P. C. 特纳 A. G. 麦 克伦南 A. D. 贝茨 M. R. 吐 怀特 刘进元 李文君 王 薛林等 (第 二版) OGY 现代生 物学精 要速览 中文版 团 0S SC 侶 NTF 忆 PUBLISHERS LMTED Digitized by the Internet Archive g in 2011 with funding from Institute of Botany， CAS and Internet Archive http://www.archive.org/dQtails/fenzishengwuxueOOpcte 於； .f r; •-刀 •；./ c; 、 中科院 巧物所 图书馆 、 誦圓圓 1111 王 主 S0000193 现代生 物学精 要速览 中文版 分子 生物学 (第 二版） 〔英] P. C. 特纳 A. G. 麦 克伦南 J A. D. 贝茨 M. R. H. •味特 ^ 刘进元 李文著 王 薛林等 译校 # ^ 4 泉扯 北京 本书 是目前 国外畅 销的优 秀教材 Instant Notes in Molecular 技 ’oZogy 第 二版的 中译本 ，由 英国 著名大 学具丰 富教学 经验的 一流教 授编写 ，清 华大学 生物科 学与技 术系刘 进元教 授主持 翻译。 全 书分为 19 章共 73 个 主题， 简洁的 形式概 括了核 必的分 子生物 学知识 ，既 全面重 点地阐 述了基 本理论 和主 要技术 ，又突 出介绍 了学科 发展的 前沿和 动态。 本书 编写风 格独特 、取材 新颖; 文字通 俗易懂 、简明 扼要; 插 图简练 、便 于 记忆; 每个部 分都列 出要点 、相 关主题 和进一 步阅读 书目， 重点和 主线清 晰 明确； 书末还 配有选 择题利 于读者 复习， 取 得更好 的学习 效果。 本书专 为生物 学专业 及生命 科学相 关专业 的大学 生设计 ，是 指导学 生快速 掌握分 子生 物学基 础知识 的优秀 教材； 同时对 授课教 师制定 教学计 划和备 课也大 有 帮助。 P. C. Turner, A. G. McLennan, A. D. Bates & M. R. H. White Instant Notes in Molecular Biology Original edition published in the United Kingdom under the title of Instant Notes in Molecular Biology ⑥ BIOS Scientific Publishers Limited, 2000 围字 01-99-0185 图书在 版编目 (CIP) 数据 分子 生物学 / 〔英〕 特纳 等著； 刘进 元等译 . - 2 版. - 北京： 科学出 版社， 2001.9 (现 代生物 学精要 速览中 文版） ISBN 7 - 03 - 008383-0 I .分… n. ①特… ②刘… 田 .分子 生物学 IV. Q7 中 国版本 图书馆 CIP 数 据核字 （2001) 第 045753 号 责任 编辑： 了海咖 谢灵玲 / 责任 校对； 陈玉凤 责任 印制： 刘壬平 / 封面 役计： 黄华斌 高海英 A 9 ♦於社 出版 北京 东货城 根北街 16 巧 邮歧编 Pi: 100717 http:// WWW. sciencep . com 營巧年 I 尸 印刷 科 学出版 社发行 各地 新华书 店经销 2001 年 9 月 第二版 开本 ： 787X1092 1/16 2003 年 2 月第四 次印刷 印张 ： 23 印数： 11 001—16 000 字数； 514 000 定价： ；38.00 元 (如有 印装质 量问题 ，我 社负 责调换 〈环 伟〉） 翻译人 员名单 (按章 节顺序 排列） 刘进元 王薛林 李文君 董晚柄 杨 涛 叶 彬 程 凌 郑 润 江 乐 林会蓋 悚 韵 冯 海 ••• « n%\ Hk a 八 〜•/- 1 * : iK 都 *曲；11&*3朱1^11*术'《1，^#«(|；’ 々V • ‘ ：- •作劣 pprr* 也 •於 分平 iir 姜师 w. 办 •:位 • *.,* 碱， '乐 爭作 砖? • ,於.矣?^矿*户7-’罐了中為义规骑《^.淆": 、’ ;• 表 ■" ' ，，•《’,’* W、， 和參, 租 Wft»U t; 守 4好: W ’; •-与 ，‘， • 斬 •，舞 女義 采芙 •* 遣- •教* »4 林 • -. 气 t '• 一乂 w、 ♦乂乂 I 凶化 ♦寒巧 *♦‘.'> 备 - 单签急 A 新带 ^教 斬旬巧 v'jjflNi、，”,、 ：. 呼 f 巧巧 .來巧 J -, b,| 寺 '.;fe’.— 如 • 4‘’-午" , - :; 批與 ，王 裝快 城 *6 和 满 辦典妻 跨 雌如卦 苗 * 声知 X 余 朵 健 渐 義金為 -， I. ■ 'I 一 4 iiiii^ ,*;r - - ' -■»;• «**<■»• ***-y rn^A^ «M* ♦♦‘ ’A 乐. >W‘ 'Ai^：!M^ # ••’ 、一 4 ’則 心水 ’巧 '•沸 • ."取 f I C: 不 几月， 21 世 纪即将 来临， 此刻， 我刚 完成了 < 生物化 学> 教科书 第兰版 中所担 负 的写作 任务， 面 前摆着 《现代 生物学 精要速 览> 的系 列书近 7 册， 脑海 里不时 浮想生 物科学 的百年 大事。 20 世纪初 （1900 年）， 孟德尔 （Mendel) 遗传 学的基 本定律 刚被认 知后 不久， 摩尔根 （Morgan) 创立 了染色 体基因 学说。 百 年后的 今日， 整个生 命科学 领 域的最 大课题 —— 人类 基因组 DNA 全序列 的测定 已在进 行中， 包括 数万个 基因的 30 亿对 碱基序 列的解 码进入 21 世纪即 将宣告 成功。 送是一 个激动 人心的 时代， 怎 不令人 兴奋 不已。 生命科 学发生 巨变， 缘起于 20 世纪 之初。 由于 数学、 物理、 化 学广泛 深刻地 渗入， 给 现代生 物科学 奠定了 基础， 特别在 1953 年沃森 （Watson) 和 克里克 （Crick) 发现了 DNA 分子双 螺旋结 构后， 从 20 世纪 70 年代 开始， 分 子生物 学逐步 形成， 生命 科学面 目一新 。近 20 年来， 前 沿的分 子生物 学和基 础的生 物化学 出现了 惊人的 进展， 并扩及 整 个生命 科学， 它不仅 引起了 学术界 的极大 关注， 而且 很大地 影响了 人类的 生活， 生命 科学遂 成了自 然科 学领域 的带头 学科。 生命科 学进入 分子水 平后， 才得 从本质 上揭示 各个层 次的生 命活动 的真谏 。当 前， 分 子水平 和细胞 水平的 生命科 学已全 面地进 入了重 大转变 时期。 被 称为龙 头的人 类 基因组 的研究 为例， 它的解 密将使 遗传、 变异、 生长、 发展、 衰老、 死 亡等生 命现象 获得认 识上的 飞跃。 当然， 基 因组的 解密只 是解决 遗传信 息库的 问题， 每 一生命 活动都 是由 基因表 达产物 —— 蛋白质 的特定 群体所 执行。 "后基 因组" 研究必 然落到 "蛋 白质 组" 的研 巧上， 也就 是基因 组表达 的全部 蛋白质 的整体 研究。 在生 命科学 探索的 长征途 中， "后基 因组" 的时 代已经 到来。 构 成生命 活动最 重要的 物质无 疑是蛋 白质和 核酸， 糖生物 化学在 20 世纪 60 年代还 只停留 在有机 化学的 范畴。 直到 近年， 才发现 它在生 命活动 中担负 着极为 重要的 信息功 能。 人体 中有着 40 〜 50 兆个细 胞群， 各个细 胞相互 黏着， 细跑对 底物间 的相互 识别， 发生作 用等等 都依赖 着细胞 间的分 子识别 。这 40 〜 50 兆个 细胞群 沿着空 间坐标 和时间 坐 标秩序 井然地 发生、 发 展构成 了生命 现象。 担 当这样 复杂生 命活动 的识别 功能， 只有 比核 酸链、 多化 链的信 息量大 几百、 几千 倍的糖 链才能 做到。 糖链 的这种 功能已 有很多 实验 证实， "糖生 物学" 也正 兴起。 无可 置疑， 21 世纪 必将是 分子生 物学、 生物 化学共 同 发展， 渗透到 所有生 命科学 领域的 时代。 由 于分子 生物学 和生物 化学的 渗透， 生命 科学各 个领域 都发生 T 根本性 变化， 甚至 古老 的分类 学也无 例外。 迄今靠 电镜的 形态学 研究， 若没有 生物分 子的知 识甚至 连文献 也难 看懂。 细胞生 物学、 遗 传学、 神经解 剖学、 脑 科学等 等都已 W 崭新 的内 容出现 。正 如 19 世纪 末期， 近代自 然科学 始于物 理学的 革命， 21 世纪 自然科 学的大 转变， 将始于 生 物学的 革命。 化书序 生 物是生 物整体 活动的 表现， 不 是组成 生命活 动各个 部分的 叠加。 生 命科学 的进展 使物理 学家认 识到： 需要变 革传统 物理学 的世界 观和方 法论。 眼下， 生命 活动的 最高形 式 —— 脑 活动， 已成 为理论 物理学 的最大 挑战。 物理 学和生 命科学 间的传 统界限 也正开 始 改变。 数 学也将 在对生 命科学 的挑战 中丰富 自己的 内容， 发 展新的 学科。 例如， 基 因组信 息学， 就是跨 数学、 逻 辑学、 计 算机科 学和生 物学的 学科。 又如， 生物拓 扑学、 生态几 何学、 脑 及神经 网络数 学模型 等等。 现代生 命科学 的形成 是化学 渗透撥 结果。 今后， 生命 科学仍 将是化 学的重 要结合 点。 几乎所 有生命 科学中 的重大 问题都 将受到 化学的 挑战。 从能壁 转换、 生物膜 、酶、 生 化反应 机制、 生物分 子的结 构与功 能到生 物大分 子及其 复合物 等等， 无 一不既 是生物 学 问题又 是化学 问题。 至于生 命技术 科学， 基因 工程在 农业、 医 疗等的 作用已 为人所 共知。 生命科 学与技 术 科学结 合的深 远意义 在于用 生命科 学的原 理来改 造或创 新工业 技术。 例如， 对 脑功能 W 及 思维、 学习、 记忆、 感觉 等的本 质的揭 示必将 导致计 算机、 人 工智能 等高技 术领域 的 革命性 突破。 总的 看来， 进入 21 世纪， 生命 科学自 身将发 生更大 变革和 突破， 使 人类越 来越接 近 于了解 生命的 本质。 它还 将继续 作为自 然科学 的领头 学科， 与其 他基础 学科间 相互作 用、 相互 渗透。 使 自然科 学出现 一个崭 新的、 繁荣的 局面。 作为 教育工 作巧， 此 时此刻 不能不 想该怎 样培养 生命科 学为带 头的新 一代。 对专 攻生命 科学的 学子， 要使他 们孽握 最新的 理论和 实际； 对把 生命科 学作为 副科的 各个专 业的 学生， 也 得使他 们懂得 生命科 学的基 本知识 和发展 概貌。 要 达到此 目的， 关 键在于 必得有 与生命 科学地 位相称 的教学 安排， 有好的 课堂教 学和教 科书； 还在 于领导 的英明 和 教师的 努力。 生命科 学在全 面发生 变革和 发展。 环顾各 分支学 科的教 科书， 都力求 把最新 成果包 容 进去， 内 容越来 越广， 深 度越来 越大， 送正是 现代生 命科学 的本来 面目。 在此 种情况 下， 一些基 础的内 容只得 从略， 但 協赔仍 然不断 补充。 学子们 面对这 样的大 厚本， 时常 不知 怎样在 那些外 围知识 中找出 核必的 东西。 去秋， 在 国际书 展上看 到一本 Jnstonz iVwes 执 入手 细读， 发 现它是 一 ■本 名副 其实的 "精 要， 速览" 的好书 ，遂 向科学 出版社 推荐， 他们经 过了解 研究， 取 得英国 B 似 S Scientific Publishers Ltd. 的版 权， 在国 内将把 "Instant Notes" 全系 列的英 文版和 中文译 本全部 出版。 我为青 年学子 得到 出版巧 的慧眼 识才感 到十分 高兴。 这一套 书是教 科书的 "新品 种"， 它既非 大本教 科书， 也 非简明 教程。 针 对学生 读大本 抓不住 要点， 读简 明教程 又不能 得到满 足的问 题， 它采用 了创造 性的格 式把学 生必修 的学科 内容， 分为 70 〜 80 个 主题， 用言 简意略 的 语言和 简明、 清晰 的图表 阐明每 一重要 理论或 实际。 既易于 理解， 又利于 记忆。 送套 新品 种为年 轻学生 们提供 最新 知识， 帮助 他们提 高学习 效率。 学 生们能 把这样 的学习 书和大 本的名 著配合 攻读， 定 会相得 益彰， 取 得良好 实效。 我衷私 愿望一 代学子 能迎头 赶上 生命科 学的新 时代。 王镜岩 1999 年 9 月 19 日于北 京大学 朗润园 译者序 伴 随着人 类步入 21 世纪， 分 子生物 学也步 入了后 基因组 时代。 基因 组计划 的实施 不 仅促进 了操作 DNA 的分 子技术 的迅速 发展， 提供了 大豈的 DNA 内在 信息， 而且为 分 子生物 学研究 提出了 崭新的 课题。 20 世 纪人类 揭示了 DNA 巧螺旋 结构， 将生 物学引 入分子 世界， 从而 创建了 分子生 物学， 随后 的遗传 密码的 解析、 基 因工程 技术的 诞生则 大 大促进 了分子 生物学 的迅猛 发展。 而在 21 世纪 人类需 要解决 的生物 学根本 难题是 "遗 传的 语言问 题"， 即整个 基因组 的调控 问题， 邊 无疑问 这也是 分子生 物学的 根本任 务。 如果说 DNA 双螺 旋结构 的提出 标志着 分子生 物学的 诞生， 基 因工程 技术的 建立标 志 着分子 生物学 的重大 发展， 那么遗 传语言 问题的 解决将 标志着 分子生 物学的 "成 熟"， 切望 有志于 分子生 物学发 展的中 华学子 对这一 时代的 早日到 来做出 贡献。 面对 分子生 物学内 容多、 信息 量大、 发 展快的 特点， 作 为在高 等学府 执教的 教师们 经常会 考虑哪 些基本 知识、 基 本理论 应该优 先重点 教授给 学生； 而 作为主 修生物 科学的 本 科生， 或巧 初习分 子生物 学的学 子们又 会经常 面临哪 些基本 知识、 基本 理论应 该优先 掌握的 困惑。 根 据多年 在清华 大学执 教分子 生物学 课程的 经验， 觉 得科学 出版社 引进的 《现代 生物学 精要速 览> 系 列之一 《分子 生物学 > 会 为解决 上述问 题提供 很好的 参考。 正如 本书著 巧们在 原著前 言中所 指出的 那样， 《分 子生 物学》 力求 W 简练、 易懂 的形式 传达 分子生 物学的 精髓， W 帮助 读巧提 高学习 效率。 本 书涉及 70 多个 主题， 基 本上总 括 了分子 生物学 的基本 理论、 核 心内容 W 及主要 技术。 在每一 主题中 都配有 "要点 "栏 目， 有助 于抓住 重点， 并配有 简洁的 插图， 便于 理解。 书 末配有 选择题 W 辅助 读者复 习， 并列有 大量的 附加读 物目录 W 利 于大家 寻找相 关参考 文献， 去丰富 知识， 拓 展自己 的 思路与 视野。 在科 学出版 社的主 持下， 我们 翻译了 该书， 奉献给 大家， W 期帮 助读巧 抓住 重点， 实 现快速 记忆， 取 得更好 的学习 效果。 在 翻译过 程中， 我们 力求既 忠实于 原文， 又能符 合汉语 的正确 表达。 全书 W 科学出 版社 出版的 《英 汉生物 学词汇 > 第 二版规 范所有 术语， 并对 原著的 某些笔 误及与 目前进 展不符 的措辞 一一 做了 更正。 本 书的主 要译巧 是清华 大学最 富活力 的研究 生们。 在第 一版翻 译刚完 成时， 又传来 了 该书第 二版已 再版的 消息， 为 了向读 者们提 供最新 版本， 在科 学出版 社的精 必组织 下， 我们又 在第一 版翻译 稿的基 础上， 对第 二版增 加部分 进行了 翻译。 除 了在各 部分末 尾注明 的译校 巧外， 赵 广荣、 徐 振彪、 王 泽斌、 乐怡、 李碟等 也参加 r 部分 工作。 最后 刘进 元对全 书进行 了最终 校读， W 统 一所用 术语。 由于时 间紧、 任 务重， 没有足 够的时 间对 某些深 奥的英 文表达 做仔细 推敲， 难 免会有 一些不 确切的 中文表 达甚至 译误， 在此 敬请广 大读巧 指正， W 期在再 版时加 W 更正。 列进元 2000 年 11 月 18 日 于 清华固 .A、 ■ 3 3 w. ‘-一 .乂 的樂 ^ ‘ *4少《分的*舶-‘卑，啼;夫专巧 ，，論 -:>>■:、 .A •♦义*(含|^- . ，‘ ‘ ，，A*.，’， 诞下. 生奋 ,h> m 於 ••' 一 * 了 4 W— ■* *巧感11»10|« 巧 ’>• ■v: 分 4 私也— - *'- 饼妨. 基 »1|^曲沁如化巧集 ，的抑化《龄巧节乂啼曲游|(|?或平如 ，化 巧心 A ‘ •义乂 4 逆片 城. 41 挣苗知 AKW 從巧文 可媒巧 ，新哉 遍驴從 :^' 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WW 至巧巧 ，•: 》*^ A 省巧 巧斯 知嗦如 々.與 诗 i!MI 可稱 S# 矣棘 表撫 A 考 - .»貧巧^^?>弟：^伞嗦班郁冰與‘ 带全净 茲心 •媒 曲巧薄 ji 赵 奔丈余 赛 衫诗悼 ♦#是 >, t; » tf -f 民带 W 吓 百 fcf R fl 爭 WW 二 m, :‘轉 第二 版序言 为 了在再 版时对 < 现代生 物学精 要速览 > 系 列之一 《分子 生物学 > 第 一版做 很好的 修改， 我们仔 细研究 了读者 们对第 一版的 意见， 惊喜 地发现 本书存 在的一 些疏漏 W 及值 得引起 注意的 问题。 由此我 们所面 临的挑 战是如 何在不 改变本 书现有 结构的 基础上 ，插 入 一定量 与原内 容差异 很大的 条目和 主题， 所 W 我们 的选择 是尽可 能在现 有主题 中插入 新的 内容， 只在 绝对需 要时才 创建新 主题。 从表 面上看 第二版 只改了 很少的 一部分 ，但 实际 上更新 或延伸 了的内 容包括 W 下 部分： 蛋白质 组学、 LINES/SINES、 信号 转导、 细 菌人工 染色体 （BAC)、 Z-DNA、 基 因枪、 基因 组学、 DNA 指 纹法、 DNA 芯片、 微阵 列、 RFLP、 遗传多 态性、 基因 组测序 计划、 SSCP、 自动 DNA 测序、 定位 克隆、 染色 体 跳查、 PFGE、 多重 DNA 扩增、 RT-PCR、 定量 PCR、 PCR 施选、 PCR 诱变、 简并 PCR 和 转基因 动物。 此外 还加入 了兰个 全新的 主题。 毫无 疑问， 没有分 子生物 学课本 会省略 对克里 克中私 法则的 讨论， 在 第二版 中它是 D5 主题 —— 遗传 信息流 的基础 。另 外 两个迅 速发展 并很重 要的部 分是细 跑周期 和细胞 调亡， 我 们认为 这两个 部分都 应作为 主题， 被分别 加入到 E 的 DNA 复制 部分和 S 的肿瘤 病毒与 癌基因 部分。 最后， 为了保 持 第一版 具有指 导学习 与辅助 复习的 特色， 在 第二版 中我们 根据主 题顺序 编入了 100 多 个选 择题。 这一点 点改进 也许会 大大增 进本书 的教学 效用。 致谢 感 谢那些 不厌其 烦地反 镜意见 和建议 的所有 第一版 读者， 没有 他们的 建议第 二版就 不 会有这 么大的 改进； 感谢 BIOS 的 Will Sansom、 Andrea Bosber 和 Jonathan Ray, 他们 不 停地给 我们以 鼓励； 最后还 要感谢 我们的 家人， 在 第二版 重写过 程中他 们又一 次给予 了 大力的 支持。 (王 薛林 译 刘进元 化） k 巧巧 斯挪 巧一弟 1 考诗步 平&> 一芝 代杀 < 巧整巧 》 葦# 蓮 ；^巧> 巧作 濟再 身下度 W 受从 保巧婪 海曾 萍本巧 考维巧 巧' .巧 》 巧巧 一巧 &巧巧 巧 IfW 瞄巧 tl 度 .巧 * 斯 .止脉 巧:巧 所巧奔 巧课芽 变占斗 A 巧抽 這化 W 成 A 巧利 【> 巧況由 •劲巧 iMt 斬 进巧巧 乂科 中马连 而巧尚 蘇巧梦 哉才巧 t 巧向巧 W 帘 .没主 诉眉杀 巧大巧 巧堯台 均《 芦量 巧一乂 巧 .枯淹 ^ 巧乂骄 T 巧只巧 一-满 ir；i •巧護 •巧 連巧 爹防 卡抑女 fr 巧 巧资只 •巧 巧巧雨 ,# 新诗裔 ；詞州 巧度 3WU ，聲盤 雨总巧 ：斬痛 了尚巧 S 巧灼巧 n’w 如裝 请1：1 •巧塞 巧巧 ，种巧 AWU .去 r 替靜 A 肺 3 .争 巧巧巧 办齿茫 ••AWMwOAfl) 4) 全典 *1： 乂巧 BI 巧典 ，褒 巧尚巧 ，巧 WAW! 话自 ，斯巧 巧听节 K 盛巧 ♦ ，护方 朵巧 》 .TJ3H •巧 與& ,穿11&义>1 ，巧巧 a': 巧 .张 巧故巧 ’jryiiT 巧 •，货 If A 抑 J 左姜 /：ii> 巧 丰 巧^巧 垄辛卷 巧巧 ‘ ，向 巧录* 。’ fl 主扣巧 3^ 个 S 了乂前 antjt •鮮於 扮基巧 汾>1—内 - 寡 till 基巧巧 A 冷莉 A —— 度 it 汾《习 •中 ii 二巧客 .娩 軒!?61« 兹 中巧 3 度巧 讲巧会 #增 巧 31 命巧 个巧必 乂巧巧 .劝 W 就 抢巧睐 扣苗巧 巧於巧 t 奇巧 巧: k 拓 & 个巧带 巧了 #A，^* •传 而因 H* 样巧鳥 巧押巧 8 脚 货诉巧 31 AM 幻舟 3 巧乂 qd 化种读 .g 主 朵 oot 了乂 参帘 病巧 主巧巧 巧中 巧二? 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W:. . 二. ‘扣 •‘.— m th m 巧矿一-斯5^^巧^<^[1>曲奈巧 .•试 拟巧 一？ r 貧巧舟 巧巧巧 双苗: •淑员 部游別 “V 未掛 Ml 乐; 屯,‘ 巧 曲 .，巧 & nnHinnuf 请 ladsoH 巧巧巧报11»致试姐 ！ 拥巧过 rl 巧冷 不 側； 。巧 文為 乂飞 . >.；> ♦ 壬 kfi .»f ,, , *' (到 立 im # 兴 *王） ^ n T'‘ *• -1 一 ‘W *‘ ‘: .騎 ，;— ， ..• V’* -! 可 - 4、 •方， m : % pf^nnfrv •‘ 巧、; 巧 -)， 第一 版序言 在刚刚 过去的 20 年中， 我们 对遗传 信息的 保持、 传递 和表达 等过程 即生命 本质在 分 子水平 上的理 解经历 了一场 革命。 在 许多成 为这一 知识大 拓展的 必备的 基础技 术进步 中， 占 有极为 重要地 位的是 从一种 生物中 分离某 一特定 DNA 片段， 在试 管中对 其进行 操作， 然 后将其 重新导 入相同 或不同 种生物 中去的 能力。 分子 生物学 正是由 于重组 DNA 技术， 或 称遗传 工程的 重要贡 献而得 W 发展。 分子生 物学就 是要解 释生物 分子的 结 构与功 能间的 关系， W 及这种 关系是 如何操 纵和调 控各种 生化过 程的， 其主要 目标在 于 DNA、 RNA 和 蛋白质 等大分 子和大 分子复 合体， W 及 复制、 转录 和翻译 的过程 。操 作 这些分 子的先 进的实 验技术 是现代 分子生 物学的 核心。 分子 生物学 不仅可 W 提供 这些 分子 的基本 信息， 更可 W 被广 泛应用 于开发 新型且 安全的 产品如 药物、 疫苗和 食品， W 及遗 传疾病 的诊断 与基因 治疗。 这 口学科 的大发 展必然 导致优 秀的、 综 合型的 教科书 的大量 涌现。 这 些教科 书不仅 制作 精美， 而且 对一、 二年 级本科 生在该 领域知 识广度 和深度 的拓展 都大有 婢益。 正是 基 于这一 考虑， 现 代生物 学精要 速览系 列之一 《分 子生 物学》 定位于 简练、 易 懂的形 式传达 该学科 的精髓 W 有助 于读者 复习。 这本 书分为 19 个 部分共 70 个 主题。 每 个主题 都 有一个 "要 点" 栏目， 用极为 简练的 语言概 括了本 主题所 涉及的 要点。 在正文 中对此 进 行详细 阐述并 配有简 单淸楚 的黑白 插图。 为了 最好地 利用这 本书， 必须 先学习 与主题 相关 的一些 内容， 要 点则可 用来作 为快速 复习的 辅助。 书 中各主 题的排 列顺序 合乎逻 辑， 而且可 从其中 任何一 个知识 点切入 阅读。 正因 为此， 本书提 供了大 量的参 考文献 W 引导 读者了 解相关 主题。 本书的 内容反 映了在 生命过 程的分 子分析 中所用 到的主 要技术 W 及应 用这些 技术所 得出的 结论。 它 们主要 W 本书 的作者 在利物 浦大学 给一、 二 年级生 物学科 的本科 生讲授 分子 生物学 课程的 内容为 基础。 A 介绍 了细胞 和大分 子的分 类并简 述了用 W 分析 的一些 方法； B 着重 讲述了 蛋白质 结构的 基本要 素及其 结构与 功能的 关系； C 则 讨论了 DNA 和 RNA 分子 的结构 及其物 理化学 特性， 其中包 括涉及 超螺旋 DNA 的一 些复杂 概念； D 主要 讲述了 怎样将 DNA 整合进 原核和 真核生 物复杂 的基因 组中； 基因 诱变、 DNA 复 制、 DNA 重组 及 DNA 修复等 相关主 题则在 E 和 F 中加 W 阐述。 G 介 绍了现 有的对 DNA 进行 操作的 技术， 简单的 DNA 克隆 策略图 展示了 这些基 本 方法。 如上 所述， 该部 分巩固 了我们 对细胞 过程分 子机制 的详细 理解。 H 描述 了许多 更 常用的 适于各 种用途 的克隆 载体； I 着重讲 述了用 DNA 文库来 分离筛 选新的 基因序 列； 而 J 包含 了渉及 DNA 测序 和克隆 序列分 析方面 的更加 复杂且 详细的 方法， 最后还 讨 论了基 因克隆 技术应 巧的某 些快速 进展。 原核 生物基 因转录 的基本 原理在 K 中描述 ，而 L 则列 举了一 些被细 菌用来 调控特 定基 因表达 的精细 机制的 例子。 M 和 N 讲述 了与此 相似但 更为复 杂的真 核细胞 转录机 第一 版序言 制。 新生 RNA 到成熟 RNA 分子 的加工 过程在 0 中 有详细 阐述， 而 P 和 Q 中对 这些 RNA 分 子在遗 传密码 翻译成 蛋白质 序列的 过程中 的作用 进行了 描述。 原 核和真 核生物 病 毒对我 们理解 分子信 息处理 所作的 贡献在 R 中被 详细 阐述， 最后的 S 对病毒 的研究 及分子 生物学 其他领 域所积 累的知 识是如 何帮助 我们深 入了解 主要人 类疾病 —— 癌症 的 发生机 制做了 介绍。 本书并 不意在 替代综 合的、 主 流的教 科书， 相反 希望能 成为你 课程笔 记的一 个直接 补充， 为你提 供坚实 的基础 知识。 大部 分正文 及列 在书末 的进一 步阅读 文献中 的一些 论著均 可为详 细理解 与所学 课程相 关的主 题提供 参考。 而对 于你们 当中那 些已激 发了对 该学 科极大 兴趣和 热情的 学生， 该附 加读物 栏也可 UU 旨导你 们阅读 一些更 详细和 深入的 文章， 使 你们的 视野得 超越 < 分子 生物学 > 的 范围。 不 可避免 地本书 中会有 一些遗 漏， 我们相 信每一 位读者 都会从 中发现 不同的 遗漏， 但这些 遗漏中 的许多 部分将 会在现 代生物 学精要 速览系 列的其 他卷， 例如 本书的 姊妹卷 《生 物化学 > 中涉 及到。 P. 特纳 A. 麦 克伦南 A. 贝茨 M. •昧特 致谢 我们首 先要感 谢来自 家庭的 支持与 理解， 因 为我们 将许许 多多个 原本可 与 他们一 起 欢聚的 夜晚用 在了本 书的起 草和修 改上。 我 们还要 对我们 的同事 Malcolm Bennett 和 Chris Green 在嗤 菌体、 病毒 和癌基 因等章 节的帮 助表示 感谢。 我 们同样 要感谢 BIOS 出 版社的 Jonathan Ray、 Rachel Robinson、 Lisa Mansell 和该系 列丛书 的编辑 David Hames, 是他们 在需要 时为我 们提供 支持和 有益的 建议， 并 给我们 W 按时 完成此 书的适 度的压 力。 (李 文君译 刘进 元校） 缩略语 ADP A 瓜 S AMP ARS ATP BAG BE 民 bp BRF BUdR bZIP CDK cDNA CHEF CJD C 民 P CSF-1 CTD Da dNTP ddNTP DMS DNA DNase DOP-PCR dsDNA EDTA 巨 F ENU E 民 ESI ETS FADH FIGE (3- gal GMO adenosine 5 '-diphosphate 腺背 二憐酸 acquired immune deficiency syndrome 获 得性免 疫缺陷 综合征 adenosine 5 ' - monophosphate 腺背 一 碟酸 autonomously replicating sequence 自 主复 制序列 adenosine 5 '-triphosphate 腺昔 二碟酸 bacterial artificial chromosome 细 菌人工 染色体 base excision repair 碱基切 除修复 base pairs 碱基对 TF 日 B- related factor TF D B 相 关因子 bromodeoxyuridine 5 -漠 脱氧核 搪尿巧 basic leucine zipper 碱 性亮氨 酸拉链 cyclin-dependent kinase 依赖 细胞周 期蛋白 的激酶 complementary DNA 互补 DNA contour clamped homogeneous electric field 错位 均匀电 场电泳 Creutzfeld- Jakob disease 克罗伊 茨费尔 特-雅 各布病 cAMP receptor protein cAMP 受 体蛋白 colony-stimulating factor- 1 集落刺 激因子 1 carboxyl- terminal domain C 末端 结构域 Dalton 道尔顿 deoxynucleoside triphosphate 脱 氧核糖 二踞酸 dideoxynucleoside triphosphate 巧脱 氧核糖 二碟酸 dimethyl sulfate 二 甲硫醋 deoxyribonucleic acid 脱氧核 糖核酸 deoxyribonuclease DNA 酶 degenerate oligonucleotide primer PCR 简并寡 聚核营 酸引物 PC 民 double-stranded DNA 双链 DNA ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺 四乙酸 elongation factor 延 伸因子 ethylnitrosourea 乙基亚 硝基脉 endoplasmic reticulum 内质网 electrospray ionization 电喷射 离子化 external transcribed spacer 外部转 录间隔 reduced flavin adenine dinucleotide 还原型 黄素腺 曝吟二 核脊酸 field inversion gel electrophoresis 倒转 电场凝 胶电泳 (3-galactosidase (3 -半乳 糖营酶 genetically modified organism 基因修 饰生物 r 缩略语 GTP HIV HLH hnRNA hnRNP HSP HSV-1 ICE IF IHF IPTG IS ITS JAK kb kDa LAT LINES LTR MALDI MCS MMS MMTV mRNA NAD + NER NLS NMN NMR nt NTP ORC ORF PAGE PAP PCNA PC 民 PDGF PFGE PTH RACE RBS RER guanosine 5'-triphosphate 鸟营 二稱酸 human immunodihciency virus 人类 免疫缺 陷病毒 helix-loop-helix 螺 旋-环 -螺旋 （结 构） heterogeneous nuclear RNA 核内 不均一 民 NA heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 核 内不均 一 ■核糖 核蛋白 heat-shock protein 热 激蛋白 herpes simplex virus- 1 单纯疮 疹病毒 1 inTerleukin-l-(3-converting enzyme 白介素 - 1 - P- 转换酶 initiation factor 起 始因子 integration host factor 整合宿 主因子 isopropyUp- D-thiogalactopyranoside 异丙基 硫代- P - D -半 乳糖脊 insertion sequence 插 入序列 internal transcribed spacer 内部輯 录间隔 Janus activated kinase Janus 激活 的激酶 kilobase pairs in duplex nucleic acid, kolobases in single-stranded nucleic acid 千碱基 （文 才） kiloDalton 千 道尔顿 latency-assiociated transcript 潜伏相 关转录 long interspersed element 长散 布兀件 long terminal repeat 长末 端重复 matrix-associated transcript 基 质申目 关转录 multiple cloning site 多克 隆位点 methylmethane sulfonate 甲基 甲賴酸 mouse mammary tumor virus 小鼠半 L 腺瘤 病毒 messenger RNA f 旨使 RNA nicotinamide adenine dinucleotide 烟 醜胺腺 曝吟二 核昔酸 nuleotide exzcision repair 核 脊酸切 除修复 nulear localization signal 核定位 f 旨号 nicotinamide mononucleotide 烟 醜胺单 核昔酸 nuclear magnetic resonance nucleotide 核 磁共振 nucleotide 核营酸 nucleoside triphosphate 核昔 二踞酸 origin recognition complex [复 制] 起 点识别 复合体 open reading frame 可读框 polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙婿 醜胺凝 胶电泳 poly (A) polymerase poly A 聚合酶 proliferating cell nuclear antigen 增 殖细胞 核抗原 polymerase chain reaction 聚合酶 链反应 platelet-derived growth factor 血小板 衍生生 长因子 pulsed field gel electrophoresis 脉冲凝 胶电泳 phenylt hiohydantoin 乙 内醜 苯硫脈 rapid amplification of cDNA ends cDNA 末 端快速 扩增法 ribosome-binding site 核 糖体结 合位点 rough endoplasmic reticulum 媳面 内质网 缩略语 民 F RFLP RNA RNAPol I RNA Pol n RNA Pol in RNase A RNase H RNP 民 OS 民 P-A rRNA 民 T RT-PCR SAM SDS SINES SLl snoRNP SNP snRNA snRNP SRP Ssb SSCP ssDNA STR SV40 TAF TBP a-TIF Tris t 民 NA UBF UCE U 民 E UV VNTR X- gal XP YAC YEp replicative form 复制型 restriction fragment length polymorphism 限 制性片 段长度 多态性 rebonucleic acid 核 糖核酸 RNA polymerase I RNA 聚合酶 I RNA polymerase n RNA 聚合酶 11 RNA polymerase 田 RNA 聚 合酶虹 ribonuclease A RNA 酶 A rebonuclease H RNA 酶 H ribonucleoprotein 核糖 核蛋白 reactive oxygen species 活性氧 自由基 replication protein A 复 制蛋白 A ribosomal RNA 核糖体 RNA reverse transcriptase 反 转录酶 reverse transcriptase- polymerase chain reaction 反转录 PC 民 S -adenosylmethionine S - 腺 昔甲 硫氨酸 sodium dodecyl sulfate 十 二綻基 横酸納 short interspersed elements 短散 布兀件 selectivity factor 1 选择 性因子 1 small mucleolar RNP 核仁 小核糖 核蛋白 single nucleotide polymorphism 单 核昔酸 多态性 small nulear RNA 核内小 RNA small nuclear ribonucleoprotein 核内 小核糖 核蛋白 signal recognition particle 信号识 别颗粒 single-stranded binding protein 单链 DNA 结 合蛋白 single stranded conformational polymorphism 单链构 象多态 '圧 single-stranded DNA 单链 DNA single tandem repeat 单 向重复 simian virus 40 猿 猴病毒 40 TBP- associated factor TBP 相 关因子 TATA-binding protein TATA 结 合蛋白 a- 《r 幻 ns -inducing factor a- 反式诱 导因子 tris ( hydroxymethyl) aminomethane 二 （哲 甲基） 氨 基甲烧 transfer RNA 转移 RNA 叩 stream binding factor 上游结 合因子 upstream control element 上游控 制兀件 upstream regulatory element 上游 调控兀 件 ultraviolet 紫外线 variable number tandem repeat 可变 同向重 复序列 5-bromo4-chloro-3-indolyl-(3-D-galcatopyranoside 5 -漠 -4 -氯 -3 -巧 I 噪 - (3 - D - 半睾 L 糖昔 xeroderma pigmentosum 着色性 干皮病 yeast artificial chromosome 酵 母人工 染色体 yeast episomal plasmid 醇 母附加 体质粒 n« 5* . A ♦ 4il 重 j b"’ A . 躬惠 化申 巧隹 H K 沁 巧 ifl.31 nfio) «vii(K2tli|n ' > xf 4 巧 t 打巧 巧换。 oDcorum bt3ft ^Mduoodat 、— SiH •巧 V% \ ，•知 句 f- 嫁 ft (化 A «巧巧巧 *- «% 巧由 rHI 含 liAVlil 1 WKUrtHttiiloq /vWI* ，> ‘， ，，,tw nUafturir>nvn#[| •皆 蒙乂 • W^rtsifitfeq AK5! ‘‘A 一 1^- .llM。 AliU •马 由 Hi; , AKH ， w、n*(i A 知， ' '-- .巧 ♦! 单 笨句 If l.w AglAK 巧 A ..MtMbumxfh •一 V94« ♦sru:>W* l?A 巧字 •’ 白左巧 ia^/ ^ 乐 锡曲白 > 巧巧 k. »b^ fi 巧 Vjui wihim 巧猶 綠祥 , .幻: W 策畔巧 度石一 》 Bjift. wTjmykjq"«y«Wfcf 拜’ .#*v *\1^叫.‘.々 -'. » .沪 up 巧々|&募々<1 •十 *»*Uue hrnbub aiuibc4 f* ■啤 ♦‘ .令南 ‘ • 今^於 iMt 或 woaftwl'* hva^cfnaim nodi •' *• Ws>- v*mP«< ♦■•4^ * 六 f '勺千巧主巧?^巧 I lofarf /liviiaJbi -•«*»««£ iifK^ Ik *W2 I*kj9faum lUm 一 K> it*oei)iUai tss^ 南摩 *111^* 公是 ♦niirfqiutnyloq obrkvbcffl '，如 ifc 〜 lit 的 r iiyhifru *^'； • 松 ♦ 化 冉 AV\H 小巧 * AVW Tjnkia Uaoae «t iiuMMU ii»>oiqmha«odh iMjloua ikam tao^m^ iMouAiry tumor v4n» !9flMliJ9fl^ g 此 imq noi’insf 田 m Ua* RHA 电巧巧 ftl AWQ i •雄 « r«laKi 典山 lid b*>ij 舟 <**>*»- ii^ t>^«n«MM> r«f|*tr ，巧 •破 A 议佑々 ♦ *巧1 vaUtww . 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'.’.I , A 细胞与 大分子 A1 细 胞分类 要 点 真细茵 真细菌 （eubacteria) 具原 核生物 （prokaryote) 的 构造。 每个真 细菌都 有质膜 （ plasma membrane), 通常 其膜外 包裹一 层刚性 (rigid) 的 细胞壁 （cell wall), 其内 没有分 隔小室 （intracellular compartment), 有一条 主要的 环状染 色体。 真 细茜可 (是 单细胞 或多 细胞。 大 肠杆菌 （E. coli) 是研 究得最 深入的 一种真 细菌。 古细菌 古细菌 （archaea) 在结构 上与原 核生物 相似。 但是 古细菌 很可能 是从真 核生物 （eukaryote) 分支出 来的， 这 发生在 它们共 同的祖 先 与真细 菌歧化 之后。 古细菌 常生活 于极端 环境。 从生化 角度上 看， 古细 菌在某 些方面 接近真 细菌， 而在另 一些方 面则接 近真核 生物， 也存在 一些自 己独特 的生化 特性。 1 真 板生物 1 植物、 动物、 真菌 （fungi) 和原 生生物 （protist) 细胞拥 有由脂 膜 （ lipid membrane) 包被的 亚细胞 结构如 细胞核 （ nuclei )、 线 粒体 （mitochondria) 和 内质网 （endoplasmic reticulum) 等 。送 些细 胞器是 各种独 特的生 化反应 进行的 场所， 也是 真核生 物的重 要 特征。 分 化 大多 数多细 胞真核 生物， 在发 育过程 中细胞 群经历 分化形 成具特 殊功能 的器官 （例如 ：肝、 脑和 肾）。 在大 多数情 况下， 这些器 官拥有 相同的 DNA， 但转录 不同的 基因。 正像所 有其他 细胞发 育过程 一样， 分化 由基因 控制。 不同 功能细 胞间的 协调需 要细胞 间 的信息 交换。 巧 关主题 亚 细胞器 （A2) 唆 菌体与 真核生 物病毒 （R) 原 核与真 核生物 的染色 体结构 （D) 真细菌 真细菌 是原核 生物二 个亚口 之一。 原 核生物 是最简 单的活 细胞， 通常 直径 1 〜 lO/im， 存 在于从 动物内 脏到酸 性湿泉 等各种 适宜环 境中。 分类 上， 可根据 其组构 来鉴别 （图 A1.1)。 原核生 物由嵌 有蛋白 质的脂 双分子 层 组成的 细胞膜 包被， 膜上蛋 白质可 允许 小分子 出入。 大 多数原 核生物 在质 膜外还 含有刚 性的细 胞壁， W 避免 细胞在 渗透压 与胞内 显著不 同的环 境中 膨胀或 收缩。 胞内 （细 胞质） 通常 含有一 个折叠 成类核 体附着 在质膜 上 的环状 染色体 （参见 D1)、 携有 一定遗 传信息 的质粒 [小 分子的 脱氧核 糖核酸 （DNA)， 参见 G2]、 核 糖核酸 （RNA)、 核糖体 （合 成蛋 白质的 2 A 细胞与 大分子 古细菌 真 核生物 场所， 参见 Q) W 及执行 细胞内 代谢反 应的蛋 白质。 这些蛋 白质中 的部分 与质膜 相连， 但是 不像真 核生物 有明显 的亚细 胞器将 细胞分 成不同 的代谢 小室。 原 核生物 表面可 能带有 纤毛和 鞭毛， 纤 毛可使 细胞能 够附着 在其他 细 胞的表 面上， 而鞭毛 的旋转 运动可 使细胞 游动。 大 多数原 核生物 是单细 胞的， 但是有 些具有 多细胞 结构， 其中 某些细 胞行使 特殊的 功能。 真细菌 与古细 菌的主 要区别 在于其 生化性 质上。 真 细菌大 肠杆菌 (Eschericlia coli) 有一个 4600kb 的基 因组， 携有足 编码约 3000 种蛋 白质的 遗传信 息。 大肠 杆菌的 分子生 物学研 究进行 得非常 深入。 最 简单的 生殖道 支原体 ( Mycoplasma genitalium ) 的基因 组仅由 580k;b 的 DNA 组成， 仅编码 470 种蛋 白质， 仅 有有限 的代谢 容量。 质膜 鞭毛- 图 A1.1 典 型的原 核细胞 结构图 古细菌 是原核 生物的 第二个 亚口， 常 生活于 极端环 境中。 从 结构上 看， 古 细菌与 真细菌 相似。 然 而根据 核糖体 RNA (rRNA) 的分子 进化， 古细 菌与真 细菌差 别就如 同原核 生物与 真核生 物差别 一样， 古细菌 具有一 些独特 的生化 性质， 例如 膜脂由 酷键连 接而不 是酷键 （参见 A3)。 古细菌 甲 说球菌 i Methanococcus jannaschii ) 基 因组有 1740kb, 编码 17% 种蛋 白质。 基 因组间 的比较 表明， 在 能量产 生与新 陈代谢 方面， 古细茜 同真细 菌 有着许 多相同 之处， 而 复制、 转录 和翻译 则更接 近真核 生物。 似 乎古细 菌与真 核生物 拥有一 个由真 细菌的 祖先歧 化而来 的共同 祖先。 真 核生物 分为四 个口， 包括 动物、 植物、 真 菌和原 生生物 （藻 类和原 生动 物）。 在结 构上， 真核生 物具有 膜包围 （图 A1.2) 的行 使特殊 代谢功 能的 细胞器 （参见 A2)， 其体 积要比 原核细 胞大， 直径约 10〜100；im。 真 核生物 有质膜 包围， 质膜离 度皱折 W 增 加其表 面积。 植物、 许多真 茜和原 生 生物也 有一个 刚性细 胞壁。 细跑质 是一个 高度有 序的胶 状物， 其 中含有 细 胞器、 核 糖体和 被称为 细胞骨 架能控 制细胞 形状和 运动并 组织代 谢功能 的 一系列 蛋白质 纤维。 这 些纤维 包含由 微管蛋 白组成 的微管 和由肌 动蛋白 組成 的微丝 （参见 A4)。 许多真 核生物 是多细 胞的， 在发育 过程中 不同群 细胞经 分化形 成机体 的特定 组织。 A1 细 胞分类 3 分化 图 A1.2 典 型的真 核细胞 结构图 细胞分 裂时， 子细胞 几乎与 亲本细 胞完全 一样， 或者通 过改变 基因表 达模式 变成在 功能上 与亲本 细胞不 一样的 细胞。 在 原核生 物和较 低等的 真核生 物中， 抱子 形成是 这类细 胞分化 的一个 例子 （参见 L3)。 在 复杂的 多细胞 真核生 物中， 胚胎 细胞高 度分化 成特定 细胞， 如 肌肉、 神经、 肝 和肾。 除 了几种 例外的 情况， 在所 有这些 细胞中 DNA 的含 量保持 不变， 而是被 转录基 因群体 发生了 改变。 分化是 由控制 发育的 基因来 调控的 （参见 N2)。 这些基 因的突 变导致 崎变， 如果蜡 {Drosophila) 在本 该长触 角的部 位长出 了腿。 对这 些突变 基因的 研究有 助于对 K 胎 发育的 了解。 在多 细胞生 物中， 不 同组织 和器官 间的活 动协调 是通过 它们之 间的信 息来控 制的， 包括各 种信号 分子如 神经传 递介质 、激 素 和生长 因子。 这 些分子 由某一 种组织 分泌， 而通过 细胞表 面的特 异受体 作用 于另一 组织。 A 细胞与 大分子 A2 亚 细胞器 要 点 细胞校 I 在 多染色 体的细 胞中， 有 膜包围 的细跑 核包含 了大量 的细胞 DNA, DNA 的 转录和 RNA 的加工 均发生 在细胞 核内。 细跑核 内含有 核仁。 线粒体 是细胞 呼吸、 将养料 氧化为 C02 和水 并产生 ATP 的场 所。 线 粒体由 共生的 原核生 物演化 而来， 尽 管大多 数线粒 体蛋白 质是 在细胞 核内编 码的， 但它们 仍然包 含一些 DNA、 RNA 和蛋 白 质合成 机构。 光合作 用发生 在植物 和藻类 的叶绿 体中。 叶绿体 除了 拥有一 个含捕 光色素 —— 叶绿素 的类囊 体膜系 统外， 与线粒 体的 ^基本 相似。 ~ 内质网 一~ I 光面^网是一个进行焉类生^^喜歲和生物异源物质代谢反应的 细 胞质膜 体系。 粗面内 定核 <糖 体上， 进行 膜蛋白 和分泌 蛋白的 合成， 这 些合成 蛋白由 小泡运 至高尔 基体做 进一步 加工与 分检。 线 拉体与 叶绿休 微 体 细胞器 的分离 溶酶体 含有降 解性水 解酶； 过 氧化物 酶体含 有破坏 某些有 潜在危 害 的自由 基和过 氧化氯 的酶； 植物的 乙薩酸 循环体 执行乙 酸酸循 环 反应。 打碎质 膜后， 就可 W 通 过差速 离心和 密度梯 度离心 （既有 速度区 带， 又有 等密度 区带） 相 结合的 方法将 各亚细 胞器分 离纯化 。纯 度 可由检 测细跑 器特异 性酶来 判定。 巧 关主题 细 胞分类 （A1) rRNA 加工与 核糖体 （01) 翻 译调挖 与翻译 后加工 （Q4) 细胞核 在多染 色体细 胞中， 真核生 物的细 晚核携 带细胞 的遗传 信息， 每条染 色体含 有一个 DNA 分子 （参见 D2、 D3)。 细 胞核由 一脂双 分子层 即核膜 包围。 核 膜上有 允许适 度大小 分子通 过的孔 （参 见图 A1.2)。 RNA 转录 发生在 （参见 M) 细胞 核中， 加 工后的 RNA 分子 （参见 0) 进入 细胞质 并在那 里翻译 （参见 Q)。 核仁 是细胞 核内的 小体， 是 rRNA 合成 和核糖 体 进行部 分组装 的场所 （参见 M2 与 01)。 线粒 体与叶 线粒体 是细胞 呼吸即 营养物 质氧化 W ATP 形式产 生能量 的场所 。其 绿体 直径约1〜2；1111， 每 个细胞 中含有 1000-2000 个。 线 粒体有 一个光 淸的外 A2 亚 细胞器 5 内质网 微体 细胞 器的分 离 膜 和一个 折叠的 内膜， 内膜 突出折 叠成峰 (cristae) (参见 A1， 图 A1.2)， 其 内含有 一个小 的环状 DNA 分子、 线粒 体特异 RNA 和可 合成一 些线粒 体蛋 白的核 糖体。 然而大 部分的 线粒体 （和叶 绿体） 的蛋白 均是由 细胞核 DNA 编码 并在细 胞质中 合成。 这些蛋 白均具 有特定 的信号 序列引 导它们 进入 线粒体 （参见 Q4)。 植物 的叶绿 体是进 行光合 作用的 场所， 即 依靠光 同化 C02 与 水形成 碳水化 合物和 氧气。 虽然叶 绿体比 线粒体 稍大， 但拥 有 相似的 结构， 只是 对应于 线粒体 的峨， 叶绿 体在内 膜腔内 有第兰 膜体系 (类囊 体）。 类 囊体上 含有能 捕捉光 能进行 光合作 用的叶 绿素。 叶绿 体遗传 上也是 部分独 立于细 胞核。 据说 线粒体 与叶绿 体都是 由曾与 原始具 核真核 生物有 过共生 关系的 原核生 物进化 而来。 内质网 是细胞 质内延 伸的膜 体系， 与核 膜相连 （参见 A1， 图 A1.2)。 在大 多数细 胞中可 见 到两种 形式： 光面内 质网和 粗面内 质网。 光 面内质 网携带 有许多 膜结合 的酶， 包括 那些相 关于脂 类生物 合成、 外 来物质 (xenobiotic) 如药物 的氧化 与解毒 的酶。 粗 面内质 网之所 W 被这样 称呼， 是因为 其上有 许多核 搪体的 存在。 核糖 体特异 合成由 细胞分 泌的蛋 白质， 如胞质 蛋白或 乳蛋白 或者那 些被定 位于质 膜或某 些细胞 器上的 蛋白质 。不 同于 那些早 期进入 粗面内 质网膜 的质膜 蛋白， 这些蛋 白质被 转运到 粗面内 质 网内腔 并且在 那里被 修饰， 通常是 糖基化 （参见 Q4)。 在 粗面内 质网上 合成的 脂类和 蛋白质 W 特 定的转 运小泡 转运至 具有一 迭扁平 膜渔的 高尔基 体， 在 那里进 一步被 修饰、 分检 并引至 其最终 目的地 （参 见图 A1.2)。 落酶体 是小的 有膜包 围的细 膜器， 从 高尔基 体出芽 而成， 并 且含有 ，各 类能 降解蛋 白质、 核酸、 脂 类和糖 类的消 化酶。 溶酶 体起着 从细胞 外带进 大分子 或来自 损伤细 胞器的 大分子 的回收 中心的 作用。 一些 产生高 活性自 由 基和氨 过氧化 物的代 谢反应 被限制 在被称 作为过 氧化物 酶体的 细胞器 中， W 防 止这些 分子损 伤细胞 组分。 过氧化 物酶体 拥有可 W 破坏过 氧化氯 的催 化酶； 2H2O2— ^2H20+02 乙 SI 酸循 环体是 特定的 植物过 氧化物 酶体， 进行 乙酸酸 循环。 溶酶体 、过 氧化 物酶体 和乙蔭 酸循环 体合称 微体。 真核 细胞的 质膜可 W 用各种 方式加 破坏， 包括 渗透压 冲击、 可控制 的机 械剪切 和某些 非离子 去污剂 作用。 大小和 密度不 同的细 胞器， 例如细 胞 核与线 粒体、 可 W 根据 它们的 沉降系 数值不 同由差 速离必 法互相 分离并 与其 他细胞 器分开 （参见 A4)。 细胞 裂解物 W —个足 W 仅 沉淀最 重细胞 器， 通常即 细胞核 的速度 寓心来 分离。 含有各 种其他 细胞器 的上层 悬液被 移去 并在更 高的速 度下进 行离必 W 沉降线 粒体， 依 次可分 离其他 细胞器 (图 A2.1a)。 这项技 术也被 用于分 离含不 同大小 细胞的 悬液， 如血 液中的 6 A 细胞与 大分子 、 ^ 最慢 、 > 组分 '说; i 俗嘴 •，- •说) 最快 组分 礙 巧 : 。作 1 低浓度 髙浓度 红 细胞、 白细 胞和血 小板。 在这 些细胞 的粗提 物中， 细胞核 与线粒 体通常 需要用 密度梯 度离心 方法作 进一步 纯化。 这种 方法也 被用来 分离密 度相似 的细 胞器。 在 速度区 带离屯 、中， 混合物 被加入 离必管 中预先 铺好的 适当介 质 的浓度 （形成 密度） 梯度 顶层。 通过 离心， 不同成 分将根 据他们 的沉降 系数 不 同的速 度下沉 并形成 相互分 离的带 或区带 （图 A2.1b)。 建立介 质密 度梯度 的目的 是为了 阻碍分 离后组 分的扩 散混合 （即提 供稳定 性）， 并 且确保 组分的 线性分 离速率 （当 组分进 一步向 离必管 下部运 动时， 它抵 消组 分的加 速）。 在平衡 （等 密度） 离私， 密 度梯度 延伸至 比混合 物中的 一个 或多个 组分大 一些的 密度， 因此这 些组分 在等于 他们自 己密度 的点达 到 平衡并 且停止 移动。 在 这种情 况下， 密度 梯度可 W 是预先 建立， 然后将 样 品加在 上层， 也可 W 是样 品与梯 度物质 混合在 一起离 必时自 动形成 （图 A2.1C)。 密度梯 度用下 列物质 建立： 庶糖、 Ficoll ( —种 合成多 糖）、 metrizamide (一种 合成的 重挪化 合物） 或者 CsCl (参 见口和 G2)。 亚细 胞 组分的 纯度可 W 用电 子显微 镜或测 定与特 定器官 相关的 已知酶 活来判 定， 例如 可用號 巧酸脱 氨酶来 判定线 粒体。 (a) (b) (c) 品 样 慢分 快分 最放 最组 -or- 81 离也力 图 A2.1 离心 技术。 （a) 差速离 必； （b) 速 度区带 离心和 （C) 等密 度离心 A 细胞与 大分子 A3 生物 大分子 要 点 蛋 白质和 杉:酸 多 糖 脂 类 复杂 大分子 巧 关主题 蛋白 质是氨 基酸聚 合体， 核酸 （DNA 和 RNA) 是 核脊酸 的聚合 体， 都是贬 存和表 达遗传 信息所 必需的 组分。 除此 [外， 蛋白质 还有许 多额外 的结构 与功能 作用。 a- 直链 淀粉与 纤维素 是葡萄 糖分别 W a (1 一 4) 和 P (1 一 4) 糖 昔键 相连而 成的聚 合体。 淀粉是 植物体 内葡萄 糖的胆 存形式 ，不 仅含有 a (1-4) 直链， 还含有 a (1 一 6) 支链。 纤维素 在植物 体内形 成结构 纤维， 而在动 物体内 葡萄糖 糖 原形式 於存。 几下 质是 N- 乙醜 氯基葡 糖的聚 合体， 存 在于真 菌细胞 壁和节 肢动物 的外骨 骼中。 觀多糖 （mucopolysaccharide) 是结缔 组织的 重要组 分。 含有 饱和与 不饱和 脂肪酸 的甘油 兰酷， 分别 是动物 和植物 体内的 主 要胆存 脂类。 两类脂 肪酸的 结构差 异导致 了动物 体内的 甘油兰 酷呈 固体， 而 植物体 内甘油 兰酷呈 液体。 稱 脂与銷 脂除含 有脂肪 酸成分 外还含 有极性 基团， 是所有 细胞膜 的重要 组分。 核蛋白 含有核 酸和蛋 白质， 例如 端粒酶 （telomerase) 与 核糖核 酸酶 P ( ribonuclease P ) 0 糖蛋 白与蛋 白多糖 （ mucoprotein ) 是 共 价键与 糖类相 连的蛋 白质， 通常 存在于 细胞外 表及细 胞外间 隙。 与脂 相连的 蛋白质 和脂蛋 白中脂 类与蛋 白质的 相连有 共价或 非共 价两种 形式。 糖脂含 有脂与 糖两种 组分。 这些 混合大 分子复 合物提 供了比 其组分 更多的 功能。 大分子 的组装 （A4) 蛋白 质结构 （B) 核酸 的性质 （C) 蛋白质 蛋 白质是 氨基酸 (化 键共价 连接而 成的聚 合体。 氨基酸 与蛋白 质的详 和核釀 细结 构将在 B 中叙 述。 蛋白 质起结 构和功 能双重 作用。 核酸 （DNA 和 RNA) 是核巧 酸的聚 合体， 由含氮 碱基、 五碳搪 和稱酸 组成。 核 巧酸与 核酸的 详细结 构将在 C 中详细 介绍。 核酸参 与遗传 信息的 胆存与 加工， 但这些 信息的 表达则 需要蛋 白质。 多糖 多糖 是单搪 W 糖 昔键共 价连接 成的聚 合体， 其功 能主要 作为营 养糖源 或结构 组分。 纤 维素和 淀粉在 植物体 内含量 丰富， 两者都 是葡萄 糖多聚 8 A 细胞与 大分子 脂类 体， 只是 在葡萄 糖单体 的连接 方式上 不同。 纤 维素是 (1-4) 糖苛键 相连成 的线性 多聚体 （图 A3. la), 是植 物细胞 壁的主 要结构 成分， 大约 40 条 平行链 形成水 平片层 而相互 堆积， 链与片 层之间 氨 键相连 （参见 A4) 形成坚 固的、 不溶的 纤维。 淀 粉是糖 的贬存 形式， 常 常存在 于细胞 内 的大颗 粒中， 可迅 速水解 释放出 葡萄糖 [供新 陈代谢 所需。 淀粉 含有两 个 组分： 直链 淀粉， W a (1-4) 糖巧 键相连 的线性 多聚体 （图 A3. lb); 支链 淀粉， 除含有 a (1-4) 糖 巧键相 连外， 还含有 a (1-6) 相 连的分 枝。 支链 淀粉可 聚合达 106 个 葡萄糖 残基， 是已 知最大 的分子 之一。 淀粉 中 不同的 连接形 成了难 紧 密堆积 的卷曲 构型， 造 成淀粉 可溶于 水的特 性。 真菌和 一些动 物组织 （例 如肝和 肌肉） W 糖 原的形 式胆存 葡萄糖 ，一 种 像支链 淀粉的 分枝多 聚体。 几下质 存在于 真菌细 胞壁、 昆 虫及甲 壳虫的 外 壳中。 几了 质像纤 维素， 只是其 单体为 N- 乙 醜氨基 葡糖。 黏多 糖形成 分散有 结缔组 织丝状 蛋白的 凝胶状 溶液。 大分 子多糖 的结构 确定是 很复杂 的， 因其大 小和组 成各不 相同， 不能用 研究核 酸和蛋 白质时 所用的 遗传工 程技术 来研究 多糖。 图 A3.1 纤维素 （a) [P (1-4) 连接] 和 （b) 直 链淀粉 [a (1-4) 连接] 的结 构图， 在 图中己 标出了 碳原子 1， 4 和 6 位。 若 (1-6) 相连会 产生支 链淀粉 W 及 搪原中 的分枝 尽管 将单一 脂类称 为大分 子并不 合适， 但 是许多 脂类是 由较小 的单体 构成， 并 参与许 多大分 子装配 （参见 A4)。 自 然界中 较大的 脂类分 子主要 是 碳氨化 合物， 难溶 于水。 一 些脂类 相关于 能量的 贬存和 转移， 而 另一些 则 是膜、 保护 性外銷 及 其他细 胞结构 的关键 组分。 甘油 自旨是 由一个 、两 个或云 个长链 脂肪酸 与一分 子甘油 (酷键 相连而 成的。 动物 的甘油 =醋 内， 都是 饱和脂 肪酸， 不含 双键线 性链， 分子可 W 紧密 堆积在 一起， 所形 成的 脂肪酸 脂肪是 固体。 植物油 组成中 含有一 个或更 多个双 键的不 饱和脂 肪酸， 其链 的夹角 阻碍了 脂肪酸 的紧密 堆积， 因此 在室温 下植物 油呈液 体。 膜 中含有 縣脂， 踞脂由 两分子 脂肪酸 和一分 子縣酸 W 酷 键与甘 油相结 合， 其麟 酸通常 也与一 个小分 子如丝 氨酸、 乙 醇胺、 肌醇、 胆破 W 醋键相 连 （图 A3. 2)。 膜中 还含有 銷脂， 如神 经醜胺 二糖， 其中的 长链氨 基乙醇 销 胺醇含 有由醜 胺键相 连的脂 肪酸。 碟酸胆 碱与脑 胺相连 形成销 踞脂。 A3 生物 大分子 9 0 / 油酸 岭 一 0 — C — (州2)7州 = 州(州2)7州: \ 胆喊 槐酸- 图 A3. 2 —个 典型的 踞脂： 含 有酷化 硬脂酸 和油酸 的碟脂 醜胆碱 复杂 大分子 许多大 分子含 有一种 W 上 的生物 大分子 W 共 价或非 共价键 相结合 。这 可大 大地增 加所形 成的复 合分子 的功能 或结构 容量。 例如几 乎所有 的酶都 是蛋 白质， 但某些 蛋白质 W 非共价 键与对 催化活 性极为 重要的 RNA 组分 相 结合。 核 酸与蛋 白质结 合体被 称为核 蛋白， 例如： 端 粒酶， 一个 真核染 色体 末端的 复制酶 （参见 D3 和 E3); 核糖 核酸酶 P， 一个催 化转移 RNA (tRNA) 成熟 的酶。 在端 粒酶中 RNA 可作 为端粒 DNA 合 成模板 而起作 用， 而 在核糖 核酸酶 P 中， RNA 含有酶 的催化 位点。 核糖 核酸酶 P 是一 个核酶 （参见 02)。 糖 蛋白既 含有蛋 白质又 含有糖 （其 比例可 占重量 <1%, 甚至 > 90%), 塘基 化是蛋 白质翻 译后修 饰的通 常形式 （参见 Q4)。 糖总 是与蛋 白 质的表 面共价 结合， 而 不是在 内部， 且 常在组 成上有 变化， 这就 造成了 糖蛋白 的微不 均一性 （图 A3. 3)， 同时这 也增加 了糖蛋 白研究 的困难 。糖 蛋白的 功能可 涵盖整 个蛋白 质活性 范围， 并通常 在细胞 外还有 活性。 糖蛋 白是 细胞膜 的重要 组分， 并 介导细 胞与细 胞间的 识别。 图 A3. 3 糖蛋白 结构。 不同 的符号 代表不 同的单 糖单位 （例 如： 半 乳糖， N- 己 酥葡糖 氨基） 蛋白多 糖是蛋 白质和 黏多糖 组成的 大分子 复合物 （>107Da)， 存在于 细菌细 胞壁和 结缔组 织细胞 间隙， 其 糖单元 常常含 有硫酸 基团， 这 使得糖 蛋 白高度 亲水。 高度水 化再加 上它们 的长度 （>1000 单位） 造成 了蛋白 10 A 细胞与 大分子 多糖溶 液的高 黏度， 在 细胞间 隙蛋白 多糖起 润滑剂 及缓冲 刺激的 作巧。 脂连接 蛋白与 脂类组 分共价 结合， 脂 类组分 通常是 一个脂 肪醜基 （如 豆 蔑醜基 或掠搁 醜基） 或类异 戊二搞 [如 法尼基 （farnesyl) 或從 牛基掩 牛基] 基团。 送些基 团通过 与膜脂 的疏水 作用把 蛋白质 固定在 膜中， 同时 也促 进了蛋 白质与 蛋白质 的结合 （参见 A4)。 在脂蛋 白中， 脂类与 蛋白质 非共价 结合， 因为脂 很难溶 于水， 脂类 在 血液中 W 脂蛋白 的形式 转运。 这 基本上 是甘油 兰醋和 胆固醇 的颗粒 ，并 被 一层由 憐脂、 胆 固醇和 蛋白质 （脱 脂蛋 白质） 构成 的销所 包被。 脱脂蛋 白质的 结构是 疏水氨 基酸向 颗粒的 内部， 而 带电的 W 及极性 氨基酸 （参见 B1) 朝向 颗粒外 部的水 环境， 因此该 颗粒是 可溶于 水的。 糖脂， 包括脑 巧脂和 神经节 昔脂， 脂与搪 W 共价 键相 结合， 在 脑细胞 和神经 细胞的 膜中含 量特别 丰富。 A 细胞与 大分子 A4 大分子 的沮装 要 点 蛋白质 复合休 I 真核 生物细 胞骨架 由各种 蛋白质 复合体 构成。 蛋白 质复合 体包括 微管 （由 微管 蛋白构 成）、 微丝 （由 肌动蛋 白与肌 球蛋白 构成） 和中 间纤维 （由 多种蛋 白质构 成）。 这些蛋 白质复 合体组 构细胞 的 形状、 细 胞运动 和亚细 胞器。 纤毛 与鞭毛 也是由 微管、 动力蛋 白 （dynein) (及 微管连 接蛋白 （nexin) 复合 而成。 ；! 《蛋白 I 细茜 70S 核糖体 由一个 50S 大亚基 和一个 30S 小 亚基组 成。' 前者 含有 23S 与 5S RNA 分子与 31 种蛋 白质， 后者包 含一个 16S RNA 分子与 21 种蛋 白质。 真核 生物的 80S 核糖 体含有 60S (28S、 5.8S 和多种 5SRNA) 和 40S (18SRNA) 两 个亚基 。染 色 质含有 DNA 和 碱性组 蛋白。 病 毒也是 一种蛋 白质复 合体。 i 膜 縣脂和 銷脂形 成极性 基团在 外表、 姪 链在内 部的双 分子层 。膜 蛋白可 能是外 周蛋白 或整合 蛋白， 并起 着受体 、酶、 转运 蛋白或 细胞间 介质的 作用。 大 量的弱 相互作 用维系 大分子 组装在 一起。 电荷与 电荷、 电荷与 偶极 W 及偶 极与 偶极之 间的相 互作用 构成了 全部或 部分带 电原子 间的吸 引力。 氯 键和排 斥水的 疏水作 用也很 重要。 4 戶 共价相 互作用 巧 关主题 生物 大分子 （A3) rRNA 加工与 核糖体 （01) 染色 质结构 （D2) 蹈 菌体与 真核生 物病毒 （R) 蛋白质 细胞 结构包 含着许 多由同 种或不 同种生 物大分 子组成 的大分 子复合 复合体 体。 细胞的 主要构 件和运 动元件 中许多 是由蛋 白质复 合体构 成的。 细胞骨 架就是 一系列 蛋白质 微丝， 这些微 丝组构 细胞的 形态、 控制 着细胞 的运动 及 亚细胞 器在细 胞内的 分布。 微 管蛋白 是一个 llOkDa 的球 形蛋白 ，其 纵向 排列呈 长多聚 体即形 成微管 （图 A4.1， 参见 B2)。 微 管是细 胞骨架 真核生 物纤毛 和鞭毛 W 及许 多细胞 表面毛 状结构 的主要 组分。 这些 结构物 的 运动可 移 动细胞 或移动 液体穿 过细胞 表面。 纤毛也 含有动 力蛋白 (dynein) 和 微管连 接蛋白 （nexin)。 由肌动 蛋白组 成的微 遂与肌 球蛋白 一起形 成收缩 装置， 可引起 细胞质 运动。 肌动蛋 白和肌 球蛋白 也是肌 肉纤维 的主要 组分。 细胞 骨架中 的中间 纤 维由包 括角蛋 白在内 的各种 蛋白质 组成， 并 具有包 括巩固 细胞结 构等多 种 功能。 在 所有情 况下， 运动 所需能 量是由 ATP 或 GTP 的 偶联水 解所提 12 A 细胞与 大分子 核蛋白 供。 300 么 (30 nm) 图 A4.1 微 管中微 管蛋白 a 和 P 亚基的 横截面 （a) 和表面 （b) 的 示意图 （参 见 B2) 经 Freeman, W. H. 及其 出版商 同意， 引自由 Lubert Stryer 主编的 {生 物化学 > Stryer, 1995 核 蛋白由 核酸与 蛋白质 组成。 核糖 体是较 大的细 胞质核 糖核酸 蛋白质 复 合体， 是蛋白 质的合 成场所 （参见 Q)。 细菌 70S 核糖 体含有 大亚基 (50S) 和 小亚基 （30S)， 总分子 质量为 2.5xi06Da (50S 的 S 值是 沉降系 数 的数值 S， 它描述 了大分 子或粒 子在离 必场中 沉降的 速率。 由分 子或颗 粒 的质量 与形状 决定， 因此 S 值不 是可加 的）。 50S 亚 基包含 23S、 5S RNA 分子和 31 种不同 蛋白质 ，而 30S 亚 基包含 16S RNA 分子和 21 种蛋 白质。 真核 生物的 80S 核搪 体含有 60S (包括 28S、 5.8S 和多种 5SRNA) 和 40S (含 18SRNA) 两个 亚基。 在合 适的条 件下， rRNA 和蛋白 质的混 合物在 体外可 W 精确的 程序自 动组装 成有功 能的核 糖体。 可 见核搪 体结构 的全 部信息 都胆藏 在其组 分的结 构中。 RNA 不仅是 核糖体 蛋白组 装的框 架， 还参 与信使 RNA 的结 合与肤 链合成 的催化 （参见 Q2)。 染色 质是构 成真核 生物染 色体的 元件， 是一个 由大约 等量的 DNA 与 小分子 的碱性 蛋白质 即称为 组蛋白 （参见 D1) 所组 成的脱 氧核蛋 白复合 体。 送 些复合 体形成 被称为 核小体 的重复 单位。 核小 体和许 多其他 蛋白质 复合体 的正确 组装均 需要装 配蛋白 或伴娘 蛋白。 组蛋白 中和了 DNA 糖- 憐 酸骨架 负电荷 间的排 斥力， 并使 DNA 在染色 体中紧 密堆积 在一起 。病 毒是核 蛋白复 合体的 另一个 例子， 将在 R 中被 详述。 膜 将憐 脂与销 脂置于 水中， 会自发 地形成 一个极 性基团 在外、 非 极性炫 链 在内的 脂双分 子层， 这 是所有 生物膜 的结构 基础。 这样的 膜构成 了细跑 A4 大分子 的组装 13 和细 胞器的 边界， 并 且不带 电荷的 分子可 选择性 透过。 精细 的脂类 成分随 细胞与 细胞器 的不同 而异。 蛋白质 也是细 胞膜的 一个主 要组分 （图 A4.2)。 外 围膜蛋 白疏松 地结合 在外表 或通过 一个脂 或糖基 雜脂醇 错定在 膜上， 且易于 流动。 镇嵌 膜蛋白 被埋在 膜中， 不破坏 膜就不 能移动 这些蛋 白。 当跨 膜蛋白 完全横 跨双层 膜时， 一些蛋 白质则 从膜的 内外表 面突出 (portrude), 这 些蛋白 质既有 处于细 胞膜外 的结构 域又有 细胞内 结构域 (参见 B2)。 这些 蛋白质 的跨膜 区主要 含有疏 水性氨 基酸。 膜蛋白 有多种 多样的 功能， 例如： - 作为激 素和神 经递质 等信号 分子的 受体； - 作为 在吸收 物质前 降解细 胞外分 子所需 的酶； - 作为 选择性 转运小 分子、 极 性离子 和分子 的孔或 通道； • 作为 细胞与 细胞相 互作用 的介质 （主要 是糖蛋 白）。 图 A4.2 显示主 要大分 子组分 的细胞 膜结构 示意图 非共 价巧互 大多数 大分子 的组装 是由大 量不同 的非共 价相互 作用维 系在一 起的。 作用 电荷- 电荷相 互作用 （盐 桥） 存在 于生理 pH 条件下 带有相 反电荷 的离子 基团 之间， 例如在 DNA 中的带 负电的 憐酸基 团和带 正电的 DNA 结合蛋 白诸如 组蛋白 的赖氨 酸和精 氨酸侧 链之间 （参见 D2)。 电荷- 偶极和 偶巧- 偶极 间相互 作用比 较弱， 且 由于分 子中的 电荷的 不对称 分布， 当其 中之一 或两个 都是偶 极时， 才形成 这种较 弱的相 互作用 （图 A4.3a)。 甚 至像甲 基这 样不带 电的基 团由电 子运动 引起的 瞬时偶 极的作 用也可 W 有弱 的相互 吸引 （色散 力）。 电中性 分子间 的非共 价结合 被总称 为范德 华力。 氯键 也是重 要的一 类， 在 供体基 团的一 个共价 结合的 氯原子 （例 如： 一 O — H 或 — N — H ) 和 受体基 团上一 对非成 键电子 （例 如： 0=C — 或 N — ) 之 间形成 （图 A4.3b)。 氯 键和包 含偶极 的其他 相互作 用是具 有方向 性的， 因 此这有 助于确 定大分 子形状 和分子 间相互 作用的 特性。 不 带电和 非极性 物质的 存在， 例如 脂类， 在水环 境中会 在水分 子中建 立一个 高度有 序的结 构。 当 体系的 俯值减 小时， 这 在能量 上是不 利的。 因 此非极 性分子 倾向于 14 A 细胞与 大分子 聚 集起来 W 减小 暴露给 水的表 面积。 这种 引力被 称为疏 水相互 作用， 是蛋 白质 -蛋白 质和蛋 白质- 脂类相 互作用 W 及核 酸结 构中的 主要稳 定力。 (a) I 8 - 5/ =N* 0 二 C' I \ 电 荷偶极 \8" S' \6" 扩 ^C=0---C— 0H 偶极 偶极 S+ 5— S+ 扩 — CHj HgC — 色散力 (b) C 8+ II 9 5* H I N 5' / \ 氨键 图 A4.3 范 德华力 （a) 和氯键 （b) 的例子 (董 晚柄译 刘进 元校） B 番白 质结构 B1 氨基酸 要 点 蛋白 质中已 发现的 20 种常见 的氨基 酸都有 一个与 质子、 氨基、 緩 基相连 的手性 a- 碳原 子和具 有不同 的理化 特性的 侧链。 氨基 酸 在溶液 中表现 为两性 离子， 蛋白质 中的稀 有氨基 酸通过 翻译后 修饰 产生。 结 构 谷氨酸 与天冬 氨酸都 含一个 緩基， 通常给 蛋白质 增加一 个负电 带电荷 的側韓 荷。 赖氨酸 有一个 e- 氨基、 精氨酸 有一个 脈基、 组氨酸 有一个 咪 嗤基， 这 兰个碱 性氨基 酸通常 给蛋白 质增加 一个正 电荷。 不 带电的 化 性側结 非 化性脂 杨 炫側链 丝氨 酸和苏 氨酸有 哲基、 天冬 醜胺与 谷氨醜 胺有亚 胺基、 半脱氨 酸 有一个 琉基。 甘氨酸 是最简 单的氨 基酸， 没有 侧链。 脯氨酸 是次级 氨基酸 （亚 氨 酸）， 丙 氨酸、 额 氨酸、 亮氨 酸和异 亮氨酸 有疏水 的脂肪 炫基。 甲 硫氨酸 有一个 W 硫 醋键连 结的硫 原子。 芳香 族側键 苯丙 氨酸、 酪 氨酸和 色氨酸 带有可 吸收紫 外光的 芳香族 侧链。 巧 关主题 蛋白 质结构 与功能 （B2) 蛋 白损合 成机制 （Q2) 结构 蛋 白质是 L- 氨基 酸的聚 合物。 除 了脯氨 酸外， 蛋白质 中已发 现的所 有氨 基酸都 有一个 共同的 结构， 即与一 个緩基 相连的 a- 碳 原子、 一个氨 基、 一个质 子和一 个随氨 基酸不 同而异 的侧链 （R) (图 B1.1)。 除 了甘氨 酸外， 所有的 a- 碳 原子均 具手性 （不 对称 的）， 即它 与四个 不同的 化学基 团 相连。 因此 氨基酸 存在着 成对的 光学活 性立体 异构体 （0-和1^-)。然 而在 蛋白质 中仅仅 发现了 L 型异 构体。 在水 溶液中 氨基酸 是两性 寓子， 可 W 呈酸性 和碱性 （兼性 的）。 侧 链可在 大小、 形状、 电荷 和化学 活性上 不同， 这导 致了不 同蛋白 质的性 质各异 （图 B1.2)。 一些蛋 白含稀 有氨基 酸， 如胶 原中的 4 - 咨基脯 氨酸和 5 - 姪基赖 氨酸， 它 们是经 脯氨酸 和赖氨 酸的 翻译后 修饰而 形成的 （参见 Q4)。 coo— H3N* — C 一 H 图 B1.1 L- 気基酸 的一般 结构。 R 基团表 示侧链 16 B 蛋白 质结构 带 电側链 夭 冬氨巧 (Asp.D) -CHjCOO' 不 带电极 巧側巧 丝氨巧 (Ser, 句 - CHjOH 非 极性脂 巧侧链 甘気酸 (Gly. G) -H 谷氨厳 但 lu, 日 -CHjCHjCOO' 苏氨巧 fThr. 巧 -CH{0H)CH3 丙気酸 (Ala. A) -CH3 组気酸 （His. H) y 天 冬病胺 (Asn, N) -CH2CONH2 资氨酸 (Val. V) -州(州3)2 赖氨巧 (Lys, K> - (州2)具+ 谷 氨規胺 (Gin, Q) -CHjCHjCONHj 亮氨酸 (Leu, L) - 州2州(州3)2 培氮巧 (Arg, R) /NH2 半 化氨巧 (Cys. C) -CHjSH 异亮 氨酸印 e, I) -饥(化3)州2州3 — (CHjlaNHC 甲 硫氨酸 (Met. M) 脯氨酸 (Pro, -(CHzkS 州 3 Hj^N- P)a COO' 芳香 巧侧链 H 苯 丙氨酸 （Phe. F) 酪氨酸 nVn Y) 色氨酸 （Trp. W) 图 B1.2 20 种常 见氨基 酸侧链 （R)。 括 号给出 了标准 兰字母 缩写和 一字母 缩写。 a: 脯氨 酸结构 显示 出它是 一个亚 氨基酸 带电 荷的侧 W pH 等于 7 为 一个参 考点， 在此 pH 下 几种氨 基酸侧 链上有 提供额 链 外的 正或负 电荷离 子化的 基团。 酸性 氨基酸 天冬黃 酸和谷 氨酸， 带 有通常 离子化 的额外 的綾基 （带 负电 荷）， 而碱 性氨基 酸有带 正电的 基团， 如巧 急酸有 亚急基 连接在 e- 碳原 子上， 精 氨酷则 有一个 脈基。 组氨酸 的咪嗤 基团的 pK。 接近 中性， 在生理 条件下 这个基 团可逆 的质子 化贡献 于许多 酶 的催化 机制的 实现。 酸性和 碱性氨 基酸可 W 组成 蛋白质 中重要 的盐桥 (参见 A4)。 不带 电的极 不带电 的极性 侧链氨 基酸含 有可与 水形成 氯键的 基西。 与带电 氨基酸 一 性侧链 起， 常 被称为 亲水急 基酸。 丝氨 酶和苏 量酸有 餐基， 而天冬 巧胺和 谷氯酪 胺是 由天冬 氨酸和 谷氨酸 的胺衍 生物。 半腕 氨酸有 一个易 被氧化 硫醇基 (琉 基）， 琉基 氧化后 生成脱 氨酸， 其两 个半脫 氨酸的 琉基间 可形成 在结构 上很 重要的 二硫键 （参见 B2)。 B1 氨基酸 17 非极 性脂肪 甘 ■急酸 的侧链 位置有 一个氯 原子， 不 具光学 活性。 脯氨 酸是一 个亚氨 炫侧链 基酸。 丙 氯酸、 鄉 急酸、 亮募 酸和异 亮氧酸 的侧链 上带有 疏水性 烧基， 在蛋 白 质结构 中参与 疏水相 互作用 （参见 A4)。 甲 硫氧酸 在烧基 侧链中 有一个 W 硫 酷键相 连的硫 原子。 芳香 族側链 苯丙 氯酸、 酪 氨酸和 色氯酷 有较大 的疏水 侧链， 其芳香 结构承 担蛋白 质 的紫外 吸收， 吸收在 280nm 最大。 酪氨 酸的龄 餐基也 能形成 氯键。 B 蛋白 质结构 B2 蛋白 质结构 与功能 公々'々/々々/5='舍々分宙-&/々々^。/巧'*^分々々/3^*/》*/»>*/&々/5^々/&、*/»分々*«»>*^々^ 要 点 大小 与形状 包括许 多酶在 内的球 蛋白， 在溶液 中呈紧 密的、 几乎球 形的颗 粒。 纤维 蛋白有 一个高 轴比， 在 结构形 成上很 重要， 例如 丝蛋白 (fibroin) 和 角蛋白 （keratin), 大小 范围可 W 从几 千到几 百万道 尔顿。 一些 蛋白质 常与非 蛋白性 物质相 结合， 例如 脂类、 糖或某 些较 小的辅 因子。 一 级结构 氨 基酸在 a- 緩基与 a- 氨基间 肤键 相连， 形成的 多肤链 有一个 N 端 和一个 C 端。 U> (这种 方 式相连 的多肤 通常有 100 〜 1500 个 氨 基酸。 二 级结构 多肤可 W 折叠 成几 种规则 结构， 右手 a -螺旋 每圈有 3.6 个氯基 酸， 在 肤链的 N — H 与相 隔兰个 残基的 C=0 基 团间形 成氯键 W 稳定 其整体 结构。 平 行和反 平行的 p- 折 叠片层 在肤链 的不同 部 位间由 氨键来 稳定。 王 级结构 不同的 二级结 构区域 和连接 区的组 合折叠 成一个 确定的 兰级结 构， 结果是 绝大多 数亲水 性氨基 酸在外 表面， 而疏 水性氨 基酸在 内部， 其结构 经非共 价相互 作用， 有 时是二 硫键来 稳定。 变性往 往导 致二级 和兰级 结构的 丧失。 四 级结构 许 多蛋白 质有多 于一个 的肤链 亚基， 如血红 球蛋白 有两条 a 链和 两条 (3 链。 像微 管这样 的巨大 复合体 是由单 个肤链 的四元 结合体 组 成的。 别构 效应通 常取决 于亚基 的相互 作用。 輔 基 连接蛋 白可与 提供额 外化学 功能的 非蛋白 分子相 结合。 辅 基包括 烟 醜胺二 核昔酸 （NAD+)、 血红 素和金 属离子 （例如 Zn2+)。 蛋白质 的巧能 蛋白 质具有 广泛的 功能： - 酶 可催化 绝大多 数生化 反应， 底物 的结合 取决于 特异的 非共价 相互 作用。 •当与 配体结 合时， 膜受体 蛋白将 信号传 入细胞 内部。 •转 运与 贬存， 例如 血红蛋 白在血 液中转 运氧、 铁 蛋白在 肝脏内 贬 存铁。 •胶 原和 角蛋白 是重要 的结构 蛋白， 肌动蛋 白和肌 球蛋白 构成有 收缩力 的肌肉 纤维。 - 酪蛋 白和卵 清蛋白 是为生 长提供 氨基酸 的营养 蛋白。 - 免疫系 统依赖 抗化蛋 白抵御 感染。 B2 蛋白 质结构 与功能 19 • 调节蛋 白诸如 转录因 子具有 结合并 调节其 他分子 （如 DNA) 的 功能。 结 构域、 基序、 家族与 进化 结构域 可在一 条化链 中形成 半独立 的结构 和功能 单位。 结 构域常 由一个 基因中 的单个 外显子 编码。 新 的蛋白 质可能 是从外 显子的 新组 合即由 此产生 的蛋白 质的结 构域的 重新组 合进化 而来。 基序 (motif) 是二级 结构元 件组合 或在蛋 白质家 族的相 关成员 中常发 现的 氨基酸 序列。 相似 的结构 基序常 在没有 序列相 似性的 蛋白质 中 发现。 蛋白 质家族 通过基 因复制 和随后 的新基 因趋异 进化产 生。 相 关主题 生物 大分子 （A3) 大分子 的组装 （A4) 氨基酸 （B1) 蛋白 质合成 （Q) 大小 与形状 蛋 白质可 W 区分为 两大类 球蛋白 和纤维 蛋白。 球蛋 白紧密 折叠， 在溶 液 中呈近 似球状 颗粒， 自 然界中 的绝大 部分酶 是球形 蛋白。 纤维蛋 白呈高 轴比 （长 / 宽）， 是重要 的结构 蛋白， 例如头 发与羊 毛中的 丝蛋白 和角蛋 白。 蛋白质 的分子 质量可 W 从几千 道尔顿 （如膜 岛素有 51 个 氨基酸 ，约 5734Da) 到几 百万道 尔顿， 如 丙禍酸 脱氨酶 这样的 复合体 至少有 500 万 道 尔顿。 一 些蛋白 含有非 蛋白结 合物， 可 小 的辅基 形式在 酶反应 中充当 辅 因子， 或 者是较 大分子 的联合 （例 如脂蛋 白中的 脂类或 糖蛋白 中的糖 类， 参见 A3)。 - 级结构 氮 基酸的 a - 後基通 过醜胺 键与下 一个氨 基酸的 a - 氨基共 价结合 ，在 蛋白 质中通 常称为 化键。 当两 个氨基 酸残基 (这种 方式 相连， 产物 即称为 二化。 许多氨 基酸通 过肤键 相连形 成多狀 （图 B2.1)。 a- 碳 原子和 肤键的 重 复序列 构成了 多肤的 骨架， 而不 同的氨 基酸侧 链授与 蛋白质 的功能 。在 多 肤的一 端的氨 基酸有 一个未 结合的 a- 氨基， 而 另一端 有一个 自由的 a- 援基。 因此， 多肤是 有方向 性的， 有一个 N 端和 一个 C 端。 有时 N 端被 像乙 醜基这 样的基 团封闭 。从 N 端到 C 端的 氨基酸 顺序就 是多化 的一级 结构。 典型的 单个多 肤链的 大小在 100 〜 1500 个氨基 酸范围 之内， 尽管也 图 B2.1 —条 多肤链 的部分 一级结 构图。 方框 中图示 肤键， 在 a- 螺 旋中， 第 n 个 気基酸 残基的 CO 基 团与第 n +3 个氨 基酸残 基上的 NH 基团 W 氯 键相连 （箭 头 所示） 20 有 更长或 更短的 多化。 B 蛋白 质结构 二 级结构 肋键中 C==0 与 N — H 基团的 高极性 性质使 C—N 键具有 部分双 键 特性， 这使得 肤键单 元有刚 性和平 面性， 尽管相 邻肤键 间存在 自由旋 转。 这 种极性 有利于 在适当 的空间 和方向 上的肤 键单元 间形成 氨键， 因此 多肤 链能折 叠成几 种由氨 键维持 的规则 结构。 最熟悉 的二级 结构是 a- 巧 旋 （图 B2.2a)。 肤 链骨架 形成一 个每周 3.6 个 氨基酸 的右手 螺旋， 每个 肤的 N— H 基团都 与相距 3 个 残基的 C=0 基 团间形 成氨键 （图 B2.1)。 a- 螺旋二 级结构 片段常 在球蛋 白和一 些纤维 蛋白中 发现。 P- 折备 片层是 由肤键 N — H 和 C=0 基团与 化链上 另一段 互补的 基团间 W 氯键 . 维系的 （图 B2.2b)。 多 化链中 的几个 片段可 肩并肩 排列， 形成 一个带 侧链 （R) 的片层 结构， 侧链 突出于 片层的 上面或 下面。 如 果这些 片段走 向相同 （例如 N 端一 "C 端）， 片层是 正向平 行的； 如果它 们选择 N 一 C 和 C-N, 那么 片层是 反向平 行的。 （3 -折 叠坚硬 牢固， 是重要 的结构 蛋白， 如丝 蛋白。 结缔组 织蛋白 —— 胶原蛋 白有一 个独特 的三股 巧旋的 二级结 构， 其中 兰条化 链互相 缠绕， 使 其十分 牢固。 图 B2.2 二级 结构。 （a) a- 螺旋， 图 中仅标 出化链 骨架的 a - 碳、 化键上 C 和 N 原子； （b) p- 折叠 H 级结构 不 同片段 a- 螺旋、 P- 折叠、 其他 微二级 结构和 连接环 进一步 折叠成 兰维 构象的 组织水 平即多 化的三 级结构 （图 B2.3)。 兰级结 构的特 性存在 于一 级结构 之中， 给予 合适的 条件， 绝大 多数多 肪:将 自发折 叠成正 确的兰 级 结构， 因 为那通 常是序 列能量 最低的 构象。 然而 在体内 正确的 折叠， 常 B2 蛋白 质结构 与功能 21 四 级结构 辅基 常需要 称为伴 娘蛋白 （chaperone) 的 蛋白质 帮助， 伴娘蛋 白在蛋 白质合 成 （和 一级 结构） 结束前 阻止新 生多肤 的错误 折叠。 折叠 就是： 带 有亲水 侧 链的氨 基酸主 要位于 蛋白质 外部， 可与 水或溶 剂离子 反应， 而疏 水氨基 酸 被埋在 疏水的 内部， 这使 得结构 总体上 稳定。 侧链 间各种 类型非 共价相 互作 用维系 着兰级 结构， 这 些相互 作用包 括范德 华力、 氯键、 带相 反电荷 基团 之间静 电盐桥 （如 赖氨酸 e- NH3+ 基 团和天 冬氨酸 或谷氨 酸侧链 COCT 基团 之间） W 及存 在于芳 香族和 脂肪族 氨基酸 非极性 侧链间 的疏水 相 互作用 （参见 A4)。 另外， 共价二 硫键可 W 在两 个半脫 氨酸残 基间形 成， 这两 个半脫 氨酸在 一级结 构中可 能相距 很远， 但 在折叠 的兰级 结构中 会靠得 很近。 通 过加热 及极端 pH 可 W 破 坏二级 和兰级 结构， 这 将导致 蛋白 质的变 性和无 规卷曲 构象的 形成。 N 图 B2.3 蛋 白质兰 级结构 示意图 许多 蛋白质 由两个 或多个 多化链 （亚 基） 构成。 其多 化链可 W 是相同 的或不 同的。 血 红蛋白 （hemoglobin) 有两个 a 球蛋 白链 和两个 g 球蛋白 链 （a2 耗）。 稳 定兰级 结构的 为同样 可维系 亚基在 一起， 包 括不同 多化链 的半 化氨酸 间的二 硫键。 这一 组织水 平被称 为四级 结构， 有 着特定 的重要 性。 首先， 可构 成很大 的蛋白 分子。 微 管蛋白 是一个 二琴体 蛋白， 由两个 较 小的不 相同的 a 和 (3 亚基 组成。 依靠微 管结合 GTP 的 水解， 这 些二聚 体 聚合成 含有数 百计的 a 和 P 亚基 的结构 （参见 A4， 图 A4.1)， 这些 就是 细胞骨 架中的 微管。 其次， 它能通 过复合 不同活 性于一 个整体 赋予一 个 蛋白质 W 更多 功能， 如脂 肪酸合 成酶复 合体。 常常 这些亚 基间的 相互作 用通 过与一 些小分 子的结 合而被 修饰， 导致在 酶调节 中所看 到的别 构效应 的 发生。 许多 连接蛋 白可与 被称为 辅基的 小分子 W 共 价或非 共价键 相结合 ，给 蛋 白质提 供氨基 酸侧链 所不能 提供的 功能。 辅 基的许 多是酶 催化反 应中的 辅 因子， 例 如许多 脱氨酶 中的烟 醜胺二 核昔酸 （NAD+)、 转氨酶 中的憐 22 B 蛋白 质结构 蛋白 质的功 能 结构域 、基 序、 家族与 进化 酸化 咚整、 血红蛋 白和细 胞色素 中的血 红素、 金 属离子 （例如 Zn2+) 等。 没有辅 基的蛋 白质被 称为脱 辅基蛋 白质。 •酶 。除 了少数 有催化 活性的 RNA 分子外 （参见 02)， 几 乎所有 的酶都 是蛋 白质。 酶可 W 将生化 反应速 度提高 几个数 量级。 底物 结合涉 及与特 巧氨基 酸侧链 间的各 种非共 价相互 作用。 这 些相互 作用包 括范德 华力、 氯键、 盐 桥和疏 水力。 结合的 特异性 极高， 像只与 单一底 物结合 （例如 煎萄糖 氧化酶 只与葡 萄糖结 合）， 或者是 基团特 异性的 （例 如己 糖激酶 与各种 己糖结 合)。 侧 链也可 W 直 接参与 催化， 例 如可作 为亲核 体或质 子 供体或 受体。 - 信 号传递 。细胞 膜上的 受体蛋 白质可 与来 自细胞 外介质 的配体 （如 激素） 结合， 通 过最终 的构象 改变， 在细胞 内启动 对应于 配体的 反应。 配 体结合 与底物 结合很 相似， 但 配体通 常保持 原形。 一些 激素本 身是小 分子蛋 白质， 如 膜岛素 和生长 激素。 - 转运 与胆存 。血红 蛋白在 红细胞 中转运 氧气， 而 转铁蛋 白转运 铁至肝 脏， 铁 离子一 旦进入 肝脏， 就与 转铁蛋 白结合 W 铁 蛋白的 形式储 存于肝 脏。 摄入的 脂肪在 血液中 W 脂蛋 白形式 转运。 许多 其他分 子和离 子也都 蛋 白质结 合形式 转运和 贬存， 这样 在需要 用它们 之前， 可 W 增 加溶解 性、 减 小反应 活性。 - 结构 与运动 。胶原 蛋白是 皮肤、 骨骼 和结缔 组织中 主要的 蛋白质 ，而 头发 主要由 角蛋白 组成。 细胞内 还有许 多结构 蛋白， 例如 细胞骨 架中的 许多蛋 白质。 主要 肌肉蛋 白肌动 蛋白和 肌球蛋 白组成 T 滑行 丝， 成为肌 肉 收缩的 基础。 - 营养 。酪 蛋白和 卵清蛋 白分别 是奶和 蛋中主 要的蛋 白质， 被用 来为发 育 中的后 代生长 提供氨 基酸。 种子蛋 白质也 为萌发 的植物 胚提供 营养。 - 免疫。 可 W 识别 并结合 细菌、 病毒和 其他外 源物质 （抗 原） 的 抗体， 也是蛋 白质。 - 调节。 转录 因子与 DNA 结合并 调节其 功能。 许多 其他蛋 白质通 过与其 他分子 的结合 修饰其 功能。 许多蛋 白质由 结构上 独立的 单元或 结构域 组成， 结构域 是在同 一多肤 中有 限的高 度有序 结构片 段相连 而成。 这种连 接像较 链一样 使单个 结构域 成相互 关联地 移动， 用有 限的蛋 白水解 方法破 坏这种 连接常 可将结 构域相 分离， 分离开 的单个 结构域 可像单 个球蛋 白一样 行动。 酶的 活性位 点有时 就 形成于 环绕底 物的两 个结构 域间的 沟中， 结构 域也可 W 有如 与常 用分子 ATP 结合 的特殊 功能。 当 许多不 同蛋白 质需要 这一功 能时， 常会 在它们 中发现 相同的 结构域 结构。 在 真核生 物中， 结 构域常 由基因 中的不 连续部 分称为 外显子 来编码 （参见 （)3)。 因此 人们推 测在进 化中， 经基因 组中编 码结构 域的外 显子的 复制与 重排产 生结合 位点、 催化 位点和 结构元 件的新 B2 蛋白 质结构 与功能 23 组合， 从而最 终产生 出新的 多化。 这样新 的功能 蛋白质 的进化 速率可 大 大 加快。 结 构基序 （也 称为 超二级 结构） 是 频繁出 现在球 蛋白中 的二级 结构元 件群， 它们常 常在功 能上很 重要， 代表 着蛋白 质家族 从其同 祖先进 化过程 中保留 下来的 保守的 结合位 点或催 化位点 的必要 部分； 换言 之他们 代表着 在 不相关 蛋白质 凑在一 起实现 结构- 功能统 一的最 佳解决 方案。 一 个普通 的 例子是 P 雌基 序， 其中 P- 折 叠片层 的两个 连续平 行链间 的连接 是一个 a- 螺 旋结构 （图 B2.4)。 两个重 叠的如 P 基序 （批恥 |3) 形成 了许多 不相关 蛋白质 中的二 核巧酸 （如 NAD+) 结合 位点， 其他基 序仅由 少数保 守的、 功能上 重要的 氨基酸 组成， 而不是 超二级 结构。 图 B2.4 帖3 基序。 a- 螺旋 用卷曲 的带子 表示， p- 折 叠片层 用平箭 头表示 蛋 白质家 族起源 于一个 古老基 因的连 续复制 和随后 的庭异 进化。 肌红 蛋白 （myoglobin) 即肌肉 中携氧 蛋白、 成 人血红 蛋白中 a - 与 p - 球 蛋白链 (和 微小的 S 链） W 及胚性 和胎儿 血红蛋 白中的 y、 e 和 球蛋白 都是球 蛋白家 族的相 关多化 （图 B2.5)。 这些 蛋白和 基因被 称作是 同源的 （ho- mologs)。 不同物 种的具 有相同 功能， 承担相 同生化 角色的 蛋白质 家族成 祖先 珠蛋白 血 红蛋白 肌 红蛋白 时间 图 B2.5 来 自同一 个祖先 珠蛋白 基因的 进化树 24 B 蛋白 质结构 员 （如 大鼠 和小鼠 的肌红 蛋白） 为直 向同源 （定 向进 化同源 orthologs)。 而那些 进化不 同但功 能类似 的蛋白 （如 a- 球 蛋白与 (3 -球 蛋白） 为 共生同 源 （平 行进 化同源 paralogs)。 不 同生物 体的一 个蛋白 质家族 直向同 源成员 间氨 基酸序 列的相 似程度 取决于 两个生 物体从 共同祖 先歧化 的时间 及该 序列 的保守 性对蛋 白质功 能的重 要性。 一个蛋 白质的 功能， 无论 是催化 或是结 构性的 （structural), 均天生 与结构 相关。 如上 所述， 由庭 同进化 (convergent evolution) 可得 到具有 类似结 构和功 能的蛋 白质， 即无 关基因 进化至 产生具 有相似 结构和 催化活 性的蛋 白质。 蛋白 水解酶 （细 菌） 与糜 蛋白酶 （功 能） 就是 一个很 好的例 子。 尽管它 们的氨 基酸序 列差别 很大， 由不 同的结 构基序 组合， 但 通过进 化， 他们気 基酸活 性位点 的催化 三联体 —— 丝 氨酸、 组 氨酸、 天 冬氨酸 (catalytic triad) 具 有相同 的空间 取向使 用几乎 相同的 催化机 理去水 解 化键。 这样的 蛋白质 称为功 能巧似 （functional analog), 而相似 结构基 序独立 进化， 结果形 成的蛋 白质结 构相似 （structucral analog)。 B 蛋白 质结构 B3 蛋白质 分析法 要 点 蛋白 质纯化 I 从 细胞粗 提物中 纯化蛋 白质可 通过依 据不同 特性进 行分离 的方法 组合来 进行。 凝胶过 滤层析 （gel filtration chromatography ) 是根 据蛋 白质的 大小来 分离； 离子交 换层析 （ ion-exchange chromato- graphy)、 等 电聚焦 （isoelectric focusing) 和 电泳均 是根据 蛋白质 所 带离子 电荷的 不同来 分离； 疏水相 互作用 层析利 用了疏 水性的 不同； 亲和层 析依赖 酶或者 受体与 配体间 特殊亲 和性， 如 底物与 抑制 物的亲 和性来 进行分 离的。 蛋白 质的过 量表达 会大大 提高产 量， 在重组 蛋白中 加入纯 化标签 （tag) 可达 到一步 纯化。 蛋白 质測序 I 用 特异的 蛋白酶 或化学 试剂将 多肤切 割成较 小的化 段后， 肤段可 在自动 测序仪 中利用 Edman 降解法 （ Edman degradation ) 从 N 端开始 测序。 通过不 同特异 性的蛋 白酶切 割产生 的重叠 片段的 重排再 现原始 序列。 为 了得到 一个蛋 白质序 列而对 其基因 或互补 DNA (cDNA) 进行测 序比对 蛋白质 测序要 简单。 分子 质量的 确定 通过凝 胶过滤 层析和 SDS 存在下 的凝胶 电泳可 W 获取蛋 白质的 近 似分子 质量。 利 用电喷 射电离 （ electrospray ionization, ESI) 和基 质辅助 激光解 吸电离 （ matrixassisted laser desorption/ ioniza- tion techniques, MALDI) 质谱可 给 出小于 lOOkDa 蛋白 质的准 确分子 质量。 质 谱也能 检测翻 译后的 修饰。 X 射线 晶休学 与括: 巧共化 许多蛋 白质可 W 结晶， 利用 X 射线 衍射可 确定 它们的 兰级结 构。 溶液中 小分子 质量的 蛋白质 结构可 通过 多维核 磁共振 (multidimensional nuclear magnetic resonance) 来 确定， 尤 其是正 常的 12c 和 "N 被 13c 和 "N 取 代后。 巧 能分析 I 对于一 个蛋白 质进行 功能分 析包括 对它进 行分离 纯化， W 及在突 变体 中由于 基因突 变或缺 失而使 蛋白质 缺失， 通过 研究突 变体的 表现 来研究 蛋白质 功能。 有时 也可通 过将一 个新蛋 白的序 列和结 构 与已知 蛋白比 较来预 测它的 功能。 蛋白 质组学 I 在 给定条 件下对 任何特 定细胞 类型的 所有表 达蛋白 进行分 析与鉴 定即 蛋白质 组学。 相 关主題 亚 细胞器 （A2) 蛋白 质结构 与功能 （B2) 26 B 蛋白 质结构 蛋白 质纯化 一 个典型 的真核 细胞可 W 含有数 W 千计 的不 同蛋白 质，' 一些含 量十分 丰富， 一 些仅含 有几个 拷贝。 为了 研究某 一个蛋 白质， 必须 首先将 该蛋白 从 其他蛋 白质和 非蛋白 质分子 中纯化 出来。 用 于分离 蛋白质 的最重 要特性 有 大小、 电荷、 疏水 性和对 其他分 子的亲 和性。 通常 采用多 种方法 的组合 来实现 蛋白质 的完全 纯化。 大小 凝胶过 滤层析 采用填 充有特 定孔径 的颗粒 悬浮液 的柱子 （分 子筛） 进行， 将样品 上样在 柱子顶 端时， 比孔径 大的蛋 白质分 子很快 被洗脱 至底部 ，因 为它们 被排除 在颗粒 之外， 因 而所需 缓冲液 洗脱体 积相对 较少。 比 孔径小 的 分子可 W 进入 颗粒， 因而 需要相 对较多 的缓冲 液洗脱 体积。 将小 分子在 大 分子之 后从柱 上洗脱 下来。 超 速离必 时蛋白 质在高 速离私 场中的 沉降速 度 （S 值） 随它的 大小和 形状不 同而异 （参见 A4)。 超 速离必 不仅可 W 用 于 分离蛋 白质而 且也是 研究蛋 白质结 构的有 力分析 工具。 电荷 由 于蛋白 质表面 离子化 侧链的 存在， 蛋白 质带净 电荷。 由于 这些侧 链都是 可 滴定的 （titratable), 对于 每个蛋 白都存 在一个 pH 使它的 表面净 电荷为 零即 等电点 （pi)。 在等电 点时蛋 白质最 难溶。 在 等电点 外的所 有其他 pH 值， 依据蛋 白质所 带净电 荷采用 电泳和 离子交 换层巧 来分离 和纯化 该蛋白 质。 在电 泳中， 蛋白质 混合物 被置于 支持介 质上， 通常 是一块 凝胶， 一个 电 场加于 胶上， 根据蛋 白质所 带的净 电荷的 多少将 W 不同的 速度向 阴极或 阳极 运动， 分 离后可 从胶上 回收。 在离子 交换层 析中， 结合 在堆积 于柱中 的不 溶的支 持物上 （离 子交 换剂） 的带电 离子， 可 可逆地 被溶液 中带电 蛋白质 置换。 不 同的蛋 白质对 离子交 换剂的 亲和力 不同， 因 而需要 不同的 离 子强度 再取代 他们。 通 常用一 个离子 强度不 断增长 的盐浓 度梯度 通过柱 子， 结合 的蛋白 质可分 别洗脱 下来。 在 等电聚 焦中， 被称为 多巧两 性电解 质的缓 冲液混 合物通 过电场 作用可 W 形 成一个 pH 梯度。 蛋 白质在 这个样 度中 迁移至 相应的 等电点 位置。 随着净 电荷趋 于零运 动停止 而形成 致密的 聚集带 （图 B3.1)。 pH 梯度 。 + 44 55 66 77 44 55 66 77 44 55 66 77 图 B3.1 pi 值为 4、 5、 6、 7 的蛋 白质混 合液的 等电聚 焦电泳 在电场 中形成 pH 梯 度后， 蛋白质 迁移并 聚集在 它们的 pi 值位置 B3 蛋白质 分析法 27 蛋白 质测序 化水 •性 在 高离子 强度溶 液中， 蛋 白巧和 柱中含 有的芳 香族或 脂族烧 基物质 之间的 疏 水相互 作用会 增强。 通 过一个 逐渐增 加的离 子强度 梯度， 蛋白质 会在不 同阶段 被洗脱 下来。 亲和性 酶与 底物、 受体与 配体和 抗体与 抗原反 应的高 度特异 性意味 着可依 据这些 特 性对蛋 白质进 行完全 纯化。 例 如一个 用与激 素陕岛 素共价 结合的 支持物 制 成的层 析柱可 W 特 异地结 合膀岛 素受体 而不是 别的蛋 白质。 膜岛 素受体 是一 种低丰 度的细 胞表面 蛋白质 ，可将 膜岛素 的生物 活性传 入细胞 内部。 由 于酶的 竞争性 抑制剂 不会被 要被纯 化的酶 所降解 ，故 常被用 作亲和 配体。 重 组技术 在一个 适合的 宿主细 胞中过 量表达 重组蛋 白质， 产量 的提高 大大简 化纯化 过程 （参见 H1 和 J6)。 例如将 编码蛋 白质的 基因插 入一个 在强启 动子控 制下 的嗤菌 体或质 粒的表 达载体 （参见 K3)， 并 将其转 化大肠 杆菌， 该蛋 白 质的合 成量可 占细 胞总蛋 白质的 30%。 通过在 基因的 5' 或 3' 端加入 6 个组 氨酸密 码子， 形 成用于 纯化的 标签， 可进 一步加 速纯化 进程。 这种情 况下 被合成 的蛋白 质会在 N 或 C 端有 一个六 组氨酸 标签， 这使得 在含有 固定金 属离子 如可与 组氨酸 结合的 Ni2+ 的亲和 柱上， 对蛋 白质进 行一步 纯化成 为可能 。’标 签 通常对 蛋白质 功能没 有什么 影响。 真核 生物蛋 白质可 能需要 在真核 生物宿 主-载 体系统 中表达 获 得正确 的翻译 后修饰 （参见 H4)o 理解蛋 白质是 如何行 使功能 的关键 是了解 其一级 结构。 蛋白质 的氨基 酸组成 分析可 W 用酸 （6mol/LHa， nor, 24h) 水解 化链， 并经 层析分 离所得 氨基酸 的方法 完成。 这一 方法仅 给出了 氨基酸 的个数 例如甘 氨酸有 多少、 丝氨酸 多少， 并 没有给 出实际 序列。 序 列的确 定涉及 要用特 殊的蛋 白水 解酶或 切割特 定化键 的化学 试剂将 蛋白质 分割成 一系列 的小肤 （图 B3.2)o 例如胃 蛋白酶 只切割 赖氨酸 （K) 或 精氨酸 （R) 之后的 肤键， V8 蛋白 酶只在 谷氨酸 （E) 后 切割； 而漠化 氛在甲 硫氨酸 残基后 切割肤 键。 然 后将每 一段小 化用自 动蛋白 质测序 仪采用 Edman 巧解法 （Edman degradation) 进行自 动序列 测定。 其 原理是 异硫氛 酸苯酷 （ phenylisoth- iocyanate, PITC) 与 N 端氨 基酸 反应， 在 酸处理 后释放 乙内醜 苯硫脉 ( phenylthiohydantoin, PTH) 衍 生物， 产 生新的 N 端。 PTH- 氨基 酸经层 析 分离并 与标准 氨基酸 相比而 同定， 重复 循环可 确定下 一个氨 基酸。 原初 28 B 蛋白 质结构 样品 蛋白质 的肤链 顺序可 w 通过 测定经 不同蛋 白酶处 理产生 出的化 段的序 列， 并根 据重叠 序列的 办法推 测出来 （图 B3.2)。 这种方 法既费 力又昂 贵， 因 此大多 数蛋白 质的序 列现在 都是通 过测定 其基因 或互补 DNA (cD- NA) 的 DNA 序 列再根 据遗传 密码子 来间接 测定的 （参见 J2)。 此 法比较 简单且 迅速， 但 不能反 映翻译 后修饰 的状态 （参见 Q4)。 现 在直接 测序通 常用 于验证 N 端序 列或某 些限定 的内部 序列， 这样 的内部 序列为 构建用 于寻找 基因或 cDNA 的寡聚 核昔酸 或抗体 探针提 供信息 （参 见部分 I)。 HLMGSHLVDALELVMGDRGFEYTPKAWLV - - - 序列 T1 : HLMGSHLVDALELVMGDR VI : HLMGSHLVDALE T2 : GFEYTPK V2 : LVMGDRGFE T3 : AWLV V3 : YTPKAWLV HLMGSHLVDALELVMGDR HLMGSHLVDALE LVMGDRGFE GFEYTPK YTPKAWLV AWLV HLMGSHLVDALELVMGDRGFEYTPKAWLV - - - 序列 图 B3.2 多肤序 列测定 图解。 （i) 族 蛋白酶 裂解多 肤链； （ii) V8 蛋白 酶的 裂巧； (iii) Edman 降解法 测定膜 蛋白酶 裂解的 肤片段 （T1~T3) 和 V8 蛋白酶 裂解的 肤片段 （V1~V3) 的 氨基酸 序列； （iv) 根据 重叠肤 段组装 完整的 全长序 列化链 分 子质量 经凝胶 过滤层 析将样 品蛋白 质洗脱 时间与 已知标 准蛋白 的洗脱 时间相 的确定 比 可给出 样品蛋 白的近 似分子 质量。 SDS 聚丙巧 醜胺凝 胶电泳 （SDS PAGE) 也可 用于 确定单 个化链 的大小 （在 离子型 去污剂 SDS 的存在 下， 肤键 失去其 四级结 构）， 因为 SDS 寓子型 硫酸盐 赋予所 有蛋白 质化赖 于质 壁的负 电荷， 此时 电场中 蛋白质 的移动 速度取 决于其 质量而 不是电 荷。 送 些方法 尽管不 够精确 （误差 5%~10%)， 但很 方便且 成本低 。质 谱可是 一个极 为准确 的测定 方法。 分子被 Xe 或 Ar 离子束 气化、 离 子化， 电 磁场中 离子折 射程度 是依赖 其质壁 的并可 W 被测 舊。 然而 送一方 法的测 定上 限仅几 kDa, 而对 蛋白巧 是破坏 性的。 在 这一数 量级范 围内， 现在非 破 坏性离 子化技 术得到 了极大 发展。 电喷 射电离 （SEI) 法 产生一 个高度 带 电的蛋 白质溶 液滴的 细雾， 气化 形成带 电气态 蛋白质 离子； 而基 质辅助 VI V2 T2 V3 T3 B3 蛋白质 分析法 29 激光解 巧电离 （MALDI) 质谱 是通过 激光气 化含有 蛋白质 的固态 基质而 生 成气相 离子。 对 于小于 lOOkDa 的蛋 白质， 用质谱 来测量 其分子 质量精 确 度可达 0.01%。 质 谱仪可 用于测 翻译后 修饰， 最 近也开 发出有 助于蛋 白 质鉴定 W 及序列 分析的 技术。 X 射 线晶体 球形 蛋白质 有确定 的云维 （3-D) 结构， 因 此许多 球形蛋 白质可 W 学和 巧巧共 结晶。 可用 X 射线晶 体衍射 来确定 蛋白质 的兰维 结构。 X 射线与 蛋白质 振 中 的电子 作用， 当一 束射线 通过晶 体时通 过测量 X 射线 的衍 射图像 ，可 W 计算出 晶体中 原子的 位置。 在底物 存在下 结晶一 种酶， 就可 看 到结合 和催 化反应 中精确 分子间 的相互 作用。 溶 液中小 分子球 蛋白结 构也可 W 用 二维 或呈维 核蹈共 振谱来 确定。 核磁共 振中质 子在强 磁场中 被射频 激发后 产生 的质子 松弛谱 （relaxation) 可被 测定。 松 弛谱的 特性取 决于分 子中质 子 的相对 位置。 用于蛋 白质结 构分析 的多维 NMR 需 要进一 步发展 并解决 好 大量质 子产生 的叠加 数据。 用 "c 和 isn 取代蛋 白质中 正常的 i2C 与 i4N 可消 除不必 要的共 振可大 大地改 善数据 解析。 用 这种方 法大至 30kDa 的 蛋 白质结 构都可 被 测定。 用 X 射线和 核磁共 振方法 来确定 蛋白质 结构， 两种方 法的结 果通常 吻合得 很好。 这表 明测定 的结构 就是蛋 白质在 体内的 真实 结构。 功 能分巧 许 多蛋白 的兰维 结构现 在已经 确定。 这些 结构信 息对于 新型药 物的开 发 有很高 价值， 可用来 设计与 目标蛋 白具有 高度亲 和性、 可 特异结 合的新 型 药物。 但是， 确定 兰级与 四级结 构仍是 一个相 当花钱 和困难 的过程 ，且 远远 滞后于 基因组 测序计 划所推 测的新 蛋白一 级结构 的需求 （参见 J2)。 因 此现在 计算机 方法引 起了人 们很大 兴趣， 应用 计算机 技术可 从 简单的 氨基酸 序列信 息预测 蛋白质 结构和 可能的 功能。 这些 方法很 大程度 上是基 于 下 条件； 在 自然界 中仅存 在有限 数量的 超二级 结构， 对 新蛋白 序列用 相 关氨基 酸序列 的已知 兰维结 构的蛋 白进行 作图， 不 过在解 释这样 的结果 时要特 别小必 。 例如； 溶 菌酶与 a- 乳清 蛋白显 示出高 度的序 列同源 （约 70%) 和 结构相 似性， 明显有 着密切 关系。 尽管 a- 乳清蛋 白失去 了溶菌 酶 中可水 解碳水 化合物 的关键 的催化 氨基酸 残基， 结果 仅能与 之结合 ，就 像根 据氨基 酸序列 相似性 预测的 结果那 样它并 不是一 个酶。 因此， 至少在 现在， 了 解一个 蛋白质 的真正 功能， 仍 需要对 它进行 分离， 进而了 解其生 化 与结构 特征。 基因重 组技术 在很大 程度上 有助于 蛋白质 分离。 运 用这些 技术可 克 隆表达 基因组 测序计 划所确 定的新 基因， 并制造 出那些 过去从 未被 检测过 的一些 蛋白质 （参见 J2)。 功能分 析的另 一个重 要方面 是碑定 细 胞中多 个蛋白 质与所 有其他 蛋白质 的相互 作用。 一 个蛋白 质的生 化特征 不会告 诉你该 蛋白质 在细胞 中起什 么作用 ，往 往需 要更多 的遗传 分析。 如果某 一蛋白 质的基 因可通 过突变 失活或 用重组 DNA 技术 删除， 进而 研究产 生的突 变体的 表现型 （phenotype)。 通过与 30 B 蛋白 质结构 已知的 生化信 息一同 考虑， 突变 细胞的 不同表 现有助 于揭示 该蛋白 质在体 内的 功能。 现在 已经可 制作酿 酒酵母 的全部 6000 种蛋白 质或编 码这些 蛋白 质的基 因的突 变体， 生产出 的一套 突变体 将有助 于确定 这一简 单真核 生 物中各 蛋白质 所起的 作用。 蛋白 质组学 与 基因组 （genome) —词 相似， 单词 transcriptome 用 于描述 由一个 细胞 的基因 组转录 的全部 mRNA (参见 K1), 而蛋 白质组 （proteome) 则 用于 描述一 个细胞 在它的 生存期 或它生 存的任 何一个 时间内 转录表 达的全 套 蛋白。 蛋 白质组 也包括 单个基 因由于 转录后 RNA 的不 同剪切 （参见 04) W 及某一 蛋白翻 译后经 修饰所 产生的 全部不 同产物 （参见 Q4)。 虽 然一 个生物 体内细 胞间基 因组是 相当一 致的， 而转录 组与蛋 白质组 在各类 细 胞之间 （如脑 与肝） 差异 很大， 甚 至单一 细胞类 型的不 同细胞 周期内 (参见 E3) 也是 如此； 或是 由于暴 露于不 同的外 界刺激 （如 激素、 生长因 子、 压力） 使 基因表 现型产 生很大 变化。 蛋白 质组学 就是用 高分辨 率的蛋 白质分 离和鉴 定技术 来研究 蛋白质 组。 当前， 最好的 分离方 法是二 维凝胶 电泳。 从一个 细胞或 组织中 所分离 出的 蛋白质 首先在 聚丙啸 醜胺凝 胶中由 所带电 荷在等 电聚焦 作用下 形成窄 带而得 W 分开， 再将凝 胶旋转 90% 蛋白 质在一 块含有 SDS 的凝 胶电泳 中， 由于分 子质量 不同而 再次得 分开。 结果 可得到 一张可 分开几 千种蛋 白系 列的蛋 白斑点 的二维 图谱。 各个点 迹被切 下来， 用蛋白 水解酶 如膜蛋 白酶 处理， 得出该 蛋白质 的一套 肤谱。 样品中 每一个 特定化 段的精 确分子 质 量可由 MALDI 质谱仪 确定， 产生出 该蛋白 质的一 个多化 分子质 量指纹 图谱。 现 在已有 许多生 物体的 丰富的 DNA 序列 信息， 并已 建立起 根据这 些序列 所推测 的指纹 图谱数 据率， 再 将该蛋 白质的 指纹图 谱与之 比较。 上的诸 多程序 可用机 器自动 完成， 一个 给定细 胞的蛋 白质组 的大量 蛋白质 均 可判定 出来。 这样 的蛋白 质定位 对于我 们理解 细胞如 何工作 1=^及 在疾病 中 细胞功 能的改 变极为 重要， 并对 新药设 计药物 化学有 着重大 意义。 药物 公司 将会产 生很大 兴趣， 义满足 他们在 新药设 计时对 蛋白质 信息的 要求。 (董 晚械 译 列进元 校） c 巧酸 的性质 Cl 核 酸结构 要 点 A 基 M ^ 核每酸 璋酸二 S 旨键 DNA/RNA 序列 DNA 双巧族 A 型、 B 型 义 Z 型巧旅 DNA 含有 4 种杂环 碱基； 標 吟类有 腺曝吟 （A) 和 鸟螺吟 （G)， 喀 巧类有 胞喀巧 （C) 和胸 腺啼晦 （T); 而在 RNA 中 尿喀旋 (U) 替代了 结构非 常相似 的胸腺 喀晦。 核昔由 碱基共 价结合 于戊搪 分子的 r 位而 构成。 RNA 中 的戊糖 为核糖 （ ribose ), 构成核 糖核昔 （ ribonucleoside ) 或简称 核昔； 而在 DNA 中 戊糖为 2'- 脱 氧核糖 U'-deoxyribose)， 形成 2'- 脱氧 核 搪核昔 （2'-cleoxyribonucleoside) 或简 称脱氧 核巧。 碱基 + 糖 分子 = 核巧。 核昔酸 由一个 或多个 縣酸基 团共价 结合到 核巧的 3'、 5' 位， 或 2' 位 （在 核糖核 昔中） 而 形成， 即碱基 + 搪分子 + 憐酸分 子= 核巧 酸。 RNA 和 DNA 分别由 相应的 5'- 兰縣酸 核昔， 即 5'- 兰 磯酸核 搪核巧 （NTP) 和 5'-H 稱酸 脱氧核 糖核巧 (dNTP) 构成。 核酸 链中， 核糖 或脱氧 核搪的 5' 位 和与其 相邻的 戊糖的 3' 位之 间由 踞酸键 连接， 即形成 3'， 5'- 憐酸二 酷键。 因 此核酸 由具有 方向 性的搪 -稱酸 骨架， 及结合 于每一 糖分子 1' 位 的碱基 构成。 其 重复单 位是核 昔酸。 由于 踞酸分 子带有 负电， 致 使核酸 成为具 有强负 电性的 多聚大 分子。 核酸序 列是指 DNA 或 RNA 链中 的喊基 A、 C、 G、 T 或 U 排列 顺序， 习惯上 由分子 游离的 5' 端写至 3' 端， 例如， 5'- TATTGCTC-3' (DNA) 或 5'- AUAGCUUGA _ 3' (RNA)。 DNA 分 子通常 (双螺 旋形式 存在。 两条独 立的反 向平行 的单链 DNA 分子 右手 螺旋方 式相互 缠绕， 糖-碟 酸骨架 在外， 靠氯键 和堆 积力相 互配对 的碱基 在内。 腺曝吟 （A) 与胸 腺啼巧 （T) 配对， 鸟曝跨 （G) 与 胞喀巧 （C) 配对。 两 条链是 互补的 ，一 条 链决定 了另一 条链的 序列。 虽然沃 森与克 里克所 发现的 标准的 DNA 双螺旋 ，即 B 型 被认为 是 细胞中 DNA 占 优势的 结构， 核 酸也可 W 形成 右手 A 型螺 旋， 这是 RNA 链所 采用的 形式； 而左旋 Z 型只 是在特 殊碱基 序列处 形成， 并在 细胞中 或许不 是一个 重要的 构象。 32 C 核酸 的性质 大部分 RNA 分子 W 可折 叠成 复杂构 象的单 链形式 存在， 这种复 杂 构象是 由局部 分子内 碱基配 对和其 他氯键 相互作 用而维 持的。 这种 复杂性 反映出 RNA 在细胞 中担负 着多种 功能。 修饰 杉:酸 I 核酸的 共价修 饰在细 胞中具 有特定 作用。 这些 修饰对 DNA 而言 通常 仅局限 于腺標 吟和胞 唆晦的 甲基化 (methylation); 而对 RNA 而言， 修饰范 围要大 得多。 巧 关主题 核 酸的理 化特性 （C2) 原 核与真 核生物 的染色 体结构 （D) 核酸的 光谱学 和热力 学特性 （C3) DNA 超螺旋 （C4) RNA 二级 结构 喊基 DNA 和 RNA 中的城 基是含 有多种 取代基 的杂环 （含 C、 N) 芳香族 化合物 （图 C1.1)。 嚷吟类 为双环 结构， 包 括腺螺 哈和鸟 曝吟； 而確 D 定类 为单环 结构， 包括胞 喀瞎、 胸腺喀 巧和尿 喀巧。 在 RNA 中 尿嗦巧 替代了 胸腺 唆巧。 胸腺嚼 巧与尿 喀巧的 不同仅 在于其 5' 位含一 甲基， 因 此也可 称胸腺 嗦巧为 5 - 甲基尿 唆晦。 腺嘿吟 (A) 鸟嘿吟 但） 胞嗦巧 (C) 灑點 真= 茲立 图 C1.1 组 成核酸 的碱基 核巧 核酸分 子中， 碱 基共价 结合于 戊糖的 r 位构 成核巧 （图 C1.2)。 RNA 中的 戊搪为 核糖， 而在 DNA 中为 2'- 脱氧 核糖， 即 2' 位的 轻基为 氨原子 所 替代。 核搪 与碱基 的结合 位置， 唆巧为 1 位 （N - 1)， 曝略为 9 位 (N-9) (图 1)。 为了 与碱基 序位相 区别， 戊 糖环中 的原子 数标作 1'-、 2'- 等。 碱基 与糖分 子之间 的结合 键称为 糖苔键 （glycosylic or glycosidic bond)。 若糖 分子是 核糖， 形成 的核昔 （术语 上应称 为核糖 核昔） 为腺脊 (adenosine)、 鸟巧 （guanosine)、 胞巧 (cytidine) 和尿巧 (uridine) ; 若糖 分 子是脱 氧核搪 （在 DNA 中）， 则形成 的核巧 （2'- 脱 氧核搪 核巧） 称为 脱氧 腺巧 （ deoxyadenosine ) 等等。 胸巧 （ thymidine) 和脱 氧胸巧 （ de- oxythymidine) 二词， 可 互换 使用。 核巧酸 核昔酸 由一个 或多个 縣酸分 子共价 结合于 核脊的 核糖的 3'、 5' 位或 2' 位 （仅在 核糖核 巧中） 而成。 若 糖分子 是脱氧 核搪， 则形成 的核昔 酸称为 脱 氧核糖 核巧酸 （ deoxynucleotide) (图 Cl. 3)， 属于 縣酸酷 （phosphate Cl 核 酸结构 33 踞酸 二酪键 esters) 类化 合物。 在 5' 位上， 最多可 W 连接 3 个憐酸 基团， 像 5'- 兰憐酸 腺昔 （adenosine 5 '-triphosphate) 或 5'- 二 稱酸脱 氧鸟脊 （ deoxyguanosine 5^-triphosphate), 通常可 简写为 ATP 和 dGTP， 同 样还有 dCTP、 UTP 和 dXTP 等。 5'- 单稱酸 核巧和 5'- 二憐 酸核巧 可简写 成比如 AMP 和 dGDP 等。 5'- 兰憐 酸核巧 (NTP) 或 5'- 兰 縣酸脱 氧核巧 (dNTP) 是组 成核酸 大分子 的基本 元件。 在 DNA 或 RNA 合成过 程中， 每个核 巧酸脱 掉一个 焦稱 酸基团 （pyrophosphate) (含两 个憐酸 根）， 而只 保留一 个縣酸 基团， W 此整 合到核 酸链中 （参见 E1 和 K1)。 因此 DNA 和 RNA 链中的 重复单 位 是单核 巧酸。 图 C1.2 核营 2’- 脱 氧核糖 核巧酸 5- 兰 稱厳脱 氧腺昔 （dATP) 核音酸 5 - 单巧 酸胞巧 (CMP) 图 C1.3 核巧酸 在 DNA 或 RNA 分 子中， 脱氧核 糖核巧 酸或核 糖核巧 酸通过 一个縣 酸基团 与前一 核搪的 5'- 哲基和 下一个 核糖的 3'- 哲基 的共价 连接而 形成多 聚物 （图 C1.4)。 这种键 或者连 接称为 雜酸二 醋键， 因为憐 酸在化 学上成 了双酷 形式。 因此核 酸链可 被认为 具有方 向性。 任 何一条 核酸链 （环 状的 除外， 参见 C4)， 无论 其长度 如何， 都 具有一 个连接 或没有 连接着 稱酸基 团 的游离 5' 端 （frees'- end), 和一 个通常 含有游 离餐基 的游离 3' 端 （free 3'-encl)。 在中性 pH 条 件下， 每 一磯酸 基团带 有一个 单位负 电荷。 这就 是核酸 被称为 "酸" 的 原因， 是强 酸的阴 离子， 所 核酸是 带有强 负电性 的多 聚体。 34 C 核酸 的性质 DNA/RNA 序列 DNA 双巧 旋 5' 端 — 0 \ 图 C1.4 踞酸二 醋键与 DMA 链的共 价结构 习 惯上将 DNA 或 RNA 分子 的重复 单体用 它们的 单个碱 基字母 A， T, G, C 或 U 来代 表。 还有通 常从左 向右按 5' 端向 3' 端的 方向书 写核酸 的碱基 顺序。 例 如一段 DNA 序列 可写成 5'- ATAAGCTC-3'， 或者 甚至直 接写成 ATAAGCTC， 一段 RNA 的序列 可写成 S'-AUAGCUUGA-S'。 注 意链 是有方 向性的 ，例如 ATAAG 并不 等同于 GAATA。 自然界 DNA 分 子通常 W 众所 周知的 巧燥 旋形式 存在。 这种结 构的基 本特 征是由 J. 沃森和 F. 克 里克于 1953 年提 出的， 即两条 相互独 立的单 链 DNA 分子 W 螺旋方 式相互 缠绕， 形 成右手 双螺旋 （图 C1.5a)。 带有负 电 的戊糖 -縣酸 骨架在 分子的 外侧， 碱 基则平 面堆积 于螺旋 的内部 （图 C1.5b)。 由 于骨架 双链在 螺旋轴 上的间 距并不 相等， 从而 在分子 表面形 成宽 窄不等 的大沟 （major groove ) 和小沟 （minor groove)。 双链 间对应 的碱基 靠氯键 相互作 用形成 城基对 （base pair)。 DNA 双螺 旋结构 中每一 旺螺 旋含约 10 个碱 基对。 两条链 W 5' 一 3' 方向， 反 向排列 （反 向平 行）， 更重 要的是 在序列 上两条 链互为 互补链 （complementary)。 这样的 特征是 由 于碱基 结构和 DNA 骨架 限制支 配着， 碱基间 氯 键形成 曝咚- 喀睹配 对， 因为它 们间具 有十分 相似的 空间几 何构型 （图 C1.6)， G 和 C 配对 (3 个氨 键）， A 和 T 配对 （2 个氯 键）。 这样 任意的 序列均 可构成 规则的 DNA 双链 结构。 双 链中一 条链的 序列可 特异地 确定另 一条链 的序列 ，这 些均 暗示出 DNA 自 我复制 （replication) 和 DNA 转录 （transcription) 为 Cl 核 酸结构 35 RNA 的机制 （参见 El 和 Kl)。 图 Cl. 5 DNA 双螺旋 结构。 （a) 结 构图； （b) 结 构细图 （粗 线表 示碱基 对的堆 积） 腺 頃吟： 胸 腺哇巧 鸟 頃吟； 胞哇巧 图 C1.6 DNA 碱 基对。 氨键 用虚线 表示； dR=脱 氧核搪 A 型、 B 型 事 实上， 人们观 察到有 一些不 同形式 的核巧 酸双链 螺旋， 并进 行了研 及 Z 型炼 究， 这些 螺旋均 有基本 的反向 平行的 两条螺 旋链的 形式。 该 结构由 沃森与 旋 克里克 确定， 如上 所述， 即 B-DNA (图 7a)， 被认为 是适用 于所有 DNA 的稳定 形式。 它的梓 殊的螺 旋重复 （ helical repeat ) 每西为 lObp 碱基对 (尽 管现 在认为 真正的 DNA 螺旋 重复近 于每面 10.5 碱基 对）。 现 己确认 喊基对 分布于 螺旋轴 线上， 几 乎与它 垂直。 B-DNA 有一条 主沟和 一条小 36 沟。 C 核酸 的性质 在 低温条 件下， DNA 可被诱 导形成 另一种 螺旋， 称为 A 型 （图 C1.7b)。 A 型与 B 型一 样为 右旋， 但 较宽， 结 构更加 紧密。 喊基 对倾斜 于螺旋 轴线， 且偏 离细线 （见 文未， A 型 螺旋中 有一空 洞）。 A 型 螺旋重 复 每面为 11 个碱 基对。 尽管在 异常环 境中， 细胞中 DNA 会形成 A 型或 近似 A 型， A 型 的主要 意义在 于它是 RNA (见 下文） 及 RNA 与 DNA •杂 合 体的主 要螺旋 形式， 并 说明将 RNA 的 2'-0H 纳入理 论上更 稳定的 B 型结构 是不可 能的。 尚 B-DNA (b) (C) A-DNA Z-DNA 图 Cl. 7 DNA 双 螺旋的 不同螺 旋模式 另一种 DNA 的 异常螺 旋形式 是左旋 Z-DNA。 在 单一交 替的喀 巧-嗦 口 令序列 （如 5'-CGCGCG-3'， 当 然另一 条链也 如此） 的合 成双链 DNA 中， 形成 的左旋 Z-DNA (图 C1.7c) 是稳 定的。 这是 因为在 这种结 构中， 喀瞎与 曝吟形 成差别 很大的 构象， 而 不像在 A 型与 B 型， 每个核 巧酸均 有相同 的构象 和瞬时 环境， 特别在 Z 型螺 旋中， 螺 吟核巧 酸形成 53^ 构 象， 螺吟核 巧酸及 A、 B 型中所 有核巧 酸均为 arm’ 构象。 Z 型螺旋 有一个 Z 字型的 外观， 每匹 12 个碱 基对。 尽管它 给人的 感觉是 每西为 6 个碱基 对的二 聚体， 但沿 每条链 的重复 单位的 确是一 个二核 营酸。 因 为左旋 Z 型与 B 型之间 的界限 非常不 稳定， 即 使是在 重复的 CGCGCG 区域， Z- Cl 核 酸结构 37 DNA 也不易 形成正 常型的 DNA。 尽管很 有趣， Z 型不 是体内 DNA (或 RNA) 的主 要形式 （表 C1.1)。 表 C1.1 A、 B 及 Z 型巧 旋的 主要特 征概括 A 型 B 型 Z 型 巧 巧方向 右手 右手 左手 直径 约 2 . 6nm 约 2 . Onm 约 1 • 8nm 每西巧 旋巧基 对数目 （n) 11 10 12 (6 个二 聚体） 每对 巧基旋 转角度 （ = 360/n) 33， 36* 60’ （每 个二 聚体） 毎对 巧基旋 转上升 （A) 0.26nm 0. 34nm 0.37nm 巧距 2 . 8nm 3.4pm 4.5nm 巧基对 与中屯 、轴顿 角 20。 6。 r 大沟 窄 ，深 宽 ，深 平坦 小沟 宽 ，浅 窄 ，深 窄 ，深 糖巧键 anti anti anti (嗦 巧） syn (曝 吟） RNA 二级 RNA 分 子通常 W 单链 形式 存在， 因 此不具 有双链 DNA 分子那 样的规 结构 则 双螺旋 结构， 而是 相对来 说形成 近似于 球状的 构型， 通过 分子内 的氯键 作用 和在单 核酸链 间的碱 基堆积 可形成 单链局 部区域 的螺旋 结构。 在这些 区域中 RNA 分子的 一部分 和与其 配对的 另一部 分互补 （参见 P2， 图 C1.2)。 与 DNA 相比， RNA 分 子的这 种构型 的多样 性是与 其在细 胞中的 作巧 的多样 性相适 应的。 RNA 的 结构可 包括从 较短的 snRNA 到 较大的 rRNA 分子， 前者 在真核 细胞内 有助于 mRNA 前体 的拼接 （参见 03)， 而 后者 则形成 核搪体 的骨架 结构， 并参 与蛋白 质的化 学合成 （参见 Q2)。 巧 饰核酸 核 酸分子 中的碱 基或核 巧酸的 化学修 饰是普 遍的， 并起 着许多 特定作 用。 虽然 在某些 隨茜体 DNA 上发生 着更加 复杂的 修饰， 但对 于细胞 DNA, 修饰 一般仅 限于腺 曝吟的 N -6 位、 胞 喀巧的 4- 氨基和 5 位 （图 C1.1) 的甲 基化。 这些 甲基化 具有限 制性修 饰作用 （参见 G3)、 碱基错 配修 复作用 （参见 F3) 且 在真核 基因组 构中普 遍存在 （参见 D3)。 更为 复杂的 修饰发 生在转 录后的 RNA 分 子中， 这又一 次反映 T 民 NA 在细胞 中 的不同 功能。 更为详 细的叙 述参见 03 和 P2。 c 巧酸 的性质 C2 核 酸的理 化特性 要 点 枝酸的 稳定性 酸效症 喊效后 化 学变性 黏 性 浮 力密度 相 关主题 由于 氯键的 作用， DNA 双链和 RNA 结构似 乎是稳 定的。 然而事 实并非 如此， 氯键 决定了 碱基间 的特异 配对， 而核 酸螺旋 的稳定 性 则是疏 水作用 （ hydrophobic interaction) 和堆积 在碱基 对间的 偶极 矩作用 （dipole-dipole interaction) 的共同 结果。 强酸 条件下 核酸可 水解为 碱基、 糖和 憐酸； 中度的 酸性可 使曝咚 的糖 巧键水 解而产 生脱標 吟核酸 （apurinicacid)。 更为复 杂的化 学 过程已 被发展 用来移 去特定 碱基， 这也是 DNA 测序的 基础。 强碱 条件下 DNA 和 RNA 因 其碱基 的互变 异构态 （tautomeric state) 的改变 W 及特异 氨键被 破坏而 变性。 强碱条 件下， RNA 也易 于发生 水解， 2'- 0H 参 与憐酸 二醋键 骨架的 分子内 裂解。 某 些化学 试剂， 如尿 素和甲 醜胺， 在中性 pH 条件 下能够 破坏堆 积于碱 基间的 疏水作 用而使 DNA 和 RNA 变性。 DNA 分子很 细长， 因此 其溶液 具有较 高的黏 J 性。 溶液 中的长 DNA 分 子易被 剪切而 断裂， 这种 过程可 被用来 产生特 定长度 的 DNA 片段。 DNA 的密 度约为 1.7g，cnr3， 可 W 通过氯 化飽密 度梯度 离心法 加 分析和 纯化。 DNA 分子的 精确密 度是其 （G+C) 含 量的函 数， 这项技 术可用 来分析 DNA 的碱基 组成。 核 酸结构 （C1) 核酸的 光谱学 和热力 学特性 （C3) 核酸 的稳定 乍 一看， 由于碱 基间氨 键的存 在使得 DNA 双链和 RNA 二级 结构趋 性 于 稳定， 但事 实并非 如此， 正如在 蛋白质 （参见 A4) 结构 中的氯 键通常 并不足 (提 供这种 稳定性 一样。 这是 因为， 例 如对于 DNA 分子必 须考虑 到其 单链的 无规则 卷曲与 双链构 型之间 的能量 差别。 双链分 子中碱 基与碱 基 的氯键 作用仅 仅替代 了单链 分子中 碱基与 水分子 的氯键 作用， 这 两种作 用 从能量 的角度 讲是相 同的。 当然， 氯 键使得 双链中 的碱基 间的配 对具有 特异性 （只有 互补的 两条链 之间才 能形成 DNA 双链， 参见 C1)， 但其对 于双 螺旋的 总体上 的稳定 性并无 贡献。 核酸分 子的稳 定性的 根源在 于碱基 对之 间的堆 积作用 （stacking interaction, 参见图 Cl. 5b)。 作为芳 香族化 合物， 碱基的 平面使 其不能 在自由 溶液中 与水分 子形成 氯键， 换句 话说它 们是疏 水的。 大量 水分子 的氯键 作用而 形成的 网络在 疏水的 表面附 近变得 C2 核 酸的理 化特性 39 不 稳定， 并 非所有 的水分 子都能 参与氨 键相互 反应， 而且这 些水分 子变得 更为 有序。 因此 将碱基 对堆积 起来， 从 而使所 有的水 分子排 除在这 样的表 面 之外， 从 能豊的 角度讲 是最稳 定的： 更多的 水分子 结合于 巨大的 氨键网 络中。 同 时这样 的过程 也最大 限度地 增强了 碱基的 电荷偶 极作用 （参见 A4)。 即使是 在单链 DNA 中， 碱基 也存在 着互相 堆叠的 趋势， 但 这种堆 叠 在双链 DNA 中 达到最 大化， 疏水效 应使其 成为能 量上最 为稳定 的一种 结构。 事 实上， W 上 论述是 将一种 极为复 杂的情 况简单 化了， 更为 深入的 解释则 超出了 本书的 范围。 巧效应 在 强酸和 高温， 如在 高氯酸 （HC104) 中 loot： W 上的条 件下， 核酸 完全 水解为 碱基、 核糖 或脱氧 核糖和 縣酸。 在 浓度略 稀的无 机酸中 ，如 pH3~4, 最 易水解 的化学 键被选 择性地 断裂， 一般 为连接 曝吟和 核糖的 糖 巧键， 从而产 生脱噪 吟核酸 （参见 F2)。 更 为复杂 的化学 过程已 被开发 用来移 去某些 碱基， 或将 DNA、 RNA 在特定 碱基处 断裂。 W 其 发明人 Maxam 和 Gilbert 的名字 命名的 DNA 化 学测序 法就是 此为 基础的 （参 见 J2)。 巧效应 DNA 当 pH 值 超出生 理范围 （pH 7 〜 8) 时， 对 DNA 的结构 将产生 更为微 妙的 影响， 碱效 应使碱 基的互 变异构 态发生 变化。 送种 效应可 化 合物环 己酉同 (cyclohexanone) (图 C2.1a) 为例加 (说 明： 该化合 物分子 在互变 异构 态酣式 和醇式 间达到 平衡。 中性 pH 条 件下， 该化合 物主要 W 師式存 在； pH 升 高时， 由于 失去一 质子， 导致 分子向 巧醇式 转化， 这是 因为电 负性氧 原子的 存在， 使 分子在 带负电 的情况 下达到 稳定。 同 样的， 在高 pH 下， 標 吟的分 子结构 （图 C2.1b) 转 为‘席 醇式， 而其他 的碱基 也有类 似的 变化。 这种变 化影响 到特定 碱基间 的氨健 作用， 结 果导致 DNA 双链 似 自巧的 （非变 性的） 变性的 围 C2.1 高 pH 条件下 DNA 的 变性。 （a) 碱 使之变 成‘贿 薛式异 构体； （b) 脱氧嘿 吟的异 构体互 变； （C) 双螺旋 DNA 的变性 40 解离， 称为 DNA 的变性 （图 C2.1c)。 C 核酸 的性质 化 学变性 黏性 RNA pH 较 高时， 同样 的变性 发生在 RNA 的 螺旋区 域中， 但 通常被 RNA 的诚性 水解所 掩盖。 这 是因为 RNA 中 存在的 2'-OH 参与到 对憐醋 键中踞 酸 分子的 分子内 攻击， 从 而导致 RNA 的断裂 （图 C2.2)。 因为 氨氧根 （- OH) 是一个 碱基， 这一 反应可 被高 pH 所 驱动， 反应 产物是 5'- OH 和 2', 3'- 环碟 酸二醋 （2', 3'- cyclic phosphodiester), 后 者继而 分解为 2'- 或 3' -单 縣酸。 即使 在中性 pH 下， 由于 存在有 2'- 0H， RNA 对水解 的敏感 程 度也比 DNA 高 得多。 这就 解释了 为什么 DNA 分子 中存在 2'- 脱氧核 糖， DNA 的功能 要求其 具有较 高的稳 定性。 2- -NMP 3- NMP 图 C2.2 碱性 条件下 RNA 踞酸 二醋键 的分子 内裂解 一些化 学物质 能够使 DNA 或 RNA 在中性 pH 下 变性， 其中最 熟知的 例子 是尿素 （H2NCONH2) 和 甲敌胺 （HCONH2)。 只要浓 度稍高 （几摩 尔）， 这些物 质便可 破坏水 溶液中 的氨键 作用。 这就意 味着， 由堆 积的疏 水碱基 形成的 核酸二 级结构 在能量 上的稳 定性被 削弱， 则核酸 变性。 细 胞内的 DNA 分子很 细长， 术 语称为 高轴比 （axial ratio)。 DNA 的 直径约 2nm， 长 度则达 到微米 （;xm)、 毫米 （mm) 量级， 某些真 核染色 体甚至 长达几 厘米。 打个 比方， 若 DNA 直径与 意大利 通必粉 相当， 则大 肠杆菌 （E. coli ) 的染色 体长度 （4.6xl06bp) 约为 1km 长。 另夕 hDNA 是 一个比 较刚性 分子， 其 刚性程 度几乎 与半煮 熟的意 大利通 必粉 相似。 DNA 的 这些性 质使得 其水溶 液具有 高黏性 （high viscosity)。 另一 方面很 长的 DNA 分子 又易被 机械力 （shearing forces) 或 超声化 （sonication) 损 伤， 同 时黏度 下降。 当要完 整分离 大片段 DNA 分子， 易被 机械力 破坏确 是值得 注意的 问题； 而超声 波则可 用来产 生特定 长度的 DNA 片段 （参见 D4)。 值 得注意 的是， 无论 机械力 还是超 声波均 不能使 DNA 变性， 仅仅 C2 核 酸的理 化特性 41 浮 力密度 是降低 水溶液 中双链 分子的 长度。 可根据 DNA 的密 度来对 其进行 纯化和 分析。 在 高浓度 高分子 质量的 盐溶 液中， 如 8mol/L 氯化巧 （CsCl) 中， DNA 具有 与溶液 大致相 同的密 度， 约为 1.7g，cnr3。 将溶 液高速 离必， 则 CsCl 趋于 沉降于 底部， 从而 建 立一密 度梯度 （图 C2.3); 而 DNA 最终沉 降于与 其浮力 密度相 应的位 置， 形成 狭带。 这种 技术称 为平街 密度梯 度离必 (equilibrium density gra- dient centrifugation) 或 等密度 梯度离 '心 (isopycnic centrifugation) (参见 A2)o 在 这种条 件下， RNA 沉淀 于试管 底部而 蛋白质 浮于溶 液表面 ，是 一种 DNA 与 RNA 和蛋白 质相分 离的有 效方法 （参见 G2)， 而 且由于 DNA 的精 确的浮 力密度 （P) 与 G+C 的含着 呈线性 关系， 这也是 一种有 效 的用于 DNA 分 析法； p=l. 66 + 0. 098% (G+C)。 因此， DNA 的沉降 可用 来确定 其平均 （G+C) 含量； 有 时还可 用来分 离总体 序列中 具有不 同 （G + C) 含量 的片段 （参见 D4)。 amol/LGsCl (1.7 gcm-3) 1.55 gcm-3 梯度 1.8 gcm-3 在相应 浮力密 度处的 DNA 带 图 C2.3 DNA 的 密度梯 度离必 c 巧段 的性质 C3 核酸的 光谱学 和热力 学特性 要 点 紫外 光吸收 核 酸中的 芳香族 碱基在 260nm 处具有 最大光 吸收。 减色性 核 酸碱基 的消光 系数与 它所处 的环境 有关。 单一的 核巧酸 的吸收 值比 RNA 和单链 DNA 的 吸收值 都大， 单链 DNA 又 比双链 DNA 大。 这 种双链 DNA 相对 于单链 DNA 吸收值 减少的 现象就 称为减 色效应 （hypochromicity)。 枯: 酸定量 核酸在 260nm 处的 光吸收 可用于 测定其 浓度。 当 浓度为 Img- ml — i, 光程为 1cm 时， 双链 DNA 的 A260 = 20， RNA 和单链 DNA 的 A26o = 25。 对于 RNA 和单链 DNA, A260 的值取 决于碱 基 的组成 和二级 结构。 DNA 娩度 A260/A280 比值可 用于估 计双链 DNA 样品的 纯度。 对于纯 DNA， 该 比值为 1.8; 若比 值大于 1.8， 则 意味着 RNA 污染； 若 比值小 于 1.8, 则有 蛋白质 污染。 热变性 升高温 度可使 DNA 和 RNA 变性。 RNA 随 着温度 升高而 逐渐变 性， 双链 DNA 在 某一确 定温度 "烙 解" 为单链 DNA， 这 一温度 表示为 Tm， 该值是 DNA 的 （G+C) 含量的 函数。 核酸 的变性 可 A26D 的 变化来 测定。 复 性 降 温可使 DNA 复性， 但 仅当这 一过程 进行得 足够缓 慢时， 才能 使互 补链退 火而形 成完全 的非变 性双链 DNA。 相 关主题 核 酸结构 （C1)- 基因组 复杂度 （D4) 核 酸的理 化特性 （C2) 紫外 光巧收 核酸 因含有 共扼的 苯环而 吸收紫 外光， 糖 -磯酸 骨架对 光吸收 的贡献 并不 明显。 DNA 和 RNA 的最 大紫外 光吸收 波长为 260nm = 260nm), 这可 方便 地与蛋 白质的 Xmax (280nm) 相区别 （参见 B1)。 核 酸的 光吸收 特性可 用来对 其进行 检测、 定量和 纯化。 减色性 尽管 DNA 或 RNA 的 Xma、 为一 常数， 但其消 光系数 （extinction coeffe- cient) 与碱 基所处 的环境 有关。 比较 而言， 单 一的核 昔酸在 260nm (A260) 的光 吸收值 最大， 其次 是单链 DNA (ssDNA) 或 RNA， 而双链 DNA (dsDNA) 最小， 这 是由于 碱基在 疏水环 境中的 堆积所 造成的 （参 C3 核酸的 光谱学 和热力 学特性 43 240 2 的 2 撕 波长 (nm) 图 C3.1 同 一浓度 （mg.ml—i) 的 RNA 和双链 DNA 溶液 紫外吸 收光谱 热变性 一 些化学 物质能 够使核 酸变性 （参见 C2)， 加热 同样能 够导致 DNA 和 RNA 中双 链部分 氨键的 破坏。 双链核 酸变性 为单链 核酸的 过程可 W 方 便地 从光吸 收的增 加上加 W 观察 （图 C3.2)。 dsDNA 与 RNA 的热力 学表现 不同， 随 着温度 的升高 RNA 中 双链部 分 的碱基 堆积会 逐渐地 减少， 其 光吸收 值也逐 渐地、 不 规则地 增大。 较短 见 C1 和 C2)。 这 种光吸 收的变 化称为 减色性 ，即 dsDNA 相对于 ssDNA 是减色 的 （ hypochromic ) ， 反之 ssDN A 相对于 dsDNA 是增色 的 （ hyper- chromic)。 核 巧定量 一般 不太容 易讨论 核酸的 摩尔消 光系数 u)， 因 为其值 与相应 的分子 长度 有关。 所 W 消光 系数常 W 浓度 mg’ml — 嗦示： Img’ml — 1 的 dsDNA 的 A260 为 20， 相 应地， ssDNA和RNA的A26o为25。 ssDNA 和 RNA 的 A260 值大致 由^> (下两 个因素 决定； A260 的数 值是所 有不同 碱基对 光吸收 的总和 (曝 吟的消 光系数 比喀巧 大）， 因此 与分子 中碱基 的组成 相关； dsDNA 因 具 有相同 数量的 噪吟和 喀晚， 这种效 应并不 明显。 另 一方面 由于减 色性， 光吸 收值也 取决于 给定分 子的二 级结构 （双链 区域） 的 数量。 对于 二级结 构最少 的寡核 昔酸， 通常 由单链 中每个 单一的 核巧酸 的数值 的总和 来计算 其消光 系数。 DNA 纯度 dsDNA 的大 致纯度 （参见 G2) 可由％ Onm 和 280nm 处的光 吸收的 比值 （A260M280) 来 确定。 与消 光系数 相同， 光 吸收谱 （图口 .1) 的形 状也会 随着碱 基的环 境变化 而变化 。纯 dsDNA 的 A260/A280 为 1.8， 纯 RNA 的 ^26()/ ^280 为 2 . 0, 而蛋白 质由于 Xmax 二 280nm, A260/A280 小于 1 (实 际上在 0.5 左 右)。 于是， 如果 DNA 样品的 A26()M28() 大于 1.8， 则说 明有 RNA 括染； 如果 A26()/ ^280 小于 1 . 8, 则说明 样品中 含有蛋 白质。 44 C 核駿 的性质 Tm 降温 温度 图 C3.2 (a) 双链 DNA 和 RNA 的热 变性； （b) 快速和 慢速降 温下的 DNA 复性 复性 DNA 的热 变性可 W 通过冷 却溶液 的方法 复原。 这一方 法中， 降温的 速度 对结果 有一定 影响。 快速 降温只 形成局 部区域 的双链 DNA， 经碱基 配对 或者在 DNA 内部或 DNA 之间短 的互补 区域的 退火而 形成， 因此 A26() 的下 降很小 （图 C3.2b)。 另一 方面， 慢 速冷却 提供了 足够的 时间使 得互 补链能 够相互 配对， 样品可 W 形 成完全 的双链 DNA， 具有与 原初样 品同样 的光吸 收值。 不 同核酸 链之间 的互补 部分的 复性称 为杂交 （hy- bridization)。 的碱基 配对区 域具有 更高的 热力学 活性， 因而 与较长 的区域 相比变 性快。 而 dsDNA 的热变 性或称 塔解是 一协同 过程。 分子 末端、 W 及内部 更为活 跃 的富含 A-T 的区域 的变性 将会使 其附近 的螺旋 变得不 稳定， 从 而导致 整个分 子结构 在一确 定湿度 的共同 变性。 这 一温度 取过渡 期的中 点值， 称 为解 链温度 （melting temperature, T^) (图 C3.2a)。 随着 核酸的 烙解, 其光 吸收值 增大约 40%。 Tm 是 DNA 样品中 G+C 含量的 函数， 对于长 DNA 分子， 其取值 范围是 80~ loot：。 (a) (b) 温度 (a) 双链 DNA 和 RNA 的热 变性; 巧： n 空度呆 c 核度 的性质 C4 DNA 超螺旋 要 点 闲环 DNA 自然 《件 下， DNA 通常 W 闭 环形式 存在， 即两条 单链均 为环状 且相 互连在 一起。 相互连 接的数 目称为 连接数 （linking number, Lk)。 超巧旋 超 螺旋是 DNA 轴线 的再次 螺旋， 若 W L/T 表示松 弛闭环 DNA 的 连 接数， Lr 的 改变将 导致超 螺旋。 大部 分天然 DNA 呈负 的超螺 旋， 即 DNA 变形 的方向 与双螺 旋解旋 的方向 相反。 扛扑 异构体 具 有特定 连接数 的环状 d 沁 NA 分子称 为拓扑 异构体 （topoiso- mer), 除非其 中的一 条链或 两条链 均遭到 破坏， 其连接 数不会 发生 改变。 结绕 和扭曲 超螺 旋在几 何上分 为缠绕 （twist) 和扭曲 （writhe), 前 者指双 螺 旋是紧 绕或松 绕的， 后者沿 双螺旋 轴本身 的缠绕 变化。 根据等 ■ 式： 缠 绕和扭 曲是可 (相 互转 化的。 嵌入剂 嵌入剂 （intercalator), 如漠 化乙锭 （ethidium bromide, EB), 通 过嵌 入到配 对碱基 之间的 方式与 DNA 结合， 导致 DNA 双螺旋 的局 部解旋 （untwisting); 如果 是闭环 DNA， 则会 使缠绕 增加。 超 螺旋能 负超 螺旋的 DNA 具有 很强的 扭为， 这一能 量促使 DNA 双螺旋 的 解旋， 并 驱动需 解旋的 DNA 的解旋 过程。 •is 扑 异拘畴 通过暂 时破坏 DNA 骨架的 单链或 双链， 拓扑 异构酶 （topoiso- merases) 改变 DNA 超螺旋 的水平 。第 I 类酶使 LA 改变 ± 1 ; 第 n 类酶使 LA 改变 ±2。 DNA 促旋酶 （gyrase) 利用 ATP 水解提 供的 能量为 DNA 引 进负起 螺旋， 而拓扑 异构酶 W 使子染 色体解 开。 巧 关主题 原 核生物 的染色 体结构 （D1) 真 核生物 的染色 体结构 （D3) 染色 质结构 （D2) 细菌 DNA 复制 （E2) 闭环 DNA 细胞内 的许多 DNA 分子都 是闭环 双链， 如细茜 质粒、 染色体 和许多 病毒 DNA 分子。 这意 味着不 仅每条 互补链 自身的 3' 端与 5' 端连 接成环 状， 而且两 条互补 链间相 互螺旋 缠绕。 这样的 分子中 没有游 离端， 两条链 缠绕的 数目即 为双螺 旋的螺 旋数， 称为 连接数 [Lk)。 46 C 核酸 的性质 超螺旋 拓扑 异构体 渔绕 和扭曲 许多 特性均 起因于 DNA 分子 的环状 限制， 理想方 法是将 DNA 双螺 旋 想像成 一个橡 胶管， 沿长 径画一 直线， W 便追 踪它的 扭曲， 将橡 胶管的 两端 连接在 一起形 成环状 （图 C4.1)。 如果 DNA 双 螺旋先 扭曲， 然后两 末端 相连， 则 这种变 形被固 定下来 （图 C4.1)。 这种 被固定 下来的 变形務 为超 螺旋。 超 螺旋是 DNA 双 链轴线 的高度 卷曲， 与简 单的环 状相比 ，连 接 数有所 变化。 如果 DNA 扭 曲方向 与双螺 旋方向 相同， 这 种扭曲 发生在 闭 合前， 则 形成的 超螺旋 定为正 （positive); 反之 定为负 （negative)。 平 均 来看， 几乎 所有细 胞中的 DNA 分 子超螺 旋都是 负的， 即 使对于 像真核 生物染 色体这 样依赖 蛋白质 支架形 成大环 的线性 DNA 分子也 是如此 （参 见 D2 和 E3)。 图 C4.1 DNA 超螺旋 的橡胶 管模型 （图 示了 DNA 构型上 的变化 和连接 数的变 化） 起 螺旋的 水平可 W 用 连接数 的变化 化 Lk) 来 衡量， 即 与松散 时的闭 环分子 (Lk。) 相比 发生的 变化。 送 定义为 闭环前 DNA 分子扭 曲 360° 的 圈数。 刚刚 从细胞 内分离 出来的 DNA 分子 通常是 负的超 螺旋， 约 6 圈 超螺旋 /100 圈 双螺旋 （lOOObp), 表示为 l^Lk/Lk。 二 -0.06。 闭环 DNA 的 连接数 是一个 拓扑学 的量， 即除非 DNA 的一条 或两条 链发生 断裂， 否则这 个量的 数值不 会发生 改变。 一 个具有 给定连 接数的 DNA 分子就 是一个 拓扑异 构体， 各个 拓扑异 构体之 间的区 别仅在 于它们 的 连接数 不同。 当连 接数不 变时， DNA 分子的 （几 何） 构型可 W 发生 改变。 一个超 螺旋 DNA 拓 扑异构 体的两 种极端 构型可 W 用图 C4.2 来 表示， 分 别代表 了 全部 参与形 成扭曲 （writhe) (图 C4.2a) 或全部 参与形 成缠绕 (twist) (图 C4.2c)， 橡胶 管模型 上的直 线有助 于观察 DNA 轴线的 扭曲。 介于这 两种极 端状态 之间的 平衡态 （图 C4.2b)， 对 应着扭 曲和缠 绕同时 C4 DNA 超爆旋 47 嵌入剂 超 塚旋能 拓扑 异构酶 发生 改变的 情况， 在二者 之间的 分配可 W 用 W 下 的方程 表示； = ATw + A Wr 其中 必 须为一 整数， 而 ATw 和 AWr 则无此 限制， 它 表明： 一个超 螺旋 DNA 分 子的拓 扑学改 变被分 配给了 扭曲和 （或） 缠绕 的改变 而导致 的分子 构型的 变化。 (a) (b) (c) AWr -4 AWr ^ -3 AWr = 0 图 C4.2 用橡胶 管模型 表示的 超螺旋 DNA 的 构型可 变性。 在连 接数不 变的情 况下， 缠 绕数和 扭曲数 的变化 任 何影响 DNA 双螺 旋内部 缠绕的 因素都 会使超 螺旋分 子的几 何构型 发生 变化。 例如： 升温 会减少 缠绕， 提高离 子强度 使缠绕 增多， 而 另一个 十 分重要 的因素 就是巧 人剂的 存在， 其中最 为人们 所熟知 的是漠 化乙链 (图 C4.3a)。 这是 一种带 正电的 多环芳 香族化 合物， 靠其自 身嵌入 到配对 碱基之 间而与 DNA 相连 （图 C4.3b)。 漠化 乙锭的 嵌入， 不 仅使其 自身所 发英 光大大 増强， 这 也是用 来对凝 胶中的 DNA 进 行染色 的基础 （参见 G4), 而且使 局部的 双螺旋 解旋约 26’。 这 意味着 缠绕的 减少， 在 闭环分 子中 会导致 扭曲的 増多。 对于负 超螺旋 分子， 就是 （负） 扭曲 减少， 其分 子构型 会沿图 C4.2 中 a 一 的 方向而 变化。 超螺旋 涉及向 DNA 分 子引入 了扭转 应力， 因此 超螺旋 DNA 分子比 松 散的分 子具有 更高的 能量。 对 于负超 螺旋， 这一能 量会使 DNA 螺旋更 易 于局部 解缠或 解旋。 因此 负超螺 旋有利 于一切 需要解 旋过程 的进行 ，诸 如转 录起始 或复制 （参见 E1 和 K1)。 能 够调控 DNA 分子 超螺旋 水平的 酶称为 拓扑异 构酶。 为 了改变 DNA 的连 接数， 拓扑 异构酶 必须暂 时断裂 DNA 分 子的一 条或两 条链， 通过攻 击 憐酸骨 架上的 酪氨酸 残基， 使 自身与 DNA 的一 端形成 踞酸酪 急酸键 W 建 立临时 的共价 连接。 共 有两类 拓扑异 构酶； I 型 拓扑异 构酶在 DNA 的 一股 链上产 生一个 切口， 使另一 条链得 穿越， 连 接数每 次改变 ±1 ( 图 48 C 核酸 的性质 C4.4a); 而] I 型酶由 ATP 的水 解提供 能量， 则在 DNA 的 双链上 产生切 口， 使另 一双链 DNA 片段得 穿过， 连 接数每 次改变 ±2 (图 C4.4b)。 大部分 拓扑异 构酶会 降低正 或负超 螺旋的 水平， 也就 是沿着 能量最 小的方 向 作用。 然而， DNA 促 旋酶， 一种细 菌中的 n 型酶， 利用 ATP 水 解提供 的 能量向 DNA 分子引 入负超 螺旋， 从而 抵消了 DNA 复制 中产生 的正超 螺旋 （参见 E2)。 由于 这一作 用机制 中包含 一个双 链穿过 另一双 链的过 程， n 型拓 扑异构 酶还能 够被用 来拆开 DNA 分子， 如复制 中产生 出的连 在一 起的新 生分子 （参见 E2)。 在细 茜中， 该功能 由拓扑 异构酶 担当。 对所 有的生 物体， 拓扑 异构酶 都是一 种必要 的酶， 涉及 复制、 重组 和转录 (参见 E1、 F4 和 K1)。 DNA 促旋酶 和拓扑 异构酶 IV 是抗细 菌药物 的作用 目标， 而 I， n 型 酶都是 人类抗 癌制剂 的作用 目标。 (a) (b) 图 C4.3 (a) 演化 乙锭； （b) 嵌入 过程， 图示了 DNA 巧螺旋 的增长 和解缠 巧 酸酪氨 酸连接 (b) 另 一环状 DNA 片段 感 稱 巧酪氨 酸连接 图 C4.4 拓扑 异构酶 I 型 （a) 和拓扑 异构酶 n 型 （b) 的作 用机制 （详 细见 正文） (王 薛林译 刘进 元巧） D 原 巧与真 核生物 的染色 体结构 D1 原 核生物 的染色 体结构 点 大 畅杆菌 朵色体 DNA 结构域 基因组 超巧旋 大 肠杆菌 染色体 为闭环 DNA， 长度约 4.6Mb， 集 中分布 在称为 拟核 （nucleoid) 的区 域内。 在正常 生长情 况时， DNA 保 持持续 复制。 基 因组由 50 〜 100 个 大环， 或 长度为 50 〜 lOOkb 的 结构域 组成， 与 膜蛋白 复合体 （membrane- protein complex) 结 合而被 固定。 基因组 为负超 螺旋， 每个结 构域在 拓扑学 上是独 立的， 结 果是各 结构域 可保持 不同水 平的超 螺旋。 DNA 结构域 被非特 异性的 DNA 结合 蛋白如 HU 和 H-NS (类组 蛋白， histone- like protein) 缠绕， 这些蛋 白质束 缚着约 半数的 DNA 超 螺旋。 一些 其他的 分子如 宿主整 合因子 （integration host factor)、 RNA 聚 合酶及 mRNA 等均 有助于 类核的 组构。 相 关主题 DNA 超螺旋 （C4) 染色 质结构 （D2) 基因组 复杂度 （D4) 大肠 杆菌染 原核 生物的 基因组 可用大 肠杆菌 （E. coli) 染 色体为 例来加 W 说明， 色体 其 由长为 4.6Mb 的单 一闭环 DNA 分 子组成 （参见 C4)， 被 包裹在 称为拟 核的区 域内。 该 区域内 DNA 浓 度高达 30 〜 50mg，ml-i， 并 包含着 所有与 DNA 结 合的蛋 白质如 聚合酶 （polymerase)、 阻抑物 （repressor) 和 其他成 分 （参 见下 文)。 在 试管中 DNA 浓度 就 是相当 高了。 在 正常生 长时， DNA 保 持持续 复制； 当生 长速率 达到最 大时， 平均 每个细 胞中含 有基因 组的两 个拷贝 （参见 E2)。 DNA 结构 小私地 将大肠 杆菌的 DNA 与它 的大多 数结合 蛋白分 离开， 在 电子显 域 微镜 下就可 观察到 拟核的 组构， 其 DNA 由 50-100 个环或 结构域 组成， 这些 环或结 构域的 末端被 与细胞 膜一部 分相连 的蛋白 而固定 （图 D1.1)。 环的 大小为 50~100kb， 目前还 不能确 定这些 环究竟 是静态 （static) 还是 动态 （dynamic), 但有一 种模型 暗示在 这些环 的基部 DNA 缠绕于 聚合酶 或 其他酶 作用位 点处。 基因 组超巧 尽管 有证据 表明单 个结构 域呈单 独的超 螺旋， 但 就整体 而言， 大肠杆 旋 菌 的染色 体是负 超螺旋 化 Lk/Lk。 =-0.06， 参见 C4)。 电子显 微镜表 50 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 明有 一些结 构域不 形成超 螺旋， 这可能 是因为 DNA 的 一条链 已断裂 （参 见 C4)， 而另一 些结构 域清晰 地含有 超螺旋 （图 D1.1)。 DNA 与 膜蛋白 支 架的结 合可能 阻碍了 DNA 的 自由 旋转， 因 而结构 域可能 在拓扑 学上是 独 立的。 然 而还没 有真正 的生化 证据证 实细胞 内不同 区域的 结构域 的超螺 旋水 平存在 明显的 差异。 图 D1.1 电子显 微镜下 E. CO。 染色体 （4600kb) 结构 概图， 细 线表示 DNA 双 螺 旋结构 DNA 结合 染 色体中 环形的 DNA 结构 域由于 大量的 DNA 结合蛋 白相互 作用而 蛋白 进一 步受到 束缚， 送 些蛋白 质中最 多的是 HU 蛋白 及一种 分子质 量较小 的碱性 （带 正电） 二聚体 蛋白， 非特异 地与其 周围的 DNA 结合， H-NS 蛋白 （W 前称为 H1 蛋白） 是一 种中性 的单体 蛋白， 也与 DNA 不 同序列 非共价 结合， 但是 倾向与 DNA 内部弯 曲区域 结合。 这些蛋 白质有 时被称 为类 组蛋白 （histone-like protein) (参见 Dl), 具 有压缩 DNA 的作用 ，这 对 DNA 被 包装进 入类核 W 及稳定 和限制 染色体 超螺旋 是十分 必要的 。虽 然被 分离的 染色体 = -0.06, 大约每 17 圈 DNA 螺旋存 在一个 超 螺旋， 其中 有半数 永久性 地被周 围的蛋 白质所 束缚如 HU (实际 上呈扭 曲型， 参见 C4)， 而另 一半则 没有被 束缚， 可 W 适 应不同 的扭曲 和缠绕 (参见 C4)。 研 究发现 RNA 聚 合酶、 mRNA 分子 W 及位点 专一性 DNA 结 合蛋白 [如 宿主整 合因子 （IHF)， 一种 HU 的同 系物， 与 特定的 DNA 结 合导致 DNA 弯曲 140°] 对于 DNA 结 构域的 构成都 是很重 要的。 尽管高 度 有序的 DNA- 蛋 白复合 物诸如 核小体 （nucleosome) (参 见悦） 还未被 检 测到， 类核的 组构是 相当复 杂的。 D 原 怯与真 巧生物 的染色 体结构 D2 染色 质结构 要 点 朵色质 真核 生物染 色体都 包含一 个很长 的线性 DNA 分子， 并被 组装在 细胞核 (nucleus) 内。 染 色质用 来描述 构成真 核生物 染色体 的高度 有序的 DNA- 蛋 白质复 合物。 染色 质结构 被用来 包装和 组构染 色体 DNA， 并 能在细 胞周期 的不同 阶段调 整皮缩 DNA 的 水平。 组蛋白 染色 质中的 主要蛋 白质成 分是组 蛋白： 一类分 子质量 较小的 、碱 性 （带 正电） 二聚体 蛋白， 与 DNA 紧密 结合。 组 蛋白有 四个家 族： H2A、 H2B、 拟和 H4， W 及另 一类具 有不同 特性、 特定功 能的 H1。 不 同物种 具有不 同的组 蛋白变 异体。 核小体 核小 体核私 是染色 体结构 的基本 单位， 由组 蛋白八 聚体构 成即含 四种核 必组蛋 白各两 分子。 146bp 的 DNA W 左手 方式环 绕八聚 体 1.8 圈。 环绕 在核小 体上的 DNA 占 据了真 核生物 DNA 的几 乎所有 的负超 螺旋。 H1 的功能 一 个单一 H1 分子 在出入 核小体 核私颗 粒处对 DNA 起稳定 作用， 并在 核小体 间分配 DNA。 包括 H1 的 核小体 核必颗 粒加上 H1 称 为染 色小体 （chromatosome)。 某些情 况下， HI 可 被结合 得更紧 密的 H5 所代 营， 并与 无转录 活性的 DNA 结合。 连接 DNA 核小 体核心 颗粒间 的连接 DNA 长度 从几个 bp 到大于 lOObp 不 等， 但 通常约 55bp。 这样核 小体重 复的单 位长约 200bp。 30nm 奸丝 染 色质被 组构成 30nm 纤 丝或螺 线管的 巨大结 构体， 每圈 大约由 6 个核 小体左 手螺旋 组成。 大多数 染色质 这 种形式 存在。 高 级结构 在 最大规 模上， 染色体 DNA 30nm 纤维的 形式构 成长达 lOOkb 的环， 这样 的环被 蛋白支 架和核 基质所 固定。 整体 结构与 原 核生物 DNA 的结构 域有些 类似。 相 关主题 DNA 超螺旋 （C4) 真 核生物 的染色 体结构 （D3) 原 核生物 的染色 体结构 （D1) 基因组 复杂度 （D4) 染色质 真核生 物细胞 DNA 的总长 度因不 同的种 而异， 但与原 核生物 基因姐 相比， 要大数 千倍， 并由一 定数目 的分散 的染色 体组成 （人 类为 46 条）。 每 条染色 体中的 DNA 为单 一线性 分子， 长 度可达 几厘米 （参见 D3)。 所 有这些 DNA 分 子必须 被包装 进大小 相当于 细菌细 胞的细 胞核内 （参见 52 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 组蛋白 核小体 A2); 实 际上， DNA1< :; [高 度浓缩 的形式 存在， 其浓度 可高达 200mg，mri (参见 D1)。 高度 有序的 DNA- 蛋 白质复 合体， 是一 种核蛋 白复合 体即染 色质 的形成 完成了 这一紧 密组装 的目的 （参见 A4)。 蛋白质 组分占 染色质 质量的50%1^上。 在细 胞周期 的不同 进程， 染色体 极大地 改变着 它们的 包 装水平 （参见 D3 和 E3): 从中期 （细 胞分 裂期） 的高度 浓缩的 结构到 间 期的极 为松散 结构， 这些 都暗示 出染色 质的不 同组构 水平。 真 核生物 染色质 中的蛋 白质主 要是组 蛋白， 共分五 类或五 个家族 ，即 核也组 蛋白： H2A、 H2B、 H3 和 H4， 及 H1。 核屯 、组蛋 白的分 子质量 较小， 约 10 〜 20kDa; HI 稍大， 约 23kDa。 所 有组蛋 白带有 大量正 电荷， 序列中 20% 〜 30% 由碱性 氨基酸 —— 赖氨酸 及精氨 酸组成 （参见 B1)。 这 意味 着在形 成染色 质时组 蛋白将 与带负 电荷的 DNA 紧密 结合。 同 一类组 蛋白在 不同的 物种之 间相当 保守， 如植物 和动物 之间， 这显 示出组 蛋白对 染色质 的重要 作用。 在 特定物 种中， 某 类组蛋 白通常 存在几 种 非常相 似的变 异体， 会分别 在不同 的发育 阶段、 不同 的组织 中表达 。在 不同类 的组蛋 白之间 没有序 列的相 似性， 但结 构研究 显示， 它们却 具有相 似的兰 级结构 （参见 B2)， 暗示 出所有 组蛋白 在进化 上是相 关联的 （参见 B3)o 组蛋白 HI 在某些 方面同 其他几 类组蛋 白是不 同的： 除 了分子 质量较 大 W 外， 在 不同种 之间或 同种不 同小种 之间在 序列上 比其他 几类组 蛋白具 有 更多的 差异。 H1 更容 易从染 色质中 提纯， 可能仅 为其他 几类组 蛋白存 在量的 一半， 而其 他几类 组蛋白 在染色 质中的 量相差 不多。 这些事 实表示 出 H1 在 染色质 结构中 具有特 殊的、 独特的 作用。 19 世纪 70 年代 的一些 研究主 要集中 在染色 质结构 的基本 单位。 核酸 酶 是一种 能够水 解核酸 的稱酸 二醋键 的酶。 外 切酶从 核酸链 末端释 放单个 的核 巧酸， 而内切 酶则作 用于链 内部的 憐酸二 醋键。 用 微球茜 核酸酶 （一 种切 割双链 DNA 的内 切酶） 处理染 色质， 会分离 长度为 200bp 的 不同倍 数的 片段。 研究 发现， 每个 200bp 的片段 都与由 4 种组 蛋白各 2 分子即 (H2A)2(H2B)2(H3)2(H4)2 构 成的八 聚体核 心紧密 结合， W 及 1 分子 H1 松散 结合， 这就 是之所 W 被称为 核私组 蛋白的 原因。 这 些蛋白 质保护 DNA 免受微 球菌核 酸酶的 作用。 继 续反应 将导致 H1 的 丢失， 并 产生抗 性极 强的与 组蛋白 八聚体 结合的 146bp 片段。 这 样的结 构称为 核小体 巧也、 ( nucleosome core)。 不论 染色质 来源于 何处， 都具有 相似的 核小体 结构。 通过 X 射线晶 体学的 研究， 对核 小体核 心颗粒 的结构 在细节 上有了 更为 深入的 了解。 组蛋白 八聚体 形成換 形盘， 146bp 长的 DNA W 左手方 式环绕 其周围 1.8 圈 。图 D2.1 表示了 这种结 构的基 本特性 和空间 构型。 这种 围绕核 小体的 DNA 左手 环绕形 成负超 螺旋， 即超螺 旋转折 （super- helical turn) (术 语称为 扭曲， 参见 C4)。 与原 核生物 相比， 虽然真 核生物 D2 染色 质结构 53 HI 的功能 连接 DNA DNA 具有相 似水平 的负超 螺旋， 但实 际上几 乎所有 超螺旋 都是环 绕核小 体的 结果， 并没 有不被 约束的 超螺旋 （参见 D1)。 核 小体核 也颗粒 146 bp 1.8 圈 超巧旋 组蛋白 H1 核小体 166 bp 2 圈 超巧旋 图 D2.1 核小 体核心 颗粒和 染色小 体的结 构概图 1 分子的 组蛋白 H1 与核小 体结合 ，在 DNA 出 入核小 体核私 颗粒处 对 DNA 起稳 定作用 （图 D2.1)。 由于 H1 的 存在， 又有 20bp 的 DNA 得 到 保护而 免受核 酸酶的 降解， 总 体上受 保护的 DNA 达到 166bp， 相当于 绕 组蛋白 八聚体 两圈。 核小 体核心 颗粒加 上一个 H1 分子 构成染 色小体 (chromatosome)。 与核心 组蛋白 相比， H1 分 子要大 一些， 是因为 有一个 W 稳定核 小体核 心之间 DNA 的 C 端末 尾。 综上 所述， H1 在序列 上比其 他组 蛋白具 更大的 变异； 在有些 细胞类 型中， H1 被 一种极 端变异 的组蛋 白 H5 所取 代， H5 与染色 质紧密 结合， 与 不进行 转录的 DNA 相连。 在电 子显微 镜下， 可 W 观察 一定条 件下的 DNA 核 小体核 必颗 粒呈一 种称为 "串珠 （beads on a string)" 的 结构。 这 一结构 包含球 形颗粒 （核 小 体）， 颗 粒间由 很细的 DNA 链 相连。 连接 DNA 是 在微球 菌核酸 酶实验 中 重复出 现的， 形成 200bp 片 段所需 的额外 DNA 部分 （参见 上文） 。核 必 颗粒间 的连接 DNA 的平均 长度为 55bp， 但 在不同 的种或 不同的 组织中 其长度 会在几 乎等于 0 到多于 lOObp 的范围 内变化 （图 D2.2)。 54 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 图 D2.2 由连接 DNA 相 隔核小 体链和 30nm 纤维 示意图 30nm 纤丝 组蛋白 H1 的存在 加强了 "串 珠" 的 组构， 在电 子显微 镜下呈 现一种 错 齿形的 结构。 随着盐 浓度的 改变， 核小 体进一 步形成 直径为 30nm 的纤 丝。 详细 的研究 表明送 是核小 体被组 装成高 度有序 的左手 螺旋， 又 叫摄线 管 （solenoid) 的过 程， 每圈 螺旋约 6 个 核小体 （图 D2.2)。 然而 仍有一 些关于 纤丝结 构精细 组构的 猜测， 包 括连接 DNA 所采 取的路 径以. 及不同 长度 的连接 DNA 是 W 何种方 式被组 装成看 来十分 一致结 构的， 大 部分体 内 染色体 DNA 被 装配成 30nm 纤丝 （参见 D3)。 高 级结构 染色质 的最高 水平组 构与原 核生物 DNA 十 分相似 （参化 D1)。 电镜 下 观察除 去组蛋 白的染 色体， 可 W 发现与 D1 中图 2.1 相 似的环 状结构 域。 真核 生物染 色体具 有更多 的环， 但这些 环的大 小与原 核生物 基本相 同， 约为 lOOkb DNA。 这些环 被称作 核基质 （nuclear matrix) 蛋白 质复合 体 所束缚 （参见 E3)， 环中的 DNAtU30nm 纤丝 的形式 存在， 构 成了幅 D2 染色 质结构 55 宽约 300nm 的排列 （图 D2.3)。 30 nm 纤丝 图 D2.3 30nm 纤 丝形成 染色体 环结构 示意图 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 D3 真 核生物 的染色 体结构 要 点 有 丝分裂 时配对 姐妹染 色单体 （sister chromatid) 的经典 图片展 示 出染色 质的高 度浓缩 状态。 线性 DNA 沿 着一条 单一路 径从染 色体一 端到另 一端， 30nm 纤 丝构成 的长达 lOOkb 的连 续环的 方式 错定在 核心处 的核基 质上。 着丝粒 ~~ I 着 丝粒是 两条染 色单体 相连的 区域， 也是通 过动粒 与纺链 体连接 的 部位。 在 分裂后 期纺键 体将姐 妹染色 单体向 细跑两 极拉开 。着 丝粒 具有特 别短的 DNA 序歹 1} 特征， 在 哺乳动 物中属 于卫星 DNA。 ^ ~~ I 线性 DNA 的末端 形成端 粒结构 来保护 DNA 分子 免受降 解和渐 进的 截短。 端粒是 由一种 专一端 粒酶合 成的短 重复序 列构成 ，独 立 于正常 DNA 复制。 间期 染色休 I 在间 期染色 体的环 状结构 虽然与 核基质 相连， 但采 用了一 种比较 松散的 结构。 有 丝分裂 朵色休 异 染色质 异染色 质是中 期染色 质的一 部分， 结 构比较 紧密， 无转录 活性。 常 染色质 I 常染色 质是中 期染色 体比较 松散的 区域， 包括无 活性的 30nm 纤 丝区和 转录活 跃区， 在转 录活跃 区中纤 丝已被 解散， 单个 核小体 也可 能被转 录起始 蛋白所 替代。 DNase I 超敏性 染 色质活 性区， 或 因结合 特异蛋 白或因 进行转 录而被 松散的 30nm 纤丝的 区域， 其特 征是对 DNA 酶 I (DNase I ) 的 高度敏 感性。 CpG 甲基化 I 哺 乳动物 DNA 中 5'- CG- 3' 序 列通常 在胞喀 時碱基 处被甲 基化; 但 在频繁 转录基 因的启 动子附 近产生 不被甲 基化的 CpG 岛 （is- land), 形成对 DNase I 高度 敏感的 区域。 组蛋 白变异 休 和修饰 染 色质的 浓缩程 度受下 列条件 控制， 至少部 分受其 控制， 一是对 组蛋白 的化学 修饰， 改变 其细胞 周期中 它们所 带的电 荷数； 二 是在 持定的 细胞类 型中， 或在 不同的 发育阶 段通过 利用组 蛋白变 异体来 实现。 相 关主题 染色 质结构 （D2) 基因组 复杂度 （D4) 真核 生物的 DNA 复制 （E4) D3 真 核生物 的染色 体结构 57 有丝 分巧染 色体 着竺粒 下 面的几 幅示意 图实际 上表示 染色体 有丝分 裂中高 度浓缩 的状态 （图 D3.1)。 细胞分 裂时， 子染色 体被纺 锋体拉 向细胞 两极， 如 果不是 呈这种 紧密的 结构， 脆 弱的几 厘米长 的染色 体将会 被所产 生的拉 力扯断 。图 D3.1 所示 的结构 真实地 展示出 由同一 染色体 复制产 生的两 个姐妹 染色单 体在着 丝粒处 相连， 染 色体的 末端是 端粒， 即 DNA 分子的 末端。 虽然 DNA 采取相 当复杂 的螺旋 路径， 但总的 来说是 W 线 性的方 式排列 在染色 体的长 轴上。 图 D3.1 也 显示了 有丝分 裂染色 单体的 横截面 结构。 染 色体的 环状结 构 （参见 D2) 将由蛋 白质组 成的中 心支架 或核基 质展成 扇形， 这 些环是 由 30nm 纤丝组 成的染 色质， 一 种可能 性就是 这些连 续的环 在染色 体的长 轴 方向上 W 螺旋状 的路径 排列。 端粒 横切面 图 D3.1 有丝 分裂染 色体的 结构图 着 当粒是 在分裂 中期两 条姐妹 染色单 体相连 的紧缩 区域， 也是动 粒 ■种 与纺 缠体中 的微管 （microtubule, 参见 A4) 相 连的蛋 白复合 体 的组装 场所。 微管 在分裂 末期行 使将染 色单体 分开的 功能。 酵母 DNA 的着丝 粒仅由 88bp 长 的富含 AT 的序列 组成， 与两 段很短 的保守 区域相 连； 而在 哺乳动 物中， 着丝 粒是由 相当长 的序列 构成， 其侧 翼是大 量的重 58 复 序列， 即正星 DNA (参见 04)。 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 端粒 间期 染色体 异 染色质 常 染色质 DNase I 超 巧性 CpG 甲基 化 端粒 是形成 真核生 物染色 体线性 DNA 分子 末端的 特化了 的序列 ，由 数 W 百计 的短重 复序列 （人 类中是 5'-TTAGGG- 3') 构成， 这些 序列是 端粒酶 （如 核糖核 蛋白， ribonucleoprotein, 参见 01) (独立 于正常 DNA 复制的 机制合 成的。 端粒 DNA 可 W 形成一 种特殊 的二级 结构， 其 功能是 保护染 色体末 端免遭 降解。 端 粒的自 主 合成起 到阻止 正常的 复制不 能拷贝 线性 DNA 分子 的末端 造成染 色体渐 渐变短 的作用 （参见 E4)。 在分裂 间期， 染色 体上的 基因被 转录， DNA 被复制 （在 S 期， 参见 E3 和 E4)。 此时， 在大 半个细 胞周期 染色体 均呈一 种非常 松散的 结构， 因 而不能 观察到 单个染 色体， 但 染色体 的环状 结构应 该仍然 存在， 与核基 质相连 （参见 D2， 图 D3.5)。 异染色 质是间 期染色 体内保 持高度 浓缩的 部分， 但其紧 密程度 比中期 时要差 一些。 在电 子显微 镜下能 观察到 细胞核 四周较 浓的区 域即异 染色质 区， 可能是 由紧密 压缩的 30nm 纤维 构成。 最 近越来 越多的 证据表 明异染 色质没 有转录 活性。 尽管在 某些情 况下， 整个 染色体 都呈异 染色质 状态， 如 雌性哺 乳动物 的两条 X 染色 体， 仍可 W 相信 异染 色质的 大部分 是由靠 近染色 体着丝 粒的重 复卫星 DNA 构 成的。 染色 质中的 非异染 色质的 部分， 习惯 上统称 为常染 色质， 是全 部转录 发生的 区域。 常 染色质 的构成 是不均 一的， 其 中有由 30nm 纤丝构 成的染 色 体环是 相当不 活跃的 区域， W 及基因 正在被 活跃转 录或将 要被转 录的区 域 （约占 总体的 10%)， 这里 30nm 纤 丝已被 解离成 "串 珠" 结构 （参见 D2)。 这些区 域中的 部分， 特别是 在启动 子内， 已去 除核小 体结构 W 结合 转录因 子和其 他一些 蛋白质 （图 D3.2) (参见 M5)。 脱 氧核糖 核酸酶 （DNasel) 可 切割 DNA 骨架， 除非 DNA 因结合 蛋白 质而被 保护， 因此染 色质对 DNase I 的敏 感性可 被用来 定位细 胞中具 转录活 性的染 色质。 对 DNasel 超敏 感的较 短区域 被认为 那里的 30nm 纤 丝已被 序列特 异性调 节蛋白 的结合 所破坏 （图 D3.2)， 结果 裸露出 DNA 链， 从而 很易受 DNasel 的 攻击。 较长 的敏感 区域代 表着那 里的转 录正在 进行。 这些 区域随 细胞类 型不同 而异， 同时与 那些细 胞中特 异表达 基因的 位点 相关。 在哺乳 动物细 胞中， 一种可 能传递 信号使 得表达 基因位 点处的 染色体 保 持适当 的包装 水平的 重要化 学修饰 是序列 5'-CG-3' 中对 胞喀巧 C-5 的 甲基化 即通常 所称的 CpG 甲 基化。 在哺 乳动物 细胞中 CpG 位点 通常被 D3 真 巧生衍 的染色 体结构 59 甲 基化， 因 而在整 个基因 组中含 量相对 较少， 这 是由于 5 -甲基 胞喀晚 (5 ~methylcytosine) 可 (自发 地脱氨 （deaminate) 生 成胸腺 喀晦， 而这种 错误 又往往 得不到 修复， 所 甲 基化的 CpG 很快地 突变为 TpG (参见 F1 和 F2)。 CpG 的甲 基化与 染色质 中的非 转录区 相连， 而在整 个基因 组中存 在 着未甲 基化的 CpG 的 "驻" ， 其 CG 二核 巧酸的 比例比 一般水 平高得 多。 这 些岛通 常的长 度约为 2000bp， 并且 恰好与 DNase I 敏感区 域相吻 合 （图 D3.3)。 CpG 岛 包围着 在几乎 所有细 胞类型 中都表 达的持 家基因 (housekeeping gene) 的 启动子 区域， 可能大 部分游 离出核 小体。 图 D3.2 常染 色质， 用 粗细箭 头表示 出活性 与非活 性区域 （详见 正文） DNase I 超敏 感位点 CpG 岛 l-tKUH til —— I- 启动子 约 2kb 持 家基因 T 甲 基化的 CpG I 未甲 基化的 CpG 图 D3.3 持家 基因的 CpG 岛及其 启动子 60 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 组蛋 白变异 有关染 色质的 压缩和 解压缩 的主要 机制被 认为是 通过执 行包装 的组蛋 体 和修饰 白来 操纵的 （参见 D2)。 细胞周 期中被 包装的 染色质 的快速 变化可 通过对 组蛋 白的化 学修饰 来进行 调控， 例 如活跃 转录的 染色质 与核必 组蛋白 （参 见 D2) 的 N 端赖 氨酸 （lysine) 残基的 乙醜化 ( acetylation) (参见 B2) 相 关联， 而有丝 分裂中 染色体 的浓缩 伴随着 组蛋白 H1 的踞 酸化。 这些变 化改 变了组 蛋白所 带的正 电荷， 会 影响染 色质构 象的稳 定性， 其构 象主要 指 30nm 纤丝或 纤丝间 的相互 作用。 染色质 浓缩的 慢速变 化则与 不同的 发育阶 段和不 同的组 织类型 有关。 这些 变化与 可变的 组蛋白 变异体 的利用 （参见 D1) 相 联系， 也许 同样是 改 变了染 色质构 象的稳 定性。 组蛋白 H5 是这 种效应 的一个 很好的 范例， 在 一些非 常不活 跃的染 色质中 H5 取代了 H1， 如在 禽类红 细胞中 （参见 D2)。 D 原 怯与巧 核生物 的染色 体结构 D4 基因沮 复杂度 要 点 非编码 DNA 真 核生物 细胞的 大部分 DNA 并不 编码蛋 白质； 大 部分基 因含有 较长的 内含子 （intron) 序列， 基因或 基因簇 （gene cluster) 被 大 段未知 功能的 序列所 分割。 这样的 DNA 由许多 有些相 关的短 序 列元件 的重复 组成， 有 时重复 次数高 达数百 至数千 万个。 复性 动力学 这 是根据 序列的 拷贝数 不同在 基因组 DNA 复性过 程中的 复性速 率 不同的 原理， 来识别 不同种 类的重 复序列 DNA 的一种 技术。 用这一 技术可 将人类 DNA 分为高 度重复 DNA、 中 度重复 DNA 和单 一序列 DNA。 单 一序列 DNA 复性 最慢的 DNA 组分 就是单 一序列 DNA， 一般 由单一 拷贝基 因， 或重复 仅数次 的基因 组成。 £. C0" 的 DNA 基本上 都是单 一 序列。 串联 基因簇 基 因组中 串联重 复数百 次的某 些基因 或基因 簇区域 构成中 度重复 DNA 区段， 如 rRNA 基 因和组 蛋白基 因簇。 分 散重复 DNA 中 度重复 DNA 中 的大部 由数百 碱基对 （SINES, 即 短散布 元件） 或 1 〜 5000 碱基对 （LINES, 即 长散布 元件） 的 DNA 序列 构成， 每个序 列重复 100 000 多次， 并分 散于整 个基因 组中。 在 人类基 因组 中最突 出的例 子就是 AZw 和 元件， 这 些可能 是寄生 DNA 序列， 自身可 W 通 过转座 复制。 卫星 DNA 卫星 DNA 多 位于染 色体的 着丝粒 附近， 可 能与有 丝分裂 纺鍾体 的附着 相关， 由 大量串 联重复 短序列 （多至 30bp) 组成。 卫星 DNA 的高 变性是 DNA 指纹 技术的 基础。 遗传 多态性 基因或 染色体 基因座 上的碱 基变化 （突 变） 能使该 基因座 产生多 种形式 （多形 体）， 这就被 称为基 因的多 态性。 这个 术语可 描 述单个 个体中 单拷贝 基因的 不同突 变遗传 因子。 普 通类型 包括单 核昔酸 多态性 CSNP) 和 简单序 列长度 多态性 （SSLP)， 其中 SNP 可创造 或破坏 限制酶 的识别 序列， 结 果产生 了限制 性片段 长度 多态性 （RFLP)。 巧 关主题 核酸的 光谱学 和热力 学特性 （C3) RNA 聚合酶 I 基因： 核糖 体重复 （M2) 62 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 £ coli DNA (3) 非编码 复 杂的真 核生物 基因组 DNA 是原核 生物如 E. coZz •的 1000 多倍。 显 DNA 然其中 大部分 DNA 不 编码蛋 白质， 因此 人体中 的蛋白 质种类 并不是 E. coZz •的 1000 倍。 基因的 编码区 被内含 子中断 （参见 03)， 基因可 W 长达 数千碱 基对， 但在基 因组中 基因并 不紧密 排列， 而是 被很长 的未知 功能的 序列 隔开。 这些 非编码 DNA 的 大部分 是由不 同类型 序列的 相似或 相同多 重拷贝 组成。 这些 拷贝可 是 一个接 一个依 次排列 （串 联重 复的） 如丑星 DNA, 或者可 是多拷 贝散于 整个基 因组中 （分 散的） 如 A 记元 件。 复性 动力学 在 对基因 组序列 结构大 规模测 序之前 （参见 J2)， 基因 组序列 复杂性 的 研究是 通过测 量变性 DNA 的复性 速率来 进行的 （参见 C3)， 用 超声波 破 碎或机 械力将 基因组 DNA 剪切成 大小大 致相同 （从几 百至几 千碱基 对） 的片段 （参见 C2)， 加 热变性 后在低 浓度下 复性， 在一定 时间内 （0 DNA 复性的 比例是 由初始 DNA 浓度 （Co) 决 定的。 但在 基因组 中有多 个拷贝 的单链 片段比 单一序 列有更 多的选 择性， 可 W 与许多 互补链 结合， 结果复 性速度 比单一 序列快 得多。 DNA 链 的复性 速率可 W 用光谱 法测量 (参见 C3)， 或用更 灵敏的 分离单 链与双 链的哲 踞灰石 层祈法 测量。 用剩 余 的单链 DNA 的比例 （f) 对 Cof 作图， 得到 的曲线 代表了 DNA 样品的 复性动 力学， 送就 是通常 所称的 Cof 曲线。 图 D4.1 显 示了理 想状态 下人类 和丘. CO。 基因组 DNA 的 Cof 曲线模 式， 可 看出， 人类 DNA 复 性分为 兰个不 同阶段 （1~3)， 相对于 DNA 拷 贝数的 降低， 或复 杂度的 增加。 阶段 1 对 应于高 度重复 DNA (>106 拷 贝 / 基因 组）， 阶段 2 对 应于中 度重复 DNA (<106 拷贝 / 基因 组）， 阶段 3 对 应于单 一序列 DNA (— 个或几 个拷贝 / 基因 组）。 实际上 这样划 分有些 专断， 相互间 并没有 明显的 分界， £. coZf 的 DNA 复性仅 有一个 阶段。 0,2 10 10, 10一‘ 10—1 10° 10' Cq? mol.L—i.s 1()2 10。 r 受： A 巧巧 图 D4.1 人类和 £. CO" 的 DNA 的 理想复 性动力 学曲线 模式图 D4 基因组 复杂度 63 单 一序列 DNA 串联 基因簇 分 散重复 DNA 卫星 DNA 基因 组中的 这部分 DNA 在 CoZ 曲 线中处 在最慢 的复性 阶段， 对应于 基 因的编 码区， 在 单倍体 基因组 中通常 只有一 个或几 个拷贝 W 及那 些单一 的间隔 序列。 在丘. CO/Z •基因 组中， 实际 上所有 DNA 都是单 一序列 ，主 要是 由大体 上相连 的单拷 贝基因 组成。 但是 E. coZz •的 DNA 只是 人类细 胞 DNA 的千分 之一， 在 任一给 定的浓 度下， 任一特 定序列 都有相 对较多 的 可选择 序列， 其复性 较快， 其 Ce 《值 也相对 较小。 中 度重复 DNA 由 许多类 型的重 复序列 组成。 多 重复序 列组成 的基因 簇在重 复区域 的下游 出现， 这些 通常是 其产物 需求量 很高的 基因， rDNA (编码 rRNA) 就 是其中 一例。 编码 18S、 5.8S 和 28S rRNA 的 45S 前体的 基因 就有约 10 到 10 000 个拷贝 的重复 排列， 其拷贝 数因物 种而异 （参见 M2, 图 D4.1)。 人类基 因组中 45S 基因在 5 个 不同的 染色体 上都有 排列， 每 一排列 包含约 40 个 拷贝。 在分裂 间期， 这些 区域都 处于核 仁区， 核仁 是细 胞核中 的致密 区域， 是 rRNA 合成 和修饰 的工厂 （参见 M2 和 01)。 另一个 串联基 因簇的 例子是 组蛋白 基因， 其 产物在 S 期大量 产生。 5 个组 蛋白基 因同在 一个基 因簇， 在 某些生 物中， 可 直接重 复达数 百次。 许多物 种的中 度重复 DNA 大 部分是 由数百 （SINES, 即 短散布 元件） 至 1000 〜 5000 个 （LINES, 即 长散布 元件） 碱 基序列 重复上 千次而 构成， 并分 散于整 个基因 组中， 称为分 散重复 DNA。 AZu 元件是 人类基 因组中 最 常见的 分散重 复序列 ，即 300bp 的 DNA 序 列重复 300 000 至 500 000 次。 这些 拷贝的 80% 〜 90% 是相 同的， 绝大部 分包含 AZw I 限 制位点 (参见 G3), 故称为 A/m 兀件。 兀件 是另一 个分散 序列， 和 AZm 兀 件几 乎占了 人类基 因组的 10%, 存在于 基因间 及内含 子中。 这些分 散重复 DNA 具 有很多 潜在的 功能， 从复制 起始点 （参见 E4) 到 基因调 控序列 （参见 N)。 也许最重要的功能就是 元 件和其 他这样 的基因 家族很 可能可 转座方 式在整 个基因 组中随 机地复 刷自身 （参见 F4)。 这些 序列可 是寄 生的， 或 者是自 在的， 也许其 DNA 序列 自身没 有 功能， 但 通过影 响或中 断基因 序列， 在 进化中 起着很 重要的 作用。 真核生 物基因 组中高 度重复 DNA 由一些 2bp 至 20 〜 30bp 的 极短序 列， W 数 千个拷 贝的串 联方式 排列。 这种排 列又称 为卫星 DNA， 是因为 在 染色体 DNA 片段的 CsCl 密度梯 度离私 中， 由 于浮力 密度的 不同， 在主 带 DNA 附近出 现的卫 星带。 因 为由很 短的重 复序列 组成， 其 G+C 的含 量也 不一般 （参见 C2)。 根据重 复序列 的长度 不同， 卫星 DNA 可 分为小 卫星 DNA (不 确定数 目串联 重复， VNTR) 和微卫 _星DNA (简单 串联重 复， STR)， 微卫星 DNA 由最 短的重 复序列 组成。 图 D4. 2 显示了 一个果 蜗 的卫星 DNA 序列， 该序 列在果 蜗基因 组中出 现几百 万次。 与分 散重复 序列 一样， 卫星 DNA 还没有 被证明 有任何 功能。 其 中那些 集中在 染色体 64 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 巧传 多态性 着丝粒 附近， 并形 成一大 片异染 色质区 的卫星 DNA， 很可 能起着 着丝粒 与动粒 结合的 作用。 小卫星 DNA (VNTR) —般出 现在染 色体的 末端， 而 微卫星 DNA 则 较为平 均地沿 染色体 分布。 用 来鉴定 个人与 其家族 的亲缘 关系的 DNA 指 纹技术 （DNA finger- printing technique) 的基 础就是 小卫星 DNA 的重复 序列。 在某 些卫星 DNA 序列的 排列中 拷贝数 是高度 可变的 （hypervariable), 这在不 同个体 中 的变异 极大。 这 些变异 体现了 基因的 多态性 （见 下面及 F1)。 通 过限制 性 酶切、 southern 印迹 和杂交 （参见 J1) 可 角定基 因组中 几个不 同卫星 DNA 排列 组中的 DNA 的精确 长度， 进而可 W 鉴别一 个特定 个体。 也就是 说， 另一 个个体 （除 了双 胞胎或 同一个 克隆） 具有同 样一套 排列的 长度的 概率是 极其微 小的。 因为 这种排 列是从 双亲那 里各得 一半， 亲缘关 系也可 W 通 过比较 不同个 体间的 长度来 确定。 ATAAACT TATTTGA ATAAACT TATTTGA ATAAACT TATTTGA 图 D4.2 果魄 的卫星 DNA 重 复单位 如果同 一种类 的不同 染色体 或不同 个体之 间的某 一条染 色体上 的相同 区域 或基因 座上含 有两个 （或 更多） 稍微 不同的 DNA 序列， 这就 被描述 为多 形体， 而该基 因座则 被称为 展示了 （遗 传） 多 态性。 基 因多态 性是由 突变 导致的 （参见 F1)。 譬如在 一个双 倍体个 体中， 一个特 定的单 拷贝基 因上的 两个突 变遗传 因子可 因为仅 仅一个 核昔酸 不同而 不同， 从 而该基 因就 被称为 具有多 态性。 相 似地在 一个群 体中， 如果 同一个 基因存 在其他 可 选择的 DNA 序列， 肯 定会有 许多编 码该基 因的不 同的等 位基因 （在整 个群体 中）。 导致基 因多态 性的突 变事件 （参见 F1) 不仅会 导致如 上所述 的单 核音酸 多态性 （SNP)， 而 且会导 致数组 重复序 列在长 度上的 变化。 重 复的每 一不同 长度都 是一种 不同的 形式， 也是简 单序列 度 多态性 (SSLP) 的 例子。 SNP 可 W 发生 在限制 酶识别 （参见 G3) 的短序 列中， 因此用 限制酶 消 化一个 DNA 分 子所产 生的片 段长度 对每一 个等位 基因都 是不相 同的。 这 就是所 谓的限 制性片 段长度 多态性 （RFLP)。 如 果一个 恃定的 RFLP 与 一个遗 传疾病 的等位 基因相 关联， 它就可 W 在临床 诊断上 用来做 标记。 RFLP 还可 W 用来 帮助画 出染色 体的遗 传图， 因此可 (帮助 搞清基 因组测 序计划 （参见 J2) 中的 DNA 序列的 顺序。 可 用凝 胶电泳 （参见 G3) 检测出 像限制 性片段 （参见 G3) 或 PCR 产物 （参见 J3) 这 样的具 有相同 长 度的片 段中的 SNP。 在此过 程中， DNA 片段 必须先 变性， 这样 才能使 D4 基因组 复杂度 65 两 个分开 的链在 电泳迁 移中保 持只依 赖于其 核巧酸 序列的 构象。 这 种技术 被 称为单 巧构象 多态性 （SSCP)。 D 原 巧与真 核生物 的染色 体结构 D5 遗传 信息流 要 点 中心 '法则 中心 法则最 初的观 念就是 DNA 到 RNA 到蛋 白质， 其中 转录与 翻译是 分别进 行的。 虽然 有很多 例子与 其有相 矛盾的 地方， 但它 还是在 大范围 内是正 确的。 反 转录病 毒能将 RNA 反 转录为 DNA, 很 多病毒 能直接 W RNA 为模 板复制 RNA， 还有 很多生 物能编 辑信使 RNA 序列， 因 此蛋白 质编码 序列不 仅仅直 接由特 异的 DNA 序列 决定。 原 枝基因 表达 单个基 因或操 纵子的 转录从 启动子 开始， 结 束于终 止子， 产生单 顺反 子或多 顺反子 的信使 RNA。 核糖体 从起始 密码子 （靠 近核 糖 体结合 位点） 到 终止密 码子翻 译信使 RNA 的编 码区。 转运 RNA 根据遗 传密码 把适当 的氨基 酸递送 到延长 的蛋白 链上。 真枝基 因表达 大多数 情况下 转录起 始于启 动子， 单顺反 子信使 RNA 从 一个基 因转录 而来。 产 生出的 前信使 RNA 在 5' 端 有帽子 结构， 在 3' 端 有多聚 A 尾己。 在成熟 mRNA 从核 中释放 到细胞 质中被 核糖体 翻译 之前， 其中 的内含 子通过 剪接被 去除。 巧 关主题 原 核生物 的转录 （K) 遗传 密码与 tRNA (P) 真 核生物 的转录 （M) 蛋白 质合成 （Q) RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 （0) 中 ，巳 、法则 在 20 世纪 50 年代 早期， Francis Crick 提出遗 传信息 沿着从 DNA 到 RNA 到蛋白 质单向 传递， 即 DNA 产生 RNA， RNA 产生蛋 白质。 这就是 著名 的分子 生物学 的中， I：、 法则， 虽然在 当时它 的每一 步还没 有被足 够证据 所 证明。 我们 现在知 道中心 法则的 基本框 架是正 确的， 虽然 我们还 有必要 对基本 框架作 出很多 修正。 有 关遗传 信息传 递的更 完整的 图形表 述如图 D5.1 所示， 基本的 路线仍 然是从 DNA 到 RNA 到蛋 白质。 在原核 和真核 生物细 胞中， DNA 被转录 （参见 K) 为 RNA 分子 （信使 RNA)， 它包含 了相 同的序 列信息 （虽然 U 代替了 T)， 然后 送些信 息按遗 传密码 （参见 P1) 翻译为 （参见 Q) 蛋白 序列。 我们把 DNA 复制 （参见 E) 也 包括在 图 D5.1 中， 通过对 DNA 分 子信息 的复制 形成两 个子代 DNA 分子。 但是， 也 确认出 这个基 本框架 的一些 例外。 许 多病毒 包含由 RNA 分 子 构成的 基因组 （参见 R4)。 反转录 病毒， 包 括引起 AIDS 的致 病病毒 HIV, 单链 RNA 分子 被转换 为双链 DNA 拷贝 （T 代替 U)， 随后 就插入 到宿主 细胞基 因组。 该 过程被 称为反 转录， 其 相应的 由病毒 基因组 编码的 D5 遗传 信息流 67 原核 基因表 达 真巧 基因表 达 酶， 称之 为反转 录酶。 还 有很多 病毒的 RNA 基因组 直接被 复制为 RNA， 而 不利用 DNA 作 为中介 （RNA 复 制）， 例如 冠形病 毒和丙 型肝炎 病毒。 到目 前为止 还没有 发现蛋 白质能 特异性 地决定 特定的 RNA 或 DNA 序列 的 例子， 因此 中私法 则的翻 译步骤 确实表 现出单 向性。 在 一些生 物中， 发现了 RNA 在从 DNA 转 录后被 改变的 例子， 这个 过程 被称为 RNA 编辑 （参见 04)， 所 WDNA 序列不 是非常 忠实地 被用于 编 码产物 蛋白。 RNA 编 辑；， ^RNA J : RNA 复制 涵译 图 D5.1 遗 传信息 的传递 . 图 D5.2 和图 D5.3 表示出 与真核 与原核 细胞基 因表达 的相似 点和不 同点。 在原核 生物中 （图 D5.2)， RNA 聚合酶 （参见 K2) 转录基 因起始 于启 动子， 这是 DNA 上一 段特异 性的启 动转录 （参见 K3) 的 序列， 终止 于它 特异性 地终止 转录的 终止子 （参见 K4)。 产生的 mRNA 可能 包含编 码一个 或多个 蛋白的 区域。 在后 一种情 况下， 信使 RNA 被 描述为 是多顺 反子， 编码这 部分的 DNA 区 域称为 操纵子 （参见 L1)。 mRNA 的 编码区 在 巧糖体 （参见 01 与 Q) 上被翻 译成蛋 白质， 该过 程首先 是核糖 体在核 糖体结 合位点 （RBS) 与 mRNA 结合， 通 过转移 RNA (tRNA, 参见 P2) 按 遗传密 码运送 氨基酸 （氨 酷-瓜 NA) 从起始 密码子 （通 常为 AUG) 到 终止 密码子 把信息 翻译为 氨基酸 序列。 在 真核生 物中， 转 录发生 在核内 而翻译 则发生 在细胞 质中， 因此 mRNA 具有 更长的 寿命。 转 录的前 mRNA (pre-mRNA) 由二种 RNA 聚 合酶中 的一种 （RNA 聚合酶 1， 参见 M4) 来 合成， 且通常 只编码 一个蛋 白 （即 单顺反 子）。 RNA 在核中 通过在 5' 端 加帽和 3' 端加 poly (A) 尾己 68 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 增加其 稳定性 （参见 03)。 在 大多数 真核基 因中， 蛋 白编码 区被非 编码的 间 隔序列 （称 为内 含子） 所 打断。 因此 最终前 mRNA 中的 内含子 必须被 去掉 W 产生 连续的 蛋白编 码序列 （外显 子）， 这一过 程称为 剪接， 是由一 种 被称为 snRNP (核 内小 核糖核 蛋白， 参见 03) 的 RNA- 蛋白质 复合所 介导。 成熟 mRNA 随即 就被运 出细胞 核并在 细胞中 经核糖 体翻译 成蛋白 质。 启动子 DNA_5|g|J~ 转录区 终止子 转录 RNA 聚合 酶 5' PPP - 1 终止密 AUG 11^子 RBS AUG \ __ \1/ 71T RBS mRNA 终止 密码子 "FH-OH 3' 涵译 核 巧体， 氨巧 -tRNA 图 D5.2 原核 基因表 达简图 D5 遗传 信息流 69 转录 RNA 聚合巧 II 外显子 AUG / 终止 \ / 内含子 / 5' ppp-t J L"' ; V" 'I i：cz::: _ \ 刖 mRNA poly(A) 位点 RNA 加 I 剪接， 加帽， 聚 腺巧化 5' MeGppp - [ 捐 AUG mRNA 终止 ；^-AAA … 3' Poly(A) 尾 图 D5.3 真核 基因表 达简图 (王 薛林译 刘进 元化） • : ； ’I jj： jr ••成 •••’ . ■ ii£ 牵曲齡 w -逆 .4^ — n w 。 度 •巧 IMF mmmmm 謹 ，^|— •|巧— I ' ' ' W, 啤 •- 知 0^Qih ^ 接石 度 曲-痛 板菲 编巧的 旅 g 户 支扣 々打巧 -dA 会黄可 V 續 in 矜含予 么巧彼 ^ '，把 。着占 * 巧 巧 々巧 •• 是由一 * 巧） RNA •巧白 巧复含 1^ ‘寺 一 IK* '♦當金著^5^*^产白, 参4 < . 节* j W.A i. , . 巧嗦巧 i 斯 茂中公 译化 X 毎 «々 K rr^anari： A 巧 ‘ /• A 叫 八章舍 _ ， • i ■: A … II • — — — I . 萨 、咕 TwRitTg' 兴 •乐 ii.» .M ，«« ii 餐 xii •i 省 . „ j *心 、Sja .成- 緻％ 線 — ' *• T 屯 ;m— 二 -— — ：!» 辦 y /'’ r. .. mm .巧 娜碧 >■ 、、 •： t 宙 fi 怒 《 田 》»冀 t. 巧田 也扫 • 号; 巧 '• V 节 …飾 餐 評不 .%戸 专」 ♦ 乂和 m E DNA 复制 El DNA 复 制概述 要 点 半保 留机制 I 在复 制中， DNA 双 螺旋的 两条链 解开， 并分别 作为模 板指导 脱氧 核巧酸 5'- 兰踞酸 为前体 的互补 子链的 合成。 这样每 个子细 胞接 受亲代 DNA 双 链中的 一条。 送 种机制 可用密 度标记 实验来 证明。 像 细菌、 病 毒这样 的小染 色体， 是 W 单一复 制子的 单位进 行复制 的。 复制 从特定 的位点 —— 复 制起点 开始， 双向进 行直至 终点。 真 核生物 的染色 体包含 多个复 制子， 每个复 制子有 自己的 复制起 点， 并在 复制中 融合成 一体。 起点 处富含 AT， 便于 解链。 半不连 续复制 I 每个 复制叉 中的前 导链是 连续复 制的， 而后 随链是 反方 向合成 不连 续的短 片段。 这 样的短 片段在 原核生 物中约 1000~2000nt 长， 在 真核生 物中约 100 〜 200nt 长， 由 DNA 连接酶 连接。 这种 机制 的存在 是因为 DNA 只能由 5' 一 3' 方向 合成。 RNA 引导 I 前 导链及 所有的 后随链 片段的 DNA 合 成是都 由短的 RNA 片段 引导 起始， 然后沿 DNA 模板 延伸。 引物在 连接前 被去掉 并填补 上 DNA。 这种机 制有助 于保持 高度的 复制保 真性。 复 制子、 复制 起点 与终点 巧 关主题 原 核与真 核生物 的染色 体结构 （D) DNA 修复 （F3) 细菌的 DNA 复制 （E2) 唆 菌体与 真核生 物病毒 （R) 真核 生物的 DNA 复制 （E4) 半保 留机制 DNA 复制机 制的核 心在于 DNA 双螺旋 中的两 条链都 携带相 同的信 息， 它们 的碱基 序列是 互补的 （参见 C1)。 这样在 复制中 两条亲 代链分 开， 分 别作为 模板指 导酶催 化的新 生互补 子链的 合成， 并遵 循标准 的碱基 配 对原则 （A 与 T， G 与 C)。 两条新 生双链 在细胞 分裂时 分别进 入两个 子细胞 （图 El.la)。 亲代 链分开 及新生 DNA 开始 复制处 称为复 制叉。 1958 年， Meselson 和 Stahl 用实 验证实 了半保 留机制 （图 El.lb)。 大肠 杆 菌细胞 在含有 i5N 标记的 培养基 中生长 几代， 它们的 DNA 就 完全被 "N 密度 标记上 （两条 链均被 标记； "N/i5N)。 然后将 细胞转 移到含 有正常 14 N 的培养 基中， 每一次 细胞分 裂后， 都取 样提取 DNA 并进行 CsCl 平巧密 度 梯度离 必， 可根据 浮力密 度将不 同的分 子分开 （参见 A2 与 C2)。 第一 代 细胞分 裂后， DNA 复制了 一次， 全部 是杂合 分子， 在梯 度上处 于纯" N/"N DNA 与纯 14N/14N DNA 之间。 在 i4n 的培养 基上第 2 代细 胞分裂 72 E DNA 复制 后， 一半是 杂合的 "N/14N 的 密度， 一半 是纯合 的轻链 （i4n/i4n)。 在接 下 来每一 代中， i4N/i4NDNA 的比 例逐渐 上升， 但 仍有一 部分是 杂合的 u N/i4N 分子。 上 述结果 只能用 半保留 模型来 解释。 所有 DNA 分子都 W 这 种方式 复制， 模板 W 3' 一 5' 方 向被读 （参见 C1)， 而 新生链 5' 一 3' 方向 合成。 DNA 合成 的底物 是脱氧 核巧； 縣酸 （dNTP): dATP、 dGTP、 dCTP 和 dTTP。 其反 应机制 涉及由 新生链 3' 端核 巧酸的 3'-OH 与 下一个 碱基互 补的 dNTP 的 a- 磯 原子处 的亲核 攻击， 结 果是焦 縣酸的 除去。 合 成的能 量 来自于 dNTP 的 水解， 并 产生焦 憐酸。 (a) 亲本 亲本 （a) (b) DNA DNA 复制叉 亲本 子代 子代 亲本 DNA DNA DNA DNA ) LL LH HH 2 關闢 图 E1.1 (a) 复制 叉处的 DNA 半保留 复制； （b) 半保留 复制的 验证。 左边 的离心 管表示 在生长 相 应代后 完全被 "N 标记的 DNA (HH)、 杂合 （LH) 及 完全被 "N 标记 （LL) DNA 带的在 密度梯 度中的 位置。 右边的 图表示 相应的 DNA 分子。 最初的 标记的 DNA 分子 由粗线 表示， 所有 i4N 子链 DNA 均用细 线表示 复制子 、复 单 一单位 复制的 任一段 DNA 都 称为复 制子。 在单 个复制 子内的 制起 始与终 DNA 复制是 从一被 称为起 始点的 固定点 起始的 （图 E1.2a)。 通常 两个复 点 制 叉从起 始点向 两个方 向进行 复制， 随着双 链的解 链模板 被复制 直至终 点。 所有 的原核 生物染 色体、 许多 晦菌体 W 及病 毒的 DNA 分子都 呈环形 (参见 D1)， 并 由单一 复制子 构成， 因此与 惟一起 点成约 180° 处就有 1 个 El DNA 复 制巧述 73 单 一终点 （图 El. 2a)。 线 性病毒 DNA 分子通 常只有 1 个单一 起始点 ，但 不一 定在该 分子的 中间。 不营 怎样， 起点都 是一个 复杂的 区域， DNA 复 制的 起始与 生物生 长周期 调节都 在这里 进行并 协调。 相比 之下， 真 核生物 的线形 染色体 是由多 复制子 构成， 每个 复制子 都有自 己的起 始点。 一个典 型的哺 乳动物 细胞有 50 000 〜 100 000 个复 制子， 每 个复制 子长约 40 〜 200kbo 在相 邻复制 叉的复 制泡相 遇处， 新生 DNA 融合并 形成复 制完整 的 DNA (图 E1.2b)。 真 核染色 体起始 点序列 要比单 复制子 DNA 的复制 起始 点简单 得多， 因 为真核 DNA 复制的 调控主 要是在 S 期 的开始 而不在 每 一单个 起始点 （参见 C3)。 所有 起始点 都在双 链最初 解链处 均富含 AT 序列， 富含 AT 的 起始点 比富含 GC 的起 始点更 易解链 （参见 C3)。 + # # • —— • # • — 图 E1.2 (a) 一 个环状 细菌的 复制子 的巧向 复制。 两 个复制 叉均从 起始点 （0) 向 背向终 点行进 (T). 子链 DNA 用粗线 表示； （b) 真 核生物 的多复 制子， 每一 起始点 均用黑 点表示 74 E DNA 复制 半不 连续复 在半 保留复 制中， 两条 DNA 的 新生链 合成在 同一复 制叉中 同时进 制 行。 但 DNA 复制 原则上 只允许 W 5' 一 3' 方向 进行。 因两条 DNA 链 是反向 平 行的， 那么 方向为 5' 一 3' 的那 一条亲 本链又 是如何 被复制 的呢？ 似乎应 该是 W 3'->5' 方向 进行， 而事实 上并非 这样。 如果把 £. coZf 细胞用 3H 胸 腺啼時 （一个 具放射 活性的 DNA 前体） 标记几 秒钟， 当用 碱性谎 糖巧度 对新生 DNA 进行 离必， 根据 分子大 小变性 DNA 的 单链会 分开， 结果发 现 大量新 合成的 1000~2000nt 长 （真 核中是 100~200nt 长） 的小 片段。 如果这 些细胞 进而在 未标记 的胸腺 唆睹中 培养， 那这 些冈崎 片段很 快便连 接成大 分子的 DNA。 这些 结果可 W 用半不 连续复 制模型 来解释 （图 E1.3)。 一 条链即 前导链 是从起 始点按 方向进 行连续 复制， 而另一 条链即 后随链 不立即 复制而 是被约 1000~2000nt 长 （真 核生 物中约 100- 200nt 长） 的短 片段取 代的。 后随 链的复 刺从复 制叉处 起始， 按 5' 一 3' 的 反方 向朝向 起始点 形成第 1 个冈崎 片段。 随着复 制叉的 前进， 前导 链维续 被复制 成连续 长链， 而 后随链 片段按 反方向 W 不连续 方式被 复制。 事实 上， 后 随链与 前导链 两者合 成的物 理方向 与前导 链是相 同的， 因为 后随链 在复 制叉处 回转了 180"。 合成 后不久 冈崎片 段就被 DNA 连 接酶连 成一条 连续的 DNA (参见 E2)。 3. 5’ 3. 冈 時片段 图 E1.3 半 不连续 夏制。 图 中标出 T 第 1 个 0) 及第 2 个 （ii) 冈崎 片段或 新生片 段在后 随巧上 的 形成， 只显示 出单个 复制叉 RNA 引导 对 冈崎片 段的仔 细研究 表明， 与前 导链的 头几个 一样， 每 一片段 5' 端 的头几 个核巧 酸均是 核糖核 巧酸， 因此 DNA 合 成是由 RNA 引导的 (参见 E2)。 这些引 物在片 段连接 之前被 去掉， 产生 间隙由 DNA 填补 。用 RNA 引导 DNA 复 制的原 因很可 能是出 于保证 DNA 复 制的高 忠实性 （参 见 F4)。 E DNA 复制 E2 细菌的 DNA 复制 要 点 实 验系统 遗 传上简 单的蹈 菌体和 质粒是 用于体 外研究 较大而 脆性的 细菌染 色体 很有用 的模型 系统。 这些最 简单的 DNA 几乎 完全依 赖于宿 主细胞 的复制 蛋白。 大 一些的 駿菌体 可编码 一些它 们自己 的复制 因子。 起 始 复 制是通 过起 始的速 率来调 控的。 在 的复制 起始点 oWC 处的起 始涉及 到在起 始蛋白 复合体 （DnaA-ATP) 处的 DNA 的 缠绕 (及 在富含 AT 序列处 双链的 解链， 然后 解旋酶 DnaB 结合 上 去为复 制而延 伸单链 区域。 DnaA 酶的含 营与生 长速度 相关。 解 旋 亲本链 DNA 被 DNA 解 旋酶及 单链结 合蛋白 作用而 解旋， 产生 的正超 螺旋被 拓扑异 构酶即 DNA 旋 转酶所 释放， 旋转酶 是抗生 素作 用的祀 目标。 延 伸 移 动着的 引发体 在后随 链上合 成多个 引物， DNA 聚合酶 田全酶 的二 聚体延 伸前导 链及后 随链， a 亚 基聚合 DNA， £ 亚基 校正新 生 DNA 分子。 DNA 聚合酶 I 的 5' 一 3' 外切 核酸酶 活性切 去后随 链上的 RNA 引物， 聚合酶 同时用 DNA 填补上 DNA 于缺 口中， 然后 DNA 连接酶 将后随 链上的 冈崎片 段连成 一体。 终止 与分禹 E. coli 的两 个复制 叉在与 复制起 始点成 180° 的复 制终点 相遇， 相互 连锁的 子链在 DNA 拓 扑异构 酶的作 用下相 分离。 相 关主题 原 核与真 核生物 的染色 体结构 （D) 真核 生物的 DNA 复制 （E4) DNA 复 制概述 （E1) DNA 修复 （F3) 实 验系统 DNA 复 制的大 部分知 识是利 用制备 DNA 及完 成复制 所必需 的相关 蛋 白质及 其因子 构成的 体外系 统而获 得的。 但 像丘. coZ/ 这 样的原 核生物 的染色 体大而 脆弱， 不能 用上述 方法来 研究。 因而小 且简单 的嗤菌 体和质 粒 DNA 被 广泛用 作模型 系统。 其中 遗传上 简单的 唆菌体 重 X174 为 E. coli 染 色体复 制的研 究提供 了最佳 模型， 因为 它几乎 完全依 赖于细 胞的复 制因 子来进 行自身 复制。 乐 ；n74 的复 制结构 体是一 个仅有 5kb 的 超螺旋 环状 DNA。 大一 点的峰 菌体如 T7 (40kb) 和 T4 (166kb) 编码多 个自身 复 制所需 蛋白， 并采用 一些独 特的机 制来完 成自身 复制。 虽 然不是 很好的 模型， 但仍 能提供 丰富的 信息， 且可 为阐明 复杂的 DNA 复 制机制 提供很 多 有用的 解答。 76 E DNA 复制 起始 虽 然细菌 DNA 复制也 从复制 起始点 起始， 但唆 菌体及 质粒并 不是研 究合 适细茜 DNA 复制的 模型， 这 是因为 嗤菌体 及质粒 DNA 在单 个细胞 分裂 周期可 复制许 多次， 而 细菌染 色体的 复制与 细胞生 长周期 紧密偶 联。 £. coZ: •的起 始点位 于遗传 基因座 oWC, 并与 细胞膜 相连。 这 一区域 已 被克隆 并构建 成类似 £. CO。 的染色 体的， 且易于 研究的 微型染 色体。 oriC 包含 4 个 9bp 的起 始因子 DnaA 蛋白 的结合 位点。 起始 蛋白的 合成与 生长 速度相 偶联， 因而 复制的 起始也 与生长 速度相 偶联。 细胞高 速生长 期， 原核染 色体可 在第 一轮复 制结束 之前就 从两个 新形成 的起始 点开始 第 2 轮 复制。 在 这种情 况下， 子 细胞得 到的是 部分还 在进行 复制的 染色体 (图 E2.1)。 一旦 DnaB 蛋 白达到 一个足 够量， 即 形成由 30~40 个 分子构 成的复 合体， 每 一个分 子结合 1 分子 ATP， 在其 周围的 orfC DNA 呈缠绕 形 （图 E2.2)。 该过 程需要 DNA 形成负 超螺旋 （参见 C4)。 负超 螺旋有 助于 3 个 13bp 长 的富含 AT 的重复 序列的 解链， 同 时允许 DnaB 的 蛋白结 合。 DnaB 是个 DNA 解 旋酶。 解旋酶 是利用 ATP 水 解的能 量结合 并解开 双链 DNA (或 RNA)。 用这种 方法形 成的单 链泡被 单链结 合蛋白 （Ssb) 所 覆盖， 防止发 生断裂 及重新 复性。 DNA 引发酶 结合到 DNA 上 并合成 一 段短的 RNA 引物， 从而引 发第一 个复制 叉的先 导链的 复制， 接 下来是 双向 复制。 0 图 E2.1 第一轮 复制完 成前， 细菌在 新的起 始点处 （0) 又 起始了 新一轮 复制。 T 表示 终止点 oriC DNA 为利 于复制 打开的 DNA 链 图 E2.2 通过 DnaA 蛋白 周围的 oriC DNA 的缠绕 打开起 始点处 DNA 双链 W 利 于复制 E2 细菌的 DNA 复制 77 解旋 延伸 终止 与分离 为了 使起始 于起始 点的复 制不断 进行， DNA 解 旋酶须 沿着模 板链前 进， 并打 开双螺 旋使复 制顺利 进行。 除 DnaB 外， 另一 DNA 解旋 酶可结 合 到另一 条链上 W 帮助 解链。 Ssb 蛋白 的结合 进一步 推进了 解链的 进行。 但在闭 合环形 DNA 分 子中， 在 复制叉 处的螺 旋转角 的去除 会导致 分子其 余部 位额外 转角的 导入， 结果形 成了正 超螺旋 （参见 C4)。 虽 然环形 DNA 本身 具有的 负超螺 旋部分 地抵销 了正超 螺旋， 但对于 复制叉 的不断 前进 仍是不 够的。 这些正 超螺旋 可通过 1 型 拓扑异 构酶即 DNA 旋 转酶作 用引 入负超 螺旋而 得到不 断释放 （参见 C4)。 DNA 旋转酶 的抑制 剂如新 生霉素 （novobiocin) 及 奥晰酸 （oxolinic acid) 是细菌 复制的 有效抑 制剂， 也具有 抗生素 活性。 随着新 形成的 复制叉 替代亲 本链的 后随链 （参见 E1)， 1 个包含 DnaB 解 旋酶和 DNA 引 物酶， 被称作 发体的 移动复 合体在 后随链 上每隔 1000 〜 2000nt 就合成 1 个 RNA 引物。 前导链 和后随 链的引 物均由 DNA 聚 合酶] II 全酶来 延伸。 该多 亚基复 合体是 一个二 聚体， 一个 单体用 于先导 链的 合成， 另一个 用于后 随链的 合成。 1 个 复合体 中具有 两个聚 合酶可 W 保证 两条链 同样速 度进行 合成。 二聚 体的两 个单体 都含有 聚合酶 a 亚 基， 和一个具有3_'-?^巧正巧卓抱处切握1^^亚基。 阅读 校正有 助于维 持复制 的高度 忠实性 （参见 F1)。 P 亚基 酶 结合于 DNA。 而 在每一 个单 体中的 其余亚 基各不 相同， (保证 全酶分 别在先 导链上 和后随 链上合 成长的 或短的 DNA 片段。 一旦后 随链的 引物被 DNA 聚合酶 田延伸 ，会 由 DNA 聚合酶 I 来 将引物 去除， 并 填补上 DNA。 DNA 聚合酶 I 具有 5' 一 3' 聚 合酶、 5' 一 3' 外切 核酸酶 (及 3' 一 5' 校 正外切 核酸酶 活性。 5' 一 3' 外切 核酸酶 在去掉 引物的 同时， 聚 合酶通 过延伸 邻近冈 崎片段 3' 端 DNA 来填 补缺口 （图 E2.3)。 两个片 段间最 后的縣 酸二醋 键是由 DNA 连接酶 来 催化完 成的， E. co/z •中 DNA 聚合酶 利用协 同因子 NAD+ 作为 一个特 别 的能量 来源。 NAD+ 被 分解成 烟醜胺 单憐酸 （NMN) 和 腺曝吟 单核巧 酸 （AMP)， 该 AMP 可通过 5'- 5' 连接共 价结合 到某一 片段的 5' 端。 来自 NAD+ 的 焦縣酸 键水解 的能量 上 述方式 储存， 并 用于随 后的该 5' 端与相 邻片段 之间的 3'- OH 的 连接， 同 时释放 AMP。 体内 的卫 NA 聚合酶 曲的 引 发体和 DNA 解旋醒 物理 方式结 个大 的称为 复_ 制 表巧 夏香呑 r 该复带 y 体 W 每秒 900bp 的速 率合成 DNA。 两个复 制叉在 orzC 约 180° 的对面 相遇。 在这一 区域内 有几个 终止子 的 位点， 它们与 基 因产物 即一种 DnaB 解 旋酶的 抑制剂 结合， 从而四 止复 制叉的 移动。 这 样即使 1 个复制 叉由于 某种原 因而拖 延了， 它 们仍会 在 终止处 相遇。 复制结 束时， 两 个子链 仍是相 扣的， 它们 由拓扑 异构酶 IV (一 种日型 拓扑异 构酶） 解联 （参见 C4)， 结 果随着 膜的附 着点移 动而相 互 分离， 分配到 2 个子 细胞中 （参见 D1)。 78 E DNA 复制 RNA 引物 ― 一一 \ ' 引 物去除 r 1 缺 口填补 f 1 连接 ， 5' 3. 5 ‘ 3* 5. 3' 5* 3' 图 E2.3 后 随链上 RNA 引物 的去除 及随后 的缺日 填补与 连接。 DNA 聚合酶 I 去除引 物与填 补缺口 是同时 进行的 E DNA 室制 E3 细 胞周期 要 点 细 胞周期 细胞周 期包括 DNA 复制后 的细胞 分裂， 即 从一个 母细胞 产生两 个子 细胞。 细 胞周期 是一个 有序的 过程， 受细胞 周期机 制的控 制。 细 胞周期 含有四 个主要 时期： Gi、 S、 G2 和 M 期。 S 期是 DNA 合 成期； M 期 （即 有丝 分裂） 是 细胞分 裂期。 这两 个期被 Gi、 G2 这两 个间 隙期分 隔开， M 期可 进一步 划分为 前期、 中期和 后期。 Gi、 S、 G2 共同组 成细胞 分裂的 间期， 细 胞可由 Gi 期进 入一 个非增 殖时期 —— Go 期 或称静 止期。 细胞周 期随细 胞周围 环境而 调整， W 免受损 伤的细 胞发生 增殖。 检验点 是当外 界条件 不适合 细胞分 裂时可 W 中断细 胞周期 的一些 阶段， 主 要检验 点位于 Gi 和 G2 的后期 ，在 Gi 期的 R 点， 当缺 乏促细 胞分裂 原时， 细胞会 脱离细 胞周期 进入非 增殖的 Go 期。 细 胞周期 是通过 多种蛋 白激酶 复合物 催化的 蛋白憐 酸化来 实施调 控的， 这些 复合物 包含调 控亚基 （细 胞周期 蛋白） 及催 化亚基 (依 赖细 胞周期 蛋白的 激酶， CDK)。 不同 的复合 物调控 细胞周 期中 的不同 时期， 它们的 活性同 时受到 多方面 因素的 影响， 如合 成 过程中 的转录 调控、 抑制蛋 白对其 酶活的 改变、 蛋白水 解对其 造成的 损伤。 能 否通过 Gi 期受 控于转 录因子 E2F 的 激活， E2F 刺激细 胞周期 中所需 基因的 表达， 在 Gi 期 的早期 E2F 受到 去踞 酸化的 RB 结 合的 抑制。 Gi 期 中的细 胞周期 蛋白- CDK 复 合物使 RB 踞 酸化， 从 而释放 E2F 激活 转录。 GIP 和 INK4 蛋白通 过抑制 细抱周 期蛋白 -CDK 复 合物的 活性阻 断细胞 周期的 进程， Gi 到 S 期的过 渡受到 原癌基 因和抑 癌蛋白 的 调控， B 细胞的 癌变与 细胞同 期蛋白 D1 基因的 过表达 相关。 RB 是 Gi 过渡到 S 期的 一个关 键调控 因子， 它和 INK4P16 都是 癌 症抑制 蛋白。 在 DNA 受到损 伤时， CIP 蛋白 P21WAF1/CIP1 被抑 癌蛋白 P53 所 激活。 细胞 周期的 激活、 本 P 制与 痛症 E2F 和 RB 的调控 细胞周 期蛋白 和依赖 于细胞 周期 蛋白的 激酶 检 黎点及 其词控 细 胞周期 4 个时期 80 E DNA 复制 相 关主题 真 核生物 的染色 体结构 （D3) 真核 生物的 DNA 复制 （E4) RNA 聚合酶 n 基因： 启动子 与 增强子 （M4) 转录调 控举例 （N2) 癌基因 的分类 （S2) 肿瘤抑 制基因 （S3) 调亡 （S4) 细 胞周期 细胞 分裂的 两个主 要阶段 是细胞 DNA 的 复制和 细胞分 裂^两 个子细 胞， 子 细胞进 一步分 裂形成 下一代 细胞， 细胞分 裂过程 的不断 fi 复， 也可 看 作是伴 随着细 胞分裂 DNA 复制 的不断 重复， 送就 是细胞 周期。 细 胞分裂 是一个 有序的 和受到 调控的 过程。 如果细 胞没有 先复制 DNA 就发 生分裂 或是在 细胞分 裂之前 DNA 发生了 重复的 复制， 这 将都是 灾难 性的。 所 W 可 W 把细 胞增殖 看作一 个循环 过程， 受到细 胞周期 机制的 协调 W 保证细 胞周期 的正确 顺序。 细 胞周期 4 DNA 复 制和细 胞分裂 发生在 明显的 且很有 规律的 时间间 隔内， 因此 个时期 可 将细胞 周期模 式化地 分为四 个时期 （图 E3.1) Gi 最 长的一 个时期 （又 叫间隙 期）， 在此期 间细胞 为复制 作准备 S 又称 DNA 合 成期， DNA 进行 复制， 形成每 条染色 体的完 整拷贝 （参 见 E4) G; 一个较 短的间 厥期， 位于 S 期后、 有丝分 裂之前 M ( . ' 有竺 分裂， 随 着细胞 分裂， 染色体 对等地 分配进 两个子 细胞有 丝分裂 期 可进一 步分为 前期， 染色 体发生 凝集； 中期， 此间 姐妹染 色单体 附着于 着 丝粒上 （参见 D3) 并在 细胞中 部相互 成一条 直线； 后期， 在此 过程中 姐 妹染色 单体分 离并移 向细胞 两极最 终形诚 两个子 细胞。 Gi、 S 和 G2 共同 组成 间期， 有 丝分裂 之后， 增 殖的细 胞将进 入下一 个细胞 周期的 Gi 期， 细 胞也可 在有丝 分裂之 后脱离 细胞周 期而进 入一个 非增殖 的休眠 状态， Go, 也可称 沉默期 （quiescence)。 检验 点及其 细胞 分裂周 期的起 始需要 胞外生 长因子 —— 促 细胞分 裂原。 若 缺少它 调控 的 存在， 细胞将 会离开 Gi 期 并进入 Go 休眠期 （WHyTyr 在 Gi 期 ，细 胞会 对其环 境进行 评估， 然 后决定 是否进 入另一 个分裂 周期。 Gi 期中的 E3 细 抱巧巧 81 细胞 周期蛋 白和 依赖于 细胞 周期蛋 白 的激酶 这一 点叫做 限制点 （或 R 点）。 若细胞 在到达 R 点之 前缺 乏促细 胞分裂 原， 它 将重进 Go 期， 而 无法进 行细胞 分裂。 而那 些通过 R 点之后 才开始 缺乏促 细胞分 裂原的 细胞会 在进入 Go 期之 前实现 细胞分 裂完成 细胞周 期。 在 大多数 细胞类 型中， R 点发 生在有 丝分裂 后的数 小时。 R 点 无疑对 T 解 进入细 胞分裂 周期的 细胞定 型是至 关重要 。在 Gi 期 的有丝 分裂和 R 点的 期间， 多种 信号同 时发生 并互相 作用最 终决定 细胞的 命运。 像 R 点一 样， 细胞周 期中可 W 终 止细胞 分裂或 周期进 程的那 些点叫 做检 验点。 检验点 隙 ^发生 作用， ^保证细胞有能力^^1^^1^1^ DNA 复制 （在 Gi 期的 R 点） 及在细 胞分裂 之前成 功完成 DNA 的复制 (G2 期检验 点）。 图 E3.1 细 胞周期 相图示 。各 期中重 要的调 控复合 物用斜 体表示 蛋 白縣暖 化是调 控细胞 周期进 程的一 个主要 机制， 是通过 一个由 组成的 蛋白激 酶巧实 现的。 调节亚 基叫做 细胞周 期蛋^ 催化 亚基叫 做依赖 细胞周 期蛋白 的激酶 （CDK)。 CDK 只有 与细胞 周期蛋 白发生 结合， CDK 才 有催化 活性。 每个 CDK 可 与一种 W 上 细胞周 期蛋白 结合。 存在 于一个 特定的 CDK- 细胞 周期蛋 白复合 物中的 CDK 和 细胞周 期蛋白 共同决 定将被 憐酸化 的目标 蛋白。 细胞周 期蛋白 -CDK 复合物 有互种 不同的 种类， 分别 与细胞 周期的 Gi、 S 和 M 期有 关。 GiCDK 复 合物通 过激活 的转录 因子来 保证细 胞进入 S 期。 为表达 DNA 合 成时所 需的酶 和编码 S 期 CDK 复 合物的 基因。 S 期 的 CDK 复 含物激 发有序 DNA 合成的 起始， 该机制 将确保 每一染 色体仅 复制 一次。 有竺分 裂期的 CDK 复合物 诱导染 色体凝 集并有 序地分 配进两 个子 细胞。 CDK 复合物 的活性 受呈条 途径的 调控： (i) 对 CDK 复合 物亚基 转录的 控制。 (ii) 降低 CDK 复合 物的活 性的抑 制子， 例如 有丝分 裂期的 CDK 复合物 在 S 和 G2 期 合成， 但直至 DNA 完成合 成后它 们才有 活性。 (iii) 在不 再需要 CDK 复合 物的细 胞周期 中的特 定时期 CDK 复合 物的有 82 次序 降解。 E DNA 复制 E2F 幸 □ RB 的调控 细胞 周期的 激活、 抑制 和癌症 细胞周 期中由 Gi 进入 S 期部 分地由 基因转 录激活 （有 时是 抑制） 来 调控， 而在随 后的细 胞周期 中似乎 主要被 转录后 机制所 调控。 通过 Gi 期 中 R 点主要 依靠对 E2F 这一 转录 因子的 激活。 E2F 刺激一 些基因 的转录 与 表达， 这 些基因 编码为 DNA 复制、 脱 氧核糖 核巧酸 合成所 需蛋白 W 及 细胞 周期蛋 白和在 后来的 细胞周 期中所 需要的 CDK 蛋白。 E3F 的 活性受 到与 其结合 的蛋白 RB (成 视网 膜细胞 瘤抑制 蛋白， 参见 S3) 及其 相关蛋 白的 抑制。 当 RB 处 于去碟 酸化状 态时， E2F 活性 受到 抑制。 在 Gi 中后 期， 细 胞周期 蛋白- CDK 复 合物使 RB 踞 酸化从 而释放 E2F 进而激 活转录 (图 E3.2)。 ATP ADP 有丝分 裂信号 G, 细胞 周期蛋 白 CDK 巧活 巧 © 启 动转录 并进入 S 期 图 E3.2 E2F 受 RB 和 Gi 细胞周 期蛋白 -CDK 复合物 调控的 示意图 小 的抑制 蛋白可 通 过抑制 细胞周 期蛋白 -CDK 复合物 的活性 延迟细 胞 周期的 进程。 这些抑 制因子 可分为 两类； CIP 蛋白和 INK4 蛋白。 例如 在骨 胳肌肉 细胞分 化时通 过激活 CIP 蛋白 基因中 的一个 （编码 P21WAF1/CIP1 蛋 白）， 使 分化细 胞从细 胞周期 中脱离 出来， 送是 由主调 控因子 MyoD (参见 N2) 所调 控的。 细胞 周期与 癌症之 间有着 根本的 联系， 可 原 癌基因 （参 见％) 和 抑 癌基因 （参 见％) 调控 细胞由 Gi 进入 S 期的 实验证 据得到 证明。 Gi 细 胞周期 蛋白的 一种， 细胞周 期蛋白 D1 在产生 B 细 胞免疫 球蛋白 的肿瘤 细 胞中经 常过量 表达， 这 是因为 染色体 的移位 使得免 疫球蛋 白基因 增强了 与靠近 细胞周 期蛋白 D1 基 因的染 色体某 位点的 结合。 INK4 P16 蛋白拥 有癌症 抑制子 的所有 特征， 重要 的是， 在人类 癌症中 两个重 要的抑 癌基因 的 产物： RB 和 P53 (参见 S3) 均 与细胞 周期调 控密切 相关， RB 参与调 控 E2F 的活 性； 而 P53 相关于 DNA 损 伤的细 胞周期 抑制。 当 DNA 受到 损 伤时， P53 诱导 P21 WAF1/CIP1 基因 的转录 激活。 E DNA 复制 E4 真核 生物的 DNA 复制 要 点 实 验系统 较小的 动物病 毒如猿 猴病毒 40 (SV40) 是研 究延长 的很好 模型， 但 并不适 合研究 起始。 仅有 400 个 复制子 的酵母 比含有 50 000- 100 000 个 复制子 的典型 哺乳动 物细胞 要简单 得多， 非 洲爪擔 (Xenopus) 的 卵提取 物可有 效地复 制外加 DNA。 起 始点与 起始 在 S 期的不 同时刻 大约有 20-50 个起 始点被 激活。 单细 胞酵母 的众 多起始 点已被 克隆， 且都 有一个 简单的 llbp 长 的保守 序列， 该 序列用 W 结合 起始点 识别复 合体。 一个特 定因子 可确保 每个起 始 点在每 个细胞 周期中 只被用 1 次。 复制义 染色质 解组装 W 复制 DNA 减 慢真核 生物复 制叉的 移动， 并且在 后 随链上 产生小 片段。 引 发酶及 DNA 聚合酶 a 的 聚合酶 活性可 起 始前导 链与后 随链的 复制， 然后 DNA 聚合酶 S 负责前 导链和 后 随链的 延伸， 而 DNA 聚合酶 £ 完成后 随链的 复制。 杖基质 由 不溶性 蛋白纤 维构成 的蛋白 质支架 在空间 上控制 复制。 复制工 厂 被固定 在核基 质中， DNA 可穿过 其中。 端拉 的复制 端粒 DNA 由简 单重复 序列的 多拷贝 构成， 3' 端突 出于另 一条链 的 5' 端。 端粒 DNA 由端粒 酶催化 复制， 该酶携 有用作 > 重 复片段 模 板的小 RNA 分子。 端粒 酶在体 细胞中 处于抑 制状态 '， 值在许 多癌细 胞中处 于激活 状态。 相 关主题 原 核与真 核生物 的染色 体结构 （D) 细菌的 DNA 复制 （E2) DNA 复 制概述 （E1) DNA 修复 （F3) 细 胞周期 （E3) DNA 病毒 （R3) 实 验系统 因为 染色质 结构的 复杂性 （参见 D2)， 真 核生物 复制叉 W 每秒约 50bp 的速度 推移。 W 这样的 速度， 用 2 个 复制叉 来复制 105kb 这 样大小 的典型 的哺乳 动物的 染色体 DNA 约需 30 天， 因此需 要多个 复制子 。一 个典型 的哺乳 动物细 胞中有 50 000-100 000 个复 制子。 同 时研究 这么多 的复 制子是 不可思 议的。 所幸的 是酵母 ( Sacharomyces cervisiae) 的基因 组较小 （16 条染色 体中含 14 000kbDNA)， 仅有 40 个复 制子， 目 前全部 的基 因组序 列都已 公开。 再简 单一点 的是病 毒基因 组如猿 猴病毒 40 (SV40) (参见 R3)。 SV40 的 DNA 是一个 5kb 的环状 双链， 进入 细胞核 后可 形成核 小体。 SV40 为研究 哺乳动 物复制 叉提供 了一个 极好的 模型。 84 E DNA 复制 起始点 与起始 复制叉 核基质 另 一 ■个 很有用 的系统 是从非 洲爪赡 (Xenopus Laevis) 的卵 中提出 的无细 胞提 取物。 该提取 物中含 有高浓 度的复 制蛋白 （足 支持体 内细胞 的多次 翻 番）， 所 W 能广 泛地用 于外加 DNA 或 整个细 胞核的 复制。 在 真核生 物中， 大约 20 〜 50 个 复制子 （串联 排列） 成簇在 S 期的特 定 时间同 时开始 复制。 S 期中 较早复 制的主 要是常 染色质 （其 中包 括有转 录 活性的 DNA)， 较晚 被激活 的主要 是异染 色质内 的部分 （参见 D3)， 而 着丝粒 DNA 及端粒 DNA 最后被 复制。 这种 方式反 映了不 同的染 色质结 构与 起始因 子结合 的难易 程度。 单细胞 酵母的 众多复 制起始 点已被 克隆进 原核 生物的 质粒。 由于这 些复制 起始点 序列允 许质粒 在酵母 （真核 生物） 中 复制， 被称为 自动复 制序列 （ARS)。 可支 持复制 的最短 DNA 长 度只有 llbp, 其保守 序列为 [A/T] TTTAT [A/G] TTT [A/T]。 但要 达到最 佳 效果， 需要这 一序列 的多个 拷贝。 这 一序列 被起始 点识别 复合体 (ORC) 所 结合， 被 CDK 激活后 可引导 DNA 解链 W 进行 复制。 哺 乳动物 细胞的 特定起 始点序 列还未 被分离 出来， 研究 者们认 为每个 复制子 可能会 在起 始区域 内的任 意位置 起始， 而该区 域可能 有几个 kb 长， 并且 有可能 是散 在重复 DNA 片段的 一部分 （参见 D4)。 同原 核生物 相比， 真 核生物 的 复制子 在每个 细胞周 期仅起 始一次 复制。 起 始所必 须的、 并在作 用后失 活的特 定蛋白 （特许 因子） 只有 在有丝 分裂期 核膜解 体时才 能进入 核内， 这样 就防止 了复制 完成前 的再次 起始。 复 制前， DNA 必 须在复 制叉处 从核小 体上解 离下来 （图 E4.1)， 这 一过程 使得复 制叉的 移动速 度减小 到每秒 50bp。 复 制叉通 过后， 新的核 小体由 原来的 和新合 成的组 蛋白重 新组装 起来。 同原 核生物 一样， 解开双 链需 要一种 或多种 DNA 解 旋酶， 及单链 结合蛋 白即复 制蛋白 A (RP- A)o 延伸过 程涉及 3 种 不同的 DNA 聚 合酶。 前导链 及后随 链的每 个片段 的 复制都 是利用 DNA 聚合酶 a 中的 引发酶 活性从 RNA 引物 起始的 。该 聚 合酶继 续延伸 DNA 链， 但很快 在前导 链上被 DNA 聚合酶 8 代替， 也许 在 后随链 上也是 如此。 DNA 聚合酶 e 的作 用不很 清楚， 可 能是在 引物被 移 去后， DNA 聚合酶 e 在后 随链 上完成 DNA 合成。 这两种 酶都兼 有校对 的 活性。 功能 等同于 E. DNA 聚 合酶中 全酶的 肖 亚基的 增殖细 胞核抗 原 （proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 蛟予了 DNA 聚合酶 6 合成长 链 DNA 的 能力。 真核细 胞后随 链的短 小片段 的长度 （如在 SV40 中是 135bp) 反应 了复制 叉移动 时解开 每个核 小体时 缠绕在 其上的 DNA 长度 (图 E4.1)。 在 S 期除了 DNA 的量 得到加 倍外， 组 蛋白的 量也倍 增了。 核基质 是由不 溶性蛋 白纤维 组成的 支架， 作为 核中各 种反应 （包括 DNA 复制） 进行时 的组织 架构行 使功能 （#见03)， 包括 基因簇 中所有 复 制子的 复制叉 上相关 DNA W 及所 有蛋白 的巨大 复制工 厂被固 定在基 E4 真核 生物的 DNA 复制 85 端粒 的复制 质中， 随 DNA 复制的 进行， DNA 将穿过 其中。 通过 脉冲标 记即用 胸腺喀 時的类 似物： 读脱 氯尿巧 ( bromodeoxyuridine, BUdR) 标 记正在 复制的 DNA， 可 W 在显微 镜下观 察到这 些复制 工厂。 再 通过用 可识别 BUdR 的 抗 体的免 疫黃光 法可观 察到被 标记的 DNA (图 E4.2)。 前导链 图 E4.1 真 核生物 复制叉 附近的 核小体 图 E4.2 真核 细胞核 中的复 制工厂 。经 Academic Press 的许 可引自 H. Nakamu- ra 等， 1986, Exp. Cell Res. 165, 291—297 半不 连续复 制机制 不能完 成线性 染色体 末端的 复制， 因 为没有 DNA 可 用来取 代从后 随链的 5' 端 切掉的 RNA 引物作 为模板 来延伸 相应的 DNA。 这样 遗传信 息很可 能会从 DNA 上 丢失。 为克 服这一 缺点， 真核生 物 染色体 的末端 （端 粒， 参见 D3) 采 取了由 数百个 简单重 复的序 列构成 的结构 （例 如在人 类中是 TTAGGG)， 这些 序列不 含遗传 信息， 并且 3' 端 突出 于另一 条链的 5' 端 （图 E4.3)。 端粒 酶含有 一个约 150 核昔 酸长的 RNA 分子， 其部分 序列与 上述重 复序列 互补。 该 RNA 分 作为長 忘~5 过反気 i 伸 (聚合 作用） 与 易位， 反 复地将 重复片 段加到 突出的 3' 端上， 而互 补链则 像一般 的后随 链那样 复制， 最 终留下 3' 突 出端。 有趣 的是端 86 E DNA 复制 粒 酶的活 性在多 细胞生 物体细 胞中被 抑制， 结 果是每 一细胞 子代中 染色体 的长度 都渐渐 缩短。 当 该长度 缩短到 含遗传 信息的 DNA 碱 基时， 细胞就 会衰 老然后 死亡。 这种现 象在细 胞老化 中也许 是很重 要的， 而许多 癌细胞 的无限 增殖能 力就是 与端粒 酶活性 的再次 激活相 关的。 3.-AAT C CCAATCCC- 5- 5.-TTAGGGTTAGGG (TTAGGG)。 TTAGGG-3' 图巨 4. 3 人染色 体端粒 DNA 的序列 （《 二 几百） (杨 涛 译 刘进 元化） F DNA 损伤、 修复 与重组 FI 诱变 要 点 突 变 突变是 DNA 碱基序 列水平 上的永 久性变 化且可 遗传。 点 突变可 W 是转换 （如 G’C 一 A‘T) 或颠换 （如 G’C 一 T’A)。 缺 失与插 入涉及 碱基的 丢失或 增添， 并且可 W 引起 遗传密 码可读 框的移 码。 沉默 突变没 有表型 效应， 而错义 突变和 无义突 变会改 变所编 码 蛋白的 氨基酸 序列。 复制 忠实性 DNA 复制的 高精度 （1010 个碱基 中约有 1 个 错配） 依赖 于模板 链和 进入核 昔酸在 DNA 聚合 酶的作 用位点 的正确 配对、 3' 一 5' 外 切核酸 酶对惨 入碱基 的校正 W 及错 配修复 兰方面 的精确 配合。 物理 巧变剂 离 子化的 （如 X 射线和 y 射线） 和非离 子化的 （如紫 外线） 辖 射会产 生各种 各样的 DNA 损伤。 喀 巧二聚 体是紫 外线福 射的最 常见 产物。 化学 巧变剂 碱基类 似物可 在 DNA 复制 过程中 W 错配方 式导致 突变。 亚硝 酸 可使胞 嚼惦和 腺曝吟 脱氨。 烧化剂 和芳基 化试剂 可产生 一系列 中断转 录与复 制的加 合物， 从 而直接 引发突 变或更 常见的 是间接 导致 突变。 大 部分化 学诱变 剂是致 癌的。 直 接巧变 如 果一种 碱基类 似物或 配对特 性与亲 本链碱 基不同 的修饰 碱基在 复制叉 通过之 前未被 DNA 修 复机制 去除， 结果 会引入 1 个错配 碱基， 而第 2 轮 复制会 将这一 突变在 DNA 中永久 地固定 下来。 间 接巧变 在复制 叉通过 之前， DNA 中 的大部 分损伤 都会被 直接地 无差错 恢 复或切 除修复 机制所 修复。 如果 未能被 修复， 将 与特定 DNA 聚合酶 有关的 一种转 移损伤 DNA 合成 的易错 形式就 会发生 ，结 果 是一个 或多个 错配碱 基被渗 入在损 伤部分 的对应 位点。 相 关主题 核 酸结构 （C1) DNA 损伤 （F2) DNA 复制 （E) DNA 修复 （F3) 突变 突变是 DNA 碱基 序列水 平上的 ^jc 久 性的、 可 遗传的 改变。 突 变产生 于 DNA 夏制 或减数 裂重组 程中 ^发 性错误 （参见 F4)， 或 者是由 于 物理或 化学试 剂损伤 DNA 所 致。； 最简 单的突 变是点 突变， 即一 个单一 碱基的 改变。 点 突变可 W 是转换 （曝吟 与曝吟 之间， 嚼晚 与唆晚 之间互 换） 或颠换 （曝 岭与唆 巧之间 发生互 换）。 点突 变的表 型效应 是多样 化的， 88 F DNA 损伤、 修复 与重组 如果它 发生在 DNA 的非编 码区、 非 调节区 或密码 子的第 3 个碱基 位置， 那么它 就不会 影响惨 进蛋白 质中的 氨基酸 （参见 P1)， 则该 突变是 沉默突 变； 如果 它改变 了基因 产物的 1 个氨 基酸， 则 是错义 突变。 错义突 变的效 应可 W 是无作 用的， 也可 W 是致 死的， 这取决 于被影 响的氨 基酸。 形成新 的终止 密码子 的突变 是无义 突变， 结果会 产生截 短了的 蛋白质 产物。 插入 或 缺失涉 及一个 或多个 碱基的 增加或 丢失， 这会 引起基 因的巧 码突变 。移 码突 变的结 果是所 翻译出 的蛋白 质序列 从突变 点起至 C 末端 都完 全被改 变了。 影响 细胞生 长或细 胞死亡 过程的 突变可 引 发癌变 （参见 S)。 群 体中许 多沉默 及非致 死突变 的积累 会产生 遗传多 态性， 即在 "正 常" DNA 及其 蛋白质 序列中 可接受 的变异 （参见 04)。 复制 忠实性 DNA 复制的 错误率 要比转 录的低 得多， 这是维 持上一 代与下 一代间 遗 传信息 的准确 含义的 需要。 例如， £. 在复制 中的自 发突变 率大约 是 每惨入 1010 碱 基会发 生一个 错配。 这 主要是 由于可 改变其 碱基配 对性质 的 互变异 构体稀 有碱基 的存在 （参见 C2)。 可 通过多 种机制 将错误 率降低 到最小 程度。 只有当 进入活 性位点 的核昔 酸与模 板核巧 酸满足 正确的 Watson-Crick 碱基 配对原 则时， DNA 聚合酶 才能将 其渗入 进来。 聚合酶 的 3' 一 5' 外 切酶活 性可检 测出偶 发错误 （图 Fl.la) (参见 E2)。 这 将在下 一个核 昔酸惨 入前从 3' 端去掉 错配核 巧酸， 从而 保证正 确碱基 的插入 (图 Fl.lb)。 校对 外切核 酸酶必 须能区 分正确 的与错 误的碱 基对， 才能正 常 工作。 DNA 后 随链的 新起始 片段的 5' 端 "未错 定" 的几个 碱基对 的较大 流动性 （参见 E1) 意 味着它 们决不 会正确 配对， 故 不能被 校对。 这是因 为头 几个核 脊酸是 RNA， 它们后 来被识 别为低 忠实性 碱基， 结果 被来自 邻近片 段延伸 （并 校对） 的 DNA 嘗代。 逃脱 校对的 错误可 被错配 修复机 制 所纠正 （参见 F3)。 图 F1.1 新合成 DNA 的 校对。 例如， 一个 "G" 碱基 错误地 与模板 "T" 结合 (a). 它将被 3'--5' 校对 外切酶 所切除 （b) 物理 巧变剂 高 能离子 化福射 （如 X 射线， y 射线） 的 吸收会 引起目 标分子 失去电 子， 这 些电子 会引起 DNA 发 生广泛 的化学 变异， 包括 断链、 碱基 及五碳 搪的 损伤。 非离子 化福射 会引起 在目标 分子内 的分子 振动或 促进电 子进入 较高 能级， 导 致形成 新的化 学键。 引起 DNA 损伤的 最重要 的方式 是紫外 线， 紫外线 引起相 邻嚼巧 碱基产 生嗦巧 二聚体 （参见 F2)。 FI 巧变 89 化学 诱变剂 碱基 类似物 是改变 碱基配 对特性 的正常 碱基衍 生物， 可诱发 直接诱 变。 许多天 然的、 合 成的有 机和无 机的化 学试剂 均可与 DNA 发生 反应并 改变其 特性。 畢奥 酸使胞 峰堕脱 氨变成 显蛇喧 （图 F1.2)， 从而和 腺螺吟 配对， 引起随 后复制 中发生 G，C 向 A，T 转换。 腺曝 吟脱氨 变成鸟 螺咚类 似 物次黄 曝吟， 导致 A’T 向 G’C 转换。 烧 化剂如 甲烧墳 酸甲醋 （methyl- methane sulfonate, MM^ 、 乙羣亚 硝基巧 ( ethylnitrosourea, ENU) 及芳 基化 剂通常 会产生 须经修 复才足 W 防止 给转录 及复制 过程带 来严重 破坏的 损伤 （参见 F2)。 细胞对 于这些 损伤的 处理有 可能会 由于间 接诱变 而导致 突变。 嵌入剂 （参见 C4) 会 产生插 入突变 和缺失 突变。 绝 大部分 化学诱 变 剂是致 癌剂， 诱发 癌症。 胞嗦巧 尿哇巧 图 F1.2 亚硝 酸使胞 喀巧脱 氨生成 尿喀時 直 接诱变 直接 诱变是 起因于 DNA 中 存在稳 定的、 具改变 了的配 对特性 的未修 复的 碱基。 正是 DNA 的复制 使得这 种损伤 （非 永久 性的） 固定下 来成为 突变 （永 久性， 可遗传 的）。 例如胸 腺喀巧 类似物 5 - 漠尿曠 巧的酬 基异构 体预 期会与 腺囑岭 配对， 也经 常出现 W 巧醇式 （这 是由于 漠的负 电性） 与 鸟曝 吟配对 （图 F1.3a)。 一个复 制回合 之后， 鸟噪 吟也许 就被插 入到与 5 -漠 尿略巧 对应的 位置。 在第 2 个 复制回 合后， 胞 喀巧就 会被渗 入到与 该鸟標 吟相对 应的位 置上， 这样 突变就 被固定 下来了 （图 F1.3b)。 最终 结果是 A，T 向 G，C 的 转换。 8 -氧 -dGTP 是 细胞内 氧化产 生的一 个天然 的 dGTP 的 衍生物 （参见 F2)， 可与 A 配对， 当它 结合到 DNA 中后 ，可 导致 A’T 向 G，C 颠转。 间 接诱变 化学和 物理诱 变剂导 致损伤 的绝大 部分， 在与复 制叉相 遇之前 会成为 一种 或多种 DNA 修 复机制 作用的 目标， 从而 恢复到 无差错 状态的 DNA 原 初结构 （参见 F3)。 有时这 是不可 能的， 比 如当损 伤就发 生在移 动着的 复制叉 之前， 将产生 1 个不可 "重组 修复" 的损伤 （参见 F4)。 这 会导致 在子 链上产 生一个 致命的 缺口， 因此在 这种情 况下细 胞不得 不采取 "转巧 损伤 DNA 合 成"。 这就包 括正常 的复制 装置被 一种具 有特殊 DNA 聚合酶 活性 的装置 所临时 代替， 而这种 装置则 在未修 复损伤 的对应 位点上 插入碱 基， 然 后又恢 复正常 复制。 因此损 伤没有 被转移 或修复 而是被 容忍， 从而 保 持复制 DNA 的完 整性， 在下一 轮复制 之前模 板链可 被 修复。 在 一些情 况下， 转 移损伤 DNA 合成有 可能正 确从而 插入正 确的碱 90 F DNA 损伤、 修复 与重组 基， 但被破 坏的碱 基往往 失去了 特殊的 碱基配 对性， 所 W — 些损伤 DNA 聚 合酶只 是为了 保证染 色体的 完整性 在损伤 对应的 位点上 插入错 误的碱 基， 这就 叫间接 诱变。 如果突 变只发 生在损 伤的位 点上， 该突 变就是 "定 点 的"； 如果 基因组 的其他 位点也 发生了 突变， 则该突 变就是 "非 定点 的"。 在 原核生 物中， 转 移损伤 DNA 合 成是对 DNA 损伤的 SOS 反 应中的 一 部分。 虽然它 不是一 个严格 的修复 机制， 有时也 称之为 "■% 谭度 葛; ’。 SOS 反应 涉及许 多能在 DNA 损伤后提高存活的相关基因的诱^ 。 损南诱 导性 RecA, UMUc, UmuD 和 DinB 蛋 白对于 由间接 诱变所 产生的 突变来 讲是 十分必 要的。 UmuC 和 UmuD 的 一 •种修 饰形式 （UmuD') — ■起 形成 一 个蛋白 复合体 （UmuD'zC)， 最近 被称为 DNA 聚合酶 V， 可 W 在像 "脱 嚷吟" 位点 （参见 F2) 这样的 "非 编码" 损伤对 应的位 点上插 入一个 碱基 从而导 致定点 突变。 另一 种称为 DNA 聚合酶 IV 的转 移损伤 聚合酶 DinB 会诱导 非定点 突变。 非 定点突 变是对 有害的 DNA 损伤 环境的 故意反 应， 为 了增加 突变频 率从而 产生能 更具生 存的、 抗性的 菌株。 在真 核生物 中， 转 移损伤 DNA 聚合酶 包括易 错型的 DNA 聚合酶 S (zeta) 和 可能为 无 错型的 DNA 聚合酶 T) (eta)。 (a) 氧键 (b) CCTA (i) AGC 平 T TCGAlAiGGAT AGCTBCCTA TCGAAGGAT AGCTBCCTA TCGAGGGAT AGCTTCCTA TCGAAGGAT AGCTBCCTA TCGAAGGAT 丄 . ^Q^AGCTjCjCCTA TCGAiObcAT 图 FI. 3 (a) 5 -漠 尿喀巧 少巧醉 式与鸟 標吟相 配对； （b) 5 -漠 尿喀巧 （B) 引发 的直接 诱变: (i) T 的 类似物 B 可很 容易 地接进 T 的位 置； （ii) 一次 复制后 G 被慘 入到 "B" 的相对 位置； （iii) 2 次复 制后， C 将被 棱入进 G 相对应 的位置 F DNA 损伤、 修复 与重组 F2 DNA 损伤 要 点 DNA 损伤 外 源化学 试剂或 射线对 DNA 的化学 作用会 导致其 化学或 物理结 构发生 变化。 这些变 化也许 会阻断 复制或 转录， 结果是 致死性 的； 或者 会通过 直接或 间接诱 变产生 突变。 DNA 的化学 不稳定 性可 产生自 发性损 伤如脱 氨和脱 暧吟。 氧化 性损償 活 性氧分 子如超 氧化物 及嘗自 由基会 产生种 种损伤 （如 8 -氧化 鸟 曝吟和 5 -餐甲 基尿喀 晚）。 这样的 损伤是 自发产 生的， 而且包 括 y 射线 在内的 一些外 源物质 还会提 高其发 生率。 境基化 亲 电的烧 化剂像 甲烧横 酸甲醋 （methylmethane sulfonate, MMS) 和 乙基亚 硝基尿 （ ethylnitrosourea, ENU) 能在许 多位点 上对核 昔 酸进行 修饰。 绝 大多数 损伤是 间接诱 变的， 而 06- 烧 基鸟曝 吟 （06-alkylguanine) 是直接 诱变的 结果。 聚化 加合物 大 块损伤 像唆巧 二聚体 和焼化 剂加合 物会使 得双螺 旋扭曲 变形， 引 起局部 变性， 结果 是扰乱 TDNA 的正常 功能。 巧 关主题 核 酸结构 （C1) DNA 修复 （F3) 诱变 （F1) 调亡 （S4) DNA 损伤 损伤是 DNA 正常 的化学 或物理 结构的 改变。 碱基 杂环上 的一些 N 和 C 原 子及一 些环外 功能团 （如 碱基的 酬基及 氨基） 是 具有相 当的化 学活性 的。 许 多外源 物质如 化学试 剂及射 线能引 起这些 位点的 改变。 碱基 的化学 特性的 变化会 导致不 能配对 或错配 （如 一个改 变了的 A 可 能会与 C 而不 是与 T 配 对)。 如果这 种损伤 允许在 DNA 中保留 下来， 这 一突变 就会通 过 直接诱 变或间 接巧变 而被固 定下来 （参见 F1)。 或 者这些 化学改 变也可 能造成 DNA 的结构 变形从 而阻断 复制或 （和） 转录， 导致细 胞死亡 。因 此 DNA 损伤可 是致 突变和 （或） 致死。 一 些损伤 是自发 性的， 是因为 DNA 内 在的化 学活性 W 及细 胞中存 在的正 常活性 化分子 所致。 例 如胞喀 晦会 自发地 水解脱 夏变成 尿喀巧 （参见 F1， 图 F2.2)。 如 果未被 修复， 产 生的尿 嗦巧会 在接下 来的复 制中与 腺曝吟 配对， 从 而产生 点突变 （参见 F1)。 事实上 DNA 中 这 种方式 产生尿 喀晚很 可能是 为什么 DNA 含有胸 腺 唾瞎而 不是尿 喀巧的 原因。 DNA 中 发现的 任何尿 喀晦均 可被一 种称为 尿喀巧 DNA 搪 化酶所 切除， 并由 胞喀巧 所替代 （参见 F3)。 5 -甲 基胞喀 時， 一个在 DNA 中 少量存 在的修 饰喊基 （参见 D3) 会脱 氨变成 胸腺喀 92 F DNA 损伤、 修复 与重组 氧化 性损伤 烧基化 巧化 加合物 巧， 即一 个正常 碱基， 而 检测这 种变化 是非常 难的。 脱嚷吟 作用是 另一种 在曝岭 A 和 G 的 N - 9 及脱 氧核糖 C - r 之间 N - 糖巧键 发生断 裂的自 发水解 反应， DNA 因 此失去 了嘿吟 碱基。 DNA 的 搪 -憐酸 骨架仍 然是完 整的， 产 生的脱 嘿吟位 点呈现 "非 编码损 伤"， 即该 螺 岭碱基 所编码 的遗传 信息丢 失了。 脱曝吟 作用在 37t： 下 W 每小 时丢失 10 000 个 噪吟的 速度在 人体中 发生。 脱嗦 D 定 也可能 发生， 但频率 很低。 在所有 需氧细 胞中由 于超氧 化物、 氯过氧 化物及 最重要 的餐基 自由基 等 活性氧 （ROS) 的 存在， 会在正 常条件 下会发 生氧化 损伤。 这些 自由基 可在许 多位点 上攻击 DNA， 产 生一系 列特性 变化了 的氧化 产物， 如 8 -氧 化鸟 嘿吟， 2 - 氧化腺 標吟和 5 - 餐甲基 尿嚼巧 （图 F2.1)。 电离福 射引起 的 水辖射 分解所 产生的 哲基自 由基会 提高这 些氧化 产物的 水平。 0 2 -氧化 脏標吟 5 - 哲甲基 尿唾時 图 F2.1 活性 氧作用 造成在 DNA 上形 成的氧 化碱基 的例子 烧化 剂是可 将烧基 （如 甲基） 加 入到核 酸上各 种位点 的亲电 化学试 剂， 但其加 入位点 有别于 正常甲 基化酶 的甲基 化位点 （参见 C1 及 G3)。 常见的 烧基化 试剂有 MMS 和 ENU (图 F2.2a)。 甲 基化碱 基的典 型例子 是 7 - 甲基鸟 標吟、 3 - 甲基腺 標岭、 3 - 甲基鸟 曝吟和 06- 甲基 鸟螺吟 （图 F2.2b)。 这些损 伤中的 部分由 于会在 DNA 复制 及转录 时干扰 DNA 解旋， 因而可 能是致 死的。 绝大部 分是间 接诱变 损伤； 而 06- 甲基 鸟曝吟 由于可 在复制 中与胸 腺喀晦 配对， 产生直 接诱变 损伤。 紫外 线照射 可通过 DNA 链上 相邻喀 瞎每个 碱基的 C5 双键和 C6 碳原 子环 化形成 一个环 T 焼环 从而形 成环下 烧唾巧 二聚体 （图 F2.3a)。 结果 不 能与其 相对应 的链进 行碱基 配对， 导致 DNA 局部 变性， 产生破 坏复制 与转录 的大块 损伤。 另一 种喀巧 二聚体 6， 4 -光 产物， 则是 由一个 唆惦上 的 C6 和其 相邻碱 基上的 C4 间生 成键后 形成的 （见图 F2.3a 中环 上的碳 数 字)。 当煤 焦油中 的致癌 物苯并 巧在肝 内由细 胞色素 P-450 代谢后 ，其 中 的一种 代谢物 （一 种二 醇环氧 化物） 可与 鸟嚷吟 残基共 价结合 （图 F2.3b)。 许多 其他的 芳香族 烧化剂 均能与 DNA 形成 共价加 合物。 致癌物 黄曲 霉毒素 Bi ( aflatoxir Bj ) 也可与 DNA 共价 结合， 导入 大块加 合物， 从而在 DNA 复制过 程中改 变遗传 信息。 F2 DNA 损伤 93 (a) O II CHo — S — 0 — CHo II o 甲基巧 酸甲酷 II /州2州3 HzN — C — N '^N =0 乙基亚 硝基尿 图 F2.2 焼化剂 （a) 和晓 化碱基 （b) 的例子 相邻 》 巧巧 巧残基 环下 持巧巧 二巧体 图 F2.3 相邻 胸腺喀 巧残基 形成环 T 烧喀巧 二聚体 （a), S= 搪， P= 踞酸 ，苯 并巧二 醇环氧 化物的 结合所 形成的 鸟曝吟 加合物 （b) F DNA 损伤、 修复 与重组 F3 DNA 修复 要 点 光复活 DNA 光解酶 可切开 喀巧二 聚体的 环了烧 恢复其 DNA 的 原初结 构。 光 解酶含 有可吸 收旌光 为反应 提供所 需能量 的色素 分子。 巧基 转移酶 烧 基转移 酶是一 种可诱 导的蛋 白质， 可特异 地从鸟 曝吟的 06 位 置移 去一个 晓基， 将其 转移到 蛋白质 自身， 同时导 致该蛋 白质失 活。 切 除修复 在 核昔酸 切除修 复中， 内 切核酸 酶在损 伤部位 两边切 出切口 ，去 除 损伤部 分而留 下一个 缺口， 该 缺口由 DNA 聚 合酶来 填补， DNA 连接酶 将催化 最后的 縣酸二 醋键的 形成。 在 碱基切 除修复 中， 损伤被 特定的 DNA 糖基 化酶所 切除， 产生的 AP 位点被 AP 内切 核酸酶 及外 切核酸 酶切除 并扩展 成一个 缺口， 接下 来的修 复过 程就像 核昔酸 切除修 复那样 进行。 错 配修复 遗 传性的 修 复缺陷 逃过 校对的 复制错 误在子 链上存 在一个 错配。 复制后 DNA 的半 甲基化 可将子 链与母 链区别 开来， 子 链中的 错配碱 基可被 切除修 复机制 去除。 切 除修复 基因或 损伤性 DNA 聚合酶 中的突 变会导 致不同 形式的 DNA 修 复酶缺 乏病， 又称 着色性 干皮病 （xeroderma pigmento- sum), 一种对 太阳光 敏感的 有癌变 倾向的 素乱， 切除 修复在 Cockayne 综 合征中 也是缺 乏的。 相 关主题 核 酸结构 （C1) DNA 损伤 （F2) DNA 复制 （E) 调亡 （S4) 诱变 （F1) 光复活 在可 见光存 在的情 况下， DNA 光解酶 （光复 活酶） 可 将环了 晓唆巧 二 聚体再 分解为 单体。 这 些酶含 有可吸 收藍光 并将能 量转移 到待切 环了焼 环中 的辅基 （参见 B2)。 丘. CO" 的光解 酶含有 2 个色素 分子， N5, N …- 次甲基 四氨叶 酸和还 原性的 黄素腺 曝略二 核昔酸 （FAD)。 光复活 对喀巧 二聚体 是专一 性的， 是 损伤被 "直接 修复" 的一种 例子， 是无差 错的。 烧基 转移酶 另一无 差错直 接修复 的实例 构成了 DNA 对焼 化剂的 适应性 反应。 £. coli 中低剂 量焼化 剂会诱 发込一 反应并 提高了 机体对 高剂量 的诱变 效应和 致死 的保护 能力。 能 直接从 突变的 06- 说基 鸟曝咚 （可 与胸 腺喀晦 配对， F3 DNA 修复 95 切 除修复 错 配修复 参见 F2) 上去 除烧基 的烧基 转移酶 可保护 DNA 免 受这类 诱变， 奇 怪的是 烧基 被转移 到该蛋 白本身 并使之 失活。 送样每 个烧基 转移酶 只能用 一次。 在哺 乳细胞 中也含 有这种 蛋白。 致死性 保护还 涉及由 喊基切 除修复 去除其 他 的烧化 碱基的 DNA 搪基 化酶的 诱导。 切除 修复是 一种普 遍存在 的修复 机制， 可 在一系 列的损 伤中起 修复作 用， 并且这 种修复 是无差 错的。 切除 修复有 2 种 形式， 即核 音酸切 除修复 (nuclotide excision repair, NE 民） 和 碱基切 除修复 （base excision repair, BER)。 在 NER 中， 内 切核酸 酶在损 伤部位 两边各 切除精 确数目 的碱基 (图 F3.1a， 第 1 步）， 然 后包含 损伤的 寡聚核 巧酸被 切除并 留下一 个缺口 (图 F3.1a， 第 2 步）。 举例 来看， £. coZz •中的 UvrABC 内 切核酸 酶识别 双螺旋 中发生 变形的 部位， 切除嚼 瞎二聚 体和其 他大块 损伤。 在 BER 中， 相当 专一的 DNA 糖基 化酶识 别修饰 碱基， 切除修 饰碱基 与糖基 之间的 N- 糖昔键 （参见 C1)， 留 下一个 脱嚷咚 或脱喀 D 定 (AP) 位点 （图 F3.1b， 第 la 步）。 自 发碱基 丢失也 可产生 AP 位点 （参见 F2)。 AP 内 切核酸 酶在该 位 点切开 DNA， 其外 切酶活 性可继 续切出 1 个缺口 （图 F3.1b， 第 lb 及 2 步)。 NER 中 的缺口 通常更 大些， 而在 BER 中 可小至 1 个核 巧酸。 从这 一点 来看， 两种 形式的 切除修 复本质 上是相 同的。 £. coZf 中缺 口可由 DNA 聚合酶 I 填补 （图 F3.1， 第 3 步）， 最后的 憐酸二 醋键的 形成由 DNA 连接 酶完成 （图 F3.1， 第 4 步）， 很像 DNA 复 制中后 随链片 段复制 过程 中的最 后一步 （参见 E1)。 在 真核生 物中， BER 中 的缺口 主要由 DNA 聚合酶 P 来填补 ，而 NER 中较长 的缺口 主要由 DNA 聚合酶 S 或 e 来 填补。 在真 核生物 NER 中， DNA 损伤 的识别 和切除 是一种 至少与 18 种 多化因 子相关 的复杂 过程， 这其中 包括转 录因子 TFIIH (参见 M5)。 切 除修复 是与转 录相偶 联的， 因而 被转录 （一 般是活 性的） DNA 修 复比未 被转录 DNA 区域 修复得 更快， 这 有助于 限制缺 焰基因 产物的 生成。 错配 修复是 切除修 复的一 种特定 形式， 用 于修复 在复制 中错配 并漏过 校正检 验的任 何碱基 （参见 F1)。 复 制错配 中的错 配碱基 存在于 子代链 中。 因此该 系统必 须在复 制叉通 过之后 有一种 能识别 亲本链 与子代 链的方 法， 保证只 从子代 链中去 除错配 碱基。 在 原核生 物中， 两 条链上 GATC 序列中 的某些 腺曝咚 残基正 常是甲 基化的 （参见 C1)， 子代 链的甲 基化在 复 制完成 几分钟 后随即 进行。 这样新 复制的 DNA 是 半甲基 化的， 即亲本 链是甲 基化的 而子代 链未甲 基化， 所 很容 易区分 它们。 错配的 碱基对 (如 GT 或 CA) 被由 MutS 和 MutL 蛋 白组合 的复合 体识别 并与之 结合， 该复 合体随 后再与 MutH 内切核 酸酶相 结合， 后者在 子代链 GATC 附近 的 位点上 特异性 的产生 缺刻。 这 个缺刻 启动了 对含有 错误碱 基区域 的切除 修复。 真核生 物中区 分的机 制还不 清楚， 但 显然错 配修复 对保持 DNA 复 制中 的总体 错误速 率即自 发突变 率相当 重要， 比如遗 传性非 息肉结 肠癌就 96 F DNA 损伤、 修复 与重组 遗传 性修复 缺陷 是由于 一种错 配修复 酶突变 丢失引 起的。 错配修 复还可 W 修 复真核 生物减 数分裂 重组中 由于序 列错误 对排而 产生的 错误。 (b) 隹 饰巧基 图 F3.1 (a) 核巧 酸切除 修复； （b) 碱 基切除 修复。 标 号步骤 在文中 有说明 着色性 干皮病 （ xeroderma pigmentosum, XP) 是 一 ■种常 染色体 隐性素 乱， 在表型 上表现 为对阳 光极度 敏感， 极易 产生皮 肤癌。 XP 患者 缺乏包 括 由紫外 线引起 的大块 DNA 损伤 的核昔 酸切除 功能， 至少有 7 种 不同基 因 的缺陷 可导致 XP， 表 现出哺 乳动物 细胞中 切除修 复的复 杂性。 着色性 干 皮病的 变异型 （XP-V) 在 临床上 与经典 XP 很 相似， 但是 XP-V 患者的 细胞 能执行 正常的 NER。 在这种 病中， 缺 陷位于 编码转 移损伤 DNA 聚合 酶 。的基 因中， 这 种酶在 正常情 况下可 W 在环 T 婉胸 腺喀巧 二聚体 （参见 F1 与 F2) 中的 陶腺喀 巧残基 相应的 位点上 无错性 的插入 dAMP。 因此， XP-V 细 胞就更 多的依 赖于转 移损伤 DNA 合成的另一种易错型模式1^1保 证 DNA 在受福 射损伤 后的完 整性。 Cockayne 综合征 患者也 对阳光 敏感， 并 在转录 偶联的 切除修 复中有 缺陷， 但没 有诱发 癌症的 倾向。 F DNA 损伤、 修复 与重组 F4 重组 ♦^♦^备》瓜々^々^々^一«>一*\^^席'々^々^々^分巧\^^分《5\^々々/巧'々^々/5'々/5^巧/取々/&、々*成店'分宙'々/&.巧々'々/&\分。3/5'、々/&々/&々/分一«'一«'々/巧'々/巧'々/巧\>巧 梦宙 、分 S' 要 点 同 巧重组 在真 核生物 的有丝 分裂过 程中， 广 泛存在 着两条 DNA 分 子之间 同源 区域的 交换。 在原 核生物 中依靠 wcA 的重组 产生一 个四条 链的 Holliday 中 间体， 后者可 通过两 条途径 拆分。 同源重 组复制 可使 未修复 损伤的 DNA 恢复原 来的完 整性。 发生 在非同 源区域 中特定 位点的 DNA 交换 要依靠 reA 实现。 把入 蹈菌体 整合到 E. CO" 的基 因组中 就是通 过这种 重组， 该过 程 需要两 者都含 有一个 特定的 15bp 的序列 及一 些特定 的蛋白 整合 因子。 位点 特异性 重组同 时也解 释了在 动物体 内抗体 多样性 的形成 原因。 转 座作用 ~~ I 可 转座的 DNA 元件可 使自身 插入到 基因组 的任何 位置。 所有 的 转座子 都编码 一个转 座酶用 W 催化 插入。 反转录 转座子 通过一 个 RNA 中 间体复 制并且 与反转 录病毒 有关。 位 点特异 性重组 巧 关主题 细菌 DNA 复制 （E2) DNA 修复 （F3) 诱变 （F1) RNA 病毒 （R4) 同 源重组 也 称一般 重组。 该 过程涉 及两个 DNA 分子 间同源 区域的 交换。 对于 双倍 体真核 生物， 同 源重组 经常发 生在减 数分裂 过程， 在 其中期 I 同源复 制的 染色单 体平行 排列， 非姐妹 染色单 体通过 交换相 对应的 区域。 有丝分 裂结 束后， 产 生的单 倍体配 子就会 包含来 源父母 本两方 面的遗 传信息 ，这 样就可 W 保证 个体继 承多方 的基因 信息。 单倍 体细菌 也进行 重组， 如发生 在部分 已复制 DNA 间或 发生在 染色体 DNA 与获取 的外源 DNA (如 质粒 或嗤 菌体） 之间。 也 E . coli 中二 个同源 DNA 双螺 旋排列 在一起 （如图 F4.1a), 通过核 酸酶和 RecBCD 蛋白 复合体 的作用 在一对 姐妹染 色单体 (序列 相同的 单体） 上产生 切口， 切 口具体 发生在 称为斯 （GCTGGTGG) 的 特定序 列上， 该序列 大约每 4kb 就 有一个 （图 F4.1b)。 含有 5' 端切口 的单链 DNA 被 RecA 蛋白包 裹形成 RecA-ssDNA 细丝， 这 些细丝 相互交 换 并寻找 相对的 DNA 双螺旋 上的相 应序列 （侵 人， 如图 F4.1C)， 这之后 切口被 封好并 形成四 分支的 Holliday 结构 （图 F4.1d)。 送 个结构 是动态 的， 交 叉点左 右任何 两个方 面移动 相当一 段距离 （分支 迁移， 如图 F4.1e), 这个 Holliday 中 间体能 W 两 种方式 中的一 种拆分 为两个 DNA 双 螺旋。 如果 两条侵 入链被 切断， 那么所 产生的 重组体 除了中 间的交 换部分 98 F DNA 损巧、 修复 与重组 位点 特异性 重组 之 外与原 来的分 子都是 一样的 （如图 F4.1f)。 如果 是非侵 入链被 断开， 则产 生的重 组体一 半来自 父本， 另一半 则来自 母本， 形成的 两个亲 本的杂 合 双螺旋 （图 F4.1g)。 同源 重组对 DNA 修 复也很 重要， 当 复制叉 遇到一 个未修 复的非 编码的 损伤， 它能 "跳过 " DNA 损伤区 域并继 续复制 ，留 下一个 子链缺 □， 通 过重组 将亲本 姐妹链 上相应 区域替 代并填 平缺口 。由 此产 生的亲 本姐妹 链上的 缺曰很 容易被 填平， 因 为它的 对面没 有损伤 ，原 来 损伤部 分可通 过正常 的切除 去掉。 这个 机制也 被称作 复制后 修复。 (a) 。 ■占- 州 。 ■ + ~3( + 图 F4.1 2 个 DNA 双螺 旋分子 间同源 重组的 Ho 山 day 模型 位点 特异性 重组指 非同源 DNA 的特 异片段 之间的 交换， 由能 识别特 异 DNA 序 列的蛋 直亟所 介导， 并 不需要 RecA 或单链 DNA。 X 唆菌 S (参见 R2) 可将自 身基因 组插入 E. coZf 染色体 的特定 位点， 两者 DNA 上的 连接位 点处有 15bp 的序 列是相 同的。 唆菌体 编码的 整合醇 可 在这些 序列上 形成具 7 个 bp 的 突出端 的交错 切口， 并与 细菌编 码的整 合宿 主因子 （IHF) —起促 成这些 位点与 DNA 间的重 组结果 和入- DNA 进入 宿主染 色体。 这 种方式 形成的 X 隨菌 体称 为原喧 菌体， 可随细 胞分裂 而稳定 遗传， 直至; ^嘘菌 体所编 码的切 除酶被 激活， 整个过 程再颠 倒 过来。 在 真核生 物中， 位点 特异性 重组可 W 解 释抗体 多样性 的形成 。免 疫球 蛋白由 不同类 型的两 条重链 和轻链 组成， 都包含 不变的 和可变 的氨基 酸 序列。 其 中可变 区域在 生殖细 胞中由 3 个基 因段所 编码： y、 D 和 J。 F4 重组 99 转 座作用 有 250 个 V， 15 个 D 和 5 个 J 基因用 W 编码 重链， 250 个 V 和 4 个 J 编 码 轻链。 在抗 体产生 细胞的 分化过 程中， 这些 基因段 之间的 重组能 产生大 量 （>108) 的 不同重 链和轻 链基因 序列， 进 而导致 抗体的 种类多 样化。 每个 y、 D 和 J 基因 段都与 短的识 别序列 相连用 W 形 成重组 蛋白。 y 基 因跟 有一个 39bp 的 序列， D 基因与 2 个 28bp 的序列 相连， 而 J 基因 之前 有一个 39bp 片段。 由于重 组只能 发生在 39bp 和 28bp 序列 之间， 送就保 证了只 能形成 VDJ 体。 转座子 或可转 座元件 是一些 较短的 DNA 序列， 可 W 转移 进细 胞基因 组的几 乎任何 转座作 用又被 称为^ 重组， 因务^ 列间具 有同 源性， 也 不是位 点特异 性的， 结果 氏。 最为 简单的 转座子 是丘. coZz 中的 IS 元件 或插人 序列， 它在 基因组 中可能 有几个 拷贝。 这些 拷 贝长约 l~2kb， 包 含一个 转座酶 基因， 两侧 为短的 （〜 20bp) 末端反 向重 复序列 （相 同的 序列但 方向相 反）。 转 座酶在 染色体 DNA 上 形成交 错 切口， 在 复制过 程中转 座子的 一个拷 贝插入 到目标 位点中 （图 F4.2)， 缺口在 DNA 聚合酶 I 和 DNA 连 接酶的 作用下 填平， 产生 目标位 点的一 个副 本并形 成一个 新的同 巧重复 序列。 被转座 子插入 的基因 一般会 失活， 在两 个转座 子拷贝 之间的 基因可 tU 通 过它们 之间的 重组而 M 切除。 宿主 DNA 序 列的颠 倒或其 他方式 的重排 也可能 发生。 转 座子诱 变是产 生突变 体的一 个有效 方法。 除了转 座酶， Tn 转 座子系 列还携 带其他 基因， 其中 包括 P- 内献 胺酶， 可 使生物 体抗青 霉素。 一 些抗性 基因通 过转座 作用进 入 质粒， 导致 抗生素 抗性在 细菌中 传播， 而质粒 在细菌 中很容 易复制 。转 座子 也具有 穿越原 核种间 障碍的 能力。 --CGTAAGCTGCGGCAGGATTGA-- -- GCATTCGACGCCGTCCTAACT-- --CGTAAGCT --GCATTCGACGCCG GCGGCAGGATTGA-- TCCTAACT— IS 元件 — CGTAAGCT — GCATTCGACGCCG - -CGTAAGCTGCGGC --GCATTCGACGCCG rm ITR FTR [TR GCGGCAGGATTGA-- TCCTAACT-- GCGGCAGGATTGA-- CGCCGTCCTAACT-- 图 F4.2 插 入序列 转座进 入宿主 DNA， 并 形成目 标位点 的副本 （粗 体字所 示）， ITR， 指末端 反向重 复序列 100 F DNA 损伤、 修复 与重组 许多 真核生 物转座 子有着 与反转 录病毒 基因组 （参见 R4) 相 似的结 构， 酵母中 6kb 的 Ty 元件 （在 每个基 因组中 大约有 30 个全长 拷贝） 编码 的蛋白 与反转 录病毒 的反转 录酶和 整合酶 相似， Ty 元件两 侧为长 末端重 复序列 （LTR)， 它先 转录成 RNA 再反 转录到 DNA 双螺 旋中， 然 后插入 到其他 地方。 Drosophila 中的 copm 兀件 （5kb 序列， 50 拷贝） 在 结构上 很 相似， 这 种成分 称作反 转录转 座子。 一般认 为反转 录病毒 就是那 些可存 在 于细胞 之外并 转移到 其他细 胞的反 转录转 座子。 在 高等真 核生物 中发现 的一些 分散重 复序列 （如 LINES 和 SINES) 很可能 是通过 转座作 用在基 因组内 传播的 （参见 D4)。 LINES 与反转 录病毒 基因组 相似， 而作为 SINE 的 AZm 元件则 与信号 识别颗 粒中的 7SL RNA 有 很大的 相似性 ，这 种颗 粒是可 能起源 于这种 RNA 反转 录物， 并 与内质 网中新 合成的 多化分 泌相关 的一种 复合物 （参见 Q4)。 (王 薛林译 列进元 校） G 基 因操作 G1 DNA 克 隆概述 要 点 DNA 克隆 通过将 生物体 基因组 DNA 片段 作为自 主复 制载体 的一部 分进行 独立 复制的 方式， 使对该 片段的 分离及 操作简 单化。 宿主 和載体 基 因克隆 过程中 的大多 数常规 操作中 都使用 大肠杆 菌作为 宿主细 胞。 质 粒和晦 菌体可 作为大 肠杆菌 的克隆 载体。 质粒、 病 毒及整 个 染色体 的载体 一直被 用作外 源基因 导入其 他原核 及真核 生物体 内的 工具。 亚克隆 亚克隆 只是简 单地将 己被克 隆了的 DNA 片 段从某 一载体 向另一 载体的 转换； 服务于 基因克 隆中的 许多常 规操作 技术。 DNA 文库 由基 因组或 cDNA 的一套 随机克 隆片段 构成， 其中 每个片 段连在 一个 单独的 载体分 子上， 常 用来分 离未知 基因。 巧 选文库 通过与 蛋白质 产物推 测出的 DNA 序 列或某 一相关 基因序 列的杂 交， 或 者通过 克隆片 段的蛋 白产物 来筛选 基因的 技术。 克 隆分析 鉴定 后的已 克隆基 因可用 限制性 酶切图 谱进行 分析， 并最 终进行 DNA 序列 分析。 然后 再将该 基因序 列用于 DNA 克隆的 各种应 用。 相 关主题 克 隆载体 （H) 克隆 DNA 的分析 与应用 （J) 基 因文库 与筛选 （I) DNA 克隆 长期 来， 由 于生物 体内某 些蛋白 质或其 他组分 的含量 稀少难 W 大量 纯化， 造成 对这些 物质的 详尽分 子分析 极其困 难或者 几乎不 可能。 一种途 径 是分离 负责某 一蛋白 质表达 的或某 一产物 形成的 基因。 然 而每个 生物体 的基因 组都很 庞大、 复杂 （参见 D)， 且任一 目的基 因序列 通常在 单个细 胞 中只出 现一到 两次， 因 此标准 的化学 或生化 方法都 不能被 用来分 离基因 组 中的特 定区域 W 对 其进行 研究， 尤其是 当目的 DNA 序列 与所有 其他序 列具 有化学 相同性 时更加 困难。 解决这 一难题 的方法 是将基 因组中 携有该 基因 或其他 相关序 列的较 小片段 连接到 一段可 W 自 主 复制的 DNA 即载体 上， 形成 通常可 在 另一宿 主中进 行复制 的重组 DNA， 这 种复制 是独立 于原 初基因 组的。 带 有重组 DNA 的宿 主细胞 的增殖 构成了 一群具 有遗传 一 致性的 个体， 或 称为单 克隆。 这一系 列操作 过程就 被称作 DNA 克隆。 102 G 基 因操作 宿主 和载体 在进行 DNA 克 隆中， 通常将 W 下 操作、 制作或 生产归 为遗传 工程范 畴： - DNA 序列 分析， [及 由此派 生的蛋 白质序 列分析 （参见 J2)。 - 对 基因启 动子及 其他调 控序列 的分离 与分析 （参见 J4)。 - 通过大 量正常 和突变 形式的 产物研 究来了 解这些 蛋白质 / 酶 /RNA 的功 能 （参见 J5)。 - 突变的 鉴定， 例如由 于基因 缺焰导 致形成 的疾病 （参见 J6)。 - 生物 技术， 如 蛋白质 及其他 重要生 物功能 的分子 如人膜 岛素和 生长素 的大规 模工业 化生产 （参见 J6)。 - 工程 动物、 工 程植物 W 及基 因治巧 （参见 J6)。 - 改变 了特性 的工程 蛋白质 （参见 J6)。 对 DNA 片段 最初的 分离及 分析几 乎都是 W 大肠 杆菌为 宿主进 行的， 虽然酿 酒酵母 （ Saccha romyces cerevisiae ) 被 用来操 作人类 基因的 大片段 (参见 H3)。 很 多种天 然复制 子具有 用作克 隆载体 所需的 特性。 为 了使某 些 获得克 隆基因 的长期 表达， 一些载 体被设 计用来 将外源 DNA 整 合到宿 主 细胞基 因组， 但 载体自 身通常 必须能 够独立 于宿主 细胞基 因组之 外进行 复制与 分离。 载 体还应 包含一 个选择 标记， 即 一个能 使含有 该载体 的宿主 可从那 些不含 该载体 的细胞 中被筛 选出的 基因， 一般 是赋予 宿主对 某种毒 素 的抗性 （参见 G2)， 或使 宿主细 跑能在 特定生 长条件 下生存 （参见 H3)。 最早 的大肠 杆菌载 体是染 色体外 （与 染色 体相独 立的） 的环 状质粒 (参见 G2)， W 及许多 懂菌体 （侵染 细菌的 病毒； 参见 R2)。 与质 粒载体 相比， 31 嗤菌 体可用 来克隆 较大的 DNA 片段， 唆菌体 M13 可 W 使克隆 DNA W 单链形 式被提 取出来 （参见 H2)。 许 多专用 载体被 改造成 兼具质 粒 与唆菌 体两者 特性的 形式， 比 如质粒 -X 嗤菌体 杂合体 即黏粒 （参见 H3)。 人 类和其 他物种 的巨大 基因组 片段已 被用细 菌人工 染色体 （bacteri- al artificial chromosome, BAC) 的形 式克隆 进大肠 杆菌， 或 W 聲母 人工染 色体 （yeast artificial chromosome, YAC; 参见 H3) 克隆 进酿酒 酵母。 质粒 和晦菌 体载体 已被用 来在大 肠杆菌 外的一 些细菌 中表达 外源基 因， 而 且一些 唆菌体 还可被 用来将 DNA 整合 到宿主 细胞基 因组中 ，如入 唆菌体 （参见 H2)。 已经 开发出 能在酵 母中应 用的质 粒载体 （酵母 游离型 质粒， yeast episomal plasmid) , 而对 于植物 一 ■种细 菌质粒 （根癌 农杆菌 Ti 质粒， Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid) 可被 用来将 DNA 整 合到基 因 组中。 对于 培养状 态的其 他真核 细胞， 常用 那些能 自然侵 染目标 物种的 病毒 作为载 体将其 DNA 维持 在染色 体外， 或者 是整合 到宿主 基因组 （例 如 SV40、 杆状 病毒、 反转录 病毒； 参见 H4)。 亚克隆 是 克隆实 验中最 简单的 一种， 可 W 此 来说明 DNA 克隆 中的许 多基本 G1 DNA 克 隆慨述 103 技术， 即将已 克隆的 DNA 片段从 一载体 向另一 载体的 转移， 这一 过程被 称为亚 克尾。 举巧 1 来斋 r 亚克隆 可用来 对较大 巧竞尾 片良卫 最运区 段进行 - 研究， ~ 或是将 基因转 移到能 在特定 物种中 表达的 另一载 体上。 就大肠 杆 菌的质 粒载体 来说， 最常见 的亚克 隆程序 可分为 W 下步 骤， 这在 G2~ G5 中有更 详尽的 讨论： • 含有 目标克 隆序列 的质粒 DNA 的提取 （参见 G2)。 - 用限制 性内切 核酸酶 将质粒 酶切成 不连续 的片段 （参见 G3)。 __ - 经琼脂 糖凝胶 电泳分 离片段 （参见 G3)。 • 纯化目 标片段 （参见 G3)。 - 将 目标片 段连接 在一新 质粒载 体上， 形成 新的重 组分子 （参见 G4)。 • 将连 接好的 质粒转 入某一 大肠杆 菌菌株 （转 化， transformation) (参见 04)。 • 转 化细菌 的筛选 （参见 G4)。 • 重 组质粒 的分析 （参见 G4)。 DNA 文库 用于 鉴定未 知基因 的克隆 实验的 DNA 有两 个主要 来源： 目的 物种的 基因组 DNA 和真 核生物 特定基 因表达 细胞或 组织的 mRNA 群体， 分别被 用 于构建 基因组 文库和 cDNA 文庚 （参见 II 和 口)。 DNA 文库 是一套 DNA 克隆 （一个 克隆是 一个遗 传上独 特的个 体或一 群相 同的个 体）， 每个克 隆都是 插入了 不同片 段的载 体在宿 主中扩 增后的 产物。 基 因组文 库是用 基因组 DNA 的 随机片 段制备 成的。 然而用 基因组 文库来 克隆某 一基因 是一种 篮的 方法， 特别是 对于庞 大的真 核生物 基 因组， 其 中大量 DNA 是非 编码的 （参见 D4)。 另 一种是 用来自 菱达目 设基因 细胞或 组织的 mRNA 作为来 源构建 成放文 卸 cDNA 义专 经反 转录将 mRNA 合成 cDNA (DNA 拷贝） 后， 插 入载体 构建成 cDNA 文库。 用 cDNA 文库 来克隆 目的基 因是有 效的， 但克 隆的仅 是其编 码区， 而不包 含 编码区 外的 基因组 序列。 f 筛 选文巧 因为文 库中的 哪一个 克隆含 有目的 基因并 不是从 外表可 W 看出的 ，所 必须 用一种 方法筛 选出含 有目的 基因的 克隆。 通常 是用一 段与目 的基因 序 列的某 一区段 互补或 部分互 补的放 巧 或巧光 标记的 DNA 探针. 通过 杂交来 检测出 该基因 （参见 C3)。 ^区 I 的蛋白 产物可 获得， 则 探针可 是从 该蛋白 产物序 列推测 出的一 段寡核 昔酸， 或者探 针也可 W 来自 另一物 种中的 某一相 关基因 （参见 13)。 制备 探针越 来越常 用的一 种方法 是聚合 酶 巧反应 （PCR; 参见 J3)。 另 一筛选 方法是 基于文 库中被 克隆的 编码区 表 达后， 对 其蛋白 产物进 行活性 鉴定， 或 是用特 异抗体 对其进 行鉴定 （参 见 13)。 克 隆分巧 一旦含 有目的 基因的 克隆被 确定， 就可 W 通过限 制性酶 切图谱 即用限 104 G 基 因操作 制 性酶切 来分析 DNA 片段， 来 对其克 隆的片 段的结 构进行 更进一 步的研 究 （参见 J1)， W 至最终 对全长 片段进 行测序 （参见 J2)。 随后可 通过将 所得全 长序列 与数据 库中其 他已知 序列进 行比较 分析， 确定 出该蛋 白产物 的完 整序列 （参见 J2)。 至 此就可 W 用 如上所 述的任 何克隆 程序对 该序列 进行 操作。 在体 外进行 DNA 克隆与 分析要 用到许 多酶， 其 中常用 酶的特 性特列 于表 G1.1 中， 详细 描叙其 应用的 章节也 已列于 其后。 表 G1.1 用于 DNA 克 隆的酶 酷 用 途 拍 性巧酸 巧 从巧链 或单链 DNA, 或 RNA 的 5' 端移去 雜酸基 （参见 G4)。 DNA 连接酶 由 ATP 水 解提供 能董， 将 dsDNA 的戊糖 -巧酸 骨架的 (来自 巧宙体 T4) 5'- 稱酸与 3'- 経基 相结合 。待 连接的 DNA 末 端必须 是相匹 配的， 即平 端与平 端. 或为互 补的黏 性末端 （参见 E2 和 G4)。 DNAS5 合随 I 由 含游离 3'- 轻基 的引物 起始， 沿 5' 至 3' 的方向 合成与 DNA 模板 互补的 DNA 链 （参见 E2)。 Klenow 片段是 DNA 聚合酶 I 的缺失 5 ‘至 3' 外切 核酸酶 活性的 巧短 部分。 外切 核致随 I 外切 核酸酶 从线性 DNA 的末 端依次 切除核 巧酸。 外切 核酸酶 ID 只从 dsDNA 绿豆 巧酸巧 的 3' 端切割 （参见 J4)。 降 解单链 核酸， 留下 完整的 双操、 旋区段 （参见 J4)。 巧致苗 S1 类似 绿豆核 酸酶， 并 旦能够 降解对 应于互 补链缺 刻对面 的单链 （参见 J4)。 多巧巧 唐巧苗 一个 依赖 ATP 的 反应， 向双链 或单链 DNA/RNA 的 5'- 轻 基末端 添加巧 酸基。 若使用 [y-32P] ATP, 则可将 DNA 标记上 放射性 同位素 （参见 13)。 限制節 在识别 序列处 （通常 对称） 切割 dsDNA 的 双链。 水 解戊搪 -碟酸 骨架. 使其 -端为 5'- 碟酸 基而另 一端为 3'- 経基， 形成 平端或 "黏" 末端 （5'- 或 3'- 凸 端） （参化 G3) 反 转录隨 依赖 RNA 的 DNA 聚 合酶。 由含 有游离 3' 控基 的引物 起始. 沿 5' 至 3' 方向含 成与 RNA 模板 互补的 DNA 链， 需要 dNTP (参见 口)。 RNase A 只降解 RNA. 而 不降解 DNA 的 核酸酶 （参见 G2)。 RNase H 降解 RNA-DNA 异源双 链中的 RNA 链的 核酸酶 （参见 口)。 T7, T3 巧 SP6 分别由 相应的 嗤茜体 编码的 专一性 RNA 聚 合酶。 每 种酶只 能识别 RNA 聚合巧 自身的 嗤菌体 DNA 的启 动子， 恃异地 转录各 自启动 子下游 DNA 序列 （参见 H1 和 口）。 Taq DNA g 合節 来 源于巧 热细茜 (Thermus aquaticus) 的 DNA 巧 合酶。 最适 温度为 72C, 在 末铺 转巧的 WC W 上 仍相当 稳定。 用于 PCR (参见 口）。 可将 核巧酸 加到线 性单链 或双链 DNA 或 RNA 的 3' 端。 如只用 GTP， 则仅加 上多个 G (参见 口）。 G 基 因操作 G2 质粒 DNA 的制备 載 体质粒 质 拉的小 量制备 碱裝解 龄抽提 已 醇沉淀 氣化 绝梯度 细 菌质粒 是独立 于宿主 基因组 复制、 编码抗 生素抗 性基因 的小型 环状 DNA 分子、 运 载克隆 DNA 的常用 载体。 仅从 几毫升 培养液 中提取 小量质 粒用作 分析， 这一 过程被 称作小 量制备 （minipreparation 或 miniprep)。 用 SDS 喊 性溶液 裂解大 肠杆菌 细胞， 变性蛋 白质和 DNA， 然后 中 和沉淀 染色体 DNAia 及绝大 部分蛋 白质， 在溶 液中只 剩下质 粒 DNA 和 RNA。 用酷或 酌-氯 仿混合 液抽提 W 去除 碱裂 解液中 残余蛋 白质。 加入乙 酸钢和 乙醇后 离必， 可从 溶液中 沉淀出 核酸。 这一 方法常 用 来浓缩 样品。 CsCl 梯度离 必是质 粒大量 制备过 程中的 一步， 可 将超螺 旋质粒 DNA 从蛋 白质、 RNA 及线 性或带 缺刻的 DNA 中纯化 出来。 相 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 连接、 转化 与重组 体分析 （G4) 基 因文库 与筛选 （I) 质 粒载体 20 世纪 70 年代 中期， 最早使 用的克 隆载体 是来自 大肠 杆菌的 未加工 的细菌 质粒。 质粒为 染色体 外的小 型环状 分子， 大 小约为 2 〜 200化， 通 常 多拷贝 （可 多达几 百个） 形式存 在于宿 主细胞 大扬杆 菌中。 虽 然质粒 的 正常复 制依赖 宿主细 胞中的 聚合酶 及其他 成分， 但质粒 含有复 制起点 (ori; 参见 El) 用 W 保 证质粒 的自主 复制。 质粒一 般仅携 有几个 基因， 其 中之一 会赋予 细茜对 抗生素 物质的 抗性。 最常见 的抗性 基因是 Wa， 或 基因， 编码可 [降 解青霉 素类抗 生素如 氧节青 霉素的 9 -内醜 胺酶。 另 一种常 见抗性 基因是 fwA 基因， 编码 一种可 W 从 细胞内 将四环 素类抗 生素 排出的 跨膜累 蛋白。 质粒 的小量 如将一 个基因 从某一 质粒向 另一质 粒转移 （参见 G1) 的亚克 隆过程 制备 的第 一步就 是要提 取质粒 DNA。 由于质 粒远远 小于大 肠杆菌 染色体 DNA (参见 D1)， 可 W 用物 理化学 方法将 它们相 分离， 例如碱 裂解法 （参 见下 106 G 基 因操作 城裂解 酪抽提 己 醇沉巧 氯化 巧梯度 文)。 从 几毫升 菌液中 提取出 足够量 的质粒 DNA 供 初步操 作所需 是完全 可 W 的， 这 样的提 取操作 通常称 为小量 制备。 将携有 目的质 粒的大 肠杆菌 茜株 接种于 数毫升 液体培 养基， 待 増殖至 稳定期 （过夜 培养） 后， 离心菌 液形 成菌体 沉淀， 接 着就可 W 用小 量制备 法提取 质粒。 从 染色体 DNA 及 大部分 其他细 胞成分 中纯化 出质粒 DNA 最 常用的 方法 称为破 裂解法 （图 G2.1)。 菌 体沉淀 重悬于 悬浮缓 冲液， 必要 时该缓 冲液可 加入能 降解菌 体细胞 壁的溶 菌酶。 再加入 细胞裂 解液， 即含 去污剂 十 二烧基 硫酸納 （SDS) 的碱性 NaOH 溶液。 SDS 的作用 是破碎 细胞膜 (参见 A1) 及引起 蛋白质 变性； 碱 性条件 会引起 DNA 变性 及水解 RNA (参见 C2)。 然后用 高浓度 pH5 的乙 酸钟溶 液中有 ]。 其作用 是沉淀 已变性 蛋 白质和 染色体 DNA 及 大部分 去污剂 （十 二烧 基硫酸 押不溶 于水） 。将 溶 液再次 离必， 上清 （裂 解液） 中含 有质粒 DNA。 小型闭 合环状 的质粒 DNA 在 碱处理 后很易 复性， 此时 的溶液 中还含 有大量 小分子 RNA 及少量 蛋 白质。 目 前有许 多专利 方法用 W 从 上述裂 解液中 提取出 纯质粒 DNA， 其中 多数是 采用将 DNA 选择性 地结合 于树脂 或膜， 再洗 脱掉蛋 白质和 RNA 的 原理。 而 经典的 方法， 虽 然较慢 却极为 有效， 采用 对裂解 液用齡 或齡- 氯 仿混合 液进行 抽提。 敢相与 水相不 相溶， 当 剧烈振 荡然后 静置或 离心分 相后， 变性 了的残 余蛋白 会沉降 出来处 于龄相 与水相 的界面 （图 G2.1)。 留在水 相中的 DNA 和 RNA 可 由乙醇 沉淀得 W 浓缩。 这 是常用 程序， 可应 用于任 何核酸 溶液。 当 向溶液 中加入 NaAc 至 Na+ 浓 度大于 0.3 mol/L, 溶 液中的 DNA 和 （或） RNA 加入 2~3 倍体 积的乙 醇后而 被沉淀 出来。 离必 沉淀核 酸然后 再溶于 更少的 体积， 或溶 于含新 成分的 缓冲液 中。 对于小 量制备 过程， 乙醇 可直接 加到酥 抽提后 的裂解 液中， 形 成的沉 淀 可溶于 Tris-EDTA 缓 冲液， 该 缓冲液 是用于 DNA 胆: 存的常 用溶液 。溶 液中含 Tris’HCl W 缓 冲溶液 酸碱度 （通 常为 pH8)， 还 含有低 浓度的 ED- TA 用 来整合 Mg2+ W 保护 DNA 免受 核酸酶 降解， 因 大多数 核酸酶 工作都 需要 Mg2+。 核糖 核酸酶 A (RNase A) 可同时 被加入 溶液中 W 降解 残余 的 RNA 污染。 该 酶降解 RNA 又 不损伤 DNA， 也不需 Mg2+ 参与 反应。 喊裂 解法也 可应用 于大量 制备获 得毫克 数量级 的质粒 DNA。 制备大 量 的质粒 可作为 常用克 隆载体 胆备， 或 用作大 豐酶解 反应的 底物。 此时 CsCl 密度梯 度离， I：、 （参见 C2) 可 被用来 作为最 终纯化 步骤。 该步 骤虽然 有点 费力， 但 却是获 得极纯 的超螺 旋质粒 DNA 的最佳 方法。 粗裂 解液经 含有漠 化乙锭 （参见 C4) 的 CsCl 梯度 （参见 C2) 分级分 离后， 各 种成分 会完 全分离 （图 G2.1)。 超螺旋 DNA 结合的 漠化乙 锭比线 性或带 切口的 G2 质粒 DNA 的制备 107 要小 （参见 C4)， 具 有较大 的密度 （因其 损伤最 少）。 因此 大量的 超螺旋 质粒 可一步 就从蛋 白质、 民 NA 及 污染的 染色体 DNA 中分离 出来。 从离心 管 中回收 含有质 粒带的 溶液， 在 除去漠 化乙锭 后再用 上述乙 醇沉淀 步骤进 行 浓缩。 图 G2.1 质 粒的制 备流程 （详见 正文) G 基 因操作 G3 限制酶 与电泳 点 识 别序列 限 制性内 切核酸 酶来自 细菌， 可将 DNA 酶切 （水 解） 成特定 的、 可 再生的 片段。 在细 菌中限 制性内 切核酸 酶是抵 抗外源 DNA 侵 入的限 制修饰 防卫机 制的一 部分。 限制性 内切核 酸酶是 进行基 因克隆 的基本 工具。 限制 性内切 核酸酶 在很短 的回文 （对 称的） 识别序 列处对 称切割 DNA 双链， 产 生一个 5'- 憐酸基 和一个 3'- 経基， 形成平 末端或 突出的 5' 或 3'- 薪 末端。 黏末端 限制 性畴解 相 关主题 含 有单链 末端的 限制性 内切核 酸酶酶 解产物 被称为 "赫" 末端， 因 此耗末 端可与 带有互 补末端 的其他 片段进 行碱基 的退火 配对。 在用 琼脂糖 凝胶电 泳对目 的片段 进行分 析或纯 化前， 商品 酶被用 来酶 解质粒 DNA。 琼脂糖 凝胶可 W 在电 场作 用下， 根 据线性 DNA 分子的 大小及 DNA 在凝胶 基质中 的迂移 率分离 DNA 分子。 电泳 还可用 于测定 质 粒分子 的大致 构型。 特定 DNA 片段 可从琼 脂糖凝 胶中切 出后， 回收纯 化用于 随后的 克隆 实验。 DNA 克 隆概述 （G1) 基 因文库 与筛选 （I) 限制 性内切 为了 将外源 DNA 片段插 入质粒 载体， 需要 对双链 DNA 进行 酶切和 核酸酶 再 连接。 20 世纪 60 年代和 70 年 代初， 对限 制性内 切核酸 酶的鉴 定及操 作是实 现克隆 DNA 的 关键。 许多 细菌中 含有限 制修饰 系统， 构成 了对侵 入细胞 的外源 DNA 的防卫 机制。 该 系统由 两个主 要组分 构成， 一 个是限 制性 内切核 酸酶， 可识别 一小段 对称的 DNA 序列 （图 G3.1)， 然 后在识 别位点 处切割 （水 解） 双链 DNA 骨架， 外源 DNA 因此被 降解成 相当短 的 片段。 该系统 的第二 个组分 是甲基 化酶， 该酶可 W 对细胞 DNA 的相应 识别序 列内的 C 或 A 碱基 上加一 个甲基 （参见 C1)。 这 种修饰 作用可 W 保护宿 主细胞 DNA 不被 内切酶 降解。 G3 限制酶 与电泳 109 (a) 晰 5-GAATTC-3 5‘- G-OH ©-AATTC-3 - 3 -CTTAAG -5 ' t EcoRl 5 端突出 形成黏 巧末端 3 - CTTAA-© + HO-G-5' 5 --G 3-CTTAA + AATTC 白 i 5-CTGCAG-3 5 ■- CTGCA-OH ©-G- 3 ‘ 3-GACGTe-5 t Pstl 3 端突出 形成黏 性末端 3.-G-© + HO-ACGTC-5 - i 5 -CCCGGG -3 5 - CCC-OH ©-GGG-3 5 — GAATTC --3 - 3-GGGCCC-5 t . 3-GGG-© + HO-CCC-5' 3 — CTTAAG ■■5* Smal 形成黏 性末端 图 G3.1 (a) 限 制性内 切核酸 酶在其 识别序 列处的 作用； （b) 黏末端 的退火 识 别序列 限制 性内切 核酸酶 （简 称限 制酶） 的作用 方式描 绘于图 G3. la 中， 其 中包括 作为示 例的原 始型酶 £coR I 。 这种 二聚 体形式 起作用 的酶仅 识别 6bp 的回 文序列 （即 双链中 每一条 链均按 5' 一 3' 方向 阅读， 其 序列相 同）， 线性 DNA 上 该位点 处的酶 切形成 两个双 链片段 （限 制性 片段） ，每 一片 段都具 有同一 的縣酸 基团的 5' 单链突 出末端 ，而 3' 端则 是游离 蒼基。 在随 机序列 DNA 中 平均每 46 = 4096bp 长存在 一 ■个 6bp 的识别 序列， 因此 一个 巨大的 DNA 分 子可被 这种酶 切割成 平均长 4kb 的特异 片段。 目前已 知的 限制酶 已达数 百种， 且大 部分可 W 购 买到。 这些酶 的识别 序列在 4bp 〜 8bp， 或更长 一些， 其酶 切产物 是具有 5' 或 3' 突 出的末 端或平 末端。 新 形成的 5' 端总 是保留 着碟酸 基团。 图 G3.1 还 包括另 外两个 例子。 限制 酶 对酶切 位点的 极高恃 异性保 证了将 大片段 DNA 分 子及载 体切割 成的特 定 片段， 且重复 性好。 黏末端 具有 突出末 端的限 制性酶 解反应 的产物 的末端 被称为 "黏 合的 （CO- hesive)"， 或 "黏 （stick)" 末端， 其特 性在于 它们可 通过单 链尾端 的碱性 配对 （退 火）， 与 其他任 何具有 相同突 出序列 的末端 结合。 例如任 何一个 由 EwRl 酶 切产生 的片段 均可与 相同方 式产生 的任何 其他片 段退火 （图 G3.1b), 然 后通过 连接共 价结合 在一起 （参见 E4)。 事 实上， 在 某些情 况下， 由 不同识 别序列 的酶所 形成的 DNA 末 端也可 W 是相 同的， 产生能 够相 互配对 的单链 末端。 限制 性酶解 按不同 的分析 或制备 目的， 用商品 化的限 制酶及 其缓冲 液对质 粒或基 110 G 基 因操作 因组 DNA 进行酶 解反应 （参见 II)。 所 有限制 酶均需 Mg2+ 参 与反应 ，通 常 在高至 lOmmol/L 的 浓度下 进行， 但不 同的酶 有各自 最适的 pH 值、 NaCl 浓度或 其他溶 液成分 ^>1 达到最 佳反应 活性。 某 一特定 的酶所 需的缓 冲液 W 浓 缩物的 形式与 该酶一 起提供 。图 G3.2 表示 用两种 不同的 限制酶 技 zwHl 和 £co 民 I 酶切同 一样品 质粒。 若用琼 脂糖凝 胶电泳 分析只 要对几 百纳克 （1 两 个方向 与载体 相连。 例如目 的插入 片段含 有将有 被 接到载 体启动 子的下 游的基 因编码 区时， 插 入方向 就十分 重要。 片段定 向可 用一 种已知 不对称 切割插 入片段 的酶及 另一种 能特异 性切割 载体的 酶 共同进 行酶解 反应来 进行。 如图 G4.1 和图 G4.4 所示， 用切割 插入片 段的洗 /I (S) 和 只切载 体的化 nd 田 （H) 进行双 酶切。 如图 G4.4 所 示， 可 W 看到 从两方 向插入 （重 组体 A 和 B) 的不 同图谱 （泳道 H/S)。 118 G 基 因操作 载体 重组体 A or B A B M U 巨 U E H/S H/S M 分子质 量标准 大小 (kb) 23.1 — 9.4 — 6.6 — 4.4 — 2-3 — 2.0 — 0.56 — 图 G4.4 琼 脂糖凝 胶电泳 分析重 组质粒 （文 中有 详述) (叶 彬巧 刘进元 校） H 克巧 巧体 HI 质 粒载化 的设计 要 点 连 接产物 I 克隆过 程中最 重要的 步骤之 一就是 鉴别环 化载体 分子与 重组质 粒， 已形成 了许多 方便于 鉴别的 方法。 双 化生素 化性 I 当载体 分子上 具有双 抗生素 抗性基 因时， 就可 W 用 插入片 段插入 某一抗 性基因 而使其 失活的 方式来 觸选重 组体。 蓝 -白颜 色巧选 I 质 粒上的 ZacZ' 基 因的插 入失活 被用来 在含有 IPTG 和 X-gal 的平 板上 贿选重 组体。 当佔 cZ' 基因完 整时， IPTG 诱 导其表 达后， X-gal 可转化 为蓝色 产物， 因而 重组体 在平板 上会长 成白色 菌落。 多克 隆位点 I 多克 隆位点 即具有 多个限 制酶酶 切位点 的一段 DNA 序列， 为选 择限制 酶或克 隆中所 用的酶 提供更 多的选 择性。 载体内 的启动 子可被 用来在 体内或 体外转 录插入 片段。 某 些载体 还带 有两个 特异启 动子， 从 而能使 插入片 段的两 条链均 能被转 录。 表 达载休 I 许 多载体 被设计 成使插 入片段 内的基 因可从 强后动 子起始 转录并 表达。 在 某些情 况下， 如用 T7 表达 载体， 目的产 物可占 大肠杆 菌细 胞总蛋 白的大 部分。 色克 隆插入 片段 的转录 相 关主题 基 因操作 （G) 基 因文库 与筛选 （I) 克隆 DNA 的分析 与应用 （J) 连 接产物 将 目 的片段 与质粒 载体连 接时， 最常见 的非目 标 产物就 是线性 载体片 段自 身环化 所形成 的空质 粒载体 （参见 G4)。 自环化 载体可 通过从 转化克 隆中小 量提取 质粒， 然后 酶解及 随后的 琼脂糖 凝胶电 泳分析 来与重 组体相 区分 （参见 04)， 但用此 法进行 大规模 筛选是 极不方 便的， 目前已 开发出 更有 效的、 便于 筛选的 一系列 载体。 双 抗生素 PBR322 是最 早开发 出的质 粒载体 之一。 PBR322 及其 衍生物 包含两 抗性 个抗生 素抗性 基因， aw// 和 (参见 G2)。 如 果目的 DNA 片 段插入 到这两 个基因 中的任 一编码 区内， 比如 zwA， 则该基 因会发 生插入 失活， 而 后就可 W 通 过由转 化子所 显示的 抗生素 抗性来 鉴定出 重组体 （固 Hl.la)。 120 H 克 隆载体 氨辛 青毎素 抗巧？ 是 是 四环素 抗性？ 否 是 图 H1.1 (a) 用抗性 基因的 插入失 活法来 筛选重 组体； （b) 复 制铺板 在转化 及铺板 步骤中 （参见 G4)， 所有在 氨节青 霉素平 板上长 成的菌 落 肯定都 是含有 完整的 awpt 基因的 质粒。 自 连接的 载体也 会表现 出四环 素抗性 ，而 zwA 基因中 有目的 片段插 入的克 隆将不 产生有 活性的 TetA 蛋 白， 会对 四环素 敏感。 在 最初筛 选平板 上加入 四环素 将会杀 死我们 想得到 的重组 菌落， 因此 需要运 用一种 更间接 的筛选 方法即 影印平 板巧养 （图 Hl.lb)。 在 含氨节 青霉素 的正常 平板上 长出的 菌落， 用一 种有吸 附性的 垫子 转移到 另一个 含四环 素的平 板上， 能在该 平板上 生长的 菌落很 可能是 空 载体， 而不 能生长 的菌落 则极可 能是重 组体。 后者可 W 从含 氨节 青霉素 的平板 上挑取 下来作 进一步 分析。 蓝- 白颜色 一种更 巧妙的 鉴定重 组质粒 的方法 是蓝- 白颜色 筛选， 该法可 W 在同 筛选 一转 化平板 上完成 筛选。 这种方 法也涉 及基因 的插入 失活， 正如 名称所 示， 它 利用一 种蓝色 化合物 的形成 作为指 示剂。 在这 种情况 下失活 基因是 lac 之、 该基 因编码 肖- 半乳糖 昔酶， 受 Zac 启动子 的调控 （参见 L1)。 当 E . co/z’ 菌 株表达 Lac 阻 抑物， 则载 体上的 ZacZ 基因由 异丙基 - P - D - 硫 代半 乳巧昔 （IPTG) 诱 导表达 （参见 L1)， 表 达形成 的酶可 W 利 用底物 5 -虞 -4 -寅 -3 -间巧 -p-D- 半 乳糖巧 (X-gal) 形成一 种蓝色 化合物 。重 组 质粒中 lacZ 的插 入失活 将导致 不能形 成蓝色 菌落。 该方 法具体 操作是 (图 H1.2) 将转 化细胞 涂布于 含氨节 青霉素 （通 常筛 选转化 子的方 法）、 IPTG 和 X-gal 的平 板上， 形成有 蓝白两 色的菌 落混合 群体。 白色 菌落未 HI 质 粒教体 的设计 121 表达 P- 半乳搪 巧酶， 因而 可能含 有插入 的目的 片段， 而藍 色菌落 则很可 能 是自环 载体的 克隆。 图 H1.2 (a) 用于蓝 白術选 的质粒 载体； （b) 藍 白筛选 实验中 所形成 的菌落 实际上 这种方 法中所 用到的 载体都 有一个 lacZ 截 短后的 衍生物 lacZ\ 此 基因编 码肖- 半乳糖 昔酶的 N 端的 0 狀。 这 种载体 须转入 一种含 有表达 P- 半乳糖 昔酶的 C 端部 分的 突变基 因的宿 主菌， 表达的 p - 半乳搪 巧酶的 C 端能与 a 肤互 补产生 有活性 的酶。 这 样做的 好处是 缩短了 质粒所 载 基因的 长度， 但又没 有改变 该法的 原理。 多克 隆位点 第一 个利用 藍白颜 色进行 筛选的 载体， 同时 也开辟 了多克 隆位点 (multiple cloning site, MCS)。 这些 质粒即 pUC 系列， 包含 一 ■个改 造过的 ZacZ' 基因， 在 该基因 编码区 的第一 部分有 多个限 制酶酶 切位点 （图 H1.2a 和图 H1.3)。 这 一区域 被称为 MCS。 目的 DNA 插入 于这些 位点中 的 任一个 或任两 个位点 之间， 都会使 ZacZ' 基因 失活， 并在 适宜的 平板上 产 生白色 菌落。 MCS 使 在选择 用于克 隆的限 制酶时 具有一 定的灵 活性。 Acc\ MetThrMet I 1 eThr AsnSerSerVal ProGlyAspProLeuGl uSerThrCysArgHi sAlaSerLeuAlaLeuAla . . lacZ’ 图 HI. 3 在 /acZ' 基因 5' 端 的多克 隆位点 己克 隆插人 在 pUC 载 体上与 克隆片 段的插 入位点 相邻处 有一个 启动子 （Zac), 片段 的转录 很易想 象出这 样的启 动子可 用来转 录插入 DNA， 无 论是在 体外产 生可用 作杂交 探针的 RNA 转录物 （参见 口）， 还是 表达插 入片段 内基因 的蛋白 产物 （参 见下 文）， 都不成 问题。 目前 已构建 了多种 转录型 载体， 便于在 体外进 行克隆 片段的 转录。 例如 pGEM 系 列载体 中就含 有来自 谨菌体 T7 和 SP6 的启 动子， 两 启动子 间是 MCS (其本 身是为 ZacZ' 蓝 -白筛 选而设 计）。 来 自嗤菌 体的启 动子只 能 被各自 相应的 隨菌体 RNA 聚合酶 所识别 （参见 G1.1)， 上述两 启动子 122 的任一 种均可 用于体 外转录 插入片 段的任 一链。 H 克 隆载体 表 达载体 可用 pUC 载体在 大肠杆 菌中表 达克隆 基因。 这 就需要 将克隆 片段在 MCS 中定位 使 目的基 因的编 码区与 ZacZ' 基 因具相 同的可 读框， 并且是 连续不 间断的 （参见 P1)。 在诱导 Zac 启 动子转 录后， 产生融 合蛋白 ，该 融合 蛋白是 由来自 ZacZ' 的 N 端的 几个 氨基酸 及其紧 连着的 由插入 片段所 编 码的蛋 白序列 组成。 使用强 （活 性极 高的） 启 动子， 例如 /acl/y-5 [— 种独 立于环 AMP 受 体蛋白 （CRP) 的 突变型 Zoc 启 动子， 参见 L1]、 蹈菌体 Pl 启动子 (参见 R2) W 及 艳菌体 T7 启动 子， 已 构建成 很多种 不同的 载体。 某些载 体 需要克 隆片段 提供核 糖体结 合位点 （RBS) W 及翻 译起始 密码子 （参见 Q1), 而 另一些 载体则 设计成 在表达 蛋白的 N 端加 上一 段顯合 序列， W 使 重组蛋 白可通 过一特 异结合 步骤很 方便地 被纯化 出来， 如组氯 酸标签 (His- tag) 即一 串组氨 酸残基 便是这 类序列 的一个 例子， 该 序列能 够与带 Ni2+ 的色 谱柱紧 密结合 （参见 B3)。 另一 些载体 甚至可 W 将融合 N 末端 用特 异蛋白 酶从蛋 白质分 子上切 下来。 举 个例子 来说； T7 启动子 系统能 使许多 蛋白在 大肠杆 菌中的 过量表 达 （图 H1.4)。 载 体中含 有一个 T7 启动 子和 一个大 肠杆菌 RBS， 紧接着 是一个 起始密 码子、 一个 MCS、 最 后是一 个转录 终止子 （参见 K4)。 经 IPTG 诱 导后能 在产生 T7 RNA 聚 合酶的 大肠杆 菌菌株 （一 种; ^溶 原菌； 参见 H2) 中进行 表达。 该 酶效率 很高， 且只对 T7 启动 子进 行转录 ，最 佳状态 下能使 重组蛋 白的表 达豊高 达大肠 杆菌菌 体总蛋 白豈的 30%。 T7 启动子 图 H1.4 用 T7 系统 表达 外源基 因的质 粒载体 H 克 隆载巧 H2 嗤菌 化载体 要 点 入 嗟菌体 入置换 型載体 包装 与侵染 逆菌班 的形成 入 容原体 M13 堪菌体 載休 克隆到 M13 质枉 -M13 杂 合載体 入 嗤菌体 对大肠 杆菌的 侵染及 随后的 细胞裂 解过程 可用来 扩增克 隆的 DNA 片段。 线性 48.5kb 的;^ 基因组 DNA 中 最大为 23kb 部 分可 由外源 DNA 所 替换。 将目的 DNA 片段连 接于为 侵染所 必须的 基因的 末端， 形 成重组 入 唆菌体 DNA。 包装 的抽提 液含有 X 外壳 蛋白及 包装过 程中所 需酶， 用它 可将重 组入 DNA 包 装到嗤 菌体颗 粒中， 实行对 大肠杆 菌的非 常有效 的 侵染。 将人侵 染的细 胞分布 在未被 侵染的 大肠杆 菌菌苔 中会形 成嗤菌 斑， 是由于 侵染和 细胞裂 解循环 而抑制 了细胞 生长的 区域。 利用 X 峰 菌体的 溶原生 长期将 克隆基 因整合 进大肠 杆菌基 因组， 使 其长期 表达。 M13 晦菌 体在大 肠杆菌 细胞内 双链环 状形式 复制， 可 像质 粒一样 操作双 链环状 M13 DNA, 但 产生的 晦菌体 颗粒内 仅含有 环状 ssDNA。 用标准 质粒克 隆方法 将重组 DNA 整合到 M13 载体， 重组的 M13 DNA 侵染敏 感性大 肠杆菌 细胞， 并形 成生长 缓慢的 嗤菌斑 ，然 后从 纯培养 基中的 晦菌体 颗粒中 分离出 ssDNA。 在 辅助峰 菌体帮 助下， 对宿主 细胞的 侵染， 可诱 导含有 M13 复 制起 始点的 质粒形 成单链 唆菌体 颗粒。 巧 关主题 基 因操作 （G) 基 因文库 与筛选 （I) 核 酸测序 （J2) 又 艳菌体 侵染大 肠杆菌 细胞的 X 峰菌体 可被用 作克隆 载体。 X 略 菌体的 侵染过 程将 在主题 R2 中有 详述。 简而 言之， 嗤菌体 颗粒将 其线性 DNA 注入细 胞， 进而 DNA 连成 环状， 其后该 DNA 被复制 组装成 嗤菌体 颗粒， 经裂 解细胞 释放到 胞外， 造成 细胞死 t (裂解 期）， 或通过 特异位 点将其 DNA 整合 到宿主 基因组 （参见 F4)， 而 获得长 期插入 （溶原 期）。 124 H 克 隆载体 又 置换型 载体 图 H2.1 显示 48.5kb 的入基 因组， 在其末 端有由 12bp 的郵末 端构成 的 cos (黏 性） 位点 。 cos 位点 是不对 称的， 但从另 一角度 来看， ccw 位点 相当于 较长的 （16bp) 限制 性位点 （图 H2.1 或参见 R2)， 可 W 导致 DNA 在细胞 内自身 环化。 基因 组中必 区域的 大部分 对侵染 裂解都 是不必 要的， 可 被不 相关的 DNA 序列所 替换。 不过对 插入; ^ 唆菌体 颗粒的 DNA 的 大小是 有一定 限制的 ，即 DNA 的总 长度必 须是原 长度的 75% 〜 105% 之 间， 即 37 〜 52kb。 考虑 到必要 区域， 可克 隆进; ^唆 菌体的 DNA 片 段大约 为 20kb (最大 23kb) 左右， 远远大 于可插 入质粒 载体的 片段。 31 巧菌体 c5s" 长 （左） 臂 非 必要的 48.5 kb 短 （右） 臂 cos 5- CGGGGCGGCGACCTCG-3 ‘ 3-GCCCCGCCGCTGGAGC -5 - 巧裂 （包 装时） 连接 （侵 染后） GGGCGGCGACCTCG-3- 5-CG + GC-5. 3-GCCCCGCCGCTGGA 图 H2.1 (aU 蹈菌体 及其基 因组； （b) 嗤 菌体的 cos 末端 用入 唆菌体 开发出 了许多 置换型 载体， 例如 EMBL3 和 XDASH (参见 II)。 图 H2. 2 展示 了利用 这种载 体进行 克隆实 验的一 个代表 性方案 。用 扮 zwHI 酶 解载体 DNA， 回 收长臂 （19kb) 与短臂 （9kb) (图 H2.1)。 同样用 BawHl 或 其他适 合的酶 酶解并 回收目 的片段 （参见 G3 和 II)， 同时 可用碱 性縣酸 酶处理 W 防 止片段 间相互 连接。 ： V 臂与目 的片段 在较高 浓 度下相 互连接 形成较 长的线 性产物 （图 H2.2)。 H2 堪南 体载体 125 包装 与侵染 = 20 kb 目的 DNA R R DNA 连接糜 • __ 左 ^右 三-牵 COS cos 太小不 能包装 B B 右 左 右 插 入片段 A cos 插 入片段 B cos 图 H2.2 用 X 豈换型 载体进 行的克 隆实验 虽然很 纯的环 状;^ DNA 或其衍 生物可 W 与质粒 相同的 方法转 化感受 态细胞 （参见 G4)， 但唆菌 体颗粒 的侵染 性有其 优点， 特别 是用于 DNA 文库 的构建 （参见 I)， ^ 峰菌体 在体内 复制产 生多拷 贝的; ^ 基因组 长线性 分子。 将 这些多 獻体在 ow 位点处 切开， 产 生单个 X 基因 组， 再被 包装进 峰茜体 颗粒。 晦菌 体外壳 蛋白及 峰菌体 DNA 加 工酶的 混合液 （包 装抽提 液） 在体外 可将连 接后的 线性分 子包装 成唆菌 体颗粒 （图 H2.2)。 包装抽 提 液可从 感染不 同包装 缺陷型 （突 变） 唆菌体 的两个 菌株来 制备， 因而 抽提 液中的 包装蛋 白是丰 富的。 来自两 个菌株 的抽提 混合液 提供了 包装所 需 的所有 蛋白。 这样 形成的 峰菌体 颗粒可 侵染正 常的大 肠杆菌 细胞。 不含 插入片 段的^ 末端连 接物， 或远 远小于 或远远 大于最 佳长度 20kb 的插入 片段 的连接 物对包 装都是 过小或 过大， 不能被 包装， 同时含 有两条 左臂或 两 条右臂 的重组 体也是 不能生 存的。 侵染 过程是 非常有 效的， 且每 毫克载 体 DNA 可 W 产生 出多至 109 个重 组体。 126 H 克 隆载体 艳 菌斑的 形成 又 溶原体 M13 懂菌 体载体 克隆到 M13 先将 高浓度 未被侵 染的、 可 培养形 成连续 茜苔的 细胞涂 布于琼 脂平板 上 （参见 G4)， 然 后再涂 布来自 包装反 应的被 侵染的 细胞。 在培养 后的菌 苔中 由于反 复感染 与细胞 的裂解 循环， 单个感 染细胞 处会形 成空白 区域即 嗤菌斑 （图 H2.3)。 这类似 于细菌 单菌落 （参见 G4)。 为了 进一步 研究可 从睡 菌斑中 分离出 嗟菌体 颗粒， 再纯 化出重 组的; ^ DNA， 或者也 可从用 特 异重组 峰菌斑 感染的 培养物 的上清 中纯化 （参见 J1)。 图 H2.3 经 X 感染所 形成的 嗤茜斑 入 感 染的溶 原期也 被克隆 技术所 利用。 通过 含有目 的 序列的 X 载体的 整合作 用可将 基因或 外源序 列整合 进大肠 杆菌基 因组， 这种 重组基 本上是 永久 性的。 该 方法应 用的例 子之一 就是用 T7 系统来 过量表 达蛋白 质的菌 株。 含有 Zac 启 动子控 制下的 T7 RNA 聚合 酶基因 的菌株 BL21 (DE3) 及其衍 生物， 作为; ^溶 原菌被 命名为 DE3。 该基 因可被 IPTG 诱导后 ，然 后聚合 酶将转 录出表 达载体 上的目 的基因 （参见 H1)。 所谓 的丝状 唆菌体 （参见 R2)， 尤其是 M13， 可作为 大肠杆 菌的载 体。 隨 菌体颗 粒含有 6.7kb 环 状单链 DNA。 在感染 感受性 £. C0" 细胞后 合成互 补链， 形成双 链环状 DNA， 即 复制型 （RF)， 每个 细胞中 约含有 100 个 拷贝。 与 蹈菌体 相比， M13 侵 染的细 胞并不 裂解， 而是继 续缓慢 生长， 单链 形式的 DNA 不断被 包装， 并从细 胞中巧 放出去 （每一 个细胞 多至 1000 个)。 互 补双链 中相同 的单链 总是存 在于峰 菌体颗 粒中。 作为 载体， M13 的一 个可利 用的特 性是其 复制型 （民 F)， 可 精确地 像质粒 一样被 纯化与 操作， 而 相同的 DNA 也可 W 单链 形式 从培养 基中的 唆 菌体颗 粒分离 获得。 ssDNA 有 许多种 应用， 包括 DNA 测序 （参见 J2) 和定 点诱变 （参见 J5)。 并不用 M13 作为 克隆新 的目的 DNA 的初级 载体， 而是 当需要 单链片 段时， 用标准 质粒操 作法将 片段亚 克隆进 M13 RF (参见 G)。 用重组 DNA 转染大 肠杆菌 细胞， 并涂布 平板， 会 形成像 X 唆菌体 感染相 同的蹈 菌斑， 只不 过唆菌 斑是由 于侵染 细胞生 长缓慢 而不是 裂解形 成的。 利用 MCS 和心 Z' (参见 H1) 的蓝 白筛选 已组进 M13 载体， 如 M13mpl8 和 19， 它 们极其 相似， 只是 相对于 M13 复制起 始点其 MCS 方向 相反。 复制 H2 巧菌 体载体 127 起始点 决定了 包装进 隨菌体 的链， 所 W 可根据 目的片 段的哪 条链需 要被装 入嗤 菌体来 决定使 用哪种 载体。 质粒- M13 许 多较小 的质粒 载体如 pBluescript, 都已 开发成 组合有 M13 功能的 琪 合载体 载体。 它 们既含 有质粒 也含有 M13 的 复制起 始点， 但并不 拥有为 嗤菌体 完整 生活周 期所需 的各种 基因。 因 而它们 通常像 真正的 质粒一 样扩增 ，具 有质粒 载体生 长快、 易 操作的 优点， 但在需 要时， 这 些载体 与功能 完整的 辅助 懂菌体 一起共 感染， 诱导产 生单链 晦菌体 颗粒。 这里辅 助晦菌 体提供 为单链 复制与 包装所 需的各 种基因 产物。 H 克 隆载体 H3 赫粒、 YAC 与 BAC ♦/々 •分公 公 々公 &^、分& 公 《’ 务巧 ' 公 々. 9/S & 兮 《1/^皆々成帝*巧、 公 冷 S ✓巧 \ 少巧' 公々 换巧' 咬々、 .&々'々^々^ ♦^分 一*' 要 点 大片役 DNA 的克隆 姑 粒載体 YAC 載休 BAC 載休 巧 关主题 真 核生物 基因和 真核生 物基因 组结构 的分析 需要比 质粒和 X 嗤菌 体更 能容纳 大片段 DNA 的 载体。 黏粒用 ^包 装系统 将于; U'os 位点 结合的 大片段 DNA 包装 起来， 在 侵染大 肠杆菌 细胞后 环化体 能像质 粒一样 复制。 某些締 粒载体 有两个 cos 位点， 酶 切产生 后两个 WS 末端， 可与 目的片 段的两 端 连接， 然后 包装入 >> 颗粒。 揣 粒克隆 DNA 的容 童约为 30~ 45kb。 酵 母人工 染色体 是将酵 母染色 体中为 复制与 分离所 需序列 与大片 段目的 DNA 连 接而构 成的， 可 克隆外 源片段 的长度 可大于 1Mb。 酵 母人工 染色体 （YAC) 载 体含有 两个端 粒序列 （TEL)、 一个 着丝粒 （CEN)、 一个 自主复 制序列 （ARS) W 及能 在酵母 中用 作筛选 标记的 基因。 在酵母 中筛选 YAC 或 其他载 体是利 用与不 能产生 某种基 本代谢 的突变 菌株的 互补来 进行的 ，即 YAC 载体 上携带 该突变 基因的 正常 拷贝可 W 互 补这一 缺陷。 细菌 人工染 色体是 基于大 肠杆菌 F1 因 子的， 在便 于操作 的大肠 杆 菌宿主 中能克 隆长达 350kb 的 基因组 DNA， 比 YAC 更 稳定、 易于 操作。 质 粒载体 的设计 （H1) 基因 组文库 （II) 蹈菌 体载体 （H2) 大片段 对 于庞大 基因组 的生物 （如 人类 DNA 有 3xi09bp)， 其基因 组结构 DNA 的 分析及 基因鉴 定很难 使用质 粒和; ^嗤菌 体载体 来进行 （参见 G 和 H2)， 因 克隆 为 使用此 类容童 很小的 载体来 克隆基 因就意 味着构 建一个 DNA 文 库就需 要数目 巨大的 克隆群 才能覆 盖整个 基因组 （参见 G1 和 H1)。 此外， 一些 由于 较大的 内含子 序列的 真核生 物基因 也无法 将整个 基因放 在一个 克隆片 段中。 为 解决上 述这些 问题， 己 开发出 具有大 DNA 容畳的 载体。 脉冲场 凝 胶电泳 （PFGE) 的 出现使 大片段 DNA 的 分离、 作 图和分 析成为 可能。 在 G3 中就会 看到， 传 统的琼 脂糖凝 胶电泳 有十分 明显的 缺点： DNA 大 片段分 不开， 而是共 迁移。 这是 因为核 酸在多 孔基质 如琼脂 糖凝胶 中迁移 H3 拉粒、 YAC 与 BAC 129 时， 折叠 （球 状） 型 和伸展 （线 状） 型分 子交替 出现。 当 DNA 分 子很大 时， 其球型 体与基 质网孔 就不匹 配了， 即使 在容易 操作的 低浓度 (0.1%~ 0.3%) 琼脂 糖中， 它们仍 然是共 迁移。 如果电 场是不 连续的 （脉冲 的）， 则可 克 服这个 缺点。 如果电 场方向 也是可 变的， 则 能分离 更大的 DNA 分子。 每当 电场改 变时， DNA 分离重 新调整 其长轴 方向， 而较大 的分子 需 要较长 的定位 时间。 根据 其电极 数目和 电场的 变化的 不同， 己开 发出多 种 PFGE [例 如倒转 电场凝 胶电泳 （FIGE) 和 错位均 匀电场 电泳， (CHEF)]。 已 经能分 离长达 7Mb 的 分子， 现 已可解 决整个 染色体 DNA 片段 的分离 问题， 包 括人工 染色体 的分离 （参 见下 文)。 黏 粒载体 黏 粒载体 的名称 是因为 该载体 W 质 粒分子 形式， 且 利用了 X 蹈菌体 cos 位点的 特性而 得名。 体外将 DNA 包装入 颗粒 （参见 H2) 仅要求 入 ow 位点 在线性 DNA 上 有正确 的距离 （37 〜 52kb)。 间插 DNA 可 是任 cos 1. BamHl 晦解 2. 与插 入片段 的连接 插 入片段 B _ —一 1111 ~ •- cos 包装 与侵染 图 H3.1 —个乳 粒克隆 的形成 130 H 克 隆载体 何 序列的 DNA， 例 如并不 需要含 有任何 X 基因。 最 简单的 動粒载 体是一 个正 常的小 质粒， 包含质 粒的复 制起点 （oW)、 选择 性标记 W 及一个 cos 位点和 一个用 于克隆 的限制 性位点 （图 H3.1)。 用 限制酶 降解， 与目的 DNA 片段连 接后， DNA 将被包 装进; ^ 睡菌体 颗粒。 感 染后经 ow 位点的 配对， DNA 重新 环化， 在氨节 青霉素 选择压 为下像 正常质 粒一样 扩増。 己 1. BamHi/Smal 庚解 2. 与说 mHl 消化的 插入片 段连接 插 入片段 cos cos 包装 与侵染 图 H3.2 用黏粒 载体进 行克隆 实际克 隆中对 于;^ 唾菌体 （参见 H2) 常采取 更精细 的方法 W 防载体 的多 个拷贝 或目的 DNA 的 多个拷 贝进入 某个重 组体。 其中 的一个 例子是 C2XB (图 H3.2)， 该 载体含 有两个 cos 位点， 两位 点间有 一个产 生平末 端的 限制酶 （ Swa I ) 位点 。用 垃 2wHI 和 Sma I 酶切 后产生 出两个 OM 末端， 而后 与用碱 性碟酸 酶处理 （参见 G1 和 G4) 过 的目的 DNA 片段相 连接。 在所定 条件下 Swo I 的 平末端 连接不 能有效 进行， 最终能 被包装 的 产物只 是图中 所示的 产物， 即产生 出插入 30~45kb 片段 的重组 載粒。 H3 祕植、 YAC 与 BAC 131 用 I, b 粒载体 所制备 的克隆 文库可 W 用主题 13 中 描述的 方法进 行觸选 。经 多年 努力， 整个大 肠杆菌 基因组 已可被 一套约 100 个 的觀粒 克隆所 覆盖。 YAC 载体 弄清了 真核生 物染色 体为稳 定复制 与分离 所需的 序列， 至少在 酿酒酵 母中， 是由 相当小 且确定 的序列 （参见 D3) 构 成的事 实后， 于是 构建成 了重组 染色体 （醇母 人工染 色体， YAC)。 起 初只是 为了了 解染色 体的稳 定性， 后 来就开 发成能 携带巨 大克隆 片段的 载体。 着 丝粒、 端粒及 复制起 点序列 （参见 D3、 E1 和 E3) 已经被 分离， 并且组 合到大 肠杆菌 的质粒 上。 典型 pYAC 载 体的结 构见图 H3.3。 YAC 克隆 的构建 方法类 似于黏 粒， 只 不过载 体片段 的两端 与目的 DNA 相连 构成完 整的染 色体， 再导入 (转 染） 到酵母 细胞中 （参见 H4)。 YAC 载 体可容 纳大于 Mb 的 基因组 DNA 片段， 因而可 W 用于克 隆完整 的人类 基因， 比如长 250kb 囊 性纤维 化 基因。 YAC 用来 对巨大 基因组 的大规 模结构 进行作 图时很 有效， 例如 人类 基因组 计划。 Sna Bl Sna bI 与 平末端 插入片 段连接 TEL ARS TRP1 CEN4 SUP4 插入 SUP4 URA3 TEL 转 染脖母 图 H3.3 用 YAC 载体进 行克隆 pYAC3 (图 H3.3) 所 携带的 醇母序 列分述 如下： TEL 代 表端粒 DNA 序列 片段， 该 片段可 被 酵母中 的端粒 酶延伸 （参见 D3 和 E3); CEN4 是酿 酒酵母 4 号染 色体的 着丝粒 序列， 不同 的是， 即 使着丝 粒紧邻 于 人工染 色体的 一端， 它也可 正 确地分 离子染 色体； ARS (自主 复制序 132 H 克 隆载体 歹 IJ) 的 功能是 酵母复 制起点 （参见 E3)。 TRP1 和 URA3 是 酵母选 择性标 记 （参 见下 文）， 分 别位于 两端， 确保只 有正确 重组的 YAC 才能 在酵母 细胞中 生存； SUP4, 在重組 体中行 插入失 活功能 （图 H3.3)， 是 一个相 关 于红- 白颜色 测试的 基因， 类似 于大肠 杆菌中 的蓝- 白筛选 （参见 H1)。 用飯 酒醇母 酿酒 酵母选 择性标 记并不 像大肠 朽菌的 质粒那 样能赋 W 对毒性 物质产 的筛选 生 抗性， 而是 能使酵 母在缺 乏某种 持定养 分的选 择性培 养基中 生长。 原理 是宣 养缺陷 型酵母 突变株 不能产 生某种 特定化 合物。 例如 TRP1 突 变株， 不能 合成色 氨酸， 只 有在添 加了色 氨酸的 培养基 中才能 生长。 携有 完整的 TRP1 基困的 YAC (或 其他 载体， 参见 H4) 突变酵 母株的 转化可 互补这 一 缺陷， 结果是 只有被 转染的 细胞才 能在缺 乏色氨 酸的培 养基上 生长。 BAC 载体 BAC 载体即 细菌人 工染色 体克服 了在用 YAC 克隆非 常大的 基因组 DNA 片 段时所 遇到的 问题。 YAC 能 容纳非 常大的 片段， 这 些片段 经常形 成 非她邻 （非 邻近） 片段， 在增殖 中会丢 失部分 DNA (即 不稳 定）。 BAC 能容 纳长达 300~%0kb 的插入 序列， 比 YAC 短， 但 BAC 的优点 是：稳 定、 容易 转化， 在 大肠杆 菌宿主 中生长 迅速， 应用标 准质粒 小量制 备技术 纯 化也较 简单。 BAC 载 体是基 于大肠 杆菌天 然的染 色体外 F 因子， 并编 码自 己的 DNA 聚 合酶， 在细胞 中仅有 1 或 2 个 拷贝。 BAC 载体 整合了 F 因子 复制和 保持所 需基因 及 1 个选择 标记、 一个在 稀有限 制酶位 点侧翼 的克隆 位点和 其他特 殊切割 位点。 恃殊 切割位 点确保 了克隆 能在载 体区域 内线 性化， 而不需 要在插 入片段 内进行 酶切。 BAC 比 YAC 更受使 用者的 青睐， 现已广 泛应用 于基因 组作图 计划。 H 克 隆栽体 H4 真核生 物载体 要 点 许多 基因克 隆的应 用都需 要将基 因转入 真核细 胞并获 得表达 ，不 论是暂 时性还 是永久 性的。 将 DNA 转染真 核细胞 也许需 要消化 细胞壁 （酵 母及 植物） 或是 将 DNA 沉 集到细 胞表面 （动 物细 胞）。 电穿孔 可促进 DNA 的吸 收。 微注 射或是 固体粒 子轰击 也是可 行的。 穿 梭載体 ~~ I 许多真 核载体 含有细 菌质粒 序列， 从 而能在 大肠杆 菌宿主 中构建 并 检测。 它们可 W 在两种 上 宿主间 穿梭。 利 用天然 酵母的 2/Z 质粒 的复制 起点及 选择性 标记如 LEU2 开发 出 酵母载 体系列 （YEp)。 这 些载体 可像质 粒一样 复制， 而且还 可被 整合进 染色体 DNA。 能 够侵染 某些植 物并将 其部分 Ti 质 粒整合 到植物 基因组 中的根 癌 农杆菌 已被用 来成功 将外源 基因转 入多种 植物。 杆状病 毒是一 种昆虫 病毒， 用 于在昆 虫细胞 培养中 过量表 达动物 蛋白。 许多哺 乳动物 病毒， 包括 SV40 及 反转录 病毒， 已 被用作 哺乳动 物 培养细 胞的基 因操作 载体。 不 用特巧 的真核 载体， 也可 直接将 基因导 入植物 或动物 培养细 胞。 携有真 核基因 的细菌 质粒可 W 暂时 保留 在细胞 中而不 复制， 也可低 效重组 整合进 宿主基 因组。 巧 关主题 克隆 DNA 的分析 与应用 （J) 哺 乳动物 病 毒載休 直接基 因转移 時母 附加型 质枉 化癌 农杆茵 Ti 质粒 軒 状病毒 克隆 到真杖 生物 巧朵真 巧细胞 克隆 到真核 采取 W 大肠杆 菌为宿 主的基 因克隆 技术已 从真核 生物分 离出了 许多真 生物 核 基因及 其调控 序列， 并对 其进行 分析。 然而 遗传工 程的许 多应用 （参见 J)， 如 从大壁 生产真 核蛋白 到新植 物工程 及基因 治疗， 都需 要能在 各种真 核物 种中表 达外源 基因的 载体。 针对各 种宿主 所设计 的这类 载体的 具体例 子 将在本 主题中 讨论。 134 H 克 隆载体 转 染真核 细胞 穿 梭载体 酵母 附加型 质粒 根癌 农杆菌 Ti 质粒 将 DNA 转入真 核细胞 （转 染） 比 转化细 菌西难 得多， 同时转 染的效 率也低 得多。 例如对 于酵母 及植物 细胞， 通常 要用降 解酶将 细胞壁 消化掉 W 产生脆 性原生 质体， 从而能 较容易 地吸收 DNA。 一 旦去掉 降解酶 ，细 胞壁仍 能重新 合成。 相比 之下， 动物培 养细胞 没有细 胞壁， 可 W 较低 效率 吸 收与踞 酸巧一 起沉集 于细胞 表面的 DNA。 用高电 压处理 细胞可 W 提高 转染 效率， 因为高 电度可 W 在 细胞膜 上打开 临时的 孔道， 该 过程被 称为电 穿孔 （ electroporation )D 也可采 用直接 的物理 方法如 微注射 或基因 枪等。 用极细 的玻璃 毛细管 进 行显微 注射， 直接将 DNA 注 入到培 养中的 单个动 物或植 物细胞 的细胞 质甚 至细胞 核中。 此 外还可 用基因 枪等把 包被着 DNA 的金 属微粒 打入兜 细胞。 大多 数真核 细胞中 使用的 载体都 被构建 成穿梭 载体。 这 就意味 着送些 载体 含有在 大肠杆 菌或目 的宿主 细胞中 进行复 制与筛 选所需 的序列 (ori， arnpi)。 这就 使得携 带目的 插入片 段的载 体在转 入适宜 真核细 胞前可 W 采 用完 备的大 肠杆菌 操作方 法来进 行构建 及综合 检测。 在酿酒 酵母中 用于基 因克隆 与表达 的载体 是基于 2/1 质 粒而设 计的。 这个 质粒是 根据其 DNA 的长 度而命 名的， 相当 于约为 6kb 长。 2；x 质粒含 有一个 复制起 点和两 个涉及 复制的 基因， 还编 码一个 位点特 异性的 重组蛋 白 FLP， 该蛋白 与;^ 隨菌体 整合酶 Int 同源 （参见 F4)， Int 可 W 转 换部分 2^1序列。 基于 的质 粒载体 （图 H4.1) 被 称为酵 母附加 型质粒 (YEp), 通常包含2|^t的复制起点、 大 肠杆菌 穿梭序 列和一 个可作 为选择 性标 记的酵 母基因 （参见 H3)， 如相关 于亮氨 酸生物 合成的 LEL72 基因。 虽 然这些 载体通 常像质 粒一样 地复制 ，但 YEp 也可 W 通过 与选择 基因的 缺陷 型基因 组拷贝 进行同 源重组 （参见 F4) 的方 式整合 进酵母 染色体 (图 H4.1)。 植物细 胞中不 含有能 用作克 隆载体 的天然 质粒。 一种根 癌农杆 茵主要 是侵 染双子 叶植物 （番 茄、 烟草、 碗豆 等）， 最近显 示的结 果也能 侵染单 子叶 植物如 水稻。 根 癌农杆 菌携有 200 kb 的 Ti 质粒 （Ti, tumor inducing, 诱导癌 肿）， 侵染时 Ti 质粒 的部分 T-DNA 会整合 进植物 染色体 DNA (图 H4.2)， 结果在 T-DNA 基因 指导下 造成植 物细胞 的失控 生长， 形 成冠瘦 瘤或 根瘤。 在 T-DNA 区 插入目 的基因 后重组 Ti 质粒就 能把基 因整合 到植物 DNA 并且 有可能 表达。 在实 践中， 整个 程序需 要精必 设计。 Ti 质 粒的很 大很 难对其 操作。 研 究发现 T-DNA 和 Ti 质粒 的其余 部分若 在同一 细菌细 胞中的 不同分 子上， 仍 能发生 整合。 因 此可在 标准的 大肠杆 菌质粒 上构建 重组的 T-DNA， 然后 转化到 根癌农 杆菌细 胞中， 该 农杆菌 携有无 T-DNA、 H4 真核生 物致体 135 改 造过的 Ti 质粒。 进一 步的改 良是从 T-DNA 中 删除冠 瘦形成 基因， 这就 是所 谓卸甲 T-DNA 穿梭 质粒， 用于整 合克隆 基因。 如果宿 主细胞 在培养 基中 生长， 则可 从转化 细胞再 生出完 整的重 组植株 （图 H4.3)。 LEU2 突变体 爵母 基因组 或 通过重 组整合 X 基因 LEU2 LEU2 突变体 整合 载体， 包括 X 基因 图 H4.1 利用基于2^1复制起始点的酵母附加型质粒进行克隆 基 因巧导 冠沒宿 或巧痛 图 H4.2 A. 化； Ti 质 粒的作 用方式 136 H 克 隆载体 杆 状病毒 哺 乳动物 病 毒载体 直 接基因 转移 柏 物细胞 培养液 用含 有包含 X 基因的 卸甲 T-DNA 载体 的 A (umefadens 侵染 转化 的克隆 用激素 处理再 生植株 图 H4.3 用 A. turnefaciens 构建 新工程 植株的 巧 意图 杆状 病毒侵 染昆虫 细胞。 病 毒基因 组编码 的主要 蛋白之 一是在 感染细 胞 核内大 量聚集 多角体 蛋白， 这 是因为 该基因 有一个 极强启 动子。 该启动 子 同样可 驱动 重组进 杆状病 毒基因 组的外 源基因 的过窟 表达， 从 而经培 养 被感染 的昆虫 细胞来 大舊生 产目的 蛋白。 这 一方法 已被广 泛用于 动物蛋 白的 大规模 生产， 因 为昆虫 细胞可 产生许 多翻译 后修饰 的动物 蛋白， 而细 菌表达 系统则 做不到 这一点 （参见 H1 和 Q4)。 将基因 转入哺 乳动物 细胞所 用的载 体也是 病毒为 基础来 构建的 。第 一 个被利 用的是 SV40 (参见 R4)， 该病毒 可感染 多种哺 乳动牧 I。 SV40 基 因 组只有 5.2kb， 经 历着类 似于; ^蹈菌 体的包 装限制 （参见 H2)， 所 W 利 用 SV40 来转移 大片段 是有巧 难的。 反转 录病毒 （参见 R4) 有一 条单链 RNA 基 因组， 在感 染后可 拷贝成 dsDNAo 该 I)NA 可经类 转位机 制稳定 地整合 进宿主 基因组 （参见 F4)。 反转 录病韋 有强启 动子， 所 W 被视 为基因 治疗中 的载体 （参见 化)， 同时 外源 DNA 也能 W 稳定 的方式 整合进 宿主基 因組。 严格 说来， 可 不通 过载体 将基因 暂时或 永久地 导入真 核生物 的培养 细胞。 例 如细菌 质粒上 的真核 基因可 W 在导入 某一细 胞系后 瞒时表 达其产 物， 即 使在此 类细胞 中该质 粒无法 复制。 此 外通过 转染或 微注射 导入的 DNA 也可 W 稳定地 整合进 细胞的 染色体 DNA。 在动 物细胞 中进行 这种操 H4 真核生 物载体 137 作 通常要 求外源 DNA 与 基因组 DNA 间 有显著 的序列 相似性 （类 似于图 H4.1)， 但 对于植 物细胞 任何超 螺旋质 粒都可 W 随机整 合进基 因组， 不过 其 具体过 程尚不 清楚。 这 类稳定 转染的 细胞可 像细菌 转化实 验一样 用抗药 基因进 行筛选 （参化 G4)， 并且 能够在 多次细 胞分裂 中连续 表达外 源基因 编码的 蛋白。 (叶 也译 王薛 林校） 苗平 化巧） 巧 曲拼巧 巧巧 ♦山巧 八 WI， 化巧 *昔 A 从 J 巧和 弟巧巧 K 巧 ，‘ 化不 •巧 巧基 选合巧 JT 巧口 取巧 藻々 纸占 巧巧巧 afiBftWJlH 林掛. *(1、- 如 V 化於 历斯 一身莱 巧苗巧 « 析 巧巧巧 巧公 。巧 托不 AS 拉: WAS 种， 田 萬法听 公堯赵 "安中 巧妓巧 卢旦将 ，(K) 义參） 巧巧巧 《 因楚 一咕、 • «♦*»'*!» •， •内 适舟巧 ^ ： •心) T 公 (W 共巧主 捉 、典；^户） ^4.1^ 一 >‘呼 .* i\. w 用 MlUmtM 、長 vr 啼 •’ . ■A ♦賓 貧*,*^‘ ! «工《11> V f f 八手八 ■/y /v~y~^ 1 y ' 'ti m 巧 w.i f 巧來蠢 麵 .•A 巧 :贫 • • J ‘ \nw：jr 丰 V-’， ， - f, 。 *iA:. 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V 末端 片段 或称; ^臂， W 便将 基因组 DNA 连于 其间。 原初载 体在酶 解后须 通过梯 度将中 间片段 （填充 片段） 与 X 臂相分 离而得 W 纯 化， 而现 在的新 型;^ 载体， 则可 用多种 限制酶 来进行 酶解使 填充片 段不再 被 克隆。 臂制 备好 后， 按上 述方法 制备的 基因组 DNA 可 W 用 T4DNA 连 接酶与 X 臂相连 （参见 G1 和 G4)。 连接后 的重组 分子即 可进行 包装并 扩 增而建 成文库 （参见 H2)。 I 基 因文産 与筛选 12 cDNA 文库 要 点 用 与寡聚 （dT) 共价结 合的磁 珠很容 易从真 核细胞 的裂解 液中提 取出 mRNA。 mRNA 经其 poly(A) 尾部 与寡聚 （dT) 相结合 ，而从 溶液 中分离 出来。 制备的 mRNA 的 质量可 [用麦 胚抽提 液或网 织红细 胞裂解 液进行 翻译后 ，再 由聚 丙贿醜 胺凝胶 电泳检 测翻译 产 物的方 法进行 检验; 其 质量还 可用凝 胶电泳 进行直 接检测 ，并通 过回收 凝胶泳 道中特 定区段 按分子 质量对 mRNA 进 行分级 分离。 用杂 交法可 将特异 序列从 mRNA 中分离 出来。 mRNA 分离、 纯化 与分级 分离 cDNA 的合成 第 一条链 的合成 是通过 向引物 ，通常 为寡聚 （dT) 的 3' 端添 加脱氧 核糖 核巧酸 ，用反 转录酶 来合成 mRNA 的 cDNA 拷贝。 合 成反应 可由 示踪标 记进行 监测。 用 末端转 移酶对 cDNA 第 一链的 3' 端进 行 加尾可 W 很 容易合 成出全 长的第 二链。 反转 录酶或 Klenow 酶 都可 与同聚 物尾部 [例 如， poly(dC)] 退火配 对来延 伸引物 [例 如， 寡聚 （dG)] 来合成 第二链 cDNA。 为避免 cDNA 与载 体间的 平末端 连接， 通常 用单链 特异性 核酸酶 对 cDNA 末 端进行 处理， 再用 Klenow 酶补平 后加上 接头。 为避 免当 添加的 接头被 限制酶 降解时 cDNA 被 酶解， 可 (在添 加前对 cDNA 进行 甲基化 处理。 连接分 子也可 W 用作接 头的替 代物。 cDNA 末端 的处理 与載休 的连接 I 载体 通常被 碱性憐 酸酶去 磯酸化 W 防止自 连接， 结 果会促 进重组 分子的 形成。 质 粒或唆 菌体载 体可用 于构建 cDNA 文库， 而嗤菌 体入 gtll 最 适合于 用作构 建表达 文库的 载体。 相 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 基因 组文库 （II) 质 粒载体 的设计 （H1) 筛 选流程 （13) - 隨菌 体载体 （H2) mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP (03) mRNA 分离、 通常不 用原核 mRNA 来构建 cDNA 文库， 因 为原核 mRNA 通 常不稳 纯 化与分 级定； 相比之 下则较 易制备 基因组 文库， 且可包 含所有 基因组 序列。 从真核 分离 mRNA 构建 cDNA 是 非常有 用的， 因为 cDNA 不含 内含子 序列， 可被用 来在 大肠杆 茵中表 达编码 蛋白。 由于 cDNA 从 mRNA 合成 而来， cDNA 代表 T 基因 组中 可转录 的部分 （即 为基因 而不是 非转录 DNA)。 而 且每类 细胞或 组织只 表达一 套特定 的基因 （但在 受刺激 或分化 时可能 有所改 变）， 因此 从特定 组织中 制备的 mRNA 常常会 富含某 种特异 序列， 如红 细胞中 口 cDNA 文库 143 cDNA 的 合成 的 珠蛋白 mRNA。 所 对 作为起 始材料 （组 织） 的 选择要 考虑到 有利于 cDNA 克隆。 在 真核生 物中， 大部分 mRNA 都是 聚腺昔 酸化的 （参见 ()3)， 其约 200 个腺昔 酸残基 构成的 3' 尾 部为分 离真核 mRNA 提 供了有 效的 方法。 寡聚 （dT) 可 W 与 poly (A) 尾相 结合， 被用 于回收 mRNA。 传 统方法 是将提 取的总 RNA (用 酌-氯 仿抽提 细胞裂 解液） 通 过寡聚 (dT) 纤维 素柱来 制备。 但为了 能将核 酸酶造 成的损 伤降至 最低， 现在常 采 用一种 更迅速 的方法 即直接 将结合 着寡聚 （dT) 的磁珠 加入到 细胞裂 解 液中， 再 用强磁 铁将踐 珠吸出 再洗出 mRNA。 某些情 况下， 裂 解细胞 后用荒 糖梯度 （参见 A2) 来制备 mRNA- 核糖体 复合物 （多 聚体， 参见 Q1) 可 W 作 为提取 mRNA 的替换 途径。 在用 制备的 mRNA 进行 cDNA 克 隆前， 最好检 测一下 mRNA 是否已 被 降解。 检 测可通 过翻译 mRNA 或凝 胶电泳 分析来 进行。 无细胞 翻巧系 统如麦 胚抽提 液或兔 网织红 细胞裂 解液通 常被用 来检测 制备的 mRNA 的 完 整性。 也可 W 将 制备的 mRNA 显微注 射到细 胞内检 测其翻 译产物 。用 琼脂 糖或聚 丙贿醜 胺凝胶 来分析 mRNA 也是很 常用的 方法。 制备的 mRNA 在凝胶 上常常 会形成 大小在 0.5kb 到 lOkb 上的分 子范围 内的不 清晰 的成片 条带。 通 常两种 最大的 rRNA 会污染 mRNA 制 备物， 由于其 大量存 在会在 mRNA 的 成片条 带中形 成清晰 条带。 有时 在克隆 cDNA 之前分 级分离 或富集 mRNA 是很有 效的， 特别是 当要 克隆某 一特定 基因而 不是构 建完整 cDNA 文 库时。 分 级分离 是基于 mRNA 的大小 进行的 ，按 mRNA 的不 同大小 分别从 琼脂糖 凝胶中 回收。 富 集常通 过杂交 进行。 例 如当想 要构建 一个由 激素、 细胞因 子或药 物处理 细 胞而诱 导产生 的全部 mRNA 的 cDNA 文 库时， 须 同时用 诱导与 未诱导 的细胞 来制备 mRNA。 从未诱 导细胞 mRNA 制备的 第一链 cDNA (参见 下文） 可用来 与诱导 细胞的 mRNA 杂交。 两种 mRNA 制备 物中的 共有序 列 会杂交 形成双 链体， 而 新诱导 产生的 mRNA 则 不会被 杂交。 不 形成双 链体的 mRNA 则可 W 被分 离出来 （如 使用 磁珠） 用 于构建 cDNA 文库。 这 样的文 库可称 为扣除 cDNA 文库。 图口 .1 显示 出制备 cDNA 的 方案。 第 一链合 成时， 反 转录酶 （参见 G1, 表口 .1) 需 要一个 引物用 W 延伸 W 合成 mRNA 模板的 拷贝。 为了合 成 完整的 cDNA 通 常引物 为寡聚 （dT), 但若想 获得随 机引物 cDNA， 引 物也可 W 是六 聚核 巧酸所 有可能 组合的 随机混 合物。 合成 需要加 入四种 dNTPo 如 果加入 少壁某 一放射 性标记 dNTT， 则 可用凝 胶分析 来测定 cDNA 合成的 效率。 这称 为示踪 标记。 通 过向延 伸中的 引物的 3' 端 添加互 补的 核巧酸 来拷贝 模板。 然 而不幸 的是， 反 转录酶 容易从 模板上 脱落下 来， 尤其是 碰到二 级结构 集中的 区域， 因 此有时 很难一 步获得 完整的 （全 长） cDNA 分子。 144 1 基 因文库 与筛选 (a) 5-- 34 5'— 3--CCCCCCCC4 5 - P GGGG~OH 3 - CCCCCCCC 夺 mRNA 反 转录酶 4 种 dNTP mRNA cDNA —— AAAAA-3' HO-TTTTTp-5. 寡聚时 n AAAAA-3- •TTTTTp- 5. 末端 转移巧 dCTP mRNA cDNA AAAAACCC-3- •TTTTTp -5. 碱 （水解 RNA) 纯化 DNA 寡聚 归句 cDNA TTTTTp -5. 5-pGGGG— 3.-CCCCCCCC4 Klenow 聚合酶 或 反转录 SI 4 种 dNTP 双链 cDNA ►-3- TTTTTp- 5. (b) 5-pGGGG 3-CCCCCCCC 5-pGGGG 3--CCC 5-pGGGG 3-CCCC HO-CCGAATTCGGGGGG 3-GGCTTAAGCCCCCC 5-pAATTCGGGGGG 3- GCCCCCC 双链 CDNA TTTTTp -5' 单链 特异性 核酸巧 -3. TTTTTp -5' Klenow 聚合釀 dNTP (用氏 oRl 甲基化 酶 处理） 3* TTTTTp -5* 用 T4 DNA 连接巧 HO-CCGI AATTCGG-3 - 化上氏 ORI 接头 3’-GGCTTAAIGCC^H CCGAATTCGG-3 - TTTTTGGCTTAAGCC -0H EcoRl 巧解 CCG-3 - TTTTTGGCTTAA p-S. 连 至载体 并转化 图 12.1 cDNA 克隆 过程。 （a) 第 一与第 二链的 合成； （b) 双链 cDNA 末端 的形成 及其接 头添加 第二链 的合成 也需要 引物。 虽然可 供选择 的引物 很多， 但获 得全长 口 cDNA 文库 145 cDNA 的最佳 方案也 许是通 过对第 一链的 3' 端 "加 尾"， 用 与之互 补的引 物来 合成第 二链。 末端 转移酶 （参见 G1， 表口 .1) 可无需 模板向 单链或 巧链 核酸的 3' 端 添加核 昔酸。 如 果只提 供一种 dNTP, 如 dCTP (图 口 .1)， 则将在 mRNA-cDNA 杂合 巧链的 3' 端 加上由 C 残基的 同聚尾 。在 用 碱降解 mRNA 链后 （参见 C2)， 可 W 用寡聚 （dG) 作 引物， 在 反转录 酶或 £. CO" DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段 （参见 G1， 表口 .1) 的催化 下 合成第 二链。 这 一反应 的产物 是双链 cDNA， 但分 子的末 端可能 还不适 合用于 克隆。 第 一链的 3' 端 可能会 超出第 二链的 5' 端， 具 体要看 poly (dC) 尾 与寡聚 （dG) 引物 的相对 长度。 因此有 必要对 cDNA 的末 端进行 加工。 cDNA 末端 大 片段的 平末端 连接是 效率很 低的， 所 W 为了避 免用平 末端与 载体连 的处理 接， 而 对双链 cDNA 的 末端进 行加工 是很值 得的。 通 常是添 加特异 核酸接 头 形成适 合于克 隆的黏 J 性 末端。 因为可 W 过 量添加 接头， cDNA 与接头 的平末 端连接 反应进 行得很 顺利。 具体 讲添加 接头第 一步是 用单链 特异性 核酸酶 （S1 或 绿豆核 酸酶） 处理 cDNA 切除掉 凸出的 3' 端。 然 后再用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段和 dNTP 来补平 3' 端。 如果接 头含有 cDNA 上也具 有的限 制性酶 切位点 （如 £coRl， 图口 .化)， 则 cDNA 应 在添加 接头 前先用 EcoRl 甲基化 酶进行 甲基化 （参见 G3)。 这用 W 保证 限制性 内切 核酸酶 不会在 cDNA 内 部进行 切割。 随后可 W 用 T4DNA 连接酶 （参 见 G1.1) 将接头 与双链 cDNA 平末端 连接。 如 果接头 未被縣 酸化， 则每 个 5'- 縣 酸化的 cDNA 末 端上可 连 接一个 接头， 否则 会连接 上多个 接头。 最终用 EwR I 进 行的限 制性酶 解将会 产生可 W 与载体 进行连 接的薪 性末 端。 有许多 方法可 用 来制备 cDNA 末端， 其中 包括用 末端转 移酶向 cD- NA 末端 加上与 克隆载 体末端 互补的 "尾 部"， 或是 使用衔 接分子 来行使 黏 末端的 功能， W 免进行 cDNA 的 甲基化 反应。 与 载体的 任 何带有 EwRi 位点 的载体 都可用 于图口 .1 中的 cDNA 克隆。 由于 连接 cDNA 相 对较短 （0.5~10kb)， 所 W 常采 巧质粒 载体； 而为 了大量 克隆， 尤其是 为了构 建表达 cDNA 文库， 常常 选用; ^嗤菌 体载体 （参见 H2)。 连 接前常 常用碱 性踞酸 酶将载 体去踞 酸化， 避免 连接中 载体片 段自身 连接， W 保证产 生的是 载体与 cDNA 连接形 成的重 组体。 载体; ^gtll 有一 个位于 其 lacZ 基因的 C 端 附近的 £a)R I 位点， 从 而能将 cDNA 表达成 (3 -半乳 糖昔酶 融合蛋 白的一 部分。 这 将有助 于文库 的筛选 （参见 13)。 常用 T4 DNA 连接 酶连接 载体与 cDNA， 重组 分子可 W 通过 包装 （参见 H2) 或转 化 （参见 G2) 来 构建成 cDNA 文库。 I 基 因文库 与筛选 13 筛 选流程 要 点 I 拜选 从 一个基 因文库 分离出 某个特 定克隆 的筛选 通常需 用一个 核酸探 针进行 杂交， 该探针 可与其 互补序 列相结 合从而 检测出 目的克 隆。 将平皿 上菌落 或峰菌 斑位置 复制于 膜的表 面后， 将 其置于 含有标 记探针 的溶液 中进行 保溫。 杂 交并洗 膜后， 结合了 探针的 位畳就 可 W 被检 出。 将结 合有标 记的克 隆或峰 菌斑稀 释后， 再涂 板进行 下一轮 筛选直 至获得 单克隆 为止。 表达 y'l 选 ~ cDNA 表达文 库中的 1/6 的 克隆将 W 载体 编码的 p- 半乳 糖巧酶 的融合 蛋白形 式表达 它们所 编码的 多肤。 目 的蛋白 的抗体 可被用 来按类 似于峰 菌斑杂 交的流 程来筛 选文库 从而获 得特定 克隆。 cDNA 克 隆可与 mRNA 样品进 行杂交 阻 止或抑 制某些 mRNA 随后的 翻译。 另一方 面通过 杂交， 那些与 cDNA 克隆 杂交的 mRNA 也可 W 得到 纯化， 从 cDNA 库 中释放 出来， 被翻 译后用 于编码 多化的 鉴定。 杂交 扣留与 释放 茵落 及遊茵 妃杂交 朵色 休步^ I 这是 为了获 得重叠 克隆群 而对基 因组文 库进行 的重复 筛选， 因而 可 构成覆 盖一个 染色体 的某部 分所有 克隆的 总汇。 染色体 步移还 涉及用 插入片 段的末 端作为 探针进 行连续 筛选。 染 色体跳 查是一 个 相似的 过程。 相 关主题 质 粒载体 的设计 （H1) 克隆 的鉴定 （J1) 嗤菌 体载体 （H2) mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP (03) 筛选 从基因 文库的 大豐克 隆中鉴 定出某 个含有 目的基 因的特 定克隆 的过程 称为 煎选。 筛选 中如要 将一段 cDNA 片 段或一 段相关 序列用 作核酸 探针则 需要 了解该 基因或 其产物 的某些 信息。 如果能 够获得 足够多 的蛋白 质产物 则可 W 测 定出一 段氨基 酸序列 （参见 B2)， 那 么就可 W 此信 息派生 出可编 码该氨 基酸序 列的所 有可能 DNA 序列的 混合物 。该 DNA 序列信 息可用 来制 作用于 杂交饰 选文库 的核酸 探针。 制作用 于文库 筛选的 DNA 探针最 普通 方法之 一是用 聚合酶 链反应 （PCR， 参见 J3)， 此法制 作的探 针叫做 PCR 探针。 较 短的核 酸探针 （寡 聚核 音酸） 很容易 用自动 化学合 成仪合 成， 这些合 成物可 直接 用于杂 交或制 作更长 PCR 探 针用于 杂交。 如果 能设 计一对 引物， PCR 也可 用作一 种筛选 文库的 技术， 因 为一种 PCR 产 口 筛 选流程 147 茜落 及嗤菌 斑杂交 表 达筛选 物仅当 该序列 （也 就是 克隆） 存 在时才 将被检 测到， 并 且该克 隆库可 连 续地亚 克隆， 直到分 离出一 个单一 的旧性 克隆。 如 果已由 某蛋白 制成抗 体， 则可用 该抗体 来检测 W 顯合蛋 白方式 表达该 蛋白的 克隆。 能表 达出有 活性的 蛋白的 cDNA 文库还 可对其 生物活 性进行 筛选。 不表 达编码 蛋白的 cDNA 文库可 [通 过翻译 结合于 （杂 交于） 克 隆群的 mRNA 来进行 筛选， 那 些能翻 译出目 的蛋白 的克隆 将再被 细分。 这 些途径 中一些 将在本 主题中 被 描述。 虽然 X 基因 文库产 生唆菌 斑而非 菌落， 除 初始步 骤外， 这二种 筛选方 法基本 相同。 第一 步如图 13.1 所示 是将蹈 菌斑或 菌落中 的部分 DNA 转移 到一张 尼龙膜 或硝酸 纤维素 膜上。 因为唆 菌斑是 已被细 菌裂解 的区域 ，所 只 要将膜 置于平 皿上， 嗤菌体 DNA 就可直 接与膜 结合。 细菌菌 落必须 先 被裂解 W 释放出 DNA， 通常 可在置 于平板 表面的 膜上直 接培养 复制物 (影印 平板培 养）。 膜表面 的细菌 会在十 二烧基 硫酸納 和蛋白 酶液浸 膜后而 裂解， 而 原始平 板将被 保留用 W 分 离相关 的克隆 （即 含有 重组质 粒的菌 落）。 X 唆菌 体可从 唆菌斑 平皿的 剩余的 唆菌斑 中获得 分离。 两种 情况下 膜上的 DNA 都 是被碱 变性成 单链， 再 通过烤 膜或紫 外光照 射单链 将与膜 牢固 结合。 然 后膜被 浸于含 有通常 为放射 性标记 （参见 J1) 的核 酸探针 的溶 液中， 保温 (使探 针与其 互补序 列进行 杂交。 杂 交后， 充 分冲洗 W 除 去 膜上未 杂交的 探针， 显 影后有 探针的 区域就 可显示 出来。 如果探 针为放 射性标 记的， 则 可由对 X 线片 曝光 （放 射性自 显影） 来 进行； 如 果探针 是用 修饰核 巧酸标 记的， 则 可用抗 体或酶 及底物 溶液来 检测。 通过 将膜与 原始平 板进行 比较， 标出被 杂交的 区域， 可 W 鉴别 出最初 的菌落 或唆菌 斑。 这些菌 落或嗟 菌斑再 W 较 低的密 度重新 涂板， 重 复杂交 过程直 至获得 单 克隆。 将 cDNA 克隆 至;^ gtll 载体的 £a>R I 位点 ，该 cDNA 有 1/6 的概率 能 正确的 方向、 正确的 可读框 架插入 （参见 P1)， 翻译 出它的 基因产 物。 £coRl 位 点靠近 ZacZ 基因的 C 端， 插 入片段 的编码 区必须 W 正确的 方向 和可读 框架与 lacZ 相连 才能表 达出含 cDNA 基 因产物 的顯合 蛋白。 （3 - 半乳糖 巧酶融 合蛋白 可能含 有能被 天然蛋 白的抗 体所识 别的多 肤区域 (抗原 决定部 位）。 这些 抗体可 W 用于筛 选表达 文库。 筛选流 程与晚 菌斑杂 交 程序相 类似， 因为 "蹈 菌斑 复制" 是 通过在 嗤菌斑 平皿表 面放豈 一张膜 来进 行的， 只不过 在抗体 筛选中 所要检 测的是 cDNA 编码的 蛋白质 而不是 DNA 本身。 膜被 处理后 与蛋白 质共价 结合， 再 浸入含 抗体的 溶液中 。当 抗体 与其抗 原决定 部位结 合后， 可 W 由其他 抗体和 （或） 可 识别它 的化学 物廣来 检测。 通 过这种 筛选可 W 将表 达唆菌 斑的位 置确定 下来。 需 要进行 重复循 环筛选 获 得纯峰 菌斑。 148 I 基 因文库 与筛选 转移 至尼龙 膜或硝 酸纤 维素膜 32P- 标 记的与 目的基 因互补 的採针 对胶 片巧光 保留原 始平板 从 原始平 板选出 阳 性克隆 变性 DNA (NaOH) 固定 于膜上 图 13.1 经峰菌 斑杂交 的筛选 杂交 扣留与 单个 cDNA 克隆 或克隆 群都可 巧来与 mRNA 样 品进行 杂交。 杂交后 释放 mRNA 可 被直接 翻译， 通过检 测其产 物会显 示出某 些产物 的翻译 被抑制 r (杂交 扣留翻 译）。 将 cDNA 群 细分成 少量的 cDNA 组并 重复杂 交实验 最终可 检 测出抑 制某蛋 白翻译 的单个 cDNA。 另一 方面杂 交后， 也可 W 纯化出 杂合子 （例 如若 cDNA 与 磁珠结 合或是 与引导 cDNA 合成的 修饰核 昔酸的 抗体凝 集）， 再将 杂交的 mRNA 从杂 合子释 放出来 （通过 加热和 (或） 变性） 并进行 翻译。 这种杂 交释巧 翻译可 鉴定出 cDNA 克隆 编码的 蛋白。 染色 体步移 从文库 中找到 相邻的 基因组 克隆常 常是必 要的， 也许是 因为克 隆的仅 是基 因的一 部分， 或是含 有调控 序列的 5' 端或 3' 端的 丢失。 有时 可在制 作遗传 学图谱 的实验 中发现 某一特 定基因 邻近一 个已被 克隆的 基因， 因此 很有 可能通 过不断 从文库 中分离 相邻的 基因组 克隆来 克隆目 的基因 （位置 克 隆)。 这 被称为 染色体 步疼， 通过 染色体 步移可 W 获得代 表某一 特定染 色体的 较长连 续区段 的重叠 基因组 克隆群 （图 13.2)。 要分 离某一 重叠基 因组 克隆， 需要 从插入 片段末 端制备 探针。 这 可能会 涉及该 克隆的 限制性 酶 切图谱 （参见 J1)， W 便 能从凝 胶电泳 回收某 个特定 片段， 但某 些载体 可通过 对载体 -插入 片段连 接处的 体外转 录合成 探针。 这样的 探针可 W 被 用 于菌落 或晦菌 斑杂交 对文库 进行再 筛选， 然 后可经 分析并 定出新 提取的 口 筛 选流程 149 克隆 与初始 克隆间 的相对 位置。 如果 幸运， 在几个 新的克 隆中， 会 有某个 克 隆能少 着地与 初始克 隆重叠 （例 如重叠 25kb 中的 5kb)， 然 后又可 用 第二 个克隆 的远端 （离 初始插 入片段 末端最 远的） 制 备的探 针重复 整个流 程， 并 W 此往 复。 如 果染色 体步移 终止， 可能 是因文 库中不 包含一 段适合 序列， 用染色 体跳 查法可 克服这 一问题 。当 "步 移" 距离很 大时， 也能 应用染 色体跳 查， 例 如当从 一个相 对距离 起始位 点进行 位置克 隆时。 一个长 DNA 片段 的相 对的末 端在该 DNA 环化或 ^ 隆进入 一种黏 粒载体 （见 H3) 时连接 到 一起。 不 用图谱 完整的 DNA，’ 末端 片段能 够用作 （亚 克隆） 连 续的探 针 来筛选 一个文 库且它 能允许 50kb 左 右的克 隆互相 之间分 离开， 因此形 成一 种比图 13.2 所示 方法更 快迅的 "步 移"。 载体臂 基因组 克隆插 入片段 载体骨 …… h— H- …… 限 制位点 j ^ 从插 入片段 末端制 备探针 重 筛基因 组文库 j 新基因 组克隆 的限制 巧作困 ^ —— m 1 ~~ H —— ■I —— m —— …… …… — I ~~ H —— ^ —— hH ■H 从 最少重 叠的插 入片段 的远端 制备新 的探针 重 筛基因 组文库 新基因 组克隆 的限制 巧作图 困口 .2 染色 体步移 (叶 破译 李文 君化） 个 某巧名 .中 《 史贿 it 个北若 .鼓 :4 供妃 巧 UT&y 巧巧 >巧 进巧 麻的权 il 妾度 接巧巧 *心-_~ .…. :黙! ^扣* 峰 M 化? ^. ••‘ -jJfiili； 读 為^這 "奇 争义齒 & 巧朽 .Airf 巧专杂 今^求 I 々一 £.*j - ‘-… -- 一 -: 心 个乃输 诏遂^ :; 4 朵评 - „ ., 、 巧 哀巧巧 1^ ，•' 大 ，巧考* 色 。»巧一巧宛巧巧載查|115|| 封种 /乂过 5^个^=*"^|病4'3^#5|巧巧京进曲沒萬巧你诉^ 〜从堯 ^成巧 .查 巧躬林 （則巧> im •錄 W 户二 ，令 化《 东艇 斯种 Am 逆巧 牌巧 满巧 彩-争 f 消巧采 1 ^巧# 菊巧 M 纷斯 .A’ •任4 巧# 余巧巧 巧禾 •> 冻， 功 啼‘ 巧化凹 ，巧托 批巧 3^ 巧去 《 度的 VV 畫巧 兩 油 3、 岛 賓玄十 T •化 巧身的 > - i' ••；» 聲* 汾 盛射受 巧常录 W [.a tail -Ht- 3a '-'-々:• n 我 jH 巧片乂 MM 衣巧 fag 令 T 如尽乃 rili w 善 乂 •" ■ "f,, > s 4 - "今 / 抑 T* 伞 ，义 AMfl, L. w … '， »< U> » . 人 W; . 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Wl. — 一― 一？ 么 击一， 山 KM‘b 知 化节 禪 巧： r * Jti ♦巧不 f 巧 Al^, 1|1& 而巧 1分於 拌 巧山斯 巧巧的 J 克隆 DNA 的分巧 与应用 J1 克隆 的鉴定 要 点 I 克 隆的鉴 定过程 包括测 定重组 DNA 分 子的各 种特性 如大小 、限 制 图谱、 基因 的方向 W 及 核巧酸 序列， 该过 程需要 纯的已 克隆化 的 DNA 样品。 用一种 或二种 W 上的 限制酶 对重组 DNA 分 子进行 酶解， 可 构 建 标明该 DNA 分子的 酶切位 点和片 段大小 的限制 图谱。 用 限制酶 对末端 标记的 DNA 片段进 行部分 酶解， 并测定 所生成 片段的 大小， 也可构 建限制 图谱。 可 用多聚 核巧酸 激酶或 末端转 移酶对 DNA 和 RNA 分子 进行末 端 标记。 全长标 记须用 聚合酶 合成一 条完整 的被标 记链。 将 凝胶泳 道中的 核酸带 转移至 膜上， 固定之 后与标 记的核 酸探针 进行 杂交， 经洗脱 除去未 杂交的 探针， 然后 对膜进 行处理 W 显示 出杂 交带。 Northern 杂交 可检测 特定的 RNA 分子， 而经 South- ern 杂 交所显 示出的 DNA 带 应该是 基因组 DNA 中 基因或 已克隆 基因的 部分。 巧 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 质粒 DNA 的制备 （G2) 限制酶 与电泳 （G3) 基因 组文库 （II) 筛 选流程 （13) 核 酸测序 （J2) 签定 鉴定 基因组 克隆或 cDNA 克隆的 过程应 从纯的 DNA 样品的 制备开 始， 然 后才是 鉴定该 克隆的 部分或 全部的 特性， 包括 片段的 大小、 插入片 段 的大小 W 及插入 DNA 片段的 限制酶 切图谱 （限 制图 谱）。 其中 是否含 有基因 （转 录序 列）， 如 果有则 该基因 的所在 位置及 其方向 W 及插入 DNA 的部分 或全部 序列。 在 未能快 速进行 DNA 测序 （参见 J2) 之前， 鉴定的 步骤 通常大 致按上 述顺序 进行， 但现在 对克隆 进行部 分或全 部测序 往往是 第 一步。 虽然 序列分 析可提 供推测 基因的 大小、 限 制图谱 及方向 或者可 读框 （ORF) (参见 P1)， 但仍 须有实 验证明 推测基 因确实 在某生 物体的 一些 细胞中 转录成 RNA， 而对 于那些 编码蛋 白的基 因还要 证明所 预测大 小 的蛋白 确实在 体内被 合成。 从细菌 菌落进 行质粒 DNA 的制 备已在 G2 中 叙述。 除 此之外 DNA 也 可很方 便地从 唆菌体 颗粒的 载体中 制得。 这一 过程 包括： 先用 懂菌斑 经纯化 的堪窗 体在允 许细胞 裂解的 条件下 感染细 152 J 克隆 DNA 的分析 与应用 限 制图谱 部 分酷解 核 酸标记 茜， 然后 从裂解 液中移 去细胞 残骸， 经 直接离 私或在 高盐溶 液中的 聚乙二 醇 沉淀来 从细胞 裂解液 中回收 蹈菌体 颗粒。 再 经苯酷 -氯仿 抽提、 乙醇沉 淀， 最终 得到的 DNA 通常 溶解在 TE 缓冲液 中 （ lOmmol/L Tris • HCl, Immol/L EDTA, pH 8.0) (参见 G2)。 通过琼 脂糖凝 胶电泳 并与已 知片段 大小的 DNA 标记相 比较可 W 测定 线状 DNA 分子 的大小 （参见 G3)。 对 质粒或 隨菌体 克隆中 插入的 基因组 DNA 片段或 cDNA 片段的 大小， 最好用 能将插 入片段 与载体 DNA 分开的 限 制酶来 酶解。 对用 EcoR I 位点构 建成的 cDNA 克隆， 还用 £coR I 来酶 解将 可回收 到插入 片段与 载体。 将酶 切后的 样品与 DNA 标 记一起 进行琼 脂 糖凝胶 电泳就 可测得 插入片 段及已 知载体 DNA 的 大小。 这一信 息只是 制 作重组 DNA 分 子图谱 所需信 息的一 部分， 而载 体中插 入片段 的方向 (参见 H2)， 及 若是多 个片段 则其排 列顺序 都是未 知的。 要获得 这些信 息， 可 iU 用 不同限 制酶来 单切、 或 组合起 来进行 切割。 图 J1. la 给 出了一 个入 EMBL3 基因组 克隆限 制图谱 的制作 过程。 如/ I 在 £coR I 或 BawHI 克隆位 点附近 切割并 从载体 上释放 出插入 片段。 因 此在插 入片段 内没有 SaZ I 切割 位点， 所 W 仅 形成大 小约为 9kb、 15kb 和 19kb 的兰个 片段。 在 载体短 臂上只 有一个 Wfnd 田 位点， 在距 末端约 4kb 处。 在这一 例 子中， 化 nd 田在 插入片 段中还 有两个 切点， 共产 生大小 分别为 4kb、 7kb、 llkb 和 21kb 的四个 片段。 4kb 是短 臂的一 部分， 21kb 片段 必定是 长 臂加上 2kb (19 + 2 = 21)， 但 剩下两 个片段 的顺序 仍然不 能确定 。用 Sa/ I 与 化 nd 田的 双酶切 产生出 2kb、 4kb、 5kb、 6kb、 7kb 和 19kb 六个 片段， 其中 19kb W 及 4kb 和 5kb — 起是载 体的两 个臂。 由于 SaZi 在克 隆 位点处 切割， 所 W 会将 21kb 切成 （19 + 2) kb, llkb 切成 （6 + 5) kb， 其中 6kb 是 插入片 段的一 部分。 7kb HVnd 田片 段未被 SaZ I 切割， 表明该 片段位 于插入 片段的 中间， 结 果构成 了如图 J1. la 所示 的限制 图谱。 当某种 限制酶 的切点 较多， 且双酶 解产生 的图谱 又很复 杂时， 部分酶 解技 术可提 供制作 完整限 制图谱 所需的 信息。 送一 过程最 好是在 DNA 片 段的一 个末端 加上一 个修饰 过的、 或具 放射活 性的核 巧酸， 形成一 个如图 J1. lb 所示的 末端标 记分子 。用 丘 CO 民 I 完全 消化未 标记的 lOkb 片 段产生 出 Ikb、 2kb、 3kb 和 4kb 四个 片段， 而 部分酶 解能产 生出所 有可连 续的片 段， 当总 DNA 被酶解 后再经 EB 染色 显示出 6kb、 7kb 和 lOkb 的 呈条增 加 条带。 注意到 3kb、 4kb 和 6kb 的片段 可由多 种方式 产生， 但部 分酶解 泳道被 放射自 显影来 显示那 些末端 标记的 分子， 切 割图谱 应该是 3kb、 4kb、 6kb 和 lOkb。 这些信 息就足 W 构建 出如图 所示的 图谱。 可 W 对 DNA 和 RNA 分子的 末端进 行标记 （末端 标记） 或全 长进行 标记 （均 匀标 记）。 从一端 开始均 匀标记 也是可 能的， 但在有 限的时 间内， J1 克隆 的鉴定 153 并 非产生 一个全 长均匀 标记的 分子， 其方 式可能 更像末 端标记 分子。 也可 W 只标 记双链 分子的 DNA 特 定链。 标记 通常用 放射性 同位素 进行， 但也 有 非放射 性标记 方法， 例 如可被 生物素 特异抗 体检测 的生物 素标记 dUTP 来 标记。 (a) Sail 19 kb, 15 kb, 9 kb Hind 叫 21 kb. 11 kb, 7 kb, 4 kb Sa/l + H/ndlll 19kb, 7 kb, 6 kb. 5kb, 4 kb, 2 kb 19 (长 臂） ® 15 f 9( 短臂) I n H H 1 H I 7 1 11 4 I SH 1 H I S H !! u_ _ 6 ,5,4 2 完 全庚解 部 分巧解 放射 自显影 10 kb * 6 kb ^ — ♦ 4 kb ^ ♦ 3 kb ^ — ♦ 3 kb 1 kb 2 kb EE E 6 kb —— 4 kb 3 kb 4 kb -10 kb 图 Jl.l 限制 图谱。 （a) 单 酶解和 双酶解 完成的 图谱； （b) 经末 端标记 分子的 部分酶 解所制 作的图 谱。 *代 表标记 末端。 5 -pNpNpNpN 3. DNA 或 RNA 满性 巧酸巧 5-NpNpNpNpNpN . A-p-p-p, " 多核 巧酸激 SS + [7 - -"PI ATP 5-*pNpNpNpNpNpN 3. + A-p-p (ADP) 图 J1.2 核酸 分子的 5' 端标记 5' 端标记 （图 J1.2) 可用多 聚核巧 酸激酶 （polynucleotide kinase) 来 154 J 克隆 DNA 的分析 与应用 进行， 结果是 将具放 射活性 的縣酸 加到具 有游离 5'- OH 的核 酸上。 游离 5' 慧基可 由碱性 踞酸酶 （ alkaline phosphatase) 去 踞酸化 ( dephosphory- lation) 产生。 ATP 的最 外端的 y- 磯酸 是用来 标记的 标记源 （参见 G1 中 的表 1)。 对于 3' 端标 记则可 用末端 转移酶 （terminal transferase) 向核酸 的 3' 端 加上一 个或多 个核巧 酸进行 （参见 口）。 诸 如由某 些限制 性内切 核酸酶 （EcoRl、 技 zwHl 等， 参见 G1) 所 产生 的双链 DNA 分子 的凹进 3' 端可通 过多种 DNA 聚合酶 （DNA poly- merases) 米用被 标记的 核昔酸 （如 [a-32P] dCTP) 来 填外。 因为每 一 3' 端只能 被加上 1~4 个核 巧酸， 该 DNA 分子 基本上 是末端 标记， 但是是 不同链 的两个 末端。 若对 这样的 DNA 分子 进行限 制图谱 构建， 须 用另一 种限制 酶进行 酶切， 再分离 出各具 末端标 记的片 段来制 作限制 图谱。 DNA 聚 合酶也 可被用 来制作 均匀标 记的高 活性的 DNA 探针。 在进行 切口 平移 （nick translation) 标 记中， 用微量 DNase I 处 理双链 DNA, 会在其 两条链 上引入 随机的 切口。 DNA 聚合酶 I 利 用它的 5' 一 3' 外切核 酸酷活 性可 找到这 些切口 （参见 E2) 并移去 dNTP， 随着从 切口的 5' 端 移去一 个 残基， 将在 3' 端加上 一个核 巧酸， 从而利 用它的 聚合酶 活性惨 入具放 射活 性的核 巧酸， 结 果是切 口的位 置沿该 DNA 分 子移动 （即 定向平 移）。 DNA 聚合 酶也可 在所有 组合六 聚核昔 酸均存 在下， 在变性 双螺旋 DNA 模 板后， 被用 来制备 探针。 这 些六聚 核昔酸 于单链 上的互 补位置 处退火 ，并 作 为聚合 酶合成 互补放 射活性 的链的 引物。 亦见 PCR (J3)o 可 W 通过 将双链 DNA 分子 克隆于 M13 嗤菌体 （参见 H2) 载 体而获 得 的单链 DNA， 或经 3' 一 5' 外切 核酸酶 酶解后 的单链 片段， 来制 备链特 异 DNA 探针。 DNA 聚 合酶可 W 像合成 第二链 cDNA 那样再 合成另 一渗入 具放 射活性 的核脊 酸的链 （参 见口， 图 la)。 链特异 RNA 探 针可由 RNA 聚 合酶如 SP6、 T7 或 T3 喧菌体 聚合酶 （参见 H1) 体 外转录 来制备 。如 果将 目的序 列克隆 进一个 在克隆 位点的 末端有 上述任 一聚合 酶后动 子的体 外转 录载体 （如 pGEM、 pBluescript) 上， 就可 W 用一 种聚 合酶制 得有义 RNA 转录物 （与 天然、 RNA 转 录物相 同）， 而用另 一种聚 合酶制 得反义 RNA 转录物 （与 天然 RNA 转 录物互 补）。 具放射 活性的 NTP 被 用于标 记。 链 特异探 针的反 义链可 与细胞 RNA 杂交， 在 Northern 杂交 （参 见下 文） 中很 有用， 因 而有义 链探针 将用作 对照。 DNA 与 为了检 测琼脂 搪凝胶 上众多 DNA 或 RNA 分子 中能与 特定探 针杂交 RNA 杂交 的 DNA 或 RNA 分子， 进行 Southern 杂交 （检测 DNA) 或 Northern 杂交 (检测 RNA) (图 J1.3)。 前 者根据 其发明 者的名 字来命 名的， 而后 者是由 前 者推导 而来。 核酸 子经琼 脂糖凝 胶电泳 分离， 再转 移到尼 龙膜或 硝酸纤 维素 膜上。 这一步 通常由 毛细管 作用实 现的， 也 可由电 转移、 真空 转移或 离心来 完成。 就 Southern 印迹 而言， 转移前 DNA 通常用 碱变性 （参见 C2). 形成单 链后方 可用于 杂交。 而对于 RNA， 并不需 要进行 碱变性 ，碱 J1 克隆 的鉴定 155 变 性反而 会水解 RNA 分子 （参见 C2)。 转移后 DNA 杂交和 RNA 杂交的 步 骤就一 样了。 核酸被 固定在 膜上， 与标 记探针 杂交， 充分洗 涂后， 检测 出杂交 的探针 （通常 用放射 自显影 或抗体 法）。 杂交和 洗脱的 条件很 关键， 如果探 针与目 的序列 100% 相同， 应进行 高严紧 杂交。 严紧性 （stringen- cy) 是由杂 交缓冲 液中的 盐浓度 和杂交 温度来 决定的 （离温 和低盐 的条件 是最严 紧的， 只 有完全 匹配的 杂交分 子才稳 定）。 而 对与目 的序列 不完全 匹配的 探针， 严紧 性应降 到可形 成不完 全匹配 的杂交 分子的 程度。 如果杂 交或 洗脱的 严紧性 太低， 探针就 会与许 多序列 结合， 而 降低特 异性。 向杂 交缓 冲液添 加甲醜 胺可将 实际杂 交温度 降低约 25仁， 从 通常的 68t： 降至 43t：。 洗脱步 骤应在 比探针 和目的 序列的 理论融 化温度 ： Tm 低 UC 的条 件下 进行， Tm 可 由公式 Tm = 69.3’ + 0.41 [ (G+C)%] -650// 求得， 其中的 / 表 示探针 分子的 长度。 RNA 杂 交能提 供有关 mRNA 及任 一前体 大小的 信息， 还可用 来判定 用作 探针的 cDNA 克隆 是否是 全长， 或 者是否 是相关 转录产 物家族 中的一 种。 RNA 杂 交还可 有助于 确定一 基因组 DNA 克 隆是否 含有转 录区， 当被 转移的 RNA 是来自 不同组 织时， 还可 确定这 些转移 物是在 哪种组 织中被 转录。 基因组 DNA 克隆 片段的 Southern 杂 交可用 cDNA 分子 为探针 来找出 基因 组克隆 的哪一 部分与 cDNA 片段相 对应。 如果 用包含 整个基 因组的 DNA 片段 来进行 Southern 杂交， 结果 会给出 有关基 因组中 特定基 因片段 的 大小， 及该基 因在基 因组中 有多少 拷贝的 信息。 来自 不同生 物体的 DNA 或 RNA 样品的 杂交会 显示出 一个基 因在不 同种间 的保守 程度。 琼 脂糖巧 胶中的 DNA 片段 / 硝酸纤 维素膜 硝酸纤 维素膜 MM \ 重巧 巧纸 巧胶 转 移装置 图 J1.3 DNA 杂交 J 克隆 DNA 的分巧 与应用 J2 核 酸测序 DNA 测序 DNA 测 序有两 种主要 方法， 一是 Maxam 和 Gilbert 的化 学法， 即在 对末端 标记的 DNA 进行 碱基特 异切割 反应后 进行凝 胶分离 的 方法； 另一是 Sanger 的酶 学法， 即用双 脱曼核 巧酸作 为链终 ^gl^'J. 通 过聚合 酶的引 物延伸 产牛一 系列大 /j^ 不 同的分 子后再 进行 方法。 RNA 测序 I 可在 特定核 巧酸的 3' 端切 割的一 套四种 RNase 被 用来消 化末端 标记的 RNA 形 成一系 列大小 不同的 片段， 再经聚 丙巧醜 胺凝胶 电泳最 终读出 序列。 序列 数据库 I 新 测定的 DNA、 RNAIM 及蛋白 巧序列 被输入 数据库 （EMBL 和 GenBank), 所 有进入 数据库 的已知 序列都 可随时 被调出 用于计 算机 分析。 序 列分析 I 用 特定的 计算机 软件来 对核酸 及蛋白 质的序 列进行 检索与 分析， W 找出某 种图谱 （如限 制酶切 位点） 或 相似性 （如 对新序 列）。 基因 组测序 计划 几 种生物 的全部 基因组 序列已 被测定 （病 毒、 细菌、 酵母 、线 虫、 拟 南芥和 人）， 而另 一些生 物的基 因组测 序正在 进行中 （水 稻 、鱼、 鼠 等）。 通常 先制作 出遗传 学图谱 W 助于 计划 进行。 巧 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 蹈菌 体载体 （H2) DNA 測序 测 定较长 DNA 分 子序列 的两种 主要测 序方法 （化学 法和酶 学法） 的 任何 一种都 涉及具 有一末 端相同 而大小 不同的 一系列 分子的 形成， 再经聚 丙‘ 席酥胺 凝胶电 泳分离 W 读出其 序列。 早期的 Maxam 和 Gilbert 的 化学法 要求待 测序的 DNA 片 段的一 端进行 标记， 通 常是添 加一个 放射活 性的踞 酸至 5' 端或 3' 端， 或加 上一核 脊酸至 3' 端。 这 一方法 对单链 和双链 DNA 都 适用， 并涉及 两步反 应的巧 基特异 切割。 碱基先 用特定 化学试 剂修饰 (参 见下 文）， 然后嘛 D 定可 在此位 点切割 DNA 的搪 -踞酸 骨架。 控 制喊基 修饰的 反应时 间或反 应物浓 度可确 保生成 一个系 列依次 加长的 分子， 而不 是 完全切 成短的 寡聚核 巧酸。 特定 的碱基 修饰反 应包括 用硫酸 二甲醋 (dimetlyl sulfate, DMS) 甲基化 G 碱基， 甲 酸作用 于嚷跨 A 和 G, 而肤 (hydrairne) 可被 用来在 喀巧处 （C+T) 进行 水解， 但高 盐浓度 会抑制 T 反应。 所 W 对测 序凝 胶的四 个泳道 （G、 A+G、C + T和C) 进行 分析就 可 W 确定 出序列 （图 J2.1a)。 这 一方法 适用于 对未克 隆过的 基因组 DNA J2 核 酸測序 157 0<<>-01-00<00»-<000<<1-1-<0<<< < C00t-Of； 巧妄 左 如换空 X 巧妄 .1 巧供呈 TTnm aST £ 企 tTit 二 M M I mirrfu 加 地巡巧 jrllmill」ll 二 UJE;: £ 丘 内 、。 jmllllli 立 忘 化运党 巧媒正 「Tllfimmllljgg; £ jrnlllll 爲 正 長 |& 在 W 技 1& 在 HI £ 叩 孩扳«曼运巧如11^" 容货 巧皿 垣巧如 cod" —— 巧糊當 " -II 孩皆 麻曼" ！！ 孩 & 化血 164 J 克隆 DNA 的分析 与应用 链序列 之一是 N 端序 列， 那 么序列 的顺序 也就知 道了， 从 而可决 定引物 方向。 应用 简并寡 核昔酸 引物的 PCR 有时 亦称为 DOP-PCR。 酶 从 许多嗜 热菌中 分离得 到的热 稳定的 DNA 聚合酶 被用于 PCR 反应。 其中最 常用的 Tag 聚合 顧是从 Thermus aqucUicus 菌中制 备的。 该 酶能经 受 1 〜 2min95t： 变性 步骤， 在该 温度下 的半衰 期大于 2 h。 由于 不具备 3'~-5' 的校 正外切 酶活性 （参 见表 F1.1 和表 G1.1)， 已知 Tag 酶 在复制 DNA 时 会引入 错误， 大约 每聚合 250nt 发 生一次 错误。 由 于这一 原因， 常 选用其 他精度 更高的 热稳定 DNA 聚 合酶用 于某些 特定的 实验。 PCR 的条 即使 使用已 克隆的 DNA 和已知 序列的 引物， 一般 PCR 效率也 不会达 件优化 到 100%, 通 常都要 优化反 应条件 W 期提高 效率。 当 试图从 众多序 列中扩 增 出一特 定目标 序列， 如从 基因组 DNA 中扩 增一个 基因， 或从 cDNA 文 库或 第一链 cDNA 合 成的产 物中扩 增一个 cDNA 时， 条件优 化尤为 重要。 mRNA 反转录 后再用 PCR 扩增 第一链 瓜 NA 的方 法称为 反转录 PCR (re- verse transcriptase PCR, RT-PCR)。 如 果反应 条件不 适宜， PCR 产 物在凝 胶上就 会出现 不清晰 的成片 条带， 而不 是明显 条带。 常改变 的参数 包括退 火 温度和 Mg2+ 巧度。 退火温 度太低 会发生 错配。 对 不同序 列有不 同的最 适 Mg2+ 浓度， 但 通常在 1 〜 4mmol/L 之间。 可用 嵌套式 PCR 来改 善反应 的特 异性。 所谓 嵌套式 PCR 就是在 第二轮 PCR 中， 使用一 套新的 引物， 它与第 一套引 物扩增 的片段 结合， 形成 更短的 PCR 产物。 如果在 PCR 第 一轮中 产生出 一些非 特异的 产物， 在凝 胶上带 不清晰 或有许 多带， 而使用 嵌套 PCR 就会 确保只 有目的 产物被 扩增， 因 为只有 目的序 列才会 含有与 两 套引物 结合的 位点。 PCR 派生 假如加 入多对 引物， PCR 可用于 扩増同 一反应 中多个 DNA 片段 ，且 巧术 如果这 些片段 长度不 同则可 容易地 在凝胶 上区分 开来。 这种 用多套 引物的 PCR 被称 为复合 PCR， 并经常 用于一 种快速 实验中 ^>1 检测 可能污 染食物 或水 体的微 生物的 存在， 或被感 染组织 存在。 对基本 PCR 的改良 使得扩 增 位于基 本成对 引物扩 增的序 列的上 下游区 域成为 可能。 例 如如果 基因组 DNA 首先 用限制 性内切 核酸酶 消化， 然后 用连接 酶连接 环化， 一 对背对 背 的引物 可用于 从已知 序列区 域扩增 该圆环 获得 5' 及 3' 侧翼区 直到连 接的 限制性 位点。 送被称 作反向 PCR。 当通过 RT-PCR 得到 cDNA 片段， 可 首先利 用末端 转移酶 加尾， 例如将 oligo (dC) 加到 第一链 cDNA 末 端 来扩增 5'- 侧 翼序列 （参 见图 J3.1， 口）。 这 样就可 用一与 oligo (dG) 引物 相连的 基因特 异引物 来扩增 5' 区。 这一技 术称为 cDNA 末端快 速扩巧 (RACE)。 扩 增真核 mRNA 3'- 侧翼 序列的 3'- RACE 则 利用与 mRNA 3' 端的 poly (A) 尾 退火的 oligo (dT) 引 物和与 之相连 的基因 特异引 物进行 扩增。 通过在 PCR 反应的 后期加 入放射 性或修 饰的核 巧酸， 或如 J1 描述 J3 巧合巧 链反应 165 的那 样标记 PCR 产物， PCR 可 W 用于 制备 标记的 探针筛 选文库 （参见 13) 或进 行杂交 试验。 PCR 还可用 于将特 异突变 引入到 一特定 DNA 片段 中， J5 中介 绍了一 个关于 PCR 诱变 过程的 例子。 定 *PCR 可 W 确定一 实验样 品中的 DNA 数量 （分子 数）。 定量 PCR 最 好方法 之一是 在扩增 前的样 品中加 入一已 知数量 的相似 DNA 片段 ，如 含 有短的 缺失的 DNA 片段。 两 种产物 的比例 取决于 加入的 缺失片 段的数 量， 并可算 出样品 中目标 分子的 数量。 在 不对称 PCR 中， 只有一 条链被 扩増 （W 线性方 式）， 当 应用到 DNA 测序时 （参见 J2) 被 称为环 状測序 (cycle sequencing)。 PCR 还可用 于増加 DNA 指纹 分析的 灵敏度 （参见 D4 和 J6)。 J 克隆 DNA 的分析 与应用 J4 克 隆基因 的组构 要 点 ^ W 寡 脱氧胸 腺巧酸 引导的 瓜 NA 克隆的 极性可 良容 易地从 poly (A) 的 位置来 判断， 由此推 导出编 码区。 基因 组克隆 中基因 的存在 和其极 性不很 明显， 但可通 过作图 和杂交 实验来 确定。 cDNA 克隆 的一部 分为探 针进行 Southern 杂交， 可显 示出基 因 组克隆 中的哪 一部分 对应于 cDNA 序列。 S1 核酸 酶作图 I 转 录物的 5' 端或 3' 端 可通过 并具末 端标记 的较长 的反义 片段与 该 RNA 的杂交 来鉴别 。用 S1 核酸酶 处理杂 交分子 去除单 链区， 经凝胶 电泳分 析可测 出剩余 片段的 大小。 在 基因组 DNA 上定位 cDNA 聚合酶 可延伸 引物直 达模板 末端， 然后 从模板 解离。 延伸 产物的 全长 代表着 模板的 5' 端。 将蛋白 质抽提 物与标 记过的 DNA 片 段混合 后进行 非变性 凝胶电 泳 分析， 显示出 蛋白质 -DNA 复合 物的带 会延后 出现。 用少量 DNase I 处 理末端 标记的 DNA 和蛋白 质的混 合物， 然后 进 行电泳 分析， 可 显示出 与某一 DNA 序 列特异 结合蛋 白的足 迹。 这一 足迹是 在切割 产物梯 状带中 的无带 区域。 为了 验证启 动子的 功能， 可将 启动子 与一个 产物易 于检测 的基因 (报道 基因） 的 编码区 相连， 应在启 动子被 激活的 条件下 分析蛋 白质 产物。 巧 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 基因 组文库 （II) 组构 cDNA 克隆 有一定 的组织 方式， 尤 其那些 W 寡聚 dT 为引物 合成的 cDNA 克隆。 通常 在克隆 的一端 有一串 A 残基， 标志着 3' 端。 在一串 A 残基 上游的 一定距 离处会 有一个 终止于 终止密 码子的 可读框 （参见 P1)。 如果 cDNA 克 隆是完 整的， 会含 有一个 ATG 起始密 码子， 在这之 前通常 有 20~100nt。 真 核生物 的基因 组克隆 更大， 并含有 内含子 序列和 非转录 序列， 这些 序列增 加了了 解克隆 的组织 方式的 困难。 在 分离得 到一个 cDNA 克 隆后， 通常 要克隆 出该基 因的基 因组序 列进行 研究。 之后 的问题 就 是找出 这两个 克隆的 哪些部 分相互 对应。 这 就意味 着找出 了出现 在成熟 J4 克 隆基因 的组构 167 在 基因组 DNA 上定位 cDNA S1 核酸酶 作图 引 物延伸 巧 胶阻滞 的 mRNA 转录 物中的 基因组 序列。 cDNA 克 隆中不 包含的 基因组 序列通 常是内 含子、 转录 起始点 的上游 及 3'- 加工位 点的下 游序列 （参见 M4 和 03)。 其 他要鉴 定的重 要特征 包括转 录的起 始点、 终点和 转录调 控序列 (参见 M 和 N)。 如果 基因组 克隆与 cDNA 克隆都 有限制 图谱， 一 个重要 实验是 将酶解 后的基 因组克 隆产物 电泳， 并 用全长 或部分 cDNA 为探 针进行 Southern 杂交 （参见 J1)。 用全长 cDNA 克隆为 探针可 W 显示 出基因 组克隆 的哪些 恨 制性酶 切片段 中会有 cDNA 中的 序列。 如果存 在大内 含子， 送些 片段在 限 制图谱 中可能 不相邻 。用 cDNA —端 制得的 探针可 显示出 基因组 克隆中 该 基因的 极性。 两类克 隆中可 能会有 一些相 同的限 制酶切 位点， 但 其间的 距 离可能 不同。 这常有 利于了 解基因 组克隆 的组织 方式。 基 于这个 信息， 可 对基因 组克隆 的某些 区域进 行测序 验 证上述 结论。 这一技 术可精 确测定 RNA 转 录物的 5' 端与 3' 端， 只是对 5' 端与 3' 端 需 分别用 不同的 探针。 如图 J4.1 所示 5' 端的 作图， 是将一 个末端 标记的 反义 DNA 分子与 RNA 样 品进行 杂交。 如果 用双链 DNA 来杂交 （只 有反 义链有 末端标 记）， 在杂交 缓冲液 中应加 80% 甲酸 W 利于 DNA-RNA 杂交 分子 比双链 DNA 更易 形成。 然后用 单链特 异性的 S1 核酸 酶处理 杂交分 子， 移 去突出 于两端 的单链 部分， 并 将样品 与分子 质量标 记或该 DNA 的测 序反应 样品一 起进行 PAGE 分析。 再根 据放射 自显影 所显示 出的抗 核 酸酶带 的大小 来推测 RNA 分子的 末端。 RNA 5|-, DNA 3.1 加入 S1 核酸巧 末端被 标记的 DNA 与 RNA 的杂交 RNA 5- DNA 3. PAGE 分析 图 J4.1 对 RNA 的 5' 端进行 S1 核酸酶 作图。 •二 末端标 记部位 用反转 录酶沿 5' 端向 3' 端 方向延 伸反义 DNA 引物， 即 从引物 与目的 序 列配对 处向聚 合酶解 离的模 板末端 延伸， 然 后将引 物延伸 的产物 与能确 定其长 度的分 子质量 标记和 （或） 不同大 小的序 列共同 电泳， 可 测定出 RNA 分子的 5' 端 （图 J4.2)。 当某 一基因 的转录 产物的 5' 端被 确定后 （如 通过 S1 核 酸酶作 图）， 在基 因组克 隆上的 相应位 置就是 转录起 始点。 DNA 序列的 上游含 有控制 168 J 克隆 DNA 的分析 与应用 DNase I 足迹法 巧 道基因 基因时 空转录 的调控 序列。 转 录因子 （参见 N1) 与 特异的 调控序 列相结 合， 并有助 于转录 起始。 巧胶阻 滞技术 （巧 胶移位 分析） 能 显示出 与标记 核酸结 合蛋白 的阻滞 效果， 并 可被用 来检测 与调控 序列相 结合的 转录因 子。 将 一段短 的标记 核酸， 如基 因组克 隆的转 录起始 点上游 区域， 与可能 会含有 结合蛋 白的细 胞或核 的抽提 物相混 合后， 并与 对照样 品一起 进行非 变 性的琼 脂糖或 聚丙斌 醜胺凝 胶电泳 分析。 在 未标记 的不同 核酸过 量存在 下， 这些 核酸与 蛋白质 非特异 结合， 而 标记分 子与蛋 白因子 特异结 合产生 一种 或多种 DNA 蛋白复 合物， 经 放射自 显影在 凝皎上 作为慢 迂移带 （延 迟带） 得 显示。 RNA 5 3 - 引 物退火 3-1112 *5. DNA 引物 化入 巧合晦 dNTP RNA 5-|-|-|-f 3 DNA 3 ' ■ *5' 引物延 伸产物 PAGE 分析 图 J4.2 引物 延伸。 ’= 末端标 记部位 虽 然凝胶 阻滞能 显示出 蛋白与 DNA 分子的 结合， 但它 并不能 提供在 所 用片段 中结合 位点的 序列， DNase 足 迹法可 确定与 蛋白作 用的实 际序列 区域。 同 样需要 用末端 标记的 DNA 片 段与蛋 白样品 （如 核抽 提物） 相混 合， 待 相互结 合后， 用 DNase I 酶对复 合物进 行温和 酶解， W 期 产生平 均 一个分 子被切 一次的 产物。 在蛋 白结合 区域， 核酸酶 不能轻 易接近 DNA 骨架， 很 难实现 切割。 将部分 酶解的 DNA 进行 PAGE 电泳 分析， 在对照 DNA 的泳 道中的 梯状显 示出所 有随机 的核酸 酶切割 部位， 而在加 入蛋白 样品的 泳道， 显示 出的梯 状带中 会有某 些带的 空缺， 或者未 切割的 区域， 正好 对应于 受蛋白 保护免 受核酸 酶切割 的蛋白 结合的 DNA 位点 (足 迹）。 其 他一些 DNA 切 割试剂 也可用 于足迹 实验， 如経基 自由基 (•OH) 和 二甲基 横酸。 当 控制转 录的基 因区域 （启 动子， 参见 K1) 经 测序、 S1 作图和 DNA- 蛋 白结合 实验确 定后， 通 常要将 启动子 接上报 道基因 对其功 能进行 研究， 1=^ 验证 该后 动子所 具有的 特性。 例如将 热休克 基因的 启动子 HSP70 与 (3 -半乳 糖脊酶 基因的 编码区 相连， 当这一 结构体 表达， 且在有 生 色底物 （X-gal， 参见 HI) 存 在时， 就 会产生 蓝色。 若将 HSP70 启动 子- 报道基 因的结 构体引 入一个 细胞， 并给该 细胞或 细胞系 热激， 就会产 生 p-gal 转录 产物， 并 可通过 检测蓝 色来分 析蛋白 产物。 这 显示出 热激可 J4 克 隆基因 的组耗 I 169 激活 通常非 活性状 态的启 动子， 其机 制是因 为一个 特定的 转录因 子结合 到启 动子的 调控序 列上， 激活 该基因 （参见 N2)。 J 克隆 DNA 的分析 与应用 J5 克 隆基因 的诱变 要 点 缺 失巧变 从一端 开始渐 渐缺失 DNA 对 于确定 特定序 列的重 要性是 很有用 的。 用可从 凹进的 3' 端沿 3' 向 5' 方 向移去 一条链 的外切 核酸酶 田进 行单向 缺失， 再用 一种单 链特异 性核酸 酶制成 平末端 用于连 接， 经 转化产 生出具 缺失的 克隆。 定 点诱变 在 一个特 定位点 改变一 个或几 个核巧 酸通常 需要将 诱变引 物与模 板 退火， 再用 DNA 聚合酶 合成互 补链。 过去 多用由 M13 制备的 单链 模板， 但 现在倾 向于用 PCR 技术。 PCR 巧变 用 正向与 反向突 变的引 物及可 结合常 用载体 序列的 另一对 引物， 进 行两组 PCR 反应 来分别 扩增待 突变的 DNA 的 5' 与 3' 部分 。然 后将 这两组 PCR 产物 混合， 并逆行 只用外 部引物 的另一 PCR。 这些产 物中部 分再通 过亚克 隆代替 最初分 子中要 突变的 区域。 巧 关主题 DNA 克 隆概述 （G1) 嗤菌 体载体 （H2) 连接、 转化 与重组 体分析 （G4) 聚合酶 链反应 （J3) 缺 失诱变 对于小 基因组 或是生 活周期 短的生 物体， 有可能 在这些 生物体 内制作 突变体 并进行 解析， 但对于 像人这 样的生 物体， 不易 进行这 种操作 或是不 可接 受的。 但若 克隆基 因已被 分离， 相当 容易在 体外对 它们进 行突变 ，并 通 过体外 或体内 表达该 突变基 因来分 析突变 效果。 对 cDNA 克隆与 基因组 克 隆制作 缺失诱 变是可 行的。 对于 cDNA 克隆， 通常 从编码 区的一 端逐渐 删除， 产生 N 端或 C 端截短 的蛋白 （表达 后）， 从而 可发现 整个蛋 白的哪 一部分 （或结 构域） 具 有特殊 特性。 例如某 一特定 蛋白的 N 端区 域可能 ^DNA 结 合域， 中间 部分是 ATP 结合 位点， 而 C 端区域 则有助 于蛋白 相 互作用 形成二 聚体。 对于 基因组 克隆， 鉴 别出转 录起始 点后， 逐步删 除 其上游 的序列 发现 具有启 动子和 调控功 能的最 短上游 序列。 虽 然只要 其作 用位点 落在可 操作的 部位， 可 用限制 酶制作 缺失突 变体， 而用 外切酶 制作 单向缺 失的方 法也很 常用。 图 J5.1 显示 克隆进 质粒载 体多克 隆位点 （MCS) 的 cDNA 在 插入片 段 两端的 多克隆 位点处 存在几 个限制 性酶切 位点， 选 择两个 对载体 和插入 片段单 一的， 并分别 可给出 5' 和 3' 凹 端的酶 切位点 来进行 单向缺 失体的 制作。 外切 核酸酶 1 [可 从 凹进的 3' 端沿 3' 一 5' 方向 移去一 条核巧 酸链， 而 并不从 3' 凸端。 因 此在图 J5.1 中外切 核酸酶 m 只 能随时 间逐步 移去插 J5 克 隆基因 的诱变 171 入 片段的 下链。 用 S1 或绿豆 核酸酶 （参见 G1) 等对 等分样 品进行 不同时 间 处理， 去掉 两端的 突出单 链部分 形成平 末端， 然后 经连接 重新环 化成质 粒， 再进 行转化 （参见 G4)， 将产 生一系 列缺失 不同长 度的亚 克隆。 这一 技术常 被用来 获取克 隆的全 序列， 因 为可用 同一测 序引物 对一系 列相差 200bp 左右的 克隆进 行序列 分析。 大约 S 分之 一的缺 失体仍 保持正 确的可 读框， 能 用来表 达截短 蛋白。 可 用同样 方法对 cDNA 另一 端进行 缺失。 重 组质粒 GAGCT-3 ‘ 5-GATCC C- 5 - 3-G 未 切掉的 核巧酸 GAGCT-3‘ C-5‘ G-3- C-5. 外切 核 巧巧田 5-GATCC 被 切掉的 核巧酸 S1 或绿豆 核酸巧 连接 G C 转化 图 J5.1 单向缺 失诱变 定 点诱变 仅改变 一个序 列中的 一个或 几个特 定核巧 酸对于 验证某 一假说 是非常 有 效的。 转 录因子 结合位 点的每 一残基 的重要 性可通 过将各 残基逐 个突变 来 检验。 对 蛋白质 中可能 起重要 作用的 氨基酸 可通过 改变其 对应的 cDNA 的核 巧酸来 改变该 蛋白的 组成， 进而 对所产 生的突 变蛋白 进行功 能分析 W 检 测突变 效果。 最 初的定 点诱变 是用单 链模板 （由 M13 亚克隆 制备） 及 含有待 突变的 寡巧核 巧酸引 物来进 行的。 引物与 模板退 火后， 用 DNA 聚 合酶 延伸， 用 DNA 连接 酶缝合 切口， 并将不 完全配 对的双 链转化 细菌。 某 些细菌 能移去 错配， 产生 出所期 望的点 突变， 当然 也会有 一些含 原初序 列 的克隆 产生。 因为这 种方法 效率低 （并 非所有 克隆都 是突变 体）， 且经 172 J 克隆 DNA 的分析 与应用 PCR 诱变 M13 的亚克 隆来制 备单链 DNA 很费 时间， 现 在多用 PCR 来进行 定点诱 变。 用 PCR 方法 （参见 J3) 来 制作缺 失和点 突变有 好几种 方法， 图 J5.2 显示 了进行 点突变 的一种 方法。 设 计一对 已含有 突变序 列的、 且彼 此重叠 至少 20nt 的 引物。 如果待 突变的 DNA 是被 克隆在 标准载 体上， 载 体上会 有标准 的引物 位点， 如 pGEM 上的 SP6 与 T7 启动子 位点， 这些标 准引物 可与 诱变引 物组合 使用。 分别进 行两次 PCR 反应， 一次用 SP6 与 反向引 物来扩 增插入 片段的 5' 端， 另 一次用 正向与 T7 引 物来扩 增插入 片段的 3' 端。 将两次 PCR 产物 纯化、 混 合并用 SP6 与 T7 引物 一起来 扩増， 结果 惟 一的产 物应是 一个全 长的突 变了的 分子。 只有当 5' 端有 义链与 3' 端反 义 链借助 重叠的 20nt 进行 退火或 反之， 然后进 行延伸 才会产 生上述 产物。 这一方 法几乎 100% 有效， 而且 很快。 一 个更方 便的可 选择的 版本， 至少 是 基于一 种商用 诱变试 剂盒， 包括用 正向和 反向诱 变引物 （图 J5. 2) 来 SP6 引物 正向诱 变引巧 反向巧 变引巧 T7 引物 第一轮 PCR X —— 除去引 巧， 变性 和退火 X —— —— X 延伸 并进行 第二轮 PCR SP6 引巧 - ■ » X —— —— X T7 引巧 X X 亚克隆 图 J5.2 PCR 诱变。 X 表示 PCR 产物 中的突 变位点 J5 克 隆基因 的诱变 173 延伸 含有目 的基因 的整个 质粒。 在 反应结 束时， 一些 产物将 含有在 两条链 中都存 在突变 的环状 分子及 在每一 引物序 列末端 均存在 切口。 这些 分子能 直接用 于转化 产生含 有突变 质粒的 克隆， 而无 需用限 制性内 切核酸 酶消化 及 连接。 因为所 有突变 体在被 使用前 要经测 序进行 检查， 因此最 好不用 PCR 形成的 DNA 整个 分子， 而 将含有 突变区 的较小 片段亚 克隆进 原初克 隆 的相同 位点， 这样 只有被 转移区 域才需 要测序 检查。 J 克隆 DNA 的分巧 与应用 J6 克 隆技术 的应用 点 应 用 重 组蛋白 DNA 指 纹分析 基因克 隆技术 有多种 应用， 包 括重组 蛋白的 生产、 遗传修 饰生物 体的 构建、 DNA 指纹 分析、 诊断 试剂盒 1=^ 及基因 治疗。 将 编码珍 贵蛋白 的基因 插入质 粒并在 细菌中 表达出 大量生 产重组 蛋白。 如果翻 译后的 修饰很 重要， 则 基因须 在真核 细跑中 表达。 向 一个生 物体引 入一个 可在其 内增殖 的外源 基因， 构成一 种遗传 修饰生 物体。 例如已 做出的 转基因 羊能在 其奶汁 中生产 外源蛋 白。 将 基因组 DNA 与可识 别单核 巧酸重 复的探 针进行 Southern 杂 交， 产生出 为某一 个体所 独有的 图谱， 可被 用来进 行指纹 分析。 这在法 医学、 动植 物育种 W 及 进化研 究中有 着广泛 应用。 医 学珍巧 I 可 根据已 克隆的 具有重 要医学 价值基 因的序 列信息 设计多 种诊断 试 剂盒， 来对 多种疾 病进行 预测与 确诊。 基 因治疗 I 通 过向病 人导入 特定基 因试图 来治疗 某种遗 传疾病 的方法 称为基 因 治疗。 相 关主题 基因组 复杂度 （D4) 真核生 物载体 （H4) 质 粒载体 的设计 （H1) 癌基因 的分类 （S2) 应用 基因 克隆技 术促进 了生物 学研究 的快速 发展， 并在日 常 生活的 多个领 域有着 越来越 广泛的 应用。 送些 应用包 括药用 蛋白与 非药用 蛋白的 生物技 术 生产、 基 因修饰 生物体 的诞生 （尤 其是 食物生 产的改 良）、 医学 诊断试 剂盒的 开发、 PCR 及克 隆技术 在法医 和进化 研究中 的应用 W 及用基 因治疗 医 治遗传 病的尝 试等。 本节将 介绍送 些应用 中的一 部分。 重 组蛋白 已知许 多正常 产量很 少的蛋 白在多 种疾病 患者体 内产生 缺失或 缺陷， 包 括生长 激素、 与搪 尿病相 关的膜 岛素、 与 某些免 疫疾病 相关的 白介素 及血 友病相 关的凝 血因子 理。 在基因 克隆及 用重组 DNA 技 术进行 蛋白生 产 之前， 须从 动物组 织或捐 献的人 血中纯 化这些 分子。 这两 种来源 都有欠 缺， 如来自 动物细 胞的蛋 白有轻 微的功 能差异 W 及血 液中可 能的病 毒污染 (如 HIV、 CJD)。 用特定 的非病 原性的 生物体 来进行 蛋白质 的基因 工程生 J6 克 隆技术 的应用 175 遗 传修饰 生物体 DNA 指纹 分丰斤 产避免 了这些 问题， 所 W 制药 公司和 生物技 术公司 致力于 这项技 术的发 展。 最初用 细菌来 生产蛋 白是惟 一常用 方法， 且使用 不含内 含子的 cDNA。 cDNA 须与 原核生 物的转 录和翻 译信号 相连， 并插 入多拷 贝质粒 （参见 H1)。 但 占总细 胞蛋白 30% 的过量 表达蛋 白经常 会发生 沉淀或 不溶， 也缺 乏 真核生 物那样 的翻译 后修饰 （参见 Q4)。 有 时采用 融合表 达来解 决上述 这些 问题。 顯 合蛋白 经切割 可释放 出目的 蛋白。 但随后 采用真 核细胞 （酵 母或哺 乳动物 细胞） 进行蛋 白生产 的方法 更方便 可行。 可支 配血友 病的人 凝 血因子 VIII 蛋 白可在 转染人 基因组 186kb 片段的 仓鼠细 胞系中 生产。 这样 该细 胞系已 被遗传 修饰， 而現在 已可对 所有生 物体进 行巧传 修饰。 重组蛋 白 也可通 过诱变 （参见 J5) 引 入新的 氨基酸 来进行 修饰。 这可对 蛋白进 行 改良， 如 构建更 稳定的 酶应用 于洗衣 粉等。 将克隆 基因引 入能够 形成整 个机体 组织的 细胞可 构建成 遗传修 饰生物 体 （ genetically modified organisms, GMO)。 在 真核生 物中， 如果被 引入的 基 因来自 另一生 物体， 形成的 转基因 植物或 动物可 由常规 育种来 繁殖。 已构建 成几种 转基因 植物， 并已对 其食物 生产的 安全性 进行了 检验。 GMO 的例子 之一是 一种促 成熟酶 基因失 活的西 红柿。 由于 该酶的 缺失这 一品 系的西 红柿变 软所需 的时间 更长， 因 此也就 能储存 更久， 同时 还有其 他一 些改良 特性。 转基因 羊已获 成功， 并希望 在其乳 汁中生 产有价 值的蛋 白。 目 的基因 需要连 接上一 个羊的 启动子 W 保证在 乳腺中 表达， 从 乳汁中 纯化 蛋白比 从培养 细胞或 血液中 纯化更 容易。 一种转 基因生 物体的 定义是 指含 有一个 外源基 因的生 物体， 但该术 语现在 常被用 来指生 物体经 过遗传 操作后 含有多 个外源 基因、 一种内 源基因 的多拷 贝或一 个基因 被破坏 （基 因剔 除）。 该术 语不常 用在一 些动物 克隆中 （产 生同一 个体） 常见 的增加 外源 基因的 最极端 形式， 即其中 全部的 基因都 被另一 个细胞 核来源 的基因 取代。 这 种用一 个成熟 细胞核 取代一 个卵子 细胞核 的方案 （核 巧殖） ，在 1997 年曾 用来创 造了绵 羊多利 （Dolly)。 这个 著名的 动物克 隆的例 子造成 了很多 争论， 因为它 使从成 熟细胞 克隆人 的可能 性大大 提高。 许多 国家现 在已 经立法 禁止多 种形式 的人的 克隆， 这将 阻止用 于治疗 的替代 细胞和 (或） 器官的 开发。 同 卵双生 的双胞 胎是自 然形成 的人的 克隆。 基因组 测序计 划已从 人类基 因组中 鉴别出 许多重 复序列 （参见 D4)， 其中一 些是简 单重复 序列， 不同个 体间重 复数目 不同但 可遗传 （VNTR)。 如果将 一个家 族成员 的经限 制酶酶 解后的 基因组 DNA 与能 探测某 种重复 序 列的探 针进行 Southern 杂交， 每 一样品 都会出 现一套 不同长 度的带 (在 两个限 制酶切 位点间 的重复 长度不 同）。 一 个杂交 基因座 （成对 等位基 因） 展 示于图 J6.1， 其中一 些带与 母本的 相同， 另 一些与 父本的 相同， 且这 些带型 将与无 关个体 不同。 个体之 间在每 一简单 重复位 点上的 图谱不 同意味 着用少 数探针 就可使 两个体 间形成 相同图 谱的可 能性几 乎为零 。这 176 J 克隆 DNA 的分析 与应用 就是 DNA 指巧 技术， 被用 于法医 学来判 别无罪 和证实 有罪。 同时 也在人 类 的家谱 检测， 商用动 物的血 统检测 及野生 动物的 交配习 性的研 究方面 有 着广泛 应用。 图 J6.1 也显示 DNA 指 纹图谱 怎样在 少量的 样品中 实现， 例 如在某 犯罪现 场留下 的一个 血斑或 发囊。 可 根据 重复的 独特的 侧翼序 列设 计一对 PCR 引物 来替代 用限制 性内切 核酸酶 E 在 每一个 VNTR 末端 消化 DNAUJ [及 Southern 杂交 （在图 J6. 1 中用 箭头表 示）， 该 VNTR 可被 扩增并 通过凝 胶电泳 后染色 可直接 观察。 (a) R1 A2 f R1 R2 R3 R4 R5 R6 R1 R2R3 X R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 (b) 亲本 可能 的后代 不相 关个体 重 复数目 4 图 J6.I DNA 指纹 分析显 示两个 VNTR 等位 基因可 能的遗 传方式 （见正 文）。 (a) 亲本 VNTR 等位 基因； （b) VNTR 等位基 因的琼 脂糖凝 胶分析 医 学诊断 许 多疾病 起因于 变异。 诸如肌 肉萎缩 或囊性 纤维化 这样的 遗传病 ，个 体出生 时即带 有引起 该症状 的错误 基因。 许多 癌症的 产生是 由于体 细胞中 控制细 胞生长 的基因 发生自 发突变 的结果 （参见 S2)。 有关 遗传病 与癌症 基因 的克隆 显示出 某些突 变较为 常见， 且其 中一些 与更为 严重的 疾病相 关。 利用 序列信 息设计 PCR 引物和 探针， 来 开发多 种检测 方法用 W 对病 I 人进 行临床 上重要 突变的 检查。 利用这 些检测 方法， 若发现 父母均 是某一 突 变的杂 合体， 可 被告之 未出生 的孩子 是否会 得如肌 肉萎缩 或囊性 巧维化 这样的 遗传病 （从父 母各继 承一个 错误基 因）， 进而 父母可 W 考虑 是否要 这个 孩子。 检验 基因中 突变的 存在可 证实基 于其他 临床症 状所作 出的诊 I 断。 对于 癌症， 了解 哪个致 癌基因 发生了 突变， W 什么 方式发 生突变 ，将 J6 克 隆技术 的应用 177 基 因治疗 有助于 决定最 好的治 疗程序 W 及为开 发新疗 法提供 信息。 人 类已在 尝试通 过向病 人导入 缺陷基 因的正 常拷贝 来治疗 遗传病 ，这 就 是基因 治疗。 用 于体内 基因治 疗的基 因可被 自身支 配或被 克隆进 用作载 体的、 能复制 但不会 致病的 缺陷型 病毒内 （参见 H4); 对某些 疾病， 患者 骨髓被 破坏， 可通 过引入 （cjcWw 基因 治疗） 携有 正常基 因或保 护基因 (如对 核酶， 参见 02) 的细胞 来进行 治疗。 基 因治疗 会在病 人中产 生转基 因 体细胞 （见 上）， 基 因治疗 虽不很 成熟， 但它 的潜力 巨大。 (程 凌 译 王薛林 化） Wl 成: — % A 苗. 基詩 主可中 人巧 畫姊 若嫩杂 編雜嗓 餘辩 ^汾巧 4 •巧 巧巧晰 ‘ . 。丈 巧托 习 •面 ，爲 化巧不 ft 巧巧 巧美 ，(i 决） 就 臨扣西 * 轉 一 ' Aj。 為祈 J- 0 d : 【•"，; 壮巧玉 广乂嚴 y;J. 半 X W (巧 A . .，:^左巧' 巧 a .1^4 ..i^ir：i^jRj| .'述 ， ♦二! -!♦ 巧 l 巧 旬祖巧 S 々可文 ^义 巧义>* !•, •* 护' > 下* 巧竹 4RI • i^y VNTR 等佑1点21的媒>11111? 穿: 祷一" 娘知 .-'. r . ■ 、飞 *身 L I 4 - 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A 巧任 诗证实 ♦丫 巧他膊 床豁巧 亦巧雌 的 A ». 诗个 » * 公句 换扭岁 菊 因 《朱（ 々度 > W 价么黄 或发生 餐巧' •， ir： 巧 y ;疋 warn K 原 巧生物 的转录 K1 转 录的基 本原则 要 点 转 录概述 I 转 录是指 W 双链 DNA 为 模板合 成单链 RNA。 RNA 的 合成沿 5' 一 3' 方向 进行， 其 序列与 DNA 有 义链相 一致。 起 始 I RNA 聚合 酶是负 责转录 的酶， 它 结合到 被称为 启动子 的特定 DNA 序列上 起始 RNA 的 合成。 这 些序列 位于蛋 白质编 码区的 上游 （5' 端)， 含有一 些短而 保守的 DNA 序列， 在 不同启 动子中 这些序 列是相 同的。 RNA 聚合 酶结合 到双链 DNA 的启动 子序列 上， 引起 DNA 局部 解旋。 合成 第一个 RNA 碱基 的位置 称为起 始 位点， 其位 置称为 + 1。 H 坏 ~~ I RNA 聚合 酶沿着 DNA 链 移动， 顺次 合成民 NA 链。 DNA 在移动 的聚 合酶抵 达之前 解旋， 在其 经过之 后又恢 复成双 螺旋。 ^ 玉 I RNA 聚合酶 识别终 止子， 导 致不再 有新的 核巧酸 插入， 该序列 通常 是发夹 结构。 一些 终止子 需要一 种称作 P 的辅 助因子 来终止 转录。 相 关主题 核 酸结构 （C1) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 大 肠杆茵 RNA 聚合酶 （K2) 色氨酸 操纵子 （L2) 大 肠杆菌 (jW 启动子 （K3) 转 录概述 转 录就是 W DNA 为 模板的 RNA 的酶促 合成。 这是基 因表达 全过程 的第 一步， 并最 终导致 由基因 所编码 蛋白的 合成。 转录由 RNA 聚 合酶催 化， 它需 要双链 DNA 模 板与前 体核糖 核巧酸 ATP、 GTP、 CTP 和 UTP (图 K1.1)。 RNA 合成 的方向 总是固 定的， 即从 RNA 分子的 5' 一 3' (参 见 C1)。 通 常两条 DNA 链 中只有 一条会 转录成 RNA， 其中 一条链 称为有 父链， RNA 的序列 就是有 义链上 脱氧核 巧酸序 列的直 接拷贝 （WU 替代 T)o 另 一条链 称为反 义链， 也称模 板链， 因为 它用作 RNA 合成过 程中核 糖核巧 酸碱基 配对的 模板。 起 始 转录 的起始 涉及到 RNA 聚合酶 与双链 DNA 的 结合。 RNA 聚 合酶通 常 是多亚 基酶。 它 们结合 到双链 DNA 并在被 称作启 动子的 部位起 始转录 (图 K1.2)。 启 动子是 基因起 始处的 DNA 序列， 即在编 码区的 5' 端 （上 游）。 不 同基因 的启动 子序列 元件经 常是保 守的。 不 同基因 间启动 子的差 别会 导致转 录起始 效率的 差异且 与其调 控有关 （参见 L)。 启动子 内的短 180 K 原 核生物 的转录 的保守 序列是 聚合酶 或其他 DNA 结合蛋 白的结 合位点 W 起始或 调控转 录。 为使模 板链能 与碱基 配对， DNA 双 螺旋必 须局部 解旋。 解旋从 RNA 聚合 酶结合 的启动 子部位 开始。 然后 聚合酶 从一特 定的、 被 称为起 始位点 的 核昔酸 处起始 RNA 链的 合成。 这 一位点 被定义 为基因 序列的 + 1 位置 (图 K1.2)。 结合到 DNA 模 板上的 RNA 聚合 酶及其 辅助因 子通常 被称为 转录复 含物。 图 K1.1 转 录过程 中踞酸 二爾键 的形成 转录 RNA 二- AUACG 终止子 3 - 有义巧 5 ‘ 反义巧 3' 图 K1.2 典 型的转 录单元 结构， 标明了 启动子 、终 止子 序列和 RNA 产物 K1 转 录的基 本原则 181 延 伸 RNA 聚合酶 向正在 增长的 RNA 链的 3' 端共 价地添 加核糖 核昔酸 （图 K1.1)。 因 此聚合 酶是沿 5' 一 3' 方向延 伸正在 增长的 RNA 链。 同 时酶自 身沿 着反义 DNA 链 （模 板） 的 3' 一 5' 方向 移动。 酶移 动时局 部解旋 DNA, 使两条 DNA 链 分开暴 露出模 板链， 供 核糖核 巧酸碱 基配对 并向増 长着的 RNA 链的 3' 端共 价添加 核糖核 巧酸。 在聚合 酶经过 之后又 重新形 成双 螺旋。 37t： 时， £.co。 RNA 聚合酶 完成该 反应的 速度是 每秒约 40 个 碱基。 终 止 转录 终止即 转录复 合物的 解体和 RNA 合成的 终止， 发生在 特定的 DNA 序 列即终 止子处 （参 见图 K1.2 和 K2、 K3)。 这些序 列经常 含有一 些 自身互 补区， 能在 RNA 产物 上形成 茎环或 发夹二 级结构 （图 K1.3)。 这些结 构使聚 合酶停 顿并随 即终止 转录。 一些终 止子可 W 不需要 辅助因 子而独 立终止 转录， 另一些 则需要 rho 蛋白 （P) 作辅助 因子。 在 终止反 应中， RNA-DNA 杂交 体分开 W 重新形 成双链 DNA， 同时 RNA 聚合 酶和所 合成的 RNA 从 DNA 链上被 释放下 来。 5 - ... NNNNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUU -0H 3* N N I I N C G*C C*G C-G G-C C*G G-C A-U 发 夹或茎 环结构 A>U • ••NNNN UUUU-OH 图 K1.3 RNA 发 夹结构 K 原 巧生物 的转录 K2 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 点 大 肠押菌 RNA 聚合晦 亚基 0 亚基 日 '亚基 因子 RNA 聚合 酶负责 RNA 的合成 （转 录)， 其核' 。酶由 2a、 巧、 ip' 和 Iw 亚基 组成， 负 责转录 延伸。 0 因子对 于转录 的正确 起始是 必 需的。 因 此核私 酶加上 0 因子所 组成的 完整的 酶称为 全酶。 RNA 聚 合酶中 有两个 a 亚基， 它们 可能与 启动子 的结合 有关。 RNA 聚 合酶中 有一个 (3 亚基， 抗生 素利福 平和利 迪链菌 素都可 与 P 亚基 结合。 P 亚 基可能 与转录 的起始 和延伸 有关。 RNA 聚 合酶中 有一个 P' 亚基， 它可能 与模板 DNA 的结合 有关。 肝 素可与 护亚基 结合。 0 因子 是核私 酶 W 外的 单独 成分。 大肠 杆菌编 码几种 0 因子 ，最 常 见的是 cjW。 0 因子 对在正 确启动 子位点 起始转 录是必 需的。 这一 功能是 通过降 低核必 酶对 非特异 DNA 序列的 结合， 同时増 强对 特异启 动子序 列的结 合来实 现的。 转录产 物的长 度达到 8〜 9nt 时， 0 因 子就从 核必酶 上释放 下来。 巧 关主题 转 录的基 本原则 （K1) 不同 0 因子 对转录 的调节 （L3) 大 肠杆菌 (jW 启动子 （K3) 兰种 RNA 聚合酶 :性质 与功能 (Ml) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 大 肠杆窗 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 是大肠 杆菌细 胞中最 大的酶 之一， 该酶 至少由 RNA 聚合 5 个亚基 组成， 分别是 a、 P、 p'、 CO 和 o 亚基。 在称 为全酶 的完整 的酶分 酶 子中 有两个 a 亚基， 另四 种亚基 各一个 （即 asPP'wa)。 全 酶是转 录起始 所必 需的。 但0因 子对于 转录延 伸并不 必需， 转录起 始后就 从转录 复合物 上释 放下来 。剩下 的酶沿 DNA 链 移动， 称 为核屯 、酶， 其 结构是 02(3 护 山。 大 肠杆菌 RNA 聚 合酶在 37t： 时合成 RNA 的 速度是 每秒约 40nt， 需有 Mg2+ 激活。 该酶是 非球状 结构， 在 一圆柱 形孔道 旁有一 突起。 孔 道的大 小表 明它可 直 接结合 16 bp 的 DNA。 整个聚 合酶所 结合的 DNA 区域覆 盖了约 60 bp。 虽 然多数 RNA 聚合酶 都像大 肠杆菌 RNA 聚合酶 一样有 多亚基 结构， 但必须 注意的 是多亚 基结构 并非必 需的。 隨菌体 T3 和 T7 所 编码的 RNA 聚合酶 （参见 H1) 只有 一条多 化链， 比细菌 的多亚 基酶小 得多。 它们能 快 速合成 RNA (37t： 时每秒 200 nt) 并 识别自 身 特异的 DNA 结合 序列。 K2 大 肠杆茜 RNAll 合巧 183 a 亚基 P 亚基 P' 亚基 0 因子 核必 RNA 聚合酶 有两个 相同的 a 亚基， 该 亚基由 基因 编码。 a 亚基对 于核必 酶的组 装是必 需的， 但尚未 发现它 有明确 的转录 功能。 晦菌 体 T4 感染 大肠相 菌时， a 亚基被 修饰， 其中 的一个 精氨酸 被腺巧 二稱酸 (ADP) 核糖 基化。 此时 RNA 酶结合 启动子 的能力 降低， 表明 a 亚基 可能 在启 动子识 别中发 挥一定 作用。 核必 酶中 有一个 P 亚基， 这一 亚基被 认为是 RNA 聚合酶 的催化 中私。 这一观 点的强 有力证 据来自 对抑制 RNA 聚合酶 转录的 抗生素 的研究 。重 要的抗 生素利 福平是 RNA 聚合酶 的强抑 制剂， 它能 阻止起 始但不 影响延 伸。 这 一类的 抗生素 并不抑 制真核 细胞的 RNA 聚 合酶， 因 此在医 学上被 用于治 疗革兰 氏阳性 菌的感 染和结 核病。 已证 明利福 平是与 9 亚 基结合 的。 能导 致对利 福平抗 性的突 变被定 位在呼 oB 基 因内， 该基 因编码 P 亚 基。 另 一种抗 生素利 迪链菌 素能抑 制转录 延伸， 能产 生对该 抗生素 抗性的 基因突 变也被 定位在 rpoB 基 因内。 这些研 究表明 P 亚基可 能含有 两个结 构域， 分 别负责 转录的 起始和 延伸。 核私 酶中 有一个 亚基 ，由 r/>oC 基因 编码。 这一亚 基结合 了两个 Zn2+， 这两个 Zn2+ 被认 为参与 了该酶 的催化 功能。 多阴离 子肝素 能结合 到 p' 亚 基上。 在体 外肝素 能抑制 转录， 并与 DNA 竞 争结合 到聚合 酶上。 送表明 矿 亚 基可能 负责酶 与模板 DNA 结合。 大 肠杆菌 中最常 见的。 因子是 (jW (因 其分子 质量为 70kDa 而得 名）。 与 0 因子的 结合使 RNA 聚合酶 由核必 酶 转变为 全酶。 0 因 子在启 动子识 别中 起关键 作用， 但对 转录延 伸并不 需要。 0 因子是 通过将 核必酶 对非特 异序列 的亲和 力降低 104 倍， 同 时增加 其对启 动子的 亲和力 来帮助 启动子 识 别的。 许多原 核生物 （包 括大肠 杆茵） 有多种 0 因子。 它 们与识 别各种 类 型的启 动子序 列有关 （参见 L3)。 RNA 链 延伸至 8~9nt 时， o 因子会 从 RNA 聚合酶 中释放 出来。 然后核 必酶沿 DNA 模 板移动 并合成 不断增 长的 RNA 链。 释放 出来的 0 因子可 再与其 他核屯 、酶 结合重 新起始 转录。 细胞内 0 因 子数量 只有核 必酶的 30%。 因此在 任何时 刻只有 1/3 的聚合 酶能 W 全酶 的形式 存在。 K 原 核生物 的转录 K3 大 肠杆菌 c7" 启动子 要 点 启动 子序列 启动 子含有 RNA 聚 合酶特 异性结 合和转 录起始 所需的 保守序 列。 启动 子大小 启 动子区 域长约 40 bp。 在 这段序 列内， 有 一些对 于启动 子的功 能很 关键的 高度保 守的短 序列。 - 10 序列 - 10 序 列是几 乎所有 启动子 都含有 的一个 6 bp 的 序列。 该六聚 体通 常位于 转录起 点上游 lObp 处。 共有的 - 10 序列是 TATAATo -35 序列 -35 序 列是另 一个在 大多数 启动子 中都可 找到的 6 bp 序列 。该 六聚 体一般 位于转 录起始 点上游 35bp 处。 共有的 - 35 序列是 TTGACAo 1 转录 起始点 1 转录 起始点 处的碱 基多为 曝岭， G 比 A 更常 见。 1 启动 子效率 1 不同 启动子 序列与 不同基 因的转 录速率 都千差 万别。 可调 控的后 动子 （如 山 C 启动 子） 要结合 辅助性 的激活 因子如 cAMP 受体蛋 白 （CRP) 才能被 激活。 保守启 动子序 列的不 同类型 （如 热休克 启 动子） 只 能被含 有不同 0 因子的 RNA 聚 合酶所 识别。 相 关主题 克 隆基因 的组构 （J4) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 转 录的基 本原则 （K1) 乳糖 操纵子 （L1) 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 （K2) 不同 0 因子 对转录 的调节 （L3) 后动 子序列 RNA 聚合酶 结合到 待转录 序列上 游的特 定起始 位点， 即 启动子 部位。 尽 管识别 不同的 启动子 需要不 同的与 RNA 核心酶 结合的 C 因子， 但大肠 杆菌 中最常 见的。 因子是 (jW。 启动子 的特性 最初是 通过能 增加或 降低基 因 转录速 率的突 变来鉴 定的， 例如山 C 操纵子 （参见 L1)。 启动子 位于通 常 被称为 + 1 位点的 转录起 始位点 的上游 （参见 K1)。 按 照这一 编号方 法， 启动 子序列 编号为 负数， 反 映其在 转录起 始位点 上游的 距离。 大肠杆 菌启 动子的 突变分 析表明 只有很 短的几 个保守 序列是 启动子 行使功 能所必 需的。 居动 子大小 启 动子由 40 至 60 bp 的序列 组成。 -55 到 + 20 之间 的区域 都被聚 合酶的 结合， - 20 到 + 20 之间的 区域被 强有力 地保护 起来， 不受 DNase I 消化 （参见 J4)。 这表 明该区 域与聚 合酶紧 密地结 合从而 阻止了 K3 大 肠杆茜 启动子 185 -10 序列 -35 序列 转录 起始点 启动 子效率 核酸 酶接近 DNA。 启动 子序列 的突变 分析表 明直至 -40 位 置的区 域对于 启动 子功能 仍是必 需的。 在 - 10 和 - 35 位置 的两个 6 bp 序 列对于 大肠杆 菌 中启动 子的功 能尤其 重要。 大肠 杆菌的 启动 子中最 保守的 序列是 一个在 许多不 同的大 肠杆菌 基 因启动 子中都 存在的 6 bp 序列。 这 一序列 的中私 位于相 对于转 录起始 位点的 -10 位置 （图 K3.1)。 有时 也称这 一 序列为 Pribnow 框， 因为是 由 Pribnow 于 1975 年发 现的。 它有 一段共 有序列 TATAAT， 在比 较了许 多后动 子序列 后发现 这段共 有序列 是在各 个位置 上最常 出现的 核巧酸 。头 两 个碱基 （TA) 和 最后的 T 是最保 守的。 该六 聚体距 转录起 始位点 5 至 8 bp。 其 间的间 隔序列 是不保 守的， 但 距离很 重要。 -10 序列似 乎是聚 合 酶启动 DNA 解旋 的序列 （参见 K4)。 iTTGACAl 16-18 bp TATAAT 5-8 bp C-^T -35 序列 -10 序列 +1 图 K3.1 £. CO。 启动 子的共 有序列 （最 保守 的序列 用黑体 表示） 在 -35 位置 附近的 上游区 也有一 段保守 的六聚 体序列 （图 K3.1)。 其共有 序列是 TTGACA， 该序 列在高 效启动 子中是 非常保 守的。 该六聚 体的前 兰个碱 基最保 守的， 在 90% 的启动 子中该 序列距 -10 框有 16 至 18 bp。 在这 两个保 守元件 之间的 间隔序 列并不 重要。 90% 的 基因的 转录起 始位点 是螺岭 （图 K3.1)， G 比 A 更常见 。通 常在 起始点 核昔酸 的两侧 分别是 C 和 T 碱基 （如 CGT 或 CAT)。 上面提 到的序 列是强 启动子 中典型 的共有 序列， 但不同 启动子 的序列 之间 有很大 差异， 而且其 转录效 率相差 可高达 1000 倍。 总 的说来 不同启 动 子区域 的功能 如下： • - % 序 列组成 增强与 聚合酶 0 因子相 识别和 相互作 用的识 别区。 • - 10 序 列对于 DNA 解旋很 重要。 • 起始 位点附 近的序 列可影 响转录 起始。 最初 转录的 30 个碱基 序列也 会影响 转录。 该序 列控制 RNA 聚合酶 离开启 动子， 使 另一聚 合酶复 合物得 重 新起始 转录的 速率， 由此 影响转 录的速 率乃至 整个启 动子的 强度。 DNA 模板的 负超螺 旋可增 强转录 起始， 这 可能是 因为负 超螺旋 结构需 要较少 的能量 来解旋 DNA， 由此可 见起始 反应中 两链分 开的重 要性。 一些 启动子 序列与 通常条 件下可 被较强 转录的 共 有序列 不十分 相似。 一个 例子是 fac 启动子 它需要 一个辅 助激活 因子 CAMP 受 体蛋白 （CRP) 结合到 DNA 上一个 靠近启 动子的 位点， 186 K 原 核生物 的转录 增 强聚合 酶的结 合和转 录起始 （参见 L1)。 其 他启动 子如与 热休克 相关基 因的启 动子， 含有 只能被 与一般 (jW 的不同 0 因子 结合的 RNA 聚合 酶所识 别的不 同的共 有启动 子序列 （参见 L3)。 、 K 原 核生物 的转录 K4 转录 的起始 、延伸 与终止 要 点 启动 子结合 0 因子可 增强核 'Ll、 RNA 聚合酶 012 P P W 与启 动子结 合的特 异性。 聚 合酶通 过沿着 DNA 链滑 动并与 启动子 DNA 形 成闭合 复合物 来 找到后 动子的 - 35 序列和 - 10 序列。 DNA 解旋 1 在聚 合酶的 作用下 大约有 17 bp 的 DNA 解旋， 形 成一个 开放的 复 合物。 许 多启动 子中负 超螺旋 DNA 可增强 DNA 解旋 ，但 DNA 促旋酶 亚基基 因的启 动子却 被负超 螺旋所 抑制。 RNA 链起始 I RNA 的合 成无需 引物， 最初的 9 个核 巧酸是 在聚合 酶不沿 DNA 链移 动或者 0 因子存 在的情 况下合 成的。 RNA 聚 合酶首 先要经 过 多次无 效的链 起始， 在成功 起始之 后0因 子释放 出来， 形成一 个负责 RNA 链延 伸的四 聚体复 合物。 - RNA 链延伸 1 RNA 聚 合酶沿 DNA 链 移动， DNA 链上始 终保持 一段称 为转录 泡的解 旋区。 在转录 泡内的 RNA5' 端的 10-12 个 核巧酸 始终与 DNA 模板链 配对。 聚合酶 在转录 泡的前 方解旋 DNA， 而 在其后 方复旋 DNA。 RNA 链终止 ~1 基因 3' 端 自身互 补的序 列会在 RNA 中形 成发夹 结构作 为终止 子。 发夹 的茎部 通常有 较高的 G-C 含量， 使 其有很 高的稳 定性， 从而 使聚合 酶在此 停顿。 发 夹之后 通常是 4 个或 更多的 U 碱基， 导致 RNA 和反义 DNA 链的弱 结合。 这利于 RNA 链 的解离 ，从 而终止 转录。 依赖 P 的 转 录终止 有些 基因的 终止序 列需要 一个辅 助的蛋 白因子 P (rho) 才 能有效 地终止 转录。 P 结合 到单链 RNA 的 特定位 点上， 它水解 ATP 并 沿 RNA 链 向转录 复合物 移动， 与之 结合后 使聚合 酶终止 转录。 巧 关主题 DNA 超螺旋 （C4) DNA 复制； 概述 （E1) 转 录的基 本原则 （K1) 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 （K2) 大 肠杆茜 启动子 （K3) 原核生 物的转 录调控 （L) 真 核生物 的转录 （M) 后动 子结合 RNA 聚 合酶的 核心酶 a2 P P'w 对 DNA 有一 种非特 异性的 亲和力 ，这 被 称为松 散结合 并相当 稳定。 当 0 因子 加入核 心酶形 成全酶 之后， 全酶对 非特异 DNA 的亲和 力显著 降低达 20 000 倍； 同时 0 因子使 全酶结 合到正 确的启 动子位 点的能 力增强 100 倍。 总 的效果 就是显 著地增 强了全 酶与正 188 K 原 核生物 的转录 DNA 解旋 RNA 巧 起始 RNA 链 延伸 RNA 巧 终止 确的 启动子 结合位 点相结 合的特 异性。 在大肠 杆菌基 因组中 全酶发 现并与 启动 子结合 是很迅 速的。 这一 过程太 快了， 因此不 可能是 通过与 DNA 的 反复结 合与解 寓来实 现的， 一般认 为聚合 酶沿着 DNA 链滑 动直达 启动子 序 列处。 在启动 子处， 聚合 酶识别 双链的 -% 序列和 -10 序列。 聚合酶 与 处于碱 基配对 状态的 启动子 DNA 所 形成的 最初的 复合物 被称为 闭合复 合物。 为使反 义链实 现碱基 配对， DNA 双螺旋 必须被 聚合酶 解旋。 负超螺 旋能増 进许多 基因的 转录， 因 为它有 利于聚 合酶的 解旋。 但 是也有 一些启 动子不 能被负 超螺旋 激活， 说 明天然 DNA 拓扑构 象的区 别可能 影响转 录， 这 可能是 因为双 螺旋上 -％ 序列和 -10 序 列的空 间关系 的差异 。例 如， DNA 促旋酶 亚基基 因的启 动子就 被负超 螺旋所 抑制。 DNA 促 旋酶负 责 大肠杆 菌基因 组的负 超螺旋 的形成 （参见 C4)， 因此这 可能是 DNA 促 旋酶蛋 白表达 中的一 个精细 的反馈 调节。 DNA 的 初始解 旋导致 DNA 与聚 合 酶形成 开巧复 合物， 这一过 程被称 为紧密 结合。 几 乎所有 RNA 起始位 点都由 一个曝 吟残基 组成， 其中 G 比 A 更常 见。 与 DNA 合 成不同 （参见 E)， RNA 合成不 需引物 （图 K4.1)。 链 W GTP 或 ATP 开始， 接 着继续 链的其 余部分 合成。 聚 合酶最 先渗入 最初两 个核 巧酸， 并形 成一个 縣酸二 醋键。 最初的 九个碱 基依次 加上， 酶 并不沿 DNA 链 移动。 这九个 核巧酸 每加上 一个， 这条 链都很 有可能 被流产 。这 种无效 起始对 于转录 的配体 速率很 重要， 因为 它对于 聚合酶 要花多 长时间 离 开启动 子并允 许另一 个聚合 酶来起 始新一 轮转录 有重要 作用， 启 动子清 除 的最短 时间是 1 〜 2s， 相对 于转录 的其他 步骤， 这 是一个 较长的 过程。 起 始成功 之后， 聚合酶 释放出 0 因子， 形成 聚合酶 -DNA- 新生 RNA 的 兰聚复 合物， 使聚 合酶沿 DNA 链移动 （后 动子 •清 除）， 允 许另一 RNA 聚合 酶全酶 从启动 子处再 度起始 转录。 DNA 的 解旋区 （称 为转 录泡） 可 能和 聚合酶 一起沿 DNA 链 移动。 解旋 DNA 区域的 大小稳 定地保 持在约 17 bp (图 K4.2)， RNA 的 5' 端 与反义 DNA 链 形成约 12 bp 的杂 合双螺 旋。 这正 好小于 RNA-DNA 双 螺旋的 一圈。 大 肠杆菌 聚合酶 每秒 40 个 核昔酸 的速度 移动， 但对 于不同 的局部 DNA 序 列速度 会有所 差异。 保持 一 个短的 DNA 解 旋区表 明聚合 酶在转 录泡之 前解旋 DNA， 而在其 之后复 旋 DNA。 每加 一个核 昔酸到 RNA 链上 RNA-DNA 双 螺旋就 要旋转 一次。 民 NA 聚合 酶在到 达转录 单位末 尾的终 止序列 （终止 信号） 之 前一直 结合在 DNA 上并持 续转录 （图 K4.3)。 最常 见的终 止信号 是一个 RNA 发 夹 结构， 其中的 RNA 转 录物是 自身互 补的。 因 此这种 RNA 能形 成一个 稳 定的、 带一 个茎和 一个环 的发夹 结构。 通常 茎部结 构富含 G-C， 利于碱 K4 转录的 起始、 延伸 与终止 189 基 配对的 稳定性 （G-C 碱基 配对比 A-U 配对稳 定）。 RNA 发夹的 后面通 常跟 有一串 4 个或 更多的 U 残基。 聚合 酶在合 成发夹 RNA 后似乎 就立刻 停了 下来。 其后 的一串 U 残基 与反义 DNA 链的 相应的 A 残基配 对作用 弱， 这 有利于 RNA 与模板 DNA 链的 解离， 结果 RNA 从转 录复合 物中释 放 出来。 反义 DNA 链上 非配对 的部分 随即与 DNA 有义链 退火， 该心酶 从 DNA 上 解离。 5. 3. 灯 因子 RNA 聚合 巧 -35 -10 +1 反义 （模 板） 链 3’ 5 起始 图 K4.1 转录复 合体的 形成： 起始 与延伸 190 K 原 核生物 的转录 RNA 聚合 巧 有义链 图 K4.2 延 伸过程 中转录 泡的结 构简图 费 图 K4.3 不依赖 P 的转 录终 止简图 依赖 P 的 尽管 RNA 聚合酶 可在紧 跟一串 U 残基的 发夹结 构处自 行终止 转录， 转 录终止 但有的 终止位 点并不 形成强 的发夹 结构， 须用一 种辅助 因子即 P 蛋白 来帮 助转录 终止。 P 是 一个六 聚体蛋 白质， 在 有单链 RNA 存在时 可水解 ATP。 K4 转录的 起始、 延伸 与终止 191 这个蛋 白似乎 能结合 RNA 上一串 72 个核 昔酸， 这 可能通 过识别 一种特 定 的结构 特征， 而 不是某 个共有 序列。 P 沿新生 RNA 链向 转录复 合物移 动， 能使 RNA 聚 合酶在 P 依赖性 终止子 处终止 转录。 像 不依赖 P 的终止 子 一样， 这 些信号 是在新 合成的 RNA 链中 而不是 在模板 DNA 链 中被识 别的。 有时 P 依赖性 的终止 子有发 夹结构 但缺少 之后的 不依赖 P 终 止所必 需 的一串 U 残基。 (程 凌译 李文 悬校） w r 贫 #：» 巧巧拉 巧这 乂茸 》 个巧: 啤‘若 似 I 合於 •與 需巧自 巧个巧 入’‘ ## 、台 H 於 巧巧巧 AW! 姜巧 《9 * 巧斗旁 華杂蒂 •巧 WIP 芳惡 A 々巧 9 巧 巧不巧 。策钟 it# 公千 劝 々兹 满每巧 A、 ’>i ‘典游 ’ I 联 讓 WS 中 S —‘ > 条化 ’Jjl 一询需 巩 社％ ll 巧 9»巧 。… ， 。 巧岭 .护如 皆-询 /}•''•' fllD^ 诗 义《舞任.々 F (妨 ♦文牟 々: 、一. _ 一 K 生* ^ • 叫? 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CO。 聚合 酶中的 a 亚基 具有同 源性。 另 外还有 五种亚 基在 这兰种 聚合酶 中是共 同的， 剩下 的其他 的亚基 是各种 聚合酶 所特 有的。 真 杖生物 RNA 聚合酶 的活性 像原 核生物 RNA 聚合酶 一样， 真 核生物 的聚合 酶也不 需要引 物， 沿 5' 至 3' 方 向合成 RNA。 与细菌 聚合酶 不同的 是在与 DNA 结 合时需 要辅助 因子。 RNA 聚合酶 n 的最 大的亚 基在綾 基端有 走个 氨基酸 的重复 序列， 被 称为緩 基末端 结构域 （ carboxyl- terminal domain, CTD) , 序列 Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 在鼠的 RNA 聚合酶 11 中重复 52 次， 并 且被縣 酸化。 相 关主题 蛋白质 分析法 （B3) 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 （K2) RNA 聚合酶 I 基因： 核糖 体重复 （M2) RNA 聚 合酶田 基因： 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 （M3) RNA 聚 合酶日 基因： 启 动子与 增强子 （M4) 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 n 的起始 （M5) 转录调 控实例 （N2) RNA 聚合薛 n 的 CTD 真 核生物 真核 生物的 转录机 制与原 核生物 相似， 然 而与真 核生物 转录机 制相关 RNA 聚合 的 大量多 化的参 与使真 核生物 RNA 聚合酶 显得更 复杂。 兰种 不同的 RNA 酶 聚 合酶复 合体负 责不同 类型真 核生物 基因的 转录。 不同的 RNA 聚 合酶可 206 M 真 核生物 的转录 RNA 巧合 酶亚基 真 核生物 RNA 巧合 酶 的巧性 RNA 巧合 酶 n 的 CTD W 依据 在色谱 层析柱 上被洗 脱下来 的不同 盐浓度 而区分 （参见 B4)。 同时 也 可利用 每一种 RNA 聚合 酶对真 菌毒素 —— a -鹤膏 章碱有 着不同 的敏感 性 来区分 它们的 活性。 • RNA 聚合酶 I (RNAPol I ) 转录 大部分 rRNA 的 基因， 存在 于核仁 中， 并对 a- 鹤膏 章碱不 敏感。 • RNA 聚 合酶日 （RNAPol 日） 转录所 有的编 码基因 和一些 snRNA 基 因， 存 在于核 质中， 对 a- 鹤膏章 碱非常 敏感。 • RNA 聚 合酶田 （RNA Pol m ) 转录 t 民 NA、 5S rRNA 和 U6 snRNA 的 基因 W 及其 他一些 小分子 RNA， 也存 在于核 质中， 对 a- 鹤膏章 碱中度 敏感。 除 了这些 核中的 酶外， 真核 生物的 细胞还 在线粒 体和叶 绿体中 含有其 他聚 合酶。 所有这 兰种聚 合酶都 是含有 12 个或 更多亚 基的大 分子。 编 码每一 RNA 聚合酶 的两个 大亚基 （相 关的 DNA 编码 序列） 具有同 源性。 这兰种 真核 生物聚 合酶都 含有与 £ . CO" 核私 RNA 聚合酶 (3 P' 亚 基相同 源的亚 基 （参见 K2)。 每一真 核生物 RNA 聚合 酶中的 最大亚 基与丘 .CO。 聚合酶 中的 亚基 相似， 第二大 亚基与 E.coZz •的含 有活性 位点的 P 亚基 相似 。这 一活 性位点 同样存 在于第 二大亚 基中， 证明了 这种同 源性在 功能上 的重要 性。 在 RNA 聚合酶 I 与 聚合酶 田中共 存两个 亚基， 另一个 RNA 聚合酶 n 专有 亚基与 E.CO。 RNA 聚 合酶的 a 亚基 具有同 源性。 至 少还有 五种小 亚基普 遍存在 于这兰 种不同 的聚合 酶中， 此外 仅存于 某一特 定聚合 酶中的 亚 基还有 4 〜 7 个。 与细菌 RNA 聚合酶 一样， 每种 聚合酶 都沿着 5' 至 3' 方 向催化 转录， 并合成 与反义 模板链 互补的 RNA。 这一 反应需 要前体 核脊酸 ATP、 GTP、 CTPW 及 UTP， 不需 要转录 起始的 引物， 不同 于纯的 细菌聚 合酶， 纯的 真 核生物 RNA 聚合 酶在与 启动子 结合、 起 始转录 之前， 需 要一些 额外的 起始 蛋白的 参与。 在 RNA 聚合酶 n 的援 基端含 有一段 7 氨 基酸的 序列。 该序列 在鼠的 聚合酶 中重复 52 次， 在酵母 中重复 26 次。 这一^;：化序列为 Tyr-Ser-Pro* Thr-Ser-Pro-Ser, 被称 作筵基 末端结 构域即 CTD， 对酶活 性是必 需的。 CTD 序列可 在丝氨 酸和某 些络氨 酸处踞 酸化。 体外 研究表 明在转 录起始 时， CTD 被去縣 酸化， 但 在转录 延伸过 程中， 随着 RNA 聚 合酶解 离启动 子时， 又被縣 酸化。 因为 RNA 聚合酶 n 催化 所有真 核生物 编码基 因的转 录， 可见 该酶对 于研究 特异基 因的表 达非常 重要。 现 已发现 CTD 是转录 延 伸过程 中特异 激活的 一个重 要标兜 （参见 M5 与 N2)。 M 其 巧生物 I 的转录 M2 RNA 聚合酶 I 基因； 核搪 体重复 一一 •♦八 八 •♦一 一*々 •々八 •*•々 •々 S 要 点 杖仁 的作用 RNA 聚合禱 I 层动子 上游结 合因子 选择 因子 1 TBP 与 TAFi 巧 关主题 前 rRNA 转录 单元含 有编码 18S、 58S 和 28S rRNA 的兰段 序列， 在 基因组 中成簇 排列， 中间 被非转 录的间 隔序列 分开。 前 rRNA 由 RNA 聚合酶 I ( RNA Pol I ) 在 核仁中 合成。 rRNA 基 因排列 成环一 起组成 核仁， 也就是 熟知的 核组织 区域。 前 rRNA 启动子 由两个 转录控 制区域 组成。 转录起 始位点 包含于 核私元 件上， 上游调 控元件 （UCE) 长约 50 个 碱基， 开始于 - 100 位 点处。 上游结 合因子 （UBF) 与 UCE 结合， 同时 也可结 合到核 必元件 上游的 不同位 点上， 使 得两位 点间的 DNA 形 成环状 结构。 选 择因子 1 (SL1) 与 UBF-DNA 复合 物结合 并使其 稳定， 然后 RNA 聚合酶 I 再结合 进来， 并起始 转录。 SL1 由四 个亚基 组成， 其 中包括 TATA 结 合蛋白 （TBP)。 TBP 为所有 3 种 RNA 聚 合酶起 始转录 所需。 其他 一些因 子是民 NA 聚合酶 I 所 特异的 TBP 相关 因子， 被称作 TAFi。 Acanthamoeba 含有 一个简 单的转 录调控 系统， 包 括一个 单一的 控制 元件和 一个单 一因子 TIF- 1， 这些为 RNA 聚合酶 I 的结合 及在 rRNA 启动 子上的 起始所 必需。 基因组 复杂度 （D4) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 (K2) 兰种 RNA 聚合酶 :性质 与功能 (Ml) 大 肠杆菌 (jW 启动子 （K3) rRNA 加工与 核糖体 （01) 巧巧体 RNA 聚合酶 I 负责 rRNA 在 分裂间 期的连 续合成 。人 类细胞 在不同 RNA 基因 染 色体上 分布有 5 簇 rRNA 重复 基因， 每簇 大约有 40 个 拷贝的 rRNA 基 因 （参 见图 M2.1 与 D4)。 每一 rRNA 基因产 生一个 45S 的 rRNA 转录 物， 长约 13 OOOnt (参见 D4)。 这 一转录 物随后 被切成 28S RNA (5000nt)、 18S (2000nt) 和 5.8S (160nt) rRNA 各一个 （参见 Ol)。 这 种 RNA 多基 因拷贝 的连续 转录是 产生足 够量且 加工的 rRNA、 进 而包装 进核 糖体所 必需。 208 M 真 核生物 的巧录 核仁 的作用 RNA 聚合 酶 I 启动子 上游 结合因 子 18S 5.8S 28S 单转 录单元 未转 录的间 厢 DNA 串 联拌列 图 M2.1 核搪体 RNA 转 录单元 每一 rRNA 簇被称 为一个 核组织 区域， 因 为核仁 内含有 与该基 因簇相 对应的 DNA 的 大环。 经 有丝分 裂形成 一个细 跑后， 重新开 始合成 rRNA, 并在 rRNA 基因所 在的染 色体部 位出现 小核仁 。在 rRNA 合成的 活跃阶 段， 前 rRNA 转 录物与 rRNA 基因 捆扎在 一起可 在电子 显微镜 下看到 "圣 诞树" 样的 结构。 在 这些结 构中， RNA 转 录物与 DNA 被 紧密地 裹在一 起， 并从 DNA 上垂直 突出。 可 在基因 起始处 观察到 短的转 录物， 它逐 渐伸长 直至转 录单元 末端， 这可 从 RNA 转录物 消失的 现象中 得到暗 巧 0 哺乳动 物的前 rRNA 基因启 动子由 两部分 的转录 控制区 域构成 （图 M2. 2)。 核 必元件 包括转 录起始 位点， 跨越 -31 到 + 6 区域。 送一 序列为 转 录所必 需的。 另 一大约 50 〜 80 个 碱基区 域称作 上游控 制元件 （UCE)， 从 起始上 游大约 lOObp 处 （-100) 起始。 与核必 元件单 独作用 相比， UCE 的存 在使转 录效率 提高了 10 〜 100 倍。 图 M2. 2 哺乳 动物前 rRNA 启动子 的结构 上 游结合 因子或 UBF 是一 种特异 DNA 结合 蛋白， 可 W 与 UCE 结合。 除了与 UCE 结 合外， UBF 还可 与核心 元件上 游的一 段序列 结合。 两个 UBF 结合 位点的 序列间 没有明 显的相 似性。 一般 认为 UBF 的一个 分子结 合一 个序列 元件。 随 后两个 UBF 分子可 通过蛋 白-蛋 白相互 作用而 相互结 合， 导致 在两个 结合位 点间的 DNA 形成 一个环 状结构 （图 M2. 3)。 当 UBF 缺 乏时可 W 观察到 低水平 的本底 转录， 而在 UBF 存 在下， 转 录速率 M2 RNA 聚合 巧1 基因： 核糖 体重复 209 选 择因子 1 会大大 增强。 UCE 核也 图 M2. 3 rRNA 转录起 始的图 解模型 选 择因子 （SL1) 为 RNA 聚合酶 I 转录所 必需。 SL1 结合 并稳定 UBF-DNA 复 合物， 且与核 必元件 游离的 下游部 分相互 作用。 SL1 的结合 使得 RNA 聚合酶 I 能与 上述复 合物结 合并起 始转录 ，对 rRNA 转 录非常 重要。 210 M 真 核生物 的转录 TBP 和 TAF, 其他 rRNA 基因 研 究发现 SL1 含 有多个 亚基， 其 中包括 被称作 TBP 的蛋白 （TATA 结合蛋 白）。 TBP 为所有 兰种真 核生物 RNA 聚 合酶起 始所需 （参见 Ml、 M3 和 M5)， 似乎 是真核 生物转 录过程 中的一 个关键 因子。 SL1 的 其他呈 个亚 基属于 TBP 相 关因子 或称为 TAF， 为 RNA 聚合酶 I 转录所 需的亚 基 被称为 TAFi。 在 一 ■个简 单的真 核生物 Acanthamoeba rRNA 基 因的转 录起始 点上游 大约 12 〜 72 个 碱基处 的启动 子区域 内有一 个单一 的控制 元件， 被称作 TIF- 1 的 因子是 SL1 的同 源物， 与该 位点结 合后， 方可让 RNA 聚合 酶 I 结合 进来， 从 而起始 转录。 当聚合 酶沿着 DNA 远离起 始位点 的方向 移 动时， TIF-1 因 子仍与 DNA 处于 结合的 状态， 这 样会让 另一聚 合酶的 起始进 入转录 的多轮 循环。 因此这 是一个 非常简 单的转 录控制 系统。 而在 脊椎 动物中 好像已 经进化 产生了 另一个 UBF， 该因子 负责将 SL1 的特异 序列 引向启 动子。 M 真 巧生物 的转录 M3 RNA 聚 合酶] I [基 因； 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 要 点 RNA 聚合酶 面1 RNA 聚合酶 in (RNAPol 田） 由 16 个 或更多 的亚基 组成， 存在 于核 质中， 负 责转录 5S rRNA 的 前体、 tRNA W 及其他 snRNA 和胞质 RNA。 tRNA 基因 I 称作 A 框和 B 框的 两个 转录控 制区位 于转录 起始点 的下游 ，其 序列 不仅是 tRNA 中 的保守 序列， 也是 DNA 启动 子中的 保守序 列。 TF 田 C 与 tRNA 启动 子中的 A 框和 B 框 结合； TF 田 B 与 TF 中 C-DNA 复合体 结合， 并与 TF 田 C 结合 位点 上游的 DNA 相 互 作用。 TF 田 B 含 有兰个 亚基即 TBP、 BRF 和 B"， 并引导 RNA Pol 田 的结合 而起始 转录。 5S rRNA 基因 1 5S rRNA 基因串 联成簇 排列， 5S rRNA 启动 子含有 2 个保 守框即 C 框和 A 框。 C 框位于 起始位 点下游 81 〜 99 个碱 基处， 而 A 框 则位 于起始 位点下 游大约 50 〜 65 个碱 基处。 TF 田 A 牢固 地结合 在 C 框启 动子序 列上， 接着 TF 田 C 与 TF 田 A-DNA 复合体 结合， 并与 A 框序 列相互 作用。 这一 复合体 形成后 TF 田 B 才能 结合进 来， 吸收 聚合酶 并起始 转录。 可变的 RNA 聚 合畴田 启动子 RNA 聚合韓 田 的终止 巧 关主题 许多 RNA 聚合酶 in 启动子 可被其 上下游 序列所 调控， 而 其他启 动 子仅需 要上游 序列， 包括 TATA 框 及在 RNA 聚合酶 D 启动 子 中存在 的其他 序列来 调控。 RNA 聚合酶 可在无 辅助因 子参与 下终止 转录， 一串 A 残基 常足 W 终止 转录。 大 肠杆茜 RNA 聚合酶 （K2) tRNA 结构 与功能 （P2) 兰种 RNA 聚 合酶： 性质 与功能 （Ml) RNA 聚合酶 I 基因： 核糖 体重复 （M2) RNA 聚合酶 n 基因： 启 动子与 增强子 （M4) 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 n 的起始 （M5) rRNA 加工与 核糖体 （01) RNA 聚合 RNA 聚 合酶田 （RNAPol 田） 是一个 至少由 16 个不同 亚基组 成的复 酶曲 合体， 与民 NA 聚合酶 n 相同 位于核 质中。 RNA 聚合酶 in 负责 5S rRNA 的 前体、 tRNA W 及其他 snRNA 和胞质 RNA 的 转录。 212 M 真 巧生物 的转录 tRNA 基因 来自 tRNA 基因 的最初 转录物 是被加 工成成 熟的前 RNA 分子 （参见 02) 0 tRNA 基因的 转录控 制区位 于转录 单元内 的转录 起始位 点之后 。在 DNA 编码的 tRNA 的 DNA 中有两 个高度 保守的 序列， 即 A 框 （S'-TG- GCNNAGTGG-3') 和 B 框 （5'- GGTTCGANNCC - 3')。 该序列 同时也 是 一编码 tRNA 自身 的重要 序列， 即编码 tgNA 的 D 环和 T'lM： 环 （参见 P2)o 这 意味着 tRNA 内的高 度保守 序列同 也 是高度 保守的 启动子 DNA 序列。 / ->—1. 、 TFHIC 图 M3.1 真 核生物 tRNA 后动 子转录 的起始 由 DNA 聚 合酶田 起始 tRNA 基因 转录所 需的两 个复杂 DNA 结合因 子已 被鉴定 出来， 即 TFlllB 和 TF 皿 C (图 M3.1)。 TF 曲 C 可与 tRN A 启 动子的 A 框和 B 框结 合， TFDIB 则可与 A 框 50bp 上 游序列 结合。 TF 田 B 由兰 个亚基 组成， 其中 一个是 TBP， 为兰种 RNA 聚合 酶所需 （参见 M2 和 M5)。 第二 个亚基 被称作 BRF (TFIIB 相关 因子， 因 为它与 RNA 聚合 酶口起 始因子 TFDB 同源， 参见 M5)。 第 兰个亚 基称作 B"。 TF 田 B 没有 ANA Pol 田 TF 田 C M3 RNA 聚合 SI 田 基因： 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 213 5S rRNA 基因 序列特 异性， 因此 它的结 合位点 似乎由 TF 田 C 与 DNA 结 合的位 置所决 定。 TF 田 B 可使 RNA 聚合酶 in 结 合进来 并起始 转录。 一旦 TF 田 B 结合 后， TF 田 C 可在 不影 响转录 的情况 下解离 出去。 因此 TF 田 C 是一 个为起 始因子 TF 田 B 定位 的装配 因子。 图 M3. 2 真 核生物 5S rRNA 启动 子转录 的起始 RNA 聚合酶 in 转录核 糖体大 亚基的 5S rRNA 部分， 是 惟一单 独被转 录的 rRNA 亚基。 与 RNA 聚合酶 I 转录的 另一些 rRNA 基 因一样 ， 5S 214 M 真 核生物 的转录 rRNA 基因 也是串 联排列 在基因 簇中。 在人 类基因 组中， 有一个 大约由 2000 个 基因组 成的基 因簇。 5S rRNA 基 因的启 动子上 含有一 个称为 C 框 的内 部控制 区域， 它 位于转 录起始 点下游 81-99 碱 基处， 而另一 个位于 + 50 至 + 65 间 的称为 A 框 的序列 也非常 重要。 5S rRNA 启 动子的 C 框是一 个特异 DNA 结合蛋 白 TF 田 A 的结 合位点 (图 M3. 2)。 TF 田 A 作为 装配因 子使得 TF 田 C 可与 5S rRNA 启动 子相互 作用。 A 框也可 能稳定 TF 田 C 的结 合， 在一个 相对于 tRNA 启动 子起始 位点 的等同 位置， TFinC 与 DNA 结合 。——旦 TFinC 结合， TF 田 B 就能 与 复合体 起作用 并促使 RNA 聚 合酶田 的结合 而起始 转录。 可变 RNA 许多 RNA 聚合酶 in 基 因也受 上游序 列作用 来调控 其自身 转录。 一些 聚合酶 11 启动 子诸如 U6 小核 RNA (U6 snRNA) 和 来自非 洲淋己 瘤病毒 中的小 启动子 RNA 基因 只使用 其转录 起始位 点上游 的调控 序列。 U6 snRNA 的 编码区 有一个 独特的 A 框， 但该序 列并不 为转录 所需。 U6 snRNA 上游序 列含有 RNA 聚合酶 n 启动子 的典型 序列， 其中 包括一 个位于 - 30 〜 - 23 喊基处 的 TATA 框 （参见 M4)。 在这些 启动子 中也与 许多由 RNA 聚合酶 n 所转 录的 URNA 基因 一样， 存在一 些上游 转录因 子结合 序列。 送些现 象表明 一般 的转录 因子可 W 调节 RNA 聚合酶 n 和 RNA 聚合酶 田 基因。 RNA 聚合 RNA 聚合酶 m 转录 的终止 似乎仅 需要聚 合酶识 别一个 简单的 核巧酸 酷皿 的终止 序列 。该 序列由 成簇的 dA 残基 构成， 其终 止效率 受到周 围的序 列的影 响。 例如 5' - GCAAAAGC - 3' 序列 就是在 Xerwpus borealis 体 细胞中 5S rRNA 基 因的一 个有效 的终止 信号。 M 真 巧生物 的转录 M4 RNA 聚合酶 I 基因； 启 动子与 增强子 要点 RNA 聚合酶 n (RNA Poll!) 催化所 有编码 基因的 mRNA 前体 的 合成。 RNA 聚合酶 n 转录 的前 mRNA 须经过 加帽、 加 尾和剪 接 等加工 过程。 ~~ I 许多 RNA 聚合酶 n 启动 子都 含有一 个称做 TATA 框 的序列 ，该 序 列位于 起始位 点上游 25 〜 30 碱 基处。 其 他的基 因含有 一个与 起始位 点重叠 的起始 元件， 这 些元件 为基本 转录复 合体形 成和转 录起始 所需。 RNA 聚合 磅日 上游调 控元件 1 启动 子上游 100 〜 200bp 内的元 件通常 是有效 转录所 需的， 例如 SP1 的 CCAAT 框。 ~~ 导否字 ~~ I 能从 启动子 的上游 或下游 数千个 bp 处来激 活转录 的序列 元件称 为增 强子。 增 强子可 W 是组 织特异 性的， 也可 具有广 泛的活 性， 并拥 有多种 基序。 从极 长的增 强子元 件到较 短的启 动子元 件， 其 内均存 在一系 列连续 的调控 元件。 相 关主题 大 肠杆菌 0^ 启动子 （K3) RNA 聚合酶 I 基因： 核糖 体重复 （M2) RNA 聚 合酶田 基因： 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 （M3) 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 n 的起始 （M5) 真核生 物的转 录因子 （N1) mRNA 力口 工、 hn 民 NP 与 snRNP (03) RNA 聚合 RNA 聚合酶 n 位于核 质中， 负责 所有编 码基因 和一些 snRNA 基因的 酶 1 转录。 前 mRNA 合成之 后要经 过一系 列加工 过程， 包括在 RNA5' 端生成 帽子 结构、 在 3' 端加上 poly (A) 尾己 W 及 剪接掉 内含子 （参见 03)。 后动子 很 多真核 生物的 启动子 含有一 个称做 TATA 框的 序列， 位于转 录起始 位点上 游大约 25 〜 35bp 位置 （图 M4.1)。 TATA 框有 7 对共 有碱基 序列； 5'- TATA (A/T) A (A/T) -3'， 现 在已经 知道与 TATA 框结合 的蛋白 TBP 结合 8 对 碱基， 包括一 对颖外 的下游 碱基， 这 一碱基 对是什 么并不 重要 （参见 M5)。 TATA 框的作 用与丘 .CO。 启 动子的 -10 序 列相似 ，决 定 RNA 聚合酶 n 的位 置或 正确起 始转录 （参见 K3)。 TATA 框与 转录起 始位点 之间的 序列并 不重要 ，而 TATA 框周 围的碱 基序列 却非常 关键。 216 M 真 核生物 的转录 上游 调控元 件 巧强子 不过 TATA 框与转 录起始 位点之 间的距 离也很 重要。 转录 起始位 点的大 约 50% 是 W 嗦吟 碱基 开始。 増强子 / 上游 元件 图 M4.1 含有 TATA 框的 RNA 聚合酶 n 启动子 某 些真核 基因仅 含有一 个起始 元件， 而不是 TATA 框。 该起 始元件 位于 转录起 始位点 附近。 许 多起始 元件在 -1 位置是 C， 在 + 1 位置是 A。 还有一 些启动 子既无 TATA 框又 无起始 元件， 这些 基因通 常转录 速率很 低， 其转 录起始 可发生 在长至 200bp 内的 不同起 始点。 这些 基因通 常在起 始位 点上游 100~200bp 范围内 含有一 段富含 20~50bp 的 GC 区。 位 于启动 子上游 的其他 元件可 [极 大地提 高基本 启动子 的低水 平转录 活性， 这 些元件 在许多 基因中 存在， 这 些基因 在不同 的组织 中表达 水平相 差 很大。 两个 常见的 例子是 SP1 框和 CCAAT 框， 前 者在很 多基因 的上游 单独存 在或与 TATA 框一道 存在。 启 动子可 W 含有上 述序列 的一个 、两 个 或多个 拷贝。 这些 通常位 于启动 子上游 100 〜 200bp 范围 内的序 列被称 为 上游调 控元件 （UREs), 在确 保后动 子的有 效转录 方面起 着重要 作用。 许多真 核生物 启动子 的转录 可被远 离转录 起始位 点数千 个碱基 的调控 元件所 增强， 这 一调控 元件被 称为增 强子。 这一 现象最 巧是在 DNA 病毒 SV40 基因 组中发 现的， 来自 SV40 DNA 的约 lOObp 的 序列， 即使 处于上 游很远 的位置 也能显 著增强 基本启 动子的 转录。 增 强子的 特征是 100 〜 200bp 长， 含有多 个对增 强子总 体活性 起作用 的序列 元件， 这些元 件或是 广 谱的， 或是 细胞类 型特异 性的。 一 般来说 增强子 具有下 列共同 特性； - 赋 予其相 连基因 从正确 的起始 位点的 强转录 活性； - 不 管位于 其连接 的基因 的上游 或下游 任一方 向上均 可激活 转录； - 无 论是上 游还是 下游， 可在 远离起 始位点 Ikb (上发 挥 作用； • 优先激 活两个 串连的 启动子 中距离 最近的 一个。 然而， 随 着更多 的增强 子和启 动子被 鉴定， 现已 发现上 游启动 子和增 强 子元件 在结构 和功能 上均有 重叠。 在 传统的 增强子 元件与 那些具 有方向 特异性 的启动 子元件 之间似 乎存在 一个连 续体， 必须 放在靠 近启动 子的位 置 才有增 强转录 活性的 作用。 M 真 核生物 的转录 M5 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 I 的起始 要 点 一系 列复 杂的基 本转录 因子， 具有与 RNA 聚合酶 日启动 子结合 并一 起起始 转录的 特征。 而这 些因子 及其组 成亚基 正在被 逐个鉴 定， 它们 最初被 命名为 TFU A、 TFDB、 TFnC 等。 TFE D 与 TATA 框 结合， 是由 TATA 结 合蛋白 （TBP) 与被称 做 TBP 相关 因子或 TAFn 的多 辅助因 子构成 一个多 蛋白复 合体。 TBP 是所 有兰种 RNA 聚合酶 转录起 始所需 的转录 因子。 该因子 有一 个可与 TATA 框处的 DNA 小沟 结合的 马鞍型 结构， 可使 DNA 解 旋并引 入一个 45° 的 弯曲。 TFH a TFIIA 可增强 TFDD 与 TATA 框的 结合。 TF^A似乎可l^中 止抑制 因子与 TFDD 的 结合， 否则 这些抑 制因子 会进一 步阻碍 转录复 合体的 组装。 TFIIB 与 TFDD 结合， 并为 RNA 聚 合酶结 合起一 个桥梁 作用。 RNA 聚 合酶与 TFD F 相连的 复合体 结合。 TF 口 E 与 RNA 酶 的结合 RNA 聚合酶 日 的基 本巧录 因子 TFD D RNA 聚合酶 进入 之后的 结 合因子 TFU H 作用下 的 CTD 诗酿化 RNA 聚合 酶进入 之后， TFIIE、 TFIIH 和 TFDJ 按一定 的结合 顺序与 转录复 合体相 结合。 这些蛋 白都是 体外转 录所必 需的。 TFIIH 使 RNA 聚合酶 n 的證 基末端 结构域 （CTD) 憐酸化 ，结 果 导致聚 合酶复 合体的 形成。 起 始巧录 复合休 TBP 在 另一个 DNA 结 合蛋白 的作用 下被添 加到含 起始子 的启动 子上， 然后 TBP 就能 W 类似含 TATA 框 的启动 子机制 起始转 录。 相 关主题 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 （K2) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 兰种 RNA 聚 合酶； 性质 与功能 （Ml) RNA 聚合酶 I 基因： 核糖 体重复 （M2) RNA 聚 合酶田 基因； 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 （M3) RNA 聚合酶 n 基因； 启 动子与 增强子 （M4) 真核生 物的转 录因子 （N1) 转录调 控举例 （N2) 218 M 真 核生物 的转录 RNA 聚合 一系 列核转 录因子 已经被 鉴定、 纯化与 克隆。 这些多 亚基因 子均为 酶 n 的基本 RNA 聚合酶 n 启动 子序 列进行 体外基 本转录 的起始 所需， 且被命 名为转 巧 录因子 录因子 DA、 DB (TFIIA、 TFEB) 等等。 现已证 明它们 W 特定 的顺序 在基本 启动子 上组装 （图 M5.1)， 且可能 受到不 同水平 的调控 （参见 N1)。 TATA 框 图 M5.1 RNA 聚合酶 n 转录 起始复 合体在 一含有 TATA 框的启 动子上 的组装 M5 通 用转录 因子与 RNA 聚合 iln 的起始 219 TFKD TBP TFI A TF 1 B 与 RNA 酶的 奸 A 7 口 D RNA 聚合 酷进 入之后 的结 合因子 在含有 TATA 框 的启动 子上， RNA 聚 合酶日 转 录因子 TFD D 负责与 这 个关键 的启动 子元件 结合。 TFU D 与 TATA 框的结 合是在 RNA 聚合 酶 n 转录 起始 复合体 形成的 早期。 TFIID 是多 蛋白复 合体， 复合 体中只 有 一条多 肤链即 TATA 结 合蛋白 （TBP) 与 TATA 框 结合， 该复 合体还 含 有其他 多肤如 TBP 相 关因子 （TAFu)。 有 迹象表 明哺乳 动物细 胞中， 是 TBP 与 TATA 框 结合， 接 着至少 8 个 TAFu 加入进 来形成 TFU D。 TBP 在真核 生物兰 种转录 复合体 （SL1、 TF 田 B 和 TFIID) 中都存 在， 在转 录起始 中起重 要作用 （参见 M2 和 M3)。 TBP 是一 个单体 蛋白， 所有被 分析过 的真核 生物的 TBP 都有 一个由 180 个 残基构 成的非 常保守 的装基 末端结 构域， 泣个 保守的 结构域 在体内 转录中 的作用 与全长 蛋白所 起作用 相同。 不 太保守 的装基 末端结 构域的 功能还 不完全 了解。 TBP 有 一个完 全二元 对称的 马鞍型 结构， 但 分子的 两半却 不完全 相同。 TBP 作 用于 DNA 小沟， 结果 马鞍型 结构的 内部与 DNA 的 TATA 框 结合， 其蛋 白 的外表 面便可 与其他 蛋白因 子相互 作用。 TBP 的 结合使 DNA 变形 ，导 致 DNA 弯进马 鞍型的 内部并 解链。 这 样就在 TATA 框 8 个 碱基的 头两个 与最 后两个 碱基对 之间形 成一个 45’ 的 扭结。 虽然在 TATA 框结合 的区域 内发生 突变的 TBP 具有为 RNA 聚合酶 I 和田 转 录所需 的功能 （参见 M2 和 M3)， 但它 却抑制 RNA 聚合酶 n 的转录 起始。 这 表明另 有两个 聚合酶 利用 TBP 起始 转录， 但是 TBP 在这 些复合 体中的 确切作 用仍不 清楚。 TFI A 与 TFIID 结合， 并增强 TFD D 与 TATA 框的 结合， 稳定 TFD D-DNA 复 合体。 TFn A 至 少由兰 个亚基 组成。 在 体外转 录研究 中， 在 TFIID 得到纯 化后， 就不 再需求 TFIIA 了。 在完 整的细 胞中， TFD A 似乎能 抵消抑 制因子 诸如与 TFD D 相关的 DR1 和 DR2 的 作用， 很可能 TFD A 与 TFIID 结合 结果阻 碍了这 些抑制 因子的 结合， 让 组装过 程得 W 继续。 一旦 TF n D 结合到 DNA 上， 另 一个转 录因子 TF I B 就会与 TF 11 D 结合， 而 TFIIB 又可与 RNA 聚合酶 结合。 这 似乎是 转录起 始中重 要的一 步， 因为 TFD B 起一 个允许 聚合酶 和另一 个因子 TFIIF 加 入到复 合体中 来 的桥梁 作用。 RNA 聚合 酶结合 之后， 另兰 个转录 因子， TFIE、 TFI[H和TF丑J 迅 速结合 到复合 物上。 这些 蛋白是 体外转 录所必 需的， 并与 复合体 按一定 次序 结合。 TFIIH 是一个 至少由 五个亚 基组成 的大复 合体。 TFnj 的特 性还有 待全面 鉴定。 220 M 真 核生物 的转录 TF 丑 H 作 用下的 CTD 踞酸化 起 始转录 复合体 TFDH 是一 个大的 既有激 酶活性 又有螺 旋酶活 性的多 组分蛋 白复合 体。 TFUH 的 活性在 于导致 RNA 聚合 酶的錢 基末端 结构域 （CTD) 的縣 酸化 （参见 Ml)。 这种 稱酸化 的结果 导致了 RNA 聚 合酶复 合体的 形成， 并 且允许 RNA 聚合 酶离开 启动子 区域。 因此 TFD H 看来 在转录 延伸的 调控上 具有非 常重要 的功能 （参见 N2 中的 Tat 蛋白功 能）。 TFUH 的组 成成 分对于 DNA 修复 及调控 细脑周 期的细 胞周期 依赖性 激酶复 合体的 憐酸 化也很 重要。 许 多不含 TATA 框的 RNA 聚合酶 D 含有 与其起 始位点 重叠的 起始元 件。 在这 些启动 子上， 似乎 TBP 是通 过另一 可与起 始元件 结合的 DNA 结 合蛋 白而被 添加到 启动子 上的， 接着 一种 类似于 在含有 TATA 框的启 动子上 发生的 方式来 吸收别 的转录 因子和 RNA 聚 合酶。 (郑 巧译 李文 君化） N 真巧生 物的转 录调挖 N1 真核生 物的转 录因子 转录因 子的分 子结构 由二个 结构域 组成， 一 部分用 来结合 DNA， 另一 部分用 来激活 转录。 一些转 录因子 还有二 聚体结 构域。 - 螺 旋-转 角-螺 旋这样 的结构 域存在 于原核 生物的 DNA 结合蛋 白如乳 糖阻抑 蛋白同 源异型 框序列 编码的 60 个 氨基酸 的结构 域中。 两个 a- 螺 旋由一 个特定 角度的 P- 转角 分开， 其中用 于 认别的 a- 螺旋与 DNA 发 生相互 作用。 • 轉指结 构域有 二种， 一种 是通过 二个半 化氨酸 和两个 组氨酸 残基 与巧离 子结合 形成的 C2H2 型， 另一种 是通过 4 个 半脫氨 酸 残基与 巧离子 相连的 C4 型。 C2H2 型的 巧指与 DNA 结合需 要 兰个或 更多的 "手 指"， 而 C4 型则 成对 出现， 1=^二 聚体的 形式与 DNA 结合。 • 碱性 结构域 （basic domain) 是 与亮氨 酸拉链 W 及 螺旋- 环-螺 旋 （helix- loop-helix, HLH) 二聚 体结构 域相结 合的， 碱性结 构 域一般 W 二 聚体的 形式与 DNA 结合。 • 在 亮氨酸 拉链的 a -螺旋 区内疏 水亮氨 酸精确 地相距 7 个氨基 酸 残基， 这样在 a- 螺旋 的某一 侧面， 每 两圈就 会出一 个亮氨 酸。 两个 单体的 蛋白通 过亮氨 酸的相 互作用 实现二 聚化。 • HLH 蛋白 有两个 a- 螺旋， 中间被 非螺旋 的肤环 隔开。 C 端 a- 螺旋 某一面 的疏水 氨基酸 残基可 W 进行 二聚。 和亮 氨酸拉 链 一样， HLH 基序通 常与为 DNA 二聚化 所需的 N 端 碱性结 构域 相邻。 • 许多 转录激 活因子 都含有 由高比 例酸性 氨基酸 组成的 酸性激 活结 构域。 • 富 含谷氨 醜胺结 构域包 含高比 例的谷 氨醜胺 残基， 存 在于转 录激 活结构 域中， 例如转 录因子 SP1。 - 富含脯 氨酸结 构域包 含一段 连续的 脯氨酸 残基， 能够 激活转 录， 原 癌基因 c-jun 的产 物中就 存在一 个富含 脯氨酸 的激活 结 构域。 要 点 转录因 子结构 域结构 DNA 结合 结构域 二聚休 结构域 转 录激活 结构域 222 N 真核生 物的转 录调控 阻抑物 结构域 I 阻抑 物可通 过掩盖 DNA 结合 区域或 降低转 录活性 来间接 地阻断 转录 因子的 活动， 或者 他们本 身就含 有一个 特定的 直接阻 抑的结 构域。 转 录调控 的对象 起始 转录复 合物中 不同的 激活结 构域可 能有多 个不同 的对象 ，例 女口 TFDD 中的 TAFn、 TFUB 和进行 C 端结构 域的憐 酸化的 THDH。 巧 关主题 蛋白 质结构 与功能 （B2) 转录调 控举例 （N2) RNA 聚合酶 n 基因： 启 动子与 增强子 （M4) 晦菌体 （R2) 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 n 的起始 （M5) 转录 因子结 与起 始复合 物中的 通用转 录因子 （general transcription factor) (参见 构 域结构 M5) 不同， 转录因 子是通 过它们 与启动 子的特 定结构 （如： 上游 调控元 件或 增强子 区域） 的亲和 力才首 次被发 现的。 这些 因子有 两种独 特的活 • 性； 首先 它们特 异地与 DNA 结合 位点相 结合， 然 后激活 转录。 这 些活性 可 W 独立 分配给 特定的 蛋白结 构域， 分 别称作 激活结 构域和 DNA 结合结 构域。 另外， 许多转 录因子 同型 或异型 的二聚 体形式 存在。 还有 一些转 录因子 有配体 结合结 构域， 可 W 与附加 的小分 子结合 来调控 转录因 子自身 的 活性， 类 固醇激 素受体 （参见 N2) 是包含 所有这 四种结 构域的 一个例 子。 对 酵母转 录因子 Gal4 和 Gcn4 的诱变 （mutagenesis) 实验发 现它们 的 DNA 结合和 转录激 活结构 域处在 蛋白质 的不同 部位。 通 过实验 把这些 激活 结构域 融合到 细菌的 LexA 阻抑 物中， 该杂 交離合 蛋白可 从包含 le 工 A 操 纵基因 的启动 子激活 转录， 表 明酵母 蛋白的 转录激 活功能 是与其 DNA 结合活 性相分 离的。 这类 实验叫 做结构 域交换 实验。 蝶旋 -转角 -巧旋 结构域 这类 结构域 的恃点 是它的 DNA 结合 蛋白包 含一个 60 个氨 基酸的 同巧域 (homeodomain), 该 同源域 是由一 段称为 同源框 （homeobox) 序列 编码的 (参见 N2)。 在 果蜗的 触角足 （ Antennapedia) 转录因 子中， 该结构 域是由 4 个 a- 螺旋 组成， 螺旋 n 与田 之间 保持了 适当的 角度， 并 被一个 颇具特 征的 p- 转角所 分隔。 这 个特殊 的螺旋 -转角 -螺旋 -结构 （图 N1.1) 也在 其他 蛋白中 出现， 如; ^嘘 茜体的 Cro 阻抑物 （参见 R2)、 乳 糖和色 氯酸阻 抑物 （参见 L1 和 L2) 及 cAMP 受 体蛋白 （参见 L1)。 这 种结构 域的一 个被 称为识 别的螺 旋部分 处在大 沟中， 并与 DNA 发生 作用。 两个 同源域 因子 Bicoid 和 Antennapedia 的识别 螺旋可 W 互换， 也就 交换了 它们的 DNA 结合 特性。 实际上 只要改 变识别 螺旋上 的一个 氨基酸 就会改 变其与 N1 真核生 物的转 录因子 223 DNA 的结合 特性。 mm 图 N1.1 螺 旋-转 角-螺 旋的核 心结构 (a) 巧指 锋指 图 N1.2 (a) C2H2 巧指 结构； （b) 巧 指折叠 结构； （C) C4 巧指 结构 224 N 真核生 物的转 录调控 辞指 结构域 这种 结构域 有两种 形式， "C2H2" 型锋指 有一个 12 个 氨基酸 的环， 通过 2 个 半脫氨 酸和两 个組氨 酸残基 固定， 这 四个残 基与锋 离子在 空间上 形成一 个四面 体结构 （图 N1.2a)。 这 种巧指 折叠形 成一个 紧密的 结构， 由二条 P 链和 一个 a- 螺旋 組成， 后者与 DNA 大 沟结合 （图 N1.2b)。 该 a- 螺 旋区域 上含有 保守的 碱性氨 基酸， 负责与 DNA 的 结合。 这个 结构在 RNA 聚合酶 in 转 录因子 TF 田 A 中重 复了 9 次 （参见 M3 )， 在转 录因子 SP1 中也 有兰个 拷贝。 一 般来说 须要有 兰个或 更多的 C2H2 型巧指 才能与 DNA 结合。 另一 锋指结 构是巧 离子与 4 个半 脫氨酸 结合， 它出现 在一百 多种 类固醇 激素受 体转录 因子中 （参见 N2)。 这些因 子由同 型或异 型的二 聚体 组成， 其中 每一单 体包含 2 个 C4 巧指 结构 （图 N1.2C)。 两个 单体通 过 巧离子 稳定折 叠成更 复杂的 构象， 再 把每个 单体的 a- 螺旋 插入到 DNA 的 连续大 沟中， 这与 HLH 蛋白 类似。 碱性 结构域 在许多 DNA 结合蛋 白中都 发现了 碱性结 构域， 它通常 是与亮 氨酸拉 链或 HLH 基 序中的 一个联 合在一 起的， 结果被 称做碱 性亮募 酸拉链 (bZIP) 或碱性 HLH 蛋白， 蛋白 的二聚 作用使 二个碱 性结构 域相邻 ，进 而可与 DNA 发生 作用。 二聚 体结构 域 亮氣 酸拉结 亮氨酸 拉链的 肤链上 每相隔 韦个残 基就会 有一个 疏水的 亮氯酸 残基， 这些残 基位于 DNA 结 合域的 C 端 a -螺 旋上， 这样 a -螺旋 的侧面 每两圈 就 会出现 一个亮 氨酸， 形 成一个 疏水的 表面。 结果在 a- 螺 旋的疏 水表面 间就可 互相 作用， 形成 二聚体 （图 N1.3)。 这种相 互作用 形成一 个卷曲 的卷 曲结构 （coiled-coil structure)。 bZIP 转录 因子包 含一个 碱性的 DNA 结合 区域， 其 N 端与 亮氨 酸拉链 相连， 这也可 W 被看 作是 a- 螺旋 C 端的 延伸。 每个 a- 螺旋 相连的 碱性结 构域形 成一个 对称的 结构， 沿 DNA 相反 的 方向延 伸并与 对称的 DNA 识别位 点发生 作用， 最终像 一个夹 子夹在 DNA 上。 亮 氨酸拉 链在一 些利用 DNA 结合 结构域 的蛋白 中也可 W 不通过 碱性 结构域 而作为 二聚体 结构域 使用， 包 括一些 同源域 蛋白。 巧 旋-环 -巧堤 结构域 这一 结构在 总体上 与亮氨 酸拉链 相似， 只是它 的二个 a -螺旋 被一个 非 螺旋的 多肤环 分成二 个单体 蛋白， C 端 a- 螺 旋一侧 的疏水 残基可 W 二 聚化， 这种 结构在 MyoD 送类 蛋白中 发现过 （参见 N2)。 与 亮氨酸 拉链一 样， HLH 结构 也经常 与碱性 结构域 相邻， 形成 DNA 结 合所需 的二聚 N1 真核生 物的转 录因子 225 转录 •激 活结 构域 阻抑 物结构 域 体。 这种异 型二聚 体的形 成増加 了转录 因子所 有组成 成分的 多样性 和复杂 性。 图 N1.3 bZIP 蛋白 的亮氯 酸拉链 和破性 结构域 二聚体 釀 性激活 结构域 通过比 较酵母 Gcn4 和 Gal4 的转录 激活结 构域、 哺乳动 物糖皮 质激素 受体 W 及疮 疹病毒 激活子 VP16 发现它 们都含 有很高 比例的 酸性気 基酸， 这样 的结构 域被称 作酸性 激活结 构域， 且是许 多转录 激活结 构域的 特征， 但作为 一个有 效的转 录激活 结构域 还需要 其他什 么特性 仍不很 清楚。 富含谷 氣既胺 结构域 富 含谷氯 臨胺的 结构域 是在转 录因子 SP1 的二 个激活 区域上 首次发 现的。 与酸性 结构域 一样， 谷氨 醜胺残 基所占 的比例 似乎比 总体结 构更重 要。 砖 录因子 SP1 中的 富含谷 氨醜胺 转录激 活结构 域与果 蜗的触 足是蛋 白 间的结 构域交 换实验 表明这 些结构 域是可 W 互相替 换的。 富含 脯氛酸 结构域 在 c-Jun， AP2 和 Oct -2 等 转录因 子中所 发现的 宮含脯 氯酸结 构域， 与谷 氨醜氨 相似， 有一个 能激活 转录的 连续脯 氨酸残 基链。 转 录的阻 抑有可 能是通 过间接 地对激 活因子 功能的 干扰而 实现， 有 W 下几种 情况： - 阻断 了激活 因子的 DNA 结 合位点 （与 原核生 物的阻 抑蛋白 一样， 参见 L)o . 非 DNA 结合 复合体 的形成 （如： 类 固醇激 素受体 的阻抑 蛋白， 或阻断 226 N 真核生 物的转 录调控 转录 调控的 对象 HLH 蛋白与 DNA 相 互作用 Id 蛋白， 因为它 们缺少 DNA 结合 的结构 域， 参见 N2)。 - 并 非阻碍 DNA 结合而 是掩盖 了激活 结构域 （如； Gal80 掩盖了 酵母转 录因子 Gal4 的激 活结构 域）。 当然还 存在一 些其他 方式， 阻 抑蛋白 的特定 结构域 直接抑 制转录 。例 如哺 乳动物 甲巧腺 激素受 体的结 构域在 缺少甲 状腺激 素的情 况下可 W 阻抑 转录， 而在 与配体 结合后 又可激 活转录 （参见 N2)。 Wilms 癌基因 WTJ 的产物 就是一 个抑癌 蛋白， 它有 一个特 定的缺 乏电荷 残基的 富脯氨 酸阻抑 结 构域。 激 活结构 域多样 性的存 在给我 们提出 了一个 问题， 即在 起始转 录复合 体 中它们 的调控 对象是 相同的 还是不 同的？ 酸性 激活结 构域可 W 从 下游的 增 强子位 点激活 转录， 而 富含脯 氨酸结 构域的 激活力 很弱， 富含谷 氨醜氨 根 本无法 激活； 在酵 母中富 含脯氨 酸的结 构域和 酸性结 构域具 有活性 ，而 富 含谷氨 醜胺的 结构域 则没有 活性， 这 些都表 明激活 结构域 有着不 同的调 控 对象。 不同 的转录 激活因 子调控 的对象 可能有 W 下几 种： • 染色质 结构； • 通过 特定的 TAFu 与 TFIID 作用； • 与 TFIIB 作用； • 对 TFIIH 复合 体的调 整和作 用导致 RNA 聚合酶 n 的 CTD 的特 异性憐 酸化。 不同 的激活 结构域 似乎有 着不同 的调控 对象， 而 且转录 起始和 延伸过 程的 任何组 分或阶 段都可 能成为 调控的 对象， 从而 实现转 录的多 阶段谓 控。 N 真巧生 物的转 录调挖 N2 转录调 控举例 SP1 是 一个广 泛存在 的转录 因子， 包含 3 个锋指 结构和 2 个富含 谷氨醜 胺转录 激活结 构域。 类固醇 激素进 入细胞 后与它 的受体 结合， 致 使该受 体与被 结合的 抑制 蛋白相 分离， 在二 聚化后 转移到 核中。 类固 醇激素 受体的 DNA 结合结 构域与 DNA 上相应 元件相 结合， 完成对 目标 基因的 激活。 甲状 腺激素 受体是 一个转 录阻抑 蛋白， 但它 与甲状 腺激素 结 合后， 又可 转为转 录激活 因子。 y 干扰 素激活 JAK 激酶， 后者可 W 使 STATIC 发生憐 酸化， STATIC 二聚化 后转移 到细胞 核中， 进而 激活目 标基因 表达。 Tat 蛋白可 结合到 HIV RNA 的 5' 端的一 段称为 TAR 的序列 上， 如 果没有 Tat 的 结合， HIV 的 转录就 会过早 终止。 Tat-TAR 复 合体在 启动子 处激活 转录起 始复合 体中的 TFDH， 导致 RNA 聚合酶 n 幾基端 结构域 （CTD) 的稱 酸化， 使聚合 酶的全 程转录 成为 可能。 wjyoD 及其相 关基因 (myf5、 mrf4 和; njyogem— n ) 的 表达可 W 将非 肌肉细 胞转化 成肌肉 细胞。 他们 的表达 激活特 定的肌 肉基因 表达， 并阻碍 细胞的 分裂。 每一 基因可 W 编码 一种 HLH 转录因 子， HLH 异型二 聚体的 形成使 其结构 具有多 样性， 并与非 DNA 结合抑 制因子 （ non-DN A binding inhibil;or) Id 的二 聚化可 W 对 这类 转录因 子进行 调控。 编码 的一种 DNA 结合 结构域 的同源 框最初 是在果 蜗中编 码转录 因子 的同源 异型基 因中发 现的。 这些 转录因 子决定 身体各 部分的 发育。 果 蜡和哺 乳动物 间的这 些同源 异型基 因簇不 管在功 能还是 在组成 上都表 现出很 强的保 守性， 这 说明他 们在发 育中扮 演着很 重要的 角色。 相 关主题 细 胞分类 （A1) 通 用转录 因子与 RNA 聚合酶 n 的起始 （M5) 真核 生物的 DNA 复制 （E4) 真核生 物的转 录因子 （N1) 兰种 RNA 聚 合酶： 性质 与功能 （Ml) 月丕胎 发育； 同源 域蛋白 细胞 决定； myoD 诗釀化 巧控; STAT 蛋白 转录 延伸: HIV Tat 要 点 组成 性巧录 因子； SP1 激素 巧控； 类固 醇激素 受休 228 N 真核生 物的转 录调控 组成 性转录 因子： SP1 激素 调控: 类固 醇激素 受体 SP1 与一 段富含 GC 的保 守序列 GGGCGG 相连， 是一 种组成 性转录 因子， 其结 合位点 存在于 许多持 家基因 的启动 子中。 SP1 存 在于所 有的细 胞类 型中， 包含 3 个巧 指结构 [及 2 个富含 谷氨醜 胺转录 激活结 构域。 SP1 的富 含谷氨 醜胺结 构域与 TAFu 110 发生 特异性 作用， TAFn 110 是 TAFn 中的 一种， 后者与 TATA 结 合蛋白 （TBP) 相结 合组成 TFDD。 这就是 SN 如何 调控起 始转录 复合体 的一种 方式。 许多 转录因 子是由 激素激 活的。 这些 激素通 常由一 类细胞 分泌， 然后 将信号 转移给 另一类 细胞。 类固 醇激素 是脂溶 性的， 可 W 穿过 细跑 膜与被 称作类 固醇激 素受体 的转录 因子相 互作用 （参见 N1)。 在没 有类固 醇激素 存 在的条 件下， 该受 体与抑 制蛋白 结合， 游 离在细 胞质中 （图 N2.1)。 当 类固醇 激素与 受体结 合后， 可 使受 体从抑 制蛋白 上游离 出来， 然 后受体 二 聚化， 进 而转移 到细胞 核中。 受 体上的 DNA 结合结 构域与 特定的 DNA 圏 类固醇 图 N2.1 类固醉 激素激 活搪皮 质激素 受体的 模式图 N2 转录调 控举例 229 序 列或反 应元件 作用， 从而激 活目标 基因。 相 关受体 中比较 重要的 有：糖 皮质 激素、 雌性 激素、 视黄酸 和甲状 腺激素 受体。 上所述 的一般 模式并 非对 所有这 些受体 有效， 例如甲 状腺激 素受体 在没有 激素结 合的情 况下是 阻抑 蛋白， 但 若与激 素结合 后又可 W 转化 为转 录激活 因子。 巧 酸化调 许多 激素并 不穿过 细胞， 它 们与细 胞表面 的受体 结合， 通过称 为信号 巧： STAT 转导的 过程将 信号传 递给细 跑内的 蛋白， 该过 程通常 涉及到 蛋白踞 酸化。 蛋白 y -干扰 素通过 激活一 种称为 JAK 的激酶 诱发转 录因子 STATIC 的縣 酸化。 若 STATla 没有憐 酸化， 它只 单体的 形成存 在于细 胞质中 并且没 有转录 活性。 然而 它的一 个特定 酪氨酸 残基发 生雜酸 化后， 便能够 形成同 型二聚 体， 并 从细胞 质转移 到细胞 核中， 进而 激活在 后动子 处含有 一保守 DNA 结合基 序的目 标基因 的表达 （图 N2.2)。 未巧 酸化的 STATla 单体 /、 Y- 干扰素 JAK 巧巧 图 N2.2 由 STATla 转录因 子的踞 酸化及 二聚化 引起的 y- 干扰 素的转 录激活 过程 230 N 真核生 物的转 录巧控 转录 延伸; H1V Tat 细胞 决定; myoD 人类 免疫缺 陷病毒 （HIV) 编码一 种称为 Tat 的激活 蛋白， 该 蛋白为 HIV 基因 的大量 表达所 必需。 Tat 与 RNA 上的一 段称为 TAR 的苯 环结构 结合。 TAR 是 HIVRNA5' 端的 转录起 始点后 的一段 不翻译 区域。 在哺乳 动物 细胞中 Tat 所 起的主 要作用 表现在 转录延 伸的过 程中， 若没有 Tat 的 存在， RNA 聚合酶 n 转 录复合 体将因 进程过 慢而使 HIV 的转录 过早终 止。 Tat 可与 RNA 结合因 子一起 iU 复合体 形式结 合在转 录物的 TAR 序列 上， 该蛋白 -RNA 复 合体可 tU 向后 成环， 并 与装配 在后动 子处的 新形成 的转 录起始 复合体 作用， 送种作 用导致 TFIIH 的激酶 活性被 激活， 结果 RNA 聚合酶 n 的綾 基端 结构域 （CTD) 实现憐 酸化， 使得 RNA 聚 合酶前 进 （参见 Ml 和 M5)， 使 其完成 HIV 转录 单位的 阅读， 最 终实现 HIV 蛋 白的大 量合成 （图 N2.3)。 ，被 巧活的 TFIIH 使 RNAPoin 的 CTD 巧酸化 TAR 茎 环结构 图 N2.3 HIV Tat 蛋白 激活转 录延伸 的机制 肌肉 细胞由 来于称 为体节 （somites) 的 中歴层 细胞。 在 机体能 够通过 细胞分 化形成 骨骼肌 肉细胞 （称 为生 肌节） 之前， 由 体节负 责肌肉 细胞的 生成， 该过 程称 为细胞 决定。 wjyoD 最初 是作为 一个在 （成肌 细胞， my- oblast) 未 分化细 胞中表 达并负 责肌肉 形成与 执行细 胞决定 的基因 被鉴定 出 来的， 它 的过量 表达可 使成纤 维细胞 （在 许多 组织中 的基质 铺垫细 胞） 变成 表达肌 细胞特 异基因 的类肌 肉细胞 和类生 肌节。 MyoD 蛋白可 直接激 活肌细 胞特异 基因的 表达， 同时也 可激活 的表 达。 P21 WAF1/CIP1 是一 个依赖 细胞周 期蛋白 的激酶 （ cyclin-dependent kinases, CDK) 的小分 子抑制 因子， 该 因子对 CDK 活性的 抑制可 W 使细 胞周期 停滞在 Gi 期 （参见 E3)。 所 W 说 wwO 的表 达是细 胞退出 细胞周 期的 原因， 而 退出细 胞周期 正是已 分化肌 细胞的 特征。 现在 已发现 的四种 基因 w^yoD 、 myogenin > /ny/S 和 /nr/4 中的任 一 基因的 表达都 可使成 纤维细 胞转 化为肌 细胞， 它们 所编码 的蛋白 都属于 HLH 转 录因子 家族的 成员。 MyoD 与 组成性 HLH 转 录因子 E12 和 E47 结合 成异型 二聚体 时活性 最强。 通过 不同的 组合， 这些 HLH 型 的转录 因子能 够产生 多种各 自具有 不同功 N2 转录调 控举例 231 能 与作用 的同型 或异型 的转录 因子， 送些 因子可 W 受一种 被称为 W 的抑 制因子 调控。 该 Id 缺乏与 DNA 结 合的结 构域， 但 都含有 HLH 的 二聚化 结 构域， 当它与 MyoD 和相关 蛋白结 合后， 形 成的异 型二聚 无法与 DNA 结合， 因此 也就无 法调控 转录。 胚胎 发育： 同源框 是一段 保守的 DNA 序列， 编码一 种称做 同源异 型域的 螺旋- 同源 域蛋白 转角- 螺旋的 DNA 结 合蛋白 （参见 N1)。 同源 异型域 最初是 在果蜗 同源异 型基 因编码 的转录 因子中 发现， 该基因 负责身 体各部 分的正 确分化 （参见 A1)。 例如， 同 源异型 基因中 的一种 如 U 的突变 可使果 蜗在应 该长触 角的地 方长出 腿来。 这些 基因对 胚胎的 空间构 型的形 成非常 重要。 同源 框序列 在真核 生物的 许多种 中非常 保守， 含有同 源框的 基因在 哺乳动 物的发 育中起 着重要 作用。 在 果蜡和 哺乳动 物中， 同 源异源 基因被 排列在 同源 基因相 同顺序 的基因 簇中， 这 些基因 同系物 在胚胎 的前后 轴间也 相 似的顺 序进行 表达。 W 上现象 说明由 保守同 源异型 基因所 编码的 DNA 结 合 结构域 是转录 因子的 特征， 而 转录因 子在胚 胎发育 的过程 中有着 固定的 功能。 (江 乐 译 刘进元 化） 己任 * .. 成 ii f. ^tmmmmnn IWfi 巧化种 巧材人 玄 （所 tU 振巧 WfiHWWCTk 々巧 撕巧 巧 巧白弟 MMtaW H'lHi* M9m - /、 内 a 科 jmbiakr •贫 的苯 巧巧将 A«a 芦 巧巧於 。的 巧度 (也 度巧 r 泼成 瓜 在 ,& 曲 ♦寡 W,f •私 誘乐, 化晒巧 ♦煤 ^没巧 Tw 巧一 挣私. 4| 兵 A li 弁 》M ;* ♦朵合 体巧巧 推粗过 缉巧巧 HIV 的巧 珠泣孕 - »1巧 # 巧供補>?^與‘ 、巧 》f • W A* 的请巧 W 坦 -I 巧 s^cii 荣物成 育嗦 度一苗 弟苗 AMHM 辑則 W‘m 义々 > 白迄奇 i!r ■ uTililWWf uOi»Jl 义巧） ：* H^niafcACbWHp, 诗) 乐 典於端 IS 必中巧 乂妒 I 觀 3 巧 々巧 »iBid|r •敎张 •, 巧苗 W 巧 巧话 ♦巧化 biM 从 斯钟 成如 ‘:巧 控写度 巧义他 HHMI/CNA, 含 •»> 常非 » 々炸巧 W» 艾快满 巧對、 « 篷巧 gH 彿好米 :^京 《 ^舶巧 H 進 pi 实 g HJV X J 巧度 WA 巧 巧巧热 巧巧麻 爱 旅巧 巧托中 軒柔辛 iW 婚全 巧巧必 吹巧菊 gilh L 巧 W 成巧 * 弓巧巧 汾础 a：J9tt 诫 ^3 带 i •; 巧風饼 4, 品罔 苗盟^ • 於 AWJ 的輯 •巧巧 f 进山 誰 公父 巧； 巧安 B 審巧中 沒巧覆 I 愚 lili •气 确话転 頑巧拜 (义 A 挺矜 私 巧 A 難 W 巧合 满巧 'r.: 〜 •- 1 W 的 <♦* 巧 巧尸井 与 K 佑复 合体 < .乂、 ^umn 产复 々偉 >jtTFi 口 ，■，, 婚 >化 ’■• : • A ‘4、 给 JL - "f 二 m ■4l 讓 ~ ♦ f !>： 青傳巧 (•cmitcM) 的中 ttfcWiU 如 化体巧 公通巧 琴 iifiHi 巧巧巧 (诗 受生 fi 巧 J 么 W. 由聲實^1巧肌巧细*的 ^ I *需> 决走， 气 wD 覆巧 1ft 作为 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Ill I t I P F III mil III P F P E 1 1 II 1 ] 口 □ RNA SI M16 t M16 t M23 t t M23 M5 初生 转录物 前体 I I ~1 口 leSrRNA 23S rRNA 5S rRNA 成巧 rRNA (b) 前 18S rRNA 前 5.8S rRNA 前 28S rRNA ETS 1 f.||- 1." • ’I’liiii I ."ij ITS 1 口 ITS 2| 一 '. • ETS 2 RNIA 巧 rnaSI RNA SI -O- -O RNA 庚 -O- □ 18S rRNA 5.8S rRNA 28S rRNA 47S 前 rRNA 初生 转录物 45S 前 rRNA 41S 前 rRNA 20S 和 32S 前 rRNA 成巧 rRNA 图 01.1 (a) £. CO" rRNA 初生转 录物的 加工； （b) 哺乳 动物前 rRNA 分 子加工 236 O RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 列， 通过配 对决定 甲基化 修饰的 部位。 至少有 一 ■种 真核 生物， 嗜热 四膜虫 ( Tetrahymena thermophila ) ， 其 rRNA 在具备 功能前 经历了 一种不 同寻常 的加工 过程。 该前 体包含 一个在 加工中 必须被 切除的 内含子 （参见 03)， 虽然 这种加 工过程 是在蛋 白存在 的情 况下在 胞内发 生的， 但在 完全无 蛋白存 在的试 管中， 这 个内含 子居然 还是被 自身切 除了。 这种 RNA可U> (折叠 成有 酶切活 性的构 型或者 称作核 酶 （参见 02) 去完 成自身 剪切与 连接。 核巧 巧蛋白 在细 胞内， RNA 分子通 常与蛋 白复合 存在， 特定的 蛋白与 特定的 复合 体及其 RNA 结合。 这种 RNA 与 蛋白复 合体称 为核糖 核蛋白 （ribonucleoprotein, 研究 RNP)。 核糖 体是最 大且最 复杂的 RNt 在 加工过 程中由 rRNA 和 特定的 核 搪体蛋 白复合 而成。 其他的 RNP 将在 02 和 03 中 讨论。 用 于研究 RNP 的方 法有； 分 离可将 RNP 纯化后 分解为 RNA 分子与 蛋白， 然后 再分别 鉴定； 重装 配用来 发现组 分相应 结合在 一起的 规则， 如 果这些 组分可 W 被 修饰， 就可 W 获得 一些 关于它 们各自 功能的 线索； 如果足 够大， 可 用电子 显微 镜来直 接观察 RNP， 否则也 可粗略 地显示 其总体 形状； 用 RNP 或他 们单一 组分的 抗体来 纯化， 也可用 来封闭 RNP 的 功能， 若 与电子 显微镜 联用可 确 定特定 的组分 在整个 结构中 的大致 位置； RNA 结合 实验可 W 显示 一种特 定蛋白 与某一 RNA 的 结合， 随后用 RNA 酶处理 RNA- 蛋白 复 合体可 显 示出结 合蛋白 保护了 RNA 的哪 一部分 （RNase 保护实 验）； 运 用紫外 光照射 经过和 未经过 化学试 剂交联 的交联 实验， 可 显示 哪一部 分 RNA 与蛋 白分子 在复合 体中是 紧密结 合在一 起的； 而物 理方法 如中子 和 X 射线 衍射 最终可 W 给出 RNP 完 整的兰 维结构 （参见 B3)。 在 本节和 随后 一些章 节中所 述的许 多有关 RNP 结构的 信息是 通过上 述研究 方法所 获 得的。 原核 生物的 大肠 杆菌核 糖体占 干重的 25% (总 蛋白的 10% 和总 RNA 的 80%), 巧搪体 这 很好地 体现出 核糖体 对于细 胞的重 要性。 图 01.2 显示了 大肠杆 菌核糖 体的 组分， 70S 核糖 体分子 大约有 2.75 X 106Da， 由一个 50S 大亚 基和一 个 30S 小亚基 组成。 后者 由一个 16S rRNA 的 分子和 被标为 & 到 如 的 21 种蛋白 组成。 大 亚基包 含一个 5S 和一个 23S rRNA 分子及 31 种 不同蛋 白， 根据双 向凝胶 电泳， 这 31 种蛋白 被分别 命名为 Li 到 L34， 然 而随后 发现 L26 就是 S20， L7 是乙 醜化的 Li2， Ls 是 Lio 和 L7 的复 合体， 所 W 只有 31 种 大亚基 蛋白。 核糖 体蛋白 的大小 各异， L34 只有 46 个氯 基酸， 而 Si 有 557 个。 大多数 相对较 小的蛋 白是碱 性的， 这可 能与它 们结合 RNA 有 关。 用 RNA 和蛋 白组分 可重新 装配成 有功能 的大肠 杆菌核 糖体， 并且已 形成一 条固定 的装配 路线。 如图 01.3 所示， 多种方 法研究 已揭示 出大肠 杆 菌核糖 亚基的 结构。 01 rRNA 加工与 核巧体 237 原 核生物 大 肠杆菌 0.95 X 10® Da 31 种 蛋白质 + 23S rRNA (2904 nt) 5S rRNA (120 nt) 21 种 蛋白质 + 16S rRNA (1542 nt) 核巧体 亚基 蛋 白质和 RNA 宾 核生物 鼠 3 X 10® Da 1.5 X 10® Da 大约 化 种 蛋白质 28S rRNA 5.8S rRNA (4718 nt) (158 nt) 5S rRNA (121 nt) 大约 30 种 蛋白质 + 18S rRNA (1874 nt) 图 01.2 典 型的原 核与真 核搪体 的组成 (a) 柄 大亚基 图 01.3 丘. CO/: •核 搪体 特征。 （a)30S 亚基； （b)50S 亚基； （c) 完整的 70S 核搪体 真核 生物的 图 01.2 显示了 真核生 物大鼠 核搪体 80S 的 相应大 小及组 成成分 。在 巧糖体 60S 大亚 基中， 包含 了大约 45 种 蛋白、 一个 5S rRNA 分子、 一个 5.8S rRNA 及一个 28S rRNA 分子， 后 两者相 当于原 核生物 23S rRNA。 40S 小 238 O RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 亚 基包含 18S rRNA 和大约 30 种不同 蛋白。 虽然 真核生 物中的 rRNA 均 大 一些， 但在 相当大 程度上 均保留 了各自 RNA 分 子的二 级结构 的保守 性， 由 于其更 大的复 杂性， 真核 生物核 糖体亚 基还无 法重新 装备成 有功能 的复 合体， 它们的 结构也 不十分 清楚。 在一个 典型的 真核细 胞中的 核糖体 1| 每秒 总共可 生成约 100 万个 化键。 O RNA 加工 与巧糖 核蛋白 复合体 02 tRNA 的 加工、 RNA 酶 P 和核酶 要 点 原杖 生物的 tRNA 加王 真枝 生物的 tRNA 加工 枝糖 枝酸酶 P 校 路 巧 关主题 经对较 长的前 tRNA 转 录物进 行加工 后形成 成熟的 tRNA。 该加 工过程 涉及特 定的内 切和外 切酶如 RNaseD、 E、 F、 P 剪切 W 及 随 后对每 一特定 tRNA 类 型所进 行的独 特碱基 修饰。 RNase E、 F 开始对 3' 端切 割后， RNase D 可 对 3' 端 修剪直 至其比 成熟长 度多 2 个 nt。 RNase P 酶 然后对 5' 端进行 切除， 生成 成熟的 5' 端。 最后 RNase D 将移 去两个 3' 端的 残基， 同时进 行碱基 修饰。 许 多真核 生物前 tRNA 会含有 内含子 W 及 5' 端和 3' 端额外 的核巧 酸， 这些 在加工 中必须 去除。 与原 核生物 tRNA 不同， 真 核生物 3' 端的 CCA 是由 tRNA 核酸转 移酶加 上的， 并且 发生了 许多的 碱基 修饰。 在 大肠杆 茜中， 由一个 377nt RNA 和一个 13.7kDa 的蛋 白组成 的 RNase P 是一个 简单的 RNP。 在 真核和 原核生 物中， 该 RNP 的功 能都是 剪切前 tRNA 5' 端先导 序列。 在 体外， 单独的 RNA 成 分就可 剪切前 tRNA, 所 iU 它 是一个 有催化 功能的 RNA 或称 核酶。 数个 生化反 应可由 RNA 酶 或核酶 催化， 这种 具催化 功能的 RNA 可 剪切 自身或 其他的 RNA 分子， 或者完 成连接 或自身 剪接反 应。 核酶可 W 独自 进行 催化， 但在体 内通常 与蛋白 结合在 一起工 作， 这将提 高它们 的催化 活力。 科 学家们 现在可 设计核 酶作为 剪切 RNA 工具。 RNA 聚 合酶田 基因； 5S 基因与 tRNA 基因 的转录 （M3) tRNA 的结构 与功能 （P2) rRNA 加工与 核糖体 （01) 原核 生物的 从 01 的图 01.1 中 可知大 肠杆菌 rRNA 操 纵子中 包含了 tRNA 编码 tRNA 加工 区域， 除此 之外， 大肠杆 菌还有 其他包 含多至 韦 种 tRNA 基 因的操 纵子， 这些 tRNA 基 因被间 隔序列 相隔。 成熟的 tRNA 分子可 从 这些操 纵子的 前体 转录物 加工， 即经过 RNase E、 F、 D、 P 按顺序 的一系 列加工 步骤， 图 02.1 显 示了大 肠杆菌 tRNATyt 的加工 过程。 一旦 转录物 前体经 过折叠 形成 特征茎 环结构 （参见 P2)， 内切 核酸酶 （参见 D2) (RNase E、 F) 在 3' 端 切除一 个侧翼 序列， 在 前体的 3' 端 留下一 个额外 的九核 巧酸， 然后外 240 O RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 真巧 生物的 tRNA 加工 核 巧核酸 酶 P 切酶 RNase D 依 次切去 3' 端 区域的 7 个核 昔酸， 接着 RNase P 进行 内切产 生出 成熟的 tRNA 5' 端。 随后， RNase D 再继 续除去 3' 端剩 余的两 个核巧 酸， 产生出 成熟的 3' 端。 最后 tRNA 再经 过一系 列碱基 修饰。 不 同的前 tRNA 相 似的方 式进行 加工， 但巧 基修饰 对于各 种特定 RNA 类 型都是 独 特的。 最 通常的 tRNA 修 饰参见 P2 的图 P2.1。 1. 内切 核酸庚 图 02.1 £ CO。 中前 tRNA 的加工 过程 真 核生物 酵母菌 tRNATyt 的加 工过程 图 02.2 表示。 如图所 示该前 tRNA 带 有一个 16nt 5' 端前 导区， 一个 14nt 内 含子和 2 个 额外的 3' 端核 昔酸。 初生的 转录物 形成一 个具特 征茎环 的二级 结构， 内切 酶正是 识别这 种结构 并切除 5' 端前 导区和 2 个 额外的 3' 端核 昔酸。 真核生 物与原 核生物 的 主要不 同点是 原核生 物成熟 tRNA 3' 端的 CCA 是 基因编 码的， 但真核 生物 核编码 tRNA 不 属这种 情况。 当 3' 端的两 个核巧 酸被切 除后， tRNA 按 音酶转 移酶将 5'- CCA -3' 序列 添加到 tRNA 的 3' 端， 产生出 成熟的 tRNA 3' 端。 下 一步是 切除内 含子， 由内 切酶将 内含子 两端切 除后， 再将 两个 半个的 tRNA 分子 连接在 一起。 酵 母菌前 tRNA 中的内 含子可 在脊椎 动物 细胞内 加工， 所 跑真 核生物 tRNA 加工 机制看 来在进 化中是 高度保 守的。 RNase P 是 由一个 RNA 分子 和一个 蛋白分 子组成 的一种 内切酶 ，是 一种很 简单的 RNP。 该 酶在细 胞中的 作用是 修剪前 tRNA 分子产 生出成 熟的 5' 端。 RNase P 在真 核和原 核生物 中都有 发现。 真核 生物中 RNase P 真巧 生物的 tRNA 加工 核 巧核酸 酶 P 02 tRNA 的 加工、 RNA 酶 P 和核酶 241 爭 ■OH 3 D 环 T 环 加工 C U .2 酵 母菌前 tRNAT> "的加 工 过程， 用方 框表示 内含子 核巧酸 核酶是 一种可 催化特 定生化 反应的 RNA 分子。 虽然发 现较晚 ，但 已知在 自然界 有几种 核酶。 目前 研究者 已能够 用胞外 选择技 术来设 计出新 型的 核酶。 RNaseP 是一种 广泛存 在可使 tRNA 成熟的 核酶， 它的 RNA 组分是 一种可 W 做为 内切核 酸酶的 核酶。 在 四膜虫 的 rRNA 大亚 基中有 一个内 含子， 可在无 蛋白条 件下， 可 W 对转 录物 进行体 外自 我剪接 （参见 01)。 这种 加工称 为自我 剪接， 该 过程需 要鸟巧 或稱酸 化的 衍生物 作为辅 因子。 体 外反应 的效率 只有体 内反应 的五十 分之一 ，所 细 胞内蛋 白可能 会有助 于体内 的催化 反应。 在一些 植物病 毒复制 过程中 会产生 出连体 分子， 这是 由于在 完成一 个循环 RNA 合成后 聚合酶 继续合 成 所致。 这种 分子可 折叠然 后自身 剪切成 为一个 基因组 大小长 度的单 体。 对送些 自身剪 切分子 的研究 已经确 定出所 需最小 序列， 研究者 们已能 设 计并合 成出能 W 顺式 或反式 切割其 他目标 RNA 分子的 核酶。 近 来更多 的 研究转 向通过 利用核 酶在体 内剪切 mRNA 分 子来抑 制基因 表达， 也许 这可 能会阻 止病毒 复制， 杀死 癌细胞 W 及通过 使基因 失活来 研究新 基因的 功能。 位于 核内， 是一种 核内小 分子民 NP (snRNP)。 在大 肠杆菌 中该内 切核酸 酶 由一个 377nt RNA 和一个 13.7kDa 小的碱 性蛋白 组成， 该 RNA 的二级 结构 在进化 中高度 保守。 令人惊 奇的是 如果向 试管中 加入前 tRNA, 单独 的 RNA 组分 就可行 使内切 核酸酶 功能。 这种 RNA 是一种 具催化 活性的 RNA, 或称为 核酶， 即 使无蛋 白存在 也可催 化化学 反应。 现在已 知有多 种 核酶， 体外的 RNaseP 催化反 应比在 体内需 更高的 镇离子 浓度， 因此在 细胞 内蛋白 组分可 能有助 于催化 反应。 5 P-I 围 02 核酶 A.9C.A4 f 6. O RNA 加工 与怯糖 巧蛋白 复合体 03 mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP 要 点 mRNA 的加 xT] 原核 生物的 mRNA 基本 不需要 加工， 在转 录结束 前就可 开始 翻译。 在 真核生 物中， RNA 聚 合酶日 负责较 长的前 mRNA 合 成， 送些不 同的前 mRNA 被统称 为核内 不均一 RNA (hnRNA)。 特定 蛋白与 hnRNA 结 合形成 hnRNP, — 些核内 小分子 RNP (snRNP) 颗粒与 hnRNP 发生 作用， 完成 对某些 RNA 加工 。真 核生物 hnRNA 加工包 括四个 方面： 5' 端 加帽、 3' 端剪切 和聚腺 巧化、 剪接 及甲 基化。 hnRNP 1 RNA 聚 合酶口 转录物 （hnRNA) 与 S 种 hnRNA 蛋白 A、 B、 C 复 合形成 hnRNP 颗粒， 其中 包含兰 个四聚 体各兰 个拷贝 和大约 600-700 核 昔酸的 hnRNA。 hnRNP 辅助 RNA 的 加工。 snRNP 颗拉 I 由 RNA 聚合酶 日转录 的许多 富含尿 喀瞎的 snRNA 分子 与特定 的 蛋白复 合形成 snRNP, 其中 绝大多 数参与 剪接， 大多 参与确 定前 rRNA 分 子内的 甲基化 位点， 那些含 有序列 5' - RA (U)，GR-3' 的 snRNP 在 细胞质 内与八 个常见 蛋白相 结合， 经甲基 化后再 被运回 核中。 5' 端加帽 ~ I 当 RNA 聚合酶 n 聚合 的转 录产物 达到约 25nt 长时， 在其 5' 端加 上 了一个 7 -甲基 化鸟巧 （m7G)， 该 7 -甲 基化鸟 巧或称 帽子结 构是 W 5'-5' 方向相 连的， 用 来防止 5'- 外 切酶的 攻击， 但却有 利于 剪接、 转运和 翻译的 进行。 剪 接 许多 真核生 物的前 mRNA 在多聚 A 位 点被剪 切后， 多聚 A 聚合 酶 （RAP) 在 形成的 RNA 3' 端 加上约 250 nt 的 poly (A) 尾己， 形成 成熟的 3' 端。 在真核 生物前 mRNA 加工过 程中， 打断编 码区的 内含子 序列被 切除， 然后 两侧的 外显子 片段相 连接。 这 种剪接 反应在 核内进 行， 需要内 含子有 5'- GU、 AG- 3'!^：/ 及一段 分支点 序列。 在两 步反 应中， 内 含子先 —个具 尾的环 状分子 或套索 状分子 形式被 删除， 然后被 降解。 剪 接包括 snRNP 与保 守序列 结合， 形成剪 接体， 在 其内发 生剪切 与连接 反应。 前 mRNA 的 甲基化 在前 mRNA 上的一 小部分 腺標吟 残基， 当 序列为 5'-RRACX- 3' 时 （其中 R 为曝 咚） 会在 N6 位置 发生甲 基化。 03 mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP 243 相 关主题 RNA 聚合酶 n 基因： 启 动子与 增强子 （M4) 瓜 NA 加工与 核糖体 （01) mRNA 的 加工 原核 生物中 mRNA 转 录物根 本不需 要或很 少需要 加工。 事实 上核糖 体在 mRNA 分子的 合成未 完成前 就开始 翻译。 原 核生物 mRNA 很快从 5' 端 的开始 降解， 所 W 第一个 顺反子 （蛋 白编 码区） 的 翻译被 限制在 很短的 时 间内。 一 些内部 顺反子 为保护 自身， 在 3' 端和 5' 端 形成茎 环结构 ，做 为对外 切酶暂 时性的 屏障， 所 在其 完全降 解前可 增 加翻译 频率。 因为真 核生物 RNA 聚合酶 n 要 转录基 因种类 很多、 大小 不一从 60〜 300nt 的 核内小 RNA (snRNA) 到长 度超过 lOOkb 的 Antennapedia 基因。 该 酶转录 产物的 群体统 称为核 内不均 一RNA (hnRNA), 那 些即将 被加工 成 mRNA 分 子的转 录物被 称为前 mRNA, 前 mRNA 分 子经过 5' 端 加帽、 3' 端 剪切及 加多聚 A 尾、 剪接 和甲基 化加工 产生出 成熟的 mRNA 分子。 hnRNP 由 民 NA 聚合酶 n 合成的 hnRNA 主 要是前 mRNA, 并 很快被 蛋白包 裹 形成核 内不均 一 RNP (hnRNP), 所涉 及蛋白 被分成 A 〜 U 类的 hnRNP 蛋白。 兰 种非常 丰富的 hnRNP 蛋白是 A、 B、 C， 每 一种均 有两种 构型。 从 核中提 纯这些 物质， 可得到 一种约 30 〜 40S 的同源 性相当 高的、 被称为 hnRNP 的 颗粒。 这 些颗粒 直径约 20nm， 每个 颗粒包 含一个 600 ~ 700rit 的 RNA 分子， 并与兰 种不同 四聚体 的各兰 个拷贝 形成复 合体。 这 些四聚 体是 （八1)3&、 （A2)3Bi 和 （Ci)3C2， hnRNP 蛋 白被认 为有助 于保持 hnRNA 的单链 状态， 并辅 助各种 RNA 加工 反应。 snRNP 颗粒 RNA 聚合酶 n 也转 录大 部分的 snRNA， 后 者常与 特定蛋 白形成 snRNt 这些 RNA 富含尿 喀巧， 因此被 命名为 U1、 U2 等。 含量 最丰富 的 是那些 参与前 mRNA 剪接的 U1、 U2、、 U4、 U5 和 U6。 而且 snRNP 种类正 在不断 增加， 大部分 好像参 与了前 rRNA 加 工中甲 基化位 点的确 定， 因此位 于核中 （参见 01)。 主 要核质 snRNP 由 单一的 snRNA 和一组 8 个碱 性蛋白 及多种 snRNP 特 定蛋白 构成。 这 些核必 蛋白， 依据 识别它 们的 抗体被 命名为 Sm 蛋白， 需要 RNA 单 链区中 有一段 5'- RA(U)。 GR- 3' 序列。 U6 中不 含该 序列， 但通常 进行与 含有该 序列的 U4 碱基配 对。 snRNP 的构 成过程 如下： 由 RNA 聚合酶 n 在核中 合成， 并具 有一个 正常的 5' 帽 子结构 （参 见下 文）， 然后 进入细 胞质， 与核 心蛋白 及其他 特 定蛋白 结合， 然后 再转运 核中行 使剪接 功能。 在 它们的 5' 端帽 结构上 得 到两个 甲基。 5' 端加帽 RNA 聚 合酶开 始转录 后不久 ，在 RNA 链长 度超过 20~30nt 之前， 其 5' 端经化 学修饰 被加上 了一个 7 - 甲基鸟 巧残基 （图 03.1)， 这种 5' 端 244 O RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 3' 端 剪切及 加尾 的修 饰被称 为帽子 结构。 与 正常的 3'-5' 连 接方式 不同， 它通 过一个 GMP 核巧酸 W 反方 向加到 新生的 RNA 转 录物上 产生， 从 而形成 5'- 5' 兰磯酸 桥。 催化 这一添 加核巧 酸反应 的酶是 mRNA 鸟巧转 移酶， 特别的 是在脊 椎动 物中， 它 首先对 搪昔甲 基化， 然后再 转录核 昔酸。 这 种帽子 结构对 5' 外 切核酸 酶形成 屏障， 起到 稳定转 录物的 作用， 同时对 mRNA 及其前 体 的其他 反应如 剪接、 转运 和翻译 也十分 重要。 图 03.1 真 核生物 mRNA 的 5' 端 帽结构 对于大 多数前 mRNA 而言， 其 成熟的 mRNA 分子 3' 端 是经过 剪切再 加上一 串多聚 A 残基 即称为 poly (A) 尾 后而形 成的。 利用 这一特 征可将 mRNA 分 子从其 他类型 RNA 中纯化 出来， 用于 cDNA 文库 的构建 （参见 II 和 口）， 进而分 离特定 基因、 分析 它们的 功能。 剪切和 聚腺巧 酸化反 应需要 DNA 和前 mRNA 转 录物上 的特定 序列， 即 5'-AAUAAA- 3' 聚 腺巧酸 化信号 序列， 在其后 11 ~20nt 处紧随 着一个 "5'- YA- 3'" 结构， 其中 Y 为嚼瞎 （图 03. 2a)， 在其下 游常有 一富含 GU 的 序列。 这些 序列共 同决定 了聚腺 巧酸化 位点。 一些特 定蛋白 因子识 别上述 这些序 列元件 并与前 mRNA 结合， 当复 合 体组装 完成后 即开始 剪切。 随 后一种 称为聚 腺巧酸 聚合酶 （PAP) 剪切 后的前 mRNA 3' 端加 上多至 250 个 A 残基， 即 产生出 poly (A) 尾部 。前 mRNA 上的 poly (A) 尾被 认为有 助于稳 定整个 分子， 因为 有一种 poly 03 mRNA 加工、 hnRNP 巧 snRNP 245 (A) 结合 蛋白与 poly (A) 结合， 起抵抗 3'- 外 切核酸 酶攻击 的作用 。另 外， poly (A) 尾也 有助于 细胞质 中成熟 mRNA 的 翻译。 组 蛋白前 mRNA 不进行 聚腺巧 酸化， 但也是 在其一 段特定 序列被 剪切后 才生成 成熟的 3' 端。 (a) DNA 5. • • . . AATAAA. . . ( 20 bp ) . . . CA . . 3.. . . .TTATTT GT . . . . TTGTGTGTTG . . 3. . . AACACACAAC . . 5. RNA 5 . . . . AAUAAA . . ( 20 碱 基）. CA. . . . UUGUGUGUUG. .S' I I 聚 腺巧酸 化信号 Poly(A) 添 加位点 切 割位点 富含 GU 区 (的 5 巧 接位点 外显子 内含子 3’ 巧 接位点 I 外显子 5-..AAGUAAGU . CURAY . . (10-40) . (U/C)" N C A G G . . .3' 分支 点序列 巧巧区 图 03.2 典型的 聚腺巧 酸化位 点序列 （a) 和剪接 位点保 守序列 （b) 剪 接 在真核 生物前 mRNA 加 工中， 在 聚腺巧 酸化位 点上游 的一些 已转录 序列最 终还是 被切除 T， W 产生出 成熟的 mRNA。 这些序 列从前 mRNA 的中必 区切 去后， 两端 相连成 一体。 这 些插入 序列或 称内含 子中断 了成熟 mRNA 中相 邻的外 显子， 即 通常是 mRNA 的 蛋白编 码区。 切除内 含子将 外 显子连 接在一 起的过 程称为 剪接， 就像 poly (A) 化 的加工 一样， 发生 在 核内， 且在 成熟的 mRNA 分 子转运 到胞质 之前。 剪接也 需要有 一组特 殊序列 （图 03.2b)。 几乎 所有内 含子的 5' 端均 有 5'- GU- 3' 序列， 3' 端 通常是 5'- AG- 3' 序列， 在 3' 端的 AG 序 列之前 还 有一段 称做喀 D 定区 （ polypyrimidine tract) 的富含 喀瞎的 序列。 脊椎动 物中 在喀巧 区上游 10-40 个残 基处有 一被称 为分支 点序列 的区域 ， 5'- CURAY-3' 序列 （其中 R 代表 曝吟、 Y 代表嚼 赌）， 而在酵 母中则 是一个 更特定 的序列 5'- UACUAAC - 3'。 剪接是 一个二 步反应 （图 03. 3a)， 首先， 在 内含子 5' 端 G 之前 称为 5'- 剪 接位点 处的被 分支点 序列中 A 残 基上的 2' 餐基 攻击形 成了一 个称为 套索状 的尾环 分子， 并 释放出 外显子 1; 接着在 3' 剪 接位点 处的剪 切发生 AG 中的 G 之后， 随后两 段外显 子序列 连接成 一体。 其 内含子 套 索形式 246 O RNA 加工 与核搪 核蛋白 复合体 被 释放， 最终被 降解。 剪接 过程由 U1、 U2、 U4、 U5 和 U6 snRNP 催化， 也 有其他 剪接因 子 参与。 这些 snRNP 中的 RNA 成分与 5' 和 3' 剪接点 及分支 点的多 种保守 碱 基配对 （图 03. 3b)。 在 剪接的 前期， U1 snRNP 5' 端 与剪接 位点的 5' 端 接合， U2 紧 接着与 分支点 接合， 随后 snRNP 中 U4、 U5 和 U6 结合成 复 合体， 使内 含子形 成环状 结构， 结果 使得外 显子的 3' 端和 5' 端 接近。 这些 snRNP 经 相互作 用形成 一个复 合体， 使前 mRNA 折叠 利于剪 切的正 确 构型。 该前 mRNA 与 snRNP 形成的 复合体 使得上 下游的 外显子 靠近， 同 时内含 子呈一 个环状 结构。 这一 mRNA 与 snRNP 的复合 体被称 为剪接 体 （spliceosome)。 在剪 接体形 成后， 在二步 剪接发 生之前 剪接体 内进行 重排， 并 套索 构型择 放出内 含子。 (a) 外显子 1 内含子 外显子 2 (b) 外显子 1 内含子 外显子 2 \ 分 支位点 U1 剪接体 图 03.3 真核 生物前 mRNA 的 剪接。 （a) 两步 反应； （b) snRNP 参与 剪接体 的形成 前 mRNA 许多前 mRNA 所经历 的最终 修饰或 加工是 某些碱 基的甲 基化。 在脊 的 甲基化 椎动 物中， 最常见 的是在 A 残基 N6 位置的 甲基化 修饰， 特 别是当 A 残基 位于 "5'-RRACX- 3 … 序 列中， 这里的 X 很少是 G。 多至 0.1% 的前 03 mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP 247 mRNA 中 A 残基 是甲基 化的， 成熟的 mRNA 中甲基 化修饰 是高度 保守, 尽管 甲基化 的功能 还不很 清楚。 O RNA 加工 与怯巧 怯蛋白 复合体 04 可变 mRNA 加工 ■一 •分 & 少’ 5、 巧夺’ 巧 .兮 々•々'»/& 々々 龄宙 分令 & 公、 3/^、'3/公*々々/々''»^.々^>»^々^々^々^々^>»^分巧'々^々^^«/宙々^々"^々'分分々^分@'々^々^'»席'分々'一^々^々^ 要 点 可变 加工 可变 mRNA 加工 可将前 mRNA 转化 为一种 W 上的 成熟 mRNA, 通 过使用 不同的 poly (A) 位点 或不同 的剪接 方式实 现对前 mRNA 的 加工。 某些前 mRNA 含 有一个 la 上的 poly (A) •位 点， 可 W 在不 同情况 下 （如 在不同 细胞类 型中） 产生 出不同 的成熟 mRNA。 在某些 情 况下， 相 关因子 将结合 在某特 定位点 近旁， 激活 或抑制 活性。 可 变剪接 I 可 W 从 一个特 定基因 转录物 通过利 用不同 5'、 3' 剪 接位点 产生出 不同 的成熟 mRNA。 可变剪 接有四 种主要 方式： 1) 利用不 同的启 动子； 2) 利用 不同的 poly (A) 位点； 3) 保留 某些内 含子； 4) 保留 或去除 某些外 显子。 在不同 细胞类 型中会 有不同 的情况 发生， 这 可能是 由于细 胞类型 依 赖因子 在其激 活或抑 制结合 位点附 近的加 工位点 的活性 所造成 的。 RNA 编辑 I RNA 加工 的一种 形式， 是通过 改变、 插入 或删除 初生转 录物特 定部位 的碱基 而改变 其中的 核巧酸 序列。 例 如人类 Apo-B 蛋白， 在肠细 胞内通 过将 mRNA 上 的一个 C 换为 U 产 生出一 个终止 子， 翻译 形成一 个截短 蛋白。 民 NA 编 辑会涉 及向导 RNA (RNA 编 辑的模 板）。 巧 关主题 RNA 聚合酶 n 基因： 启 动子与 增强子 （M4) mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP (03) 可变 poly (A) 位点 可 变加工 在 许多情 况下真 核生物 的一个 特定前 mRNA 会产生 出一种 lit 上的 mRNA。 当特定 外显子 （可 变外 显子） 被 剪掉， 在 成熟的 mRNA 分子中 不 保留该 外显子 序列， 就发生 了可变 加工。 另 外如有 可被利 用的可 选择 poly (A) 位点， 就 会产生 具不同 3' 端 的成熟 mRNA。 可变 RNA 加工的 类型包 括可变 （或 差异） 剪接 和可变 （或 差异） poly (A) 加工。 可变 poly —些前 mRNA 含有 多于一 组的用 于剪切 及加尾 的序列 （参见 03)。 (A) 位点 细 胞或生 物体可 W 选择使 用其中 一组。 若上游 位点被 使用， 而位于 被剪除 部位 的控制 mRNA 稳定 性或定 位的序 列就有 可能被 切掉。 因此可 从同一 基 因产生 出具有 相同编 码区， 不同 稳定性 或定位 的成熟 mRNA。 在某些 04 可变 mRNA 加工 249 可 变剪接 情 况下， 在同一 细胞中 两个位 点均可 W —定 频率 （反映 它们相 对效率 ，强 度） 被 利用， 结果该 细胞会 同时含 有两种 mRNA。 poly (A) 位点 的效率 反 映出与 保守序 列的匹 配程度 （参见 03)。 另一 方面， 一种 细胞可 W 只利 用一个 poly (A) 位点， 而不同 细胞采 用另一 poly (A) 位点。 最 可能的 解释是 在某一 细胞中 最强的 位点被 滥用， 而在 其他细 胞中， 由于存 在某一 可 活化弱 位点的 因子， 结果 该位点 被强制 使用； 或者 存在一 个阻止 强位点 被 使用的 因子。 在 某些情 况下， 可变 poly (A) 位点 的使用 可导致 采用不 同的剪 接方式 （参 见下 文）。 图 04.1 可变 剪接的 方式。 （a) 启动子 户1 或 。的 选择； （b) 剪切和 （或） 多 腺 巧酸化 位点的 选择； （C) 内 含子的 保留； （d) 外 显子的 跳读。 白盒表 示外显 子， 灰 盒表示 可变外 显子， 细线 表示内 显子。 根据 D. M. Freifelder (1987) 分 子生 物学， 第二版 绘制。 图 04.1 概 括出四 种最常 见的可 变剪接 方式。 如图 04. la 所示 启动子 的 选择决 定剪接 方式， 这种 情况在 a- 淀粉酶 和肌球 蛋白的 轻链基 因中发 生。 从上 游启动 子转录 的外显 子有着 较强的 5' 剪接 位点， 结果 "击 败" 从 下游启 动子的 5' 位点， 而获得 第一个 3' 剪接 位点的 使用。 例如 在唾液 腺中， 特定 的转录 因子使 a- 淀 粉酶基 因从上 游启动 子开始 转录； 而在肝 细 胞中， 使用 下游启 动子， 结果 较弱的 （第 二） 5' 剪 接位点 自然被 使用。 图 04. lb 显示了 poly (A) 位 点的不 同使用 所导致 的可变 剪接。 只 有当下 游的 poly (A) 位点被 使用， 较强的 3' 剪接位 点才会 存在， 这样倒 数第二 个外显 子将被 删除； 而当 上游的 poly (A) 位点被 使用时 （如 不同 细胞或 发育的 不同阶 段）， 剪 接便自 然利用 较弱的 （上 游） 3' 剪接 位点。 对于免 250 O RNA 加工 与核巧 核蛋白 复合体 疫 球蛋白 来说， 使用 下游的 poly (A) 位点可 W 使编 码膜错 定区域 的外显 子保留 下来， 而 使用上 游位点 这些区 域就不 存在， 便 产生分 泌型的 免疫球 蛋白。 在 某些情 况下， 如图 04.1c 所 示内含 子可被 保留。 若内含 子包含 一个 终止密 码子， 翻译 时就会 产生一 个截短 蛋白， 这 可能导 致产生 一个没 有 活性的 蛋白， 正如 果蜗体 细胞的 P 元件 转移酶 的情况 那样。 在 化性细 胞中， 一个 特定的 因子可 吏 内含子 正确剪 接产生 较长的 mRNA， 进而 翻 译成功 能酶， 而体 细胞中 缺少这 种特定 因子。 最后 一种可 变剪接 （图 04. Id) 展 示出某 些外显 子在不 同的情 况下可 被保 留或被 切除， 其可能 的原 因是存 在一种 因子。 在某一 细胞类 型中， 该 因子可 促 进特定 剪接位 点 使用， 或者抑 制另一 位点的 使用。 大鼠肌 巧蛋白 T 的前 mRNA 就是 W 这种不 同的方 式进行 差异剪 接的。 RNA 编辑 一 种不同 寻常的 RNA 加工 模式， 即原始 转录物 的一些 序列被 更改， 叫做 RNA 编辑。 有这样 的一些 例子， 似 乎在非 脊椎动 物中更 加普遍 。人 体中 的脱辅 基脂蛋 白 B 前 mRNA 编 辑使一 个碱基 C 变换为 U， 结 果在肠 细胞 14500nt 分子的 6666 位 点产生 了一个 终止密 码子。 在 肝细胞 中未编 辑的 RNA 产生载 脂蛋白 B100， 一个 512kDa 的 蛋白， 而在肠 细胞中 ，编 辑结果 产生了 截短载 脂蛋白 B48 (241kDa)o 相 似地在 神经细 胞中， 谷氨 酸 受体前 mRNA 上 的一个 A 变为 G， 产 生出一 种不同 构型的 受体。 在纤 毛原生 动物， 利什曼 原虫属 (Leishmania) 中这种 编辑更 令人杠 、奇。 当线 粒体细 胞色素 b 基因的 cDNA 被 克隆出 来时， 它有一 个与蛋 白顺序 相对应 的编码 区域， 虽然已 知它由 线粒体 基因组 编码， 然而 在基因 组中却 没有发 现 相应的 序列， 最 终获得 的一些 cDNA 克隆， 其序列 是介于 基因组 序列与 成熟 mRNA 之间 的相应 序列， 好像 原始转 录物， 在 一些特 定位点 不断被 编辑插 入一些 额外的 U， 经过 许多轮 的编辑 最终产 生出可 被翻译 的成熟 RNA。 一 些被称 为向导 RNA 的短 RNA 分子似 乎参与 其中， 它们 的序列 与 基因组 DNA 的序 列及编 辑后的 RNA 序列 互补。 一 些其他 类型的 RNA 编 辑也有 发现。 (江 乐 译 刘进元 化） P 逸传 密码与 tRNA PI 遗 传密码 要 点 特 性 遗 传密码 是核酸 中的核 昔酸序 列指定 蛋白质 中的氨 基酸序 列的一 种 方式， 是 由兰个 核巧酸 组成的 兰联体 密码， 密码子 （兰 核昔酸 组） •是 相连的 （不重 叠）、 中间没 有任何 的停顿 （没有 逗号) 。由 于 64 个密码 子中的 许多是 编码同 一氨基 酸的， 因 此遗传 密码具 简并性 （有丰 余)。 破 详 标 准造传 密码是 通过向 具有有 限翻译 能为的 细胞提 取物中 加入单 一核昔 酸的聚 合物， 多 核昔酸 共聚物 或合成 的核巧 酸兰联 体而破 译成 功的， 结 果发现 61 种密码 子编码 20 种氨 基酸， 而另 外有兰 个 终止密 码子。 特 征 20 种氨基 酸中的 18 种是 由多个 密码子 （同 义密 码子） 编 码的， 这 些同义 密码子 在遗传 密码表 中成组 排列， 通常它 们仅在 密码子 的第兰 位上有 差异。 第兰位 如果是 喀巧， 那 么它们 总是编 码同一 氨 基酸； 如果是 曝吟， 通常也 是编码 同一氨 基酸。 突变 的效应 成组同 义密码 子的存 在意味 着可将 突变的 效应最 小化。 密 码子第 兰位的 转换通 常是无 效的， 多半 的颠换 也是无 效的。 在第一 、二 位的突 变通常 导致化 学特性 上相似 类型氨 基酸。 通用性 目 前仍认 为标准 遗传密 码是通 用的， 但在线 粒体及 一些单 细胞生 物中 现已发 现一些 例外。 可读框 可读框 （ORF) 是 指新测 DNA 序 列中， 由 计算机 辨认出 的可能 编码 区域， 它是 从起始 密码子 起到终 止密码 子止的 一段连 续的密 码子 区域。 重 查基因 指一 个基因 的编码 区部分 或全部 与另一 基因的 编码区 重叠， 因此 一种可 读框编 码一种 蛋白， 而 其他可 能的可 读框编 码第二 种蛋白 的一 部分或 全部。 某些 较小病 毒的基 因组利 用送种 方式来 增加它 们 基因组 的编码 能力。 相 关主题 诱变 （F1) 真核生 物蛋白 质合成 的起始 （Q3) tRNA 结构 与功能 （P2) 翻 译调控 与翻译 后加工 （Q4) 蛋 白质合 成机制 （Q2) 252 P 遗传 密码与 tRNA 特性 巧译 遗 传密码 统一了 核酸中 四种核 巧酸序 列与蛋 白质中 20 种氨基 酸序列 的对 应性。 研 究证明 遗传密 码是兰 联体， 每兰 个核巧 酸编码 一种氨 基酸， 这可 W 从数 字上加 W 论征， 由于 （42二16)<20<(43二64)，可见指定每种 氨 基酸至 少需要 3 个核 脊酸。 不过需 要指定 的氨基 酸只有 20 种， 而潜在 的不 同的兰 联体有 64 种， 结果大 多数氨 基酸是 由多于 一个兰 联体所 编码， 因此说 遗传密 码是简 并的， 或有 丰余。 从 固定的 起始点 开始， mRNA 的编 码 区内每 3 个相 邻的碱 基代表 一个密 码子， 被某 一特定 tRNA 分子 的一端 的互补 兰联体 （或 称反密 码子） 所识别 （参见 P2)。 兰联体 密码是 线性 方式 被读， 中间既 不存在 重叠也 不存在 停顿。 一县 阅读自 正确的 起始点 (参见 Q3) 开始， 密 码子就 W 相邻兰 联体的 形式被 破译。 随 着越来 越多的 基 因和蛋 白序列 信息的 获得， 越来 越清楚 地表明 遗传密 码几乎 （而 不是绝 对） 是 普遍适 用的， 这 有力地 支持了 所有生 命都起 源于共 同的祖 先的假 说。 20 世纪 60 年代， Nirenberg 建立 了大肠 杆菌无 细胞蛋 白合成 体系。 本 质上这 是经离 心后的 细胞裂 解液， 是用 DNase 处理 抑 制任何 转录， 而在 加入自 然的或 合成的 mRNA 盾， 又能进 行有限 的蛋白 合成的 体系。 为了确 认哪种 氨基酸 被聚合 到新合 成的多 肤中， 需平 行进行 20 个 反应。 每 个反应 中含有 19 种非放 射性的 氨基酸 和一种 放射性 标记的 氨基酸 。利 用 多聚核 音酸踞 酸化酶 合成只 有一种 核巧酸 成分的 mRNA, 即多 聚尿略 晚 核巧酸 [poly(U)]、 多聚 胞喀瞎 核昔酸 [poly(C)]， 多 聚腺曝 吟核昔 酸 [poly(A)]、 W 及多聚 鸟曝吟 核脊酸 [poly(G)]。 如果 加入一 种这样 单 一组成 的合成 mRNA 后， 发 生了蛋 白质的 合成， 那么 20 个反应 管中肯 定会 有一个 试管， 其 放射活 性将被 渗入多 化中。 用这种 方法， 结 果发现 poly (U) 指 导了多 聚苯丙 氨酸的 合成、 poly (C) 编码了 多聚脯 氨酸、 poly (A) 编码 多聚赖 氨酸， 而 poly (G) 没有 蛋白的 合成因 为它形 成了复 杂 的二级 结构。 如 果多聚 核昔酸 憐酸化 酶能够 被用来 聚合两 种核营 酸的混 合物， 比如 说 U 和 G， 不同的 比例如 0.76:0.24， 那 么在兰 联体中 GGG 出现 最少， UUU 将 是最普 遍的， 而 兰联体 中含有 2 个 U 和一个 G 的 出现频 率则次 之。 利 用这些 随机共 聚物作 为合成 mRNA 加 入到无 细胞体 系中， 来确认 某种 特定氨 基酸惨 入到多 肤中的 比例， 就可能 确定出 许多氨 基酸的 密码子 的 构成。 但兰联 体密码 子的精 确顺序 的确定 还需要 另外的 信息。 直到 20 世纪 60 年 代末， 研 究发现 合成的 兰核巧 酸能够 附着在 核糖体 上， 并与 其对应 的氨醜 -tRNA 结合， 而 经膜过 滤后， 只有核 搪体、 合成 的兰联 体^> (及氨 醜 -tRNA 形成的 复合体 （参见 P2) 才 能保留 在膜上 。若 将含 有所有 氨醜- tRNA 的混合 物分成 20 组进行 实验， 每组 含有一 种被放 射性同 位素标 记的氨 基酸， 那么 实验会 显示出 特定兰 联体可 明确地 来指定 特 定该氨 基酸。 结果 总其有 61 种 密码子 编码氨 基酸， 而 3 个是终 止密码 PI 遗 传密码 253 子 （表 P1.1) (氨基 酸的兰 字母代 码和一 字母代 码参见 B1)。 表 P1.1 巧用遗 传密码 第一位 第二位 第三位 (3, 端） (5, 端） U C A G Phe uuu Ser ucu Tyr UAU Cys UGU u Phe uuc Ser ucc Tyr UAC Cys UGC c U Leu UUA Ser UCA 终止 密码子 UAA 终止 密码子 UGA A Leu UUG Ser UCG 终止 密码子 UAG Trp UGG G Leu CUU Pro ecu His CAU Arg CGU U Leu cue Pro CCC His CAC Arg CGC C C Leu CAU Pro CCA Gin CAA Arg CGA A Leu CUG Pro CCG Gin CAG Arg CGG G lie AUU Thr ACU Asn AAU Ser AGU U lie AUC Thr ACC Asn AAC Ser AGC C A lie AUA Thr ACA Lys AAA Arg AGA A Met AUG Thr ACG Lys AAG Arg AGO G Val GUU Ala GCU Asp GAU Gly GGU U Val GUC Ala GCC Asp GAC Gly GGC C G Val GUA Ala GCA Glu GAA Gly GGA A Val GUG Ala GCG Glu GAG Gly GGG G 特征 遗 传密码 具有简 并性， 即同一 种氨基 酸具有 多个密 码子， 编码 同一氨 基酸的 密码子 被称为 同义密 码子。 20 种氨基 酸中， 除了蛋 氨酸和 色氨酸 仅有一 个密码 子外， 其他 18 种均 有一个 W 上的密 码子。 同 义密码 子不是 随机排 列的， 多 数同一 気基酸 的密码 子均在 同一方 框内， 通 常只是 第兰个 碱基 不同； 在 多数情 况下， 这 第兰位 如果是 喀惦， 将编码 相同的 氨基酸 (是 同义 的）， 大多 数情况 下如是 標吟， 其 密码子 也是同 义的。 一般 来说， 如 果第二 位是喀 晦它所 编码的 氨基酸 是亲水 性的， 如 果第二 位是標 岭则所 编码 的氨基 酸是极 性的。 突变 的效应 一 般认为 遗传密 码进化 方式是 突变穀 响的最 小化进 行的。 最 常见的 突变是 转换， 即 由一喀 巧突变 为另一 唆巧， 或 者是由 一曝咚 转变为 另一標 岭。 颠换是 由喀晚 突变为 曝岭或 由囑吟 转变为 喀巧的 突变。 第兰位 的转换 通 常不改 变其编 码的氨 基酸， 例 外的是 会引起 蛋氨酸 与异亮 氨酸、 或者色 氨 酸与终 止密码 子间的 互换。 在第兰 位的颠 换一半 上是无 效的， 其余的 通常 导致相 似氨基 酸间的 互换， 如天 冬氨酸 或谷氨 酸间的 互换。 在 第二位 的转 换将导 致化学 性质相 似氨基 酸间的 转变， 而颠换 将改变 氨基酸 类型。 254 P 遗传 密码与 tRNA 通用性 可读框 重 巧基因 第 一位上 的突变 （无 论是转 换还是 颠换） 通常编 码性质 相似的 氨基酸 ，在 少 数情况 甚至是 同一氨 基酸。 在遗传 密码破 译后的 相当长 一段时 间里， 大家认 为密码 子是普 遍适用 的， 即在 所有生 物中都 通用。 然而 1980 年后， 发现 线粒体 基因组 所使用 的 密码子 与标准 或者说 "通 用" 密 码稍有 不同。 其实 现在已 知一些 单细胞 生物也 使用一 些变异 了的遗 传密码 。表 P1.2 列举了 这些变 异了的 遗传密 码。 表 P1.2 遗 传密码 的例外 密码子 通 常含义 变异的 细胞器 或生物 AGA Arg 终止 密码子 ， Ser 一些 动物的 线粒体 AGG AUA lie Met 线粒体 CGG Arg Trp 植物 线粒体 CUN Leu Thr 酵母 线粒体 AUU lie 起始 密码子 一些原 核生物 GUG Val UUG Leu UAA 终止 密码子 Glu 一些原 生动物 UAG UGA 终止 密码子 Trp 线 粒体， 支原体 观察 DNA 序列， 例 如经基 因组测 序计划 获得的 序列， 无论是 用肉眼 或是计 算机都 可辨认 出始于 ATG， 止于 TGA、 TAA 或 TAG 的连 续的密 码子 区域。 当没有 已知的 蛋白产 物时， 该 区域被 称为可 读框， 而当 确知该 可 读框编 码某一 确定蛋 白时， 它就被 称为编 码区。 也 就是说 一个可 读框是 潜 在的编 码区。 尽 管通常 一个基 因编码 一条多 肤链， 而在 进化上 受到很 大限制 在一特 定区域 编码多 于一个 蛋白有 很多， 现 在知道 有许多 有重叠 编码区 （重 叠基 因） 的 例子。 重叠 基因通 常是在 基因组 较小而 需要胆 存更多 信息的 情况下 产生。 例如晦 菌体蛋 X 174 基因 组只有 53%bp， 却 编码了 11 种蛋白 ，其 总分子 质量达 262kDa。 如果 基因不 重叠， 整个 基因组 至多只 能编码 200kDa 的 蛋白。 该基因 组中有 兰个较 短链的 蛋白编 码区在 较长蛋 白的编 码 区内。 在 原核生 物中， 核糖 体为翻 译重叠 基因须 发现第 二个起 始密码 子， 这一 步可在 不解离 模板的 状态下 实行。 而 真核生 物采用 不同的 方式起 始蛋 白合成 （参见 Q3)， 通常采 取可变 RNA 加工方 式来从 一个基 因合成 出不问 蛋白。 P 遗传 密码与 tRNA P2 tRNA 的结构 与功能 tRNA 功能 化正 tRNA 的线 性长度 （一级 结构） 约 60 〜 95 个核 昔酸， 通常为 76, 其中 含有许 多修饰 核巧， 特 别是胸 腺喀巧 核巧、 假 尿喀巧 核巧、 二氨 尿巧和 肌巧。 tRNA 分 子中有 15 个不变 残基、 8 个 可变残 基。 兰叶 草结构 通常是 tRNA 分 子二级 结构的 模型， 显 示出由 于不同 区域 的碱基 配对而 形成的 四个茎 （臂） 兰 个环的 结构。 5' 端与 3' 端的 碱基配 对形成 不带环 的氨基 酸的接 受臂。 tRNA 的结 构按逆 时 针方向 依次为 二氨尿 喀巧环 （D-loop), 反密 码子环 [及 T 环 (T-loop)。 大 部分恒 定和半 恒定残 基位于 环上， 而不在 茎部。 在单 链环的 碱基间 （主要 是不变 残基） 形 成九个 氯键， 将 二级结 构 折叠成 L 形兰级 结构， 其分 子的两 端分别 是反密 码子环 W 及 另一 端的氨 基酸接 受臂。 tRNA 的 3' 端负 载特定 氨基酸 后形成 氨醜- tRNA, tRNA 分子在 蛋白合 成中起 转接器 作用。 tRNA 分子 的负载 或氨醜 化是通 过二步 反应完 成的。 首 先氨醜 tRNA 合 成酶将 腺脊酸 （AMP) 附着 到氨基 酸的哲 基上， 形成氨 醜腺 巧酸中 间体， 随后 合适的 tRNA 替代 AMP。 合 成酶可 W 是单 体、 二聚 体或四 聚体。 氨醜 tRNA 合成 酶在其 L 形内部 与相关 tRNA 发生 反应， 并利用 tRNA 被称 作识别 元件的 部分鉴 别这些 相似的 tRNA 分子。 当合成 酶完成 第一步 反应， 一 个化学 结构相 似但是 错误的 氨基酸 被 氨酥化 了时， 合成酶 不进行 第二步 反应， 而是水 解掉氨 醜腺昔 酸 来完成 校正。 相 关主题 核 酸结构 （C1) tRNA 加工、 RNaseP 和核酶 （02) tRNA 的一 tRNA 是将氨 基酸转 运到核 糖体， 并破译 mRNA 信息的 转接器 分子。 级结构 它 们的一 级结构 （即 核昔酸 的线性 序列） 长约 60-95 个核 巧酸， 通常为 76。 在任何 tRNA 分 子中， 均 含有许 多修饰 碱基， 有 时能占 到分子 总碱基 数的 20%。 实 际上， 在迄今 为止已 鉴定的 几百种 tRNA 分 子中， 已观察 到 50 余种不 同类型 的修饰 碱基， 都 是在转 录后经 修饰形 成的。 图 核昔 的形式 列出了 最常见 的走种 类型。 其 中的四 种是在 tRNA 分子 中常见 256 P 遗传 密码与 tRNA 的修饰 碱基， 分别是 含有在 RNA 分子 中不常 见的胸 腺喀巧 碱基的 胸腺唾 口定核 糖核巧 (T), 及在 RNA 分子中 常见的 假尿懼 D 定核巧 （扣、 二象尿 昔 （D) 和肌巧 （I)。 除肌 巧外， 它 们几乎 出现在 tRNA 序 列中的 相似位 置。 字母 D 和 T 被用 来命名 二级结 构特征 （参 见下 文）。 在 tRNA 的一级 结 构中， 有 15 个核巧 酸是恒 定的， 有 8 个位 置上的 核巧酸 是半恒 定的， 即要么 是曝吟 （R) 要么 是喀瞎 （Y)。 按标 准定位 习惯， 将第 1 位定为 5' 端， 而将第 76 位定为 3' 端， 于 是有； 8, 11, 14, 15, 18, 19, 21, 24, 32, 33, 37’ 48, 53, 54, 55, %, 57, %, 60, 61， 74,75,76 D 环 反密 码子环 T 环 接受臂 恒定或 半恒定 核巧酸 所处位 置在二 级结构 或兰级 结构形 成中均 起作用 （参 见下 文）。 S H 11 H N C I II /C C (/ \n/ \h I 核巧 0 H li H 、八 /H N N I I /C /C 1 核巧 0 N C I II /C c 1 核巧 4 - 硫尿电 Ms4u) 假尿巧 巧核巧 w 胸脏 嗦巧核 箱核巧 m 0 H II „ 、八 户 N C、|_| I I^H \n/ \h I 核巧 二 気巧巧 (D) 州, '\ /C\ N N C/ I II C-H H Cv C、、,/ N/'V N\ H 核巧 甲 基鸟巧 (m1^ O H\/C\ N、 I II C-H 八/ N 核巧 肌巧 /州3 NH— 州2— CH = C、 I \州3 ^C\ /N\ I II C-H /VY 核巧 w6- 异戊巧 基腺巧 (i6A) 图 P2.1 tRNA 中的修 饰核昔 tRNA 的二 所有 tRNA 都有共 同的二 级结构 即兰叶 草结构 （图 P2. 2a 不同 区域的 级结构 碱基配 对形成 茎环结 构）。 这 一结构 含有由 RNaseP 切割 形成的 5'- 单縣酸 而不是 通常的 5'- 兰磯酸 （参见 02)。 还有由 tRNA 分子的 3' 端与 5' 端间 的碱基 配对而 形成的 7bp 茎 结构， 不过真 核生物 在加工 中添加 上去的 74 至 76 位的恒 定残基 （即 末端的 5'-CCA-3') 并不包 含在这 一碱基 配对区 段 （参见 02)。 这一茎 结构被 称为急 基酸接 受臂。 按 逆时针 方向由 5' 向 3' 的 方向， 接下 来的二 级结构 被称为 D 环， 由 3 或 4 个碱基 对的茎 和一个 D 环 （二 氨尿 昔环） 组成， 该环上 常含修 饰碱基 二氯尿 喀旋。 下一个 特征结 构是由 5 个 碱基对 的茎和 7 个残基 对的环 组成， 环中 含可与 mRNA 兰联体 密码 序列互 补的相 邻兰核 巧酸， 即反密 码子。 肌巧在 反密码 子中的 出现使 得 tRNA 能够与 多于一 个的密 码序列 进行碱 基配对 （参见 Q1)。 接 着是可 变臂， 含有 3~21 个残基 不等， 并且可 形 成多至 7 个碱 基对的 茎状结 P2 tRNA 的结构 与功能 257 构。 tRNA 长度变 异的另 一部位 是在图 P2. 2a 中 虚线 表示的 D 环。 二级 结构的 最后一 个主要 特征是 T 臂或 T>I^C 臂 ，由 5 个 碱基对 的茎和 含有恒 定碱基 GimC 的环 构成。 值得一 提的是 tRNA 分子 中大多 数的恒 定残基 位于 环区， 在 二级结 构形成 中并不 起主要 作用， 其中 的几个 有助于 兰级结 构的 形成。 (a) 76 A-OH 3 9 気基巧 接受臂 C 常为 I 反巧 码子环 (b) 76 A'OH 3. C I C (c) TyC 环 图 P2.2 tRNA 结构。 （a) 显示恒 定和半 恒定核 昔酸的 兰叶草 结构， 1= 肌巧， <^=假 尿昔， 1^=嗦 吟， Y= 喀喧， *表 示修饰 碱基； （b) 用虚线 表示的 tRNA 核 巧酸间 的兰级 氨键； （C) 酵母 tRNAT^ 的 1^形= 级结构 （图 C 引自 E). M. Freifelder (1987) 分子生 物学， 第二 版）。 tRNA 的= 共有 9 个氯键 （三级 氨键） 帮 助形成 tRNA 分子 的兰级 结构。 这些氯 级结构 键 主要涉 及几个 恒定碱 基间碱 基配对 （图 P2.2b)。 D 臂上和 T 臂的 碱基 配对将 tRNA 分子 折叠成 L 形， 反密 码子在 L 形的 一端， 而氨基 酸接受 258 P 遗传 密码与 tRNA tRNA 功能 tRNA 的量 敌化 夏敌 tRNA 合成酶 臂 则在另 一端。 tRNA 兰 级结构 经碱基 堆叠作 用而得 到加强 （图 2C) (参 见 C2)。 经 氨醜化 反应， tRNA 与 氨基酸 连接成 为氧酥 -tRNA (负载 tRNA), 而蛋白 合成中 的转接 器分子 正是这 些负载 tRNA。 被称为 氨醜- tRNA 合 成酶特 异催化 氨醜化 反应， 且极 为专一 （即将 特定的 氨基酸 连接到 特定的 tRNA 上）， 这种特 定的氨 基酸与 tRNA, 或 tRNA 与氨酷 tRNA 合 成酶被 称之 为关联 组合， 其命名 列于表 P2.1 中。 表 P2.1 tRNA 合成酶 与反载 tRNA 的命名 氨基酸 相关 tRNA 相 关氨酥 -tRNA 合成酶 氨南 -tRNA 丝氨酸 tRNA 沿 丝氨醜 -tRNA 合成酶 Seryl-tRNA&f 亮氨酸 tRNA 山 亮氨醜 -tRNA 合成酶 Leucyl-tRNA^ tRNA 挽 A Leucyl-tRNA 抚 A 夏献化 反应过 程如图 P2. 3 所示， 是一由 ATP 驱动 的两步 反应。 第一 步， AMP 连接 到氨基 酸的哲 基上， 形成 称为氯 醜腺巧 酸高能 中间体 ，释 放出 的焦憐 酸水解 （得到 2 分子 的无机 稱酸） 驱动反 应继续 进行； 第二 步， 氨醜 腺巧酸 与适合 的空载 tRNA 作用形 成氨醜 tRNA 和 AMP。 一些 合成 酶可将 氨基酸 连接到 核糖的 2'- 哲基， 而另 一些可 连接在 3'- 轻 基上， 连接 后送两 种产物 可相互 转换。 由 于氨醜 -tRNA 的键 能高于 肤键， 因此 氨醜 tRNA 的 形成有 助于驱 动蛋白 合成， 因为 肤键的 形成是 一个耗 能的反 应。 尽 管它们 都负责 将氨基 酸连接 到相应 tRNA 上， 各合成 酶却有 很大的 差异。 根据亚 基结构 可将它 们分为 四类， 即 a、 02、 04^ 及 耗。 其多肤 链的 长度从 334 个氨 基酸至 1000 多个 不等。 这 些合成 酶是在 tRNA L 形 的侧 面与之 结合， 并 有各自 的氨基 酸结合 位点。 合成 酶须能 够区分 细胞中 40 多种形 状相似 的不同 tRNA 分子， 这主要 依赖于 tRNA 分子上 称为鉴 别元 件的梓 殊部位 （图 P2.4)。 鉴别 元件并 非总是 反密码 子序列 （在 不同 tRNA 分子中 是不同 的）， 常常 还包含 接受臂 中的碱 基对。 如果这 些元件 在 tRNA 间被 互换， 那么 合成酶 就会将 氨基酸 接在不 对应的 tRNA 上 。例 如， 如果 tRN A^a 的鉴 别元件 G3 : U70 被用 来替换 tRN aGy* 或 tRN Afhe 的 3:70 碱 基对， 那么这 些被修 饰过的 tRNA 就 会被丙 氨醜- tRNA 合 成酶所 识别， 结果 负载丙 氨酸。 P2 tRNA 的结构 与功能 259 校正 腺巧 •) P H P n P ATP + C — CH — NHq I A 氨基酸 第 1 步 腺巧 C — CH — NHg 氨規 腺巧巧 AMP o % O O ， ooS oooo ooooo ooooo" ’§ 掉 s % o II + -C —— CH —— NHo I R 3 -氨規 tRNA 图 P2.3 氨骄 -tRNA 的形成 某些 须对两 种化学 结构相 似的氨 基酸进 行区分 的合成 酶行使 校正功 能。 如果偶 然在进 行第一 步反应 时将错 误的氨 基酸氨 醜化， 那么它 们将不 再进行 第二步 反应， 而是进 行氨醜 腺巧酸 水解。 只有 当单一 识别过 程不足 区分不 同氨基 酸时， 校正 才是必 需的。 苯丙 氨酸和 酪氨酸 在第一 步即可 被区分 开来， 因 为苯环 上餐基 位置的 不同， 因 此这种 情况下 就不需 校正。 260 P 遗传 密码与 tRNA o O G24 o O o. oo ooooo。。。 O > o G20 OOOO O OO tRNAAb O O G34 • A36 A35 tRNAP 始 G35 • U37 A36 tRNAfWet tRNA 論 图 P2.4 不同 tRNA 分子 中的鉴 别元件 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00000 — 00000 0 OOOO %。、 o o o o o rooo ooooo ooooooooooo ooooooo o oo o o o o o o o o o o o o OOO0000OOOO 3 21 w 777a Gccu • ••OOOO 123 GG^ o oo 鄉 o o o ooooo ooooo o o o r 8 000。 o o ooooo ooooo o . o o o o o o o ooooooooooo ooooooo o oo o o o o o o o / o o o o o o o 0000020000 ooooooo 3 o G oo o o o o o o (林 会兰译 刘进 元化） Q 蛋白 质合成 Q1 蛋 白质合 成概述 要 点 在核 糖体的 大小亚 基的缔 合处， mRNA 的密 码子与 tRNA 上的 反密 码子平 行形成 3 个碱 基对。 如 果反密 码子的 5' 碱基是 被修饰 过的， 则其 tRNA 通常能 与一个 W 上 的密码 子相互 反应。 摆 动假说 描述了 被修饰 过的反 密码子 5' 碱基 能与密 码子的 3' 碱 基 形成非 标准型 的碱基 配对。 当摆 动位核 巧是肌 巧时， tRNA 能 与 3' 端 碱基为 A、 C、 U 的 3 种密 码子形 成碱基 配对。 核搪体 结合位 点是原 核生物 mRNA 起 始密码 子上游 的一段 序列， 它 能够与 16S rRNA 的 3' 端附 近的互 补序列 配对， 对核糖 体进行 定位 便 起始蛋 白质的 合成。 若 W 其 发现者 的名字 来命名 则称之 为 Shine-Dalgarno 序列 ，即 SD 序列。 多聚 化糖休 I 当 核糖体 连续不 断地向 mRNA 附着， 并 进行翻 译且沿 mRNA 移 动时， 就形成 多聚核 糖体。 多聚 核糖体 是位于 mRNA 分 子链上 处 于不同 翻译阶 段的多 个核糖 体的复 合体。 起始 tRNA I 在 原核和 真核生 物中能 够识别 AUG 起始密 码子， 起动蛋 白合成 的一种 特殊的 tRNA。 在 原核生 物中， 起始 tRNA 首先在 甲硫氨 醜 tRNA 合成 酶的作 用下负 载甲硫 氨酸， 接 着甲硫 氮酸残 基经转 甲醜 酶作用 转变为 N - 甲 醜甲硫 氨酸。 在 真核生 物中， 起始 tRNA 携带的 甲硫氨 酸未经 修饰。 在 大肠杆 菌中， 起始 tRNA 与 运送内 部甲硫 氨酸的 tRNA 在结构 上是不 同的。 相 关主题 rRNA 加工与 核糖体 （01) tRNA 的结构 与功能 （P2) tRNA 加工、 RNaseP 和核酶 （02) 蛋 白质合 成机制 （Q2) 板糖 休结合 位点 密码 子与反 密码子 的相互 作用 ~揉 动现象 密码 子与反 当 mRNA 与 tRNA 在核糖 体的凹 槽处相 遇时， tRNA — 端的反 密码子 密码 子的巧 将与 mRNA 上的互 补的兰 联体碱 基即密 码子相 互作用 （参见 01)。 这种 互作用 作 用具反 向平行 的恃征 （图 Q1.1)。 研 究发现 某些高 纯度的 tRNA 能与多 于 一个的 密码子 作用， 这与反 密码子 5' 位存 在修饰 核巧尤 其是肌 巧相关 (参见 P2)。 5' 位的 肌昔是 经腺巧 的转录 后加工 （参见 02) 而 形成， 该反 应 由可将 6 - 氨基转 变为刚 基的反 密码子 脱貢酶 催化完 成的。 摆 动现象 为解释 遗传密 码的丰 余性， 克里 克提出 了摆动 假说。 通 过模型 分析， 克里 克认识 到反密 码子的 5' 碱基 相对于 另外两 个喊基 有更大 的活动 范围， 262 Q 蛋白 质合成 因此 只要核 糖间的 距离接 近正常 距离， 它能够 形成非 标准碱 基对。 他的划 时代预 言及其 实际观 察结果 列于表 Q1.1。 標吟 -囑吟 或喀巧 -喀巧 配对是 不允 许的， 因 为核糖 之间的 距离不 合适， 没 有一种 tRNA 能够识 别兰个 上的密 码子， 因此， 至 少需要 32 种 tRNA 去破译 61 个 密码子 （终 止密码 子除 外)。 tRNA 依其摆 动碱基 （反密 码子的 5' 碱基） 能够识 别一个 、两 个或 兰个密 码子。 如果 5' 碱基是 C， tRNA 只 能识别 G 结 尾的密 码子; 如果是 G， 则可 将识别 U 和 C 结尾的 两种密 码子； 如果是 U， 它将随 即被 修饰， 可与 A 或 G 配对。 摆动 核巧决 不会是 A， 因 为通常 A 被转成 能与 A、 C 或 U 配对的 肌巧。 3’ 甲 硫氨酸 巧码子 图 Q1.1 密码 子与的 反密码 子的相 互作用 表 Q1.1 最 初的摆 动预测 反密 码子的 5 ‘碱基 预测的 3' 密码 子碱基 实 际观察 A U 经反密 码子脱 氨酶将 A 修饰为 I C G 没有 摆动， 正常碱 基配对 G C 和 U G 及修饰 G, 能与 C 和 U 配对 U A 和 G 未 发现反 密码子 5' 碱基是 U I A、 C 和 U 按 所预言 的规律 摆动. I 能识别 3'-A， -(：或-1； 核糖 体结合 在原 核生物 mRNA 起 始密码 子上游 8 〜 13 个核巧 酸处有 一保守 序列。 位点 该 序列由 訊 ine 和 Dalgarno 发现， 是一通 常含有 5'- AGGAGGU - 3' 序列 的 全部或 部分的 多曝吟 序列。 实验证 实这段 序列可 与核糖 体小亚 基中的 16S rRNA 的 3' 端序列 5'- ACCUCCU - 3' 进 行碱基 配对， 因 此称之 为核糖 体结合 位点或 Shine- Dalgarno 序列即 SD 序列 。涨 序 列的作 用被认 为是相 Q1 蛋 白质合 成概述 263 (a) 甲規甲 硫氨酸 脚 Met 对 于起始 密码子 而正确 定位核 糖体。 多聚 核糖体 当 核搪体 开始对 mRNA 分子进 行翻译 （参见 Q2)， 并 从起始 密码子 处 移动约 70-80 个核昔 酸后， 第二个 核糖体 能够在 核糖体 结合位 点处组 装 并开始 翻译； 而当第 二个核 糖体沿 mRNA 移动， 第兰个 核糖体 又开始 组装， 如此 往返， 结果在 mRNA 上聚集 多个核 糖体。 特 将单一 mRNA 分 子 上的多 个核搪 体称为 多聚核 糖体。 某些 mRNA 分 子上会 聚集有 50 个核 糖体 之多， 尽管它 们之间 相隔约 80 个核 昔酸。 起始 tRNA 研究 发现， 无 论在原 核生物 中还是 真核生 物中， 惨入蛋 白质多 化链的 第 一个氨 基酸都 是甲硫 氨酸， 只不 过在原 核生物 中甲硫 氨酸被 修饰为 N- 甲 酥甲硫 氨酸。 在 两类生 物中， AUG 起 始密码 子均由 一个特 定起始 tRNA 所 识别。 起始 tRNA 与识别 编码区 内其他 AUG 密 码子的 tRNA 有所 不同， 如在原 核生物 大肠杆 菌中， 这两种 tRNA 之间 有微妙 的差别 （图 Q1.2)。 起始 tRNA 的 碱基配 对有更 大的灵 活性， 由于 它的反 密码子 环上缺 少烧基 化的 A, 因此 可识别 AUG 和 GUG 起始密 码子， 而 GUG 是原核 生物的 mRNA 中很少 出现。 而 非起始 tRNA 缺乏灵 活性， 只能与 AUG 配对。 这 两种 tRNA 均由 同一甲 硫氨醜 -tRNA 合成 酶催化 完成， 甲 硫氨酸 的负载 而 形成甲 硫氨醜 -tRNA, 但只有 起始甲 硫氨醜 tRNA 被转 甲醜酶 修饰， 而 转变为 N- 甲醜甲 硫氨醜 -tRNA。 N- 甲硫基 与化键 相似， 会有 助于起 甲 麻腺脊 反 密码子 fMet-tRNA … 反 巧码子 Met-tRNA*^ 图 Q1.2 £. CO。 的甲 硫氨酥 tRNA。 （a) 起始 tRNA, fMet-iRNA^^*'; (b) 甲硫 氨醜- I ACCAAC - 5CG iACCACC 二 •5 gg tRNA, Met-tRNA' 264 Q 蛋白 质合成 始 tRNA 进入核 糖体的 P 位点， 而其他 tRNA 则进入 A 位点 （参见 Q2)。 Q 蛋白 质合成 Q2 蛋 白质合 成机制 要 点 基 本过程 I 蛋白 质的合 成过程 可分为 兰步： • 起始 核 搪体在 mRNA 上的 组装； • 延伸 氨 基酸的 转运、 肤键形 成及沿 mRNA 移动 （移 位） 的 重复 循环； ’ - 终止 多 肤链的 释放。 起 始 I 在 原核生 物中， 蛋白质 合成的 起始需 要核糖 体大小 亚基、 mRNA、 起始 tRNA、 3 种起 始因子 （IF) 及 GTP。 1。 和 IF] 与 30S 亚基 结合， 阻止大 亚基的 结合； 接着 IF2 和 GTP 与小亚 基 结合， W 利 于随后 的起始 tRNA 的 结合； 形成的 小亚基 复合体 方 能经由 核糖体 结合点 附着到 RNA 上。 而 后起始 tRNA 与 AUG 起 始密码 子配对 并释放 IF;， 最 终形成 30S 起始复 合体。 接着大 亚 基与该 复合体 结合， 替换 IFi 和 IF2 + GDP, 形成 70S 起始复 合物。 这是在 mRNA 正 确部位 组装的 完整核 糖体。 坏 — ~ I 延 伸涉及 S 个延 伸因子 （EF; EF-Tu、 EF-Ts 和 EF-G)、 GTP、 负载 tRNA 及 70S 起始 复合体 （或 等同 物）。 反应 分兰步 进行； • 负载 tRNA 与 EF-Tu 和 GTP 形成 的复合 体被运 送至核 糖体， GTP 水解、 EF-Tu-GDP 释 放出来 。在 EF-Ts 和 GTP 的作用 下， Tu’GDP 可被 再利用 （经由 EF-Tu-EF-Ts 交换循 环）。 - 肤醜转 移酶将 相邻的 两个氨 基酸相 连形成 肤键， 该过 程不需 要 能量的 输入。 • 移位酶 （EF-G) 利用 GTP 水解 释放的 能量， 使核 糖体沿 mRNA 移动 一个密 码子， 释放 出空载 tRNA 并 将新生 肤链运 至 P 位点。 终 止 I 释 放因子 （RF1 或 RF2) 识别 终止密 码子， 并在 RF3 的作 用下， 促使肤 醜转移 酶在化 链上加 上一个 水分子 并释放 肤链。 核 糖体释 放因子 有助于 核糖体 亚基从 mRNA 上 解离。 巧 关主题 tRNA 加工、 RNaseP 和核酶 （02) 蛋 白质合 成概述 （Q1) tRNA 结构 与功能 （P2) 真核生 物蛋白 质合成 的起始 （Q3) 基 本过程 蛋 白质合 成过程 可分为 兰步； • 起始 —— 核 搪体在 mRNA 分 子上的 组装; 266 Q 蛋白 质合成 起始 延伸 . 延伸 一 氨基 酸添加 的重复 循环； - 终止 —— 新 生蛋白 （多 化） 链的 释放。 如图 Q2.1 〜 Q2. 3 所示 该过程 还涉及 一系列 因子。 在原核 生物中 ，起 始和 延伸因 子分别 缩写成 IF 及 EF， 而在真 核生物 中则分 别称为 elF 和 eEFo 原核生 物与真 核生物 的蛋白 质合成 机制在 细节上 有明显 的不同 ，这 主 要表现 在起始 阶段。 鉴 于此， 本 节将讨 论原核 生物中 的合成 机制， 下一 节 （Q3) 将详细 描述真 核生物 的蛋白 质合成 过程。 起始 阶段的 主要任 务是在 mRNA 分子的 正确起 始点即 起始密 码子处 完成 完整核 糖体的 组装。 涉 及的组 成元件 有大小 核糖体 亚基、 mRNA、 已 负载 的起始 tRNA、 兰 个起始 因子及 GTP。 起 始因子 IFi、 IF2 及 IF3 在数 目 上巧是 核糖体 的十分 之一， 其分 子质量 分别为 9、 120 及 22kDa， 只有 IF2 与 GTP 结合。 尽 管详细 过程有 待深入 研究， 但 整个过 程如下 （图 Q2.1)： • IFi 和 IF3 与 游离的 30S 亚基 结合， (阻 止在与 mRNA 结合前 30S 亚 基与大 亚基的 结合， 从而 防止无 活性核 糖体的 形成。 - 接着 IF2 与 GTP 的复合 体结合 到小亚 基上， 这将 有助于 已负载 的起始 tRNA 与该 复合体 结合。 • 30S 亚 基利用 mRNA 分子 上的核 糖体结 合位点 （RBS) 附着到 mRNA 上 （参见 Q1)。 • 接 着起始 tRNA 通过 其反密 码子与 mRNA 分子上 AUG 密码子 的碱基 配对， 与上述 复合体 结合， 同时 巧放出 IF3。 IF3 的作用 在于保 持大小 亚基彼 此分离 状态， W 及 有助于 mRNA 结合。 此时 的复合 体称为 30S 起始复 合体。 • 此时 50S 亚基将 与上述 复合体 结合， 替换出 IFi 和 IF2， 而 GTP 在此 耗能过 程中被 水解。 起始后 期形成 的该复 合体被 称为叫 70S 起 始复合 体。 如图 Q2.1 〜 Q2.3 所示， 组 装完的 核糖体 有两个 tRNA 结 合位点 ，分 别称为 A 位点和 P 位点， 即 氨醜基 位点和 肤醜基 位点。 A 位点是 氨醜- tRNA 结合的 位点， 而 P 位点则 是延伸 肤链所 在处。 两个位 点均位 于小亚 基的 凹槽处 （参 见主题 01)， 含有 正在被 翻译的 相邻密 码子。 起始 的主要 成果是 将起始 tRNA 置于 P 位点。 只 有起始 tRNA 能 进入该 位点， 其他 tRNA 必 须进入 A 位点。 随着 70S 起始复 合体的 形成， 延伸循 环随即 开始。 延伸 过程也 可细分 为 兰步： ①募醜 tRNA 的 转运； ② 化键的 形成； ③ 移位。 如图 Q2.1 所 示， 延伸时 P 位点 负载 有化醜 -tRNA, 而 A 位点处 于空载 状态。 延伸过 程涉及 3 个延伸 因子即 EF-Tn、 EF-Ts 和 EF-G， 它们 均能与 GTP 或 GDP 结合， 分 子质量 依次为 45、 30 和 80kDa。 EF-Ts 和 EF-G 在 数量上 与核搪 Q2 蛋 白质合 成机制 267 体 相当， 而 EF-Tn 约 为核糖 体数的 10 倍。 30S 亚基 30S 起始 复合体 fMet 50S 亚基 70S 起始 复合体 3 mRNA 图 Q2.1 £. CO。 中蛋白 质合成 的起始 268 Q 蛋白 质合成 肚 基转移 巧中也 化規一 RNA 从 A 位转 移至 P 位 EF-G GTP 复合体 GTP 图 Q2.2 蛋白质 合成的 延伸期 Q2 蛋 白质合 成机制 269 图 Q2.3 £. ro/:' 中蛋白 质合成 的终止 270 Q 蛋白 质合成 终止 ① 氨醜 -tRNA 的 转运。 EF-Tn 为氨醜 tRNA 进入 A 位点 所必 须的， 此过 程利 用水解 GTP 所 释放的 能量。 在 EF-Ts 的作 用下， 释放的 EF-Tn， GDP 复 合体可 再生。 在 EF-Tn-EF-Ts 交换 循环途 径中， EF-Ts 替换了 GDP, 但随 后又被 GTP 所 取代。 产物 EF-Tn，GTP 复合 体可与 另一个 氨醜 -tRNA 结合， 并 将其运 送至核 糖体。 除起始 tRNA 外， 所有 氨醜- tRNA 都能与 EF-Tu 形成复 合体。 ② 肤键的 形成。 氨醜 -tRNA 进 入后， A 位点和 P 位点都 满载， 两 个要相 连接 的氨基 酸靠得 很近， 此时 50S 亚 基的化 醜转移 酶可在 两个氨 基酸之 间形成 化键， 该 反应无 需任何 能量的 补给， 因为 ATP 的能量 在活化 tRNA 时已 被储存 （参见 P2)。 ③ 移位。 移位是 一耗能 过程。 具体 过程是 EF-G (移 位酶） 和 GTP 的复合 体与核 糖体结 合后， 卸载的 tRNA 从 P 位点 解离， 肤醜 -tRNA 从 A 位 点移至 P 位点， mRNA 相对 于核糖 体移动 一个密 码子。 最后 GDP 和 EF-G 被 释放， 而后者 将被再 利用。 在 腾空的 A 位点 上将 出现一 个新密 码子。 最新证 据表明 在原核 生物中 卸载的 tRNA 首 先移到 E 位 （去 位)， 然后 当気醜 -tRNA 结 合时而 脱离， 通 过送种 方式， 核 糖体与 mRNA 通 过 6 个碱 基对保 持结合 而很好 地降低 了移码 的概率 （见 R4)。 综上 所述延 伸循环 中的一 个循环 的兰步 反应至 此全部 完成， 这样的 循环 会一直 重复， 直至 终止密 码子在 A 位点 出现。 通 常没有 tRNA 分子能 够识别 终止密 码子， 而称 为释放 因子的 蛋白因 子可 与终止 密码子 作用， 致使 新生多 化链的 释放。 RF1 可识别 UAA 和 UAG, RF2 识别 UAA 和 UGA， 而 RF3 有助于 RF1 或 RF2 的 活性。 释放 因子 使肤醜 转移酶 将多化 链转至 H2O 分 子而不 是通常 的氨醜 -tRNA、 释 放出 mRNA、 并与核 糖体亚 基完全 解离。 此时 IF3 可 与小亚 基结合 W 阻止 无活性 70S 核 糖体的 形成。 Q 蛋白 质合成 Q3 真核生 物蛋白 质合成 的起始 要点 基 本过程 原 核生物 与真核 生物蛋 白质合 成机制 的主要 差别在 于起始 阶段。 除此 W 外， 那就是 真核生 物只有 一种巧 放因子 （eRF), 真核生 物 的起始 tRNA 不 像原核 生物那 样被甲 醜化。 担 描 真核 生物的 40S 核糖体 亚基复 合体与 mRNA 的 5' 帽结构 区域结 合， 并沿着 mRNA 移动 （扫 描） 寻找 AUG 起始密 码子。 起始点 并不一 定总是 第一个 AUG 密 码子， 因为其 周围还 必须有 适当的 序列。 起 始 原 核生物 与真核 生物蛋 白质合 成过程 的主要 差别在 于起始 阶段， 至少有 9 种 elF 相关。 按功 能可将 这些因 子分为 几组， 即 与核糖 体亚 基结合 的或与 mRNA 结 合的、 运 送起始 tRNA、 或 是其他 替换 因子。 与原 核生物 相比， 真核生 物的起 始在与 mRNA 结合 前起始 tRNA 先与 40S 亚基 结合。 转 运起始 tRNA 的 eIF2 的碟 酸化是 重要的 被调控 对象。 延 伸 蛋白 质合成 在延伸 阶段基 本上与 原核生 物相同 （参见 Q2)。 与原 核 生物的 EF-Tu、 EF-Ts 和 EF-G 具 相同功 能的真 核生物 延伸因 子分 别称为 eEFla、 eEF 的和 eEF2。 终 止 在真 核生物 的终止 过程中 只使用 一种释 放因子 （eRF), 该因子 需要 GTP W 终 止蛋白 合成， 并能识 别兰种 终止密 码子的 任何一 种。 巧 关主题 tRNA 加工、 RNA 酶 P 和核酶 （02) 蛋 白质合 成机制 （Q2) tRNA 结构 与功能 （P2) 基 本过程 除 了在真 核细胞 的线粒 体和叶 绿体内 （被 认为 是起源 于共生 原核生 物， 参见 A2)， 蛋 白质合 成的详 细机制 也与在 Q2 所描 述的 原核生 物的不 同， 其主 要区别 是在涉 及许多 elF 因子 的起始 阶段。 由于 mRNA 上没有 核糖 体结合 位点， 要找到 正确的 起始密 码子需 要经过 一扫推 过程。 有两种 不 同的甲 硫氨酸 tRNA， 其 中之一 是起始 tRNA, 结 合的甲 硫氨酸 并不被 转变成 N -甲 巧甲硫 氨酸。 在原 核生物 和真核 生物蛋 白质合 成中所 涉及各 种因子 的比较 列于表 Q3.1。 272 Q 蛋白 质合成 扫描 起始 表 Q3.1 原 怯真巧 生物蛋 白质合 成因子 的比较 原核的 真核的 功 能 起 始因子 肌、 IF3 eIF3、 eIF4C、 eIF6 与核 糖体亚 基结合 eIF4B、 eIF4F 与 mRNA 结合 IF2 eIF2、 eIF2B 起始 tRNA 传递 eIF5 替换其 他因子 延 伸因子 EF-Tu eEFla 传 递氨骄 tRNA 至 核糖体 EF-Ts eEFlpr EF-Tu 或 eEFlo 的 再循环 EF-G eEF2 位移 终 止因子 RF1 RF2 e 民 F 多化链 的巧放 RF3 由于真 核生物 mRNA 上没有 Shine-Dalgarno 序列 （SD 序 列）， 所1^(选 择起 始密码 子的机 制当然 不同。 Kozak 提出 了扫描 假说， 认为已 与起始 tRNA 结合的 40S 亚基， 附着到 mRNA 的 5' 端， 并沿着 mRNA 移动 ，直 至找到 合适的 AUG 起始密 码子。 合适的 AUG 并不一 定总是 第一个 AUG, 因为 还需要 有正确 的上下 游序列 （5'- CCR CCAUGG-3')， 这里 R 代表 標吟。 图 Q3.1 显示 了在真 核生物 蛋白质 合成的 起始阶 段所涉 及到的 步骤及 因子。 在真核 生物蛋 白质合 成中至 少涉及 有九种 已被鉴 定的起 始因子 ，其 中一些 与兰种 原核生 物的起 始因子 有相似 功能。 根据 它们的 功能， 可将其 分组 如下： • 与核糖 体亚基 结合的 因子， 如 eIF6、 eIF3 和 eIF4C; •与 mRNA 结合 W 识别 5' 帽子结 构并解 开二级 结构的 ，如 eIF4B 和 eIF4Fo eIF4F 是帽 子结合 蛋白即 eIF4E 和 eIF4A 的复 合体； • 与起始 tRNA 输送相 关的， 如 eIF2 和 eIF2B; • 其他 可替换 因子， 如 eIF5， 该 因子能 替代另 外两种 因子使 60S 亚基得 结合 Q 从 游离的 40S 亚 基和具 5' 帽子 结构的 mRNA 分 子开始 的蛋白 质合成 过程 如下： eIF3 和 4C 结合到 40S 亚 基上， 促使其 与三元 复合体 （起始 tRNA、 eIF2 和 GTP) 结合。 请注意 真核生 物中的 不同装 配顺序 ，在 mRNA 结合之 前起始 tRNA 先 与小亚 基结合 （与 Q2 相比 较， 图 Q3.1)。 在 上述复 合体与 mRNA 结合 之前， mRNA 先要与 eIF4B 和 4F (4F 具有 识别 5' 帽子 结构的 功能） 作用， 利 用来自 ATP 的能舊 解旋去 掉二级 结构。 在 40S 亚 基复合 体通过 5' 帽子 结构与 mRNA 复 合体结 合后， 利用 ATP 能 量开 始扫描 mRNA W 寻找 AUG 起始密 码子。 起始点 通常是 第一个 AUG。 Q3 真核生 物蛋白 质合成 的起始 273 eIF2 和 eIF3 被 eIF5 替换后 60S 亚基 方能与 40S 亚基 结合， 并水解 GTP: eIF4C 在帮助 60S 亚基结 合形成 完整的 80S 起始 复合体 后即被 释放。 elF2 eIF3 elF4C elF5 tRNA, 40S 核糖 体亚基 固 3 r 43S 核糖化 复合体 GTP 43S 起始前 复合体 图 Q3.1 真核生 物蛋白 质合成 的起始 274 Q 蛋白 质合成 延伸 终止 释 放后的 eIF2 - GDP 复 合体在 eIF2B 的作 用下 进入下 一轮。 循环的 速率 （也 即蛋白 质合成 的起始 速率） 被 eIF2 的 a 亚基 的憐 酸化所 调控。 某些 生物例 如病毒 感染及 随后干 扰素的 产生等 反应均 可促进 eIF2 的碟酸 化而 导致对 蛋白质 合成的 抑制。 原 核生物 与真核 生物的 蛋白质 合成的 延伸循 环非常 相似， 所需 兰种因 子 的性质 与原核 生物相 应因子 的相似 （表 Q3.1)。 eEFla、 eEFl 的和 eEF2 分别 具有在 Q2 所述 EF-Tu、 EF-Ts 和 EF-G 相应 功能。 真核生 物中， 仅有 一个单 一的释 巧因子 eRF， 可识别 兰个终 止密码 子， 并 执行原 核生物 RF1 (或 民 F2) 和 RF3 的 功能。 eRF 活 性需要 GTP， 但 还不清 楚在真 核生物 中是否 存在为 亚基与 mRNA 解离所 需的核 糖体择 放因子 的等效 因子。 Q 蛋白 质合成 Q4 翻 译调控 与翻译 后加工 * 巧'々 ■&分 々令 々^公 *>巧'4/«\*^分分*/55?'々^々^々/«?'々/々'分**/々'4(/©«々^一<©\3/©'*^々^分《'.一《«分々々^々/!©'々/!5?'*^ 要 点 翻 译调控 在 原核生 物中， 不同顺 反子的 翻译水 平受下 列因素 影响： ①较短 反义 分子的 结合； ②多 顺反子 mRNA 对核 酸酶的 相对稳 定性； ③阻碍 核糖体 附着的 蛋白质 结合。 在 真核生 物中， 蛋白质 结合也 能 够掩盖 mRNA, 阻碍 翻译。 5'- AUUUA - 3' 重复序 列会使 mRNA 不 稳定， 降 低翻译 效率。 多蛋白 单一翻 译产物 被切割 形成两 个或多 个独立 蛋白， 则被称 为多蛋 白。 许 多病毒 产生多 蛋白。 蛋白 质定位 蛋 白质中 某些短 肤序列 可决定 蛋白质 的细胞 定位， 如 细胞核 、线 粒 体或叶 绿体。 分泌蛋 白的信 号序列 导致执 行翻译 的核糖 体某些 使得 核糖体 停泊在 膜上的 因子的 结合， 并将 合成蛋 白转至 膜外。 通 常信号 序列随 后被信 号肤酶 切掉。 蛋白 质修饰 新生多 化的最 常见的 加工是 被切割 及化学 修饰。 信 号肤的 切除、 多蛋 白成熟 片段的 释放、 中间肤 的切除 及 N 端和 C 端的 修剪 均需 要进行 切割。 除 6 种氨 基酸侧 链外， 所 有的氨 基酸侧 链都可 发生多 种化学 修饰。 通常 碟酸化 调控着 蛋白质 活性。 蛋白 质降解 对损 害的、 被修饰 的或遗 传上不 稳定的 蛋白， 可用 共价结 合的泛 素分子 标记来 观察蛋 白降解 过程。 随后 26S 蛋白酶 复合体 会将遍 在 蛋白质 降解。 相 关主题 RNA 聚 合酶日 基因； 启动子 与增强 蛋 白质合 成机制 （Q2) 子 （M4) 真核生 物蛋白 质合成 的起始 （Q3) mRNA 加工、 hnRNP 和 snRNP (03) 可变 mRNA 加工 （04) 翻 译调控 由于 原核生 物与真 核生物 mRNA 的性 质不同 （即 多顺 反子与 单顺反 子， 参见 L1)， 且前 者没有 核膜， 所 W 有不 同的翻 译调控 方式。 在 原核生 物中， mRNA 某一 区段形 成的结 构可掩 盖核糖 体结合 位点， 这样 相对其 他顺反 子而言 就降低 了翻译 速率。 茎 环结构 的形成 可抑制 外切核 酸酶攻 击， 使多 顺反子 mRNA 的某 一区域 相对其 他区域 而言有 更长的 半衰期 (因 而有 更多的 翻译机 会）。 在 £. CO。 中， 几 个编码 核糖体 蛋白的 操纵子 显示 出一种 有趣的 翻译调 控方式 ，即 mRNA 的某一 区域能 形成类 似于由 276 Q 蛋白 质合成 多蛋白 蛋白 质定位 该 mRNA 所 编码核 搪体蛋 白的结 合位点 的王级 结构， 如 果没有 足够的 rRNA 供翻 译产物 结合， 这些 产物将 结合到 自身的 mRNA 上， 并 阻碍其 进一步 翻译。 原 核生物 有时会 产生较 短的、 可 与某些 mRNA 上的 核糖体 结 合位点 附近的 序列形 成双链 的反义 RNA W 抑制 翻译。 真 核生物 通常用 改变基 因的转 录水平 （参见 M4) 和 （或） RNA 的加 工 （参见 03 和 04) 来 控制特 定蛋白 质的合 成量， 但也有 一些调 控发生 在细胞 质中。 通常在 3' 非编 码区存 在多个 5'- AUUUA -3' 单元， 是 mRNA 快速 降解的 标志， 因 而限制 翻译。 另一 种形式 的翻译 调控是 蛋白质 直接结 合到 mRNA 上 并阻止 翻译。 这种 RNA 被称为 "掩蔽 mRNA", 在 适当的 条 件下， 当蛋白 解离时 mRNA 即可被 翻译。 一 些非编 码序列 可使得 mRNA 定位 在细胞 质特定 部位， 当翻 译时， 能 产生细 胞内的 蛋白质 浓度梯 度。 唆 菌体、 病毒 转录物 （参见 R2) 及许多 真核生 物编码 激素的 mRNA (如 阿里皮 素原） 翻译后 先生成 一条多 化链， 随后被 特定的 蛋白酶 切割， 结 果从一 条翻译 产物生 成多个 成熟蛋 白质。 原 来的多 肤链被 称为多 蛋白。 研究发 现蛋白 在细胞 内的最 终定位 取决于 其自身 蛋白的 特性、 相对长 短 及其 氨基酸 序列。 这些 序列可 决定蛋 白是被 分泌、 转运 至核内 还是其 他细胞 器内。 真 核细胞 的结构 越复杂 （参见 A1) 就 意味着 有越多 的定位 类型。 无 论原核 生物还 是真核 生物， 蛋白分 化涉及 新生蛋 白的信 号序列 W 及特殊 蛋白， 包括 能识别 信号序 列的一 种核搪 核蛋白 颗粒即 信号识 别颗粒 (SRP) (图 Q4.1)。 如果胞 内核搪 体开始 翻译编 码分泌 蛋白的 mRNA, SRP 会与 核糖体 和新生 的多化 链结合 W 停止 翻译。 SRP 能够 识别含 有信号 化序列 的新生 化 链的核 糖体。 信号化 一般由 13 至％ 个 氨基酸 构成， 至少 有一个 带正电 的 残基， 其 后是约 10 至 15 个残 基的疏 水核， 接 着为小 的中性 残基， 通常 为 Ala。 SRP 和受 阻的核 糖体一 起结合 到内质 网外侧 的受体 （SRP 受体或 停靠 蛋白） 上 （参见 A2)， 当 核搪体 附着到 内质网 上的核 糖体受 体蛋白 后， SRP 即被释 放并可 被循环 利用。 核糖 体继续 翻译， 新 生肤链 被运送 到内 质网的 腔内。 在穿 过内质 网时， 信号 化被信 号肤酶 切除。 蛋白 释放到 内 质网腔 内后， 通常被 修饰， 通常是 糖基化 修饰。 不 同的糖 基化修 饰似乎 控制着 蛋白质 的最终 定位。 蛋白质 中的其 他序列 也决定 蛋白质 的胞内 定位， 如 不同的 N 端序列 能 导致蛋 白质进 入线粒 体或叶 绿体； 内 部序列 -Lys-Lys-Lys-Arg 丄 ys, 或 任何五 个连续 的带正 电荷氨 基酸， 是 核内定 位信号 （NLS)， 能导 致含该 序列 的蛋白 （如组 蛋白） 被运进 核内。 Q4 翻 译调控 与翻译 后加工 277 图 Q4.1 真核 生物中 的蛋白 质分泌 蛋白 质修饰 新 生多化 未必立 即成为 有功能 的蛋白 （参见 B2)， 除了 正确折 叠及可 能形成 的二硫 键外， 蛋白质 要行使 其功能 还需要 其他的 修饰， 包括 切割和 各 种共价 修饰。 切割 是常见 的修饰 方式， 尤其 是利用 氯化酶 和戀化 酶的修 剪； 但也会 发生化 链内部 切割， 如 膜岛素 中内部 化段的 切除。 信号 序列通 常 从分泌 蛋白中 切除， 若当 蛋白是 多蛋白 的一部 分时， 必须 通过切 割释放 其组成 蛋白。 遍在蛋 白是含 有头尾 相连的 多个拷 贝的多 蛋白， 必须 被切割 W 形成 单个遍 在蛋白 分子。 化 学修饰 有多种 方式， 可 W 发生在 N 末端、 C 末端 及 20 种 氨基酸 中除 Ala、 Gly、 lie、 Leu、 Met 和 Val 外 的大部 分氨基 酸的侧 链上。 这些 修饰 包括乙 敌化、 迄 基化、 携 酸化、 甲 基化、 糖 基化甚 至核巧 的添加 。胶 原 蛋白中 Pro 的哲 基化是 常见的 修饰， 而组 蛋白常 常是被 己醜化 （参见 D3)。 许 多酶的 活性， 如 糖原憐 酸化酶 及某些 转录因 子是通 过踞酸 化来调 控的。 蛋白 质降解 不 同的蛋 白有不 同的半 衰期， 调节 蛋白需 要迅速 更新， 而且细 胞要能 够除 去有缺 陷的和 受损的 蛋白。 在 真核生 物中， 研 究发巧 N 端残 基在蛋 白稳 定性上 起关键 作用。 8 个 N 端氨 基酸 （Ala、 Cys、 Gly、 Met、 Pro、 Ser、 Thr、 Val) 显示高 稳定性 （fi/2>20h)， 而另 8 个 （Arg、 His、 lie、 278 Q 蛋白 质合成 Leu、 Lys、 Phe、 Trp、 Tyr) 显巧 短的 半畏期 （2 〜 30min), 而 4 个氛基 酸 （Asn、 Asp、 Gin、 Glu) 经化学 修饰后 稳定性 降低。 损 伤的、 修饰的 或者 含有不 稳定的 N 端残 基的 蛋白质 可通过 共价结 合高度 保守的 小分子 蛋 白质遍 在蛋白 而被泛 骄化， 这是 通过遍 在蛋白 分子的 装基端 Gly 连接到 蛋 白质的 Lys 残 基而完 成的。 遍在 蛋白被 26S 蛋白酶 复合体 （蛋白 酶体） 消化 降解， 该反 应需要 ATP 并释放 完整的 遍在蛋 白分子 供再被 利用。 (林 会兰 译 刘进 元化） R 途 苗体与 真核生 物病毒 R1 病 毒简介 要 点 病 毒 病毒 是极小 （20~30nm) 的寄 生物， 无法 在宿主 细胞外 复制、 转录或 翻译。 W 细 菌为宿 主的病 毒称嗤 菌体。 病毒 颗粒至 少由两 部分 组成； 核酸 与蛋白 衣壳。 有 些病毒 有一个 脂蛋白 外膜， 还有 具有为 侵染后 转录或 复制所 必需的 非结构 蛋白。 病毒 基因组 病毒基 因组由 DNA 或 RNA 组成， 可 W 是 双链或 单链， 而且对 于单链 基因组 来说， 可 是 正义、 负义 或双义 （根 据其 mRNA 序列定 义）。 基因 组的大 小可由 Ikb 到接近 300kb， 复制 时利用 病毒自 身和宿 主细胞 两方面 的酶。 复 制策络 病毒 的复制 策略主 要取决 于其类 型和基 因组的 大小。 小的 DNA 病毒 通常能 更多地 利用宿 主细胞 的复制 系统， 而大的 DNA 病毒 常 编码自 己的聚 合酶。 RNA 病毒的 复制则 必需有 自己编 码的依 赖 RNA 的聚 合酶。 有些 RNA 病毒利 用依赖 RNA 的 DNA 聚合 酶 （反 转录 酶）， 通过 DNA 中介来 复制。 病 毒毒性 许多 病毒并 不引起 疾病， 病毒 毒性的 产生机 制往往 与其生 命周期 吻合， 但也有 一些会 有助于 传播。 相 关主题 嗤菌体 （R2) 民 NA 病毒 （R4) DNA 病毒 （R3) 病毒 很难 给病毒 下一个 准确的 定义。 病 毒这个 词最早 来源于 18 世纪 90 年 代， Jenner 在描 述牛痘 和天花 时把它 们认为 是一种 毒素。 病 毒颗粒 （viri- on) 属于 亚显微 层次， 并 且只能 在宿主 细胞内 复制。 所有病 毒的翻 译完全 依赖 于宿主 细胞， 有些 病毒的 转录、 复制因 子也不 同程度 地依赖 宿主细 胞。 原 核生物 的病毒 被称为 懂菌体 （bacteriophage 或 phage)。 病毒 至少由 病毒编 码的蛋 白衣壳 （capsid) 包裹 的单链 或双链 DNA 或 RNA 基因组 组成。 衣壳及 其与基 因组的 作用基 本决定 了病毒 的结构 (参 见图 R1.1， 显 示不同 结构病 毒的例 子)。 在 成熟病 毒颗粒 形成过 程中， 病毒 衣壳是 通过蛋 白亚单 位逐步 组装起 来的， 该过程 可能需 要蛋白 与基因 组的相 互作用 （基 因组与 衣壳的 复合体 称 核壳， nucleocapsid)。 最简单 的模型 是一些 唆菌体 （如 唆菌体 M13) 和 较小的 哺乳动 物病毒 （如 骨髓灰 质炎病 毒）， 而且一 些更大 更复杂 的病毒 也 是遵循 同样的 原则。 280 R 嗤 菌体与 真核生 物病毒 图 R1.1 病毒形 态举例 （未 按比例 画）。 （a) 二十面 体病毒 （如 骨髓灰 质炎病 毒）； （b) 有二十 面体头 部和尾 的复杂 喧菌体 （如 嗤菌体 T4); (C) 螺 旋病毒 （如 唆菌体 M13); (d) 有外 膜的二 十面 体病毒 （如 泡疹病 毒）； （e) 棒状 病毒典 型的子 弹状、 螺 旋的被 膜病毒 许多种 病毒有 一双层 脂蛋白 外膜。 送个外 膜来自 于宿主 细胞膜 （通过 出芽 方式， budding), 有时会 带些宿 主细胞 蛋白。 病 毒编码 的包膜 糖蛋白 ( envelope glycoprotein) 对于 病毒的 组装与 结构很 重要， 通 常是与 宿主细 胞特 殊受体 （receptor) 结 合的受 体配体 （receptor ligand) 或 反受体 （an- tireceptor)。 基质 （matrix) 蛋白提 供核壳 与外膜 之间的 联系。 基 质与衣 壳 蛋白在 病毒的 转录与 复制中 可能起 非结构 作用。 结 构蛋白 往往是 重要的 抗原， 因此可 lit 用 来设计 疫苗。 许多 RNA 病毒和 一 •些 DNA 病毒 在病毒 颗粒内 部也含 有一些 为感染 后即发 转录或 复制所 必需的 非结构 蛋白。 病毒 基因组 病毒 基因组 是根据 在成熟 病毒粒 内的状 态来定 义的， 并 在病毒 家族间 变异。 与 真生物 （true organism) 的 基因组 不同， 病 毒基因 组可由 单链或 巧链的 DNA 或 RNA 组成。 在 某些病 毒中， 基因组 仅由一 条单一 线状的 (linear) 或 环状的 （circular) 核 酸分子 构成， 而 在另一 些病毒 中却可 从是 节 段型的 （segmented) 或二 倍体。 单链病 毒基因 组可分 成正父 （positive sense) (核 S 父 序列和 mRNA 相 同）、 负义 （negative sense) 或双义 （ambi- sense, 基因可 W 是正、 负义而 且经常 是重叠 编码， 参见 P1)。 并 非所有 病毒都 有一个 完整的 或全功 能的基 因组， 事实 上复制 出的病 R1 病 奉简介 281 复 制策略 病 毒毒性 毒 粒子数 （可 通过电 镜数） 是可侵 染病毒 粒子数 （由细 胞培养 决定） 的 100 倍 W 上， 甚至常 常是数 千倍。 自身 无法复 制的基 因组可 W 通过 与辅助 病毒 （ helper virus) 共 侵染， 借助其 具复制 能力的 野生型 （wild-type) 基 因组的 生物， 或者 通过共 侵染中 基因组 的不同 突变、 或 缺失间 的互补 ( complementation) (参见 H2) 来恢 复复制 能力。 病 毒的复 制或转 录策略 主要依 赖于基 因组的 类型， 不同 种群之 间差异 很大。 DNA 病毒 通常比 RNA 病毒 更多地 利用宿 主细胞 的核酸 聚合酶 。具 有 较大基 因组的 DNA 病 毒如疮 疹病毒 （herpesvirus, 参见 R3) 比 小基因 组的 如乳多 空病毒 （ papouavirus , 参见 R3) 中的 一 ■种猿 猴病毒 40 (SV40) 要更 独立于 宿主细 胞的复 制转录 机制。 RNA 病毒 复制所 需的依 赖于 RNA 的聚 合酶一 般的宿 主细胞 中并不 存在， 需由 病毒自 己编码 。某 些 RNA 病毒 如反转 录病毒 （retrovirus) 编码 一 ■种反 转录酶 （reverse tran- scriptase, 一种 依赖于 RNA 的 DNA 聚 合酶） 经 DNA 过渡 来复制 其自身 RNA 基因组 （参见 R4)。 病毒对 宿主细 胞复制 功能的 依赖性 及对特 殊细胞 表面受 体的要 求决定 着病毒 的宿主 细胞特 异性。 能够 提供病 毒复制 的代谢 需求的 细胞可 W 说成 是 被允许 （permissive) 侵染； 而不能 提供病 毒复制 所必需 条件的 就是非 允许 （nonpermissive) 细胞。 然而在 某些情 况下， 非 允许细 胞也可 能被侵 染， 病毒可 lit 对 宿主细 胞产生 显著影 响如细 胞转型 （transformation, 参见 R3 与 S)。 有些病 毒损坏 它们赖 复制的 细胞， 如果 足量的 细胞被 破坏结 果将导 致 疾病。 但 病毒并 不是为 了引起 疾病而 存在， 仅仅是 因为它 们能够 复制。 在 许多情 况下， 毒性 （virulence， 引起 疾病的 能力） 是 不利的 （即 毒性会 降 低病毒 自身的 复制能 力）； 而 对于另 一些病 毒来说 毒性可 能会有 助于其 传播。 毒性 的进化 往往造 成对宿 主细胞 的破坏 能力增 强和传 播能力 的减弱 或 相反。 病毒 的毒性 机制可 分成六 大类： (1) 对细 胞代谢 的机遇 性损伤 （如 与宿主 细胞竞 争为复 制所必 需的酶 、核 脊酸， 或病毒 生长因 子）。 (2) 在 细胞间 传播过 程中对 细胞膜 的损伤 （例 如许多 晦菌体 使细胞 裂解， 或疮疹 病毒使 细胞融 合）。 (3) 病症对 宿主间 传播的 重要性 （例 如普 通感冒 病毒引 起的打 喷嚷、 狂犬 病毒 引起的 行为改 变)。 (4) 逃 避宿主 的免疫 系统， 如通 过快速 突变。 (5) 病 毒抗原 机遇性 的引起 有害免 疫应答 （例如 B 型肝炎 病毒） 或 导致自 身 免疫病 的交叉 反应。 (6) 细 胞转型 （参见 S) 和癌变 （例 如某些 乳多空 病毒： SV40， 参见 R3)。 R 途 宙化与 真巧生 物病毒 R2 嗤菌体 要 点 一 般特性 尽 管唾茵 体基因 组有大 有小， 生活周 期有简 单的也 有复杂 到包括 调 控病毒 与宿主 细胞代 谢的， 但它们 都有一 个共同 的特点 即侵染 细菌。 裂 解性与 溶原 性巧染 在裂 解性侵 染中， 病毒粒 子从溶 解细跑 中释放 出来， 而溶 原性侵 染中病 毒则将 它们的 基因组 整合到 宿主细 胞基因 组中， 并 可能稳 定遗传 直至转 变进入 裂解性 侵染。 途菌休1^1不1 嗤菌体 M13 有一 个很小 的单链 DNA 基 因组， W 双链 DNA 复制 型 复制， 可进 行不引 起细胞 裂解的 侵染。 经 修饰的 M13 唆菌体 已被广 泛地用 作克隆 载体。 一~ I 嗦菌 体可能 是研究 得最彻 底的溶 原性晦 菌体。 通 过对不 同基因 表达 的时序 调控， 可 W 使 该病毒 既能进 行快速 裂解性 侵染， 又能 在 环境条 件不利 的情况 下进行 作为原 嗤菌体 整合进 宿主细 胞基因 组中的 溶原性 侵染。 c/ 基因产 物即; V 阻抑 物的表 达是确 定溶原 性侵染 的关键 步骤。 巧座逆 茵-课 一1 有些唆 菌体如 嗤菌体 Mu, 通常 整合进 宿主基 因组， 并经 重复转 座来 复制。 相 关主题 嗤菌 体载体 （H2) 转录的 起始、 延伸 与终止 （K4) 转录调 控举例 （N2) 病 毒简介 （R1) DNA 病毒 （R3) RNA 病毒 （R4) — 巧特性 艳菌体 （bacteriophage 或 phage) 是侵染 细菌的 病毒。 它们的 基因组 可 是 RNA 或 DNA， 大小可 从 2.5kb 到 150kb。 它们 的生活 周期可 W 很 简单或 更复杂 且高度 受控、 包 括基因 组整合 （integration) 甚 至转座 (transposition, 参见 F4)。 嗤菌体 在病毒 学和分 子生物 学历史 上扮演 着重要 角色。 Twort 和 d’Herelle 分别于 1915 年和 1917 年最初 发现嗤 菌体。 隨菌体 作为模 式病毒 而 被广泛 研究， 并在 早期的 DNA 作 为遗传 物质的 鉴定、 遗传密 码的确 定、 mRNA 的发现 W 及 许多分 子生物 学的基 本概念 的建立 中成为 重要的 研究 工具。 由 于嗤菌 体寄生 在原核 生物细 胞内， 它们 常含有 与宿主 极相似 的 基因组 序列， 因 此作为 一个简 单模型 广为应 用于原 核分子 生物学 中的各 个 方面。 有 些嚼菌 体还被 用作克 隆载体 （参见 H2)。 细茜学 家也常 利用种 R2 喧菌体 特异裂 解型嗤 菌体的 生物型 来研究 各种病 原细菌 的流行 283 巧解 性与疮 有些嗤 菌体能 W 惊人 的速度 复制， 侵染、 复制、 组装 及裂解 释放整 原 性侵染 个过 程仅需 20min。 在 这种情 况下， 嗤 菌体基 因组的 复制独 立于细 菌基因 组。 然而有 时病毒 复制与 释放可 W 不造 成溶菌 （如 蹈菌体 M13)， 而另一 些 唾茜体 则在裂 解性侵 染与溶 原性侵 染之间 转换。 裂 解性侵 染时， DNA 在 细胞内 复制， 溶原 性侵染 则将其 DNA 整合 入宿主 基因组 （X 嗤菌 体）。 还有一 些病毒 将基因 组整合 宿主基 因组后 转 座方式 来复制 （如 嗤菌体 Mu)。 堪菌体 嗤菌体 M13 有一 较小的 （6.4kb) 环状 单链， 正义 DNA 基因组 （图 M13 R2.1)。 其 病毒粒 子通过 位于病 毒一端 的一种 微小衣 壳蛋白 （g3p) 特异 性地附 着大肠 杆菌的 性纤毛 （由一 个称为 F 因子 的质粒 编码） （参见 A1)， 这一 微小衣 壳蛋白 的结合 诱导了 主要衣 壳蛋白 的结构 改变， 引起整 个病毒 粒子 变短， 并 将病毒 DNA 注 入宿主 细胞。 接 着宿主 酶将其 单链基 因组转 化 成单链 DNA 复制型 （ replicative form, RF)。 M13 基 因组有 10 个紧密 排列的 基因及 一个含 有复制 起点的 基因间 序列。 转录 仍旧是 利用宿 主细胞 的酶， 可 W 从几 个启动 子中的 任一个 开始， 终止于 两个终 止子中 的一个 (图 R2.1)。 这种 转录方 式造成 靠近终 止子的 基因比 远离终 止子的 有更大 的转录 概率， 形 成了病 毒最主 要的表 达调控 方式。 RF 的复 制是正 常的双 链 DNA 复制， 产 生多个 RF 拷贝， 但 RF 复 制的起 始需要 病毒内 切核酸 酶在 （+ ) 链上 制造一 个切割 W 添 加一个 3'- OH， 而不是 RNA 引发 。最 终装 配新的 嗤菌体 颗粒经 RF 的连 续复制 产生众 多单股 （+ ) 链， 与此同 时嗤 菌体基 因与蛋 白将包 裹新生 （+ ) 链 [阻 止互补 （-) 链 的合成 。然 后这些 被包裹 的前体 被运送 至细跑 膜上， 在那里 DNA 与主 要衣壳 蛋白结 合。 同时， 新的 病毒粒 子在不 造成细 胞裂解 的情况 下排出 细胞膜 。被 M13 侵 染的细 胞仍能 继续生 长分裂 （尽管 W 低速 率）， 产生 出的子 代也同 样 是被侵 染的， 且能继 续释放 M13。 另外 在各个 病毒颗 粒内的 DNA 量也 变 化无常 （造 成病毒 粒子的 长短不 一）， 含有 多个拷 贝基因 组的颗 粒与仅 含有 部分基 因组的 颗粒在 任一群 体中都 会同时 并存。 上述 M13 生 活周期 中的 几个特 征使其 成为理 想的克 隆载体 （参见 H2)。 双链 环形的 RF 在实 验中正 好可当 作质粒 操作； 而且 基因组 与病毒 颗粒的 大小没 有严格 限制意 味 着基因 组内可 tU 插 入较大 的外源 DNA 片段； 病毒 的单链 DNA 基因组 使得其 DNA 成为测 序反应 的理想 模板； 最后 M13 生 活周期 的非裂 解特性 使 得获取 大量的 纯病毒 DNA 的分离 变得很 容易。 又 堪菌体 另一 个被作 为基因 表达的 调控模 型研究 得较彻 底的唆 菌体是 X 嗤菌 体， 其 派生结 构常被 用作克 隆载体 （参见 H2)。 X 嗤 菌体颗 粒有一 个包裹 着 48.5kb 的线 性双链 DNA 基因组 的二十 面体的 头部， 及一个 长的柔 284 R 蹈 菌体与 真核生 物病毒 初的 尾部。 该嗤 菌体能 识别大 肠杆菌 外膜上 的特异 受体， 并 通过其 尾部将 其基 因组注 入宿主 细胞。 尽管 在病毒 颗粒内 的基因 组是线 性的， 但 它的两 端 是单链 且互补 被称作 COS 末端 （cos end) (参见 H2)。 一 旦进入 细胞， 两个 cos 末端 就会迅 速相互 结合， 形成有 缺口的 环状基 因组， 细胞的 DNA 连 接酶可 修补该 缺口。 在 感染细 胞内， ； ^唆菌 体既可 营裂解 性的生 活 周期， 也可 是溶原 性的。 在 溶原性 生活周 期内， 基因组 线性 拷贝或 原蹈菌 体形式 整合进 宿主基 因组。 图 R2.1 M13 的 基因组 （a) 及其 病毒颗 粒结构 （b) 的 示意图 。图 （a) 中的 箭 头表示 启动子 ，而 （b) 中的封 /> 表示 3 蛋白 基因， 等等 有兰纽 X 基因 在侵 染后不 同时期 表达。 首先表 达的是 立即早 期基因 ( immediate- early ) , 接着 是巧早 期基因 （ delayed-early) 。 这 两组基 因的表 达导致 基因组 复制。 然后晚 期基因 （late) 表 达产生 为组装 新病毒 颗粒的 结 构蛋白 及 细胞裂 解所需 蛋白。 ； ^幢茵 体的基 因调控 机制比 较复杂 ，在 此只 作简要 介绍。 图 R2. 2 展示; ^蹈 菌体基 因组。 基 因组环 化后随 即立即 早期基 因开始 转录。 转录从 和 />R 两个启 动子 起始， 并进 行两个 立即早 期基因 N 和 cro 的 转录。 这 两个启 动子利 用 DNA 的不 同链作 为合成 RNA 的 模板， 分 别向左 （/)L) 向有 （衣 R) 转 录 （图 R2.2)。 N 和 cro 基 因转录 的终止 都依赖 rho 因子 （参见 K4 ) 。 N 蛋 白是一 个抗终 止子， 能使 RNA 聚合 酶通读 N 和 cro 基因 的转录 终止信 号， 结果使 得转录 向左右 延伸， 右边的 转录通 过有复 制基因 0、 P、 进入 Q, 而 左边则 转录进 相关于 重组及 复制的 基因。 这些 基因的 转录使 得宿主 酶系 统进行 DNA 巧向 复制成 为可能 （参见 E4)， 而 在蛋白 pO, pP 与宿主 解旋酶 （DnaB) 的复 合体作 用下， 双向 复制从 or/ (复制 起点） 位点起 始。 此后护 m: 基因 产物使 复制转 化为巧 环复制 （rolling circle replication), 产生 出线性 基因组 串联体 （多 个基 因组的 串联） （图 R2.3)。 R2 巧菌体 285 晚 期转录 晚早 期转录 晚 期转录 立印早 期转录 pL pft |4 头 1 尾 1 - ; int gam N 品 O 户 0 、 ■ 1 cos att on COS 1 0 10 1 20 ■ 1 30 1 40 pL pci pR cUI N cl Cro cU O 图 R2.2 隨菌体 基因组 的简图 （线 性化) COS cos 图 R2.3 嗤菌 体的滚 环复制 从衣 R 的转 录结果 产生出 Cro 蛋白， 而 该蛋白 能结合 并覆盖 和 女 R 启动 子， 抑 制从该 两个启 动子的 转录。 结果 早期转 录就被 关闭。 Q 蛋 白与 N 蛋白 相似， 也具 有抗终 止功能 （可与 HIV 的 Tat 蛋白 相比较 ，参 见 N2)。 Q 蛋白 的生成 引起从 /)R' 起始的 晚期基 因转录 的开始 （图 R2.2)。 晚期基 因编码 病毒颗 粒头部 和尾部 的结构 蛋白、 能切割 cos 末端 产生 出线性 基因组 的蛋白 及 导致宿 主细胞 裂解、 病毒 释放的 蛋白。 整个 裂解过 程可在 35mm 内 完成， 并能 释放出 100 个 左右的 病毒粒 子。 裂解 循环需 要晚期 基因的 表达， 而溶 原过程 则需要 被称为 31 阻抑物 (lambda repressor) 的 合成。 阻 抑物是 c/ 基因的 产物。 晚 早期基 因包括 复制 和重组 基因， 还 编码兰 个调控 因子。 这 兰个调 控因子 一个是 Q 蛋白， 负 责晚期 基因的 表达， 另两个 和 调 控基因 分别由 和/ >L 启 动。 C 产物具 有稳定 产物的 作用。 C 分产物 能结合 并激活 mz 基因 和 c/ 基因启 动子。 上述 znf 基因负 责将; C 基因 组整合 进宿主 细胞基 因组； 286 R 嗤 菌体与 真核生 物病毒 转座 艳菌体 而 c/ 基因 编码; V 阻抑 物。 阻抑物 抑制/ >R 和/ >1^启 动子， 结果 是抑制 了 所有早 期基因 （包括 cro 和 Q 基因） 的 表达， 从 而也抑 制了晚 期基因 表达 和裂解 循环， 进 入溶原 状态。 裂解与 溶原间 的调和 取决于 Cro 蛋白 (抑 制早期 基因和 c/ 基因的 表达） 和利于 裂解的 Q 蛋白 （激活 晚期基 因） 的 浓度， 另 一个方 面也取 决于所 建立的 溶原途 毎中的 C 分、 C# 的蛋 白及 X 阻抑 物。 溶原性 侵染可 W 维持许 多代， 在此 期间原 嗤菌体 象细菌 基因组 的其他 部 分一样 复制。 溶原 期的转 录主要 受制于 c/ 基因， c/ 有自己 的启动 子， 可由 cD 蛋白増 强但并 不是必 需的， 因为 c/ 产物也 能调控 自身转 录。 一般 当感染 细胞受 到威胁 或发生 DNA 损伤 （如受 到电离 福射） 时， 溶原 平衡被 打破。 这时将 会诱导 宿主细 胞表达 RecA (参见 F4)， 降解入 阻 抑物， 使 病毒进 入裂解 循环。 常在 革兰氏 阴性菌 中发现 转座唆 菌体， 尤其是 假单胞 杆菌属 中的细 菌。 其中研 究最彻 底的是 嗤菌体 Mu i{x)o 转座隨 菌体与 峰菌体 相似， 都 有裂解 期和溶 原期， 但它 们基因 组的复 制方式 不同。 在裂解 "早 期"， 一个由 病毒转 座酶、 细菌 DNA 聚合酶 和其他 病毒与 细茵的 酶共同 参与的 复 杂过程 介导了 病毒基 因组的 复制和 转座， 可 使其拷 贝分布 于宿主 基因组 的任何 位置， 且原病 毒基因 组无需 离开宿 主细胞 基因组 （参见 F4)。 仅经 过几 轮的复 制转座 （ replicative transposition ) , 病毒 基因组 就被从 细胞基 因组 上切除 （且 还会带 有邻近 的细胞 DNA 部 分）， 然后被 包装。 结果引 起宿主 细胞基 因组的 降解， 并碍放 出新的 唆茜体 颗粒。 R 哇 苗体与 真核生 物病毒 R3 DNA 病毒 要 点 DNA 病 毒的基 因组可 W 是 双链或 单链。 几 乎所有 的真核 DNA 病 毒都在 宿主细 胞核内 复制， 且能利 用宿主 细胞的 复制、 转 录和翻 译 系统。 较大 的双链 DNA 病毒 往往有 比较复 杂的生 活周期 ，包 括 对病毒 和细胞 的复制 、•转 录、 翻译 的时序 控制， 而较小 DNA 基 因组的 病毒则 会更依 赖于宿 主细胞 来完成 复制。 乳多 空病毒 科是小 DNA 病毒 家族中 的一例 ，如 SV40 和 多瘤病 毒。 它们 均只有 5kb 的 双链基 因组， 靠 基因重 叠和拼 接编码 6 个 基因。 这 些病毒 能反式 激活细 胞复制 系统， 导致病 毒和细 胞都进 行 复制， 因 此会在 宿主体 内诱发 肿瘤。 较大的 DNA 病毒中 包括疮 疹病毒 家族。 疮 疹病毒 侵染许 多脊椎 动物， 并能 引起多 种严重 疾病。 单纯疮 疹病毒 -1 (HSV-1) 有 70 个 W 上的可 读框， 其 基因组 长 150kb 左右。 侵染细 胞后， 兰组基 因即立 即早期 （a)、 早期 (則 和晚期 （Y) 基因 会按严 格时序 表达。 这些基 因能表 达一系 列 反式激 活因子 来调控 的病毒 转录和 活化。 这种病 毒能进 行潜伏 性 感染。 较大 DNA 病毒 单 纯癌疹 病毒 - 1 较小 DNA 病毒 DNA 病 毒基因 组： 复制与 巧录 相 关主题 真核生 物载体 （H4) 真 核生物 的转录 （M) 病 毒简介 （R1) 唆菌体 （R2) RNA 病毒 （R4) 肿瘤 病毒与 癌基因 （S) DNA 病毒 较大的 DNA 病毒 （如 疮疹 病毒、 腺 病毒） 具 有多至 200 个 上编码 基因 组：复 基因的 双链基 因组， 其复杂 的生活 周期不 仅包括 对自身 复制的 调控， 而且 制 与转录 有时 还能调 控其宿 主细胞 的生活 周期及 功能。 而 在另一 极端， 乳多 空病毒 是 仅拥有 几个编 码基因 的极小 的双链 环状基 因组， 需 要依靠 宿主来 完成大 部 分复制 功能。 大多 数真核 DNA 病毒在 宿主细 胞核内 复制， 在 那里即 使最大 最复杂 的 病毒也 会利用 细胞的 DNA 代谢 途径。 这意 味着病 毒和宿 主细胞 的启动 子 序列常 有相当 大的相 似性。 由 于这一 原因， DNA 病毒的 启动子 常被用 在 哺乳动 物表达 载体中 （参见 H4)。 288 R 嗤 菌体与 真核生 物病毒 较小 DNA 病毒 较大 DNA 病毒 单纯 疮疹病 毒 -1 乳多 空病毒 包括猿 猴病毒 40 (simian virus 40, SV40)。 由于它 是一种 致 癌病毒 而被广 泛研究 （参见 S)。 SV40 拥 有一个 5kb 双链 环状超 螺旋基 因组， 并 利用来 自细胞 的组蛋 白包装 成一个 45nm 的 二十面 体病毒 颗粒。 为 了在这 么小的 基因组 中编码 5 个 基因， 结果 是两条 链均编 码并且 相互还 有基因 重叠。 这些 基因可 分成两 个重叠 的转录 单元： 早 期和晩 期基因 (图 R3.1)。 通 过不同 的重叠 可读框 及不同 的拼接 方式可 产生。 SV40 依靠 宿 主细胞 的酶来 转录、 复制， 其早 期基因 可产生 转录活 化因子 （称 为大 T 抗 原和小 t 抗原， large T- antigen and small t-antigen) 来激 活病毒 和宿主 细胞的 转录与 复制。 这就是 该病毒 致癌的 原因。 晚 期基因 能产生 S 个为病 毒颗粒 包装所 需的衣 壳蛋白 VP1、 VP2 和 VP3。 图 R3.1 SV40 病毒 基因组 的结构 。外 侧线表 示转录 物和编 码区， A=poly (A) 尾部 疮疹 病毒是 "大" DNA 病毒 与宿主 之间复 杂的相 互作用 的最好 例子。 疮疹 病毒感 染脊椎 动物， 其病 毒粒子 很大、 具二 十面体 及被膜 （参见 R1), 拥 有一条 270kb 上编码 100 个左右 可读框 （ORF) 的双 链线性 DNA 基 因组。 根 据其生 物学特 征及基 因组组 构可将 疮疹病 毒分成 兰个亚 组， 总 共约有 100 多种， 而 且大部 分是宿 主专一 性的。 其中 感染人 类的病 毒 包括： 能 引起冻 疮的单 纯疮疹 病毒、 能引起 水痘的 水痘带 状疮疹 病毒、 能引 起传染 性的单 核细胞 增多症 （腺 热） 及某 些肿瘤 的非洲 淋己瘤 病毒。 、 HSV-1 已被研 究得很 透彻。 它的基 因组大 小约为 150kb， 含有 70 多 个 ORF， DNA 的 两条链 都编码 基因， 有时还 会相互 重叠， 并且可 将整 个 基因组 （图 R3.2) 分成长 短两个 部分： 每 一部分 都含有 一个单 一片段 (Ui^ 和 Us), 两 个片段 之间是 反向重 复序列 （IRi^ 和 IRs), 在两端 也有未 R3 DNA 病毒 289 端 反向重 复序列 （T 咕和 TRs)。 这 些反向 重复由 b、 b' 和 C、 C' 组成 。另 外还 有一个 短序列 （a) 在其 中重复 出现， 重复次 数不定 （a。 和 am)。 IRl IRs TRg ^ b' Sm c ca 图 R3.2 HSV-1 的基因 组结构 疮 疹病毒 基因组 的转录 与复制 受严格 的时序 控制。 在 感染允 许细胞 (permissive cell, 允 许病毒 侵染和 复制的 细胞， 参见 R1) 后， 基因 组环化 位于末 端重复 区域间 的一组 基因， 立即早 期基因 或称为 a 基因在 RNA 聚 合酶 n 的作用 下开始 转录， 该 a 基因 的转录 是被病 毒编码 蛋白即 a 反式巧 导因子 （a-Krans-inducing factor 或 a-TIF) 反式 激活的 。与 HSV - 1 基因 产 物中约 兰分之 一一 样， a-TIF 并不为 复制所 必需， 而是作 为成熟 病毒颗 粒基 质的一 部分， 在进入 细胞后 与细胞 转录因 子发生 作用， 并与 a 启动子 上 游的特 定序列 结合， 从 而提高 它们的 表达。 amRNA (其 中某些 mRNA 经受 拼接） 编 码早期 基因或 P 基因 的反 式激活 因子， 而 13 基 因又编 码大多 数用于 进一步 转录与 基因组 复制所 需的非 结构蛋 白及少 数结构 蛋白。 早期 基因 产物包 括参与 核巧酸 合成所 需的酶 （如 腺昔 激酶、 核昔 酸还原 酶）、 DNA 聚 合酶、 立 刻早期 基因表 达的抑 制蛋白 W 及能 够降低 宿主细 胞各方 面代谢 的调节 蛋白。 P 基 因的启 动子与 它们宿 主的启 动子很 相似， 蛋白均 在转录 启动子 点上游 20 〜 25bp 处有 明显的 TATA 框及 CCAAT 框， W 及 转录因 子结合 位点。 疮疹病 毒基因 组整合 到宿主 基因组 中后， （3 基 因启动 子 能很好 地后动 转录， 因而早 就被当 作模式 RNA 聚合酶 n 启动 子被研 究。 复制 可从环 状基因 组上几 个可能 的起始 （0RI) 位点中 的任何 一个开 始， 需要有 病毒所 编码的 ORI 结合 蛋白、 解 旋酶- 引发酶 复合体 和聚合 酶 -DNA 结合 蛋白复 合体的 参与。 DNA 合成 是半不 连续的 （参见 E)， 产 生 多个复 制复合 体和复 制叉构 成的多 联体。 晚期 基因或 Y 基因 （有些 只能在 DNA 复 制后才 表达） 主要编 码结构 蛋白， 或 者是侵 染后立 即需用 的因子 （如 a-TIF)。 该病毒 在核内 组装， 空的衣 壳与游 离基因 组末端 的重复 "a" 序列 结合， 接着装 入一个 基因大 小的 序列， 然后切 割再从 下一个 "a" 序列处 开始重 复包装 循环。 病毒的 外 膜来自 修饰的 核膜， 并含有 为附着 与进入 所需的 重要的 病毒塘 蛋白。 除了上 面所说 的严格 受控的 复制循 环外， 疮疹病 毒还能 进行潜 伏性感 染 （latent infection), 它 们能下 调自身 的转录 至可使 环状基 因组在 宿主细 胞 核内保 持外源 染色体 状态而 不进行 复制的 水平。 潜 伏性感 染可在 整个细 胞 生存期 持续， 在此期 间可能 会有周 期性的 复制。 HSV-1 主要在 神经元 内 潜伏， 而 其他疮 疹病毒 潜伏侵 染包括 淋己细 胞在内 的其他 组织。 疮疹病 TRl 290 R 權 菌体与 真核生 物病毒 毒 潜伏与 复制的 精确调 控机制 还没有 完全搞 清楚， 可 能与编 码在末 端重复 区内 和某些 a 基因重 叠并互 补的一 些特殊 RNA (潜伏 关联转 录物， laten- cy-associated transcripts, LAT) 的转录 相关。 泡疹 病毒及 其他大 DNA 病毒 （如 腺病 毒）， 凭 借巨大 的基因 组和复 杂 的生活 周期， 常编码 许多只 对理想 复制重 要并非 必需的 基因， 尤 其是在 细胞 培养期 （如 腺巧 激酶基 因）。 与较 小的病 毒相比 它们更 能克服 基因组 大小 的巨大 变异， 而不 失去稳 定性。 这 些特性 （W 及重组 DNA 比 RNA 相对 容易） 使得 它们用 作实验 室进行 外源基 因操作 的载体 W 及用作 疫苗。 R 堪 菌化与 真巧生 物病毒 R4 RNA 病毒 I 要 点 病毒 RNA 基 因组可 W 是单 链或 双链、 正义或 负义， 而且 还有多 种不同 的复制 机制。 由于完 全是依 赖病毒 编码的 依赖于 RNA 的 聚合酶 来进行 复制， 其合 成互补 RNA 链的 错误率 要远远 大于依 赖于 DNA 的聚 合酶。 送 在很大 程度上 影响着 RNA 病毒的 进化， 这种进 化朝着 增强承 受能力 的方向 发展， 但却 限制了 RNA 病毒 基因组 増大。 病毒的 反转录 I 来自病 毒的反 转录酶 （RT) 的利用 是分子 生物学 领域划 时代的 革新。 尽管 不同的 RNA 病 毒家族 复制方 式大不 相同， 但 均需经 反转 录来完 成其基 因组的 复制， 它 们反转 录酶的 相似足 W 暗示它 们来源 于同一 祖先。 义转 录病毒 I 反转 录病毒 有二倍 体的、 正义链 RNA 基 因组， 经 由双链 DNA 中 介完成 复制。 这 个中介 称作原 病毒， 能够 插入到 宿主细 胞基因 组内。 反转 录病毒 与真核 反转录 转座子 如酵母 Ty 元件有 许多相 似的 特性。 RNA 病 毒基因 组的一 般特性 致 癌性度 转 录病毒 反转录 病毒对 宿主基 因组的 插入可 引起宿 主基因 失控， 或 有时会 引起 病毒与 宿主基 因重组 （病毒 获得宿 主的基 因）。 如果 反转录 病 毒改变 了一个 重要的 细胞调 控基因 称为癌 基因的 表达或 活性就 可 能导致 癌症。 反转 录病毒 基因 组结构 义 其表达 反转 录病毒 基因组 的基本 结构是 gag 、 poL 化 env 基因两 侧排列 5' 及 3'- 长 末端重 复序列 （LTR) 。 负责整 个病毒 转录的 启动子 存在于 5'- LTR 的 U3 区域。 病毒 的转录 产物会 被加上 poly A 尾， 而且可 能需要 拼接。 在人类 免疫缺 陷病毒 （HIV) 中， Tat 调 控从病 毒启动 子开始 的转录 延伸； 而 Rev 调 节将未 拼接的 RNA 向细 胞质的 运送。 反巧录 病毒的 突变率 某 些反转 录病毒 的反转 录酶复 制错误 率可高 达万分 之一。 有缺陷 的基 因组可 通 过互补 与重组 来得到 挽救， 因此结 合病毒 快速变 异 （对 HIV 来说， 每天有 109 〜 1010 个新 病毒产 生）， 能 使它们 很快适 应选择 压力。 巧 关主题 cDND 文库 （12) 病 毒简介 （民 1) RNA 聚合酶 n 基因： 启 动子与 增强子 （M4) DNA 病毒 （R3) 转录调 控举例 （N2) 肿瘤 病毒与 癌基因 （S) 292 R 堪 茜体与 真核生 物病毒 RNA 病毒 基因 组的一 巧特性 病毒 的反转 录 反转 录病毒 依 据病毒 家族， 病毒 RNA 基 因组可 W 是 单链或 双链， 若是单 链基因 组则 有正义 与负义 之分。 由于 宿主细 胞没有 依赖于 RNA 的 RNA 聚 合酶， 所 只 能由病 毒自己 编码， 且 该聚合 酶基因 （/ >oZ) (该 基因 还常编 码其他 非结 构功能 蛋白） 通常是 RNA 病毒基 因组中 最大的 基因。 这使 RNA 病 毒成为 真正的 翻译寄 生者， 而复制 和转录 往往完 全独立 于宿主 细胞核 ，因 此 与真核 DNA 病毒 不同， 许多 RNA 病 毒在细 胞质中 复制。 依赖于 RNA 的聚合 酶不像 依赖于 DNA 的 聚合酶 得那样 准确， 通常 RNA 病毒 无法进 行校正 （参见 F1)， 因 此许多 RNA 病毒有 10-3~10 一 4 的 突变率 （即 在每个 复制循 环中每 103~104 个碱 基中有 一个突 变）， 而大 DNA 病毒 中却可 低到 10 — 8 〜 10-11 (如 疮疹病 毒）。 这里 有兰个 主要结 论： (1) RNA 病毒 变异率 很高， 因 此如果 该病毒 复制周 期快， 那么病 毒的抗 原性 与毒性 就会很 快地发 生较大 的变化 （即 RNA 病 毒能很 快进化 适 应改变 了的新 环境、 新宿主 等）。 (2) 有些 RNA 病毒 变异速 率太快 UjI 致 于它们 准种 （guasispecies) 形式 存在于 单一宿 主内， 即不同 基因组 的群体 （常 进行 互补复 制）， 而且 只能根 据大部 分或平 均序列 对它们 给出分 子上的 定义。 (3) 由于 大多数 突变对 病毒复 制是有 害的， 因此突 变率给 RNA 病 毒基因 组 的大小 设定了 一个约 104 碱基的 上限， 突变率 的倒数 （即每 个基因 组平 均发生 一个突 变的大 小）。 反转录 过程 W 及反 转录酶 （ reverse transcriptase, RT ) 的利用 在上文 中已 有叙述 （参见 口)。 尽 替采用 反转录 的不同 病毒会 有不同 的形态 、不 同 的基因 组结构 和生活 周期， 但 它们反 转录酶 及其核 私蛋白 的序列 是高度 相 似的， 足 推测它 们进化 自同一 祖先。 反转 录病毒 基因组 与许多 真核细 胞 中所发 现的反 转录转 座子如 酵母的 Ty 反转 录转座 子在结 构上有 明显的 相似 （序列 同源） （参见 F4)。 反 转录病 毒有一 条单链 RNA 基 因组。 每 一病毒 粒内有 两个拷 贝的正 义链基 因组。 病毒 侵染细 胞后， 单链 RNA 由 反转录 酶转化 成双链 DNA 拷贝， 随后 的复制 与转录 这一 dsDNA 中介体 为模板 进行。 送一 中介体 通 常称为 原病毒 （provirus), 可通 过病毒 整合酶 （integrase enzyme) 整合 进 宿主基 因组。 反转 录病毒 复杂程 度不一 （如图 R4.1)， 极 简单的 基因组 仅只比 反转录 转座子 多一个 侵染所 需的包 膜糖蛋 白基因 （enu)。 而另一 极端， 慢病毒 属像人 类免疫 缺陷病 毒 （ human immunodefeciency virus, HIV) 具有 编码能 在复制 期的不 同阶段 起调控 作用的 各种顺 式作用 元件及 反 式作用 因子的 巨大基 因组， 并 具有调 控病毒 和细胞 功能的 能力。 R4 RNA 病毒 293 U3 R U5 U3 R U5 (a) 1 1 I I n~r (b) gag I pol env (c) gag 图 R4.1 反转录 病毒原 病毒的 基因组 结构。 （a) 反转 录病毒 原病毒 的基本 结构， 含有由 U3、 R 和 U5 元件 组成 的长终 止重复 （LTR); (b) 禽 类白血 病病毒 （ALV), —种简 单的反 转录 病毒； （C) HIV-1, —种含 有附加 调控因 子的复 杂反转 录病毒 致癌 性反转 反转录 病毒有 时会与 宿主基 因发生 重组， 因此这 些病毒 通常有 复制缺 录病毒 陷。 反转录 病毒会 干扰宿 主基因 的表达 调控， 或者会 将宿主 DNA 片段插 入到自 己的 基因组 内实现 重组。 如果该 宿主细 胞基因 编码一 个调控 细胞分 裂的 蛋白， 就 会引起 癌症， 这 个基因 也就是 癌基因 （oncogene) (参见 S)。 目前已 经鉴定 许多表 达人癌 基因的 致癌性 反转录 病毒。 反转 录病毒 反转 录病毒 基因组 结构的 几个特 例如图 R4.1 所示， 可 见所有 的反转 基因 组结构 录病毒 都有相 似基本 结构。 gag 基因编 码二十 面体衣 壳的核 心蛋白 ，抑 Z 及 其表达 基因 编码病 毒复制 相关酶 （如 反转 录酶、 RNase、 RNaseH、 整合 酶及蛋 白水解 酶）， 而 enu 基 因编码 包膜糖 蛋白。 在 病毒基 因组的 两端分 别是与 复制、 宿主 细胞整 合和病 毒基因 表达相 关的单 一元件 （U5 及 U3) 和重 复 元件。 整合后 的原病 毒的转 录要依 赖宿主 RNA 聚合酶 n, 由 5' 端长 末端重 复序列 （LTR) 中的 U3 区的 启动子 启动。 RNA 转 录产物 被加上 poly A 尾， 且可 能是经 拼接的 产物。 未经 拼接的 RNA 在细 胞质核 搪体上 通过诸 如 读框位 移方式 （核糖 在模板 RNA 上 滑过一 个读框 W 避开 一个终 止密码 子） 翻 译产生 gag 多聚 蛋白和 gag-pol 多聚 蛋白。 拼 接后的 mRNA 在与膜 结合 的核糖 体上翻 译产生 包膜搪 蛋白。 有些反 转录病 毒如慢 病毒属 的病毒 294 R 蹈 菌体与 真核生 物病毒 能产 生多个 或不同 拼接的 RNA， 它们 能翻译 出各种 调控因 子诸如 分别调 控 转录与 mRNA 加工的 Tat (参见 N2) 和 Rev。 Tat 蛋白 调控从 HIV 基 因组的 5' LTR 的转 录延伸 （参见 N2)。 民 ev 可促进 未拼接 mRNA 从核向 细 胞质的 转运， W 便在细 胞质中 合成充 足的病 毒结构 蛋白。 反转 录病毒 某些反 转录病 毒的反 转录酶 （如 HIV-1) 约有 l(r4 的高 错误率 ，即 的 突变率 平均每 个基因 组有一 个突变 （上文 已有叙 述）。 结果 复制出 许多有 缺陷的 基 因组。 虽然可 通过与 另一基 因组的 互补复 制来克 服上述 种缺陷 （通 常一 个 反转录 病毒颗 粒包装 有两个 RNA 基因 组）。 但在 反转录 期间任 一病毒 颗粒中 的两个 不同的 基因组 会发生 重组。 综合 W 上两个 特点， 再加上 HIV-1 病 毒的快 速更新 （每天 会产生 109 〜 1010 个新病 毒）， 足 吏它能 很快 地适应 新环境 （如 对抗体 或药物 处理的 选择压 力）， 这 也是逐 渐被人 们 认识了 的诸如 AIDS 病等感 染病理 的关键 特征。 反转录病毒具有将自身基因组整合进宿主细胞基因组的能力1^及相对 容易对 其复制 能力进 行实验 室遗传 修饰的 特性。 这二 个特性 使得它 们成为 创造 新细胞 系及在 生物基 因治疗 中使用 的主要 载体。 (陆 韵译 刘进 元校） s 肿瘤 病毒写 癌基因 S1 肿瘤病 毒中的 癌基因 要 点 ^ ^ 癌 症是阻 断正常 细胞生 长的调 控机制 突变的 结果。 正常细 胞的生 长 经受多 种不同 类型的 调控， 而在正 常细胞 逐步转 变成恶 性肿瘤 细 胞的过 程中这 些调控 可相互 独立地 丧失。 癌基因 ~~ I 癌基因 是那些 活性过 高的能 使细胞 癌化的 基因。 相对于 未突变 (正 常） 的 基因， 癌 基因是 处于遗 传显性 状态。 第一 个癌基 因是从 致癌性 反转录 病毒中 分离得 到的。 反转 录病毒 通 过表达 细胞生 长调控 的突变 基因， 或激化 正常细 胞基因 的过量 表 达而导 致细胞 癌化。 癌基因 的分离 I 癌 基因的 分离可 W 借助 于检测 DNA 转变 NIH - 3T3 鼠成 纤维细 胞生长 方式的 能力的 测活来 进行。 这 种测法 有很大 的实用 价值， 已用来 分离出 许多癌 基因， 但其应 用也是 有局限 性的。 致癌性 反转录 病毒 相 关主题 诱变 （F1) RNA 病毒 （R4) 癌基因 的分类 （S2) 肿瘤抑 制基因 （S3) 癌症 癌症是 正常细 胞生长 失控而 造成的 疾病。 正常细 胞的生 长发育 受到多 种不同 方式的 调控。 完 全恶性 （malignant) 的 肿瘤细 胞就可 能丧失 了全部 或是大 部分的 调控。 然而 只有当 丧失了 某些调 控出现 中间态 细胞时 才可被 检 测到。 从 正常细 胞到恶 性肿瘤 细胞的 转化是 一个多 步过程 （multistep process), 每一 步对应 于一个 正常细 胞调控 机制的 雍疾。 人 们早就 认识到 癌症是 与基因 相关的 疾病。 现 已有兰 方面的 证据； - 发展成 某一特 定类型 的癌症 是可遗 传的； • 在某些 癌症患 者中， 肿瘤 细跑的 染色体 明显不 正常； • 能 引起突 变的物 质往往 也能引 起癌症 （参见 F1)。 正 常生长 的失控 好像是 由于负 责调控 的基因 发生了 突变。 癌症 也就是 在肿 瘤细胞 内一系 列特殊 的突变 的积累 造成的 结果。 近 年来， 对癌 化过程 中突 变基因 的鉴定 取得了 长足的 进展。 引起癌 症被鉴 定的第 一个基 因被命 名为 癌基因 （oncogene)。 癌基因 癌基因 就是那 些表达 后能引 起细胞 癌化的 基因。 这种基 因的正 常状态 称为原 癌基因 （proto-oncogene) 不引起 癌化， 一旦发 生突变 就异常 活跃， 其 遗传显 性程度 远远高 于原癌 基因， iU 致于只 要有一 个癌基 因就足 W 改变 296 细胞 行为。 S 肿瘤 病毒与 癌基因 致癌 性反转 癌 基因的 基本概 念是从 致癌性 病毒， 尤其 是致癌 性反转 录病毒 录病毒 （oncogenic retrovirus) 的 研究中 得来的 （参见 R4)。 致癌性 病毒是 动物癌 症 的主要 病因， 而对 于人类 仅有少 数种类 的癌症 与病毒 有关。 反转 录病毒 是 RNA 病毒， 通过 DNA 中介 （原 病毒） 复制， 并 能插入 到宿主 基因组 中， 借助 细胞的 RNA 聚 合酶转 录病毒 RNA。 许多致 癌性反 转录病 毒中有 一 个多余 基因， 而 具有亲 缘关系 的非致 癌性病 毒中却 没有。 通过将 该基因 转染 到末癌 化的细 胞后能 致使该 细胞癌 化的实 验表明 该基因 就是癌 基因。 不同的 致癌病 毒有不 同的癌 基因。 癌基 因的分 癌 基因的 分离与 其他生 化分子 的分离 一样， 依赖 于特殊 测定法 的有效 寓 性。 分离 癌基因 的主要 方法是 应用对 NIH-3T3 细胞的 DNA 转染 实验来 进行。 NIH-3T3 是一 个永 久的鼠 成纤维 细胞系 （在 体外生 长良好 的结缔 组织细 胞）， 将其注 入免疫 缺陷的 小鼠不 会引发 肿瘤。 培 养中的 NIH- 3T3 细胞 生长 模式是 正常的 非癌化 细胞的 模式。 将待测 DNA 转染 NIH- 3T3 细胞 （即将 DNA 细小 沉淀加 到细胞 上）， 结果少 量细跑 会吸收 并表达 外源 DNA。 如果 进入的 DNA 含有癌 基因， 则 培养细 胞的生 长模式 就会呈 现出 癌细胞 的特征 （图 S1.1)。 这一 测定法 的优点 在于： 图 S1.1 通过检 测引起 NIH- 3T3 细胞 的生 长模式 的改变 与否来 确定被 转染的 DNA 中 是 否存在 癌基因 - 测定只 需要进 行细胞 培养， 而 不是整 个动物 试验， 所 特别适 合大量 SI 肿瘤病 毒中的 癌基因 297 的样品 筛选； • 与 体内试 验相比 能更加 快地获 得试验 结果； • NIH-3T3 细胞 很易吸 收及表 达外源 DNA; - 与体内 试验相 比这是 一个技 术比较 简单的 测法。 与 体内试 验相比 操作更 简单， 但在 广泛的 应用中 也暴露 出许多 实际的 与 潜在的 弊端： - 某 些癌基 因是细 胞专一 性的， 所 W 不可 用鼠 成纤维 细胞来 测定。 - 因为很 难对大 基因进 行完整 转染， 大基因 会容易 丢失。 • NIH-3T3 细胞 是一 个永久 细胞系 而不是 "正 常" 细胞， 所 W 致癌早 期相关 基因可 能检测 不到。 • 该 方法要 求被转 染的基 因呈遗 传显性 状态， 因而 将无法 检测肿 瘤抑制 基因 （参见 汾）。 第一 个癌基 因是从 致癌性 反转录 病毒中 分离出 来的。 当 反转录 病毒的 癌 基因被 克隆， 且 被用作 杂交探 针时， 取 得了一 个重要 发现， 即正 常细胞 的 DNA 中也有 癌基因 的同源 序列。 后 来又发 现反转 录病毒 的癌基 因起源 于正常 细胞中 的原癌 基因， 可能 是因为 当原病 毒整合 进正常 细胞的 原癌基 因附 近时被 惨进病 毒基因 组的。 随后， 从非病 毒感染 的癌症 患者身 上分离 出相似 （有 时是 相同） 的癌 基因。 在所 有的情 况下， 癌基因 与正常 的原癌 基 因在许 多重要 方面有 区别。 (a) 插入 基因组 DNA 的 反转录 病毒的 原病毒 —^int-2 低水 平转录 , ... .. - ... ■ 、、'、、 丫 ' — 「一 (b) 在病韋 増强子 影咱下 反转录 病奉的 原病奉 巧 1' ~~ 图 S1.2 MMTV 引 起鼠乳 腺癌的 机制。 （a) MMTV 原病毒被整合前的 鼠 " 2 基因； （b) 原病 毒的整 合导致 t’nf -2 的过 量表达 • 量 的区别 （ A quantitive difference)。 基因的 编码功 能可能 没有被 改变， 但 由于诸 如受控 于病毒 的启动 子或增 强子， 或是 它被转 移到基 因组的 另一新 位点， 致 使基因 W 高速 率或在 不正常 环境下 转录， 结果 造成正 常基 因产糊 的过量 形成。 例如， 鼠腺 癌是由 鼠乳腺 瘤病毒 （mouse mammary tumor virus, MMTV) 引 发的， 即当 MMTV 原病毒 插入到 298 S 肿瘤 病毒与 癌基因 鼠 z‘nf-2 基因 （编 码生长 因子） 附近， 病 毒的增 强子序 列就会 强烈刺 激 的活性 （图 S1.2)， 从而 产生出 过量的 生长因 子致使 细胞不 停地 分裂的 结果。 • 质 的区别 （ A qualitative difference)。 编码序 列也可 能会被 改变， 如经 基因缺 失或点 突变， 导致 基因产 物在功 能上的 改变， 常 常是变 得过分 活跃。 例如 癌 基因编 码一个 被截短 了的生 长因子 受体， 由 于缺失 的 部分正 好是生 长因子 的结合 部位， 导致 该癌基 因呈现 组成性 活性， 不 停向核 （图 S1.3) 发送 信号， 指导细 胞不断 分裂。 正常的 ErbB, 仅 当生长 图 S1.3 癌基因 编码具 有组成 活性的 生长因 子受体 s 肿瘤 病毒与 癌基因 S2 癌基因 的分类 要 点 许 多癌基 因编码 蛋白参 与细胞 生长因 子调控 过程中 的各个 步骤， 由 这样的 癌基因 所致变 的癌细 胞就成 了好像 在被生 长因子 不停地 刺 激而不 断进行 分裂的 细胞。 括; 癌基因 ~~ I 另一些 癌基因 编码核 DNA 结合 蛋白， 来作 为转录 因子调 控与细 胞分 裂相关 的基因 表达， 其结 果导致 在癌细 胞中细 胞分裂 相关基 因表 达的调 控机制 失效。 用 癌基因 转染直 接取自 鼠正常 成纤维 细胞时 发现， 生长因 子相关 的癌 基因及 核癌基 因二者 均为细 胞完全 癌化所 必须。 这反 映出体 内细 胞的癌 化过程 至少需 要一个 W 上 的变化 步骤。 相 关主题 真核生 物的转 录因子 （N1) 肿瘤病 毒中的 癌基因 （S1) 寇基 因间的 协 同作用 癌基因 与生长 因子 癌基 因与生 癌 基因的 分离使 得研究 每个癌 基因在 癌化过 程中的 作用成 为可能 。许 長因子 多 癌基因 编码生 长因子 应答机 制中各 个步骤 相关的 蛋白。 生 长因子 是经许 多 种细胞 分泌到 体液中 的肤， 它们能 够与附 近的组 织细胞 （可 W 是 与分泌 细胞 相同或 不同的 细胞） 上的 特异性 细胞表 面受体 结合， 并 激起一 个通常 导 致细胞 分裂速 率增加 的应答 反应。 表 现为依 赖于其 生长因 子相关 活性的 癌基因 包括： •sis 癌 基因编 码血小 板生表 :因子 （platelet-derived growth factor, PDGF) 的一个 亚基， 如 果含有 该基因 的细胞 也含有 PDGF 的 受体， 则 该生长 因 子的过 量表达 就会自 动促进 癌细胞 生长。 • fms 癌基 因编码 一 ■个 集落剌 激因子 1 ( colony-stimulation factor ~ 1, CSF-1) 受 体的突 变型， 该 因子在 血细胞 形成过 程中刺 激骨髓 细胞。 在 Fms 蛋 白中， 正常 CSF- 1 受体 C 端的 40 个氨 基酸被 11 个 不相关 的氨 基酸所 代替， 结果 Fms 不管 CSF-1 存在 与否， Fms 蛋白 总处在 活 性状态 （图 S2.1)。 • 各种/ "as 癌基 因编码 质膜蛋 白中的 G 蛋白 （G-protein) 家族的 成员。 G 蛋 白能将 来自许 多细胞 表面受 体的信 号传递 给酶， 从而 产生第 二信巧 ( second messenger) 。 正常的 G 蛋白被 激活时 能结合 GTP, 而 自身的 GTP 酶活 性也可 使自身 失活。 ras 癌 基因的 点突变 抑制了 自身的 GTP 酶 活性， 结 果它们 可比正 常蛋白 维持更 长活性 （图 S2.2)。 300 S 肿瘤 病毒与 癌基因 酪氨 酸残基 '对 受体的 铭 化是必 需的 跨膜 结构域 图 S2.1 /ms 癌基因 编码一 个突变 成组成 活性的 生长因 子受体 正常的 G- 蛋白 被细胞 表面受 体巧活 巧 内源的 GTP 庚活 性纯化 图 S2.2 MS 癌 基因编 码的信 号转导 蛋白发 生突变 W 致失 去了純 化自身 的能力 核 癌基因 另一 类癌基 因编码 作为转 录因子 （参见 N1) 调 控其他 基因的 表达的 核 DNA 结合 蛋白。 • 正常 细胞中 /nyc 基因的 表达是 由多种 促细胞 分裂剂 （促 进细胞 分裂的 试剂） 诱 导的， 其 中包括 PDGF。 编 码的蛋 白能与 特殊的 DNA 序 列 结合， 并 激活为 细胞分 裂所需 基因的 转录。 癌 细胞中 的 过量表 达 可受多 种机制 作用， 可 W 是病毒 增强子 导致的 转录量 增加， 也可 W 是 其编码 序列从 8 号染色 体的正 常位置 易位到 14 号染 色体， 受 控于免 疫球 蛋白重 链的活 性启动 子之下 所造成 的表达 增加， 或 者还可 是 mRNA 的 5' 端非编 码序列 的缺失 而引起 mRNA 半衰期 延长。 • /os 和 mw 癌基 因编码 正常转 录因子 AP- 1 的 亚基。 在 正常细 胞中， 第 二信使 ras 癌基 因产物 被细胞 表面受 体巧活 有 活性的 GTP 无 gtpSI 无純化 V \ 第 二信使 质膜 正常的 CSF-1 受体 fms 癌基 因产物 CSF-1 结合区 CSF-1 结合区 换的 替键 酸关度 基括氛 氨包酪 巧结 氨巧域 酪激构 酸结 氨巧巧 酪激构 S2 癌基因 的分类 301 /os 和知 n 的表达 是很短 暂的， 紧 跟在促 细胞分 裂剂刺 激后； 而 /OS 和 jun 的 基因产 物的正 常细胞 浓度不 仅被基 因转录 效率， 而 且还被 mRNA 稳 定性来 调控。 而 在癌细 跑中， 这两 过程都 被增加 T。 • erAA 是禽类 成红细 胞增生 病毒中 发现的 第二个 癌基因 （除了 夕 h)。 该基 因编码 一个甲 状腺激 素核受 体的缺 陷型。 甲状 腺激素 受体在 与 甲状腺 激素结 合后被 激活， 作 为调控 特殊基 因表达 的转录 因子。 ErbA 蛋白缺 少正常 受体的 C 端序 列， 因 而不能 与激素 结合， 也 不能激 活基因 转录， 但它仍 旧能与 DNA 的相 同位点 结合， 从而 成为正 常甲状 腺 激素受 体的措 抗物。 癌基 因间的 正常细 胞向完 全癌化 细胞的 转变是 一个多 步骤的 过程， 涉及到 多个基 协 同作用 因 表达的 改变。 尽 管在大 多数情 况下， 将 上述单 个癌基 因转染 将导致 NIH-3TC 细胞系 细贿的 癌变， 而当用 直接从 鼠身上 取出的 成纤维 细胞的 培 养物来 代替该 细胞系 则会出 现不同 结果。 仅有 WS 或仅有 癌 基因都 无法使 正常细 胞完全 癌化， 只 有当两 癌基因 的同时 转染才 能达到 完全癌 化。 其他还 有多种 癌基因 的配对 能够引 起正常 鼠成纤 维细胞 癌化， 而单独 基因作 用同样 不行。 有趣 的是， 若 要有效 的话， 配对 的两个 癌基因 必须与 一 个是生 长因子 相关， 另一个 是核癌 基因。 所 W 任何 一个有 活性的 癌基因 只 能完成 将正常 细胞完 全转变 成癌化 过程所 需变化 中的一 部分。 s 肿瘤 病毒与 癌基因 S3 肿瘤抑 制基因 要 点 概_ 聋 J 肿瘤抑 制基因 由于突 变而失 活将引 起细胞 癌化。 在 正常细 胞内肿 瘤抑制 基因起 限制细 胞分裂 速率的 作用。 肿瘤 抑制基 因存在 的证据 是多样 的且间 接的， 其中 包括正 常细胞 与 癌细胞 融合后 的杂交 细胞的 行为、 某些家 族性癌 症的遗 传特征 W 及 作为肿 瘤细胞 染色体 标记的 "杂合 性的丢 失"。 R6J 基因 I 是 第一个 被分离 到的肿 瘤抑制 基因， 已被 证明是 引起儿 童期眼 瘤， 即成视 网膜细 胞瘤。 RB] 基因 的突变 已在乳 腺癌、 结肠癌 及肺 癌患者 中被检 测到。 肿瘤抑 制基因 存在 的证据 巧 3 基因 ~~ I 是多 种不同 肿瘤中 发生突 变的肿 瘤抑制 基因。 最初被 鉴定时 发现 该基因 既有癌 基因的 特征， 又有肿 瘤抑制 基因的 特征， 现在 已 知它是 一 ■个 W 显 性失活 （dominaut- negative) 方 式干扰 剩下的 正 常等位 基因功 能的肿 瘤抑制 基因。 相 关主题 肿瘤病 毒中的 癌基因 （S1) 癌基因 的分类 （S2) 概述 肿瘤抑 制基因 与癌基 因在作 用方式 上根本 不同。 原癌基 因通过 突变转 变 成活性 大大增 加的癌 基因； 而 肿瘤抑 制基因 转变成 致癌性 则是发 生消除 其正常 活性的 突变的 结果。 正常 的未突 变的肿 瘤抑制 基因能 够阻止 进入有 丝 分裂， 从而 抑制正 常细胞 分裂， 而 将送一 负调控 除去就 可恢复 细胞分 裂。 这种 作用机 制的一 个重要 后果是 为了移 去所有 限制， 肿 瘤抑制 基因的 两个等 位基因 均失去 活性， 送正是 肿瘤抑 制基因 W 隐性 遗传 方式起 作用的 证据。 肿瘤 抑制基 不像癌 基因有 NIH-3T3 测定法 那样， 对 肿瘤抑 制基因 目前还 没有快 因存 在的证 速方 便的测 定法， 只有几 个肿瘤 抑制基 因得到 分离， 且在很 长一段 时期内 据 这 类基因 在癌化 过程中 的根本 重要性 一直没 有得到 鉴定。 现 在已知 它们的 确 存在， 而且发 现了越 来越多 的相关 证据。 - 早在 19 世纪 60 年代， 就已发 现正常 细胞与 癌细胞 （不同 种的） 融合 所产 生的杂 交细胞 （hybrid cell) —律 是非癌 性的， 经 传代， 杂 交细胞 失 去染色 体后， 会 转变成 癌细胞 表型。 转 变常常 与某个 特定细 胞正常 染色体 （携 有肿 瘤抑制 基因） 的丢失 有关。 • 检查某 些家族 性癌症 （familial cancer) 的 遗传特 征发现 癌症由 隐性突 S3 肿瘤抑 制基因 303 I 连锁序 列中的 等 位基因 2 连 接序列 + 无活性 的 肿庙抑 制基因 等 位基因 1 和 正常的 肿宿抑 制基 因巧失 连锁序 列中的 等 位基因 2 连 接序列 + 无活性 的 肿疮抑 制基因 正常组 织细巧 舟瘤 细巧 (森 合的 -两种 （琪合 性丢失 -只有 连锁序 连接 序列） 列 的一个 版本） 图 S3.1 杂 合性的 丢失暗 示出细 胞丢失 了含有 惟一肿 瘤抑制 基因活 性的等 位基因 的染色 体部分 的过程 成 视网膜 细胞瘤 （retinoblastoma) 是一 种儿童 眼瘤， 是 由于肿 瘤抑制 基因 丢失造 成癌症 的可靠 例证。 成视网 膜细胞 瘤有家 族性的 （占 40%) 和 散发性 的两种 形式。 家族性 形式是 W 隐性基 因方式 遗传， 常常是 双眼发 病； 散发 型并不 经家族 遗传， 通常 只有一 只眼睛 发病。 上述 结果暗 示出成 视 网膜细 跑瘤是 由同一 基因的 两个等 位基因 均失活 的两个 突变造 成的。 在 家族性 发病形 式中， 一个 已突变 的等位 基因是 种系遗 传的， 它自身 是无害 的， 而当剩 下的另 一个正 常等位 基因也 发生突 变时就 会在成 视网膜 细胞中 引发 肿瘤。 在每只 眼中有 107 个成 视网膜 细胞， 若所 有细胞 都携有 癌基因 就使得 产生眼 瘤的概 率相对 较高。 而散 发型是 非遗传 形式， 由于需 要两个 突变 均在同 一细胞 发生， 这 种突变 的概率 很低， 所 W 通常仅 有一只 眼发病 (图 S3. 2)。 值得注 意的是 虽然遗 传性成 视膜细 胞瘤只 占病例 中的少 部分， 但 它却占 肿瘤的 多数。 成 视网细 胞瘤的 "双 击" 假说 （"two-hit") 也可从 杂合 性的丢 失的证 据得到 证明。 对家族 疾病的 遗传分 析暂定 成视网 膜细胞 瘤基因 （RSj) 位于人 13 号染 色体。 用与 基因 紧密连 锁的标 记做探 针进 行杂交 显示连 锁序列 杂合病 人的瘤 细胞仅 有该序 列的单 拷贝， 正说明 瘤细 胞中所 推测的 R 卽 基因所 在区有 缺失， 而正常 细胞中 并没有 缺失。 RB1 基因 在鉴定 出由最 紧密连 锁的标 记序列 （总 是与 基因 一起遗 传的特 定 染色体 DNA 序列） 所 限定的 13 号 染色体 上特定 区域的 DNA 序 列后分 离出 RB1 基因。 编 码一个 llOkDa 的可与 DNA 结 合的憐 蛋白， 具有 抑制 原癌基 因诸如 myc、 fos 转录的 作用， 在成视 网膜细 胞瘤中 R 剧 mRNA 不 是没有 就是不 正常， 将已克 隆的、 正常的 RBj 基 因转染 培养状 变 造成。 在许 多癌细 胞内， 总 是有某 一特定 染色体 的特征 区域的 丢失。 送种 "杂 合性的 丢失" （loss 'of heterozygosity) 表 明在丢 失染色 体片段 上的肿 瘤抑制 基因的 丢失图 S3.1。 1 正基 中因 + 制 列 基列抑 锁 等接肿 连 的连的 304 S 肿瘤 巧毒与 癌基因 态 下的瘤 细胞， 结 果瘤细 胞转变 成正常 状态， 这就 清楚地 证实了 基 因的 功能。 出人 意料的 是在乳 腺癌、 结肠 癌和肺 癌患者 中也检 测到了 RB1 的突 变型。 13 正常只 S7 基因 家巧的 13 13 I 突变的 （无 突变的 （无 活性) 的 活性) 的 AW 基因 基因 散 发性的 IB 突变的 （无 活性) 的 AS7 基因 正常 AS 7 1- 基因 正常 AS7 非 癌性的 成 巧网膜 细跑癌 非 癌性的 图 S3. 2 成视 网膜细 胞瘤是 13 号染 色体上 基因 的两个 拷贝均 失活的 结果。 由于正 常 基因两 个拷贝 的突变 （散发 性）， 或 者一个 失活拷 贝的遗 传再加 上另一 个维持 功能拷 贝的获 得突变 （家 族性） 均 可发病 P53 基因 同 样的技 术被应 用来鉴 定或分 离其他 癌症中 相关的 肿瘤抑 制基因 ，其 中 真正具 肿瘤抑 制作用 的基因 被称为 P53。 P53 基 因位于 17 号染 色体的 短 臂上， 该区 域的缺 失与近 50% 的人癌 相关。 P53 的 mRNA 长 2.2~ 2.5kb， 编 码一个 52kDa 的核 蛋白。 该蛋 白在大 多数细 胞内浓 度很低 ，且 半衰 期很短 （6 〜 20min)。 令人迷 惑的是 P53 同时具 有癌基 因和肿 瘤抑制 基因 的某些 特性： • 已 发现多 种突变 （点 突变、 缺失、 插 入等） 都能使 P53 转变成 致癌性 基因 。巧 3 的突 变体与 ras 癌基因 一起共 转染能 使正常 鼠成纤 维细胞 转型。 在癌细 胞里， P53 蛋 白半衰 期变长 （4 〜 8h)， 结果 是蛋白 浓度的 提高， 所 有这些 都表明 P53 是 一个癌 基因。 • 在 许多肿 瘤中也 观察到 17 号染 色体的 短臂上 有相同 缺失。 在脑癌 、郭 腺癌、 肺癌 和结肠 癌中， 凡 R53 基因 缺失， 另一 个等位 基因必 然也已 发生 突变， 这 表明巧 3 •也是 一个肿 瘤抑制 基因。 看 来较好 的解释 只能是 P53 W 二聚 体形式 作用。 当突 变了的 （失活 的） P53 蛋白存 在时， 它 与野生 型蛋白 结合形 成一个 失活的 二聚体 复合体 (图 S3. 3)。 这就是 所谓的 显性负 （dominant- negative) 效应。 然而 由于正 常 蛋白二 聚体的 形成， 由突 变基因 所引起 的正常 P53 基因 的失活 不可能 达到 100%, 而另一 个正常 P53 基因的 丢失就 相当于 完全逃 脱了该 基因的 肿 瘤抑制 作用。 S3 肿瘤抑 制基因 305 有 活性的 P53 蛋白 正常 水平的 25% 无 活巧的 P 的蛋白 图 S3. 3 突变 了的巧 3 基因的 显性失 活效应 取决于 突变蛋 白与正 常蛋白 形成二 聚体的 程度， 并使 正常蛋 白失活 (陆 韵译 刘进元 校） s 肿瘤 病毒与 癌基因 S4 调亡 要 点 在多细 胞生物 体中， 调亡 是一类 引起细 胞死亡 的重要 途径。 调仁 的 发生经 历一系 列特定 过程， 并 受保守 机制的 调控。 湘 t 的根本 作用 是在发 育过程 中去除 那些不 必要的 细胞。 细胞 的分裂 与網亡 间 的平衡 对于维 持细跑 数量的 稳定是 非常重 要的。 调亡在 清除损 伤细胞 或危险 性细胞 方面发 挥重要 作用， 例 如自身 免疫的 预防或 DNA 损伤的 应答。 在调 t 中， 细胞 核内的 染色质 浓缩、 DNA 断裂。 发生调 亡的细 胞脱 离周围 细胞， 皱缩并 且断裂 成淵亡 小体。 邻近 细胞识 别调亡 小体， 并 通过胞 吞的方 式清除 他们。 线虫 (Caenorhabditis elegans) 的 成虫由 959 个固 定数量 的细胞 构成， 是 从早期 形成的 1090 个 细胞， 经发 育过程 中刚好 131 个 细胞 调亡的 结果。 ced- 3 和06^^ -4 基因为细胞调亡所需， 通过 抑制 cec^-9基因的产物， 引 起大量 调亡。 哺乳 动物中 与线虫 cfd -9 基因相 似的是 -2 基因， 其 作用是 抑制 调亡。 bcl-2 的其 他类似 物在维 持细胞 存活和 死亡平 衡中， 或 者抑制 调亡， 或 者增强 调亡。 哺乳动 物中的 ced -3 基 因类似 物编码 一 ■种 称为 caspase 蛋 白酶， 在调亡 过程中 起重要 作用。 網 亡的失 调在疾 病和癌 症中很 关键。 一些 原癌基 因例如 -2 阻碍湘 t 发生， 反映 了在肿 瘤形成 中抑制 调亡的 作用。 c-mjyc 原 癌基 因具有 双重作 用既可 W 促进 细胞 增殖， 同时在 某些生 长信号 缺乏 时诱发 调亡。 癌症 化疗一 般使用 可引发 澗亡的 DNA 损伤药 物。 调亡 在疾病 和癌 症中的 作用 哺乳动 物中的 调 ifr 损伤或 危险性 细胞 的清除 词亡 过程中 细 胞变化 线虫中 的调古 作用 巧 关主题 细 胞周期 （E3) 诱变 （F1) DNA 损伤 （F2) DNA 修复 （F3) 限制酶 与电泳 （G3) 癌基因 的分类 （S2) 肿瘤抑 制基因 （S3) 调亡 调亡是 一种细 胞的正 常死亡 机制， 其过程 涉及一 整套程 序化的 生化和 形态的 变化。 在 多细胞 生物中 網亡是 一种频 繁而又 普遍的 过程， 并 在正常 组织的 形成、 维持 和成型 过程中 起重要 作用。 湘亡发 生在发 育过程 的几乎 S4 巧亡 307 损伤 或危险 性细 胞的清 除 谓 t： 过程中 的细 胞变化 线虫 中的调 亡作用 所 有组织 及许 多成体 组织。 例如網 t 在手指 间缝隙 的形成 过程中 起重要 作用， 否则人 手则会 成为网 状物。 在两 栖动物 变态过 程中， 稱科尾 己的丢 失也 是一种 網亡。 在许多 细胞类 型中， 调亡是 一种内 在自我 破坏的 途径。 当生长 信号缺 乏时该 途径会 被自动 引发， 而生 长信号 则是促 使细胞 存活。 这种 细胞分 裂与调 亡的平 衡对于 维持生 物体内 细胞数 量的稳 定是至 关重要 的。 所 W 在成体 中组织 体积的 保持不 仅通过 细胞的 增殖、 分化 和迁移 ，而 且在 很大程 度上通 过调亡 来控制 细胞的 消除。 網亡 不是细 胞死亡 的惟一 途径。 在 坏死过 程中， 细胞膜 失去完 整性， 细胞 裂解并 释放内 容物。 通常 不发生 完整生 物体内 容物的 择放。 因 此網亡 是生 理性细 胞死亡 的主要 途径， 也可称 之为程 序性细 胞死亡 （也被 认为是 细胞自 杀）。 網亡负 责清除 掉损伤 细胞或 危险性 细胞。 胸腺 中大于 90% 的 免疫细 胞都经 调亡而 除去。 该过 程对清 除自身 反应性 T 淋己 细胞十 分重要 ，否 则会使 免疫系 统攻击 宿主细 跑而引 起自身 免疫病 。当 T 细 胞杀死 其他细 胞时， 是通过 激活湘 亡途径 并诱导 细胞自 杀而实 现的。 许多 感染病 毒的细 胞 通过调 t 而限 制病 毒在机 体内的 传播。 由于 DNA 过度损 伤而导 致细胞 无法修 复时， 肿瘤 抑制子 P53 有双重 作用， 首先 抑制细 胞周期 （参见 E3) 然 后诱导 澗亡。 调亡 过程中 细胞核 皱缩、 染色体 浓缩。 在这个 过程发 生时， DNA 在 核 小体之 间被核 酸酶酶 解切成 碎片， 通过 DNA 的凝胶 电泳可 W 得到展 示， （图 S4.1a， 参见 G3) 调亡的 细跑脱 离周围 细胞， 变圆、 收缩、 片状 化 形成澗 亡小体 （图 S4.1b) 通 常在渦 亡小体 内有完 整的细 胞器和 原生质 膜。 邻 近细胞 快速吞 唆并破 坏網亡 小体。 目前 认为调 亡小体 细胞表 面的变 化在指 导胞吞 过程中 起重要 作用。 调亡 发生半 小时后 可见形 态学特 点的变 化。 对 于线虫 （C. elegans)， 每个雌 雄同体 的成虫 都是相 同的， 由 959 个细胞 构成。 线虫的 细胞谱 系是被 严格调 控的， 在幼虫 发育过 程中， 早期 形成 1090 个 细胞， 其中的 131 个细胞 通个调 t 而被 除去。 4 两 种基因 的产生 是发育 过程中 调亡发 生所必 需的。 如果其 中任何 一个基 因由于 突变而 没有被 激活， 那么这 131 个 细胞就 没有一 个会死 t。 另一个 ced-9 基 因所编 码的蛋 白则执 行相反 的功能 即抑制 澗亡。 突变造成 - 9 基因 失活会 引起细 胞过量 死亡， 甚至 在正常 发育过 程中不 该死亡 的细胞 也会 死亡。 因此 rec/ -9 为 那些在 正常情 况下不 死亡细 胞的存 活所需 ，并 抑制细 胞死亡 的整体 进程。 308 S 肿瘤 病毒与 癌基因 图 S4.1 调亡。 （a) 处 于调亡 细胞中 DNA 的特 征性梯 状带； （b) 显示網 亡小体 T- 细 胞的显 微图； （C) 调 亡过程 各阶段 的面图 哺乳 动物中 哺乳动 物的原 癌基因 -2 与 线虫的 调亡抑 制基因 cec/ -9 同源， 的调亡 -2 基 因是被 发现的 一类具 有新功 能的原 癌基因 （参见 S2) 中的 第一个 基因。 这一 家族的 成员主 要是抑 制细胞 调亡而 不是促 进细胞 增殖。 现在知 道 在哺乳 动物体 中存在 一套抑 制细胞 死亡的 基因， 其中的 一些是 -2 的同 源物。 包括 6cZ-2 类 似物的 另一组 蛋白如 Aaj 具有促 进细胞 死亡作 用。 BCL-2 和 BAX 蛋白 在细胞 内相互 结合， 因此细 胞内信 号转导 通路所 调节 的调亡 有可能 部分是 通过改 变其抑 制死亡 和促进 死亡蛋 白在细 胞内的 相对水 平来实 现的。 线虫^6^^-3、 杀 手基因 的哺乳 动物同 源物也 已被鉴 S4 巧亡 309 定。 ced -3 基因 编码的 多肤与 半脫氨 酸蛋白 酶家族 同源， 其中代 表性的 原型是 白介素 -1 转换酶 （ICE)。 这些 白介素 - 1 转换 酶也被 称之为 cas- pase 酶， 他们 主要执 行澗亡 作用。 由此 可见细 胞调亡 不仅是 最重要 的生命 过 程而且 在进化 上是保 守的。 ‘ 调亡 在疾病 细胞调 亡的失 控会导 致许多 疾病， 包 括神经 退行性 病变、 免疫 缺陷、 和癌 症中的 私脏 病发作 或中风 后的细 胞死亡 及病毒 或细菌 感染。 尤为 重要的 调亡的 作用 丧失 会引起 癌症。 癌症是 多细胞 生物体 的一种 疾病， 主要是 由于细 胞增殖 (参见 E3) 和细 胞死亡 之间的 平衡被 打破。 许多原 癌基因 （参见 S2) 调 节细胞 分裂， 但另一 些则调 节綱亡 (如 bd -2)， 反 映了平 衡在这 些过程 中的重 要性。 原 癌基因 c-W3^ (参见 S2) 具 有双重 作用， 既可 激 活细胞 分 裂又可 引发 调亡， 当生长 因子缺 乏或细 胞处于 DNA 损 伤时， c-W3^ 起调亡 作用。 因此 由于基 因突变 造成的 调亡途 径的丧 失或相 当低水 平的调 控结果 会导致 癌症。 另一方 面某些 基因如 -2 这样 抑制正 常的淵 t 途 径基因 的过度 表达也 会引起 癌症。 许多 癌症治 疗采用 DNA 损 伤药物 （原 则参见 F2)， 这些 药物可 杀死分 裂中的 细胞。 目前 己认识 到抗癌 药与其 说没 有持异 性作用 倒不如 说是通 过诱发 调亡而 杀死癌 细胞。 对这些 药物产 生抗药 性的主 要机制 之一在 于调亡 途径的 抑制。 在 癌症患 者中， 有 50% 是由于 肿瘤抑 制基因 P53 的突变 造成的 （参见 S3)。 其结果 P53 被称为 "基 因组 的守护 者"。 在对 DNA 损 伤的反 应中， P53 在引起 调亡过 程中起 中私 作用， 同时它 又启动 DNA 修 复过程 （参见 F3) 且抑制 细胞周 期行进 (参见 E3)。 当损 伤太大 无法修 复时， 诱 导调亡 不仅可 清除癌 细胞， 而且 可 抑制突 变细胞 在细胞 群内的 增殖， 否 则会因 细胞变 化而生 成更加 恶性的 肿瘤。 (冯 海 译 刘进元 化） ^4 I 扯 X I - - m 【 r 4 巧 S |^,*。巧*11 ^^^♦巧中其。 •巧 亂琴 义» 巧化巧 丰护 w 矣灼巧 化围惠 t， •苗 -^)巧女请，知攻«汾^^<^ 【^^巧众台络& 。(汪 W 爾舆巧 1，>如 巧虽肋 R ♦坐 巧巧 Ail 毋进 <号 ，身 I 汾巧巧 ，巧病 扣：：5»巧91^坟责. 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DNA 中 的一段 5'- AGTCTGACT-3' 序列 等同于 RNA 中的哪 一段？ A. 5'- AGUCUGACU-3' B. 5'-UGTCTGUTC-3' C. 5'- UCAGUCUGA-3' D. 5'-AGUCAGACU-3' 2. 下哪一 个是对 A-DNA 的正确 描述？ A. 是右 手反巧 平行双 螺旋， 每圈 10 个 碱基， 碱 基平面 与螺旋 轴垂直 B. 是 左手反 向平行 双螺旋 ，每圈 12 个碱基 ，由 交替的 曝吟- 喀巧序 列形成 C. 是 右手反 向平行 双螺旋 ，每圈 11 个碱基 ，碱基 的朝向 与螺旋 轴有关 D. 是球状 结构， 由单链 核酸中 形成的 短的分 子内螺 旋构成 3. 双链 DNA 的变 性涉及 。 A. 断裂为 短的双 链片段 B. 分开成 为单链 C. DNA 骨架 的分解 D. 碱基 从糖- 踞酸骨 架上分 裂下来 4. UjI 下哪一 个在％ Onm 波长下 具有最 大的单 位质量 吸收？ A. 双链 DNA ■ B. 单 核巧酸 C. RNA D. 蛋白质 5. I 型 DNA 拓朴 异构酶 。 A. 使连接 数改变 ±2 选择题 317 B. 需要 ATP C. 将 DNA 双 螺旋中 的一条 链打断 D. 是 抗生素 类药物 的祀向 D 原 核与真 核生物 的染色 体结构 1. W 下哪 一个是 大肠杆 菌和真 核生物 染色体 的共同 之处？ A. DNA 是 环状的 B. DNA 被 包装成 核小体 C. DNA 位 于核中 D. DNA 是负 超螺旋 2 . 由 166pb DNA、 组 蛋白八 聚体和 组蛋白 HI 组成 的复合 体叫做 A. 核小 体核必 B. 螺线管 C. 30nm 纤维 D. 核小体 3. 分裂 间期染 色体转 录发生 在什么 区域？ A. 端粒 B. 着丝粒 C. 常 染色质 D. 异 染色质 4. 下关于 CpG 岛 和甲基 化的陈 述哪一 个是错 误的？ A. CpG 岛对 DNase I 有部 分抗性 B. CpG 甲基化 是真核 生物对 CpG 突变为 TpG 的反应 C. CpG 岛 出现在 活性基 因启动 子附近 D. CpG 甲基 化伴随 着染色 质失活 5. W 下哪一 个是高 度重复 DNA? A. Alu 元件 B. 组蛋白 基因簇 C. DNA 微卫星 D. 散 在重复 DNA E DNA 复制 1. 一个典 型哺乳 动物细 胞中复 制子的 数目是 。 A. 40-200 B. 400 C. 1000-2000 D. 50 000-100 000 2. 原核 生物中 ，后随 链的引 物是被 清 除的。 A. 3' 至 5' 外切 核酸酶 318 选择题 B. DNA 连接酶 C. DNA 聚合酶 I D. DNA 聚 合酶田 3. 在 大肠杆 菌复制 起始点 处的基 本起始 蛋白是 。 A. DnaA B. DnaB C. DnaC D. DnaE 4. 如果 细胞在 3 点前缺 乏有丝 分裂剂 ，它 将进入 期。 A. Gi B. S C. G2 D. Go 5. W 下哪 一个陈 述是正 确的？ A. —旦细 胞越过 R 点， 细胞分 裂就不 可避免 B. Gi 细胞周 期蛋白 -CDK 复 合体对 RB 的 磯酸化 是进入 S 期的 关键 C. Gi 细胞周 期蛋白 -CDK 复 合体对 E2F 的碟 酸化 是进入 S 期的 关键 D. 细胞周 期蛋白 D1 和 INK4 P16 是 肿瘤抑 制蛋白 6. 在真核 生物中 ，常 染色质 优先在 复制。 A. S 期早期 B. S 期中期 C. S 期晚期 D. G2 期 7. 原核 生物的 质粒如 果含有 酵母的 就可 在酵母 细胞中 复制。 A. ORC B. CDK C. ARS D. RNA F DNA 损伤 、修复 与重组 1. 每惨入 一个核 巧酸， 大肠杆 菌的自 发突变 频率是 。 A. 1/106 B. 1/10® C. 1/109 D. 1/10 … 2. 咨自 由基对 DNA 的作 用产生 了大量 。 A. 喀巧 二聚体 B. 8 - 氧化鸟 曝口令 C. 06- 甲基 鸟曝吟 选择题 319 D. 7 - 轻甲基 鸟標吟 3. 在大 肠杆菌 的甲基 指向错 配修复 过程中 ，含 有错配 碱基的 子链被 _ A. MutH 内切 核酸酶 B. UvrABC 内切 核酸酶 C. AP 内切 核酸酶 D. 3' 至 5' 外切 核酸酶 4. 异常 重组又 被称为 。 A. 位 点特异 性重组 . B. 转座 C. 同 源重组 D. 转 移损伤 DNA 合成 5. 在患有 的个体 中缺乏 对紫外 线诱导 DNA 损伤 的切除 修复。 A. 遗传型 结肠癌 B. Crohn 氏症 C. 典型的 DNA 修复酶 缺乏病 D. DNA 修复酶 缺乏病 的变型 G 基 因操作 1. 细 茜培养 物中某 种质粒 的存在 通常用 来 确定。 A. 蓝 -白颜 色筛选 B. 在抗生 素存在 下生长 C. 一 种限制 酶降解 D. 琼 脂糖凝 胶电泳 2. 碱性 麟酸酶 。 A. 将双链 DNA 片段连 接起来 B. 在 DNA 的 5' 端加上 一个稱 酸基团 C. 切 断双链 DNA D. 从 DNA 的 5' 端去除 一个稱 酸基团 3. 转化是 。 A. 细茜 吸收一 个质粒 B. 细菌 表达一 个基因 C. 细菌吸 收一个 隨菌体 D. 从 细菌中 分离一 个质粒 4. T4 DNA 连接酶 。 A. 需要 ATP B. 将具 有相邻 3'- 稱酸和 5'- 轻基 的双链 DNA 片段连 接起来 C. 需要 NADH D. 将单链 DNA 连 接起来 5. 在琼脂 糖凝胶 电泳中 。 切开。 320 选择题 A. DNA 向负 极移动 B. 超螺旋 质粒泳 动得比 其带切 口的异 构体慢 C. 大 分子比 小分子 泳动快 D. 漠化乙 锭被用 来显色 DNA H 克 隆载体 1. 蓝- 白筛选 被用于 。 A. 检测细 菌中某 一质粒 的存在 B. 提 示一个 克隆化 DNA 片段 的性质 C. 表达一 个克隆 化基因 D. 检测 质粒中 某一插 入片段 的存在 2. 多克 隆位点 。 A. 含有许 多拷贝 的克隆 化基因 B. 使 得对克 隆所用 的限制 酶的选 择具有 灵活性 C. 使得 对克隆 所用的 生物种 类的选 择具有 灵活性 D. 含 有许多 拷贝的 同一种 限制酶 切位点 3. 入晦菌 体对大 肠杆茜 的感染 一般用 检测。 A. 细菌 对某种 抗生素 的抗性 B. 单菌落 在琼脂 平板上 的生长 C. 琼 脂平板 上产生 裂解细 菌区域 D. 细菌 DNA 的限制 性消化 4. 哪一 个载体 适用于 150kb DNA 片段的 克隆？ A. 质粒 B. ^载体 C. BAC D. YAC 5. 要在 植物中 表达一 个外源 基因， 你会选 用哪个 载体? A. 杆状病 毒载体 B. 反 转录病 毒载体 C. Yep 载体 D. T- DNA 载体 I 基 因文库 与筛选 1. W 下关于 基因组 文库陈 述哪两 个是错 误的？ A. 基 因组文 库是用 cDNA 制备的 B. 包 含某种 生物所 有基因 的基因 组文库 ，必定 是代表 性文库 C. 若 要含有 某种生 物的所 有基因 ，基 因组文 库就必 须含有 最少的 重组子 D. DNA 必须 先被切 成适合 于所用 的载体 的大小 E. 真 核生物 DNA 的 基因组 文库通 常用质 粒载体 选择题 321 2. W 下对 cDNA 克隆步 骤的描 述哪一 个是正 确的？ A. mRNA 的反 转录， 第二链 合成， cDNA 末端 修饰， 连接到 载体上 B. mRNA 制备， 用 反转录 酶合成 cDNA， 用末端 转移酶 合成第 二链， 连接到 载体上 C. 用 RNA 聚合 酶合成 mRNA， mRNA 的反 转录， 第二链 合成， 连接到 载体上 D. 双链 cDNA 合成 ，限制 酶消化 ，加 接头， 连接到 载体上 3. W 下哪 一种方 法对于 筛选文 库是无 效的？ . A. 用核酸 探针对 菌落和 （或） 嗤菌体 溶出的 DNA 进 行杂交 B. 用目 标蛋白 的抗体 筛选表 达文库 C. 从 具生物 活性的 表达文 库中筛 选克隆 D. 用 抗体作 探针对 菌落和 （或） 嗤菌体 溶出的 DNA 进 行杂交 J 克隆 DNA 的分析 与应用 1. 一 个线性 DNA 片段的 一端被 100% 标 记且有 3 个 EcoR I 位点。 如果该 片段被 EcoRl 部分 消化并 得到所 有可能 产生的 片段， 将 会多少 片段被 标记， 多 少片段 未被标 记？ A. 4 个标记 ,6 个未 被标记 B. 4 个标记 ， 4 个未 被标记 C. 3 个标记 ， 5 个未 被标记 D. 3 个标记 ， 3 个未 被标记 2. W 下哪一 种方法 对于标 记双链 DNA 是无 效的？ A. 用寡核 巧酸激 酶进行 5' 端标记 B. 用寡核 巧酸激 酶进行 3' 端标记 C. 用末 端转移 酶进行 3' 端标记 D. 用末 端转移 酶进行 5' 端标记 E. 切 口平移 3. 下关于 核酸测 序的陈 述哪一 个是正 确的？ A. Sanger DNA 的 测序法 包括曠 巧的碱 基特异 性切割 B. Maxam 和 Gi 化 ert 的 DNA 测序法 要用到 DNA 聚 合酶和 链终止 双脱氧 核巧酸 C. RNA 的酶 法测序 要用到 RNase A、Tl、PhyM 和 B . cereus RNase D. DNA 的 酶法测 序要用 到引物 ，该引 物是用 RNA 聚合酶 延伸的 E. RNA 的酶 法测序 要用到 RNase Tl、U2、PhyM 和 B . cereus RNase 4. 下关于 PCR 的陈 述哪一 个是错 误的？ A. PCR 循环 包括模 板变性 、引 物退火 和核巧 酸聚合 B. PCR 要用热 稳定的 DNA 聚合物 C. 理想的 PCR 引物要 长度和 G+C 含量 都相似 D. PCR 条 件的优 化通常 包括镑 离子浓 度的变 化和聚 合温度 的变化 E. 如果 PCR 的效 率达到 100% ， 那 么在几 个循环 之后目 标 分子将 被扩增 2" 倍 5. 下关 于基因 作图技 术的陈 述哪两 个是正 确的？ A. S1 核酸酶 作图法 确定的 是基因 中的非 转录区 322 选择题 B. 引 物延伸 法确定 的是转 录物的 3' 端 C. 凝胶阻 滞法可 显 示蛋白 是否能 与某一 DNA 片段结 合并阻 滞该片 段通过 琼脂糖 凝胶 的迁移 D. DNase I 足迹法 确定蛋 白结合 到某一 DNA 片段中 的哪一 个区域 E. 基因启 动子中 DNA 序列的 功能可 通 过将其 连接到 报道基 因下游 并分析 其表达 来确定 6. (下关 于 诱变技 术的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 外切 酶田将 DNA 的一 条链从 5' 凹端按 5' 到 3' 方 向切除 B. 外切 酶田将 DNA 的一 条链从 3' 凹端按 3' 到 5' 方 向切除 C. 在 PCR 中可 W 用诱变 引物来 引入碱 基变化 D. 可 用诱 变引物 、单链 模板和 DNA 聚 合酶来 引入碱 基变化 E. 可用 限制酶 产生缺 失突变 7. 下关于 基因克 隆的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 可 用基 因克隆 来大量 表达重 组蛋白 B. DNA 足迹法 被用于 检测与 DNA 结合 的蛋白 C. 被克 隆的基 因可被 用于检 测致病 基因的 携带者 D. 基 因治疗 是通过 将正确 的基因 导入病 人体内 W 纠 正原有 的错误 E. 遗传修 饰生物 已被用 来生产 临床上 有重要 用途的 蛋白质 K 原 核生物 的转录 1. W 下 关于转 录的陈 述哪两 个是正 确的？ A. RNA 合成按 3' 至 5' 方 向进行 B. RNA 聚 合酶按 5' 至 3' 方向沿 DNA 有义 链移动 C. RNA 聚 合酶按 5' 至 3' 方向沿 DNA 模板 链移动 D. 转录 所得的 RNA 与模板 链互补 E. RNA 聚合 酶将核 糖核昔 酸添加 到正在 生长的 RNA 链的 5' 端 F. RNA 聚 合酶将 脱氧核 糖核昔 酸添加 到正在 生长的 RNA 链的 5' 端 2. W 下 关于大 肠杆菌 RNA 聚合 酶的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 全 酶包括 0 因子 B. 核必 酶包括 0 因子 C. 需要 Mg2 + 才 有活性 D. 需要 Zn2+ 才 有活性 3. W 下哪个 陈述不 正确？ A. 大 肠杆茜 RNA 聚合酶 有两个 a 亚基 B. 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 有一个 P 亚基 C. 大 肠杆菌 有一个 0 因子 D. 大 肠杆茜 RNA 聚合酶 P 亚基 被利福 平抑制 E. 利迪链 菌素可 抑制转 录延伸 F. 发夹结 构是聚 阴离子 ，它 可与 P' 亚基 结合 选择题 323 4. W 下有 关大肠 杆菌转 录的陈 述哪一 个是正 确的？ A. - 10 序 列通常 正好位 于转录 起始位 点上游 lObp 处 B. 起始 核巧酸 通常是 G C. -35 和 -10 序列间 的间隔 序列是 保守的 D. 转 录起始 位点后 的序列 对于转 录效率 不重要 E. -35 和 -10 序列的 距离对 于转录 效率非 常重要 5. W 下有 关大肠 杆菌转 录的陈 述哪一 个是正 确的？ A. RNA 聚合 酶的核 私酶与 DNA 的 结合是 非特异 、不 稳定的 B. 0 因 子大大 提高了 聚合酶 对正确 启动子 位点的 亲和力 C. 几 乎所有 RNA 起始位 点都由 一个曝 吟残基 组成， 而且 A 比 G 出现频 率更高 D. 所有 启动子 都被负 超螺旋 所抑制 E. 终止子 通常是 A-U 发 夹结构 L 原巧生 物转录 的调控 1. W 下陈 述哪两 个是正 确的？ A. 含有 5'-GGATCGATCC-3'序列的双链DNA序列是一个回文结构 B. 含有 5'-GGATCCTAGG- 3' 序列 的双链 DNA 序列是 一个回 文结构 C. Lac 阻 抑蛋白 抑制聚 合酶与 Zac 启动子 的结合 D. Lac 操 纵子直 接被乳 糖诱导 E. Lac 阻 抑蛋白 与异乳 糖的结 合降低 了它与 Zac 启 动子的 亲和力 F. IPTG 是 Zac 启动子 的天然 诱导剂 2. W 下有关 分解代 谢调节 的操纵 子的陈 述哪一 个是错 误的？ A. cAMP 受 体蛋白 （CRP) 和分解 代谢激 活蛋白 （CAP) 是 同一蛋 白的不 同名称 B. 当 细胞中 存在葡 萄糖时 cAMP 水 平下降 C. CRP 结合到 cAMP 上导 致转录 被激活 D. 当 cAMP 缺乏时 CRP 结合到 DNA 上 E. CRP 能使 DNA 弯曲 ，导 致转录 被激活 3. W 下有 关色氨 酸操纵 子的陈 述哪一 个是正 确的？ A. 色 氨酸操 纵子的 RNA 产物 很稳定 B. Trp 阻抑 蛋白是 色氨酸 操纵子 的产物 C. Trp 阻抑 蛋白和 Lac 阻抑蛋 白一样 ，是 相同 亚基的 四聚体 D. Trp 阻 抑蛋白 与色氨 酸结合 E. 色氨 酸激活 色氨酸 操纵子 的表达 F. 色氨酸 操纵子 只被色 氨酸阻 抑蛋白 所调控 4. W 下 对于色 氨酸操 纵子的 弱化作 用的陈 述哪两 个是正 确的？ A. 弱化 作用是 rho 依 赖性的 B. 弱化 序列的 缺失会 导致色 氨酸启 动子转 录的基 本和激 活水平 的上升 C. 弱化子 位于色 氨酸操 纵序列 的上游 D. 弱化 作用不 需要转 录和翻 译的密 切结合 324 选择题 E. 当色 氨酸缺 乏时， 核糖体 在前导 肤上两 个色氨 酸密码 子之间 的暂停 导致弱 化作用 F. 当 色氨酸 缺乏时 ，一 种叫做 反终子 的发夹 结构阻 止了终 止发夹 的形成 ，导致 trpE 基 因的转 录通读 5. 下关于 C 因子 的陈 述哪两 个是错 误的？ A. 缺乏。 因子亚 基的大 肠杆菌 RNA 聚合 酶核心 酶不能 从启动 子处起 始转录 B. 不同的 。因 子识 别不同 系列的 启动子 C. 0 因 子识别 -10 和 -35 启动 子元件 D. 大肠 杆菌热 休克启 动子有 不同的 -35 和 - 10 序 列且与 17 种 不同的 热休克 0 因子 结合 E. B . subtilis 的抱 子形成 受多种 (J 因 子调节 F. T7 蹈菌体 表达它 自己的 0 因子， 而不是 编码它 自己的 RNA 聚合酶 M 真 核生物 的转录 1 . W 下 对于真 核生物 DNA 聚合酶 I、 n 和 m 的陈 述哪一 个是错 误的？ A. RNA 聚合 酶日对 a- 鹤膏 章碱非 常敏感 B. RNA 聚合酶 n 存在于 核质中 C. RNA 聚合酶 阻转录 tRNA 基因 D. 真 核细胞 含有除 RNA 聚合酶 I 、n 和 in 之外的 其他民 NA 聚合酶 E. 每一种 RNA 聚合 酶除含 有与大 肠杆菌 RNA 聚 合酶同 源的亚 基外， 还有每 一种聚 合 酶所特 有的其 他亚基 F. RNA 聚合酶 n 的 終基末 端含有 一段称 为綾基 末段区 (CTD) 的只有 7 个氨基 酸的短 序列 ，它 可能被 憐酸化 2. 下对于 RNA 聚合酶 I 基 因的陈 述哪两 个是正 确的？ A. RNA 聚合酶 I 为 核糖体 RNA 转录 该基因 B. 人细 胞含有 40 簇 5 个 拷贝的 tRNA 基因 C. 18S、5.8S 和 28S rRNA 是分开 转录的 D. RNA 聚合酶 I 的转录 发生在 核质中 E. RNA 聚合酶 I 的转录 发生在 胞质中 F. rRNA 基因簇 被称为 核仁组 织区域 3. W 下对于 RNA 聚合酶 I 转 录的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 在 RNA 聚合酶 I 启动 子中， 核必 元件是 上游调 控元件 (UCE) 下游的 1000 个碱基 B. 上游结 合因子 (UBF) 与 UCE 和 RNA 聚合酶 I 启动 子核心 元件的 上游部 分结合 C. 选择 性因子 SL1 使 UBF-DNA 复合 体稳定 D. SL1 包 含几个 亚基， 包括 TATA 结 合蛋白 TBP E. Acanthamoeba 的 rRNA 基因 启动子 中只有 一 •个调 控元件 4. W 下 对于民 NA 聚合 酶田基 因的陈 述哪两 个是正 确的？ A. tRNA 基因的 转录调 控区位 于转录 起始位 点上游 B. tRNA 基 因编码 区中的 高保守 序列也 是启动 子序列 C. TBP 是 TFinC 的亚 基之一 选择题 325 D. TF 田 B 自身就 是一个 序列特 异性转 录因子 E. 人 类基因 组内有 2000 个拷贝 的单基 因簇的 5S rRNA 基因 5. W 下陈 述哪一 个是正 确的？ A. RNA 聚合酶 n 只转 录编 码蛋白 的基因 B. TATA 框对转 录效率 有影响 ，但 对转 录起始 位点的 定位没 有影响 C. TBP 与 TATA 框结合 D. 增 强子通 常位于 转录起 始位点 的上游 100-200 碱基处 6. W 下对 于一般 转录因 子的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 了 F 口 D 结合 TATA 框 B. TFIID 是由 TBP 和 TAFn 组成的 多蛋白 复合体 C. TBP 是 RNA 聚合酶 I 、 n 和 田转录 中的共 同因子 D. TFDB 使 TFUD-DNA 复合 体稳定 E. RNA 聚 合酶结 合后， TFD E、TFn H 和 TFII J 与转 录复合 体结合 F. TFIIH 使 CTD 踞酸化 N 真核生 物转录 的调控 1. 下对于 转录因 子的陈 述哪两 个是正 确的？ A. 螺 旋-转 角-螺 旋结构 域是转 录激活 结构域 B. 转 录因子 的二聚 化发生 在碱性 结构域 C. 亮氨酸 拉链与 DNA 结合 D. 当来自 几 个转录 因子的 DNA 结合 区和激 活区誠 合在一 起时， 得到功 能性转 录因子 是 可能的 E. 转录因 子的同 一结构 域即可 作为阻 抑蛋白 也可作 为激活 结构域 2. W 下对于 转录调 控的陈 述哪两 个是错 误的？ A. SP1 含有两 个激活 结构域 B. 类固醇 激素通 过与细 胞表面 受体结 合来调 节转录 C. Statla 的踞酸 化导致 它从胞 质向核 内转移 D. HIVTat 调节 RNA 聚合酶 n 的憐 酸化和 持续合 成能力 E. MyoD 蛋白能 和许多 其他的 HLH 转录 因子形 成异源 二聚体 F. 同源 异型框 是一种 保守的 DNA 结合 结构域 0 RNA 加工 与核糖 核蛋白 复合体 1. W 下 几组术 语哪一 组能正 确是描 述大肠 杆菌大 (50S) 亚基 的几个 部分？ A. 杆状 、中 心突起 、凹谷 和裂隙 B. 上兰 分之一 、下兰 分之一 、凹谷 和杆状 C. 裂隙 、凹谷 、杆 状和 小突起 D. 杆状 、多 化出口 、凹 谷和中 私突起 2. 大肠杆 菌中哪 些酶参 与合成 成熟的 tRNA? A. RNase A、D、E 和 F 326 选择题 B. RNase D、E、F 和 H C. RNase D、E、F 和 P D. RNase A、D、H 和 P 3. 大多数 真核生 物前体 mRNA 是通 过其末 端的哪 一种修 饰而成 熟的？ A. 3' 端 加帽， 5' 端切割 并聚腺 巧酸化 B. 在 5' 端 加一个 GMt 3' 端切割 并聚腺 巧酸化 C. 在 5' 端加 一个鸟 曝吟， 然 后切割 并聚腺 昔酸化 [形成 3' 端 D. 在 5' 端 加一个 GMP， 聚腺巧 酸化， 然 后切割 形成 3' 端 4. 下对于 大多数 真核生 物前体 mRNA 的 剪接加 工的描 述哪一 个是正 确的？ A. 在两步 反应中 ，剪 接体将 外显子 W 套索 的形式 去除， 然 后将两 个内含 子连接 在一起 B. 剪接要 求有保 守序列 ，包括 5'- 剪接 位点， 3'- 剪接 位点、 分枝点 和聚曝 吟序列 C. U1 snRNP 最初与 5'- 剪 接位点 结合， U2 与分枝 点序列 结合， 然后 tri-snRNP、U4、 U5 和 U6 才可 UjI 结 合上去 D. 在剪接 的第一 步中， 内含子 3' 端的 G 与 分枝点 序列的 A 残基的 2'- 哲 基连接 起来， 形成一 个套索 P 遗传 密码与 tRNA 1. 下哪 一组是 对遗传 密码特 征正确 描述？ A. 兰联体 ，简 并性， 几乎是 通用的 ，无 逗点， 不重叠 B. 兰联体 ，通 用性， 无逗点 ，简 并性， 不重叠 C. 重叠 ，兰 联体， 无逗点 ，简 并性， 几乎是 通用的 D. 重叠 ，无 逗点， 不简并 ，几 乎是通 用的， 兰联体 2. W 下对 tRNA 的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 大多数 tRNA 长约 76 个残基 ，其 74、75、76 位点 分别为 CCA B. 许多 tRNA 含有修 饰的核 昔酸如 假尿巧 、二 氯尿巧 、胸腺 嚼巧核 糖核巧 和肌巧 C. tRNA 有着 相同的 L 形的兰 组结构 ，其 一端有 兰个能 与信使 RNA 分 子上的 反密码 子进 行碱基 配对的 核巧酸 D. tRNA 有着 相同的 兰叶草 状二级 结构， 包括 D 环、 T 环和反 密码子 环兰个 单链环 3. [下哪 兰个陈 述是正 确的？ 氨醜 tRNA 合成 酶反应 。 A. 将 AMP 连接到 tRNA 的 3' 端 B. 是两 步反应 C. 将 任何的 氨基酸 连接到 A76 残基 核糖的 2'- 餐基 D. 是高 度特异 性的， 因为 合成酶 使用与 tRNA 中相 同的元 件来区 分它们 E. 将 AMP 连 接到氨 基酸上 W 产生 中间体 F. 在第二 步棒放 焦縣酸 Q 蛋白 质合成 1 . W 下 关于密 码子- 反 密码子 相互作 用的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 它是 反向平 行的， 能包容 非标准 碱基对 选择题 327 B. 5' 反密 码子位 置的肌 巧能与 3' 密码子 位置的 A、C 或 U 配对 C. 3' 反密 码子位 置的肌 巧能与 5' 密码子 位置的 A、C 或 U 配对 D. 5' 反密 码子位 置不可 能出现 A， 因为 它被反 密码子 脱氨酶 所修饰 2. W 下关于 大肠杆 茵蛋白 合成起 始的陈 述哪一 个是正 确的？ A. 起始 tRNA 结合到 訊 ine-Dalgarno 序列上 B. 有兰个 起始因 子参与 ，且 IF2 与 GTP 结合 C. 含有 IF1、IF2、IF3、 起始 tRNA 和 mRNA 的中间 体称为 30S 起始 复合体 D. 50S 亚基的 结合使 IF1、IF2、GMP 和 焦稱酸 被释放 E. 当 70S 起始复 合体形 成时起 始过程 完成， 该复合 体中核 糖体的 A 位点 是起始 tRNA 而 P 位点 是空的 3. 下 关于原 核生物 蛋白合 成的延 伸的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 延 伸可分 为兰步 :肤醜 tRNA 的传递 、肤 键形成 和转位 B. 大核糖 体亚基 的肤醜 tRNA 中必 负责肤 键形成 C. 在 EF-Fu-Ts 交换循 环中， EF-Fu-GTP 可通过 EF-Ts 替换 GDP 而再生 D. EF-G 又叫转 位酶， 它需要 GTP 4. 大肠 杆菌释 放因子 l(RFl) 识别 W 下 哪个密 码子？ A. 只识别 UAA B. 只识别 UAG C. 只识别 UGA D. UGA 和 UAA E. UAG 和 UAA F. UAG 和 UGA 5. 下 关于真 核生物 蛋白合 成的起 始的陈 述哪两 个是正 确的？ A. 真核 生物用 mRNA 扫描 法来定 位正确 的起始 密码子 B. 至少有 9 种真核 生物起 始因子 (elFs) C. 真核起 始使用 N- 甲斬甲 硫氨酸 D. 80S 起始 复合体 完成起 始过程 ，其 A 位点含 有与起 始密码 子配对 的起始 tRNA E. 在巧描 过程中 ATP 被 水解成 AMP 和 焦縣酸 F. 当 mRNA 与小亚 基结合 ，后， 起始 tRNA 再结合 6. W 下 哪一对 蛋白合 成因子 在原核 和真核 生物中 的作用 是不对 应的？ A. EF-G; eEF2 B. EF-Tu; eEFla C. RFl 和 RF3; eRF D. EF-Ts; eEFotg 7. 下 关于翻 译后事 件的陈 述哪一 个是错 误的？ A. —些 mRNA 编码 多蛋白 B. 蛋 白祀向 与新生 化链的 信号序 列有关 C. 信号 化酶从 一些蛋 白的氨 基末端 去除一 至两个 氨基酸 D. 蛋白能 被乙醜 、磯 酸化和 糖基化 等作用 所修饰 328 选择题 R 懂 菌体与 真核生 物病毒 1. W 下 关于病 毒的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 病毒只 能在宿 主细胞 内复制 B. — 些病毒 的被膜 中含有 宿主细 胞蛋白 C. 病毒基 因组可 W 是双链 或单链 DNA 或 RNA D. 复制 缺陷型 病毒可 W 通过互 补作用 来复制 E. 所有的 病毒都 依赖于 宿主细 胞的复 制和转 录机制 F. 有些 病毒利 用病症 来辅助 它们在 宿主间 的传播 2. W 下关于 M13 唆菌 体的陈 述哪一 个是正 确的？ A. M13 唆菌体 有双链 DNA 基因组 B. M13 嗤菌 体通过 与性伞 毛结合 而进入 大肠杆 菌宿主 细胞内 C. 多 拷贝的 复制型 (RF)M13 是由 正常的 RNA 引发 的双链 DNA 复制而 产生的 D. 不同的 M13 晦菌体 颗粒中 DNA 的 数量差 别很大 3. (下关 于 唆菌 体的陈 述哪兰 个是正 确的？ A. 嗤菌 体具 有双链 DNA 基因组 B. X 唆菌 体与大 肠杆菌 外膜上 的受体 结合， 将病毒 DNA 注入 细胞内 C. 裂 解型生 命周期 需要将 X 唆菌 体基因 组整合 到宿主 细胞基 因组中 D. N 和 CTO 基因的 终止是 依赖于 rho 的 E. 阻抑蛋 白是抑 制裂解 作用的 F. 宿 主细胞 的应激 有利于 启动裂 解周期 4. 下关于 DNA 病 毒的陈 述哪一 个是错 误的？ A. DNA 病 毒和宿 主细胞 的启动 子之间 经常有 着序列 同源性 B. SV40 基 因组有 重叠的 可读框 C. SV40 大 T- 抗原 调节病 毒和宿 主细胞 的转录 和复制 D. DNA 病毒 调节宿 主细胞 复制的 能力可 能会导 致宿主 细胞产 生肿瘤 E. SV40 的 VPUVP2 和 VP3 蛋白 对于该 病毒的 致瘤特 性是很 重要的 5. 下对于 泡疹病 毒的陈 述哪一 个是正 确的？ A. 疮疹 病毒与 致瘤作 用无关 B. 泡 疹病毒 基因组 只有一 条链上 有基因 C. HSV-1 编码它 自身的 DNA 聚合酶 D. HSV-1 有 一个复 制原点 E. 泡疹 病毒的 潜伏型 感染需 要病毒 基因组 的染色 体整合 F. 所有的 疮疹病 毒基因 对于病 毒的复 制都是 必需的 6. 下 对于反 转录病 毒的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 依赖 RNA 的聚合 酶的精 确性没 有依赖 DNA 聚 合酶高 B. 像反 转录病 毒一样 ，酵母 Ty 转座 子编码 一种逆 转录酶 C. 反转 录病毒 有单链 RNA 基因组 D. HIV 的 Rev 蛋白调 节病毒 的转录 选择题 329 S 肿瘤 病毒与 癌基因 1. 下 哪一种 陈述不 支持癌 症是一 种遗传 疾病的 观点？ A. 有些 癌症是 遗传的 B. 有的 癌细胞 有异常 染色体 C. 癌 症是由 致癌剂 引起的 D. 许 多致癌 剂能引 起突变 2. W 下关于 NIH-3T3 细胞转 染法分 离癌基 因的陈 述哪两 个是错 误的？ A. 它 比体内 分析法 更简单 B. 它比体 内分析 法更快 C. NIH- 3TS 细胞是 正常的 ，但 很容易 被转化 进肿瘤 细胞内 D. NIH-3T3 细胞 适于吸 收和表 达外源 DNA E. NIH- 3T3 细胞 是可 W 检 测细胞 型特异 性的癌 基因的 干细胞 3. W 下哪个 蛋白群 不含有 癌基因 产物？ A. 转 录因子 B. 细胞表 面受体 C. 蛋 白激酶 D. 脂酶 E. 多 肤激素 4. W 下关于 抑癌基 因的陈 述哪一 个是错 误的？ A. 抑癌基 因是性 遗传的 B. 抑癌基 因比癌 基因少 C. 成视 网膜瘤 基因是 肿瘤抑 制基因 D. 肿 瘤抑制 基因通 过突变 消除其 正常的 活性可 W 成为 癌基因 E. 肿 瘤抑制 基因与 某些家 族性癌 症有关 5. W 下哪兰 个能在 理论上 增强癌 细胞的 形成或 存活？ A. 使 - 2 基 因家族 成员之 一失活 B. 使 Aaj 基 因家族 成员之 一失活 C. 过量 表达巧 3 基因 D. 增加 细胞内 BCL-2 蛋白与 BAX 蛋白 的比例 E. 去除 P53 蛋白 F. 去除生 长因子 6. W 下哪 两个陈 述是正 确的？ A. 调亡是 多细胞 生物中 细胞死 亡的惟 一机制 B. 在所 有的发 育期， 细 胞澗亡 的速率 必须与 细胞分 裂的速 率相同 C. 调亡 是许多 细胞在 缺乏生 长信号 时默认 的途径 D. 调亡 需要对 细胞原 生质膜 完整性 的破坏 E. 淵亡 包括核 DNA 降解 巧 《 禾应单 ^ 巧請藻 鮮嵌种 去棘魚 巧支不 t 菊軒一 > 不 Am •、 一 海^巧 •/? 哪 A .‘'•—？々 W 刊化 A 靡 存 ..A I ，矿 巧4^^矣、一-‘ W 这巧 說巧® 的巧 >8 <. A& • k 巧沒 lew 蘇巧由 & 益 R 化 ftfeii 相 w’«r.- y*- • • , *， 义巧巧 巧维巧 斯度 ♦巧 .a' t E ,*n4*«jN|rtir 迫命巧 巧也為 巧學㈱ 事传 癖巧詩 WBUTg-HlW. 干美 TW .s fr 〜― 多 於铃補 单巧 5 巧 巧化巧 與为习 '. A t / r 娜 • 。 9 绒巧 ？ 汾 5 巧巧 化巧媒 .a . * : V 旬 igK* 巧々 客巧 @ •拍常 五缉苗 I 巧 arC'^Hiw ：) * • '•- ，夺: > ―一 '；^巧* 需 iMi 熙 ^邱娜 齊胡说 打€ •扣 M .a 今 h ， •-)j^i饼巧斗议城^巧雌鮮膊賴取si,卿々^|f^^|於W辦 .立 奴魁瓷 W# 素巧 爸不巧 白巧千 >了口 .C 怎 嗚的？ .，， — 示因振 W .A * I <'^>巧> 典议 .8 巧 ‘、； 支 试结合 ，待 病毒 y 、乂活、11||^巧4>巧肖餐 .3, …一 心4«一 A — •一 ^ 〜— •一" — 么 itiai 片 严 •% 吃 •‘.， 。始 。巧 心一油 ;• > r®iiKl»v»【..々 ， 6 植 A 知 ; : — C， 9 巧 •肩 *!护 基巧巧 & 舍巧巧 主巧* f 麵投 茫兩， 《巧 .幻 D. 〜抑 - 4? f ,1»的 •々• e*«i| 丢 .3 fc， iw 難 作 n 致 > 签巧 的巧 基巧巧 干关了 w. 户 F •♦垄 巧 ♦♦卢 i 周 W ，‘ :: 為巧化 -巧虽 巧學斯 » .A t • 4. u •寺 《Nm 的？ 因基 » 出扭 巧巧巧 .a A r^A0wmrmmp\ 进化 •禾之 括拴 * 々势 美分 巧东兮 * ; 媒 mw 巧 a •、：> n *种0 4 赵巧 4 朽 进巧巧 巧玉其 W 巧巧 巧巧 ft 狂基 巧巧 »w 店 C： SV,d * \ tr ** 巧 '^♦’1. 1<亨巧巧魚雌鲁«?#«巧某择巧募»棘》報 .3 D, ^、病,||节 . ？*參血争乐專許々聲4^巧《*»^^為考為角1个立,不畔.3 E. SV1^1：; ># 於、 瞻禽 A 巧 巧 C 巧满金 .3 ■ . D.HSVM 言 * V «pi 子困并 全铺去 .3，^ . 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DNA 引发酶 76 DNA 指纹法 64,175-176 E2F 81-82 erbB 基因 298 FIGE 129 /os 基因 300,303 F 因子 283 GTP M 299 G 蛋白 299 H-NS 蛋白 50 HU 蛋白 50 ICE 蛋白酶 309 Klenow 聚合酶 140,144,145,158 LINES 63 myc 基因 301 , 303 NIH-3T3 细胞 Northern 印迹 154—155 PFGE 128 Pribnow 框 185 RBS 67 RB 蛋白 82 RecA 蛋白 90,97 Rev 蛋白 294 RFLP 64 Rho 蛋白 181,191,198 RNA 编辑 67,250 RNA 病毒 HIV 66 反转 录病毒 292 脊 髓灰质 炎病毒 280 RNA 复制 67 RNA 加工 234 RNA 聚合酶 67 T3 蹈菌体 182 T7 嗤菌体 182 a 亚基 183 P' 亚基 183,206 P 亚基 183,206 0 因子 182,187,201-203 大 肠杆菌 179,182-183,187,201-203 核屯 、酶 183,187 全酶 182,188 RNA 聚合酶 I 206.207-210,234 启动子 208 RNA 聚合酶 n 67,206,218 CTD 206,220,230 基础转 录因子 218-220 启动子 215,289 增强子 216 RNA 聚 合酶中 206,211-214 启动子 214 终止 214 RNA 酶 A 104, 106 RNA 酶 H 104 RNA 酶保护 2% RNA 转 录图谱 168 rRNA 233-238 16S 234 18S 235 23S 234 28S 235 5S 234 5S 启动子 214 5S 转录 206,213 5.8S 235 反转录 PCR 164 基因 207 加工 234-236 甲基化 235 转 录单元 189 转 录起始 189 336 索 引 自 我剪接 241 S- 腺巧甲 硫氨酸 234 S1 核酸酶 104, 145, 171 SD 序列 262 SINES 63 SNP 64 Southern 杂交 154 SP1 216,228 SP01 202 SRP 受体 276 SSCP 65 SSLP 64 ST AT 蛋白 229 T4DNA 连接酶 104,141,145 T7 DNA 聚合酶 158 TAFi 210 TAFu 219 Tat 蛋白 230,285,294 TATA 框 215,289 TBP 210,212,215,219 TIF- 1 210 tRNA 加工 原核的 240 真核的 239-240 Ty 反转录 转座子 100,292 U6 小核 RNA 214 Wilms 瘤基因 226 X- 半乳糖 120,168 X 射 线衍射 236 X 衍射 晶体学 蛋白质 29 核小体 52 Zoo 印迹 155 a- 淀粉 酶基因 249 a- 巧 宵學碱 206 p- 半乳 糖巧酶 120,145,194 p- 内 蘭胺酶 105 入 隨菌体 ，见 蹈菌体 283-286 。因子 182.187,201-203 癌 281, 288, 293, 295, 302. 309 癌基因 2%~305 核的 300 种类 299 艾滋 病病韋 159.294 氯节 青巧素 105,120-121 氯基酸 15-17 氨 基化酶 277 氨醜基 -tRNA 252,258 转移至 核糖体 270 氨骄基 -tRNA 合成酶 258 氨骄基 腺巧酸 258 摆动 261-262 抱 子形成 202 报 道基因 168-169 闭环 DNA 45,49-50 鞭毛 2，11 变性 ，失活 161 DNA 变性 39-40.44,154,161 RNA 变性 40, 44 蛋白 质变性 21 遍 在蛋白 277 表 达筛选 147 表 达文库 147 病毒 包被 280 出芽 280 毒力 281 反受体 280 感染 281,289 核衣壳 279 基 质蛋白 280 疮 疹病毒 281 受体 280 衣壳 279 增强子 300 病毒 基因组 280 病 專类型 单纯泡 疹病毒 -1 288-290 反转 录病奉 281 非 洲淋己 瘤病毒 288 感冒 281 互扑 281,294 狂犬病 281 禽 类白血 病病毒 293 乳多 空病毒 281 水痘- 带状疮 疹病毒 288 乙肝 281 猿 猴病毒 40 281 病毒体 279 部 分酶解 140,152 操纵基 因序列 193 操纵子 67,193 捆序 Maxam 和 Gilbert 156 Sanger 法 158 核 搪核酸 158 化学法 158 度法 158 脱氧核 搪核酸 157-158 循环 165 自动的 159 缠绕 46 巧 染色质 58,84 超巧巧 DNA 沉 降系数 5,12 成 视网膜 细胞瘤 303 成纤 维细胞 230,296 程 序性细 胞死亡 307 持 家基因 59,228 重 叠基因 254 重复 DNA, 分散 重复的 1 邮 重组 ，见 DNA 重组 宝组 DNA 101 重 组蛋白 27,122,174 重组 动力学 62 化角足 222,225,231,243 串联 基因巧 63 催化性 RNA 241 单 核巧酸 多态性 (SNP) 64 单 链构象 《态性 (SSCP) 65 单 顾反子 mRNA 67 单序 列长度 多态性 (SSLP) 64 蛋 白刑巧 27-28 蛋 白纯化 26-27,122,174 蛋 白分泌 276 蛋 白合成 66 30S 起始 复合体 266 70S 起始 复合体 266 80S 起始 复合体 273 核搪体 67 30S 亚基 236 50S 亚基 236 A 和 P 位点 266 RNA 组分 11 蛋白 质组分 11 结 构特点 237 化 键形成 266 原核的 12,237 真核的 12,237 核 搪体结 合位点 (RBS) 机制 265-270 起始 266,272 起 始因子 266-272 扫描 271 释 放因子 270 延伸 266 延 伸因子 266 移码 293 真 核起始 272 真 核因子 272 终止 270 蛋 白聚塘 9 蛋白酶 复合体 278 蛋白 巧 体 278 蛋白 巧消化 140 蛋白质 C 端 19 N 端 19 X- 衍射 晶体学 29 a -燥旋 20 p -折叠 20 超二 级结构 23 等 电点％ 二 级结构 20 非共 价作用 13,21,22 共巧的 20 核磁 共振谱 29 基序 22 家族 22 结构域 13 氨键 13,20,21 球形的 19 兰股螺 、旋 20 兰 级结构 20 疏水力 14,20,21 四 级结构 21 巧 基末端 19 化键 19 纤 维状的 19 一 级结构 19 质 量测定 28 质谱 分析法 28 蛋白 巧组学 30 等密 度离心 6,41,71,106 338 索 引 第 二信使 299 电穿孔 134 电极 13,39 电泳 CHEF 129 FIGE 129 PFGE 128 聚 丙巧醜 胺凝胶 28 琼脂 糖凝胶 103,110-112,117-118 双 向电泳 30 淀粉 7 调 控基因 193 定 位克隆 148 端粒 57,58 端粒酶 9,58 多蛋白 、聚 蛋白 276 《核巧 酸激酶 104.152 多核 巧酸巧 酸化酶 252 多 核巧体 263 多聚 A 尾己 67,143,244 多聚喀 巧序列 245 多克 隆位点 (MCS) 121 多联体 289 多 顺反子 mRNA 67,194,275 多搪 7 黏多糖 8 糖基化 5 恶 性肿瘤 295 二 氨尿唾 巧核巧 256 发 夹结构 181,198 翻 译调控 275-276 翻译 后修饰 15 翻 译体系 ，无 细胞的 143 巧 译移位 293 反 密码子 252,256 反 密码子 脱务巧 261 反 向重复 194 反义 RNA 276 反义链 154,178 反 终止子 200 反转录 DNA 103, 139, 142-145 反转 录病毒 66,100,292 gag 基因 293 HIV 66 反转录 巧 67,281,292 禽 类扫血 病病毒 293 突变率 2%, 294 移码 293 原病毒 292 整合酶 292 env 基因 292 如/ 基因 292 反转 录酶- PCR 164 反 转录酪 67,104,143,281,292 反转录 转座子 100,292 范 德华力 13,21 放射 自显影 147 非 洲淋己 瘤病毒 214,288 分化 2,3,230 分支 点序列 245 分 子伴侣 12,21 酪 -氯仿 106,140,152 辅基 19,21 复制体 77 复制型 126,283 干扰素 174,229 甘 油胆液 117 肝素 183 高尔基 复合体 3,5 功能基 因组学 160 共 有序列 185 共 阻抑物 198 古细菌 2 寡聚 dG 145 寡聚 dT 143 寡聚 核巧酸 146 接头 145 引物 154,158,161,167,172 果蜗 3,159,231 P 元件 转座酶 250 合成兰 核巧酸 252 核 3,4 核孔 3,4 核腹 3,4 核 癌基因 300 核蛋白 9,12 核定 位信号 (NLS) 276 核巧 32 核巧酸 32 加成 234,277 去除 234,240 修饰 234,240 anti -构象 36 巧《 - 构象 36 核基质 54,57,84 核 巧 9,236,241 核内 不均一 RNA, 见 hnRNA 核内 不均一 RNA 243 核 内不均 一RNP 243 核仁 3,4 核酸 3' 端 32 5' 端 32 变性 40,43 除 语吟的 39 定量 43 核巧 32 核巧酸 32 减色性 43 巧基 32 巧 基互变 异构体 39 巧效应 39 均 匀标记 152 链特异 性标记 153 末 端标记 152 酸效应 39 探针 146 糖-巧 酸主链 32 退火 44 稳定性 38 杂交 44 紫 外吸收 42 最大吸 收波长 43 核酸酶 52,239 DNA 巧 I 58, 154,168 RNA 巧中 234 RNA 巧 A 104,106 RNA H D 239 RNA 巧 E 239 RNA SI F 239 RNA 酪 H 104 RNA H M16 234 RNA 酶 M23 234 RNA 酶 M5 234 RNA 巧 P 239 RNA 度 Phy M 158 RNA SS T1 158 RNA H U2 158 SI 104, 167 单链的 145 枯 草杆菌 核酸酶 158 绿豆 核酸酶 104,145,171 内切 核酸酶 52.239 外切 核酸酶 52, 77, 88, 239, 243, 276 外切 核酸酶 m 104,170 微球菌 核酸酶 52 限制酶 108 核酸酶 S1 167 核搪 32 核糖 核蛋白 （RNP) 58,234,240 电子显 微镜术 2% 交联 236 抗体 2；?6 脱离 ，释放 236 再装配 Z36 核搪 核蛋白 核 糖核酸 测序 158 成熟 234 发 夹结构 188,199 反义链 154 、 复制 67 合成 179-181 碱基 32 碱水解 40 结构 31-37 结 合试验 236 茎- 环结构 230 链起始 188 链终止 188 氯键 34 酸效应 39 稳定性 38-39 修饰 37 延伸 188 有义链 154 紫 外吸收 42 核搪体 67 核搪体 DNA 63 核塘 体蛋白 2% 核 搪体结 合位点 67,122,262,276 核 搪体受 体蛋白 276 核小体 12, 52, 58, 59, 84 核衣壳 279 340 索 引 核移植 175 互 补作用 281,294 环腺 巧酸受 体蛋白 185,195-196,198 回 文结构 194,198 肌 动蛋白 2,11,22 肌 巧蛋白 TmRNA 250 肌巧 256,261 肌 球蛋白 12,22 肌 球蛋白 D 82,224,230 肌球蛋 白基因 249 基 因表达 67 基 因剔除 175 基 因文库 103,139-149 大小 140 代表的 139 反转录 DNA 103,139 基 因组的 103,139 筛选 146-149 基 因治疗 102,177 基因组 病毒 281 大 肠杆苗 2,49,62,159 果巧 159 甲 持巧苗 2 酿 酒酵母 159 人 159 细菌 支原体 2 线虫 159 真核的 62 基因 组測序 159 基因 组文库 103,139 基 因组学 159 DNA 微阵列 160 DNA 芯片 160 功能基 因组学 160 脊 巧灰质 炎病毒 279 甲基化 37, 58, 92, 95,108,1%, 246, 277 甲基 甲巧酸 89,93 甲酸 156 甲巧胺 40,155 甲 状腺激 豪受体 226,229,301 假尿巧 256 兼 性离子 15 减 数分巧 97 巧接 6^245 snRNP 68 变化的 248-249 内含子 68 外显子 68 自身 241 剪接体 . 246 巧 基互变 异构体 88 巧性 巧酸巧 104,113,115.124.145.154 鉴 别元件 258 胶原 20,22,277 角蛋白 12,22 酵 母人工 染色体 131 Z-DNA 35,36,37 插入 159 载体 141 结 构基因 193 经过遗 传改造 的生物 (GMO) 175 茎- 环结构 181,188,199 耕 156 聚合 巧 链反应 (PCR) 不 对称的 165 定量的 165 多聚体 164 反向 PCR 164 反转录 (RT-PCR) 164 简并 寡核巧 酸引物 (DOP) 164 快 速扩示 cDNA 末端 (RACE) 164 酶 164 读离 子浓度 164 模板 162 嵌套的 164 退 火温度 162,164 引物 162,172 优化 164 诱变 165, 172 周期 162 聚腺巧 酸合成 巧 244 聚腺 巧酸化 143,236 可 变加工 248 聚 乙二醇 152 卷曲巧 旋结构 224 菌落 147 菌落刺 激因子 l(CSF-l) 298 苗 落杂交 147 菌 毛伞毛 2,283 抗体 22, 147 多样性 98 抗原 决定基 147 可读框 151,254 可读框 254 克隆 ，见 DNA 克隆 克隆化 ，见 DNA 克隆化 克 隆载体 102,141 质粒 134"^ 135 M13 102, 126-127 pBR322 119-120 Ti 质粒 102,134-135 Xgtll 145,147 又载体 102,123-126 又置 换质粒 124 表 达载体 122,287 病毒的 136 哺乳 动物的 287 穿 梭载体 134 反转 录病毒 102,136 杆 状病毒 102,136 巧 母人工 染色体 （YAC) 102,131-132 醇母游 离质粒 (YEp) 102, 134 黏粒 102,129-130 嗤菌体 102,123-127 细 茜人工 染色体 (BAC) 102,132,159 巧 猴病毒 40 102,136 杂 合质粒 M13 127 质粒 102,105,119-122 巧 草杆菌 202 类固 巧激素 228 受体 228 效 应元件 229 终止 密码子 67,252,270 类 组蛋白 50 离 'L、 差 速离心 5 等密 度离心 6,41,71,106 速度 区带离 屯、 6 利迪 链菌素 182,183 利福平 183 利什曼 原虫属 250 连接数 45 亮氯 酸拉链 224 裂 解性生 命周期 123,284 巧巧 二酷键 33 巧巧化 277 硫酸 二甲醋 156 绿豆 核酸酶 104,145,171 氯化绝 41,71,106 巧 旋-环 -圾旋 结构域 224,231 燥旋 -转角 -操旋 结构域 222 — 223,231 麦芽 提取物 143 慢 病奉属 293 密度梯 度离心 6,41,71,106 密码子 -反密 码子相 互作用 261 密码子 252,256 同义的 253 喀巧 32,253,256 免疫 球蛋白 250,300 模板链 179 膜 核膜 4 膜蛋白 13 膜结构 13 内 质网膜 5 原 生质膜 1~3 末 端标记 152 末端 转移酶 104, 145, 154 内部转 录间隙 (ITS) 235 内含子 62,68,240,245 内质网 3,5,276 尼龙膀 147,154 拟核 ，类核 1,49 結蛋白 9 黏 粒载体 102,129-131,140,141 黏 性位点 (末 端） 124,284 鸟標吟 32 尿喀瞎 32 尿素 40 凝 胶阻滞 (凝胶 迂移） 168 扭曲 （W,) 46 呢巧 156 疮 疹病毒 281 HSV- 1 病毒 288-290 曝岭 32,253,256 启动子 67 -10 序列 185,188,201-202 — 35 序列 185,188,201-202 RNA 聚合薛 I 208 RNA 聚合酶 n 215 RNA 聚合酶 m 211 大 肠杆茜 179,182-186,188,202 热休克 202 342 索 引 起始 tRNA 263,266,272 起始 密码子 67,266 起 始元件 216,220 前 mRNA 67 潜伏期 289 嵌入剂 47,89 笞 基巧灰 石层析 62 切 口平移 154 禽 类白血 病病毒 293 氯键 13,17,22 琼脂搪 110-112 染 色单体 57 染色体 DNA 环 49-50,57 DNA 结构域 49-50,54,57 超螺旋 49,52-53 大 肠杆菌 49 动粒 57 端粒 57,58,131 纺捶体 57 分 裂间期 58 核基质 54,57,84 晴形 295 微管 57 细 菌人工 染色体 (BAC) 132,159 性 染色体 X 58 有丝 分裂的 57 原核的 49-50 真核的 54,56-60 支架 57 着丝粒 57,131 染色 体步移 148-149 染色 体跳査 149 染 色小体 53 染色质 12,51-55 30 纳 米纤维 54, 57, 58, 59 CpG 甲基化 58-59,141 DNA 酶 I 敏感性 58 常 染色质 58,84 商度有 序结构 54 巧基质 54,57,84 核小体 52-53 巧线管 54 染 色小体 53 衔接 DNA 53 异 染色质 58,84 组蛋白 12,52-54,60,277 热休克 蛋白质 198 基因 168 启动子 185 Helicobacter pylori 159 人 免疫缺 陷病毒 66,292 . Rev 蛋白 294 TAR 序列 230 Tat 蛋白 230,285,294 基 因表达 230 人生 长激素 102 溶 原性生 命周期 123,124,284 乳多 空病毒 287 乳糖 194 乳搪 诱导物 195 弱 化作用 198-200 扫 描假说 272 色氨酸 操纵子 198 前导 RNA 199 前导化 199 弱化子 198 阻抑物 198 上游 179 上游调 节元件 （URE) 216,222 上游结 合因子 (UBF) 208 上游控 制元件 (UCE) 208 生 长因子 298,299 生物 信息学 159 十 二烧基 硫酸巧 106.147 示 踪标记 143 释 放因子 270,274 隨菌斑 口 如147 喧菌 斑复制 147 晦菌 斑杂交 147 嗤菌体 M13 嚼菌体 102,126-127,279,283 Mu 嗤茵体 283,286 RNA 聚合酶 182 SP6 121 SP01 202 T4 隨苗体 75 T7 嗤茜体 75,121,122 入 蹈菌体 98,102,123-126,159.283-286 0 因子 202 辅助 喧苗体 127 喧巧 体包装 125,141 巧菌 体纯化 151 巧菌 体巧适 125,141 唾菌 体整合 282 喧苗 体转座 282 化 U 74 堪茜体 75,254 喧菌体 受体 ，细 胞表面 299 疏水性 14,17,22,26 疏 水作用 39 巧据库 158 双化氧 核巧巧 158 水痘- 带状疮 疹病毒 288 顺反子 243 四环素 105,120 巧基 末端区 206,220,230 疼 基化巧 277 化 基转移 巧 270 搪巧键 32 搪基化 5.277 搪原 8 搪脂 10 套索 245 体 外转录 147 停 靠蛋白 276 同聚物 ，均 聚体 145 同义 密码子 253 同源框 222,231 同 ’混异 型基因 231 同源域 222,231 突变 295,304 错义 88 颠换 87,253 点 87. 90 无义 88 移码 88 隐性 302 转换 87,253 自发 88.91 突变剂 芳 基化剂 89,92 放射性 88 巧基 类似物 89 嵌入剂 89 惊化剂 89,92 亚硝酸 89 图 式形成 231 脱巧 酸作用 145,154 脱氧核 搪核酸 (DNA) A-DNA 35-37 、1说1 泌 比值 43 B-DNA 34, % ~ 37 CpG 甲基化 58-59,141 DNA 结 合蛋白 50,222-226 G+C 含量 41,63 SINES 63 Z-DNA 36,37 闭环的 45,49 变性 39-40,44,154,161 部 分酶解 140, 152 测序 104,156-160 缠绕 46-47 长散 布元件 63 超螺旋 ，见 DNA 超巧旋 趙 声处理 40,62,140 纯 度測定 43 大沟 34,35 定量 43 多变的 64 反向 平行链 35 非 编码的 62 分散 重复的 63 浮 力密度 41 复性 44 复杂度 62 高度 重复的 62 核 巧体的 63 互补链 34 甲基化 37, 58, 92, 95, 108,1%, 277 剪切 62, 140 巧基 32 喊基对 34~35 喊基 特异性 的切割 156 巧效应 39-40 接头 145 解结 ，烙解 44 解 链温度 44 开环的 111 连接 103,114,141,145 连接数 45 连接数 的变化 46-47,49-50 344 索 引 末 端标记 152 末 端修复 140 拉性 40 扭曲 46 扭 转应力 47 嵌入物 47,89 氯键 35-37,38 缺刻的 111 热变性 44 双操旋 34 ~ % 松弛的 46 松散 时闭环 分子的 连接数 46 酸效应 39 探针 103 特 有序列 62 退火 44,109 拓扑 异构巧 47-48 弯曲 1% 微卫星 63 卫星 58,63-64 稳定性 38-39 衔接子 145 线 粒体的 4~5 小沟 34,35 小卫星 63 修饰 37 漠化乙 锭结合 47,111 叶绿体 5 杂交 44, 103 指纹法 64,175-176 中度 重复的 62 重 新缔合 动力学 62 轴比 40 紫 外吸收 42 自 动合成 146 外部转 录间隙 235 外显子 22,68,245 可变 外显子 248 网织 红细胞 裂解物 143 微管 2,11,12 巧管 2,11,22,57 谢 [球 菌核酸 巧 52 微体 3 卫星 DNA 58,63-64 细胞 细 胞分化 2,3,230 细 胞决定 230 细 胞转化 281 细胞壁 1 细 胞调亡 306-309 单纯泡 疹病毒 -1 288-290 反转 录病毒 281 非渊 淋己 瘤病毒 288 互补 281,294 狂犬病 281 乳多 空病毒 281 水痘- 带状疮 疹病毒 288 乙肝 281 猿 猴病毒 40 281 细胞分 级分离 6,140 细 胞骨架 2,3,11,22 微管 2 微丝 2,11 中 间纤维 11 细胞质 1,2 细 胞周期 79-82,220,230 DNA 合成期 80 E2F 81-82 Go 期 80 Gi 期 80 G2 期 80 M 期 80 S 期 80 成视网 膜细胞 瘤基因 （K 丘） 81-82 促细胞 分裂源 80 分 裂后期 80 分 裂间期 80 分 裂前期 80 分 裂中巧 80 关卡 80-81 激活 82 间期 80 静止期 80 巧制点 (R 点） 80 抑制 82 有 丝分裂 80 周期 80 细胞周 期蛋白 81 细 菌人工 染色体 (BAC) 102,132,159 纤毛 11 , 纤维素 7 显性 负效应 304 索 引 345 线虫 159,307 线粒体 3,4 限制巧 108,140 部 分消化 152 回 文序列 109 黏 性末端 109 巧 性末端 109 识 别序列 109 双薛切 117,152 作图 151-152 Bam H I 140 EcoRl 109 &k3A 內切 核酸 巧 140 限 制性巧 切图谱 103,149,151-152 限 制性片 段长度 多态性 (RFLP) 64 腺巧吟 32 相抽提 106,140 巧酸纤 维素膜 147 小核 RNA 243 转录 206 小 核核巧 巧蛋白 68,235,241,243 小 鼠乳腺 瘤病毒 (MMTV) 297 巧指 结构域 224 信号识 别颗粒 (SRP) 276 信号化 276 信号化 巧 276 信 号序列 276 信 号转录 229 信使 RNA poly(A) 尾 68 大小 143, 155 单顺 反子的 67,275 多顺 反子的 67,194,275 分级 143 分离 143 富集 ，浓缩 143 合成的 252 加工 242-247 加帽 67,243 甲基化 246 降解 243 巧腺 巧酸化 244 可 变加工 248-250 拼接 .剪接 245-246 起始 密码子 67 隐蔽的 276 终止 密码子 67 珠蛋白 143 晚 腺唾巧 32 胸 腺喀暗 32 胸 腺喀巧 核糖核 256 漠 化乙淀 47,111 漠脱 氧尿巧 85 序列 数据库 158 血 红蛋白 21 血小板 衍生生 长因子 299 血友病 174 亚克隆 103 叶绿体 4-5 依赖 细胞周 期蛋白 的激酶 (CDK) 81,220,230 膀巧素 102 移码 293 移位酶 270 遗传 多态性 63-64,88 遗 传工程 102 遗 传密码 66,251-254 表 253 简并性 252 解读 、破译 252 特征 253 通用性 254 同义 密码子 253 突变 253 修饰 254 己 醉沉淀 106 乙基亚 硝基腺 89,% 异丙基 -p-D- 硫代半 乳搪巧 120,195 异 染色质 58,84 异乳糖 194-195 抑 癌基因 292,302-305 易位 266,270 因子 V 中 174 引物 154,162,172 简并的 162 引 物延伸 167 隐 性突变 295 印迹 Northern 印迹 154—155 Southern 印迹 154~155 Zoo 印迹 155 影印平 板培养 147 用于 DNA 克 隆的酶 104 346 索 引 有 丝分裂 57,80 有义链 154,179 诱变 定 向位点 172 间接 89,91 聚合酶 链反应 172 缺失 170-171 直接 89,91 转 移损伤 DNA 合成 89 原 癌基因 295 原病毒 2S>2,296 原 核生物 1 原 生质体 134 原 嗤菌体 284 巧 猴病毒 40 83,216,288 杂 合细胞 302 杂交 44, 146 菌落 147 唾茜斑 147 探针 297 严紧性 155 杂交 分子捕 获翻译 148 杂交 分子释 放翻译 148 载 脂蛋白 250 增强子 216,300 廉 巧持度 143 真 核生物 1 真细菌 1,2 整合酶 98 整合宿 主因子 50 脂蛋白 10,22 脂类 7, 10 指导 RNA 250 质 粒载体 ，见克 隆载体 致 癌病毒 DNA 病毒 288 反转 录病毒 293,296 致 癌作用 89，％， 295 中 必法则 66 中 子衍射 236 终产 物抑制 198 终 止序列 181,188 肿 瘤病毒 295-305 肿 瘤形成 281,288,293 珠蛋白 mRNA 143 转化子 117 保存 117 麻选 117 转基 因生物 175 转 甲酌酶 263 转录 66 闭合 复合体 188 单元 180 调 控目标 226 复合物 180,226 开放 复合体 188 后动子 67 启动 子清除 188 起始 179 起 始位点 167,180,185 兰元 复合物 188 体外 154 延伸 181,188 终止 67,181 终 止信号 188 终 止序列 181,188 转录泡 188 阻 抑物区 225 转 录因子 22,221-226 DNA 结合区 222 RNA 聚合酶 I 207-210 RNA 聚 合酶日 218 RNA 聚合酶 m 211-214 SP1 216,228 TBP 210,212,215,219 激活区 225 结构域 222 结 合位点 168, 171 巧酸化 277 域互 换试验 222 转录体 30 转染 134,297 转移 RNA 67 CCA 末端 240 D 环 212,2% T 环 212,257 氨基酸 接受臂 256 摆动 261-262 被修饰 的碱基 255 不变 核巧酸 256 二 级结构 256 功能 258 核昔 酸转移 61 240 基因 212 加工 239-240 结构 与功能 255 可变臂 256 起始 密码子 263,272 兰 级结构 257-258 兰叶草 256 校正 259 - 级结构 255 转录 206,211 转座 63 L1 元件 63 Tn 转座子 99 巧 入序列 99 反转录 转座子 100,292 巧菌体 286 Alu 元件 63 Ty 元件 100, 292 着丝粒 57 紫 外福射 147 自身 免疫病 281 自 我剪接 241 组氯酸 操纷子 200 组蛋白 12,52,84,277 H1 52,53 H5 53, 60 八 聚体核 ,!> 52 变异体 60 核心 52 踞酸化 60 己醜化 60 Alu 兀件 63 £coRI 甲 基化酶 145 erbA 基因 301 fms 基因 299 int - 2 基因 297 jun 基因 301 /acZ 基因 120,147,194 L1 元件 63 N- 甲醜甲 硫氯酶 263,271 P53 基因 304 nw 基因 299 RB1 基因 303-304 基因 299 Syn -构象 36 TagDN'A 聚合酶 104 Tetrahymena thermophila 236 trpR 操纵子 198 ! 收麵 > 24. I 来源 王 縣- I 书价 I 单掘 •号 i mm 中科晓 巧物巧 围书馆 圓圓圓 》11! S0000193 借 者单位 000027522 58.178 487 -2001 r 分子 生物学 借 者巧名 li 借 出日巧 I 还书 ..日 -巧 58.178 .487 000027522 Q — 096 0 04 责 任编辑 / 下海挪 谢灵冷 •封 面设计 / 黄华斌 高海英 生 命科学 编辑部 联系 屯 巧： 010-64012501 http://spbio.ycah.net e-mail:spbio^l 63.net 21 巧巧 国际化 新概璋 敦巧