法 ， 这 种 方法 能 制备 可 供 限 制 性 内 切 酶 酶 切 的 高 质量 的 DNA。 2. 材 料 2.1 MHRA 1) 硝化 纤维 素 膜 (SEK 1): 每 个 被 筛选 的 平 血 需要 两 张 膜 ， 硝 化 纤维 素 膜 不 必 Kea 〈 人 参见 注释 2)。 2) 3 MM 滤纸 (Whatman, Maidstone, UK): 切 成 比 膜 稍 大 的 尺寸 。 3) 4) 5) 6 Ye 7 Yo 8) 9) 10) 11) 12 . —— 13 Ye 14) 15) 16) 17) 18) 19) 20) 变性 液 , 1.5 moyL NaCl, 0.5 mol/L NaOH， 此 溶液 应 现 配 。 中 和 液 : 1.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.0. 20 SSC: 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬 酸 钠 、pH 7.4。 用 去 离子 水 稀释 成 为 x SSC 工作 溶液 。 SM 缓冲 液 : 1 中 含 5.8 g NaCl, 2 g MgSO4 :2HO，50 ml 的 1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 415 ml 2% 明胶 。 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 2.2 筛选 表达 型 文库 IPTG: 配制 10 mmol/L 异 丙 基 硫 代 -B-D- 半 乳糖 苷 溶液 以 50 ml 分 装 ，= 20TH 存 。 | TBS: 20 mmol/L Tris-HCl, 137 mmol/L NaCl, pH 7.6. TBST: 20 mmol/L Tris-HCl, 137 mmol/L NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20. TBST 封 阻 剂 : 在 TBST 中 加 3%BSA (组 分 V: Sigma [St.Louis, Mo] A4503). 抗体 : 在 筛选 前 应 通过 Western 印迹 测定 抗体 的 效 价 ， 以 确证 它 有 较 强 的 信号 ( 检 测 50 pg 变性 蛋白 ) 及 低 的 本 底 !。 文 库 筛 选 时 ， 用 产生 可 接受 的 本 底 的 最 高 稀释 度 。 二 级 抗体 应 与 适当 的 检测 系统 相 结合 ， 例 如 ， 放 射 性 标记 ， 或 结合 到 HRP 或 AP 上 。 如 果 一 级 抗体 是 IgG， 可 用 蛋白 A 代替 二 级 抗体 。 一 级 抗体 溶液 可 在 0.02% 释 所 化 钠 中 保存 于 4C ， 并 且 可 反复 使 用 几 次 。 检测 试剂 : 应 使 用 适当 的 检测 系统 。 用 一 种 有 效 的 直接 对 膜 进 行 染 色 的 显 色 法 来 检 测 AP， 所 用 染色 液 是 5 -省 -4 - 氧 -3 15) HR BERS (BCIP) Al A PGMA(NBT;8). 膜 拷贝 的 方法 见 第 7.8 和 十 章 。 2.3 二 级 和 三 级 筛选 L - 肉 汤 养 基 : 1 L 中 溶解 10 g 细菌 培养 用 的 胰 蛋 白 肪 ，5 g 酵母 提取 物 和 5 g NaCl， 调 pH 值 到 7.2， 高 压 灭 菌 。 要 培养 入 则 加 MgSO, 至 终 浓 度 为 10 mmol/L. 上 层 琼脂 : 在 1 补充 有 10 mmol/L MgSO, 的 工 - 肉 汤 培养 基 中 加 7 g 细菌 培养 用 琼脂 ， 高 压 灭 菌 。 L Skis: 在 1L 补充 有 10 mmol/L MgSO, 的 工 - 肉 汤 培养 基 中 加 15 g 细菌 培养 用 琼脂 ， 高 压 灭 菌 。 和 宿主 细菌 : 适当 菌株 的 新 鲜 培 养 物 〈 人 参见 注 释 3)。 TM: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol/L MgSO4。 2.4 入 鸣 菌 体 的 小 量 制备 RNase A: 10 mg/ml 溶 于 去 离子 水 中 ，- 20 保存 。 DNase A: 1 mg/ml 溶 于 去 离子 水 中 ， -20C 保存 。 20% PEG/2 mol/L NaCl: 于 TM 中 配制 ， 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 > a96 “ 21) 去 离子 水 配制 的 10% SDS (w/v), ZRF. 22) 0.5 mol/L EDTA: 调 pH 值 到 8.0 使 溶解 ， 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 23) 蛋白 酶 KK: 10 mg/ml 的 溶液 ，- 20T7 保存 。 24) M/A: 酚 与 氯仿 1:1 的 混合 液 。 酚 用 pH 8.0 的 Tris-HCl 平衡 。 25) Afi. 26) 醋酸 钠 : 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 5.2， 高 压 灭 菌 ， 室 温 保 存 。 27) ZB: 无 水 和 70% (v/v) 两 种 贮存 液 。 28) 10x 凝 胶 加 样 缓冲 液 : S0% 甘 油 ，0.5% SDS, 10 mmol/L EDTA, 0.25% ]RMiK, 1 2 3 4 ) ) YA 5) 6 7 8 9 10 11 ) ) ) ) Se YA 0.25% 二 甲苯 青 。 3. A 法 在 制备 影印 膜 之 前 ， 按 第 二 十 二 和 二 十 五 章 中 介绍 的 方法 平 严 培 养 入 文库 。 3.1 鸣 菌 斑 杂 交 在 覆盖 硝酸 纤维 素 膜 前 使 平 秋 于 4Y 中 冷却 至 少 1 h。 小 心地 在 每 一 平 阵 上 放 一 张 膜 ， 注 意 在 膜 与 琼脂 之 间 不 要 形成 气泡 ， 膜 在 平 亚 上 放 置 3 min. . 用 19 号 针头 在 膜 的 四 角 刺 孔 次 入 琼脂 中 以 标志 四 个 角 (参见 注释 4)， 用 笔 在 平 严 的 底 上 画 一 小 “x”， 以 标明 琼脂 中 和 孔 的 位 置 。 取 出 每 张 膜 并 做 上 标记 (参见 注释 5 立即 在 平 阵 上 放置 另 一 张 膜 ， 放 $ min 以 制作 第 二 张 (RIA) 影印 膜 。 用 针尖 以 与 第 一 次 同样 的 方式 标记 该 副本 膜 ， 这 样 ， 在 杂交 后 可 把 两 张 放 射 自 显影 片 加 以 排 齐 比较 。( 参 见 注 释 6)。 将 平 严 倒置 保存 在 IC. 将 每 张 膜 转移 到 一 张 浸 在 变性 溶液 中 的 3 MM 滤纸 上 ， 噬 菌 斑 一 面 朝 上 ， 放 置 5 min. 将 膜 在 盛 有 中 和 溶液 的 浅 盘 中 漂洗 $ min。 取出 膜 ， 在 3 x SSC 中 漂洗 2 min. 于 3 MM 滤纸 上 吸 干 膜 并 于 80 们 中 烘 1 h。 用 第 6 章 中 介绍 的 核酸 探 针 进 行 杂 交 。 重 要 的 是 在 自 显影 前 要 在 膜 的 周围 标 上 适当 的 方位 标志 ， 使 放射 自 显影 照片 与 膜 得 以 准确 对 齐 。 在 放射 自 显影 片上 标明 针 孔 的 位 置 ， 并 与 副本 对 齐 ， 阳 性 喉 菌 斑 将 在 两 张 放 射 自 显 影片 上 都 出 现 (参见 注释 7)， 通 过 针 孔 可 使 放射 自 显 影片 和 平 严 对 齐 。 用 宽 嘴 的 滴 管 取出 比 阳性 噬 菌 斑 稍 大 的 琼脂 块 以 挑 取 阳性 噬 菌 斑 。 在 进行 第 二 次 得 选 前 将 琼脂 块 挤 入 1 ml SM 缓冲 液 中 ， 并 在 室温 中 浸泡 2 h 或 4 人 过 夜 ，( 参 见 3.3 小 节 )。 这 项 技术 作 适 当 改变 后 可 用 于 筛选 细菌 菌落 ， 例 如 可 从 质粒 文库 和 秋 粒 文库 〈 人 参见 = EZ > 注释 8) 及 M13 叭 菌 体 克隆 (参见 注释 9) 中 筛选 细菌 菌落 。 3.2 筛选 表达 型 文库 1) 将 表达 型 文库 与 适当 的 宿主 一 起 接种 平 阵 ， 并 将 这 些 平 亚 于 42 尼 培养 3 一 4 h (SB 见 注释 10). 2) 将 所 需 数量 的 硝酸 纤维 素 膜 浸 在 10 mmol/L IPTG 中 ， 使 用 前 室温 中 于 cling film 上 和 王 燥 几 小 时 。 3) 当 鸣 菌 斑 已 长 到 适当 大 小 时 (参见 注释 11) 放 上 第 一 张 膜 并 将 平 严 放 在 370 中 至 少 培养 4 h (参见 注释 12)。 4) 标 出 所 有 膜 的 四 角 并 从 平 严 中 取出 膜 (参见 3.1 节 )， 立 即 放 到 TBS 中 。 5) PERI, KOE MAZE 37Y 中 培养 3 ho 6) 每 张 膜 在 TBS 中 洗 5 min， 重 复 一 次 ， 然 后 在 TBST - 封 阻 剂 中 室温 放置 至 少 1 h， 也 可 在 4°C 中 保温 过 夜 。 按 下 列 顺序 洗 膜 : 先 用 TBST 冲洗 2 次 ， 再 用 TBST 洗 15 min， 最 后 用 TBST 洗 两 次 ， 每 次 $ min. 8) 加 一 级 抗体 并 置 于 振荡 平台 上 ， 在 室温 中 播 1 一 4 h 或 4 摇动 过 夜 。 9) FA TBST 洗 膜 ， 第 一 次 洗 15 min， 第 二 、 三 次 各 洗 $ min (参见 注释 13)。 然 后 加 二 级 抗体 并 置 于 振 功 平台 上 ， 室 温 中 摇 1 h。 从 二 级 抗体 中 取出 膜 并 按 下 列 顺 序 洗 膜 : 先 用 TBST 冲洗 两 次 ， 再 用 TBST 漂洗 15 min， 最 后 用 TBST 漂洗 两 次 ， 每 次 min. 使 用 适当 的 检测 系统 ， 并 将 已 处 理 好 的 膜 或 显影 了 的 胶片 与 文库 平 严 对 齐 ， 并 按 3.1 节 第 11 FAY PIEPER BA Ee Bl BE f Se 10 11 ~~ 3.3 ”第 二 和 第 三 级 筛选 1) 将 每 一 浸泡 含 叭 菌 斑 的 琼脂 块 的 SM 缓冲 液 作 下 列 稀释 ; 10 pl DF 1 ml 的 SM 中 〈10- :稀释 度 ) 100 pl 的 10 一 稀释 液 加 到 1 ml 的 SM 中 〈10-3 稀 释 度 ) 100 pl 的 10 一 稀释 液 加 到 1 ml 的 SM 中 〈10-4 稀 释 度 ) 100 由 的 10 一 稀释 液 加 到 1 ml 的 SM 中 〈10-5 稀 释 度 ) 2) 分 别 加 10 由 的 107°, 10°44 10 5 稀 溶 液 到 0.3 ml 的 宿主 细菌 和 3 ml SOC 中 保温 的 已 融化 的 上 层 琼脂 中 ， 将 每 个 混合 液 分 别 倒 平 严 并 保温 过 夜 ， 这 样 ， 这 些 平 亚 上 噬菌体 的 稀释 度 就 分 别 是 SM 叭 菌 体 原液 的 10-5，10-56 和 1077, 3) 按 3.1 小 节 的 方法 再 次 筛选 ， 同 样 挑 取 阳 性 鸣 菌 斑 的 琼脂 块 到 SM 中 。 4) 假定 效 价 为 107 叭 菌 斑 /ml， 作 下 列 稀释 0 ， 10 由 加 到 1 ml 的 SM 中 (10> ?稀释 度 ) 1) 原文 稀释 有 误 ， 已 巴 订 正 。 一 一 译 者 注 “SS - 100 pl 10 ?稀释 液 加 到 1 ml 的 SM (10° ?稀释 度 ) 100 pl 10° ?稀释 液 加 到 1 ml HY SM 中 (10 “稀释 度 ) 分 别 加 10 wl A 10°*, 10°24 10 “FREE 0.3 ml 宿主 细菌 和 3 ml SOC 中 保温 的 已 熔化 的 上 层 琼脂 中 ， 平 严 培 养 每 一 混合 液 并 保温 过 夜 。 结 果 应 分 别 产生 1000, 100 和 10 (MRA BE. 5) 按 3.1 节 方法 再 次 筛 选 并 挑 取 含 阳性 叭 菌 斑 的 琼脂 块 到 SM 中 。 6) 以 培养 下 上 的 溶菌 产物 形式 保存 阳性 叹 菌 体 。 为 此 ， 在 9 cm 直径 的 平 亚 上 可 培养 10° WERT 〈 约 10 pl 的 三 级 筛选 原液 )。 操 作 方 法 像 前 面 一 样 ， 并 于 37 培养 过 夜 。 整 个 菌 苦 应 被 溶菌 。 7) 加 5 ml TM， 并 于 室温 中 缓慢 地 摇 2h, RACHHK. 8) 用 吸管 将 TM 转移 到 离心 管 中 ，4 和 中 4000 g 离心 10 min。 吸 取 上 清 液 ， 加 入 一 滴 氯仿 ， 并 于 4 保存 。 3.4 入 鸣 菌 体 的 小 量 制备 1) 制备 平 严 溶菌 产物 ， 除 在 平 严 中 用 琼脂 糖 代 替 琼脂 外 ， 其 余 同 3.3 节 ， 第 5 步 (人 参 见 注释 14), HS ml TM 加 在 平 由 上， 于 室温 缓慢 振 功 2 h 或 4Y 振荡 过 夜 。 2) 用 吸管 将 TM 转移 到 离心 管 中 ， 再 用 1.5 ml TM 洗 平 阵 ， 合 并 于 离心 管 中 ， 在 47C 中 以 4000 g 离心 10 min。 3) 吸取 上 清 液 ， 加 2 pl RNase 和 2 pl DNase, 37°C 保温 30 min. 4) 加 等 体积 的 20% 的 PEG/2 mol/L NaCl， 置 于 冰 上 2 h。 5) 在 4 中 以 10 000 g 离心 10 min。 轻 轻 地 倒 出 上 清 液 ， 用 卷 简 纸 尽 可 能 吸 干 管 壁 。 6) 用 0.5 ml 的 TM 重新 悬浮 叭 菌 体 沉淀 ， 加 5 wl 10% AY SDS fl 5 pl 0.5 mol/L EDTA, 65C 保温 5 min. 7) 12 pl SARK, FF 37C 保温 30 min. 8) 用 等 体积 的 酚 / 氧 仿 抽 提 两 次 ， 再 用 氯仿 抽 提 一 次 。 9) 用 0.1 倍 体积 的 醋酸 钠 和 2 倍 体积 的 无 水 乙醇 沉淀 。 10) 每 亚 溶 菌 产物 的 沉淀 物 于 50 TE 中 重新 悬浮 ， 如 有 必要 ， 可 加 热 至 SO0C 以 使 其 溶解 。 取 2 pl 与 适当 的 相对 分 子 质 量 标准 一 起 在 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 以 检测 得 率 。 11) 在 100 由 总 体积 中 用 5 pl RNase 和 50~ 100 U 的 酶 消化 每 一 份 10 则 的 小 量 制备 的 DNA 样品 2 一 3 h。 加 入 0.1 体积 的 醋酸 钠 和 2 倍 体积 的 无 水 乙醇 ， 置 于 冰 上 5 min, 于 台式 离心 机 上 离心 15 min。 移 去 上 清 液 ， 空 气 干 燥 后 溶 于 18 pl TEP. M2 yl 10x 凝 胶 加 样 缓冲 液 ， 电 泳 前 加 热 至 68Y 保持 3 min， 然 后 置 于 冰 上 冷却 (IER 15). 4. 党 AE (1) 也 可 使 用 其 他 的 杂交 膜 ， 但 我 们 推荐 用 硝酸 纤维 素 膜 ， 许 多 含 尼 龙 的 膜 是 很 黏 的 ， » > (2) (3) (4) (S Ye (6 4 (7 Yo (8) (9 Ye (10) (11) Wl EEE A HB PO LB PE Feet APRS E EDL. SCRHEBLAES ST 7k PBC EAE, 但 必须 将 膜 夹 在 两 张 3 MM 滤纸 之 间 除 去 过 多 的 水 分 。 至 关 重 要 的 是 必须 确保 膜 湿 得 均匀 ， 如 果 不 能 做 到 的 话 ， 可 调换 不 同 厂家 的 膜 ， 或 者 在 0.1% SDS PVR 1 一 2 min， 接 着 用 薰 馏 水 洗 S 次 以 充分 洗 净 。 从 甘油 保藏 的 原 种 中 取 适 当 菌 株 在 L - 肉 汤 琼 脂 平 阵 上 划 线 接种 ， 于 37 忆 倒置 培 养 过 夜 。 例 如 可 用 于 AEMBL 的 NM359， 可 用 于 XgH0 的 C600， 可 用 于 和 gtll 的 Y1090， 可 用 于 XZAP 的 XI - 1 blue。 如 果 用 Y1090, 平 阵 上 应 加 氮 葵 青霉素 (50 pwg/ml) 以 维持 质粒 pMC9 上 的 Lac RAGE. 将 新 长 出 的 细菌 接种 到 100 ml 含有 10 mmol/L MgSO4 fl 0.2%# FH LAB 培养 基 中 ， 置 播 床上 .37 它 培养 ， 生 长 至 0.5 As 时 分 装 培养 物 到 两 个 50 ml RA 烯 管 中 ， 于 台式 离心 机 上 以 2000 g 离心 10 min 以 沉淀 细菌 ， 小 心地 移 去 上 清 液 ， 重新 悬浮 于 40 ml 10 mmol/L MgSO, 中 。 注 意 : 沉淀 可 能 较 松 散 。 在 准备 使 用 平 亚 培 养 出 细菌 前 可 于 4Y 短期 保存 。 重要 的 是 能 使 最 终 的 放射 自 显影 胶片 上 的 位 置 与 平 阵 上 的 位 置 相对 应 。 AF OL 一 般 是 正方 形 的 或 圆 形 的 ， 所 以 定位 孔 的 位 置 分 布 越 不 对 称 越 好 。 应 注意 不 要 在 揭 膜 时 连同 上 层 琼 脂 一 起 揭 下 ， 在 加 上 层 琼脂 培养 物 前 先 使 平 亚 干 燥 有 助 于 上 层 琼脂 的 附着 ， 用 琼脂 糖 代替 琼脂 同样 有 利 。 如 果 有 上 层 琼脂 粘 到 膜 上 必须 非常 小 心地 洗 去 。 杂交 常 产生 班 点 状 的 背景 ， 可 能 被 错 认为 是 阳性 的 杂交 鸣 菌 班 。 因 而 ， 对 副本 影 印 膜 进 行 杂 交 是 很 重要 的 ， 这 样 可 以 减少 假 阳 性 喉 菌 斑 数 。 当 将 膜 放 到 平 咀 上 时 常常 会 导致 在 平 咽 上 向 着 加 膜 的 方向 轻微 移动 ， 这 一 现象 可 以 加 以 利用 ， 过 度 的 移动 应 该 避免 ， 但 是 少量 的 移动 是 有 用 的 ， 因 为 它 可 以 导致 阳性 喉 菌 班 形成 一 个 小 的 “ 彗 ” 尾 ， 可 帮助 从 背景 中 识别 真正 的 阳性 。 杂 交 过 乍 -中 膜 可 能 会 轻微 地 伸展 ， 因而 当 膜 与 噬 菌 斑 对 齐 时 应 允许 少量 偏 移 。 放 射 自 显影 片上 的 信号 与 单个 的 噬 菌 斑 一 一 对 齐 是 不 可 能 的 ， 因 而 与 信号 对 应 范围 中 的 所 有 鸣 菌 斑 都 应 连同 琼脂 一 起 挑 取 ， 然 后 再 进行 平 亚 培养 以 作 第 二 次 筛选 。 通常 须要 再 一 次 (第 三 次 ) 筛选 以 确切 地 分 离 出 阳性 克隆 。 同样 的 方法 可 用 于 筛选 质粒 文库 和 黏 粒 文 库 ， 甚至 在 亚 克 隆 时 还 可 筛选 细菌 转化 子 。 不 管 怎样 ， 细 菌 在 变性 前 在 SDS 中 溶菌 (3.1 小 节 ， 第 5 步 ) 以 限制 质粒 DNA 的 扩散 。 这 主要 是 通过 从 平 严 的 表面 制作 影印 膜 ， 并 把 菌落 面 朝 上 置 于 浸 在 10% SDS 的 3 MM 纸 上 3 min 而 实现 的 。 已 制作 影印 膜 的 平 亚 应 置 于 37 尼 中 几 个 小 时 使 菌落 在 制作 副本 影印 膜 或 保存 平 严 前 能 再 度 生 长 。 筛选 重组 子 M13 叭 菌 体 是 非常 简单 的 ， 因 为 DNA 是 以 单 链 形式 被 包装 的 。 进 行 盘 选 时 像 鸣 菌 体 中 描述 的 一 样 制作 影印 膜 ， 然 后 立即 在 80 中 烘 干 。 42° 中 生长 阻止 溶 原 化 的 发 生 。 如 果 阳 性 噬 菌 斑 很 分 散 ， 那 么 便 易于 识别 。 重 要 的 是 唆 菌 斑 不 能 相互 粘连 在 一 起 ， 为 避免 这 一 情况 的 发 生 ， 平 阵 培养 密度 不 能 大 于 每 平方 厘米 500 WR BE, FF AD 须 经 常 观察 噬 菌 斑 的 生长 。 叭 菌 班 在 42 时 生长 较 快 。 * Tou * (12) MRAM COKER, ROR EMER, MERA, WARK fF ME 4 h， 第 二 张 膜 4 一 6 h。 (13) 如 果 一 级 抗体 易于 形成 高 的 背景 信号 ， 可 尝试 在 移 去 初级 抗体 后 进行 下 列 洗涤 : 用 TBST 洗 一 次 ，15 min, A 2 mol/L 尿素 ，10 mmol/L 甘氨酸 ，1% NP40 HE 一 次 ,15 min， 最 后 用 TBST 洗 两 次 ， 每 次 1$ min。 (14) 用 上 层 (0.7%) 和 底层 (1.4%) 琼脂 糖 蔡 代 琼脂 ， 这 样 可 以 避免 存在 于 琼脂 中 的 限制 性 内 切 酶 抑制 物 。 (15) 被 克隆 的 cDNA 插入 片段 通常 仅 是 入 鸣 菌 体 DNA 的 一 小 部 分 。 因 此 须要 酶 切 大 量 的 喉 菌 体 总 DNA， 以 便 凝 胶 电泳 后 能 观察 到 插入 片段 。 记 住 ， 这 将 比 通 常 的 限制 性 内 切 酶 的 酶 切 需 要 更 多 的 酶 。 基 因 组 克隆 中 包含 较 大 量 的 插入 片段 ， 因 此 只 须 分 析 较 少量 的 DNA。 参考 XM 献 1. Hyunh, T. V., Young, R. A., and Davis, R. W. (1985) Constructing and screening cDNA libraries in Lambda gt10 and Lambda gt11, in DNA Cloning I, A Practical Approach (Glover, D. M., ed.), IRL, Oxford, UK. 2. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Labo- ratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 3. Cowell, I. G. and Hurst, H. C. (1994) in Protocols for Gene Analysis. Methods in Molecular Biology, vol. 31 (Harwood, A. J., ed.), Humana, Totowa, NJ, pp. 363-376. 4. Mutzel, R. (1994) in Protocols for Gene Analysis. Methods in Molecular Biology, vol. 31 (Harwood, A. J., ed.), Humana, Totowa, NJ, pp. 397-408. 5. Guesdo, J. I., Ternynck, T., and Avrameas, S. (1979) The use of avidin-biotin inter- action for immunoenzymatic techniques. J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1139. 6. Buckland, R. M. (1986) Strong signals from strepavidin-biotin. Nature 320, 557,558. 7. McGookin, R. (1988) New Nucleic Acid Techniques. Methods in Molecular Biol- ogy, vol. 4 (Walker, J. M., ed.), Humana, Clifton, NJ, pp. 301-306. 8. Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. *—Tolr = erhwes wae y=» SRI avec Sa Ae eR n * ee Te AIR 只 SAE ho 1 $4 ee” CARR TABI 1 NT HOD Tie RE a ep oa oes Tear Ra ane eR ote OE ce ewes he Aree ee Be he fie MR LSS AA I Aa SE UAT SE ee ee pee Tt WAR Te ueibet) WME (1 Ree et a 文 ” ee AES . : _ Boicsste Bile gaitoiraso.d (28°) & diva bow .A SI nine Dir ‘ dwr a 这 a sige. 281 Gabo Moe ‘ mex elaine (ORCS 7 M bau 7 5 4 ol ae oil 1 rota thing? blo") 85 pace renny PwUsnk era 9) tlooovee’ ai (A001). A ara bem, 站 OT RUE { Dayle. A tenant Ae 下 : al a) os fh tu Andh wed ey fh. iota nhs ae TRE aq AV: ,cwoseT anki Cbs AN be -Mibive wsaually (OCR 14.8, Domes A bane am | ee a oO wire sfeary pow arnt S ibiveqeie tov alneryie soon? 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Nickoloff Ul 1. 5 亚 克 隆 技术 用 于 将 DNA 片段 从 一 个 载体 CL, BARS A) 转移 到 另 一 个 载 体 上 。 它 们 通常 用 于 构建 表达 系统 ， 或 是 将 DNA 片段 转移 到 特殊 的 载体 上 以 制备 杂交 探 针 或 是 制备 测序 用 的 单 链 模板 。 典 型 的 载体 含有 三 个 必要 的 元 件 : 一 个 抗生素 抗 性 标 记 、 一 个 复制 起 点 〈 以 便 选 择 转化 了 的 大 肠 杆菌 宿主 ) 以 及 一 个 或 多 个 可 供 揪 入 外 源 DNA 片段 的 限制 酶 切 位 点 。 叭 菌 体 载体 ， 例 如 建立 在 M13 册 基础 上 的 载体 是 不 用 抗 性 标记 的 ， 因 为 转化 子 所 产生 的 病毒 颗粒 可 将 被 感染 的 细菌 杀 死 或 使 它 长 得 很 慢 ， 这 样 就 在 未 感染 的 菌 苦 上 出 现 了 鸣 菌 斑 。 下 面 我 们 介绍 各 种 通用 的 亚 克 隆 策略 与 方法 ， 一 些 更 加 专门 的 策略 将 在 其 他 章节 中 讨论 〈 例 如 人 参考 文献 2)。 基本 的 亚 克 隆 操作 包含 四 步 : 首先 用 合适 的 限制 性 内 切 酶 切割 载体 与 插入 片段 ， 接 着 用 T4 DNA 连接 酶 将 DNA 片段 与 载体 连接 ， 然 后 转化 宿主 大 肠 杆 菌 ， 最 后 筛选 出 含 有 所 需 结构 的 重组 质粒 。 限 制 酶 切割 所 产生 的 末端 可 以 是 3 突出 、5 突出 或 是 平 末端 。 尽管 任何 一 个 平 未 端 都 能 连接 ， 但 是 突出 的 末端 更 易于 黏合 。 所 以 载体 与 插入 片段 经 常 用 同一 种 酶 切割 ， 连 接 后 形成 与 原来 相同 的 切 点 。 虽 然 两 种 酶 可 能 识别 不 同 的 酶 切 位 点 ， 却 能 产生 可 以 黏合 的 3 或 $ 端 。 在 这 种 连接 中 ， 原 来 的 酶 切 位 点 不 再 出 现 。 平 末 端的 连接 可 以 为 亚 克 隆 方案 提供 比较 宽松 的 设计 ， 但 是 连接 效率 低 ; 至 于 黏 性 末端 则 只 有 通过 用 同一 种 酶 切割 所 产生 的 两 个 末端 相连 时 ， 方 能 形成 原来 的 位 点 。 较 新 的 载体 的 特点 是 具有 一 连 串 独特 的 限制 酶 切 点 (多 位 点 接头 )， 从 而 提供 了 多 种 不 同 的 黏 性 末端 与 平 末端 而 有 利于 亚 克 隆 的 进行 。 很 多 限制 酶 切割 的 DNA 片段 可 以 插入 到 多 聚 接 头 中 去 ， 旁 边 的 位 点 也 可 能 在 以 后 的 操作 中 利用 。 亚 克 隆 仅仅 包含 两 段 线 型 DNA 分 子 的 连接 ， 通 常 形成 环 状 的 重组 分 子 。 当 载体 与 持 入 片段 具有 同样 黏 性 未 端 时 ， 插 入 片段 以 相等 的 比例 形成 插入 方向 相反 的 两 种 重组 分 子 ， 如 图 27.1 (A)。 如 果 用 产生 不 相同 末端 的 两 种 限制 酶 对 载体 和 揪 入 片段 分 别 作 双 酶 切 时 ， 插 入 片段 就 只 能 以 一 个 方向 与 载体 进行 连接 ， 如 图 27.1 (B)。 这 种 定向 克隆 也 包括 一 个 末端 是 平 末 端 而 另 一 个 末端 是 $ 或 3 突出 的 。 在 许多 亚 克 隆 操作 中 所 希望 的 重组 子 往往 只 以 很 低 的 频率 出 现 ， 这 是 因为 双 分 子 反 应 速率 远 远 低 于 载体 重新 环 化 以 及 形成 其 他 不 希望 有 的 产物 的 单 分 子 反 应 速率 。 通 过 优化 DNA 浓度 可 以 促进 所 希望 的 双 分 子 产 物 生 成 B]， 但 是 在 我 们 的 经 验 中 ， 这 种 调节 是 不 必要 的 。 我 们 通常 使 用 的 载 体 与 插入 片段 的 分 子 比 在 1:1 到 1:2 之 间 ， 这 一 比例 的 增加 会 减少 不 需要 的 亲本 载体 ， 但 总 的 效率 并 没有 增加 ， 因 为 插入 多 个 片段 的 产物 增加 了 。 即 使 在 最 适 条 件 下 连接 的 分 子 中 也 只 有 一 小 部 分 是 所 希望 的 产物 。 在 本 章 中 我 们 将 介绍 能 提高 亚 克 隆 效率 的 、 可 以 * 165 。 单独 或 组 合 使 用 的 各 种 策略 ， 这 些 策 略 包括 有 利于 鉴定 出 稀有 产物 的 筛选 步骤 以 及 富 集 所 需 产 物 的 选择 步骤 。 (A) (B) Xho] Xhol Xhol — EcoRI BamHI EcoRI = BamHI | Xhol | xhol | EcoRI/BamHI [pepe Cmepeette) |cm | (用 胶 纯化 ) | CeBee 连接 酶 () Xhol Xhol Xhol Xhol EcoRI BamHI 图 27.1 (A) 相同 黏 性 末端 片段 的 连接 。XhoI MPH SEK CA) 线性 化 并 将 一 个 片段 从 供 体 〈 细 线 ) 上 切割 下 来 。 将 受 体 作 去 磷酸 化 处 理 并 将 片段 纯化 可 以 减少 不 需要 的 产物 。 片 段 可 以 以 两 个 方向 插入 。 本 图 以 及 随后 的 图 中 列 于 括号 中 的 是 供 选用 的 步骤 ， 这 些 步 骤 可 能 增加 所 需 产物 的 产量 。 (B) HRA EER. EcoRI 与 Bam HI 酶 切 后 的 末端 序列 不 配对 ， 防 止 了 每 一 个 组 分 的 自 连 。 胶 纯化 步骤 保证 了 只 回收 所 需 的 连接 产物 。 片 段 的 插入 只 能 以 一 个 方向 进行 。 筛选 步骤 中 包括 物理 的 与 表 型 的 两 种 筛选 方法 。 最 直接 的 物理 筛选 方法 是 抽 提 10 一 20 个 转化 子 的 少量 培养 物 中 的 质粒 DNA， 然 后 制作 物理 图 谱 。 如 果 所 期 望 产 物 以 10% 或 更 高 的 频率 出 现时 ， 推 荐 使 用 这 个 快速 而 有 效 的 方法 ， 例 如 亚 克 隆 操作 中 包括 富 集 所 需 产 物 的 各 个 步骤。 其 他 一 些 物理 的 筛选 方法 虽然 能 够 鉴定 出 以 很 低频 率 出 现 的 可 能 的 亚 克 隆 ， 但 以 后 的 工作 更 加 费时 间 ， 因 为 仍 须要 制备 质粒 DNA 并 通过 制作 限制 酶 图 谱 方 能 确切 地 鉴定 其 是 否 就 是 所 需要 的 克隆 。 例 如 可 以 从 6 一 10 个 转化 子 的 混合 培养 物 中 抽 提 质粒 进行 图 谱 分析 ， 用 这 个 方法 可 以 筛选 200 个 甚至 更 多 的 转化 子 。 从 某 一 组 混合 转化 子 的 抽 提 物 中 鉴定 到 所 需 质 粒 ， 接 着 可 以 从 母 平 阵 上 成 片 的 转化 子 中 回收 这 一 质粒 。 检 出 频率 低 至 10 “的 所 需 质粒 的 一 个 快速 方法 中 包括 电泳 分 析 有 裂解 的 菌落 中 的 未 经 纯化 的 超 螺 旋 DNA (“lid 溶菌 产物 ”)[41。 用 有 裂解 菌落 法 筛选 往往 只 有 当 揪 入 片段 使 亲本 载体 的 相对 分 子 质量 增加 25% 或 更 多 时 方才 有 效 。 建 立 在 PCR 基础 上 的 一 些 方 法 的 检测 水 平 也 大 致 相似 ， 但 是 价格 偏 高 。 也 可 以 用 亚 克 隆 中 同样 的 DNA 片段 制备 的 探 针 进行 菌落 杂交 筛选 ， 这 种 方法 的 灵敏 度 极 高 ， 可 以 检测 非常 稀有 的 产物 (<10 “)。 但 是 由 于 杂交 筛选 很 费时 间 ， 所 以 很 少 用 于 常规 的 亚 克 隆 筛选 上 。 表 型 筛选 的 方法 非常 有 效 并 且 易 于 进行 ， 当 载体 的 克隆 位 点 或 是 多 聚 接头 位 点 存在 于 第 二 个 表 型 标记 内 部 时 即 可 进行 表 型 筛选 ， 片 段 插入 到 这 些 位 点 后 通常 会 使 标记 失 活 。 第 二 个 标记 可 以 是 抗生素 的 抗 性 基因 ， 例 如 在 pBR322 中 的 抗 性 基因 05]。 在 这 种 情 沈 下 携带 重组 质粒 的 转化 子 印 影 到 含有 第 二 种 抗生素 的 平 血 上 便 不 能 生长 ， 但 可 以 从 母 * 166 - 平 血 上 回收 得 到 。 在 一 种 基于 标记 失 活 的 一 步 筛选 中 利用 了 大 肠 杆 菌 的 /acZ 基因 中 的 一 部 分 序列 ， 例 如 pUC119LU。 这 些 载体 转化 到 带 有 第 二 个 lacZ 基因 缺陷 的 特定 菌株 中 (例如 DHSa 2K YM101), lacZ 基因 可 以 被 异 丙 基 -B-D- 硫 代 半 乳糖 苷 (IPTG) 所 BS. Att lacZ 基因 产物 通过 互补 而 形成 一 个 有 活性 的 半 乳 糖苷 酶 ， 分 解 生 色 底 物 X- GAL 后 形成 蓝 色 菌落 。DNA 片段 插入 lacZ 使 基因 失 活 ， 形 成 白色 菌落 。 尽 管 插入 失 活 的 方法 有 效 而 又 方便 ， 但 却 不 能 用 于 再 次 插入 片段 的 筛选 。 选择 策略 比 筛 选 策略 更 加 有 效 。 有 几 种 选择 步骤 是 建立 在 环 状 DNA 分 子 比 线性 DNA 分 子 的 转化 效率 高 10 一 1000 倍 [6@7 的 基础 上 的 ， 这 一 方法 决定 于 能 否 防 止 不 需要 的 产物 环 化 或 需要 的 2 产物 线性 化 。 一 个 非常 有 效 并 且 通 用 的 方法 包括 DNA 片段 与 载 体 相 连接 前 用 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 (CIP) 对 线性 载体 进行 去 磷酸 化 处 理 ， 如 图 27.1 (A)。T4 DNA 连接 酶 催化 DNA 末端 的 3 羟基 与 $ 磷 之 间 形 成 新 的 磷酸 二 酯 键 。 正 常 的 情况 下 每 一 个 连接 的 末端 产生 两 个 新 的 键 ， 也 即 当 一 个 片段 插入 到 载体 中 去 时 产生 四 个 新 的 键 。 去 磷酸 化 可 以 防止 载体 DNA 的 自 连 ， 这 是 由 于 T4 DNA ERA SBE 末端 上 发 生 反 应 。 但 是 去 磷酸 化 的 载体 可 以 与 插入 片段 的 $“ 磷 末端 连接 生成 带 有 两 个 新 键 、 而 在 相对 链 上 具有 两 个 单 链 切口 的 环 化 分 子 。 不 需要 的 产物 也 可 能 由 载体 携带 其 他 片段 所 形成 。 为 了 避免 这 类 情况 的 发 生 ， 可 先 用 限制 性 内 切 酶 从 质粒 上 切 下 所 需要 的 片段 ， 电 泳 分 离 后 切割 凝 胶 ， 将 片段 纯化 后 再 与 (CIP 处 理 过 的 ) 载体 连接 ， 如 图 27.1 (A)。 对 于 定向 克隆 的 策略 来 说 ，CIP 处 理 载 体 就 没有 必要 了 ， 因 为 载体 有 两 个 不 配对 的 末端 而 不 能 自 环 。 当 定向 克隆 中 包含 有 两 个 很 近 的 连接 位 点 时 ， 例 如 在 多 位 点 接头 〈polylinker) 上 ， 通 常 不 须要 用 凝 胶 纯 化 的 方法 将 载体 大 片段 从 多 位 点 接头 小 片 段 中 分 离 出 来 ， 相 反 地 可 以 通过 琼脂 糖 凝 胶 CL-6B 离心 柱 将 小 片段 除去 。 一 种 更 加 特殊 的 策略 是 包括 用 两 种 不 同 的 限制 性 内 切 酶 切割 载体 与 插入 DNA， 所 产生 的 非 黏 性 未 端 为 带 有 4 个 碱 基 的 $ 突出 末端 。 每 个 突出 末端 用 T4 DNA 聚合 酶 将 四 个 碱 基 中 的 两 个 补 平 〈 图 27.2)， 这 样 形成 的 两 个 碱 基 的 突出 末端 就 不 会 发 生 自 连 ， 但 载体 和 插入 片段 却 可 以 相互 连接 [1 。 另 一 个 简单 而 有 效 的 方案 是 使 用 识别 不 同位 点 然而 却 能 产生 黏 性 末端 的 酶 ， 在 图 27.3 (A) 中 载体 用 Xho I 切 割 ， 待 克隆 片段 由 Sal I 切割 产生 。Sal lL RRB A RHA 经 切割 的 Sal 工 或 Xho I 位 点 相连 ， 当 与 载体 片段 连接 时 会 生成 与 以 上 两 者 都 不 相同 的 位 点 。 连 接 后 用 其 中 的 一 种 酶 〈 或 二 种 都 用 ) 处 理 ， 切 开 可 能 形成 的 亲本 载体 。 这 些 线 状 的 分 子 转化 细菌 时 效率 非常 低 。 所 需 的 产物 由 于 不 能 被 酶 消化 而 保持 环 状 ， 所 以 具有 较 高 的 转化 效率 。 表 27.1 中 所 列 为 能 产生 匹配 末端 的 几 组 酶 。 这 个 方案 对 于 用 不 同 酶 切 而 产生 的 平 末 端 进行 亚 克 隆 也 非常 有 效 。 这 个 方案 的 一 个 优点 是 不 须 用 CIP 处 理 。 除了 在 克隆 过 程 中 使 用 的 酶 切 位 点 外 ， 其 他 的 限制 酶 切 位 点 还 可 用 于 通过 选择 去 除 不 需 要 的 产物 。 任 何 位 点 只 要 存在 于 不 需要 的 产物 之 中 ， 而 所 需 产 物 中 无 此 位 点 时 就 可 用 于 在 连接 反应 中 使 不 需要 的 产物 线性 化 ， 如 图 27.3 (B)。 这 个 方案 常 可 用 于 定向 克隆 ， 因为 两 个 多 位 点 接头 片段 间 其 他 克隆 位 点 已 被 消除 。 1) 原文 误 作 不 需要 的 。 一 一 译 者 注 « 167 - Xhol Sau3Al Sau3Al | xhol | sau3Al T AGCT 0 Oe DNA 聚合 酶 DNA 聚合 酶 +C,T +A,G TC GATC AGCT AG TCGA TCGA CGA. CTAG 连接 酶 Sau3Al Sau3Al (XhoI) (Xhol) 图 27.2” 带 有 部 分 补 平 末端 的 片段 的 连接 。Xho I 与 Sax3AI 酶 切 后 产生 不 配对 的 4 个 碱 基 突 出 的 5 端 , 经 部 分 补 平 后 就 可 以 进行 载体 与 供 体 的 连接 ， 但 不 会 发 生 自 连 。Xho 工 位 点 不 会 重新 出 现 。 (A) (B) (C) 人 Sal | Sal | x X 人 | sal 2 EcoRI EcoRI. ‘EcoRI hol \x X iio | ( 北 胶 纯化 ) A isos EcoRI | cc) | 连接 酶 | 连 | (Sal I 1/8 Xhol) si 连接 酶 5 1 a 2 X x iy EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI 27.3 三 种 有 效 的 亚 克 隆 方案 。(A) 用 Sol 1 45 Xho 工 酶 切 后 产生 不 同 的 黏 性 末端 ， 连 接 后 产生 两 种 酶 都 不 能 切割 的 位 点 。 连 接 反 应 后 可 以 用 两 种 酶 中 的 任何 一 种 或 是 用 两 种 酶 将 重新 环 化 的 亲本 质粒 在 原来 的 酶 切 位 点 上 切 成 线性 分 子 。(B) 用 识别 位 点 为 Z 的 酶 切割 连接 混合 物 ， 将 不 需要 的 产物 线性 化 。 但 所 需 的 产物 中 必须 没有 Z 位 点 。(C) 从 Km 质粒 上 切 下 的 片段 连接 到 Apr' 载 体 上 去 。 产 物 可 通 过 独特 的 Apr、Km* 表 型 来 筛选 。 (Xhol) (XhoI)(XhoD”(XhoJ) (Sal 1) Sui) ora (Sal I) » 68 - 表 27.1 产生 黏 性 末端 的 成 组 的 酶 组 号 fait 2 Neol, BspHI (Aflll)® 3 Agel, Xmal, NgoMI, BspEI 4 BssHI., MluI (Dsal1) 5 Spel, XbaI, Avrll, Nhel 6 Bgll, BamHI, Bel I 7 Eag1, Bsp1201 8 BsiiW1, Acc651, BsrGI 9 SalI, XhoI 10 Ppul01, ApaLl (Sfcl1) 11 PstI, NsiI (Bsp1281 ) 12 Psp14061 (BsaHI ) 13 Clal, BstBI a 经 任何 一 组 的 两 种 酶 切割 后 所 形成 的 黏 性 末端 连接 时 不 恢复 原 有 的 两 个 酶 切 位 点 。 b 括号 中 的 酶 识别 不 止 一 种 酶 切 位 点 ， 某 些 或 全 部 识别 位 点 的 切割 产生 特定 的 黏 性 末端 。 如 果 供 体 与 载体 具有 遗传 上 的 或 是 结构 上 的 特殊 性 质 ， 就 能 据 此 设计 高 效 而 又 非常 简单 的 亚 克 隆 方案 。 如 果 一 个 特定 的 片段 须要 反复 地 进行 亚 克 隆 ， 那 么 这 样 的 设计 就 特 别 有 价值 。 这 一 设计 要 使 用 两 个 具有 不 同 抗 性 标记 的 亲本 质粒 。 图 27.3 (C) 展示 了 一 个 片段 从 卡 那 霉 素 抗 性 (Km') 质粒 上 转移 到 毛茶 青霉素 抗 性 (Ap") 的 载体 上 去 的 设 计 方 案 。 所 需 的 产物 可 以 在 含有 氨 茶 青霉素 的 平 血 上 进行 选择 。 用 CIP 处 理 氨 葵 青 霉 素 抗 性 的 载体 可 以 降低 得 到 亲本 (Ap") 载体 的 机 会 ， 而 重 行 环 化 的 供 体质 粒 则 因为 对 氨 共 青霉素 敏感 而 不 会 出 现在 平 血 上 。 因 此 这 个 方案 无 须 从 胶 中 纯化 所 需 片 段 这 一 操作 步 又。 就 像 以 上 讨论 的 那样 ， 定 向 克隆 可 以 不 用 CIP 处 理 。Nickoloff 和 Reynolds[9] 将 Km5-Apr 方 案 与 不 同 酶 切 的 黏 性 末端 连接 方案 联合 使 用 而 省 略 CIP 处 理 或 胶 纯 化 步骤 ， 所 需 产物 的 得 率 可 达 90% 以 上 。 由 于 限制 酶 切 点 对 于 高 效 的 亚 克 隆 方案 起 着 重要 的 作用 ， 所 以 经 常 须要 在 特定 的 部 位 消除 或 引入 一 个 新 的 位 点 ， 下 面 介 绍 两 种 实现 这 一 修改 的 方法 。 酶 的 切 点 可 以 通过 T4 DNA 聚合 酶 对 “或 3“ 突出 末端 补 平 形成 平 末端 后 自 连 而 消除 (图 27.4)。 这 些 反应 往往 使 消除 酶 切 位 点 之 处 引入 2 一 4 个 新 的 碱 基 对 。 如 果 这 一 缺失 恰 在 编码 顺序 内 时 可 以 造成 基因 失 活 。 因 为 绝 大 多 数 酶 的 识别 位 点 是 回 文 对 称 的 ， 填 平 $ 端的 自 连 可 能 形 成 被 其 他 限制 酶 识别 的 新 的 回 文 对 称 序列 001。 另 一 个 产生 新 位 点 的 方法 是 通过 接头 的 插入 (图 27.4)。 接 头 是 具有 回 文 对 称 序列 的 平 末端 DNA 序列 (8~10 bp)， 与 平 末端 连接 后 可 以 产生 新 的 酶 切 位 点 。 接 头 与 平 末端 的 连接 非常 有 效 ， 因 为 在 连接 反应 中 可 以 使 用 过 量 的 摩尔 浓度 。 接 头 的 插入 通常 会 破坏 插入 位 点 ， 但 是 可 以 通过 设计 重新 产生 原 来 的 位 点 。 在 这 种 情况 下 接头 的 两 侧 将 会 出 现 两 个 原 有 的 酶 切 位 点 。 接 头 也 可 以 在 片段 插入 载体 之 前 预先 加 在 片段 的 两 个 末端 。 更 加 有 效 的 操作 方法 是 利用 接头 克隆 具有 平 - €69 | 接头 2ss | 连接 本 连接 栈 | 0 | seen 位 点 消除 Z(X) 接头 插入 图 27.4 位 点 的 消除 与 接头 的 插入 。 用 T4 DNA 聚合 酶 填补 的 平 末端 再 连接 后 可 以 消除 X 点 ( 左 侧 ) 或 是 通过 连接 产生 新 的 位 点 〈 右 侧 )。 连 接 有 时 会 重新 形成 目标 位 点 X。 末端 的 DNA 片段 ， 而 不 是 直接 将 具有 平 末端 的 片段 插入 到 平 示 端的 切 点 中 去 。 亚 克 隆 操作 包括 很 多 连续 的 酶 切 步 又 ， 在 进行 下 一 步 操作 时 通常 应 将 上 一 步 使 用 的 酶 灭 活 或 去 除 。 从 前 纯化 时 先 用 酚 / 氯 仿 抽 提 ， 然 后 再 用 乙醇 沉淀 悦 。 这 是 一 个 耗费 时 间 (30 一 60 min) 的 方法 ， 若 代 之 以 Sepharose CL - 6B 离心 柱 层 析 则 操作 只 需 5 min, 所 以 多 步骤 的 操作 可 以 方便 地 在 一 天 之 内 完成 。 这 种 柱 能 去 除 小 分 子 物 质 〈 例 如 盐 、 SDS、 核 苷 酸 以 及 小 于 100 bp 的 DNA 片段 ) 并 能 使 大 多 数 的 酶 去 除 或 失 活 。DNA 回收 在 TE (10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA) 中 ， 回 收 的 DNA 的 浓度 可 以 达到 DNA 加 入 时 的 浓度 。 2.4 BF 2.1 DNA 的 酶 切 1) 质粒 DNA: 一 般 用 已 纯化 的 DNA 作为 亚 克 隆 的 起 点 ， 但 其 实 甚至 是 微量 抽 提 的 粗 制品 也 是 可 以 用 的 〈 参 见 第 十 三 至 三 十 三 章 )。 - 170 + 2) 限制 酶 与 缓冲 液 : 可 从 各 个 制造 厂家 购 得 ， 一 般 都 随同 供应 缓冲 液 。 3) TE: 10 mmol/L Tris-HCI、pH 7.5, 1 mmol/L EDTA， 高 压 灭 菌 。 1) 2) 3) 4 YA 5) 1 SS 2) 3) 1 ~ 2) 3) 1) 2) 3) 4) 2.2 Sepharose 离心 柱 层 析 1.5 ml 微型 离心 管 (有 盖 或 无 盖 的 )。 2 天 号 针尖。 硅化 玻璃 珠 : 200~300 pm (直径 ) (Sigma, St. Louis，MO)。 用 和 氯仿 洗涤 玻璃 珠 除去 机 油 ， 然 后 浸 在 含 $ % 二 甲 基 二 氯 硅烷 的 氯仿 和 95% CBS min。 用 95% 乙 醇 与 蒸馏 水 交替 洗涤 $ 次 ， 最 后 放 在 蒸馏 水 中 高 压 灭 菌 。 处 理 过 的 玻璃 珠 很 容易 用 RS RB, FAAS RNIN RK, AWHILE DNA 因 粘 附 于 上 而 造成 损失 。 Sepharose CL-6B: (Pharmacia，Piscawaty，NJ)。 用 等 体积 的 TE 洗涤 8 次 ， 然 后 以 60% CL-6B 45 40% TE 的 比例 悬浮 成 糊 状 物 。 以 100 ml 为 单位 分 批 高 压 灭 菌 40 min， 小 心地 保持 无 菌 状态 ， 因 为 处 理 过 程 中 已 将 防腐 剂 除去 。 贮 存 于 ACH CL-6B 至 少 可 以 稳定 一 年 。 10x AILIBS RW: 50% 甘油 ，0.5% SDS, 10 mmol/L EDTA, 0.25% 省 酚 蓝 ， 0.25% —FaAR (RIA ESSER SEH). 2.3 质粒 去 磷酸 化 10 x CIP 缓冲 液 : 500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9，100 mmol/L MgCl, 10 mmol/L DTT. CIP: MAF 4T. Br / Ai / Fe DCR (25:24:1): 用 pH8.0 的 TE 平 衡 酚 。 2.4 5 端的 填 人 与 3 端的 去 除 10xT4 DNA 聚合 酶 缓冲 液 :$00 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L MgCh, 10 mmol/L DTT, 500 pg/ml 乙酰 化 BSA. 2 mmol/L dNTPs (从 10 mmol/L 的 贮存 液 中 新 鲜 配 制 )。 T4 DNA 聚合 酶 : 3 U/ul, HEF -20T. 2.5 接头 的 磷酸 化 与 连接 FEA: 以 每 毫升 10 Azeo 的 浓度 溶 于 蒸馏 水 中 〈 人 参见 注释 1)。 10 X 激酶 缓冲 液 : 700 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCl, 50 mmol/L Drrs 1.0 mmol/L ATP: 从 20 mmol/L 的 贮存 液 中 新 鲜 配 制 。 T4 BK RARE: 10 U/pl, FEAF F-20T. 。- - 171 - 5) 10x 连 接 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCl, pH7.8, 100 mmol/L MgCl, 100 mmol/L DTT, 10 mmol/L ATP, 250 pg/ml BSA. 6) T4 DNA 连接 酶 ，400 U/pl (参见 注释 2). New England Biolabs (Beverly, MA) 的 产品 较 好 ， 贮 存 于 - 20 2.6 在 XGAL 平 血 上 筛选 重组 DNA 1) X-GAL: 20 mg /ml X-GAL， 溶 于 二 甲 基 甲 酰胺 ， —20C Ie. 2) IPTG: 100 mmol/L IPTG， 溶 于 蒸馏 水 ， -2CKF. Sue 法 3.1 DNA Ayes) 所 有 亚 克 隆 操作 的 第 一 步 都 是 选用 合适 的 酶 切割 参与 克隆 的 DNA。 在 20 由 的 反应 体积 中 切割 每 种 DNA 1 一 2 pe (参见 注释 3)。 每 个 样品 取出 1/10 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 沪 分 析 以 检查 酶 切 是 否 完全 (人 参见 注释 4)。 用 Sepharose CL —- 6B 柱 离心 纯化 剩余 的 DNA (F#5L 3.2 47). 3.2 Sepharose 离心 柱 层 析 在 亚 克 隆 过 程 中 的 每 一 步 酶 切 反 应 后 都 应 用 Sepharose CL-6B 柱 纯 化 DNA。 1) 用 27 号 针头 在 管子 的 底部 刺 一 个 孔 ， 用 滴 管 吸入 约 50 pl 的 玻璃 珠 。 2) 剧烈 振 划 Sepharose CL-6B 使 之 彻底 悬浮 ， 在 柱 上 加 入 约 10 FRA DNA 体积 的 CL-6B。 将 柱 轻 放 在 第 二 个 管子 上 ， 如 果 形 成 密封 ， 可 能 由 于 压力 而 使 流速 变 慢 。 3) 在 甩 平 转 头 上 以 600 g 离心 2 min， 弃 去 下 层 套 管 ， 将 柱 转移 到 新 的 管子 上 。 4) 柱 准备 过 程 中 加 入 1/10 倍 DNA 体积 的 10x 终 止 混合 物 ， 置 于 涡 旋 振 划 器 上 稍 加 振 GB, 65 加 热 3 min. 5) 将 DNA 样品 均匀 地 放 在 预先 离心 好 的 柱 上 (FER HIS 30 min 内 )， 以 600 g 离心 2 min， 含 DNA 的 溶液 收集 在 下 面 这 一 管子 中 (参见 注释 $ 与 6)。 3.3 质粒 DNA 的 去 磷酸 化 处 理 1) 加 入 2.5 岂 的 10xCIP 组 冲 液 和 大 约 1 pg 线性 化 的 载体 至 1.5 ml 的 离心 管 中 ， 再 加 蒸馏 水 至 终 体 积 为 25 yl. 2) M1 0.1~1.0 UM CIP, ROG 37 保温 1h。 3) 加 dH,O 至 50 pl, FA PR PRY B/S / Se EH HEE IE, OR KAR. Sepharose CL — 6B 柱 进 行 纯化 〈 人 参见 注释 7)。 4) 为 了 评 佑 反应 的 效率 ， 将 去 磷酸 化 的 载体 分 成 二 个 均等 的 部 分 ， 一 部 分 用 于 与 亚 克 4 .全 和 * 隆 片 段 连接 ( 见 3.6 节 )， 另 一 部 分 用 于 自 连 反应 。 两 个 反应 的 体积 应 相同 。 连 接 反 应 后 用 CL- 6B 柱 纯化 ， 从 两 个 反应 中 取出 相同 的 量 转 化 大 肠 杆菌 ， 这 样 可 以 了 解 在 预期 的 克隆 中 自 连 产物 所 占 的 比例 。 3.4 5 端的 补 平 和 3 “端的 切 平 这 一 操作 用 于 制备 各 种 亚 克 隆 方案 中 所 必需 的 DNA 平 末端 (参见 注释 8)。 1) 1.5 ml 的 离心 管 中 加 入 1.5 pl 2.0 mmol/L 的 dNTPs, 2.5 岂 的 10xT4 聚合 酶 缓冲 液 以 及 大 约 1.0 pe 线性 化 的 质粒 DNA ( 见 第 3.1 节 )， 加 蒸馏 水 至 终 体积 为 25 yl. 2) 加 入 2.4U 的 T4 DNA RAB, JIRAUR 37C 保温 20 min 以 补 平 $ 突出 端 ， 并 保温 5 min 以 去 除 3 突出 端 (人 参见 注释 9)。 3) 通过 Sepharose CL-6B 柱 纯化 DNA. 3.5 接头 的 磷酸 化 与 连接 1) 1.5 ml 的 离心 管 中 加 入 1 岂 10x 激 酶 缓冲 液 、1 pl 1.0 mmol/L ATP、2 pl ek, K 后 加 dH,O 至 10 ul. 2) 加 入 10 U T4 SRA BMA, 37C 保温 2 h。 在 与 DNA 连接 之 前 不 必 纯 化 磷酸 化 的 连接 物 〈 人 参见 注释 10 与 11)。 3) 平 末端 DNA 中 加 入 5 pl 磷酸 化 的 接头 与 3.5 pl 10X 连 接 缓冲 液 ( 见 第 3.4 节 ) 并 加 dH2O 至 35 ul. 4) 加 入 400 U 的 T4 DNA #288, IRSA 16C 保温 30 min. 5) 通过 Sepharose CL — 6B 柱 纯 化 DNA. 6) 用 50~100 U 的 限制 酶 消化 DNA 至 少 4h 1 (参见 注释 11)。 通 过 Sepharose CL — 6B 柱 纯 化 。 7) 与 质粒 载体 的 连接 : 混合 4 pl 10x 连 接 缓冲 液 、35 岂 第 6 步 的 反应 物 以 及 400 UN T4 DNA 连接 酶 ，16Y 保温 2 h。 通 过 Sepharose CL- 6B 柱 纯 化 后 转化 大 肠 杆菌 。 3.6 片段 与 载体 的 连接 1) 如 有 必要 可 以 通过 凝 胶 纯化 所 须 转移 的 DNA 片段 (参见 第 二 十 八 章 )， 并 将 受 体 DNA 去 磷酸 化 〈 见 第 3.3 节 )。 2) 取 1.5 ml 离心 管 ， 加 入 载体 与 插入 DNA， 二 者 的 物质 的 量 的 比例 范围 从 1:1 至 1:2 (各 约 1 pe), UR3 pl 10x ERB, DM dH,O 2 30 pl. 3) MA 400 U T4 DNA 连接 酶 ， 混 匀 后 16C 保温 。 连 接 黏 性 末端 时 保温 2 h， 连 接 平 末 端 则 须 保 温 4 h 以 上 (参见 注释 12 与 13)。 4) 通过 CL-6B 柱 纯化 DNA， 用 于 转化 大 肠 杆 菌 〈 人 参见 第 二 十 九 与 三 十 章 )。 . 173 - 3.7 用 X-GAL 平 血 筛选 重组 子 如 有 片段 插入 到 质粒 的 lacZ 基因 内 ， 转 化 子 呈 白色 ， 亲 本 载体 的 JacZ 基因 是 完整 的 ， 所 以 转化 子 呈 蓝 色 。 1) 将 X-GAL § IPTG 各 40 岂 涂 布 在 含有 合适 抗生素 的 LBFOE, HT. 2) 涂 布 转化 菌 ，37 培养 过 夜 。 3) FMLA WARE 4 中 冷冻 几 小 时 使 颜色 更 加 明显 。 4. 注 AF (1) 已 经 去 磷酸 化 的 和 未 经 去 磷酸 化 的 接头 都 能 购买 到 。 为 了 保证 能 获得 最 高 的 效率 我 们 推荐 在 临 用 前 对 接头 进行 磷酸 化 。 (2) 连接 酶 单位 的 定义 至 少 有 两 种 ， 这 里 使 用 的 酶 单位 是 New England BioLabs 公司 的 定义 。 如 果 是 从 其 他 公司 购买 的 酶 应 根据 他 们 的 说 明 使 用 。 (3) 将 反应 物 恰 当地 混合 似乎 是 很 平常 的 ， 但 是 对 于 所 有 的 酶 反应 来 说 却 是 非常 重要 的 。 酶 总 是 最 后 一 个 加 入 到 反应 体系 中 的 成 分 ， 加 入 后 必须 缓慢 地 吸 放 液 体 或 是 拍 击 管子 使 其 中 的 组 分 彻底 混 匀 ， 使 用 涡 旋 振 功 器 可 能 使 酶 失 活 。 反 应 完成 后 加 入 终止 混合 液 ， 用 振荡 器 剧烈 振荡 并 加 热 至 6SY 使 酶 失 活 ， 最 后 用 CL=6B 柱 进 行 纯化 。 (4) 在 亚 克 隆 实验 中 开始 时 质粒 DNA 的 消化 是 非常 关键 的 一 步 ， 因 为 以 后 所 有 的 亚 克 隆 步 又 中 都 要 依赖 这 一 反应 所 产生 的 末端 。 酶 反应 后 总 是 要 取出 总 体积 的 1/10 进 行 琼脂 糖 凝 胶 电泳 以 检查 酶 切 的 完全 程度 。 未 被 酶 切 的 载体 的 转化 效率 很 高 ， 造 成 不 能 接受 的 亲本 质粒 的 高 本 底 。 (S) 蓝 色 的 指示 染料 作为 离心 柱 的 内 部 对 照 。 若 在 洗 脱 液 中 出 现 染 料 ， 说 明 柱 同样 不 . 能 滞留 其 他 小 分 子 。 用 稍 多 一 些 的 Sepharose CL - 6B 将 样品 再 度 上 柱 。 当 使 用 多 根 柱 处 理 DNA 时 染料 也 能 起 到 识别 哪 一 根 柱 已 经 上 过 DNA 样品 的 作用 。 (6) 回收 的 DNA 片段 小 于 100 bp 时 ， 例 如 回收 接头 、 引 物 与 PCR 扩 增 的 小 片段 时 不 用 Sepharose CL-6B 柱 ， 因 为 它们 会 滞留 在 柱 中 。 (7) CIP 必须 通过 酚 抽 提 以 去 除 和 干净 ， 否 则 会 在 以 后 的 连接 过 程 中 使 插入 片段 发 生 去 磷酸 化 作用 。 所 有 其 他 的 DNA 修饰 酶 ， 也 包括 热 稳 定 的 酶 ， 都 可 以 通过 Sepharose CL — 6B 纯化 而 被 灭 活 或 去 除 。 (8) 尽管 大 肠 杆 菌 的 DNA 聚合 酶 的 Klenow 片段 与 T4 DNA 聚合 酶 都 能 使 3 或 9 突出 端 形成 平 末端 ， 但 是 T4 DNA 聚合 酶 具有 更 强 的 3 一 5 外 切 活 力 ， 所 以 是 去 除 3 端 突出 部 分 的 首选 酶 。 我 们 使 用 T4 DNA 聚合 酶 使 5 与 3 突出 端 都 变 为 平 未 端 。 (9) 如 采 核 苷 酸 浓度 太 低 ，T4 DNA 聚合 酶 的 3'~>5' 外 切 活 力 会 很 快 降解 掉 一 大 段 DNA。 该 酶 在 平 末 端 反复 地 加 上 和 除去 未 端的 核 苷 酸 ， 这 一 循环 使 核 苷 酸 库 的 少 度 迅速 降低 ， 所 以 这 些 反 应 不 能 超过 规定 的 时 间 并 且 不 能 使 用 过 量 的 酶 。 410) 如 果 需 要 ， 可 用 自 连 反应 来 评估 接头 的 磷酸 化 效果 ， 连 接 后 的 产物 在 5% 一 10% 的 - 174 + 丙烯 酰胺 胶 上 电泳 观察 结果 。 磷 酸化 的 接头 可 以 相互 连接 并 且 形 成 具有 特征 性 的 阶梯 状 条 带 。 在 旁边 的 孔 中 点 上 未 用 连接 酶 处 理 的 样品 作为 对 照 。 (11) 接头 的 连接 反应 应 短 于 30 min， 因 为 连接 时 间 过 长 会 产生 由 更 多 的 接头 相连 的 产 物 ， 它 们 必须 在 下 一 步 中 去 除 。 如 果 要 消化 接头 连接 反应 系统 中 过 量 的 接头 ， 则 应 尽量 多 用 一 些 限制 酶 〈 通 常 可 以 用 到 反应 总 体积 的 10% )。 这 是 必需 的 ， 因 为 底 物 中 有 着 大 量 的 目标 位 点 。 (12) 具有 一 个 平 末 端 与 一 个 黏 性 末端 的 片段 之 间 的 双 分 子 连接 反应 效率 明显 高 于 两 个 平 末端 的 连接 反应 效率 。 单 分 子 〈 环 化 ) 反应 对 平 末端 或 黏 性 末端 都 比较 有 效 。 我 们 不 用 电泳 的 方法 检测 连接 反应 的 结果 ， 因 为 这 些 反 应 往往 不 能 形成 独立 的 条 带 。 (13) 连接 反应 中 DNA 的 浓度 调节 在 小 于 或 等 于 50 ng/nl， 这 样 可 有 利于 生成 环 化 产物 而 不 是 生成 多 连 体 产 物 。 Wt = XM 献 — . Yanisch-Perron, C., Vieira, J., and Messing, J. (1985) Improved M13 phage clon- ing vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119. 2. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 3. Dugaiczyk, A., Boyer, H. W., and Goodman, H. M. (1975) Ligation of EcoRI endonuclease-generated DNA fragments into linear and circular structures. J. Mol. Biol. 96, 171-184. 4. Hoekstra, M. F. (1988) Lid lysates: an economical and rapid method for plasmid analysis. Biotechniques 6, 929-932. 5. Bolivar, F., Rodriguez, R. L., Greene, P. J., Betlach, M. C., Heynecker, H. L., Boyer, H. W., Crosa, J. H., and Falkow, S. (1977) Construction and character- ization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113. 6. Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., and Hsu, L. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114. 7. Conley, E. C. and Saunders, J. R. (1984) Recombination-dependent recircular- ization of linearized pBR322 plasmid DNA following transformation of Escheri- chia coli. Mol. Gen. Genet. 194, 211-218. 8. Hung, M.-C. and Wensink, P. C. (1984) Different restriction enzyme-generated sticky DNA ends can be joined in vitro. Nucleic Acids Res. 12, 1863—1874. 9. Nickoloff, J. A. and Reynolds, R. J. (1991) Subcloning with new ampicillin and kanamycin resistant analogs of pUC19. Biotechniques 10, 469-472. 10. Nickoloff, J. A. (1992) Converting restriction sites by filling in 5' extensions. Bio- techniques 12, 512-514. 11. Nickoloff, J. A. (1994) Sepharose spin-column chromatography: a fast, nontoxic replacement for phenol:chloroform extraction/ethanol precipitation. Mol. Biotechnol. 1, 105—108. = aS. - yee AR Be il BS be EHP AH EL DNA 片段 Etienne Joly Tl 1. 引 在 进行 连接 反应 前 或 是 标记 探 针 前 通常 要 选择 一 定 大 小 的 DNA 片段 。 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 后 纯化 DNA 片段 的 方法 有 很 多 种 ， 包 括 用 低 熔 点 琼脂 糖 法 、DEAE 纸 片 法 、 电 洗 Rik (ASE) 以 及 使 用 各 种 DNA 结合 材料 的 方法 。 以 下 的 方法 建立 在 碘 化 钠 能 够 溶 解 琼脂 糖 凝 胶 以 及 在 高 盐 浓度 中 DNA 能 够 结合 到 玻璃 表面 的 基础 上 。 研 成 粉末 状 的 玻 璃 与 DNA 结合 能 力 非 常 强 。 洗 涤 后 玻璃 上 结合 的 DNA 极 易 被 洗 脱 到 水 中 ， 终 浓度 可 达 100 pg/ ml. 以 下 介绍 的 方法 最 初 是 由 Vogelstein 与 Gillespie 报道 的 41。 这 一 方法 快速 、 可 靠 、 价格 便宜 并 且 回 收 率 高 达 90% 。 回 收 的 DNA 可 用 于 限制 酶 切割 、 连 接 反 应 以 及 标记 反 应 。 有 些 实验 室 甚至 用 这 种 方法 纯化 DNA， 用 于 对 受精 的 卵 母 细 胞 进行 微 注射 以 制作 转基因 鼠 。 这 个 方法 也 可 用 于 高 相对 分 子 质量 DNA 的 纯化 而 无 明显 的 降解 。 但 是 在 片 段 小 于 400 bp 时 效率 有 所 下 降 ， 尤 其 当 片 段 非常 短 (<200 bp) 时 回收 效率 急剧 下 降 。 此 法 惟一 的 缺点 是 必须 在 TAE 缓冲 液 配制 的 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 DNA. 2. 材 料 2.1 制备 玻璃 珠 糊 1 Yo 硅 粉 ，325 目 : 料 石 玻璃 可 以 从 陶瓷 制品 商店 购 得 。 其 中 一 种 是 美国 嫌 石 玻璃 公司 的 产品 ， 是 从 研 碎 的 闪烁 管制 得 。 此 外 也 可 使 用 从 Sigma (St. Louis, MO) (S- 5631) 购 得 的 硅 粉 ， 但 是 其 中 含有 很 高 比例 的 极 细 颗 粒 ， 须 用 差 速 沉 降 法 除去 〈 见 3.2 PF Je 硝酸 (APPT AGATA): 在 使 用 浓 酸 时 必须 非常 小 心 ， 要 戴 上 手套 并 在 通风 橱 中 打开 瓶 2é IL o 灭 菌 蒸馏 水 : 使 用 双 蒸 水 并 经 高 压 灭 菌 。 2 — 3 2.2 从 琼脂 糖 凝 胶 中 纯化 DNA 片段 — — 50 x TAE 电泳 缓冲 液 : 242 g Tris Pl, 57.1 ml 冰 醋 酸 ，100 ml 0.5 mol/L EDTA、 pH 8 0， 加 水 至 1 LE。 ”176 ， 2) Nal WHR: 90.8 g Nal (Sigma S— 8379), 1.5 g NaSO; (Sigma S- 0505), DIKE 蒸馏 水 至 终 体 积 为 100 ml. 4CEAF RUMAH ARH (参见 注释 1 与 2)。 3) 乙醇 洗涤 液 : $S0 % 乙醇 ，100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5, 1 mmol/L EDTA。 室 温 贮存 于 密封 的 容器 中 。 SH 法 3.1 从 碎 玻璃 制备 玻璃 珠 糊 1) 将 250 ml (220~250 g) 玻璃 粉 放 在 500 ml 烧杯 中 ， 倒 入 500 ml 蒸馏 水 搅拌 1 h。 2) 静 置 1 h 后 将 上 清 液 倒 进 一 离心 上 叛 中 ，4000 g BOS min。 将 沉淀 悬浮 于 200 ml 水 中 ， 转 移 到 PyrexIM 懂 杯 中 。 3) 加 入 200 ml HAR (大 约 70% )， 在 通风 橱 中 烧 至 近 沸 。 4) 冷却 后 转移 到 离心 频 中 ， 用 灭 菌 重 蒸 水 悬浮 、 离 心 ， 共 洗涤 四 次 。 5) 将 沉淀 悬浮 在 灭 菌 蒸馏 水 中 制 成 S0% 的 糊 状 物 -(Y7v)， 分 成 小 份 装 在 密闭 的 容器 中 贮存 于 4C ， 防 止 水 分 蒸发 (参见 注释 3)。 从 250 ml (220~ 250 g) 的 玻璃 粉末 中 可 以 得 到 大 约 25 ml 细 颗 粒 精 制 物 (50 ml 50% 的 糊 状 物 )。 使 用 前 须 再 检查 一 下 糊 状 物 中 水 的 比例 是 否 约 为 S0%， 如 果 水 分 蒸发 可 以 加 入 一 些 灭 菌 的 蒸馏 水 。 3.2 ”从 硅 粉 制备 玻璃 珠 糊 这 种 粉末 中 含有 极 细 的 颗粒 ， 可 用 粗放 的 沉淀 方法 将 其 去 除 。 1) 将 100 g 硅 粉 放 在 500 ml 的 烧杯 中 ， 加 入 500 ml 蒸馏 水 搅拌 1 h。 2) 沉淀 2 min 后 倒 入 干净 的 烧杯 中 除去 已 经 下 沉 的 团 块 ， 放 置 2 h。 3) 倾 浴 去 上 清 液 后 回收 沉淀 部 分 ， 这 时 体积 大 约 为 S0 一 75 ml。 这 步 操 作 必 须 非 常 小 心 ， 因 为 下 沉 的 部 分 流动 性 很 大 ， 容 易 漂 浮 起 来 ， 可 能 被 一 起 倒 掉 。 所 以 最 好 的 方 法 是 将 上 清 液 倒 在 另 一 烧杯 中 ， 至 少 是 初次 进行 这 样 的 操作 时 可 以 这 样 做 。 4) 加 入 蒸馏 水 至 200 ml 按照 3.1 节 第 三 步 进行 操作 。 从 100 g 硅 粉 中 应 该 可 以 得 到 100~150 ml 的 50% 糊 状 物 。 3.3 ”从 琼脂 糖 凝 胶 中 纯化 DNA 1) 用 TAE 缓冲 液 在 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 DNA 片段 (参见 注释 4)。 2) 在 透射 紫外 线 灯 下 观察 待 纯 化 的 DNA， 并 将 这 块 琼脂 糖 凝 胶 切 下 (参见 注释 5 与 6)， 装 在 1.5 ml 的 离心 管内 。 3) 估计 琼脂 糖 凝 胶 的 质量 并 按 每 毫克 琼脂 糖 凝 胶 2 一 3 Al Nal 溶液 的 比例 加 入 Nal. 4) 保温 直至 琼脂 糖 凝 胶 熔 化 ， 这 一 过 程 需要 5 一 10 min， 偶 尔 地 摇动 可 以 促进 这 一 过 - iT 程 。 5) 加 入 2 一 5 局 玻璃 珠 糊 至 一 小 管 并 在 旋涡 振 划 器 上 混 匀 (参见 注释 7)。 室 温 放 置 10 min, 其 间 偶 尔 摇动 或 振 功 。 6) 在 微型 离心 机 中 离心 20 s 后 弃 去 上 清 液 。 7) 加 入 500 已 乙醇 洗涤 液 后 用 微量 移 液 器 吸 放 数 次 悬浮 沉淀 ， 然 后 按照 第 6 步 离心 。 重复 两 次 。 8) 最 后 一 次 洗涤 后 再 离心 一 次 ， 小 心地 抽 气 吸 去 最 后 一 滴 乙 醇 ， 沉 演 物 于 空气 中 干燥 数 分 钟 。 9) 用 10 一 20 由 水 悬浮 沉淀 后 于 SSY 保温 5 min。 按 照 第 6 步 离 心 并 收集 含 已 纯化 的 DNA 的 上 清 液 。 10) 重复 第 8 与 第 9 步 ， 合 并 两 次 洗 脱 DNA 的 上 清 液 。 11) 按照 第 6 步 再 次 离心 DNA 洗 脱 液 ， 然 后 将 90% 的 上 清 液 转移 到 干净 的 管子 中 ， 确 保 不 将 可 见 或 不 可 见 的 玻璃 粉 沉淀 也 吸 到 上 清 液 中 去 〈 参 见 注释 8)。 DNA 片段 现在 已 可 使 用 。 这 个 操作 步 又 也 可 用 来 净化 质粒 DNA 的 制备 物 〈 参 见 注 FE 8)， 例 如 供 测 序 用 的 模板 〈 见 第 45 章 )。 4. 注 iE (1) 并 非 所 有 的 亚 硫 酸 盐 都 能 溶解 。 但 不 用 担心 ， 因 为 这 只 是 用 来 作为 抗 氧 化 剂 的 。 (2) 这 一 溶液 会 随 着 时 间 的 推移 而 变 黄 ， 但 不 会 显著 影响 它 的 活性 。 (3) 玻璃 珠 糊 可 于 - 20 或 -707C 长 期 保存 。 (4) 所 使 用 的 琼脂 糖 的 纯度 必须 是 分 子 生 物 学 级 ， 特 别 是 当 DNA 要 用 于 连接 反应 时 。 并 且 不 能 用 低 熔 点 胶 ，TBE 电泳 缓冲 液 制 的 胶 也 不 宜 使 用 。 (5) 切割 琼脂 糖 胶 上 的 DNA 片段 时 胶 块 越 小 越 好 。 (6) 这 一 操作 进行 得 越 快 越 好 ， 因 为 紫外 线 对 待 纯 化 的 DNA 和 实验 人 员 都 不 利 。 (7) 1 pl 的 玻璃 珠 糊 足 够 回收 2 pe DNA， 但 是 为 了 得 到 好 的 沉淀 应 至 少 用 2 pl 的 玻璃 珠 为 好 。 (8) 如 果 回 收 DNA 中 混 有 痕 量 玻璃 珠 ， 在 含 盐 缓冲 液 ， 例 如 大 多 数 酶 反应 的 缓冲 液 中 ， DNA 可 能 重新 结合 到 玻璃 珠 上 去 。 为 了 确保 没有 痕 量 的 玻璃 珠 遗 留 下 来 ， 最 好 每 次 使 用 前 稍 事 离心 ， 并 且 紧 靠 着 表面 吸取 所 需 体 积 的 DNA 溶液 。 (9) 纯化 质粒 DNA 时 ， 在 含 质粒 溶液 中 加 入 2 倍 体积 的 7 mol/L 盐酸 县 ， 并 按照 每 wg 质粒 DNA 1 各 玻璃 珠 糊 的 比例 加 入 玻璃 珠 糊 ， 按 照 3.3 节 第 $ 步 进行 纯化 。 应 该 注意 用 这 个 方法 纯化 的 质粒 是 松弛 型 结构 的 。 参考 文 献 1. Vogelstein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619. - T78 - eS ee eee eee TILE Kit any 1b Fiona M. Tomley Tl 1. 引 近 几 年 中 报道 了 一 些 向 大 肠 杆菌 中 引入 外 源 DNA 的 方法 。 这 些 方法 都 是 建立 在 Mandel 与 Higa 的 一 些 发 现 的 基础 之 上 的 册 。 他 们 发 现 将 细菌 与 裸露 的 噬菌体 DNA 一 起 放 在 冷 的 氧化 钙 中 培养 时 细菌 会 将 噬菌体 DNA 摄 入 ， 并 且 将 混合 物 作 短暂 的 热 休克 会 大 大 增加 转化 效率 。 以 后 这 个 方法 被 用 来 向 大 肠 杆菌 中 引入 各 种 环 状 与 线形 的 DNA， 并 出 现 了 各 种 旨 在 提高 转化 率 (或 是 对 于 M13 MAKI, WER RR) 的 方法 。 转化 的 机 制 尚 不 甚 清楚 ， 但 转化 成 功 的 要 点 是 : 须要 有 多 价 阳 离子 存在 ， 在 接近 于 0T7C 进行 保温 以 及 小 心 控制 420 的 热 休 克 。 但 是 即使 用 了 非常 有 效 的 方法 ， 可 是 能 成 为 转化 “感受 态 ” 的 细胞 也 只 限于 约 总 数 的 10%。 制 备 好 的 感受 态 细 胞 可 以 立即 使 用 ， 也 可 以 分 成 者 干部 分 后 于 -70C 冰 冻 ， 用 时 融化 。 本 章 主 要 介绍 两 种 不 同 的 方法 : 一 种 是 建立 在 最 初 的 CaCl, 方法 基础 上 的 快速 操作 法 ， 另 一 种 是 转化 效率 很 高 的 Hanahan 法 刀 。 以 下 介绍 的 方法 也 可 以 将 质粒 DNA 或 M13 MEEK DNA 引入 感受 态 细 胞 中 去 。 2. 材 料 2.1 用 Caclu 法 制备 感受 态 细胞 1) 合适 的 大 肠 杆 菌 菌 株 : 例 如 用 蓝 白色 B- 半 乳糖 苷 酶 活性 筛选 时 ,宿主 菌 必 须 具 有 5 端 缺失 的 染色 体 /acZ FEAL, 而 扩 增 M13 喉 菌 体 载体 则 必须 要 有 下 ' 附 加 体 。 扩 增 M13 的 菌株 我 们 推荐 用 JM101、JM103、JM107、JM109、TG1 以 及 TG2( 人 参见 注释 1)。 2) L- 肉 汤 : 1%RBARK, 0.5% BEER, 200 mmol/L NaCl， 分 装 后 高 压 灭 菌 。 3) 无 去 污 剂 的 灭 菌 1 LER, RASTA RT MERE. AA REE SF 在 37C ARG (KA 250 r/min) 的 旋转 式 摇 床 。 4) 50 ml RAMS: 例如 一 次 性 的 Falcon 2070 或 是 可 重复 使 用 的 Oakridge 管 ， 管 子 必 须 无 去 污 剂 并 经 灭 菌 处 理 。 最 好 使 用 有 冷冻 设备 的 并 能 进行 4000 g 离心 的 离心 机 。 100 mmol/L CaCl: 以 每 份 1.5 ml 的 1 mol/L CaCl 贮存 于 -20C ， 用 时 化 冻 ， 然 后 稀释 至 15 ml， 过 滤 后 置 冰 上 冷却 (人 参见 注释 2)。 5 2.2 用 Hanahan 法 制备 感受 态 细胞 — 4 SOB: 2% AR ARK, 0.5% 酵母 抽取 物 ，10 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L KCl, - 179 + 2 — 3 Ye 4 Ye 1) 2) 3) pH 7.0。 按 所 需 的 体积 分 成 小 份 后 高 压 灭 菌 ， 临 用 前 加 入 过 滤 除 菌 的 1 molL MgCl 或 是 1 mol/L MgSO4 母 母液 至 镁 离子 的 终 浓度 为 20 mmol/L. TFB:10 mmol/L K-MES, 100 mmol/L RbCl 或 KCl, 45 mmol/L MnCh, 10 mmol/L CaCh, 3 mmol/L 已 胺 氯 化 钴 。 配 制 成 1 mol/L 的 2- (CN - 吗 啉 代 ) 乙 磺 酸 (2 - (N-morpholino ) ethanesulfonic acid, MES) 贮存 液 后 用 5 mol/L KOH 将 pH 值 调 至 6.3 (1 mol/L K-MES)， 以 每 份 10 ml 贮存 于 -20C 。 取 1L 份 10 ml 1 mol/L K-MES 加 入 其 他 固体 盐 ， 配 成 1L TFB， 过 滤 后 以 每 份 153 ml 贮存 于 4 可 稳定 一 年 以 上 。 非常 重要 的 一 点 是 缓冲 液 的 最 终 pH (AMA 6.15+0.1. FSB: 10 mmol/L 醋酸 钊 ，100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl,:4H,O, 10 mmol/L CaCl,+2H,O, 3 mmol/L GRA EH, 10% 甘油 。 配 制 1 mol/L BRAM, 2 mol/IL 醋 酸 将 pH 值 调 至 7.2， 以 每 份 10 ml AF - 200. AH—-f4 10 ml 1 mol/L 酷 酸 钾 加 入 其 他 固体 盐 ， 并 加 甘油 到 10% 配 成 1LFSB， 用 0.1 mol/L HCl # pH {8 调 至 6.4， 过 滤 后 以 每 份 13 MEAS AC. CANE pH 值 降 至 6.1 一 6.2 然后 稳定 下 来 。 如 果 加 入 的 HCI 过 量 时 不 要 回调 pH 值 ， 只 能 弃 去 重新 配制 。 DMSO/DTT (参见 注释 3): 取 一 瓶 新 鲜 的 、 最 高 级 别 的 DMSO 分 装 成 每 份 10 ml, 于 -70C 迪 存在 灭 菌 的 密封 管 中 。 配 制 10 ml 的 DMSO / DTT 时 可 使 用 一 份 100 ml) 89 1 mol/L 醋酸 钾 〈 见 第 2.2 节 ， 第 3 步 )，9 ml DMSO 与 1.53 g DTT， 通 过 耐 有 机 溶剂 的 滤 膜 〈 例 如 Millex SR，millipore) 过 滤 除 菌 后 以 每 份 300 pl MAF -20T7 。 2.3 # 化 X-gal: 20 mg/ml 溶 于 二 甲 基 甲 酰胺 ，- 20C 贮 存 于 暗 处 。 IPTG: 24 mg/ml 溶 于 水 中 ，- 20 们 贮存 于 暗 处 。 L -琼脂 /抗生素 平 严 : 1% BARAK, 0.5% RERERHIE, 200 mmol/L NaCl, 1.2% bacto Sits, VAI 4 Ay RAR Pe, ARC BA. PB OL TF 7k 3 ae aR BR, RAE SOCH MA SMR (参见 注释 4)。 将 熔化 的 琼脂 倒 入 置 于 水 平 桌面 上 的 平 秋 中， 每 平 严 约 15 一 20 ml。 待 琼脂 凝固 后 将 平 血 倒置 ，375 保温 数 小 时 使 琼 脂 表 面 干 燥 。 2.4 将 M13 DNA 引 人 和 人 感受 态 细胞 H Sei: 1% WEA AWK, 140 mmol/L NaCl, 1.2% bacto -琼脂 ， 以 所 需 的 体积 分 装 小 份 后 高 压 灭 菌 。 倒 亚 前 用 沸水 浴 或 微波 炉 熔 熔化 琼脂 ， 冷 却 至 SO0C 左右 时 加 入 合适 的 抗生素 。 将 熔化 的 琼脂 倒 在 置 于 水 平 桌面 上 的 平 血 中 (15~20 ml/ 平 血 )， 待 琼脂 凝固 后 将 平 严 倒置 ， 于 使 用 前 37°C 保温 数 小 时 使 琼脂 表面 干燥 。 1) 是 否 有 误 。 一 一 译 者 注 - G80 - 2) H- 上 层 琼 脂 : 1% BREAK, 140 mmol/L NaCl, 0.8% bacto -琼脂 ， 以 所 需 的 体积 分 装 小 份 后 高 压 灭 菌 。 同 上 法 熔化 琼脂 并 于 48 水 浴 中 保温 备用 。 3) 平 严 接种 所 用 的 细菌 : 新 鲜 的 SO ml 大 肠 杆菌 培养 物 (ARR SSA). Mak 受 态 细胞 并 列 备 用 。 4) 灭 菌 的 、 一 次 性 使 用 的 $ ml 管 ， 例 如 Falcon 2054。 Sus Fi 法 3.1 用 Cachl 法 制备 感受 态 细 胞 1) 从 新 划 种 的 平 茵 上 挑 取 一 个 单 菌落 或 吸取 500 以 过 夜 培养 的 新 鲜 菌 液 ， 接 种 到 一 个 EA 50 ml L - 肉 汤 的 1L 锥 形 瓶 中 。 2) 37C 剧烈 振 功 培 养 直 至 菌 浓度 达到 $x 107 个 /ml， 对 大 多 数 大 肠 杆 菌 菌株 来 说 这 时 的 Asoo 值 为 0.3 一 0.4。 如 果 从 单 菌 落 开 始 培养 至 此 约 需 3 h， 如 从 过 夜 菌 液 开 始 培养 约 需 2 h。 3) 将 培养 液 转移 至 一 灭 菌 并 已 预 冷 的 $S0 ml 离心 管 中 于 冰 上 放置 10 min. 4) 4000 g 离心 10 min 沉淀 细胞 ， 小 心地 倒 去 上 清 液 并 倒转 管子 将 残余 的 液体 沥 干 。 5) 将 细胞 悬浮 在 10 ml 冷 的 0.1 mol/L CaCh 中 ， 置 冰 上 5 min， 重 复 第 4 步 操 作 以 沉淀 细胞 。 6) 将 细胞 悬浮 在 2.5 ml 冷 的 0.1 mol/L CaCh 中 ， 置 于 冰 上 备用 。 操作 到 这 一 步 时 可 将 细胞 分 成 小 份 装 在 冷 的 、 灭 菌 的 1.5 ml BP, EMA PR 冻 后 于 -70 兹 贮存 备用 。 使 用 时 取出 迅速 解冻 后 立即 放 在 冰 上 (参见 注释 5)。 3.2 用 Hanahan 法 制备 感受 态 细 胞 1) 从 新 划 种 的 平 血 上 挑 取 一 个 单 菌 落 或 吸取 5$00 pl 新 鲜 培 养 的 过 夜 培养 液 ， 接 种 到 50 ml 的 SOB - 肉 汤 中 。 2) 37 剧烈 振荡 培养 直至 菌 液 浓 度 达 到 大 约 每 毫升 S x 10 "个 细胞 ( 见 第 3.1 节 第 2 步 )。 3) 将 培养 液 转移 到 一 个 灭 菌 并 预 冷 的 $S0 ml 离心 管 中 ， 冰 上 放置 10 min. 4) 4000 g 离心 10 min 后 小 心地 倒 去 上 清 液 ， 将 管子 倒转 除去 残余 的 液体 。 5) 将 沉 省 悬浮 在 10 ml 冷 的 TFB 中 ， 冰 上 放置 10 min 后 按照 第 4 步 沉 淀 细胞 。 6) 将 细胞 轻 轻 地 悬浮 在 4 ml 冷 的 TFB 中 ， 置 冰 上 备用 。 7) 加 入 140 pl DMSO / DTT 后 立即 轻 轻 地 旋转 混 匀 ， 于 冰 上 放置 15 min 后 再 次 加 入 140 pl DMSO / DTT 并 立即 混 匀 。 8) KERR 15 min 后 分 小 份 分 装 在 $ ml MAHESH. 如 果 制 备 的 细胞 准备 冷冻 贮存 ， 可 同样 按 上 述 步 又 进 行 ， 但 必须 用 FSB 代替 TSB 并 且 使 用 不 含 DTT 的 DMSO。 操 作 至 第 7 步 后 将 细胞 分 装 预 冷 的 $ ml 小 管 放 入 液 氮 中 8 速冻 ， 细 胞 必须 贮存 于 — 70°C 。 使 用 时 迅速 化 冻 后 置 于 冰 上 15 min。 3.3 转化 (参见 注释 6) 1) 使 用 前 将 感受 态 细胞 放 在 冰 水 浴 中 ， 对 大 多 数 实验 来 说 50 由 能 产生 足够 的 菌落 ， 但 如 果 希 望 得 到 大 量 的 菌落 ， 可 以 使 用 更 多 的 感受 态 细 胞 (参见 注释 5 和 7)。 2) 小 心地 向 每 份 细胞 中 加 入 体积 不 超过 Sol AY 40 一 400 ng 质粒 DNA 或 连接 产物 ， 组 HIE (AUER 8)。 转 化 实验 中 包括 两 份 对 照 是 非常 有 用 的 ， 一 份 为 含有 5 一 10 pg 的 质粒 DNA， 另 一 份 不 含 DNA。 3) 冰 水 浴 中 放置 30 一 45 min。 4) 将 管子 移 到 CAE PHIRGBE, HH 90 s 进行 热 休 克 〈 参 见 注 释 9)。 5) 立即 将 管子 放 回 到 冰 水 浴 中 ， 加 入 SOB 肉 汤 (无 Mg 离子 ) 至 终 体积 达到 200 pl. 如 果 预 期 可 以 得 到 大 量 菌落 则 须 将 感受 态 细胞 混合 物 分 成 二 份 ，180 pl 的 一 份 留 在 第 一 个 管 中 ，20 由 的 另 一 份 放 入 第 二 个 管 中 (参见 注释 7)。 6) 管子 放 在 37C 保温 50 min。 7) 每 个 样品 (200 pl 的 体积 ) 中 加 入 40 pl X-gal 和 40 pl IPTG 后 涂 布 于 含 抗 生 素 的 L -琼脂 平 血 上 。 待 干 后 将 平 严 倒转 ， 于 37C 培养 过 夜 。 3.4 将 M13 DNA 引入 到 感受 态 细 胞 中 (参见 注释 10) 1) 熔化 足够 的 H -上 层 琼脂 (3 ml/ 平 阵 ， 再 多 加 几 毫 升 ) 放 在 48C KA PRB. 2) 按照 3.3 节 中 第 1 至 第 3 步 进行 转化 操作 。 3) 热 体 克 前 按照 每 平 亚 200 各 宿主 细菌 、40 pl X-gal 以 及 40 pl IPTG 制备 混合 物 。 4) 将 感受 态 细 胞 /连接 物 的 管子 转移 到 427 水 浴 中 的 架子 上 ， 静 置 90 s 进行 热 休 克 (参见 注释 9)。 : 5) 将 管子 放 入 冰 水 洽 中 ， 加 入 SOB 肉 汤 (不 含 Mg 离子) 到 终 体积 为 200 plo MRA 为 噬 菌 斑 将 会 太 多 ， 可 在 这 时 将 样品 分 成 若干 份 〈 参 见 注释 7)。 6) 在 每 个 样品 中 加 入 280 yl 宿主 细菌 /X-gaMIPTG 混合 物 。 然 后 每 次 只 操作 一 个 样品 :加 入 3 ml H -上 层 琼脂 后 快速 混合 并 倒 在 已 干 的 H -琼脂 平 血 上 。 注 意 不 要 引入 气泡 。 7) 待 平 严 彻 底 干 后 倒转 ，37 尼 培养 过 夜 〈 参 见 注释 11) 。 4. 注 释 (1) M13 宿主 细菌 可 在 基本 培养 基 (M9) 上 4Y 短期 保存 。M9 可 以 维持 F'- 附 加 体 ， 但 是 必须 将 -707 中 贮存 的 菌 种 中 经 常 在 L - 肉 汤加 15% 甘油 平 阵 上 接种 传代 。 (2) 用 于 制备 与 贮存 的 所 有 转化 缓冲 液 只 能 用 高 质量 的 纯 水 ， 例 如 Mili-Q 或 其 他 同样 的 产品 。 使 用 经 灭 菌 的 、 无 去 污 剂 的 玻璃 或 塑料 器 血 ， 溶 液 用 0.45 pm 孔径 的 滤 膜 〈 例 如 Nalgene 或 Acrodisc 的 产品 过 滤 除 菌 。 (3) 在 原始 的 Hanahan 方法 中 DMSO 和 DTT 溶液 是 按 次 序 加 入 的 ， 但 是 如 果 两 种 溶 ~ 782 - 液 一 起 加 入 ， 也 会 得 到 同样 高 的 转化 效率 中 。 (4) 进行 正确 的 选择 是 非常 重要 的 , 最 普通 的 是 用 毛茶 青 霉 素 进行 抗 性 选择 , 但 是 也 可 以 利用 卡 那 霉 素 抗 性 和 四 环 素 抗 性 。 当 使 用 四 环 素 抗 性 进行 选择 时 必须 要 小 心 , A 为 有 些 宿主 细菌 是 利用 四 环 素 抗 性 保持 F -附加 体 的 ,例如 XL-1 蓝 细胞 和 SureIM。 (5) 使 用 冷冻 的 感受 态 细胞 比 使 用 新 鲜 的 感受 态 细 胞 的 转化 效率 为 低 ， 不 过 除非 需要 极 大 量 的 只 菌 斑 ， 否 则 使 用 冷冻 的 细胞 不 但 可 行 而 且 非 常 方便 。 (6) 由 于 质粒 使 宿主 菌 对 抗生素 产生 抗 性 , 从 而 在 过 夜 培 养 后 形成 菌落 而 被 选择 。 还 可 以 利用 另外 一 些 质 粒 选 择 方 法 ,例如 pUC 与 Bluescript, 它们 表达 lacZ 基因 的 a- 片 段 。 当 带 有 这 些 质粒 的 宿主 菌 与 IPTG 和 X-gal 一 起 倒 在 平 阵 上 时 产生 蓝 色 的 菌落 。 把 DNA 片段 亚 克 隆 在 质粒 中 而 破坏 了 a -片段 的 表达 , 结果 便 产 生 白色 菌落 。 (7) 每 次 转化 或 转 染 所 得 到 的 菌落 或 噬 菌 斑 数 由 于 各 种 因素 的 影响 而 变化 很 大 ， 这 些 影响 因素 分 别 是 DNA 的 加 入 量 、 连 接 反应 中 插入 片段 与 载体 的 比例 、 连 接 的 效率 以 及 转化 的 效率 。 一 般 来 讲 闭环 质粒 DNA 在 用 Hanahan 方法 转化 时 应 该 得 到 高 于 10’ 个 / wxg。 对 照 组 用 10 pg 的 质粒 DNA 转 染 时 应 该 得 到 超过 100 个 鸣 菌 斑 。 载 体 DNA 线性 化 后 与 未 端 匹 配 的 过 量 插入 片段 再 行 连接 后 ， 因 连接 效率 的 差异 而 少 得 到 每 pg DNA 10°~10* 个 转化 子 。 这 样 ， 每 次 实验 转 染 40 一 400 ng 的 DNA 可 能 取得 40 一 40 000 个 转化 子 。 氯 化 钙 法 产生 的 转化 子 大 致 上 要 低 2 一 10 倍 。 用 和 氧化 钙 处 理 过 的 新 鲜 制 备 的 细菌 可 于 CaCl 中 4 人 贮存 多 至 48 h， 转 化 效率 在 最 初 的 24 h 内 提高 六 倍 ， 以 后 又 下 降 到 原来 的 水 平 4] 。 (8) 加 入 到 菌 液 中 的 连接 的 DNA 体积 不 能 超过 总 体积 的 10% 。 (9) 热 休克 时 间 的 长 短 是 按 Falcon 2504 管 子 标定 的 , 使 用 其 他 管子 则 时 间 可 能 有 所 不 同 。 (10) M13 DNA 引入 到 大 肠 杆菌 中 的 方法 与 质粒 DNA 完全 一 样 。 但 不 用 抗生素 进行 选 择 ， 因 为 转化 细胞 与 宿主 细菌 一 起 涂 布 在 平 血 上 后 当 感染 了 周围 的 细菌 后 就 会 产 AE TE PAE 〈 参 见 第 四 十 一 章 )。 也 可 以 像 质粒 转化 那样 使 用 蓝 / 和 白斑 选择 的 方法 。 注意 要 做 一 个 与 转化 平行 的 宿主 细胞 倒 亚 对照。 (11) 在 倒 入 上 层 琼 脂 之 前 底层 琼脂 必须 彻底 干燥 。 参考 文 献 — . Mandel, M. and Higa, A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infec- tion. J. Mol. Biol. 53, 159-162. Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557—580. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Preparation and transforma- tion of competent E£. coli, in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Plasmid Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 1.74-1.84. Dagert, M. and Ehrlich, S. D. (1979) Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene 6, 23-28. XN “ ow - 183 - 第 三 十 章 ANP Hal SE LA AE Lucy Drury Tl 1. 3 引 利用 电场 力 对 细胞 的 可 逆 性 穿 透 (电击 穿孔 ) 已 经 成 为 向 真 核 与 原核 细胞 中 转移 DNA 的 有 效 技术 。 很 多 种 类 的 细菌 可 以 成 功 地 被 电击 穿孔 避 ， 并 且 大 肠 杆 菌 的 很 多 菌 株 用 电击 法 转化 时 通常 1 pg DNA 能 得 到 10? 一 102 个 转化 子 。 转 化 效率 可 高 达 存 活 细胞 的 80% ， 并 且 当 DNA 的 浓度 接近 每 毫升 10 pe 转化 DNA BY Se et RE 能 得 到 如 此 高 转化 效率 的 优点 是 很 明显 的 。 例 如 质粒 文库 ， 由 于 质粒 DNA 小 并 且 可 塑性 强 ， 所 以 用 质粒 构建 基因 文库 的 方案 更 为 可 取 。 此 外 对 于 真 核 生物 中 应 用 穿梭 质 粒 进行 转 染 也 是 非常 有 价值 的 。 化 学 法 诱发 感受 态 的 方法 不 能 产生 足够 高 的 转化 率 来 构 建 基因 文库 。 一 些 商 品 化 的 仪器 可 以 提供 方 波 脉 冲 或 是 指数 脉冲 。 由 于 大 部 分 发 表 的 数据 是 使 用 指数 脉冲 波 得 到 的 ， 所 以 下 面 的 讨论 也 限于 这 种 脉冲 形式 。 指 数 脉 冲 是 由 电容 器 放电 所 产生 。 电 压 〈 随 时 间 ) 的 衰减 是 时 间 常 数 r 的 函数 。 t= RC (1) AP R 是 电阻 ， 以 欧姆 为 单位 ; C 是 电容 ， 以 法 拉 第 为 单位 ;是 时 间 常 数 ， 以 秘 为 单位 。 施 加 于 细胞 悬浮 液 两 端的 电势 对 于 任何 一 个 细胞 来 讲 是 电场 强度 (下 = VJ/2， 式 中 d 为 两 个 电极 之 间 的 距离 ) 和 细胞 长 度 的 函数 。 在 细胞 膜 的 两 端 产 生 一 个 电位 ， 一 且 细 胞 膜 上 所 产生 的 电位 超过 一 定 的 限度 时 膜 就 发 生 局 部 的 破裂 ， 从 而 导致 外 界 分 子 渗 . 透 进 入 细胞 。 只 要 电场 的 大 小 与 持续 时 间 都 不 超过 一 定 的 限度 ， 细 胞 膜 上 所 产生 的 通 透 性 便 是 暂时 的 ， 否 则 细胞 就 产生 不 可 逆 的 破损 。 由 于 电场 的 强度 与 细胞 的 大 小 旦 反比 关 系 ， 所 以 对 于 相同 的 通 透 性 来 讲 原核 细胞 比 真 核 细 胞 须要 用 更 高 的 场 强 。 如 果 电 压 以 及 随 电 压 而 变 的 电场 强度 下 降 ， 就 需要 较 长 的 脉冲 时 间 方 能 达到 最 大 的 转化 效率 ， 但 是 这 种 补偿 的 范围 是 有 限 的 。 增 加 场 强 导致 细胞 的 存活 率 降 低 ， 而 最 大 的 转化 效率 往往 只 能 在 细胞 存活 为 30% 一 40% 时 才能 达到 。 本 章 叙 述 并 讨论 细菌 的 电击 转化 法 ， 特 别 是 有 关 大 肠 杆菌 的 资料 。 1) 合适 的 大 肠 杆 菌 菌 株 : 作者 所 测试 过 的 菌株 在 用 电击 法 转化 中 都 取得 了 比 化 学 诱导 法 更 高 的 转化 率 参考 文献 1 中 就 是 一 些 曾 成 功 地 应 用 于 电击 转化 法 的 菌株 。 * 184 。 2) L - 肉 汤 培 养 基 : 1% bacto FRHAR, 0.5% bacto -酵母 抽 提 物 ，0.5% NaCl. 3) 0.1 mmol/L HEPES、pH 7.0， 可 用 蒸馏 水 代替 。 4) 蒸馏水 : 高 压 灭 菌 。 5) 10% 甘 油 (v/v): 用 灭 菌 的 蒸馏水 配制 。 2.2 感受 态 细菌 的 电击 穿孔 1) 电击 仪 : 转化 实验 需要 高 压 的 电击 装置 ， 例 如 Bio-Rad (Richmond，CA) 公司 的 带 有 脉冲 控制 的 基因 脉冲 仪 ， 以 及 放置 细菌 悬 液 的 小 杯 ， 杯 中 电极 距离 为 0.1 cm 或 0.2 cmo 2) TE: 10 mmol/L Tris-HCl. pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. 3) SOC: 2% bacto - % A HK, 0.5% bacto -酵母 抽 提 物 ，10 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgSO,, 20 mmol/L 葡萄 糖 。 3.4 法 3.1 感受 态 细 菌 的 制备 1) 从 已 选 定 的 大 肠 杆菌 菌株 的 新 划 线 的 琼脂 平 血 开始 。 2) 挑 取 一 个 单 菌落 接种 于 世 - 肉 汤 培 养 基 或 其 他 合适 的 营养 丰富 的 培养 基 中 ， 培 养 过 夜 。 3) 次 日 取 10 ml 过 夜 培养 的 菌 液 接种 至 1LL- 肉 汤 培 养 滚 中 ， 于 37Y 中 在 良好 通气 的 条 件 下 继续 培养 ， 快 速生 长 的 细胞 可 以 得 到 最 佳 结果 (参见 注释 1)。 4) 当 培 养 液 的 ODsoo 达 到 0.$ 一 1.0 时 置 于 冰 上 。 不 同 菌株 的 最 适 菌 浓度 是 不 同 的 ， 但 作者 发 现 OD 值 在 0.5 时 往往 能 得 到 最 好 的 结果 。 5) 冰 上 放置 15~30 min. 6) 4C FL 4000 g 离心 6 min， 倒 去 上 清 液 。 7) 再 次 将 细胞 悬浮 于 等 体积 的 0.1 mmol/L HEPES RMF, BHM EK LY A (参见 注释 2)。 8) 在 4 中 离心 沉淀 细胞 并 再 次 悬浮 于 1/2 倍 体积 的 HEPES 中 ， 由 于 细胞 在 低 离 子 强度 的 溶液 中 形成 的 沉淀 很 松 ， 所 以 操作 必须 非常 小 心 。 9) 4C 中 再 次 离心 收获 细胞 并 再 次 悬浮 于 20 ml 冰冻 过 的 10% 甘 油 中 。 10) 最 后 一 次 离心 收集 细胞 并 悬浮 于 2~3 ml 10% 的 甘油 中 。 细 胞 的 终 浓 度 应 在 3X101 个 /ml 左右 。 细胞 可 以 立即 使 用 或 者 用 干冰 速冻 后 于 - 70 保存 ， 细 胞 可 以 在 大 约 6 个 月 内 保持 感受 态 ， 细 胞 在 数 次 冷冻 与 解冻 后 只 有 少量 的 活力 损失 (参见 注释 3)。 - i>» 3.2 感受 态 细菌 的 电击 穿孔 1) 将 样品 杯 及 杯 架 放 在 冰 上 冷却 (BOER 4). 2) 将 仪器 调节 到 适当 的 参数 ， 例 如 电容 为 25 wpF， 电 压 为 1.8 kV 或 2.$ kV ( 指 分 别 使 用 0.1 cm 或 0.2 cm 的 样品 杯 时 )。 将 脉冲 控制 单位 设 定 于 2000。 3) 将 冷冻 的 一 部 分 细胞 在 冰 浴 中 解冻 或 使 用 新 制备 的 细胞 〈 也 应 置 于 冰 浴 中 )。 4) 冷却 的 1.5 ml 聚 丙烯 管 中 加 入 40 pl 细胞 悬浮 液 ( 用 0.2 cm 的 样品 杯 时 则 加 入 45 yl, 参见 注释 5) 和 1 一 5 岂 溶 于 水 或 是 低 离子 强度 缓冲 液 如 TE WY DNA WRK. KA a EK 上 放置 约 1 min( 参 见 注释 6 一 9), 再 延长 冰 浴 放置 时 间 并 无 好 处 (参见 注释 10)。 5) 将 细胞 与 DNA 的 混合 液 转 移 到 一 个 冷 的 电击 样品 杯 中 ， 如 有 必要 可 轻 轻 拍打 使 悬浮 液 处 于 样品 杯 的 底部 。 在 以 上 设置 的 条 件 下 施加 一 个 脉冲 ， 所 产生 的 时 间 常 数 为 4.6 一 4.8 ms (样品 杯 为 0.1 cm 时 场 强 为 18 kV/cm, 0.2 cm 的 样品 杯 则 是 12.5 kV/cm). 立即 加 入 1 ml SOC 培养 液 至 样品 杯 中 〈 置 于 室温 )。 重 新 悬浮 细胞 并 转移 到 17 mm Xx 100 mm 的 聚 丙烯 管 中 ，37 培养 1 h (参见 注释 11)， 在 培养 时 间 内 以 225 r/min 揪 动 管子 可 提高 转化 子 的 得 率 。 8) 以 合适 的 稀释 度 涂 布 于 选择 性 平 血 上 。 6 Ye 7 可 能 碰 到 的 问题 在 注释 12~ 16 中 进行 讨论 。 4. 释 (1) 者 要 得 到 高 度 (电击 ) 感受 态 的 大 肠 杆菌 细胞 必须 使 它 快速 生长 ， 并 在 对 数 期 早 期 至 中 期 收集 。 始 终 将 细菌 保持 于 4 ， 并 应 尽 可 能 快 地 进行 操作 。 (2) 洗涤 细菌 并 将 其 悬浮 于 低 离 子 强度 的 溶液 中 是 非常 重要 的 ， 因 为 这 样 可 以 防止 样 品 杯 中 由 于 电 穿 孔 所 需 的 高 压 而 发 生 电弧 放电 。 (3) 10% 的 甘油 溶液 能 在 - 70Y 为 大 肠 杆菌 提供 理想 的 低温 保护 。 细 胞 芸 浮 液 分 成 小 份 装 在 预 冷 的 1.5 ml 聚 丙烯 管 中 后 置 于 干冰 中 冷却 ， 但 是 在 液 氮 中 快速 冷却 可 能 有 害 ”]。 在 冰 中 小 心 进行 几 次 融化 -冰冻 的 过 程 对 细胞 的 感受 态 水 平 看 来 没有 太 大 的 影响 。 (4) 由 于 电击 时 须 使 用 高 场 强 ， 所 以 对 大 多 数 细菌 来 讲 电 穿孔 最 好 在 0 一 4 进行 。 当 电 穿 孔 在 室温 进行 时 效率 要 降低 100 倍 ， 这 可 能 与 膜 的 状态 有 关 或 者 可 能 是 在 脉 冲 过 程 中 产生 了 过 多 的 热量 所 致 [4] 。 (S) 当 使 用 电极 距离 为 0.2 cm 的 样品 杯 时 40 岂 的 细胞 悬浮 液 正好 将 杯 底 盖 没 。 最 好 使 用 45 pl 的 细菌 悬浮 液 ， 这 样 能 防止 吸 量 的 误差 。 样品 杯 中 液体 不 足 时 容易 发 生 电弧 放电 。 (6) 转化 效率 可 以 通过 改变 细菌 悬浮 液 的 浓度 来 进行 调节 。 细 菌 的 浓度 从 0.8 x 10° 个 /ml 提高 到 8 x 10° 个 /ml 时 转化 效率 可 提高 10 一 20 倍 品 。 实 验证 明 当 细菌 的 浓 - 186 - a Ne den _ aur @ 6 + cee eee 度 提 高 到 2.8 x 10 /ml 并 使 用 固定 的 DNA 浓度 时 转化 子 数 稳步 提高 6]。 (7) 引入 细胞 的 转化 DNA 必须 放 在 低 离子 强度 的 溶液 中 ， 注 释 2 中 提 到 高 离子 强度 的 溶液 使 杯 中 产生 电弧 放电 或 是 很 短 的 脉冲 时 间 ， 从 而 造成 细胞 的 死亡 和 导致 样品 的 损失 。 例 如 CsCl 或 醋酸 铵 之 类 的 盐 离子 浓度 必须 控制 在 10 mmolyL 以 下 。 最 好 是 将 DNA 溶 于 TE 或 水 中 。 这 一 点 在 连接 反应 之 后 特别 重要 ， 因 为 连接 缓冲 液 中 的 离子 强度 非常 高 ， 不 能 直接 用 于 电击 。DNA 必须 用 乙醇 /醋酸 贸 进 行 沉 淀 ( 沉 淀 时 加 入 载体 tRNA 不 会 影响 转化 频率 )。 或 者 连接 液 可 以 按照 1/100 稀释 后 取 5 岂 用 于 电击 转化 6]。 (8) 电击 时 转化 DNA 的 浓度 直接 与 被 转化 细菌 的 百分比 有 关 。 对 于 大 肠 杆菌 这 个 百 分 比 可 以 适用 于 几 个 数量 级 范围 中 ， 当 DNA 达到 高 浓度 (直至 7.5 pg/ml) 时 大 约 80% 的 存活 细胞 可 以 转化 成 功 习 。 这 与 化 学 处 理 的 感受 态 细胞 不 同 ， 在 化 学 法 中 DNA 2 BE4K 100 倍 时 已 经 饱和 ， 这 时 只 有 小 部 分 细胞 处 于 感受 态 而 被 转化 [91。 对 于 要 求 高 效 而 低频 的 转化 〈 例 如 构建 基因 文库 时 不 希望 有 共 转 化 子 的 )， 小 于 10 ng/ml 的 DNA 浓度 和 小 于 3 x 1028 的 细胞 浓度 是 比较 合适 的 。 相 反 地 ， 如 果 需 要 高 频 转 化 ， 可 以 用 1 一 10 prg/ml， 这 样 可 以 转化 大 部 分 存活 细胞 已 。 (9) DNA 分 子 的 大 小 与 拓扑 构 型 可 以 影响 转化 效率 。 有 报道 认为 大 至 20 kb 的 质粒 与 3 kb 的 质粒 的 摩尔 转化 效率 相同 ， 并 且 当 这 些 质粒 转变 为 松弛 型 时 并 不 影响 他 们 的 转化 活性 。 较 大 的 分 子 能 被 吸入 但 效率 极 低 ， 例 如 线 型 ADNA (48 kb) 的 摩尔 转化 效率 仅 为 小 分 子 质粒 的 0.1%Bl。 对 于 具有 相同 复制 起 点 、 相 同 启动 子 与 相 同 基因 标记 但 大 小 不 同 的 大 肠 杆菌 质 粒 的 直接 比较 未 见 文献 报道 ， 但 是 在 我 的 经 验 中 不 同 构造 的 质粒 具有 不 同 的 摩尔 转化 效率 。Powell FU HRT FRR ( Streptococcus lactis ) 中 有 关 的 质粒 的 吸入 ， 认 为 质粒 的 大 小 与 摩尔 转化 效率 之 间 没有 明确 的 关系 。 (10) 转化 过 程 中 并 未 发 现 DNA 结合 在 细胞 表面 的 证 据 ， 因 此 增加 电击 前 的 保温 时 间 至 30 min 对 转化 结果 没有 什么 影响 2]。 为 了 支持 这 一 观察 ，Calvin Ee THEN 实验 : 将 细胞 与 放射 性 标记 的 质粒 混合 ， 洗 涤 两 次 后 发 现 只 有 少量 的 放射 性 物质 仍 结合 在 细胞 上 。 某 些 种 类 的 细菌 ， 例 如 干 酷 乳 酸 杆 菌 (Lactobacillus casei) 能 分 泌 核 酸 酶 ， 因 此 增加 电击 前 的 保温 时 间 可 能 有 害 [9] 。 (11) 电击 后 的 大 肠 杆菌 是 非常 脆弱 的 ， 迅 速 加 入 恢复 生长 的 培养 基 可 以 大 大 增加 其 活 力 和 转化 效率 。 甚 至 迟 一 分 钟 加 入 ， 转 化 效率 就 会 降低 3 一 5 倍 ， 若 迟 至 10 min 后 加 入 ， 转 化 效率 会 降低 20 倍 忆 1。 电击 后 恢复 生长 对 于 表达 转化 质粒 所 引入 的 抗 性 基因 也 属 必 要 ， 通 常 需要 1 h。 (12) 有 一 些 原因 会 造成 样品 杯 中 电弧 放电 ， 其 中 一 个 原因 可 能 是 DNA 溶液 或 是 细菌 悬 浮 液 的 离子 强度 太 高 。 非 常 重要 的 一 点 是 DNA 应 悬浮 于 TE 或 水 中 。 和 若是 连接 混 合 物 则 必须 用 0.3 mol/L 的 醋酸 钠 和 2 一 3 倍 体积 的 乙醇 沉淀 ， 或 者 在 TE 或 水 中 稀释 10~ 100 倍 。 如 果 细 胞 /DNA 混合 没有 到 达 样 品 杯 的 底部 或 是 样品 杯 中 溶液 太 少 时 也 会 发 生 同 样 的 问题 (参见 注释 5)。 另 一 个 可 能 的 原因 是 样品 杯 与 腔 室 在 冰 上 冷却 时 残留 在 表面 的 水 分 引起 电弧 。 当 须 要 电击 处 理 很 多 样品 时 不 必 在 每 一 次 脉冲 后 冷却 样品 杯 架 ， 但 最 好 在 做 了 几 > 187 > MER LAMB, AWARKAB AR ie hk ME (13) 若 转化 后 得 不 到 菌落 ， 问 题 可 能 出 在 细菌 上 或 是 DNA 上 。 BRE SH KE 释 的 超 螺旋 质粒 ， 例 如 pUC18， 以 便 在 所 有 的 实验 中 都 以 此 作为 正 对 照 。 用 这 种 方法 可 按 常规 检验 制备 的 细菌 〈 若 制备 的 细菌 具有 pe DNA 转化 10 个 转化 子 的 转化 效率 ， 那 么 5 pg 超 螺旋 的 DNA 能 够 得 到 大 约 10 000 个 转化 子 )。 如 果 正 对 照 中 不 能 得 到 转化 子 ， 就 要 检查 细菌 的 培养 与 收获 条 件 是 否 都 是 正确 的 。 更 高 感受 态 细胞 是 在 对 数 早 期 至 对 数 中 期 内 收获 的 快速 生长 的 细菌 。 操 作 时 所 有 的 洗涤 液 保持 在 4C ， 收 集 菌 体 时 也 要 保持 在 冷 的 状态 下 。 在 处 理 一 个 新 的 菌株 时 最 好 在 ODso 为 0.4 一 1.0 时 收获 ， 我 们 发 现 最 佳 菌 浓 约 在 0.5 左右 。 如 果 电 击 处 理 的 感受 态 细 胞 曾 保存 在 -70C ， 那 么 必须 肯定 它们 仍 是 活 的 ， 可 以 用 合适 稀释 度 涂 布 于 非 选择 性 的 培养 基 上 测试 存活 数 。 如 果 转 化 细菌 只 出 现在 对 照 中 ， 则 应 先 检 验 所 使 用 DNA 的 浓度 ， 也 可 能 DNA 中 含有 酚 或 SDS 等 有 毒 的 杂质 。 电 击 后 细胞 的 存活 率 可 以 用 涂 布 在 非 选 择 性 下 上 的 方法 来 测定 。 若 使 用 第 3 节 中 列 出 的 参数 可 望 达 到 30% 一 40% 的 存活 率 ， 但 同 时 也 应 用 对 照 DNA 转化 同 量 细 菌 来 核实 。 如 果 DNA 已 被 污染 可 沉淀 后 用 70% 的 乙醇 洗涤 或 用 玻璃 珠 法 (参见 二 十 八 章 ) HE DNA 去 除 不 要 的 化 学 物质 。 (14) 如 果 发 现 已 经 测定 过 电击 感受 态 的 一 批 新 近 制 备 的 细胞 的 转化 效率 下 降 了 ， 那 么 问题 可 能 出 在 电击 穿孔 这 一 步 。 非 常 重要 的 一 点 是 样品 杯 与 杯 架 必须 冷却 ， 使 细 菌 在 开始 电击 时 保持 在 0 一 4 。 至 关 重 要 的 是 在 电击 后 立即 加 入 恢复 生长 的 培养 基 (在 室温 保存 )。 另 一 可 能 的 情况 是 保存 细菌 的 条 件 未 能 保持 恒定 ， 例 如 冰箱 的 温度 不 能 维持 不 变 。 (15) 对 于 未 曾 预料 到 的 高 转化 效率 有 多 种 可 能 的 解释 ， 最 简单 的 解释 是 抗 性 下 已 经 过 期 。 此 外 因为 细胞 是 高 感受 态 的 ，DNA 的 污染 也 会 成 为 问题 。 非 常 重 要 的 一 点 是 要 使 用 无 菌 操 作 技 术 并 且 要 仔细 使 用 微量 移 液 器 ， 防 止 上 次 实验 中 的 DNA 与 本 次 实验 造成 交叉 污染 。 由 于 电击 法 可 使 细胞 释放 质粒 ， 所 以 前 一 次 转化 的 细菌 所 造 ， 成 的 污染 效应 将 大 大 升 高 ， 特 别 是 当 污 染 的 细菌 含有 高 拷贝 的 质粒 时 。 (16) 大 肠 杆菌 转化 中 遇 到 的 上 述 的 一 些 问题 如 果 在 其 他 细菌 的 转化 中 也 遇 到 时 ， 可 能 是 由 于 该 细菌 的 特殊 性 质 。 例 如 如 果 转 化 的 细菌 有 蓉 膜 ， 它 就 可 能 阻碍 DNA 的 进 入 ， 某 些 种 类 的 细菌 还 会 分 泌 核酸 酶 降解 DNA， 某 些 类 型 的 细菌 须要 较 长 的 恢复 时 间或 在 较 长 时 间 后 才能 表达 选择 性 标记 。 如 果 细 胞 的 大 小 不 寻常 时 可 能 在 电击 时 须要 用 到 与 常规 不 同 的 场 强 。 建 立 应 用 于 一 种 新 的 细菌 的 电击 条 件 ， 最 好 参照 类 似 细菌 〈 参 考 文献 1 中 所 列 的 材料 ) 的 常规 参数 ， 然 后 在 此 基础 上 进行 优化 。 参考 文 献 1. Bacterial species that have been transformed by electroporation (1990) Bio-Rad Laboratories, 1414 Harbor Way South, Richmond, CA 94804. Bull. 1631. 2. Dower, W. J., Miller, J. F., and Ragsdale, C. W. (1988) High efficiency trans- formation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145. - Tae ° . Dower, W. J. (1990) Electroporation of bacteria: a general approach to genetic transformation, in Genetic Engineering, vol. 12 (Setlow, J. K., ed.), Plenum, New York, pp. 275—295. . Shigekawa, K. and Dower, W. J. (1988) Electroporation of eukaryotes and prokary- otes: a general approach to the introduction of macromolecules into cells. Biotech- niques 6, 742-751. . Willson, T. A. and Gough N. M. (1988) High voltage E. coli electrotransformation with DNA following ligation. Nucleic Acids Res. 16, 11,820. . Hanahan, D. (1995) Techniques for transformation of E. coli, in DNA Cloning. A Practical Approach, vol. 1, 2nd ed. (Rickwood, D. and Hames, B. D., eds.) Oxford University Press, New York, pp. 1-36. . Powell, I. B., Achen, M. G., Hillier, A. J., and Davidson, B. E. (1988) A simple and rapid method for genetic transformation of Lactic streptococci by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 54, 655—660. . Calvin, N. M. and Hanawalt P. C. (1988) High efficiency transformation of bacte- rial cells by electroporation. J. Bacteriol. 170, 2796-2801. . Chassy, B. M. and Flickinger, J. L. (1987) Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177. * #59 > 第 三 十 一 章 “应 用 碱 裂解 法 制备 质粒 DNA Etienne Joly Tl 1. 引 质粒 的 “微量 抽 提 ”方法 很 多 ， 几 乎 是 有 多 少 分 子 生 物 学 实验 室 便 有 多 少 个 “微量 抽 提 ”法 。 以 下 的 方法 是 从 Birnboim 与 Doly 册 发 表 的 碱 裂解 法 衍生 而 来 的 ， 它 在 1982 年 版 的 《分 子 克 隆 实验 操作 手册 》 中 已 略 加 修改 2]。 这 个 方法 通过 NaOH 与 SDS 裂解 细胞 ， 然 后 用 高 浓度 的 栈 酸 钾 中 和 ， 结 果 使 细菌 的 染色 体 DNA 与 其 他 高 相对 分 子 质量 的 细胞 结构 选择 性 地 沉淀 下 来 ， 留 在 上 清 液 中 的 质粒 DNA RARE. 以 后 引入 了 一 些 简 化 的 方法 ， 而 且 多 数 液体 可 以 用 重复 加 样 的 移 液 器 吸取 。 如 果 仅 抽 提 几 个 样品 并 且 使 用 最 简单 的 方法 ， 那 么 可 以 在 10 min 内 从 2 ml 的 培养 液 中 抽 提 到 KF 20 pg 的 纯度 足以 用 于 酶 切 的 质粒 DNA。 在 初步 鉴定 后 可 以 用 RNase 进一步 纯化 部 分 或 全 部 样品 并 用 有 机 溶剂 抽 提 。 这 种 进一步 纯化 的 DNA 适用 于 亚 克 隆 、 测 序 、 放 射 性 同位 素 标记 甚至 用 于 真 核 细胞 的 转化 。 这 一 操作 可 以 放大 至 “大 量 抽 提 ”法 制备 大 量 的 质粒 DNA。 如 果 需 要 极 高 纯度 的 制品 ， 则 可 再 用 氧化 饮 / 溴 化 乙 锭 密度 梯度 离心 法 去 除 痕 量 的 污染 染色 体 DNA。 2. 材 料 2.1 小 规模 质粒 DNA 的 制备 _ TB 细菌 培养 基 : 将 100 ml KP 溶液 与 900 ml pre- TR 溶液 混合 。KP 溶液 的 配方 是 2.31 g KH,PO,, 12.54 g K HPO:， 加 蒸馏 水 至 100 ml。pre-TB 溶液 的 配方 为 : 12 g bacto RAR AKK, 24 g bacto -酵母 提取 物 ，4 ml 甘油 ， 加 水 至 900 ml。 这 两 种 溶液 必须 分 别 灭 菌 。 使 用 时 加 入 合适 的 抗生素 。 2) 灭 菌 试管 : 必须 大 于 10 ml， 保 证 培养 细菌 时 有 良好 的 通气 条 件 。 3) 适用 于 微型 离心 机 的 1.5 ml 离心 管 和 一 个 大 的 金属 架子 ， 作 者 所 用 为 有 金属 线 网 的 架子 ， 能 容纳 直径 为 13 mm 的 管子 。 可 重复 加 样 的 上 装 针 简 的 移 液 管 : 例如 Eppendorf 组 合 吸 嘴 ， 可 吸取 50. 100 以 及 250 jl 液体 。 每 种 液体 配 一 个 一 次 性 的 针 简 ， 可 以 使 用 数 百 次 。 细菌 悬浮 液 (BRS): 50 mmol/L 葡萄 糖 , 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, RFF 4C 中 以 防止 污染 ， 6) 裂解 液 (LS) : 200 mmol/L NaOH, 1% SDS， 室 温 贮存 。 7) 中 和 液 (KoAc): 3 mol/L K+ /5 mol/L Ac 。100 ml 溶液 中 含有 29.4 g HAR, « Teo » 4 ~~ 5 ~~ — Re 8) 9) 10) 11) 1) 2) 3) 4) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 88.5 ml 水 以 及 11.5 ml 冰 醋 酸 ， 室 温 贮存 。 FAB. 70% 乙醇 。 TE: 10 mmol/L Tris-HCl. pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. RNase A: 购买 冷冻 干燥 的 粉剂 (Sigma, [St, Louis, MO], R9009). Bc 10 mg/ml 的 水 溶液 后 于 沸水 中 放置 10 min 消除 残余 的 DNase 活力 。 分 装 小 管 于 -- 20 贮存 。 2.2 质粒 的 纯化 0.4 mol/L MRE. 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 : 按 25:24:1 的 比例 混合 TE Fe. AGAR RB. ATH 存 以 减少 氯仿 的 挥发 。 氯仿 / 异 成 醇 : 氯仿 和 异 成 醇 的 比例 为 24:1。4 和 贮存 以 减少 氯仿 的 挥发 。 100% 乙醇 。 2.3 质粒 DNA 的 大 量 抽 提 大 三 角 烧 瓶 : REKF2L HEAR, SERB. 500 ml HB DH (也 可 选择 250 或 是 100 ml 的 ) 以 及 合适 的 转 头 与 离心 机 。 TsoE: 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA. 一 次 性 的 10 ml FRAME. Abe: 选择 纯度 为 分 子 生 物 学 级 的 氯 化 饮 ， 但 没有 必要 选用 超 纯 级 的 试剂 ， 因 为 超 纯 试 剂 的 价格 过 于 昂贵 ， 比 分 子 生 物 学 级 贵 两 倍 多 。 溴 化 乙 锭 (EB): ACK 10 mg/ml 的 水 溶液 。EB 是 强烈 的 诱 变 剂 ， 操 作 时 必须 戴 上 FE, PAM FEY AE he), 超 离 心 管 : 快 封口 管子 和 热 封 口 器 (Beckmann, Palo Alto, CA). 针 简 与 针头 : 2 ml 针 简 和 19 号 针头 。 水 饱和 的 丁 醇 (WSB)。 30 ml Bb (PM Corex)， 合 适 的 转 头 与 离心 机 。 SP 法 3.1 质粒 DNA 的 小 量 抽 提 在 亚 克 隆 中 往往 必须 用 限制 性 内 切 酶 切割 质粒 DNA 的 方法 对 大 量 含有 质粒 的 菌落 进行 筛选 。 在 这 种 情况 下 就 须 同 时 进行 快速 而 小 量 的 质粒 DNA 抽 提 。 1) 挑 取 不 同 的 单 菌落 分 别 接种 于 2 ml 灭 菌 的 TB 培养 液 中 (参见 注释 1)。 盖 上 盖子 于 37C 振荡 过 夜 。 9 2h * 2) 将 每 一 试管 中 的 培养 液 倒 入 贴 上 标签 的 1.5 ml 管 中 ， 放 入 微型 离心 机 以 12 000 g 离心 30 s 细菌 将 形成 压 紧 的 奶油 状 沉淀 。 3) 倾 浴 去 除 上 清 液 ， 将 管子 垂直 置 于 管 架 上 数秒 钟 〈( 即 倾 誉 其 余 小 管 所 需 时 间 六 积 在 管 底 的 最 后 一 滴 液 体 可 用 一 细 口 的 滴 管 或 200 品 的 吸 嘴 接 在 真空 系统 上 吸 去 。 4) 用 重复 使 用 的 移 液 管 在 每 一 管子 中 加 入 100 pl 的 BRS 溶液 后 盖 上 盖子 ， 将 每 个 管 子 与 金属 架子 摩擦 以 重新 悬浮 细菌 (参见 注释 2)。 5) 用 重复 使 用 的 移 液 管 在 每 个 管 中 加 入 200 由 的 LS 溶液 ， 反 复 倒转 管子 并 用 手 摇 动 数秒 钟 使 内 容 物 混 合 (参见 注释 3 与 4)。 溶 液 应 该 很 快 从 混浊 变 为 透明 ， 表 示 细 菌 已 经 及 时 地 裂解 了 。 裂 解 至 少 进行 3 min。 在 打开 盖子 前 须 静 置 30 s 使 黏稠 的 液体 回 到 管 底 。 6) 用 重复 使 用 的 移 液 管 在 每 个 管 子 中 加 入 150 pl 的 KOAc。 按 第 5 步 操作 摇动 管子 。 生成 的 白色 沉淀 中 含有 细菌 的 染色 体 DNA、 大 部 分 SDS 以 及 很 多 其 他 不 需要 的 细 菌 成 分 。 在 微型 离心 机 中 全 速 离心 2 一 5 min。 7) 同时 将 一 组 新 的 管子 贴 上 标签 ， 每 管 中 加 入 250 ol RAR. 8) 从 离心 机 中 取出 管子 小 心地 放 在 架子 上 ， 使 白色 沉淀 仍 黏附 于 管 壁 上 ， 用 1aml 可 调 移 液 管 吸 去 上 清 液 ， 尽 可 能 不 要 吸 到 白色 的 沉淀 〈 参 见 注释 S)。 吸 出 的 液 相 放 在 盛 有 蜡 丙 醇 的 一 组 干净 的 管子 中 。 9) 盖 上 盖子 后 在 涡 旋 振 功 器 上 振荡 数秒 钟 ， 通 常会 形成 乳白 色 沉 淀 。12 000 g 离心 30 s 后 质粒 DNA 形成 白色 的 沉淀 。 10) 倒 去 上 清 液 ， 加 入 750 由 70% 的 乙醇 洗涤 沉淀 ， 稍 稍 涡 旋 振 葛 后 离心 30 s。 倒 去 乙 醇 后 再 次 离心 10 s 使 剩余 的 乙醇 沉 到 管 底 。 小 心地 抽 气 除去 液体 ， 管 子 于 空气 中 后 2 1~5 min. 11) 每 管 中 加 入 50 由 的 TE 悬浮 沉淀 〈 参 见 注释 6). 如 果 抽 提 的 是 高 拷贝 的 质粒 并 且 得 率 也 良好 ， 那 么 2 一 3 以 的 DNA 溶液 已 足够 进 . 行 酶 切 与 电泳 分 析 了 。 酶 切 体系 中 加 入 RNase (每 个 酶 切 样品 中 加 1 pe) 以 便 在 电泳 前 去 除 污 染 的 RNA。 另 外 也 可 以 用 一 一 种 比较 繁琐 的 方法 在 质粒 DNA 的 制备 过 程 中 去 除 RNA (参见 注释 7 与 8)。 3.2 质粒 的 纯化 用 凝 胶 电 泳 鉴 定 质粒 DNA 的 质量 后 可 能 还 有 进 一 一 步 的 工作 要 做 ， 如 测序 、 亚 克隆 以 及 DNA 介 导 的 基因 转移 ， 为 此 还 须 对 DNA 再 次 进行 纯化 。 1) 每 份 小 量 制备 物 中 加 入 50 yl 4 mol/L BRE, PY 200 ug/ml RNase A， 室 温 放 置 20 min。 2) 每 份 DNA 样品 中 加 入 100 岂 的 酚 / 氯 仿 ， 稍 稍 涡 旋 振荡 后 12 000 g 离心 2 min。 将 上 层 液 体 (含有 DNA) 吸 至 一 个 干净 的 含有 100 pl AMEE (BOLE 9)。 3) 稍稍 涡 旋 振荡 后 12 000 g 离心 2 min, 再 次 将 含有 DNA 的 上 清 液 吸 到 一 个 王 净 的 ° Te2 - 含有 200 pl 100% 乙醇 的 管子 中 。 4) FARMER GLE DNA 沉淀 ， 室 温 离心 S min。 5) 用 70% 乙醇 淋 洗 ， 稍 事 离心 ， 抽 和 气 除去 剩余 乙醇 后 空气 干燥 $ min。 6) 用 50 pl KR TE 溶解 DNA. 3.3 质粒 DNA 的 大 量 制备 大 量 制备 质粒 DNA 时 可 以 使 用 放大 了 的 小 量 制备 方法 。 1) 接种 25$0 一 500 ml 的 TB 培养 液 ，37? 振荡 过 夜 。 2) 将 培养 液 转移 到 一 个 合适 的 离心 饶 中 (例如 Beckman 355607 BL), 5000 g 离心 3 mino 3) 倒 去 上 清 液 ， 倒 转 离心 钒 几 秒 钟 沥 干 液体 ， 或 用 干净 的 滴 管 接 在 真空 系统 上 吸 去 液 体 。 4) 将 菌 体 重新 悬浮 在 20 ml 的 BRS 溶液 中 。 5) £40 ml 的 LS 溶液 中 裂解 细胞 。 用 手 播 动 并 于 室温 放置 10 min. 6) 用 30 ml 的 KOAc 中 和 上 述 溶液 。 用 手 摇动 ， 开 始 时 要 缓慢 ， 到 最 后 要 剧烈 地 摇 。 应 有 白色 的 沉淀 形成 。 7) 4 中 以 6000 g 离心 10 min， 将 液 相 转移 到 一 个 干净 的 含有 55 ml 异 丙 醇 的 离心 负 中 ， 移 取 液 体 时 使 用 25 ml 的 移 液 管 ， 尽 量 不 要 将 白色 的 沉淀 吸入 。 8) be GV 6000 g 在 室温 中 离心 S min， 用 10 ml 70% 乙醇 洗 涤 沉 淀 ， 再 次 离心 5 min。 倒 去 上 清 液 ， 用 接 在 真空 系统 上 的 滴 管 抽 气 除去 剩余 的 痕 量 乙 醇 。 9) 再 次 将 沉淀 悬浮 于 4 ml TsoE 中 。 置 于 377 摇动 可 促进 沉淀 的 悬浮 (参见 注释 10)。 10) 将 体积 准确 地 调整 到 4.5 ml (参见 注释 11) 并 转移 到 10 ml 的 一 次 性 聚 丙 烯 管 中 。 准确 加 入 S g CsCl， 待 溶解 后 加 入 500 pl EB. 11) 以 4000 或 5000 r/min 离心 10 min 除去 紫色 的 沉淀 物 ， 并 用 滴 管 将 溶液 转移 至 一 个 Sm 的 快速 封口 型 超 离心 管 中 。 12) HHO 〈 参 见 注释 12)， 在 16 人 中 以 200 000 g (45 000 r/min) 离心 10 h 以 上 。 离心 结束 后 小 心地 取出 管子 并 将 其 牢 牢 夹 住 。 质 粒 DNA 浮 在 管子 的 中 部 形成 一 红 色 的 条 带 〈 参 见 注释 13)。 离 心 过 程 中 RNA 沉 下 并 集聚 在 管子 的 外 侧 ， 而 蛋白 质 WU FFE SAR ES FA AMM. 13) 用 针头 在 管子 的 顶部 穿刺 使 形成 一 气孔 。 用 带 针 简 的 针头 在 质粒 DNA 条 带 下 缘 穿 Rl, we ALE] RNA 与 蛋白 质 沉淀 。 将 针头 的 末端 正好 与 质粒 DNA 条 带 的 底部 接触 并 缓慢 地 将 其 吸入 针 简 中 。 在 收集 体积 尽 可 能 小 的 情况 下 (<1 ml) 尽量 地 收集 这 一 条 带 。 14) 从 离心 管 上 拔 下 针头 ， 千 万 注意 这 一 操作 一 定 要 在 合适 的 容器 上 方 进 行 ， 因 为 管 里 剩余 的 液体 会 从 孔 中 流出 。 将 含有 EB 的 DNA 溶液 转移 到 微型 离心 管 中 。 15) 离心 管 中 加 入 WSB 至 满 ， 稍 加 涡 旋 振 功 后 离心 数秒 钟 。EB 主要 分 布 在 丁 醇 相 中 ， 呈 紫 色 。 弃 去 丁 醇 相 。 依 据 质粒 的 量 重复 抽 提 4 一 7 次 〈 参 见 注释 14)。 待 水 相 中 看 不 出 红色 后 再 抽 提 两 次 的 做 法 可 以 视 为 一 个 基本 准则 。 + A958 * 16) 将 水 相 转移 至 30 ml 的 离心 管 中 ， 加 入 TE 至 5 ml。 加 入 10 ml 100% 乙醇 后 涡 旋 振 %, HF-20C 10 min 或 更 长 的 时 间 。4 中 以 12 000 g 离心 10 ming 用 70% 忆 醇 淋 洗 沉淀 ， 空 气 干 燥 后 溶 于 500 pl AS TE 中 (参见 注释 14)。 4. AE (1) 将 过 夜 生 长 的 2 ml 菌 液 倒 入 (而 不 是 吸入 ) 1.5 ml fH Eppendorf 管 中 ， 这 样 操作 可 以 节约 时 间 与 吸 嘴 。 剩 余 未 倒 出 的 菌 液 足 够 冰冻 保存 或 是 作为 大 规模 培养 的 种 季 ， (2) 将 小 管 在 金属 试管 架 底 部 的 网 上 摩 扩 2 一 3 次 便 可 使 沉淀 浮 起 来 ， 也 使 操作 过 程 中 添加 一 些 音乐 感 。 非 常 关键 的 一 点 是 要 等 到 细胞 彻底 悬浮 后 方 能 加 入 裂解 液 。 (3) 在 这 个 阶段 不 能 涡 旋 振 功 ， 因 为 振 功 会 剪断 染色 体 DNA 而 且 使 制备 物 脐 脏 难看 。 (4) 用 空 着 的 一 只 手 盖 在 管子 上 方 握 住 所 有 的 管子 ， 这 样 可 以 同时 操作 全 部 小 管 。 (5) 由 于 有 些 沉淀 是 浮 着 的 ， 所 以 最 好 使 用 移 液 器 和 一 次 性 吸 嘴 吸 出 而 不 要 采取 倒 出 上 清 液 的 办 法 。 (6) 笔者 的 经 验 ， 对 每 个 管子 使 用 一 个 干净 的 200 pl 吸 嘴 并 将 其 留 在 管 中 是 一 个 最 经 济 的 方法 ， 这 个 吸 嘴 以 后 还 可 以 将 液体 吸 上 吹 下 数 次 使 DNA 充分 悬浮 ， 最 后 还 可 用 于 吸取 部 分 样品 作 酶 切 之 用 。 (7) 以 下 的 操作 步骤 较 长 ， 但 可 以 得 到 比较 纯净 并 且 不 含 RNA 的 DNA， 在 这 一 操作 步骤 中 用 100 pg/ml 的 RNase A 取代 了 BRS 中 的 葡萄 糖 ， 溶 液 仍然 贮存 于 47 ， 除 以 下 不 同 之 处 外 其 余 均 与 原 步 又 相同 : a. 细菌 悬浮 在 300 pl 的 BRS-RNase 溶液 中 ， 用 300 pl LS 液 裂解 ， 室 温 放 置 15 一 20 min 使 RNase 彻底 作用 。 b. Fhe ATES ACT AY 300 pl KoAc (2.55 mol/L 醋酸 钊 ， 用 醋酸 将 pH 值 调 至 4.8) 中 和 。 c. 用 500 pl 异 丙 醇 沉淀 质粒 DNA. (8) 另 一 个 获得 较 纯 DNA 的 方法 是 在 4°C 中 将 用 栈 酸 钾 沉 淀 的 DNA 离心 5 一 10 min, 不 过 这 一 改进 是 非常 有 限 的 。 (9) 笔者 认为 做 酚 /氯仿 抽 提 时 最 为 经 济 的 办 法 是 在 转移 DNA Z HABA ROBE 于 一 干净 的 管子 中 。 这 样 可 以 使 用 同一 个 吸 嘴 将 样品 加 入 全 部 管 中 而 不 用 担心 交 又 污染 。 (10) 比 氧化 饮 密 度 梯 度 离心 法 快速 但 制备 物 较 不 纯净 的 一 种 方法 是 用 RNase 处 理 DNA， 人 然后 用 酚 / 氯 仿 抽 提 。 加 入 RNase A 与 NaCl 至 终 浓度 分 别 为 100 pg/ml 与 100 mmol/L, 37C 保温 30 min， 用 4 ml 酚 / 氯 仿 抽 提 ， 然 后 再 用 4 ml A i TH HE, 最 后 用 8 ml 100% 乙醇 沉淀 DNA. 4 RHE He HS LHW 8000 r/min 离心 10 min， 用 5 ml 70% 乙醇 淋 洗 一 次 ， 离 心 除去 剩余 的 液体 ， 沉 淀 于 空气 干燥 后 溶 PL ml TE 中 ， 取 1 在 琼脂 糖 胶 上 电泳 估计 浓度 及 产量 ， 如 有 必要 可 再 行 稀 汪 。 尺 一 种 方法 是 使 用 硅 藻 土 柱 〈 详 见 第 三 十 三 章 )。 (11) 为 了 使 质粒 DNA 形成 条 带 ， 非 常 重要 的 一 点 是 建立 一 个 具有 正确 的 初始 密度 的 * 194 。 CsCl/EB 溶液 。 在 称 取 CsCl 的 质量 与 量 取 溶 液 的 体积 时 应 该 做 到 非常 精确 。 一 支 10 ml 的 移 液 管 就 能 方便 地 测量 溶液 的 总 体积 ， 如 果 使 用 不 同 超 离 心 管 时 体积 也 很 容易 调整 。 为 了 得 到 正确 的 浓度 可 以 使 用 这 样 的 规则 : 1 ml 水 溶液 中 加 入 1 g CsClé (12) 如 果 和 氧化 饱 溶液 的 比重 是 正确 的 (1.55 g/ml), PA—-X5 ml 快 封 管 的 质量 应 该 接近 9.5 g。 (13) 如 果 质 粒 DNA 量 较 少 (< 100 pg) 最 好 用 手提 和 式 长 波 紫外 线 灯 观察 ， 条 带 可 以 看 得 比较 清楚 。 紫 外 线 灯 照射 的 时 间 越 短 越 好 ， 因 为 紫外 线 会 损伤 DNA。 (14) 只 要 你 有 一 些 经 验 ， 就 可 以 根据 密度 梯度 条 带 的 亮度 估计 出 DNA 的 含量 ， 并 且 可 以 用 TE 调整 到 所 需要 的 体积 (在 多 数 情况 下 1 pe/ml 是 很 合适 的 )。 参考 文 献 1. Birnboim, H. C. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513. 2. Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 368,369. » BOD = 第 三 十 二 章 ”应 用 快速 郑 沸 法 制备 小 量 质粒 DNA Adrian J. Harwood Ul 1. 4] 除了 碱 裂解 法 0 (参见 第 三 十 一 和 三 十 三 章 ) 外 另 一 种 经 典 的 制备 质粒 DNA 的 方 法 是 Holmes 与 Quigley!?) #2 14 HY. 通常 所 称 的 快速 煮沸 法 。 这 个 方法 的 原理 与 碱 法 抽 提 的 原理 完全 相同 。 细 菌 局 部 裂解 ， 质 粒 DNA 从 中 逸 出 ， 而 大 部 分 的 染色 体 DNA 则 包 BEAR ARR DRE, BPH RAR DNA 可 以 在 变性 后 快速 复 性 的 过 程 中 去 除 。 这 里 的 变性 步骤 是 用 高 温 处 理 而 不 是 用 高 pH 值 。 由 于 质粒 分 子 的 超 螺 旋 结 构 ， 在 上 述 的 条 件 下 会 很 快 地 复 性 ， 而 染色 体 DNA 仍 处 在 变性 状态 ， 不 会 出 现在 以 后 的 乙 醇 沉 淀 中 。 对 于 抽 提 为 数 众 多 的 小 量 质粒 DNA (小 量 制备 )， 这 是 一 个 快速 而 又 方便 的 方法 。 所 得 到 的 DNA 的 质量 很 好 ， 可 以 直接 用 于 酶 切 或 亚 克 隆 。 如 须 作 为 测序 模板 只 须 进 一 步 加 工 即 可 。 但 是 对 于 大 量 抽 提 ， 者 沸 法 就 不 方便 而 碱 裂解 法 比 煮沸 法 更 为 合适 。 2. 材 料 1 — STET: 5% Triton X - 100, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/L EDTA, pH 8.0，8% 芒 糖 。 可 于 室温 贮存 。 2) 溶菌 酶 : FH, F-2CKF. 3) FARE. 4) 70% 乙醇 。 5) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA. 6) 沸水 浴 : FEOUT Emm Bub FRB AS KBD BT, INCA, AD 须 直 接 接触 水 浴 ， 达 到 快速 加 热 的 目的 。 3.957 法 1) 对 于 每 一 份 小 量 制备 ， 准 备 一 份 细菌 培养 物 ， 取 单 菌落 接种 到 含 合适 抗生素 〈 例 如 100 pg/ml WAKER) 的 L - 肉 汤 中 ，375 剧烈 振 葛 培 养 过 夜 〈 参 见 注释 1)。 2) 在 开始 抽 提 前 准备 好 沸水 浴 与 新 鲜 配 制 的 1 mg/ml 的 溶菌 酶 /STET 溶 液 。 3) 将 培养 物 倒 入 1.5 ml 离心 管 中 。12 000 g 离心 1 min 沉淀 细菌 (人 参见 注释 2)。 用 接 在 水 泵 上 的 尖 头 滴 管 小 心地 吸出 上 清 液 。 = 796 - 4) EATER BH LRGRY HRA, BPE POA 200 由 的 STET， 这 时 再 行 振 BAe MARA FRR RK (参见 注释 3)。 5) 立即 将 管子 播 在 无 底 的 管 架 上 ， 在 沸水 浴 中 准确 放置 4$ s， 保 证 每 个 管子 至 少 有 一 半 高 度 是 浸没 在 水 中 的 。 6) 12 000 g 离心 10 min， 这 时 应 该 形成 一 大 块 松 散 的 并 且 有 些 黏稠 的 沉 演 。 7) 用 木质 牙签 将 管 中 的 沉淀 捞 出 ， 由 于 沉淀 很 滑 所 以 要 在 管 口 处 准备 一 块 纸巾 以 便 “ 抓 ” 住 沉淀 ， 防 止 沉淀 再 次 滑 向 管 底 。 8) 每 个 管子 中 加 入 200 pl FAB, 12 000 g 离心 min. 9) 抽 气 吸 去 上 清 液 后 用 500 pl 70% 乙醇 洗 涤 沉 演 。 离 心 1 min 使 沉淀 压 紧 ， 抽 和 气 吸 去 70% 的 乙醇 。 10) 空气 干燥 10 min 后 用 100 pl TE BRATS POE. (EAA Bi ie te GH FFE 10 min 以 保证 沉淀 彻底 溶解 。 11) 每 一 次 酶 切 与 电泳 检测 时 取 用 2 一 10 pl (对 大 多 数 载体 来 说 相当 于 100 ng 的 质粒 )。 4. 3E 释 (1) 高 拷贝 质粒 的 培养 时 间 可 缩短 至 6 h， 这 样 整个 过 程 就 可 以 在 一 天 之 内 完成 。 (2) 较 短 的 离心 时 间 可 以 使 沉 演 不 至 于 压 得 过 紧 ， 使 沉淀 的 重新 悬浮 更 易于 进行 。 (3) 如 果 沉 淀 不 易 悬 浮 ， 可 以 用 吸 嘴 吸 放 溶液 使 沉淀 松动 ， 但 不 要 将 沉淀 直接 吸入 吸 嘴 中 。 Wt = XM mh 1. Holmes, D. S. and Quigley, M. (1981) A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal. Biochem. 114, 193-197. « 107 » 第 三 十 三 章 WARES + hls AL DNA Laura Machesky Ti 1. 引 PY REA LR, DNA 是 分 子 生 物 学 技术 中 最 常用 的 方法 之 一 。 传 统 上 纯度 最 高 的 质粒 DNA 是 用 CsCl 密度 梯度 离心 法 将 DNA 分 带 制 备 而 得 。 但 是 这 种 方法 很 费时 并 且 价 格 昂贵 ， 因 此 都 在 找寻 另外 的 纯化 DNA 的 方法 。 其 中 之 一 就 是 使 用 越 来 越 广泛 的 硅胶 吸附 DNA 的 方法 。 这 种 材料 可 以 购买 到 ， 但 在 实验 室 中 也 很 容易 制备 。 本 章 介 绍 硅 藻 土 法 大 规模 抽 提 质粒 DNA 的 操作 步 又。 这 个 方法 是 根据 Boom 等 人 上 和 Carter 与 Milton 的 工作 器 以 及 TIBS6J 中 推荐 的 “ 土 法 ”纯化 DNA 试剂 盒 的 资料 。 尽 管 这 是 一 个 大 量 制备 方法 ，DNA 产量 是 毫克 级 ， 但 也 能 适用 于 小 量 制 备 得 到 微克 级 的 质粒 DNA), 2. 材 料 所 有 试剂 都 要 用 灭 菌 的 蒸馏 水 配制 ， 除 了 特别 注 明 外 所 有 的 试剂 均 于 室温 贮存 。 2.1 质粒 DNA 的 制备 1) 2xTY: 在 1 水 中 溶解 16 g bacto REAR, 10 g 酵母 抽 提 物 和 10 g NaCl BE - 灭 菌 。 2) 500 ml 4 250 ml 离心 瓶 高 压 灭 菌 ， 或 者 用 1 mol/L 的 NaOH 洗涤 。 3) 溶液 I: 50 mmol/L 葡萄 糖 ，25 mmol/L Tris-HCI、pH 7.5，10 mmol/L EDTA。 4) 溶菌 酶 溶液 : 在 溶液 I 中 将 溶菌 酶 配 成 浓度 为 40 mg/ml 的 溶液 。 用 前 配制 。 5) 溶液 IT: 0.2 mol/L NaOH, 1% SDS。 用 前 配制 。 6) 溶液 下: 5 mol/L ARF. pH 4.8， 加 冰 栈 酸 至 3 mol/L 的 醋酸 钾 中 ， 直 至 达到 所 需 要 的 pH 值 。 7) 70% 和 80% 的 乙醇 。 8) TE: 1 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA. 2.2 柱 上 纯化 DNA _ — PYRG W: 7 mol/L #hARW, pH 6.5。 不 用 调节 pH 值 ， 因 为 盐酸 肌 溶 解 后 即 为 此 值 。 + 198 - 2) 树脂 糊 母 液 : 5 go HERS 50 ml 树脂 缓冲 液 混合 。 作 者 使 用 的 是 购 自 Sigma 公司 AY PR VE TERRE (St. Louis, MO) (cat no. D— 5384) (人 参见 注释 1)。 ) SHH RTE: 层 析 柱 安装 在 直径 为 1.$ cm、 体 积 为 S0 ml 的 圆锥 形 管 上 (BRE 释 2 和 3)。 从 Bio-Rad (Hercules, CA) 购买 的 Econo 柱 用 热 的 剃刀 将 顶部 割 去 后 可 适用 。 4) 柱 洗 涤 液 : 50% ZB, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EDTA. ce 法 3.1 质粒 DNA 的 制备 1) 在 新 划 线 接种 的 平 阵 上 挑 取 含 含有 质粒 的 菌落 (参见 注释 4) 接种 于 含有 500 ml 2 x TY 培养 基 和 抗生素 的 4 世 三 角 烧 瓶 中 ， 以 200 r/min 的 转速 在 旋转 式 摇 床 上 37? 培 养 过 夜 。 2) 倒 入 500 ml BOF, LA 5000 g 离心 10 min 沉淀 细菌 。 将 上 清 液 侄 出 并 将 离心 瓶 倒置 于 纸巾 上 数 分 钟 (SB LIE 5). 3) 将 沉淀 重新 悬浮 在 18 ml 溶液 I 中 。 加 入 2 ml 溶菌 酶 溶液 并 用 移 液 管 搅 动 混合 ， 室 温 放 置 10 min。 4) 加 入 40 mM ARI, KARA Fok EES min. 5) MA 20 ml ARI, BHRAORFRKLMAB 15 min。 这 时 有 白色 沉淀 形成 。 6) 8000 g 离心 10 min， 将 上 清 液 通过 粗布 滤 入 一 干净 的 250 ml BOM. 7) 上 清 液 中 加 入 45 ml 的 异 丙 醇 ， 混 匀 后 8000 g 离心 10 min. 8) 小 心地 沥 干 管子 并 用 70% 乙醇 洗涤 沉淀 。 抽 气 吸 去 剩余 的 乙醇 ， 置 空气 中 干燥 10 一 20 min (人 参见 注释 6)。 9) 将 沉淀 溶解 在 2 ml 的 TE 中 ， 这 步 需要 一 些 时 间 。 作者 在 进行 这 一 操作 时 是 在 沉淀 中 加 入 TE 后 放置 大 约 10 min， 这 样 可 使 沉淀 开始 溶解 ， 但 作者 仍 用 1 ml 的 吸 嘴 反 复 吸 放 以 加 速溶 解 。 对 于 较 小 的 质粒 来 说 温和 的 涡 旋 振 功 也 有 利于 溶解 。 3.2 ， 层 析 柱 纯化 DNA 1) 将 3.1 节 第 9 步 的 DNA 溶 液 加 入 15 ml 锥 形 管 中 。 加 入 10 ml 树脂 糊 母 液 ， 取 用 时 要 摇 勺 以 保证 树脂 在 溶液 中 。 倒 转 数 次 使 DNA 与 树脂 混 匀 。 2) 将 树脂 DNA 糊 状 物 倒 入 柱 中 ， 置 于 烧杯 或 是 50 ml 锥 形 管 上 方 。 3) 将 柱 连 接 到 真空 系统 上 ( 接 在 水 泵 上 已 足够 ) 将 缓冲 液 抽 过 柱 〈 人 参见 注 释 7)。 如 有 必要 可 以 使 用 橡皮 连接 管 保 证 与 真空 系统 紧密 连接 。 4) 用 13 ml 洗涤 液 淋 洗 原来 盛 放 DNA 和 树脂 糊 的 管子 ， 洗 后 倒 入 层 析 柱 。 用 真空 系统 将 洗涤 液 抽 过 柱 ， 重 复 一 次 。 5) 用 5 ml 80% 乙醇 洗涤 ， 用 真空 泵 抽 吸 过 柱 。 柱 继续 留 在 真空 系统 上 10 min 使 柱 干 。 799 ， He (参见 注释 8)。 6) 从 真空 系统 上 取 下 柱 ， 加 入 1.5 ml 65 一 70Y 预 热 的 水 或 TE， 放置 1 min。 7) 将 柱 放 在 一 个 大 的 管子 中 ， 例 如 50 ml HUE, 在 医用 离心 机 或 是 角度 转 头 中 以 1300 g 离心 5 min， 洗 脱 液 收 集 在 大 管子 的 底部 后 转 至 1.5 ml 的 管子 中 贮存 。 一 个 高 拷贝 质粒 的 典型 的 DNA 收获 量 是 在 2 一 5 mg 之 间 (参见 注释 9)。 这 样 得 来 的 DNA 可 用 于 双 链 测序 、 亚 克隆 以 及 真 核 生 物 细胞 的 转 染 。 4. 注 释 (1) Hengen 所 推荐 使 用 的 其 他 类 型 的 树脂 有 从 闪烁 管 上 破碎 下 来 的 料 石 玻璃 、 Cellite™ 以 及 二 氧化 硅 颗粒 。Hengen 还 建议 用 针 简 与 滤纸 或 是 用 微型 离心 管 与 硅化 玻璃 滤 板 制作 层 析 柱 。 (2) 在 进行 大 量 制备 时 非常 重要 的 一 点 是 要 选用 一 根 粗 的 柱 ， 这 样 可 以 防止 DNA 溶液 所 引起 的 柱 堵塞 现象 。 (3) 大 量 制备 的 试剂 盒 中 的 柱 可 以 重复 使 用 ， 但 要 经 NaOH 洗涤 或 是 高 压 灭 菌 6。 (4) 尽管 最 好 是 使 用 平 烟 上 新 划 种 的 单 菌落 接种 ， 但 也 可 以 直接 从 甘油 冻 存 的 穿刺 培养 的 菌 种 中 控 出 一 小 块 进行 接种 。 如 果 手 头 只 有 DNA 就 要 先行 转化 然后 用 转化 的 细 菌 进行 接种 。 最 后 一 种 方法 可 能 冒 着 得 到 不 均一 质粒 群体 的 危险 。 (5) 沉淀 的 细菌 可 以 在 这 一 步 于 - 20 忆 冷冻 贮存 。 (6) 沉淀 不 需要 绝对 的 干燥 ， 小 心地 用 滴 管 吸 几 次 去 除 所 有 的 乙醇 可 以 节省 干燥 所 需 的 时 间 。 (7) 除非 DNA 样品 非常 宝贵 ， 没 有 必要 保留 洗涤 液 ， 因 为 在 这 步 操作 中 大 部 分 、 甚 至 有 多 至 5 mg 的 DNA 可 结合 在 树脂 上 。 (8) 另 一 个 办 法 是 放 在 一 个 较 大 的 管子 中 ， 例 如 50 ml 锥 形 管 中 ， 在 医用 离心 机 中 以 2000 g 离心 10 min。 (9) 小 量 制备 步骤 详 见 Carter 与 Miltont2] 。 参考 文 献 1. Boom, R., Sol, C. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen, C. L., Wertheim van Dillen, P. M. E., and van der Noordaa, J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495,496. 2. Carter, M. J. and Milton, I. D. (1993) An inexpensive and simple method for DNA purifications on silica particles. Nucleic Acids Res. 21, 1044. 3. Hengen, P. N. (1994) Methods and reagents: on the magic of mini-preps. JIBS 19, 182,183. « 200 - -_ . —_ - ~~ ———ee—— OTE eee ee ee ee — ae 四 aD 1 Bo TM a ARAMARK: 基本 方法 Beverly C. Delidow, John P. Lynch, John J. Peluso, Bruce A. White Ul 1. 引 重复 多 轮 的 DNA 合成 技术 与 热 稳 定 DNA 聚合 酶 的 发 现 共同 为 科学 家 提供 了 被 称 为 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR) 的 强 有 力 的 技术 。PCR 是 基于 任何 DNA 合成 所 需 的 三 个 简 单 的 步 又: @ 模 板 变性 成 单 链 ; @ 引 物 与 每 一 条 原始 链 复 性 ; 为 合成 新 链 作 准备 ; OFF 链 从 引物 延伸 。 任 何 一 种 DNA 聚合 酶 都 可 以 完成 这 些 反应 而 最 终 合 成 原始 DNA 序列 的 特定 区 域 。 不 过 ， 为 进行 一 轮 以 上 的 合成 ， 模 板 必须 再 次 变性 。 由 于 变性 温度 都 大 大 高 于 使 大 多 数 酶 失 活 的 温度 ， 因 此 ， 最 初 尝 试 进 行 循 环 的 DNA 合成 是 通过 每 次 变性 后 重新 添加 新 的 DNA 聚合 酶 来 实现 的 由 3。 如 此 一 种 技术 的 高 费用 使 它 的 应 用 很 快 受到 限制 。 来 源 于 嗜 热 细菌 Thermus aquaticus (Taq) 的 热 稳定 的 DNA 聚合 酶 的 发 现 和 分 离 ， 使 Saiki 等 6 能 重复 合成 新 的 DNA 链 ， 指 数 地 扩 增 初始 物质 的 指定 区 域 ， 促 成 了 一 项 一 举 成 名 的 新 技术 的 诞生 。 限 制 酶 发 现 以 来 还 没有 一 种 新 技术 能 使 分 子 生 物 学 发 生 如 此 巨大 的 革命 。 每 月 都 有 几 十 篇 使 用 PCR 方法 的 杂志 论文 发 表 ， 而 且 还 有 PCR 的 专 刊 (至少 一 种 )。 对 那些 每 天 应 用 和 /或 阅读 有 关 PCR 的 人 们 而 言 ， 值 得 注意 的 是 这 一 方法 只 有 10 年 多 一 点 的 历史 。 PCR 最 大 的 优点 之 一 是 虽然 对 于 实验 室 有 一 些 要 求 ， 但 所 需 设 备 相 对 而 言 价 格 低 廉 ， 占 用 很 小 的 空间 。PCR 的 惟一 特殊 仪器 是 一 台 热 循 环 仪 。 虽 然 没 有 热 循 环 仪 也 可 以 从 事实 验 ， 但 用 三 台 控 温 的 水 浴 锅 进行 手工 操作 太 繁 琐 上 且 费 时 了 。 现 在 市 场 上 已 有 不 同 种 类 的 仪器 可 购置 。 一 套 专用 移 液 器 尽管 有 利 ， 但 并 非 必需 。 如 果 守 核 苷 酸 引物 是 购 得 的 ， 那 么 PCR 所 需 的 其 他 设备 在 任何 一 个 从 事 分 子 生 物 学 研究 的 实验 室 中 都 具备 。 因此 ， 对 大 多 数 研 究 人 员 而 言 ，PCR 是 一 种 既 非 常 有 效 又 是 经 济 上 容易 办 到 的 方法 。 关于 PCR 广泛 的 应 用 请 参阅 本 丛书 第 15 BRILB RY), ABER DNA, RNA 模板 的 分 离 、PCR 的 基本 方法 及 几 种 分 析 PCR 产物 的 通用 方法 。 2. 材 料 2.1 DNA 和 RNA 模板 的 分 离 2.1.1 _ DDNA 的 分 高 1) 用 于 抽 提 DNA 的 组 织 或 细胞 。 2) Dounce 勾 浆 器 。 - 203 - 3) 消化 缓冲 液 ， 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 25 mmol/L EDTA, 0.5% SDS. 4) HAH K: 20 mg/ml, -20CRF. 5) a， 经 缓冲 的 酚 :， 酚 是 强 腐蚀 性 的 ， 操 作 时 须 戴 手套 并 穿 防 护 衣 。 只 能 用 玻璃 移 液 6 7 8 ) ) ) 9) 10 11 12 13 14 15 16 ) ) — ) ) ) ~~ S RPP A ES . BAA HER AR ZB BY. b. 缓冲 溶液 : 1 mol/L Tris 碱 ; 10 TE, pH 8.0 (100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA); 1X TE, pH 8.0 (10 mmol/L Tris, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA); 在 一 瓶 分 子 生 物 学 级 的 重 结晶 酚 内 加 等 体积 1 mol/L Tris ho BHF 60 水 浴 中 使 酚 液化 〈 约 1 h)， 在 通风 橱 中 待 其 冷却 。 盖 紧 瓶 盖 ， 摇 动 以 混 匀 各 相 (摇动 时 瓶子 切 勿 向 着 自己 )， 将 瓶 置 于 通风 橱 中 通风 。 小 心 倒 入 或 用 玻璃 移 液 管 将 酚 移 至 带 螺旋 帽 的 S0 ml 离心 管 中 。 室 温 中 以 4000 g 离心 5 二 10 min 以 分 相 。 抽 和 气 去 除 上 层 水 相 。 再 在 下 层 ( 酚 ) 中 加 入 同等 体积 10 x TE (pH 8.0)， 半 紧 离心 管 充 分 摇动 混 匀 并 再 次 离心 。 抽 和气 去 除 水 相 。 用 等 体积 1X TE (pH 8.0) 再 抽 提 酚 2~3 次 至 上 层 相 pH 值 为 7~8 (用 pH 试纸 检测 )。 分 装 经 缓冲 的 酚 ， 加 -一 层 1xTE (pH8.0) 于 -207C 保存。 CHCL: Affi. 70% ZB. TE 缓冲 液 、pH 8.0: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA. 经 磷酸 盐 缓 冲 的 生理 盐水 (PBS): 20 x 母液 (2.74 mol/L NaCl, 53.6 mmol/L KCl, 166 mmol/L Na,HPO,, 29.4 mmol/L KHPO,、pH 7.4). HE RBFRIBK 配置 ， 用 0.2 pm 滤 膜 过 滤 ， 室 温 保存 。 用 时 取 25 ml 母液 加 去 离子 蒸馏 水 稀释 至 500 ml， 加 250 pl 1 mol/L MgCb， 过 滤 除 菌 ，.4Y 保存 。 7.5 mol/L BRR FR . RNase A: 在 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 15 mmol/L NaCl 中 制备 10 mg/ml RNase A. 1000 中 保温 15 min, YHERB, —20 CRE. 20% SDS (w/v): 去 离子 水 配制 。 2.1.2 RNA 的 分 离 2.1.2.1 和 氯 化 饮 离心 制备 RNA ( 见 注释 1) 用 于 抽 提 RNA 的 组 织 或 细胞 。 2 ml 的 Wheaton Pe FH AAR BE Fil FA AAI / 8 - 琉 基 乙醇 溶液 (GITC/BME) ;4.2 mol/L Fh AAA, 0.025 mol/L FF PAREN. pH 7.0, 5% + —bESEWLEFAREN (Sarkosyl), 0.1 mol/L 8 -一 基 乙醇 。 除 入 基 乙醇 外 ， 其 余 成 分 用 去 离子 蒸馏 水 配制 成 母液 ， 用 Nalgene 0.2 wm 滤 膜 (Nalge Co. , Rochester, NY) (参见 注释 2) 过 滤 除 菌 后 50 ml ay, —20C 保存。 使 用 前 冻 融 ， 取 所 需 体 积 的 溶液 至 一 新 管 中 ， 每 毫升 缓冲 液 中 加 7 岂 B- 琉 基 乙醇 。 异 硫 氛 酸 股 和 B- 琉 基 乙 醇 是 强 刺激 物 ， 小 心 使 用 。 1 ml 的 结核 菌 素 针 简 ， 配 以 21 号 针头 。 - 204 - 17) 18) 19) 20 ~~ 21 Sa 22) 23 SA 24 ~~ 25 YA 26) 27) 28 a 十 分 洁净 的 超速 离心 机 离心 管 ，11 mmx 34 mm (Beckman # 347356). 焦 碳酸 二 乙 酯 (DEPC): 97% 溶 液 ，4 CHF. DEPC 处 理 过 的 水 已 71: 在 烤 和 干 的 耐 高 压 灭 菌 玻 璃 上 瓶 中 ， 装 入 2/3 体积 去 离子 蒸馏 水 。 加 DEPC 至 终 浓 度 为 0.1%， 加 盖 ， 振 荡 。 松 开 瓶 盖 使 瓶 通风 。 于 377 至 少 保 温 12 h (过 夜 方便 些 )。 高 压 灭 菌 15 min， 使 DEPC 失 活 。 室 温 保存 。 200 mmol/L EDTA, pH 8.0: 将 分 子 生 物 学 级 EDTA 二 钠 盐 溶 于 去 离子 蒸馏 水 ， 0.2 pm 滤 膜 过 滤 除 菌 。 置 于 带 螺 旋 帽 耐 高 压 灭 菌 的 瓶 内 ， 按 处 理 DEPC 水 的 方法 进行 处 理 后 室温 保存 。 Ab (CsCl): 分 子 生 物 学 级 。 如 配 20 mi, R20 g 固 体毛 化 饮 置 50 ml KAS 内 。 加 10 ml 经 DEPC 处 理 的 200 mmol/L EDTA (pH8.0)。 倒 入 DEPC 水 至 体积 20 ml。 经 0.2 pm HERE, ICRF. TE 缓冲 液 、pH 7.4: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 1 mmol/L EDTA. /4 DEPC 水 配制 成 10 mmol/L Tris-HCl 和 1 mmol/L EDTA (pH 7.4) 的 溶液 (参见 注释 3)。 经 0.2 pm 滤 膜 过 滤 ， 高 压 灭 菌 15 min 后 室温 保存 。 TE-SDS: 每 次 用 时 新 鲜 配 置 。 以 DEPC 水 制备 10% SDS 贮存 液 ， 于 分 装 的 TE (pH7.4) 中 加 入 10%SDS, BAREH 0.2%. 4 mol/L NaCl: 用 去 离子 蒸馏 水 配制 ， 并 经 DEPC 处 理 ， 高 压 灭 菌 1$ min， 室 温 保 存 。 Polyallomer 1.5 ml 微量 离心 管 。 用 于 超速 离心 机 (Beckman $ 357448, Beckman In- strument Inc., Fullerton, CA). RNasin RNA 酶 抑制 剂 ，40 U/pl (Promega, Madison, WI), —20C 保存 。 Beckman TL - 100 台式 超速 离心 机 ，TLS 55 HLA TLA-45 转 头 。 2.1.2.2 用 股 / 酚 (RNAzorRM) 抽 提 法 分 离 RNA RNAzor 试 剂 (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX): AGH MRAM, B-M2E 乙醇 及 酚 。 须 小 心 操作 。 29) 玻璃 - 聚 四 氟 乙 烯 匀 浆 器 。 30) 31) 32) 33) 34) 35) 36) REA SE A LE AF AE SF E(1.5 ml) (Kontes Life Science Products, Vineland, NJ). 氯仿 (ACS &). FARE (ACS), —20C 保存 。 80% ABE: 用 经 DEPC 处 理 的 水 稀释 100% CB, —20C 保存 。 2.1.3 从 RNA 合 成 互补 DNAsS (cDNAs) SEE dT 1g~295| (Pharmacia, Piscataway, NJ): 将 SOD U ¥#¥ 180 ul KEIDEPC 水 中 ， 终 浓度 为 1.6 pg/pl. 特异 性 引物 ， 自 选 。 选 择 序 列 并 取得 像 进行 PCR 那样 的 引物 。 Moloney 鼠 白 血 病 病毒 逆转 录 酶 (MMLV RT, 200 U/pl), 用 制造 商 推荐 的 缓冲 液 及 0.1 mol/L DTT 配制 。 “0S - 37) 38) 39) 40) 41 ~~ 42 Te 43) 44) 45) 46) 47) 48) dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP). VA 10 mg 固体 状态 供应 。 制 备 10 mmol/L dNTP 母液 : 将 10 mg dNTP 悬浮 于 比 配 制 10 mmol/L 溶液 少 Low MRK FA 灭 菌 的 NaOH 及 pH 试纸 调节 溶液 pH 至 近似 于 中 性 。 根 据 供 应 商 提 供 的 每 一 dNTP 的 特定 波长 和 摩尔 消光 系数 ， 由 OD 值 测定 确切 的 浓度 。 例 如 : dATP 的 A，(259nm) 为 15.7x 10°, #84 1: 100 稀释 的 10 mmol/L dATP 溶液 的 Azs = (0.01 mol/L x15.7x103 OD U/mol/L) xl/100=1.57， 假 如 1:100 稀释 的 dATP 的 实测 OD 值 为 1.3， 则 dATP # EE =1.3/1.57 X 10 mmol/L =8.3 mmol/L. VY 50~ 100 pl4t AY dNTP 贮存 液 于 - 200 保存 。 配 制 在 灭 菌 水 中 含 每 种 dNTP 125 wmolL 的 日 常 工作 贮存 液 作为 CDNA 合成 或 PCR 之 用 。 不 用 的 工作 贮存 液 可 F -20C PHRF 2 周 。 2.2 PCR 操作 (参见 注释 4) SRR S|: 互补 于 待 扩 增 序列 的 $ 和 3“ 端 ， 可 在 市 场 上 购 得 。= 207 保存 。 经 紫外 线 照射 的 灭 菌 水 〈 参 见 注释 5): 过 滤 除 菌 后 的 去 离子 蒸馏水 用 Stratagene (La Jolla, CA) Stratalinker UV 交 联 仪 (200 mJ/cm2)[8] 的 上 紫外 线 照 射 2 min 或 用 254 nm 和 300 nm 波长 照射 S min[91]， 室 温 保存 。 PCR 母液 : 供 PCR 专用 。 制 备 下 列 三 种 溶液 ， 经 过 滤 除 菌 后 高 压 灭 菌 1$ min: 1 mol/L Tris-HCl, pH 8.3, 1 mol/L KCl, 1 mol/L MgCl. 10 < PCR 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3; 500 mmol/L KCl; 15 mmol/L MgCh; 0.01% (w/v) 明胶 。 这 种 缓冲 液 可 从 Perkin-Elmer/Cetus 公司 购 得 。 每 1 ml 10 x PCR 缓冲 液 含 : 100 pl 1 mol/L Tris-HCl. pH 8.3, 500 pl 1 mol/L KCl, 15 pl 1 mol/L MgCh, 375 由 经 紫外 线 照射 的 灭 菌 水 。 用 经 紫外 线 照射 的 灭 菌 水 配制 1% FARE, 60~70C 下 加 热 ， 偶 尔 加 以 搅拌 以 使 明胶 溶解 。 趁 溶液 尚 热 时 用 0.2 pm 滤 膜 过 滤 明胶 液 ， 每 1 ml 10 PCR 缓冲 液 中 加 10 pl 1% 明胶 液 。 小 份 : 分 装 的 PCR 缓冲 液 (300~500 wl) 在 -20C 下 保存 。 格 外 小 心 起 见 ， 每 次 使 用 前 可 用 紫外 线 照 射 10 x PCR 缓冲 液 。 10 mmol/L dNTPs 贮存 液 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 用 经 紫外 线 照 射 的 水 制备 ， 见 2.1.4 节 ， 第 5 项 。 1.25 mmol/L dNTPs 工作 母液 。 每 种 dNTP KE H 1.25 mmolL， 用 经 紫外 线 照射 过 的 灭 菌 水 配制 。 轻 矿 物 油 。 7.5 mol/L MRR, 40.2 pm 滤 膜 过 滤 除 菌 ， 室 温 保存 。 Taq DNA 聚合 酶 。 2.3 FASS PCR 方法 分 析 PCR FH"! 低 熔 点 琼脂 糖 。 琢 脂 糖 凝 胶 电泳 试剂 ( 见 2.3.1.1， 第 2 一 5 项) 。 = 206 - 49) BRR, BHAT DNA 部 分 的 内 部 序列 〈 巢 式 引 物 ，nested primer). 2.4 通过 直接 标记 的 PCR 产物 的 聚 两 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 PCR 产物 50) a**P-dCTP, 3000 Ci/mmoL. 51) 3 MM 滤纸 52) X HARE FH 法 3.1 DNA 和 RNA 模板 的 分 离 3.1.1 DNA 的 分 离 口 以 下 方法 适用 于 从 较 大 量 的 组 织 样品 中 分 离 用 于 -PCR 的 DNA， 或 从 培养 细胞 中 大 量 制备 DNA。 1) 将 组 织 块 置 于 冰冷 的 PBS 中 ， 称 重 后 用 刀片 切 成 小 块 。 如 果 培 养 细胞 则 经 离心 收 集 ， 用 冰冷 的 PBS 洗 一 遍 ， 加 入 与 沉淀 体积 相等 的 PBS 重 悬 细胞 。 2) 将 组 织 或 细胞 放 在 Dounce 匀 浆 器 中 ， 每 克 组 织 (或 每 训 升 的 压 紧 的 细胞 ) 中 加 入 12 ml 消化 缓冲 液 。 3) 置 冰 浴 中 ， 用 B 研 棒 轻 轻 研 磨 20 KEM. 4) 将 样品 移入 试管 ， 加 蛋白 酶 K 至 终 浓度 100 pg/ml, SOCHAUK. 5) 用 等 体积 酚 / 氯 仿 (1:1， 体 积 比 ) 抽 提 两 次 。 6) 等 体积 氯仿 抽 提 两 次 。 7) 加 0.5 倍 体积 7.5 mol/L BARA 2 倍 体积 无 水 乙醇 ， 轻 轻 混 匀 ， 应 立即 可 见 有 纤 维 状 的 DNA 沉淀 s 8) 4C FV 12 000 g BL 15 min 以 收集 DNA. 9) 用 75% 乙 醇 洗 涤 沉 证 ， 倾 去 上 清 液 ， 空 气 中 干燥 。 10) # DNA BAF TE 缓冲 液 、pH8.0 (7~10 ml/g AA), F65C 中 轻 轻 摇动 培养 样 品 有 利于 DNA 重 悬 。 11) 加 SDS FAME 0.1% & RNase A 至 终 浓度 1 pg/ml. 37C 保温 1 h。 12) 按 步骤 5 一 10 A/ ARE MH, Wie, BADNA. EICHLEPAKWRE DNA. 3.1.2 RNA 的 分 离 目前 从 细胞 或 组 织 提 取 RNA 的 方法 有 多 种 。 以 下 介绍 的 两 种 方法 我 们 常规 用 于 从 较 少 组 织 样品 或 培养 细胞 中 分 离 RNA。 一 是 氯 化 饮 离心 法 : 使 RNA 通 过 氯 化 饮 垫 层 的 离心 可 更 为 彻底 地 去 除 DNA. BFP HER RNA 的 方法 较为 省 时 。 - 207 - 3.1.2.1 SBOE RNA Fe] 8S FILE AO SEER NA (SIA 6 TON, 249 150 mg AA/Fean), WBE 粒 层 细胞 及 从 GH; 垂体 肿瘤 细胞 (来 自 5x107 细胞 核 ) 中 分 离 RNA。 与 下 面 介绍 的 肌 / 酚 抽 提 法 相 比 ， 此 法 更 为 耗 时 ， 但 我 们 发 现 用 这 种 方法 可 从 卵巢 组 织 得 到 更 纯 的 RNA 制备 物 ， 尽 管 在 卵 偶 组 织 中 不 仅 含 有 DNA， 且 有 丰富 的 脂 质 沉积 。 此 法 也 被 推荐 用 于 制备 核 RNA， 因 为 细胞 核 的 DNA 含量 要 比 整 个 细胞 或 组 织 中 含量 高 得 多 。 1) 取 数 分 钟 内 处 死 的 动物 组 织 ， 放 入 冰冷 的 PBS 中 ， 如 有 必要 ， 剔 除 脂肪 及 /或 筋 膜 。 将 组 织 切 成 (2 一 3 mm 见方 的 ) 小 块 。( 参 见 注释 6)。 2) 将 组 织 放 入 2 ml 的 Wheaton 玻璃 匀 浆 器 中 ， 内 含 1 ml GITC/BME BAM. LFA 浆 直 至 无 明显 的 块 状 物 为止 (参见 注释 7 和 8)。 3) 将 样品 移 至 $ ml BK 15 ml Falcon 管 中 。 用 装 有 21 号 针头 的 1 ml ABARAT, 反复 通过 针头 吸 放 以 前 切 DNA， 应 避免 形成 泡沫 ， 直 至 溶液 不 太 黏稠 而 能 一 滴 滴 地 滴 出 为 止 〈 参 见 注 释 9)。 4) 用 0.3 ml GITC/BME 缓冲 液 洗 涤 十 分 透明 的 Beckman BOS, SIRT, HTS WA, MA 875 pl 氧化 饮 溶 液 至 每 一 管 底 。 5) 每 一 组 织 样品 中 加 300 pl GITC/BME 缓冲 液 ， 混 匀 。 将 整个 样品 〈1.3 ml) 铺 在 氧 化 饮 垫 层 顶部 ， 注 意 不 要 扰乱 交界 层 。 6) 在 每 一 管 中 加 入 样品 或 /和 GITC/BME 缓冲 液 直 到 离 管 口 2 mm 处 。 用 GITC/BME 缓冲 液 平衡 离心 管 ， 偏 差 在 0.01 g 以 内 。 7) 将 离心 管 放 入 TLS - 55 转 头 (Beckman) 的 吊 篮 中 ， 在 16C 中 以 100 000 g 离心 3 h。 这 使 RNA 沉淀 而 DNA 不 沉淀 〈 参 见 注释 10) 。 8) 从 吊 篮 中 取出 离心 管 ， 快 速 倒 转 以 倾 室 上 清 液 ， 并 即刻 将 管 口 向 下 放 在 管 架 上 或 放 在 干净 的 纸巾 上 约 15 min 以 吸 干 管内 液体 。 在 管内 液体 未 干 前 勿 扶正 离心 管 。 9) 用 干净 卷 简 纸 伸 入 试管 内 壁 以 吸 去 残留 液体 。 不 要 磁 到 管 底 。RNA 沉淀 是 看 不 到 的 。 10) 加 400 pl TE-SDS 2# JK, Df TE-SDS 顺 管 壁 流下 。 盖 上 管 盖 ， 放 入 试管 架 ， 置 于 旋转 平台 上 ， 室 温 中 缓 缓 转动 20 min 以 溶解 RNA。 11) 用 设置 在 200 岂 刻 度 的 微量 移 液 管 分 两 次 将 RNA 溶液 转移 到 1.5 ml 微型 离心 管内 (参见 注释 11)。 在 吸取 RNA 溶液 过 程 中 ， 注 意 上 下 吹 吸 并 用 吸管 尖端 轻 刊 管 底 以 确保 RNA 溶 解 。 在 这 一 过 程 中 应 避免 SDS 形成 泡沫 。 12) 在 1.5 ml 微型 离心 管 的 RNA 样品 中 加 200 pl 经 缓冲 的 酚 和 200 pl Ath, 充分 混 匀 。 13) 于 台式 离心 机 上 以 最 高 速 离心 2 min 使 分 相 。 14) 转移 上 层 水 相 至 干净 的 微型 离心 管 中 ， 加 400 由 氯 仿 ， 混 匀 ， 离 心 分 相 如 步骤 13。 15S) 再 把 水 相 移 至 清洁 管 中 ， 再 次 用 氯仿 抽 提 。 16) 将 最 终 澄清 水 层 移 至 Beckman 超速 微型 离心 管 中 。 加 25 ul 4 mol/L AH, HA. 加 1 ml A) 95% CR, FRR, F-20C 中 沉淀 过 夜 (BEF 12). 17) 用 Beckman TLA — 45 转 头 在 4 中 以 12 000 g 离心 30 min 以 收集 RNA。 18) 倾 去 上 清 液 ， 将 管 口 向 下 歼 在 干净 的 卷 简 纸 上 ， 空 气 中 干燥 。 此 时 管 底 可 见 半 透 明 白色 RNA 沉淀 * 208 - 19) 01 25~100 pl TE (pH7.4) HA RNA, RAMAARRRATENHZE. AT JE RNA 降解 ， 加 1 U/pl 核糖 核酸 酶 抑制 剂 并 轻 轻 混 匀 。 20) 在 3~5 岂 RNA 溶 液 中 加 0.4 一 1 ml 灭 菌 水 ， 测 定 ODy69 RK ODzso。ODzo/OD2so 值 应 接近 2.0。 若 ODr69/OD2g9 << 1.7 WHA RNA 中 混 有 酚 和 蛋白质 ， 应 再 次 抽 提 和 沉淀 。RNA MERU FARIS: [RNA] (pg/pl) = (OD;ox40) x 总 体积 0OD'd (ml) /pl RNA OD'd 21) 如 RNA 短期 ( 几 周 ) 贮 存 , 可 将 RNA 的 水 溶液 在 -207 中 保存 。 如 以 更 为 稳定 的 状态 作 较 长 期 保存 , 则 保存 在 乙醇 中 .加 NaCl( 终 浓度 为 0.25 mol/L ) 和 2.5 倍 体积 05% 乙 醇 至 RNA 的 水 溶液 中 , 混 匀 , —20C 保存 。 按 步骤 17 离 心 可 使 RNA 复原 。 3.1.2.2 用 RNAzor 法 分 离 RNA 用 RNAzor 技 术 (TEL-TEST, Inc. ) 可 快速 分 离 得 到 非常 纯 的 RNA, 这 是 基于 Chom- czynski 和 Sacchil12] 的 方法 。 从 多 份 样品 , 尤其 从 小 组 织 样品 (< $00 mg) 分 离 RNA 时 这 一 方法 最 为 有 用 。 以 下 方案 是 来 自 TEL-TEST 公司 ,通常 我 们 使 用 时 略 加 修改 。 1) 每 100 mg 匀 浆 组 织 加 2 ml RNAZo |), AROMA (Teflon) 玻璃 匀 浆 器 捣 几 次 。 如 标本 < $0 mg， 应 用 Kontes RAH BE 1.5 ml Eppendorf 管内 研磨 义 浆 。 短暂 的 超声 处 理 有 利于 的 碎 任何 残留 组 织 块 ， 但 切 幻 使 义 浆 器 发 热 (参见 注释 9)。 2) 悬浮 生长 的 细胞 应 在 培养 基 中 离心 (最 大 200 g, 5 min) 沉淀 。 倾 去 上 清 液 ， 按 0.2 mlM105 细 胞 加 入 RNAzor， 反 复 抽 吸 ， 涡 旋 振 功 ， 使 细胞 完全 裂解 。 3) 生长 于 培养 下 上 的 细胞 可 在 培养 四 内 裂解 。 去 除 培 养 基 后 在 培养 下 中 加 入 RNAzor (如 1.5 ml/3.5 cm 培养 四 ) 使 覆盖 细胞 。 用 刊 棒 刮 细胞 或 /和 用 移 液 管 反复 吹 吸 细 胞 ， 以 确保 细胞 完全 有 裂解。 附着 的 细胞 也 可 用 刊 棒 刮 拢 收集 在 一 起 ， 然 后 按 步 又 2 使 细胞 沉淀 和 裂解 。 4) 每 1 ml SRM ml 氯仿。 在 涡 旋 振 划 器 上 至 少 剧 烈 震 划 1$ s， 直 至 匀 浆 液 完全 变 成 白色 泡沫 状 ， 置 冰 上 15 ming RA BRAK AB iA ek GE 4C 中 以 10 000 g 离 心 1$ min. 5) 此 时 离心 管内 应 可 见 两 层 液 相 。 小 心 取出 并 保存 上 层 含 RNA 的 水 相 。 这 水 相 体积 约 为 匀 浆 的 体积 的 一 半 。 吸 取 时 不 要 触及 交界 面 。 将 下 层 的 有 机 相 弃 入 废 液 缸 中 ， 用 适当 方法 处 置 。 6) 水 相 内 加 入 等 体积 冰冷 的 异 丙 醇 , 于 - 200 中 放置 45 min( 人 参见 注释 13) 使 RNA it 演 。 在 4 中 以 12 000 g 离心 1$ min (或 在 台式 离心 机 上 ,在 4C 中 以 10 000 g 离心 30 min), 以 沉 汪 RNA。 这 一 步 后 常 在 管 底 可 见 (但 并 不 总 是 可 见 ) 白 色 RNA 沉淀 。 7) 小 心 倒 去 上 清 液 。 用 80% 乙 醇 (0.8 ml/100ng RNA) MEW. MA hee 松 开 ， 然 后 在 4 人 中 以 12 000 g 离心 10 min。 倾 去 上 清 液 并 重复 乙醇 清洗 。RNA 沉 演 往往 与 管 壁 粘 附 不 太 牢 ， 故 弃 上 清 液 时 动作 应 轻 。 8) 沉 汪 可 空气 干燥 ， 直 到 略 显 潮湿 〈 完 全 干燥 的 沉淀 难以 重 悬 ) 。 每 100 pg RNA 中 加 50 pl TE 缓冲 液 (pH 7.4)， 涡 旋 振 功 或 反复 吹 吸 使 沉淀 重 悬 。 室 温 放置 15 一 30 min 有 助 于 重 悬 难以 悬浮 的 沉淀 。 如 果 其 他 方法 都 不 见效 ,为 了 重 悬 也 可 在 60Y 中 保温 10~15 min。 我 们 用 此 法 常 能 获得 OD;o/OD;so 的 值 为 2.0 一 2.1。 如 果 比 值 <1.7, 须 - 209 - #5 3.1.2 步骤 1 重新 抽 提 和 沉淀 。 用 此 法 分 离 的 RNA 在 作 酶 处 理 前 还 应 再 沉淀 。 3.1.3 从 RNA 合 成 互补 的 DNAs 为 了 用 Taq DNA 聚合 酶 对 RNA 序列 作 PCR, RNA 必须 先 反 转 录 成 互补 DNA (saDNA)， 因 Taq 酶 仅 具 有 限 的 逆转 录 酶 活性 0 (参见 注释 14)。 用 于 合成 EDNAs 的 引物 有 几 种 ， 寡 聚 - dT 能 在 所 有 poly+A RNAs 上 引发 cDNA 合成 。 这 些 cDNAs 可 用 于 多 种 RNA 的 扩 增 ， 所 以 为 方便 起 见 所 常用 。 随 机 引发 的 cDNA 合成 也 能 产生 各 种 各 样 的 cDNAs， 不 限于 poly At RNAs。 最 后 ， 与 目标 RNA(s) 2 #hH BRB SID HER 用 来 合成 高 度 特异 的 cDNAs。 我 们 建立 以 下 使 用 寡 聚 - dT 或 RNA 特异 性 引物 的 方法 。 关于 用 随机 引物 合成 DNAs 的 方法 可 参见 参考 文献 05]。 1) 在 装 有 4 pe BR- dT 或 200 pmol 的 特异 性 引物 和 5S pl 10 x 反 转 录 缓 冲 液 的 微型 离心 管 中 加 20 pe RNA， 总 体积 为 6.5 pl (BRIER 15), BRIA 2) 65C 保温 3 min， 置 冰 上 冷却 。 3) 加 5 pl 100 mmol/L DTT, 1 pl (40 U) RNasin 和 35 yl 脱氧 核 苷 酸 混合 物 ， hats 种 核 苷 酸 1.25 mmol/L (HRA RAM BN 125 pmol/L )。 加 2.5 pl (500 U) MMLV 6, BIRD. ARYA 50 yl. 4) 37C 保温 1 h。 5) 由 此 生成 的 CDNA 可 直接 用 于 PCR 反应 ， 或 被 进一步 修饰 (参见 注释 16)。 3.2 PCR # fF 进行 PCR 的 理想 情况 应 是 有 专用 实验 室 、 专 用 试剂 及 设备 。 如 此 奢侈 实 属 不 易 ， 但 PCR 试剂 必须 专用 。 一 套 专 用 移 液 器 及 带 有 滤 膜 的 吸 嘴 对 PCR 十 分 有 帮助 ， 且 目前 已 有 多 家 厂家 供应 。 当 处 理 PCR 试剂 时 ， 总 应 戴 手 套 。 务 使 靶 序 列 浓缩 母液 〈 如 重组 URL) 远离 PCR 区 域 及 PCR 仪器 。 偶 然 性 污染 的 追查 和 摆脱 是 极 难 的 。 PCR 循环 有 三 个 基本 步骤 ， 1) 变性 : 使 模板 解 链 成 单 链 ， 并 消除 二 级 结构 。 在 常规 周期 中 这 一 步 于 94 和 他 进行 1 一 2 min。 然 而 ， 扩 增 基 因 组 DNA 时 需 较 长 的 起 始 变性 时 间 (295 min) 以 使 其 解 链 。 2) 复 性 : 使 引物 与 模板 “杂交 ”。 此 步 的 反应 温度 取决 于 引物 解 链 温 度 及 对 扩 增 的 特异 性 的 要 求 。 典 型 的 反应 通常 采用 SSC 的 复 性 温度 作用 1 一 2 min。 如 对 扩 增 反应 的 特 异性 要 求 较 高 ， 则 于 60~65C 中 进行 复 性 。 引 物 特 异性 较 低 的 反应 可 在 37 一 457 中 复 性 。 3) 延伸 : 合成 新 的 DNA 链 。 这 步 通 常 于 72Y 进行 ， 这 一 温度 是 Taq DNA 聚合 酶 的 最 适 温 度 。 扩 增 时 间 则 取决 于 待 扩 增 序列 的 长 度 。 在 最 适 条 件 下 ，Taa DNA 聚合 酶 的 延伸 率 为 2 一 4 kb/min (制造 商 提 供 的 资料 )。 通 常 ， 我 们 设置 的 扩 增 率 为 1 kb/min, 如 扩 增 长 度 >3 kb， 所 设置 的 扩 增 1 kb 所 需 的 时 间 要 长 些 (参见 注释 17)。 20~30 个 PCR 循环 对 于 许多 应 用 是 足够 了 。 当 引物 和 dNTPs 耗 尽 时 及 当 模 板 分 子 数 目 超过 聚合 酶 的 供应 时 ，DNA 的 合成 效率 就 会 下 降 。 因 此 ， 最 后 一 次 循环 后 于 。 210 。 72C PRABEK 5~15 min 会 使 一 些 未 完成 的 合成 反应 得 以 完成 。 在 扩 增 程序 结束 以 后 ， 许 多 循环 仪 有 一 种 便利 的 功能 ， 可 使 样品 无 限期 地 保存 于 1SC ， 尤 其 适用 于 通宵 进行 PCR 实验 。 在 理想 情况 下 ， 对 每 一 种 模板 和 相应 的 引物 都 应 分 别 设 置 最 优 反应 条 件 ， 但 在 实际 工作 中 ， 大 多 数 研 究 人 员 使 用 供应 商 推荐 的 条 件 ， 除 非 所 得 的 结果 偏离 预测 太 远 。 除 引 物 序列 外 ， 对 于 每 一 个 扩 增 反应 可 能 被 优化 的 变量 有 6 个 : 复 性 温度 、 引 物 浓度 、 模 板 YEE. MgCl 浓度 、 延 伸 时 间 、 循 环 数目 〈 见 参考 文献 5])。 标 准 的 条 件 叙 述 如 下 : 1) 配制 PCR 试剂 的 混合 母液 (4 100 pl HW PCR 反应 液 ) 含 10 pl 10x 扩 增 缓冲 液 ， 100 pmol 上 游 引 物 ，100 pmol 下 游 引物 ，16 pl 1.25 mmol/L dNTP 工作 母液 (参见 注释 18)。 加 入 经 紫外 线 照 射 的 灭 菌 水 ， 所 加 水 的 体积 是 使 加 了 样品 和 Tag 聚合 酶 后 总 反应 体积 为 100 pl, AeA (PE 0.2 一 0.5 次 反应 所 需 量 ) 的 混合 母液 以 保证 足以 提供 所 有 的 样品 所 需 用 的 量 。 2) 按 所 需 量 ， 将 样品 分 装 到 有 标记 的 0.5 ml 微型 离心 管 中 。 我 们 通常 扩 增 由 10 pg RNA 制 成 的 50 pl CDNA 中 的 5 pl (1/10)。 基 因 组 DNA 通常 被 扩 增 的 量 为 100 ng 一 1 pg。 用 经 紫外 线 照 射 的 灭 菌 水 调节 体积 使 各 管 体 积 相 等 。 3) 于 母液 中 每 次 反应 加 0.5 pl Tag RAR (2.5 U)， 充 分 混 匀 ， 并 在 微型 离心 机 中 短 暂 离 心 以 收集 所 有 液体 〈 参 见 注释 19). 4) 每 一 样品 管 中 加 一 定 体积 的 混合 母液 ， 使 总 体积 现在 是 100 vl. UH, ARGH 管内 液体 混 匀 ， 再 在 微型 离心 机 中 短暂 离心 。 5) 打开 管 盖 ， 于 反应 体系 中 加 入 数 滴 轻 矿物 油 以 防 样品 蒸发 。 6) 在 装 样品 的 热 循 环 仪 的 每 一 样品 槽 内 加 一 滴 轻 矿物 油 。 插 入 样品 管 〈 参 见 注释 20)。 7) 根据 前 面 所 述 的 原则 扩 增 样品 。 a. 用 于 1 kb 扩 增 区 域 的 cDNA 的 典型 循环 程序 是 下 列 30 个 循环 : 94. 2 min (变性 ); SST. 2 min (引物 的 “杂交 ”); 和 72C、1 min (引物 延伸 ); 接着 72C. Smin (最 后 延伸 ); MISC 中 无 限期 地 保存 直到 样品 取出 。 b. 用 于 2 kb 扩 增 区 域 的 基因 组 DNA 的 典型 循环 程序 是 : 940. 5 min (起 始 变 性 ); 接着 的 30 循环 是 94C 2 min; 60C,. 2 min; #1 72C,. 2min;s 最 后 延伸 72C 、10 min; RAFF 15T. 8) PCR 反应 结束 后 取出 样品 ， 每 管 中 加 入 200 岂 氯 仿 ， 矿 物 油 将 沉 入 管 底 。 9) 无 须 混 匀 ， 将 样品 置 于 台式 离心 机 上 以 最 高 速 离心 30 s。 10) 将 上 层 相 移入 一 干净 的 微型 离心 管 中 。 加 50 局 7.5 mol/LBRR, RAEN (BR 注释 21)。 11) 加 375 由 95% 乙 醇 ， 混 匀 。 对 于 浓缩 的 样品 在 室温 中 静 置 10 min， 对 于 不 甚 浓缩 的 样品 则 置 冰 浴 30 min. 12) 在 台式 离心 机 上 以 最 高 速 离心 1$ min, 13) 倾 汐 去 上 清 液 〈 参 见 注释 22)， 空 气 中 晾 干 沉淀 ， 用 20 pl 灭 菌 水 重 悬 沉淀 。 q 2h « 3.3 ”用 梨 式 PCR 分 析 PCR 产物 琼脂 糖 凝 腕 和 丙烯 酰胺 凝 胶 均 可 用 于 分 析 PCR 产物 ， 这 取决 于 所 要 求 的 分 辨 率 和 是 否 须 从 凝 胶 回 收 PCR 产物 。 微 型 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 快 速 易 行 ， 且 能 很 快 地 用 以 估计 PCR OWA EMRE 〈 参 见 第 三 章 )。 了 琼脂 糖 凝 胶 比 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 可 以 更 快 和 更 有 效 地 回收 DNA (参见 第 二 十 八 章 )。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 用 特异 性 探 针 作 Southern 印迹 杂 交 ， 能 在 高 度 非 专 一 扩 增 的 背景 中 检测 某 一 PCR 产物 B]， 这 也 是 证 明 扩 增 片段 相应 于 已 知 序列 的 一 种 方法 B,16]。 最 后 ， 当 PCR 产物 丰 度 不 足以 用 省 化 乙 锭 染色 检测 时 ， 用 Southern 印迹 都 能 检测 出 来 06]。 巢 式 引物 能 通过 再 度 扩 增 DNA 内 侧 区 域 来 确定 PCR 产物 。 这 一 方法 利用 低 熔点 琼 脂 糖 胶 上 的 DNA 带 可 被 割 下 后 直接 用 于 PCR 反应 而 不 须 进一步 纯化 的 事实 [4711。 1) 在 0.7% 一 1% 低 熔点 琼脂 糖 (如 NuSieve, FMC BioProducts) 凝 胶 电 泳 扩 增产 物 。 若 于 4Y 中 缓慢 地 进行 电泳 (12~25V) 则 分 辩 率 可 能 会 提高 。 2) 用 紫外 线 灯 照 射 省 化 乙 锭 染色 的 凝 胶 以 确定 所 需 条 带 的 位 置 。 割 下 条 带 ， 移 入 微型 离心 管 中 。 3) 68C 保温 5 一 10 min， 使 凝 胶 条 带 熔 化 。 4) 取 10 pl BRMBA—S PCR 混合 液 和 巢 式 引物 各 100 pmol 的 管 中 ， 再 次 扩 增 。 5) 按 第 三 章 的 方法 ， 通 过 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检查 第 二 次 PCR 产物 。 3.4 直接 标记 的 PCR 产物 的 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电泳 用 于 PCR 产物 的 分 析 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 可 提供 较 高 的 分 辨 率 以 及 对 扩 增 产物 大 小 更 为 精确 的 估计 “【 参 见 第 十 三 章 )， 这 是 检测 直接 标记 的 PCR 产物 的 首选 方法 。 变 性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 中 含有 尿素 ， 可 用 于 分 析 例如 来 自 不 对 称 PCR 的 单 链 产物 。 在 PCR 混合 液 中 加 入 放射 性 元 素 标记 的 核 苷 酸 来 标记 DNA 片段 ， 通 过 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 及 自 显影 ， 可 高 灵敏 度 和 半 定 量 地 检测 PCR 产物 。 用 密度 扫描 仪 扫描 ， 或 将 凝 胶 上 切 下 的 标记 条 带 直 接 进 行 闪烁 计数 ， 可 以 对 凝 胶 上 的 条 带 作 定量 分 析 。 我 们 曾 用 直接 标记 的 PCR 产物 的 放射 自 显影 法 测定 鼠 卵 巢 基 粒 细胞 Qt91 及 垂体 肿瘤 细胞 株 G 的 数 种 mRNA 的 相对 水 平 。 1) 制 胶 和 制 样 、 电 泳 、 染 色 、 照 相 (参见 第 十 三 章 )。 记 住 ， 凝 胶 是 放射 性 的 ， 应 小 心 操作 。 2) 切 一 片 大 于 凝 胶 的 3 MM 滤纸 。 将 凝 胶 擒 起 放 在 塑料 纸 上 ， 再 把 塑料 纸 放 在 平坦 的 表面 上 。 展 平 凝 胶 中 的 任何 皱纹 。 3) 把 滤纸 盖 在 凝 腕 上面。 当 滤 纸 与 凝 胶 粘 在 一 起 后 滤纸 应 即刻 开始 浸 湿 。 将 凝 胶 、 塑 料 纸 及 滤纸 一 起 反 过 来 ， 于 是 凝 胺 有 了 一 层 滤纸 衬托 。 4) 次 胶 在 凝 胶 干燥 机 上 和 干燥 30 一 45 min。 为 避免 污染 凝 胶 干 燥 机 ， 在 凝 胶 下 可 再 垫 一 212 - 5) 将 干 了 的 凝 胶 用 新 的 塑料 纸 包 好 。 放 入 装 有 X 射线 底片 的 暗盒 内 曝光 4 h 至 2 d。 4. 注 释 (1) 为 防止 无 所 不 在 的 RNase 降解 RNA， 在 配置 RNA 分 离 试 剂 和 分 离 RNA 过 程 中 必 须 注 意 以 下 问题 : 整个 过 程 都 要 戴 手 套 。 尽 可 能 用 最 高 质量 的 分 子 生 物 学 级 别 的 试剂 所 有 的 玻璃 器 严 都 经 烘 烤 。 使 用 一 次 性 灭 菌 的 塑料 制品 。 (2) FA AIM 6 YR BE YS fH Corning YEAR, BX Nalgene eRe a (3) DEPC 在 Tris 缓冲 液 中 要 分 解 ， 故 不 能 用 DEPC 配置 Tris Bap?! , (4) 在 制备 PCR 试剂 或 操作 PCR 时 ， 应 戴 手 套 ， 以 防 污染 。 (5) 建议 只 要 不 含 核 苷 酸 或 引物 ， 所 有 用 在 PCR 中 的 溶液 均 须 经 紫外 线 照 射 灭 菌 以 减 少 母 液 偶 受 PCR 目标 序列 的 污染 的 机 会 ， 从 而 干扰 样品 的 扩 增 '9]。 (6) 收集 用 作 分 离 RNA 的 培养 细胞 时 ， 将 所 需 体 积 的 细胞 悬 液 直接 倒 入 50 ml 离心 管 中 ， 贴 壁 细 胞 则 用 刊 棒 刊 落 ， 避 免 用 酶 取 下 贴 壁 细 胞 ， 因 酶 制品 可 能 污染 有 核酸 Be. F4C PU 250 g 离心 4 min。 用 原 体积 1/10 的 冷 PBS 重 悬 细胞 ， 再 离心 。 分 离 完 整 细 胞 的 RNA 按 注释 10 进行 。 提 取 核 RNA 则 将 细胞 在 含 0.5% NP - 40 的 1 ml PBS 中 裂解 ，4 中 以 600 g BLS min 收集 细胞 核 ， 接 着 按 注释 10 进行 。 (7) 匀 浆 时 应 避免 样品 形成 泡沫 。 (8) 对 于 细胞 或 核 沉 淀 ， 用 手指 轻 弹 微型 离心 管 管 壁 以 松动 沉淀 ， 加 1 ml GITC/BME 缓冲 液 ， 置 冰 浴 几 分 钟 使 沉淀 溶解 。 用 处 理 组 织 块 所 用 的 方法 剪 切 DNA (人 参见 Se B34). (9) 也 可 用 超声 波 于 1.5 ml 微型 离心 管 中 处 理 DNA 以 代替 剪 切 。 根 据 样品 的 黏 滞 度 ,我 们 用 Virsonic 50 细 胞 粉碎 仪 (Virtis, Gardiner, NY), 设 定 在 产生 最 大 脉冲 的 40% 一 50% 的 脉冲 ,根据 样品 的 黏 滞 度 作 用 10 一 30 s。 使 用 超声 波 仪 时 , 为 减少 泡沫 须 保 证 探头 尖端 处 于 样品 底部 。 仅 当 浸没 探头 后 才 接 通 超声 波 仪 ,如 超声 波 处 理 不 止 一 次 ， 则 各 次 脉冲 应 间 踊 10 s 以 使 样品 冷却 。 为 防止 RNA 降解 , 探头 在 使 用 前 要 用 灭 菌 水 清洗 ,用 后 同样 用 灭 菌 水 洗 净 肌 溶液。 同时 应 注意 保护 操作 者 的 听觉 。 (10) TLS- 5S5 转 头 有 4 只 吊 篮 ， 虽 然 只 有 两 份 样品 也 能 用 ， 但 离心 期 间 必 须 4 个 吊 篮 都 就 位 。 (11) 样品 不 能 置 于 极 透明 (ultraclear) 管 中 抽 提 ， 因 其 不 耐 有 机 溶剂 。 (12) 沉淀 也 可 于 - 70C 中 进行 1 h。 (13) 用 异 丙 醇 于 -20T7 中 长 时 间 沉 淀 RNA 时 ， 将 使 污染 物 与 RNA 同时 沉淀 。 此 时 如 必须 暂停 操作 ， 可 在 这 步 将 标本 保存 于 4C 。 继 续 时 ， 按 步骤 4 将 样品 于 -207 中 放置 45 min. (14) 目前 多 种 具有 逆转 录 酶 活性 及 DNA 聚合 酶 活性 的 双重 功能 的 耐 热 酶 已 有 市 售 (TetZ, Amersham, Arlington Heights, IL; TTh; 20)。 不 同 的 活性 依赖 不 同 的 二 价 离子 ， 因 此 改变 缓冲 液 可 调节 不 同 的 活性 。 (15) 合成 可 扩 增 PCR AY cDNA 所 需 的 RNA 量 的 低 限 不 能 为 常规 方法 所 检 出 。 我 们 曾 用 少 至 0.4 ne 的 可 测量 的 RNA 制备 cDNA， 甚 至 用 更 稀 的 RNA， 稀 到 测量 不 出 让 多 RS 。 OD 值 为 止 Lt,19]。 也 有 人 用 PCR 从 单个 细胞 制备 的 RNA/cDNA 样品 中 检测 特异 的 RNAs?!) (16) cDNA 的 一 些 应 用 如 加 尾 反 应 可 能 须 合 成 双 链 CDNA. RNase H & DNA 聚合 酶 可 完成 第 二 链 的 合成 。 达 到 这 一 目的 的 步骤 可 得 自 出 售 试剂 盒 的 厂 方 和 参阅 参考 文 献 [57]。 同 聚 物 加 尾 可 用 于 锚 定 DNA 序列 ， 使 扩 增 从 已 知 区 域 开 始 一 直到 未 知 的 加 尾 未 端 L81]。 加 尾 反应 的 步骤 亦 可 参阅 参考 文献 [4 71。 此 外 ， 也 曾 报道 用 RNA 连 HERG CE ARE cDNA 的 3“ 端 加 上 接头 〈 相 当 于 RNA 未 知 的 $ 端 )。 这 就 使 得 在 cD- NA 已 知 区域 和 接头 间 可 进行 后 续 的 PCR， 且 有 助 于 确定 mRNA 的 $ 端 。 在 其 他 PCR 应 用 中 有 必要 除去 用 于 制备 cDNA 的 引物 。 这 可 能 通过 许多 轮 次 的 酷 酸 贸 沉 淀 或 通过 从 凝 胶 中 纯化 而 达到 。 (17) 虽然 对 于 非常 长 的 靶 序 列 的 扩 增 ，PCR 的 效率 可 能 会 减低 。 但 我 们 已 成 功 地 扩 增 出 长 度 大 于 6 kb 的 序列 。 (18) 为 了 直接 标记 PCR 产物 ， 改 变 核 苷 酸 混合 液 使 它 含 : 625 pmol/L dCTP, 1.25 mmol/L dATP, 1.25 mmol/L dGTP, 1.25 mmol/L dTTP。 并 于 上 述 混合 物 中 每 100 pl MA S~10 pCi (0.5~1 pl) 的 oP-dCTP (3000 Ci/mmol) /100 pl. (19) 对 于 在 加 Taq DNA RAMA ABH 〈“ 热 启动 ")[22] 的 那些 PCR 程序 ， 制 备 的 反应 液 的 体积 应 稍 小 并 且 不 加 Tog 酶 。 样 品 置 于 循环 仪 中 进行 初步 变性 ， 接 着 保 持 于 复 性 温度 中 2 min。 升 温 至 6SC 时 加 入 溶 于 少量 UV 灭 菌 水 中 的 Taa 酶 ， 此 步 的 时 间 设 置 应 使 所 有 样品 中 都 能 加 入 酶 。 这 些 样品 接着 于 72Y 中 延伸 适当 时 间 ， 然 后 和 一 般 PCR 一 样 进行 热 循 环 。 (20) 如 果 在 样品 的 周围 放 些 空 管 ， 可 得 较 均 匀 的 加 热 和 冷却 。 (21) 酯 酸 铵 沉淀 可 去 除 引物 及 剩余 的 核 苷 酸 !23]。 (22) 如 果 样 品 是 放射 性 的 ， 务 必 适 当 处 理 废 物 。 a 我 们 感谢 Puja Agarwal 及 Anna Pappalardo 提供 的 优秀 的 技术 帮助 。 此 文 由 NIH 基 金 赞 助 (HRA DK43064). 参考 文 献 — . Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., and Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354. - Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335—350. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., and Erlich, H. A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491. No Ww . ae * —————— aa 4. Erlich, H. A., Gelfand, D., and Sninsky, J. J. (1991) Recent advances in the poly- a 6. ~— oo 10. 19. 20. 2 22. 2 -一 Ww merase chain reaction. Science 252, 1643-1651. Robert, S. S. (1991) Amplification of nucleic acid sequences: the choices multiply. J. NIH Res. 3(2), 81-94. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Labora- tory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. . Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidman, J. G., and Struhl, K. (eds.) (1987) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, New York. . Dycaico, M. and Mather, S. (1991) Reduce PCR false positives using the Stratalinker UV crosslinker. Stratagene Strategies 4(3), 39,40. . Sarkar, G. and Sommer, S. S. (1990) Shedding light on PCR contamination. Nature 343, 27. Zintz, C. B. and Beebe, D. C. (1991) Rapid re-amplification of PCR products puri- fied from low melting point agarose gels. Biotechniques 11, 158—162. . Delidow, B. C., Peluso, J. J. and White, B. A. (1989) Quantitative measurement of mRNAs by polymerase chain reaction. Gene Anal. Tech. 6, 120-124. . Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159. . Chomcezynski, P. (1991) Isolation of RNA by the RNAzol method. TEL-Test, Inc., Bull. 2, 1S. . Myers, T. W. and Gelfand, D. H. (1991) Reverse transcription and DNA ampli- fication by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30, 7661— 7666. . Zimmer, A. and Gruss, P. (1991) Use of polymerase chain reaction (PCR) to detect homologous recombination in transfected cell lines, in Methods in Molecular Biol- ogy, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols (Murray, E. J., ed.) Humana, Clifton, NJ, pp. 411-418. . Ohara, O., Dorit, R. L., and Gilbert, W. (1989) One-sided polymerase chain reac- tion: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5673-5677. . Belyavsky, A. (1989) Polymerase chain reaction in the presence of NuSieve™ GTG agarose. FMC Resolutions 5, 1,2. . Belyavsky, A., Vinogradova, T., and Rajewsky, K. (1989) PCR-based cDNA library construction: general cDNA libraries at the level of a few cells. Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932. Delidow, B. C., White, B. A., and Peluso, J. J. (1990) Gonadotropin induction of c-fos and c-myc expression and deoxyribonucleic acid synthesis in rat granulosa cells. Endocrinology 126, 2302-2306. Tse, W. T. and Forget, B. G. (1990) Reverse transcription and direct amplification of cellular RNA transcripts by Taq polymerase. Gene 88, 293-296. . Rappolee, D. F. A., Mark, D., Banda, M. J., and Werb, Z. (1988) Wound macro- phages express TGF-a and other growth factors in vivo: analysis by mRNA pheno- typing. Science 241, 708-712. Rauno, G., Brash, D. E., and Kidd, K. K. (1991) PCR: the first few cycles. Perkin- Elmer Cetus Amplifications 7, 1-4. . Crouse, J. and Amorese, D. (1987) Ethanol precipitation: ammonium acetate as an alternative to sodium acetate. BRL Focus 9, 3—S. ‘Sia * 第 三 十 五 章 ， 反 向 聚合 酶 链 式 反应 Daniel L. Hartl, Howard Ochman Tl 1. 4] 反 向 聚合 酶 链 式 反应 (IPCR) 是 常规 聚合 酶 链 式 反应 的 最 早 的 扩展 ， 它 可 以 用 来 扩 增 未 知 的 寡 核 苷 酸 序列 而 无 须 求助 于 常规 的 克隆 。 在 常规 聚合 酶 链 式 反应 中 ， 用 与 已 知 序列 未 端 互补 的 合成 寡 核 苷 酸 引 物 扩 增 该 序列 QL2]。 两 条 引物 的 3' 端 彼此 面 对 ， 一 条 引物 的 延伸 产生 为 另 一 条 引物 复 性 的 模板 。 周 而 复 始 的 引物 复 性 、 聚 合 及 模板 变性 导致 靶 序 列 的 拷贝 作 指数 式 增长 。 但 是 ， 位 于 已 知 序列 界线 外 侧 的 区 域 并 不 能 用 常规 PCR 进行 直接 扩 增 。 因 为 指向 外 侧 区 域 合成 的 DNA 链 与 从 另 一 方向 合成 的 DNA 链 并 不 互 补 ， 外 侧 序列 的 拷贝 至 多 以 线性 速率 增加 而 已 。 然而 能 选择 性 地 扩 增 外 侧 序列 的 方法 是 很 多 的 。 这 些 应 用 中 包括 转 座 因 子 在 基因 组 的 插入 位 点 的 测定 ， 在 这 里 转 座 因 子 序列 可 用 于 选择 寡 核 苷 酸 引 物 ， 也 可 以 用 以 测定 cDNA 编码 序列 两 侧 的 基因 组 DNA 上 下 游 区 域 ， 这 里 cDNA 5 及 3“ 端 序列 可 用 于 选择 引物 。 另 外 一 些 应 用 包括 测定 克隆 的 DNA 片段 未 端的 核 昔 酸 序列 ， 尤 其 当 这 些 DNA 片段 是 像 克隆 于 人 工 酵 母 染 色 体 上 03,4] 或 者 叭 菌 体 P1 Lag KR BE DNA; 在 这 些 应 用 中 引物 序列 的 选择 根据 克隆 位 点 两 侧 的 载体 序列 。 2 0 图 35.1 反 向 PCR 的 主要 应 用 。 图 中 深 色 阴影 区 代表 已 知 序列 ， 浅 色 阴 影 区 代表 未 知 序 列 。(A) 已 知 序列 位 于 未 知 序列 之 间 ，(B) 未 知 序列 位 于 已 知 序列 之 间 。 带 箭头 的 括号 表 示 限 制 酶 切 位 点 的 可 能 位 置 。 它 们 使 左 侧 (L) 的 或 右 侧 (R) 的 序列 得 以 通过 IPCR 而 扩 增 。 用 适当 的 限制 酶 消化 后 分 子 环 化 ， 使 已 知 序列 中 的 两 个 位 置 与 未 知 序列 相 邻 近 ， 于 是 已 知 序 列 便 作为 寡 核 苷 酸 引 物 位 置 ( 弯 箭 头 ) 而 扩 增 未 知 序列 。 。 216 ° 扩 增 两 侧 序列 的 可 能 性 很 是 诱 人 ， 使 好 几 个 研究 组 接受 了 这 一 挑战 ， 三 个 实验 室 几 乎 同时 独立 地 建立 了 成 功 的 方法 咏 91， 而 且 三 种 方法 的 思路 相同 ， 正 如 图 35.1 所 勾画 。 方法 (A) 及 (B) 代表 两 类 主要 的 应 用 。 深 色 阴 影 区 代表 已 知 序列 区 域 ， 浅 色 阴 影 区 代表 未 知 序列 区 域 。 在 方法 (A) 中 已 知 序列 〈 例 如 编码 区 ) 是 连贯 的 ， 问 题 是 要 扩 增 基因 组 DNA 左 (L) 或 右边 (R) 的 两 侧 序 列 。 在 方法 (B) 中 已 知 序列 〈 例 如 在 克隆 载体 中 ) 是 间断 的 ， 问 题 是 要 扩 增 在 左 (L) 或 右边 (R) 带 有 未 知 序列 的 连接 区 。 为 便于 进一步 讨论 ， 我 们 把 已 知 序列 、 未 知 序列 分 别称 为 “核心 ”序列 及 “ 靶 ” 序 列 。 这 种 方法 的 第 一 步 是 确定 两 种 限制 性 内 切 酶 ， 它 们 分 别 在 核心 序列 和 靶 序 列 内 切 割 ， 使 切 下 的 DNA 片段 中 包含 核心 序列 以 及 相 邻 的 靶 序 列 。 限 制 酶 的 切割 位 点 在 图 35.1 中 用 箭头 表示 ， 通 常 每 一 连接 区 需要 不 同 的 酶 。 对 于 每 一 连接 区 ， 通 过 选择 能 在 核心 序列 内 距离 连接 区 $0 一 1000 bp 位 置 上 切割 的 酶 ， 组 成 一 批 候选 的 内 切 酶 。 在 候选 者 中 一 方面 可 以 根据 尝试 法 ， 或 者 更 可 靠 地 用 核心 序列 作为 探 针 通 过 Southern 印迹 00] 最 后 选 定 所 要 用 的 限制 酶 。 带 有 四 个 碱 基 切 割 位 点 的 限制 酶 通常 更 为 可 取 ， 因 它 切割 靶 序列 的 位 点 常常 更 能 令 人 接受 。 切割 后 的 下 一 步 是 环 化 ， 环 化 时 限制 酶 所 释放 的 片段 的 末端 相互 连接 。 这 样 产生 的 环 化 分 子 有 两 个 核心 - 靶 连 接 区 ， 一 个 存在 于 原先 的 分 子 中 ， 第 二 个 由 连接 产生 。 连 接 后 接着 用 靠近 核心 - 靶 连 接 区 的 核心 序列 设计 守 核 苷 酸 引物 进行 PCR。IPCR 的 “ 反 疝 ” 一 词 来 源 于 这 样 一 个 事实 ， 即 引物 的 SME (APSA). AF 底 物 的 环 状 构 型 ， 每 一 聚合 形成 的 产物 可 以 作为 相对 引物 的 复 性 模板 。 因 此 ， 周 而 复 始 的 复 性 、 聚 合 和 模板 变性 可 以 使 靶 序 列 的 拷贝 以 指数 方式 增长 。 在 病毒 和 转 座 因子 插入 片段 基因 组 的 两 侧 序列 的 回收 方面 "-9， 在 产生 互补 于 克 隆 的 插入 片段 末端 的 探 针 以 用 于 染色 体 步 移 方面 LI， 以 及 在 直接 克隆 源 于 总 RNA 的 未 知 cDNA 序列 方面 405]，IPCR 都 被 证 明 是 非常 有 用 的 。 从 IPCR 诞生 起 已 经 发 展 了 许多 方法 ， 或 是 作为 IPCR 的 替代 ， 或 者 更 合适 用 于 某 些 特殊 的 用 途 。 例 如 ， 用 于 人 类 基因 组 DNA 的 一 项 技术 中 应 用 载体 序列 设计 一 条 引物 ， 用 Alu 共同 序列 作为 另 一 条 引 物 ， 用 以 扩 增 YAC 或 和 粒 克隆 的 插入 片段 的 末端 4461。 与 这 些 技术 最 相关 的 技术 在 注释 中 将 作 简 要 讨论 (参见 注释 )。 2. 材 料 2.1 限制 酶 切片 段 的 制备 1) 限制 酶 和 缓冲 液 : 它们 常常 一 起 出 售 。 进 行 消化 时 按 制 造 商 推荐 的 方法 操作 。 不 同 的 酶 遵循 不 同 的 操作 。 2) To.1E: 10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0. 2.2 连接 成 环 3) 10x 连 接 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCI、pH 7.4，100 mmol/L MgCl, 100 mmol/L “2 piT 。 DTT, 10 mmol/L ATP. 4) T4 DNA 连接 酶 : 厂家 供应 的 浓度 为 1000 Weiss U/pl. 5) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA. 2.3 PCR FF 10 X PCR 缓冲 液 ， 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4, 500 mmol/L KCl, 5 mmol/L MgCl, 0.1% FARE. dNTP ES): 将 等 摩尔 的 每 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 (dNTP)， 混 合成 100 mmol/L 母液 (每 种 dNTP 浓度 各 为 25 mmol/L). 8) Taq RAB: 厂家 供应 的 浓度 为 5 U/pl (参见 注释 1)。 9) 引物 : 引物 长 度 因 不 同 的 应 用 而 不 同 ， 但 平均 含 20 个 核 苷 酸 (SHER 2). HE 母液 至 $S0 pmol/pl. 6 Yo 7 Yo Bri yy 法 3.1 限制 酶 切片 段 的 制备 这 一 步 中 最 大 的 可 变 因 素 是 DNA 的 质量 及 复杂 程度 。 能 获得 最 佳 结 果 的 DNA 往 往 经 酚 抽 提 而 得 并 来 源 于 简单 的 基因 组 ， 例 如 细菌 、 酵 母 、 线 虫 、 果 蝇 (ZUWLEF IT 1) 根据 制造 商 提 供 的 条 件 ， 于 37C 中 用 限制 酶 消化 2 h。 通 常 在 初次 消化 中 用 1 一 5 pe 基因 组 DNA， 在 20~50 pl AP PHT. AF DNA 样品 在 连接 前 须要 沉淀 ， 所 以 反 应 体积 不 是 关键 的 。 2) 用 等 体积 经 平衡 的 酚 抽 提 。 上 下 倒转 样品 ， 在 微型 离心 机 上 短暂 离心 使 分 相 ， 移 出 水 相 (参见 注释 8). 3) 用 氯仿 / 异 戊 醇 (24:1) 抽 提 前 一 次 抽 提 物 的 水 相 ， 方 法 同步 又 2。 4) 乙醇 沉淀 : 加 0.1 倍 体积 3 mol/L 醋酸 钠 (pH 5.3)， 接 着 加 2 倍 体积 无 水 乙醇 ， 置 于 -207 中 30 min Witte DNA, AE 4 离心 20 min 以 收集 DNA, FA 70% ZB 淋 洗 DNA 沉淀 ， 真 空 干燥 。 5) 样品 重 悬 于 To.IE， 浓 度 为 100 ng/yl. 3.2 连接 成 环 为 了 选择 某 一 比较 有 利于 形成 单 体 环 的 稀释 度 ， 建 议 以 不 同 浓度 的 DNA (20, 100, 500 pg/pl) 同时 进行 反应 。 1) 设置 三 管 ， 每 管内 分 别 含有 0.2 wl. 1.0 由 、5.0 pl BLE. 2) 加 入 10 pl 10 x 连接 缓冲 液 和 水 至 终 体 积 95 pl (蒸馏 水 分 别 为 93.8 pl, 93 pl 及 89 yl). “Vis 3) MA 0.05 Weiss U/ul H T4 DNA 连接 酶 。 于 14 保温 至 少 2 h (连接 反应 通常 进行 wt). | 4) 65C 加 热 15 min Ki, EZRIRA WEA TREN TEA / Ate, wie DNA, 并 于 10 pl TE PH DNA. 3.3 PCR 扩 # 1) 对 于 每 一 连接 产物 ， 在 适 于 PCR 反应 的 管内 加 4 岂 来 源 于 连接 反应 的 DNA。 (参见 注释 9)， 加 5 pl 10 x PCR 缓冲 液 ，0.4 由 dNTP 混合 物 ， 每 种 引物 ipl 和 水 至 终 体 FAA 50 pl, ERMIRGWLERD Wik 50 ul. 2) 反应 混合 物 于 9$Y 中 加 热 10 min 使 环 化 DNA 模板 上 产生 切口 以 利于 扩 增 的 进行 。 加 0.2 pl Tag RAB. 3) 标准 的 扩 增 条 件 是 30 个 循环 ， 其 中 包括 OSC 中 变性 40s, 56C 中 引物 复 性 30 s, 72 和 中 引物 延伸 100 s (参见 注释 10)。 4) 取 每 一 样品 的 1/10 于 1% 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 以 分 析 扩 增产 物 。IPCR 产物 可 以 用 Southern 印迹 或 者 用 来 源 于 核心 序列 的 探 针 进行 杂交 以 求证 实 (参见 注释 11)。 一 经 证 实 ，PCR 产物 便 可 用 于 克隆 (参见 第 二 十 七 、 三 十 七 章 ) 或 直接 测序 (参见 第 四 PIL Ys 3.4 IPCR 产物 的 再 次 扩 增 如 果 有 非特 异性 产物 被 扩 增 出 来 ， 那 么 进行 第 二 次 扩 增 有 时 会 有 帮助 。 两 种 不 同 的 方法 可 以 采用 。 3.4.1 #2 xX 45] w 在 这 里 ， 初 始 引物 之 一 为 另 一 引物 所 替代 ， 后 者 用 能 与 靠近 核心 - 靶 连 接 区 但 仍 位 于 扩 增 片段 内 部 的 核心 序列 复 性 。 1) 取 1 pl MM PCR 产物 作为 扩 增 模板 。 2) 用 另 一 对 引物 取代 初始 引物 重复 初次 PCR， 但 是 循环 数 减少 到 15 次 。 3.4.2 HR aA tt 另 一 种 方法 是 将 初次 PCR 反应 产物 先 在 琼脂 糖 凝 胶 上 进行 分 离 。 1) RS wl MM PCR 产物 于 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 。 2) 用 滴 管 的 尖端 吸取 大 小 合适 的 片段 进行 抽 提 。 吸 取 的 凝 胶 栓 应 为 $ 一 10 pl. 3) 将 凝 胶 栓 加 入 100 pl 蒸馏 水 中 ， 于 9SY 中 加 热 $ min 以 熔化 琼脂 糖 。 4) 取 1 由 用 两 条 初始 引物 或 巢 式 引物 重复 PCR。 用 巢 式 引物 的 扩 增 方法 参见 3.4.1. +e Bo a (1) (2) (3) (4 ~~ (5 So (6 2 (7 — (8 — (9) 4. 注 eg 在 扩 增 来 源 于 肠 道 细 菌 的 片段 时 ， 我 们 用 从 嗜 热 细 菌 中 纯化 的 Tad 聚合 酶 ;克隆 的 热 稳定 聚合 酶 (AmpliTaq) 用 于 其 他 工作 中 。 PCR 扩 增 的 特异 性 很 大 程度 上 取决 于 对 朝 核 苷 酸 引 物 的 选择 。 我 们 典型 地 选用 由 20 个 核 苷 酸 组 成 的 引物 ， 其 中 G+ C 含量 为 50% 左 右 ， 理 论 上 的 平均 复 性 温度 为 60 。 复 性 温度 按 下 法 计算 : Tu<*2x(A+T)+4x(G+C)。 限制 酶 的 选择 由 靶 序 列 中 的 限制 酶 切 位 点 的 分 布 情 况 决定 ， 必 要 时 可 通过 South- ern 印迹 确立 0101 以 及 由 PCR 反应 所 能 扩 增 的 最 长 片段 的 大 小 确定 。 片 段 所 含 的 加 序列 以 <3 kb 为 较 好 ， 因 为 这 样 能 达到 最 好 的 扩 增 效果 。 应 用 合适 的 限制 酶 有 时 只 须 进 行 一 次 酶 切 就 可 获得 大 小 合适 的 、 含 有 左 侧 或 右 侧 核心 - 靶 连 接 区 (RA 3$.1 的 站 和 有 R) 的 片段 。 为 了 获得 大 小 合适 的 核心 - 靶 片 段 ， 有 时 须 同 时 使 用 两 种 限制 酶 来 消化 ;如果 限 制 酶 产生 不 匹配 末端 ， 就 须 在 连接 反应 之 前 用 Klenow 酶 或 T4 DNA 聚合 酶 将 其 末 端 补 平 。 在 IPCR 的 特殊 用 途中 ， 我 们 曾 成 功 地 用 Psz 工 回收 大 肠 杆菌 的 插入 片段 IS1 的 侧 FS"), FA Cla KM Tag I 回 收 插入 片段 IS30 HMB, A EcoRV 可 以 回收 最 常用 的 YAC 克隆 载体 内 紧邻 着 丝 粒 的 插入 连接 区 ， 用 Hine I TUE 紧邻 端 粒 的 插入 连接 区 [2] 。 当 核 心 序列 内 具有 方便 的 4 个 碱 基 的 限制 酶 切割 位 点 时 ， 大 多 数 实 验 室 通 常 的 经 验 是 在 不 预先 进行 Southern 印迹 L10] 的 情况 下 IPCR 约 有 一 半 的 成 功 可 能 性 。 这 一 成 功率 可 能 是 由 于 这 样 一 个 事实 : 4 个 碱 基 的 限制 酶 切 位 点 是 非常 常见 的 〈 从 理 论 上 讲 ， 约 256 对 碱 基 中 即 可 能 存在 一 个 由 4 个 碱 基 组 成 的 酶 切 位 点 )， 因 而 靶 序 列 上 亦 可 能 存在 一 个 这 样 的 酶 切 位 点 ， 且 与 核心 片段 的 距离 不 远 亦 不 近 ， 正 好 合 . 适 。 如 果 第 一 次 实验 失败 ， 那 么 后 续 的 试验 须要 根据 Southern 印迹 的 初步 资料 来 选 出 合适 的 限制 酶 (或 一 对 酶 ) 。 须 再 次 强调 的 是 ，IPCR 的 成 功 取决 于 起 始 样品 的 复杂 程度 ， 基 因 组 越 简单 结果 越 可 靠 。 这 一 方法 在 处 理 克 隆 的 DNA 及 大 肠 杆 菌 、 线 虫 、 果 蝇 这 些 分 析 对 象 时 表现 良好 。 复 杂 的 基因 组 会 增加 非特 异性 PCR 产物 ， 并 降低 环 化 反应 效率 。 通 过 富 集合 适 大 小 的 DNA 片段 ， 可 以 促进 从 较为 复杂 的 基因 组 中 回收 侧翼 序列 。 例 如 可 用 玻璃 粉 、 电 洗 脱 或 者 DEAE 膜 从 琼脂 糖 凝 胺 上 回收 所 需 大 小 的 限制 酶 切片 段 〈 由 初步 的 Southern 印迹 确定 )。 为 了 用 几 种 浓度 的 DNA 进行 环 化 及 PCR， 大 约 需 总 量 为 1 ng 的 酶 切 DNA. 将 酶 消化 的 样品 热处理 (于 68C 、10 min) 以 灭 活 限 制 酶 ， 样 品 可 以 稀释 并 进行 连接 反应 而 不 需要 中 间 的 纯化 步骤 (步骤 2 一 5)。 一 些 报道 认为 当 用 线 状 分 子 而 不 是 用 环 状 分 子 时 IPCR 的 效率 可 以 得 到 改善 包 。 此 时 ， 可 于 核心 序列 的 单一 酶 切 位 点 进行 酶 切 使 环 状 片 段 线性 化 。 不 过 为 寻找 合 庆 的 限制 酶 一 方面 增加 了 工作 量 ， 另 一 方面 可 带 来 潜在 的 复杂 因素 。 220 “ (10) 如 果 扩 增产 物 预期 长 于 3 kb， 则 变性 时 间 应 相应 地 增加 到 60 s, ERAT SY Hn Bl 150 So (11) 不 宜 使 用 PCR 引物 作为 探 针 , 因为 这 种 探 针 能 与 由 它们 延伸 的 所 有 PCR 产物 杂交 。 (12) IPCR 相关 技术 : 在 IPCR 相关 技术 中 ， 可 以 考虑 从 基因 组 DNA 回收 侧翼 序列 的 有 如 下 几 种 。 详 细 的 实验 方法 可 参见 原始 文献 ，Ochman 等 发 表 的 论文 中 尚 有 关 于 这 些 方法 的 总 体 讨 论 07]。 a. 由 连接 所 介 导 的 PCR 中 应 用 双 链 区 段 ， 其 中 包括 一 个 24-mer 和 一 个 与 24-mer 的 3“ 端 互补 的 11-mer 守 核 苷 酸 链 ， 该 区 段 的 平 末端 连接 在 由 复 性 到 核心 序列 的 守 核 苷 酸 作为 引物 延伸 得 来 的 DNA 片段 上 。 实 验 细节 可 在 文献 18 一 20 PH 到 。 . 小 载体 (或 称 “ 气 泡 ”) PCR 曾 被 用 来 回收 YACs Ay eA TA A Bie 区 避 1。 用 酶 切 位 点 处 于 核心 序列 中 方便 位 置 的 限制 酶 处 理 从 含有 YAC 的 酵母 细胞 得 来 的 DNA。 把 一 个 包含 非 互补 碱 基 的 “气泡 ”区 的 双 链 守 核 苷 酸 区 段 (小 载体 ) 连接 到 靶 序 列 的 末端 。 从 专 一 于 YAC 载体 的 引物 开始 ， 利 用 一 个 复 性 于 新 合成 链 区 域 的 窒 核 苷 酸 作为 引物 进行 反方 向 的 聚合 ， 通 过 扩 增 合成 一 条 新 的 、 与 “气泡 ”中 一 个 不 配对 的 环 相 互补 的 链 。 . BRKT SH PCR 中 用 一 个 连接 在 经 合适 的 限制 酶 切割 后 的 靶 序 列 上 的 WHE 28-mert22]。 通 过 与 核心 序列 互补 的 生物 素 标 记 的 引物 延伸 ， 经 过 大 约 50 个 循环 的 扩 增 取得 生物 素 标记 的 扩 增 产物 ， 使 它 和 链 霉 素 抗 生物 素 蛋 白 所 包 被 的 玻璃 珠 相 结合 。 这 样 分 离 得 来 的 产物 再 用 一 个 处 于 核心 序列 中 的 梨 式 引物 和 一 个 反 向 引物 作 常 规 PCR。 致谢 这 一 工作 得 到 D. L. Hartl 所 获得 的 NIH 资助 项 目 GM40322 和 HG00357 以 及 H. Ochman 所 获得 的 NIH 资助 项 目 GM40995 的 支持 。 — N Ww = 45 X 献 . Saiki, R. K., Scharf, S. J., Faloona, F., Mullis. K. B.. Horn, G. T.. Erlich. H. A., et al. (1985) Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354. . Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R. G., Horn, G. T., et al. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491. . Burke, D. T., Carle, G. F., and Olson, M. V. (1987) Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science 236, 806-812. Hieter, P., Connelly, C., Shero, J., McCormick, M. K., Antonarakis, S., Pavav, W., et al. (1990) Yeast artificial chromosomes: promises kept and pending, in Genetic and Physical Mapping, vol. 1 (Davies, K. E. and Tilghman, S. M., eds.), Cold ~ Za: Nw nN 13: 14. 2 2 -一 nN tN Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 83—120. . Sternberg, N. (1990) Bacteriophage P1 cloning system for the isolation, amplification, and recovery of DNA fragments as large as 100 kilobase pairs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 103—107. Pierce, J. C. and Sternberg, N. L. (1993) Using the bacteriophage P1 system to clone high molecular weight (HMW) genomic DNA. Meth. Enzymol. (in press). . Ochman, H., Gerber, A. S., and Hartl, D. L. (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120, 621-623. . Triglia, T., Peterson, M. G., and Kemp, D. J. (1988) A procedure for in vitro ampli- fication of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16, 8186. Silver, J. and Keerikatte, V. (1989) Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 63, 1924-1928. . Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-517. . Garza, D., Ajioka, J. W., Carulli, J. P., Jones, R. W., Johnson, D. H., and Hartl, D. L. (1989) Physical mapping of complex genomes. Nature 340, 577,578. . Ochman, H., Medhora, M. M., Garza, D., and Hartl, D. L. (1990) Amplification of flanking sequences by IPCR, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, ML Gelfand, D., Sninsky, J., and White, T., eds.), Academic, New York, pp. 219-227. Silverman, G. A., Ye, R.,D., Pollack, K. M., Sadler, J. E., and Korsmeyer, S. J. (1989) Use of yeast artificial chromosome clones for mapping and walking within human chromosome segment 18q21.3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7485—7489. Silverman, G. A., Jockel, J. I., Domer, P. H., Mohr, R. M., Taillon-Miller, P., and Korsmeyer, S. J. (1991) Yeast artificial chromosome cloning of a two-megabase- size contig within chromosomal band 18q21 establishes physical linkage between BCL2 and plasminogen activator inhibitor type-2. Genomics 9, 219-228. . Huang, S., Hu, Y., Wu, C., and Holcenberg, J. (1990) A simple method for direct cloning cDNA sequence that flanks a region of known sequence from total RAN by applying the inverse polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18, 1922. . Breukel, C., Wijnen, J., Tops, C., Klift, H. V., Dauwerse, H., and Meera Khan, P. (1990) Vector-Alu PCR: a rapid step in mapping cosmids and YACs. Nucleic Acids Res. 18, 3097. . Ochman, H., Ayala, F. J., and Hartl, D. L. (1993) Use of the polymerase chain reaction to amplify segments outside the boundaries of known sequences. Meth. Enzymol. 218, 309-321. . Pfeifer, G. P., Steigerwald, S. D., Mueller, P. R., Wold, B., and Riggs, A. D. (1989) Genomic sequencing and methylation analysis by ligation mediated PCR. Science 246, 810-813. - Mueller, P. R. and Wold, B. (1989) In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science 246, 780-786. . Fors, L., Saavedra, R. A., and Hood, L. (1990) Cloning of the shark Po promoter using a genomic walking technique based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18, 2793-2799. . Riley, J., Butler, R., Ogilvie, D., Finniear, R., Jenner, D., Powell, S., etal. (1990) A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucleic Acids Res. 18, 2887-2890. . Rosenthal, A. and Jones, D. S. C. (1990) Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18, 30953096. =. a Bo TNE AD FE IRA 引物 的 PCR £2 AN oe BE HE Bl A HK Gregory M. Preston Tl 1. 引 1.1 什么 是 基因 家 族 随 着 越 来 越 多 的 基因 被 克隆 和 测序 ， 显 然 可 见 几 乎 所 有 的 基因 之 间 都 彼此 相关 。 相 类 似 的 基因 组 成 基因 家 族 。 例 如 胶原 基因 家 族 、 珠 蛋白 基因 家 族 、 肌 球 蛋白 家 族 。 还 有 基因 超级 家 族 ， 它 们 由 高 度 同 源 和 高 度 不 同 源 的 区 域 组 成 。 例 如 瘤 基 因 超 级 家 族 、 同 源 异 形 基因 超级 家 族 以 及 近来 发 现 的 与 晶体 纤维 细胞 主要 内 源 和 蛋白 有 关 的 跨 膜 蛋白 超级 家 族 和 MIP 基因 超级 家 族 0。 在 多 数 例子 中 ， 基 因 家 族 内 不 同 的 成 员 行使 相关 的 功能 。 1.2 密码 子 选择 在 特定 的 生物 中 ， 某 些 氨基 酸 密码 子 具 有 “优势 "， 与 其 他 密码 子 相 比 ， 被 使 用 的 频率 较 高 刀 。 例 如 ， 参 与 组 成 丙 氨 酸 的 密码 子 有 四 种 ， 都 以 GC 开始 ， 这 一 密码 子 的 第 3 位 置 上 的 碱 基 G 在 人 类 (~10.3%) RR (~8.0%) 中 较 少 出 现 ， 而 在 大 肠 杆 菌 中 较为 多 见 〈 一 35% )。 这 些 密码 子 选择 的 特点 对 设计 简 并 守 核 苷 酸 引物 甚 为 有 用 。 1.3 用 PCR 克隆 基因 家 族 成 员 的 优点 与 常规 的 克隆 方法 相 比 ， 用 PCR 法 鉴别 基因 家 族 成 员 有 许多 优点 。 © 在 PCR 克隆 中 可 以 用 一 条 或 一 对 简 并 引物 。 由 于 保守 基因 的 序列 倾向 于 它们 的 末端 有 所 不 同 ， 因 此 两 条 简 并 引物 法 通常 只 能 提供 某 一 基因 的 一 个 内 部 片段 序 列 。 锚 式 PCR 只 使 用 一 条 简 并 引物 ， 可 用 于 获得 延伸 到 5 或 3 端的 序列 。 对 于 fax. PCR， 第 二 条 引物 的 位 点 必须 由 连接 反应 介 导 ， 使 其 序列 或 是 进入 克隆 载 体内 (图 36.1， 第 2 步 ) 或 是 进入 合成 的 接头 序列 内 (如 RACE-PCR 中 的 polyG 尾 )。 可 是 这 一 方法 可 能 导致 非特 异性 扩 增 物 高 本 底 ， 由 于 第 二 条 引物 存 在 于 所 有 作为 原始 材料 的 基因 中 ， 当 所 处 理 的 原始 材料 中 的 基因 为 数 较 少 时 ， 这 更 成 问题 。 通 过 运用 虽 式 扩 增 方法 对 目的 序列 进行 优先 扩 增 ， 这 种 缺点 常常 可 以 部 分 获得 解决 。 在 梨 式 PCR 中 ， 用 第 二 条 引物 对 初次 PCR 扩 增 产物 再 次 扩 增 ， 这 里 第 二 条 引物 与 初次 引物 的 内 部 序列 复 性 。 @ 对 从 少量 mRNA 反 转 录 得 来 的 cDNA 第 一 链 实施 PCR 反应 是 可 能 的 ， 而 且 从 理 “2 CHIP 蛋 白 的 N 端 序列 (M ASEFKKKLFWRAVVAEFLATTLFVFISIGSALGFK wf | 第 ! 步 入 gt11L_ «Sw a 22 oot pe 图 36.1 CHIP28 基因 的 5 Se ARI AY EE EME SE. TT CHIP28 蛋白 的 N 端 氨基 酸 序列 8]， 这 里 增加 了 一 个 从 pPCR - 2 的 $“- 克 隆 推导 得 来 的 甲 硫 毛 酸 (M). BH RREBRRSID, AWAKE 3, ~ Ra SMEAR, AAR ABADI, AR 1， 测 定 在 一 对 简 并 引物 A 和 了 B 之 间 的 19 bp 序列 ， 并 用 以 设计 非 简 并 引物 C. HR 2, 用 引物 B、C 与 Xgtll -L 进行 筑 梨 式 PCR。 所 得 到 的 110 bp 扩 增 产物 包括 与 氨基 端 22 个 氨基 酸 对 应 的 序列 、 起 始 密码 子 甲 硫 氨 酸 及 5 端的 38 bp 的 不 翻译 序列 。 论 上 讲 ， 甚 至 是 来 源 于 单个 细胞 的 mRNA。 几 个 来 源 于 不 同 激素 作用 下 或 不 同 分 化 阶段 中 的 多 种 组 织 或 培养 细胞 的 单 链 “ 微 型 文库 ”可 被 快速 制备 并 进行 PCR 分 析 。 因 此 ， 某 些 罕见 基因 家 族 成 员 或 mRNA 剪 切 变异 体 的 定时 表达 ， 都 可 通过 PCR 克隆 的 研究 获得 ， 而 这 些 资料 在 重组 文库 中 难以 取得 。 @ 与 常规 的 方法 相 比 , PCR 克隆 更 快速 而 廉价 , 在 某 些 情况 下 , 还 可 能 是 惟一 可 行 的 办 法 。 从 和 Xgtl0 文 库 筛 选 300 000 个 叭 菌 斑 通常 要 花 至 少 4 天 时 间 , 而 用 PCR 对 一 个 含有 10 个 独立 的 重组 体 的 完整 文库 (一 5.4 ng DNA) 进 行 筛选 , 只 须要 进行 一 次 反应 。 不 过 ，PCR 克隆 时 因 经 常会 引入 突变 型 ， 因 此 在 用 PCR 法 获得 一 个 克隆 后 ， 建 议 从 文库 中 分 离 出 对 应 的 克隆 。 或 者 对 独立 的 两 个 或 多 个 PCR 克隆 进行 测序 ， 亦 可 达到 这 一 目的 。 1.4 简 并 寡 核 苷 酸 理论 由 于 遗传 密码 是 简 并 的 ， 针 对 特定 氨基 酸 序列 的 引物 也 应 该 是 简 并 的 才 有 可 能 编码 出 所 有 可 能 的 排列 。 这 样 ， 针 对 有 64 种 变化 的 某 一 段 六 个 氨基 酸 序列 的 一 个 引物 应 能 潜在 性 地 识别 64 种 不 同 的 寡 核 苷 酸 序列 ， 其 中 只 有 一 种 序列 存在 于 靶 基 因 中 。 如 果 在 PCR 反应 中 使 用 一 对 这 样 的 引物 ， 可 能 的 排列 数 达 到 .64 x 64 = 4096。 由 于 PCR 以 指数 级 方式 扩 增 产物 ， 通 过 使 用 高 度 简 并 的 引物 可 望 克 服 这 样 一 种 困难 , 即 只 有 一 小 部 分 引 物 能 识别 靶 基 因 。 另 一 个 问题 是 其 余 的 4095 种 可 能 排列 可 能 识别 其 他 基因 产物 , 从 而 产生 非特 异性 产物 的 本 底 。 这 种 情况 也 可 通过 选用 另 一 对 引物 或 用 “猜测 多 聚 体 " 作 为 引物 对 初级 扩 增 产物 进行 第 二 轮 梨 式 PCR 扩 增 而 得 以 避免 猜测 多 聚 体 是 根据 多 个 物种 和 组 织 中 某 些 最 常用 的 密码 子 设计 的 , 所 以 其 中 并 不 包含 氨基 酸 序列 所 有 的 可 能 排列 ， ， 224 ， ee 1.5 BREE 作者 采用 的 这 一 基因 克隆 策略 中 ， 先 用 两 条 简 并 引物 从 cDNA 文库 模板 克隆 一 段 靶 基因 序列 。 并 以 此 序列 设计 指向 cDNA 的 5 端 及 3 "端的 特异 性 引物 。 这 些 新 的 引物 与 能 和 文库 载体 内 部 序列 复 性 的 引物 联合 使 用 ， 用 来 进行 PCR PMMA PRAY Rn 序列 。 在 这 两 种 情况 中 ， 为 增加 产物 的 量 ， 用 原 引物 或 梨 式 引物 进行 第 二 轮 扩 增 。 如 图 36.1 所 示 CHIP28 基因 的 克隆 就 是 这 一 策略 的 例子 。 mm 材 料 1) 模板 : 热 变 性 的 cDNA 文库。 在 PCR 扩 增 前 DNA 于 99Y 中 热 变性 10 min。 作 者 发 现 取 自 叹 菌 体 粗 裂解 物 或 从 叭 菌 体 衣 壳 中 分 离 的 DNA 作为 模板 无 明显 差异 。 2) 双 蒸 水 经 0.2 p RABE (Millipore, Bedford, MA) 过 滤 ， 高 压 灭 菌 后 保存 。 3) 简 并 寡 核 苷 酸 引物 ， 20 pmolml， 溶 于 双 茹 水 。 所 选择 的 引物 与 氨基 酸 序列 对 应 (WL 3.1. 47). 36.1 简 并 核 苷 酸 表 字母 表 示 Adenosine Guanosine puRine (A or G) Keto (G or T) Strong (G or C) Not A (G, Cor T) Not G (A, Cor T) aNy (A, G, Cor T) Cytidine Thymidine pYrimidine (C or T) aMino (A or C) Weak (A or T) Not C (A, G, or T) Not T (A, Cor G) Inosine* a 尽管 Inosine 不 是 真正 意义 上 的 核 音 酸 ， 由 于 很 多 研究 者 已 应 用 含有 它 的 寡 核 苷 酸 引 物 来 克隆 基因 家 族 成 员 ， 因 MIE EINE IFT REF ae eds @ Aare ww APO > 4) 10X PCR 反应 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3 (25T BY), 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCh, 0.1% (w/v) FARE. F SOC 中 保温 以 溶解 明胶 ， 过 滤 除 Ho F-20CRF. 5) dNTP 贮存 液 : dATP. dCTP, dGTP, dTTP & 1.25 mmol/L 的 溶液 。 6) 热 稳定 DNA RAR: 作者 用 AmpliTaq DNA 3 4B (Perkin Elmer Cetus, Nor- «225 walk, CT), LA5 U/ml 溶液 供应 。 7) 矿物 油 。 8) Afi. 9) 7.5 mol/L MRR: WHREMRKP, 0.2 pT. BRABANT, AS 物 和 核 苷 酸 于 醋酸 铵 中 不 易 沉 省。 10) 100% 乙 醇 : -20 保存 。 11) 70% 乙 醇 : 室温 保存 。 12) 离心 透析 柱 ， 用 于 纯化 PCR 产物 非常 理想 。 许 多 厂家 都 有 供应 〈 如 Millipore K Centricon)。 作 者 更 喜欢 用 Millipore Ultrafree MC (kV AF (30 000 mol wt cut- off)， 因 它 便 于 台式 离心 机 上 离心 。 13) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4，1 mmol/L EDTA。 高 压 灭 菌 。 BPR Ne 3.1 SHFRBRARS Hit PHARM Rit ERERAHBKER., FRERTUE PR PaI—# 原则 : 1) 首先 写 出 氨基 酸 序列 ， 然 后 据 此 推断 其 核 苷 酸 序列 (或 互补 序列 用 于 设计 下 游 引 物 )， 这 里 应 考虑 到 所 有 可 能 的 排列 。 例 如 氨基 酸 序列 亮 氢 酸 (Leu) / 蜡 亮 氨 酸 (Ile) /甘氨酸 (Gly) / 谷 氨 酸 (Glu) 的 简 并 核 苷 酸 序列 为 S-YTN-ATH-GGN- GAR-3’ (参见 表 36.1)。 如 果 氢 基 酸 序列 较 长 ， 可 设计 两 条 甚至 更 多 的 简 并 引物 。 如 仅仅 设计 一 条 简 并 引物 ， 则 尽量 选用 那些 GC 含量 最 高 的 序列 ， 因 为 这 类 引物 的 复 性 条 件 更 为 严格 ， 例 如 更 高 的 复 性 温度 〈 参 见 注释 1)。 2) 在 推导 的 核 苷 酸 序列 中 计算 其 排列 的 数目 。 序 列 5 -YTN-ATHGGN-GAR-3“ 的 排列 ， BA: (2X4) x3x4x2=192 (种 )。 通 过 引入 猜测 多 聚 体 ， 其 简 并 性 会 有 所 降 低 。 如 果 这 一 引物 用 于 克隆 人 类 基因 ， 可 以 应 用 的 一 个 有 用 的 猜测 体 将 是 $-CTB- ATY-GGN-GAR-3“， 它 仅仅 含有 64 种 排列 2J。 引 物 的 3“ 端 必须 包括 氨基 酸 序列 所 有 可 能 的 排列 ， 因 Tag DNA 聚合 酶 无 法 对 3“ 端 错 配 的 引物 进行 延伸 。 3) 引物 的 简 并 性 还 可 用 次 黄 苷 替代 “不 能 猜测 ”的 核 苷 酸 以 求 进一步 减少 ， 因 为 这 一 种 合成 的 核 苷 能 与 所 有 4 种 天 然 碱 基 通 过 氢 键 配对 。 如 此 ， 上 述 序列 将 变 为 $- CTB-ATY-GGI-GAR-3’, (#4 12 种 排列 数目 。 不 过 ， 由 于 采用 次 黄 苷 将 降低 复 性 温度 ， 可 能 会 由 于 非特 异性 扩 增 而 导致 更 高 的 本 底 。 4) 引物 的 $ 端 应 尽 可 能 引入 限制 酶 切 位 点 以 利于 克隆 到 质粒 载体 中 去 。 如 果 每 一 条 引 物 都 添加 了 不 同 的 限制 酶 切 位 点 ，PCR 产物 就 可 直接 用 于 克隆 。 应 注意 到 并 非 所 有 的 限制 酶 都 能 识别 双 链 DNA 分 子 末 端的 同族 位 点 。 但 在 限制 酶 切 位 点 之 前 加 上 2 一 4 个 核 苷 酸 的 5 端 突出 可 避免 这 一 困难 (参见 注释 2)。 可 采用 的 最 佳 限制 酶 切 位 点 是 EcoRI, BamHI fl Xba TI[3]。 可 能 发 生 的 一 种 难以 预见 的 困难 是 当 所 加 的 限制 酶 切 位 点 同样 存在 于 扩 增 产物 内 部 ， 如 果 这 样 则 只 有 扩 增 产物 的 一 个 部 分 将 被 "220 ° 克隆 到 。 5) 最 后 的 考虑 是 引物 3 ` 端 最 后 一 个 核 苷 酸 的 类 别 。 引 物 的 3 端 核 苷 酸 最 好 选用 G 或 C， 而 不 是 N、I 或 T， 因 为 胸 苷 和 次 黄 音 都 不 能 特异 性 地 引导 任何 序列 。 由 于 乌 苷 与 胞 苷 间 具 有 三 个 氢 键 ， 比 A:T 碱 基 对 中 的 两 个 氢 键 更 为 牢固 ， 所 以 鸟 苷 和 胞 音 更 为 可 取 。 3.2 fiFRBRARS |W PCR 克隆 克隆 的 第 一 步 是 确定 位 于 简 并 引物 之 间 的 核 苷 酸 序列 (36.1, FR1). RAK 的 cDNA 可 用 作 这 些 反 应 的 模板 ， 但 作者 更 喜欢 用 cDNA 文库 (参见 注释 3)。 载 体 DNA 应 该 用 相同 的 引物 进行 的 扩 增 作为 阴性 对 照 。 1) 于 0.5 ml 微型 离心 管内 依次 加 入 已 经 高 压 灭 菌 的 双 薰 水 $58.5 pl, ABE DNA 5.0 由 ， 简 并 引物 各 5.0 wl, 10 pl 10 x PCR 反应 缓冲 液 ，16 pl dNTPs 贮存 液 ， 热 稳定 DNA 聚合 酶 0.5 wj。 如 果 须 同时 进行 几 个 反应 ， 可 由 下 列 成 分 配制 基本 溶液 ; WK. SIM. RRR. dNTPs 和 Tag DNA 聚合 酶 。 这 一 反应 混合 液 应 于 最 后 加 入 〈 人 参见 注释 4、5) 。 2) 短暂 涡 旋 振 功 每 一 样品 ， 于 微型 离心 机 中 离心 10 s。 3) A2~3 滴 矿 物 油 覆 盖 每 一 样品 。 4) 用 以 下 循环 参数 扩 增 : 步骤 1: 947 变性 60 s; 步骤 2: SOCK Ws (参见 注释 6); FR3: 720 延伸 60 s。 扩 增 24 个 循环 ， 接 着 步骤 4: 720, 4 min, SRS: 保持 于 107 。 5) 从 热 循环 仪 中 取出 反应 管 ， 加 入 200 由 氯 仿 。 在 微型 离心 机 上 离心 10 s， 使 水 层 与 油 - 氯 仿 层 分 离 。 6) 小 心地 将 水 相 转 移 到 另 一 干净 的 微型 离心 管 中 。 如 果 带 入 少量 的 油 - 氯 仿 层 ， 必 须 再 用 100 由 氯仿 抽 提 以 除去 油 -氯仿 层 。 7) 各 取 10 则 初次 反应 产物 ， 按 上 述 方法 和 循环 参数 设置 4 管 再 次 扩 增 。 全 部 样品 再 次 用 氯仿 抽 提 去 除 油 后 将 4 管 反 应 产物 一 起 倒 入 一 个 1.5 ml 微型 离心 管 中 。 8) 于 300 pl PCR 反应 产物 中 加 入 150 pl 7.5 mol/L BRR, BH RRBWIED. MM 1 ml 100% 乙 醇 以 沉淀 DNA. HERG S5~10s, MIR 15 min. 9) 用 微型 离心 机 在 4 中 以 12 000 g BL 10 min 以 沉淀 DNA. FEAR, AA 500 pl ”70% 乙 醇 淋 洗 沉 淀 。 短 暂 涡 旋 ，4Y 中 再 次 离心 5 s。 弃 乙醇 ， 于 室温 中 将 离心 管 敞 开 倒置 以 凉 二 沉淀。 或 置 于 Speed-Vac 中 2 一 10 min LAF RYE. FA 100 pl 双 蒸 水 Hi DNA. 扩 增 的 DNA 可 直接 用 于 测序 或 克隆 。 如 果 简 并 引物 引入 了 新 的 限制 酶 切 位 点 ， DNA 应 经 酶 切 并 凝 胶 纯 化 ， 然 后 克隆 入 合适 的 质粒 载体 。 或 者 DNA 用 T 工 -载体 方法 (参见 第 三 十 七 章 ) 进行 平 末端 克隆 。 如 果 扩 增产 物 > 400 bp， 可 用 琼脂 糖 凝 胶 纯化 (参见 第 二 十 八 章 )， 如 果 <400 bp， 则 应 用 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 纯 化 〈 人 参见 第 十 三 章 )。 ‘ oie * 3.3 应 用 锚 式 PCR 克隆 cDNA 5 端 或 3 Sita 最 初 的 简 并 PCR 方案 只 能 分 离 保守 基因 内 的 一 段 序列 。 锚 式 PCR 可 用 于 获得 这 一 基因 的 其 余 的 5" 端 和 3“ 端 区 域 。 载 体 DNA 仍 应 用 相同 的 引物 进行 PCR 扩 增 作为 阴性 对 1) 依次 于 若干 0.5 ml 微型 离心 管 中 加 入 以 下 成 分 : WRK 〈 已 高 压 灭 菌 ) 53.5 由 ， 热 变性 文库 DNA 10 pl, ABS 5.0 局 ， 与 载体 同 源 的 引物 5.0 nl，10X PCR 反应 组 冲 液 10 pl, dNTP 贮存 液 16 pl, Tag DNA 聚合 酶 0.5 yl. 2) 短暂 涡 旋 振 划 每 一 样品 ， 在 微型 离心 机 中 离心 10 s。 3) 加 入 2~3 滴 矿 物 油 覆 盖 样 品 。 4) 用 以 下 循环 参数 扩 增 : 步骤 1: 94C 变性 60 s; 步骤 2: SACRE 60 s〈 人 参见 注释 6); 步骤 3: 72°C 延伸 60 s。 扩 增 31 个 循环 ， 接 着 步骤 4: 72C，4 min， 步 又 5: 保持 于 10T. 5) 从 热 循环 仪 中 取出 反应 管 ， 加 入 200 由 氯 仿 。 在 微型 离心 机 上 离心 10 s 使 水 层 与 油 - 氯仿 层 分 离 。 6) 小 心 将 水 相 转移 到 另 一 干净 的 微型 离心 管 中 。 如 果 带 入 少量 的 油 -氯仿 层 ， 必 须 再 用 100 pl ATHEW RAW ARE. 7) 用 离心 透析 柱 离心 去 除 DNA 扩 增 产物 中 剩余 的 核 苷 酸 及 引物 (SER 6 和 7)。 DNA 仍 滞 留 在 膜 上 ， 而 核 苷 酸 及 引物 则 滤 过 。 加 400 ll TE 淋 洗 样品 ， 并 再 次 离心 使 其 浓缩 。 再 淋 洗 一 次 。 于 样品 中 加 入 TE 使 终 体 积 为 50 ul, BRR BAT 灭 菌 管 中 。 8) 取 5 几 PCR 产物 用 原来 的 引物 再 次 扩 增 。 或 者 如 可 能 则 用 第 二 条 引物 替代 原来 的 一 条 引物 。 按 3.2. 节 第 8、9 步 的 方法 纯化 产物 。 4. 注 AE (1) 进行 PCR 克隆 时 ， 一 个 关键 性 的 参数 是 引物 复 性 温度 的 选择 ， 当 使 用 简 并 引物 时 尤其 如 此 。 引 物 的 复 性 温度 (T,,) 按 下 法 计算 : 每 一 个 A: 工 碱 基 对 加 2C ， 每 一 A G:C AEM 3C ， 每 一 个 N:N 碱 基 对 加 2C ， 每 一 个 IN 碱 基 对 加 1C 。 多 数 文献 建议 你 计算 Tu 值 ， 然 后 把 复 性 温度 设 定 在 比 最 低 的 Tu 值 再 低 5 一 10C 。 按 这 一 规则 纹 ) 曾 克隆 到 关系 下 远 的 超级 基因 家 族 中 的 成 员 。 不 过 ， 作 者 发 现 较 高 的 复 性 温度 有 利于 减少 非特 异性 复 性 ， 这 对 含有 简 并 引物 的 反应 会 产生 显著 影响 。 (2) 在 设计 带 有 限制 酶 切 位 点 和 5 端 突出 的 引物 时 ， 应 注意 到 5“ 端 突出 不 可 含有 与 限制 酶 切 位 点 3 端 相 紧 接 部 位 互补 的 序列 ， 因 为 这 将 导致 引物 二 聚 体 的 形成 。 考 虑 这 样 一 个 引物 : $ -ggg. aagett. CCCAGCTAGCTAGCT-3’, 4 5’-ggg 和 CCC-3' 间 有 一 Hind WAU. Soni 12 个 核 苷 酸 形成 的 回 文 序列 极 易 与 另 一 相同 的 引物 形 成 二 聚 体 。5 端 突 出 较 好 的 选择 应 是 $'-cac。 用 文库 DNA 作为 模板 有 一 个 可 能 发 生 的 问题 是 某 些 序列 并 未 与 主要 的 序列 一 起 被 5 (3 克隆 ， 因 而 被 低估 。 如 初次 克隆 失败 ， 或 者 须 尝 试 不 同 的 文库 ， 或 者 直接 从 未 经 克 隆 的 cDNA 进行 扩 增 。 (4) 非 离子 去 污 剂 如 Nonident P-40 能 用 于 PCR 分 析 样 品 的 制备 而 不 明显 地 影响 Tag 酶 的 活性 6]。 在 某 些 情况 下 ， 这 些 去 污 剂 则 是 绝对 需要 的 ， 因 为 只 有 用 这 些 去 污 剂 才 能 可 重复 地 检测 由 模板 的 链 内 或 链 间 二 级 结构 导致 的 专 一 性 PCR 产物 [61。 四 甲 基 氯 化 铵 能 减少 引物 非 专 一 性 复 性 ， 从 而 提高 PCR 反应 的 特异 性 [7 。 (5) 所 有 PCR 反应 的 加 样 过 程 应 于 超 净 台 内 进行 ， 并 使 用 正 向 置换 移 液 器 或 带 滤 膜 的 吸 嘴 以 防止 DNA 对 样品 、 引 物 、dNTP、 反 应 缓冲 液 的 污染 。 同 样 地 ， 用 于 PCR 的 所 有 样品 、 引 物 、dNTP、 反 应 缓冲 液 制备 和 分 装 时 均 应 采用 相同 的 预防 措施 。 (6) 在 进行 梨 式 PCR 扩 增 之 前 ， 去 除 前 次 PCR 反应 的 引物 是 必要 的 ， 但 如 果 使 用 同一 引物 则 无 此 必要 。 (7) 如 PCR 产物 >500 bp (参见 第 二 十 八 章 ) 可 用 玻璃 珠 纯化 。 由 于 玻璃 珠 对 < 500 bp 的 产物 极 少 结合 ， 故 可 有 效 地 去 除 PCR 产物 的 小 分 子 污 染 物 。 臻 谢 感谢 同事 们 给 予 的 支持 及 参与 有 益 的 讨论 ， 尤 其 要 感谢 Eric Fearon 在 技术 上 提供 的 帮助 。 同 时 感谢 Peter Agre 无 私 的 支持 ， 是 他 同意 详细 发 表 这 些 方案 。 此 工作 部 分 受 NIH #4 (项 目 HL33991) 给 予 Peter Agre 的 资助 所 支持 。 参考 文 献 — . Pao, G. M., Wu, L.-F., Johnson, K. D., Héfte, H., Chrispeels, M. J., Sweet, G., Sandal, N. N., and Saier, M. H., Jr. (1991) Evolution of the MIP family of integral membrane transport proteins. Mol. Microbiol. 5, 33-37. 2. Wada, K.-N., Aota, S.-I., Tsuchiya, R., Ishibashi, F., Gojobori, T., and Ikemura, T. (1990) Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data. Nucleic Acids Res. 18, 2367-2411. . Appendix of any New England Biolab enzyme catalog. 4. Zhao, Z.-Y. and Joho, R. H. (1990) Isolation of distantly related members in a multigene family using the polymerase chain reaction technique. Biochem. Biophys. Res. Comm. 167, 174-182. 5. Weyant, R. S., Edmonds, P., and Swaminathan, B. (1990) Effects of ionic and nonionic detergents on the Taq polymerase. BioTechnology 9, 308,309. 6. Bookstein, R., Lai, C.-C., To, H., and Lee, W.-H. (1990) PCR-based detection of a polymorphic Bam HI site in intron 1 of the human retinoblastoma (RB) gene. Nucleic Acids Res. 18, 1666. . Hung, T., Mak, K., and Fong, K. (1990) A specificity enhancer for polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18, 4953. . Preston, G. M. and Agre, P. (1991) Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11,110—11,114. Ww ~— Oo + 229 4k ”应 用 工 -载体 克隆 PCR 产物 Michael K. Trower, Greg S. Elgar ul 1. 引 PCR 因 能 扩 增 特异 性 DNA 序列 Q-3]， 使 分 子 生物 学 家 操纵 核酸 的 方法 发 生 了 巨大 的 变革 。 它 的 应 用 十 分 广阔 [0]， 许 多 应 用 须 将 扩 增 得 来 的 DNA 产物 克隆 入 载体 后 作 进 一 步 的 分 析 。 这 通常 可 通过 所 谓 “ 黏 端 ”克隆 来 实现 ， 在 这 一 方法 中 于 PCR 引物 的 S’ 端 引 入 限制 酶 识别 位 点 65]。 扩 增 反应 后 纯化 DNA 片段 ， 用 合适 的 限制 酶 消化 并 与 相同 的 限制 酶 酶 切 后 的 载体 相连 接 。 在 线 状 PCR 产物 的 末端 获得 有 效 的 酶 切 较 为 困难 [61， 而 且 会 导致 存在 于 扩 增 片段 内 部 的 限制 酶 切 位 点 被 切 。 这 种 方法 的 一 个 独特 的 优点 是 通 过 设计 的 酶 切 位 点 ，PCR 产物 可 被 强行 克隆 ， 例 如 一 个 作为 前 导 信号 序列 的 DNA 片段 可 以 与 结构 基因 融合 成 同步 结构 ， 用 于 基因 表达 的 研究 。 如 果 不 需 要 准确 的 同步 性 ， 平 末端 克隆 是 克隆 PCR 产物 的 另 一 种 选择 。 这 一 方法 由 于 Taq DNA 聚合 酶 具有 内 在 的 末端 转移 酶 活性 而 变 得 复杂 化 ， 它 倾向 于 在 PCR 产 物 的 3 端 加 上 不 依赖 于 模板 的 单个 脱氧 腺 苷 酸 残 基 (A)b71。 这 一 PCR 产物 经 纯化 后 ， AA 3 一 5 外 切 核 酸 酶 校对 活性 的 DNA 聚合 酶 (如 Klenow 或 T4 DNA RABE) TF 用 以 形成 平 末端 ， 然 后 才能 与 平 末端 载体 相连 [81。 但 不 幸 的 是 ， 尽 管 可 采用 蓝 / 白 B- 半 乳糖 苷 酶 颜色 选择 ， 在 筛选 时 常常 发 现 大 多 数 的 质粒 并 不 含有 插入 片段 。 近年 来 报道 的 另 一 些 克 隆 PCR 产物 的 方法 中 利用 Tag DNA 聚合 酶 的 末端 转移 酶 活性 [9%,101]。 这 些 方法 可 使 效率 提高 到 平 末端 克隆 法 的 50 倍 以 上 。 这 些 方法 有 赖 于 某 些 克隆 载体 (T -载体 ) 的 构建 ， 当 这 种 载体 线性 化 后 ， 它 每 条 臂 的 3" 端 均 带 有 一 脱氧 胸 苷 (T)。 这 就 使 它 能 与 经 Taq DNA 聚合 酶 作用 后 末端 带 有 脱氧 腺 苷 的 PCR 产物 直接 进行 黏 端 连接 ， 而 无 须 对 PCR 产物 进行 进一步 的 酶 学 处 理 。 在 Smith 等 [的 方法 中 通过 核酸 内 切 酶 消化 特殊 的 质粒 以 产生 载体 的 延伸 部 位 。 Marchuk 等 40] 描 述 的 方法 则 利用 Taq DNA 聚合 酶 的 末端 转移 酶 活性 ， 于 酶 切 后 的 载体 平 末端 加 上 脱氧 胸 苷 残 基 (T) 而 制 得 (如 图 37.1)。 后 者 有 两 大 优点 : 首先 ， 可 从 许 多 分 子 生物 学 实验 室 中 常用 的 克隆 载体 制备 T -载体 ， 第 二 ， 因 载体 的 自身 连接 率 低 ， 故 产 生 的 本 底 亦 低 。 下 面 详细 介绍 这 一 方法 ， 包 括 引 物 的 设计 ，PCR 反应 的 进行 ， PCR 产物 的 分 离 ，T -载体 的 构建 以 及 如 何 利 用 工 -载体 来 克隆 PCR 产物 。 2. 材 料 所 有 试剂 均 用 灭 菌 蒸 馏 水 制备 ， 除 特殊 声明 外 均 贮 存 于 室温 。 0 ee a eee - 2.1 PCR 反应 及 产物 分 离 1) PCR 引物 : MRAMRNHREARS|DWEREDA 10 mmol/L (参见 注释 1)，- 207C 保 存 。 引 物 设 计 是 PCR 反应 成 功 的 关键 (参见 注释 2 和 3)。 2) 10 x PCR 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3 (2SYC )，500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCh, 0.1% (w/v) 明胶 。 于 S50C 中 待 明 胶 充 分 溶解 后 过 滤 除 菌 ， 于 —20C 保存 。 dNTP 混合 物 : 溶 于 蒸 饮水， 每 一 种 dNTP 的 浓度 为 2 mmol/L. dNTP 母液 可 从 公 司 购 得 ， 如 Pharmacia (Piscataway, NJ). Boehringer (Indianapolis，IN)。 我 们 发 现 ”这 些 产品 既 方 便 又 可 靠 。- 20Y 保存 。 4) 矿物 油 。 5) Taq DNA 聚合 酶 : 5 U/pl, —20CRF. 6) PCR 终止 混合 物 : 25% Ficoll 400, 100 mmol/L EDTA, 0.1% (w/v) RM BK. 7) 琼脂 糖 凝 胶 : 在 TAE (50 X TAE: 242 g Tris 碱 , 57.1 ml YK BEAR, 100 ml 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0) 或 TBE (10x TBE: 121g Tris, 55 g HMR, 7.4 g/LEDTA) 中 熔 化 电泳 级 的 琼脂 糖 ， 绥 慢 煮 沸 〈 可 用 微波 炉 )。 冷 却 至 手 握 不 汤 时 倒 入 胶 模 。 在 100V 左右 跑 小 型 凝 胶 ， 用 终止 缓冲 液 中 的 染料 作为 迁移 示 踪 剂 〈 参 见 注释 4)。 8) 酚 : 超 纯度 的 酚 在 TE FFE SBA. ACRE. 9) Afi: 按 29:1 与 异 戊 醇 混合 。 3 A EcoRV F* 用 Tae 端的 消化 | 和 引物 对 进行 PCR 扩 增 Taq 聚合 酶 末 端 转移 酶 活性 SS 了 fi2it Diced een Comatiioer 记载 体 PR 产物 连接 与 转化 A 含有 插入 片段 的 重组 质粒 T 图 37.1 用 T- 载 体 克 隆 PCR 产物 的 示意 图 。 了 2.2 T- 载 体制 备 、 连 接 及 转化 10) 载体 DNA: 合适 的 载体 如 pBluescript I (Stratagene, La Jolla，CA) 少量 制备 的 DNALI]。- 207 保存 。 11) 限制 酶 ,如 EcoRV，SmaI， 或 其 他 平 末 端 切割 酶 。- 207 保存 。 12) dTTP: 100 mmolyL 贮存 液 。 分 小 份 保存 于 -207 。 13) 10X PCR 缓冲 液 : 0.5 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6，100 mmol/L MgCh, 500 pg/ml 牛 血 清白 蛋白 (BSA). —20CRF. 14) DTT: 100 mmol/L 的 二 硫 苏 糖 醇 贮存 液 。 分 小 份 保 存 于 -20Y 。 15) ATP: 用 于 连接 反应 ，10 mmoyL 的 贮存 液 。 分 小 份 保存 于 -207 。 16) T4 DNA 连接 酶 : T4 DNA 连接 酶 可 从 多 家 供应 商 处 购 得 。 其 活性 常 以 Weiss 单位 ( 焦 磷 酸 置换 反应 ) 或 环 化 形成 单位 或 以 生产 厂家 自己 的 单位 〈 例 如 ，AV/Ezzd 酶 切片 段 连接 反应 ) 表示 。 所 以 尽管 通常 用 0.5 岂 已 足够 ， 最 好 按照 产品 说 明 书 选择 连接 酶 的 用 量 。 保 存 于 -20?7 。 By 法 3.1 PCR 反应 及 产物 分 离 设置 一 套 能 确保 对 靶 DNA 序列 进行 特异 性 扩 增 的 PCR 反应 条 件 并 非 易 事 。 以 下 所 提供 的 基本 方案 ， 在 大 多 数 情况 下 我 们 已 证 明 是 行 之 有 效 的 ， 因 此 在 进行 任何 修改 之 前 ， 应 首先 经 过 试用 。 尽 管 如 此 ， 我 们 建议 对 PCR 不 熟悉 的 读者 参看 注释 5 一 8 及 第 三 十 五 章 。 虽然 可 取 部 分 PCR 反应 混合 物 直接 与 工 -载体 连接 ， 我 们 发 现 如 事先 对 DNA 产物 - 进行 纯化 ， 连 接 效率 将 会 提高 。 对 此 ， 有 许多 建议 ， 例 如 在 第 6、7 步 中 的 描述 。 1) 按 下 列 方法 配置 PCR 反应 混合 物 。 在 0.5 ml Eppendorf 管内 加 引物 各 5 wl, 10x PCR 缓冲 液 5 pl, dNTPIRAM 5 wl, DNA 模板 1 pl (BWMIER 9), AK 29 pl, 总 体积 为 $0 由。 在 反应 体系 上 覆盖 足 量 的 矿物 以 油 防 止 蒸发 。 2) Eppendorf 管 置 于 热 循 环 仪 上 95° 加 热 5 min。 加 Tag DNA 聚合 酶 0.3 vl, “AaB” 反应 。 3) 立即 开始 后 续 的 程序 扩 增 30 一 35 循环 (参见 注释 10): 变性 9SC 、30 s， 引 物 复 性 50 一 60C 、30 s， 引 物 延 伸 72C 、30 s~3 min. 4) 最 后 一 循环 后 于 72°C 额外 延伸 5 min 以 确保 引物 延伸 得 以 完成 而 生成 全 长 的 双 链 DNA。 5) 加 1 pl PCR 终止 混合 液 至 $ 由 PCR 产物 中 ， 于 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 以 检测 PCR 区 应 的 得 率 和 特异 性 。 预 期 的 PCR 产物 得 率 为 10 一 50 ng DNA/pl RAV. 6) 无 论 PCR 产生 单一 条 带 或 数 条 条 带 ， 全 部 都 可 能 是 正确 的 扩 增 产物 。 全 部 PCR 反应 混合 物 可 经 酚 / 氧 仿 抽 提 ， 乙 醇 沉 淀 ， 重 悬 于 10 pl TE 或 蒸馏 水 中 〈 参 见 注释 11)。 2 ° me 7) 若 同 时 出 现 不 想 要 的 条 带 ， 整 个 反应 应 于 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 用 干净 的 刀 切 割 回收 目的 条 带 。 切 割 条 带 时 最 好 用 发 射 长 波 的 紫外 线 (365 nm)， 这 样 对 DNA 的 损伤 较 小 。 有 多 种 方法 纯化 回收 凝 胶 内 的 DNA (参见 注释 11)。 3.2 T -载体 的 制备 、 连 接 、 转 化 T -载体 的 制备 包括 首先 用 限制 酶 消化 克隆 载体 产生 平 末端 ， 接 着 利用 Tag DNA 聚合 酶 的 内 在 末端 转移 酶 活性 使 经 切割 载体 加 上 T - 残 基 。 这 一 简单 的 操作 过 程 使 得 任 何 带 有 平 末端 酶 切 位 点 的 克隆 载体 经 相应 酶 切 (如 EcoRV. Smal) 消化 后 均 可 制备 T -#¢(&. pBluescript I 载 体系 列 (Stratagene) 能 很 好 地 满足 这 一 要 求 ， 因 其 多 接头 处 含 上 述 两 种 酶 切 位 点 。T -载体 可 成 批 制 备 ， 因 而 可 以 用 于 许多 反应 。 例 如 5 pe T -8K 体 DNA 足以 供给 100 次 克隆 实验 用 。 体外 扩 增 反应 后 ， 分 离 的 PCR 产物 可 应 用 与 黏 端 克 隆 相 同 的 反应 条 件 直 接 将 它 连 在 制备 好 的 T -载体 上 。 每 一 连接 反应 所 需 PCR 产物 的 最 适量 较 难 估计 ， 因 为 这 与 PCR 产物 的 得 率 、 复 杂 性 及 Taq DNA 聚合 酶 的 末端 转移 活性 对 DNA 产物 的 加 A 作用 效率 有 关 。 为 确保 PCR 产物 的 量 处 于 成 功 克 隆 所 需 量 的 范围 之 内 ， 我 们 常设 置 两 个 连 接 反 应 ， 其 中 之 一 用 1:10 稀释 的 纯化 DNA。 1) 用 限制 酶 消化 S ng 载体 DNA， 使 其 产生 独特 的 平 末 端 位 点 。 例 如 用 EcoRV、 Smal, ¥ 37CiHHh2h (参见 注释 12)。 2) 酶 切 产物 于 1% 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 。 于 紫外 灯 下 切 下 含 线性 载体 DNA A BE 胶 ， 酚 /氯仿 抽 提 ， 乙 醇 沉 淀 〈 人 参见 注释 11、13)。 在 0.5ml Eppendorf 管 中 用 20 ul 水 重 悬 产物 。 3) 加 10x PCR 缓冲 液 wl, 100 mmol/L dTTP 1 pl, @iBK 24 wl, Taq DNA RAB 0.4 pl, Biz 40 pl ASAT, 72°C 保温 2 h。 为 方便 起 见 可 用 热 循 环 仪 。 4) 用 酚 / 氯 仿 抽 提 ， 乙 醇 沉 淀 以 纯化 工 - 载 体 。 最 后 ， 重 溶 于 100 pl TE MAK, i FEA 50 ng/nl。 5) 于 3 个 管内 分 别 加 入 : 1.0 以 PCR 产物 、1.0 pl 1:10 稀释 的 PCR 产物 、1.0 pl iB 水 〈 作 为 对 照 以 了 解 载体 自身 连接 产生 的 本 底 )。 每 管 加 入 下 列 成 分 : 制备 的 工 - 载 体 1.0 wl，10x 连 接 缓冲 液 1.0 pl, DTT 1.0 pl, ATP 1.0 pl, BiB 4.5 pl, T4 DNA 324288 0.5 pl. F 16C 保温 过 夜 。 6) 5.0 岂 每 一 连接 产物 转化 合适 的 感受 态 大 肠 杆 菌 〈 人 参见 注释 14) 。 一 般 转 化 后 可 分 离 得 到 数 百 个 菌落 〈 参 见 注释 15 一 17)。 如 果 采 用 蓝 / 白 克 隆 选 择 方法 ， 我 们 通常 发 现 它们 的 比例 约 为 50% 。 可 从 白色 菌落 ， 或 者 如 未 采用 非 重 组 体 的 鉴别 方法 ， 则 从 随机 的 菌落 中 筛选 插入 片段 。 图 37.2 显示 一 典型 的 PCR 克隆 实验 结 果 。 “55 * A tens cae a Rd Aen 图 37.2 (A) 用 一 对 简 并 引物 作 PCR 用 以 扩 增 复杂 生物 的 基因 组 DNA. JA PCR 反应 产物 的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 的 结果 中 可 以 看 到 一 系列 复杂 的 条 带 ， 其 中 一 个 主要 条 带 长 约 340 bp (B)。 因 驾 序 列 的 期 望 大 小 为 200 一 400 bp, PCR 产物 按 3.1 节 第 6 步 的 方法 纯化 ， 然 后 与 工 - 载体 pBluescript I SK (+) 相连 接 ， 并 转化 E. coli XL1-Blue 株 。 经 含 X-gal 及 IPTG HA HBA (100 ng/ml) 平 严 筛选 ， 在 获得 的 约 200 个 菌落 中 ， 蓝 / 白 菌 落 各 占 一 半 。19 个 白色 及 1 个 蓝 色 菌落 用 T3 及 T7 侧翼 通用 引物 通过 PCR 进一步 测定 克隆 片段 的 大 小 及 上 述 方法 的 效率 (参见 第 三 十 五 章 )。 扩 增产 物 于 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 鉴定 。 上 图 B 显示 : 19 个 白色 菌落 PCR 产物 约 为 500 bp。 因 载体 多 接头 片段 为 166 bp， 故 揪 入 片段 实际 长 度 约 为 340 bp, 这 一 结果 同时 亦 证 实 了 PCR 的 正确 克隆 。 (A) 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 。 泳 道 1 为 123bp 阶梯 相对 分 子 质量 标准 (Life Technologies), 泳 道 2 为 PCR 产物 。 (B) 19 个 白色 菌落 ( 泳 道 2 一 H 20) 和 1 个 蓝 色 对 应 菌落 ( 泳 道 21) 用 T3 A T7 通用 引物 的 PCR 筛选 结果 。 泳 道 1 和 22 都 是 123bp 阶梯 相对 分 子 质量 标准 。 Sti = « 的 4. 注 释 (1) 我 们 发 现 用 凝 胶 或 高 效 液 相 色谱 法 对 我 们 列 出 的 这 样 大 小 的 引物 进行 纯化 并 非 必 有 要。 我 们 常规 将 引物 沉淀 后 溶 于 200~500 pl RA AIBKRN TE 缓冲 液 中 。 它 们 的 浓度 可 用 分 光 光 度 计 测定 (1 ODzo = 20 wg 单 链 寡 核 苷 酸 )。 按 每 个 碱 基 的 平均 相对 分 子 质 量 为 325 计 估算 出 物质 的 量 , 并 将 每 份 引物 贮存 液 稀 释 到 10 umol/L 的 深度。 (2) 设置 PCR 反应 的 首要 步骤 是 选择 一 对 朝 核 昔 酸 引物 。 尽 管 尚 无 一 种 可 供 遵循 的 过 人 硬 、 快 速 的 引物 设计 规则 能 绝对 确保 扩 增 出 目的 DNA 片段 ， 设 计 引 物 时 如 果 参 昭 我 们 列 出 的 一 些 指南 ， 会 增加 成 功 扩 增 出 靶 DNA 序列 的 机 会 。 a. 通常 应 考虑 待 扩 增 片段 的 两 个 末端 序列 的 资料 (17 一 25 bp) (参见 注释 3)。 从 实践 意义 出 发 ， 扩 增 片段 不 宜 超过 3 一 4 kb (参见 注释 10)。 b. 从 复杂 的 基因 组 DNA 中 扩 增 靶 片 段 ， 我 们 发 现 20 一 ?4 个 碱 基 的 长 度 已 足够 使 儿 序 列 作 特 异性 的 扩 增 ; 对 于 比较 简单 的 DNA， 例 如 质粒 DNA， 引 物 长 度 可 减少 至 17 bp， 可 以 制备 更 长 的 引物 ， 但 是 这 一 则 浪费 ， 二 则 并 不 必需 。 c. 引物 ， 尤 其 3" 端 必须 与 靶 序 列 配对 良好 。 如 有 可 能 ， 使 每 条 引物 的 GVC 含量 保 持 在 大 约 50% ， 并 应 避免 同一 碱 基 连 续 重复 过 多 。 两 条 引物 长 度 应 相仿 。 d. 为 防止 形成 引物 二 聚 体 ， 两 条 引物 ， 尤其 3 端 不 能 有 明显 的 互补 性 。 和 否则 会 相 工 杂 交 形 成 非常 有 效 的 PCR 反应 底 物 而 扩 增 成 为 主要 的 产物 [3] ， - 234 ， e. 4 PCR 扩 增 是 为 了 克隆 一 已 知 的 基因 或 其 同 源 基因 ， 须 检索 EMBL/ 基 因 库 资 料 以 确保 引物 对 模板 DNA 的 特异 性 。 f. 牢记 引物 的 长 度 及 GVC 含量 决定 着 PCR 反应 的 最 适 复 性 温度 。 目 前 已 有 大 量 的 电脑 程序 可 供 选 择 ， 用 于 设计 针对 特异 性 靶 序 列 的 引物 。 用 PCR 方法 从 复杂 的 基因 组 克隆 一 段 序列 时 设计 引物 的 困难 之 一 在 于 靶 区 域 的 确 切 序列 往往 是 未 知 的 。 因 此 必须 根据 不 同 的 生物 中 已 报道 的 相同 基因 或 相 类 似 基 因 的 序列 资料 进行 推断 。 对 于 结构 基因 ， 其 已 知 的 DNA 序列 同 源 区 须 先 翻译 成 蛋 白质 ， 并 排列 成 队 。 计 算 机 的 许多 列队 程序 例如 CLUSTALH41 可 协助 进行 这 项 工 作 并 识别 出 保守 区 域 。 特 别 应 寻找 保守 区 内 带 有 低 简 并 性 的 氨基 酸 序列 ， 尤 其 是 那些 仅 具 一 个 密码 子 的 氨基 酸 ， 如 甲 硫 氨 酸 (Met), FAR (Trp); 以 及 两 个 密 码 子 编码 的 氨基 酸 ， 如 天 冬 酰 腕 (Gln)、 天 冬 氢 酸 (Asp)、 半 胱 氨 酸 (Cys), F FRG (Gln). @ARM (Glu), AAR (His)、 赖 氨 酸 (Lys)、 葵 两 氨 酸 (Phe), BRA (Tyr); 按照 这 些 氨基 酸 设计 的 引物 可 降低 它 的 简 并 性 。 尽 可 能 避免 选用 那些 具有 6 个 密码 子 编码 的 氨基 酸 (GERM Leu、 丝 氨 酸 Ser. FAR Arg) Kix 计 引 物 051。. 另 外 ， 在 设计 引物 时 尚 须 考 虑 所 研究 特定 生物 的 密码 子 选 择 ， 这 可 通 过 查 表 获得 。 最 后 ， 将 可 以 获得 的 最 为 保守 的 序列 资料 定位 于 引物 的 3" 端 。 (4) 当 制 备 琼 脂 糖 凝 胶 时 ， 若 用 试剂 盒 (如 GeneClean) 则 记 住 以 TAE 为 缓冲 液 更 方 便 。 对 于 科 100 bp 的 扩 增 片段 应 用 >2% 的 凝 胶 ， 对 于 300 一 400 bp 的 扩 增 片段 可 用 1.5% 的 凝 胶 ， 以 低 相 对 分 子 质量 的 相对 分 子 质量 标准 ， 如 123 bp 阶梯 (Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) 或 pPBR322/ Msp I BBUF EEA PCR 产物 的 电泳 标准 较为 可 取 。 (5) 为 提高 扩 增 反应 的 特异 性 ， 可 对 PCR 基本 反应 体系 作 许 多 调整 。 尽 管 考 虑 到 诸多 AIA, PCR 反应 的 非特 异性 扩 增 似乎 因 非 特异 性 引物 复 性 而 难以 杜绝 。 对 扩 增 产 物 得 率 及 复杂 性 产生 最 大 影响 的 参数 是 引物 的 复 性 温度 。 通 过 提高 复 性 温度 时 因 引物 的 结合 更 为 严格 ， 反 应 的 特异 性 将 会 提高 。 但 如 复 性 温度 过 高 ， 扩 增产 物 的 得 率 会 减少 ， 甚 至 扩 增 不 出 来 。 通 过 试验 不 同 的 复 性 温度 ， 往 往 可 以 选 出 某 对 特 定 引 物 的 最 适 PCR 条 件 。 在 0.5~5 mmol/L 的 终 浓 度 范围 内 改变 PCR 缓冲 液 中 Mg 浓度 也 可 能 改善 扩 增 特异 性 。 另 外 ， 在 5% ~10% (w/v) 范围 内 DMSO 也 可 提高 PCR 的 特异 性 。 如 上 述 尝试 均 告 失败 ， 则 用 另外 一 对 处 于 前 一 对 引物 内 侧 的 〈 巢 式 ) 引物 ， 对 上 述 扩 增 产物 进行 再 一 次 扩 增 器。 (6) PCR 反应 即使 按 优化 模式 进行 ， 仍 可 能 出 现 一 些 似是而非 的 扩 增 产物 。 我 们 发 现 这 常常 是 由 于 其 中 一 条 引物 的 特异 性 双重 引导 模板 扩 增 的 结果 。 因 此 我 们 常规 设 置 只 含 一 条 引物 的 扩 增 体系 与 上 述 体系 同时 扩 增 ， 并 于 琼脂 糖 凝 胶 相 邻 的 泳 道上 进行 电泳 ， 从 而 区 分 这 些 产物 是 由 于 两 条 引物 相互 作用 或 由 一 条 引物 造成 。 (7) Tag DNA 聚合 酶 缺乏 3 一 $ 外 切 核酸 酶 校正 活性 061， 所 以 在 DNA 扩 增 中 积累 的 PCR 产物 的 错 配 率 可 高 达 2 x 10- 463]。 这 种 错误 出 现 于 早期 的 扩 增 产物 时 ， 它 将 存在 于 一 部 分 扩 增 分 子 中 ， 因 而 也 将 出 现在 许多 克隆 中 。 因 此 当 分 离 未 知 片 段 时， 我 们 建议 必须 对 来 自 相 互 独立 的 至 少 三 个 PCR 产物 进行 测序 。 (8) 扩 增 反应 的 高 度 敏 感性 使 其 易于 受 微 量 外 源 DNA 的 污染 。 当 序列 量 微 且 存在 于 © 285+ ° (3 ~~ 复杂 的 基因 组 中 时 ， 因 常 须 进行 多 轮 PCR 扩 增 而 尤其 成 为 问题 。 为 避免 这 样 的 污 染 的 办 法 包括 ; 戴 手 套 ， 使 用 带 过 滤 装置 的 吸 嘴 ， 试 剂 和 试管 用 紫外 线 处 理 ， 以 及 必要 时 工作 可 于 超 净 台 上 进行 。 (9) 模板 DNA 可 来 源 于 基因 组 DNA、cDNA、 从 YAC ti] A DNA, Bhar, A. ALR M13 WERK, MAA WE WHERE. DNA 来 源 的 复杂 性 愈 高 ， 所 须 DNA 的 量 也 愈 多 ， 这 可 作为 一 项 指南 。 例 如 使 用 复杂 的 基因 组 DNA BRA DNA, Efi] 的 浓度 分 别 是 10 一 100 pg/ml 和 1 一 10 ng/ml。 模 板 量 过 多 会 降低 扩 增 效 率 。 另 外 ， 从 单个 克隆 的 入 叭 菌 体 贮存 液 或 噬 菌 斑 、 含 质粒 的 菌落 或 甘油 贮存 液 、MI13 鸣 菌 斑 直接 挑 取 或 吸取 少量 作为 模板 ， 我 们 也 成 功 地 完成 了 扩 增 。 (10) 作为 复 性 温度 的 粗略 计算 : 每 增加 一 对 G/C 增加 4C ， 每 增加 一 对 A/T 增加 20C。T， =4x(G+C)+2x(A+T)。 因 此 长 度 为 18 bp 具有 10(G+C) 的 引物 的 复 性 温度 为 : 10x4+8x2=56 (CC )。 引 物 延 伸 时 间 按 1 kb/min 计 ; 从 实践 的 角度 He, Taq DNA 聚合 酶 扩 增 的 能 在 凝 胶 上 显示 并 能 纯化 并 克隆 的 最 大 片段 长 度 大 约 为 3 一 4 kb. (11) 以 下 为 用 于 纯化 PCR 产物 的 两 种 常用 方法 ， 直 接 纯化 PCR 产物 或 者 先 经 从 琼脂 糖 凝 胶 分 离 后 再 行 纯 化 : a. 酚 / 氯 仿 抽 提 。 加 等 体积 酚 ， 混 匀 ， 以 13 000 g 离心 10 ming MR (LE) 水 相 至 另 一 微型 离心 管内 ， 加 等 体积 氯仿 ， 混 匀 ， 再 次 离心 。 吸 取 (ERB) 水 相 ， 加 1/10 体积 3 mol/L BRA 2.5 倍 体积 乙醇 ， 于 - 20?7 或 干冰 中 静 置 10 min. 13 000 g 离心 10 min。 弃 上 清 液 ， 用 70% 乙 醇 200 ul MITE. BA 中 干燥 或 真空 抽 干 ， 重 悬 于 所 需 体 积 的 TE 或 水 中 。 如 果 从 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 中 回收 DNA， 把 切 下 的 凝 胶 称 重 ， 加 等 体积 水 ， 在 加 入 酚 前 于 6SY 加 热 使 胶 完全 熔化 。 b. 试剂 盒 如 GlassMax (Gibco-BRL) 中 的 DNA 结合 基质 可 用 于 纯化 PCR 产物 。 按 产品 说 明 书 操作 ， 同 样 也 可 以 直接 从 PCR 产物 中 ， 或 凝 胶 沉 淀 后 纯化 DNA。 - (12) 如 果 能 用 EcoRV， 它 比 Smal #H, AW EcoRV 在 37X 更 为 稳定 ， 且 对 载体 DNA 的 切割 效率 更 高 。 如 DNA 中 只 含有 Sma I 的 平 末端 酶 切 位 点 ， 消 化 时 保温 温度 应 为 2ST 。 (13) IT- 载体 经 凝 胶 纯化 时 未 被 消化 的 载体 将 被 去 除 ， 这 可 减少 没有 插入 片段 的 载体 所 造成 的 本 底 。 (14) 感受 态 大 肠 杆 菌 既 可 以 按 Hanahan 的 方法 4] (参见 第 二 十 九 章 ) 制备 ， 也 可 以 直 接 购 得 。 (15) 如 果 所 用 的 载体 具有 B - 半 乳 糖苷 酶 蓝 / 白 选 择 系统 ， 在 含 IPTG 及 X-gal 的 培养 基 中 进行 转化 ， 重 组 克隆 将 呈现 白色 。 这 是 由 于 8B - 半 乳 糖苷 酶 基因 的 插入 失 活 ， 使 其 不 能 分 解 产 色素 的 乳糖 类 似 物 X-gal， 从 而 阻止 了 蓝 色 菌 落 的 形成 。 但 白色 菌落 并 不 肯定 带 有 重组 体 ， 这 部 分 可 能 是 由 于 载体 误 连 了 非 匹 配 末端 [181 或 发 生 了 移 码 。 相 反 ， 某 些 蓝 色 菌落 倒 可 能 含有 重组 体 ， 这 可 能 是 B - 半 乳 糖苷 酶 基因 在 框架 内 发 生 的 变化 并 不 影响 读 码 ， 从 而 使 酶 仍然 具有 活性 。 (16) 转化 结果 培养 四 上 未 见 有 任何 菌落 ， 则 或 是 由 于 大 肠 杆菌 的 低 感 受 态 ， 或 是 PCR *。 236 。 产物 与 工 - 载 体 连接 失败 之 故 。 对 每 一 批 的 转化 均 应 设立 对 照 质粒 以 监测 大 肠 杆菌 的 转化 效率 。 另 外 ， 可 通过 样品 于 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 以 确定 工 -载体 与 PCR 产 物 的 浓度 ， 并 了 解 连 接 反应 是 否 成 功 。 (17) 大 量 蓝 色 菌 落 的 出 现 或 者 用 筛选 方法 检测 中 发 现 高 背景 的 非 重 组 克隆 ， 这 大 多 是 由 于 载体 臂 上 加 工 的 失败 。 重 复 此 步 可 以 确认 试剂 已 经 加 全 以 及 Taq 酶 并 不 失 活 。 通 过 在 不 含 PCR 产物 时 的 T -载体 连接 反应 可 以 确证 T -载体 的 制备 已 成 功 ， 在 这 种 情况 下 转化 后 应 该 仅 存 在 小 部 分 非 重组 CR) 菌落 。 致 四 谢 感谢 剑桥 大 学 医学 部 的 Sydney Brenner 为 我 们 提供 这 一 工作 的 机 会 。 当 时 ， 作 者 之 一 M. K. Trower & E. I. du Pont de Nemours and Co. Inc.，Wilmington，DE，USA 的 奖学金 资助 , 另 一 作者 G. S. Elgar 则 受 Jeantet 基金 的 资助 。 参考 xX 献 1. Saiki, R. K., Scharf, S. J., Faloona, F. A., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., and Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354. 2. Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350. 3. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., and Erlich, H. A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491. 4. Erlich, H. A., Gelfand, D., and Sininsky, J. J. (1991) Recent advances in the poly- merase chain reaction. Science 252, 1643-1651. 5. Scharf, S. J., Horn, G. T., and Erlich, H. A. (1986) Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science 233, 1076-1078. 6. Kaufman, D. L. and Evans, G. A. (1990) Restriction endonuclease cleavage at the termini of PCR products. Biotechniques 9, 304,305. 7. Clark, J. M. (1988) Novel non-templated nucleotide reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 18, 9677-9686. 8. Hemsley, A., Arnheim, N., Toney, M. D., Cortopassi, G., and Galas, D. J. (1989) A simple method for site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17, 6545-6551. 9. Mead, D. A., Pey, N. K., Herrnstadt, C., Marcil, R. A., and Smith, L. (1991) A universal method for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid. Biotechnol- ogy 9, 657-663. 10. Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A., and Collins, F. S. (1991) Construction of T- vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 19, 1154. 11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., eds. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 1.25—1.28. 12. Giissow, D. and Clackson, T. (1989) Direct clone characterisation from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17, 4000. 13. Mullis, K. B. (1991) The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion. PCR Meth. Appl. 1, 1 一 4. - 237 - “2386 * . Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1988) CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73, 237-244. . Wada, K., Wada, Y., Ishibashi, F., Gojobori, T., and Ikemura, T. (1992) Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data. Nucleic Acids Res. 20(Suppl.), 2111-2118. . Tindall, K. R. and Kunkel, T. A. (1988) Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry 27, 6008-6013. . Hanahan, D. (1985) Techniques for transformation of E. coli, in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, G. M., ed.), vol. 1, pp. 109-135. . Wiaderkiewicz, R. and Ruiz-Carillo, A. (1987) Mismatch and blunt to protruding- end joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 15, 7831—7848. TNE PCR 产物 的 直接 放射 性 标记 Tim McDaniel, Stephen J. Meltzer 1. 4] Ul 放射 性 标记 的 聚合 酶 链 式 反应 产物 在 分 子 生 物 学 研究 技术 中 的 应 用 越 来 越 广 。 这 里 面包 括 基于 PCR 技术 的 一 些 多 态 性 分 析 ， 例 如 连锁 分 析 5 及 肿瘤 细胞 的 等 位 基因 缺失 检测 如。 放射 性 标记 PCR 的 其 他 应 用 包括 : 合成 探 针 用 于 Southern 杂交 及 Northern 杂 交 B]， 以 及 用 单 链 构象 多 态 性 分 析 (SSCP) 技术 进行 多 态 性 筛选 及 点 突变 分 析 等 鸣 。 PCR 产物 的 放射 性 标记 最 常用 的 方法 有 两 种 : 于 PCR 反应 体系 中 加 入 放射 性 标记 的 dNTPs0 以 及 在 扩 增 反应 前 进行 引物 末端 标记 65]， 这 两 种 方法 均 存 在 一 些 问 题 ， 如 热 循环 仪 易 遭 受 放 射 性 污染 和 扩展 了 同位 素 工 作 区 域 。 这 里 描述 的 技术 ! 是 基于 O'Farrell 等 品 及 NelKints] 的 方法 ， 在 这 里 放射 性 标记 是 在 PCR 已 完成 并 完全 脱离 PCR . 仪 后 进行 ， 故 可 以 克服 上 述 缺 点 。 另 外 ， 这 一 方法 也 是 快速 的 ，PCR 产物 无 须 纯 化 (如 酚 / 氧 仿 抽 提 )， 并 且 在 标记 后 2 h 内 可 以 肉眼 看 到 极 少 量 的 PCR 产物 。 这 一 方法 利用 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 I 的 Klenow 片段 的 5’>3’ DNA 聚合 活性 及 3 S 外 切 活 性 〈 校 正 活 性 )。 即 于 不 含 dNTPs 的 PCR 反应 产物 中 加 入 Klenow 片段 ， 这 时 因 缺 乏 底 物 (dNTPs), HAY S’>3’ DNA 聚合 活性 得 不 到 体现 ， 而 仅仅 显示 它 的 3 一 和 $ 外 切 活 性 ， 于 是 PCR 产物 的 3“ 端 碱 基 被 去 除 ， 稍 后 再 加 入 dNTPs 包括 [2P] - dCTP， 依 靠 Klenow 片段 重新 补 齐 末 端 ， 从 而 标记 了 3 的 缩 进 一 端 。 2. # 料 1) PCR*Y. 2) Klenow 片段 (1U/yl). 3) 10 X Klenow 酶 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCl, pH 7.8, 100 mmol/L MgCh, 10 mmol/L 8- 琉 基 乙 醇 。 4) [a-*P] dCTP (脱氧 胞 核 苷 5 -[u-?2P] 三 磷酸 ， 三 乙 胺 盐 ， 水 溶液 ，10 mCi/ml, 3000 Ci/mmol). 5) dNTP 溶液 (4 400 pmol/L 的 dGTP, dATP, dTTP). 6) 测序 酶 终止 液 : 95% FABER, 20 mmol/L EDTA, 0.05% 72M KK. 7) DNA 测 序 装 置 (包括 玻璃 平板 、 垫 片 、 杭 子 )。 a 法 1) PCR 产物 $ 端 2 的 消化 ， 于 微量 离心 管内 混 匀 2 pl PCR 产物 (来 自 100 pl ME 系 )，2 pl 10 x Klenow 酶 缓冲 液 ，1 pl Klenow FB, 15 pl H,O. 2) 室温 静 置 10 min。 3) MA 0.5 pl [a—2P] dcCTP 和 1 AdNTP 溶 液 以 补 平 被 消化 的 末端 。 4) 室温 静 置 10 min (参见 注释 1)。 5) 70C 保温 15 min 以 灭 活 Klenow 酶 。 6) 此 时 根据 实验 需要 摊 入 标记 的 DNA， 或 者 按 下 法 于 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 以 显示 标记 的 DNA。 7) 取 8 由 标记 混合 液 与 2 岂 测 序 终止 液 混 匀 。 8) 90°C 加 热 5 min 使 双 链 DNA 变性 。 9) 上 样 于 已 经 预 电 泳 过 的 8% 丙 烯 酰胺 /50% 脲 素 测序 腕 上 ， 电 泳 90 min。 电 压 维 持 在 使 凝 胶 表 面 温度 达 SOC 的 水 平 〈 根 据 测 序 装 置 不 同 ， 电 压 亦 不 同 )。 10) 用 增 感 屏 于 -70C 放射 自 显影 1.5 h (参见 注释 2)。 4. iE 释 (1) 为 确保 3? 端 完全 补 平 ， 可 在 70Y 保温 灭 活 Klenow 酶 前 补 加 1 pl 400 pmol/L dCTP, 反应 5 min。 不 过 我 们 认为 这 并 不 必要 。 (2) 为 确认 标记 的 PCR 产物 的 大 小 ， 可 与 用 同样 方法 标记 的 DNA 相对 分 子 质量 标准 同 时 电泳 。 为 标记 DNA 相对 分 子 质量 标准 ， 在 上 述 操作 中 用 2 pl (2 pg) 相对 分 子 质 量 标准 DNA 取代 PCR 产物 。 致谢 本 文 受 ACS 基金 (4 PDT-419)、 美 国 Crohn 和 Colitis 基金 会 及 退伍 军人 事务 部 的 支持 。 We 考 XM mm 1. Peterson, M. B., Economou, E. P., Slaugenhaupt, S. A., Chakravarti, A., and Antonarakis, S. E. (1990) Linkage analysis of the human HMG 14 gene on chro- mosome 21 using a GT dinucleotide repeat as polymorphic marker. Genomics 7, 136-138. 2. Bookstein, R., Rio, P., Madreperla, S. A., Hong, F., Allred, C., Grizzle, W. E., and Lee, W.-H. (1990) Promoter deletion and loss of retinoblastoma gene expression in 1) 应 是 3'S, ——iP# AE - 240 - human prostate carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7762-7766. 3. Schowalter, D. B. and Sommer, S. S. (1989) The generation of radiolabeled DNA and RNA probes with polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 177, 90—94. 4. Orita, M., Suzuki, Y., Sekiya, T., and Hayashi, K. (1989) Rapid and sensitive detec- tion of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reac- tion. Genomics 5, 874-879. 5. Hayashi, S., Orita, M., Suzuki, Y., and Sekiya, T. (1989) Use of labeled primers in polymerase chain reaction (LP-PCR) for a rapid detection of the product. Nucleic Acids Res. 18, 3605. 6. McDaniel, T. K., Huang, Y., Yin, J., Needleman, S. W., and Meltzer, S. J. (1991) Direct radiolabeling of unpurified PCR product using Klenow fragment. BioTechniques 11, 7,8. 7. O’Farrell, P. H., Kutter, E., and Nakanishi, M. (1980) A restriction map of the bacteriophage T4 genome. Mol. Gen. Genet. 179, 421-435. 8. Nelkin, B. D. (1990) Labeling of double stranded oligonucleotides to high specific activity. BioTechniques 8, 616-618. - 241 « 第 三 十 九 章 ”应 用 PCR EX AR RR aE Ez 5 ME Hr BY a Michael K. Trower 1. 引 Tl 在 连接 反应 产物 转化 进入 感受 态 大 肠 杆菌 后 ， 成 功 的 亚 克 隆 通常 用 两 种 方法 鉴定 。 第 一 种 方法 是 从 若干 菌落 小 规模 制备 质粒 DNA， 接 着 根据 其 独特 的 限制 酶 切 图 谱 或 直 接 DNA 测序 来 确认 目的 重组 质粒 。 第 二 种 方法 ， 当 涉及 大 量 的 假定 的 重组 子 时 ， 和 常 用 标记 的 探 针 进 行 菌落 杂交 。 本 章 描述 另 一 种 基于 PCR 的 方法 ， 可 以 用 来 直接 筛选 转化 子 ， 这 种 方法 既 简 便 、 快 速 又 完全 不 须 经 历 耗 时 的 质粒 DNA 制备 。 简 言 之 ， 用 牙签 将 转化 菌落 直接 挑 入 少量 PCR 反应 液 中 ， 这 里 面 含 有 克隆 位 点 的 侧翼 引物 ， 通 常 来 源 于 载体 多 位 点 接头 的 通用 引物 吕 JI。 随 后 在 体外 进行 扩 增 ， 每 一 反应 的 一 小 部 分 用 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 析 以 确证 插入 片段 的 存在 及 片段 的 大 小 。 2. At 料 这 里 描述 的 方法 须 用 热 稳定 微量 滴定 板 ， 但 也 可 用 200~ 500 pl HS RS. A 试剂 均 用 灭 菌 蒸 馏 水 配置 。 除 注 明 者 外 ， 其 余 均 室温 保存 。 1) PCR 9/0: @ MAY SEK FBS) (17 ~ 21 RAE), 制 成 10 pmol/L 贮存 液 , -20C 保 . 存 。 2) 10 PCR 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 9.0, 50 mmol/L KCl, 15 mmol/L Mg- Cl, 1% Triton X-100. —20C 保存 。 3) dNTPs: JC##MA dATP. dCTP, dGTP, dTTP 各 2 mmol/L, —20C RF. 4) Taq DNA RG BBS U/pl, —20C 保存 。 5) 热 稳 定 96 孔 微量 滴定 板 (参见 注释 1)。 6) 丰富 培养 液 。 7) 灭 菌 的 鸡 尾 棒 (cocktail stick)”, 8) 灭 菌 的 培养 用 微量 滴定 板 。 9) 矿物 油 。 10) 10 BER EERE: 25% Ficoll 400, 100 mmol/L EDTA, 0.1% 2B} iK. 1) 可 用 灭 菌 牙签 代替 。 一 译 者 注 . 242 . cer] 法 1) 确定 所 须 进 行 筛选 反应 的 次 数 (参见 注释 2)。 配 置 一 PCR 反应 混合 贮存 液 ， 其 中 每 一 待 扩 增 菌落 须 用 : 各 0.5 由 正 向 / 反 向 通用 引物 〈 人 参见 注释 3)，1.0 pl dNTP 液 ，1.0 pl 10x PCR 缓冲 液 ，0.04 pl Tag DNA 聚合 酶 ，6.96 岂 蒸 馏 水 。 2) 取 10 已 反应 混合 贮存 液 ， 加 到 热 稳 定 9%6 孔 微 量 滴定 板 每 一 设 定 的 孔 内 。 3) 对 于 每 一 被 筛选 的 菌落 ， 吸 取 100 pl 丰富 培养 液 〈 含 抗生素 及 其 他 选择 性 药物 ) 加 到 另 一 块 微 量 滴 定 板 的 孔 内 。 每 孔 标 以 号 码 ， 以 便 在 分 析 扩 增产 物 后 特定 菌落 很 容 易 被 辨认 出 来 。 4) 用 灭 菌 的 鸡 尾 棒 挑 取 每 一 菌落 , 先 于 PCR 反应 混合 液 中 漂洗 , 然后 于 含有 新 鲜 培 养 液 的 滴定 板 的 相对 应 的 孔 中 漂洗 (参见 注释 4 和 5)。 滴 定 板 置 37X 保温 箱 中 至 少 6 h。 5) 按 制造 厂家 的 说 明 书 提供 的 方法 密封 热 稳定 微量 滴定 板 。 如 果 热 循环 仪 不 具备 热 盖 ， 则 于 反应 体系 上 加 盖 足 量 的 矿物 油 以 防止 蒸发 (一般 加 40 一 50 yl). 6) 将 板 置 于 装 有 微量 滴定 金属 板 的 热 循环 仪 内 ，9SY HA 1 min。 接 着 启动 以 下 的 程序 扩 增 30 一 35 个 循环 : 9ST AH 30 s; 50 一 SSY 引物 复 性 30 s (如 引物 为 17 个 碱 基 ， 复 性 温度 为 SOC ) ;727 引物 延伸 30 s ~3 min ( 按 合成 1 kb/minit) (参见 注释 6)。 最 后 一 个 循环 后 于 72°C 额外 延伸 $ min 以 确保 合成 全 长 的 双 链 产物 。 7) 每 一 反应 孔 加 1 pl 10 x ERR EBL, FA 1% 琼 脂 糖 凝 胶 进行 电泳 分 析 ( 人 参见 注释 7 和 8)。 8) 培养 用 微量 滴定 培养 板 上 的 阳性 克隆 可 取出 用 于 接种 培养 以 便 制备 质粒 DNA 用 于 进 — Ba ET» 用 于 PCR 的 同一 通用 引物 可 作为 克隆 片段 测序 的 起 始 引 物 , 这 取决 于 引物 距 克 隆 位 点 的 距离 (10 一 50 个 碱 基 之 间 是 合适 的 ) (参见 注释 9)。PCR 克隆 实验 的 典型 结果 见 图 39.1, ee ee 双 链 DNA 123456789101112131415 16 17 18 192021 22 23 24 25 26 27 28 (bp) 图 39.1 长 短 不 一 的 DNA 混 合 物 被 连接 入 载体 pCRscript SK( + ) 4 Srf 1 BRU LA, FRE XK 肠 杆 菌 ( 正 . coli, XL1- blue tk), H&A X - gal R IPTG 的 氨 茶 青霉素 (100 pg/ml) FM Mi ve, 以 T3 及 KS 通用 多 位 点 接头 引物 对 筛选 出 的 28 个 菌落 进行 PCR 分 析 ( 泳 道 1 一 28)。 结 果 显 示 每 一 个 克隆 都 含有 一 个 长 短 不 一 的 插入 片段 。 泳 道 5: 和 8 为 由 非 重 组 子 所 产生 的 载体 多 位 点 接头 衍生 而 来 的 123 bp 对 应 条 带 。 泳 道 11 有 两 个 扩 增 片段 ,表明 在 扩 增 体系 内 挑 入 了 两 个 克隆 。 3 上 述 方案 加 以 修改 ， 可 用 于 对 定点 诱 变 得 来 的 DNA 序列 的 筛选 和“; 另外， 未 纯化 的 PCR 产物 亦 可 用 于 直接 测序 5 。 4 . 注 释 (1) 多 种 型 号 的 热 循 环 仪 均 备 有 微量 滴定 板 , 如 Hybaid (Middlesex, UK )、MJ Research (Watertown , MA)(PTC 100 及 200) 和 Perkin-Elmer(Norwalk，CT)(9600), 后 者 使 用 中 不 须 覆 盖 矿 物 油层 。 (2) 微量 滴定 板 孔 数 从 10 一 96 不 等 ， 所 需 孔 数 由 用 于 亚 克 隆 的 DNA 的 复杂 性 及 所 筛选 DNA 片段 的 种 类 多 少 而 定 。 (3) 用 侧翼 通用 引物 的 一 个 独特 的 优点 是 重组 子 即 使 不 含 插入 片段 也 能 扩 增 出 双 链 DNA 条 带 ,说 明 PCR 反应 是 成 功 的 。 也 可 应 用 其 他 引物 组 合 , 例如 采用 一 条 通用 引物 及 一 条 插入 片段 特异 性 引物 , 使 所 克隆 的 DNA 片段 方向 得 以 确定 。 或 者 在 缺乏 任何 的 通用 引物 或 当 目 的 克隆 片段 >4 kb 的 情况 下 , 可 选用 一 对 插入 片段 特异 性 的 引物 。 (4) 这 一 筛选 方法 也 可 用 于 重组 Ml13 叹 菌 体 克 隆 的 筛选 ， 惟 一 的 修改 是 在 培养 液 内 加 入 1/100 体积 过 夜 培养 的 大 肠 杆 菌 。 所 选 宿 主 菌株 必须 带 F“' 附 加 体 ， 以 便于 鸣 菌 体 能 感染 这 些 细胞 ;合适 的 实验 室 菌株 有 M109, TG1, NMS522. XL1-Blue. (5) 如 果 所 筛选 的 克隆 数目 较 多 ， 先 将 菌落 挑 入 微量 培养 板 中 培养 过 夜 。 接 着 用 96 贞 接种 工具 从 培养 孔 接种 到 含有 PCR 反应 混合 液 的 微量 滴定 板 的 孔 中 。 (6) 从 实际 出 发 ， 筛 选 方案 的 上 限 为 3 一 4 kb, WAH ER <500 bp， 可 选用 快速 的 两 步 循环 程序 : 于 9SC 变性 30 s, BK SO0~S55C 引物 复 性 30 s， 共 扩 增 30 一 35 个 循 环 。 引 物 复 性 温度 和 变性 温度 之 间 的 过 渡 时 间 对 Tag DNA 聚合 酶 延伸 引物 的 作用 来 说 已 经 足够 。 (7) 所 筛选 的 非 重组 子 PCR 产物 的 大 小 取决 于 克隆 载体 上 的 一 对 引物 之 间 的 距离 。 因 此 如 果 单 一 限制 酶 切 位 点 被 用 于 亚 克 隆 时 ， 重 组 子 PCR 产物 的 大 小 应 加 上 这 一 长 度 。 在 估计 插入 片段 的 大 小 时 这 一 点 应 予 考虑 。 (8) 或 者 取 少 量 每 一 次 PCR 产物 ， 加 入 上 样 染料 后 于 琼脂 糖 凝 胶 上 进行 电泳 。 如 PCR 产物 显示 已 知 序列 的 单一 条 带 ， 可 取 2 一 5 pl PCR 产物 进行 限制 酶 切 〈 酶 切 混 合 物 体积 为 20~50 种)， 根 据 限制 酶 切 图 谱 进一步 确认 。 (9) 即使 PCR 产物 显示 单一 条 带 ， 其 中 也 可 能 含有 不 止 一 种 产物 。 因 此 对 若干 重组 克 隆 进行 测序 是 明智 的 ， 这 便于 确认 目的 片段 的 存在 。 参考 文 献 1. Giissow, D. and Clackson, T. (1989) Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17, 4000. 2. Trower, M. K. (1992) A rapid PCR dependent microtitre plate screening method for DNA sequences altered by site-directed mutagenesis. DNA Sequence—J. DNA Sequenc. Map. 3, 233-235. . Trower, M. K., Burt, D., Purvis, I. J., Dykes, C. W., and Christodoulou, C. (1995) Fluorescent dye-primer cycle sequencing using unpurified PCR products; devel- opment of a protocol amenable to high-throughput DNA sequencing. Nucl. Acids Res. 23, 2348,2349. * 244 + Ww 第 四 十 章 ”应 用 PCR eA ive 吹 瑚 体 文 库 Lei Yu ，Laura J. Bloem 1. 引 Tl 从 cDNA 或 基因 组 文库 中 分 离 一 个 克隆 往往 须 从 文库 中 多 次 接种 及 滤 膜 杂交 以 进行 筛选 。 这 不 仅 繁琐 、 耗 时 ， 并 且 常 因此 带 来 矫 作物 ， 例 如 滤 膜 杂交 中 常常 出 现 假 阳性 。 在 常规 滤 膜 杂交 前 的 几 轮 筛选 中 采用 聚合 酶 链 式 反应 (PCR) 可 以 减少 上 述 问 题 。PCR 筛选 有 三 方面 的 优点 : O 阳性 的 克隆 是 根据 凝 胶 中 DNA 条 带 的 大 小 来 判断 ， 可 避免 滤 膜 杂 交 中 的 假 阳性 斑点 造成 的 混淆 ;@ 省 时 ， 尤 其 在 前 几 轮 筛选 时 ，(G@) 通过 应 用 合适 的 引物 ， 可 在 同一 PCR 中 对 多 个 基因 进行 筛选 。 随 着 噬菌体 群体 的 复杂 性 的 减少 和 其 中 真 阳性 克隆 得 以 确认 后 可 用 常规 方法 对 单一 克隆 进行 分 离 。 PCR 筛选 的 基本 步骤 如 图 40.1 Arm: @ Micrel ER PF vee; @ Mae ARE Vt Fe ca BAL ; @ 用 鸣 菌 体 洗 脱 液 进行 PCR。 噬菌体 文库 平 严 取 下 滤 膜 ete RUB i nt lala wy 滤 腊 杂交 图 40.1 POR 法 筛选 唆 菌 体 文库 的 基本 步骤 。 从 一 特定 平 亚 上 鉴定 了 一 个 阳性 信号 后 ， 从 这 一 平 亚 上 长 满 吻 菌 体 的 琼脂 上 切 下 一 小 块 以 缩小 搜索 的 范围 ， 然 后 重复 这 些 步骤 ， 进 行 另 一 轮 次 的 PCR 筛选 。 或 者 ， 可 揭 下 阳性 平 亚 的 另 一 张 滤 膜 ， 用 作 和 常规 滤 膜 杂交 。 « 245 - 2. 材 料 1) 鸣 菌 体 稀释 缓冲 液 : 100 mmol/L NaCl, 8 mmol/L MgSO,, 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.$，0.1% 明 胶 。 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 2) HR 〈 参 见 注 释 1)。 ee, 法 参见 注释 2 一 4。 1) Fete ECE cDNA 或 基因 组 文库 与 合适 的 宿主 细菌 混合 铺 于 含 琼脂 糖 上 层 的 150 mm 平 血 上， 于 37 培养 。 在 形成 大 小 合适 的 叭 菌 斑 后 ， 平 严 置 于 4 中 冷却 至 少 1 h。 2) 在 平 血 上 放 一 硝酸 纤维 膜 ， 确 保 在 琼脂 和 滤 膜 之 间 无 气泡 。 如 果 平 严 是 新 鲜 的 ， 滤 膜 将 于 数秒 钟 内 湿润 。 对 于 已 存放 一 段 时 间 的 平 阵 ， 或 者 要 从 平 亚 多 次 揭 取 滤 膜 ， 为 使 滤 膜 完全 浸 湿 ， 可 能 需要 较 长 的 时 间 。 3) 用 两 个 平头 杀 子 小 心地 将 滤 膜 提起 ， 确 保 勿 使 琼脂 上 层 撕 裂 。 使 含 噬菌体 的 一 面向 下 将 滤 膜 置 于 1$0 mm 灭 菌 培 养 平 亚 中 〈 平 严 的 底 或 盖 都 可 以 )， 平 亚 内 含 3 ml 叹 菌 体 洗 脱 缓冲 液 ， 反 复 上 下 提起 滤 膜 数 次 以 洗 下 鸣 菌 体 颗粒 。 最 后 ， 提起 滤 膜 泣 二 液体 (通常 10 一 20 s BH), EAI. 4) 加 20 pl 噬菌体 洗 脱 液 至 PCR 管 中 ， 盖 紧 盖 子 ， 置 于 沸水 中 5 min, FRECA, 以 此 为 模板 按 常 规 进行 PCR (总 体积 100 由，PCR 条 件 见 三 十 四 章 。 参 见 注释 5、 6)。 如 果 以 后 要 进行 更 多 次 的 PCR， 保 存 一 些 鸣 菌 体 洗 脱 液 在 Eppendorf 管 中 〈 参 见 注释 7)。 5) 用 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 析 PCR 产物 (参见 注释 8)。 如 果 一 块 平 阵 有 一 个 或 多 个 阳性 噬 菌 斑 ， 那 么 ， 与 其 相对 应 的 泳 道 会 出 现 预期 大 小 的 扩 增 条 带 。 这 一 平 严 可 认为 阳 OF IML. 6) 此 时 可 用 阳性 平 四 进行 常规 滤 膜 杂 交 以 筛选 阳性 噬 斑 。 但 是 也 可 以 按 下 面 所 介绍 的 方法 进行 新 一 轮 次 的 PCR 筛选 以 进一步 缩小 一 块 阳性 平 亚 叹 菌 体 群 体 的 复杂 性 。 7) 取 一 新 的 硝酸 纤维 膜 盖 于 阳性 平 血 上 (参见 注释 9)。 用 灭 菌 手术 刀 将 滤 膜 及 其 下 方 的 琼脂 切 成 数 块 ， 琼 脂 可 切 成 任何 形状 及 数目 。 然 而 ， 我 们 发 现 如 按 放射 状 切 成 4 一 8 块 ， 则 操作 很 是 方便 。 8) 同步 又 3， 取 每 一 滤 膜 切片 在 噬菌体 洗 脱 液 中 漂洗 。 因 滤 膜 切片 较 小 ， 漂 洗 可 在 更 小 的 ， 例 如 100 mm 的 培养 四 中 进行 ， 或 在 干净 保鲜 腊 (Saran WrapIM) 上 淋 洗 。 这 取决 于 滤 膜 切片 的 大 小 ， 一 般 可 用 0.2 一 0.5 ml 的 洗 脱 液 。 9) 用 切片 的 洗 脱 液 如 步骤 4 进行 PCR。 10) 通过 PCR 鉴别 出 含有 阳性 鸣 菌 体 信 号 的 切片 后 ， 在 相应 的 琼脂 切 块 上 再 次 印 膜 并 用 此 滤 膜 进行 常规 滤 膜 杂交 。 或 者 刮 下 此 琼脂 切 块 的 顶层 琼脂 ， 按 下 法 再 次 接种 平 四 - 246 - 11) REE RR EY, ABA) RH ORK SR Le 琼脂 刮 入 含有 20 ml WATER RA 50 ml 锥 形 管 中 。 为 避免 交叉 污染 ， 在 刊 不 同 琼脂 过 程 中 ， 玻 棒 必 须 用 灭 菌 水 认真 清洗 。 12) HE Sine, MESA ZI 2 h 到 过 夜 。 以 800 g BLS min 以 沉淀 琼脂 ， 将 部 分 上 清 液 液 保存 在 Eppendorf 管 中 ， 丢 弃 含 琼脂 的 锥 形 管 ， 检 测 叹 菌 体 滴 度 ， 按 所 需 密度 重新 接种 ， 进 行 新 一 轮 PCR 筛选 或 常规 滤 膜 杂交 。 4. 3% 释 (1) 各 种 品牌 的 不 带电 荷 的 膜 ， 无 论 是 硝酸 纤维 膜 或 尼龙 膜 都 适用 于 此 项 操作 。 但 我 们 发 现 如 使 用 带电 荷 滤 膜 ， 这 上 面 的 噬菌体 颗粒 不 易 洗 脱 ， 这 可 能 是 由 于 膜 上 的 电荷 干扰 了 鸣 菌 体 颗粒 的 洗 脱 。 (2) 用 PCR 筛选 噬菌体 文库 的 最 主要 优点 是 在 开始 进行 常规 滤 膜 杂交 之 前 ， 可 使 噬 菌 体 文 库 的 复杂 性 减少 。 一 个 文库 的 多 块 平 血 可 用 这 里 描述 的 方法 进行 操作 和 筛选 。 例如 ， 要 筛选 100 7 SMR ERE, MPAA TE SO 000 pfu/ MH, WIA 20K FO. 用 常规 滤 膜 杂交 进行 筛选 ， 要 付出 大 量 的 时 间 和 精力 ， 用 PCR ie ER) A A 就 可 完成 。 再 者 ， 如 把 一 阳性 培养 平 血 上 的 琼脂 切 成 八 块 进 行 新 一 轮 PCR， 则 可 于 KA 6250 pfu 重组 噬菌体 中 筛选 出 阳性 叹 菌 斑 。 这 样 一 个 规模 的 群体 用 常规 滤 膜 杂 交 已 较 易 实施 。 (3) 在 筛选 一 个 文库 之 前 ， 推 荐 从 完整 的 文库 中 取出 少量 做 一 次 PCR。 这 有 两 个 目的 : 其 一 ， 确 证 所 期 望 的 克隆 存在 于 文库 中 ， 其 二 ， 确 证 所 用 的 PCR 条 件 能 扩 增 出 预 期 信号 。 操 作 时 在 100 pL 的 PCR 系统 中 加 入 热 变 性 的 文库 $ 由。 还 可 以 对 扩 增 片 肌 进 行 测序 ， 以 证 实 扩 增 片段 的 正确 性 及 PCR 条 件 的 特异 性 。 这 些 工作 可 在 PCR 筛选 文库 之 前 或 同时 进行 。 (4) 在 开始 筛选 文库 之 前 ， 要 做 的 另 一 件 有 用 的 事情 是 估计 文库 中 目的 克隆 的 丰 度 。 这 可 用 PCR 对 不 同 稀 释 度 ， 以 及 不 经 稀释 的 完整 文库 进行 扩 增 (参见 注释 3) 而 实 现 。 例 如 目的 克隆 存在 于 含 20 000 个 克隆 的 群体 内 ， 就 不 必 按 常规 筋 选 1 百 万 个 克 隆 了 。 (5) 不 时 地 ，PCR 可 并 无 明显 的 原因 而 失败 。 为 防止 将 这 种 偶然 出 现 的 “系统 性 的 失 败 ” 当 作 阴 性 结果 ， 在 PCR 中 应 设置 对 照 。 可 以 设置 两 种 形式 的 对 照 : 内 对 照 和 平行 对 照 。 对 于 内 对 照 ， 可 在 扩 增 载体 的 PCR 管 中 同 时 扩 增 引物 ， 例 如 在 克隆 入 载体 的 文库 中 包括 一 段 入 臂 。 或 者 ， 文 库 可 以 和 一 已 知 克隆 及 针对 这 一 克隆 的 引物 用 在 同一 PCR 中 。 如 果 内 对 照 并 不 必需 ， 可 在 平行 的 管 中 用 PCR 扩 增 一 已 知 序列 作为 平行 对 照 。 (6) 同时 筛选 多 个 基因 时 ， 在 同一 PCR 内 可 加 入 多 对 引物 ， 只 要 所 期 望 的 PCR 产物 因 为 长 度 不 同 而 可 在 凝 胺 上 彼此 区 分 开 来 就 行 。 这 一 方法 最 主要 的 局 限 性 是 在 进行 文 库 筛 选 之 前 必须 有 序列 资料 用 以 合成 引物 。 在 PCR 筛选 中 以 基于 特定 序列 资料 的 非 简 并 引物 为 最 好 。 用 简 并 引物 寻找 相关 基因 也 可 能 是 一 种 选择 ， 尽 管 我 们 并 未 学 IX — Tr Xo - 247 - (7) FW PWR A HO BEBE DIESE, [LES By FA] 2 EH 筛选 。 (8) 如 果 筛 选 一 较 小 的 片段 ， 扩 增 数 多 于 标准 的 30 循环 可 能 是 有 必要 的 。 对 于 一 个 200 bp 的 片段 ， 我 们 扩 增 35 个 循环 以 取得 足够 浓度 的 DNA， 使 在 3% 的 琼脂 糖 效 胶 上 看 到 条 带 。 (9) 鉴于 PCR 的 灵敏 度 ， 同 一 平 阵 上 的 文库 可 被 多 次 筛选 而 不 会 丢失 阳性 信息 。 平 严 也 可 于 4 匀 条 件 下 存放 数 周 以 备 再 次 印 膜 。 无 论 是 新 鲜 的 或 存放 3 ARM, Be 曾 用 同一 平 阵 印 膜 5 次， 而 从 哈 菌 体 洗 脱 液 获得 良好 扩 增 。 对 于 叭 菌 体 洗 脱 液 也 是 如 此 ， 可 在 扩 增 前 存放 数 周 或 更 长 的 时 间 。 参考 X 献 1. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. ， 248 - AS7\ Ebay DNA 序列 测定 第 四 十 一 章 py A M13 BA TE a 克隆 DNA 片段 Qingzhong Yu 1. 引 Tl We Pal AS M13 已 发 展 成 为 取得 单 链 DNA 模板 的 载体 克隆 系统 ， 它 可 用 于 双 脱 氧 链 终 止 法 对 DNA AMF], ESE RAH Ml3 的 资料 已 在 参考 文献 3 中 有 详尽 论述 ， M13 克隆 中 所 用 的 外 源 性 DNA 片段 (插入 片段 ) 的 制备 也 已 在 第 二 十 七 、 二 十 八 章 中 进行 过 讨论 ， 本 章 主要 讨论 M13 载体 的 制备 和 如 何 将 外 源 DNA 片段 插入 到 该 载体 系统 中 去 。 10) 11) 12) 2. 材 料 2.1 复制 型 (RF) M13 DNA 的 制备 L =- 肉 汤 培 养 基 : 1% bacto RHA, 0.5% bacto -酵母 浸出 液 ，1% NaCl, BE 灭 菌 。 Mo9 固体 基本 培养 基 : M9 盐 (12.8 g NaHPO4.7H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl, 1.0 g NH,Cl), 20 ml 20% 葡 萄 糖 ， 加 水 至 1 L， 高 压 灭 菌 。 M13 RRA. 挑 取 新 近 的 转化 细菌 培养 下 上 的 单个 蓝 色 喉 菌 斑 。 E. coli JM103 或 JM109: M9 基本 琼脂 平 血 上 长 出 的 单个 菌落 。 YEW 1: 50 mmol/L 葡萄 糖 ，25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0， 高 压 灭 菌 后 置 4Y 中 贮藏 。 YEW: 0.2 mol/L NaOH, 1% SDS。 临 用 前 加 等 体积 的 0.4 mol/L NaOH 和 2% SDS 母液 ， 混 匀 后 使 用 。 YE 1: 60 ml 5 mol/L 醋酸 钊 ，11.5 ml 冰 醋 酸 ，28.5 ml 水 ， 置 4 保存 ， 临 用 前 放 在 冰 上 。 TE: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0。 酚 / 氯 仿 : 混合 等 体积 TE 饱和 的 酚 (核酸 级 ) 和 和 氯仿 (AR 级 )， 置 深 色 玻璃 瓶 中 ACRE. Ati: ARR. 乙醇 : 100% CB, —20T 贮藏 。 RNase: 1 mg/ml ff RNase A (不 含 DNase)。 ob 2.2 M13 载体 的 制备 1) 适当 的 限制 酶 : -20?7 保存 。 2) 10x 限 制 酶 (RE) 缓冲 液 : 通常 与 限制 酶 由 厂家 一 起 提供 。 3) 3 mol/L 醋酸 钠 、pH $.2，4f 保存 。 4) 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酯 酶 (CIP) B40. 5) 10XxCIP 去 磷酸 缓冲 液 : 500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L MgCl, 10 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 。 6) 和 蛋白酶 K: 母液 10 mg/ml, —-20CKRF. 7) 10% SDS。 8) 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0。 9) 10X TBE: 108 g Tris - 碱 ，55 g HR, 9.5 g EDTA.2H2O。 加 水 至 1L。 10) 用 1xTBE 配 制 0.8% 琼脂 糖 凝 胶 。 2.3 插入 片段 和 MI13 载体 的 连接 1) T4 DNA 连接 酶 : -20CRKF. 2) 10x 连 接 缓冲 液 : 500 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L MgCl, 10 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 。 3) 10 mmol/L ATP: —20C IK. BNE 法 有 多 种 构建 好 的 M13 载体 [4 由 厂商 提供 ， 因 此 购买 要 比 自行 制备 方便 得 多 。 但 有 时 为 了 满足 某 一 克隆 目的 ， 要 求 一 个 具有 特殊 克隆 位 点 的 M13 载体 则 又 当 别 论 。 3.1 RF M13 DNA 的 制备 1) 将 M9 基本 培养 基 平 中 上 划 线 接种 的 M13 宿主 细菌 〈 如 JM103，JM109) 的 单 菌落 中 的 细胞 接种 在 一 20 ml RARE GHA) PHYS ml L 肉 汤 培养 基 中 ， 在 37fKC 中 的 旋转 式 摇 床上 培养 过 夜 (参见 注释 1)。 2) 吸取 SO 各 细菌 培养 物 加 到 装 有 2 ml L 肉 汤 培 养 基 的 5 ml 管 中 ， 用 灭 菌 牙 签 轻 轻 地 接触 转化 平 血 上 的 单个 蓝 色 喉 菌 斑 ， 将 牙签 未 端 置 上 述 培养 管 中 轻 洗 (参见 注释 2)， 经 感染 的 培养 物 在 37°C 中 的 旋转 式 摇 床上 培养 4 一 5 h。 3) 取 1.0 一 1.5 ml 培养 物 加 入 微型 离心 管 中 ， 以 12 000 ¢ 在 室温 中 离心 2 min。 上 清 液 转 移 至 一 新 管 中 ， 注 意 不 要 搅动 沉淀 。M13 单 链 DNA (ss-M13) 也 可 由 上 清 液 制备 〈 参 见 第 四 十 三 章 )。 4) 抽 气 除去 所 有 剩余 的 上 清 液 (参见 注释 3)。 加 100 岂 溶 液 I， 用 吸管 上 下 吹 吸 或 通 人 过 强力 涡 旋 振荡 以 重新 悬浮 沉淀 。 室 温 放置 $ 一 10 min. 5) 加 200 岂 溶 液 I， 盖 紧 管 口 ， 快 速 上 下 倒转 $ 次 混 匀 ， 但 不 要 涡 旋 振荡 。 冰 上 放置 5 min, 6) 加 150 岂 冰 冷 的 溶液 亚 。 在 倒置 状态 轻 轻 地 涡 旋 振 功 10s, Hk ES min. 7) 以 12 000 g BOS min， 将 上 清 液 转移 到 新 管 中 。 8) 加 等 体积 的 酚 / 氯 仿 ， 涡 旋 振 功 20~30 s 使 其 混 匀 ， 按 步骤 7 离心 ， 转 移 水 相 (上 层 ) 到 一 新 管 中 。 9) 加 等 体积 的 氯仿 ， 涡 旋 振 划 20 一 30 s 以 混 匀 。 按 步骤 7 离心 ， 将 水 相 上 层 转 移 到 新 管 中 。 10) 加 2 倍 体积 的 乙醇 ， 涡 旋 振 功 混 匀 ， 置 室温 5 min。 按 步骤 7 离心 ， 轻 轻 抽 气 除 去 上 清 液 〈 参 见 注释 4) 。 11) 用 1 ml70% 乙 醇 洗涤 沉淀 ， 在 不 改变 试管 放置 方向 的 状态 下 离心 2 min 以 求 不 搅动 沉淀 。 按 步骤 10 除去 上 清 液 。 空 气 中 干燥 10 min。 12) 加 20 TE (pH 8.0) 以 溶解 沉淀 ，TE FA RNase (20 pg/ml) 以 除去 其 中 的 RNA。 稍 事 涡 旋 振 功 。 至 此 双 链 RF M13 DNA 已 制备 完毕 ， 可 用 于 限制 酶 切 分 析 。 3.2 M13 载体 的 制备 RF M13 DNA 必须 用 限制 酶 进行 消化 后 经 CIP 去 磷酸 处 理 以 减少 载体 连接 时 非 重 组 分 子 的 再 环 化 以 达到 降低 背景 的 目的 。 如 果 插 入 DNA 片段 可 以 通过 两 种 不 同 的 限制 酶 的 作用 而 产生 不 同 的 黏 性 末端 ， 那 么 可 以 制备 双重 酶 切 载体 而 无 须 去 磷酸 处 理 (参见 注释 5). 1) 在 下 列 反应 体系 中 加 入 一 种 限制 酶 以 消化 RF M13 DNA: 10 pl RF M13 DNA (244 400 ng), 3~5 倍 过 量 的 限制 酶 ，2 pl 10 x 相应 的 缓冲 液 ， 加 水 达到 总 体积 20 pl. 37C 中 保温 2 ho 2) M2 pl RM, 120.8% 琼脂 糖 北 胶 上 电泳 以 分 析 酶 切 消 化 的 程度 ， 用 未 经 消化 的 M13 DNA 作 参 照 (参见 注释 3)。 如 果 消 化 不 完全 ， 加 大 限制 酶 的 用 量 并 继续 保温 。 3) 完全 消化 后 用 酚 / 氯 仿 提取 M13 DNA， 加 0.1 倍 体积 的 3 mol/L NaAc 和 2.5 倍 体积 的 乙醇 ， 在 -207 中 至 少 沉淀 1 h。 4) 用 微型 离心 机 以 12 000 g 离心 10 min 以 沉淀 DNA， 用 70% 乙醇 洗涤 沉淀 ， 空 气 中 干燥 。 用 20 pl TE ARTE. 5) 在 20 pl RHE RA POA: 5 pl 10x CIP 缓冲 液 ，1 U CIP， 加 水 至 50 pl. 37C 保温 30 min (参见 注释 6)。 6) 保温 结束 时 将 下 述 溶 液 加 入 反应 体系 中 : 2.5 pl 10% SDS ( 终 浓度 0.5% )，0.5 wl 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0 (AK 5 mmol/L), 0.5 pl 10 mg/ml 蛋白 酶 K ( 终 浓 度 100 pg/ml). 56C 保温 30 min 使 CIP RIG 〈 参 见 注释 7)。 7) 将 反应 冷却 至 室温 ， 酚 /氯仿 提取 两 次 ， 再 经 氯仿 提取 一 次 (3.17, FRSA “全 53， 9)。 加 0.1 倍 体积 的 3 mol/L NaAc, pH 7.0 (参见 注释 8)， 充 分 混 匀 ， 加 和 5 倍 体 积 的 乙醇 。 1S, —-2C 放置 至 少 1 ho 8) 按 步骤 4 回收 DNA。 用 20 JUTE 溶 解 沉 淀 。 至 此 已 经 为 与 插入 片段 的 连接 做 好 准 备 。 3.3 PARKS M13 载体 的 连接 1) 依次 加 入 下 列 各 物 进 行 连接 : 1 pl M13 载体 ( 约 20 ng), 1 pl 10 mmol/L ATP, 1 yl 10 x 连接 缓冲 液 ，1 一 4 由 揪 入 片段 DNA (按摩 尔 量 计 超 过 3 一 4 倍 )， 对 于 黏 性 未 端 的 连接 ,用 1 U T4 DNA 连接 酶 (参见 注释 9)， 加 水 至 10 岂 总 体积 。 同 时 做 两 个 对 照 反 应 ， 一 个 对 照 中 用 水 代替 插入 片段 DNA， 另 一 个 对 照 中 则 用 适量 的 已 成 功 地 克 隆 在 M13 载体 中 的 测试 DNA. 14C 保温 过 夜 。 然 后 - 20 贮存 ， 或 直接 用 于 转化 。 2) 连接 后 取 1 ul 连接 反应 物 用 0.8% 琼脂 糖 进行 凝 胶 电泳 分 析 以 检验 连接 是 否 成 功 (参见 注释 10)。 用 同样 量 的 M13 载体 和 未 作 连 接 处 理 的 插入 片段 DNA 作为 对 照 。 3) 将 5 由 连接 好 的 样品 转化 进 恰当 的 感受 态 正 .coli 株 中 ， 例 如 JM103， 或 JM109 ( 参 - 见 第 二 十 九 和 第 三 十 章 )。 4. 注 ze (1) M9 基本 培养 基 对 带 有 下 ' 附 加 体 的 细菌 如 JM103 或 JM109 具有 选择 作用 。 它 们 在 M9 基本 培养 基 中 只 能 缓慢 地 生长 ，4Y 保存 时 存活 时 间 不 长 。 因 此 ， 最 好 每 个 月 把 保存 的 菌株 在 基本 培养 基 平 阵 上 划 线 培养 以 保存 菌 种 ， 再 从 这 些 平 严 接种 工 - 肉 汤 培 养 基 。 细 菌 的 母 株 应 当 贮 存在 含有 15% 甘油 的 工 - 肉 汤 培 养 基 中 ，= 70 季 保 存 。 (2) Mitra AS M13 能 在 转化 平 血 上 层 琼脂 中 扩散 相当 长 的 距离 。 因 此 ， 应 挑 取 一 个 与 相 邻 噬 菌 斑 远 远 隔离 的 噬 菌 斑 以 避免 交叉 污染 。 要 获得 高 产量 的 RF M13 DNA， 最 好 从 新 近 转 化 的 平 阵 上 挑 取 喉 菌 斑 。 (3) 因为 RF M13 DNA 保留 在 感染 细菌 的 内 部 ， 而 含有 ss-M13 DNA 的 M13 FARM 体 则 被 释放 到 培养 基 中 ， 所 以 移 去 剩余 的 上 清 液 可 以 减少 ss-M13 DNA 的 污染 。 即便 如 此 ， 有 时 仍 可 能 出 现 ss-M13 DNA 污染 ， 从 而 可 能 混淆 限制 酶 消化 结果 的 分 析 。 因 此 用 限制 酶 消化 RF M13 DNA 和 凝 胶 电泳 分 析 时 不 忘 用 未 经 消化 的 DNA 作对 照 。 由 于 ss-M13 DNA 不 能 被 限制 酶 消化 ， 所 以 消化 过 的 或 未 经 消化 的 DNA 的 电泳 带 的 移动 并 无 不 同 。 (4) 在 回收 M13 DNA 时 ， 有 时 看 不 到 M13 DNA 沉淀 。 因 此 ， 有 必要 小 心 取出 上 清 液 后 留 下 少量 的 液体 (20 一 30 pl) 以 减少 DNA WEA. FA 70% 乙醇 洗涤 和 在 空气 中 干燥 时 也 要 注意 这 一 点 。 (5) 双重 消化 的 载体 可 产生 不 配对 的 黏 性 未 端 ， 因 此 几乎 不 会 因 载体 的 再 环 化 而 形成 tate. 如 果 两 种 限制 酶 的 反应 可 在 同一 种 缓冲 液 中 进行 ， 可 同时 用 两 种 不 同 的 酶 消化 RF M13 DNA。 为 了 检测 消化 片段 的 大 小 ， 建 立 两 个 反应 体系 ， 两 种 酶 .254 . 分 别 反 应 便 可 彼此 作为 对 照 。RF M13 DNA 被 完全 消化 后 ， 接 着 按 3.2 THER 3 和 4 步 操 作 。 最 后 沉淀 溶解 在 20 pl TE 中 准备 作 连 接 用 。 如 果 两 种 限制 酶 不 能 同时 使 用 ， 那 么 用 一 种 酶 消化 后 应 按 第 3.2 节 步 骤 3 和 4 重 行 沉淀 DNA， 并 将 它 重新 悬浮 在 10 岂 TE 液 中 。 接 着 用 第 二 种 酶 消化 ， 然 后 再 按 第 一 种 酶 消化 后 的 相 同步 又 抽 提 。 为 了 检验 第 二 种 酶 的 消化 情况 ， 用 未 经 切割 的 RF M13 DNA 进行 平 行 的 消化 反应 。 经 双 酶 切 去 除 的 小 片段 如 果 重 新 连接 到 载体 上 便 可 能 产生 背景 问题 。 如 遇 到 这 类 问 题 ， 应 对 载体 DNA 作 凝 胶 纯 化 〈 参 见 第 二 十 八 章 )。 (6) 对 于 平 末端 或 缩 进 的 末端 ， 应 用 1 UV/2 pmol & CIP £# 37C 保温 15 min 。 然 后 加 “it CIP, 55°C 中 继续 保温 45 min. (7) 活性 CIP 的 存在 会 对 以 后 的 M13 载体 与 插入 DNA HERP EMEA. GR 法 以 外 的 另 一 方法 是 在 5 mmol/L EDTA 中 70C 加 热 10 min 使 CIP 失 活 ， 然 后 用 酚 / 氯 仿 抽 提 。 (8) 由 于 在 酸性 pH 条 件 下 EDTA 的 浓度 超过 5 一 10 mmol/L 时 便 从 溶液 中 析出 ， 因 此 乙醇 沉淀 时 必须 用 pH 7.0 的 3 mol/L NaAc 取 代 常 用 的 pH 5.2 的 3 mol/L NaAc。 (9) 平 未 端的 连接 效率 低 于 黏 性 未 端的 连接 效率 。 为 了 提高 平 末端 连接 效率 ， 须 要 用 较 高 浓度 的 插入 DNA 和 T4 DNA 连接 酶 ， 应 用 5 U 连接 酶 进行 平 末端 反应 。 (10) 可 用 0.8% 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 来 检查 M13 载体 与 插入 片段 的 连接 情况 ， 用 未 连接 的 M13 及 持 入 片段 作对 照 。 由 于 相对 分 子 质量 增加 的 缘故 ，M13 与 插入 片段 连接 后 在 胶 上 移动 较 慢 ， 有 时 表现 为 弥散 或 不 清晰 的 条 带 ， 这 种 条 带 指示 连接 的 程度 。 a 谢 作者 感谢 D. Cavanagh 在 本 稿 写作 中 所 给 予 的 帮助 。 参考 文 献 Messing, J. (1983) New M13 vectors for cloning. Meth. Enzymol. 101, 20--79. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. Messing, J. (1993) M13 cloning vehicles, in DNA Sequencing Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 23 (Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds.), Humana, Totowa, NJ, pp. 9-22. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., and Messing, J. (1985) Improved M13 phage clon- ing vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119. nN = ye > t= ee 第 四 十 二 章 ”应 用 外 切 核酸 酶 亚 制备 有 序 缺 失 系列 Denise Clark, Steven Henikoff Ti 1. 引 分 子 遗传 学 中 的 一 个 重要 操作 是 将 克隆 的 DNA 片段 按 顺 序 造 成 缺失 。 这 一 操作 广 泛 用 于 DNA 测序 中 。 有 序 缺 失 也 可 用 于 对 基因 中 具有 重要 功能 的 序列 的 描绘 ， 例 如 转 录 所 需 的 序列 。 应 用 有 序 缺 失 方法 于 测序 工作 的 原理 是 使 克隆 在 质粒 载体 上 的 一 个 片段 的 各 个 连续 部 分 与 载体 上 的 测序 引物 位 点 相 邻 接 。 缺 失 是 用 大 肠 杆 菌 外 切 核酸 酶 焉 (Exo 亚 )5 单 向 消化 DNA 而 形成 。 如 果 末 端 为 平 末端 或 5’ 突出 端 ，Exo 亚 通 过 切除 3’ 端 核 苷 酸 消 化 掉 双 链 DNA 的 一 个 链 。3 ”端的 4 个 或 更 多 碱 基 的 突出 则 不 能 被 Exo TWH 这 里 介绍 两 种 制备 用 于 Exo 亚 消 化 的 模板 的 方法 ， 扼 要 总 结 在 图 42.1 中 。 方 法 I 从 双 链 质粒 DNA 开始 。 用 限制 酶 A 和 了 B 消 化 DNA， 这 里 A 产 生 接近 靶 序 列 的 $ 突 出 端 或 平 末 端 ，B 产生 接近 引物 位 置 的 3 突出 端 。 线 性 DNA 用 Exo 下 消化， 每 一 个 时 间 点 取 一 个 消化 产物 样品 ， 这 样 就 得 到 一 套 所 期 望 长 度 的 缺失 。 方 法 IC2] 从 鸣 菌 体 单 链 DNA 开始 。 用 一 个 引物 和 它 复 性 使 之 形成 一 个 具有 切口 的 双 链 环 ， 使 它 的 $ 端 接 近 插 入 片段 ， 然 后 用 T4 DNA 聚合 酶 合成 第 二 个 链 。 接着 用 Exo 开 消化 带 切口 链 的 3’ 端 。 剩 下 的 尚未 消化 的 单 链 用 S1 核酸 酶 消化 。 用 低 熔 点 凝 胶 电泳 检查 缺失 反应 效果 ， 并 从 切 下 的 凝 胶片 内 分 离 出 所 需 的 缺失 产物 5,4]。 这 一 步 的 目的 在 于 排除 不 含 所 需 缺 失 的 DNA。 在 稀释 的 琼脂 糖 凝 胶 上 用 Klenow DNA 聚合 酶 修复 未 端 ， 并 通过 连接 末端 而 环 化 。 转 化 进 大 肠 杆 菌 后 ， 挑 选 适当 克隆 作 测 序 用 。 方法 工 的 优点 是 可 从 插入 片段 的 两 侧 进行 缺失 ， 使 得 从 单个 质粒 开始 ， 就 可 以 对 插 入 片段 的 两 个 单 链 进行 测序 。 不 过 载体 上 的 多 聚 接头 内 的 限制 酶 切 位 点 并 不 总 是 能 满足 所 需 的 多 种 独特 位 点 的 要 求 ， 在 这 一 点 上 方法 I 更 具 优越 性 ， 因 为 它 不 需要 限制 酶 切 位 点 。 这 也 意味 着 用 方法 贡 可 使 用 通用 的 引物 从 任何 固定 的 一 点 开始 制备 一 个 缺失 系列 。 方法 I 革 的 缺点 是 对 插入 片段 的 两 条 链 测 序 ， 就 需要 DNA 片段 以 不 同方 向 插入 的 两 个 克 隆 。 不 过 两 个 方法 可 以 联合 应 用 ， 从 一 个 亲本 克隆 对 两 条 链 进行 测序 ， 降 低 了 对 多 个 惟 一 限制 酶 切 位 点 的 需求 。 在 设计 测序 方案 时 ， 要 充分 意识 到 虽然 对 方法 工 来 说 单 链 或 双 链 模 板 都 是 可 行 的 ， 但 方法 贡 惟有 双 链 模板 可 用 。 理由 是 对 多 数 喉 粒 载体 来 说 ， 合 成 切 口 环 第 二 条 链 的 引物 复 性 到 插入 片段 中 进行 单 链 模板 测序 时 的 引物 位 点 的 另 一 侧 。 0 FRE I ; 方法 Il 插入 片段 插入 片段 Grace 可 作为 单 链 模 板 的 引物 la) 作为 单 链 模 板 的 引物 | SS er 载体 atk 测序 引物 位 点 剖 \N\LD_ 展 制 醋 消 化 ] YN LI SEF 5' 突出 Z+L2> A Qa 3' 突出 \ Dom] 1 min 3 min 5 min 1 min 3 min 5 min 3) S1 核 酸 酶 消化 7 [2,Exo Il YH | DO TT a | VARY cua \ Do BARRE: [L9 7a 图 42.1 方法 的 提纲 。 2. 材 料 2.1 一 般 性 问题 酶 的 缓冲 溶液 用 经 高 压 灭 菌 的 蒸馏 水 配制 。 除 非 另 有 说 明 ， 溶 液 均 在 室温 中 贮存 。 酶 的 贮存 按 厂商 要 求 。 < 2.1.1 方法 I， 限 制 酶 消化 1) 10 wg 4 DNA: DNA Dy Oe RE Ze J ALB A VA GM Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) 的 多 克隆 位 点 中 。DNA 可 用 碱 裂解 方法 制备 45] (参见 注释 1)。 在 10 ml 加 适 量 选 择 药物 〈 如 氨 革 青霉素 ) 的 LB 培养 液 中 培养 过 夜 的 细菌 可 提供 足够 量 的 DNA。 限制 酶 及 缓冲 液 由 厂商 提供 。 选 择 一 种 只 在 多 克隆 位 点 中 邻近 插入 片段 的 部 位 切割 质粒 而 产生 5 突出 端 或 平 未 端的 限制 酶 (图 42.1 中 的 A )。 限 制 酶 B 也 必须 切割 多 克隆 部 位 的 专 一 位 点 以 产生 4 个 碱 基 的 3“ 突 出 端 ， 使 线 状 DNA 中 最 接近 测序 引 物 位 点 的 未 端 不 能 被 Exo 亚 消 化 。 如 果 得 不 到 这 样 的 位 点 ， 则 可 以 制造 一 个 5 突出 端 ， 然 后 用 au - 硫 代 磷酸 u - phosphorothionate KH Mit Klenow 片段 的 作用 将 来 Heeb ELS 3) M/A: 1:1 混 合 ，4 保存 。 4) 10 mol/L MRK. 5) ZB: 95% #1 70% (v/v). 6) 10X Exo I 缓冲 液 : 660 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 6.6 mmol/L MgCl。 2.1.2 FEI: 具 切 口 的 环 状 质粒 的 合成 7) RM: 2.5 pg BREVEHE DNA, 0.2~2.0 pg/ml。 小 规模 (2 一 3 ml 培养 物 ) 制备 应 产生 足够 量 的 DNAG]。 8) 引物 : a-T3 20-mer (5$ CCCTTTAGTGAGGGTTAATT3' )， 或 对 等 引物 ， 例 如 反 向 杂交 引物 17-mer ($'GAAACAGCTATGACCAT3')， 浓 度 为 4 pmol/pl; = 20T 保存 。 9) T4 DNA RAAB: 1~10 UV/ 由 i， 从 克隆 或 从 经 T4 感染 的 细胞 得 到 。 10) 10X TM: 660 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 30 mmol/L MgCh. 11) 2.5 mmol/L dNTPs: 四 种 三 磷酸 脱氧 核 苷 各 2.5 mmol/L; -20?7 保存 。 12) BSA: 1 mg/ml 牛 血 清白 蛋白 (无 核酸 酶 )，- 20 贮存 。 2 ~ 2.2 Exo 1 F0S1 核酸 酶 消化 13) E. coli Exo fl: 150~200 U/pl (1 U=37C # 30 min 产生 1 nmol MIHERABM 需 的 酶 量 )。 S1 缓冲 液 浓缩 物 : 2.5 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 醋酸 钾 (用 HClI 将 pH 滴定 到 4.6, 不 要 用 醋酸 )，10 mmol/L ZnSO,, 50% (v/v) 甘油 。 15) Sl 核酸 酶 : 60 U/l, MM Promega 购 得 (1 U= 在 37C 中 每 分 钟 释放 1 pe BARA 溶 的 核 苷 酸 所 需 的 酶 量 ) 。 也 可 用 Mung bean 核酸 酶 。 | S1 混合 液 : 27 wl Sl 缓冲 液 浓缩 物 ，173 ml 7K, 1 pl (60 U) S1 核酸 酶 。 临 用 前 配 制 ， 冰 上 贮 放 。 S1 终止 液 : 0.3 mol/L Tris 碱 (无 盐酸 )，50 mmol/L EDTA。 « 258 > 14 16 Te 17 Yo 2.3 凝 胶 纯化 ， 末 端 修复 ， 连 接 和 转化 18) 琼脂 糖 : 低 熔 点 琼脂 糖 ， 适 宜 于 作 克 隆 用 的 级 别 ， 例 如 Seaplaque GTG RAS (FMC). 19) Rk ZA: 10 mg/ml; 保存 在 深 色 容器 中 。 20) 50X TAE 电泳 缓冲 液 : 1 内 含 242 g Tris 碱 ，$7.1 ml 冰 醋 酸 ，100 ml 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0。 稀 释 后 得 到 1x 缓冲 液 ， 内 含 40 mmol/L Tris HRM, 1 mmol/L EDTA。 21) 10x 上 样 缓冲 液 : 0.25%R MH, 50% HH (wWv)， 蒸 馅 水 配制 。 22) 10 xKlenow 缓冲 液 : 20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 100 mmol/L MgCl. 23) Klenow #¥: E.coli DNA 聚 合 酶 的 大 片段 (2 U/pl). -20CKRF.~ 24) Klenow RAM: 每 10 pl 10 x Klenow 缓冲 液 中 加 1 U Klenow HF, FART BCH, Zk 上 放置 。 25) dNTPs: 0.125 mmolL 的 每 种 脱氧 核 苷 ，- 20Y 保存 。 26) 10x EAE MPM: 0.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCh, 10 mmol/L ATP; —20C 保存 。 27) PEG: 50% (w/v) 6000~8000 AHR AMCOB, 4CRF. 28) DTT: 0.1 mol/L 二 硫 苏 糖 醇 ，- 20T 保存 。 29) T4 DNA 连接 酶 : (1 U/pl), —20C0 保存 。 30) 连接 混合 液 : (1 mi): 570 wl HO，200 岂 连 接 酶 缓冲 液 ，200 pl PEG, 20 ul 0.1 mol/L DTT, 10 U T4 连接 酶 。 临 用 前 配制 ， 冰 上 保存 。 31) 宿主 大 肠 杆 菌 : 感受 态 的 recA 细胞 ， 例 如 DHSa。 32) 培养 基 : LB 培养 基 05] 。 3 潜 3.1 Exo 开 底 物 的 制备 3.1.1 方法 I， 限 制 酶 消化 1) 100 由 体积 中 彻底 消化 10 pe 质粒 。 在 每 一 设 定 的 酶 切 时 间 点 ， 样 品 的 消化 中 至 少 须 用 200 ng 的 质粒 〈 人 参见 注释 1)。 2) 提取 DNA 时 加 100 由 酚 / 氯 仿 ， 涡 旋 振 荡 ， 将 水 相 层 转移 到 新 管 中 。 3) 加 25 pl 10 mol/L BARA 200 pl 95% 乙醇 。 置 冰 上 15 min， 用 微型 离心 机 以 12 000 g 离 心 min. 4) 用 70% 乙醇 洗 沉 淀 ， 空 气 中 干燥 。 加 90 pl 蒸馏 水 和 10 pl 10 Exo DW 缓冲 液 (100 ng/ pl) H&K DNA 沉淀 。 3.1.2 FEL: 具 切 口 的 环 状 噬 粒 的 合成 1) ££ 22 pl AR PIRG 2.5 pwg 单 链 噬 粒 DNA，4 pl 10X TM, 1 ul (4 pmol) a-T3 引物 « 259 - (或 对 等 引物 )。 2) 75K 中 加 热 5 min。 然 后 在 30~ 60 min 内 慢 慢 冷却 。 置 铝 制 的 试管 加 热 块 中 加 热 ， 管 上 加 盖 一 片 绝缘 的 泡沫 塑料 以 减少 蒸发 和 浓缩 。 吸 取 2 yl 以 备 作 凝 胶 电 泳 分 析 。 3) 在 20 由 体积 中 混合 2 pl DTT, 4 pl 2.5 mmol/L dNTPs, 4 pl BSA, 5 U T4 DNA #& 合 酶 。 4) 预 热 到 37fC 并 在 这 温度 中 加 入 到 结合 有 引物 的 DNA 中 ， 保 温 2 一 8 h。 图 42.2 所 示 是 一 个 切口 环 的 例子 。 当 质粒 为 如 此 大 小 的 分 子 时 ， 作 者 建议 4 一 6 h 后 在 延伸 反应 物 中 再 加 0.4 mmol/L dNTPs 和 0.1 U/ 岂 聚合 酶 ， 然 后 保温 过 夜 。 为 了 监测 延伸 反 应 效果 ， 可 取 0.5 赂 反应 物 加 在 凝 胶 上 进行 电泳 。 5) 70C 加 热 10 min 使 孙 合 酶 失 活 ， 然 后 在 冰 上 贮存 。 M 1 2 3 4 ° 5°6 7 8 F 2S 图 42.2 PEATE HAY DNA 缺失 系列 在 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 上 的 电泳 噬 粒 ， 大 小 为 9.5 kb。 泳 道 1: 单 链 噬 粒 。 泳 道 2: 具有 切口 的 双 链 环 经 T4 DNA 聚合 酶 过 夜 延 伸 。 根据 凝 胶 的 状态 ， 可 能 会 偶尔 看 到 在 切口 环 的 下 方 有 一 个 不 是 主要 的 条 带 ， 它 可 能 是 以 自身 的 3 端 作为 引物 的 单 链 线 状 分 子 的 延伸 结果 器 。 泳 道 3 一 10:， Exo 1 Miki 2 中 的 材料 进行 消化 1，2……: 8 min 的 结果 。 泳 道 M: 1 kb 阶梯 相对 分 子 质量 标准 (BRL), 7 kb 条 带 与 消化 8 min 的 样品 迁移 到 达 同 一 位 置 上 。 3.2 Exo 下 酶 消化 为 有 一 定 程度 重 麦 的 连续 序列 ， 须 要 分 离 相 隔 200 一 250 碱 基 的 缺失 。 因 此 ， 4 kb 插入 片段 的 测序 须 用 16 一 20 个 时 间 点 人 见 注释 2) 。 下 述 方法 用 于 16 个 时 间 点 。 1) 配制 16 份 7.5 pl Sl 核酸 酶 (人 参见 注释 冰 上 RA. 4 -时 间 点 使 用 一 份 。 2) 将 40 岂 DNA 加 到 一 个 试管 中 〈( 见 3.1.4. dee 8 a a fe ir. DNA 升温 到 *。， 260 - 37C (BWIER 3). MM1~2 pl Exo I (5 一 10 U/pl), RAE PREKRIES. 3) 每 隔 30s 取 2.5 由 加 到 在 冰 上 的 预 置 有 S1 混合 液 的 管 中 ， 用 吸管 上 下 吹 吸 ， 置 于 冰 上 直到 全 部 时 间 点 处 理 完毕 。 4) 从 冰 上 取出 全 部 样品 ， 在 室温 中 放置 30 min 。 5) 加 1nMlSi 终 止 液 ， 加 热 到 70C ， 保 温 10 min 使 酶 失 活 。 3.3 凝 胶 纯化 ， 末 端 修复 ， 连 接 和 转化 1) 每 一 样品 中 加 1 pl 10x 凝 胶 上 样 缓冲 液 ， 上 样 到 以 1XTAE 电泳 缓冲 液 配 制 的 、 内 含 0.5 pg/ml 省 化 乙 锭 的 0.7% 低 熔 点 琼脂 糖 的 凝 胺 上 ， 以 3 一 4 V/em 电泳 大 约 2 h， 直 到 各 个 时 间 点 的 缺失 样品 能 够 分 开 (参见 注释 4)。 在 300 nm 的 紫外 线 光源 照射 下 用 一 小 药 匙 或 解剖 刀 从 胶 上 取出 所 要 的 条 带 。 2) MA 2 倍 体积 的 蒸 饮 水 稀释 凝 胶 切 片 ，68 习 熔化 5 min。 室 温 下 将 1/3 HRA DNA 转移 到 一 新 管 中 ， 新 管 中 盛 有 0.1 倍 体积 的 Klenow 混合 物 ， 反 复 上 下 吹 吸 使 混 匀 。 37 保温 3 min。 加 0.1 倍 体积 dNTPs FHIES, 37C 保温 5 min (参见 注释 5)。 3) 加 等 体积 的 连接 混合 物 ， 混 匀 ， 室 温 中 放置 至 少 1 h。 如 果 连 接 反 应 保温 过 夜 ， 可 获 最 大 量 的 转化 子 。 4) 用 每 一 连接 物 的 一 半 转 化 2~3 倍 体积 的 在 冰 上 解冻 的 感受 态 细 胞 ， 冰 上 放置 30 min, 42C 热 休 克 90 s，37 中 用 0.2 ml LB 培养 基 后 再 保温 60 min。 与 适当 的 选 择 性 培养 基 混 合 后 倒 入 平 亚 中 ，377 培养 过 夜 。 从 每 一 样品 所 获 菌落 可 达 500 个 。 这 取决 于 连接 反应 进行 的 时 间 及 细胞 的 感受 态 。- 20C 贮 存 剩余 的 连接 混合 物 。 5) 在 测序 前 从 每 一 时 间 点 取 一 个 菌落 建立 培养 物 并 抽 提 它 的 质粒 DNA， 验 证 每 一 DNA 样品 所 包含 的 缺失 是 否 是 所 期 望 的 大 小 。 4: 注 es (1) ExoE 在 切口 部 位 消化 DNA 就 像 在 未 端 一 样 有 效 ， 因 而 形成 非 期 望 的 克隆 的 背景 。 切口 可 因 DNA 中 的 杂质 或 由 限制 酶 所 引起 。 通 过 凝 胶 纯化 能 消除 这 种 背景 。 经 凝 胶 纯化 后 ， 质 粒 DNA 可 用 标准 的 碱 裂 解法 制备 ， 其 中 包括 酚 / 氯 仿 提取 步骤 !4]。 如 果 证 实 切口 确实 是 一 个 问题 ， 可 用 Qiagen Inc. (Chatsworth, CA) 的 预制 柱 纯化 超 螺旋 DNA。 限 制 酶 偶尔 也 会 产生 过 多 切口 或 出 现 “ 星 号 ”活性 。 试 用 不 同 厂 商 的 供 货 常常 能 够 解决 这 一 问题 。 (2) 37C 中 Exo 亚 每 分 钟 消化 400 一 500 个 碱 基 ， 在 30~40C 范围 内 ， 这 速率 直接 与 温 度 有 关 ， 大 约 为 10%/ 1CbD1。 建 议 选 少数 时 间 点 ， 对 DNA 样品 进行 Exo 亚 消 化 试验 。 这 样 做 的 理由 有 三 : a. 如 果 和 采用 方法 工 的 话 ， 便 可 以 证 实 两 种 酶 都 进行 了 完全 酶 切 (参见 注释 4). b. 对 于 一 个 特定 批号 的 Exo 焉 ， 可 以 得 到 精确 的 消化 率 。 c. 可 以 肯定 在 DNA 样品 中 不 存在 过 多 的 切口 〈 人 参见 注释 3)。 (3) 如 果 处 理 大 批 时 间 点 样品 ， 可 不 用 微型 离心 管 而 用 一 种 有 盖 的 锥 形 底 微 量 滴 定 板 更 > 261 - (4) (S) 为 有 效 。 这 种 滴定 板 可 用 于 S1 RRBK BE. BR A. ERR. ARS 修补 和 转化 。 偶尔 可 见 到 对 Exo 下 不 敏感 的 片段 ， 这 是 酶 A 消化 不 完全 的 结果 (图 42.1)。 只 要 这 种 片段 不 是 主要 带 型 ， 对 消化 片段 作 凝 胶 分 离 时 可 以 不 考虑 它 的 存在 。 相 反 地 ， 也 可 能 存在 消化 率 较 高 的 另 一 片段 。 这 是 酶 B 消化 不 完全 ， 以 及 其 后 Exo IBM 段 的 两 端 进行 消化 的 结果 。 同 样 地 ， 如 果 它 不 是 主要 的 产物 ， 凝 胶 分 离 应 当 能 解决 这 一 问题 。 代替 胶 内 连接 的 另 一 个 方法 是 将 未 端 修补 和 连接 合并 为 一 个 步骤 。 在 1 ml 混合 液 中 含 560 pl 2K, 200 pl 连接 缓冲 液 、200 pl PEG、20 pl DTT、 各 种 dNTPs 20 yl (2.5 mmol/L), 1 U T4 DNA 聚合 酶 和 10 U T4 DNA 连接 酶 。 混 合 稀释 凝 胶片 中 的 DNA 的 1/3 和 等 量 的 连接 混合 液 ， 室 温 保温 1 h 到 过 夜 。 依 照 3.3 步骤 4 的 方 法 进行 转化 。 We = 文 献 -一 . Henikoff, S. (1984) Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing. Gene 28, 351-359. 2. Henikoff, S. (1990) Ordered deletions for DNA sequencing and in vitro mutagenesis by polymerase extension and exonuclease III gapping of circular tem- plates. Nucleic Acids Res. 18, 2961-2966. 3. Nakayama, K. and Nakauchi, H. (1989) An improved method to make sequential deletion mutants for DNA sequencing. Trends Genet. 5, 325. 4. Steggles, A. W. (1989) A rapid procedure for creating nested sets of deletions using mini-prep plasmid DNA samples. Biotechniques 7, 241,242. . Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 6. Putney, S. D., Benkovic, S. J., and Schimmel, P. R. (1981) A DNA fragment with an a.-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from diges- tion by exonuclease III and can be replicated in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7350-7354. 7. Henikoff, S. (1987) Unidirectional digestion with exonuclease III in DNA sequence analysis. Meth. Enzymol. 155, 156-165. WN * 262 > 第 四 十 三 章 “ MI13 喉 菌 体 生长 和 单 链 DNA 制备 Fiona M. Tomley 1. 引 Tull M13 细菌 噬菌体 具有 一 单 链 DNA (ssDNA) 基因 组 ， 已 证 实 它 是 极为 有 用 的 载体 ， 从 中 可 以 取得 用 于 测序 和 定点 诱 变 的 单 链 模板 。 感 染 宿主 细胞 后 ， 叹 菌 体 DNA 开始 复 制 成 为 双 链 叹 菌 体 DNA 中 间 体 ， 由 此 产生 含有 ssDNA 鸣 菌 体 的 颗粒 。 被 感染 的 细胞 并 不 有 裂解， 相反 地 吹 菌 体 颗粒 却 持续 释放 。 不 过 ， 被 M13 叹 菌 体 所 感染 的 细胞 具有 较 长 的 复制 周期 ， 这 意味 着 在 整个 感染 过 程 中 生长 较 慢 的 细胞 区 域 在 未 感染 的 大 肠 杆 菌 背 景 中 呈现 为 半 透 明 的 叹 菌 斑 [1。MI13 重组 噬菌体 克隆 可 从 隔离 得 很 好 的 叹 菌 斑 取 得 ， 并 用 作 ssDNA 的 来 源 。 本 章 介绍 用 于 测序 的 M13 ssDNA 微量 制备 方法 。 该 方法 有 两 个 部 分 : 从 液体 培养 基 中 生长 的 细胞 取得 包装 的 颗粒 ， 以 及 用 酚 法 除去 外 壳 蛋 白 久 31]。 如 果 具 备 过 夜 培养 的 宿主 细菌 ， 本 方法 可 很 容易 同时 用 来 纯化 多 种 样品 并 且 只 需 一 天 时 间 。 2. 材 料 1) 适宜 于 细菌 M13 SAK EH E.coli 株 菌 。 推 荐 菌株 包括 JM101、JM103、 JMI107、JM109、TG1、TG2。 2) 2XTYAW: 1%RE AR, 1% BAHT, 100 mmol/L NaCl ， 以 每 管 $S0 ml 分 装 后 高 压 灭 菌 。 3) 容纳 1.5 ml 培养 物 的 灭 菌 管 ， 例 如 用 一 次 性 的 10 ml 的 Falcon 管 或 者 通用 的 塑料 或 玻璃 瓶 以 及 37 中 快速 振荡 用 的 旋转 式 摇 床 。 4) 微型 离心 机 和 1.5 ml 离心 管 。 5) PEG/NaCl: 20%PEG, 2.5 mol/L NaCl。 每 一 次 配制 100 ml， 经 过 滤 除 菌 后 AC 存 。 6) TE: 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0。 为 方便 起 见 ， 以 1ml 量 分 装 1 mol/L Tris-HCl 和 100 mmol/L EDTA, pH 8.0, -—20C PIC. BAAR, 稀释 到 100 ml, KH pH fA, WAZ ARE. 7) 酚 : VA 100~500 ml 量 分 装 较 高 级 别 的 重 蒸 酚 ，- 207 中 贮存 。 平 衡 时 先 加 热 到 室 温 ， 然 后 6SY 中 熔化 ， 加 羟基 唆 啉 到 浓度 为 0.1%。 在 熔化 的 酚 中 ， 加 等 体积 0.5 mol/L Tris-HCl. pH 8.0， 混 合 几 分 钟 后 使 两 相 分 开 ， 取 去 上 层 (Sw). A 0.1 mol/LTris-HCl, pH 8.0 重 复 抽 提 直到 酚 相 达到 pH 7.8 左 右 。 用 TE 抽 提 一 » 265 + 8 9 10 1 2 3 ) Yo ) Yo Ye ) 次 ， 去 除 水 相 ， 将 酚 贮 藏 在 深 色 瓶 中 ， 上 加 一 层 新 配 的 TE (100 ml 酚 中 约 加 20 ml)，4 和 贮存 。 新 鲜 酚 应 每 月 配制 一 次 。 Si: 使 用 未 经 在 空气 中 长 时 间 曝 露 的 高 级 别 的 氯仿 。 与 异 戊 醇 以 24:1 混合 ， 盖 紧 瓶 盖 室 温 贮存 。 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 5.2: 在 水 中 溶解 固体 醋酸 钠 ， 用 冰 醋 酸 将 pH 值 调整 到 5.2， 分 装 后 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 。 乙醇 : 为 方便 起 见 ， 盖 紧 瓶 盖 在 -20Y PRE. rl 法 KE. coli 宿主 的 新 近 划 线 接种 的 培养 四 上 的 单个 菌落 接种 到 装 有 10 ml 2xTY 培 养 液 的 250 ml 锥 形 瓶 中 ， 置 摇 床 上 37C 振荡 培养 过 夜 。 过 夜 培养 物 以 1:100 接种 入 2xTY， 以 取得 足够 提供 每 一 样品 1.5 ml 的 新 鲜 培 养 物 。 在 每 一 灭 菌 管 中 分 装 1.5 ml 培养 物 供 各 个 样品 用 。 ARATE) DER TOA APSR, ELS ml 含有 新 接种 的 细菌 的 管 中 洗 牙签 未 端 〈 人 参见 注 释 1 和 2)。 这 样 就 从 鸣 菌 斑 转 移 足 够 数量 的 感染 细胞 到 新 鲜 培养 物 中 。1.5 ml 的 培养 物 在 37Y PHM RGF 4.5~5.5h (参见 注释 3 和 4)。 4) 将 培养 物 转移 到 1.5 ml 微型 离心 管内 ， 离 心 Smin。 5 6 7 8 9 10 11 12 (1 ) YA ~— ) ) ) — — ol 将 上 清 液 转移 入 清洁 管 中 ， 确 保 沉 淀 物 不 被 搅动 。 每 一 管 中 加 200 pl PEG/NaCl, 涡 旋 振荡 混 匀 ， 置 室温 中 至 少 15 min. 用 微型 离心 机 离心 S min 以 沉淀 吧 菌 体 颗粒 ， 用 吸管 移出 含 PEG 的 上 清 液 ， 再 次 BOR Ht. ARMS) ORAM RATE ARM SHOR Li (SOLER 5)。 在 管 底 应 该 可 以 见 到 叹 菌 体 沉 淀 。 每 一 噬菌体 沉淀 中 加 入 100 pl TE， 剧 烈 涡 旋 振 功 以 确保 沉淀 物 得 以 悬浮 ， 然 后 加 50 由 酚 并 涡 旋 振 功 ， 留 置 几 分 钟 。 再 一 次 涡 旋 振 功 ， 离 心 2 min 将 相 层 分 开 。 仔细 将 上 面 的 水 相 层 转移 到 一 1.5 ml 新 管 中 ， 小 心 使 所 有 在 界面 上 的 沉淀 物 留 下 。 加 50 pl Ah, REG, Bo1 min 分 开 相 层 (参见 注释 6) 。 仔细 将 上 层 水 相 转移 到 1.5 ml 新 管 中 ， 加 0.1 体积 的 3 mol/L 酯 酸 钠 和 2.5 倍 体积 的 无 水 乙醇 以 沉淀 DNA。 用 微型 离心 机 离心 S min， 通 过 抽 气 去 除 乙 醇 ， 注 意 不 要 搅动 DNA 沉淀 ， 这 一 阶 Bri) DNA 沉淀 往往 只 能 隐约 看 到 。 加 200 由 70% 乙 醇 ， 离 心 2 min 后 非常 仔细 地 取出 乙醇 。 然 后 在 真空 中 干燥 几 分 钟 ， 或 者 将 管 敞开 经 蒸发 干燥 。 加 30 pl TE 溶解 沉淀 。 在 这 一 阶段 可 取出 几 微 升 (2~5 pl) 在 微型 胶 上 作 电 泳 以 检查 DNA 的 质量 和 产量 (参见 注释 7)。 其 余 DNA 于 -20?f 保存 备用 。 4. 释 如 果 噬 菌 斑 已 被 挑 取 并 在 平 咽 上 以 菌落 状态 再 度 生长 时 (例如 由 于 须要 通过 杂交 得 选 插入 片段 )， 制 备 ssDNA 用 的 培养 物 可 通过 下 列 方法 取得 ， 用 牙签 在 菌落 上 轻 轻 "264 。 接触 后 洗 入 1.5 ml 新 鲜 细 胞 悬 液 中 。 (2) 一 旦 获得 了 鸣 菌 斑 ， 最 好 尽快 地 将 只 菌 体 扩 增 并 将 DNA 纯化 。 因 为 如 果 叹 菌 体 在 4C 中 贮存 的 话 ， 叭 菌 斑 污染 的 机 会 将 增加 ， 而 且 DNA 质量 将 下 降 。 (3) 在 1.5 ml 管 中 不 要 生长 过 长 时 间 ， 因 为 这 将 导致 裂解 细胞 的 增加 ， 从 而 造成 宿主 DNA 的 污染 ， 并 增加 突变 叹 菌 体 的 出 现 概率 。 (4) 培养 温度 不 要 超过 37C ， 在 这 温度 中 虽然 宿主 细菌 可 生长 ， 但 M13 ee 将 随 温度 的 上 升 而 明显 下 降 。 (5) 确保 去 除 全 部 PEG， 因 为 它 将 在 测序 中 导致 较 高 背景 。 (6) 氯仿 提取 步骤 可 省 略 ， 但 如 果 要 获得 最 高 质量 的 模板 则 不 能 省 去 这 一 步骤 。 (7) 5~10 pg/ml 的 ssDNA 产量 是 正常 的 。 如 果 最 后 的 沉淀 以 30 由 TIE 溶 解 ， 约 4 一 8 已 足够 用 于 标准 的 双 脱 氧 方法 以 获取 高 质量 的 测序 结果 。 参考 文 献 一 . Marvin, D. A. and Hohn, B. (1969) Filamentous bacterial viruses. Bacteriol. Rev. 33, 172-209. Bankier, A. and Barrell, B. G. (1983) Shotgun DNA sequencing, in Techniques in the Life Sciences (Biochemistry), vol 85: Techniques in Nucleic Acid Biochemistry (Flavell, R. A., ed.), Elsevier, Amsterdam, pp. 1 一 34. . Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Small-scale preparation of single- stranded bacteriophage M13 DNA, in Molecular Closing, A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 4.29-4.30. Ww * 205 * 第 四 十 四 章 We hr eX Ahi ssDNA Michael K. Trower Ti 1oe3§ 制备 单 链 DNA 模板 对 于 DNA 测序 及 定向 诱 变 具 有 重要 的 意义 。 通 常情 况 下 ， 进 行 该 项 工作 是 将 要 分 析 的 DNA 区 域 亚 克 隆 到 源 出 于 单 链 DNA 鸣 菌 体 的 载体 上 ， 最 普 通 的 是 M13。 不 过 ， 虽 然 这 些 载体 适宜 于 产生 sDNA， 但 它们 使 用 起 来 不 及 质粒 方便 ， 比 双 链 DNA 产量 低 ， 且 缺少 可 供 正 向 选择 的 标记 。 称 作 叹 粒 (phagemid) 的 发 明 结 合 了 质粒 和 鸣 菌 体 两 者 的 优点 ， 这 项 工作 源 出 于 Zinder 的 工作 t0， 他 证 实 当 宿 主 细胞 通 WRU GET RORI, THA fl 丝 状 叭 菌 体 的 基因 间 区 有 段 的 质粒 可 被 包装 成 ssD- NA。 可 是 第 一 代 噬 粒 ， 即 pEMBL 载体 的 ssDNA 产量 低 并 且 不 可 重复 。 这 一 难题 通过 两 种 主要 方式 得 以 解决 : 第 一 ， 在 fl 的 基因 间 区 段 造成 缺失 可 促进 喉 粒 的 复制 如 ;第 二 ， 使 用 弱 复 制 起 点 的 辅助 叭 菌 体 可 极 大 地 改进 喉 粒 与 辅助 噬菌体 的 包装 比率 B]。 由 于 上 述 的 研究 工作 ， 具 有 稳定 性 以 及 便于 从 质粒 dsDNA 克隆 载体 取得 大 量 ssDNA 的 新 一 代 噬 粒 载体 就 此 具备 。 2. 材 料 除非 特别 说 明 ， 溶 液 均 在 室温 保存 。 通过 转化 将 叭 粒 引 入 含 适当 FAME. coli 宿主 菌株 ， 如 实验 室 常 用 的 菌株 JM109, NMS522, TG1 或 XL1-Blue (参见 注释 1 一 3) 。 2) Hi BN MER: M13K07 或 VCSM13。 它 们 的 典型 滴 度 是 101 一 1012 pfu/ml。 3) TBG 培养 基 : 配制 1L， 加 12 ¢ REAR, 24 g 酵母 提取 物 ，4 ml Hi, WRK 加 至 总 体积 882 ml， 高 压 灭 菌 。 冷 却 后 加 100 ml 灭 菌 的 0.17 mol/L KH>PO, 和 0.72 mol/L K2HPO4 溶液 ，18 ml 20% 葡 萄 糖 溶 液 (w/v). 20% 的 葡萄 糖 液 应 单独 高 压 灭 菌 。 4) FABER: 加 水 配 成 75 mg/ml 母液 ，- 20fC 保存 。 5) PEG/NaCl 溶液 : 20% (w/v) 聚 乙烯 乙 二 醇 6000 或 8000，2.5 mol/L NaCl。 6) TE 缓冲 液 : 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，1 mmol/L EDTA， 高 压 灭 菌 。 7) 酚 : 重 蒸 并 加 TE 缓冲 液 到 饱和 ，4 民 贮存。 8) 3 mol/L ARRAN, pH 5.2。 1 ~~ ae 法 1) 将 新 近 划 线 培 养 得 来 的 菌落 接种 到 2 ml TRG 培养 液 中 。 加 入 大 约 107 一 108 pfu/ml * 266 - 的 VCSM13 或 M13KO7 辅助 噬菌体 。 这 样 得 到 的 感染 倍数 (moi) 为 10 一 20 (参见 注释 4 和 5)。 如 果 质 粒 可 用 抗生素 科 选 ， 例 如 用 氢 苯 青霉素 (100 pg/ml)， 也 应 加 Ao 37C 中 强劲 通风 条 件 下 培养 he 加 2 pl KABBHR (75 mg/ml) 后 继续 生长 过 夜 ，VCSM13、MI13KO7 鸣 菌 体 都 对 于 这 一 抗生素 具有 抗 性 。 由 于 辅助 噬菌体 不 会 裂解 被 感染 的 细胞 ， 过 夜 培养 物 应 达 饱 和 生长 状态 。 转移 1.4 ml 过 夜 培养 物 到 1.5 ml Eppendorf 管 中 ， 以 13 000 g 离心 S min。 将 上 清 液 倾 入 一 新 管 中 ， 注 意 不 要 倒 进 细 胞 。 重 新 离心 S min， 并 将 此 上 清 液 再 次 倒 入 新 管 中 。 如 果 得 到 的 ssDNA 当时 不 能 进一步 处 理 ， 上 清 液 可 在 4 中 贮存 24 h， 不 过 在 继续 操作 前 必须 重新 离心 。 沉 证 可 以 丢 奔 。 加 200 pl PEG/NaCl 溶液 ， 混 合并 在 冰 上 放置 20 min, BOS min。 这 时 管 底 应 可 见 少量 沉淀 。 和 丢弃 上 清 液 ， 以 13 000 g 重新 离心 2 min。 以 微型 吸管 的 吸 嘴 小 心 移 去 残 存 的 PEG/NaCl 溶液 。 在 150 pI TE 缓冲 液 中 重 悬 沉淀 ， 加 等 体积 TE HAM. ERG 10~15 s， 试 管 放 置 $ min。 重 新 涡 旋 振 功 后 以 13 000 g 离心 3 min。 再 次 取出 上 层 至 新 管 中 。 不 必 担 心 上 层 很 浑 池 ， 这 些 制备 物 中 出 现 浑 间 相 当 和 党 见 加 150 wl Ai, HERG 10~15 s, MHS min. 重新 涡 旋 振 芒 并 离心 3 min， 再 次 将 上 层 转移 到 新 管 中 。 加 15 3 mol/L 醋酸 钠 (pH 4.8 一 5.2) 和 300 pl 乙醇。 将 管 放置 干冰 上 10 min 或 -20C 过 夜 。13 000 g 离心 10 min， 倒 掉 液 体 ， 重 新 离心 2 min， 用 微型 吸管 的 吸 嘴 取 出 残留 液体 ， 然 后 真空 或 空气 中 干燥 。 此 时 应 当 能 见 到 少量 沉淀 。 以 50 pl TE 或 水 溶解 沉淀 。 如 果 不 立 即使 用 ，- 20Y 保存 。 2 A 3 So 4 ~ 3 YA 6 4 7 aS ssDNA 产量 通常 约 每 毫升 肉 汤 培养 基 10 wg DNA. FI ZE 1% 琼 脂 糖 凝 胶 上 以 少量 提 取 物 (2 一 5 pl) 作 电 泳 来 鉴定 所 分 离 的 模板 质量 及 产量 。 用 省 化 乙 锭 染色 可 见 两 条 带 : 辅助 叭 菌 体 ssDNA FEAL ssDNA。 辅 助 鸣 菌 体 不 应 干扰 测序 反应 和 诱 变 反 应 。 4. 注 释 (1) PrAE. coli 菌株 必须 含有 下 "附加 体 ， 使 辅助 喉 菌 体能 够 感染 宿主 细胞 。 (2) 叭 粒 包 括 pUC118/9"), pBluescript II (Stratagene), pGEMZf£ (Promega) 系列 克 隆 载体 。 £1 复制 起 点 的 方向 决定 了 辅助 叹 菌 体感 染 后 产生 噬 粒 的 是 哪 一 条 DNA 链 。 一 般 把 吹 粒 的 两 个 链 称 为 (+ ) 和 (- )， 对 于 pBluescript II 叭 粒 来 讲 ， 它 们 分 别 指 从 lacZ 基因 得 来 的 有 义 链 和 反 义 链 。 在 设计 测序 引物 和 诱 变 引 物 以 确保 它们 能 与 获 LAY sDNA 模板 相 杂 交 方 面 ， 这 种 信息 是 至 关 重 要 的 。 moi 指 辅助 喉 菌 体 和 培养 物 中 的 细胞 数 的 比率 。 例 如 ，moi 为 10 时 意味 着 10 个 辅 助 吧 菌 体 对 一 个 细菌 细胞 。 一 般 情 况 下 ，moi 为 10 一 20 时 可 以 得 到 高 产量 的 ssDNA. 也 可 用 R408 辅助 噬菌体 ， 但 在 第 3 步 中 不 加 抗生素 ， 因 为 R408 不 具 卡 那 霉 素 搞 » 267 * (3 ~~ (4 YA a Ye 致谢 作者 感谢 剑桥 大 学 医学 系 的 Sydney Brenner 所 给 我 设计 这 一 方法 的 机 会 ， 此 外 ， 这 项 工作 还 得 到 上 .I. du Pont Nemours and Co. Inc., Wilmington, DE. 奖学金 的 资助 。 参考 文 献 1. Dotto, G. P., Enea, V., and Zinder, N. D. (1981) Functional analysis of bacterio- phage fl intergenic region. Virology 114, 463-473. 2. Zagursky, R. J. and Berman, M. L. (1984) Cloning vectors that yield high levels of single-stranded DNA for rapid DNA sequencing. Gene 27, 183-191. 3. Vieira, J. and Messing, J. (1983) Production of single-stranded plasmid DNA. Meth. Enzymol. 153, 3 一 1 1 . 5 第 四 十 五 章 ” 用 于 双 脱 氧 测 序 的 快速 质粒 纯化 法 1. 4] Ul 双 脱 氧 链 终止 法 的 DNA 测序 分 析 中 包含 从 单 链 模板 合成 DNA 1X —- 264), BA 从 宴 核 背 酸 引 物 复 性 的 位 置 开 始 。 传 统 上 ， 所 测定 的 是 由 单 链 的 M13 噬菌体 己 31 或 鸣 粒 多 所 产生 的 模板 序列 。 进 行 质粒 测序 具有 无 须 将 待 测 片段 亚 克 隆 进 MIS 的 优点 ， 并 且 通 过 反 向 引物 从 同一 质粒 可 测 出 两 条 链 的 序列 。 对 于 大 多 数目 的 ， 用 手工 操作 5 或 自动 测序 仪 呈 进行 线性 扩 增 (循环 测 序 ) 可 获得 最 为 满意 的 结果 。 不 过 经 变性 的 质粒 DNA 在 手工 操作 的 非 扩 增 方法 口中 也 可 作为 合适 的 DNA 模板 。 特 别 重要 的 是 当 制 备 测 序 用 的 质粒 DNA 时 应 十 分 注意 DNA 分 离 和 纯化 的 技术 。 大 多 数 与 质粒 测序 有 关 的 问 题 出 在 模板 的 质量 上 。 用 CsCl -省 化 乙 锭 梯度 离心 法 制备 的 质粒 DNALSI 可 用 作 测 序 的 模板 ， 但 不 一 定 比 微量 制备 DNA 方法 得 到 的 结果 更 好 。 有 多 种 微量 制备 DNA 方法 可 用 来 制备 测序 模 板 [9]。 使 用 碱 处 理 或 煮沸 〈 引 物 存在 时 ) 可 达到 变性 的 目的 。 对 于 线性 扩 增 测序 ， 事 先 变 性 并 无 必要 ， 因 为 质粒 在 热 循环 过 程 中 必 被 加 热 变 性 。 本 章 介 绍 一 种 微量 制备 方法 ， 其 中 包含 碱 裂解 法 tt01， 接 着 用 GeneCleane (一 种 纯 化 DNA 的 商品 试剂 盒 ) 纯化 DNA. GeneClean 试剂 盒 依 据 的 是 DNA 能 与 二 氧化 硅 基 质 结合 而 DNA 污染 物 则 不 结合 的 原理 ， 后 者 经 反复 洗涤 便 可 从 二 氧化 硅 - DNA 结合 物 上 除去 Q0。 所 取得 的 DNA 可 直接 用 作 循 环 测序 的 模板 或 经 碱 变性 后 用 于 测序 酶 DNA 聚 合 酶 Version 2.0 测序 。 2. 材 料 2.1 DNA 制 备 1) GET 缓冲 液 : $0 mmol/L 葡萄 糖 ，10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0。 配 成 的 溶液 应 以 10 lb/in* (68.9 kPa) HERE 15 min 后 4C 保存 。 2) 溶菌 酶 缓冲 液 : 在 GET 缓冲 液 中 以 每 毫升 20 mg 溶菌 酶 新 鲜 配 制 。 3) 碱 性 SDS: 200 mmol/L NaOH，1% SDS。 按 下 列 成 分 新 鲜 配 制 : 200 pl 5 mol/L NaOH, 500 pl 10%SDS， 加 4.3 ml 水 。 4) 3 mol/L ARRAN. pH 4.8。 用 六 醋酸 将 pH 值 调 节 到 4.8. 5) 酚 / 氯 仿 : 由 等 量 的 酚 和 氯仿 配 成 。 混 合 物 也 可 用 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.6) - 269 。 平衡 几 次 ， 但 这 并 非 必 要 。 2.2 DNA 纯化 (使 用 GeneClean-II 试剂 盒 ) 6) GeneClean-II 试剂 盒 可 从 BIO 101 Inc. (La Jolla, CA), 或 从 Stratech Scientific (Lu- ton, Bedfordshire, England) 购 得 。 此 外 ， 也 可 以 自行 配制 (BRB—+T+AB). 2.3 碱 变 性 7) 100% ZB. 8) 70% AE. 2.4 引物 复 性 9) 质粒 反应 缓冲 液 : (5x 涤 缩 ) 200 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，100 mmol/L MgCh, 250 mmol/L NaCl. 10) 51M: 0.5 pmol nl。 BMG 法 3.1 DNA fil 备 1) 5 ml 肉 汤 过 夜 培养 物 以 12 000 g 离心 S min (人 参见 注释 1) 收集 细胞 。 2) 在 100 岂 溶 菌 酶 缓冲 液 中 重 悬 沉淀 并 转移 到 新 的 1.5 ml 微型 离心 管 中 ， 然 后 冰 上 放置 30 min (参见 注释 2 一 5)。 3) 加 200 pl LYE SDS， 涡 旋 振 划 ， 然 后 冰 上 放置 $ min。 4) 加 150 pl 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 4.8, wei BAM ERE 20 min. 5) 在 微型 离心 机 中 以 12 000 g 离心 10 min, RR 0.4 ml 上 清 液 转移 到 一 新 管 中 。 6) 用 等 体积 酚 / 毛 仿 抽 提 两 次 。 3.2 DNA 纯化 (用 GeneClean-II 试剂 盒 ) 1) 从 GeneClean-II 试剂 盒 取 3 倍 体积 的 Nal 母液 加 到 酚 / 氯 仿 抽 提 过 的 微量 制备 物 中 (参见 注释 6、7)。 如 有 必要 ， 可 用 2 ml 微量 离心 管 。 2) 从 GeneClean-II 试剂 盒 取 5 pl GLASSMILK 悬 液 ， 加 入 后 混合 ， 室 温 放置 $ min. 3) 微型 离心 机 中 离心 s. 4) 移 去 上 清 液 ， 用 GeneClean-II 试剂 盒 的 NEW WASH 洗 沉淀 三 次 。 5) 小 心地 从 沉淀 中 移 去 最 后 的 痕 量 NEW WASH. 6) 将 DNA 洗 脱 在 100 pl 7K. 5 3.3 碱 变 性 碱 变性 对 热 循 环 测序 不 是 必需 的 。 1) FX 86 pl 444K AN DNA, D4 pl 5 mol/L NaOH 和 10 pl 2 mmol/L EDTA, 37C 保温 30 min (参见 注释 8). 2) FA 10 wl 3 mol/L 醋酸 钠 (pH 4.8) 中 和 。 3) 用 2 TERR 100% CBFFE — 70T 沉淀 15 min. 4) 用 微型 离心 机 离心 2 min Wize DNA. 5) 用 70% 乙 醇 洗 涤 沉 淀 。 6) 真空 中 干燥 ， 用 7 由 水 重新 溶解 沉淀 。 3.4 引物 -模板 复 性 反应 这 一 步骤 对 热 循 环 测序 并 非 必需 。 1) 在 小 的 微型 离心 管内 建立 下 述 反 应 : 1 wl 31M (0.5 pmol/ul), 2 pl 5x MALRMR 冲 液 ， 和 7 岂 变 性 的 质粒 DNA (参见 注释 9)。 2) HOSCKB#F 2 min, EKA 30 min 内 缓慢 冷却 到 300, MAKE (参见 注释 10). 3) 如 同 在 四 十 六 章 所 描述 的 那样 ， 用 测序 酶 Version 2.0 T7 DNA 聚合 酶 测序 。 热 循 环 测 序 按 文献 (A, A, AMAR) 进行 (参见 注释 11、12)。 4. eg (1) 重要 的 是 在 细菌 培养 物 离心 后 要 从 细胞 沉淀 中 去 除 全 部 肉 汤 培养 基 上 清 液 。 (2) 重要 的 是 要 确保 细菌 沉淀 能 在 溶菌 酶 缓冲 液 中 彻底 重 悬 。 剧 烈 地 涡 旋 振荡 可 达 此 目的 。 某 些 作者 指出 用 碱 裂 解 作 微量 制备 时 不 须 加 溶菌 酶 如。 我 们 认为 虽然 溶菌 酶 不 是 必要 的 成 分 ， 但 使 用 溶菌 酶 后 可 裂解 得 更 好 。 (4) 在 本 方法 中 RNase 处 理 不 是 必需 的 。 (5) 本 方法 适用 于 pUC AWB NR RMI REGED. WAR OL RR (Bi oT pBR322 及 其 衍生 物 )， 则 可 能 须要 放大 反应 规模 以 获取 同样 量 的 质粒 DNA。 (6) 微量 制备 质粒 DNA 常常 受到 小 的 寡 脱 氧 核 苷 酸 及 核糖 核 苷 酸 的 污染 ， 它 们 可 能 作为 引物 而 在 凝 胶 上 形成 微弱 的 背景 带 或 终止 物 以 及 其 他 矫 作 物 。DNA 聚合 酶 的 抑制 物 也 可 能 存在 。 按 照 作 者 的 经 验 ， 用 GeneClean 的 方法 纯化 DNA， 并 结合 用 测序 酶 DNA 聚合 酶 Version 2.0 测序 ， 可 减少 上 述 麻 烦 。 其 他 的 商品 试剂 盒 例 如 US Bioclean (可 从 United States Biochemical Corp. [ Cleve- land, OH] 或 从 Amersham Life Science [Little Chalfont, England] 等 处 购 得 )， 或 用 非 商品 试剂 的 实验 方法 依据 GeneClean 相似 的 原理 5%2 自制， 也 能 获 满意 结果 。 ae) i WG (3 YA (7 A (8) 双 链 超 螺旋 DNA 最 好 用 碱 变性 法 变性 。 者 沸 法 可 以 成 功 地 将 线性 DNA 变性 (A 引物 存在 时 )。 (9) 用 测序 酶 DNA 聚合 酶 对 质粒 DNA 测序 时 ，DNA 模板 略微 过 量 是 有 帮助 的 。 一 般 用 5 Hgo (10) 复 性 反应 混合 物 于 37TC 加 热 15 一 30 min 可 同样 达到 复 性 目的 。 (11) 对 变性 的 双 链 DNA 作 测 序 时 ， 用 较 长 引物 (25 一 29 个 核 苷 酸 ) 可 能 有 助 于 减少 矫 作物 条 带 。 (12) 测序 酶 DNA 聚合 酶 Version 2.0 用 于 双 链 DNA 测序 效果 恨 好 。 参考 文 mM 一 一 . Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. 2. Messing, J., Gronenborn, B., Miiller-Hill, B., and Hofschneider, P. H. (1977) Fila- mentous coliphage M13 as a cloning vehicle: insertion of a HindIII fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3642-3646. . Messing, J. (1983) New M13 vectors for cloning. Meth. Enzymol. 101, 20-78. 4. Zagursky, R. J. and Berman, M. L. (1984) Cloning vectors that yield high levels of single-stranded DNA for rapid DNA sequencing. Gene 27, 183-191. 5. Blakesley, R. W. (1993) Cycle sequencing, in DNA Sequencing Protocols. Meth- ods in Molecular Biology Series, vol. 23 (Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds.), Humana, Totowa, NJ, pp. 209-217. 6. Rosenthal, A. and Jones, D. S. C. (1993) Linear amplification sequencing with dye terminators, in DNA Sequencing Protocols. Methods in Molecular Biology Series, vol. 23 (Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds.), Humana, Totowa, NJ, pp. 281-296. 7. Griffin, H. G. and Griffin, A. M. (1993) Plasmid sequencing, in DNA Sequencing Protocols. Methods in Molecular Biology Series, vol. 23 (Griffin, H. G. and Grif- fin, A. M., eds.), Humana, Totowa, NJ, pp. 131—135. 8. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning—A Labora- tory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 9. Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds. (1993) DNA Sequencing Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 23, Humana, Totowa, NJ. 10. Birnboim, H. C. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513—1523. 11. Vogelstein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparation and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619. 12. Vieira, J. and Messing, J. (1982) The pUC plasmids, an M13 mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259-268. Ww - 272 - 第 四 十 六 章 ”应 用 测序 酶 Version 2.0 T7 DNA 聚合 酶 进行 DNA 测序 Carl W. Fuller, Bernard F. McArdle, Annette M. Griffin, Hugh G. Griffin Tl 1. 引 双 脱 氧 链 -终止 法 DNA 测序 中 包括 在 DNA 聚合 酶 作用 下 从 特异 引物 延伸 的 一 条 DNA 链 的 合成 赔 ， 为 达到 此 目的 ， 有 几 种 不 同 的 酶 可 供 选 用 ， 每 一 种 有 不 同 的 性 质 和 特点 。 鸣 菌 体 T7 DNA 聚合 酶 是 由 两 个 亚 单位 组 成 的 一 种 蛋白 质 咏 4]。 较 小 的 亚 单位 ， 硫 氧 还 蛋白 〈 相 对 分 子 质量 12 000) HE. coli 的 trz A 基因 产物 ， 较 大 的 亚 单位 〈 相 对 分 子 质 量 80 000) 是 T7 基因 5 的 产物 。 这 一 聚合 酶 有 两 个 已 知 催化 活性 ， 即 依赖 于 DNA 的 DNA 聚合 酶 活性 和 可 对 单 链 及 双 链 DNA 都 起 作用 的 3 一 $ 外 切 酶 活性 。 外 切 酶 活力 是 如 此 之 高 ， 以 至 于 该 酶 不 适 于 作 测 序 用 。Tabor 和 Richardsont5'5] 报 道 一 种 使 外 切 酶 氧化 失 活 而 几乎 不 影响 聚合 酶 活性 的 方法 !"'。 这 种 经 化 学 方法 改造 的 T7 DNA RAB 在 商业 上 称 Sequenace™ Version 1.0 T7 DNA 聚合 酶 。 此 外 还 有 用 基因 工程 方法 制造 的 、 在 催化 亚 单位 外 切 酶 结构 域内 少 了 28 个 氨基 酸 的 T7 DNA 聚合 酶 [9%,!01。 这 种 酶 具 有 极 佳 的 DNA 测序 性 能 ， 商 品名 称 为 测序 酶 Version 2.0 T7 DNA 聚合 酶 。 经 化 学 改造 和 通过 基因 工程 方法 得 到 的 酶 具有 相似 的 特征 和 相似 的 使 用 方法 6555。 . 这 里 只 讨论 测序 酶 Version 2.0 T7 DNA 聚合 酶 的 使 用 方法 和 结果 。 1.1 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 的 性 质 所 用 方法 和 DNA 测序 实验 结果 取决 于 DNA 聚合 酶 的 活力 和 特性 ， 包 括 酶 的 催化 速度 和 推进 能 力 ， 包 括 对 结合 在 模板 上 的 链 的 排斥 和 读 通 模板 的 二 级 结构 的 能 力 以 及 利 用 核 苷 酸 类 似 物 作 底 物 的 能 力 。 低 外 切 核酸 酶 活力 的 T7 DNA 聚合 酶 与 天 然 的 高 外 切 酶 活力 的 酶 不 一 样 ， 具 有 较 强 的 链 置换 活力 [9%,21， 使 经 改造 的 T7 DNA 酶 具有 能 够 对 二 级 结构 测序 的 能 力 。 经 改造 的 T7 DNA 具有 快速 的 催化 活力 (300 个 /s) 和 较 高 的 加 工 进 度 ， 能 与 引物 -模板 相 结合 而 催化 成 百 上 千 的 核 苷 酸 的 聚合 物 而 不 解 离 5]， 这 一 特点 有 助 于 消除 对 读 序 带 来 干扰 的 背景 终止 。 目前 所 经 常 进 行 的 DNA 测序 广泛 采用 核 苷 酸 类 似 物 做 标记 ， 以 使 压缩 的 条 带 分 开 并 用 于 链 的 终止 。 利 用 a - 硫 代 dNTPs 进行 的 一 S 标记 的 挫 入 率 基 本 上 与 正常 dNTPs 摊 入 率 相 等 ”21。 同 样 地 ， 用 于 消除 测序 胶 中 压缩 矫 作 物 的 dGTP 类 似 物 (包括 7- 1 deaza-dGTP 和 dITP) 可 通过 经 改造 的 T7 DNA KAMA EA I A HBA), Ze 各 种 用 于 测序 的 DNA 聚合 酶 中 ， 要 求 最 低 的 双 脱 氧 核 苷 酸 和 脱氧 核 音 酸 比率 ， 意 味 着 这 类 链 终止 核 苷 酸 有 较 强 的 活力 。 在 使 用 染料 标记 的 核 苷 酸 终止 物 荧 光 测 序 时 ， 它 可 以 同样 地 取得 较 好 的 结果 04]。 未 端 标记 的 一 个 重要 方面 是 由 于 因 测 序 条 带 强度 差异 而 表现 出 终止 速率 的 差异 。 由 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 得 到 的 条 带 强 度 在 约 4 倍 范围 内 作 较 小 的 变化 。 与 之 相 比 ， 用 Klenow 酶 在 测序 胶 上 形成 的 条 带 强度 的 变化 范围 高 达 14 倍 [13,18]。Tabor 和 Richard- son 报道 的 是 在 电泳 时 用 Mn2+ 代替 Mg2+ (或 者 外 加 Mn2+ ) 的 观察 结果 05'161。 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 用 Mn2+ 时 ， 须 用 较 低 的 双 脱 氧 核 苷 酸 和 脱氧 核 苷 酸 比 率 ， 较 加 Mg2+ 时 所 形成 的 条 带 明 显 地 更 为 均匀 062。 在 有 Mn2 的 情况 下 ， 超 过 95% 的 条 带 位 于 平均 强度 的 10% 范 围 内 。 条 带 强 度 的 均一 性 改进 了 机 器 读 序 结果 的 解释 06'19201。 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 加 Mn?* 可 用 于 采用 荧光 标记 的 引物 或 特别 设计 的 荧光 双 脱 氧 终 端 标记 以 取得 测序 数据 90144201。 1.2 测序 中 焦 磷 酸 酶 的 应 用 包括 T7 DNA 聚合 酶 在 内 的 所 有 的 DNA 聚合 酶 都 能 催化 焦 磷酸 盐 的 分 解 呈 ,21。 焦 磷酸 盐水 解 作 用 是 聚合 作用 的 道 反应 ， 其 中 DNA 的 3“ 端 碱 基 和 焦 磷 酸 反应 形成 脱氧 核 苷 三 磷酸 ， 使 DNA 分 子 缩短 一 个 碱 基 。 在 通常 用 于 合成 DNA 的 情况 下 〈 即 较 高 的 dNTP 浓度 和 较 低 的 焦 磷 酸 盐 浓 度 )， 正 向 反应 (聚合 反应 ) 明显 超过 逆向 反应 【〈 焦 磷 酸 盐 水 解 反 应 )。 不 过 如 果 给 予 足够 的 时 间 ， 焦 磷酸 盐水 解 作用 确实 在 某 些 条 件 下 发 4217) (E54 dITP 取代 dGTP 时 )。 焦 磷酸 盐水 解 作用 速度 随 相 邻 序列 的 变化 而 变化 ， 因而 减弱 某 些 条 带 的 强度 而 不 改变 另 一 些 条 带 02,22]。DNA 测序 反应 中 加 无 机 焦 磷酸 MB (来 自 酵母 菌 ) 可 稳定 全 部 条 带 的 强度 ， 即 使 在 保温 时 间 为 60 min 并 用 dITP 取代 dGTP Hit F. DIE RERAE TATA T7 DNA 测 序 方案 是 有 益 的 或 者 至 少 无 害 。 1.3 DNA 测 序 反 应 中 的 甘油 在 几 种 情况 中 在 测序 反应 中 加 入 S5% 或 稍 大 量 的 甘油 有 利于 测序 的 进行 。 最 简单 的 例子 是 在 DNA 聚合 酶 的 应 用 ， 聚 合 酶 贮存 液 中 的 甘油 可 采用 某 一 浓度 而 在 使 用 时 不 须 黎 释 。 此 外 ， 加 入 5$% 一 20% 的 甘油 可 使 反应 在 提高 温度 的 情况 下 顺利 地 进行 ， 而 且 可 、 以 改善 测序 结果 。 例 如 ， 标 记 反 应 的 温度 可 提高 到 37Y 而 没有 明显 的 酶 活力 丧失 ， 却 进一步 增加 了 引物 复 性 的 严格 性 ]。 而 且 终止 反应 可 在 加 甘油 的 条 件 下 用 较 高 的 温度 (37~SO0CT) 和 在 较 长 时 间 (10~30 min) 内 进行 。 较 高 温度 下 聚合 反应 可 以 更 迅速 ， 而 且 温 度 超 过 45 时 可 消除 某 些 模 板 的 二 级 结构 的 干扰 (参见 注释 1)。 1.4 耐 甘油 的 测序 胶 加 入 到 DNA 测序 凝 胶 中 的 样品 中 的 甘油 (一 般 每 一 泳 道 25 pe MBS) 可 引起 条 . 274 - ARTE RAS BA Se TH tH De PB AY 74), i RH HC 29 HH BE BS 1 300 ~ 500 个 碱 基 处 ， 使 得 测序 结果 难以 阅读 。 这 种 现象 值得 注意 是 因为 甘油 被 广泛 用 于 酶 的 保存 中 ， 例 如 用 于 DNA 测 序 的 DNA 聚合 酶 的 保存 。 已 知 甘油 与 硼 酸 反应 形成 在 测序 腕 上 移动 的 带电 Bem), TRE 中 的 硼酸 被 不 与 甘油 反应 的 弱酸 取代 时 便 不 出 现 扭曲 条 带 。 牛 磺 酸 是 硼酸 较 好 的 替代 物 。 以 20 倍 浓缩 的 Tris - 牛 磺 酸 - EDTA 很 容易 配制 ， 可 用 在 一 般 的 测 序 胶 中 取代 常用 的 TBE (5 一 10 倍 浓缩 物 )[23] 。 1.5 模板 和 引物 的 复 性 链 终止 测序 方法 最 初 应 用 单 链 DNA 模板 。 使 用 叹 菌 体 M13 作为 克隆 载体 可 以 满足 这 一 需要 。 单 链 喉 菌 体 DNA 只 须 与 寡 聚 核 苷 酸 引物 混合 后 在 37 一 70Y 作 短 暂 复 性 。 假 如 双 链 DNA 用 作 测 序 模 板 的 话 ， 首 先 须 对 模板 作 变 性 处 理 。 早 期 虽 有 几 种 质粒 DNA 测序 的 方法 ， 但 在 碱 变性 方法 问世 前 没有 一 种 方法 是 令 人 满意 的 [5-311。 最 初 的 碱 变 性 方法 包括 4 步 ， DNA 与 碱 混 合 ， 用 浓 醋 酸 盐 缓 冲 液 中 和 ， 用 乙醇 沉淀 ， 用 反应 缓冲 液 重新 溶解 DNA。 沉 淀 步 又 起 到 两 种 作用 : 浓缩 DNA 和 将 先前 加 入 的 盐 与 DNA 分 离 。 对 产生 适用 于 测序 的 单 链 模板 来 说 ， 这 些 步骤 效果 相当 不 错 ， 但 沉淀 及 重新 溶解 步 又 既 费时 又 费力 。 这 里 介绍 两 种 简便 而 有 效 的 不 须 沉 淀 质粒 DNA 的 变性 方法 。 在 第 一 种 方法 中 ， 直 接 将 NaOH 加 到 含 纯 化 的 质粒 DNA 和 引物 的 混合 物 中 使 双 链 DNA 变性 621。375 中 作 短暂 保温 后 准确 量 取 等 摩尔 的 盐酸 加 到 混合 物 中 以 中 和 其 中 的 碱 。 然 后 加 涤 缩 缓冲 液 (pH 固定 在 一 适当 的 值 )， 混 合 物 作 短暂 保温 以 使 引物 和 模板 中 适当 的 序列 复 性 。 NaOH 和 HCl 化 合 形成 了 NaCl, RA DNA 测序 混合 物 的 一 个 常规 成 分 。 只 要 NaClik 度 保持 在 大 约 低 于 0.2 moyL 以 下 ， 聚 合 酶 便 有 较 好 活力 并 可 获得 高 质量 的 测序 结果 。 在 第 二 种 方法 中 ， 双 链 质 粒 DNA 和 引物 中 加 进 乙 二 醇 试 剂 (50% 甘油 ，5$0% 乙 二 醇 ) 使 乙 二 醇 终 浓度 接近 40% 。 这 一 浓度 足以 降低 多 数 质粒 的 解 链 温度 到 < 90C 。 混 ADF 90~100T 保温 5 min 使 质粒 变性 。 变 性 后 加 缓冲 液 ，37?7 短暂 保温 以 使 引物 与 模板 的 适当 序列 复 性 。 这 种 方法 须 用 耐 甘油 的 测序 凝 胶 B3]; (参见 注释 1)。 1.6 两 步 反 应 法 模板 和 引物 复 性 后 聚合 酶 常 同 时 用 于 标记 测序 产物 及 序列 专 一 的 终止 反应 。 用 经 改 造 的 T7 DNA 聚合 酶 测序 的 最 常用 的 方法 由 两 个 连续 步骤 组 成 : 标记 步骤 和 终止 步 又 7181。 这 种 方法 与 Sanger 最 初 所 用 的 方法 不 同 。 其 中 标记 和 终止 在 一 次 反应 中 完成 ， 而 且 需 要 一 个 “追加 ”步骤 以 减少 背景 的 出 现 口 ]。 在 标记 步骤 中 ， 用 限量 的 核 苷 三 磷酸 延伸 引物 ， 其 中 包括 一 种 放射 性 标记 的 qdNTP。 反 应 液 中 的 多 数 核 苷 酸 ， 包 括 标记 的 核 苷 酸 ， 被 挫 入 到 较 短 的 DNA HH (小 于 50 个 核 苷 酸 )。 这 样 ， 标 记 物 便 高 效 和 定量 地 挫 入 DNA 链 中 。( 如 果 使 用 标记 引物 ， 则 上 述 标记 步骤 可 完全 省 略 )。 取 四 等 份 的 标记 过 的 反应 物 加 入 到 终止 反应 管 中 以 启动 终止 反应 。 终 止 反 应 管 中 预 先 加 有 全 部 三 磷酸 脱氧 核 苷 和 四 种 三 磷酸 双 脱 氧 核 苷 中 的 一 - 275 ， 种 。 控 制 核 苷 酸 的 温度 和 浓度 使 聚合 反应 迅速 并 连续 地 进行 ， 以 便 取 得 最 低 背 景 的 测序 结果 并 且 使 用 最 短 的 反应 时 间 。 加 甲 酰 胶 和 EDTA 以 终止 反应 ， 加 热 变 性 ， 土 样 到 电 泳 胶 上 。 2 ae 料 2.1 模板 和 引物 的 复 性 1) 反应 缓冲 液 (5 x WHR): 200 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5, 100 mmol/L MgCh, 250 2 S 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ) — ) ) ) ) Se Se A ol Ye mmol/L NaCl. 引物 : 0.5~2.5 pmol/pl. 2.2 标记 步骤 T7 DNA 聚合 酶 ， 用 化 学 方法 或 遗传 工程 方法 改造 过 的 酶 2,181]， 浓 度 调 整 到 13 U/ ul KA 1.0 mg/ml. 酵母 无 机 焦 磷酸 酶 ， 用 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mmol/L EDTA, 50% 1 油 配 成 5 U/ml WM. ER: 焦 磷酸 酶 可 和 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 预先 混合 ， 其 比率 为 0.004 U 焦 磷 酸 酶 :3 U 的 聚合 酶 。 (在 2SC 中 1 U 焦 磷酸 酶 每 分 钟 水 解 1 pmol/L 的 焦 磷 酸 盐 )。 酶 稀释 用 缓冲 液 :10 mmol/L Tris-HCLpH 7.5,5 mmol/L DTT,0.5 mg/ml BSA. 甘油 - 酶 稀释 用 缓冲 液 : 20 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5, 2 mmol/L DTT, 0.1 mmoMLEDTA，50% 甘 油 。 可 用 来 保持 较 高 浓度 的 甘油 ( 见 1.3 节 )。 DTT 溶液 : 0.1 mol/L. 标记 dATP: 可 以 是 [a-*P J-dATP. [a P] -dATP & [aS] -dATP， 用 于 序列 的 放射 自 显 影 检 测 。”“S、:?P 或 3P 的 比 活 应 为 1000 一 1500 Ci/mmol. 用 于 标记 的 dATP 的 标记 混合 物 (dGTP KRM): 1.5 pmol/L dGTP, 1.5 pmol/L dCTP 和 1.5 pmol/L dTTP (参见 注释 2)。 2.3 终止 步骤 ddG 终止 混合 液 : 80 pmol/L dGTP (或 7-deaza-dGTP), 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddGTP, 50 mmol/L NaCl. ddA 终止 混合 液 : 80 pmol/L dGTP (或 7-deaza-dGTP), 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddATP, 50 mmol/L NaCl. ddT 终止 混合 液 : 80 umol/L dGTP (7-deaza-dGTP), 80 pmol/LdATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddTTP, 50 mmol/L NaCl. ddC 终止 混合 液 : 80 pmol/L dGTP (7-deaza-dGTP), 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddCTP, 50 mmol/L NaCl. - 216 * 14) 终止 液 : 95% BERR, 20 mmol/L EDTA, 0.05%)/R MK, 0.05% — HAF FF. 2.4 质粒 DNA 测 序 15) 质粒 反应 缓冲 液 (5x 浓 缩 )， 200 mmol/L Tris-HCl. pH 7.5，100 mmol/L MgCh, ”250 mmol/L NaCl. | 16) NaOH 溶液 : 1.00+0.03 mol/L (必须 精确 ) 。 17) HCI 溶液 : 1.00+0.03 mol/L (必须 精确 )。 18) 质粒 变性 试剂 : 10 mmol/L Tris-HCI、pH 7.5，1 mmol/L EDTA, 50% HYH, 50% on 4 19) 20x 耐 甘油 凝 胶 缓 冲 液 : 1.78 mol/L Tis，0.58 mol/L 牛 磺 酸 ，0.01 mol/L NaEDTIA +2H,0. 2.5 增进 接近 引物 的 条 带 的 强度 20) Mn 缓冲 液 : 0.15 mol/L 异 柠檬 酸 钠 ，0.1 mol/L MnCl. 2.6 离 引 物 400 个 碱 基 之 外 的 测序 21) 测序 延伸 混合 物 (dGTP 反应 用 ): 180 pmol/L dGTP, 180 pmol/L dATP, 180 umol/L dCTP, 180 pmol/L dTTP, 50 mmol/L NaCl. 2.7 EE 缩 22) 用 于 标记 的 dATP 的 标记 混合 液 (7-deaza-dGTP 反应 ): 1.5 pmol/L 7-deaza-dGTP, 5 pmol/L dTTP, 1.5% anol/UdOTP Me ( diTP Ms 3.01 PndIAdITP/ 1.5 umol/L dCTP, 1.5 pmol/L dTTP. dITP 反应 的 终止 混合 液 : 23) ddG 终止 混合 液 : 160 pmol/L dITP，80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 1.6 pmol/L ddGTP, 50 mmol/L NaCl. 24) ddA 终止 混合 液 : 160 pmol/L dITP, 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 umol/L dTTP, 8 pmol/L ddATP, 50 mmol/L NaCl. 25) ddT 终止 混合 液 : 160 pmol/L dITP, 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddTTP, 50 mmol/L NaCl. 26) ddC 终止 混合 液 : 160 pmol/L dITP, 80 pmol/L dATP, 80 pmol/L dCTP, 80 pmol/L dTTP, 8 pmol/L ddCTP, 50 mmol/L NaCl. 测序 延伸 混合 液 (dITP 反应 用 ): 360 pmol/L dITP, 180 pmol/L dATP, 180 umol/L dCTP, 180 pmol/L dTTP, 50 mmol/L NaCl. 27 —— - 277 . is 法 3.1 模板 和 引物 的 复 性 每 组 四 条 测序 泳 道 (以 及 其 后 的 标记 反应 ) 只 用 一 次 复 性 反应 。 有 关 质 粒 DNA 模 板 的 变性 和 测序 见 3.4 节 。 1) 离心 管内 加 入 下 述 液体 : 1 pl 51H (0.5 pmol), 2 赂 反应 缓冲 液 ，1 ng DNA (如 用 dsDNA， 须 经 变性 处 理 )， 加 7 pl ddH2O 至 终 体积 10 pl. 2) BEB DSA OSC 加 热 2.min， 然 后 缓慢 冷却 至 室温 (大 约 需 30 min). 3) 复 性 后 将 管 放置 冰 上 ，4 h 内 使 用 。 3.2 mica B 1) FARA) i PER EAE T7 DNA 聚合 酶 至 工作 浓度 (1.6 U/yl). 2) 在 经 复 性 的 模板 -引物 中 (在 冰 上 ) 加 入 下 述 溶液 : 10 由 模板 -引物 ，1 pl DTT (0.1 mol/L), 2 pl HIDIRAMW, 0.5 pl [aS] -dATP (参见 注释 3)，2 vl 稀释 的 酶 (BRERA). EAR 15.5 pl. 3) 充分 混合 后 室温 中 放置 2 一 5 min (人 参见 注释 4)。 Yo 3.3 ik SR APR 1 Fl 2 最 好 在 开始 标记 反应 前 做 完 。 1) 取 四 支 试 管 标 记 G. A, THC. 2) G 管内 加 2.5 pl ddGTP 终止 混合 液 。 同 样 地 ， 将 2.5 wl ddATP、ddTTP 和 ddCTP 终止 混合 液 分 别 加 入 A、 工 和 C 管 。 盖 紧 管 口 以 防 蒸发 。 3) 加 标记 反应 液 前 至 少 37Y 预 热 试 管 1 min, 4) 标记 反应 完成 后 ， 取 3.5 由 反应 物 加 到 CEH, 37C 继续 保温 G 管 。 同 样 地 ， 取 反 应 物 3.5 所 分 别 加 到 A、C 和 T 管 中 ， 将 它们 返还 37 辫 水浴 中 。 继 续 保 温 ;， 总 时 间 为 3 一 5 min. 加 4 同 终 止 液 到 每 一 反应 物 内 ， 充 分 混合 ， 放 置 冰 上 保存 直到 准备 上 样 到 电泳 凝 胶 ER AE. APS 标记 的 样品 可 在 -20 保存 一 周 几乎 没有 损坏 。 用 32P 标记 的 样品 应 在 当天 上 样 。 准备 好 凝 胶 后 将 样品 75 一 80Y 加 热 2 min 后 立即 上 样 。 每 一 泳 道 加 2 一 4 plo 5 — 6 — 3.4 质粒 DNA 的 测序 去 得 到 最 佳 测序 结果 ， 重 要 的 是 要 用 高 质量 的 质粒 DNA。 含 大 量 切口 或 断裂 的 质 粒 DNA 可 能 产生 较 高 背景 和 因 链 断裂 而 出 现 的 假 性 条 带 。 双 链 DNA 必须 在 测序 前 作 278 ， 变性 处 理 。 本 文 叙述 两 种 方便 、 人 快捷 的 质粒 变性 方法 。 1) 双 链 DNA 通过 下 列 两 种 快捷 方法 之 一 变性 ， a. 碱 变性 法 (不 经 沉淀 ): 在 一 个 微型 离心 管 中 加 入 下 述 溶液 : 1~8 pl DNA (1~ 3ug), 2 pl 1.0 mol/L NaOH, 1 由 引物 (0.5~5 pmol)， 加 水 至 终 体积 11 vl, 底 混 匀 后 37C 保温 10 min。 混 合 液 放 置 冰 上 ， 加 2 pl 1.0 mol/L HCl, 2 pl 质粒 反应 缓冲 液 至 终 体积 15 pl, ARSE RR 2 进行 复 性 。 b. 加 热 / 乙 二 醇 变性 法 : 将 下 述 溶液 加 入 微型 离心 管 中 : 1~7 pl DNA (1 一 3 pg)， 5 凡 质 粒 变性 试剂 ，1 pl 引物 (0.5~5 pmol)， 加 水 至 终 体 积 13 ol, WRG (混合 物 较 黏 稠 )。90 一 100Y 保温 5 min 后 转移 到 冰 水 浴 中 ， 加 2 pl 质粒 缓冲 液 至 终 体积 1$ pl, MER 2 进行 复 性 。 2) 46 37C 保温 模板 /引物 /缓冲 混合 物 10 min 进行 复 性 ， 冰 上 冷却 。 3) 进行 标记 步骤 (3.2 节 )。 按 照 这 些 方法 ， 标 记 反 应 的 体积 会 大 于 上 述 容 积 。 因 此 ， 将 4.5 由 标记 混合 液 转移 到 每 一 终止 反应 管内 (G、A、T、C)， 按 实验 步骤 继续 进 行 (参见 注释 1). 4) 用 耐 甘油 凝 胶 缓 冲 液 配制 凝 胶 进 行 电泳 。 3.5 在 9%6 和 孔 微量 反应 板 上 进行 测序 耐 热 的 96 孔 TU 形 底 的 反应 板 是 同时 进行 几 套 终止 反应 的 理想 工具 。 应 当 注 意 不 要 让 反应 物 蒸发 至 干 。 除 非 试剂 是 特别 为 反应 板 测序 设计 ， 复 性 和 标记 反应 最 好 在 小 离心 管 里 进行 ， 终 目 反 应 则 用 反应 板 按 下 述 步骤 进行 : 1) 在 反应 板 的 恰当 的 孔 内 加 2.5 凡 终 止 混合 液 。 2) 标记 反应 接近 完成 时 ， 将 反应 板 放 在 37 人 电热 块 上 或 37 人 水 浴 中 使 终止 反应 得 以 预 热 。 3) 标记 反应 结束 后 将 3.5 凡 反 应 产物 转移 至 四 个 终止 反应 孔 的 每 一 也 中， 按 常规 混 5. 4) 终止 反应 37C 保温 直到 全 部 反应 至 少 进 行 了 2 min, (AA 10 min. 5) 从 37 人 水 浴 中 取出 反应 板 ， 加 4 岂 终 止 液 到 每 一 反应 孔 中 。 6) 临 上 样 前 在 电热 块 上 75T 加 热 反 应 板 2 min 使 反应 产物 变性 。 3.6 增进 靠近 5 物 端 的 条 阐 的 强度 即使 在 Mg Al Mn 都 存在 的 情况 下 ， 反 应 缓冲 液 中 增加 Mn?* 可 改变 各 种 dNTP 与 ddNTP 反应 强度 之 比 高 达 5 倍 45'16]。 因 此 ， 测 序 反 应 缓冲 液 中 加 入 Mn2+ 与 增加 四 种 ddNTP 的 相对 浓度 具有 相同 的 效果 。 这 导致 终止 作用 发 生 在 接近 引物 结合 位 点 ， 强 化 了 接近 引物 部 位 的 测序 。 这 一 作用 的 有 利之 处 是 当 反 应 系统 所 含 的 DNA 模板 量 少 于 正常 量 时 ， 将 导致 接近 引物 处 出 现 弱 的 条 带 。 在 Mn 存在 的 情况 下 ， 即 使 可 利用 的 模 板 量 较 少 ， 测 序 时 也 常会 恢复 接近 引物 的 序列 。 在 Mo 的 使 用 中 ， 只 要 在 加 稀释 的 酶 之 前 将 1 pl Mn 缓冲 液 加 到 标记 反应 中 便 行 了 (2.5 节 )。 。 279 > 也 可 在 标记 步骤 中 使 用 较 少 的 脱氧 核 苷 酸 以 获取 接近 引物 处 的 序列 。 只 要 将 2.2 8 中 所 讲 的 标记 混合 物 中 的 核 苷 酸 稀释 四 倍 ， 使 它 达到 0.38 pmol/L, AERA SID FH 仅 几 个 核 昔 酸 处 得 以 延伸 。 3.7 离 引 物 400 个 碱 基 之 外 的 测序 离 引 物 300 一 400 个 碱 基 处 的 序列 ， 只 须 依 据 上 述 方法 便 能 容易 进行 测序 。 为 了 进 一 步 扩展 序列 ， 可 利用 序列 延伸 混合 液 以 增加 终止 步 又 中 脱氧 核 苷 酸 与 双 脱 氧 核 苷 酸 的 比率 ， 从 而 增加 了 平均 延伸 长 度 。 该 方法 可 延伸 几 千 个 碱 基 而 不 削弱 接近 引物 的 序列 的 信息 。 重 要 的 是 ， 应 该 记 住 虽然 在 测序 反应 中 可 将 引物 延伸 达 几 千 个 碱 基 ， 但 目前 的 凝 胶 技术 还 不 能 解析 相对 分 子 质 量 大 于 700 个 碱 基 长 度 的 DNA 分 子 。 在 用 延伸 混合 液 时 ， 将 每 一 终止 混合 液 的 量 由 2.5 pol ES 内， 并 加 1 岂 的 延伸 混合 液 。 这 样 就 可 以 增加 脱 氧 核 苷 酸 与 双 脱氧 核 苷 酸 的 比率 达 2.5 倍 ， 如 有 必要 可 通过 实验 决定 使 用 其 他 比率 。 3.8 压缩 现象 DNA 测 序 的 最 后 步骤 包括 用 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 按 分 子 大 小 分 离 DNA。 完 全 按 分 子 大 小 进行 的 分 离 就 须 从 DNA 分 子 中 去 掉 全 部 二 级 结构 ， 一 般 通 过 在 胶 里 加 进 尿素 并 在 较 高 的 温度 中 进行 电泳 便 可 。 凝 胶 电泳 中 无 论 何 时 出 现 结构 稳定 的 DNA 二 级 结构 都 会 形成 人 为 条 带 压缩 现象 。 由 凝 胶 上 带 与 带 之 间 出 现 异 常 的 间隔 可 以 认识 这 种 压缩 现 象 : 几 个 序列 条 带 较 正常 者 更 接近 且 无 法 解析 ， 而 在 它 上 方 的 另 一 些 带 的 间隔 则 比 正 常 的 大 。 要 肯定 这 种 压缩 现象 的 存在 ， 重 要 的 是 要 看 条 带 挤 在 一 起 JEM) 和 条 带 间隔 过 K (“PK”) 这 两 种 现象 是 否 并存 。 条 带 压 缩 可 用 下 述 两 种 方法 之 一 加 以 解决 : 在 测序 反应 中 使 用 dGTP 类 似 物 或 者 增 强 胶 的 变性 条 件 。 使 用 核 苷 类 似 物 作 双 脱氧 测序 既 简 便 而 有 效 。 用 dITPL7'133] 或 7-deaza- dGTP03] 作 测序 的 核 苷 酸 混合 物 见 第 二 节 。 上 述 类 似 物 取代 dGTP 后 ，DNA 产物 与 dC 部 位 只 形成 较 弱 的 碱 基 对 ， 在 凝 胶 电 泳 中 容易 变性 。 即 使 最 不 容易 分 开 的 压缩 条 带 也 可 用 dITP 加 以 解析 ， 而 7-deaza-dG 则 不 大 可 能 解决 全 部 压缩 问题 ,34]。 不 过 ， 重 要 的 是 在 作 dITP 测序 时 要 同时 作 dGTP 测序 ， 因 为 用 类 似 物 测序 时 往往 会 出 现 其 他 假象 。 另 一 较 好 的 解决 方法 是 在 胶 中 加 进 较 强 的 变性 成 分 。 作 者 实验 室 常 用 7 mol/L (不 是 8 mol/L) 尿素 和 20% 一 40% 甲 酰胺 。 与 不 用 甲 酰胺 相 比 ， 这 种 凝 胶 的 聚合 须 3 一 5 倍 的 TEMED。 3.9 解决 四 条 泳 道 的 同一 位 置 上 出 现 条 带 的 问题 习 一 个 常见 的 测序 胶 上 的 假象 是 四 条 泳 道 的 同一 位 置 上 出 现 条 带 的 现象 ， 也 称 测 序 的 “停止 ”或 “暂停 ”。 在 这 里 可 观察 到 带 与 带 间 的 距离 并 不 改变 以 区 别 于 压缩 现象 。 “暂停 ”可 能 由 一 个 或 几 个 不 同 的 因素 所 造成 。 聚 合 酶 可 暂停 在 模板 DNA 的 特殊 的 二 级 结构 处 ， 特 别 是 使 用 如 dITP 之 类 的 核 苷 酸 类 似 物 时 。DNA 模板 制备 物 不 纯 ， 进 行 各 2。 步 测序 反应 时 的 温度 ， 或 者 混合 不 彻底 ， 都 可 使 聚合 效能 下 降 。 一 般 来 讲 ， 在 进行 终止 和 标记 反应 时 都 必须 仔细 通过 吸管 反复 吸 放 使 其 彻底 混 义 。 标 记 反 应 应 在 低温 (4 ~ 20C) 条 件 下 进行 ， 时 间 < 5 min。 终 止 反应 进行 前 须 将 终止 反应 混合 物 在 37~ 45 中 预 热 ， 然 后 加 入 标记 反应 产物 并 继续 保温 5 一 20 min。 本 文 提 出 了 几 条 减少 “暂停 ”的 建议 〈 参 见 注释 4)。 4 (1) 在 测序 反应 中 ， 质 粒 变性 试剂 、 酶 的 甘油 稀 释 缓冲 液 或 其 他 情况 中 加 入 甘油 时 ， 都 有 必要 在 测序 凝 胶 系 统 中 采用 耐 甘油 的 凝 胶 缓冲 液 ， 因 为 甘油 将 使 一 般 测 序 胶 上 的 条 带 发 生 严重 的 变形 。 见 1.4 和 2.4 节 所 载 的 20x 耐 甘油 胶 缓冲 液 。 (2) 本 文 所 载 的 标记 dATP 混合 物 的 浓度 相当 于 商品 试剂 盒 的 1:5 稀释 液 。 (3) 根据 实验 需要 调整 标记 核 苷 酸 的 量 。 (4) 关于 减少 “暂停 ”( 四 条 泳 道 的 同一 位 置 上 出 现 条 带 ) 的 建议 。 a. 降低 标记 反应 的 温度 和 /或 缩短 反应 时 间 (例如 4C 、5 min). b. 降低 dNTPs KEE (至 正常 量 的 一 半 或 四 分 之 一 ) 使 到 达 “ 和 暂停 ”部 位 继续 延伸 。 c. 对 有 问题 的 模板 使 用 较 多 的 聚合 酶 〈 例 如 超过 正常 3 一 8 倍 的 量 ) 可 能 解决 条 带 “暂停 ”现象 。 要 肯定 至 少 所 推荐 量 的 聚合 酶 已 完全 混 匀 在 标记 反应 物 中 (通过 吸管 的 反复 吹 吸 )。 d. 在 标记 反应 中 加 入 0.5 ul E.coli ssh 蛋白 有 时 能 有 效 地 消除 “暂停 ”条 带 。 如 果 使 用 ssb， 电 泳 前 必须 使 之 失 活 。 加 终止 液 后 加 入 0.1 pe BAM K, 65C 保温 20 min。 e. 使 用 高 浓度 的 dNTPs 和 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 的 追加 步骤 可 减少 测序 反应 中 的 “暂停 >， 特 别 是 在 包含 dITP 的 反应 中 B4]。 以 TE 缓冲 液 配制 四 种 mmol/L dNTPs 母液 。 将 母液 中 的 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 (TDT) 稀释 到 2 U/L, WE 冰 上 ， 临 用 前 稀释 配制 只 供 当 时 用 的 量 。 使 用 dGTP 或 dITP 标记 和 终止 混合 物 按 两 步 法 测序 ， 不 要 加 终止 液 。 终 止 反 应 完成 后 ， 每 一 终止 反应 管 里 加 1 器 TdT 稀释 液 ，37Y 中 保温 30 min。 每 一 反应 管内 加 4 岂 终 止 液 。 按 常规 加 热 变 性 并 上 样 测序 胶 。 . 对 于 疑难 的 测序 模板 ， 在 甘油 存在 的 情况 下 煮沸 变性 对 “暂停 ”条 带 的 解析 很 有 效 。 质 粒 测序 见 3.4 节 步 又 1b. . 或 是 对 另 一 链 用 一 新 的 引物 或 是 在 离 “ 暂 停 " 位 点 下 50 个 碱 基 处 引发 聚合 反应 。 -—_ 0a 参考 文 献 1. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. 2. Modrich, P. and Richardson, C. C. (1975) Bacteriophage T7 deoxyribonucleic acid replication in vitro. A protein of Escherichia coli required for bacteriophage T7 DNA polymerase activity. J. Biol. Chem. 250, 5508-5514. - 281 = Ww 12. 13. . Modrich, P. and Richardson, C. C. (1975) Bacteriophage T7 deoxyribonucleic acid replication in vitro. Bacteriophage T7 DNA polymerase: an enzyme composed of phage and host-specific subunits. J. Biol. Chem. 250, 5515-5522. Hori, K., Mark, D. F., and Richardson, C. C. (1979) Deoxytibonucleic acid poly; merase of bacteriophage T7. Characterization of the exonuclease activities of the gene 5 protein and the reconstituted polymerase. J. Biol. Chem. 254, 11,598— 11,604. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) Selective oxidation of the exonuclease domain of bacteriophage T7 DNA polymerase. J. Biol. Chem. 262, 15,330-1 pec Tabor, S. and Richardson, C. C. (1990) U.S. Patent 4,946,786. Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) U.S. Patent 4,795,699. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Selective inactivation of the exonuclease activity of bacteriophage T7 DNA polymerase by in vitro mutagenesis. J. Biol. Chem. 264, 6447-6458. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1990) U.S. Patent 4,942,130. . Patel, S. S., Wong, I., and Johnson, K. A. (1991) Pre-steady-state kinetic analysis of processive DNA replication including complete characterization of an exonuclease deficient mutant. Biochemistry 30, 511-525. Fuller, C. W. (1988) Sequenase® Version 2.0; a new genetically engineered enzyme for DNA sequencing. Editorial Comments 15(2), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, pp. 1-4. Mizusawa, S., Nishimura, S., and Seela, F. (1986) Improvement of the dideoxy chain termination method of DNA sequencing by use of deoxy-7-deazaguanosine triphosphate in place of dGTP. Nucleic Acids Res. 14, 1319-1324. . Lee, L. G., Connell, C. R., Woo, S. L., Cheng, R. D., McArdle, B. F., Fuller, C. W., Halloran, N. D., and Wilson, R. K. (1992) DNA sequencing with dye-labeled ter- minators and T7 DNA polymerase: effect of dyes and dNTPs on incorporation of dye terminators and probability analysis of termination fragments. Nucleic Acids Res. 20(10), 2471-2483. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Effect of manganese ions on the incorpora- tion of dideoxynucleotides by bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli DNA polymerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1990) U.S. Patent 4,962,020. . Fuller, C. W. (1989) Variation in band intensities in DNA sequencing. Editorial Comments 16(3), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, pp. 1-8. . Fuller, C. W. (1988) DNA Sequencing; Sequenase® users observations. Editorial Comments 14(4), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, pp. 1—7. . Kristensen, T., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Sproat, B., and Ansorge, W. (1988) T7 DNA polymerase in automated dideoxy sequencing. Nucleic Acids Res. 16, 3487-3496. . McArdle, B. F. and Fuller, C. W. (1991) Using Sequenase in automated DNA sequencing. Editorial Comments 17(4), United States Biochemical Corp., Cleve- land, OH, pp. 1-8, 17. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1990) DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Effect of pyrophosphorolysis and metal ions. J. Biol. Chem. 265, 8322-8328. - Ruan, C. C., Samols, S. B., and Fuller, C. W. (1990) Role of pyrophosphorolysis in DNA sequencing. Editorial Comments 17(1), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, pp. 1-27. 23. 24. = 26. zr 28. 29: 30. at, 32. 33 34. Pisa-Williamson, D. and Fuller, C. W. (1992) Glycerol tolerant DNA sequencing gels. Editorial Comments 19(2), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, pp. 1-7. Fuller, C. W. (1989) The effect of excess glycerol on DNA sequencing gels. Editorial Comments 16(2), United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, p. 19. Cotton, F. A. and Wilkinson, G. (1980) Advanced Inorganic Chemistry, John Wiley, New York, p. 298. Chen, E. J. and Seeburg, P. H. (1985) Supercoil sequencing: a fast and simple method for sequencing plasmid DNA. DNA 4, 165-170. Hattori, M. and Sakaki, Y. (1986) Dideoxy sequencing method using denatured plasmid templates. Anal. Biochem. 152, 232-238. Haltiner, M., Kempe, T., and Tjian, R. (1985) A novel strategy for constructing clustered point mutations. Nucleic Acids Res. 13, 1015—1026. Lim, H. M. and Pene, J. J. (1988) Optimal conditions for supercoil DNA sequenc- ing with the Escherichia coli DNA polymerase I large fragment. Gene Anal. Tech. 5, 32-39. Toneguzzo, F. Glynn, S., Levi, E., Mjolsness, S., and Hayday, A. (1988) Use of a chemically modified T7 DNA polymerase for manual and automated sequencing of supercoiled DNA. Biotechniques 6, 460-469. Hsiao, K. (1991) A fast and simple procedure for sequencing double-stranded DNA with Sequenase. Nucleic Acids Res. 19, 2787. Sequenase™ Quick Denature™ Plasmid Sequencing Kit, first edition (1993) United States Biochemical Corp., Cleveland, OH. Gough, J. A. and Murray, N. E. (1983) Sequence diversity among related genes for recognition of specific targets in DNA molecules. J. Mol. Biol. 166, 1-19. Fawcett, T. W. and Bartlett, G., (1990) An effective method for eliminating “arti- fact banding” when sequencing double-stranded DNA templates. BioTechniques 9, 46-49. + 2a ° 第 四 十 七 章 Be PE AG Ee 测序 胶 的 洪 注 Paul Littlebury Ti 1. 4l 测序 反应 的 产物 在 薄 的 、 低 浓度 (PR 6%) 的 聚 丙 烯 酰胺 胶 上 被 分 开 。 通 常情 况 下 这 种 胶 长 40 一 50 cm、 宽 20 cm, /Z0.3~0.4 mm。 长 达 100 cm 的 胶 和 更 宽 的 胶 也 可 被 灌 制 (以 便 阅 读 更 长 的 序列 和 上 样 更 多 的 克隆 )。 然 而 ， 大 型 胶 难 于 在 电泳 后 作 固 定 、 干 燥 、 自 显影 等 处 理 。 本 章 所 述 方法 只 设计 用 于 “标准 ”大 小 的 测序 胶 ， 但 对 大 型 凝 胶原 则 上 是 一 样 的 ， 除 了 需要 更 多 的 胶 混 合 液 以 及 可 能 需要 大 小 不 同 的 梳子 、 隅 条 及 玻璃 板 以 外 。 测序 凝 胶 灌 在 两 块 以 薄 的 隔 条 分 开 的 玻 板 间 ， 确 保 胶 形成 一 致 的 厚度 〈 厚 度 的 改变 将 变更 样品 的 移动 率 )。 在 仍 处 于 模子 中 的 凝 胶 上 加 样 和 进行 电泳 ， 玻 璃 板 可 为 易 碎 的 凝 胶 提供 支撑 物 。 因 此 ， 其 中 的 一 块 玻璃 必须 切 一 个 几 厘 米 深 、 和 玻 板 几乎 等 宽 的 目 槽 ， 以 便 为 阴极 提供 与 电泳 缓冲 池 的 接触 。 凝 胶 的 这 一 端 在 灌 胶 后 立刻 插 进 梳子 以 形成 加 样 孔 ， 梳 子 与 隔 条 厚度 相同 。 它 们 均 可 买 到 ， 也 可 采用 制 模 卡 〈PlastikardIY) 按 需 要 进行 切割 后 自制 。 适 用 于 宽 20 cm 的 胶 、 上 样 12 个 克隆 的 典型 的 梳子 应 具有 50 个 齿 (2 mm 宽 、3 mm 深 )。 本 章 介绍 如 何 灌 制 线性 胶 和 梯度 缓冲 液 胶 。 线性 胶 最 便于 灌 制 ， 但 每 一 克隆 常 只 能 阅读 序列 的 200~250 个 碱 基 ， 因 凝 胶 的 解 析 度 沿 胶 的 长 度 而 改变 。 在 凝 胶 的 底部 条 带 占 有 较 宽 的 空间 并 有 较 好 的 解析 度 ， 但 接近 胶 的 顶部 则 条 带 间 距 缩 小 而 难以 读 出 序列 。 与 线性 胶 相 比 ， 由 于 梯度 缓冲 液 胶 馈 的 底 部 30% 的 胶 里 的 DNA 分 子 的 移动 减 慢 了 ， 从 而 增加 了 可 读 序 列 的 量 。 这 种 方法 可 将 小 分 子 滞留 在 凝 胶 上 ， 使 位 于 项 部 凝 胶 内 的 分 子 电泳 较 长 的 时 间 ， 因 此 它们 可 得 以 较 好 地 分 开 。 配 制 梯度 胶 要 求 在 胶 的 底部 加 进 较 高 浓度 的 离子 。 因 此 灌注 梯度 缓冲 胶 须 用 两 种 不 同 离子 浓度 的 胶 混合 物 ， 首 先 以 较 高 浓度 的 混合 物 灌 注 ， 接 着 灌注 较 低 离子 浓度 的 胶 。 灌 制 梯度 胶 需 要 一 些 经 验 ， 因 为 要 确保 梯度 正确 地 形成 以 免 序 列 变形 。 2. 材 料 1) 10X TBE: 108 g Tris, 55 g 硼酸 ，9.3 g EDTA (二 钠 盐 )， 加 去 离子 水 到 1 L。 如 果 形 成 沉淀 则 丢弃 。 2) 40% 丙 炳 酰胺 (19:1): 380 g 丙烯 酰胺 (Electran-BDH), 20 g N,N'- 亚 甲 双 -丙烯 酰胺 (Electran-BDH) 加 去 离子 水 到 1 L。 加 20 g Amberlite MBI 树脂 ， 轻 轻 搅拌 10 min， 过 滤 后 4 中 保存 (参见 注释 1) 。 * 284 - 3) 0.5X TBE 凝 胶 混 合 液 : 75 ml 40% 丙烯 酰胺 (19:1), 25 ml 10X TBE, 230g 素 ( 超 纯 级 ) 。 加 去 离子 水 到 500 ml。 过 滤 后 AC 中 保存 可 达 一 个 月 。 4) 5X TBE 6% 凝 胶 混合 液 : 30 ml 40% 丙烯 酰胺 (19:1), 100 ml 10xTBE，92 gk 素 〈 超 纯 级 )。 加 去 离子 水 到 200 ml。 过 滤 ，4 中 保存 可 达 一 个 月 。 5) 25% 过 硫酸 贸 : 加 在 去 离子 水 中 到 25% (ww) KE. 4C 中 可 保存 几 个 月 。 6) TEMED: N,N,N“,N“- 四 甲 基 - 1,2 -二 氨基 乙 烷 。4? 中 保存 。 7) 二 甲 基 二 氯 硅烷 溶液 : 硅烷 化 玻 板 用 。 8) 玻璃 板 : 50 cmx20 cm. 9) 隔 条 : 50 cmx0.5 cm x0.35 mm 厚 的 塑料 制品 。 10) ft: 5 cmX15 cmx0.35 mm 塑料 制品 。 11) 防水 黏 胶带 及 折 丢 夹子 。 “有 法 3.1 测序 玻 板 的 安装 1 S 温水 清洗 一 对 玻璃 板 ， 然 后 用 蒸馏 水 淋 洗 。 如 果 每 次 使 用 后 玻 板 都 保持 清洁 ， 并 无 必要 用 清洁 剂 处 理 ， 玻 板 置 空气 中 干燥 。 在 通风 柜 中 硅烷 化 每 一 玻 板 的 一 面 (参见 注释 2)。 用 纸巾 对 所 选择 的 一 面 涂 布 2 ml 硅烷 剂 ， 注 意 使 玻 板 面 全 部 涂 满 ， 玻 板 留置 在 通风 柜 中 5 一 10 min 待 干燥 。 用 少量 乙醇 措 洗 玻 板 ， 确 保 玻 板 光亮 无 尘埃 ， 否 则 在 灌 胶 时 将 引起 凝 胶 起 泡 (参见 注释 3)。 4) 沿 一 块 〈 常 是 不 带 凹 槽 的 一 块 ) 玻璃 板 的 每 一 长 边 各 放置 一 个 隔 条 ， 将 第 二 块 玻 板 正 对 第 一 块 摆 放 ， 使 两 个 硅烷 化 的 面 形成 胶 模 的 内 壁 。 在 一 侧 用 夹子 夹 住 玻 板 ， 以 胶带 封 住 玻 板 的 另 一 侧 和 底部 ， 将 夹子 转换 到 已 封 住 的 一 侧 ， 然 后 封 住 全 部 的 边 。 如 有 必要 的 话 ， 可 用 胶带 沿 底部 和 两 角 封 第 二 层 ， 以 减 少 漏 胶 的 可 能 。 Zz SA 3 we 5 Se 3.2 线性 测序 凝 胶 的 灌 制 1) 将 50 ml0.5SxTBE 的 6% 的 凝 胶 混 匀 并 加 热 达 室温 。 2) 上 述 胶 中 加 100 pl 25% RRA 100 pl TEMED， 转 动 混 匀 。 3) 将 凝 胶 吸 进 SO ml 针 简 内 〈 不 用 针头 )， 以 稳定 流速 注射 到 玻璃 板 模 的 两 块 玻璃 板 间 。 胶 进入 玻 板 的 流速 可 通过 改变 玻 板 的 角度 来 控制 。 一 有 旦 凝 胶 注 满 到 胶 模 的 顶端 ， 以 正好 超过 梳 齿 根部 为 度 插入 梳子 。 夹 住 玻 板 的 顶部 及 底部 ， 以 确保 凝 胶 厚度 均匀 一 致 。 放 置 30 min 使 凝 胶 聚 合 (参见 注释 4)。 4 4 3.3 梯度 缓冲 液 凝 胶 的 灌 制 1) 预 热 凝 胶 混合 液 达 室温 。 制 备 缓冲 液 梯度 胶 需 要 50 ml 0.5xTBE 凝 胶 混 合 液 及 10 0“ ml 5 X TBE 凝 胶 混 合 液 。 2) 将 100 pl TEMED 和 100 pl 25% st wiAR HINA 0.5x TBE 凝 胶 混合 液 中 ， 并 取 20 ul TEMED 和 20 pl 25% 过 硫酸 铵 加 到 5xTBE 凝 胶 混 合 液 中 。 3) 使 用 25 ml 吸管 吸取 7 ml 0.5xTBE 凝 胶 混 合 液 ， 接 着 再 吸取 7 ml 5x TBE BBE 合 液 〈 参 见 注释 $)。 该 两 种 凝 胶 混 合 液 应 在 界面 上 混合 ， 方 法 是 用 吸管 吸 进 少量 气泡 ， 使 它们 在 凝 胶 混 合 液 中 逐渐 上 升 。 4) 将 混合 液 从 一 侧 或 胶 模 的 中 心 灌 入 。 5) 一 旦 吸管 排 空 ， 降 低 模子 到 水 平 位 置 以 阻止 凝 胶 进 一 步 流动 。 将 剩余 的 0.5xTBE ERE SRE SO ml 注射 器 里 ， 把 它 注 入 胶 模 达 顶 部 而 把 梯度 混合 液 冲 到 底部 。 插入 梳子 ， 夹 住 玻 板 ， 放 置 30 min 使 凝 胶 聚 合 。 4. 注 aE (1) 丙烯 酰胺 为 一 种 强烈 的 累积 性 的 神经 毒物 。 称 量 或 处 理 含 丙 烯 酰胺 的 固体 或 液体 应 戴 手 套 和 面 畦 。 凝 胶 应 在 塑料 盘 中 灌 制 以 防 泄漏 和 溅 出 。 聚 丙烯 酰胺 被 认为 是 无 毒 的 ， 但 仍 应 戴 上 手套 ， 因 为 可 能 有 残存 的 未 聚合 的 丙烯 酰胺 存在 。 (2) 许多 人 只 硅烷 化 一 块 玻璃 板 ， 理 论 上 凝 胶 会 黏着 在 未 硅烷 化 的 一 块 玻璃 板 上 。 但 实 际 上 并 非 如 此 ， 凝 胶 似乎 以 相同 的 效率 黏着 在 任何 一 块 玻 板 上 ， 因 而 对 两 块 玻 板 硅 烷 化 似乎 有 助 于 凝 胶 的 灌 制 。 (3) 如 果 出 现 气 泡 的 话 ， 可 用 以 下 两 种 方法 加 以 排除 。 使 胶 模 装置 处 于 垂直 位 置 并 轻 轻 拍打 玻 板 ， 气 泡 就 会 升 到 胶 顶 并 消失 。 或 者 ， 可 用 一 旧 的 X 射 线 底 片 将 气泡 推 到 凝 胶 的 一 侧 ， 在 这 个 位 置 上 不 会 干扰 样品 的 电泳 。 (4) 凝 胶 聚 合 的 速率 可 通过 改变 TEMED 量 来 控制 。 初 次 灌注 梯度 凝 胶 时 如 果 把 TEMED 减少 10 一 20 由 常常 是 有 帮助 的 ， 这 会 给 新 手提 供 更 多 时 间 来 灌 胶 并 排除 灌 胶 中 形成 的 气泡 。 (5) 使 用 缓冲 液 梯度 凝 胶 时 ， 只 须 改 变 两 种 混合 液 的 离子 浓度 就 可 改变 梯度 。 例 如 ， 加 入 的 SxTBE 混合 液 越 多 ， 梯 度 就 越 陡 。 参考 文 献 1. Biggin, M. D., Gibson, T. J., and Hong, G. F. (1983) Buffer gradient gels and 35S label as an aid to rapid DNA sequence determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965. * 286 - 第 四 十 八 章 MAE Se RE a BY HL ok Alan T. Bankier Tl 1. 4 Sanger!!] a # Maxam 和 Gilbert!? 44 DNA 测序 方法 都 是 根据 能 够 对 长 度 只 差 一 个 核 苷 酸 的 单 链 DNA 分 子 进 行 分 离 和 解析 的 原理 。 已 有 报道 称 可 在 1 m KNBR 胺 凝 胶 上 对 长 度 为 0.6 kb 的 序列 作出 解析 9]。 阅读 长 序列 更 为 实用 的 系统 采用 较 短 的 缓冲 液 梯 度 凝 胶 〈 人 参见 第 四 十 七 章 ) 多 次 上 样 〈 电 泳 时 间 约 3 h 和 6 h)， 并 将 聚 丙烯 酰胺 的 浓度 降低 到 3.5% 。 即 使 用 了 这 些 技术 ， 在 常规 操作 中 ， 测 序 精 确 性 的 限度 估计 为 每 一 模板 4530 二 500 个 核 苷 酸 。 在 具有 重复 性 特点 的 鸟 枪 法 中 ， 跑 胶 似乎 成 了 限 速 步 又， 这 使 得 在 每 一 次 缓冲 液 梯度 凝 胶 电 泳 或 攀 形 凝 胶 电 泳 中 以 阅读 350 个 碱 基 为 更 有 效 % -6]。 电 泳 后 对 凝 胶 作 放射 自 显影 处 理 ， 由 于 具 放射 活性 的 同位 素 标记 的 碱 基 已 通过 聚合 反应 而 挫 入 ， 因 而 可 呈现 每 一 条 带 的 位 置 。 用 荧光 方法 观察 样品 现在 常用 相似 于 胶片 曝光 的 方法 检测 条 带 5]。 自 动 化 的 荧光 检测 方 法 可 用 来 直接 在 胶 上 进行 检测 ， 而 不 须 对 凝 胶 进 行 处理 和 自 显 影 (参见 第 五 十 一 章 )。 EPP 标记 的 测序 中 ， 可 在 覆盖 保鲜 膜 的 湿 胶 上 进行 直接 自 显影 ， 但 凝 胶 干 燥 后 自 显影 可 获得 较 大 的 解析 度 。 凝 胶 底 部 的 放射 性 粒子 向 各 个 方向 放射 出 来 ， 使 位 于 凝 胶 表 面 的 曝光 结果 显得 宽 而 弥散 。 如 果 凝 胶 在 放射 自 显 影 之 前 干燥 ， 这 种 放射 状 的 扩散 可 明 显 减少 。 如 果 用 ”>S 标记 ， 因 发 射 光 的 能 量 较 低 ， 所 以 必须 对 凝 胶 先 行 干燥 处 理 。 最 方 便 的 是 用 加 热 的 真空 干燥 器 干燥 凝 胶 ， 需 时 <1 h。 在 已 经 考虑 到 亚 克 隆 方法 中 的 所 有 问题 ， 例 如 冒 着 健康 危险 处 理 有 害 物 质 ， 不 经 意 地 操作 一 些 极 微量 的 试剂 ， 以 及 成 功 地 处 理 了 可 能 导致 自 显影 图 谱 弯 曲 变形 的 易于 破裂 的 凝 胶 之 后 ， 在 操作 中 的 最 困难 的 事情 还 可 能 依然 存在 。 准 确 阅 读 测序 胶片 是 一 项 技术 性 较 强 的 工作 。 虽 然 有 一 些 像 本 章 一 样 的 准则 可 供 遵循 ， 但 没有 任何 东西 可 替代 来 自 对 已 知 序 列 和 推导 的 序列 的 比较 并 调整 两 者 的 差异 而 得 来 的 实际 经 验 。 有 几 种 胶片 扫描 仪 和 和 旨 在 解释 测序 数据 的 软件 可 以 利用 ， 最 有 名 的 如 Amersham Autoreader (Amersham, Arlington Heights，IL)。 这 类 仪器 的 性 能 在 逐步 改良 ， 但 就 总 体 而 言 ， 它 们 均 依 赖 于 输 入 资料 的 质量 。 归 根 到 底 任何 机 器 都 难以 接受 实际 上 难以 阅读 的 胶片 。 2. 材 料 1) 凝 胶 电泳 仪器 。 仪 器 不 须要 太 复 杂 ， 因 为 满意 的 结果 可 用 较 便 宜 和 简单 的 系统 取 得 。 2) 至 少 能 提供 2000 V 电压 的 高 压 电 源 〈 直 流 输出 )， 供 20 cmx50 cmx0.3 mm 厚 的 - B87 。 凝 胶 用 的 电泳 条 件 为 15300 V. 30 mA 左右 。 10 TBE: 108 g Tris BR, 55 g 硼酸 ，9.3 g NaEDTA， 以 去 离子 水 溶解 ， 配 成 终 体积 1 L。 甲 酰胺 染料 混合 液 : 100 ml 去 离子 甲 酰胺 ，0.1 g 二 甲苯 青 FF，0.1 g 溴 酚 蓝 ，2 ml 0.5 mol/L NaEDTA。 染 料 混合 液 在 一 般 温 度 中 可 保存 几 个 月 而 几乎 不 会 影响 结果 ， 但 建议 溶液 分 装 小 份 后 冰冻 保存 。 甲 酰胺 为 危险 品 ， 刺 激 皮 肤 和 眼睛 。 用 狭 窗 或 扁平 头 的 一 次 性 吸 嘴 上 样 ， 也 可 使 用 装 细 针头 的 Hamilton /) 4h. AB 验 的 人 常用 接 在 用 嘴 吸 的 管 上 的 拉 尖 的 毛细 管 ， 但 出 于 安全 的 考虑 ， 应 当 尽量 避免 这 类 操作 。 6) Whatman (Maidstone, UK) 3 MM 滤纸 ， 按 稍 大 于 凝 胶 的 大 小 切割 。 7) Saran Wrap 或 相当 的 膜 ， 如 不 渗水 的 食物 保鲜 膜 。 8) Be BE + He BS, Savant (Hicksville, NY) SGD4050 或 BioRad (Richmond, CA) SE1125B. 9) 高 压 真 空 泵 。 油 和 泵 需要 精心 地 维护 ， 如 果 凝 胶 在 干燥 前 固定 ， 酯 酸 将 迅速 损坏 油 Ro. RA CRRA ENP RS, Tre (例如 Vacuubrand GMBH). Fuji RX 或 相当 的 X 射 线 底片 。 某 些 底片 曝光 速度 很 快 (较为 晶 贵 )， 但 不 一 定 适 用 于 自动 测序 。 11) 自 显影 用 的 不 漏 光 底片 匣 。 12) 底片 加 工 用 的 试剂 。 3 Yo 4 Ye 5 YA 10 Yo ae 法 本 文 所 描述 的 方法 包括 三 个 方面 : 凝 胶 电泳 、 自 显影 和 读 胶 。 3.1 Be BE AB ik 1) 从 聚合 的 胶 底 部 取 去 全 部 胶 封 带 ， 从 凝 胶 顶 部 取出 梳子 ， 并 用 去 离子 流水 冲洗 样品 孔 (参见 注释 1)。 2) 如 果 使 用 获 鱼 齿 梳 子 ， 小 心地 将 它 横 跨 胶 的 整个 宽度 均匀 地 插 到 整个 胶 面 里 ， 直 到 杭 齿 正好 进入 胶 的 表层 。 3) 将 凝 胶 和 电泳 槽 装配 好 ， 使 带 止 槽 的 玻璃 板 面向 上 面 的 缓冲 液 槽 ， 在 上 下 缓冲 槽 中 都 装 满 1xTBE。 4) 用 TBE 彻底 冲洗 样品 孔 ， 用 滴 管 或 注射 器 吸出 全 部 未 聚合 的 丙烯 酰胺 。 凝 胶 预 先 电 泳 不 是 绝对 必要 的 ， 但 如 果 需 要 的 话 ， 可 将 仪器 盖 上 盖 ， 接 上 高 压 电 源 ，30 V/em 大 约 电 泳 30 min (参见 注释 2)。 5) 如 果 样 品 保存 在 -20C ， 则 在 冻 融 后 每 管 加 2 凡 甲 酰胺 染料 混合 液 。 临 上 样 前 将 样 品 作 变 性 处 理 后 放置 冰 上 。 试 管 中 制 备 的 样品 应 当 在 70C 中 变性 3 min, 6) 切断 电 瀛 电源， 冲洗 顶部 凝 胶 的 样品 孔 以 排除 扩散 出 凝 胶 的 尿素 。 7) 用 一 效 在 小 容量 吸管 上 的 细 口 聚 丙 烯 吸 嘴 在 每 一 孔 中 加 入 约 2 由 样品 。 同 一 吸 嘴 只 。 288 - 须 在 下 面 的 缓冲 液 槽 中 淋 洗 一 次 便 可 重复 使 用 。 如 果 由 于 气泡 使 少量 样品 阻塞 在 吸 嘴 中 ， 可 把 吸 嘴 丢 弃 在 放射 性 废物 箱 中 并 换 一 新 的 吸 嘴 〈 参 见 注释 3 和 4)。 8) 待 所 有 的 样品 都 已 上 样 后 盖 上 盖子 并 接 通 高 压 电 源 。 在 约 30 V/cm 条 件 下 进行 电 ik, BERG RPA HRN (参见 注释 5 和 6)。 3.2 凝 胶 的 干燥 和 自 显 影 1) 电泳 完成 后 切断 电泳 装置 的 电源 ， 倒 掉 上 槽 中 的 缓冲 液 ， 按 推荐 方法 处 理 下 槽 中 放 射 性 缓冲 液 。 从 电泳 装置 中 取出 整体 凝 胶 及 其 支撑 玻 板 ， 去 除 留 在 上 面 的 封闭 胶带 。 2) 将 有 止 槽 的 一 端 向 上 ， 在 两 块 玻 板 间 插 入 刮刀 并 轻 轻 转动 刮刀 以 援 开 两 块 玻璃 。 假 如 凝 胶 粘 着 在 带 止 槽 的 玻 板 上 ， 取 出 刮刀 后 连同 胶 和 玻 板 整体 倒 过 来 ， 援 开 背 面 的 玻 板 。 如 果 凝 胶 始 终 同 时 粘着 在 两 块 玻 板 上 ， 最 好 将 整体 浸 于 水 中 或 10% 醋酸 中 ， 这 时 手动 玻 板 时 便 可 以 使 凝 胶 与 上 面 这 一 玻 板 上 脱离 。 将 一 块 坚 实 的 塑料 网 覆盖 其 上 ， 在 其 后 的 操作 中 凝 胶 就 可 保持 这 一 状态 (参见 注释 7)。 3) 在 浅 盘 内 将 胶 浸 没 在 约 1L 10% RRP 10~15 mn 以 透析 出 尿素 。 如 果 浅 盘 底 上 没 有 高 出 的 脊 粱 ， 则 应 不 时 地 轻 轻 摇动 液体 。 取 出 仍 处 在 玻璃 板 上 的 胶 ， 尽 可 能 地 沥 干 上 面 的 液体 〈 人 参见 注释 8). 4) 从 一 端 向 前 或 从 中 心 向 两 端 展开 卷 拢 的 3 MM 滤纸 ， 使 纸 平稳 而 均匀 地 放 在 胶 上 并 将 凝 胶 转 移 到 纸 上 ， 轻 轻 地 使 纸 直 接 完全 接触 整个 胶 面 ， 然 后 将 纸 揭 离 玻璃 板 。 5) 将 一 层 保 鲜 膜 (Saran Wrap) 覆盖 胶 面 ， 切 除 过 多 的 3 MM 滤纸 或 膜 。 修 剪 胶 的 顶 部 和 各 边 ， 使 之 能 放 进 凝 胶 干 燥 器 ， 在 真空 中 80C 烘 干 15 min. 6) 从 干 胶 上 取 下 保鲜 膜 ， 将 干 胶 放 入 不 漏 光 的 X 射 线 片 匣 中 使 与 底片 紧密 接触 。 曝 光 时 间 根 据 不 同 的 标记 物 而 定 ， 如 果 上 样 的 是 全 部 样品 ， 而 且 使 用 ”>S 作为 标记 物 ， 则 曝光 18 一 36 h BAY, WAP 则 理想 曝光 时 间 可 短 到 1 h (参见 注释 9)。 7) 按照 供应 商 推荐 的 方法 处 理 X 射 线 底片 。 3.3 Kk BR 原则 上 ， 从 自 显 影 底 片 的 四 条 轨道 上 的 条 带 来 推导 一 个 序列 应 当 是 简单 的 。 由 于 各 种 分 子 根 据 其 相对 分 子 质 量 大 小 被 分 开 ， 所 要 做 的 无 非 是 确认 从 底部 到 顶部 连续 条 带 的 位 置 。 如 果 下 一 条 带 出 现在 A 泳 道上 ， 那 么 该 序列 的 下 一 个 碱 基 必 定 是 A 碱 基 。 几 种 情况 可 能 搅乱 这 一 理想 的 状况 。 两 条 带 的 前 后 位 置 可 能 不 清晰 ， 特 别 是 所 关注 的 条 带 是 在 靠 外 侧 的 轨道 上 。 两 个 或 更 多 的 条 带 可 能 占据 了 同样 的 垂直 位 置 ， 或 者 一 些 假 条 带 妨碍 我 们 对 特定 位 置 上 碱 基 的 确认 ， 在 一 些 理应 出 现 条 带 的 位 置 上 却 似乎 是 空 的 。 除 上 述 种 种 情况 以 外 还 可 能 有 模板 质量 差 ， 测 序 反应 不 完全 以 及 凝 胶 电泳 和 自 显 影 等 方面 的 问题 。 大 概 读 胶 的 最 好 教训 是 知道 什么 时 候 该 不 读 。 大 多 数 错 误 是 尝试 阅读 劣质 胶片 上 的 序列 或 者 是 过 于 深入 到 解析 度 较 差 的 区 域 。 最 终 ， 错 误 读 序 将 不 得 不 与 其 他 准确 的 序列 进行 协调 ， 这 将 是 很 耗 时 的 。 很 常见 的 情况 是 放置 几 周 或 数 月 后 再 读 胶片 时 ， 第 一 印象 - 289 - 是 完全 不 敢 相信 和 曾经 读 过 这 个 序列 。 读 胶 的 准则 中 包括 一 般 性 的 叙述 以 及 特定 克隆 或 测序 方案 所 预期 的 非常 特殊 假象 的 叙述 。 这 里 只 叙述 直接 有 关 的 内 容 ， 然 后 再 涉及 其 一 般 内 容 。 许 多 假象 可 能 与 特殊 试剂 有 关 ， 它 们 可 通过 对 照 加 以 验证 。 3.3.1 有 关 读 序 的 一 般 问 题 1) 由 于 在 凝 胶 上 产生 的 许多 不 正常 条 带 的 迁移 速率 问题 往往 与 较 高 的 G/C 序列 有 关 ， 所 以 将 这 两 个 轨道 放 在 彼此 邻近 的 位 置 比 较 合 理 。 最 常用 的 轨道 排列 为 ACGT 和 TCGA. 读 序 前 应 先 对 数据 做 一 般 性 的 质量 评价 并 决定 是 否 值得 读 序 。 应 当 综观 条 带 的 清晰 度 、 弥 散 物 背 景 存 在 与 否 ， 以 及 有 无 额外 条 带 。 确保 最 适当 的 曝光 时 间 。 曝 光 过 短 可 能 使 弱 条 带 消 失 。 曝 光 时 间 过 长 可 能 增加 弥散 背景 和 假象 。 如 果 使 用 “P， 过 度 曝光 将 大 大 地 降低 解析 度 。 标 出 或 描 出 四 条 轨道 以 免 各 条 轨道 间 相 互 混淆 ， 并 且 标 出 端点 。 这 点 可 能 就 是 质量 和 解析 度 低 于 所 要 求 的 标准 的 位 置 ， 或 者 是 短 的 插入 片段 连接 到 载体 的 位 置 。 阅读 条 带 的 间隔 可 能 与 阅读 条 带 本 身 一 样 重要 。 始 终 要 注意 所 关注 的 条 带 位 置 上 是 否 出 现 空 除 。 在 条 带 次 序 含糊 的 地 方 ， 常 常 可 通过 比较 附近 区 域 中 邻近 条 带 的 间隔 而 推论 正确 的 条 带 次 序 。 在 一 特定 的 空隙 里 ， 应 当 能 估计 出 该 有 多 少 条 带 。 如 果 连 续 出 现 不 能 解释 的 条 带 ， 使 用 瘤 鱼 齿 杭 可 能 对 正确 读 胶 有 所 帮助 。 采 取 这 一 措施 后 ， 在 相 邻 轨道 常 可 发 现 小 的 重 至 ， 从 而 使 序列 解释 变 得 容易 。 读 序 不 要 中 途 停顿 ， 一 旦 开始 便 应 从 下 至 上 一 次 读 完 。 停 顿 一 会 儿 后 ， 很 可 能 从 错 误 的 点 重新 开始 阅读 ， 尤 其 是 在 具有 重复 序列 时 更 是 如 此 。 自 显影 片上 的 小 斑点 或 线条 常 因为 胶 上 的 气泡 或 颗粒 引起 ， 一 般 可 以 避免 。 灌 胶 前 应 确保 玻璃 板 清洗 干净 。 避 免 用 卷 简 纸 来 擦洗 ， 以 免 在 玻璃 板 上 留 下 颗粒 。 出 现 模糊 的 斑 块 ， 可 能 是 凝 胶 与 底片 未 能 紧密 直接 接触 的 缘故 ， 或 者 是 凝 胶 聚 合 得 不 均匀 所 致 。 这 些 斑 块 也 可 能 是 因为 电泳 过 快 而 引起 局 部 温度 过 高 所 致 。 3.3.2 测序 中 的 常见 问题 和 假象 高 弥散 背景 一 般 与 特定 的 DNA 模板 有 关 。 用 酚 或 氯仿 抽 提 和 乙醇 沉淀 以 进一步 纯 化 模板 并 不 总 能 解决 背景 问题 。 条 带 强度 的 差异 常 由 酶 的 内 在 性 质 所 决定 。 它 们 是 碱 基 序列 特异 的 ， 并 以 可 预测 的 状态 出 现 。 测 序 酶 中 加 入 锰 离 子 可 使 条 带 强度 非常 均一 。 3) “条 带 堆积 "。 四 条 轨道 上 几乎 在 同样 的 位 置 上 出 现 条 带 ， 这 是 非特 异性 终止 的 结果 。 主要 原因 是 聚合 酶 不 能 通过 模板 内 的 二 级 结构 (不 同 的 聚合 酶 或 不 同 批号 的 同样 的 酶 可 在 一 定 程度 上 解决 该 问题 )， 或 者 由 于 双 链 DNA 复 性 而 导致 聚合 反应 的 阻 断 ， 这 在 PCR 产物 的 测序 中 是 相当 常见 的 现象 。 这 两 个 问题 均 可 通过 促使 模板 内 结构 不 稳定 而 得 以 缓解 ， 例 如 可 增加 延伸 反应 的 温度 或 降低 反应 溶液 的 盐 浓度 。 如 果 不 能 解决 问题 ， 则 必须 更 换 聚 合 酶 ， 这 种 情况 最 可 能 的 原因 是 使 用 了 低 质量 的 酶 。 影子 带 ， 即 在 其 他 轨道 上 的 微弱 的 额外 条 带 ， 可 能 是 由 于 下 述 几 个 原因 之 一 。 假 如 - 290 «- 2 ~~ 3 Yo 4 Yo 5 ~~ 6 ~~ 7 SS 8 ~~ 9 YA 1 Yo 2 — 4 ee Oe ES SS “OGA ce are ee! bb rt 5 Ye 6 Yo i Se 8) (1) (2) (3 ad (4) (5S) 阴影 只 出 现在 邻近 的 轨道 上 ， 这 可 能 是 由 于 样品 溅 到 旁边 的 孔 中 所 致 。 随 机 分 布 的 弱 的 条 带 可 能 意味 着 存在 第 二 背景 序列 。 这 可 能 起 因 于 从 琼脂 平 血 上 挑 取 喉 菌 斑 时 因 朴 忽而 碰 到 了 另 一 叹 菌 斑 ， 或 由 于 叭 菌 体 在 生长 中 发 生 缺 失 而 使 模板 丰 度 下 降 ， 或 者 是 与 非特 异性 的 引物 结合 的 缘故 。 最 后 ， 一 些微 弱 的 假 带 是 某 些 聚合 酶 特有 的 ， 它 出 现在 什么 位 置 由 碱 基 序列 所 决定 。 比较 清楚 但 却 很 微弱 的 条 带 可 能 是 模板 或 引物 浓度 较 低 所 引起 ， 或 因 复 性 温度 过 高 而 导致 引物 结合 效率 不 高 所 致 。 “压缩 "， 在 序列 的 特异 位 置 上 条 带 间隔 所 占 空 间 减 小 或 缺失 ， 伴 随 一 个 异常 大 的 空 白 区 ， 这 可 能 是 在 凝 胶 电 泳 过 程 中 的 二 级 结构 所 导致 。 条 带 强度 分 布 不 均衡 ， 表 示 双 脱氧 核 苷 酸 和 脱氧 核 苷 酸 比 率 不 恰当 。 在 较 短 距离 中 出 现 强度 高 峰 意 味 着 双 脱 氧 核 苷 酸 浓度 太 高 ， 而 较 长 距离 中 呈现 高 强度 峰 则 表示 双 脱氧 核 苷 酸 浓度 过 低 。 在 对 于 测序 酶 所 推荐 的 两 步 标记 方法 中 ， 类 似 的 条 带 强度 问 题 则 因 模 板 浓度 变化 而 引起 ， 例 如 模板 浓度 低 则 增加 较 长 分 子 的 强度 。 在 一 个 轨道 上 根本 不 出 现 条 带 ， 常 由 于 偶尔 忘 了 加 入 某 一 成 分 之 故 。 在 一 组 四 个 轨 道上 都 不 出 现 条 带 ， 则 或 是 由 于 复 性 时 没有 加 入 引物 或 缓冲 液 ， 或 是 没有 能 从 DNA 制备 物 取得 模板 ， 或 是 引物 不 恰当 ， 或 是 在 重组 子 中 发 生 了 引物 结合 位 点 的 缺失 之 故 。 4. jE 释 取出 梳子 后 必须 立即 淋 洗 胶 孔 ， 因 为 任何 留 下 的 未 聚合 的 丙烯 酰胺 可 能 随后 聚合 而 造成 不 均匀 的 凝 胶 表 面 ， 临 上 样 前 冲洗 孔 可 以 去 除 从 胶 中 析出 的 尿素 ， 以 便 在 上 样 中 得 到 紧密 的 条 带 。 “微笑 ”是 指 靠 近 凝 胶 边 缘 的 样品 的 移动 慢 于 中 央 的 样品 ， 起 因 于 横 跨 凝 胶 各 处 的 热量 损失 (因而 也 是 温度 ) 不 均匀 。 可 以 采用 两 种 简单 的 方法 进行 补救 : 第 一 ， 在 离 凝 胶 边 缘 2 cm 处 不 加 样品 ， 因 为 在 这 里 温度 的 变化 最 大 ; 第 二 ， 把 一 张 铝 膜 放 在 玻 板 的 外 表面 ， 它 能 使 凝 胶 各 处 的 温度 较为 均匀 。 此 外 还 有 多 种 更 为 巧妙 和 费用 较 大 的 温度 控制 方法 ， 不 过 除了 在 自动 系统 那样 的 特殊 情况 中 ， 它 们 并 不 必需 。 如 有 可 能 ， 比 较 好 的 方法 是 在 离 孔 底部 1 一 2 mm 处 上 样 ， 而 不 是 从 顶部 慢 慢 地 注 入 ， 这 样 可 以 得 到 一 个 明晰 的 样品 条 带 。 用 微量 滴定 板 可 以 延长 变性 时 间 (80C 、20 min)， 这 样 就 可 以 减 小 体积 而 便于 全 部 样品 的 上 样 。 为 了 调整 体积 ， 可 以 变更 变性 时 间 。 例 如 ， 用 装 有 风扇 的 温 箱 就 可 以 大 大 地 缩短 时 间 。 在 试管 内 进行 变性 的 样品 中 只 能 加 样 一 部 分 ， 因 其 体积 不 会 减 小 过 多 。 不 要 试图 加 过 量 样品 。 作 为 一 个 准则 ， 样 品 高 度 应 小 于 胶 孔 的 宽度 ， 而 理 想 情 况 则 要 求 小 得 多 。 本 方法 所 要 求 的 条 件 须 要 有 稳定 的 电压 。 实 际 上 在 恒 功 率 条 件 下 进行 变性 胶 电 泳 最 理想 ， 因 为 凝 胶 温度 是 最 重要 的 控制 因素 。 胶 内 温度 应 达到 60~70C. Xt 20 cmx 50 cmx0.3 mm 厚 的 胶 ，35$ 一 40 W 恒 功 率 足 够 使 用 。 如 果 仍 然 有 “压缩 ”现象 出 现 ， 此 时 甚至 要 求 增 加 功率 以 使 凝 胺 有 更 高 的 温度 。 - 291 » (6) (7) (8) (9) 当然 ， 停 止 电泳 的 准确 时 间 应 由 引物 的 长 度 和 从 引物 开始 的 待 读 距离 以 及 丙烯 酰胺 的 浓度 所 决定 。 如 果 用 通用 引物 ， 在 6% 凝 胶 上 M13 的 克隆 位 点 大 致 上 相当 于 省 酚 蓝 标记 的 位 置 。 当 援 开 玻 璃 板 时 ， 不 要 对 着 带 止 槽 玻璃 板 两 侧 的 “ 耳 部 ” 抬 起 ， 这 些 地 方 较 脆 弱 容 Fy BR 凝 胶 干 燥 前 不 须要 固定 。 未 经 固定 的 胶 在 80Y 真空 干 胶 器 中 干燥 须 经 45 一 60 min, 如 果 无 真空 干燥 器 ， 可 在 空气 中 干燥 过 夜 。 应 用 薄 层 胶 和 用 35S 标记 物 旨 在 改善 解析 度 。 使 用 单 面 X 射线 底片 有 利于 自 显 影 解 析 度 的 提高 ， 但 必须 注意 感光 乳胶 面 对 着 干燥 的 凝 胶 并 揭 去 保鲜 膜 。 et Ww a = = X 献 . Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. . Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564. . Ansorge, W. and Barker, R. (1984) System for DNA sequencing with resolution of up to 600 base pairs. J. Biochem. Biophys. Meth. 9, 33-47. Bankier, A. T. and Barrell, B. G. (1983) Shotgun DNA sequencing, in Techniques in Life Sciences, Nucleic Acid Biochemistry vol. B5 (Flavell, R. A., ed.), Elsevier, Ireland, pp. 1—34. . Biggin, M. D., Gibson, T. J., and Hong, G. F. (1983) Buffer gradient gels and 35S label as an aid to rapid DNA sequence determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965. . Bankier, A. T. and Barrell, B. G. (1989) Sequencing single-stranded DNA using the chain termination method, in Nucleic Acids Sequencing: A Practical Approach (Howe, C. J. and Ward, E. S., eds.), IRL, Oxford, pp. 37,38. . Beck, S. (1993) DNA sequencing by chemiluminescent detection, in Methods in Molecular Biology, vol. 23: DNA Sequencing Protocols (Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds.), Humana, Totowa, N. J., pp. 235-242. 第 四 十 九 章 PCR 产物 的 直接 测序 Janet C. Harwood, Geraldine A. Phear 1. 引 Tl 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR) FEA AA TK ERS DHARRRA AH Taq 聚合 酶 催化 的 中 间 序 列 的 扩 增 而 使 快速 分 离 DNA 序列 成 为 现实 。 该 技术 有 多 种 用 途 ， 最 为 有 用 的 一 种 是 在 大 量 的 样品 中 在 特定 座位 上 搜寻 突变 位 点 ， 例 如 用 在 临床 研究 或 培养 细胞 系 的 分 析 中 中 3。 如 果 没 有 PCR 技术 ， 进 行 上 述 工作 只 能 是 分 离 每 一 个 体 的 DNA， 制 备 各 个 基因 文库 并 逐一 进行 筛选 。PCR 技术 的 应 用 意味 着 先前 花 一 个 月 检 查 一 个 样品 ， 现 在 检查 几 个 样品 只 须 花 几 天 时 间 。 另 外 ， 通 过 宛 余 引物 的 应 用 ， 甚 至 可 能 分 离 和 它 相 关 的 新 的 基因 。 为 要 充分 利用 这 一 技术 ， 必 须 能 够 对 所 扩 增 片段 作 快 速 测序 。 不 过 PCR 产物 的 测 序 面临 一 个 主要 的 技术 问题 。 用 于 PCR 反应 的 朝 核 苷 酸 引 物 也 同时 用 作 测 序 反 应 的 引 物 。 由 于 多 个 序列 的 重 春 ， 使 得 测序 胶片 难以 阅读 。 已 有 许多 方法 曾 被 用 来 解决 这 一 问 题 。 起 初 ，PCR 产物 被 克隆 进 一 个 适 于 测序 的 载体 (4。 然 而 ， 该 方法 有 两 个 缺点 : @ 该 方法 较 耗 时 ;@ 每 一 克隆 只 代表 来 自 PCR 产物 的 单个 分 子 ， 而 为 了 避免 因为 Taq 聚合 酶 的 不 忠实 性 而 造成 的 人 为 不 可 靠 因素 ， 必 须 测定 几 个 克隆 的 序列 。PCR 产物 的 直接 测序 可 减少 上 述 错误 ， 因 为 模板 是 PCR 扩 增 的 全 部 产物 的 一 个 样本 。 直接 测序 有 两 种 基本 的 方法 。 第 一 ， 双 链 模 板 可 从 窒 核 苷 酸 引物 中 纯化 。 这 里 有 许 多 方法 可 供 选择 ， 包 括 凝 胶 纯 化 和 根据 分 子 筛 原理 利用 GeneClean™ 5K Centricon #E4t 离 大 小 不 等 的 DNA 分 子 。 第 二 ，PCR WH DNA 产物 可 用 作 制 备 单 链 DNA 的 模板 ， 可 经 非 对 称 PCR 反应 达到 这 一 目的 559。 此 外 ， 还 可 使 PCR 反应 作 某 些 变化 ， 使 其 中 一 个 引物 成 为 带 有 生物 素 的 链 ， 于 是 ， 使 含 生物 素 的 单 链 结 合 到 链 霉 抗 生 物 素 结合 蛋白 (streptavidin) 包 被 的 磁性 颗粒 上 ， 便 能 纯化 出 单 链 模板 91。 虽然 许多 这 些 方法 都 得 到 过 成 功 的 应 用 ， 但 测序 前 PCR 模板 均 须 进行 其 他 多 项 处 理 。 这 里 介绍 的 是 对 PCR 产物 进行 直接 测序 的 一 个 简单 而 快速 的 方法 ， 其 基础 是 先前 MATTE), MRA BAM MF SW, BARNA 2 kb 的 PCR 产物 的 测序 来 讲 ， 这 是 一 个 理想 的 方法 。 双 链 模 板 在 末端 标记 引物 存在 的 情况 下 通过 者 沸 并 立即 在 冰 水 里 冷却 而 变性 ， 这 样 可 阻止 模板 恢复 原状 并 有 利于 模板 -引物 的 复 性 。 其 后 的 测序 步骤 是 经 改良 的 双 脱 氧 核 苷 酸 测 序 技术 [9]。 AAU SI Dh Antic SRR PCR 引物 的 内 部 ， 即 所 谓 梨 式 引物 。 这 种 方法 具有 几 个 优点 ; @ 不 须要 从 模板 中 除去 PCR 引物 。 由 过 量 的 PCR 引物 所 发 动 的 测序 反应 的 产物 不 会 被 检 出 ， 因 为 PCR 引物 不 是 放射 性 标记 的 。 这 一 最 低 限 度 的 模板 纯化 操作 将 « 295) 减少 材料 的 损失 而 使 它 足 够 为 测序 所 用 。 四 测序 引物 是 存在 于 PCR 引物 内 部 的 第 三 个 寡 核 音 酸 ， 对 所 需要 的 PCR 产物 来 讲 又 是 特异 的 ， 它 不 与 非特 异 的 PCR 产物 复 性 ， 因此 ， 测 序 特 异性 达到 了 最 大 程 度 。 图 这 一 技术 的 灵敏 度 很 高 ， 每 作 一 次 测序 反应 只 需 150 ng 的 模板 。 这 方法 的 缺点 是 需要 一 个 “ 梨 式 ” 测 序 引 物 。 不 过 只 要 把 PCR 反应 中 所 用 的 赛 核 苷 酸 首先 从 模板 里 排除 ， 就 可 用 其 中 一 个 PCR 引物 来 进行 PCR 产物 的 测序 。 这 一 方法 可 顺利 地 用 于 以 20 mer 引物 对 约 250 bp 的 PCR 产物 的 测序 。 它 也 适用 不 同 长 度 的 PCR 产物 和 引物 。 然 而 所 用 材料 的 量 必须 调整 到 保持 摩尔 比率 为 1 pmol FR 板 :3 pmol 引 物 (人 参见 注释 aia 1 YY 2 “ 3) 4) 5) 6) 1) 2) 3) 4) 5) 2. 材 料 全 部 试剂 应 达到 分 子 生 物 学 所 需 的 标准 ， 用 分 子 生物 学 级 的 试剂 和 灭 菌 蒸馏 水 配 测序 试剂 可 购买 商品 试剂 盒 。 2.1 朝 核 苷 酸 引 物 的 末端 标记 y- [3P] ATP: 5000 Ci/mmol, Amersham (Arlington Heights，IL)。 这 是 一 种 释 放 高 能 量 B- 射 线 的 放射 性 物质 ， 因 此 必须 采取 适当 防护 措施 (参见 注释 2)。 10 x 多 核 苷 酸 激酶 缓冲 液 : 0.5 mol/L Tris-HCl. pH 7.6, 0.1 mol/L MgCh, 50 mmol/L DTT,1 mmol/L 亚 精 胺 ，1 mmol/L EDTA, pH 8.0， 分 装 后 = 20T 存 。 PCR 序列 特异 性 的 巢 式 寡 核 苷 酸 引物 : 0.1pg /由 水 溶液 (参见 注释 3)。 ZH YAR (10 000 U/ml, New England Biolabs, Beverly, MA). TE: 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0. Sephadex G50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 用 TE 2H (人 参见 注释 4)。 2.2 PCR 产物 的 纯化 和 测序 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 5.2. 100% 乙醇 。 5x 测 序 酶 缓冲 液 : 200 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100 mmol/L MgCl, 250 mmol/ L NaCl. 0.1 mol/L DTT: -—20CK FF. 慰 记 混合 液 : 每 一 种 dNTP 7.5 pmol/L 溶液 。 配 制 标记 母液 : 7.5 pl 1 mmol/L dATP, 7.5 pl 1 mmol/L dCTP, 7.5 yl 1 mmol/L dGTP, 7.5 pl 1 mmol/L dTTP, 加 970 pl 7K, —20°CUE FE. FAK IR 8 倍 作为 工作 标记 混合 液 。 + 294 - 6) 测序 酶 : (Version 2.0 USB, 14 U/ul): 临 用 前 加 冷 TE 稀释 8 倍 到 1.75 UV/nml。 7) 终止 混合 液 :每 一 种 核 苷 酸 ( 即 A,C,G 和 T) 需 要 一 种 终止 液 。 由 80 pmol/L 每 一 种 dNTP 和 8 pmol/L 相应 的 双 脱 氧 核 苷 酸 (ddNTP) 在 $0 pmol/L NaCl 中 组 成 。 终止 混合 液 按 下 述 成 分 配制 〈 全 部 以 pl WBA): A 混 合 液 C 混 合 液 G 混 合 液 工 混合 液 10 mmol/L dATP 8 8 8 8 10 mmol/L dCTP 8 8 8 8 10 mmol/L dGTP 8 8 8 8 10 mmol/L dTTP 8 8 8 8 1 mmol/L ddATP 8 = 一 ao 1 mmol/L ddCTP = 8 — 二 1 mmol/L ddGTP = 一 = 8 -一 1 mmol/L ddTTP 一 一 王 8 1mol/L NaCl 50 50 50 50 水 910 910 910 910 8) 甲 酰胺 染 液 : 95% 甲 酰胺 (v/v), 20 mmol/L EDTA, 0.05% 溴 酚 蓝 (w/v), 0.05% 二 甲苯 青 (w/v). 9) 测序 胶 : 0.4 mm 厚 ，6% 变 性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。 10) 固定 液 : 10% 醋 酸 /10% 甲醇 (wv)， 可 在 室温 贮存 并 重复 用 4 一 5 次 。 11) 自 显影 底片 : 如 Kodak XARS. A 法 3.1 测 序 引 物 的 末端 标记 这 里 我 们 叙述 的 是 200 ng RRA RY tid, CRBAF 10 次 测序 反应 。 这 一 标记 反应 也 可 用 于 100 ng 的 量 (参见 注释 5$)。 1) 在 1.5$ ml Eppendorf 管 中 干 燥 100 pCi y- [22P] ATP. 2) 放 在 冰 上 ， 然 后 依次 加 入 5 由 水 ，1 pl 10x 多 核 苷 酸 激 酶 缓冲 液 ，200 ng (2 pl) # WHR, 2 pl SRARAB (20 VU). 3) 37C 保温 1 h。 加 90 pl TE FIRE, FE Sephadex G50 BDH LA OE wich se RR, VA 1.5 ml Eppendorf 管 收 集 过 柱 的 液体 。 4) 将 样品 干燥 ， 加 水 重 悬 至 10 ng/pl, —20C 中 冷冻 到 使 用 时 为 止 。 -20 条 件 下 ， 标 记 的 寡 核 苷 酸 可 保持 稳定 几 周 ， 但 由 于 其 放射 性 半衰期 的 原因 ， 使 用 期 是 有 限 的 。 a * 3.2 PCR 产物 的 制备 和 测序 模板 测序 前 ， 应 作 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 估计 PCR 产物 的 量 。 每 一 测序 反应 至 少 需要 150 ng PCR 产物 。 1) 整个 PCR 反应 物 通过 经 TE 平衡 的 Sephadex G50 离心 柱 离心 。 注 意 不 要 混 进 石 晴 油 ， 如 有 必要 可 用 氯仿 抽 提 去 除 。 用 1.5 ml Eppendorf 管 收集 洗 脱 液 ， 这 一 步 去 除 (B) (A) ONE Res: hy : i te ro me : (C) 图 49.1 (A) FAY P 标记 的 巢 式 引物 对 POR 产物 进行 测序 所 取得 的 放射 自 显 影 图 谱 。〈B) 凝 胶 的 上 部 ， 显 示 经 复 性 并 延伸 但 并 未 终止 的 充分 延伸 产物 ， CC) 凝 胶 的 底部 ， 显 示 未 延伸 的 游离 的 未 端 标记 引物 - 296 * 了 PCR 反应 中 过 多 的 dNTPs. 2) 测量 反应 物体 积 ， 加 0.1 体积 的 3 mol/L BMA. pH 5$.2， 加 2.5 体积 乙醇 沉淀 PCR 产物 ， 置 干冰 上 15 min, H-20C 中 放置 过 夜 。 3) 4C FLA 12 000 g 离心 15 min。 除 去 上 清 液 ， 短 暂 干燥 沉淀 ， 用 灭 菌 蒸馏 水 稀释 到 RK RE 150 ng/pl. 4) 在 0.5 ml Eppendorf 管 中 混 合 1 ul (150 ng) PCR 产物 、2 pl (20 ng) 标记 引物 、 2 岂 Sx 测 序 酶 缓冲 液 以 及 5 pl K. 5) 试管 煮沸 5 min 后 立即 在 冰 水 中 放置 5 min 使 引物 与 守 核 苷 酸 复 性 (参见 注释 6 和 7)。 6) 在 微型 离心 机 上 离心 几 秒 钟 以 收集 管 壁 上 的 液体 ， 加 1 pl 0.1 mol/L DTT、2 pl 记 混 合 物 工 作 液 和 2 pl 稀释 的 测序 酶 ， 室 温 保温 5 min (参见 注释 8)。 7) 当 标 记 反 应 进行 时 ， 在 4 个 1.5 ml Eppendorf 管 上 标明 A、C、G 和 T， 在 各 管 中 加 2.5 由 的 相应 的 终止 液 。 8) 在 第 一 次 5 min 保温 结束 时 ， 在 每 一 终止 混合 物 管 中 加 入 3.5 岂 标 记 反 应 物 ，37T 保温 5 min。 9) 加 4 凡 甲 酰胺 染料 液 ，- 20 人 贮存 直到 使 用 时 。 在 -207 中 这 些 反 应 物 在 一 周 内 都 是 相当 稳定 的 。 10) 上 样 到 测序 胶 上 前 将 测序 反应 物 在 95°C 中 加 热 3 min。 电 泳 进行 到 溴 酚 蓝 恰恰 走出 胶 底 为 止 ， 这 时 多 余 的 标记 引物 正好 走出 凝 胶 ， 但 仍 能 读 出 离 引物 20 bp 范围 内 的 序列 。 11) 将 凝 胶 转移 到 一 片 3 MM 滤纸 (Whatman, Clifton, NJ) 上 。 或 者 就 在 测序 凝 胶 玻 板 上 固定 。 在 固定 液 中 至 少 放 置 10 ming AMER PRR, AKA 覆盖 在 上 并 使 其 干燥 。 12) 在 -70C 中 自 显影 过 夜 。 大 体 来 说 ， 如 果 反 应 正常 ， 用 一 台 900 型 微型 监测 仪 (Mini Instruments, Ltd.) 应 该 可 以 在 干燥 的 凝 胶 上 于 二 甲苯 青 到 达 的 位 置 上 读 到 50 cps 的 读数 。 (B) (A) (©) ee 图 49.2 (A) 在 四 条 泳 道 上 都 出 现 条 带 。 这 很 可 能 由 于 聚合 酶 遇 到 了 模板 上 的 二 级 结构 而 停止 前 进 所 造成 。 (B) 测序 凝 胶 上 的 斑点 可 能 是 末端 标记 引物 降解 所 造成 。 左 图 表示 极端 的 情况 ， 这 里 引物 已 充分 降解 ， 因 而 不 能 进行 测序 反应 。 右 图 表示 仍 可 读 出 序列 的 情况 。(C) 用 未 端 标 记 的 PCR 引物 而 不 是 用 巢 式 引物 进行 测序 的 结果 。 图 中 显示 由 于 众多 序列 相 重 琶 而 使 读 序 无 法 进行 的 情况 。 这 是 末端 标记 引物 复 性 到 许多 非特 异性 PCR 产物 上 所 造成 的 结果 。 ae 图 49.1 (A) 所 示 的 是 一 个 典型 的 结果 。 关 于 一 些 可 能 发 生 的 常见 问题 的 讨论 见 注 释 9 一 14 ( 见 图 49.2)。 (1) (2) (3) (4) (S) (6) (7) (8) (9) (10) (11 ~~ + 298 - 4. 注 释 用 这 一 方法 测序 时 模板 大 小 的 限度 大 约 是 2 kb， 在 使 用 大 的 模板 时 应 注意 改变 模 板 的 量 ， 使 模板 -引物 摩尔 比 保持 不 变 。 例 如 1 pmol 250 bp 的 模板 相当 于 150 ng， 但 1.6 kb 的 模板 则 是 1 png。 可 用 [35S]-7y-ATP 或 [3P]:7-ATP 标记 测序 引物 的 末端 。 这 种 方法 可 增加 胶 顶 部 的 解析 度 并 减少 对 实验 者 的 辐射 。 用 [35S]-yY-ATP 的 末端 标记 反应 需 4 hb， 信和 号 强度 减低 意味 着 自 显 影 可 能 要 花 几 天 时 间 。 测序 引物 不 应 含有 任何 可 能 形成 二 级 结构 的 序列 ， 不 应 含有 较 多 连续 的 CRA, 并 且 在 3 端 无 不 正确 配对 。 Sephadex G50 离心 层 析 柱 可 以 快速 而 简便 地 制备 。 将 Sephadex G50 加 到 TE WH (pH8.0) 中 ， 室 温 中 放置 过 夜 。 用 多 聚 毛 绒 塞 住 1 ml 的 一 次 性 注射 器 将 Sephadex G50 充满 注射 器 ， 使 TE 流 干 (在 离心 前 Sephadex 应 充填 到 注射 句 的 顶 端 )。 将 注射 管 放置 在 1$ ml 的 大 离心 管 里 (可 用 15 ml 的 Falcon tube 2095), W 200 g 离心 3 min (台式 离心 机 1000 rmin)。 柱 中 内 容 物 应 填充 至 1 ml 体积， 将 样品 装载 到 柱 上 后 再 一 次 离心 〈 同 一 速度 3 min)， 用 敞开 的 Eppendorf 管 收 集 样 Hpo 用 50 pCi y-ATP 标记 100 ng (15 pmol) BRARIW., LBRAVEFT Rid 物 ， 终 反应 体积 保持 在 10 pl, (AS RARE DLS ZI 1 pl (10 U)s 对 大 多 数 PCR 产物 5 min 煮沸 时 间 足 够 了 ， 但 在 某 些 情况 下 ， 例 如 人 的 DNA 和 Bs ey IOS AA HE he EH DNA， 者 沸 时 间 需 长 达 10 min 才能 取得 较 好 的 变性 效果 。 将 复 性 反应 物 立 即 放 入 冰 水 中 很 有 必要 ， 因 为 缓慢 地 冷却 模板 -引物 混合 物 会 导致 模板 链 再 次 复 性 。 标记 混合 物 作 8 倍 稀释 可 使 读 序 进行 到 接近 引物 20 bp 处 。 在 复 性 反应 中 加 锰 离 子 缓冲 液 (0.15 mol/L 异 柠檬 酸 钠 ，0.1 mol/L MnCl) 能 使 读 序 更 接近 引物 。 在 3.2 步骤 4 中 的 复 性 后 的 引物 -模板 混合 物 中 加 入 这 一 缓冲 液 1 pl. HRS 物 的 序列 可 能 需要 更 浓 的 标记 混合 物 。 条 带 缺 失 ， 但 在 胶 的 顶部 出 现 一 条 强 带 ， 起 因 于 链 延 伸 而 不 终止 ， 这 可 能 是 由 于 陈旧 的 终止 混合 物 的 分 解 或 稀释 不 当 所 致 。 因 此 应 配制 新 的 溶液 ， 如 图 49.1 (B). 条 带 缺 失 ， 但 在 胶 的 底部 出 现 一 条 强 带 ， 是 引物 不 能 与 模板 复 性 的 结果 ， 如 图 49.1 (C)。 这 种 强 带 是 游离 的 末端 标记 引物 ， 可 能 由 于 模板 的 引物 结合 位 置 发 生 突变 之 故 。 可 试用 另 一 种 引物 。 再 一 种 解释 是 模板 未 能 完全 变性 〈 见 注释 6、7)。 条 带 微弱 可 能 是 (a) 模板 用 量 不 足 或 〈b) 引物 标记 质量 较 差 之 故 。 后 一 种 情况 可 能 是 能 是 因为 7Y-[ P]ATP 放置 时 间 过 长 或 激酶 反应 效率 不 能 达到 所 需 的 摊 入 量 (12) (13) (14) (10° cpm/pg) « 二 级 结构 可 引起 全 部 泳 道中 的 序列 过 早 终止 ， 如 图 49.2 (A). THBAKTRA 似 物 的 方法 解决 这 一 问题 ， 例 如 将 dITP 或 7-deaza -2’ dGTP! hn Fl il FRI A HH, a Tag 聚合 酶 测序 542]1。 新 近 报 道 一 种 把 PCR 和 末端 标记 引物 测序 431 相 合 的 方法 ， 这 一 方法 可 能 将 被 证 实 是 有 价值 的 。 在 一 段 短 距 离 后 ， 信 和 号 可 能 变 得 很 弱 以 至 不 能 阅读 ， 这 既 可 以 是 由 于 标记 混合 物 结 太 稀 ， 也 可 以 是 由 于 终止 混合 物 中 双 脱 氧 核 背 酸 浓度 过 高 之 故 。 自 显影 图 谱 上 的 黑 点 ， 如 图 49.2 (B) 常 由 于 引物 降解 引起 ， 可 能 发 生 在 标记 过 程 中 。 这 不 是 一 个 严重 问题 ， 除 非 引物 降解 达到 很 严重 的 地 步 而 使 它 不 能 引发 测 序 反 应 。 12. 13. 2 5X 献 . Harwood, J., Tachibana, A., and Meuth, M. (1991) Multiple dispersed spontaneous mutations: a novel pathway of mutation in a malignant human cell line. Mol. Cell Biol. 11, 3163-3170. . Phear, G. A., Armstrong, W., and Meuth, M. (1989) Molecular basis of spontaneous mutation at the aprt locus of hamster cells. J. Mol. Biol. 209, 577-582. . Gibbs, R. A., Nguyen, P.-N., McBride, L. J., Koepf, S. M., and Caskey, C. T. (1989) Identification of mutations leading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated DNA sequencing of in vitro amplified cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1919-1923. Scharf, S. J., Horn, G. T., and Ehrlich, H. A. (1986) Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science 233, 1076-1078. Ward, M. A., Skandalis, A., Glickman, B. W., and Grosovsky, A. J. (1989) Rapid generation of a specific single-stranded template DNA from PCR-amplified mate- rial. Nucleic Acids Res. 20, 8394. . Loh, E. Y., Elliott, J. F., Cwirla, S., Lanier, L. L., and Davis, M. M. (1989) Poly- merase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor 5 chain. Science 243, 217. . Hultman, T., Stahl, S., Hornes, E., and Uhlen, M. (1989) Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Res. 17 (13) 4936,4937. . Wong, C., Dowling, C. E., Saiki, R. K., Higuchi, R. G., Ehrlich, H. A., and Kazazian, H. H. (1987) Characterisation of B-thalassemia mutations using direct genomic sequencing of amplified genomic DNA. Nature 330, 384. . Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463—5467. . Barnes, W. M., Bevan, M., and Son, P. H. (1983) Kilo sequencing: creation of an ordered nest of asymmetric deletions across a large target sequence carried on phage M13. Meth. Enzymol. 101, 98—122. . Innis, M. A., Myambo, K. B., Gelfand, D. H., and Brow, M. A. D. (1988) DNA sequencing with Thermus aquaticus polymerase and direct sequencing of poly- merase chain reaction-amplified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9436-9440. Peterson, G. (1988) DNA sequencing using Taq polymerase. Nucleic Acids Res. 22, 10,915. Ruano, G. and Kidd, K. K. (1991) Coupled amplification and sequencing of genomic DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2815-2819. « 2 * SAE MAA OW AE 进行 DNA 测序 Barton E. Slatko ul ps 许多 实验 室 中 DNA 测序 已 经 很 快 成 为 日 常 工作 的 一 部 分 ， 多 种 不 同 的 新 的 克隆 载 体 、 测 序 策 略 和 技术 已 经 发 展 起 来 ， 以 便 更 有 效 地 测定 各 种 DNA 模板 。 尽 管 目前 关注 的 焦点 主要 在 自动 DNA 测序 方面 ， 但 在 自动 化 测序 方法 广泛 应 用 之 前 ， 仍 然 须 用 其 他 方法 。 最 近 在 人 工 测序 方面 又 增加 了 一 种 新 的 方法 ， 称 作 热 循 环 测序 。 热 循 环 测 序 方法 的 基础 是 Sanger 等 的 双 脱氧 核 苷 酸 链 终止 法 上。 在 这 一 反应 中 一 个 合适 的 引物 DNA 分 子 与 互补 的 一 段 DNA 单 链 进行 复 性 ， 将 这 一 引物 模板 复合 物 和 耐 热 DNA 聚合 酶 一 起 保温 ， 所 用 的 耐 热 酶 是 Thermococcus litoralis 的 外 切 核酸 酶 活性 缺陷 的 DNA 聚合 酶 、Ventgr (exo) DNA # AME? 7] Thermus aquaticus (Taq) 聚合 酶 (4-71， 此 外 加 入 三 磷酸 脱氧 核 苷 (dNTPs) 和 三 磷酸 双 脱 氧 核 苷 (ddNTPs)。 四 种 分 开 的 反应 混合 物 , (每 一 反应 混合 物 中 含有 四 种 dNTPs 和 四 种 ddNTPs 中 的 一 种 ) 经 保温 产生 四 套 不 同 长 度 的 片段 ， 每 套 终 止 在 一 特定 核 背 酸 残 基 位 置 。 加 过 量 引 物 、 Ventg DNA 聚合 酶 、dNTPs 和 ddNTPs， 从 少量 的 模板 分 子 经 重复 变性 复 性 和 链 延 伸 反应 ， 可 获得 反应 产物 的 线性 扩 增 及 较 强 的 测序 信号 (图 50.1)。 在 每 一 循环 中 ， 反 应 温度 升 高 到 OSC 使 双 链 模板 或 单 链 DNA 模板 的 二 级 结构 变性 ， 降 低 到 SSC 以 使 模板 与 引物 复 性 ， 然 后 将 温度 升 高 到 72Y 进行 DNA 链 的 延伸 反应 。 然 后 变性 、 复 性 、 延 伸 反 图 50.1 热 循环 测序 反应 示意 图 ， 表 明 通过 复 性 、 延 伸 和 变性 等 步 又 形成 双 脱 氧 -终止 的 DNA 片段 。 本 图 的 翻印 得 到 New England Biolabs, Inc. 的 同意 。 * oe ¢ 复 进 行 ， 在 这 些 反应 中 过 量 的 引物 像 第 一 次 循环 那样 一 再 与 同一 变性 模板 复 性 。 热 循环 测序 有 几 个 优点 超过 以 前 的 测序 技术 !4-81。 @ 反 应 快速 ， 操 作 简便 并 且 效 率 高 ， 在 自动 DNA 测序 和 手工 测序 中 同样 有 用 。 @ 由 于 标记 产物 的 线性 扩 增 ， 较 标准 方法 须 用 模板 量 少 。 @@ 开 始 测序 反应 前 并 无 必要 将 DNA 模板 变性 。 国 在 以 后 各 次 反应 前 不 须 另 行 复 性 。 @ 应 用 耐 热 DNA 测序 酶 使 测序 反应 可 在 高 温 条 件 下 进行 ， 有 利于 获得 具有 大 量 二 级 结构 的 DNA 模板 的 信息 ， 而 低温 度 的 测序 方法 便 难 于 对 付 这 种 情况 。 这 一 方法 可 用 于 单 链 DNA 的 测序 ， 如 来 自 M13、fl、fd BRAY, BM Mn ek 获得 的 DNA， 或 用 于 双 链 DNA 模板 ， 如 质粒 DNA 或 PCR 扩 增 产物 ， 或 大 的 线性 双 链 DNA， 如 鸣 菌 体 入 的 DNA。 另 外 ， 也 可 以 用 这 一 方法 对 鸣 菌 斑 或 细菌 菌落 作 直 接 测 序 [8~10]。 为 了 观察 胶 上 的 双 脱 氧 终止 链 ， 已 发 展 了 多 种 标记 的 方法 。 通 常 ， 通 过 在 反应 混合 物 中 加 入 wa- 标记 的 三 磷酸 脱氧 核 苷 而 使 2?P、3P、5S 挫 入 到 新 生 链 里 。 在 另外 一 种 方 ER, AA T4 多 核 背 酸 激酶 将 TATP 上 的 7-[2P] 或 Y-[”P] 转 移 到 引物 的 $ 端 。 类 似 地 ， 引 物 经 修饰 可 用 于 化 学 荧光 发 光 测 序 00， 或 将 荧光 染料 做 末端 标记 用 于 自动 测 序 t&,2]。 在 使 用 少量 模板 DNA 的 情况 下 ，5“ 端 标记 2 P 或 3P 可 用 于 热 循环 测序 ( 见 3.2 节 )。5“ 端 标记 的 引物 也 可 用 于 较 大 模板 〈 例 如 XgtI) HM, Ree ABA tric 技术 时 只 能 取得 不 太 满 意 结 果 的 模板 的 测序 中 。 测序 反应 产物 ， 即 长 度 不 同 的 DNA 链 ， 可 用 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 分 开 ， 如 果 使 用 放射 性 同位 素 或 非 放 射 性 的 化 学 荧光 发 光 物 标记 DNA 分 子 ， 凝 胶 可 经 处 理 后 进行 X 射 线 底片 曝光 。 所 取得 的 自 显 影 谱 为 测序 分 析 提 供 资料 。 如 果 用 自动 DNA 测序 仪 ， 资 料 收集 可 随时 进行 而 不 须要 对 凝 胶 作 后 加 工 处 理 。 本 章 提 供 一 套 通过 $“ 端 标记 引物 (32P、33P、 或 经 修改 后 用 于 荧光 探测 ) BASS, Pp. BP [dATP] 放射 性 元 素 挫 入 来 测定 毫 微量 级 的 单 链 或 双 链 DNA 模板 序列 的 热 循 环 测 序 方 法 。 2. 材 料 1) 10 X Ventg™ (exo ) DNA 聚合 酶 测序 缓冲 液 : 100 mmol/L (NH,)2SO,, 100 mmol/L KCl, 200 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L MgSO,. pH 8.8 (室温 )。 —20T 保存 。 2) Ventp™ (exo ) DNA 聚合 酶 脱氧 / 双 脱 氧 测 序 混合 物 : 用 1 Xx VentgIM (exo-) DNA 聚合 酶 测序 缓冲 液 配制 (参见 注释 1)。 > 301 umol/L 浓度 A 混合 液 C 混合 液 G 混合 液 工 混 合 液 ddATP 900 2 a ddCTP = 400 2 E ddGTP “ £ 360 2 dd TTP = - E 720 dATP 30 30 30 30 dCTP 100 37 100 100 dGTP 100 100 37 100 dTTP 100 100 100 33 -207 保存 。 3) 30 x Triton X-100: 3% Triton X-100, — 20C 保存 。 4) 放射 性 标记 : (参见 注释 2)。 如 3.1 WHR, FA a[*°S]-dATP, 500 Ci/mmolia-[3P]- dATP, 400 Ci/mmol, 或 [33P]-dATP, 3000 Ci/mmol 标记 dATP. FA 3000 Ci/mmol y-[22P]-rATP 2% 3000 Ci/mmol y-[3P]-rATP 作 引 物 末 端 标记 (如 3.2 节 所 描述 )。 —20C RFF. 5) Ventp™ (exo ) DNA #4 fi: 2 U/pl (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). 于 -20?7 RE. 6) 终止 /上 样 染 料 液 : 含 0.3% 二 甲 茶 青 FF、0.3% 溴 酚 蓝 和 0.37% EDTA (pH 7.0) 的 去 离子 甲 酰 胺 溶液 。 —20C RE. SF 法 3.1 用 标记 的 dATP BA EAH OF 1) 将 四 个 微型 离心 管 分 别 标 上 A 、C、.G\T。 把 VentgIM(exo - )DNA 聚合 酶 脱氧 / 双 脱 氧 WW FIBA A.C.G.T 33 pl HINA A\C\G\T 管 的 底部 。 2) 将 下 列 成 分 混合 在 一 个 0.5 ml 微型 离心 管 中 : 0.04 pmol 单 链 模 板 DNA 或 0.1 pmol 双 链 模板 DNA (参见 注释 3 和 4)、0.6 pmol 单 链 模板 的 引物 或 1.2 pmol 双 链 模板 的 引物 、1.5 pl 10x VentRIM (exo) DNA 测序 缓冲 液 、1 pl 30 x Triton X-100 溶液 用 蒸馏 水 加 到 总 体积 为 12.0 ml。 用 吸管 轻 轻 吹 吸 混 匀 。 3) 用 上 述 方法 逐一 处 理 全 部 引物 和 模板 试管 ， 全 部 处 理 完毕 后 前 进 到 第 四 步 操 作 。 在 SR. S|. BMP. Triton X-100 和 水 的 离心 管内 加 2 wl NEC. BM 2~4 U VentgIM (exo ) DNA 聚合 酶 ， 轻 轻 吹 吸 混 匀 液 体 。 立 即将 3.2 ROME 放 进 标 以 A 的 脱氧 / 双 脱 氧 管 ， 轻 轻 吹 吸 混 匀 。 重 复 该 步骤 分 别 加 到 C、G 和 了 T 管 ， 每 次 更 换 吸 嘴 。 每 管 加 一 滴 灭 菌 矿 物 油 ， 将 试管 放 进 已 设置 好 反应 时 间 和 温度 的 热 循 环 仪 (BE 释 S)。 启 动 热 循环 仪 。 5) 加 热 周 期 完成 后 ， 将 4 由 终止 /上 样 染 料 液 加 到 每 管 的 矿物 油层 的 下 面 ， 至 此 全 部 反应 » 13@2 ‘= 4 —— 完成 ， 随 时 可 在 适当 的 变性 凝 胶 上 作 电 泳 〈 参 见 注释 6)。 反 应 物 可 在 -20Y7 保存 。 3.2 FAS 端 标记 的 引物 作 热 循环 测序 1) 将 四 个 微型 离心 管 标 上 AL C. GAT EF. 483 pl VentRgIM (exo ) DNA RAB 脱氧 / 双 脱 氧 测 序 混合 物 A 加 到 A 管 底部 ， 同 样 分 别 加 3 pl C. GH TRG WE C、 G、T 各 管 底部 。 2) 在 一 个 0.5 ml 微型 离心 管 中 将 下 述 液 体 混 合 在 一 起 : 0.004 pmol 单 链 模板 DNA 或 0.01 pmol 双 链 DNA 模板 (参见 注释 3、4 和 7)、0.6 pmol 单 链 DNA 模板 的 末端 标 记 引 物 或 1.2 pmol WHE DNA 模板 的 末端 标记 引物 〈 参 见 注释 8). 1.5 pl 10 x Ven- tRIM (exo ) DNA 聚合 酶 测序 缓冲 液 、1 pl 30 x Triton X-100 AM, AABN 总 体积 为 14.0 pl, BRKRIED. 3) 对 每 一 模板 / 引物 离心 管 逐 个 操作 ， 待 全 部 完成 后 ， 进 入 第 四 步 。 取 2 一 4 U Ven- tRIM (exo ) DNA 聚合 酶 加 入 含有 模板 、 引 物 、 缓 冲 液 、Triton X-100 和 水 的 管 中 ， 轻 轻 吹 吸 混 匀 溶 液 ， 立 即 取 3.2 局 加 到 标 A 字样 的 离心 管 中 ， 轻 轻 吹 吸 混 匀 液体 。 重复 该 步骤 分 别 加 到 C、G 和 工 管 中 ， 每 一 次 更 换 吸 中 (B) ® €) “a © ©) FA 50.2 Ventg™ (exo) DNA RAMAGAMFRMA BiB, BIMIEX. (A) A? PS 端 标记 (经 激酶 作用 ) 的 M13 前 向 测序 引物 (NEB, New England Biolabs, Inc. # 1224)， 从 含有 pUC19 双 链 质粒 DNA 的 菌落 直接 获得 的 测序 结果 ; (B) 用 ”P 5 端 标记 (AMBER) 的 M13 前 向 引物 (NEB # 1224)， 从 一 个 MI13mp18 We Ba BES AY DNA 的 直接 测序 结果 ; (C) APP 5 端 标记 〈 经 激酶 作用 ) 的 20-mer 引物 ， 从 0.01 pmol PCR 双 链 模板 获得 的 DNA 测序 结果 ; (D) 用 M13 前 向 通用 引物 (NEB #1224) fla-[*S]dATP BAH, M 0.004 pmol (10 ng) M13mp18 单 链 DNA 模板 得 到 的 DNA 测序 结果 ; (E) 用 M13 前 向 通用 引物 (NEB #1224) 和 a-[**S]dATP BAH, M0.01 pmol (20 ng) pUC19 HE DNA 模板 (NEB# 304-1) 得 到 的 DNA 测 序 结果 ; (F) FA? P 5 Sar tric 5 | By WA oe Hl AY ALE DNA 模板 得 到 的 测序 结果 ; 全 部 轨道 的 上 样 都 是 从 左 到 右 : G、C、 A、T。 除 (D) 和 (E) 曝光 为 36 h 外 ， 其 余 样 品 曝光 过 夜 ， 未 用 增 感 屏 。 : B83 - 4) 用 一 滴 灭 菌 矿 物 油 覆 盖 每 一 离心 管 。 设 置 好 反应 时 间 和 温度 (参见 注释 5)， 将 加 样 完毕 的 离心 管 放 在 热 循 环 仪 上 。 启 动 热 循环 仪 。 5) 完成 预定 循环 后 ， 加 4 局 上 样 / 终止 染料 液 到 矿物 油 下 面 ， 至 此 ， 反应 已 完成 ， 随 时 可 在 适当 的 变性 凝 胺 上 进行 电泳 〈 参 见 注释 6)。 反 应 物 可 在 -20 保存 。 图 50.2 所 示 为 一 组 典型 的 结果 。 可 能 发 生 的 问题 在 注释 9 和 10 中 有 叙述 。 4. 注 释 (1) 可 用 等 摩尔 浓度 的 7-deaza dGTP (7-deaza-2“ 一 脱氧 鸟 苷 - 5 三 磷酸 ) 代替 三 磷酸 脱 氧 鸟 昔 或 用 等 摩尔 浓度 的 7-deaza dATP 代替 三 磷酸 脱氧 腺 苷 以 改进 对 三 级 结构 含 量 高 的 区 域 的 测序 。 但 不 推荐 用 dITP (2“- 脱 氧 肌 昔 - 5 三 磷酸 ) 替代 三 磷酸 脱氧 岛 昔 ， 因 为 它 的 挫 入 效率 不 高 ， 而 且 因为 在 所 有 四 条 轨道 上 都 倾向 于 显示 浅 的 条 带 (过 早 终 止 )。 (2) 少量 DNA 模板 (0.004~0.01 pmol) 的 测序 或 直接 由 菌落 或 噬 菌 斑 测序 ， 应 使 用 35S 或 2P 未 端 标记 引物 。 所 有 其 他 测序 方法 ， 包 括 PCR 产物 测序 ，2S、”P MP 均 可 被 有 效 地 利用 。 由 于 35S 在 激酶 反应 中 摊 入 效率 较 低 ， 不 推荐 用 于 少量 DNA 模板 的 测序 。 如 果 用 激酶 反应 制备 末端 标记 引物 ， 推 荐 用 较 高 比 活 〈3000 Ci/mmol) 的 rATP， 因 为 它 能 提供 较 强 的 信号 。 全 部 实验 操作 中 ， 放 射 性 物质 应 在 不 超过 两 个 半 训 期 的 时 间 内 使 用 。 使 用 下 述 模板 和 制备 物 可 得 到 较 好 结果 a. 质粒 模板 的 纯化 应 用 CsCl 梯度 离心 法 、 标 准 微量 制备 方法 !3]、 微 量 柱 层 析 或 更 新 的 方法 ， 例 如 Insta-PrepIM (5 prime~3 prime, Inc., Boulder, CO). b. 应 以 PEG 沉淀 法 53] 或 固 相 支持 法 54 纯化 单 链 M13 模板 。 c. A (Mgtl10，11 等 ) 和 黏 粒 模板 应 用 CsCl 梯度 离心 或 微量 制备 方法 纯化 呈 ]。 d. PCR 反应 完成 后 ， 一 定 要 将 双 链 或 单 链 PCR 产物 中 遗留 的 过 量 引物 和 核 苷 酸 去 除 掉 。 用 酚 / 氯仿 提取 及 用 酒精 沉淀 PCR 反应 产物 ， 以 50 局 蒸馏 水 重 悬 干燥 的 沉淀 。 用 PVDF 膜 (0.025 ») (Millipore Corp., Bedford, MA) 点 滴 透 析 反 应 产物 (1 hb， 用 200 ml 水 )05， 或 用 凝 胶 纯化 、 玻 璃 珠 法 或 排出 法 〈 即 离心 柱 法 ) 纯化 产物 。 e. 用 菌落 直接 测序 [8,101] 时 将 菌落 悬浮 在 12 pl PC E/E (pH 7.5 的 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 50 mg/ml 蛋白 激酶 民 ; 每 次 用 新 鲜 配 制 的 溶液 。 和 蛋白 激酶 K 母液 可 以 配 好 后 分 装 ， 于 - 207 保存 )。 短 暂 涡 Wet GYM, 55 CR 15 min， 然 后 80 CHR 15 min， 冰 上 放置 1 min 后 在 微 型 离心 机 上 离心 3 min。 取 9 局 上 清 液 作 为 测序 反应 末端 标记 引物 的 模板 用 。 . 对 M13 或 入 叭 菌 斑 作 直 接 测序 !&-10 时 用 牙签 挑 取 琼 脂 表 面 的 噬 菌 斑 放 入 1.5 ml 离心 管 里 ， 其 中 含有 新 鲜 制 备 的 菌落 / 鸣 菌 斑 裂 解 液 12 pl (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 50 mg/ml 蛋白 激 K; 每 次 用 新 鲜 配 制 的 溶液 ， 蛋 日 酶 母液 可 配制 好 并 分 装 后 - 20°C 中 保藏 )。 短 暂 涡 旋 振 功 后 55 保温 15 min， 然 = (3 YA = 后 80C 中 保温 15 min， 置 冰 上 1 min， 在 微型 离心 机 中 离心 3 min， 取 9 pl LiF 液 作为 末端 标记 引物 的 模板 。 (4) 摩尔 比 的 计算 : 下 列 公 式 可 用 作 引 物 或 模板 量 (pmol) 的 计算 : (5 (6 ) YA 单 链 DNA (M13 MRA, SE PCRP WM. BRARSIDS.)* # pmol = (#pg DNA x 10° pg/pg)/( + 碱 基数 x 330 pg/pmol) WHE DNA (WE PCR 产物 、 质 粒 、 入 DNA、 限 制 酶 切片 段 等 。)”“ # pmol = (# pg DNA x 10° pg/pg)/( + 碱 基 对 x 660 pg/pmol 碱 基 对 ) *40 ng =1 ODr03 # pg FRAR = # ODr60 x 40 pg/ODr60 ** 50 pg =1 OD2z6o; # pg HRAR = # ODy¢60 X 50 pg/OD 260 一 些 有 用 的 数字 : 0.04 pmol 7.25 kb 单 链 DNA 模板 = 一 100 ng 0.004 pmol 7.25 kb 单 链 DNA 模板 = 一 10 ng 0.1 pmol 3 kb 双 链 DNA 模板 = ~200 ng 0.01 pmol 3 kb 双 链 DNA 模板 = ~20 ng AAS: 对 大 多 数 热 循 环 仪 ， 包 括 Techne (Duxford, UK) PHC-2 和 Perkin- Elmer-Cetus (Norwalk, CT) 480 热 循环 仪 ， 使 用 20 次 循环 : 95T 20s 55T 20s ze 20 s 可 以 改变 循环 条 件 而 仍 保持 良好 效果 。 可 以 减少 反应 循环 次 数 ， 尤 其 是 当 模 板 DNA 量 超过 操作 指南 所 推荐 的 用 量 时 。 不 过 进行 少量 DNA 样品 的 测序 时 ， 循 环 次 数 超过 30 次 往往 效果 不 好 ， 在 所 得 到 的 自 显 影 谱 上 ， 这 种 操作 常常 会 增加 浅 的 条 带 。 变 更 循环 反应 的 时 间 和 /或 温度 也 是 可 行 的 。 模 板 测序 可 只 用 两 步 : 95Y 变性 MM 72°C 复 性 和 延伸 步骤， 所 使 用 的 引物 的 表 观 解 链 温 度 (Tu) 可 低 至 55C 。 这 一 方法 所 获得 的 信号 的 强度 可 能 较 标 准 的 三 步 法 要 弱 。 降 低 复 性 及 延伸 温度 到 引物 的 Ta 而 进行 包括 两 个 步骤 的 测序 循环 也 是 可 行 的 。 例 如 ， 采 用 9SY 变性 温度 和 55C 复 性 和 延伸 温度 。 如 果 在 标准 三 步 法 中 得 到 的 测序 信号 较 弱 ， 复 性 温度 对 于 所 用 引物 来 讲 可 能 太 高 了 。 复 性 温度 可 以 降低 到 相应 于 个 别 引物 的 Tu。 要 成 功 地 使 用 某 些 热 循 环 仪 ， 可 能 需要 较 长 的 反应 时 间 (在 每 一 循环 中 ， 每 一 步 从 20 s 增加 到 1 min). , 反应 结束 后 在 微型 离心 机 上 作 短 暂 离心 (5 s) 有 助 于 确保 完全 将 油层 与 水 层 分 开 ， 在 测序 胶 上 临 加 样 前 将 反应 物 在 80Y 中 加 热 2 min。 每 一 次 加 样 ， 将 吸管 插入 履 盖 的 油层 下 面 ， 吸 出 2.5 由 样品 。 加 样 前 为 了 去 除 吸 嘴 上 残留 油 物 ， 或 许 有 必要 将 吸 嘴 稍 事 接触 卷 简 纸 。 也 可 用 硅油 覆盖 在 上 ， 接 着 将 反应 物 从 油 中 沉淀 61， 或 用 ParafilmTM 去 除 油 层 07]。 另 一 种 方法 是 用 “ 热 盖 ”装置 ， 将 温度 定 在 高 出 热 循环 仪 中 最 高 温度 1SC (一 11SC )， 这 样 可 以 避免 莱 发 并 使 反应 过 程 中 不 须 加 油 。 应 该 指出 的 是 ， 我 们 从 来 没有 经 历 过 由 于 履 盖 油 层 而 带 来 测序 胶 中 出 现 不 正常 条 带 的 情 况 。 (7) 多 达 10 倍 量 的 DNA 模板 可 用 于 本 测序 方法 中 。 4 (8) 对 于 Y-[32P] 或 Y- [3P]rATP 末端 标记 ， 可 用 下 述 方法 : a. 在 一 个 0.5 ml 微型 离心 管 中 混合 下 述 物质 : 13.5 由 水 , 2.5 pl 10x T4 BYE 激酶 缓冲 液 (10 x 缓冲 液 = 500 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCh, 50 mmol/L DTT), 10.5 pmol 引物 (1 由 引物 母液 ; 母液 =2.5 pg 24-mer 引物 悬浮 在 30 pl K#), 7 岂 Y-[32P]rATP (11.5 pmol), 1 pl (10 U) 14 多 核 苷 酸 激酶 (10 000 U/ml). b.37C 中 反应 30 min. 。 在 95f 终 止 反应 5 min， 室 温 中 在 微型 离心 机 上 作 短 暂 离心 ，- 200 中 贮存 。 这 一 方法 可 在 25 由 反应 体系 中 提供 10.5 pmol 的 5 端 标记 引物 ， 这 样 得 来 的 引物 最 终 浓度 为 0.4 pmol/nl。 (9) 下 述 测序 特点 为 VentRTM (exo) DNA 聚合 酶 所 特有 : a. 若干 个 连续 的 C 中 的 第 一 个 C 比 其 后 的 CBR. b. 若干 个 连续 的 A 中 第 二 个 A 比 前 一 个 〈 和 /或 后 面 的 ) A BR. c. 紧 接着 AHA G 倾向 于 比 其 他 G HERR. d. 紧 接着 A 带 的 工 带 倾 向 于 比 其 他 工 带 较 深 。 (10) 如 果 DNA 测序 结果 不 那么 满意 ， 有 几 个 因素 可 以 考虑 。 问 题 往往 出 在 模板 的 制备 上 。 用 酚 / 氯 仿 抽 提 或 酒精 沉淀 后 接着 用 70% 酒 精 淋 洗 常常 可 解决 这 一 问题 ; 第 二 个 问题 是 在 反应 中 引物 和 /或 模板 用 量 过 多 或 过 少 ; 这 里 所 介绍 的 以 pmol 计 的 量 是 由 经 验 得 来 的 最 佳 用量 。 另 一 个 可 能 的 问题 是 热 循环 仪 的 欠 恰 当 的 操作 。 某 些 热 循环 仪 或 许 需要 较 长 的 反应 时 间 ， 因 而 会 带 来 问题 。 这 里 往往 呈现 为 一 条 或 两 条 轨道 上 的 条 带 比 其 他 轨道 上 的 条 带 较 浅 或 者 一 条 轨道 上 条 带 全 缺 。 这 些 现象 说 明 热 循环 仪 可 能 存在 问题 。 参考 文 献 -一 . Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. Kong, H., Kucera, R., and Jack, W. (1992) Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralis. J. Biol. Chem. 268, 1965-1975. . Perler, F., Comb, D., Jack, W., Moran, L., Qiang, B.-Q., Kucera, R., Benner, J., Slatko, B., Nwankwo, D., Hempstead, K., Carlow, C., and Jannasch, H. (1991) Novel intervening sequences in an Archaea DNA polymerase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5577-5581. 4. Adams, S. and Blakesley, R. (1991) Linear amplification sequencing. Focus (BRL) 13(2), 56—5S7. . Carothers, A. M., Urlaub, G., Mucha, J., Grunberger, D., and Chasin, L. A. (1989) Point mutation analysis in a mammalian gene: rapid preparation of total RNA, PCR amplification of cDNA and Tag sequencing by a novel method. a Ww wn - 306 - 2 10. rz. 13. BioTechniques 7, 494-499. . Craxton, M. (1991) Linear amplification sequencing: a powerful method for sequencing DNA. Methods, a companion to Meth. Enzymol. 3, 20-26. Murray, V. (1989) Improved double-stranded DNA sequencing using the linear polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17, 8889. Sears, L. E., Moran, L. S., Kissinger, C., Creasey, T., Sutherland, E., Perry- O’Keefe, H., Roskey, M., and Slatko, B. (1992) Thermal cycle sequencing and alternative manual and automated DNA sequencing protocols using the highly thermostable Ventg™ (exo) DNA polymerase. BioTechniques 13, 626-633. Krishnan, B. R., Blakesly, R. W., and Berg, D. E. (1991) Linear amplification DNA sequencing directly from single phage plaques and bacterial colonies. Nucleic Acids Res. 19, 1153. Young, A. and Blakesley, R. (1991) Sequencing plasmids from single colonies with the dsDNA cycle sequencing system. Focus (BRL) 13(4), 137. . Creasey, A., D’Angio, L., Dunne, T. S., Kissinger, C., O’Keeffe, T., Perry-O’Keefe, H., Moran, L. S., Roskey, M., Schildkraut, I., Sears, L. E., and Slatko, B. (1991) Application of a novel chemiluminescence-based DNA detection method to single- vector and multiplex DNA sequencing. BioTechniques 11, 102-109. Biosystems Reporter (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (1991) 13, 1-2. Slatko, B., Heinrich, P., Nixon, B. T., and Eckert, R. (1991) Preparation of tem- plates for DNA sequencing unit 7.3, in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J., Smith, J., and Struhl, K., eds.), Wiley, New York. . Hultman, T., Bergh, S., Moks, T., and Uhlen, M. (1991) Bidirectional solid phase sequencing of in vitro amplified plasmid DNA. BioTechniques 10, 84-93. . Silhavy, T., Berman, M., and Enquist, L. (1984) Experiments With Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. . Ross, J. and Leavitt, S. (1991) Improved sample recovery in thermocycle sequencing protocols. BioTechniques 11, 618-619. . Whitehouse, E. and Spears, T. (1991) A simple method for removing oil from cycle sequencing reactions. BioTechniques 11, 616-618. - 307 - 第 五 十 一 章 “自动 DNA 测序 仪 的 使 用 Zijin Du, Richard K. Wilson QU 1. 引 由 于 荧光 标记 双 脱 氧 核 苷 酸 测序 化 学 以 及 在 凝 胶 电 泳 中 荧光 标记 DNA 实时 检测 仪 的 发 展 Q-59， 使 大 规模 DNA 测序 计划 的 完成 效率 大 增 。 除 了 避免 使 用 放射 性 同位 素 外 ， 这 些 系统 可 使 读 序 自动 化 ， 从 而 提供 能 直接 分 析 的 或 是 可 输入 序列 收集 装置 的 计算 机 可 读数 据 。 在 本 章 中 我 们 将 介绍 第 一 台 商 品 化 的 DNA 测序 仪 一 一 373A 型 自动 测序 仪 ， 由 Applied Biosystems, Inc. 公司 所 开发 。 此 种 测序 仪 最 初 在 1987 年 以 370A 型 出 现 ， 它 利用 “四 色 同 道 ”技术 使 测序 胶 中 的 每 一 道 都 可 检测 到 四 种 不 同 的 荧光 [9。 在 DNA 测序 反应 中 挫 入 四 种 标记 物 ， 它 们 可 能 出 现在 测序 引物 的 $ 端 (“ 染 料 - 引 物 ” 标 id) 或 在 三 磷酸 双 脱 氧 核 苷 上 (“ 染 料 - 末 端 ” 标 记 )。 由 于 对 每 一 样品 373A 只 需要 一 条 泳 道 ， 每 次 电泳 最 多 可 分 析 36 个 样品 。 相 比 之 下 ，Pharmacia ALF 测序 仪 仅 利用 单 色 荧 光 、 四 条 泳 道 引 物 标 记 技术 ， 每 次 电泳 最 多 只 能 分 析 10 个 样品 。373A 型 测序 仪 的 这 种 既 可 用 引物 标记 又 可 用 末端 标记 的 能 力 使 得 须 用 鸟 枪法 和 用 引物 介 导 测序 的 工作 更 趋 于 高 效 。 我 们 曾 用 373A 仪 对 M13、 质 粒 和 鸣 粒 亚 克 隆 以 及 PCR 产物 模板 DNA 作 测 序 分 析 。 这 里 介绍 一 种 用 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 和 荧光 -染料 引物 对 单 链 M13 和 质粒 DNA 进行 测序 的 方法 。 这 里 描述 的 第 二 种 测序 方法 用 Taq T7 DNA 聚合 酶 和 热 循环 仪 ， 并 且 也 适用 于 染料 -引物 和 单 链 或 双 链 模板 。 在 第 三 种 测序 方法 中 利用 T7 RAHM RK 光 染 料 末端 标记 ， 可 被 用 于 单 链 M13 AMOR: DNA 的 测序 。 这 第 三 种 方法 须 在 373A 中 安装 特殊 硬件 。 另 一 种 用 Taq DNA 聚合 酶 的 染料 -末端 标记 方法 由 Applied Biosystems 所 提供 ， 不 过 在 我 们 实验 室 里 这 一 方法 尚 不 成 熟 ， 因 此 不 在 本 章 叙 述 。 2. 材 料 1) 线性 扩 增 测序 和 PCR 模板 制备 中 都 须 用 PCR 仪 〈 参 见 注 释 1)。 我 们 实验 室 用 Ge- neAmp 9600 热 循 环 仪 (Pekin-Elmer，Norwalk，CT) 和 PTC-200 热 循环 仪 (MJ Re- search ，Boston，MA)， 工 作 性 能 都 很 好 。 两 种 仪器 均 配 备 有 96 孔 的 微量 反应 板 ， 有 明显 较 快 的 启动 时 间 ， 且 有 一 加 热 盖 ， 消 除了 用 矿物 油 作 覆 盖 的 刺 病 。Techne MW-1 热 循 环 仪 在 利用 96 孔 微 量 反应 板 的 线性 扩 增 测序 反应 中 也 有 较 好 的 工作 性 能 (M. Craxton， 个 人 通讯 )。 这 里 描述 的 自动 荧光 测序 系统 为 Applied Biosystems， Inc. (Foster City，CA) 的 373A 型 ， 现 有 型 号 的 Macintosh IIci 计算 机 配备 有 8 MB RAM 和 100 MB 硬盘 。 * 308 ， 2 ~~ 3) Thermus aquaticus (Taq) DNA 聚合 酶 可 从 几 家 公司 之 一 购置 。 按 我 们 的 经 验 Epi- centre 公司 (Madison, WI) 的 Sequi-therm 酶 可 得 到 最 好 结果 。 4) 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 (测序 酶 ) 应 从 United States Biochemical (Cleveland, OH) 购买 ;Version 1.0 用 于 染料 -引物 标记 测序 效果 最 佳 ; Version 2.0 含有 焦 磷 酸 酯 酶 ， 为 染料 -末端 标记 测序 所 首选 。 5) 脱氧 核 苷 酸 (dNTPs) 和 双 脱 氧 核 苷 酸 (ddNTPs) : a. 母液 : 100 mmol/L dNTP 和 5 mmol/L ddNTPs 溶液 可 从 Pharmacia (Piscataway, NJ) JA, VA TE 缓冲 液 配 制 含 每 一 种 dNTP 20 mmol/L WER, —20C 保存 。 b. 用 于 PCR: A TE 缓冲 液 制备 含 每 一 种 dNTP 1.25 mmol/L 的 溶液 ，- 207 RFF. c. 利用 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 作 染料 -引物 标记 测序 : i. 配制 8 mmol/L dNTP 混合 物 : 用 TE 缓冲 液 配制 100 mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 100 中， 最 终 体积 为 1.25 ml (-20CKF). ii. 配制 SO pmol/L ddNTP 溶液 : ddA: 2 pl 5 mmol/L ddATP+198 pl TE 缓冲 液 ddC: 2 pl 5 mmol/L ddCTP + 198 pl TE 缓冲 液 ddG: 4 pl 5 mmol/L ddGTP + 396 pl TE 缓冲 液 ddT: 4 pl 5 mmol/L ddTTP +396 pl TE 缓冲 液 iii. 测序 混合 物 : 混合 等 体积 的 8 mmol/L dNTP 混合 物 和 四 种 50 pmol/L ddNTP 中 的 一 种 。 足 够 100 次 反应 用 ， 配 制 100 已 A 和 C 混 合 液 以 及 200 pl GH TIES 液 。 d. 用 于 线性 扩 增 的 染料 -引物 标记 测序 : i. 配制 dNTP 母液 (足够 200 次 反应 ) (参见 注释 2): dATP 混合 液 : 1.25 wl 20 mmol/L dATP, 20 mmol/L dCTP, dGTP, dTTP 各 5.0 ul, 184.75 ul TE dCTP 混合 液 : 1.25 pl 20 mmol/L dCTP, 20 mmol/L dATP, dGTP, dTTP 各 5.0 ul, 184.75 pl TE dGTP 混合 液 : 2.50 pl 20 mmol/L dGTP, 20 fae L dATP, dCTP, dTTP # 10.0 ul, 367.50 pl TE dTTP 混合 液 : 2.50 pl 20 mmol/L dTTP, 20 mmol/L dATP, dCTP, dGTP 各 10.0 ul, 367.50 pl TE ii. 配制 ddNTP MK (2% 167 次 反应 ) : ddATP (3.0 mmol/L): 100 pl 5 mmol/L ddATP + 67 pl TE ddCTP (1.5 mmol/L): 50 pl 5 mmol/L ddCTP + 117 pl TE ddGTP (0.25 mmol/L): 16.7 pl 5 mmol/L ddGTP + 317.3 pl TE ddTTP (2.5 mmol/L): 167 pl 5 mmol/L ddTTP + 167 pl TE iti. 配制 dNTP / ddNTP 工作 液 (24% 100 次 反应 ) : 50 pl dATP 混合 液 + 50 pl 3.0 mmol/L ddATP 50 pl dCTP 混合 液 + 50 pl 1.5 mmol/L ddCTP 100 pl dGTP 混合 液 + 100 pl 0.25 mmol/L ddGTP - BOO - 100 pl dTTP 混合 液 + 100 pl 2.5 mmol/L ddTTP e. 用 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 作 染料 -末端 标记 测序 : i. 2 mmol/L [aS]dNTPs, 10 mmol/L Tris-HCI, pH 7.2, 0.1 mmol/L EDTA ii. ZL 1.1.1.2 染料 -未 端 标记 混合 液 : 2.2 pmol/L ddT - 6fam, 9.0 pmol/L ddC- Szoe, 6.0 pmol/L ddA-lou, 16.0 pmol/L ddG-nan (可 从 ABI 购 得 ; —20CIEF). 6) SRR: 对 于 M13 ARAM, GAA. Bay T7 和 SP6 引物 可 从 Applied Biosystems 购 得 。 这 些 引物 序列 为 : (-21 M13) 5’TGT-AAA-ACG- ACG-GCC-AGT 3’, (M13RP1) 5’CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC 3’ (参见 注释 Bye 40% A& BY: 380 g AeBihe, 20g 双 丙 烯 酰 腕 ， 加 蒸馏 水 到 1 L， 加 入 Amber- lite MB-1 (50 g/L) 后 搅拌 1 h 以 去 离子 ， 过 滤 ， 用 不 透明 瓶 4C 中 保存 。 8) 20xTBE 缓冲 液 : 324 g Tris 碱 ，55 g 硼酸 ，18.6 g EDTA， 加 蒸馏 水 到 1L。 9) 15% RE. 10) 5X Hind/DTT (+Mn ;新 鲜 配 制 ) a.50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 300 mmol/L NaCl, 5 mmol/L DTT. b. 临 测序 前 将 3 由 1 mol/L MnCl, 加 到 197 pl 5X Hind/DTT 缓冲 液 中 。 11) 5 mol/L BARR. pH7.4. 12) 5 x LASR 缓冲 液 : 400 mmol/L Tris-HCl, pH 8.9, 100 mmol/L (NH, )2SO,, 25 mmol/L MgCl. 13) 10 X Mn?* 缓冲 液 : 50 mmol/L MnCl, 150 mmol/L 异 柠 檬 酸 钠 。 14) 10 MOPS 缓冲 液 : 400 mmol/L MOPS, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L MgCl 。 15) 9.5 mol/L BARR. pH 7.4。 7 Se Se Se 3 法 3.1 DNA 测 序 反应 3.1.1 应 用 荧光 染料 标记 引物 的 TI7/mT7 DNA 聚合 酶 测序 法 在 本 方法 中 正 像 在 荧光 染料 引物 测序 [9 中 那样 ， 使 用 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 [8] 作 测 序 。 用 9%6 和 孔 U 形 底 的 微量 反应 板 (Falcon, Becton Dickinson Co. Rutherford, NJ, No. 3911) 便于 进行 操作 ， 既 可 用 手工 也 可 用 自动 加 样 装置 [!01。 由 于 G 和 工 反应 中 荧 光 染 料 产生 的 反应 信号 较 弱 ， 反 应 体积 应 加 倍 。 1) 复 性 反应 按 下 表 加 液 : A C G T 5S Hind/DTT (+Mn?** ; Ki FA BiB Hil) Dul pl 2p 2yl 模板 DNA Zyl 3ypl 6yl 6yl 每 种 染料 引物 (0.4 pmol/l) 1 gb: Kyl, A2eabep el - 310 = RM MMA SSC, 3~S min 后 缓慢 冷却 到 室温 10~15 min。 如 果 反 应 在 96 孔 板 中 进行 ， 干 的 加 热 块 可 加 以 改进 使 9 FLA UI pO), 2) 每 一 复 性 反应 中 加 : A C G aT 8 mmol/L dNTPs + 50 pmol/L ddXTP 混合 液 2 由 2 由 4 由 4ul 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 (1.5 U/pl) 1.5yl1.5pl 3yl 入 出 四 种 反应 均 在 37 保温 5 一 10 min. 3) 延伸 和 终止 反应 后 ， 在 将 它们 混合 并 浓缩 作 电泳 前 四 种 反应 必须 停止 。 简 单 的 停止 方法 是 在 1.5 ml 离心 管 (每 一 模板 用 一 管 ) 中 加 6 wl 5 mol/L BRK (pPH 7.4)， 120 pl 95% 乙醇 。 对 每 一 组 模板 ， 将 8 岂 A 反 应 液 转移 到 管 中 ， 上 下 快速 往返 吹 吸 两 次 以 淋 洗 吸 嘴 并 使 样品 与 乙醇 溶液 混合 ， 不 换 吸 嘴 将 8 由 的 C 和 16 由 的 G 和 T 加 入 管内 ， 每 加 一 反应 液 后 上 下 吹 吸 。 乙 醇 能 有 效 终止 酶 的 进一步 作用 。 每 一 套 模 板 重复 这 一 操作 。 将 混合 在 一 起 的 反应 液 放 在 -20C 中 30 min 以 沉淀 DNA 产物 。 4) 在 室温 中 以 13 000 g BL 15 min 以 收集 DNA, 用 300 pl 70% 乙醇 在 室温 中 洗涤 一 次 ， 真 空中 稍 事 干 燥 。 干 燥 的 样品 可 在 - 207 放置 几 天 。 3.1.2 应 用 荧光 染料 引物 的 线性 扩 增 测序 法 (Tag DNA 聚合 酶 ) 1) 测序 反应 在 0.5 ml 离心 管 或 0.2 ml Micro-AmpIM 管 中 进行 ， 各 管 含 下 述 成 分 : A c eS 下 5X LASR 缓冲 液 fol tal 2. 2 al dNTP/ddXTP 混合 液 Saeki o 2 ol Zl 每 种 染料 引物 (0.4 pmol/ ul) 2 模板 DNA ( 约 250 ng/yl) 1 pobilqcdAph) ) 2p Ml Tag DNA 聚合 酶 (0.7 U/zl) Tul pl 2pl 2pL 总 体积 Sul Syl 0 pl 2) 如 有 必要 ， 用 5$0 ud RT WHER. ARAMA 9$SC ， 样 品 放 在 预 热 的 金属 板块 上 ， 使 用 Perkin-Elmer 的 热 循 环 仪 以 下 述 参数 进行 热 循 环 (参见 注释 4) : DNA 热 循 环 仪 9600 热 循 环 仪 95T 30s 95T 4s 55 30s 35C>10'5 70CT 60s 70CT 60s 15 次 循环 后 15 次 循环 后 95T 30 s 95T 45 70CT 60s 70 60s 再 进行 15 次 循环 再 进行 15 次 循环 me” 循环 结束 后 样品 保存 在 4 中 。 3) 正如 有 关 经 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 反应 中 所 叙述 的 那样 ， 四 种 测序 反应 必须 在 混合 并 浓缩 前 终止 以 备 作 电泳 。 终 止 反应 的 一 种 简便 的 方法 是 将 每 一 反应 物 转移 到 一 含 有 醋酸 铵 /乙醇 溶液 的 1.5 ml 微型 离心 管 中 ， 经 乙醇 沉淀 后 干燥 样品 可 在 一 20 忆 贮 FILK. 3.1.3 应 用 荧光 染料 未 端的 mT7 DNA 聚合 酶 测序 法 这 一 方法 须 在 373A DNA 测序 仪 上 装备 特殊 的 五 色 (531/545/560/580/610) 滤 色 轮 ， 测 序 反应 中 的 单 链 DNA KA M13 BME AL. 1) 每 一 样品 在 一 个 1.5 ml 微型 离心 管 中 加 下 列 复 性 反应 液 : 2 pl 10x Mn 缓冲 液 ， 2 pl 10x MOPS2R HK, x pl ssDNA (2.5 pg), 0.5 由 引物 (3.2 pmol/pl), My yl ddH,O, (44 11 yl. 2) SSC 保温 S min， 然 后 冷却 至 室温 后 放置 min. BAB OMRME. 3) 复 性 反应 液 中 加 入 下 述 试剂 : 4 pl 2 mmol/L [aS] dNTPs, 4 pl ZL 1.1.1.2 染料 -未 端 混 合 液 ，1 由 测序 酶 / BERBERS (13 U/yl). 4) BEIRS, 37C 保温 10 min. 5) 每 一 管 中 加 20 pl 9.5 mol/L RRA 90 pl CB, BRIS a KE 10 min. 6) 室温 中 13 000 g BL 15 min 使 其 沉淀 ，300 pl 70% 乙醇 洗 两 次 ， 真 空 短暂 干燥 ， 通 常情 况 下 肉眼 看 不 到 DNA 沉 演 。 3.2 DNA 测 序 胶 的 配制 1 仔细 清洗 玻璃 板 (由 Applied Biosystems, Inc. 供应 ) 为 荧光 测序 法 的 关键 所 在 ， 因 为 尘埃 和 磨损 可 导致 光 的 散射 。 玻 璃 板 应 仔细 用 稀释 的 Alconox 液 以 软 纸 拱 洗 〈 可 用 大 张 Kimwipe'")， 温 水 淋 洗 后 再 用 蒸馏 水 彻底 淋 洗 ， 然 后 用 无 水 酒精 淋 洗 ， 并 在 内 表面 以 异 丙 醇 措 洗 ， 在 空气 中 干燥 。 隔 条 及 梳子 也 应 作 透 彻 的 清洗 和 和 王 燥 。 重 要 的 是 每 一 块 板 要 指定 一 面 为 内 表面 ， 以 尽量 减少 胶 面 由 于 玻璃 磨损 而 起 泡 ， 要 做 到 这 一 点 可 以 在 玻璃 的 外 表面 的 一 角 用 刻 玻 璃 刀 划 一 痕迹 ， 或 贴 上 胶带 或 用 不 褪色 的 墨水 做 记号 。 将 没有 凹 槽 的 玻璃 板 外 表面 朝 下 放 在 稳定 的 平台 上 。 沿 玻 板 两 长 边 放 置 胶 隔 条 ， 将 带 凹 槽 的 玻 板 轻 轻 地 放 在 无 止 槽 的 玻 板 及 隔 条 上 ， 确 保 两 块 玻 板 边 沿 全 部 对 齐 ， 且 隔 条 准确 地 安放 在 两 块 玻 板 间 ， 在 每 一 长 边 用 两 个 大 的 夹子 将 玻 板 及 隔 条 固定 在 一 起 。 在 250 ml 烧杯 中 加 下 列 试剂 以 制备 凝 胶 : 22 g 尿素 ，8 ml 40% A 和 B, 2.5 ml 20 xTBE， 加 蒸馏 水 至 S0 ml, SSC 加 热 数 分 钟 以 溶解 尿素 ， 搅 拌 直至 溶液 变 清 晰 ， 用 0.45 pm 滤 膜 过 滤 凝 胶 溶 液 (参见 注释 $)。 把 245 wl 15% 过 硫酸 铵 和 30 pl TEMED 加 进 凝 胶 溶 液 中 ， 旋 转 烧 杯 以 混 匀 液 体 并 22105 60 ml 针 简 。 将 凝 胶 板 装置 平 放 在 台面 上 ， 于 两 块 玻 板 间 将 凝 胶 沿 带 止 模 玻 板 顶部 的 边缘 注入 ， 从 凝 胶 板 装置 的 一 侧 开始 缓慢 地 向 另 一 侧 移动 注射 器 ， 靠 毛细 管 - Bk2 - 2 3 dl 4 ~~ 作用 将 胶 吸 入 。 如 果 出 现 气泡 ， 用 手指 弹 动 玻 板 顶部 使 胶 流 过 产生 气泡 的 部 位 。 当 胶 溶 液 的 最 前 沿 已 到 达 胶 的 开口 处 时 停止 注 液 ， 在 胶 的 顶部 目 模 中 插入 直 缘 铸模 杭 子 。 沿 止 槽 玻 板 顶 部 用 三 个 固定 夹 夹 牢 ， 凝 胶 至 少 应 聚合 2 h。 取出 夹子 和 梳子 。 止 槽 玻 板 的 内 侧 可 能 出 现 聚 丙烯 酰胺 的 薄片 ， 用 梳子 沿 槽 边缘 移 动 以 去 掉 这 些 薄 片 ， 用 水 淋 洗 玻 板 外 表面 以 去 除 任 何 遗留 的 胶 物 质 ， 接 着 用 乙醇 淋 洗 ， 并 在 空气 中 干燥 。 用 TexwipeIY 和 玻璃 清洁 剂 或 异 丙 醇 拱 洗 玻璃 板 的 外 表面 ， 将 凝 胶 装 置 放 进 373A DNA 测序 仪 的 电泳 槽 中 。 6) 重新 启动 Macintosh 计算 机 ， 确 保 ABI 数据 收集 软件 和 数据 分 析 软 件 已 预 置 在 “ 自 动 运行 ”中 。 在 373A 测序 仪 上 启动 玻 板 检查 功能 以 确保 玻 板 已 确实 清洁 干净 ， 并 且 无 脏 物 和 凝 胶 物 质 。 应 在 数据 收集 程序 的 “扫描 ”窗口 扫描 查看 玻 板 ， 应 当 看 到 代表 四 种 荧光 颜色 的 四 条 平坦 的 线 。 如 果 看 到 蓝 峰 ， 意 味 着 玻 板 上 有 人 尘埃 或 污点 ， 应 用 异 丙 醇 或 TexwipeIX 清 洁 剂 仔细 清除 污点 区 ， 如 有 必要 可 重复 玻 板 扫描 检查 。 如 果 观 察 到 四 个 峰 ， 就 表示 是 胶 本 身 污 染 而 造成 的 光 散 射 ， 在 这 种 情况 下 如 果 对 胶 作 预 电泳 则 峰 可 能 会 消失 。 如 果 清 洗 玻 板 和 预 电 泳 后 污染 峰 仍 持续 存在 ， 则 建议 重 新 制 胶 或 在 发 生 问题 的 区 域 的 孔 中 不 加 样品 。 假 如 样品 孔 空 置 着 ， 则 电泳 完成 后 要 检查 样品 轨道 ， 应 确信 污染 峰 没有 被 记录 和 分 析 。 将 上 边 的 缓冲 液 槽 和 塑料 标 斥 放置 就 位 。 将 瘤 齿 梳 小 心地 插 在 两 块 玻璃 板 中 间 ， 利 用 标 斥 上 的 数字 摆 正 梳子 的 位 置 。 梳 子 的 齿 应 恰恰 穿 入 胶 的 顶部 。 拧 紧 上 槽 两 个 螺 丝 使 标尺 固定 。 用 1xTBE 缓冲 液 装 满 上 下 两 个 缓冲 液 槽 。 用 滴 管 冲 掉 样 品 孔 中 的 尿素 ， 将 373A 和 缓冲 液 槽 的 电极 连接 起 来 ， 关 闭 电 泳 槽 的 门 。 以 30 W 稳 压 在 40T 中 预 电 泳 30 min， 在 预 电 泳 过 程 中 应 当 打开 一 个 新 的 样品 表 CE “OE” REP), 并 输入 适当 的 数据 。 5 4 7 a 3.3 电泳 和 数据 收集 1) 在 5$ 岂 上 样 液 中 溶解 干燥 的 测序 反应 物 ，98 人 加热 3 一 5 min。 2) 用 滴 管 冲洗 去 除 全 部 样品 孔 中 的 尿素 ， 将 标 奇 数 的 样品 加 进 奇 数 孔 中 (如 1、3、 $)。 关 闭 电泳 室 门 ， 以 30 W 恒 功 率 在 40 人 电泳 2 一 5 min 使 样品 进入 凝 胶 中 去 。 打 开 电 泳 室 门 ， 将 偶数 样品 加 入 偶数 孔 中 ， 关 闭 电泳 室 门 ， 稳 定 于 30 W 在 407 中 电 泳 10 一 14 h。 由 于 样品 进入 胶 时 的 盐 效 应 ， 按 奇数 和 偶数 次 序 上 样 将 使 泳 道 间 留 下 小 的 空 除 ， 从 而 有 利于 分 析 软 件 准确 地 跟踪 泳 道 。 用 鼠标 按 下 收集 钮 开始 作 数 据 收 集 。 计 算 机 将 收集 10~14 h 的 数据 ， 这 期 间 建议 Macintosh 主机 不 作 其 他 用 途 。 电 泳 期 间 可 能 出 现 的 问题 参见 注释 6 一 14。 电泳 完毕 后 打开 电泳 室 门 ， 虹 吸取 出 上 边 缓 冲 液 槽 中 的 一 部 分 缓冲 液 ， 拔 掉 电 极 线 ， 切断 激光 电源 ， 从 仪器 中 小 心 取出 上 边 缓 冲 液 槽 和 凝 胶 装 置 。 留 在 上 边 缓冲 液 槽 的 液体 可 以 废弃 ， 小 心 分 开 玻 板 ， 清 洁 后 放置 在 安全 的 地 方 。 吕 免 用 刀片 取出 凝 胶 ， 应 用 纸巾 贴 在 腕 上， 使 纸巾 和 凝 胶 一 起 脱离 玻 板 后 丢弃 ， 冲 洗 上 下 两 个 缓冲 液 槽 ， 倒置 于 纸巾 上 待 干燥 。 3 Neg 4 Se - 85 - 3.4 数据 分 析 和 评估 收集 数据 结束 后 ，Macintosh 计算 机 将 自动 启动 数据 分 析 程 序 。 这 时 ， 一 份 凝 胶 文 件 和 包含 每 一 样品 的 一 份 结 果 以 及 测序 文件 便 会 建立 。 有 时 最 初 阶段 的 分 析 可 能 会 出 现 问题 ， 导 致 分 析 数 据 的 缺失 。 如 果 发 生 这 类 情况 ， 可 用 注释 15 所 述 的 恢复 程序 补救 数 据 。 从 “窗口 ”菜单 中 选择 “已 分 析 数 据 "， 可 借助 位 于 可 移动 的 分 析 控 制 板 上 的 放大 器 打开 的 任 一 样品 文件 进行 查看 。 如 果 Macintosh 主机 连接 有 彩色 打印 机 或 绘图 器 ， 分 析 过 的 数据 可 被 打印 出 来 。 此 外 ， 通 过 与 另外 的 Macintosh 计算 机 的 网 络 连接 ， 或 利用 如 NCSA Telnet 等 信息 交流 程序 将 数据 在 Sun 计算 机 上 贮存 起 来 。 如 果 以 后 所 取 用 的 数 据 限于 在 Macintosh 计算 机 上 应 用 ， 样 品 文件 应 通过 所 选择 的 MacBinary 程序 转换 。 通常 ， 数 据 分 析 在 未 摊 入 的 标记 引物 所 产生 的 四 种 色 块 出 现 之 后 立即 开始 。 然 而 由 于 外 源 荧光 信号 被 检测 ， 数 据 分 析 的 起 始 有 时 会 提前 。 这 些 样品 可 用 手工 操作 进行 分 Or; 可 通过 查看 该 样品 的 原始 数据 以 决定 样品 分 析 的 新 的 起 始点 ， 从 “分 析 ” 菜 单 中 选 择 “ 碱 基 判 读 "， 将 新 的 起 始点 输入 到 适当 的 位 置 。 可 以 打开 位 于 “窗口 ”菜单 下 面 的 “分 析 列 表 ” 以 监测 分 析 过 程 。 注 意 ， 可 以 同时 进行 多 个 样品 的 再 分 析 。 可 从 几 个 方面 发 现 数据 质量 的 线索 。 最 为 明显 的 表现 是 数据 的 外 观 和 范围 。 数 据 应 有 相当 一 致 的 信号 强度 ， 在 整个 读 序 范围 中 只 应 有 轻 度 的 下 降 。 虽 然 在 整个 读 序 过 程 中 都 将 进行 碱 基 判 读 ， 但 经 验 表 明 在 400 个 碱 基 以 后 仪器 的 碱 基 确认 准确 性 大 为 下 降 。 对 于 相当 高 质量 的 样品 ， 在 最 初 400 个 碱 基 中 “无 碱 基 ” (N) 是 不 常见 的 。 背 景 噪 音 ， 表现 为 沿 着 基线 的 许多 小 峰 ， 应 当 不 会 高 到 干扰 碱 基 的 判读 。 过 多 噪音 常 由 于 模板 不 纯 引起 (参见 注释 16 一 18)。 有 关 数 据 质量 的 其 他 信息 可 从 “文件 信息 ”窗口 获得 。 这 里 展示 了 信号 和 碱 基 间 隔 的 数据 。 典 型 的 情况 下 ， 对 于 一 个 高 质量 的 样品 来 说 ， 它 的 信号 强度 应 比 四 种 染料 中 最 弱 的 一 种 大 40 一 50。 碱 基 间 隔 应 为 9 一 11; 如 果 碱 基 间 隔 超出 这 一 范围 ， 精 确 的 碱 基 判读 可 能 受到 影响 。 碱 基 间 隔 可 通过 调整 胶 和 缓冲 液 成 分 以 及 电泳 条 件 达 到 最 佳 状 态 。 凝 胶 文件 ， 包 括 全 过 程 中 计算 机 描绘 的 彩色 “ 自 显影 图 谱 ” 也 是 评 估 数 据 质量 的 有 用 的 资料 。 在 这 里 应 该 可 以 看 到 直 而 分 开 的 泳 道 ， 直 到 志 沪 最 后 阶段 都 有 明显 的 条 带 。 在 观察 凝 胶 文件 中 的 数据 时 ， 与 胶 有 关 的 问题 往往 显然 可 见 。 通 过 观察 是 否 所 有 样品 为 白色 的 “跟踪 线 ” 所 分 开 ， 就 可 以 知道 “跟踪 线 ” 的 好 坏 。 如 果 “ 跟 踪 线 ” 没 有 很 好 地 跟踪 样品 条 带 ， 该 样品 必须 进行 手工 跟踪 。 从 “分 析 ” 菜 单 中 选择 “了 跟 踩 泳 道 ” 并 沿 着 样品 泳 道 确定 几 点 便 可 以 达到 这 一 目的 。 irate 吉 束 后 样品 即 可 进行 自动 分 析 。 4. 注 释 (1) 通过 PCR 产生 的 模板 (i) PCR 反应 可 以 用 下 列 材 料 进行 ， 鸣 菌 体 裂解 物 、DNA (0.01~1 pe) 或 接种 到 少量 水 或 TE 缓冲 液 中 的 细菌 菌落 或 噬 菌 班 。 反 应 液 中 应 含 下 述 成 分 , x pl HE Wa7K, S pl 10 x PCR 缓冲 液 ， 8 pl 1.25 mmol/L dNTPs, 2.5 ul 51 1 . BAR. (20 pmol/L), 2.5 由 引物 2 (20 pmol/L), y pl (一般 用 1 一 5 pl) RAR, 0.2 yl Taq DNA 聚合 酶 (5 U/l), BAAA 50 pl. Gi) 如 有 必要 ， 用 80 岂 轻 质 矿 物 油 覆盖 反应 物 表 面 。 热 循环 仪 预 热 到 OSC, Fem 放置 预 热 的 金属 加 热 板块 中 ， 在 OSC 保温 2 min。 用 Perkin-Elmer (ae 7% Pit 参数 进行 热 循 环 反应 : DNA 热 循 环 仪 9600 热 循 环 仪 94T 30s 92T 10s 55T 30s 55T 60s 72T 60s 72T 60s 循环 35 次 循环 35 次 反应 结束 后 ， 样 品 在 4 保存 。 (iii) 样品 从 反应 管 中 取 出 ， 转 移 到 装 有 8 vl 3 mol/L 醋酸 钠 、pH 4.8，20 pl 40% (w/v) PEG-8000, 10 mmol/L MgCh 的 1.5 ml 微型 离心 管 中 ， 如 果 样 品 用 矿 物 油 覆 盖 ， 很 重要 的 是 不 要 把 矿物 油 转 移 。 样 品 通过 涡 旋 振 蔓 混 匀 后 室温 中 放置 10 min。 (iv) 以 13 000 g 在 室温 中 离心 1$ min 以 取得 DNA 沉淀 。 用 抽 和 气 法 小 心地 去 除 全 部 上 清 液 。250 pl 100% 乙 醇 洗 两 次 (室温 )， 真 空中 稍 事 干 燥 。 (v) 用 20 pl 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mmol/L EDTA 溶 解 各 个 样品 。 可 取 1 一 2 ml Fein ESR AB EER EE iT. DNA 测序 采用 下 面 所 描述 的 线性 扩 增 分 析 方 法 : A、C RMA 1 pl PCR 制备 的 DNA，G 和 工 反 应 中 用 2 pl DNA。 这 一 方法 可 用 来 从 黏 粒 或 噬菌体 克隆 直接 制备 模板 。 (2) 核 背 酸 类 似 物 ， 例 如 7-deaza-dATP 和 7-deaza-dGTP 可 用 于 解析 某 些 压缩 的 序列 ， 可 从 Boehringer-Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) 公司 购 得 10 mmoML 的 溶液 。 在 所 有 的 混合 液 中 7-deaza-dATP 和 7-deaza-dGTP 可 取代 dATP 和 dGTP. dATP 混合 液 中 ， 用 2.5 wl 7dce-dATP 和 10 pl 10 mmol/L 7dc-dGTP; dCTP RAK 中 用 10 wl 10 mmol/L 7dc-dATP 和 10 mmol/L 7dc-dGTP; dGTP 混合 液 中 用 5 yl 5 mmol/L7dc-dGTP 和 10 pl 10 mmol/L 7dc-dATP; dTTP 混合 液 中 用 10 mmol/L 7dc-dATP 和 10 mmol/L 7dc-dGTP 各 20 pl. (3) 以 M13 RP1 作为 引物 时 ， 某 些 从 pUC18 和 pUC118 制备 的 DNA 在 3“ 端 引物 位 点 已 缺失 了 一 个 核 苷 酸 。 应 用 这 些 载体 作 亚 克隆 测序 时 ， 应 当 用 缺少 3“C 的 逆向 引 物 f (17) 5’'TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG 3’, (SP6) 5’ ATT-TAG-GTG- ACA-CTA-TAG B48 (4) 如 果 用 荧光 标记 SP6 测序 引物 ， 复 性 温度 应 从 SSC 降 到 SOC 。 同 样 地 ， 对 于 其 他 的 测序 引物 ， 应 计算 解 链 温度 (Ta。) 并 据 此 调整 热 循 环 条 件 。 (5) 如 果 每 日 都 进行 凝 胶 测 序 ， 工 作 胶 溶液 可 配制 好 后 在 ACU AR. JRA 110.3 g 尿素 ， 40 ml 40% A&B, 13 ml 20xTBE，125 ml 蒸馏 水 。 按 前 述 方法 溶解 尿素 并 进行 过 +, S16? 。 滤 。 如 果 用 不 透明 的 瓶子 保存 ， 该 溶液 可 用 2 一 3 星期 ， 每 一 块 胶 用 50 ml。 如 果 扫 描 窗 中 没有 发 现 扫描 线 ， 应 检查 373A 机 的 “开始 扫描 ”按钮 是 否 确 已 按 下 。 主 菜单 应 读 出 “停止 扫描 ”。 如 果 扫 描 已 经 启动 但 无 扫描 线 出 现 ， 停 止 这 次 操 作 并 重新 启动 。 如 扫描 线 仍 不 出 现 ， 按 主键 盘 上 的 删除 键 并 在 LCD 莱 单 上 选 “ 全 部 重新 设置 ”以 重新 启动 373A ( 注 : 重新 设置 将 把 日 期 、 时 间 和 PMT 电压 删 去 ， 在 重新 设置 完毕 后 将 这 些 数 据 再 次 输入 )。 如 果 重 新 设置 不 解决 问题 ， 则 须 检 查 373A 与 主机 间 的 连接 线 。 如 果 上 述 种 种 都 不 能 解决 任何 问题 ， 应 与 ABI 地 区 服务 部 门 联系 。 扫描 线条 约 为 满 度 的 25% 。 在 操作 开始 时 观察 扫描 窗口 ， 平 坦 的 扫描 线条 应 为 满 度 的 25% 一 30% 。 如 果 扫 描 线 条 低 于 此 值 ， 则 应 增加 PMT 电压 。 在 PMT 电压 的 设置 中 先 选用 “标定 ”calibration)， 再 选用 LCD 菜单 上 的 “安装 ” (configure), 并 进行 随后 的 几 种 选择 。 每 台 机 器 的 PMT 电压 设置 都 不 同 ， 并 且 可 能 随 着 激光 的 老化 而 改变 。 典 型 的 情况 下 设置 在 S40 一 560 效果 较 好 。 (8) 当 电源 发 生 故障 时 373A 将 对 用 户 发 出 哪 哪 的 报警 声 。 这 时 应 立即 停止 电泳 或 预 电 泳 ， 然 后 再 重新 开始 电泳 。 如 果 观 察 不 到 电流 ， 则 应 打开 电泳 槽 的 门 ， 检 查 电 极 线 的 连接 ， 并 检查 螺丝 的 连接 。 如 果 电 源 故 障 依然 存在 ， 则 在 373A 的 主键 盘 上 按 删 除 键 ， 并 选择 LCD 上 的 “elect only”"。 如 果 以 上 种 种 都 不 解决 问题 ， 则 应 与 ABI 地 区 服务 部 门 联系 。 (9) 马达 发 生 故障 。 驱 动 扫描 仪 的 电 马达 有 一 定 的 寿命 。 这 一 部 件 的 损坏 常会 先 出 现 呼 叫 声 。 这 一 问题 不 容易 由 用 户 自行 解决 。 应 与 ABI 地 区 服务 部 门 联系 。 (10) 激 光 故 障 。 各 个 氨 激 光 的 寿命 虽然 相差 较 大 ， 但 是 都 具有 一 定 的 寿命 。 为 了 保证 不 发 生 突 然 的 激光 故障 ， 应 每 周 进行 激光 检验 。 在 373A LCD“ 自 测试 ”菜单 上 按 “more” 键 直到 激光 测试 选择 显示 出 来 。 按 “激光 ” 键 并 输入 “40” 作 为 靶 功 率 ( 即 40 mW); 准确 记录 激光 输出 和 激光 摄取 的 电流 。 当 激光 老化 时 则 将 耗 去 更 多 电流 以 产生 所 需 的 电压 。 如 果 激 光 故 障 明 显 ， 激 光 摄 取 的 电流 量 将 明显 增加 。 此 时 ， 应 与 ABI 地 区 服务 部 门 联系 。 (11) 凝 胶 聚 合 不 完全 。 表 现 为 凝 胶 文件 中 的 畸形 图 形 。 测 序 胶 要 求 聚合 时 间 不 少 于 2 h。 如 果 已 有 足够 的 聚合 时 间 ， 配 制 新 的 15% APS 和 TEMED 可 能 解决 这 一 问题 。 (12) 样 品 带 “互相 渗透 "。 观 察 凝 胶 文件 可 发 现 这 种 现象 ， 它 可 能 是 制 胶 时 效 齿 梳子 插 入 不 当 所 致 。 杭 子 应 插入 到 梳 齿 进入 胶 中 1 一 2 mm WE. Bb, MART 稍 有 移动 后 再 插入 ， 胶 孔 间 便 可 能 出 现 渗 漏 。 假 如 梳子 造成 部 分 凝 胶 损 伤 ， 则 不 应 在 损伤 区 加 样 或 者 重新 制 胶 。 聚 合 不 完全 的 凝 胶 也 可 能 造成 样品 渗 漏 〈 参 见 注释 11). (13) FR am Oia A, AY RE HE Pa AR AE LE PR eI ALA, ROHS, 泳 道 跟踪 便 可 能 受到 和 干扰。 如 果 第 二 次 与 第 一 次 加 样 的 间隔 时 间 过 长 ， 还 会 发 生 另 外 的 问题 。 这 种 情况 下 ， 伴 随 着 反应 产物 前 面 的 引物 / 盐 前 沿 的 荧光 信和 号 可 能 对 泳 道 的 恰当 检测 和 跟踪 产生 干扰 。 加 偶数 样品 前 的 时 间 间 隔 不 应 超过 5 min。 (14) 电 泳 速度 太 快 或 太 慢 。60 一 80 min 后 凝 胶 上 应 能 见 到 未 挫 入 的 染料 引物 或 染料 未 闯 标 记 物 。 如 果 上 述 物 质 的 高 峰 出 现 过 早 或 过 迟 ， 数 据 分 析 可 能 受到 严重 影响 。 在 - BIG - (6 NA (7 So 373A 上 核实 电泳 条 件 ; 我 们 常规 用 30 W 稳 恒 功率 进行 电泳 。 凝 胶 和 缓冲 液 成 分 也 应 进行 检查 。 除 了 6% 以 外 ， 其 他 浓度 的 聚 丙烯 酰胺 胶 都 与 373A 不 相 匹 配 。 (15) 计 算 机 问题 。Macintosh 主机 硬盘 容量 超过 75$% 也 可 引起 数据 分 析 上 的 问题 。 为 了 避免 这 些 问 题 ， 样 品 文件 应 进行 拷贝 ， 既 可 以 拷贝 在 软盘 上 也 可 拷 在 输出 的 远 端 硬 盘 上 ， 并 进行 适时 删除 。 另 外 ，Macintosh 主机 应 作为 专用 机 ， 不 应 用 作文 字 或 图 像 处 理 ， 或 作 其 他 目的 之 用 。 在 计算 机 上 装载 各 种 INITs 和 cDevs (控制 器 ) 可 导 致 严重 问题 。 为 了 避免 硬盘 配制 引起 的 问题 ， 每 月 至 少 运行 一 次 硬盘 修复 程序 (如 Apple’s Disk First Aid)。 如 果 数 据 分 析出 现 问题 ， 检 查 数据 收集 程序 或 数据 分 析 程 序 中 位 于 “窗口 ”菜单 下 的 “记录 文件 ”(log file)。 这 一 文件 含有 数据 收集 和 分 析 事件 表 ， 可 能 为 间歇 发 生 的 计算 机 问题 提供 线索 。 如 果 数 据 分 析 发 生 故 障 并 且 出 现 了 错误 的 信息 ， 运 用 恢复 程序 之 一 可 以 完全 恢复 全 部 数据 。 完 整 的 错误 信息 列表 和 错误 发 生 的 原因 可 从 Applied Biosystems 公司 获得 ， 并 可 获得 数据 恢复 的 详细 指南 。 推荐 373A 用 户 取得 这 一 列表 并 将 它 张贴 在 测序 仪 的 附近 。 (16) 测 序数 据 过 早 终止 。 几 个 因素 可 能 与 测序 的 数据 中 断 有 关 。 如 果 制 备 模板 用 了 RNase 步骤 ， 其 中 污染 的 DNase 可 能 导致 测序 数据 的 中 断 。 这 问题 常常 伴随 着 背景 峰 的 增加 。 模 板 DNA 用 量 不 足 的 反应 会 导致 数据 中 断 ; 也 可 以 在 文件 信息 窗口 上 见 到 明显 减弱 的 信和 号 强度 。 模 板 过 多 也 会 引起 数据 中 断 。 如 果 为 了 去 掉 模 板 中 的 RNA 而 进行 某 种 树 酯 的 处 理 ， 污 染 物 可 能 随 DNA 一 起 纯化 而 突出 了 这 一 问题 。 在 这 里 为 获得 高 质量 测序 所 需 的 DNA 的 量 应 进行 标定 。 另 一 常见 的 造成 数据 中 断 的 原因 是 dNTP / ddNTP 配方 不 正确 。 (17) 低 信号 强度 。 测 序 反 应 中 模板 DNA 或 引物 用 量 不 足 可 引起 信号 强度 减低 。 应 检查 引物 浓度 是 否 准确 。 对 于 某 些 测序 引物 ， 标 准 的 SSY 的 复 性 温度 可 能 太 高 ， 应 当 降低 ， 对 于 线性 扩 增 测序 法 更 是 如 此 。 例 如 SP6 引物 用 复 性 温度 SOT 能 获得 很 好 的 结果 ， 如 果 用 SST 的 复 性 温度 则 几乎 不 出 现 信号 。 测 序 试 剂 配方 和 贮存 不 正确 也 可 导致 低 信 号 强度 。 (18) 高 背景 。 含 有 大 量 RNA 的 DNA 将 形成 高 背景 ， 对 于 线性 扩 增 测序 法 尤其 如 此 。 另 一 引起 高 背景 的 常见 原因 是 反应 物 中 不 止 一 种 DNA 模板 的 存在 。 这 可 能 是 不 适 当地 挑 取 了 不 止 一 个 菌落 或 噬 菌 斑 之 故 ， 小 心地 挑 取 单 个 菌落 或 叹 菌 斑 可 避免 发 生 这 种 情况 。 其 他 背景 问题 可 能 是 因为 在 模板 的 制备 或 在 测序 反应 中 用 了 污染 的 试 剂 。 致谢 作者 对 R. Waterston fl J. Sulston 以 及 线虫 基因 组 测序 项 目的 全 体 成 员 所 给 予 的 建 WW. SHRM ALAR AHS “ 317 - \D 12. 参考 xX mM . Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R., Heiner, C., Kent, S. B. H., and Hood, L. E. (1986) Fluorescence detection in auto- mated DNA sequencing. Nature 321, 674-679. . Ansorge, W., Sproat, B. S., Stegemann, J., Schwager, C., and Zenke, M. (1987) Automated DNA sequencing: ultrasensitive detection of fluorescent bands during electrophoresis. Nucl. Acids Res. 15, 4593-4602. . Prober, J. M., Trainor, G. L., Dam, R. J., Hobbs, F. W., Robertson, C. W., Zagursky, R. J., Cocuzza, A. J., Jensen, M. A., and Baumeister, K. (1987) A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science 238, 336-341. . Brumbaugh, J. A., Middendorf, L. R., Grone, D. L., and Ruth, J. L. (1988) Con- tinuous, on-line DNA sequencing using oligodeoxynucleotide primer with mul- tiple fluorophores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5610-5614. . Kambara, H., Nishikawa, T., Katayama, Y., and Yamaguchi, T. (1988) Optimiza- tion of parameters in a DNA sequenator using fluorescence detection. Biotechnol- ogy 6, 816-821. . Connell, C. R., Fung, S., Heiner, C., Biidgham, J., Chakerian, V., Heron, E., Jones, B., Menchen, S., Mordan, W., Raff, M., Recknor, M., Smith, L., Springer, J., Woo, S., and Hunkapiller, M. (1987) Automated DNA sequence analysis. BioTechniques 5, 342-348. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771. . Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Effect of manganese ions on the incorpora- tion of dideoxynucleotides by bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080. . Wilson, R. K., Chen, C., and Hood, L. (1990) Optimization of asymmetric polymerase chain reaction for fluorescent DNA sequencing. BioTechniques 8, 184-189. . Wilson, R. K., Chen, C., Avdalovic, N., Burns, J., and Hood, L. (1990) Develop- ment of an automated procedure for fluorescent DNA sequencing. Genomics 6, 626-634. Koop, B. F., Wilson, R. K., Chen, C., Halloran, N., Sciammis, R., and Hood, L. (1990) Sequencing reactions in microtiter plates. BioTechniques 9, 32-37. ar 二 (1991) A temperature regulator for microtiter plates. Nucleic Acids Res. » 2506. * 31875 第 五 十 二 章 ” 用 于 Maxam-Gilbert DNA 测序 法 中 的 DNA 未 端 标记 Eran Pichersky Tl 1. 5] 两 种 酶 可 用 来 在 DNA 的 末端 标记 上 同位 素 ”P。T4 SK RAS AT ATP 的 一 个 PERE (ATP 的 y -磷酸 基 团 ) 优先 加 到 5“ 端 。DNA 聚合 酶 可 将 互补 的 核 苷 酸 补 平 缩 进 的 3" 端 缺口 ， 它 的 3 一 5 外 切 酶 活性 也 能 使 平 未 端 或 3" 端 凸 出 成 为 3 IE, SR 同样 地 补 平 这 些 空缺 。 不 过 聚合 酶 常用 于 填充 反应 ， 而 下 . coli DNA Pol I Klenow 片段 只 有 很 低 的 3 一 和 外 切 酶 活性 ， 因 而 对 于 用 于 测序 的 DNA 的 末端 标记 来 讲 ， 它 对 平 末 端 和 3“ 端 的 填充 活力 在 原则 上 可 以 忽略 不 计 (参见 注释 1)。 用 限制 酶 消化 得 到 的 线 状 双 链 DNA 分 子 一 般 是 DNA 末端 标记 的 起 始 材 料 。( 由 于 几乎 所 有 的 限制 酶 都 作用 于 双 链 DNA)， 经 它 作 用 后 的 DNA 可 以 说 具有 两 个 $ 端 和 两 个 3 端 。 因 此 T4 DNA 多 核 苷 酸 激酶 将 标记 两 个 $ 端 (在 双 链 分 子 的 两 个 相反 的 末端 上 )， 而 Klenow 酶 使 它们 形成 两 个 标记 的 3“ 端 ， 也 同样 标记 双 链 分 子 的 两 个 相反 的 未 端 。 不 过 注意 ， 每 一 链 仅 被 标记 一 端 。 要 获得 适用 于 化 学 测序 的 标记 DNA， 可 以 采用 下 列 两 种 方法 之 一 。 一 种 是 使 DNA 变性 并 将 两 链 分 离 〈 每 一 链 只 在 一 端 被 标记 )。 虽 然 在 原则 上 有 时 是 可 行 的 〈 例 如 ， 用 较 长 变性 胶 电泳 较 长 的 时 间 )， 但 另 一 方法 则 更 为 简便 ， 因 此 分 离 末 端 标记 的 单 链 的 方 法 几乎 从 未 实际 应 用 过 。 在 另 一 方法 中 消化 两 端 标记 的 双 链 DNA 分 子 ， 然 后 在 另 一 种 切 在 两 个 未 端 之 间 的 限制 酶 的 作用 下 产生 两 个 片段 (幸运 的 话 ， 长 度 不 等 )， 每 一 片段 只 在 双 链 分 子 所 产生 的 四 个 末端 之 一 被 标记 上 。 接 着 在 非 变 性 丙烯 酰胺 凝 胶 上 可 将 两 个 片段 分 开 ， 重 新 分 离 后 直接 用 于 测序 。 虽 然 这 样 的 片段 是 双 链 分 子 ， 只 有 一 条 链 做 了 标 记 ， 而 且 这 链 仅 在 一 端 被 标记 。 所 有 化 学 反应 进行 如 常 。 然 后 对 样品 进行 变性 及 电泳 (参见 第 五 十 三 章 ); 未 经 标记 链 的 降解 产物 不 会 在 自 显影 谱 上 显示 出 来 ， 也 就 对 测序 过 程 没 有 影响 上 。 须要 考虑 的 一 个 重要 因素 是 标记 反应 所 用 的 起 始 物质 ， 它 可 以 是 被 克隆 进 质 粒 的 DNA， 或 者 是 一 个 重组 喉 菌 体 或 PCR 产物 。 我 们 认为 用 CsCl 作 梯 度 离 心 纯化 的 DNA 是 最 好 的 来 源 ， 虽 然 由 各 种 微量 制备 方法 得 来 的 质粒 也 是 适用 的 。DNA 必须 经 限制 性 内 切 酶 切 制 ， 产 生 至少 一 个 或 几 个 线性 片段 。 如 果 用 作 模 板 的 DNA 经 限制 酶 消化 后 产 生 了 不 止 一 个 片段 ， 而 只 要 求 对 某 一 特定 片段 作 测序 ， 那 么 在 进行 末端 标记 前 先 分 离 出 该 片段 ， 例 如 通过 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 洗 脱 进行 分 离 应 该 是 可 取 的 。 不 过 每 一 纯化 步骤 会 引 起 一 些 DNA 的 丢失 (可 是 在 标记 好 以 后 一 般 总 得 再 一 次 分 离 目 标 片 段 以 去 除 未 挫 入 的 标记 物 ， 而 且 当 不 止 一 种 片段 被 标记 时 ， 将 它 和 其 他 片段 相 分 离 )。 此 外 ， 从 琼脂 糖 凝 >) i 胶 上 洗 脱 下 来 的 片段 不 像 仍 在 限制 酶 切 反应 试管 中 的 那些 片段 那样 标记 得 好 。 因 此 ， 要 取得 高 产量 和 高 比 活 ， 最 好 是 在 一 个 反应 管 中 完 成 全 部 的 反应 ， 不 要 经 受 纯化 的 种 种 步 又 和 改变 缓冲 体系 。 然 后 这 些 片段 在 丙烯 酰胺 凝 胶 上 进行 分 离 ， 按 理 可 得 到 100 一 1000 个 核 苷 酸 范围 内 的 片段 (参见 注释 2)。 怎样 才能 在 同一 个 反应 管 中 不 改变 缓冲 体系 而 取得 只 标记 一 个 末端 的 DNA 片段 WE? FIFE. coli 聚合 酶 I 的 Klenow 片段 的 特点 ， 标 记 3 缩 进 的 末端 〈 补 平反 应 ) 而 不 标记 $“ 缩 进 的 末端 (BN 3 突出) 或 平 末 端 (理论 上 Klenow 也 能 对 5’ 缩 进 端 和 平 末 端 进行 标记 ， 不 过 在 程度 上 大 大 地 低 于 3“ 缩 进 端 ， 因 此 实际 上 可 以 看 作 Klenow 片段 只 对 一 端 标 记 ， 参 见 注 释 1 和 3)。 所 以 在 一 个 须 测序 的 片段 中 如 果 已 经 存在 一 个 能 形成 3“ 缩 进 的 酶 切 位 点 时 ， 我 们 只 须 在 它 的 近 旁 找 一 个 经 酶 切 后 两 端 都 不 被 标记 的 酶 切 位 点 即 可 。 例 如 限制 酶 Pst 1. Sacl. Sph I (3’4th) 和 Dre 工 、Hee 焉 以 及 Ria 工 CE 末端 )， 在 我 们 所 采用 的 条 件 下 ， 在 下 列 反 应 中 所 产生 的 酶 切 位 点 基本 上 都 是 不 标记 的 。 应 该 注意 ， 由 于 标记 的 片段 须 在 丙烯 酰胺 凝 胶 上 分 离 ， 因 此 所 产生 的 片段 的 大 小 有 一 个 上 限 (在 凝 胶 上 >1 kb 的 片段 分 离 得 不 好 ， 并 且 也 不 容易 扩散 到 溶液 里 )。 如 果 在 做 上 标记 的 位 点 近 旁 没有 已 知 的 有 用 位 点 时 ， 我 们 就 用 切割 四 个 碱 基 的 酶 ， 例 如 Hoel, A 为 可 以 假定 在 标记 位 点 的 不 远 处 肯定 会 有 这 样 的 位 点 存在 。 如 果 情 况 并 不 是 这 样 ， 那 么 可 以 换 其 他 切割 4 bp 的 酶 ， 直 到 找到 一 种 合适 的 酶 为 止 。 此 外 ， 当 小 片段 克隆 到 质粒 的 多 位 点 接头 时 ， 我 们 可 以 利用 多 位 点 接头 上 的 限制 酶 切 位 点 。 这 样 就 可 以 选 出 两 种 酶 ， 它 们 分 别 使 克隆 片段 的 一 端 产生 3 “ 缩 进 而 另 一 端 产生 3' 凸 出 。 于 是 就 可 使 这 一 片 段 只 在 一 端 标 记 ， 在 另 一 反应 中 采用 另 一 对 酶 ， 这 一 片段 的 另 一 端 也 可 被 标记 。 2. 材 料 1) DNA: 经 CsCl 纯化 的 质粒 ，1 pg/ml。 2) 限制 酶 。 3) 限制 酶 缓冲 液 (由 制造 商 供应 ) 。 4) DNA Pol I Klenow 片段 。 5) [a 一 P ]dATP; 比 活 =3000 Ci/mmol. 6) 10 mmol/L dCTP。 7) 10 mmol/L dTTP. 8) 10 mmol/L dGTP, 9) 上 样 染 料 : 50 mmol/L EDTA, 10 mmol/L HCl, pH 7.5, 0.1% (w/v) 省 酚 蓝 ， 0.1% (w/v) = AEA FF, 50% HY. oa 10)10 x TBE 缓冲 液 : 0.5 mol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L 硼酸 ，10 mmol/L EDTA, pH 7.5!) , 11) FA EH 12) ALPS Aes EA 13)100% ZR. 14)0.5 mol/L ABR, 1 mmol/L EDTA, pH 7.5. * 320 - 15) 玻 璃 移 液 管 。 16) 玻 璃 羊毛 。 17)ddH,O ( 双 蒸 水 )。 Be 法 1) 在 总 体积 30 局 中 用 酶 消化 1 pg DNA， 每 一 种 酶 1~3U (如 2 U EcoRI, 2U Hae 亚 )，37? 中 保温 30 min。 2) 混 匀 下 述 液体 : 1 pl dTTP, 1 pl dCTP, 1 pl dGTP, 1 pl *P (a)-dATP, 1 U Klenow 酶 ， 加 入 反应 管 中 ，37? 中 保温 20~30 min. 3) 加 20 以 上 样 染料 液 以 终止 反应 CER: 与 琼脂 糖 凝 胶 中 用 的 是 同一 种 染料 ， 但 与 测序 胶 中 用 的 染料 不 一 样 ) 。 | 4) 将 样品 加 在 15 cm Ky 0.3 mm 厚 的 非 变性 5% 丙烯 酰胺 凝 胶 上 (Ae BER SOTA 酰胺 之 比 为 20:1，1xTBE 缓冲 液 )， 样 品 槽 宽 3 一 4 cm。 待 溴 酚 蓝 跑 到 凝 胶 底 部 时 停止 电泳 。 取 去 一 块 玻璃 ， 然 后 用 Saran WrapIM 纸 盖 住 凝 胶 。 在 暗室 里 将 X 射线 底 片 放 在 盖 住 了 的 胶 上 ， 标 明 底片 在 胶 上 人 位置， 曝光 5 一 10 min。 然 后 将 底片 显影 。 5) 将 显影 后 的 又 射线 底片 摆 在 凝 胶 上 ， 找 出 标记 DNA 片段 的 位 置 ， 切 下 并 取出 相应 i AY BEBE, WEA 1.5 ml Eppendorf 管 中 ， 不 必 将 凝 胶 切 成 小 片 。 加 入 0.6 ml 0.5 mol/LA#RE. 1 mmol/L EDTA、pH 7.5 溶液 ， 充 分 摇动 ， 确 保 整个 凝 胶 条 浸 没 ， 然 后 在 37Y 中 至 少 保温 8 h (RK). 6) 用 底部 塞 有 玻璃 羊毛 的 吸管 吸取 管 中 溶液 ， 使 溶液 通过 玻璃 羊毛 移入 另 一 管 中 。 加 1 ml 100% 乙 醇 ， 充 分 摇动 后 立即 离心 10 min。 倒 去 上 清 液 ， 加 入 乙醇 ， 离 心 2 min， 再 次 丢弃 上 清 液 ， 用 拉 尖 的 滴 管 抽 气 吸出 剩余 液体 。 真 空中 干燥 10 min。 加 ddH,O (S0~100 中， 用 量 由 放射 活性 的 量 来 决定 ) 重 悬 样品 。 至 此 ，DNA 已 可 作 测 序 用 (参见 第 五 十 三 章 )。 AP 3 释 (1) 用 Klenow 酶 进行 标记 的 反应 可 直接 在 限制 酶 消化 反应 管 里 进行 ， 无 须 改变 缓冲 液 。 根 据 酶 的 要 求 ， 限 制 酶 消化 可 在 低 、 中 或 高 盐 的 缓冲 液 中 进行 ， 这 三 种 缓冲 液 中 都 含有 Mg 。Klenovw 酶 在 上 述 缓冲 体系 中 作用 都 很 好 ， 因 此 在 整个 标记 反应 中 ， 只 须 加 入 放射 性 和 非 放 射 性 的 核 苷 酸 及 Klenow 酶 。 也 可 一 次 加 入 全 部 反应 物 ， 即 将 限制 酶 、 核 苷 酸 和 Klenow 酶 一 起 加 入 。 不 过 作者 喜欢 使 标记 反应 仅 作用 20~30 min， 而 1pg 的 DNA 的 限制 酶 切 则 大 约 需 1 h。 因 此 ， 标 记 混 合 液 应 在 限 制 酶 反应 开始 后 30 min 加 入 。 只 要 有 可 能 ， 作 者 喜欢 用 “P-dATP 做 标记 ， 因 为 在 作者 实验 室 中 “P-dATP fF 为 标准 的 放射 性 核 苷 酸 ， 也 用 于 其 他 多 种 目的 。 几 乎 所 有 的 3“ 缩 进 末端 都 可 用 dATP 标记 。 位 点 上 其 余 的 核 苷 酸 必须 以 非 放 射 性 状态 加 入 ， 如 果 它 们 出 现在 AK 昔 酸 的 上 游 ， 则 直到 其 他 的 核 苷 酸 加 入 后 再 加 入 A。 如 果 它 们 出 现在 A 的 下 游 ， s’ S2i- * 还 是 应 把 它们 包括 在 反应 中 ， 因 为 它们 以 明显 高 于 ”“P-dATP 浓度 出 现 ， 因 此 ， 一 旦 加 入 了 A 核 苷 酸 ， 其 下 游 位 点 几乎 以 100% 的 效率 被 补充 ， 而 Klenow Mt A FEE 头 用 它 的 3' 一 5 外 切 酶 活性 切 掉 A 核 苷 酸 。 作 为 常规 ， 作 者 把 三 种 非 放 射 性 的 核 苷 酸 (dTTP, dCTP, dGTP) 都 加 入 ， 即 使 其 中 某 一 核 苷 酸 不 出 现在 该 位 点 。 不 需 要 的 核 苷 酸 对 标记 反应 没有 作用 。 非 放射 性 核 苷 酸 的 另 一 有 用 之 处 是 在 另 一 端 CH 常 是 3 突出 端 或 平 末端 ) 也 可 以 立即 为 非 放 射 性 的 核 苷 酸 所 填充 ， 即 使 在 Klenow3“ 一 和 外 切 酶 的 作用 下 产生 了 3“ 缩 进 末 端 也 是 这 样 。 当 然 ， 除 非 该 位 点 确实 需要 一 个 A 核 背 酸 。 似 乎 在 后 一 种 情况 下 ， 测 序 自 显影 谱 上 可 能 会 出 现 较 高 的 背 景 ， 但 作者 并 不 觉得 这 是 一 个 问题 ， 这 可 能 是 因为 Klenow 酶 的 3 一 5 外 切 酶 的 作 用 较 慢 和 填充 反应 时 间 较 短 (20 min). (2) 作者 用 5$% 的 非 变性 丙烯 酰胺 凝 胶 纯化 标记 片段 。 所 分 离 片 段 大 小 为 100 一 1000 bp。 对 小 于 这 一 范围 的 片段 不 值得 作 测序 ， 虽 然 在 丙烯 酰胺 凝 胺 上 可 以 分 离 这 样 的 片段 ， 而 >1000 bp 的 片段 在 凝 胶 中 不 易 分 开 。 即 使 用 琼脂 糖 凝 胶 可 分 离 大 片段 ， 可 是 作者 从 来 就 不 能 用 直接 从 琼脂 糖 凝 胶 分 离 的 片段 来 测序 (标记 前 的 DNA 可 以 在 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 但 在 测序 前 应 先 从 丙烯 酰胺 凝 胶 上 再 行 分 离 一 次 。 用 从 琼脂 糖 凝 胶 上 直接 分 离 的 片段 测序 时 ， 序 列 的 可 读 性 极 差 ) 。 至 于 洗 脱 片段 ， 作 者 仅 将 胶 在 37C 的 洗 脱 缓冲 液 中 保温 过 夜 ， 但 并 不 执 碎 。 DNA 能 很 好 地 扩散 出 来 ， 虽 然 较 大 片段 扩散 较 慢 。 经 过 夜 保温 后 ， 含 1 kb 左右 的 片段 的 管 中 的 放射 性 至 少 有 50% 进入 溶液 ， 对 于 较 小 的 片段 来 说 ， 则 这 百 分 值 更 大 。 然 后 用 玻璃 羊毛 过 滤 溶 液 去 除 较 大 块 的 丙烯 酰胺 凝 胶 。 残 留 的 丙烯 酰 腕 〈 单 体 或 小 的 多 聚 体 ) 对 测序 反应 或 以 后 对 DNA 的 操作 并 无 和 干扰， 即使 它 与 DNA 一 起 沉淀 下 来 。 要 沉淀 标记 的 DNA， 作 者 在 室温 下 加 二 倍 体积 的 100% 乙醇 ， 混 合 后 立即 离 心 。 不 必用 任何 其 他 浓度 的 乙醇 。 目 的 是 要 使 尽 可 能 少 的 盐 和 DNA 一 同 被 沉淀 下 来 。 乙 醇 沉淀 后 抽 气 去 除 液体 ， 再 加 乙醇 洗涤 一 次 ， 抽 气 去 除 液 体 。 沉 淀 出 现在 管 壁 上 。 用 拉 尖 的 滴 管 伸 进 离心 管 的 底部 吸 尽 所 有 液体 。 重 复 操作 悬浮 及 沉淀 步骤 并 无 必要 。 在 低温 下 长 时 间 保 温 也 大 可 不 必 。 室 温 中 DNA 沉淀 较 好 ， 而 低温 下 会 使 盐 沉淀 得 更 多 ， 事 情 不 是 更 好 反而 更 精 。 (3) 应 用 T4 -多 核 苷 酸 激酶 的 DNA 标记 反应 需要 较 长 时 间 ， 并 且 须 使 用 大 量 的 放射 性 物质 及 多 次 变换 缓冲 液 。 因 为 这 些 缺 点 ， 作 者 从 不 用 这 种 酶 做 未 端 标记 来 测序 。 参考 xX 献 1. Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) Sequencing end-labeled DNA with base- specific chemical cleavages. Method. Enzymol. 65, 499-560. 2. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Labo- ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 第 五 十 三 章 DNA 的 化 学 测序 Eran Pichersky Ul 1. 7 DNA 化 学 测序 方法 上 与 酶 法 测序 2 相 比 ， 既 有 优点 也 有 缺点 。 主 要 的 缺点 是 作 同 样 量 的 测序 须要 花 更 多 的 时 间 ， 之 所 以 如 此 ， 有 两 个 方面 的 原因 。 第 一 ， 在 实际 作 化 学 测序 反应 前 必须 对 DNA 进行 末端 标记 ， 并 且 须 再 次 分 离 ， 这 一 步骤 常常 须 用 额外 的 一 天 时 间 (参见 第 五 十 二 章 )。 并 且 由 于 在 反应 中 须 用 更 多 的 DNA， 以 及 由 于 所 测序 的 DNA 的 放射 性 比 活 较 低 ， 因 此 在 自 显影 中 须 用 增 感 屏 ， 所 得 到 的 电泳 条 带 不 及 酶 方法 清晰 ， 因 此 难以 取得 大 约 250 个 核 苷 酸 以 上 序列 的 可 靠 测 序 结果 (除非 跑 很 长 的 凝 胶 )。 不 过 化 学 方法 常常 在 几 个 方面 值得 采用 。 可 以 从 一 个 克隆 的 任何 位 置 开 始 进行 测序 而 无 须 先 行 亚 克 隆 ， 只 要 在 这 一 位 置 上 有 一 个 可 以 用 以 进行 标记 的 限制 酶 切 位 点 。 所 得 到 的 序列 可 用 来 合成 寡 核 苷 酸 引物 用 于 酶 法 测序 。 此 外 ， 在 酶 法 测序 中 某 些 区 域 的 测序 结果 不 理想 的 情况 下 〈 因 为 二 级 结构 阻碍 了 聚合 酶 反应 )， 化 学 方法 几乎 总 是 能 解决 这 一 问题 并 获得 正确 的 测序 结果 。 化 学 测序 有 技术 难度 大 的 “美称 "。 作 者 认为 这 种 美称 是 过 奖 了 。 作 者 的 实验 室 用 化 学 方法 获得 的 结果 如 同 酶 法 一 样 成 功 可 靠 。 根 据 作者 的 经 验 ， 可 以 认为 分 子 生 物 学 的 许多 操作 方法 中 包含 着 不 少 不 必 要 的 步骤 。 可 能 的 解释 是 当 研究 者 遇 到 困难 时 便 增 加 了 这 些 步骤 以 求解 决 问 题 ， 往 往 假 定 增加 的 步骤 即使 并 无 帮助 至 少 不 会 对 整个 过 程 造成 问 题 。 这 种 想法 显然 是 有 问题 的 。 在 这 里 所 介绍 的 对 现 有 方法 的 改进 中 ， 许 多 步 又 已 被 略 去 。 一 般 情况 下 ， 作 者 认为 逐步 省 略 这 些 步 又 使 序列 的 质量 得 到 了 改进 。 可 能 仍然 还 有 一 些 步骤 是 不 必要 的 ， 但 肯定 没有 必要 再 增加 一 些 额外 的 步 又。 而 且 ， 这 些 改动 的 最 终 结果 是 使 这 里 所 介绍 的 方法 十 分 简便 ， 整 个 测序 过 程 (从 DNA 的 末端 标记 开始 ) 包括 凝 胶 电泳 在 内 所 用 时 间 不 超过 1 天 (整整 一 天 )。 2. 材 料 1) GRR: 50 mmol/L 二 甲 肿 酸 钠 (sodium cacodylate), pH 8.0. 2) CT/C A ILM: 0.3 mol/L BARA, 1 mmol/L EDTA, pH7.0. 3) AG 终止 液 : 0.3 mol/L BARRE. pH 7.0. 4) GAILM: 1.5 mol/L BAMA, 1 mol/L 2 - 琉 基 乙醇 、pH 7.0. 5) 10% 甲酸 。 6) 硫酸 二 甲 酯 (DMS) (参见 注释 1)。 7) BR (95% 无 水 ) (参见 注释 1)。 828 » 8) 100% AR. 9) 5 mol/L NaCl. 10)ddH,O (双重 蒸馏 水 ) 11) tk DNA; 1 mg/ml， 溶 于 ddH2O 中 〈 可 用 任何 DNA， 作 者 用 质粒 DNA). 12)tRNA: 10 mg / ml， 溶 于 ddH,O 中 (可 用 任何 tRNA). 13) 待 测序 的 DNA 片段 ， 只 在 一 端 作 上 标记 ， 溶 在 ddHzO 中 〈 参 见 第 五 十 二 章 )。 14)10% 六 所 吡啶 〈 实 验 当 天 黎 释 )。 15) 上 样 缓冲 液 ， 100% 甲 酰胺 ，0.1% (w/v) 溴 酚 蓝 , 0.1% (w/v) FAR FF. Poe 法 1) 对 每 一 待 测序 DNA 片段 用 四 个 做 上 记号 的 1.5 ml Eppendorf 反应 管 ， 加 下 述 溶液 : “G” 管 : 1 pl RK DNA, 200 pl G 缓冲 液 ，5 由 标记 DNA。 “AG” 管 : 1 pl RAK DNA, 10 pl LARK, 10 由 标记 DNA. “CT” #: 1 pl RAK DNA, 10 岂 双 蒸 水 ，10 由 标记 DNA. “C” 管 : 1 pl RK DNA, 15 pl 5 mol/L NaCl, 5 pl tric DNA. 2) 把 四 个 1.5 ml Eppendorf 管 标 以 终止 字样 并 加 下 述 溶液 “G 终止 ” 管 : 2 wl tRNA, 50 pl GAILR, 1 ml 乙醇 。 “AG 终止 ” 管 : 2 pl tRNA, 200 pl AG 终止 液 ，1 ml GH. “CT Aik” 管 : 2 pl tRNA, 200 pl CT/CAIEM, 1 ml 乙醇 。 Rik” 4: 2yltRNA, 200 pl CTVC 终止 液 ，1 ml 乙醇 。 分 别 向 下 列 各 管 加 溶液 以 启动 反应 (参见 注释 2) : “G” 管 : 1 岂 DMS， 混 匀 ， 室 温 反应 5 min。 “AG” 管 : 3 pl 10% FR, HA, 37C RM 15 min。 “CT” &: 30 unl Ht, HS, BYR 9 min. “C” @: 30 pl, HA, BWR 11 min. 吸取 对 应 的 终止 管 中 的 全 部 液体 加 入 反应 管 中 以 终止 反应 (Bsc, Aik 液 略微 交叉 污染 不 影响 结果 ， 但 不 要 将 滴 管 接触 反应 管 的 内 容 物 )， 盖 紧 反 应 管 ， 短 暂 振 功 但 须 剧 烈 ， 放 在 干冰 -乙醇 浴 中 (-80C ) 3~10 min (3 mn BEB, MRE 他 管 的 操作 仍然 未 完成 ， 可 将 管 放 在 冰 浴 中 达 10 min; 但 不 要 超过 10 min) (BM 注释 3)。 4C PRL 7 min， 丢 弃 上 清 液 ， 用 一 尖 嘴 的 滴 管 抽 气 吸出 剩余 的 液体 ， 然 后 加 1 ml 100% 乙醇 ， 倒 转 两 次 ， 室 温 中 离心 2 min。 再 次 抽 气 吸出 剩余 的 液体 ， 真 空中 干燥 10 min。 在 各 反应 管 中 加 进 100 pl 10% NAMM (不 要 振动 管子 ， 因 并 无 必要 重 悬 DNA), id‘ MOF RCE 90°C 加 热 金 属 板 上 。15 一 30 s 后 加 盖 放 置 30 min. 从 金属 板 上 取出 试管 ， 室 温 放置 2 一 5 min， 短 暂 离心 使 管 壁 上 的 冷凝 水 滴 沉 到 试管 底部 ， 用 注射 针头 在 试管 盖 上 穿 一 个 洞 ， 然 后 放 在 干冰 -乙醇 浴 中 5 min. 8) 将 试管 放 入 Speed Vac 机 器 ， 冻 干 2 h， 真 空 x 应 保持 在 100 毫 托 (millitorr) (1 torr= + 324 ， 3 Yo 4 ~ 5 ~ 6 ol 7 Ye 9) (1) (2) (3) (4 a (S) 1.3310 Pa) WF. r 电泳 前 每 管 加 10 pl LRM, M@BAETERBHRERL, Kid OT 加 热 金属 板 上 10 min， 每 一 样品 取 1 一 2 pl LH 〈 参 见 注 释 4 和 5S)。 Al zs 化 学 药品 的 质量 : 一 般 来 说 ， 应 使 用 标准 实验 室 级 别 的 试剂 。 某 些 化 学 药品 由 于 纯 度 不 足 或 放置 时 间 过 长 (大 概 是 由 于 降解 之 故 ) 可 能 是 出 现 问题 的 原因 。 作 者 只 在 两 种 化 学 药品 上 遇 到 过 问题 ( 见 下 述 ): MRO PRA. HAIER, EL 学 物质 和 六 氢 吡 啶 都 属于 有 毒化 合 物 。 除 了 应 遵循 处 理 与 放射 性 化 合 物 有 关 的 规定 外 ， 与 这 三 种 化 合 物 有 关 的 所 有 反应 均 须 在 通风 橱 中 进行 。 通常 作者 将 全 部 化 学 反应 放 在 一 起 进行 ， 并 使 反应 在 同一 时 间 结 束 。 如 果 要 测序 5 种 不 同 的 样品 ， 全 部 20 个 管 可 作 一 次 离心 〈 作 者 的 实验 室 有 一 个 放置 20 个 离心 管 的 微型 离心 机 )。 将 20 个 管 的 反应 几乎 在 同一 时 间 停 止 ， 某 些 反应 往往 须要 设 定 较 长 的 时 间 ， 但 一 般 这 并 不 成 为 问题 ， 因 为 上 述 所 设 定 的 时 间 是 一 般 性 的 ， 可 被 延长 30% 而 没有 太 明 显 的 影响 。 作者 总 是 用 100% 乙醇 。 在 整个 过 程 中 并 没有 必要 使 用 其 他 浓度 的 乙醇 ，100% 乙 醇 有 蒸发 快 的 优点 。 目 的 是 要 沉淀 DNA 片段 而 尽 可 能 减少 盐 的 伴 同 沉 淀 。 可 以 通 过 在 乙醇 沉淀 后 以 及 用 乙醇 洗涤 后 抽 气 吸出 全 部 液体 而 达到 此 目的 。 沉 淀 物 能 很 好 地 在 管 壁 形 成 ， 很 容易 将 较 长 的 滴 管 伸 到 试管 的 底部 以 吸出 全 部 液体 。 重 复 再 悬浮 及 沉淀 是 不 可 取 的 步骤 。 也 完全 不 鼓励 延长 干冰 -乙醇 浴 中 放置 的 时 间 。 室 温 下 DNA 沉淀 良好 ， 但 在 低温 下 会 得 到 更 多 的 盐 沉淀 物 ， 因 此 使 事情 更 坏 而 不 是 更 好 。 作者 几乎 都 在 室温 下 沉淀 DNA; 只 在 步骤 4 使 用 -80C 保温 ， 目 的 在 于 使 反应 不 由 于 未 经 去 除 的 反应 试剂 的 存在 而 继续 进行 。 ERE HK: 作者 用 60 cmx40 cm (0.3 mm 厚 ) 的 6% 丙 烯 酰胺 胶 〈 丙 烯 酰胺 : 双 丙 eB REA 2:1, 50% RH, 50 mmol/L Tris, 50 mmol/L 硼酸 盐 ，1 mmol/L ED- TA?!), FA 65 W 恒 功 率 电 泳 ， 用 铝板 散热 。 样 品 分 两 次 上 样 〈 长 时 间 的 和 短 时 间 的 电泳 ) : BKM PH AAPA MIRE KA 2/3 的 路 程 时 进行 第 二 次 上 样 。 第 二 次 样品 中 的 省 酚 蓝 跑 到 胶 的 底部 时 停止 电泳 。 全 部 电泳 需 时 5 一 6 h， 在 短 时 间 电 泳 中 大 约 可 读 出 从 25 到 150~250 个 核 苷 酸 ， 在 长 时 间 电 泳 中 读 出 的 核 苷 酸 数 可 从 100 到 200 一 250。 更 长 的 序列 可 用 较 长 的 凝 胶 通过 第 三 次 加 样 取得 ， 如 果 有 必要 也 可 采用 其 他 多 种 方法 。 故障 分 析 : G 反 应 : 这 一 反应 常常 是 清楚 的 ， 但 它 对 延长 保温 时 间 及 高 活性 试剂 DMS 的 质量 最 为 敏感 。 如 果 反 应 超过 所 设 定 的 时 间或 使 用 过 期 或 质量 低劣 的 DMS， 将 会 出 现 过 多 或 非特 异性 的 DNA 降解 产物 。 而 且 当 几 个 G 连续 出 现时 (在 3 i Klenow 酶 标记 的 情况 下 ， 其 中 下 方 的 几 个 G) 可 能 条 带 较 弱 。 AG 反应 : 这 是 经 常 不 出 现 问题 的 反应 。 CT 和 C 反 应 : 肝 的 质量 应 好 (但 没有 必要 特别 好 )， 否 则 会 发 生 过 多 的 和 非特 异 * B25 。 的 降解 。 当 碱 基 为 G 时 ， 有 时 在 C 和 CT 轨道 上 会 出 现 弱 的 条 带 〈 这 时 在 G 轨道 上 出 现 一 条 强 带 )。 可 能 的 解释 是 试管 中 pH 值 太 低 (C，CT 管 中 无 缓冲 液 ， 但 是 从 DNA 样品 中 带 入 的 缓冲 液 可 能 会 引起 这 一 问题 )。 不 过 这 类 弱 带 不 及 G 轨道 的 信号 强 ， 也 不 及 C 和 CT 碱 基 的 真实 条 带 强 。 此 外 ，CT 轨道 上 的 工 常 不 如 C 带 强 ， 这 可 能 是 由 于 残留 的 盐 抑 制 了 反应 的 缘故 〈 在 C 反 应 中 ， 为 了 使 反应 完全 被 抑制 ， 特 别 加 入 了 盐 )。 参考 X 献 . Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) Sequencing end-labeled DNA with base- specific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65, 499-560. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 一 一 N ~ * B20 ° 5 EVO Re LE LYE BAS 结构 域 置 换 以 及 标记 获救 Jac A. Nickoloff, Win-Ping Deng, Elizabeth M. Miller, F. Andrew Ray Ul 1. 引 FTIR SIE A SEE DNA 中 引入 特定 变异 ， 包 括 碱 基 对 置换 、 插 入 和 和 缺失。 这 是 研究 基因 表达 和 和 蛋白质 结构 与 功能 关系 的 一 个 重要 途径 。 已 有 多 种 方法 可 使 质粒 DNA 的 特定 碱 基 发 生 突 变 ， 所 有 这 些 方 法 都 涉及 带 有 特定 突变 的 寡 核 苷 酸 引物 SARIS, ( 见 综 述 5)。 在 引物 引导 下 的 DNA 合成 产生 一 条 带 有 预期 突 变 的 DNA 链 ， 该 链 转化 进入 下 .coi 宿主 后 ， 在 DNA 复制 过 程 中 可 能 与 野生 型 模板 链 发 生 分 离 。 虽 然 突变 产物 的 理论 得 率 是 $0%， 但 实际 得 率 通常 要 低 得 多 ， 因 此 必须 设 法 富 集 来 自 突变 链 的 产物 。 有 两 种 成 功 的 富 集 突变 型 的 策略 ， 一 是 使 胸腺 喀 啶 被 尿 喀 啶 取代 了 的 野生 型 链 在 体内 降解 85; (参阅 第 五 十 五 章 ); 二 是 在 新 合成 的 链 上 同时 引入 另 一 个 具有 某 种 功能 的 能 (被 ) 选择 的 标记 ， 如 B- 内 酰胺 酶 基因 ， 通 过 功能 筛选 而 富 集 突变 型 "1]。 第 二 种 方法 依赖 于 在 DNA 合成 过 程 中 两 种 引物 的 配合 ， 而 且 还 可 由 于 用 T4 DNA BARBIE . coli DNA 聚合 酶 的 Klenow 片段 而 得 以 改进 ， 因 为 T4 DNA 聚合 酶 不 会 置换 诱 变 引 物 !&.91。 使 用 错 配 修复 缺陷 宿主 (mut S) 还 可 以 提高 双 引 物 诱 变 的 效率 0]， 因 为 这 能 增加 能 (被 ) 选择 的 突变 与 非 能 (被 ) 选择 的 (nonselectable) (所 期 望 的 ) 突变 在 第 一 轮 DNA 复制 期 间 得 以 偶 联 分 离 的 概率 。 虽然 通过 这 些 早期 方法 可 高 效率 地 得 到 突变 ， 但 它们 都 受到 靶 序 列 及 引物 设计 的 诸 多 限制 ， 并 且 都 需要 制备 单 链 模板 的 工作 。 这 里 介绍 两 种 相关 的 方法 ， 都 涉及 限制 酶 切 位 点 的 并 发 诱 变 。 这 些 方法 不 仅 高 效 、 快 速 ， 而 且 在 靶 序 列 的 选择 和 引物 设计 以 及 引入 多 重 突变 的 策略 上 具有 更 大 的 灵活 性 9421; (图 54.1)。 两 种 方法 对 于 几乎 任何 质粒 ， 不 论 双 链 或 单 链 ， 都 可 有 效应 用 。 双 链 质粒 经 热 变性 产生 单 链 模板 ， 然 后 使 诱 变 引 物 与 模板 复 性 ， 用 以 消除 非 必需 的 限制 酶 位 点 [能 (被 ) 选择 的 突变 ] 并 且 用 以 引入 所 期 望 的 非 能 (被 ) 选择 的 突变 。 在 转化 进入 天 . coli 之 前 用 能 识别 该 非 必需 的 限制 酶 切 位 点 的 限制 酶 处 理 突变 型 的 和 非 突 变型 的 质粒 DNA 混合 物 ， 就 可 将 非 突变 型 质粒 通过 筛选 而 排除 。 通 过 这 样 的 处 理 ， 野 生 型 质粒 被 酶 切 开 ， 突 变质 粒 因 不 能 被 酶 切割 而 保持 环 状 ， 从 而 使 前 者 的 转化 效率 减少 到 低 于 后 者 约 10 一 1000 倍 。 在 引物 引导 的 DNA 合成 过 程 中 ， 正 常情 况 下 ， 所 期 望 的 突变 与 能 (被 ) 选择 的 突变 发 生 连 锁 的 频率 大 于 80%， 所 以 我 们 可 以 得 到 所 期 望 的 突变 。 两 种 方法 的 区 别 在 于 诱 变 引 物 在 体外 连锁 到 一 起 的 方 式 不 同 。 在 原始 的 方法 一 一 惟一 位 点 消除 (unique site elimination, USE) 诱 变 中 ， 与 一 条 链 互补 的 两 个 诱 变 引 物 在 第 二 条 链 的 合成 过 程 中 连锁 到 一 起 4。 在 第 二 种 方法 - 829 - 任何 单一 限制 酶 切 位 点 USE 引 物 PCR 目标 基因 第 二 引物 “PCR 产 物 目标 质粒 热 变 性 与 引物 或 PCR 产 物 复 性 合成 第 二 链 USE 引物 第 二 引物 < 长” 引物 转化 E.coli mut S 菌 株 大 量 制备 DNA USE 酶 消化 FRM E.coli 具有 二 个 突变 的 产物 图 54.1 用 限制 酶 切 位 点 并 发 诱 变 的 方法 进行 定点 诱 变 。 图 的 上 部 是 两 个 具有 非 必需 的 惟一 限制 酶 切 位 点 〈 空 心 长 方 小 块 ) 的 靶 质粒 。USE 和 LP-USE 诱 变 分 别 图 示 于 左边 和 右边 。 黑 箭头 表示 诱 变 引物 ; 黑色 长 方 小 块 表 MRA, WHR DNA 经 加 热 变 性 ， 引 物 引 导 的 DNA 合成 (HR) 连接 两 个 诱 变 引 物 或 延伸 带 有 两 个 引物 的 PCR 产物 。USE 引物 引入 的 突变 是 可 选择 的 。 将 DNA SE1K BIE. coli mut S 菌株 中 以 提高 两 个 突变 连锁 分 离 的 频率 。 从 全 部 mut S 转化 子 培养 物 制备 质粒 DNA， 用 识别 靶 惟 一 位 点 的 限制 酶 处 理 ， 再 转化 到 正常 下 .coli 菌株 中 ， 通 常 就 能 得 到 带 有 两 个 突变 的 产物 。 同 时 使 用 针对 不 同 惟一 位 点 的 几 种 USE 引物 可 以 进一步 提高 选择 的 力 度 。 中 [21， 分 别 与 DNA 两 条 链 互补 的 两 个 诱 变 引物 通过 PCR 过 程 连锁 到 一 起 ; 随后 ， 变 性 的 PCR 产物 〈 作 为 一 个 “长 引物 ") 指导 第 二 条 链 的 合成 (长 引物 惟一 位 点 消除 诱 变 ，LP-USE mutagenesis)[12]。 对 限制 酶 切 位 点 消除 的 选择 既 简单 易 行 又 广泛 适用 。 大 多 数 质粒 都 具有 适 于 引入 能 (RK) 选择 的 突变 的 一 个 或 多 个 限制 酶 位 点 (USE 位 点 ); 也 可 以 通过 人 工 改造 而 引入 合适 的 USE 位 点 。 环 状 单 链 模板 可 简单 地 通过 双 链 质粒 DNA 热 变性 得 到 ， 所 以 事实 上 任何 双 链 质粒 都 能 用 这 些 方 法 有 效 地 进行 诱 变 。 从 M13 鸣 菌 体 或 噬 粒 得 到 的 环 状 单 链 DNA 也 可 作为 合适 的 模板 。 因 为 无 须 通 过 亚 克 隆 就 能 对 靶 基 因 诱 变 ， 这 些 方 法 也 是 对 表达 载体 上 的 基因 进行 诱 变 的 很 好 途径 。 从 双 链 质粒 开始 进行 诱 变 的 另 一 个 好 处 是 诱 变 引物 可 以 与 两 条 链 中 的 任 一 条 互补 。 这 样 ， 就 有 可 能 设计 通用 于 诱 变 、 测 序 、 杂 交 和 PCR 的 多 功能 引物 。 而 且 ， 引 物 对 既 可 以 与 同一 条 链 互补 1， 或 者 先进 行 PCR 扩 增 后 也 可 以 分 别 与 两 条 链 互补 Q2] 。 可 设计 多 种 通用 引物 用 以 消除 多 种 载体 上 共同 序列 中 的 限制 酶 切 位 点 。 所 以 ， 只 需 很 少 几 种 引物 就 能 向 大 多 数 质 粒 上 引入 突变 。USE 位 点 可 以 位 于 基因 外 或 基因 内 ， 包 括 各 种 必要 的 基因 如 抗生素 抗 性 基因 。 如 果 靶 位 点 存在 于 一 个 必要 的 基因 中 ， 可 通过 改 2 变 密码 子 第 三 位 上 的 碱 基 或 不 影响 读 框 的 碱 基 插 入 来 引入 无 表 型 效应 的 突变 。 某 些 诱 变 引物 可 以 将 一 种 限制 酶 切 位 点 转变 成 另 一 种 限制 酶 切 位 点 。 如 果 新 产生 的 限制 位 点 也 是 惟一 的 ， 就 可 以 通过 在 两 种 惟一 的 限制 位 点 之 间 的 循环 变换 而 连续 地 向 靶 基 因 中 引入 多 BRE. 54.1 通用 的 惟一 位 点 消除 引物 靶 位 点 新 位 点 Pe ail RK tk la. AatII SalI GTGCCACCTGTCGACTAAGAAACC 1,2,4 1b. SalI Aat II GTGCCACCTGACGTCTAAGAAACC 1,2,4 2a. AHIII BglII CAGGAAAGAAGATCTGAGCAAAAG — 16 2b. BglII APIII CAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG 16 3a. Scal Mlul CTGTGACTGGTGACGCGTCAACCAAGTC 1—6 3b. Mlul Scal CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC 1~6 4a. SspI EcoRV CTTCCTTTTTCGATATCATTGAAGCATTT 1,2,4 4b. EcoRV SspI CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTT 1,2,4 5. AlwNI Poull CTGGCAGCAGACTGGTAACAG 下 人 6. XmnI None TTGGAAAACGCTCTTCGGGGCG 1,3~6 7. Bsal None TGATACCGCGGGACCCACGCTC 1~6 8. Scal None CTGGTGAGTATTCAACCAAGTC 6 9. EcoRI EcoRV CGGCCAGTGATATCGAGCTCGG 1 10. Hindlll MlulI CAGGCATGCACGCGTGGCGTAATC 1 PMA ELMER RAS RRL RM RAPER. Be RT R-ARRBAA, 列 序列 与 PAR REAR A CE +). PRA OR (RAE RL, WAZA By PER 位 点 ) 用 黑体 字母 标 出 ; 突变 碱 基 下 加 黑 点 。 载 体 ; 1，pUC19; 2, pBR322; 3, pBluescript 和 pBluescript 1; 4, pSP6/T3 和 pSP6/T7-19; 5, pT7/T3a-19; 6，pTZ19R。 引 物 对 〈 即 la 和 1b) 中 两 种 引物 的 轮换 使 用 可 形成 突变 与 野生 型 的 往复 循环 。 如 果 原 有 的 野生 型 SIMA CRB, BASH 1b 就 可 应 用 于 所 列 的 载体 。 只 有 当 pSP6/T3 上 原 有 的 野生 型 BI MAC RRAM, SM 2b 才 可 应 用 于 该 载体 。 当 原 有 的 野生 型 EcoRV 位 点 已 被 破 坏 时 ， 引 物 4b 可 应 用 于 pBR322。AlwNI 引物 造成 核 苷 酸 缺 失 CCA (A). EcoRI Ml 死 zd 亚 引物 造成 多 位 点 接头 区 的 缺失 ， 如 果 诱 变 引 物 位 置 上 插入 了 外 源 DNA 时 ， 就 不 能 使 用 这 两 种 引物 。 表 54.1 列 出 了 一 些 这 样 的 USE 引物 。 另 外 ， 也 可 通过 向 USE HAW DNA SRR 应 中 同时 加 入 多 种 诱 变 引物 而 一 次 性 地 引入 多 重 突 变 。 利 用 这 种 方法 得 到 多 重 突变 的 频 率 大 约 是 各 单独 诱 变频 率 的 乘积 。 虽 然 ， 使 用 基于 PCR 的 诱 变 方 法 也 可 以 一 次 引入 多 BRE (通过 采用 基于 PCR 的 诱 变 方法 ， 见 参考 文献 031)， 但 用 上 述 标准 方法 要 简便 得 多 。 这 些 方法 最 初 被 称 为 惟一 位 点 消除 (USE) 诱 变 ， 因 为 它 的 最 简单 “版 本 ”依赖 于 选择 单个 惟一 的 酶 切 位 点 的 消失 。 不 过 如 果 有 多 个 限制 酶 切 位 点 被 消除 ， 就 会 有 更 高 的 灵活 性 和 更 大 的 选择 力度 。 两 个 (或 多 个 ) 相同 或 不 相同 的 限制 酶 切 位 点 的 消除 也 能 被 选择 。 使 多 个 限制 酶 切 位 点 被 诱 变 时 就 增加 了 针对 非 突变 型 的 选择 压力 ， 这 对 于 大 质粒 (>10 kb) 的 诱 变 可 能 是 很 重要 的 。 限制 酶 切 位 点 并 发 诱 变 方法 可 以 用 来 将 突变 从 任何 基因 组 中 的 某 个 基因 转移 到 它 的 克隆 拷贝 上 ， 或 从 某 一 质粒 转移 到 另 一 质粒 上 。 使 用 这 些 方法 ， 无 须 进 行 片段 的 亚 克 隆 就 能 实现 突变 的 转移 ， 所 以 也 不 必要 求 在 突变 原 在 位 置 的 DNA 顺序 中 存在 着 天 然 的 或 人 工 的 限制 酶 切 位 点 。 这 里 介绍 的 三 种 非常 有 效 的 LP-USE 诱 变法 适用 于 所 有 生物 ， 可 用 于 分 析 特 定 基 因 或 基因 内 特定 结构 域 的 功能 。 例 如 ， 从 某 一 基因 的 克隆 拷贝 开始 ， 可 用 USE 或 LP-USE 诱 变法 引入 各 种 特定 的 突变 (图 54.1)。 这 些 突变 可 以 〈 通 过 转 染 ) 转移 到 某 种 宿主 细胞 中 以 分 析 突变 的 表 型 效应 。 接 下 来 ， 突 变 的 存在 可 通过 LP-USE 诱 转 染 的 基因 eS) USE 引 物 OL ie 第 二 引物 | por USE 位 点 < a =a ae — 具有 突变 基因 的 质粒 PCR 产 物 图 54.2 ” 转 染 基因 中 突变 的 证 实 。 图 示 一 个 带 有 突变 基因 (MR) 的 质粒 整合 在 基因 组 DNA (HA) 上 。 使 用 突变 两 侧 的 一 个 USE 引物 和 一 个 第 二 引物 进行 PCR， 得 到 一 个 带 有 三 个 突变 ( 粗 短 黑 线 ) 的 片段 。 接 着 该 PCR 产物 引导 带 有 野生 型 基因 的 质粒 模板 进行 第 二 条 链 的 合成 。 余 下 的 步骤 奶 图 54.1 所 示 。 第 二 引物 上 也 可 带 有 一 个 能 产生 新 限制 酶 切 位 点 的 突变 。 丢 失 了 USE 位 点 并 获得 了 新 限制 酶 切 位 点 的 产物 将 带 有 原来 在 转 染 基因 上 的 突变 ， 它 的 存在 可 以 通过 DNA 序列 分 析 加 以 鉴定 。 变法 的 第 一 种 应 用 加 以 证 实 (7 54.2). LP-USE 诱 变法 的 第 二 种 应 用 所 引起 的 结构 域 置换 可 用 于 对 来 自 同 一 基因 家 族 的 相关 基因 或 来 自 不 同 种 属 的 相关 基因 的 同 源 区 域 进行 功能 分 析 〈 见 参考 文献 441)。 结 构 域 置换 也 能 方便 地 将 突变 从 一 个 质粒 转移 到 另 一 质 粒 。 例 如 某 一 基因 中 的 突变 可 以 从 一 个 带 组 成 型 启动 子 的 表达 载体 被 转移 到 一 个 带 诱导 型 启动 子 的 表达 载体 上 (图 54.3), LP-USE 诱 变法 的 第 三 种 应 用 是 可 以 有 效 地 将 任何 一 个 基因 上 的 未 知 突变 转移 到 它 的 克隆 拷贝 或 EDNA 上 (标记 获救 )。 在 这 一 操作 中 ， 使 用 目标 基因 两 侧 的 一 对 引物 ， 通 过 PCR 扩 增 可 将 突变 从 基因 组 DNA (或 mRNA) 复 制 下 来 。 目 标 基 因 的 克隆 拷贝 或 EDNA 上 的 相应 序列 可 以 利用 两 侧 的 USE 位 点 进行 操 作 。 这 些 USE 位 点 在 基因 组 DNA 或 mRNA 中 是 不 存在 的 ， 所 以 在 PCR 产物 中 也 不 会 出 现 。 克 隆 的 基因 通过 PCR 产物 引导 的 DNA 合成 可 以 除去 两 个 USE 位 点 ， 并 高 效 地 将 突变 基因 上 的 任何 突变 转移 到 克隆 拷贝 上 (图 54.4)， 然 后 可 以 通过 DNA 测序 鉴定 突变 。 由 于 不 止 一 个 基因 的 克隆 拷贝 可 能 存在 于 表达 质粒 上 ， 通 过 上 述 过 程 得 到 的 突变 基因 又 可 以 重新 引入 细胞 中 以 验证 其 表 型 。 如 果 某 个 基因 含有 许多 外 显 子 但 不 具备 cD- NA， 对 于 那些 具备 克隆 的 特定 外 显 子 上 的 突变 ， 可 先 用 SSCP 分 析 加 以 确认 [45]， 然 后 扩 增 带 有 突变 的 外 显 子 ， 将 突变 转移 到 外 显 子 的 克隆 拷贝 上 进行 测序 。 虽 然 直 接 对 ”332 - PCR 产物 进行 测序 也 能 鉴定 突变 ， 但 使 用 标记 获救 法 有 一 个 好 处 ， 那 就 是 可 以 将 获救 的 突变 重新 导入 细胞 进行 表 型 分 析 。 质粒 A 上 的 突变 质粒 B 上 的 野生 型 基因 o) 可 诱导 的 启动 子 0S re A 质粒 B 上 的 突变 图 $54.3 结构 域 置 换 。 突 变 ( 粗 短 黑 线 ) 从 一 种 质粒 (A) 上 的 某 一 基因 转移 到 另 一 种 带 诱 导 型 启动 子 的 表达 载体 (B) 上 。 经 变性 的 突变 结构 域 的 PCR 扩 增 产物 在 以 环 状 单 链 质粒 B 为 模板 进行 第 二 条 链 合成 时 与 一 个 USE 引物 连接 到 一 起 。 余 下 步骤 同 图 $4.1。 突变 基因 具有 二 个 制造 好 的 一 一 USE 位 点 的 克隆 基因 一 -一 = 克隆 的 突变 基因 图 54.4 标记 获救 。 一 个 基因 上 的 突变 〈 粗 短 黑 线 ) 用 两 个 野生 型 PCR 引物 扩 增 。PCR 产物 引导 带 有 该 基因 野生 型 克隆 拷贝 的 质粒 模板 进行 第 二 条 链 的 合成 ， 该 野生 型 基因 两 端 各 有 一 个 人 工 引 入 的 USE 位 点 〈 粗 短 黑 线 )。USE 位 点 可 以 通过 在 天 然 位 点 上 插入 连接 片段 或 由 定点 诱 变 产 生 。 通 过 消除 两 个 USE 位 点 的 选择 过 程 (如 图 54.1 所 示 ) 就 可 得 到 带 有 突变 基因 的 质粒 。 2. 材 料 2.1 诱 变 引 物 的 磷酸 化 1) 10x 激 酶 缓冲 液 : 700 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 100 mmol/L MgCh, 50 mmol/L * 5557 * 二 硫 苏 糖 醇 。 2) 10 mmol/L ATP: —20C 保存 。 3) RHR S|: 100 pmol KKRFRHABKAM, KRSRERMNRSSIDH PCR 产物 ( 约 0.005 一 1.5 pmol)。( 人 参见 注释 1) 4) T4 多 核 苷 酸 激 酶 : 10 U/Al，-207 保存 。 — 2.2 定点 诱 变 5) 具有 一 个 或 多 个 非 必 需 限 制 酶 切 位 点 的 质粒 DNA。 6) E.coli mut S 菌 株 ， 如 BMH71~18 mut S!!°), 7) 10x 复 性 缓冲 液 : 200 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 100 mmol/L MgCh, 500 mmol/L NaCl. 10 x 合成 /连接 缓冲 液 : 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, dATP, dGTP, dCTP. dTTP 各 5 mmol/L, 10 mmol/L ATP, 20 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 。 9) T4 DNA 聚合 酶 : (10 U/yl )。 10)T4 DNA 连接 酶 : (400 UV/ )。 11)10 x 终止 混合 液 : 50% 甘油 ，0.5% SDS, 10 mmol/L EDTA, 0.25% 省 酚 蓝 ， 0.25% — FA FF. 12)Sepharose CL-6B: 参见 第 二 十 七 章 。 13) 制 备 和 转化 感受 态 细胞 、 质 粒 DNA 的 限制 酶 消化 以 及 离心 柱 层 析 所 需 的 试剂 与 设 备 。 8 Yo 本 法 3.1 寡 核 苷 酸 引 物 或 PCR 产物 的 磷酸 化 (参见 注释 2) 1) 在 1.5ml 管 中 加 入 2 pl 10Xx 激 酶 缓冲 液 ，2 ul 10 mmol/L ATP, 100 pmol HRB ( 约 0.2 pg 21 + i BE A Ae AY SE KF BR) 或 0.005 一 1.5 pmol PCR 产物 ， 加 水 至 20 plo ; 2) MA 10 U T4 SRA BIA, 37°C 保温 2 h。 Bre BAC HY SEF PBK PCR 产物 无 须 纯化 即 可 直接 用 于 第 二 条 链 的 合成 。 3.2 定点 诱 变 整个 过 程 分 三 个 阶段 a. 第 二 条 链 的 体外 合成 /连接 反应 ， 转 化 下 coli mut S 菌株 ， 转 化 子 混合 培养 过 夜 。 b. 质粒 DNA 纯化 ， 限 制 酶 消化 ， 转 化 正 . coli 正常 菌株 。 * 654 » c. 突变 质粒 的 抽 提 和 鉴定 。 以 下 叙述 包括 用 于 估计 各 阶段 效率 的 对 照 实 验 。 1) 使 诱 变 引物 与 靶 质 粒 复 性 : 在 1.5 ml 微型 离心 管 中 加 入 5 ol 磷酸 化 了 的 引物 (25 pmol) 2% 5 ul BERR {LAY PCR 产物 ，0.025 pmol 质粒 DNA (240.1 yg), 2 pl 10x 复 性 缓冲 液 ， 加 水 至 20 ul, (BWIEF 3) 12S, 100C AH 3 min， 立 即 置 于 冰 浴 中 1 min， 在 微型 离心 机 中 离心 $Ss 以 收集 冷 凝 水 滴 ， 置 室温 30 min. 在 复 性 反应 液 中 加 入 3 pl 10 x 合成 /连接 缓冲 液 、3 U T4 DNA 聚合 酶 、400 U T4 DNA 连接 酶 ， 加 水 至 总 体积 30 同 〈 酶 最 后 加 入 )， 混 匀 。 如 果 使 用 窒 核 苷 酸 引 物 ， 置 377 保温 30 min; 如 果 使 用 >1000 bp 的 PCR 产物 ， 则 置 377 保温 5 min (人 参见 注释 4). MA 3 已 10x 终 止 混合 液 ， 略 加 涡 旋 振动 混 匀 后 6S 保温 5 min 以 终止 反应 。 通 过 Sepharose CL-6B 离心 柱 纯 化 DNA。 用 电 穿 孔 法 或 其 他 标准 方法 转化 忆 .coii BMH 71~18 mut S (或 其 他 合适 的 mxz S) 菌株 〈 参 见 注释 $S)。 将 细胞 悬浮 于 lml SOC 培养 基 中 ，37 培养 1 h。 取 100 pl A 胞 悬浮 液 涂 布 到 一 个 含 相 应 抗生素 的 LB EMILE, 37C 培养 过 夜 以 估 计 转 化 效率 。 在 剩 下 的 细胞 悬 液 中 加 入 $ ml 含 抗生素 的 液体 LTB，371 剧烈 振 划 培养 过 夜 。 取 十 分 之 一 转化 混合 物 涂 平 亚 以 测定 液体 培养 物 中 初级 转化 子 的 数目 。 这 一 测定 非常 重 要 ， 因 为 初级 转化 子 的 数目 决定 着 下 一 步 质 粒 DNA 制备 物 的 最 大 的 复杂 性 (参见 注释 6)。 6) M5 ml 培养 物 制备 质粒 DNA (参见 第 三 十 一 一 三 十 三 章 )。 7) 46 20 pl RAR, URGE USE 位 点 的 限制 酶 切割 0.25 pe 质粒 DNA。 取 15 pl BD 反应 物 并 用 等 量 未 切 DNA 作对 照 ， 通 过 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 酶 切 情况 。 酶 切 过 的 DNA 样品 中 应 该 看 不 到 或 者 只 看 到 很 少 的 环 状 构 型 (参见 注释 7 和 8)。 用 一 部 分 酶 切 过 的 DNA 转化 正常 下 .co 菌株 (40 HB101 或 DHSa)。 从 多 个 转化 子 分 离 质粒 DNA 以 检查 USE 位 点 是 否 丢 失 。 在 那些 USE 位 点 发 生 了 突变 的 转化 子 中 ， 约 有 80% 会 带 有 我 们 所 期 望 的 非 能 (被 ) 选择 的 突变 ， 它 们 可 通过 DNA 测序 加 以 确认 〈 人 参见 注释 9)。 典型 情况 下 ，50% 一 100% 的 次 级 转化 子 在 USE 位 点 上 带 有 突变 (参见 注释 10 和 11). SASH RIES MSA MBH RE, KA 80%AY USE 位 点 发 生 了 突 变 的 产物 带 有 所 期 望 的 不 经 选择 得 来 的 突变 (参见 注释 12 和 13)。 如 果 同 时 用 多 个 引物 引入 两 个 或 多 个 不 经 选择 得 来 的 突变 ， 各 个 突变 都 将 各 自 以 80% 的 概率 独立 发 生 。 如 果 使 用 基于 PCR 的 方法 ，USE 位 点 上 带 有 突变 的 产物 通常 会 100% 地 带 有 所 期 望 的 突变 (参见 注释 13 一 17)。 2 4 3 So 4 Se 5 YA 8 od 4. 注 释 (1) 使 用 多 个 引物 可 同时 引入 多 重 不 经 选择 得 来 的 突变 ， 但 每 个 引物 都 必须 作为 能 被 选 - 335 - (2 (3 (4 (5 (6 (7 (8 — ) ) Yo — Yo 择 的 USE 引物 复 性 到 同一 条 链 上 。 对 于 LP-USE 诱 变 来 讲 ， 两 个 引物 必须 分 别 与 两 条 链 互 补 以 实现 PCR 扩 增 。 3.2. WER 3 中 的 连接 反应 要 求 磷酸 化 的 引物 或 PCR 产物 。 虽 然 不 通过 连接 反应 也 能 得 到 突变 型 ， 但 最 好 不 要 这 样 做 ， 因 为 即使 用 T4 DNA 聚合 酶 可 以 避免 体外 链 置换 的 发 生 [&,9]， 但 链 置换 仍然 可 能 在 体内 发 生 。 这 些 方法 的 成 功 依赖 于 在 体外 连接 到 一 起 的 两 个 突变 在 体内 的 伴 同 分 离 。 有 拖 个 因 素 会 影响 连锁 突变 的 形成 和 稳定 。 首 先 ， 在 第 二 条 链 合成 过 程 中 诱 变 引物 的 连锁 ， 要 求 两 个 引物 复 性 到 同一 条 模板 分 子 链 上 并 引导 DNA 合成 ， 通 过 连接 封闭 切口 而 形成 一 条 完整 的 第 二 链 。 引 物 相 对 于 模板 的 过 量 有 助 于 两 个 引物 一 同 复 性 ， 通 常用 1000:1， 但 应 根据 引物 与 靶 序 列 复 性 时 形成 错 配 的 数量 和 类 型 加 以 适当 调整 。PCR 产物 与 模板 的 比率 的 要 求 不 必 那 么 严格 ， 因 为 在 第 二 条 链 合 成 之 前 ，PCR 过 程 使 经 选择 的 和 不 经 选择 的 诱 变 引物 连接 到 一 起 。 有 效 的 PCR 产物 与 模板 的 摩尔 比 应 在 0.1 一 100:1 范围 内 。 T4 DNA 聚合 酶 合成 一 条 完整 的 第 二 链 ，DNA 连接 酶 封闭 切口 而 产生 一 个 共 价 闭 合 的 环 状 双 链 质粒 。 在 合成 /连接 反应 中 加 入 T4 的 基因 32 蛋白 能 促进 T4 DNA R 合 酶 的 作用 ， 这 一 可 有 可 无 的 成 分 对 于 某 些 模板 -引物 组 合 可 能 是 有 帮助 的 。 对 于 0.025 pmol 的 $ 一 6 kb 大 小 的 模板 ， 可 加 入 1.5 pl HALA 10 倍 稀释 液 COA TE 释 ; 约 15 pmol)。 这 样 能 达到 大 约 50% 的 饱和 度 ， 因 为 一 个 基因 32 蛋白 单 体 可 结 合 10 个 核 苷 酸 。DNA 合成 还 可 能 受到 模板 质量 及 模板 或 引物 的 自身 复 性 的 影响 。 (EAE. coli mu S 菌株 是 因为 它们 带 有 错 配 修复 缺陷 ， 这 可 提高 在 宿主 细胞 中 的 第 一 轮 质粒 复制 过 程 中 错 配 碱 基 得 以 伴 同 分 离 的 概率 。 然 而 mut S 菌株 也 是 增 变 菌 株 ， 可 能 自发 地 产生 一 些 我 们 不 希望 看 到 的 性 状 ， 也 包括 恢复 错 配 修复 能 力 的 回复 突变 ， 从 而 降低 诱 变 效率 。 所 以 ， 感 受 态 mut S 细胞 应 从 冷冻 保存 的 菌 种 制备 ， 不 应 使 用 经 过 反复 传代 的 培养 物 。 在 第 一 次 转化 中 不 要 采用 正常 的 已 . coli BH, 否则 会 大 幅度 降低 诱 变 效率 5]。 测定 液体 培养 物 中 初级 转化 子 的 数量 是 非常 重要 的 (3.2 节 ， 步 骤 5)， 这 一 数量 决 定 着 下 一 步 质粒 DNA 制备 物 的 最 大 的 复杂 性 。 因 为 在 这 一 阶段 突变 型 的 比率 可 以 是 从 5% 到 <1%， 在 含有 不 足 100 个 初级 转化 子 扩大 得 来 的 培养 物 中 可 能 只 有 极 少 或 根本 没有 突变 型 。 值 得 注意 的 是 ， 通 过 过 夜 培养 ， 从 单个 初级 转化 子 也 能 产生 达到 静止 期 的 培养 物 ， 所 以 不 能 用 已 达到 静止 期 的 培养 物 来 判断 初级 转化 子 的 数 量 。 虽 然 ， 能 够 得 到 足够 数量 转化 子 的 任何 转化 方法 都 可 以 选用 ， 但 用 电 穿 孔 法 通 常 能 获得 最 高 的 转化 效率 。 通过 筛选 排除 非 突变 质粒 取决 于 从 初级 转化 子 (或 二 级 转化 子 ， 如 果 要 进行 第 二 轮 选择 的 话 ; 参见 注释 10) 制备 得 到 的 质粒 DNA 的 完全 酶 切 。 最 好 不 要 一 次 酶 切 大 量 的 DNA， 和 否则 酶 切 不 完全 的 可 能 性 增加 ， 从 而 会 导致 无 法 接受 的 高 本 底 非 突变 质粒 。 增 加 限制 酶 用 量 可 以 避免 不 完全 酶 切 。 因 为 在 初级 转化 子 中 突变 质粒 的 比率 ARK (1% 一 5% )， 几 乎 所 有 DNA 都 应 被 切 成 线 状 ， 所 以 在 省 化 乙 锭 染色 的 凝 胶 上 一 般 看 不 到 突变 型 的 〈 环 状 构 型 ) DNA。 从 未 发 现 过 选择 和 诱 变 效 率 为 被 消除 的 限制 酶 位 点 的 类 型 〈( 即 酶 切 后 生成 的 未 端 种 5 类 ， 包 括 平 末端 和 5 或 3 突出 末端 ) 或 引物 位 置 间 的 距离 所 影响 的 情况 。 (9) 在 做 DNA 测序 分 析 之 前 进行 限制 酶 切 位 点 丢失 的 质粒 的 筛 查 ， 是 一 个 快速 而 又 方 便 的 估计 诱 变 效率 的 方法 。 (10) 如 果 次 级 转化 子 中 没有 丢失 USE 位 点 者 不 足 30%2， 可 通过 第 二 轮 选 择 进行 富 集 。 将 次 级 转化 子 菌落 (3.2. 节 ， 步 又 8) 悬浮 于 5 ml LB 培养 基 中 (无 须 进 一 步 培 养 )， 重 复 步骤 6 一 8。 当 满足 下 述 两 个 条 件 时 ， 第 二 轮 筛 选 会 得 到 最 好 的 结果 ; (a) 通过 对 照 涂 严 计 数 ， 推 断 液 体 培养 物 至 少 由 200 个 初级 转化 子 扩大 得 来 (3.2. , BRS); (b+) 用 至 少 200 个 次 级 转化 子 菌落 (3.2. 节 ， 步 又 8) 的 混合 物 制 备 质 粒 DNA。 随 着 初级 或 次 级 转化 子 数量 的 减少 ， 分 离 到 同胞 质粒 的 风险 增 大 ， 于 是 ， 增 加 筛选 轮 次 可 能 仅仅 起 着 富 集 那些 丢失 了 USE 位 点 的 质粒 ， 但 并 不 起 着 富 集 带 有 所 期 望 的 突变 的 质粒 的 作用 。 第 二 轮 盘 选 之 所 以 有 效 ， 是 因为 带 有 USE 位 点 突变 的 质粒 在 第 一 轮 筛 选中 已 被 富 集 ; 而 且 ， 从 正常 正 . coli 菌株 制备 的 质粒 tM mut S 菌株 制备 得 到 的 质粒 的 质量 较 好 ， 因 而 更 容易 被 完全 酶 切 。 (11) 另 一 种 降低 野生 型 背景 频率 的 方法 是 在 转化 mut S 菌株 之 前 ， 以 及 如 图 $4.1 所 示 在 第 二 次 转化 之 前 ， 两 次 施加 USE 选择 压力 。 (12) 如 果 能 高 效 地 得 到 经 选择 得 来 的 (selected) 突变 , 而 不 经 选择 得 来 的 (nonselected) 突 变 的 得 率 极 低 甚至 为 零 ， 则 应 增加 不 经 选择 的 突变 引物 和 经 选择 的 突变 引物 的 比 率 。 (13) 对 于 任何 引物 引导 的 DNA 合成 反应 ， 低 效率 的 复 性 或 引物 延伸 都 可 能 带 来 麻烦 。 一 条 链 上 带 有 切口 的 环 状 质粒 变性 后 能 产生 所 需 的 单 链 环 状 模板 ， 所 以 无 须 使 用 高 度 超 螺旋 质粒 。 不 过 如 果 质 粒 的 两 条 链 上 都 带 有 切口 ， 就 不 能 产生 单 链 环 状 模 板 ， 因此 不 要 用 切口 很 多 的 质粒 制备 模板 。 (14) 当 用 PCR 产物 诱 变 时 ， 最 后 的 测序 分 析 应 覆盖 整个 扩 增 区 域 ， 因 为 PCR 过 程 中 可 能 会 产生 一 些 我 们 不 想 要 的 突变 061]。 采 用 高 保 真 的 耐 热 酶 和 尽量 减少 PCR 循环 数 可 以 减少 这 类 不 想 要 的 突变 。 这 些 突变 偶尔 也 会 发 生 在 诱 变 引 物 顺 序 内 或 其 近 旁 ， 它们 可 能 由 mut S 菌株 中 残留 的 倾向 错误 的 修复 作用 引起 21。 不 过 所 有 这 些 突变 都 能 通过 DNA 顺序 分 析 很 容易 地 被 鉴别 出 来 。 除 上 述 情况 外 ， 这 类 突变 并 不 常 见 。 (15) 在 确证 转 染 基因 上 突变 的 存在 时 ， 为 了 避免 扩 增 出 内 源 基因 ， 应 设计 一 个 与 载体 的 顺序 互补 的 PCR 引物 (图 $4.2)。 (16) 不 带 能 被 选择 的 突变 的 PCR 产物 与 USE 引物 相连 锁 的 效率 取决 于 PCR 产物 与 USE 引物 模板 的 比率 (图 54.3)。PCR 产物 与 USE 引物 之 比 以 1 比较 合适 。 (17) 如 果 在 单个 诱 变 引物 上 带 有 许多 突变 ， 得 到 的 产物 可 能 带 有 部 分 但 不 是 全 部 所 期 望 的 突变 。 可 能 的 原因 是 多 个 间隔 很 近 的 错 配 形成 一 个 激发 mut S 菌株 残存 错 配 修 复 能 力 的 强烈 信号 。 1) 原著 此 处 错误 ， 应 为 “如 果 次 级 转化 子 中 丢失 了 USE 位 点 者 不 足 30% ”。 一 译 者 注 .337 - > Ww Nn 16. Wh = x 献 Zoller, M. J. and Smith, M. (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template. Methods Enzymol. 154, 329-350. Kramer, W. and Fritz, H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of muta- tions via gapped duplex DNA. Methods Enzymol. 154, 350-367. . Kunkel, T. A., Roberts, J. D., and Zakour, R. A. (1987) Rapid and efficient site- specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154, 367-382. . Carter, P. (1987) Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vec- tors. Methods Enzymol.:-154, 382-403. . Smith, M. (1985) In vitro mutagenesis. Annu. Rev. Genet. 19, 423-462. Kunkel, T. A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without pheno- typic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492. . Lewis, M. K. and Thompson, D. V. (1990) Efficient site directed in vitro mutagen- esis using ampicillin selection. Nucleic Acids Res. 18, 3439-3443. . Masumune, Y. and Richardson, C. A. (1971) Strand displacement during deoxyri- bonucleic acid synthesis at single strand breaks. J. Biol. Chem. 246, 2692-2701. . Nossal, N. G. (1974) DNA synthesis on a double-stranded DNA template by the T4 bacteriophage DNA polymerase and the T4 gene 32 DNA unwinding protein. J. Biol. Chem. 249, 5668-5676. . Zell, R. and Fritz, H.-J. (1987) DNA mismatch-repair in Escherichia coli coun- teracting the hydrolytic deamination of 5-methyl-cytosine residues. EMBO J. 6, 1809-1815. . Deng, W. P. and Nickoloff, J. A. (1992) Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site. Anal. Biochem. 200, 81-88. . Ray, F. A. and Nickoloff, J. A. (1992) Site-specific mutagenesis of almost any plasmid using a PCR-based version of unique-site elimination. Biotechniques 13, 342-346. . Higuchi, R. (1989) Using PCR to engineer DNA, in PCR Technology (Erlich, H. A., ed.), Stockton, New York, pp. 61—70. . Rubin, J. B., Verselis, V. K., Bennett, M. V. L., and Bargiello, T. A. (1992) A domain substitution procedure and its use to analyze voltage dependence of homotypic gap junctions formed by connexins 26 and 32. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3820-3824. . Orita, M., Suzuki, Y., Sekiya, T., and Hayashi, K. (1989) Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5, 874-879. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., and Erlich, H. A. (1988) Primer—directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491. . 30 ¢ 第 五 十 五 章 应 用 含 尿 喀 呢 的 噬 粒 为 模板 的 定点 诱 变 法 Michael K. Trower pad pe Till jE ARE PE A Be, HS RY WT) EDDA 分 子 引 进 特定 的 变 FPA BETA ARE FE, CE HECTARE IR A ERRATA. BAL RE 核 苷 酸 介 导 的 诱 变 方法 见 诸 文献 ， 它 们 都 能 通过 筛 除 野生 型 DNA 分 子 而 使 那些 所 需 的 突变 的 分 子 得 以 富 集 0 41。 总 的 说 来 ， 这 些 方法 还 有 一 些 欠 缺 ， 包 括 需 要 多 重 酶 促 反 诱 变 引物 U #£ dut-,ung- E.coli i Sed a 株 中 制备 含 尿 喀 啶 的 单 链 U DNA， 复 性 到 诱 变 引物 上 | ] U U SS DNA 聚 合 酶 dNTPs All T4DNA 连 接 酶 闭环 杂 合 双 链 DNA 的 体外 合成 转化 入 dut+,un8g+ BFE E.coli 含 尿 喀 啶 的 链 失 活 ， 突变 型 链 具 有 极 强 的 选择 优势 图 $S5$.1 基于 Kunkel EME ABD, WME. colidut”, ung 宿主 制备 的 含 尿 喀 喧 的 sDNA HRR, LAGEAESE 核 苷 酸 为 引物 ， 通 过 DNA 聚合 酶 和 T4 DNA 连接 酶 的 作用 ， 体 外 合成 一 条 蜡 源 dsDNA。 将 该 dsDNA 转化 到 E.colidut*, ung* 早生 型 菌株 中 。 通 过 含 尿 喀 喧 的 DNA 链 在 野生 型 宿主 中 的 选择 性 失 活 ， 新 合成 的 诱 变 DNA 链 得 以 富 集 。 - 339 - 应 步骤 ， 需 要 沉淀 DNA， 需 要 合适 的 限制 酶 切 位 点 以 及 需要 特殊 的 载体 。Kunkel 等 介 绍 的 一 种 巧妙 的 定点 诱 变 方法 可 以 避免 上 述 问题 ， 同 时 能 高 效 地 得 到 含 所 需 的 突变 的 DNA 分 子 [5,61， 其 整个 过 程 如 图 55.1 所 示 。 这 一 方法 基于 下 述 发 现 : 缺少 两 种 关键 性 的 酶 ，dUTPase 和 尿 喀 啶 N - 糖 基 化 酶 的 已. coli 菌株 在 合成 DNA 时 ， 会 在 少量 胸腺 喀 啶 位置 上 挫 入 尿 喀 啶 。 从 这 种 dut~, ung 宿主 菌株 制备 的 含 尿 喀 喧 的 单 链 DNA (ss- DNA) 可 以 用 作 模 板 ， 在 一 个 具有 诱 变 作用 的 窒 核 苷 酸 引物 的 发 动 下 通过 DNA 体外 合 成 产生 一 条 互补 链 。 这 一 异 源 双 链 被 转化 到 一 个 野生 型 已 . coi 菌株 〈dut ，zwzg ) 中 后 ， 含 有 尿 喀 啶 的 模板 链 选择 性 地 失 活 ， 最 后 得 到 的 主要 是 事前 设计 的 突变 的 子 识 。 下 面 介绍 的 是 一 种 基于 Kunkel 原理 的 实验 步骤 ， 但 所 用 的 单 链 DNA 来 自 一 种 鸣 粒 而 不 是 更 常用 的 M13 叭 菌 体 。 其 明显 的 优点 是 减少 了 定点 诱 变 过 程 所 需 的 亚 克 隆 的 数量 。. aie som ya 除非 另 有 说 明 ， 所 有 溶液 均 可 室温 保存 。 1) E.coli A: a. 带 有 下 ' 附 加 体 的 dut , ung 菌株 CJ236， 或 其 他 具有 相同 基因 型 特点 的 宿主 细 菌 。 b. BF dut*, ung* AR, WW DHSa，JM109，NM522，TG1， 或 XL1-Blue. #Ff 生 型 宿主 无 须 带 有 下 "附加 体 。 2) T4 SRA BMB (10 U/yl). 3) 10x T4 多 核 苷 酸 激 酶 缓冲 液 : 0.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mol/L MgCh, 50 mmol/L DTT, 0.5 mg/ml 无 核酸 酶 的 牛 血清 白 蛋 白 (BSA). —20C 保存 。 4) Klenow 片段 : DNA 聚合 酶 I 的 大 片段 (SU/pl )。 5) 10 x Klenow 缓冲 液 : 0.5 mol/LTris-HCl, pH 7.4, 0.1 mol/L MgCh, 10 mmol/L DTT, 0.25mg /ml 无 核酸 酶 的 BSA。- 207 保存 。 6) dNTP 母液 : dATP, dCTP, dGTP 和 dTTP 的 浓度 各 为 4 mmol/L. —20C 保存 。 7) ATP: 10 mmol/L 溶液 。- 207 RF. 8) T4 DNA 连接 酶 : 400 U/yl 。 9) 诱 变 引 物 (参见 注释 1): 0.5 pm /LHALARERER. : a oe FEL EEF MBE tll FR BME HY) ssDNA BEAR. E. coli CJ236 菌株 是 一 个 理想 的 宿 主 ， 因 为 它 既 是 dut”, ung” 菌株 又 带 有 使 它 可 被 辅助 噬菌体 感染 的 F' 附 加 体 。 1) JH 10~S0 ng 插入 了 目标 DNA 序 列 的 鸣 粒 DNA 转化 CJ236 菌株 ， 在 适当 的 培养 基 上 选 择 转化 子 〈 参 见 注释 2)。 用 第 四 十 四 章 介 绍 的 方法 制备 喉 粒 ssDNA (参见 注释 3)。 混合 1.0 pl 10xT4 多 核 苷 酸 激酶 缓冲 液 ，1.0 pl ATP, 1.0 凡 诱 变 引物 ，6.5 pl 馏 水 和 0.5 ul T4 多 核 苷 酸 激酶 。37YC 保温 60 min， 然 后 置 70C 中 5 min 以 终止 激酶 的 作用 。 - 340 。 2 Yo 3) ERB T SERRA OCI, DNA 2 以 含 尿 喀 喧 的 ssDNA 模板 (24 20~50 ng 的 DNA) ,将 反应 管 放 在 200~300 ml 的 70C KIA, ARCH BSE. 4) 加 入 2.0 pl 10 xKlenow 聚合 酶 缓冲 液 ，1.0 由 dNTP 母液 ，2.0 pl ATP, 3.0 pl & (87k, 1.0 pl Klenow 酶 和 1.0 pl T4 DNA EERE, 16C 保温 过 夜 〈 参 见 注释 4)。 5) Fe 1~10 pl 延伸 /连接 反应 液 转化 感受 态 野生 型 E.coli dut*, ung* 菌株 ， 将 细胞 涂 布 到 选择 性 平 严 上。 转化 后 ， 一 般 能 在 平 血 上 得 到 十 个 到 几 百 个 菌落 。 典 型 情况 下 ， 诱 变 位 点 的 挫 入 效 率 高 于 50% (参见 注释 5 一 8)， 直 接 通过 DNA 测序 检查 少数 菌落 就 能 找到 所 设计 的 突 变 产 物 。 而 且 ， 如 果 引 入 的 变异 能 生成 或 消除 一 个 限制 酶 位 点 ， 就 可 以 先 如 图 55 . 示 那 样 进行 限制 酶 位 点 分 析 。 所 有 定点 变异 ， 包 括 那 些 涉 及 限制 酶 位 都 应 DNA 测 序 加 以 确证 〈 人 参见 注释 9)。 (A) NcoI 识别 位 点 -—— (C) 野生 型 “突变 型 5 'GAGGATCGTTTCCCATGGTTGAACAAGATG 3' TCGATCGA AphA-2 的 起 始 密码 子 (B) LL ee" 10 L Pe 图 55.2 (A) BRit—-t+ BRR, AFH Tn5 AphA-2 ( 卡 那 霉 素 磷酸 转移 酶 ) 基因 的 起 始 密码 子 位 置 上 引入 一 个 限制 酶 Neol 识别 位 点 (CCATGG)。 其 结果 是 使 野生 型 的 这 一 顺序 发 生 两 处 变化 〈 黑 体 字 母 ) : AphA-2 基因 的 起 始 密码 的 - 2 位 置 的 G->C 和 +4 位 置 的 A>G. X— 30 SMASH RM $ 读 向 3 的 两 个 点 突变 的 外 侧 各 有 12 个 碱 基 。 图 中 箭头 表示 AphA-2 结构 基因 的 转录 方向 。(B) 进行 定点 诱 变 后 ， 从 转化 平 严 上 几 百 个 菌落 中 选取 10 个 以 制备 质粒 DNA。 其 中 7 个 样品 用 Neol 酶 切 后 产生 3.75 kb 和 560 bp 的 两 个 片段 (第 1，2，4~7 及 9 泳 道 )， 这 与 向 载体 上 引进 了 第 二 个 Nol 识别 位 点 的 预期 结果 一 致 。 那 些 不 带 有 所 设计 的 突变 的 质粒 被 NcoI 切割 后 产生 一 条 4.3 kb 的 线性 片段 (第 3，8 和 10 泳 道 )。L: 1 kb 的 阶梯 状 相对 分 子 质量 标准 (Stratagene). (C) 野生 型 和 突变 型 质粒 DNA 的 测序 分 析 。 用 复 性 到 AphA-2 基因 起 始 密码 子 上 游 55 个 PAE Ab A PERK (17 个 碱 基 ) 作 引 物 ， 得 到 野生 型 和 带 有 Neol 突变 的 载体 的 DNA 序列 。 4.- 注 AE (1) 诱 变 引物 应 由 一 个 错 配 区 域 及 其 两 侧 与 模板 互补 的 序列 组 成 ， 以 确保 引物 能 与 指定 的 靶 序 列 有 效 地 复 性 。 错 配 区 可 以 是 插入 、 缺 失 、 蔡 换 或 几 者 的 结合 。 若 是 引入 一 个 或 两 个 突变 ， 突 变 位 点 两 侧 各 有 10 个 互补 碱 基 通 常 就 足够 了 。 如 果 两 侧 区 域 均 富 含 A 和 T， 或 者 要 对 驾 序列 做 很 大 的 改变 ， 两 侧 的 互补 碱 基数 可 以 增加 到 15 个 * 341° (2 (3 (4 (S (6 (7 (8 ) No ) Yo YA Yo Ye 或 更 多 。 只 要 可 能 ， 应 尽量 在 引物 的 $" 端 带 上 一 个 或 多 个 G 或 C 以 避免 引物 在 延 伸 过 程 之 后 被 DNA 聚合 酶 置换 掉 ， 即 使 必须 增加 引物 的 长 度 也 在 所 不 惜 。 引 物 不 能 包含 反 向 重复 序列 ， 否 则 会 形成 引物 二 聚 体 从 而 妨碍 引物 与 靶 序 列 的 复 性 。 可 以 大 胆 设计 能 使 相当 大 的 靶 DNA 区 域 环 出 (loop out) 的 诱 变 引 物 。 例 如 ， 使 用 上 面 介绍 的 方法 ， 可 以 将 人 类 巨细 胞 病毒 IE, 编码 序列 中 的 一 个 237 bp 的 区 域 定 点 缺 失掉 ， 所 用 引物 由 30 个 碱 基 组 成 ， 缺 失 位 点 两 侧 各 15 个 碱 基 (Stephen Walker, 私人 通讯 )。 CJ236 和 野生 型 宿主 的 感受 态 细 胞 可 用 Hanahan 介绍 的 冻 存 缓冲 液 法 (FSB) 制 ll, (参见 第 二 十 九 章 )。 用 此 法 制备 的 感受 态 细胞 可 分 装 保存 于 -70C， 随 时 取 用 ， 非 常 方便 。 KunkelL5'6] 在 制备 M13 ssDNA 的 过 程 中 添加 了 尿 喀 啶 核 苷 (0.25 pg/ml)， 但 本 文 作者 发 现 对 于 制备 叭 粒 ssDNA 来 说 ， 这 样 做 是 没有 必要 的 。 在 本 方法 中 用 于 引物 延伸 的 DNA 聚合 酶 是 Klenow 片段 ， 它 没有 对 ssDNA 的 S 核 酸 外 切 酶 活性 ， 所 以 不 会 降解 诱 变 引 物 。 也 可 以 采用 T4 或 T7 DNA 聚合 酶 。 与 Klenow 相 比 ， 它 们 的 优点 是 工作 效率 较 高 ， 所 以 使 用 这 两 种 酶 可 以 显著 缩短 引物 延伸 反应 所 需 时 间 。 然 而 作者 发 现 ， 在 最 终 能 分 离 得 到 带 有 所 需 定点 诱 变 的 克隆 这 一 点 上 ，Klenovw 是 更 可 靠 的 酶 ， 所 以 作者 建议 使 用 Klenow 酶 。 如 果 在 转化 平 耻 上 没有 菌落 出 现 ， 通 常 可 归 因 于 宿主 细胞 的 低 感 受 态 。 在 任何 转化 工作 中 ， 都 应 同时 设置 质粒 对 照 以 确定 所 用 的 宿主 细胞 是 处 于 感受 态 。 转化 平 血 上 无 菌落 生长 也 可 能 因为 在 前 一 步 反 应 中 没有 生成 异 源 双 链 DNA。 在 这 种 情况 下 ， 首 先 应 证 实 从 ssDNA 模板 生成 dsDNA 的 过 程 确 已 完成 ; 方法 是 在 1% 琼脂 糖 凝 胶 上 比较 守 核 苷 酸 的 延伸 /连接 反应 液 样品 和 ssDNA 模板 对 照样 品 。 正 常 情况 下 ， 在 延伸 /连接 反应 液 样品 的 电泳 图 谱 上 看 不 到 叭 粒 的 ssDNA 条 带 而 能 看 到 一 个 新 的 、 亮 度 较 高 且 电 泳 速度 明显 低 于 ssDNA 模板 样品 的 条 带 。 这 条 新 带 应 该 或 是 松弛 的 闭合 环 状 dsDNA (KV 型 ) 的 异 源 双 链 ， 或 是 没有 连接 好 的 带 有 切口 的 环 状 dsDNA .( I #4). GU FR CE SE (H/C PE i BY HL Dk PS _E A ZR OR, ssDNA HF, PEARY f DNA 并 未 合成 。 这 可 能 由 下 列 许多 因素 之 一 引起 ， DNA 聚合 酶 失去 活力 或 反应 体系 中 污染 有 酶 抑制 物 ; 诱 变 引物 未 能 与 模板 复 性 或 模板 带 有 二 级 结构 如 发 夹 环 。 如 果 是 第 一 种 情况 ， 应 换 用 新 的 Klenow 酶 ， 核 实 诱 变 引物 的 稀释 度 ， 重 新 沉淀 处 理 ssDNA 模板 以 除去 所 有 污染 物 。 为 了 确证 诱 变 寡 核 苷 酸 已 复 性 到 模板 的 正确 位 置 上 ， 可 以 将 它 作为 测序 引物 ， 对 含有 尿 喀 啶 且 含 有 所 克隆 的 靶 序 列 的 叭 粒 ssDNA 测序 。 得 到 的 DNA 序列 应 刚好 位 于 诱 变 引 物 结合 位 点 的 下 游 。 在 T4 DNA 连接 酶 不 能 有 效 地 工作 以 去 除 新 合成 的 链 与 诱 变 博 核 苷 酸 $ 端 之 间 的 切口 的 情况 下 ， 理 应 仍然 可 以 分 离 得 到 突变 菌落 ， 虽 然 效率 可 能 较 低 。 宿 主 菌 的 DNA 修复 系统 可 在 体内 完成 突变 链 的 环 化 。 导致 低 诱 变 效 率 的 可 能 原因 包括 : ssDNA 模板 上 无 尿 喀 啶 ， 因 而 在 转化 入 野生 型 宿主 中 后 不 能 失 活 ; 进行 中 的 DNA 聚合 酶 对 诱 变 寡 核 苷 酸 的 置换 作用 或 者 叭 粒 ssSDNA 制 备 物 中 的 杂质 DNA 作为 引物 引发 了 模板 进行 DNA 合成 。 .342 ， 用 10 ng ssDNA 模板 同时 转化 CJ236 和 野生 型 已 . colidut*, ung’ 菌株 可 以 检 查 模 板 上 尿 喀 啶 的 挫 入 情况 。 由 于 含 尿 喀 啶 链 的 选择 性 降解 ， 在 野生 型 菌株 上 观察 到 的 转化 效率 应 该 比 CJ236 菌株 低 10° 倍 以 上 。 在 引物 的 $ 端 增加 与 模板 互补 的 G 或 C 碱 基 的 数量 可 以 减少 对 引物 的 置换 。 另外 ， 可 以 用 T4 DNA 聚合 酶 或 天 然 的 T7 DNA RABE ( 非 测序 酶 ) 代替 Klenow 酶 ， 因 为 这 两 种 酶 没有 链 置换 活性 。 由 模板 中 的 杂质 DNA 启动 的 DNA 合成 可 通过 下 述 方法 检 出 : 在 不 加 入 诱 变 引物 的 情况 下 进行 延伸 /连接 反应 ， 如 果 吧 粒 ssDNA 也 被 转变 为 dsDNA YW, 应 重新 制备 模板 。 (9) 整个 定点 诱 变 过 程 ， 包 括 通过 测序 来 鉴定 所 设计 的 突变 克隆 ， 可 以 在 一 个 星期 内 完 成 。 而 且 ， 每 一 轮 反 应 所 需 模板 量 很 少 ， 每 次 反应 仅 耗 去 含 尿 喀 啶 的 ssDNA 的 1/25, 一 次 制 得 的 含 尿 喀 啶 的 ssDNA 可 多 次 用 于 向 所 克隆 的 插入 片段 中 引进 其 他 突 变 ， 从 而 可 以 节省 一 天 时 间 。 re 感谢 剑桥 大 学 医学 系 的 Sydney Brenner 给 了 作者 设计 这 一 方法 的 机 会 。 作 者 还 得 到 3€8 E. 1. du Pont de Nemours and Co. Inc.，Wilmington，DE. 的 资助 。 2 2X 献 一 一 . Vandeyar, M. A., Weiner, M. P., Hutton, C. J., and Batt, C. A. (1988) A simple and rapid method for the selection of oligodeoxynucleotide-directed mutants. Gene 65, 129-133. 2. Stanssens, P., Opsomer, C., McKeown, Y. M., Kramer, W., Zabeau, M., and Fritz, H.-J. (1989) Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454. 3. Lewis, M. K. and Thompson, D. V. (1990) Efficient site directed in vitro mutagen- esis using ampicillin selection. Nucleic Acids Res. 18, 3439-3443. 4. Sayers, J. R., Schmidt, W., Wendler, A., and Eckstein, F. (1988) Strand specific cleavage of phosphorthioate containing DNA by reaction with restriction endonu- cleases in the presence of ethidium bromide. Nucleic Acids Res. 16, 803-814. 5. Kunkel, T. A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without pheno- typic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492. 6. Kunkel, T. A., Roberts, J. D., and Zakour, R. A. (1987) Rapid and efficient site- specific mutagenesis without phenotypic selection. Meth. Enzymol. 154, 367-382. . Hanahan, D. (1985) Techniques for transformation of E. coli, in DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 (Glover, G. M., ed.), IRL, Oxford, pp. 109-135. — ~ 843. - 第 五 十 六 章 “ 无 细胞 系统 中 的 mRNA 翻 至 免 网 织 红 细胞 裂解 液 Louise Olliver, Charles D. Boyd Tl 1. 引 体外 翻译 系统 的 创建 大 大 促进 了 对 特异 性 mRNA 分 子 及 其 所 编码 的 蛋白 质 的 鉴定 。 这 些 无 细胞 的 提取 物 含有 和 蛋白质 合成 所 需 的 各 种 细胞 组 分 ， 即 核糖 体 、tRNA、rRNA、 各 种 氨基 酸 、 起 始 因子 、 延 伸 因 子 、 终 止 因子 以 及 能 量 产生 系统 QI。 使 用 下 列 各 种 细 胞 的 提取 物 都 能 对 异 源 mRNA 进行 高 效 而 忠实 的 翻译 :HeLa 细胞 2 、Krebs II 腹水 瘤 细胞 2 、 小 鼠 工 细胞 CI] 、 小 鼠 和 大 鼠 的 肝 细 胞 B]、 中 国 仓 鼠 卵 梨 (CHO) AAA), $e 网 织 红 细胞 裂解 液 ,4] 以 及 黑 麦 胚 6] 和 小 麦 胚乳 !(9]。 与 非洲 爪 将 卵 母 细胞 体内 翻译 系统 相 比 ， 无 细胞 系统 中 的 翻译 更 简单 、 快 速 (AG 60 min， 而 前 者 需 24 h)。 mRNA 翻译 产物 的 生成 可 通过 放射 性 标记 氨基 酸 的 挫 入 来 检测 ， 一 般 选 择 那些 在 产物 蛋白 中 含量 丰富 的 氮 基 酸 加 以 放射 性 标记 。 翻 译 产 物 的 分 析 通 常 包括 特异 性 免疫 沉 淀 ]， 以 及 随后 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 B 及 荧光 显影 9] 等 过 程 (OLA 56.1). 体外 翻译 系统 在 mRNA 的 种 类 鉴定 及 其 蛋白 质 产物 的 定性 研究 、 转 录 和 翻译 调控 的 研究 以 及 在 加 入 到 翻译 反应 体系 中 的 微粒 体 膜 对 伴 同 翻译 的 分 泌 蛋 白 加 工 过 程 ,1 的 研究 中 都 起 着 重要 的 作用 。 本 章 介 绍 用 于 mRNA 体外 翻译 的 兔 网 织 红 细胞 裂解 液 系 统 。 虽然 网 织 红 细胞 裂解 液 中 内 源 mRNA 的 含量 已 经 很 低 ， 但 还 可 以 使 它 进 一 步 减少 以 增加 翻译 过 程 对 外 源 mRNA 的 依赖 性 。 用 一 种 被 钙 离 子 激活 并 被 随后 加 入 的 EGTA 灭 活 的 核酸 酶 处 理 便 能 达到 这 一 目的 鸣 。 这 样 一 来 ， 这 系统 的 体内 环境 在 某 种 程度 上 已 被 破坏 并 且 变 得 对 钙 离 子 十 分 敏感 。 这 一 系统 对 外 源 mRNA 引导 的 放射 性 氨基 酸 挫 入 翻译 产物 来 说 ， 却 已 经 成 为 最 有 效 的 体外 翻译 系统 ， 因 此 特别 适用 于 翻译 产物 的 研 究 。 不 过 它 对 某 些 代谢 物 的 消耗 以 及 氯 高 铁血 红 素 和 双 链 RNA 等 起 调节 作用 的 因素 很 是 敏感 ， 因 而 可 用 来 研究 这 些 因素 在 不 同 mRNA 的 翻译 调控 中 的 作用 。 网 织 红 细胞 裂 解 液 昌 然 是 一 个 很 有 效 的 体外 翻译 系统 ， 但 不 同 种 类 的 mRNA 在 其 中 竞争 翻译 起 始 的 情形 可 能 与 在 体内 环境 中 有 所 不 同 ， 因 此 各 种 产物 的 合成 可 能 也 不 按 体内 比例 进行 ; 相 比 之 下 ， 麦 胚 提取 物 无 细胞 系统 (参见 第 五 十 七 章 ) 能 更 忠实 地 反映 体内 情形 。 经 核酸 酶 处 理 过 的 兔 网 织 红 细胞 裂解 液 无 细胞 系统 的 试剂 盒 可 从 许多 供应 厂商 购 得 。 + 344 ， _ 图 56.1 体外 翻译 产物 的 SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 。 在 一 依赖 mRNA 的 网 织 红细胞 裂解 液 无 细胞 体系 中 ， 从 外 源 mRNA 得 到 体外 翻译 产物 。 经 8% SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 腕 电泳 后 ， 通 过 荧光 显影 分 析 放 射 性 蛋白 质 产物 。 泳 道 1， 已 知 相对 分 子 质量 的 [1MC] -标记 的 蛋白 质 ; 磁 酸化 酶 A (93K)、 牛 血清 白 蛋白 (68K), SHEA (43K) # - 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 (25.7K). YG 2~5 依次 是 下 列 mRNA 用 CH) - 且 氨 酸 标记 的 翻译 产物 : 泳 道 2: 网 织 红细胞 裂解 液 的 内 源 mRNA; 泳 道 3; 0.3 pe KA ERM MAS polyA* 化 的 RNA; 泳 道 4; 0.3 pe 与 泳 道 3 相同 的 RNA， 翻 译 产物 经 5 品 羊 抗 人 原 弹性 蛋白 血清 免疫 沉淀 ; 泳 道 5 0.3 pe 45 泳 道 3 相同 的 RNA, 翻译 产物 经 0.3 Axeo nm 微粒 体 膜 进行 共 翻 译 加 工 。 2. 材 料 所 有 体外 翻译 组 分 均 应 - 707 保存 。 裂 解 液 、 微 粒 体 膜 和 [2S] -标记 的 氨基 酸 对 温度 特别 敏感 ， 应 以 适当 体积 分 装 保存 于 - 70Y 并 尽量 减少 冻 融 过 程 ; 溶液 在 贮存 前 用 于 冰 或 液 氮 快速 冷冻 。 1) 叶酸 溶液 : 1 mg/ml 叶酸 ，0.1 mg/ml 维生素 B，0.9% (w/v) NaCl、pH7.0; 用 0.45 pm 滤 膜 过 滤 ， 分 装 保存 于 -20T7 。 2) BRYA MR: 2.5% (w/v) BH, 0.9 % (w/v) 碳酸 氢 钠 ， 用 NaOH 调 pH 值 至 7.0。 按 一 次 使 用 量 分 装 保存 于 -20C ， 保 存 期 不 超过 一 周 。 融 化 后 未 用 完 的 溶液 应 EF. HY RS ARH fae OR. 3) 生理 盐水 : 0.14 mol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCh, 5 mmol/L KCl. 4 保存 。 4) 1 mmol/LABKMAZ, 5) 0.1 mol/L CaCl. 6) 7500 U/ml 微 球菌 核酸 酶 的 灭 菌 水 溶液 。- 20T7 保存 。 7) 免 网 织 红细胞 裂解 液 : 基本 上 按照 Palham 和 Jackson 介绍 的 方法 [制备 而 成 。 第 一 RE FE 1 ml 叶酸 溶液 的 肌肉 注射 ， 以 后 每 天 按 0.25 ml/kg EN MAAR, * 345 - 共 注 射 6 次 (参见 注释 1) 使 免 发生 贫 血 。 当 网 织 红 细胞 计数 达到 至 少 80% 时 ， 于 第 七 或 第 八 天 通过 心脏 穿刺 将 血液 收集 到 一 只 含有 大 约 3000 U 肝素 的 200 ml 离心 管 中 ， 充 分 混 匀 。 以 下 制备 过 程 应 于 240 中 继续 进行 。 a. 血液 在 2C 以 120 g 离心 12 min， 抽 气 吸 除 血 浆 。 b .血细胞 重新 悬浮 于 150 ml 冰镇 生理 盐水 中 ， 以 650 g 离心 洗涤 5 min， 重 复 三 次 。 c. 轻 轻 地 转动 沉淀 物 ， 然 后 转移 到 Corex FP 〈 装 到 半 满 )。 加 入 等 体积 生理 盐水 ， 轻 轻 地 悬浮 细胞 ， 然 后 再 在 2C 以 1020 g 离心 15 min 以 收集 沉淀 。 用 真空 泵 吸 除 淡 黄 ， 色 的 白细胞 表层 。 d. 置 冰 浴 中 ， 加 入 等 体积 冰镇 灭 菌 去 离子 水 ， 在 涡 旋 振 功 器 上 剧烈 振 功 30 s 以 裂解 细 Al (参见 注释 2)， 立 即 在 2C 以 16 000 g BL 18 min. e. 于 4 小 心 吸 了 到 上 清 液 (沉淀 物 为 各 种 膜 和 细胞 碎片 )， 分 装 成 约 0.5 ml/ 管 ， 用 液 氮 毛 高 铁血 红 素 应 根据 微 球菌 核酸 酶 消化 情况 在 0 ~ 1000 pmol/L 之 间 决 定 它 的 最 适 浓度 , 混合 477.5 由 裂 解 液 .$ pl 0.1 mol/L CaCcb 和 5 pl 核酸 酶 ( 终 浓 度 75 U/ml). 取 97.5 岂 的 这 一 混合 液 与 2.5 pol 待 测 浓度 的 氯 高 铁血 红 素 溶液 一 起 于 20 保温 20 min， 然 后 加 4 pl 0.05 mol/L EGTA 溶液 以 终止 酶 反应 (参见 注释 3)。 在 标准 的 无 细胞 抽 提 液 中 测 得 最 高 翻译 活性 (放射 性 氨基 酸 的 挫 入 量 ) ( 见 第 3 节 ) HARK 血红 素 的 浓度 就 是 它 的 最 适 浓度 。 一 般 用 25 pmol/L 可 以 保证 有 效 的 翻译 起 始 。 裂解 液 对 乙醇 、 去 污 剂 、 金 属 和 盐 ， 尤 其 是 钙 离 子 极为 敏感 。 于 -70C 保存 ， 网 织 红 细胞 裂解 液 可 保持 活性 6 个 月 以 上 。 8) (PH) 或 [2S] 标记 的 L -氨基 酸 。 为 了 检测 翻译 产物 ， 必 须 向 翻译 反应 体系 中 加 六 一 种 高 比 活 的 放射 性 标记 氨基 酸 (140 Ci/mmol [3H] 标记 的 或 约 1 Ci/mmol [25S] 标记 的 氨基 酸 )。 应 选择 在 目的 产物 蛋白 中 含量 丰富 的 氮 基 酸 加 以 放射 性 标记 。 放 射 性 氨基 酸 最 好 是 水 溶液 ; 若 pH 值 偏 低 ， 应 用 NaOH 调 至 中 性 ; 用 冷冻 干燥 法 除 尽 乙醇 ， 并 且 应 检测 溶剂 对 裂解 液 活性 的 影响 。 [55S] 标记 的 氨基 酸 很 容易 降解 成 亚 硕 类 物质 ， 应 分 装 保存 于 -707 以 避免 亚 硕 类 物质 对 翻译 过 程 的 影响 。 9) 信使 RNA。 有 多 种 方法 可 用 来 从 各 种 组 织 中 提取 总 RNA (参见 第 一 和 第 十 六 章 )。 RNA 于 灭 菌 的 蒸馏 水 中 置 - 70 保存 可 保持 稳定 一 年 以 上 。 应 避免 离子 、 金 属 和 去 污 剂 的 污染 。 可 用 氯仿 / 丁 醇 (4:1) 抽 提 去 除 酚 ， 可 通过 含 0.4 mol/L BRA (pH 6.0) 的 乙醇 沉淀 RNA 以 去 除 盐 ; 乙醇 应 用 冷冻 干燥 法 去 除 。 用 于 翻译 的 贮存 液 的 合适 泊 度 为 1.5 mg/ml 总 RNA 或 150 pg/ml polyA+ RNA. 10) 翻 译 混合 液 : 250 mmol/L HEPES、pH 7.2，400 mmol/L KCI， 除 放射 性 标记 氢 基 酸 外 的 19 种 氨基 酸 各 500 mmol/L; 100 mmol/L 磷酸 肌 酸 。 11)20 mmol/L MARE. pH 7.2。 12)2.0 mol/L BARB. pH 7.2. 13) 灭 菌 蒸 馅 水 。 及 用 无 菌 操 作 。 为 避免 RNase 污染 ,玻璃 器 血 须 经 热处理 (250C ,12 h) ;对 于 热 敏感 * 346 - 材料 可 先 用 焦 碳 酸 二 乙 酯 处 理 , 然后 用 蒸馏 水 漂洗 。 整 个 过 程 都 应 戴 灭 菌 手 套 操作 。 ety 法 体外 翻译 最 好 在 经 高 压 灭 菌 过 的 微型 塑料 离心 管 (1.5 ml) 中 进行 ;用 干 热 培 养 箱 提供 恒温 环境 比 用 水 浴 好 。 所 有 加 样 操作 都 应 在 冰 上 进行 。 1) 在 冰 上 向 一 只 反应 管 中 依 次 加 入 0.7 pl RA RiBK, 1.3 pl 2.0 mol/L BRA (2 TLIEFE 4), Sul (10 一 50 pCi) 放射 性 标记 氢 基 酸 (参见 注释 S) 和 3 ol MARS 液 ， 涡 旋 振 蔓 混 匀 。 置 冰 上 的 每 一 管 中 分 装 10 pl 〈 人 参见 注释 6)。 2) 加 入 10 pl (300 mg”) 总 RNA (参见 注释 7 和 8)。 设 置 一 不 加 外 源 mRNA 的 对 照 反应 以 检查 是 否 有 残留 的 网 织 红 细胞 内 源 mRNA 被 翻译 。 3) 最 后 加 入 10 pl 裂解 液 以 启动 翻译 过 程 。 如 果 要 对 翻译 产物 进行 伴 同 翻译 的 加 工 ， 则 同时 加 入 0.5 Asconm U 微粒 体 膜 〈 人 参见 注释 9 和 10)。 4) 轻 轻 地 涡 旋 振 功 混 匀 后 ， 于 37 保温 60 min。 将 反应 管 置 冰 上 以 停止 反应 (BME FE 6)。 5) mRNA 指导 的 放射 性 氨基 酸 摊 入 翻译 产物 的 情况 可 通过 测定 酸 沉淀 计数 值 来 检查 。 在 保温 开始 和 结束 时 ， 各 取 5 由 反应 液 滴 到 两 张 玻璃 纤维 滤 膜 上 上， 空气 干 燥 后 将 滤 膜 依 次 放 入 下 列 溶 液 中 处 理 ， 溶 液 用 量 为 每 张 滤 膜 10 ml. a. 10% (v/v) 预 冷 的 三 氯 醋酸 (TCA), ERE 10 min. b. 5% (v/v) TCA, A$ 15 min 以 降解 氨基 酸 - tRNA 复合 物 。 c. 5% (v/v) HHH TCA, HK ERE 10 min. 依次 用 95% (v/v) GB. 50% (v/v) 乙醇 /50% (v/v) 丙酮 和 100% (v/v) FABRE UE AR. SOC HF 30 min 后 将 滤 膜 浸入 S ml 以 甲苯 为 溶剂 的 闪烁 液 中 ， 用 闪烁 计数 器 测定 被 TCA 沉淀 的 放射 性 强度 。 外 源 mRNA 刺激 的 翻译 能 使 2H]- 或 [>S]- 标 记 氢 基 酸 的 挫 入 量 比 背景 值 高 出 5 一 30 倍 。 向 剩 下 的 20 pl 翻译 体系 中 加 入 等 体积 的 2% (w/v) SDS, 20% (w/v) 甘油 ， 0.02% (w/v) 省 酚 蓝 和 1 mol/L 尿素 ， 再 加 入 二 硫 苏 糖 醇 (DIT) 至 终 浓 度 为 0.1 mol/L.95C 加 热 6 min, 自然 冷却 至 室温 后 在 适当 浓度 (6% ~ 17% ) 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 腕 上 进行 电泳 ,电泳 后 就 可 以 在 荧光 谱 上 看 到 凝 胶 上 的 放射 性 部 位 (图 $6.1)。 6 SA 4. 注 释 (1) 为 使 免 发 生 最 大 程度 的 贫血 ， 可 在 第 3 天 减少 葵 肝 注 射 剂 量 ， 以 后 几 天 中 增加 剂 量 。 网 织 红 细胞 计数 通过 下 述 过 程 测定 : a. 向 100 pl 血液 中 加 入 20 由 含 0.1% 肝 素 的 生理 盐水 。 b. 取 50 所 血 液 肝 素 ， 加 入 等 体积 含 1% (w/v) RAE, 0.6% (w/v) 柠檬 1) 此 处 有 明显 错误 ， 疑 是 “300 ng” 的 误 排 。 一 一 译 者 注 “> 酸 钠 和 0.7% (w/v) NaCl AR, 37°C 保温 20 min。 。 在 显微镜 下 观察 到 的 网 织 红 细胞 呈 较 大 圆 形 ， 内 含 蓝 色 颗 粒 ; 而 红细胞 则 较 小 ， 呈 卵 形 ， 无 颗粒 。 (2) 裂解 网 织 红细胞 所 需 灭 菌 水 的 体积 〈 以 毫升 计 ) 与 管 中 沉 淀 物 的 质量 (sit) 相等 。 (3) 裂解 液 中 的 内 源 mRNA 被 由 钙 离 子 激 活 的 核酸 酶 降解 ， 随后 加 入 的 EGTA 使 该 酶 失 活 。 所 以 裂解 液 对 钙 离 子 十 分 敏感 ， 应 避免 向 反应 体系 中 引进 钙 离 子 以 免 外 源 mRNA 被 激活 的 核酸 酶 降解 。 钾 离 子 的 最 适 浓度 随 所 用 的 mRNA 种 类 的 不 同 而 变化 ， 范 围 在 30 一 100 mmol/L 之 间 ， 应 在 正式 进行 翻译 之 前 确定 下 来 。 另 外 ， 不 同 的 mRNA 对 镁 离子 的 要 求 也 可 能 不 一 样 ， 常 用 的 镁 离子 浓度 范围 是 0.6 一 1.0 mmol/L. (5) 如 果 放 射 性 氨基 酸 的 比 活 高 于 第 二 节 所 说 的 标准 ， 可 能 会 导致 该 种 氨基 酸 的 耗 尽 ， 结果 对 翻译 产生 抑制 作用 。 (6) 剧烈 的 振 功 会 降低 翻译 效率 ， 所 以 在 制备 反应 混合 物 时 应 轻 轻 地 混 匀 。 (7) 在 进行 正式 的 翻译 之 前 ， 应 在 维持 其 他 条 件 不 变 的 情况 下 改变 mRNA 的 用 量 以 确 定 其 最 适 浓度 。 注 意 避 免 mRNA 的 过 量 ; polyA* mRNA 的 用 量 超过 1 pg 就 会 对 翻 译 产 生 抑 制作 用 。 (8) 在 加 入 反应 体系 之 前 ，mRNA 4 70~80C 热处理 1 min 并 随后 于 冰 浴 中 快速 冷却 ， 这 一 处 理 可 以 提高 富 含 GC 的 mRNA 的 翻译 效率 ; 例如 ， 经 热处理 的 弹性 蛋白 mRNA 的 翻译 效率 ， 按 翻译 产物 中 的 摊 入 的 同位 素 计 比 未 经 处 理 者 高 100%02]。 伴 同 翻译 的 加 工 产物 可 通过 向 翻译 反应 体系 中 加 入 狗 胰腺 微粒 体 膜 来 检 出 。 这 种 腊 可 以 用 Jackson 和 Blobel 介绍 的 方法 69 自行 制备 ， 也 可 与 翻译 试剂 盒 一 起 向 厂商 订 购 。 微 粒 体 膜 应 分 装 成 约 5 Asonm U 于 20 mmol/L HEPES (pH7.5) 中 置 -70Y 保存 ， 避 免 反 复 冻 融 。 (10) 在 某 些 情况 下 ， 向 反应 体系 中 加 入 约 0.4 mmol/L DRS MEAS), BRE 因为 它 对 有 关 的 核酸 具有 稳定 作用 。 但 这 种 效应 也 可 能 随 不 同 的 裂解 液 样品 而 异 ， 如 有 必要 ， 对 不 同 的 裂解 制备 物 应 分 别 确定 亚 精 胺 的 最 佳 用 量 。 (4 — (9 a S$ = xX 献 -一 . Lodish, H. F. (1976) Translational control of protein synthesis. Annu. Rev. Biochem. 45, 39-72. . McDowell, M. J., Joklik, W. K., Villa-Komaroff, L., and Lodish, H. F. (1972) Translation of reovirus messenger RNAs synthesized in vitro into reovirus polypeptides be several mammalian cell-free extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2649-2653. . Sampson, J., Mathews, M. B., Osborn, M., and Borghetti, A. F. (1972) Hemoglo- bin messenger ribonucleic acid translation in cell-free systems from rat and mouse liver and Landschutz ascites cells. Biochemistry 11, 3636-3640. Pelham, H. R. B. and Jackson, R. J. (1976) An efficient mRNA-dependent transla- tion system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. 67, 247-256. N Ww = + 348 - 这 . Carlier, A. R. and Peumans, W. J. (1976) The rye embryo system as an alternative to the wheat-system for protein synthesis in vitro. Biochem. Biophys. Acta 447, 436-444. . Roberts, B. E. and Paterson, B. M. (1973) Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330-2334. Kessler, S. W. (1981) Use of protein A-bearing staphylococci for the immunopre- cipitation and isolation of antigens from cells, in Methods in Enzymology (Langone, J. J. and Van Vunakis, H., eds.), Academic, New York, pp. 441-459. . Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. . Banner, W. M. and Laskey, R. A. (1974) A film detection method for tritium-labelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46, 83-88. . Shields, D. and Blobel, G. (1978) Efficient cleavage and segregation of nascent presecretory proteins in a reticulocyte lysate supplemented with microsomal mem- branes. J/. Biol. Chem. 253, 3753-3706. . Jackson, R. C. and Blobel, G. (1977) Post-translational cleavage of presecretory proteins with an extract of rough microsomes, from dog pancreas, with signal pepti- dase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5598-5602. . Karr, S. R., Rich, C. B., Foster, J. A., and Przybyla, A. (1981) Optimum conditions for cell-free synthesis of elastin. Coll. Res. 1, 73-81. - 349 - 第 五 十 七 章 ”无 细胞 系统 中 的 mRNA 翻译 一 一 考 胚 提取 物 Louise Olliver, Anne Grobler-Rabie, Charles D. Boyd ul 1. 引 Ze Ua Se HU th Sb AE A SEO ORTIZ PE AKA mRNA 在 异种 无 细胞 体 系 中 的 有 效 而 忠实 的 翻译 0 9。 就 翻译 产物 的 得 率 而 言 ， 麦 胚 提 取 物 不 如 大 多 数 网 织 红细胞 裂解 液 有 效 ， 但 它 却 具 有 下 述 优点 : 中 各 种 mRNA 在 其 中 竞争 翻译 的 情形 更 接近 于 体内 环境 ， 所 以 麦 胚 提 取 物 更 适用 于 翻译 调控 的 研究 0 。 四 内 源 mRNA 含量 和 内 源 核酸 酶 活力 都 特别 低 001， 所 以 无 须 再 用 依赖 钙 离 子 的 核 酸 酶 处 理 。 这 样 ， 体 内 环境 受到 较 少 的 破坏 ， 钙 离子 污染 的 危害 性 也 大 为 减 小 。 减少 内 源 mRNA 的 干扰 对 各 种 大 小 的 外 源 mRNA 翻译 产物 的 分 析 鉴定 也 更 简单 易 行 。 @ 翻 译 产物 没有 翻译 后 修饰 过 程 ， 因 此 所 研究 的 是 最 初 翻译 产物 ;虽然 也 可 以 向 反 应 体系 中 加 入 微粒 体 膜 以 对 产物 进行 翻译 后 加 工 。 田 对 不 同 大 小 的 mRNA 模板 ， 可 通过 改变 离子 环境 来 优化 反应 条 件 C] (参见 注释 1)。 加 入 一 个 由 ATP、GTP、 磷 酸 肌 酸 和 肌 酸 激酶 组 成 的 能 量 发 生 系统 能 使 这 一 体系 获得 最 高 的 翻译 活性 ”。 麦 胚 可 以 购买 ， 且 很 便宜 (参见 注释 2), 提取 物 的 制备 简单 ， 快速 ， 得 率 高 。 市 场 上 也 有 麦 胚 提 取 物 试剂 盒 供应 。 2. 材 料 支 胚 体外 翻译 系统 的 组 分 对 温度 敏感 ， 须 以 适当 体积 分 装 ， 于 — 70 保存 并 尽量 减 少 冻 融 次 数 。 整 个 过 程 都 应 在 灭 菌 条 件 下 进行 。 为 了 防止 RNase 污染 ， 所 用 器 材 须 经 高 温 处 理 (250C ，8 h)， 或 先 经 焦 碳 酸 二 乙 酯 处 理 ， 然后 用 灭 菌 蒸 馏 水 彻底 清洗 。 1) EMERY. 基本 上 按照 Roberts 和 Paterson 介绍 的 方法 制备 [9 。 制备 过 程 须 在 4 进行 ;最 好 使 用 塑料 容器 ， 因 为 起 始 因子 容易 黏着 在 玻璃 器 严 上 。 将 新 鲜 麦 胚 〔 约 5g) 〈 参 见 注释 2) 与 等 质量 的 沙 粒 以 及 28 ml 逐渐 加 入 的 下 列 各 物 : 20 mmol/L HEPES (pH 7.6)、100 mmol/L KCl, 1 mmol/L Ae A EL 2 mmol/L CaCl, 6 mmol/L 2 - 琉 基 乙醇 ， 一 起 碾 磨 后 将 混合 物 以 28 000 g T£2C,. pH6.5 PBL 10 min。 这 样 的 pH 环境 能 防止 内 源 mRNA 从 多 聚 核糖 体 上 释放 下 来 ， 因 而 也 就 无 须 ”350 - PSG BW ei SR ROE I a), LEVY (S28) 通过 用 20 mmol/L HEPES (pH 7.6). 120 mmol/L KCl, 5 mmol/L BARRE. 6 mmol/L 2 -Ft2E CBS Sephadex G-25 (442%) 凝 胶 柱 层 析 以 除去 内 源 氨 基 酸 和 对 翻译 有 抑制 作用 的 植物 色 素 。 反 相 层 析 可 以 防止 氨基 酸 的 损失 。 合 并 少 度 高 于 20 Aco nm/ml 的 组 分 ， 然 后 以 约 100 Ago nm/ml 的 浓度 分 装 。 保 存 于 -70C ， 提 取 物 可 维持 翻译 活性 一 年 以 上 。 [3H] 或 [35S] 标记 的 世 - 氢 基 酸 : 为 了 检测 翻译 产物 ， 在 反应 体系 中 加 入 10~ 50 pwCi 放 射 性 标记 的 〈 在 翻译 产物 中 含量 丰富 的 ) 一 种 氨基 酸 。 合 适 的 比 活 是 [HI] tric AER: 140 Ci/mmol; [*S] 标记 氮 基 酸 : 1 Ci/mmol (参见 注释 3)。 放 射 性 氨基 酸 应 是 水 溶液 ， 因 为 乙醇 、 盐 、 去 污 剂 和 某 些 溶剂 都 会 干扰 翻译 。 乙 醇 应 通过 冷冻 干燥 法 除去 ; 其 他 成 分 对 翻译 的 影响 都 应 事先 分 析 确 定 。 [S] 标记 的 氨基 酸 必须 小 量 分 装 后 置 -70 保存， 这 样 可 以 稳定 6 个 月 ; 过 此 期 限 ， 其 中 的 降解 产物 亚 硕 类 物质 会 对 翻译 产生 抑制 作用 。 信使 RNA: 抽 提 总 RNA 和 多 聚 腺 苷 酸化 的 RNA 的 方法 已 见 诸 许多 报道 00-2]1。 方 便 的 母液 浓度 为 : 总 RNA，1.5 mg/ml; 或 polyA* RNA, 150 pg/ml (在 灭 菌 蒸 馅 水 中 )。RNA 在 -707C 可 稳定 一 年 以 上 。 钾 离子 (人 参见 注释 1) 、 葵 酚 和 乙醇 污染 必 须 分 别 通过 70% (v/v) 乙醇 洗涤 、 和 氯仿 / 丁 醇 (4:1) 抽 提 和 冷冻 干燥 除去 。 4) 10x 能 量 混 合 液 : 10 mmol/L ATP, 200 pmol/L GTP, 80 mmol/L 磷酸 肌 酸 。 应 使 用 核 苷 三 磷酸 钾 盐 ， 并 用 NaOH 调节 pH 值 至 7.4 一 7.6。 5) 0.5~1.0 mol/L 醋酸 钾 (参见 注释 1)，25 mmol/L BRE. 6) 20 mmol/L DTT. 7) 0.6~1.2 mmol/L 精 胺 或 4.0 一 8.0 mmol/L WAH (BIE 4). 8) 0.2 mol/L HEPES, pH7.4~7.6 (参见 注释 $)。 9) 200~500 pg/ml 肌 酸 激酶 (参见 注 释 6)。 2 S 3 ~~ mba 法 所 有 制备 操作 都 应 在 冰 上 进行 。 各 种 组 分 用 过 后 剩余 部 分 用 干冰 快速 冷冻 。 反 应 在 灭 菌 塑 料 微型 离心 管 中 进行 。 1) 在 一 只 反应 管 中 混 合 下 列 溶液 〈 总 各 量 50 wl): 5 由 能 量 混合 液 ，5 pl 醋酸 钾 / 醋 酸 FRYE M, Spl DTT, 5 pl HEPES, 5 pl FARK, 10 由 (0.3~8.0 pg) mRNA 水 溶液 (参见 注释 7), 10 pl RBM Y, 10 岂 肌 酸 激酶 (0.8 一 1.0AzoU) 和 5 ul RH 酶 。 如 果 要 同时 进行 多 组 反应 ， 可 按 所 需 总 量 先 制备 前 5 种 溶液 的 混合 物 ， 然 后 以 每 份 25 岂 分 装 到 各 组 反应 管 中 。 肌 酸 激酶 应 最 后 加 入 以 避免 能 量 浪费 。 敲 击 或 轻 微 振 功 离 心 管 以 使 溶液 混 匀 。 如 果 需 要 ， 可 在 肌 酸 激酶 之 前 加 入 微粒 体 膜 (0.5 Az6oU) 以 检测 翻译 产物 的 加 工作 用 (参见 注释 8)”. 1) 原著 该 步骤 有 一 些 错误 和 疑问 ， 因 无 法 校正 ， 逐 句 直 译 如 文 。 很 明显 的 有 两 点 : 第 一 ， 加 了 两 次 肌 酸 激 酶 是 错 文 ， 由 于 总 各 量 系 50 局 所 以 似乎 “10 pl URIBE (0.8 一 1.0 AmU)” 应 删 去 ; 第 二 ， 没 有 加 入 放射 性 标记 氨基 酸 ， 这 与 前 后 文 均 不 一 致 。 请 读者 综合 参考 本 章 的 材料 部 分 、 注 释 3 以 及 其 他 有 关 文 献 ， 然 后 自作 结 @. Wat 2) F28C 保温 1h (参见 注释 9)。 置 4 人 终止 反应 。 3) 取 一 部 分 反应 液 进行 TCA 沉淀 以 检查 放射 性 氨基 酸 摊 入 翻译 产物 的 情况 〈 参 见 第 五 十 六 章 ; 注释 10), HREM AS PINE mRNA 刺激 的 放射 性 氨基 酸 摊 入 翻译 产 物 的 效率 一 般 没 有 网 织 红细胞 裂解 液 系统 那样 高 。 4) 可 用 标准 方法 对 剩余 的 体外 翻译 产物 做 进一步 分 析 ， 例 如 胰 和 蛋白 酶 定位 和 离子 交换 Be, 对 于 专 一 性 的 产物 ， 可 先进 行 免疫 沉淀 ， 然 后 用 SDS 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 进 行 分 析 。 中 这 iE (1) 麦 胚 提 取 物 的 翻译 活性 对 钾 离 子 浓度 的 变化 特别 敏感 。 钾 离子 浓度 低 于 70 mmol/L 时 ， 比 较 小 的 mRNA 优先 得 到 翻译 ;而 较 大 mRNA 的 完全 翻译 则 要 求 70 mmol/L 或 更 高 浓度 的 醋酸 钾 [,5]。 在 适当 的 离子 条 件 下 ， 能 合成 大 到 200 KkDa 的 多 肽 [1。 另外 ， 毛 离子 对 翻译 有 抑制 作用 ， 所 以 最 好 使 用 醋酸 钾 5。RNA 制备 物 中 残留 的 钾 离 子 应 通过 70% 乙醇 洗涤 彻底 除 尽 。 (2) 提取 物 固有 的 翻译 活性 随 不 同 批号 的 麦 胚 材料 而 异 。 用 以 色 列 的 一 些 面粉 厂 〈 例 如 “Bar-Rav”Mill，Tel Aviv) 供应 的 麦 胚 制备 的 提取 物 通常 都 具有 较 高 的 翻译 活性 。 绝 大 部 分 内 源 氨基 酸 已 通过 Sephadex G-25 ( 粗 级 ) KBR RR. HAA 提取 物 的 不 同 ， 可 能 有 必要 加 入 氨基 酸 (AWE 25 pmol/L) 和 /或 tRNA (ARE 58 pg/ml) 以 优化 翻译 活性 。 麦 胚 提取 物 对 氨基 酸 饥饿 特别 敏感 ; 使 用 比 活 高 于 所 推荐 的 放射 性 氨基 酸 可 能 导致 氨基 酸 饥 俄 从 而 抑制 翻译 。 加 入 精 胺 或 亚 精 胺 通常 能 促进 翻译 ， 对 于 较 大 的 多 肽 的 合成 尤为 必需 5]， 可 能 因 为 它们 对 较 大 的 mRNA 分 子 具 有 稳定 作用 。 若 省 略 任 一 成 分 ， 则 须 将 醋酸 镁 的 最 适 浓度 提高 到 4.0 一 4.3 mmol/L. 对 麦 胚 提取 物体 外 翻译 系统 来 说 ，HEPES 的 缓冲 效果 比 Tris -醋酸 好 [4]。 如 果 使 用 后 者 ， 则 钾 离 子 和 镁 离子 的 最 适 浓度 都 须 改变 。 肌 酸 激酶 的 各 种 商业 制品 在 核酸 酶 污染 程度 上 是 有 差别 的 ， 如 果 肌 酸 激酶 的 用 量 较 大 ， 必 须 考虑 到 这 一 点 。 (7) 较 大 的 mRNA 经 70C 加 热 1 min 然后 在 冰 上 快速 冷却 ， 这 样 可 以 提高 它们 在 麦 胚 提取 物 系 统 中 的 翻译 效率 。 伴 同 翻译 的 翻译 产物 加 工 过 程 可 通过 向 翻译 反应 体系 中 加 入 狗 胰 腺 微粒 体 膜 来 检 测 。 这 种 膜 可 以 用 Jackson 和 Blobel 介绍 的 方法 :2 自行 制备 ， 也 可 与 翻译 试剂 盒 一 起 向 厂商 订购 。 微 粒 体 膜 应 分 装 成 约 5 Azonm U 于 20 mmol/L HEPES (pH 7.5) 中 ， 置 -707 保存 ， 必 须 避 免 反 复 冻 融 。 mRNA 刺激 的 放射 性 氨基 酸 挫 入 翻译 产物 的 过 程 是 线性 的 : 先 有 一 个 5 min AYER 期 ， 接 着 是 50 min 的 线性 上 升 ，90 min 后 全 部 完成 。 这 一 系统 在 高 于 30fC 的 温度 中 是 不 稳定 的 ; 最 高 活性 随 不 同 批号 的 麦 胚 提取 物 制 品 而 异 ， 一 般 在 25 一 30C 之 间 。 委 用 的 反应 温度 是 28 。 (10) 为 了 得 到 最 高 的 翻译 活性 ， 须 对 每 一 次 的 麦 胚 提 取 物 制品 分 别 确定 最 佳 反应 条 件 ， * 352 。 (3 ~~ (4 ~~ (S 4 (6 (8 ~ (9 YA 包括 mRNA KE. FR PFMRAPTREU RRM. MSA RE ROE 层 析 洗 脱 液 中 各 种 盐 的 浓度 。 We 考 文 献 1. Steward, A. G., Lloyd, M., and Arnstein, H. R. V. (1977) Maintenance of the ratio of a and B globin synthesis in rabbit reticulocytes. Eur. J. Biochem. 80, 453-459. 2. Benveniste, K., Wilczek, J., Ruggieri, A., and Stern, R. (1976) Translation of col- lagen messenger RNA in a system derived from wheat germ. Biochemistry 15, 830-835. 3. Huntner, A. R., Farrell, P. J., Jackson, R. J., and Hunt, T. (1977) The role of poly- amines in cell-free protein in the wheat germ system. Eur. J. Biochem. 75, 149-157. 4. Roberts, B. E. and Paterson, B. M. (1973) Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330-2334. 5. Davies, J. W., Aalbers, A. M. J., Stuik, E. J., and van Kammen, A. (1977) Transla- tion of cowpea mosaic RNA in cell-free extract from wheat germ. FEBS Lett. 77, 265-269. 6. Boedtker, H., Frischauf, A. M., and Lehrach, H. (1976) Isolation and translation of calvaria procollagen messenger ribonucleic acids. Biochemistry 15, 4765-4770. 7. Patrinou-Georgoulas, M. and John, H. A. (1977) The genes and mRNA coding for the theory chains of chick embryonic skeletal myosin. Ce// 12, 491-499. 8. Larkins, B. A., Jones, R. A., and Tsai, C. Y. (1976) Isolation and in vitro transla- tion of zein messenger ribonucleic acid. Biochemistry 15, 5506-5511. 9. Schroder, J., Betz, B., and Hahlbrock, K. (1976) Light-induced enzyme synthesis in cell suspension cultures of petroselinum. Eur. J. Biochem. 67, 527-541. 10. Pelham, H. R. B. and Jackson, R. J. (1976) An efficient mRNA-dependent transla- tion system from reticuloctye lysates. Eur. J. Biochem. 67, 247-256. 11. Darnbrough, C. H., Legon, S., Hunt, T., and Jackson, R. J. (1973) Initiation of protein synthesis: evidence for messenger RNA-independent binding of methiony]- transfer RNA to the 40S ribosomal subunit. J. Mol. Biol. 76, 379403. 12. Jackson, R. C. and Blobel, G. (1977) Post-translational cleavage of presecretory proteins with an extract of rough microsomes, from dog pancreas, with signal peptidase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5598-5602. * B55 = 第 五 十 八 童 ” 应 用 6x His 标签 和 Ni-NTA 树脂 对 重组 蛋白 进行 一 步 纯 化 Joanne Crowe, Brigitte Steude Masone, Joachim Ribbe ul 1. 引 对 于 重组 蛋白 质 和 抗原 性 肽 的 亲 和 纯 化 ，6 x His/Ni-NTA 系统 是 一 个 快速 而 用 途 广泛 的 工具 。 其 基本 原理 是 利用 连续 的 6 个 组 氢 酸 残 基 (6 x His 标签 ) 与 固定 化 镍 离 子 的 高 度 选 择 性 的 强 亲 和 结 合 ， 来 实现 带 有 6 x His 标签 的 蛋白 质 或 蛋白 质 复合 体 的 一 步 纯化 ， 使 总 蛋白 样品 中 含量 少 到 1% 以 下 的 目标 蛋白 质 在 仅仅 一 步 纯 化 中 达到 95% 以 haga, PRES Ni-NTA 树脂 的 结合 非常 牢固 ， 所 以 可 用 严格 的 条 件 轻 易 地 洗 掉 杂 质 ; 而 目标 蛋白 质 可 通过 咪唑 的 竞争 或 pH 值 的 小 幅度 降低 而 被 温和 地 洗 脱 。 此 外 ， 这 种 相互 作用 不 受 标签 的 三 级 结构 的 影响 ， 所 以 即使 在 溶解 包涵 体 所 需 的 强 变性 条 件 下 也 能 进行 带 6x His 标签 蛋白 质 的 纯化 。 构成 6 x His 标签 的 六 个 组 氨 酸 残 基 可 连接 在 重组 蛋白 的 任 一 末端 ， 在 生理 pH 值 条 件 下 不 带电 荷 ， 而 且 除 某 些 猴 以 外 对 所 有 物种 都 基本 没有 免疫 原 性 。 因 此 ，6 X His 标签 一 般 不 会 影响 被 贴标签 的 蛋白 质 的 结构 或 功能 ， 不 必 在 纯化 之 后 将 它 从 蛋白 质 上 去 除 掉 B]。 另 外 ， 因 为 序列 短小 ， 很 容易 将 它 引入 任何 表达 系统 。 将 6xHisNi-NTA 法 与 细菌 高 表达 系统 相 结合 ， 就 得 到 了 一 个 简单 而 又 巧妙 的 蛋 白质 纯化 方法 一 一 不 论 表 达 蛋 白质 的 含量 是 高 是 低 ， 是 变性 的 或 是 与 其 他 蛋白 质 、 DNA 或 RNA 结合 在 一 起 ， 都 行 之 有 效 。 从 抗体 生产 方面 大 规模 蛋白 质 纯 化 到 能 与 带 标 签 蛋白 质 发 生 相 互 作用 的 抗体 、 亚 基 和 底 物 的 纯化 ， 这 一 方法 都 得 到 广泛 的 应 用 。 1.1 用 pQE 系列 表达 载体 表达 蛋白 质 PQE 系列 的 表达 载体 能 在 已. coli 中 高 水 平地 表达 带 有 6 x His 标签 的 蛋白 质 或 肽 。 标签 可 以 位 于 蛋白 质 的 N 端 ， 形 成 W 型 结构 ; 或 者 位 于 CH, Bae, 或 者 位 于 一 个 从 自身 的 ATG 起 始 密码 子 开 始 翻译 的 蛋白 质 (pQE-60) 的 C 端 ， 形 成 ATG 型 结 构 (图 58.1)。 如 果 要 合成 小 天 ， 可 以 将 它 融 合 到 鼠 的 二 氧 叶酸 还 原 酶 (dihydrofolate reductase，DHFR)， 形 成 I 型 结构 ; 其 中 免疫 原 性 很 低 的 DHFR 能 稳定 正在 表达 中 的 小 肽 并 增强 其 抗原 性 。 PQE 系列 质粒 来 源 于 质粒 pDS56/RBSII 和 pDS781/RBSILDHFRSI。 如 图 58.2 中 的 典型 载体 pQE-30 (IV 型 ) 和 pQE-40 (II 型 ) 所 示 ， 它 们 含有 下 述 结构 要 素 ; 由 一 个 经 优化 的 、 可 调控 的 启动 子 /操纵 基因 元 件 N250PSN250P29。 它 含有 来 自 E.coli 噬菌体 TS 的 启动 子 (能 被 已. coli RNA 聚合 酶 识别 )， 该 启动 子 含有 两 个 - 354 - pQE 载 体 中 的 表达 结构 蛋白 质 〈 例 如 酶 , 受 体 蛋 白 ) 6XHis -蛋白 质 6XHis-DHFR- 融 合 lV 型 结构 Il 型 结构 DHFR & (A) prom./oper./S.D. pQE-30 all 826 3462 bp Ncol 860 Bgl 2590 Xbal 1164 ta NdeI 1400 (B) Xho I/Ava I1 prom./oper./S.D. pHFRS amp Bgl1 3160 pQE-40 4032 bp Pvul 11029 ORI TI/TMB E.c. Ball 1396 Xba 11734 Nde 11970 图 58.2 ”典型 的 pQE 表达 载体 。 (A) pQE-30 (型 结构 )。 多 克隆 位 点 区 域 紧 接 在 6 x His 标签 序列 的 3’. (B) pQE-40 (I W444). 46 His 标签 和 多 克隆 位 点 区 域 之 间 有 一 DHFRS 序列 。DHFRS 对 短小 的 蛋白 链 有 稳定 作用 。 3 lac 操纵 基因 序列 ， 可 确保 严格 的 调控 ; @ 一 个 人 工 合成 的 、 极 易 被 识别 和 结合 的 核糖 体 结合 位 点 (ribosome binding site I, RBSTI); 图 优化 的 6 X His 标签 编码 序列 ; 四 小 鼠 DHFR 编码 序列 〈 仅 见于 某 些 载体 ); 回 多 克隆 位 点 〈 可 形成 各 种 读 框 ); @ 所 有 读 框 的 翻译 终止 密码 子 ; OKA AMER aA IEF “29”; @ 不 翻译 的 氧 霉 素 乙 酰 转 移 酶 开放 读 杠 ; OE. coli rrnB 操纵 子 的 转录 终止 子 “z”; © JAR pBR322 的 复制 区 及 8B- 内 酰胺 酶 基因 。 E.coli 宿主 细胞 M15 [pREP4] 和 SG13009 [pREP4] 含有 多 拷贝 的 pPREP4 质粒 。 该 质粒 带 有 能 使 宿主 产生 卡 那 霉 素 抗 性 的 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 (NEO) 基因 和 编码 lac 阻 过 物 的 JacI 基 因 。 多 拷贝 的 bpREP4 使 宿主 细胞 含有 高 水 平 的 /ac BAD, Mim PRUE 蛋白 质 表 达 的 严格 调控 。 含 25 pg/ml 卡 那 霉 素 的 培养 基 能 维持 该 质粒 在 瓦 . coli 细胞 中 的 存在 0J。 加 入 使 阻 过 物 失 活 的 IPTG 可 快速 诱导 pQE 载体 上 基因 的 表达 。 通 过 改变 诱导 物 IPTG 的 用 量 可 以 控制 表达 水 平 的 高 低 。 带 有 阻 过 质粒 (pREP4) AYE. coli 菌株 M15 [pREP4] 或 SG13009 [pREP4] 很 适 于 用 来 表达 重组 蛋白 。 带 有 acla AWE. coli 菌株 如 XL1-Blue、JM109 和 TG1 等 可 用 来 保存 和 增殖 pQE 质粒 ， 因 为 它们 无 须 携带 pREP4 质粒 就 能 产生 足够 的 lac SAD 以 阻止 有 关 基 因 的 表达 。 它 们 也 能 用 做 表达 型 宿主 ， 但 其 表达 过 程 不 像 带 pREP4 质粒 的 菌株 那样 能 被 严格 地 调控 ， 可 能 会 出 现 “ 毒 ”蛋白 问题 。 用 Ni-NTA 树脂 进行 纯化 所 需 的 亲 和 标 签 仅 由 六 个 连续 的 组 氨 酸 残 基 组 成 。 这 意味 着 只 癌 重 组 蛋白 质 上 引入 很 少 的 几 个 额外 氨基 酸 。 该 标签 只 有 很 弱 的 免疫 原 性 ， 而 且 对 除 某 些 猴 以 外 的 所 有 物种 根本 没有 免疫 原 性 ， 且 在 生理 pH 值 条 件 下 不 带电 荷 ， 一 般 不 影响 蛋白 质 的 分 泌 或 折 友 。 在 数 百 种 用 这 一 系统 纯化 的 蛋白 质 中 几乎 没有 发 现 X His 标签 干扰 和 蛋白质 的 结构 或 功能 的 现象 。 若 干 种 带 有 6 x His 标签 的 蛋白 质 已 被 结晶 ， 它 们 的 结构 与 未 加 标签 的 同 种 蛋白 质 没有 不 同 [4] 。 因为 一 般 没 有 必要 在 蛋白 质 纯 化 后 除去 6x His 标签 ， 所 以 pQE 载体 不 包含 有 关 的 RAMU; 相反 ， 在 很 多 情况 下 ， 标 签 的 存在 是 大 有 好 处 的 一 一经 纯化 后 仍 带 着 6X His 标签 且 未 丧失 功能 的 蛋白 质 可 以 被 固定 在 Ni-NTA 树脂 上 以 便 进行 许多 下 游 工 作 ， 如 抗体 的 纯化 以 及 蛋白 质 相互 作 用 的 研究 等 5-7]。 大 多 数 蛋 白 酶 的 切割 位 点 由 带 电 符 很 强 的 氨基 酸 残 基 组 成 ， 如 果 重 组 蛋白 上 带 有 这 种 位 点 ， 可 能 会 给 下 游 应 用 带 来 问 题 ， 所 以 通常 必须 将 它 切除 (可 能 既 费 时 又 低 效 )。 当 然 ， 如 果 有 必要 在 纯化 后 将 6 x His 标 签 从 蛋白 质 上 切除 ， 可 以 在 克隆 过 程 中 引进 一 个 合适 的 蛋白 酶 作用 位 点 。 蛋 白 fi rTEV (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 带 有 一 个 6x His 标签 ， 很 容易 用 Ni NTA 柱 将 它 与 被 切割 的 蛋白 质 〈 以 及 6 x His 标签 片段 和 所 有 未 被 切 开 的 蛋白 质 分 子 ) - 道 被 分 离开 来 四] "Dap * 因为 序列 短小 ，6 x His 标签 也 能 方便 地 被 引入 各 种 各 样 的 其 他 表达 系统 。 在 原核 类 、 哺 乳 类 、 酵 母 、 杆 状 病毒 以 及 其 他 真 核 系统 中 ，6 x His 标签 都 能 很 好 地 发 挥 作用 。 六 个 组 所 酸 残 基 能 很 容易 地 通过 PCR、 诱 变 或 人 工 合成 小 片段 的 连接 而 被 引进 表达 结 构 中 ， 位 于 表达 产物 蛋 日 质 的 C 端 或 N 端 。 1.2 用 Ni-NTA 树脂 纯化 所 表达 的 蛋白 质 固定 化 金属 丈 合 物 亲 和 层 析 法 于 1975 年 首次 被 用 来 进行 蛋白 质 纯化 59 。 因为 简便 而 有 效 ， 这 种 技术 现 已 得 到 非常 广泛 的 应 用 。 在 开发 利用 氮 - 三 乙酸 (nitrilo-triacetic acid, NTA) 之 前 ， 人 们 用 配 位 体 亚 氨基 二 乙酸 (iminodiacetic acid, IDA) 与 金属 离子 如 Zn2+ 或 N2+ 形 成 的 整合 物 去 纯化 各 种 各 样 的 蛋白 质 和 多 肽 ol。 但 IDA 只 有 三 个 歼 合 基 团 ， 不 能 牢固 地 歼 住 这 些 具 有 六 个 配 位 位 置 的 金属 离子 。 因 而 当 用 具有 温和 鳌 合 作 用 的 蛋白 质 或 多 肽 上 柱 时 ， 或 在 洗 脱 待 纯 化 和 蛋白质 的 过 程 中 ， 金 属 离子 都 有 可 能 从 树脂 上 被 冲洗 下 来 ， 从 而 导致 低 结 合 容 量 、 低 收 率 以 及 产物 的 不 纯 。 NTA 正 是 为 了 解决 上 述 问题 而 被 开发 应 用 的 一 种 新 颖 的 丈 合 剂 (图 58.3)。NTA 能 与 Ni 形成 四 个 配 位 键 ( 剩 下 的 两 个 位 点 可 自由 地 与 6x His 标签 相互 作用 )， 因 而 ABE RMB ES BTU, A Ni-NTA 树脂 与 蛋白 质 的 结合 比 Ni-IDA 要 稳定 约 100 一 1000 fF; 使 它 可 以 将 含量 占 细胞 总 蛋白 1% 以 下 的 蛋白 质 一 步 纯 化 到 95% 以 上 的 Si EL?) 。 NH \ / O 4 \ | oe eens CH-CH,, yi / CH. CH, NH CHOH 人 全 人 六 NH / Bee /\ CH CH, CH, CH, CHO fe C 让 | at | CH-CH ,, CR 9 1/ NH O 图 58.3 相 邻 的 His 残 基 与 Ni-NTA 树脂 相 结合 的 模型 。 NTA 配 基 以 很 高 的 表面 浓度 附着 到 支持 体 如 Sepharose CL-6B (NTA 琼脂 糖 ) 或 硅 胶 上 即 得 到 Ni-NTA 树脂 。Ni-NTA 与 琼脂 糖 的 结合 容量 为 每 毫升 树脂 5 一 10 mg 带 标 7575 A Jet (BY 1 ml Ni-NTA 琼脂 糖 通常 能 结合 300 一 400 nmol 蛋白 质 ) 一 一 取决 于 蛋白 质 的 大 小 、 特 性 和 纯化 条 件 。Ni-NTA 琼脂 糖 非常 稳定 上 且 易 操作 ， 可 于 室温 保存 。 将 Ni-NTA 与 硅胶 相连 而 制 成 的 适当 规格 的 N-NTA 离心 柱 可 用 于 和 蛋白质 小 量 制备 。 每 个 离心 柱 能 从 细胞 裂解 液 中 纯化 出 多 达 100 pe 的 带 6x His 标签 的 蛋白 质 ， 整 个 过 程 只 需 - 357 + 15 min 即 可 完成 。 小 量 制备 蛋白 质 是 对 表达 与 纯化 条 件 的 快速 优化 ， 对 低 水 平 表达 的 蛋白 质 的 浓缩 以 利于 进行 凝 胶 电 泳 分 析 以 及 对 各 种 人 工 表达 结构 进行 功能 筛选 的 理想 途 径 。 在 N 端 或 C 端 带 有 6x His 标签 的 蛋白 质 与 N-NTA 树脂 之 间 的 亲和力 比 大 多 数 搞 体 和 抗原 、 酶 和 底 物 之 间 的 亲和力 强 得 多 。 所 以 ， 能 很 容易 地 在 比较 严格 的 条 件 下 洗 除 因 天 然 含有 相 邻 组 氨 酸 残 基 而 结合 到 树脂 上 的 杂质 蛋白 ， 而 不 影响 带 标签 的 蛋白 质 与 树 脂 的 结合 。 这 种 高 结合 常数 使 那些 在 样品 溶液 中 含量 非常 稀少 的 蛋白 质 ， 如 表达 水 平 很 低 或 分 泌 到 培养 基 中 的 蛋白 质 ， 也 能 有 效 地 与 树脂 结合 并 被 纯化 。 带 标签 的 蛋白 质 与 树脂 的 结合 不 要 求 蛋白 质 具 有 任何 功能 性 的 结构 ， 因 而 不 受 强 变 性 剂 如 6 mol/L 盐酸 且 (GuHCl) 或 8 moyL 尿素 的 影响 。 这 意味 着 与 那些 基于 抗 原 / 抗 体 或 酶 / 底 物 相 互 作用 的 纯化 系统 不 同 ，Ni-NTA 可 用 来 纯化 几乎 所 有 的 蛋 自 质 ， 甚至 那些 在 自然 〈 非 变性 ) 条 件 下 不 可 溶解 因而 须 在 纯化 之 前 进行 变性 处 理 的 蛋 自 质 (如 朴 水 性 蛋白 质 和 其 他 形成 包涵 体 的 蛋白 质 )。 此 外 ， 在 上 柱 缓冲 液 中 加 入 少量 的 pB- 斑 基 乙醇 ， 能 轻易 地 排除 那些 因 形 成 二 硫 键 而 可 能 被 一 起 纯化 的 已 . coxi TH EW BA 质 。 低 浓度 的 去 污 剂 ， 如 Triton X-100 和 Tween-20， 或 高 浓度 的 盐 ( 表 58.1) 也 不 会 影响 带 标 签 的 蛋白 质 与 树脂 的 结合 ， 因 此 可 以 彻底 清除 那些 因 非 特异 性 朴 水 作用 或 离子 间 相 互 作用 而 在 正常 条 件 下 可 能 会 被 一 起 纯化 的 蛋白 质 。 与 某 些 DNA 或 RNA 结合 蛋 白 连 在 一 起 的 核酸 也 能 被 有 效 地 清除 而 不 影响 带 标签 的 蛋白 质 的 回收 。 表 58.1 一 般 不 会 影响 6 x His 标签 与 Ni-NTA 树脂 相 结 合 的 一 些 试剂 6 mol/L GuHCl 8 mol/L 尿素 2% Triton® X-100 2% Tween-20 1% CHAPS 20 mmol/L 8 ~3t3& Z BF 50% Hit 30% CBE 2 mol/L NaCl 5 mmol/L CaCh 25 mmol/L Tris-HCl 20 mmol/L 咪唑 有 几 种 方法 可 用 于 带 标 签 的 蛋白 质 的 洗 脱 。 降 低 pH 值 能 使 组 氨 酸 残 基质 子 化 从 而 与 Ni-NTA 配 基 解 离 。 单 体 蛋白 质 一 般 可 于 pH 5.9 左右 洗 脱 ， 而 聚集 体 和 带 有 一 个 以 上 标签 的 重 日 质 能 于 pH 4.5 左右 洗 脱 。 通 过 咪唑 的 竞争 结合 也 能 将 带 标 签 的 蛋白 质 从 Ni-NTA 上 置换 下 来 而 得 以 洗 脱 。 还 可 以 用 低 浓 度 的 咪唑 选择 性 地 洗 除 与 树脂 结合 得 不 很 牢固 的 杂质 ， 或 者 在 过 柱 时 阻止 杂质 与 树脂 的 结合 2]。NiNTA 纯化 的 一 个 典型 结果 见 图 58.4. 298 * SRR Soe ne 图 58.4 从 细菌 中 纯化 DHFR (采用 变性 条 件 )。 泳 道 1: 未 经 诱导 的 细胞 的 总 蛋白 ; 泳 道 2; 经 诱导 的 细胞 的 总 蛋白 ; 泳 道 3: 过 柱 流出 液 ，pH 8.0; 泳 道 4: 洗 脱 组 分 ，pH 6.3; 泳 道 S: 纯化 的 洗 脱 蛋 白质 ，pH 5.9; 泳 道 M; 相对 分 子 质量 标准 。 1.3 ”一般 注 意 事项 本 章 介 绍 一 种 小 量 制备 蛋白 质 的 技术 ， 它 可 被 用 来 检验 蛋白 质 是 否 已 得 到 正确 的 表 达 ， 并 检验 在 非 变 性 条 件 和 变性 条 件 下 从 下 .coii 中 大 量 纯化 蛋白 质 的 方法 。 虽 然 每 种 方法 对 于 大 多 数 蛋 白质 都 是 非常 有 效 的 ， 但 若 使 用 除 正 . coli 以 外 的 其 他 表达 宿主 ， 则 可 能 须 对 这 些 方法 做 些 必要 的 修改 。 对 各 种 不 同 的 蛋白 质 分 别 优化 反应 条 件 ， 方 能 更 好 地 发 挥 6x His/Ni-NTA 系统 的 纯化 能 力 。 注 释 1~S 考虑 了 一 些 可 能 的 修改 方案 。 在 变性 条 件 下 纯化 的 蛋白 质 能 直接 用 于 抗体 诱导 ， 经 透析 处 理 后 能 在 溶液 中 重新 折 @; 也 可 以 使 之 在 Ni-NTA 柱 上 重新 折 释 ， 然 后 洗 脱 或 者 作为 固定 化 配 基 供 进一步 研究 之 用 (参见 注释 1)。 2. 材 料 各 种 pQE 载体 ，E.coi 宿主 M15 [pREP4] 和 SG13009 [pREP4], Ni-NTA -琼脂 糖 以 及 Ni-NTA 离心 柱 都 由 Qiagen 供应 ， 包 括 Qiagen GmbH (Hilden, Germany), Qia- gen Inc. (Chatsworth, CA), Qiagen Ltd. (Dorking, UK), Qiagen AG (Basel, Switzer- land) 以 及 它们 的 分 部 。 2.1 小 量 表达 培养 物 的 快速 筛 查 1) 培养 基 : 含 100 pg/ml 氨 茶 青霉素 和 25 wg/ml 卡 那 霉 素 的 LB 液体 培养 基 或 2x YT 或 高 浓度 培养 基 ， 用 于 培养 带 pQE 表达 系统 和 pREP 阻 过 质粒 的 M15 细胞 〈 参 见 + 359 - 注释 6). LB: 每 升 含 10 g MRR RARE AK. 5 g 细菌 培养 用 酵母 提取 物 和 5 g NaCl 2XYT: 每 升 含 16 g MAHAR A. 10 g 细菌 培养 用 酵母 提取 物 和 5 g NaCl. 高 浓度 培养 基 : 每 升 含 25 g MARK AREA. 15 g 细菌 培养 用 酵母 提取 物 和 5 g NaCl. 2) IPTG: 母液 浓度 1 mol/L. 3) 缓冲 液 A; 6 mol/L 盐酸 县 (GuHCl), 0.1 mol/L NaH,PO,, 0.01 mol/L Tris-HCl, 用 NaOH if pH (8 2 8.0. 4) 缓冲 液 B: 8 mol/L RX, 0.1 mol/L NaH)PO,, 0.01 mol/L Tris-HCl, 3 NaOH 调 pH 值 至 8.0。 为 避免 尿素 解 离 的 影响 ，pH 值 应 在 临 用 前 调节 。 缓冲 液 C: 成 分 与 缓冲 液 B 相同 ， 但 用 HCl 调 pH 值 至 6.3。 为 避免 尿素 解 离 的 影 响 ，pH 值 应 在 临 用 前 调节 。 缓冲 液 E: 成 分 与 缓冲 液 B 相同 ， 但 用 HCl 调 pH 值 至 4.$S。 为 避免 尿素 解 离 的 影 响 ，pH 值 应 在 临 用 前 调节 。 5 x SDS-PAGE 加 样 缓冲 液 : 15% B-RAECAB, 15% SDS，1.5% 溴 酚 蓝 和 50% 油 。 8) 12.5% 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 ， 含 0.2% Sps!?!, 5 ~ 6 7 ~~ 2.2 非 变 性 条 件 下 可 溶性 蛋白 质 的 纯化 9) 超声 处 理 缓冲 液 : 5$0 mmol/L NaH,PO,, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 咪唑 和 1 mmol/L PMSF, 10) 74 ABE: 10 mg/ml 贮存 液 。 11)RNase: 200 mg/ml 贮存 液 。 12)DNase: 60 mg/ml 贮存 液 。 13) 洗涤 缓冲 液 : 50 mmol/L NaH,PO,, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L 咪唑 和 1 mmol/L A EGS BER (phenylmethy! sulfonyl fluoride, PMSF). 14) 洗 脱 缓冲 液 : 50 mmol/L NaH,PO,, 300 mmol/L NaCl 和 250 mmol/L 咪唑 。 2.3 变性 条 件 下 不 溶性 蛋白 质 的 纯化 15) 绥 冲 液 D: 成 分 与 缓冲 液 B 相同 ， 但 用 HCl 调 pH 值 至 $5.9。 为 避免 尿素 解 离 的 影 响 ，pH 值 应 在 临 用 前 调节 。 ae 法 3.1 小 量 表 达 培 养 物 的 快速 筛 查 下 面 介 绍 的 是 一 种 在 小 量 培养 物 中 表达 蛋白 质 并 通过 用 Ni-NTA 离心 柱 纯化 带 - 360 - 6X His 标 签 的 蛋白 质 ， 以 便 对 表达 结果 进行 筛 查 的 基本 方法 。 纯 化 工作 在 变性 条 件 下 进 行 ， 因 此 任何 带 标签 的 蛋白 质 ， 不 论 它 在 细胞 内 的 溶解 度 如 何 ， 都 能 被 分 离 出 来 。 此 外 ， 带 6x His 标签 的 蛋白 质 经 变性 后 其 6x His 标签 完全 暴露 在 外 ， 从 而 更 容易 与 Ni- NTA 结合 ， 与 非 变性 条 件 下 的 纯化 相 比 ， 产 率 也 因此 得 到 提高 (参见 注释 1)。 用 缓冲 液 B 裂解 细胞 可 以 使 大 多 数 蛋 白质 和 包涵 体 溶 解 ， 因 此 可 直接 用 SDS-PAGE 对 裂解 液 进行 分 析 。 然 而 ， 如 果 细 胞 或 蛋白 质 不 能 在 缓冲 液 B 中 溶解 〈 例 如 高 度 世 水 性 蛋白 质 和 一 些 膜 蛋白 )， 就 必须 采用 缓冲 液 A, GuHCl 是 一 种 比 尿素 更 有 效 的 溶解 剂 ， 可 能 为 溶解 包涵 体 所 必需 。 此 外 还 可 能 有 必要 加 入 非 离子 型 去 污 剂 (在 SDS-PAGE 之 前 须 对 缓冲 液 A 裂解 样品 进行 处 理 ， 方 法 见 注释 7)。 如 果 蛋 白质 的 表达 水 平 很 高 (>10 mg/L, ASA RBA 8%), MIB eR AIK 缩 程度 2 不 应 超过 25 倍 ; 若 表达 水 平 较 低 (2 一 5 mg/L), WMA AT ik 50 倍 。 当 表达 水 平 低 于 1 mg/L 时 ， 有 裂解 液 须 经 浓缩 至 少 $0 倍 ， 以 保证 能 通过 考 马 斯 兰 染 色 检 测 蛋 白质 的 存在 〈 见 表 58.2 和 注释 8)。 表 58.2 用 Ni-NTA 离心 柱 纯化 蛋白 质 时 所 用 细胞 培养 物 的 合适 体积 的 一 些 例子 带 标签 蛋白 质 。 OK 培养 物体 积 600 品 裂 解 液 中 带 标 答 pine / (mg/L) /% /ml 的 蛋白 质 的 含量 /pg 变性 条 件 50 40 3 90 3X 10 8 10 60 10 x 2 1.6 25 30 25 X 0.5 0.4 50 15 50 x 0.1 0.08 100 6 100 x 非 变性 条 件 >1 =| 50 > 30 50 x 去 | <1 100 <60 100 x a 以 预期 的 表达 水 平和 特定 的 纯化 条 件 下 制备 1 ml AH IR ACHE 有 些 蛋 白质 可 能 在 细胞 的 收获 、 裂 解 甚至 诱导 后 的 生长 期 间 发 生 降 解 。 在 这 种 情况 下 ， 最 好 加 入 PMSF (0.1~1 mmol/L) 或 其 他 蛋白 酶 抑制 剂 。 不 过 在 细胞 生长 期 间 用 PMSF 处 理 可 能 会 导致 表达 水 平 的 降低 。 所 有 培养 基 都 应 含 100 wg/ml 氨 苯 青霉素 和 25 pe/ml 卡 那 霉 素 。 1) 将 一 个 新 鲜 的 带 pQE 表达 质粒 的 M15 [pREP4] 菌落 接种 到 10 ml 含 100 pg/ml A* 青霉素 和 25 pe/ml 卡 那 霉 素 的 LB 培养 液 中 ，37 培养 过 夜 。 2) 将 200 由 未 经 诱导 的 过 夜 培养 物 稀释 到 10 ml & 100 pg/ml 氨 葵 青霉素 和 25 pg /ml 卡 那 霉 素 的 新 鲜 LB 培养 液 中 (1:50 稀释 )。377 剧烈 振 功 培 养 至 Aso 值 达到 0.7 一 0.9 (参见 注释 8 和 表 2)。 1) 指 诱导 培养 物体 积 对 裂解 液体 积 的 比值 ， 下 同 。 一 一 译 者 注 ei 3) MA IPTG 至 终 浓 度 1 mmol/L, RAF 37C 继续 培养 4 h 〈 参 见 注释 9)。 4) 培养 物 于 4 000 g 离心 10 min， 弃 上 清 液 ， 收 获 细 胞 。 5) 用 0.1 倍 体积 0 的 缓冲 液 B 悬浮 细胞 。 轻 微 涡 旋 振 荡 ， 或 者 于 室温 搅拌 1 h AH 解 。 注 意 避 免 泡 沫 (参见 注释 10)。 6) 裂解 物 以 10 000 g 室温 离心 10 min 以 除去 细胞 碎片 。 将 上 清 液 转移 到 一 只 新 管 中 。 保留 沉淀 物 和 20 ul SRM HE SDS-PAGE 分 析 〈 参 见 注释 11)。 7) 用 600 pl Serb HE B BEE Ni-NTA 离心 柱 。 以 和 700 g (42000 r/min) 离心 2 min (参见 注释 12 )。 8) 将 多 达 600 pl SH 6 x His 标签 的 蛋白 质 的 裂解 液 上 清 液 加 到 经 预 平 衡 过 的 NENTA 离心 柱 上 。 以 和 受 700 g 离心 2 min (参见 注释 13)。 保 留 过 柱 流出 液 以 供 SDS-PAGE 分 析 。 9) 用 2x600 pl SMR CHER Ni-NTA BOE. W<700 g 离心 2 min。 保 留 过 杜 流出 液 以 供 SDS-PAGE 分 析 (参见 注释 14). 10) 用 2x 200 岂 缓 冲 液 下 洗 脱 蛋白 质 。 以 2000 r/min 离心 2 min， 分 管 收 集 两 次 洗 脱 物 (参见 注释 15). 11) 从 所 有 各 种 组 分 中 分 别 取 出 20 由 样品 ， 各 加 5 pl SX PAGE 加 样 缓冲 液 〈 参 见 注释 7), F95T MP7 min。 通 过 12.5% 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 及 考 马 斯 蓝 染 色 分 析 样 品 。 3.2 在 非 变性 条 件 下 可 溶性 蛋白 质 的 大 量 纯 化 这 一 方法 利用 Ni-NTA 琼脂 糖 纯化 多 达 5 一 10 mg 的 可 溶性 带 6 x His MEN BA 质 。 在 用 非 变 性 条 件 纯化 蛋白 质 之 前 ， 重 要 的 是 应 该 先 和 弄 清 目标 蛋白质 有 多 少 溶解 在 细 胞 质 中 ， 有 多 少 存在 于 不 可 溶 的 沉淀 物 或 包涵 体 中 。 因 此 ， 最 好 在 变性 条 件 下 同时 对 蛋 白质 进行 纯化 (第 3.3 节 )。 待 纯化 蛋白 质 的 量 取 决 于 它 的 表达 水 平 。 这 一 方法 适用 于 表达 水 平 在 1 一 5 mg/L 间 的 情况 。 为 了 得 到 最 好 的 结果 ， 应 根据 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 的 表达 水 平 对 此 法 加 以 适当 的 放大 或 缩小 。 在 过 柱 、 洗 涤 和 洗 脱 的 过 程 中 液 流 速度 都 不 应 超过 1 ml/min, 1) 按 第 3.1 节 所 列 的 方法 培养 和 诱导 1 L 培养 物 。 2) 于 4000 g 离心 20 min 收获 细胞 。 用 2~5 体积 /g 湿 重 2) 的 超声 处 理 缓冲 液 重新 悬浮 EW (BREF 16)。 在 干冰 /乙醇 中 冷冻 (或 置 - 20C 过 夜 )， 然 后 于 冷水 中 融 化 ; 或 者 加 入 溶菌 酶 至 1 mg/ml， 置 冰 上 30 min. 3) 在 冰 上 进行 超声 处 理 (1 min 处 理 /1 min 冷却 /200 一 300 W)， 并 通过 测定 As 吸收 值 检查 核酸 释放 程度 以 监测 细胞 破裂 情况 ， 直 至 Ag) UGA BIB KIA. 4) 如 果 裂 解 液 非常 黏稠 ， 可 加 入 RNase A 至 10 ug/ml 和 DNase I # 5 pg/ml, vk LO~15 min; 或 者 使 裂解 液 反复 几 次 通过 小 孔径 注射 针 。 然 后 以 >10 000 g 40 中 离 心 20 min 以 收集 上 清 液 。 保 留 20 ul EYL Ht SDS-PAGE 分 析 。 1) 诱导 培养 物体 积 的 1/10， 这 里 为 1 ml， 浓 缩 倍数 为 10 倍 。 2) 此 种 表示 方式 很 不 明确 ， 似 应 作 “2 一 5 ml/g ER” 译 者 注 译 者 注 302 °* 5) 加 入 2 ml 预先 在 超声 处 理 缓冲 液 中 平衡 过 的 S0%Ni-NTA 琼脂 糖 匀 浆 ， 在 冰 上 搅拌 60 min (参见 注释 17)。 6) 将 上 述 裂 解 液 和 Ni-NTA 琼脂 糖 的 混合 物 装 柱 ， 收 集 过 柱 流出 液 供 SDS-PAGE 分 析 。 尽 可 能 于 4Y 操作 。 7) 用 8 ml 超声 处 理 缓冲 液 洗涤 ， 或 直到 流出 液 的 Azso 吸 收 值 低 于 0.01 (人 参见 注释 18)。 收 集 各 洗涤 组 分 供 SDS-PAGE 分 析 。 8) 用 2x8 ml 洗涤 缓冲 液 洗 涤 ， 或 直到 流出 液 的 Azso 吸 收 值 低 于 0.01. 9) 用 6 ml 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 蛋 白质 〈 参 见 注释 19)。 按 500 ml/ 管 收集 洗 脱 组 分 ， 各 取 5 pl 样品 进行 SDS-PAGE 分 析 (参见 注释 7、20 和 21)。 3.3 在 变性 条 件 下 不 溶性 重 白 质 的 大 量 纯化 这 一 方法 利用 Ni-NTA 琼脂 糖 纯化 多 达 5 一 10 mg 的 带 6x His 标签 的 蛋白 质 。 用 变 性 条 件 纯化 蛋白 质 通常 比 用 非 变性 条 件 较为 有 效 ， 对 那些 不 经 变性 就 无 法 溶解 的 蛋 白 质 来 说 更 属 必 要 。 待 纯 化 蛋白 质 的 量 取决 于 它 的 表达 水 平 。 这 一 方法 适用 于 表达 水 平 大 约 为 10 mg/L 的 情况 。 为 了 得 到 最 好 的 结果 ， 应 根据 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 的 表达 水 平 对 此 法 加 以 适当 的 放大 或 缩小 。 在 过 柱 、 洗 涤 和 洗 脱 的 过 程 中 液 流 速度 都 不 应 超过 1 ml/min. 1) 按 第 3.1 节 给 出 的 方法 培养 和 诱导 500 ml 培养 物 。 以 4 000 g 离心 10 min 收获 细 胞 。 可 置 -707 保存 。 2) 将 细胞 融化 15 min， 然 后 用 5 ml/g ( 湿 重 ) 的 缓冲 液 B 重 新 悬浮 (SEF 10 和 22)。 在 室温 中 搅拌 1 h。 以 10 000 g 在 室温 将 裂解 物 离心 153 min。 收 集 上 清 液 并 留 出 20 pl # SDS -PAGE 分 析 (参见 注释 18). 3) 加 入 2 ml 预先 在 缓冲 液 B 中 平衡 过 的 S0%NiLNTA 琼脂 糖 匀 浆 。 室 温 搅拌 45 min, 然后 小 心 装 柱 。 收 集 过 柱 流出 液 供 SDS-PAGE 分 析 。 4) 用 10 ml RAM B 洗 涤 。 若 有 必要 ， 则 进一步 洗涤 直到 流出 液 的 Azso 吸 收 值 低 于 0.01。 5) 用 6 ml 缓冲 液 C 洗 涤 ， 或 直到 流出 液 的 Azso 吸 收 值 低 于 0.01。 6) 用 10 ml 缓冲 液 下 洗 脱 蛋白 质 (BOLE 23). 500 局 / 管 收 集 洗 脱 组 分 ， 用 SDS- PAGE 分 析 样 品 〈 参 见 注释 7、20 和 21). 在 纯化 过 程 中 可 能 会 遇 到 的 问题 及 其 解决 方法 见 注 释 23 一 28。 4. 注 es (1) 很 多 香 白 质 在 表达 过 程 中 一 直 处 于 溶解 状态 ， 在 非 变 性 条 件 下 能 以 天 然 形 式 在 Ni NTA 柱 上 得 到 纯化 ， 有 些 蛋 白质 在 表达 后 会 形成 不 溶性 沉淀 。 但 几乎 所 有 的 这 些 55 ARAB AE TE 6 mol/L 盐酸 县 中 溶解 。 因 此 ，6 x His 标签 /Ni-NTA 系统 可 用 于 所 有 重组 恒 日 质 的 纯化 。 纯 化 时 采用 变性 条 件 还 是 非 变 性 条 件 ， 取 决 于 目标 蛋白 质 的 溶 ~ 8 (2 (3 (4 ~~ ~ ~~ 解 度 和 它 所 处 的 位 置 以 及 与 6x His 标签 的 接触 程度 。 对 表达 后 溶解 在 细胞 质 中 或 分 泌 到 外 周 质 间 隙 中 的 蛋白 质 ， 一 般 可 用 非 变 性 条 件 进行 纯化 〈 但 请 注意 后 面 提 到 的 例外 )。 如 果 目 标 蛋 白质 是 不 溶性 的 或 存在 于 包涵 体 中 ， 一 般 须 在 纯化 前 进行 变 性 处 理 使 它 溶解 。 不 过 加 入 去 污 剂 有 时 也 能 使 某 些 蛋 白质 溶解 ; 所 以 如 果 有 必要 保 持 蛋 白质 的 天 然 构 型 ， 则 值得 尝试 各 种 不 同 的 促 溶 技术 。 很 多 形成 包涵 体 的 蛋白 质 往往 在 细胞 质 中 也 存在 着 一 定 的 量 ， 因 而 也 能 有 效 地 在 Ni-NTA 柱 上 以 天 然 状态 被 纯化 ， 即 使 得 率 非 常 低 。 在 某 些 罕见 的 情况 下 ，6 x His 标签 被 处 于 天 然 状态 下 的 蛋白 质 的 三 级 结构 隐 藏 起 来 。 这 时 ， 可 溶性 蛋白 质 也 须 经 变性 才能 结合 到 Ni-NTA WARE. MRA 进行 变性 处 理 ， 将 6x His 标签 移 到 蛋白 质 的 另 一 未 端 通常 也 能 解决 问题 。 用 变性 条 件 纯化 的 蛋白 质 或 者 可 直接 投入 应 用 ， 或 者 在 有 还 原型 及 氧化 型 谷 胱 甘 肽 存在 的 情况 下 ， 在 稀 的 溶液 中 经 透析 除 掉 变 性 剂 而 使 它 重 新 折 寿 314]。 此 外 ， 还 有 可 能 使 蛋白 质 在 Ni-NTA 柱 上 发 生 复 性 52,15,16]。 利用 Ni-NTA 树脂 可 以 大 批量 纯化 蛋白 质 ， 也 可 以 在 离心 柱 上 进行 小 量 纯化 。 批 量 纯化 工艺 要 求 在 溶液 中 进行 目标 蛋白 质 和 NiNTA 树脂 的 结合 ， 然 后 小 心 个 掉 上 清 液 并 将 蛋 昌 质 /树脂 复合 体 装 柱 以 便 进行 洗涤 和 洗 脱 。 这 样 做 能 使 蛋白 质 以 更 高 的 效率 与 树脂 结合 ， 尤 其 是 在 非 变性 条 件 下 ， 而 且 可 以 减少 加 到 柱 上 的 细胞 碎片 的 量 。 在 小 量 的 柱 纯 化 法 中 ， 将 细胞 裂解 液 慢 慢 加 到 装 好 并 经 过 平衡 的 NENTA 离心 柱 上 。 背景 污染 来 自序 列 中 含有 毗邻 组 氨 酸 因而 与 树脂 有 一 定 亲 和 力 的 蛋白 质 ， 来 自 以 二 硫 键 与 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 相 连 而 被 连带 纯化 的 蛋白 质 ， 来 自 通过 非特 异性 相 互 作用 与 带 标签 的 蛋白 质 相 连 的 蛋白 质 以 及 与 带 标签 的 蛋白 质 结 合 在 一 起 的 核酸 等 。 用 适当 的 条 件 洗涤 树脂 ， 可 以 轻易 地 排除 所 有 这 些 污 染 物 。 一 级 结构 中 含有 毗 邻 组 氨 酸 的 蛋白 质 在 细菌 中 并 不 多 见 ， 但 在 哺乳 类 细胞 中 却 屡见不鲜 。 这 些 蛋白 质 与 树脂 的 结合 比 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 要 弱 得 多 ， 因 而 即使 其 含量 远 比 后 者 高 ， 也 很 容易 被 洗 除 5 〈 另 请 参考 注释 4)。 在 上 柱 缓冲 液 中 加 入 10~20 mmol/L 的 B -和 殖 基 乙 醇 可 以 减少 由 交 联 蛋白 质 引起 的 污染 。 不 要 使 用 >1 mmol/L 的 DTT, A 为 高 浓度 的 DTT 可 能 还 原 Ni2+ 离子 。 因 非 特异 性 相互 作用 而 与 带 标签 的 蛋白 质 或 树脂 相连 的 蛋白 质 以 及 伴 同 纯化 的 核酸 都 可 以 通过 以 下 几 种 方法 清除 ; 用 低 浓 度 的 去 污 剂 (<2% Triton X-100 或 0.5% 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 ) 洗涤 ; 增加 盐 浓度 直至 2 mol/L NaCl; 或 者 加 入 30%Z 醇 或 50% 甘油 以 减弱 疏水 性 相互 作用 。 对 不 同 的 蛋白 质 应 通过 实验 确定 上 述 各 种 试剂 的 最 佳 浓度 。 污染 蛋白 质 的 洗 除 和 带 标签 的 蛋白 质 的 洗 脱 可 以 通过 降低 pH 值 使 组 氨 酸 残 基质 子 化 ， 或 加 入 与 带 标签 的 蛋白 质 竞争 NLNTA 树脂 结合 位 点 的 咪唑 来 实现 。 虽 然 两 种 方法 同样 有 效 ， 但 第 二 种 方法 相对 来 说 比较 温和 ; 当 降 低 pH 值 可 能 会 损害 蛋白 质 (例如 四 聚 体 醛 缩 酶 ) 时 ， 最 好 采用 咪唑 竞争 法 3]。 当 使 用 细菌 表达 系统 时 ， 一 般 没 有 必要 用 非常 严格 的 条 件 去 洗涤 结合 的 蛋白 质 ， 因 为 蛋白 质 的 表达 水 平 很 高 而 背景 污染 较 少 。 不 过 对 哺乳 类 系统 ， 或 者 当 在 非 ” 364 - (5 (6 @ (8 (9 Se SS ) ) 变性 条 件 下 会 有 很 多 的 毗邻 组 氨 酸 残 基 暴 露 在 外 而 易 与 树脂 结合 时 ， 可 能 就 有 必要 显著 地 提高 洗涤 的 严格 程度 。 这 可 通过 逐渐 降低 洗涤 缓冲 液 的 pH AMR eK 唑 的 浓度 来 实现 。 在 洗 脱 开始 前 不 同 的 和 蛋白质 所 能 容忍 的 pH 值 和 咪唑 浓度 也 略 有 不 同 。 当 带 标签 的 蛋白 质 含量 非 常 低 而 背景 一 般 较 高 的 情况 下 〈 如 在 哺乳 类 表达 系统 中 )， 最 好 在 稍 低 的 pH 值 或 有 低 浓 度 味 唑 存在 的 条 件 下 使 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 与 树脂 结合 ， 在 这 样 的 环境 中 ， 背 景 蛋白 质 无 法 竞争 结合 位 点 。 同 样 道 理 ， 如 果 带 标签 的 蛋白 质 的 量 与 所 用 树脂 的 结合 容量 配合 得 恰到好处 ， 换 名 话说 在 尽量 减少 树 脂 的 用 量 的 情况 下 ， 也 能 得 到 最 好 的 纯化 效果 (H. Stunnenberg， 私 人 通讯 )。 因 为 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 与 N-NTA 树脂 的 亲和力 较 背 景 蛋 白质 为 高 ， 它 会 占据 所 有 可 能 结合 的 位 点 而 使 只 有 极 少量 的 背景 蛋白 质 能 在 树脂 上 存留 。 不 要 在 树脂 上 使 用 强 还 原 剂 如 DTT 或 DTE， 因 为 它们 会 还 原 Ni 六 离子 而 使 它 从 树 虽 上 洗 脱 下 来 。 在 大 多 数 情况 下 ， 可 以 使 用 高 至 20 mmol/L 的 B- 玉 基 乙醇 ， 但 如 果 蛋 和 白质 本 身 也 具有 强 还 原 性 ， 即 使 这 样 低 的 浓度 也 偶尔 会 带 来 问题 。 应 小 心 使 用 任何 还 原 性 物质 ， 要 是 拿 不 准 ， 可 以 先 在 小 量 NENTA 树脂 上 检测 它们 的 效应 。 强 BS RLSM NTA 树脂 上 夺 走 Ni， 因 此 不 要 使 用 EDTA、EGTA SKE RBS 剂 。( 不 过 也 有 一 些 在 缓冲 液 中 使 用 1 mmol/L EDTA 的 成 功 的 例子 。) 我 们 建议 同时 使 用 所 有 三 种 培养 基 来 试行 表达 ， 并 在 加 诱导 物 后 记录 表达 的 时 间 进 程 。 在 不 同 的 培养 基 中 表达 不 同 的 时 间 ， 表 达 水 平 往往 有 显著 的 差别 。 在 微型 凝 胺 上， 每 一 组 分 取样 $ 岂 加 等 体积 的 、 含 或 不 含 3%8 - 琉 基 乙醇 的 SDS- PAGE 加 样 缓冲 液 进行 分 析 一 般 就 足够 了 。 含 GuHCI 的 组 分 会 与 SDS 发 生 沉 演 ， 所 以 在 电泳 前 必须 对 它们 先行 稀释 (1:6) 后 透析 处 理 ; 或 者 通过 TCA 沉淀 使 它 与 GuHCl 分离 。 方 法 是 : 将 样品 稀释 到 100 站， 加 等 体积 10% 的 TCA， 置 冰 上 20 min， 离 心 13 min， 用 100 则 冰镇 乙醇 洗涤 沉淀 ， 干 燥 后 用 加 样 缓冲 液 溶解 。 如 果 样 品 中 存在 哪怕 极 微量 的 GuHCI， 也 应 在 95°C BAT min 后 立即 上 样 。 表达 培养 物 所 需 的 体积 主要 取决 于 表达 水 平 及 表达 产物 在 细胞 中 的 位 置 和 纯化 条 件 。 纯 化 低 水 平 表达 的 蛋白 质 至 少 需要 30 ml 细胞 培养 物 。 加 到 Ni-NTA 离心 柱 上 的 细胞 裂解 液 应 经 50 倍 浓缩 以 增加 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 的 含量 和 溶液 的 黏度 从 而 提高 得 率 。 纯 化 高 水 平 表达 的 蛋白 质 ， 尤 其 是 使 用 变性 条 件 时 情况 有 所 不 同 〈 见 # $8.2)。 对 于 很 高 水 平 表达 的 蛋白 质 (>10 mg/L， 相 当 于 表达 产物 约 占 细胞 总 蛋白 的 8%)， 制 备 细胞 裂解 液 时 的 浓缩 倍数 不 应 超过 10 RP, RIK EA 10 mg/EL 时 ， 在 用 缓冲 液 B 制 备 的 、 经 10 RSW 600 岂 细 胞 裂解 液 中 大 约 含 有 60 pg 带 6x His 标签 的 蛋白 质 。 对 于 以 较 低 水 平 表达 的 蛋白 质 (2~5 mg/L)， 细 胞 裂解 液 应 经 25 TEU SR (600 pl 裂解 液 中 含 30 一 75.wg 蛋白 质 ) JADE Ni-NTA 离心 柱 上 。 者 表达 水 平 低 于 1 mg/EL， 细 胞 裂解 液 应 经 50 ~ 100 倍 浓缩 。 如 果 表 达 产 物 很 容易 降解 ， 则 应 缩短 诱导 培养 过 程 并 确定 最 佳 表 达 时 间 。 在 某 些 情 况 下 ， 可 在 诱导 后 加 入 0.1 一 1 mmol/L PMSF 以 抑制 对 PMSF 敏感 的 蛋白 酶 。 不 1) 这 一 句 与 第 3.1 节 中 有 关 的 说 法 不 一 致 。 一 一 译 者 注 ~ G9, = 过 PMSF 处 理会 导致 表达 水 平 的 降低 。 (10) 完 全 裂解 后 溶液 应 变 成 半 透 明 状 。 用 缓冲 液 B 裂解 细胞 比较 好 ， 这 样 ， 细 胞 裂解 液 可 以 直接 用 于 SDS-PAGE 分 析 。 如 果 细 胞 或 蛋白 质 在 缓冲 液 B 中 不 能 溶解 ， 则 须 采 用 缓冲 液 A。 在 SDS-PAGE 上 样 前 用 缓冲 液 A 处 理 样品 的 方法 见 注释 7。 (11) 所 有 可 溶性 蛋白 质 都 在 上 清 液 中 。 不 溶性 蛋白 质 则 形成 沉淀 。 应 保留 沉淀 物 并 用 SDS-PAGE 进行 分 析 。 (12) 将 Ni-NTA 离心 柱 离心 时 ， 转 速 不 要 超过 2000 r/min ( 约 700 g)， 这 一 点 很 重要 。 更 高 的 转速 会 使 NTA 硅胶 颗粒 被 压 紧 ， 导 致 高 流速 GN) 以 及 结合 效率 降低 。 (13) 当 结合 过 程 以 较 低 的 动力 学 水 平 进 行 时 ， 例 如 在 非 变 性 条 件 下 ， 建 议 将 过 柱 流出 液 再 次 上 柱 。 (14) 即 使 开始 时 采用 缓冲 液 A 溶解 蛋 白质 ， 仍 用 缓冲 液 C 洗 涤 NiNTA 离心 柱 。 大 多 数 蛋白 质 可 在 缓冲 液 C 中 保持 溶解 状态 ， 有 时 可 能 没有 必要 重复 缓冲 液 C 洗涤 步 又 。 为 获得 高 度 纯净 的 蛋白 质 所 需 的 洗涤 次 数 主要 取决 于 带 6 x His HEN SAM 的 表达 水 平 。 表 达 水 平 较 高 时 ， 两 次 洗涤 通常 就 足以 排除 污染 。 如 果 表 达 水 平 很 低 ， 或 裂解 液 浓缩 程度 很 高 ， 则 可 能 需要 三 次 洗涤 以 保证 高 纯度 。 (15) 大 部 分 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 (>80%) 会 被 洗 脱 到 最 初 的 200 pl VER, 别 是 在 待 纯化 蛋白 质 的 分 子 质量 小 于 30 kDa 时 。 剩 下 部 分 会 被 洗 脱 到 第 二 个 200 岂 洗 脱 液 中 。 如 果 不 希 望 得 到 低 浓度 的 蛋白 质 溶液 ， 就 不 要 合并 洗 脱 液 ， 或 者 按 每 管 100 一 150 pl 收集 洗 脱 物 以 提高 蛋白 质 的 浓度 。 (16) 超 声 处 理 、 洗 涤 及 洗 脱 缓冲 液 的 成 分 可 加 修改 以 适应 特殊 用 途 ， 例 如 ， 在 加 入 低 浓 度 的 咪唑 、1% ~2% Tween, 5~10 mmol/L 8 ~3t3£ BE. 1 mmol/L PMSF 或 者 提 高 NaCl 或 甘油 的 浓度 的 情况 下 。 (17) 如 果 在 这 些 条 件 下 带 6x His 标签 的 蛋白 质 不 能 与 树脂 结合 ， 则 应 将 超声 处 理 缓冲 液 中 咪唑 的 浓度 减少 到 1 一 5 mmol/L. BRE 1 PRK “BR” PEMA. (18) 变 色 的 或 不 纯净 的 试剂 会 影响 光 密 度 读数 ， 咪 唑 在 280 nm 处 也 有 光 吸 收 。 (19) 有 多 种 不 同 的 方法 可 用 来 洗 脱 蛋白 质 。 如 果 合 适 或 愿意 ， 可 通过 调节 pH 值 从 8.0 FREE 4.5 来 洗 脱 ，pH 值 可 以 连续 地 或 逐 级 下 降 。 大 多 数 蛋白 质 能 用 pH 4.5 的 组 冲 液 有 效 地 洗 脱 ， 虽 然 有 许多 (特别 是 单 体 蛋 白质 ) 可 以 在 更 高 的 pH 值 下 洗 脱 。 (20) 如 果 可 能 ， 在 洗 脱 过 程 中 随时 测定 洗 脱 物 的 As 值 ， 把 几 管 的 量 合 在 一 起 收集 而 不 WTAE WB (21) £ SDS-PAGE 之 前 不 要 煮沸 处 理 含 有 咪唑 的 样品 ， 否 则 会 使 对 酸 不 稳定 的 键 发 生 水 解 。 可 将 样品 于 37 加 热 几 分 钟 ， 然 后 立即 上 样 。 (22) 纯 化 过 程 于 8 mol/L 尿素 中 进行 ， 因 为 6 mol/L 盐酸 肌 会 与 SDS 发 生 沉淀 从 而 给 样 品 的 SDS-PAGE 分 析 带 来 麻烦 。 除 这 一 点 之 外 ， 不 论 单独 使 用 尿素 或 盐酸 肌 或 二 者 并 用 ， 对 纯化 过 程 的 其 他 任何 环节 都 没有 影响 。 (23) 可 供 选择 的 洗 脱 方法 有 多 种 。 单 体 通常 可 用 缓冲 液 D 洗 脱 ， 而 多 聚 体 、 聚 集体 和 带 有 两 个 6 x His 标签 的 蛋白 质 一 般 可 用 缓冲 液 E 洗 脱 。 洗 脱 也 可 以 于 pH 值 在 4.0 一 6.5 范 围 内 变化 的 8 mol/L 尿素 或 0.1 mol/L NaH,PO, 或 0.01 mol/L Tris-HCl 中 进行 。 如 果 和 希望 在 较 高 的 pH 值 中 洗 脱 ， 则 对 大 多 数 蛋白 质 来 说 可 用 含有 5 366 ，。 100~250 mmol/LOKMEN RH HK Bo (24) 如 果 表 达 水 平 过 高 ， 采 用 下 述 方法 中 的 一 种 或 多 种 可 以 解决 问题 : 减少 IPTG 用 量 (0.01 mmol/L) 能 使 表达 水 平 降 低 10~ 15 倍 ; 缩短 诱导 培养 时 间 和 /或 降低 培养 温度 ; 在 较 高 的 细胞 浓度 (0.8 Asoo) 下 施加 诱导 ; 开始 时 用 非 变性 方法 ， 然 后 采 用 变性 方法 纯化 剩 留 在 未 被 溶解 的 细胞 碎片 和 包涵 体 中 的 蛋白 质 。 (25) 当 纯化 过 程 中 出 现 沉 淀 现象 时 ， 检 查 是 否 因 带 标签 的 蛋白 质 形 成 聚集 体 所 引起 ， 并 尝试 加 入 Tween 或 Triton (可 高 至 2%) 或 10 一 20 mmol/L 8 - 琉 基 乙醇 ， 并 检查 是 否 须要 加 入 稳定 辅助 因子 (例如 Mg )。 确 保 盐 浓度 至 少 达 到 300 mmol/L Na- Cl。 采 用 变性 方法 进行 纯化 时 应 检查 室温 (>20? )。 (26) 如 果 6x His 标签 与 N-NTA 树脂 的 结合 不 够 充分 ， 则 应 检查 体系 中 是 否 存在 歼 合 剂 (EDTA/VEGTA)、 高 浓度 的 供电 子 基 团 (NH4)、 离 子 型 去 污 剂 以 及 其 他 成 分 如 ” 甘氨酸、 组 胺 或 锌 等 ， 并 用 新 的 缓冲 液 重复 结合 步骤 。 如 果 要 从 培养 基 中 提纯 蛋白 质 ， 可 能 必须 先 经 透析 除去 上 述 物质 ， 然 后 再 进行 结合 。 若 6x His 标签 隐藏 在 蛋 白质 天 然 结构 的 内 部 ， 可 向 用 于 非 变性 条 件 下 样品 制备 的 缓冲 液 中 加 入 低 浓 度 的 尿 素 或 去 污 剂 以 增加 其 暴露 程度 。 缓 慢 的 结合 动力 学 可 通过 延长 样品 与 NTA 接触 的 ”时 间 以 取得 补偿 ， 这 在 批量 纯化 条 件 下 更 容易 做 到 。 此 外 ， 可 以 尝试 将 6x His 标 签 放 到 蛋白 质 的 另 一 末端 ， 或 采用 彻底 的 变性 条 件 (Se YK A 加 10 mmol/L 8B -和 琉 基 ZR). HERE AAA N -离子 的 试剂 。 (27) 根 据 带 6 x His 标签 的 蛋白 质 的 表达 水 平 调节 Ni-NTA 琼脂 糖 的 用 量 可 以 减少 背景 结合 。 尽 量 使 树脂 的 结合 容量 不 超过 带 标签 的 蛋白 质量 的 2 一 $ 倍 。 (28) 部 分 地 被 隐藏 在 天 然 蛋白 质 结构 内 的 6 X His 标签 会 导致 蛋白 质 过 早 地 被 洗 脱 。 (29) 不 要 用 SDS-PAGE 测定 重组 产物 的 分 子 质 量 。 添 加 或 变换 几 个 氨基 酸 会 使 蛋 日 质 条 带 位 置 发 生 移动 而 使 测 得 的 分 子 质 量 可 能 比 实际 分 子 质量 高 出 几 千 道 尔 顿 。 所 以 不 能 用 这 种 方法 测定 带 6x His 标签 的 蛋白 质 的 分 子 质 量 。 参考 文 献 1. Stiiber, D., Matile, H., and Garotta, G. (1990) System for high-level production in Escherichia coli and rapid purification of recombinant proteins: application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis, in Immunological Methods, vol. IV (Lefkovits, I. and Pernis, B., eds.), Academic, New York, pp. 121—152. . Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R. A., Nordheim, A., and Stunnenberg, H. G. (1991) Rapid and efficient purification of native histidine- tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976. Dobeli, H.,Trecziak, A., Gillessen, D., Matile, H., Srivastava, I. K., Perrin, L. H., Jakob, P. E., and Certa, U. (1990) Expression, purification, biochemical character- ization and inhibition of recombinant Plasmodium falciparum aldolase. Mol. Bio- chem. Parasitol. 41, 259-268. i) Ww ee s© 10. 11. - 36 _ Lindner, P., Guth, B., Wilfing, C., Krebber, C., Steipe, B., Miller, F., and Pliickthun, A. (1992) Purification of native proteins form the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli using IMAC and histidine tails: a comparison of proteins and protocols. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4(2), 41-SS. : . Gu, J., et. al. (1994) Recombinant proteins attached to a Ni-NTA column: use in affinity purification of antibodies. BioTechniques 17(2), 257-262. . Gamer, J., Bujard, H., and Bukau, B. (1992) Physical interaction between heat- shock proteins DnaK, DnaJ, and GpE and the bacterial heat-shock transcription factor a32. Cell 69, 833-842. Sporeno, E., Paonessa, G., Salvati, A. L., Graziani, R., Delmastro, P., Ciliberto, G., and Toniatti, C. (1994) Oncostatin M binds directly to gp130 and behaves as inter- leukin-6 antagonist on a cell line expressing gp130 but lacking functional oncostatin M receptors. J. Biol Chem. 269(15), 10,991—10,995. Polayes, D., Goldstein, A., Ward, G., and Hughes, A. (1994) TEV protease, recombinant: a site-specific protease for cleavage of affinity tags from expressed proteins. Focus (Life Technologies, Inc.) 16(1), 2—5. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., and Belfrage, G. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 598,599. Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, \—7. Hochuli, E., Dobeli, H., and Schacher, A. (1987) New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighboring histidine residues. J. Chromatog. 411, 177-184. . Takacs, B. J. (1979) in Immunological Methods, vol. | (Lefkovits, I. and Pernis, B., eds.), Academic, New York, p. 81. . Thanos, D. and Maniatis, T. (1992) The high mobility group protein HMG I(Y) is required for NF-«B-dependent virus induction of the human IFN-B gene. Cell 71, 623-635. . Fischer, B., Perry, B., Summer, I., and Goodenough, P. (1992) A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coli inclusion bodies. Prot. Eng. 5(6), 593-596. . Urban, S. and Hildt, E. (1994) Use of Ni-NTA resin for isolation of cellular pro- teins binding to HBV transactivator proteins HBx and MHB“. QOJAGEN News 1, 14-16. © . Sinha, D.., et. al. (1994) Ligand binding assays with recombinant proteins refolded on an affinity matrix. BioTechniques 17(3), 509-514. P #48 4) AF A te HAA AT $0003528 ing sit | 58.17425057 000027850 406 00 _DNA 及 RNA 基 本 实验 技 E 人 (Q-1047. 0102) ISBN 7-03-009186-8 30 atl 86 —. £ th: 47.00 < rat : | | re ee Wa Bs Bi : ; ) || I 几 Hi | = 3s > | t b . . % i | a | | iil Hh ae . ia |! i] 1] q ， . a F| Hin || Be ISBN _7—03-009186-8 . ae