下 必 L06yY 了 二 和 B 开 了 上 和 | 了 只 RE ea -一 | 中 科 院 植物 所 图 书馆 册 册 0 5 S0000097 2 人 饼 学 多 版 社 牙 .本 27419 图 字 : 01-99- 0182 内 容 简 介 本 书 将 分 子 生 物 学 、 遗 传 学 的 内 容 进 行 了 有 机 的 组 织 ， 分 成 30 个 主 题 ， 清 晰 而 富有 逻辑 性 。 内 容 涵盖 了 分 子 生物 学 各 重要 领域 ， 如 细胞 周 期 、 细 胞 器 和 质粒 、 重 组 和 复制 、 转 录 、 基 因 表 达 与 调控 、PCR 等 ， 另 外 还 有 DNA、RNA 及 染色 体 的 结构 、 功 能 、 修 饰 、 突 变 及 修复 等 。 本 书 按 参 考 手册 的 风格 编写 ， 通 过 阐述 重要 理论 、 解 释 关 键 性 术语 、 设 置 交叉 参考 等 ， 向 读者 提供 了 在 其 他 专业 书 中 难以 找到 或 不 易 把 握 的 内 容 。 本 书 适合 高 年 级 本 科 生 、 研 究 生 以 及 更 高 层次 的 人 员 阅 读 。 Richard M. Twyman Advanced Molecular Biology: A Concise Reference Original edition published in English under the title of Adzazzcedz Moiecxvlar Biology: A Concise Reference (OBIOS Scientific Publishers Limited，1998 图 书 在 版 编目 (CIP) 数据 高 级 分 子 生物 学 要 义 /[ 英 ] R，M. 特 怀 曼 著 ; 陈 淳 ， 徐 沁 等 译 。- 北 京 : 科学 出 版 社 ，2000. 11 书 名 原文 : Advanced Molecular Biology: A Concise Reference ISBN 7-03-- 008299 -0 工 . 高 … 工 .中 特 … 思 陈 …@Q 徐 … 正 . 分 子 生 物 -研究 人 Qr7 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2000) 第 02615 号 责任 编辑 : 马 学 海 /责任 校对 : 陈 玉 凤 责任 印 制 : 刘 士 平 /封面 设计 : 王 浩 刍 学 灾 厂 让 出 版 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http:/ www.sSciencep.com 而 涯 印 押 厂 印刷 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销 关 2000 年 11 月 第 一 版 “开本 : 787x1092 1716 2003 年 1 月 第 三 次 印刷 ”印张 : 31 印 数 : 5 501 一 8 500 字数 : 705 000 定价 : S5.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ， 我 社 负责 调换 〈 新 欣 >) 献 给 我 的 父母 : 彼得 和 艾 琳 我 的 子女 : 埃 米 莉 和 露 西 性 是 山本 了 有 有 侦 李 玫 缠 ， 引 必 通过 和 下 7 了 趾 前 这 本 书 开 始 时 是 一 套 仓促 写成 的 濠 草 讲 稿 ， 后 来 工整 地 着 写成 供 考试 参考 的 笔记 。 由 于 一 个 朋友 的 过 玲 竟 促使 这 本 书 一 举 出 版 。 这 位 朋友 借 了 这 本 笔记 ， 读 后 使 他 一 下 子 明白 了 以 前 某 些 未 领会 的 报告 ， 从 而 认为 这 本 笔记 作为 一 种 参考 资料 是 十 分 有 用 的 。 这 本 书 的 宗旨 在 那 时 就 已 形成 了 。 各 章 的 目的 提供 分 子 生物 学 重要 领域 中 的 简明 概 论 。 它 适合 高 年 级 本 科 生 、 研 究 生 以 及 更 高 层次 的 人 员 。 在 写 这 本 书 的 过 程 中 ， 我 遇 到 了 很 多 困难 并 为 之 奋斗 : 当 阅 读 一 些 文章 、 综 述 和 其 他 书籍 时 ， 我 和 别人 一 样 ， 感 到 要 想 找到 要 点 需要 翻阅 很 多 页 正文 ， 要 准确 把 握 一 个 重要 信息 的 程度 也 非 易 事 。 为 了 达到 这 些 目的 我 提出 了 30 个 分 子 生 物 学 的 主题 ， 我 希望 它们 清晰 而 富有 逻辑 ， 每 一 主题 正 文 限制 在 10 一 20 页 的 范围 内 。 内 容 又 分 成 易 操 作 的 节 段 。 针 对 每 个 主题 在 有 限 的 篇 幅 中 提供 详细 的 讨论 ， 这 对 那些 对 遗传 学 和 分 子 生物 学 有 基本 了 解 的 读者 来 说 是 一 种 有 效 的 方法 。 这 本 书 既 不 打算 作为 分 子 生 物 学 初学 者 的 指南 ， 也 不 作为 报告 、 综 述 和 已 出 版 的 一 些 教科 书 的 代用 品 ， 意 在 补充 它们 ， 并 帮助 读者 获得 关键 信息 。 这 本 书 从 头 到 尾 着 重 于 定义 。 当 关键 性 术语 在 书 中 首次 出 现时 已 用 黑体 标明 ， 并 加 以 详细 说 明 。 书 中 的 图 清晰 是 必要 的 ， 同 时 图 的 风格 有 意 使 其 简明 ， 这 样 不 仅 便 于 记忆 ， 而 且 也 易于 复制 。 在 各 章节 之 间 存 在 着 交叉 参考 ， 是 希望 强调 虽然 书 可 以 分 成 不 同 的 主题 (转录 、 发 育 、 细 胞 周期 、 信 和 号 转 导 等 ) 来 叙述 ， 但 是 所 有 这 些 过 程 在 分 子 水平 上 都 是 有 着 重要 的 相互 联 系 。 在 书后 提供 了 一 系列 参考 文献 ， 这 些 文献 都 属于 近期 的 一 些 综述 或 经 典型 文章 。 我 希望 读者 感到 《高 级 分 子 生 物 学 要 义 》 这 本 书 是 有 趣 的 ， 也 是 有 用 的 ， 但 任何 有 关 对 以 后 编辑 中 的 改进 意见 和 建议 都 将 被 愉快 地 接受 。 我 想 感 谢 很 多 人 ， 没 有 他 们 的 帮助 和 影响 ， 这 本 书 将 不 可 能 出 版 。 感 谢 Alison Morris， 他 第 一 个 建议 将 仓促 写成 的 濠 草 讲 稿 整理 出 版 。 感 谢 Stuart Glover，Liz Jones， Bob Old，Steve Hunt 和 John O”Brien， 他 们 以 不 同 的 方式 在 一 开始 就 予以 鼓励 。 非 常 感谢 分 子 生物 学 实验 室 的 Steve Hunt，Mary-Anne Starkey，Nigel Unwin 和 Richard Hen- derson， 他 们 一 直 支 持 我 直到 完稿 。 特 别 感谢 那些 知识 比 我 渊博 得 多 的 Derek Gatherer， Gavin Craig，Dylan Sweetman，Phil Gardner，James Palmer，Chris Hodgson，Sarah Lum- mis，Alison Morris，James Drummond，Roz Friday， 他 们 花 了 很 多 时 间 阅 读 了 每 一 章节 ， 并 作 了 评论 。 尤 其 是 Bill Wisden， 他 的 评论 和 建议 是 极其 宝贵 的 。 最 后 还 要 感谢 分 子 生 物 学 MRC 实验 室 的 Annette Lenton 和 BIOS 的 Rachel Offord，Lisa Mansell，Andred Bosher 和 Jonathan， 没 有 他 们 的 帮助 这 本 书 将 不 可 能 面世 。 R. M. 特 怀 曼 / 渍 苦 开业 妇 , 花 指 和 草 允 的 入 甘 动人 玉兰 一 县 oh iT 了 淮 帮 “ 尖 册 学 一 六 本 丰台 只 妆 记 WA | 区 雹 点击 从 ,者 不 的 会 FF 和 Ad Re 二 志 扩 才 纺 薪 艾 凶 于 交往 ， 让 一 加 其 商 帮 要 ， 上 ,本寺 二 举 蛙 : 丢 检 村 昌 外 公交 穿 内 儿 亩 尝 具 下 公 卫 兴 , 宕 摧 的 次 关中 党 时 求 笠 苍 茧 者 温 叭 共 训 训 Biological Heredity and Variation The Cell Cycle Chromatin Chromosome Mutation Chromosome Structure and Function 三 上 0 ( 注 : 章 的 顺序 按 其 英文 的 字母 顺序 排列 ) 前 言 pe 1 缩 略 语 表 pe 这 章 生物 的 遗传 和 变异 oooooeoesooooooooooooooooooooo。ooo。oo。oos。o。 os。 1 T 备 德 尔 式 遗传 oaaeeseeeeooeoeosoooeoseeoeoeeoeoeoosseseeeeeeeeseeeese 1 TS 一 个 基因 座 上 的 分 离 ooooeeeeoooeeeooooooooesooooosesooeseoossso。 3 | 了、 在 两 个 座位 上 的 分 离 aeeooeseoeoeoeoeeeeooeoooosoooeeeooeeoooooseeeeos 8 1.4 数量 遗传 pe 11 第 2 章 细胞 周期 pp 19 2.1 细菌 的 细胞 周期 o 人 ee 20 2.2 真 核 细胞 的 细胞 周期 pp 9 21 2 光 细胞 周期 调节 的 分 子 基础 oseoeoeeeeoooooooossos 24 广 友 细胞 周期 的 进行 oaeeeseoeeoessoeosoosooeseooooooooeo。 26 2.5 动物 中 特殊 的 细胞 周期 系统 ………………… 30 第 3 章 ” 染 色 质 3 3.1 核 小 体 入 pe 39 3.2 染色 质 的 高 级 结构 pe99e…e9 36 3.3 染色 质 和 染色 体 的 功能 pp 38 3.4 细菌 类 核 的 分 子 结构 pe 1 第 4 章 ， 染色 体 突变 pp 42 4.1 数量 染色 体 突 变 peeeeeeee9eee9eeee, 43 4.2 染色 体 结构 突变 ppp 47 第 S 章 染色 体 结构 与 功能 oo S3 SI 正常 的 染色 体 二 三 一 役 形 态 53 So 特异 染色 体 结 构 ooeoooeooooeooooososeooooesessaosos S5 5$.3 染色 体 结 构 的 分 子 方面 ，…… 和 ve S6 ” Development， Molecular Aspects DNA Methylation and Epigenetic Regulation The Gene Gene 了 Xpression and Regujation Gene Transfer in Bacteria The Genetic Code Genomes and Mapping 6.1 分 化 ooeeoeeoeseeesooeseoeoeooesesoossseeeooooooooooooossessseesssssees 60 6.2 模式 形成 和 位 置信 息 eesesoeeseeeeoeoeoeeeoeooeoooeseseeossssss68 67 6.3 发 育 的 环境 sosoooeeeoeosoessssoseesoooooooeeoooooseseseesseseoses 69 第 7 章 DNA 甲 基 化 及 外 遗传 调节 oooooeoooooeeeeeososoeeesoseee 85 7 全 | 原核 细胞 的 DNA 甲 基 人 化 pe 85 了 真 核 细 胞 的 DNA 甲 基 人 化 pe 8 了 7.3 哺乳 动物 的 DNA 甲 基 化 对 外 遗传 基因 的 调控 …… 89 第 8 章 基因 pp 95 R 本 基因 的 概念 oo 95 8.2 遗传 结构 和 遗传 功能 的 单位 oooooooooooosseooosessesessss 96 8.3 原核 和 真 核 细胞 中 基因 - 顺 反 子 的 相互 关系 ………e 97 8.4 基因 结构 和 构造 ooooooosoooooooooooooooooooooooooossesessses 98 第 9 章 基因 表达 和 调节 oosooooeesoosoooooooooooooooooseosssoeseseesooe 104 9.1 基因 表达 ooooosoossoooooosooosooooooooooooooooooooosoososooseseos 105 92 基因 调节 ooooooooooosoesssssssssoooooooooooosoosssosossessseoeese 106 9.3 真 核 和 原核 生物 的 基因 表达 osooooooooo ooeooessssoseosseses 107 第 10 章 细菌 中 的 基因 转移 ooeooooooooooeoosooeosooosoooosooosssossoess 109 10.1 扩 人 ooeoeeeooeoooooooooseoeoeooooooooosoeosooeoooeooossssos0ssseoss5as 109 10.2 转化 ooooooooesoooooooooooooivsooooooooooooovoooiosooossassoasee 二 10.3 转 导 oooooooooosooooooooesoooooosoooooooooooooooooooooooossssss6ss 地 第 11 章 遗传 密码 oos5aesooeooaesiosssoeiicooeeeoooeeooeeooo5aasaas 118 T[ 遗传 密码 的 概论 osoo5esioodoooooaoooeoseeeoeooeeeoosaaaaee ss 二 8 11.2 翻译 120 11.3 密码 子 的 特殊 属性 2 120 第 12 章 基因 组 与 作 图 pp 125 12.1 基因 组 、 染 色 体 倍数 性 和 染色 体 数目 ee 124 12 位 基因 组 的 物理 化 学 性 质 wo 124 12.3 基因 组 大 小 和 序列 组 成 ee 126 也 大 :| 基因 结构 和 高 级 基因 组 组 织 ooeoseoeooooooooooossossssssss TI?77 12.5 重复 顺序 DNA pp 129 12.6 哺乳 动物 基因 组 的 等 容 线 组 织 PP 139 12.7 基因 作 图 pp 134 12.8 遗传 作 图 136 12.9 物理 作 图 和 pp 140 第 13 章 ， 可 移动 的 遗传 因子 pe 152 13.1 转 座 的 机 制 pe 15$3 13.2 转 座 的 效应 pe 158 13.3 转 座 子 .ee 162 13.4 反 转 录 因 子 pe 166 和 第 14 章 诱 变 和 DNA 修复 ppp 169 14.1 诱 变 和 复制 忠实 性 .pp 169 14.2 DNA 损伤 ， 突变 和 致死 pep 191 14.3 DNA 修复 pe 174 14.4 直接 恢复 性 修复 pp 174 14.5 切除 修复 ppp 176 14.6 错 配 修复 pp 180 14.7 重组 修复 pp 182 14.8 SOS 反应 和 诱 变 修复 pp 183 d 第 1S 章 突变 与 选择 pp 185 15.1 突变 的 结构 与 功能 性 效应 9 186 15.2 突变 型 等 位 基因 及 表现 型 的 分 子 基 础 ……PPP” 192 1$.3 突变 的 分 布 与 分 子 进 化 .PP 195 15.4 遗传 分 析 中 的 突变 PP 197 基 第 16 章 “核酸 结构 ppp 205 过 16.1 核酸 的 基本 结构 .ppp 205 16.3 核酸 的 三 级 结构 和 PP 213 第 17 章 ”核酸 结合 蛋 自 217 17.1 核酸 被 蛋白 识别 站 pp 218 17.2 蛋白 中 的 DNA 结合 基 序 pe 220 17.3 蛋白 中 RNA 结合 基 序 和 pe 325 17.4 和 蛋白， 核酸 结合 的 分 子 基础 PP，eee9ee9eee…， 226 17.5$ 序列 特异 性 结合 .pe 229 17.6 研究 蛋白 核酸 相互 作用 的 技术 .PP 9] Oncogenes and 第 18 章 癌 基 因 与 总 ooeeeosagsacsaaseeseoeeeoeooeeseossso5eses6iaa 235 Cancer 18.1 癌 基 因 和 236 18.2 抑 癌 基 因 .ee 240 Organelle 第 19 章 细胞 器 基因 组 PP 243 Genomes 19.1 细胞 器 遗传 学 243 19.2 细胞 器 基因 组 pe 245 Plasmids 第 20 章 质粒 ee 250 20.1 质粒 的 种 奖 | 20.2 质粒 复制 和 维持 PP 53 The 第 21 章 聚合 酶 链 式 反应 (PCR) oo 25S8 Polymerase 21.1 PCR 反应 的 特异 性 pe 258 Chain Reaction 21.2 PCR 基本 战略 的 提高 和 扩展 .ee 262 (PCR) 21.3 体外 扩 增 的 其 他 方法 ，peeeeeeeeeeeeee 63 Proteins， 第 22 章 蛋白 质 : 结构 ， 功 能 与 进化 ppp 264 Structure， 22.1 蛋白 质 一 级 结构 .pp 265 Function and 22.2 高 级 蛋白 质 结构 266 了 Evolution 22.3 蛋白 质 修饰 pe 292 22.4 蛋白 质 家 族 各 Pen 273 22.5 和 蛋白质 切 能 的 综合 从 术 280 Protein 第 23 章 和 蛋白质 合 成 pe 288 Synthesis 23.1 蛋白 质 合成 的 组 分 ee 288 23.2 蛋白质 合成 的 机 制 Po 290 23.3 和 蛋白质 合成 的 调 葡 ee 294 Recombinant 第 24 章 重组 DNA 与 分 子 克隆 pp 298 DNA and 24.1 分 子 克 隐 ee 299 Molecular 24.2 基因 分 离 的 策略 ee 306 Cloning 24.3 克隆 DNA 的 性 质 ppm 1 24.4 克隆 DNA 的 表达 ppp 313 24.$ 基因 调节 的 分 析 pp 316 24.6 蛋白 分 析 与 蛋白 间 相互 作用 的 分 析 ee 318 24.7 体外 诱 变 pe 9T9 24.8 转基因 : 基因 转移 到 动物 和 植物 ……… 和 9 321 Recombination Replication 攻 RNA Processing Signal Transduction Transcription 第 2S 章 重组 pe 338 25$.1 同 源 重 组 ee 339 25$.2 同 源 重 组 和 遗传 作 图 ppp 342 25.3 随机 和 程序 化 非 交 互 重 组 ee ee ee 344 25.4 位 点 专 一 性 重组 ee 346 25.5 免疫 球 蛋 白 的 产生 和 T- 细 胞 受 体 的 多 样 性 ………。 347 25$.6 非常 规 重 组 pe 35S0 第 26 章 复制 四 356 26.1 复制 的 策 力 pp 356 26.2 细胞 复制 体 和 延伸 的 酶 学 PP ee 359 26.3 复制 的 起 始 Pei 367 26.4 引物 和 引发 ee 370 26.5 复制 的 终止 pp 7 26.6 复制 的 调节 eeoeeseessscooseooeeooeosooooeoeeoossoeoooeoosooseoooo。 372 第 27 章 RNA 加 工 症 pp 375 27.1 非 翻 译 RNAS 的 成 冲 pe ee 9 376 27.2 mRNA 的 末端 修饰 和 甲 基 化 pe ee 376 27.3 RNA 前 接 pe 378 27.4 RNA 编辑 pp 385 27.$ 后 加 工 调 区 .pe 385 第 28 章 信号 传 导 ………………… 人 388 28.1 受 体 和 信号 途径 .ee ee, 389 28.2 细胞 内 酶 级 联 和 ee， 394 28.3 第 二 信使 pe 397 28.4 信号 交付 和 ppp 402 第 29 章 转录 pp 404 29 1 转录 的 基本 原理 soseooooosooooooooooooooooooooooooooooooooo。 404 29.2 原核 生物 的 转录 起 始 一 一 基本 的 结构 成 分 …………” 406 29.3 真 核 生物 转录 起 始 一 基本 的 结构 成 分 …… 和 0 407 29.4 转录 起 始 调节 成 分 ee 410 29.5 细菌 和 真 核 生物 转 录 调 节 的 策略 ………………………………， 416 29.6 转录 的 延伸 和 终止 pp ee vv…， 419 se。 Vil。 30.1 病毒 感染 策略 oooooeoeooosoooeooooooooooooooooooooooosessssssoos 425 30.2 复制 策略 的 多 样 性 ooeseoeoseseoooooooooooooooesseseosssssos66 426 30.3 病毒 基因 表达 的 策略 .pp 433 30.4 亚 病毒 感染 因子 .Be 434 本 而 六 册 而 可 可 二 本 而 放 避 认 6666055665egl on 丽 < 泡 ieogoieeoooeecsEesaes 二 442 人 456 *，Viii。 缩 略 语 表 腺 味 叭 ( 碱 基 ) , 腺 苷 酸 ( 核 酸 ) | CIE 项 外 胚层 旺 DAG 本 Dam 腺 苷 单 磷酸 ,二 磷酸 ,三 磷酸 ATP 触角 足 复 合体 Dcnm 无 味 叭 或 无 喀 啶 位 点 DEAE 后 期 促进 复合 物 DIF 自发 复制 序列 DMS 腺 苷 三 磷酸 酶 DNS 碱 基 、 碱 基 对 dJNTP 细菌 人 工 染 色 体 B 细 胞 受 体 ON A/ 碱 基 切 除 修复 RNA 碱 性 螺旋 - 环 螺旋 EGF(R) 骨 形 成 蛋 日 FER 双 胸 复合 体 ES 细胞 碱 性 亮 氨 酸 拉链 FST CDK 激活 激酶 FISH 钙 调 蛋白 细胞 黏附 分 子 环 c C+D, 复 制 在 细胞 分 裂 之 前 结束 。 在 生长 旺盛 时 ,倍增 时 间 比 一 轮 完 整 的 复制 和 分 裂 的 时 间 要 短 。 细 胞 只 有 使 IC+D, 即 新 一 轮 的 复制 必须 在 上 一 轮 复 制 完 成 前 开始 ,才能 使 固定 的 染色 体 周 期 适应 快速 生长 的 需要 。 此 外 ,在 快速 生长 中 , 子 代 细 胞 得 到 的 染色 体 已 部 分 复制 [多 叉 染 色 体 (mnultiforked chromosomes) ] ,所 以 复制 能 在 下 一 轮 细 胞 分 裂 前 完 成 。 复制 起 始 的 频率 被 正 调控 因子 所 调节 ,这 种 调控 因子 在 每 个 复制 起 始 (参阅 ) 处 ,必须 达到 一 定 的 浓度 才能 使 复制 起 始 。 在 快速 生长 过 程 中 ,调节 因子 积累 更 快 , 允 许 更 频繁 的 起 始 。 一 旦 复制 起 始 ,在 分 裂 中 细胞 的 复制 起 始点 和 调控 因子 的 有 效 浓 度 就 失效 了 ,所 以 在 下 一 轮 起 始 时 ,这 些 因 素 必 须 重 新 积累 。 支 持 存 在 正 调控 因子 的 根据 是 复制 起 始 是 依 赖 于 蛋白 质 的 从 新 合成 的 ,但 到 目前 为 止 ,这 正 调控 因子 的 天 然 属性 还 不 得 而 知 。 复 制 起 始 蛋 白 DnaA 可 能 是 这 种 调控 因子 的 候选 者 ,另外 控制 oriC( 和 cdrzaA4 启动 子 ) 甲 基 化 的 因子 可 能 也 与 此 相关 (参见 复制 起 始 、 甲 基 化 )。 分 配 和 胞 质 分 裂 ”染色 体 周 期 达到 高 潮 的 标志 是 已 复制 的 染色 体 进 行 分 配 ,接着 就 开 始 细胞 分 裂 。 在 母 细胞 的 中 间 形 成 被 称 为 周 隔 环 (periseptal iannulus) 的 隔 片 (septum) ,在 此 处 细胞 周 缘 的 内 外 膜 相 互 融合 。 通 过 复制 形成 的 环 迁 移 到 细胞 长 度 的 四 分 之 一 和 四 分 之 三 位 置 ,这 是 下 一 轮 细 胞 分 裂 子 代 细胞 分 离 的 地 方 。 一 旦 隔 片 形成 ,细胞 就 进行 胞 质 分 裂 (cytokinesis) 以 二 分 裂 (binary fission ) 进 行 分 裂 。 研究 有 关 阻 断 细 胞 分 裂 和 分 配 突变 表明 ,有 两 个 过 程 可 以 被 阻 断 ,这样 的 突变 可 分 为 几 类 。Fts 突变 体 隔 片 形成 有 障碍 , 丝 体形 成 是 温度 敏感 性 的 (Filament that are tempera- ture sensitive， 太 *)。 丝 体 上 往往 有 规则 排列 的 类 核 ,这 说 明 复制 和 分 配 功能 是 正常 的 。 zi 突变 是 隔 片 形 成 太 频繁 ,结果 形成 很 多 小 细胞 (minicells) ,有 些小 细胞 不 含有 染色 体 DNA( 有 可 能 含有 质粒 DNA)。zar 突变 体 细 胞 大 小 正常 ,但 在 染色 体 分 配 有 缺陷 , 且 高 频率 地 产生 二 倍 体 和 无 核 细 胞 的 频率 增加 。 细胞 分 裂 和 分 配 调节 途径 的 细节 还 有 待 于 进一步 研究 ,但 目前 已 知 其 中 一 些 关键 分 子 。 细 胞 分 裂 的 起 始 因子 可 能 是 FtsZ,FtsZ 从 结构 和 功能 上 都 与 在 真 核 细 胞 中 形成 收缩 环 的 微 管 蛋 白 相 似 。FtsZ 在 整个 细胞 周期 中 普遍 存在 ,分 布 在 D 期 环 周围 形成 乙 环 (Z ring)。FtsZ 的 含量 与 细胞 分 裂 的 频率 相 一 致 , jsZ 突变 就 不 能 形成 隔 片 (和 丝 体 ) ,而 过 ss 20 ss 度 表 达 会 使 隔 片 产 生 过 多 ,形成 小 细胞 。ZipA 蛋白 可 能 对 FtsZ 的 定位 很 重要 , 它 的 N 端 定位 在 细胞 膜 上 ,C 端 与 FtsZ 相互 作用 。 到 目前 为 止 隔 片 在 细胞 中 是 如 何 定位 的 还 不 清 楚 。 当 温度 敏感 的 万 *Z 突变 体 转移 到 适宜 的 温度 时 , 丝 体 可 以 迅速 形成 收缩 环 , 所 以 可 能 存在 成 核 位 置 (nucleation site) 。 基 因 zizzB 可 以 限制 染色 体 分 配 到 中 心 环 ,抑制 在 前 一 轮 细 胞 分 裂 后 末端 环形 成 的 过 程 。MinC 和 MinD 是 分 配 抑 制 因 子 , 而 MinE 是 MinC 和 MinD 的 持 抗 剂 。 这 三 种 成 分 的 平衡 抑制 末端 分 配 ,保护 中 心 环 免 受 抑 制 。 细菌 染色 体 分 配 过 程 与 质粒 分 配 (参阅 ) 类 似 。 分 配 涉及 染色 体 与 细胞 膜 的 相连 ,并 有 可 能 被 复制 所 调节 :复制 的 起 始 和 终止 ,复制 叉 的 激活 都 是 与 细胞 膜 相 关 的 过 程 。 细 菌 中 影响 分 配 的 突变 体 可 分 为 两 类 :一 类 与 互联 的 已 复制 的 染色 体 作 用 (包括 拓扑 异 构 酶 和 Xer 位 点 特异 重组 突变 体 ) ; 另 一 类 直接 影响 分 配 过 程 本 身 。 在 后 一 种 情况 中 ,在 染色 体 上 未 发 现 顺 式 作用 位 点 ,但 有 一 些 反 式 作 用 因子 被 发 现 , 如 膜 蛋 白 MukA 和 微 管 相 关 和 蛋 白 MukB, 这 两 个 基因 突变 会 形成 无 核 细胞 。 2.2 ， 真 核 细胞 的 细胞 周期 标准 的 真 核 细胞 的 细胞 周期 真 核 细 胞 的 细胞 周期 可 以 分 为 四 个 互 不 重 到 的 阶段 。 染 色 体 周期 中 独立 的 事件 (DNA 合成 和 有 丝 分 裂 ) 分 别 发 生 在 S$ 期 和 M 期 ,在 大 多 数 细胞 周期 中 ,M 期 和 S 期 为 Gil 和 G; 期 ( 间 期 1 和 2, 也 分 别称 为 合成 前 期 和 合成 后 期 ) 所 分 开 , 在 Gil 和 G* 期 中 mRNA 和 和 蛋白质 继 续 积累 ( 图 2.1)。 从 细胞 周期 中 的 一 个 期 进入 另 一 期 称 为 细胞 周期 过 渡 (cell cycle transition)。 整 个 细胞 周期 中 ,在 有 丝 分 裂 期 中 可 以 观 察 到 明显 的 细胞 结构 的 变化 ,而 其 他 时 期 肉眼 看 来 毫 无 变化 , 称 为 分 裂 间 期 (interphase)。 尖 [ 扩 和 和 蛋白 质 DNA Gz M I G S 图 2.1 标准 的 真 核 生 物 细胞 细胞 周期 。 染 色 体 周 期 分 为 四 个 阶段 :构成 间 期 (interphase) 的 Gi， S 和 G: 期 ;有 丝 分 裂 的 M 期 。 左 边 是 细胞 周期 不 同 阶段 的 相对 时 间 ,根据 不 同 物种 、 细 胞 类 型 和 生长 情况 而 不 同 。 如 果 在 Gi 期 早期 生长 因子 缺乏 ,动物 细胞 可 以 进入 静止 期 ,Go; 如 果 细 胞 已 通 过 限制 点 (R) ,就 进入 下 一 轮 DNA 复制 和 分 裂 。 图 中 反映 了 细胞 成 分 的 持续 积累 和 DNA 非 持续 合成 。 当 M 期 结束 细胞 分 裂 完成 ,细胞 成 分 减 半 。 细胞 周期 中 的 变化 ( 表 2.1) 包 括 :一 个 或 两 个 间 期 (gap) 缺 失 ,S 期 或 M 期 的 缺少 会 分 别 导致 细胞 中 DNA 含量 的 减少 或 加 倍 。 此 外 ,细胞 可 以 在 细胞 周期 中 的 某 一 阶段 被 阻 滞 (arrested) ,如 在 卵 母 细胞 的 成 熟 过 程 中 和 有 丝 分 裂 期 后 的 (postmitotic) 细 胞 (如 神经 元 细胞 ) 。 动 物 细胞 还 可 以 完全 从 细胞 周期 中 离开 ,进入 一 个 生长 和 分 裂 受 抑制 的 静止 期 , 称 为 Gy 期 。 这 些 反 映 了 必需 存在 相应 的 生长 因子 和 环境 中 的 信号 分 子 以 及 其 他 水 平 sw 表 2.1 真 核 细 胞 细胞 周期 四 个 阶段 的 变化 改变 环境 阶段 被 去 除 没有 G 期 因为 在 卵细胞 中 有 足够 的 供 细胞 分 裂 所 需 的 原料 ,所 以 在 一 些 有 大 型 卵细胞 的 动 物 发 育 过 程 中 没有 Gl 期 ,M 期 和 S 期 得 以 快速 转换 。 许多 组 织 缺 少 一 个 或 整个 G 期 ,如 网 柄 菌 属 盘 脉 菌 ( Dictyosteliuzz discoidexzz ) 在 有 丝 分 裂 后 立刻 进行 DNA 的 复制 (没有 Gi 期 ); 在 酿酒 酵母 中 ,DNA 复制 后 立 刻 进 行 有 丝 分 裂 (没有 Gz 期 )。 没有 S 期 在 减 数 分 裂 时 ,两 轮 细 胞 分 裂 中 间 没 有 DNA 的 合成 没有 M 期 在 果 蝇 (Drosophile ) 分 刻 组 织 中 有 多 轮 DNA 复制 但 细胞 并 不 分 裂 ,以 产生 多 线 染 色 体 (polytene chromosomes) (人 参阅 )。 阶段 延长 G@Gi,G2> 或 M 期 阻 滞 卵 母 细 胞 根据 物种 不 同 ,在 Gl,G2 或 M 期 阻 滞 ,受精 可 以 脱离 阻 滞 , 使 细胞 周期 继 细胞 周期 从 G; 期 中 退出 和 和 动 和 届 遇 届 可 汪 G 期 中 退出 ,进入 静止 期 , 常 称 为 Gu 期 ,Go 期 可 数 月 或 数 (Go 期 ) 年 。 这 往往 发 生 在 G 期 的 早期 关键 的 生长 因子 缺乏 或 细胞 周期 调控 机 制 失控 时 。 如 果 所 需 的 生长 因子 具备 ,静止 的 细胞 可 以 重新 进入 细胞 周期 。 因 为 调节 成 分 需要 重新 合成 ,所 以 在 S 期 开始 前 需要 有 较 长 时 间 。 正 常 的 体 细胞 经 常 经 过 多 轮 分 裂 后 进入 Go 期 , 称 为 Hayflick 限制 (Hayflick limit)。 又 称 为 细胞 衰老 (senescence) ，Go 在 很 多 动物 中 可 能 与 端 粒 的 长 度 有 关 , 在 真菌 中 也 可 被 某 些 质 粒 诱导 。 有 些 细胞 (如 神经 元 和 肌 细 胞 ) 作 为 它们 分 化 的 一 部 分 ,完全 从 细胞 周 期 中 脱离 ,成 为 有 丝 分 裂 期 后 的 (postmitotic) 细 胞 。 的 对 细胞 周期 的 调节 ,才能 使 单个 细胞 的 分 裂 与 多 细胞 组 织 相 协调 。 这 些 调节 机 制 的 失 控 可 以 导致 肿瘤 中 异常 细胞 分 裂 (参见 癌 基 因 和 瘤 一 章 )。 细胞 周期 关卡 ”细胞 周期 基本 功能 就 是 精确 地 复制 基因 组 均等 地 分 配 到 两 个 子 细胞 中 。 正 是 这 个 原因 ,细胞 周期 的 各 个 事件 按 正确 的 顺序 进行 就 极为 重要 ,也 就 是 说 细胞 周 期 中 下 一 期 必需 在 上 一 期 完成 后 才 开始 。 细 胞 内 DNA 含量 保持 恒定 ,只 有 在 DNA 复制 和 有 丝 分 裂 交 替 进 行 ,有 丝 分 裂 在 DNA 复制 完成 后 开始 ,复制 在 有 丝 分 裂 精 确 地 将 DNA 分 配 到 子 代 细胞 中 后 开始 。 细 胞 通过 将 细胞 周期 组 织 成 一 系列 相互 依赖 的 事件 来 满足 这 一 要 求 。 如 果 有 丝 分 裂 被 阻 断 ,细胞 周期 就 停留 在 M 期 直到 阻 断 因素 去 除 一 一 细胞 周期 不 会 自行 进行 下 去 并 复制 DNA(DNA 的 复制 依赖 于 有 丝 分 裂 的 完成 )。 同 样 当 DNA 复 制 受阻 ,细胞 也 不 会 试图 进行 有 丝 分 裂 , 因 为 有 丝 分 裂 依 赖 于 DNA 复制 的 完成 。 细胞 周期 进一步 的 功能 是 使 染色 体 周 期 与 细胞 生长 相 协调 , 这 样 细胞 质 就 不 会 增加 或 减少 ,并 且 细 胞 也 不 会 在 不 适合 的 环境 下 继续 生长 。 细 胞 周期 的 进行 还 依赖 于 细胞 的 大 小 ,并 为 所 提供 的 营养 ,交配 信 息 素 (在 酵母 中 ) 生长 因子 和 激素 (动物 中 ) 所 调节 。 细胞 拥有 一 系列 的 调节 系统 ,来 感受 细胞 周期 进行 的 情况 , 当 出 现 失常 时 ,在 相应 阶 段 终 止 细胞 周期 。 这 些 调节 机 制 称 为 细胞 周期 的 关卡 (cell cycle checkpoint) ,代表 调节 细 胞 周期 的 内 在 信号 系统 。 关 卡 机 制 也 可 对 外 源 信和 号 作出 反应 ,如 当 营 养 或 生长 因子 缺乏 时 ,时 细胞 周期 受阻 。 在 细胞 周期 中 有 很 多 关卡 ,被 分 为 两 大 类 一 一 发 生 在 G; 期 ,对 进 ee 少 仿 四 人 S 期 进行 调节 ;发 生 在 G 期 ,调节 细胞 进入 M 期 (图 2.2)。 这 两 类 阻 断 暗示 内 源 和 外 源 信号 可 能 集中 到 细胞 周期 调节 的 共同 成 分 中 。 另 一 类 关卡 保证 组 成 有 丝 分 裂 的 事件 能 有 序 且 相互 依赖 地 进行 。 图 2.2 已 知 真 核 细胞 周期 的 关卡 。 代 表 了 特异 的 蛋白 激酶 的 激活 / 灭 活 的 位 置 。 Gi 和 G; 期 的 关卡 对 不 同 器 官 有 不 同 程度 的 意义 ,这 反映 了 细胞 从 环境 中 得 到 的 信 息 。 在 啤酒 酵母 中 Gi 期 的 关卡 占 主 导 地 位 , 称 为 起 始 (START) ,在 动物 细胞 中 则 称 为 限 制 点 (restriction point) 或 关键 点 (commitment point)。 在 Gl 期 ,酵母 对 营养 和 交配 信息 素 的 提供 情况 进行 判断 ,动物 细胞 对 生长 因子 作出 到 应 。 如 果 环 境 不 利 ,细胞 就 停留 在 关卡 处 ,一 旦 通过 了 关卡 ,新 一 轮 的 DNA 复制 和 有 丝 分 裂 得 以 进行 ,并 不 再 考虑 环境 的 因素 。 相反 ,在 裂 殖 栗 酒 酵母 ( Schizosaccharomzyces 加 omzpe ) 中 ,环境 的 因素 在 G, 期 的 关卡 进行 检 测 。 在 适合 的 条 件 下 ,细胞 进行 有 丝 分 裂 和 下 一 轮 的 DNA 复制 直到 遇 到 关卡 为 止 。 对 单 倍 体 酵 母 细 胞 而 言 ,停留 在 G; 期 比 Gi 期 的 优点 是 在 G; 期 基因 组 有 两 份 拷贝 ,DNA 损 伤 可 以 通过 重组 来 修复 。 细胞 周期 调节 的 研究 ”两 种 互补 的 研究 手段 被 用 来 分 析 和 提取 细胞 周期 的 调节 成 分 。 在 异 核 体 的 方法 中 ,不 同 染 色 体 周期 的 细胞 核 与 正常 细胞 质 融合 ,观察 其 行为 。 培 养 的 哺 乳 动 物 细胞 和 两 栖 类 动物 的 卵细胞 常 被 用 来 做 这 类 实验 。 表 2.2 表示 的 是 不 同 细胞 周期 阶段 的 同步 化 的 成 纤维 细胞 的 结果 。M 期 激活 因子 (M-phase promoting factor) 存 在 的 最 早 证 据 是 M 期 细胞 可 以 诱导 任何 间 期 细胞 进入 有 丝 分 裂 。 在 非洲 爪 蟾 细胞 核 移 植 实验 中 也 可 以 得 到 类 似 的 结论 一 一 当 植 和 一 处 于 M 期 卵细胞 时 , 间 期 细胞 形成 纺锤 体 , 从 这 些 细胞 中 得 到 的 细胞 质 还 可 以 诱导 G; 期 的 卵 母 细胞 进入 M 期 。 从 卵细胞 中 提取 得 到 的 相关 因子 ,被 称 为 成 熟 促 进 因 子 (maturation promoting factor，MPF)。 进 一 步 的 研究 表 明 ,成 熟 促进 因子 也 可 以 诱导 体 细 胞 的 有 丝 分 裂 ,也 就 是 M 期 激活 因子 ,统称 为 MPF。 另 一 种 方法 是 利用 酵母 遗传 的 多 变性 ,分 离 与 细胞 周期 功能 相关 的 条 件 突 变 体 。 很 多 不 同 细胞 周期 阶段 阻 断 的 突变 体 被 发 现 , 统 称 为 edc 突变 体 ( 细 胞 分 裂 周期 ) ,同时 这 样 的 突变 体 的 数量 还 在 不 断 地 增加 。 另 一 类 称 为 wee 突变 体 ,过 早 通 过 细胞 大 小 的 关卡 ,所 以 细胞 比 野生 性 细胞 要 小 。 许 多 从 cac 突变 中 得 到 的 基于 并 非 是 细胞 周期 专 一 性 的 调节 因子 ,而 是 细胞 周期 所 依赖 的 过 程 ,如 DNA 复制 修复 和 配对 中 的 调控 因子 。 尽 管 如 此 ， 还 是 有 一 些 ccc 基因 是 直接 调控 细胞 周期 的 。 令 人 欣慰 的 是 以 上 两 种 方法 得 到 的 MPF 因子 基本 是 同一 系列 的 分 子 。 9 8 记 表 2.2 异 核 体 实验 研究 调控 细胞 周期 因子 融合 结果 结论 S+ On 两 个 核 都 复制 S 期 的 核 含 有 启动 进入 S 期 的 激活 因子 S+G> S 期 细胞 完成 复制 ,G 期 的 细胞 等 竺 G2 期 对 S 期 启动 因子 没有 反应 ,同时 S 期 启动 因子 也 是 S 期 核 完 成 复制 , 两 个 细胞 都 进入 M 期 的 抑制 因素 M 期 M+ Gil,S 或 ， 1 Co> 0 玉 相 轴 汪 2 进入 M 期 细胞 核 含有 进入 M 期 的 激活 因子 Ci+OC2 细胞 并 不 进入 有 丝 分 裂 或 复制 S 期 和 M 期 激活 因子 的 表达 是 瞬时 的 2.3 细胞 周期 调节 的 分 子 基础 细胞 周期 蛋白 和 细胞 周期 蛋白 依赖 激酶 ”细胞 周期 阶段 性 进行 反映 了 调节 不 同 细胞 周 期 事件 中 的 关键 分 子 的 不 同 磷酸 化 状态 。 这 些 不 同 的 磷酸 化 状态 代表 了 细胞 周期 的 过 渡 。G1 - S 的 过 渡 涉 及 DNA 复制 相关 蛋白 的 磷酸 化 ,而 Gz - M 期 的 过 渡 与 有 丝 分 裂 相 关 和 蛋白 的 磷酸 化 。 细 胞 周期 调控 的 基础 是 一 系列 激酶 家 族 ,将 相应 细胞 周期 过 渡 所 需 蛋 白 磷 酸化 。 发 现 细胞 周期 调节 涉及 蛋白 激酶 是 在 酿酒 酵母 cdc 突变 体 的 研究 中 ,发现 阻 断 起 点 (START) 的 基因 产物 CDC 28 ,是 一 34kD 的 蛋白 激酶 ,是 Gl -S 过 渡 的 主要 调节 因子 。 在 栗 酒 酵母 (S. ozpe ) 中 同样 重要 的 G; - M 的 调节 因子 是 cdc 2 ,是 上 述 激酶 的 同 源 蛋 白 。 在 这 之 后 , 肴 椎 动物 细胞 中 编码 类 似 和 蛋白 激 酶 的 基因 逐步 被 克隆 ,这些 蛋 白 都 可 以 恢 复 酵 母 cdc 突变 体 的 细胞 周期 功能 。 值 得 一 提 的 是 ,非洲 爪 蟾 的 CDC28/Cdc2 的 同 源 蛋 白 就 是 MPF 的 成 分 。 这 些 激酶 在 细胞 核 中 含量 保持 恒定 ,但 随 细 胞 周期 的 进行 而 活性 发 生变 化 。 对 它们 活性 变化 的 解释 来 自 于 对 海胆 卵 的 研究 ,从 中 发 现 了 一 类 分 子 , 它 们 的 合成 和 活性 随 细胞 周期 而 变动 。 这 些 分 子 被 称 为 细胞 周期 蛋白 (cyclin) ,此 后 在 其 他 包括 酵母 和 糊 椎 动物 的 真 核 生 物 中 也 发 现 了 cyclin。MPF 的 第 二 类 成 分 是 了 型 cyclin。 MPF 的 活性 在 有 催化 作用 的 激酶 亚 基 , 但 依赖 于 细胞 周期 蛋白 亚 基 的 构象 改变 而 促 进 其 活性 。 所 以 细胞 周期 激酶 被 称 为 细胞 周期 蛋白 依赖 激酶 (cyclin-dependent kinase， CDKs) ,以 CDK-cyclin 全 酶 形式 发 挥 作 用 。 这 种 细胞 周期 调节 方式 在 真 核 细 胞 中 是 保守 的 。 酵母 和 动物 细胞 周期 中 CDK-cyclin 的 差异 从 酵母 中 得 到 很 多 潜在 的 CDK, 但 只 有 了 酿 酒 酵母 的 CDC28 和 栗 酒 酵母 的 Cdc2 看 来 是 直接 参与 细胞 周期 调控 ,分别 为 G - S 和 Gz - M 的 过 渡 所 需 。 动 物 细胞 中 有 更 多 的 CDKs。 第 一 个 被 发 现 的 ,可 能 是 MPF 的 分 子 是 p34“, 专 一 性 在 G - M 的 过 渡 中 发 挥 作 用 。 动 物 细胞 中 发 现 有 十 多 个 CDKs， 其 中 五 个 在 细胞 周期 早期 阶段 发 挥 作用 。 ， 殉 因为 在 动物 和 酵母 中 ,不 同 的 细胞 周期 阶段 合成 不 同 的 细胞 周期 蛋白 ,所 以 细胞 周期 蛋白 的 多 样 性 更 其 于 CDKs。 至 少 有 八 个 家 族 的 肴 椎 动物 的 细胞 周期 蛋白 (命名 为 A- H)。 因 为 CDKs 在 细胞 周期 的 不 同 阶段 过 渡 时 作用 于 不 同 的 底 物 ,所 以 细胞 周期 蛋白 不 仅 为 激酶 活性 所 需 ,还 为 底 物 专 一 性 所 需 。 在 动物 中 ,不 同类 型 的 细胞 表达 不 同 的 细胞 周 期 蛋白 ,这 样 有 助 于 不 同 分 化 细胞 对 细胞 周期 特异 的 调控 ,在 所 有 器 官 中 主要 有 三 种 类 型 的 细胞 周期 蛋白 :G 期 细胞 周期 蛋白 调节 Gi - S 的 过 渡 ;S 期 细胞 周期 蛋白 为 DNA 复制 所 需 ;M 期 细胞 周期 蛋白 在 有 丝 分 裂 中 发 挥 作用 。M 期 细胞 周期 蛋白 包括 酿酒 酵母 (S. cerevisiae)CLB 细胞 周期 蛋白 、 关 椎 动物 A 型 和 B 型 细胞 周期 蛋白 以 及 粟 酒 酵母 的 Cigl3。 它 们 是 稳定 的 蛋白 ,都 有 一 个 称 为 破坏 盒 (destruction box) 的 保守 基 序 ,破坏 盒 是 触发 泛 肽 化 (参阅 ) 所 需 ,使 蛋白 在 有 丝 分 裂 过 程 中 降解 。 其 他 细胞 周期 蛋白 在 遗传 上 不 稳定 ,含有 PEST 结构 域 ( 参 阅 ) ,它们 的 表达 水 平 由 其 基因 的 转录 激活 所 决定 。 所 有 的 细 胞 周期 蛋白 都 有 保守 的 CDK 结合 所 需 的 细胞 周期 蛋 自 盒 (cyclin box) ,参见 图 2.3。 酵 母 和 动物 细胞 的 CDKs 和 细胞 周期 蛋白 在 表 2.3 中 得 到 总 结 。 表 2.3 酵母 和 哺乳 动物 不 同 细胞 周期 阶段 的 CDKs 和 细胞 周期 蛋白 阶段 酿酒 酵母 栗 酒 酵母 哺乳 动物 G CDK:CDC28 CDK:Cdc2 CDK:CDK2 ,4,5,6 Cyclin:CLN1-3 Cyclins:Cig2 Cyclins:D1-3 CDK:CDK2 Cyclins: 下 型 S 期 CDK:CDC28 CDK:Cdc2 CDK:CDK2 Cyclins:CLNS ,CLN6 Cyclins:Cig2 ? Cyclins:A 型 Gz/M 期 ”CDK:CDC28 CDK:Cdc2 CDK:CDK1(CCDC2) Cyclins:CLB1-4 Cyclins:Cdc13 Cyclins:A 和 了 B 型 在 哺乳 动物 细胞 周期 的 Gi 期 中 的 两 种 CDK -周期 蛋白 系统 是 有 活性 的 。CDK2 -周期 蛋白 下 复合 体 对 于 Gi-S 过 渡 是 必需 的 。 其 他 的 CDKs 和 周期 蛋白 D 负责 解释 来 自 环境 的 生长 因子 信号 ,作用 限制 位 点 开辟 了 细胞 进入 新 的 Gi 期 和 Go 期 。 哺 乳 动 物 的 CDK -细胞 周期 了 B 复 合体 是 MPF - 肴 椎 动物 和 酵母 Cdc2/CDC28 的 同 源 物 , 称 为 Cdc2 或 CDK1。CDK7/H- 周 期 蛋白 是 CAK ,哺乳 动物 CDK Thr - 161 激酶 ,CDK7VZH -周期 蛋白 被 认为 是 连续 表达 的 。 图 2.3 cyclin 的 结构 域 。(1) 含 PEST 结构 域 的 cyclin 易 被 蛋白 降解 ,很 不 稳定 。 这 一 类 包括 酿 酒 酵 母 的 CLN cyclin 和 肴 椎 动物 的 CD 和 FE 型 cyclin。 大 部 分 是 GrMS cyclin。(2) 有 丝 分 裂 cyclin 在 间 期 中 比较 稳定 ,包含 一 M 期 泛 肽 依赖 降解 所 需 的 破坏 盒 。 第 一 个 cyclin 是 根据 其 活性 的 变 化 分 离 得 到 的 ,但 有 些 在 体内 表达 稳定 ,根据 cyclin 同 源 性 定义 。 CDK-cyclin 活性 的 调节 ”细胞 周期 转换 最 显著 的 特点 是 CDK 活性 的 爆发 , 它 又 然 打 开 细胞 周期 事件 中 靶 蛋 白 进 入 磷酸 化 状态 的 开关 。 因 为 细胞 周期 蛋白 在 细胞 中 是 逐步 积 。 29 。 累 , 只 有 有 丝 分 裂 中 细胞 周期 蛋白 快速 被 蛋白 酶 降解 ,所 有 激酶 活性 的 爆发 并 不 是 通过 细 胞 周期 蛋白 的 合成 和 降解 来 调节 的 。 CDKs 磷酸 化 靶 和 蛋白, 但 其 本 身 也 为 磷酸 化 所 调控 (参见 第 28 章 信号 转 导 )。 酵 母 的 CDC28 和 Cdc2 的 CDKs 在 两 个 关键 的 残 基 Tyr- 15 和 Thr - 161 上 磷酸 化 ,。Thr- 161 的 磷酸 化 是 激酶 活性 所 需 , 但 Tyr- 15 的 磷酸 化 可 以 抑制 Thr - 161 的 磷酸 化 。 在 酵母 中 决定 CDK-cyclin 活性 的 是 Tyr- 15 的 磷酸 化 状态 ,一些 上 游 调控 成 分 已 被 发 现 。 在 票 酒 酵母 中 ,Weel 是 可 以 磷酸 化 Cdc2 Tyr - 15 的 酷 氨 酸 激 酶 ,并 灭 活 Cdc2。Weel 活性 为 Cdc25 磷酸 脂 酶 所 括 抗 ,Cdc25 可 以 将 同样 底 物 上 的 磷酸 基 团 移 去 。Weel 和 Cdc25 本 身 为 内 外 信和 号 所 调节 ,被 认为 是 此 物种 中 G - M 关卡 的 基础 分 子 。 是 进入 有 丝 分 裂 还 是 阻 滞 在 G; 期 反映 了 这 两 种 活性 的 相对 水 平 , 对 这 一 关卡 的 反应 调节 网 络 在 下 文中 进行 讨 论 。 在 哺乳 动物 细胞 中 也 发 现 了 rwee1 和 cac 25 的 同 源 蛋 白 ,在 哺乳 动物 中 情况 更 复杂 ， 因为 有 针对 不 同 CDK-cyclin 复合 物 的 多 种 异 构 体 。 哺 乳 动物 的 CDC2(CDK1) 有 三 个 磷 酸化 位 点 ,Thr- 14 和 Tyr- 15 的 磷酸 化 抑制 激酶 活性 ,而 Thr- 161 的 磷酸 化 是 激酶 活 性 所 必需 的 。 使 Thr - 161 磷酸 化 的 蛋白 已 经 被 发 现 , 是 另 一 CDK-cyclin 复合 物 , 由 CDK7 和 cyclin H 组 成 , 称 为 CDK 激活 激酶 (CDK-activating kinase，CAK)( 人 参见 TFIIH)。 使 Thr- 14 位 磷酸 化 的 蛋白 激酶 目前 还 未 发 现 。 CDK - cyclin 复合 物 也 为 抑制 蛋白 所 调节 。 内 源 和 外 源 的 调节 通过 三 个 水 平 来 实 行 。 如 下 文 将 讨论 的 , 栗 酒 酵母 Ruml 蛋白 是 一 专 一 性 有 丝 分 裂 CDK-cyclin 复合 物 的 抑 制 蛋白 ,在 整个 G; 和 S 期 合成 ,防止 细胞 周期 越过 DNA 复制 进入 有 丝 分 裂 。 酿 酒 酵母 的 FAR1 蛋白 被 交配 型 信息 素 激 活 ,抑制 起 点 CDK-cyclin 复合 物 ,使 细胞 处 于 G; 期 ,等 竺 交配 的 进行 。 哺 乳 动物 中 发 现 两 个 家 族 的 CDK-cyclin 抑制 剂 (CDK-cyclin inhibitors， CKI) 。 一 类 抑制 所 有 的 CDK-cyclin 活性 , 另 一 类 专 一 性 抑制 含 CDK4 和 CDK6 的 了 型 细胞 周期 蛋白 复合 物 (它们 的 主要 底 物 是 成 视网膜 细胞 瘤 易 感 蛋 白 , Rb)。 这 些 调节 机 制 将 在 下 文中 详细 讨论 。 2.4 细胞 周期 的 进行 酵母 中 起 点 关卡 的 通过 ”起 点 (START) 是 酿酒 酵母 中 主要 的 细胞 周期 关卡 ,在 此 物种 已 被 很 好 地 阐明 (图 2.4)。 在 G; 期 ,CDC28 的 CDK 可 以 和 三 种 细胞 周期 蛋白 (CLN1， CLN2,CLN3) 中 的 任何 一 种 结合 。 这 三 种 cyclin 至 少 在 实验 室 条 件 下 具有 荔 能 宛 余 性 三 种 中 的 一 个 或 一 对 缺失 后 不 影响 表 型 ,但 三 个 同时 突变 使 细胞 阻 滞 在 G 期 )。 高 度 不 稳定 的 CLN3 的 表达 是 组 成 型 的 ,可 以 作为 细胞 生长 的 指示 。 当 CDC28-CLN3 浓度 达 到 一 定 水 平 ,激酶 激活 两 个 转录 因子 SBF 和 MBF 的 表达 ,这 两 个 转录 因子 都 有 一 共同 的 成 分 :SWI6。SBF 启动 G; cyclin 所 需 基 因 CLN1 和 CLN2 的 转录 。 这 些 细 胞 周期 蛋白 和 CDC28 结合 形成 CDK-cyclin 复合 物 激 活 六 个 CLB 细胞 周期 蛋白 (有 丝 分 裂 细 胞 周期 蛋 白 CLB1,CLB2,CLB3,CLB4 和 S 期 细胞 周期 蛋白 CLB5,CLB6) ,这 些 细胞 周期 蛋白 都 有 保守 的 破坏 盒 。 首 先 它 们 减缓 了 CLB 细胞 周期 蛋白 的 蛋白 酶 降解 ,其 次 增加 了 CDK- CLB 抑制 剂 SIC1 的 水 解 速度 。 已 遇 2 一 细 饥饿 “交配 ”大 小 | CemD Go 主 于 复制 基因 Stel | ee 本 图 2.4 酬 酒 酵母 中 起 点 分 子 调节 的 总 结 。CLN3 是 细胞 大 小 的 指标 (点 线 表示 ) ,达到 临界 浓度 后 ,CDC28 的 激酶 活性 被 诱导 并 激活 两 个 转录 因子 。SBF 促进 CLN -3 转录 ,产生 一 正 反馈 通路 。 由 于 饥饿 CLN2 的 蛋白 酶 降解 能 延缓 进入 S 期 。MBF 激活 CLN5 和 CLN6 基因 ,同时 被 激活 的 CDC28 激酶 抑制 cyclin 的 降解 并 促进 抑制 剂 SIC1 的 降解 。CLN5 和 CLN6 与 激活 复制 基因 的 表 达 的 CDC28 形成 复合 物 。 第 二 个 转录 因子 MBF 启动 CLB5 和 CLB6 基因 转录 ,通过 刺激 S 期 细胞 周期 蛋白 的 转录 增加 它们 的 稳定 性 。Gi 期 专 一 性 的 CDK-cyclin 复合 物 当 细胞 生长 足够 时 开始 进入 S 期 。S 期 专 一 性 的 CDK-cyclin 复合 物 刺 激 复制 蛋白 的 转录 或 激活 ,这 可 能 包括 建立 识 别 酵 母 ARS 元 件 上 复合 体 的 结构 区 (参见 第 26 章 复 制 )。 细胞 只 有 在 有 丝 分 裂 结束 后 才能 通过 START 这 一 起 点 ,在 栗 酒 酵母 中 是 通过 一 负 反馈 机 制 来 完成 的 :有 丝 分 裂 CDK-cyclin 复合 物 抑 制 DNA 复制 起 始 所 需 蛋白 Cdc18。 在 没有 Cdcl8 活性 时 ,DNA 的 复制 中 断 , 当 有 丝 分 裂 激 酶 被 破坏 后 ,抑制 效应 去 除 ( 见 下 启 站 哺乳 动物 细胞 进入 S 期 在 哺乳 动物 细胞 中 ,四 个 CDK (CDK2, CDK3, CDK4 和 CDK6) 在 Gi 早期 起 作用 。 四 个 都 与 D cyclin 结合 ,D cyclin 以 生长 因子 依赖 的 形式 (生长 因子 对 细胞 周期 的 调节 在 下 文中 讨论 ) 在 Gi 期 早期 合成 。CDK4 和 CDK6 在 调节 下 游 事 件 中 起 主要 作用 。 目 前 所 知 的 这 些 早期 G; 期 CDK-cyclin 复合 物 的 底 物 是 成 视网膜 细胞 瘤 易 感 蛋 白 RB- 1,RB- 1 是 细胞 周期 负 调 控 因 子 。 非 磷酸 化 状态 的 和 转录 因子 E2F 结 合 ,E2F 正常 情况 下 激活 进入 S 期 所 需 基因 。RB- 1 通过 两 种 途径 抑制 这 些 基 因 的 表达 : 阻 断 E2F 的 激活 结构 域 和 直接 抑制 染色 质 的 重建 。CDK - D cyclin 复合 物 对 RB-1 的 磷 酸化 ,去 除了 RB= 1 的 抑制 作用 。CDK-D-cyclin 激活 的 一 重要 下 游 作 用 是 E cyclin 的 激 活 ,E cyclin 是 G -=S 过 渡 所 需 的 蛋白 。E cyclin 和 CDK2 形成 复合 物 ,然后 激活 CDC25A 磷酸 酯 酶 ,CDC25SA 接着 可 以 激活 S 期 专 一 性 的 CDK2/A cyclin 复合 物 。 这 一 复合 物 是 复制 起 始 所 需 , 可 以 与 PCNA( 参 阅 ) 一 一 真 核 细 胞 DNA 聚合 酶 的 成 分 之 一 一 一 一 起 免疫 共 沉 淀 ,定位 于 复制 起 始点 。 起 始 复合 物 的 靶 蛋 白 还 有 竺 进一步 研究 ,cyclin A 和 cyclin 下 复合 物 可 以 磷酸 化 和 调节 转录 因子 (如 E2F 家 族 .p53、B-Myb 和 蛋白 螺旋 - 环 - 螺旋 抑制 蛋白 Id2 ) 的 活性 。 每 一 细胞 周期 只 复制 一 次 的 限制 上 面谈 到 的 细胞 融合 表明 S 期 的 核 可 以 诱导 Gi 期 5 人 人 核 进入 复制 ,但 G; 或 M 期 的 核 不 行 ,只 有 完成 有 丝 分 裂 后 才 有 DNA 复制 的 能 力 。 不 管 在 何 种 情况 ,复制 在 一 个 细胞 周期 中 只 进行 一 次 。 一 个 试图 解释 这 些 结 果 的 模型 涉及 复 制 许可 因子 (replication licensing factor) ,有 如 下 特性 : 。 在 有 丝 分 裂 后 期 和 DNA 复制 起 始点 相互 作用 。 为 DNA 复制 起 始 所 必需 ,但 一 旦 复制 起 始 它 就 被 灭 活 或 降解 。 ”不 能 通过 核 膜 这 种 模型 假设 复制 许可 因子 在 有 丝 分 裂 末 期 , 核 膜 重 组 之 前 与 DNA 复制 起 始点 结 合 。 这 种 因子 为 刺激 进入 S 期 的 CDK-cyclin 复合 物 的 调节 目标 ,在 S 期 开始 时 启动 复制 起 始 。 在 细胞 周期 的 其 他 时 间 内 ,新 的 许可 因子 不 能 进入 细胞 核 ,重复 的 复制 起 始 被 抑 制 。 因 子 在 有 丝 分 裂 开 始 时 进入 细胞 核 ,保持 非 活性 状态 或 因为 染色 质 凝 聚 状 态 的 原因 不 能 与 DNA 相互 作用 。 当 染色 质 构象 去 凝聚 状态 时 ,因子 与 复制 起 始点 作用 ,但 仍 保 持 非 活 性 状态 ,等 待 S 期 信号 。 核 膜 形成 阻止 其 他 因子 进入 细胞 核 ,任何 核 内 未 结合 的 和 细 胞 质 中 的 因子 就 被 降解 。 在 非洲 爪 蟾 属 ( Xezozpws ) 哺 乳 动物 和 酵母 中 ,很 多 有 许可 因子 特性 的 蛋白 已 被 发 现 。 在 酿酒 酵母 中 , CDC 46 基因 产物 就 被 认为 是 许可 因子 或 其 中 的 一 个 成 分 。 尽 管 酵 母 的 细胞 核 膜 在 有 丝 分 裂 的 过 程 中 并 不 破坏 而 许可 因子 通过 转运 可 进入 细胞 核 。 控制 进入 有 丝 分 裂 ”在 酵母 中 调节 起 点 START 的 细胞 周期 蛋白 依赖 激酶 (Cdc2 ， CDC28) 也 同样 控制 进入 有 丝 分 裂 , 但 与 有 丝 分 裂 的 细胞 周期 蛋白 结合 。 有 丝 分 裂 的 细胞 周期 蛋白 在 酿酒 酵母 中 由 CLB 1 ,CLB2 ,CLB3 和 CLB4 基因 编码 ,在 栗 酒 酵母 中 由 cdc 13 基因 编码 。 在 关 椎 动物 中 ,CDK1(CDC2) 激 酶 与 酵母 中 相对 应 的 A 和 也 型 细胞 周 期 蛋白 都 有 有 丝 分 裂 破坏 盒 。 在 栗 酒 酵母 中 发 现 了 很 多 与 调节 G - M 期 关卡 相关 蛋白 ， 在 真 核 细 胞 中 也 得 到 了 类 似 蛋 白 。 最 关键 的 是 ,有 丝 分 裂 通过 翻译 后 正 反 馈 机 制 , 使 Cdc2 活性 爆发 启动 (这 与 在 酿酒 酵母 中 通过 转录 后 反馈 机 制 进 入 S 期 不 同 )。 这 种 机 制 在 整个 真 核 生 物 中 是 保守 的 ,但 进入 有 丝 分 裂 关 卡 的 调节 如 下 文 讨论 的 是 通过 不 同 途 径 。 在 栗 酒 酵母 ,Cdc2 细胞 周期 依赖 激酶 主要 为 Tyr - 15 的 磷酸 化 调节 (图 2.5)。 它 由 Cdc25 和 另 一 个 磷酸 酯 酶 Pyp3 去 磷酸 化 激活 ,而 被 激酶 Weel 和 Mikl 灭 活 。G; 期 到 M 期 的 转换 与 Cdc2 激酶 活性 的 破坏 相 一 致 ,Cdc2 激酶 由 一 个 正 反 馈 途 径 来 调节 ,在 此 途径 中 ,Cdc2《vCdcl3 激酶 磷酸 化 并 激活 Cdc25 ,再 使 Cdc2 去 磷酸 化 和 激活 (Cdc2 也 可 使 Weel 失 活 )。 这 样 激 酶 活性 的 突然 增加 促进 了 很 多 靶 蛋 白 的 磷酸 化 状态 的 改变 ,有 效 地 转换 了 启动 有 丝 分 裂 的 开关 ( 表 2.4)。Weel 和 Cdc25 加 工 内 源 信 和 号 并 汇集 了 来 自 环境 的 信和 号 ， 可 能 是 主要 的 关卡 调节 因子 。 激 酶 Niml 对 细胞 的 营养 状态 作出 反应 ,调节 Weel 的 活 性 。 一 组 基因 ,包括 cdc 18 ,cat1I 和 cut5 ,监测 DNA 复制 是 否 完成 和 有 无 受 损 DNA 的 存在 ,它们 的 蛋白 产物 被 认为 形成 一 识别 复合 物 ,为 Radl, Rad3, Rad8, Radl17, Rad26 和 Husl 检测 。 这 些 信 和 号 的 下 游 目 标 可 能 是 Cdc25 或 Weel ,或 者 两 者 都 是 。 最 近 发 现 Rad3 磷酸 化 Chkl ,Chkl 进一步 磷酸 化 Cdc25 ,使 其 不 能 与 14-3-3 和 蛋白 形成 复合 物 。 在 哺乳 动物 细胞 中 ,还 有 不 依赖 于 Tyr - 15 磷酸 化 的 调节 CDC2 激酶 活性 的 调节 机 制 。 酿酒 酵母 缺乏 明确 的 G, 期 ,DNA 损伤 和 DNA 复制 的 关卡 与 上 述 不 同 。 在 这 种 物种 中 ,细胞 形成 纺锤 体 , 对 DNA 损伤 和 未 完成 的 DNA 复制 的 反应 是 在 中 期 阻 滞 。 关 卡 调 控 的 靶 是 后 期 促进 复合 物 (APC, 见 下 文 ) , 它 是 通过 泛 素 与 有 丝 分 裂 的 cyclin 破坏 盒 相 连 28 日 本 <、 Chkl Cee3) wise 人 训 国王 人 人 -了 (Tyr-15) Radl, Rad3, Rad9 一 一 -全 Rad17, Rad26, Husl 和 4p0yrl5 Ge 1 cdcl8, Cdtl Cut5 PypPlPyP2 、 | SS | 人 1 DNA 损伤 Gi DNA 复制 不 完全 营养 状态 图 2.5 栗 酒 酵母 中 进入 有 丝 分 裂 的 调控 。 进 入 有 丝 分 裂 需 要 激活 Cdc2/Cdc13 激酶 ,它们 再 进 一 步 磷酸 化 和 激活 细胞 结构 改变 所 需 的 一 系列 蛋白 。Cdc2/Cdcl13 活性 主要 由 Cdc2 Tyr- 15 的 磷 酸化 调控 ，Cdc25 磷酸 酯 酶 和 Weel 激酶 对 Tyr- 15 磷酸 化 起 相反 的 调节 作用 。 这 些 调节 因子 本 身 由 内 源 和 外 源 信号 调节 (正如 正文 中 所 述 , 如 不 完全 DNA 复制 营养 状况 ) 。 接 来 促进 分 裂 期 进入 中 -后 期 。DNA 损伤 关卡 可 以 被 PDS1 蛋白 调节 ,PDS1 控制 姐妹 染 色 单 体 的 分 离 或 直接 抑制 APC 起 作用 。 有 趣 的 是 , 梨 曲 霉 (Aspergilius midxlazs ) 的 DNA 复制 关卡 涉及 Cdc2( 通 过 Weel 和 Cdc25) 和 下 游 成 分 NimA 激酶 的 控制 (通过 wmFE 基因 的 产物 ) ,BimE 是 梨 曲 霉 APC 的 成 分 。 有 丝 分 裂 M 期 的 CDK-cyclin 复合 物 有 丝 分裂 时 使 其 结构 的 改变 (染色 质 凝 聚 、 纺 锤 体 组 装 、 细 胞 核 重建 和 细胞 动力 学 机 制 的 组 建 ) ,磷酸 化 靶 蛋 白 , 尽 管 目 前 只 有 个 别 蛋 白 被 阐明 ( 见 表 2.4)。 一 个 重要 的 但 可 能 不 是 直接 的 M 期 激酶 的 靶 蛋 白 是 后 期 促进 复合 物 (anaphase-promoting comples,APC) ，APC 是 破坏 盒 依赖 的 泛 素 连接 酶 ,有 助 于 有 丝 分 裂 细胞 周期 蛋白 (在 动物 中 分 裂 期 的 cyclin A 和 中 期 -中 后 期 转换 时 的 cyclin B 一 一 不 同 的 时 期 可 能 会 反映 破坏 盒 的 效率 ) 的 快速 降解 。 其 他 APC 的 靶 包 括 维持 姐妹 染色 单 体 所 需 蛋白 ,可 能 是 着 丝 粒 的 成 分 或 是 更 广泛 分 布 的 因子 ,如 上 文中 所 讨论 的 ,酿酒 酵母 中 的 一 候选 者 是 PDS1。 另 一 个 M 期 激酶 的 重要 靶 蛋 白 是 肌 球 蛋白 的 轻 链 , 它 的 磷酸 化 状态 阻 止 与 肌 动 蛋白 的 结合 和 胞 质 分 裂 所 需 细胞 骨架 环 的 形成 。 细 胞 周期 蛋白 B 的 降解 依赖 于 有 丝 分 裂 纺锤 体 上 染色 质 的 排列 ,所 以 APC 的 形成 可 能 依赖 于 着 丝 粒 的 附着 并 为 未 附 着 的 着 丝 粒 所 抑制 。M 期 激酶 的 失 活 (为 cyclin B 的 降解 所 抑制 ) 允 许 M 期 激酶 的 底 物 如 肌 球 蛋白 去 磷酸 化 ,这 有 利于 胞 质 分 裂 所 需 的 细胞 骨架 的 组 织 , 核 纤 层 重建 和 染色 质 去 凝聚 状态 。 细 胞 保证 有 丝 分 裂 事 件 按 正 确 的 顺序 进行 ,细胞 周期 作为 整体 ,组 织 成 为 一 系 列 相互 依赖 的 事件 ( 表 2.5)。 9 人 表 2.4 M 期 开始 后 细胞 结构 的 变化 和 M 期 激酶 的 功能 底 物 在 有 丝 分 裂 中 的 功能 Cdc25 正 反馈 途径 使 M 期 激酶 活性 骤然 出 现 分 裂 后 期 促进 复合 物 (可 能 是 非 直接 底 “_ 负 反馈 途径 诱导 细胞 周期 蛋白 的 降解 ,引起 M 期 起 始 时 激酶 活性 的 瞬时 物 ) 爆发 组 蛋白 HL ,HMG 蛋白 染色 质 凝 聚 TFIID,TFIIIB, 多 聚 腺 味 叭 聚合 酶 抑制 基本 的 转录 SBF,SWI5( 酿 酒 酵母 ) 调节 转录 (SWIS 的 磷酸 化 抑制 细胞 核 输入 ) 核 纤 层 蛋白 核 纤 层 蛋白 的 磷酸 化 使 核 纤 层 蛋白 解 聚 引起 破坏 核 屋 和 驱动 核 膜 溶解 RMSA( 有 丝 分 裂 纺锤 体 组 建 调 节 因 子 ) “有丝分裂 纺锤 体 组 建 波形 蛋白 Vimentin 细胞 骨架 重建 钙 调 (结合 ) 蛋 白 (Caldesmon)， 肌 球 蛋 ， 钙 调 ( 结 合 ) 蛋 白 是 肌 动 蛋白 丝 调节 因子 , 肌 球 蛋白 轻 链 与 肌 动 蛋白 相互 白 轻 链 作用 在 胞 质 分 裂 的 位 置 形成 收缩 环 。 它 们 的 磷酸 化 抑制 其 活性 Caesein 激酶 IIw 和 B 亚 基 ,c-Src,c-AbI ”具有 调节 作用 或 其 他 特异 性 下 游 目 标的 蛋白 激酶 表 2.5 有 丝 分 裂 不 同 阶段 的 重要 细胞 事件 和 以 楷体 表示 的 分 子 机 制 (已 知 的 ) 阶段 重要 事件 前 期 M 期 激酶 激活 。 染 色 质 凝聚 ,有 丝 分 裂 纺锤 体 开 始 形成 。 这 些 可 能 是 M 期 激酶 直接 磷酸 化 靶 蛋 (prophase) 白 所 致 。 前 中 期 在 后 生动 物 中 , 核 膜 破裂 允许 纺锤 体 接 近 染 色 体 。 一 些 纺锤 体 的 微 管 连接 着 丝 粒 。 细 胞 核 的 重 (prometaphase) 建 直接 受 M 期 激酶 的 调节 。 当 所 有 的 染色 体 都 附着 在 纺锤 体 上 ,APC 被 CDC20/Slpl 激活 ， 随 之 是 MADABUB 途径 的 抑制 。 中 期 Cyclin A 降 解 。 染 色 体 通过 附着 在 着 丝 粒 上 的 纺锤 体 , 由 两 极 的 纺锤 体 的 拉力 引导 人 中 期 板 (metaphase) (metaphase plate) 。 后 期 (二 ba) Cyclin 了 降解 ;M 期 激酶 失 活 。 配 对 的 着 丝 粒 由 于 微 管 的 缩短 而 向 两 极 分 离 ; 两 极 也 由 于 微 管 的 极 性 分 开 。 负 责 cyclin B 降解 的 蛋白 酶 解 机 制 可 能 还 触发 姐妹 染色 单 体 结合 的 蛋白 (Sccl7 Mecdl)。 这 一 阶段 必须 在 染色 体 排列 完成 后 进行 。 早 中 期 中 阻止 cyclin B 降解 和 过 早 分 裂 的 信号 特点 目前 还 不 得 而 知 , 但 这 组 成 了 一 个 细胞 周期 中 的 主要 关卡 。 末期 M 期 激酶 的 底 物 去 磷酸 化 (包括 肌 球 蛋白 轻 链 , 核 纤 层 蛋白 ,组 蛋白 )。 染 色 体 达到 两 极 , 核 膜 重 (telophase) 建 , 染 色 质 去 凝聚 ,收缩 环 装配 。 起 质 分 列 收缩 环 装配 完成 。 细 胞 绊 缩 在 残存 的 纺锤 体 附近 ,细胞 分 虱 成 两 个 子 细胞 。 (cytokinesis) 2.5 动物 中 特殊 的 细胞 周期 系统 从 细胞 周期 中 退出 ”如 上 文中 所 讨论 的 ,在 Gi 期 的 一 定 阶 段 中 动物 细胞 在 生长 因子 消失 导致 停止 生长 并 从 细胞 周期 中 退出 ,进入 静止 期 Go。 这 可 能 是 对 生长 因子 缺乏 的 瞬 时 反应 ,或 分 化 的 永久 属性 (如 神经 元 和 肌 细 胞 ) ,或 在 发 育 过 程 中 控制 生长 结构 大 小 。 生 长 因子 缺乏 使 细胞 从 细胞 周期 中 退出 是 因为 生长 因子 是 D cyclin 合成 所 必需 的 ,一 些 非 30 常 不 稳定 的 蛋白 只 有 在 Gi 早期 通过 新 的 转录 产生 。 这 些 转 录 由 生长 因子 信号 的 激活 而 产生 (参见 第 28 章 信号 转 导 )。 简 而 言 之 ,生长 因子 是 酷 氨 酸 激酶 受 体 的 配 体 , 酷 氨 酸 激 “ 酶 通过 Ras,Raf 和 MAP 激酶 启动 信号 传导 通路 ,最 终 激活 核 内 的 转录 因子 。 这 些 转录 因 子 的 靶 蛋 白 是 一 系列 称 为 早早 期 基因 (immediate early genes)。 其 中 一 些 编码 激活 D cy- clin 转录 的 转录 调节 因子 。G 期 细胞 受 生 长 因子 刺激 数 小 时 后 进入 S 期 ,反映 了 D cyclin mRNA 在 细胞 质 中 出 现 的 时 间 。 从 细胞 周期 中 退出 同样 需要 生长 抑制 因子 如 TGF -B 的 促进 ,接触 抑制 信号 或 失去 底 物 。 这 些 分 散 的 信号 通过 小 分 子 细胞 周期 依赖 激酶 的 抑制 剂 (CKIs) 作 用 特异 触发 细 胞 周期 机 器 的 成 分 。 抑 制剂 家 族 p16 通过 防止 CDK-D cyclin 组 装 和 对 RB-- 1( 人 参见 肿瘤 抑制 基因 ) 蛋 白 的 磷酸 化 能 力 特异 性 抑制 其 活性 。p21 和 p27 家 族 抑制 所 有 的 CDK-cy- clin 活性 使 细胞 周期 阻 清 ,它们 通过 抑制 CAK( 本 身 是 CDK-cyclin 全 酶 ) 对 CDK-cyclin D 复合 物 的 激活 达到 目的 ,同时 还 抑制 了 含 cyclin 下 和 cyclin A 复合 物 和 PCNA - DNA 聚合 酶 复合 物 本 身 的 活性 。CKI 也 汇集 内 源 性 途径 的 信号 。DNA 损伤 的 主要 调节 途径 通过 激活 p21 的 p53 调节 因子 起 作用 (参见 第 18 章 癌 基 因 和 癌 )。 与 刺激 D cyclin 合成 一 样 生 长 因子 抑制 许多 上 述 CKI 以 促进 细胞 生长 。 具 有 讽刺 意 味 的 是 ,发 现 p21 或 p27 在 细胞 中 的 始终 存在 ,并 是 正常 有 功能 的 CDK-cyclin 复合 物 的 一 部 分 。 抑 制 蛋白 的 化 学 剂量 的 结合 并 不 影响 激酶 活性 ,而 是 在 高 浓度 时 抑制 作用 才 表 现 出 来 。p21 也 能 直接 与 PCDAVDNA 聚合 酶 $ 亚 基 结 合 ,DNA 损伤 抑制 DNA 复制 比 通 过 CDK -依赖 激酶 的 信号 传导 通路 更 直接 。 细胞 凋 亡 是 细胞 周期 阻 滞 的 另 一 种 方式 ”细胞 凋 亡 (apoptosis) 又 称 为 细胞 程序 化 死亡 (programed cell death) ,是 细胞 对 不 同 的 内 源 和 外 源 信 号 反应 后 启动 细胞 死亡 的 一 种 形式 [和 坏死 (necrosis) 相 反 , 后 者 是 由 于 损伤 . 感 当 和 伤害 所 引起 的 ]。 细 胞 凋 亡 在 发 育 中 起 重要 作用 ,也 是 对 化 学 伤害 和 感染 的 抵御 。 抑 制 细 胞 凋 亡 可 以 引起 癌症 。 凋 亡 中 的 细胞 的 行为 与 坏死 截然 不 同 。 它 涉及 染色 质 的 凝聚 和 外 周 化 、 细 胞 质 的 减 少 , 核 的 片段 化 、 细 胞 器 的 致密 化 ,与 周围 细胞 联系 的 中 断 \ 内 质 网 与 细胞 膜 的 融合 和 最 终 细胞 片段 化 形成 很 多 细胞 凋 亡 体 (apoptotic body) ,被 周围 细胞 知人 。 没 有 像 细 胞 坏死 中 所 见 到 的 发 炎 现 象 。 染 色 质 凝聚 之 前 ,DNA 降解 成 存在 多 个 核 小 体 单 位 的 小 片段 。 控制 细胞 凋 亡 的 重要 细胞 死亡 调节 因子 是 BCL - 2 家 族 。BCL - 2 本 身 是 存活 因子 (survival factor， 即 它 抑制 细胞 凋 亡 ) ,与 在 线虫 (C. elesgazrzs ) 发 育 过 程 中 存活 细胞 表达 的 CED-9 和 蛋白 同 源 。 家 族 中 的 其 他 成 员 ( 如 BAX,BAD 和 BAK) 是 细胞 凋 亡 的 刺激 因子 。 这 些 蛋 白 形 成 二 聚 体 ,与 其 竞争 ,此 反映 了 它们 的 相对 丰 度 ,这 种 竞争 决定 了 细胞 的 命运 。 BCL- 2 信号 的 效应 因子 是 与 白介素 - 18 转化 酶 (ICE 蛋白 酶 ) 相 关 的 半 胱 氨 酸 蛋白 酶 家 族 。 很 多 这 样 的 蛋白 酶 在 哺乳 动物 细胞 中 以 无 活性 的 酶 原 的 形式 合成 ,通过 一 系列 蛋白 酶 解 激 活 ,从 而 使 如 多 聚 ADP 核糖 聚合 酶 和 核 纤 层 等 细胞 凋 亡 的 直接 效应 分 子 的 活性 达 到 最 高 。 引起 细胞 凋 亡 的 信号 传导 途径 还 未 被 完全 阅 明 。 其 中 涉及 p53( 参 见 第 18 章 癌 基因 和 癌 ) 的 是 在 某 些 细胞 类 型 中 (如 皮肤 细胞 ) 对 DNA 损伤 启动 细胞 凋 亡 是 抑制 BCL - 2 和 激活 BAX。 在 其 他 一 些 细 胞 中 ,p53 通过 激活 抑制 CDK - cyclin 复合 物 和 应 激 -激活 蛋白 四 31 中 激酶 (stress-activated protein kinases)( 人 参阅 ) 的 CKI, 使 细胞 阻 清 在 Gi 期 。 这 些 途 径 在 发 育 过 程 (如 肢 芽 的 趾 间 区 ) 中 并 不 起 作用 。 因 为 小 鼠 中 p53 的 同 源 基因 TP 53 缺失 后 发 育 完全 正常 。 其 他 信和 号 ,如 生长 抑制 因子 TGF-B 也 可 诱导 细胞 凋 亡 , 它 是 通过 BCL - 2 家 族 途 径 但 不 依赖 于 p53。 也 有 直接 影响 ICE 家 族 蛋 白 酶 的 信号 途径 。 如 肿瘤 坏死 因子 (TNF) 通 过 胞 浆 中 80 个 残 基 死 亡 结 构 域 (death domain) 启 动 细胞 凋 亡 ,这 结构 域 为 TNF 受 体 和 其 他 一 些 受 体 以 及 胞 内 凋 亡 信 号 分 子 所 共有 (如 TRADD,Fas,MORT1 和 RIP) ,这 些 分 子 都 可 以 激活 ICE 蛋白 酶 。CrmA 是 牛 冶 病 毒 编码 的 ICE 蛋白 酶 的 抑制 剂 。 这 个 存活 因子 可 以 阻 断 由 p53、\TGF-B 和 TNF 所 引起 的 凋 亡 ,使 病毒 在 感染 后 的 免 于 死亡 。 1 《 检 a 扫 。 .32 基本 概念 和 定义 。 真 核 细胞 染色 体 中 的 DNA 通常 是 和 质量 较为 均衡 的 蛋白 质 一 起 以 复合 物 的 形 式 存 在 ,形成 高 度 有 序 的 核 蛋白 物质 , 称 为 染色 质 (chromatin ) 。 染色 质 中 的 蛋白 质 主要 成 分 主要 由 组 蛋白 (histone) 构 成 ;此 外 尚 含 有 少量 其 他 有 蛋 白 ,统称 为 非 组 蛋白 (nonhistone) 。 组 蛋白 相对 比较 均一 ,以 维持 染色 质 结构 的 基 本 形状 ;而 非 组 蛋白 是 不 均一 的 且 执 行 多 种 不 同 的 功能 。 每 条 染色 体 中 的 DNA 则 是 单个 很 长 的 分 子 [ 称 之 为 单线 模型 (unineme model) ] 。 一 个 真 核 细胞 核 的 直径 不 超过 lum, 但 是 它 含 有 10?bp 以 上 的 DNA, 这 样 大 小 的 DNA 分 子 如 果 完 全 延展 开 来 长 度 将 达到 几米 。 因 此 ,这 种 DNA 必需 是 一 种 高 度 折 生 的 ,这 种 性 质 表 述 为 DNA 的 包装 比 (packaging ratio) , 即 细胞 核 内 DNA 的 长 度 与 其 延展 状态 的 理论 长 度 的 比值 。 间 期 核 中 DNA 的 包装 比 约 为 10 。 DNA 包装 成 染色 质 成 分 的 过 程 是 高 度 有 序 化 的 ,经 过 了 一 系列 不 同 级 别 的 结构 次 序 来 完成 。 染 色 质 不 仅仅 是 一 种 物理 结构 , 它 还 是 影响 基因 活性 的 重要 因素 之 一 。 染 色 质 的 组 成 调节 基因 表达 ,并 是 后 生性 细胞 记忆 的 基础 。 3.1 核 小 体 核 小 体 结构 “，” 核 小 体 (nucleosome) 是 染色 质 的 基本 结构 单位 ,几乎 在 所 有 真 核 生 物 中 都 有 存在 ,除了 双 凌 甲 藻 (dinoflagellate) 以 外 ,结构 保守 。 当 细胞 核 在 低 盐 溶液 中 裂解 时 ， 染色 质 解 聚 、 核 小 体 以 串珠 状 的 形式 释放 出 来 。 核 小 体 与 DNA 之 间 的 结构 关系 可 以 通过 核酸 酶 的 作用 加 以 阐明 (图 3.1)。 解 聚 后 的 染色 质 经 过 核酸 酶 的 部 分 消化 分 离 ,成 为 由 单个 核 小 体 单位 (mononucleosome) 或 多 联 核 小 体 组 成 的 短小 片段 。 与 单个 核 小 体 结合 的 DNA 长 度 是 恒定 的 ,一 般 在 200bp 左右 (精确 长 度 具 有 种 属 和 细胞 类 型 的 特异 性 )。 经 过 消化 裂解 后 的 染色 质 所 释放 出 的 DNA 通过 电泳 分 离 ,可 以 呈现 出 与 单个 核 小 体 DNA 长 度 的 整数 倍 的 阶梯 状 特征 谱 图 ,表明 核 酸 酶 的 前 切 作用 位 点 是 在 每 个 核 小 体 之 间 相 对 恒定 的 位 置 上 。 在 大 多 数 物种 中 , 核 小 体 DNA 在 核酸 酶 的 进一步 消化 作用 下 其 长 度 可 以 缩短 为 165bp。 此 过 程 是 通过 一 步 反 应 完成 的 ,提示 在 最 初 的 核酸 酶 剪 切 作用 之 后 , 紧 随 其 后 的 是 DNA 游离 的 末端 被 快速 修剪 。 保 留 在 核 小 体 上 的 DNA -受到 核 小 体 颗粒 蛋白 的 保 33 。 护 ,被 称 为 染色 小 体 (chromatosome) 。 图 3.1 染色 质 中 核 小 体 的 结构 。 释 放 的 DNA 以 串珠 形式 存在 ,串珠 由 核 小 体 通过 连接 DNA 连 接 而 成 ,用 微 球菌 核酸 酶 来 前 切 ,产生 单个 核 小 体 。 经 进一步 消解 切除 大 部 分 连接 DNA, 产 生 单 个 的 染色 小 体 。 经 进一步 消化 ,与 HI 组 蛋白 结合 的 DNA 也 被 切除 , 解 离 出 核 小 体 核 心 颗粒 , 它 含有 余下 的 146bp 的 DNA。 在 核酸 酶 的 继续 消化 作用 下 , 核 小 体 中 的 DNA 长 度 减 小 至 146bp 左右 ,同时 有 少量 的 蛋白 质 成 分 也 从 核 小 体 中 释放 了 出 来 。 这 样 长 的 核 小 体 DNA 在 各 种 真 核 细 胞 中 都 有 存在 ,并 且 具 有 一 定 耐 受 核 酸 酶 作用 的 能 力 。 核 小 体 DNA 的 存在 形式 与 组 成 核 小 体 核 心 部 分 的 蛋白 质 关 系 密切 。 核 小 体 核心 颗粒 (nucleosome core particle) 由 组 蛋白 八 聚 体 和 DNA 组 成 ,四 种 组 蛋白 H2A、H2B\、H3 和 H4 每 种 2 个 拷贝 组 成 八 聚 体 结构 ,长 度 为 146bp 的 核心 DNA 在 组 蛋白 八 聚 体外 环绕 将 近 2 周 。 核 小 体 核心 颗粒 之 间 由 连接 DNA (linker DNA) 相 连 ,连接 DNA 的 长 度 在 不 同 种 属 和 细胞 类 型 之 间 差 异 较 大 。 对 于 大 多 数 的 物种 而 言 ,DNA 进出 核心 颗粒 上 DNA 的 进 端 和 出 端 与 连接 组 蛋白 (linker histone) 一 一 组 蛋白 HL 相 结合 , 在 此 处 HI 将 DNA 的 两 端 封闭 在 一 起 。 核酸 酶 对 染色 质 的 消化 作用 可 概括 如 下 :核酸 酶 最 初 在 连接 DNA 的 特殊 位 点 前 切 ， 然后 修剪 DNA 末端, 直到 受到 组 蛋白 保护 ,而 保留 在 核心 颗粒 上 。 在 核酸 酶 的 进一步 消 解 下 ,与 HL 组 蛋白 结合 的 DNA 也 被 切除 ,HI 的 丢失 表明 HI 组 蛋白 位 于 核心 颗粒 以 外 ， 而 紧 靠 着 它 。 经 过 核酸 酶 作用 后 残余 的 DNA 被 核 小 体 核 心 颗粒 保护 起 来 。 在 酵母 染色 质 中 似乎 没有 连接 组 蛋白 ,因此 在 核酸 酶 的 最 初 消化 作用 下 ,产生 的 单个 核 小 体 DNA 的 长 度 为 164bp, 然 后 经 过 一 步 修剪 成 为 146bp 的 核心 DNA。 连 接 核 小 体 核心 颗粒 之 间 的 DNA 长 度 大 约 为 18bp ,是 已 知 最 短 的 连接 DNA, 然 而 在 酵母 的 基因 组 中 组 蛋白 HI 基因 已 被 鉴定 出 来 。 组 蛋白 ”组 蛋白 是 高 度 碱 性 的 蛋白 质 ( 富 含 带 正 电荷 的 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 残 基 ) , 它 折 秋 形成 一 个 带 有 吓 出 N 端 尾 巴 的 致密 核心 。 这 些 正 电荷 的 残 基 ,可 以 与 DNA 相互 作用 ， DNA 通过 携带 负电 荷 的 DNA 骨 哥 与 蛋白 形成 盐 桥 连接 。 而 组 蛋白 游离 的 尾部 是 翻译 后 sw 3 修饰 的 靶 、 并 能 促进 核 小 体 间 相 互 作用 以 及 与 其 他 染色 质 蛋 白质 之 间 的 相互 作用 。 目 前 已 经 有 几 百 个 组 蛋白 编码 顺序 被 测定 ,显示 出 在 真 核 生物 中 具有 明显 的 保守 性 。 组 蛋白 H3 和 H4 保守 性 最 强 , 各 种 连接 组 蛋白 则 显示 出 很 大 的 多 样 性 。 除 了 H4 组 蛋白 以 外 ,所 有 的 组 蛋白 都 是 以 多 种 同等 型 的 异型 组 蛋白 (isohistone) 存 在 的 ,这 种 现象 与 染色 质 的 超 优势 度 (predominance) 在 不 同 细胞 类 型 中 以 特异 方式 改变 有 关 。 连 接 组 蛋白 显示 出 很 多 的 异型 多 样 性 ,而且 分 成 不 同 亚 类 (HL、H5、H10)。 组 蛋白 具有 特定 结合 形成 各 种 复合 体 的 固有 能 力 ,而 且 不 需要 DNA 的 参与 ,比较 典 型 的 是 (H3 - H4)， 四 聚 体 和 H2A- H2B 二 聚 体 。 每 个 组 蛋白 都 含有 一 个 三 螺旋 的 基 序 , 称 为 组 蛋白 折 丢 (histone fold) , 它 可 促进 相互 作用 。 体 外 实验 证 实 , 组 蛋白 四 聚 体 可 以 与 DNA 组 装 成 核 小 体 样 的 颗粒 ,同时 加 入 其 他 组 蛋白 ,染色 质 就 可 以 目 动 组 装 , 该 过 程 通常 是 缓慢 进行 的 ;而 在 体内 , 核 小 体 的 装配 还 需要 有 分 子 伴 倡 (molecular chaperone) 的 参与 (参阅 )。 用 X 射 线 唱 体 衍射 以 及 化 学 交 联 (cross- linking) 对 组 蛋白 的 八 聚 体 进行 了 研究 ,目前 分 辨 率 已 经 达到 2.8A。H2A-H2B 二 聚 体 存 在 于 中 心 (H3-H4)， 四 聚 体 的 上 下 部 位 ,由 此 形成 圆柱 状 颗粒 的 外 表面 DNA 在 其 上 超 螺 旋 附 着 的 地 方 , 此 表面 是 光滑 的 ,由 于 很 多 弯曲 存在 使 表面 变 成 曲折 不 平 。 当 DNA 进出 组 蛋白 四 聚 体 时 ,会 与 H3 组 蛋白 的 游离 末端 结合 。 所 有 的 组 蛋白 似乎 都 要 经 历 翻译 后 修饰 的 过 程 , 这 种 修饰 作用 通常 发 生 在 NH2 - 末 端 ,并 且 在 大 多 数 情况 下 ,修饰 的 特殊 方式 与 染色 质 功 能 的 变化 相关 。H3 和 H4 组 蛋白 的 乙酰 化 是 易 接 近 的 “开放 "染色 质 标志 之 一 ,但 最 近 也 有 很 多 实验 表明 乙酰 化 与 遗传 活 的 ] ,HI 组 蛋白 的 磷酸 化 程度 是 按 细胞 周期 而 变化 。 各 种 组 蛋白 也 会 被 甲 基 化 、 或 者 与 泛 素 (ubiquitin) 或 多 聚 ADP 核糖 (poly-ADP-ribose) 结 合 , 但 这 种 修饰 作用 的 意义 目前 还 不 十 分 清楚 。 组 蛋白 的 尾巴 长 而 未 形成 一 定 结构 ,这 对 于 核 小 体 之 间 的 相互 作用 是 必需 的 。 因此 组 蛋白 的 修饰 被 认为 是 瓦解 核 小 体 之 间 的 相互 作用 ,并 扰乱 了 高 度 有 序 的 染色 质 。 非 组 蛋白 在 染色 质 中 的 蛋白 成 分 里 ,组 蛋白 占有 相当 大 的 比例 ,而 且 , 在 性 质 上 相对 较为 均一 。 染 色 质 中 其 他 的 蛋白 质 统称 为 非 组 蛋白 (nonhistone protein) ,虽然 含量 很 少 ， 但 表现 出 极端 的 不 均一 性 。 非 组 蛋白 主要 包括 与 DNA 和 组 蛋白 的 代谢 、 复 制 、 重 组 、 转 录 调 控 等 (参阅 ) 密 切 相 关 的 各 种 酶 类 。 它 们 还 包括 形成 染色 质 高 级 结构 的 支架 蛋白 (scaffold protein) 和 高 迁移 率 蛋白 (high mobility group protein,HMG protein) ,这 类 蛋白 携 带 较 高 的 电荷 ,在 染色 质 结构 组 成 以 及 基因 调控 中 发 挥 各 种 各 样 的 作用 。 其 中 核 小 体 结 合 蛋 白 的 HMG14Z17 家 族 可 积聚 于 活化 的 染色 质 上 ,推测 这 一 现象 有 助 于 染色 质 较 高 级 结构 的 解 聚 。HMG IZY 家 族 的 非 组 蛋白 它们 的 确切 作用 还 不 十 分 清楚 ,但 已 知 其 优先 与 含有 AT 重复 序列 的 DNA 相 结合 ;并 且 , 和 HI 型 组 蛋白 类 似 , 它 们 可 以 被 周期 蛋白 依赖 性 激酶 的 激酶 所 磷酸 化 (参见 细胞 周期 章节 的 有 关内 容 )。 在 包装 和 转录 激活 等 过 程 中 ， HMG 蛋白 的 另 一 个 重要 作用 是 使 DNA 产生 角度 较 小 的 弯曲 (sharp bend) ,在 包装 的 过 程 中 DNA 需要 采用 这 种 特殊 的 三 维 构象 ,而 在 转录 过 程 中 ,在 其 相 邻 的 不 同位 点 上 将 结 合 调节 因子 (参见 SRY 因子 ,增强 体 )。 还 有 一 类 非 组 蛋白 是 鱼 精 蛋 自 (protamine) , 它 可 以 促进 DNA 包装 进 精子 头 部 。 这 类 蛋白 排列 在 DNA 双 链 相 邻 的 大 沟 中 ,使 DNA 折 释 下 34 成 高 度 致 密 的 一 束 平行 纤维 结构 。 组 蛋白 -DNA 对 接 和 连接 数 的 矛盾 ”在 DNase I 或 者 自由 基 的 作用 下 , 核 小 体 核心 颗粒 中 的 DNA 可 降解 为 10 一 1lbp 大 小 的 片段 ,这 一 现象 提示 :缠绕 于 组 蛋白 八 聚 体外 的 DNA 是 以 B 型 构象 的 形式 存在 的 (参见 核酸 结构 等 章节 的 有 关内 容 )。 上 述 这 种 剪 切 作 用 可 以 发 生 在 核 小 体 表 面 的 各 种 部 位 ,但 多 发 生 在 其 两 端的 位 置 ,而 很 少 发 生 于 核 小 体 的 中 部 ,这 说 明 当 DNA 缠绕 于 八 聚 体 组 蛋白 的 外 表面 时 ,其 结构 发 生 了 某 种 变化 。DNA 在 核心 颗粒 外 缠绕 2 圈 ,然后 形成 近 1.8 周 的 负 超 螺旋 结构 。 通 过 DNA 结合 成 核 小 体 从 而 形成 超 螺旋 程度 的 检测 实验 结果 则 表明 ,每 个 核 小 体 实 际 只 产生 正好 11 周 的 负 超 螺旋 。 此 矛盾 称 为 连接 数 矛盾 现象 (linking number paradox, 参 见 DNA 拓扑 学 )。 对 上 述 现象 的 一 种 可 能 的 解释 ,是 由 于 核 小 体 中 DNA 的 螺 距 (每 周 螺旋 含有 的 碱 基数 目 ) , 比 游离 DNA 的 要 小 一 些 的 缘故 。 核 小 体 与 DNA 结合 的 位 置 ”” 核 小 体 与 DNA 不 是 随机 结合 的 ,而 是 有 优先 结合 位 点 。 这 种 特性 称 为 核 小 体 分 相 (nucleosome phasing) ,并 可 以 通过 微 球菌 核酸 酶 和 限制 性 内 切 酶 对 染色 质 的 消化 实验 来 证 实 。 上 述 实 验 将 产生 不 连续 的 DNA 片段 ,这 是 因为 相对 于 每 条 染色 质 中 的 核 小 体 而 言 ,DNA 内 部 的 限制 性 酶 切 位 点 总 是 相对 一 致 的 。 核 小 体 分 相 通常 以 两 种 方式 出 现 :或 者 是 通过 特殊 顺序 上 的 组 蛋白 八 聚 体 使 DNA 弯曲 而 定位 ;或 者 是 通过 核 小 体 在 特殊 界面 受到 排斥 而 定位 ,这样 可 获得 两 类 分 相 。 产 生 弯 曲 的 特殊 DNA 序列 有 影响 核 小 体 的 定位 的 趋势 (譬如 启动 和 增强 子 部 分 ) ,正如 其 他 一 些 蛋 白质 对 无 核 小 体 区 域 ,如 启动 子 和 增强 子 区 的 结合 。 对 于 酵母 染色 质 而 言 , 核 小 体 分 相 发 生 于 转录 阻 抑 的 染色 质 上 ; 而 在 活化 的 染色 质 上 , 核 小 体 的 结合 位 置 是 随机 的 。 这 一 现象 提示 : 核 小 体 分 相 可 能 是 起 始 染色 质 高 级 结构 的 形成 所 需要 。 3.2 染色 质 的 高 级 结构 30nm 染色 质 丝 DNA 盘 绕 成 核 小 体 仅仅 是 形成 染色 质 的 一 级 结构 。 当 细胞 核 放 在 低 盐 的 溶液 时 ,染色 质 是 以 典型 的 念珠 状 形式 存在 的 , 即 通常 所 谓 的 10nm 染色 质 丝 (10nm fiber) ,此 时 的 DNA 包装 比 约 为 $, 且 没有 HI 型 组 蛋白 。 而 在 较 高 浓度 的 盐 溶液 中 ,染色 质 以 更 致密 的 形式 存在 ,并 需要 在 H1 组 蛋白 ,形成 直径 25 一 45Snm 的 螺 线 管 样 结构 , 即 为 30nm 染色 质 丝 (30nm fiber)。 虽 然 也 有 人 提出 另 一 种 模型 :如 “Z" 字 型 结构 ;或 者 核 小 体 并 不 形成 规则 结构 ,而 是 以 不 规则 的 团 块 或 者 超 颗粒 (superbead) 以 线性 方式 排列 ,形成 纤 维 。 人 们 根据 30nm 染色 质 丝 的 密度 (30nm 染色 质 丝 是 由 10nm 的 念珠 状 染 色 质 纤维 盘 绕 形 成 的 ,每 图 含有 6 一 8 个 核 小 体 , 而 DNA 的 包装 比 增 大 为 40) ,对 其 结构 提出 了 多 种 不 同 的 结构 假说 ,但 根据 X 射线 衍射 实验 结果 表明 30nm 染色 质 丝 中 的 核 小 体 盘 的 平面 平行 与 螺旋 轴 成 一 定 倾斜 角 。 目 前 关于 连接 区 DNA(linker DNA) 的 功能 和 组 蛋白 Hl 的 位 置 争论 较 多 ,它们 可 能 是 通过 协同 结合 的 方式 形成 极 性 丝 状 体 的 。 染色 质 环 ”处 于 有 丝 分 裂 间 期 的 细胞 核 中 染色 质 的 整体 结构 并 不 十 分 清楚 ,但 推测 *， 36 ， 30nm 染色 质 丝 附着 在 核 基 质 5 (nuclear matrix) 上 的 不 同位 点 ,形成 一 系列 的 环 状 结构 ， 内 含 30 一 100kb 大 小 不 等 的 DNA[ 即 折 丢 纤 维 模型 (folded fiber model) ]。 去 除了 和 蛋白质 成 分 的 染色 质 通 过 扫描 电子 显微镜 可 以 清楚 地 观察 到 这 种 环 状 结构 ,它们 碱 基 与 核 基 质 中 的 支架 蛋白 结合 (参见 灯 刷 染色 体 )。 这 种 环 状 结构 的 功能 学 意义 不 清 , 但 它们 与 以 后 将 要 讨论 的 染色 质 功 能 区 (chromatin domain) 有 关 ,它们 已 经 被 遗传 学 和 生物 化 学 的 分 析 所 鉴别 。 常 染 色 质 和 异 染色 质 ”有丝分裂 间 期 的 染色 质 以 两 种 截然 不 同 的 形式 存在 :一 种 是 较 为 松散 的 常 染 色 质 (euchromatin) ,正如 前 面 所 述 的 , 它 主 要 由 30nm 染色 质 丝 缠绕 、 混 合 而 成 ,多 存在 于 核 质 中 ; 另 一 种 是 高 度 浓缩 的 异 染 色 质 (heterochromatin ) , 以 高 度 有 序 的 结构 形式 存在 于 细胞 核 的 周边 部 位 。 异 染 色 质 通常 处 于 转录 抑制 状态 , 据 推测 它们 高 度 有 序 的 结构 与 有 丝 分 裂 期 的 染色 质 相 似 , 不 含有 转录 调控 蛋白 。 尽 管 DNA 序列 不 是 很 重要 的 决定 因素 , 目前 对 于 异 染 色 质 的 结构 特性 仍 知之 甚 少 , 璧 如 组 成 型 异 染 色 质 (constitutive heterochromatin )( 在 各 种 细 胞 中 任何 时 期 都 是 以 浓缩 的 形式 存在 ,并且 经 常 位 于 着 丝 粒 附近 )。 真 核 细 胞 中 还 含有 兼 性 异 染 色 质 (facultative heteromatin) , 它 在 某 些 细胞 中 是 保持 着 抑制 状态 ; 而 在 另外 一 些 细胞 中 则 恰好 相反 ,例如 失 活 的 又 染色 体 。 似 乎 一 些 特 殊 的 核 蛋 白 和 调节 异 染 色 质 的 结 构 有 关 , 从 几 种 不 同 的 组 织 中 已 分 离 出 可 能 具有 上 述 功能 的 候选 者 ,它们 都 具有 调控 与 花 斑 位 置 效 应 有 关 的 现象 ( 见 下 文 )。 高 等 真 核 细胞 的 异 染色 质 还 含有 比例 较 高 的 经 过 特殊 修饰 的 组 蛋白 ,这 种 现象 与 DNA 甲 基 化 水 平 增 加 有 关 。 中 期 染色 体 有丝分裂 中 期 的 染色 质 处 于 高 度 凝 聚 的 状态 ,此 时 的 染色 体 被 包装 为 微 小 的 、 易 于 分 离 的 独立 结构 。 关 于 染色 质 高 凝聚 状态 (包装 率 10” ) 的 形成 同样 也 不 是 十 分 清楚 。 但 已 知 这 种 高 度 浓缩 的 染色 质 丝 以 环 状 结构 附着 于 蛋白 骨架 之 上 ,形成 由 中 心 螺旋 发 出 的 染色 质 放射 状 环 。 尽 管 还 不 知道 这 些 环 状 结构 与 前 面 讨论 过 的 分 裂 间 期 细胞 核 中 的 染色 质 环 是 否 属 于 同样 的 结构 ,但 这 两 种 结构 形成 所 需 的 DNA 基体 是 相似 的 。 骨架 结构 存在 于 每 一 对 姊妹 染色 单 体 上 的 相应 部 位 ,并且 在 有 丝 分 裂 开 始 时 彼此 连接 起 来 。 有 丝 分 裂 期 的 染色 质 最 显著 的 特点 是 它 虽 然 处 于 高 度 浓 缩 的 状态 ,但 仍然 可 以 保持 在 以 前 分 裂 间 期 时 何 种 基因 具有 转录 活性 、 何 种 被 抑制 的 记忆 能 力 。 同 时 ,在 有 丝 分 裂 期 染色 体 中 DNA 的 包装 也 不 尽 相 同 ,这样 的 组 织 结构 为 随后 的 分 裂 间 期 染色 质 去 凝聚 状 态 时 ,其 开放 或 关闭 染色 质 结 构 域 的 特殊 排列 得 到 恢复 。 有 丝 分 裂 染 色 质 DNA 的 不 同 包装 ,可 以 通过 不 连续 的 染色 体 显 带 (chromosome banding) 技 术 ( 人 参阅 ) 来 显示 。 利 用 该 技 术 处 理 后 的 染色 体 在 显微镜 下 显示 不 同形 式 的 明暗 区 带 ,相应 区 域 的 遗传 学 活性 可 以 通 过 生物 化 学 分 析 来 决定 。 1) 核 基 质 [nuclear matrix, 也 称 为 核 骨 架 (nuclear scaffold) ] ,是 细胞 核 经 过 去 垢 剂 、 核 酸 酶 和 高 浓度 盐 溶液 抽 提 后 所 能 残留 的 结构 成 分 。 它 组 成 纤维 网 格 状 结构 ,将 细胞 核 内 隔 成 许多 独立 的 区 域 , 且 组 成 单个 的 染色 体 。 核 基质 的 成 分 还 不 十 分 清楚 ,已 知 其 中 含有 拓扑 异 构 酶 开 (topoisomerase 工 ) ,这 种 酶 也 是 中 期 染色 体 的 中 心 骨 架 (central scaf- fold) 、 或 者 染色 体 核心 颗粒 (chromosome core) 的 一 种 成 分 。 目 前 虽然 已 经 有 一 些 证 据 表 明了 核 基质 与 DNA 功能 关 系 , 但 是 尚 缺乏 充分 的 证 据 证 实 染色 质 与 核 基质 相互 作用 在 DNA 复制 和 转录 起 始 等 过 程 中 起 作用 。 sa 3.3 染色 质 和 染色 体 的 功能 染色 质 和 从 DNA 中 获取 的 信息 ”DNA 组 成 了 高 度 有 序 的 结构 (在 这 种 结构 当中 ,其 全 长 都 伴随 有 蛋白 质 的 存在 ) ,因此 而 引出 的 问题 就 是 :究竟 何 种 蛋白 质 介 导 DNA 的 功能 。 尤为 特别 的 是 复制 和 转录 必须 在 核 小 体 区 域 进 行 , 同 时 需要 大 量 的 酶 复合 物 参与 ,这些 酶 复合 物 沿 DNA 方 向 持续 移 位 ,但 又 不 围 着 DNA 盘 绕 。DNA 和 RNA 聚合 酶 都 比 核 小 体 大 许多 。 当 DNA 组 成 染色 质 时 ,是 如 何 从 DNA 中 获取 信息 将 是 重要 的 。 在 DNA 复制 时 核 小 体 的 结构 “在 DNA 复制 的 过 程 中 ,在 复制 叉 中 核酸 酶 敏感 性 特殊 模式 在 复制 中 亲 代 双 链 的 分 离 表 明 DNA 的 组 蛋白 被 取代 了 ,游离 的 组 蛋白 很 快 会 与 子 代 DNA 双 链 重新 缔 合 。 在 体外 实验 中 当 组 蛋白 通过 复制 很 快 在 裸露 DNA 上 竞争 性 装 配 成 核 小 体 。 用 扫描 电镜 观察 复制 的 SV40 DNA 证 实 了 这 个 过 程 ,显示 核 小 体 是 以 念珠 状 存在 于 亲 代 链 和 两 条 子 代 双 链 上 很 快 向 复制 叉 靠 近 。 染色 质 的 复制 是 分 散 的 ,而 不 是 保守 的 。 从 亲 代 双 螺 旋 上 解 离 下 的 组 蛋白 表明 并 不 优先 结合 任何 一 条 子 代 的 DNA 双 链 ,而 且 还 会 与 细胞 周期 中 Gi 期 新 合成 积累 下 来 的 组 蛋白 混合 (参见 细胞 周期 )。 在 体内 的 精细 装配 机 制 还 不 十 分 清楚 ,但 一 种 称 为 NIZXN2 的 分 子 伴侣 可 以 通过 将 (H3-H4)， 四 聚 体 装 到 DNA 上 而 启动 核 小 体 的 形成 , 与 之 相对 应 的 另 一 种 分 子 伴侣 核 质 蛋 白 (nucleoplasmin) 则 可 以 促进 H2A- H2B 组 蛋白 二 聚 体 的 停靠 作 用 。 关 于 染色 质 功能 人 们 提出 另 一 个 问题 是 通过 成 功 的 复制 ,染色 质 中 的 活化 和 抑制 区 域 是 怎样 稳定 地 传递 下 来 ,这 似乎 反映 了 伴随 着 复制 叉 的 通过 ,经 特殊 修饰 的 亲 代 组 蛋白 立即 分 配 到 两 条 子 链 上 ,维持 了 原 有 染色 质 的 结构 。 在 复制 过 程 中 ,无论 是 核 小 体 还 是 转 录 复 合 物 ,都 可 以 竞争 占据 DNA 上 重要 的 位 点 ,这 样 ,就 为 细胞 的 变化 趋向 提供 不 同 的 选择 机 遇 ,特别 是 在 复制 过 程 起 始 之 前 ,如 果 有 新 的 转录 调控 因子 合成 的 情形 下 ,这 种 机 制 就 显得 比较 有 意义 了 ,竞争 作用 的 结果 将 会 反映 细胞 内 调控 复合 物 与 DNA 之 间 的 亲 合 能 力 及 其 在 细胞 中 的 有 效 浓度 (参见 下 文 )。 转录 过 程 中 的 核 小 体 结构 ”和 复制 过 程 一 样 ,转录 开始 时 核 小 体 与 DNA 分 离 ,而 紧 随 RNA 聚合 酶 后 核 小 体 又 重新 装配 起 来 。 大 多 数 可 转录 的 基因 都 保持 有 核 小 体 的 结构 ,而 非 转 录 基 因 的 核 小 体 分 相 特殊 模式 不 复 存在 ,结果 经 微 球 菌 核酸 酶 和 限制 性 内 切 酶 消化 后 ,DNA 电泳 显现 为 界限 不 清晰 的 成 片 条 带 , 而 不 是 不 连续 的 条 带 。 检 测 聚 合 酶 复合 物 在 核 小 体 中 作用 的 实验 表明 : 当 酶 复合 物 通过 核心 颗粒 DNA 一 半 位 置 的 时 候 会 暂停 ,这 似乎 说 明 当 酶 试图 通过 核 小 体 释 放 的 第 一 个 螺旋 时 ,染色 质 中 存在 着 一 种 扭 应 力 。 当 酶 通过 这 一 位 和 八 聚 体 组 蛋白 被 解 离 出 来 。 在 酶 作用 之 后 , 八 聚 体 又 与 DNA 重新 结合 ,多 半 是 由 于 八 聚 体 可 能 是 与 非 转 录 链 结合 ;也 可 能 是 它 与 酶 本 身 暂 时 结合 。 转录 水 平 很 高 的 基因 ,如 灯 刷 染色 体 (lampbrush chromosome) (参阅 ) 的 rRNA 基因 ，， 在 其 染色 质 的 构象 是 伸展 的 ,表明 没有 核 小 体 的 结构 存在 。 转 录 延 伸 复 合 物 后 面 的 转录 后 的 DNA 不 能 与 解 离 的 组 蛋白 重新 装配 。 而 在 非常 活跃 的 基因 中 构成 的 染色 质 中 , 存 在 着 不 定数 的 无 核 小 体 区 域 ,从 而 能 保护 RNA 聚合 酶 正常 发 挥 作用 。 染色 质 结构 域 ”具有 转录 活性 或 潜在 活性 的 染色 质 其 结构 特性 与 无 活性 染色 质 是 截然 *，38 ， 不 同 的 。 具 备 转 录 能 力 的 染色 质 , 对 DNase I 的 消化 作用 普遍 较为 敏感 ,说 明 它 们 是 以 相 对 较为 松散 的 结构 包装 的 ,因此 又 称 为 开放 染色 质 (open chromatin)。 事 实 上 ,转录 作用 对 于 核 小 体 的 结构 也 具有 破坏 作用 ,而 染色 质 DNA 对 DNase 工 的 敏感 区 域 可 以 延伸 到 实 际 转录 单位 两 侧 几 千 个 碱 基 外 ,并 且 这 种 敏感 性 在 转录 没有 开始 之 前 就 已 经 存在 了 ,提示 这 种 现象 涉及 到 比 核 小 体 更 高 级 的 组 织 结构 。 对 DNase I 敏 感性 的 程度 确定 了 染色 质 结构 域 (chromatin domain) 的 概念 : 即 在 这 样 一 个 特定 的 染色 质 区 域 当中 ,其 活性 与 染色 质 其 他 部 分 无 关 。 对 DNase 工 普 遍 敏 感 (gen- eral DNase I sensitivity) 的 区 域 统称 为 DNase 工 高 敏感 区 (DNase I hypersensitive site) 。 这 些 结构 区 通 存在 于 转录 单位 的 两 侧 , 并 且 能 优先 被 较 低 浓度 的 DNase 工 所 前 切 消 化 。 它 们 的 碱 基 长 度 大 多 在 200bp 左右 ,并 且 与 顺 式 作 用 [参见 调控 元 件 、 增 强 子 (enchancer)、 基 因 座 控制 区 (locus control region) ] 有 关 。 它 们 的 存在 将 有 利于 染色 质 提 供 没有 核 小 体 结 合 的 区 域 ,使 得 转录 调控 复合 物 可 以 与 DNA 有 效 地 结合 。 上 述 论 点 可 以 通过 对 SV40 基 因 组 的 研究 所 证 实 ,DNase I 水 解 位 点 的 分 子 生 物 学 分 析 表 明 与 调控 元 件 相关 ;通过 扫描 电镜 进行 的 拓扑 学 研究 亦 已 鉴别 了 无 核 小 体 结合 区 。 虽 然 开 放 染 色 质 结构 的 分 子 基 础 仍 未 完全 被 前 明 ,但 已 经 有 了 一 些 有 趣 的 相关 性 ,开放 染色 质 含 有 比 其 他 大 部 分 染色 质 更 多 的 氨基 端 乙酰 化 的 核心 颗粒 组 蛋白 和 HMG 14Z21 蛋白 ,并 且 连 接 组 蛋白 的 含量 相对 较 低 。 由 于 连接 区 组 蛋白 对 于 30nm 染色 质 丝 是 必须 的 ,并 且 组 蛋白 N 端 尾巴 可 促进 核 小 体 之 间 相 互 作 用 ,所 以 处 于 抑制 状态 的 染色 质 转化 为 开放 染色 质 的 有 可 能 和 30nm 染色 质 丝 解 聚 成 为 简单 10nm 染色 质 丝 结构 有 关 。 这 时 的 染色 质 主要 依靠 非 组 蛋白 来 稳定 。 组 蛋白 乙酰 转移 酶 和 脱 乙 酰 酶 显示 可 能 会 被 一 些 转录 因子 所 招募 ,提供 了 染色 质 重组 机 制 (chromatin remodeling) ,成 为 转录 活化 或 抑制 过 程 的 起 始 步骤 。 在 哺乳 动物 和 植物 之 中 ,抑制 型 染色 质 (repressed chromatin) 通 常 与 DNA 高 度 甲 基 化 有 关 。 而 DNA 的 甲 基 化 在 基因 表达 的 调控 方面 可 能 起 主要 作用 (参见 DNA 甲 基 化 ) ,而 DNA 甲 基 化 在 许多 低 等 真 核 生 物 细 胞 中 是 不 存在 的 ,如 酵母 和 果 蝇 中 。 真 核 生物 基因 组 可 以 被 分 成 功能 各 异 的 独立 区 域 , 这 种 结构 方式 对 于 哺乳 动物 而 言 ， 具有 显著 的 意义 ,因为 染色 质 的 结构 与 M 期 的 染色 体 在 拓扑 学 上 是 相互 对 应 的 (参见 染 色 体 的 结构 与 功能 )。 采 用 各 种 不 同 的 分 化 染色 方法 (参见 常见 的 如 G- 带 和 民 - 带 显示 技术 ) ,可 以 重复 地 显示 明暗 相间 的 横向 带 谱 , 与 染色 质 结构 的 不 同 的 密度 区 域 相对 应 。 G- 带 与 其 他 方法 显示 的 染色 体 带 是 一 致 的 ,例如 :瞬时 复制 显 带 (transient replication ,此 技术 可 以 特异 性 地 标记 早期 和 晚期 复制 的 DNA); 和 了 - 带 技术 ,此 技术 可 以 鉴别 DNase 敏感 区 域 。 分 子 生 物 学 的 实验 证 据 表明 :这 些 区 域 中 的 DNA 序列 与 其 结构 组 成 之 间 存 在 着 差异 ,这 就 为 哺乳 动物 基因 组 的 双 相 组 织 结 构 (biphasic organization) (人 参阅) 提供 了 一 定 的 理论 依据 。 功能 区 及 其 边缘 部 位 的 功能 “染色 质 在 物理 学 上 可 以 划分 成 许多 不 连续 的 结构 ,从 拓 扑 学 上 也 可 分 为 独立 的 区 域 。 此 已 被 染色 质 上 去 除了 和 蛋白 质 的 环 和 骨架 结构 所 证 实 ; 灯 刷 染色 体 (lampbrush chromosome) (参阅 ) 的 侧 环 ; 以 及 果 蝎 多 线 染 色 体 (Drosopjpila poly- tene chromosome) 可 重 现 的 区 带 图谱 等 所 证 实 。 染 色 质 环 的 基部 系 于 核 基质 上 ,似乎 是 和 特殊 的 核 蛋 白 复 合 物 有 关 。 染 色 质 环 的 意义 还 不 十 分 清楚 ,推测 它们 可 能 与 前 面 讨论 过 的 独立 功能 区 域 的 形成 有 关 , 正 因为 如 此 ,染色 质 上 相 邻 区 域 可 以 采取 不 同 级 的 包装 形 *，39 ， 式 , 并 且 可 能 为 增强 子 单 配 性 (enhancer monogamy) 提 供 一 种 机 制 , 即 每 一 个 特定 的 增强 子 都 有 其 限定 的 靶 基 因 。 如 果 染 色 质 环 能 够 与 其 功能 区 很 好 地 对 应 ,就 可 以 预测 哪些 DNA 序列 与 核 基质 具 有 相互 作用 ,这 些 序列 应 当 分 布 于 染色 质 功 能 区 域 的 边缘 部 位 ,从 而 就 能 从 效应 区 域 的 邻 近 部 位 将 有 关 基 因 分 离 出 来 。 它 们 很 可 能 是 以 绝缘 子 (insulator) 或 者 边界 元 件 (boundary element) 等 形式 存在 的 。 曾经 推测 存在 的 基质 结合 区 域 (matrix-associated region，MAR )[ 亦 称 为 核 骨架 附着 区 (scaffold attachment region，SAR) ] ,已 经 根据 其 结合 核 基 质 蛋 白 的 能 力 ,通过 两 种 互补 的 实验 方法 被 鉴别 出 来 。 在 不 溶性 的 成 分 中 DNA 片段 与 基质 成 分 接触 能 捕获 到 假定 的 MARs。 另 外 ,去 除了 和 蛋白质 成 分 的 染色 质 经 过 核酸 酶 消化 以 后 , 仅 有 受到 MARs 保护 的 部 分 ,不 受 核 酸 酶 活性 的 作用 。 上 述 这 些 实验 还 鉴别 了 一 些 富 含 AT 碱 基 的 元 件 ,除了 具 有 拓扑 异 构 酶 II 的 识别 位 点 以 外 ,它们 没有 很 严格 的 序列 保守 性 。 此 外 还 鉴别 出 核 基质 以 及 分 裂 中 期 的 核 骨架 两 种 成 分 。 很 有 可 能 拓扑 异 构 酶 II 将 染色 质 分 成 为 拓扑 学 隔离 功能 区 。 通过 细胞 生物 学 和 生物 化 学 等 方法 也 鉴别 了 一 些 边界 元 件 ,它们 一 般 定 位 于 已 知 染 色 质 结构 区 的 边缘 部 位 ,并 含有 核酸 酶 高 度 敏 感 的 位 点 。 这 类 元 件 包括 果 蝇 特殊 染色 质 结构 (Drosozjila special chromatin structures,scs 和 scs ) 以 及 鸡 和 人 的 来 自 基 因 座 控制 区 (locus control region ) (人 参阅) 的 B- 珠 蛋白 HS5 元 件 。 而 一 个 真正 完整 的 边界 元 件 应 该 能 - 以 自主 方式 建立 一 个 独立 染色 质 功 能 区 域 ,而 B- 珠 蛋白 的 座位 控制 区 域 (locus control re- gion，LCR) 在 体内 的 作用 被 认为 具有 这 种 特点 。 这 种 功能 可 以 通过 两 种 方法 检测 ,一 是 经 检测 旁 侧 边界 元 件 可 保护 转基因 不 受 内 源 性 位 置 效应 的 作用 ;二 是 边界 元 件 经 检测 可 使 增强 子 产 生 “* 绝 缘 "。 用 上 述 方法 已 经 成 功 地 鉴定 了 果 蝇 的 scs 样 元 件 、 鸡 B- 珠 蛋白 LCR 的 SHS 位 点 以 及 鸡 溶菌 酶 基因 A 元 件 。 这 些 元 件 之 间 的 可 交换 性 存在 着 一 种 梯 度 , 例 如 :8B- 珠 蛋白 LCR SHS 位 点 在 果 蝇 是 有 功能 的 ,而 scs 样 元 件 在 转基因 小 鼠 中 就 没 有 功能 ; 鸡 的 溶菌 酶 A 元 件 在 转基因 鼠 和 转基因 植物 中 都 抑制 位 置 效 应 [也 可 参阅 吉普 赛 转 座 子 (gypsy transposon) ] 。 尽管 对 用 物理 方法 分 离 的 MARs 功能 进行 检测 实验 的 结构 并 不 明确 ,但 某 些 边界 元 件 的 功能 鉴别 表明 染色 质 物 理 结构 分 成 为 很 多 环 ,此 可 能 是 划分 染色 质 功 能 区 域 的 基础 。 异 染 色 质 结构 和 外 遗传 基因 调控 常 染 色 质 DNA 易 位 至 异 染 色 质 区 通常 会 导致 转录 抑制 播 散 到 常 染 色 质 区 域内 。 在 不 同 的 细胞 中 蜡染 色 质 化 范围 是 不 同 的 ,但 是 以 克隆 方 式 扩 增 的 ,因此 ,染色体 断 裂 点 附近 的 基因 表达 形式 就 多 种 多 样 了 。 花 斑 位 置 效应 (posi- tion effect variegation，PEV) 这 种 现象 表明 , 顺 式 作 用 潜在 的 活性 可 以 穿越 染色 体 断 裂 点 。 这 种 播 散 效 应 是 线性 的 且 不 会 间断 ,因此 染色 体 断 裂 点 附近 的 基因 座 虽然 处 于 抑制 状态 ， 但 这 种 抑制 状态 从 不 会 跳 过 基因 。 这 就 提示 蜡染 色 质 的 正常 传播 过 程 是 通过 特殊 的 蛋白 加 到 业已 存在 的 异 染色 质 上 ,然后 逐渐 扩大 范围 ,直到 遇 到 某 个 边界 元 件 为 止 。 易 位 的 过 程 可 能 移 去 了 这 些 边 界 元 件 , 可 变化 的 播 散 导致 产生 了 PEV 现象 ,此 反映 出 在 不 同 的 细 胞 当中 ,与 异 染 色 质 相 关 的 蛋白 质 总 数 是 可 变 的 。 蜡染 色 质 蛋白 和 常 染 色 质 蛋白 似乎 是 均衡 地 存在 于 核 质 和 染色 质 之 中 的 , 带 有 染色 质 功 能 的 一 些 突变 编码 基因 将 改变 这 些 蛋白 的 平衡 状态 ,而 伴随 着 易 位 事件 导致 PEV 的 四 40 ee 范围 发 生 位 移 [ 这 种 情形 称 为 完全 相反 效应 (antipodal effect) ]。 在 通常 情况 下 ,上述 这 种 突变 其 行为 或 将 成 为 PEV 的 抑制 子 或 成 为 PEV 的 增强 子 , 和 染色 质 高 级 结构 的 基因 将 可 被 鉴别 。 在 果 蝇 中 PEV 调节 物 中 寻求 那些 各 种 细胞 中 已 分 离 出 在 异 染色 质 中 起 作用 的 成 分 。 异 染色 质 本 身 是 最 好 的 PEV 调节 物 之 一 ,通过 增加 Y 染色 体 的 量 ( 大 多 数 为 异 染色 质 )， PEV 也 可 以 被 抑制 ,这 可 能 是 由 于 核 质 中 异 染 色 质 蛋白 减少 的 缘故 ,其 中 组 蛋白 也 被 作 为 一 种 重要 的 成 分 被 鉴别 出 来 。 异 染色 质 通常 较 少 含 有 乙酰 化 的 H4 型 组 蛋白 ,但 富 含 其 特殊 乙酰 化 的 形式 。 还 有 一 些 调节 物 与 在 异 染色 质 结构 中 发 挥 直 接 的 作用 的 特殊 蛋白 相关 ,包括 通用 和 蛋白质 HP1, 以 及 某 些 基因 表达 的 调节 物 , 如 多 覆 状 体 (polycomb ,参见 同 源 异 型 基因 、 分 化 的 维持 ) ,它们 在 染色 质 结 构 水 平 上 介 导 它们 的 作用 。 这 些 蛋 白质 常 有 一 个 保守 的 结构 , 称 为 染色 质 功 能 区 (chromodomain ) 。 在 酵母 细胞 中 , 异 染 色 质 蛋白 根据 沉默 交配 型 基因 座 去 阻 巡 突变 而 被 分 离 出 来 。 此 基因 座 常 隐藏 在 端 粒 附近 的 抑制 性 染色 质 [参见 交配 型 转换 (mating type switching) ] ,和 组 蛋白 H3、H4 类 似 的 沉默 信息 调控 因子 SIR3、SIR4 以 及 另外 一 种 称 为 抑制 - 激活 RAP1 的 蛋白 质 都 已 经 被 分 离 。 很 明显 , 异 染 色 质 化 的 扩展 反映 组 蛋白 和 SIR 产物 之 间 的 相互 作用 、 并 被 RAP 所 促进 (如 SIR3 与 组 蛋白 H4 的 N 一 末端 尾巴 相互 作用 )。 3.4 细菌 类 核 的 分 子 结构 细菌 染色 体 的 组 成 ”细菌 细胞 含有 单个 的 染色 体 , 它 和 真 核 细胞 染色 体 一 样 ,是 以 核 蛋 白 复合 物 的 形式 存在 的 。 这 种 类 核 (nucleoid) 在 细胞 分 裂 之 前 是 以 不 凝聚 的 状态 存在 的 ， 也 不 呈现 真 核 染色 体 结 构 致 密 的 特点 ,但 它 也 会 形成 一 系列 的 环 状 区 域 , 就 像 反应 了 结构 有 序 性 一 样 也 反应 了 其 不 同 的 功能 。 在 大 肠 杆菌 ( 瑟 . coi ) 中 ,上 述 这 种 环 状 结构 区 域 的 长 度 大 约 在 50kb 左右 ,在 整个 基 因 组 内 有 接近 100 个 环 。 每 个 结构 区 域 在 拓扑 学 上 是 相互 独立 的 ,这 样 就 有 利于 对 不 同 的 启动 子 进行 独立 的 拓扑 控制 。 这 种 组 成 的 分 子 机 制 目前 还 不 清楚 ,例如 : 尚 不 知道 这 些 环 状 结构 是 限定 于 染色 体 的 特定 区 域 ,还 是 随机 形成 ;还 未 弄 清 这 些 结构 与 染色 体内 何 种 序列 有 关 ; 而 且 也 不 知道 这 些 环 状 结构 是 如 何 形 成 与 维持 。 类 核 中 一 系列 成 分 已 被 确定 (如 :HU 、 HI) ,虽然 影响 到 其 他 系统 发 生变 化 的 一 些 基 因 的 突变 已 被 鉴定 出 来 ,但 影响 类 核 功能 的 突变 尚未 被 鉴别 ,表明 类 核 蛋白 可 能 是 较为 丰 余 的 ,并 且 可 以 间接 地 影响 到 其 他 的 系统 ,例如 :可 能 会 通过 修饰 DNA 的 拓扑 学 状态 ,从 而 作为 一 种 重要 的 转录 激活 调控 因子 (参见 第 29 章 转录 ,第 16 章 核酸 结构 )。 (方向 东 . 王 琪 译 ) 。41 . 第 4 章 染色 体 究 变 基本 概念 与 定义 。 ”染色体 突 变 [chromosome mnutation ,或 称 染 色 体 畸变 (chromosome aberration) ] 是 涉及 基因 组 大 片断 的 突变 。 这 样 的 突变 往往 影响 很 多 基因 并 且 可 在 细胞 遗传 学 水 平 上 观察 到 , 即 用 光学 显微镜 可 见 。 。 染色体 突 变 如 包含 染色 体 数目 变化 的 数量 (numerical) 突变, 和 涉及 染色 体 片 断 的 断裂 与 重 排 就 是 结构 (structural) 突变 。 数 量 突 变 往 往 是 由 结构 突变 导致 的 染色 体 分 离 错 误 引 起 的 ,但 也 可 能 反映 了 异常 复制 或 受精 时 的 错误 。 结 构 突 变 是 由 断 裂 染 色 体 的 错误 修复 或 非 等 位 重组 事件 引起 的 。 在 哺乳 动物 与 果 蝇 中 ,微细 的 结 构 突 变 也 可 被 监测 到 ,因为 它们 破坏 了 染色 体 带 型 (参阅 )。 如 果 DNA 只 发 生 重 排 , 而 没有 物质 的 丢失 与 获得 ,这 种 结构 突变 是 平衡 的 (balanced) ;如 发 生 了 DNA 的 丢失 与 获得 则 是 不 平衡 的 (unbalanced)。 所 有 的 数量 突变 都 是 不 平衡 的 。 。 染色体 突变 有 四 种 后 果 , 上 断裂. 融合 位置 与 剂量 效应 。 断 裂 与 融合 效应 (disrup- tion and fusion effect) 发 生 在 结构 突变 中 并 且 反 映 了 突变 前 与 突变 后 染色 体 断 裂 位 点 的 性 质 ( 例 如 一 断裂 位 点 将 一 基因 与 其 启动 子 断裂 或 分 离 ,导致 基因 功能 的 丧失 ,而 融合 将 两 个 基因 连接 到 一 起 ,导致 一 复合 产物 的 合成 ,可 能 具有 新 的 功 能 )。 位 置 效 应 (position effect) 也 发 生 在 染色 体 结构 突变 中 ,反映 了 染色 质 结构 对 基因 表达 的 总 体 影 响 。( 例 如 , 转 座 可 能 会 使 一 正常 活性 基因 与 一 异 染 色 质 区 域 相 邻 ,从 而 抑制 转录 ,参见 染色 质 区 域 , 花 斑 位 置 效 应 )。 剂 量 效应 在 结构 与 数 量 突变 中 都 有 发 生 ,与 细胞 内 基因 的 拷贝 数 有 关 。 很 多 常 染 色 体 基因 的 剂量 水 平 是 比较 灵活 的 ,但 另 一 些 基 因 表 现 出 单 倍 不 足 性 (haploinsufficiency)( 人 参阅) 这 类 剂量 效应 。 不 平衡 的 染色 体 突 变 , 特 别 是 完全 的 非 整 倍 性 ,同时 改变 了 很 多 基因 的 剂量 ,因此 往往 增 大 了 剂量 效应 。 很 多 连续 的 特别 是 整 条 染色 体 上 的 所 有 基因 的 剂量 的 改变 ,被 称 为 染色 体 不 平衡 (chromosome imbalance) 。 。 组 成 型 染色 体 突 变 (consititutional chromosome mutation ) 发 生 在 生殖 系 或 合子 中 ， 因而 影响 身体 中 的 每 一 个 细胞 。 在 人 类 中 ,这 会 引起 特异 的 临床 综合 征 [ 例 如 , 唐 氏 综 合 征 (Down'" s syndrome) , 克 兰 费 尔 特 氏 综 合 征 (Klinefelter 's syndrome) ] 。 组 成 型 数量 突变 的 发 生 往往 是 由 于 减 数 分裂 中 (如 同 源 染 色 体 配对 失败 ) 或 受精 中 (如 双 精 人 负 个 卵子 被 两 个 精子 受精 ) 的 错误 造成 的 。 体 细胞 染色 体 突 变 ( somatic chromosome mutation ) 影 响 个 别 的 细胞 及 由 这 些 细胞 产生 的 克隆 ; 体 细胞 数量 突变 往往 反映 了 有 丝 分 裂 中 的 错误 。 在 发 育 早期 发 生 的 体 细胞 突变 可 能 会 产生 不 同 细胞 系 的 冬 合 体 。 。 ”正常 基因 组 中 染色 体 的 数目 与 性 质 用 染色 体 组 型 (参阅 ) 来 表示 ,特异 的 畸变 在 通 常 的 染色 体 组 型 附加 信息 来 辨别 。 在 表 4.1 中 总 结 了 这 种 命名 法 。 。42 。 表 4.1 染色 体 畸 变 的 细胞 遗传 学 命名 法 ,以 人 类 染色 体 核 型 为 例 染色 体 核 型 含义 命名 法 的 例子 表明 染色 体 及 染色 体 臂 的 符号 1 一 22 常 染 色 体 (人 类 基因 组 ) 无 玫 性 染色 体 p,q 相对 的 短 臂 与 长 臂 pter, qter 短 臂 与 长 臂 的 末端 部 分 表明 突变 的 符号 直 附加 的 染色 体 或 染色 体 部 分 * -1 一 丢失 的 染色 体 或 染色 体 部 分 * 46，XX,，17q- del 缺失 :未 端 46，XX, del(12)(p13.3 一 pter) 中 间 46，XX,， del(12)(p12.1 一 p12.3) der 染色 体 衍 生物 (参阅 ) der(12) dup 重复 46，XY，dup(2)(q21.1 一 q23.1) fra 脆性 位 点 46，XY，fra(Xq27) h 附加 的 异 染 色 质 ( 即 次 弱 痕 ) 46，XX，16qh+ i 等 臂 染 色 体 46,，X,，i(Xq) iny 倒 位 ; 臂 间 的 46,，XY,， inv(2)(p12.1q23.2) 同 臂 内 的 46,，XY，inv(2)(p11. 1q12.3) Inarker 标记 染色 体 ! 47，XY，+ marker T 环 状 染色 体 46,，XY, r(19)(pl13ql13) s 额外 卫星 物质 ( 即 随 体 ) 46，XX，21ps+ t 易 位 :交互 易 位 46，XX, t(7;19)(q34.2;p13.1) 罗 伯 和 逊 易 位 45，XX，-=-14，-21, t(14q;219q) ai + “和 ”“- " 放 在 染色 体 标 志 之 前 ,说 明 是 额外 增加 或 缺失 的 染色 体 ( 如 + 21); 放 在 染色 体 标志 之 后 , 则 表示 该 染色 体 额 外 增加 或 缺失 的 不 明确 的 片段 (如 17q- )。 1 译 者 注 :原文 为 “未 鉴别 染色 体 ”, 但 根据 ISCN(1978) 的 符号 和 缩写 术语 应 为 “标记 染色 体 ”。 数量 染色 体 突变 包括 整套 染色 体 的 数量 突变 ”在 指定 的 真 核 细胞 中 整套 染色 体 的 数目 被 定义 为 倍数 (ploidy) ( 表 4.2)。 很 多 多 细胞 的 真 核 生物 在 营养 阶段 即 指 体 细胞 为 二 倍 体 ,这 是 两 性 生 殖 所 要 求 的 最 少 的 倍数 。 在 哺乳 动物 与 鸟 类 中 ,二 倍 体 的 组 成 型 的 改变 是 几乎 不 可 耐 受 的 ,导致 完全 不 正常 的 子 代 。 这 反映 了 常 染 色 体 与 活性 的 性 染色 体 之 间 及 印痕 基因 间 的 剂量 平衡 (参见 剂量 补偿 , 亲 代 印痕 )。 4.1 = 3 表 4.2 描绘 倍数 状态 的 一 些 术语 术语 定义 倍数 (ploidy) 细胞 中 全 套 染 色 体 的 套数 二 倍 体 (diploid) 两 套 染 色 体 一 倍 体 (monoploid) 一 套 染 色 体 单 倍 体 (haploid) 严格 意义 指 在 减 数 分 裂 后 细胞 (如 配子 细胞 ) 中 发 现 的 染色 体 套 数 为 正常 细胞 的 一 半 。 但 往往 作为 一 倍 体 的 同义词 因为 大 部 分 配子 含有 一 套 染 色 体 (参见 单 倍数 ,一 倍数 )。 多 倍 体 (polyploid) 多 于 两 套 染 色 体 ,三 倍 体 (triploid) 为 3 套 , 四 倍 体 (tetraploid) 为 4 套 , 六 体 (hexaploid) 为 6 套 等 等 。 超 过 基因 组 的 10 个 拷贝 用 数字 表示 ,如 12 合体 (2 ua 多 倍 体 指 具 有 超过 两 套 同 源 染 色 体 ,多 线性 指 每 一 染色 体 上 有 多 个 (等 同 7) 的 ) 染 色 单 体 ,如 同 在 果 蝇 唾 腺 中 观察 到 的 那样 。 偶 倍 体 (isoploid) 与 奇 倍 体 (anisoploid) ”分 别 指 染色 体 套数 为 偶数 或 奇数 。 因 为 在 减 数 分 裂 中 不 平衡 的 分 离 , 奇 倍 体 个 体 往往 是 不 育 的 。 同 源 多 倍 性 (autopoly_ploid) 与 异 源 多 倍 。“ 同 源 多 倍 性 指 由 内 源 的 基因 组 重复 引起 的 多 倍 体 ,而 异 源 多 倍 性 指 由 种 性 (alopolyploidy) 属 杂交 引起 的 基因 组 重复 产生 的 多 倍 体 。 同 倍 体 (homoploid) 与 异 倍 体 (heterploid) 分 别 是 具有 种 属 典 型 /非典 型 染色 体 数目 。 相反 ,在 植物 中 单 倍 体 与 多 倍 体 的 耐 受 性 很 高 ,多 倍 体 在 自然 中 十 分 普遍 。 很 明显 ， 多 倍 体 有 增加 植物 大 小 的 倾向 ,因而 是 植物 育种 者 所 需要 的 性 状 。 这 种 性 状 主要 是 由 细 胞 大 小 的 增加 引起 的 而 非 细 胞 数目 的 增加 ,表明 了 DNA 含量 影响 细胞 周期 中 细胞 大 小 的 关卡 (参阅 )。 在 自然 界 中 也 有 单 倍 体 与 多 倍 体 的 低 等 动物 的 例子 (例如 ,一 些 昆 虫 是 单 倍 体 ,一 些 水 蚂 是 多 倍 体 ) ,在 这 些 动物 中 倍数 的 不 正常 状态 较 之 脊椎 动物 中 耐 受 性 更 强 。 多 倍 体 动 物 如 水 蚂 其 细胞 较 之 二 倍 体 大 ,但 由 于 细胞 数目 的 减少 ,个 体 大 小 并 不 增加 ,这 反映 了 发 育 中 的 调节 机 制 ( 见 第 6 章 发 育 : 分 子 机 制 )。 虽然 具 不 正常 的 倍数 的 个 体 可 能 存活 ,但 它们 可 能 是 不 育 的 。 一 般 , 任何 奇 倍 体 (anisoploid, 染 色 体 套数 为 奇数 ) 的 种 类 由 于 减 数 分 裂 的 失败 都 是 不 育 的 。 例 如 ,在 三 倍 体 中 ,三 套 染 色 体 在 减 数 分 裂 过 程 中 试图 配对 与 分 离 ,产生 严重 不 平衡 的 产物 。 这 可 应 用 于 商业 的 水 果 作物 来 产生 无 核 的 品种 。 单 倍 体 不 能 进行 减 数 分 裂 只 能 无 性 繁殖 。 单 倍 体 昆 虫 中 就 是 这 样 ,它们 采用 孤 肉 生殖 方式 ,在 植物 中 ,它们 的 生命 周期 包括 单 倍 体 / 一 倍 体 世 代 交 蔡 。 植 物 的 单 倍 体 品 种 特别 有 用 ,因为 如 同 细菌 与 酵母 ,其 培养 细胞 可 用 于 突变 筛 选 ,并 可 根据 直接 显示 的 突变 表 型 被 选择 (例如 除草 剂 的 耐 受 性 )。 具 有 所 需 性 状 的 细胞 可 以 通过 二 们 化 (diploidization, 通 过 人 为 地 阻 断 有 丝 分 裂 诱导 染色 体 数 目 加 倍 ) 得 到 繁殖 能 力 ,然后 经 过 激素 处 理 长 成 整 株 植物 ( 见 第 15 章 突变 与 选择 ) 。 以 上 讨论 的 多 倍 体形 式 是 同 源 多 倍 体 (autopolyploid) ,因为 它们 包含 “内 源 ” 基 因 组 的 加 倍 。 异 源 多 们 性 (allopolyploidy) 是 多 倍 体 的 一 种 不 同形 式 ,个 体 具 有 来 自 不 同 种 属 的 染色 体 的 多 个 拷贝 。 在 简单 的 杂交 失败 的 情况 下 ,这 种 策略 可 将 两 种 植物 的 所 需 性 状 集 于 一 身 。 种 间 的 杂交 导致 的 杂种 不 育 反 映 了 减 数 分 裂 的 失败 , 即 不 同 种 属 的 染色 体 不 能 形成 合适 的 配对 。 然 而 如 果 杂 合 的 基因 组 被 诱导 加 倍 ,那么 每 一 个 染色 体 都 有 一 同 源 的 染色 体 可 配对 ,杂交 种 属 就 成 为 有 繁殖 能 力 的 了 。 在 同 源 多 倍 体 中 染色 体 之 间 种 属 特异 。，Ld44 。 的 配对 被 称 为 同 源 联 会 (autosynapsis) ,而 种 属 之 间 的 配对 被 称 为 异 源 联 会 (allosynapsis) 。 来 自 不 同 种 属 的 部 分 同 源 的 染色 体 被 称 为 部 分 同 源 染 色 体 (homoeologous chromosome) (参考 同 源 染 色 体 )。 表 4.3 用 于 描绘 核 型 中 个 别 染 色 体 的 数目 的 术语 术语 整 倍 体 (euploidy) ; 非 整 倍 体 (aneuploidy) 染色 体 不 平衡 (chromosome imbalance) 超 倍 体 (hyperploidy) ; 亚 倍 体 (hypoploidy) 假 二 倍 体 (pseudodiploidy) 正体 (eusomy); 非 正体 (aneusomy) 定义 具有 整套 染色 体 ;个 别 染 色 体 丢失 或 获得 。 产生 多 重 基 因 剂 量 效果 的 染色 体 的 丢失 与 获得 。 具有 超过 正常 数目 的 染色 体 ; 具 有 少 于 正常 数目 的 染色 体 。 具有 正常 的 染色 体 数 目 但 核 型 不 正常 ,由 于 同时 发 生 了 不 同 染色 体 的 单 体 性 与 三 体 性 。 特定 染色 体 具 有 正确 的 拷贝 数 ;特定 染色 体 具 有 不 正确 的 拷贝 数 。 零 体 (nullisomy) 为 无 拷贝 , 单 体 (monosomy ) 为 一 拷贝 , 双 体 (disomy) 为 二 拷 贝 ,多 体 (polysomy ) 为 两 拷贝 以 上 ,如 三 体 (trisomy) 为 三 拷贝 ,四 体 (te- trasomy) 为 四 拷贝 ,等 等 。 表 4.4 人 类 出 生存 活 时 观察 到 的 非 整 数 倍 非 整数 信 常 染色 体 非 整数 信 21 三 体 ( 唐 氏 综合 征 ,Dowmn's syndrome) 18 三 体 (爱德华 综合 征 ,Edward's syndrome) 13 三 体 ,偶尔 14 或 15 三 体 ( 帕 帮 氏 综合 征 ,Patau's syndrome) 性 染色 体 非 整数 倍 单 体 X ( 特 纳 氏 综合 征 ,Tumer's syndrome) 三 体 X CXXX 综合 征 ) 多 体 X 和 了 ( 克 莱 恩 费 尔 特 综合 征 , Klinefelter syndrome) 二 体 半 (“ 超 雄 ” 综合 征 ,“supermale”syn- drome) 发 生 率 与 临床 表 型 在 出 生存 活 婴 儿 中 发 生 率 为 1:700 ,临床 表 型 表现 为 智力 与 生长 障碍 , 特 征 性 脸 部 特征 ( 眼 上 吊 , 鼻 小 ,张口 伸 舌 , 耳 位 低 ) ,部 分 并 由 具 有 类 人 猿 的 掌 纹 。 再 显 风险 率 很 低 虽 然 它 随 母 体 年 龄 增加 而 增 大 。 如 果 三 体 是 由 于 易 位 引起 的 (参见 易 位 唐 氏 综合 征 ) , 则 再 显 风 险 率 较 高 。21 三 体 患者 的 寿命 预期 比 正 常人 低 ,很 多 在 儿童 时 期 死亡 。 在 出 生存 活 婴 儿 中 发 生 率 为 1:3 一 60007) ,临床 表 型 为 长 头 , 耳 位 低 且 发 育 异 常 , 罗 圈 腿 , 紧 握 拳 ,心血 管 与 肾脏 功能 紊乱 , 产 期 死亡 。 在 出 生存 活 婴 儿 中 发 生 率 为 1:5 一 100002 ,临床 表 型 为 耳 位 低 且 发 育 异 常 。 产 期 死亡 。 在 女性 出 生存 活 婴 儿 中 发 生 率 为 1:10000。 临 床 表 型 为 身材 矮 ,中 颈 、 支 撑 角 宽 ( 肘 外 翻 ) ,乳头 距离 远 , 基 本 无 月 经 , 且 不 育 在 女性 出 生存 活 机 儿 中 发 生 率 为 1:1000。 临 床 表 型 包括 一 级 与 二 级 性 征 发 育 失 常 , 轻 度 智能 障碍 ,但 很 多 个 体 是 可 育 与 正常 的 。 主要 与 核 型 47,，XXY 有 关 , 虽 然 已 观察 到 更 多 包括 多 个 X 与 了 染色 体 的 非 整 数 倍 体 。 在 男性 出 生存 活 婴 儿 中 发 生 率 为 1:1000, 临 床 表 型 可 能 包括 不 育 ,男性 乳房 发 育 ( 在 男性 中 胸 且 发 育 ) , 符 丸 萎缩 ,阴茎 畸形 , 精 子 无 功能 ,身材 较 高 , 轻 度 智能 障碍 。X 染色 体 数 目 增加 , 表 型 趋向 严 重 虽然 观察 到 稀少 的 48,XXYY, 但 主要 与 核 型 47,XYY 有 关 。 在 男性 出 生 存活 婴儿 中 发 生 率 为 1:1000。 临 床 表 型 包括 身材 较 高 。 核 型 与 反 社 会 及 暴力 行为 倾向 有 不 明显 的 联系 ,这 种 联系 仍 未 定论 。 个 体 通 常 可 育 。 1) 这 两 处 数字 按 原 文 可 能 有 误 , 似 应 为 1/6000 一 3/6000 以 及 17X10000~-5X10000。 一 一 译 者 注 。4S 。 包括 个 别 染 色 体 的 数量 了 叶 变 ”一 正常 细胞 , 整 倍 体 (euploid) 应 该 包含 整套 染色 体 , 如 发 生 个 别 染 色 体 缺失 或 增加 , 就 被 称 为 非 整 倍 体 (aneuploid)( 表 4.3)。 非 整 倍 体 在 植物 或 动物 中 都 是 有 害 的 ,而 在 动物 中 后 果 尤 为 严重 。 染 色 体 的 缺失 或 获得 被 称 为 染色 体 不 平 衡 (chromosome imbalance) ,这 样 会 发 生 多 个 基因 的 缺失 或 获得 , 具 多 重 剂 量 效应 。 在 人 类 中 这 种 效应 往往 是 致命 的 ,在 可 能 的 22 种 常 染色 体 三 体 中 ,只 有 三 种 能 在 出 生 时 存活 ， 只 有 一 种 可 长 期 存活 ( 表 4.4)。 因 为 剂量 补偿 机 制 (参见 ) 可 以 抑制 性 染色 体 数 目 天 然 变 化 的 后 果 ,性 染色 体 的 非 整 倍 体 耐 受 性 较 高 。 而 由 于 X 染色 体 失 活 (参阅 )X 染色 体 的 单 体 性 与 多 体 性 产生 相对 温和 的 表 型 。 在 特 纳 综合 征 (Turner'"s syndrome) 与 XXX 综合 征 中 的 失常 可 能 反映 了 逃脱 了 失 活 的 基因 的 剂量 效应 ,并且 效 应 发 生 在 发 育 早期 X 失 活 之 前 。Y 染色 体 的 二 体 性 几乎 没有 表 型 效果 ,与 这 种 核 型 相 联系 的 行为 异常 仍 有 争议 。 数量 染色 体 了 嘛 变 的 起 因 倍数 的 改变 可 能 由 细胞 周期 的 失误 引起 ,或 是 由 DNA 复制 遗漏 /额外 的 染色 体 分 离 (使 倍数 减 半 ) 引 起 ,或 由 染色 体 分 离 遗漏 /额外 的 DNA 复制 (使 倍数 加 倍 ) 引 起 。 倍 数 的 改变 也 可 能 由 受精 过 程 引 起 ,如 在 哺乳 动物 中 ,三 倍 体 可 能 是 由 于 精子 或 卵子 的 二 倍 性 造成 的 ,更 常见 的 是 发 生 二 精 人 卵 (由 两 个 精子 受精 )。 这 种 由 不 正常 的 受精 过 程 导 致 的 发 育 不 正常 被 称 为 囊 状 的 或 水 泡 状 脂 块 L[hydatidiform 或 vesicular mole( 参 见 亲 代 印 痕 )]。 非 整数 倍 反 映 了 细胞 周期 更 为 局 部 的 紊乱 并 可 以 几 种 方式 发 生 , 最 常见 的 被 称 为 不 接合 (nonconjunction ,在 减 数 分 裂 的 前 期 同 源 染 色 体 对 未 能 相互 接合 ,参见 减 数 分 裂 ) 与 不 分 离 (nondisjunction, 配对 正常 ,但 同 源 染色 体 对 分 离 失 败 )。 初 级 不 分 离 (primary nondisjunction) 发生 在 第 一 次 减 数 分 裂 中 ,导致 某 一 对 同 源 染色 体 移 向 一 极 。 次 级 不 分 离 (secondary nondisjunction) 发 生 在 第 二 次 减 数 分 裂 中 ,导致 了 一 对 姐妹 染色 单 体 一 起 移 向 同一 极 (图 4.1)。 这 往往 是 由 于 着 丝 粒 分 离 的 失败 。 在 有 丝 分 裂 中 也 会 发 生 类 似 的 情况 (有 丝 分 裂 不 分 离 , mitotic nondisjunction ) , 导致 体 细胞 的 非 整 倍 体 。 如 果 着 丝 粒 过 早 分 离 ,在 第 一 次 减 数 分 裂 中 也 可 能 发 生 部 分 的 不 分 离 ,将 一 对 染色 单 体 中 的 一 个 与 另 一 同 源 染色 体 的 一 对 染色 单 体 分 到 一 起 。 几 种 结构 突变 增加 了 不 分 离 的 机 会 (参见 环 状 染 色 体 ， 并 连 染 色 体 , 罗 伯 进 易 位 )。 (D) 初级 不 分 离 (2) 次 级 不 分 离 图 4.1 在 配子 中 由 于 不 分 离 现 象 引起 的 非 整 倍 体 。(1) 在 第 一 次 减 数 分 裂 中 同 源 染色 体 未 能 分 离 (初级 不 分 离 )(2) 在 第 二 次 减 数 分 裂 中 姐妹 染色 单 体 分 离 失败 (次 级 不 分 离 ) 。 引发 非 整 倍 体 的 另外 一 些 途径 包括 染色 体 获 得 (chromosome gain, 单 个 染色 体 的 额外 复制 的 结果 ) 及 染色 体 丢 失 (chromosome lose) ,后 者 发 生 于 某 一 染色 体 分 离 过 慢 而 未 包括 在 子 代 的 核 中 (后 期 落后 ,anaphase lag) ,或 染色 体 未 能 在 第 一 位 置 与 纺锤 体 相 接 。 4.2 染色 体 结 构 突变 断裂 点 “染色体 结构 突变 是 由 染色 体 断 裂 的 错误 修复 或 同 源 非 等 位 位 点 之 间 的 重组 造 成 的 。 发 生 断 裂 或 重组 的 位 点 被 称 为 染色 体 断 裂 点 (breakpoint) ,结构 重 排 的 染色 体 被 称 为 染色 体 衍生 物 (chromosome derivative) 。 如 果 衍 生物 包含 不 同 染色 体 的 部 分 ,它们 根据 着 丝 粒 的 来 源 命名 。 那 么 ,如 果 人 类 12 和 17 号 染色 体 断 裂 并 且 断 裂片 断交 换 ,包含 12 号 染色 体 着 丝 粒 的 染色 体 被 称 为 12 号 染色 体 簿 生物。 上 面 已 讨论 过 ,结构 突变 可 能 是 平 衡 的 ,也 可 能 是 不 平衡 的 。 平 衡 与 不 平衡 的 突变 型 都 可 用 遗传 学 方法 根据 它们 的 改变 的 连锁 图 谱 来 辨别 ,并且 在 杂 合子 中 ,可 用 细胞 学 方法 通过 减 数 分 裂 中 同 源 染色 体 的 异常 配 对 图 式 来 辨别 。 动 物 与 植物 对 结构 突变 的 耐 受 性 不 同 。 即 使 是 严重 不 平衡 的 动物 配子 也 仍 具 有 功能 ,并 可 参与 受精 过 程 产 生 不 平衡 的 合子 。 植 物 中 如 突变 发 生 在 胚珠 中 情况 也 一 样 ,但 发 生 染 色 体 结构 畸变 的 花粉 粒 却 容 易 退 化 ,并 不 发 生 受精 。 不 平衡 结构 突变 不 平衡 突变 (unbalanced mutation) 包 括 遗 传 物 质 的 丢失 或 获得 ,表现 为 部 分 的 单 体 性 或 三 体 性 - 即 由 于 一 些 连 续 基 因 的 丢失 或 获得 ,它们 表现 出 多 剂量 效应 。 包括 DNA 丢失 的 结构 突变 被 称 为 缺失 (deletion ) 或 缺乏 (deficiency) ,而 包括 DNA 获得 的 结构 突变 被 称 为 插入 (insertion) 或 重复 (duplication ) ;如果 它们 涉及 遗传 物质 的 量 是 可 见 的 ,它们 就 被 认为 是 染色 体 突 变 。 大 的 缺失 可 以 通过 在 杂 合 子 中 缺失 环 (deletion loop) 的 出 现 来 辨别 ,这 是 出 现在 减 数 分 裂 中 由 于 没有 同 源 配对 区 域 而 突出 于 配对 染色 体 的 一 个 结构 。 插 人 也 有 类 似 的 表现 ,而 串联 重复 可 以 产生 更 加 复杂 的 结构 ,重复 结构 可 能 会 突出 形成 一 个 环 ,也 有 可 能 染色 体内 部 的 重复 序列 的 两 个 拷贝 相互 配对 而 使 正常 染色 体 的 同 源 区 域 环 状 突出 ( 另 参见 基因 扩 增 )。 在 人 类 染色 体 中 最 小 的 可 见 缺失 与 重复 都 会 影响 几 兆 碱 基 的 DNA, 因此 覆盖 很 多 基 因 位 点 。 它 们 往往 引起 连续 基因 综合 征 (contiguous gene syndrome)( 表 4.5)。 这 些 突变 通常 没有 精确 定义 ,因为 在 细胞 学 水 平 无 法 确切 了 解 它 们 的 边界 。 连 续 基 因 综 合 征 可 以 通过 包括 一 系列 相互 覆盖 的 临床 症状 的 可 变 表 型 来 辨别 。 不 同 病 人 中 个 别 症 状 的 对 应 关 系 使 我 们 可 以 构建 一 基因 图 谱 , 被 称 为 发 病 图 谱 (morbid map)。 如 果 在 没有 可 见 突变 的 情况 下 发 生 同 样 的 表 型 ,就 可 在 光学 显微镜 的 分 辩 率 之 下 推测 缺失 或 重复 的 大 小 (微小 缺 失 与 微小 重复 ,microdeletions and microduplication ) , 或 这 种 表 型 可 能 由 点 突变 (参阅 ) 引 起 。 当 着 丝 粒 在 错误 的 平面 分 裂 时 ,同时 发 生 整 个 臂 的 缺失 与 重复 ,产生 具有 两 个 长 臂 没 有 短 臂 的 染色 体 及 相反 的 情况 。 这 种 具 中 间 着 丝 粒 的 染色 体 被 称 为 等 臂 染 色 体 (isochro- mosome) , 它 引起 一 臂 的 单 体 性 及 另 一 臂 的 三 体 性 ,从 而 产生 相应 的 基因 剂量 效应 。 平衡 结构 突变 平衡 突变 (balanced mutation) 又 被 称 为 染色 体重 排 (chromosome rear- rangement) , 它 包 括 DNA 的 重 排 而 没有 遗传 物质 的 净 获 得 或 失去 。 带 有 这 种 重 排 的 个 体 s。 表 4.5 与 不 平衡 结构 染色 体 畸 变 (缺失 与 重复 ) 有 关 的 人 类 综合 征 综合 征 核 型 与 临床 症状 猫 叫 综合 征 (Cr du chat syndrome) del(5)(pl4-pter)。 小 头 ,智能 障碍 ,特征 性 避 声 似 猫 叫 贝 - 魏 综合 征 (Beckwith-Wiedemann syn- dup(11p15)。 胎 儿 过 度 生 长 导致 巨人 症 , 舌 头 肥大 ,儿童 时 期 出 现 侧 位 肿 drome) 大 WAGR 综合 征 (WAGR syndrome ) del(11p13)。 根 据 主要 的 症状 命名 :维尔 姆 斯 瘤 ,无 虹膜 ,两 性 生殖 器 官 及 智能 障碍 猫眼 综合 征 (Cat eye syndrome) +iso(22)(pter 一 ql1)。 眼 缺陷 ,肛门 闭锁 ,心血 管 缺 陷 和 智能 障碍 Prader-Wil 综合 征 父母 染色 体 del(15)(ql1 - ql13)。 身 材 矮 小 肥胖 ,生殖 器 官 小 ,行为 困难 ， 智能 障碍 Angelmam 综合 征 母系 染色 体 del(15)(ql1- q13)。 智 能 障碍 ,运动 失调 ,不 适宜 地 发 笑 某 些 病症 ,如 WAGR, 是 真正 的 连续 基因 综合 征 ,一 系列 相互 覆盖 的 临床 症状 反映 了 一 复 连 续 基 因 的 缺失 。 另 外 一 些 , 如 贝 一 魏 综 合 征 ,主要 与 某 一 单个 基因 的 缺 隐 有 关 ( 在 这 个 例子 中 是 IGF2 基因 的 活性 过 高 ;参见 亲 代 印 痕 )。 往往 具有 正常 的 表 型 ,但 杂 合子 可 能 是 半 不 育 的 。 因 为 :@ 在 减 数 分 裂 中 重 排 染色 体 表 现 不 正常 ,往往 分 离 产 生 不 平衡 的 配子 ;G@) 重 排 内 的 交换 产生 不 平衡 的 重组 产物 , 倒 位 不 能 存活 。 由 于 空间 位 阻 (steric hindrance) 在 这 些 重 排 的 断裂 点 重组 受 抑 制 (参见 重组 冷 点 )。 这 些 原 则 应 用 于 果 蝇 来 抑制 交换 ,使 特定 染色 体 可 以 在 不 重组 的 情况 下 传递 ,以 获得 特定 的 果 蝇 株 型 。 具 有 复杂 的 多 个 倒 位 的 染色 体 可 抑制 交换 因此 每 一 个 染色 体 可 作为 完整 的 单位 遗传 。 这 种 重组 抑制 因子 被 称 为 平衡 器 染色 体 (balancer chromosome) 。 单个 染色 体 的 平衡 结构 突变 ” 倒 位 (inversion) 指 包括 某 一 单个 染色 体 中 DNA 片断 的 翻转 的 染色 体重 排 过 程 。 它 们 可 能 由 染色 体 断 裂 的 错误 修复 或 反 向 重复 序列 之 间 的 染色 体内 重组 引起 。 除 非 @ 断 裂 点 打 断 了 一 个 基因 ;@ 重 排 导 致 不 利 的 位 置 效应 (参阅 ), 倒 位 不 产生 表 型 ,但 倒 位 序列 可 以 通过 遗传 学 方法 用 改变 连锁 图 谱 来 辨别 ,或 在 杂 合子 中 通过 观察 减 数 分 裂 中 倒 位 环 (inversion loop ) 的 形成 可 辨别 大 的 倒 位 , 倒 位 环 指 染 色 体 沿 轴 的 方向 弯曲 ,以 使 倒 位 位 点 能 插 和 人 配对 染色 体 相 应 区 域 。 因为 倒 位 只 涉及 单个 染色 体 , 本 质 上 它们 不 会 影响 减 数 分 裂 的 分 离 ( 参 见 转 座 )。 然 而 ,由 于 严重 不 平衡 的 交换 产物 的 产生 ,它们 抑制 重组 回复 。 交 换 产 物 的 本 质 取决 于 倒 位 区 是 否 含 盖 着 丝 粒 (图 4.2)。 如 着 丝 粒 包括 在 倒 位 中 ( 臂 间 倒 位 ,pericentric inversion) ,就 会 产生 包含 缺失 与 重复 的 重组 产物 。 然 而 ,如 果 着 丝 粒 不 在 倒 位 发 生 范 围 内 ( 臂 内 倒 位 ， paracentric inversion ) 就 存在 潜在 的 更 严重 的 问题 ,重组 可 能 会 把 两 个 着 丝 粒 连 在 一 起 形 成 一 个 有 两 个 着 丝 粒 的 染色 体 和 一 个 无 着 丝 粒 断 片 。 后 者 由 于 无 法 附着 于 纺锤 体 上 往往 会 丢失 。 有 两 个 着 丝 粒 的 片断 会 延伸 在 两 个 核 之 间 ,或 者 由 于 后 期 落后 而 被 排斥 ,或 者 被 随机 打 断 产生 一 断裂 端 , 可 能 会 起 始 另 一 个 断裂 -融合 - 桥 循 环 ( 人 参阅) 。 。 48 ， 图 4.2 在 倒 位 杂 合子 中 交换 的 效果 。 倒 位 使 一 染色 体 上 位 点 C,D, 正 方向 颠倒 ,在 减 数 分 裂 时 形成 一 倒 位 环 。 在 两 侧 倒 位 中 ( 左 ) ,着 丝 粒 包括 在 倒 位 中 ,交换 产生 包含 缺失 和 重复 的 不 平衡 产物 。 在 臂 内 倒 位 中 ( 右 ) ,着 丝 粒 在 倒 位 范围 之 外 , 倒 位 环 内 发 生 交换 产生 一 无 着 丝 粒 断 片 (将 丢失 ) 和 两 着 丝 粒 的 桥 。 第 二 类 分 子 内 的 结构 畸变 的 情况 为 染色 体 两 端的 端 粒 都 丢失 ,两 个 断裂 的 末端 融合 到 一 起 。 这 种 环 状 染 色 体 复 制 后 连 成 串 ,如 果 不 能 分 开 的 话 ,不 分 离 是 不 可 避免 的 。 多 个 染色 体 的 平衡 结构 突变 ”一 条 染色 体 的 一 部 分 转移 到 另 一 染色 体 上 ,这 种 结构 畸 变 被 称 为 易 位 (translocations) 。 易 位 可 能 是 交互 的 也 可 能 是 非 交互 的 。 当 两 条 染色 体 断 裂 , 远 端 片断 互相 交换 并 重新 连接 , 这 种 情况 是 相互 易 位 (reciprocal translocation )。 非 相 互 易 位 (nonreciprocal translocation ) 指 物质 的 单 向 转移 。 一 条 染色 体 片 断 插 人 另 一 染色 体 的 内 部 位 点 被 称 为 内 易 位 (internal translocation)。 同 样 的 ,遗传 物质 加 到 另 一 染色 体 的 末端 被 称 为 末端 易 位 (terminal translocation) 。 跳 跃 易 位 (jumping translocation ) 是 一 种 特 别 的 末端 易 位 ,同样 的 染色 体 片断 连续 地 跳 牙 到 不 同 染色 体 ,在 不 同 细胞 中 出 现在 不 同 末 端 位 置 。 非 相互 易 位 的 一 种 特别 形式 被 称 为 罗 伯 逊 易 位 (Robertsonian ) 或 整 臂 易 位 (whole arm translocation) ,两 条 近 端 着 丝 粒 染色 体 (参阅 ) 在 着 丝 粒 或 着 丝 粒 附近 融合 产 生 一 可 作为 单个 分 离 单 位 分 离 的 复合 染色 体 @ (compound chromosome) 。 如 同 倒 位 一 样 , 易 位 是 平衡 的 。 但 与 倒 位 不 同 的 是 , 易 位 涉及 一 条 以 上 的 染色 体 。 因 此 ,在 杂 合 子 中 减 数 分 裂 时 的 配对 可 能 会 包括 两 对 以 上 染色 体 。 因 而 易 位 杂 合 子 往往 不 育 并 不 仅仅 是 由 于 交换 的 效应 ,也 因为 分 离 过 程 本 身 不 正常 ,会 产生 不 平衡 的 配子 (图 4.3)s 由 于 罗 伯 逊 易 位 涉及 整 条 染色 体 ,不 平衡 的 分 离 产 生 单 体 与 三 体 配子 。 这 可 由 唐 氏 综合 征 的 发 病 率 反 映 出 来 , 当 由 自发 不 分 离 引起 时 其 再 显 率 很 低 , 但 如 受 包 括 21 号 染色 @ 复合 染色 体 指 融 合 在 一 起 的 两 条 完整 的 染色 体 。 罗 伯 进 易 位 包括 两 条 近 端 着 业 粒 染色 体 (参阅 ) 的 融合 ,部 分 短 臂 的 丢失 对 表 型 没有 明显 的 影响 。 两 条 长 臂 融合 产生 近 中 着 毕 壮 染色 体 (参阅 ) 包 含 两 条 原来 的 近 端 着 丝 粒 染 色 体 的 长 臂 及 一 通常 的 着 丝 粒 (因此 整 辟 易 位 )。 也 有 可 能 两 条 近 中 着 丝 粒 染色 体 ,如 X- 染 色 体 ,连接 在 一 起 。 这 样 的 桨 色 体 是 具 双 着 丝 粒 的 ,被 称 为 并 联 染色 体 (attached chromosome)。 并 联 -X 染色 体 可 用 于 证 明 遗 传 的 染色 体 理论 ， 9: 竹 一 外 一 外 Le 和 图 4.3 在 减 数 分 裂 中 杂 合 子 的 交互 易 位 行为 。(1) 两 条 染色 体 发 生 了 双 链 断裂 (箭头 所 示 ) , 然 后 (2) 末端 连接 修复 引起 了 一 交互 的 易 位 (或 者 易 位 是 由 于 每 一 染色 体 中 位 点 间 的 重组 导致 的 )。 (3) 在 减 数 分 裂 中 , 易 位 体 试图 与 它们 正常 的 同 源 序列 排列 在 一 起 ,通常 产生 一 四 染色 体 结 构 被 称 为 四 价 染 色 体 (tetravalent)。(4) 四 价 染 色 体 可 能 以 多 种 方式 分 离 。 在 相间 分 离 (alternate seg- regation) 中 (5) ,两 条 正常 的 染色 体 分 到 一 极 ,而 两 条 发 生 易 位 的 染色 体 分 到 一 极 , 产 生平 衡 的 配 子 。 在 工 类 相 邻 分 离 (adjacent - 1 segregation) 中 (6) ,每 一 正常 的 染色 体 与 它 的 非 同 源 的 易 位 染色 体 分 到 一 起 ,产生 不 平衡 的 配子 。 在 2 类 相 邻 分 离 (adjacent - 2 segregation) 中 (7) ,每 一 正常 的 染 色 体 与 它 的 同 源 的 易 位 染色 体 分 到 一 起 ,产生 不 平衡 的 配子 (2 类 相 邻 分 离 极 少 发 生 )。 在 罗 伯 还 易 位 中 (图 中 没有 显示 ) ,复合 染色 体 试图 与 其 同 源 序列 配对 ,形成 一 三 染色 体 结 构 被 称 为 三 价 染 色 体 (trivalent)。 在 相间 分 离 中 ,复合 染色 体 分 离 到 一 极 , 另 两 条 正常 的 染色 体 分 配 到 另 一 极 , 产 生平 衡 的 配子 。 在 相 邻 分 离 ,复合 染色 体 与 正常 的 同 源 染 色 体 的 一 条 分 离 到 一 极 , 剩 下 的 另 一 条 正常 的 染色 体 分 配 到 另 一 极 ,产生 配子 不 平衡 旦 是 非 整 数 倍 的 。 体 的 罗 伯 进 易 位 引发 ,再 显 率 要 高 很 多 。 在 最 特殊 的 例子 中 , 罗 伯 逊 易 位 可 将 21 号 染色 体 的 两 个 同 源 拷贝 融合 在 一 起 。 在 这 种 情况 下 ,每 一 次 减 数 分 裂 都 会 产生 21 号 染色 体 不 平衡 的 配子 ,所 有 的 存活 后 代 都 患 有 唐 氏 综合 征 ( 即 ,再 显 风险 率 为 100% )。 脆性 位 点 染色体 上 不 能 染色 的 空隙 被 辨 明 是 严厉 生长 条 件 诱 导 的 次 级 弱 痕 ,人 们 认 为 这 是 染色 体 断 裂 的 热点 ,被 称 为 脆性 位 点 (fragile site)。 这 些 位 点 根据 诱导 它们 产生 的 生长 条 件 来 分 类 。 在 人 类 染色 体 中 ,已 辨别 出 出 现在 大 部 分 人 体内 的 超过 50 种 共同 脆性 位 点 (common fragile site) 。 还 描绘 了 出 现在 人 群 中 少数 个 体 中 的 20 种 稀有 脆性 位 点 (rare fragile site) 。 一 般 说 来 ,脆性 位 点 没有 表 型 效应 。 一 个 例外 是 位 于 Xq27 的 叶酸 敏 感 的 稀有 脆性 位 点 ,对 应 地 在 男性 携带 者 中 出 现 智力 障碍 ,大 符 丸 以 及 特征 性 的 面貌 ;在 一 些 女性 携带 者 中 出 现 智力 障碍 [马丁 - 贝尔 综合 征 (Martin-Bell syndrome ) 或 称 脆 性 X 综合 征 (fragile X syndrome) ]。 这 种 综合 征 的 病因 是 基因 FMRI 中 的 多 态 性 的 三 联 重复 突变 ,这 就 解释 了 观察 到 的 复杂 的 遗传 图 式 ( 参 见 三 联 重复 综合 征 )。 虽 然 影 响 DNA 复 制 与 修复 的 条 件 可 以 诱导 产生 脆性 位 点 ,但 使 这 个 座位 具有 脆性 的 位 点 性 质 本 质 上 与 这 种 突变 没有 关系 。 结构 突变 的 起 因 缺失 ,重复 、 倒 位 或 易 位 都 可 能 由 不 正确 修复 的 DNA 或 同 源 的 畸变 形式 或 位 点 特异 重组 引起 (参见 异常 重组 )。 串 联 重复 DNA 的 不 等 交换 可 能 产生 缺失 与 0 复制 ,同时 分 散 的 重复 序列 如 不 同 染 色 体 上 的 转 座 因子 之 间 的 重组 会 导致 易 位 。 易 位 也 可 能 是 有 非法 的 V-D-J 重组 (参阅 ) 引 起 的 ,这 种 畸变 往往 是 淋巴 样 失常 的 根源 ( 见 第 18 章 癌 基因 与 癌 ) 。 染色 体 的 断裂 可 能 自然 发 生 ,也 可 由 被 称 为 断裂 剂 (clastogen) 的 化 学 或 物理 因素 诱 导 发 生 。 在 具有 遗传 性 弱点 时 ,如 负责 DNA 重组 与 修复 的 基因 的 突变 ,发 生 断 裂 的 机 会 上 升 。 染 色 体 断裂 的 频率 与 姐妹 染色 单 体 交换 (sister chromatid exchange,SCE ,染色 体 中 两 姐妹 染色 单 体 之 间 的 交换 ) 的 频率 有 关 , 因 为 同 源 重 组 会 被 双 链 断裂 所 促进 ( 见 第 25 章 重组 )。SCE 的 频率 可 通过 姐妹 染色 单 体 的 不 同 染 色 来 定量 (参见 复制 带 型 ) 。 在 几 种 染 色 体 不 稳定 综合 征 (chromosome instability syndrom) 中 观察 到 SCE 的 频率 上 升 :Bloom 氏 综合 征 ,Fanconi 氏 综 合 征 和 共 济 失调 毛细 血管 扩张 ,它们 是 由 DNA 修复 基因 或 DNA 损 伤 反应 基因 的 突变 所 至 (参见 修复 缺陷 综合 征 )。 染 色 体 DNA 中 断裂 位 点 的 分 布 并 不 是 随机 的 。 虽 然 已 知 不 同 的 断裂 剂 具 有 不 同 的 断裂 热点 ,染色 质 区 域 中 的 热点 复 主 要 位 于 明 G 带 (参见 染色 体 带 型 ) ,暗示 了 敏感 位 点 与 染色 质 结 构 有 关 ( 见 第 3 章 染 色 质 )。 个 体 中 的 混合 核 型 上 面 几 节 讨 论 了 组 成 型 染色 体 突 变 (consititutional chromosome mutation) , 即 影响 体内 的 每 个 细胞 。 第 二 类 染色 体 畸 变 被 称 为 体 细胞 染色 体 突 变 或 获得 性 染色 体 突 变 (somatic or acquired chromosome mutation ) ,这 种 畸变 在 发 育 中 发 生 ,导致 了 同一 核 型 中 不 同 核 型 的 混合 ( 表 4.6)( 参 见 体 细 胞 突变 , 瘤 这 )。 这 样 的 一 个 体 被 称 为 峙 合体 (mosaic) 。 同 样 的 混合 核 型 也 可 能 在 两 个 独立 发 生 克隆 的 混合 情况 下 发 生 。 这 样 的 个 体 被 称 为 异 源 凡 合 体 (chimera) 。 在 两 种 情况 都 是 同一 生物 体 中 分 布 着 不 同 的 细胞 ,但 只 有 在 岩 合体 中 ,两 类 细胞 才 来 自 同一 祖先 。 异 源 骨 合 现象 天 然 发 生 的 频率 很 低 : 异 卵 双 生 的 融合 导致 双 精 子 藤 合 体 (dispermic chimeras) 的 产生 , 源 于 同 对 双生 细胞 的 一 双生 体 的 克隆 化 导致 血细胞 藤 合 体 (blood chimeras) 的 产生 ( 另 参 见 转基因 小 筷 ,ES 细胞 )。 表 4.6 各 方面 等 同 的 细胞 表现 的 不 同 表 型 有 关 的 术语 及 它们 的 内 在 起 因 术语 定义 花 班 (variegation) 在 一 组 织 中 ,出 现 表 现 不 同 表 型 的 部 分 (例如 一 些 植物 中 的 白 / 妇 花 班 )。 这 可 能 并 不 反应 基因 型 的 内 在 差别 。 混 倍 性 (同体 异 数 ) [mixoploidy ”携带 具有 不 同 核 型 的 体 细 胞 的 个 体 。 混 倍 性 可 以 是 嵌 合 体 也 可 以 是 异 源 红 合体 (aneusomaty)] ( 见 下 文 )。 真 体 (eusomaty) 指 细胞 具有 相同 核 型 的 个 体 。 丹 合 体 (mosaic) 携带 来 源 于 同一 祖先 具有 不 同 基因 型 (或 核 型 ) 的 体 细胞 的 个 体 , 如 来 源 于 突变 或 体 细 胞 重组 。 异 源 嵌 合体 (chimera) 携带 来 源 不 同 具 有 不 同 基因 型 (或 核 型 ) 的 体 细胞 的 个 体 。 异 源 嵌 合体 往往 来 源 于 胚胎 融合 或 克隆 化 (参见 转基因 小 鼠 ,ES 细胞 ) 。 非 自主 表 型 (alopheny) 由 于 另 一 组 织 中 的 嵌 合 导致 的 一 组 织 表现 出 花 斑 的 现象 , 例 花 斑 组 织 的 差异 不 是 由 于 内 在 的 差异 ,而 是 由 于 具有 不 同 基 因 型 的 其 他 细胞 的 诱导 性 的 相互 作用 。 获得 非 自 主 表 型 的 动物 可 测试 一 突变 的 细胞 自主 性 。 非 自主 表 型 的 果 蝇 可 以 通 过 X 射 线 诱导 体 细 胞 重组 产生 ,例如 为 了 研究 眼 发 育 中 的 相互 作用 (参见 seven- less 信号 途径 ) 。 混合 核 型 效应 的 最 重要 的 决定 因素 是 各 细胞 株 的 克隆 程度 及 涉及 的 基因 自主 性 。-- se 区 中 闻 有 害 的 核 型 如 果 只 限于 组 织 的 一 小 部 分 或 这 种 缺陷 是 细胞 非 自主 的 ( 即 它 可 被 其 他 细胞 的 产物 所 补偿 ) 情 况 下 可 能 不 会 有 整体 的 效应 。 反 之 ,一 核 型 如 果 是 广泛 存在 或 它 影响 一 特异 的 器 官 ,或 这 缺陷 是 细胞 自主 的 从 而 导致 广泛 的 细胞 死亡 , 它 有 可 能 是 致命 的 。 在 动 物 中 ,来 自 肉 性 和 雄性 的 细胞 的 典 合 体 或 异 源 拱 合 体 ( 雄 肉 骨 合 体 ,gynandromorph) 可 以 象 任 一 性 别 那样 正常 发 育 表现 为 间 性 (intersex, 具 有 两 种 或 中 间 性 征 的 个 体 ) 或 表现 为 雄 上 峻 同体 (hermaphrodite, 既 可 以 产生 雄性 配子 又 可 以 产生 肉 性 配子 的 个 体 ) ,这 依赖 于 每 一 细胞 株 的 克隆 程度 。 嵌 合 体 这 个 术语 常常 被 广泛 地 用 来 描绘 任何 各 方面 等 同 的 细胞 表现 的 不 同 表 型 的 情 况 。 然 而 严格 说 来 峙 合 现象 指 基因 型 的 混合 而 不 包括 由 不 同 的 外 显 率 与 表现 度 引 起 的 不 同 表 型 ,如 由 环境 效应 或 后 生 调 节 引 起 的 表 型 差异 (例如 位 置 花 斑 效应 (参阅 ) 或 不 同 活化 与 失 活 的 X 染色体 的 遗传 ) 。 当 未 监测 到 基因 型 的 内 在 差别 时 ,应 该 使 用 表 型 花 斑 (varie- gation) 这 个 术语 。 (徐汇 主 ) a 手 池 二 第 5 章 染 色 体 结构 与 功能 基本 概念 与 定义 。 染色体 (chromosome) 是 一 独立 的 携带 必需 遗传 信息 的 DNA 分 子 , 并 包括 决定 其 结构 的 有 关 蛋 白质。 这 个 术语 的 范围 可 包括 细菌 的 核酸 ,细胞 器 基因 组 和 病毒 基 因 组 ,同样 包括 真 核 核 内 染色 体 。 在 这 一 章 中 只 讨论 最 后 一 种 情况 。 最 初 认 识 到 基因 由 染色 体 携带 是 基于 染色 体 与 备 德 尔 基因 行为 的 平行 关系 (成 对 出 现 , 均 等 分 离 ,独立 的 类 型 )。 这 是 遗传 的 染色 体 理论 (chromosome theory of in- heritance) 。 在 二 倍 体 真 核 生 物 中 有 三 个 水 平 的 对 偶 性 。 体 内 出 现 同 源 染 色 体 对 ,并且 当 单个 染色 体 在 减 数 分裂 中 变 得 可 见 时 ,可 以 看 到 它们 包括 一 对 姐妹 染色 单 体 (chro- matids) ,由 一 共同 的 着 丝 粒 连接 ,每 一 姐妹 染色 单 体 包括 两 条 双 螺 旋 的 DNA 链 。 尽管 出 现 了 八条 DNA 链 , 细胞 仍然 是 二 倍 体 。 事 实 上 ,每 一 双 螺 旋 中 只 有 一 条 链 携带 有 (转录 ) 信 息 ,并 且 两 个 姐妹 染色 单 体 的 出 现代 表 了 信息 的 加 倍 以 备 分 离 进入 子 细胞 - 细胞 产生 时 只 带 有 一 份 拷贝 ( 当 分 离 时 姐妹 染色 单 体 成 为 一 染色 体 )。 另 外 ,每 一 有 丝 分 裂 染 色 体 的 姐妹 染色 单 体 是 等 同 的 ,而 同 源 染 色 体 不 等 同 。 因 此 在 整个 细胞 周期 中 ,每 一 位 点 只 有 两 个 等 位 基因 。。 在 减 数 分 裂 中 可 辨别 出 两 类 染色 体 : 常 染色 体 (autosome) 具 有 同形 (homomeor- phic ,结构 完全 一 样 ) 的 配对 染色 体 因此 形成 同 源 染 色 体 对 。 异 染色 体 (hetero- somes or allosome) 具 有 异形 (heteromorphic, 结 构 不 同 ) 的 配对 染色 体 并 且 只 有 部 分 同 源 区 能 相互 配对 。 两 条 异形 染色 体 的 相互 配对 部 分 被 称 为 假 常 染色 体 区 域 《pseudoautosomal region ) ,因为 这 个 区 域 中 的 基因 表现 出 常 当 色 体 基因 同样 的 遗 传 方式 。 异 染色 体 往 往 是 性 染色 体 (sex-chromosome) (参见 谱系 分 析 、 性 连锁 遗 传 、 性 别 决 定 )。 染色 体 的 作用 是 提供 一 框架 ,使 基因 组 的 线性 片断 能 有 效 地 复制 与 分 离 。 这 两 个 过 程 中 任 一 的 失败 都 会 导致 子 细胞 中 的 染色 体 不 平衡 。 三 个 特异 的 顺 式 作 用 位 点 是 稳定 的 染色 体 维 持 所 必需 的 ,它们 是 复制 原点 (参阅 )、 着 丝 粒 、 端 粒 。 5.1 正常 的 染色 体 一 一 一 般 形 态 正常 染色 体 的 细胞 遗传 学 特征 ”在 细胞 周期 的 大 部 分 中 , 真 核 染色 体 以 松散 堆积 的 染 2 向 | 色 质 形式 存在 ,并 且 无 法 从 细胞 核 中 辨别 出 来 。 它 们 在 有 丝 分 裂 (或 减 数 分 裂 ) 的 开始 成 为 可 见 , 这 时 染色 质 压 缩 后 形成 分 立 的 结构 , 当 用 适当 的 染料 处 理 核 时 可 以 被 染色 ( 文 杠 5.1)。 细 胞 分 裂 中 期 的 染色 体 的 形态 特征 在 图 $.1 中 显示 ,这 使 我 们 可 以 识别 各 个 染色 体 并 辨别 畸变 ( 见 第 4 章 当 色 体 突变 )。 表 5$.1 染色 体 分 带 技 术 的 选择 分 带 技 术 “ 方法 与 应 用 C 带 型 ”一 基于 吉姆 萨 方法 的 技术 ,包括 与 氢 氧 化 钒 的 保温 ,可 辨别 异 染 色 质 ( 参 阅 ) 区 域 ,因此 可 用 来 确定 着 丝 粒 的 位 置 。 Ci 带 型 ”辨别 动 粒 (参阅 ) 的 技术 。 D 带 型 ”辨别 DNase [敏感 区 域 的 技术 ,一 般 对 应 于 具有 潜在 转录 活性 的 开放 染色 质 区 域 。 G 带 型 ”最 常用 的 染色 体 分 带 技术 ,高 重复 性 的 带 型 是 国际 标准 人 类 与 小 鼠 细胞 遗传 学 图 谱 的 基础 。 染 色 体 用 胰 蛋 白 酶 部 分 水 解 ,与 吉姆 萨 氏 染料 (giemsa's stain , 溶 于 甲醇 中 甲 基 蓝 , 曙 红 及 其 他 染料 的 混合 物 ) 保温 。 G12 带 在 高 pH 下 的 G 带 技术 ,对 人 类 与 小 鼠 的 染色 体 染 色 不 同 ,使 它们 可 以 区 别 开 , 例 如 在 体 细 胞 杂交 中 。 N 带 型 ”特异 染色 核 仁 组 织 区 域 的 技术 ,如 硝酸 银 染 色 。 Q 带 型 用 荧光 染料 奎 纳 克 林 的 带 型 技术 。 它 产生 与 G 带 型 相同 的 图 谱 , 但 还 使 异 染 色 质 区 域 发 荧光 ,如 辨别 立 染 色 体 。 R 带 型 ”一 基于 吉姆 萨 方法 的 技术 ,包括 一 热 变 性 步骤 获得 与 通常 的 G 带 型 方法 相反 的 带 型 图 式 。 这 技术 非常 有 用 ,如 鉴别 末端 缺失 等 。 复制 带 型 ， 这 个 技术 包括 将 溴 脱氧 尿 苷 插入 复制 DNA。 在 S 相 的 一 短 的 脉冲 是 复制 时 间 可 被 监测 。 如 果 延 长 时 间 ,产生 与 吉姆 萨 染 色相 似 的 图 式 ,说明 G 带 对 应 于 复制 时 间 区 带 (参阅 )。 插 人 后 经 过 两 轮 复制 可 以 分 辨 姐妹 染色 单 体 由 于 一 条 染色 体 两 条 链 都 有 省 脱氧 尿 苷 的 插入 , 另 一 只 有 一 条 链 被 插入 。 这 样 姐妹 染色 单 体 在 吉姆 萨 染 料 或 在 荧光 染料 Hoechst 33258 的 存在 下 就 会 有 不 同 的 染色 情况 。 这 个 技 术 被 称 为 花 斑 染色 (harlequin staining) 可 用 于 姐妹 染色 单 体 交 换 ( 人 参阅) 的 监测 。 T 带 型 有 R 分 带 技术 的 变化 。 只 有 端 粒 DNA 可 被 染色 , 工 带 是 基因 富 集 的 区 带 (参见 等 容 , 转 录 图 谱 )。 在 很 多 情况 下 ,这 些 方法 是 经 验 性 的 , 即 它们 的 工作 原理 并 未 被 了 解 ,值得 注意 的 是 这 些 不 同 的 技术 产生 同样 的 相似 的 带 型 ,强烈 暗示 了 使 基因 组 成 为 分 立 的 等 容 的 结构 组 织 。 染色 体 臂 : 短 臂 称 为 P(petite)， 卫星 区 域 (在 核 仁 组 织 长 臂 称 为 q 区 域 远 侧 ) > 桨 色 单 人 | 初级 弱 痕 次 级 弱 痕 (着 丝 粒 ) ( 核 仁 组 织 区 ) 图 5.1 正常 中 期 染色 体 的 形态 特征 。 初 级 绞 痕 (primary constriction) 指 明了 着 丝 粒 的 位 置 染色 较 浅 ,连接 所 有 四 条 染色 体 臂 (arm) 。 次 级 痕 (secondary constriction) 染 色 较 浅 ,往往 代表 了 核 仁 组 织 区 域 (nucleolar organizer region,NOR ) ,是 串联 重复 rRNA 基因 的 位 置 。 在 人 类 染色 体 1,9 和 16 中 发 现 了 中 间 的 次 级 弱 痕 ,而 在 染色 体 13,14,15,21 和 22 中 发 现 了 远 端 次 级 弱 痕 。NORs 的 远 端 端 粒 染 色 体 片断 被 称 为 卫星 区 域 因为 它们 与 染色 体 的 主体 显得 被 分 离 。 由 于 核 仁 组 织 区 形 成 一 共同 的 核 仁 (nucleolus) ,不 同 染 色 体 的 卫星 区 域 (satellite region) 往 往 连接 在 一 起 (卫星 连接 ， satellite association)。 其 他 的 次 级 弱 痕 可 由 在 不 正常 的 条 件 下 细胞 的 生长 所 诱导 ,被 称 为 脆性 位 点 (参见 ) 。 染 色 体 多 态 性 (chromosome polymorphism) 或 称 异 形 性 (heteromophism) 是 在 一 个 群体 中 变化 的 染色 体 的 某 些 遗传 形态 特征 ,它们 没有 表 型 效应 。 例 子 包括 可 变异 染色 质 ( 如 图 所 示 )， 倒 位 (参见 ) 和 稀有 脆性 位 点 ,这 些 可 用 作 细 胞 遗传 学 标记 。 多 机， 染色 体 带 型 ”在 图 5.1 中 显示 描绘 的 染色 体 的 特征 基于 与 DNA 结合 染料 如 富 尔 根 (feulgen) 的 均 相 染色 (homogeneous staining)。 哺 乳 类 的 染色 体 也 可 使 用 一 系列 破坏 性 技 术 以 异 相 染色 方式 被 染色 ,会 显现 明暗 相间 的 高 重复 性 与 特异 的 横 带 图 式 ( 表 5$.1)。 这 种 染色 体 分 带 (chromosome banding ) 方 法 是 具有 同样 的 大 致 形态 的 染色 体 可 被 分 辩 , 并 为 基因 作 图 提供 了 一 细胞 遗传 学 的 基础 。 它 们 在 表征 染色 体 畸 变 时 特别 有 用 。 在 细胞 分 裂 中 期 的 染色 体 中 只 能 观察 到 低 分 辨 率 , 但 在 较 不 紧密 的 前 中 期 染色 体 中 每 一 中 期 带 型 都 可 细 分 为 许多 亚 带 。 人 类 细胞 遗传 学 命名 法 (the International System for Human Cytoge- netic Nomenclature,ISCN) 就 是 基于 早 、 晚 前 中 期 与 中 期 染色 体 的 带 型 与 亚 带 型 建立 的 (分 别 具 有 400、550 与 8S0bp 的 分 辩 率 )。 每 一 带 用 它 所 在 的 染色 体 与 染色 体 臂 ( 例 ,1p， 2q) 和 从 着 丝 粒 数 起 的 带 数 来 表征 (cez )。 分 辩 率 增加 用 更 多 的 数字 来 表示 (例如 1p3 一 1p34->1p34.1)。 染 色 体 带 型 图 式 反 映 了 哺乳 类 基因 组 的 结构 与 功能 的 组 织 (参见 等 容 )， 例如 , 明 的 吉姆 萨 带 对 应 于 具有 一 般 转 录 活 性 ` 早 期 复制 与 低 重复 DNA 含量 .DNA 酶 敏 感 的 区 域 。 由 于 每 一 条 带 对 应 于 超过 10Mb 的 DNA, 这 种 是 大 致 的 划分 ( 见 第 3 章 染 色 质 ,第 12 章 基 因 组 与 作 图 )。 低 等 的 真 核 染 色 体 用 适用 于 哺乳 动物 染色 体 的 染色 技术 不 能 染色 ,但 双 翅 目 昆 虫 的 多 线 染 色 体 显示 天 然 的 高 分 辨 率 的 带 型 ( 见 下 文 )。 S$.2 特异 染色 体 结构 A 和 B 染 色 体 在 大 多 数 真 核 生物 中 ,正常 个 体 的 每 一 个 细胞 中 都 携带 有 确定 不 变 的 一 套 染 色 体 ,可 以 用 于 种 属 的 判断 (参见 核 型 ;参考 双 微 染色 体 , 基 因 扩 增 )。 然 而 有 些 种 属 携带 有 额外 的 染色 体 ,往往 表 现 为 全 部 由 异 染 色 质 组 成 ,没有 表 型 效应 ,在 指定 群体 中 甚至 在 同一 个 体 的 不 同 细 胞 中 往往 都 有 变化 。 这 些 结构 有 不 同 的 名 称 , 如 附属 染色 体 (accessory chromosomes) ,卫星 染色 体 (satelite chromosomes) , 超 数 染 色 体 (supernumerary chromosomes) ,或 者 在 植物 中 ,被 称 为 B 染色 体 (B-chromosome) (与 不 变 和 必需 的 A 染色 体 (A-chromosome) 相 区 别 )。 它 们 一 般 不 参与 减 数 分 裂 而 是 随机 分 离 。 它 们 可 以 被 认为 是 巨大 的 线性 质粒 。 多 线 染色 体 ”在 果 蝇 与 其 他 双 翅 目 昆 虫 中 ,特定 幼虫 分 泌 组 织 ( 如 唾液 腺 ) 的 细胞 中 含 有 由 超过 1000 个 染色 单 体 组 成 的 巨大 染色 体 (giant chromosome)。 它 们 也 可 被 称 为 多 线 染色 体 (polytene chromosome ) 或 根据 它们 的 发 现 者 命名 为 巴尔 比 亚 尼 染色 体 (Balbiani chromosome) ,这 种 染色 体 是 由 于 作为 一 种 基因 扩 增 的 策略 在 不 发 生 有 丝 分 裂 情况 下 多 轮 复制 而 造成 的 。 多 线 染 色 体 不 仅 比 正常 染色 体 更 粗 , 也 比 正常 染色 体 更 长 ,由 于 多 个 染色 单 体 的 聚集 使 正常 的 染色 质 结构 不 可 能 形成 。 多 线 染 色 体 的 一 显著 的 特征 就 是 高 度 重 复 性 的 横向 深 色 的 带 (band) (或 称 染 色 粒 ， chromomere) 和 浅 色 的 间 带 (interband)。 它 们 被 认为 反映 了 染色 质 密度 上 的 区 域 差异 并 且 功 能 性 地 对 应 于 不 同 的 染色 质 区 域 (参阅 )。 这 种 带 型 的 分 辩 率 甚至 较 之 哺乳 类 染色 体 的 前 中 期 的 带 型 更 为 精细 (各 多 线 带 长 度 1 到 100kbp DNA 的 范围 内 ) ,但 可 以 相同 的 方 式 应 用 ,来 构建 细胞 遗传 学 图 谱 与 表征 染色 体 突变 。 ee 5S5 se ee gs 多 线 染 色 体 的 第 二 个 特征 是 染色 体 膨 大 (chromosome puff) 和 巴尔 比 亚 尼 环 (Balbiani ring)。 它 们 分 别 是 染色 体 上 相对 较 小 或 较 大 的 膨胀 部 分 ,对 应 于 转录 活性 区 域 ,可 能 反 映 了 染色 质 结构 的 区 域 膨胀 。 特 定 的 环境 刺激 可 诱导 发 生 重 复 性 的 膨大 或 环 的 图 式 ( 例 用 赔 皮 激 素 处 理 ) ,这 样 可 以 通过 直接 观察 确定 激活 基因 的 位 置 。 灯 刷 染色 体 ”在 双 翅 目的 卵 母 细胞 中 ,细胞 周期 在 第 一 次 减 数 分 裂 的 双 线 期 (参阅 ) 被 抑 制 ,形成 单个 的 核 仁 以 满足 特大 细胞 的 需要 。 减 数 分 裂 的 二 价 体 的 四 个 染色 单 体 被 交叉 连 在 一 起 ,可 以 看 到 ,从 深 色 的 堆积 的 染色 粒 (同一 术语 用 来 描绘 灯 刷 染色 体 与 多 线 染 色 体 中 深 色 堆 积 的 可 能 是 非 活化 的 染色 质 部 分 ,也 用 在 去 紧缩 的 哺乳 类 染色 体 上 ) 突 出 长 的 不 卷曲 的 转录 活化 染色 质 的 外 侧 环 (lateral loops)。 这 种 环 成 对 出 现 ,发 生 于 每 一 染色 单 体 上 ,并 且 它们 被 一 核糖 核 蛋白 的 环 所 环绕 。 这 些 以 及 逐渐 去 紧缩 的 环 结构 被 认为 反映 了 染色 体 连 续 与 巨大 的 转录 活性 。 整 个 细胞 共有 10 一 15 000 在 活动 的 环 , 但 大 部 分 DNA 仍 以 染色 粒 的 形式 紧缩 。 如 同 多 线 带 与 间 带 ,每 个 环 被 认为 对 应 于 一 染色 质 区 域 (参阅 )。 5.3 染色 体 结构 的 分 子 方面 染色 体 功能 所 要 求 的 分 子 结构 “染色体 的 大 体形 态 对 它 如 何在 细胞 中 起 作用 提示 很 少 。 首 先 , 染 色 体 的 功能 是 提供 了 一 个 框架 ,使 基因 组 的 每 一 线 状 片断 可 以 有 效 地 复制 与 分 离 ,这 两 个 过 程 中 任 一 的 失败 都 会 导致 子 细胞 中 染色 体 的 失衡 ( 见 第 4 章 染 色 体 突变 )。 由 于 每 一 真 核 染 色 体 带 有 基因 的 不 同 排列 ,染色 体 上 携带 的 信息 不 会 影响 它 的 功能 。 稳 定 维持 的 染色 体 要 求 有 三 个 顺 式 作用 位 点 :复制 起 点 (参阅 ) ,着 丝 粒 和 端 粒 。 复 制 原点 对 染色 体 的 复制 是 必要 的 ,因为 它 提 供 了 复制 起 始 蛋 白质 的 结合 位 点 ( 见 第 26 章 复制 )。 着 丝 粒 (centromere) 对 分 离 是 必要 的 ,因为 它 提供 了 一 动 粒 组 建 的 位 点 ,促进 微 管 的 附着 。 端 粒 (telomeres) 对 染色 体 的 稳定 是 必需 的 ,因为 它们 在 DNA 复制 后 完成 染色 体 末端 形 成 ,防止 与 其 他 染色 体 错误 的 末端 连接 。 携 带 有 任意 DNA 的 人 工 染 色 体 (参阅 ) 只 要 具 有 这 三 种 元 件 ,就 可 以 与 内 源 基因 组 共同 稳定 保持 。 着 丝 粒 的 分 子 性 质 在 酿酒 酵母 中 ,遗传 学 上 着 丝 粒 根据 它们 在 质粒 中 的 有 丝 分 裂 的 稳定 性 来 确定 (这 被 称 为 CEN 功能 ,CEN function)。 用 染色 体 步 移 ( 参 阅 ) 的 方法 克隆 了 几 个 着 丝 粒 , 它们 显示 在 功能 上 可 相互 代替 。 序 列 比较 辨 明了 三 个 保守 元 件 ,被 称 为 CDIL,CDIL CDIII。CDI 具 有 一 短 的 共有 序列 主要 在 减 数 分 裂 中 起 作用 。CDII 是 一 约 100bp 的 富 含 AT 的 序列 ,其 作用 是 不 清楚 的 。 这 两 种 元 件 中 的 突变 影响 有 丝 分 裂 的 过 程 但 不 会 消除 它 ,CDIII 是 一 个 高 度 保 守 的 26bp 的 元 件 表现 出 二 重 对 称 性 , 它 似乎 对 着 丝 粒 的 活性 是 必需 的 ,因为 在 对 称 中 心 的 点 突变 能 消除 着 丝 粒 功能 ,导致 不 稳定 的 分 离 。 一 个 被 称 为 Cbf-III 的 多 蛋白 复合 物 与 这 元 件 结合 并 表现 微 管 马达 活性 。Cbf-III 可 能 代 表 了 微 管 附着 与 分 裂 后 期 分 离 启 动 的 位 点 。 栗 酒 酵母 及 更 高 级 的 真 核 生物 中 ,着 丝 粒 延伸 约 几 十 kbp, 而 相对 的 较 小 的 酿酒 酵母 的 着 丝 粒 为 125bp, 这 反映 了 纺锤 体 附 着 的 性 质 。 在 酿酒 酵母 中 ,一 单个 纺锤 体 纤 维 附着 于 每 一 染色 体 , 而 在 栗 酒 酵母 及 哺乳 动物 中 ,涉及 数目 众多 的 纤维 ,着 丝 粒 中 包含 重复 DNA。 在 粟 酒 酵母 中 着 丝 粒 表现 出 二 重 对 称 性 ,而 在 哺乳 动物 中 ,着 丝 粒 包含 大 量 的 卫星 DNA( 参 ee 5S6 四 阅 ) ,在 灵 长 类 动物 中 包含 170bp 局 部 微 扰 的 串联 重复 。 茶 些 蛋 白质 特异 地 作用 于 哺乳 类 着 丝 粒 ,其 中 之 一 在 体外 能 与 卫星 DNA 结合 ,并 可 能 代表 了 着 丝 粒 形成 位 点 。 端 粒 的 分 子 性 质 ”线性 染色 体 的 属性 代表 了 真 核 细 胞 的 两 个 问题 。 首 先 ,由 于 DNA 又 合 酶 (参阅 ) 的 性 质 ,每 一 链 的 5 端 在 复制 中 不 能 完成 ( 见 第 26 章 复 制 )。 第 二 ,由 于 DNA 修复 的 末端 连接 酶 的 丰 余 ,染色体 未 端 会 被 连接 在 一 起 产生 具 多 着 丝 粒 的 复合 染色 体 或 环 状 染 色 体 ,这样 不 能 正确 分 离 ( 见 第 4 章 染 色 体 突变 )。 这 两 种 潜在 致命 的 过 程 被 端 粒 (telomerse) 所 防止 , 它 是 一 特异 的 结构 以 复制 独立 的 方式 加 在 染色 体 未 端 。 端 粒 还 作为 联 会 起 始 者 的 作用 。 它 们 与 核 膜 相 互 作 用 并 且 是 染色 体 中 最 早 配对 的 区 域 。 在 酵母 与 锥 虫 中 , 亚 端 粒 DNA 在 基因 表达 调控 中 起 重要 的 作用 ,它们 含有 信息 的 沉默 拷贝 , 通 过 非 交互 重组 转移 到 满足 表达 的 位 点 (参见 交配 型 转换 ,抗原 转换 )。 端 粒 DNA 包括 短 的 串联 重复 序列 。 在 很 多 真 核 生 物 中 都 鉴别 到 这 种 序列 ,并 且 往 表 5 2 不 同 真 核 生物 中 的 端 粒 重复 序列 往 是 富 含 GC 对 ,一 条 链 上 徐 集 着 鸟 呀 叭 , 另 人 生物 体 端 粒 重复 一 条 链 上 簇 集 着 胞 喀 啶 ( 表 5.2)。 它 们 可 以 TO 通过 鸟 味 叭 之 间 的 非常 规 相 互 作 用 形成 异常 锥 由 寺 蚌 若 作 的 四 倍 体 结构 ,这 可 能 保护 端 粒 不 发 生 末 端 酿酒 酵母 (TG) -3TGGG 连接 反应 ( 见 第 16 章 核酸 结构 )。 在 不 稳定 拟 南 并 TAGGG 的 线 状 质粒 的 未 端 添加 端 粒 重复 序列 导致 了 哺乳 类 TITAGGG 如 同 着 丝 粒 存在 同样 的 稳定 性 。 端 粒 由 一 特异 的 核糖 核 蛋 白 复合 物 被 称 为 端 粒 酶 (telomerase) 加 到 DNA 末端 上 , 它 由 多 条 多 肽 链 与 一 单个 RNA 分 子 组 成 ,RNA 分 子 包含 两 拷贝 的 在 端 粒 DNA 中 出 现 的 胞 喀 啶 富 集 的 序列 。 端 粒 酶 的 蛋白 组 分 具有 反 转 录 酶 活性 ,但 其 活性 只 限于 应 用 端 粒 酶 特异 的 RNA 作为 模板 。 基 于 这 个 信息 , 现 有 模型 认为 端 粒 重复 是 通过 一 引物 延伸 /和 粳 板 转换 的 策略 添加 到 已 存在 的 端 粒 3 末端 ,如 图 $.2 所 示 。 最 远 端 的 端 粒 重复 被 认为 可 形 成 能 封闭 端 粒 末端 的 结构 , 这样 就 可 以 防止 不 正常 的 末端 连接 。 这 可 能 还 涉及 DNA 的 环 化 和 / 或 端 粒 结 合 蛋白 的 聚合 。 末 端 DNA 的 环 化 可 以 启动 富 含 G 的 DNA 链 的 合成 。 端 粒 酶 的 成 员 与 其 他 与 端 粒 活性 有 关 的 蛋白 质 可 以 通过 分 析 影 响 端 粒 功能 的 突变 来 辨别 。 酵 母 中 发 现 有 一 种 株 特 异 的 特征 性 与 端 粒 长 度 有 关 的 一 个 突变 , 具 老 化 表 型 ,通过 这 种 突变 鉴别 出 了 TLC1 基因 (编码 端 粒 酶 RNA) 和 几 个 编码 端 粒 酶 多 肽 链 和 端 粒 结合 蛋白 如 哺乳 类 的 TRFI1 的 EST 位 点 (甚至 较 短 的 端 粒 )。 老 化 的 表 型 表明 了 端 粒 在 指定 细胞 的 寿命 范围 决定 中 可 能 起 着 重要 的 作用 。 这 种 推断 被 以 下 的 观察 结果 进一步 证 明 了 :在 特定 的 人 类 体 细胞 中 端 粒 的 长 度 随 年 龄 增长 而 下 降 ,而 在 生殖 细胞 中 , 端 粒 的 长 度 一 直 保持 着 ( 另 参见 生长 转换 ; 见 第 18 章 癌 基 因 与 癌症 )。 然 而 在 小 鼠 的 寿命 比 人 类 短 得 多 ,而 端 粒 的 长 度 却 比 人 类 长 ,没有 观察 到 与 年 龄 有 关 的 端 粒 缩短 。 有 推断 认为 端 粒 长 度 缩短 到 一 定 限 度 会 诱导 一 种 DNA 修复 机 制 ,并 抑制 细胞 周期 。 如 果 这 样 , 细 胞 扩 增 就 要 求 端 粒 酶 活力 ,在 大 多 数 人 类 主要 的 肿瘤 中 端 粒 酶 活性 的 存在 支持 了 这 种 假设 ; 端 粒 酶 可 能 是 抗 癌 治 疗 的 合适 的 作用 物 。 然 而 ,最 近 得 到 的 端 粒 酶 基因 效 除 的 小 鼠 表现 出 与 其 野 生 型 的 对 照相 似 的 癌症 发 生 率 ( 见 第 26 章 复制 )。 下 人 图 5.2 端 粒 酶 活性 的 模型 。(1) 端 粒 酶 RNA( 黑 体 ) 与 染色 体 末 端的 DNA 配 对 。(2) 端 粒 酶 RNA 作为 反 转 录 的 模板 ;DNA 引物 延伸 到 模板 的 末端 。(3) 端 粒 酶 转移 到 新 的 染色 体 末 端 。 在 果 蝇 中 , 端 粒 的 远 端 在 结构 上 与 其 他 真 核 生物 相同 并 且 可 能 以 同样 的 方式 一 一 形 成 可 封闭 末端 连接 的 帽子 起 作用 。 然 而 , 端 粒 长 度 以 一 种 新 的 方式 得 到 保持 ,其 中 包括 类 LINE1 逆转 录 因 子 特异 地 重复 转 位 到 染色 体 未 端 。 这 些 元 件 定位 的 方式 仍 不 清楚 。 文 框 S.1 染色 体 分 类 与 命名 染色 体 参 数 ”所 有 的 已 知 的 真 核 生物 的 单 倍 体 都 具有 两 条 以 上 的 染色 体 。 所 以 必须 定义 一 描 绘 性 的 命名 系统 可 使 每 一 染色 体 与 核 仁 中 的 其 他 染色 体 区 分 开 来 。 下 面 简要 介绍 这 种 命名 法 , 它 可 特别 指出 着 丝 粒 的 位 置 与 类 型 以 及 染色 体 辟 的 相对 长 度 。 大 部 分 染色 体 可 用 三 个 参数 来 定义 ， d- 值 ,- 值 与 着 丝 粒 指数 (i) 。 着 丝 粒 指数 限定 了 着 丝 粒 出 现 的 染色 体 区 域 而 不 考虑 染色 体 长 度 。 d- 值 (4d-value) 指 染色 体 长 臂 与 短 臂 之 间 长 度 的 差别 , 即 4a=a-z,q 和 z 分 别 指 长 臂 与 短 臂 的 长 度 , 并 且 染 色 体 的 总 长 被 分 成 10 个 相对 单位 。 产 值 (>-value) 指 染色 体 两 臂 长 度 之 比 , 即 ~=q /ze 着 丝 粒 指数 (centromeric index) 指 着 丝 粒 到 短 臂 末端 的 距离 ,用 占 染 色 体 总 长 度 的 百分比 来 表示 ， 即 ;=1002 人 ( 户 + 9g)。 根 据 这 些 参 数 与 染色 体 的 大 小 ,人 类 染色 体 被 分 成 几 类 , 如 下 图 所 示 。 图 注 : 用 于 定义 形态 参数 4 ,~ 与; 的 测量 本 *， 5S8 ， 术语 定义 单 着 丝 粒 的 (monocentric) 具有 单个 确定 着 丝 粒 的 染色 体 。 大 部 分 正常 染色 体 是 单 着 丝 粒 的 。 全 着 丝 粒 的 (holocentric) 具有 弥散 的 着 丝 粒 的 染色 体 。 因 而 整个 染色 体 都 发 生 纺锤 体 的 附着 (外 侧 附 着 ,lateral attachment) ,如同 在 鳞 翅 目 中 发 现 的 那样 。 端 着 丝 粒 的 (telocentric 或 talomictic) ”具有 末端 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 ( 刀 =0,qg=10,d=10,r= cc 以 及 i=0) ,也 被 称 为 T- 染 色 体 (T-chromosome) 或 单 臂 染 色 体 (monobrachial chromosome)。 这 种 染色 体 极 少 天 然 发 生 ， 大 部 分 得 到 的 单 臂 染色 体 都 具有 一 较 短 但 确定 的 之 臂 ,因而 这 个 术语 被 广泛 误 用 了 。 它 可 用 来 描绘 从 着 丝 粒 处 断裂 的 畸 变 染 色 体 。 非 端 着 丝 粒 (atelocentric 具有 非 未 端 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 ( 双 名 染 色 体 , dibrachial 或 atelomictic) chromosome) 。 进 一 步 的 分 类 见 下 。 中 着 丝 粒 的 (metacentric) 具有 中 央 或 靠近 中 央 的 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 。 如 果 着 丝 粒 正好 位 于 中 点 , 它 被 归 类 为 M -染色 体 (M-chromosome, d = 0,r=1.0 和 ;i=5S0) ,而 如 果 着 丝 粒 不 是 正中 的 而 是 位 于 中 间 区 域 (median region ) 中 , 就 被 归 类 于 m- 染 色 体 (m-chromo- some,d = >0 一 2.$,r= >1.0 一 1.7 和 ii=37.5 一 <50)。 天 然 的 M 染色 体 是 极 少 的 。( 参 见 等 臂 染 色 体 ) 近 中 着 丝 粒 的 (submetacentric) 具有 位 于 亚 中 区 域 (submedian region) 的 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 (d&=2.5 一 5$.0,r=1.7 一 3.0 和 ;i=25 一 37.5)。 亚 近 端 着 丝 粒 的 (subacrocentric ) 具有 位 于 亚 末端 区 域 (subterminal region) 的 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 (=5.0 一 7.5$,r=3.0~-7.0 和 1;i=12.5 一 25)。 近 端 着 丝 粒 的 (acrocentric ) 具有 位 于 末端 区 域 (terminal region) 的 着 丝 粒 的 单 着 丝 粒 染色 体 (d=7.5 一 <10,r=7.0 一 cc 和 ii= >0 一 12.5) ,也 被 称 为 t- 人 很 多 被 称 为 端 着 丝 粒 的 染色 体 事实 上 是 近 端 着 丝 粒 染 D 组 B 和 D E F 忆 染色 体 1-3 45 G12,X 13-15 16-18 19, 20 21,.22,Y 疏 改 本 改 疏 木 1 水 仿 Ju UL 少 功 。。 降 涤 - 千 攻 训 放 攻 7 吉 失 汪 过 簿 涟 间 王 启 - 训 生 慎 族 六 斌 六 性 质 导 吉 后 站 冰 必 语 - 刁 二 攻 二 了 刁 于 总 泡 疏 隧 二 晤 主 让 性 妆 ”时 曙 六 疏 瞧 赋 屿 关 评 萎 了 图 注 : 用 上 面 讨论 过 的 命名 法 进行 人 类 染色 体 分 类 。 人 类 常 染 色 体 根据 大 小 编号 ,1 号 (最 大 ), - 22 号 (最 小 ) ,虽然 事实 上 22 号 染色 体 较 之 21 号 大 。 ( 徐 江 译 ) *， 9 。 第 6 章 发 育 ,分 于 机 制 基本 概念 和 定义 。 发 育 (development) 是 复杂 、 多 细胞 生物 产生 的 过 程 。 它 经 常 是 从 一 个 细胞 开始 ， 即 一 个 受精 卵细胞 ,但 在 特定 物种 中 , 它 也 可 以 从 无 性 生殖 开始 ,如 通过 单 性 生殖 或 从 成 体 出 芽 开 始 。 发 育 是 渐 成 的 (epigenesis) ,是 部 分 的 变化 过 程 , 而 不 是 先 成 的 (preformation) , 即 不 是 预先 构建 的 小 形 有 机 体 的 增 大 。 这 样 在 早期 胚胎 形成 简单 和 粗糙 的 模式 , 随 胚胎 生长 不 断 完 善 。 发 育 可 以 被 描述 成 三 个 重 肆 和 相互 依赖 的 过 程 。 分 化 (differentiation) 是 细胞 对 应 其 不 同 功 能 特殊 化 的 过 程 , 反 映 了 不 同 蛋 白 系列 的 形成 。 区 域 专 一 化 是 细胞 获 得 位 置信 息 的 过 程 , 此 信息 也 就 是 控制 它们 行为 和 使 它们 在 正确 位 置 形成 特定 结 构 的 指令 ,是 图 式 形成 (pattern formation ) 的 基础 。 形 态 发 生 (morphogenesis ) 形 成 形状 ,反映 了 不 同方 面 细 胞 的 行为 : 生长 和 分 裂 ,相对 其 他 细胞 的 运动 ,形状 和 大 小 的 改变 ,与 其 他 细胞 和 细胞 外 基质 的 相互 作用 及 细胞 死亡 。 除了 少数 例外 ,发 育 中 生物 的 细胞 保留 相同 的 基因 组 ,也 就 是 发 育 主 要 是 通过 基 因 表 达 的 调节 来 控制 的 。 发 育 过 程 是 由 内 源 和 外 源 因 子 控制 的 。 在 大 多 数 生物 中 ,分 化 和 图 式 发 生 的 第 一 个 相 | 位 是 通过 卵细胞 中 已 经 存在 的 (内 在 ) 不 对 称 性 。 进 一 步 的 变化 和 图 式 形成 是 通过 外 源 加 工 完 成 的 一 一 细胞 - 细胞 联系 和 细胞 间 及 细胞 与 环境 闻 的 相互 作用 。 发 育 从 受精 开始 ,但 很 难说 明 它 是 何 时 停止 的 。 很 多 细胞 变 得 是 终 末 分 化 的 ,此 被 认为 是 它们 的 最 终 形式 ,而 其 他 细胞 一 一 干细胞 一 一 并 不 是 如 此 ;很 多 发 育 过 程 是 反复 的 。 有 些 人 把 衰老 看 成 是 发 育 的 过 程 ; 当 生 物 死亡 时 发 育才 最 终结 束 。 分 化 基因 组 等 同性 ”在 分 化 过 程 中 ,细胞 变 得 特殊 化 ,以 行使 它们 特定 的 功能 ,这 反映 在 合 成 的 一 系列 特殊 蛋白 的 性 质 。 除 了 少数 例外 ( 文 框 6.1) ,发 育 中 生物 的 所 有 细胞 的 基因 组 都 是 相同 的 ,表明 分 化 的 基础 是 选择 性 基因 表达 。 基 因 表 达 可 以 在 很 多 水 平 被 调节 ( 见 第 9 章 基 因 表达 与 调节 ) ,一 些 发 育 基因 调节 的 例子 在 表 6.1 中 列 出 。 基因 组 等 同性 的 证 据 是 同时 从 分 子 和 功能 的 研究 中 得 到 的 。 基 因 组 DNA 的 分 子 分 *。， 060 ， 表 6.1 在 基因 表达 的 不 同 水 平 上 分 化 调节 基因 表达 水 平 发 育 系统 转录 肌 细 胞 的 分 化 是 由 转录 因子 如 MyoDl 的 合成 来 控制 的 ,它们 激活 肌肉 特异 性 基因 。 RNA 加 工 果 蝇 的 性 别 分 化 是 由 性 别致 死 . 转 化 子 和 两 性 基因 的 基本 转录 本 的 选择 性 剪接 来 控制 。 在 蛾 ( Marduwca sezta ) 的 卵 母 细胞 中 很 多 mRNA 的 过 早 翻 译 因 延迟 的 加 帽 而 被 阻止 。 RNA 周转 鸡 的 肢 芽 发 育 部 分 是 由 FGF -2 的 表达 控制 的 。 与 FGF -2 mRNA 互补 的 反 义 RNA 在 鸡 的 肢 芽 表 达 , 目标 定 到 FGF -2 的 RNA 上 ,并 使 其 降解 。 蛋白 合成 在 果 蝇 早期 发 育 前 和 后 结构 的 建立 部 分 是 由 翻译 抑制 控制 的 。Bicoid 蛋白 抑制 前 部 ceaa: mRNA 的 翻译 ,而 Nanos 蛋白 在 后 部 抑制 驼背 基因 (jzxrzchpacg mRNA) 的 翻译 。 非洲 爪 昌 成 纤维 生长 因子 受 体 的 合成 在 卵 母 细胞 中 通过 蛋白 与 XA 名 六 mRNA 的 结合 被 抑 制 ; 此 抑制 在 成 熟 的 卵细胞 中 消失 。 蛋白 功能 果 蝇 胚胎 中 背 - 腹 极 性 的 建立 依赖 于 Dorsal 蛋白 转移 到 细胞 核 , 这 是 通过 对 抑制 蛋白 Cactus 的 磷酸 化 (从 此 失 活 ) 产 生 的 。 析 ( 如 Southern 杂交 或 PCR) 显 示 在 所 有 细胞 中 无 论 其 基因 是 否 表达 ,基因 组 结构 是 完全 相同 的 。 功 能 实验 显示 分 化 的 细胞 在 特定 的 环境 中 ,能够 去 分 化 (dedifferentiate) , 而 沿 着 另 一 条 不 同 的 发 育 途 径 进行 ,这 样 的 现象 称 为 转 分 化 (transdifferentiation ) 或 组 织 转 化 (metaplasia) 。 这 表明 在 特定 细胞 类 型 中 不 使 用 的 基因 是 潜伏 的 ,能 够 被 重新 被 激活 。 全 能 性 的 测试 是 从 单个 分 化 的 细胞 重新 产生 整个 有 机 体 。 这 在 植物 中 是 完全 可 能 的 , 几 种 物种 的 分 化 细胞 可 以 在 培养 中 去 分 化 ,生长 成 为 没有 结构 的 未 分 化 细胞 克隆 , 称 为 愈 伤 组 ， 织 (callus)。 愈 伤 组 织 可 以 在 植物 激素 的 作用 下 ,重新 形成 完整 的 植物 ,这 样 的 过 程 被 应 用 于 有 重要 商业 价值 的 植物 物种 进行 遗传 操作 中 ( 见 第 24 章 重 组 DNA 与 分 子 克 隆 )。 对 分 化 的 动物 细胞 不 可 能 得 到 同样 的 结果 ,但 可 能 通过 将 两 栖 动物 细胞 核 移 位 到 摘除 细 胞 核 的 卵细胞 中 ,产生 存活 的 豚 胎 。 尽 管 胚胎 不 能 发 育成 成 体 ,这 些 实验 证 实 分 化 的 动物 细胞 ,不 象 植物 细胞 ,不 能 完全 反 转 它们 的 发 育 定型 (即使 被 分 离 和 置 于 异常 环境 中 ) , 细 胞 核 保 留 了 某 些 潜 能 。 用 从 两 栖 动物 豚 胎 细胞 的 细胞 核 进行 同样 的 实验 ;可 以 发 育 到 成 体 阶段 , 且 来 自 特 定 动物 预先 培植 豚 胎 的 细胞 核 也 能 支持 完整 的 发 育 。 这 些 结果 说 明 动 物 细胞 核 不 断 失 去 发 育 过 程 的 潜能 ,有 关 原 因 在 下 面 讨 论 。 除 了 这 些 限 制 ,最 近 通 过 转移 完全 分 化 的 乳腺 细胞 核 到 去 除 细胞 核 的 卵细胞 中 ,克隆 得 到 一 个 绵羊 ,第 一 次 证 实 分 化 的 动物 细胞 核 保留 了 产生 生物 全 部 功能 的 所 有 信息 。 分 化 的 简单 模型 多 细胞 生物 的 发 育 是 复杂 的 过 程 ,因为 它 不 仅 涉 及 到 细胞 类 型 的 变 化 ,而 且 涉 及 它们 精确 的 空间 组 成 。 单 细胞 生物 也 可 对 环境 反应 而 分 化 ,它们 提供 了 涉及 在 多 细胞 发 育 过 程 同 样 原理 的 简单 模型 体系 一 一 由 内 部 和 外 部 因子 控制 的 不 同 基因 表达 一 一 但 缺乏 模式 形成 。 最 简单 的 发 育 模型 可 能 是 枯草 杆菌 (Bacillus subiilis ) 的 胞 子 形 成 ,枯草 杆菌 有 两 种 类 型 细胞 : 胞 子 和 母 细 胞 ,在 营养 缺乏 时 分 化 ( 文 框 6.2)。 酵 母 细 胞 被 证 实 是 转 分 化 的 简单 形式 ,它们 可 以 自发 从 一 种 交配 型 转换 到 另 一 种 交配 型 ,这 个 过 程 涉及 程序 化 非 互 换 的 重组 (参见 交配 类 型 转换 )。 粘 菌 (Dictyostelizza discoidexzz ) 在 单 细 胞 存在 和 简单 多 细胞 生物 之 间 交 替 转 换 ,可 能 是 复杂 生物 发 育 最 有 益 的 模型 。 细 胞 聚集 *， 0601 ， 显示 了 动物 胚胎 的 很 多 属性 ,包括 模式 形成 .区域 特 异化 的 简单 机 制 和 调节 缺失 部 分 的 能 力 ( 文 框 6.3)。 早期 发 育 的 模式 和 分 化 ”在 多 细胞 生物 中 ,分 化 和 模式 形成 的 过 程 是 不 可 分 割 的 。 发 育 的 早期 涉及 不 同 谱系 的 分 离 (一 个 例子 是 肴 椎 动物 中 的 三 个 胚层 分 化 , 即 外 肥 层 .中 胚 层 和 内 胚层 ) 和 以 主体 轴 形 式 建 立 第 一 个 初始 的 位 置 轴 。 正如 上 面 所 讨论 的 ,发 育 过 程 由 内 源 和 外 源 两 种 信号 控制 的 。 在 大 多 数 动物 和 植物 ， 中 ,发 育 过 程 由 卵细胞 中 内 源 生 化 不 对 称 性 所 起 始 。 当 卵细胞 分 裂 时 特定 的 分 子 进入 不 同 的 细胞 ,因此 由 胚胎 的 不 同位 置 所 产生 的 细胞 就 不 再 是 等 同 的 了 。 这 样 的 分 子 称 为 胞 质 决 定子 (cytoplasmic determinats) , 它 是 母体 基因 组 在 卵细胞 中 所 处 特定 位 置 的 产物 。 因此 是 母体 基因 型 决定 了 胚胎 早期 发 育 的 表 型 ,这 个 现象 称 为 母体 效应 (maternal effect) (图 6.1)。 图 6.1 在 椎 实 螺 (Lizzaea ) 中 的 母体 效应 。 螺 壳 的 旋转 方向 是 由 单 基 因 座 决定 的 ,显现 等 位 基因 决定 右 旋 ,而 隐 性 等 位 基因 4 决定 左旋 。D 等 位 基因 编码 的 细胞 质 蛋 白 在 卵 母 细胞 中 合 成 , 它 决 定 了 第 二 次 分 裂 中 有 丝 分裂 纺 锤 体 的 方向 ;这 个 因子 在 左旋 卵 母 细胞 中 没有 ,说 明 左旋 是 缺陷 途径 。 互 交 产生 Fl 代 椎 实 螺 有 确定 的 杂 合 基因 型 但 螺 壳 旋转 表 型 决定 于 母体 在 卵 母 细 胞 中 对 D 蛋白 的 合成 能 力 ,也 就 是 依赖 于 母体 的 基因 型 ,而 在 每 次 杂交 中 不 同 。 如 果 珀 代 自 交 ， PF2 代 都 是 右 旋 , 因 为 杂 合 的 Fi 椎 实 螺 能 在 卵 母 细胞 中 合成 D 蛋 白 , 说 明 这 种 右 旋 和 它们 本 身 的 表 型 无 关 。 注 意 : 等 位 基因 的 分 离 是 符合 备 德尔 原理 的 (参见 备 德 尔 遗 传 )。 外 源 刺激 可 导致 进一步 的 发 育 ,在 所 有 的 肴 椎 动物 胚胎 中 ,如 背 腹 轴 是 由 环境 中 外 源 的 物理 刺激 决定 的 。 原 肠 胚 从 胚胎 的 背 侧 表面 开 始 ,这 样 建立 了 前 后 轴 。 在 蛙 中 ,胚胎 的 背 腹 轴 是 由 受精 行为 决定 的 - 精子 进入 的 位 置 的 对 面 区域 经 涉及 皮质 旋转 的 机 制 变 成 背 侧 。 重 力 和 旋转 对 在 乌 类 和 (假定 的 ) 哺 乳 动物 中 对 极 性 来 说 也 很 重要 。 在 各 种 情况 下 ， 同 源 分 子 在 背 侧 组 织 中 心 表达 ( 文 框 6.4)。 卵细胞 中 多 少 是 由 细胞 质 决定 安排 的 ,这 有 一 个 限制 。 在 早期 发 育 中 ,内 源 性 指令 用 来 作为 多 样 性 的 唯一 机 制 ,而 以 后 的 特异 化 由 外 源 指令 控制 , 即 这 种 指令 是 从 细胞 间 相 互 作用 中 产生 。 在 这 种 过 程 中 ,通过 细胞 质 决 定 和 物理 刺激 的 表达 分 离 建 立 初始 的 模式 ,可 以 经 过 细胞 间 相 互 作用 对 每 一 层 的 细节 进行 而 不 断 精 细 化 和 补充 。 镶嵌 式 和 调节 式 发 育 ”在 早期 发 育 中 胞 质 决定 和 细胞 之 间 相 互 作用 的 相对 优势 在 动物 界 中 是 不 同 的 。 通 常 , 胞 质 决 定 出 现在 大 多 数 无 脊 椎 动物 胚胎 ,而 细胞 之 间 相 互 作 用 是 在 ss， 脊 椎 动物 发 育 中 。 这 两 类 信息 来 源 决定 了 发 育 的 两 种 极端 机 制 , 称 为 久 租 式 和 调节 式 (图 6.2)。 卵 细 胞 或 胚胎 的 原 基 分 布 图 (fate map) 显 示 了 每 个 区 域 的 命运 (fate)( 正 常 发 育 的 结果 )。 在 镶 嵌 式 发 育 (mosaic development) 中 ,单个 细胞 的 命运 完全 由 它 内 在 性 质 决定 ( 即 它 的 胞 质 决定 ) ,而 在 调节 发 育 (regulative development) 中 ,每 个 细胞 的 命运 由 它 与 其 他 细胞 的 相互 作用 决定 。 在 镰 骨 发 育 中 ,每 个 细胞 进行 自主 特异 化 , 即 在 原则 上 ,如 果 将 它 从 胚胎 中 取 出 , 它 会 根据 内 在 指令 发 育 。 一 个 分 离 的 细胞 将 会 分 化 成 胚胎 的 正确 部 分 ,而 剩余 的 胚胎 会 缺失 这 一 部 分 (参见 群体 效应 )。 胚 胎 的 原 基 分 布 图 可 以 从 单个 细胞 在 分 离 状 态 下 的 分 化 的 命运 来 重建 。 在 调节 发 育 中 ,每 个 细胞 进行 条 件 特异 化 , 即 如 果 将 它 从 胚胎 中 取出 ， 它 不 能 完成 其 最 终 命运 ,因为 它 将 缺乏 与 其 他 细胞 正确 的 相互 作用 。 剩 余 的 胚胎 可 以 调 节 自 身 , 替 代 缺 失 的 部 分 。 这 是 因为 它们 还 会 发 生 正确 的 相互 作用 ,所 以 剩余 细胞 的 结局 还 未 被 决定 。 驱 动 这 样 相互 作用 的 胚胎 区 域 称 为 形成 体 (organizer); 它 有 一 种 特别 的 属 性 , 那 就 是 当 转 移 到 另 一 个 胚胎 区 域 中 会 形成 新 的 结构 ,这 是 由 于 它 是 基本 诱导 信和 号 的 来 源 (图 6.2)。 自主 特异 化 胡 2 下 区 E 上 D WE E 条 件 特异 化 图 6.2 自主 和 条 件 特异 化 。 在 自主 特 化 (上 图 ) 中 ,胚胎 的 五 个 区 域 (A~E) 已 经 通过 卵细胞 中 胞 质 决 定 特异 化 ,并 通过 剪 切 而 分 离 。 在 条 件 特异 化 (下 图 ) 中 ,胚胎 的 五 个 区 域 是 通过 细胞 - 细 胞 相互 作用 特 化 。 两 种 胚胎 都 有 同样 的 原 基 分 布 图 ,但 对 分 离 实验 有 不 同 的 反应 。 如 果 对 应 于 组 织 孔 的 区 域 从 早期 豚 胎 中 移 去 ,上 面 的 胚胎 会 显示 灸 般 式 发 育 ( 分 离 的 细胞 会 分 化 成 组 织 了 ,而 剩余 的 胚胎 会 缺失 B) ,而 下 面 胚胎 会 显示 调节 发 育 ( 分 离 的 细胞 会 分 化 成 组 织 A, 因为 它们 还 没 B, 剩 余 的 胚胎 会 对 缺失 部 分 调节 ,也 就 是 下 会 作为 形成 体 诱 导 A 形 成 C,A 会 诱导 C 生 了 B)。 镶嵌 发 育 的 最 极端 例子 是 发 生 在 有 被 膜 的 胚胎 , 它 的 主要 胚胎 细胞 类 型 已 经 被 卵 细 胞 胞 质 决定 特异 化 。 在 有 些 物 种 中 ,如 本 1ocyntia roretzi ,决定 的 分 布 非常 明显 ,因为 它 _ 们 是 不 同 颜色 的 ! 即使 这 样 , 正 确 的 发 育 需 要 有 些 诱导 的 相互 作用 ,如 神经 系统 通过 卵 列 球 间 的 相互 作用 先 于 原 肠 胚 形成 之 前 而 特 化 。 哺 乳 动物 提供 了 -一 个 有 调节 发 育 的 极端 的 例子 。 在 卵细胞 中 没有 内 在 的 不 对 称 性 ,在 最 初 的 几 次 分 裂 中 , 胚 泡 中 的 任何 细胞 都 可 以 被 分 离 , 并 发 育成 完整 的 胚胎 。 最 早 的 分 化 是 将 滋养 外 胚层 从 内 细胞 团 中 分 离 出 来 ( 简 而 言 之 ,它们 将 发 育成 胚 外 膜 和 胚胎 ) 。 这 个 决定 看 来 是 完全 随机 的 ,每 个 细胞 的 命运 取决 于 它 的 位 置 。 是 在 表面 还 是 在 胚 泡 中 。 大 多 数 生物 某 种 程度 上 属于 这 些 极端 例子 之 间 ， 而 出 现在 发 育 的 早期 发 育 阶段 有 自主 和 条 件 特 化 的 例子 。 非 洲 爪 蟾 被 用 作 例证 ( 文 框 中 6063 四 6.4)。 很 多 昆虫 ,如 果 蝇 ,在 发 育 早期 有 独特 的 方式 , 它 的 特 化 发 生 是 和 合 胞 体 有 关 的 , 细 胞 的 命运 在 细胞 形成 之 前 被 各 个 细胞 核 中 可 扩散 调节 因子 的 相互 作用 所 决定 。 细 胞 形成 后 ,进一步 的 特 化 通过 细胞 - 细胞 相互 作用 而 发 生 。 果 蝇 的 发 育 在 这 方面 被 研究 得 特别 清楚 ,在 文 框 6.5 和 6.6 中 讨论 。 发 育 中 的 细胞 -细胞 相互 作用 ”细胞 通过 改变 基因 表达 方式 和 细胞 中 已 经 存在 的 蛋白 分 子 的 活性 对 来 自 其 他 细胞 和 环境 的 信号 作出 反应 ( 见 信 号 传导 )。 这 些 反应 都 是 分 化 的 潜在 途径 ,一 个 细胞 (或 者 更 正确 地 说 是 它 产 生 的 物质 ) 影 响 了 另 一 个 细胞 的 发 育 命运 ,这 样 的 过 程 称 为 诱导 (induction)( 见 文 框 6.4)。 诱导 信号 有 多 种 形式 。 首 先 ,可 以 区 分 涉及 不 同 细胞 类 型 和 同等 细胞 的 相互 作用 。 在 前 一 种 形式 中 ,细胞 间 的 信号 可 以 通过 局 部 分 刻 的 物质 经 过 短 臣 离 ( 旁 分 泌 ) 激 活 或 者 远 处 细胞 释放 的 信和 号 通过 血管 系统 转运 到 他 们 的 目标 (内 分 记 ) 来 介 导 。 细 胞 -细胞 的 联 系 需 要 信和 号 传导 [有 时 称 为 近 分 沁 (juxtacrine) 信 号] ,或 者 细胞 可 能 对 分 沁 到 细胞 外 基质 中 的 分 子 作 出 反应 。 有 两 类 诱导 相互 作用 。 在 指导 诱导 (instructive induction) 中 ,在 诱导 因子 存在 和 缺乏 的 情况 下 ,反应 细胞 采用 不 同 的 命运 , 即 诱导 细胞 指导 效应 细胞 遵循 特定 的 发 育 途 径 。 在 许可 性 诱导 (permissive induction ) 中 ,效应 细胞 已 经 注定 某 一 命运 ,但 需 要 特定 信号 使 它们 得 以 继续 进行 , 即 别 无 选择 。 对 诱导 的 几 种 反应 也 可 加 以 区 分 。 经 典 的 反应 是 相同 的 ,也 就 是 诱导 信和 号 引起 效应 细胞 采用 单一 的 ,特有 的 命运 。 这 经 常 发 生 在 两 层 组 织 在 一 起 时 (附加 诱导 ) 或 者 被 认为 是 在 单 细 胞 水 平 上 诱导 被 考虑 时 。 形 态 发 生 素 (morphogen) 是 在 给 定 细胞 群 (形态 发 生 区 域 ) 中 建立 浓度 梯度 的 一 种 可 传播 信号 。 自 体 诱导 (homeogenetic induction) 是 可 传 布 的 反应 ,反应 组 织 被 再 诱导 分 化 成 诱导 组 织 , 然 后 诱导 它 附近 的 细胞 进行 同样 的 反应 。 这 些 不 同类 型 的 诱导 在 图 6.3 中 作 了 总 结 。 ce [AR [二 CS SYS 可 和 。T BEE | 和 车- 一 一 -*] -ER 本 > ] 0 诱导 组 织 从 一 层 细胞 产生 “邻近 细胞 的 诱导 分 化 图 6.3 诱导 的 机 制 。 上 面 的 图 表 显示 了 许可 性 诱导 和 指导 诱导 的 差别 。 在 许可 性 诱导 (1) 中 ， 反应 组 织 的 命运 是 固定 的 ,但 需要 诱导 信号 来 完成 。 没 有 其 他 选择 ,在 没有 诱导 时 ,组 织 不 能 分 化 。 在 指导 诱导 中 (2) ,在 诱导 信号 存在 时 效应 组 织 以 一 种 方式 分 化 而 在 诱导 信号 侧 乏 的 情况 下 以 另 一 种 方式 分 化 。 下 面 的 图 表 显示 了 不 同形 式 诱导 信号 的 结果 。 在 附加 诱导 中 (3) ,诱导 细胞 引起 效应 细胞 产生 单个 反应 。 相 反 ,形态 发 生 素 (4) 是 可 传播 的 信号 ,在 细胞 范围 中 形成 梯度 , 引 起 分 化 细胞 根据 它们 的 位 置 采取 不 同 的 命运 。 在 自发 诱导 中 (5), 诱 导 细胞 效应 细胞 采取 与 诱导 细胞 同样 的 命运 。 效 应 细胞 变 成 一 个 诱导 因子 ,能够 诱导 邻近 的 细胞 , 信号 可 以 在 细胞 群 中 传播 直到 它们 都 采取 同样 的 命运 。 要 0604 章 上 面 所 讨论 的 诱导 机 制 都 涉及 不 同 细 胞 间 的 相互 作用 。 分 化 也 可 以 在 相同 细胞 群 中 通过 称 为 边缘 抑制 (lateral inhibition) 的 过 程 产生 。 在 这 种 模型 中 (图 6.4) ,相同 的 未 分 化 的 细胞 分 沁 一 种 信和 号 ,抑制 周围 细胞 的 分 化 并 抑制 进一步 的 信号 。 在 所 有 细胞 信和 号 以 低 剂 量 传递 给 它们 邻近 的 细胞 在 此 区 域 建立 了 平衡 。 偶 尔 产 生 的 不 平衡 可 以 打 断 这 样 的 信和 号 过 程 , 并 被 反馈 所 放大 。 中 心细 胞 所 释放 信和 号 的 随机 爆发 将 会 抑制 周围 细胞 的 信和 号 ， 而 使 中 心细 胞 分 化 。 然 而 ,周围 细胞 不 仅 不 再 抑制 分 化 , 而且 也 不 再 抑制 从 中 心细 胞 来 的 信和 号。 这样 中 心细 胞 通过 持续 高 水 平 的 信号 建立 了 优势 ,同时 周围 细胞 既 不 能 传递 信号 也 不 能 分 化 。 这 样 的 机 制 被 认为 是 果 蝇 外 胚层 和 状 椎 动物 脑 中 神经 元 前 体 细胞 分 化 以 及 线虫 (CC. elegans ) 子 宫 中 锚 细 胞 分 化 的 基础 ( 见 文 框 6.6)。 机 出山 人 00 图 6.4 边缘 抑制 。 在 相同 细胞 群 中 分 化 通过 信和 号 分 子 来 抑制 ,这 些 分 子 下 调节 周围 细胞 信号 的 产生 ,也 可 上 调节 受 体 的 合成 。 起 始 的 平衡 通过 相互 的 抑制 维持 ,但 在 一 个 随机 事件 中 ,一 个 特 定 的 细胞 瞬间 合成 了 比 其 周围 细胞 更 多 的 信和 号 ,抑制 周围 细胞 产生 信和 号 的 能 力 , 增 加 它们 对 信和 号 的 接受 能 力 。 在 周围 细胞 最 终 停止 信号 产生 ,只 接受 信号 的 地 方形 成 正 反 馈 环 路 。 在 图 中 例 举 的 果 蝇 神经 发 生 中 的 NotchMDelta 信号 途径 。 与 边缘 抑制 相反 的 是 群落 效应 (community effect) ,在 这 种 效应 中 和 分 离 状 态 细胞 行 为 和 在 相同 细胞 群体 中 是 不 同 的 。 这 种 效应 是 通过 上 自 分泌 (细胞 对 其 本 身分 泌 信 号 有 反 应 的 能 力 ) 信 号 产生 的 。 在 这 种 情况 中 ,相同 的 细胞 分 记 它 们 本 身 和 周围 细胞 分 化 所 需 的 信和 号。 一 群 细胞 协同 的 效果 可 以 产生 足以 改变 它们 命运 的 信号 ,但 单个 细胞 不 能 达到 相 同 的 反应 。 在 发 育 的 过 程 中 有 很 多 诱导 的 例子 ,其 中 一 些 涉 及 早期 主要 的 过 程 (如 中 胚层 诱导 和 神经 诱导 ,在 文 框 6.4 中 讨论 ) ,有 些 发 生 在 晚期 特定 器 官 的 形成 中 。 后 者 研究 得 较为 清 楚 的 例子 包括 线虫 中 阴 门 的 特异 化 ( 文 框 6.6) 和 果 蝇 眼 发 育 中 R7 光 受 体 细 胞 的 特异 化 【六 芽 将 7。 分 化 状态 的 定型 和 维持 ”通过 不 断 的 细胞 - 细胞 相互 作用 胚胎 的 变化 使 开始 少量 的 细 胞 类 型 能 够 精细 地 分 化 成 成 熟 动物 或 植物 中 很 大 细胞 类 型 。 这 以 一 个 级 系 (hierarchy) 发 生 : 当 细胞 类 型 产生 越 多 ,诱导 相互 作用 类 型 也 可 能 越 多。 在 本 章 开 始 所 讨论 的 动物 细胞 的 一 个 显著 特点 ,是 它们 倾向 于 定型 在 特定 的 发 育 途 径 上 。 一 旦 早期 脊 椎 动物 胚胎 形成 外 胚层 `. 中 胚层 和 内 胚层 ,这 些 细胞 系 其 细胞 的 命运 就 被 限制 ,只 能 分 化 成 它们 自己 细胞 系 的 细胞 类 型 ,而 不 能 是 其 他 细胞 系 。 例 如 ,一旦 一 个 细胞 作为 外 胚层 分 化 , 它 的 命运 就 限制 在 表皮 或 神经 组 织 , 它 不 再 能 使 发 育 途径 成 为 中 胚层 的 延伸 ,如 肌肉 。 动 物 发 育 的 过 程 这 样 沿 一 系列 不 可 道 的 决定 进行 ,细胞 不 断 限 制 在 越 来 越 狭 窗 的 命运 中 ,直到 它们 最 终 分 化 。 在 这 点 上 ,细胞 停止 生长 (如 神经 元 ,肌肉 ) 或 只 产生 它们 同样 类 型 的 细胞 (如 角质 细胞 ) 。 这 个 原则 的 主要 例外 是 干细胞 和 胚 细 胞 ( 见 表 6.2)。 4 人 和 表 6.2 与 细胞 特定 发 育 途径 定型 相关 的 名 称 名 称 定义 定型 (commitment) 导致 细胞 沿 特定 发 育 途径 的 一 种 性 质 去 分 化 (dedifferentiation) 反 转 发 育 途径 的 能 力 ,从 分 化 的 状态 变 成 更 易 变化 的 状态 长 几 : 玫 遇 二 0) 细胞 对 特定 命运 的 不 可 逆 定 型 ,是 驱动 细胞 进入 同样 命运 与 其 环境 状态 无 关 的 条 件 分 化 (differentiation) 通过 合成 或 激活 一 系列 新 的 蛋白 而 采取 新 的 表 型 。 终 末 分 化 (terminal differentiation) 是 在 任何 特定 细胞 系 中 的 最 后 状态 ,细胞 变 得 静止 或 只 产生 同样 类 型 的 后 代 ( 参 见 千 细 胞 ` 胚 细胞 ) 命运 (fate) 特定 细胞 在 将 来 会 成 为 分 化 细胞 类 型 。 原 基 分 布 图 (fate map) 是 显示 卵 细胞 或 胚胎 所 有 细胞 的 命运 的 图 谱 生殖 细胞 (germ cell) 形成 配子 的 细胞 。 生 殖 细胞 在 动物 发 育 早期 经 常 从 体 细 胞 中 分 离 ,是 在 成 熟 动 物 中 唯一 保持 全 能 性 的 细胞 。 相 反 , 植 物 生 殖 细胞 在 成 熟 植物 中 从 体 细胞 而 来 。 生 物 学 上 的 基本 差异 可 以 解释 分 离 的 动物 和 植物 细 胞 有 不 同 的 潜能 潜能 (potency) 一 个 细胞 所 有 可 能 命运 的 总 和 (在 任何 环境 中 \ 不 只 是 在 正常 发 育 中 )。 全 能 性 (totipotent) 一 一 能 够 采取 任何 命运 ,也 就 是 原则 上 可 以 形成 完 整 的 生物 ;多 能 性 (pluripotent) 一 一 能 够 采取 几 种 ,但 不 是 所 有 命运 特 化 (specification) 在 中 性 环境 的 分 离 状态 下 细胞 对 特定 命运 的 定型 。 确 定 通常 的 发 育 程 序 , 但 可 以 被 外 在 影响 所 改变 干细胞 (stem cel) 在 每 次 分 裂 中 产生 两 种 类 型 派生 的 细胞 :一 个 是 其 本 身 的 拷贝 ,一 个 会 分 化 (参见 胚胎 干细胞 ) 转 决 定 (transdefermination) 定型 的 改变 偶尔 可 以 在 果 蝇 成 虫 盘 细胞 中 看 到 的 ,通过 移植 到 果 昌 成虫 的 腹部 可 维持 生长 状态 ,而 不 是 进行 分 化 。 这 样 的 变化 不 是 随机 的 ,但 以 预定 程序 发 生 , 可 能 反映 了 调节 蛋白 活性 的 微小 改变 转 分 化 (transdifferentiation) 去 分 化 和 改变 发 育 途径 的 能 力 。 经 常 在 切除 后 再 生 组 织 中 发 生 定型 发 生 在 几 个 阶段 。 一 个 细胞 可 以 通过 内 在 性 质 , 采 用 特定 的 命运 而 被 特 化 ,在 分 离 状 态 下 以 这 种 途径 分 化 。 然 而 , 当 暴露 于 不 同 环境 的 区 域 , 它 的 命运 可 以 通过 与 其 他 细 胞 的 相互 作用 而 改变 。 当 一 个 细胞 定型 是 不 可 逆转 时 ,此 细胞 已 被 决定 了 , 即 它 将 沿 着 同 样 的 发 育 途 径 进 行 ,而 不 受 环境 影响 。 决 定 的 时 间 选 择 可 以 通过 移植 实验 来 确定 。 爪 蟾 胚胎 的 外 胚层 特 化 成 表皮 ,但 将 它 移植 到 背 中 胚层 也 可 以 诱导 形成 神经 板 。 在 决定 前 , 预 定 的 表皮 或 预定 的 神经 板 在 分 离 状态 下 都 分 化 成 表皮 ,但 一 旦 预定 的 神经 板 被 决定 , 它 就 变 成 神经 板 而 不 受 环境 影响 一 一 无 论 在 原 位 、 分 离 或 移植 到 异 位 位 置 。 特 化 和 决定 经 常 在 分 化 之 前 ,因为 它们 涉及 激活 控制 分 化 的 下 游 基 因 的 调节 分 子 合 成 。 两 个 定型 状态 之 间 的 差异 反映 了 调节 分 子 它们 本 身 是 如 何 被 调节 的 。 决 定 涉及 调节 环 路 的 永久 维持 , 赋 予 细 胞 对 定型 状态 的 记忆 。 维 持 可 以 通过 细胞 质 反馈 回 路 而 发 生 或 对 染色 质 结构 的 识别 而 发 生 ,这 些 机 制 可 以 帮助 解释 早先 的 核 移植 资料 。 在 肌肉 细胞 系 中 ,决定 被 反馈 所 控 制 。 肌 肉 分 化 是 被 称 为 MyoD 家 族 的 bHLH 调节 蛋白 所 控制 。 在 体 节 中 ,一 旦 这 些 调 节 因子 在 体 细胞 中 被 可 诱导 的 相互 作用 激活 ,它们 可 以 激活 肌肉 专 一 性 基因 的 转录 (如 骨骼 肌 动 蛋 自 和 肌 球 蛋白 ) ,起 始 肌肉 的 分 化 。 而 且 MyoD 也 激活 其 本 身 基 因 和 其 家 族 中 的 其 。 66 se 他 成 员 ,并 通过 正 反馈 维持 它们 的 表达 。 一 旦 细胞 开始 表达 MyoD 调节 因子 , 它 变 成 不 可 逆 的 定型 肌肉 细胞 系 。 然 而 ,在 原则 上 ,细胞 质 环 路 可 以 通过 将 细胞 核 移 植 到 其 他 细胞 质 中 而 被 阻 断 。 相 反 在 其 他 细胞 中 定型 状态 的 维持 发 生 在 染色 体 本 身 的 水 平 上 。 在 果 蝇 中 , 同 源 异 型 基因 的 表达 是 通过 染色 体 结 构 的 重建 维持 的 ,通过 多 棋 (Polycomb) 和 三 胸 (trithorax) 基 因 产 物 调 节 ( 文 框 6.8) ;在 肉 性 哺乳 动物 中 ,染色 质 结构 和 DNA 甲 基 化 使 一 条 又 -染色 体 维持 在 失 活 状态 ( 见 DNA 甲 基 化 和 基因 组 外 调节 )。 这 种 形式 定型 状态 的 维持 不 能 通过 细胞 核 移 植 到 不 同 的 细胞 质 环 境 中 重建 ,而 在 动物 中 流行 的 基因 组 外 定型 可 以 解释 体 细 胞 核 不 能 起 始 去 核 卵 细胞 的 发 育 。 植 物 中 成 功 的 体 细胞 克隆 表明 定型 的 状 态 是 被 外 在 加 工 所 维持 ,也 就 是 细胞 - 细胞 之 间 的 信和 号 传导 作用 , 而 不 是 内 在 的 调节 系 统 , 所 以 细胞 转移 到 不 同 的 环境 中 时 仍 能 足以 重建 发 育 的 程序 。 类 似 的 情况 可 以 在 动物 细胞 中 看 到 ,细胞 对 受伤 反应 而 去 分 化 ,并 促进 再 生 。 在 这 种 情况 中 ,分 化 在 没有 决定 时 发 生 ,使 分 化 状态 被 所 处 环境 所 控制 。 6.2 模式 形成 和 位 置信 息 模式 形成 模式 形成 (pattern formation ) 是 细胞 采用 一 个 精确 的 空间 组 织 过 程 ,保证 物 种 所 有 成 员 在 形态 上 类 似 。 模 式 形 成 是 由 区 域 专 一 化 和 形态 形成 所 组 成 。 区 域 专 一 化 (regional specification) 是 细胞 获得 位 置 值 (positional values) 的 过 程 , 也 就 是 分 子 信息 导致 细胞 在 整个 生物 中 以 正确 方式 转运 到 它们 的 位 置 中 ,通过 打 断 位 置信 息 和 产生 相应 的 行 为 。 区 域 专 一 化 ” ”区域 专 一 化 可 分 为 两 种 形式 ,一 种 是 控制 分 化 并 导致 在 特定 位 置 产 生 特 定 的 细胞 类 型 , 另 一 种 是 在 分 化 状态 相同 细胞 中 控制 形态 形成 ,也 就 是 导致 它们 行为 的 差 异 , 产 生 区 域 专 一 化 的 结构 。 这 两 种 过 程 的 例子 在 状 椎 动物 肢 的 发 育 中 却 可 以 发 现 。 肢 由 很 多 不 同 细胞 类 型 组 成 ,有 的 形成 骨骼 \ 有 的 形成 肌肉 有 的 形成 皮肤 等 ,由 这 些 细 胞 组 成 一 个 骨骼 在 内 ,肌肉 包 在 外 ,皮肤 在 表面 的 近似 同心 圆 的 模式 。 一 旦 这 个 过 程 开 始 , 在 不 同位 置 上 的 相同 细 胞 ,如 在 前 肢 和 后 肢 之 间 , 沿 肢 三 个 主要 的 轴 的 细胞 间 产 生 结构 上 的 分 化 。 这 样 的 差异 反 映 了 每 个 位 置 上 细胞 的 不 同行 为 ,如 不 同 的 生长 和 形状 的 改变 。 位 置信 息 ”细胞 获得 它们 的 位 置 值 的 方式 是 通过 基因 表达 模式 所 赋予 的 位 置信 息 (po- sition information) 。 位 置信 息 的 来 源 首 先是 在 果 蝇 中 通过 分 析 功 能 破坏 的 身体 模式 突变 (表明 特定 细胞 获得 了 错误 的 位 置信 息 ) 被 证 实 的 。 两 个 系列 的 基因 控制 沿 前 后 轴 的 位 置 值 , 体 节 极 性 基因 (segment polarity genes) 的 作用 是 在 每 个 体 节 中 指定 特定 细胞 类 型 的 位 置 ,而 同 源 异型 选择 者 基因 (homeotic selector genes) 的 作用 是 指令 这 些 细胞 产生 正确 区 域 结构 的 方式 来 表现 。 特 定 细 胞 中 综合 的 基因 表达 产生 一 个 "地址 ” ,并 将 其 分 配 到 胚胎 的 特定 区 域 。 体 节 极 性 基因 的 突变 引起 体 节 特定 区 域 的 缺失 ,它们 被 余下 细胞 的 镜像 所 替 代 ( 也 就 是 细胞 类 型 不 是 相应 的 特异 ) ,而 同 源 异 型 选择 者 基因 的 突变 是 奇异 的 ,有 时 是 奇 怪 的 表 型 ,身体 的 一 部 分 被 另 一 个 类 似 物 所 替代 (也 就 是 正确 的 细胞 类 型 是 存在 的 ,但 它 们 的 表现 反常 )。 在 果 蝇 中 这 些 基 因 的 调节 和 功能 在 文 框 6.8 中 讨论 。 。 67 。 引 人 注 目的 是 体 节 极 性 基因 和 同 源 异型 基因 在 动物 进化 中 都 是 保守 的 ,并 在 所 有 动 物 的 模式 形成 中 起 重要 作用 ,这 包括 销 椎 动物 。 关 椎 动物 同 源 异型 基因 的 作用 和 它们 和 与 果 蝇 同 源 异 型 的 类 似 性 在 文 框 6.9 中 讨论 。 肢 的 发 育 ( 文 框 6. 10) 提 供 了 两 个 系列 基因 如 何在 肴 椎 动物 发 育 中 发 挥 功能 ,不 仅 这 些 基 因 本 身 的 功能 是 保守 的 ,而 且 它 们 调节 的 相 互 关系 也 是 保守 的 。 动物 的 同 源 异 型 基因 在 植物 界 中 没有 发 现 :完全 不 同 的 身体 设计 和 发 育 机 制 表明 完 全 不 同 的 调节 策略 。 然 而 ,根据 动物 所 拥有 的 MADS 盒 (在 哺乳 动物 血清 反应 因子 中 也 有 的 基 序 ) 的 转录 因子 家 族 在 拟 南 芥 属 ( Arapbidozpsis thaliana ) 中 发 现 ,并 且 它 们 的 功能 缺 失 引 起 在 花 的 重复 结构 的 (花瓣 、 苯 片 ` 雄 蕊 和 心 皮 中 ) 同 源 异 型 转化 。 似 乎 相似 的 原理 控制 了 这 些 因 子 和 动物 同 源 异 型 基因 的 表达 和 活性 ,因此 MADS 系统 可 能 是 植物 中 位 置 信息 的 基础 。 但 是 ,有 关 植 物 中 这 些 调节 因子 和 这 些 分 子 的 效应 物 以 及 细胞 -= 细胞 信和 号 还 有 待 于 研究 。 发 育 中 形态 发 生 的 作用 ”形态 发 生 是 形式 和 结构 的 产生 ,可 以 被 看 作 是 发 育 的 “第 三 ” 个 成 分 ,作用 于 已 分 化 并 赋予 位 置 值 的 细胞 ,将 它们 所 拥有 的 指令 翻译 成 特定 的 运动 和 在 空间 上 产生 精确 排列 的 行为 。 然 而 ,除了 形态 形成 确实 作为 发 育 程 序 的 效应 作用 以 外 , 它 还 在 控制 上 起 很 强 的 活化 作用 。 从 发 育 的 非常 早期 的 阶段 ,细胞 行为 的 方式 一 一 它们 如 何 生长 和 分 裂 , 如 何 相互 黏附 ,如何 改变 形状 一 一 在 胚胎 中 控制 细胞 的 相互 作用 然后 建立 分 化 和 区 域 专 一 性 的 框架 。 一 个 基本 的 例子 是 原 肠 胚 的 形成 ,在 原 肠 胚 中 动物 胚胎 的 结 构 在 发 育 早期 基本 上 被 重新 组 成 :这 涉及 到 很 多 形态 形成 的 过 程 ,包括 细胞 形状 的 改变 、 细胞 增殖 和 通过 细胞 黏附 分 子 的 表达 方式 的 改变 所 引起 的 细胞 亲 和 人 性 的 差异 。 在 文 框 6.4 中 显示 爪 蟾 胚胎 原 肠 胚 形 成 的 结果 - 背部 中 胚层 被 赋予 位 置信 息 , 因 其 可 诱导 所 以 置 于 内 胚层 之 上 , 变 成 神经 板 。 因 此 形态 形成 可 作为 分 化 和 区 域 专 一 化 后 驱动 力量 。 形态 发 生 的 机 制 ”形态 发 生 的 基础 是 细胞 行为 。 这 可 以 被 认为 是 独立 的 过 程 或 根据 细 胞 与 环境 的 相互 作用 的 过 程 。 细 胞 内 在 的 驱动 形态 形成 过 程 包括 细胞 生长 和 增殖 的 速 率 , 细 胞 分 裂 的 性 质 , 细 胞 外 形 的 改变 和 细胞 死亡 。 在 表 6.3 中 显示 了 这 些 在 发 育 中 发 生 的 过 程 。 对 有 些 物 种 这 些 过 程 是 精密 调节 的 。 在 线虫 纲 的 蠕虫 ( Czerorhapczitis elegazzs ) 每 个 细胞 的 分 裂 和 死亡 都 有 恒定 的 发 育 程序 。 可 预计 的 移动 意味 着 所 有 细胞 -= 细胞 诱导 性 相互 作用 也 是 不 变 的 ,每 个 个 体 在 精确 的 位 置 上 含有 同样 精确 数目 的 细胞 。 在 C. ee- gazas 鉴别 出 了 多 个 调节 这 种 细胞 行为 的 基因 。 一 个 例子 是 jiz -4 基因 , 它 编 码 的 一 个 转 录 因 子 在 幼体 的 第 一 阶段 所 需要 的 。LIN-4 蛋白 水 平 上 的 修饰 通过 引起 细胞 行为 以 异 时 (heterochronic) 方 式 一 一 即 符合 早先 的 或 后 期 的 发 育 阶段 , 阻 断 几 种 细胞 系 。ziz -4 过 度 表 达 导 致 很 多 细胞 表现 为 发 育 早期 阶段 不 成 熟 的 和 重复 分 裂 的 性 质 。 功 能 缺失 突变 相 反 地 引起 细胞 跳 过 某 些 分 裂 ,产生 更 符合 后 期 发 育 的 形式 。 在 更 为 广泛 的 生物 体 中 ,细胞 生长 和 细胞 分 裂 倾向 于 整个 被 生长 因子 和 激素 所 调节 ,而 不 受 内 在 的 程序 控制 。 这 在 细 胞 数目 和 统计 资料 上 有 很 大 的 变化 而 不 是 程序 化 地 一 个 给 定 细胞 确定 的 分 裂 。 这 样 的 随 机 影响 可 能 在 发 育 唆 音 (参阅 ) 中 起 主要 作用 ,发 育 噪音 是 在 恒定 环境 中 维持 同 基因 型 群 体 变 异 的 来 源 。 表 6.3 在 发 育 中 形态 发 生 的 过 程 形态 形成 的 机 制 发 育 中 的 例子 细胞 生长 (大 小 增加 ) 神经 元 对 神经 生长 因子 的 反应 增殖 在 两 栖 动物 原 肠 胚 形成 中 的 织 原 (organizer) 细 胞 细胞 分 裂 爪 昌 卵 不 均等 的 分 裂 产生 大 的 植物 性 分 裂 球 和 小 的 动物 性 分 裂 球 细胞 形状 改变 神经 管 关 闭 时 神经 板 匀 链 区 域 的 神经 细胞 项 柱 变 罕 细胞 融合 肌 管 从 成 肌 细胞 中 分 化 细胞 死亡 很 多 神经 元 趾 间 坏死 区 域 中 间 充 质 细胞 的 死亡 细胞 - 细胞 黏附 消失 哺乳 动物 和 鸟 类 : 当 细 胞 通过 原 条 移动 时 细胞 分 层 细胞 - 细胞 黏附 获得 在 肢 发 育 中 软骨 充 质 细胞 的 浓缩 细胞 -基质 相互 作用 神经 贱 细 胞 的 迁移 细胞 二 基质 相互 作用 消失 从 皮肤 基层 刺激 分 化 成 角质 细胞 的 分 层 驱动 细胞 形态 发 生 的 外 在 过 程 包括 细胞 - 细胞 黏附 和 细胞 - 基质 相互 作用 。 细 胞 可 以 改变 它们 表达 的 细胞 黏附 分 子 的 内 容 , 这 样 来 改变 与 周围 细胞 的 关系 。 两 个 细胞 黏附 分 子 家 族 已 被 识别 :Ca 依赖 的 钙 粘 着 蛋白 和 免疫 球 蛋 白 超 家 族 的 Ca 不 依赖 的 细胞 符 附 分 子 ( 如 N-CAM) 。 通 过 表达 不 同 的 CAMs 和 和 钙 粘着 蛋白 ,细胞 可 以 选择 是 否 相 互 黏 着 并 可 以 相互 移动 ,使 它们 形成 片 或 块 状 结构 或 者 分 散 。 这 样 的 相互 作用 对 原 肠 胚 形 成 中 所 产生 的 复杂 的 形态 发 生 移动 很 重要 , 随 细胞 建立 和 打 断 联系 豚 胎 中 细胞 黏附 分 子 的 表达 也 可 以 看 到 变化 。 细 胞 也 通过 细胞 表面 称 为 整合 素 的 受 体 与 细胞 外 基质 中 的 层 粘连 蛋白 和 纤 粘 连 蛋 白 作 用 。 这 种 的 细胞 - 基质 相互 作用 对 迁移 细胞 如 神经 风 细 胞 和 原生 殖 细胞 的 以 及 对 角质 细胞 都 很 重要 。 6.3 发 育 的 环境 发 育 中 的 基因 和 环境 在 前 面 的 部 分 中 ,发 育 作为 基因 组 中 程序 化 的 一 种 遗传 过 程 ,在 细胞 质 中 正确 的 设置 下 产生 整个 生物 。 在 关 椎 动物 发 育 早期 物理 指示 的 应 用 明明 需要 考 虑 环境 的 整个 作用 。 在 群体 中 观察 到 环境 影响 在 发 育 过 程 中 引起 的 表 型 变化 ,以 及 发 育 嗓 音 (参阅 ) 背 后 的 随机 影响 。 像 很 多 发 育 过 程 一 样 ,性 别 决定 同时 涉及 遗传 和 环境 的 因 素 , 这 个 过 程 的 特点 是 这 些 因素 可 以 分 开 , 且 在 不 同 的 器 官 中 所 起 作用 的 相对 重要 性 是 不 同 的 。 在 不 同 的 物种 中 存在 初级 性 征 (产生 配子 的 类 型 ) 的 发 育 和 第 二 性 征 (个 体 的 表现 ) 是 通过 一 些 共同 成 分 的 不 同 途径 调 节 的 。 在 很 多 动物 中 一 个 重要 的 性 别 决 定 特征 是 性 染 色 体 (人 参阅) 的 存在 。 这 些 染色 体 在 性 别 中 的 分 布 是 不 对 称 的 ,剂量 补偿 机 制 对 矫正 一 种 性 别 相对 另 一 性 别 有 两 倍 剂量 的 特定 基因 产物 是 必须 的 。 在 果 蝇 和 哺乳 动物 中 ,雌性 有 两 条 X 染 色 体 ,而 雄性 只 有 一 条 。 在 果 蝇 中 ,X -剂量 补偿 是 通过 在 峻 性 中 将 X- 连 锁 基 因 座 转录 率 降 低 到 $S0% ( 表 6.4)。 在 哺乳 动物 中 ,同样 的 结果 可 以 通过 使 X- 染色 体 中 的 一 条 失 活 来 完成 ( 见 DNA 甲 基 化 和 基因 组 外 调节 ) 。 *。， 6069 ， 表 6.4 在 性 别 决定 机 制 中 一 些 遗 传 优势 和 环境 优势 的 例子 机 制 描述 遗传 优势 机 制 哺乳 动物 一 一 染色 ”在 哺乳 动物 中 ,初级 的 性 征 (性 腺 生理 学 ) 是 由 立 染色 体 上 SRY 基因 的 存在 决定 的 。 有 站 染 体 决 定 色 体 的 个 体 经 常 是 雄性 ,不管 X- 染 色 体 的 数目 有 多 少 ,而 XO 个 体 是 肉 性 。SRY 编码 一 个 含 HMG 盒 的 转录 因子 ,诱导 其 他 调节 因子 的 表达 (包括 SOX9 和 SF1 ) ,在 性 腺 中 可 以 抑制 Want- 4a 信号 。SFI1 在 两 种 性 别 性 腺 发 育 早期 都 需要 ,但 不 存在 SRY 的 肉 性 中 其 水 平 逐渐 下 降 。 在 雄性 中 SF1 表达 得 到 维持 , 它 在 支持 细胞 中 诱导 副 中 肾 抑制 物质 和 间 质 细胞 中 备 酮 的 表达 。 这 两 种 激素 刺激 中 肾 管 (将 来 成 为 输精管 ) 存 留 和 副 中 肾 管 (将 来 的 肉 性 生殖 管 ) 的 退化 。SRY 去 除 Wnt -4a 的 效应 可 能 是 抵消 X- 连 锁 的 DAX 基因 的 效应 。 当 DAX 存在 一 个 拷贝 表达 不 足以 取消 SRY 的 效应 ,但 两 份 DAX 基因 座 引 起 XY 个 体 发 育成 肉 性 。 哺乳 动物 的 第 二 性 征 决 定 于 激素 。 在 这 种 情况 下 , 肉 性 是 默认 状态 。 缺 乏 备 酮 受 体 时 ,XY 个 体 ( 内 部 ) 雄 性 生殖 腺 发 育 但 是 肉 性 的 第 二 性 征 也 得 到 发 育 。 同 样 原 理 , 肉 性 小 牛 在 子宫 中 可 被 雄性 挛 生 小 牛 产生 的 睾酮 诱发 产生 雄性 特征 ,产生 称 为 双生 间 肉 (freemartin) 的 动物 。 果 蝇 一 一 平衡 机 制 ”在 果 蝇 中 ,性 别 基 本 上 是 由 常 染色 体 和 XXX- 染色 体 之 间 的 平衡 决定 的 ,而 Y- 染 色 体 为 雄性 生 育 所 需 , 它 不 是 雄性 性 征 的 初级 决定 。 因 此 XY 个 体 是 雄性 ,而 XO 个 体 是 不 育 的 雄性 。X: A( 常 染色 体 ) 比 例 为 1:1 时 是 肉 性 ,而 比例 为 1:2 的 是 雄性 ,中 间 比 例 有 中 间 表 型 , 称 为 肉 雄 间 性 (intersexes) ,更 极端 的 比例 显示 了 极端 的 “雄性 "和 ”* 崔 性 ”, 称 为 超 雄 性 (metamales) 和 超 肉 性 (metafemales) 。 平衡 机 制 反 映 了 X- 染 色 体 和 常 染 色 体 编 码 的 不 同 螺旋 - 环 一 螺旋 转录 因子 相对 水 平 。X -= 连 锁 基 因 sis-a ( sisterless-a ) 、sis-b (sisterless-9 ) 和 sis-c (sisterless-c ) 编 码 的 因子 ,它们 激活 Szz (Ser-Lethal) 基 因 。 而 常 染 色 体 dzzt (deadzpan ) 基 因 编 码 一 个 抑制 物 , 可 能 通过 阻止 上 述 螺 旋 - 环 -螺旋 成 为 非 活性 的 异 源 二 聚 体 。 在 Sis 因子 占 优 势 的 肉 性 中 Szl 是 激活 的 ,而 在 雄 性 中 ,由 于 相对 高 水 平 的 dzp , sz/! 这 个 基因 是 抑制 的 。Sz: 蛋 自 行使 两 个 功能 。 第 一 是 起 始 一 个 不 同 的 RNA 剪接 反应 ,产生 肉 性 专 一 性 的 asrz (covbiesez ) 基 因 转 录 本 ,第 二 是 抑制 一 系列 调节 X -连锁 基因 雄性 专 一 性 转录 速度 的 基因 。 果 蝇 性 别 决 定 中 RNA 剪接 反应 在 : 27.4 中 显示 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 环境 优势 机 制 海龟 一 一 温度 依赖 ”大 多 数 怜 行动 物性 别 决 定 机 制 类 似 哺乳 动物 的 染色 体 ,但 海龟 和 乌龟 的 性 别 是 依赖 温度 的 。 这 反映 了 将 睾酮 转化 为 肉 激 素 的 酶 合成 或 活性 是 温度 敏感 的 。 酶 活性 本 身受 温度 影响 ,或 者 依赖 于 调节 酶 合成 的 上 游 因子 。 蜗牛 一 一 基质 依赖 ” 履 螺 属 的 蜗牛 ( Crepidvie ) 形 成 含有 5 一 10 个 体 的 丘 状 隆起 ,这 些 个 体 开 始 都 是 雄性 的 。 在 老 的 蜗牛 中 ,生殖 系统 被 破坏 ,根据 基质 重新 产生 雄性 或 肉 性 。 在 幼年 的 雄性 群体 中 ,如 果 与 死亡 的 蜗牛 接触 就 产生 峻 性 ,与 肉 性 蜗牛 接触 产生 雄性 。 在 缺少 的 状态 时 是 肉 性 一 一 分 离 状态 经 常 是 肉 性 。 0， 文 框 6.1 发 育 中 基因 组 的 不 均衡 随机 和 程序 化 改变 ”大 多 数 发 育 生 物 的 细胞 常常 包含 同样 的 遗传 信息 ,差异 可 以 以 两 种 方式 产 生 。 第 一 是 通过 突变 ,关于 改变 的 类 型 和 发 生 的 位 置 ( 见 突 变 和 选择 ) 两 者 都 是 随机 的 。 第 二 是 程 序 化 的 改变 ,改变 类 型 和 位 置 在 发 育 过 程 中 是 严格 地 受到 调节 的 。 这 些 过 程 都 涉及 DNA 获得 、 丢 失 或 重 排 。 基因 扩 增 ”基因 扩 增 是 特定 基因 或 其 他 DNA 序 列 的 拷贝 数 增加 。 在 体内 已 识别 有 两 种 程序 化 扩 增 的 模式 :整个 基因 组 扩 增 和 选择 性 扩 增 。 整 个 基因 组 扩 增 (whole genome amplification ) 通 过 增 加 细胞 中 基因 组 的 拷贝 数 而 增加 特定 基因 的 拷贝 数 。 在 真 核 生 物 中 ,在 DNA 复制 后 细胞 没 能 进 行 有 丝 分 裂 ,基因 组 就 加 倍 , 例 如 在 哺乳 动物 肝 细 胞 中 是 四 倍 体 ,但 在 双 翅 目 ( 如 果 蝇 ) 的 分 刻 腺 中 最 明显 ,很 多 轮 的 复制 产生 巨大 的 多 线 染 色 体 (人 参阅) 包含 多 于 1000 染色 单 体 。 选 择 性 扩 增 是 调 节 性 发 育 过 程 偶尔 用 来 增加 需求 量 高 的 基因 产物 的 量 。 有 三 个 经 详细 研究 的 扩 增 体系 。 很 多 纤 毛虫 (如 四 膜 虫 ) 和 有 些 多 细胞 动物 (如 蛙 ) 选 择 性 扩 增 它们 的 zRNA 基因 。 在 这 两 种 情况 扩 增 都 发 生 在 蛋白 合成 需求 高 的 非常 大 的 细胞 中 (如 蛙 的 成 熟 卵 母 细 胞 ) ,这 反映 了 没有 其 他 方法 增加 TRNA 的 产物 一 一 它 不 被 翻译 。 在 两 种 情况 中 , 扩 增 都 涉及 从 基因 组 中 剪 切 rDNA。 原 生动 物 有 单 个 IRNA 基 因 ,而 蛙 在 生殖 细胞 中 以 及 有 多 于 1000 个 rRNA 基因 。 在 四 膜 虫 中 ,前 切 的 rDNA 是 通过 发 夹 引 导 复 制 的 ,产生 一 个 线性 的 反 向 重复 元 件 。 在 蛙 中 , 剪 切 下 来 的 rDNA 在 扩 增 前 环 化 。 基因 组 的 完整 性 在 扩 增 中 得 到 维持 ,因此 似乎 是 额外 的 DNA 环 在 剪 切 前 进行 复制 ,是 重组 引起 单 个 rDNA 单元 被 剪 切 。 编 码 蛋白 的 基因 很 少 被 扩 增 ,因为 产量 可 以 在 蛋白 合成 水 平 上 来 提高 。 果 蝇 的 卵 帝 蛋白 基因 是 一 个 例外 一 一 卵 壳 蛋白 在 短期 中 大 量 需要 ,这 通过 在 卵泡 细胞 中 选择 性 扩 增 来 满足 。 与 了 NA 基因 不 同 , 卵 壳 蛋 白 基 因 不 被 剪 切 ,但 在 基因 组 中 通过 复制 的 重 登 环 而 被 扩 增 ， 产生 一 系列 的 协同 扩 增 子 (concentric amplicons)( 洋 葱 皮 模型 ) 。 在 其 他 昆虫 中 ,在 生殖 细胞 中 发 现 了 多 拷贝 的 卵 壳 蛋 白 基 因 ,为 什么 在 果 蝇 中 进化 成 为 一 种 选择 性 扩 增 现在 还 不 清楚 。 染色 质 减 少 和 其 他 DNA 缺失 情况 ”基因 扩 增 的 同时 ,DNA 也 可 以 是 选择 性 的 缺失 或 者 涉及 整 个 基因 组 的 拷贝 。 在 减 数 分 裂 时 ,所 有 细胞 基因 组 都 减少 :在 中 间 插 人 的 DNA 复制 以 外 有 两 轮 连 续 的 分 裂 。 一 种 特殊 的 DNA 丢失 的 方式 是 从 哺乳 动物 网 织 红 细胞 中 细胞 核 被 排除 ,分 化 成 为 无 核 的 红细胞 [ 零 倍 体 (nulliploidy) ]。 选 择 性 DNA 丢失 可 以 在 很 多 低 等 真 核 生物 中 看 到 , 它 与 体 细 胞 和 生殖 细胞 的 分 化 有 关 。 一 般 , 生 殖 细胞 保留 了 整套 DNA, 而 在 体 细 胞 系 中 有 选择 性 DNA 丢失 或 染色 质 减 少 。 这 个 过 程 涉及 位 置 专 一 性 的 DNA 剪 切 和 分 离 。 其 意义 还 不 清楚 ,但 看 来 是 体 细 胞 发 育 的 重要 方面 ,并 被 细胞 质 成 分 的 区 域 性 分 布 所 调控 。 程序 化 重组 ”少数 细胞 类 型 的 分 化 依赖 于 重组 。 程 序 化 非 交 换 重组 控制 着 酵母 交配 类 型 转换 和 锥 虫 的 抗原 转换 ,而 程序 化 位 置 特 异性 重组 控制 着 脊椎 动物 B 细胞 和 工 细胞 分 化 的 很 多 方 面 ( 见 第 25 章 重组 ) 。 5 文 框 6.2 ” 相 草 杆菌 ( Bacillus suBiilis) 的 孢子 形成 孢子 形成 途径 概述 ” 饥 煞 的 营养 期 枯草 杆菌 细胞 诱导 孢子 形成 一 基因 组 的 一 个 拷贝 分 离 成 为 前 芽孢 ,外 面包 以 芽孢 外 被 ,同时 另 一 个 保留 在 母 细胞 中 ,最 终 被 破坏 。 这 是 分 化 的 一 种 简单 形 式 一 一 一 个 细胞 产生 两 个 表 型 独特 、 功 能 不 同 的 细胞 。 分 化 的 过 程 主要 是 通过 合成 不 同 的 c- 因 子 (细菌 RNA 聚合 酶 的 成 分 , 见 第 29 章 转录 ) 和 其 他 转录 调节 因子 在 转录 水 平 上 进行 初步 调控 。 孢 子 形成 的 途径 涉及 每 个 细胞 中 转录 调节 因子 及 交叉 的 转录 后 调节 。 孢子 形成 的 起 始 “” 当 饥 饭 诱导 的 蛋白 激酶 级 联 反应 在 转录 调节 因子 SpoOA 被 磷酸 化 时 终止 ,此 时 孢子 形成 便 开 始 了 。 激 活 的 SpoOA 通过 与 营养 期 c- 因 子 cA 和 oH 的 相互 作用 ,诱导 很 多 控制 进入 隐 子 形成 途径 的 基因 转录 。 两 个 新 的 c- 因 子 ,oF 和 coE 作为 起 始 反应 的 一 部 分 被 合成 。 在 从 中 间 到 两 极 的 分 离 中 有 一 开关 ,在 细胞 两 个 末端 的 两 极 位 置 形成 蛋白 FtzZ 的 环 (参见 细菌 细胞 周 期 )。 只 在 细胞 的 一 个 未 端 形成 隔膜 ,对 应 隔膜 的 小 间隔 区 变 成 前 芽孢 。 目 前 还 不 知道 细胞 是 如 何 选择 变 成 孢子 的 未 端 ,但 形成 单 孢子 是 依赖 oE 的 。 分 离 后 发 生 染 色 体 分 离 ,所 以 染色 体 必 须 穿 越过 隔膜 进入 前 芽孢 ,这 是 由 SpoIIIE 蛋白 执行 的 。 6- 因 子 的 级 联 反应 ”孢子 形成 的 过 程 可 以 分 成 很 多 依赖 于 不 同系 列 基因 表达 ,形态 显著 不 同 的 阶段 基因 的 表达 与 转录 调节 蛋白 级 联 反 应 结构 相 一 致 。 孢 子 分 化 的 进行 涉及 ecF 在 前 芽孢 特异 性 的 激活 。cF 作为 一 种 带 有 SpoIIAB 蛋白 的 非 活性 复合 物 开 始 是 均匀 分 布 的 。SpoIIAB 是 磷酸 化 SpoIIAA 蛋白 的 激酶 ; 它 的 活性 被 膜 结合 的 磷酸 酶 SpoIIE 所 持 抗 。 在 它 的 非 磷酸 化 形式 时 , SpoI- IAA 可 以 与 coF/SpoIIAB 复合 物 相 互 作 用 ,替代 c- 因 子 ; 因 此 去 磷酸 化 的 SpoIIAA 的 浓度 原则 上 决 定 了 oF 的 活性 。SpoIIE 被 认为 存在 于 隔 片 膜 两 侧 , 但 因为 前 芽孢 体积 小 , 它 的 相对 浓度 高 ,使 平 衡 向 有 利于 SpoIIAA 去 磷酸 化 方向 进行 ,结果 在 前 芽孢 中 特异 性 替代 和 激活 cF。 下 一 个 阶段 是 关系 到 与 在 母 细胞 中 cE 的 特异 性 激活 。 与 oF 一 样 ,oE 开始 以 非 活性 形式 均匀 分 布 , 但 它 的 非 活性 形式 是 因为 作为 蛋白 前 体 合成 的 , 必须 被 蛋白 酶 剪 切 。 和 蛋白 酶 是 由 szoIIGA 基因 编码 的 跨 膜 受 体 , 它 的 蛋白 酶 活性 被 配 体 SpoIIR 激活 ,SpoIIR 在 cF 的 调节 下 特异 性 在 前 芽 孢 中 合成 。 因 此 cE 在 母 细胞 中 的 激活 需要 前 芽孢 中 的 cF。SpoIIR 是 从 前 芽孢 中 分 刻 到 中 间 区 域 , 激 活 前 切 cE 的 蛋白 酶 。coE 在 前 芽孢 中 本 身 是 没有 活性 的 ,因为 显然 在 SpoIIE 蛋白 的 控制 下 ， 它 被 完全 降解 。 依赖 oE 的 基因 在 两 个 时 期 被 转录 :最 初 的 基因 包括 spoITID , 它 编码 一 个 第 二 时 期 oE 转录 需 要 的 转录 因子 。 在 第 二 时 期 的 依赖 oE 基因 中 有 编码 另 一 个 c 因 子 o 的 sizgK 基因 。cK 的 表达 调 节 非 常 复杂 ,因为 这 个 基因 被 称 为 winz 的 隐藏 的 原 叹 菌 体 打 断 , wzz 必须 被 切 离 。 这 个 过 程 通过 si 中 编码 的 位 置 专 一 性 重组 酶 SpoIVCA 执行 的 ,SpoIVCA 的 表达 依赖 于 oE 和 SpoIIID。 一 且 sigK 基因 座 的 两 半 重 新 结合 ,基因 在 oE 和 SpoIIID 的 控制 下 转录 ,翻译 产生 一 个 类 似 于 原 鸣 非 活 性 的 前 体 蛋白 。SpoIIID 可 以 作为 oE 的 激活 因子 和 抑制 因子 ,是 o 史 依赖 基因 。 在 前 芽孢 中 ,oF 基因 的 进一步 的 调节 在 coF 本 身 激 活 后 一 小 时 被 诱导 。 这 包括 了 编码 另 一 个 0- 因子 coG 的 spoTTG ,出 现 延 迟 反应 了 在 母 细胞 中 转录 对 oE 功能 的 依赖 性 (尽管 所 涉及 的 假定 信 号 分 子 还 没有 被 发 现 ) 。cG 激活 也 需要 oE, 尽 管 机 制 还 不 清楚 。 在 前 芽孢 中 ,oG 指导 后 期 钨 子 形成 基因 的 表达 ,其 中 一 个 是 spoIVB。 它 编码 了 涉及 母 细 胞 中 o 激 活 的 信号 蛋白 。 象 原 oE 一 样 , 原 cK 被 膜 结合 蛋白 酶 激活 (这 种 情况 下 是 SpoIVFB) , 它 起 先 是 非 活性 形式 的 ,被 来 自前 芽孢 的 信号 所 激活 。 然 而 ,与 正常 情况 下 是 无 活性 的 SpoIIGA 不 同 ， SpoIVFB 始终 是 有 活性 的 ,但 通过 spoTVFA 和 如 反 基因 编码 的 抑制 蛋白 形成 非 活性 复合 物 。 因 2 2 2 此 SpoIVB 的 作用 是 起 抑制 因子 的 作用 ,而 不 是 直接 激活 蛋白 酶 。 aoG 和 cK 分 别 控制 前 芽孢 和 母 细胞 的 后 期 基因 表达 ,都 能 正 调节 它们 本 身 。 另 外 ,coK 依赖 基 因 在 两 个 时 期 被 转录 。 基 本 的 时 期 包括 编码 转录 调节 因子 的 gerE, 它 激活 和 抑制 一 些 其 他 coK 依 赖 基因 。 控制 枯草 杆菌 孢子 形成 的 调节 网 络 。 转 录 调 节 以 细 箭 头 表示 ,翻译 后 调节 以 粗 箭头 表示 。 膜 蛋白 以 环 表示 。 文 框 6.3 人 盘 基 网 柄 杆菌 (Dictyoste1izzza discoidexzz ) 的 生命 周期 生命 周期 概观 ”在 营养 状态 下 , 盘 基 网 柄 杆菌 以 单 倍 体 的 单 细 胞 存在 , 称 为 变形 粘 菌 (myxamoe- bae) ,是 无 性 繁殖 的 。 引 人 注目 的 是 , 当 单 细 胞 消耗 了 营养 供应 时 ,它们 聚集 成 串 ,迁移 到 中 心 点 形 成 多 细胞 聚合 体 。 聚 集中 的 细胞 分 化 ,形成 前 孢子 细胞 和 前 柄 细胞 。 前 柄 细胞 在 聚合 体 的 顶部 形 成 ,而 前 孢子 细胞 在 基部 。 聚 合体 在 它 的 侧面 伸 出 ,移动 时 整个 的 聚合 体 就 像 一 条 昨 蛤 [也 称 为 伪 原生 质 团 (pseudoplasmodium) 或 粘 聚 体 (grex)]。 当 昨 蛤 从 暗 处 移动 到 明亮 的 地 方 , 它 分 化 成 子 实 体 , 由 提高 的 柄 及 其 上 的 一 个 孢子 细胞 组 成 。 孢 子 细胞 分 散 形成 新 的 胶 质 变形 体 。 聚合 体 的 分 子 基 础 ”决定 聚集 是 根据 所 提供 的 营养 和 细胞 密度 。 胶 质变 形体 可 以 通过 监测 称 为 饥 俄 前 因子 (prestarvation factor，PSF) 的 分 刻 蛋 白 来 测定 细胞 密度 。 饥 狐 的 细胞 释放 c 汪汪 SN SENGSRASY 人 人 全 SN 1. 事 先 已 存在 卵 中 的 动 -植物 极 的 不 对 称 性 (A.V)。2. 受 精 导致 皮层 旋转 并 通过 B 连 环 蛋 白 的 区 域 激活 ,建立 了 Nieuwkoop 中 心 (NC)。3. 植 物 极 细胞 诱导 了 边缘 区 (MZ) 的 动物 极 细胞 使 其 变 成 为 中 胚层 。NC 诱 导 了 背部 的 中 胚层 (组 织 者 ,DO) ,有 可 能 是 通过 Vg- 1 和 转录 因子 Siamois 所 激活 的 产物 二 者 协同 作用 。 腹 部 的 植物 极 细 胞 (VV) 以 涉及 到 FGF 因子 及 BMP - 4 的 一 种 途径 诱导 腹部 的 中 胚层 (VM)。4. 来 自 组 织 者 的 侧 辟 信 和 号 (Chordin,Follistastin,Noggin) 在 腹部 中 胚层 中 与 BMP - 4 相互 作用 。5.BMP- 4 分 极 抑制 建立 了 一 个 中 间 胚 层 型 的 区 域 (IM) 。6. 组 织 者 起 始 了 原 肠 胚 形 成 。 中 间 中 胚层 被 置换 到 胚 的 侧面 ,最 前 面 的 组 织 者 细胞 分 沁 了 Cerberus 蛋白 ,此 蛋白 诱导 了 头 部 前 端的 结构 ,如 胶 粘 腺 (C)。 余 下 的 组 织 者 诱导 神经 板 (N) ;那些 越 过 胚 孔 迁 移 细胞 (O1) 首 先 变 成 为 前 部 的 中 胚层 ,并 诱导 前 部 的 神经 板 (N1)。 神 经 形成 信号 的 特点 还 不 知道 ,但 它 可 以 激 活 外 胚层 蛋白 激酶 C 和 腺 苷 环 化 酶 。Chordin，Follistain 和 Noggin 诱导 前 部 神经 的 命运 ,次 级 信和 号 也 能 是 FGF 常常 可 以 结束 神经 膜 ,产生 后 神经 结构 (N2,N3)。 5 人 由 文 框 6.5 ” 果 蝇 中 体 轴 的 多 核 体 特异 化 概观 ”如 上 文 所 讨论 的 ,早期 昆虫 发 育 是 在 合 胞 体 环 境 中 发 生 的 , 合 胞 体 在 原 肠 胚 形 成 前 细胞 化 。 在 果 蝇 中 ,前 后 体 轴 被 母体 基因 (maternal gene, 在 母 细 胞 中 表达 的 基因 ,其 产物 转移 到 卵 细 胞 ) 特 异化 ,它们 在 合 胞 体 胚胎 中 建立 了 前 部 后 部 和 末端 组 织 中 心 。 这 些 基 因 编 码 调节 因子 建立 了 相反 的 形态 发 生 梯 度 ,以 浓度 依赖 的 方式 激活 下 游 的 合子 基因 (zygotic, 在 发 育 中 胚胎 表达 的 基 因 ,而 不 是 在 周围 母 细胞 中 表达 的 基因 )。 连 续 的 级 联 激活 不 同类 型 的 合子 基因 ,将 合 胞 体 分 成 为 由 基因 表达 区 域 定 义 的 条 状 区 。 这 些 形成 了 体 节 的 基础 ,成 为 由 后 期 作用 的 基因 模式 。 前 后 部 中 的 母体 基因 “控制 果 蝇 前 后 组 织 有 四 个 基本 的 基因 :它们 是 特异 化 前 方 结构 的 picoiz 和 jerchpacg ,和 特异 化 后 方 结构 的 zazos 和 caxda! 。 在 每 种 情况 中 ,mRNA 都 是 在 滋养 细胞 中 合 成 , 它 位 于 卵 的 前 部 。 picoid 的 3? 端 非 翻 译 区 (UTR) 通 过 erxuzperaztia 和 szualiorw 基因 产物 附着 于 前 方 细胞 骨架 上 。 picoid mRNA 的 翻译 开始 被 其 非常 短 的 多 聚 腺 味 叭 尾巴 所 阻止 ,但 受精 后 , corzez , graxzoze 和 stazxjen 基因 产物 促进 进一步 多 聚 腺 味 叭 化 ,使 Bicoid 蛋白 合成 。zarzos mRNA 通过 osgar ,stax 帮 nm ， tudor, zasa 和 zalois 基因 产物 ,转移 到 卵细胞 的 后 部 , 它 的 3"UTR 与 后 部 细胞 骨架 相 结合 。 jaizchpacg 和 caxcdal 的 mRNA 不 定位 ,在 整个 卵细胞 中 分 散 分 布 。 Bicoid 是 含 同 源 异 型 结构 域 的 蛋白 ,与 DNA 和 RNA 结 合 。 它 在 合子 细胞 核 中 激活 airzcRpacR 基因 的 转录 ,抑制 母体 caxaa! mRNA 在 卵细胞 前 部 的 翻译 。 相 反 的 是 , Nanos 蛋白 抑制 母体 jazzchpacR mRNA 在 卵细胞 后 部 的 翻译 ( 它 不 是 转录 因子 )。Pumilio 蛋白 与 .zxrchpacR mRNA 结 合 , 为 Nanos 提供 进入 位 置 。 四 个 基因 产物 的 相互 作用 产生 了 一 个 Bicoid 和 Hunchback 的 前 = 后 梯度 及 Nanos 和 Caudal 的 后 一 前 梯度 。 末端 的 母体 基因 末端 的 基因 特异 化 顶 节 (acron) 和 尾 节 (telson) ,这 样 的 结构 形成 了 前 后 轴 的 末端 。 这 个 群体 中 的 关键 因素 是 troxo 和 torsolize 基因 。Terso 是 酷 氨 酸 激酶 类 型 的 一 个 跨 膜 受 体 。zroso 的 mRNA 在 卵细胞 中 广泛 分 布 , 它 编码 的 受 体 在 整个 细胞 质 膜 上 分 布 。 末 端 特 异化 是 被 配 体 Torsolike 控制 ,Torsolike 只 从 前 后 的 卵泡 细胞 中 分 谱 。Terso 被 其 配 体 激活 ,诱导 一 个 涉及 Ras、Raf 和 MAP 激酶 的 信号 通路 ( 见 信号 传导 ) ,在 一 个 诱导 裂 缺 (gap) 基 因 jauckebein 和 taiies 转 录 的 未 知 转录 因子 激活 时 达到 顶峰 。 这 些 基 因 编 码 激 活 特异 化 末端 结构 基因 的 转录 因子 。 顶 节 特异 基因 也 需要 Bicoid 蛋白 。 持 续 激 活 的 Torso 突变 体 上 位 于 前 后 部 基因 - 表 型 是 “ 超 末端 "的 ， 有 大 的 项 节 和 尾 节 , 但 它们 中 间 没 有 身体 。 前 后 合子 基因 母体 基因 picoid , hzrchpacg 和 caxdal 编码 控制 合子 基因 表达 的 转录 因子 ,涉及 体 节 形成 的 规划 。 分 成 五 类 合子 基因 裂 缺 基因 (gap genes) 将 胚胎 分 成 对 应 副 节 的 主要 区 域 ,缺失 功能 突变 导致 这 些 副 节 在 幼虫 中 丢失 ( 副 体 节 包 含 一 个 体 节 的 前 面部 分 和 邻近 体 节 的 后 面部 分 ;胚胎 期 果 蝇 身体 的 划分 是 通过 基 因 表达 区 域 分 成 副 节 , 虽 可 识别 的 形态 结构 是 体 节 )。 初级 配对 规则 基因 (primary pair rule genes) ”为 裂 缺 蛋白 调节 ,在 不 同 的 副 节 中 表达 ,这 些 结构 在 功能 缺失 突变 中 缺失 。 次 级 配对 规则 基因 (secondary pair rule genes) ”与 上 面 一 样 , 但 比 初级 配对 规则 基因 作用 晚 ， 需要 初级 配对 规则 基因 和 裂 缺 蛋白 来 建立 它们 的 表达 区 域 。 配 对 规则 基因 一 起 确定 胚胎 中 的 副 节 。 ，76 ， 体 节 极 性 基因 (segment polarity genes) “是 在 连续 副 节 和 每 个 相同 的 相对 位 置 表达 。 它 们 负责 副 节 中 细胞 类 型 的 特异 化 ,功能 缺失 突变 引起 相应 副 节 的 缺失 ,取而代之 的 是 呈 镜 像 的 剩余 部 分 。 同 源 异 型 选择 基因 (homeotic selector genes) 在 包含 一 个 或 几 个 副 节 的 特定 区 域 中 表达 , 特 异化 体 节 的 特征 ,也 就 是 使 每 个 体 节 将 发 育成 怎样 的 结构 。 裂 缺 基因 和 配对 规则 基因 因此 解 译 了 定义 轴 的 母体 信息 ,将 其 转换 成 重复 的 体 节 结构 ,而 体 节 极 性 基因 和 同 源 异 型 基因 赋予 体 节 位 置 值 。 裂 缺 基因 和 配对 规则 基因 在 下 面 将 更 详细 讨论 , 体 节 极 性 基因 和 同 源 异 型 选择 基因 的 讨论 见 文 框 6.8。 和 裂 缺 基因 ”有 裂 缺 基因 开始 在 广泛 区 域 中 表达 , 当 Hunchback 蛋白 梯度 稳定 后 定位 。Bicoid 和 Hunchback 在 胚胎 前 部 激活 giazt 和 Krzzpzpel ,抑制 ezzras。Caudal 蛋白 负责 胚胎 后 部 的 giazz 和 Rzirzs 的 转录 。 三 个 头 部 特异 基因 orzpodenzicle ,emzzty sziracles 和 Buttozhead 只 在 有 高 浓度 Bicoid 蛋白 的 地 方 表 达 。iazilless 和 juckepein 基因 受到 胚胎 末端 Torso 信和 号 激活 的 转录 因子 调节 。 产 生 的 裂 缺 基因 表达 模式 在 下 面 可 以 看 到 。 裂 缺 基 因 的 产物 本 身 都 是 转录 调节 因子 ,它们 有 两 个 功能 一 一 相互 反馈 和 调节 ,以 及 调节 下 游 配 对 规则 基因 的 表达 。 这 样 的 调节 看 来 基本 上 都 是 负 调节 。 一 旦 mRNA 翻译 ,蛋白 分 向 两 侧 分 散 ,抑制 邻近 裂 缺 基因 的 表达 ,这 样 建立 了 明显 的 转录 边界 。 配对 规则 基因 配对 规则 基因 在 中 胚层 细胞 化 过 程 中 表达 ,mRNA 沿 前 后 轴 呈 斑纹 分 布 。 每 个 斑纹 被 所 在 位 置 裂 缺 基 因 产 物 单独 调节 。 不 同 配对 规则 基因 对 不 同 裂 缺 蛋白 浓度 反应 ,所 以 在 重 复 模式 中 ,邻近 斑纹 细胞 表达 不 同 组 合 的 配对 规则 基因 产物 。 有 三 个 基本 的 配对 规则 基因 , ever- iped ，hairy 和 rz, 它们 的 表达 对 分 节 模 式 的 建立 很 重要 。 基 本 配对 规则 基因 的 表达 模式 通过 交互 调节 稳定 ,帮助 特异 化 次 级 配对 规则 基因 产生 的 模式 ,这 包括 Asjii tarazx 和 oaqdd-zaired。 初 级 配对 规则 基因 eex-s&izpped (eve) 的 调控 研究 得 最 清楚 , 它 主要 是 负 调 控 。eve mRNA 在 大 多 数 裂 缺 蛋白 低 的 地 方 表达 ,也 就 是 在 裂 缺 蛋白 基因 区 域 的 边界 。 如 下 所 示 ,每 个 ewe 表达 班 纹 受 几 个 裂 缺 基因 的 控制 ,这 反映 了 ee 启动 子 的 调节 结构 ,有 分 离 的 调节 元 件 控制 斑纹 4 一 6、 斑 纹 1、 2、3、 7。 斑 纹 2 的 调控 元 件 被 细致 地 作 图 ,启动 子 的 这 个 区 域 包 含 Bicoid、Hunchback、Giant 和 Kruppel 的 结合 位 点 。 正 调节 因子 (Bicoid 和 Hunchback) 的 结合 位 点 经 常 与 负 调 节 因 子 (Giant 和 Kruppel) 的 重 和 至。 表明 不 同调 节 因 子 的 竞争 是 斑纹 定位 的 重要 机 制 。 背 腹 极 性 果 蝇 的 背 腹 极 性 是 在 细胞 化 后 通过 核 Dorsal 蛋白 的 梯度 建立 的 。Dersal 在 果 蝇 中 普 遍 合成 的 ,但 它 特异 性 转移 到 胚胎 腹 侧 的 细胞 核 中 。 在 胚胎 背 侧 ,Dorsal 与 第 二 个 蛋白 Cactus 相 联 系 ,Cactus 掩 藤 Dorsal 核定 位 信号 。Cactus 的 降解 是 被 磷酸 化 诱导 的 ,磷酸 化 是 通过 从 胚胎 腹 侧 发 出 的 信号 传导 反应 。Dorsal 是 与 脊椎 动物 转录 因子 NF-kB 同 源 ,而 Cactus 与 抑制 蛋白 LeB 同 源 ; 激活 的 信号 途径 也 是 保守 的 。 背 腹 极 性 的 途径 从 卵 母 细 胞 本 身 开 始 , 通过 gxwrger 和 cormicpor 基 因 产 物 使 卵泡 细胞 背 侧 化 。Gurken 是 与 哺乳 动物 表皮 生长 因子 (EFG) 同 源 ,在 卵泡 细胞 膜 上 激活 受 体 Torpedo( 与 EGF 受 体 同 源 ) 。Torpedo 受 体 的 激活 诱导 抑制 zzcel , ruzrctpervtel 和 亡 e 基因 的 信和 号 途径 。 在 胚胎 的 腹部 ,这些 基因 是 活性 状态 的 ,它们 的 产物 形成 膜 复合 物 ,其 功能 是 激活 由 胚 胎 分 泌 的 ,easter ,szake 和 gastrxulation dejectioe 编码 的 三 个 丝氨酸 蛋白 酶 。Gastrulation defective 的 激活 起 始 蛋白 酶 级 联 反 应 ;Gastrulation defective 剪 切 .Snake, Snake 剪 切 Easter, Easter 再 剪 切 另 一 个 背 侧 基 因 szatzle 产物 ,spatzle 产物 是 Toll 受 体 的 配 体 。Toll 在 卵细胞 膜 上 广泛 分 布 ,但 因为 蛋 白 酶 级 联 反应 只 在 腹 侧 激活 Spatzle,Toll 信号 也 是 腹 侧 特异 的 。Toll 激活 涉及 iute 基因 的 信和 号 传 导 途 径 中 的 蛋白 酷 氨 酸 激酶 Palle。Pelle 是 磷酸 化 Cactus 的 酶 ,诱导 它 的 降解 ,允许 Dorsal 蛋白 进 入 腹 侧 细胞 核 。 在 细胞 核 中 ,Dorsal 同时 作为 转录 激活 因子 和 抑制 因子 。 它 激活 ”omzbpoid 、sazt 人 7 和 tuist 基因 ,而 抑制 背 侧 化 基因 zer&zzliz tiolioig 和 decapentazlegic。 2 3 1 1 1 1 Hunchback EEC 和) Giant Kruppel eoer-skipped mRNA 吓 Hunchback 。”KrupPel Giant 合子 基因 产物 对 euen-sibtped 转录 的 调节 。 在 裂 缺 蛋白 质 水 平 最 低 处 定位 了 exe mRNA 斑纹 ,除了 由 Bi- coid 和 Hunchbake 正 向 调控 的 斑纹 2。 文 框 6.6 线虫 (C. elegaxzs ) 的 阴 门 特异 化 阴 门 系 ”线虫 的 阴 门 (vulva) 是 腹部 真皮 (动物 的 外 层 , 相 当 与 哺乳 动物 的 真皮 ) 中 的 开口 ,通过 阴 门 卵细胞 从 上 面 的 子宫 远 处 移出 。 阴 门 由 22 个 细胞 组 成 ,从 三 个 真皮 细胞 经 过 三 次 细胞 分 裂 ， 而 其 他 真皮 细胞 只 分 裂 一 次 释放 出 产生 真皮 细胞 。 真 皮 细 胞 通过 性 腺 上 称 为 锚 状 细胞 (ancher- cell) 的 一 个 单 细 胞 ,诱导 形成 阴 门 。 如 果 锚 状 细胞 被 破坏 ,所 有 的 腹部 真皮 细胞 只 分 裂 一 次 ,形成 真皮 。 如 果 所 有 的 性 腺 细胞 除了 锚 状 细胞 都 被 破坏 , 阴 门 还 会 形成 。 如 果 锚 状 细胞 被 机 械 去 除 ， 邻近 的 真皮 细 胸 能够 对 此 反应 ,形成 阴 门 ,但 只 有 六 个 真皮 细胞 有 能 力 这 样 做 。 阴 门 前 体 细 胞 表 型 特异 化 ”涉及 阴 门 特异 化 的 基因 通过 无 阴 门 和 多 阴 门 表 型 的 突变 发 生 进 行 筛选 鉴别 ,证 明 在 简单 系统 中 确定 发 育 途径 的 遗传 力量 。 阴 门 模型 提供 了 几 种 类 型 细胞 相互 作用 的 例子 。 起 先 ,两 个 相当 的 细胞 有 能 力 变 成 锚 状 细胞 ,接受 它们 之 间 的 信号 ,涉及 信和 号 分 子 LAG - 2 和 受 体 LIN- 12, 结 果 在 侧面 抑制 其 中 一 个 细胞 。 如 果 通 过 eg -2 或 /ix -2 任 一 突变 消除 信和 号 ， 两 个 细胞 都 成 为 锚 状 细胞 。 在 持续 信号 显 型 功能 获得 jiz -12 等 位 基因 突变 体 中 ,两 个 细胞 都 变 成 子宫 组 成 的 前 体 细 胞 。 了 8 ， 一 旦 锚 状 细胞 特异 化 , 它 诱 导 下 面 的 下 胚层 细胞 形成 阴 门 。 中 心细 胞 成 为 中 心 阴 门 细胞 ,两 侧 细胞 为 侧 部 阴 门 细胞 。 特 别 有 意 思 的 是 编码 信号 途径 基因 与 哺乳 动物 的 RTK-Ras-Raf 途径 同 源 ( 见 信号 传导 )。 由 2 -3 基因 编码 的 配 体 是 生长 因子 EGF 家 族 的 成 员 ,是 锚 状 细胞 所 需 的 。 其 他 成 分 由 友 -23 ,sem -5,Let -60 和 ji -45 编码 ,是 下 胚层 细胞 反应 和 所 需 , 对 应 于 受 体 ,接头 蛋白 ,Ras 和 Raf。MEK 和 MAP 激酶 的 同 源 蛋白 也 已 经 被 鉴别 。LIN- 3 可 能 是 引起 下 面 的 阴 门 前 体 细胞 和 侧 部 细胞 不 同 反应 的 形态 生成 因子 。 中 心细 胞 也 分 泌 额 外 的 信号 ,诱导 两 侧 细胞 Ziz - 12 的 表达 ,阻止 它们 分 化 成 中 心 阴 门 细胞 。 LN-3 .人 外、、 人 0 3 人 品 吕 骂 20 0 线虫 (CC. elegans) 阴 门 特 异化 总 结 。 侧 抑制 建立 了 锚 细 胞 , 锚 细 胞 再 诱导 下 面 的 下 胚层 细胞 分 化 为 阴 门 细胞 ， 初级 和 次 级 细胞 系 可 通过 LIN - 3 的 浓度 梯度 或 通过 来 自 中心 阴 门 细胞 的 信号 而 特 化 。 文 框 6.7 果 蝇 眼 的 发 育 光 受 体 细胞 : 果 蝇 的 复眼 包括 大 约 800 个 功能 单位 , 称 为 omatidia, 每 个 由 20 个 细胞 组 成 ,其 中 八 个 是 光 受 体 。 眼 细胞 分 化 涉及 在 单 细 胞 水 平 上 一 系列 结构 诱导 性 级 联 调节 ,晶状体 代表 了 缺乏 状 态 ( 非 诱导 )。 眼 起 源 于 一 层 细胞 ,omatidia 分 化 通过 程序 性 的 细胞 - 细胞 相互 作用 而 发 生 。 决 定 第 一 个 细胞 的 是 中 心 R8 细胞 。 其 机 制 还 不 清楚 ,但 可 能 涉及 信号 分 子 ,如 在 跨越 眼 原 基 的 形态 发 生 沟 中 Hedgehog 和 Decapentaplegic。 从 RS8 发 散 的 信号 诱导 沿 前 后 轴 邻 近 细胞 分 化 成 为 功能 相等 的 R2 和 RS 细胞 。 这 些 细胞 再 将 信号 传递 到 附近 两 侧 未 分 化 细胞 ,形成 R1,R3,R4 和 R6 细胞 , 它 们 也 是 功能 相当 的 。 最 后 是 R7 光 受 体 细 胞 的 特异 化 ,其 机 制 已 经 研究 得 较 完善 。 所 有 其 他 细胞 成 为 晶状体 。 R7 光 受 体 的 特异 化 ”通过 异常 R7 细胞 发 育 表 型 发 现 了 很 多 基因 。 无 七 基因 [ seuenless(seo)] 和 无 七 基因 的 新 娘 [bricde of seoenless(toss)] 似 乎 是 在 途径 开始 时 发 挥 功能 的 ,镶嵌 分 析 表 明 seo 在 将 来 R7 细胞 所 需要 而 boss 在 诱导 R8 细胞 中 需要 。Boss 是 激活 Sevenless 受 体 酷 氨 酸 激酶 的 信号 分 子 , 起 始 R7 细胞 中 的 信号 传递 反应 。 这 个 信号 途径 中 的 很 多 成 分 已 经 被 鉴别 一 “Drk(down- stream of receptor kinase, 下 游 受 体 激 酶 ) 是 有 SH2 和 SH3 结构 域 的 接头 蛋白 ,无 七 基因 的 儿子 [Sos (son of sevenless)] 是 鸟 苷 酸 交 换 因子 ,作用 于 Ras。Ras,Raf 和 MAP 激酶 同 源 蛋白 也 被 发 现 (尽管 “ 尖 9“ 这 些 基因 突变 是 多 效应 的 和 致死 的 ,因为 同样 的 蛋白 还 调节 果 蝇 中 其 他 信号 途径 )。 看 来 途径 中 还 有 其 他 不 同 的 支 路 ,涉及 蛋白 酷 氨 酸 磷酸 酶 Corkscrew 和 它 的 底 物 无 七 基因 的 女儿 [Dos(daugh- ter of sevenless) ] ,Dos 也 可 以 激活 Ras。 R7 的 决定 反映 了 存在 一 种 由 R8 细胞 显示 的 可 对 Boss 信号 反应 的 受 体 和 信和 号 途径 。 然 而 所 有 的 光 受 体 细 胞 最 初 合成 Sevenless, 这 就 意味 着 在 其 他 细胞 中 须 存 在 抑制 途径 的 机 制 。 一 个 称 为 Sevenup 的 转录 因子 可 能 在 R1,R3,R4 和 R6 细胞 中 调节 这 种 功能 ,因为 功能 缺失 突变 导致 这 四 个 细胞 分 化 成 类 R7 细胞 。 在 R2 和 R5 细胞 中 表达 Rough 转录 因子 是 R3 和 R4 细胞 中 sz 岂 表达 所 需 , 可 能 类 似 的 机 制 诱导 R1 和 R6 中 sxzp 的 表达 ,在 R2 和 RS 本 身 抑制 Boss - Sev 信和 号 传导 途径 。 无 七 基因 的 新 娘 人 无 七 基因 受 体 激酶 的 下 游 了 人 Rough 无 七 基 贞 的 儿子 无 七 基因 的 女儿 于 进 引 D-Ras D-Raf D-Sor Rolled Pointed 果 蝇 眼 发 育 。( 左 图 ) 特 化 光 受 体 细 胞 命运 的 诱导 反应 的 次 序 。( 右 图 )R7 光 受 体 的 特异 性 受 其 他 细胞 中 阻 断 Boss-Sev 信号 转 导 的 调节 子 控 制 。( 上 图 )Boss-Sev 信号 转 导 途 径 到 R7 的 分 化 ( 见 信号 转 导 )。 文 框 6.8 ” 果 蝇 中 分 节 化 和 体 节 特 性 体 节 极 性 基因 ”母体 基因 ,前 后 轴 的 合子 裂 缺 基因 和 配对 规则 基因 都 编码 基因 表达 调节 因子 (不 是 转录 就 是 翻译 的 ) ,因为 发 育 到 这 点 时 合 胞 体 已 经 发 生 , 而 调节 因子 自由 扩散 在 细胞 核 内 相 互 作 用 ( 见 文 框 6.5)。 在 配对 规则 基因 表达 时 发 生 细胞 化 ,因此 下 游 过 程 发 生 在 多 细胞 环境 中 进 行 。 体 节 极 性 基因 编码 信号 蛋白 和 转录 因子 。 体 节 极 性 基因 有 两 个 功能 一 一 它们 通过 接受 信号 维持 和 加 强 副 节 的 分 节 模 式 和 它们 在 每 个 副 节 中 建立 单个 细胞 的 归宿 。 第 一 种 加 工 在 副 节 两 侧 细胞 中 研究 得 较 清楚 。 起 先 ,表达 engraizedz 的 细胞 在 euen-skipzed 或 jusjitarazz 的 控制 下 ,从 每 个 副 节 前 部 边缘 产生 。 表 达 wingless 的 细胞 从 每 个 副 体 节 不 表达 ee 和 态 z 的 后 部 产生 ,因此 wingless 可 能 被 Odd-paired 或 其 他 配对 规则 蛋白 调节 。 一 旦 建立 , zwingless 和 engrailed 的 表达 通过 接受 下 面 阐述 的 信号 途径 维持 。 分 泌 的 Wing- less 激活 Frizzled 受 体 和 细胞 内 信和 号 ,结果 激活 转录 因子 Armadillo,Armadillo 激活 engrailed 基因 的 转录 。Engrailed 诱导 hedeehor 的 转录 。 它 编码 一 个 与 邻近 细胞 上 Patched 受 体 作 用 的 信和 号 分 子 ， *，80 ， 将 信号 蛋白 Smoothened 从 抑制 状态 释放 出 来 。 通 过 胚 节 阻 断 而 Smoothened 的 信和 号 诱导 rwizzgless 基因 的 转录 ,使 细胞 分 刻 Wingless 蛋白 。 第 二 个 过 程 了 解 较 少 。 在 不 同 的 配对 规则 基因 的 控制 下 , 体 节 极 性 基因 在 每 个 副 体 节 中 特定 细胞 中 表达 。 这 样 它 们 可 以 调节 导致 每 个 细胞 分 化 成 区 域 正确 细胞 类 型 的 基因 。 然 而 ,上 述 的 Wingless 和 Engrailed 细胞 看 来 在 这 一 过 程 中 起 主要 作用 ,表明 Wingless 和 Engrailed 与 建立 副 节 分 界 一 样 ,在 副 节 中 传播 分 级 信号 , 特 化 单个 细胞 的 命运 。 同 源 异 型 选择 基因 同 源 异型 选择 基因 提供 体 节 位 置信 息 , 也 就 是 它们 控制 体 节 的 单个 发 育 ， 从 共同 的 细胞 类 型 群 产生 区 域 专 一 性 结构 。 因 此 这 些 基 因 的 突变 有 将 身体 一 部 分 转换 成 类 似 另 一 部 分 的 效果 , 称 为 同 源 异 型 转化 (homeotic transformation)。 大 多 数 的 果 蝇 同 源 异 型 基因 在 染色 体 3 的 两 个 基因 簇 中 发 现 , 称 为 触角 足 复 合体 [antennapedia,ANT-C, 包 含 基因 有 唇 (opial ) ,触角 足 (artermazeia ) ,性 梭 减 少 (sez comzbs reduced ) ,畸形 (dejormezd ) 和 吻 足 (zroposcipedia ) ,特异 化 头 和 胸 的 体 节 ] 和 双 胸 复合 体 [bithorax complex,BX- C, 包 含 基因 有 超 双 胸 ( Uzzrabithoraz ) ,腹部 A 和 腹部 B(apaomzizal A 和 Apaomzizal 忆 ) ,特异 化 腹部 体 节 ]。 这 些 一 起 组 成 同 源 异 型 复合 体 ， HOM-C。 同 源 异 型 基因 在 胚胎 的 特定 区 域 表 达 , 在 有 些 情况 中 ,对 应 于 特定 的 体 节 或 副 节 ,在 其 他 跨越 几 个 副 体 节 ( 这 些 表 达 参 数 在 文 框 6.9 中 显示 了 与 哺乳 动物 Hoz-B 基因 簇 基 因 的 比较 )。 值 得 注意 的 是 , 沿 染色 体 基因 的 顺序 通过 胚胎 表达 图 谱 的 空间 区 域 来 概括 ,3 端 基 因 在 大 多 数 前 部 区 域 表 达 ( 见 文 框 6.9)。 同 源 异 型 基因 表达 由 裂 缺 基因 和 配对 规则 基因 产物 的 活性 来 起 始 。 象 体 节 极 性 基因 , 同 源 异 型 基因 通过 交互 调节 维持 它们 的 表达 模式 。 因 此 同 源 异 型 突变 的 效果 不 仅 是 对 突变 的 基本 反应 ,而 且 是 对 其 他 同 源 异 型 基因 区 域 的 影响 。 再 者 ,交叉 调节 在 自然 界 中 主要 是 负 调节 ,每 个 异型 基因 被 在 更 后 面 区 域 表 达 的 基因 所 抑制 。 失 去 功能 的 同 源 异 型 突变 因此 增加 了 前 面 区 域 的 基因 ,结果 使 后 面体 节 变 成 前 面 一 个 。 同 源 异 型 基因 转录 活性 通过 染色 质 结构 的 修饰 而 稳定 。 无 活性 的 同 源 异 型 基因 隐蔽 在 被 抑制 的 染色 质 中 ,这 样 的 染色 质 被 多 榜 (Polycomb) 家 族 的 蛋白 所 稳定 。 相 反 的 ,三 胸 (Trithorax) 家 族 蛋 白 似乎 是 维持 活性 染色 质 区 域 ( 见 染色 质 )。 同 源 异 型 基因 编码 的 转录 调节 因子 包含 保守 的 DNA 结合 结构 域 , 称 为 同 源 异 型 结构 域 ( 见 核酸 结合 蛋 白 )。 它 们 在 体外 似乎 有 重 到 的 DNA 结合 专 一 性 ,在 体内 被 认为 与 辅助 因子 一 起 作用 确定 真正 的 DNA 结 合 位 置 。 一 些 可 能 的 辅助 因子 已 经 被 发 现 ,包括 外 小 齿 (Exztradenticle ) 和 teashirt 基因 的 产物 。 同 源 异 型 结构 域 蛋白 调节 的 很 多 下 游 靶 基因 也 被 发 现 。selzrz 和 dstal-less 基因 分 别 是 眼 和 腿 发 育 所 需 的 ,它们 本 身 编码 转录 因子 ,而 decapenzazplegic 编码 涉及 腿 命运 特异 化 的 信号 分 子 。 偶数 体 节 果 蝇 中 维持 副 节 分 界 的 信号 途径 的 总 结 。 egailed 基因 开始 由 Even-skipped 或 Fushi tarazu 活化 ,而 相 邻 细胞 中 的 wingless 由 另外 的 配对 规则 蛋白 所 活化 ,可 能 是 Odd-paired。 配对 规则 基因 的 表达 是 瞬时 的 ,但 wingless 与 Engrailed 一 旦 活化 就 可 以 通过 交互 信号 彼此 副 体 节 1 的 后 部 asia | 。aksaams 副 体 节 2 的 前 部 * 果 蝇 早期 发 育 中 的 一 些 突变 体 及 相应 基因 常 被 人 们 用 一 些 形 象 的 词汇 来 描 叙 ,如 两 头 尖 (biocoid) ,驼背 (hunchback) 等 ,图 中 的 独 猴 (Armadilo) 和 刺 狂 (hodgehog) 也 是 用 来 描 叙 突变 体 表 型 特征 的 。 一 一 译 者 注 5 人 和 文 框 6.9 着 椎 动物 Hor 基因 脊椎 动物 基因 组 包含 了 四 个 拷贝 的 果 蝇 同 源 异 型 复合 物 , 称 为 EorzA ,HorB ,HozC 和 Hor- D。 尽 管 脊 椎 动物 和 果 蝇 有 明显 的 差异 ,这 种 类 似 性 是 引 人 注 目的 。 同 样 类 型 的 同 源 异 型 盒 基因 出 现 ,根据 同 源 异 型 盒 结 构 分 成 13 个 相关 组 ( cognate groups) (共生 同 源 亚 群 , paralogous sub- groups) 。 进 而 基因 沿 染色 体 以 或 多 或 少 相同 的 顺序 排列 ,以 类 似 的 方式 表达 ,3 端 基 因 在 大 多 数 前 部 结构 域 表达 ,而 5 端 基 因 在 大 多 数 后 部 分 结构 域 表 达 。 因 为 果 蝇 和 兰 椎 动物 的 差异 , 果 蝇 HOM-C 分 成 两 个 亚 复 合 物 ,而 脊 椎 动物 基因 簇 进行 5 末端 扩 增 ,整个 复制 后 产生 四 个 复合 物 。 每 个 四 复合 物 有 单个 的 缺失 ,这 在 物种 间 存 在 差异 。 如 在 上 图 中 代表 Hoz-C 基因 的 有 阴影 的 框 盒 在 人 类 中 存在 ,但 在 小 鼠 中 没有 。 ZE1 bcd amLQ Pz 汪 本 本 job 了 功 Scr Antp D 反 Ubr abdh4 MbdB | | 果 蝇 和 痛 椎 动物 Hox 基因 艇 的 结构 。 果 蝇 基 因 艇 被 包括 wicoid 的 非 Eoz 基因 打 断 。 原 始 的 关 椎 动 物 基 因 簇 在 复制 前 进行 5 扩 增 , 几 个 基因 被 丢失 。 根据 结构 ( 见 上 图 ) 和 表达 分 布 ( 见 下 图 ) 这 二 者 , 果 蝇 和 兰 椎 动物 同 源 异 型 盒 包 含 基因 的 类 似 性 是 保守 功能 的 有 力 证 据 。 用 克隆 的 人 类 FOX 基因 恢复 果 蝇 同 源 异 型 突变 和 定向 破坏 小 鼠 的 Hoz 基因 确实 产生 部 分 同 源 异 型 转化 (参见 基因 项 除 ) 证 实 上 述 的 保守 功能 。 如 Hozc-8 基因 的 缺 失 ,结果 腰椎 部 分 转化 成 有 更 多 前 部 特征 的 椎 骨 ( 在 这 种 情况 下 是 有 肋骨 的 完善 的 胸 锥 )。 副 基因 人 Ma Mx LIb TI T 1T3 Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9/10 5 OF 了 果 蝇 HOM-C 复合 物 和 小 鼠 Hoz-B 基因 艇 在 神经 系统 中 的 表达 。 座 Hoz 基因 看 来 有 重 琶 但 功能 不 完全 一 样 ,在 特定 情况 下 相互 协作 。 在 副 基 因 座 亚 群 3 中 单个 基 因 的 敲 除 ,引起 颈 结构 不 同类 型 的 分 布 ,但 在 同一 只 小 鼠 中 组 合 时 ,可 以 观察 到 严重 的 缺陷 ,包括 椎 骨 的 缺失 。 文 框 6.10 养 椎 动物 肢 的 发 育 脊 椎 动物 肢 的 起 源 和 发 育 ”并 椎 动物 肢 从 肢 区 (limb fields) 发 育 得 到 , 肢 区 通过 前 后 方向 Horz 基因 确定 的 体 轴 特定 位 置 产 生 ( 见 文 框 6.9). 侧 板 中 胚层 (形成 骨骼 元 件 ) 和 体 节 (形成 肌肉 元 件 ) 的 生长 形成 称 为 肢 芽 的 突出 。 生 长 可 以 被 中 期 肾 分 谈 的 FGF - 8 所 诱导 。 肢 发 育 的 一 个 重要 事件 是 项 外 胚层 晴 (apical ectodermal redge，AER) 的 形成 。 这 是 外 胚层 升 起 的 顶部 ,在 中 胚层 下 维持 生 长 ,并 在 轴 特 异化 中 起 重要 的 调节 作用 。 只 有 外 胚层 在 胚胎 的 背 / 腹 边缘 才 有 能 力 形成 AER ,这 反 映 了 称 为 主 缘 膜 (radical fringe) 在 背 外 胚层 的 合成 。 主 缘 膜 可 能 涉及 接受 邻近 腹 侧 表达 en -2 细 胞 的 信号 ,en -2 是 果 蝇 engrailed 基因 的 同 源 基 因 。 边 缘 细胞 被 诱导 升 高 并 合成 FGF - 8, 使 它们 支持 下 面 中 胚层 的 生长 。 随 着 肢 芽 的 延伸 ,一 个 不 连续 的 大 约 200pum 的 前 进 区 域 可 以 在 AER 下 面 发 现 , 在 这 个 区 域 中 细胞 继续 生长 。 在 前 进 区 域 后 面 ,细胞 分 化 成 沿 远 近 方 向 (手臂 到 手指 )、 前 后 方向 (拇指 到 手指 ) 和 背 腹 方向 ( 指 节 到 手掌 ) 轴 ,对 应 它们 位 置 正 确 的 结构 。 前 进 区域 的 大 小 反 映 了 FGF-8 信号 的 范围 。 前 肢 或 者 后 肢 ? 分 化 成 前 肢 或 后 肢 结构 的 决定 反映 了 前 后 Eoz 编码 的 中 胚层 肢 的 成 分 中 的 位 置信 息 。 在 前 和 后 肢 中 有 不 同 的 Boz 基因 组 合 和 其 他 转录 因子 (如 Tbx4 和 Tbx5 分 别 在 小 鼠 的 前 肢 和 后 肢 表 达 )。 这 些 因子 控制 了 对 形态 发 生 指令 的 反应 ,如 生长 和 分 化 信和 号 ,使 细胞 在 每 个 肢 中 不 同 表现 ,形成 肢 特 异性 结构 。 远近 方向 轴 沿 远近 方向 轴 的 区 域 专 一 性 分 化 (如 手臂 、 肽 部 尺骨 掌骨 或 手指 ) 反 映 了 细胞 保 留 在 前 进 区 域 中 时 间 的 长 度 。 异 时 嫁接 (一 个 肢 芽 的 前 进 区 域 被 嫁接 到 另 一 个 AER 下 面 形成 不 "。， 83 ， 同 的 发 育 阶 段 ) 显 示 了 肢 的 发 育 与 提供 的 前 进 区 域 所 携带 的 指令 一 致 。 离 开 前 进 区 域 的 老 细胞 持 续 表 达 BozA 和 上 ErzD 基因 簇 的 末梢 基因 , 副 基因 座 Hoz 基因 的 混合 敲 除 引起 特定 远近 结构 的 人 缺失。 这样 看 来 开始 分 化 时 细胞 的 年 龄 多 半 通 过 它 进 行 分 裂 的 次 数 显示 ,可 能 以 某 些 方式 调节 Foz 基因 表达 ,并 输入 远近 位 置信 息 到 分 化 细胞 。 背 腹 方向 轴 肢 的 背 侧 是 通过 信和 号 分 子 Wnt-7a 特异 化 的 ,Wnt-7a 在 背 外 胚层 表达 。 缺 乏 wz-7a 基因 的 小 鼠 有 腹 肢 ,缺乏 后 部 结构 因为 Wzt+-7a 是 前 后 轴 特 异化 所 需 ( 见 下 文 )。 一 个 转录 因子 Lmxl 被 发 现 是 背 特异 化 所 需 , 它 的 基因 被 Wnt-7a 信和 号 途径 诱导 。 前 后 方向 轴 前 后 方向 轴 是 通过 后 部 的 极 性 活性 区 域 (zone of polarizing activity,ZPA) 特 异 化 的 ,ZPA 在 AER 形成 时 从 肢 区 形成 的 。ZPA 作为 一 个 组 织 者 , 当 嫁 接 到 肢 的 不 同位 置 ,诱导 第 二 个 轴 。 从 ZPA 散 发 的 信号 诱导 末梢 EozD 基因 的 浓度 艇 套 式 表达 分 布 , 散 除 破坏 和 蜡 位 表达 实验 表明 特定 BEoz-D 基因 组 合 决定 了 前 后 位 置 值 ,如 形成 趾 的 类 型 。Eoz-D 表达 分 布 的 建立 是 以 一 涉及 ZPA 豪猪 (Sonic hedgehog,Shh) 和 蛋白 Shh 的 复杂 的 方式 ,Shh 与 其 他 在 AER 中 合成 的 信 号 分 子 FGF-4 和 了 BMP- 2 协同 作用 。 从 早期 AER 分 记 的 FGF -8 和 在 背 外 胚层 表达 的 Wnt-7a 起 始 si 的 表达 。spn 的 表达 限制 在 肢 芽 的 后 部 ,而 前 部 边缘 表达 jnozbg -8 。Shh 诱导 在 AER 后 部 的 危 F-4 表达 ,两 个 蛋白 通过 自 动 调节 环 路 相互 维持 。 维 甲酸 诱导 sj 表达 ,模拟 ZPA, 可 能 也 涉及 诱导 忘 F-4 的 表达 。 因 此 Shh 的 表达 和 功能 是 依赖 于 涉及 所 有 肢 轴 特 异化 的 分 子 。 果 蝇 和 疹 椎 动物 中 的 位 置信 息 “。” 肢 的 模型 表明 Hoz 基因 在 特异 化 位 置信 息 方面 与 果 蝇 中 同 源 异型 基因 显示 了 类 似 的 作用 。 在 两 种 生物 中 , Eoz 基因 的 缺失 造成 同 源 异 型 转化 ,尽管 在 糊 椎 动 物 中 这 种 情况 通过 有 些 成 分 的 过 剩 而 复杂 化 。 果 蝇 中 的 体 节 极 性 基因 是 维持 细胞 边界 和 建立 细 胞 命运 和 功能 所 需 , 不 仅 在 体 节 特异 化 ,而 且 在 其 他 结构 中 ,包括 腿 和 翅 。 在 轴 特 异化 中 特别 重要 的 是 Hedgehog、Wingliess 和 Engrailed 蛋白 的 相互 作用 。 在 兰 椎 动物 的 肢 和 其 他 区 域 中 ,都 涉及 同 样 这 三 个 分 子 。 其 次 因为 存在 着 重复 , 故 果 蝇 和 兰 椎 动物 有 差异 ,在 小 鼠 中 有 三 个 Hedgehog 相关 分 子 . 多 于 10 个 Wingless 同 源 蛋 白 和 两 个 Engrailed 相关 转录 因子 。 在 肢 芽 中 , Shh、Wnt = 7a (Wingless 相关 蛋白 ) 和 Engrailed - 2 在 体 轴 特 异化 起 重要 作用 ,并 作用 于 上 游 的 蕊 zx 基因 。 值 得 注意 的 是 很 多 果 蝇 区 域 特 异化 网 络 中 的 成 分 在 峭 椎 动物 中 反复 使 用 ,而 它们 早期 发 育 是 基本 不 同 的 。 ( 徐 兴 译 ) 。84 ， 第 7 章 DNA 甲 基 化 及 外 遗传 调节 基本 概念 和 定义 核酸 和 蛋白质 在 合成 或 合成 后 可 通过 某 些 特殊 化 学 基 团 的 加 入 进行 修饰 。RNA 和 蛋白质 经 常 发 生 修饰 ( 见 第 27 章 RNA 的 加 工 , 和 第 22 章 蛋 白质 ) ,而 DNA 分 子 的 修饰 是 有 限 的 。 一 些 病毒 改变 其 基因 组 中 特定 的 核 苷 酸 残 基 , 来 保护 DNA 免 受 核酸 酶 的 降解 或 促进 病毒 包装 到 衣 壳 中 ( 见 表 7.1)。DNA 甲 基 化 (DNA methylation) 是 一 个 主要 的 例外 , 它 是 在 原核 生物 和 高 等 真 核 生 物 中 经 常 发 生 的 现象 ,在 DNA 识别 和 功能 中 起 多 方面 的 作用 。 DNA 的 甲 基 化 和 病毒 基因 组 的 修饰 都 涉及 DNA 碱 基 的 共 价 修饰 ,但 并 不 改变 碱 基 配 对 的 专 一 性 ,也 并 不 改变 DNA 所 携带 的 遗传 信息 (参考 突变 )。 甲 基 化 可 以 影响 DNA 的 功能 ,例如 改变 DNA 与 转录 因子 以 及 其 他 一 些 和 蛋白 因 子 的 相互 作 用 方式 。 因 此 DNA 的 甲 基 化 状态 可 以 调节 基因 的 表达 并 直接 影响 生物 的 表现 型 。 将 甲 基 加 入 到 DNA 中 去 的 酶 称 为 DNA 甲 基 转移 酶 (或 称 为 DNA 甲 基 化 酶 ) , 它 利用 S - 腺 苷 酰 甲 硫 氨 酸 作为 甲 基 的 供 体 。 体 内 两 种 甲 基 化 酶 的 活性 可 被 区 分 一 种 称 为 从 头 合成 甲 基 化 的 酶 , 它 将 甲 基 加 到 DNA 的 特定 位 点 ,启动 一 种 DNA 甲 基 化 的 模式 。 而 维持 甲 基 化 酶 将 甲 基 加 到 一 条 链 已 甲 基 化 的 DNA ( 半 甲 基 化 DNA) 上 。 这 样 通过 连续 的 复制 使 甲 基 化 的 模式 保持 不 变 。 维 持 甲 基 化 酶 的 靶 位 点 通常 是 二 重 对 称 的 ,因此 同一 种 酶 能 甲 基 化 两 条 子 链 的 新 生 链 。 DNA 携带 着 两 种 形式 的 信息 :由 核 苷 酸 序列 决定 的 遗传 信息 和 由 它 的 结构 决定 的 外 遗传 信息 。 外 遗传 信息 是 不 处 于 DNA 自身 的 核 苷 酸 序列 中 的 可 影响 DNA 活性 的 任何 可 遗传 的 性 质 (也 就 是 说 ,最 终 将 影响 器 官 的 表现 型 )。DNA 的 甲 基 化 是 外 遗传 的 一 种 : 它 是 可 遗传 的 (由 维持 甲 基 化 酶 催化 ) ,而 且 能 够 调控 基因 的 表达 。 因 此 甲 基 化 的 表现 型 被 称 为 后 生 型 (epigenotype) , 而 甲 基 化 的 改变 称 为 后 生 突变 (epimutation) 。 外 遗传 信息 的 其 他 形式 还 有 染色 质 的 结构 ( 见 染 色 质 ) 和 DNA 分 子 的 构象 和 拓扑 特征 ( 见 核酸 结构 )。 7.1 原核 细胞 的 DNA 甲 基 化 限制 修饰 系统 的 甲 基 化 ”许多 细菌 能 编码 以 序列 特异 方式 前 切 DNA 的 内 切 核酸 酶 。 。， 8S ， 表 7.1 病毒 基因 组 中 DNA 核 苷 酸 的 修饰 病毒 核 苷 酸 的 修饰 FV3 约 20% 胞 苷 酸 甲 基 化 为 5 - 甲 基 胞 苷 酸 hyW-14 胸 苷 生成 a- 1,4 - 丁 二 胺 脱氧 胸 代 PBS1 胸 苷 形成 脱氧 尿 苷 SPO1 胸 苷 形成 5 -羟基 尿 苷 酸 T- 偶 数 家 族 胞 苷 酸 生成 羟 甲 基 胞 苷 酸 注 :FV3 是 一 种 真 核 病毒 , 它 能 编码 自身 DNA 的 胞 喀 啶 甲 基 转 移 酶 。 而 其 余 四 种 都 是 噬菌体 病毒 。 这 些 酶 能 在 外 源 性 DNA( 例 如 叭 菌 体 基 因 组 ) 进 入 细胞 时 切断 外 源 DNA 从 而 建立 一 种 保 护 机 制 。 因 此 敏感 性 噬菌体 在 转 染 编码 DNA 内 切 核酸 酶 的 宿主 菌 时 效率 较 低 ,而 在 不 编码 DNA 内 切 核酸 酶 的 宿主 菌 中 的 转 染 效率 有 很 大 的 提高 。 由 于 宿主 菌 能 通过 它 所 编 码 的 DNA 内 切 核酸 酶 限制 相应 的 喉 菌 体 在 胞 内 的 繁殖 ,因此 这 类 酶 被 称 为 限制 性 内 切 酶 (restriction endonucleases) 。 宿主 菌 通常 通过 在 内 切 核酸 酶 识别 位 点 中 特定 碱 基 的 甲 基 化 来 保护 自身 DNA 免 受 内 切 核 酸 酶 的 酶 解 。 因 而 每 一 种 DNA 内 切 酶 都 有 一 个 相关 甲 基 化 酶 (cognate methy- lase) ,这 种 酶 可 能 是 一 个 独立 的 酶 ,也 可 能 是 一 个 通用 的 全 酶 的 一 部 分 。 这 样 就 组 成 了 一 种 限制 修饰 系统 。 这 在 细菌 中 普遍 存在 ,目前 已 分 离 出 数 百 种 限制 性 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 。 它们 在 体外 DNA 实验 操作 中 已 被 广泛 采用 ( 见 第 24 章 重 组 DNA)。 许 多 DNA 鸣 菌 体 也 进化 产生 了 多 种 对 抗 限制 的 策略 ,如 改变 自身 基因 组 DNA 或 合成 限制 性 内 切 酶 的 抑制 剂 。 很 多 鸣 菌 体 在 相应 的 宿主 菌 内 并 不 受 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 作用 。 很 多 病毒 也 缺少 其 宿主 的 限制 靶 位 点 。 Dam 甲 基 化 ”在 大 肠 杆 菌 中 ,DNA 腺 味 吟 甲 基 化 酶 (Dam) 通 常 催化 GATC 序列 中 腺 味 叭 残 基 的 第 六 位 氮 原 子 (N?) 甲 基 化 。 该 序列 表现 出 二 重 对 称 , 被 作用 时 两 条 链 上 的 腺 味 叭 残 基 都 发 生 甲 基 化 。 这 种 修饰 机 制 的 主要 作用 是 使 细胞 识别 DNA 复制 后 的 母 链 和 暂时 还 未 甲 基 化 的 子 链 ,这 促进 了 校正 复制 错误 产生 错 配 的 DNA 修复 系统 , 即 复 制 后 错 配 修复 (人 参阅) 的 作用 。 子 链 的 非 甲 基 化 作用 将 指导 修复 酶 从 子 链 上 切除 错误 的 核 苷 酸 而 不 是 切除 母 链 上 正确 的 核 苷 酸 。 DNA 腺 味 吟 甲 基 化 酶 在 DNA 的 复制 中 也 起 着 直接 的 作用 。 在 大 肠 杆菌 复制 起 始 区 oriC 中 有 14 个 腺 味 吟 甲 基 化 位 点 ,编码 必需 的 复制 起 始 蛋白 (参见 复制 起 始 ) 的 dzraA 基因 的 启动 子 上 也 发 现 了 另 一 个 甲 基 化 位 点 。 在 复制 开始 后 半 甲 基 化 的 起 点 可 能 由 于 与 细胞 膜 中 的 成 分 相互 作用 而 无 法 再 次 启动 DNA 的 复制 。 子 链 oriC 起 始 区 和 waA 基因 启动 子 上 的 甲 基 化 位 点 通常 比 一 般 Dam 位 点 中 的 甲 基 化 更 晚 一 些 , 并 可 能 受 细菌 细胞 周 期 因子 (参阅 ) 的 直接 调控 。DxzaA 基因 启动 子 中 的 GATC 序列 可 能 作为 一 种 转录 沉默 子 而 阻止 转录 的 再 起 始 。 类 似 的 ,多 种 细菌 转 位 子 中 的 GATC 序列 可 能 通过 阻 断 转 位 酶 基因 的 转录 而 阻 断 基因 的 转 位 ,或 者 在 转录 后 阻 断 转 位 酶 与 DNA 的 结合 而 发 挥 作 用 。 在 两 种 情况 中 , 易 位 被 限制 在 较 短 的 时 间 中 ,从 而 确保 胞 内 存在 两 个 基因 组 以 利 重 组 介 导 的 损伤 修复 。 有 趣 的 是 ,DNA 甲 基 化 在 真 核 基因 的 转 位 中 也 起 着 重要 作用 ,这 将 在 下 文 中 讨论 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 )。 se 86 se Decm 甲 基 化 ”在 大 肠 杆 菌 中 ,CCWGG 序列 中 的 胞 喀 啶 残 基 在 DNA 胞 喀 啶 甲 基 化 酶 (Dem) 的 催化 下 转变 成 5 - 甲 基 胞 喀 啶 。 这 种 甲 基 化 的 作用 目前 还 不 清楚 , 它 可 能 保护 基 因 组 免 受 限 制 性 内 切 酶 EcoRII 的 酶 解 。5 - 甲 基 胞 吵 啶 容易 自发 脱 氢 而 形成 胸腺 喀 啶 ， 会 导致 G-T 错 配 。 Vsr 基因 编码 的 DNA 修复 系统 通常 能 纠正 这 一 错误 (参见 极 短 补 丁 错 配 修复 )。 值 得 注意 的 是 , wsr 基因 和 dc 基因 位 于 同一 个 操纵 子 上 ,它们 的 读 框 有 6 个 密码 子 相 互 重 登 。 7.2 真 核 细胞 的 DNA 甲 基 化 真 核 细 胞 中 胞 喀 啶 甲 基 化 的 模式 ”在 真 核 细 胞 DNA 中 发 生 修饰 的 碱 基 一 般 只 有 5 - 甲 基 胞 喀 啶 (5 - meC) ,并 可 能 是 仅 有 的 程序 化 修饰 。5 - 甲 基 胞 喀 啶 的 丰 度 在 不 同 的 物种 间 差异 较 大 ,通常 在 真菌 和 无 俏 椎 动物 中 含量 较 少 (例如 在 酿酒 酵母 和 果 蝇 中 5 - 甲 基 胞 喀 院 检 测 不 到 ), 在 肴 椎 动物 中 有 一 定 的 含量 (高 至 10% 的 胞 喀 啶 残 基 会 发 生 甲 基 化 ) ,而 在 很 多 植物 中 含量 最 高 (最 高 可 有 30% 的 胞 喀 啶 残 基 发 生 甲 基 化 )。 在 峭 椎 动物 细胞 中 , 胞 喀 啶 残 基 甲 基 化 通常 发 生 在 5S- CG- 3 二 核 苷 酸 基 序 中 ,而 在 植物 细胞 中 5-CG-3 和 5-CNG-3 这 两 种 二 重 对 称 的 基 序 都 可 被 甲 基 化 。 目 前 分 离 得 到 的 真 核 细胞 DNA 甲 基 化 酶 多 是 维持 甲 基 化 酶 ,很 多 真 核 基 因 组 中 观察 到 的 DNA 甲 基 化 是 组 成 型 的 , 甲 基 化 的 维持 对 其 增殖 已 足够 。 下 面 还 将 讨论 到 ,在 动物 和 植物 发 育 过 程 中 观察 到 DNA 甲 基 化 状态 的 全 局 性 变化 证 实 了 从 头 合成 甲 基 化 酶 和 去 甲 基 化 酶 的 存 在 ,尽管 这 两 类 酶 的 性 质 目前 未 被 描绘 。 另 外 ,在 非 对 称 序 列 上 也 可 能 发 生 胞 喀 啶 甲 基 化 ,该 甲 基 化 可 能 受 DNA 复制 的 调控 (参见 深 娄 甲 基 化 岛 ) ,这 些 位 点 的 甲 基 化 修饰 也 需 要 从 头 合成 甲 基 化 酶 的 活性 。 胞 哮 啶 的 甲 基 化 ,突变 和 基因 组 进化 ”在 兰 椎 动物 细胞 DNA 中 , 由 于 5 - 甲 基 胞 喀 喧 的 高 突变 率 ,CG 出 现 的 频率 只 有 按 核 苷 酸 组 成 计算 出 的 频率 的 20% 。 脱 气 基 作用 〈 参 阅 ) 是 DNA 自发 损伤 的 一 种 普遍 形式 ,未 发 生 修饰 的 胞 喀 啶 的 脱 氨基 产物 是 尿 喀 啶 , 它 可 以 通过 碱 基 切 除 修复 (参阅 ) 从 DNA 上 有 效 切 除 。 而 5 - 甲 基 胞 喀 啶 的 脱 氨基 产物 是 胸腺 喀 啶 是 一 种 合法 的 DNA 碱 基 , 在 细菌 中 存在 一 种 特殊 的 修复 系统 来 纠正 由 此 产生 的 工 :G 错 配 。 但 这 种 修复 作用 是 泄漏 型 的 ,因而 导致 胞 喀 啶 随 着 进化 历程 含量 下 降 。 在 人 类 点 突变 引起 的 疾病 中 C 一 工 的 转换 占 大 多 数 。 CpG 留 通过 分 析 5 - 甲 基 胞 喀 喧 在 真 核 细胞 基因 组 中 的 分 布 可 以 发 现 CpG 岛 的 存在 (或 称 为 HIF 岛 1 ) 这 些 区 域 是 非 甲 基 化 的 ,通常 为 1 一 2kbp 大 小 ,并 且 绝 大 多 数 结合 一 些 基 因 的 5 末端。 这 些 序列 富 含 GC, 并 且 有 大 量 的 CpG 二 核 背 酸 基 序 。 这 表明 甲 基 化 的 去 除 防 止 了 胞 喀 啶 残 基 的 缺失 。CpG 岛 的 这 些 性 质 可 以 用 于 诊断 或 鉴别 一 些 大 的 基因 组 克隆 中 的 潜在 基因 (参见 定位 克隆 )。 1D) CpG 岛 又 称 为 HTF 岛 是 由 于 它 的 片段 中 含有 一 镀 5 - meC 敏感 性 限制 性 内 切 核酸 酶 oo 工 的 作用 位 点 。 在 正常 的 ( 即 甲 基 化 的 )DNA 中 , Hpa [由 于 作用 位 点 经 常 被 切除 或 发 生 修饰 而 很 少 进行 酶 切 。 而 在 CPG 岛 中 由 于 有 大 量 的 未 发 生 修饰 的 作用 位 点 因而 Hpa I 可 以 进行 酶 切 从 而 产生 Hpa I tiny framents (HTF) ,所 以 CpG 岛 又 称 为 HTF 岛 ( 参 见 限 制 性 内 切 酶 ) 。 下 87 四 在 人 类 基因 组 中 大 约 存在 着 约 0 000 个 CpG 岛 。 其 中 约 有 一 半 与 管家 基因 (house- keeping genes) 相 联系 , 另 一 半 与 细胞 类 型 特异 基因 相 联 系 。 无 论 这 些 基 因 是 否 表达 ,这 两 类 基因 的 中 CpG 岛 都 是 组 成 型 非 甲 基 化 的 , 失 活 X- 染色 体 上 的 基因 则 例外 ,它们 的 甲 基 化 主要 取决 于 亲本 印迹 (在 下 文中 讨论 ) 。CpG 岛 的 位 置 和 性 质 决 定 了 未 甲 基 化 的 启动 子 是 转录 所 必需 的 ,但 并 非 是 启动 转录 活性 的 充分 条 件 。CpG 岛 的 人 工 甲 基 化 将 抑 制 转录 活性 也 证 明了 这 一 点 。 启 动 子 上 的 CpG 岛 可 能 由 于 与 转录 因子 的 组 成 型 结合 而 避免 了 被 DNA 甲 基 化 酶 作用 ,这 也 可 以 解释 非 甲 基 化 ,转录 因子 的 缔 合 以 及 异 位 甲 基 化 效应 。 在 细胞 类 型 特异 性 基因 中 ,可 以 认为 某 些 转录 调节 复合 物 自发 与 DNA 组 成 型 结 合 (产生 了 *“ 岛 ) ,转录 的 活化 还 要 求 其 他 的 细胞 类 型 特异 因子 。 很 多 基因 并 不 与 CpG 岛 相 联 系 。 哺乳 动物 细胞 中 的 甲 基 化 和 基因 调控 ”一 系列 的 证 据 表明 在 DNA 的 甲 基 化 和 基因 的 转录 ,特别 是 在 非 甲 基 化 或 甲 基 化 不 足 (hypomethylation) 和 转录 活性 之 间 存 在 着 联系 。 例如 上 面 讨 论 过 的 CpG 岛 对 转录 活性 的 影响 ,另外 在 转基因 实验 中 被 转化 基因 在 进入 细 胞 前 如 已 甲 基 化 则 不 能 表达 ; 甲 基 化 阻 断 性 药物 如 5$ - 氮 杂 胞 喀 啶 核 苷 对 基因 表达 有 诱导 作用 ;以 及 细胞 类 型 特异 性 基因 甲 基 化 模式 以 及 在 失 活 的 X- 染 色 体 上 亲本 印迹 位 点 CpG 岛 的 超 甲 基 化 (特定 位 点 甲 基 化 率 上 升 )。 一 般 来 说 , 甲 基 化 的 DNA 能 通过 多 种 方式 影响 转录 。 首 先 , 它 能 够 直接 干扰 转录 因 子 与 其 识别 位 点 胞 喀 啶 的 结合 。 其 次 , 它 能 够 与 特异 性 识别 甲 基 化 DNA 蛋白 结合 从 而 阻 断 或 取代 转录 因子 的 作用 ,目前 已 有 两 种 这 种 性 质 的 甲 基 化 CpG 结合 蛋 自 (methyl- CpG-binding protein) 被 分 离 出 来 。 第 三 , 它 能 够 通过 影响 核 小 体 的 位 置 或 与 其 他 染色 质 蛋白 相互 作用 而 改变 染色 质 的 结构 。 尽管 已 确 知 DNA 的 甲 基 化 对 基因 表达 有 影响 ,但 是 除了 亲本 印迹 和 X 染色 体 失 活 的 例子 ( 见 下 文 ) ,目前 它 在 体内 的 调节 机 制 还 没有 令 人 信服 的 证 据 。 目 前 已 有 的 大 部 分 DNA 的 甲 基 化 作为 普遍 调控 方式 的 证 据 来 源 于 细胞 的 体外 培养 系统 ,而 这 类 DNA 甲 基 化 的 模式 与 内 源 组 织 的 甲 基 化 模式 常常 并 不 相同 。 在 体内 可 以 观察 到 细胞 类 型 特异 的 甲 基 化 模式 ,有 可 能 这 种 差异 将 导致 基因 活性 的 分 化 。 甲 基 化 通常 被 认为 是 基因 表达 差异 的 原因 之 一 。 例 如 调节 蛋白 与 DNA 的 结合 可 以 阻 断 维持 甲 基 化 酶 作用 于 DNA, 从 而 引 起 基因 的 不 同 表 达 并 维持 这 样 的 分 化 状态 。 实 验 发 现 ，DNA 甲 基 化 酶 缺陷 的 纯 合 型 小 鼠 胚 胎 在 原 肠 胚 形 成 后 就 迅速 死亡 ,说明 DNA 甲 基 化 酶 对 于 体 细 胞 的 进一步 发 育 是 必 需 的 。 不 过 这 种 效应 也 可 能 是 由 于 X 染色 体 所 有 拷贝 的 失 活 而 导致 印迹 基因 产生 轻 度 的 下 降 调节 ( 见 下 文 )。 如 果 DNA 的 甲 基 化 最 终 仅 仅 调 控 一 小 部 分 基因 ,那么 在 高 等 真 核 生 物 基 因 组 中 观 察 到 的 广泛 的 甲 基 化 作用 是 什么 ? 一 种 理论 认为 它 可 以 减少 高 等 真 核 生物 基因 组 中 异常 基因 的 表达 , 即 它 可 以 降低 "遗传 噪音 ”(genetic noise) 。 最 近 观察 到 的 一 个 有 趣 的 现象 是 在 哺乳 动物 基因 组 中 许多 甲 基 化 的 胞 喀 啶 处 于 转 座 子 中 (参阅 )。 有 两 类 逆转 录 因 子 ( 参 阅 )，LINEs 和 SINEs( 分 别 代表 长 和 短 的 分 散 排 列 的 逆转 录 因 子 ) 在 哺乳 动物 DNA 中 含 量 特 别 丰富 并 且 是 哺乳 动物 基因 组 中 中 等 分 子 量 的 DNA 重复 序列 的 重要 组 成 ( 见 可 移 动 遗传 因子 ,基因 组 和 作 图 )。DNA 的 甲 基 化 可 以 抑制 植物 和 细菌 的 转 座 子 ,在 背 椎 动物 中 甲 基 化 可 能 也 有 相同 的 作用 。 与 之 吻合 ,重组 逆转 录 病 毒 转 人 小 鼠 的 基因 组 后 常常 由 四 88 下 于 超 甲 基 化 作用 而 保持 沈默。 有趣 的 是 ,由 可 移动 遗传 因子 引起 的 染色 体重 排 及 突变 的 发 生 率 在 哺乳 动物 中 非常 低 而 在 DNA 不 发 生 甲 基 化 的 果 蝇 中 却 非常 高 。 植物 中 的 甲 基 化 和 基因 的 调控 ” 当 植 物 内 源 性 基因 的 额外 拷贝 或 待 转化 基因 的 多 拷贝 整合 到 植物 细胞 基因 组 后 常常 会 导致 内 源 和 外 源 的 基因 发 生 外 遗传 沉默 。 这 种 外 遗传 沉 默 的 机 制 可 能 发 生 在 两 种 水 平 上 :一 种 是 在 转录 水 平 ( 即 同 源 性 依赖 转录 基因 沉默 ,包括 顺 式 或 反 式 的 DNA 配 对 ) , 另 一 种 是 在 转录 后 水 平 〈 即 同 源 性 依赖 转录 后 基因 沉默 或 共 抑制 ,包括 反 义 RNA 的 作用 [参见 本 条 和 降解 体 (degradosomes) ] ,但 在 这 两 种 情况 下 DNA 的 序列 都 不 发 生变 化 。 在 许多 例子 下 外 遗传 的 沉默 与 序列 中 许多 重复 序列 的 超 甲 基 化 有 关 。 转录 水 平 沉 默 所 产生 的 遗传 效应 与 副 突变 (paramutation) 的 自然 过 程 十 分 相似 。 副 突变 是 等 位 基因 间 的 一 种 相互 作用 , 即 在 杂 合 子 中 一 条 发 生 副 突变 的 等 位 基因 抑制 了 另 一 条 能 发 生 副 突变 的 等 位 基因 。 在 许多 情况 下 这 种 副 突变 的 结果 是 使 这 条 能 发 生 副 突变 的 等 位 基因 也 发 生 副 突变 ,并 且 这 种 副 突变 的 效应 可 以 通过 减 数 分 裂 而 遗传 ,但 最 终 是 可 逆 的 。 同 样 , 副 突 变 并 不 改变 DNA 的 序列 ,而 且 这 种 效应 似乎 与 基因 的 拷贝 数 和 它 在 染 色 体 上 的 位 置 有 关 。 在 许多 但 不 是 全 部 情况 下 副 突变 常常 伴随 着 一 定数 量 的 DNA 甲 基 化 。 植物 以 及 一 些 真菌 中 的 重复 DNA 序列 的 超 甲 基 化 可 能 是 一 种 阻止 转 座 子 传播 的 防 御 机 制 〈 与 在 脊 椎 动物 中 类 似 ) 。 在 共 抑 制 和 副 突 变 中 DNA 重复 序列 所 起 的 作用 似乎 也 支持 这 种 理论 。 与 动物 相似 ,植物 在 发 育 过 程 中 经 历 全 局 性 的 甲 基 化 状态 改变 ,这 可 能 会 产生 转 位 的 高 潮 ,很 多 转 座 子 家 族 被 迅速 激活 。 例 如 一 种 阿拉 伯 果 蝇 (Arapidozpsis ) 由 于 发 生 了 DNA 甲 基 化 酶 的 缺陷 突变 ,尽管 能 够 存活 , 却 存在 着 许多 发 育 上 的 缺陷 ,可 能 对 应 于 转 座 子 家 族 的 活化 。 目 前 DNA 甲 基 化 在 植物 中 的 普遍 调控 机 制 还 不 清楚 ,而 DNA 甲 基 化 的 缺陷 可 能 反映 了 外 遗传 的 降 调 节 作 用 而 不 是 突变 发 生 的 增加 。 7.3 哺乳 动物 的 DNA 甲 基 化 对 外 和 遗传 基因 的 调控 甲 基 化 的 全 局 调控 模式 ”在 哺乳 动物 中 ,成 体 的 特征 的 甲 基 化 模式 在 原 肠 胚 形成 之 前 就 已 建立 。 在 合子 中 甲 基 化 的 水 平 较 高 ,而 在 卵 裂 期 则 发 生 广泛 的 去 甲 基 化 作用 ,随后 从 头 甲 基 化 发 生 仅 在 形成 成 体 体 细胞 组 织 的 外 豚 层 。 而 胚 外 部 分 ,包括 胚 外 膜 和 原生 殖 细 胞 ,在 配子 形成 之 前 一 直 保持 非 甲 基 化 ,在 形成 后 这 时 生殖 细胞 才 发 生 从 头 合成 甲 基 化 。 上 面 已 讨论 过 ,大 部 分 甲 基 化 和 去 甲 基 化 作用 都 是 组 成 型 的 ,并 且 可 能 作为 一 种 保护 机 制 来 抑制 转 座 子 的 活性 以 及 “遗传 噪音 "。 但 是 在 这 中 间 也 有 两 个 例外 , 比如 印迹 基因 和 位 于 X 染 色 体 上 的 Xist 基因 座 , 它 们 在 生殖 细胞 中 以 性 别 特异 的 方式 甲 基 化 ,并 且 不 经 历 发 育 早期 发 生 的 全 局 性 去 甲 基 化 和 从 头 甲 基 化 。 亲本 印迹 ”印迹 (imprint) 是 记录 外 遗传 信息 的 一 种 方式 。 亲 本 印迹 是 通过 这 一 遗传 机 制 可 保留 亲本 来 源 的 外 遗传 信息 的 染色 体 区 域 。 在 体 细胞 中 ,许多 基因 在 母系 和 父系 来 源 的 染色 体 上 同时 表达 ,而 印迹 基因 的 表达 却 以 亲本 染色 体 特 异 的 方式 表达 。 通 常 ,如 果 一 条 等 位 基因 被 抑制 则 它 被 称 为 被 "印迹 例如 ,在 母系 印迹 基因 座 处 ,只 有 与 它 对 应 的 "89 ， 父系 来 源 的 等 位 基因 能 够 表达 )。 但 这 只 是 一 种 较 片面 的 定义 ,并 不 能 够 确切 反映 印迹 机 制 的 内 在 特征 。 在 分 子 水 平 上 , 印迹 就 是 DNA 的 甲 基 化 ,一 些 位 点 的 DNA 甲 基 化 对 应 于 基因 的 活化 而 另 一 些 位 点 上 则 对 应 于 基因 的 失 活 。 在 下 文中 我 们 将 会 谈 到 ,许多 印迹 基因 是 成 和 存在 的 ,在 顺 式 作用 控制 位 点 的 单 甲 基 化 印迹 就 能 直接 导致 一 些 基 因 的 母系 或 父系 的 特异 性 表达 。 在 遗传 杂交 中 亲本 印迹 的 结果 如 图 7.1 所 示 。 尽 管 形成 合子 时 父 系 和 母系 来 源 的 染色 体 数 量 是 相等 的 ,但 印迹 基因 座 是 功能 性 半 合 子 式 的 ,因此 互 交 的 结 果 并 不 一 致 。 人 Aia Aiai 缺失 表 型 野生 表 型 图 7.1 在 互 交 中 亲本 印迹 的 效应 。 纯 合 的 野生 型 个 体 (AA) 与 纯 合 的 无 效 突变 个 体 (aa) 杂 交 产 生 杂 合 的 Fi 代 (Aa)。 母 系 等 位 基因 携带 印迹 ( 深 色 条 纹 ) 并 不 表达 ,而 父系 等 位 基因 表达 。 当 母 本 为 无 效 亲 本 时 ,Fi 代 显 示 与 父系 等 位 基因 A 相关 的 显 性 表 型 。 如 果 母 系 为 野生 型 亲本 ,Pi 代 显示 与 父系 无 效 等 位 基因 a 相关 的 突变 表 型 。 亲本 印迹 存在 的 第 一 个 证 据 是 从 单 性 生殖 发 育 ( 即 由 未 受精 的 卵细胞 进行 发 育 ) 的 失 败 中 发 现 的 。 细 胞 核 移 植 的 实验 表明 父系 和 母系 的 基因 组 都 是 正常 发 育 所 必需 的 。 单 亲 发 育 的 小 鼠 胚 胎 , 即 由 两 只 雄性 ( 孤 雄 生殖 ,androgenotes) 或 两 只 肉 性 小 鼠 ( 孤 肉 生殖 ， gynogenotes) 的 细胞 核 组 成 的 合子 而 来 的 小 鼠 胚 胎 在 发 育 过 程 中 常常 表现 异常 并 且 在 出 生前 就 已 死亡 。 其 中 孤 肉 生殖 的 胚胎 可 进行 正常 的 早期 发 育 ,但 它 的 胚 外 膜 却 并 不 发 育 。 而 孤 雄 生殖 的 小 鼠 尽 管 胚 外 膜 发 育 正 常 ,但 它 的 豚 胎 却 表现 出 生长 停滞 。 这 种 反常 的 现 象 被 称 作 complete hytaditiform moles(partial moles 包括 一 种 三 倍 体 的 胎儿 , 它 由 两 个 父 系 和 一 个 母系 的 基因 组 共同 组 成 )。 使 用 含有 同 二 体 (isodisomic) 二 倍 染 色 体 片段 的 小 鼠 品系 (染色 体 的 两 个 拷贝 都 起 源 于 同一 个 亲本 ) 实 验 已 经 辨 明了 同 基 因 印 迹 作 用 有 关 的 染 色 体 区 域 。 例 如 ,人 类 基因 组 上 的 同 线 (syntenic) (参阅 ) 区 域 已 被 证 实 同一 些 典 型 的 印 迹 异 常 疾 病 如 PraderWilli & Angelman 综合 征 和 Beckwith-wiedemann 综合 征 有 关 。 在 动物 中 ,印迹 效应 主要 发 生 在 哺乳 动物 中 ,在 植物 中 也 发 现 印 迹 效 应 ,但 由 于 植物 对 剂量 有 更 强 的 耐 受 性 ,因而 产生 形态 差异 的 表 型 而 不 是 疾病 。 亲本 印迹 和 DNA 的 甲 基 化 ”目前 在 人 类 和 上 鼠 身 上 至 少 已 辨 明了 20 种 印迹 基因 ,而 且 其 中 许多 编码 与 生长 调节 有 关 的 产物 。 与 鼠 的 印迹 染色 体 区 域 一 致 ,大 多 数 人 类 的 印迹 基因 集中 在 三 个 簇 中 。 有 证 据 表 明 在 每 个 基因 复 上 都 存在 着 特异 的 印迹 盒 (imprinting boxes) 能 顺 式 调节 印迹 基因 的 亲本 特异 性 表达 ,这 些 位 点 上 表现 出 亲本 特异 性 的 甲 基 化 ee 90 模式 ,其 建立 与 重新 起 始 独立 于 哺乳 动物 发 育 的 早期 全 局 性 的 从 头 合成 甲 基 化 作用 和 去 甲 基 化 作用 。 在 哺乳 动物 中 ,雄性 和 雌性 配子 中 印迹 盒 发 生 的 甲 基 化 是 不 同 的 ,从 而 能 指 导 亲 本 特异 性 基因 的 表达 。 同 时 父系 和 母系 染色 体 也 由 于 重组 的 频率 ,染色 质 的 结构 以 及 复制 时 间 的 不 同 而 表现 出 差异 。 在 人 类 染色 体 11p15. 5 位 置 上 的 印迹 基因 繁 与 胎儿 的 过 度 生 长 异常 即 Beckwith- Wiedemann 综合 征 (BWS) 有 关 。 这 个 基因 簇 中 包含 至 少 7 个 基因 ( 表 7.2) ,在 父系 特异 性 的 IGF2 周围 环绕 着 母系 特异 性 的 HI19 ,KCNA9 ,CDKNIC 和 NAP2 。JIGF2 编码 一 种 生长 因子 , 它 的 降 调 表达 在 BWS 综合 征 中 起 着 主要 的 作用 。 在 鼠 的 相关 同 源 簇 上 也 克 隆 到 了 三 个 印迹 基因 ,其 中 Ins2 是 父系 表达 的 印迹 基因 , 它 编 码 另 一 种 生长 因子 且 与 人 类 基因 和 佬 上 的 INS 基因 有 同 源 性 ,而 人 INS 基因 表达 的 模式 目前 还 不 清楚 。 小 鼠 中 另 外 两 个 基因 Mash -2 和 下 PPr 是 母系 表达 的 ,其 中 到 记 r 编码 父系 特异 性 的 下 尼 的 受 体 (人 类 IJGF2R 为 双 等 位 表达 )。 在 鼠 的 某 些 组 织 中 , Je 记 和 xms2 也 表现 为 双 等 位 表达 ,这 表明 基因 的 印迹 作用 是 有 种 间 特 异性 的 ,也 就 是 说 ,这 些 基 因 是 被 条 件 性 印迹 (condition- ally imprinted ) 。 表 7.2 人 类 BWS 印迹 基因 簇 和 X- 失 活 中心 (XIC) 上 的 印迹 基因 基 因 产 叶 - 霹 所 处 位 置 ”表达 情况 Beckwith-Wiedemann 综合 征 基 因 符 JIGF2 生长 因子 父系 表达 INS 生长 因子 未 知 一 一 在 鼠 中 为 父系 表达 HH19 非 翻 译 RNA 11lp15.5 ”母系 表达 JGF2R 生长 因子 受 体 双 等 位 表达 一 一 在 鼠 中 为 母系 表达 KCNA9 K+ 通 道 母系 表达 CDKNIC CDK 抑制 剂 母系 表达 X- 失 活 中 心 XIST RNA Xql13 在 原 肠 胚 形成 前 为 父系 表达 注 : 在 BWS 印迹 基因 艇 中 生长 调节 因子 占 主 要 。IGF2 和 INS 编码 生长 因子 。IGF2R 是 生长 因子 的 受 体 , HI19 调节 IGF2 的 转录 , CDNKIC 被 认为 是 细胞 周期 的 调节 子 。 鼠 的 BWS 印迹 基因 焦 上 还 包括 一 个 母系 表达 的 基因 Ma -2 , 它 编码 一 个 转录 因子 。 人 类 的 HI19 和 JIGF2 基因 的 互 斥 表达 是 调控 BWS 综合 征 的 关键 。 许 多 BWS 综合 征 的 病例 涉及 到 IGF2 的 双 等 位 表达 (在 正常 情况 下 仅仅 是 父系 染色 体 上 的 IGF2 表 达 ) ,其 中 大 部 分 反映 了 所 谓 的 父系 单亲 二 体 染 色 体 或 父系 三 体 染 色 体 。 然 而 ,即使 在 正 常 的 情况 下 两 条 染色 体 来 源 于 不 同 的 亲本 , 它 的 母系 的 酝 19 基因 座 仍 可 能 会 发 生 缺 失 或 甲 基 化 ,这 是 由 于 它 包 含 了 一 个 父系 特异 性 的 甲 基 化 位 点 ,因而 其 甲 基 化 导致 了 RH19 的 不 表达 。H19 突变 体 的 上 位 作用 和 这 种 上 位 突变 对 JIGF2 转录 的 影响 形成 了 一 种 增强 子 竞争 模式 (enhancer competition model) ,在 这 个 模式 中 刀 19 和 TIGF2 的 转录 被 认为 依赖 于 同一 个 增强 子 , 当 H19 转录 利用 了 这 个 增强 子 后 就 阻 断 了 IJGF2 的 表达 。 因 此 只 有 当 HB19 发 生 甲 基 化 作用 阻止 了 转录 后 JGF2 基因 才 会 进行 表达 。19 的 转录 产物 是 非 翻 译 的 RNA, 除 了 转录 能 够 抑制 JGF2 的 转录 外 未 显示 其 他 的 内 在 功能 。 。 9]1 。 最 近 , 包 含 完 整 的 鼠 BWS 基因 簇 的 酵母 人 工 染 色 体 (YACs) 的 转基因 小 鼠 实验 显示 出 反 义 的 RNA 在 下 PPr 的 印迹 表达 中 起 着 重要 的 作用 (在 正常 情况 下 有 @ 记 r 仅 在 母系 来 源 的 染色 体 上 表达 )。 在 丽 记 的 启动 子 上 存在 着 一 个 父系 特异 的 甲 基 化 位 点 ,在 一 个 内 含 子 中 还 存在 着 一 个 母系 特异 的 甲 基 化 位 点 ,在 人 和 上 鼠 中 这 两 个 位 点 都 存在 ,但 在 人 类 中 这 个 基因 是 双 等 位 表达 的 。 了 Pr 基因 内 含 子 上 的 甲 基 化 位 点 标明 了 反 义 链 转录 的 启动 子 的 位 置 ,在 未 甲 基 化 的 父系 来 源 的 染色 体 上 反 义 链 能 正常 转录 ,从 而 抑制 了 父系 的 了 PPr 的 表达 。 当 母系 的 反 义 链 启动 子 发 生 甲 基 化 ,JePr 的 转录 去 抑制 。 在 上 述 这 两 个 例子 中 亲本 印迹 的 发 生 是 通过 不 同 的 甲 基 化 作用 起 始 并 由 竞争 机 制 来 调节 的 。 环 记 r 的 这 种 竞争 机 制 即 反 义 链 的 转录 所 引起 的 逆向 转录 能 对 抗 且 PPr 的 正常 转录 其 本 质 目前 还 不 清楚 , 它 可 能 包 被 染色 体 并 诱导 类 似 与 Xist RNA ( 见 下 文 ) 的 异 染 色 质 的 出 现 ,或 者 可 能 存在 一 种 类 似 于 区 户 /HI19 调节 元 件 的 竞争 机 制 。 印迹 的 作用 :促进 发 育 还 是 亲 代 间 相互 拓 抗 的 结果 9 为 解释 哺乳 动物 中 印迹 的 重要 性 和 在 进化 过 程 中 的 作用 提出 了 各 种 各 样 的 理论 。 很 多 理论 认为 它 在 哺乳 动物 的 发 育 过 程 中 起 着 内 在 作用 。 实 验 发 现 虽然 孤 峻 生殖 小 鼠 不 能 正常 发 育 , 但 是 孤 峻 生殖 细胞 和 正 常 细胞 的 侍 合 体 仍 然 能 够 存活 。 孤 肉 生 殖 细胞 在 异 源 舱 合 的 小 鼠 胚 胎 中 的 分 布 提 示 发 生 印迹 分 化 的 细胞 在 小 鼠 脑 的 发 育 中 起 着 重要 的 作用 。 例 如 , 孤 肉 生殖 细胞 在 下 丘脑 中 没 有 分 布 而 在 前 脑 中 则 大 量 存 在 。 另 一 种 亲 代 持 抗 模式 (parental conflict model) 认 为 在 多 配偶 的 哺乳 动物 中 印迹 的 出 现 是 父系 和 母系 基因 组 竞争 的 结果 。 在 多 配偶 的 哺乳 动物 中 ,父亲 总 是 努力 想 使 它 的 下 一 代 获 得 最 强 的 生存 能 力 从 而 能 战胜 母亲 与 其 他 配偶 产生 的 下 一 代 , 而 母亲 则 总 是 想 使 更 多 的 子 代 能 活 下 来 。 因 此 ,自然 选择 导致 来 自 父 系 的 等 位 基因 能 促进 个 体 的 生长 , 而 来 自 母系 的 等 位 基因 则 抑制 个 体 的 生长 。 在 鼠 的 BWS 基因 簇 中 ,父系 的 古 忆 和 ns 编码 生长 因子 ,而 母系 的 瑟 19 则 是 环 忆 转录 的 抑制 子 , 同 时 母 系 的 及 Pr 作为 不 尼 的 清除 受 体能 够 降低 血清 中 生长 因子 的 水 平 。 在 BT19 或 环 PPr 被 敲 除 的 小 鼠 中 由 于 不 记 mRNA 和 游离 蛋白 水 平 的 增高 促进 了 循环 的 囊 户 数量 的 增加 ， 因此 小 鼠 出 生 时 的 体重 也 呈 增 长 的 趋势 (相反 的 如 果 来 自 父 系 染色 体 的 大 等 位 基因 被 逆 除 的 话 ,其 生长 速度 只 有 正常 小 鼠 的 60% )。 有 趣 的 是 , 当 一 种 多 配偶 的 老鼠 和 另 一 种 单 配偶 的 老鼠 交配 后 ,它们 Fi 子 代 出 生 时 的 体重 也 表现 出 亲本 印迹 的 现象 。 当 多 配偶 的 公 鼠 与 单 配偶 的 母 鼠 交配 后 它们 产生 的 子 代 要 比 单 配 偶 的 公 鼠 与 多 配偶 的 母 鼠 产生 的 子 代 要 大 。 这 种 现象 符合 亲 代 持 抗 的 模型 。 因 为 单 配 偶 的 公 鼠 生育 更 强壮 的 子 代 的 压力 较 小 而 单 配偶 母 鼠 促进 更 多 子 代 存活 的 压力 也 较 小 而 当 这 两 种 不 同 的 鼠 种 间 进 行 交配 时 ， 由 于 多 配偶 鼠 的 竞争 策略 使 Fl 子 代 体重 呈 上 升 的 趋势 。 综 上 所 述 , 这 种 模型 只 是 预言 了 而 非 反 映 了 哺乳 类 发 育 的 内 在 性 质 。 比 如 Igf2 和 Igf2r, 或 者 是 Igft2 和 Hl19 被 敲 除 的 小 鼠 , 它 们 的 表 型 都 和 正常 小 鼠 一 致 。 X 染色 体 失 活 在 肉 性 哺乳 动物 的 体 细 胞 中 ,X 染色 体 的 剂量 补偿 (参阅 ) 可 以 通过 X 染色 体 的 失 活 来 实现 。 一 条 染色 体 缩 聚 成 异 染色 质 而 失去 转录 活性 。 失 活 的 和 染色 体 (Xi) 在 整个 细胞 周期 中 一 直 保持 缩聚 的 状态 ,可 以 被 染 成 深 色 , 称 作 巴尔 小 体 (Barr body) ,而 另 一 条 活化 和 染色 体 (Xa) 则 保持 正常 。 在 肉 性 的 配子 中 ,起 初 两 条 染色体 都 具有 活性 。X 染色 体 的 失 活 首先 发 生 在 胚 外 se 92 系 的 囊 胚 泡 期 的 晚期 以 及 在 更 晚 一 些 时 候 发 生 在 形成 了 胚胎 体 细 胞 的 外 胚层 系统 中 。 在 具有 胎盘 的 哺乳 动物 胚胎 组 织 中 , 失 活 的 X 染 色 体 的 选择 是 随机 的 。 一 旦 被 选中 这 个 过 程 就 不 可 逆转 :具有 活性 和 失 活 的 X 染 色 体 分 别克 隆 扩 增 ,所 以 在 一 个 杂 合 子 个 体 中 可 见 的 X 连 锁 的 标记 就 能 够 显示 被 标记 表 型 的 花 斑 分 布 〈 例 如 球 了 猫 的 毛皮 )。 在 许多 哺 乳 动物 的 胚 外 组 织 中 (但 不 包括 人 类 ) , 父 源 的 X 染 色 体 更 容易 失 活 (亲本 印迹 的 一 个 例 子 , 见 上 文 ) ,而 在 有 袋 类 动物 的 胚胎 组 织 和 胚 外 组 织 中 却 倾 向 于 父 源 的 又 染 色 体 失 活 。 在 这 两 个 例子 中 ,亲本 印迹 不 是 X 染色 体 失 活 所 必需 的 ,因为 在 包含 有 两 条 母 源 X 染色 体 的 胚胎 中 也 能 发 生 正常 的 入 染色体 失 活 现象 。 X 染 色 体 失 活 的 分 子 机 制 X 染 色 体 的 失 活 可 以 分 为 四 个 时 期 :计数 期 ,起 始 期 ,增殖 期 (传播 期 ) 和 维持 期 。 一 个 X 染 色 体 的 顺 式 作用 位 点 ,和 失 活 中 心 (Xizc ) ,似乎 与 这 四 个 时 期 都 有 关 , 通 过 对 X 染色 体 的 缺失 和 转 位 所 引起 的 失 活 破坏 的 实验 而 定位 了 这 个 位 点 。 如 果 含 有 Xic 的 区 域 被 缺失 ,突变 后 的 X 染色 体 仍 然 具有 活性 ;而 如 果 双 染色体 发 生 了 转 位 , 则 包含 Xic 的 片段 会 失 活 ( 转 位 到 常 当 色 体 构成 常 染色 体 的 一 部 分 ) ,而 其 余 的 片段 仍 具 有 活性 。 通过 Xic 的 精确 定位 发 现 了 一 个 单 基因 座 , Xisz , 它 仅 仅 在 Xi 上 有 特异 性 的 表达 ( 即 Xi 特异 转录 体 )。Xzsz 编码 一 种 很 大 的 非 翻 译 的 RNA, 它 在 细胞 核 内 与 Xi 相互 结合 并 被 认为 通过 包 被 染色 体 而 诱导 染色 体 的 异 染 色 质 化 。 几 个 设计 巧妙 的 实验 提供 了 清晰 的 证 据说 明 Xisz RNA 在 X 染 色 体 失 活 过 程 中 所 起 的 重要 作用 。 例 如 , 当 转 染 的 Xizst DNA 整 合 到 雄性 ES 细胞 (参阅 ) 的 常 染色 体 上 后 导致 了 重组 的 常 染色 体 或 内 源 性 X 染 色 体 的 随机 失 活 (也 就 是 说 含有 Xazst 的 常 染色 体 被 细胞 认 作 第 二 条 X 染色 体 ) 。 在 鼠 中 , 另 一 个 基因 座 , Xce (X-controlling element) 与 Xzst 相连 并 且 能 够 影响 X 染色 体 失 活 的 随机 性 质 ,通常 情况 下 ,含有 相对 较 弱 的 Xce 等 位 基因 的 X 染 色 体 更 容易 失 活 。 计数 期 和 起 始 期 ”和 染色 体 失 活 的 总 体 调节 反映 了 X 染色 体 和 常 染 色 体 之 间 的 一 种 平衡 关系 。 多 体 性 X 染 色 体 (参阅 ) 由 于 额外 X 染色体 的 失 活 产生 了 多 个 巴尔 小 体 而 耐 受 ,而 多 倍 性 (参阅 ) 则 导致 了 更 多 的 保持 活性 的 X 染色 体 。 计 数 期 机 制 的 本 质 目前 还 不 清楚 ,而 转基因 小 鼠 的 研究 对 Xce 所 起 的 作用 提供 了 互相 矛盾 的 证 据 。 目 前 还 不 清楚 当 多 个 顺 式 的 Xce 转 人 后 是 否 是 单个 计数 的 ,在 具有 二 倍 Xce 的 人 类 男性 中 并 不 发 生 广 染 色 体 的 失 活 。 在 配子 发 生 过 程 中 , Xist 启动 子 发 生性 别 特异 性 的 甲 基 化 作用 ,从 而 在 合子 中 产生 了 母系 印迹 ( 见 上 文 的 亲本 印迹 ) 。 这 导致 了 父 源 Xist 等 位 基因 的 优先 表达 ,而 引起 了 父 源 X 染 色 体 的 失 活 倾向 。 在 鼠 的 胚 外 系统 中 这 种 甲 基 化 的 模式 能 够 维持 ( 父 源 的 X 染 色 体 保持 失 活 状态 ) ,而 在 鼠 的 外 胚层 系统 中 这 种 甲 基 化 的 模式 由 于 一 种 全 局 性 的 去 甲 基 化 作用 而 重新 起 始 ,而 Xzst 启动 子 的 从 头 合成 甲 基 化 作用 则 随机 发 生活 性 与 失 活 染色 体 的 选择 最 终 要 依赖 从 头 合成 甲 基 化 酶 ,但 是 目前 仍然 不 清楚 这 种 随机 的 选择 是 如 何 进行 的 。 在 人 类 ,X 染 色 体 的 随机 失 活 在 胚 外 系 和 外 胚层 系 中 都 有 发 生 ,在 一 些 胚 外 细胞 中 两 条 X 染色 体 都 保持 活性 。 有 人 认为 细胞 内 X 染 色 体 的 失 活 倾向 性 是 对 染色 体 突 变 的 回应 。 因 此 杂 合 子 个 体 中 染色 体 较 大 区 域 的 缺失 将 导致 缺失 染色 体 的 失 活 ,从 而 能 够 避免 以 正常 染色 体 为 代 。， 9093 ， 价 去 维持 这 样 的 缺陷 带 来 的 致命 后 果 。 事 实 上 ,细胞 在 染色 体 的 选择 上 并 无 偏见 ,观察 到 的 细胞 的 均一 性 反映 了 细胞 的 这 种 选择 。 细 胞 存活 能 力 的 差别 是 由 于 在 发 育 的 早期 细胞 含有 不 同 的 Xi 和 Xa 的 结果 。 当 细胞 含有 发 生 突变 的 Xa 时 不 易 存 活 ,而 只 有 含有 正常 的 Xa 的 细胞 才能 扩 增 形成 完整 的 拥 胎 。 X 染色 体 失 活 的 增殖 期 和 维持 期 Xi 的 失 活 反 映 了 染色 质 结构 和 DNA 甲 基 化 模式 的 改变 。 当 乙酰 化 的 组 蛋白 H4( 见 第 3 章 染 色 质 ) 缺 失 时 ,染色 质 是 高 度 缩聚 的 ,而且 许 多 X 连锁 基因 上 游 的 CpG 岛 是 超 甲 基 化 的 。 引 起 这 些 变化 的 信和 号 目前 还 不 知道 ,而 又 染色 体 沉 默 中 涉及 的 染色 质 蛋 白 也 还 未 被 识别 (参考 花 斑 位 置 效 应 ，SIR 有 蛋白质 )。XiSE RNA 自身 可 能 在 对 染色 质 的 控制 中 起 着 重要 作用 ,但 它 还 不 足以 引起 X 染色 体 的 完全 失 活 : 在 和 Xi- 常 染色 体 转 位 中 , 失 活 可 能 通过 转 位 的 转折 点 而 扩散 进入 常 染 色 体 但 决 不 作用 于 常 染 色 体 的 末端 ,尽管 Xist RNA 包 被 了 整个 染色 体 。 这 说 明 在 常 染 色 体 上 可 能 存在 着 一 种 边界 元 件 阻 断 了 失 活 的 扩散 ,或 是 阻 断 了 X 染色 体 上 顺 式 失 活 部 位 ,激发 元 件 (booster element ) 。 在 正常 的 X 染 色 体 上 , 失 活 作 用 从 Xizc 传播 需要 好 几 天 并 且 失 活 在 CpG 岛 超 甲 基 化 前 就 已 发 生 。 失 活 作 用 的 传播 可 能 代表 了 一 种 协同 效应 即 特异 性 的 蛋白 结合 到 已 存在 的 失 活 染色 质 上 ,这 与 异 染 色 质 在 常 染 色 体 转 位 中 的 传播 相似 (参考 花 斑 位 置 效 应 )。 在 人 类 ,一 些 X 连 锁 的 基因 能 够 “逃脱 " 失 活 〈 例 如 编码 类 固 醇 硫 酸 酯 酶 的 基因 )。 这 样 的 基因 常常 成 科 存 在 ,说 明 在 Xi 中 存在 着 一 个 局 部 的 活性 区 域 。 由 于 在 鼠 中 对 应 的 基因 常常 是 失 活 的 ,因此 这 一 现象 无 法 外 推 到 其 他 的 哺乳 动物 。 看 来 DNA 的 甲 基 化 在 X 染 色 体 的 失 活 中 发 挥 着 双重 的 作用 :首先 可 以 引起 Xisz 的 表达 ,其 次 可 以 维持 转录 的 抑制 作用 ,也 就 是 说 ,维持 甲 基 化 酶 的 活力 使 失 活 的 X 染 色 体 通过 随后 数 次 的 DNA 复制 进行 克隆 扩 增 , 并 维持 其 失 活 状态 。 (王家 楠 译 ) 。 94 ，。 基本 概念 和 定义 。 ”基因 (gene) 是 遗传 信息 的 物理 和 功能 单位 , 它 具 有 被 表达 潜 势 , 即 可 被 用 作 模 板 产生 一 种 或 多 种 RNA 或 蛋白 质 的 基因 产物 。 基 因 组 (参阅 ) 指 细胞 内 所 有 遗传 信息 ,这 种 遗传 信息 以 核 苷 酸 序 列 的 形式 存 贮 。 所 有 的 遗传 信息 都 可 以 作为 染色 体 的 一 部 分 被 存 贮 并 世代 相传 ,但 只 有 基因 被 表达 , 其 他 基因 座 的 功能 仅 处 于 DNA 水 平 上 ,其 中 包括 调控 元 件 , 复 制 起 点 ,着 丝 点 和 端 粒 。 顺 反 子 (cistron) 是 由 互补 试验 定义 的 遗传 功能 的 单位 ,例如 ,细菌 基因 就 等 同 于 顺 反 子 一 一 它 是 对 应 于 一 个 开放 阅读 框 的 遗传 功能 单位 。 但 在 真 核 细胞 中 ,基因 与 顺 反 子 的 关系 较为 复杂 ,这 是 因为 真 核 基 因 可 被 选择 性 使 用 ,或 是 在 转录 后 发 生 改 变 ,还 可 能 同 其 他 基因 一 起 产生 一 种 基因 产物 。 8.1 基因 的 概念 基因 概念 的 发 展 ”基因 一 词 最 早 在 1909 年 为 Wilhelm Johansen 采用 来 描述 传递 和 表 达 特 定 的 生物 性 状 的 可 遗传 因子 ,并 未 涉及 任何 特殊 的 遗传 理论 。 可 见 ,基因 最 初 的 含义 中 不 包含 特殊 的 物质 基础 ,纯粹 作为 一 个 抽象 的 名 词 使 用 ,如 同 在 传递 遗传 学 中 使 用 的 情 况 (参见 和 孟 德 尔 遗 传 )。 20 世纪 前 半 叶 , 几 个 独立 的 工作 导出 了 基因 物理 和 功能 基础 的 更 为 精确 的 概念 。 1902 年 ,Archibald Garrod 提出 ,代谢 紊乱 中 的 尿 黑 酸 症 是 由 于 某 一 种 特殊 的 酶 的 失 活 引 起 的 ,并 且 以 常 染 色 体 隐 性 遗传 的 方式 传代 。Garrod 将 这 种 现象 称 为 先天 性 代谢 缺陷 (inborn error of metabolism) ,由 于 Garrod 并 不 熟悉 孟 德 尔 遗 传 ,这 个 发 现 的 重要 性 直到 30 年 后 George Beadle 和 Edward Tatum 发 现 了 用 X 射 线 诱导 的 真菌 突变 导致 特定 的 生 化 缺陷 才 被 认识 ,这 些 发 现 促进 了 基因 功能 的 一 基因 一 酶 ( one gene one enzyme) 模 型 的 出 现 。1911 年 ,Thomas Hunt Morgan 指出 基因 定位 于 染色 体 上 并 且 在 物理 上 相连 〈 人 参见 遗传 的 染色 体 学 说 )。1944 年 ,Oswald Avery 和 其 同事 通过 消除 实验 证 明 ,DNA 就 是 遗 传 物质 ,这 样 便 勾勒 出 基因 概念 的 轮廓 一 即 染色 体 上 的 一 段 长 度 的 DNA, 它 可 以 编码 一 个 酶 的 信息 。 基因 这 个 概念 必须 进一步 扩展 才能 涵盖 现在 所 了 解 的 关于 基因 功能 的 知识 :首先 ,不 是 所 有 的 基因 都 编码 酶 (一 些 基 因 编 码 具 有 不 同 功能 的 肽 链 , 有 些 基因 编码 功能 性 RNA 分 子 ， 。， 95 。 如 tRNA 和 RNA); 其 次 ,在 病毒 中 ,基因 可 能 是 RNA 而 不 是 DNA。 更 进一步 地 ,基因 中 的 信息 可 被 选择 性 使 用 产生 一 种 以 上 的 产物 。 备 德尔 遗传 中 关于 单个 基因 控制 单个 生物 性 状 的 概念 也 有 所 扩展 ,现在 已 认识 到 一 个 基因 可 能 同时 影响 多 个 性 状 〈 多 效 性 ,pleiotopy) ,而 多 个 基因 可 以 相互 合作 控制 同一 性 状 (参见 数量 遗传 )。 随 着 分 子 生 物 学 的 出 现 ,现在 可 以 更 精确 地 从 基因 结构 和 功能 来 定义 基因 概念 ,但 是 由 于 真 核 和 细菌 在 基因 表达 和 基因 组 的 组 织 上 的 策略 有 显著 差异 ,因而 基因 的 定义 有 所 不 同 (参见 及 病 毒 )。 8.2 遗传 结构 和 遗传 功能 的 单位 遗传 结构 的 不 可 分 割 单 位 ”在 基因 位 于 染色 体 上 并 且 能 够 用 重组 的 方法 作 图 定位 ( 参 见 遗 传 作 图 ) 的 概念 建立 后 ,单个 基因 逐渐 被 认为 是 遗传 信息 结构 和 功能 的 基本 和 不 可 分 割 的 单位 ,从 结构 和 功能 来 看 ,它们 以 线性 的 形式 相互 连接 (串珠 理论 ,the beads on a string theory)。 然 而 这 种 观点 又 受到 了 喉 菌 体重 组 实验 结果 的 挑战 ,这 些 实验 结果 表明 ， 基因 可 被 分 为 更 小 的 单位 。 于 是 ,Seymour Benzer 引入 了 突变 子 (muton ) ,重组 子 (recon) 和 顺 反 子 (cistron) 这 些 术 语 分 别 定义 突变 ,重组 和 功能 的 不 可 分 割 单 位 。 在 噬菌体 感染 中 ,通过 同一 基因 的 不 同 突变 的 杂交 实验 可 以 恢复 产生 野生 型 的 噬菌体 。 如 果 突 变 位 于 同一 基因 中 不 同 亚 元 件 中 ,那么 ,这 只 可 能 是 基因 内 重组 (intragenic recombination ) 的 结 果 。 这 说 明基 因 可 被 分 为 更 小 的 单位 ,这些 单位 可 发 生 重 组 和 突变 。 这 样 ,重组 子 和 突变 子 等 价 于 单个 核 苷 酸 对 。 基因 作为 遗传 功能 的 不 可 分 割 单 位 ”Benzer 的 顺 反 子 概念 意 为 基因 功能 的 不 可 分 割 的 单位 。 顺 反 子 的 确定 可 通过 互补 分 析 实 验 (complementation analysis) 确 定 。 在 实验 中 , 测 试 基 因 ( 或 更 特 指 其 产物 ) 在 同一 细胞 中 补偿 同 源 基因 突变 的 能 力 。 成 功 的 互补 可 恢复 野生 型 表 型 。 互补 实验 的 基础 是 顺 反 测验 (cis-tzraxns test) ( 顺 反 子 一 词 来 源 于 这 个 实验 ; 文 框 8.1) ,成 对 的 独立 的 突变 被 认为 存在 顺和 反 两 种 构 型 。 顺 式 测 验 是 对 照 组 ,因为 如 果 两 个 突变 均 在 同一 个 基因 组 中 ,那么 另 一 个 基因 组 的 两 个 基因 座 均 为 野生 型 ,其 产物 为 正常 的 基因 产物 ,这样 细 胞 表现 出 野生 表 型 。 反 式 测验 是 互补 实验 ,可 以 确定 功能 单位 的 边界 。 如 果 两 个 突变 在 同一 个 基因 中 ,那么 它们 以 反 式 构 型 出 现在 细胞 中 时 ,每 一 基因 组 都 携带 有 这 一 基因 的 突变 体 拷贝 ,因而 在 细胞 中 不 能 产生 具有 功能 的 产物 一 一 即 不 出 现 互补 。 如 果 罕 变 位 于 不 同 基因 中 , 当 它 们 以 反 式 构 型 出 现时 ,那么 每 个 基因 组 均 可 补偿 另 一 个 基 因 组 缺少 的 正常 产物 。 细 胞 具有 所 有 基因 产物 ,表现 为 野生 型 一 一 这 就 是 正 互补 (posi- tive complementation ) 。 在 细胞 和 酵母 中 的 互补 分 析 建 立 了 一 基因 一 顺 反 子 的 概念 , 即 基 因 可 被 定义 为 功能 单位 。 这 种 实验 在 指定 途径 中 确定 参与 基因 的 数量 时 也 十 分 有 用 ,而 且 还 可 进一步 通过 突变 体 之 间 的 互 养 实验 来 确定 基因 之 间 的 作用 顺序 。 此 外 ,互补 实验 还 可 以 用 于 探究 基 因 功 能 或 克隆 已 知 功能 基因 (参见 标记 获救 、 功 能 克隆 、 表 达 克 隆 )。 *， 96 ， 8.3 原核 和 真 核 细 胞 中 基因 - 顺 反 子 的 相互 关系 在 简单 基因 组 中 基因 与 顺 反 子 等 价 ”在 原核 和 低 等 真 核 细 胞 中 ,基因 同 其 产物 之 间 的 关系 一 般 比较 简单 。 在 许多 情况 中 ,通常 是 一 基因 一 相应 产物 ,而 且 基 因 往 往 与 产物 共 线 性 。 因 而 ,在 这 些 生物 中 ,基因 和 顺 反 子 等 价 :基因 是 遗传 功能 单位 ;也 是 可 表达 的 遗传 信 息 的 单位 。 在 细菌 中 ,基因 是 编码 区 的 同义词 (开放 阅读 框 ) ,而 在 真 核 细胞 中 ,基因 是 转 录 单 位 的 同义词 ,这 是 由 于 细菌 基因 常常 组 合成 一 个 操纵 子 (参阅 ) ,这 样 几 种 产物 均 由 一 条 多 顺 反 子 mRNA (polycistronic mRNA) 翻 译 而 成 ,相反 ,在 真 核 细胞 中 ,大 多 数 基因 以 单 顺 反 子 mRNA (monocistronic mRNA) 的 形式 转录 (参见 TRNA 基因 、 反 式 剪 接 \ 内 部 核 糖 体 进入 位 点 )。 复杂 基因 组 中 基因 与 顺 反 子 不 等 价 ”在 高 等 真 核 细胞 的 基因 组 中 ,基因 和 产物 之 间 的 关 系 较为 复杂 (图 8.1)。 大 多 数 高 等 真 核 细胞 基因 包含 有 内 含 子 , 它 们 是 一 些 不 出 现在 最 终 产物 中 因而 不 是 功能 组 成 部 分 的 DNA 插 人 序列 ( 见 第 12 章 基 因 组 与 作 图 )。 真 核 基因 代表 整个 转录 单位 ,而 顺 反 子 可 能 被 内 含 子 插 和 人 所 分 隔 , 因 而 顺 反 子 等 价 于 真 核 基因 的 外 显 子 。 (a) 基因 1 基因 2 上 于 转录 拉 区 于 二 二 1 ET TS 反 式 剪接 RNA 编 辑 pre-mRNA ES | | gRNA DIE 和 惩 | 蛋白 质 合成 小 人 NE 多 种 剪接 方式 E1 E2 E4 了 RS ETE3TTBY 丙 涝 5 [一 一 一 zzzgzzzppzzz 一 ) [一 gaspzzzgzgaz 一 ) 四 蛋白 质 合成 小 1 1 产物 1 产物 2 图 8.1 在 真 核 细胞 中 基因 与 顺 反 子 不 等 价 的 例子 (图 中 较 宽 的 框 表示 DNA, 罕 框 表示 RNA, 链 表示 蛋白 质 )。(a) 在 反 式 剪接 与 RNA 编辑 的 例子 中 ,单个 多 肽 链 的 合成 需要 多 个 基因 的 表达 ,每 个 基因 都 是 同一 功能 单位 的 部 分 并 构成 单个 顺 反 子 。 空 白 的 框 代 表 来 自 某 一 基因 的 信息 而 填充 的 框 代 表 来 自 另 一 基因 的 信息 。 注意 在 所 有 已 知 的 反 式 剪接 的 例子 中 ,3“ 剪 接 转录 物 不 被 翻译 ,虽然 在 理论 上 还 不 能 解释 它 为 何不 产生 蛋白 产物 。(b) 一 个 基因 通过 多 种 前 接 方式 或 其 他 选择 性 信息 利用 方式 ( 见 正 文 ) 产 生 多 种 产物 。 基 因 中 包含 相互 ”. 覆盖 的 顺 反 子 。 内 含 子 用 有 斜纹 的 框 表示 ,它们 在 RNA 加 工 过 程 中 被 前 切 。 外 显 子 也 用 框 表示 ,如果 不 被 翻 译 用 空白 框 表示 ,填充 框 表示 编码 区 。 注 意 内 含 子 可 以 插 人 到 编码 或 非 编 码 的 外 显 子 中 ,而 外 显 子 可 以 包含 翻译 或 非 翻译 信息 ( 即 外 显 子 2 和 5)。 *。， 97 ， 在 真 核 基 因 中 ,基因 与 产物 相互 关系 的 复杂 性 还 来 源 于 某 些 遗传 信息 被 选择 性 地 利 用 以 产生 多 种 的 产物 。 这 种 过 程 可 通过 选择 性 剪接 (参阅 ) 来 完成 ,这 种 选择 性 反映 了 在 RNA 加 工 过 程 中 或 在 启动 子 选 择 ,及 转录 过 程 中 多 聚 腺 苷 酸 位 点 的 使 用 等 水 平 的 调节 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 这 些 结构 上 相 联系 的 基因 产物 往往 具有 不 同 的 功能 ,因而 基因 还 可 能 包含 一 系列 的 相互 重 玲 的 顺 反 子 。 同上 述 情况 相反 ,有 时 一 种 产物 需要 两 个 基因 共同 产生 ,如 反 式 剪接 , 即 两 个 分 别 编 码 的 mRNA 被 剪接 在 一 起 翻译 , 另 一 个 例子 是 在 锥 体 虫 中 的 RNA 编辑 (参阅 ) ,mRNA 和 gRNA 都 是 产生 蛋白 合成 的 成 熟 模板 所 必需 的 。 这 种 情况 中 每 个 基因 对 于 产生 共同 产物 都 是 必需 的 ;它们 是 同一 顺 反 子 的 一 部 分 。 还 有 一 些 例 子 中 几 种 不 同 蛋白 都 来 源 于 同一 个 开放 阅读 框 :翻译 首先 产生 一 个 多 蛋 . 和 白 (polyprotein) ， 随 后 在 被 剪 切 成 具有 不 同 功能 的 产物 。 一 些 RNA 病毒 采用 这 种 策略 以 适应 真 核 细 胞 中 单 顺 反 子 的 机 制 。 这 种 情况 也 发 生 在 一 些 内 源 基 因 中 ,例如 在 哺乳 动物 的 脑 中 ,前 强 啡 肽 原 基因 可 以 产生 七 种 有 着 不 同 功能 的 多 肽 。 在 这 种 情况 中 ,编码 每 种 肽 段 的 开放 阅读 框 被 认为 是 一 个 顺 反 了 于。 重合 和 族 套 基因 大 多 数 基因 是 分 立 不 重叠 的 单位 , 即 它们 不 和 其 他 基因 使 用 共同 的 遗传 信息 。 重 午 基 因 (overlapping genes) 指 调控 具有 独立 性 但 部 分 使 用 共同 基因 序列 的 ” 基因。 大体 上 ,基因 重 到 发 生 在 两 种 水 平 。 在 细菌 系统 或 其 他 的 空间 限制 必需 的 情况 中 (如 在 RNA 病毒 基因 组 中 和 动物 的 线粒体 DNA 中 ) ,基因 可 以 在 阅读 框 水 平 上 重 到 ,这 样 同 样 的 遗传 信息 产生 两 种 或 多 种 互 不 相关 的 和 蛋白质。 在 同一 开放 阅读 框 可 将 负 链 为 模 板 转录 ,或 从 不 同 的 方向 翻译 ,可 以 是 不 同 基因 使 用 不 同 的 读 框 ,也 就 是 说 基因 间 除 了 共 同 使 用 部 分 空间 以 外 ,并 无 相似 之 处 。 其 中 一 个 例子 便 是 轻 小 病毒 的 裂解 蛋白 基因 ( 包 括 鸣 菌 体 MS2 ) ,与 复制 酶 和 衣 壳 蛋白 基因 重 私 ,但 是 它们 从 不 同 的 方向 和 以 不 同 的 开放 阅读 框 翻译 。 在 一 些 种 属 中 ,裂解 蛋白 基因 完全 包含 在 复制 酶 基因 中 。 在 真 核 细胞 中 , 基 因 在 转录 单位 的 水 平 中 相互 重 秋 ,但 是 外 显 子 保持 分 立 。 由 于 在 一 个 基因 中 的 外 显 子 DNA 被 作为 其 重 和 至 基因 内 含 子 的 一 部 分 ,因而 两 个 基因 的 蛋白 产物 中 并 不 出 现 相 同 的 信 息 ( 例 如 ,人 的 TCRA 和 TCRD 工 细胞 的 受 体 基因 在 外 显 子 水 平 上 重 到 )。 偶 然 还 会 出 现 一 个 完整 的 基因 包含 在 另 一 较 大 基因 的 内 含 子 中 :与 内 含 子 代 谢 有 关 的 编码 蛋白 的 开放 阅读 框 往往 位 于 自 剪 接 内 含 子 中 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 例 如 有 3 个 小 基因 就 隐 含 在 较 大 的 人 类 基因 NEF-1 的 第 26 号 内 含 子 中 。 重 和 到 基因 可 能 反映 了 一 类 调控 机 制 。 在 质 粒 中 ,基因 编码 的 反 义 RNA 往往 同 其 调控 的 基因 相 重 到 (参见 反 向 转录 )。 芍 套 基因 (nested gene) 指 那些 通过 调节 蛋白 合成 终点 而 产生 两 种 或 更 多 种 骨 套 蛋白 产物 的 基因 。 这 可 能 通过 终止 子 的 渗 漏 通读 (例如 Qp 病毒 的 衣 壳 蛋白 基因 ) ,或 者 是 翻 译 时 发 生 移 码 ( 如 在 大 肠 杆菌 dezX 基因 和 下 质粒 的 treX 基因 )。 真 核 细 胞 的 RNA 病 毒 也 采用 类 似 策 略 如 反 转 录 病 毒 ,并 且 真 核 基因 也 可 通过 选择 性 剪接 或 采用 选择 性 多 聚 腺 苷 酸 位 点 产生 艇 套 产物 。 8.4 基因 结构 和 构造 基因 的 结构 组 成 ”基因 可 划分 为 具有 特定 功能 的 分 立 区 域 ( 表 8.1)。 *。， 98 ， 表 8.1 定义 基因 功能 性 成 分 的 术语 术语 定义 等 位 基因 基因 的 一 个 序列 变异 体 (或 者 称 为 遗传 标记 ,如 RFLP,VNTR 序列 )。 顺 反 子 基因 功能 的 一 个 单位 ,可 以 编码 特定 产物 的 一 段 DNA。 编码 区 ,开放 阅读 框 ” 可 以 翻译 成 蛋白 质 的 DNA 区 域 ,在 细菌 中 , 即 为 一 个 基因 。 在 真 核 细胞 中 ,编码 区 可 以 被 (ORF) 内 含 子 隔断 。 分 段 基因 具有 处 于 不 同 基因 座 上 的 外 显 子 区 的 断裂 基因 ,这 些 外 显 子 必须 分 别 转录 并 通过 反 式 剪接 相连 接 。 实 际 上 每 一 基因 座 应 被 认为 是 一 分 立 的 基因 ,这 属于 术语 的 误 用 。 基因 在 细菌 中 ,是 指 编码 一 个 分 立 的 蛋白 质 或 RNA 分 子 的 遗传 功能 单位 。 在 真 核 细胞 中 ,是 指 编码 一 个 或 多 个 产物 的 , 或 对 某 一 个 产物 产生 有 贡献 的 一 个 转录 单位 。 基因 座 染色 体 上 一 个 基因 的 位 置 ,包括 两 侧 的 调控 元 件 。 基 因 座 一 词 的 本 义 是 指 任何 标记 物 的 位 置 一 一 包括 基因 ,调控 元 件 ,复制 起 始 区 ,细胞 遗传 学 中 的 标记 等 等 。 操纵 子 包含 几 个 基因 (可 作为 一 个 多 顺 反 子 的 转录 物 被 转录 ) 及 其 共同 调控 元 件 的 细菌 基因 座 。 假 基因 类 似 基因 的 一 段 无 功能 的 序列 ( 见 第 15 章 突变 与 选择 )。 被 分 隔 基因 包含 内 含 子 的 基因 。 转录 间隔 区 RNA 基因 或 RNA 基因 操纵 子 中 不 出 现在 成 熟 RNA 分 子 中 的 部 分 。 转录 单位 ,转录 区 域 ”可 以 转录 为 RNA 的 一 段 DNA 区域 。 在 真 核 细胞 中 即 为 一 个 基因 。 在 细菌 中 可 能 包含 多 个 基因 。 非 翻 译 区 (UTR ) , 非 ” 转录 单位 中 不 能 翻译 成 蛋白 的 部 分 。 在 编码 区 或 操纵 子 两 侧 的 UTRs 为 5 和 3“UTRs( 或 称 编码 区 (NCR) 为 前 导 和 尾随 序列 )。 对 于 任何 给 定 的 基因 座 , 被 转录 的 DNA 称 为 转录 单位 (transcription unit)。 在 原核 细胞 中 ,一 个 转录 单位 可 能 包括 多 个 基因 组 成 一 个 操纵 子 ,但 在 真 核 细 胞 中 ,转录 单位 几 乎 总 是 等 价 于 单个 基因 (由 RNA 聚合 酶 工 转录 的 rRNA 基因 多 顺 反 子 ,RNA 病毒 基因 和 细胞 器 基因 组 等 例外 ;参见 内 部 核糖 体 进入 位 点 \ 反 式 剪 接 )。 对 于 编码 蛋白 质 的 基因 ,翻译 成 多 肽 序列 后 的 信息 和 未 翻译 的 信息 之 间 可 能 存在 差 别 。 在 细菌 中 ,被 翻译 的 区 域 [ 开 放 阅 读 框 (open reading frame)、 编 码 区 (coding region) ] 同 基因 等 价 , 并 且 ,基因 间 通 常 被 短 的 内 部 非 编 码 区 (internal noncoding regions) 分 隔 。 操 纵 子 的 未 端 基因 的 侧翼 存在 有 $ 非 翻 译 区 (5 untranslated region ，UTR ) 或 称 为 前 导 序 列 (leader sequence) 和 32UTR 也 称 为 尾随 序列 (trailer sequence) 。 这 些 序列 往往 具有 调控 功能 ;5 UTR 控制 核糖 体 的 结合 还 可 能 促进 衰减 子 控制 (attenuator control) ;而 37UTR 在 mRNA 的 稳定 性 中 起 重要 作用 。 在 真 核 细 胞 中 ,编码 区 的 两 侧 也 存在 具有 调控 功能 的 UTRs, 两 侧 的 UTRs 和 开放 阅读 框 都 被 非 编 码 序 列 即 内 合子 插入 ,内 含 子 在 RNA 从 核 仁 运输 出 来 时 被 剪 切 掉 ,也 就 是 说 它们 不 出 现在 成 熟 的 转录 物 中 。 在 真 核 和 原核 细胞 中 ,RNA 基因 可 被 单独 或 作为 操纵 子 的 一 部 分 转录 。 基 因 中 与 蛋 白 编 码 区 类 同 部 分 即 最 终 形 成 成 熟 RNA 的 部 分 。 一 些 RNA 作为 成 熟 转录 物 被 转录 ,而 。 99 ee 另 一 些 需 经 过 剪 切 ,加工 和 内 含 子 的 剪接 等 过 程 。 渐 次 丢失 的 所 有 序列 都 被 称 为 转录 间 隔 序列 (transcribed spacer sequence)。 细 菌 和 真 核 细胞 基因 的 典型 结构 组 成 见 图 8.2。 (a) 5UTR 基因 1 [ 屯 基因 2 和 基因 3 ”3UTR 和 3: 由 转录 SC 一 gzazzzzgzzzmyr 一 gazzzzgzzzzzzzzdy 一 Eggzaazaaaa 瑟 3 y y 由 。 蛋白 质 合成 1 SBSSBSSSAAT ERETDOIAE AS 直人 下 @@ 二 二- 编码 区 域 王 一 一 一 一， NTR 5 一 [LEFT 2 DA 3 EEEE 一 一 一 3/ 转运 ) 图 8.2 原核 细胞 与 真 核 细 胞 编码 蛋白 质 基 因 的 典型 结构 (图 中 较 宽 的 框 表 示 DNA, 罕 框 表示 RNA, 链 表示 蛋白 质 )。(a) 在 细菌 中 ,同一 转录 单位 包含 多 个 基因 。 它 们 作为 可 分 为 不 同 编码 区 (基因 ) 的 同一 mRNA 被 转录 ,编码 区 在 图 中 用 灰色 表示 , 非 编码 区 用 白色 表示 。 每 一 基因 编码 一 独立 的 多 肽 链 。(b) 在 真 核 生 物 中 ,转录 单位 由 单个 基因 组 成 。 基 因 包 含 中 心 的 编码 区 域 ,用 灰 色 表 示 ,两 侧 的 非 编码 区 域 用 白色 表示 。 基 因 往 往 被 一 个 或 多 个 内 含 子 (用 斜纹 表示 ) 插 入 ,内 含 子 在 转录 完成 后 被 剪 切 。 在 图 中 的 例子 中 ,成 熟 的 转录 物 编码 单个 多 肽 链 ,但 不 同 的 剪接 方式 可 能 可 产生 一 系列 不 同 的 产物 。 基因 命名 法 ”基因 的 命名 一 般 根据 种 属 习惯 ( 表 8.2)。 一 般 用 斜体 表示 基因 的 名 称 ， 等 位 基因 及 其 基因 型 ,或 在 必要 时 表示 基因 转录 而 成 的 mRNA, 而 蛋白 产物 和 表 型 用 正 体 来 表示 。 但 是 在 研究 不 同 生物 的 同一 遗传 机 制 时 ,往往 会 产生 一 些 混淆 ,如 在 研究 酿酒 酵母 和 粟米 酵母 的 细胞 周期 有 关 基因 的 命名 中 ( 见 第 2 章 细胞 周期 )。 此 外 ,许多 基因 在 不 同 实验 中 从 相同 组 织 被 分 离 出 好 几 次 而 具 豆 和 环 同 命名 :重要 的 果 蝇 的 发 育 基因 iortedo 便 是 其 中 一 例 一 一 它 在 筛选 不 同 表 型 的 过 程 中 三 次 被 鉴定 并 被 命名 三 种 不 同名 称 。 果 蝇 提供 了 关于 遗传 命名 的 最 为 丰富 的 例子 ,特别 是 在 发 育 生物 学 中 ( 见 第 6 章 发 育 ,分 子 机 制 )， 这 种 趋势 也 扩展 至 峭 椎 动物 中 。 在 许多 种 属 中 ,基因 由 包括 几 个 字母 和 数字 的 符号 来 表示 ,一些 种 属 命名 惯例 (如 果 蝇 \ 大 肠 杆菌 ) 认 为 使 用 小 写字 母 表示 隐 性 突变 , 而 用 第 一 个 字母 大 写 来 表示 显 性 突变 。 在 其 他 一 些 种 属 包括 人 的 基因 命名 中 ,基因 全 由 大 写字 母 表示 。 现 在 ,通过 大 规模 的 测序 方法 ,更 多 的 基因 不 断 被 鉴定 ,因而 十 分 需要 一 个 统一 的 命名 方法 。 表 8.2 传统 基因 命名 法 提要 物种 惯例 大 肠 杆菌 和 其 他 细菌 ”三 个 小 写字 母 表示 一 个 操纵 子 ,接着 的 大 写字 母 表示 不 同 基 因 座 。 例 如 : /ac 操纵 子 ;基因 座 : /acZ，jacY，jacA。 蛋 白质:LacZ, LacY, LacA。 另 外 还 采用 特殊 惯例 命名 吾 ，suzazis 的 孢子 发 生 基因 ( 见 文 框 6.2)。 这 些 基因 以 光 后 加 上 表示 孢子 发 生 的 形态 阶段 的 罗马 数字 表示 ,再 用 大 写字 母 表示 操纵 子 , 而 后 为 基因 座 , 例 如 ,stoIIGA 就 表示 在 第 二 阶段 表 达 的 操纵 子 G 的 第 一 个 基因 座 。 酵母 三 个 字母 表明 基因 功能 ,而 后 的 数字 表示 不 同 的 基因 座 。 啤 酒 酵 母 基 因 GAL4，CDC28; 蛋 白质 :GAL4 ，CDC28。 非 洲 粟 酒 酵母 基因 gal4 ，cac2; 和 蛋白质:Gal4，Cdc2。 线虫 用 三 个 小 写字 母 表示 突变 表 型 ,如 存在 不 只 一 个 基因 座 , 用 连 字符 后 接 数 字 表 示 ,例如 ,基因 zc -86，ced -9; 蛋白 UNC-86;CED-9。 果 蝇 来 自 突变 表 型 的 描述 可 以 用 1 一 4 个 字母 代表 。 例 如 ,基因 rite( 世 )，iailles ( 志 )， hedsgehog ( 友 ); 而 蛋白 为 White, Tailless，Hedgehog。 植物 虽然 没有 适用 于 所 有 植物 的 惯用 法 ,但 大 多 数 用 1 一 3 个 小 写字 母 表示 。Arabidotpsis 基因 用 果 蝇 的 方法 命名 但 使 用 大 写字 母 ,例如 ,基因 AGAMOUS(AG) ,蛋白 AGAMOUS。 脊 椎 动物 一 般 以 描述 基因 功能 的 1 一 4 个 小 写字 母 和 数字 表示 其 基因 功能 。 例 如 ,基因 sy，zyc, 蛋 白 Sey，Myco。 人 类 方法 如 糊 椎 动物 但 需 大 写 。 例 如 基因 MYC 、ENOLTI ,蛋白 MYC、ENO1。 文 框 8.1 顺 反 测验 : 实验 原理 顺 反 测 验 可 应 用 于 在 同一 个 细胞 中 的 成 对 突变 ,来 验证 相互 互补 是 否 会 恢复 野生 表 型 (是 否 每 个 基因 组 可 补偿 另 一 个 基因 组 的 缺陷 )。 现 举例 说 明 , 如果 两 种 基因 产物 都 是 将 底 物 (S) 经 中 间 物 (DT) 转 化 成 色素 (P) 所 必需 的 ,而 这 种 色素 是 野生 型 的 表 型 特征 之 一 。 当 不 能 产生 这 种 色素 时 将 导致 突变 表 型 , 它 同 野生 表 型 从 颜色 上 即 可 区 分 。 正 常 路 径 用 下 图 表示 。 顺 反 子 1 顺 反 子 2 产物 1 产物 2 S 一 -一 和 工 一 一 和 P 野生 型 反 式 测验 ”实验 中 的 反 式 部 分 是 互补 测验 。 两 个 突变 被 认为 处 于 反 式 构 型 中 , 正 互 补 (Positive complementation ) ,也 即 野生 表 型 的 恢复 通常 只 发 生 在 两 个 突变 处 于 不 同 的 顺 反 子 中 的 情况 ,也 就 是 说 ,二 倍 体 细胞 至 少 携带 每 种 基因 野生 型 的 一 个 拷贝 。 这 被 称 为 顺 反 子 间 互补 (又 称 基 因 间 互 补 ) (intercistronic ( orintergenic ) complementation ) .如果 突变 位 于 同一 个 顺 反 子 中 ,互补 通常 “= 不 会 发 生 , 因 为 两 个 基因 组 都 没有 野生 型 的 基因 拷贝 ,因而 每 个 基因 组 都 不 能 产生 有 功能 的 产物 。 等 位 互补 在 一 些 偶 然 情况 中 ,位 于 同一 个 顺 反 子 中 的 不 同 突变 相互 间 也 可 以 发 生 互补 ,这 便 是 已 知 的 等 位 互补 , 顺 反 子 内 互补 或 称 基因 内 互补 ( Allelic，intracistronic or intragenic complementa- tion )。 这 种 情况 发 生 于 基因 产物 需 以 多 聚 物 的 形式 作用 时 ,一 个 突变 基因 产物 可 以 补偿 多 聚 复合 物 中 另 一 个 产物 的 缺陷 。 由 于 突变 的 异 多 聚 物 比 野生 型 的 同 多 聚 物 活性 低 , 等 位 互补 通常 可 以 同 正常 基因 间 互 补 区 分 开 。 一 个 实际 例子 便 是 wa -互补 (ccomplementation ) :许多 克隆 载体 都 只 携 带 有 大 肠 杆菌 /ac2 基因 的 $ 部 分 , 它 不 能 产生 有 功能 的 酶 。 这 些 载体 可 在 缺失 5 ”ec2 的 宿主 细 胞 中 使 用 ,在 细胞 中 ,两 种 /ac2 的 缺失 等 位 基因 都 没有 功能 ,但 是 两 个 蛋白 部 分 可 以 缔 合 形成 有 功 能 的 酶 。a- 互 补 多 应 用 于 基因 克隆 实验 中 的 重组 筛选 中 (参见 蓝 白斑 筛选 ) 。 顺 反 子 1 顺 反 子 2 顺 反 子 1 顺 反 子 2 产物 2 产物 2 ae 野生 型 S 一 - 作 产物 2 突变 型 ee | 顺 反 子 1 顺 反 子 2 顺 反 子 1 顺 反 子 2 基因 组 1 产物 1 产物 2 产物 1 “产物 2 S 一 天 工 一 一 >P 野生 型 S 一 一 工 一 一 和 P 野生 型 基因 组 2 “上 一 一 > 一- 一 :一 一 | 正 互补 (基因 间 互 补 ) 不 发 生 互补 顺 式 测 验 ”测验 的 顺 式 部 分 仅仅 是 一 个 对 照 , 因 为 当 两 个 突变 位 于 同一 个 基因 组 中 ,那么 第 二 个 基因 组 是 野生 型 ,因而 细胞 显示 出 野生 表 型 。 当 这 种 现象 不 出 现时 ,这 意味 一 个 基因 组 产生 的 突变 基因 产物 对 于 其 他 基因 组 产生 的 野生 产物 起 显 性 作用 ,这 称 为 负 互补 ( negative complementa- tion ) ,与 等 位 互补 类 似 , 这 种 现象 在 基因 产物 是 多 聚 物 时 常常 发 生 。 在 这 种 情况 下 , 失 活 的 突变 产 物 同 野生 产物 作用 产生 没有 活力 的 异 多 聚 物 ,例如 , 它 可 将 野生 型 多 肽 链 束缚 于 一 个 失 活 的 复合 物 中 。 这 种 突变 又 被 称 为 反 式 显 性 (trazs-dominant) 或 显 性 失 活 (domimant negative) 。 顺 式 显 性 ”互补 仅 发 生 于 基因 之 间 , 这 是 因为 它们 产生 可 扩散 的 基因 产物 。 在 同一 个 细胞 中 ， 即使 提供 了 野生 型 的 等 位 基因 ,一 些 突变 也 不 能 发 生 互 补 ,这 又 称 为 顺 式 显 性 (cisdominant)。 这 表明 存在 顺 式 作用 元 件 的 突变 而 非 基因 本 身 的 突变 所 造成 。 极 性 突变 ”细菌 互补 分 析 中 的 复杂 性 还 体现 在 极 性 突变 (polar mutation) 的 效应 中 。 由 于 很 多 细 菌 基 因 排 列 于 操纵 子 中 ,而 且 以 多 顺 反 子 mRNAs 形式 被 转录 ,核糖 体 的 结合 依赖 于 上 游 基因 翻译 的 完成 ,造成 一 个 基因 的 突变 可 以 干扰 下 游 基因 的 表达 。 互补 ,回复 突变 和 重组 上述 三 个 过 程 均 可 恢复 野生 型 。 回 复 突 变 是 突变 的 逆 过 程 ,从 功能 丧 失 的 突变 恢复 成 野生 型 的 等 位 基因 , 即 它 包 括 基因 型 的 改变 。 在 两 个 突变 的 等 位 基因 间 的 重组 也 可 以 产生 野生 型 的 基因 组 ,如 同 双 突变 , 它 也 涉及 了 基因 型 的 改变 。 而 互补 不 包括 基因 型 的 改变 ， 它 反映 了 基因 产物 间 的 相互 作用 。 在 互补 分 析 中 ,回复 突变 和 重组 会 产生 似是而非 的 结果 ,但 是 ”人 ” 回复 突变 和 重组 都 可 以 根据 它们 在 分 离 后 保持 野生 表 型 而 被 区 分 。 由 于 重组 造成 的 复杂 性 可 用 使 用 重组 缺陷 型 的 株 型 的 方法 避免 。 互补 作 图 相互 间 不 发 生 互补 的 突变 称 为 一 个 互补 群 (complementation group) ,它们 对 应 于 同一 顺 反 子 。 进 行 许多 突变 间 成 对 互补 分 析 可 构建 一 个 互补 图 (complementation map) , 它 以 分 立 不 重 于 的 线段 表示 互补 组 构成 。 这 个 方法 可 以 确定 特定 生化 途径 中 包含 基因 数量 ,而且 还 可 通过 互 养 (将 一 个 突变 体 暴露 于 另 一 的 突变 体 的 产物 中 ) 确 立 基因 的 作用 顺序 。 在 严格 意义 上 ,互补 图 不 能 称 为 基因 图 谱 , 因为 它 没有 对 基因 间 的 物理 联系 加 以 说 明 。 互补 作 图 的 一 个 简单 例子 如 下 所 示 。 五 株 均 不 能 合成 一 个 特殊 代谢 物 的 酵母 进行 互补 实验 ， 其 实验 结果 如 左下 图 所 示 : + 代表 正 互补 ( 即 野生 型 的 恢复 ), - 代表 没有 互补 。 图 中 表明 1、2 形 成 一 个 互补 群 ,3、4、5 形成 另 一 个 互补 群 即 存在 第 二 个 基因 。 在 第 二 基因 中 ,4`、$ 可 以 互补 ,这 是 等 位 互补 ,因而 第 二 个 基因 的 产物 很 可 能 以 多 聚 物 形 式 作 用 。 ( 袁 铬 译 ) ”可 网 愤 第 9 章 基因 表达 和 调 攻 基本 概念 和 定义 基因 (人 参阅) 不同 于 其 他 形式 的 遗传 信息 ,因为 它 需 要 被 表达 。 基 因 表 达 涉 及 从 基 因 中 得 到 信息 ,并 利用 它 产 生 基 因 产 物 ,产物 可 以 是 RNA 或 蛋白 质 。 以 最 简单 的 形式 ,基因 表达 可 以 总 结 为 分 子 生 物 学 的 中 心 法 则 (central dogma) : 遗传 信息 单 向 从 DNA 通过 RNA 再 到 蛋白 质 ( 表 9.1)。 这 对 大 多 数 细胞 内 基因 都 适用 ,但 在 病毒 中 信息 在 核酸 之 间 的 传递 较为 复杂 。 无 论 如 何 信息 不 能 从 DNA 直接 到 蛋白 质 或 蛋白 质 返 回 到 核酸 。 基因 产物 最 终 释放 之 前 ,基因 表达 通过 不 同 环节 进行 。 主 要 的 环节 发 生 在 转录 和 蛋白 合成 ,但 还 存在 很 多 对 遗传 信息 进行 过 滤 和 修饰 的 微调 过 程 。 原 则 上 所 有 阶 段 都 能 被 调节 。 基 因 表 达 各 阶段 的 主要 调节 方式 在 真 核 生 物 和 原核 生物 中 有 所 不 同 的 。 基因 调节 用 于 控制 细胞 产生 基因 产物 的 量 。 调 节 涉 及 顺 式 作用 元 件 和 反 式 作用 因子 ;可 以 是 正 调节 或 负 调 节 ;诱导 或 抑制 ;广泛 的 或 专 一 性 的 。 这 些 术语 将 在 下 文中 讨论 。 表 9.1 原来 的 中 心 法 则 和 考虑 到 遗传 信息 流向 的 多 种 途径 而 作 的 修正 中 心 法 则 DNA 转录 RNA 和 蛋白质 中 心 法 则 的 延伸 举例 DNA->~>RNA( 没 有 蛋白 质 ) RNA 基因 RNA->~ 蛋 白质 (没有 DNA) RNA 基因 组 RNA->DNA( 反 转录 ) 类 逆转 录 病 毒 复制 RNA->RNA(RNA 复制 ,RNA 转录 ) RNA 病毒 复制 和 转录 本， 心 法 则 DNA 一。 yi () DNA 复制 RNA 复 制 与 转录 遥 病 毒 ? *， 104 ， 9.1 基因 表达 基因 表达 的 多 个 阶段 ”基因 表达 的 阶段 ( 表 9.2) 即 信息 从 基因 到 产物 转化 途径 中 的 可 以 被 调控 的 独立 阶段 。 转 录 常 被 认为 是 基因 表达 的 起 始 阶段 ,并 是 基因 调节 的 主要 阶段 ， 但 在 转录 成 为 可 能 之 前 ,基因 必须 进入 适 于 转录 的 形式 。 真 核 生 物 中 准备 阶段 特别 重要 ， 在 这 个 阶段 中 ,DNA 甲 基 化 和 染色 质 中 DNA 的 包装 对 其 转录 能 力 有 着 复杂 的 影响 。 转 录 和 和 蛋白 合成 都 可 以 分 为 起 始 、 延 伸 和 终止 等 时 期 ,每 个 时 期 都 可 以 被 独立 调节 (参见 第 29 章 转录 ,第 23 章 蛋 白质 合成 )。 在 细菌 中 ,转录 蛋白 合成 和 RNA 降解 在 相同 细胞 空间 中 同时 进行 ,基因 表达 的 不 同 阶段 之 间 可 能 存在 着 交叉 调节 (参见 衰减 \ 反 向 调节 )。 在 真 核 生 物 中 ,mRNA 前 体 在 细胞 核 内 加 工 ,然后 运输 到 胞 浆 中 进行 翻译 ,加 工 和 转运 过 程 都 可 以 被 调节 (参见 第 27 章 RNA 加 工 )。 和 蛋白 合成 后 ,蛋白 可 能 被 共 价 修饰 及 与 其 他 分 子 发 生 非 共 价 相互 作用 ,以 此 调节 它们 的 活性 (参见 第 22 章 蛋 白质 :结构 功能 与 进化 )。 一 个 很 重要 但 很 少 被 重视 的 基因 调节 阶段 是 RNA 和 蛋白质 的 降解 速率 。 蛋 白质 的 降解 被 认为 是 基因 表达 的 最 终 阶 段 ,在 细胞 周期 (参阅 ) 中 尤为 重要 。 表 9.2 基因 表达 的 主要 阶段 和 调节 机 制 基因 表达 的 阶段 涉及 的 调节 过 程 基因 的 准备 去 膜 ( 病 毒 ) 基因 组 模板 链 的 合成 (病毒 ) 染色 质 结构 的 改变 ( 真 核 生物 ) DNA 拓扑 和 构象 性 质 的 改变 DNA 甲 基 化 状态 的 变化 基因 组 重 排 基因 扩 增 转录 启动 子 的 使 用 活性 转录 复合 物 的 形成 启动 子 逃 避 延伸 或 暂停 终止 或 抗 终止 (原核 生物 ) 衰减 (原核 生物 ) RNA 加 工 ( 真 核 生物 ) 加 帆 RNA4 运 “二 NA 从 多 胞 术 运 办 到 用 村 (其 核 和 移 ) RNA 降解 RNA 去 除 反 向 调节 (原核 生物 ) 要 核 精 体 结合 /看 白 合成 起 始 区 密码 子 的 使 用 移 杠 通读 / 硒 代 半 胱 氨 酸 插 人 蛋白 修饰 残 基 的 化 学 修饰 人 立 细胞 空间 定位 蛋白 定位 分 沙 蛋白 去 除 蛋白 的 丢失 和 降解 在 其 他 章 中 对 每 个 阶段 均 都 有 较 详细 的 阐述 。 03 9.2 基因 调节 基因 调控 的 原理 ”基因 调控 是 指 细胞 用 来 控制 各 基因 产物 产 出 量 的 机 制 。 即 使 最 简单 的 细胞 也 有 数 以 百 计 的 基因 ,基因 产物 既 不 是 同时 都 需要 ,也 不 需要 相同 的 量 。 然 而 基因 调节 不 仅 是 控制 在 需要 时 表达 单个 基因 的 机 制 , 同 时 还 要 避免 不 同 基因 产物 之 间 的 无 意 义 的 相互 作用 。 没 有 基因 调节 就 没有 多 细胞 的 后 生动 物 ( 多 细胞 生物 ) 的 分 化 , 即 没有 细 胞 类 型 的 区 别 。 调 节 可 以 是 组 成 型 的 ,也 就 是 表达 速率 根据 细胞 一 般 需 求 保 持 一 定 , 也 可 以 是 可 调 的 ,表达 的 速率 适合 不 同 环境 下 细胞 的 需求 ,或 是 在 后 生动 物 中 反映 了 不 同 细胞 类 型 的 特殊 属性 。 理 论 上 ,基因 调节 可 以 在 基因 表达 的 任何 阶段 进行 ( 表 9.2), 但 实际 上 ,主要 发 生 在 转录 起 始 阶段 。 因 为 这 是 表达 的 初始 阶段 ,可 以 避免 那些 不 需要 的 转录 所 造成 的 资源 浪费 。 顺 式 作用 元 件 和 反 式 作用 因子 ”核酸 的 调控 过 程 可 以 是 顺 式 的 或 反 式 的 (图 9.1)。 在 DNA 中 , 顺 式 作用 元 件 是 它 调节 邻近 基因 的 核酸 序列 ( 即 同一 染色 体 上 的 基因 ; 顺 式 构 型 的 基因 ) ,对 其 他 染色 体 上 的 基因 ( 反 式 构 型 ) 没 有 影响 。DNA 上 的 顺 式 作用 元 件 可 调 节 转 录 过 程 ,转录 成 的 mRNA 可 以 调节 RNA 加 工 , 转 换 和 蛋白 合成 。 顺 式 作用 元 件 的 突 变 是 顺 式 显 性 (cis-dominant) 的 ,因为 它们 只 影响 邻近 的 基因 ,而 且 不 能 被 同一 细胞 内 反 式 构 型 的 另 一 份 野 生 型 的 拷贝 补偿 (参见 补偿 )。 叉 和 图 9.1 顺 式 作用 元 件 和 反 式 作用 因子 。 罕 变 以 又 来 表示 。(a) 顺 式 作用 元 件 的 突变 是 顺 式 构 型 显 性 的 ,因为 它们 不 能 被 同一 细胞 内 另 一 份 野生 型 的 拷贝 补偿 。(b) 突 变 的 反 式 作用 因子 一 般 是 隐 性 的 ,因为 同一 细胞 中 的 另 一 份 野 生 型 拷贝 可 以 补偿 突变 基因 的 功能 。 偶 尔 突 变 因 子 (以 白色 圈 表 示 ) 会 阻 断 野 生 型 因子 (黑色 图表 示 ) 的 功能 ,产生 反 式 显 性 突变 。 反 式 作用 因子 包括 各 种 可 扩散 分 子 ( 经 常 是 蛋白 质 ,有 时 是 RNA) ,可 调节 与 它们 接 触 的 基因 的 表达 。 调 节 转录 的 反 式 作用 因子 称 为 转录 因子 , 另 一 些 反 式 作用 因子 调控 RNA 加 工 和 蛋白 合成 。 这 些 因子 的 突变 (编码 这 些 因子 的 基因 突变 ) 一 般 是 隐 性 的 ,因为 同一 细胞 中 的 另 一 份 野生 型 找 贝 可 以 提供 这 类 可 扩散 因子 的 大 部 分 。 一 类 特殊 的 反 式 显 性 突变 使 突变 的 因子 通过 与 目标 序列 的 不 可 逆 结 合 或 形成 没有 活性 的 多 聚 体 ,干扰 野生 sd06 ， 型 的 功能 (参见 显 性 失 活 突变 )。 偶尔 也 有 顺 式 作用 因子 和 反 式 作用 元 件 。 顺 式 作 用 蛋白 立即 与 其 编码 DNA 链 作 用 ,形成 不 可 逆 结 合 。 这 样 的 因子 只 存在 于 转录 和 和 蛋白 合成 紧密 相连 的 原核 生物 中 , 如 T7z5 编码 的 转 座 酶 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 ) 和 鸣 菌 体 蚁 174 编码 的 A 蛋白 ( 见 病 毒 一 章 )。 反 式 作 用 元 件 在 称 为 反 式 感应 ( tra715-sSensing ) 的 现象 中 也 会 遇 到 ,此 现象 是 一 条 染色 体 上 的 调节 元 件 可 以 影响 另 一 条 同 源 配对 的 染色 体 上 反 式 构 型 基因 的 表达 。 这 些 过 程 中 较为 常见 的 是 联合 调控 (transvection) ,由 于 转录 因子 跨越 在 两 条 染色 体 上 ,在 一 条 妆 色 体 上 的 启动 子 可 以 控制 配对 染色 体 的 基因 表达 。 在 果 蝇 中 有 丝 分 裂 期 细胞 中 同 源 染 色 体 配对 时 就 出 现 这 样 联 会 依赖 性 的 过 程 (synapsis-dependent processes) 。 在 其 他 真 核 生 物 包括 人 类 中 当 同 源 染 色 体 连结 时 ,偶尔 也 有 发 生 这 种 情况 ( 另 参见 同 源 依 赖 性 沉默 )。 基因 调控 模式 ”基因 调控 分 为 正 ` 负 调控 及 诱导 和 抑制 。 如 果 基 因 处 在 正 调控 下 ,特定 调控 因子 的 存在 增加 (上 调 ) 基 因 的 表达 , 当 调 控 因 子 缺 乏 时 使 表达 下 降 ( 下 调 ) ,这 样 的 因子 为 激活 物 (activator)。 在 负 调 控 中 ,特殊 调控 因子 的 存在 使 基因 表达 减少 ,而 当 其 缺乏 则 表达 增加 ;这 类 因子 称 为 阻 遏 物 (repressor)。 正常 情况 下 基因 的 表达 往往 显示 了 基因 调节 的 模式 。 可 诱导 的 基因 以 低 水 平 表 达 ， 不 是 因为 被 阻 遇 ( 负 调 节 ) 就 是 缺乏 激活 物 ( 正 调节 )。 去 阻 遇 / 阻 遏 物 或 激活 (激活 物 的 提 供 ) 使 基因 表达 被 诱导 。 可 阻 遏 基因 往往 是 活化 的 ,由 于 阻 遏 物 缺 乏 ( 负 调控 ) 或 存在 激活 物 ( 正 调控 ) , 阻 过 通过 去 除 激活 物 或 提供 阻 遇 物 使 基因 表达 下 降 。 这 四 种 基因 表达 的 模式 经 常 可 以 在 转录 调节 中 发 现 , 同 时 这 些 概念 适用 于 基因 表达 的 任何 阶段 。 细 菌 中 调控 的 四 种 模式 在 转录 水 平 可 能 是 同样 普遍 的 ,而 在 真 核 生 物 中 , 正 的 可 诱导 调节 占 主要 地 位 ,因为 基本 的 转录 体系 在 遗传 上 是 不 稳定 的 ,基因 的 转录 是 被 阻 遏 的 ,除非 有 激活 因子 提供 才 启 动 转 录 ( 参 见 第 29 章 转录 )。 基因 调节 的 范围 全 局 调控 (global regulation) 广泛 区 域 调 控 (wide domain regula- tion)\ 共 调节 和 局 部 区 域 调控 (narrow domain regulation) 经 常 被 用 来 描述 调节 机 制 的 适用 范围 。 全 局 调节 机 制 同时 控制 很 多 基因 ,反映 了 细胞 的 基本 变化 。 真 核 生 物 中 的 全 局 转 录 调 控 可 能 由 染色 质 结 构 控 制 (如 在 有 丝 分 裂 时 转录 停止 )。 同 样 ,在 蛋白 合成 过 程 中 通 过 阻 断 mRNA 前 体 加 工 或 调节 翻译 延伸 因子 的 合成 来 进行 全 局 调控 。 广 泛 和 局 部 区 域 调控 机 制 是 指 对 一 种 基因 或 一 组 基因 的 调控 ,通过 对 单个 启动 子 和 增强 子 的 转录 激活 来 实现 。 广 泛 区 域 调节 的 例子 包括 饥饿 对 酵母 氨基 酸 合成 基因 的 共 调 节 、 肉 性 果 蝇 X 染色 体 基 因 的 剂量 补偿 (参阅 ) ,大 肠 杆 菌 的 SOS 反应 。 局 部 区 域 控制 包括 单个 基因 的 调控 和 一 小 组 基因 的 协同 调控 ,如 乳糖 对 大 肠 杆菌 乳糖 操纵 子 ec 三 个 基因 的 调节 。 9.3 真 核 和 原核 生物 的 基因 表达 基因 调节 策略 的 比较 ”尽管 原核 和 真 核 生物 都 遵循 中 心 法 则 ,但 它们 的 基本 生物 学 属 性 有 着 各 种 差异 ,反映 在 它们 基因 表达 和 调节 的 机 制 和 策略 上 存在 差异 。 (1) 真 核 生物 细胞 核 “细菌 没有 细胞 核 ,基因 表达 的 不 同 阶段 都 在 细胞 的 同一 空间 进行 。 转 录 、 蛋 白 合成 和 RNA 更 新 是 紧密 相连 的 , 允许 像 衰减 和 反 向 调节 (人 参阅) 这样 在 5 齐 了 真 核 生物 中 不 存在 的 调节 机 制 。 真 核 生物 细胞 核 的 出 现 将 转录 和 和 蛋白 合成 分 在 不 同 空间 和 时 间 进 行 。mRNA 转运 出 细胞 核 的 过 程 , 增 加 了 调控 层次 。 (2) 顺 式 调 控 的 协调 “在 细菌 中 ,类 同 功能 的 基因 经 常 排列 成 基因 徐 , 受 到 同样 的 转录 调节 , 称 为 操纵 子 (参阅 )。 多 基因 转录 为 多 顺 反 子 mRNA, 这 使 基于 操纵 子 内 基因 的 位 置 进行 基因 调节 (如 转录 的 抗 终止 和 和 蛋白 合成 时 核糖 体 结合 的 顺序 依赖 性 ) 成 为 可 能 。 基 因 排 列 相 近 意味 着 可 以 应 用 如 逆向 转录 (countertranscription, 参 阅 ) 的 策略 ,逆向 转录 是 指 附近 的 启动 子 用 来 调节 基因 的 表达 。 操 纵 子 的 结构 在 真 核 生物 系统 中 几乎 完全 被 据 弃 ,因为 在 真 核 生 物 中 核糖 体 只 能 与 mRNA 经 过 修饰 的 5 端 结合 ,而 不 能 与 中 间 位 置 结 合 (参见 内 部 核糖 体 进入 位 点 )。 另 外 , 真 核 生 物 的 基因 分 布 比 原核 生物 松散 。 这 两 个 因素 都 阻止 真 核 生物 协同 的 顺 式 转录 ,尽管 共享 远 端 的 调节 元 件 时 转录 的 顺 式 共 调 节 还 是 可 能 的 。 (3) 内 含 子 “高 等 真 核 生物 的 基因 经 常 被 一 个 或 多 个 内 含 子 (参阅 ) 打 断 , 内 含 子 所 含 信息 并 不 出 现在 最 终 的 基因 产物 中 。 一 些 低 等 真 核 生 物 内 含 子 很 少 出现 ( 如 酵母 ) ,在 细菌 中 则 几乎 不 出 现 内 含 子 。 内 含 子 通过 真 核 生 物 RNA 剪接 (参阅 ) 而 被 去 除 ,这 样 在 转录 和 和 蛋白 合成 中 增加 了 一 个 调节 阶段 ,并 能 有 选择 地 使 用 基因 的 信息 。 细 菌 基 因 一 般 只 编码 一 种 基因 产物 而 很 多 真 核 生物 基因 可 以 编码 多 个 相互 重 琵 的 产物 。 (4) 染 色 质 ”在 真 核 和 原核 生物 中 DNA 结构 对 基因 表达 的 调节 都 是 全 局 的 调控 机 制 ,因为 DNA 结构 可 以 影响 转录 调节 因子 与 DNA 的 结合 。 在 真 核 生 物 中 ,DNA 包装 成 被 称 为 染色 质 (参阅 ) 的 高 度 有 序 核 蛋白 复合 物 , 它 的 结构 在 有 潜在 转录 活性 的 形式 和 转录 抑制 的 凝聚 状态 之 间 转 换 。 染 色 质 结构 对 基因 活性 的 调节 使 大 部 分 基因 完全 被 抑制 或 激活 ,这 对 含有 庞大 基因 组 的 生物 可 能 是 有 利 的 。 (5S)RNA 聚合 酶 活性 ， 在 细菌 中 ,RNA 聚合 酶 全 酶 有 一 亚 单位 一 一 c 因子 ,促进 RNA 聚合 酶 对 启动 子 识别 和 结合 。 如 果 存 在 合适 的 启动 子 ,不 需 其 他 调控 方式 就 能 进行 有 效 的 转录 。 在 真 核 生 物 中 ,RNA 聚合 酶 本 身 不 能 识别 启动 子 , 需 要 一 系列 基本 转录 因 子 促进 装配 和 模板 的 进行 性 。 起 始 复合 物 不 稳定 上 且 只 有 很 弱 的 转录 活性 。 有 效 的 转录 还 需要 组 建成 型 的 正 调 节 因 子 来 稳定 起 始 复合 物 。 (6) 转 录 调 节 ”在 细菌 中 ,转录 的 调节 主要 是 由 直接 与 RNA 聚合 酶 作用 的 因子 优 先 介 导 的 ,这 些 因 子 经 常 受 别 构 调 节 。 这 些 以 及 mRNA 的 高 更 新 率 有 助 于 对 不 断 变化 的 环境 条 件 作 出 快速 反应 。 在 真 核 生物 中 ,转录 调节 常 依赖 于 结合 在 远 处 基本 启动 子 上 的 因子 ,这 种 相互 作用 由 环 出 的 间隔 DNA 介 导 。 这 样 允许 基因 竞争 远 处 的 增强 子 和 其 他 调节 元 件 的 协同 顺 式 调节 发 生 ( 参 见 增 强 子 竞争 .基因 座 控制 区 域 ) 。 在 细菌 中 ,对 已 经 存 在 的 转录 因子 的 别 构 改 变 可 以 介 导 对 细胞 外 诱导 事件 的 迅速 反应 。 在 真 核 生物 中 ,转录 因子 翻译 后 加 工 也 是 一 种 普遍 的 调节 策略 ,而 重新 合成 新 的 转录 因子 用 来 调节 相当 缓慢 和 长 期 的 反应 ,如 发 育 过 程 中 的 分 化 (参见 第 6 章 发 育 ,分 子 机 制 )。 ( 徐 江 译 ) ”08 第 10 章 细 范 中 的 基因 转移 基本 概念 和 定义 。 ”基因 转移 (gene transfer) 是 指 外 源 ( 经 常 指 另 一 个 细胞 ) 的 遗传 信息 进入 一 个 细胞 的 现象 。 这 种 过 程 在 细菌 和 真 核 生物 中 都 会 自然 发 生 , 称 为 水 平 或 横向 遗传 传递 (horizontal or lateral genetic transmission) ,区 别 于 称 为 纵向 遗传 传递 ( vertical ge- netic transmission) 的 亲 代 到 子 代 遗传 信息 的 传递 。 种 内 基因 转移 有 利于 无 性 繁殖 物种 中 的 遗传 混合 , 它 模仿 了 有 性 生殖 的 效果 。 这 样 的 准 性 交换 机 制 (parasexual exchange mechanisms) 可 用 来 对 原核 基因 组 作 图 ， 类 似 与 真 核减 数 分 有 作 图 (参阅 )。 种 间 基 因 转 移 也 可 能 发 生 ,是 转基因 (参阅 ) 的 自然 机 制 。 种 间 基 因 转 移 是 重要 的 进化 过 程 , 与 一 些 最 基本 的 进化 事件 有 关 ( 如 真 核 细 胞 器 的 内 共生 体 起 源 ) ,也 与 细菌 和 真 核 生 物 间 特 异 的 相互 作用 有 关 [ 如 根 瘤 农 杆菌 (Agropacterixwzz iuzzorfociers ) 的 肿瘤 诱导 ;参见 Ti 质粒]。 被 转移 信息 的 来 源 称 为 供 体 (donor) ,被 转移 的 遗传 信息 称 为 外 基因 子 (ex- ogenote, 外 源 基 因 组 ,一 般 是 供 体 基 因 组 的 一 个 片段 )。 基 因 转 移 的 目标 是 受 体 (recipient) , 它 具 有 内 基因 子 (endogenote, 内 源 基因 组 ) 。 如 果 外 基因 子 与 内 基因 子 的 一 部 分 同 源 ,基因 转移 会 使 受 体 细胞 成 为 部 分 二 倍 体 (部 分 合子 , merozy- gote) ,这 种 情况 下 可 能 发 生 重 组 ,包括 等 位 基因 的 替换 (标记 基因 交换 )。 细菌 中 基因 转移 有 四 种 主要 的 机 制 : 细 胞 融合 \ 接 合 、 转 化 和 转 导 ( 表 10.1)。 所 有 基因 转移 的 机 制 都 包括 将 DNA 导 和 人 受 体 和 一 个 决定 外 基因 子 命运 的 分 离 期 。 基 因 转移 有 四 种 结果 :拒绝 (降解 ) 保 留 ( 也 就 是 处 于 细胞 质 中 )、 置 换 ( 与 内 基因 子 重 组 ) 和 至 加 (整合 到 内 基因 子 中 )。 置 换 只 有 在 外 基因 子 与 部 分 内 基因 子 同 源 时 才能 发 生 。 人 工 基 因 转 移 用 于 基因 的 克隆 与 表达 菌株 构建 、 定 靶 突变 产生 转基因 生物 和 基 因 表 达 分 析 。 在 这 些 情况 下 ,外 基因 子 是 重组 DNA 分 子 , 进 一 步 讨 论 见 重组 DNA。 sl 接合 接合 的 要 求 ”细菌 接合 包括 在 细胞 发 生物 理 接 触 时 遗传 信息 从 一 个 细胞 转移 到 另 一 个 细 胞 。 供 体 细 胞 被 人 为 地 定义 为 雄性 ,而 受 体 细胞 为 肉 性 ,基因 转移 后 , 受 体 可 被 称 为 转 ”和 9 ，。 表 10.1 细菌 基因 转移 的 四 种 基本 机 制 基因 转移 机 制 ”定义 特征 萎 合 DNA 从 细胞 到 细胞 直接 转移 ,经 常 通过 一 个 特定 的 管道 。 接合 是 质粒 转移 机 制 进 化 而 来 ,需要 许多 特殊 的 功能 ,往往 由 质粒 提供 。 转化 细胞 从 周围 介质 中 吸收 裸露 的 DNA。 在 细菌 中 转化 是 指 从 周围 介质 中 吸收 裸露 的 染色 体 或 质 粒 DNA。 对 裸露 的 病毒 基因 组 DNAMRNA 的 吸收 称 为 转 染 (transfection)。 极 少 种 属 能 自发 有 转化 能 力 ,在 一 些 耐 大 肠 杆菌 素 的 种 属 中 通过 不 同 的 化 学 处 理 , 能 被 诱导 产生 转化 的 人 工 感受 态 (参见 第 24 章 重 组 DNA) 。 在 动物 细胞 中 ,从 周围 介质 中 吸收 任何 裸露 DNA 都 称 为 转 染 , 尽 管 转 化 这 个 名 称 可 以 用 来 特 指 因此 带 来 的 表 型 改变 。 酵 母 和 植物 细胞 中 导 人 裸露 的 DNA 可 以 称 为 转 染 或 转化 。 转 导 通过 病毒 颗粒 介 导 将 染色 体 或 质粒 DNA 转移 到 细胞 中 。DNA 可 能 取代 病毒 基因 组 被 包装 在 鸣 菌 粒 中 (普遍 性 转 导 ) 或 共 价 地 加 入 到 病毒 基因 组 中 (特异 性 转 导 )。 细胞 融合 发 生 在 有 些 细菌 种 属 中 的 由 细胞 质 膜 的 融合 介 导 基因 转移 (如 链 霉 菌 属 ) 。 注意 转化 和 转 染 两 个 术语 在 细菌 和 真 核 生 物 中 的 不 同 使 用 方法 。 接合 子 (transconjugant)。 通 过 接合 而 转移 DNA 的 能 力 是 由 接合 质粒 (CNS plas- mid) 提 供 ( 或 很 少 情况 下 是 接合 转 座 子 提供 ) ,他 们 是 自身 可 传送 的 元 件 ,编码 所 有 通过 接 合 将 自身 拷贝 转移 到 其 他 细胞 所 需要 的 功能 。 如 果 接 合 质粒 能 促进 染色 体 基 因 的 转移 ， 它 就 称 为 性 因子 (sex factor) 。 FEF 质粒 (F 因子 \ 致 育 因 子 ) 是 大 肠 杆 菌 的 一 种 接合 质粒 , 它 除 了 致 育 (刺激 接合 转移 的 能 力 ) ,不 赋予 其 宿主 其 他 表 型 。F 因子 是 第 一 个 发 现 的 ,接合 系统 研究 得 也 最 为 清楚 ( 见 文 框 10.1)。 由 于 与 其 他 接合 质粒 不 同 , 它 的 接合 基因 是 组 成 型 去 阻 遏 的 ,因而 在 自发 状态 下 ,上 启动 从 供 体 (雄性 ,F” ) 细 胞 到 受 体 (雌性 ,F- ) 的 高 效 自身 转移 。 在 雄性 和 肉 性 细胞 的 混合 群体 中 ,大 多 数 雌 性 细胞 接受 了 下 的 拷贝 成 为 雄性 ,但 在 很 高 的 雄 : 雌 的 比例 时 , 峻 性 可 能 由 于 接合 转移 被 杀 死 ,这 一 现象 称 为 致死 接合 (lethal zygosis)。R 质粒 (R 因 子 , 抗 药 因子 ) 是 携带 抗生素 抗 性 标记 的 接合 质粒 。 因 为 转移 基因 被 抑制 ,R 质粒 促进 接 合 的 效率 不 像 下 因子 那么 高 ;它们 通过 反 式 抑制 F 转移 基因 ,对 下 显示 致 育 抑制 。 这 可 发 生 在 上 系统 中 ,因为 下 型 质粒 在 两 个 不 相 容 组 中 扩散 (参阅 )。 质粒 DNA 的 转移 和 命运 接合 需要 细胞 间 的 接触 ,这 样 DNA 才能 从 供 体 转移 到 受 体 。 在 革 兰 氏 阴 性 细菌 中 (如 大 肠 杆菌 ) ,这 样 的 接触 包括 质粒 编码 的 蛋白 管道 ( 伞 毛 、 性 伞 毛 接合 管 ; 复 伞 毛 ) , 它 从 供 体 延 伸 到 受 体 细胞 表面 将 接合 细胞 拉 在 一 起 。 伞 毛 是 成 功 接合 必需 的 ,可 表明 接合 在 何 种 条 件 下 发 生 。 一 旦 接触 成 功 发 生 ,就 释放 启动 DNA 移动 的 信号 。 在 革 兰 氏 阳 性 细菌 中 (如 链 霉 菌 属 ) ,接合 不 需要 菌 毛 而 是 细胞 间 直 接 接触 。 一 旦 建立 了 连接 ,接合 质粒 的 DNA 就 进入 可 移动 状态 (为 转移 做 准备 )。 在 下 质粒 的 情况 下 ,这 包括 通过 在 转移 起 始点 (origin of tranfer) oriT 处 导入 缺口 , 解 开 单 链 DNA， 并 传送 入 伞 毛 中 。DNA 的 端 最 先 被 吸收 ,因此 oriT 缺口 的 $ 位 置 先进 入 受 体 细胞 。 在 受 体 细 胞 中 , 单 链 DNA 作为 模板 产生 双 链 分 子 , 再 重新 环 化 ,这 种 过 程 称 为 独立 复制 (repliconation) 。 在 供 体 细 胞 中 ,保留 的 单 链 也 作为 模板 替代 被 转移 的 链 ( 供 体 接 合 DNA 合成 )。 因 此 接合 是 半 保 留 的 过 程 (图 10.1)。 . 110 ， 染色 体 DNA 的 转移 和 命运 接合 质粒 不 仅 自身 可 以 转移 ,而 且 还 促进 自身 不 能 转移 的 染色 体 或 其 他 质粒 DNA 的 接合 转移 。 如 果 外 源 DNA 与 接合 质粒 共 价 接合 ,这 种 情况 可 以 顺 式 作用 形式 发 生 ( 顺 式 移动 或 共 转 导 ) ,如 果 另 一 质粒 是 可 移动 的 ,也 可 以 以 反 式 发 生 (也 就 是 它 可 以 对 反 式 作用 的 移动 因子 如 核酸 内 切 酶 TraY ,产生 反应 ,但 本 身 不 编码 这 样 的 因子 ; 反 式 移动 或 给 体 作用 )。 -二 是 人 人 和 供 体 接合 DNA 合 成 “独立 和 他 10.1 质粒 DNA 接合 转移 的 步骤 。 当 接合 转移 涉及 染色 体 基 因 的 移动 和 转移 ,此 过 程 将 促进 准 性 交换 , 称 为 性 导 (sex- duction) (或 在 F 质粒 存在 时 为 了 因子 转 导 ) ,可 用 于 对 原核 基因 作 图 ( 文 框 10.2)。F- 质 粒 可 以 通过 IS 因子 之 间 ( 参 阅 ) 的 同 源 重组 整合 到 宿主 的 染色 体 中 。 一 旦 整合 , 它 就 可 以 顺 式 移动 它 所 共 价 连接 的 染色 体 DNA, 使 染色 体 DNA 从 一 个 体 转移 到 另 个 个 体 中 。 受 体 细 胞 对 转 导 的 基因 而 言 是 二 倍 体 ,如 果 供 体 和 受 体 细胞 是 不 同 的 基因 型 , 随 着 外 基因 子 和 内 基因 子 的 同 源 重组 ,标记 基因 产生 互 换 。 整 合 有 下 质粒 的 细菌 菌株 被 称 为 Hfr 菌 株 ,因为 它们 促进 了 在 供 体 和 受 体 起 始点 的 染色 体 标 记 的 高 频 重 组 (high frequency of re- combination) 。 当 供 体 菌 株 具 有 自发 的 F 质粒 时 ,只 能 观察 到 低频 率 的 标记 交换 ,被 认为 存在 少量 的 游离 F 携带 者 所 致 。 自 发 质粒 的 转移 总 是 使 F ( 肉 性 ) 受 体 细胞 变 成 F- (雄性 ) ,而 在 Htfr 菌株 中 不 会 发 生 这 种 情况 。 其 中 原因 反映 了 转移 区 域内 的 or;T 位 置 。 因为 oriT 位 于 转移 区 域 的 $ 边 界 ( 见 文 框 10.1) , 紧 连 or;iT $ 的 基因 座 最 先进 入 受 体 细 胞 ,转移 基因 经 常 最 后 进入 受 体 细胞 。 游 离 F 质粒 因为 经 常 整个 质粒 转移 而 不 受 影 响 ; 然而 如 果 质 粒 是 整合 到 细菌 染色 体 中 ,接合 转移 几乎 总 是 在 整个 染色 体 被 转移 前 被 打 断 ， 这 样 使 受 体 细胞 保持 F- 。 游离 的 F 质粒 是 偶尔 从 宿主 基因 组 中 不 精确 切 离 而 产生 的 , 它 携带 部 分 染色 体 DNA (参见 误 切 质 兰 )。 增 大 后 的 质粒 ,现在 称 为 下 质粒 ,能 够 转移 到 F 细菌 中 ,使 它们 变 成 FE” ,上 且 对 额外 基因 是 二 倍 体 。F' 质 粒 文库 [ 养 粒 (fosmid) 文 库 ,参见 粘 粒 ] 可 以 用 来 分 离 包 含 整 个 大 肠 杆菌 染色 体 的 区 域 ,这 样 的 质粒 可 以 有 很 多 用 途 : 在 重组 缺陷 的 宿主 中 , 部 分 三 倍 体 可 以 用 于 研究 反 式 补偿 (人 参阅) 的 突变 效应 ; 它 是 精细 分 析 乳 糖 操纵 子 的 方法 ;在 容 易 重 组 的 受 体 中 ,在 染色 体 和 质粒 携带 基因 间 可 以 发 生 标记 的 交换 ,类 似 于 特异 性 转 导 (人 参阅) 机 制 的 性 导 过 程 可 用 于 菌株 构建 。F 质粒 和 下 ' 质 粒 的 性 导 过 程 在 图 10. 2 中 进行 了 比较 。 10825 转化 转化 的 要 求 ”在 细菌 中 ,转化 是 从 周围 介质 吸收 裸露 DNA ,使 受 体 细胞 , 即 转化 体 ”了 F 整合 入 受 体 染 色 体 二 -可 L 一 下 十 肥 历 不 精确 切 离 F 性 导 :F 传 导 整 个 供 体 染 色 体 , 受 体 仍 保持 F- 因 为 tra 基 因 很 少 被 子 转移 . oo 一 OocA -oO F' 性 导 :F 传导 供 体 染 色 体 的 小 的 切割 片段 ， 由 于 tra 基因 一 般 被 转移 ， 受 体 细胞 成 为 F* 10.2 性 导 : 接 合 时 染色 体 DNA 的 转移 。 通 过 传导 其 整合 人 的 染色 体 或 传导 由 不 精确 切 离 所 捕获 的 染色 体 基因 来 介 导 性 转 导 。 (trasformant) 基 因 型 发 生 改 变 。 很 多 细菌 中 自然 发 生 转化 〈 如 杆菌 、 链 霉菌 属 、 嗜 血 杆 菌 ) ,尽管 感受 态 (competence)( 有 能 力 吸收 外 源 DNA 的 状态 ) 经 常 是 瞬时 的 ,与 特定 的 生 理 状 态 有 关 ,并 需要 表达 特定 的 感受 态 因子 (competence factors)。 其 他 细菌 种 属 , 包 括 大 肠 杆菌 , 自然 转化 无 法 发 生 ,但 可 以 通过 人 工 诱 导 产生 感受 态 , 使 其 能 够 吸收 DNA; 促 进 大 肠 杆菌 在 分 子 克 隆 中 的 使 用 ( 见 第 24 章 重 组 DNA)。 DNA 的 转移 和 命运 ”在 自然 的 感受 态 细胞 中 , 供 体 DNA 先 与 表面 受 体 可 逆 结 合 。 有 些 细 菌 中 (如 杆菌 ) ,DNA 通过 前 切 和 降解 ,最 后 只 有 一 条 链 被 内 化 。 在 其 他 菌株 (如 哮 血 流 感 杆 菌 ) 中 两 条 链 都 进入 细胞 。 人 工 转化 大 肠 杆菌 也 可 使 DNA 被 完整 地 内 化 ,可 能 是 因为 处 理 过 程 中 增加 了 细胞 膜 对 DNA 通 透 性 。 一 般 ,DNA 的 结合 和 内 化 是 非特 异性 的 ,尽管 在 有 些 例 子 中 ,如 嗜 血 流 感 杆 菌 只 吸收 有 特定 DNA 吸收 位 点 的 DNA,DNA 吸收 位 点 是 在 嗜 血 流 感 杆菌 基因 组 出 现 频 率 很 高 的 顺序 ,这样 保 证 细胞 只 转化 从 同一 种 属 来 的 DNA。 如 果 转 化 的 DNA 是 质粒 , 它 在 受 体 细 胞 中 可 以 作为 自主 复制 子 存 在 。 线 性 化 染色 体 DNA 可 以 与 宿主 染色 体重 组 ,产生 标记 交换 。 这 两 种 情况 都 产生 稳定 的 或 永久 的 转 化 。 另 外 转化 的 DNA 也 可 能 被 降解 ,在 这 种 情况 下 , 它 所 提供 的 任何 特性 是 短期 的 ( 明 时 转化 ) 。 偶 尔 转化 的 DNA 可 以 通过 非法 的 末端 整合 连接 到 宿主 染色 体 中 ,尽管 由 于 富 含 末端 连接 修复 酶 ,在 真 核 细胞 中 线性 化 DNA 的 导入 是 更 常见 的 现象 (参见 转 染 、 转 基 因 、 非 法 重组 )。 10.3 转 导 通过 普遍 性 转 导 和 特异 性 转 导 转 移 DNA 转 导 (transduction ) 是 通过 病毒 颗粒 将 细胞 内 基因 从 供 体 转移 到 受 体 细胞 的 过 程 , 受 体 在 转移 后 称 为 转 导 体 (transductant)( 参 见 信 号 传导 )。 自 然 的 转 导 可 以 两 种 方式 发 生 ( 表 10.2)。 在 广泛 性 转 导 中 ,染色体 或 质粒 和 表 10.2 广泛 转 导 和 特 导 转 导 的 特性 广泛 性 转 导 特异 性 转 导 转 导 颗粒 的 成 分 “只 有 宿主 DNA, 理 论 上 任何 顺序 都 可 以 与 噬菌体 DNA 共 价 连接 的 宿主 DNA。 噬 著 体 经 常 是 缺陷 的 。 宿 主 DNA 限制 在 原 噬 苗 体 插 和 人 位置 的 两 侧 机 制 在 裂解 循环 中 通过 错误 的 对 宿主 DNA 包装 进 “ 在 原 噬菌体 异常 前 切 后 形成 颗粒 入 衣 壳 形成 颗粒 分 辨 力 完全 转 导 :与 宿主 基因 组 同 源 重组 一 转 导 体 “置换 转 导 :与 宿主 基因 组 同 源 重组 一 转 导体 是 单 倍 体 是 单 倍 体 流产 转 导 : 供 体 DNA 保留 在 细胞 质 中 ,不 复制 ”插入 转 导 :由 转 导 鸣 菌 体 溶 源 化 一 一 转 导 体 是 - 转 导 体 是 部 分 二 倍 体 ,一 群 细胞 中 只 有 一 “部 分 二 倍 体 个 细胞 包含 转 导 的 基因 要 求 低 毒 性 ( 叭 菌 体 在 包装 前 不 能 破坏 宿主 DNA) ， 必须 是 温和 性 噬菌体 ,也 就 是 必须 整合 到 宿主 包装 DNA 是 非特 异性 的 ,如 通过 头 满 装 机 “ 基因 组 中 制 ( 人 参阅 ) 宿主 重组 体系 完全 转 导 需 要 细菌 rec 系统 ,完全 :流产 转 导 的 ”置换 转 导 需 要 细菌 rec 系统 。 加 入 转 导 依赖 于 比例 随 供 体 DNA 双 链 断裂 增加 而 增加 缺陷 鸣 菌 体 性 质 ,不 一 定 要 求 rec 系统 举例 大 肠 杆 菌 的 噬菌体 P1; 沙门 氏 菌 (S. zy 大 肠 杆 菌 的 入 噬菌体 ;枯草 杆菌 的 噬菌体 SPB 雄 izzzurziuzza ) 的 噬菌体 P22 DNA 偶 尔 替 代 鸣 菌 体 基因 组 被 包装 到 喉 菌 体 头 部 。 因 为 感染 是 由 鸣 菌 体 颗粒 而 不 是 所 携带 的 核 苷 酸 提供 的 能 力 , 所 以 这 是 一 种 有 效 的 细胞 间 基 因 转 移 的 机 制 ,理论 上 染色 体 的 任何 区 域 都 可 以 被 转 导 。 在 特异 转 导 (或 限制 性 转 导 ) 中 ,对 原 噬菌体 不 精确 的 切 离 使 原 鸣 菌 体 两 侧 的 宿主 DNA 被 移 人 和 包装 。 因 此 转 导 的 DNA 是 共 价 地 与 噬菌体 基因 组 相 连接 ,能 够 转 导 的 基因 被 限制 在 原 喉 菌 体 插 入 位 置 的 两 侧 。 在 真 核 生 物 中 可 以 观察 到 特 异性 转 导 而 不 是 普遍 性 转 导 (参见 急性 转化 逆 病 毒 ) 。 病毒 基因 组 可 以 用 来 作为 克隆 载体 (参阅 ) ,通过 将 重组 病毒 包装 进入 衣 壳 ,将 克隆 基 因 转 移 到 克隆 宿主 中 , 这 个 过 程 可 被 认为 是 人 工 转 导 ;使 用 重组 喉 菌 体 入 是 人 工 特异 性 转 导 ,因为 克隆 的 DNA 共 价 地 与 入 基因 组 连接 。 相 反 , 用 鸣 菌 粒 载体 克隆 更 像 普 遍 性 转 导 ， 因为 根本 没有 使 用 入 基因 组 ( 见 第 24 章 重 组 DNA)。 大 多 数 温和 的 鸣 菌 体 可 以 作为 特异 性 转 导 叭 菌 体 , 但 极 少 喉 菌 体 天 然 就 具有 普遍 性 转 导 的 能 力 一 这 是 因为 普遍 性 转 导 噬菌体 必须 不 破坏 宿主 DNA, 并 且 使 用 不 需要 特定 只 菌 体 顺 序 的 包装 机 制 ,也 就 是 头 满 装 机 制 ( 见 第 30 章 病 毒 )。 很 多 不 能 作为 普遍 性 转 导 的 野生 型 噬菌体 通过 特殊 突变 可 以 补偿 得 到 这 种 能 力 ( 如 入 和 T7 鸣 菌 体 ) 。 普遍 性 转 导 听 菌 体 ”主要 的 普遍 性 转 导 鸣 菌 体 是 大 肠 杆菌 吻 菌 体 P1 和 沙门 氏 菌 ( S. tyjizzxriuzz ) 的 噬菌体 P22。 它 们 的 基因 组 是 环形 排列 和 末端 宛 余 的 (参阅 ), 这 是 多 联 体 基因 组 DNA 包装 的 结果 ,环形 排列 是 由 从 同样 的 多 联 体 中 剪 切 基因 组 亚 单位 的 结果 ， 末端 元 余 是 每 个 未 端 都 填补 了 比 一 个 基因 组 大 的 固定 长 度 基因 组 DNA, 即 头 满 装机 制 的 结果 (参阅 )。 宿 主 DNA 替代 鸣 菌 体 基因 组 进入 头 部 形成 转 导 颗粒 。 理 论 上 ,宿主 染色 体 的 任何 部 分 都 可 以 相同 的 效率 被 包装 和 转 导 。 但 实际 上 ,不同 的 标记 以 不 同 的 频率 转 “有 导 , 有 三 个 数量 级 的 变化 。 在 P22 转 导 中 这 种 效应 特别 明显 ,这 反映 了 在 P22 基因 组 中 ， 组 成 染色 体 包 装 位 点 ( zac ) 的 特定 染色 体 区 域 的 包装 倾向 。 已 获得 了 包装 专 一 性 缺陷 的 突变 鸣 菌 体 株 ,它们 以 类 似 的 效率 转 导 所 有 的 标记 。 普遍 性 转 导 DNA 的 命运 ”外 源 DNA 通过 病毒 颗粒 进入 受 体 细胞 后 可 能 有 多 种 结果 。 如 果 转 导 的 DNA 是 质粒 , 它 可 以 作为 自主 复制 子 在 细胞 质 中 存在 ;大 的 质粒 在 转 导 后 变 小 ( 转 导 短 化 ) ,这 一 现象 反映 了 自发 缺失 突变 的 包装 效率 更 高 。 转 导 染 色 体 DNA 的 线 性 片断 能 与 受 体 基因 组 的 同 源 区 域 相 联 会 进行 同 源 重 组 (参阅 ) 和 标记 交换 ;这 称 为 完全 转 导 (complete transduction) 。 保 留 在 细胞 质 中 的 线性 DNA 可 能 被 降解 或 在 细胞 质 中 作 为 脱氧 核糖 体 的 一 部 分 稳定 下 来 ;这 称 为 流产 转 导 (abortive trans duction)。 转 导 的 基因 可 以 表达 ,但 由 于 缺乏 起 点 它们 不 能 复制 ,合成 的 蛋白 会 被 不 断 增加 的 群体 所 迅速 稀释 。 因此 ,如 果 携 带 一 个 营养 缺陷 (参阅 ) 突 变 的 细胞 用 对 应 的 野生 型 等 位 基因 转 导 ,一 些 完全 转 导 体会 在 选择 性 培养 基 中 正常 生长 ,而 流产 转 导 生 长 会 非常 缓慢 ,产生 小 的 菌落 一 一 这 是 因为 转 导 DNA 可 以 产生 细胞 生长 所 需要 的 酶 ,但 不 能 在 细胞 分 裂 时 扩 增 它 仅 能 遗传 给 一 个 子 代 细胞 。 因 此 尽管 每 一 子 代 细胞 中 可 能 有 足够 的 酶 维持 几 代 细 胞 的 生长 ,但 最 终 被 稀释 和 降解 ,所 以 除了 携带 片断 的 细胞 ,其 他 细胞 停止 生长 。 利用 和 听 菌 体 的 特异 性 转 导 “特异 性 转 导 由 原 叹 菌 体 的 异常 切 离 产 生 ( 见 第 30 章 病 毒 ) ,使 原 噬 菌 体 插入 位 点 两 侧 的 宿主 基因 被 转 导 。 很 多 温和 的 鸣 菌 体 有 特殊 的 插 和 人 位 点 。 叭 菌 体 Mu 是 一 例外 ,因为 它 通 过 较 小 靶 位 点 倾向 性 的 重复 转 座 复制 。Mu 可 以 作为 普遍 性 转 导 鸣 菌 体 起 作用 ,Mnu 的 缺失 衍生 体 可 以 作为 特异 性 转 导 鸣 菌 体 起 作用 ,这 个 过 程 称 为 (缺陷 )Mu 噬菌体 转 导 (mini-Muduction)。 在 入 鸣 菌 体 的 情况 中 ,特异 性 转 导 颗粒 携带 ga 或 bio 基因 座 (在 入 鸣 菌 体 插 人 位 置 cazB 两 侧 )。 转 导 是 以 基因 组 另 一 端的 噬 菌 体 基 因 丢 失 为 代价 的 , 即 产生 一 个 缺陷 噬菌体 (缺乏 关键 基因 的 噬菌体 ,只 有 在 通过 称 为 辅助 噬菌体 的 野生 型 噬菌体 反 式 提供 缺失 的 功能 时 才能 感染 宿主 细胞 )。 这 样 异 常 的 剪 切 发 生 频 率 不 高 ,用 从 wio 宿主 产生 的 裂解 液 培养 感染 bio 受 体 细 胞 ,使 少数 细胞 被 感 染 ,然后 它们 通过 wo 的 特异 性 转 导 颗粒 (Mbio+ ) 被 转 导 。 这 样 的 裂解 液 称 为 低频 转 导 裂解 液 Llow-frequency transducing(LFT) lysates]。 如 果 偶 尔 入 叭 菌 体 整 合 在 与 atziB 以 外 的 位 置 , 其 他 基因 也 能 被 转 导 。 特异 性 转 导 DNA 的 命运 如 果 zio 感染 第 二 个 Mbio -的 宿主 ,可 能 有 两 种 结果 (图 10.3)。 转 导 的 基因 与 染色 体 基 因 座 重组 ,有 利于 标记 交换 。 这 是 置换 转 导 , 转 导 体 是 5io ,但 保留 了 单 倍 体 的 wo 基因 座 。 另 一 种 情况 是 特异 性 转 导 颗粒 中 的 DNA 可 能 整合 进入 宿主 基因 组 中 ( 择 入 转 导 )。 这 只 能 在 有 辅助 鸣 菌 体 的 同 源 重 组 情况 下 发 生 , 因 为 特 异性 转 导 颗 粒 的 DNA 对 位 置 专 一 性 重组 缺乏 有 效 的 供 体位 点 。 因 为 在 LFT 裂解 液 中 有 过 量 的 野生 型 噬菌体 , 受 转 导 鸣 菌 体感 染 的 受 体 细胞 同时 也 感染 了 野生 型 颗粒 。 两 种 鸣 菌 体 的 整合 产生 了 双重 溶 原 (double lysogen) ,宿主 对 wio 基因 座 是 二 倍 体 。 这 样 的 转 导 被 称 为 溶 原 部 分 合子 (1ysogenic merozygote) ,通过 原 喉 菌 体 的 整合 有 一 个 额外 wo 拷贝 。 后 来 的 双重 溶 原 诱 导 产 生 包 含 等 量 的 野生 型 噬菌体 和 特异 性 转 导 喉 菌 体 的 裂解 液 , 它 可 以 高 频率 转 导 另 一 群 io 的 受 体 细胞 [高 频率 转 导 (HEFT) 有 裂解 液 ]。 .114 ， 8q1 QttB Dio+ Sql 入 入 bio+ bio- | 10.3 入 噬菌体 的 特异 转 导 。(1) 入 鸣 菌 体 整 合 在 大 肠 杆 菌 ge! 和 zio 间 的 atiB 位 点 。(2) 异 常 切 离 产 生 携带 io 基因 的 特异 性 转 导 颗粒 Mbio ” ,再 次 对 pio 宿主 感染 造成 (3) 重 组 引起 的 置换 转 导 或 (4) 整 合 引起 的 插入 转 导 , 后 者 产 生 一 X: Zio 双重 溶 原 , 可 以 产生 高 频率 转 导 的 裂解 液 。 在 go;! 基因 座 的 情况 是 类 似 的 。 文 框 10.1 下 质粒 上 的 转移 基因 tra 区 域 和 它 的 调节 ”大约 三 分 之 一 的 下 质粒 包含 一 个 转移 操纵 子 (transfer operon) , 约 35 个 基因 ， 被 traj 基因 产物 正 调节 。 在 操纵 子 的 5 端 有 3 个 基因 座 : 转 移 起 点 oziT, 受 Taj 控制 的 独立 转移 基 traM 和 trajJ 本 身 。 这 3 个 基因 座 和 下 游 的 操纵 子 组 成 了 转移 区 域 (transfer region) ,携带 了 所 有 自 身 转 移 所 需要 的 基因 。 在 其 他 接合 质粒 中 , traj 的 表达 被 两 个 基因 fixzrO 和 fixzP 的 作用 所 抑制 ,后 者 编码 小 RNA 分 子 ,与 FinO 一 起 结合 在 zraj 的 前 导 顺 序 上 ,抑制 其 表达 [ 反 义 RNA 是 质粒 (参阅 ) 基因 调节 的 常用 策略 ]。 在 下 质粒 中 , fxzO 基因 被 IS 因子 (人 参阅) 的 插入 打 断 ,转移 基因 组 成 性 表达 。 图 中 是 与 大 肠 杆 菌 染 色 体 重组 的 IS 因子 。 oriT tmaF trbA artA tmmQ trbBJF traHCSTD trbH tmmlX F 质粒 的 ztra 区 域 包含 (从 $ 到 3 人 方向 )orT traM、zraj 和 ztra 操纵 子 。zra 操纵 子 是 连续 的 ;如 上 所 示 ， 1rpP 和 trpF 之 间 没 有 物理 断裂 。 " 提 村 > tra 操纵 子 的 基因 “大约 20 个 转移 基因 的 功能 已 经 知道 。 其 他 如 产物 大 小 及 它 在 很 多 情况 中 的 亚 细 胞 定位 和 可 能 相互 作用 配偶 体 也 已 经 得 知 ,但 精确 的 功能 还 有 待 于 进一步 确定 。trar 基因 座 通过 内 套 翻译 编码 Tral 和 Tra”* (以 前 是 TraZ) 两 种 产物 ,Tral 的 功能 还 不 清楚 。 基因 产物 功能 衣 壳 蛋白 ,可 能 涉及 细胞 -细胞 识别 是 traM 和 tra 操纵 子 转录 正 调节 因子 内 切 酶 ,在 orT 处 产生 DNA 缺口 编码 性 伞 毛 的 主要 亚 基 菌 毛 蛋 白 traL traE 、iraK 、tiraB、iraV、\tiraC tra 砚 性 伞 毛 装配 traU、irbC、traF tiraH、tiraG 性 伞 毛 装配 与 交配 集合 物 稳 定 化 性 伞 毛 交配 集合 物 稳定 化 表面 排斥 : 接合 时 DNA 转运 traf 解 旋 酶 ,转移 所 需 的 DNA 解 旋 。 也 有 内 切 酶 活性 1 表面 排斥 (surface exclusion) 是 阻止 供 体 细 菌 与 其 他 携带 相同 接合 体系 的 供 体 细菌 接合 的 现象 。 文 框 10.2 ”细菌 连锁 作 图 细菌 的 遗传 作 图 ”细菌 中 准 性 交换 被 用 来 进行 基因 作 图 ,这 和 真 核 生 物 中 利用 减 数 分 裂 交 换 作 图 的 方法 相同 ( 见 重组 ,基因 组 和 作 图 )。 细 菌 连锁 作 图 的 策略 十 分 精致 ,并 提供 了 几 种 原核 生物 基因 组 的 详细 图 谱 , 但 它 现在 逐渐 被 快速 精确 确定 基因 组 DNA 克隆 的 序列 和 高 产量 的 测序 策略 等 先进 物理 方法 所 取代 ( 见 第 24 章 重组 DNA, 第 12 章 基因 组 和 作 图 )。 下 面 讨论 的 作 图 方法 证 明 了 遗传 分 析 的 力量 ,而 不 仅仅 出 于 历史 的 兴趣 。 通过 性 导 作 图 ”如 果 野 生 型 的 大 肠 杆菌 Hfr 株 与 携带 很 多 突变 的 F- 细胞 混合 ,野生 型 的 等 位 基因 从 供 体 传递 到 受 体 ,标记 交换 也 可 能 发 生 , 所 以 转 接合 子 使 一 个 或 多 个 突变 基因 座 变 成 野生 型 。 因 为 染色 体 以 线性 形式 转移 到 受 体 细胞 ,以 oriT 的 $ 端 为 DNA 的 开始 ,位 于 供 体 染色 体 接 近 oriT 5 端的 标记 基因 最 先进 入 细胞 。 在 任何 细胞 群 中 ,一 对 接合 细胞 可 以 随机 分 离 ; 这 样 处 在 离 oriT 较 远 的 标记 基因 进入 受 体 细胞 的 机 会 要 少 一 些 。 这 样 建立 了 一 个 转移 梯度 (gradient of transfer) ,在 这 个 梯度 中 ,接近 oriT 的 5 边界 的 标记 比 远 处 的 标记 转移 频率 高 ,发生 标记 交换 的 频 率 也 要 高 。 转 移 梯 度 可 用 来 确定 基因 座 顺 序 。 如 果 由 Hfr 和 F- 细胞 起 始 接合 ,然后 将 样品 取出 ， 在 不 同 的 时 间 振 功 来 阻 断 接合 对 ,在 阻 断 较 晚 的 样品 中 有 更 多 的 染色 体 被 转移 ,oriT 较 远 处 的 标 记 可 进行 重组 。 这 样 的 中 断 杂 交 (interrupted mating) 实 验 可 以 用 来 确定 基因 在 染色 体 上 的 顺序 ， 并 估 测 它们 之 间 的 图 距 , 以 分 钟 来 表示 的 ( 见 图 )。 8 中 断 杂 交 作 图 的 原理 :一 Hfr 供 体 以 线性 方式 转 导 染 色 体 进入 受 体 细 胞 。 经 过 时 间 +, 接合 被 振 蔓 打 断 (折线 表示 )。oriT 5 侧 附 近 位 置 的 基因 座 会 先 被 转移 ,所 以 在 时 间 上 =1 时 ,只 有 标记 a 被 转移 和 交换 ， 产生 表 型 为 a+b-c- 的 转 接合 体 。 在 时 间 :=2, 标 记忆 被 转移 和 交换 产生 表 型 为 a+ b+c- 的 接合 体 。 在 时 间 上 =3 时 ,标记 c 被 转移 ,产生 表 型 为 a+b+ c+ 的 转 接合 体 。 这 样 建立 了 基因 顺序 ,用 每 个 标记 转 移 所 需 时 间 所 反映 的 距离 构建 一 个 粗略 的 图 谱 。 通过 共 转 导 和 共 转 化 作 图 中 断 杂 交 可 测 得 基因 座 的 顺序 和 对 它们 之 间 的 距离 有 一 个 概念 。 但 它 不 能 应 用 于 精细 作 图 ,因为 紧密 连锁 的 标记 转移 的 分 离 时 间 只 差 几 秒 。 为 了 更 精确 ,根据 不 同 的 细菌 菌株 采用 了 共 转 导 或 共 转 化 作 图 。 普 遍 性 转 导 可 以 频繁 发 生 ( 野 生 型 P1 和 P22 唉 菌 体 有 1% 一 5% 为 转 导 颗粒 ) ,但 任何 特定 基因 座 的 成 功 转 导 以 很 低 的 频率 发 生 ( 大 约 10 ) ,而 共 转 导 ( 两 个 基因 座 同 时 转 导 ) 被 作为 两 个 基因 在 同一 DNA 片段 上 连锁 的 证 据 。 这 样 精细 基因 作 图 可 以 通过 测定 一 对 供 体 染色 体 上 标记 的 共 转 导 频 率 (cotransduction frequency) 来 进行 ,高 的 共 转 导 频 率 表明 强 的 连锁 。 在 枯草 杆菌 中 ,通过 共 转 化 作 图 (两 个 基因 座 同 时 转化 ) 是 以 同样 的 原理 进行 的 。 在 一 定 的 DNA 浓 度 下 (每 个 细胞 只 吸收 一 个 DNA 片段 ) , 共 转 化 是 连锁 的 证 据 , 共 转化 频率 (cotransformation frequency) 反 映 了 基因 座 之 间 的 距离 。 如 果 一 些 连锁 的 基因 以 上 面 三 种 机 制 中 的 任何 一 种 转移 到 受 体 细胞 中 ,基因 座 之 间 的 距离 可 以 通过 重组 作 图 (recombination mapping) 估 测 ， 也 就 是 通过 确定 标记 基因 对 之 间 的 重组 频率 估 测 物理 距离 。 ( 徐 浴 译 ) ”证 训 1 -下 第 11 章 遗传 密码 基本 概念 和 定义 。 遗传 信息 (genetic information) 指 DNA 中 碱 基 序列 。 遗 传 信息 也 可 能 存在 于 染色 体 物 理 结构 中 ,与 碱 基 序 列 不 直接 相关 ,这 称 为 外 遗传 信息 (epigenetic information ) (参见 染色 质 .DNA 甲 基 化 、 遗 传 外 调节 和 核酸 结构 各 章 )。 。 遗传 信息 要 以 多 肽 序列 形式 表达 ,就 必须 将 核酸 的 4 字符 语言 翻译 成 多 肽 序列 的 21 字符 语言 ,用 核酸 中 的 碱 基 序列 定义 特异 的 多 肽 的 氨基 酸 序列 ,也 就 是 说 使 基 因 编 码 蛋白 质 结构 的 体系 就 是 遗传 密码 (genetic code) 。 遗 传 密码 是 近乎 通用 的 三 联 体 密 码 ,只 有 一 种 阅读 方法 ,但 却 是 高 度 简 并 的 。 。 翻译 通过 tRNA 进行 :tRNA 是 小 分 子 RNA, 它 拥有 氨基 酸 结合 位 点 ,可 识别 mRNA 上 密码 子 的 反 密 码 子 而 扮演 了 适配器 的 角色 。 这 样 tRNA 携带 正确 的 氨基 酸 带 到 核糖 体 上 进行 蛋白 合成 。 。 蛋白 质 含 有 很 多 不 同类 型 的 氨基 酸 , 但 遗传 密码 只 对 应 有 21 种 氨基 酸 ,其 余 由 翻 译 后 加 工 产生 (参见 蛋白 质 一 章 )。 11.1 遗传 密码 的 概论 遗传 密码 的 性 质 遗传 密码 用 三 个 碱 基 的 组 合 定义 一 种 氨基 酸 。 三 碱 基 的 一 种 组 合 称 为 密码 或 三 联 体 (triplet ) ,前 者 适用 于 mRNA, 后 者 对 基因 而 言 。mRNA 上 有 义 密 码 (sense codon) 的 线性 排列 决定 了 多 肽 上 氮 基 酸 的 线性 排列 。 特 别 的 密码 子 决定 多 肽 链 的 起 始 和 终止 。 起 始 密码 子 (initiator codons) 总 是 编码 甲 硫 氨 酸 (原核 生物 和 细胞 器 中 是 甲 酰 甲 硫 氮 酸 ) ,而 终止 密码 子 (stop codons) 不 编码 氨基 酸 ,而 作为 解散 核糖 体 的 释放 因子 (release factors) 作 用 的 信号 。 终 止 密码 子 也 称 为 无 义 密码 子 (nonsense codons) ,因为 没有 可 翻译 的 意义 。 无 义 密 码 子 有 三 种 ,分 别称 为 琥珀 (amber,UAG) 赭石 (ochre,UAA) 和 乳 白 (opal,UAG) 或 灰色 (umber)。 遗 传 密码 的 性 质 列 在 表 11.1, 通 用 遗传 密码 在 图 11.1 中 表示 。 密码 子 由 蛋白 质 合成 机 器 从 起 始 到 终止 以 不 重 和 和 不 停顿 的 方式 进行 “阅读 ”", 即 每 个 核 苷 酸 三 联 体 相对 独立 且 在 密码 子 之 间 没 有 空格 。 这 样 任何 核 苷 酸 顺 序 都 可 能 以 三 种 方式 分 成 不 同 的 密码 子 ,也 就 是 说 有 三 种 读 框 (reading frames)( 图 11.2)。 蛋 白 合 成 所 用 的 阅读 框架 决定 于 起 始 密码 子 的 位 置 , 偶尔 在 翻译 过 程 中 也 有 读 框 的 改变 (参见 移 框 突 变 ,frameshift mnutation, 共 翻译 移 框 ,cotranslations| frameshift) 。 在 基因 组 顺序 资料 中 , 潜 HS 。 在 的 基因 往往 是 根据 开放 阅读 框架 (open reading frames，ORFs) 而 定义 ,也 就 是 不 间断 的 有 义 密码 子 的 长 顺序 ,因为 不 正确 的 阅读 框架 往往 含有 一 个 或 多 个 终止 密码 子 ( 这 就 是 为 什么 移 框 突变 会 使 基因 产物 截 短 的 原因 )。 当 一 个 阅读 框架 被 鉴定 而 其 产物 还 不 清楚 ,就 称 为 未 鉴定 的 读 框 (unassigned reading frame,URF)。 表 11.1 遗传 密码 的 性 质 和 已 知 的 例外 情况 性 质 巩义 例外 通用 性 在 所 有 生物 体 中 密码 相同 (通用 遗传 密码 ,uni- ”细胞 器 和 低 等 真 核 生物 基因 组 中 有 例外 情况 versal ngenetic code) 。 (参见 表 11.2)。 不 重重 每 个 密码 子 都 是 独立 的 单位 ,密码 子 以 1-2- ， 翻译 过 程 中 的 移 框 和 绕道 (参见 翻译 调节 )。 3,4-5-6,7-8-9 顺序 阅读 ,而 不 是 1-2 站 二 二 二 3 六 二 二 Sa 无 标点 密码 子 之 间 没 有 空格 。 单一 读 法 每 个 密码 子 只 对 应 一 种 氨基 酸 或 终止 信和 号。 不 常用 的 起 始 密码 子 , 硒 代 半 胱 氨 酸 在 UGA 处 插入。 简 并 性 有 61 个 有 义 密码 子 和 21 种 氨基 酸 ,每 种 氨基 ”密码 子 作为 整体 而 言 是 简 并 的 , 色 氢 酸 和 (内 酸 ( 或 终止 信号 ) 可 以 由 多 个 密码 子 定义 。 部 的 ) 甲 硫 氨 酸 在 通用 密码 子 中 只 有 一 个 密 码 子 对 应 。 Cys SS SN 图 11.1 通用 遗传 密码 子 。 氨 基 酸 以 三 字符 命名 ( 见 文 杠 22.1)。 无 义 密码 子 根据 名 字 定 义 ,注意 密码 子 AUG 和 UGA。 读 框 1 …AGCAGCAGCAGSAG. -Ser-Ser-Ser-Ser-… 读 框 2 .AGCAGCAGCAGCA G.… -Ala-Ala-Ala-Ala-.… 读 框 3 vvAGCAGCAGCAGCAG...， -Giln-Gln-Cln-CGlin-… .Met-Ser-Ser-Ser-,. 由 起 始 密码 位 置 ”ATGAGCAGCAGCAG.… 确定 读 框 1 LE 11.2 阅读 框 和 在 蛋白 合成 过 程 中 如 何 选 择 正确 的 阅读 框 。 ”9 11.2 翻译 蛋白 合成 过 程 中 密码 子 的 解 译 ”蛋白 合成 阶段 称 为 翻译 , 指 对 遗传 信息 的 解 译 , 即 mRNA 中 的 密码 子 和 所 对 应 的 氨基 酸 相 匹配 的 过 程 。 这 一 过 程 需要 转移 RNA(CRNAI) (参阅 ) ,tRNA 结构 中 包括 了 反 密 码 子 (anticodon) (与 密码 子 互补 的 三 碱 基 序列 ) 和 一 共 价 结合 氨基 酸 的 受 体 柄 。 当 tRNA 与 氨基 酸 结 合 即 被 装载 , 称 为 氨 酰 妇 NA(aminoacyl- tRNA)。 氮 酰 tRNA 进入 核糖 体 A 位 点 , 反 密 码 子 与 密码 子 配 对 。 在 这 个 位 置 上 ,氨基 酸 处 于 与 核糖 体 肽 基 转 移 酶 活性 位 点 邻近 的 位 置 , 后 者 催化 氨基 酸 从 tRNA 转移 到 存在 的 多 肽 链 上 ( 详 见 蛋白 合成 一 章 )。 翻译 的 保 真 度 ”翻译 过 程 的 精确 性 通过 不 同 氨 酰 tRNA 合成 酶 家 族 来 控制 , 氨 酰 tRNA 合成 酶 的 功能 是 负责 tRNA 与 其 相应 氨基 酸 的 结合 。 这 些 酶 对 底 物 的 专 一 性 是 通过 特殊 识别 机 制 ,而 不 是 和 任何 特殊 结构 相关 (参见 核酸 结合 蛋白 )。 有 多 少 氨基 酸 就 有 多 少 氮 酰 tRNA 合成 酶 ,每 种 酶 都 能 识别 所 有 的 同 工 tRNA( 人 参阅 )。 转移 RNA 的 装载 有 两 个 阶段 , 称 为 激活 和 转移 ,二 者 都 可 以 被 校正 。 在 激活 (activa- tion) 过 程 中 ,氨基酸 与 氨 酰 tRNA 合成 酶 相连 ,产生 活化 复合 物 ; 这 过 程 依 赖 于 ATP 结合 和 水 解 。 很 多 氮 酰 tRNA 合成 酶 与 氨基 酸 的 结合 是 一 步 识别 ,如 果 氨 基 酸 与 激活 位 点 不 匹配 就 将 其 抛弃 ( 色 氮 酸 就 是 以 这 种 方式 识别 的 )。 那 些 在 类 似 底 物 ( 如 两 氨 酸 和 有 异 亮 氢 酸 ) 之 间 选 择 的 氨 酰 RNA 合成 酶 可 能 在 识别 步骤 时 两 种 底 物 中 的 任 一 个 都 能 结合 ,而 在 以 后 的 阶段 将 不 正确 的 氨基 酸 抛 弃 。 在 转移 过 程 中 ,激活 的 复合 物 结合 tRNA, 氨 栈 基 团 从 酶 转移 到 tRNA 的 3 端 腺 味 叭 上 ,并 释放 出 AMP。 根 据 反 应 的 性 质 , 氢 酰 tRNA 合成 酶 分 为 两 类 :I 类 酶 将 氨基 酸 转 移 到 3 “羟基 而 II 类 酶 将 氨基 转移 到 2 羟基 端 。 酶 开始 与 tRNA 开始 的 作用 引起 构象 的 改变 ,如 上 文 所 述 , 如 果 氨 基 酸 不 正确 就 将 其 抛弃 (转移 前 校正 ) 。 氮 基 酸 转移 到 tRNA 后 , 酶 识别 产物 的 外 形 , 如 果 tRNA 装载 不 正确 就 水 解 肽 键 (转移 后 校正 ) 。 转 移 前 后 的 选择 称 为 双 筛 校正 (two sieve proofreading mechanism) 。 11.3 密码 子 的 特殊 属性 同 工 tRNAs 和 摇摆 碱 基 配 对 遗传 密码 表现 出 两 种 类 型 的 简 并 性 :第 一 和 第 二 位 碱 基 的 简 并 性 (密码 子 前 两 位 不 同 碱 基 可 能 编码 相同 的 氨基 酸 ) 和 第 三 位 碱 基 的 简 并 性 (密码 子 不 同 的 第 三 位 碱 基 可 能 编码 相同 的 氨基 酸 )。 对 应 相同 氨基 酸 的 密码 子 称 为 密码 子 家 族 (codon family) ,其 成 员 称 为 同 义 密 码 子 (synonymous codons)。 密 码 子 家 族 规模 最 大 的 为 六 个 ,最 小 为 三 个 (图 11.1)。 第 一 和 第 二 位 碱 基 的 简 并 性 反映 了 存在 同 工 tRNAs 的 存在 。 原 核 和 真 核 生物 都 合 成 大 约 30 种 不 同 种 类 的 tRNA, 但 对 应 遗传 密码 子 的 只 有 21 种 氨基 酸 , 某 些 tRNA 种 类 必然 识别 相同 的 氨基 酸 。 其 中 类 似 的 tRNA 有 相同 的 反 密 码 子 ,它们 在 功能 上 可 相互 替 换 。 而 另 一 些 tRNA 携带 不 同 的 反 密 码 子 ,识别 不 同 的 密码 子 , 它 们 称 为 同 工 tRNAs, 其 相对 丰 度 决定 了 密码 子 的 选择 使 用 (codon usage, 参 阅 ) 。 密码 子 第 三 位 的 简 并 性 可 以 用 Francis Crick 的 摆动 假说 (wobble hypothesis) 来 解释 ， 5 me er 一 -Am、: 摆动 学 说 假定 在 正常 碱 基 配对 原则 中 密码 子 中 第 三 个 碱 基 和 反 密 码 子 第 一 个 碱 基 ( 摆 动 位 置 ) 配 对 较 松 散 , 允许 一 种 tRNA 识别 不 同 的 密码 子 。 这 种 假说 假定 正常 碱 基 在 播 摆 位 置 时 识别 能 力 降低 ,在 某 些 情况 下 只 识别 碱 基 类 型 ( 味 叭 或 喀 啶 ) ,而 不 是 相对 链 的 特殊 的 碱 基 。 这 解释 了 两 种 密码 子 组 成 家 族 的 简 并 性 ,它们 的 第 三 位 不 是 味 叭 就 是 喀 啶 (AAR 编码 赖 氨 酸 ,AGY 编码 丝氨酸 )。 在 另 一 些 情况 下 ,第 三 位 碱 基 是 不 相关 的 ,这 解释 了 四 个 密码 子 家 族 简 并 性 的 存在 (如 CCN 编码 且 氨 酸 )。 此 外 tRNA 中 的 稀有 碱 基 人 允许 非特 异 的 相互 作用 (如 次 黄 味 叭 可 以 腺 味 叭 . 胞 喀 啶 和 尿 喀 啶 配对 )。 摆 动 规则 在 不 同 物种 中 有 所 不 同 ,反映 了 tRNA 修饰 的 差异 。 密码 子 的 使 用 ”密码 子 的 使 用 ,选择 ,偏爱 和 倾向 性 (codon usage,choich,bias or prefer- ence) 指 在 特殊 的 生物 中 密码 子 家 族 中 的 某 些 密码 子 被 更 多 使 用 的 现象 。 这 随 物 种 不 同 而 不 同 ,所 以 简 并 的 氨基 酸 通常 仅 由 代表 它们 的 密码 子 中 的 一 种 或 几 种 编码 ,而 且 在 不 同 生物 体 中 主要 的 密码 子 不 同 。 第 一 和 第 二 位 碱 基 倾 向 性 反映 了 不 同 同 工 tRNA 种 类 的 相 对 丰 度 。 第 三 位 碱 基 倾 向 性 反映 了 在 复杂 的 摆动 规则 中 某 种 配对 构象 更 稳定 。 不 管 是 哪 种 情况 ,密码 子 的 使 用 可 以 作为 基因 调控 的 一 种 机 制 (如 一 个 稀有 密码 子 可 以 延迟 蛋白 合 成 )。 密 码 子 的 偏爱 可 以 是 由 于 总 体 效应 所 引起 ,如 嗜 热 菌 偏爱 包含 鸟 味 哈 和 胞 喀 啶 的 密 码 子 来 保持 较 高 的 GC 含量 。 遗传 密码 的 不 确定 性 ”遗传 密码 在 大 部 分 情况 下 是 明确 的 ,这 种 属性 对 遗传 信息 的 忠 实 翻译 非常 重要 。 但 存在 两 种 允许 密码 子 不 确定 性 的 特定 环境 , 因 其 情况 的 特殊 性 ,所 以 并 不 影响 翻译 的 保 真 度 。 翻译 起 始 中 可 以 观察 到 不 确定 性 。 通 用 起 始 密码 子 AUG 在 内 部 位 点 和 起 始 位 置 编 码 甲 硫 氨 酸 ( 原 核 生 物 和 细胞 器 中 起 始 甲 硫 所 酸 被 修饰 成 N - 甲 酰 甲 硫 氨 酸 )。 在 细菌 中 ,还 可 以 选择 性 使 用 其 他 起 始 密码 子 : 如 在 深 黄 色 微 球菌 (Micrococcxws 1utervs ) 中 一 般 为 GUG, 在 大 肠 杆菌 中 偶尔 为 GUG 和 UUG( 这 些 密码 子 在 内 部 位 点 为 瑚 氨 酸 和 亮 氨 酸 ,但 在 起 始 位 点 总 是 N - 甲 酰 甲 硫 氨 酸 )。 在 真 核 生 物 基 因 组 中 很 少 有 不 同 的 起 始 密码 子 , 虽 偶尔 用 CUG。 这 种 类 型 的 不 确定 性 反映 了 和 蛋白 合成 中 起 始 和 延伸 阶段 的 不 同 分子 环 境 在 大 肠 杆 菌 中 甲 硫 氨 酸 不 插入 内 部 的 GUG 和 UUG 位 点 ( 详 见 蛋白 合成 一 章 )。 第 二 种 情况 是 在 由 内 部 插 人 稀有 的 硒 代 半 胱 氨 酸 。 这 种 氨基 酸 与 半 胱 氨 酸 类 似 , 以 硒 代 替 了 硫 , 为 有 些 称 为 硒 蛋白 (selenoproteins) 或 硒 酶 (selenoenzymes) 的 几 种 基因 产物 的 有 效 功 能 所 需 。 大 多 数 蛋 白质 中 不 常用 氨基 酸 是 翻译 后 加 工 的 产物 ,但 硒 代 半 胱 氢 酸 是 参 人 前 由 丝氨酸 的 修饰 产生 ,然后 与 其 对 应 的 tRNA 结合 。 硒 代 半 胱 氨 酸 由 通常 为 终止 密码 子 的 UGA 定义 。 在 编码 硒 蛋 白 的 mRNA 中 , 称 为 硒 代 半 胱 氨 酸 播 入 序列 (seleno- cysteine insertion sequence,SECIS ) 的 二 级 结构 使 蛋白 合成 装置 翻译 这 种 密码 子 , 具 体 的 机 制 目前 还 不 清楚 。 在 细菌 中 ,SECIS 位 于 mRNA 编码 区 ,而 在 真 核 生 物 中 ,SECIS 位 于 3? 端 非 翻 译 区 。 与 大 肠 杆 菌 SECIS 相互 作用 的 蛋白 已 被 发 现 。 标准 遗传 密码 的 歧化 ”遗传 密码 的 通用 性 是 很 明显 的 ,被 研究 的 生物 物种 越 多 ,密码 排 布 (codon assignment) 的 差异 也 就 更 多 地 被 发 现 ( 表 11.2)。 大 多 数 了 衍生 发 生 在 线粒体 基 因 组 中 ,可 能 与 它们 编码 的 蛋白 种 类 较 少 有 关 。 但 在 植物 细胞 器 中 ,RNA 编辑 (参见 ) 是 主要 的 ,目前 还 不 清楚 植物 中 遗传 密码 的 歧化 是 真 的 变异 还 是 翻译 前 RNA 编辑 的 结果 。 * 2 。 细菌 基因 组 和 真 核 生物 细胞 核 基因 组 中 密码 子 偶尔 也 有 改变 ,但 常 发 生 在 终止 密码 子 处 。 这 些 改变 的 系统 分 布 表明 密码 子 仍 在 演变 。 除 了 这 些 固定 的 改变 ,还 有 位 点 专 一 性 的 密 码 子 排 布 的 改变 ,如 特殊 的 密码 子 因为 其 位 置 的 缘故 ,以 非常 规 方式 被 打 断 。 如 上 文 所 讨 论 的 ,这 样 的 效应 包括 在 UGA 密码 子 处 插入 硒 代 半 胱 氨 酸 ,终止 密码 子 通读 ,阅读 框 的 移动 和 绕 路 (参见 翻译 调节 )。RNA 编辑 (参阅 ) 也 被 认为 是 正常 遗传 密码 的 一 种 歧化 。 表 11.2 “密码 子 排 布 的 变化 密码 子 AGR UGA UGA 通用 的 翻译 Lys 终止 系统 一 些 动物 的 线粒体 果 蝇 线粒体 大 部 分 动物 线粒体 背 椎 动物 线粒体 一 些 动物 和 酵母 线粒体 圆柱 念珠 菌 (Cazmzaiaa cylirzcyracea ) 细 胞 核 基 因 组 酵母 线粒体 一 些 纤毛 虫 (ciliate) 细 胞 核 基 因 组 [如 四 膜 虫 (Tetrahymzera ) ] 动物 和 酵母 线粒体 基因 组 支原体 基因 组 一 些 纤毛 虫 (ciliate) 细 胞 核 基因 组 [如 游 纤 例外 系统 中 的 翻译 Asp Ser Try Cys 虫 属 ( Euzlotes)] 第 二 种 遗传 密码 tRNA 对 核酸 顺序 信息 的 识别 是 遗传 密码 的 基础 。 其 他 生物 体系 也 依赖 于 对 核酸 顺序 信息 的 识别 , 主要 是 控制 转录 和 其 他 DNA 功能 的 蛋白 与 DNA 的 结 合 。 对 控制 序列 专 一 性 的 蛋白 -核酸 相互 作用 的 “氨基 酸 密码 ”的 研究 表明 不 存在 通用 的 序列 对 序列 的 对 应 关系 。 然 而 对 某 些 蛋 白 家 族 而 言 ,识别 的 密码 已 开始 被 描述 (参见 核酸 结合 蛋白 )。 7 (徐汇 评 ) 第 12 章 基因 组 与 作 图 基本 概念 和 定义 基因 组 (genome) 是 细胞 中 全 部 的 遗传 信息 ,包含 了 细胞 发 挥 功能 所 需 的 “程序 "。 它 被 认为 是 所 有 的 遗传 物质 ,或 者 当 同样 信息 存在 多 个 拷贝 时 ,单个 信息 拷贝 的 遗 ， 传 物质 (后 者 有 时 称 为 单 倍 体 基 因 组 ) 。 细 胞 基因 组 中 多 余 的 拷贝 数 称 为 染色 体 倍 数 性 (ploidy) 。 在 真 核 生 物 中 ,大 于 99% 的 DNA 在 核 基因 组 (nuclear genome) 中 ， 但 细胞 器 中 也 存在 DNA( 参 见 细胞 器 基因 组 )。 细 菌 和 细胞 器 的 基因 组 较 小 ,通常 是 单个 环 状 染色 体 ,但 也 有 报道 存在 一 些 线性 的 细菌 基因 组 。 真 核 生 物 核 基因 组 相对 大 得 多 ,分 成 多 个 线性 染色 体 。 病 毒 基因 组 结构 变化 很 大 (进一步 讨论 见 病 毒 六 基因 组 不 是 简单 的 基因 随机 组 合 。 它 们 有 功能 性 的 高 级 结构 ,能够 根据 它们 的 物 理 = 化 学 性 质 和 顺序 组 成 得 到 描绘 。 大 部 分 生物 的 DNA 可 以 分 为 几 种 序列 成 分 : 只 出 现 一 次 的 单一 顺序 DNA(unique sequence DNA) 和 不 同类 型 的 重复 DNA (repetitive DNA) 。 大 多 数 基因 是 在 单一 顺序 DNA 中 发 现 ,但 在 中 等 重复 DNA 中 也 有 与 高 度 保守 的 多 基因 家 族 相 对 应 的 基因 。 其 他 重复 DNA 顺序 不 被 转录 ,由 分 散 分 布 的 重复 顺序 (经 常 对 应 于 活性 的 或 突变 的 转 座 因 子 ) 或 真 核 生 物 中 简单 顺序 的 随机 重复 (其 中 一 些 在 染色 体 功 能 中 起 作用 ) 组 成 。 细菌 和 真 核 生 物 基 因 组 及 高 等 和 低 等 真 核 生 物 基 因 组 之 间 在 基因 结构 和 基因 在 基 因 组 中 的 组 织 方式 存在 显著 不 同 。 细 菌 和 很 多 低 等 真 核 生 物 有 高 度 复杂 和 高 基因 密度 的 小 基因 组 :基因 组 的 绝 大 部 分 是 可 表达 的 单一 DNA 顺序 。 基 因 小 且 一 般 没 有 内 含 子 。 相 反 ,高 级 真 核 生 物 基因 组 大 , 主要 是 非 编码 的 DNA, 可 以 是 单一 或 重 复 顺 序 。 基 因 在 大 小 上 变化 很 大 ,经 常 包含 多 个 内 含 子 ,内 含 子 一 般 比 外 显 子 大 。 基因 间距 离 较 大 。 细 菌 中 ,基因 经 常 根据 功能 成 能 排列 成 操纵 子 ,但 在 真 核 生 物 中 很 少 如 此 。 状 椎 动物 基因 组 对 应 于 染色 体 带 型 ,在 基因 密度 上 有 区 域 差 别 。 在 一 些 细菌 中 ,基因 方向 反映 了 复制 起 始 的 位 置 。 目前 在 国际 范围 内 正 对 人 类 和 选择 的 模式 生物 (model organisms) 基 因 组 进行 作 图 和 测序 。 这 包括 养 椎 动物 ,如 小 鼠 和 河豚 鱼 , 它 们 的 基因 组 作 图 除了 本 身 的 用 处 ， 其 图 谱 还 可 用 于 人 类 基因 组 计划 的 探索 (参见 比较 作 图 ) , 像 大 肠 杆菌 、 啤 酒 酿酒 酵 母线 虫 和 黑 腹 果 蝇 等 物种 作为 实验 室 模型 广泛 用 于 不 同 生物 系统 的 研究 ,是 分 子 生物 学 研究 的 基础 。 有 三 类 重要 的 基因 组 作 图 :细胞 遗传 .遗传 学 和 物理 作 图 ,其 分 辩 率 渐次 增加 。 最 终 物 理 作 图 是 基因 组 测序 (分 辩 率 是 1 个 核 苷 酸 )。 一 个 元 整 "28 “> 的 基因 组 序列 是 无 价 的 ,因为 它 提 供 了 基因 结构 、 调 节 、 功 能 和 表达 的 信息 ,不 同 有 机 体 进 化 关系 ,基因 组 高 等 结构 的 性 质 和 基因 组 进化 。 基 因 组 序列 有 很 多 商业 应 用 ,如 药物 开发 、 工 业 生 产 的 疫苗 和 酶 。 基 因 图 谱 是 定位 克隆 (positional cloing, 参 阅 ) 的 先决 条 件 。 在 基因 密度 低 的 高 度 真 核 生 物 基 因 组 中 ,集中 分 析 表 达 的 DNA 十 分 有 用 (参见 转录 作 图 )。 12.1 基因 组 、 染 色 体 倍 数 性 和 染色 体 数目 : 染色 体 倍 数 性 ”一 个 细胞 中 特定 基因 的 拷贝 数目 定义 为 其 剂量 ,而 整个 基因 组 的 拷贝 数 被 定义 为 细胞 的 倍数 性 (ploidy)。 在 真 核 生物 中 这 就 是 染色 体 组 的 数目 。 真 核 细 胞 如 果 只 有 一 组 染色 体 则 是 单 倍 体 (haploid)2 ,有 两 组 则 为 二 倍 体 (diploid) 。 在 细胞 周期 中 真 核 细胞 的 倍数 性 会 发 生 改 变 。 在 DNA 复制 中 ,染色体 倍数 加 倍 , 而 在 减 数 分 裂 中 减 半 。 增殖 细胞 的 正常 染色 体 倍 数 是 根据 它 出 生 时 染色 体 的 套数 决定 。 由 于 藤 套 式 复 制 (参见 Helmstetter-Cooper 模型 ) 细 菌 细胞 的 有 效 染色 体 倍 数 随 生长 速度 改变 ,接近 复制 起 点 的 基因 剂量 尤其 大 。 染色 体 数 目 在 真 核 生 物 中 ,一 倍 体 数目 (monoploid number)(z ) 是 代表 基因 组 一 份 拷 贝 的 染色 体 的 数目 ,也 就 是 一 套 染 色 体 中 染色 体 的 数目 。 单 倍数 (haploid number)(z ) 是 配子 中 染色 体 的 数目 。 在 大 多 数 真 核 生 物 中 ,配子 包含 一 套 染 色 体 ,也 就 是 元 = 工 ,但 对 于 往往 是 多 倍 体 的 植物 , ” 是 多 份 x。 二 倍 体 数目 (diploid number)(2” ) 通 常用 来 描述 大 多 数 动物 体 细胞 中 染色 体 总 数 ,是 核 型 的 基础 (参见 下 文 )。C - 值 是 单 倍 体 基 因 组 中 DNA 的 总 量 , 它 可 以 用 碱 基 对 、 相 对 分 子 量 或 准确 分 子 量 来 表示 。 偶 尔 ,染色 体 倍 数 性 可 以 以 C- 值 表示 ,如 二 倍 体 细 胞 是 2C。 核 型 (karyotype) 是 描述 总 染色 体 数目 和 性 染色 体 构 象 的 简单 方法 。 例 如 ,人 类 男性 体 细 胞 的 核 型 为 46,XY ,女性 是 46,XX。 在 异常 细胞 中 , 核 型 增加 的 信息 表示 了 特定 染 色 体 异常 (参见 表 4.1)。 核 型 图 (karyogram) 在 另 一 方面 是 同 源 配对 染色 体 染 色 图 谱 , 用 来 鉴定 染色 体 异 常 (参见 染色 体 分 带 )。 12.2 基因 组 的 物理 化 学 性 质 碱 基 组 成 ”基因 组 可 以 根据 它们 的 物理 化 学 性 质 来 描绘 。 既 然 所 有 细胞 基因 组 都 是 DNA, 基 因 组 之 间 的 物理 化 学 性 质 的 差异 反映 了 两 种 性 质 之 一 : 碱 基 组 成 (base composi- tion) 的 大 量 差 异 ( 腺 叶 叭 /胸腺 喀 啶 和 胞 喀 啶 / 岛 味 叭 的 相对 量 ) 或 是 DNA 甲 基 化 (参阅 ) 1) 单 倍 体 这 个 术语 严格 说 来 是 “染色 体 倍数 的 一 半 " 且 被 固定 用 来 描述 配子 的 状态 (其 染色 体 倍数 是 减 数 分 裂 细 胞 的 一 半 )。 由 于 大 部 分 减 数 分 裂 细胞 都 是 二 倍 体 ,大 部 分 单 倍 体 细胞 具有 -- 套 染色 体 ,因此 这 个 术语 被 用 于 描述 一 组 染色 体 的 细胞 。 但 带 有 6 套 染色 体 植物 的 配子 严格 说 来 也 应 称 为 单 倍 体 (monoploid) ,虽然 这 些 配 子 具有 三 套 染色 体 ,也 是 三 倍 体 。 一 倍 体 术语 是 特 指 那些 只 具有 一 套 染 色 体 的 细胞 ( 见 第 4 章 染色 体 突变 )。 . 124 . 程度 的 不 同 。A:T 碱 基 对 包含 两 个 氢 键 而 G:C 对 有 三 个 。G:C 碱 基 对 含量 高 增加 了 基 因 组 的 物理 稳定 性 ,因为 它 需 要 更 多 的 能 量 才能 将 链 分 开 。 高 G: C 碱 基 对 含量 与 高 热 熔 解 温 度 有 关 ( 参 见 核酸 杂交 )。 同 样 G:C 碱 基 对 的 相对 分 子 量 要 大 于 A:T 碱 基 对 ,GC 丰 富 的 DNA 的 浮力 密度 大 于 AT 丰富 的 DNA。 甲 基 化 也 能 增加 浮力 密度 (参见 浮力 密度 梯度 离心 .卫星 DNA) 碱 基 组 成 可 以 用 两 种 方法 表示 。 碱 基 比 例 (base ratio)[ 也 称 为 不 对 称 比 例 (dis- symetry ratio) 或 Chargaff 比例 (Chargaff ratio) ] 用 于 微生物 DNA。 它 定义 为 (A+T)X(G +C) ,以 一 数字 表示 。 碱 基 比 例 大 的 物种 称 为 AT 型 (AT types) , 碱 基 比 例 小 的 称 为 GC 型 (GC types) 。GC 百分比 含量 ( % GC content) 适 用 于 所 有 基因 组 。 它 定义 为 (G+ C)X(A + 下 +C+G) ,以 百分数 表示 。 嗜 热 生 物 经 常 是 GC 型 (高 GC 含量 ) ,因为 G:C 丰富 的 基 因 组 有 助 于 在 高 温 下 维持 DNA 的 双 链 。 不 同 有 机 体 的 GC 含量 在 表 12.1 中 表示 。 表 12.1 一 些 生物 的 基因 组 数据 各 基因 组 大 小 复杂 性 (%) GC 含 量 (%) 基因 数目 入 噬菌体 45kbp >99 48 100 大 肠 杆菌 4.7Mbp 99 51 4100 啤酒 酿酒 酵母 13.5 Mbp 90 41 6300 和 裂 殖 非 洲 栗 酒 酵母 20 Mbp 90 6000 盘 基 网 柄 菌 47 Mbp 70 23 7000 秀丽 隐 杆 线虫 100 Mbp 83 14000 黑 腹 果 蝇 165 Mbp 70 39 12000 河豚 鱼 400 Mbp >90 44 70000 担 尼 鱼 1.9Gbp 70000 非洲 爪 蟾 2.9 Gbp 54 50 70000 小 鼠 3.3 Gbp 58 41 70000 人 3.3 Gbp 64 40 70000 拟 南 芥 70Mbp 80 25000 复杂 性 是 以 单一 DNA 顺序 的 百分比 来 表示 的 ,基因 数目 是 指 从 基因 组 测序 计划 中 获得 。 完 全 的 基因 组 顺序 尚未 获得 的 情况 中 ,复杂 性 是 通过 现 有 顺序 的 资料 进行 推测 来 评价 的 。 碱 基 比 例 和 GC 含量 是 整个 基因 组 中 平均 值 。 但 在 大 多 数 基因 组 中 碱 基 组 成 有 变 化 ,使 一 些 区 域 AT 丰富 , 另 一 些 GC 丰富 。 在 较 小 的 基因 组 中 , 碱 基 组 成 的 区 域 差 别 通 过 变性 作 图 (denaturation mapping) 鉴 定 : 当 基 因 组 部 分 变性 后 用 电子 显微镜 观察 ,AT 丰 富 区 域 形 成 泡 结构 。AT 丰富 和 GC 丰富 DNA 的 不 同化 学 行为 与 哺乳 动物 染色 体 观 察 到 的 带 型 有 关 ( 参 见 等 容 线 模型 ) ,两 种 不 同 荧光 染料 的 不 同 结合 能 力 可 用 来 将 单个 染色 体 分 离 ( 参 见 流 式 分 离 )。 非 特征 性 碱 基 组 成 的 染色 体 区 域 的 存在 经 常 是 物种 间 水 平 转移 的 标志 (参见 密码 子 选 择 ) ;在 细菌 中 ,很 多 致 病 性 岛 (pathogenicity islands) 一 水 平 转移 的 致 “说 5 3， 病 性 基因 一 就 是 以 这 种 方式 被 鉴定 的 。 12.3 基因 组 大 小 和 序列 组 成 基因 组 大 小 和 复杂 性 单 倍 体 基 因 组 中 总 DNA 的 量 (C - 值 ) 预 期 随 物 种 生物 复杂 性 的 增加 而 增加 ,因为 较 复 杂 的 生物 需要 更 多 的 基因 产物 。 这 在 广义 上 是 正确 的 : 肴 椎 动物 一 般 比 无 脊椎 动物 有 更 多 的 DNA, 后 者 比 真 菌 多 ,真菌 比 细菌 多 ,而 细菌 比 病毒 多 。 在 每 个 门 中 最 小 的 基因 组 的 大 小 看 来 是 根据 生物 复杂 性 增加 ,但 在 类 似 的 物种 中 C- 值 也 有 反常 的 差异 ,在 每 个 门 中 产生 C - 值 的 扩展 。 在 两 栖 动物 的 极端 例子 中 ,最 小 和 最 大 基因 组 有 两 个 数量 级 的 差别 。 更 有 甚 者 ,最 大 的 昆虫 基因 组 比 最 大 的 哺乳 动物 基因 组 大 ,而 所 有 物种 中 最 大 基因 组 是 显 花 植物 。 这 样 的 现象 不 能 仅 用 所 需要 的 基因 产物 来 解 释 , 集 中 显示 了 C- 值 矛盾 (C - value paradox) 。 这 种 矛盾 可 以 用 很 多 真 核 生物 基因 组 中 主要 是 非 编 码 DNA 来 解释 。 非 编码 DNA 可 能 是 重复 DNA 或 单一 顺序 DNA 中 都 有 发 生 。 基 因 组 的 复杂 性 (complexity) 由 单一 顺 序 DNA 的 总 和 来 定义 ,可 以 用 物理 单位 (参见 碱 基 对 、 皮 克 ) 或 更 经 常 是 总 基因 组 的 百 分 比 来 表示 ( 表 12.1)。 重 复 DNA 的 存在 最 早 是 通过 重新 组 合 动力 学 ( 文 框 12.1) 被 发 现 并 部 分 解释 了 C - 值 矛 盾 。 同 一 门类 中 C - 值 的 差异 主要 反映 了 对 基因 组 复杂 性 没有 贡献 的 重复 顺序 DNA 的 含量 的 差异 。 当 将 重复 顺序 DNA 考虑 在 内 时 ,在 有 类 似 生 物 复 杂 性 的 物种 间 仍 存在 基因 组 大 小 的 不 一 致 性 ,特别 是 在 一 群 单 细 胞 有 机 体 中 间 进 行 比 较 时 。 例如 酿酒 酵母 中 的 C - 值 大 约 为 13.SMbp ,而 另 一 种 酵母 , 裂 殖 酵 母 接近 20Mbp。 这 两 种 有 机 体 有 类 似 的 结构 复杂 性 和 较 少 的 重复 顺序 DNA。 差 异 反映 了 非 编码 的 单一 顺序 DNA 之 间 的 不 同 , 如 基因 间 DNA 片段 和 内 含 子 : 裂 殖 酵母 40% 的 基因 有 内 含 子 , 而 酿酒 酵母 只 有 4% 基 因 有 内 含 子 。 在 更 高 等 的 真 核 生物 中 ,基因 间 区 域 和 内 含 子 更 大 ,内 含 子 数量 更 多 ,使 基因 的 平均 大 小 和 基因 间距 离 增加 。 DNA 序列 成 分 的 分 布 状态 和 功能 ”在 细菌 中 基因 组 的 绝 大 部 分 是 单一 序列 DNA, 代 表 基 因 和 调节 元 件 。 一 些 基 因 和 其 他 序列 是 重复 的 ,但 拷贝 数 (或 重复 频率 ) 一 般 很 低 , 经 常 <10。 这 样 的 重复 序列 的 例子 包括 rRNA 基因 (在 大 肠 杆 菌 中 有 7 个 ) 和 可 转 座 的 因子 如 IS 因子 (参阅 )。 偶 尔 特定 的 序列 基 序 也 可 被 适度 重复 。 在 1.8Mbp 的 流感 嗜 血 杆 菌 (Haoemobpjpilus 加 juenzxae) 基 因 组 中 ,有 大 约 1500 个 拷贝 的 30bp DNA 吸收 位 点 (参见 转 化 )。 类 似 的 大 肠 杆菌 基因 组 包含 了 两 个 重复 元 件 ERIC( 肠 细菌 重复 内 在 共有 顺序 ) 和 REP( 重 复 基 因 外 回 文 顺序 ) 的 多 个 拷贝 。 总 之 细菌 重复 顺序 DNA<1% , 它 的 基因 组 大 小 直接 反映 了 其 复杂 性 。 在 真 核 生物 中 ,重复 DNA 占 基 因 组 的 很 大 一 部 分 。 所 占 比 例 在 不 同 物种 中 差别 很 大 ,在 某 些 真 核 微 生物 中 低 至 5% ,在 哺乳 动物 中 占 40% ~ 50% , 而 在 一 些 显 花 植 物 中 高 至 80%。 最 初 复 性 实验 ( 文 框 12.1) 表 明了 真 核 DNA 可 被 分 为 三 种 组 分 ,单一 序列 DNA, 中 等 重复 DNA 和 高 度 重复 DNA, 这 将 在 下 文中 详细 讨论 。 基 因 组 DNA 可 以 根据 他 们 在 细胞 中 的 功能 来 分 类 ( 表 12.2)。 7 8 表 12.2 真 核 生 物 基 因 组 成 分 根据 含量 和 功能 分 类 DNA 类 型 定 汪 多 根据 含量 单一 顺序 ( 单 拷贝 , 低 拷贝 , 非 重 ”每 个 基因 组 中 顺序 出 现 一 次 或 很 少 次 。 包 括 大 部 分 基因 和 内 含 子 , 调 节 顺 序 和 复 顺序 DNA) 其 他 未 知 功能 的 DNA。 中 等 重复 顺序 DNA 每 个 基因 组 中 出 现 10 一 10 000 个 拷贝 。 一 般 是 代表 高 度 保 守 的 多 基因 家 族 的 分 散 重 复 顺 序 (功能 基因 和 假 基因 ) 和 转 座 因子 。 偶 尔 成 篮 排 列 。 高 度 重 复 顺序 每 个 基因 组 中 出 现 10 000 一 1 000 000 个 拷贝 的 序列 。 一 般 作 为 随机 重复 顺序 被 发 现 ,一 些 超 丰 度 的 (弥散 的 ) 转 座 因 子 也 属于 这 类 (如 Alu 元 件 )。 根据 功能 基因 DNA 基因 , 即 可 以 表达 的 DNA。 基 因 DNA 可 以 进一步 分 为 mDNA( 编 码 蛋 白 )、 IDNA\tDNA、snDNA 等 ,代表 了 不 同 的 基因 产物 。 调节 DNA DNA 的 功能 是 调节 基因 表达 (如 启动 子 、 增 强 子 ) 或 调节 DNA 功能 (如 复制 起 始 区 , 核 基质 结合 区 域 )。 基因 内 DNA, 间 隔 DNA 内 含 子 和 分 隔 基因 的 DNA。 卫星 DNA 靠近 着 丝 粒 、 端 粒 和 其 他 位 置 的 高 度 重复 DNA, 有 些 卫星 DNA 在 染色 体 功能 中 发 挥 作用 。 自在 DNA 功能 是 介 导 自身 在 基因 组 中 的 复制 和 生存 ,如 一 些 卫 星 DNA 和 转 座 因子 。 无 用 DNA 没有 确定 功能 的 DNA。 12.4 基因 结构 和 高 级 基因 组 组 织 DNA 序列 成 分 中 基因 分 布 在 高 等 真 核 生物 中 ,大 多 数 基因 被 认为 处 于 单一 顺序 DNA 中 ,因为 它们 的 存在 可 以 通过 单一 突变 被 定义 。 如 果 基 因 是 重复 的 ,观察 到 表 型 突 变 需 要 几 个 突变 同时 发 生 ,这 样 会 缺乏 维持 多 拷贝 的 选择 压力 (参见 功能 过 剩 )。 细 菌 和 低 等 真 核 生物 的 基因 致密 基因 组 主要 是 单一 顺序 DNA 组 成 。 追 踪 重 新 组 合 实验 首先 表 明 高 等 真 核 生 物 的 大 多 数 基因 确实 在 单一 DNA 顺序 中 , 这 还 被 单个 克隆 基因 的 DNA 基 因 组 杂交 所 证 实 。 通过 逐渐 降低 杂交 分 析 的 严格 性 , 越 来 越 多 的 基因 被 发 现 是 中 等 重复 顺序 成 分 ,表明 基因 属于 不 同 程度 序列 保守 的 多 基因 家 族 。 在 高 严格 的 条 件 下 ,重复 顺序 DNA 中 被 鉴 定 的 基因 是 高 度 保 守 或 是 完全 一 样 的 多 基因 家 族 (如 fRNA 基因 和 组 蛋白 基因 )。 属 于 多 基因 家 族 的 基因 所 占 比 例 在 不 同 物种 间 有 差异 。 在 大 肠 杆菌 中 ,最 近 发 表 的 基因 组 序列 数据 表明 在 这 种 细菌 中 高 达 一 半 的 基因 属于 多 基因 家 族 ,而 其 他 细菌 中 比例 要 小 得 多 (如 在 流感 哮 血 杆菌 中 是 23% 一 30% )。 这 可 能 反映 了 大 肠 杆菌 的 不 同 生活 方式 ,如 它们 所 需 的 营养 条 件 。 在 哺乳 动物 中 ,真正 单一 基因 的 比例 还 要 小 ,大 部 分 人 类 基因 属于 多 基因 家 族 ,有 些 家 族 包含 了 上 千 个 成 员 。 这 可 能 反映 了 发 生 在 兰 椎 动物 谱系 中 的 基因 组 复制 和 家 族 扩 展 (参见 第 22 章 蛋 白质 :结构 功能 与 进化 ) 。 基 因 组 中 多 基因 家 族 的 结构 和 组 织 在 下 文中 讨论 。 基因 大 小 和 内 含 子 -外 显 子 结构 ”细菌 基因 较 小 (平均 1kbp) , 且 在 大 小 上 变化 不 大 ,而 .127 . 高 等 真 核 生 物 基 因 较 大 (平均 16kbp) , 且 大 小 变化 很 大 。 哺 乳 动物 中 最 小 的 基因 与 细菌 基因 相当 (如 人 类 的 w- 干扰 素 基 因 < 1kbp) ,但 很 多 超过 100kbp DNA 大 小 ,目前 发 现 的 最 大 基因 是 人 类 的 肌 营 养 不 良 蛋 白 基 因 , 有 2500kbp 长 。 尽管 高 等 真 核 生物 基因 一 般 比 细菌 基因 大 得 多 ,从 它们 中 得 到 的 mRNA 并 非 如 此 。 这 样 的 差异 是 由 内 含 子 (introns) 引 起 的 :内 含 子 是 打 断 转录 单位 的 间 插 序列, 必须 在 RNA 水 平 上 去 除 (参见 第 27 章 RNA 加 工 )。 转 录 单 位 余下 部 分 通过 剪接 结合 起 来 并 表 达 称 为 外 显 子 (exons) 。 基 因 大 小 与 基因 中 外 显 子 比例 成 反比 。 细 菌 基因 一 般 缺 乏 内 含 子 ,100% 是 外 显 子 。 内 含 子 在 很 多 真 核 微生物 中 也 很 少 ( 如 酿酒 酵母 ) ,它们 的 基因 一 般 大 小 为 1 一 2kbp 与 细菌 类 似 ! 。 在 人 类 中 ,最 小 的 基因 有 很 少 的 内 含 子 上 且 内 含 子 很 小 (如 S$00bp 组 蛋白 H4 基因 没有 内 含 子 )。 相 反 ,最 大 的 基因 有 >>95% 的 内 含 子 。 上 面 提 到 的 肌 营 养 不 良 蛋白 基因 有 78 个 内 含 子 ,平均 大 小 是 30kbp; 只 有 基因 的 0.5% 是 外 显 子 。 然而 高 等 真 核 生 物 的 内 含 子 大 小 和 数量 变化 很 大 ,外 显 子 大 小 则 在 一 狭窄 的 范围 内 。 如 人 类 的 不 连续 基因 中 ,外 显 子平 均 长 度 为 170bp, 在 S0bp 和 300bp 范围 内 变化 。 有 一 些 值 得 一 提 的 例外 ,如 载 脂 蛋白 也 基因 的 26 号 外 显 子 有 7.6kb 长 度 , 但 这 样 的 例子 很 少 。 无 糊 椎 动物 与 脊椎 动物 相 比 有 更 大 的 外 显 子 ,因为 它们 的 内 含 子 极 少 ( 表 12.3)。 对 内 含 子 的 起 源 和 功能 的 讨论 ,参见 第 22 章 蛋 白质 ;剪接 机 制 参见 第 27 章 RNA 加 工 。 表 12.3 不 同 真 核 生物 中 内 含 子 - 外 显 子 的 组 织 。 酿 酒 酵母 很 少 有 被 打 断 的 基因 ,基因 长 度 与 mRNA 长 度 一 致 。 高 度 真 核 生 物 基因 大 小 逐步 加 大 ,但 mRNA 大 小 保持 恒定 。 一 般 基因 大 小 与 内 含 子 数量 成 比例 ,与 外 显 子 含量 成 反比 。 酿酒 酵母 下 3 >95% 不 被 打 断 工 7 100 线虫 4 3 一 4 3 77 果 蝇 11 3 一 4 3 25 人 类 16 67- 信 2 小 13 注 :线虫 与 果 蝇 有 类 似 的 内 含 子 数量 ,但 内 含 子 更 小 ,使 基因 平均 大 小 要 小 一 些 。 基因 数目 和 密度 ” 几 种 微生物 的 基因 数目 通过 基因 组 测序 计划 被 确定 (参见 表 12.1 中 的 例子 )。 细 菌 基因 数目 变化 有 一 个 数量 级 ,从 473( 枝 原 体 ) 到 大 约 8000 (粘液 球菌 )。 而 大 肠 杆菌 大 约 有 4100 个 基因 。 在 基因 数目 上 ,最 大 的 细菌 基因 组 与 低 等 真 核 生 物 相差 不 多 。 酿 酒 酵母 有 6340 个 基因 。 无 脊椎 动物 的 模式 生物 果 蝇 和 线虫 预计 有 了 酬 酒 酵 母 两 倍 的 基因 数量 。 状 椎 动物 代表 了 另 一 层次 的 复杂 性 ,预计 有 大 约 70 000 个 基因 。 这 些 预 计 的 信息 来 自 部 分 基因 组 测序 `CpG 岛 分 析 ( 参 阅 ) 和 EST 方案 (参阅 )。 维持 一 个 独立 生命 有 机 体 所 需 的 最 小 基因 数目 是 多 少 ? 细菌 基因 组 比较 发 现 了 一 系 列 必需 生化 途径 ,并 有 256 个 基因 编码 其 中 的 成 分 。 真 核 生 物 细 胞 建立 复杂 的 细胞 内 结 1) 细菌 基因 经 常 被 定义 为 开放 阅读 框架 ,而 真 核 基因 经 常 被 称 为 转录 单位 ( 见 第 8 章 基因 )。 酵 母 基因 平均 大 小 比 细菌 基因 大 ,部 分 是 因为 酵母 mRNA 包括 了 非 编码 区 。 = 二 构 似 乎 需要 更 多 的 途径 。 多 细胞 生物 调节 发 育 和 分 化 细胞 的 功能 就 需要 更 多 。 然 而 关键 生化 途径 的 数目 在 所 有 后 生动 物 中 类 似 , 因 为 脊 椎 动物 中 大 量 基 因 被 认为 是 通过 整个 基 因 组 的 两 轮 重复 ,加 上 不 同 染 色 体 区 域 和 单个 基因 的 重复 产生 的 。 起 初 过 剩 的 基因 被 用 于 特殊 的 功能 ,经 常 是 因为 表达 模式 的 分 化 ,但 途径 是 高 度 保守 的 。 有 很 多 关于 这 种 假说 的 证 据 趣 谈 : 果 蝇 中 很 多 单 基 因 出 现在 销 椎 动物 中 的 多 基因 家 族 中 。 例 子 包 括 果 蝇 jhedgehog ( 背 椎 动物 的 somic hedgehog , desert hedgehog 和 iaiaz hedgehog ) , 果 蝇 的 同 源 异型 复合 物 ( 糊 椎 动物 的 Foz-A、Hoz-B、Hor-C、Hozr-D 基因 簇 ) ,以 及 编码 信号 蛋白 Ras 和 Raf 的 基因 。 基因 组 中 基因 的 高 度 有 序 组 织 可 以 分 为 结构 组 织 和 功能 组 织 \ 方 向 和 基因 密度 。 枝 原 体 基因 组 中 的 一 个 独特 的 性 质 是 所 有 基因 的 方向 都 是 与 复制 方向 相反 ;这 种 现象 的 意 义 目前 还 不 清楚 。 细 菌 和 真 核 生物 基因 组 最 大 的 不 同 是 细菌 中 功能 相关 而 结构 无 关 的 基 因 组 织 成 操纵 子 。 这 类 组 织 在 真 核 生物 中 明显 缺乏 ,因为 多 开放 阅读 框架 不 能 从 一 共同 的 多 顺 反 子 转录 本 中 翻译 得 到 (参见 操纵 子 、 多 顺 反 子 mRNA、 核 糖 体 结合 位 点 )。 代 替 它 的 是 ,功能 相关 的 真 核 基因 ,如 那些 相同 生化 途径 的 成 分 的 编码 基因 通常 是 分 散 的 。 因 为 串联 重复 ,在 细菌 和 真 核 生物 中 都 有 结构 相关 基因 的 成 复 排 列 ,这 样 的 基因 可 能 是 功能 相关 的 和 处 于 相关 的 转录 调控 下 (如 珠 蛋 白 基 因 和 伐 和 Hoz 基因 簇 )。 细菌 中 基因 密度 最 高 ,平均 每 一 kbp DNA 有 一 个 基因 ,反映 了 操纵 子 中 开放 阅读 框 架 排列 紧密 。 酿 酒 酵母 中 的 基因 密度 大 约 是 细菌 中 的 一 半 , 反 映 了 转录 单位 的 分 离 。 高 等 真 核 生 物 中 基因 密度 的 降低 有 几 个 原因 。 第 一 ,在 越 复杂 的 有 机 体 中 ,内 含 子 越 大 也 越 多 。 第 二 ,重复 序列 DNA 所 占 比 例 也 逐渐 增加 。 第 三 ,因为 需要 更 大 和 更 复杂 的 调节 元 件 ,基因 间距 离 增 加 。 在 这 些 一 般 原 则 中 也 有 例外 ,例如 河豚 鱼 (Fuxwgw rwpbrizpes )。 这 种 东方 豚 鱼 的 基因 组 值得 注意 的 特点 是 高 复杂 性 (>90% ) 和 基因 小 ,反映 了 缺乏 分 散 的 重 复 顺 序 和 基因 组 范围 内 内 含 子 大 小 的 减 小 。 东 方 豚 鱼 中 与 哺乳 动物 大 基因 的 同 源 基 因 ， 如 肌 营 养 不 良 基因 只 有 约 10% 的 大 小 ,但 保留 相同 的 内 含 子 = 外 显 子 结构 ;内 含 子 小 得 多 ,大 多 数 在 30bp 和 150bp 之 间 。 基因 密度 在 整个 高 等 真 核 生 物 中 并 不 是 不 变 的 。 哺 乳 动 物 基 因 组 基因 密度 有 区 域 性 变化 ,反映 了 等 容 线 结构 (参见 等 体 容 线 模型 ) 。 无 脊 椎 动物 基因 组 结构 较 简 单 : 果 蝇 基因 组 分 为 113SMbp 的 基因 富 集 区 和 5$0Mbp 的 基因 缺乏 的 异 染 色 质 区 (参见 重 登 基因 、 谈 套 基因 )。 12.$ 重复 顺序 DNA 多 基因 家 族 ”多 基因 家 族 是 一 个 基因 组 中 同 源 基因 的 家 族 (参见 基因 家 族 )。 在 这 些 基 因 中 ,拷贝 数 、 顺 序 保守 性 、 构 成 、 分 布 状 态 和 功能 相关 性 有 很 大 差异 。 在 一 些 例子 中 ， 家 族 成 员 可 能 非常 相似 或 完全 一 样 (如 rRNA 基因 ) ,在 严格 的 杂交 条 件 下 作为 重复 DNA 被 鉴定 。 在 其 他 一 些 例子 中 ,保守 性 非常 差 , 即 使 通过 序列 比较 也 不 能 发 现 (参见 同 源 性 \ 基 因 超 家 族 )。 经 典 的 多 基因 家 族 是 结构 相似 ,在 整个 编码 顺序 中 保守 。 它 们 可 以 在 特殊 座位 上 成 饶 排 列 (如 人 类 8B- 珠 蛋 白 基 因 六 分 散 的 (如 人 类 肌 动 蛋白 基因 ) 或 者 两 者 都 有 (玉米 醇 溶 蛋白 基因 )。 成 徐 的 多 基因 家 族 的 偶尔 分 散 的 成 员 称 为 孤独 基因 . 129 ， (orphon)D 。 其 他 多 基因 家 族 只 在 特殊 的 对 应 保守 的 蛋白 结构 域 的 亚 基因 区 域 相 同 ( 如 同 源 异 形 基因 在 编码 DNA 结合 的 结构 域 的 180bp 同 源 盒 相关 )。 更 有 其 他 一 些 只 在 一 个 非常 短 的 氨基 酸 基 序 相 关 ( 如 MADS 盒 和 DEAD 盒 RNA 螺旋 酶 基 序 )。 更 为 复杂 的 是 ， 很 多 基因 呈现 为 对 应 不 同 蛋白 结构 域 的 相对 独立 功能 单位 的 艇 合 分 子 , 使 它们 能 够 同时 成 为 几 个 不 同 家 族 的 成 员 。 这 样 的 基因 被 认为 是 通过 祖先 基因 间 的 重组 产生 的 (参见 外 显 子 改组 ) ,可 以 包含 重复 的 编码 信息 (参见 外 显 子 重复 )。 假 基 因 多 基因 家 族 经 常 包含 结构 保守 的 基因 ,它们 是 通过 积累 突变 产生 ,来 满足 不 同 的 功能 需要 。 在 一 些 例子 中 ,突变 使 基因 功能 完全 丧失 ,这 样 的 无 功能 的 基因 拷贝 称 为 假 基因 (pseudogene) , 经 常用 希腊 字母 小 表示 。 根 据 起 源 和 结构 的 不 同 , 假 基 因 分 为 两 类 。 未 加 工 的 假 基 因 (nonprocess pseudogenes) 也 称 为 常规 假 基因 (conventional pseudo- genes) ,是 通过 基因 组 DNA 复制 产生 (参见 第 15 章 突变 与 选择 ) ,经 常 位 于 相同 基因 有 功 能 拷贝 的 附近 。 它 们 与 有 功能 的 同 源 基 因 有 类 似 的 结构 ,可 以 包括 内 含 子 和 调节 元 件 。 这 样 的 假 基 因 在 细菌 和 真 核 生 物 中 都 有 发 现 ,因为 它们 是 积累 突变 ,包括 使 转录 消失 的 调 节 突 变 和 产生 截 短 编码 产物 的 无 义 突变 ,所 以 能 够 被 识别 。 偶 尔 未 加 工 的 假 基 因 可 以 通 过 一 个 有 利 的 突变 重新 激活 。 产 生 未 加 工 假 基 因 的 过 程 也 可 能 产生 部 分 基因 或 截 短 的 拷 贝 。 加 工 的 假 基 因 (processed pseudogenes) 也 称 为 反 转 录 假 基因 (retropseudogenes) ,是 通 过 对 mRNA 的 反 转 录 和 获得 的 EDNA 的 随机 整合 而 产生 ;它们 经 常 是 分 散 的 。 加 工 假 基 因 是 由 反 转 录 因 子 (参阅 ) 编 码 的 反 转 录 酶 和 整合 酶 的 外 来 活性 而 产生 的 ,只 在 真 核 生 物 中 被 发 现 。 加 工 的 假 基 因 结 构 对 应 于 起 源 基因 的 转录 单位 ,缺乏 内 含 子 和 侧翼 顺序 。 为 缺乏 侧翼 顺序 ,加 工 假 基因 一 般 不 表达 ,尽管 它们 偶尔 整合 在 内 源 性 启动 子 附近 ,并 受 它 的 控制 (人 类 编码 丙酮 酸 氢化 酶 的 基因 被 认为 是 这 种 方式 产生 的 )。RNA 聚合 酶 III 有 内 在 的 启动 子 , 所 以 它 的 加 工 的 假 基 因 可 以 表达 。 人 类 高 度 重 复 Alu 元 件 是 表达 的 RNA 聚合 酶 III 加 工 的 假 基因 的 例子 。 结构 和 功能 的 也 余 性 元 余 (redurndant) 序 列 是 在 基因 组 中 出 现 超 过 一 次 的 序列 ,也 就 是 增加 基因 组 大 小 ,并 不 增加 复杂 性 的 序列 。 宛 余 基 因 并 不 必定 是 功能 宛 余 。 一 些 基 因 被 发 现 有 宛 余 拷贝 ,以 产生 足够 基因 产物 (rRNA 基因 属于 这 一 类 ) , 另 一 些 进化 以 实现 不 同 功能 。 功 能 元 余 可 以 通过 当 特 定 基 因 或 元 件 缺 失 造 成 表 型 缺失 来 建立 。 完 全 或 部 分 功能 基因 宛 余 在 多 细胞 有 机 体 的 很 多 定向 突变 中 可 以 看 到 ,即使 同样 的 基因 在 异 位 表达 时 表现 出 显著 的 功能 效应 的 增加 。 另 一 个 例子 是 转录 因子 MyoD, 它 可 以 通过 激活 生 肌 途径 使 很 多 不 同 的 细胞 类 型 转变 成 肌肉 。 当 小 鼠 myoD 基因 删除 (参见 基因 敲 除 ), 同 源 基因 无 效 的 个 体 是 正常 的 。 这 是 因为 另 一 个 转录 因子 ,Myf-5 能 够 对 MyoD 缺 失 进行 补 偿 。 功 能 宛 余 经 常 反映 了 结构 宛 余 (祖先 基因 通过 复制 产生 的 两 份 拷贝 ,如 同上 述 例 1) 孤 独 基 因 与 孤儿 基因 (orphan) 不 同 , 孤 儿 基因 是 在 基因 组 测序 计划 中 发 现 的 ,在 其 他 有 机 体 中 没有 对 应 的 基 因 , 已 确定 它 没有 功能 。 “1 80.。 ER 子 2 ,它们 可 以 补偿 相互 的 功能 缺失 )。 在 其 他 的 情况 中 ,不 同 的 基因 在 相同 的 功能 上 汇 集 , 例 如 几 种 不 相关 的 蛋白 从 两 栖 动物 织 原 中 分 这 一 妥 蛋 白 ,成 头 重 白 , 赛 泡 抑制 素 ; 它 们 的 共同 功能 是 阻 断 TGF-B 信号。 功能 元 余 在 有 重要 发 育 作 用 的 基因 中 是 普遍 存在 的 ， 而 在 看 家 基因 中 较 少 。 为 什么 这 么 多 基因 功能 元 余 , 它们 是 如 何 通过 选择 保留 下 来 ?3 有 限 的 基因 痪 除 动 物 研究 表明 殴 除 突变 在 不 同 的 品系 (也 就 是 不 同 的 遗传 背景 ) 中 经 常 有 不 同 的 效果 。 迄 今 为 止 所 报道 的 很 多 元 余 现 象 反 映 了 不 同 特殊 遗传 背景 和 环境 的 影响 ,而 自然 选择 在 一 不 受 控 制 的 体系 中 进行 ,其 中 适应 性 的 精细 差别 可 以 被 应 用 。 重复 DNA 顺序 的 结构 ”重复 DNA 顺序 由 特定 大 小 序列 (重复 单位 , repeat unit) ,以 特 定 拷贝 数目 在 空间 上 以 特殊 的 方式 组 成 。 重 复 单 位 可 以 以 三 种 方式 被 组 织 : 串 联 重复 (tandem repeats) 在 单个 重复 单位 间 没 有 间隔 ;不 完善 的 重复 (hyphenated repeats) 被 小 间 隔 分 离 ,但 还 是 成 群 排列 ; 分 散 重 复 (dispersed repeats) 散布 在 整个 基因 组 中 。 单 个 重复 顺序 闻 可 以 是 相同 方向 ( 正 向 重复 ) 或 者 是 相反 方向 ( 反 向 重复 ) 排 列 (图 12.1)。 串联 不 完善 AGGTAGGT GGT ACTTTTCA ”ACTTENNNNNTTCA 两 侧 对 称 TGAAAAGT 。 TGAANNNNNAAGT (真正 回 文 ) 和 和 每 三 的 六 一 ACGGCCGT “AcCGGNNNNNCCGT “旋转 或 二 重 对 称 TGCCGGCA “”TGCCNNNNNGGCA ( 回 文 ) 图 12.1 重复 DNA 的 顺序 结构 。 重 复 顺 序 可 以 相同 方向 排列 ( 正 向 重复 ) 或 以 相反 方向 排列 ( 反 向 重复 )。 反 向 重复 中 可 以 是 每 条 链 以 相对 的 方向 阅读 的 两 侧 对 称 (bilateral symmetry)( 真 正 的 回 文 ) ,或 者 是 两 条 链 以 相同 极 性 阅读 的 顺序 相同 的 二 重 对 称 (dyad symmetry)( 也 称 为 回 文 ,尽管 有 时 并 不 精确 )。 正 向 和 反 疝 重复 都 可 以 是 连续 的 或 被 非特 定 顺 序 所 间隔 。 串联 重复 DNA 中 最 简单 的 结构 是 重复 单位 只 有 一 个 核 苷 酸 ,这 被 称 为 同 聚 体 (ho- mopolymer)。 也 有 二 核 苷 酸 ,三 核 苷 酸 等 串联 重复 ,与 大 重复 单位 的 串联 重复 一 样 称 为 小 卫星 DNA( 人 参阅)。 分 散 的 单 核 苷 酸 或 二 三 核 苷 酸 的 重复 显然 不 值得 注意 ;只 有 比 随机 出 现 频 繁 得 多 的 长 DNA 顺序 的 分 散 重复 才 有 意义 。 短 的 分 散 重 复 经 常 对 应 于 功能 DNA 基 序 (如 流感 嗜 血 杆 菌 上 升 位 点 的 30bp) ,然而 转 座 因 子 和 宛 余 基 因 要 大 得 多 。 1) 事 实 上 MyoD 不 能 完全 补偿 Myf-5 的 缺失 ,因为 zzy 大 5 基因 在 小 鼠 发 育 早期 表达 ,功能 缺乏 延迟 肌肉 生成 直到 现 y0D 表达 开始 后 恢复 ,结果 是 推迟 了 肌肉 发 育 和 产 期 致死 。 很 多 发 育 基因 显示 出 这 一 类 的 部 分 元 余 , 这 些 基 因 具 有 重奏 的 功能 , 当 在 重组 中 缺失 后 比 缺 失 单个 的 基因 产生 更 严重 的 表 型 。 在 轴 骨 和 肢 骨 发 育 中 , 销 椎 动物 的 FEoz 基因 是 一 个 有 说 服 力 的 例子 ( 见 文 框 6.9) ,如 同 yoD 和 zyF$ 双 剔 除 时 产生 没有 肌肉 等 组 织 的 小 鼠 。 > 短 的 功能 性 基 序 可 以 由 它们 特殊 的 结构 鉴定 。 很 多 转录 因子 和 其 他 DNA 结合 蛋白 的 识别 位 点 由 一 对 正 向 或 反 向 重复 组 成 ,可 以 是 不 完善 的 或 串联 的 ,反映 了 蛋白 的 二 聚 性 。 反 向 重复 经 常 是 二 重 对 称 , 有 形成 如 发 天 和 茎 环 ( 参 阅 ) 二 级 结构 的 潜在 能 力 。 作为 分 散 重 复 DNA 的 转 座 因 子 ”如 上 文 所 讨论 的 ,一 些 基 因 组 范围 分 散 的 重复 DNA 对 应 于 多 基因 家 族 的 成 员 ,包含 功 能 基因 和 假 基 因 。 另 外 它 可 以 代表 在 DNA 水 平 上 起 作用 的 基 序 。 大 多 数 分 散 重复 DNA 对 应 于 有 功能 的 转 座 因 子 或 它们 的 " 空 壳 ?形式 ( 通 过 突变 失 活 的 因子 )。 这 种 序列 类 型 的 优势 在 不 同 生 物体 中 变化 很 大 。 在 细菌 基因 组 中 ， 转 座 因子 的 拷贝 数 经 常 <10 ,而 养 椎 动物 一 般 分 布 广泛 (尽管 在 河豚 鱼 基 因 组 中 不 存在 )。 在 哺乳 动物 中 ,两 类 特殊 的 逆转 录 因 子 是 如 此 丰富 ,以 致 它们 每 个 都 定义 了 一 类 不 同类 型 的 分 散 重 复 。SINEs 是 短 散 布 核 元 件 (short interspersed nuclear element) ,对 应 于 加 工 的 7SL RNA 假 基因 的 拷贝 , 它 在 人 类 中 称 为 Ai 元件 ,在 小 鼠 中 是 B1 元 件 。LINEs 是 长 散 布 核 元件 (long interspersed nuclear elements) ,对 应 于 称 为 LINE-1(L1) 的 丰富 反 转 录 转 座 子 的 拷贝 。Alx 元 件 大 约 300bp 长 度 , 像 其 他 转 座 因 子 一 样 两 侧 是 正 向 重复 ,反映 了 其 整合 机 制 (参见 移动 遗传 因子 )。 它 主要 位 于 GC 丰富 的 DNA 区 域 ,估计 有 105 的 拷贝 数 , 平 均 每 4kbp 有 一 个 元 件 。 相 反 L1 元 件 最 大 长 度 为 6kbp, 拷 贝 数 105( 尽 管 全 长 的 元 件 只 占 一 小 部 分 ,<《5000 拷贝 )。L1 和 Alx 元 件 都 是 与 基因 相 联 系 的 ,但 它们 的 分 布 是 相关 的 ,与 基因 组 的 等 容 线 结构 有 关 ( 人 参阅 ) ,可 能 是 因为 整合 靶 位 点 的 倾向 性 。 这 些 元 件 都 不 在 基因 的 编码 区 一 一 它们 经 常 出 现在 内 含 子 和 两 侧 区 域 , Ajx 元 件 偶尔 出 现在 基因 的 3 非 翻 译 区 域 ,可 以 被 RNA 聚合 酶 I 作 为 基因 的 一 部 分 转录 。 卫星 DNA 是 高 等 真 核 生 物 基 因 组 重复 程度 最 高 的 成 分 ,通过 快速 再 聚集 鉴定 ,由 非 常 短 的 串联 多 次 重复 DNA 序列 组 成 。 占 优势 的 高 度 重 复 DNA 在 物种 间 变 化 ,但 一 般 占 了 基因 组 的 10% 一 30% 。 因 为 它 的 低 复杂 性 ,有 时 称 为 简单 序列 DNA, 又 因为 其 不 寻常 的 核 苷 酸 组 成 , 它 经 常 在 浮力 密度 梯度 离心 中 从 整个 基因 组 DNA 中 分 离 成 一 个 或 多 个 “卫星 "条 带 , 也 称 为 卫星 DNA。 隐 项 卫星 DNA(cryptic satellite DNA) 有 与 大 多 数 基因 组 DNA 相 当 的 浮力 密度 ,不 形成 卫星 条 带 ; 它 通 过 其 他 方法 被 鉴定 ,如 限制 性 作 图 。 卫 星 DNA 以 大 的 基因 复 (100 一 3000kb) 分 布 ,经 常 位 于 异 染 色 质 的 着 丝 粒 ,可 能 在 染色 体 功 能 中 起 作用 。 大 多 数 人 类 染色 体 的 中 心 粒 DNA 包含 了 隐藏 卫星 DNA, 称 为 阿尔 法 DNA (w- 卫星 DNA) ,尽管 另 一 种 成 分 ,B- 卫星 DNA 至 少 在 人 类 8 条 妆 色 体 的 中 心 粒 中 也 很 丰富 。a- 和 有 B- 卫星 DNA 家 族 中 染色 体 特异 性 序列 存在 差异 。 在 昆虫 中 ,卫星 DNA 由 很 多 非常 短 的 显著 链 不 对 称 序列 (5 一 13Sbp) 组 成 。 哺 乳 动 物 卫星 DNA 的 组 织 方式 更 复杂 。 简 单 重复 序列 表现 出 一 些 可 变性 ,经 常 形成 些 串 联 重复 的 一 定 程 度 可 变 的 区 域 。 卫 星 DNA 因此 是 由 分 层 结构 的 简单 序列 块 组 成 ,被 认为 通过 持续 突变 和 扩 增 的 循环 产生 ,可 能 涉及 不 对 称 交 换 和 基因 转换 ( 见 第 15 章 突变 和 选择 )。 小 卫星 DNA 和 微 卫 星 DNA 大 多 数 卫 星 DNA 是 以 染色 体 着 丝 粒 区 域 或 核 仁 组 织 者 (参阅 ) 的 重复 序列 组 成 的 大 基因 往 存 在 ,但 也 经 常 出 现在 称 为 小 卫星 DNA 的 小 基因 答 (100bp 一 10kbp) 中 ,一 般 位 于 端 粒 处 。 有 两 种 形式 的 小 卫星 DNA。 在 每 个 染色 体 臂 的 未 端 是 端 粒 DNA。 在 大 多 数 真 核 生 物 中 , 它 由 特征 性 的 几 千 碱 基 的 串联 五 核 苷 酸 或 六 核 苷 酸 DNA 重复 组 成 ( 见 表 $.5) , 它 的 功能 是 在 随后 的 DNA 复制 周期 中 阻止 染色 体 缺 损 ( 参 和 见 端 粒 、 端 将 酶 ) 。 第 二 类 高 度 可 变 的 小 卫星 DNA 位 于 亚 端 粒 区 域 。 高 度 可 变 DNA 的 重复 单位 在 不 同 的 位 置 不 同 ,但 都 包含 了 共同 的 GC 丰富 的 核心 共有 序列 。 每 个 位 置 的 拷贝 数 是 高 度 多 态 性 的 [因此 又 称 为 VNTR 序列 (variable number of tandem repeats, 同 向 重复 序列 可 变数 ]。 高 度 可 变 小 卫星 DNA 的 功能 (VNTR DNA) 还 不 清楚 ,但 它 可 能 可 以 促进 重组 (在 染色 体 的 亚 端 粒 区 域 交 换 趋 向 于 成 复 )。 端 粒 位 置 的 倾向 性 意味 着 小 卫星 DNA 不 仅 对 基因 组 范围 的 遗传 作 图 有 用 , 它 还 可 被 广泛 用 于 DNA 印记 的 诊断 标记 ( 文 杠 众多 )8 微 卫 星 DNA 出 现在 更 小 的 基因 簇 (<200bp) 中 ,以 非常 短 的 重复 单位 (1 一 4bp) 为 特 征 。 它 们 有 高 度 的 多 态 性 ,分 布 在 整个 基因 组 中 ,所 以 它们 是 理想 的 遗传 标记 。 在 两 种 可 能 的 同 源 多 聚 体 中 ,ploy(A) poly(T) 远 比 ploy(C)Mpoly(G) 普 遍 , 上 且 二 核 苷 酸 微 卫 星 ploy (CG) 人 poly(GC) 因 为 CpG 基 序 的 损耗 (参见 5- 甲 基 胞 喀 啶 ) 而 稀少 。 三 和 四 核 苷 酸 微 卫 星 DNA 相对 稀少 ,但 作为 标记 比 通常 出 现 的 二 核 苷 酸 微 卫星 更 有 用 ,因为 在 PCR 基因 型 印记 中 链 的 跳 格 较 少 (参见 分 子 标记 、 链 跳 格 )。 一 般 小 卫星 和 微 卫 星 DNA 是 在 基因 外 的 ,但 偶尔 出 现在 基因 的 编码 区 中 ,产生 高 度 多 态 性 的 蛋白 ;在 有 些 情况 中 这 是 病理 性 的 (参见 三 联 体重 复 综合 征 )。 其 他 重复 DNA 更 稳定 的 形式 也 可 以 在 基因 中 看 到 。o2 胶原 基因 包含 很 多 由 9bp 单位 重复 组 成 的 外 显 子 ,产生 每 三 个 残 基 有 一 个 甘氨酸 的 特征 氨基 酸 顺 序 。 大 的 重复 单位 也 被 发 现 , 最 大 的 对 应 于 整个 蛋白 质 结构 域 (参阅 )。 12.6 哺乳 动物 基因 组 的 等 容 线 组 织 染色 质 的 双 相 结构 对 哺乳 动物 染色 体 转录 活性 和 染色 质 结构 的 研究 表明 染色 质 在 有 潜在 或 真实 的 转录 活性 时 与 抑制 状态 的 染色 质 采 用 了 不 同 的 结构 ,反映 了 核 苷 酸 修饰 和 组 织 方式 的 差异 和 高 级 折 笃 结构 的 去 除 ( 见 第 3 章 染 色 质 )。 这 一 现象 的 两 种 结果 是 活性 染色 质 在 S 期 早期 复制 , 变 得 对 DNase I 敏 感 。 通 过 早期 复制 DNA( 复 制 分 带 ) 细 胞 遗传 作 图 或 DNase 工人 敏感 区 域 (D 带 型 ) ,对 激活 和 抑制 染色 质 结构 域 分 布 分 析 , 发 现在 观察 到 的 图 谱 与 通过 常规 染色 体 分 带 技术 (参阅 ) 得 到 的 带 型 ,如 G- 带 ,有 惊人 的 相关 性 。 这 样 的 技术 被 认为 是 显示 了 不 同 碱 基 组 成 DNA 区 域 的 区 别 ,暗示 了 哺乳 动物 基因 组 物理 化 学 性 质 和 功能 性 质 的 相关 性 。 进 一 步 的 研究 确实 显示 了 GC 丰富 、G 带 染 色 淡 的 区 域 基因 丰富 ,而 AT 丰富 、G 带 染 色 深 的 区 域 基因 相对 少 。 在 人 类 基因 组 中 , Azxw 元 件 可 能 也 倾向 于 位 于 浅 带 区 域 ,而 L1 元 件 倾 向 于 深 G 带 区 域 。 等 容 线 和 高 级 基因 组 结构 等 容 线 模型 (isochore model) 将 哺乳 动物 基因 组 分 成 不 同 的 区 域 ,长 度 >300kbp, 以 相对 均一 的 碱 基 组 成 为 特征 。 哺 乳 动 物 基 因 组 平均 的 GC 含量 约 40% ,但 不 同 区 域 间 在 37% 和 5355% 之 间 变 化 。 片 段 化 DNA 可 以 通过 浮力 密度 梯度 分 为 五 个 等 容 线 类 型 :L1 和 L2(AT 丰富 ) 和 HL\、H2、H3(GC 丰富 )。 所 有 的 哺乳 动物 显示 了 类 似 的 等 容 线 表 现 。 通过 确定 克隆 基因 的 GC 含量 和 将 YACs 分 成 等 容 线 类 型 ,可 以 研究 等 容 线 类 型 中 基因 分 布 。AT 丰富 的 等 容 线 组 成 了 人 类 基因 组 的 65% ,但 只 包含 30% 的 基因 。 在 H2 和 Hg3 等 容 线 中 基因 密度 最 大 。 在 H3 等 容 线 类 型 中 ,预计 密度 是 每 10kbp 一 个 基因 ,与 386” 果 蝇 基因 组 的 平均 基因 密度 相同 ,但 比 酿酒 酵母 基因 组 少 五 倍 。 相 反 , 在 L2 等 容 线 类 型 中 ,预计 是 每 100kbp 一 个 基因 。 令 人 吃惊 的 是 ,从 基因 组 计划 数据 有 限 的 分 析 中 显示 GC 丰富 的 等 容 线 相 对 小 的 基因 丰富 ,一 般 有 少 而 小 的 内 含 子 和 较 小 的 开放 阅读 框架 ,而 AT 丰富 的 等 容 线 倾向 于 包含 有 很 多 大 内 含 子 的 较 大 基因 上。 杂交 分 析 确 定 了 等 容 线 的 分 布 反映 了 哺乳 动物 染色 体 的 带 型 , AT 丰富 的 等 容 线 大 致 对 应 于 深 色 G 带 而 GC 丰富 等 容 线 对 应 于 淡 G 带 。 基 因 密 度 非 常 大 的 H3 等 容 线 倾 向 于 在 亚 端 粒 区 域 ,尽管 也 有 例外 :在 人 类 基因 组 中 ,19 号 染色 体 几 乎 整个 都 是 由 H3 等 容 线 组 成 ,而 13 号 染色 体 几 乎 都 是 LI1 和 L2 等 容 线 。Alx 和 LINE 元 件 差异 分 布 的 现象 被 证 实 :Aix 元 件 倾向 于 出 现在 GC 丰富 等 容 线 中 或 邻近 位 置 ,而 LINE 元 件 与 AT 丰富 等 容 线 有 联系 。 有 趣 的 是 Alx 和 LINE 元 件 可 能 在 等 容 线 边缘 起 结构 的 作用 ,因为 它们 经 常 在 这 些 位 置 的 邻近 基因 徐 中 被 发 现 。 12.7 基因 作 图 基因 作 图 的 目的 ”基因 作 图 是 将 基因 分 配 到 染色 体 的 基因 座 上 。 通 过 对 很 多 基因 和 其 他 标记 相对 位 置 的 作 图 ,可 能 产生 一 个 染色 体 图 谱 或 整个 基因 组 的 图 谱 。 基 因 作 图 可 帮 助人 们 理解 与 开发 生物 性 状 的 遗传 性 质 ,特别 是 通过 遗传 连锁 (参阅 ) 将 一 种 性 状 的 遗传 与 另 一 种 (或 者 合适 的 遗传 标记 ,参阅 ) 相 联系 ,或 者 通过 将 表 型 差异 与 染色 体 结构 的 改变 联系 起 来 。 商 业 上 ,这 可 以 使 动物 和 植物 繁殖 产生 有 改良 性 状 的 农作物 和 兽 类 ,在 人 类 范 围 中 ,这 使 生化 机 制 不 清楚 的 遗传 疾病 的 基因 在 特定 染色 体 或 染色 体 带 型 中 定位 (分 配 到 一 个 基因 座 ) ,并 通过 标记 相连 锁 追 踪 家 谱 ( 参 见 基因 追踪 )。 根据 最 近 重 组 DNA 技术 的 进展 (参见 第 24 章 重组 DNA、 第 21 章 聚 合 酶 链 式 反 应 )， 通过 建立 基因 组 DNA 片段 克隆 和 分 析 可 能 产生 详细 的 基因 图 谱 。 最 终 , 可 能 获得 基因 组 的 整个 DNA 顺序 ,这 一 无 价 的 资源 不 仅 提供 了 基因 结构 的 信息 ,而 且 有 高 度 有 序 的 基 因 组 序列 高 级 结构 和 基因 与 基因 组 进化 的 信息 。 现 在 ,对 几 种 模式 生物 在 国际 范围 内 开 展 制作 遗传 和 物理 图 谱 的 工作 ,最终 的 目标 是 确定 整个 基因 组 的 顺序 ( 表 12.4)。 与 物理 基因 作 图 相 联 系 的 技术 用 于 定位 克隆 (参阅 ) ,每 个 基因 序列 的 获得 有 很 多 商业 用 途 ,包括 药物 开发 。 基 因 组 作 图 、 分 析 和 测序 的 学 科 称 为 基因 组 学 (genomics)。 三 种 基因 图 有 三 种 主要 的 基因 图 :遗传 (连锁 ) 图 细胞 遗传 图 和 物理 (分 子 ) 图 。 遗传 或 连锁 作 图 (genetic or linkage map) 是 将 基因 分 配 到 连锁 群 (linkage group)( 因 在 染色 体 上 位 置 邻近 倾向 于 一 起 遗传 的 一 群 基因 )。 遗 传 图 以 绝对 单位 被 标定 ,反映 了 通 过 重组 (如 在 减 数 分 裂 作 图 中 ) 或 染色 体 片段 化 (如 在 放射 性 杂交 作 图 和 HAPPY 帮 图 中 ) 标记 分 离 的 可 能 性 ,遗传 作 图 依赖 的 原理 是 两 个 基因 座 出 现在 同一 DNA 片段 的 机 会 随 它们 之 间距 离 的 增加 而 减少 。 在 细菌 中 的 遗传 作 图 涉及 相似 的 原理 ,水 平 基因 转移 自然 机 制 使 作 图 成 为 可 能 ( 见 第 10 章 细菌 中 的 基因 转移 )。 遗 传 图 谱 分 辩 率 在 细胞 遗传 和 物 理 图 谱 之 间 ,但 那些 基于 重组 频率 的 作 图 可 以 被 相对 高 或 相对 低 的 重组 所 牌 曲 (参见 重组 热点 和 冷 点 )。 另 外 ,重组 的 频率 在 各 种 物种 中 并 不 一 样 ;因此 遗传 图 谱 在 不 同 的 物种 中 反映 了 不 同 的 物理 距离 。 细胞 遗传 图 谱 是 通过 将 可 观察 到 的 染色 体重 排 和 表 型 相 联系 而 产生 的 。 这 一 类 图 谱 . 134 。 分 辨 率 低 ,在 少数 物种 中 应 用 ,如 哺乳 动物 和 果 蝇 ,它们 在 目 然 或 诱导 可 以 产生 可 重复 的 染色 体 带 型 ( 另 见 病 理 作 图 )。 简 单 基 因 组 的 细胞 遗传 作 图 (如 病毒 \ 质 粒 等 ) 用 来 确定 它 们 物理 性 质 差异 的 位 置 (参见 变性 作 图 )。 表 12.4 用 于 基因 组 作 图 和 测序 计划 的 物种 生物 体 细菌 酿酒 酵母 果 蝇 东方 豚 鱼 斑马 鱼 小 鼠 其 他 肴 椎 动物 人 类 拟 南 芥 其 他 植物 评论 大 肠 杆菌 和 枯草 杆菌 是 得 到 细致 研究 的 模式 生物 ,被 用 于 基因 结构 和 调节 的 前 沿 研究 。 大 肠 杆 菌 基因 组 序列 最 近 被 发 表 ,而 枯草 杆菌 在 近 些 年 也 将 完成 。 许 多 其 他 细菌 基因 组 已 经 完成 测 序 :第 一 个 是 嗜 血 流 感 菌 。 酿酒 酵母 和 相关 的 裂 殖 酵母 广泛 用 于 真 核 基 因 结构 和 调节 的 研究 ,在 核心 途径 如 DNA 复制 和 细胞 周期 的 研究 中 尤其 重要 。 最 近 完 整 的 酿酒 酵母 序列 被 发 表 一 一 这 种 酵母 有 大 约 6300 个 基因 ; 比 原先 预测 的 多 。 线虫 是 最 简单 的 无 脊椎 动物 模式 动物 (基因 组 为 100Mb)。 它 被 广泛 用 于 发 育 、 特 别 是 神经 发 育 的 研究 ,这 是 因为 它 不 变 的 世系 (从 一 个 卵细胞 成 为 959 个 体 细胞 的 成 体 的 发 育 途径 已 被 完 全 阑 述 ) ,上 且 其 神经 系统 的 相互 作用 被 完全 作 图 。 已 经 完成 高 密度 的 遗传 和 物理 作 图 ,测序 计 划 也 接近 完成 。 果 蝇 是 所 有 模式 生物 中 研究 得 最 广泛 的 ,特别 是 在 发 育 遗 传 的 早期 研究 中 。 基 因 组 用 形态 标记 高 密度 作 图 , 果 蝇 还 被 广泛 用 于 连锁 分 析 原 理 的 教学 。 基 因 组 大 小 为 165Mb, 测序 计划 处 于 起 始 阶段 。 河豚 鱼 与 大 多 数 脊 椎 动物 相 比 基因 组 较 小 (400Mb) ,但 基因 数目 相当 ,也 就 是 大 小 的 降低 反映 了 非 编码 DNA 的 减少 (特别 是 分 散 的 重复 DNA 和 内 含 子 )。 基 因 和 调节 序列 表现 出 高 度 保 守 , 所 以 河豚 鱼 基因 组 是 鉴定 其 他 基因 密度 低 的 峭 椎 动物 基因 的 潜在 有 力 工具 。 斑马 鱼 基 因 组 是 典型 哺乳 动物 基因 组 的 三 分 之 二 大 小 ,正在 进行 遗传 和 物理 作 图 。 斑 马 鱼 因 其 遗传 可 操作 性 ,是 有 用 的 发 育 模式 ,如 单 倍 体 胚 胎 可 存活 到 孵育 期 。 最 近 斑 马 鱼 用 于 饱和 突 变 筛 选 发 育 相关 基因 有 许多 原因 ,小 鼠 是 直接 与 人 类 相关 的 最 重要 的 模式 生物 (或 者 较 小 范围 中 大 鼠 也 是 )。 小 鼠 和 人 类 基因 组 在 大 小 ` 复 杂 性 可 以 相 比 ,大 量 的 同 线性 是 保守 的 。 小 鼠 的 遗传 可 操作 性 在 哺乳 动物 中 是 无 可 比拟 的 ,因为 它 个 体 小 ,容易 繁殖 。 它 也 可 以 进行 突变 筛选 和 遗传 杂交 产生 标 记 图 谱 和 对 疾病 基因 座 定位 。 它 还 可 以 对 生殖 细胞 修饰 来 研究 基因 功能 (参见 转基因 动物 ， 基因 融 除 ,ES 细胞 ) 对 许多 其 他 兰 椎 动物 也 进行 了 高 密度 标记 作 图 和 基因 作 图 ,包括 很 多 重要 商业 价值 的 家 畜 ( 牛 、 猪 . 羊 ) 和 驯服 的 动物 ( 猫 \ 狗 )。 通 过 用 标记 辅助 对 质量 性 状 的 筛选 ,来 改进 家 畜 的 产量 和 质 量 ,并 作为 比较 基因 组 学 的 数据 (参阅 )。 人 类 基因 组 计划 (Human Genome Project) 希 望 在 2005 年 前 完成 , 目标 是 完成 对 基因 组 的 遗传 和 物理 作 图 ,确定 整个 基因 组 序列 。 这 些 信 息 的 提供 可 以 给 医药 、 诊 断 和 开发 药物 带 来 希望 ,而 不 仅仅 是 确定 大 多 数 遗 传 失常 和 疾病 的 机 制 。 但 也 存在 这 些 信 息 被 错误 使 用 的 担心 ,如 对 有 特殊 基因 型 个 体 的 歧视 ,可 能 导致 种 族 灭 绝 的 重新 出 现 。 对 个 别 基因 的 作 图 通过 表达 顺序 标 记 作 图 (参阅 ) 正 在 进行 中 (在 基因 组 中 的 3% )。 拟 南 芥 在 植物 中 有 相对 紧密 的 基因 组 , 它 与 果 蝇 位 于 同一 类 ,也 就 是 相对 简单 的 后 生 模 式 生物 。 与 果 蝇 一 样 ,这 种 植物 被 广泛 用 于 发 育 的 研究 ,遗传 和 物理 作 图 正在 构建 中 。 有 几 种 重要 商业 价值 的 植物 物种 基因 组 计划 正在 进行 ,如 称 \ 小 麦 和 玉米 ,这 将 有 助 于 选择 改良 的 性 状 , 如 抗 虫 . 抗 除草 剂 等 ,及 增加 产量 。 这 些 性 状 中 很 多 是 数量 性 状 ,标记 辅助 筛选 将 会 帮助 在 繁殖 过 程 中 发 现 这 样 的 性 状 。 5 物理 或 分 子 图 谱 是 通过 基因 组 DNA 克隆 片段 的 排序 产生 的 ,以 真实 单位 ( 碱 基 对 、 千 碱 基 对 、 兆 碱 基 对 ) 标 定 。 物 理 作 图 有 最 精细 的 分 辨 率 , 是 作 图 计划 的 最 终 目的 。 然 而 由 于 高 等 真 核 生 物 基因 组 只 有 一 小 部 分 被 表达 ,有 些 物 理 作 图 方法 被 用 来 鉴定 转录 的 序 列 ( 也 就 是 基因 )。 在 过 去 ,精细 的 策略 被 用 来 产生 不 同 生物 的 连锁 图 谱 , 但 这 一 方法 逐步 被 粗放 的 物理 作 图 方法 所 代替 ,因为 物理 方法 获得 整个 基因 组 顺序 相对 容易 。 遗 传 作 图 在 细菌 和 单 细 胞 真 核 生物 中 已 经 落伍 ,因为 物理 作 图 和 完全 基因 组 测序 相对 快 得 多 。 在 不 久 的 将 来 , 遗 传 作 图 在 如 线虫 和 果 蝇 等 物种 (这 些 物 种 最 先 用 于 遗传 作 图 ) 中 也 会 变 得 陈旧 ,但 在 大 基 因 组 的 起 始 的 低 分 辩 率 作 图 中 还 是 需要 的 ,如 人 类 基因 组 。 分 子 标记 (参阅 ) 的 改进 使 三 类 作 图 逐步 综合 。 多 态 性 分 子 标记 , 如 限制 性 片段 长 度 多 态 性 和 包含 小 卫星 DNA 序列 标记 位 点 可 以 被 同时 用 于 连锁 分 析 中 的 遗传 标记 和 作为 核酸 探 针 鉴定 物理 克隆 。 同 时 ， 原 位 杂交 使 物理 克隆 能 精确 分 配 到 细胞 遗传 作 图 的 染色 体 条 带 上 。 12.8 和 遗传 作 图 用 自然 和 人 工 断 点 遗传 作 图 ”遗传 作 图 的 基本 原理 是 ,假定 染色 体 断 裂 是 随机 的 染色 体 上 两 个 任意 基因 座 越 远 ,它们 越 容 易 被 染色 体 断 裂 所 分 离 。 利用 这 原理 通过 人 工 导 人 染色 体 断 裂 点 发 展 了 几 种 作 图 技术 ,包括 放射 性 杂交 作 (radiation hybrid mapping ,染色 体 断 点 是 通过 放射 体 细胞 杂交 产生 ) 和 HAPPY 作 图 (基因 组 DNA 是 通过 振 划 或 超声 打 断 )。 在 每 一 种 情况 中 , 物理 作 图 技术 可 以 被 用 于 检测 连 锁 : 同 一 DNA 片段 上 是 否 存 在 两 个 标记 是 通过 杂交 \、PCR 或 基因 产物 的 检测 确定 的 (图 12.2)。 实 验 被 多 次 重复 ,连锁 率 通 过 标记 被 分 离 的 频率 计算 。 放 射 杂 交 作 图 是 在 射线 百 分 数 中 (cR-,z 是 X 射 线 的 剂量 ) 校 正 ,1 cR 相当 于 1% 频 率 的 分 离 。 A B C LE 一 | 诱导 随机 断 列 A B 候 ES 生 ES 有 | CE 总 LEEEsae9iE 队 Ge 用 aasasa 吉 EEC， ES Hpy HA 放射 性 杂交 作 图 分 散在 相当 于 单 信 体 在 体 细胞 攻 交 中 基因 组 的 DNA 库 中 ， 次 (站 全 生生 示 记 通 去 ,处 标记 通过 PCR 来 分 析 交 -RK 丽 全 下 全 产物 检测 来 分 析 图 12.2 ”用 人 工 导 入 的 断裂 点 遗传 连锁 作 图 。 在 放射 性 杂交 作 图 中 染色 体 的 断裂 是 通过 照射 诱 导 产生 的 ,而 且 在 体 细胞 杂交 (放射 杂种 ) 桨 色 体 片段 被 获救 。 它 们 可 以 通过 杂交 \、PCR 或 蛋白 质 检测 来 分 析 。 在 HAPPY 作 图 中 ( 单 倍 体 PCR 作 图 ) ,基因 组 DNA 被 随机 前 切 分 散在 相当 于 单 倍 体 基 因 组 的 DNA 库 中 ,标记 通过 PCR 来 分 析 。 连锁 作 图 最 通常 的 方法 是 利用 因为 减 数 分 裂 时 交换 ( 同 源 染 色 体 ) 产 生 的 天 然 染色 体 136 ， 断 点 。 在 这 种 情况 下 ,物理 距离 是 根据 标记 间 重 组 频率 标定 的 (如 距离 越 远 ,它们 之 间 越 容易 发 生 交换 ) ,这 要 求 在 两 个 基因 座 上 是 杂 合 基因 型 ,这样 亲本 的 和 重组 的 单 倍 型 可 以 被 区 分 。 在 图 12.3 中 举 了 个 例子 。 与 减 数 分 裂 连锁 分 析 相 关 有 很 多 限制 和 问题 ,包括 样 本 大 小 基因 型 检测 和 所 提供 标记 的 数量 ,信息 性 分 离 的 缺乏 (在 人 类 中 ) 和 内 在 的 不 精确 性 ( 文 框 12.3)。 sz 时 -全 和 _T 曙 ) ， 人 @- 写 号 AD) ， 图 12.3 用 重组 频率 进行 遗传 作 图 的 原理 :考虑 两 个 连锁 的 基因 座 ,A 和 B。 一 个 个 体 ( 图 左 ) 在 两 个 基因 座 上 都 是 杂 合 的 (如 基因 型 为 ALA2B1B2) ,可 以 从 一 个 亲本 遗传 得 到 Al - Bl 单元 型 ,从 另 一 个 亲本 得 到 A2 - B2 单元 型 一 一 这 些 是 亲 代 ( 非 重组 ) 单 元 型 ,也 就 是 减 数 分 裂 输 入 。 进 行 减 数 分 裂 的 个 体 转移 一 条 染色 体 到 他 的 后 代 ; 减 数 分 裂 的 四 种 产物 在 图 中 表示 。 如 果 A 和 了 之 间 没有 交换 (NCO) ,作为 减 数 分 裂 的 输出 ,后 代 继 承 了 亲 代 单元 型 的 一 种 (Al - Bl 或 A2 - BE2 ) , 称 为 亲 组 合 的 或 非 重 组 合 (P) 。 相 反 的 ,如 果 A 和 孔 存在 单个 交换 (SCO) ,作为 减 数 分 裂 的 输出 ,后 代 继 承 了 重组 的 单 倍 型 (Al - B2 或 A2 - Bl ) , 称 为 重组 合 (R)。 随 着 基因 座 之 间距 离 的 增加 重组 体 基 因 型 的 频率 增加 , 因为 交换 在 距离 大 的 基因 座 之 间 更 容易 发 生 。 然 而 ,重组 频率 最 大 是 50% ,因为 四 条 染色 体 中 只 有 两 条 涉及 单 交换 ,所 以 只 有 50% 的 减 数 分 裂 的 产物 是 重组 的 ( 文 杠 12.3)。 注 意 如 果 个 体 在 两 个 基因 座 上 都 是 纯 合 的 , 减 数 分 裂 将 不 提供 重组 信息 , 因为 不 可 能 区 分 亲 组 合 和 重组 合 。 在 二 倍 体 物 种 中 ,成 功 的 减 数 作 图 依赖 于 根据 后 代表 型 确定 单元 型 的 能 力 。 如 果 亲 代 提 供 同样 的 等 位 基因 或 者 等 位 基因 间 是 显 性 关系 ,这 也 是 不 可 能 的 ( 见 正 文 )。 连锁 分 析 中 的 样本 大 小 如 果 从 给 定 交 配 得 到 足够 的 后 代 可 以 被 计算 和 定型 (确定 它 们 的 基因 型 ) ,任何 一 对 杂 合 基因 座 之 间 的 重组 频率 (~) (recombination ) 或 者 交换 值 (cioss-over value) 可 以 用 以 下 公式 计算 : _ 减 数 分 裂 的 重组 产物 ” ” 减 数 分 裂 的 总 产物 重组 频率 被 用 来 标定 遗传 图 谱 :1% 的 重组 频率 (也 就 是 每 100 个 后 代 只 有 一 个 遗传 了 重 组 单元 型 ) 对 应 于 一 个 遗传 图 距 单位 或 厘 摩 (根据 Thomas Hunt Morgan 命名 ,在 他 的 实 验 室 最 先进 行 果 蝇 基 因 的 遗传 作 图 ) 的 遗传 距离 ,重组 频率 对 遗传 可 操作 物种 可 以 被 计 算 ,如 酵母 和 果 蝇 ,它们 可 以 进行 大 量 交配 ,产生 上 千 或 上 百 万 后 代 测 定 得 到 统计 意义 的 连锁 信息 。 杖 球 体 护 小 和 有 人 的 人 人 生 1 这 样 的 杂交 是 不 可 能 的 ， 数据 必须 从 分 析 已 经 存在 的 家 谱 直 计 玉 全 让 和 二 帮 革 基 大 类 家 庭 , 特 别 是 含有 疾病 等 位 基因 的 家 庭 很 少 能 大 到 产生 统计 意义 的 连锁 信息 。 另 一 是 因为 人 类 交配 不 是 实验 所 计划 的 ,家 谱 经 常 是 不 完美 的 ， TO 息 和 重组 体 不 能 被 鉴定 。 解决 的 方法 是 根据 提供 的 不 完全 信息 计算 统计 可 能 性 。 因 为 样本 小 ,在 人 类 中 遗传 距离 是 以 重组 分 数 (9) 计 算 的 , 它 与 重组 频率 一 样 计 算 ,但 以 在 0 到 1 之 间 的 数值 表示 ,而 不 是 百分数 (也 就 是 一 个 遗传 图 谱 单 位 等 于 0.01 的 重组 分 数 )。 从 单个 家 谱 中 分 析 减 数 分 裂 ,计算 支持 连锁 或 独立 分 布 的 可 能 性 。 连 锁 的 统计 可 能 性 以 “连锁 优势 "的 对 数 表示 ， ”各 7 经 常 称 为 对 数值 (Z ) : 人 六 两 个 基因 座 之 间 的 链 锁 ,假定 一 0) 力 ( 两 个 不 连锁 的 基因 座 ,也 就 是 RF=0.5) 一 般 的 策略 是 计算 对 于 一 定 6 值 范围 的 Z 和 绘制 Z 对 应 于 6 的 曲线 图 。 对 数值 >3 被 认 为 是 连锁 的 证 据 , 代 表 1000:1 的 优势 。 最 大 的 对 数值 Z.. 表 示 了 两 个 基因 座 之 间 最 可 能 的 遗传 距离 。 对 数值 < - 2 是 不 连锁 的 强 有 力 证 据 , 用 负 的 对 数值 否定 连锁 关系 称 为 排除 作 图 。 对 数值 是 对 数 计算 的 数值 ,所 以 它们 有 可 以 在 家 谱 中 总 结 数据 的 优点 。 尽 管 这 是 增 加 连锁 信息 的 有 效 方法 ,但 得 到 的 图 谱 的 分 辩 率 比 简单 生物 通过 计算 重组 频率 得 到 的 遗 传 图 谱 低 。 另 一 个 增加 人 类 杂交 样本 大 小 的 方法 是 测定 配子 而 不 是 后 代 的 类 型 ,但 因为 配子 不 出 现 人 类 的 疾病 表 型 ,所 以 只 有 遗传 标记 而 不 是 真实 的 疾病 可 用 这 种 方法 作 图 。 对 数值 系统 的 一 个 缺点 是 在 任何 给 定 家 谱 的 统计 连锁 可 能 性 是 通过 假定 性 状 的 遗传 方式 已 知 的 情况 下 计算 的 。 这 适用 于 研究 得 比较 清楚 的 备 德 尔 性 状 ,但 对 遗传 模式 不 清 楚 的 ,可 以 应 用 很 多 稍 差 一 些 但 不 依赖 模式 的 策略 , 见 表 12.5。 表 12.5 人 类 连锁 图 谱 的 其 他 形式 ,不 需要 特定 遗传 模式 。 它 们 描绘 了 要 研究 的 染色 体 片 段 (含有 标 记 ) , 带 有 特定 性 状 的 一 些 个 体 都 具有 此 片段 方法 基础 和 限制 同胞 对 分 析 一 对 同胞 同时 患 一 种 特定 疾病 (因此 假定 携带 同样 的 疾病 等 位 基因 ) ,通过 一 系列 标记 测 定 。 他 们 都 具有 与 疾病 等 位 基因 连锁 的 标记 倾向 大 于 25% (25% 的 一 对 同胞 会 有 同时 具有 任何 两 个 等 位 基因 ,即使 它们 是 独立 分 配 的) 标记 和 表 型 关系 越 密切 ,连锁 也 就 越 近 。 同 合子 作 图 用 来 对 近亲 家 庭 (consanguineous families)( 近 亲 结 婚 的 家 庭 ) 的 隐 性 性 状 作 图 。 同 合子 (au- tozygosity) 意 味 着 在 特定 基因 座 是 纯 合 子 因为 等 位 基因 通过 血统 鉴定 (来 源 于 同一 基 因 )。 在 近亲 家 庭 中 隐 性 性 状 的 显现 经 常 表示 是 同 合子 ,标记 的 同 合子 证 明 连 锁 。 疾病 相关 这 种 形式 的 作 图 是 将 存在 的 标记 与 疾病 表 型 相 联系 。 如 果 相 对 风险 (RR) 比 1 足够 大 或 足 够 小 ,疾病 相关 性 是 明显 的 。RR = zw 字 300kbp 体 ) 游离 载体 限制 图 ”限制 性 内 切 酶 可 用 来 产生 基于 限制 位 点 位 置 的 物理 图 谱 ( 限 制图 ,restriction maps)。 图 的 解析 度 依 赖 于 DNA 片段 中 限制 位 点 出 现 频率 ,而 这 又 由 限制 位 点 的 大 小 和 碱 基 组 成 所 决定 。 具 有 4 一 6bp 识别 位 点 的 酶 可 用 来 产生 小 DNA 分 子 如 质粒 ,PCR 片段 .142 ， 和 入 插 人 片段 的 限制 图 。 具 有 较 大 的 限制 内 切 位 点 (8 一 10bp) 和 /或 识别 未 被 充分 代表 序 列 如 哺乳 动物 基因 组 中 的 CpG 的 内 切 酶 称 为 稀有 切割 者 。 可 以 用 这 种 酶 来 获得 整 条 染 色 体 的 限制 图 谱 ,虽然 产生 的 DNA 片段 必须 用 脉冲 场 凝 胶 电 泳 (参阅 ) 等 方法 分 离 。 分 离 获得 的 限制 性 片段 可 以 通过 杂交 (参见 southern 印迹 ) 或 PCR 来 测试 所 携带 的 标记 。 使 用 一 组 限制 性 内 切 酶 使 片段 定 序 并 相互 重 竺 。 对 于 限制 性 内 切 酶 在 分 子 生 物 学 中 的 使 用 的 讨论 , 见 重 组 DNA( 本 章 也 提供 了 一 个 质粒 载体 的 限制 图 的 例子 )。 真 核 基 因 组 的 作 图 与 鉴定 ”在 较 高 级 真 核 生 物 的 大 基因 组 中 ,大 部 分 DNA 不 表达 , 它 们 中 很 多 是 重复 的 。 因 此 有 必要 设计 基因 鉴定 的 特异 性 策略 。 在 理论 上 ,基因 可 能 由 于 它 的 序列 与 以 前 鉴定 的 基因 保守 ,或 它 在 基因 组 中 具有 独特 的 结构 ,或 因为 它 表达 产生 RNA 转录 本 等 而 被 鉴定 。 上 述 策 略 都 被 应 用 ( 表 12.10)。 选 择 峭 椎 动物 基因 组 中 富 含 基因 的 克隆 包括 CpG 岛 作 探 针 来 确定 基因 的 5 端 。 还 可 以 使 用 河豚 鱼 的 基因 组 克隆 ,其 基因 组 的 复杂 性 大 于 90% 。 这 些 策 略 都 有 它们 的 缺点 :估计 的 70 000 个 哺乳 类 基因 只 有 一 半 与 CpG 岛 有 关联 ,也 并 非 所 有 的 基因 具有 与 河豚 基因 足 够 的 同 源 性 可 以 以 杂交 鉴别 。 表 12.10 基因 组 DNA 中 基因 鉴别 的 方法 。 鉴 别 特异 基因 的 策略 参见 定位 克隆 。 方法 策略 利用 序列 保守 性 种 间 同 源 种 间 基 因 往往 具 有 保守 性 ,而 非 编码 DNA 则 不 然 。 因 而 可 以 用 亚 克 隆 对 不 同 种 属 的 基因 组 作 southern 印迹 ,来 显示 保守 的 基因 序列 (参见 zoo 印迹 )。 数据 库 同 源 搜 索 来 自 一 亚 克 隆 的 序列 可 以 与 序列 数据 库 中 的 序列 相 比 较 。 可 能 会 发 现 与 已 克隆 基因 的 同 源 区 域 。 河豚 鱼 比较 筛选 对 低 复杂 性 的 脊椎 动物 基因 组 ,与 河豚 鱼 基因 组 克隆 的 杂交 可 帮助 鉴别 基因 ,因为 河豚 鱼 基因 组 的 复杂 性 很 高 。 外 显 子 预测 基于 开放 读 码 框 与 剪 切 顺序 的 出 现 用 计算 机 程序 来 预测 假想 的 外 显 子 位 置 。 利用 独特 的 结构 CpG 岛 的 鉴别 在 高 级 真 核 生物 中 包含 CpG 岛 (人 参阅) 的 区 域 往往 标志 着 基因 的 5 末端 ,可 以 通过 杂交 或 识别 位 点 具有 CpG 基 序 的 限制 性 内 切 酶 图 谱 或 PCR 来 辨别 。 利用 基因 的 表达 表达 杂交 标记 基因 组 探 针 的 northern 印迹 杂交 来 辨 明 转 录 区 域 , 在 cDNA 库 中 分 离 表达 基因 。 外 显 子 捕获 基因 组 克隆 插 人 到 表达 载体 中 两 个 外 显 子 之 间 的 内 含 子 中 ,构建 完成 后 转化 到 细胞 内 。 如 果 基 因 组 克隆 中 包含 外 显 子 ,前 切 会 产生 具有 三 个 外 显 子 的 成 熟 转录 体 ( 两 个 载体 外 显 子 和 中 间 被 捕获 的 外 显 子 )。 如 果 不 然 ,转录 本 只 包含 两 个 外 显 子 。 细 胞 中 分 离 的 RNA 用 RT-PCR 的 方法 获得 此 外 显 子 (外 显 子 扩 增 ) 。 cDNA 选择 与 俘获 cDNA 与 基因 组 克隆 (或 固定 于 一 滤 膜 上 或 在 溶液 中 但 用 生物 素 标记 以 利 纯化 ) 杂 交 。 基 因 组 DNA 与 cDNA 的 异 源 双 链 通 过 洗涤 或 链 霉 亲 合 素 纯化 ,cDNA 用 PCR 扩 增 和 鉴定 。 扩 增 cDNA 可 经 历 几 轮 基因 组 杂交 以 富 集 阳 性 序列 。 基因 鉴定 的 另 一 种 方法 是 特异 性 的 克隆 并 鉴别 表达 DNA 而 不 是 从 基因 组 DNA 中 筛选 。 这 可 以 通过 对 cDNA 的 广泛 鉴别 或 外 显 子 捕获 或 cDNA 俘获 等 策略 来 进行 〈 表 143 ， 12.10) ,但 这 些 方法 的 缺点 是 不 能 提供 基因 结构 与 调节 信息 ,而且 瞬时 表达 基因 或 只 在 特 异 细胞 /以 最 低 水 平 表 达 的 基因 会 被 漏 掉 。 集 中 研究 哺乳 类 基因 组 的 表达 序列 ,有 可 能 将 基因 组 中 200000) 可 以 足以 定位 大 部 分 基因 。EST 可 以 用 放射 杂交 定位 到 染色 体 上 ,或 是 重 至 图 的 个 别 YACs 上 以 产生 全 长 cDNA 重 和 顺序 (EST 步 移 )。 虽然 EST 鉴定 可 以 鉴别 很 多 表达 序列 , 它 几 乎 不 能 提供 定量 信息 。 最 近 已 发 展 了 几 种 技术 以 对 多 个 基因 座 的 基因 表达 同时 进行 定量 分 析 ( 例 如 SAGE, 寒 核 苦 酸 芯片 , 参 阅 )。 这 些 方法 ,以 及 通过 突变 来 确定 功能 的 相关 方法 和 利用 双 杂 交 系 统 研究 基因 产物 的 相互 作用 的 方法 ,一 起 组 成 了 快速 延伸 的 功能 基因 组 学 (functional genomics) 的 领域 。 它 将 开发 基因 组 测序 获得 的 信息 并 利用 它 在 整个 基因 组 范围 内 将 功能 与 DNA 序列 联系 起 来 。 进 一 步 的 讨论 见 第 22 章 蛋 白质 :结构 ,功能 与 进化 。 比较 基因 组 作 图 ”比较 基因 组 学 是 基因 组 科学 的 分 支 , 它 涉及 不 同 种 类 基因 组 间 的 比 较 。 这 种 比较 有 两 个 目的 :提供 基因 与 基因 组 进化 有 关 的 信息 ( 即 在 基因 组 水 平 了 解 种 间 的 相同 与 不 同 之 处 ) ,并 通过 比较 或 同 线性 作 图 (comparative or synteny mapping) 为 基因 克隆 提供 帮助 。 糊 椎 动物 种 间 的 比较 作 图 特别 有 价值 ,因为 它 可 能 为 人 类 的 遗传 疾病 提 供 新 的 动物 模型 和 新 的 治疗 方法 ,同时 也 可 提供 兰 椎 动物 进化 模式 有 关 的 信息 。 河 豚 鱼 基因 组 是 特别 有 用 的 比较 作 图 工具 ,因为 它 的 堆积 程度 与 基因 密度 高 ,在 鱼 与 其 他 的 状 椎 动物 中 谱系 往往 是 保守 的 ,但 河豚 鱼 基 因 组 中 的 基因 更 容易 分 离 ,因而 可 用 作 探 针 来 监测 保守 的 哺乳 类 基因 。 兰 椎 动物 的 比较 作 图 通过 不 同 水 平 的 保守 染色 体 片段 来 描绘 。 低 解析 度 的 比较 作 图 可 以 用 染色 体 着 色 (zoo-FISH) , 即 从 一 个 种 类 的 单个 染色 体 上 分 离 得 到 的 DNA 被 扩 增 ， 用 荧光 探 针 标 记 后 ,与 另 一 种 类 的 中 期 染色 体 进行 原 位 杂交 。 人 类 与 猫 的 染色 体 之 间 的 比较 显示 了 广泛 的 同 线性 ,在 某 些 例子 中 观察 到 整 条 染色 体 的 保守 ,而 在 人 类 与 小 鼠 中 保 守 区 域 要 小 得 多 [X 染色 体 特别 强烈 地 保守 ,因为 对 X 偶 联 基因 座 有 剂量 补偿 效应 的 限 制 (参阅 )]j。 在 更 精细 的 扩 度 中 , 比较 作 图 可 以 显示 在 同 线性 片段 的 标记 之 间 的 保守 联 系 。 用 于 比较 研究 的 标记 类 别 为 基因 (在 种 间 差 异 很 小 的 基因 ) ,而 不 是 在 谱系 研究 中 使 用 的 高 变 的 微 卫星 标记 (种 内 具有 多 态 性 ,在 种 间 保 守 程 度 低 )。 通 过 比较 测序 获得 的 功 能 性 DNA 序列 的 保守 性 可 帮助 鉴别 基因 和 基因 外 的 调控 元 件 。 哺 乳 动物 中 的 比较 作 图 由 锚 参 比 基 因 座 (anchor reference loci) 的 使 用 而 增强 。 它 们 位 于 染色 体 片 段 中 ,表现 了 所 有 构建 中 的 哺乳 类 基因 组 图 谱 的 保守 联系 (这 种 片段 如 SCEUSs: 最 小 的 保守 进化 单位 片 段 ,smallest conserved evolution unit segments) 。 在 SCEUs 或 其 他 区 域 鉴 别 的 单一 序列 (序列 标记 位 点 ) 可 以 用 来 产生 标记 图 谱 ,使 所 有 将 获得 的 哺乳 类 基因 组 图 谱 相 互联 系 。 在 所 有 的 哺乳 动物 中 保守 的 序列 标记 位 点 被 称 为 CATS( 保 守 锚 标记 序列 ,conserved an- chor-tagged sequences) 。 。 14 ， 外 An 二- 文 框 12.1 决定 基因 组 性 质 的 复 性 动力 学 Cot 分 析 ”在 通过 测序 进行 基因 组 分 析 成 为 可 能 之 前 , 复 性 动力 学 (reassociation kinetics) (分 析 单 链 核酸 在 溶液 中 退火 行为 ) 被 用 来 研究 基因 组 性 质 。 尽 管 这 种 技术 现在 主要 是 具有 历史 意义 ， 但 其 原理 对 理解 基因 组 结构 和 核酸 杂交 (人 参阅) 还 是 有 用 的 。 双 链 DNA 可 以 通过 加 热 被 变性 或 熔 解 (分 成 单 链 ) ,如 果 逐 渐 降 温 , 会 重新 组 合 ( 复 性 .退火 ) 形 成 双 链 分 子 。 因 为 反应 有 两 条 链 , 所 以 单 链 DNA 在 溶液 中 重新 组 合 遵循 二 级 动力 学 ,发 生 的 速度 可 以 以 公式 12.1 表 示 ,C 是 在 时 间 z 时 单 链 DNA 的 浓度 ;& 是 复 性 速率 常数 。 一 定 比 例 的 单 链 DNA 分 子 在 任何 时 间 都 存在 ,起 始 浓度 Co 可 以 通过 积分 确定 , 见 公式 12.2。 这 证 实 了 Cu 的 产物 和 上 是 控制 复 性 速度 的 参数 。 二 类 (12.1) 人 Co TI+AC 人 一 半 DNA 复 性 的 点 (如 5) 被 选 作 参 考点 。 在 这 点 上 ,C/XCo=0.5, 通 过 对 公式 12.2 的 重 排 ， 表现 出 Cot ;=1 太 。Coz0 5 称 为 Cot 值 , 与 基因 组 复杂 性 成 正比 。 这 是 因为 复杂 性 增加 ,任何 单 个 顺序 相对 浓度 下 降 ,需要 更 长 的 时 间 找 到 互补 的 链 。 复 性 反应 因此 需要 更 长 的 时 间 达 到 中 点 。 Cot 曲线 ”从 基因 组 Cot 分 析 得 到 的 数据 经 常 以 loglo Cozo ;对 复 性 DNA(1 - CZCo) 作 图 ,产生 Cot 图 或 Cot 曲线 。 对 细菌 和 病毒 的 简单 基因 组 , 复 性 发 生 在 Cot 值 的 两 个 数量 级 范围 , Cot 曲线 在 其 长 度 的 80% 是 线性 的 。 随 着 基因 组 复杂 性 的 增加 ,Cot 5 增加 ,曲线 右 移 。 大 肠 杆菌 和 入 史 菌 体 的 Cot 曲线 与 人 工 的 复杂 性 为 1 的 多 聚 尿 喀 喧 /多 聚 腺 味 叭 在 下 面 一 起 表示 ,进行 类 似 分 析 的 真 核 生 物 基因 组 显示 出 在 更 大 的 Ceot 值 范围 内 进行 复 性 。 真 核 生物 Cot 曲线 经 常 分 成 三 个 重叠 的 曲 线 ,代表 了 不 同 顺序 复杂 性 的 基因 组 片段 ,有 时 称 为 快速 .中 间 和 缓慢 成 分 ,对 应 于 高 度 重复 .中 等 重复 和 单一 顺序 DNA。 缓 慢 成 分 是 对 真实 基因 组 复杂 性 的 最 好 预测 ,因为 大 多 数 基 因 在 单一 顺序 DNA 中 发 现 。 一 部 分 DNA 几乎 立即 退火 。 这 些 零 时 间 结 合 的 DNA 也 被 称 为 反 折 DNA(snap- back DNA) 或 折返 DNA(fold-back DNA) ,因为 其 代表 了 可 以 通过 分 子 内 碱 基 配 对 杂交 的 二 元 对 称 区 域 。 标 准 哺 乳 动物 的 Cot 曲线 比 上 述 简单 基因 组 更 复杂 。 Rot 分 析 ” 复 性 动力 学 还 被 用 来 研究 RNA 成 分 的 性 质 和 丰 度 。RNA 在 溶液 中 与 互补 DNA 复 性 ,遵循 类 似 于 DNA 复 性 的 动力 学 。 反 应 的 驱动 参数 是 起 始 RNA 的 浓度 和 时 间 , 称 为 Roz 或 Reot 值 。RNA 与 cDNA 的 重新 组 合用 来 确定 RNA 的 复杂 性 ,也 就 是 细胞 中 不 同 RNA 分 子 的 代表 性 。 这 类 重新 组 合 实验 产生 跨越 几 个 数量 级 的 宽 Reot 曲线 ,一 般 分 解 成 三 个 成 分 :高 丰 度 成 分 ,中 等 和 稀少 成 分 。 高 丰 度 成 分 在 低 Rot 值 杂交 ,因为 其 包含 少 于 50 个 mRNA, 经 常 称 为 简单 成 分 。 这 些 成 分 在 每 个 细胞 中 出 现 高 达 10000 次 ,达到 整个 mRNA 群体 的 50% 。 高 丰 度 成 分 经 常 代 表 了 组 织 特异 性 转录 本 :例子 包括 c- 和 8B-=- 珠 蛋白 \ 肌 动 蛋白 \ 肌 球 蛋白 和 和 白 蛋白 的 mRNA。 中 等 丰 度 成 分 在 10 到 102 Ret 值 杂交 ,包含 100 一 1000 个 转录 本 ,每 个 出 现 几 千 拷贝 数 。 稀 少 或 稀有 成 分 在 高 Rot 值 杂 交 , 经 常 称 为 复杂 成 分 ,因为 其 包含 了 上 万 个 转录 本 ,每 个 出 现 少 于 100 次 。 大 多 数 管家 基因 在 这 种 成 分 中 发 现 。 . 145 ， 大 肠 杆 菌 (47Mbp) “典型 "哺乳 动物 (3000 kbp) 107 104 105 10%4 103 102 101 1 10 10 105 Cous 驱动 物 和 追踪 物 “特殊 复 性 成 分 的 行为 可 以 通过 在 复 性 实验 中 包含 少量 放射 性 标记 的 材料 来 研究 ,这样 的 材料 称 为 追踪 物 。 反 应 的 动力 学 由 过 量 出 现 的 复 性 成 分 控制 ,这 样 的 成 分 称 为 驱动 物 (DNA 出 现 大 于 RNA 的 反应 称 为 DNA 驱动 反应 ,遵循 Cot 曲线 ,相反 的 RNA 驱动 反应 遵循 Reot 曲线 )。 一 个 在 DNA 复 性 反应 中 的 RNA 追踪 物 可 以 鉴定 表达 的 DNA 成 分 ,这 类 实验 用 来 确定 单 一 顺序 DNA 中 的 大 部 分 基因 。 在 需要 鉴定 复 性 反应 中 不 杂交 的 成 分 时 ,反应 可 以 进行 达到 饱和 ， 可 以 观察 到 Cot 或 Reot 曲线 的 平台 。 这 样 的 饱和 动力 学 实验 可 以 被 用 来 如 确定 不 出 现在 特定 RNA 群体 中 的 DNA 比例 。 文 框 12.2”DNA 分 型 DNA 分 型 的 基础 ” DNA 分 型 (DNA typing) 或 DNA 分 布 图 (DNA profiling) 涉 及 用 小 卫星 DNA (CVNTR) 产 生 DNA 片段 组 ,以 电泳 分 离 时 ,提供 任何 个 体 的 独特 模式 (这 样 的 分 型 有 时 称 为 DNA 指纹 )。 小 卫星 DNA 是 高 度 多 态 性 的 (每 个 位 置 重 复 单位 的 数目 ) ,而 在 基因 组 中 有 很 多 小 卫星 DNA, 倾 向 于 分 布 在 亚 端 粒 区 域 。 如 果 足 够 的 位 点 被 同时 分 型 ,不 相关 的 个 体 极 不 可 能 产生 相同 的 分 布 图 ,但 因为 小 卫星 是 以 孟 德 尔 性 状 传递 的 ,相关 个 体会 有 类 似 分 布 图 ,并 且 相 匹配 的 DNA 片段 数目 与 对 应 于 它们 亲缘 关系 的 紧密 程度 呈正 相关 。 应 用 DNA 分 型 产生 个 体 特异 性 DNA 分 布 图 的 能 力 可 应 用 在 犯罪 研究 中 。DNA 可 以 从 犯罪 现场 的 组 织 和 体液 中 提取 (经 常 是 血液 精液 或 毛发 ) ,然后 与 怀疑 对 象 取得 的 对 照样 品 比较 。 同 样 的 ,DNA 也 可 以 从 动物 和 植物 中 获得 ,与 保存 的 参照 比较 确定 它们 的 起 源 , 如 在 被 偷盗 的 濒临 灭 绝 鸟 类 和 它们 的 蛋 的 情况 中 。 相 关 个 体 VNTR 等 位 基因 分 享 的 倾向 可 以 加 以 利用 。 这 可 帮助 确 立 亲 子 关系 ( 见 下 面 的 例子 ) ,证 实 家 谱 或 显示 个 体 的 相关 性 (如 被 迁移 打 断 的 )。 DNA 分 型 方法 学 ”原先 的 DNA 分 型 方法 涉及 用 限制 性 酶 前 切 DNA, 通 过 基因 座 特 异性 探 针 进 行 Southern 杂交 (参阅 ) 分 型 。 限 制 性 片段 大 小 将 依赖 于 每 个 小 卫星 重复 单位 的 数量 。 这 些 技术 需要 相对 大 量 的 新 鲜 ( 未 降解 的 )DNA, 而 法 院 证 供 的 证 据 经 常 只 有 少量 , 且 经 常 是 陈旧 而 降解 的 。 这 些 问 题 在 一 定 程度 上 通过 扩 增 微 卫星 重复 聚合 酶 链 式 反应 (参阅 ) 得 到 解决 。PCR 分 型 方法 类 似 于 分 布 图 ,但 可 以 应 用 于 微量 样品 (如 干 了 的 一 滴 血 ,一 根 毛 发 ) ,并 可 容忍 一 定 程 度 的 DNA 降 解 。 然 而 ,必须 小 心 避免 外 源 的 污染 , 按 和 常规 样品 和 对 照常 规 在 不 同 的 实验 室 进行 。 ”146 ， wwGN、195 C( 无 争议 的 孩子 ) 图 中 显示 了 一 个 简单 的 DNA 分 型 ， 用 于 父子 关系 的 争议 。 父 亲 的 VNTR 基因 座 (A)、 和 母亲 (B) 和 两 个 小 孩 (C,D) 在 图 中 显示 。 小 孩 C 的 父子 关系 无 可 争议 ,但 A 怀疑 他 不 是 小 孩 D 的 父亲 。 从 血液 中 的 得 到 的 DNA 用 限制 性 酶 剪 切 (小 箭头 表示 跨越 VNTR 顺序 的 限制 性 位 点 ) ,通过 电泳 分 离 , 以 对 应 于 不 变 区 域 ( 深 色 框 ) 的 探 针 Southern 杂交 。 每 个 等 位 基因 产生 不 同 大 小 的 电泳 条 带 ， 依赖 于 重复 的 数量 (以 数字 表示 )。 分 布 图 显示 小 孩 C 从 每 个 亲 代 遗传 了 一 个 VNTR 顺序 ,小孩 D 从 母亲 遗传 了 一 个 VNTR 顺序 , 另 一 个 等 位 基因 不 是 从 A 中 得 到 的 (以 黑色 带 表 示 )。A 假定 他 不 是 小 孩 D 的 父亲 ,因此 可 能 是 正确 的 。 文 框 12.3 ”连锁 作 图 精确 性 的 限制 限制 的 总 结 ”” 当 考 虑 到 非常 大 或 非常 小 的 基因 座 之 间 的 距离 ,连锁 作 图 本 身 是 不 准确 的 ,这 是 因为 : (1) 不 考虑 基因 座 之 间 的 距离 ,最 大 的 重组 频率 是 530% ,这 是 因为 交换 的 统计 分 布 考虑 到 四 条 染 色 体 是 等 价 的 ; (2) 多 次 交换 的 影响 当 基 因 座 之 间距 离 变 大 时 导致 对 重组 频率 的 低估 变 大 ; (3) 当 基 因 座 之 间 的 距离 变 得 小 时 , 非 交 互 重组 对 重组 频率 分 析 的 影响 。 用 重组 频率 的 连锁 作 图 在 短 距 离 是 精确 的 (也 就 是 多 次 交换 不 会 发 生 的 地 方 ) ,但 在 被 研究 的 两 个 基因 座 距 离 太 近 ,重组 会 将 它们 包括 在 一 个 异 源 双 链 DNA 的 片段 中 。 (4) 不 同 重组 频率 的 区 域 和 重组 热点 和 冷 点 的 存在 ,意味 着 遗传 和 物理 距离 间 关 系 不 是 不 变 的 。 重组 频率 在 性 别 和 物种 间 也 有 变化 。 最 大 重组 频率 不同 染色 体 上 基因 座 独 立 分 配 ,重组 频率 是 30% ,因为 亲本 染色 体 的 重组 以 重 组 组 合 频率 进行 ,这 是 因为 中 期 板 同 源 配对 的 随机 方向 。 对 于 同一 染色 体 上 的 基因 座 , 独 立 分 配 是 不 可 能 的 ,但 重组 单元 型 可 以 通过 交换 产生 。 随 基因 座 之 间距 离 的 增加 ,交换 的 机 会 也 增加 ,但 重组 频率 不 会 超过 50% ,因为 即使 距离 是 远 到 交换 一 定 会 发 生 ,一 个 交换 涉及 二 价 染色 体 的 两 个 染色 单 体 和 只 有 减 数 分 裂 的 一 半 产 物 是 重组 的 。 如 果 考 虑 双 交 换 , 不 同类 型 的 双 交 换 的 分 布 也 确 保 最 大 重组 频率 是 0% :只 有 涉及 所 有 四 条 链 的 双 交 换 产生 四 个 重组 合 (100% 重 组 ) 的 染色 体 ,但 .147 ， 只 涉及 两 条 链 的 双 交 换 统计 上 同样 发 生 的 ,这 样 产 生 四 个 亲 组 合 染色 单 体 (0% 重 组 )。 涉 及 三 条 链 的 双 交 换 产生 两 个 亲 组 合 和 两 个 重组 合 染色 单 体 (50% 重 组 )。 这 样 整个 重组 的 频率 是 50% 。 多 次 交换 ”遗传 距离 对 应 于 物理 距离 的 线性 范围 是 很 短 的 (大 约 15 个 图 距 单 位 )。 随 基因 座 之 间距 离 变 大 ,通过 重组 频率 确定 的 距离 偏 低 于 标记 间 真 实 的 遗传 距离 。 这 是 因为 多 次 交换 的 影 啊 。 在 杂 合 基因 型 标记 间 单 个 交换 将 亲本 基因 型 变 成 重组 基因 型 ,通过 交配 产物 的 分 析 计 算 这 种 改变 的 基础 上 ,连锁 作 图 才 起 作用 。 到 某 一 点 之 前 ,基因 座 之 间 增 加 的 距离 增加 了 基因 座 单 交 换 的 可 能 性 ,使 重组 频率 准确 预测 物理 距 离 。 然 而 , 随 着 进一步 分 离 ,开始 发 生 双 交换 。 这 样 的 情况 可 以 被 计 为 两 次 单 交 换 , 但 在 两 个 基因 座 交 配 中 , 双 交 换 类 型 是 不 能 与 亲 组 合 区 分 ,就 不 能 在 计算 中 被 扣除 。 因 此 交换 事件 的 计数 比 真实 值 低 ,重组 频率 和 基因 座 之 间 的 距 离 也 被 低估 了 。 基因 座 距 离 的 进一步 增加 ,更 多 次 交换 可 能 发 生 。 然 而 ,三 交换 会 被 计 为 重组 合 ,四 交换 类 型 是 亲 组 合 的 ,这 因为 基因 型 无 法 区 分 。 遗 传 作 图 的 基本 弱点 是 任何 偶数 交换 被 分 型 为 亲 组 合 , 而 任何 奇数 交换 是 重组 合 。 最 后 ,基因 座 之 间 的 距离 变 得 如 此 之 大 ,以 致 产生 偶数 交换 的 可 能 等 同 于 奇数 ,重组 频率 为 50% 。 在 这 点 上 ,即使 在 同一 染色 体 上 的 基因 座 的 行为 如 同 它们 是 独立 分 配 的 。 多 点 交换 和 作 图 功能 ”在 原则 上 ,遗传 距离 的 低估 可 以 通过 测定 多 次 交换 类 型 或 用 被 低估 的 一 个 预测 真实 距离 来 校正 。 在 遗传 易 操 作 的 物种 中 ,对 多 次 交换 的 测定 可 以 通过 包括 更 多 基因 座 的 杂交 进行 ,如 在 经 典 的 果 蝇 三 点 测 交 中 ,这样 作 图 的 区 域 分 成 较 小 的 基因 座 上 臣 离 。 在 人 类 中 ,疾病 基因 对 标记 框架 的 多 点 作 图 比 两 点 优势 对 数 分 析 更 优越 ,因为 有 了 多 种 不 同 的 标记 ,未 提供 重组 信息 的 减 数 分裂 的 机 会 就 减 小 了 。 用 两 个 以 上 基因 座 也 能 确定 基因 在 染色 体 上 排列 顺序 。 在 有 些 真菌 中 (如 曲霉 菌 , 襄 霉 菌 ) 减 数 分 裂 的 四 个 产物 保留 在 一 起 ,在 称 为 子囊 (ascus) 襄 状 结构 中 作为 四 分 体 (tetrad) 存 在 ,这 样 , 可 能 得 到 校正 双 交 换 的 连锁 数据 ,因为 每 个 减 数 分 裂 染色 体 的 产物 可 以 被 鉴定 (四 分 体 分 析 )。 对 遗传 图 距 的 校正 通过 作 图 函数 来 实现 , 作 图 函数 是 重组 频率 和 遗传 距离 之 间 的 数学 关系 。 有 三 种 类 型 的 作 图 函数 ,Haldane 的 .Kosambi 的 和 Ott 的 。Haldane 的 函数 是 最 简单 ,因为 它 假 定 交换 是 随机 分 布 的 ,没有 相互 干扰 ( 见 下 )。 它 可 以 下 面 的 公式 表达 ,4 = 遗传 距离 ,~= 重组 频率 ; 洒 受 2 动 入 干扰 ”” 当 一 个 重组 发 生 时 , 它 是 否 会 影响 另 一 个 的 起 始 ? 干扰 (interference) 表 述 的 就 是 这 样 的 效应 , 正 干 扰 是 一 个 交换 抑制 另 一 个 ,而 负 干 扰 是 刺激 另 一 个 。 在 果 蝇 中 ,通过 观察 特定 三 点 杂交 中 双 交 换 的 数量 是 否 是 每 个 单 交换 类 型 频率 所 预期 的 ,可 以 来 预测 和 干扰。 乘积 定律 规定 两 个 事件 同时 发 生 的 可 能 性 等 于 每 个 单个 事件 发 生 可 能 性 的 乘积 。 双 交换 预期 频率 因此 是 观察 到 的 单 交 换 频率 的 乘积 干扰 按 下 式 计 算 的 ,IT 是 干扰 指数 ,c 是 并 发 系数 : [三 1 一 c 而 5 预期 双 交 换 频 率 在 真 核 生 物 中 ,一 般 观 察 到 重组 是 正 干 扰 的 ,也 就 是 一 个 交换 抑制 附近 另 一 次 交换 的 起 始 。 .148 ， 用人 3 全 然而 ,非常 接近 标记 间 的 重组 显示 了 负 王 扰 的 证 据 , 也 就 是 几 个 交换 呈现 出 成 篮 现 象 。 事 实 上 这 是 杂 合 双 链 DNA 加 工 产生 的 假象 ,可 以 用 基因 转换 (人 参阅) 而 不 是 链 互 换 来 解释 。 区 域 重组 频率 变化 .热点 和 冷 点 ”连锁 作 图 依赖 于 交换 的 随机 分 布 , 但 在 基因 组 中 存在 区 域 变 化 以 及 重组 的 促进 位 点 (重组 子 . 重 组 遗传 元 件 . 重 组 热点 ) 和 抑制 位 点 (重组 冷 点 )。 在 人 类 中 ,在 每 个 染色 体 中 都 有 重组 频率 的 区 域 变 化 。 交 换 在 染色 体 端 粒 区 域 比 着 丝 粒 发 生 更 频繁 。 峻 性 比 雄 性 重组 频率 更 高 一 些 ,而 雄性 在 X:Y 对 的 拟 常 染色 体 区 域 显 示 出 专 性 的 交换 ， 所 以 重组 频率 经 常 是 30% 。 值 得 注意 的 是 立 染 色 体 没有 减 数 分 裂 图 谱 , 因为 它 不 涉及 交换 事件 ， 尽管 它 可 以 通过 放射 性 杂交 作 图 得 到 遗传 图 谱 。 重组 热点 经 常 是 内 切 酶 靶 位 点 ,因为 前 切 提供 了 起 始 同 源 重 组 (参阅 ) 的 单 链 DNA。 这 样 的 位 点 包括 大 肠 杆 菌 中 的 ou 位 点 和 其 他 细菌 中 的 相关 位 点 。 重 组 热点 引起 对 遗传 距离 的 高 估 , 因 为 如 果 重 组 倾向 于 在 特定 位 点 起 始 ,这 些 位 点 两 侧 基 因 座 的 重组 比 平均 水 平 频繁 。 然 而 , 纵 观 整个 基因 组 ,重组 热点 相对 平均 分 布 。 仅 在 考虑 短 距 离 时 它们 影响 明显 ,导致 酵母 杂交 中 的 极 性 现象 ， 在 这 种 现象 中 ,涉及 基因 转换 的 不 同等 位 基因 有 不 同 的 频率 ,依赖 于 从 交换 起 始 位 置 分 支 迁 移 ( 参 阅 ) 的 范围 。 重组 冷 点 经 常 是 同 源 DNA 不 能 有 效 联 会 的 位 置 。 这 经 常 发 生 在 有 不 育 阻碍 的 位 置 ,如 一 条 染色 体 倒 位 或 易 位 杂 合 型 ,在 断裂 点 处 联 会 被 阻止 。 这 种 位 点 两 侧 的 基因 座 显得 比 它们 实际 上 上 距 离 近 , 这 是 因为 它们 之 间 的 重组 频率 低 。 复 杂 的 重 排 异 构 体 缺乏 联 会 能 力 可 被 利用 来 阻止 重组 。 文 框 12.4 DNA 测 序 DNA 测序 方法 1977 前 ,确定 DNA 中 碱 基 顺 序 (DNA 测序 ) 是 费力 的 工作 , 且 只 能 应 用 于 如 tRNA 的 小 分 子 。 在 这 时 发 展 了 两 个 快速 大 量 DNA 测序 的 技术 ,两 个 都 涉及 产生 一 套 重 释 的 长 度 相差 一 个 碱 基 的 DNA 片段 。 四 个 测序 反应 平行 进行 ,每 个 产生 确定 末端 碱 基 的 重 和 到 的 片段 。 这 些 反 应 的 并 排 电 泳 使 顺序 通过 电泳 胶 或 放射 自 显 影 读 出 。 Maxam 和 Gibert 测序 包括 用 修饰 特定 碱 基 的 化 学 试剂 降解 限制 性 片段 。Sanger 测序 方法 包 括 DNA 合成 ,每 个 反应 包括 少量 四 种 双 脱 氧 核 背 酸 三 磷酸 (ddNTPs) 的 一 种 。 它 们 是 生长 终止 剂 (telogens) ,也 就 是 引起 链 终止 的 物质 ,因为 它们 缺乏 延伸 所 需 的 3 羟基 基 团 ,因此 这 种 方法 经 常 称 为 双 脱 氧 方法 或 链 终止 方法 。Maxam 和 Gilbert 测序 起 初 是 最 常用 的 ,因为 它 能 用 限制 性 酶 和 通 常 的 实验 室 试剂 进行 ,而 Sanger 方法 需要 特定 的 试剂 和 M13 载体 。 随 着 噬 菌 粒 (phagemid) 的 发 展 和 优良 试剂 如 双 脱 氧 核 苷 酸 的 商业 化 ,Sanger 方法 变 得 更 普遍 。 它 最 适合 自动 化 大 量 测序 计划 ， 并 且 大 多 数 现在 进行 的 一 般 测序 也 是 用 这 种 方法 。Maxam 和 Gilbert 测序 对 有 些 特 殊 的 应 用 如 DNase 足 迹 法 (footprinting)( 人 参阅 ) 还 是 有 用 的 。 最 近 发 展 了 几 种 新 的 测序 方法 ,其 中 两 种 可 能 在 将 来 会 被 应 用 。 第 一 个 是 扫描 隧道 显微镜 和 类 似 原理 的 原子 力 显 微 镜 可 以 对 DNA 分 子 表面 结果 作 图 , 随 技 术 改 进 有 可 能 分 辩 单 个 碱 基 。 第 二 是 杂交 测序 ,是 用 系列 的 固定 化 窒 核 苷 酸 产 生 杂 交 图 谱 。 杂 交 测 序 要求 在 朝 核 苷 酸 自动 化 合成 以 格子 分 布 方面 的 提高 ,如 所 有 可 能 的 十 聚 体 需要 合成 和 定位 超过 50 000 分 离 的 分 子 。 在 将 来 ， 可 在 小 的 芯片 上 分 布 上 千 个 守 核 苷 酸 用 于 杂交 ,通过 计算 机 直接 分 析 图 谱 , 快 速 确定 顺序 。 Maxam 和 Gilbert 测序 ”在 这 种 技术 中 ,进行 四 个 反应 ,末端 标记 的 限制 性 片段 与 修饰 或 去 除 特 定 类 型 碱 基 的 试剂 作用 。 硫 酸 二 甲 酯 甲 基 化 鸟 味 聆 , 酸 去 除 任何 嗓 叭 肝 修 饰 所 有 的 喀 啶 , 肝 和 和 毛 149 ， 化 钠 特异 修饰 胞 喀 啶 。 修 饰 的 碱 基 被 哌 啶 去 除 , 链 在 脱 碱 基 位 点 处 剪 切 。 试 剂 在 只 引起 每 条 链 修 饰 一 个 位 置 的 浓度 下 使 用 。 这 样 产 生 有 同样 标记 末端 的 和 不 同 碱 基 特 异性 非 标记 末端 的 重 橙 片 段 系列 。 四 个 反应 的 产物 在 电泳 胶 上 并 排 电 泳 ,顺序 通过 放射 自 显影 读 出 。 标准 链 终 止 测序 ， 在 这 个 技术 中 ,引物 与 单 链 DNA 退火 ,通过 DNA 聚合 酶 延伸 一 T7DNA 桶 合 酶 的 高 活性 重组 形式 称 为 测序 酶 (sequenase) 经 常 被 使 用 。 同 位 素 标记 的 核 苷 酸 在 引物 延伸 中 挫 入 ,有 四 个 反应 ,每 个 都 包含 少量 四 种 双 脱 氧 核 苷 酸 中 的 一 种 。 这 样 每 个 反应 产生 一 套 重 春 标 记 产物 ,从 测序 引物 开始 ,在 特定 碱 基 终 止 。 这 些 通过 邻近 泳 道 的 电泳 ,使 顺序 由 放射 自 显影 读 出 ( 见 图 )。 起 先 ,这 种 技术 需要 以 M13 载体 为 基础 的 单 链 模板 。 这 样 的 模板 会 得 到 最 佳 的 结果 ,但 也 可 以 进行 双 链 测序 ,通过 对 质粒 等 的 dSDNA 模板 先 变 性 。 测 序 引物 只 与 一 条 链 退 火 , 所 以 只 有 一 条 链 被 用 作 模 板 。 近来 对 链 终止 测序 的 改进 ”最近 对 链 终止 反应 的 很 多 改进 是 从 自动 化 过 程 和 增加 得 到 顺序 信 息 而 获得 。 多 路 测序 是 很 多 克隆 在 同一 反应 中 测序 ,并 在 同样 的 泳 道上 电泳 :每 个 克隆 并 非 通过 插入 标记 测序 ,而 用 独特 的 引物 进行 ,引物 用 于 Southern 杂交 确定 对 克隆 特异 的 测序 条 带 。 染 料 终止 测序 使 用 荧光 染料 标记 的 双 脱 氧 核 苷 酸 。 用 四 种 产生 不 同 波 长 的 光 染 料 ,每 个 对 应 于 一 种 碱 基 。 这 使 四 个 反应 在 一 个 泳 道上 进行 ,顺序 由 电泳 过 程 中 凝 胶 末 端的 探测 器 读 出 (实时 测序 )。 这 不 仅 增加 了 流通 量 , 且 因为 信息 直接 从 探测 器 到 计算 机 ,减少 了 记录 顺序 的 误差 。 循 环 测序 是 链 终止 测序 和 PCR 的 杂 合 。 用 双 链 模板 和 单 链 测序 引物 ,但 反应 用 热 稳 定 DNA 聚合 酶 (参见 第 21 章 聚 合 酶 链 式 反应 ) 通 过 热 循环 进行 。 循 环 测序 降低 了 由 模板 二 级 结构 引起 的 假象 ,因为 产物 以 线性 方式 积累 (参见 不 对 称 PCR) ,只 需要 少量 模板 。 循 环 测序 比 标准 测序 精确 度 低 一 些 , 因 为 热 稳定 聚合 酶 如 Taq DNA 聚合 酶 是 差错 倾向 较 高 。 5” 一 一 一 GGATTCTGCTACGGA 3 包含 ddATP 的 反应 5 一 一 GGATTCTGCTACGCGA EN 一 > 3， 人 TOCCTE ddACGATGCCT [一 一 一 ddAGACGATGCCT [一 一 ddAAGACGATGCCT [一 包含 ddCTP 的 反应 5 一 一 一 GGATTCTGCTACGGA DDN 一 > 3， aas [es COAIGGCTE ddCcTAAGACGATGCCT [一 一 ddcCcTAAGACGATGCCT [请 包含 ddGTP 的 反应 5 一 一 GGATTCTGCTACGGA EN- 3， -OonD-mPDaoPDPpPpmoOOD ddGACGATGCCT 放 一 一 ) 包含 ddTTP 的 反应 5” 一 一 一 GGATTCTGCTACGGA ER -> 3， 四 ge ddTAAGACGATGCCT [CC “天 基因 组 计划 中 的 测序 策略 ”对 大 量 测序 计划 ,如 基因 组 测序 ,大 的 基因 组 克隆 经 常 随机 亚 克 隆 到 鸣 菌 粒 载体 ,产生 很 多 相互 重 琶 的 克隆 。 这 些 克 隆 被 随机 挑选 和 测序 ( 乌 枪 测序 ,shotgun se- quencing) ,顺序 信息 输入 计算 机 ,由 计算 机 检测 重 到 和 将 插 人 片段 排列 成 连续 的 分 辨 率 为 一 个 碱 基 的 图 谱 。 任 何 存在 的 孔隙 通过 在 原始 基因 组 克隆 中 的 引物 步 移 (priner walking) 补 平 ,引物 步 移 是 引物 根据 接近 和 孔隙 的 已 经 测序 顺序 设计 引物 ,得 到 缺失 的 顺序 。 顺序 信息 的 操作 和 储存 ”生物 信息 学 是 指 快速 发 展 用 于 储存 分 析 、 比 较 和 组 织 DNA 和 和 蛋白 顺 序 信息 的 计算 机 技术 。 有 三 个 并 列 的 数据 库 :EMBL( 由 欧洲 信息 研究 所 发 布 ) ,Genebank( 由 美国 国家 生物 技术 中 心 发 布 ) 和 DDBJ( 日 本 的 DNA 数据 库 ) ,包含 了 主要 的 DNA 顺序 信息 ,并 随 新 序 列 被 发 表 不 断 更 新 。 特 殊 的 数据 库 也 有 提供 ,用 来 保存 快速 扩展 的 基因 组 计划 中 的 表达 顺序 标记 ( 见 正文 ), 及 显示 基因 组 作 图 ,基因 顺序 和 表达 分 布 的 模式 生物 数据 库 。 数 据 库 通过 互联 网 对 世 界 范围 的 研究 科学 家 开放 ,并 可 以 和 多 种 精妙 的 作 图 、 顺 序 排列 和 预测 蛋白 顺序 、 同 源 性 和 功能 的 分 析 程 序 共 同 使 用 。 现 在 ,大 多 数 顺序 信息 是 免费 开放 的 ,但 在 基因 组 科学 中 不 断 增 长 的 商业 价 值 ,不 可 避免 造成 芍 断 的 危险 性 ,如 医药 公司 和 农业 公司 会 控制 基因 组 顺序 来 保护 它们 的 利益 和 投资 。 ( 陈 淳 译 ) 和 第 13 章 可 移动 的 遗传 因 于 基本 概念 和 定义 可 移动 的 遗传 因子 (mobile genetic elements) 是 指 可 在 同一 细胞 中 基因 组 内 或 一 个 细胞 的 基因 组 间 从 一 个 位 点 移动 到 另 一 位 点 的 DNA 片段 。 它 在 原核 生物 和 真 核 生物 中 均 有 所 发 现 , 由 于 结构 、 移 动机 制 、 分布 、 移 动 自 由 度 、 自 主 水 平 的 不 同 而 分 为 许多 种 类 。 虽然 一 些 因 子 的 移动 具有 明确 的 细胞 功能 ,但 大 多 数 因子 被 认为 是 自私 DNA 或 偶 然 发 生 移动 的 DNA。 在 高 等 真 核 生物 中 ,很 大 一 部 分 的 基因 组 是 由 有 功能 和 “ 假 ” (ghost) 转 座 因子 组 成 (由 突变 而 失 活 ) 。 一 些 细菌 的 移动 因子 发 展 了 一 种 细菌 在 宿 主 细胞 的 共生 关系 。 可 移动 的 遗传 因子 在 基因 组 进化 中 起 着 重要 作用 。 可 移动 的 遗传 因子 根据 它们 独立 的 水 平 可 大 致 分 为 三 类 。 第 一 类 为 附加 体 (epi- some) ,如 鸣 菌 体 入 F 质粒 。 此 类 因子 能 以 两 种 形式 存在 - 或 整合 在 宿主 基因 组 内 ,或 作为 染色 体外 的 自主 复制 子 。 第 二 类 为 暗盒 (cassette)0 (例如 酵母 的 交配 型 盒 , 锥 虫 VSG 盒 等 )。 此 类 因子 的 移动 由 细胞 控制 ,并 介 导 特异 性 的 基因 组 重 排 。 附加 体 和 盒 式 元 件 的 移动 均 利 用 同 源 重 组 或 位 点 特异 性 重组 (参阅 ), 即 对 靶 位 点 的 选择 很 严格 ,一 般 只 是 一 个 位 点 。 第 三 类 称 转 座 因 子 (transposable elemement) (如 了 因子、 反 转 录 病 毒 等 )。 转 座 因子 在 宿主 基因 组 外 不 能 复制 ,但 可 在 宿主 基因 组 内 调控 自发 移动 。 转 座 因 子 通过 转 座 作 用 发 生 移动 ,此 作用 无 需 转 座 因 子 与 靶 位 点 同 源 性 而 形成 重组 ,所 以 在 靶 位 点 的 选择 上 有 一 定 自 由 度 。 转 座 因子 是 可 移 动 的 遗传 因子 中 最 大 的 一 类 , 它 在 结构 、 转 座机 制 、 自 主 水 平方 面 呈 现 多 样 性 。 有 些 可 移动 的 遗传 因子 是 病毒 。 鸣 菌 体 和 是 病毒 附加 体 的 例子 。 噬 菌 体 Mu 是 转 座 因子 的 例子 一 一 它 必 需 整 合 到 宿主 基因 组 中 才能 复制 。 真 核 生 物 反 转录 病毒 也 是 转 座 因子 的 例子 。 根据 转 座机 制 不 同 , 转 座 因子 可 分 为 两 大 类 。I 类 转 座 因子 ( 反 转 录 因 子 ,retroele- ment) 它 在 转 座 过 程 中 利用 RNA 来 介 导 一 一 整合 因子 先 转录 ,再 反 转 录 为 cDNA 拷贝 整合 在 新 位 点 。 开 类 转 座 因子 ( 转 座 子 ， transposons) 它 直接 以 DNA 形式 进行 转 座 。 通 过 前 切 、 整 合 或 复制 过 程 使 转 座 子 一 个 拷贝 留 在 原 位 点 , 另 一 个 拷贝 整合 在 新 位 点 。 若 转 座 因 子 编码 的 蛋白 满足 它们 自己 转 座 作 用 (至 少 是 转 座 起 始 , 保 留 到 细胞 结 束 ) 的 需要 ， 此 类 转 座 因子 是 有 活性 的 或 自主 的 。 对 于 转 座 子 而 言 , 转 座 作用 的 最 0 低 要 求 是 转 座 酶 (transposase) 和 它 所 识别 的 顺 式 作 用 位 点 。 此 位 点 使 转 座 子 能 确 定 自己 的 DNA 和 宿主 DNA 二 者 之 间 的 边界 。 对 于 反 转 录 因 子 来 说 ,在 需要 转 座 酶 (一 般 称 整合 酶 ?2 ,integrase) 时 还 需要 反 转 录 酶 。 另 一 些 转 座 因 子 是 有 缺陷 的 ， 失去 了 酶 的 功能 ,但 有 顺 式 作用 位 点 ,并 可 以 通过 一 个 活化 因子 的 反 式 作用 而 移 动 。 依 赖 反 式 作用 而 移动 的 因子 称 非 自主 的 或 被 动 的 (nonautonomous or passive) 。 自主 的 和 缺陷 的 因子 可 形成 相关 序列 的 家 族 。 非 自主 的 反 转 录 因 子 的 家 十 分 庞大 的 且 结 构 呈 现 多 样 性 ,其 序列 与 已 知 的 自主 因 子 无 同 源 性 。 当 反 转 录 酶 和 整合 酶 反 式 提供 时 , 非 自 主 的 反 转 录 因 子 作 为 细胞 的 RNA 可 偶然 发 生 转 座 , 这 就 产生 了 在 兰 椎 动物 基因 组 中 含量 很 高 的 加 工 假 基 因 (processed pseudogene) 。 另 一 种 孙 生 类 型 的 移动 因子 , 它 无 转 座 所 需 的 顺 式 作 用 位 点 因此 它 是 “稳定 "的 ,但 编码 反 式 作用 蛋白 ,并 将 蛋白 给 同一 细胞 中 可 顺 式 作用 的 因子 ,例如 果 蝇 的 P 因子 的 剪 翅 衍生 物 (wings-clipped derivative) 。 注释 :1) 障 盒 指 可 交换 的 遗传 信息 的 片段 。 大 多 数 遗 传 基因 座 的 变化 发 生 是 等 位 的 ,但 暗盒 是 非 等 位 的 , 因 为 发 起 于 不 同 的 座位 。 暗 盒 的 例子 包括 酵母 的 交配 型 盒 , 锥 虫 的 可 变性 表面 抗原 基因 和 细菌 整合 子 中 的 抗生素 抗 性 基因 。 作 为 此 术语 的 一 种 延伸 暗盒 也 可 指 用 于 体外 诱 变 中 可 交换 的 寡 核 苷 酸 。2) 由 工 类 转 座 因子 编码 的 整 合 酶 与 由 工 类 转 座 因子 编码 的 转 座 酶 在 结构 和 功能 上 是 同 源 的 。 虽 然 噬菌体 人 编码 的 位 点 特异 性 的 重组 酶 也 称 为 整合 酶 ,但 它 不 是 转 座 酶 。 这 两 种 酶 在 功能 上 是 相似 的 ,但 转 座 酶 虽 无 靶 , 但 对 转 座 因子 有 较 高 的 特异 性 。 而 位 点 特异 性 的 重组 酶 必须 识别 重组 中 供 体 和 受 体 的 顺序 。 13.1 转 座 的 机 制 转 座机 制 概述 ”根据 转 座机 制 不 同 , 转 座 因子 分 为 两 个 家 族 。 转 座 子 直接 以 DNA 形 式 转 座 ,而 反 转 录 因 子 以 RNA 为 介 导 。 每 个 家 族 中 又 存在 几 种 特异 类 型 的 转 座机 制 。 在 详细 介绍 个 别 机 制 前 , 先 介绍 适合 所 有 转 座 因子 的 相同 点 。 (1) 增殖 (proliferation) :所 有 转 座 事件 都 有 在 基因 组 中 增加 转 座 因子 拷贝 数 的 能 力 。 此 过 程 可 被 动 或 主动 地 完成 。 (2) 转 座 的 步骤 : 转 座 子 的 主动 转移 可 分 为 三 步 ( 见 图 13.1)。@ 供 体 剪 切 阶段 : 转 座 酶 催化 核酸 内 切 反 应 ,使 转 座 因 子 从 宿主 DNA 中 分 离 出 。@ 链 交换 阶段 : 转 座 酶 催化 一 对 转 酯 反应 ,使 转 座 因 子 3 端 与 靶 位 点 相连 ;@ 修 复 阶段 :以 DNA 合成 反应 填补 留 下 的 缺 日 。 对 于 反 转 录 因 子 , 它 通过 转录 和 反 转 录 产 生 可 加 工 的 cDNA 并 进行 整合 来 完成 这 三 步 。 非 病毒 逆转 录 因 子 仅 利用 DNA 修复 步骤 就 可 整合 到 宿主 DNA 中 。 (3) 靶 位 点 的 重复 制 :对 于 大 多 数 转 座 因子 , 转 座 的 链 交 换 发 生 在 靶 DNA 交错 断裂 ， 所 以 新 整合 的 因子 位 于 单 链 DNA 尾 端的 两 侧 。 对 于 缺口 的 修复 合成 产生 同 向 重复 顺 序 , 故 称 为 靶 位 点 重复 (target site duplications TSD)( 图 13.2)。 大 多 数 转 座 因子 产生 特定 长 度 的 TSDs, 但 I.2 类 的 反 转 录 因 子 在 同一 基因 组 中 也 可 产生 不 同 大 小 的 TSDs。 这 可 能 是 因为 它 利用 偶然 打开 的 DNA 末端 的 原因 。 * 老 3 。 转 座 反 转 录 转 座 反 转 座 整合 元 件 整合 元 件 整合 元 件 8 8 反 转 录 反 转 录 供 体 剪 切 供 切 人 ae 修复 合成 修复 合成 修复 合成 相合 元 人 骆 元 伯 明 合 元 件 13.1 三 种 主要 的 自主 转 座机 制 的 总 结 ,它们 分 别 利用 II 型 ,I.1 型 ,I.2 型 转 座 因子 。 TAO 人 | 疙 2 图 13.2 驾 位 点 重复 (TSD) 产 生 的 机 制 。 划 位 点 重复 是 转 座 特有 的 标志 ,其 他 重组 机 制 只 能 精 确 地 保留 重组 序列 ,但 不 能 使 靶 位 点 重复 。 在 靶 位 点 处 产生 交错 切口 , 转 座 因 子 与 5 突出 端 连 接 。 剩 余 的 缺口 由 修复 合成 补 平 , 故 在 交错 切口 产生 同 向 重复 顺序 。 几 乎 所 有 的 转 座 因子 均 产 生 TSD, 不 能 产生 TSD 的 因子 (如 IS91) 可 能 在 靶 位 点 处 产生 一 个 平 末 端 。 (4) 靶 位 点 的 优先 性 :不 同 转 座 因 子 对 靶 位 点 选择 的 优先 性 不 同 。 有 的 在 特异 性 位 点 整合 ,有 的 随机 整合 。 大 肠 杆 菌 转 座 子 Tn7 一 般 在 特异 性 位 点 整合 ,但 若 位 点 无 效 的 话 , 它 能 转换 为 随机 整合 。 大 多 数 转 座 因 子 避 免 整 合 在 早已 存在 的 相同 类 型 的 转 座 因 子 上 , 即 它们 有 顺 式 免疫 作用 (czs-immunity)。 经 过 对 个 别 转 座 事件 的 研究 发 现 , 大 多 数 转 座 因子 有 位 置 优先 性 。 一 些 真 核 转 座 子 的 移动 距 供 体 位 点 很 近 , 仅 (1 一 10kb), 这 是 区 域 的 再 整合 。 细 菌 复制 型 转 座 子 优先 转移 到 质粒 上 ,而 不 是 由 质粒 转移 到 细菌 染色 体 。 保守 转 座 和 复制 转 座 ” 转 座机 制 或 者 是 保守 的 或 者 是 复制 的 。 保 守 转 座 (conservative transposition, 也 称 为 非 复制 转 座 或 简单 转 座 或 切割 粘贴 机 制 ) 涉 及 从 一 个 位 点 切 下 转 座 因子 而 在 另 一 位 点 整合 。 自 主 转 座机 制 不 增加 转 座 因子 的 拷贝 数 ,尽管 可 被 动 完 成 ( 见 下 文 )。 复 制 转 座 (replicative transposition)( 又 称 为 非 保守 或 复合 转 座 )。 涉 及 转 座 因子 的 重复 ,一 分 拷贝 留 在 供 体 位 点 ,一 份 整合 在 靶 位 点 。 反 转录 因子 转 座 必定 是 复制 的 ,因为 反 转 录 因 子 产 生 转 录 本 ,再 变 成 EDNA 整合 到 基因 组 中 。 对 于 转 座 子 ,保守 转 座 和 复制 转 座 之 间 的 区 别 反映 了 供 体 切割 反应 的 时 间 不 同 , 如 图 13.3 所 示 。 两 者 通过 供 体 前 切 因 子 的 3 端 起 始 转 座 ,提供 可 与 靶 位 点 相互 作用 的 游离 未 4 供 体 加 和 估 夫人 关 雪 全 共和 y 供 体 和 靶 位 点 靠近 。 发 生 链 交 换 本 Shapiro 中 间 体 开 卫 遇 出 和 点 剪 切 本 DNA 从 3” AN RN SS Ta 图 13.3 非 复制 转 座 和 复 钊 转 座 的 统 _ 模 型 。 细 线 代表 供 体 DNA, 帮 线 代表 鼻 DNA, 方 框 代表 转 座 子 ,黑色 箭头 代表 链 发 生 断 裂 的 地 方 ,白色 箭头 代表 复制 。 此 模型 中 ,在 形成 Shapiro 中 间 体 前 ,两 种 转 座 的 步骤 相同 。Shapiro 中 间 体 指 供 体 和 轩 DNA 结合 在 一 起 的 结构 。 如 果 供 体 5 端 发 生 切 割 , 则 供 体 DNA 释放 ,此 过 程 为 非 复制 转 座 。 如 果 供 体 5 端 不 发 生 切 割 , 而 在 连接 点 进行 复 制 , 此 过 程 为 复制 转 座 。 供 体 5 端 切割 发 生 在 链 交换 前 ,所 以 不 形成 shapiro 中 间 体 结构 ,这 种 机 制 被 非 复制 转 座 子 采用 。 若 靶 位 点 切割 发 生 在 链 交 换 转 酯 反应 时 , 划 DNA 的 双 链 切口 不 能 产生 (对 照 归 巢 内 含 子 、 被 动 转 座 ) 。 端 。 在 保守 转 座 中 , 供 体 DNA 的 释放 是 通过 转 座 因 子 5 端的 切 制 完成 的 ,并 使 供 体 DNA 留 下 一 个 缺口 。 在 复制 转 座 中 ,只 有 转 座 子 的 3 端 被 切割 ,所 以 供 体 DNA 和 靶 DNA 保 持 物理 连接 ,修复 复制 以 宿主 DNA 的 3 游离 末端 为 引物 越过 转 座 子 。 然 后 转 座 因子 复 制 。DNA 转 座 的 公认 模型 是 根据 包括 唉 菌 体 Mu、Tn5 和 反 转 录 病 毒 在 内 的 转 座 因子 的 特点 进行 深入 研究 而 得 到 的 。 此 模型 有 不 同 的 形式 ,把 主要 的 反应 放 在 不 同 的 次 序 上 。 所 有 步骤 中 最 重要 的 一 点 是 供 体 5 端 切割 的 时 间 选 择 。 如 果 它 发 生 在 链 交 换 前 , 转 座 因 于 以 游离 分 子 形式 释放 ;如 果 它 发 生 在 链 交 换 后 , 转 座 因 子 直接 从 一 个 位 点 转移 另 一 个 位 点 。 对 于 象 吻 菌 体 Mu 那样 既 可 非 复制 转 座 , 又 可 复制 转 座 的 转 座 因子 ,其 供 体 5 端 切 割 有 两 种 可 能 ,一般 发 生 在 链 交换 后 。 对 于 像 P 因 子 、.Ac-Ds 因子 那样 非 复制 转 座 的 转 座 因 于 ,其 供 体 5 端 转 座 可 能 发 生 在 链 交换 前 。 目 前 关于 5 端 切割 的 机 制 知道 的 很 少 。 ”本 7 解 离 “在 两 个 质粒 之 间 经 复制 转 座 后 ,两 个 环 可 连接 出 一 个 复合 结构 , 称 为 共 合 体 (cointegrate) 。 在 共 合 体 中 ,参与 形成 共 合 体 的 两 个 复制 子 之 间 的 交界 处 是 以 转 座 因 子 的 拷贝 作为 标志 的 。 以 这 种 方式 移动 的 转 座 子 也 具有 将 共 合 体 分 离 成 两 个 复制 子 成 分 的 功 能 ,此 过 程 称 为 解 离 (resolution) 。 每 个 转 座 子 可 编码 解 离 酶 (resolvase) 。 解 离 酶 是 可 作用 转 座 子 内 部 的 一 段 短 序 列 的 位 点 特异 性 重组 酶 。 这 段 短 序列 称 为 内 部 解 离 位 点 (res,in- ternal resolution site) 。 由 解 离 酶 催化 共 合 体 中 两 个 res 元 件 之 间 的 重组 将 共 合 体 解 离 为 两 个 分 子 。 解 离 酶 的 活性 有 很 强 的 倾向 性 , 即 此 反应 很 少将 两 个 分 离 的 分 子 形成 共 合 体 。 这 种 特异 性 是 由 于 拓扑 学 条 件 所 导致 。 被 动 转 座 ”被动 转 座 指 转 座 因 子 的 任何 转移 过 程 都 不 能 依靠 本 身 来 完成 。 被 动 转 座 有 两 种 类 型 。 (1) 反 式 被 动 转 座 采用 与 主动 转 座 相同 的 机 制 , 但 所 需 的 酶 (如 转 座 酶 \ 反 转录 酶 ) 由 主动 转 座 因子 反 式 提供 。 只 有 非 自主 的 因子 的 转移 采用 反 式 被 动 转 座 。 (2) 细 胞 控制 的 被 动 转 座 指 由 细胞 DNA 复制 所 导致 的 转 座 事件 (图 13.4)。 自 主 和 非 自主 的 因子 采用 此 过 程 移 动 。 复制 的 DNA REF 未 复制 的 DNA 图 13.4 细胞 控制 的 被 动 转 座 中 的 非 复制 转 座 使 拷贝 数 增加 。 上 图 示意 了 两 种 机 制 , 每 种 分 为 预 转 座 阶 段 (A) ,主动 转 座 阶 段 (B) 和 被 动 转 座 阶 段 (C)。 归 巢 内 含 子 和 内 蛋白 子 采用 没有 主动 转 座 的 第 二 种 机 制 。 内 含 子 或 内 蛋白 子 编码 的 核酸 内 切 酶 切割 同 源 序列 , 内 含 子 的 DNA 和 序列 通过 基因 转换 拷贝 到 无 内 含 子 的 等 位 基因 中 。 所 有 的 转 座 因 子 必须 通过 转 座 增加 自己 的 拷贝 数 以 防 灭 绝 。 对 于 非 复 制 转 座 的 因子 的 扩 增 必须 通过 细胞 被 动 地 实现 。 细 胞 控制 的 被 动 转 座 以 两 种 方式 产生 四 从 已 复制 的 DNA 转 座 到 未 复制 的 DNA 一 一 例如 玉米 的 Ac-Ds 因子 即 采用 此 方式 。@ 通 过 基因 转变 修复 切除 所 产生 的 断裂 一 一 例如 果 蝇 P 因子 , 归 梨 内 含 子 和 归 梨 内 蛋白 子 (homing in- tein)( 人 参阅 ) 采 用 此 方式 。 另 外 拷贝 数 的 增加 可 通过 增加 宿主 复制 子 的 拷贝 数 而 实现 ,如 ，156 ， 细菌 转 座 子 整合 到 质粒 或 噬菌体 时 采用 此 方式 。 反 转 录 转 座 和 反 转 座 I.1 型 的 反 转 录 因 子 的 转移 方式 是 通过 转录 出 被 整合 因子 后 反 转录 成 EDNA, 最 后 整合 在 一 新 位 点 (CDNA 合成 的 过 程 在 反 转 录 病 毒 (参阅 ) 感 染 周期 这 一 部 分 作 更 为 详细 的 讨论 ) 。 对 于 反 转 录 病 毒 转 座 作 用 发 生 在 病毒 感染 周期 的 连接 中 , 即 转录 本 和 反 转 录 酶 一 起 包装 在 病毒 粒子 中 ,然后 导 和 细胞。 而 其 他 的 反 转 录 转 座 子 ,整个 周期 发 生 在 细胞 内 。 一 旦 产生 cDNA, 病 毒 家 族 的 反 转 录 因 子 按照 转 座 子 相似 的 途径 转 座 。 但 因为 它 多 了 一 步 额 外 反 转 录 , 故 称 反 转录 转 座 (retrotransposition)。 其 cDNA 两 侧 通常 有 很 少量 的 宿主 DNA( 一 般 为 2bp) ,这 是 在 类 似 转 座 阶段 宿主 3 端 切割 的 反应 中 通过 整合 酶 在 每 条 链 的 3 切割 而 产生 ,然后 整合 酶 在 cDNA 的 游离 3 末端 和 宿主 靶 位 点 间 进 行 转 酯 反应 。 整合 后 是 修复 反应 , 它 可 产生 2bp 的 驾 位 点 重复 ,并 可 能 从 转 座 因 子 的 $ 端 除去 原 供 体位 点 的 2bp 的 DNA。 I.2 型 的 转 座 因子 通过 与 反 转 录 病 毒 复制 无 关 的 机 制 进行 转移 。 其 cDNA 通过 以 自 身 或 靶 位 点 上 的 DNA 为 引物 而 产生 。 整 合 过 程 是 以 RNA 为 模板 ,越过 变 位 点 的 EDNA 修复 合成 而 完成 。 因 为 此 途径 缺少 典型 转 座机 制 中 的 许多 步骤 ,但 有 一 步 涉及 反 转 录 , 故 称 为 反 转 座 (retroposition)。 图 13.5 表示 反 转 录 转 座 和 反 转 座 的 机 制 。 yy cDNA 合成 | 供 体位 点 前 切 yy Shapino 中 间 体 y 第 二 链 cDNA 合成 > = 13.5 ” 反 转 录 转 座机 制 (上 ) 和 反 转 座机 制 (下 ) 的 总 结 。 细 线 代 表 RNA, 方 框 代表 整合 的 因 子 , 粗 线 代 表 DNA , 粗 虚 线 代表 在 靶 位 点 重复 位 置 修复 合成 的 DNA。 “证 几 。 转 座 的 调控 ”作为 自私 DNA, 成 功 的 转 座 因 子 经 常 发 生 转移 并 尽 可 能 增加 它 的 拷贝 数 。 但 不 受 控制 的 转 座 会 破坏 宿主 的 基因 组 ,并 最 终 影响 宿主 的 基因 组 中 的 转 座 因 子 。 所 以 大 多 数 转 座 因子 必须 调控 它们 本 身 的 转 座 作 用 。 这 些 调 控 机 制 不 仅 控制 转 座 的 频 率 , 而 且 还 控制 转 座 相 对 细胞 周期 的 时 间 和 靶 位 点 的 特点 。 此 原则 的 一 个 例外 是 叹 菌 体 Mu, 它 的 宿主 大 肠 杆 菌 的 存活 并 不 重要 。 鸣 菌 体 Mu 通过 重复 转 座 破坏 宿主 的 基因 组 ， 然后 多 拷贝 的 叭 菌 体 Mu 与 宿主 DNA 一 起 包装 在 叹 菌 体 颗粒 中 。 转 座 作 用 有 很 多 调控 方式 。 果 蝇 P 因子 和 细菌 转 座 子 Tn10 是 了 解 的 最 清楚 的 转 座 因子 。 很 多 转 座 子 编码 的 转 座 酶 阻 过 蛋白 与 转 座 酶 是 共 线性 的 。P 因子 在 生殖 细胞 中 转 座 即 以 此 方式 受到 限制 。P 因子 的 转 座 酶 基因 中 有 三 个 内 含 子 , 在 生殖 细胞 和 体 细胞 中 发 生 不 同 的 拼接 。 在 生殖 细胞 中 ,三 个 内 含 子 均 被 除去 ,成熟 的 转录 本 编码 一 个 有 转 座 酶 活性 的 87kDa 的 多 肽 。 在 体 细胞 中 ,内 含 子 3 未 被 除去 。 在 此 内 含 子 中 有 一 终止 密码 子 , 故 产生 截 短 蛋白 。 此 蛋白 可 以 各 种 方式 作为 转 座 的 阻 遏 物 一 一 可 以 结合 转 座 酶 的 底 物 , 阻 断 其 活性 或 结合 酶 本 身 来 抑制 它 。 相 同 的 机 制 也 被 其 他 转 座 子 利用 ,如 玉米 的 Ac 因子 虽然 它 不 是 组 织 特异 性 的 拼接 。Tn5 也 可 产生 截 短 蛋白 以 用 来 选择 转录 起 始点 。 Tnl0 是 通过 由 一 个 叫做 pour 的 启动 子 的 转录 来 抑制 转 座 ,pour 和 转 座 酶 的 启动 子 pm 极 性 方向 相反 。 从 pour 起 始 的 转录 以 各 种 方式 阻 遏 转 座 : 通 过 反 向 转录 来 对 抗 Pw 的 产物 ;通过 产生 反 义 RNA 以 阻 遏 转 座 酶 结合 到 识别 位 点 。Tanl0 的 转 座 酶 是 顺 式 优先 (cis-preferce) 的 例子 , 即 它 只 作用 于 编码 它 的 因子 上 。 尽 管 顺 式 优 先 的 原理 现在 还 不 很 清楚 ,但 它 代 表 另 一 类 转 座 调控 的 机 制 :增加 Tnl10 的 拷贝 数 并 不 能 增加 有 效 转 座 酶 数 量 , 也 并 不 增加 转 座 活 性 。 转 座 酶 的 结合 和 从 pw 启动 子 的 转录 二 者 均 可 被 DNA 的 甲 基 化 所 抑制 (参阅 )。 Tn10 中 有 许多 Dam 甲 基 化 位 点 ,所 以 其 转 座 被 严格 地 限制 在 复制 后 未 被 甲 基 化 的 链 上 的 一 段 区 域 。 这 使 得 转 座 因子 只 有 在 宿主 细胞 中 有 第 二 份 基因 组 时 才能 发 生 转 座 。 所 以 . 由 剪 切 造成 的 损伤 可 由 重组 方式 得 到 修复 。DNA 的 甲 基 化 在 真 核 生 物 中 用 以 抑制 转 座 ， 看 来 像 是 对 高 度 增殖 (overpriliferation) 的 一 种 拷贝 数 依赖 的 防卫 系统 ( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 和 外 遗传 的 调节 )。 13.2 转 座 的 效应 转 座 的 遗传 学 效应 转 座 因子 是 因 其 可 导致 突变 而 首次 被 认识 的 。 揪 入 突变 (基因 了 破 坏 ) 是 转 座 最 直接 的 效应 。 但 转 座 也 可 通过 干扰 宿主 基因 与 其 调控 元 件 之 间 的 关系 或 改 变 DNA 的 结构 而 影响 基因 的 表达 。 插入 诱 变 一 次 能 影响 一 个 或 几 个 基因 ,以 致 杂种 不 育 。 转 座 的 典型 作用 是 产生 不 稳 定 的 突变 等 位 基因 。 突 变 等 位 基因 (参阅 ) 它 能 以 很 高 的 频率 回复 为 野生 型 状态 。 但 回复 突变 不 受 诱 变 剂 的 影响 (这 是 因为 这 种 回复 突变 是 一 个 前 切 事件 )。 在 细菌 中 ,操纵 子 中 的 插 人 突变 常 有 极 性 效应 。 因 为 转录 被 转 座 因 子 阻 断 了 ,或 下 游 基因 不 能 有 效 翻译 (参见 极 性 突变 )。 细 菌 的 转 座 子 通常 有 转录 终止 子 或 复杂 的 二 级 结构 以 阻止 邻近 启动 子 的 转 录 。 极 性 突变 可 防止 转 座 因子 的 异 位 激活 作用 ,此 作用 对 细胞 是 致死 的 。 除了 插入 失 活 ,如 果 转 座 因子 中 含有 内 源 基因 ,并 且 此 基因 为 因子 内 部 元 件 调 控 , 基 * 区 9。 外 4 因 表 达 的 变化 也 可 能 发 生 。 此 现象 常 在 反 转 录 病 毒 中 发 现 ,并 导致 许多 癌 基 因 ( 人 参阅 ) 的 分 离 。 转 座 因子 可 利用 自己 的 调控 顺序 影响 附近 基因 的 表达 ,如 反 转 录 病 毒 型 的 转 座 因 子 的 长 未 端 重复 顺序 (人 参阅) 中常 有 强 启动 子 。 另 外 , 转 座 因子 中 在 插入 顺序 上 具有 杂 调控 元 件 , 如 许多 IS 因子 中 有 与 细菌 启动 子 -35 金 ( 人 参阅) 基 序 类 似 的 顺序 , 故 它 能 激活 因 缺 少 此 基 序 而 被 阻 遇 的 操纵 子 , 如 zac。 基因 的 表达 还 可 因为 DNA 结构 的 改变 而 受 影响 。IS1 可 通过 改变 插 和 人 处 DNA 的 拓 扑 学 而 激活 隐藏 在 内 部 的 操纵 子 ( 相 同 的 效应 也 可 由 编码 DNA 旋转 酶 的 基因 发 生 点 突 变 而 导致 )。 一 些 真 核 生物 利用 DNA 的 甲 基 化 限制 转 座 子 的 增殖 ,但 如 果 转 座 子 插入 在 内 源 重 复 序列 附近 ,它们 会 发 生 甲 基 化 作用 ,从 而 导致 外 遗传 的 沉默 (epigenetic silencing ) ( 见 DNA 甲 基 化 )。 基 因 座 的 沉默 也 可 因果 蝇 反 转录 转 座 子 gytpsy 因子 而 引起 。gyztsy 因子 尽管 插 在 距 此 基因 数 kb 处 ,但 仍 可 诱导 基因 的 功能 丢失 。gy 因子 含有 作为 边界 元 件 ( 参 阅 ) 的 重复 序列 , 故 gypsy 因子 标志 着 一 段 受阻 过 的 染色 质 区 域 。 精确 转 座 的 结构 效应 。” 转 座 事 件 可 介 导 两 侧 的 宿主 DNA 发 生 一 系列 的 重 排 。 最 简单 的 情况 是 当 供 体 和 训 位 点 位 于 不 同 的 分 子 上 时 。 如 两 者 位 于 不 同 的 质粒 上 (分 子 间 转 座 ) , 非 复制 转 座 使 转 座 因子 整合 到 划 复 制 子 上 ,而 在 供 体 复制 子 留 下 一 个 缺口 (此 缺口 若 不 被 修复 则 可 能 被 丢失 )。 复 制 转 座 产生 共 合 体 , 即 一 个 融合 的 复制 子 有 两 份 转 座 因子 。 共 合 体 可 通过 位 点 特异 性 地 重组 而 解 离 ,并 产生 没有 发 生变 化 的 供 体 复制 子 和 增加 了 一 个 插入 片断 的 靶 复 制 子 。 这 些 是 交 蔡 进行 的 ,如 图 13.6 所 示 。 当 转 座 子 转移 到 同一 复制 子 的 另 一 位 点 时 ,将 产生 新 的 结构 区 域 ( 分 子 内 转 座 ) 。 在 复制 转 座 过 程 中 , 链 交 换 时 链 与 链 间 的 特殊 关系 决定 了 是 产生 缺失 还 是 重复 倒 位 ,如 图 13.7 所 示 。 非 复制 的 分 子 间 转 座 不 产生 任何 重 排 ,例如 IS 因子 (尽管 它 在 切割 位 点 上 产生 一 个 切口 )。 然 而 复合 转 座 子 可 产生 大 量 的 缺失 和 倒 位 衍生 物 。 这 些 衍生 物 只 含有 一 个 IS 因子 ,并 缺少 转 座 子 的 内 部 区 域 。 保持 复制 @ @ 从 | | 9 二 C ， 13.6 分 子 间 转 座 的 效应 。D, 供 体 分 子 ;T, 靶 分 子 ;C , 共 合体 。 交 叉 代表 位 点 特异 性 的 重组 ( 解 离 )。 在 非 复制 转 座 过 程 中 , 转 座 子 的 精确 剪 切 不 能 使 供 体位 点 的 结构 回复 到 整合 前 状 态 。 因 为 如 果 切 口 通过 同 向 连接 作用 得 以 修复 , 划 位 点 的 重复 仍 是 转 座 事件 的 足迹 (foot- Frint)s。 根据 足迹 的 大 小 和 位 置 , 经 精确 剪 切 产生 的 基因 仍 可 恢复 表达 。 如 Sprm 因子 虽 159 ， 然 恢 复 了 初始 的 阅读 框 ,但 仍 产生 3bb 的 重复 。 甚 至 不 是 3 核 苷 酸 倍数 的 足迹 最 终 也 可 通过 第 二 次 突变 而 回复 。 很 多 整合 事件 发 生 在 非 编 码 DNA 中 ,此 时 足迹 无 作用 。 异常 转 座 的 效应 以 上 所 讨论 的 都 是 正常 转 座 事 件 ,异常 或 不 完美 的 转 座 过 程 包括 一 端 转 座 (one-ended transposition ) 即 转 座 子 的 一 端 整合 在 靶 位 点 ;部 分 转 座 (partial transpo- sition) 即 只 有 转 座 子 的 一 部 分 发 生 转 座 , 在 供 体位 点 留 下 了 大 的 足迹 ;隐蔽 位 点 转 座 (cryptic-site transposition) 因 为 转 座 酶 识别 宿主 两 侧 DNA, 故 它 可 与 转 座 子 一 起 转移 ; 协 同 转 座 (cooperative transposition) 两 个 转 座 子 偶 尔 可 转 座 间 择 DNA 片段 ,转移 的 效率 与 两 转 座 因子 的 距离 成 反比 。 细 菌 的 复合 转 座 子 可 自发 完成 此 过 程 ,但 小 的 环 状 复 制 子 有 时 转移 错误 的 中 央 区 域 , 即 转移 了 复制 子 的 其 他 区 域 ,而 不 是 转 座 子 的 中 间 部 分 。 这 种 转 座 称 为 倒 位 转 座 (inverse transposition ) 。 四 Ar er | 修复 合成 | hb d AGREEere， 重复 倒 位 缺失 图 13.7 ”分子 间 复制 转 座 的 结构 效应 。 供 体 分 子 (D) 有 a\b、c,sd 四 个 基因 座 ,c 是 复制 原点 。 中 间 的 一 排 表 示 交 替 的 Shapiro 中 间 体 , 当 供 体 与 靶 序 列 在 同一 环 状 分 子 中 时 , 它 可 形成 。 在 一 个 构 型 中 ,DNA 合成 穿 过 中 间 体 产生 反 向 重复 。 另 一 个 DNA 合成 穿 过 中 间 体 将 原 复制 子 分 成 两 个 。 缺 少 复制 起 始点 c 的 环 将 丢失 , 另 一 个 环 将 以 缺失 突变 体形 式 存在 。 对 宿主 细胞 活力 的 影响 ”宿主 细胞 可 利用 已 整合 因子 的 被 动 转 座 作为 正常 DNA 代谢 的 一 部 分 。 但 细胞 DNA 代谢 可 通过 三 个 主要 过 程 介 导 异 常 重 排 : @ 试 图 修复 前 切 所 留 下 的 切口 ; 思 转 座 因 子 内 的 重组 ;G) 转 座 因 子 间 的 重组 。 转 座 子 的 切除 在 供 体位 点 产生 双 链 缺口 。 细 胞 常 试图 以 另 一 条 姊妹 染色 单 体 (或 细 菌 的 姊妹 基因 组 ) 或 真 核 生 物 中 的 一 条 同 源 染 色 体 为 模板 ,通过 同 源 重组 进行 修复 。 另 外 ,断裂 端 可 直接 发 生 末端 连接 (产生 简单 的 靶 位 点 重复 足迹 ) ,或 者 通过 降解 游离 末端 来 加 工 , 产 生 缺 失 。 在 真 核 生 物 中 ,由 同 源 重 组 介 导 的 修复 经 常 导 致 被 动 转 座 。 因 为 含有 已 整合 的 转 座 因子 的 等 位 基因 可 作为 模板 使 用 。 如 果 同 源 染 色 体 缺少 转 座 子 ,一 个 没有 转 座 子 的 等 位 基因 将 被 用 作为 修复 的 模板 。 这 将 产生 回复 , 即 切除 了 转 座 因 子 和 驾 位 点 的 重复 。 在 负载 等 位 基因 的 转 座 子 中 偶尔 只 有 部 分 信息 被 用 以 同 源 重 组 ,导致 部 分 被 动 转 .160 ， 座 , 产 生 一 种 不 完全 切割 效应 。 产生 双 链 断裂 的 另 一 反应 是 P-DNAD 的 形成 。P-DNA 是 指 宿 主 DNA 在 供 体位 点 的 反 向 重复 。P-DNA 是 复制 后 由 姊妹 染色 单 体 在 断裂 的 染色 单 体 末端 链 到 链 (Strand to strand) 连 接 形 成 ,并 产生 一 个 发 夹 将 两 个 染色 单 体 连 在 一 起 。 然 后 具有 双 着 丝 粒 的 染色 体 的 分 离 可 在 末端 产生 随机 断裂 ,在 一 条 染色 体 上 产生 反 向 重复 而 在 另 一 条 染色 体 上 产 生 缺 失 。 新 的 断裂 又 在 下 一 轮 的 复制 中 重新 连接 ,并 重复 以 上 过 程 , 因 此 称 为 断裂 -融合 - 桥 循 环 (breakage-fusion-bridge)。 当 端 粒 加 在 断裂 端 时 ,此 过 程 停止 (参见 非法 重组 )。 转 座 因子 内 的 重组 可 导致 供 体位 点 的 剪 切 。 此 过 程 由 反 向 末端 重复 顺序 或 同 向 重复 顺序 之 间 的 同 源 重组 而 产生 。 前 者 常 产生 完全 (perfect) 剪 切 (但 留 下 一 个 靶 位 点 重复 足 迹 ); 后 者 常 留 下 包含 一 个 同 向 重复 顺序 的 大 足迹 。 后 者 的 过 程 可 能 解释 了 很 多 真 核 生 物 中 “单一 "的 反 转 录 转 座 子 LTRs 的 普遍 存在 ,如 酵母 中 $ 因子 , 它 是 Ty 反 转 录 转 座 子 的 LITR。 部 位 点 重复 顺序 之 间 的 重组 也 可 发 生 , 并 导致 回复 。 这 种 部 分 剪 切 、 完 全 切割 和 回 复 都 可 能 是 转 座 因 子 内 部 重组 的 结果 。 在 一 些 特 殊 转 座 因子 所 采用 的 机 制 中 ,重复 序列 的 长 度 起 着 重要 作用 。 相似 的 过 程 在 不 依赖 宿主 或 转 座 子 编码 的 重组 系统 中 也 可 发 生 , 并 留 下 相关 的 因子 的 足迹 。 此 时 , 反 向 重复 顺序 之 间 可 形成 链 间 发 夹 或 蕉 环 结构 。 复 制 穿 过 环 出 区 域 时 将 导致 子 链 的 缺失 。 这 是 链 的 滑动 (strand slipping) 形 成 非法 重组 (人 参阅) 的 极端 例子 。 最 后 ,拥有 中 到 高 度 拷 贝 数 的 转 座 因 子 存 在 着 可 移动 的 重组 序列 。 同 一 染色 体 上 分 散 的 同 源 转 座 因 子 之 间 的 重组 可 导致 缺失 \ 倒 位 或 (线性 染色 体 的 ) 环 化 。 不 同 染 色 体 上 两 个 因子 之 间 的 重组 可 导致 末端 缺失 \ 染色体 的 融合 (形成 共 合体 ) 和 易 位 。 转 座 的 纵览 ”以 上 讨论 的 转 座 效 应 都 是 单个 转 座 事件 的 术语 ,但 在 一 个 特定 的 基因 组 中 存在 几 十 个 到 几 百 万 个 潜在 的 转 座 因 子 , 所 以 有 必要 在 更 广 范围 来 关注 转 座 的 含义 。 至 于 转 座 因子 在 基因 和 结构 的 进化 和 基因 组 形成 中 所 起 的 作用 ,在 另 一 章 中 加 以 讨论 ， ( 见 基因 组 和 作 图 、 蛋 白 的 结构 功能 和 进化 )。 果 蝇 中 杂交 不 育 指 特定 杂交 后 代 中 出 现 的 许多 缺失 突变 。 不 育 后 代 常 不 能 生育 ,并 有 很 高 频率 的 染色 体重 组 和 突变 。 但 这 些 突变 不 稳定 ,可 在 随后 的 世代 中 回复 为 野生 型 。 此 现象 是 因为 许多 转 座 因 子 同时 被 激活 而 产生 的 。 果 蝇 中 两 种 转 座 因子 家 族 ,P 因 子 和 1 因子 都 可 导致 杂交 不 育 。 当 了 品系 雄性 ( 带 有 了 因子 ) 与 M 品系 肉 性 (雌性 中 无 P 因子 ) 杂交 时 ,发生 PM 不 育 。 但 反 交 并 不 产生 不 育 后 代 ,P 品系 雄性 与 P 品系 肉 性 之 间 的 杂交 也 不 产生 不 育 后 代 。P 品系 的 卵细胞 细胞 质 中 含有 P 因子 转 座 的 阻 遏 蛋白 ,而 M 品系 的 细胞 质 中 不 含有 。 它 们 被 称 为 P 细胞 型 和 M 细胞 型 。 当 了 品系 的 精子 DNA 释放 在 M 癌 系 的 卵细胞 中 时 ,精子 基因 组 中 的 许多 P 因子 被 同时 激活 ,并 转移 到 新 位 点 ,从 而 导致 突变 。 相 反 ,释放 在 P 品系 的 卵细胞 中 的 P 因子 会 被 卵细胞 中 的 阻 遏 蛋白 所 阻 遏 。 阻 过 蛋 自 是 P 因子 编码 的 一 个 被 截 短 的 转 座 酶 。 在 通过 DNA 甲 基 化 全 方位 调节 转 座 子 移动 的 植物 中 可 发 现 转 座 活性 的 突然 爆发 。 许多 不 同 家族 的 转 座 因 子 同时 转移 ,这 意味 着 大 多 数 因 子 由 同一 种 机 制 调控 。 与 果 蝇 的 1) P-DNA 由 发 夹 介 导 的 修复 在 转 座 子 剪 切 位 置 常 产生 DNA 的 反 向 重复 。 但 相同 的 术语 也 可 用 来 描述 在 乙醇 溶 剂 中 某 些 DNA 的 三 级 结构 ,还 可 以 用 于 任何 DNA 在 减 数 分 裂 (参阅 ) 粗 线 期 中 的 合成 。 ”全 情况 不 同 ,植物 转 座 激 活 时 具有 协同 效应 和 再 生效 应 ,这些 效 应 在 连续 发 育 过 程 中 受到 调 控 。 现 在 不 清楚 此 点 是 否 反 映 了 转 座 爆 发 在 发 育 过 程 中 的 特殊 作用 。 转 座 因子 作为 一 种 研究 工具 转 座 因子 最 显著 的 特点 是 它们 可 被 分 子 生 物 学 家 作为 很 有 用 的 研究 工具 。 转 座 因 子 在 基因 组 间 转 移 的 能 力 使 它 可 作为 基因 传送 载体 使 用 。 它 们 破坏 基因 的 倾向 可 作为 诱 变 剂 使 用 。 转 座 因子 已 被 用 于 产生 基因 组 重 排 ,作为 可 转移 的 报告 系统 和 克隆 邻近 基因 的 标签 等 , 转 座 因 子 在 很 多 方面 都 可 被 应 用 ,请 参看 表 13.1。 表 13.1 ， 转 座 因 子 的 用 途 用 途 例子 基因 传送 载体 通过 克隆 和 转化 转 座 子 在 细菌 染色 体 中 导 和 人 基因 通过 向 生殖 细胞 注射 含有 P 因子 的 重组 质粒 将 基因 导 人 果 蝇 通过 转移 Ti 质粒 载体 上 重组 的 Ac-Ds 因子 将 基因 导 人 植物 通过 重组 的 反 转 录 病 毒 载体 产生 转基因 小 鼠 基因 突变 通过 普遍 性 插入 诱 变 产 生 随 机 突变 体 通过 使 用 转 座 子 和 基因 特异 性 引物 的 PCR 分 离 特定 的 突变 体 通过 前 切 后 的 转基因 介 导 修复 产生 寻 部 突变 结构 重组 通过 分 子 间 转 座 产生 细菌 的 嵌 套 缺失 通过 向 基因 组 转移 FLP/FRP 重组 酶 系统 产生 特异 性 的 基因 组 重 排 基因 表达 通过 强 启动 子 诱导 邻近 基因 的 过 量 表达 通过 截留 载体 (参阅 ) 进 行内 源 调节 功能 的 分 析 克隆 以 转 座 子 为 标签 直接 从 突变 生物 体 中 克隆 基因 一 一 转 座 子 标记 (参阅 ) 利用 质粒 拯救 (参阅 ) 在 转 座 子 中 导 人 质粒 的 复制 起 始点 以 噬菌体 Mu 进行 体内 克隆 - 通过 包装 到 噬菌体 头 部 从 突变 细胞 中 分 离 基因 基因 作 图 通过 插 人 突变 绘 出 质粒 的 图 谱 导 人 可 利用 测序 引物 的 模板 进行 大 规模 测序 13.3 ” 转 座 子 转 座 子 的 结构 和 亚 分 类 转 座 子 这 个 术语 曾 描述 细菌 中 带 有 抗 药性 基因 的 转 座 因子 以 及 与 转 座 相关 的 转 座 因子 。 现 在 这 个 术语 指 直接 以 DNA 形式 移动 的 所 有 转 座 因子 , 即 所 有 第 工 类 转 座 因子 。 所 有 转 座 子 都 有 一 个 保守 结构 ,结构 中 含有 一 个 或 多 个 开放 阅读 框 (其 中 一 个 编码 转 座 酶 ) 。 两 侧 是 反 向 末端 重复 序列 (inverted teminal repeats,TITRs) 。 示 端 重复 序列 是 转 座 所 必需 的 ,因为 它 是 转 座 酶 所 识别 的 底 物 。 但 仅 靠 ITR 还 不 够 ,还 需要 其 他 一 些 内 部 序 列 。 在 细菌 中 三 种 主要 转 座 子 被 识别 。I 类 转 座 子 包括 IS 因子 (简单 转 座 子 ) 和 复合 转 座 子 ;II 类 转 座 子 是 复杂 转 座 子 ;II 类 转 座 子 是 与 Mu 噬菌体 相关 的 转 座 叭 菌 体 。 有 人 建议 将 不 属于 以 上 三 类 的 转 座 子 称 为 第 IV 类 。 所 有 真 核 的 转 座 子 都 类 似 细菌 的 IS 因 子 , 因 为 它们 只 编码 转 座 所 需 的 功能 蛋白 。 大 多 数 真 核 的 转 座 子 有 典型 的 结构 :一 个 中 央 区 域 ,其 两 侧 是 短 的 ITR。 一 类 特殊 的 转 座 子 称 为 折 回 因子 (foldback elements) , 它 主要 “省 由 很 长 的 反 向 重复 序列 组 成 。 对 折 回 因子 的 移动 结构 了 解 很 少 ,但 它 不 利用 RNA 中 间 体 。 转 座 子 结构 的 总 结 见 图 13.8。 13.8 不 同类 型 转 座 子 的 结构 (A) 细菌 的 IS 因子 ;(B) 含 有 同 向 IS 因子 的 复合 转 座 子 ;(C) 含 有 反 向 IS 因子 的 复合 转 座 子 。ISL 和 ISR 的 名 称 是 依据 内 部 区 域 遗 传 图 的 极 性 而 定 的 ;(D) 一 个 复杂 转 座 子 ;(E) 一 个 典型 的 真 核 转 座 子 ;(F) 一 个 真 核 折 回 因子 。tra 是 编码 转 座 酶 的 基因 。 在 图 B 和 C 中 只 有 一 个 zra 是 其 功能 必须 的 。ORF 是 编码 非 必 需 蛋 白 的 基因 ,如 抗生素 抗 性 。 IS 因子 细菌 的 转 座 因子 的 发 现 是 因为 它们 能 使 大 肠 杆 菌 发 生 不 稳定 但 是 很 强 的 极 性 突变 。 杂 交 分 析 显 示 一 种 小 家 族 的 插入 DNA 序列 与 观察 到 的 很 多 突变 有 关 , 这 些 序 列 称 为 插入 顺序 (IS 因子 )。 大 约 有 100 种 不 同 的 IS 因子 已 被 鉴定 ,大 多 数 在 肠 道 细 菌 和 它们 的 质粒 中 。 它 们 一 般 很 小 (<2.5Skb) ,由 一 个 中 央 单 一 区 域 和 两 侧 不 完全 的 反 向 末端 重复 序列 构成 ,这 些 末端 重复 序列 大 小 序列 、 相 关 性 各 不 同 。 中 央 区 域 可 能 含有 1 一 3 个 开放 阅读 框 , 其 中 一 个 编码 转 座 酶 。 没 有 和 转 座 功能 无 关 的 基因 ,所 以 它们 又 被 称 为 简单 转 座 子 。 不 同 IS 在 靶 位 点 的 优先 性 和 部 位 点 重复 顺序 大 小 方面 不 同 。 这 些 特征 反映 转 座 子 编码 的 转 座 酶 的 特异 性 。 表 13.2 列 出 一 些 IS 因子 的 属性 。 表 13.2 一 些 IS 因子 的 属性 名 称 因子 大 小 ITR(CLAR) TSDs 优先 的 靶 位 点 IS1 768 20]23 9 以 G 或 C 为 末端 的 AT 丰富 区 IS2 1327 32M41 邓 P2 基因 组 的 热点 IS3 1258 297/40 3 ? IS4 1426 16718 11 一 13 AAANzOTTT IS10 1329 177]22 9 GCTNAGC IS91 1800 87]9 0 ? ITRs : 反 向 重复 序列 ; TSDs: 靶 位 点 重复 。 注意 左 端 (L) 和 右 端 (R) 的 反 向 末端 重复 常 在 长 度 和 大 小 不 同 。 以 上 所 有 单位 都 是 bp。 "68 复合 转 座 子 和 复杂 转 座 子 ，” 转 座 子 原 定 义 为 细菌 的 转 座 因 子 , 不 仅 带 有 转 座 所 必需 的 基因 ,而 且 还 带 有 转 座 非 必需 的 基因 ,如 抗生素 抗 性 基因 。 那 些 不 同 于 IS 因子 的 转 座 因 子 称 为 Tn。 现 在 转 座 子 的 术语 含 盖 了 所 有 细菌 的 可 移动 因 了 于。IS 因子 被 确定 为 简单 转 座 子 ,其 他 因子 被 称 为 复合 转 座 子 和 复杂 转 座 子 。 复合 转 座 子 或 复杂 转 座 子 (composite or compound transposon) 的 结构 包括 含有 转 座 非 必需 基因 的 中 央 区 域 和 两 侧 两 个 IS 因子 。 转 座 酶 和 转 座 的 底 物 由 一 个 或 两 个 协同 转 移 间 插 DNA 的 IS 因子 提供 。IS 因子 可 同 册 或 反 回 排列 , 故 复合 转 座 子 中 有 长 同 向 重复 序列 或 长 反 向 重复 序列 ( 见 图 13.8)。 有 些 转 座 子 两 侧 的 IS 因子 相同 ,而 另 一 些 则 不 同 。 这 种 不 同 往往 是 因为 其 中 的 一 个 发 生 了 一 次 突变 ,并 只 能 提供 顺 式 作用 。 复 合 转 座 子 中 的 IS 因子 也 可 独自 转移 。 转 座 子 的 维持 [ 转 座 子 粘着 (transposon coherence) ] 反 映 了 间 插 序列 所 产生 表 型 的 选择 压力 ( 另 见 反 向 转 座 )。 复杂 转 座 子 (complex transposon) 的 结构 更 像 单个 的 IS 因子 ,但 它 包 含 转 座 必 需 基 因 和 非 必需 基因 。 两 种 基因 都 位 于 中 央 区 域 , 两 侧 是 短 的 反 向 末端 重复 顺序 。 表 13.3 列 出 了 复合 转 座 子 和 复杂 转 座 子 中 一 些 有 代表 性 例子 的 属性 。 表 13.3 细菌 复合 和 复杂 转 座 子 的 特点 名 称 长 度 选择 标记 ITRs 复合 转 座 子 (IT 类 ) 非 必需 基因 的 两 侧 是 IS 因子 Tn5 5.4kb 卡 那 霉 素 抗 性 长 (1.5kb)。 反 上 向 的 IS50 ,只 有 IS50R 有 功能 Tn9 2.6kb 毛 霉 素 抗 性 短 (18/23bp)。 同 向 IS1 ,两 个 都 有 功能 Tn903 3.1kb 卡 那 霉 素 抗 性 长 (1.1kb)。 反 向 TS903 ,两 个 都 有 功能 复杂 转 座 子 ( 工 类 ) 必需 和 非 必需 基因 的 两 侧 是 反 向 末端 重复 序列 Tn3 Skb 氨 苯 青霉素 抗 性 38bp Tn501 8.2kb ”和 示 抗 性 35/38bp Tn7 14kb 三 甲 氧 共 二 氨 喀 啶 抗 性 , 链 霉 素 “六 30bp 抗 性 , 状 观 霉 素 抗 性 ITRs, 反 向 末端 重复 。 注 意 类 转 座 子 包括 复合 转 座 子 和 IS 因子 。 真 核 生 物 中 的 转 座 子 家 族 真 核 生物 中 , 转 座 子 被 称 为 第 II 类 转 座 因子 (I 类 因子 以 RNA 为 中 间 体 移动 )。 这 套 命名 体系 与 各 类 细菌 转 座 子 的 命名 无 关 。 在 很 多 真 核 生 物 已 被 鉴定 出 转 座 子 ,虽然 脊 椎 动物 中 的 转 座 子 缺乏 特点 而 且 通 过 基 因 组 测序 表明 酵母 中 无 转 座 子 。 大 多 数 真 核 生物 的 转 座 子 的 结构 类 似 于 细菌 转 座 子 :一 个 编码 转 座 酶 和 转 座 所 需 其 他 蛋白 的 中 央 区 域 ,两 侧 是 短 的 反 向 末端 重复 序列 。 折 回 因 子 是 真 核 生物 转 座 子 中 一 个 不 同 的 家 族 , 它 有 较 长 的 ITR 和 一 个 小 的 中 央 区 域 ,区 域 含 有 几 个 编码 转 座 所 需 蛋 白 的 开放 阅读 框 。 真 核 生 物 中 一 些 主要 的 II 类 转 座 因子 家 族 的 性 质 列 于 表 13.4。 。 刀 64 “。 全 表 13.4 ”一些 有 代表 性 的 真 核 转 座 子 的 属性 物种 I 类 转 座 因 子 家 族 ITRs TSDs 果 蝇 31 8 Ahopo 12 8 Ma7z7mer 28 迷 FB 大 9 线虫 Tcl 5S4 2 玉米 Ac/TDs 10/1L1 8 Szpzmz /csomz 13 3 Mux /Mr 200 9 金鱼 草 Taml 137X14 3 Tam3 12 8/S 一 些 真 核 生物 TUVXPuppy 大 8 TSDs, 靶 位 点 重复 。 第 一 个 被 发 现 的 转 座 因 子 是 玉米 转 座 子 , 现 已 发 现 10 个 或 更 多 不 同 的 家 族 。 如 同 其 他 的 转 座 因子 ,它们 之 所 以 被 首先 发 现 是 因为 它们 对 内 源 基 因 有 不 稳定 的 诱 变 效 应 , 故 称 为 控制 因子 。 通 过 对 它们 的 遗传 分 析 将 它们 列 人 不 同 的 家 族 ,并 分 为 自主 型 和 非 自主 型 。 分 子 生 物 学 分 析 显 示 出 这 种 二 分 法 反映 了 全 长 有 活性 的 因子 和 长 度 不 同 的 缺陷 因子 的 存 在 。 一 个 例子 是 Ac-Dxs 家 族 失 去 潜在 转 座 功能 :自主 的 基因 因子 (Ac ) 长 4.5kb, 编 码 有 功 能 的 转 座 酶 ,而 解 离 因子 (Ds ) 是 可 变 长 度 缺 陷 因 子 的 了 衍生 物 。Ac-Ds 家 族 有 10 一 1lbp 不 完全 未 端 重复 ,并 产生 8bp 的 靶 位 点 重复 序列 。 相 同 的 情况 在 果 蜗 了 因子 也 存在 。P 因 子 是 所 有 真 核 生物 转 座 子 中 了 解 得 最 清楚 ,应 用 最 广 的 转 座 子 。P 因子 是 在 对 果 蝇 杂种 不 育 (人 参阅) 现象 的 研究 中 发 现 的 。P 因子 的 插 人 导致 广泛 的 杂种 不 育 。 黑 腹 果 蝇 的 某 些 品系 中 含有 40 一 50 个 了 因子 ,而 其 他 品系 缺少 P 因子 。 自 主 的 P 因子 长 3kb, 两 侧 有 31bp 的 完全 ITRs, 优先 的 靶 位 点 是 GGCCAGAC, 产 生 8bp 的 靶 位 点 重复 。 在 特定 品系 的 果 蝇 中 ,273 的 P 因子 是 缺陷 的 ,其 大 小 范围 从 几 百 bp 到 2.9kb。 上 两 例 中 转 座 酶 基因 呈现 一 个 开放 阅读 框 , 并 由 一 些 内 含 子 隔断 。P 因子 的 剪接 调 节 在 生殖 细胞 和 体 细胞 中 是 不 同 的 ,所 以 转 座 只 发 生 在 生殖 细胞 中 。 在 Ac 因子 中 ,剪接 是 组 成 性 的 ,所 以 转 座 并 不 限于 生殖 细胞 。 玉 米 转 座 的 一 个 效应 是 花 斑 , 它 是 不 同 的 突变 发 生 在 不 同 的 细胞 中 并 被 克隆 繁殖 的 结果 。P 因子 和 Ac-Ds 因子 现 都 已 作为 基因 转移 载 体 用 于 研究 基因 的 表达 和 调控 。 与 细菌 转 座 子 类 似 , 这 些 因子 也 可 用 作 诱 变 剂 ,并 作为 克 隆基 因 时 的 标签 ( 表 13.1)。 可 转移 的 内 含 子 和 内 蛋白 子 ”可 转移 的 内 含 子 指 在 酵母 线粒体 中 发 现 的 一 类 转 座 因 子 。 这 些 内 含 子 含有 一 个 编码 位 点 特异 性 内 切 酶 的 开放 阅读 框 。 这 一 点 与 细菌 的 限制 性 内 切 酶 很 相似 ,但 它 的 靶 位 点 很 长 ,典型 的 大 于 20bp。 这 么 长 的 划 顺 序 意味 者 它 出 现 的 频率 很 低 , 其 实 它 在 基因 组 中 只 出 现 一 次 ,内 含 子 插入 在 此 位 点 中 。 这 种 内 切 酶 不 能 切割 宿主 DNA, 除 非 在 细胞 中 存在 一 个 没有 内 含 子 的 等 位 基因 。 如 果 这 种 等 位 基因 存在 ,此 内 切 酶 将 导致 双 链 断 裂 ,此 断裂 可 被 含有 内 含 子 等 位 基因 通过 同 源 重组 而 修复 ,这 个 过 程 导致 内 含 子 被 拷贝 并 通过 基因 转变 被 插 和 人 到 一 个 本 来 没有 内 含 子 的 等 位 基因 中 (这 也 是 被 动 转 座 的 一 个 例子 , 见 被 动 转 座 )。 这 些 独特 的 因子 称 为 归 某 内 含 子 (homing introns)， “由 5 “ 这 是 因为 它们 能 回 到 靶 基 因 的 特定 位 点 中 。 更 复杂 的 是 归 巢 内 蛋白 子 (homing intein)， 这 是 翻译 的 初生 肽 链 经 过 剪接 产生 的 多 肽 (参阅 蛋白 质 修 饰 )。 它 们 也 能 编码 内 切 酶 ,这 些 内 切 酶 切割 无 内 蛋白 子 的 等 位 基因 的 开放 阅读 框 , 通 过 基因 转变 局 动 内 蛋白 子 转移 。 细菌 的 整合 子 ”整合 子 (integren) 指 含有 不 同 结构 基因 组 成 的 细菌 操纵 子 。 整 合子 包 括 调控 区 ,编码 位 点 特异 性 重组 酶 的 开放 阅读 框 ,及 重组 酶 的 靶 位 点 att T。 整 合子 可 整 合 多 种 带 有 59- 碱 基因 子 的 抗生素 抗 性 基因 的 盒 元 件 。 这 个 59- 碱 基因 子 可 被 重组 酶 识 别 。 它 不 像 其 他 类 型 的 盒 系统 (cassette system) 靶 位 点 从 不 空 着 ,一 个 盒 元 件 可 通过 非 互 交 的 重组 过 程 取 代 另 一 个 盒 元 件 。 而 整合 子 的 靶 位 点 可 以 是 空 着 的 或 整合 一 个 或 多 个 串 联 的 盒 元 件 。 整 合子 可 通过 不 同 盒 元 件 的 59- 碱 基因 子 间 的 重组 以 除去 特定 基因 或 建立 稳定 的 连接 。 通 过 atz 工 位 点 的 转录 促进 了 一 个 共同 操纵 子 中 所 有 插 人 基因 的 表达 。 因 为 像 入 喉 菌 体 整 合子 的 转移 是 通过 位 点 特异 性 重组 而 不 是 转 座 , 所 以 它 不 是 真正 的 转 座 子 , 称 为 位 点 特异 性 转 座 子 。 13.4 反 转 录 因 子 反 转 录 因 子 结构 和 分 类 反 转 录 因 子 (retroelement)(I 类 因子 ) 指 以 RNA 为 介 导 通过 反 转 录 来 移动 ,以 cDNA 形式 整合 到 基因 组 中 的 遗传 因子 。 这 些 因子 是 真 核 生 物 所 特有 ( 见 反 转 录 , 如 酵母 和 肴 椎 动物 ) ,并 是 可 转移 DNA 的 主要 形式 。 反 转录 因子 可 分 为 两 类 主要 的 家 族 。 病 毒 家 族 (I.1 类 转 座 因 子 ) ,包括 反 转 录 病 毒 (参阅 ) 和 在 结构 和 转 座机 制 上 似 于 反 转 录 病 毒 的 非 病毒 转 座 子 (它们 被 称 为 反 转 录 转 座 子 )。 非 病毒 家 族 (I.2 转 座 因子 ) ,包括 与 反 转 录 病 毒 的 结构 和 转 座 机 制 不 同 的 自主 转 座 子 [它们 被 称 为 反 转 录 子 (retroposon) ] 因 得 到 外 来 的 反 转 录 酶 的 反 式 作用 而 发 生 偶 然 移 动 的 DNA 序列 。 这 些 序 列 称 为 反 转 录 序 列 (retrosequences ) ,细胞 mRNA 中 与 之 对 应 的 是 反 转 录 基 因 (retro- genes) ,又 称 加 工 假 基 因 (Pprocessed pseudogenes, 参 阅 )。 不 同 反 转 录 因 子 的 分 类 的 总 结 见 表 13.5。 不 同 真 核 反 转 录 因 子 的 比较 见 图 13.9 ,一 些 例 子 列 于 表 13.6。 反 转 录 病 毒 一 和 二 = 反 转 录 转 座 子 (L.1 类 ) 反 转 录 子 (L.2 类 ) c [一 本 站 ww 反 转 录 序 列 (I2 类 ) D 壮 jAAAAAAAAAA [LAL Te[]AAAAAAAAAA 加 工 假 基 因 (RNAP ID SINE 图 13.9 真 核 反 转 录 因 子 的 结构 。(A) 反 转录 病毒 有 LTR( 箭 头 ) 和 gag, pol]int 和 eno 的 开放 阅读 框 ;(B) 反 转录 转 座 子 有 类 似 的 结构 但 缺少 ez 开放 阅读 框 ;(C) 反 转录 子 缺 少 反 转录 病毒 结 构 , 但 有 polyA 尾 ,通常 含 gag 和 加 !/izt 开放 阅读 框 ;(D) 反 转录 序列 是 非 自 主 的 反 转 录 因 子 , 又 称 加 工 假 基因 。 它 是 细胞 RNA 聚合 酶 I 转 录 本 的 拷贝 。 它 有 polyA 尾 。 当 整合 时 不 表达 ,在 其 他 方面 它们 无 相关 性 。SINE 是 RNA 聚合 酶 III 转录 本 加 工 假 基 因 。 它 有 两 个 内 部 启动 子 (如 A、 了 B 框 所 示 ), 这 使 SINE 能 表达 。 7 5 表 13.5 反 转 录 因 子 的 亚 分 类 反 转 录 因 子 反 转 录 因 子 病毒 家 族 (I.1 类 因子 ) 反 转 录 病 毒 副 反 转 录 病 毒 (Pararetrovirus) 反 转 录 转 座 子 非 病毒 家 族 (I.2 类 因子 ) 反 转 录 转 座 子 反 转 录 序 列 (被 动 的 反 转录 子 ) 反 转 录 基 因 SINE 反 转 录 操 纵 子 (Retron) 中 玫 叉 通过 反 转 录 的 RNA 为 中 间 体 而 移动 的 转 座 因 子 。 与 反 转录 病毒 结构 和 转 座机 制 相 似 的 反 转 录 因 子 。 一 种 必须 整合 到 宿主 基因 组 才能 复制 , 且 复制 以 RNA 为 中 间 体 的 病毒 。 其 特 征 是 两 侧 具 有 LTRs 和 三 个 开放 阅读 框 gag ，ztpo! ，ezu。 其 中 pol 编码 反 转 录 酶 /整合 酶 。 它 只 在 真 核 生 物 中 发 现 。 反 转 录 病 毒 样 颗粒 , 它 不 能 转 座 ( 即 因为 缺少 反 转 录 酶 )。 它 是 一 种 缺陷 反 转 录 病毒 。 一 种 有 反 转 录 病 毒 特 征 但 缺少 形成 感染 粒子 能 力 的 移动 因子 ( 虽 可 形成 某 种 胞 内 颗粒 ) 。 在 结构 或 转 座机 制 不 同 于 反 转 录 病 毒 的 反 转 录 因 子 。 结构 不 同 与 反 转 录 病 毒 ( 如 缺少 LITRs 和 反 转 录 病 毒 内 部 组 织 形 式 ) 但 可 编码 反 转 录 酶 /整合 酶 的 移动 因子 。 结构 与 反 转 录 子 相似 (无 LIR 和 polyA) 但 失去 了 反 转 录 酶 整合 酶 功能 的 移动 因子 , 需 反 式 提供 这 些 功 能 。 类 似 内 源 基 因 的 cDNA 拷贝 的 反 转 录 序 列 ,又 称 加 工 假 基因 。 短 散在 核 元 件 ,一 种 起 源 II 类 真 核 基因 的 反 转 录 序 列 (如 Ajw ,Bl), 它 在 真 核 生物 中 有 成 数 百 万 个 拷贝 。 细菌 中 未 知 意义 的 操纵 子 , 它 编码 反 转 录 酶 ,并 有 一 个 非 翻 译 区 。 此 区 开始 转 录 , 然 后 部 分 反 转 录 产 生 DNA-RNA 结构 。 反 转录 操纵 子 不 能 移动 ,但 因 其 序列 可 通过 反 转 录 而 移动 , 故 称 为 反 转 录 因 子 。 表 13.6 真 核 生物 中 的 一 些 反 转录 因子 家 族 物种 L1 型 因子 [2 型 因子 (自主 反 。 。 工 2 型 因子 (被 动 反 转 录 子 -SINE ( 反 转 录 转 座 子 ) 转录 子 ) 和 其 他 加 工 过 的 假 基 因 ) 啤酒 酵母 Ty 人 Bl104 哺乳 动物 JAP,THE1? LINE Aiu,BL,ID Tad-1 玉米 Bsl Cin4 I.1 类 反 转 录 因 子 ” 反 转 录 转 座 子 与 反 转 录 病 毒 有 许多 结构 上 的 相似 处 ,包括 同 向 长 末端 重复 顺序 ,每 个 重复 序列 两 侧 是 短 反 向 重复 序列 ,此 因子 还 含有 几 个 开放 阅读 框 的 中 央 区 域 ( 见 有 关 反 转录 病毒 基因 组 结构 和 复制 循环 的 详细 讨论 )。LTR 的 相似 性 常 延 伸 到 可 识别 的 U3 、R 和 1U5 区 ,相似 的 启动 子 和 poly A 位 点 , 反 转 录 时 tRNA 引物 结合 的 了 位 点 。 反 转录 转 座 子 的 中 央 区 域 含有 与 gag 和 zol 同 源 的 开放 阅读 框 。 其 中 与 如 ol 同 源 的 开放 阅读 框 编码 反 转录 酶 和 整合 酶 。 但 exv 基因 通常 被 破坏 或 没有 ,这 可 解释 反 转 录 “古国 7 到 转 座 子 不 能 形成 感染 粒子 的 原因 。 故 反 转 录 转 座 子 活性 的 机 制 与 反 转 录 病 毒 不 同 。 反 转 录 转 座 子 的 转录 本 位 于 核糖 核 蛋 白 体 颗粒 上 , 经 过 反 转 录 整 合 在 基因 组 中 。 通 常 产 生 2bp 的 靶 位 点 重复 。 这 就 是 以 上 讨论 过 的 反 转 录 转 座机 制 。 I.2 类 反 转 录 因 子 II.2 类 反 转 录 因 子 代 表 各 种 不 同 于 反 转 录 病 毒 的 反 转 录 因 子 即 非 病毒 家 族 。 自 主 性 的 I.2 类 因子 是 反 转 录 子 。 它 们 缺少 LTRs 和 经 典 的 反 转 录 病 毒 的 组 织 形式 ,但 很 多 都 含有 与 反 转 录 病 毒 gag 和 zol 同 源 的 开放 阅读 框 。 果 蝇 中 存在 反 转 录 子 的 不 同 家 族 。 哺 乳 动 物 中 LINE- 1[ 长 散在 元 件 (LINE,long interspersed element)] 代 表 了 中 度 重复 DNA 中 重要 的 一 类 。 与 其 他 转 座 因子 不 同 ,I.2 转 座 因子 产生 的 靶 位 点 重 复 的 大 小 不 同 , 可 能 是 因为 偶然 利用 DNA 的 双 链 缺口 。 经 过 被 动 转 座 的 细胞 mRNA 形 成 加 工 假 基因 (这 些 是 被 动 反 转 录 子 )。 且 不 能 控制 转 座 的 序列 。 尽 管 加 工 假 基 因 可 占 高 等 真 核 生物 基因 组 的 10% ,但 单个 基因 出 现 的 频率 还 是 很 低 的 。scRNA 假 基 因 [ 又 称 SINE( 短 散在 元 件 )] 是 此 原则 的 例外 。 这 类 的 特定 序列 是 高 度 重 复 的 ,最 好 的 例子 是 人 类 的 Aix 因子 (7SL RNA 基因 的 加 工 假 基因 ) 有 将 近 100 万 的 拷贝 数 。 与 内 源 基 因 相 比 因子 Aix 原则 上 已 重新 组 织 ,但 仍 保留 RNA 聚合 酶 III 内 部 启动 子 的 结构 ,所 以 它 是 表 达 的 。 这 可 能 与 优先 扩 增 有 关 。 一 些 可 移动 的 内 含 子 也 属于 I.2 反 转 座 因子 。 这 些 内 含 子 编码 反 转 录 酶 ,通过 反 转 录 归 梨 (retrohoming ) 而 移动 。 细菌 的 反 转 录 酶 操纵 子 (retron) 虽然 许多 细菌 可 合成 反 转 录 酶 , 转 座 的 反 转 录 因 子 只 限于 真 核 生 物 。 反 转录 酶 的 惟一 目的 是 产生 多 拷贝 的 单 链 DNA (msDNA，mnultiple- copy,single stranded DNA) 。 这 些 DNA 与 RNA (msdRNA,msDNA-associated RNA) 共 价 连接 。msDNA-RNA 的 结构 已 在 一 些 细菌 中 得 到 鉴定 。 它 们 的 序列 不 同 , 但 二 级 和 三 级 结构 相同 。msDNA-msdRNA 的 显著 特征 是 ODmsDNA 的 5 端 通过 2 一 5 磷酸 二 酯 键 连接 在 msdRNA 的 内 部 的 鸟 苷 酸 残 基 上 ;@OmsDNA 的 3" 端 和 msdRNA 的 3“ 端 形成 短 杂 种 双 链 结构 ;G@msDNA 和 msdRNA 均 可 形成 多 个 葵 环 结构 。 此 msDNA 、msdRNA 和 反 转 录 酶 由 单个 座位 编码 ,并 被 共同 转录 。 这 个 座位 称 为 反 转录 酶 操纵 子 (retron，reverse transcriptase operqn) 。 一 些 反 转 录 酶 操纵 子 是 原 喉 菌 体 的 一 部 分 (这 些 原 吻 菌 体 为 反 转 录 叭 菌 体 (retronphage) ) ,并 可 作为 喉 菌 体 一 部 分 而 移动 。 反 转 录 酶 操纵 子 是 不 能 移动 的 。 现 在 还 没有 证 据 表 明 反 转 录 酶 操纵 子 的 初始 转录 能 像 反 转录 病毒 那样 促进 其 整合 到 基因 组 中 。 ( 张 ” 勇 译 ) TO 第 14 章 诱 变 和 DNA 修复 基本 概念 和 定义 。 突变 是 基因 型 中 可 遗传 的 变化 , 它 由 基因 组 中 某 一 特定 区 域 的 核 苷 酸 残 基 序 列 变 化 造成 的 。 这 些 变化 包括 以 下 四 种 方式 的 诱 变 (mutagenesis) : (1) 在 DNA 复制 中 核 苷 酸 的 错误 挫 人 。 (2) 对 DNA 的 损伤 (可 能 是 自发 的 ,或 是 被 环境 中 的 诱 变 剂 所 诱导 ) 以 及 细胞 的 修复 。 (3) 异常 重组 (例如 ,末端 的 连接 ,复制 中 链 的 跳 格 ,不 对 等 的 交换 ) (参见 异常 重 组 和 不 对 等 交换 )。 (4) 可 移动 遗传 因子 的 活性 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 )。 单个 碱 基 的 错误 挫 人 和 损伤 常 产 生 点 突变 (point mutations) ,也 就 是 一 个 核 苷 酸 被 另 一 个 代替 (参见 转换 和 颠 换 )。 基 因 中 的 点 突变 可 以 改变 编码 蛋白 的 性 质 ,那些 基因 外 的 点 突变 会 影响 一 些 DNA -蛋白 间 的 相互 作用 。 碱 基 的 损伤 还 能 导致 致命 的 复制 阻 断 。 其 他 形式 的 DNA 损伤 (例如 染色 体 断 裂 ) ,异常 重组 和 可 移动 因子 的 活性 往往 造成 更 显著 的 大 突变 (macromutations) , 这 会 影响 到 许多 相 邻 的 核 苷 酸 。 因此 ,突变 能 通过 几 种 不 同 机 制 影 响 基因 的 功能 ,经 常 是 有 害 影 响 ( 见 第 15 章 突变 与 选择 )。 细胞 将 许多 资源 用 来 维持 和 修复 DNA。 它 具有 保证 DNA 复制 忠实 性 的 机 制 , 同 时 有 在 溶液 中 修复 被 破坏 的 核 苷 酸 ,修复 和 取代 DNA 中 被 损伤 的 碱 基 并 调节 它们 的 活性 以 应 答 DNA 的 损伤 的 机 制 。 所 有 细胞 都 有 一 个 自发 突变 率 ,定义 为 一 段 特 定时 间 内 基因 组 正常 发 生 的 突变 次 数 。 这 个 比例 反映 了 DNA 复制 忠实 性 和 修复 的 效率 。 控 制 这 些 过 程 的 基因 的 突 变 可 能 会 增高 或 减少 自发 突变 率 , 这 些 基因 被 分 别称 为 增 变 基 因 (mnutator) 和 抗 变 基因 (antimutator genes)( 人 参见 突变 频率 )。 14.1 诱 变 和 复制 忠实 性 DNA 合成 过 程 中 核 苷 酸 的 错误 摊 入 ”尽管 DNA 碱 基 形成 特定 碱 基 对 ,但 这 不 是 一 个 高 度 精确 的 过 程 。 从 能 量 上 考虑 , 预计 可 以 产生 1% 一 10% 的 出 错 频率 。 复 制 机 构 的 成 分 通过 三 个 主要 机 制 将 复制 的 精确 度 提 高 了 几 个 数量 级 。 (1) DNA 聚合 酶 的 碱 基 选 择 ; 169 (2) DNA 聚合 酶 的 外 切 酶 校正 功能 ; (3) 辅助 蛋白 稳定 复制 复合 体 的 功能 (例如 单 链 结合 蛋白 , 它 限 制 了 模板 DNA 二 级 结构 的 形成 ) 。 当 dNTP 结合 到 模板 -引物 - 酶 的 三 元 复合 体 上 时 ,DNA 聚合 酶 具有 高 度 选择 性 ， 错 配 核 苷 酸 的 结合 没有 正确 配对 稳定 。 根 据 特 定 的 酶 , 错 配 的 类 型 和 其 前 后 序列 的 情况 的 差异 ,鉴别 错误 的 水 平 变 化 范围 在 0 一 400 倍 。 这 反映 了 鉴别 过 程 中 碱 基 配 对 和 堆积 力 的 影响 。 再 有 ,发生 在 结合 之 后 的 以 及 将 dNTP 置 于 酶 的 活性 位 置 的 构象 变化 的 频率 ,对 于 形成 Watson-Crick 配对 的 碱 基 来 说 要 大 5000 倍 。 正 确 配 对 的 碱 基 形 成 磷酸 二 酯 键 的 频率 也 要 高 一 些 。 这 三 种 鉴别 步骤 的 相对 重要 性 对 各 种 多 聚 酶 是 不 同 的 。 校正 功能 由 DNA 聚合 酶 内 在 的 3 一 5 外 切 酶 活性 完成 。 每 一 次 加 入 的 步骤 后 都 有 一 个 稍微 的 停顿 ,这 让 多 聚 酶 除去 错 配 的 碱 基 , 但 是 校正 的 主要 部 分 发 生 在 随后 的 多 聚 循 环 的 起 始 。 当 引物 末端 和 模板 错 配 后 挫 人 的 频率 非常 低 , 这 为 外 切 酶 活性 提供 了 一 个 好 机 会 。 因 此 ,校正 是 一 种 掌握 时 机 的 行为 , 它 由 多 聚 酶 不 能 有 效 地 延伸 错 配 末端 这 种 性 质 来 控制 。 在 达 .coli 中 ,这 些 因素 将 积累 的 出 错 频率 降 至 每 10” 个 碱 基 对 只 有 一 次 错误 挫 人 ， 但 这 仍 比 观察 到 的 自发 突变 率 高 三 至 四 个 数量 级 。 更 高 的 忠实 性 是 由 复制 后 错 配 修复 (参阅 ) 导 入 的 , 它 在 复制 后 将 新 合成 链 中 错 配 核 苷 酸 纠正 过 来 。 DNA 中 瞬时 的 、 自 发 的 化 学 变化 与 DNA 合成 相 联系 的 出 错 频率 (在 错 配 修复 和 校正 之 前 ) 反 映 了 多 聚 酶 在 选择 核 苷 酸 时 的 不 精确 性 。 多 聚 酶 内 在 的 性 质 (就 是 说 ,偶尔 挫 人 错 配 核 苷 酸 的 趋向 ) 是 造成 出 错 的 部 分 原因 ,但 这 也 反映 了 DNA 碱 基 经 历 自发 的 ,瞬时 的 变化 的 能 力 ,这 些 变化 涉及 氧 原子 的 重 排 。 这 类 变化 是 互 变异 构 移 位 (tautomeric shifts) , 而 形成 的 同 分 异 构 体 是 互 变异 构 体 (tautomers)( 图 14.1)。 所 有 碱 基 以 具有 一 定 平衡 的 互 变异 构 形式 的 混合 物 存在 (尽管 对 那些 出 现在 DNA 和 RNA 中 的 碱 基 来 说 ,一 种 形式 的 互 变异 构 体 很 稳定 , 且 转 化 成 不 稳定 形式 的 时 间 很 短 )。 不 同形 式 的 互 变异 构 体 可 能 与 互补 链 中 的 不 同 碱 基 配 对 。 例 如 ,稳定 的 鸟 味 叭 的 酮 式 互 变异 构 体 只 与 胞 喀 啶 配 对 ,但 不 多 见 的 烯 醇 式 形 式 与 胸腺 喀 啶 配对 。 绝 大 多 数 互 变异 构 转 化 是 无 害 的 ,因为 它们 出 现在 双 链 DNA 中 上 且 迅 速 回 到 起 初 状态 。 然 而 ,如 果 在 复制 中 模板 发 生 一 次 变化 ,就 会 0 Se 图 14.1 互 变异 构 移 位 形成 的 诱 变 。 鸟 味 叭 正常 的 酮 式 异 构 体 起 初 与 胞 喀 啶 配对 ,但 当 作为 模 板 时 它 移 位 成 不 常见 的 烯 醇 式 形式 (用 * 表 示 ) ,造成 胸腺 喀 啶 挫 人 了 互补 链 中 ,这 产生 了 错 配 而 不 是 突变 ,因为 胸腺 喀 啶 能 被 错 配 修复 替换 。 如 果 这 个 胸腺 喀 啶 保留 到 下 一 轮 复制 , 腺 味 叭 将 挫 人 到 第 三 代 的 链 中 ,突变 就 稳定 下 来 了 。 .170 ， 发 生 一 次 错误 抄 人 。 如 果 这 不 被 纠正 ,一 次 突变 将 出 现在 下 一 轮 复制 中 。 起 初 错误 挫 人 的 碱 基 不 一 定 会 形成 突变 ,因为 它 可 能 在 被 用 作 模 板 前 被 正确 核 苷 酸 取代 。 移 码 诱 变 ”选择 和 校正 增加 了 替换 的 忠实 性 ,也 就 是 挫 和 人 一 个 核 苷 酸 而 不 是 另 一 个 的 正确 性 。DNA 聚合 酶 显示 的 另 一 种 类 型 的 不 忠实 性 是 移 码 造成 的 不 忠实 性 ,这 是 在 模板 复制 时 与 引物 链 从 寄存 器 (register) 滑 出 时 造成 的 。 这 个 过 程 [有 时 称 为 跳 格 (slipping)， 打滑 (stuttering ) 或 震 额 (chattering) ] 会 产生 小 的 插入 或 丢失 。 在 编码 区 跳 格 会 产生 移 码 突变 ,但 这 个 术语 被 用 来 描述 所 有 这 类 性 质 的 突变 而 不 管 它们 发 生 在 哪儿 。 移 码 诱 变更 依赖 于 模板 的 性 质 而 不 是 DNA 聚合 酶 。 这 类 突变 被 重复 序列 (诱发 跳 格 ) 和 互补 区 域 (便于 形成 发 赤 和 其 他 二 级 结构 ) 激 发 。 这 些 区 域 是 突变 热点 ( 见 第 15 章 突变 和 选择 ) 。 移 码 错误 会 因为 加 工 的 减少 而 增加 ,这 暗示 着 当 多 聚 酶 从 模板 解 离 后 移 码 更 易 发 生 (这 提供 了 一 个 可 能 的 解释 ,为 什么 观察 到 的 前 导 链 和 滞后 链 合成 的 忠实 性 不 同 , 见 复制 ) 单 链 结合 蛋 白 减少 移 码 错 误 , 它 增加 了 单 链 DNA 的 稳定 性 旺 避免 了 二 级 结构 的 产生 。 14.2 DNA 损伤 :突变 和 致死 DNA 损伤 _DNA 总 是 在 受到 攻击 ,遭受 多 种 损伤 。DNA 的 一 个 损伤 区 域 被 称 为 一 个 损害 (lesion)。DNA 损伤 的 影响 是 两 方面 的 。 中 如 果 一 个 损害 改变 了 碱 基 配对 的 专 一 性 ， 它 被 称 为 误导 的 损伤 (misinstructional lesion) ,上 且 可 能 在 下 一 轮 复制 中 通过 图 14.1 显示 的 机 制 产生 一 个 突变 。@ 如 果 一 个 损害 使 DNA 不 能 特异 于 一 个 互补 碱 基 , 它 被 称 为 非 指 导 的 损伤 (noninstructional lession) ,可 能 产生 一 个 复制 阻 断 ( 那 儿 复 制 叉 被 延误 了 ) ,这 是 致死 的 ,因此 DNA 损伤 可 能 产生 突变 或 致死 。 为 了 避免 复制 阻 断 的 致死 效应 ,细胞 发 展 了 损伤 耐 受 机 制 , 这 让 复制 能 在 损害 存在 的 情况 下 继续 (参见 重组 修复 ,SOS 反应 )。 产 生 于 损害 位 置 的 突变 称 为 定向 突变 (targeted mnutation ) ,其 他 位 置 的 突变 ,例如 归 因 于 复制 错误 的 突变 称 非 定向 突变 (参见 基因 导向 )。 预 示 突 变 的 损害 称 为 前 诱 变 损伤 (premuta- genic lesion ) 。 DNA 损伤 的 种 类 “”DNA 损伤 可 以 定义 为 任何 不 是 正常 完好 无 损 DNA 分 子 具 有 的 结 构 , 并 且 如 果 不 处 理 的 话 ,会 造成 突变 和 复制 中 断 ,一 些 类 型 的 DNA 损伤 列 在 表 14.1 中 。 自发 和 诱导 损害 ” DNA 可 能 内 在 地 (由 于 分 子 自身 性 质 ) 或 外 在 地 (由 于 外 界 因 素 效 应 ) 遭 受 损伤 。 自 发 损害 的 产生 由 于 DNA 分 子 内 在 性 质 或 与 DNA 损伤 性 化 学 试剂 相互 作用 ,例如 作为 新 陈 代谢 副 产 物 产生 的 自由 基 团 。 由 这 些 损害 产生 的 突变 ,加 上 那些 通过 复制 和 重组 错误 产生 的 突变 ,以 及 可 移动 遗传 因子 活动 造成 的 突变 组 成 了 自发 突变 ,这 是 特定 生物 自发 突变 率 ( 参 阅 ) 的 基础 。 诱 发 的 损害 由 称 为 诱 变 剂 (mutagens) 的 DNA 损伤 因子 作用 形成 ,然而 特定 诱 变 剂 和 天 然 新 陈 代谢 副 产 物 造成 DNA 损伤 的 分 子 机 制 是 一 样 的 。 这 儿 , 自发 和 诱 变 损害 的 区 分 变 得 模糊 了 。 在 DNA 中 通过 自发 产生 某 些 化 学 反应 来 发 生 损 伤 , 这 包括 脱毛 ( 碱 基 上 失去 氨基 ) 和 通过 水 解 N - 糖苷 键 造成 碱 基 丢失 ,这 个 过 程 根据 碱 基 类 型 称 为 脱 嘎 叭 或 脱 喀 啶 。 脱 氨 产 生 误导 损害 ,造成 的 后 果 列 于 表 14.2。 水 解 造成 的 碱 基 丢 失 产生 一 个 非 指 导 性 的 171 ， AP 位 点 ( 表 14.1) , 它 阻 断 复制 。 然 而 在 正 . coii 的 SOS 反应 (参阅 ) 中 , 转 损害 (transle- sion) 的 合成 可 能 会 越过 AP 位 点 发 生 , 且 腺 味 叭 残 基 被 优先 挫 人 , 即 所 谓 的 A 法 则 。 除 了 这 些 内 在 的 自发 反应 , 氧 反 应 因子 ,例如 自由 基 团 ,会 造成 一 系列 氧化 型 DNA 损害 。 脱 氨 , 碱 基 技 失 和 和 氧化 型 损伤 也 会 被 诱 变 剂 诱导 。 表 14.1 _ DNA 损伤 的 分 类 和 它们 是 如 何 产生 的 损伤 类 型 定 义 起 因 二 可 以 是 “DNA 中 除 A,C,G,T 外 的 碱 基 自发 脱 氨 | 物理 或 化 学 因素 造成 的 碱 基 损伤 被 损伤 的 普通 碱 复制 过 程 中 尿 喀 啶 挫 人 基 或 DNA 中 不 适 复制 过 程 中 碱 基 类 似 物 挫 人 大 型 化 学 添加 物 加 到 碱 基 上 AP en 元 秦 “一 个 无 碱 基 位 点 ( 焉 基 从 DNA 主干 上 被 除 自发 碱 基 丢 失 诱发 的 水 角 人 去 的 位 点 ) 由 酶 将 异常 碱 基 除去 产生 的 位 点 缺口 (Gap) 双 链 中 的 一 条 链 委 失 一 个 或 多 个 核 苷 酸 形 ”外 切 酶 活性 造成 的 缺口 (往往 与 修复 有 联 成 的 位 点 系 ) 由 不 完全 复制 造成 的 缺口 (包括 切除 引物 和 复制 上 的 旁 路 ) 切口 (Nickt) 双 链 一 条 链 骨 架 上 的 损伤 , 并 没有 碱 基 缺 ”物理 /化 学 上 的 对 DNA 骨架 的 损伤 失 。 切 口 的 特点 是 通过 进一步 破坏 DNA ”AP 位 点 的 B- 去 除 未 端 来 阻止 简单 的 重新 连接 修复 合成 后 的 切口 保存 与 许多 细胞 过 程 联系 的 外 切 酶 活性 断裂 ( 双 链 断 裂 ) 。 。 双 链 的 两 条 链 上 的 损害 ,这 样 分 子 被 切 开 了 ”对 DNA 骨架 的 物理 /化 学 性 的 损伤 与 某 些 细胞 过 程 联系 的 外 切 酶 活性 紫外 诱导 的 碱 基 二 聚 体 化 交 联 DNA 链 共 价 连接 造成 的 损伤 , 这样 一 个 连 接 可 能 包含 同一 条 链 的 两 个 部 分 ( 链 ”化 学 诱导 的 交 联 内 交 联 ) 或 两 条 分 开 的 链 ,往往 是 双 链 的 两 条 链 ( 链 间 交 联 ) 表 14.2， 脱 氨 造 成 的 结果 正常 碱 基 互补 碱 基 脱 氨 产物 互补 碱 基 后 果 A 最 次 黄 味 吟 区 A-G 转换 C G 尿 喀 和 A G-A 转 换 G C 黄 味 叭 不 固定 复制 中 断 灾 A 无 5-- 甲 基 胞 喀 啶 G 工 克 G-A 转换 四 种 DNA 碱 基 ( 加 上 5- 甲 基 胞 喀 啶 ) 特 异 配 对 的 碱 基 以 及 它们 损伤 的 产物 环境 中 损伤 DNA 且 导 致 突变 或 致死 的 因子 是 基因 毒性 ( 表 14.3) 的 。 诱 变 剂 可 以 是 化 学 的 物理 的 或 生物 的 因子 ( 表 14.4) 化 学 或 物理 的 诱 变 剂 通过 与 DNA 作用 使 键 断裂 或 重新 排列 ,或 新 的 键 生成 。 这 往往 包含 增加 新 的 化 学 基 团 。 生 物 诱 变 剂 为 可 移动 遗传 因子 (参阅 ) ,它们 通过 转 座 进 入 DNA 而 打 断 它 ,它们 还 造成 各 种 类 型 的 结构 重 排 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 ) 。 .172 ， 表 14.3 基因 毒性 因子 的 分 类 基因 毒性 剂 调 聚 剂 致 畸 ( 胎 ) 剂 征文 促使 真 核 细胞 肿瘤 转化 的 因子 。 许 多 致癌 物 也 是 诱 变 剂 ,但 反 过 来 并 不 总 是 正确 诱导 染色 体 断 裂 , 也 就 是 双 链 断 裂 的 因子 通过 直接 和 DNA 作用 或 产生 新 陈 代谢 产物 来 促成 诱 变 的 因子 诱导 肿瘤 形成 的 因子 特别 有 效 的 诱 变 剂 ,例如 甲 基础 酸 乙 酯 导致 复制 提早 结束 的 因子 ,例如 2 ,3 一 二 脱氧 核 苷 诱导 发 育 异 常 的 因子 ,不 一 定 是 基因 毒性 因子 ,就 是 说 包括 不 改变 DNA 结构 而 发 挥 作用 的 分 子 表 14.4 不 同 种 类 的 诱 变 剂 诱 变 剂 化 学 诱 变 剂 脱 所 剂 烷 化 剂 大 型 加 合 物 供 体 碱 基 类 似 物 插入 剂 交 联 剂 物理 诱 变 剂 电离 辐射 紫外 辐射 生物 诱 变 剂 限制 性 酶 可 移动 遗传 因 了 于 描述 诱导 碱 基 脱 氨 的 因子 ,包括 非 专 一 性 的 硝酸 和 专 一 地 使 胞 喀 啶 脱 氨 的 亚 硫 酸 氢 钠 。 与 核酸 的 亲 核 中 心 反 应 的 分 子 。 它 用 链 烷 以 及 其 衍生 物 来 取代 亲 核 中 心 。 这 类 化 学 性 质 往往 是 强 有 力 的 诱 变 剂 ,例如 EMS 和 二 甲 基 亚 硝 胺 。 烷 化 剂 导 致 多 种 类 型 DNA 损伤 : 碱 基 修 饰 会 改变 烷 化 剂 的 配对 能 力 ,造成 复制 中 的 错误 挫 人 。 另 一 方面 ,一 个 大 型 加 合 物 (bulky adduct) 会 阻 断 复制 。 双 功能 的 因子 (能 使 两 个 亲 核 中 心 烷 基 化 ) 会 造成 交 联 。 这 是 一 种 代谢 后 能 将 大 型 化 学 基 团 加 到 碱 基 上 的 分 子 。 例 如 黄 曲霉 素 B, 和 苯 两 吡 。 这 类 反应 的 结果 是 形成 一 个 膨胀 的 扭曲 的 双 螺 旋 , 它 会 阻 断 复制 。 这 是 一 些 类 似 碱 基 的 分 子 ,它们 能 形成 可 以 挫 人 正在 生成 的 核 苷 酸 链 的 核 苷 酸 (例如 , 溴 脱氧 尿 喀 啶 )。 与 主要 碱 基 不 同 的 是 , 碱 基 类 似 物 会 显示 异常 的 碱 基 配 对 性 质 。 例 如 ,它们 能 与 不 目 一 种 碱 基 配 对 ,因为 它们 在 不 同 的 互 变异 构 形 式 下 都 能 保持 稳定 。 碱 基 类 似 物 通常 用 一 种 高 度 专 一 的 方式 产生 点 突变 。 具有 平面 结构 的 分 子 , 它 能 能 人 到 DNA 的 碱 基 之 间 ( 例 如 溴 化 乙 啶 ,了 啶 橙 )。 插 人 因子 通过 解 旋 DNA 链 而 增加 其 长 度 。 这 会 诱导 移 码 突 变 , 阻 断 复制 且 抑 制 核 苷 酸 的 切除 修复 ,这 通过 使 酶 束缚 在 无 活性 复合 物 状态 来 完成 。 这 是 使 DNA 链 便于 共 价 连接 的 分 子 。 这 些 药剂 因子 包括 双 功 能 性 的 烷 化 剂 , 氮 芥 和 硫 芥 , 铂 的 衍生 物 。 平 面 分 子 , 补 骨 脂 素 当 暴露 于 紫外 光 时 也 会 交 联 DNA。 电离 辐射 导致 各 种 DNA 损伤 ,包括 碱 基 损 伤 , 糖 环 的 损伤 ,裂口 和 断裂 。 电 离 辐 射 的 效应 可 能 是 直接 的 (由 DNA 分 子 中 原子 电离 造成 ) 或 间接 的 (由 细胞 中 其 他 活性 分 子 产生 ,主要 是 活性 氧 组 分 (reactive oxygen species) ,它们 与 DNA 相互 作用 )。 紫外 诱导 的 损伤 称 为 光合 产物 。 紫 外 辐射 的 主要 效应 是 产生 相 邻 碱 基 连 接 的 光合 二 聚 体 。 最 常见 的 光合 二 聚 体 是 环 丁 基 喀 了 啶 二 事 体 , 它 可 在 任何 两 个 相 邻 喀 啶 间 产 生 ,T= 工 是 最 普遍 的 ,其 他 依次 为 C=T,T=C,C=C. 另 一 个 常见 的 光合 二 聚 体 是 (6- 4) 损 害 。 包 含 味 叭 的 光 合 二 聚 体 也 有 形成 。 此 外 辐射 也 会 对 单个 碱 基 产 生 损伤 ,通常 是 使 其 水 合作 用 。 对 枯草 杆菌 孢子 的 辐射 会 产生 一 个 独特 的 孢子 光合 物 。 这 类 酶 由 细菌 产生 ,它们 在 诸如 噬菌体 基因 组 之 类 的 “人 侵 "DNA 上 产生 断裂 (参见 限制 和 修饰 系统 ,限制 性 内 切 酶 )。 这 是 能 在 基因 组 中 移动 的 DNA 序 列 ,例如 病毒 (比如 ,细菌 噬菌体 Mu\ 反 转录 病毒 ) ,附加 体质 粒 ( 比 如 下 因子) 和 转 座 遗 传 因子 (如 了 因子 ,Ty 因子 )。 由 于 它们 插 和 人 或 打 断 基因 ,而 导致 诱 变 的 或 可 能 带 有 基因 调控 元 件 来 影响 编码 基因 的 表达 ,它们 的 分 散 的 拷贝 可 能 便于 异常 重 组 。 7 14.3 DNA 修复 修复 机 制 ”如 果 所 有 DNA 损伤 都 不 修复 ,细胞 将 很 快 死亡 ,这 是 因为 致死 突变 的 积累 和 依赖 于 DNA 完整 性 的 一 些 关 键 过 程 被 抑制 (这 些 过 程 包括 复制 和 转录 )。 细 胞 发 展 了 众多 的 机 制 来 处 理 DNA 损伤 ,这 可 被 分 为 三 大 类 : (1) 直接 恢复 修复 机 制 ; (2) 损伤 切除 和 利用 互补 序列 来 修复 ; (3 可 诱导 的 损伤 耐 受 。 是 尽管 有 这 些 防卫 措施 ,细胞 最 终 要 衰亡 (例如 ,显然 衰老 的 细胞 )。 然 而 ,通过 损伤 避 免 和 修复 机 制 ,细胞 的 衰弱 明显 地 减 慢 了 。 可 被 直接 修复 的 损伤 类 型 是 很 有 限 的 。 合 成 能 特定 修复 每 一 种 可 能 损伤 的 酶 系 所 需 ， 的 资源 是 巨大 的 。 因 此 在 所 有 有 生命 的 有 机 体 中 的 主要 DNA 修复 方式 是 切除 修复 。 损 伤 的 DNA 被 除去 ,利用 未 损伤 链 作为 模板 链 在 缺口 处 合成 新 DNA。 这 里 强调 了 双 链 DNA 基因 组 对 许多 病毒 单 链 基因 组 的 一 个 重要 优势 :如 果 一 条 链 受 损 , 另 一 条 链 总 能 被 用 来 恢复 失去 的 信息 。 直 接 的 修复 和 切除 因此 是 准确 的 , 非 诱 变 的 或 无 差错 修复 (error- free repair) 系 统 。 在 以 下 几 种 情况 下 中 双 链 的 两 条 链 都 损伤 了 ;@ 损 伤 出 现在 DNA 的 一 个 单 链 区 域 上 (例如 复制 中 的 模板 链 ) ;@ 切 除 修 复 系 统 饱和 了 ,细胞 更 能 承受 非 指导 损伤 而 不 是 经 受 使 复制 中 断 的 致死 效应 。 在 这 些 情况 下 ,复制 叉 能 穿 过 一 处 损伤 , 留 下 一 个 缺口 , 它 可 以 通过 与 一 同 源 双 链 重组 而 弥补 ,在 相应 处 又 留 下 一 个 原 有 的 损伤 。 另 一 种 解决 方法 是 ,一 个 能 承受 损伤 的 可 诱导 系统 能 发 挥 作用 ,这 时 DNA 聚合 酶 可 以 用 降低 忠实 性 的 复制 经 过 损伤 处 。 这 种 倾向 差错 (error-prome) 的 修复 或 诱 变 修复 在 瓦 . coli 中 产生 许多 紫外 诱 导 的 突变 。 DNA 修复 机 制 对 存活 和 保持 完整 性 至 关 重 要 。 在 动物 中 ,DNA 修复 特别 重要 , 因为 影响 细胞 生长 的 突变 会 致癌 ( 见 第 18 章 癌 基因 )。 一 些 由 于 丢失 DNA 修复 功能 或 失去 对 DNA 损伤 的 细胞 反应 而 产生 的 人 类 疾病 列 于 表 14. 5。 14.4 直接 恢复 性 修复 DNA 损伤 的 直接 修复 ”有 三 类 损伤 可 以 直接 恢复 性 修复 :@ 简 单 裂 口 能 直接 重 连接 ; @ 某 些 紫外 光合 物 能 通过 光复 活 作 用 来 修复 ;@ 某 些 被 烷 基 化 的 碱 基 能 通过 除去 加 合 物 修复 .还 有 ,有 些 酶 能 在 受 损伤 核 苷 酸 加 入 DNA 前 将 其 修复 (例如 下 .coli 中 的 MutT ) 裂口 的 直接 修复 如果 3 -OH 端 和 5 -P 端 完好 无 损 的 话 ,由 电离 辐射 等 DNA 损伤 因子 产生 的 裂口 能 被 直接 修复 。 然 而 ,这 类 损伤 往往 包括 对 末端 碱 基 的 修饰 ,因此 在 连接 以 前 需要 进一步 的 加 工 。 ”的 表 14.5 与 DNA 修 复 缺 隐 有 关 的 人 类 遗传 病 病症 临床 表现 遗传 本 质 共 济 失调 毛细 管 扩 ”面部 血管 扩张 ,神经 肌肉 退化 ,免疫 缺陷 对 电离 辐射 敏感 显示 了 DNA 修复 缺陷 。 有 张 关 基 因 已 经 定位 在 人 的 染色 体 11q 位 置 ， 尽管 其 功能 还 没 确定 布 卢 姆 氏 综合 征 光敏 感 ,免疫 缺陷 ,生长 迟缓 ,易于 瘤 变 高 频率 的 姐妹 染色 体 交 换 对 诱 变 剂 敏感 , 冈 崎 片段 连接 延迟 ,DNA 连接 酶 缺陷 科 克 因 氏 综合 征 强烈 的 光敏 感 , 神 经 错乱 , 拓 小 ,视力 缺陷 ， 与 XP 类 似 ,尽管 皮肤 病 与 皮肤 冶 不 多 见 。 (CS) 面部 特征 以 及 四 肢 尺 寸 不 合 比例 三 个 互补 群 与 三 个 基因 被 鉴定 ,一 个 是 XPB ,其 他 的 是 CS 专 有 的 范 科 尼 氏 贫血 先天 性 皮肤 和 骨骼 异常 ,血细胞 丧失 对 交 联 剂 敏 感 显 示 了 DNA 修复 的 职能 。 该 病症 的 特征 是 反映 染色 体 断 裂 的 多 重 染 色 体 突变 。 四 个 互补 群 与 一 个 基因 FACC 被 鉴定 遗传 性 非 多 发 性 息 ”结肠 直肠 瘤 有 关 错 配 修复 的 基因 的 突变 肉 肠 痛 (HNPCC) 毛发 硫 营养 不 良 发 脆 , 皮 肤 磷 状 , 生 长 缺陷 ,精神 迟缓 ,有 许多 TTD 细胞 不 能 被 XP-D 细胞 补体 致 活 ， (TID) 50% 的 病例 光敏 感 这 说 明了 TID 可 能 包含 了 XPD 基因 不 同 突变 用 不 同方 式 影响 XPD 蛋白 ,一 些 是 影响 其 修复 功能 ,其 他 的 影响 其 基本 转 录 功 能 (参见 TFMIF) 着 色 性 干 皮 病 (XP) ”严重 光敏 感 , 皮 痛 ,视力 缺陷 ,神经 错乱 七 个 互补 群 (从 XP-A 到 XP-G) ,另外 还 有 XPV。 人 类 基因 XP4，XPB，XPC， XPD,XPF,XPG 已 被 克隆 。 主 要 缺陷 好 象 出 在 核 苷 酸 切除 修复 ( 见 表 14.6) 光复 活 光复 活 (photoreactivation or photorestoration ) 是 一 个 依靠 光 的 DNA 修复 机 制 , 它 将 某 些 类 型 的 喀 啶 二 聚 体 切 开 ( 单 倍 体 化 ) 。 这 种 修复 途径 在 许多 细菌 中 发 现 , 例 如 正 . coli 和 沙门 氏 菌 (Salrzomelia zyzpjpizaxurizoz ) ,但 在 枯草 杆菌 中 不 存在 , 它 的 主要 紫外 辐 射 产物 一 一 孢子 光合 物 一 一 被 认为 是 通过 一 种 类 似 但 不 需要 光 的 途径 单 倍 体 化 的 。 刁 .coii 中 ,用 于 光复 合 的 酶 有 许多 叫 法 ,如 DNA 光 解 酶 ,脱氧 核糖 二 喀 啶 光 解 酶 或 光复 活 酶 , 它 由 加 r 基因 编码 。 这 种 酶 结合 到 具有 喀 啶 二 聚 体 的 DNA 上 , 当 暴 露 于 波长 在 300 一 500 nm 的 可 见 光 时 ,将 二 聚 体 转化 为 喀 啶 单 体 。 在 许多 但 不 是 所 有 低 等 真 核 生 物 内 都 发 现 了 性 质 相 似 的 光 解 酶 ,但 没什么 证 据 证 明 它 在 高 等 真 核 生 物 中 广泛 存在 [尽管 在 果 蝇 中 描述 了 一 种 能 直接 修复 (6- 4) 光 合 物 的 光 依 赖 性 酶 ] 。 光复 活 不 应 与 其 他 非 酶 活性 的 单 体 化 机 制 混淆 :直接 光 恢 复发 生 在 持续 的 对 DNA 紫外 辐射 下 ,这 反映 了 相 邻 喀 啶 间 建 立 了 一 个 单 体 和 二 聚 体 间 的 平衡 。 致 敏 光 恢 复 在 有 色 氢 酸 存在 时 发 生 , 它 提供 一 个 电子 而 有 助 于 单 体 化 。 再 有 ,紫外 辐射 会 扰乱 其 他 细胞 组 分 ,抑制 生长 并 给 光合 二 聚 体 的 切除 修复 提供 时 间 ,这 种 现象 称 为 间接 光 修 复 。 烷 基 化 碱 基 的 直接 修复 ”下 .coli 中 ,095 烷 基 化 的 鸟 味 哈 和 O” 烷 基 化 的 胸腺 喀 啶 残 175 ， 基 , 以 及 甲 基 化 的 磷酸 二 酯 键 由 Ada 酶 修复 (在 其 更 广泛 的 底 物 专 一 性 被 发 现 以 前 ; 称 为 O6 一 甲 基 鸟 味 叭 DNA 甲 基 转 移 酶 I[,06 - MGT I)。Ada 具有 双 功 能 性 :其 一 是 将 二 个 烷 基 基 团 从 碱 基 的 碱 式 基 团 上 转移 , 另 一 个 是 将 一 个 甲 基 从 甲 基础 酸 二 酯 键 上 转移 ,从 而 直接 扭转 了 甲 基 化 因子 的 效应 。Ada 被 称 为 一 个 自杀 酶 ,因为 它 将 烷 基 转移 到 自身 并 且 失 去 活性 。 第 二 种 烷 基 转 移 酶 ,056 - MGT II, 不 能 催化 甲 基 从 磷酸 三 酯 上 转移 。 在 其 他 细菌 和 真 核 生 物 中 都 找到 了 相似 的 酶 ,尽管 它们 对 Ada 蛋白 不 同 底 物 的 专 一 性 不 同 。 适应 反应 五 . co 中 ,环境 中 低 浓 度 的 烷 化 剂 能 激发 一 个 修复 系统 。 这 种 适应 反应 是 SOS 依赖 性 的 (参见 SOS 诱 变 ) 并 和 aaa aidB 、cRA 和 azRB 基因 有 关 。 此 xzK&A 基因 编 码 3-- 甲 基 腺 味 叭 DNA 糖 基 化 酶 ,执行 碱 基 切 除 修 复 ( 见 下 一 节 ) ,识别 广 谱 的 烷 基 化 碱 基 。adaa 基因 编码 05- MGT I, 也 就 是 刚才 讨论 过 的 Ada 蛋白 , 它 通 过 从 碱 基 和 磷酸 三 酯 键 转 移 烷 基 到 自身 来 完成 对 DNA 烷 基 化 损伤 的 直接 修复 。 从 磷酸 三 酯 键 上 移 走 的 甲 基 被 转移 到 一 个 胞 喀 啶 残 基 的 C 端 。 这 不 仅 使 蛋白 失 活 ,而 且 将 其 转化 成 其 自身 基因 以 及 aidB ,akA 和 akB 的 正 调控 因子 。 由 该 蛋白 修复 活动 造成 的 蛋白 失 活 通过 诱导 基因 表达 来 补充 。 在 DNA 碱 基 烷 基 化 频繁 发 生 的 同时 ,由 甲 基 化 产生 磷酸 三 酯 键 只 是 在 细 胞 暴露 在 烷 化 剂 危 险 的 浓度 时 才 发 生 ,要 除去 它们 需要 更 为 一 致 的 努力 。 通 过 蛋白 水 解 酶 对 甲 基 化 失 活 的 Ada 蛋白 的 剪 切 可 以 终止 适应 反应 ,因为 某 些 剪 切 产物 能 作为 适应 反 应 基因 表达 的 抑制 物 。aiaB 和 ak2 的 功能 不 明 。aada 和 osgzt( 编 码 056-MGT IT) 基 本 上 以 低 水 平 持续 转录 ,但 只 有 Ada 蛋白 是 遗传 调控 因子 ,结果 只 有 acaa 基因 能 被 细胞 内 烷 基 化 所 诱导 。 14.5 切除 修复 碱 基 切除 修复 ”一 种 叫做 DNA 糖 基 化 酶 (DNA glycosylases) 的 酶 能 从 DNA 中 除去 特 定 类 型 损伤 或 不 合适 碱 基 ( 表 14.6)。 这 个 过 程 叫 碱 基 切 除 修复 (BER)。 碱 基 由 入 =- 糖 苷 键 (图 14.6) 的 水 解除 去 ,这 种 键 将 碱 基 连 到 DNA 主干 的 糖 环 上 。 损 伤 的 一 半 被 切除 作为 游离 的 碱 基 ,由 此 产生 另 一 种 类 型 的 DNA 损伤 , 即 一 个 AP 位 点 (参阅 )。 DNA 糖 基 化 酶 有 以 下 性 质 : (1) 它们 识别 DNA 中 损伤 的 或 不 合适 的 单个 特定 类 型 碱 基 ,或 者 一 个 相关 化 学 加 合 物 的 小 基 团 。 (2) 它们 通过 N- 糖苷 键 的 水 解除 去 碱 基 。 某 些 糖 基 化 酶 还 能 通过 相关 的 AP 裂解 酶 活性 在 损伤 的 3 端 引 入 一 个 切口 ,但 这 个 行为 不 是 后 来 的 修复 步骤 必须 的 , 它 的 生理 意义 也 不 清楚 。 (3) 几乎 所 有 DNA 糖 基 化 酶 都 作用 于 单个 碱 基 ,对 涉及 多 个 碱 基 的 更 大 更 复杂 的 损 伤 没有 专 一 性 。 然 而 ,对 喀 啶 二 聚 体 专 一 的 一 个 DNA 糖 基 化 酶 已 在 鸣 菌 体 T4 和 微 球菌 属 中 发 现 。 (4) 大 多 数 DNA 糖 基 化 酶 识别 损伤 或 不 合适 的 DNA 碱 基 , 但 其 中 一 些 识别 正常 碱 基 的 酶 在 错 配 修复 (参阅 ) 中 也 起 作用 。 “76 ，。 表 14.6 DNA 糖 基 化 酶 和 其 底 物 专 一 性 ,以 及 顾 . coji 中 编码 它们 的 基因 和 已 知 的 功能 同 源 的 真 核 基 因 。 每 种 酶 都 根据 * 底 物 - DNA 糖 基 化 酶 (DG)? 原 则 命名 。 底 物 通 常 缩写 (如 uracil= Ura) 酶 物种 基因 专 一 性 注释 Ura-DG 大 肠 杆菌 Uzmg 全 的 5- 闫 基 居 喀 人 类 UDC 3-meA-DG 大 肠 杆菌 iag 3-meA QIRA 3-meA, 7-meG, 3-meG, DO- 对 亚 致 死 剂量 的 烷 化 剂 meC，O-maT，5S-foU， 的 aRA 部 分 的 适应 反 5 一 羟基 尿 喀 喧 应 (参见 烷 化 剂 的 剂 量 ) 啤酒 酵母 MAG 3-meA 7-meG 次 黄 味 吟 人 类 MPGCG 3-meA,8-oxoG Fapy/8-oxoG-DG 大 肠 杆菌 bbLzattM 开 环 味 叭 (例如 fapy,8- < 啤酒 酵母 OGG1 oOxoG) 汪 人 生 和 人 类 OGG1 内 切 酶 III 大 肠 杆 菌 7 太 喀 啶 氧化 的 衍生 物 对 喀 啶 氧化 损伤 的 修复 (thymine 虹 ycol- DG) MutY 大 肠 杆 菌 772t 了 7 A:G 中 的 A 和 A:8-oxo 错 配 修复 一 G 错 配 内 切 酶 VIII 大 肠 杆 菌 11ei 喀 啶 氧化 衍生 物 外 切 酶 芭 UV-=- 内 切 酶 T4 aenV 和 微 球菌 胸腺 二 聚 体 GT 错 配 人 类 GT 错 配 中 的 胸腺 喀 喧 错 配 修复 碱 基 切 除 后 的 修复 完成 ”在 碱 基 被 DNA 糖 基 化 酶 切除 后 ,产生 了 一 个 AP( 无 味 叭 /无 喀 啶 ) 位 点 。 这 被 第 二 类 叫 AP 内 切 酶 的 专 一 性 修复 酶 识别 , 它 在 AP 位 点 5 端 引 入 一 个 切口 。 大 肠 杆菌 中 有 两 类 AP 内 切 酶 : (1) 外 切 酶 TI: 起 初 作为 具 相 关 的 磷酸 酶 活性 的 3 一 5 外 切 酶 被 鉴定 (因此 得 名 ) , 实 际 上 该 酶 的 主要 生理 作用 是 其 $” AP 内 切 酶 活性 。 由 于 其 组 成 型 表达 , 它 是 主要 的 AP 内 切 酶 ,由 xth 基因 编码 。 其 他 物种 中 有 功能 性 同系 物 : EzoA [肺炎 双 球 菌 (S，zrpevno- 1iae)、 APE/ZHAP( 人 类 )、APEX( 小 鼠 )、BAP( 牛 ) 和 Rrpl( 果 蝇 )]。 (2) 内 切 酶 TV: 通常 只 占 AP 内 切 酶 活性 的 10% ,该 酶 由 反映 氧化 损伤 修复 重要 性 的 超 氧化 物 诱导 。 它 由 xz 万 基因 编码 ,是 啤酒 酵母 中 发 现 的 APN1 的 功能 同系 物 。 在 AP 位 点 $ 端 切割 后 , 另 一 个 酶 :脱氧 核糖 磷酸 二 酯 酶 (dRpase) ,对 于 将 5 端 残 基 水 解 是 必须 的 。 由 它 产 生 一 个 单个 核 苷 酸 缺 口 。DNA 聚合 酶 可 能 从 这 个 缺口 启动 修复 合成 ,用 一 个 核 苷 酸 修复 补 钉 来 取代 丢失 的 核 苷 酸 残 基 。 另 外 ,损伤 位 置 的 3 端的 DNA 可 以 被 切除 , 随 之 是 广泛 的 取代 合成 。 最 后 ,修复 合成 后 剩 下 的 切口 被 DNA 连接 酶 所 封 闭 。 核 苷 酸 切 除 修复 ”直接 恢复 修复 和 BER 都 涉及 到 识别 特定 DNA 损伤 的 酶 。 核 苷 酸 切 = 除 修复 (NER) 是 一 个 识别 广 谱 DNA 损伤 的 系统 ,这 些 损伤 包括 交 联 ,大 型 加 合 物 和 涉及 多 碱 基 的 损伤 。 这 些 损伤 被 一 个 多 功能 的 酶 复合 物 除 去 , 它 产生 一 个 被 DNA 聚合 酶 和 DNA 连接 酶 修复 的 缺口 。 现 在 还 不 清楚 NER 酶 是 如 何 识别 不 同 损伤 的 :其 中 一 些 , 但 不 是 所 有 的 ,导致 双 螺旋 变形 。 但 天 然 的 干扰 ,例如 缠 结 ,发卡 结构 和 错 配 只 能 作为 不 理想 的 底 物 。 损 伤 DNA 通过 磷酸 二 酯 键 水 解 被 释放 ,作为 完好 无 损 的 核 苷 酸 ,或 者 更 常见 的 是 作为 核 苷 酸 片段 。DNA 中 喀 啶 二 聚 体 的 修复 在 可 见 光 和 黑暗 情况 下 都 发 生 : 在 可 见 光 下 ,二 聚 体 通过 光复 活 修复 (参见 ) ,因此 叫 光 修 复 ,而 瞳 修复 是 核 苷 酸 切 除 修复 , 它 通 过 另 一 种 机 制 发 生 。 大 肠 杆菌 中 的 核 苷 酸 切 除 修复 大肠 杆 菌 中 有 三 种 主要 NER 基因 : xur4A , xorB 和 wwrC ,它们 的 产物 结合 起 来 形成 一 个 依赖 ATP 的 内 切 酶 (也 叫 UvrABC 内 切 酶 或 切除 酶 ， 叫 切除 酶 是 因为 它 与 切除 有 关 。 图 14.2)。 两 分 子 的 UvrA 结合 到 一 分 子 的 UvrB 上 ,这 个 复合 物 再 结合 到 损伤 DNA 上 (UvrA 的 功能 可 能 是 运载 UvrB 蛋白 )。 然 后 UvrA 解 离 (其 中 必须 ATP 的 水 解 ) ,Uvrc 的 结合 造成 一 个 构象 变化 ,这 让 UrvrB 在 损伤 的 3 产生 一 个 切口 。 然 后 UvrC 蛋白 产生 5 切口 。UrvarC 的 结合 和 随后 的 双 位 点 切割 (bimodal in- cisions) 需 要 ATP 的 结合 但 不 需 其 水 解 。5 端的 切割 常 在 损伤 处 上 游 8 个 核 苷 酸 的 位 置 ， 而 3“ 端 切割 位 点 根据 损伤 的 性 质 更 加 多 变 。S$' 和 3“ 的 切割 位 置 都 会 受 前 后 序列 影响 。 产 生 的 寡 核 苷 酸 片 段 被 vurD 基因 编码 的 DNA 解 旋 酶 II 切除 。 同 时 除去 了 UvarC 蛋白 ,让 UvrB 横 跨 在 两 个 缺口 上 ,这 可 能 是 保护 单 链 区 域 免 受 进 一 步 的 损伤 。DNA 聚合 酶 工 结 合 到 暴露 的 3 羟基 上 并 越过 缺口 合成 。 在 此 过 程 中 ,同时 除去 UvrB, 产 生 一 个 大 约 12 个 核 苷 酸 的 修复 补 箱 (patch)( 这 类 修复 有 时 称 为 短 补 条 NER) 。 最 后 的 切口 被 DNA 连接 酶 封闭 。 UvrA UvrB UvrC 和 图 14.2 ”大肠 杆 菌 中 的 核 苷 酸 切 除 修 复 。UvrA 将 UvrB 运输 到 DNA 上 ,然后 解 离 ;该 过 程 中 有 ATP 的 水 解 。 然 后 Uvrc 结合 到 复合 物 上 并 在 损伤 的 $ 和 3 端 引入 切口 (箭头 处 ) ,这 时 UvrD 解 旋 酶 将 赛 核 苷 酸 片段 和 UvrC 除去 ,让 UvrB 连接 缺口 。 这 缺口 被 DNA 聚合 酶 I 和 连接 酶 修复 ; 最 后 UvrB 被 去 除 。 “ UvrABC 内 切 酶 以 低 水 平 组 成 型 表达 ,但 worA 和 zxorB 基因 也 可 通过 SOS 诱导 ( 傅 见 SOS 反 应 )。 第 二 种 核 苷 酸 切 除 修复 过 程 ,也 与 wor 基因 有 关 且 也 是 SOS 诱导 性 的 ， 可 以 造成 大 到 2kb DNA 的 切除 和 取代 。 这 种 称 为 长 补 钉 NER 的 现象 ,具体 机 制 还 不 清 楚 。 核 苷 酸 切 除 修补 优先 以 活性 基因 已 转录 链 为 靶 。 当 转录 被 DNA 损伤 中 断 可 能 会 诱 导 切 除 修复 。 一 个 由 参 友 基因 编码 的 称 为 转录 修复 偶 联 因 子 (TRCF ) 的 蛋白 能 结合 到 拖 延 的 RNA 多 聚 酶 一 DNA 损伤 一 RNA 复合 物 上 ,并 取代 转录 机 制 。TRCF 还 结合 UvrA， 这 显示 一 旦 结合 到 损伤 DNA 上 , 它 可 能 特异 性 地 将 uvrA-uvrB 复合 物 招募 到 模板 上 。 真 核 生 物 中 的 核 苷 酸 切 除 修复 ” 真 核 生物 中 核 苷 酸 的 切除 修复 与 一 大 群 基因 有 关 。 酵 母 中 ,这 些 基因 归 到 RAD3 上 位 群 (参见 上 位 )。 因 为 其 中 大 多 数 已 经 在 对 辐射 敏感 的 遗 传 筛选 中 被 鉴定 。 人 类 的 酵母 RAD 基因 同系 物 起 初 称 ERCC( 切 除 修复 的 互补 成 分 ) 基 因 ,但 许多 都 引起 特殊 疾病 表 型 ,例如 着 色 性 干 皮 病 ,因而 这 些 基 因 被 重新 命名 ( 表 14.7) 其 他 NER 基因 也 被 鉴定 ,因为 它们 对 转录 也 是 至 关 重 要 的 ,并 显示 了 真 核 细 胞 转录 和 修 复 的 紧密 联系 。 这 种 联系 的 基础 是 普遍 的 转录 因子 TFIIH , 它 既 是 细胞 基本 转录 装置 的 一 个 重要 成 分 ,也 是 修复 蛋白 复合 物 修复 体 (repairosome) 的 主要 成 分 。 在 转录 复合 物 中 ， TFIIH 的 核心 与 一 个 依赖 细胞 周期 蛋白 的 激酶 复合 物 ( 在 哺乳 动物 中 是 CDK7/ 细 胞 周期 表 14.7 ”与 核 苷 酸 切 除 修 复 有 关 的 真 核 基因 啤酒 酵母 ( 栗 酒 酵母 ) 基 因 人 类 基因 “” 功 能 RADI (radl16 ) XPF RAD1 和 RAD10 结合 起 来 形成 一 个 内 切 酶 , 它 对 双 链 - 3 单 链 的 连 接 有 专 一 性 RADIO0(swil0) ERCC1 RAD2 (rad13 ) XPG 对 双 链 - 5“ 单 链 的 连接 有 专 一 性 的 内 切 酶 RAD4 XPC 不 明 , 可 能 有 助 于 将 转录 复合 物 转变 成 修复 体 RAD14 XPA 损伤 趋向 性 DNA 结合 蛋白 RAD3 (rad15 ) XPD 是 具有 5 一 3 解 旋 酶 活性 的 TFIH 的 成 分 SSL2/RAD25(ERCC3 历 ) XPB 是 具有 3 一 5 解 旋 酶 活性 的 TFIH 的 成 分 SSL1 Pd44 是 基本 转录 因子 TFIIH 的 成 分 TFB1 P62 TFB2 P52 TFB3 MATT1 TFB4 P34 RAD7 扰乱 染色 质 的 结构 RAD16 RAD23 PSO2 , PSO3 修复 补 骨 脂 素 诱导 的 损伤 酵母 中 ,核心 TFII H 有 七 种 成 分 ,而 人 类 核心 TFII 有 6 种 。MAT1, 人 类 一 个 依赖 细胞 周期 蛋白 的 激酶 (CDK) 装 配 因子 ,在 修复 中 不 处 于 核心 ,但 它 是 CDK 的 一 部 分 。 酵 母 中 的 同系 物 TFB3(p38) 在 修复 时 中 仍 留 在 核心 中 。 “全 蛋白 和 装配 因子 MAT1 ,参见 CAK 结合 ) , 而 在 修复 时 , 它 与 其 他 修复 蛋白 结合 。 因 此 ,修复 总 是 优先 被 引导 到 活性 转录 基因 的 已 转录 链 ( 即 转录 偶 联 修复 ) ,并 且 转 录 正 在 进 行 时 修复 更 活跃 [ 即 转录 依赖 性 修复 (transcription dependent repair)]。 核 苷 酸 切 除 修复 机 制 在 真 核 生 物 与 细菌 中 很 相似 ,都 是 先 切割 两 端 再 切除 之 并 重新 合成 。 人 类 中 核 背 酸 切除 后 的 修复 补 箱 比 大 肠 杆菌 中 的 (30nt) 要 稍微 长 一 些 ,被 含糊 地 称 为 长 补 钉 修复 ,这 用 来 与 碱 基 切除 修复 中 的 1 一 2 核 苷 酸 的 短 补 钉 修 复 相 区 别 。 现 在 还 没有 证 据 证 明 真 核 生 物 中 有 像 大 肠 杆菌 中 那样 的 大 于 1500bp 的 长 补 钉 修 复 。 14.6 错 配 修复 碱 基 错 配 和 错 配 修复 ”。 错 配 修复 是 一 种 纠正 双 链 DNA 中 碱 基 对 错 配 的 切除 修复 过 程 。 一 个 错 配 是 一 个 非 Watson - Crick 碱 基 对 ,尽管 错 配 修复 系统 也 纠正 小 的 〈 小 于 4 不 核 苷 酸 的 残 基 ) 插 入 和 删除 ,从 而 不 仅 有 助 于 取代 的 忠实 性 ,还 有 助 于 移 码 突变 的 纠正 。 错 配 修复 和 其 他 形式 的 DNA 修复 不 同 的 是 被 切除 的 物质 是 正常 的 (未 损伤 的 )DNA 中 常 见 的 碱 基 , 因 此 肯定 有 一 种 机 制 来 区 分 正确 和 非 正确 的 链 ,这 样 模板 链 中 诱 变 的 核 苷 酸 而 不 是 正确 的 核 苷 酸 被 除去 。 错 配 能 通过 几 种 方式 产生 :复制 中 的 错误 挫 人 ;@ 重 组 时 形成 异 源 DNA 双 链 ;@5/ 甲 基 胞 喀 啶 的 脱 氨 产 生 胸 腺 喀 啶 ( 见 DNA 甲 基 化 和 外 遗传 调控 )。 还 有 , 短 的 插 人 或 删 除 能 通过 下 面 方式 形成 :DDNA 复制 中 链 的 跳 格 ;@ 产 生 一 个 不 相等 的 异 源 双 链 。 错 配 修复 不 影响 非常 相似 序列 间 的 重组 ,但 减少 了 明显 有 差异 序列 间 的 重组 ,因为 产 生 了 重 又 的 切除 区 域 。 因 此 该 修复 系统 能 充当 明显 有 差异 的 ,但 不 是 生殖 隔离 的 生物 体 间 的 物种 屏障 。 大 肠 杆菌 中 的 长 补 钉 修复 ”复制 中 引入 的 错 配 修复 被 专 一 性 地 从 新 生 链 中 切除 ,让 正 确 序 列 越过 产生 的 缺口 重新 生成 。 这 称 为 复制 后 的 错 配 修复 ,将 替换 和 移 码 的 忠实 性 提 高 了 几 个 数量 级 。 修 复 被 引导 到 子 链 ,因为 它 暂时 还 未 被 甲 基 化 。GATC 顺序 中 的 腺 顺 叭 残 基 被 DNA 腺 味 吟 甲 基 化 酶 在 N? 位 置 甲 基 化 (参见 Dam 甲 基 化 酶 ) ,但 在 复制 后 ,在 该 酶 对 新 合成 的 子 单 链 完 成 甲 基 化 之 前 还 有 一 段 时 间 差 ( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 )。 在 这 段 时 间 里 ,细胞 能 区 分 亲本 链 和 子 链 ,因而 将 修复 引导 到 子 链 。 如 果 两 条 链 都 未 甲 基 化 ， 修复 仍 会 出 现 , 但 不 会 偏向 哪 一 边 ,如 果 两 条 都 甲 基 化 了 ,修复 仍 不 会 偏向 ,但 效率 要 低 得 多 。 四 个 基因 (ax ,maxtL ,axutS 和 utD) 对 长 补 钉 修 复 来 说 是 绝对 需要 的 。 它 们 是 增 变 基因 ,因为 影响 它们 功能 的 突变 会 改变 DNA 复制 的 忠实 性 ,因而 改变 了 自发 突变 率 。MutS 蛋白 识别 错 配 DNA, 其 效果 要 根据 错 配 类 型 和 前 后 序列 而 定 (G:T 和 A:C> G:G 和 A:A>T:T,C:T 和 G:A>C:C)。 未 甲 基 化 的 GATC 序列 作为 MutH 的 底 物 ， MutH 是 一 个 内 切 酶 。 子 链 紧 靠 有 鸟 味 叭 残 基 的 $ 端 产 生 切 口 ,使 包括 错 配 核 苷 酸 的 补 钉 得 以 切除 。MutS\、MutL、ATP 和 二 价 阳 离子 以 及 MutH 的 内 切 酶 活性 是 需要 的 ,并 且 切除 时 UvrD 是 必需 的 DNA 解 旋 酶 。 因为 MutH 只 有 在 错 配 存在 时 才 行 使 功能 ,所 以 它 像 是 一 种 修复 蛋白 ,GATC 位 点 和 ”180 ， 错 配 必需 发 生物 理 相 互 作 用 。 这 种 模型 得 到 一 种 论证 的 支持 。 这 种 论证 认为 ,无 论 错 配 位 于 最 近 的 GATC 位 点 的 $ 端 还 是 3 端 ,切除 修复 总 是 取 最 短路 线 。 从 GATC 开始 而 在 错 配 的 大 约 100 个 核 苷 酸 以 外 的 位 置 结 束 。 由 于 UvrD 是 一 个 $ 一 3 的 解 旋 酶 ,这 要 求 它 处 在 甲 基 化 的 链 来 修复 $ 错 配 ,并且 处 在 未 甲 基 化 的 链 来 修复 3“ 错 配 ,这 是 一 个 需要 两 个 位 置 间 相 互 作 用 的 机 制 。 根 据 错 配 的 位 置 还 需要 不 同方 向 的 外 切 酶 。 图 14.3 显示 了 一 个 错 配 修复 的 模型 。 uvb 解 旋 靖 / | 训 儿 和 CH。s DNA 聚 合 酶 1 DNA 连 接 酶 一 -一 人 一 一 图 14.3-” 大 肠 杆 菌 中 的 一 种 错 配 修复 模型 。MautSs 结合 到 一 个 错 配 位 置 并 且 募 集 MutH 和 MutL。 这 个 过 程 依赖 于 ATP 的 水 解 。DNA 弯曲 从 两 侧 绕 过 修复 复合 物 ,产生 一 个 环 , 直 到 遇 上 第 一 个 GATC 位 点 。 这 儿 MutH 引入 一 个 切口 。UrvrD 解 旋 酶 从 GATC 位 点 解 开 DNA, 并 排出 修 复 蛋白 ;DNA 被 一 个 外 切 酶 降解 。 最 后 缺口 被 DNA 聚合 酶 和 连接 酶 修复 。UvrD 是 一 个 3 一 9 解 旋 酶 ,所 以 对 于 修复 而 言 表 明 都 必须 被 运载 到 未 甲 基 化 的 链 上 ,并 使 用 一 个 3 一 5 的 外 切 酶 , 例 如 外 切 酶 I。 如 果 最 近 的 GATC 位 点 位 于 错 配 的 任意 一 端 ,那么 解 旋 酶 不 得 不 被 运载 到 甲 基 化 链 上 ,并 且 需 要 一 个 $ 一 3“ 的 外 切 酶 ,例如 外 切 酶 VII。 其 他 有 机 体 的 长 补 钉 修 复 ”与 大 肠 杆 菌 MutHLS 错 配 修复 同 源 的 系统 已 在 其 他 的 细 菌 和 真 核 生 物 中 被 发 现 , 尽 管 在 许多 细菌 和 所 有 真 核 生 物 中 修复 不 依赖 于 甲 基 化 。 链 的 区 分 可 能 涉及 切口 的 识别 。 这 些 切口 是 在 被 DNA 连接 酶 修复 前 的 复制 中 产生 的 (这 些 切口 可 能 在 后 潇 链 中 自然 产生 ,而 在 前 导 链 中 被 特异 地 引入 , 见 复制 )。 结 果 , 大 肠 杆菌 mtS 和 ?7zx 红 (但 没有 ut 百 ) 的 真 核 同 系 物 已 被 分 离 , 列 于 表 14.8 中 。 在 酵母 和 人 类 细 胞 中 ,每 一 种 大 肠 杆 菌 基 因 至少 有 两 种 同系 物 , 它 们 的 产物 形成 异 源 二 聚 体 。 真 核 基 因 MLHI 和 MSH2 被 认为 在 插入 /缺失 错 配 修复 中 发 挥 主要 作用 ,因为 它们 的 任 一 个 发 生 突变 都 会 造成 微 卫 星 的 不 稳定 性 ,这 在 人 类 中 与 遗传 性 非 多 发 性 息肉 着 色 性 癌 (heredi- "全 8 。 tary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC) 有关。 表 14.8 大肠 杆菌 长 补 钉 错 配 修复 基因 的 真 核 同系 物 大 肠 杆菌 基因 啤酒 酵母 基因 哺乳 动物 基因 注释 matt MLHI1 MLHI 与 HNPCC 相关 PMS1 PMS2 PMS1 72UtS MSH2 MSH2 与 HNPCC 相关 MSH6 GTBP MSH1 线粒体 的 MSH2 Duc-1,REP3 MSH3 MSH3 MSH4 短 补 钉 错 配 修复 原核 生物 和 真 核 生 物 二 者 都 有 以 短 切除 补 钉 为 特征 的 错 配 修复 系 统 , 特 别 是 少 于 10 个 核 苷 酸 长 度 的 补 箱 。 在 大 肠 杆菌 中 ,有 两 个 不 依赖 于 mxwtHLS 错 配 修复 的 系统 : (1)MutY 依赖 的 修复 取代 A:G 和 A:C 错 配 中 的 腺 味 叭 残 基 。MutY 编码 一 个 DNA 糖 基 化 酶 (参见 碱 基 切 除 修复 ), 它 的 主要 职能 是 除去 腺 味 叭 残 基 对 面 的 8-oxo-7,8-- 二 氧 脱氧 鸟 味 叭 残 基 , 但 它 也 能 作用 于 错 配 。 (2) 极 短 补 钉 (VSP) 错 配 修复 纠正 G:T 错 配 中 的 胸腺 喀 啶 。 这 发 生 在 Dem 甲 基 化 酶 的 靶 顺 序 CC(AAT)GG( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 ); 内 部 的 胞 喀 啶 残 基 被 修饰 成 $ 甲 基 胞 喀 了 啶 并 且 通 过 脱 氨 可 能 被 转化 成 胸腺 喀 啶 。VSP 修复 需要 mxwtS 和 mxtL 但 不 需要 mxt 百 和 wwrD 基因 的 产物 。 它 还 需要 vsr 编码 一 种 内 切 酶 ,该 酶 对 顺序 CT(AXT)GG 中 的 GT 错 配 有 专 一 性 。 哺乳 动物 中 一 种 短 补 钉 修复 已 被 鉴定 , 它 纠 正 G:T 错 配 中 的 胸腺 喀 啶 ,特别 是 在 CpG 基 序 中 。 这 同时 也 是 一 种 DNA 糖 基 化 酶 , 它 像 大 肠 杆菌 的 VSP 那样 作用 ,阻止 $“ 甲 基 胞 喀 啶 脱 氮 造 成 的 突变 ( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 )。 14.7 重组 修复 重组 修复 的 证 据 ”重组 修复 是 涉及 同 源 重 组 (参阅 ) 在 内 任何 的 DNA 修复 或 损伤 耐 受 的 战略 。 停 留 在 G; 和 G> 期 的 单 倍 体 酵 母 对 电离 辐射 的 不 同 敏感 性 证 实 了 这 种 修复 机 制 的 存在 (这 对 静止 期 和 对 数 期 的 细菌 细胞 也 是 类 似 的 ) ;每 种 情况 下 ,具有 更 多 基因 组 拷 贝 数 的 细胞 抗 性 更 强 。 重 组 修复 的 更 直接 的 证 据 来 自 对 大 肠 杆菌 和 啤酒 酵母 的 重组 缺陷 突变 体 的 研究 ,它们 也 是 辐射 敏感 的 。 重组 修复 的 机 制 。 重组 修复 有 两 种 底 物 ; 双 链 断裂 和 单 链 缺 口 。 对 于 在 同 源 依赖 性 修 复 中 有 关 的 机 制 , 见 重组 中 的 图 25.3。 双 链 断 裂 可 以 通过 两 种 方式 修复 ,要 么 是 一 种 交 换 修复 ( 双 链 断 裂 修复 ) ,要 么 是 一 种 非 交换 修复 (合成 依赖 的 链 退 火 修复 ) ,后 者 出 现在 特 “2 化 的 系统 ,例如 了 因子 的 转 座 和 酵母 交配 型 的 转换 。 当 复制 在 一 处 非 指导 性 损伤 阻 断 时 可 以 产生 单 链 缺口 ,并 在 下 游 重新 启动 合成 ,在 损伤 模板 链 的 对 面 处 留 下 一 个 缺口 。 这 个 缺口 被 一 个 姐妹 双 链 的 同 源 区 域 所 填充 [ 称 子 链 缺 口 修复 (DSGR ) 或 复制 后 修复 (PRR) ] 。 利用 游离 的 ,互补 的 姐妹 双 链 作为 模板 可 对 有 缺口 的 子 链 进行 修复 合成 。 注 意 ,这 个 过 程 并 没有 实际 修复 模板 链 起 初 的 损伤 。 正 如 此 名 称 所 暗示 的 ,是 子 链 被 修复 了 ;起 初 的 损伤 仍 保留 在 基因 组 中 ,除非 通过 切除 去 掉 。DSGR 是 一 个 主要 的 损伤 耐 受 机 制 , 它 在 大 肠 杆 菌 中 作为 SOS 反应 (参阅 ) 的 一 部 分 被 诱导 。 14.8 SOS 反 应 和 诱 变 修 复 SOS 反应 的 调控 ”大肠 杆菌 的 SOS 反应 是 对 DNA 损伤 的 一 个 可 诱导 的 反应 , 它 导 致 DNA 修复 能 力 增加 ,细胞 分 裂 的 抑制 和 代谢 的 改变 。 该 反应 由 大 约 20 个 SOS 基因 ( 表 14.9) 的 活化 来 介 导 ,由 于 受到 LexA 阻 遏 物 的 转录 抑制 ,SOS 基因 在 正常 情况 下 以 低 水 平 表达 ,该 阻 过 物 结合 在 每 个 基因 上 游 的 操纵 子 序列 (SOS 框 )。LexA 对 不 同 操纵 子 有 不 同 的 亲 和 性 ,因而 SOS 基因 被 不 同 的 反应 半 值 所 诱导 ,这 些 冰 值 导致 当 只 有 部 分 SOS 反 应 被 活化 时 才 观 察 到 的 分 裂 表 型 (split phenotype) 现 象 。LezA 基因 自身 上 游 也 有 一 个 低 亲 和 性 的 SOS 框 ,因此 它 能 抑制 其 自身 合成 ,但 该 系统 是 渗 漏 的 ,此 有 利于 对 其 他 的 SOS 基因 充分 阻 遇 。 当 DNA 被 广泛 损伤 , 单 链 区 域 被 暴露 出 来 。 单 链 DNA 与 RecA 相 互 作 用 表 14.9 大 肠 杆菌 SOS 基因 和 它们 的 功能 SOS 基因 功能 dinB diz 基因 是 损伤 诱导 的 基因 ,它们 的 功能 还 需要 确认 dinD ainF aamC din 再 air anaN DNA 聚 台 酶 III 的 亚 基 LerA SOS 基因 的 阻 歇 物 77CAB DNA 代谢 zolB(dinA) DNA 聚合 酶 I recA (1) 剪 切 Lex A 以 利于 SOS 反应 (2) 重组 修复 所 必须 (3) 剪 切 UmuD 蛋白 并 且 … (4)… 在 损伤 处 组 装 UmuD2zC 复合 物 以 利于 倾向 差错 修复 重组 修复 DNA 解 旋 酶 ,与 重组 有 关 ruOAB 操纵 子 重组 修复 SULA 抑制 细胞 分 裂 UzzzxDC 操纵 子 SOS 专 一 性 的 错误 趋向 修复 MUrA 核 苷 酸 切 除 修复 UnurB 核 苷 酸 切除 修复 UnurD DNA 解 旋 酶 ,与 修复 有 关 "13 产生 一 个 叫 RecA* 的 活性 复合 物 , 它 通 过 增加 LexA 本 身 的 蛋白 水 解 率 来 帮助 切除 LexA 阻 遇 物 。 被 切割 的 LexA 蛋白 不 能 再 结合 到 DNA 上 , SOS 基因 被 解除 抑制 。 当 受 损 DNA 在 细胞 中 不 再 存在 ,RecA 失 活 ,不 再 有 利于 LexA 的 前 切 。 这 样 细胞 中 高 浓度 的 未 前 切 LexA 蛋白 从 现存 的 lexA mRNA 池 中 迅速 积蓄 ,而 lexA 基因 和 其 他 SOS 基因 被 关 闭 。 这 是 一 个 典型 的 负 反 馈 循环 。 SOS 诱 变 伴随 着 SOS 反应 ,DNA 修复 能 力 的 增加 部 分 由 于 涉及 核 苷 酸 切 离 和 重组 碱 基 的 修复 过 程 的 组 成 基因 的 上 调节 (xurA 和 vorB 一 但 不 是 vorC 一 一 具有 SOS 框 ， 就 像 rec4A 和 recN 那样 )。 在 这 两 种 机 制 都 是 精确 的 (无 差错 修复 ) ,同时 第 三 种 系统 ,其 只 在 SOS 反应 中 被 诱导 并 涉及 xxC , xzxuD 基因 ,增强 了 DNA 的 修复 ,但 也 导致 突变 发 生 ( 倾 向 差错 或 诱 变 修 复 )。 这 种 SOS 诱 变 在 突变 前 的 非 指导 性 损伤 处 特异 性 出 现 ,也 会 通过 忠实 性 降低 的 不 可 读 模板 链 合成 产生 ( 转 损伤 的 合成 )。UzzxDC 操纵 子 的 突变 ， 使 得 一 些 细胞 对 于 产生 复制 中 断 的 紫外 辐射 和 其 他 诱 变 剂 是 不 易 变 的 ,但 对 这 些 诱 变 剂 的 致死 作用 更 加 敏感 ,这 与 转 损伤 合成 能 力 的 丢失 是 相称 的 。 这 些 突变 体 仍 然 对 产生 复 制 中 断 ,导致 碱 基 错 配 的 诱 变 剂 敏感 。 转 损伤 合成 的 精确 机 制 还 不 清楚 ;UmuDC 蛋白 可 能 与 DNA 聚合 酶 下 相互 作用 并 降 低 其 选择 性 和 (或 ) 校 对 能 力 。 依 赖 UmuDC 的 倾向 差错 修复 在 一 般 情 况 下 被 强烈 阻 过 ， 因为 其 活化 的 三 个 步骤 都 需要 RecA* 蛋白 。 (1) RecA ”前 切 LexA 阻 遇 物 来 恢复 wzzxDC 的 转录 。 (2) RecA 剪 切 UmuD( 一 个 无 活性 前 体 ) 来 产生 活性 UmuD' (未 剪 切 的 UmuD 不 仅 在 倾向 差错 修复 中 无 活性 ,而且 通 过 将 UmuD' 束 缚 在 无 活性 异 源 二 聚 体 的 状态 来 抑制 倾 向 差错 修复 )。 (3) RecA* 可 能 有 助 于 将 UmuD'2>UmuC 蛋白 复合 物 定 位 于 损伤 处 。 SOS 反应 对 哄 菌 体 感染 的 影响 ”一 些 病 毒 具 有 对 宿主 细胞 指导 性 损伤 的 机 制 ,并 利用 RecA 系统 。 活 化 的 RecA ”复合 物 诱导 剪 切 ,不 仅仅 是 LexA 和 UmuD, 还 有 只 菌 体 入 的 CI 阻 遏 蛋 白 ,因为 这 三 种 蛋白 都 具有 一 个 共同 的 自我 蛋白 水 解 基 序 。CI 抑制 蛋白 负责 维持 溶 原 化 , 它 的 失 活 预 示 着 裂解 周期 的 到 来 ( 见 第 30 章 病 毒 , 文 框 30.1)。 这 样 ,通过 例如 紫外 辐射 方法 激发 SOS 反应 诱导 入 原 鸣 菌 体 的 切 离 。 诱 导入 所 必须 的 DNA 损伤 水 平 要 比 引 发 SOS 反应 所 需要 的 高 得 多 , 这 是 因为 CI 阻 遏 蛋白 对 RecA* 的 敏感 性 相对 低 一 些 。 基 因 组 受 损 的 喉 菌 体 被 引入 宿主 细胞 后 一 般 存 活 率 较 低 。 然 而 ,如 果 宿 主 在 被 感 染 前 被 紫外 辐射 过 , 喉 菌 体能 存活 。 这 种 现象 , 称 Weigle 复活 (W- 复活 ) ,伴随 着 一 个 更 高 的 喉 菌 体 突变 频率 (Weigle 诱 变 ) 并 反映 了 SOS 反应 的 诱导 导致 对 鸣 菌 体 基 因 组 的 迅 速 修复 ,其 中 一 些 是 依赖 UmuDC 的 倾向 差错 修复 。 其 他 物种 的 趋向 错误 的 修复 ” 除 大 肠 杆菌 外 , 像 SOS 那样 的 倾向 差错 修复 很 少 在 细菌 中 发 现 ,因此 大 多 数 细菌 对 紫外 诱导 的 诱 变 有 抗 性 , 尽管 更 容易 被 杀 死 。 功 能 上 和 w722C , 722UD 同 源 的 基因 在 几 种 接合 型 质粒 中 发 现 。 也 有 一 些 有 限 的 证 据 证 明 真 核 生 物 中 有 诱 变 修复 。 〈《 张 颁 文 译 ) 第 15 章 突变 与 选择 基本 概念 与 定义 突变 (mutation) :在 基因 组 的 某 一 特定 区 域 核 苷 酸 序列 发 生 改 变 而 引起 的 基因 型 稳 定 的 可 遗传 的 改变 [参见 外 突变 (epimutation), 副 突变 (paramutation)]。 带 有 某 一 特定 突变 基因 的 基因 组 ,细胞 或 个 体 被 称 为 突变 体 (mutant) 。 突变 可 能 是 局 部 的 ( 即 影响 单个 核 苷 酸 或 一 小 复核 苷 酸 ) ,也 可 能 包括 基因 的 大 片 断 。 在 前 一 种 情况 中 ,所 谓 的 基因 突变 (gene mutation) 发 生 在 某 一 基因 内 部 ,会 影 响 基 因 产 物 的 性 质 或 干扰 其 表达 ,而 基因 外 突变 (extragenic mutation) 往往 不 产生 效应 (除非 它们 破坏 了 调控 元 件 )。 大 范围 的 突变 可 能 涉及 几 十 到 上 千 个 核 苷 酸 ， 影响 整个 基因 或 一 组 基因 。 在 真 核 生 物 中 ,最 大 的 突变 在 细胞 遗传 学 水 平 上 是 可 见 的 ,并 被 称 为 染色 体 突 变 ( 参 见 第 4 章 染 色 体 突变 )。 基因 突变 使 一 个 基因 的 等 位 形式 变 成 了 另 一 种 。 对 许多 基因 座 而 言 , 野 生 型 等 位 基因 在 群体 中 占 优 势 。 这 是 因为 这 样 体现 了 最 大 的 适合 度 (fitness)( 指 生存 与 繁殖 的 能 力 )。 这 种 基因 往往 编码 正常 的 功能 性 产物 ,此 野生 型 表 型 (wild-type pheno- type) 反 映 了 正常 的 基因 活性 。 另 外 ,少数 等 位 基因 由 突变 型 等 位 基因 (mutant alle- les) 所 主导 ,那么 编码 的 产物 的 量 和 /或 结构 性 质 可 能 会 不 同 , 从 而 产生 不 同 的 突变 体 表 型 (mutant phenotypes) 。 偏 离 野 生 型 的 基因 突变 大 部 分 是 有 害 的 或 是 选择 中 性 的 ,只 有 极 少数 是 有 益 的 。 除了 单一 的 野生 型 等 位 基因 ,在 一 群体 中 可 能 存在 着 几 种 相同 的 适合 度 的 等 位 基 因 相 互 平 衡 。 那 么 这 个 基因 座 被 称 为 多 态 性 (polymorphic) 的。 如 群体 已 处 于 一 新 发 生 的 有 益 突 变 的 过 渡 状 态 ,或 如 存在 对 多 个 等 位 位 点 的 平衡 性 选择 ,多 态 现象 也 可 能 涉及 到 不 同 适合 度 的 多 个 等 位 基因 。 存 在 着 多 种 不 同 的 力量 保持 或 改变 一 群 体 中 等 位 基因 的 发 生 频率 ,如 突变 压力 `. 迁 移 、 随 机 遗传 漂 变 及 自然 选择 。 自 然 选 择 排 除了 适合 度 降 低 的 等 位 基因 。 所 以 能 存活 的 突变 的 突变 范围 与 位 点 具有 明显 的 偏向 ,导致 功能 上 重要 的 DNA 序列 是 进化 保守 的 。 在 某 一 环境 中 有 害 或 中 性 的 等 位 基因 在 另 一 环境 中 可 能 是 有 益 的 ,或 者 有 赖 于 它 在 群体 中 的 发 生 频 率 。 在 现 代 群 体 某 一 基因 座位 的 野生 型 等 位 基因 可 能 在 进化 史 的 早期 曾 是 一 非常 稀少 的 突 变 等 位 基因 。 单 细 胞 生物 将 新 发 生 的 突变 传递 给 所 有 接受 其 染色 体 的 后 代 。 但 在 多 细胞 生物 中 ,突变 可 能 发 生 在 生殖 系统 (形成 的 配子 的 组 织 ) 或 躯体 组 织 中 。 只 有 生殖 或 生 了 。 殖 系统 突 变 (germinal or gerline mutation) 方 可 传递 给 后 代 。 体 细胞 突变 (somatic mutation) 无 法 传递 给 后 代 , 除 非 能 用 体 细胞 进行 克隆 。 在 后 一 情况 下 ,根据 体 细 胞 突变 发 生 的 时 间 和 位 置 不 同 , 可 能 只 影响 单个 细胞 ,在 一 野生 型 的 背景 下 产生 一 突 变 细胞 的 克隆 。 或 者 如 果 体 细胞 突变 在 发 育 早期 发 生 , 可 能 产生 一 崇 合 体 (参阅 )。 影响 生长 控制 基因 的 体 细 胞 突变 可 能 引发 癌症 (参见 第 18 章 瘤 基 因 与 癌 )。 15.1 突变 的 结构 与 功能 性 效应 突变 的 结构 分 类 根据 突变 涉及 的 DNA 序列 性 质 与 数量 的 不 同 , 可 以 分 为 四 个 结构 类 别 。 这 四 类 突变 由 不 同 机 制 引 起 且 具 不 同 的 效应 。 点 突变 发 生 于 单个 位 点 并 涉及 少数 几 个 核 苷 酸 残 基 。 如 核 苷 酸 发 生 在 一 基因 内 部 ( 见 表 15.2) ,产生 的 效应 依赖 于 所 编码 的 多 肽 链 的 表达 情况 与 结构 的 改变 ,可 能 是 中 性 的 ,也 可 能 具 很 大 的 危害 。 基 因 外 的 点 突变 往往 是 中 性 的 ,但 它们 如 果 发 生 在 调节 元 件 中 可 能 改变 基因 表达 的 水 平 与 时 相 。 复杂 突变 比较 少见 。 它 们 由 一 秘 点 突变 组 成 。 一 般 反 映 了 同 源 重 组 时 在 异 源 双 链 DNA 中 发 生 的 基因 转变 (gene conversion, 参 阅 ) ,它们 可 能 与 DNA 修复 相 联系 ,也 可 能 与 修复 关系 不 大 。 重 组 序列 可 能 是 等 位 的 (经 典 基 因 转 变 ) ,也 可 能 是 非 等 位 的 (常常 包括 同 ， 向 与 反 向 的 重复 序列 )。 后 者 可 能 导致 协同 演化 (converted evolution ,参阅 )。 大 突变 是 染色 体 结构 上 的 突变 一 一 大 的 缺失 ,插入 或 重 排 ,其 中 最 天 的 在 细胞 遗传 学 水 平 上 可 见 。 它 们 往往 导致 基因 的 破坏 或 丢失 ,并且 有 时 引起 基因 融合 效应 ,位 置 效应 或 基因 剂量 效应 ( 见 表 15.3)。 染色 体 不 平衡 是 染色 体 数 量 上 的 突变 一 一 整 条 染色 体 或 偶尔 整套 染色 体 的 缺失 或 增 加 。 染 色 体 不 平衡 引起 多 个 基因 的 剂量 效应 ,在 哺乳 动物 中 往往 是 致命 的 。 突变 的 功能 效应 一 一 一 般 原理 ”很 多 突变 不 引起 表 型 的 变化 。 因 为 突变 位 点 (muta- tion site, 基 因 组 内 突变 发 生 的 位 置 ) 不 影响 基因 的 功能 和 表达 或 更 高 级 别 的 基因 功能 (如 DNA 复制 ,有 丝 分 裂 分 离 )。 这 一 类 突变 被 描绘 为 选择 性 中 性 ,因为 它 不 影响 个 体 的 达尔 文 适 合 度 ,它们 中 包括 很 多 基因 外 突变 。 很 多 能 产生 表 型 改变 效应 的 突变 发 生 在 基因 或 能 控制 这 些 基 因 的 调控 元 件 内 部 。 这 种 突变 的 靶 序列 有 三 种 :基因 的 编码 区 域 ; 位 于 转录 单元 内 的 非 编码 序列 ;或 转录 单元 外 的 调控 序列 。 很 多 位 于 基因 内 部 的 点 突变 是 中 性 的 ,这 是 因为 它们 没有 改变 编码 产物 的 结构 或 表 达 情 况 ( 见 表 15.2)。 而 那些 改变 了 其 编码 产物 的 结构 或 表达 情况 的 点 突变 往往 是 有 害 的 或 是 中 性 的 一 一 其 中 很 少 是 有 益 的 ,这 取决 于 多 肽 链 结构 的 选择 性 约束 与 多 肽 链 的 功 能 环境 (参见 自然 选择 ,分子 钟 ) 。 在 基因 内 部 发 生 的 或 涉及 几 个 基因 的 染色 体 变 异 往往 是 有 害 的 ,因为 它们 引起 了 较 大 的 破坏 (参见 表 15.3)。 对 非 正 常 的 血红 蛋白 的 研究 为 很 多 不 同类 型 突变 的 效应 提供 了 例子 ( 文 框 15.1)。 TO 表 15$.1 突变 的 类 别 与 起 因 点 突变 (point mutation)( 简 单 突 变 , 单 位 点 突变 ) 定义 :单个 位 点 的 突变 ,涉及 单个 残 基 或 少量 残 基 。 碱 基 蔡 代 (base subsitutions) 是 点 突变 的 一 种 ,序列 中 的 某 一 碱 基 被 另 一 种 碱 基 蔡 换 :转换 (transitions) 指 一 种 味 叭 被 另 一 种 味 叭 所 替换 ,或 一 种 喀 啶 被 另 一 种 喀 啶 所 替换 ; 颠 换 (transversions) 指 一 种 味 叭 被 一 种 喀 啶 所 替换 或 反之 。 小 的 插入 与 缺失 (small insertions and deletions)( 小 于 $ nt) 也 可 被 认为 是 点 突变 。 碱 基 蔡 换 的 起 因 ( 插 人 与 缺失 的 起 因 见 下 文 ) (1) DNA 聚合 酶 的 自发 错误 。 (2) 复制 模板 含有 单个 碱 基 的 误导 。 如 碱 基 受 损 或 含有 不 恰当 的 碱 基 , 碱 基 类 似 物 ,或 罕见 的 互 变异 构 体 (参阅 )。 (3) 复制 模板 含有 一 单个 碱 基 的 非 指 导 性 损伤 。 如 含有 一 个 AP 位 点 (参见 A 规 则 )。 (4) 5- 甲 基 胞 喀 喧 脱 氨 基 变 成 胸腺 喀 啶 。 (5) 异 源 双 链 DNA 的 错 配 修复 。 进一步 的 讨论 , 见 突变 发 生 与 DNA 修复 。 效应 :依赖 位 点 一 一 见 表 15.2。 复合 突变 (complex mutation)( 多 点 突变 ) 定义 : 几 个 不 连续 的 点 突变 形成 的 簇 。 起 因 : (1) 异 源 双 链 DNA 的 错 配 修复 (或 是 等 位 基因 的 转变 或 非 等 位 基因 的 ,包括 重复 DNA)。 (2) 低 忠实 度 的 DNA 聚合 酶 的 活性 (如 反 转 录 酶 )。 (3)SOS 反 应 中 的 倾向 差错 的 修复 (参阅 )。 效应 :如 点 突变 一 一 见 表 15.2。 染色 体 变 异 (macromutation ) 定义 :在 单位 点 上 发 生 ,但 影响 很 多 连续 的 核 苷 酸 残 基 。 最 大 的 大 突变 可 以 在 细胞 遗传 学 的 水 平 上 观察 到 。 涉 及 DNA 技 失 的 突变 被 称 为 缺失 (deletions) 与 缺损 (deficiencies)。 涉 及 DNA 增 多 的 突变 被 称 为 插入 (insertions) 或 添加 . (additions) [然而 ,如 果 揪 和 人 的 部 分 是 基因 组 的 成 分 ,这 种 突变 可 称 为 重复 (duplications) ,如 果 插 人 的 部 分 是 串联 重 复 的 一 部 分 ,那么 可 称 为 扩 增 (amplifications) 或 重复 扩展 (repeat expansions) ]。 蔡 代 (substitutions) 是 指 DNA 序列 的 一 部 分 被 等 量 的 新 的 信息 所 取代 的 突变 。 重 排 (rearrangments) 涉 及 遗传 物质 的 重新 组 织 ,但 不 包括 丢失 与 增加 。 重 排 包括 倒 位 (inversions) , 指 DNA 的 片断 的 方向 颠倒 , 易 位 (translocations) 指 DNA 片断 从 基因 组 的 某 一 位 置 转移 到 另 一 位 置 ; 共 合 (cointegrations) 或 融合 (fusions) 是 指 两 个 染色 体 共 价 连接 ,或 是 线性 的 染色 体 被 环 化 。 起 因 ， (1) 染色 体 断 裂 或 随机 的 重 接 。 (2) 非 等 位 基因 序列 的 同 源 重组 :如 不 等 交换 或 不 等 姐妹 染色 单 体 交换 ,或 分 散 的 重复 顺序 之 间 的 重组 。 (3) 位 点 特异 的 重组 。 (4) 可 移动 的 遗传 因子 的 活性 。 (5) 串联 重复 序列 的 复制 中 模板 或 引物 链 发 生 跳 格 (仅仅 引发 缺失 和 插入 )。 (6) 反 向 重复 序列 的 复制 时 ,模板 或 引物 产生 稳定 的 二 级 结构 (仅仅 引发 缺失 和 插入 )。 (7) 不 平衡 的 减 数 分 裂 过 程 , 涉 及 结构 重 排 的 染色 体 (仅仅 引发 缺失 和 插 人 )。 (8) 进一步 的 讨论 , 见 第 4 章 染色 体 突变 ,并 参见 非 正 常 重组 。 效应 :依赖 于 突变 的 位 点 与 大 小 一 一 见 表 15.3。 染色 体 不 平衡 (chromosome imbalance) 定义 :染色 体 数 目的 异常 。 由 于 整个 染色 体 的 失去 或 获得 ( 非 整数 倍 性 ,aneuploidy) 或 整套 染色 体 的 失去 或 获得 (多 们 性 ,polyploidy) 而 引起 的 缺失 或 添加 。 起 因 (1) 额外 的 DNA 复制 或 缺乏 DNA 复制 。 (2) 额外 的 减 数 分 裂 上 有 丝 分 裂 或 不 发 生 减 数 分 裂 / 有 丝 分裂。 (3) 染色 体 分 离 失 败 (往往 由 于 事先 存在 的 结构 异常 )。 (4) 涉及 不 平衡 ( 非 整数 倍 ) 配 子 的 受精 过 程 。 进一步 的 讨论 , 见 染色 体 突 变 。 效应 :多 基因 的 剂量 效应 一 一 见 表 15.3。 “SS1， 表 15.2 点 突变 对 多 肽 链 结构 与 基因 表达 的 影响 突变 的 位 置 与 类 别 位 点 :编码 区 域 沉默 突变 或 同 义 突变 错 义 突变 无 义 突变 通读 突变 移 码 突变 非 移 码 插 人 /缺失 位 点 :基因 内 非 编码 区 域 内 含 子 9 定义 及 效应 定义 :不 影响 密码 子 含义 的 碱 基 替换 ,因而 对 多 肽 链 结构 没 有 影响 。 沉 默 突变 的 发 生 是 由 于 遗传 密码 的 简 并 性 (参阅 )。 例 如 :ATT 突变 为 ATC, 两 者 都 编码 异 亮 氨 酸 。 效应 : 同 义 突变 一 般 为 中 性 。 它 们 在 下 面 的 情况 下 会 影响 表 型 ,(1) 由 于 某 一 种 tRNA 非常 稀少 而 造成 的 密码 子 偏 倚 性 (参阅 );(2) 突变 破坏 了 一 个 内 在 的 调控 元 件 ; (3) 突变 恰好 产生 了 一 个 隐秘 的 前 切 位 点 。 定义 :改变 密码 子 含义 的 碱 基 蔡 换 。 导 致 编码 的 多 肽 链 中 某 一 个 氨基 酸 残 基 被 另 一 种 氨基 酸 所 取代 。 如 果 新 的 氨基 酸 具 有 与 原来 的 氨基 酸 同 样 的 化 学 性 质 ,这 个 错 义 突 变 是 保守 (conservative) 的 。 如 果 原 来 的 氨基 酸 被 具有 不 同化 学 性 质 的 氨基 酸 所 取 代 , 错 义 突变 是 非 保 守 (nonconservative) 的 。 例 如 :AAG 突变 为 GAG, 编码 的 氨基 酸 由 亮 氨 酸 变 成 谷 氨 酸 。 效应 :一 个 错 义 突变 的 影响 取决 于 它 是 保守 的 抑或 非 保守 的 ,还 取决 于 被 替换 的 残 基 在 多 肽 链 功能 中 的 重要 程度 。 保 守 的 替换 一 般 是 中 性 的 ,除非 突变 发 生 在 一 个 关键 的 残 基 ( 如 酶 的 活性 位 点 ) ,而 非 保守 的 替换 一 般 会 破坏 多 肽 链 的 结构 和 / 尸 改变 多 肽 链 的 性 质 , 从 而 产生 罕 变 的 表 型 。 有 些 错 义 突变 的 影响 十 分 微妙 ,可 能 只 在 一 定 的 环境 条 件 下 (如 高 温 ) 表 现 出 来 (参见 条 件 突 变型 )。 定义 :将 一 有 意义 的 密码 子 改变 成 无 义 密码 子 (终止 密码 子 ) 的 碱 基 蔡 换 。 根 据 突变 产 生 的 无 义 密 码 子 类 型 可 分 成 琥珀 突变 体 (amber mutation) ,乳白 突变 体 (opal muta- tion) 和 赭石 突变 体 (ochre mutation)。 例 如 :TGC( 亮 氨 酸 ) 突 变 为 TGA( 终 止 密码 三 居 时 效应 :无 义 突变 造成 蛋白 质 合 成 的 提前 终止 ,产生 不 完整 的 蛋白 质 。 突 变 效应 的 严重 性 由 突变 在 编码 区 的 位 置 决定 。5 无 义 突变 导致 产生 很 不 完整 的 多 肽 链 ,引起 多 肽 链 功能 的 丧失 。3 无 义 突变 可 能 对 编码 多 肽 链 的 结构 影响 不 大 ,但 可 能 影响 mRNA 的 稳定 性 。 在 真 核 基因 中 的 无 义 突变 偶尔 会 在 前 切中 引起 外 显 子 忠 路 (参阅 )。 定义 :将 无 义 密码 子 转变 为 一 有 意义 的 密码 子 ,造成 通读 , 使 多 肽 链 延 长 的 碱 基 替 换 。 例如 :TAG( 终 止 密码 子 ) 突 变 为 CAG( 谷 氨 酰 氮 ) 效应 : 连 读 突 变 可 能 影响 多 肽 链 的 性 质 和 mRNA 的 稳定 性 。 一 般 情 况 下 ,多肽 链 不 会 延长 太 多 ,因为 在 天 然 的 终止 密码 子 的 下 游 有 不 定位 置 的 终止 密码 子 。 定义 :一 较 短 的 3 + 1 个 核 背 酸 的 插 人 与 缺失 ,使 阅读 框 发 生变 化 ,突变 远 端 产生 的 新 的 多 肽 链 序列 。 效应 :与 无 义 突变 类 似 。 移 码 突变 的 影响 取决 于 它 的 位 置 。5 “突变 的 后 果 比 3 “突变 要 严重 。 大 部 分 开放 阅读 框 有 读 框 外 (out-of-frame) 的 终止 密码 子 , 所 以 移 码 突变 往往 造成 蛋白 质 合 成 的 提前 终止 ,产生 不 完整 的 多 肽 链 。 另 见 共 翻译 移 码 。 定义 :一 较 短 的 3” 个 核 苷 酸 的 插 人 与 缺失 。(indel 是 插 人 或 缺失 的 统称 ) 效应 :这 类 突变 不 破坏 阅读 框 ,往往 是 可 以 容忍 的 。 但 关键 残 基 的 缺失 或 被 隔 开 可 能 会 使 基因 丧失 功能 。 效应 :内 含 子 中 的 点 突变 一 般 是 中 性 的 。 它 们 在 下 面 的 情况 下 会 影响 表 型 (1 突变 破坏 了 一 个 内 含 的 调控 元 件 如 增强 子 ;(2) 突变 破坏 了 一 前 切 位 点 (无 法 进行 剪 切 并 造成 与 内 含 子 的 连 读 ,往往 引起 中 断 , 有 时 会 发 生 外 显 子 跳跃 ); (3) 突变 位 点 产生 一 个 隐秘 的 前 切 位 点 ,使 内 含 子 的 顺序 包含 在 成 熟 的 转录 本 中 (一 般 会 由 于 内 含 子 中 的 终止 密码 子 或 是 移 码 产生 的 读 框 外 的 终止 密码 子 而 造成 多 肽 链 中 断 )。 续 表 15.2 非 翻译 区 域 效应 :很 多 非 翻 译 区 突变 是 中 性 的 。 但 在 有 些 情 况 下 ,突变 可 以 通过 影响 蛋白 质 合成 ， RNA 稳定 性 或 RNA 转移 来 影响 转录 后 调节 。 多 聚 腺 味 叭 往往 是 有 害 的 ,因为 破坏 了 转录 后 过 程 。 位 点 :基因 外 调节 元 件 ; 效应 :大 部 分 基因 外 突变 是 中 性 的 。 但 影响 了 转录 调控 元 件 如 启动 子 或 增强 子 的 突变 可 能 会 破坏 或 影响 转录 过 程 。 在 增强 子 中 的 突变 对 串联 基因 复制 (参阅 ) 的 表达 图 谱 的 多 样 化 很 重要 。 表 15.3 染色 体 变 异 与 染色 体 不 平衡 对 基因 结构 ,表达 与 功能 的 影响 数 色 体 变 异 的 物理 效应 ”功能 效应 整个 基因 缺失 基因 功能 丧失 。 效 果 取决 于 此 位 点 的 剂量 敏感 程度 (参见 单 倍 不 满足 性 ,haploinsu 仁 - ciency)。 可 能 是 一 较 大 范围 的 缺失 的 一 部 分 ,导致 一 连续 的 基因 综合 症 (人 参阅) 部 分 缺失 ( 平 截 ) 效应 取决 于 缺失 程度 。 较 大 程度 的 平 截 使 基因 功能 丧失 。 不 太 严 重 的 平 截 可 能 会 产 生 具 有 新 功能 的 产物 。 如 verz 瘤 基 因 ( 见 第 18 章 瘤 基 因 与 瘤 )。 部 分 缺失 (内 部 缺失 ) 效应 取决 于 缺失 程度 。 较 大 程度 的 缺失 使 基因 功能 丧失 。 较 小 程度 的 外 显 子 的 缺失 可 能 会 产生 一 个 改变 的 产物 ,但 阅读 框 的 移动 一 般 会 导致 提前 终止 和 不 稳定 。 在 真 核 生 物 中 ,内 含 子 的 缺失 一 般 是 中 性 的 ,除非 调控 元 件 被 改变 了 。 整个 基因 重复 (基因 扩 增 ) 提高 基因 产物 的 水 平 。 效 应 依赖 于 突变 位 点 的 剂量 敏感 程度 。 对 很 多 基因 来 说 , 扩 增 没有 什么 影响 ,在 一 定 的 环境 中 可 能 还 有 益处 (参见 基因 扩 增 )。 另 一 些 基因 是 剂量 敏感 的 ,因为 它们 的 产物 需要 与 另外 的 基因 的 产物 定量 作用 。( 参 见 正文 中 的 剂量 效应 ) 部 分 重复 (内 部 ) 效应 取决 于 重复 的 程度 与 拷贝 数目 。 外 显 子 的 重复 可 能 会 改变 多 肽 链 的 功能 。 更 小 的 重复 (外 显 子 内 的 重复 ) 往 往 是 有 害 的 ,因为 它们 改变 了 读 框 并 且 产 生 中 断 的 不 稳 定 的 蛋白 质 。 在 一 些 人 类 疾病 基因 中 发 生 基 因 内 的 串联 的 三 核 苷 酸 重复 的 延伸 。 ( 文 框 15.2) 缺失 / 重 排 / 竹 入 造成 的 ”被 平 截 的 基因 一 般 失 去 功能 。 偶 尔 ,一 个 融合 基因 可 能 会 具有 新 的 性 质 ( 见 正 文 )。 破坏 如 果 一 个 基因 受 异 源 调节 ,那么 可 能 存在 位 置 效应 ( 见 正文 )。 染色 体 丢失 或 获得 改变 很 多 基因 产物 的 剂量 ,往往 导致 严重 的 多 剂量 效应 ( 见 第 4 章 染 色 体 突变 )。 整个 基因 组 的 复制 改变 了 所 有 基因 的 剂量 。 在 植物 中 有 很 大 的 耐 受 性 。 但 在 较 高 级 的 动物 中 ,由 于 性 染 色 体 的 剂量 与 印迹 基因 的 剂量 在 发 育 中 起 很 重要 的 作用 ,这 种 突变 的 耐 受 性 很 差 (参见 多 倍 体 , 亲 代 标 记 )。 不 论 一 种 突变 本 身 会 引起 何 种 效应 ,这 种 效应 是 否 反映 到 表 型 的 水 平 取决 于 另外 的 几 种 因素 。 (1) 显 性 :在 二 倍 体 中 ,突变 体 等 位 基因 相对 于 野生 型 等 位 基因 是 隐 性 的 , 它 的 影响 在 杂 合子 中 不 会 表现 出 来 。 (2) 咕 传 背景 与 环境 : 突变 等 位 基因 的 效应 受到 非 等 位 基因 的 相互 作用 (如 丰 余 基 因 , 外 抑制 基因 的 突变 ) 或 环境 因素 (如 互 养 ) 的 补偿 ,即使 在 纯 合 状态 下 也 不 会 显示 出 来 。 (3) 镶 炭 性 :在 多 细胞 生物 中 , 体 细胞 突变 的 效应 取决 于 突变 细胞 的 所 占 比例 与 分 89 >， 布 。 (4) 单个 等 位 基因 表达 :在 哺乳 动物 中 ,印迹 (imprinted) 基 因 及 非 活化 X- 染色 体 上 的 基因 (在 雌性 个 体 中 ) 是 外 遗传 抑制 的 。 因 此 一 种 突变 的 效应 取决 于 它 的 亲 代 来 源 及 包 含 特异 的 非 活化 的 X- 染色 体 的 细胞 克隆 的 分 布 ( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 及 外 遗传 调 节 )。 点 突变 的 功能 性 效应 ”大 部 分 产生 病理 性 效应 的 点 突变 是 发 生 在 基因 编码 区 并 且 是 非 同 义 的 ( 表 15.2)。 这 些 突变 可 能 通过 蔡 换 单个 氨基 酸 引起 多 肽 链 结构 的 特异 的 局 部 改 变 ( 错 义 突变 ) ,也 可 能 涉及 更 多 氨基 酸 引起 更 严重 的 改变 (无 义 突变 , 移 码 突变 或 连 读 突 变 )( 图 15.1)。 同 义 突变 往往 是 中 性 的 ,但 也 可 能 通过 偶然 改变 基因 的 表达 情况 来 影响 表 型 ,如 产生 一 隐秘 的 前 切 位 点 。 在 非 编码 的 转录 序列 中 发 生 的 有 害 的 点 突变 往往 可 以 用 于 辨 明 功 能 性 重要 的 基 序 如 调控 元 件 或 剪 切 位 点 。 基 因 外 侧 的 点 突变 可 以 通过 产生 或 消除 启动 子 和 增强 子 与 转录 因子 的 结合 位 点 或 改变 它们 的 空间 关系 来 改变 启动 子 和 增强 子 的 功能 。 THE CAT SAW THE DOG AND RAN (END) 野生 型 THE CAT SAW THE DOG AND MAN (END) 销 义 THE CAT SAW THE DOG END 无 义 THE CAT SAW THE DOG AND RAN AND...…... 通读 THE CAT TSA WTH EDO GAN DRA NEN D...…. .， 移 码 THE CAT SAW THE BIG DOG AND RAN (END) 非 移 码 插 和 人 /缺失 图 15.1 编码 区 域 的 点 突变 及 其 对 遗传 信息 的 解释 的 影响 。 每 三 个 字母 ( 核 苷 酸 ) 形 成 一 个 词 ( 密 码 子 ) ,在 一 个 句子 (多 肽 链 ) 中 传递 一 定 的 意义 。 不 同类 型 的 点 突变 以 不 同方 式 破坏 整个 句子 。 在 多 肽 链 的 开始 部 分 发 生 的 无 义 与 移 码 突变 具有 最 大 的 潜在 的 危害 。 在 图 中 的 例子 中 ,无 义 突变 发 生 在 天 然 态 的 密码 子 附近 ,大 部 分 信息 的 意义 得 以 保留 。 反 之 , 移 码 突变 发 生 在 句子 的 开端 ,大 部 分 意义 丢失 了 。 点 突变 往往 只 影响 单个 基因 。 但 如 果 突 变 发 生 在 处 于 控制 地 位 的 调控 元 件 , 如 启动 子 , 细 菌 操纵 子 ( 参 阅 ) 中 的 操纵 基因 位 点 和 真 核 生物 中 的 基因 座 控制 区 (参阅 ) ,产生 的 后 果 可 能 会 是 显著 的 。 操 纵 子 结构 基因 中 的 突变 偶尔 可 能 通过 破坏 多 顺 反 子 mRNA 的 蛋 白质 合成 来 影响 多 个 下 游 基因 的 表达 (参见 极 性 突变 )。 染色 体 变异 的 功能 性 效应 染色 体 变 异 与 染色 体 不 平衡 较 之 点 突变 效果 更 为 严重 , 因 为 它们 牵涉 到 更 多 数量 的 DNA( 表 15.3)。 缺 失 与 重复 可 能 同时 涉及 基因 的 部 分 ,整个 基因 与 多 个 基因 。 基 因 部 分 缺失 , 插 人 (如 转 座 因 子 的 插 和 人 ) 及 重复 往往 引起 移 码 ,从 而 造 成 序列 的 丢失 与 获得 ,导致 非 正常 与 不 稳定 的 蛋白 质 的 产生 ,这 种 蛋白 质 会 被 逐渐 降解 。 在 真 核 生物 中 ,即使 一 分 离 外 显 子 的 缺失 / 揪 人 也 很 可 能 导致 上 述 效 应 ,因为 在 同一 基因 中 不 同 外 显 子 的 边界 并 不 一 定 与 读 码 框 相 关 ( 参 见 外 显 子 缺失 ,外 显 子 重复 )。 基因 破坏 (gene disruption) 一 般 会 导致 功能 的 丧失 。 染 色 体 变异 与 之 相似 ,可 以 通过 几 种 不 同 的 途径 来 改变 表 型 。 基 因 了 融合 效应 (gene fusion effects) 指 由 于 缺失 重复 、 倒 位 和 易 位 使 得 两 个 基因 被 打 断 并 旦 使 分 离 的 元 件 合 在 一 起 。 如 果 融 合 中 保持 了 同一 阅读 框 架 , 这 个 基因 可 以 表达 并 产生 出 一 个 具有 新 的 性 质 的 杂种 基因 产物 (例如 并 参见 伯 基 特 淋 190 下 巴 瘤 ,肯尼亚 血红 蛋白 )。 缺 失 和 重复 还 可 能 引起 剂量 效应 (dosage effects) , 指 改变 细胞 内 基因 的 拷贝 数 而 引起 的 病理 效应 。 基 因 拷 贝 数 改 变 在 某 些 位 点 可 能 是 无 害 的 甚至 是 有 益 的 (参见 基因 扩 增 ) ,但 如 果 细 胞 要 求 正 常数 量 的 基因 产生 正常 数量 的 产物 以 维持 与 其 他 基因 产物 的 竞争 性 平衡 ,那么 拷贝 数 改变 就 可 能 引起 有 害 的 剂量 效应 。 例 如 形成 多 聚 体 蛋白 质 要 求 多 肽 链 的 化 学 计量 (如 血红 蛋白 中 的 o,B 球 蛋白 , 见 文 框 15. 1) ,或 是 微妙 平衡 的 调控 系统 中 如 果 蝇 性 别 决定 (参阅 ) 的 控制 。 另 外 ,依赖 数量 调节 的 调控 系统 也 是 剂量 敏感 的 一 一 如 很 多 细胞 信号 途径 ( 见 原 癌 基因 与 癌症 ) 。 染 色 体 不 平衡 同时 影响 了 很 多 基因 的 剂量 。 这 种 突变 产生 最 严重 的 剂量 效应 ( 另 参见 性 染色 体 非 整 倍 性 ,剂量 补偿 机 制 )。 最 后 , 倒 位 、 易 位 和 大 的 缺失 可 能 使 一 个 基因 处 于 非 正 常 的 调控 环境 中 如 处 于 一 异 源 增 强 子 的 控制 之 下 或 进入 一 非 活化 的 异 染 色 质 而 失去 功能 。 由 于 这 种 顺 式 作用 的 位 置 效应 (position effect) ,基因 表达 的 方式 与 水 平 可 能 被 改变 。 涉及 重复 DNA 的 突变 随机 的 染色 体 断 裂 与 未 端 连接 发 生 的 错误 修复 可 能 会 引起 缺 失 , 插 人 和 重 排 。 但 重复 DNA 往往 归 因 于 染色 体 变 异 。 重 复 DNA( 参 阅 ) 可 由 几 种 途径 产生 [例如 重复 性 转 座 , 姐 妹 染 色 单 体 的 断裂 与 重 连接 ,期 外 复制 (unscheduled replica- tion) ] ,一 旦 发 生 , 它 可 以 作为 非 等 位 同 源 结 构 域 ,通过 链 跳 格 发 生 非 正 常 同 源 重 组 及 非 正常 DNA 复制 。 在 大 的 同 向 重复 单元 中 ,如 在 珠 蛋 白 基因 秘 中 染色 体 可 能 出 现 错误 排列 ,使 非 等 位 重 复 序 列 间 发 生 同 源 重组 。 这 种 重组 可 能 是 同一 染色 体 的 姐妹 染色 单 体 之 间 的 (姐妹 染色 单 体 不 等 交换 ,unequal sister chromatid exchange) ,也 可 能 在 同 源 染 色 体 之 间 ( 不 等 交换 ， unequal crossover) 。 在 任何 一 种 情况 下 ,都 会 导致 重组 一 方 的 缺失 和 重组 , 另 一 方 的 序列 插入 ,但 不 对 称 交换 还 涉及 到 侧翼 标记 的 重组 (图 15.2)。 珠 蛋白 基因 复 的 不 等 交换 可 能 引起 杂种 的 多 肽 链 , 有 时 会 引起 致命 的 血红 蛋白 的 遗传 性 延续 ( 文 框 15.1)。 分 散 的 重复 如 转 座 因子 之 间 也 会 发 生 重组 。 这 种 重组 的 效果 取决 于 重组 各 成 分 的 相 对 位 置 与 方向 。 同 一 染色 体 中 的 同 向 重复 之 间 的 重组 导致 重复 序列 之 间 的 DNA 序列 的 缺失 。 反 之 ,如 果 重 复 是 反 向 的 ,那么 重组 会 使 间 捅 DNA 倒 位 。 如 果 分 散 的 重复 位 于 不 同 ( 非 同 源 ) 染 色 体 上 ,重组 会 引起 交互 的 易 位 ( 线 状 染 色 体 ) 或 共 整合 ( 环 状 染 色 体 或 质 粒 )。 短 的 串联 重复 序列 如 发 生 在 微 卫星 DNA 中 的 序列 ,在 复制 中 往往 发 生 链 跳 格 , 即 模 板 与 引物 链 配 对 后 发 生 滑动 ,造成 两 条 链 间 等 同 的 重复 序列 被 跳 过 (图 15.2)。 这 被 认为 是 微 卫 星 DNA 的 多 态 性 形成 的 原因 ,因为 在 过 程 中 不 发 生 侧翼 标记 的 重组 ( 即 没有 交 换 )。 链 跳 格 复制 也 可 由 链 内 二 级 结构 如 发 夹 或 十 字 结 构 引 发 ,这些 结构 稳定 了 链 的 错误 排列 。 虽 然 二 级 结构 的 形成 受到 单 链 DNA 结合 蛋白 (人 参阅) 的 抑制 从 而 大 大 提高 了 移 码 忠实 度 (参阅 ) , 反 向 重复 仍 是 缺失 与 插入 的 热点 。 短 的 串联 重复 序列 广泛 分 布 在 高 级 真 核 生 物 的 基因 组 中 ,大 部 分 是 基因 外 DNA, 很 少 位 于 基因 编码 序列 中 。 这 种 基因 间 的 重 复 的 延伸 与 很 多 人 类 疾病 有 关 ( 文 框 15.2)。 重复 DNA 序列 之 间 的 物理 相互 作用 还 导致 非 等 位 的 基因 转变 (参阅 ) 事 件 的 发 生 。 重组 中 间 体 异 源 双 链 DNA 可 能 被 错 配 修复 ,导致 重复 序列 的 顺序 均一 化 。 这 是 真 核 基 因 组 中 成 得点 突变 的 主要 来 源 (又 见 体 细 胞 超 突变 ,SOS 反 应 ) ,并 可 能 是 协同 演化 的 一 种 机 制 ( 参 阅 )。 重 复 DNA 序列 之 间 的 物理 相互 作用 还 导致 基因 表达 的 外 遗传 改变 (参见 ”和 四 TFT CCC HOT 7 让 丙 不 等 交换 或 ”人 受 小 不 均等 姐妹 染色 单 体 不 等 交换 HE 人 缺失 [HeHsHaa IEHAEHAEHAEHAEHESGHASSHAEHAG 区 上 引物 链 跳 格 造成 错 配 EECHEHAEHAEHAEHEGEHACHAEHAEC] 一 寺 连续 复制 没有 纠正 所 产生 的 插 人 [SHE 避 人 SHEsHSHEA ESHEHAEHAEHAEHESEHASHAEHAE 1$.2”DNA 中 通过 同 向 重复 启动 插 人 与 缺失 。(A) 同 向 重复 是 不 等 交换 (不 等 交换 或 不 均等 姐妹 染色 单 体 不 等 交换 ) 的 热点 。 两 条 姐妹 染色 单 体 可 能 错误 排列 与 交换 产生 交互 重复 与 缺失 产物 。(B) 短 的 同 向 重复 是 复制 跳 格 的 热点 , 即 模板 与 引物 链 配对 后 发 生 滑动 。 引 物 链 的 后 退 跳 格 造成 插入 ,前进 跳 格 (图 中 未 显示 ) 造 成 缺失 。 两 种 跳 格 与 不 交换 都 与 三 联 体重 复 综合 征 有 关 《区 人 EM1S33 > 中 副 突变 , 同 源 依赖 沉默 , 共 抑 制 )。 1$.2 突变 型 等 位 基因 及 表现 型 的 分 子 基础 野生 型 与 突变 型 等 位 基因 等 位 基因 (alleles) 指 同一 基因 的 不 同形 式 , 开 始 是 由 基因 的 表 型 效应 来 定义 的 ,但 实质 上 还 是 由 基因 的 核酸 顺序 决定 的 。 任 何 位 点 的 野生 型 等 位 基 因 (wild-type alleles) 都 是 在 群体 中 占 绝对 优势 的 等 位 基因 , 它 一 般 具 有 最 高 的 适合 度 , 产 生 完 全 功能 的 产物 。 正 向 突变 (forward mnutation) 指 背离 野生 型 的 突变 , 它 产 生 有 别 于 对 生 型 等 位 基因 的 突变 型 等 位 基因 (mutant allele) ,其 产物 在 性 质数 量 或 分 布 上 与 野生 型 的 产物 不 同 。 向 野生 型 回复 的 突变 称 为 回复 突变 (reversion ) 。 通过 比较 突变 型 等 位 基因 与 野生 型 等 位 基因 的 表现 型 ,可 以 很 简便 地 将 其 分 类 。 在 二 倍 体 中 特别 重要 的 是 在 杂 合子 中 突变 型 与 野生 型 等 位 基因 的 相互 作用 的 方式 。 已 发 展 了 三 种 分 类 系统 来 定义 突变 型 等 位 基因 的 性 质 ( 表 1$.4)。 在 原则 上 , 正 向 突变 可 以 三 种 方式 影响 基因 的 功能 与 表达 : 它 可 能 引起 基因 活性 的 减 少 或 丧失 (功能 丢失 等 位 基因 ,a loss of function allele) ; 它 可 能 使 基因 的 活性 上 升 ,或 使 编 码 的 多 肽 链 获 得 新 的 功能 (功能 获得 等 位 基因 ,a gain of function allele) ;或 者 突变 型 与 野 生 型 等 位 基因 虽然 核 苷 酸 序列 有 差异 ,但 不 表现 出 表 型 上 的 差异 (这 种 野生 型 与 突变 型 等 位 基因 被 称 为 同等 位 基因 ,isoalleles)。 产 生 同 等 位 基因 的 突变 是 中 性 的 ,它们 常常 是 同 义 替代 。 引 起 基因 功能 的 丢失 或 获得 的 突变 可 能 是 中 性 的 `. 也 可 能 是 有 害 的 或 有 益 的 。 区 。 攀 2 分 某 一 特定 基因 功能 的 丢失 与 获得 的 效应 与 整体 适合 度 的 丢失 与 获得 是 十 分 重要 的 。 例 如 ,在 人 类 中 ,在 某 一 基因 座 的 功能 的 丧失 导致 一 完全 无 害 的 不 能 卷 舌 头 的 表现 效应 (中 性 ) ,而 癌 基 因 功 能 的 获得 是 癌症 发 生 途 径 的 一 步 ( 有 害 )。 表 15.4 突变 等 位 基因 分 类 的 三 种 系统 系统 标准 功能 的 获得 与 丢失 可 适用 于 单 倍 体 与 二 倍 体 的 生物 体 。 比 较 野 生 型 与 突变 型 等 位 基因 的 功能 的 水 平 与 作用 范围 。 如 突变 等 位 基因 的 产物 活性 低 于 野生 型 ,可 划分 为 功能 丢失 等 位 基因 ; 如 产物 活性 高 于 野生 型 或 产生 新 的 功能 ,可 划 为 功能 获得 等 位 基因 。 显 性 关系 只 适用 于 二 倍 体 生 物体 。 比 较 野 生 型 ,野生 型 与 突变 型 的 杂 合 子 ,突变 纯 合 子 的 表 型 。 根据 突变 的 表 型 在 杂 合子 中 的 表现 程度 ,等 位 基因 可 分 为 显 性 ,部 分 显 性 , 共 显 性 或 隐 性 。 米 勤 分 类 只 适用 于 二 倍 体 生物 体 。 这 个 系统 是 在 果 蝇 中 发 展 的 , 果 蝇 具有 各 种 可 获得 的 缺失 突 变型 。 比 较 某 一 感 兴趣 的 基因 座 缺 失 纯 合 个 体 与 纯 合 突变 型 以 及 缺失 /突变 杂 合 型 的 表 型 差异 。 等 位 基因 可 以 分 为 : 无 效 等 位 基因 一 没有 活性 ， 亚 效 等 位 基因 一 一 相对 于 野生 型 活性 下 降 ， 反 效 等 位 基因 一 一 与 野生 型 活性 相反 ， 超 效 等 位 基因 一 一 与 野生 型 相 比 活性 上 升 ， 新 效 等 位 基因 一 一 与 野生 型 相 比 具有 新 的 活性 。 较 之 野生 型 活性 下 降 的 等 位 基因 与 野生 型 等 位 基因 相 比 活性 下 降 的 等 位 基因 被 称 为 ”功能 丢失 等 位 基因 ( loss of function allele) 。 这 可 能 是 由 于 突变 发 生 在 调节 基因 的 表达 的 上 游 区 域 从 而 减少 了 基因 产物 的 量 ( 低 表 达 突 变 , 或 启动 子 减 效 突 变 ,down or downpro- moter mutation) ,也 可 能 是 突变 使 基因 产物 改变 , 较 之 野生 型 功能 下 降 ,例如 使 基因 产物 质量 下 降 。 如 果 基 因 表 达 被 完全 抑制 ,或 是 基因 的 产物 完全 不 具有 正常 的 功能 ,这 样 的 功 能 完全 丧失 的 等 位 基因 (total loss of function alleles ) 称 为 无 效 等 位 基因 (null alleles， amorphs) 。 整 个 基因 的 缺失 、 破 坏 调控 元 件 的 突变 或 使 编码 的 多 肽 链 提前 终止 的 点 突变 都 可 能 产生 无 效 等 位 基因 。 如 果 突 变 只 是 减弱 基因 的 功能 而 非 完 全 消除 ,这些 基因 编码 的 生物 活性 在 生物 体 仍 能 作用 ,只 是 相对 于 野生 型 效率 降低 。 这 种 功能 部 分 丧失 的 等 位 基因 (partial loss of function alleles) 称 为 渗 漏 等 位 基因 (1leaky alleles) 或 亚 效 等 位 基因 (hy- pomorphs)。 基 因 内 部 发 生 错 义 碱 基 蔡 换 ,产物 仍 具 有 较 小 活性 或 是 基因 上 游 调 控 因 子 发 生 罕 变 ,使 基因 的 表达 减少 但 未 完全 消除 。 这 两 种 情况 都 可 能 产生 渗 漏 等 位 基因 。 突 变 表 型 的 严重 程度 取决 于 突变 多 肽 链 的 残余 功能 :产生 一 较 剧 烈 的 表 型 的 等 位 基因 被 称 为 强 等 位 基因 (strong alleles) , 而 产生 一 较 温 和 的 表 型 的 等 位 基因 被 称 为 弱 等 位 基因 (weak alleles) 或 温和 等 位 基因 (moderate alleles) 。 一 缺失 突变 的 严重 程度 在 不 同 环境 中 也 可 能 不 同 ( 参 见 条 件 突变 型 ) 并 且 在 环境 不 恒定 的 情况 下 表现 出 不 完全 的 外 显 率 。 在 二 倍 体 中 ,功能 丢失 的 突变 等 位 基因 相对 于 野生 型 往往 是 隐 性 的 (参阅 ), 即 突变 效 应 在 杂 合子 中 不 表现 。 这 是 因为 在 大 部 分 基因 座 中 ,基因 的 一 个 野生 型 拷贝 ( 它 产 物 的 3 50% 的 剂量 ) 就 足以 满足 细胞 的 需要 。 在 两 种 情况 下 ,功能 丢失 的 突变 等 位 基因 相对 于 野生 型 可 能 是 显 性 的 。 一 种 情况 是 发 生 单 倍 不 满足 性 (haploinsufficiency) 即 维持 野生 的 表 型 需要 基因 的 两 份 功能 性 拷贝 ， 5$0% 的 产物 剂量 对 于 基因 的 生理 功能 是 不 够 的 。 在 具有 单 倍 不 满足 性 的 基因 座 , 功 能 丢 失 的 突变 等 位 基因 相对 于 野生 型 是 部 分 显 性 (参阅 ) 的 (突变 的 效应 在 产物 剂量 $9% 的 杂 合子 中 表现 ,但 在 产物 剂量 为 0 的 纯 合 子 中 更 为 严重 )。 一 个 单 倍 不 满足 性 的 例子 是 高 胆 固 醇 血 症 ,一 种 低 密 度 脂 蛋白 受 体 水 平 S0% 的 减少 引起 的 部 分 显 性 的 人 类 疾病 。 如 果 突 变 产 物 干 扰 野 生 型 产物 的 功能 ,功能 丢失 的 突变 等 位 基因 相对 于 野生 型 等 位 基因 也 可 能 是 完全 显 性 的 。 这 常常 发 生 在 基因 产物 是 多 聚 体 的 情况 下 , 突变 型 可 与 野生 型 多 肽 链 相 互 作用 形成 无 活性 的 复合 物 。 例 如 , 受 体 酷 氨 酸 激酶 是 二 聚 体 ,突变 的 不 能 进 行 信号 传导 的 受 体 可 以 通过 与 野生 型 多 肽 链 形成 无 活性 的 异 二 聚 体 来 阻 断 信号 。 这 种 性 质 的 等 位 基因 被 称 为 显 性 失 活 (dominant negative)( 有 时 被 分 类 为 反 效 等 位 基因 , anti- morphs, 因 为 它们 与 野生 型 作用 相反 或 相持 抗 ) 。 较 之 野生 型 活性 提高 的 等 位 基因 相对 于 野生 型 活性 有 所 提高 的 等 位 基因 被 称 为 功能 获得 等 位 基因 (gain of function allele) 或 超 效 等 位 基因 (hyper-morph)。 这 种 等 位 基因 可 能 通过 以 下 途径 提高 基因 产物 的 活性 :提高 基因 产物 的 量 (高 表达 突变 或 启动 子 增 效 突变 ， up or uppromoter mutation ) ,编码 产物 相对 于 野生 型 具有 改善 的 或 新 的 性 质 , 使 基因 产物 的 表达 与 活化 超出 野生 型 的 常规 水 平 (例如 组 成 型 突变 型 , constitutive mutant, 野生 型 产 物 受 调控 表达 , 而 突变 型 一 直 活 化 , 异 位 表达 突变 型 ,ectopic expression mutant, 调节 的 突 变型 使 一 个 基因 的 表达 超出 常规 的 时 间 与 空间 区 域 ) 。 如 果 基 因 的 表 型 是 明显 的 ,功能 获 得 突变 等 位 基因 相对 于 野生 型 往往 是 显 性 的 ,但 也 有 可 能 在 形成 宾 聚 蛋白 情况 下 ,野生 型 多 肽 链 可 遮 贡 功 能 提高 突变 等 位 基因 的 量 的 效应 。 显 性 激活 (dominant positive) 与 显 性 失 活 相反 , 即 突 变型 多 肽 链 通过 在 守 聚 体 蛋白 质 中 与 野生 型 产物 相互 作用 来 发 挥 其 效应 ， 且 在 这 种 情况 下 突变 型 突破 了 野生 型 产物 所 受到 的 限制 与 调节 ,例如 在 组 成 型 信号 受 体 酷 氨 酸 激酶 中 观察 到 的 那样 。 新 效 等 位 基因 (neomorph) 较 之 野生 型 等 位 基因 具有 新 的 活 性 。 异 位 表达 突变 型 往往 具有 新 的 效应 ,因为 在 其 常规 的 时 间 与 空间 之 外 表达 一 多 肽 链 的 效果 是 很 难 预 料 的 。 功 能 获得 的 同 源 异 型 突变 型 ,如果 蝇 触角 足 ,在 触角 应 该 发 生 的 体 节 生 出 足 , 就 是 新 效 等 位 基因 (参见 同 源 异 型 基因 )。 与 野生 型 活性 相似 的 等 位 基因 很 多 突变 没有 表 型 效应 ,并 且 是 选择 性 中 性 的 。 不 同 等 位 基因 具有 相同 的 表 型 ,无 法 从 形态 上 区 分 彼此 ,这 样 的 等 位 基因 被 称 为 同等 位 基因 (isoalleles) 。 同 等 位 基因 由 不 改变 基因 产物 的 量 \ 性 质 与 分 布 的 突变 产生 (例如 同 义 核 苷 酸 蔡 代 ) ,或 者 突变 虽 可 以 改变 编码 多 肽 链 的 结构 与 表达 但 在 表 型 上 没有 反映 ,因为 这 种 改变 可 以 忽略 (例如 调节 区 域 的 突变 使 基因 表达 的 速率 发 生 温和 的 但 没有 症状 的 改变 ,或 在 功能 不 重要 的 多 肽 区 域 发 生 的 保守 错 义 突变 )。 同等 位 基因 是 选择 中 性 的 ,但 并 非 所 有 中 性 的 等 位 基因 都 是 同等 位 基因 。 如 果 突 变 引起 表 型 的 变化 ,但 不 同 表 型 不 影响 适合 度 ,突变 仍 是 中 性 的 (例如 引起 眼睛 颜色 改变 的 突变 )。 突变 的 效应 可 从 几 个 层次 进行 考虑 :@ 对 核 苷 酸 序列 的 影响 ;@ 对 基因 活性 的 影响 ;G) 对 表 型 的 影响 ; GO 对 整体 适合 度 的 影响 。 只 有 影响 到 适合 度 的 突变 要 经 受 自然 ， 194 ， 选择 。 对 基因 活性 没有 影响 的 突变 (如 同 义 突变 或 发 生 在 编码 区 以 外 的 大 部 分 突变 ) 在 所 有 的 环境 中 往往 都 是 中 性 的 。 改 变 了 基因 的 活性 或 表 型 的 突变 可 能 在 某 些 环境 中 是 中 性 的 而 在 另 一 些 环境 中 不 是 。 中 性 的 等 位 基因 不 经 受 自 然 选择 。 因 而 可 能 有 几 个 等 位 基因 以 相对 较 高 的 频率 在 一 个 群体 中 保持 平衡 (参见 多 形 现 象 )。 表 型 有 区 别 的 中 性 等 位 基因 可 从 形态 上 区 分 ,但 同 等 位 基因 只 能 从 分 子 水 平 区 分 。 在 某 些 情 况 下 ,蛋白 质 多 态 现象 (protein polymorphisms) 可 从 蛋白 质 的 不 同形 式 在 电泳 胶 上 的 不 同行 为 来 监测 ( 另 见 蛋白 质 平 蕉 测试 )。DNA 序 列 的 多 态 现象 (IDNA sequence polymorphisms) 有 时 可 通过 限制 酶 切片 断 或 PCR 产物 长 度 的 改变 来 监测 ,这 是 因为 突变 可 能 引起 酶 切 位 点 的 产生 或 破坏 (限制 性 片断 长 度 多 态 性 ， restriction fragment length polymorphisms) ,或 是 卫星 DNA 串联 重复 序列 的 延伸 或 缩短 (简单 序列 长 度 多 态 性 , simple sequence length polymorphisms) 。 另 外 , 单 链 DNA 或 异 源 双 链 DNA 可 用 于 监测 突变 (参见 突变 筛选 )。 唯 一 能 毫 不 含糊 地 监测 与 分 辨 所 有 多 形 性 的 方法 是 DNA 序列 分 析 。 据 估算 ,人 类 DNA 的 平均 杂 合 性 (mean heterozygosity) 是 0.004, 即 每 300 个 碱 基 中 有 一 个 是 具有 多 态 性 的 。 9 次 交 的 抢 布 与 分 子 进 化 突变 谱 与 突变 在 基因 组 中 的 区 域 分 布 ”在 基因 组 的 群体 中 突变 的 谱 型 与 分 布 不 是 随机 排 的 位 点 。 串 联 重复 DNA 是 链 跳 格 复制 或 不 等 交换 的 热点 , 反 向 重复 是 二 级 结构 诱导 的 缺失 的 热点 ,而 5$- 甲 基 胞 喀 喧 残 基 通 过 脱 氨 基 是 C->T 替代 的 热点 。5- 甲 基 胞 喀 喧 的 不 稳定 性 部 分 解释 了 在 哺乳 动物 中 出 乎 意料 的 转换 的 频率 高 于 颠 换 。 对 任何 一 个 碱 基 , 苏 换 有 两 种 选择 而 转换 只 有 一 种 选择 ,所 以 随机 的 改变 造成 的 颠 换 的 频率 应 是 转换 的 两 倍 。 事 实 正好 相反 ,转换 的 频率 约 是 颠 换 的 两 倍 。 不 同 碱 基 的 替代 频率 相差 很 大 。 由 于 5= 甲 基 胞 喀 啶 的 不 稳定 性 ,C->T 的 转换 频率 是 其 他 碱 基 蔡 换 的 十 倍 , 至 少 在 具有 甲 基 化 DNA 的 生物 体内 。 在 其 他 11 种 甲 基 蔡 代 中 也 有 一 定 的 趋向 性 ,这 反映 了 DNA 修 复 机 制 中 的 偏向 性 ,特别 是 错 配 修复 或 由 于 甲 基 损坏 造成 的 常见 非 结构 性 损坏 的 修复 ( 见 第 14 章 诱 变 与 DNA 修复 )。 当 考 虑 到 突变 热点 与 碱 基 修 复 的 偏向 性 ,原则 上 ,基因 组 的 任何 区 域 具有 相同 发 生 突 变 的 机 会 , 即 突 变 是 随机 与 非 定 向 的 ,作为 被 作用 物 为 自然 选择 提供 “选择 随机 性 ”。 在 文 框 15.3 中 我 们 将 讨论 所 谓 的 程序 性 突变 (programmed mutation) , 即 突变 作为 发 育 程序 的 一 部 分 由 细胞 诱导 发 生 ,以 及 定向 突变 (directed mutation ) , 即 对 特定 选择 压力 做 出 的 反 应 。 在 群体 中 等 位 基因 的 发 生 频率 ”在 一 指定 的 群体 中 等 位 基因 的 发 生 频率 受 很 多 因素 的 影响 ,如 群体 的 大 小 与 结构 ,交配 方式 ,突变 速率 ,迁移 ,随机 遗传 漂 变 以 及 基因 转化 ( 见 表 15.5)。 突 变 与 迁移 是 使 新 的 等 位 基因 进入 一 个 群体 的 两 个 因素 。 新 产生 (或 到 达 ) 的 等 位 基因 相对 于 现 有 的 野生 型 等 位 基因 可 能 是 有 害 的 ,中 性 的 或 ( 极 少 情况 下 ) 有 益 的 。 在 最 简单 的 例子 中 ,使 适合 度 下 降 的 等 位 基因 会 被 自然 选择 消除 ( 负 选 择 , negative selec- tion) 并 且 由 于 频 发 突变 与 迁移 保持 一 较 低 的 频率 (突变 压力 ,mutation pressure)。 使 适合 “195， 度 提高 的 等 位 基因 将 在 群体 中 传播 开 来 ( 正 选 择 ,positive selection) ,并 逐渐 代替 原来 的 野 生 型 等 位 基因 。 如 果 在 这 个 替代 的 过 程 中 对 此 群体 进行 分 析 ,就 会 发 现在 这 个 位 点 上 的 多 态 性 (polymorphism)( 即 指 同 时 有 两 个 或 两 个 以 上 的 等 位 基因 ,每 一 个 的 发 生 频 率 都 大 于 0.01)。 这 可 被 称 为 过 渡 性 多 态 现象 (transient polymorphism) 因 为 所 有 的 等 位 基因 的 发 生 频 率 在 趋向 固定 (fixation ,频率 为 0 或 1)。 表 1$.5 ”描绘 等 位 基因 在 群体 中 分 布 与 改变 分 布 的 作用 力 的 术语 术语 定义 突变 速率 在 一 段 时 间 内 发 生 的 突变 的 数量 。 例 每 一 代 每 一 个 基因 发 生 的 突变 数 s 突变 频率 (等 位 基因 频率 ) 在 一 指定 的 群体 中 带 有 特定 的 突变 型 等 位 基因 的 个 体 的 数量 。 突变 压力 通过 频 发 突变 提高 特定 的 等 位 基因 的 频率 的 作用 力 。 突变 负荷 (遗传 负荷 ) 在 群体 中 有 害 的 等 位 基因 的 效应 。 迁移 通过 向 群体 中 输入 或 从 群体 中 输出 个 体 来 改变 特定 等 位 基因 的 发 生 频 率 的 作用 力 。 自然 选择 通过 消除 在 一 指定 环境 中 使 适合 度 下 降 的 等 位 基因 来 改变 等 位 基因 的 频率 的 作 用 力 。 随机 遗传 漂 变 通过 随机 取样 改变 等 位 基因 频率 的 作用 力 。 如 果 一 个 新 的 基因 是 选择 中 性 的 ,等 位 基因 的 发 生 频率 更 多 地 取决 于 概率 事件 , 即 配 子 的 随机 取样 (随机 遗传 漂 变 ,random genetic drift) , 而 非 自 然 选择 。 漂 变 的 等 位 基因 发 生 频 率 渐 趋 固定 ,但 在 一 个 大 的 群体 中 这 需要 很 长 的 时 间 ,到 达 固 定 后 显示 出 中 性 多 态 性 (neutral polymorphism) 。 漂 变 的 效果 在 小 的 群体 、 群 体 的 瓶颈 及 新 的 群体 中 较 明 显 ( 建 立 者 效应 ) ,在 这 些 群 体 中 出 现 特定 等 位 基因 时 漂 变 可 引起 快速 与 显著 的 变化 。 如 果 条 合子 的 适合 度 落 在 由 两 种 纯 合 子 的 适合 度 定义 的 范围 之 外 ,情况 将 更 为 复杂 。 当 一 个 等 位 基因 较 之 群体 中 的 其 他 等 位 基因 适合 度 更 大 ,而 杂 合 子 的 适合 度 介 于 两 种 纯 合子 之 间 ,那么 选择 是 定向 的 并 导致 最 适 等 位 基因 的 固定 。 如 果 杂 合子 的 适合 度 大 于 任 何 一 种 纯 合子 ( 超 显 性 ) ,选择 趋向 杂 合子 ,两 种 等 位 基因 将 维持 一 种 平衡 多 态 性 (balanced polymorphism)。 这 方面 的 一 个 例子 是 B 珠 蛋白 的 正常 等 位 基因 (Hba) 与 镶 状 细胞 等 位 基 因 (Hbs) 的 超 显 性 选择 。 在 一 些 非 洲 国家 具有 这 两 种 等 位 基因 的 多 态 性 ,因为 虽然 Hbs 在 纯 合 状态 下 是 有 害 的 ,但 HbAVHbS 的 杂 合 子 具 有 闪 疾 抗 性 , 较 HbA 纯 合子 的 适合 度 更 高 。 另 一 种 平衡 选择 的 形式 包括 具有 频率 依赖 的 适合 度 的 等 位 基因 。 杂 合子 的 适合 度 可 能 低 于 任何 一 种 纯 合 子 (次 显 性 ) 。 当 这 种 情况 发 生 时 ,就 会 出 现 发 散 的 选择 ,但 如 果 随 机 的 交配 持续 , 杂 合 群体 将 增多 且 各 种 等 位 基因 维持 一 种 不 稳定 的 多 态 性 (unstable poly- morphism ) 。 选择 压力 与 分 子 钟 ” 当 考虑 到 突变 分 布 的 区 域 性 差别 ,整个 基因 组 的 DNA 发 生 突变 的 可 能 性 是 相等 的 。 然 而 ,发 生 在 非 编 码 区 域 的 绝 大 部 分 突变 是 中 性 的 ,而 发 生 在 编码 DNA 的 很 多 突变 是 有 害 的 因而 被 自然 选择 消除 。 因 而 我 们 观察 到 的 现存 的 在 编码 区 的 突变 频率 远 远 小 于 非 编 码 区 ,导致 编码 DNA 序列 在 进化 时 间 内 是 保守 的 。 ， 196 ， 维持 了 DNA 编码 序列 的 选择 压力 (selection pressure) 控 制 了 观察 到 的 突变 的 谱 带 与 分 布 。 在 编码 DNA 中 的 大 部 分 现存 突变 是 碱 基 蔡 换 , 因 为 更 剧烈 的 突变 ,如 移 码 突变 ， 大 的 缺失 等 ,一般 都 是 有 害 的 并 将 被 消除 。 在 简 并 性 位 点 (degenerate sites, 蔡 换 不 会 改变 密码 子 的 含义 的 位 点 ,一 般 在 密码 子 的 第 三 位 ) 比 非 简 并 位 点 (nondegenerate site, 突变 产 生 错 义 , 导 致 氨基 酸 蔡 换 的 位 点 ) 碱 基 蔡 换 发 生 较 频繁 。 进 化 中 的 蛋白 质 中 非 同 义 的 碱 基 替换 的 速率 表征 了 维持 蛋白 质 结 构 的 选择 压力 的 强度 。 一 些 蛋白 质 改 变 很 少 因为 几乎 所 有 的 残 基 在 维持 蛋白 质 的 结构 和 功能 中 都 起 着 重要 的 作用 (例如 组 蛋白 )。 另 一 些 蛋白 质 进化 很 快 ,因为 其 多 肽 链 结构 对 功能 不 太 重 要 (如 胰岛 素 连接 链 , 其 功能 是 分 开 A 链 与 B 链 ,并 在 多 肽 链 剪 切 后 被 弃 去 ) 。 同 义 替 代 的 速率 与 选择 压力 无 关 , 因 为 它们 一 般 是 中 性 的 。 因 而 ,组 蛋白 与 白 蛋白 的 同 义 突变 的 频率 是 相似 的 ,虽然 在 白 蛋 白 中 非 同 义 突变 的 频率 上 百倍 地 高 于 组 蛋白 中 的 频率 。 这 引出 了 分 子 钟 (molecular clock) 的 概念 ,以 中 性 进化 的 速率 来 衡量 进化 时 间 。 然 而 ,分子 钟 并 非 恒 定 的 。 不 同 基因 中 性 替代 速率 不 同 即 氨基 酸 取代 速率 不 同 , 如 胰岛 素 的 中 性 蔡 代 的 速率 是 次 黄 味 叭 转 磷酸 核糖 基 酶 (HPRT) 的 两 倍 , 虽 然 它 们 的 非 同 义 替 代 的 速率 相似 , 即 处 于 相似 的 选择 压力 下 。 很 多 因素 会 影响 替代 的 速率 ,其 一 就 是 DNA 修复 的 偏 问 性 。 在 上 面 讨论 过 , 某 些 类 型 错 配 与 碱 基 损 伤 较 其 他 类 型 更 易 得 到 修复 ,所 以 中 性 进化 的 速率 可 能 受 基因 的 碱 基 组 成 的 影响 。 基 因 组 之 间 修 复 效率 不 同 也 会 有 影响 (这 个 原因 可 解释 动物 线粒体 基因 组 的 快速 进化 ,因为 它 缺 少 核 苦 酸 切除 修复 ,参阅 )。 分 子 钟 在 不 同 的 种 属 谱系 中 运行 速度 也 不 同 。 一 般 , 具 有 较 长 的 代 间 隔 的 种 属 中 分 子 钟 较 慢 , 因 为 新 产生 的 突变 的 效果 将 在 延续 的 子 代 中 得 到 测试 。 真 实时 间 中 的 代数 越 少 ,可 测试 的 新 的 突变 就 越 少 。 1$.4 遗传 分 析 中 的 突变 经 典 遗 传 分 析 和 反 向 遗传 学 ”剖析 生物 体系 的 经 典 方法 是 分 离 此 体系 中 突变 缺陷 型 ， 然后 决定 突变 基因 的 结构 与 精确 的 功能 。 另 一 种 途径 则 包括 基于 某 一 基因 的 结构 分 离 基 般 通 过 对 其 编码 的 蛋白 质 的 序列 测定 一 一 然后 突变 这 个 基因 来 研究 其 功能 ,这 种 方法 有 时 被 称 为 反 向 遗传 学 (reverse genetics) (参见 体外 突变 ,基因 导向 ,基因 敲 除 )。 经 典 的 遗传 分 析 要 求 突变 型 的 产生 ,对 群体 进行 筛选 来 辨别 感 兴趣 体系 的 突变 型 ,然后 对 效应 基因 进行 作 图 与 克隆 。 一 旦 得 到 感 兴趣 的 突变 型 ,就 开始 第 二 轮 筛选 来 得 到 改变 第 一 轮 突 变 表 型 的 突变 ,这 样 可 以 辨别 那些 与 在 第 一 轮 辨 别 的 基因 相互 作用 的 基因 ( 文 杠 lzd4)5 遗传 筛选 ”突变 可 以 通过 将 生物 群体 暴露 于 物理 或 化 学 的 诱 变 因素 而 产生 。 亚 硝 基 肌 常常 用 于 诱 变 细菌 类 , 甲 基 磺 酸 乙 酯 或 X 射 线 常 常用 于 果 蝇 。 另 外 , 转 座 子 可 用 于 产生 突变 :P 因子 被 广泛 地 用 于 果 蝇 中 , Ac-Ds 因子 用 于 植物 中 (参见 P 因子 突变 发 生 , 转 座 子 标记 )。 用 这 种 方法 可 产生 随机 突变 个 体 的 群体 ,然后 必须 分 辩 与 分 离 感 兴趣 的 体系 的 突 变型 。 在 很 多 情况 下 ,突变 型 具有 特定 的 形态 学 上 的 表 型 ,可 以 通过 费力 的 可 见 筛选 来 得 到 (如 大 规模 筛选 植物 、. 果 蝇 、 斑 马 鱼 的 发 育 突变 型 ,酵母 的 细胞 周期 突变 型 , 果 蝇 与 小 鼠 种 。 197 ，。 系 的 增强 子 捕 获 与 基因 捕获 (参阅 ) 的 有 趣 的 表达 图 式 )。 当 找到 一 生化 或 生理 的 突变 ,以 利通 过 选择 得 到 所 需 突变 型 群体 是 有 价值 的 。 对 于 功能 获得 突变 型 ,如 细菌 类 对 抗生素 抗 性 的 获得 ,可 以 使 用 正 选 择 (positive selection or direct selection ) 即 在 有 抗生素 存在 下 培养 细菌 ,没有 抗 性 的 细胞 ( 非 突变 细胞 ) 被 杀 死 。 功 能 丢失 突变 ,如 细菌 中 的 营养 缺陷 型 (参阅 ) 可 以 使 用 负 选 择 (negative selection ,或 反选 择 ,counter selection)。 这 个 策略 利用 突变 型 细胞 失去 的 某 些 敏感 性 。 在 营养 缺陷 型 的 情况 下 ,反选 择 往 往 通过 青霉素 富 集 (penicillin enrichment) 来 进行 :青霉素 能 阻止 细胞 壁 成 分 的 合成 ,因此 对 扩 增 细胞 是 致死 的 。 突 变型 由 于 其 代谢 缺陷 不 能 在 基本 培养 基 上 扩 增 ,因而 对 青霉素 具有 抗 性 ( 另 见 正 一 负 选 择 ) 。 青 霉 素 富 集 不 能 分 辨 特定 的 代谢 缺陷 型 ,选择 需要 通过 一 间接 的 两 步 过 程 进行 影印 铺 板 (replica plating)。 这 包括 将 一 有 细菌 克隆 的 主 盘 复印 到 织物 上 (将 一 绒布 铺 在 克隆 上 ,使 每 一 克隆 的 部 分 细胞 转 到 布 上 ) ,再 将 这 织物 放 到 一 新 鲜 的 平板 上 ,这 样 细胞 沉 积 于 培养 基 上 ,产生 了 同 原来 一 样 的 克隆 排列 图 式 。 如 主 盘 提供 了 适宜 的 代谢 终 产物 , 原 养 型 与 营养 缺陷 型 都 可 以 生长 ,而 复制 平板 包含 基本 培养 基 , 营养 缺陷 型 无 法 生长 。 那 么 就 可 以 通过 在 复制 盘 上 不 出 现 对 应 克隆 在 主 平 板 上 辨别 营养 缺陷 型 ( 另 见 重组 选择 )。 同样 的 遗传 筛选 的 原理 可 应 用 于 更 高 级 的 生物 ,但 只 有 在 能 饲养 与 突变 大 量 生 物 的 情况 下 才 可 行 , 例 如 果 蝇 ,酵母 ,植物 ,培养 的 动物 细胞 。 由 于 二 倍 性 这 种 筛选 变 得 更 复 杂 , 为 了 辨别 隐 性 突变 ,突变 型 需要 通过 传代 获得 突变 纯 合子 或 者 在 一 单 倍 的 背景 下 进行 研究 (如 使 用 非 整 数 倍 细胞 系 )。 在 有 些 二 倍 体 种 属 中 , 单 倍 体 也 能 生存 (例如 很 多 植物 ， 斑马 鱼 ) 。 一 旦 辨别 了 一 种 突变 ,就 可 以 分 离 与 克隆 这 个 基因 并 了 解 其 生化 作用 。 这 方面 工作 的 原理 另外 讨论 ( 见 第 24 章 重 组 DNA)。 条 件 突 变型 ”对 于 必需 体系 如 DNA 复制 、 发 育 、 细 胞 周期 等 的 遗传 分 析 十 分 困难 , 因 为 突变 往往 是 致命 的 。 不 能 进行 复制 的 细胞 会 死亡 ,在 发 育 早期 被 阻 断 的 机 体 也 会 死亡 。 在 二 倍 体 中 , 隐 性 的 致死 突变 可 在 杂 合 子 中 保持 ,其 致死 的 趋势 可 通过 使 杂 合子 相交 ,分 析 其 纯 合 后 代 来 研究 。 其 实 , 不 论 是 单 倍 体 还 是 二 倍 体 ,都 广泛 利用 条 件 突变 型 (condi- tional mutant) 来 分 析 必 需 体系 。 条 件 突 变型 带 有 只 在 特定 的 限制 条 件 (restrictive condi- tions) 下 明显 表现 出 来 的 (往往 是 错 义 的 ) 突 变 。 在 通常 的 允许 条 件 (permissive conditions) 下 , 它 表 现 出 野生 型 的 表 型 。 条 件 突 变型 的 较 重 要 的 类 别 有 温 度 敏感 突变 型 (tempera- ture-sensitive mutations) , 提高 温度 条 件 下 表现 突变 型 表 型 ,以 及 冷 敏感 突变 型 (cold-sensi- tive mnutations) ,在 低温 下 表现 突变 型 的 表 型 。 在 两 种 情况 下 突变 型 的 性 质 都 涉及 在 限制 温度 蛋白 质 的 变性 趋势 上 升 。 遗传 途径 分 析 很 多 基因 是 遗传 途径 (genetic pathways) 和 遗传 网 络 (genetic networks ) 的 部 分 。 遗 传 途径 指 将 一 个 底 物 转变 为 产物 经 过 多 个 中 间 阶 段 , 每 一 个 阶段 受 不 同 基因 控制 。 在 某 些 情况 下 , 底 物 指 一 种 信息 ,如 一 个 到 达 细 胞 表面 的 信号 必须 传导 到 核 内 ,或 是 以 基因 调控 的 形式 ,通过 多 个 调控 开关 到 达 下 游 的 靶 序 列 。 在 另 一 些 情况 下 , 底 物 是 一 个 物理 分 子 代 谢 物 必须 转变 成 有 用 的 产物 。 突 变 分 析 可 以 决定 这 些 途径 中 包含 的 基因 ， 它们 的 活性 顺序 ,以 及 在 途径 的 何 处 发 生 了 分 支 与 收敛 。 在 某 些 方面 代谢 途径 是 最 易 剖 分 的 ,因为 其 起 始 底 物 ,中 间 物 以 及 终 产物 都 是 物理 分 子 而 非 信息 的 传递 状态 。 一 般 情 况 下 ,代谢 包括 一 序列 化 学 反应 ,每 一 反应 都 由 特异 的 酶 *。 198 。 催化 。 每 一 种 酶 都 由 一 个 基因 编码 。 破 坏 酶 功能 的 突变 将 造成 代谢 阻 断 (metabolic block) 其 特征 是 :中 不 能 产生 反应 的 终 产物 ;@ 代 谢 中 间 物 的 积累 。 这 两 种 不 正常 状态 之 一 或 共同 产生 表 型 ,并且 往往 是 对 机 体 有 害 的 。 细 菌 可 以 利用 简单 的 碳 源 ,水 ,金属 合成 很 多 必须 的 有 机 分 子 , 因 而 可 以 在 包含 这 些 物质 的 基本 培养 基 (minimal medium) 上 生长 。 具有 这 类 野生 型 的 代谢 性 质 的 细菌 细胞 被 称 为 原 养 型 (prototrophic)。 所 谓 的 营养 缺陷 型 是 (auxotroph) 指 一 种 细菌 的 代谢 酶 的 突变 缺陷 型 ,这 种 缺陷 使 营养 缺陷 型 的 细菌 不 能 在 可 以 满足 野生 型 细菌 的 培养 基 上 生长 ,而 必需 包含 被 破坏 的 代谢 途径 的 终 产物 的 补 加 培 养 基 (supplemented medium) 。 如 果 代谢 阻 断 的 表 型 主要 表现 为 不 能 产生 代谢 终 产物 , 那 么 这 个 途径 中 任何 基因 的 突变 都 会 产生 类 似 的 表 型 (基因 座 不 均一 性 ,locus heterogene- ity)。 开 始 时 ,途径 中 的 阶段 的 数目 可 以 通过 互补 分 析 ( 参 阅 ) 来 估算 ,将 两 种 突变 放 在 一 起 ,观察 彼此 基因 组 的 产物 是 否 可 以 补偿 另 一 个 的 缺陷 。 基 因 作用 的 顺序 可 以 通过 分 析 代谢 中 间 物 来 建立 。 可 用 互 养 来 了 解 是 否 一 个 突变 细胞 的 中 间 产 物 可 被 另 一 突变 型 细胞 用 来 产生 终 产物 。 信息 转移 途径 的 分 析 较 为 复杂 ,因为 突变 既 可 以 产生 在 代谢 失常 中 最 常见 的 功能 丢 失效 应 ,也 可 能 引起 功能 获得 效应 (组 成 途径 活化 ) 。 显 性 的 功能 获得 突变 有 一 定 用 处 ,两 个 突变 杂交 获得 同时 携带 这 两 种 突变 的 个 体 ,可 用 于 研究 途径 的 顺序 。 早 期 作用 的 功能 丢失 的 突变 可 以 阻 断 信号 转移 , 它 对 于 作用 于 较 晚 期 的 功能 获得 的 ,引起 组 成 型 信号 转移 的 突变 来 说 是 下 位 性 的 。 而 较 晚 作用 的 功能 丢失 的 突变 相对 于 较 早 作用 的 功能 获得 的 突 变 是 上 位 性 的 (参见 上 位 性 ,下 位 性 )。 文 框 1$.1 人 类 疾病 中 的 突变 与 病理 学 一 一 血红 蛋白 失常 正常 与 不 正常 的 血红 蛋白 ”血红 蛋白 (hemoglobin) 是 红细胞 中 的 携 氧 蛋白 ,使 红细胞 可 以 从 呼 吸 系统 中 运输 氧 。 血 红 蛋 白 是 一 个 四 聚 体 蛋 白 ,包括 两 个 "型 珠 蛋 白 链 以 及 两 个 B 型 珠 蛋 白 链 , 它 们 通过 和 氢 键 相互 作用 。 每 一 个 珠 蛋 白 链 与 一 个 血红 素 结合 ,其 功能 是 与 氧 结合 。 人 类 珠 蛋 白 基 因 被 发 现 有 两 个 基因 簇 。aw- 珠 蛋白 基因 簇 包 含 5- 珠 蛋白 基因 ,两 个 等 同 的 - 珠 蛋 白 基 因 ,一 个 未 知 功能 6- 珠 蛋白 基因 。B- 珠 蛋白 基因 艇 包含 5- 珠 蛋 白 基 因 ,两 个 Y- 珠 蛋白 基因 ,其 产物 相差 一 个 氨基 酸 残 基 , 还 有 8$- 珠 蛋白 基因 ,8B- 珠 蛋白 基因 。 这 两 个 篮 都 含有 假 基 因 。 这 两 个 簇 的 基因 都 按时 间 顺 序 表 达 , 所 以 在 发 育 过 程 中 合成 的 血红 蛋白 在 改变 (B- 珠 蛋 白 基 因 往 的 发 育 调控 的 分 子 基础 将 在 文 框 29.3 中 讨论 )。 在 生命 的 前 6 一 8 星期 ,血红 蛋白 在 卵黄 囊 中 合成 ,是 由 两 个 5- 珠 蛋 白 链 与 两 个 s- 珠 蛋 白 链 组 成 的 四 体 ( 胚 胎 血 红 蛋 自 , embryonic hemoglobin or Hb Gower I) 。 然 而 ,从 第 二 星期 开始 ,胚胎 血红 蛋白 的 合成 下 降 并 且 w- 珠 蛋白 与 7 一 珠 蛋 白 的 合成 起 始 。 到 出 生 时 ,血红 蛋白 主要 由 肝 合 成 ,是 由 两 个 a- 珠 蛋白 链 与 两 个 y 一 珠 蛋 白 链 组 成 的 四 体 (胎儿 血红 蛋白 ,fetal hemoglobin,HbF)。 在 成 体 中 ,a-- 珠 蛋白 继续 合成 ,但 在 怀孕 30 星期 和 出 生 12 星期 后 ,y 一 珠 蛋 白 的 合成 下 降 而 B- 珠 蛋 和 白 与 $- 珠 蛋 白 的 合成 上 升 。 血 红 蛋 白 产 生 的 首要 位 点 从 肝 转 移 到 骨 人 。 成 体 血红 蛋白 (adult hemoglobin ) 主 要 是 HbA(oB ) ,HbA2 (ob ) 占 整体 的 一 小 部 分 ( 约 2% )。 199 ， 血红 蛋白 的 失常 有 三 种 形式 :血红 蛋白 病 (hamoglobinpathies)( 珠 蛋白 链 的 结构 性 质 改变 ,导致 产生 了 不 正常 的 血红 蛋白 多 肽 链 ) ;地 中 海 贫血 (thalassemias)( 珠 蛋白 合成 的 量 的 减少 ,使 - 珠 蛋 白 链 与 B 一 珠 蛋 白 链 之 间 出 现 不 平衡 ) ;发 育 失常 (破坏 了 珠 蛋 白 表 达 的 发 育 时 间 相 )。 这 些 失常 ， 效果 从 无 症状 到 致命 各 不 相同 , 阑 明了 很 多 不 同类 型 的 突变 的 病理 效果 。 点 突变 产生 的 变异 珠 蛋白 ”很 多 不 同 的 珠 蛋 白 变异 体 产 生 于 错 义 突变 ,在 - 珠 蛋白 链 与 B= 珠 蛋白 链 中 超过 50% 的 残 基 都 被 发 现 有 替代 。 很 多 替代 在 对 血红 蛋白 功能 的 影响 上 是 中 性 的 ,而 有 一 些 是 病理 性 的 ,因为 干扰 了 血红 蛋白 的 三 级 结构 或 进行 构象 改变 的 能 力 ,从 而 改变 了 分 子 对 氧 的 亲和力 或 干扰 了 分 子 与 血红 素 的 结合 。 最 常见 的 病理 性 替代 是 将 B- 珠 蛋 白 链 的 第 6 位 密码 子 从 GAG 改变 为 GTG( 谷 氢 酸 被 VAL 取代 )。 产 生 的 血红 蛋白 (HbS) 在 脱氧 状态 下 更 易 发 生 分 子 间 的 黏附 。Hbs 在 低 氧 张力 下 结晶 ,形成 僵硬 的 镰刀 状 的 红细胞 ,会 阻 断 毛细 管 床 ,损伤 内 脏 。 在 突变 的 纯 合 个 体 中 ,这 种 细胞 的 破坏 导致 了 严重 的 镰 细胞 贫血 (sickle-cell anemia)。HbSs 的 等 位 基 因 是 很 稀少 的 ,但 在 某 些 非 洲 国家 存在 多 态 性 ,因为 正常 基因 与 HbS 基因 的 杂 合 子 对 更 严重 的 并 疾 有 抗 性 (参见 超 显 性 选择 ) 。 虽 然 杂 合子 携带 有 HbS 基因 ,但 很 少 显示 出 症状 一 一 只 有 在 氧气 张 力 特别 低 的 情况 下 ( 镰 状 细胞 性 状 ,sickle-cell trait) 。 将 收集 的 细胞 暴露 于 极端 的 条 件 下 ,可 以 识别 出 携带 者 。 其 他 在 珠 蛋 白 编码 区 发 生 的 突变 可 分 为 移 码 突变 ,无 义 突 变 和 通读 突变 。 移 码 突 变 与 无 义 突 变 如 果 发 生 在 编码 区 域 的 3 端 就 会 产生 变异 的 珠 蛋 白 ,如果 发 生 在 5 端 就 会 由 于 严重 的 平 截 与 功 能 丢失 ,产生 地 中 海 贫 血 。Cranston 血红 蛋白 包含 一 变异 的 B- 链 ,其 3 端的 移 码 (在 密码 子 144 与 145 之 间 两 个 核 苷 酸 的 插入 ,GA) 引 起 了 终止 密码 子 的 通读 。 产 生 的 多 肽 链 比 正常 的 长 10 个 残 基 。Constant spring 血红 蛋白 由 一 个 通读 突变 产生 ,此 突变 使 c- 珠 蛋 白 链 的 终止 密码 子 从 UAA 变 成 CAA。 这 种 变异 型 比 正常 的 c 一 珠 蛋 白 链 长 31 个 残 基 。 重复 DNA 序列 重组 后 产生 的 变异 珠 蛋白 ”重复 序列 之 间 的 错 排序 列 交换 (不 对 称 交 换 , 或 不 对 称 姐妹 染色 单 体 交 换 ) 既 可 能 产生 在 单个 珠 蛋 白 基 因 中 的 小 的 重 排 , 也 可 能 产生 包括 整个 珠 蛋 白 基因 艇 的 大 的 重 排 。 位 于 B- 珠 蛋白 的 第 91 一 94 位 密码 子 与 第 9%6 一 98 位 密码 子 之 间 序 列 GCTG- CACGTG, 其 同 向 重复 拷贝 之 间 偶 尔 会 发 生 不 对 称 交 换 。 这 导致 了 一 条 链 的 15 个 核 苷 酸 的 缺失 与 另 一 条 链 的 同样 序列 的 插 人 ,这 样 仍然 保持 了 阅读 框架 ,产生 了 变异 珠 蛋白 Gun Hill。 整 个 基因 的 错误 排列 导致 的 不 对 称 交换 产生 杂种 珠 蛋白 融合 链 。 最 常见 的 重 排 包括 准 一 珠 蛋 白 与 B- 珠 蛋 白 之 间 的 不 对 称 交 换 , 产 生 血 红 蛋 白 Kenya( 具 有 准 一 珠 蛋 白 的 N 端 与 B- 珠 蛋白 的 C 端 区 域 , 见 下 图 )。 这 个 事件 还 使 ;$- 珠 蛋 白 基 因 缺 失 并 引起 了 遗传 性 的 胎儿 血红 和 蛋白 的 延续 。 不 同 的 Hb Kenya 亚 型 反映 了 交换 的 不 同 的 可 能 位 点 。 对 于 每 一 个 Hb Kenya 染色 单 体 ,都 有 另 一 个 带 有 互补 交换 产物 的 染色 单 体 :Hb 反 Kenya 带 有 By^-- 珠 蛋白 的 融合 链 (此 染色 单 体 上 还 包含 一 复制 的 8- 珠 蛋 白 基 因 )。 引起 地 中 海 贫血 的 突变 地中海 贫血 源 于 珠 蛋 白 基 因 失去 表达 ,此 可 能 由 大 范围 的 缺失 或 更 敏 感 的 突变 所 引起 。 血 红 蛋 白 的 可 溶性 与 携 氧 能 力 依赖 于 分 子 中 -与 B- 珠 蛋白 数目 的 化 学 计量 关系 。 在 一 地 中 海 贫 血 中 ,只 能 提供 B- 珠 蛋白 ;在 B- 地 中 海 贫血 中 ,只 能 提供 w- 珠 蛋白 。 在 这 两 种 情况 中 , 仅 存 的 珠 蛋 白 仍 试图 形成 四 体 , 但 这 种 四 体 缺 少 氧 载体 并 且 会 形成 不 溶 的 复合 物 。 因为 在 体内 有 两 个 多 余 的 "- 珠 蛋白 基因 ,所 以 只 有 当 三 个 甚至 全 部 四 个 等 位 基因 都 丢失 的 情况 下 , 才 会 发 生产 重 的 "- 地 中 海 贫血 。 大 部 分 "- 地 中 海 贫血 是 由 w- 珠 蛋白 基因 对 之 间 的 不 。 2000， 等 交换 或 染色 单 体 断裂 造成 的 缺失 所 引起 的 。 偶 尔 ,基因 功能 的 丢失 是 由 一 更 加 敏感 的 突变 造成 的 ,如 移 码 突变 ,但 这 在 B 一 地中海 贫血 中 更 加 常见 ,因为 只 有 一 个 B- 珠 蛋白 基因 。 很 多 情况 下 -地中海 贫血 是 由 点 突变 引起 的 。 包 括 在 B- 珠 蛋白 基因 启动 区 的 突变 ,5 无 义 突变 和 移 码 突 变 ， 在 多 聚 腺 苷 化 位 点 发 生 的 突变 与 在 内 含 子 中 发 生 的 突变 会 阻止 剪 切 。 更 不 寻常 的 例子 包括 在 B- 珠 蛋 白 基 因 的 密码 子 26 位 的 错 义 突变 ,使 谷 氨 酸 变 成 赖 氨 酸 。 虽 然 这 是 一 个 非 保守 的 突变 ,但 推 测 它 应 产生 一 变异 的 血红 有 蛋 白 而 并 非 引 起 地 中 海 贫 血 。 然 而 ,这 个 突变 又 在 B- 珠 蛋白 基因 中 引 人 了 一 个 潜在 的 剪接 位 点 ,引起 了 错误 剪 切 的 发 生 , 使 野生 型 的 B- 珠 蛋白 的 量 下 降 到 正常 水 平 的 50% 一 60% 。 由 于 点 突变 或 染色 体 变 异 影响 单个 珠 蛋 白 基 因 产 生 单 地 中 海 贫血 ,而 珠 蛋 白 基 因 座 控制 区 域 ( 人 参阅 ) 的 缺失 会 导致 多 地 中 海 贫血 ,因为 这 种 区 域 负责 基因 艇 中 所 有 基因 的 高 水 平 的 协 调转 录 。 如 B- 珠 蛋白 LCR 的 缺失 引起 sy 88B- 地 中 海 贫血 。 遗传 性 的 胎儿 血红 蛋白 的 持续 出 现 (HPFH) 在 正常 成 体 中 ,胎儿 血红 蛋白 占 血红 蛋白 总 量 的 1% 以 下 ,因为 在 发 育 过 程 中 存在 Y- 珠 蛋 白 基因 表达 向 B- 珠 蛋白 的 转变 。 然 而 在 HPFH 病例 中 ;正常 发 育 的 转换 失效 导致 HbF 占 细胞 中 血红 蛋白 总 量 的 20% 一 100% 。HPFH 的 缺失 形式 与 B- 地 中 海 贫血 同时 发 生 , 即 部 分 或 全 部 B- 和 8$- 珠 蛋 白 基 因 及 其 控制 元 件 的 缺失 使 正常 的 转换 无 法 发 生 , 在 这 种 情况 下 ,HbF 可 以 补偿 成 体 血 红 蛋 白 的 缺少 从 而 导致 HPFH( 然 而 ,并 非 所 有 的 缺失 型 的 B= 地 中 海 贫血 中 都 发 生 HPFH) 。 另 一 些 HPFH 的 例子 与 缺失 无 关 , 反 映 了 启动 子 中 使 转换 不 能 正常 发 生 的 突变 。 另 外 ,也 有 报道 HPFH 的 病例 ,未 发 现在 B- 珠 蛋白 的 基因 簇 中 有 突变 ,这 证 明 存 在 基因 簇 外 的 调节 元 件 。 E YY 从 5 B 错 排 列 的 YE YAB Hb Kenya 文 框 1$.2 ”人 类 疾病 中 的 致 病 的 三 密码 子 重复 三 密码 子 重复 综合 征 ”很 多 人 类 疾病 ,包括 亨廷顿 氏 舞蹈 症 , 肌 强直 营养 障碍 及 脆性 X 染 色 体 综合 证 都 表现 出 复杂 的 家 谱 , 其 特征 如 :不 完全 外 显 ,变化 的 表现 度 及 前 发 性 (anticipation)( 遗 传 疾 病 在 延续 的 子 代 中 有 症状 严重 并 且 发 病 时 期 提早 的 趋势 )。 在 1990 年 ,对 脆性 X 染 色 体 综合 症 基 因 FMR1 的 序列 分 析 辨 明 7 5 非 翻 译 区 的 一 串联 重复 三 密码 子 区 域 ,(CGG)” 的 多 态 区 域 。 在 正 常 的 个 体 中 ,重复 拷贝 数目 少 于 50 ,而 在 患者 中 ,此 区 域 延伸 并 且 包 含 超过 1000 的 拷贝 。 从 那 时 起 ,10 种 另外 的 三 密码 子 重复 综合 征 (tripet repeat syndroms) 被 鉴定 。 三 类 三 密码 子 重 复 综合 征 ”脆性 染色 体 综 合 征 是 典型 的 开 类 三 密码 子 重复 综合 征 , 其 三 密码 子 重复 出 现在 非 编码 DNA 区 域 并 且 富 含 GC。 致 病 的 三 联 重复 的 延伸 数目 的 变化 较 大 (从 正常 的 50 一 100 拷贝 到 超过 2500 拷贝 ) ,这 是 通过 染色 质 的 再 塑 及 DNA 甲 基 化 抑制 了 转录 产生 的 。 享 廷 顿 氏 舞 蹈 症 是 [类 三 密码 子 重复 综合 征 : 重 复 的 三 密码 子 (CAG) ” 位 于 基因 的 编码 区 ,编码 一 串 谷 叶 区 县 ， 氨 酰 氨 残 基 。 致 病 的 三 联 重复 的 延伸 数目 的 变化 较 小 (从 正常 的 10 一 30 拷贝 到 40 一 100 拷贝 )。 转录 不 受 延 伸 的 影响 ,突变 的 效应 可 能 作用 于 蛋白 功能 的 水 平 上 。 在 肌 强 直 营 养 障碍 症 中 ,在 3 UTR 中 发 现 有 (CTG)” 重复 ,数目 从 小 于 50 拷贝 到 超过 3000 拷贝 。 它 似乎 既 不 影响 转录 也 不 影 响 多 肽 链 结构 ,其 致 病 机 制 可 能 是 通过 中 和 了 能 在 转录 中 能 识别 三 密码 子 重复 顺序 的 特异 RNA 结合 蛋白 。 已 鉴定 到 几 种 CUG 结合 蛋白 ,延伸 的 重复 序列 可 能 与 它们 结合 并 阻止 它们 与 正常 情 况 下 的 靶 RNA 序列 结合 。 重复 延伸 的 机 制 ”基因 内 串联 重复 的 不 稳定 本 质 正好 解释 了 在 三 密码 子 重复 综合 征 中 观察 到 的 复杂 的 家 谱 情况 。 有 可 能 重复 数目 较 小 的 变化 是 由 DNA 复制 中 的 链 滑 动 引 起 的 ,但 较 大 的 重 复数 目 增加 可 能 涉及 不 同 的 机 制 ,如 不 等 交换 或 姐妹 染色 单 体 不 等 交换 。 前 发 性 反映 了 一 且 重 复 数目 达到 一 严格 的 前 突变 (premutation) 阔 值 就 会 发 生 重复 延伸 的 强烈 倾向 。 在 肌 强 直 营 养 障碍 证 中 ,这 个 冰 值 处 于 40 一 50 拷贝 的 较 罕 的 范围 中 ,而 在 脆性 X 染 色 体 综合 征 , 阔 值 是 350 一 200 拷贝 。 一 且 重 复 延 伸 到 此 拷贝 数目 ,就 有 很 大 的 可 能 性 继续 导致 致 病 性 延伸 ,缩短 的 可 能 性 较 低 。 这 种 倾向 性 的 本 质 还 属 未 知 。 文 框 1$S.3 ”随机 ,定向 与 编程 突变 细菌 中 随机 和 定向 突变 ”突变 是 否 仅仅 随机 发 生 , 为 自然 选择 提供 原材料 ,还 是 它们 是 对 选择 压力 作出 的 反应 。 突 变 的 随机 、 非 定向 的 本 质 于 1943 年 Lucia 和 Delbruck 的 仿 德 变异 测试 (fluctu- ation test) 首 次 表明 。 细 菌 在 优化 的 条 件 下 培养 几 代 后 移 人 严峻 的 培养 环境 (用 鸣 菌 体 T1 来 感染 细菌 )。 抗 鸣 菌 体 的 突变 株 在 培养 几 代 后 分 离 得 到 。 如 果 突 变 是 随机 发 生 的 ( 即 不 依赖 于 叹 菌 体 感染 ) ,一 些 培养 的 细菌 可 能 包含 较 少 的 鸣 菌 体 抗 性 细胞 (因为 在 实验 中 突变 发 生 较 晚 ) ,而 另 一 些 可 能 包含 较 多 (因为 突变 发 生 较 早 ,在 暴露 于 鸣 菌 体 之 前 已 发 生 )。 相 反 , 如 果 突 变 作为 对 鸣 菌 体 感染 的 反应 而 发 生 ,所 有 的 培养 物 应 该 包含 相同 数目 的 抗 性 细胞 。 实 验 结果 表明 在 不 同 培养 物 之 间 抗 性 细胞 的 数目 有 较 大 的 差异 ,说 明 突变 是 随机 发 生 的 。 在 1988 年 ,Cairn 提供 证 据 表 明 Lac - 菌株 (乳糖 利用 的 营养 缺陷 型 细菌 ) 在 提供 乳糖 的 情况 下 转变 为 野生 型 的 速度 大 大 超过 正常 情况 。 其 他 的 研究 者 也 在 另外 的 营养 缺陷 型 中 发 现 类 似 结 果 。 这 些 结果 表明 在 突变 更 适合 于 环境 时 ,细菌 可 使 特定 基因 发 生 定 向 的 突变 , 即 突 变 作 为 选择 压力 的 反应 而 发 生 。 自 从 这 些 实验 的 结果 发 表 后 ,对 定向 突变 的 概念 有 争议 ,对 于 这 样 的 过 程 的 机 理 与 进化 后 果 都 有 热烈 的 论战 发 生 。 在 哺乳 类 细胞 中 随机 和 定向 基因 扩 增 当 培 养 的 哺乳 类 细胞 用 药物 处 理 来 抑制 特定 的 酶 时 , 抗 性 细胞 可 以 被 分 离 到 并 生长 。 抗 性 的 克隆 可 暴露 在 渐次 增加 浓度 的 药物 中 ,药物 的 量 远 远 超 过 起 始 的 细胞 群落 的 致死 量 ,仍然 能 分 离 到 抗 性 细胞 。 例 如 ,药物 氨 甲 蝶 叭 是 叶酸 的 类 似 物 , 它 是 二 氢 叶酸 还 原 酶 (DHFR) 的 竞争 性 抑制 剂 。 野 生 型 细胞 对 0. lpg ml-1 的 氮 甲 蝶 叭 敏感 ,但 经 过 逐步 的 选择 ,可 以 分 离 到 能 耐 受 1mg ml :的 氨 甲 蝶 叭 的 细胞 ,这 个 量 比 野生 型 致死 量 高 五 个 数量 级 。 对 抗 性 细胞 的 DNA 进行 分 析 ,发 现 有 些 是 在 DBFR 基因 中 发 生 了 简单 的 突变 ,使 酶 对 抑制 剂 的 敏感 性 下 降 , 有 些 突变 发 生 在 另外 一 些 基 因 中 ,限制 氨 甲 蝶 叭 的 吸收 。 然 而 ,更 多 的 是 扩 增 了 DEFR 基 因 座 ,在 经 过 几 轮 筛选 的 高 抗 性 细胞 中 ,这 个 基因 座 可 能 扩 增 上 千 倍 。 在 这 种 高 选择 性 的 细胞 的 染色 体制 备 中 ,可 以 观察 到 扩 增 区 域 形 成 一 延伸 的 染色 体 带 (均匀 染色 区 ,homogeneously staining … region ) ,或 形成 小 的 特别 的 染色 体 被 称 为 双 微 体 (double minute)。 偶 尔 , 扩 增 的 区 域 会 易 位 到 其 他 的 染色 体 中 。 表面 上 看 , 当 药 物 剂 量 上 升 药物 抗 性 基因 扩 增 的 现象 似乎 是 选择 压力 下 定向 突变 的 例子 。 然 而 ,在 第 一 轮 筛 选 后 ,在 起 始 的 野生 型 的 群落 中 只 有 极 少数 细胞 (1:107) 能 存活 ,这些 代表 随机 发 生 DHFR 基因 座 的 扩 增 的 细胞 。 哺 乳 类 基因 组 的 任何 区 域 扩 增 的 自发 发 生 率 都 很 低 , 而 筛选 过 程 富 集 了 培养 物 中 那些 已 发 生 有 益 扩 增 的 细胞 。 这 些 细 胞 一 旦 被 分 离 并 产生 抗 性 克隆 ,其 中 的 一 些 细 胞 可 能 发 生 进 一 步 的 扩 增 并 经 过 第 二 轮 药物 处 理 被 筛选 出 来 ,这 个 步骤 渐次 重复 进行 下 去 。 扩 增 单位 ( 扩 增 子 ,amplicon) 往 往 很 大 (大 于 100kb) 并 且 除 了 DHFR 基因 座 以 外 还 包含 很 多 两 侧 的 序列 ,可 能 还 包括 基因 组 其 他 部 分 或 其 他 染色 体 上 的 DNA。 重 复 不 是 同 源 的 :它们 长 度 不 同 并 且 经 历 了 重 排 。 一 旦 选择 压力 移 去 它们 变 为 不 稳定 。 基 因 扩 增 可 能 包括 很 多 混杂 和 动态 的 重组 事件 或 期 外 复制 (unscheduled replication) ,其 机 制 并 未 完全 了 解 清楚 。 非 选择 性 的 两 侧 序列 的 共 扩 增 可 被 开发 用 于 哺乳 类 表达 克隆 (参见 扩 增 载体 )。 基 因 扩 增 作为 原 癌 基 因 过 度 表达 的 主要 机 制 在 癌 细 胞 中 也 可 观察 到 ( 见 第 18 章 原 癌 基 因 与 癌 )。 发 育 中 的 编程 扩 增 ”如同 在 所 有 细胞 都 会 发 生 随机 扩 增 并 可 以 通过 药物 处 理 来 筛选 或 在 癌 中 通过 体 细胞 自然 选择 而 筛选 到 扩 增 突变 体 ,在 发 育 中 特定 的 扩 增 事件 会 以 编程 方式 发 生 。 编 程 扩 增 的 对 象 包括 很 多 两 栖 动物 的 rRNA 基因 ,这 些 基 因 以 小 DNA 环 的 形式 从 基因 组 中 被 切 离 , 还 有 果 蝇 的 卵 壳 基 因 会 在 基因 组 内 选择 性 地 扩 增 。 有 关 编 程 扩 增 的 进一步 讨论 , 见 第 6 章 发 育 , 分 子 机 制 。 体 细胞 超 变 ” 体 细胞 突变 的 一 个 清楚 的 例子 是 体 细胞 超 变 (somatic hypermutation) :在 了 细胞 发 育 中 ,通过 向 核 苷 酸 序列 中 导入 变化 来 改变 胚 系 免疫 球 和 蛋白 DNA。 在 人 类 与 小 鼠 中 , 体 细 胞 超 变 特异 地 发 生 在 免疫 球 蛋 白 已 经 重 排 与 表达 的 B 细胞 中 :这 是 亲和力 成 熟 (affinity maturation) 的 机 理 , 即 抗体 与 特定 抗原 的 亲和力 的 提高 。 在 绵羊 中 ,未 重 排 的 免疫 球 蛋 白 基 因 发 生 超 变 以 提供 较 分 散 的 抗体 基本 的 所 有 组 成 成 分 (repertoire) 。 由 于 较 低 级 的 兰 椎 动物 具 有 很 少 组 合 与 连接 的 多 样 性 但 仍 发 生体 细胞 超 变 (参见 V(D)J 重 组 ) ,看 来 体 细胞 重组 的 开始 的 作用 是 产生 一 级 多 样 性 。 体 细胞 超 变 的 机 制 仍 属 未 知 ,但 已 鉴别 到 一 超 变 募集 的 同一 位 点 ,并 有 几 条 线索 暗示 了 它 与 转录 的 联系 。 很 多 工作 集中 在 小 鼠 Igk 位 点 ,转基因 Igk 被 广泛 应 用 在 对 这 个 过 程 的 研究 中 ,因为 它们 可 以 作为 体 细胞 超 变 的 底 物 。Igk 基因 的 体 细胞 超 变 的 区 域 起 始 于 重 排 V 片断 的 前 导 内 含 子 上 游 区 域 中 ,延伸 通过 V 和 本 片断 并 进入 J-C 内 会 子 中 (参见 免疫 球 蛋 白 基 因 )。 然 而 ,突变 较 大 程度 地 被 限制 在 对 应 于 可 变 区 的 DNA 中 ,在 高 变 区 即 抗体 实际 上 与 抗原 接触 的 部 分 簇 集 。 共 有 核 苷 酸 序列 RGYW 被 认为 是 超 变 募集 位 点 的 一 部 分 ,因为 很 多 (但 非 全 部 ) 这 种 位 点 是 区 域 超 变 的 热点 。 对 丝氨酸 密码 子 分 布 的 研究 表明 胚 系 免疫 球 蛋白 通过 进化 使 超 变 集中 于 高 变 区 。 丝 氢 酸 由 两 个 不 相关 的 密码 子 家 族 编码 :AGY( 超 变 同一 序列 的 部 分 ) 与 TCN( 不 是 超 变 序列 的 部 分 )。 在 免疫 球 蛋白 位 点 中 ,丝氨酸 密码 子 的 使 用 有 偏向 性 ,AGY 密码 子 倾向 于 出 现在 高 变 区 ,而 TCN 密码 子 在 别处 。 而 在 不 发 生 超 变 的 工 细 胞 受 体 基 因 中 ,TCN 在 V 区 的 各 处 出 现 。 超 变 区 域 位 于 Igk 转录 单位 中 , 且 超 变 显 示 了 独特 的 链 极 性 ,这 些 数据 表明 超 变 与 转录 相 偶 联 ,可 能 以 转录 偶 联 DNA 修复 ( 参 阅 ) 相 同 的 方式 进行 。 与 转录 的 联系 的 进一步 的 证 据 来 自转 基 因 实 验 , 表 明了 k 轻 链 增强 子 是 超 变 所 要 求 的 ,但 启动 子 与 V 片断 的 大 部 分 可 被 异 源 序列 替代 仍 可 作为 超 变 的 底 物 。 在 超 变 中 具有 明确 作用 的 反 式 因子 还 未 被 鉴别 ,一 种 可 能 的 候选 物 是 TFIIH 一 一 基本 的 转录 因子 ,在 转录 偶 联 DNA 修复 中 起 核心 作用 。 现 有 的 模型 认为 TFIIH 可 吸 引 易 出 错 的 DNA 聚合 酶 到 超 变 位 点 ,在 下 一 轮 的 DNA 复制 中 导 和 人 核 苷 酸 替 代 。 “3 文 框 1$.4 第 二 位 点 突变 抑制 与 增强 第 二 位 点 突变 (second site mutation) 是 在 初始 的 第 一 位 点 突变 (primary site muta- tion) 以 外 发 生 的 突变 , 它 可 以 改变 由 第 一 位 点 突变 决定 的 表 型 。 当 第 一 突变 的 效应 被 第 二 突变 所 改善 ,这 种 现象 被 称 为 抑制 (suppression) ; 当 效 应 被 加 强 , 这 种 现象 被 称 为 增强 (enhancement)。 第 一 位 点 突变 也 可 被 环境 所 抑制 ,例如 , 链 霉 素 可 通过 减少 翻译 的 忠实 度 模 拟 信 息 抑 制 ( 见 下 文 ); 这 被 称 为 表 型 抑制 (phenotypic suppression ) ( 另 见 表 型 ) 。 在 表 型 水 平 上 ,抑制 的 效应 等 同 于 回复 突 变 。 然 而 只 有 在 抑制 中 ,效应 的 成 分 才 可 被 重组 即 突变 位 点 之 间 的 交换 所 分 离 。 在 同一 基因 中 的 抑制 因子 基因 内 抑制 (intragenic suppressors) 或 内 源 抑 制 (internal suppressors) 指 第 二 位 点 突变 发 生 在 第 一 位 点 突变 的 同一 基因 中 (参考 等 位 互补 ), 它 表现 为 顺 式 作用 通过 使 某 些 结构 缺陷 改良 来 保持 野生 型 表 型 ,如 在 某 处 发 生 了 单个 核 苷 酸 的 插 人 导致 移 码 的 第 一 突变 , 附 近 的 单个 核 苷 酸 的 缺失 就 可 作为 抑制 因子 来 恢复 原来 的 阅读 框 。 在 密码 子 内 抑制 (intracondon suppressors) 的 特殊 例子 中 , 第 二 位 点 突变 与 第 一 位 点 突变 发 生 在 同一 密码 子 中 ,通过 恢复 密码 子 原来 的 含义 或 将 非 保 守 突 变 改 变 为 保守 突变 来 补偿 第 一 位 点 突变 。 在 不 同 基因 中 的 抑制 因子 ”基因 间 抑 制 或 基因 外 抑制 或 外 抑制 基因 (intergenic or extragenic or external suppressors) 指 第 二 位 点 突变 与 第 一 位 点 突变 发 生 在 不 同 基 因 中 。 基 因 外 抑制 的 效应 不 是 基因 水 平 的 补偿 ,而 是 产物 水 平 的 补偿 ( 即 它们 反 式 抑制 功能 )。 在 某 些 例子 中 基因 外 抑制 因子 可 能 进行 生理 性 补偿 (例如 ,无 法 合成 一 种 重要 的 酶 如 酷 氨 酸 合成 所 需 的 酶 的 功能 缺失 突变 ,可 能 被 另 一 基因 中 发 生 的 能 更 有 效 地 从 环境 中 吸收 栈 氨 酸 的 第 二 位 点 突变 所 补偿 )。 在 另外 的 情况 下 ， 基因 外 抑制 因子 可 用 于 鉴别 与 其 相互 作用 蛋白 的 基因 ,筛选 非 联系 的 抑制 因子 突变 体 已 广泛 用 于 这 个 目的 ( 另 见 双 杂 交 系 统 )。 基 因 外 抑制 是 非 等 位 相互 作用 的 一 种 形式 (参阅 ) 另 见 互补 。 信息 抑制 因子 信息 抑制 因子 (informational suppressors) 或 称 超 抑制 因子 (supersuppressors) 通 过 在 相应 的 tRNA 的 反 密 码 子 环 (参阅 ) 内 引 和 人 突变 来 补偿 错 义 无 义 甚 至 小 的 移 码 突变 的 基因 间 抑 制 因子 ,这 样 使 突变 的 编码 区 域 仍 然 按 野生 型 的 密码 解读 。 无 义 抑制 因子 根据 它们 改变 为 有 义 密 码 子 的 无 义 密码 子 的 类 型 被 分 为 琥珀 抑制 因子 (amber suppressors) ,乳白 抑制 因子 (opal suppres- sors) 和 赭石 抑制 因子 (ochre suppressors) 。 因 为 RNA 基因 一 般 出 现在 很 多 拷贝 中 ,一 个 信息 抑制 因子 的 出 现 不 会 导致 所 有 终止 密码 子 的 错误 替换 ;因此 野生 型 基因 的 终止 正常 发 生 并 且 机 体 可 以 存活 。 增强 突变 ”第 二 位 点 突变 增加 了 原来 突变 表 型 的 严重 程度 ,这 个 过 程 被 描绘 为 增强 (enhance- ment) ,这 种 突变 被 称 为 增强 突变 (enhancer mutation) 。 如 同 抑制 因子 可 能 是 顺 式 或 基因 内 2 的 ,也 可 能 是 反 式 或 基因 间 的 ,后 者 可 鉴别 相互 作用 的 基因 产物 。 增 强 突变 不 可 与 增强 子 (参阅 ) 一 种 顺 式 作用 调节 元 件 混 消 。 ( 徐 兴 译 ) 1) 原 文 误 写 为 “基因 间 的 "(intergenic) ,应 为 基因 内 的 (inteagenic) 。 一 一 译 者 注 “4 ” 基本 概念 及 定义 。DNA 及 RNA 被 称 为 核酸 (nucleic acids) ,是 由 核 苷 酸 单 体 构成 的 多 聚 体 。 核 苷 酸 是 含 氮 碱 基 连 接 到 磷酸 化 的 糖 环 上 形成 。 糖 环 由 $ 一 3 磷酸 二 酯 键 相连 接 ,形成 一 条 固定 但 有 极 性 的 主 链 , 碱 基 伸 出 于 主 链 之 外 。 核酸 多 聚 体 携带 碱 基 的 性 质 及 其 排列 顺序 组 成 了 遗传 信息 。 特 定 碱 基 间 可 相互 作 用 形成 互补 配对 ,使 核酸 具有 双 螺 旋 结 构 、 可 充当 模板 及 识别 同 源 序 列 。 并 以 此 为 基础 进行 复制 .重组 和 基因 表达 (人 参阅) 这些 重要 的 生命 过 程 。 双 螺 旋 核 酸 的 构象 依赖 于 碱 基 序列 ,拓扑 限制 ,不同 的 外 界 环境 及 与 蛋白 质 相 互 作 用 。 这 种 构象 多 态 性 (conformational polymorphism ) 与 碱 基 序 列 本 身 的 多 态 性 一 样 , 对 核酸 的 功能 有 重要 作用 。 DNA 是 细胞 的 遗传 物质 , 它 主 要 以 双 链 形式 存在 - 这 使 它 特 别 适 合作 为 遗传 物质 的 载体 , 即 信息 的 蓝本 (blueprint) ,因为 它 能 够 通过 模板 的 自我 修复 保持 遗传 信息 的 完整 性 〈 见 第 14 章 诱 变 和 DNA 修复 ) 。 细 胞 内 的 RNA 从 DNA 转录 而 来 , 它 主要 以 单 链 形式 存在 ,通过 折 丢 形成 复杂 的 二 、 三 级 结构 。 胞 内 存在 几 类 RNA ,分 别 行 使 不 同 的 功能 , 主要 参与 遗传 信息 的 表达 ( 表 16.1)。 病 毒 的 基因 组 既 可 以 是 DNA 也 可 以 是 RNA ( 见 第 30 章 病 毒 )。 16.1 核酸 的 基本 结构 核 苷 酸 的 结构 ” 核 苷 酸 是 核酸 的 基本 重复 单位 ,由 碱 基 \ 糖 及 磷酸 三 部 分 组 成 。 核 苷 酸 在 细胞 内 有 多 种 功能 ,如 :作为 能 量 的 载体 ,神经 递 质 或 作为 第 二 信使 ( 见 信 号 传导 )。 碱 基 (bases) 是 碱 性 含 握 杂 环 化 合 物 喀 啶 (pyrimidine) 及 哇 叭 (purine) 的 衍生 物 (图 16.1)。DNA 和 RNA 都 含有 四 种 主要 碱 基 (major bases) ,其 中 腺 味 叭 (adenine) 、 乌 味 叭 (guanine) 及 胞 喀 了 啶 (cytosine) 是 两 者 共有 ,此 外 尿 喀 啶 (uracil) 为 RNA 特有 ,胸腺 喀 喧 (thymine) 为 DNA 所 特有 。DNA 含有 胸腺 喀 啶 可 能 是 进化 过 程 中 形成 的 , 它 避 免 了 由 于 胞 喀 啶 脱 氨 基 形 成 尿 喀 啶 产生 的 突变 (参见 5- 甲 基 胞 喀 啶 )。 在 DNA 及 RNA 中 都 含有 稀有 了 碱 基 (minor bases， 如 次 黄 苷 ) , 它 可 直接 来 源 于 聚合 过 程 ,也 可 能 是 聚合 后 修饰 的 结 果 。( 参 见 DNA 修饰 ,tRNA,RNA 编辑 , 碱 基 类 似 物 )。 碱 基 可 以 多 种 异 构 体形 式 存 在 ， 它们 形成 氢 键 的 能 力 各 不 相同 ,因而 导致 各 种 突变 的 产生 ( 见 第 14 章 诱 变 和 DNA 修 复 )。DNA 及 RNA 中 的 常见 碱 基 通常 处 于 一 种 相对 稳定 的 异 构 体 状态 (主要 异 构 体形 "209Sy， 式 ,dominant tautomeric form) ,因此 它们 才 被 用 以 携带 遗传 信息 。 表 16.1 细胞 内 RNA 主要 与 次 要 的 功能 类 型 RNA 的 种 类 功能 主要 类 型 mRNA( 信 使 RNA) ”转录 自 编码 蛋白 质 基 因 的 RNA, 携 带 翻 译 信 息 。 有 些 类 mRNA 的 转录 本 不 能 被 翻译 ,如 : XIST,H19 (参见 亲本 印迹 ) hnRNA( 核 内 不 均一 mRNA 剪接 前 体 。 真 核 基因 经 修饰 的 转录 产物 。 由 于 它 的 大 小 与 了 NA 及 zRNA 相 比 变 RNA) 动 范围 很 大 ,因而 得 名 tRNA( 转 运 RNA) 在 翻译 过 程 中 的 转 接 分 子 。 在 反 转 录 病 毒 复制 的 过 程 中 ,tRNA 可 作为 DNA 复制 的 引物 (参见 反 转 录 病 毒 ) rRNA( 核 糖 体 是 核糖 体 的 主要 结构 组 成 部 分 ,蛋白 质 合成 过 程 所 必需 。 RNA) 次 要 类 型 iRNA( 起 始 RNA) 在 DNA 合 成 中 作为 后 滞 链 合成 引物 的 短 RNA 片段 (参见 复制 ) SnDRNA 核 质 中 的 低 分 子 量 RNA, 富 含 经 修饰 的 尿 喀 了 啶 残 基 , 参 与 内 含 子 的 前 切 及 其 他 加 工 过 程 ( 核 内 小 RNA) 又 称 U-RNA( 富 含 尿 喀 啶 的 RNA) snORNA( 核 仁 小 见于 核 仁 的 低 分 子 量 RNA, 可 能 参与 了 rRNA 的 加 工 过 程 RNA) scRNA( 胞 质 内 小 在 胞 浆 中 发 现 的 有 多 种 功能 的 低 分 子 量 RNA。 例 如 :7SRNA 是 信号 识别 颗粒 的 组 成 部 分 RNA) (参阅 ) ,而 pRNA (prosomal RNA) 是 能 与 近 20 种 蛋白 质 相 互 作用 的 RNA 分 子 ,并 且 发 现在 mRNP 或 称 信息 体 ( 人 参阅 ) 中 , 它 能 与 mRNA 共同 被 包装 ,可 能 对 基因 表达 有 普遍 的 调控 端 粒 酶 RNA 作为 形成 端 粒 (参阅 ) 重 复 序列 的 模板 的 核 RNA, 是 端 糙 酶 (参阅 ) 的 组 成 部 分 SRNA( 指 导 RNA) 在 锥 虫 动 基 粒 中 合成 的 RNA 种 类 ,可 作为 RNA 编辑 过 程 中 的 模板 反 义 RNA (mRNA 反 义 RNA 与 mRNA 互补 ,可 与 其 形成 双 螺 旋 结构 阻 断 蛋白 质 的 合成 。 自 然 产 生 的 反 义 干扰 互补 RNA， RNA 见于 多 种 生物 系统 ,但 在 细菌 中 最 常见 。 可 被 称 为 mRNA 干扰 互补 RNA( 参 见 质 micRNA) 粒 复 制 ,F 转移 区 域 , 和 噬菌体 ,蛋白 质 合 成 调控 及 基因 治疗 ) 核 酶 指 具 有 化 学 催化 功能 的 RNA 分 子 (RNA 酶 )。 它 通常 具有 自我 催化 功能 (参见 自身 剪 切 内 含 子 ), 而 核糖 核酸 酶 P 是 真正 意义 上 的 催化 剂 (参见 tRNA 的 加 工 )。 其 他 的 RNA 与 蛋 白质 共同 发 挥 作用 ,例如 :在 线粒体 DNA 复制 中 的 MRP 内 切 酶 ( 见 第 19 章 细胞 器 基因 组 ) 大 多 数 RNA 是 线性 的 ,但 也 有 分 支 状 的 (如 :在 内 含 子 加 工 过 程 中 的 套 索 结构 ) ,也 有 环 状 的 (如 :类 病毒 及 SRY mRNA; 参 见 性 别 决 定 ) 。 206. Re ee DNA 和 RNA 都 含有 五 碳 糖 (sugar, 戊 糖 ,pentose) ,其 糖分 子 内 部 产生 的 半 缩 酮 基 团 使 之 形成 了 陵 喃 糖 (furanose) 环 结构 [由 于 这 个 结构 与 杂 环 化 合 物 叶 吐 (furan) 相 似 ]( 图 16.1)。DNA 与 RNA 本 质 的 不 同 在 于 它们 含有 的 五 碳 糖 类 别 不 同 :RNA 含有 D- 核糖 (D=ribose) [因而 称 为 核糖 核酸 (ribonucleic acid，RNA)] ,而 DNA 含 有 2 -脱氧 -D- 核糖 (2 - deoxy - D =- ribose) , 即 核糖 2 位 的 凑 基 被 氢 原 子 取 代 ( 因 而 称 为 脱氧 核糖 核 酸 ,deoxyribonucleic acid ,DNA)。 这 一 结构 上 的 微小 差异 使 DNA 和 RNA 的 理化 性 质 有 很 大 不 同 。DNA 由 于 立体 化 学 的 空间 位 阻 (steric hindrance) 而 更 加 坚硬 , 而且 在 碱 性 条 件 下 不 易 水 解 。 这 部 分 解释 了 为 什么 DNA 被 选 作 基本 的 遗传 物质 。 喀 喧 味 只 Im cr 贡 G 世 胞 喀 啶 ”胸腺 喀 啶 尿 喀 喧 采 嗓 只 乌 嗓 叭 二 N 16.1 核酸 中 的 碱 基 及 糖 。 核 酸 中 常见 的 几 种 碱 基 , 胞 喀 啶 、 胸 腺 喀 啶 及 尿 喀 啶 是 杂 环 化 合 物 喀 啶 的 衍生 物 ,而 腺 味 叭 及 鸟 味 叭 是 杂 环 化 合 物 味 叭 的 衍生 物 。 胸 腺 喀 啶 和 尿 喀 啶 结构 相似 , 它 们 都 能 以 相似 的 方式 与 腺 味 叭 配对 (参见 碱 基 互 补 配对 )。 所 以 DNA 中 的 胸腺 喀 喧 在 RNA 中 可 为 尿 喀 啶 所 替代 。 图 中 也 显示 了 DNA 中 的 稀有 碱 基 :5- 甲 基 胞 喀 啶 及 肌 苷 。D-- 核糖 及 2 -- 脱 氧 -D= 核 糖 被 称 为 叶 喃 糖 , 因 为 在 结构 上 它们 与 杂 环 化 合 物 叶 喃 相似 。 图 中 标 出 了 常规 的 环 上 原子 的 记 数 法 ,为 了 与 碱 基 的 记 数 系统 相 区 别 , 糖 环 上 的 记 数 加 了 ””。 碱 基 连接 于 五 碳 糖 的 Cl 位 形成 核 昔 (nucleosides) 。 糖 的 Cl 碳 原 子 与 喀 啶 的 N! 氨 原 “ 子 相 连接 或 与 味 叭 的 N? 所 原子 相连 (图 16.2) ,形成 8-N- 糖苷 键 (B-N-glycosidic bond) 。 核 苷 的 命名 法 与 碱 基 有 一 些 不 同 ( 表 16.2)。 核 苷 酸 (nucleotides) 是 核 苷 的 磷酸 酯 。 酯 化 可 发 生 在 核 苷 酸 的 任何 游离 羟基 ,但 在 核 酸 中 最 常 发 生 在 5 和 3 位 点 。 磷 酸 基 通 过 磷酸 一 酯 键 (phosphomonoester bond) 与 糖 环 相连 ,再 通过 磷酸 苷 键 (phosphoanhydride bonds) 可 顺序 连接 多 个 磷酸 基 团 (图 16.2)。 5“= 三 磷酸 核 苷 是 核 苷 酸 合成 时 的 底 物 。 两 个 羟基 可 通过 同一 磷酸 基 团 酯 化 形成 环 化 核 苷 酸 (cyclic nucleotide) ,例如 : 环 腺 苷 酸 (cCAMP, 3 - 5 - 环 磷 酸 腺 苷 ; 见 第 28 章 信和 号 转 导 )。 ”到 (GD 脱氧 胞 苷 N NH:> oO 作 < 办 必 、 Sai DC N N O 7 这 HO OH Phosphoanhydride bond 腺 苷 酸 (AMP) 1 _diphosphae(ApP ”5'- 二 磷酸 腺 苷 CC NHn N AR 人 D om 一 守 D .triphosphate (ATP) 三 磷酸 腺 苷 环 腺 苷 酸 图 16.2 核 苷 和 核 苷 酸 。(a) 两 个 核 苷 的 化 学 结构 图 中 显示 了 连接 糖 与 碱 基 的 糖苷 键 。(i) 腺 味 聆 核 苷 : 含 味 叭 的 核糖 核 苷 。(ii) 脱氧 胞 喀 喧 核 苷 : 含 喀 啶 的 脱氧 核 苷 。(b) 单 磷 酸 腺 味 叭 核 苷 酸 ( 腺 苷 酸 ) 及 其 二 磷酸 ,三 磷 酸 衍生 物 , 图 中 显示 磷酸 基 团 的 命名 法 。 并 标明 了 单 酯 键 及 磷酸 苷 键 的 位 置 。(c) 环 状 核 苷 酸 : 环 腺 嗓 叭 单 磷酸 。 表 16.2 碱 基 及 其 核 苷 、 核 苷 酸 衍生 物 的 命名 规则 (括号 内 为 缩写 ) 碱 基 核 苷 核 苷 酸 (以 腺 味 叭 衍生 物 为 例 ) 一 磷酸 核 苷 二 磷酸 核 苷 三 磷酸 核 苷 核 苷 酸 残 基 在 缩写 中 ,脱氧 核糖 的 核酸 及 核 苷 酸 衍生 物 的 区 别 在 于 前 级 '“d'。 当 需要 特别 说 明 时 , 核 苷 及 核 苷 酸 前 绥 为 r , 例 如 ATP= dATP。 只 有 第 二 个 缩写 字母 可 区 分 $ 及 3 磷酸 ,5 磷酸 残 基 置 于 碱 基 之 前 (如 pA 是 指 $“ 单 磷酸 腺 苷 ) ,3“ 磷 酸 残 基 置 于 碱 基 之 后 (如 Ap 是 指 3 单 磷酸 腺 苷 )。 胸 腺 喀 啶 衍生 物 前 的 脱氧 前 级 可 以 省 略 , 因 为 它 是 一 种 DNA 特异 性 的 碱 基 , 它 所 含 的 糖 显然 是 脱氧 核糖 。 由 于 胸腺 喀 喧 很 少 出 现 于 RNA 中 ,这 种 表示 方法 也 是 一 种 习惯 用 法 。 当 上 DNA RNA 腺 味 吟 (A) 腺 味 叭 (A) 胞 喀 啶 (C) 胞 喀 啶 (C) 鸟 嘎 叭 (G) 鸟 味 叭 (G) 胸腺 喀 啶 (T) 尿 喀 啶 (U) 脱氧 腺 苷 (dA) 腺 苷 (A) 脱氧 胞 苷 (dC) 胞 苷 (C) 脱氧 乌 苷 (dG) 鸟 苷 (G) (脱氧 ) 胸 苷 (dT) 尿 苷 (U) 5 - 单 磷酸 脱氧 腺 苷 (d4AMP,dpA) 5 一 单 磷酸 腺 苷 或 称 腺 苷 酸 (AMP,pA) -二 磷酸 脱氧 腺 苷 (d4ADP,dppA) 5- 二 磷酸 腺 苷 (ADP,ppA) 5- 三 磷酸 脱氧 腺 苷 (dATP,dpppA) 5- 三 磷酸 腺 苷 (ATP,pppA) 脱氧 腺 苷 酸 腺 苷 酸 下 文 很 清楚 的 情况 下 ,DNA 及 RNA 的 序列 都 可 以 用 碱 基 序 列 来 表示 。 不 确定 碱 基 表 示 法 :R=A 或 G( 任 何 叮 叭 ); Y=C 或 TU( 任 何 喀 啶 ); K=G 或 T; M=A 或 C; S=G 或 C( 三 键 , 强 相互 作用 ); W=A 或 工 (二 键 , 弱 相 互 作用 ); B=G,T 或 C( 即 非 A); D=G,A 或 T( 即 非 C); H=A,C 或 工 ( 即 非 G); V=A,C 或 G( 即 非 工 )。 = 核酸 的 一 级 结构 核酸 (nucleic acids) 是 核 苷 酸 单元 组 成 的 长 链 ,或 称 多 聚 核 苷 酸 (polynucleotides) ,多 聚 反应 的 底 物 是 三 磷酸 核 苷 ,但 核酸 中 的 重复 单位 ,或 称 为 单 体 ,是 单 磷酸 酯 化 的 (一 磷酸 核 苷 残 基 , 核 苷 酸化 残 基 , 核 背 酸 残 基 )。 在 聚合 过 程 中 , 链 末 端 核 苷 酸 残 基 的 3 羟基 对 即将 挫 人 核 苷 酸 的 "- 磷酸 (也 就 是 最 内 部 的 磷酸 ) 进 行 亲 核 攻击 形 成 一 个 5 一 3 “磷酸 二 酯 键 ($ 一 3"phosphodiester bond) 。 这 一 反应 由 DNA 或 RNA 聚合 酶 催化 (box 26.1) ,同时 形成 副 产 物 焦 磷酸 (参见 DNA 复制 ,转录 )。 多 次 聚合 反应 产生 链 状 聚 合 物 , 它 包 括 固定 的 具有 $ 一 3 极 性 (5 一 3 polarity) 的 糖 - 磷酸 主 链 (sugar - phos- phate backbone) 以 及 向 外 伸 出 的 含 氨 碱 基 。DNA 和 RNA 的 基本 化 学 结构 及 常用 简写 形 式 见 图 16.3 ( 另 参见 RNA)。 过 辫 下 号 品 一 mm 人 证 4T+6f+a4c …pTpGpApc.…，TGAC 图 16.3 一 小 段 DNA(a) 及 RNA(b) 及 基本 化 学 结构 ,图 中 标示 出 了 5 一 3 磷酸 二 酯 键 , 并 显示 了 三 种 一 级 序列 缩写 方法 。 袁 核 苷 酸 (oligonucleotides) 指 较 短 的 核酸 (如 长 度 小 于 <100nt)。 究 核糖 核 苷 酸 在 细 胞 中 天 然 存在 , 它 可 作为 细胞 内 DNA 复制 的 引物 ,也 可 有 其 他 用 途 。 可 用 化 学 方法 合成 守 核 苷 酸 , 它 在 实验 上 有 很 多 用 途 (例如 并 参见 DNA 测序 ,聚合 酶 链 式 反应 , 原 位 杂交 ， 核酸 探 针 ,核酸 杂交 及 基因 治疗 )。 16.2 核酸 的 二 级 结构 碱 基 间 相互 作用 的 两 种 方式 通过 碱 基 间 两 种 非 共 价 结合 力 : 碱 基 配对 及 碱 基 堆 积 , 形 成 了 核酸 的 二 级 结构 (nucleic acid secondary structure) 。 碱 基 配 对 (base pairing) 是 一 种 氢 键 结合 力 ,也 是 使 核酸 链 相互 缔 合 的 主要 作用 力 , 另 外 通过 相 邻 碱 基 x 电子 形成 的 踢 水 作用 力 使 整个 结构 保持 稳定 ,被 称 为 碱 基 堆积 (base stacking) 作 用 力 。 DNA 的 二 级 结 构 是 指 通过 分 子 间 相互 作用 形成 的 双 链 (double - stranded) 或 称 双 螺旋 (duplex) 分 子 "。 209 。 (dsDNA)。RNA 分 子 通常 以 单 链 形式 存在 , 它 的 二 级 结构 反映 了 分 子 内 碱 基 间 的 相互 作 用 。 碱 基 互 补 配对 “Edwin Chargaff 最 早 指出 ,尽管 从 不 同 生物 体 提 取 的 DNA 中 四 种 碱 基 的 丰 度 有 很 大 差别 ,但 腺 味 叭 与 胸腺 喀 啶 的 比值 和 鸟 味 叭 与 胞 喀 啶 的 比值 总 是 相同 的 。 Chargaff 定律 (chargraff's rules) 说 明 A=T 和 G=C。Chargaff 定律 的 分 子 机 制 是 双 链 DNA 中 和 A 与 工 以 及 C 与 G 间 的 碱 基 互补 配对 (complementory base pairing)。 碱 基 间 通 过 和 氢 键 (hydrogen bonds) 形 成 特殊 稳定 的 构 型 从 而 促进 配对 的 形成 。 一 条 链 上 的 嗓 吟 总 是 与 另 一 条 链 上 的 喀 喧 配对, 这样 就 形成 了 由 Jame Watson 和 Francis Crick 提出 的 DNA 双 螺旋 结构 ( 见 下文 )。 氢 键 的 供 体 及 受 体 的 相对 位 置 导 致 了 特异 配对 的 形成 。 A:T 碱 基 对 间 存 在 两 个 氢 键 ( 供 体 - 受 体 对 受 体 - 供 体 ) ,C:G 碱 基 对 间 为 三 个 氢 键 ( 受 体 - 受 体 - 供 体 对 供 体 - 供 体 - 受 体 ) 一 一 见 图 16.4。Watson-Crick 碱 基 配 对 (Watson- Crick base pair) 是 核酸 二 级 结构 形成 的 基础 ,并 解释 了 Chargaff 定律 ,同时 它 也 说 明了 为 什么 DNA 能 够 作为 转录 及 复制 的 模板 (参阅 ) ,能 够 进行 重组 (参阅 ) 以 及 通过 修复 ( 参 阅 ) 维 持 遗 传 信息 的 完整 性 。 在 RNA 中 , 尿 喀 啶 蔡 代 了 胸腺 喀 啶 ,由 于 尿 喀 啶 与 胸腺 喀 啶 有 着 相似 的 化 学 结构 , 它 能 与 腺 味 叭 形 成 同样 的 氢 键 配对 。 两 种 核酸 杂交 遵循 同样 的 规律 。 虽 然 这 类 相互 作用 十 分 广泛 ,但 还 存在 其 他 的 碱 基 配 对 方式 ,在 形成 核酸 二 、 三 多 结构 时 发 挥 着 重要 作用 。 这 将 在 下 文中 讨论 。 图 16.4 Watson-Crick 碱 基 配 对 。 氢 键 位 置 用 虚线 表示 。G- C 对 间 形 成 三 个 氢 键 ,A-T 工 (或 A -U) 对 间 形 成 二 个 氢 键 。 因 而 G- C 对 更 加 稳定 (参见 GC- 含量 , 热 解 链 曲 线 )。 其 他 形式 的 碱 基 配对 Watson-Crick 碱 基 配对 对 于 核酸 结构 维持 及 功能 的 发 挥 至 关 重 要 。 然 而 , 碱 基 间 两 个 氨 键 有 28 种 可 能 的 排列 方式 ,这 使 得 碱 基 间 的 相互 作用 也 可 有 多 种 形式 。 在 各 种 可 变 构 型 中 ,最 有 意义 的 是 Hoogsteen 碱 基 配 对 (Hoogsteen base pairs ) ， 它 在 了 NA 结构 及 三 螺旋 结构 的 形成 中 起 重要 作用 。 摆 动 配对 (wobble pairs) 是 对 Wat- son-Crick 碱 基 配 对 的 重要 补充 , 它 允 许 tRNA 反 密 码 子 上 $? 端 第 一 个 碱 基 与 mRNA 中 的 碱 基 不 完全 配对 (参见 遗传 密码 ,摆动 假说 ) 。 碱 基 在 Watson-Crick 碱 基 配 对 中 的 位 置 发 生 偏 移 , 失 去 一 个 氢 键 后 产生 了 摆动 配对 现象 。 DNA 双 螺 旋 1953 年 ,Jame Watson 和 Francis Crick 通过 X 射线 衍射 实验 研究 (由 Maurice Wilkins 及 Rosalind Franklin 提供 DNA 纤维 标本 ) ,解析 了 DNA 双 链 (double- stranded DNA) 结 构 (dsDNA)。 双 链 DNA 通常 由 两 条 反方 向 平行 (antiparallel) 的 单 链 ( 即 $ 一 3“ 的 极 性 相反 ) 围 绕 一 公共 轴 旋 转 形成 右手 双 螺旋 。 由 糖 - 磷酸 重复 单位 构成 了 螺旋 的 主 链 (back bone) , 碱 基 向 螺旋 的 内 部 伸展 ,对 应 的 碱 基 间 可 形成 穿 过 螺旋 中 轴 “0 的 氢 键 。 由 碱 基 配 对 及 相 邻 碱 基 间 (r- r) 堆 积 力 维持 双 螺 旋 结构 的 稳定 。 碱 基 位 于 螺 旋 内 部 , 受 外 界 环境 的 影响 较 小 〈 使 遗传 信息 免 受 各 种 理化 因素 的 影响 , 见 突变 及 DNA 修复 )。 由 于 碱 基 间 的 相互 作用 使 得 螺旋 的 表面 并 不 是 光滑 的 ,而 是 有 较 宽 的 大 沟 (ma- jor groove) 及 较 军 的 小 沟 (minor groove) 相 间 隅 ,这 有 利于 序列 特异 的 蛋白 质 与 DNA 间 的 相互 作用 ( 见 第 17 章 核酸 结合 蛋白 )。 表 16.3 三 种 主要 DNA 螺旋 类 型 的 形态 特征 、 扭 转角 及 螺旋 参数 的 比较 构象 A B 4 形态 特征 螺旋 方向 右 右 左 螺 距 (每 圈 碱 基数 ) 11 10 12 大 沟 深 , 守 宽 - 它 小 沟 宽 , 浅 罕 窗 , 很 深 螺旋 直径 2.3nm 1.9nm 1.8nm ” 扭 转 参数 糖 环 构象 C2 内 式 C3 内 式 交替 糖苷 键 角 反 式 反 式 反 式 和 顺 式 交替 螺旋 参数 位 移 一 4.4 0.6 3 扭转 33 36 -49/- 10 正 乔 2.6 3.4 357 倾斜 22 -2 -7 由 于 B-DNA 中 的 位 移 及 倾斜 很 小 ,其 中 的 碱 基 与 螺旋 轴 是 垂直 的 (图 16.5)。 图 16.5 A-DNA,BDNA 及 CDNA 双 螺旋 的 结构 。 在 体内 ，B-DNA 形式 占 绝 大 多 数 。M 指 大 沟 ,m 指 小 沟 ,G 指 Z-DNA 中 的 单一 的 沟 。( 引 自 :DNA 复制 , Kornberg 及 Bader(1992), WH Freeman ,New Yorko。) 以 上 DNA 双 螺 旋 的 结构 特征 是 由 长 的 DNA 纤维 得 到 的 ,因而 是 普遍 的 性 质 ,没有 考虑 由 特殊 碱 基 序列 结构 引起 的 局 部 的 扰动 。 而 且 除 了 被 称 为 BDNA 的 最 前 见 的 双 螺 旋 结 构 ,体内 也 存在 着 不 同 结构 的 螺旋 形式 ( 见 下 文 ) 。 多 种 螺旋 构象 ” 对 DNA 三 级 结构 的 研究 表明 ,在 不 同 的 湿度 下 DNA 可 呈现 不 同 螺旋 /全 > 构 型 ( 异 构 体 ,conformers) (通常 用 大 体形 态 , 键 角 及 螺旋 参数 来 描述 螺旋 构象 , 见 文 框 16.1)。A-DNA 及 B-DNA 都 为 右手 螺旋 , 但 A- DNA 较 宽 ,每 圈 螺 旋 含 有 更 多 碱 基 , 而 且 比 上 面 描绘 的 经 典 的 BDNA 刚性 强 。 这 反映 了 螺旋 的 盘 绕 方式 及 碱 基 平 面 倾 角 的 差 异 , 以 及 由 于 脱水 作用 使 碱 基 对 离开 了 螺旋 轴 。 构 型 的 改变 使 螺旋 表面 大 沟 、 小 沟 的 形状 也 起 了 变化 ,从 而 影响 了 和 蛋白质 与 DNA 间 的 相互 作用 。 在 生理 状况 下 , 双 链 RNA 和 RNA:DNA 杂交 体 都 处 于 A 型 结构 ,因此 它们 比 DNA 缺乏 柔 志 性 。A 型 的 DNA 比 也 型 难以 溶解 , 这 就 是 为 什么 过 度 干燥 的 DNA 会 很 难 溶 解 ,如 在 提取 质粒 时 会 遇 到 的 那 样 。 由 于 分 析 方 法 的 改进 以 及 合成 特定 窒 核 苷 酸 能 力 的 提高 ( 见 上 文 ) ,已 经 观察 到 许多 不 同 构 型 的 DNA 螺旋 结构 。 它 们 基本 上 可 分 为 三 类 ,前 述 的 A 型 及 也 型 以 及 Z 型 ( 表 16.3 及 图 16.5)。 早 期 对 由 味 叭 - 喀 喧 交替 组 成 的 寡 核 苷 酸 的 研究 发 现 了 左手 螺旋 构 型 的 ZDNA。 它 的 结构 特征 为 以 两 个 碱 基 对 为 周期 交替 出 现 的 螺旋 参数 与 扭转 角 ,这 使 螺 旋 的 主 链 成 为 锯齿 状 (这 也 是 ZDNA 名 称 的 来 源 )。 由 此 可 见 ,Z-DNA 的 重复 单位 为 两 个 碱 基 对 而 不 是 像 ADNA 和 B-DNA 中 的 一 个 碱 基 对 。 尽 管 由 味 叭 - 喀 啶 交替 组 成 的 窒 核 苷 酸 ,如 oligo-dGdC,oligo-dAdC ,都 是 形成 ZDNA 的 良好 底 物 ,但 现在 还 不 知道 这 一 序列 特异 性 是 否 为 形成 ZDNA 的 充分 条 件 或 必要 条 件 。 在 过 度 扭 曲 的 DNA 中 易于 形 成 ZDNA 的 构 型 ,并 由 脱水 作用 而 稳定 ,这 在 基因 表达 的 调控 中 可 能 起 重要 作用 ( 见 转 二 DNA 结构 中 的 局 部 可 变性 ”对 春 核 苷 酸 唱 体 的 分 析 表 明 ,与 DNA 长 纤维 有 很 大 不 同 ， 不 同 的 碱 基 顺 序 产生 差异 很 大 的 螺旋 参数 ,这 是 由 于 不 同 的 序列 影响 螺旋 与 扭转 参数 以 得 到 最 稳定 的 碱 基 堆 积 及 配对 方式 。 从 这 个 角度 来 说 ,B-DNA 柔韧 性 较 大 ,由 于 特异 碱 基 序 列 可 形成 各 种 不 同 的 局 部 构 型 。 这 也 提示 ,DNA 的 构 型 并 不 是 一 成 不 变 的 ,而 是 可 以 在 不 同 构 型 间 转 换 。 就 某 一 种 特定 的 构 型 来 说 ,也 存在 着 局 部 多 态 性 ,如 :由 于 局 部 多 态 性 而 形成 的 DNA 弯曲 及 螺旋 转换 (helical transitions， 指 在 一 个 分 子 中 出 现 的 由 一 种 螺旋 形式 突然 转换 为 另 一 种 形式 ,如 :B-Z 转 换 )。DNA 弯曲 (DNA bending) 是 由 于 局 部 碱 基 序列 的 不 同 由 碱 基 堆积 作用 引起 的 固有 的 性 质 , 可 表现 为 各 向 同性 (isotropic, 无 偏 性 ) 或 各 向 异性 (anisotropic, 因为 DNA 向 某 特定 方向 折 和 到)。 在 富 含 AT 区 及 与 螺旋 周期 相 一 致 的 GGCC 重复 区 ,DNA 倾向 于 形成 弯曲 构 型 。 蛋 白质 ( 见 核酸 结合 蛋白 ) 及 环 化 (参见 DNA 拓扑 学 ) 都 可 诱导 DNA 弯曲 的 形成 。 在 DNA 组 装 形成 染色 体 ( 见 染色 质 ) 及 复制 、 重 组、 转录 (参阅 ) 的 过 程 中 被 诱导 DNA 弯曲 都 是 必 不 可 少 的 。 蛋 白质 可 能 可 识别 处 于 某 种 特定 弯曲 构 型 的 DNA (如 拓扑 异 构 酶 )。 RNA 及 非 双 链 DNA 的 二 级 结构 “在 RNA 及 DNA 的 单 链 区 ,其 二 级 结构 是 由 分 子 内 的 碱 基 配对 决定 的 。 但 是 细胞 内 的 DNA 通常 以 双 链 形式 存在 ,能 够 形成 分 子 内 配对 的 碱 基 很 少见 。 与 此 相反 ,在 胞 内 RNA 中 ,分子 内 形成 二 级 结构 的 情况 很 常见 ,并 且 是 它 们 行使 功能 的 分 子 基 础 。 在 基因 的 表达 及 调控 过 程 中 ,RNA 的 二 级 结构 起 了 主要 作用 ; rRNA 与 mRNA 间 的 碱 基 配 对 控制 着 蛋白 质 合 成 的 起 始 ,tRNA 与 mRNA 间 的 碱 基 配 对 促进 了 翻译 过 程 ,RNA 发 夹 结构 及 茎 环 结构 控制 了 转录 的 终止 ,翻译 的 效率 以 及 mRNA 的 稳定 性 。RNA-RNA 间 的 碱 基 配 对 在 内 含 子 的 前 切 过 程 中 也 起 着 重要 作用 ( 见 转录 ， 5 RNA 加 工 ,蛋白 质 合成 各 章 )。 表 16.4 列 出 了 几 种 主要 的 分 子 内 核酸 二 级 结构 。 与 DNA 相似 , 局 部 碱 基 序列 特 征 对 RNA 的 构 型 也 有 影响 ,而 且 , 相 对 较 高 的 修饰 碱 基 含量 使 RNA 的 结构 更 加 多 变 。 表 16.4 核酸 分 子 链 间 二 级 结构 元 件 二 级 结构 定义 凸 起 及 凸 环 在 双 螺 旋 的 一 条 链 上 有 额外 碱 基 时 出 现 的 畸形 结构 。 思 起 (bulges) 是 由 于 多 出 了 单 个 碱 基 。 吓 环 是 由 于 多 出 一 个 以 上 的 碱 基 。 它 破坏 了 邻近 碱 基 的 堆积 力 ,诱导 形 成 弯曲 ,增加 了 DNA 大 沟 的 柔顺 性 。 双 链 DNA 中 的 凸 起 和 凸 环 是 由 于 插 人 形成 的 ( 见 第 14 章 诱 变 和 DNA 修复 )。 内 部 环 ( 泡 ) 在 双 链 结构 中 由 于 一 个 或 多 个 碱 基 错 配 形成 的 畸形 结构 。 在 RNA 中 ,内 部 环 或 泡 与 蛋白 的 识别 位 点 有 关 。 发 夹 结 构 , 茎 环 结构 具有 不 完善 的 两 侧 对 称 结构 的 区 域 形 成 的 二 级 结构 。 两 段 互补 的 序列 可 配对 形成 茎 干 , 它 可 能 完全 互补 形成 发 夹 (hairpin) ,也 可 能 末端 有 未 配对 的 碱 基 形 成 莹 环 结构 (stem loop) ,发 夹 - 环 结构 (hairpin-loop)。 由 于 环 内 特殊 的 碱 基 配 对 及 碱 基 堆 积 力 ， 三 到 四 个 碱 基 形成 的 环 特别 稳定 。 在 许多 生物 系统 中 ,发 夹 结构 及 茎 环 结构 都 是 有 重要 生物 功能 的 元 件 ,包括 tRNA 和 RNA 的 结构 ,转录 终止 ,调控 翻译 及 病毒 基因 组 的 包装 ,说明 这 一 结构 是 RNA- 蛋白 的 相互 作用 位 点 。 柄 环 结构 一 段 线 型 的 核酸 :其 末端 是 互补 的 可 形成 一 段 短 的 双 链 区 ,分子 的 其 余部 分 形成 环 状 结构 。 十 字形 结构 在 具有 两 侧 对 称 序列 的 双 链 核酸 中 当 两 条 链 都 可 自发 形成 发 夹 或 蕉 环 结构 时 可 产生 这 种 十 字形 结构 。 这 种 结构 是 复制 错误 的 主要 来 源 , 单 链 结合 蛋白 可 抑制 这 种 结构 的 形成 。 套 索 状 结构 (lariats 参阅 ) 通 常 被 归 为 二 级 结构 ,但 由 于 它们 是 由 核 苷 酸 间 的 共 价 键 连接 形成 的 ,所 以 严格 地 说 应 属于 一 级 结构 。 16.3 核酸 的 三 级 结构 DNA 中 的 三 链 相互 作用 核酸 的 三 级 结构 (nucleic acid tertiary structure) 反映 了 对 整 体 三 维 形状 有 影响 的 相互 作用 ,包括 不 同 二 级 结构 元 件 间 的 相互 作用 、 单 链 与 二 级 结构 元 件 间 的 相互 作用 以 及 核酸 的 拓扑 特征 。 在 DNA 中 单 链 与 双 链 及 双 链 与 双 链 之 间 的 三 级 相互 作用 形成 了 三 链 或 四 链 结构 。 鸟 嘎 叭 可 形成 碱 基 四 聚 体 (base tetrads) ,从 而 使 含有 一 段 多 聚 鸟 苷 酸 的 DNA 可 形成 四 螺旋 结构 , 它 可 能 与 端 粒 结构 的 形成 有 关 ( 参 阅 )。 单 链 DNA 可 与 双 链 DNA 分 子 中 的 碱 基 发 生 相 互 作 用 ,通过 双 链 DNA 的 大 沟 第 三 条 链 与 双 链 中 的 一 条 链 的 碱 基 间 形成 非 Watson-Crick 配对 ,从 而 自发 形成 DNA 三 链 结构 。 对 朝 核 苷 酸 与 双 链 DNA 相互 作用 的 研究 使 人 们 首次 认识 到 三 链 螺旋 的 存在 ,并 且 发 现 了 四 种 常见 的 包括 Hoogsteen 碱 基 配 对 碱 基 三 阳 体 (base triples)。 含 有 同 聚 味 叭 / 同 聚 喀 啶 序列 的 DNA 可 通过 Hoogsteen 碱 基 配 对 形成 分 子 内 三 链 结构 , 称 为 H-DNA (由 于 质子 化 而 得 名 )。 形 成 HDNA 的 生理 意 义 目前 还 不 清楚 ,但 有 证 据 表明 它 与 某 些 基因 的 调控 有 关 , 如 哺乳 动物 中 的 CAP-43( 参 见 三 链 螺旋 治疗 )。 当 发 生 DNA 重组 时 , 单 链 DNA 侵入 DNA 双 螺 旋 也 可 形成 三 链 = DNA 结构 。 由 于 拓扑 结构 的 限制 ( 见 下 一 章 ) ,侵入 链 必 须 与 双 螺旋 中 的 一 条 链 配 对 而 不 能 缠绕 于 其 上 ,形成 一 种 称 为 平行 汇 接 (paranemic joint) 的 结构 ,这 种 结构 必须 通过 与 蛋 白质 相互 作用 才能 达到 稳定 状态 。 这 一 过 程 包括 双 链 DNA 的 较 大 程度 的 解 螺 旋 或 形成 左手 或 右手 螺旋 交替 的 片段 (V-DNA)。 如 果 侵 入 链 有 一 自由 末端 或 有 较 强 拓扑 异 构 酶 活性 , 则 它 能 与 双 链 中 对 应 的 互补 链 形成 正常 双 螺 旋 以 形成 相 缠 汇 接 (plectonemic joint ) 结构 ,而 双 链 中 的 另 一 条 链 则 游离 出 来 形成 替代 环 (displacement loop,D-loop)。 当 从 双 链 DNA 转录 RNA 这 一 过 程 被 原 位 固定 下 来 时 ,可 形成 类 似 的 被 称 为 R- 环 的 三 级 结构 。 这 种 情况 可 在 ColE1 质 粒 复制 的 引发 阶段 发 生 ( 见 第 20 章 质粒 )。 在 DNA 重组 过 程 中 也 可 以 形成 才 利 迪 连 接 体 (Holliday junctions) ,这 是 一 种 由 四 条 链 形成 的 三 级 结构 (参见 同 源 重组 )。 RNA 的 三 级 结构 RNA 的 单 链 、 环 状 结构 及 双 螺 旋 间 的 相互 作用 产生 了 RNA 复杂 的 高 级 结构 。 例 如 ,在 tRNA 中 就 有 碱 基 三 聚 体 、 部 分 三 链 螺旋 、 茎 连接 体 (stem junctions， 由 两 个 或 多 个 双 螺 旋 区 结合 而 成 ) 及 假 结 (pseudoknots, 由 RNA 单 链 与 蔡 环 结构 相互 作 用 而 形成 ) 等 三 级 结构 。 RNA 的 折 肥 与 蛋白 质 折 肆 相 似 ,通常 是 在 分 子 伴 侣 (参阅 ) 的 控制 下 完成 。RNA 只 有 具有 复杂 的 三 级 结构 才能 成 为 有 生物 活性 的 分 子 。 象 蛋白 质 一 样 ,RNA 也 能 催化 特定 的 化 学 反应 。 这 种 有 催化 活性 的 RNA 称 为 核 酶 (ribozyme)。 一 些 核 酶 具有 自身 催化 功 能 (如 : 自 剪 接 内 含 子 的 转录 ,参阅 )。 其 余 的 需要 反 式 激活 ,包括 核糖 核酸 酶 P 及 来 自 于 植物 类 病毒 (参阅 ) 的 锤 头 核 酶 (hammerhead ribozyme) 家 族 。 锤 头 核 酶 的 名 称 来 源 于 其 催化 结构 域 的 三 级 螺旋 结构 ( 另 参见 基因 治疗 )。 DNA 的 拓扑 结构 ”拓扑 学 是 数学 的 一 个 分 支 , 它 主 要 研究 物质 几何 结构 的 特性 ,这 种 特性 与 形状 大 小 无 关 , 并 且 不 会 由 于 变形 而 改变 。 如 果 双 链 DNA 分 子 有 自由 末端 ,这 两 条 链 可 按 能 量 最 低 的 原则 相互 缠绕 ,分 子 处 于 松弛 (ralexed ) 状 态 。 在 松弛 状态 时 ,一 条 链 缠绕 另 一 条 链 的 环 数 称 为 双 链 盘 绕 数 (duplex winding number)。 如 果 分 子 中 导入 上 额 外 的 缠绕 使 双 螺旋 过 度 缠绕 (overwound) ,此 时 被 称 为 连接 数 (linking number) 的 总 螺旋 环 数 大 于 双 链 盘 绕 数 。 相 反 , 如 果 由 于 外 界 环境 的 作用 使 双 螺旋 缠绕 不 足 (under- wound) ,此 时 的 双 链 盘 绕 数 就 大 于 连接 数 。 在 这 两 种 情况 下 , 双 螺 旋 都 可 通过 一 条 链 相 对 于 另 一 条 链 的 旋转 来 恢复 到 松弛 态 。 对 于 闭环 双 螺 旋 来 说 ,由 于 不 存在 自由 未 端 ,连接 数 就 成 为 其 拓扑 学 特征 一 一 它 不 随 形状 变化 而 变化 ,只 有 当 双 螺旋 DNA 断裂 成 为 开 环 状态 时 才能 改变 这 一 特征 。 当 闭环 DNA 处 于 过 度 缠 绕 或 缠绕 不 足 状 态 时 , 它 只 能 通过 螺旋 轴 自 身 的 盘 绕 形成 超 螺旋 (supercoiling) 来 缓解 扭曲 的 张力 。 超 螺旋 是 核酸 的 四 级 结 构 的 另 一 种 形式 , 它 主 要 涉及 扭转 张力 对 双 螺 旋 形 状 的 影响 而 不 是 链 之 间 的 相互 作用 ( 文 框 16.2)。 超 螺旋 的 生理 意义 在 于 自由 状态 的 DNA 通常 是 没有 生物 活性 的 。 许 多 重要 的 生物 过 程 需要 引入 负 超 螺旋 ,如 :复制 ,转录 及 重组 的 过 程 。 超 螺 状 态 的 DNA 储存 了 驱动 这 些 反 应 所 需 的 能 量 。 真 核 细胞 的 染色 体 是 线性 的 ,通过 支架 蛋白 将 两 端 固定 于 结构 蛋白 ， 然后 染色 质 自身 盘 绕 导入 拓扑 学 张力 。 核 小 体 的 结构 使 真 核 细 胞 的 DNA 维持 负 超 螺旋 形式 (参见 染色 质 环 ,基质 结合 区 域 ,DNA 拓扑 异 构 酶 ,位 点 专 一 性 重组 )。 ”过 到 “ 核酸 的 四 级 结构 ”在 许多 结构 中 核酸 以 反 式 作用 (如 :核糖 体 ,剪接 体 ) ,这 可 看 作 是 核 酸 的 四 级 水 平 的 结构 。 核 酸 还 可 与 多 种 蛋白 质 相互 作用 (如 :基因 组 结构 蛋白 ,转录 因子 ， 酶 及 剪接 因子 ) 。 这 些 蛋 白质 的 大 部 分 对 DNA 或 RNA 的 构象 有 显著 影响 。 与 蛋白 质 的 相互 作用 可 能 是 序列 特异 的 ,也 可 能 是 普遍 的 ,并 可 能 引起 DNA 结构 或 多 或 少 的 改变 。 例如 ,限制 性 内 切 酶 EcoR 工 及 EcoR V 都 可 在 其 识别 序列 处 引起 DNA 明显 的 纽 结 ,这 可 能 对 其 内 切 酶 活性 有 促进 作用 。HMEG 家 族 的 蛋白 质 可 使 与 其 结合 的 DNA 弯曲 从 而 有 利于 结合 于 DNA 不 同位 置 的 蛋白 质 间 的 相互 作用 。 关 于 核酸 与 蛋白 质 间 的 相互 作用 的 进一步 讨论 见 第 17 章 核酸 结合 蛋白 。 文 框 16.1 螺旋 的 形态 ,参数 及 扭转 角度 螺旋 的 形态 DNA 和 RNA 螺旋 根据 其 大 致 形态 来 分 类 。 其 标准 包括 螺旋 直径 ,螺旋 方向 (heli- cal sense) , 螺 距 (pitch, 指 每 一 图 的 碱 基数 ) ,及 大 ,小 沟 的 宽度 和 深度 。 大 沟 和 小 沟 起 初 是 根据 它们 在 BDNA 中 的 相对 大 小 来 定义 的 。 然 而 ,由 于 在 构象 紧张 的 情 况 下 ,它们 的 大 小 是 可 以 改变 的 ,所 以 还 需要 有 更 精确 的 定义 。 大 沟 被 定义 为 含有 喀 啶 的 C 或 嗓 叭 的 N" ,而 小 沟 包 含 喀 啶 的 O' 或 嘎 叭 的 NT 。 扭转 角度 ”构象 结构 的 细节 可 用 糖 - 磷酸 骨架 , 叶 喃 环 自身 及 糖苷 键 的 各 种 扭转 角度 来 清楚 地 描述 ,可 用 以 下 五 个 键 对 构象 进行 简单 描述 :3(C3 -- C+ ,与 糖 基 平面 有 关 的 键 ) ,X( 糖 苷 键 ) ,7Y(C+ =- Cs ) 及 磷酸 键 和 5。 另外, 这些 键 大 部 分 不 是 彼此 独立 的 ,因而 可 以 不 用 绝对 的 键 角 来 表示 ,而 只 说 明 其 大 概 的 构象 ,例如 用 ”“ 反 式 " 或 " 顺 式 "来 表示 糖苷 键 , 用 C 内 或 C” 内 来 表示 糖 环 的 位 置 。 螺旋 参数 ”可 用 一 套 通用 的 螺旋 参数 (helix parameters) 来 描述 堆积 或 成 对 碱 基 间 的 位 置 关系 。 用 相对 位 移 及 旋转 的 参数 可 描述 在 配对 碱 基 中 的 碱 基 相 对 位 置 ,在 堆积 碱 基 中 相 邻 碱 基 间 相对 位 置 及 碱 基 对 相对 螺旋 轴 的 绝对 位 置 ,这 些 参 数 见 下 表 。 4， 坐标 X 轴 Y 轴 Z 轴 相对 螺旋 轴 的 绝对 位 置 。” X 位 移 Y 位 移 逐个 碱 基 对 的 取代 移 位 (shift) 滑动 (slide) 上 升 (rise) 取代 碱 基 对 中 的 碱 基 切 变 (Shear) 拉 长 (stretch ) 交错 (stagger) 相对 螺旋 轴 的 绝对 扭转 倾斜 角 (Inclination,m) ”倾斜 (Tip,6) 逐个 碱 基 对 的 扭转 倾斜 (Tilt,r) 摇摆 (p) 扭转 (9) 配对 碱 基 间 扭转 弯曲 (k) 螺旋 扭转 (ow) 展开 (c) 5 和 文 框 16.2 DNA 的 拓扑 性 质 的 定量 表示 螺旋 缠绕 数 的 量度 连环 数 (linking number, 工 ) 指 双 螺 旋 中 两 条 链 相互 缠绕 的 次 数 ,在 右手 螺 旋 中 工 为 正 数 。 双 链 缠 绕 数 (duplex winding number，Lo) 指 松 弛 态 DNA 的 连环 数 , 它 代 表 了 DNA 最 低能 量 状 态 的 构象 。 对 B- DNA 来 说 ,平均 Lo= xzV/10.3 ,其 中 ”为 碱 基 对 。 如 果 DNA 为 松弛 态 则 工 = Lo。 任 何 使 DNA 过 度 缠绕 或 羯 绕 不 足 的 情况 都 会 产生 扭曲 张力 。 对 于 开 环 DNA 来 说 (有 自由 末端 的 DNA) ,这 种 张力 以 两 条 链 相 互 间 的 旋转 来 衡量 ,而 对 于 共 价 闭环 DNA ( 环 状 DNA 或 两 个 未 端 固定 的 DNA) 来 说 ,由 于 不 能 反 向 旋转 , 它 的 扭转 张力 必须 以 超 螺旋 的 情况 来 衡量 。 超 螺旋 的 量度 特定 DNA 的 超 螺 旋 程 度 可 用 超 螺 旋 密 度 (superhelical density, 入 ) 来 表示 。 其 计 算 公 式 如 下 : 交 ER (as 了 0) [0 0 超 螺 旋 绕 数 (superhelical winding number,r) 是 指 工 与 世 v 间 的 关 值 。 处 于 过 度 缠 绕 状 态 的 DNA 称 为 正 超 螺 旋 ,* 为 正 值 ;处 于 缠绕 不 足 状 态 的 DNA 称 为 负 超 螺旋 ,r 为 负 值 。r 值 定量 描述 了 分 子 所 承受 的 扭转 张力 及 形成 超 螺旋 的 倾向 ,但 它 并 不 表示 确切 的 超 螺旋 数 ,因为 螺旋 的 螺 距 会 因 捏 转 张力 而 改变 。 超 螺旋 数 可 用 缠绕 数 (writhing number, 友 ) 来 表示 , 它 与 连环 数 工 的 关系 是 : 工 = T+ 本 ,其 中 开 是 扭转 数 (twisting number) , 它 指 DNA 分 子 中 总 的 螺旋 数 。 连 环 数 是 DNA 分 子 的 拓扑 性 质 (在 变 构 时 它 不 会 改变 ) ,所 以 任何 引起 叉 值 的 改变 都 伴 有 T 值 等 值 的 负 向 变化 。 在 一 个 松弛 分 子 中 , 工 = 工 ,因而 太 =0, 所 有 的 缠绕 都 是 由 螺旋 引起 的 。 一 个 单位 的 缠绕 相当 于 0.5 个 单位 的 超 螺旋 , 即 相对 于 DNA 螺旋 轴 旋 转 180"。 当 一 个 超 螺旋 分 子 被 置 于 水 平面 上 时 ,两 个 双 螺旋 交叉 之 处 被 称 为 节 (node) ,这 个 点 可 被 认为 是 一 个 缠绕 单位 。 链 状 排列 及 结 ” 同 闭 环 分 子 的 螺旋 缠绕 特性 一 样 , 链 状 排列 (catenation， 环 状 DNA 的 内 部 交 锁 ) 及 形成 结 (knots) 都 是 DNA 的 拓扑 性 质 , 只 有 打开 闭环 DNA 分 子 才能 破坏 这 种 结构 。 当 DNA 分 子 被 置 于 一 平面 上 时 ,这 两 种 结构 都 会 出 现 由 于 两 条 双 螺 旋 交 叉 而 形成 的 节 。 所 以 ,对 给 定 的 DNA 分 子 来 说 ,总 的 连环 数 可 用 连环 数 加 上 连锁 与 结 的 数目 来 表示 , 即 总 链 环 数 = 工 +C+ 开 。 ( 谍 向 雷 译 ) 2 人 RE 人 第 17 章 核酸 结合 蛋 和 白 基本 概念 和 定义 同 核酸 相互 作用 的 蛋白 特别 重要 ,因为 它们 控制 一 些 非 常 基本 的 生命 过 程 , 这 些 过 程 包括 DNA 复制 ,重组 ,DNA 的 修复 ,转录 ,RNA 的 加 工 和 和 蛋白 合成 。 尽 管 蛋白 核酸 的 相互 作用 在 细胞 中 的 功能 多 样 , 但 是 它们 的 功能 主要 可 分 为 四 类 :(1) 结 构 和 包装 作用 :( 例 如 :染色 体 中 的 组 蛋白 ,细菌 类 核 (bacterial nucleoid) 的 HU , 病毒 的 衣 壳 蛋白 ) ; (2) 运 输 和 定位 作用 :包括 DNA 在 核 仁 中 分 离 和 定位 ,RNA 的 输出 和 定位 ,质粒 的 转移 ;(3) 代 谢 和 重 排 作 用 :( 例 如 :DNA 和 RNA 聚合 酶 ,核酸 酶 , 解 旋 酶 ,DNA 修复 酶 ,重组 酶 ,拓扑 异 构 酶 );(4) 基 因 表 达 作 用 :例如 :(RNA 聚合 酶 ， 转录 因子 ,核糖 体 和 起 始 因子 ,RNA 剪接 装置 ,氨基 酰 RNA 合成 酶 ); 对 于 某 种 蛋 白 ,这 些 功能 中 很 多 是 重 和 到 的 (例如 ,组 蛋白 是 包装 蛋白 ,但 是 又 可 影响 基因 表达 ， 又 如 RNA 聚合 酶 既 可 完成 基因 表达 又 涉及 到 RNA 的 代谢 )。 所 有 的 核酸 在 它们 生活 史 中 的 某 个 时 期 需 同 蛋白 作用 ,并 且 许 多 核酸 以 核酸 蛋白 复合 体 的 形式 存在 。 DNA 通常 以 双 股 长 链 的 形式 存在 ,并 且 有 相对 均一 的 螺旋 结构 ,而 RNA 主要 以 单 链 形式 存 在 ,并且 其 二 级 和 三 级 结构 形式 多 样 。 这 些 差别 同时 也 反映 在 DNA 和 RNA 同 蛋 白 相 互 作 用 的 原理 和 复杂 性 上 。 核酸 结合 蛋白 可 根据 其 底 物 的 特殊 性 分 为 三 大 类 :@ 非 特异 性 结合 蛋白 ;@ 序 列 特 异性 结合 蛋白 ;@@ 结 合 非 正 常 结构 的 蛋白 (例如 在 DNA 中 的 不 正常 碱 基 、 重 组 中 间 体 等 以 及 RNA 中 剪接 套 索 )。 相 互 作 用 的 模型 可 能 涉及 未 端 基 团 的 结合 ,或 将 核 酸 封闭 在 窗 缝 或 环 中 ,大 部 分 核酸 结合 蛋白 在 一 个 内 部 位 点 以 定位 方式 相互 作用 。 常常 涉及 用 作 识 别 因 子 的 蛋白 中 的 特定 的 二 级 结构 ,并 且 往 往 根据 包含 这 些 因 子 组 件 的 结构 ,将 核酸 结合 蛋白 分 成 不 同 的 家 族 。 对 于 DNA 结合 蛋白 ,这 些 组 件 常 常 包 含 一 个 穿越 DNA 大 沟 的 = 螺旋。 与 此 相反 ,8B- 折 和 至 和 其 他 一 些 具有 平 直 的 表面 的 二 级 结构 在 RNA 结合 蛋白 中 出 现 的 频率 更 高 。 蛋白 可 以 同 核 苷 酸 的 主 链 或 碱 基 相 互 作 用 ,在 双 链 分 子 中 , 需 在 大 沟 和 小 沟 处 绪 合 。 许 多 不 同类 型 的 非 共 价 键 被 用 于 蛋白 同 核酸 的 相互 识别 中 , 主要 包括 静电 吸 引 和 和 氢 键 , 主 链 连接 、 氧 键 和 碱 基 连接 。 氢 键 常常 涉及 界面 上 有 序 的 水 分 子 的 使 用 。 和 蛋白 和 核酸 相互 作用 通常 通过 两 种 分 子 的 构象 改变 来 描述 ,这 样 可 产生 最 大 的 互补 作用 表面 ,其 中 包括 一 些 包 埋 的 接触 面 : 范 德 华 力 对 于 相互 作用 十 分 重要 。 序列 特异 性 结合 可 能 是 由 碱 基 所 显示 的 不 同 结合 模式 识别 来 完成 ， 或 者 是 识别 .217 ， 主 链 的 不 同 构 象 。 许 多 序列 特异 的 DNA 结合 蛋白 以 二 聚 体 的 形式 存在 ,这 样 增加 了 核酸 蛋白 相互 作用 的 灵敏 性 和 特异 性 ,并 且 产 生 协 同 结合 的 效应 。 核 酸 结合 蛋白 的 二 聚 化 还 可 以 用 于 增加 识别 的 多 样 性 和 可 调控 的 程度 。 17.1 核酸 被 蛋白 识别 DNA 识别 的 一 般 方 式 ” 胞 内 DNA 主要 以 很 长 的 双 链 分 子 (dSDNA) 形 式 存在 , 同 RNA 不 同 , 双 链 的 总 体 结构 相对 稳定 (参见 双 链 螺旋 ) 。DNA 结合 蛋白 识别 整个 螺旋 分 子 的 几 何 结构 ,通过 接触 大 沟 或 小 沟 (参阅 ) ,连接 不 变 的 核糖 磷酸 主 链 或 碱 基 同 DNA 相互 作 用 。 然 而 ,螺旋 的 构象 是 多 种 多 样 的 ,这 些 不 同 不 仅 可 由 于 外 部 环境 造成 〈 例 如 和 氢 键 ) ,还 可 能 是 局 部 碱 基 堆 集 的 相互 作用 造成 ,这 种 作用 为 顺序 特异 的 。 局 部 结构 的 多 形 性 不 仅 影响 了 碱 基 同 螺旋 轴 之 间 的 关系 ( 见 文 框 6.1 对 螺旋 参数 的 讨论 ) ， 而且 还 影响 了 螺旋 的 周期 性 和 大 沟 ,小 沟 的 大 小 。 碱 基 序列 也 决定 了 DNA 内 在 的 可 弯曲 的 程度 ,局 部 的 变化 可 通过 决定 在 蛋白 结合 时 成 键 原 子 间 的 空间 组 成 和 DNA 可 改变 的 能 力 大 小 ,从 而 控制 了 蛋白 和 DNA 之 间 的 空间 化 学 关系 。 同 双 链 DNA(dsDNA) 结 合 的 蛋白 可 被 分 为 三 类 :@ 同 DNA 未 端 相 互 作用 的 蛋白 (如 DNA 连接 酶 ,外 切 酶 ) ;@ 围 绕 DNA 或 以 深 的 狭 缝 结合 DNA 的 蛋白 (如 DNA 聚合 酶 , 拓 扑 异 构 酶 );G 同 DNA 双 螺 旋 的 表面 作用 的 蛋白 。 前 两 类 酶 包括 了 许多 DNA 加 工 的 酶 ， 而 后 一 类 成 员 最 多 ,包括 大 多 数 转录 因子 ,限制 性 内 切 酶 ,DNA 包装 蛋白 ,位 点 特异 的 重 组 酶 和 DNA 修复 酶 。 因 而 ,后 一 类 蛋白 不 仅 包括 普通 的 和 序列 特异 的 DNA 结合 蛋白 ， 而 且 还 包括 识别 非 正 常 核 酸 结 构 ( 如 损伤 碱 基 等 ) 的 蛋白 。 还 有 一 些 蛋 白 同 单 链 DNA(ss- DNA) 作 用 如 RecA( 参 阅 ) ，SSB( 人 参阅 ) ， 丝 状 吹 菌 体 Ml13 的 衣 壳 蛋白 那些 同 双 螺旋 表面 相互 作用 的 蛋白 通常 具有 一 种 十 分 符合 大 沟 的 基 序 。 这 种 结合 通 过 形成 稳定 结合 的 埋藏 接触 面 使 接触 区 最 大 化 。 侵 入 大 沟 对 于 序列 特异 的 蛋白 结合 是 十 分 重要 的 ,这 样 有 助 于 通过 直接 结合 碱 基 进 行 序列 识别 。 对 于 这 些 相 互 作用 来 讲 ,结合 大 沟 比 结合 小 沟 更 适合 ,因为 它 更 大 (可 容纳 w 螺旋 ,8 带 结 构 , 折 至 链 和 环 状 结构 ) 并 且 键 形式 不 固定 。 相 反 ,在 小 沟 处 ,不 同 碱 基 对 产生 同样 的 成 键 形式 ( 见 下 文 )。 同 磷酸 主 链 的 结合 允许 普遍 性 识别 ,可 以 稳定 同 大 沟 结合 的 结构 ,不 过 ,由 于 局 部 碱 基 顺 序 可 能 会 影 响 主 链 的 三 级 结构 ,因而 同 主 链 结合 也 用 于 序列 特异 结合 。 根据 用 于 DNA 识别 的 结构 基 序 不 同 ( 表 17.1， 和 下 面 章节 ) ,将 DNA 结合 蛋白 分 为 不 同 的 家 族 , 通 常 这 个 基 序 中 包含 着 一 个 侵入 大 沟 的 螺旋 ,但 是 在 另 二 些 家 族 中 ,一 个 B 带 结构 或 环 状 结构 代替 了 a 螺旋 的 作用 ,相互 作用 涉及 到 互补 表面 ,结合 后 可 能 会 改变 构象 以 使 蛋白 和 核酸 的 特异 化 学 基 团 相互 作用 。 虽 然 由 于 碱 基 堆 集 而 成 的 静电 键 , 范 德 华 力 和 分 散 力 对 于 整个 识别 和 稳定 结构 是 十 分 重要 的 ,但 是 从 识别 的 特异 性 来 讲 , 氧 键 是 主要 形式 。 s 老 。 表 17.1 DNA 和 了 RNA 结合 蛋白 中 基本 的 识别 结构 。 这 些 结构 定 义 了 下 文中 讨论 的 蛋白 家 族 。 最 大 的 家 族 (HTH\ 锌 指 和 碱 性 结构 域 家 族 ) 可 以 进一步 分 为 不 同 的 亚 家 族 结构 识别 分 类 学 分 布 举例 DNA-- 结 合 结构 螺旋 一 转角 一 螺旋 o 一 螺旋 所 有 的 大 肠 杆菌 Lac 阻 过 物 , 果 蝇 的 触角 足 蛋 白 HMG 结构 域 a 一 螺旋 真 核 生 物 大 鼠 的 HMG1 锌 指 结构 a 一 螺旋 主要 在 真 核 生 物 ”小 鼠 的 Zif268, 果 蝇 的 Tramtrack 类 固 醇 受 体 家 族 a 一 螺旋 真 核 生物 人 类 维 甲 酸 受 体 ,大 鼠 糖 皮质 激素 受 体 双核 基因 簇 ao 一 螺旋 酵母 酵母 GAL4 碱 性 结构 域 a 一 螺旋 真 核 生 物 酵母 GCN4, 人 类 MyoD, 小 鼠 Max BPV E2 基 序 a 一 螺旋 乳头 瘤 病 毒 BPV E2 蛋白 有 的 大 肠 杆菌 MetJ 阻 晕 物 , 拟 南 章 TATA 结合 蛋白 其 他 片 层 结构 组 蛋白 一 核心 静电 作用 ” 真 核 生物 人 类 TAFr31,TAFrm80 一 接头 a 一 螺旋 人 类 H5 Rel 同 源 蛋 白 环 真 核 生物 NF- kB p50 同 源 二 聚 体 RNA-- 结合 结构 RNP 结构 域 B= 折 午 真 核 生物 ULA snRNP dsRBD 8B= 折 县 所 有 的 果 蝇 的 Staufen 开 =- 同 源 蛋 白 环 真 核 生物 hnRNP 开 缩写 :HMG= 高 泳 动 蛋白 ;TAF=TBP(TATA 结合 蛋白 ) 相 关 因 子 ;BPV= 牛乳 头 状 瘤 病 毒 ;RNP = 核糖 核酸 蛋 白 ;dsRBD= 双 链 RNA 结合 蛋白 ;hnRNP= 核 内 不 均一 核糖 核 蛋白 。 RNA 识别 的 一 般 方 式 “不同 于 DNA, 胞 内 RNA 通常 以 单 链 形式 存在 ,但 往往 折 丢 成 各 种 二 级 结构 (突起 ,发 夹 , 蔡 环 ) ,这 些 结构 可 作为 蛋白 结合 位 点 ,并 且 还 能 形成 更 为 复杂 的 三 级 结构 (三 股 螺旋 , 假 结 )。RNA 这 种 可 形成 高 级 结构 的 能 力 使 其 具有 更 大 的 构象 多 样 性 ,使 RNA 还 具有 了 同 蛋 白质 一 样 的 催化 功能 (参见 核 酶 ) ,这 些 特点 意味 着 RNA-- 蛋 白 相 互 作 用 的 机 理 将 更 为 复杂 。 如 同 DNA 一 样 , 某 些 RNA 结合 酶 特异 性 地 同 末 端 基 团 作用 ,并 将 一 些 底 物 封闭 人 隧道 或 狭 颖 中 。 然 而 大 部 分 RNA 结合 蛋白 以 一 种 局 部 形成 的 方式 同 RNA 进行 普遍 性 或 序列 特异 性 的 相互 作用 。 尽 管 对 于 RNA- 蛋白 作用 的 潜在 复杂 性 ,从 许多 蛋白 RNA 结构 的 最 新 解释 已 经 确立 了 一 些 共 同 的 主题 ( 见 表 17.1 和 下 面 章 节 )。 值 得 特别 注意 的 是 ,B 折 和 春 经 常用 于 相互 识别 的 表面 ,可 能 是 由 于 这 种 结构 使 暴露 的 RNA 碱 基 利 于 伸展 而 更 合适 化 学 结合 , 当 在 RNA 分 子 内 出 现 双 链 RNA 时 ,2 - 羟基 减 小 了 双 螺 旋 的 柔性 ， 这 种 双 螺旋 采用 了 A- DNA 的 典型 构象 (参阅 ) ,在 这 种 结构 中 ,小 沟 宽 而 浅 , 而 大 沟 罕 而 深 , 在 一 些 RNA 病毒 的 衣 壳 蛋白 中 ,就 发 现 它 同 小 沟 作 用 。 但 是 ,由 于 RNA 环 化 或 弯曲 而 导致 扭曲 ,可 以 扩大 大 沟 , 这 样 一 些 典型 的 DNA 结合 结构 ,如 同 源 结 构 域 也 可 以 同 RNA 结合 。 ”9 17.2 蛋白 中 的 DNA 结合 基 序 螺旋 - 转角 - 螺旋 基 序 螺旋 - 转角 -螺旋 (HIH) 基 序 (motif) 是 第 一 个 被 确立 而 被 广泛 研究 的 DNA-- 结 合 结构 。 在 大 肠 杆 菌 和 其 鸣 菌 体 中 ,许多 经 深入 研究 过 的 基因 调控 蛋白 中 发 现 了 经 典 的 HTH。 和 蛋白 -DNA 复合 物 结构 经 X 光 衍射 结晶 和 NMR 方法 解析 成 功 :Lac 阻 遏 蛋白 ,，Trp 阻 遏 蛋 白 、 分 解 代 谢 激活 蛋白 (CAP) , 入 阻 遇 蛋白 入 - Cro， 叭 菌 体 434 阻 遏 蛋 白 , 鸣 菌 体 434 Cro PurR( 人 参见 噬菌体 入 \lac 操纵 子 、 转 录 调 节 - 细菌 ). 还 有 更 多 的 含有 HTH 结构 的 蛋白 在 不 含 DNA 的 情况 下 解析 成 功 。 这 种 基 序 包 含有 两 个 螺旋 ,螺旋 之 间 间 隔 有 一 个 短 的 B 转 角 , 使 两 个 螺旋 可 通过 政 水 作用 装配 起 来 (图 17.1)。 第 一 个 螺旋 稳定 并 使 第 二 个 螺旋 暴露 出 来 ,与 DNA 的 大 沟 作用 ,而 特异 性 地 与 碱 基 接 触 。 因 而 ,尽管 两 个 螺旋 ,或 包含 HTH 的 结构 域 中 的 其 他 残 基 也 可 能 参与 了 同 DNA 的 相互 作用 ,但 第 二 个 螺旋 仍 被 称 为 识别 螺旋 (recognition he- lix)。 上 述 的 相互 作用 锚 定 了 和 蛋白质 中 识别 螺旋 的 位 置 并 稳定 了 DNA 的 构象 ,从 而 调节 了 不 同 蛋 白 和 其 结合 位 点 的 亲和力 。 守 (a) 螺 旋 - 转角 - 螺旋 (b) Cys; - His; 锌 指 ( 光 Per (@) 碱 性 亮 氨 酸 拉链 (d) 带 -螺旋 -螺旋 图 17.1 共同 的 DNA 结 合 基 序 。(a) 从 入 噬菌体 来 源 的 螺旋 - 转角 -- 螺旋 基 序 。(b) 从 爪 蟾 Xfin 来 源 的 CysHis; 锌 指 组 件 。(c) 从 小 鼠 Max 来源 的 亮 氨 酸 拉链 / 婴 旋 - 环 一 螺旋 二 聚 体 基 序 的 a 螺旋 ( 线 代表 了 在 卷曲 的 二 聚 体 界 面 中 的 亮 氨 酸 之 间 的 键 )。(d) 从 鸣 菌 体 P22 Arc 阻 过 物 来 源 的 带 一 螺旋 一 螺旋 基 序 。 箭 头 代表 识别 结构 ,侵入 大 沟 与 碱 基 形成 氢 键 。 二 聚 体 以 阴影 表示 。 典型 的 细菌 HTH 蛋白 有 一 个 高 度 保 守 的 转角 结构 ,包含 有 4 个 残 基 , 其 中 第 二 个 残 基 往 往 为 甘氨酸 ,在 另外 一 些 非 保守 的 细菌 HTH 蛋白 中 [如 ,LexA( 参 阅 ) 和 AraC ], 这 种 限制 是 不 严格 的 。 真 核 细 胞 的 HTH 蛋白 有 着 变化 更 大 的 转角 和 环 结构 ,依据 上 述 特 点 ,总 体 结 构 和 序列 保守 性 ,可 将 蛋白 分 为 许多 家 族 。 最 大 和 研究 最 仔细 的 是 同 源 结构 域 ”全 加 (homeodomain) 家 族 , 同 源 结 构 域 首 先 从 果 蝇 中 的 触角 足 蛋 白 (Anternapidia proteins) 中 被 发 现 , 而 且 这 种 结构 在 许多 控制 内 环境 稳定 (homeostasis) 的 转录 调控 因子 和 发 育 过 程 中 的 决定 区 域 特 异性 的 蛋白 中 占 主导 地 位 (参见 同 源 异 形 基 因 )。 在 DNA 修复 和 染色 体 结 构 的 蛋白 中 , 同 源 结 构 域 蛋 白 也 有 发 现 。 同 源 结 构 域 是 一 个 60 个 氨基 酸 的 保守 结构 域 ， 含有 四 个 螺旋 ,螺旋 工 和 螺旋 焉 之 间 由 有 B 转 角 相 连 并 成 直角 ,左右 形成 了 HIH 基 序 , 螺 旋 亚 作为 识别 螺旋 。 与 含有 HTH 结构 密切 相关 的 结构 包括 POU 特异 结构 域 和 成 对 结构 域 。POU 转录 因子 包含 两 个 HTH 基 序 ,一 个 在 同 源 结构 域 中 , 另 一 个 形成 POU 特异 结构 域 , 它 同 入 阻 过 蛋白 的 HTH 结构 十 分 类 似 。 同 源 结 构 域 和 POU 特异 性 结构 域 之 间 有 螺旋 间隔 的 连 接 臂 ,POU 转录 因子 可 同时 结合 DNA 双 螺 旋 的 对 侧 。 两 个 结构 域 中 的 任 一 个 都 可 单独 结合 DNA, 但 是 同时 结合 增加 了 结合 的 特异 性 和 稳定 性 。 由 于 POU 特异 性 结构 域 首 先 在 脊椎 动物 的 转录 因子 一 一 Pit-1, Oct-1 和 Oct-2, 以 及 线虫 的 Unc- 86 蛋白 中 发 现 , 因 而 用 这 些 基 因 的 首 写字 母 命名 。 同 源 结 构 域 蛋 白 中 的 配对 家 族 (包括 果 蝇 的 配对 和 以 及 很 大 肴 椎 动物 的 Pax 一 一 配 对 盒 一 一 转录 因子 可 能 也 含有 两 个 HTH 基 序 。 配 对 相关 蛋白 含有 第 二 个 HTH 基 序 和 一 个 与 Hin 重组 酶 同 源 的 组 件 ,一 道 组 成 了 独特 的 配对 功能 域 (paried domain) 。 其 他 的 真 核 细 胞 的 HTH 蛋白 还 包括 同 酵母 热 休 克 调 控 因 子 有 关 的 一 大 家 族 以 及 被 称 为 翅 状 螺旋 (winged - helix) 转 录 因 子 的 HNF3/Fork head 的 家 族 。 高 泳 动 蛋白 功能 域 [high mobility group(HMG) domain] 也 包含 着 由 B 转 角 连 接 的 系列 螺旋 的 结构 , 它 存在 于 染色 体 结 构 和 蛋白 和 如 睾丸 决定 因子 Sry 等 转录 因子 中 ,也 由 转角 隔 开 的 几 个 w 螺旋 组 成 。 然 而 折 县 的 几何 学 与 典型 的 HTH 基 序 不 同 。HMG 蛋白 可 以 和 dsDNA 的 小 沟 作 用 。 因 此 它们 属于 与 HTH 蛋白 不 同 的 DNA 结合 蛋白 家 族 。 细菌 和 真 核 细 胞 的 HTH 基 序 在 拓扑 上 近似 ,第 二 个 螺旋 都 作为 识别 螺旋 ,并 且 和 蛋白 中 的 其 他 部 分 帮助 识别 螺旋 同 DNA 的 大 沟 作 用 ( 同时 同 DNA 产生 其 他 的 相互 作用 )。 但 是 ,从 识别 螺旋 在 大 沟 中 的 方向 来 看 是 不 同 的 。 细 菌 的 识别 螺旋 的 N 端 区 域 对 于 结合 是 至 关 重 要 的 ,同时 由 同 源 结 构 域 识 别 螺旋 的 中 部 区 域 完 成 其 结合 功能 。 而 且 , 虽 然 细 菌 识别 螺旋 的 方向 变化 大 (如 在 入 - 阻 遏 蛋白 中 ,其 顺 着 大 沟 排 列 。 而 在 Trp 阻 遏 物 中 , 识 别 螺旋 又 与 大 沟 垂直 ) ,而 同 源 结 构 域 识 别 螺旋 的 方向 是 十 分 保守 的 。 细 菌 的 HTH 蛋白 普遍 以 同 二 聚 体 的 方式 作用 ,识别 DNA 的 回 文 序 列 。 直 至 最 近 , 含 有 同 源 结构 域 的 蛋白 还 被 认为 在 不 对 称 的 位 点 以 单 体 的 形式 作用 。 但 是 ,有 越 来 越 多 的 证 据 表 明 同 源 结构 域 在 体外 可 以 二 聚 化 , 几 种 同 源 结 构 域 的 同 二 聚 体 同 DNA 结合 的 复合 物 和 异 二 聚 体 同 DNA 结合 的 复合 物 的 结构 被 解析 出 来 (例如 果 蝇 的 配对 同 二 聚 体 ,酵母 交配 型 调节 因子 MATal 和 MATa2 的 异 二 聚 体 )。 同 源 结构 域 蛋白 也 可 以 同 非 同 源 结构 域 蛋 白 形 成 二 聚 体 ( 例如 ,MAT2 同 MCMI 二 聚 化 ,而 且 许多 果 蝇 同 源 结构 域 的 辅助 因子 ,如 Teashirt 已 经 被 鉴定 )。 半 胱 氨 酸 - 组 氨 酸 锌 指 锌 指 结构 (zinc finger) 是 第 一 个 被 发 现 的 真 核 细 胞 中 同 DNA 结合 有 关 的 结构 ,并 且 也 是 已 知 存在 最 广泛 的 蛋白 组 件 之 一 ,大 约 占 真 核 基因 组 的 编码 序 列 的 0.5% (参见 蛋白 质 家 族 )。 含 锌 的 蛋白 在 结构 上 多 样 , 并 且 可 根据 锌 配 位 的 机 制 和 结构 域 结 构 将 其 分 为 至 少 6 个 大 家 族 (图 17.2, 另 见 后 面 的 章节 )。 相 对 来 讲 , 锌 指 结构 1 在 细菌 中 十 分 少见 :大 肠 杆菌 DNA 修复 蛋白 MutM 是 具有 含 锌 配 位 组 件 的 细菌 蛋白 的 少数 例子 之 一 。 《c) 核 受 体 ( 未 折 释 ) (d) 核 受 体 (已 折 重 ) 17.2 三 种 主要 类 型 的 锌 指 等 同 结构 的 结构 。(a) 经 典 的 CzH: 锌 指 。(b) 双 核 基 因 艇 GAL4 的 Cg。(c) 核 受 体 的 2x C4 锌 指 ,没有 折 友 以 显示 拓扑 学 结构 (转录 因子 GATA- 1 有 类 似 结构 的 单个 C4 锌 指 ) 和 (d) 折 笃 以 显示 结构 域 结构 ,N 末端 识别 螺旋 。a 螺旋 以 圆柱 表示 ,B 链 以 箭头 表 示 。C= 半 胱 氨 酸 ,H= 组 氨 酸 ,N=N 末 端 ,CT=C 末 端 。 CyszHis, 锌 指 包含 有 一 对 半 胱 氨 酸 残 基 和 一 对 组 氨 酸 残 基 ,这些 残 基 在 12 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 环 中 与 锌 离子 配 位 。 这 个 环 状 结构 也 包括 一 些 保守 的 疏水 残 基 和 许多 碱 性 残 基 , 其 核心 的 保守 序列 是 人 一 久 2 和 人 站 二 一 上 一 多 这 个 环 状 结构 凸 出 于 蛋白 表面 (因此 称 为 手指 ) ,其 顶端 的 碱 性 残 基 同 DNA 分 子 的 大 沟 作用 。 锌 指 采用 的 结构 被 认为 是 B 发 夹 和 一 个 相 邻 的 螺旋 (包含 有 His 残 基 ) ,前 一 种 结构 同 DNA 的 主 链 作 用 并 使 螺旋 维持 在 大 沟 处 ,作用 产生 序列 特异 性 的 接触 (图 17.1)。 除去 锌 后 ,或 将 保守 的 半 胱 氨 酸 突变 ,或 阻止 锌 的 配 位 ,蛋白 的 功能 都 将 丧失 ,这 些 说 明和 锌 对 于 正确 构象 的 维持 是 十 分 重要 的 。 第 一 个 锌 指 基 序 图 样 发 现 于 爪 蟾 基本 转录 因子 TFIIIA 中 。 这 个 蛋白 含有 9 个 串联 起 来 的 锌 指 , 并 且 由 柔性 的 连接 子 连接 起 来 的 多 个 锌 指 是 此 家 族 DNA 结合 蛋白 的 特点 之 一 。 大 鼠 转录 调控 因子 SP1 和 Zif268 含有 三 个 锌 指 ,而 果 蝇 的 转录 因子 Tramtrack， Kruppel 和 Hunchback 分 别 含 有 2,4,6 个 锌 指 。 著 名 的 爪 蟾 蛋白 ,xFin 含有 不 少 于 37 个 锌 指 ! 几 种 锌 指 蛋 白 同 DNA 结合 的 复合 物 的 结构 已 经 解析 得 出 。 表 明 多 个 锌 指 沿 着 大 沟 螺旋 方向 同 DNA 碱 基 形 成 一 系列 的 结合 。 每 个 锌 指 结构 识别 三 个 碱 基 一 组 的 密码 ,这 种 识别 由 氢 键 介 导 (如 Zif268 在 9bp 的 识别 顺序 中 形成 11 个 氨 键 )。 至 少 对 于 类 Zif268 锌 指 结构 ,一 个 完整 的 氨基 酸 与 DNA 碱 基 识别 的 密码 的 简单 规则 已 经 出 现 ( 见 下 文 )。 对 于 一 些 锌 指 蛋白 ,虽然 同 DNA 作用 的 整个 几何 形状 是 保守 的 ,但 不 是 每 一 个 锌 指 都 参 ”于 与 同 碱 基 的 特异 识别 ,许多 和 锌 指 一 般 作为 隔离 物 作用 ,它们 根本 不 与 DNA 直接 接触 。 半 胱 氨 酸 锌 指 典型 的 锌 指 组 件 包 含有 一 个 锌 ,其 由 两 个 半 胱 氨 酸 和 两 个 组 氨 酸 残 基 配 位 。 而 其 他 许多 含 锌 的 DNA 结合 结构 域 只 用 半 胱 氨 酸 配 位 锌 ,因此 ,有 时 被 称 为 多 半 胱 氨 酸 锌 指 。 最 大 的 多 半 胱 氨 酸 锌 指 蛋 白 家 族 是 转录 因子 中 的 类 固 醇 胸腺 激素 核 受 体 家 族 。 每 个 这 种 蛋白 包含 有 二 个 指头 ,每 个 指头 中 有 4 个 半 胱 氨 酸 配 位 锌 离子 ,并且 每 个 指头 与 螺 旋 N 端的 延伸 部 分 共同 形成 (图 17.2)。 这 种 锌 指 缺 乏 CysHis 锌 指 具 有 的 保守 朴 水 残 基 , 其 参与 形成 包含 着 有 垂直 的 螺旋 的 一 个 单个 的 ,球形 的 DNA 结合 结构 (图 17.2)。 N 端的 螺旋 是 其 识别 螺旋 ,而 第 二 个 螺旋 可 能 与 其 二 聚 化 有 关 。 类 固 醇 受 体 以 同 二 聚 体 的 形式 结合 于 DNA 的 回 文 靶 位 点 。 而 胸腺 激素 ,维生素 D 和 视 黄 酸 的 受 体 主 要 同 其 他 家 族 成 员 一 一 视 黄 醛 X 受 体 一 一 形成 异 二 聚 体 , 与 正 向 重复 部 分 结合 。 一 些 核 受 体能 以 单 体 与 DNA 结合 ,这 种 情况 至 少 在 体外 实验 中 可 观察 到 。 其 他 多 半 胱 氨 酸 锌 指 还 包括 造血 的 转录 因子 GATA - 1, 与 酵母 转录 调节 因子 GAL4 有 关 的 一 些 蛋 白 及 一 种 人 的 延伸 因子 。GATA=-1 的 结构 非常 类 似 于 核 受 体 家 族 , 虽 然 它 仅 有 单个 的 锌 结合 组 件 。 相 反 地 ,GAL -4 相关 和 蛋白 的 结构 是 独特 的 ,至今 只 发 现 于 酵母 蛋白 中 :6 个 半 胱 所 酸 配 位 2 个 锌 原子 。 这 样 中 间 的 半 胱 氨 酸 参与 2 个 锌 离子 配 位 (图 17.1)。 有 时 ,这 种 结构 又 被 称 为 锌 双核 徐 (zinc binuclear cluster) , 它 上 具有 下 列 保 守 序列 : 是 竹 全 于 计生- 可 所 二 全 作 且 个 下 二 光 记 避 这 种 的 锌 配 位 结构 被 认为 帮助 " 螺旋 存在 于 大 沟 处 。 但 是 ,在 人 的 延伸 因子 中 ,为 一 个 折 和 至 同 DNA 结合 。p53 肿瘤 抑制 因子 却 用 一 个 “螺旋 侵入 DNA 的 大 沟 ,而 含 锌 配 位 结 构 使 存在 于 小 沟 的 残 基 呈 稳定 的 环 状 结构 。 碱 性 结合 结构 域 ” 真 核 细胞 的 转录 因子 中 的 一 大 类 家 族 都 含有 一 个 高 度 碱 性 的 螺 旋 ,作为 同 DNA 的 基本 识别 结构 。 在 许多 情况 中 。 这 个 螺旋 直接 同 二 聚 化 结构 域 相连 ， 或 是 一 个 亮 氨 酸 拉链 (leucine zipper)[ 因 此 又 称 为 碱 性 亮 氨 酸 拉链 (basic leucine zipper， bZIP) ] 或 是 一 个 螺旋 - 环 -螺旋 结构 [因此 又 称 碱 性 螺旋 - 环 -螺旋 (basic lwliz- loop 一 helix，bHLH) ] ,或 者 两 者 都 有 。 这 种 结构 形成 螺旋 卷曲 ,这 样 使 碱 性 结构 域 维 持 在 某 一 构象 ,允许 它们 可 与 DNA 的 对 侧 作用 。 它 们 同 不 同 的 家 族 成 员 形 成 同 源 或 异 源 的 二 聚 体 使 DNA 结合 家 族 更 具 功 能 的 多 样 性 ,更 易于 调控 。 识别 螺旋 可 能 是 作为 DNA 结合 的 一 种 后 果 : 酵 母 bZIP 蛋白 GCN4 的 研究 表明 , 碱 性 结构 域 在 溶液 中 采用 一 种 无 序 的 部 分 螺旋 的 结构 ,不 过 , 当 同 DNA 结合 时 , 这 种 构象 发 生 了 变化 从 而 诱导 了 典型 " 螺旋 的 形成 。 在 GCN4 的 二 聚 体 中 ,识别 螺旋 是 刚性 结构 ， 其 仅 以 几 个 碱 基 同 DNA 轻微 接触 。 但 是 在 小 鼠 的 Max 蛋白 中 ,螺旋 在 中 部 弯 折 ,围绕 DNA 折 秋 成 剪刀 柄 式 , 紧 贴 于 DNA 的 大 沟 ,形成 更 广泛 的 接触 (图 17. 1)。 突 变 分 析 表 明 : 二 聚 化 结构 域 同 碱 性 结构 域 一 样 都 是 DNA 结合 所 必要 的 。 这 是 由 于 二 聚 化 结构 域 中 的 残 基 参 与 了 同 DNA 的 结合 ,并 且 要 形成 同 DNA 高 度 亲 和 的 结合 ,也 需 二 育 化 ;如 有 果 人 为 通过 二 硫 键 连接 一 对 单独 的 碱 性 结构 域 , 它 可 与 DNA 结合 。 但 是 ,一 些 碱 性 结构 域 蛋白 缺乏 拉链 /HLH 二 聚 化 基 序 ( 如 果 蝇 中 的 蛋白 Mastermind)。 另 外 ,在 一 些 HTH 和 蛋 ”229 > 白 (如 酵母 的 热 休 克 因 子 ) 和 一 些 具 有 锌 指 结构 的 蛋白 (如 GAL4) 中 ,拉链 也 作为 二 聚 化 的 结构 作用 。 类 组 蛋白 结合 基 序 ，” 真 核 细胞 的 DNA 分 子 可 通过 同 组 蛋白 作用 被 包装 成 重复 的 结构 单位 , 称 为 核 小 体 ( 见 第 3 章 染 色 质 ) 。 在 核 小 体 的 核心 颗粒 中 包含 有 二 个 负 超 螺旋 弯曲 的 DNA 围绕 着 一 个 组 蛋白 的 八 聚 体 。 这 个 八 聚 体 分 别 由 同样 两 个 核心 组 蛋白 H2A， H2B 及 H3,H4 组 成 。 它 们 同 DNA 之 间 的 相互 作用 涉及 DNA 中 富 含 AT 区 域 的 小 沟 出 现在 组 蛋白 八 聚 体 的 表面 并 将 其 缠绕 。 一 级 序列 排列 (primary sequence alignments ) 揭 示 : 各 组 蛋白 之 间 仅 有 很 低 的 同 源 性 (<20% ) ,但 是 它们 具有 一 个 保守 的 结构 , 即 组 蛋 自 折 丢 (histone fold) , 它 包 含 着 由 二 个 介 导 二 聚 化 的 融合 的 螺旋 - 链 = 螺旋 的 结构 ,组 蛋白 的 连接 子 ( 如 HL,HS ) 也 在 染色 体 的 高 度 有 序 化 中 起 作用 ( 参见 30 nm 纤 丝 ) ,它们 通过 结合 DNA 进入 和 离开 核 颗粒 的 区 域 封闭 了 核 小 体 。 许多 转录 因子 与 不 同 的 核心 组 蛋白 同 源 , 其 中 包括 同 基本 转录 因子 IID( TFIID ) 相 关 的 TAFs( 参 阅 )。 例 如 ,人 类 的 TAFrm31 同 H3 同 源 ,而 TAFrn80 同 H4 同 源 。TAFrn20 同 H2B 同 源 ,但 是 缺少 同 H2A 同 源 的 基本 因子 。TAFrn20,TAFr31 和 TAFrm80 可 以 组 成 类 似 于 组 蛋白 八 聚 体 的 四 级 结构 ,其 中 TAFr20 形成 同 二 聚 体 ;还 有 证 据 表面 ,TEIID 诱 导 了 DNA 负 超 螺旋 的 形成 。 负 调控 因子 DR1, 可 抑制 TFIID 的 作用 ,并 且 这 种 作用 可 被 TFIIA 阻 断 ( 参 见 转录 起 始 一 RNA 聚合 酶 IT) , 它 同 组 蛋白 H2A 同 源 ,DRI1 同一 个 称 为 DRAPI1 的 蛋白 形成 二 聚 体 产生 作用 ,这 个 二 聚 体 同 H2AVZH2B 的 二 聚 体 类 似 。 连接 子 组 蛋白 HS 已 解析 的 结构 中 发 现 :在 其 球状 结构 域 中 ,存在 着 一 个 螺旋 - 转 角 一 螺旋 的 基 序 。 正 如 上 面 讨论 的 那样 ,这 种 基 序 在 许多 真 核 和 原核 细胞 复制 起 始 区 的 转录 因子 中 可 找到 。 组 蛋白 的 HTH 基 序 包含 于 一 个 大 的 结构 域 中 , 这 个 结构 域 还 包括 其 他 的 螺旋 , 链 和 环 。 在 属于 HNF3/Fork head 家 族 的 真 核 HTH 转录 因子 的 翅 状 螺旋 结 构 域 中 和 大 肠 杆 菌 中 , pio 操纵 子 的 阻 遇 物 BirA 中 可 以 找到 相似 的 拓扑 构象 。 乳头 瘤 病 毒 的 E2 蛋 日 ”这 种 蛋白 具有 一 种 独特 的 结构 ,包括 4 个 B 链 和 一 个 突出 的 螺旋 。4 条 链 形成 一 个 弯曲 的 B- 折 有 至 ,可 作为 二 聚 化 的 作用 表面 。 因 此 ,整个 二 聚 体 蛋 白 具 有 一 个 穹顶 状 ,由 8 条 链 组 成 的 B- 桶 状 结构 ,其 中 还 带 有 二 个 突出 的 螺旋 。DNA 围绕 此 蛋白 规则 地 弯曲 ,a 螺旋 在 两 个 连续 的 大 沟 中 形成 碱 基 特 异性 识别 。 通过 8- 链 识别 ”在 上 述 讨 论 过 的 大 部 分 蛋白 中 ,与 DNA 的 识别 序列 中 涉及 一 个 w 螺 旋 , 存 在 于 大 沟 。 然 而 ,在 三 种 细菌 阻 遇 物 ( Metj，Are 和 Mnt ) 中 发 现 了 另 一 种 称 为 带 一 螺旋 一 螺旋 (ribbon-helix-helix) 的 基 序 , 它 同 DNA 的 识别 是 由 一 个 B 折 释 介 导 的 (这 个 带 是 一 二 条 反 向 平行 8B 折 丢 链 组 成 适合 于 进入 DNA 的 大 沟 )。 这 三 个 阻 遇 物 以 二 聚 体 的 形式 作用 ,每 个 单 体 提供 一 个 由 二 个 螺旋 稳定 的 单个 B 链 。 通 过 四 级 结构 的 相互 作用 ,B 链 呈 带 状 排列 , 顺 大 沟 放 置 ,通过 形成 多 个 氢 键 有 利于 识别 (图 17.1)。 二 聚 化 对 于 构成 DNA 结合 结构 域 是 必需 的 。 细 菌 类 核 包 装 蛋白 HU 可 能 也 采用 相 类 似 的 作用 模 型 。 在 真 核 细胞 中 ,负责 真 核 基因 基本 转录 的 TATA 结合 蛋白 (TBP)( 参 阅 ) 也 可 以 通过 一 个 反 平 行 的 B- 折 释 同 DNA 作用 。 这 个 蛋白 明显 为 一 个 单 链 多 肽 ,但 是 它 形成 了 两 个 结构 非常 相似 的 结构 域 ,这 样 形成 一 个 对 称 的 C 字形 分 子 , 象 马鞍 状 包围 DNA 分 子 。 在 。， 224 ， 弧 形 表面 的 B-- 链 的 残 基 是 同 DNA 作用 的 主要 残 基 ， 而 在 弧 形 外 表面 的 螺旋 同 其 他 基 本 的 转录 因子 作用 。 与 细菌 的 绥 带 状 阻 遏 物 不 同 ,TBP 蛋白 中 的 B 链 结合 DNA 的 小 沟 。 The Rel 家 族 ”在 真 核 细胞 转录 因子 中 的 Rel 家 族 对 于 各 种 不 同 的 环境 刺激 产生 效应 ， 并 且 在 发 育 过 程 中 也 起 着 十 分 重要 的 作用 。Rel 转录 因子 中 包括 果 蝇 的 和 哺乳 动物 的 NEF-kB。Rel 蛋白 有 一 个 保守 的 结构 , 即 Rel 同 源 结 构 域 (RHD)D , 它 全 长 大 约 300 个 氨基 酸 残 基 , 由 一 个 柔性 的 贸 链 区 连接 二 个 免疫 球 和 蛋白 折 用 构 成 。 虽 然 两 个 折 乔 中 的 残 基 都 可 以 同 DNA 作用 ,但 是 它们 的 分 工 明确 ,其 中 的 一 个 是 二 聚 化 的 结合 面 , 另 一 个 是 直接 同 序列 特异 DNA 相互 作用 。Rel 蛋白 可 以 形成 同 二 聚 体 和 不 同 的 异 二 聚 体 ,都 具有 二 聚 化 的 倾向 。 同 二 聚 体 和 异 二 聚 体 结合 不 同 的 DNA 位 点 ,但 相互 作用 是 相当 混乱 的 。Rel 蛋白 结合 的 组 成 和 二 聚 化 的 混杂 性 ,以 及 细胞 类 型 和 发 育 的 特异 表达 ,为 复杂 的 调控 网 络 作出 了 和 贡献。 一 些 Rel 蛋白 也 可 以 以 单 体 同 DNA 结合 。 二 体 Rel 蛋白 包括 原始 型 (anchetypal) 的 转录 因子 NF-kB, 它 由 两 个 亚 基 一 一 P50 和 P65( 即 RelA 蛋白 组 成 )。P50 同 二 聚 体 同 DNA 结合 的 复合 物 的 解析 表明 , 它 同 DNA 的 相互 作用 主要 由 位 于 DNA 大 沟 中 的 Rel 的 一 个 长 的 环 状 结构 所 介 导 。 在 这 个 环 状 结构 中 的 残 基 同 5 个 连续 的 DNA 碱 基 结 合 ,而 更 多 的 位 于 环 状 结构 外 的 残 基 可 以 同 DNA 产 生 序列 特异 性 结合 。 DNA 加 工 酶 中 的 结合 基 序 “DNA 加 工 酶 同 其 底 物 结合 的 结构 是 多 种 多 样 的 。 那 些 催 化 合成 和 拓扑 修饰 的 酶 以 其 沟 状 或 环 状 结构 围绕 DNA。 第 一 个 得 到 解析 的 此 类 基 序 来 源 于 开 .co 的 DNA 育 合 酶 工 的 Klenow 片段 ,这 个 酶 有 一 个 深 沟 ,首先 此 深 沟 同 DNA 结 合 , 随 后 再 围绕 DNA 折 释 并 将 DNA 包 庄 起 来 。 但 对 于 大 肠 杆菌 中 的 DNA 聚合 酶 III 却 有 着 不 同 的 策略 :其 B 亚 基 是 由 新 月 状 亚 基 组 成 的 二 聚 体 , 像 一 个 滑动 的 夹子 ,围绕 DNA 形成 一 个 环 。 真 核 细胞 中 的 PCNA( 参 阅 ) 也 以 同样 的 方式 作用 ,但 是 它 是 三 聚 体 。 有 裂缝 结构 在 其 他 一 些 聚 合 酶 中 也 有 发 现 :例如 ,HIV 的 反 转 录 酶 ,RNA 聚合 酶 工 ,它们 都 被 认 为 用 同样 的 方式 同 其 底 物 作用 。HIV 反 转 录 酶 与 核酸 复合 物 的 高 分 辨 率 结构 表明 :结合 是 通过 一 个 包 埋 于 DNA 大 沟 中 的 酶 的 一 个 环 状 区 域 同 DNA 磷酸 主 链 作用 。 功能 简单 的 酶 ,如 核酸 内 切 酶 , 同 DNA 螺旋 的 表面 结合 ,这 种 蛋白 家 族 我 们 在 前 面 已 有 所 讨论 。 此 类 酶 的 多 数 采 用 侵 和 人 大 沟 或 小 沟 的 结构 ,但 是 它们 比 转录 因子 同 DNA 的 相互 作用 更 为 广泛 ,它们 的 结合 结构 域 部 分 地 包 庄 螺旋 。 几 种 限制 性 内 切 酶 同 DNA 的 结合 复合 物 的 结构 已 经 被 解析 ,其 中 揭示 出 许多 不 同 的 DNA 结合 基 序 。 通 常 的 观点 认为 限制 性 内 切 酶 倾向 于 使 DNA 发 生 剧 烈 扭曲 。 EcoR 工 诱导 一 个 尖 的 纽 结 ,将 酶 切 位 点 处 的 大 沟 或 小 沟 扩 大 ,这样 可 以 允许 一 个 大 的 四 个 桶 状 的 “螺旋 置 于 大 沟 之 中 ,而 延伸 处 的 手臂 将 围绕 这 个 螺旋 。 相 反 , EcoRV 利用 环 状 结构 同 靶 位 点 的 大 沟 作 用 ,非特 异性 的 DNase 工 也 是 如 此 。 17.3 ”蛋白 中 RNA 结合 基 序 RNP 结构 域 ”最 为 了 解 的 RNA 结合 结构 域 , 即 核糖 核 蛋 白 (RNP) 结 构 域 , 首 先 在 酵母 1) 原 文 误 为 RHB, 应 为 RHD(Rel homology domain) , 译 为 Rel 同 源 结构 域 。 一 一 译 者 注 005 的 多 聚 腺 昔 结 合 蛋白 (polyadenylate-binding protein) (人 参阅) 中 发 现 。 此 类 结构 也 有 两 种 保守 基 序 一 RNP1 和 RNP2 ,它们 都 对 RNA 特异 性 结合 十 分 重要 ,而且 它们 仅 是 一 个 更 大 结构 的 一 部 分 ,这 个 大 的 结构 由 4 个 B 链 和 2 个 ua 螺旋 以 B-a-B-B-a=8B 的 拓扑 结 构 组 成 。RNPL 和 RNP2 基 序 位 于 一 个 四 条 B 折 和 琶 的 中 心 B 链 处 。 UlA 剪接 体 蛋白 含有 二 个 这 样 的 结构 域 , 它 可 以 结合 U1 SnRNA 的 一 个 发 夹 结构 ， 这 种 RNA 蛋白 复合 物 的 结构 已 被 解析 , 它 由 8B 折 私 形 成 一 个 非特 异性 的 RNA-=- 和 蛋白 结 合 平台 ,Ul SnRNA 的 发 夹 结构 和 一 个 富 含 负 电荷 残 基 的 环 状 结构 之 间 的 相互 作用 ,在 折 丢 稳 定 了 RNA 的 构象 中 连接 两 个 B 链 ,这 样 RNA 可 以 特异 地 同 RNP1 和 RNP2 作用 。 双 链 RNA - 结合 结构 域 ” 双 链 RNA 结合 结构 域 (dsRBD) 是 一 个 短 的 (大 约 65 个 残 基 ) 的 组 件 , 它 存在 于 好 几 种 可 结合 双 链 RNA 的 蛋白 中 ( 如 : 腺 苷 脱 氮 酶 ,dsRNA= 依赖 性 激酶 , 果 蝇 Staufen 和 大 肠 杆 菌 RNase III) 。 它 们 的 拓扑 结构 类 似 于 RNP 结构 域 ( 形 成 一 个 B 折 丢 的 三 个 B 链 和 两 个 螺旋 , 带 有 B-a-8B-8B-a-8B 的 拓扑 排列 ) ,但 是 同 RNA 的 特异 性 结合 仅 发 生 于 此 结构 域 中 第 二 个 "螺旋 和 8B 折 释 形 成 的 裂 颖 中 。 K 同 源 结构 域 K 同 源 结构 域 首先 在 核 不 均一 RNA 结合 蛋白 hnRNP 开 中 发 现 ,这 个 蛋白 含有 三 个 这 种 结构 域 。 在 几 种 其 他 的 RNA 结合 蛋白 ,其 中 包括 脆性 =-X 基因 FMRI1 的 产物 中 也 发 现 了 这 种 结构 。 同 dsRBD 一 样 ,K 同 源 结 构 域 以 三 个 链 组 成 的 B 折 丢 为 中 心 ,但 是 它们 还 具有 三 个 螺旋 ( 拓扑 组 成 为 B-a-a-B=-B=oa), 特 异性 相互 作用 被 认为 产生 于 RNA 和 头 两 个 螺旋 连接 区 的 残 基 之 间 。 其 他 RNA 结合 结构 ”在 上 面 讨 论 过 的 一 些 真 核 细 胞 的 DNA 结合 蛋白 同样 也 可 以 结 合 RNA。 锌 指 蛋 白 TFIIIA 可 同 SS rRNA 作用 作为 调控 蛋白 合成 的 一 种 形式 ,而 果 蝇 的 同 源 结构 域 蛋 白 Bicoid 可 以 通过 结合 caxdalz mRNA 而 阻 遇 Caudal 蛋白 的 合成 。 由 于 RNA 的 大 沟 太 军 , 从 而 不 能 容纳 这 些 结合 蛋白 常规 的 识别 螺旋 ,因此 ,很 可 能 是 由 不 同 的 残 基 参 与 同 DNA 和 RNA 的 结合 ,或 者 是 识别 位 点 的 RNA 产 生 严 重 扭曲 ,这 样 可 以 允许 其 侵入 大 沟 。 最 新 解析 而 得 的 核糖 体 蛋白 L11 的 结构 显示 其 具有 与 同 源 结构 域 结 构 类 似 的 HIH RNA 结合 基 序 ,而 HIV Rev 中 被 认为 是 通过 一 个 螺旋 在 一 个 加 宽 的 大 沟 处 结合 。 这 个 螺旋 也 是 ColE1 质粒 编码 的 Rom 蛋白 作用 的 基本 识别 基 序 ( 见 第 20 章 质 ” 粒 )。 然 而 在 这 种 情况 中 ,一 个 四 螺旋 束 以 B 折 至 相同 的 作用 方式 提供 一 个 平面 来 展示 和 解读 RNA 碱 基 。 相 反 地 ,在 HIV 的 Tat 蛋白 中 ,由 一 个 B 带 侵入 Tar 大 沟 一 侧 ,以 利于 进行 碱 基 的 识别 。 许 多 核酸 结合 结构 偶尔 也 用 于 蛋白 与 蛋白 的 相互 作用 。 17.4 蛋白 ,核酸 结合 的 分 子 基础 核酸 与 蛋白 的 直接 作用 核酸 蛋白 直接 作用 的 四 种 途径 为 :OO 蛋白 侧 链 同 碱 基 作用 (是 序列 特异 性 相互 作用 的 主要 形式 );@ 和 蛋白 主 链 (如 氨基 基 团 ) 同 碱 基 作 用 ;@ 和 蛋白 侧 链 同 磷酸 骨架 的 作用 ;@@ 蛋 白 主 链 同 磷酸 骨架 的 作用 。 许多 不 同类 型 的 非 共 价 相互 作用 存在 于 蛋白 和 核酸 的 相互 作用 中 :和 氢 键 , 范 德 华 力 ， 朴 水 作用 ,球形 吸引 和 排斥 的 静电 作用 以 及 特殊 的 静电 键 。 此 外 ,核酸 自身 的 氢 键 , 碱 基 堆 集 作 用 以 及 蛋白 氨基 酸 残 基 侧 链 间 的 吸引 和 排斥 力也 参与 其 中 。 "226 。 蛋白 和 核酸 磷酸 骨架 的 相互 作用 常常 涉及 带 负 电 的 磷酸 残 基 和 带 正 电 的 氨基 酸 残 基 (如 Lys，Arg) 之 间 的 静电 相互 作用 。 此 外 ,在 核酸 骨 和 蛋白 侧 链 或 主 链 氨基 之 间 可 形 成 氢 键 。 除 了 蛋白 和 核酸 骨架 的 直接 作用 之 外 ,远程 的 静电 吸引 在 蛋白 核酸 相互 作用 中 起 着 十 分 重要 的 作用 。 实 验证 实 , 将 中 性 的 氨基 酸 残 基 换 成 碱 性 残 基 ,一 些 转录 调控 因子 同 核酸 的 亲和力 可 增强 ,甚至 是 当 这 些 残 基 离 核酸 太 远 而 无 法 直接 同 DNA 作用 的 时 候 。 与 主 链 的 接触 也 常常 存在 于 非特 异性 结合 之 中 ,但 是 特殊 的 碱 基 序列 可 能 会 影响 核酸 骨 架 的 三 级 结构 ,这 种 结构 可 以 被 蛋白 识别 和 解读 ,产生 序列 特异 性 的 相互 作用 。 蛋白 和 核酸 碱 基 之 间 的 相互 连接 识别 ,不管 是 开放 性 地 ( 同 单 链 ) ,还 是 通过 大 小 沟 ( 双 链 分 子 ) ,主要 由 碱 基 和 氨基 酸 残 基 侧 链 之 间 形 成 的 氢 键 介 导 。 这 种 接触 可 能 是 一 一 对 应 的 ,但 是 几 个 侧 链 可 以 同一 个 碱 基 对 连接 ,长 的 侧 链 还 可 以 横 跨 好 几 个 碱 基 对 。 序 列 特异 性 的 核酸 结合 蛋白 倾向 于 利用 其 埋藏 表面 ,例如 一 个 插入 大 沟 的 "螺旋 ,使 它们 之 间 的 接触 最 大 化 。 和 蛋白 残 基 和 DNA 碱 基 之 间 的 相互 作用 对 于 序列 特异 识别 是 十 分 重要 的 ,但 不 是 所 有 的 接触 都 是 特异 的 ,例如 ,在 糖 皮质 激素 受 体 和 DNA 的 相互 作用 时 ,就 产 生 非 特异 性 识别 而 形成 的 广泛 的 碱 基 和 蛋白 侧 链 的 接触 。 水 在 核酸 蛋白 相互 作用 中 的 作用 有 序 的 水 分 子 存在 于 核酸 蛋白 作用 的 接触 面 ,它们 或 仅 是 接触 空间 的 填充 物 ,或 者 本 身 参 与 了 键 的 形成 。 在 非特 异性 结合 蛋白 中 ,水 被 认为 是 绝缘 子 , 衬 于 接触 的 内 表面 ,这样 使 得 蛋白 可 滑动 扫描 并 促进 非特 异性 的 相互 作用 。 水 也 参与 蛋白 和 DNA，RNA 主 链 或 碱 基 的 氢 键 形成 ,在 一 些 情 况 中 ,水 也 是 碱 基 识 别 所 必 需 的 ,例如 ,在 Trp - 阻 过 物 - DNA 的 复合 物 中 ,和 在 疏 NAce 同 Gln-tRNA 合成 酶 的 复 合 物 中 。 现 在 认为 ,水 负责 结合 反应 的 亲和力 和 特异 性 。 当 BaxH I 同 其 酶 切 位 点 作用 时 ,四 个 有 序 的 水 分 子 介 导 蛋白 侧 链 和 碱 基 的 接触 ,水 也 可 能 延伸 由 核酸 蛋白 组 成 的 氢 键 网 络 , 和 增强 识别 的 特异 性 。 在 许多 的 蛋白 核酸 的 复合 物 中 (例如 锌 指 蛋 白 Tramtrack 同 其 靶 位 点 结合 ) 这 些 水 分 子 固定 为 一 种 特殊 的 构象 ,其 极 性 表面 也 是 刚性 的 。 在 其 他 的 例 子 中 (如 同 源 结构 域 蛋 白 触角 足 结 合 其 靶 位 点 时 ) 水 分 子 可 跳动 ,这样 允 许 氨 基 酸 残 基 侧 链 采 取 不 同 的 构象 ,并 在 两 个 或 多 个 结合 态 之 间 选 择 。 结 合 面 的 流动 性 是 很 重要 的 ,这 是 因为 流动 性 增加 了 在 接触 面 突变 时 (蛋白 本 身 或 其 靶 位 点 ) 蛋 白 结合 的 适应 性 ;还 可 能 是 由 于 接触 面 的 部 分 变形 ,增加 了 此 系统 的 焙 。 水 在 蛋白 同 核 酸 骨架 或 大 沟 接触 中 起 着 十 分 重要 的 作用 ,而 在 小 沟 处 的 相互 作用 (如 包括 HMG 蛋白 ,或 者 是 基本 转录 因子 TBP) 主要 是 由 于 玻 水 性 ,水 好 像 被 排出 在 接触 面 外 。 核酸 结构 的 蛋白 调节 在 DNA 中 特殊 的 碱 基 序 列 可 以 促进 内 部 的 暗 带 (anisotropic bending)( 人 参阅 ) 和 呼吸 (参阅 ) ,但 是 DNA 在 同 蛋 白 作用 时 也 发 生 了 扭曲 变形 。 蛋 白 可 通 过 熔 解 碱 基 对 , 减 小 或 增 大 弯 折 或 螺旋 来 改变 DNA 的 结构 。 许 多 DNA 结合 蛋 日 造成 了 DNA 的 一 些 结构 变化 ,这 些 构象 变化 可 形成 两 个 接触 面 之 间 更 佳 的 结合 。DNA 的 构象 变化 不 仅 对 于 最 初 接触 面 的 调整 起 作用 ,而 且 还 可 控制 选择 性 的 结合 和 /或 序列 特异 性 DNA 结合 蛋白 的 活性 。 最 剧烈 的 扭曲 和 纽 结 是 由 限制 性 内 切 酶 造成 的 ,DNA 解 旋 对 于 加 宽 和 暴露 DNA 的 大 沟 催 化 活性 中 心 是 十 分 必要 的 。EcoR I 高 度 选择 性 地 结合 DNA 中 的 限制 性 酶 切 位 点 ,而 EcoRV 以 同样 亲和力 结合 于 许多 DNA 序列 。 这 是 由 于 ,对 于 EcoR I 而 言 , 底 物 位 57 点 的 选择 性 是 由 于 在 接触 阶段 对 于 序列 特异 的 碱 基 的 识别 ,而 EcoRV 对 于 底 物 的 选择 发 生 于 变化 阶段 ,这 时 仅 有 某 些 序列 被 解 旋 和 纽 结 。 转 录 因 子 也 可 以 利用 DNA 的 柔性 。 在 转录 复合 体 或 增强 体 (参阅 ) 处 的 DNA 环 便 是 一 例 , 这 样 可 引导 适当 的 调控 蛋白 参与 接触 ,而 且 其 中 常常 涉及 前 面 提 及 的 HMG 家 族 中 的 DNA 弯曲 蛋白 。DNA 内 源 柔 性 在 染色 质 结构 的 形成 中 也 起 着 十 分 重要 的 作用 (参见 核 小 体 , 核 小 体 分 相 )。 二 聚 化 和 协同 性 ”许多 转录 因子 ,限制 性 内 切 酶 和 其 他 许多 序列 特异 性 的 DNA 结合 蛋白 以 二 体 或 更 高 聚合 物 的 形式 作用 ,在 一 些 情况 下 ,这 是 同 DNA 结合 所 必需 的 (如 在 带 - 螺 旋 = 螺 旋 的 阻 遏 物 中 ) ; 而 在 其 他 的 情况 中 ,每 个 单 体 都 有 一 个 相对 独立 的 识别 结 构 , 但 是 二 聚 化 可 以 增加 结合 的 特异 性 和 灵敏 度 。 综 合 起 来 可 能 有 以 下 几 种 目的 :@ 通 过 增加 结合 蛋白 的 大 小 ,增加 接触 面 和 碱 基 识别 的 数量 ;@ 通 过 增加 蛋白 同 DNA 结合 的 接 触 面 ,增加 结合 的 稳定 性 ;@ 通 过 可 循环 的 蛋白 与 蛋白 作用 ,增加 作用 的 亲和力 ;这 种 协同 性 的 结合 在 许多 转录 因子 中 可 以 看 到 ,包括 那些 省 类 受 体 家 族 ( 在 这 里 它们 可 通过 改变 重复 识别 序列 的 间隔 被 协同 性 地 调节 )。 二 聚 化 既 可 以 通过 异 二 聚 体 来 增加 识别 靶 位 点 的 范围 ,又 可 以 在 调控 中 使 用 非 活 性 单 体 来 增加 蛋白 作用 的 多 样 性 。 虽然 蛋白 相互 作用 的 形式 多 样 ,但 是 许多 转录 因子 还 以 二 聚 体形 式 作 用 。 一 些 蛋 和 白 (如 细菌 HTH 和 蛋白, 类固醇 激素 受 体 ) 以 同 源 二 聚 体 的 形式 识别 DNA 中 的 回 文 序列 。 其 他 一 些 蛋 白 ( 如 bZIP 蛋白 ) 可 以 在 同 家 族 中 选择 性 地 形成 同 源 或 异 源 的 二 聚 体 。 同 源 结构 域 蛋白 也 可 以 在 同 家 族 的 蛋白 中 选择 性 地 形成 同 源 或 异 源 二 聚 体 ,还 可 以 同 其 他 家 族 蛋 白 形 成 异 源 二 聚 体 。 甲 状 腺 素 受 体 和 其 相关 转录 因子 主要 同一 个 简单 分 子 形成 异 源 二 聚 体 ,直接 识别 重复 序列 。 还 有 其 他 一 些 蛋 白 以 单 体形 式 作用 ,但 是 它们 内 部 有 重复 结 构 ( 如 POU 结构 域 转录 因子 包含 二 个 HTH 基 序 ,可 结合 双 螺 旋 的 两 侧 , 而 TATA 结合 蛋 白 包 含 二 个 同样 的 DNA 结合 组 件 , 锌 指 蛋 白 包 括 从 两 个 到 差不多 40 个 的 结合 组 件 )。 二 聚 化 对 于 bZIP 和 bHLH 蛋白 家 族 成 员 的 作用 是 十 分 重要 的 。bZIP 蛋白 通过 亮 氨 酸 拉链 基 序 二 聚 化 , 亮 氨 酸 拉链 是 一 种 两 亲 性 " 螺旋 ,可 形成 螺旋 卷曲 ( 参阅 )。 在 二 聚 体 中 ,每 个 螺旋 的 周期 从 3.6 减 至 3.5, 这 样 可 使 亮 氨 酸 每 隔 7 个 氨基 酸 产生 相互 作用 。 但 是 ,在 最 初 的 模型 中 , 亮 氨 酸 残 基 被 认为 是 交错 对 插 ,类 似 于 拉链 的 齿 ,但 现在 认为 这 是 不 正确 的 ,现在 认为 亮 氨 酸 残 基 像 梯 子 上 的 横 档 一 样 形成 直接 接触 (图 17.1)。bHLH 和 蛋 白 有 一 个 二 聚 化 的 螺旋 - 环 - 螺旋 的 基 序 , 它 同 亮 氨 酸 拉链 相似 , 而 不 同 于 上 面 所 讨论 的 螺旋 -转角 一 螺旋 的 结构 。 一 些 蛋 白 同 时 具有 拉链 和 HLH 的 二 聚 化 结构 ,如 Maxs bZIP 和 bHLH 家 族 成 员 形象 地 诠释 了 功能 和 调节 的 多 样 性 可 由 选择 性 地 由 二 聚 化 产生 。 两 种 bZIP 蛋 日 c- Fos 和 c- Jun 形成 被 称 为 AP- 1 的 异 二 聚 体 转录 因子 ;而 c- Jun 还 可 以 形成 同 源 二 聚 体 ,但 是 c- Fos 不 可 能 。 肌 浆 中 的 bHLH 蛋白 MyoD1 ,成 肌 素 (myogenin) ,Myf-S 和 MREF-4 的 活性 形式 主要 是 异 二 聚 体 。 然 而 ,每 种 蛋白 都 同一 种 称 为 Id( 差 异 抑制 物 (Inhibitor of differentiation) ) 的 小 蛋白 二 聚 化 ,这 种 蛋白 缺乏 碱 性 结 构 域 ,可 以 阻止 同 DNA 的 结合 。 因 而 ,Id 蛋白 如 同一 个 天 然 的 显 性 失 活 突变 体 (dominant negative mutant, 参 阅 ) ,通过 使 所 有 的 活性 bHLH 蛋白 形成 非 活 性 异 二 聚 体 的 方法 调节 活性 。 。 228 。 17.5 序列 特异 性 结合 蛋白 识别 的 DNA 序列 ”许多 序列 特异 性 识别 蛋白 同 DNA 的 复合 物 的 结构 已 经 被 解 析 , 其 中 一 些 蛋 白 造成 了 一 个 或 多 个 碱 基 对 的 解 离 , 但 大 部 分 识别 发 生 在 闭合 双 链 的 前 后 。 总 体 上 ,相互 作用 可 归 为 两 种 形式 。 直 接 解 读 (direct readout ) , 它 涉及 在 大 沟 或 小 沟 处 蛋白 和 碱 基 之 间 的 相互 作用 :由 于 不 是 某 一 个 键 就 可 以 明确 地 识别 一 对 碱 基 , 因 此 直接 解读 涉及 接触 的 多 个 层面 ,其 中 有 蛋白 和 DNA 之 间 的 作用 ,还 有 同 作为 桥 分 子 的 水 分 子 的 作用 。 非 直接 解读 :涉及 蛋白 和 糖 ,磷酸 骨架 之 间 的 相互 作用 。 在 这 种 情况 中 , 由 于 一 些 序列 造成 的 整个 DNA 的 特殊 构象 ,蛋白 可 以 识别 这 些 序列 。 在 DNA 结合 蛋 白 的 结构 分 析 中 出 现 的 一 个 最 让 人 惊奇 的 发 现 便 是 在 序列 特异 识别 中 非 直接 解读 的 突出 地 位 。 DNA 中 的 分 子 信号 ”通过 直接 解读 的 序列 特异 性 识别 涉及 蛋白 和 碱 基 间 的 键 的 形成 。 这 表明 :DNA 碱 基 中 有 一 种 隐 含 在 键 模式 中 的 分 子 信 号 。 这 种 信号 可 以 通过 研究 在 大 沟 和 小 沟 处 的 化 学 基 团 加 以 确定 ,在 这 些 位置 , 碱 基 暴 露 在 溶液 中 。 在 大 沟 处 ,成 键 基 团 模 式 对 于 每 个 碱 基 对 是 唯一 的 ,因而 可 在 大 沟 进 行 明确 地 序列 解读 (图 17.3)。 而 在 小 沟 处 ,成 键 模式 是 简 并 的 , 仅 存 在 AX 和 GXC 之 间 的 区 别 。 在 大 沟 处 , 某 些 键 的 位 置 也 是 不 确定 的 ,因此 大 ,小 沟 中 都 可 识别 变化 的 序列 。 在 一 些 转录 因子 ,限制 性 内 切 酶 等 结合 蛋白 中 ,其 识别 位 点 是 严格 的 不 可 改变 ,而 对 于 其 他 一 些 蛋白 ,它们 可 以 允许 在 一 定位 置 上 的 某 种 程度 的 简 并 性 ,例如 ,在 味 哈 和 喀 啶 之 间 ,在 酮 基 和 氨基 之 间或 在 强 和 弱 的 成 键 碱 基 之 间 ( 见 图 的 说 明 , 表 16.2 有 关 的 解释 和 碱 基 符号 )。 大 沟 侧 H 供 体 受 体 “ 受 体 cH，、 受 体 供 体 受 体 全 会 2 基 和 起 关 1 | | 到 1 H Rs N CH。 下 、 > N N RN G4 < NE 全 N、 N aiN 一 EN / 电 抽 汪 | 下 几 0 个 | 让 本 | | 受 体 ” 供 体 受 体 受 体 下 8 记 受 体 小 沟 侧 17.3 ”在 大 沟 和 小 沟 中 DNA 碱 基 配 对 的 分 子 性 质 。 大 沟 允 许 对 所 有 四 种 可 能 的 碱 基 配 对 加 以 区 分 ,因为 键 的 分 布 是 不 对 称 的 。 相 反 ,在 小 沟 中 键 的 分 布 是 对 称 的 ,所 有 很 难 区 分 A:T 和 T: A 以 及 G:C 和 C:G 碱 基 对 。 粗 键 表 示 了 每 个 碱 基 与 DNA 骨架 之 间 的 连接 。 解读 蛋白 中 的 氨基 酸 ”在 DNA 结合 蛋白 中 一 些 保守 的 DNA 结合 结构 域 的 发 现 很 自 然 使 我 们 提出 这 样 的 问题 :是 否 存在 有 一 套 特殊 的 规则 指导 着 序列 特异 性 的 识别 ,例如 ， 核 昔 酸 识别 的 一 个 氨基 酸 密码 。 在 大 的 蛋白 家 族 (HTH, 锌 指 ,基本 结构 域 ) 中 存在 着 不 同 的 序列 特点 却 有 着 结构 上 十 分 相似 的 结构 域 的 例子 。 这 样 可 以 在 三 个 水 平 上 进行 精细 229 ， 的 突变 分 析 :@D 结 构 域 交换 ;@ 部 分 交换 (置换 ) ;@ 结 构 分 析 。 结构 域 交 换 实 验 包括 在 不 同 的 蛋白 中 进行 DNA 结合 结构 域 的 交换 。 这 种 实验 已 经 应 用 于 在 许多 例子 中 , 它 可 以 了 解 这 些 DNA 结合 结构 域 对 于 普遍 DNA 的 结合 能 力 和 序 列 特异 性 的 结合 是 否 是 必需 和 足够 重要 的 。 分 离 的 结构 域 常 常 可 以 单独 结合 DNA; 而 杂 交 蛋 白 同 样 具有 其 原 DNA 结合 蛋白 的 结合 特点 。 部 分 结构 域 交换 是 最 精细 的 水 平 ,包括 单个 残 基 的 置换 ,可 以 鉴定 出 控制 序列 特异 性 的 DNA 结合 结构 域 中 的 某 些 特定 区 域 。 置 换 特 殊 残 基 可 以 改变 识别 特异 性 ,在 比较 那 些 在 结合 特异 性 上 不 同 而 具有 高 相关 性 的 蛋白 中 ,常常 可 以 说 明 仅 有 一 些 必 要 残 基 涉 及 结合 。 根 据 其 它 蛋 白 而 进行 残 基 的 系统 性 置换 可 以 造成 在 结合 特异 性 上 发 生变 化 ,其 变 化 后 的 特异 性 可 同 其 模型 蛋白 相同 。 最 近 , 系 统 置换 已 被 噬菌体 展示 (phage display)( 参 阅 ) 所 替代 :这 种 方法 可 以 使 DNA 结合 结构 域 随机 地 在 一 个 或 几 个 位 置 发 生 改 变 ,这 样 变化 丰富 的 突变 体 展现 在 噬菌体 的 表面 ,可 根据 识别 特异 性 加 以 选择 。 这 种 技术 已 经 成 功 地 应 用 于 锌 指 DNA 结合 蛋白 的 分 析 中 ,在 下 面 将 加 以 讨论 。 通过 X 射线 和 NMR 对 于 蛋白 - DNA 复合 体 的 结构 进行 分 析 是 在 原子 分 辩 水 平 上 确定 分 子 内 键 的 空间 排列 的 唯一 方法 。 许 多 蛋白 - DNA 结构 已 经 被 解析 ,这 些 研究 在 对 于 揭示 DNA 和 蛋白 在 适应 结合 过 程 中 的 构象 变化 ,以 及 水 分 子 在 蛋白 DNA 复合 物 中 的 作用 中 起 着 特殊 作用 。 假定 的 锌 指 蛋白 DNA 识别 密码 ”通过 系统 的 结构 域 交 换 实验 和 蛋白 - DNA 复合 物 的 高 分 辩 结 构 分 析 表 明 ,没有 一 套 普 遍 的 密码 适用 于 所 有 序列 特异 性 蛋白 和 DNA 的 相互 作用 。 这 反映 了 识别 结构 的 多 样 性 ,同时 也 反映 了 同样 的 识别 结构 ,例如 一 个 螺旋 ,可 以 通过 不 同 的 方式 呈 递 于 DNA。 在 DNA 结 合 蛋白 的 一 些 家 族 中 ,相互 作用 是 十 分 复杂 和 高 度 变化 的 ,因为 可 由 不 同 的 方式 产生 同样 的 三 级 结构 。 同 样 的 结构 可 介 导 序列 特异 性 地 又 可 介 导 同 DNA 普通 地 相互 作用 (例如 ,位 点 特异 性 重组 INT 和 同 其 紧密 相关 的 普 遍 DNA 结合 蛋白 HU) ,这 便 是 一 个 很 明显 的 例子 。 然而 ,对 于 某 些 蛋白 家 族 , 同 DNA 的 作用 特点 简单 ,因为 总 是 同样 的 几 个 氨基 酸 侧 链 同 碱 基 作 用 。 这 至 少 在 一 些 CysHis 锌 指 蛋 白 中 是 事实 ,同时 其 空间 立体 化 学 码 已 被 确立 ( 表 17.2)。DNA 和 Zif268 的 锌 指 蛋 白 的 相互 作用 已 经 被 研 明 。 识 别 螺旋 中 ,三 或 四 个 特殊 残 基 侧 链 在 同 碱 基 作 用 中 起 主要 作用 ,而 且 大 多 数 为 简单 的 一 一 对 应 成 键 。 锌 指 码 让 人 联想 到 遗传 密码 (参阅 ) ,虽然 有 简 并 但 并 非 含混 不 清 。 目 前 为 止 ,这 种 密码 仅 基 于 很 小 一 部 分 结构 信息 并 且 不 完善 。 但 是 今后 , 随 着 越 来 越 多 的 结构 的 信息 被 解析 和 吸 收 进来 ,将 变 得 越 来 越 复杂 ,并 且 在 碱 基 识 别 中 其 他 氨基 酸 侧 链 的 作用 也 将 被 揭示 。 表 17.2 与 Zif268 相关 的 锌 指 蛋 白 的 部 分 DNA 识别 密码 三 联 体 密 码 中 碱 基 的 位 置 碱 基 S: 中 部 当 A 3 一 Asn 一 1-~Gln + 2->Ala 人 3 一 Asn,leu, Thr，Val G 6 一 Arg;6- 一 Ser,Thr+ 2 一 Asp 3 一 His -1~Arg + 2 一 Asp 二 6->Ser,Thr+ 2 一 Asp 3->Ala,Ser,Val -1-~>Asn 一 1 一 Gin + 2 一 Ser 和 多 续 表 17.2 碱 基 由 特定 的 氨基 酸 识 别 ,特别 是 在 锌 指 组 件 ( 左 图 ) 的 螺旋 识别 位 点 的 -1,2,3 和 6 位 。 例 如 果 蝇 的 Tram- track 蛋白 ( 右 图 ) 锌 指 1 的 相互 作用 。 在 很 大 情况 下 , 碱 基 和 和 氢 基 酸 侧 链 的 比例 是 1:1。 在 其 他 情况 中 ,两 个 氨基 酸 侧 链 相互 支持 来 识别 一 个 碱 基 。 在 这 个 表 中 一 个 碱 基 对 应 于 螺旋 上 相应 的 位 置 的 氨基 酸 是 特异 的 ,每 个 位 点 含有 氨基 酸 x\y 和 z。 若 两 个 残 基 相 互 支撑 , 则 第 一 个 残 基 后 面 加 上 ”+ "表示 。 碱 基 以 三 联 体 排列 ,不 同 的 氨基 酸 用 来 识别 三 联 体 中 不 同位 置 上 相同 的 氨基 酸 。 这 是 由 于 识别 螺旋 的 螺 距 是 根据 -1,3 和 6 位 置 上 的 残 基 ,它们 不 完全 处 于 螺旋 的 同一 表面 上 ,因此 离 DNA 的 距离 也 不 同 。 与 不 同 长 度 侧 链接 触 的 同一 类 氨基 酸 往往 用 来 作为 碱 基 的 识别 (如 Val， Leu, Ile)。 象 遗传 密码 一 样 , 锌 指 的 密码 也 是 简 并 的 ,但 含义 明确 。 它 也 涉及 碱 基 的 三 联 体 ,但 这 是 与 锌 指 组 件 有 关 的 较 表面 的 性 质 ,这 个 密码 本 身 不 象 遗 传 密码 那样 涉及 3:1 翻译 。 序列 特异 性 的 RNA 识别 ”相对 来 讲 ,序列 特 异性 识别 蛋白 同 RNA 的 相互 作用 的 知识 了 解 得 较 少 ,这 主要 是 由 于 只 有 很 少 RNA- 蛋白 复合 物 的 结构 得 以 解析 ,这 些 结构 ,如 3 种 氨基 酰 -tRNA 合成 酶 ,结合 于 ULlsnRNA 发 夹 的 ULA 剪接 体 蛋 白 , 和 结合 于 RNA 发 夹 结 构 的 喉 菌 体 MS2 的 衣 壳 蛋白 ,揭示 了 少数 统一 的 原则 。 还 有 部 分 原因 是 因为 RNA 在 细胞 中 的 作用 多 样 化 ,同时 形成 的 结构 也 就 多 样 。 氨基 酰 - tRNA 合成 酶 是 很 独特 的 一 类 酶 ,它们 被 认为 以 呀 吕 异 氰 方式 同 其 底 物 作 用 。 但 是 这 些 结构 的 细微 之 处 仅 有 很 小 的 相似 性 ,对 此 我 们 不 必 惊 讶 。 我 们 根据 是 哪 一 类 tRNA 末端 腺 苷 酸 的 产 基 负载 氨基 酸 , 而 将 乙酰 氢 基 酸 - tRNA 合成 酶 分 为 两 类 。 第 一 类 酶 以 2 羟基 作用 ,在 这 类 中 ,大 肠 杆菌 的 Glu - tRNA 合成 酶 的 结构 已 被 解析 。 而 第 二 类 酶 以 3' 凑 基 作 用 ,其 中 啤酒 酵母 Asp - tRNA 合成 酶 和 耐 热 菌 的 Ser - tRNA 合成 酶 的 结构 已 经 解析 。 每 种 酶 以 不 同 的 方式 结合 了 NA。Asp- tRNA 合成 酶 结合 于 受 体 茎 部 的 大 沟 处 ,而 Glu- tRNA 合成 酶 结合 于 小 沟 的 一 侧 ( 这 两 种 酶 有 着 不 同 的 催化 机 制 )。 两 种 酶 都 同 tRNA 的 反 密 码 子 环 作用 并 识别 反 密 码 子 , 但 他 们 的 作用 方式 不 同 。sSer - RNA 不 同 反 密码 子 环 作用 ,但 是 其 螺旋 卷曲 结构 可 同 TYC 环 和 可 变 环 作用 。 这 里 包含 了 直接 和 非 直接 的 解读 机 制 。 17.6 研究 蛋白 核酸 相互 作用 的 技术 同 蛋白 作用 的 核 苷 酸 序列 的 描述 ”分析 蛋白 核酸 相互 作用 常常 从 研究 同 蛋 白 结合 "2 DNA 或 RNA 序 列 开始 。 现 在 已 发 展 了 许多 方法 来 鉴定 和 了 解 这 些 序列 的 特点 ,这 些 方 法 既 可 以 将 蛋白 核酸 复合 物 从 裸露 的 核酸 中 分 离 出 来 ,又 可 以 在 蛋白 结合 的 保护 中 使 核 苷 免 受 化 学 和 酶 的 降解 。 这 些 技术 的 具体 细节 将 在 表 17.3 和 图 17.4 中 描述 。 表 17.3 ”用 于 鉴定 同 蛋白 结合 的 核酸 序列 的 技术 (图 17.4) 用 于 研究 蛋白 核酸 相互 作用 的 方法 技术 : 凝 胶 阻 滞 分 析 (gel retardation assay) (电泳 迁移 分 析 ` 迁 移 带 分 析 、 胶 迁移 分 析 ) 。 原理 :DNAVXRNA 蛋白 复合 物 比 裸露 的 RNA 或 DNA 的 电泳 迁移 得 慢 。 用 途 : 鉴 定 和 了 解 蛋 白 在 DNA 和 RNA 结 合 位 点 。 说 明 : 同 蛋白 抽 提 物 保温 或 未 保温 的 标记 的 DNA 和 RNA 片段 用 于 凝 胶 电 泳 。 成 功 的 结合 显示 为 迁移 带 由 于 胶 阻 滞 作 用 ,在 经 保温 或 未 保温 的 样品 之 间 出 现 不 同 的 迁移 带 (蛋白 核酸 复合 物 有 着 相对 慢 的 迁移 率 )。 和 蛋白 还 可 以 进一步 用 抗体 结合 鉴定 ,由 于 阻 滞 变 大 , 带 将 出 现 进一步 迁移 [或 超 迁 移 (supershift)]。 结 合 位 点 的 精确 定位 还 可 以 通过 加 入 过 量 的 特殊 碱 基 序 列 的 竞争 性 址 豆 核 背 酸 (competitor) 加 以 研究 。 如 果 竞 争 结合 位 点 是 适合 的 , 竞 争 性 寡 聚 核 苷 酸 将 从 标记 的 DNA 或 RNA 处 俘获 那些 蛋白 ,这 样 迁移 带 将 消失 ;如 果 竞 争 位 点 不 适合 ,将 没有 明 显现 象 。 这 种 方法 可 用 于 精确 定位 连续 的 结合 位 点 。 技术 :DNA 酶 工 足迹 法 ( DNase I footprinting ) 原理 :结合 有 蛋白 的 DNA 片段 受到 保护 而 不 被 酶 降解 。 用 途 : 鉴 定 被 特殊 蛋白 占据 的 准确 的 核 苷 酸 位 点 。 说 明 :DNA 在 相同 或 不 同 蛋白 抽 提 物 保温 后 , 仅 在 一 端 被 标记 , 同 限制 酶 量 的 DNase I 酶 解 产 生 一 组 标记 条 带 。 这 些 片 段 通过 电泳 产生 一 系列 条 带 。 蛋 白 同 片段 结合 保护 其 不 被 酶 切 ,在 这 些 条 带 中 产生 间隔 。 同 时 对 相同 片段 进行 测序 (参见 Maxam and Gilbert 测序 ) 来 确定 被 蛋白 保护 的 正确 的 核 苷 酸 序 列 。DNaseI 足 迹 法 可 以 同时 鉴定 同一 DNA 片 段 上 的 几 个 结合 位 点 ,并且 竞 争 核 苷 酸 也 可 以 同 胶 阻 滞 中 一 样 使 用 来 了 解 其 结合 的 特异 性 。 技术 :修饰 保护 (modification protection)[ 例 如 硫酸 二 甲 酯 保护 分 析 (Dimethylsulphate protection assay) ] 原理 :结合 DNA 或 RNA 的 蛋白 可 以 保护 特殊 的 碱 基 不 被 化 学 修饰 (参见 修饰 干涉 modification interference ) 用 途 :鉴定 同 蛋白 作 用 的 特殊 碱 基 说 明 : 硫 酸 二 甲 酯 (dimethylsulfate,DMS) 可 以 特定 地 甲 基 化 鸟 味 叭 碱 基 , 作 用 后 可 以 用 哌 啶 在 修饰 位 点 处 前 切 。 蛋 白 可 以 结合 鸟 嘎 叭 碱 基 而 防止 甲 基 化 而 不 被 剪 切 。DNAMRNA 同 蛋 白 抽 提 物 保温 后 ,用 DMS 处 理 , 同 裸 DNA 的 剪 切 产 物 相 比较 ,被 保护 的 鸟 味 吟 便 被 鉴定 出 来 。DMA 保护 也 可 以 用 于 细胞 内 来 了 解 DNA 与 蛋白 的 相互 作 用 (体内 足迹 法 ) 而 不 仅仅 用 于 体外 研究 。DMS 对 于 细胞 是 可 透 过 的 ,主要 可 以 直接 甲 基 化 胞 内 基因 组 的 鸟 顺 叭 ,接着 将 DNA 分 离 , 用 哌 啶 处 理 , 再 用 PCR 加 以 扩 增 来 鉴定 被 保护 和 未 被 保护 的 产物 。 如 果 PCR 产物 位 于 被 保护 的 鸟 味 叭 的 两 侧 , 如 果 有 和 蛋白 结合 可 得 到 额外 的 PCR 产物 。 技术 :修饰 干涉 (modification interference) 原理 : 碱 基 被 化 学 修饰 后 通常 不 会 结合 蛋白 (参见 甲 基 保 护 ) 用 途 : 了 解 同 蛋白 结合 的 特殊 碱 基 说 明 : 在 DNA 甲 基干 涉 分 析 (methylation interference assay) 中 ,DNA 片段 用 限量 的 DMA 处 理 ,这 样 甲 基 基 团 随 机 引入 ,然后 同 蛋白 抽 提 物 保温 ,通过 凝 教 阻 滞 电 泳 分 离 。 如 果 一 个 特殊 的 鸟 味 叭 碱 基 对 于 蛋白 结合 是 必需 的 , 修 饰 甲 基 可 以 影响 结合 并 且 所 有 包含 修饰 碱 基 的 片段 将 在 未 受阻 滞 的 裸 DNA 带 中 出 现 。 将 受阻 洁 和 未 受阻 滞 的 条 带 分 别 割 下 ,DNA 用 哌 啶 处 理 。 由 于 未 被 阻 洁 的 条 带 中 含有 唯一 的 片段 ,其 大 小 可 以 反映 可 结合 蛋白 的 碱 基 的 位 置 。 使 用 同样 的 方法 ,而 用 不 同 的 化 学 修饰 剂 ,可 以 了 解 DNA 中 其 他 碱 基 的 作用 。 对 于 RNA, 若 碳酸 二 乙 酯 (diethylpyrocarbonate,DEPC) 可 以 羧基 化 味 吟 ,并且 剧 可 以 前 切 喀 啶 。 这 样 不 仅 可 以 阻止 RNA 同 蛋白 质 相 互 作用 ,而 且 RNA 可 被 苯胺 前 切 。 同 核 苷 酸 作用 的 蛋白 质 的 纯化 方法 ”用 传统 的 蛋白 纯化 方法 (如 HPLC) 纯 化 核酸 结合 蛋白 ,如 转录 因子 的 结果 往往 较 差 ,这 是 由 于 这 些 蛋 白 的 丰 度 往往 较 低 。 然 而 ,利用 蛋白 同 特殊 的 DNA 或 RNA 序列 有 结合 的 特点 ,可 以 得 到 少量 十 分 纯 的 核酸 结合 蛋白 。 首 先 ,用 蛋白 抽 提 物 同 总 基因 组 DNA 或 非特 异性 的 RNA( 如 酵母 tRNA ) 混 合 去 除非 特异 性 结合 的 蛋白 ,然后 ,根据 共有 DNA 结合 序列 或 特殊 的 RNA 序列 设计 的 朝 聚 核 苷 酸 用 于 提取 感 兴趣 的 蛋白 。 一 种 早期 用 于 分 离 RNA 结合 蛋白 的 简单 方法 仅 是 将 混合 物 通过 8 硝酸 纤维 素 层 析 , 因 RNA( 包括 其 结合 蛋白 ) 可 结合 于 纤维 素 上 , 而 其 他 的 蛋白 被 洗 脱 除 去 ,这 样 RNA 结合 蛋白 可 用 阻 证 样品 分 析 中 得 到 。 一 个 高 效 并 应 用 广泛 的 分 离 DNA 结 合 蛋 白 的 方法 是 亲 和 层 析 , 它 是 将 寡 聚 核 苷 酸 连 接 于 层 析 柱 中 的 固体 基质 上 ,再 将 抽 提 物 上 样 , 在 这 个 过 程 中 ,结合 蛋白 将 被 吸附 。 使 用 生物 素 一 链 零 素 系统 (biotin-streptavidin system, 人 参阅) 的 亲 和 层 析 过 程 同上 。 ts 和 由 由 这 个 碱 基 被 保护 meGmce mG CG 半 一 一 站 半 - 一 (P) 林 剪 切 和 | 二 上 | : 主 三 和 = 剪 切 产物 消失 ， 因 为 和 三 三 三 一 一 4 刀 -被 保护 的 碱 基 没 硅 研 村 有 被 修饰 (a) 凝 胶 阻 洁 分 析 (b) DNA 酶 足迹 法 (e) 修饰 保护 有 限 的 修 人 人 @ 中 9 99 9 饰 (随机 ) 一 一 一 一 G_ 。”GmG G “一 从 胶 上 人 切 出 G GG meG 全 时 一 一 一 和 由 修饰 的 片段 出 现在 非 阻 滞 的 带 因此 产生 独特 的 剪 切 产物 (d) 修饰 干涉 图 17.4 分 析 DNA 同 蛋白 的 相互 作用 。 标 记 DNA 或 RNA 同 蛋白 抽 提 物 混合 保温 ,用 图 示 方 法 并 且 用 电泳 分 离 。 具 体 方法 可 参看 表 17.3。(a) 凝 胶 阻 滞 分 析 : 和 蛋白 核酸 结合 的 迁移 带 显 示 , 带 迁移 率 不 同 是 由 于 蛋白 核酸 复 合 物 被 凝 胶 阻 滞 所 致 。(b)DNA 酶 工 足迹 法 :可 通过 在 DNA 的 一 端 标 记 , 再 用 限制 酶 量 的 DNA 酶 I 处 理 成 一 系 列 的 标记 片段 的 方法 ,精确 定位 蛋白 结合 位 点 。 蛋 和 白 结 合 片段 受到 保护 而 不 被 酶 解 ,因而 在 梯 带 中 产生 间隔 。(c) DMIS 保护 :DMS 可 以 特异 性 地 甲 基 化 鸟 味 叭 碱 基 , 使 之 可 被 哌 叮 前 切 。 结 合 蛋白 可 防止 鸟 味 叭 被 甲 基 化 ,从 而 防 止 被 剪 切 。 结 合 特定 鸟 味 叭 的 蛋白 可 由 缺失 的 酶 解 片段 所 显示 。(d)DMR 干涉 : 同 < 法 ,在 蛋白 保温 前 进行 修饰 , 因 此 蛋白 结合 被 阻止 ,裸露 的 DNA 从 DNA 蛋白 复合 物 中 分 离 出 来 ,从 而 分 离 得 到 包含 鸟 味 叭 的 片段 。 这 个 片段 可 以 和 和 蛋白 结合 成 非 阻 滞 带 。 将 各 个 片段 分 别 用 哌 叮 剪 切 ,进一步 电泳 ,通过 产生 的 额外 前 切 产物 显示 出 乌 苷 带 型 。 1 289 ， 用 上 述 方法 纯化 的 蛋白 可 通过 Edman 降解 (参阅 ) 进 行 微量 测序 ,可 用 得 到 部 分 氨基 酸 序列 ,这样 可 以 根据 此 设计 简 并 的 核 苷 酸 探 针 或 引物 ,通过 筛 cDNA 文库 分 离 对 应 于 DNA 结合 蛋白 的 克隆 。 同 样 ,还 可 以 用 含有 核 苷 酸 识 别 序列 的 寡 聚 核 苷 酸 探 针 筛 cDNA 表达 文库 来 获取 基因 (这 个 方法 称 为 DNA 结合 蛋 白 的 southwestern 筛选 和 RNA 结合 蛋 白 的 northwestern 筛选 ,参见 核 苷 酸 杂 交 )。 一 旦 cDNA 分 离 得 到 ,将 其 克隆 于 表达 载体 中 ,并 在 大 肠 杆 菌 中 大 量 表达 重组 蛋白 ,这样 利 于 更 深入 的 功能 研究 (参见 表达 克隆 )。 鉴定 必需 的 核酸 蛋白 “RNA- 蛋白 的 相互 作用 反映 了 在 细胞 中 的 广泛 功能 ,而 核糖 核 蛋白 常常 是 复杂 的 结构 ,包含 几 个 RNA 分 子 和 许多 蛋白 分 子 (参见 核糖 体 、 剪 接 体 、 信 号 识别 颗粒 、 编 辑 体 、 信 息 体 )。 通 常 通过 确定 他 们 的 结构 组 成 (例如 某 一 成 分 同 其 余 成 分 的 作用 ) 来 研究 核糖 核 蛋 白 复 合 物 的 结构 和 不 同 成 分 的 功能 重要 性 。 一 般 可 以 用 在 文 杠 22.2 中 所 讨论 的 生物 物理 的 方法 来 了 解 复合 物 的 结构 ,还 可 以 用 分 子 交 联 ,免疫 共 沉 演 和 亲 和 吸 附 的 方法 了 解 不 同 成 分 的 相互 作用 ,在 功能 研究 中 ,可 以 采用 在 某 个 特定 时 间 除 去 某 一 成 分 的 方法 了 解 其 在 复合 物 中 的 作用 。RNA 可 以 RNA 酶 A 去除 ,而 特殊 的 RNA 和 其 部 分 片段 可 先 同 寡 聚 DNA 杂交 ,再 用 RNase H 酶 切 ,可 特定 地 水 解 在 DNA、 RNA 复合 体 中 的 RNA 片段。 ( 袁 群 译 ) .234 ， SR nn 第 18 章 瘤 基 因 与 瘤 基本 概念 和 定义 癌症 是 多 细胞 生物 的 疾病 ,这 些 生物 的 细胞 生长 异常 ,失去 调节 , 常 伴 有 异常 分 化 (形成 瘤 ,neoplasia) 。 癌 证 往往 是 由 于 突变 的 积累 而 引起 的 ( 见 下 文 ); 它 在 高 等 兰 椎 动物 中 普遍 存在 ,其 他 生物 中 因为 生活 期 短 , 所 以 不 发 生 癌症 。 动 物 中 的 癌 症 被 广泛 的 研究 ,植物 中 也 有 肿瘤 发 生 ( 参 见 冠 疗 病 ,crown gall disease) 。 癌症 发 生 与 自然 选择 类 似 , 但 只 涉及 个 体 中 的 体 细 胞 而 不 是 整个 器 官 。 正 常情 况 下 , 体 细 胞 有 一 发 育 过 程 ,为 了 生物 的 生存 和 各 种 需要 , 需 确保 生长 的 控制 。 单 个 细胞 失去 生长 控制 时 ,要 比 周 邻 细 胞 生长 快 数 倍 ,形成 定 域 增生 细胞 群 。 在 肿瘤 形成 (oncogenesis or tumorigenesis) 过 程 中 , 发 展 成 分 隔 的 生长 ( 瘤 ,neoplasm; 或 原 生 肿 瘤 ,primary tumor) ,可 能 会 有 未 定性 的 分 化 细胞 类 型 ,并 可 进入 血管 等 。 肿 瘤 如 果 局 限 在 一 区 域内 是 良性 的 ,因为 它 通 常 可 以 通过 外 科 手 术 切 除 。 恶 性 肿瘤 是 转移 性 的 一 一 细胞 破裂 , 播 散 到 其 他 组 织 。 在 此 阶段 ,癌症 变 得 难以 控制 最 终 导致 死亡 。 因 为 它 会 破坏 和 危害 其 他 重要 的 器 官 。 癌症 是 由 控制 细胞 生长 的 机 制 被 破坏 而 引起 的 ,或 是 由 于 蛋白 功能 水 平 上 的 病毒 活性 (偶尔 也 由 细菌 信号 引起 ) ,或 是 重要 的 生长 调节 基因 的 突变 。 有 两 类 基因 已 被 发 现 : 癌 基 因 (oncogene) 促 进 细 胞 增生 ,癌症 由 它们 不 恰当 的 活性 (产生 功能 突 变 ) 引 起 ; 另 一 类 抑 癌 基因 (tumor supperssor gene, 工 SGs) 抑 制 细胞 生长 ,癌症 可 由 于 抑 癌 基 因 活 性 的 下 降 ( 功 能 缺失 突变 ) 引 起 。 原 则 上 ,有 很 多 控制 细胞 增生 和 分 化 的 信号 传导 系统 和 调节 机 制 的 破坏 都 会 引发 癌症 (参见 信号 传导 ,细胞 周期 ,发 育 : 分 子 机制 )。 其 他 被 发 现 与 癌症 有 关 的 基因 往往 是 在 DNA 修复 或 细胞 对 DNA 损伤 作出 反应 的 基因 。 虽 然 这 些 基 因 的 突变 本 身 不 会 引起 癌症 ,但 它们 增 加 了 突变 发 生 率 ,使 癌 基 因 和 TSG 突变 更 易 发 生 。 癌症 发 生 有 几 个 阶段 ,经 常 从 一 个 温和 的 生长 紊乱 开始 (发 育 异 常 ,dysplasia) ,可 以 逐渐 变 得 严重 (肿瘤 发 展 ,tumor progression ) 。 同样 , 原 代 培养 的 细胞 开始 也 象 体内 细胞 一 样 (它们 表现 出 血清 依赖 ,接触 抑制 有限 的 寿命 等 )。 它 们 可 以 通过 一 个 多 阶段 的 生长 转化 过 程 (growth transformation) ,失去 这 些 抑 制 特 性 ,而 转变 成 癌 细 胞 。 在 这 种 过 程 的 早期 ,细胞 变 得 永生 化 ,但 其 他 方面 仍 正 常 。 然 而 以 后 ， 细胞 失去 了 血清 依赖 性 等 ,逐渐 变 成 致 病 性 。 这 种 逐渐 严重 的 过 程 反 映 了 控制 细 胞 生长 和 分 化 的 单一 突变 往往 不 足以 引起 癌症 。 癌 症 是 突变 积累 引起 的 ,它们 作 5 用 是 逐渐 扩大 和 以 逐步 方式 (多 击 假说 ,multiple hit hypothesis) 进 行 。 这 也 反映 了 存在 多 种 细胞 增生 调控 机 制 ,是 动物 生存 的 安全 方面 的 需要 ,如 人 有 大 于 108 个 细胞 和 很 长 的 生存 时 间 。 每 代 每 个 基因 发 生 突变 的 概率 是 104 分 之 一 ,一 个 突 变 就 引起 癌症 会 使 每 个 个 体 中 数 以 千 记 的 细胞 受 影 响 ,物种 不 可 生 能 生存 。 在 任 何 一 个 细胞 中 瘤 的 发 生 需 4 一 6 个 独立 的 基因 突变 ,使 危险 性 大 大 下 降 。 18.1 癌 基 因 宫 基 因 活 性 的 基础 ” 瘤 基 因 是 有 潜在 的 促 发 肿瘤 发 生活 性 的 基因 。 它 们 最 早 是 在 分 析 肿瘤 病毒 (tumor viruses) 中 发 现 。 肿 瘤 病 毒 的 感染 可 以 诱发 肿瘤 的 生长 。DNA 和 RNA 病毒 通过 不 同 的 机 制 诱 发 肿瘤 生长 。DNA 病毒 编码 的 产物 通过 在 蛋白 水 平 上 影响 宿主 细胞 的 生长 调节 ,这些 产 物 在 宿主 的 基因 组 中 没有 对 应 物 ( 见 下 文 )。RNA 病毒 通过 两 种 途径 刺激 细胞 增生 ,或 是 携带 一 个 高 活性 形式 的 宿主 基因 的 变 体 ,其 本 来 的 正常 功能 是 促 进 细 胞 增生 的 ,或 是 用 病毒 中 强调 控 元 件 整 合 在 邻近 位 置 ,激活 内 源 性 基因 。 在 以 上 任 一 情况 下 ,对 应 宿主 基因 被 鉴定 ,这些 基因 突变 时 也 有 诱发 肿瘤 的 能 力 ( 没 有 病毒 的 情况 网。 病毒 癌 基 因 和 原 癌 基 因 有些 RNA 肿瘤 病毒 可 以 在 感染 它们 的 宿主 后 立即 引发 肿 瘤 ,被 称 为 急性 转化 反 转 录 病 毒 (acute tranforming retroviruses)。 肿 瘤 发 生 是 由 于 病毒 基 因 组 中 存在 的 信息 所 引起 ,这 种 信息 常 由 单个 病毒 癌 基 因 ( 称 为 ozc ) 组 成 。 癌 基因 常 以 牺牲 病毒 基因 组 信息 为 代价 ,急性 转化 反 转 录 病 毒 是 有 缺陷 的 ,需要 辅助 病毒 (helper virus) 来 提供 它 失去 的 功能 。 第 一 个 被 发 现 有 癌 基 因 的 反 转 录 病 毒 是 劳 斯 肉瘤 病毒 (Rous Sarcoma virus) , 它 是 个 例外 :除了 有 整个 病毒 基因 组 外 ,还 有 v-src 基因 。 每 个 病毒 瘤 基因 都 有 一 个 细胞 内 对 应 体 , 有 类 似 或 相同 结构 的 细胞 瘤 基因 或 称 为 原 瘤 基 因 ( 以 (c-oxc ) 表 示 )。 原 瘤 基 因 是 细胞 内 基因 ,功能 是 传导 信和 号 ,调节 细胞 生长 和 分 化 。 病 毒瘤 约 因 是 细胞 序列 被 转 导 、 修 饰 的 复制 品 , 并 有 不 恰当 的 活性 。 原 癌 基 因 根 据 其 产物 的 细胞 功能 可 以 分 成 多 种 类 型 ( 见 表 18.1)。 促 进 细 胞 生长 的 多 种 信号 途径 另行 讨 论 ( 见 信和 号 传导 ) ,而 瘤 基因 的 功能 与 这 些 途 径 中 的 成 分 相对 应 。 原 则 上 ,任何 信号 蛋白 不 恰当 的 活性 都 有 潜在 的 肿瘤 发 生 能 力 。 然 而 特别 有 趣 的 是 ,大 多 数 是 这 些 途 径 中 的 下 游 成 分 ,直接 控制 基因 的 转录 因子 负责 调控 生长 ,它们 汇集 到 细胞 表面 成 为 复杂 信和 号 ,这些 因子 有 的 单独 起 作用 (Ets\Myb) ,有 的 和 不 同 癌 蛋 白 (Fos 和 Jun) 或 其 他 蛋白 (Myc 和 泛 蛋白 Max) 形 成 复合 物 起 作用 。 很 多 有 诱发 肿瘤 能 力 的 转录 因子 的 表达 量 很 低 , 由 蛋白 水 平 的 磷酸 化 调节 。 突 变 引 发 过 量 表达 或 失去 调节 才 具 有 诱发 肿瘤 活性 。 因为 反 转 录 病 毒 只 能 在 分 裂 期 细胞 中 复制 ,而 癌 基 因 使 它们 诱发 宿主 细胞 生长 ,所 以 这 些 病毒 更 多 的 是 转 导 癌 基因 。 一 些 癌 基 因 最 初 以 病毒 癌 基 因 形 式 被 发 现 ,对 应 的 原 瘤 基因 的 功能 列 在 表 18.2 中 。 5 表 18.1 瘤 蛋 白 的 主要 功能 和 编码 它们 的 原 癌 基 因 举 例 癌 蛋 白 的 功能 举 ”全 分 泌 蛋 白 ( 生 长 因子 ) c-sisy rontl 跨 膜 受 体 c-Rityc-eraB 接头 蛋白 cr，uaO GTP 结合 蛋白 c- Fas 细胞 内 激酶 c-aBL ,c-swcyc-7a 太 转录 因子 c-jamz yc- jos,c-7X 转录 延伸 因子 el RNA 结合 蛋白 ErUS 细胞 周期 调节 因子 cyxcD1l, cadc25A 最 先 在 病毒 中 发 现 的 癌 基 因 定 为 病毒 癌 基 因 ( 如 vc ) , 定 为 细胞 癌 基 因 用 前 级 表示 (如 c-myc) 表 18.2 在 急性 转化 病毒 中 发 现 的 癌 基 因 和 它们 在 细胞 内 对 应 物 的 功能 ;大 多 数 以 病毒 命名 痛 基 因 。 转 导 的 反 转 录 病 毒 物种 。 原 发 肿瘤 产物 。 ”Ableson 白血病 病毒 小 鼠 ”淋巴 痪 酷 氨 酸 激酶 (cytosolic) eriA 。。 鸟 红细胞 瘤 病毒 鸡 白血病 , 肉 痛 转录 因子 (甲状 腺 素 受 体 ) er5B 受 体 酷 氨 酸 激酶 (EGF 受 体 ) Jims ， ， 猫 肉 瘤 病毒 猫 肉瘤 受 体 酷 氨 酸 激酶 (MLCSF 受 体 ) js FEFBJ 小 鼠 骨 瘤 病毒 小 鼠 ， 软骨 肉瘤 转录 因子 jos _，。 Fuiinami 肉瘤 病毒 鸡 肉 冯 酷 氨 酸 激酶 (cytosolic) jun ，_ ， 鸟 内 癌 病 毒 鸡 肉 冯 转录 因子 垃 。。。 猫 肉瘤 病 毒 猫 肉 冯 受 体 酷 氨 酸 激酶 ( 青 灰 因子 受 体 ) max 英 洛 尼 鼠 类 肉瘤 病毒 小 鼠 。 肉瘤 丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶 mao。 鸟 中 幼 粒 冯 鸡 白血病 转录 因子 me 鸟 中 幼 粒 细胞 瘤 病毒 鸡 中 幼 粒 细胞 瘤 ,肉瘤 ”转录 因子 maf 小 鼠 肉 瘤 病毒 小 鼠 , 鸡 “ 肉 冯 丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶 Has 小 鼠 肉瘤 病毒 (Harvey 株 ) 大 鼠 。 肉瘤 , 红 白 血 病 Ras GTP 酶 K-ras 小 鼠 肉瘤 病毒 (Kirsten 株 ) 网 状 内 皮 细 胞 病毒 火 鸡 白血病 转录 因子 Sis 猴 肉 瘤 病毒 猴 肉瘤 生长 因子 (PDGF 8B 链 ) 品 猫 肉瘤 病毒 猫 wc 。。 劳 氏 肉瘤 病毒 (RSV) 鸡 肉瘤 膜 相 关 酷 氨 酸 激酶 大 部 分 病毒 都 携带 了 单个 的 瘤 基因 ,有 些 携带 得 更 多 。 如 AEV 带 有 2 个 ,verp4A 和 v-erpB ,它们 是 不 相关 的 。 很 多 癌 基 因 是 某 种 病毒 所 特有 的 ,而 有 两 种 不 相关 的 病毒 都 扒 有 vszs。 有 的 病毒 品系 带 有 相同 瘤 基 因 的 不 同类 型 ,如 MuSV 带 有 v-ras 的 不 同类 型 。 缩 略 语 :EGF, 表 皮 生 长 因子 (epidermal growth factor); M-CSF, 巨 鸣 细 胞 集落 刺激 因子 (macrophage colony stimu- lating factor) ;PDGF , 血小板 衍生 生长 因子 (platelet-derived growth factor) 。 “有关 这 些 产 物 在 细胞 生长 中 的 作用 ,可 参见 第 28 章 信号 转 导 。 全 突变 激活 癌 基 因 尽管 很 多 癌 基 因 是 在 研究 急性 转化 反 转 录 病 毒 中 被 发 现 ,但 大 多 数 癌症 的 发 生 并 没有 病毒 感染 。 另 一 种 鉴定 癌 基 因 的 方法 是 直接 分 析 肿 瘤 细 胞 的 DNA, 可 以 从 结构 上 寻找 正常 细胞 和 肿瘤 细胞 之 间 DNA 的 区 别 , 也 可 从 功能 上 ,将 肿瘤 细胞 的 DNA 转 染 培养 细胞 ,分 析 转 化 生长 的 能 力 。 小 鼠 3T3 细胞 是 这 种 分 析 的 理想 材料 ,因为 它们 已 经 历 了 生长 转化 ,积累 了 癌症 发 生 所 需 的 几 个 突变 。3T3 分 析 (3T3 assay) 鉴 别 了 很 多 最 早 在 研究 反 转 录 病 毒 中 发 现 的 癌 基 因 和 其 他 转化 病毒 中 未 报导 的 瘤 基 因 ( 如 romz- 1 ,ziR ,ret,lcR 和 pcl-2)。 在 比较 对 应 的 v-oxzc 和 c-oxc 序列 ,以 及 从 正常 细胞 和 转化 细胞 中 的 c-oxc 的 序列 ， 发 现 原 癌 基 因 诱 发 肿瘤 是 由 结构 上 的 改变 ( 质 的 改变 引起 不 恰当 的 活性 ) 或 表达 量 的 增加 (产生 的 癌 基 因 产 物 增多 引起 量 的 改变 ) 引 起 的 (图 18.1, 表 18.3)。 当 正常 癌 蛋 和 白 被 其 结 构 所 约束 时 (如 受 体 需要 它 的 配 体 激 活 ) , 质 的 改变 会 引起 非常 严重 的 后 果 , 而 当 正 常 癌 蛋 白 活 性 受 其 丰 度 调节 时 (如 转录 因子 ) , 量 的 改变 就 更 重要 。 最 简单 的 质变 是 基因 突变 ,无 论 是 点 突变 还 是 平 截 突 变 , 改 变 癌 蛋 白 的 结构 ,使 其 在 正常 量 时 有 过 高 的 活性 。 量 的 改变 可 能 涉及 调节 元 件 突变 ,增加 基因 的 转录 活性 或 增加 基因 mRNA 或 蛋白 的 稳定 性 的 突 变 。 另 外 基因 表达 量 的 增加 也 可 通过 基因 扩 增 或 将 原 瘤 基 因 易 位 到 强 异 源 启 动 子 或 增强 子 的 控制 之 下 。 在 人 类 , 癌 基 因 的 基因 扩 增 经 常 与 EGF 受 体 基 因 相 关 , 如 RAS 和 MYC 或 11 号 染色 体 含 有 多 个 癌 基 因 ( 包 括 BCL1 , INT2 和 EST1 ) 的 区 域 。 扩 增 经 常 是 p53 蛋 白 功 能 缺失 的 ( 见 下 文 ) 的 二 级 反应 ,p53 蛋白 功能 缺失 使 复制 在 双 链 断裂 处 发 生 。 至 少 在 50 种 癌症 中 发 现 易 位 将 癌 基 因 置 于 强 转录 调控 之 下 。 易 位 也 能 产生 了 融合 瘤 基 因 (fusion oncogenes) :产物 可 能 功能 正常 ,但 过 度 表 达 [ 如 在 非洲 淋巴 瘤 白 基 特 淋巴 瘤 (Brukitt"s lymphoma) 的 Myc 中 ] 或 可 能 有 不 恰当 的 活性 [如 ABLVZBCR 融合 蛋白 在 慢性 押 细 胞 白血病 中 (chronic myeloid leukemia) 所 起 的 作用 ]。 大 多 数 融 合 癌 基 因 被 发 现 是 编 码 改变 底 物 专 一 性 的 融合 激酶 或 融合 转录 因子 。 人 和 二 质 改 变 - 以 正常 速率 产生 高 活性 的 产物 二 一 平 夫 数量 改变 - 正常 产物 过 量 表 达 LI 启动 子 突变 或 易 位 到 强 启动 子 /增强 子 处 天 扩 江 一 SEE 嘲 位 激活 一 上 assees 吻 位 和 基因 融合 图 18.1 交 基 因 激 活 的 机 制 。 3B 表 18.3 瘤 基因 激活 的 机 制 改变 质变 点 突变 平 截 量变 扩 增 增加 转录 易 位 位 置 效 应 融合 瘤 基因 举例 C-7Qs : Ras 是 传导 生长 因子 受 体 信和 号 的 GTP 结合 蛋白 。 受 体 激 活 通过 募集 鸟 嘎 叭 交换 因子 ,促进 GTP 与 Ras 的 结合 。Ras-GTP 募集 细胞 内 的 Raf 到 细胞 膜 ,使 之 激活 并 传导 生长 信号 。Ras 有 GTP 水 解 酶 活性 ,使 本 身 很 快 失 活 ,所 以 它 的 信号 传导 活性 是 瞬时 爆发 的 。ras 基因 的 点 突变 ， 特别 是 影响 12 和 61 位 氨基 酸 的 突变 ,降低 了 GTP 水 解 酶 的 活性 ,使 其 对 生长 因子 的 反应 增 大 和 细胞 生长 过 量 。 V-erpB : c-erpB 编码 表皮 生长 因子 受 体 ,是 跨 膜 酷 氨 酸 激酶 受 体 。 病 毒 的 癌 基 因 verB 在 两 端 被 截 短 ， 这 样 就 同时 仙 乏 N 端 配 体 结合 结构 域 (使 受 体 在 没有 配 体 存 在 下 就 形成 二 聚 体 ) 和 C 端的 抑制 结构 域 (使 信号 持续 传导 )。 受 体 在 没有 配 体 存在 下 持续 激活 ,使 细胞 增生 不 受 调控 。 Cc-71ZyC ; 特别 是 在 生长 受 瘤 蛋白 量 控制 的 情况 下 ,结构 正常 的 原 瘤 基 因 的 简单 扩 增 引起 癌症 。c-zayc 基 因 就 是 这 种 情况 ,c-ayc 编码 的 转录 因子 平时 只 有 有 限 的 量 。 这 一 基因 在 特定 的 癌 中 ,包括 乳 腺 痛 , 有 数 百倍 的 增加 (参见 DNA 扩 增 )。 V-71205 ,C-712XC ，C-711yD : 在 生长 受 某 种 癌 蛋 白 有 限 的 量 的 控制 的 情况 下 ,癌症 可 由 这 种 癌 基 因 转 录 的 增加 而 引起 。 这 有 多 种 方式 。 增 加 瘤 基 因 转 录 的 调节 突变 在 c-xzyxc 中 有 发 生 。 另 外 病毒 的 转 染 使 正常 的 原 瘤 基 因 受 一 强 病毒 启动 子 的 调节 : 转 导 的 病毒 v-zos 与 c-zxos 相同 , 由 病毒 的 LTR 启动 子 驱动 而 过 度 表 达 。 原 瘤 基 因 也 可 被 整合 在 附近 的 反 转 录 病 毒 反 式 激 活 。c-zxayc,c-xzayg 和 c-ra 基因 就 是 以 这 种 形式 被 激活 ,在 c-zzyc 的 基因 座 , 反 转录 病毒 的 整合 偶尔 也 会 产生 舱 合 mRNA。 72XC : 在 人 类 中 ,染色 体 易 位 攻 8;14)(q24;q32) ,将 ayc 基因 带 到 IgH 的 基因 座 ,将 其 置 于 强 免疫 球 蛋 白 增 强 子 的 控制 下 。 这 种 移 位 被 认为 是 白 基 特 淋巴 瘤 的 基础 。MYC 蛋白 结构 没有 变化 ,但 基 因 被 上 调 (upregulate) 了 。 与 免疫 球 蛋 白 和 开 细 胞 受 体 基 因 座 相关 的 易 位 常 与 癌症 相关 ,因为 V (D)J 的 重组 体系 提供 了 不 正常 重 排 的 可 能 性 ,使 基因 座位 于 强 增强 子 的 控制 之 下 [参见 V(D)J 重 组 ]。 ABL/ZBCR : ABL 基因 位 于 9 号 染色 体 , BCR 基因 在 22 号 染色 体 上 。 交 互 易 位 产生 一 复合 染色 体 ( 费 城 染 色 体 ,Philadelphia chromosome) ,结果 是 ABL 基因 被 剪接 到 不 同 长 度 的 BCR 基因 的 5 末端 。 融 合 产物 缺乏 ABL 蛋白 N 端的 激酶 调节 结构 域 , 这 样 它 的 活性 状态 被 BCR 蛋白 片段 所 稳定 , 结 果 是 融合 的 酷 氨 酸 激酶 具有 持续 的 活性 。 很 多 其 他 癌 基 因 了 融合 蛋白 得 到 研究 ,其 中 大 多 数 是 转 录 调 节 因 子 。 不 管 通过 何 种 途径 ,激活 癌 基 因 的 突变 是 放大 功能 (gain of function) 突 变 如 促进 生长 活性 的 放大 ,并 对 野生 型 等 位 基因 是 显 性 。 在 反 转 录 病 毒 转 导 的 情况 下 被 转 导 的 瘤 基 因 必然 比 两 份 野 生 型 的 等 位 基因 发 挥 更 强 的 作用 。 癌 基 因 被 慢性 RNA 肿瘤 病毒 激活 急性 转化 反 转 录 病 毒 通过 转 导 一 高 活性 或 过 度 表 达 的 病毒 癌 基 因 到 宿主 的 基因 组 中 ,使 宿主 细胞 转化 ,而 第 二 类 RNA 肿瘤 病毒 只 能 在 感 “22589 >” 染 较 长 时 间 后 启动 肿瘤 的 发 生 。 这 些 慢性 反 转 录 病 毒 不 是 缺陷 的 ,也 没有 携带 v-oxc 基 因 。 癌 基因 的 激活 是 因为 反 转 录 病 毒 整合 到 正常 原 癌 基 因 的 附近 ,使 其 被 病毒 中 强 启动 子 长 末端 重复 序列 所 激活 (参见 反 转 录 病 毒 )。 这 延迟 的 时 期 反映 了 反 转 录 病 毒 的 多 轮 复 制 和 整合 ,直到 病毒 整合 到 某 一 位 置 ,在 此 可 以 激活 附近 的 原 癌 基因 。 不 同 的 反 转 录 病 毒 倾向 于 激活 不 同 的 原 癌 基 因 ,如 禽类 白血病 病毒 (avian leukosis virus) 倾 向 于 激活 c-xzyc。 这 可 能 反映 了 每 种 病毒 群 反 转 录 整 合 的 区 域 专 一 性 。 18.2 抑 癌 基因 抑 癌 基因 活性 的 基础 ”肿瘤 抑制 基因 ( 抗 瘤 基因 、 隐 性 瘤 基 因 或 癌症 抑制 基因 ) , 它 的 失 活 具 有 促进 肿瘤 生长 的 潜 势 。 细 胞 融合 实验 预言 TSGs 的 存在 ,一 个 生长 转化 的 细胞 可 以 通过 与 正常 细胞 融合 得 到 恢复 ( 即 肿瘤 生成 表 型 得 以 纠正 ) 。 这 样 实验 表明 TSGs 与 一 隐 性 失 活 的 等 位 基因 (如 RB-1 ) 相 一 致 ,但 很 多 TSGs 突变 后 (如 TP53 和 WT-I) (图 18.2) 是 显 性 失 活 (参阅 )。TSGs 的 正常 功能 是 限制 细胞 生长 ,而 且 很 多 TSG 的 产物 被 发 现 是 细胞 周期 (参阅 ) 的 调节 因子 或 是 生长 相关 基因 的 转录 抑制 子 ( 表 18.4)。 正 党 正常 异常 被 转化 时 一 原 癌 基 因 或 显 性 失 活 肿瘤 抑制 基因 二 记 基本 的 隐 性 肿瘤 抑制 基因 于 中 间 效 应 图 18.2 瘤 基因 的 突变 和 分 类 。 家 族 性 癌症 和 努 森 (Knudson's) 的 两 步 打击 假说 ”大 多 数 由 瘤 基 因 引 发 的 癌症 是 由 体 细 胞 突变 发 生 ,而 不 是 家 族 性 的 。 这 是 因为 癌 基 因 是 显 性 效应 ,在 胚胎 中 失去 生长 控 制 的 显 性 结构 是 致死 的 。 家 族 性 瘤 症 按照 备 德尔 规律 遗传 ,这 也 是 存在 隐 性 肿瘤 抑制 基 因 的 证 据 。 有 意思 的 是 ,家 族 性 瘤 症 是 不 完全 外 显 的 常 当 色 体 显 性 遗传 。 . 240 ， ageeeeiieeieee ec， 表 18.4 一 些 研究 得 较 多 的 抑 瘤 基因 和 它们 的 功能 TSG RBI1 P21 和 PI16 BRCAI 和 BRCA42 蛋白 的 功能 成 视网膜 细胞 瘤 蛋 白 RB1 在 调控 细胞 周期 中 起 关键 作用 。 它 与 转录 因子 E2F 家 族 和 基本 转录 机 器 RNA 聚合 酶 I,III 的 成 分 及 重要 的 UBF 结合 并 抑制 其 活性 (参见 RNA 聚合 酶 ID)。 当 RNA 聚 合 酶 1 和 II 合成 TRNA 和 tRNA 时 ,E2F 和 蛋白 为 进入 S 期 而 激活 有 关 基 因 ( 如 c-zzyc ,c-zzyp 和 cac2 ) 所 需 。RBI 蛋白 控制 细胞 生长 不 仅 通过 阻 滞 细 胞 周期 ,还 限 制 蛋白 合成 的 速度 。 因 此 RB1 受 磷 酸化 调节 。 它 在 磷酸 化 状态 是 非 活性 形式 , 它 在 S 期 几 小 时 前 ,被 含 细胞 周期 蛋白 DI 的 细胞 周期 蛋白 - CDK 复合 物 ( 参 见 细胞 周期 ) 磷 酸 化 。 其 他 蛋白 也 与 RB1 作用 ,如 细胞 癌 基 因 MDM2 的 产物 。 几 种 DNA 肿瘤 病毒 癌 基 因 的 产物 也 抑制 RB1 ,不 是 通过 隔离 使 RB1 成 为 非 活性 形式 的 复合 物 ,就 是 触发 其 降解 (如 SV40 工 抗原 )。 p53 蛋白 是 调节 细胞 增生 和 对 信号 (如 DNA 损伤 ) 反 应 的 调节 因子 ,通过 使 细胞 周期 阻 滞 或 诱导 细胞 凋 亡 来 进行 调节 。 细 胞 周期 阻 滞 是 通过 转录 激活 编码 p21/p27 家 族 的 cyclin 依赖 性 激酶 的 抑制 物 以 及 抑制 像 MYC 这 类 具有 导致 细胞 增生 活性 的 基因 来 进行 的 。 p53 还 有 对 DNA 损伤 识别 和 反应 的 广泛 功能 ,因为 它 有 3 - 3 外 切 酶 活性 ,反映 了 它们 具有 修复 DNA 的 功能 。 在 对 细胞 肿瘤 化 的 行为 的 应 答 中 ,p53 在 特定 细胞 类 型 中 可 以 诱导 细胞 调 亡 ,部 分 是 通过 对 EAX 和 BCL2 基因 的 调节 (参见 细胞 调 亡 )。TP53 的 点 罕 变 和 缺失 突变 在 所 有 人 类 肿瘤 中 有 60% 以 上 的 发 生 率 ,并 在 DNA 结合 的 结构 域 产 生 一 连 串 突变 。 因 为 p53 是 四 聚 体 , 突变 往往 是 显 性 失 活 的。 稀少 的 家 族 性 Li-Fraumeni 综 合 征 就 与 生殖 细胞 的 TP53 突变 有 关 , 特 点 是 肿瘤 谱系 多 样 性 。 象 RB1 一 样 ,p53 也 可 被 MDM2 瘤 蛋 白 抑制 ,并 与 多 种 DNA 肿瘤 病毒 的 瘤 蛋白 相互 作用 。 NEF1 是 RAS-GTPase 的 激活 蛋白 (GAP) , 它 的 功能 是 通过 增加 RAS 内 源 的 GTP 水 解 酶 活 性 , 持 抗 RAS 信号 。RAS 是 鸟 味 叭 结合 蛋白 , 它 与 GTP 结合 时 有 活性 ,与 GDP 结合 由 失 活 。 激 活 的 RAS 使 RAF 募集 到 细胞 膜 ,在 此 处 被 磷酸 化 并 能 启动 MAP 激酶 信号 途 径 ( 见 第 28 章 信号 传导 )。NF1I 缺失 使 细胞 失去 关闭 RAS 信号 的 能 力 ,持续 激活 促 有 丝 分 裂 的 MAP 激酶 途径 。 当 广 谱 的 GTP 水 解 酶 激活 蛋白 GAPP2 存在 时 ,就 会 发 生 这 种 情况 。 生 殖 细胞 NEFTI 突变 与 神经 纤维 瘤 和 慢性 通 细 胞 性 白血病 有 关 。 WT1I 基因 通过 不 同 的 剪接 ,编码 至 少 4 个 锌 指 蛋白 。 主 要 的 剪接 变异 体 是 涉及 生长 调控 的 几 个 基因 (包括 BCL2 ,JGFE 开 和 MYC ) 的 转录 抑制 因子 。 使 WT1 失去 DNA 结合 能 力 的 基因 突变 在 肾 的 Wilm 氏 瘤 和 Denys-Drash 综合 征 中 可 以 发 现 。WTI1 是 以 二 娶 体 发 挥 作用 , 故 WT1 突变 常 是 显 性 失 活 的 。 p2 1 是 cyclin 依赖 激酶 的 抑制 因子 (参阅 ) ,为 p53 对 DNA 损伤 反应 后 激活 。pl16 是 CDK4 和 CDK6-D cyclin 复合 物 的 特异 性 抑制 因子 。 这 些 基 因 失 活 突 变 编 码 蛋白 失去 阻 断 细 胞 周期 在 Gi 期 的 能 力 。D cyclins 负责 促进 S 期 的 起 始 事件 (参见 第 2 章 细胞 周期 ) 。 BRCA41 和 BRCA42 突变 与 常见 的 并 发 乳腺 癌 和 卵巢 癌 家 族 性 病例 有 关 , 其 中 一 半 病 例 只 出 . 现 乳 腺 癌 。 这 两 个 蛋白 非常 相似 ,都 有 一 锌 指 结构 ,在 细胞 周期 中 受 磷 酸化 调节 。 它 们 具体 的 功能 还 不 得 而 知 ,但 可 能 BRCAI1 在 发 育 中 发 挥 作用 。 努 森 的 被 两 步 打 击 假说 (Knudson's two-hit hypothesis) 是 对 目前 所 存在 矛盾 的 一 种 解释 。 第 一 个 研究 的 家 族 性 癌症 是 成 视网膜 细胞 瘤 ,是 一 罕见 的 儿童 视网膜 肿瘤 。 成 视 网 膜 细胞 瘤 发 生 有 家 族 性 (60% ) 和 散发 的 病例 (40% ) 两 类 ,而且 家 族 性 癌症 是 常 染 色 体 显 性 遗传 性 状 。 大 多 数 散发 的 病例 都 是 单 侧 的 ,而 双 侧 的 肿瘤 多 为 家 族 性 成 视网膜 细胞 瘤 。 努 森 认 为 产生 成 视网膜 细胞 瘤 细胞 需要 两 个 独立 的 突变 (二 击 ) ,在 家 族 性 成 视网膜 . 241 、 细胞 瘤 中 , 胚 系 已 有 一 次 突变 ,所 以 体 细胞 只 需 一 次 突变 就 可 满足 要 求 。 因 为 突变 的 发 生 率 为 10-5 ,而 在 视网膜 中 大 约 有 105 细胞 ,所 以 带 有 受精 卵 一 个 突变 的 个 体 很 容易 产生 成 视网膜 细胞 瘤 细胞 ,肿瘤 因此 是 强 显 性 但 外 显 率 不 完全 。 在 散发 病例 中 ,一 个 细胞 需要 两 次 体 细 胞 突变 ,这 在 每 10 000(10-5x10-5x105=10-4) 人 中 发 生 一 次 。 家 族 性 成 视 网 膜 细 胞 瘤 的 显 性 遗传 和 外 显 率 不 完全 反映 了 ”第 二 次 打击 ” 体 细胞 突变 的 可 能 性 ,不 是 胚 系 丢 失 隐 性 功能 等 位 基因 而 显示 了 显 性 效应 。 两 次 打击 假说 为 肿瘤 细胞 中 经 常 性 的 杂 合 性 丢失 (loss of heterozygosity) 所 支持 。 如 果 以 正常 细胞 (从 血液 中 得 到 ) 为 对 照 ,成 视网膜 细胞 瘤 细 胞 作 连 锁 标 记 经 典 分 析 ,经 常 发 现在 对 照 中 为 杂 合 的 标记 在 肿瘤 细胞 中 是 半 合 子 。 这 是 因为 第 二 次 打击 突变 往往 是 染色 体 缺 失 ,将 成 视网膜 细胞 瘤 基 因 座 和 相关 的 标记 一 起 除去 。 尽 管 并 不 总 是 这 样 (第 二 次 突 变 也 可 能 是 RB - 1 基因 的 点 突变 或 是 不 影响 侧翼 标记 的 缺失 突变 ) , 杂 合 性 的 丢失 可 以 用 来 鉴定 和 定位 备 德 尔 规律 的 TSGs 到 一 系列 基因 组 上 的 标记 如 微 卫 星 重复 序列 (参见 第 8 章 基 因 )。 DNA 肿瘤 病毒 ”大 多 数 真 核 细胞 的 DNA 病毒 是 裂解 感染 ,导致 宿主 细胞 死亡 。 偶 尔 特定 的 DNA 病毒 在 不 发 生 裂 解 感染 而 潜伏 在 细胞 中 。 这 些 DNA 肿瘤 病毒 [包括 多 瘤 病 毒 家 族 (polymavirus, 如 SV40), 人 类 乳头 瘤 病 毒 家 族 ,乳头 状 瘤 病毒 (papillomavirus， HPV) 家 族 和 腺 病毒 家 族 (adenovirus) |] 能够 转化 宿主 细胞 。 这 是 通过 病毒 癌 蛋 白 的 合成 ， 作用 和 抑制 宿主 TSG 蛋白 实现 的 。 肿 瘤 抑制 基因 的 产物 首先 是 通过 它们 与 这 些 病 毒 蛋 白 的 作用 分 离 得 到 的 ,这些 病毒 蛋白 与 RNA 病毒 中 的 不 同 , 它 们 在 宿主 基因 组 中 没有 对 应 物 。 多 瘤 病 毒 家 族 产 生 两 种 肿瘤 抗原 (tumor antigens) , 工 和 t, 它 们 是 肿瘤 产生 所 需 的 。 已 知 工 抗原 与 RB- 1 和 p53 作用 并 使 之 失 活 ,使 细胞 周期 从 抑制 状态 中 释放 出 。 同 样 , 腺 病毒 合成 两 种 蛋白 ,EI1A 和 E1B, 前 者 与 RB- 1 作用 ,后 者 与 p53 作用 。HPYV 病毒 的 E6 蛋白 也 可 抑制 p53 的 功能 ,而 E7 抑制 RB - 1。 这 样 看 来 ,P533 和 RB-1 在 DNA 肿 瘤 病毒 的 感染 方式 中 起 决定 性 作用 ,加 上 其 他 研究 的 结果 ,认为 它们 是 细胞 周期 的 中 心 调 节 因 子 。 ( 陈 淳 译 ) ~ as ee ac esnaiaacagancea ee eemeeeee me Eee 第 19 章 细胞 规 基 因 组 基本 概念 和 定义 。， 在 有 性 繁殖 的 真 核 生 物 中 ,父系 和 母系 对 子 代 核 基因 组 的 贡献 都 是 均等 的 ,产生 典型 重 德 尔 遗 传 模式 (参见 亲本 印记 和 性 连锁 遗传 )。 所 以 核 遗 传 (nuclear inher- tance) 被 称 为 双亲 融合 (biparental) 。 。 细胞核 含 有 染色 体 ,在 有 的 真 核 生 物 中 还 有 质粒 。 然 而 细胞 中 除了 细胞 核 还 有 其 他 细胞 器 有 自身 的 基因 组 (最 主要 的 例子 是 线粒体 和 叶绿体 ) ,同时 细胞 质 中 还 有 可 能 含有 寄生 虫 ,病毒 或 内 共生 体 等 有 机 体 。 。 细胞质 内 遗传 信息 与 细胞 核 内 基因 的 遗传 方式 是 不 同 的 。 细 胞 质 遗 传 (cyto- plamic inheritance, 核 外 遗传 或 基因 组 外 遗传 ) 通 常 是 单亲 遗传 (uniparental) , 即 仅 由 单亲 提供 到 合子 中 。 在 动物 中 ,细胞质 遗 传 与 母系 遗传 (maternal inheritance) 是 同 义 的 ,因为 只 有 母系 配子 对 合子 提供 细胞 质 。 在 植物 中 ,母系 遗传 占 主导 地 位 ,但 某 些 物种 是 父系 遗传 (patennal inheritance ) ,还 有 的 双亲 都 有 细胞 质 传 递 的 能 力 ( 不 是 同时 起 作用 )。 在 植物 和 低 等 的 真 核 生 物 中 ,双亲 的 配子 都 能 为 合子 提供 等 量 的 细胞 质 ,但 是 双亲 之 一 细胞 质 的 基因 经 常 被 选择 性 的 破坏 或 失 活 ,所 以 遗传 方式 还 是 功能 性 单亲 遗传 。 后 代 的 基因 型 只 决定 于 双亲 之 一 ,与 另 一 个 的 基因 型 无 关 (图 19.1)。 。 “细胞 器 基因 组 在 结构 和 功能 上 和 某 些 真 细 菌 的 基因 组 的 性 质 相 似 。 因 此 一 般 认 为 它们 是 由 寄居 在 早期 真 核 细 胞 中 的 内 共生 生物 演化 而 来 的 。 细 胞 器 基因 组 和 核 基 因 组 在 功能 上 的 高 度 整 合 是 细胞 器 功能 所 必须 的 ,这 也 暗示 着 在 细胞 器 进化 的 过 程 中 ,大 量 细胞 器 的 基因 都 被 转移 到 核 基 因 组 中 去 。 19.1 细胞 器 遗传 学 母系 遗传 ”母系 遗传 是 指 只 通过 母系 进行 基因 以 及 它们 所 控制 的 性 状 的 传递 。 这 反映 了 一 个 事实 :在 很 多 高 等 的 真 核 生 物 中 ,母亲 提供 受精 卵 全 部 的 细胞 质 而 父亲 只 提供 父系 的 核 物 质 。 母 系 遗 传 的 结果 在 图 19.1 中 描述 。 两 个 对 照 种 系 的 杂交 实验 中 ,其 中 一 个 等 位 基因 是 全 显 性 的 , 正 反 交 的 结果 对 于 核 基因 是 相同 的 ,而 对 母系 遗传 的 基因 是 不 同 的 ， 母系 遗传 取决 于 母系 的 基因 型 。 母 体 遗 传 不 能 与 母体 影响 (参阅 ) 相 混 消 ,后 者 只 反映 在 早期 发 育 中 母体 的 控制 ,与 核 基 因 遗 传 相 关 , 表 现 出 正常 的 孟 德 尔 分 离 比 ( 见 图 6.1)。 ww 2 淋 方 + 攻 汪 + Q 基因 型 GG 唉 G g RE 基因 型 Gg 必 F: 代 基因 型 GG G8g G8 可 GT 已 GE 预期 表 型 3 绿色 : 1 白色 全 部 绿色 核 遗 传 细胞 质 遗 传 亲 代 9 Le 9 Cf 基因 型 gg GG g G F, 代 基因 型 Se 、\， F2 代 基因 型 GG Gg Gg 可 区 让 革 S 入 预期 表 型 ”3 绿色 : 1 白色 全 部 白色 图 19.1 核 ( 孟 德 尔 ) 遗 传 和 母系 遗传 。 植 物 中 颜色 的 变异 往往 是 控制 叶绿体 功能 的 基因 突变 所 造成 的 。 其 中 一 些 突变 涉及 叶绿体 携带 的 基因 并 表现 为 母系 遗传 。 另 外 一 些 存在 于 核 内 表现 为 和 孟 德 尔 遗传 。 如 绿色 (正常 色素 ) 对 白色 (失去 颜色 ,无效 突变 ) 是 显 性 的 ,就 可 以 观察 到 不 同 的 传 递 模式 。 备 德尔 遗传 中 父母 的 遗传 物质 贡献 相同 , 正 反 交 的 结果 是 同样 的 [植物 并 不 具有 与 哺乳 动物 相似 的 异形 性 染色 体 ,因而 没有 性 相关 的 遗传 (参阅 )]2 。 细胞 器 突变 影响 细胞 器 基因 组 的 突变 可 导致 光合 作用 和 和 氧化 磷酸 化 的 缺陷。 叶绿体 突变 株 经 常 有 明显 的 形态 表 型 (如 斑 叶 ) ,这 在 母系 遗传 的 研究 中 已 经 得 到 了 应 用 。 真 核 微生物 线粒体 的 突变 被 深入 地 研究 ,这 种 突变 产生 了 生长 较 缓 慢 的 表 型 [在 酵母 中 称 之 为 “小 菌落 "(peptite) ,在 粗糙 脉 胞 菌 ( Nexrospora crassa ) 称 之 为 "生长 缓慢 "(poky)]。 在 酵 母 中 ,细胞 质 遗 传 是 双亲 性 的 (但 是 在 其 他 的 真菌 中 不 是 这 样 )。 这 就 使 得 对 于 线粒体 缺 陷 株 的 研究 是 在 异 质 状态 下 进行 的 ( 即 多 个 不 同 基因 型 的 细胞 器 共存 于 同一 细胞 质 中 )。 在 表 19.1 中 根据 酵母 不 同 的 “小 菌落 "突变 体 的 遗传 方式 和 它们 对 于 野生 型 线粒体 的 显 性 进行 了 总 结 。 表 19.2 定义 了 细胞 器 生物 学 中 所 用 的 一 些 术 语 。 人 的 线粒体 突变 表 型 是 复杂 的 ,因为 它们 导致 组 织 特异 性 效应 ,这 反映 了 线粒体 DNA 的 产物 与 细胞 类 型 特异 核 基因 编码 的 产物 相互 作用 。 它 们 可 能 引起 退行 性 的 紊乱 称 为 线粒体 疾病 (mitochondriopathies ) 。 家 族 性 的 严重 肌 病 ,Kearns-Sayre 综合 征 , 都 和 线粒体 DNA 的 缺失 有 关 , 但 是 和 酵母 zet 突变 一 样 符合 孟 德 尔 遗 传 规律 。 这 种 疾病 是 由 于 控制 线粒体 DNA 稳定 性 的 核 DNA 的 缺失 造成 的 。 另 外 一 些 疾病 ,如 勤 伯 尔 氏 遗传 性 的 视神经 萎缩 ,与 酵母 的 it 突变 株 类 似 , 表 现 为 母系 遗传 ,反映 了 线粒体 DNA 本 身 的 突变 。 在 所 有 的 人 类 线粒体 疾病 中 , 异 质 性 的 细胞 同时 含有 突变 型 的 和 野生 型 的 线粒体 DNA, 突变 型 的 细胞 器 对 于 正常 的 细胞 器 是 显 性 的 ,这 与 酵母 的 ho 的 突变 株 类 似 。 异 质 性 与 显 性 维持 的 机 制 还 不 清楚 ,有 可 能 是 突变 线粒体 DNA 的 自在 复制 ,因为 绝 大 多 数 突变 型 线粒体 DNA 保留 了 复制 的 双 起 始 位 点 ( 见 下 文 )。 1) 有 些 高 等 植物 是 具有 异形 性 杂 色 体 的 ,因而 也 看 在 伴 性 遗传 ,如 女 类 菜 属 ( Melardiumz albuzz ) 等 ,原著 此 处 的 提 法 有 误 。 一 一 译 者 注 7 于 ， 表 19.1 酵母 中 线粒体 的 四 种 功能 异常 突变 体 原 有 名 称 突变 型 名 称 ”分 子 基础 线粒体 型 小 菌落 7 让 单个 线粒体 基因 的 点 突变 使 其 失去 功能 。 表现 为 细胞 质 遗 传 分 离 型 小 菌落 te: 影响 线粒体 功能 的 核 基因 发 生 突变 。 表现 为 正常 的 孟 德尔 遗传 ,缓慢 生长 表 型 抑制 型 小 菌落 7jo 失去 大 部 分 的 mtDNA, 只 剩 下 小 的 自在 复制 环 ,从 而 与 野生 型 杂交 后 产生 的 全 是 小 菌落 竞争 超出 野生 型 的 线粒体 。 中 型 小 菌落 并 o0 失去 全 部 的 mtDNA, 线粒体 的 合成 主要 是 核 基因 组 与 野生 型 杂交 后 全 是 正常 菌落 控制 ,所 以 线粒体 在 失去 所 有 的 基因 组 后 也 能 合 成 。 相似 的 分 类 也 可 见于 叶绿体 突变 和 动物 的 线粒体 突变 ,反映 了 两 个 共同 的 主题 。(1) 细 胞 器 和 核 基因 组 对 于 细胞 器 功能 的 双重 控制 。(2) 在 同一 个 细胞 中 ,突变 的 细胞 器 对 于 野生 型 的 细胞 器 是 显 性 。 表 19.2 ”用 于 描述 细胞 器 基因 组 行为 的 一 些 名 词 名 词 细胞 型 同 质 的 异 质 的 胞 质 杂 合子 细胞 质 分 离 蜡 核 体 , 同 核 体 ， 融合 体 定义 是 由 细胞 质 而 不 是 核 中 的 物质 给 予 细 胞 的 特性 。 不 仅 用 来 描述 细胞 质 基 因 控 制 的 性 状 , 还 可 以 用 来 描述 在 细胞 质 中 合成 并 发 挥 功 能 的 核 基因 所 控制 的 性 状 ( 如 参见 P 因 子 , 杂 种 不 育 )。 由 纯 合 细胞 质 而 来 -有 同一 基因 型 的 细胞 器 的 个 体 。 由 杂 合 细胞 质 而 来 - 具有 不 同 基 因 型 的 细胞 器 的 个 体 。 异 质 细胞 。 高 等 真 核 生 物 的 细胞 有 同 质 的 趋势 ,除非 产生 自发 突变 , 胞 质 杂 合子 可 以 由 细胞 融合 而 产生 。 胞 质 杂 合子 在 低 等 真 核 生物 中 是 由 双亲 融合 子 的 细胞 质 遗 传 而 自然 产生 的 。 在 这 些 物 种 中 双亲 的 一 方 细胞 质 将 被 破坏 ,这 一 过 程 的 失败 就 产生 了 胞 质 杂 合子 。 这 些 异 常 的 细胞 叫做 双亲 融合 子 合子 〈biparental zygotes) 。 在 有 丝 分 裂 中 , 异 质 性 的 细胞 产生 了 同 质 性 的 细胞 。 这 反映 细胞 器 在 子 代 细胞 中 的 随机 分 配 ,一 个 随机 的 过 程 引起 的 失 衔 可 以 在 下 一 轮 的 分 型 中 得 到 进一步 的 放大 。 一 般 几 代 以 后 ， 所 有 的 子 代 细胞 都 是 同 质 性 的 。 相 同 的 原理 也 可 见于 多 拷贝 质粒 的 分 离 ( 见 第 20 章 质粒 ) 。 这 些 术 语 是 与 核 而 非 细胞 质 基因 有 关 的 ,但 经 常 与 细胞 质 遗 传 相 混淆 ,因而 在 此 说 明 。 异 核 体 是 一 个 细胞 含有 一 个 以 上 的 核 且 这 些 核 有 不 同 的 基因 型 。 同 核 体 是 多 核 的 ,但 所 有 的 核 都 是 同一 种 基因 型 。 融 合体 包含 二 倍 体 的 核 。 一 个 合子 可 以 被 称 为 做 融合 体 。 19.2 细胞 器 基因 组 细胞 器 基因 组 的 一 般 特 征 ”利用 多 种 技术 来 鉴定 核 DNA 和 线粒体 DNA 在 结构 和 功 能 上 的 区 别 大 大 促进 了 对 细胞 器 基因 组 分 子 水 平 的 描绘 。 这 些 技术 包括 利用 不 同 的 抗 生 素 选 择 性 去 抑制 核 基因 或 线粒体 基因 的 表达 ,分离 细胞 器 中 转录 和 蛋白 合成 的 分 析 ,细胞 器 DNA 和 RNA 的 体外 表达 ,连锁 作 图 ,限制 性 内 切 酶 图 谱 , 杂 交 分 析 和 测序 。 细 胞 器 基 因 组 和 核 基因 组 在 它们 的 结构 组 织 ,稳定 性 和 基因 表达 和 调节 机 制 等 方面 表现 出 根本 的 差异 。 细 胞 器 基因 组 的 一 些 特性 列 于 表 19.3。 . 245 . 表 19.3 细胞 器 基因 组 的 一 些 特性 基因 组 经 常 是 环 状 ,并 且 是 多 拷贝 的 。 绝 大 多 数 细胞 器 基因 都 是 有 基因 表达 功能 的 (如 tRNA.rRNA.RNA 聚合 酶 )。 还 有 的 基因 编码 细胞 器 功能 (如 与 光合 作用 和 氧化 磷酸 化 有 关 的 蛋白 ) ,不 过 大 多 数 蛋白 是 由 核 编码 后 运输 进来 的 。 基因 组 经 常 以 重组 产生 的 序列 变异 体 混合 物 的 形式 存在 。 转录 和 翻译 的 调控 是 由 原核 生物 类 似 的 调控 序列 和 反 式 作用 因子 完成 的 。 细胞 器 基因 组 的 表达 对 于 抗生素 敏感 ,但 对 真 核 核 基 因 的 抑制 因子 并 不 敏感 ,这 个 现象 对 于 核 基因 和 细胞 器 基因 分 离 研究 很 有 用 。 转录 很 复杂 ,包括 多 个 转录 起 始 位 点 和 多 顺 反 子 信息 。 细胞 器 基因 基本 上 是 以 转录 后 加 工 的 机 制 调控 ,包括 mRNA 稳定 性 的 调节 ,RNA 加 工 , 蛋 白质 合成 和 蛋白 质 降 解 。 基因 表达 具有 特征 性 的 复杂 的 RNA 加 工 反 应 ,包括 切割 , 顺 式 -、 反 式 -前 接 ,RNA 的 编辑 和 降解 。 细胞 器 经 常 使 用 统一 的 遗传 密码 的 变 体 ,反映 更 小 RNA 种 类 的 组 成 和 更 大 的 摆动 相互 作用 ( 见 第 11 章 遗 传 密 码 )。 细胞 器 可 以 携带 基因 组 外 的 质粒 ,通过 介 导 基因 重 排 质粒 可 提供 宿主 更 多 的 表 型 。 质 体 基因 组 原 质 体系 (plastome) 是 从 质 体 中 分 离 得 到 的 DNA ( 质 体 是 与 叶绿体 相关 的 多 种 植物 细胞 器 之 一 )。 对 此 DNA 的 分 析 发 现 , 它 们 含有 与 叶绿体 DNA (chloroplast DNA) 相 似 的 DNA (ctDNA)。 它 们 的 基因 组 为 环 状 ,大 小 在 110kb 到 1S0kb 之 间 ,编码 了 叶绿体 基因 表达 所 需 的 各 种 蛋白 和 结构 RNA, 包 括 各 种 密码 子 所 需 的 tRNAs,rRNA， 一 些 核糖 体 蛋白 和 RNA 聚合 酶 。 此 外 叶绿体 编码 在 光合 作用 中 具有 直接 的 作用 的 蛋 白 ， 包 括 光 合 系统 II 和 II 中 的 组 成 部 分 。 叶 绿 体 中 所 用 的 绝 大 部 分 多 肽 是 由 核 基因 组 编码 产生 ， 再 转运 至 叶绿体 中 。( 参 见 蛋白 质 定 位 )。 核 /细胞 质 整合 的 程度 非常 高 ， 在 某 些 时 候 很 多 叶绿体 编码 的 和 核 编 码 的 蛋白 相互 缔 合 发 生 作 用 。 例 如 ， 在 一 些 植物 中 ， 核 酮 糖 - 1，5 -二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 (RuBisCO) 二 聚 体 的 大 亚 基 是 由 叶绿体 编码 ， 而 小 亚 基 由 核 编码 。 在 某 些 植物 中 叶绿体 基因 组 基本 上 是 单一 的 序列 ,但 是 在 另 一 些 植物 中 ,是 由 两 个 单 一 序列 及 其 中 间 插 人 反 向 重复 序列 组 成 ,这 些 重复 序列 包含 了 rRNA 基因 等 几 种 基因 。 在 重复 序列 区 经 常 发 生 重组 产生 插 人 型 的 异 构 体 和 多 联 体 。 调控 叶绿体 基因 表达 的 顺 式 作用 元 件 在 结构 上 与 细菌 的 启动 子 类 似 ,并 可 以 在 大 肠 杆菌 中 起 作用 。 转 录 通 常 很 复杂 ,产生 不 同 大 小 的 多 顺 反 子 mRNAs (参阅 ) ,在 特定 的 加 工 位 点 加 以 前 切 。 基 因 的 调控 通常 发 生 在 RNA 的 稳定 性 和 和 蛋白 质 合 成 的 水 平 上 ,很 多 宿主 编码 的 在 叶绿体 基因 转录 后 调节 过 程 中 起 作用 的 蛋白 已 经 被 分 离 出 来 。 很 多 叶绿体 的 基因 含有 I 型 自 剪 接 的 内 含 子 ,这 暗示 还 存在 另外 一 些 复杂 的 RNA 加 工 的 过 程 , 如 反 式 剪 接 和 RNA 编辑 (参阅 )。 和 蛋白 质 合成 中 的 核糖 体 结合 位 点 与 大 肠 杆菌 中 的 相 类 似 ， 叶绿体 使 用 的 密码 子 是 未 修饰 的 普 适 的 遗传 密码 。 线粒体 DNA: 大 小 ,基因 组 成 和 基因 组 结构 ”线粒体 基因 组 是 极其 多 样 化 的 ,其 大 小 和 结构 组 成 在 不 同 分 类 群 中 表现 出 极 大 的 不 同 。 虽 然 类似 于 叶绿体 基因 组 ,但 线粒体 基因 组 主要 编码 具有 基因 表达 功能 的 基因 (如 rRNA,tRNA 和 RNA 剪接 酶 ) 和 一 些 有 关 线 粒 体 功能 的 多 肽 。 很 多 线粒体 蛋白 是 在 细胞 质 内 合成 后 转运 人 线粒体 。 酵母 的 线粒体 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 长 度 约 80kbp, 是 真菌 mtDNA 中 246 . 最 长 的 。 它 包括 了 一 些 非 编 码 富 含 AT 的 DNA, 它 被 富 含 GC 的 区 域 所 分 割 , 并 含有 复制 起 始 位 点 。 很 多 酵母 mtDNA 有 很 大 的 内 含 子 , 它 们 可 能 包含 编码 控制 内 含 子 剪接 和 转 座 蛋白 的 开放 阅读 框 (参见 归 梨 内 含 子 )。 在 mtDNA 中 含有 所 有 三 种 类 型 的 自我 剪接 内 含 子 (参阅 )。tRNA 基因 经 常 以 功能 簇 的 形式 出 现 ,而 rRNA 的 基因 是 分 散 的。 另外 一 些 真菌 的 mtDNA 比较 小 ,大 约 20kbp, 含 有 较 少 的 重复 序列 。 植物 mtDNA 在 大 小 上 表现 出 令 人 难以 置信 的 多 样 性 ,从 100kbp 到 2.SMbp, 较 大 的 基因 组 含有 较 高 比例 的 DNA 重复 序列 。 在 一 些 植物 种 属 中 ,mtDNA 大 小 相同 ,但 是 很 多 植物 中 存在 着 复杂 结构 ,包括 不 同 大 小 的 线 状 , 环 状 分 子 和 重组 所 产生 的 一 些 结构 。 完 整 的 基因 组 称 为 主 环 (master circur); 而 小 的 衍生 物 叫 做 亚 基因 组 环 (subgenomic cir- cles) 。 主 环 的 重复 序列 为 重组 的 位 点 一 一 一 般 可 以 看 见 每 一 个 基因 组 重组 产物 的 全 貌 。 异常 重 排 mtDNA(sublimons) 的 扩 增 ,可 能 如 酵母 的 rho 突变 株 一 样 自在 复制 。 与 此 相对 照 的 是 动物 mtDNA。 它 往往 比较 小 (小 于 20kbp) ,结构 上 也 很 经 济 ,不 包 含 内 含 子 ,基因 之 间 的 空隙 很 小 ,只 有 单个 控制 复制 和 基因 表达 的 非 编 码 区 。 动 物 线粒体 DNA 的 空间 节约 体现 在 多 方面 ,包括 全 基因 组 转录 ( 见 下 文 ) ,基因 重 秋 和 无 终止 密码 子 (它们 是 在 RNA 多 腺 苷 酸化 的 转录 后 加 工 的 过 程 中 加 上 去 的 )。 线粒体 基因 表达 动物 和 真菌 的 mtDNA 的 转录 是 多 顺 反 子 的 (参阅 ) ,真菌 mtDNA 中 有 多 个 启动 子 , 但 动物 mtDNA 中 每 一 条 链 都 只 有 一 个 启动 子 , 最 初 表达 为 全 基因 组 (pangenomic, 整 个 基因 组 ) 转 录 本 。 植 物 中 绝 大 多 数 的 线粒体 mRNA 是 单 顺 反 子 (rRNA 基因 是 例外 ) ,但 它们 是 从 多 个 起 始 位 点 开始 转录 的 。 所 有 线粒体 都 使 用 与 原核 生物 相似 的 启动 子 序列 ,编码 与 原核 生物 酶 相关 的 RNA 聚合 酶 ,包括 使 用 与 c 因子 类 似 的 辅助 因 子 (参阅 )。 酵 母 和 动物 mtDNA 的 转录 需要 与 HMG 蛋白质 家 族 有 关 的 转录 因子 (参阅 )。 线粒体 中 RNA 的 加 工 有 好 几 种 形式 。 植 物 中 rRNA 的 转录 本 剪 切 后 成 熟 ,内 含 子 被 剪 切 (但 是 观察 不 到 叶绿体 中 出 现 的 反 式 剪 切 ) ,一 些 基 因 可 以 进行 RNA 编辑 。 动 物 中 ,加 工 过 程 包括 将 多 顺 反 子 信使 切割 成 单个 的 基因 片段 ,tRNA 的 二 级 结构 基 序 为 内 切 酶 活性 所 作用 , 它 的 分 散 分 布 对 于 以 上 的 过 程 可 能 起 促进 作用 。 动 物 线 粒 体 的 mRNA 和 rRNA 都 可 以 被 多 腺 苷 酸化 。 真 菌 的 线粒体 中 RNA 的 加 工 与 3 端 12 个 核 苷 酸 信号 有 关 , 它 们 控制 转录 本 的 成 熟 。 植物 ,真菌 和 动物 线粒体 的 翻译 使 用 修饰 的 遗传 密码 ,这些 修 饰 是 具 类 群 特异 性 的 ， 反映 了 较 小 的 tRNA 基因 组 成 库 ,在 某 些 情 况 下 反映 了 特殊 的 tRNA 结构 。tRNA 种 类 的 缺失 可 为 摆动 配对 的 修饰 所 补偿 , 所 以 可 耐 受 更 大 的 简 并 性 〈 见 第 11 章 遗 传 密码 )。 植物 的 线粒体 往往 编码 整套 的 RNA, 虽然 有 些 物种 特定 tRNA 是 被 核 编码 翻译 后 转运 入 线粒体 的 。 一 些 藻类 和 原生 生物 的 线粒体 有 很 少 的 耻 NA 基因 ,有 的 甚至 没有 ,这 种 情 况 下 ,大 部 分 tRNA 是 从 核 内 转运 的 。 翻 译 的 起 始 包括 原核 生物 类 似 的 核糖 体 结合 位 点 ， 起 始 氨基 酸 是 N- 甲 酰 甲 硫 氨 酸 ( 见 第 23 章 蛋 白质 合成 )。 翻 译 是 线粒体 中 蛋白 质 基因 调控 的 重要 层次 。 线粒体 DNA 的 复制 ”一 些 植物 和 真菌 线粒体 复制 的 起 点 已 被 阐明 ,但 复制 的 机 制 还 不 了 解 :在 有 些 植物 中 ,控制 复制 的 系统 必须 能 够 判别 主 环 和 亚 基因 组 环 ( 见 第 26 章 复 制 )。 在 动物 中 ,由 RNA 聚合 酶 合成 的 大 的 RNA 引物 启动 了 前 导 链 ( 重 链 或 卫 - 链 ) 的 复制 , 引 247 ， 物 被 核糖 核 蛋 白 内 切 酶 MRP 切割 (参见 核 酶 ) ,然后 DNA 的 合成 就 由 DNA 聚合 酶 Y( 参 见 ) 起 始 。 引 物 的 延伸 和 随从 链 (resident strand) 的 替代 产生 了 D - 环 ,延伸 经 常 在 这 一 步 被 打 断 ,这 有 可 能 与 D - 环 中 的 基 序 有 关 ( 终 止 相关 序列 ,terminal associated sequyences)。 这 些 位 点 的 通读 或 被 终止 链 的 重新 开始 产生 成 功 的 复制 。 互 补 链 ( 轻 链 或 工 - 链 ) 的 起 始 是 在 重 链 的 对 面 ,与 一 个 特殊 的 线粒体 引物 酶 有 关 。 这 种 特殊 的 连续 复制 表明 mtDNA 在 大 多 数 时 间 内 以 单 链 形式 存在 ,这 可 能 是 它 突变 率 相 对 较 高 的 原因 之 一 (参阅 ) 。 动 核 DNA 原生 生物 含有 单个 的 高 度 特 化 的 线粒体 称 为 动 核 (kinetoplast) , 与 其 他 的 线粒体 相似 , 它 有 自己 的 基因 组 ( 动 核 DNA,kinetoplast DNA, kKDNA)。KkDNA 基因 组 的 结构 有 很 鲜明 的 特点 ,整个 的 基因 组 [大 环 ](maxicircles) 在 一 个 很 复杂 的 网 络 中 与 很 多 小 的 衍生 物 [小 环 ] (minicircles) 互 连 。 大 环 和 小 环 的 复制 都 是 使 用 滚 环 复制 原理 。kDNA 的 原始 转录 本 提供 非常 丰富 的 RNA 编辑 (参阅 ) 的 例子 。 一 个 极端 的 例子 ,就 是 50% 以 上 的 核 苷 酸 被 去 除 , 引 导 RNA (参阅 ) 有 利于 这 一 过 程 的 发 生 , 它 是 小 环 合成 的 惟一 产 物 。 原 生生 物 的 动 核 (藻类 线粒体 也 有 ) 的 特性 还 包括 没有 细胞 器 编码 的 RNA( 见 上 ) 和 小 片段 rRNA 的 合成 ,rRNA 散布 于 整个 基因 组 。 功 能 性 RNA 被 认为 是 由 分 子 内 部 碱 基 配 对 产生 的 。 细胞 器 质粒 ”很 多 植物 的 线粒体 除了 基因 组 外 还 携带 质粒 ,它们 的 结构 非常 多 样 化 ( 基 因 组 是 线性 或 双 链 环 状 DNA, 或 单 链 / 双 链 RNA) ,它们 很 多 与 细胞 质 雄 性 不 育 (cytoplas- mic male sterility，cms) 有 关 ,细胞 质 因子 阻 断 雄性 花粉 的 产生 ,这 促进 植物 的 异型 杂交 ， 因而 总 的 来 说 对 于 植物 是 有 利 的 。cms 表 型 可 以 为 核 基 因 的 表达 所 抑制 。 例 如 cmsT 的 线粒体 产生 一 个 新 质粒 编码 的 蛋白 ,以 一 个 我 们 目前 还 不 了 解 的 机 制 产生 不 育 的 表 型 。 这 种 表 型 可 以 通过 增加 两 个 核 基因 座 ( 尺 六 和 尺 记 ) 的 表达 加 以 抑制 ,它们 能 够 阻 断 此 和 蛋 白 的 合成 。 真菌 线粒体 的 质粒 可 能 是 隐蔽 性 的 ,也 可 能 提供 长 寿 〈longevity) 或 细胞 死亡 (senes- cence) 有 关 性 状 。 后 者 是 以 细胞 质 的 方式 遗传 ,与 为 质粒 整合 所 诱导 的 线粒体 基因 组 的 重 排 有 关 。 例 如 脉 孢 菌 的 线性 kalilo 因子 2 ,虽然 相同 的 表 型 可 以 由 自主 移动 的 内 含 子 所 引起 ,但 它们 中 的 一 部 分 也 可 以 质粒 的 形式 存在 。 内 共生 理论 和 混 栖 DNA 细胞 句 有 可 能 是 由 与 原始 的 真 核 细胞 形成 内 共生 体 原 核 生 物 演化 而 来 的 。 这 个 模型 的 证 据 包 括 ,细胞 器 与 现 有 的 细菌 在 基因 组 结构 ,基因 表达 的 机 制 和 对 抗生素 敏感 性 等 方面 的 相似 性 ,以 及 它们 的 基因 和 多 肽 序列 的 相似 性 。 经 历 了 一 个 进化 时 期 ,线粒体 和 叶绿体 的 部 分 基因 丢失 进入 核 内 ,从 而 对 宿主 依赖 。 混 栖 DNA (promiscuous DNA) (细胞 器 起 源 的 序列 ,可 插入 核 或 多 种 细胞 器 的 基因 组 ) 的 存在 也 支持 了 上 述 观 点 。 混 栖 DNA 的 序列 能 够 反映 一 些 最 近 DNA 转 座 的 事件 。 虽 然 这 种 转 座 的 机 制 还 不 清楚 。 但 是 基因 从 细胞 质 转移 到 核 内 的 罕见 事件 的 确 发 生 。 细胞 质 遗 传 的 其 他 形式 ”线粒体 DNA 和 叶绿体 DNA 是 最 普通 和 了 解 最 清楚 的 细胞 质 遗传 形式 。 其 他 的 细胞 器 虽然 被 确信 也 含有 DNA (如 中 心 粒 ) ,但 其 编码 潜 势 和 功能 1) 脉 钨 菌 中 有 一 特殊 品系 ,在 一 般 培 养 中 不 能 生长 ,不 久 死亡 。 在 夏威夷 发 现 ,这 是 由 于 一 线性 质粒 所 致 , 夏 威 夷 语 称 为 死亡 之 门 “kalilo。 一 一 译 者 注 ”248 ， 了 解 得 还 是 很 少 。 内 源 性 的 微生物 以 寄生 和 共生 的 方式 与 宿主 共存 时 ,也 产生 细胞 质 遗 传 的 信息 。 我 们 已 经 讨论 的 一 些 事 例如 病毒 ,细菌 甚至 原核 生物 存在 于 大 的 真 核 细 胞 细 胞 质 内 ,以 母系 遗传 的 方式 ,给 予 了 宿主 某 些 表 型 。 在 果 蝇 中 发 现 了 两 个 主要 的 例子 ,一 个 是 病毒 sigma 提供 二 氧化 碳 的 敏感 性 表 型 , 另 一 个 是 寄生 的 原生 生物 的 细胞 产生 特异 性 杀 死 雄 蝇 的 毒素 。 这 种 性 别 调节 器 不 传 给 或 很 少 传 给 存活 的 雄性 。 ( 张 颂 文 译 ) “249 。 基本 概念 和 定义 质粒 (plasmid) 是 在 原核 生物 中 常见 的 染色 体外 的 自主 复制 子 , 它 也 存在 于 真 核 生物 及 其 细胞 器 中 。 它 们 一 般 为 共 价 闭合 状态 的 超 螺旋 构 型 双 链 DNA ,长度 为 1 一 300kpb。 质 粒 可 包含 1 一 100 个 以 上 的 基因 。 有 些 质粒 可 整合 到 宿主 基因 组 中 而 被 称 为 附加 体 。 质粒 是 寄生 性 的 结构 [自在 DNA (参阅 )] , 它 可 以 通过 接合 、 转 化 、 转 导 或 细胞 融 合 等 方式 在 群体 间 转 移 ( 见 细菌 中 的 基因 转移 )。 质 粒 至 少 需要 编码 它 在 宿主 中 复制 与 维持 所 必需 的 产物 。 许 多 质粒 还 携带 那些 能 促进 细胞 间 自 身 转 移 的 基因 (参见 接合 质粒 )。 大 部 分 细菌 质粒 还 携 有 能 提供 对 宿主 有 利 但 非 必需 的 表 型 的 基因 (如 抗生素 抗 性 ) 。 这 些 基因 常常 处 于 能 在 同一 细胞 中 的 不 同 质粒 间 跳 路 的 转 座 因子 中 。 相 反 , 真 核 生 物 细胞 核 中 的 质粒 一 般 是 隐蔽 性 质粒 (cryptic plas- mid， 有 DNA。 在 质粒 生物 学 中 用 到 的 术语 列 在 表 20.1 中 。 质粒 和 病毒 的 根本 区 别 在 子 前 者 作为 稳定 的 染色 体外 复制 子 存 在 ， 它们 不 编码 病 毒 赖 以 形成 感染 性 颗粒 的 外 壳 蛋 白质 。( 因 此 质粒 在 细胞 外 只 能 以 裸 DNA 形式 存在 ) ,一 些 病毒 能 以 质粒 形式 存在 ,如 Pl 原 鸣 菌 体 在 温和 感染 中 以 质粒 形式 存 在 ,但 反之 不 然 。 质粒 被 广泛 用 作 克 隆 载体 ( 见 第 24 章 重 组 DNA) ,但 这 一 章 的 主要 内 容 是 介绍 天 然 发 生 的 质粒 的 行为 。 表 20.1 在 质粒 生物 学 中 使 用 的 部 分 术语 的 定义 术语 基本 复制 子 能 复制 同样 大 小 完整 质粒 的 质粒 最 小 区 域 ,典型 的 复制 子 含有 :复制 起 点 、 质 粒 维持 序 定义 列 (plasmid maintenance sequences) ,调节 复制 及 质粒 维持 的 元 件 (参阅 )。 接合 质粒 与 非 接合 质粒 ” 即 能 或 不 能 通过 接合 促使 自身 转移 的 质粒 (参阅 )。 拷贝 数 每 个 细胞 中 质粒 的 平均 数目 ,通常 用 质粒 DNA 数 目 或 用 编码 基因 产物 的 定量 来 量度 。 cop 突变 体 携带 能 影响 拷贝 数 突变 的 质粒 。 隐蔽 性 质粒 没有 明显 表 型 的 质粒 消除 自发 或 诱导 性 的 质粒 丢失 ,自发 消除 发 生 频 率 很 低 , 但 可 通过 插 人 剂 和 抗生素 来 诱导 。 os 术语 排斥 附加 体 同 质粒 、 异 质粒 不 相 容 性 反 转 质粒 杀伤 系统 维持 系统 小 质粒 单 向 不 相 容 性 分 配 ,分 配 系统 质粒 质粒 复制 起 点 质粒 分 高 混 栖 质粒 (广泛 宿主 质粒 ) 误 切 质粒 (prime plasmid) 续 表 20.1 定义 一 个 常 驻 的 质粒 被 另 一 个 相 容 的 质粒 取代 的 罕见 现象 ,这 种 现象 常 被 解释 为 不 相 容 性 (参阅 ) ,但 它 也 可 能 反映 另 一 个 质粒 编码 的 限制 性 内 切 酶 的 活性 等 机 理 。 一 种 病毒 或 质粒 既 能 在 染色 体外 复制 又 能 整合 人 宿主 基因 组 中 ,如 下 质粒 ( 见 细菌 中 的 基因 转移 )。 描述 细胞 携 有 一 种 类 型 质粒 或 两 种 不 同类 型 质粒 (参见 质粒 分 离 )。 在 对 两 种 质粒 都 不 进行 选择 的 情况 下 ,两 种 不 同类 型 的 质粒 在 几 代 后 不 能 共存 于 同一 细胞 的 现象 ,反映 了 共同 复制 或 分 配 机 制 。 一 种 真 核 生 物 中 线 状 质粒 , 带 有 较 长 的 完整 的 反 向 末端 重复 顺序 。 保证 破坏 被 消除 子 细胞 的 维持 系统 ( 见 表 20.4)。 确保 质粒 在 分 裂 的 细胞 群体 中 得 以 维持 的 系统 ( 见 表 20.4) 较 大 质粒 (如 下 质粒 ) 中 的 基本 复制 子 。 1 型 质粒 被 引入 某 一 已 有 2 型 质粒 存在 的 细胞 群体 中 时 ,表现 不 相 容 性 ,但 如 将 2 型 质 粒 引 入 1 型 质粒 所 在 的 细胞 群体 中 , 则 不 发 生 不 相 容 现象 ,这 反映 了 两 种 质粒 相似 但 并 不 等 同 的 复制 机 制 。 分 配 是 指 在 细胞 分 裂 时 ,质粒 分 配给 不 同 子 细胞 的 现象 ,分 配 系统 是 一 种 保证 平均 分 配 的 维持 系统 ( 见 表 20.4)。 一 种 自主 的 染色 体外 复制 子 , 它 在 正常 生长 条 件 下 并 非 必需 ,也 不 是 细胞 基因 组 的 一 部 分 。 质粒 DNA 复制 起 始 的 座位 。 在 细胞 分 裂 时 ,不 同 种 类 的 质粒 分 离 到 不 同 的 子 细胞 中 (由 于 不 相 容 )。 具有 广泛 的 宿主 范围 的 一 种 细菌 质粒 (通常 包括 革 兰 氏 阳 、 阴 性 细菌 )。 产生 错误 前 切 并 携带 了 部 分 宿主 染色 体 的 质粒 附加 体 , 工 类 误 切 质粒 (type I prime plas- mids) 质 粒 基因 与 宿主 基因 发 生 交换 , 开 类 误 切 基因 (type II prime plasmids) 携带 所 有 的 质粒 基因 再 加 上 宿主 基因 的 一 部 分 。( 参 见 F 质粒 ) 松弛 型 质粒 一 种 复制 时 不 需要 连续 合成 蛋白 质 的 质粒 , 它 的 拷贝 数 在 蛋白 质 合 成 受阻 时 仍 继续 增 长 ,这 是 由 于 某 种 抑制 性 蛋白 的 去 除 。 严 紧 型 质粒 一 种 复制 时 要 求 不 断 合成 蛋白 质 的 质粒 ,其 拷贝 数 在 蛋白 质 合成 受阻 时 下 降 。 20.1 质粒 的 种 类 根据 表 型 分 类 质粒 可 有 许多 种 分 类 方法 ,最 简单 但 也 是 用 处 最 小 的 标准 是 它们 赋予 宿主 细胞 的 表 型 ( 表 20.2)。 在 细菌 质粒 中 ,那些 对 复制 维持、 转移 不 必要 的 基因 经 常 位 于 可 移动 因子 中 ,这些 因 子 可 以 转 座 到 其 他 质粒 和 宿主 染色 体 中 。 由 一 种 细菌 质粒 提供 的 表现 型 并 不 反映 质粒 分 子 本 身 的 任何 内 在 特性 ,同一 质粒 可 提供 多 种 不 同 的 表 型 。 巨 大 质粒 (megaplasmids) 携 带 着 对 多 种 抗生素 抗 性 的 基因 因而 对 健康 有 重要 意义 。 由 于 可 移动 因子 的 丰富 性 以 及 质粒 重组 的 趋势 ,所 以 质粒 本 身 的 结构 是 流动 的 ,因此 设计 出 单纯 以 表 型 为 基础 质粒 的 命名 系统 非常 困难 ( 表 20.3)。 许 多 真 核 质粒 不 具备 表现 型 而 无 法 用 这 一 套 命名 系统 命名 ,而 另 一 些 质粒 ,它们 的 表 型 并 非 来 自 其 编码 功能 ,而 是 来 自 于 质 “51 > 粒 的 行为 (如 染色 体 整 合 和 重 排 ) 。 表 20.2 质粒 提供 的 某 些 表 型 表 型 质粒 及 宿主 种 类 举例 无 (隐蔽 性 质粒 ) 啤酒 酵母 ,2 质粒 抗生素 抗 性 肠 细菌 ,R6k 抗生素 合成 肠 细菌 ,ColEl1 抗原 获得 耶 尔 森 氏 杆菌 , Vwa 质粒 气泡 形成 嗜 盐 菌 ,卫星 DNA 质粒 重金 属 耐 受 性 假 单 胞 杆菌 ,FP2 携带 宿主 基因 啤酒 酵母 ,3w 质粒 长 寿 性 柄 移 壳 菌 ,PAL2-1 代谢 利用 假 单 胞 杆菌 ,OCT 质粒 限制 修饰 系统 混 栖 质粒 ,N3 衰老 粗糙 脉 孢 菌 (线粒体 ) ,kalilo 铁 载体 合成 ( 铁 转运 ) 肠 细菌 (线粒体 ), 特定 Colv 质粒 不 育 性 玉米 (线粒体 ) ,S1、S2 质粒 合成 毒物 肠 细 菌 ,ENT P307 诱导 肿瘤 根瘤 农 杆 菌 ,Ti 质粒 UV 保护 (SOS 系统 ) 混 栖 质粒 ,R46 根据 结构 分 类 虽然 大 部 分 质粒 以 双 链 闭环 DNA 形式 存在 ,但 质粒 的 定义 并 不 排除 其 他 结构 。 链 霉菌 属 ( Stretomzyces ) 和 梭 状 芽 胞 杆菌 属 ( Clostriadixzz ) 中 已 发 现 有 单 链 环 状 的 质粒 存在 ,多 种 线 状 双 链 DNA 质粒 也 已 从 一 些 细菌 和 真 核 生物 中 分 离 出 来 ,如 在 包 和 柔 螺 旋 体 属 ( Borrelia hersii ) 细 菌 中 的 线性 质粒 编码 不 同 的 表面 抗原 ,是 回归 热 的 发 病 原因 。 在 含有 线性 质粒 的 真 核 生物 中 ,哪些 物质 应 被 称 为 质粒 ,以 及 哪些 应 被 称 为 染色 体 的 界定 并 不 清楚 ( 即 :哪些 因子 是 染色 体外 物质 ,哪些 是 基因 组 的 一 部 分 )。 从 本 质 上 说 ， 在 质粒 与 染色 体 间 并 无 结构 差别 ,认为 细菌 质粒 在 正常 生长 条 件 下 是 非 必需 的 ,这 种 常见 说 法 是 无 意义 的 ,除非 所 谓 的 正常 生长 条 件 的 意义 能 明确 定义 。 例 如 ,酵母 人 工 染 色 体 及 哺乳 动物 的 了 Y 染色 体 并 不 是 必需 的 ,但 这 两 种 因子 通常 不 被 定义 为 质粒 。 生物 中 还 存在 RNA 质粒 。 类 病毒 (参见 ) 的 特征 为 : 它 是 不 携带 基因 的 单 链 环 状 RNA 质粒 。 在 酵母 中 发 现 的 一 些 二 重 的 、 线 状 的 、 双 链 的 RNA 物质 也 符合 这 种 质粒 的 定 义 。 它 们 被 称 为 放 毒 者 因子 (killer factor) ,因为 它们 使 宿主 表现 出 杀伤 表现 型 ( 表 20.3)。 它们 编码 一 种 包 圳 基因 组 的 外 壳 蛋 白 ,类 似 RNA 病毒 的 衣 壳 蛋白 ,但 它 不 能 感染 其 他 细 胞 而 只 能 在 细胞 内 转运 ,因此 放 毒 者 因子 介 于 质粒 和 病毒 之 间 ,可 以 被 划 归 于 任何 一 种 2 表 20.3 ”基于 表 型 的 质粒 分 类 与 命名 法 质粒 类 型 表 型 例子 产 细菌 素 编码 细菌 素 ( 能 杀 死 或 抑制 其 他 细菌 生长 的 蛋白 “Agk84,cloDF13 ,colE1 一 K30 ,colv1-k94 质 ,如 土壤 杆菌 素 和 大 肠 菌 素 ) ,也 编码 免疫 功 ”以 编码 的 细菌 素 命名 (土壤 杆菌 素 84， 肠 道 菌 素 能 ,以 使 宿主 细胞 不 被 破坏 。 酵 母 中 的 放 毒 者 DF13 ,大 肠 菌 素 EL.V 及 la) 质粒 (killer plasmids) 就 有 类 似 功能 。 隐蔽 型 无 21，MazxrzceviLie 降解 型 分 解 代谢 Lac,TOL,Cit, 由 底 物 命名 (如 乳糖 ,甲苯 ,柠檬 酸 ) F 致 育 性 (接合 转移 ) F 质粒 ( 见 细菌 中 的 基因 转移 ) 抗 性 (如 对 抗生素 ,重金 属 ) R1,R46,RK6 ,多 抗 性 质粒 重组 (在 体外 通常 为 抗生素 抗 性 一 一 被 用 作 主 要 选择 标记 ( 参 由 自然 产 见 质粒 载体 ) pBR322,pML31,pBluescriptll ,重组 质粒 通常 冠 以 p 开 头 的 单词 ,后跟 字母 或 数目 以 表示 来 源 的 生 质 粒 部 实验 室 ,商品 化 重组 质粒 给 予 俗名 说 明 其 用 分 构建 ) 途 。 致 病 力 能 使 宿主 发 生 疾病 ,特别 指 那些 编码 直接 致 病 功 “Ent 质粒 ,Ti,Ri 能 的 质粒 (如 毒素 合成 ,肿瘤 诱导 ) 但 也 指 非 直 接 功能 如 抗生素 抗 性 (可 能 通过 使 宿主 抗 药物 的 治疗 而 提高 致 病 力 ) 这 是 一 个 人 为 的 不 基于 任何 质粒 内 在 性 质 的 分 类 系统 ,因而 相关 命名 是 不 系统 的 ,往往 存在 多 种 俗名 ,反映 了 很 多 质粒 编码 多 种 功能 的 事实 。 (人 参见 亚 病 毒物 质 )。 注 意 , 放 毒 者 因子 不 同 于 放 毒 者 质粒 ,后 者 是 能 使 宿主 呈 杀 伤 表 型 的 较 常 规 的 酵母 DNA 质粒 。 根据 内 在 性 质 分 类 ”利用 质粒 的 内 在 性 质 如 其 转移 复制 和 维持 机 制 来 分 类 是 更 好 的 质粒 分 类 系统 。 在 细菌 中 ,质粒 可 通过 四 种 途径 转移 :细胞 融合 、 转 化 、 转 导 和 接合 ( 见 细菌 中 的 基因 转移 )。 前 三 种 过 程 对 于 质粒 来 说 是 被 动 的 ,而 接合 是 主动 的 ,许多 质粒 携带 有 可 促进 以 这 种 方式 在 细胞 间 进 行 自身 转移 的 基因 ,因此 细菌 质粒 可 以 归 成 两 个 主要 类 别 :接合 型 (conjugative) 和 非 接 合 型 (nonconjugative) 。 接 合 型 质粒 可 根据 特异 的 接合 机 制 再 细 分 下 去 ( 文 框 20.1)。 在 真 核 生物 中 ,质粒 转移 机 制 在 分 型 中 用 处 不 大 。 平 行 质粒 转移 往往 只 发 生 在 细胞 融合 中 (如 有 性 生殖 ,或 者 真菌 菌 丝 网 的 形成 ) ,或 者 偶尔 通过 机 械 转 移 (类 病毒 即 通过 此 途径 传播 ) ,偶尔 细菌 质粒 也 可 转移 给 真 核 生物 , 像 发 生 在 细菌 酵母 之 间 的 接合 ,以 及 根瘤 农 杆 菌 属 Ti 质粒 的 特例 中 。 20.2 质粒 复制 和 维持 质粒 拷贝 数 ”质粒 复制 和 维持 是 所 有 质粒 都 具备 的 本 质 特 性 。 因 而 可 根据 它们 复制 和 分 配 策略 及 它们 的 拷贝 数 的 调节 方式 来 进行 分 类 。 质粒 复制 是 自主 的 ,但 可 能 与 宿主 基因 组 的 复制 相 偶 联 ,并 可 能 受 和 宿主 及 其 所 处 的 环 .253 ， 境 影响 。 一 般 来 说 ,质粒 需要 利用 宿主 编码 的 复制 工具 (如 DNA 聚合 酶 .RNA 聚合 酶 、 DNA 引 发 酶 ) ,但 编码 复制 起 始 及 其 调节 所 需 的 其 他 因子 。 复 制 起 始 于 一 个 特殊 的 起 点 ， 这 是 质粒 复制 的 限 速 步骤 。 成 功 启 动 的 频率 决定 了 每 个 细胞 中 质粒 分 子 的 特征 性 的 平均 数目 , 即 拷贝 数 (copy number) 。 在 细菌 中 , 较 大 的 质粒 通常 有 1 一 3 个 拷贝 ,它们 的 复制 偶 联 于 染色 体 的 复制 ,被 称 为 单 拷贝 质粒 (single-copy plasmids) ,他 们 通常 是 接合 型 质粒 。 较 小 的 质粒 有 较 高 的 拷贝 数 10 一 30 , 称 为 多 拷贝 质粒 (multicopy plasmids)。 他 们 的 复制 随机 发 生 而 且 是 自我 调控 的 。 这 种 质粒 多 为 非 接合 型 质粒 。 质 粒 复制 的 控制 机 制 即 保持 适当 的 拷贝 数 的 机 制 是 通 过 衡量 细胞 中 复制 起 点 的 相对 浓度 来 实现 的 ( 见 下 文 )。 假 如 一 个 突变 破坏 了 关键 的 调控 元 件 的 功能 , 则 拷贝 数 将 会 有 很 大 的 改变 。 复 制 的 强 抑制 可 导致 质粒 丢失 ,而 复制 的 非 调 节 性 复制 (失控 复制 ,runaway replication) 可 以 提高 拷贝 数 10 倍 。 失 挖 复制 只 有 当 DNA 复制 中 另 一 成 分 ,如 一 种 酶 或 底 物 有 限时 才 会 受到 阻 遇 。 一 个 携带 此 种 突变 的 基因 被 称 为 COP 突变 体 。 真 核 生 物质 粒 的 行为 在 啤酒 酵母 中 进行 了 研究 , 带 有 2 起 点 的 质粒 能 保持 高 的 拷贝 数 (<100) ,虽然 复制 只 发 生 在 S 期 (参阅 ) 而 且 偶 联 于 染色 体 复制 。 相 反 ,类似 于 染色 体 的 质粒 ( 即 拥有 ARS 起 点 和 一 个 着 丝 粒 ) 却 维持 1 一 2 个 拷贝 数 ,着 丝 粒 比 质 粒 的 复制 起 点 更 重要 ,所 以 人 工 合成 带 有 着 丝 粒 ,ARS. 和 2 复制 起 点 的 质粒 其 行为 类 似 染 色 体 ( 参 见 酵母 克隆 载体 ) 。 质粒 保持 ”如同 自我 转移 和 复制 的 调控 ,质粒 也 编码 维持 功能 (maintenance func- tions) , 以 确保 在 细胞 分 裂 中 两 个 子 细胞 均 能 获得 质粒 。 将 质粒 分 配 到 分 裂 成 的 两 个 子 细 胞 的 过 程 称 为 分 配 (partition) ,没有 维持 功能 ,在 分 配 中 就 会 发 生 自 发 消除 ( 表 20.1)。 在 正 常生 长 条 件 下 ( 即 不 存在 对 质粒 所 提供 表 型 的 选择 ) 没 有 质粒 的 细胞 比 带 有 质粒 的 细胞 具 有 更 强 的 竞争 力 ,因为 它们 不 需 将 资源 分 流 给 质粒 功能 一 一 因此 ,消除 质粒 的 细胞 在 群体 中 快速 增加 ,在 数目 上 胜 过 带 质 粒 的 细胞 。 细 菌 中 维持 功能 已 被 详细 阐述 并 分 成 几 个 类 别 〈 表 20.4)。 维 持 功能 的 存在 使 质粒 和 病毒 以 及 转 座 因子 一 样 属于 自在 DNA 种 类 人参 阅 )。 质粒 的 不 相 容 性 不 相 容 性 (incompatibility) 是 指 两 质粒 不 能 共存 于 同一 宿主 株 , 除非 供 选 择 的 表 型 必须 由 两 质粒 共同 提供 ,否则 不 相 容 的 质粒 迅速 地 分 离 产生 两 种 同 质粒 株 。 不 相 容 性 发 生 在 具有 相似 的 复制 和 / 吉 分 离 调控 机 制 的 质粒 之 间 ,质数 拷贝 数 的 调控 方式 主要 是 负 调控 。 这 样 ,在 同一 细胞 中 两 个 单 拷贝 质粒 如 有 相同 的 复制 机 制 ;就 会 互相 抑制 复制 直至 细胞 分 裂 为 止 , 当 它们 分 开 后 ,抑制 就 解除 了 。 混 合 多 拷贝 质粒 也 表现 出 这 种 的 相互 抑制 复制 的 作用 直至 细胞 分 裂 为 止 。 在 子 细胞 中 ,抑制 作用 被 解除 ,而 且 由 于 多 拷贝 质粒 的 复制 是 随机 的 ,每 种 类 型 的 质粒 都 有 相同 的 机 会 进行 复制 。 得 胜 的 质粒 将 获 得 较 多 的 拷贝 数 ,而 且 将 在 下 一 轮 分 裂 中 占 优势 ,最 终 将 导致 同 质粒 细胞 的 增殖 。 因 此 多 拷贝 质粒 将 比 单 拷贝 需要 更 多 的 时 间 才 能 分 离 。 具 有 相同 分 配 机 制 的 质粒 发 生 分 离 是 由 于 二 者 竞争 相同 的 “分 配 位 点 ”, 这 种 位 点 ,在 细胞 中 可 能 只 出 现 两 次 。 质 粒 的 不 相 容 性 提 供 根据 复制 和 分 配 策略 的 有 效 的 分 类 方法 。 相 互 不 相 容 的 质粒 (具有 相同 策略 ) 被 放 人 二 个 不 相 容 组 (incompatibility group，Inc group) ,大 约 存在 30 类 属于 大 肠 杆菌 及 相关 肠 细 . 254 ， 表 20.4 质粒 维持 功能 维持 功能 描述 分 配 ( par) 系 统 “在 低 拷 贝 数 的 质粒 中 发 现 的 系统 ,能 精确 均等 地 将 质粒 的 拷贝 在 细胞 分 裂 之 前 分 离 于 细胞 两 极 。 分 配 系统 需要 反 式 作用 因子 和 质粒 中 的 顺 式 作用 元 件 , 可 能 还 包括 质粒 与 细胞 膜 相 连 的 系 带 。 细 菌 染 色 体 使 用 一 种 相似 的 分 配 机 理 ( 见 细胞 周期 )。 高 拷贝 数 质粒 缺乏 特定 分 配 机 理 ,依赖 每 个 子 细胞 至 少 能 获得 一 个 拷贝 的 高 概率 。 杀伤 ( 态 1) 系 统 ”使 质粒 编码 一 种 稳定 的 杀伤 蛋白 (killer protein ， 对 宿主 细胞 致死 的 蛋白 ) 和 一 个 不 稳定 的 “ 解 (成 瘾 系统 ) 毒 ` 分 子 , 这 种 "解毒 "分子 可 作为 杀伤 蛋白 本 身 的 后 抗 物 或 它 合成 过 程 的 阻 过 物 。 在 被 消除 细胞 中 ,杀伤 蛋白 比 解 毒 因 子 持 久 , 则 细胞 被 杀 死 。 细胞 分 裂 延 迟 ”能 在 质粒 拷贝 数 低 的 情况 下 延迟 细胞 分 裂 的 系统 。F 质粒 能 通过 诱导 SOS 反应 〈 人 参阅) 来 延迟 细胞 分 裂 。 重组 系统 质粒 编码 了 一 种 位 点 特异 的 重组 系统 (参阅 ) , 它 能 抑制 导致 多 聚 化 的 同 源 重组 事件 ,并 确保 单 体能 被 分 配 ,大 肠 杆 菌 的 zerC 和 zerD 基因 编码 类 似 功 能 ,以 确保 染色 体 的 单 体 化 ,酵母 2 质粒 也 编码 一 个 位 点 特异 重组 系统 以 提高 其 拷贝 数 。 注意 :分 配 系统 ,杀伤 系统 和 细胞 分 裂 延 迟 系统 均 确保 质粒 分 离 的 效果 优 于 通过 阻止 消除 细胞 生成 的 随机 分 离 。 相反 的 ,重组 系统 并 不 阻止 消除 细胞 的 生成 ,它们 只 能 达到 最 佳 的 随机 质粒 分 离 。 菌 属 的 不 相 容 组 ( 文 框 20.1)。 质粒 DNA 复制 机 制 ”大 部 分 细菌 中 的 典型 闭环 双 链 DNA 质粒 的 复制 与 染色 体 相 似 ， 它们 的 启动 依赖 于 特殊 的 启动 蛋白 , 即 Rep 蛋白 〈Rep proteins) 与 起 点 处 的 重复 序列 结 合 ( 见 复制 )。 对 于 许多 质粒 (如 F、R1 质粒 )Rep 蛋白 促进 复制 起 始 位 点 的 解 旋 , 允许 解 旋 酶 的 结合 并 促使 单个 或 两 个 复制 又 的 形成 。 在 另 一 些 质粒 中 (如 葡萄 球菌 中 的 BT181) ,Rep 蛋白 是 一 种 切口 酶 (参阅 ) ,能 启动 滚 环 复制 (参阅 )。 大 肠 杆菌 相关 质粒 不 需要 Rep 蛋白 ,因为 宿主 RNA 聚合 酶 被 用 来 产生 一 个 通过 复制 起 点 引物 起 始 引 导 链 的 转录 。 这 种 质粒 处 于 松弛 控制 中 ( 见 下 文 )。 线 状 的 细菌 质粒 类 似 于 线 状 病毒 基因 组 。 例 如 :他 们 都 有 共 价 闭合 末端 (如 Borellia 质粒 ) 或 者 末端 蛋白 和 反 向 重复 序列 (如 链 霉 菌 属 质粒 ) ,而 且 都 可 以 利用 与 病毒 相似 的 方 法 进行 复制 ( 见 复 制 和 病毒 )。 真 核 生 物 的 线 状 质粒 通常 编码 它们 自己 的 聚合 酶 , 据 推测 ， 这 种 酶 可 用 于 自主 性 复制 。 以 下 的 讨论 是 关于 质粒 独特 的 复制 调控 策略 。 多 起 点 和 重复 区 ”很 多 较 大 的 质粒 都 有 多 个 复制 起 点 (经 常 与 不 同 的 调控 机 制 相 联 系 ) ,这 样 将 这 种 质粒 归 人 单个 不 相 容 组 就 很 困难 。 在 某 些 质粒 中 (如 下 质粒 ) , 某 个 特定 的 复制 起 始 位 点 利用 率 较 高 ,而 其 他 起 点 的 作用 还 不 清楚 。 在 另 一 些 质 粒 中 (如 R6K 质 粒 ) ,不 同 起 点 有 相同 的 使 用 机 率 。 许 多 重组 质粒 载体 已 被 精确 地 设计 为 既 有 真 核 复制 起 始 位 点 又 有 原核 复制 起 始 位 点 ,使 它们 能 在 两 种 类 型 细胞 中 维持 (如 穿梭 载体 )。 质粒 复制 起 点 往往 以 必需 重复 序列 即 重复 子 (iteron ) 为 标志 。 象 细菌 染色 体 一 样 (参见 复制 起 点 ) ,这 些 重复 区 就 是 质粒 中 的 共同 基 序 ( 如 RK2 质粒 ) ,也 是 一 些 能 像 质粒 一 样 复制 的 噬菌体 的 共同 基 序 (P1 和 1 细菌 唉 菌 体 )。 质 粒 重 复 子 是 Rep 蛋 日 结合 位 点 , 它 既 可 单独 作用 也 可 以 与 宿主 起 始 蛋白 缔 合 起 作用 (如 大 肠 杆 菌 中 的 DnaA)。 例 如 : 在 RK6 质粒 中 ,不 管 三 个 复制 起 始 位 点 中 哪 一 个 被 采用 ,7 复制 起 点 范围 内 的 七 个 直接 .255 串联 重复 序列 对 于 复制 都 是 必需 的 。 反 义 RNA 控制 质粒 复制 ” 带 有 一 个 ColE1 类 的 复制 起 点 的 质粒 (包括 质粒 克隆 载体 中 的 绝 大 部 分 ) ,从 一 条 单 链 RNA 引物 开始 前 导 链 DNA 的 合成 ,这 条 单 链 RNA 引物 由 宿主 RNA 聚合 酶 合成 ( 见 引物 ,引发 策略 )。 实 际 上 复制 起 始 位 点 处 根据 两 条 链 转录 出 了 两 个 转录 本 ,RNAI 和 RNALI。RNAI 是 引物 ,而 RNAI ,与 RNAI 链 部 分 互补 , 通 过 与 RNAI 形 成 失 活 的 双 螺 旋 而 起 阻 过 作用 。DNA 合成 开始 于 复制 起 始 位 点 ,而 RNA 开 转 录 始 于 复制 起 始 位 点 上 游 55$Sbp 处 ,并 且 从 那里 开始 延伸 经 过 复制 起 始 位 点 。 此 转 录 本 必须 在 复制 起 始 位 点 处 被 切割 以 产生 功能 的 引物 ,这 个 过 程 由 RNaseH( 参 见 核酸 酶 ) 催 化 ,RNAI 所 形成 的 三 蔡 环 二 级 结构 促进 了 这 一 过 程 。 RNAI 和 RNAI 的 相互 作用 在 它们 完全 杂交 (参阅 ) 时 达到 顶点 ,二 者 杂交 可 以 破坏 RNAI 结 构 并 阻止 它 与 DNA 杂交 。 这 反 过 来 阻止 了 转录 本 的 加 工 并 引起 复制 阻 断 。 在 体外 ,只 有 当 后 者 长 度 在 100~350 nt 时 RNAI 和 RNAI 能 杂交 ,这 意味 着 RNAI 必 须 在 RNAI 转 录 本 合成 早期 时 与 新 生 的 RNAI 转 录 本 杂交 以 阻止 复制 。 一 个 称 为 Rom 的 质粒 编码 的 蛋白 在 RNAI 长 度 超过 200 核 苷 酸 时 能 增强 RNAI :RNAI 杂 交 形 成 的 速率 ,因而 是 ColE1 复制 的 一 个 关键 调节 物 。 R1 质粒 的 复制 也 由 反 义 RNA 调节 。 质 粒 编码 的 起 始 蛋 白 RepA 是 复制 启动 所 必需 的 。 但 相 邻 基因 的 转录 形成 了 一 条 反 义 RNA (copA4 ) , 它 与 repA mRNA ( 称 为 copT) 的 前 导 区 结合 ,阻止 mRNA 的 翻译 ( 见 反 义 RNA, 翻 译 控制 )。cop4A 和 copT RNA 都 可 形 成 二 级 结构 ,突变 分 析 表 明 两 者 间 的 相互 作用 可 能 包括 这 些 二 级 结构 ,而 不 是 全 部 双 螺 旋 的 形成 [一 个 所 谓 的 相 吻 复合 物 (kissing complex) ] 。 质粒 中 广泛 存在 着 反 义 RNA 调节 物 , 这 表明 当 蛋 白质 的 调控 不 能 完全 满足 需要 时 ， RNA 为 复制 的 调控 提供 了 一 种 独特 的 策略 。 在 许多 不 同 质粒 中 存在 着 相同 的 机 制 : 较 短 的 反 义 RNA 抑制 因子 与 一 必需 的 功能 性 RNA 的 9 端 杂 交 阻 过 其 活性 。 一 个 可 能 的 解 释 是 质粒 拷贝 数 的 维持 要 求 一 个 不 稳定 的 调节 物 , 以 便 使 质粒 群落 可 以 对 标准 拷贝 数 的 偏离 迅速 作出 反应 。RNA 无 疑 是 这 种 不 稳定 调节 物 的 适宜 的 候选 者 。 松弛 型 和 严 紧 型 控制 质粒 复制 可 能 是 在 松弛 型 或 严 紧 型 控制 (relexed or stringent control) 之 下 。 假 如 细胞 的 蛋白 质 合 成 受 抑 制 , 例 如 用 氯 霉 素 抑 制 , 则 一 些 质粒 继续 复制 而 且 它们 的 拷贝 数 增长 超过 了 一 般 营 养 状 态 的 水 平 。 这 就 是 松弛 型 质粒 (relaxed plas- mids) ,是 典型 的 小 的 多 拷贝 质粒 。 另 一 些 质 粒 当 新 蛋白 的 从 头 合 成 被 抑制 时 则 伴随 宿主 染色 体 停止 复制 , 称 为 严 紧 型 质粒 (stringent plasmids) ,是 典型 的 大 的 单 拷 贝 接合 型 质 粒 。 大 部 分 一 般 用 途 的 质粒 克隆 载体 都 处 于 松弛 型 控制 之 下 。 松弛 型 质粒 在 缺乏 宿主 蛋 白 合成 时 继续 复制 的 能 力 反 映 了 宿主 复制 启动 所 需 的 宿主 蛋白 的 稳定 性 和 质粒 编码 调节 物 的 不 稳定 性 。 例 如 :ColE1 质粒 处 于 松弛 型 控制 下 ,因为 启动 因子 Rom 具有 负 调 控 作 用 一 一 它 通 过 促进 反 义 RNA 与 前 导 引 物 链 的 配对 来 抑制 启 动 。 当 Rom 缺乏 时 ,质粒 复制 解除 抑制 而 且 拷 贝 数 增加 (拷贝 数 很 高 的 克隆 载体 没有 功 能 性 的 ”om 基因 )。 相 反 地 , 严 紧 型 质粒 ,如 下 质粒 需要 正 调控 作用 的 活性 Rep 蛋白 促进 复制 起 始 。 如 缺乏 Rep, 无 论 宿 主 DNA 复制 蛋白 是 否 存在 ,质粒 复制 都 会 被 阻 抑 。 3 文 框 20.1 不 相 容 组 与 不 相 容 性 有 关 的 问题 质粒 根据 它们 相互 之 间 的 不 相 容 性 被 归 人 不 相 容 组 (incompatibility groups, Inc groups) ,这 种 现象 (不 相 容 ) 表 现 为 在 一 个 包含 异 质 料 (heteroplasmid) (人 参阅) 的 细胞 群 落 中 , 随 种群 数 目 增长 分 离 为 两 个 同 质 粒 (homoplasmid) (人 参见) 的 亚 群 ,因为 这 些 质粒 有 类 同 的 复 制 或 分 配 控制 机 制 。 但 不 相 容 的 质粒 可 以 表现 出 相 容 性 ,假如 它们 进行 重组 ,或 在 拷贝 数 较 高 的 情况 下 , 数 代 后 才 会 发 生 分 离 。 相 反 地 , 相 容 的 质粒 能 表现 出 不 相 容 性 ,如 果 他 们 发 生 排 斤 ( 参 阅 ) ,或 假如 这 个 细胞 中 有 几 个 未 被 觉察 的 表现 不 相 容 性 的 隐蔽 性 质粒 。 总 之 ,大 质粒 经 常 有 多 个 不 同 的 起 点 (多 复制 子 质粒 ,multireplicon plasmids) ,并 且 不 可 能 很 清楚 地 归 人 某 一 不 相 容 组 。 不 相 容 组 命名 法 ”在 肠 细菌 中 ,不 相 容 组 用 一 个 字母 代表 特定 的 质粒 接合 系统 来 命名 ,后 加 罗 马 数字 和 /或 希腊 字母 顺序 来 表明 不 相 容 状态 (反映 分 配 与 复制 机 理 )。 带 有 下 型 接合 系统 的 质粒 被 分 成 两 个 不 相 容 组 ,IncFI 和 IncFI ,它们 有 不 同 的 复制 控制 策略 ,其 他 自然 发 生 的 接合 质粒 各 有 其 独特 的 复制 策略 。 来 自 非 肠 杆菌 属 的 质粒 也 可 以 被 归 人 不 同 的 不 相 容 组 。 在 假 单 胞 菌 属 中 ， 不 相 容 组 包括 :P1、P2、P3 组 等 ,代表 15 个 或 更 多 不 同 复制 系统 ,接合 系统 在 这 里 不 宜 作为 特征 。 在 肠 杆菌 属 和 假 单 胞 菌 属 的 不 相 容 组 之 间 存 在 重 本 , 即 存 在 广泛 宿主 范围 的 质粒 ,例如 :P1、P3 和 P4 不 相 容 组 分 别 等 同 于 肠 杆菌 属 的 P.C\Q 不 相 容 组 。 以 接合 系统 来 划分 的 基础 ” 在 肠 杆菌 属 中 的 接合 系统 ,根据 菌 毛 形态 学 进行 划分 (例如 : 硬 的 或 有 弹性 的 , 粗 的 或 细 的 ) ,以 及 吸附 在 菌 毛 上 的 细菌 叹 菌 体 进 行 划分 ( 见 第 30 章 病毒 )。 例 如 :F 型 接合 系统 标志 为 粗 的 有 弹性 的 菌 毛 及 其 上 附 有 类 M13 - DNA 和 RNA 鸣 菌 体 如 Q8 和 R17。 不 相 容 组 IncFI 和 IncFI 代表 两 组 F 型 接合 系统 质粒 ,它们 具有 不 同 的 复制 策略 ,第 一 种 如 下 质粒 本 身 , 第 二 种 如 R1 和 R100 质粒 。 ( 旋 向 雷 译 ) .257 第 21 章 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR) 基本 概念 和 定义 。 ” 事 合 酶 链 式 反应 (PCR ) 是 体外 扩 增 DNA 序列 的 技术 : 即 DNA 复制 不 是 像 分 子 克隆 技术 中 那样 在 细胞 内 进行 ,而 是 用 纯化 的 酶 进行 。 基本 的 PCR 是 利用 一 对 根据 所 扩 增 的 目的 片段 所 设计 的 诊 核 苷 酸 引物 进行 的 。 引物 与 对 应 的 DNA 链 退火 ,DNA 合成 向 中 心 区 域 进行 。 反 应 涉及 三 个 不 同 温度 的 阶段 : 双 链 DNA 的 变性 (90C 以 上 进行 ) ,引物 与 单 链 模 板 的 退火 (50C 左右 进 行 ,最 适 温度 根据 引物 序列 而 定 ) ,引物 延伸 ,合成 新 的 DNA 越过 部 区 域 (70 左 右 进 行 )。 每 组 三 个 反应 称 为 一 个 PCR 循环 (PCR cycle) ,从 理论 上 目标 序列 数 量 增加 一 倍 (参见 图 21.1)。 PCR 反应 在 小 体积 (20 一 100ml) 中 进行 ,在 单个 PCR 小 管 或 多 孔 板 中 进行 ,用 带 有 自动 热 循 环 的 加 热 块 来 精确 控制 温度 。 反 应 体系 中 有 模板 DNA、 引 物 、 四 种 脱 氧 核 苷 酸 三 磷酸 、 热 稳定 的 DNA 聚合 酶 和 反应 缓冲 液 , 其 中 最 关键 的 成 分 Mg 离子 。 PCR 的 优点 是 比 常 规 的 克隆 方法 快速 灵敏 ,即使 在 DNA 来 源 严 重 降解 或 从 来 源 困难 的 DNA 中 分 离 ( 如 已 固定 组 织 的 情况 下 ) 都 是 非常 有 效 的 。 但 PCR 也 有 出 错 倾向 高 ,产物 大 小 受到 限制 和 必须 预先 有 目标 序列 信息 等 缺点 。 21.1 PCR 反应 的 特异 性 单一 顺序 的 扩 增 “因为 所 有 的 DNA 聚合 酶 都 需要 引物 (参阅 ) 来 启动 DNA 的 合成 ( 参 见 复制 一 章 ) ,通过 设计 针对 目标 序列 的 特异 性 引物 ,PCR 可 扩 增 特异 性 的 序列 。PCR 引 物 是 化 学 合成 的 寒 核 音 酸 (参阅 ) ,它们 的 设计 是 PCR 的 成 功 与 否 的 关键 。 最 有 效 的 特异 扩 增 反应 的 引物 的 长 度 是 17 一 30 碱 基 , 因 为 这 样 的 序列 不 太 可 能 随机 与 高 等 真 核 生 物 单 一 顺序 DNA( 参 阅 ) 配 对 。 引 物 经 常 有 约 50% 的 GC 含量 ,避免 同一 种 核 苷 酸 串 联 和 二 级 结构 的 出 现 ,因为 这 样 的 结构 会 使 引物 成 环 和 在 错误 的 结合 位 点 处 稳定 结合 。 除 此 以 外 ， 引物 还 要 避免 自身 配对 ,因为 这 样 会 形成 引物 二 聚 体 ,造成 产物 的 大 幅度 减少 。 与 通常 的 克隆 方法 相 比 ,PCR 有 快速 .灵敏 的 优点 ,即使 在 DNA 来 源 严重 降解 或 必 须 从 困难 的 来 源 中 分 离 DNA( 如 已 固定 组 织 的 情况 下 ) 的 情况 下 仍 是 非常 有 效 的 。 但 PCR 也 有 出 错 , 产 物 大 小 受到 限制 和 必须 预先 有 目标 序列 信息 等 缺点 。 。 25S8 。 _ SSsssssss4S 潮 ?3 2 ASSSESSSSSSSSSSESSS 一 一 二 II 一 ”RSSSSSSSSSSSSSSSSS 3 5 7 Eee ， 3 6 -_”，Aassssssssssk > 玫 和 7 本 * 一 一 SFsssss 江 一 引 1 5 -六 姓 一 [SSSSSSSSSSSSSSSSS y 各 3 一 人 SSSSSSSSSSSSSSSSS 一 9 邓 3 -> ?一 -一 7 了 5 3 图 21.1 基本 PCR 反应 。 在 第 一 个 PCR 循环 中 , 原 有 的 四 序 列 (1) 以 斜 线 表 示 被 变性 (2) ,引物 退火 (3)。 引 物 向 中 心 区 延伸 (4) ,使 靶 序 列 加 倍 ,尽管 第 一 个 循环 的 产物 的 长 度 不 具有 专 一 性 (以 黑体 表示 )。 在 第 二 次 循环 中 扩 增 的 靶 序 列 变性 ,引物 退火 (5) ,引物 延伸 (6) 使 靶 序 列 量 加 倍 。 第 二 次 循环 的 产物 以 白色 框 表 示 ,其 中 一 半 大 小 没有 专 一 性 , 另 一 半 根 据 引 物 退 火 的 位 置 ， 与 扩 增 片段 大 小 完全 一 致 。 在 以 下 的 循环 中 ,这 些 特 异性 产物 以 指数 倍 积累 ,而 长 度 不 专 一 的 产 物 以 线性 方式 增加 ,在 最 终 产物 混合 物 中 占 很 小 的 比例 。 当 引 物 在 较 低 温度 下 退火 时 ,可 能 引起 特异 性 的 降低 ,因为 错 配 可 被 忍受 并 在 引物 延 伸 后 被 稳定 下 来 。 当 反应 成 分 在 室温 下 混合 时 容易 发 生 这 种 情况 ,但 可 以 通过 热 启动 PCR(hot-start PCR) 得 到 解决 , 热 启 动 是 当 反 应 达到 退火 温度 时 才 加 入 反应 关键 成 分 DNA 聚合 酶 。 散 套 式 引 物 (nested primers) 可 以 用 来 增加 PCR 的 特异 性 ,一 次 PCR 扩 增 得 到 的 产物 接着 用 第 二 套 引 物 进 行 第 二 次 扩 增 。 第 二 套 引 物 和 相同 的 靶 位 点 结合 但 是 在 原来 引物 的 内 侧 , 所 以 在 第 二 次 反应 中 ,只 有 特异 性 产物 才能 被 扩 增 , 称 为 散 套 式 PCR (nested PCR) 。 单一 顺序 扩 增 的 应 用 单一 顺序 扩 增 有 很 多 方面 应 用 。 作 为 一 种 诊断 技术 可 以 用 来 判 断 在 复杂 样品 中 是 否 存 在 某 一 特定 序列 (如 确定 转基因 或 质粒 插 和 人 的 存在 ); 检 测 多 态 性 (如 小 卫星 DNA 的 变异 ;参见 DNA 分 型 ) 和 检测 未 知 突变 。 特 异性 的 序列 可 以 作为 序列 标记 位 点 (sequence tagged sites) (参阅 ) ,在 基因 组 作 图 和 定位 克隆 中 起 作用 ( 见 第 12 章 基 因 组 和 作 图 ,第 24 章 重 组 DNA)。 引 物 无 法 结合 也 可 用 于 诊断 中 。 等 位 基因 特异 性 PCR (allele-specific PCR) 可 以 用 于 检测 疾病 相关 的 点 突变 ,引物 根据 突变 位 置 设计 ,只 能 与 特 别 的 等 位 基因 退火 。 这 种 检测 方法 比 杂 交 分 析 ( 参 阅 ) 更 灵敏 和 方便 ,因为 它 可 以 检测 很 小 的 序列 差别 ,而 这 种 差别 在 Southern 杂交 中 不 能 检测 到 。 此 外 ,PCR 只 需 很 少 的 材料 ， 所 以 它 在 临床 样品 有 限时 非常 有 用 ,如 绒毛 膜 取样 (chorionic villus sampling)。 PCR 还 可 作为 从 复合 物 中 扩 增 特异 性 序列 而 无 需 分 子 克 隆 的 制备 技术 。 这 方面 PCR 的 主要 缺点 是 产物 的 大 小 限制 。PCR 扩 增 较 少 被 用 于 基因 组 克隆 中 ,而 用 来 产生 部 “人 59)。 分 的 cDNA 片段 , 即 表 达 序 列 标记 (expressed sequence tag，EST)( 参 阅 )。 同 样 ,这 需要 对 目标 序列 有 一 定 的 了 解 ,所 以 尽管 PCR 方法 快速 经 济 , 但 它 不 可 能 完全 取代 文库 为 基础 的 筛选 方法 ,文库 筛选 提供 了 直接 得 到 全 长 克隆 的 途径 并 可 采用 不 同 的 筛选 策略 如 免疫 和 配对 筛选 途径 (参见 表达 克隆 )。 相关 顺序 的 扩 增 ”PCR 的 应 用 目的 并 不 都 是 产生 特异 性 的 产物 。PCR 也 可 用 于 鉴定 序列 相关 的 家 族 或 根据 一 种 物种 的 序列 信息 扩 增 另 一 物种 的 相关 序列 。 在 这 样 的 情况 下 ,可 以 围绕 着 在 高 度 保守 的 结构 域 来 设计 特异 引物 ,使 内 部 序列 不 同 的 产物 得 以 鉴别 。 另 一 种 方法 是 应 用 简 并 嘉 核 苷 酸 引 物 (degenerate oligo-nucleotide primers，DOP-PCR ) , 简 并 引物 是 在 某 些 位 置 上 带 有 不 同 核 苷 酸 的 引物 混合 物 。 这 种 称 之 为 同 源 性 筛选 (homology screening ) 的 方法 是 根据 保守 结构 域 设 计 引 物 ,但 不 与 该 家 族 中 已 知 序列 混同 。 这 种 方法 已 经 成 功 地 扩大 了 一 些 基因 家 族 , 包 括 POU 结构 域 的 转录 因子 (参阅 ) 和 细胞 周期 蛋白 及 细胞 周期 蛋白 依赖 激酶 (参阅 )。 当 只 知道 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 简 并 引物 还 用 于 扩 增 对 应 于 已 知 蛋白 质 的 特异 序列 。 在 这 种 情况 下 , 简 并 引物 的 应 用 反映 了 遗传 密码 的 简 并 性 ,与 简 并 窒 聚 核 苷 酸 探 针 从 cDNA 文库 中 筛选 克隆 类 似 ( 人 参见 第 24 章 重 组 DNA)。 非 相关 序列 的 扩 增 ”PCR 的 另 一 个 主要 应 用 是 微生物 的 鉴别 ,如 组 织 感染 和 水 污染 的 检测 ,以 便 采 用 正确 的 处 理 和 清除 的 方法 。 而 根据 形态 学 代谢 和 行为 表 型 的 传统 方法 费 力 又 只 能 用 于 少数 种 类 。PCR 作为 一 种 简单 的 诊断 方法 使 用 ,可 根据 微生物 的 核 苷 酸 序 列 获得 明确 鉴别 。 另 一 个 优点 是 用 多 套 引 物 可 以 在 一 个 反应 体系 中 同时 检测 许多 不 同 种 类 的 微生物 (多 重 PCR ,multiplex PCR ) ,每 一 种 都 有 特异 性 大 小 的 诊断 产物 。 任意 序列 的 扩 增 ”在 特定 的 情况 下 ,PCR 的 目的 不 是 产生 一 个 或 多 个 特异 性 或 相关 的 产物 ,而 是 为 了 收集 任意 序列 的 集合 用 于 进一步 分 析 。 这 种 策略 主要 用 于 cDNA 克隆 和 基因 作 图 两 方面 。 任 意 引 物 (arbitrary primers) 进 行 扩 增 即 用 能 和 很 多 位 置 退 火 的 短 引 物 (9- 1$nt) 扩 增 出 随机 的 非 相 关 产 物 。cDNA 任意 扩 增 产物 产生 部 分 cDNA 片段 的 文库 ， ESTs, 同 样 ,这些 文库 可 用 作 基 因 组 作 图 中 的 序列 标记 位 点 。ESTs 也 可 以 用 来 分 析 表 达 基因 的 差异 (参见 差 示 PCR)。 任 意 扩 增 的 基因 组 DNA 在 遗传 和 物理 作 图 中 可 用 于 产生 标记 。RAPDs 是 随机 扩 增 的 多 态 性 DNA(randomly amplified polymorphic DNA) 标 记 , 在 植物 基因 组 作 图 中 广泛 应 用 。 随 机 基因 组 PCR 产物 用 电泳 分 离 后 ,多 态 性 根据 不 同 的 条 带 很 容易 鉴定 。 带 有 特定 的 多 态 性 标记 的 性 状 共 分 离 是 连锁 的 证 据 , 通 过 产物 分 析 和 发 展 更 特异 的 引物 ,RAPDs 可 以 转变 成 物理 作 图 中 的 序列 标记 位 点 ( 见 第 12 章 基因 组 与 作 图 )。 随机 PCR 终极 形式 是 扩 增 出 所 有 的 靶 序 列 。 达 到 此 目的 的 一 种 方法 是 在 所 有 来 源 的 DNA 分 子 上 加 上 接头 (linkers, 参 阅 ) ,用 识别 接头 的 引物 进行 PCR 杂乱 扩 增 (连接 - 衔 接 PCR 或 连接 -引发 PCR ，ligation-adaptor PCR ，linker-primed PCR )。 另 一 种 方法 是 DOP-PCR 引物 是 完全 简 并 的 寡 核 苷 酸 , 这 样 所 有 的 顺序 都 能 被 识别 。 PCR 诱 变 和 增 大 ”引物 设计 不 仅 用 于 扩 增 序列 ,还 可 用 于 改变 序列 。 这 主要 有 两 种 用 途 :点 突变 的 导 和 人 (体外 突变 的 一 种 形式 ,参见 ) 和 利于 进一步 的 操作 的 PCR 产物 未 端的 修饰 。 。 260 ， 在 第 一 种 方法 (PCR 诱 变 ) 中 ,引物 设计 成 与 靶 顺 序 不 完全 配对 ,选择 允许 退火 进行 的 条 件 。 扩 增 将 末端 引物 中 的 突变 引入 产物 中 。 如 果 需 要 在 中 间 位 置 突 变 , 突变 产物 本 身 可 以 作为 一 大 引物 (megaprimer) ,在 原先 的 模板 中 延伸 。 或 者 合并 一 对 相互 重 琶 的 PCR 反应 产物 ,通过 限制 性 酶 切 和 连接 (如 果 有 合适 位 点 ) 或 末端 到 末端 的 重组 PCR (end-to-end recombination PCR ) 得 到 终 产 物 。 这 两 种 策略 在 图 21.2 中 进行 比较 。 1 En 2 3 RS 少 图 21.2 PCR 诱 变 。 可 以 用 不 完全 配对 的 引物 在 PCR 产物 中 导 人 突变 ,但 这 只 人 允许 在 PCR 产物 末端 突变 。 两 种 策略 都 允许 在 靶 片 段 中 的 任何 位 置 上 突变 。 在 大 引物 的 策略 中 , 以 错 配 的 引物 A 和 了 B(1) 扩 增产 生 半 长 产物 (2) ,作为 大 引物 ,与 引物 C(3) 组 合 产生 全 长 的 突变 序列 (4)。 在 重组 PCR 策略 中 ,两 次 扩 增 (1) 产 生 两 个 半 长 产物 (2)。 两 个 错 配 引物 在 相反 方向 (A 正 向 ,A 反 向 )， 所 以 产物 末端 重 伙 。 两 个 产物 混合 后 通过 未 端 到 末端 的 重组 PCR(3) 连 接 或 适宜 的 限制 性 酶 切 位 点 通过 连接 (4) 得 到 突变 全 长 产物 。 在 第 二 种 方法 中 ,引物 的 5 端 可 以 加 上 与 模板 DNA 不 配对 的 顺序 ,使 PCR 产物 末端 加 上 额外 的 顺序 。 这 有 很 多 用 途 : 加 上 限制 性 内 切 酶 位 点 以 利于 亚 克 隆 ,加 上 通用 引物 结 合 位 点 便于 测序 和 加 上 鸣 菌 体 启 动 子 用 于 体外 转录 。 下 游 应 用 ” 当 PCR 产物 大 量 需 要 并 有 多 种 下 游 应 用 时 ,常规 的 亚 克 隆 技术 在 体外 操作 方面 还 是 最 方便 的 。 然 而 PCR 产物 必须 以 和 任何 过 客 DNA 分 子 一 样 的 方式 ( 见 重组 DNA) , 插 人 到 克隆 载体 中 。 倾 向 差错 热 稳 定 DNA 聚合 酶 ,如 Ta 聚合 酶 ,倾向 于 以 不 依 赖 模板 的 方式 在 PCR 产物 的 3 端 加 上 一 个 核 苷 酸 (通常 为 dATP)。 而 校正 酶 如 Pu 酶 则 产生 一 平 端的 产物 。PCR 产物 的 亚 克 隆 有 多 种 策略 可 供 选 择 , 参 见 表 12.1。 = 表 12.1 PCR 产物 克隆 的 方法 方法 优 缺 点 平 端 克 隆 所 有 的 PCR 产物 都 可 以 用 这 种 方法 克隆 ,如 Tad 酶 的 产物 需要 去 除 突出 的 碱 基 , 产 生平 端 , 亚 克 隆 是 没有 方向 性 的 。 工 -载体 工 - 载 体 有 突出 的 5 胸腺 喀 啶 能 够 有 效 的 克隆 如 Tza 聚合 酶 有 突出 的 腺 味 叭 的 产物 ,产物 不 需要 处 理 , 但 亚 克 隆 没有 方向 性 。 接头 引物 引物 含有 接头 ,在 PCR 产物 末端 加 上 限制 性 酶 切 位 点 。 产 物 在 亚 克 隆 前 需要 酶 切 , 如 果 9 和 3“ 端 加 上 不 同 的 位 点 , 亚 克 隆 是 非常 有 效 和 有 方向 性 的 。 在 亚 克 隆 前 必须 确定 PCR 产物 内 部 没有 所 使 用 的 酶 切 位 点 。 DISECZXZTRISEC 二 核 苷 酸 /三 核 苷 酸 黏 端 克隆 。 产 物 和 载体 需要 部 分 补 平和 外 切 酶 处 理 , 但 亚 克 隆 是 有 效 和 有 方向 性 的 。 21.2 PCR 基本 战略 的 提高 和 扩展 反 转 录 PCR(RT-PCR) ”cDNA 的 PCR 扩 增 称 为 RT-PCR, 因 为 在 扩 增 前 涉及 反 转 录 步骤 。cDNA 第 一 链 的 合成 反应 以 常规 方式 进行 (参见 cDNA 合成 ) ,而 在 PCR 的 第 一 次 循环 中 进行 cDNA 第 二 链 的 合成 。 有 反 转 录 活 性 的 温度 稳定 的 DNA 聚合 酶 最 近 已 有 报 道 , 在 将 来 有 可 能 使 RT-PCR 在 一 个 反应 中 完成 。 RT-PCR 是 扩 增 RNA 分 子 的 序列 非常 灵敏 的 方法 ， 能 够 在 复杂 的 来 源 中 检测 和 分 离 cDNA 序列 。RT-PCR 作为 一 种 制备 技术 比 起 常规 文库 为 基础 的 cDNA 克隆 方法 有 很 多 优越 性 ,包括 :快速 度 , 需 要 实验 材料 少 ,能 以 细胞 总 RNA 为 材料 ,不 受 大 量 污 染 rRNA 和 tRNA 的 影响 。 缺 点 是 倾向 于 产生 部 分 长 度 的 产物 (ESTs) , 而 且 不 像 文库 能 作为 永久 性 的 实验 材料 。 任 意 RIT-PCR 是 用 随机 的 六 碱 基 或 长 一 些 的 任意 引物 和 与 mRNA 多 到 腺 味 叭 尾巴 配对 的 寡 聚 胸腺 喀 啶 的 引物 ,产生 代表 表达 情况 的 标记 库 以 供 进一步 分 析 。 中 所 存在 的 序列 更 有 可 能 是 单一 顺序 。 第 二 个 应 用 是 鉴定 差 示 表达 基因 。 这 种 技术 ,被 称 为 差 示 PCR(different display PCR ) 或 mRNA 指纹 法 (mRNA fingerprinting ) ,将 不 同 来 源 扩 增 得 到 的 ESTs 在 电泳 中 的 邻近 泳 道中 进行 比较 。 差 示 表 达 的 基因 在 电泳 上 表现 为 条 带 的 增加 或 消失 ,这 是 非常 灵敏 的 检测 被 调节 基因 产物 的 方法 。 另 一 种 类 似 用 于 鉴定 基因 组 DNA 差异 的 方法 是 根据 限制 性 酶 切片 段 的 大 小 和 数量 的 变化 , 称 为 表现 度 差 示 分 析 (representational difference analysis，RDA) 。 作为 诊断 技术 ,RIT-PCR 用 于 基因 产物 的 定量 和 定位 。 定 量 PCR 是 将 靶 cDNA 的 扩 增 与 在 反应 体系 中 事先 加 入 的 已 知 量 的 片段 进行 竞争 。 通 过 所 扩 增 的 竞争 性 片段 的 量 作 一 线性 图 ,来 对 目标 片段 定量 。 原 位 PCR (in sitx PCR) 是 在 细胞 的 自然 位 置 处 扩 增 mRNA 的 RT-PCR 反应 ,能 够 精确 地 确定 很 少 的 转录 本 。 这 两 种 以 PCR 为 基础 的 方法 都 要 比 传统 的 杂交 方法 (参见 Northern 印迹 .RNA 酶 保护 实验 及 原 位 杂交 ) 灵 敏 。 未 知 序列 的 扩 增 ”基本 的 PCR 反应 限于 扩 增 已 知 引 物 之 间 的 DNA 序列 ,这 样 就 需要 事先 知道 序列 的 情况 。 然 而 我 们 经 常 需要 分 析 已 知 序 列 的 DNA 侧翼 区 域 ( 未 测序 ), 如 根据 ESTs 克隆 全 长 cDNA 或 扩 增 基因 片段 的 上 游 调 挖 元件 。 反 向 PCR[inverse PCR ,或 外 翻 PCR(inside out PCR)] 用 来 扩 增 基因 组 DNA 的 两 侧 顺序 。 如 果 用 限制 性 内 切 酶 作用 DNA, 需 要 被 扩 增 的 序列 将 位 于 具有 $ 和 3“ 两 侧 区 域 。 262 ， DNA 大 片段 中 。 这 样 的 片段 经 过 连接 酶 作用 形成 环 状 的 结构 ,原先 用 来 扩 增 内 部 序列 的 引物 就 可 以 用 来 扩 增 环 状 结构 的 剩余 部 分 的 序列 。 另 一 些 同样 目的 的 策略 是 在 线性 DNA 分 子 两 侧 加 上 接头 ,作为 引物 结合 位 置 ,或 者 利用 分 子 内 的 二 级 结构 如 葵 - 环 结 构 ( 锅 柄 PCR，panhandle PCR) 和 内 部 的 泡 结构 (小 载体 PCR , vectorette PCR) 用 于 链 的 特异 引发 。 限 制 性 酶 切片 段 的 末端 加 上 接头 后 ,以 一 已 知 (基因 专 一 性 ) 引 物 和 接头 对 应 的 引 物 扩 增 。 扩 增 得 到 的 产物 包括 了 两 个 引物 之 间 的 未 知 侧 端 序列 。 如 果 基 因 专 一 性 的 引物 被 生物 素 标 记 , 产 物 就 可 以 用 链 霉 抗 生物 素 蛋 白 捕捉 (捕捉 PCR，capture PCR ) ,这 样 那 些 接头 间 非 特异 性 的 产物 就 被 去 除 ( 参 见 生 物 素 链 霉 抗 生物 素 系统 ) 。 一 个 类 似 的 策略 用 于 从 ESTs 产 生 全 长 cDNA。 在 这 种 称 为 快速 扩 增 cDNA 末端 (rapid amplification of cDNA ends，RACE) 的 技术 中 ,用 基因 专 一 性 引物 和 与 多 聚 腺 味 叭 尾巴 结合 的 寡 聚 胸腺 喀 啶 引物 , 扩 增 cDNA 的 3 端 顺序 (3” RACE)。 同 样 $ 端的 扩 增 也 可 以 同样 的 方式 用 末 端 转移 酶 在 cDNA 第 二 链 加 上 人 工 的 尾巴 ,或 者 类 似 捕 捉 PCR 加 上 一 接头 , 称 为 $ RACE。 不 对 称 PCR(asymmetric PCR) ”在 上 文 讨 论 的 PCR 中 ,引物 对 都 是 以 等 量 的 方式 产生 同样 量 目标 链 ,从 而 形成 大 量 的 双 链 扩 增 产物 。 另 一 种 标准 PCR 方法 的 演变 是 不 对 称 PCR(asymmetric PCR ) 或 单 链 PCR (single-stranded，ssPCR ) ,引物 对 中 一 条 引物 大 大 过 量 , 在 一 定 正 常 PCR 循环 后 , 另 一 条 引物 被 消耗 完 , 反 应 变 成 一 条 链 的 线性 增加 。 这 种 技 术 有 很 多 应 用 ,包括 产生 用 于 构象 电泳 分 析 ( 参 见 突变 检测 ) 的 单 链 DNA; 探 针 合成 ;序列 测定 。DNA 序列 测定 可 以 通过 单 链 PCR ,只 使 用 一 条 引物 ,并 加 入 双 脱 氧 核 苷 酸 三 磷酸 (参见 循环 测序 ) 。 21.3 体外 扩 增 的 其 他 方法 其 他 扩 增 系统 ”PCR 是 体外 扩 增 用 得 最 广泛 的 方法 ,但 不 是 唯一 的 方法 , 表 21.2 中 列 举 了 其 他 一 些 技术 和 它们 的 应 用 。 表 21.2 其 他 一 些 体外 应 用 方法 系统 解释 和 应 用 连接 酶 链 反应 (ligase chain reac- ”用 于 灵敏 地 检测 DNA 序 列 的 变化 和 等 位 基因 的 差异 。 用 两 个 引物 在 目标 基因 tion，LCR) 的 邻近 位 置 退火 。 如 果 目 标 序列 出 现 , 引 物 被 连接 酶 连接 ,可 以 作为 进一步 退火 和 连接 的 位 点 ,导致 引物 连接 产物 扩 增 。 在 目标 基因 缺乏 的 情况 下 , 没 有 连接 和 扩 增 发 生 。 选 择 只 有 完全 配对 的 引物 才能 退火 的 条 件 ,能 够 灵敏 地 检测 等 位 基因 点 突变 的 差异 , 称 为 等 位 基因 专 一 性 连接 (allele-specific liga- tion) ,参见 等 位 基因 专 一 性 杂交 (allele-specific hybridization ) 和 挂 锁 探 针 (pad- lock probes) 。 转录 为 基础 的 扩 增 ; (transcrip- ”以 转录 和 反 转 录 为 基础 的 快速 扩 增 方法 , 靶 DNA 或 RNA 通过 用 含 噬菌体 启动 tion-based amplification ) ; 核酸 子 的 引物 的 标准 技术 来 扩 增 。 进 一 步 的 扩 增 是 用 兄 菌 体 RNA 聚合 酶 转录 来 序列 为 基础 的 扩 增 (nucleic 完成 ,转录 本 反 转 录 产 生 cDNA 以 供 进一步 扩 增 。 转 录 反 应 比 起 PCR 每 循 acid sequence-based amplifica- 环 两 倍 的 增加 ,可 以 每 次 扩 增 一 千 倍 。 tion，NASBA) 链 置换 反应 (strand displacement “与 PCR 反应 类 似 的 一 种 技术 ,但 每 个 循环 不 需要 变性 步 又 。 延 伸 后 ,引物 从 延 reaction ) 伸 产 物 上 通过 限制 性 内 切 酶 处 理 分 离 出 来 。 进 一 步 的 延伸 通过 缺口 处 的 链 置换 进行 。 扩 增 得 到 的 DNA 必须 受到 保护 ,以 免 被 剪 切 。 ( 陈 淳 译 ) ， 263 ， 第 22 章 基本 概念 与 定义 。 蛋白 质 是 由 一 条 或 多 条 多 肽 链 组 成 的 大 分 子 ,每 一 条 多 肽 链 都 是 由 一 系列 氨基 酸 残 基 通 过 肽 键 一 个 一 个 连接 而 成 。 多 肽 链 的 一 级 结构 (primary structure) 指 由 遗 传 密码 决定 的 氮 基 酸 残 基 的 线 状 排列 ,这些 残 基 都 来 自 21 种 基本 氨基 酸 及 其 衍 生物 ( 见 第 11 章 遗 传 密码 )。 。 ”一旦 被 插入 一 多 肽 链 , 个 别 的 氨基 酸 就 可 能 会 发 生 共 翻译 修饰 (cotranslation modification) 或 翻译 后 修饰 (posttranslational modification)。 这 可 能 包括 简单 的 化 学 修饰 (例如 甲 基 化 ,羟基 化 ) ,或 大 的 化 学 基 团 的 添加 (例如 糖 基 化 , 酰 化 )。 较 小 的 修饰 可 能 是 永久 的 并 且 对 蛋白质 的 正确 折 友 与 功能 是 必须 的 (例如 胶原 蛋白 中 且 氨 酸 与 赖 氨 酸 的 羟基 化 ) ;但 更 常见 的 是 可 逆 的 较 小 的 修饰 对 蛋白 质 的 活性 进 行 调节 (例如 在 真 核 信号 蛋白 质 中 丝氨酸 , 苏 氨 酸 与 酷 氨 酸 的 磷酸 化 ; 见 信 号 传 导 )。 较 大 的 化 学 加 合 物 的 添加 往往 是 永久 性 修饰 ,并 且 关 系 到 胞 内 和 蛋白质 的 运 输 与 加 工 ( 例 如 很 多 分 泌 蛋 白质 被 糖 基 化 的 ) 或 者 一 蛋白 质 与 其 辅 基 共 价 的 连接 (例如 细胞 色素 C 与 血红 素 基 团 连 接 ) 。 。 ”一 新 合成 的 多 肽 链 必须 折 麦 成 它 的 天 然 构 象 (native conformation ,生物 活性 的 构 象 ) 。 在 天 然 蛋白 质 中 观察 到 结构 组 织 的 几 个 不 同 水 平 。 二 级 结构 (secondary structure) 指 残 基 局 部 构 型 的 重复 ,例如 a -螺旋 与 B- 折 释 , 主 要 由 多 肽 键 单位 之 间 形 成 氢 键 的 需要 而 产生 。 二 级 结构 往往 聚集 在 一 起 形成 更 大 更 复杂 的 排列 (如 螺旋 一 转角 -螺旋 基 序 ) ,它们 可 能 会 在 与 其 他 胞 内 组 分 的 相互 作用 中 起 特定 的 作用 。 三 级 结构 (tertiary structure) 指 多 肽 链 的 整体 三 维 构 型 ,反映 了 很 多 不 同类 型 的 共 价 或 非 共 价 的 化 学 键 作 用 ,稳定 了 能 量 上 最 适合 的 折 丢 构象 。 四 级 结构 (quaternary structure) 指 多 亚 基 蛋 白质 中 多 肽 链 亚 基 的 排列 。 考 虑 到 蛋白 质 可 能 采取 的 其 他 构象 (变性 构象 ) 的 数目 十 分 庞大 ,人 们 仍 不 清楚 蛋白 质 是 如 何 折 丢 成 天 然 构 象 的 。 折 释 可 由 内 在 因素 指导 (由 一 成 核 中 心 或 一 系列 适宜 的 中 间 体 ) ,也 可 被 外 在 因素 指导 [如 被 称 为 分 子 伴侣 (molecular chaperones) 的 蛋白 质 ]。 很 多 蛋白 质 可 以 不 同 的 稳定 构象 存在 并 显示 不 同 的 活性 。 这 些 状态 之 间 的 转换 可 以 通过 共 价 修饰 或 与 其 他 蛋白 质 的 非 共 价 相互 作用 调节 ( 别 构 性 ,allostery)。 。 可 以 基于 蛋白 质 结 构 与 功能 的 相似 将 其 划分 为 家 族 。 在 经 典 的 家 族 中 ,相关 蛋白 质 通 过 基因 重复 (gene duplication ) 和 趋 异 (divergence) 而 进化 :一 祖先 基因 重复 ， 04 等 位 拷贝 由 于 积累 的 突变 而 趋 异 。 突 变 可 以 引起 序列 ,结构 以 及 表达 模式 的 变 化 ,导致 新 的 功能 的 出 现 。 在 一 些 串联 排列 的 基因 家 族 中 ,由 非 等 位 重组 事件 即 不 等 位 交换 和 /或 基因 转变 引起 的 趋 异 的 突变 压力 由 序列 均一 化 (sequence ho- mogenization) 来 计算 。 更 复杂 的 进化 方式 包括 藤 合 蛋白 质 (chimeric proteins) ,由 已 存在 的 蛋白 质 的 组 件 (module, 连 续 的 功能 片断 ) 重 组 得 到 。 垦 合 蛋 白质 的 进化 由 于 真 核 基 因 的 外 显 子 / 内 含 子 的 结构 而 可 能 发 生 : 单 个 的 外 显 子 可 能 发 生 串 联 重复 ,导致 单个 多 肽 链 中 有 重复 的 蛋白 质 组 件 [外 显 子 重复 (exon repetition) ] , 另 外 ,外 显 子 可 能 扩散 而 重复 ,并 克隆 其 他 的 基因 产生 符合 蛋白 质 [外 显 子 改组 (ex- on shuffling)]。 某 些 蛋 白质 组 件 ,如 锌 指 DNA 结合 组 件 ,分 布 十 分 广泛 。 。 蛋白质 在 最 显著 的 水 平 表 现 了 基因 的 功能 。 但 蛋白 质 结构 的 解析 虽 已 变 得 常规 化 ,对 蛋白 质 功能 的 确定 却 往往 不 是 直接 的 。 从 理论 上 说 ,蛋白 质 的 功能 可 以 通 过 对 结构 ,表达 模式 ,突变 效应 及 与 其 他 细胞 组 分 的 相互 作用 的 分 析 来 确定 。 有 时 候 , 一 种 策略 就 可 以 得 到 目的 ,但 如 用 一 种 方法 得 不 到 所 需 的 信息 时 ,往往 就 需 要 多 种 策略 相互 补充 (例如 由 于 遗传 丰 余 突 变 不 显示 效应 )。 现 在 还 不 能 从 蛋白 质 的 一 级 序列 信息 来 预测 蛋白 质 的 三 级 结构 ,但 由 于 可 得 到 的 一 级 序列 不 断 增 多 ,很 多 和 蛋白质 的 结构 与 功能 可 以 通过 与 已 经 研究 过 的 蛋白 质 的 同 源 性 来 了 解 。 着 眼 于 单个 蛋白 质 的 深入 分 析 可 能 会 在 不 远 的 将 来 被 着 眼 于 整个 基因 组 功能 的 分 析 所 超越 (功能 基因 组 ,functional genomics) , 这 包括 对 胞 内 合成 的 所 有 蛋白质 的 结构 ,表达 ,突变 与 相互 作用 的 系统 性 考察 。 22.1 有 蛋白质 一 级 结构 多 肽 链 结构 ”多肽 链 (polypeptides) 是 氨基 酸 残 基 ( 文 框 22.1) 通 过 肽 键 (peptide bond) [通过 相 邻 所 基 酸 的 氨基 (一 NH2 ) 与 羧基 (一 COOH) 缩 合 而 成 的 键 ;图 22.1] 共 价 连接 形 成 的 线 状 长 链 。 多 肽 链 的 第 一 个 残 基 仍 保留 它 的 氨基 ,而 最 后 一 个 残 基 仍 保留 它 的 羧基 。 因此 多 肽 链 的 末端 分 别 被 称 为 N 端 (N-terminal) 与 C 端 (C-terminal) 。 蛋 白质 的 一 级 结构 (primary structure) 指 的 是 氨基 酸 顺 序 (amino acid sequence) ,常规 上 从 和 N 到 CC 的 方向 读 出 。 这 和 核 背 酸 的 一 级 序列 一 一 即 核 苷 酸 顺 序 是 同 义 的 ,而 且 多 肽 链 N->~C 极 性 (polari- ty) 与 它 同 来 源 的 mRNA 的 从 5 一 3 的 极 性 ( 见 第 16 章 核酸 结构 ) 是 共 线 性 的 。 所 有 的 新 生 肽 链 都 以 甲 硫 氢 酸 起 始 ( 见 第 23 章 蛋 白质 合成 ) ,虽然 它 往往 在 翻译 后 被 切除 。 在 原核 与 真 核 生 物体 中 ,N 端 甲 硫 氢 酸 的 氨基 在 与 起 始 耻 NA( 人 参阅 ) 连 接 后 被 甲 酰 化 封闭 。 多 肽 链 的 键 构象 ”多肽 链 是 由 氨基 酸 单 体 组 成 的 大 分 子 ,那么 很 容易 把 它们 想象 成 线 上 的 一 串珠 子 ,氨基 酸 是 坚硬 的 珠子 而 肽 键 是 柔软 的 连接 物 使 折 笃 可 以 发 生 。 事 实 上 完 全 相反 。 肽 键 采取 僵硬 的 平面 式 构 象 , 而 氨基 酸 残 基 中 的 键 , 键 (Ca-N 键 ) 与 末 键 (Ca- C' 键 ) 可 以 有 不 同 程度 的 旋转 (图 22.1)。 肽 键 (@ 键 ) 往 往 采 取 反 式 构 象 (180" 旋 转 ) ,但 在 且 氨 酸 残 基 时 由 于 二 级 氨基 基 团 的 环 状 结构 肽 键 无 法 旋转 。 因 此 邻近 且 氨 酸 残 基 的 肽 键 采取 顺 式 构象 。 s 汪 9S 。 22.1 多 肽 链 主 链 的 键 构象 。 由 氢 酰 残 基 组 成 的 多 肽 链 (在 左 图 中 用 AA1,AA2,AA3 表示 ) 由 肽 键 (o 键 ) 连 接 而 成 ,用 粗 线 表示 。 肽 键 形成 平面 的 刚性 的 结构 (用 圆圈 界定 ) ,往往 是 反 式 构 象 。 氨基 酸 的 $ 键 与 亚 键 可 以 旋转 使 蛋白 质 折 亚 。 允 许 的 $ 键 与 亚 键 的 范围 用 Ramachandran 构象 图 ( 右 图 ) 表 示 , 其 中 B 为 B 折 到 ,oaR 代表 右手 螺旋 以 及 oL 代表 左手 "螺旋 。Ca 是 中 心 的 四 价 的 碳 原子 ,C 是 每 一 肽 键 的 羧基 碳 原 子 。 Ramachandran 构象 图 (Ramachandran plot) 是 以 $ 键 与 亚 键 角度 作为 不 同 的 坐标 绘 制 的 点 图 (图 22.1)。 它 表示 了 能 量 许可 即 不 被 多 肽 链 主 链 与 侧 链 的 立体 效应 所 限制 的 $ 键 与 亚 键 角度 的 集合 。 对 大 部 分 氨基 酸 来 说 ,允许 的 集合 落 在 三 个 主要 的 区 域 , 分 别 对 应 于 8B 折 和 ,右手 螺旋 以 及 左手 " 螺旋 ( 见 下 文 )。 甘 氨 酸 带 有 由 一 个 氢 原 子 组 成 的 较 小 的 侧 链 ,可 以 采取 更 多 种 类 的 构象 ,因而 在 蛋白 质 结构 的 多 样 性 中 起 重要 的 作用 。 然 而 ,多 肽 链 主 链 的 整体 折 笃 可 以 迫使 一 些 氨基 酸 采 取 能 量 不 适宜 的 键 构象 。 22.2 高 级 蛋白 质 结 构 二 级 结构 蛋白 质 的 二 级 结构 (secondary structure) 是 由 分 子 内 和 氢 键 和 其 他 的 弱 键 相互 作用 产生 的 规则 重复 的 局 部 构象 。 虽 然 氢 键 是 由 极 性 氨基 酸 侧 链 (如 丝氨酸 和 苏 氨 酸 侧 链 ) 形 成 的 ,但 多 肽 链 主 链 自 身 也 具有 极 性 ,因为 每 一 肽 键 单位 的 氨基 氮 原 子 可 以 作为 氢 键 给 体 。 而 羧基 氧 原 子 可 以 作为 氢 键 受 体 。 多 肽 链 上 肽 键 单位 的 周期 性 的 间隔 使 规律 有 序 的 结构 得 以 形成 。 已 识别 到 三 大 类 二 级 结构 ,分 别 定义 为 螺旋 (helix) , 折 生 (sheet) 与 转角 (turn) 。 其 中 螺旋 与 B 折 释 是 最 常见 的 ,在 连续 残 基 具 有 相同 的 $ 键 与 更 键 角度 时 发 生 (图 22.2)。 不 同 于 这 三 类 的 二 级 结构 统称 为 卷曲 (coil) 。 在 多 肽 链 中 w 螺旋 往往 是 由 L -氨基 酸 组 成 的 右手 螺旋 ,在 连续 残 基 具 有 相同 的 分 别 约 为 - 60 与 -45 的 $ 键 与 亚 键 角度 时 发 生 ,对 应 于 在 Ramachandran 构象 图 中 左下 方 的 四 分 之 一 区 域 中 封闭 曲线 的 值 ( 图 22.1)。 主 链 的 卷曲 使 每 隔 四 个 残 基 的 肽 键 单位 之 间 可 以 产生 氢 键 。a 螺旋 中 肽 键 的 排列 是 同 向 的 ,这 样 就 放大 了 肽 键 单位 的 轻微 极 性 的 电荷 分 布 ,使 "螺旋 产生 一 显著 的 偶 极 矩 。 螺 旋 之 间 的 相互 作用 不 仅仅 反映 了 个 别 残 基 的 化 学 基 团 的 相互 作用 ,还 反映 了 整体 结构 的 累积 电荷 分 布 。a 螺旋 的 长 度 从 4 残 基 到 超过 40 个 残 基 (1 一 12 圈 螺 旋 )。 在 螺旋 中 出 现 的 氨基 酸 有 一 定 的 倾向 性 ,如 朴 水 残 基 丙 氨 酸 与 亮 氨 酸 经 常 出 现 而 另 一 些 氨基 酸 如 丝氨酸 就 很 少 出 现 。 两 亲 aw 螺旋 (amphipathic a helix) 一 面具 有 下 水 残 基 相 对 的 一 面 有 极 性 的 或 带电 荷 的 残 基 。 这 样 产 生 了 既 可 以 与 极 性 化 学 环境 也 可 以 与 非 极 性 化 学 环境 相互 作用 的 结构 (参见 亮 氨 酸 拉链 ,离子 通道 )。 5 @) 反 平 行 和 平行 B- 折 释 图 22.2 ”蛋白质 中 主要 的 二 级 结构 。(a) 螺旋。 相隔 四 个 残 基 的 氨基 氮 与 羧基 氧 形成 氢 键 产生 右手 螺旋 ,每 3.6 个 残 基 为 一 周期 。 箭 头 表明 氢 键 并 指向 偶 极 和 矩 的 负极 。(b) B 折 琶 。 右 手 的 B 层 片 可 以 通过 层 片 间 的 氢 键 (箭头 ) 形 成 反 平 行 或 平行 的 B 折 二 。 反 和 平行 的 B 折 县 往往 被 转 角 分 开 ,而 平行 的 B 折 释 往 往 被 "螺旋 分 开 。 粗 线圈 出 的 碳 原 子 是 Ca 碳 原子 。 在 蛋白 质 剖 面 图 中 螺旋 与 B 折 释 往 往 分 别 用 圆柱 (或 卷曲 ) 和 箭头 来 表示 。 B 折 又 (B-sheet) 由 多 肽 链 中 肾 链 (B-strands) 区 域 形 成 。 在 B 链 中 , 键 角 几乎 完全 伸 展 , 对 应 于 在 Ramachandran 构象 图 中 左上 方 的 四 分 之 一 区 域 中 较 广 泛 区 域 中 的 值 ( 图 22.1)。 几 个 8B 链 以 平行 或 反 平 行 或 混合 方式 排列 ,使 不 同 B 链 的 肽 键 单位 可 以 形成 氢 键 。 这 种 结构 常常 被 称 为 裙 状 折 丢 (pleated sheets) ,因为 每 一 链 中 的 Ca 碳 原子 是 在 折 笃 平面 或 上 或 下 排列 的 。B 折 县 往往 以 右手 方向 弯曲 ,有 时 弯曲 达到 形成 类 螺旋 桨 结构 的 程度 。 在 有 些 蛋 白质 中 ,B 链 以 相互 垂直 方式 排列 以 产生 篮 状 排列 的 B 折 私 类 型 。 a 螺 旋 与 B 折 到 通 过 连接 残 基 相 连 ,这 些 连 接 残 基 也 可 通过 氢 键 产生 自身 的 二 级 结 构 ,被 称 为 转角 (turns)。 最 简单 的 转角 很 短 ,例如 B 转 角 是 由 相隔 三 个 残 基 的 肽 键 单位 之 间 的 氢 键 产生 的 ,导致 了 多 肽 链 主 链 形成 一 发 夹 状 转角 。 也 有 可 能 ,连接 残 基 没 有 形成 任 何 二 级 结构 ,这 时 它们 被 称 为 环 (loops)。 由 于 缺少 分 子 内 的 氢 键 , 环 常 与 水 形成 氢 键 , 因 而 往往 在 蛋白 质 的 表面 被 发 现 。 超 二 级 结构 ”几乎 所 有 的 蛋白 质 都 包含 这 样 的 区 域 , 它 们 采取 w 螺旋 或 B 折 县 的 结构 ， 由 转角 或 环 连 接 。 两 个 以 上 的 二 级 结构 往往 组 合 形成 一 更 加 复杂 的 结构 ,可 以 被 称 为 超 二 级 结构 (supersecondary structure) 或 基 序 (motifs, 又 译 “ 模 体 ”")0) 。 有 些 组 合 是 特别 普遍 的 并 构成 结构 性 结构 域 的 基础 ( 见 下 文 ) 或 可 与 胞 内 的 其 他 分 子 的 发 生 特异 的 相互 作用 。 1) 基 序 是 描述 被 识别 的 短 多 肽 顺序 的 另 一 种 方式 ,因为 它 在 两 种 或 更 多 的 蛋白 中 保守 。 基 序 的 含义 并 不 是 仅 指 上 述 的 结构 基 序 ( 见 本 章 后 面 的 基 序 、 组 件 和 结构 域 部 分 )。 ”267 。 在 三 种 或 更 多 没有 关系 的 蛋白 质 中 观察 到 的 超 二 级 结构 被 称 为 超 折 大 (superfold)。 已 被 描绘 的 超 二 级 结构 数目 众多 ,在 表 22.1 中 列 出 了 有 些 常 见 的 例子 。 它 们 由 相 邻 的 “螺旋 和 B 折 释 的 侧 链 相互 堆 积 而 成 。 三 级 ,四 级 以 及 活性 结构 蛋白 质 的 三 级 结构 (tertiary structure) 指 多 肽 链 的 整体 三 维 结构 ,反映 了 二 级 结构 与 超 二 级 结构 的 堆积 形成 紧密 的 球状 结构 域 。 结 构 域 (domain) 是 蛋白 质 三 级 结构 的 最 小 单位 ( 见 组 件 ) ,可 能 可 被 认为 是 独立 或 准 独立 的 功能 单位 。 小 的 蛋白 质 可 能 只 包括 单个 结构 域 , 而 大 蛋白 质 一 般 由 多 个 结构 域 集 合 而 成 ,这 些 结构 域 在 理 论 上 可 以 独立 地 或 在 一 般 合 蛋白 质 中 折 友 与 执行 功能 (参见 折 县 元 , 襄 合 蛋白 ,结构 域 交 换 )。 很 多 多 肽 链 是 单独 起 作用 的 ,而 有 些 则 聚集 成 寡 聚 与 多 聚 复合 物 ,它们 可 能 包含 同一 多 肽 链 的 多 个 拷贝 [ 同 聚 多 亚 基 蛋白 (homomultimers) ,例如 B 乳 糖苷 酶 ], 也 可 能 包括 不 同 的 多 肽 [ 异 聚 多 亚 基 蛋白 (hetermultimers) ,如 血红 和 蛋白]。 在 多 聚 复合 蛋白 中 人 们 认识 了 更 高 级 的 结构 层次 ,四 级 结构 (quaternary structure) , 它 反映 了 单个 成 分 ( 原 聚 体 , pro- tomers) 的 空间 组 织 以 及 它们 之 间 形 成 的 化 学 键 。 单 个 的 原 聚 体 的 功能 可 能 独立 或 依赖 于 整个 复合 物 。 在 后 一 种 情况 中 ,四 级 结构 在 蛋白 质 活性 的 调节 中 十 分 重要 (参见 协同 结 一 六 必 当 蛋 白质 与 非 蛋白 因子 如 辅 因子 \ 配 体 \ 底 物 等 等 相互 作用 时 会 形成 进一步 的 结构 层 次 。 只 有 在 非 蛋白 辅 因子 存在 时 才能 行使 功能 的 蛋白 质 被 称 为 结合 蛋白 质 (conjugated proteins) 。 它 们 与 它们 的 辅 因 子 (例如 辅酶 , 核 苷 酸 ,金属 离子 ) 往 往 是 非 共 价 结合 的 ,在 辅 因子 不 存在 时 它们 被 称 为 脱 辅 基 蛋白 质 (apoprotein ) 而 与 辅 因子 结合 后 被 称 为 全 蛋白 质 (holoprotein)。 然 而 也 有 一 些 辅 因 子 是 与 蛋白 质 共 价 结合 的 ,在 这 种 情况 下 被 称 为 畏 基 (prosthetic group, 例 如 在 血红 蛋白 中 的 血红 素 )。 在 两 种 情况 下 ,蛋白 的 活性 在 与 辅 因 子 结合 后 会 发 生变 化 ,可 能 是 由 于 辅 基 对 蛋白 结构 的 影响 或 是 由 于 辅 基 的 特异 的 化 学 性 质 。 和 蛋白 质 与 配 体 或 底 物 的 相互 作用 可 能 包括 共 价 与 非 共 价 键 , 虽 然 前 者 往往 是 可 逆 的 (参见 自杀 酶 )。 配 体 或 底 物 结合 引起 的 蛋白 质 结 构 改 变 对 蛋白 质 的 功能 可 能 十 分 重要 (参见 异 构 ,诱导 偶合 )。 二 级 结构 的 形成 主要 受 氢 键 影响 ,但 三 级 四 级 与 活性 结构 包括 很 多 不 同类 型 的 化 学 键 ( 共 价 与 非 共 价 ) 的 贡献 。 由 于 这 些 键 的 复杂 性 ,现在 还 不 可 能 从 一 级 氢 基 酸 序列 预测 高 级 有 序 的 结构 。 蛋 白质 的 三 级 四 级 结构 以 及 与 辅 因 子 、 配 体 、 底 物 的 相互 作用 的 结构 只 能 用 生物 物理 的 方法 来 研究 ( 文 框 22.2)。 高 级 蛋白 质 结构 中 的 共 价 键 ”在 有 些 蛋白 质 中 ,只 有 多 肽 链 主 链 与 氨基 酸 残 基 基 团 中 存在 共 价 键 。 然 而 ,很 多 蛋白 质 需要 另外 的 共 价 相互 作用 以 到 达 它 们 的 天 然 构象 ,它们 需 要 半 胱 氨 酸 残 基 的 迟 基 (sulfydryl group, - SH) 之 间 形 成 的 二 硫 键 (disulfide bonds)。 在 很 多 和 蛋白质 中 分 子 内 的 二 硫 键 是 稳定 的 三 级 结构 所 必需 的 ,而 分 子 间 的 二 硫 键 还 可 以 稳定 四 级 结构 。 这 包括 同一 多 肽 链 的 拷贝 之 间或 是 不 同 基因 编码 的 多 肽 链 之 间 形 成 的 二 硫 键 (例如 在 抗体 合成 中 ,二 硫 键 连接 两 条 抗体 重 链 ,也 连接 重 链 与 轻 链 )。 胰 岛 素 提供 了 一 个 有 趣 的 变异 的 例子 。 在 成 熟 蛋白 质 中 有 三 对 二 硫 键 , 一 对 是 A 链 的 分 子 内 二 硫 键 ,两 对 是 连接 A 链 与 孔 链 的 分 子 间 二 硫 键 。 然 而 在 新 生 肽 链 中 ,三 对 二 硫 键 都 是 分 子 内 二 硫 键 。268 ， 因为 A 链 与 也 链 是 由 同一 基因 编码 ,开始 它们 之 间 有 一 段 C 多 肽 连接 ,在 二 硫 键 形成 后 C 多 肽 被 切除 。 表 22.1 和 蛋白质 中 常见 的 超 二 级 结构 的 一 些 例子 。 它 们 中 间 很 多 可 以 在 SCOP 数据 库 查 看 ( 见 本 章 结尾 ) 结构 组 成 简单 超 二 级 结构 :a 螺旋 卷曲 螺旋 两 个 以 上 的 “螺旋 互相 卷曲 ,这 种 结构 特别 稳定 ,往往 在 纤维 结构 蛋白 质 如 角 和 蛋白, 胶原 蛋白 及 纤维 蛋白 原 中 发 现 。 竞 氢 酸 柱 链 (参阅 ) 的 二 聚 形成 一 个 两 螺旋 的 卷曲 螺旋 。 普 通 的 "螺旋 的 螺旋 重复 是 3.6 个 残 基 。 但 在 一 两 螺旋 的 卷曲 螺旋 中 ,扭曲 使 周期 减少 到 3.5 个 残 基 , 这 样 允许 每 隔 七 个 出 现 的 亮 氨 酸 可 以 相互 作用 ( 见 第 17 章 核 酸 结合 蛋白 )。 螺旋 -转角 -螺旋 两 个 人 这 个 结构 是 一 常见 的 原核 与 真 核 的 DNA 结合 基 序 ( 见 核酸 结 合 蛋 5 螺旋 - 环 -螺旋 两 个 螺旋 由 一 环 连接 区 域 连接 ,是 一 种 常见 的 基 序 ,在 一 些 DNA 结合 蛋白 质 (例如 Achaeta-scute, 无 姐妹 (Sisterless-a) , 肌 浆 蛋白 D(MyoD)) 的 二 聚 组 件 中 及 它们 的 抑制 剂 (例如 Id,Deadpan) 中 (参见 基本 螺旋 一 环 一 螺旋 ,性 别 决 定 ) 以 及 钙 调 蛋白 中 发 现 。 在 钙 调 蛋白 中 ,螺旋 正和 下 采取 一 种 相互 垂直 的 螺旋 一 环 一 螺旋 结构 被 称 为 FF 手 (EF-hand)。 简单 超 二 级 结构 :B 折 丢 B- 发 夹 由 环 连 接 的 两 个 反 平 行 的 B 链 。 在 很 多 蛋白 质 中 单独 或 作为 大 的 B 折 县 的 一 部 分 被 发 现 。 没有 特殊 的 功能 与 这 种 结构 相关 。 Ba-g 基 序 由 螺旋 分 开 的 两 个 平行 的 B 链 。 大 部 分 包括 平行 的 B 链 的 B 折 释 使 用 这 种 基 序 ,这 样 B 链 的 相连 的 两 端 在 B 折 琶 的 相对 的 两 面 。 有 弓 由 环 连 接 的 两 个 相 邻 的 B 链 形成 的 结构 ,但 这 些 层 片 位 于 不 同 的 B 折 登 中 。 B 吓 起 8B 链 中 特殊 的 残 基 引 起 B 折 至 的 扭曲 。 复杂 超 二 级 结构 :a 螺旋 四 螺旋 束 四 个 反 平 行 的 螺旋 相互 堆积 形成 疏水 核 ,而 亲 水 表面 暴露 。 在 很 多 主要 由 螺旋 组 成 的 蛋白 质 如 Rop 和 铁 蛋 白 中 发 现 。 珠 蛋 白 折 释 八 个 螺旋 以 一 种 复杂 的 方式 排列 ,这 样 多 肽 链 一 级 结构 相 邻 的 螺旋 在 二 级 结构 中 不 一 定 相 邻 。 螺 旋 形成 口袋 状 是 蛋白 质 的 活性 位 点 。 珠 蛋白 折 释 在 进化 中 高 度 保 守 : 在 血红 蛋 白 与 肌 红 蛋白 中 它 与 血红 素 基 团 结合 。 复杂 超 二 级 结构 :B 折 丢 B- 桶 由 大 的 反 平 行 B 折 县 形成 的 结构 ,整个 折 琶 卷曲 使 第 一 个 B 链 与 最 后 一 个 B 链 通过 氢 键 相 互 作用 从 而 形成 一 个 近似 的 圆柱 形 。 每 一 B 层 片 通过 一 发 夹 转 角 或 环 与 其 他 层 片 相连 。 这 种 结构 往往 形成 与 小 分 子 结合 的 口袋 ,例如 视 黄 醛 结合 蛋白 包含 与 视 黄 醛 分 子 结合 的 B- 桶 结构 。 - B 螺 旋 浆 8B 链 扭曲 成 旋转 排列 的 B 折 释 ; 流 感 病毒 神经 氨 酸 酶 蛋白 包括 6 个 B 螺 旋 浆 基 序 , 每 个 由 4 个 反 平 行 B 链 组 成 。 这 6 个 基 序 排列 形成 一 种 类 桶 状 结 构 域 。 B- 三 明治 结构 两 个 以 上 的 B 折 琶 , 一 个 堆积 在 另 一 个 上 面 。 希腊 钥匙 四 链 的 反 平 行 B 折 释 。 一 级 序列 顺序 为 (1-2-3=-4) 的 四 个 链 在 剖面 图 上 顺序 为 (4 一 1 2-3)。 在 很 多 具有 反 平 行 B 折 重 的 蛋白 质 中 发 现 。 果冻 卷 四 个 希腊 钥匙 基 序 形成 一 桶 状 结构 , 它 的 名 称 是 由 于 多 肽 链 主 链 缠绕 在 桶 状 结构 上 的 方 式 。 在 流感 病毒 的 血 凝 素 等 蛋白 中 发 现 。 复杂 超 二 级 结构 :螺旋 与 B 折 午 桶 由 顺序 的 Bo-B 基 序 形成 的 结构 ,它们 卷曲 形成 圆柱 体 ,B 链 是 平行 的 ,a 螺旋 使 之 封闭。 在 酶 如 丙酮 酸 激酶 , 醛 缩 酶 , 烯 醇化 酶 ,RuBisCo, 葡萄 糖 异 构 酶 以 及 三 磷酸 异 构 酶 (因此 往 往 被 称 为 TOM 桶 ,TIM barrel) 等 等 中 常见 的 基 序 。 轨 开 放 折 县 由 顺序 的 Be-B 基 序 形成 的 结构 ,它们 没有 发 生 卷曲 而 是 形成 折 丢 ,平行 的 B 链 的 两 侧 被 螺旋 填充 。 是 在 很 多 蛋白 质 如 已 糖 激酶 和 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 中 发 现 的 高 度 可 变 的 基 序 。 Rossman 折 释 另 一 类 Ba 基 序 ,包括 中 心 部 分 的 B 折 释 及 围绕 的 螺旋。 在 核酸 结合 蛋白 与 核糖 体 蛋白 中 常见 。 其 他 结构 欧米 茄 环 长 的 环 ,两 端 靠近 。 它 不 是 严格 意义 上 的 二 级 结构 ,因为 没有 环 内 的 氢 键 相互 作用 。 "39 有 时 辅 基 与 蛋白 质 之 间 也 有 共 价 键 连接 。 例 如 细胞 色素 C 的 血红 素 基 团 就 与 蛋白 的 几 个 残 基 共 价 连接 。 在 金属 离子 的 结合 中 往往 是 配 位 键 在 起 作用 ,如 在 锌 指 (参见 此 条 ) 基 序 中 及 细菌 铜 和 冬 离 子 结合 蛋白 质 中 。 但 血红 素 中 的 铁 原 子 与 它 的 所 有 的 结合 蛋 白质 都 是 共 价 连接 的 ,包括 细胞 色素 C 与 血红 蛋 昌 。 高 级 蛋白 质 结构 中 的 非 共 价 键 ”所 基 酸 可 以 粗略 地 分 为 具 朴 水 ( 非 极 性 ) 侧 链 与 具 亲 水 ( 极 性 或 带电 荷 ) 侧 链 两 种 ( 文 框 22.1)。 在 蛋白 质 中 ,将 显著 疏水 的 残 基 暴 露 于 水 分 子 是 热力 学 上 不 能 接受 的 ,因而 可 溶性 蛋白 具有 一 朴 水 核心 (hydrophobic core) 将 非 极 性 残 基 隐藏 起 来 ,而 极 性 与 带电 荷 的 表面 暴露 于 溶剂 。 极 少 有 带电 荷 的 残 基 被 包 埋 (bury) 在 蛋白 质 的 内 部 ,但 极 性 残 基 不 一 定 被 排斥 ,而 且 多 肽 链 主 链 本 身 具 有 极 性 也 穿 过 朴 水 核心 。 极 性 原子 一 般 与 水 产生 氢 键 , 当 被 包 埋 在 蛋 白质 的 疏水 核心 中 无 法 与 水 作用 时 ,这 种 产生 氢 键 的 趋势 必需 通过 二 级 结构 来 承担 。 另 外 和 蛋白质 可 能 被 变性 一 一 其 典型 的 稳定 自由 能 等 同 于 产生 一 个 或 两 个 氢 键 的 能 量 。 二 级 结构 的 形成 ,主要 是 "螺旋 与 B 折 琶 , 中 和 了 主 链 上 的 极 性 原子 , 极 性 侧 链 也 可 以 通过 与 主 链 或 彼此 之 间 的 氢 键 来 中 和 。 下 水 核心 由 范 德 华 力 进一步 稳定 , 范 德 华 力 ( 朴 水 吸引 ) 在 中 性 原子 接触 之 前 随 它们 的 距离 接近 而 上 升 。 这 由 不 同 二 级 结构 元 件 的 表面 互补 造成 的 蛋白 质 核心 原子 的 紧密 堆积 反映 出 来 。 蛋白 质 的 表面 富 含 极 性 与 带电 荷 残 基 虽 然 非 极 性 残 基 也 可 能 暴露 出 来 。 以 这 种 方 式 , 蛋 白质 可 以 通过 静电 力 、 氢 键 、 范 德 华 力 与 其 他 分 子 发 生 非 共 价 的 相互 作用 。 如 和 蛋白 质 与 靶 分 子 带 有 不 同 电 荷 ,静电 力 就 起 很 重要 的 作用 ,如 在 高 碱 性 的 组 蛋白 与 DNA 的 负 电荷 的 磷酸 主 链 之 间 的 “ 盐 桥 "相互 作用 。 范 德 华 力 在 互补 表面 的 相互 作用 中 特别 重要 ， 这 时 水 分 子 被 排斥 ,结合 使 适宜 的 化 学 基 团 十 分 靠近 。 相 反 ,水 分 子 可 以 作为 桥梁 在 氢 键 等 蛋白 质 相互 作用 中 起 重要 作用 ,特别 是 在 蛋白 质 与 DNA 的 相互 作用 中 ( 见 第 17 章 核 酸 结合 蛋白 ) 。 蛋白 质 折 登 多肽 链 线 状 合成 后 ( 见 第 23 章 蛋 白质 合成 ) ,必需 折 笃 以 获得 正确 的 二 级 与 三 级 构象 。 正 确 的 结构 是 分 子 的 天 然 态 即 生物 活性 状态 。 非 天 然 的 变性 构象 数目 庞 大 ,并 且 Levinthal 假定 (Levinthal paradox) 表 明了 对 所 有 构象 的 随机 搜索 要 求 非常 长 的 时 间 。 因 此 ,蛋白 质 折 午 (protein folding) 必 需 由 在 能 量 上 有 利 的 相互 作用 指导 遵从 =- 限 定 途 径 进行 。 人 们 提出 了 三 种 模型 来 解释 蛋白 质 折 短 问 题 (protein folding problem) 即 使 蛋白 质 获 得 了 它们 的 天 然 构 象 过 程 的 总 和 。 其 中 两 种 模型 认为 折 麦 过程 中 有 稳定 中 间 态 的 存在 ,通过 它 折 释 得 以 进行 。 在 框架 模型 (framework model) 中 ,多肽 链 上 邻近 的 残 基 在 没有 确定 三 级 结构 存在 时 相互 作用 形 成 二 级 结构 。 二 级 结构 的 可 能 排列 数目 有 限 ,呈现 出 来 的 这 些 结构 的 随机 融合 足以 辨别 与 达到 它 的 天 然 构 象 。 朴 水 内 陷 模 型 ( hydrophobic collapse model) 认 为 非 极 性 侧 链 将 水 分 子 排斥 这 一 在 能 量 上 有 利 的 过 程 起 始 了 形成 疏水 蛋白 质 核心 的 折 释 反应 ,蛋白 质 的 其 他 部 分 可 以 在 较 有 限 的 可 能 的 构象 中 进行 选择 重新 组 织 。 在 两 种 情况 下 都 有 一 较 迟 出 现 的 紧密 堆积 的 中 间 体 , 熔 球 态 (molten globule) , 它 富 含 二 级 结构 并 且 排 列 成 大 致 正确 的 构 象 但 松散 堆积 。 蛋 白质 折 友 的 巩固 阶段 涉及 中 间 态 的 重新 组 织 以 产生 天 然 态 。 “ 另外 ,成 核 模型 (nucleation model) 认 为 蛋白 质 折 琶 通 过 多 肽 链 上 特殊 残 基 形 成 的 核 起 始 折 释 ,其 他 结构 围绕 着 核 产 生 。 这 个 球状 折 释 的 过 程 不 需要 中 间 体 ,通过 一 较 确 定 或 较 不 确定 的 核发 生 ,各 种 结构 围绕 着 核 产 生 同 时 核发 生 缩聚 ( 核 - 缩 聚 ,nucleation-conden- sation) 。 很 多 对 和 蛋白质 折 释 的 研究 已 辨 明了 中 间 折 到 状 态 从 而 支持 了 框架 与 内 陷 模 型 。 然而 最 近 一 些小 蛋白 质 表现 出 以 简单 的 两 态 模型 折 琶 ,过 程 中 没有 中 间 体 ,只 有 单个 的 过 渡 态 。 这 种 球状 折 释 单位 被 称 为 折 码 元 (foldons)。 因 此 ,对 很 多 蛋白 质 来 说 最 明显 的 折 琶 机 理 是 由 一 系列 有 效 的 动力 学 中 间 状 态 导 致 的 类 天 然 的 熔 球 态 的 形成 ,而 另 一 些 则 通 过 成 核 机 理 一 步 完 成 折 丢 。 分 子 伴 但 ”在 体内 ,很 多 新 合成 的 蛋白 质 不 能 自发 地 折 释 成 它们 的 天 然 构象 ( 自 组装 ， self-assembly) ,可 能 是 由 于 折 友 过 程 要 求 能 量 上 不 利 的 中 间 态 的 过 渡 或 由 于 同时 存在 几 种 可 能 的 稳定 折 琶 途径 ,只 有 一 种 可 以 达到 天 然 态 。 在 这 种 情况 下 ,正确 的 折 秋 由 被 称 为 分 子 伴侣 (molecular chaperones) 的 分 子 来 指导 ,它们 可 以 结合 在 天 然 态 包 埋 在 蛋白 质 内 部 而 在 变性 态 暴 露 在 蛋白 质 外 的 残 基 ( 暴 露 于 溶剂 的 疏水 残 基 ) 来 识别 变性 态 。 正 确 的 折 琶 反 映 了 分 子 伴侣 - 底 物 结合 与 释放 的 一 个 周期 ,一 般 依赖 于 ATP 的 水 解 以 及 分 子 伴侣 附属 蛋白 质 的 活性 ( 共 分 子 伴 倡 ,cochaperones)。 分 子 伴 侣 对 防止 胞 内 变性 蛋白 质 之 间 的 错误 相互 作用 是 必须 的 ,而 这 种 错误 的 相互 作用 可 能 会 导致 如 积聚 等 后 果 ( 人 参见 包含 体 ， 肝 病 毒 ) 。 分 子 伴侣 在 很 多 水 平 指导 蛋白 质 折 麦 ,去 折 县 , 重 折 县 与 聚合 ,包括 中 和 蛋白质 合成 后 起 始 折 秋 ;GO 热 诱导 变性 等 过 程 后 的 重 折 赫 (很 多 热 休 克 和 蛋白 质 与 其 他 应 激 诱导 蛋白 质 是 分 子 伴 倡 );G) 越 膜 过 程 中 的 去 折 丢 与 重 折 丢 ;人 异 构 蛋 白质 的 不 同 构象 之 间 的 转换 ;@ 重 折 和 二 ,如 作为 酶 活性 的 一 部 分 的 变性 过 程 之 后 ;@ 和 蛋白 质 降解 的 准备 ;@ 多 聚 体 与 蛋白 质 -- 配 体 复 合 物 的 形成 的 控制 。 自然 界 有 很 多 分 子 伴侣 家 族 ,它们 的 特异 性 与 折 琶 机 理 不 同 。 核 质 蛋 和 白 (nucleoplas- mins) 是 核 分 子 伴侣 ,控制 核 小 体 的 聚集 ( 见 第 3 章 染 色 质 ) 。 另 外 的 重要 的 分 子 伴侣 家 族 包括 Hsp70 家 族 , 可 以 稳定 新 生 肽 链 和 利于 膜 转 位 ,还 有 陪伴 蛋白 (chaperonins) ,控制 折 三 的 起 始 。 随 着 . coii DnaK(Hsp70 家 族 的 一 个 成 员 ,与 两 个 共 分 子 伴侣 Dnaj 与 GrpE 共同 作用 ,要求 底 物 的 结合 与 释放 ) 的 结构 的 解析 与 在 王 . Coii GroEL( 原 始 型 分 子 伴侣 ) 的 折 县 循环 中 分 子 伴 侣 与 其 底 物 的 结构 改变 的 确定 ,分 子 伴侣 活性 的 机 制 变 得 更 清楚 了 。 GroFL 形成 一 14 聚 结构 包括 两 个 内 翻 的 七 元 环 ,一 端 由 一 共 分 子 伴侣 GroES 的 七 聚 体 盖 住 。 每 一 GroEL 亚 基 结合 ATP 以 提供 底 物 结合 的 能 量 。GroES 促进 正确 折 释 产物 的 释放 。 全 部 的 折 释 过 程 要 求 好 几 轮 ATP 水 解 。 另外 ,研究 得 不 很 透彻 的 分 子 伴 侣 家 族 包括 Hsp90 和 Hsp100 , 主要 在 蛋白 合成 后 起 作用 ,可 能 在 应 激 过 程 之 后 防止 和 /或 逆转 蛋白 质 错 折 笃 与 积聚 。 还 有 , 当 有 些 分 子 伴侣 主要 是 在 胞 质 中 起 作用 , 另 一 些 ,如 原核 生物 中 由 羽 . coii sec 基因 编码 的 Grp78, 特 异地 在 分 泌 系 统 中 起 作用 ( 文 框 22.3)。 别 构 性 和 协同 性 ”不 同 的 构象 体 (confomers ,构象 异 构 体 ) 或 不 同 的 四 级 结构 之 间 的 转 换 常常 可 以 用 来 调节 蛋白 质 活性 。 蛋 白质 构象 通过 与 其 他 分 子 的 相互 作用 来 控制 ,还 可 能 涉及 可 逆 的 翻译 后 共 价 修饰 或 非 共 价 的 聚集 。 这 几 种 情况 都 导致 蛋白质 功能 的 可 逆转 “271 ， 换 。 通过 共 价 修饰 调节 和 蛋白质 活性 在 原核 信号 传导 与 基因 表达 的 控制 中 很 常见 。 很 多 蛋 白质 通过 磷酸 化 调节 ,例如 细胞 内 信和 号 蛋白 如 MAP 激酶 ,及 如 视网膜 母 细 胞 瘤 蛋白 RB1 这 样 的 转录 因子 ( 见 第 28 章 信和 号 传导 ,第 2 章 细 胞 周期 )。 另 外 ,组 蛋白 的 可 逆 乙 酰 化 在 染色 质 结构 的 控制 中 很 重要 ( 见 第 3 章 染 色 质 )。 共 价 修饰 以 两 种 方式 控制 蛋白 质 活性 。 首先 ,它们 可 以 影响 蛋白 质 的 三 级 结构 以 及 四 级 相互 作用 和 与 其 他 分 子 的 相互 作用 , 例 如 ,通过 暴露 或 包 埋 一 特定 区 域 如 一 催化 位 点 。 第 二 ,修饰 可 能 直接 在 相互 作用 中 起 作 用 。 例 如 酷 氨 酸 的 磷酸 化 使 蛋白 质 添加 了 负电 荷 , 引 起 了 三 级 结构 的 补偿 性 的 重组 织 。 然而 ,磷酸 化 的 酷 氨 酸 也 可 作为 某 些 配 体 如 包含 SH2 结构 域 ( 参 阅 ) 的 蛋白 质 等 的 直接 结 合 位 点 。 非 共 价 的 相互 作用 对 蛋白 质 构象 的 调节 包括 当 配 体 结合 于 某 一 位 点 时 会 诱导 另 一 位 点 的 构象 改变 。 蛋 白质 可 能 具有 几 个 活性 中 心 ,通过 构象 改变 相互 联系 ,这 种 现象 被 称 为 别 构 性 (allostery)。 配 体 可 能 是 一 小 的 效应 分 子 (例如 在 转录 调控 中 一 一 参见 转录 调控 ， lac 操纵 子 , 核 受 体 家 族 ) 、 另 一 种 蛋白 质 (例如 在 及 病毒 疾病 的 传播 中 , 见 下 文 ) 或 一 细胞 内 信号 蛋白 (例如 在 生长 因子 对 受 体 酷 氨 酸 激酶 的 激活 中 ,或 在 配 体 控 制 的 离子 通道 的 开 放 中 ; 见 信号 传导 )。 肝 病 毒 可 能 代表 了 一 异 构 控 制 链 反应 的 特殊 例子 :肝病 毒 是 一 正常 细胞 蛋白 质 PrP 的 病理 构象 异 构 体 ,有 病毒 与 正常 PrP 的 接触 可 能 会 诱导 后 者 产生 构象 改变 ,导致 它 转化 为 遥 病 毒 (参见 重 折 有 登 模型 )。 由 于 是 一 种 错 折 肥 的 构象 ,肝病 毒 会 发 生 聚合 ,在 细胞 内 积聚 形成 病理 性 斑点 (参见 传染 性 海绵 状 脑病 )。 和 蛋白质 活性 的 构象 控制 的 另 一 个 例子 是 协同 结合 (cooperative binding)。 在 这 种 情况 下 ,调节 发 生 在 四 级 结构 水 平 :与 配 体 结合 后 原 聚 体 (protomer) 改 变 构象 并 且 通 过 四 级 相 互 作用 提高 其 他 原 聚 体 的 亲和力 。 血 红 和 蛋白 与 氧 协同 性 结合 :氧气 与 一 珠 蛋 白 的 结合 引 起 其 他 珠 蛋白 的 构象 改变 ,提高 了 它们 的 氧 结合 效率 。 某 些 蛋白 质 相互 协同 性 结合 。 单 链 DNA 结合 蛋白 质 (SSB) 与 DNA 的 结合 引起 蛋白 质 的 构象 改变 ,使 其 他 SSB 分 子 以 更 高 效率 与 之 结合 ,引起 围绕 着 DNA 的 蛋白 质 丝 状 体 的 形成 。 22.3 蛋白 质 修 人 饰 蛋白 质 修饰 的 类 别 在 合成 过 程 中 或 之 后 ,在 多 肽 链 成 为 功能 性 蛋白 质 之 前 ,它们 需 经 历 某 些 形式 的 共 价 修饰 ( 表 22.2)。 从 结构 上 看 ,这 些 修 饰 可 以 被 分 为 三 种 类 型 :@ 微 小 的 取代 一 一 氨基 酸 侧 链 的 微小 改变 ;@ 增 大 一 一 特定 氨基 酸 残 基 上 添加 体积 较 大 的 基 团 ; 加 剪 切 一 一 从 新 生 肽 链 上 除去 残 基 。 从 功能 上 看 ,修饰 可 分 为 蛋白 质 功 能 中 性 或 功能 必 需 的 ,或 蛋白 质 折 和 帮 、 运 输 和 加 工 所 要 求 的 。 很 多 增 大 是 蛋白 质 的 分 选 所 必需 的 (一 些 是 蛋白 质 功能 必需 的 )。 几 类 修饰 在 蛋白 质 周 转 与 降解 中 起 重要 作用 。 修饰 还 可 分 为 永久 与 可 逆 的 。 剪 切 与 很 多 增 大 是 永久 的 。 取 代 可 能 是 永久 的 ,具有 重要 的 结构 上 的 作用 (例如 半 胱 氨 酸 残 基 的 二 硫 键 的 形成 ) ,也 可 能 是 可 逆 的 ,行使 调节 功 能 (例如 酷 氨 酸 残 基 的 磷酸 化 )。 体 内 存在 细胞 编程 的 酶 促 修饰 ,也 有 另 一 些 修 饰 以 非 酶 促 方 式 发 生 ,往往 与 重 日 质 寿命 有 关 。 这 些 修 饰 包括 氧化 、 脱 氨基 化 和 在 血 蛋白 质 中 ,与 葡萄 糖 的 反应 。 272 ， 表 22.2 程序 化 酶 促 蛋 白质 修饰 在 蛋白 质 结构 与 功能 ,蛋白 质 导 向 或 加 工 以 及 遗传 信息 的 流向 中 的 作 用 简 表 共 价 修饰 例子 取代 ( 较 小 侧 链 修饰 ) 较 小 侧 链 修饰 一 -在 胶原 蛋白 中 且 氨 酸 残 基 的 羟基 化 稳定 了 三 股 螺旋 组 成 的 卷曲 螺旋 的 三 级 结构 。 永久 性 并 与 蛋白 “在 某 些 激素 中 酷 氨 酸 残 基 的 磺 化 。 质 功能 相关 甲状 腺 球 蛋 白 的 碘 化 。 凝血 酶 原 谷 氨 酰 胺 残 基 的 Y - 羧 化 。 分 子 内 或 分 子 间 键 ”很 多 细胞 外 蛋白 质 中 二 硫 键 的 形成 ,例如 胰岛 素 , 免 疫 球 蛋白 。 的 形成 较 小 侧 链 修饰 一 一 酷 氨 酸 、 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 的 磷酸 化 调节 酶 的 活性 。 例 如 受 体 酷 氨 酸 激酶 ,细胞 周期 蛋白 激 可 逆 性 ,与 活性 调 酶 (参阅 )。 节 有 关 。 很 多 侧 链 发 生 甲 基 化 ,这 种 修饰 的 功能 仍 不 清楚 。 组 蛋白 (参阅 ) 赖 氨 酰 基 的 乙酰 化 调节 它们 形成 高 级 染色 质 结 构 的 活性 并 在 染色 质 结构 域 (人 参阅) 的 建立 中 起 重要 作用 。 增 大 ( 较 大 的 侧 链 或 主 链 修饰 ) 侧 链 上 化 学 基 团 的 。” 酶 活力 所 必需 的 核 苷 酸 的 增加 (例如 在 大 肠 杆 菌 中 谷 氨 酰 胺 合成 酶 中 腺 苷 酸 基 团 的 添加 ) 添加 一 一 与 蛋白 在 一 些 真 核 胞 浆 蛋 白质 中 丝氨酸 或 苏 氨 酸 残 基 上 乙 腺 氨基 葡 糖 的 添加 质 功 能 有 关 Fedgehog 家 族 ( 参 阅 ) 信 和 号 蛋白 质 上 胆固醇 的 添加 控制 其 扩散 。 结合 蛋白 质 上 辅 基 的 添加 ,例如 细胞 色素 C 与 珠 蛋 白 上 血红 素 的 添加 。 侧 链 上 化 学 基 团 的 半 胱 氢 酸 的 酰 化 使 蛋白 质 导向 细胞 膜 。 添加 一 一 与 蛋白 GPI 膜 的 添加 使 蛋白 质 导 向 细胞 膜 。 质 导 向 与 加 工 有 ”在 Asn-Xaa-Ser/Thr 的 顺序 中 天 冬 酰 氨 残 基 的 N - 糖 基 化 是 使 蛋白 质 进 和 分泌 途 径 的 常见 疾 修饰 ( 文 框 22.3) 在 高 尔 基 体 中 丝氨酸 或 苏 氨 酸 残 基 的 O- 糖 基 化 蛋白 质 的 泛 肽 化 使 蛋白 质 定向 降解 。 末端 残 基 修 饰 很 多 胞 浆 蛋 白质 的 N 端 氨基 酸 残 基 的 酰 化 往往 与 蛋白 质 的 转换 有 关 。 N 端 氨基 酸 残 基 的 酰 化 使 蛋白 质 定 向 到 细胞 膜 ,例如 Ras 的 豆 慈 酰 化 (参阅 ) 剪 切 ( 残 基 的 除去 ) 肽 键 的 剪 切 在 很 多 胞 浆 蛋 白质 起 始 的 甲 硫 氨 酸 共 翻 译 或 后 翻译 剪 切 分 泌 型 蛋白 质 在 穿越 内 质 网 膜 的 转运 过 程 中 信号 肽 (人 参阅) 的 剪 切 非 成 熟 蛋白 质 (蛋白 原 ,proproteins) 通 过 剪 切 成 熟 :例如 酶 原 (zymogens) 蛋 白水 解 后 活化 ; 胰 导 素 原 内 部 C- 多 肽 的 除去 ; Hedgehog 蛋白 质 被 剪 切 成 N 端 与 C 端 片断 。 遗传 信息 的 加 工 : 例 如 肴 人 灰 质 炎 病毒 基因 组 和 哺乳 类 速 激 肽 基因 合成 的 多 蛋白 (参阅 ) 的 剪 切 ,内 蛋白 子 inteins( 人 参阅 ) 的 剪 切 。 22.4 蛋白 质 家 族 常规 的 基因 与 蛋白 质 家 族 分 子 分 类 学 ”基因 家 族 (gene family) 指 具有 显著 的 序列 同一 性 的 一 些 基因 ,蛋白 质 家 族 (protein family) 指 具有 同样 联系 的 基因 产物 。 基 因 或 蛋白 质 273 ， 家 族 中 具有 特别 的 相似 性 的 成 员 又 可 被 归 类 为 亚 家 族 (subfamily) ,更 远 的 关系 可 分 别 用 超 家 族 (superfamily) 或 巨大 家 族 (megafamilies) 这 样 的 术语 来 描绘 ,代表 更 高 级 别 的 分 类 学 s 常规 的 基因 家 族 在 编码 区 域 的 全 长 中 序列 保守 。 这 样 的 家 族 的 进化 可 以 两 种 方式 解 释 一 一 源 于 同一 祖先 的 趋 异 或 源 于 无 联系 的 祖先 的 趋同 。 蛋 白质 的 平均 长 度 大 约 是 300 一 350 残 基 , 对 应 于 大 约 1kp 的 编码 区 域 。 因 此 随机 独立 趋同 到 完全 相同 核 苷 酸 顺 序 的 概率 是 1:41000 ,两 个 序列 独立 进化 到 50% 的 顺序 同一 性 的 概率 是 1:4"%0。 因 此 以 中 等 或 较 长 的 物理 距离 范围 内 的 基因 中 的 序列 保守 性 被 认为 是 同 源 性 (homology)2 的 基本 标 志 性 的 证 据 , 这 个 术语 用 于 描绘 来 源 于 相同 祖先 的 关系 。 与 之 相反 , 较 小 的 序列 基 序 如 转 录 调 节 元 件 和 前 切 位 点 中 ,有 显著 的 可 能 性 通过 随机 过 程 独立 发 生 。 序列 趋 异 反映 了 随 着 时 间 流 逝 突 变 的 积累 ,如 序列 不 断 趋 异 ,在 某 一 时 刻 就 会 发 生 同 源 性 无 法 通过 序列 的 保守 性 来 监测 。 通 过 序列 对 比 可 监测 到 30% 的 序列 同一 性 ,那么 这 些 序 列 显然 是 同 源 的 。 当 序列 等 同性 小 于 30% , 这 种 较 远 的 同 源 性 必需 通过 计算 机 分 析 确定 。 同 源 性 可 以 通过 保守 的 蛋白 质 折 和 至 ( 即 保守 的 三 级 结构 ) 来 辨别 ,但 看 起 来 相同 的 三 级 结构 往往 来 源 于 趋同 ,而 一 级 序列 则 完全 不 同 。 使 氨基 酸 序列 转变 成 三 级 结构 的 蛋 白质 结构 密码 是 高 度 简 并 的 ;因此 很 多 不 同 的 序列 可 以 采取 相同 的 结构 。 结 构 相 似 暗 示 的 同 源 性 是 不 确定 的 ,除非 被 序列 关系 所 支持 。 基因 家 族 的 关系 可 以 被 描绘 为 定向 同 源 与 平行 进化 同 源 两 种 。 定 向 进化 同 源 (or- thologous) 关 系 指 种 属 之 间 趋 异 的 基因 , 即 不 同 种 属 中 行使 相同 功能 的 家 族 成 员 ( 例 如 人 类 B- 珠 蛋白 和 鼠 B- 珠 蛋白 ) 。 平 行进 化 同 源 (paralogous) 关 系 指 同一 基因 组 中 重复 与 趋 异 的 基因 。 平 行进 化 同 源 基因 是 多 基因 家 族 成 员 ( 参 阅 )( 人 类 B- 珠 蛋白 与 人 类 a- 珠 蛋 白 )。 在 大 的 多 基因 家 族 中 ,联系 特别 紧密 的 基因 可 以 被 归 类 于 平行 进化 同 源 亚 群 ,例如 时 Foz 基因 是 平行 进化 同 源 的 ,而 代表 每 一 复 中 相当 的 位 置 的 Hoz 基因 彼此 联系 较 它们 与 其 他 Hoz 基因 之 间 联 系 更 紧密 ( 见 第 6 章 发 育 ,分 子 方面 )。 基因 重复 与 趋 异 :新 功能 的 起 源 从 简单 生物 体 到 复杂 生物 体 的 进化 提出 了 一 个 问题 新 功能 在 何 处 产生 ? 增加 生物 的 复杂 性 (例如 从 单 细 胞 生物 转变 为 后 生生 物体 ) 要 求 本 质 上 由 基因 决定 的 功能 数目 的 增加 。 那 么 ,新 功能 的 起 源 应 该 反映 了 新 基因 的 产生 ,或 已 存 在 的 基因 的 使 用 方式 的 改变 。 在 进化 中 两 种 过 程 都 会 发 生 :生物 复杂 性 上 升 总 的 基因 数 目 上 升 ( 见 基 因 结构 与 作 图 ) ,同时 单个 基因 产生 多 个 产物 ,特别 是 通过 可 变 剪 切 的 方式 (参阅 )。 在 理论 上 新 基因 可 以 通过 三 种 来 源 发 生 :GD 从 其 他 基因 组 输入 ;@ 通 过 已 存在 的 基因 1) 严格 来 说 同 源 性 是 一 个 绝对 的 术语 , 即 两 个 顺序 或 者 是 同 源 的 或 者 不 是 -不 存在 同 源 程 度 的 差别 。 为 了 定量 顺序 之 间 的 关系 使 用 同一 性 百分数 (percent identity, 完 全 保守 的 碱 基 / 氨 基 酸 的 出 现 频率 ) 或 相似 性 百分率 (percentage similarity, 完 全 保守 或 保守 改变 的 氨基 酸 出 现 的 频率 )。( 但 是 典 合 蛋白 质 可 能 被 描绘 成 部 分 同 源 , partially homolo- gous, 见 正文 )。 同 源 顺 序 之 间 的 联系 程度 反映 了 趋 异 之 后 经 历 的 时 间 ( 参 见 分 子 钟 )。 因 此 定向 进化 同 源 顺 序 的 比较 产生 了 分 子 种 系 发 生 (molecular phylogenies) 的 认识 ,而 平行 进化 同 源 顺 序 的 比较 提供 了 基因 家 族 进 化 的 信息 。 序 列 对 比 的 一 个 问题 是 缺口 的 导 和 人。 序列 可 能 会 通过 核 苷 酸 或 氨基 酸 的 插 人 或 缺失 也 可 能 通过 取代 而 趋 异 ,问题 是 通过 导 人 缺口 ,任何 一 对 序列 都 可 以 相配 ,所 以 在 序列 对 比 中 必需 有 缺口 处 罚 (gap penalty) 这 样 导 和 人 的 缺口 越 多 两 顺序 之 间 的 等 同性 越 低 。 这 往往 是 一 种 主观 确定 的 值 ,对 导 人 新 的 缺口 比 已 存在 的 缺口 更 高 。 省 了 玲 。 的 内 源 重复 ;G) 由 非 编 码 区 域 中 点 突变 的 积累 随机 自发 发 生 。 第 三 种 可 以 忽略 不 计 , 因 为 它 不 太 可 能 发 生 ( 见 较 早 的 概率 计算 )。 基 因 的 输入 (水 平 基因 转移 , horizontal gene transfer) 是 相对 较 少 发 生 的 事件 ( 见 第 10 章 细菌 中 的 基因 转移 ;参见 Ti 质粒 , 混 栖 DNA， 急性 转化 型 反 转 录 病 毒 ) 并 且 严 格 来 说 不 一 定 产生 新 的 功能 ,虽然 它们 对 被 输入 者 来 说 是 新 的 。 大 部 分 新 基因 是 由 内 源 基 因 重 复 (gene duplication ) 接 着 发 生 趋 异 产生 的 。 这 种 事 件 的 频率 解释 了 细胞 内 基因 组 中 多 基因 家 族 的 优势 。 一 有 旦 基因 重复 发 生 ,细胞 内 就 有 同一 基因 完全 相同 的 两 份 拷贝 ,这 些 基 因 开 始 会 显示 表 观 等 位 (参见 假 等 位 基因 ,基因 丰 余 )。 如 果 基 因 产 物 是 必需 的 ,选择 会 作用 于 其 中 一 个 座位 ,而 另 一 座位 可 以 发 生 突 变 (图 22.3)。 在 很 多 情况 中 ,突变 的 积累 会 导致 功能 的 丧 . 失 产 生 假 基 因 ( 参 阅 ) 并 会 渐渐 完全 丢失 。 偶 然 地 ,突变 以 某 种 方式 改变 了 基因 产物 的 结 构 使 它 可 以 行使 新 的 功能 。 然 而 更 常见 的 是 新 功能 的 获得 是 由 于 新 的 表达 模式 的 获得 ， 接着 结构 趋 异 。 举 例 说 明 ,已 发 现 后 生生 物 中 许多 酶 都 表现 为 由 显著 差别 表达 的 基因 编 码 的 多 种 同 工 型 ( 同 工 酶 ,isoenzyme,isozyme)。 在 很 多 哺乳 动物 中 的 糖 酵 解 酶 烯 醇化 酶 有 三 种 同 工 形式 ,一 种 广泛 分 布 , 另 两 种 分 别 在 成 体 的 神经 元 与 肌肉 中 特异 表达 。 这 可 能 代表 了 趋 异 过 程 的 早期 阶段 ,每 一 蛋白 质 承 担 同 样 的 功能 ,只 是 适应 于 不 同 的 胞 内 环境 例 如 神经 元 中 烯 醇化 酶 具 氯 化 物 耐 受 性 。 甚 至 更 明显 分 化 的 蛋白 质 如 果 蝇 蛋白 质 Paired 和 Gooseberry 以 及 小 鼠 Pax-3 蛋白 质 ,如果 基 因 处 于 异 源 调节 元 件 的 启动 下 (例如 goose- perry 在 paired 启动 子 下 表达 可 以 拯救 aired - 突变 果 蝇 ) ,它们 也 可 以 互相 代替 。 进 化 过 程 可 能 既 受 顺 式 DNA 元 件 中 的 突变 推动 又 受 影响 蛋白 质 结构 的 突变 推动 。 另 一 种 产生 独立 功能 的 更 复杂 的 路 线 是 组 合作 用 ,开始 丰 余 基因 拷贝 趋 异 但 保持 相 关 的 功能 并 可 以 协同 地 产生 进一步 的 功能 趋 异 性 。 例 如 在 人 类 和 其 他 哺乳 动物 中 祖先 G 生生 全 全 全 和 入 征用 这 些 受 体 单独 或 复杂 地 基 二 ER an LLTI [mm 协同 0 趋 异 和 INIININLE 原 有 功能 新 功能 假 基因 图 22.3 蛋白 家 族 的 进化 。 单 个 的 祖先 基因 可 能 重复 ,在 这 种 情况 下 选择 压力 只 集中 施加 于 一 个 拷贝 上 ,而 另 一 个 拷贝 可 能 发 生 突变 ( 带 线条 的 框 )。 这 种 歧化 可 能 导致 产生 新 的 功能 或 功能 丧失 (产生 假 基因 )。 在 串联 基因 和 能 中 ,通过 非 等 位 重组 个 体 序列 的 趋同 (homogenization) 可 能 导 致 协同 进化 。 “5 组 合成 信号 网 络 来 辨别 不 同 的 味道 。 当 承 担 了 新 的 功能 ,重复 的 基因 就 变 成 非 等 位 的 。 因 此 基因 重复 与 趋 异 的 遗传 后 果 开始 于 完全 丰 余 ,进而 部 分 丰 余 渐渐 变 成 完全 功能 独立 。 然 而 也 有 可 能 没有 联系 的 基因 趋同 产生 同一 功能 ,特别 在 真 核 生 物 的 复杂 信和 号 途径 中 会 发 生 种 种 趋同 与 趋 异 的 交织 ( 见 第 28 章 信号 转 导 )。 一 个 例子 是 脊 椎 的 组 织 者 分 泌 至 少 三 种 不 相 联系 的 蛋白 质 一 一 头发 生 素 (Noggin)、Follistatin 和 Chrodin 以 通过 骨 形 态 发 生 蛋 白质 来 阻 断 信号 ( 见 第 6 章 发 育 ,分 子 机 制 )。 基因 重复 的 机 制 ”基因 重复 ,平行 进化 同 源 基因 的 产生 可 以 发 生 在 三 个 水 平 :中 分 离 的 基因 重复 事件 ;@ 整 个 基因 组 的 重复 ;以 及 @ 涉 及 整 条 染色 体 或 染色 体 片断 的 大 范围 重 受 ; 选择 性 基因 重复 (selective gene duplication) 事 件 可 能 通过 一 系列 不 同 的 机 制 发 生 ,这 取决 于 已 存在 的 基因 的 拷贝 数 。 如 果 在 基因 组 中 已 有 一 个 以 上 的 拷贝 ,那么 不 等 交换 ,不 均等 姐妹 染色 单 体 交 换 及 复制 跳 格 (人 参阅) 都 可 能 在 重复 DNA 序列 中 产生 重复 (也 可 能 产生 缺失 )。 基 因 拷 贝 首次 重复 是 如 何 发 生 的 ? 单个 基因 的 重复 涉及 更 加 复杂 的 机 制 , 包 括 @ 整 个 基因 组 范围 的 DNA 复制 转 座 ;@ 染 色 体 断裂 后 发 生 的 非 正 常 的 姐妹 染色 单 体 末端 连接 ;以 及 G@ 可 能 随机 发 生 的 较 短 的 顺序 基 序 的 不 等 交换 。 涉 及 大 的 非 连锁 DNA 区 域 的 更 为 复杂 的 重 排 可 能 对 分 离 基因 重复 也 有 贡献 (参见 基因 扩 增 )。 很 多 平行 进化 同 源 基因 的 关系 可 能 反映 了 古代 全 基因 组 重复 (whole genome duplica- tions) 事 件 ,特别 是 在 较 大 的 基因 组 中 。 基 因 组 大 小 与 基因 数目 的 比较 分 析 表 明 人 类 基因 组 通过 至 少 两 轮 全 基因 组 重复 而 产生 。 很 多 基因 在 果 蝇 与 线虫 基因 组 中 只 出 现 一 次 ,而 在 哺乳 类 中 却 有 四 份 平 行进 化 同 源 拷贝 ,最 重要 的 例子 是 四 个 Hoz 基因 繁 (参阅 )。 全 基 因 组 重复 在 植物 中 经 常 发 生 ,而 且 虽 然 在 哺乳 类 中 是 有 害 的 ,在 很 多 无 养 椎 动物 中 却 可 被 耐 受 (参见 多 倍 体 )。 在 文昌 鱼 (Amzpjhiozovs ) 的 基因 组 中 具有 单个 的 Eoz 基因 簇 , 而 它 被 认为 是 现存 与 脊椎 动物 亲缘 关系 最 近 的 生物 。 因 此 ,有 可 能 后 来 进化 为 脊 椎 动物 的 某 一 古代 种 族 经 历 了 一 系列 基因 组 重复 事件 然后 发 生 染 色 体 水 平 的 趋 异 以 保持 二 倍 体 。 推 测 四 倍 体 状 态 在 哺乳 类 种 系 中 也 是 瞬时 的 ,因为 大 尺度 的 染色 体重 排 将 限制 同 源 染 色 体 在 减 数 分 裂 中 与 特异 的 伴侣 配对 (然而 很 多 鱼 是 四 倍 体 )。 趋 异同 时 发 生 在 基因 水 平 , 包 括 一 些 基 因 的 丢失 与 其 他 基因 的 重 排 。 最 后 ,只 有 很 少 的 古代 重复 事件 的 痕迹 保留 下 来 ， 如 平行 进化 染色 体 片断 (paralogous chromosome segments)。 例 如 ,人 类 染色 体 12 与 17 各 包含 四 个 GOX 簇 中 的 一 个 以 及 几 个 其 他 的 基因 家 族 (胶原 蛋白 , 烯 醇化 酶 , 维 甲酸 受 体 ， 角 蛋 白 , 整 联 蛋 日 , WNT 以 及 乙 醛 脱 氢 酶 ) 的 平行 进化 的 成 员 ,这 些 成 员 具 有 较 广 泛 的 保 守 性 。 大 规模 的 染色 体重 排 对 多 基因 家 族 的 进化 也 有 贡献 。 哺 乳 类 基因 组 的 比较 图 谱 ( 参 阅 ) 显 示 这 种 重 排 频繁 发 生 ,因而 同 线 区 域 (syntenic regions, 参 阅 ) 被 限制 在 较 小 的 染色 体 片 眉 。 染 色 体 重 排 使 四 倍 体 化 的 证 据 变 得 模糊 ,同时 它 还 导致 大 规模 的 亚 基 因 组 重复 (subgenomic duplication ) 事 件 。 一 个 特别 的 例子 是 人 类 染色 体 1 的 两 臂 似 乎 是 平行 进化 的 ,每 一 臂 都 包含 谷 氨 酸 草 酰 乙 酸 转氨酶 ,凝血 因子 ,两 类 tRNA, 及 铁 蛋 白 重 链 。 这 表明 染色 体 1, 人 类 最 大 的 染色 体 , 可 能 由 古代 的 包含 两 个 较 小 的 染色 体 的 罗 伯 进 易 位 (参阅 ) 事件 所 产生 。 这 序列 趋 异 与 均 化 ”如 上 面 所 讨论 的 ,基因 重复 往往 接着 发 生 序列 趋 异 ,可 能 导致 新 功能 的 获得 或 者 其 中 一 个 拷贝 功能 丧失 。 如 果 重 复 的 基因 确实 进化 产生 了 新 的 功能 ,它们 在 较 晚 的 物种 形成 事件 中 会 倾向 于 保守 ,导致 定向 进化 同 源 基因 上 比 平行 进化 同 源 基 因 的 保 守 性 高 很 多 。 在 很 多 分 散 的 多 基因 家 族 中 都 观察 到 这 种 情况 ,例如 烯 醇化 酶 等 同 工 酶 家 族 中 ,哺乳 类 的 定向 进化 同 源 基因 较 之 每 一 物种 的 平行 进化 同 源 基因 保守 性 高 很 多 。 然而 ,在 串联 排列 的 基因 家 族 中 , 非 等 位 重组 事件 如 不 对 称 交 换 、\ 不 均等 姐妹 染色 单 体 交 换 以 及 基因 转变 等 的 高 频 发 生 导 致 了 序列 趋同 (sequence homogenization )。 在 这 种 情况 下 ,平行 进化 同 源 基因 较 之 直 向 进化 同 源 基 因 更 为 相近 ,因为 独立 发 生 的 突变 在 各 个 物种 中 可 能 被 固定 。 这 种 现象 被 定义 为 协同 进化 (concerted evolution ) ,在 串联 成 复 的 基 因 中 普遍 发 生 ,如 组 蛋白 基因 ,但 并 非 所 有 基因 簇 都 会 出 现 。 例 如 , 珠 蛋 白 基 因 复 ,表现 出 分 散 基因 典型 的 进化 特征 ( 即 直 向 进化 同 源 基 因 比 平行 进化 同 源 基因 保守 性 更 高 ) ,这 可 能 是 因为 这 些 基 因 在 发 育 中 具有 不 同 的 作用 因而 顺序 均 化 可 能 是 有 害 的 。rRNA 基因 (参阅 ) 提 供 了 在 分 散 的 重复 顺序 中 协同 进化 发 生 的 特例 (在 这 个 例子 中 ,每 一 个 分 散 的 重 复 顺 序 由 一 系列 串联 排列 的 rRNA 基因 组 成 )。 这 反映 了 rDNA 复 在 核 仁 中 的 紧密 缔 合 ， 允许 频繁 的 反 式 非 同 源 重组 事件 发 生 以 维持 基因 的 均一 性 (参见 卫星 缔 合 )。 分 散 基 因 之 间 的 反 式 相互 作用 是 很 稀少 的 事件 (参见 同 源 依赖 沉默 、 共 抑制 \ 反 式 感应 )。 蛋白 质 嵌 合体 : 基 序 ,组 件 和 结构 域 ”经 典 的 基因 家 族 在 它们 的 全 长 顺序 中 表现 出 同 源 性 ,它们 的 进化 可 以 用 简单 的 复制 与 趋 异 来 讨论 。 然 而 ,基因 家 族 的 关系 也 可 能 只 涉及 出 现在 两 个 蛋白 质 中 的 特定 的 保守 区 域 ,而 蛋白 质 的 其 他 部 分 完全 不 同 。 在 一 个 基因 或 蛋 白质 中 任何 保守 顺序 单元 可 被 称 为 盒 (box) 或 基 序 ) (motif ,又 译 “ 模 体 ”) 一 一 基 序 可 能 是 短 的 顺序 元 件 如 DEAD 盒 RNA 螺旋 酶 基 序 ,到 较 大 的 功能 单位 如 锌 指 ,后 者 被 称 为 组 件 可 能 更 合适 。 组 件 (module) 指 表现 出 特异 的 功能 的 蛋白 质 连续 片段 。 组 件 一 般 由 几 个 基 序 组 成 ,虽然 锌 指 是 个 例外 。 组 件 与 蛋白 质 结 构 域 的 不 同 在 于 后 者 是 三 级 结构 的 单元 而 不 一 定 由 一 级 顺序 连续 的 元 件 组 成 。 定 义 的 这 一 差异 的 重要 性 在 于 通过 从 一 个 基因 中 移 动 连续 的 DNA 片段 到 另 一 个 基因 中 ,可 以 在 蛋 白 质 中 捅 入 或 删除 组 件 ; 而 这 不 是 对 所 有 结构 域 都 是 可 能 的 。 不 幸 的 是 ,在 使 用 中 基 序 、 组 件 与 结构 域 这 些 术语 往往 外 延 模糊 ,并 且 常 被 混用 。 部 分 同 源 的 基因 或 蛋白 质 ( 即 在 特定 的 保守 片段 同 源 ) 可 能 由 于 对 某 一 特定 组 件 的 强 烈 选 择 而 蛋白 质 的 其 他 部 分 可 以 自由 地 突变 或 趋 异 而 发 生 。 在 另外 的 例子 中 ,发现 同样 的 基 序 与 组 件 出 现在 来 自明 显 不 同 谱系 的 蛋白 质 中 。 通 过 一 系列 基因 重 排 过 程 ,组 件 可 能 以 新 的 方式 混合 产生 新 的 若 合 蛋白 质 (chimeric protein)。 这 些 使 分 子 分 类 学 复杂 化 因 为 蛋白 质 可 能 同时 包含 代表 几 个 不 同 家 族 的 组 件 ,往往 不 可 能 确定 每 一 组 件 的 来 源 。 组 件 结构 的 进化 ”单个 蛋白 质 的 重复 组 件 与 不 同 蛋白 质 中 相关 组 件 的 进化 包含 与 整个 基因 重复 (串联 或 分 散 ) 相 同 的 机 制 ,但 以 亚 基 因 尺度 发 生 。 在 真 核 生 物 中 组 件 的 进化 是 丰富 的 ,因为 内 含 子 的 出 现 使 编码 DNA 的 片段 可 以 在 不 需要 精确 的 重组 连接 的 情况 下 1) 基 序 这 个 术语 是 用 来 以 不 同 的 角度 描述 蛋白 质 中 的 超 二 级 结构 的 单位 ,如 含 两 个 或 更 多 二 级 结构 元 件 的 构 型 。 一 个 保守 序列 的 基 序 可 能 和 结构 基 序 是 一 致 的 ,但 并 不 一 定 如 此 ,注意 盒 (box) 这 个 术语 不 仅 是 描述 基因 和 和 蛋白 中 的 基 序 ,而 且 也 描述 非 编码 DNA 中 的 基 序 ( 如 TATA 颌 )。 5 发 生 重 组 。 基因 内 的 重复 组 件 可 能 是 由 于 外 显 子 重 复 (exon duplication， 或 外 显 子 再 现 ,exon repetition) 即 单个 外 显 子 经 历 串联 重复 。 这 有 两 个 直接 的 进化 益处 :中 对 结构 蛋白 质 来 说 ,外 显 子 重复 可 以 延伸 一 特异 的 结构 域 (例如 胶原 蛋白 中 的 三 螺旋 结构 域 , 为 多 个 同样 的 外 显 子 编码 );@ 对 其 他 蛋白 质 ,外 显 子 重复 提高 了 特异 功能 结构 域 的 剂量 (剂量 重复 ， dosage repetition) ,这 样 可 能 提高 了 和 蛋白质 的 活力 ,或 者 在 特别 的 例子 中 ,使 翻译 后 前 切 能 产生 多 个 功能 单位 (如 速 激 肽 和 泛 素 基因 )。 如 同 整个 基因 的 重复 和 趋 异 ,外 显 子 重复 往 往 接着 发 生 外 显 子 趋 异 (exon divergence) ,产生 具有 不 同 的 功能 而 结构 保守 的 组 件 。 重 组 会 引起 外 显 子 缺失 (exon deletion) 和 外 显 子 重复 ,使 蛋白 质 中 特定 的 组 件 被 移 去 。 外 显 子 的 分 散 重复 可 能 在 已 存在 的 基因 的 内 含 子 中 引入 单个 外 显 子 。 如 果 这 个 外 显 子 对 应 于 一 蛋白 质 组 件 ,接受 此 外 显 子 的 蛋白 质 可 能 会 被 授予 新 的 功能 。 非 等 位 基因 之 间 的 重组 会 导致 这 类 事件 发 生 , 可 能 在 非 等 位 内 含 子 中 包含 短 的 重复 元 件 或 转 座 子 ( 参 阅 )。 然 而 除非 出 现 稀少 的 双 交 换 事件 ,这 更 倾向 于 引起 基因 融合 而 非 单 个 基因 整合 。 外 显 子 插 人 的 一 更 可 能 的 解释 是 转 座 因子 活性 ,例如 不 正常 切除 (两 侧 的 部 分 寄主 DNA 代 替 部 分 的 转 座 因 子 被 转 座 ) ,或 由 于 协同 转 座 ( 两 个 因子 协同 作用 使 其 间 的 DNA 片段 转 座 )( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 ) 。 混 合 已 存在 的 组 件 产生 藤 合 蛋白 质 被 称 为 外 显 子 移 动 (exon shuffling)。 它 提供 了 从 组 件 产生 新 的 蛋白 的 快速 途径 。 藤 合 蛋白 进化 的 进一步 的 形式 为 全 基因 融合 (whole gene fusion)。 例 如 真 核 的 多 醇 蛋白 质 (multienzyme protein) 在 原核 中 的 定向 进化 同 源 蛋 白 就 是 由 不 同 的 基因 编码 。 例 如 , 兰 椎 动物 中 的 一 种 多 酶 蛋白 具有 三 种 核 苷 酸 生 物 合成 活性 : 甘 氨 酰 氨 核 苷 酸 合成 酶 (GARS) ,氨基 咪唑 核 苷 酸 合成 酶 (AIRS) 和 核 苷 酸 转 甲 酰 酶 (GART)。 在 销 椎 动物 中 这 些 活 性 分 别 由 单个 GART 基因 编码 的 蛋白 中 的 不 同 组 件 来 承担 。 在 细菌 中 ,三 个 酶 由 三 个 不 同 的 基因 来 编码 而 在 酵母 中 GARS 与 AIRS 由 一 个 酶 承担 而 GART 分 别 编码 。 在 果 蝇 中 情况 更 为 复杂 ,其 多 酶 蛋白 质 有 四 个 结构 域 因 为 AIRS 组 件 被 重复 。 最 初 曾 认为 这 种 全 基因 融合 事件 包括 一 个 基因 的 最 后 一 个 内 含 子 与 另 一 个 基因 的 第 一 个 内 含 子 之 间 的 重组 。 然 而 在 销 椎 动物 蛋白 的 分 隔 GARS 与 AIRS 组 件 的 外 显 子 中 聚 腺 苷 酸 位 点 的 发 现 。 暗 示 了 融合 可 能 发 生 在 基因 间 DNA ,接着 调节 元 件 与 前 切 信和 号 的 修饰 使 共 翻 译 与 加 工 成 为 可 能 。 所 有 形式 的 外 显 子 重 排 一 一 重复 ,移动 ,缺失 和 全 基因 融合 一 一 的 一 个 重要 方面 是 内 含 子 相 (intron phase)( 图 22.4)。 这 涉及 编码 区 域 如 何 被 中 断 因 此 只 应 用 于 编码 区 内 含 子 。 最 普遍 的 内 含 子 是 0 相 (phase 0) ,编码 序列 在 密码 子 之 间 被 打 断 ( 即 在 一 个 密码 子 的 第 三 个 碱 基 与 下 一 个 密码 子 的 第 一 个 碱 基 之 间 )。1 相 (phase 1) 与 2 相 (phase 2) 内 含 子 分 别 在 密码 子 的 第 一 与 第 二 位 或 者 第 二 与 第 三 位 之 间 打 断 。 单 个 内 含 子 的 相 没有 影 响 , 但 由 外 显 子 重 排 产 生 的 融合 内 含 子 (fusion intron) 的 相 在 新 基因 的 翻译 中 极为 重要 。 外 显 子 可 根据 两 侧 的 两 个 内 含 子 的 相 来 定义 ,起 始 与 结束 碱 基 的 相对 密码 子 边界 的 位 置 相同 的 外 显 子 被 称 为 同 相 外 显 子 (in-phase intron)。 这 些 外 显 子 可 经 历 无 限制 的 重复 并 参与 外 显 子 移动 事件 ,因为 它们 不 干扰 整体 的 读 框 。 反 之 , 异 相 外 显 子 (out-of-phase in- tron) 开 始 和 结束 于 密码 子 内 的 不 同位 置 ( 即 两 侧 内 含 子 具有 不 同 的 相 ) ,这 样 的 外 显 子 择 人 产生 移 码 。 即 使 同 相 外 显 子 如 通过 与 一 具有 不 同 相 的 内 含 子 融 合 插入 一 基因 也 会 引起 *。 278 。 A) 内 含 子 相 SET 下 下 1 ETC EAT TS 二 一 CT 和 2 人 JereEcARTGE 和 让 Leu Asp Cys Asn B) 外 显 子 相 周 相 00JEEE ACTDITICITATIAGA,CTC| ES ICRIITCTATNCACTEC 汪汪 TCRAGAECTGCT 人 一 ME IAAOTTTICTIARAGAECIGC Eee OUEE1IAGKRIIGIAEACAEGTGIET :E 一 一 一 C) 外 显 子 重 排 一 上 L 上 |- 上 | 一 内 源 基因 | 外 显 子 搬入 0 0 0 0 0 0 PS 带 有 匹配 读 框 的 同 相 插入 - 连续 翻译 0 0 1 1 0 0 人 人 LL 上 带 有 移 码 的 同 相 插入 -过 渡 移 码 , 可 能 平 截 外 显 子 滑动 0 0 0 /1 0 0 异 相 插 和 人 -永久 移 码 , 可 能 平 截 图 22.4 “内 含 子 相 与 外 显 子 重 排 的 后 果 。(a) 内 含 子 相 由 编码 区 间断 处 密码 子 位 置 来 定义 。(b) 外 显 子 相 由 两 侧 内 含 子 的 相 定 义 。 共 有 三 类 同 相 外 显 子 与 六 类 异 相 外 显 子 ( 显 示 了 两 个 例子 )。 (c) 具有 两 个 0,0 相 外 显 子 的 内 源 基 因 。 揪 人 一 0,0 相 外 显 子 后 导致 新 的 外 显 子 的 连续 翻译 。 插 人 一 1,1 相 的 外 显 子 导 致 一 瞬时 的 移 码 ,这 样 插 人 的 外 显 子 的 翻译 不 按 正 确 的 读 框 进行 。 这 往往 是 有 害 的 ,除非 这 个 外 显 子 很 小 。 插 和 人 一 异 相 的 外 显 子 引 起 不 正确 的 移 码 。 瞬 时 与 永久 的 移 码 都 可 由 小 的 插 和 人 或 缺少 来 纠正 ,或 通过 改变 外 显 子 与 内 含 子 边 界 的 剪接 位 点 突变 来 校正 (外 显 子 滑动 ) 。 内 在 的 瞬时 移 码 。 在 这 些 情 况 下 新 的 外 显 子 的 解读 是 不 可 预测 的 ,并 可 能 通过 出 现 偶然 的 终止 密码 子 引 起 基因 的 中 断 。 对 基因 功能 的 这 种 改变 可 以 被 导致 外 显 子 滑动 (exon sliding) 即 外 显 子 相对 于 两 侧 内 含 子 的 起 始 与 终止 位 置 的 改变 的 点 突变 所 校正 。 这 可 能 由 小 的 插入 与 缺失 或 影响 剪 切 位 点 位 置 的 突变 引起 。 外 显 子 滑 动 也 可 以 校正 异 相 外 显 子 参与 的 “滑动 事件 。 内 含 子 的 进化 起 源 ”在 较 高 等 的 真 核 生 物 中 ,大 部 分 基因 为 内 含 子 所 间断 ,而 在 细菌 与 很 多 低 等 真 核 生物 中 往往 缺少 内 含 子 (参见 基因 结构 )。 自 从 1977 年 内 含 子 被 发 现 , 对 其 起 源 与 功能 一 直 存在 着 争论 。 一 种 理论 是 剪接 体内 含 子 是 由 自我 剪接 内 含 子 获 得 反 式 剪 切 的 能 力 进化 而 来 (内 含 子 起 源 的 自在 DNA 模型 )。 核 内 含 子 与 第 二 类 目 剪 切 内 含 子 的 剪 切 机 理 相同 支持 这 种 模型 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 然 而 两 类 内 含 子 识别 的 剪 切 位 点 不 同 。 有 可 能 核 剪接 体内 含 子 与 第 二 类 内 含 子 由 同一 谱系 进化 而 来 。 其 他 模型 认为 核 内 含 子 是 分 别 进化 的 ,是 分 隔 古代 基因 的 基因 间 DNA 的 副 产 物 ,或 者 在 选择 性 剪接 的 进化 ' 279 ， 过 程 中 被 放弃 的 编码 片段 。 后 一 种 模型 较为 激进 ,因为 它 暗示 剪接 在 内 含 子 之 前 进化 ,在 不 存在 内 含 子 的 情况 下 某 些 现代 的 基因 可 经 历 可 变 的 外 显 子 剪接 支持 这 种 假设 。 另 一 争论 的 主题 是 内 含 子 存在 的 年 代 。 早 内 含 子 理论 (early intron theories) 认 为 内 含 子 在 最 早 的 基因 中 出 现 ,并 在 原核 谱系 被 选择 性 丢失 。 早 内 含 子 可 能 来 源 于 自我 前 切 内 含 子 ,或 进化 自分 隔 古 代 基 因 的 非 编码 DNA, 并 通过 反 向 剪接 (reverse splicing) 传 播 。 在 后 一 种 模型 中 ,剪接 的 进化 受 逐 渐 增 大 的 基因 大 小 所 驱动 。 早 内 含 子 理论 为 古代 基因 家 族 中 内 含 子 位 置 的 保守 性 所 支持 ,如 珠 蛋 白 基 因 家 族 。 外 显 子 与 蛋白 质 的 功能 性 组 件 ( 据 推测 为 原来 基因 留 下 的 痕迹 ) 之 间 的 对 应 关系 也 支持 这 种 理论 。 晚 内 含 子 理论 (late intron theories) 认 为 内 含 子 是 在 相对 较 近 的 阶段 插 人 基因 的 。 这 种 理论 为 随机 内 含 子 的 插入 所 支持 , 即 在 基因 家 族 中 插 人 的 内 含 子 既 不 是 保守 的 也 不 是 将 蛋白 质 分 隔 成 整齐 的 组 件 , 如 在 胶原 蛋白 基因 家 族 中 发 现 的 内 含 子 。 无 论 它们 的 起 源 是 什么 ,在 真 核 生物 的 辐射 期 间 内 含 子 快 速 增 生 扩 散 并 促进 组 件 进 化 (内 含 子 重复 与 移动 ) 和 不 同 的 剪接 ,此 可 作为 增加 真 核 基因 组 的 功能 丰 度 的 一 种 机 制 。 内 含 子 的 大 小 也 增加 了 ,因而 获得 状 椎 动物 基因 不 仅 富 含 内 含 子 ,而 且 内 含 子 物质 占 主 要 地 位 (参见 基因 结构 ;参考 河豚 基因 组 )。 蛋白 质 家 族 的 选择 性 扩展 ”对 基因 组 与 EST 计划 ( 见 基因 结构 与 作 图 ) 的 信息 的 分 析 可 以 证 明 特 定 蛋 白质 组 件 的 分 布 与 丰 度 。 从 全 基因 组 测序 或 很 多 进行 中 的 基因 组 测序 计 划 而 来 的 数据 显示 特定 的 蛋白 质 家族 非 常 成 功 , 但 这 种 成 功 往往 是 谱系 依赖 的 。 很 多 广 泛 存 在 的 蛋白 质 组 件 包 括 组 成 代谢 酶 与 蛋白 质 合成 装置 的 核心 组 分 的 组 件 表现 出 最 小 程 度 的 增生 扩散 。 反 之 ,其 他 的 组 件 ,如 锌 指 , 免 疫 球 蛋 白 组件 ,G 蛋白 偶 联 受 体 和 有 蛋白 酷 氨 酸 激 酶 , 却 不 成 比例 地 成 倍增 长 ,但 是 只 发 生 在 特定 类 别 的 生物 体 中 。 酵 母 中 最 大 的 蛋白 质 家 族 之 一 是 GAL4 转录 因子 家 族 ( 参 见 锌 双核 基因 给 ) ,但 它 似乎 只 出 现在 真菌 类 中 。 同样 ,免疫 球 蛋 白 组 件 只 在 动物 中 发 现 ,并 且 作 为 蛋白 质 的 串联 重复 组 件 特别 丰富 。 在 某 些 例子 中 ,在 不 同 界 中 具有 相关 功能 的 不 同 蛋白 质 家 族 的 扩散 暗示 了 一 种 随机 的 影响 。 例如 ,蛋白 质 激酶 在 所 有 的 生物 中 都 起 着 信号 分 子 的 作用 ,但 在 真 核 生物 中 丝 氢 酸 / 苏 氨 酸 激酶 与 酷 氨 酸 激酶 是 两 个 较 大 的 蛋白 质 家 族 ,而 在 细菌 中 它们 是 罕有 的 。 相 反 地 ,组 氨 酸 激酶 在 细菌 中 大 量 出 现 而 在 真 核 生 物 中 并 非 如 此 。 在 例外 的 例子 中 蛋白 质 家 族 的 扩展 可 能 反映 了 进化 中 的 功能 的 革新 :在 动物 中 EGF 与 免疫 球 蛋 白 组 件 的 扩散 可 能 反映 了 它 们 介 导 细胞 - 细胞 接触 的 能 力 , 这 对 发 育 中 复杂 的 细胞 相互 作用 有 益处 ( 见 第 6 章 发 育 ， 分 子 机 制 )。 22.5 蛋白 质 功 能 的 综合 分 析 蛋白 组 ”基因 组 指 细胞 内 全 部 完整 的 遗传 信息 ( 见 基 因 结构 与 作 图 ) ,是 细胞 (或 多 细胞 生物 ) 管 理 与 繁殖 所 要 求 的 综合 程序 的 储备 。 蛋 和 白 组 (proteome) 代 表 了 基因 组 编码 的 蛋 白质 的 全 部 集合 ,也 即 基因 组 的 综合 的 功能 谱 。 蛋 白 组 是 一 个 复杂 的 系统 ,虽然 它 只 代表 基因 组 的 一 部 分 ( 即 编码 序列 )。 这 是 由 于 存在 不 同 的 方式 使 用 同一 基因 以 产生 多 种 产物 ( 见 第 9 章 基因 表达 与 调节 )。 因 而 蛋白 组 包含 很 多 相互 覆盖 ,结构 相似 的 产物 。 蛋 白 组 与 周围 环境 相互 作用 产生 表 型 组 (phenome) , 即 生物 所 显示 的 所 有 特征 的 总 和 的 描绘 。 280 ， 功能 基因 组 学 ”近年 来 ,由 于 基因 组 作 图 与 测序 计划 以 及 与 之 一 致 的 了 解 cDNA 序列 的 工作 的 成 功 ( 见 基因 结构 与 作 图 ) ,序列 信息 的 数量 出 现 了 爆炸 性 增加 。 新 基因 序列 的 功能 可 通过 与 已 克隆 的 其 产物 功能 已 了 解 的 基因 比较 来 试探 性 地 假定 。 然 而 ,很 多 新 基 因 显示 与 以 前 了 解 的 家 族 没有 任何 关系 ,功能 从 头 分 析 往 往 是 通过 观察 表达 模式 ,突变 的 效果 ,与 其 他 细胞 元 件 的 相互 作用 在 个 体 基 础 上 进行 。 为 利用 来 自 测 序 计 划 的 大 量 数据 ,对 单个 基因 的 深入 功能 分 析 必 须 被 基因 组 范围 的 功能 分 析 方 法 (功能 基因 组 学 ,functional genomics) 所 取代 ,或 至 少 被 补充 。 这 包括 蛋白 组 中 表达 ,突变 与 相互 作用 的 系统 性 分 析 。 最 近 已 发 展 了 几 种 技术 对 基因 组 中 所 有 基因 的 表达 同时 进行 分 析 , 提供 细胞 类 别 特 异 的 基因 表达 图 谱 及 细胞 对 环境 的 反映 的 精确 描绘 。DNA 显 微 列 阵 (DNA microarrays) 与 喜 核 昔 酸 芯片 (oligonucleotide chips) 使 cDNA 或 寡 核 苷 酸 可 以 被 精确 地 排列 ,杂交 分 析 可 以 定性 与 定量 地 监测 RNA 的 表达 。 基 因 表 达 的 连续 分 析 (serial analysis of gene ex- pression，SAGE) 技 术 是 一 以 PCR 为 基础 的 方法 ,对 应 于 特定 RNA 分 子 的 短 顺序 标记 被 扩 增 和 克隆 ,提供 了 标记 物 的 一 线性 排列 以 辨别 表达 基因 。 这 些 技术 在 标记 细胞 反应 时 很 有 用 ,是 高 流量 原 位 杂交 等 方法 的 补充 ,可 提供 基因 表达 的 数据 库 ,并 帮助 建立 遗传 网 络 (genetics networks)( 见 下 文 )。 在 所 有 的 模式 生物 中 突变 被 广泛 应 用 来 确定 单个 基因 的 功能 。 在 遗传 学 上 了 解 得 最 清楚 的 生物 中 ,所 有 基因 的 系统 性 破坏 是 可 行 的 ,并 且 一 个 国际 性 的 实验 室 联 合体 已 在 全 部 测序 的 酿酒 酵母 中 开始 这 项 工程 ,用 包含 可 被 PCR 识别 的 寡 核 苷 酸 盒 的 寻 靶 载体 ( 参 阅 ) 来 分 别 破坏 6000 个 基因 中 的 每 一 个 。 基 因 导 向 在 酵母 中 非常 有 效 , 但 在 其 他 真 核 生 物 中 就 并 非 如 此 。 另 外 ,对 模式 肴 椎 动物 (如 小 鼠 ) 的 大 基因 组 ,系统 性 的 敲 除 工 程 要 求 巨 大 的 资源 投入 ,这 种 方法 不 太 可 能 在 较 近 的 将 来 被 应 用 。 然 而 ,有 可 能 产生 各 个 基因 被 破 坏 的 胚胎 干细胞 (参阅 ) 库 。 这 种 库 可 以 与 完整 的 基因 组 序列 一 起 应 用 于 提供 产生 缺失 任 何 特定 基因 的 小 鼠 的 资源 。 这 种 方法 避免 了 饲养 与 交配 大 量 突变 体 的 需要 (参见 基因 捕 获 )。 在 蛋白 水 平 ,正在 发 展 同 时 监测 细胞 内 所 有 有 蛋白 的 丰 度 与 修饰 状态 的 技术 。 一 种 方 法 是 基于 双向 (2-D) 电 泳 ( 文 框 22.2) , 另 一 个 方法 是 以 芯片 为 基础 的 ,但 以 抗体 代替 窦 核 苷 酸 ,对 蛋白 质 的 相互 作用 的 分 析 是 确定 蛋白 质 功 能 的 有 力 的 方法 。 很 多 不 同 的 技术 可 以 显示 和 蛋白质 -蛋白质 相互 作用 和 和 蛋 白质 和 核酸 之 间 的 相互 作用 ,但 噬菌体 展示 (人参 阅 ) 和 酵母 双 杂 交 系 统 ( 参 阅 ) 在 高 流量 研究 中 特别 有 用 ,一 种 将 酵母 中 所 有 蛋白 的 相互 作 用 系统 性 列 出 的 工作 正在 进行 之 中 。 用 生化 方法 研究 功能 性 的 相互 作用 的 问题 之 一 是 发 现 很 多 相互 作用 与 生理 是 不 相关 的 。 这 可 能 是 由 于 这 些 产物 并 非 是 同时 或 在 同一 细胞 类 型 中 表达 , 即 这 种 相互 作用 是 外 来 的 。 那 么 ,这些 方 法 的 综合 应 用 一 一 相互 作用 ,表达 模 式 和 突变 表 型 一 一 是 对 蛋白 功能 彻底 阐述 所 必须 的 。 “> 文 框 22.1 和 氨基酸 标准 氨基 栈 氨基 酸 (amino acid) 是 具有 了 EN-CHR-COOH 的 普遍 结构 的 两 性 (amphoteric) 分 子 (它们 可 以 作为 酸 或 碱 起 作用 )。 它 们 在 生物 体内 很 丰富 ,可 以 以 自由 的 二 极 离子 (两 性 离子 ) , 短 肽 (如 激素 ) 或 在 蛋白 质 中 出 现 。 每 一 个 氨基 酸 都 有 一 个 中 心 的 四 价 碳 原子 (Ca) , 它 具 有 四 个 配 位 基 团 ,其 中 的 三 个 ( 氢 基 ,羧基 和 和 氢 原 子 ) 是 不 变 的 ,第 四 个 基 团 被 称 为 残余 基 团 (residual group) 或 侧 链 (side chain) ,是 可 变 的 并 是 分 子 的 物理 与 化 学 性 质 的 决定 者 。 存 在 着 几 百 种 不 同类 型 的 氨基 酸 ,每 一 个 都 具有 不 同 的 侧 链 ,但 蛋白 质 是 由 遗传 密码 所 对 应 的 21 种 标准 氨基 酸 的 基本 集合 所 形 成 。 其 中 之 一 , 硒 代 胱 氨 酸 十 分 稀少 (参见 含 硒 蛋 白质 )。 氮 基 酸 可 根据 其 侧 链 的 物理 化 学 性 质 归 为 不 同类 别 :一 些 完全 由 碳 氢 基 团 组 成 ,是 疏水 的 ; 另 一 些 是 极 性 的 ,包含 酰 氨基 团 或 羟基 ,可 以 形 成 氢 键 ;其 他 的 包含 带电 荷 残 基 , 可 形成 盐 桥 。 下 图 中 显示 了 和 氢 基 酸 的 普遍 结构 ,及 21 种 标准 氢 基 酸 的 侧 链 并 根据 其 化 学 性 质 分 类 。 同 类 氮 基 酸 的 取代 往往 是 保守 的 (参阅 ) 而 类 间 的 氨基 酸 取 代 往 往 是 非 保 守 的 (参阅 )。 侧 链 中 的 第 一 个 碳 原子 是 C, 粗 横 线 代表 Cu 一 Cg 键 。 氧 基 酸 可 用 三 残 基 李 Fe 3 N\ 琉 水 侧 链 世 ] K 浊 下 的 人 人 二 丙 氨 酸 异 亮 氨 酸 亮 氨 酸 后 硫 氢 酸 苯 内 所 酸 妥 氨 酸 睛 氨 酸 A, Ala L De L, Leu 极 性 (不 带电 荷 ) 侧 链 人 Yi 人 ev ve 天 冬 酰 胺 半 陛 所 本 谷 氨 酰胺 硒 代 半 胱 氨 酸 毕 所 本 苏 所 酸 由 所 N, Asn C,Cys Q, Gin U, Sec S, Ser T, Thr WwW,Trp YTyr 带 正 电荷 侧 链 + = 一 wu， 负 NHa 带 人 和 和 丰 中 JE | [区 | 赖 氨 酸 ” 精 氢 酸 组 氨 酸 天 冬 氨 酸 谷 氨 酸 甘氨酸 K,Lys1) R, Arg H, His E, Glu G, Gly 1) 赖 氨 酸 单字 母 简称 为 K, 原 文 误 写 为 L。 一 一 译 者 注 2 282 字母 或 单字 母 简称 (three letter or one letter assignment) 来 表示 ,每 一 氨基酸 的 特殊 简称 在 图 中 也 显 示 了 。 对 有 两 种 可 能 的 残 基 也 有 三 种 说 明 方式 :Glx,Z 代表 谷 氨 酰 所 或 谷 氨 酸 ,Asx,B 代表 天 冬 栈 氨 或 天 冬 氨 酸 (这 两 对 氨基 酸 在 有 些 类 型 的 化 学 分 析 中 很 难 分 辨 )。Xaa 或 又 表示 某 一 残 基 的 性 质 还 不 了 解 ,或 者 在 一 共有 顺序 中 是 不 重要 的 。 所 有 和 氢 基 酸 ,除了 甘氨酸 ,由 于 四 价 Ca 碳 原 子 是 手 性 中 心 存在 立体 异 构 。 然 而 ,几乎 在 蛋白 质 中 出 现 的 所 有 氨基 酸 都 是 工 -型 异 构 体 ,反映 了 和 蛋白质 合 成 酶 的 特异 性 (这 种 特异 性 被 认为 是 在 一 “冷冻 进化 事件 "偶然 发 生 的 ,相反 ,生物 系统 中 很 多 糖 是 D 异 构 体 )。 且 氨 酸 被 归 类 为 标准 氨基 酸 之 一 ,但 是 由 于 它 包 含 一 个 二 级 氨基 , 它 实 际 上 是 一 种 亚 氨基酸 。 非 标准 氨基 酸 ”个 别 氨基 酸 可 能 会 经 受 共 翻 译 或 翻译 后 化 学 修饰 ,增加 和 蛋白质 键 形成 能 力 的 积 累 。 这 样 的 修饰 可 能 是 永久 的 也 可 能 是 可 逆 的 ,可 能 包含 小 的 改变 也 可 能 涉及 大 的 化 学 基 团 的 添 加 ( 见 正文 中 的 讨论 )。 重 要 的 是 ,所 有 这 些 修饰 都 发 生 在 标准 氨基 酸 插 人 到 多 肽 链 中 后 。 在 很 多 情况 下 ,也 存在 特殊 的 氨基 酸 被 用 作 插 人 的 底 物 。 甲 硫 氨 酸 和 丝氨酸 可 能 在 插 人 前 被 修饰 ,分 别 产生 六 - 甲 酰 甲 硫 氢 酸 和 硒 代 半 胱 氨 酸 。 在 这 些 例子 中 ,修饰 发 生 在 带电 荷 的 tRNA 上 ,使 之 和 常 见 的 插 人 标准 氨基 酸 的 耻 NA 不 同 (起 始 让 NA 代替 了 插 人 甲 硫 氢 酸 的 耻 NAMst ,而 RNASe 人 代替 了 插 和 人 丝氨酸 的 了 NAsS=) 。 甲 酰 化 的 甲 硫 氨 酸 与 非 甲 酰 化 的 甲 硫 氨 酸 在 功能 上 是 等 同 (封闭 甲 酰 化 反应 没有 效果 ) ,但 硒 代 胱 氨 酸 起 着 与 丝氨酸 完全 不 同 的 特殊 作用 ,因而 它 被 认为 是 一 种 独立 的 标准 氨基 酸 ,虽然 它 的 合成 是 非常 规 的 。 蛋 白质 中 插 人 非 标准 氨基 酸 的 另 一 个 例子 是 细菌 细胞 壁 的 肽 聚 糖 中 的 D -甘氨酸 残 基 。 肽 聚 糖 由 糖 基 化 的 四 D -甘氨酸 单位 由 五 - 工 -甘氨酸 桥 交 联 形成 。 这 是 一 种 特殊 的 交 联 ,可 为 青霉素 所 阻 断 。 文 框 22.2” 研 究 蛋白 质 结构 的 方法 研究 蛋白 质 大 体 性 质 的 方法 ”蛋白 质 可 通过 电泳 根据 其 分 子 量 或 带 有 的 电荷 进行 分 离 (参阅 )。 用 SDSPAGE( 有 变性 剂 十 二 烷 基 磺 酸 钠 存在 的 凝 胶 电泳 ) 可 以 分 离 不 同 大 小 的 蛋白 质 分 子 。SDS 带 有 较 大 的 负电 荷 , 并 与 蛋白 质 主 链 结合 。 与 蛋白 质 结 合 的 SDS 的 量 与 其 分 子 大 小 大 略 成 正比 ， 众多 的 SDS 所 带 的 大 量 负电 荷 使 蛋白 质 自身 所 带 的 电荷 变 得 可 忽略 。 这 样 通 过 胶 内 的 孔道 时 , 蛋 白质 仅仅 由 于 大 小 不 同 而 被 分 离 。 用 等 电 聚 焦 (isoelectric focusing) 可 以 分 离 带 有 不 同 电荷 的 蛋白 质 。 即 在 pH 梯度 中 蛋白 质 移动 到 它 的 等 电 点 (pH 平衡 点 ) 的 方法 。 在 2-D 电泳 (2-D elec- trophoresis) 中 这 两 种 方法 被 组 合 使 用 得 到 高 解析 度 的 蛋白 质 分 离 。 电 泳 方法 可 以 用 来 粗 分 ,鉴别 和 分 离 蛋白 质 , 并 使 用 标记 蛋白 来 确定 其 分 子 量 。 用 超 离 心 方法 可 以 更 精确 地 确定 分 子 量 (参见 沉降 系数 单位 )。 近 来 ,质谱 方法 也 可 用 于 分 子 量 的 精确 测定 ,这 种 方法 将 蛋白 质 溶 于 可 快速 蒸发 的 挥发 性 溶剂 中 喷射 到 质谱 仪 中 。 蛋白 质 分 析 中 抗体 的 应 用 抗体 是 对 识别 的 抗原 具有 高 特异 性 的 分 泌 的 和 免疫 球 蛋 白 ( 人 参阅)。 这 种 分 子 因而 可 以 用 来 监测 与 纯化 蛋白 。 这 样 的 抗体 是 多 克隆 (polyclonal) (由 不 同 的 也 淋巴 细胞 产生 ) 往 往 识 别 抗原 的 多 个 特征 或 抗原 决定 簇 (epitope)。 通 过 也 淋巴 细胞 与 骨髓 瘤 细胞 融合 产生 永生 的 淋巴 细胞 克隆 , 称 为 杂交 瘤 (hybridomas) 能 产生 单 克 隆 抗 体 (monoclonal antibodies) 。 杂 交 瘤 产生 一 种 类 型 的 抗体 并 且 是 永生 的 。 近 来 已 有 可 能 用 重组 DNA 技术 产生 抗体 。 重 组 抗体 可 用 来 监测 与 纯化 蛋白 以 外 ,还 具有 新 的 性 质 ,如 催化 活性 (抗体 酶 ,abzymes) 和 作为 基因 治疗 的 工具 [ 参 见 内 体 (intrabodies) ] 。 抗体 可 以 和 放射 性 ,荧光 或 酶 探 针 连 接 来 监测 电泳 后 固定 化 于 固体 支持 物 上 的 特定 蛋白 质 “2 [蛋白 质 印迹 (western blot)D ,免疫 印迹 (imnmunoblot) ] ,或 作为 筛 库 工 作 的 一 部 分 [免疫 筛选 (im- munoscreening) ,参见 表达 文库 ]。 同 样 的 原理 可 用 来 原 位 监测 蛋白 ,来 监测 蛋白 质 的 时 间 与 空间 分 布 ( 原 位 免疫 组 化 ) 。 通 过 免疫 共 沉 淀 或 亲 和 层 析 柱 ,抗体 可 用 来 纯化 和 蛋白质 。 用 标记 的 抗体 可 以 灵敏 地 测定 抗原 的 量 , 如 酶 联 免疫 吸附 测定 (ELISA)。 研究 多 肽 链 一 级 结构 的 方法 ”确定 多 肽 链 的 一 级 结构 最 快速 的 途径 不 是 通过 对 多 肽 链 的 直接 分 析 ,而 是 通过 对 相应 的 DNA 的 克隆 与 测序 。 然 而 ,这 并 非 总 是 可 行 的 ,cDNA 序列 仅仅 提供 了 新 生 多 肽 链 的 序列 ,而 功能 蛋白 可 能 经 过 剪 切 与 修饰 。 对 多 肽 链 序列 的 直接 分 析 可 以 利用 自动 埃 德 曼 降 解 (Edman degradation) ,末端 氨基 酸 被 标记 并 被 特异 地 切除 和 识别 。 这 个 过 程 已 被 自动 化 ,由 测序 仪 (sequenators) 完 成 ,每 次 测定 可 以 确定 多 肽 链 约 50 个 残 基 长 度 的 序列 。 较 大 的 和 蛋白质 可 以 首先 用 特异 蛋白 酶 或 二 肽 特异 的 化 学 物质 (如 hydroxlamine 特 异地 切 开 精 氨 酸 与 甘氨酸 键 ) 水 解 为 短 的 肽 段 进 行 测定 。 蛋 白质 微量 测序 (Protein microsequencing) 通 过 气相 自动 化 埃 德 曼 降解 接着 进行 高 效 液 相 色谱 进行 。 这 种 方法 可 以 对 皮 摩 尔 量 的 蛋白 质 直 接 测序 ,如 聚 丙烯 酰 氨 胶 洗 脱 的 条 带 , 从 而 提供 一 直接 的 途径 来 设计 简 并 守 聚 核 苷 酸 ,用 来 在 一 适宜 的 文库 (参阅 ) 分 离 相 应 的 cDNA。 研究 高 级 蛋白 质 结构 的 方法 现在 还 不 可 能 从 一 级 序列 数据 确定 其 高 级 结构 ,因此 一 系列 生物 物理 的 方法 被 用 来 直接 监测 蛋白 质 的 三 级 与 四 级 结构 。 圆 二 色 性 (circular dichroism,CD) 描 绘 了 不 对 称 分 子 的 用 左右 圆 偏振 光 吸 收 差 谱 表示 的 光学 活 性 。 在 160 到 240 nm 的 CD 光谱 可 以 快速 了 解 蛋 白质 的 二 级 结构 ,因为 螺旋 ,8B 折 友和 卷曲 产生 不 同 的 CD 谱 。 例 如 螺旋 产生 具有 190nm 左右 正 的 差 吸 收 峰 与 210nm 和 220nm 的 负 的 差 吸收 的 双 峰 特征 的 谱 图 。 又 射线 晶体 衍射 和 核磁 共振 光谱 技术 用 来 研究 蛋白 原子 结构 。X 射线 晶体 衍射 (X-ray crys- tallography) 使 用 精确 定向 的 蛋白 质 晶体 散射 X 射线 到 监测 器 上 。 射线 被 电子 散射 ,散射 效应 的 幅度 与 原子 中 电子 的 数目 成 正比 ,光波 会 互相 加 强 或 削弱 ,其 方式 依赖 于 蛋白 质 中 不 同 原子 的 空 间 排 列 。 最 终 得 到 的 影像 ,一 系列 具有 不 同 强度 的 点 或 反射 (reflection)， 可 以 通过 被 称 为 傅立叶 转换 (Fourier transform) 的 数学 函数 来 重建 蛋白 质 图 像 。 这 些 数据 被 用 来 确定 电子 密度 和 相位 来 产生 电子 密度 图 。 图 的 解析 依赖 于 在 傅立叶 合成 中 用 到 的 数据 的 量 , 这 也 决定 了 最 终 得 到 的 结构 的 解析 度 。X 射线 晶体 衍射 得 到 的 最 大 的 解析 度 大 约 为 0.1 一 0.2nm。 中 子 散 射 (neutron scattering) 可 以 用 来 提高 又 射线 晶体 衍射 图 像 因 为 中 子 由 较 小 的 原子 包括 氢 产 生 强烈 的 衍射 。 使 用 X 射线 或 中 子 的 纤维 衍射 (Fiber diffraction) 可 用 来 分 析 较 长 的 纤维 状 分 子 如 核 苷 酸 和 纤维 状 蛋白 质 ( 例 胶原 蛋白 , 角 蛋 白 )。 与 晶体 衍射 分 析 能 产生 精确 的 三 维 图 像 不 同 ,纤维 衍射 图 式 代表 纤维 状 分 子 的 圆柱 横 截 面 的 两 维 平 均 (参见 双 螺 旋 )。 - ”核磁 共振 光谱 (nuclear magnetic resonance spectroscopy) 可 用 来 分 析 溶 液 中 蛋白 质 的 结构 。 其 解析 度 与 X 射 线 晶 体 衍 射 的 解析 度 相 同 ,但 这 种 技术 只 能 应 用 于 低 分 子 量 的 分 子 。NMR 的 基础 是 包括 氢 , 氮 和 磷 的 一 些 核 (以 及 碳 和 氧 的 稀有 的 同位 素 ) 具 有 内 源 的 磁性 ,在 外 加 的 磁场 中 可 以 通过 吸收 电磁 能 在 不 同 的 磁 自 旋 状 态 之 间 转 换 [同样 的 技术 ,电子 自 旋 共振 光谱 (electron spin reso- nance Spectroscopy) 应 用 于 顺 磁 性 物质 即 包含 不 配对 电子 的 物质 ]。 吸 收 可 以 以 每 一 种 核 特异 的 共 振 频 率 来 记录 。 另 外 共振 频率 受 周围 电子 密度 影响 ,在 不 同 的 化 学 环境 中 的 原子 发 生化 学 位 移 (chemical shift) 并 在 不 同 的 共振 频率 吸收 能 量 。 这 可 用 来 鉴别 不 同 的 化 学 基 团 ( 甲 基 ,芳香 基 等 )。 在 磁 脉 冲 后 核磁 共振 衰变 的 方式 也 能 提供 很 多 信息 ,因为 它 依赖 于 分 子 的 结构 与 空间 构象 。 核 欧 沃 豪 斯 效应 (nuclear Overhauser effect，NOE) 是 磁 能 量 在 空间 转移 的 结果 并 且 只 发 生 在 相互 作用 的 核 相距 小 于 0.5 nm 时 。 两 维 NOE 光谱 (NOE spectroscopy，NOESY) 可 辨别 距离 较 近 的 原子 产生 的 对 称 峰 ,位 于 传统 的 一 维 谱 的 对 角 线 处 。 自 旋 - 自 旋 偶 合 (spin-spin coupling) 是 磁 能 量 通过 化 学 键 或 邻 近 核 的 转移 。 这 也 可 以 通过 其 他 形式 的 二 维 NMR ,被 称 为 QOSY 或 TOCSY 来 解析 。 1) 和 蛋白质 印迹 是 在 上 世纪 70 年 代 未 80 年 代 初 以 Southern 印迹 为 基础 发 展 起 来 的 一 种 检测 蛋白 质 的 方法 , 故 又 称 为 “western( 西 方 ) 印 迹 , 也 称 为 免疫 印迹 。 这 种 方法 和 Southern 印迹 的 不 同 之 处 是 :四 检测 的 对 象 是 蛋白 质 而 不 是 核酸 ;@ 用 电场 的 电位 差 将 蛋白 质 转移 到 团体 膜 上 ,而 不 是 用 毛细 管 吸 印 的 方法 。 一 一 译 者 注 “8 文 框 22.3 ”蛋白质 定位 ,分 选 和 加 工 胞 内 蛋白 质 运 输 蛋白质 导向 (protein targeting) 指 指导 蛋白 质 达 到 胞 内 特定 目的 地 的 过 程 (人参 考 基因 导向 )。 在 细菌 中 ,目的 地 的 选择 包括 胞 浆 中 ,内 外 细胞 膜 ,或 其 间 的 周 质 空间 。 有 蛋白 质 也 可 能 被 分 泌 到 胞 外 。 在 真 核 生 物 中 ,蛋白 质 还 可 能 被 导向 到 几 种 胞 内 细胞 器 的 任何 一 种 ,以 及 导 向 到 核 内 。 因 为 所 有 的 细菌 蛋白 质 和 大 部 分 真 核 蛋白 质 是 在 胞 浆 中 合成 的 ,被 导向 的 蛋白 质 必须 携带 有 可 识别 的 顺序 或 结构 使 其 能 被 转运 到 正确 的 细胞 空间 。 这 个 过 程 被 称 为 蛋白 质 分 选 (pro- tein sorting) 或 蛋白 质 运输 (protein trafficking ) 。 分 选 信息 的 本 质 很 多 定位 于 特定 细胞 空间 的 蛋白 质 包含 特异 的 氨基 酸 顺 序 或 具有 特定 化 学 性 质 的 残 基 的 排列 以 和 细胞 的 分 选 机 器 相互 作用 。 这 些 保 守 残 基 被 称 为 信号 序列 (signal se- quences) 。 它 们 往往 出 现在 多 肽 链 的 末端 (信号 肽 ,signal peptides) 并 且 在 蛋白 质 到 达 其 目的 地 后 可 能 被 切除 。 具 有 后 来 被 去 除 的 信号 顺序 的 蛋白 质 被 称 为 前 蛋白 (preprotein) ,信和 号 肽 被 称 为 前 序列 (presequence) 。 这 不 同 于 为 蛋白 水 解 所 活化 的 被 称 为 蛋白 原 (proprotein) 的 蛋白 ( 表 22.2)( 具 有 前 序列 并 可 被 蛋白 水 解 所 活化 的 蛋白 质 被 称 为 前 蛋白 原 (preproprotein) ,如 前 胰岛 素 原 )。 当 和 蛋白质 必须 穿越 细胞 内 几 个 相互 作用 的 表面 时 ,一 系列 信和 号 顺序 可 能 按 一 定 次 序 排列 并 可 能 顺 次 发 生 作 用 。N 端 信号 肽 是 新 生 肽 链 从 核糖 体 上 产生 时 出 现 的 第 一 个 结构 ,使 得 分 选 过 程 可 能 和 翻译 同时 进行 。C 端 和 中 间 的 信号 肽 如 定位 核 过 氧化 物 酶 体 的 信号 肽 以 及 在 翻译 后 起 作用 的 信号 块 在 翻 译 后 起 作用 。 所 谓 的 信号 块 (signal patch) 指 通过 折 肥 在 蛋白 质 表 面 形成 的 信号 区 域 ,在 一 级 序列 上 并 不 一 定 连续 。 有 蛋白 质 在 越 膜 之 前 必须 保持 去 折 肢 状态 或 者 必须 先 被 去 折 琶 ,这 个 过 程 由 分 子 伴侣 ( 见 正文 ) 协 助 进行 。 信 和 号 肽 一 般 直接 与 靶 蛋 白 相 互 作用 而 信和 号 块 往往 是 间接 发 生 作 用 ,如 糖 基 化 位 点 这 种 糖 残 基 为 细胞 分 选 机 制 所 识别 。 分 选 信号 可 通过 与 其 他 蛋白 的 相互 作用 来 遮蔽 ,这 可 被 用 作 一 种 调节 机 制 ,例如 转录 因子 NF-kB 具有 一 核 转运 信号 ,此 信和 号 可 以 被 抑制 因子 LkB 所 人 遮蔽。 这样 调 节 系 统 通 过 摧毁 芭 可 以 使 NE:B 进 入 核 内 并 活化 其 控制 的 基因 ( 见 第 28 章 信和 号 传导 ， 第 29 章 转录 )。 分 泌 途 径 ”在 真 核 生物 中 ,分泌 蛋白 首先 被 定位 到 内 质 网 (ER) 中 。 这 要 求 N 端 疏 水 信号 肽 , 它 可 被 称 为 信号 识别 颗粒 (signal recognition particle,SRP) 的 胞 浆 核糖 核 蛋白 复合 物 所 识别 。SRP 包 含 六 个 蛋白 质 和 一 个 小 的 与 Alu 元 件 ( 参 见 此 条 ) 同 源 的 胞 浆 RNA(7S RNA)。 当 信号 肽 从 核糖 体 上 合成 后 ,SRP 就 与 信号 肽 结合 并 使 蛋白 质 合 成 停止 直到 复合 物 到 达 ER。 在 这 儿 ,SRP 与 其 受 体 , 位 于 内 质 网 膜 上 的 二 聚 体 停 靠 蛋白 (docking protein) 结 合 (SRP 具有 三 个 功能 结构 域 分 别 起 着 与 信号 肽 结合 ,与 受 体 结合 ,和 阻 断 肽 延长 的 功能 )。 核 糖 体 与 其 自身 的 受 体 一 称 为 Sec61 的 三 聚 体 跨 膜 蛋白 相 缔 合 , 蛋白 合成 继续 进行 。 通 过 Sec61 复合 物 (一 些 蛋 白质 还 要 求 另 一 个 元 件 ， TRAM) ,多 肽 链 进 入 ER 腔 , 这 个 过 程 被 称 为 载体 释放 (vectorial discharge) 或 协同 翻译 转运 (co- translational import) 。 在 合成 后 ,GTP 交换 使 核糖 体 从 SRP 上 释放 出 来 ,SRP 也 从 其 受 体 上 释放 返 回 到 胞 浆 中 。 当 多 肽 链 进 入 ER 腔 时 ,信号 肽 被 十 聚 体 信 号 肽 酶 切除 。 在 三 肽 基 序 Asn-Xaa-Ser/Thr[ 被 称 为 顺序 子 (sequon) ] 有 精 氨 酸 残 基 出 现 的 蛋白 被 赛 糖 单位 N 端 糖 基 化 。 并 非 所 有 的 顺序 子 都 被 糖 基 化 ,因而 其 他 残 基 也 可 能 与 糖 基 化 位 点 的 决定 有 关 , 或 者 蛋白 质 的 结构 自身 可 能 会 抑制 特定 肽 段 的 糖 基 化 。 跨 膜 蛋 白 具 有 内 部 的 朴 水 转运 终止 顺序 (stop transfer sequence) ,使 蛋白 被 锚 定 在 内 质 网 腊 上 。 其 余 的 蛋白 质 被 包装 成 颗粒 运输 到 高 尔 基体 中 ,而 那些 应 该 留 在 ER 腔 内 的 蛋白 质 被 识别 并 选 4: 285 ， 择 性 地 回 到 ER 中 。 这 种 蛋白 质 往往 具有 一 个 有 共同 的 KDEL 的 序列 保留 信号 (retention signal) 。 在 高 尔 基 体 中 ,N 连接 的 多 糖 链 可 以 被 进一步 修饰 并 发 生丝 氨 酸 , 苏 氨 酸 和 产 赖 氨 酸 的 重新 O - 糖 基 化 。 在 某 些 例子 中 , 糖 基 化 是 蛋白 质 正 确 折 县 与 功能 所 必须 的 (参见 表达 克隆 ) ,而 在 另 一 些 蛋白 质 中 糖 基 化 位 点 自身 起 着 定位 信号 的 作用 。 具 有 能 被 6 -磷酸 甘露 糖 修饰 的 信号 块 的 蛋白 质 被 定位 到 溶 酶 体 。 另 一 些 蛋白 质 被 分 泌 ,虽然 其 中 一 些 具有 使 它们 在 分 泌 途 径 中 停留 在 某 一 细 胞 器 的 膜 上 ( 见 下 文 ) 的 序列 。 在 细菌 中 ,将 被 分 泌 的 蛋白 质 以 具有 N 端 信号 的 前 蛋白 的 形式 合成 ,这 种 N 端 信和 号 有 时 被 称 为 导 肽 (leader peptides) 。 细 菌 的 信号 顺序 较 短 ( 委 25 残 基 ) 包 括 一 疏水 中 心 核 , 可 以 采取 螺旋 结 构 ,两 侧 区 域 具有 几 个 带电 荷 的 残 基 。 一 些 分子 伴 侣 蛋白 可 以 在 前 导 肽 从 核糖 体 中 出 现时 与 新 生 肽 链 结合 ,以 防止 错 折 释 。 其 中 之 一 ,Sec B 在 蛋白 质 转运 中 起 着 主要 作用 ,因为 它 与 分 泌 系 统 的 另 一 成 分 Sec A 结 合 ,Sec A 是 与 易 位 机 制 有 关 的 分 子 伴 侣 。Sec A 通 过 以 ATP 水 解 依 赖 方式 将 底 物 蛋 白 送 到 易 位 装置 (包括 跨 膜 蛋白 See E 和 Sec Y) 中 来 介 导 易 位 。 这 时 导 肽 被 称 为 导 肽 酶 (lead- er peptidase) 切 除 。 在 成 熟 蛋 白质 中 ,在 剪 切 位 点 邻近 (- 1 位置 ) 和 下 游 再 隔 一 个 残 基 的 位 点 (-3 位 置 ) 往 往 会 是 具有 小 的 残余 基 团 的 氨基 酸 。 这 个 现象 被 称 为 -1 与 -3 规则 (-1and -3rule)。 定位 蛋白 质 到 膜 上 在 真 核 生 物 中 ,进入 分 刻 途 径 的 很 多 蛋白 质 是 将 被 滞留 在 特定 的 膜 上 的 。 转运 终止 顺序 使 蛋白 质 可 被 保留 到 ER 膜 上 ,通过 组 合 不 同 的 类 似 顺 序 ( 膜 锚 定 信号 ,membrane anchor signals) 与 特定 的 保留 信号 ,蛋白 质 也 可 被 定位 到 高 尔 基体 与 溶 酶 体 膜 上 。 任 何 缺 少 保留 信 号 的 膜 结合 蛋白 将 会 到 达 细 胞 膜 ,但 这 并 不 是 蛋白 质 到 达 这 个 目的 地 的 唯一 途径 。 在 高 尔 基体 中 的 带 有 GPI 顺序 的 蛋白 将 与 GPI( 糖 基础 脂 酰 肌 醇 ) 销 连接, 它 将 使 蛋白 质 到 达 内 膜 表 面 。 被 脂肪 酰 化 (如 豆蔻 酰 化 ) 的 胞 浆 蛋 白质 也 被 定位 到 细胞 膜 上 。 转运 到 核 和 胞 内 细胞 器 的 蛋白 质 ”小 的 蛋白 质 可 通过 核 孔 持续 扩散 ,但 定位 到 核 的 较 大 的 蛋白 (>50kDa) 就 必须 被 转运 ,转运 过 程 包括 核定 位 顺序 (nuclear localization sequence,NLS) 的 识别 。 NLSs 往往 较 短 , 富 含有 睛 氨 酸 与 碱 性 残 基 , 而 缺少 朴 水 残 基 。 一 些 NLSs 是 连续 的 ,例如 SV40T 抗 原 NLS(ProPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys) ,而 另 一 些 是 由 两 部 分 组 成 的 ,由 一 段 极 性 残 基 将 两 段 富 含 且 氨 酸 / 碱 性 区 域 分 开 ( 例 如 p53 NLS 为 Lys-Arg-Ala-Leu-Pro-Asn-Asn-Thr-Ser-Ser-Ser-Pro-Gln- Pro-Lys-Lys-Lys) 。 二 聚 体 胞 浆 蛋 白质 ,输入 蛋白 (importin) ,是 核 输 入 的 附着 阶段 所 必需 的 。 输 入 蛋白 与 底 物 的 NLS 顺序 结合 ,输入 蛋白 B 识 别 和 结合 核 孔 成 分 , 核 孔 蛋白 (necleoporin)。 一 种 被 称 为 Ran 的 GTP 酶 引发 输入 蛋白 解 聚 。 在 核 转运 过 程 中 可 能 包括 一 系列 这 样 的 反应 使 附着 在 核 孔 蛋 白 上 的 底 物 进入 核 孔 。 即将 被 转运 到 线粒体 或 叶绿体 的 蛋白 可 以 被 定位 到 不 同 的 空间 内 ,内 膜 的 外 边 , 膜 间 空 间 , 内 部 介质 /气孔 。 在 叶绿体 中 可 定位 到 类 厢 体 ! 膜 或 腔 。 转 运 进 细胞 器 的 蛋白 质 常 常 包 含 一 N 端 转 运 顺 序 (transit sequence) 。 这 是 一 15 一 70 残 基 顺 序 , 富 含 极 性 与 碱 性 残 基 ( 叶 绿 体 转运 顺序 比 线 粒 体 转运 顺序 极 性 残 基 含 量 要 高 ) ,被 细胞 器 表面 的 受 体 所 识别 。 在 线粒体 的 介质 或 叶绿体 的 气孔 处 ,转运 顺序 被 剪 切 ,使 蛋白 质 定位 在 这 些 地 方 。 蛋 白质 在 内 膜 和 外 膜 处 与 转运 机 器 相互 作用 , 同 时 穿 过 内 膜 和 外 膜 被 转运 。 定 位 到 其 他 的 空间 要 求 进一步 的 信号 。 细 胞 器 定位 信号 以 顺序 方式 排列 ,所 以 N 端 转运 顺序 被 切除 可 能 活化 不 同 的 信和 号。 切除 转运 顺序 的 多 肽 酶 位 于 介质 /气孔 处 ， 所 以 即使 细胞 器 蛋白 的 最 终 目的 地 不 在 此 处 ,它们 也 必须 暂时 地 进入 介质 或 气孔 。 插 人 膜 的 蛋白 1) 原文 误 写 为 “thykaloid"” ,应 为 “thylaloid` 类 厢 体 ) 。 一 一 译 者 注 1 Eee ee 质 往往 包含 疏水 的 终止 转运 顺序 。 蛋白 质 降解 途径 蛋白 质 的 稳定 性 相差 很 大 ,其 半 寿 期 从 几 分钟 ( 如 很 多 调节 和 蛋白质) 到 几 个 星 期 或 更 长 (例如 很 多 结构 和 储存 蛋白 :胶原 蛋白 ,血红 蛋白 )。 在 细胞 中 存在 着 几 种 不 同 的 降解 途 径 , 其 活性 根据 营养 状态 和 可 能 涉及 蛋白 质 的 修饰 的 其 他 细胞 的 信号 而 不 同 。 很 多 不 稳定 特征 的 蛋白 质 都 包含 PEST 位 点 (PEST sites, 即 富 含 且 氨 酸 , 谷 所 酸 ,丝氨酸 和 苏 氨 酸 )。 另 一 些 蛋白 质 可 能 通过 翻译 后 修饰 被 定位 到 降解 途径 ,或 者 包括 特定 残 基 的 化 学 修饰 (如 磷酸 化 ) 或 与 小 的 蛋白 泛 素 (ubiquitin) 连 接 。 和 蛋白 质 的 N 端 残 基 及 其 修饰 状态 可 能 通过 作为 泛 素 形成 潜在 的 靶 在 蛋白 质 代 谢 的 调节 中 起 重要 的 作用 。 这 被 称 为 N 端 法 则 (N-end rule)。 溶菌 途径 是 泛 素 依赖 途径 ,往往 包括 相对 稳定 的 蛋白 质 。 蛋 白质 通过 颗粒 出 芽 而 被 内 化 ,这 个 过 程 被 称 为 微 自 体 吞噬 (microautophagy)。 在 饥饿 状态 , 某 些 胞 浆 蛋 白 可 能 可 以 通过 信和 号 肽 的 识 别 直 接 进 入 洲 酶 体 。 泛 素 依赖 降解 ,包括 小 蛋白 泛 素 的 活化 是 胞 质 蛋 白质 的 主要 降解 途径 , 泛 素 可 以 由 载体 转运 到 其 底 物 ,并 在 一 个 称 为 蛋白 酶 体 (proteasome) 的 大 的 多 蛋白 复合 物 中 将 底 物 定 为 降解 的 靶 。 泛 素 通过 与 E1 蛋白 质 连 接 而 被 活化 ,然后 被 转移 到 蛋白 质 E2 中 ,接着 转移 到 其 靶 蛋 白 上 。 驾 蛋白 由 与 蛋白 质 E3 结合 来 辨别 ( 泛 素 连接 酶 ,ubiquitin ligase) 。 底 物 的 特异 性 由 E2 和 E3 共同 控制 , 存 在 几 种 同 工 形式 可 能 定位 不 同类 型 的 蛋白 质 。E2 转运 泛 素 到 靶 蛋 白 的 亮 氢 酸 的 s- 氨 基 上 。 然 后 泛 素 自身 也 可 成 为 泛 素 化 的 对 象 ,连接 位 点 为 Lys46, 产 生 多 泛 素 化 的 底 物 ,是 蛋白 酶 体 降 解 的 信 号 ( 徐 兴 译 ) 7 2 第 23 章 蛋白质 合 成 基本 概念 和 定义 。 蛋 白质 合成 是 基因 表达 中 信使 RNA(mRNA) 所 携带 的 遗传 信息 被 翻译 为 多 肽 链 的 阶段 。 。 蛋白 质 合 成 装置 的 组 分 有 :mRNA, 包含 被 翻译 密码 的 模板 ,核糖 体 , 大 的 核糖 核 蛋白 颗粒 (是 蛋白 质 合 成 的 位 点 ) ,转运 RNA(CtRNA) ,种 类 较 多 的 衔接 分 子 (adaptor molecular) 携 带 氨基 酸 到 核糖 体 上 以 推进 翻译 过 程 ,以 及 与 核糖 体 暂时 缔 合 的 附属 因子 ,为 对 于 核糖 体 装配 与 解 离 及 翻译 延伸 时 的 活性 所 必需 。 。 与 其 他 的 多 聚 反应 类 似 , 蛋 白质 合成 具有 起 始 (initiation) ,延伸 (elongation) 与 终 止 (termination) 等 阶段 ,其 中 每 一 阶段 都 可 被 调节 和 蛋白质 合 成 的 机 制 在 真 核 生物 与 原核 生物 中 是 相同 的 ,只 在 组 分 的 性 质 与 它们 装配 的 次 序 上 有 微细 的 差异 。 但 在 蛋 白质 合成 发 生 的 前 后 却 有 较 大 的 差别 。 在 细菌 中 ,转录 与 蛋白 质 合成 在 胞 浆 中 同时 发 生 ( 使 不 同 基因 表达 水 平 之 间 的 交互 调节 可 能 发 生 ) 并 且 mRNA 可 能 为 多 顺 反 子 。 在 真 核 生 物 中 ,转录 被 限制 在 核 中 , mRNA 被 转运 到 胞 浆 中 进行 翻译 。 新 生 mRNA 在 转运 前 被 进一步 加 工 , 并 且 常 常 是 单 顺 反 子 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 。 在 合成 后 ,多 肽 链 经 历 进一步 的 加 工 过 程 以 具备 生物 活性 。 它 必须 正确 折叠, 这 个 过 程 往往 需要 分 子 伴 侣 (参阅 ) 的 帮助 。 它 可 能 被 剪 切 ,特定 的 残 基 可 能 被 化 学 修 饰 或 与 小 分 子 连 接 。 这 样 的 修饰 往往 与 蛋白 质 定位 到 细胞 内 的 特定 空间 或 分 泌 有 关 。 蛋 白质 的 完整 的 生物 活性 可 能 还 要 求 与 其 他 蛋白 质 或 与 非 多 肽 辅 因子 非 共 价 缔 合 。 对 这 些 过 程 的 讨论 , 见 第 22 章 蛋 白质 :结构 ,功能 与 进化 。 23.1 有 蛋白质 合成 的 组 分 信使 RNA ”信使 RNA(mRNA) 是 蛋 白 质 合 成 的 模板 。 它 具有 两 个 必需 特征 :开放 的 阅 读 框 (一 段 可 翻译 密码 序列 ) 和 一 个 核糖 体 结合 位 点 (ribosome binding site, 核 糖 体 小 亚 基 结合 核糖 体 的 其 他 部 分 装配 的 位 置 ) 。 在 这 些 位 点 的 组 织 上 ,原核 生物 与 真 核 生 物 有 重要 的 差别 ,这 也 关系 到 一 典型 的 mRNA 的 寿命 的 其 他 方面 。 这 些 差别 与 其 后 果 在 下 面 作 一 总 结 。 (1) 在 细菌 中 ,转录 与 翻译 在 相同 的 细胞 空间 同时 发 生 ,而 在 真 核 生 物 ,转录 被 限制 在 核 内 ,RNA 被 转运 到 胞 浆 中 进行 翻译 。 288 。 (2) 细菌 mRNA 具有 有 限 的 半 寿 期 (最 稳定 的 转录 产物 为 几 分 钟 )。 一 些 真 核 mRNASs 也 不 稳定 ,但 大 部 分 在 几 小 时 甚至 几 天 内 是 稳定 的 (例如 在 卵 中 )。 (3) 细菌 转录 产物 被 直接 用 于 翻译 ,而 真 核 转 录 产 物 在 翻译 前 被 进一步 加 工 和 修饰 。 加 工 反 应 包括 内 含 子 的 剪 切 和 3 端的 多 聚 腺 苷 酸化 ,两 者 都 可 能 调节 翻译 的 效率 ,或 者 直接 影响 或 者 通过 调节 mRNA 的 稳定 性 。 进 一 步 的 修饰 反应 是 $ 端 7- 甲 基 鸟 苷 酸 帽 结 构 的 合成 ,在 核糖 体 结合 中 起 直接 的 作用 。 一 些 转录 产物 还 可 被 编辑 (参见 RNA 编辑 )。 (4) 细菌 中 与 核糖 体 的 结合 依赖 于 mRNA 中 的 一 保守 基 序 , 它 与 核糖 体 16S rRNA 的 部 分 互补 。 结 合 可 发 生 在 此 顺序 出 现 的 任何 地 方 , 包 括 顺 序 中 间 ,因此 细菌 转录 产物 可 能 是 多 顺 反 子 的 。 真 核 生 物 中 核糖 体 通过 一 识别 被 修饰 的 $ 帽 结构 的 蛋白 质 而 锚 定 在 mRNA 上 ,这 样 结合 不 可 能 发 生 在 mRNA 的 中 间 , 所 以 真 核 mRNAs 几乎 都 是 单 顺 反 子 的 (然而 某 些 RNA 病毒 可 以 克服 这 种 限制 以 多 顺 反 子 形式 表达 它们 自身 基因 组 中 的 基 因 ; 参 见 内 部 核糖 体 进入 位 点 )。 典 型 的 细菌 与 真 核 mRNAs 的 结构 在 图 8.2 中 显示 ( 见 第 8 章 基 因 )。 这 些 差别 的 广泛 后 果 反 映 在 原核 生物 与 真 核 生物 使 用 的 调节 策略 的 不 同 。 细 菌 mRNASs 快速 地 被 转录 ,翻译 和 降解 ,并且 这 三 个 过 程 的 紧密 关系 使 得 基因 表达 的 不 同 水 平 之 间 的 大 量 交互 调节 的 发 生 ( 参 见 衰减 作用 , 反 向 调节 )。 反 之 ,在 真 核 生物 中 ,转录 和 与 翻译 过 程 之 间 有 明显 的 延迟 ,mRNA 首先 被 加 工 然后 从 核 中 转运 出 来 。 这 两 个 过 程 都 是 调节 的 潜在 作用 过 程 。 核糖 体 “和 蛋白质 合成 发 生 在 核糖 体 (ribosomes) 上 , 它 是 大 的 含量 丰富 的 核糖 核 蛋 白 复 合 物 。 它 们 在 胞 浆 中 以 游离 的 形式 存在 ,在 真 核 生 物 中 ,还 发 现 它 们 缔 合 在 粗 面 内 质 网 腊 上 。 核 糖 体 可 以 单独 产生 功能 ( 单 核糖 体 ,monosomes) ,但 是 更 常见 的 是 它们 成 篮 同 时 翻 译 同 一 mRNA( 多 核糖 体 ,polysomes) ,多 核糖 体 可 以 从 细胞 中 抽 提 而 且 常 常 被 用 来 纯化 mRNA( 参 见 poly(A) -RNA)。 所 有 的 核糖 体 由 两 种 不 同 大 小 的 亚 基 组 成 ,大 亚 基 与 小 亚 基 (large and small sub- unit) 。 每 一 亚 基 由 几 种 核糖 体 RNAs(ribosomal RNAs,rRNAs) 和 多 种 核糖 体 蛋白 质 (ri- bosomal proteins，r-proteins) 组 成 。 它 们 的 相对 大 小 常常 用 沉降 系数 单位 来 表示 (人文 框 23.1)。 在 大 肠 杆菌 中 ,70S 核糖 体 由 小 的 30S 亚 基 和 大 的 $0S 亚 基 组 成 。 小 亚 基 包 含 21 种 不 同 的 蛋白 质 ( 被 称 为 SI 一 S21) 和 16S rRNA。 大 亚 基 由 34 种 蛋白 质 ( 被 命名 为 L1 一 L34) 和 23S 及 SS rRNAs 组 成 。 有 些 蛋 白质 在 两 种 亚 基 中 是 相同 的 (如 L16 = SS20)。 真 核 核糖 体 较 大 (80S) 并 且 包 含 更 多 组 分 。 小 亚 基 (40S) 包 含 33 种 蛋白 质 和 18S rRNA， 而 大 亚 基 (60S) 包 含 50 种 蛋白 质 和 3 种 rRNA,28S,5.8S 和 SS。5$.8S rRNA 与 细菌 23S rRNA 的 5“ 部 分 同 源 并 且 与 等 同 的 真 核 28S rRNA 形成 互补 配对 。 古 核糖 体 类 似 于 细菌 核糖 体 , 但 有 些 包 含 与 真 核 相 同 的 特别 亚 基 。 核糖 体 的 空间 组 织 是 复杂 的 。rRNA 组 成 总 分 子 量 的 60% ~-65% ,对 结构 完整 与 功 能 都 是 必需 的 ,它们 通过 分 子 内 或 分 子 间 碱 基 配 对 采取 复杂 的 三 级 与 四 级 构象 。 利 用 交 联 与 足迹 法 ,以 及 中 子 散射 和 衍射 进行 的 结构 分 析 详 尽 地 研究 了 大 肠 杆菌 核糖 体 中 蛋白 质 与 RNA 和 和 蛋白质 之 间 相 互 作 用 的 方式 。 虽 然 不 同 种 属 中 rRNAs 的 一 级 核 苷 酸 顺 序 有 显著 的 不 同 ,大 部 分 二 级 结构 似乎 是 保守 的 ,表明 所 有 的 核糖 体 具 有 共同 的 组 织 方式 。 核糖 体 的 几 个 结构 域 在 蛋白 质 合成 过 程 中 具有 特别 的 重要 性 。 小 亚 基 包含 mRNA 。289 。 的 结合 位 点 和 tRNA 的 两 个 主要 结合 位 点 。A 位 点 (氨基 乙酰 tRNA 位 点 ,amino acyl- tRNA site) 在 延长 过 程 中 与 进入 的 带电 荷 tRNA 结合 ,而 P 位 点 ( 肽 酰 tRNA 位 点 ,pep- tidyL-tRNA site) 与 携带 新 生 多 肽 链 的 tRNA 结合 。 细 菌 核糖 体 具 有 第 三 个 下 位 点 (离开 位 点 ,exit site) , 空 载 的 疏 NAs 从 此 位 点 被 排出 。 大 亚 基 具 有 肽 基 转 移 酶 结构 域 ,提供 肽 键 形成 的 催化 活性 ,GTP 酶 结构 域 , 其 活性 是 核糖 体 在 mRNA 易 位 所 必需 的 。 这 些 位 点 在 蛋白 质 合成 中 的 作用 将 在 下 面 详细 地 讨论 。 转运 RNA 在 遗传 密码 被 了 解 以 前 ,弗朗西斯 ' 克 里 克 (Francis Crick) 提 出 转 接 器 假说 (adaptor hypothesis) 来 解释 mRNA 中 的 核 苷 酸 顺 序 如 何 被 翻译 为 蛋白 质 。 这 个 模型 预测 了 既 能 识别 信息 的 核 苷 酸 序 列 又 能 识别 适宜 的 氨基 酸 的 转 接 器 分 子 的 存在 , 它 将 两 者 都 携带 到 核糖 体 上 。 这 种 转 接 器 分 子 是 转运 RNA(tRNA)。tRNAs 是 同 源 性 相对 较 高 的 RNA 分 子 , 长 度 在 75 一 100 残 基 之 间 ,在 它们 产生 后 将 被 进一步 地 加 工 ( 见 第 27 章 RNA 加工)。 它 们 具 有 特殊 的 二 级 与 三 级 结构 ( 文 框 23.2)。 最 重要 的 有 受 体 臂 (acceptor stem, 氨基 酸 结合 位 点 ) 和 反 密 码 子 环 [anticodon loop ,携带 有 与 mRNA 上 的 密码 子 配对 的 互补 碱 基 的 三 核 苷 酸 反 密 码 子 (anticodon) ]。 细 菌 细胞 包含 35 种 不 同 的 疏 NAs, 真 核 生物 中 超过 50 种 。 这 个 数目 低 于 遗传 密码 中 可 能 的 密码 子 数目 ,但 大 于 密码 子 所 代表 的 氨基 酸 数目 。 这 表明 了 个 别 疏 NAs 可 以 识别 一 个 以 上 的 密码 子 ( 反 映 了 摆动 配对 ,参阅 ), 但 不 同 的 尽 NAs 有 可 能 装载 同样 的 氨基 酸 ( 即 同 工 RNA, 参 阅 )。 tRNASsS 被 一 种 称 为 氨 酰 tRNA 合成 酶 (amino acyl tRNA synthetases ) 的 蛋白 所 装载 (与 相对 应 的 氨基 酸 连 接 )。 对 应 每 一 种 氨基 酸 有 一 种 酶 ,因此 每 一 种 合成 酶 识别 所 有 的 同性 质 的 同 工 tRNA。 装 载 机 制 与 其 调节 在 别处 详细 讨论 ( 见 第 11 章 遗 传 密码 )。 23.2 有 蛋白质 合成 的 机 制 总 述 蛋白质 合成 的 起 始 阶 段 包括 蛋白 质 合 成 元 件 的 聚合 ,核糖 体 定 位 到 翻译 起 始 位 点 ,以 及 多 肽 链 的 第 一 个 氨基 酸 的 放置 (图 23.1)。 当 第 一 个 多 肽 键 形成 时 起 始 结 束 。 在 真 核 生物 与 原核 生物 中 ,核糖 体 的 小 亚 基 与 mRNA 结合 早 于 大 亚 基 的 结合 ,其 结合 要 求 一 系列 的 起 始 因子 (initiation factors，IFs) ,它们 在 核糖 体 大 亚 基 被 征集 时 释放 。 小 亚 基 可 识别 mRNA 核糖 体 结合 位 点 (ribosome binding site)。 第 一 个 氨基 酸 与 一 特异 的 起 始 tRNA(initiator tRNA) 连 接 , 它 具 有 进入 小 核糖 体 亚 基 的 部 分 P 位 点 的 特性 。 起 始 密码 子 常常 是 AUG, 它 标志 着 开放 读 码 框 的 开始 并 且 设 定 了 多 肽 链 其 他 部 分 的 读 码 框 。 所 有 其 他 的 延伸 tRNAs(elongator tRNAs) 在 延伸 阶段 进入 完全 装配 好 的 核糖 体 的 完整 A 位 点 。 延伸 包括 三 个 反应 的 循环 :征集 , 转 肽 和 易 位 。 每 一 步 都 要 求 延 伸 因 子 (elongator factors， EFs) 的 作用 与 GTP 的 水 解 来 提供 能 量 。 三 个 反应 的 净 效 应 是 将 胞 浆 中 的 所 基 酸 转移 到 新 生 肽 链 上 并 使 核糖 体 以 三 个 核 苷 酸 残 基 为 单位 沿 着 mRNA 移动 。 当 核糖 体 遇 到 一 终 止 密码 子 时 蛋白 质 合 成 停止 ,核糖 体 上 附着 的 因子 被 释放 ,翻译 装置 从 而 解散 。 细菌 中 的 翻译 起 始 一 一 详细 的 机 制 ”在 真 细菌 中 ,30S 核糖 体 亚 基 只 在 与 起 始 因 子 IF3 缔 合 后 才能 结合 mRNA,IF3 可 以 稳定 小 亚 基 的 结构 并 防止 与 大 亚 基 的 成 熟 前 相互 作用 。 “有 1 1 IE IF3 叶 eIF2, GTP FT 扣 全 三 站 几 IF2, GTP, IF1 福 eIF3, elIF4A, elIF4B 一 -一 一 一 ~ ee G 汪 Kozak AUG AUG IFs, GDP 二 | GDP 人 Y ups aas 图 23.1 细菌 与 真 核 生物 中 的 蛋白 质 合 成 的 起 始 。 在 细菌 中 ( 左 ) 小 亚 基 (1) 与 Shine-Dalgano (SD) 顺 序 结合 (2) 并 征集 起 始 让 NA (3) ,大 亚 基 从 而 与 之 结合 (4)。 在 真 核 生 物 中 ( 右 ) ,小 亚 基 (1) 与 alF-2-GTP 及 起 始 NA 结合 形成 前 起 始 复合 物 (2) ,此 复合 物 可 识别 mRNA 的 5 帽子 上 的 帽 结 合 蛋白 (CBP) 从 而 结合 mRNA 并 沿途 搜寻 合适 位 置 上 的 起 始 密码 子 为 止 (3) ,然后 大 亚 基 与 之 结合 (4)。 为 了 显示 清楚 ,图 中 小 亚 基 只 覆盖 6 个 碱 基 , 而 实际 上 它 覆 盖 30 一 40 碱 基 ,这 样 它 能 同时 与 细菌 SD 顺序 (或 真 核 生物 的 Kozak 顺序 ) 及 起 始 密码 子 相 互 作用 。 核 糖 体 的 A 位 点 和 了 位 点 在 图 中 显示 。 虽然 IF3 控制 着 小 亚 基 与 mRNA 结合 的 能 力 , 识 别 的 特异 性 仍 是 由 核糖 体 自身 提供 的 。 mRNA 上 的 核糖 体 结合 位 点 是 Shine-Dalgarno 顺序 (保守 顺序 UAAGGAGG) , 它 与 核糖 体 16S rRNA 中 的 互补 序列 形成 碱 基 对 。 起 始 密码 子 (一 般 为 AUG 但 有 时 是 GUG 或 UUG) 处 于 ShineDalgarno 顺序 下 游 约 10nt 处 ,核糖 体 的 正确 定位 是 起 始 密码 子 处 于 核 糖 体 亚 基 的 了 位 点 。 起 始 密码 子 对 应 于 氨基 酸 的 甲 硫 氨 酸 。 在 大 肠 杆 菌 中 有 两 种 携带 甲 硫 氢 酸 的 tRNAs。 其 中 之 一 (tRNA ) 特 异地 识别 起 始 密码 子 , 而 另 一 个 (tRNAMet) 识别 中 间 的 AUG 密码 子 (内 部 的 GUG 和 UUG 密码 子 分 别 被 RNAYa 和 tRNALe 识 别 )。 一 旦 起 始 tRNAs 被 装载 , 甲 硫 氨 酸 的 氨基 就 会 被 甲 酰 化 修饰 。 这 一 修饰 的 信号 可 能 是 双 链 受 体 臂 末端 的 不 配对 残 基 , 相 应 的 残 基 在 延伸 疏 NA 中 是 配对 的 ( 甲 硫 氨 酰 的 RNAsus 不 能 被 甲 酰 化 ) 。 这 一 信号 还 可 防止 在 延伸 过 程 中 起 始 tRNA 进入 核糖 体 的 A 位 点 , 而且 此 修 饰 封闭 了 氮 基 基 团 从 而 防止 N - 甲 酰 甲 硫 氢 酸 与 上 游 残 基 形 成 肽 键 。 在 起 始 过 程 中 ,起 始 tRNA 被 装载 到 小 核糖 体 亚 基 的 P 位 点 。P 位 点 提供 了 特殊 的 分 子 环境 ,上 人 tRNA 可 以 进入 ,而 延伸 慌 NA 不 能 进入 。 起 始 密码 子 的 特异 性 与 反 密 码 子 环 中 的 三 G:C 碱 基 对 有 关 , 这 在 延伸 RNA 中 是 不 存在 的 。N 甲 酰 化 对 起 始 特异 性 关 汪 基 二 表征 包含 正常 甲 硫 氮 酸 的 起 始 疏 NAs 与 包含 甲 酰 甲 硫 氮 酸 的 修饰 起 始 tRNAs 同样 有 效 。 反 密码 子 第 三 位 有 一 定 程 度 的 播 摆 ( 参 阅 ) 人 允许 AUG,GUG 和 UUG 作为 起 始 密码 子 , 但 是 tRNAIMet 识 别 这 些 密码 子 的 效率 较 低 。 因 此 可 以 通过 选择 起 始 密码 子 来 对 蛋白 质 合 成 的 ”294 效率 建立 组 成 型 的 控制 。 在 GTP 存在 下 ,起 始 tRNA 由 IF-2 携带 到 了 位 点 。 这 时 IF-1 与 完整 的 起 始 复合 物 结合 以 稳定 它 。 当 50S 大 亚 基 被 装配 时 ,所 有 的 起 始 因子 被 释放 。 这 一 过 程 要 求 GTP 的 水 解 来 提供 能 量 。 真 核 的 起 始 一 一 详细 的 机 制 ” 真 核 与 细菌 的 机 制 是 相同 的 ,其 主要 的 区 别 在 于 各 种 成 分 装配 的 次 序 , 真 核 起 始 因子 数目 较 多 , 真 核 翻 译 的 起 始 和 延伸 都 使 用 正常 的 甲 硫 氢 酸 。 这 样 起 始 与 延伸 的 甲 硫 氨 酰 化 RNAs(tRNAIM# 和 FRINA“) 避 六 同 拓 的 全 于 列 只 在 tRNA 自身 的 结构 上 有 区 别 。 在 真 核 生物 中 ,小 核糖 体 亚 基 在 没有 和 起 始 tRNA 缔 合 时 不 能 与 mRNA 结合 ,由 tRNAM,eIF-2 和 GTP 组 成 的 三 元 复合 物 结合 小 亚 基 形成 前 起 始 复合 物 (preinitiation complex) , 它 可 与 mRNA 结合。 核糖 体 结合 位 点 由 起 始 密码 子 所 决定 ,虽然 附近 的 顺序 也 可 能 十 分 重要 , 被 称 为 Kozak 共有 序列 (ACCAUGG)。 开 始 ,前 起 始 复合 物 结合 5 7meG 帽 结构 并 沿 着 mRNA 搜寻 第 一 个 起 始 密码 子 。 这 个 过 程 需要 几 种 起 始 因子 , 包 括 帽 结合 蛋白 质 (eIF-4F) ,eIF-3,eIF-4A,eIF-4B。 帽 结合 蛋白 促进 40S 亚 基 的 起 始 结合 。 eIF-4A 与 4B 共 同 作 用 去 除 $ 非 翻 译 区 域 (UTR) 的 二 级 结构 ,然后 它们 和 eIF-3 帮助 40S 亚 基 结 合 以 形成 起 始 复合 物 (initiation complex)。 大 亚 基 与 另 一 个 起 始 因子 eIF-6 相 缔 合 大 亚 基 与 起 始 复合 物 的 结合 包括 eIF-2 和 eIF-3 从 前 起 始 复合 物 上 解 离 及 elIF-6 从 大 亚 基 上 解 离 ,这 个 过 程 由 eIF-5 介 导 。 起 始 因子 eIF-2 和 eIF-6 都 是 抗 缔 合 因子 (antiassocia- tion factors) :它们 防止 核糖 体 亚 基 在 胞 浆 中 相互 作用 。 当 大 亚 基 结合 时 其 他 的 起 始 因子 从 核糖 体 上 解 离 ,此 过 程 要 求 GTP 水 解 。 延伸 循环 ”延伸 循环 在 细菌 与 真 核 生物 中 基本 相同 ,以 三 阶段 发 生 一 一 征集 , 转 肽 作用 和 易 位 (图 23.2)。 人 /eEF-1 +GTP EF-Tu / eEF-] +GDP EF-G /eEF-2 +GDP EF-G / eEF-2 1 AUGUGC AUGUGGCUG 图 23.2 和 蛋白质 合成 的 延伸 循环 。(1) 征集 :负载 tRNA 进入 核糖 体 A 位 点 。(2) 转 肽 作用 : 连 接 氮 酰 残 基 与 P 位 点 疏 NA 的 肽 键 被 转移 到 填充 A 位 点 的 氮 酰 残 基 上 。(3) 易 位 : 空 载 的 RNA 从 了 位 点 排除 ,核糖 体 向 mRNA 下游 移 动 三 个 碱 基 , 将 A 位 点 tRNA 移动 到 了 位 点 ,下 一 个 密码 子 进入 A 位 点 ,为 下 一 负载 RNA 的 征集 作 准 备 。 图 中 标 出 了 核糖 体 的 A 位 点 与 P 位 点 。 5 在 起 始 后 ,起 始 氨 基 栈 -tRNA 填充 了 核糖 体 P 位 点 ,下 一 个 密码 子 排列 在 A 位 点 。 第 一 个 延伸 氨基 酸 -tRNA 进入 A 位 点 ,其 反 密码 子 与 密码 子 配对 ,这 种 识别 由 延伸 因子 承担 (在 细菌 中 是 EF-Tu, 在 真 核 生 物 中 是 sEF-1 ,它们 都 与 GTP 缔 合 )。 这 时 P 位 点 的 连接 起 始 tRNA 与 甲 硫 氢 酸 的 肽 键 断裂 , 甲 硫 氢 酸 与 充填 A 位 点 的 氮 基 酸 之 间 形 成 肽 键 。 起 始 tRNA 被 释放 (dischraged)。 转 肽 作用 (transpeptidation ) 由 核糖 体 大 亚 基 的 肽 基 转 移 酶 活力 介 导 。 与 EF-Tu( 或 saEF-1) 缔 合 的 GTP 被 水 解 且 延伸 因子 被 排除 。EF-Tu/GDP 是 没有 活力 的 ,此 核 苷 酸 被 第 二 种 延伸 因子 EF-Ts 所 取代 ,而 EF- Ts 又 可 被 GTP 取代 。 这 样 EF-Tu 可 以 被 重复 使 用 。 在 真 核 生 物 中 似乎 没有 EF-Ts 的 对 应 物 ,不 过 eEF-1 是 几 种 多 肽 链 的 积聚 ,其 中 之 一 可 能 具有 EF-Tu 的 功能 。 下 一 阶段 是 易 位 (translocation) 。 填 充 在 P 位 点 的 起 始 tRNA 被 排除 (在 细菌 中 被 转 移 到 另 一 个 被 称 为 下 位 点 核糖 体 结构 域 , 而 在 真 核 生物 中 tRNA 从 核糖 体 上 解 离 下 来 )。 甲 硫 氨 栈 残 基 通 过 肽 键 与 填充 A 位 点 的 氨基 酸 连 接 ,这 时 在 A 位 点 的 tRNA 被 称 为 肽 酰 - tRNA(peptidyl tRNA) 。 然 后 核糖 体 沿 着 mRNA 移动 3 个 碱 基 , 肽 酰 让 NA 仍然 与 其 . 密码 子 缔 合 。 肽 酰 tRNA 被 转移 到 了 位 点 ,mRNA 沿 核糖 体 移 动 使 下 一 个 密码 子 处 于 A 位 点 。 易 位 步骤 的 几何 学 依赖 于 mRNA 与 tRNA 的 相互 作用 :具有 四 个 反 密 码 子 碱 基 的 突变 型 tRNA 引起 四 个 碱 基 的 易 位 ,导致 移 码 或 移 码 抑制 (参阅 )。 易 位 要 求 另 一 种 延伸 因子 (细菌 中 的 EF-G, 真 核 生 物 中 的 eEF-2) ,同样 与 GTP 结合 并 要 求 GTP 的 水 解 。 在 大 肠 杆 菌 和 某 些 其 他 的 细菌 , 易 位 还 要 求 几 种 游离 的 rRNA,4.5S rRNA, 它 们 的 作用 仍 不 清楚 。 蛋白 质 合成 的 终止 ” ” 当 核 糖 体 遇 到 三 种 终止 密码 子 (参阅 ) 之 一 时 ,蛋白 质 合成 终止 。 它们 往往 没有 相应 的 RNA, 使 翻译 停止 (参考 硒 代 半 胱 氨 酸 插入 ,无 义 抑 制 基 因 )。 翻 译 完成 的 多 肽 链 被 释放 ,tRNA,mRNA 和 核糖 体 亚 基 解 离 ,在 以 后 的 翻译 过 程 中 被 循环 使 用 (图 23.3)。 终 止 要 求 一 系列 蛋白 质 杰 放 因子 (release factors，REFs) ,它们 与 A 位 点 结合 并 识别 无 义 密码 子 。 它 们 促进 了 多 肽 链 从 最 后 一 个 肽 酰 tRNA 上 释放 出 来 , 空 载 的 图 23.3 蛋白 质 合成 的 终止 。 当 核糖 体 遇 到 一 终止 密码 子 时 ,释放 因子 与 A 位 点 结合 。 它 将 新 生 肽 链 从 P 位 点 的 肽 酰 - tRNA 释放 并 使 核糖 体 解 离 ,使 蛋白 质 合成 的 成 分 可 以 被 循环 利用 。 ”98 tRNA 从 核糖 体 上 离 去 ,核糖 体 解 离 。 在 大 肠 杆 菌 中 有 两 种 不 同 的 释放 因子 识别 不 同 的 两 对 终止 密码 子 。RF1 识别 UAA 和 UAG, 而 RF2 识别 UAA 和 UGA。 它 们 都 需要 第 三 个 因子 ,RF3 的 帮助 。 在 真 核 生 物 中 ,单个 GTP 依赖 因子 (eRF) 识 别 所 有 的 终止 密码 子 ， 但 效率 不 同 。 有 时 会 发 生 通 读 ,特别 在 弱 终 止 子 时 ,这 反映 了 释放 因子 与 tRNA 之 间 的 竞 争 。 终 止 密码 子 的 错 读 是 翻译 调节 的 重要 方面 (在 下 面 讨论 ) 并 可 能 受 mRNA 的 二 级 结 构 的 影响 。 23.3 有 蛋白质 合成 的 调节 蛋白 质 合 成 的 组 成 型 控制 ”蛋白质 合成 的 效率 受 组 成 性 控制 ,但 也 可 能 在 整体 或 在 个 别 转 录 本 的 水 平 上 被 调节 。 和 有 蛋白质 合成 的 组 成 型 水 平 依 赖 于 mRNA 结构 ,还 反映 了 mRNA 稳定 性 ,序列 和 核糖 体 结合 位 点 附近 序列 ,二 级 结构 的 出 现 , 起 始 密码 子 的 选择 和 整个 开放 读 码 框 的 密码 子 偏向 等 因素 的 影响 。 二 级 结构 和 终止 密码 子 的 选择 产生 被 通称 为 程序 性 错 读 (programmed misreading ) 的 调节 现象 ,使 密码 子 顺 序 的 正常 翻译 被 抑制 。 程 序 性 错 读 的 例子 包括 通读 、 硒 代 半 胱 氢 酸 插 和 人 和 移 码 。 通 读 发 生 在 弱 终止 密码 子 上 ( 即 终止 密码 子 处 释放 因子 被 限制 ) ,在 释放 因 子 与 具有 可 耐 受 的 反 密 码 子 顺序 的 tRNA 之 间 存 在 着 竞争 。 硒 代 半 胱 所 酸 捅 人 发 生 在 终止 密码 子 UGA 处 ,并 要 求 一 定 的 二 级 结构 , 即 硒 代 半 胱 气 酸 插入 序列 (参阅 )。 当 核糖 体 在 二 级 结构 或 稀有 密码 子 处 暂停 ,向 前 或 向 后 滑动 时 一 个 核 苷 酸 或 在 一 不 同 的 读 码 框 持续 翻译 会 发 生 移 码 (frameshifting) 或 再 编码 (recoding)。 这 可 以 用 来 在 翻译 中 途 改变 读 码 框 ( 例 如 在 反 义 病 毒 o! 基因 ) 来 导致 早期 平 截 (trucation) (例如 MS2 lysis 基因 ) 或 防 止 平 截 来 延伸 一 基因 产物 (例如 在 大 肠 杆 菌 中 draX 基因 )。 在 细菌 中 ,操纵 子 环境 可 产生 翻译 调节 的 新 的 形式 ,下 游 基因 的 翻译 依赖 于 多 顺 反 子 中 上 游 基 因 的 翻译 。 个 别 开 放 阅读 框 的 空 阶 十 分 重要 。 连 续 开放 阅读 框 之 间 的 空 除 大 于 大 约 30 核 苷 酸 ,翻译 以 分 立 的 起 始 事件 开始 ,每 一 位 点 是 独立 的 。 如 果 存 在 较 短 的 空隙 ， 核糖 体 可 以 通过 连接 开放 阅读 框 重新 开始 , 即 不 发 生 从 模板 上 第 一 次 解 离 5 起 始 信和 号 与 正常 的 SD -顺序 不 同 ,核糖 体 亚 基 以 典型 的 方式 和 较 低 的 效率 自发 装配 。 封 闭 或 阻 断 上 游 基 因 翻 译 的 突变 也 会 影响 下 游 基 因 的 翻译 ,这 被 称 为 极 性 突变 (polar matation)( 例 如 并 参见 /ac 操纵 子 )。 真 核 mRNA 的 翻译 常常 是 帽 依赖 的 ,并 通过 搜寻 第 一 个 起 始 密码 子 而 发 生 。 小 RNA 病毒 家 族 提 供 了 一 个 例外 ,其 基因 组 包含 内 部 核糖 体 进入 位 点 (internal ribosome en- try site，IERS) , 即 形成 一 定 二 级 结构 的 基 序 允许 蛋白 质 合 成 的 内 部 起 始 。 内 部 起 始 依赖 于 帽 结合 蛋白 eIF-4F , 当 此 和 蛋白 质 失 活 时 会 发 生 小 RNA 病毒 内 部 起 始 (通过 抑制 eIF-4F 阻 断 宿主 蛋白 质 合成 作为 感染 策略 的 一 部 分 )。 然 而 ，IRES 功能 不 需要 病毒 蛋白 , 即 起 始 依赖 于 其 他 的 寄主 起 始 因子 。 内 部 起 始 可 能 发 生 在 特定 的 细胞 转录 本 ,包括 果 蝇 触角 足 和 小 鼠 危 记 。IRES 基 序 的 丰 度 和 它们 在 基因 表达 控制 中 的 显著 性 还 不 了 解 ,它们 被 用 功能 术语 定义 ,没有 显示 保守 的 结构 特征 。 蛋白 质 合成 的 整体 调节 ”蛋白质 合 成 的 “基本 装置 "的 成 分 (起 始 ,延伸 和 终止 因子 ,以 及 核糖 体 的 组 分 ) 可 以 被 调节 ,从 而 对 和 蛋白质 合成 进行 整体 的 调节 。 例 如 , 几 种 真 核 病 毒 .294 ， 通过 磷酸 化 起 始 因 子 eIF-2 关闭 寄主 蛋白 质 的 合成 , 当 要 求 整体 合成 抑制 时 这 个 策略 也 可 用 于 细胞 自身 (例如 当 细 胞 经 受热 休克 时 )。 在 酿酒 酵母 中 eIF-2 的 磷酸 化 允许 搜寻 的 遗漏 ,核糖 体 可 以 跳 过 弱 的 起 始 子 而 与 强 起 始 子 结合 。 这 改变 了 某 些 基因 的 抑制 如 GCN4 ,它们 在 mRNA 的 帽 和 确定 起 始 密码 子 之 间 有 多 个 无 效 的 AUG 密码 子 。 当 eIF-2 去 磷酸 化 ,核糖 体 试图 在 第 一 个 AUG 处 起 始 蛋 白质 合成 ,而 由 稍 后 的 读 码 框 内 的 终止 密 码 子 所 终止 。 蛋白 质 合成 的 个 别 结构 域 调节 特异 mRNAs 可 以 被 单独 地 调节 。 详 细 了 解 的 例子 包 括 哺乳 类 铁 蛋 白 mRNA 和 大 肠 杆菌 中 的 核糖 体 蛋白 质 L5 mRNA。 在 铁 蛋 白 系统 中 , 当 胞 内 铁 的 浓度 较 低 时 铁 蛋 白 mRNA 的 翻译 被 阻 断 。 这 种 抑制 依 赖 于 转录 本 中 的 铁 效应 元 件 (iron-response elements，IREs) 并 由 IRE 结合 蛋白 介 导 ,这 种 蛋白 在 铁 存 在 时 失 活 。 铁 蛋白 的 IRE 出 现在 转录 体 的 $“` 非 翻译 区 ,IRE-BP 通过 阻止 核 糖 体 的 搜寻 来 抑制 蛋白 质 的 合成 。 在 铁 蛋 白 mRNA 中 ,IREs 不 与 富 含 AU 的 mRNA 去 稳定 位 点 缔 合 ,并 不 影响 mRNA 的 转换 ,如 在 转 铁 蛋白 受 体 mRNA 中 的 情况 ( 见 第 27 章 RNA 加 工 )。 L5 系统 代表 了 核糖 体 组 件 合成 的 反馈 控制 。 核 糖 体 蛋白 质 S8 与 16S rRNA 残 基 5$88 一 651 形成 的 葵 环 结构 结合 。L5 核糖 体 蛋 白质 mRNA 的 5 非 翻 译 区 与 编码 区 域 的 前 30 个 碱 基 形成 同样 的 结构 。 蛋 白质 S8 与 L5 mRNA 结合 (虽然 结合 效率 低 于 16S rRNA) 并 抑制 蛋白 质 的 合成 。 多 余 的 16SrRNA 可 结合 所 有 的 S8 蛋白 质 ,从 而 使 L5 的 翻译 去 抑制 ,而 如 果 16SrRNA 的 量 有 限 ( 因 而 不 需要 LS 的 翻译 ) ,过 剩 的 S8 蛋白 质 阻止 L5 的 翻译 。 特异 翻译 调节 的 最 后 一 个 例子 由 反 义 RNA 提供 (参阅 )。 这 主要 在 原核 系统 中 发 现 (例如 在 细菌 噬菌体 入 的 Q 蛋白 质 合 成 的 控制 ,质粒 复制 基因 的 控制 ,以 及 不 同 的 转 座 子 的 转 座 酶 的 合成 的 控制 , 见 病毒 ,质粒 ,可 移动 遗传 因子 各 章 ) ,但 在 真 核 生物 中 也 有 发 现 (例如 在 鸡 肢 芽 Fgf-2 合成 的 控制 )。 最 近 , 翻译 的 反 义 抑制 被 用 作 阻 断 基 因 功 能 的 策略 而 不 必 进 行 体外 或 定点 突变 ,这 样 无 需 破 坏 基因 就 可 以 确定 零 表 型 效应 (参见 转基因 生 物 , 基 因 治 疗 , 共 抑 制 ) 。 文 框 23.1 大 分 子 质量 测定 相对 分 子 量 分 子 的 质量 常常 用 相对 分 子 量 (relative molecular mass, M,) 来 表示 , 指 相 对 于 碳 原 子 的 十 二 分 之 一 [一 原子 质量 单位 (atomic mass unit) 或 一 道 尔 顿 (dalton)] 的 质量 。 因 而 蛋白 质 或 核酸 等 大 分 子 的 质量 常常 用 千 道 尔 顿 (kilodalton，kD,kDa) 来 表示 ,这 等 于 1000 个 原子 质量 单位 。 理论 上 分 子 的 Mr 可 由 每 一 原子 的 加 和 而 得 到 ,或 通过 实验 方法 与 已 知 的 蛋白 标准 比较 大 小 得 到 (如 通过 凝 胶 电 泳 ) 。 核酸 ”核酸 往往 比 蛋白 质 大 ,常常 以 它们 包含 的 核 苷 酸 单位 的 数目 来 衡量 。 单 链 核 苷 酸 的 数目 用 碱 基 (bases,b) 数 或 核 背 酸 (nucleotides,nt) 数 来 表示 , 较 大 的 分 子 用 千 碱 基 (kilobases, kb) 表 示 。 双 链 分 子 的 大 小 用 碱 基 对 (bases pairs,bp) 和 千 碱 基 对 (kilobases pairs,kbp) 表 示 ,对 大 的 DNA 分 子 ”95 ? 如 染色 体 , 用 兆 碱 基 对 (mega bases pairs，Mbp) 表 示 。 较 之 蛋白 质 核酸 的 单 体 分 布 更 为 平均 ,质量 更 为 均一 。 因 而 从 碱 基数 或 碱 基 对 数 得 到 的 相对 分 子 量具 有 一 定 的 精确 性 。 沉降 系数 单位 ”大 分 子 与 细胞 成 分 的 质 可 从 由 超 离心 得 到 的 沉降 系数 (sedimentation coefficient) 来 估算 。 它 以 秒 (s) 为 单位 ,反映 了 在 一 单位 场 中 沉降 速率 。 大 分 子 的 沉降 系数 在 1X102 到 2x 105 的 范围 内 。1x 1093 秒 被 定义 为 一 个 沉降 系数 单位 (Svedberg unit,S)。 沉 降 系数 单位 常常 用 来 表示 核糖 核 蛋 白 颗 粒 和 RNA 分 子 的 质量 ,如 核糖 体 RNA 和 核糖 体 亚 基 ( 另 见 剪 接 体 ,信号 识别 颗 粒 )。 换算 M: 可 根据 下 式 由 沉降 系数 决定 : AM 站 全 全 二 和 大 《下 一 冤 0 R 是 气体 常数 ,T 是 温度 ,s 是 沉降 系数 ,D 是 扩散 常数 ,v 是 部 分 特异 体积 ,o 是 溶剂 密度 。 作 为 一 种 根据 实际 经 验 而 得 到 的 作法 (a rule of thumb) ,DNA 的 一 个 碱 基 对 的 平均 分 子 量 被 认为 是 650 Da,RNA 的 一 个 碱 基 为 335 Da。 这 些 是 核 苷 酸 单元 的 平均 分 子 量 再 每 核 苷 酸 加 上 一 个 磷酸 基 团 。 这 可 以 用 来 从 相对 分 子 量 或 沉降 系数 单位 估算 碱 基 或 碱 基 对 长 度 ,或 反之 。 文 框 23.2 tRNA 的 结构 与 功能 (又 见 核 苷 酸 结构 ) 一 级 结构 “所 有 的 了 RNAs 有 同样 的 长 度 ,75 一 100 nt, 并 具有 10% 的 修饰 或 超 修饰 碱 基 。tRNA 中 大 约 20% 的 碱 基 是 不 变 的 (invariant) 或 半 不 变 的 (semi-invariant)( 即 碱 基 的 类 型 , 呆 啉 或 喀 啶 是 保守 的 ) ,并 在 三 级 结构 的 形成 和 与 翻译 装置 的 其 他 元 件 的 相互 作用 中 起 重要 作用 。 超 过 一 半 碱 基 是 可 变 的 但 形成 分 子 内 的 配对 碱 基 对 。 对 这 些 碱 基 来 说 ,形成 碱 基 对 的 能 力 而 不 是 碱 基 自 身 的 特异 性 对 tRNA 的 结构 和 功能 更 为 重要 。 在 不 配对 的 环 区 发 现 其 他 的 可 变 碱 基 , 包 括 反 密 码 子 环 。 一 些 可 变 碱 基 使 每 个 tRNA 为 特异 的 氢 酰 tRNA 合成 酶 (参阅 ) 提 供 了 识别 信号 。 在 某 些 tRNAs 中 , 反 义 密码 子 环 在 特异 性 方面 起 重要 的 作用 。 但 在 另 一 些 中 特异 性 仅仅 包括 外 部 残 基 , 其 取代 会 改变 tRNA 的 “身份 ,引起 它 被 错误 地 装载 ,并 在 其 密码 子 出 现时 导 人 错误 的 氨基 酸 。 在 某 些 例子 中 ,身份 可 能 由 一 个 碱 基 对 决定 (如 tRNAAs)。 反 密码 子 只 是 负责 翻译 的 特异 性 。 如 果 已 填充 的 氨 酰 tRNA 中 的 氨基 酸 被 化 学 修饰 ,修饰 残 基 将 被 插入 到 新 生 肽 链 中 。 这 样 ,如 同 免 疫 球 蛋白 ,tRNA 具有 正常 的 由 通用 残 基 介 导 的 效应 功能 以 及 由 不 同 残 基 介 导 的 特异 功能 (与 氨 酰 tRNA 合成 酶 和 mRNA 的 相互 作用 )。tRNA 中 的 其 他 碱 基 似 乎 是 可 变 的 ,其 中 一 些 出 现在 D 环 ， 但 大 部 分 在 外 臂 ( 见 下 文 )。 二 级 结构 一 一 三 叶 草 模型 tRNA 一 级 序列 中 的 几 个 区 域 的 不 完善 两 侧 对 称 性 导致 四 个 双 链 苍 的 形成 。tRNA 的 两 端 配对 形成 受 体 臂 (acceptor stem) ,包含 3 末端 不 变 的 CCA 基 序 。 在 装载 过 程 中 ,氨基 酸 与 此 基 序 末端 的 腺 苷 酸 连接 ,可 能 与 2 或 3 的 羟基 作用 (参见 氨 酰 tRNA 合成 酶 )。 tRNA 中 间 的 残 基 折 三 形成 三 个 主要 的 环 区 :TST 环 , 它 的 得 名 来 自 它 的 固定 顺序 GTYCRANTC ( 亚 是 修饰 残 基 假 尿 苷 );D 环 , 它 的 得 名 由 于 含有 修饰 残 基 二 氢 尿 喀 啶 ; 反 密 码 子 环 携带 与 mRNA 中 的 密码 子 配对 的 三 核 苷 酸 的 反 义 密码 子 序 列 。 一 类 tRNAs 中 TYC 臂 与 反 密 码 子 臂 之 间 相 上 曙 4 一 $ 残 基 。 在 二 类 tRNAs 可 能 延伸 形成 额外 臂 (extra arms) ,为 分 子 中 最 大 的 二 级 结构 ,包含 25 个 碱 基 。 额 外 臂 的 功能 仍 不 清楚 。 2 半 反 密码 子 环 站。 ooo 反 密码 子 tRNAs 的 共同 结构 :不 变 与 半 不 变 碱 基 被 标 出 ,可 变 碱 基 用 圆圈 表示 。 下 划 线 表示 此 碱 基 往往 被 修饰 ,虽然 修饰 类 型 不 同 。 更 是 假 尿 苷 。 箭 头 表示 附加 碱 基 可 能 插入 的 位 置 ,在 D 环 中 包括 修饰 碱 基 二 氢 尿 喀 啶 。 有 阴影 的 碱 基 在 起 始 疏 NAs 中 很 重要 , 反 义 密码 子 茎 带 有 G: C 碱 基 对 , 受 体 臂 末 端 不 配对 。 三 级 结构 ，” 几 种 转运 RNAs 的 三 级 结构 用 又 射线 晶体 衍射 确定 。 分 子 呈 一 紧密 的 工 形 的 构象 ， TST 臂 与 受 体 臂 形成 连续 的 双 螺 旋 ,D 环 与 反 密码 子 环形 成 另 一 螺旋 。 这 些 螺 旋 相互 垂直 ,TYT 环 与 D 环形 成 一 核心 ,而 受 体 臂 与 反 密码 子 环 在 分 子 的 相对 末端 形成 可 移动 的 臂 。 命名 法 ”每 一 RNA 分子 根据 其 识别 的 氨基 酸 用 三 字母 表示 来 命名 ,如 耻 NA 下 是 携带 异 亮 氨 酸 的 了 NA。 同 工 不 NAs 被 加 上 不 同 的 号 码 , 如 RNA 焉 ，tRNA 焉 。 起 始 如 NAs 的 命名 不 同 ,在 正文 中 已 作 了 讨论 。 氢 酰 了 NA 合成 酶 根据 其 底 物 命名 ,如 异 亮 氨 酰 tRNA 合成 酶 将 异 亮 氢 酸 填 充 到 让 NA 上。 它们 的 命名 往往 用 三 字母 表示 法 来 简略 地 表示 , 即 IletRNA 合成 酶 。 被 填充 的 tRNA 根据 同样 的 原则 命名 。 即 如 同上 面 的 例子 , 异 亮 氢 酰 tRNAIE ,IletRNAIE。 附属 功能 ”除了 它们 在 翻译 中 所 起 的 重要 作用 ,tRNAs 在 胞 内 还 承担 其 他 的 功能 。 氢 酰 耻 NAs 可 作为 其 他 细胞 反应 的 氨基 酸 给 体 ,在 某 些 反 转 录 病 毒 (参阅 ) 的 复制 循环 中 个 别 了 RNAs 可 作为 反 转录 的 引物 。 在 大 肠 杆菌 的 His 操纵 子 中 疏 NA 或 类 似 的 结构 被 发 现 可 对 翻译 进行 调节 ,并 在 训 减 作用 中 (参阅 ) 起 重要 的 作用 。 ( 徐 兴 译 ) 5 第 24 章 重组 DNA 与 分 子 克 隆 基本 概念 和 定义 重组 DNA(recombinant DNA) 是 在 体外 将 不 同 来 源 的 DNA 分 子 共 价 连 接 而 产生 的 。 与 构建 和 应 用 重组 DNA 有 关 的 技术 称 为 遗传 工程 (genetic engineering)、 基 因 剪 接 或 基因 操作 。 重组 DNA 技术 的 基础 是 一 系列 使 DNA 能 够 被 精确 操作 和 修饰 的 关键 酶 系 和 技 术 。 使 用 的 主要 酶 列 在 表 24. 1。 最 基本 的 技术 包括 :@ 用 序列 专 一 性 的 细菌 内 切 酶 (限制 性 内 切 酶 ,restriction endonuclease) 剪 切 DNA, 产 生 确 定 的 DNA 片段 ， 使 用 连接 酶 将 DNA 连接 ;@O 在 凝 胶 电泳 上 根据 分 子 量 大 小 分 离 DNA; @ 通 过 核 酸 杂 交 在 复杂 混合 物 中 检测 特殊 的 序列 ;四 将 DNA 导入 细胞 ;@ 通 过 分 子 克 隆 或 聚合 酶 链 式 反 应 扩 增 特定 的 DNA 分 子 。 在 细胞 为 基础 的 分 子 克 隆 中 ,目标 DNA 片段 在 体内 随 增生 细胞 数量 而 扩 增 。 缺 乏 复 制 起 始点 (参阅 ) 的 DNA 分 子 不 能 复制 ,所 以 要 由 克隆 载体 提供 复制 起 始 点 ,克隆 载体 是 由 质粒 或 病毒 衍生 的 遗传 因子 ,可 以 携带 外 源 DNA( 供 体 、 外 源 、 插入 或 过 客 DNA) 。 供 体 和 载体 DNA 共 价 连接 ,产生 重组 载体 (recombinant vec- tor) 。 它 被 导入 宿主 细胞 , 随 细 胞 生长 而 复制 ,产生 供 体 DNA 的 多 个 克隆 拷贝 。 重组 载体 是 游离 的 ,能够 根据 它 特 有 的 物理 化 学 属性 与 染色 体 DNA 分 离 ,这样 可 以 从 大 量 培养 物 中 重新 得 到 很 多 被 克隆 的 供 体 DNA。 体 外 扩 增 DNA 的 另 一 个 方法 是 用 聚合 酶 链 式 反应 ,这 种 方法 比分 子 克 隆 更 快速 和 容易 ,上 且 十 分 灵敏 和 有 力 。 然 而 这 种 方法 只 能 得 到 相对 较 短 的 序列 ,所 使 用 的 酶 比 宿主 细胞 中 的 精确 性 差 , 使 PCR 产物 产生 一 些 异 质 性 。 另 外 ,分 子 克隆 不 需要 供 体 DNA 序列 的 信 息 ,而 PCR 需要 设计 引物 与 特定 DNA 两 侧 退火 。PCR 在 本 章 中 不 详细 讨论 ( 参 见 PCR)。 插 和 人 克隆 载体 中 的 DNA 从 初级 或 二 级 来 源 得 到 。 二 级 来 源 是 已 经 分 离 的 DNA 克隆 , 供 体 DNA 从 克隆 中 分 离 以 进行 进一步 操作 ,这 样 的 过 程 称 为 亚 克 隆 (sub- cloning)。 在 另 一 方面 ,初级 克隆 是 从 原始 或 初级 来 源 中 分 离 供 体 DNA, 也 就 是 从 整个 基因 组 或 一 大 群 cDNA 中 得 到 。 尽 管 偶 尔 可 能 从 低 复 杂 性 来 源 中 直接 获 得 特定 的 cDNA 或 基因 组 DNA 片段 ,初级 克隆 经 常 需 要 DNA 文库 (DNA li- brary)。DNA 文库 是 克隆 在 载体 上 的 特定 来 源 的 所 有 DNA 片段 汇集 。 所 需 的 克隆 必须 根据 供 体 DNA 的 特殊 性 质 从 文库 中 分 离 得 到 ,如 序列 .所 编码 蛋白 的 结构 或 功能 特点 。 这 样 的 过 程 称 为 筛选 (screening ) 。 = 。 一旦 特定 DNA 克隆 被 分 离 , 它 可 以 有 很 多 用 途 。 研 究 应 用 属于 下 面 中 的 一 种 或 多 种 ,在 下 文中 详细 讨论 :@ 分 析 基 因 和 基因 组 结构 及 基因 表达 ;人 @O 基 因 物 理 图 谱 和 定位 克隆 ( 见 基因 结构 和 作 图 );@@ 表 达 克 隆 ;@ 四 基因 和 产物 及 调节 元 件 的 功能 分 析 ;@ 体 外 突变 ;@@ 基 因 转 移 和 转基因 。 表 24.1 体外 DNA 操作 所 使 用 的 主要 酶 ,它们 的 活性 和 应 用 酶 基本 性 质 和 应 用 Klenow 片 段 ( 大 肠 杆 菌 缺乏 5 一 3 外 切 酶 活性 聚合 酶 I 的 一 部 分 ， 用 于 一 般 的 DNA 合 成 ,如 随机 引物 标记 ,末端 补 平 ,cDNA 第 二 链 的 合成 ,引物 延伸 参见 复制 ) T4 DNA 聚合 酶 有 3 一 5 外 切 酶 活性 用 于 置换 标记 ,产生 DNA 平 头 末端 T7 DNA 聚合 酶 快速 和 高 的 进行 性 修饰 译本 ,测序 酶 (sequenase) 缺乏 5 一 3 外 切 酶 活性 ,用 于 DNA 测序 热 温 定 DNA 聚合 酶 (如 在 高 温 下 发 挥 功能 Za DNA 育 合 酶 ) 用 于 PCR ,并 在 DNA 二 级 结构 成 为 主要 问题 时 使 用 反 转 录 酶 RNA 依赖 的 DNA 聚合 酶 活性 用 于 cDNA 第 一 链 的 合成 ,RNA 测 序 RNA 聚合 酶 (T7、T3、 强 启动 子 专 一 性 DNA 依赖 的 RNA 聚合 酶 SP6) 用 于 体外 转录 ,RNA 标 记 限制 性 内 切 酶 顺序 专 一 性 DNA 内 切 酶 ,有 超过 1000 种 商品 化 用 于 克隆 作 图 和 制备 DNA 片 段 SI1 核酸 酶 ,绿豆 核酸 酶 ” 单 链 专 一 性 DNA 内 切 酶 用 于 DNA:RNA 杂交 体 作 图 ,前 切 单 链 DNA RNA 酶 A 一 般 的 RNA 内 切 酶 用 于 将 DNA 中 污染 的 RNA 除去 DNA 酶 I 一 般 的 DNA 内 切 酶 在 DNA 中 导入 缺口 ,从 RNA 中 除去 污染 的 DNA T4 DNA 连接 酶 产生 磷酸 二 酯 键 用 于 粘 端 和 平 端 的 连接 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酶 移 去 DNA 和 RNA 的 5/ 磷酸 基 团 用 于 阻止 自身 连接 和 5 末端 标记 T4 多 核 苷 酸 激酶 在 DNA 和 RNA 加 上 5 “磷酸 基 团 用 于 5 末端 标记 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 不 依赖 模板 的 DNA 聚合 酶 用 于 3 末端 标记 和 加 尾 24.1 分 子 克 隆 分 子 克 隆 的 基本 原则 ”分 子 克隆 是 体内 产生 大 量 特定 DNA 片段 的 技术 。 过 程 中 主要 有 四 步 (图 24.1): (1) 构 建 重组 载体 ,涉及 剪 切 修饰 和 供 体 DNA 与 载体 在 体外 的 连接 ; (2) 将 重组 载体 导 人 合适 的 宿主 细胞 中 ; (3) 含 有 载体 的 细胞 选择 性 增殖 (此 是 克隆 阶段 ) ; (4) 抽 提 和 纯化 克隆 的 DNA。 99 “ 剪 切 和 连接 重组 载体 要 DNA 0 2 涂 布 | 分 离 载体 DNA 截 体 复制 | 并 纯化 插 人 片段 及 细胞 坛 生 单个 区 的 \\\ 有 上 的 菌落 或 哈 菌 班 形成 图 24.1 分 子 克隆 的 原理 。 被 克隆 的 供 体 DNA 连接 到 载体 中 ,产生 一 个 重组 分 子 。 这 个 分 子 被 导 和 人 宿主 细胞 ,细胞 涂 布 在 固体 培养 基 上 。 重 组 载体 随 细胞 增生 而 扩 增 ， 克隆 可 以 通过 菌落 或 噬 菌 斑 被 鉴定 。 单 个 克隆 被 挑 出 , 接 人 液体 培养 ,从 中 可 以 分 离 得 到 大 量 纯 系 重组 DNA。 剪 切 、 修 饰 和 连接 DNA 分 子 DNA 可 以 被 很 多 机 械 、 化 学 或 酶 学 方法 随机 剪 切 , 处 理 的 程度 决定 了 产生 片段 的 平均 大 小 ( 表 24.2) ,这 些 方法 可 以 用 来 产生 随机 的 重 玲 的 基因 组 DNA 片 段 ,其 中 只 有 用 限制 性 酶 才 可 以 产生 精确 的 特定 片段 ( 文 框 24.1) ,细菌 内 切 酶 可 以 识别 短 的 限制 性 位 点 (restriction site)。 大 多 数 II 型 限制 性 酶 识别 的 限制 性 位 点 是 二 重 对 称 的 ,在 每 条 DNA 链 的 半数 识别 序列 的 同样 位 点 剪 切 磷酸 二 酯 键 。 少 数 酶 在 对 称 轴 上 前 切 ,产生 平 端的 片段 ,但 大 多 数 剪 切 位 点 不 在 对 称 轴 处 ,所 以 产生 的 片段 有 互补 的 单 链 突出 端 ( 粘 端 或 粘性 末端 )( 图 24.2)。 通 过 氢 键 ,这 些 片段 能 与 其 他 同样 酶 (或 有 同 样 专 一 性 的 酶 ) 产 生 的 DNA 片段 连接 。 每 个 片段 未 端 突出 间 的 碱 基 配 对 , 随 之 它们 能 被 DNA 连接 酶 (DNA ligase) 有 效 地 连接 起 来 (图 24.2)。 克隆 的 最 简单 策略 是 用 同样 的 限制 性 内 切 酶 作用 供 体 和 载体 DNA, 并 用 DNA 连接 酶 连接 。 然 而 这 样 可 使 载体 在 没有 插入 片段 情况 下 重新 环 化 ,产生 高 背景 的 非 重组 载体 。 有 两 种 方法 可 防止 载体 的 自我 连接 :中 打开 的 载体 用 碱 性 磷酸 酶 (alkaline phosphatase) 去 磷酸 化 一 一 连接 需要 线性 化 载体 的 5 磷酸 基 团 ,如 果 此 磷酸 基 团 被 去 除 , 载 体 不 能 重新 环 化 除非 由 供 体 DNA 提供 5 磷酸 基 团 ;@ 载 体 和 供 体 用 一 对 限制 性 内 切 酶 产生 两 个 不 互补 的 末端 一 一 载体 不 能 重新 环 化 除非 缺口 由 同样 酶 所 产生 的 插 和 人 片段 来 填充 。 第 二 种 策略 略 高 一 筹 的 是 插 人 片段 的 方向 是 可 以 预定 的 (定向 克隆 ,directional cloning)。 *。， 300 ， 表 24.2 ”用 于 克隆 的 DNA 来 源 和 对 DNA 分 子 前 切 、 修 饰 和 连接 产生 重组 载体 的 策略 克隆 DNA 的 来 源 基因 组 DNA cDNA 以 前 分 离 的 克隆 ( 亚 克 隆 ) PCR 产物 化 学 合成 的 寡 核 苷 酸 DNA 剪 切 机 制 通过 机 械 剪 切 (超声 、 振 划 ) ` 化 学 处 理 ( 如 酸 / 碱 水 解 ) 或 非 专 一 性 的 内 切 酶 随机 剪 切 一 参差 不 齐 的 片段 用 顺序 专 一 性 的 限制 性 内 切 酶 剪 切 一 产生 平 端 或 粘 端 DNA 片段 末端 修饰 策略 以 T4 DNA 聚合 酶 未 端 补 平和 修整 一 平 端 片段 以 Klenow DNA 聚合 酶 部 分 末端 补 平一 可 变 粘 端 片 段 加 上 连接 区 再 用 限制 性 酶 消化 一 粘 端 片段 加 上 接头 一 粘 端 片段 DNA 连接 策略 粘性 未 端的 连接 平 端 连 接 同 聚 物 加 尾 也 见 表 21.1 PCR 亚 克 隆 策略 。 人 A ; cewrcF 一 3; 引 CTIAA 5 ja TREE 3 CTTAA G 了 B | 1 < 不 匹配 的 瓦 ndII 切 片段 5/ G 人 AATTC Egg 3 一 一 - 玫 G ACGCTT Egg 3 3# 志 - 田 jcmA CE 5 3 CTTAA 人 EECEESESES T4 DNA ligase | T4 DNA polymerase 5/ 3 汪 亲 人 丰 全 AT 3 5 GAATT AGCTT Eee 3 人 CTT 人 人 CG FE 己 “ 3/ CTTAA TCCGAA FE 5/ GAATTAGCTT Eee 3/ 到 CTTAATCGAA ESYSEESEEPSR - 图 24.2 DNA 的 剪 切 、 修 饰 和 连接 。(a)GAATTC 顺序 是 限制 性 内 切 酶 FoRI 的 识别 位 点 。 它 是 三 重 对 称 的 ( 即 每 条 链 的 顺序 从 5 一 3 方向 是 相同 的 ) ,但 前 切 位 置 (小 箭头 ) 不 在 对 称 轴 ( 虚 线 ), 所 以 产生 4 碱 基 的 5 突出 端 ,也 就 是 粘 端 。(b) 这 些 能 与 携带 相同 末端 的 外 源 片 段 ( 黑 线 ) 相 接 , 使 它们 能 被 DNA 连接 酶 连接 起 来 产生 重组 分 子 。(c) 如 果 有 不 配对 末端 的 外 源 片 段 ,一 种 策 略 是 用 T4 聚合 酶 使 二 者 未 端 变 成 平 端 再 连接 它们 。 其 他 连接 不 配对 末端 分 子 的 策略 在 文中 讨论 。 在 很 多 情况 下 ,合适 的 末端 不 能 有 效 连接 (如 供 体 和 载体 必须 用 不 匹配 的 酶 切 , 供 体 DNA 是 随机 前 切 ,末端 是 参差 不 齐 , 或 供 体 是 cDNA)。 在 这 样 的 情况 下 ,有 其 他 涉及 DNA 末 端 修饰 的 连接 策略 ( 表 24.2)。 一 个 常用 的 方法 是 通过 补 平 或 修整 突出 末端 产生 平 端 。 喉 菌 体 T4 DNA 聚合 酶 同时 有 这 两 个 功能 ,经 常用 来 产生 平头 末端 片段 。 平 头 末 5 309。 端的 连接 比 粘 端 连接 效率 低 , 且 没有 方向 性 ,但 对 大 多 数 亚 克隆 来 说 这 样 的 效率 已 是 足够 了 。 另 一 种 策略 是 在 供 体 或 载体 DNA 末端 上 加 连接 体 或 接头 。 连 接 体 (linkers) 是 双 链 窒 核 苷 酸 ,在 这 种 情况 下 ,含有 限制 性 酶 切 位 点 。 它 可 以 连接 到 平 端 供 体 DNA 上 ,再 用 限制 性 内 切 酶 作用 产生 适合 连接 的 粘 端 片 段 。 接 头 (adaptors) 是 已 经 限制 性 酶 消化 后 的 连接 体 。 将 一 个 接头 连接 到 平 端 供 体 DNA 产生 一 个 不 需要 限制 性 酶 处 理 的 适合 连接 的 片段 ;这 在 当 供 体 DNA 内 部 含有 所 使 用 的 限制 性 酶 切 位 点 时 经 常 使 用 。 将 供 体 和 载体 DNA 连接 的 另 一 种 可 能 的 方法 是 通过 同 聚 物 加 尾 (homopolymer tailing)。 平 端 或 参差 不 齐 的 供 体 DNA 通过 末端 脱氧 核 音 酸 转 移 酶 (参阅 ) 在 每 条 链 的 3 末端 加 上 核 苷 酸 序列 (加 尾 )。 如 果 在 反应 中 只 加 入 一 种 核 苷 酸 , 则 形成 同 聚 物 尾 巴 。 在 线性 化 载体 每 条 链 的 3 末端 可 以 加 上 互补 的 同 聚 物 尾巴 。 当 两 者 混合 ,尾巴 间 的 碱 基 配对 形成 松弛 的 环 。 这 样 的 形式 可 以 被 转化 到 细菌 中 ,在 体内 被 修复 。 克隆 载体 分子 克隆 涉及 在 宿主 细胞 中 通过 复制 来 扩 增 供 体 DNA。 然 而 ,因为 供 体 DNA 一 般 缺 乏 复制 起 始点 , 它 必 须 与 一 个 合适 的 复制 子 连 接 ,以 有 利于 克隆 。 这 样 的 复 制 子 称 为 克隆 载体 (cloning vector) , 它 是 质粒 、 病 毒 或 染色 体 的 衍生 物 。 理 想 的 克隆 载体 应 有 如 下 属性 : (1) 它 们 是 游离 的 ,也 就 是 说 它们 并 不 整合 到 宿主 基因 组 中 ,所 以 它们 能 够 较 容 易 地 从 大 量 染 色 体 DNA 中 被 分 离 出 来 ; (2) 它 们 能 自主 复制 ,达到 很 高 的 拷贝 数 ,这 样 有 利于 所 携带 的 任何 外 源 DNA 的 扩 增 ; (3) 它 们 使 携带 载体 的 细胞 从 那些 缺乏 载体 细胞 中 选择 出 来 ; (4) 它们 使 携带 载体 的 细胞 能 从 那些 带 有 非 重组 载体 的 细胞 中 被 选择 出 来 ; ($) 它 们 有 通用 性 ,有 便于 插入 的 单一 克隆 位 点 和 有 利于 克隆 后 下 游 操 作 的 辅助 功能 。 自然 的 质粒 和 噬菌体 不 是 好 的 载体 ,因为 它们 缺乏 克隆 的 通用 性 。 发 展 载体 的 重要 起 始 步骤 是 构建 含 单一 限制 性 酶 切 位 点 (克隆 位 点 ) 的 质粒 ,这 样 使 供 体 DNA 能 插入 特 定 的 位 置 ,而 不 丢失 载体 顺序 。 理 想 的 情况 是 这 些 位 点 处 于 一 个 可 选择 或 可 见 的 标记 基 因 中 ,通过 插 人 失 活 有 利于 重组 体 的 筛选 。 目 前 大 多 数 载 体 有 多 克隆 位 点 (multiple cloning sites) 或 多 位 点 接头 (polylinker) ,它们 是 一 簇 单 一 的 限制 性 酶 切 位 点 ,为 用 不 同 内 切 酶 制备 的 供 体 DNA 导入 提供 了 方便 的 位 置 。 不 同 的 载体 系统 用 来 区 隆 不 同 目的 不 同 大 小 DNA 片段 ( 表 24.3)。 一 般 目 的 质粒 载 体 用 来 亚 克 隆 和 下 游 操 作 ,因为 它们 分 子 量 小 ,易于 操作 , 且 非 常 通用 。 质 粒 载体 携带 标 记 用 来 选择 转化 细胞 ,能 在 选择 性 培养 基 中 形成 菌落 。 鸣 菌 体 和 载体 用 来 构建 DNA 文 库 , 因 为 它们 比 质粒 容量 更 大 ,在 长 期 保存 中 更 稳定 , 且 叭 菌 斑 比 菌落 更 容易 筛选 。 携 带 喉 菌 体 的 细胞 筛选 有 所 不 同 ,噬菌体 本 身 能 够 溶解 细菌 细胞 ,在 细菌 菌 苦 上 形成 噬 菌 斑 ， 喉 菌 体 是 根据 它 的 这 一 特性 筛选 的 。 很 多 载体 同时 拥有 喉 菌 体 和 质粒 的 特性 。 粘 粒 (cosmid) 是 携带 Xcos 位 点 的 质粒 ,能 够 被 包装 在 噬菌体 头 部 。 基 本 的 粘 粒 非常 小 ,所 以 这 些 载体 能 够 装载 很 大 的 供 体 DNA 片段 ,用 于 基因 组 文库 构建 和 重 登 群 作 图 (contig map- ping)( 参 阅 )。 噬 粒 (phagemids) 是 携带 M13 (或 类 似 ) 鸣 菌 体 的 复制 起 始点 的 质粒 ,这 样 在 以 反 式 提供 合适 的 喉 菌 体 功 能 时 ,使 质粒 能 够 作为 单 链 DNA 喉 菌 体 复制 。 这 样 产 生 单 链 DNA 的 载体 用 于 诸如 测序 、 体 外 诱 变 和 探 针 合成 。 最 后 噬 粒 是 复合 的 入 质粒 载体 人 插 和 人 载体 基本 上 含有 整个 质粒 。 这 样 的 载体 ,如 XZAP ,非常 通用 ,允许 在 叹 菌 体 载体 中 构 2 “ 建 cDNA 文库 ,作为 质粒 切 离 ,不 需要 亚 克 隆 ,易于 下 游 操 作 。 表 24.3 不 同 克隆 载体 系统 的 基本 性 质 和 应 用 一 般 目 的 克隆 载体 质粒 载体 基础 :在 多 拷贝 松弛 型 质粒 中 自然 发 生 。 大 多 数 现代 的 质粒 载体 是 基于 ColE1 复制 子 ( 见 第 20 章 质 粒 ) 导入 宿主 :通过 化 学 辅助 转化 、 电 转化 或 脂 质 体 转化 裸露 的 质粒 DNA 载体 筛选 :载体 携带 显 性 选择 标记 基因 ,也 就 是 说 抗生素 抗 性 标记 ,使 含 载体 的 细胞 能 在 选择 性 培养 基 上 形成 菌落 重组 筛选 :经 常用 选择 性 标记 或 可 见 标记 的 插 人 失 活 供 体 DNA 的 大 小 :0 一 20kbp, 尽 管 $ 一 10kbp 的 插入 片段 不 稳定 主要 的 应 用 : 亚 克 隆 和 下 游 操 作 、 cDNA 克隆 和 表达 评论 :大 多 数 质粒 载体 是 高 拷贝 载体 ,有 利于 供 体 DNA 的 扩 增 。 偶 尔 克隆 的 DNA 可 能 影响 宿主 细胞 ,如 消耗 宿主 编 码 的 转录 因子 等 ,一 些 低 拷贝 载体 (low copy number vector) 设 计 用 来 克隆 引起 剂量 敏感 的 序列 (有 害 序列 ) 。 一 些 低 拷贝 载体 提供 复制 的 诱导 控制 , 当 细 胞 数量 增加 足够 时 ,质粒 合成 可 以 爆发 (失控 载体 )。 质 粒 载体 进行 了 很 大 改进 以 有 利于 下 游 应 用 。 转 录 载 体 由 噬菌体 含 侧翼 多 克隆 位 点 的 启动 子 组 成 ,通过 体外 转录 产生 有 义 或 反 义 RNA。 大 肠 杆 菌 启动 子 能 被 用 于 促进 蛋白 的 过 量 表达 ,在 上 游 基 因 片 段 的 读 框 中 插 人 ,能 产生 融合 蛋白 和 触发 蛋白 的 分 沁 (参见 表达 克隆 ) 。 加 入 报告 基因 (参阅 ) 可 用 于 调节 元 件 的 分 析 。 来 自 其 他 物种 的 复制 起 始点 可 在 大 肠 杆菌 和 其 他 宿主 中 复制 和 维持 (参见 穿梭 载体 )。 另 见 噬 粒 及 下 文 噬 粒 载体 基础 :质粒 复制 子 加 上 鸣 菌 体 M13( 或 类 似 的 ) 复 制 起 始点 导 人 宿主 :与 质粒 一 样 载体 筛选 :与 质粒 一 样 重组 体 筛 选 :与 质粒 一 样 供 体 DNA 的 大 小 :与 质粒 一 样 主要 应 用 :产生 单 链 DNA 评论 :起 先 ,如 M13 和 引 l 单 链 DNA 叭 菌 体 是 用 来 产生 单 链 重组 DNA, 进行 测序 , 探 针 合成 等 。 这 些 噬菌体 是 很 简单 的 载体 ,缺乏 不 必要 基因 ,即使 中 等 大 小 的 插 和 人 片段 也 不 很 稳定 。 鸣 菌 体 的 复制 起 始点 使 质粒 由 一 个 助 噬菌体 以 反 式 方 式 提 供 喉 菌 体 功 能 时 作为 单 链 DNA 叭 菌 体 基 因 组 复制 。 噬 粒 将 质粒 的 通用 性 与 噬菌体 产生 单 链 DNA 的 能 力 结合 起 来 入 噬菌体 载体 基础 :和 噬菌体 导入 宿主 :裸露 的 叭 菌 体 DNA 的 转化 或 体外 包装 重组 噬菌体 进入 入 衣 壳 ,再 将 供 体 DNA 通过 自然 感染 途径 转 导 载体 筛选 :在 细菌 菌 苦 中 形成 鸣 菌 斑 重组 筛选 :插入 载体 一 一 通过 可 见 标记 的 插入 失 活 (cT 基因 的 阻 断 阻止 溶 原 性 ,产生 的 鸣 菌 斑 更 清晰 ;现代 的 载体 携 带 入 jac2 基因 ,可 进行 蓝 - 白 筛选 )。 置 换 载体 一 一 Spi 表 型 (对 P2 感染 敏感 性 消失 ) 是 中 心 “ 填 充 片段 ”ga 和 ye 基因 座 技 失 引 起 的 。 插 人 大 片段 的 正 选择 (如 果 基 因 组 野生 型 的 序列 小 于 75% ,和 叭 菌 体 不 能 形成 噬 菌 斑 ) 供 体 DNA 的 大 小 :插入 载体 一 一 0 一 10kbp; 置 换 载体 :9 一 23kbp。 插 人 大 小 范围 被 有 效 形成 喉 菌 斑 的 野生 型 基因 组 75% 一 105% 大 小 所 限制 主要 应 用 : 插 和 人 载体 一 一 cDNA 克隆 和 表达 文库 ; 喉 菌 体 展示 。 置 换 载体 一 一 基因 组 DNA 克隆 评论 :有 两 类 入 载体 。 揪 入 载体 有 单一 限制 性 酶 切 位 点 ,可 将 小 片段 DNA 加 进入 基因 组 。 噬 粒 ( 人 参阅 ) 是 含有 质粒 的 插 人 载体 。 置 换 载体 有 配对 的 位 点 限定 的 特点 填充 片段 ,填充 片段 含有 溶 原 和 重组 所 需 基因 ,不 需要 裂解 周期 的 基 因 。 填 充 片段 可 以 被 去 除 , 供 体 DNA 在 臂 间 插 人 粘 粒 载体 基础 :含有 入 鸣 菌 体 cos 位 点 的 质粒 导 和 宿主 :在 体外 将 重组 粘 粒 包 装 进 入 衣 壳 ,再 通过 正常 的 感染 途径 转 染 载体 筛选 :类 似 于 质粒 重组 筛选 :可 见 标记 插 人 失 活 和 小 片段 插 和 人 的 正 选 择 供 体 DNA 大 小 :30 一 45kbp。 揪 人 大 小 范围 被 有 效 形成 噬 菌 斑 的 野生 型 基因 组 73% 一 105% 所 限制 。 主要 应 用 :基因 组 文库 构建 评论 : 粘 粒 使 用 和 包装 位 点 进行 有 效 的 宿主 细胞 释放 和 大 片段 筛选 。 粘 粒 广泛 用 于 基因 组 作 图 和 重 亚 群 排列 ”过 网 二 续 表 24.3 大 容量 克隆 载体 细菌 人 工 染 色 体 [(bacterial artificial chromosomes，BACs, 养 粒 (fosmids) ] 基础 :大 肠 杆菌 质粒 导入 宿主 : 电 转 化 载体 筛选 : 显 性 选择 标记 重组 筛选 : 插 人 片段 大 小 供 体 DNA 大 小 : >300kbp 主要 应 用 :大 基因 组 分 析 评论 :低频 率 的 重 排 和 基 合 分 子 。 载 体 在 每 个 细胞 中 维持 一 个 或 两 个 拷贝 ,产生 少量 供 体 DNA P1 载体 和 P1 人 工 染 色 体 (P1 artificial chromosomes，PACs) 基础 :噬菌体 P1 导 人 宿主 :体外 包装 和 转 导 载体 筛选 : 显 性 选择 标记 重组 筛选 :有 多 种 一 一 在 一 个 系统 中 ,应 用 于 对 致死 标记 的 阻 断 进行 正 选择 供 体 DNA 大 小 :大 约 100kbp 主要 应 用 :大 基因 组 分 析 评论 :低频 率 的 重 排 和 散 合 分 子 。 载 体 维 持 低 拷贝 ,但 可 以 通过 诱导 鸣 菌 体 P1 产生 裂解 周期 而 扩 增 酵母 人 工 染色 体 (yeast artificial chromsomes，YACs) 基础 :酿酒 酵母 着 丝 粒 、 端 粒 和 自主 复制 序列 (染色 体 复 制 起 始点 ) 导 和 人 宿主 : 转 染 酵母 原生 质 体 载体 筛选 : 显 性 筛选 标记 (营养 缺陷 型 的 恢复 ) 重组 筛选 :插入 片段 大 小 供 体 DNA 大 小 : >2000kbp 主要 应 用 :大 基因 组 分 析 ,YAC 转基因 小 筷 ( 参 阅 ) 评论 :YAC 是 高 容量 克隆 载体 ,但 有 一 些 缺 点 ,包括 高 频率 的 自发 缺失 和 克隆 的 骨 合 化 。 重 组 载体 的 大 小 因 分 辩 率 的 原因 ,需要 电泳 分 析 , 有 时 难以 将 YACs 从 内 源 性 酵母 染色 体 中 分 离 。YAC 维持 在 低 拷 贝 (经 常 一 个 细胞 中 只 有 一 和 最 后 ,大 的 真 核 生物 基因 组 分 析 需 要 发 展 高 容量 的 载体 一 -人工 染 色 体 一 一 用 于 基 因 组 作 图 和 大 基因 和 基因 复合 物 的 结构 功能 的 分 析 。 酵 母 人 工 染 色 体 是 这 些 载体 中 的 最 完善 的 形式 ,拥有 最 大 的 容量 ,但 也 有 高 频率 的 克隆 散 合 化 (不 相关 供 体 DNA 片段 的 连 接 和 维持 )。 最 近 , 很 多 基于 细菌 质粒 的 人 工 染 色 体 载体 得 到 关注 。 它 们 比 YACs 容量 小 一 些 , 但 嵌 合 插入 少 很 多 。 DNA 导入 克隆 宿主 一旦 在 体外 构建 好 重组 载体 , 它 必 须 被 导 和 人 宿主 细胞 进行 克隆 。 大 肠 杆菌 是 一 般 目 的 克隆 的 主要 宿主 ,但 这 种 细菌 自然 情况 下 不 具有 从 周围 培养 基 中 吸 收 DNA 的 能 力 。 可 以 通过 化 学 处 理 产 生 有 这 种 能 力 的 人 工 状 态 ,如 与 二 价 阳 离子 一 起 孵育 。 一 个 短暂 的 热 休 克 刺 激 吸 收 DNA, 在 适宜 的 条 件 下 每 we 载体 DNA 产 生 107-? 细 菌 菌落 或 104 >, 喉 菌 斑 。 细 菌 吸 收 质粒 DNA 的 过 程 称 为 转化 (transformation) ,吸收 裸 露 的 噬菌体 DNA 为 转 染 (transfection ) ,尽管 两 种 情况 的 机 制 是 一 样 的 (转化 和 转 染 在 应 用 到 真 核 细 胞 时 是 不 同 的 途径 ,参见 表 24.11)。 电 穿孔 ( 电 转 化 ) 是 另 一 种 技术 ,DNA 通 过 短暂 的 高 电压 产生 的 孔 进 入 细胞 。 这 也 是 细胞 导入 DNA 的 有 效 方法 ,每 尼 载 体 DNA 可 以 产生 10? 的 菌落 。 这 对 如 BACs 这 样 的 低 拷贝 质粒 尤其 重要 。 尽管 这 些 技术 对 亚 克 隆 已 经 足够 了 ,但 入 喉 菌 体 文 库 构 建 需 要 更 高 效 的 DNA 转移 。 喉 菌 体 和 喉 粒 载体 能 够 通过 转 导 (transduction ) 被 高 效 转移 ,这 涉及 先 将 载体 包装 在 入 鸣 。，304 。 se 一 菌 体 的 头 部 (体外 包装 )。 这 通过 重组 载体 DNA 与 噬菌体 头 前 体 、. 尾 巴 和 包装 蛋白 混合 ， 然后 以 包装 好 的 克隆 感染 细菌 进行 培养 。DNA 通过 正常 的 鸣 菌 体感 染 途 径 进 入 细胞 ,每 民 载 体 DNA 可 以 产生 104 个 菌落 ( 鸣 菌 粒 ) 或 噬 菌 斑 (和 噬菌体 ) 。 DNA 导入 酵母 细胞 在 文 框 24.4 中 讨论 ,DNA 导入 动物 和 植物 细胞 在 表 24.90 中 讨论 。 载体 和 重组 筛选 ”无论 是 DNA 操作 还 是 基因 转移 过 程 都 不 是 100% 有 效 的 。 这 样 在 任何 克隆 实验 的 开始 ,都 会 有 大 量 缺 乏 载体 和 含 载体 的 细胞 ,中 度 比 例 的 细胞 含 非 重组 的 载体 。 空 细胞 和 非 重组 细胞 可 在 以 牺牲 重组 群体 为 代价 的 情况 下 增生 ,所 以 希望 鉴定 和 去 除 这 些 细 胞 。 载体 筛选 是 对 携带 载体 细胞 的 筛选 一 一 经 常 是 正 的 和 直接 筛选 ,也 就 是 说 载体 具有 或 赋予 细胞 一 种 可 筛选 的 属性 。 转 化 质粒 载体 的 细菌 细胞 通过 质粒 携带 的 显 性 抗生素 抗 性 标记 进行 阳性 筛选 ,有 效 地 维持 含 质 粒 细胞 的 群体 。 在 真 核 系 统 中 用 另 一 种 标记 ,如 营 养 缺 陷 型 (参阅 ) 的 恢复 经 常用 于 酵母 中 筛选 YACs, 尽管 这 需要 特殊 的 营养 缺陷 型 酵母 菌株 。 对 鸣 菌 体 载 体 而 言 ,噬菌体 本 身 可 以 通过 在 细菌 菌 苦 中 裂解 细胞 形成 喉 菌 斑 的 能 力 来 筛选 。 重组 筛选 是 在 携带 非 重 组 载体 细胞 中 选择 含 重组 载体 细胞 。 根 据 载 体 类 型 有 很 多 不 同 的 筛选 系统 可 以 应 用 。 重 组 质粒 经 常 通过 插 和 人 灭 活 第 二 个 标记 ,或 第 二 个 抗生素 抗 性 标记 (在 筛选 步 又 中 需要 影印 培养 的 过 程 ) 或 一 个 可 见 的 标记 。 目 前 普遍 的 策略 是 蓝 -- 白 斑 筛 选 。 质 粒 携带 一 个 无 功能 的 ,截断 的 rec2 等 位 基因 ,编码 B- 半 乳 糖苷 酶 的 N 端的 小 片段 , 称 为 w- 肽 。 这 可 以 通过 编码 多 肽 其 余部 分 的 等 位 基因 得 到 互补 ,这 在 如 JMI101 等 特别 修饰 的 宿主 菌 中 存在 (- 互补 )。 有 功能 的 B- 半 乳 糖苷 酶 将 无 色 的 底 物 X-gal( 见 表 24.7) 转 变 成 蓝 色 沉淀 。 人 iec2 基因 含 内 在 的 多 接头 区 , 供 体 DNA 插 人 造成 失 活 。 在 正确 的 检测 培养 基 中 ,从 白色 菌落 中 得 到 重组 细胞 和 蓝 色 菌 落 中 为 非 重组 细胞 。 一 些 直 接 负 选 择 质粒 是 根据 第 二 个 标记 基因 的 条 件 致 死 性 设计 的 ,使 含 非 重组 质粒 的 细胞 在 根 据 它们 对 标记 失去 敏感 的 特性 ,在 限制 性 条 件 下 被 反 筛 选 。 然 而 ,很 多 这 样 的 载体 需要 少 有 的 特殊 宿主 菌株 和 筛选 体系 。 重组 和 插入 载体 经 常 是 可 见 选 择 (或 阻 断 cI 基因 一 一 阻止 溶 原 性 ,产生 更 清晰 的 鸣 菌 班 一 一 或 阻 断 上 面 所 讨论 的 入 ec2 基因 )。 重 组 和 置换 载体 根据 它们 能 感染 那些 对 P2 喉 菌 体 溶 原 化 的 细菌 和 供 体 DNA 的 大 小 具有 两 种 正 选 择 。 野 生 型 的 噬菌体 有 Spi 表 型 ,因为 它们 对 P2 感染 敏感 ,也 就 是 说 它们 不 会 感染 已 经 被 噬菌体 P2 感染 的 细胞 。 这 种 敏感 性 是 由 于 填充 片段 的 gx 和 ed 基因 座 提供 的 ,填充 片段 可 以 被 供 体 DNA 切除 和 置换 。 因 此 只 有 重组 载体 才能 在 P2 溶 原 中 形成 噬 菌 斑 。 另 外 ,入 只 有 在 重组 基因 组 是 野生 型 基因 组 大 小 的 73% 一 105% 时 ,才能 形成 感染 颗粒 。105$% 的 上 限 表 明了 插 人 和 置 换 载体 的 最 大 插 人 片段 大 小 。 非 重组 插 人 载体 的 基因 组 大 约 是 野生 型 的 100% , 而 缺乏 填充 片段 的 非 重组 置换 载体 由 于 低 于 75% ,不 能 形成 噬 菌 斑 。 同 样 的 原则 适用 于 粘 粒 载 体 , 因 为 它们 在 叭 菌 体 头 部 中 进行 包装 :载体 筛选 像 常规 质粒 载体 一 样 依赖 于 抗生素 抗 性 ,但 重组 筛选 依赖 于 类 似 标准 和 载体 的 插 和 人 片段 大 小 。 1) 原文 误 写 为 表 24.10。 一 一 译 者 注 ”8 并 不 总 是 需要 对 重组 载体 进行 筛选 的 。 在 一 个 简单 的 亚 克 隆 实验 中 ,连接 反应 可 以 被 控制 ,只 产生 很 少量 的 非 重组 体 背 景 , 这 样 随机 挑选 菌落 得 到 所 想 要 的 克隆 的 可 能 性 很 大 。 同 样 , 当 菌落 或 和 叭 菌 斑 是 用 来 杂交 分 析 时 , 非 重 组 体 不 能 与 探 针 杂交 ,在 进一步 分 析 中 可 以 被 去 除 (参见 菌落 筛选 , 菌 斑 挑 出 ) 。 克隆 的 DNA 的 恢复 ”在 重组 DNA 导入 宿主 细胞 后 ,细胞 培养 较 短 时 间 就 能 恢复 和 涂 血 ( 在 固体 培养 基 上 涂 布 ) ,在 合适 的 选择 条 件 下 形成 菌落 或 噬 菌 斑 。 经 常 ,每 个 菌落 或 鸣 菌 斑 代 表 了 相同 细胞 或 噬菌体 的 克隆 ,能 够 被 挑 出 (从 平板 上 移出 ,转移 到 ) 在 液体 培养 基 中 进行 第 二 轮 克隆 (这 次 从 其 他 克隆 中 分 离 )。 平 板 接种 是 对 异 源 重 组 载体 群体 分 级 分 离 成 同 源 克隆 ,在 平均 水 平 上 ,每 一 个 宿主 细胞 有 一 种 重组 分 子 。 平 板 接种 还 是 DNA 文库 筛选 的 关键 步骤 ,在 这 过 程 中 ,每 一 个 菌落 或 吻 菌 斑 代 表 了 基因 组 的 不 同 部 分 或 不 同 的 cDNA。 分 子 克隆 的 最 后 步骤 是 所 克隆 DNA 的 恢复 。 传 统 的 方法 涉及 细胞 裂解 ,及 一 系列 选择 性 沉淀 、 沉 降 分 离 步 又 ,是 费时 费力 费 钱 的 。 最 近 的 创新 包括 了 通过 玻璃 珠 或 树脂 对 DNA 的 吸附 。 很 多 商品 化 的 方便 试剂 盒 能 在 几 小 时 内 从 细胞 中 得 到 大 量 纯 的 质粒 或 鸣 菌 体 DNA。 24.2 基因 分 离 的 策略 从 简单 和 复杂 来 源 中 分 离 DNA 片段 ”上面 讨 论 一 些 使 任何 DNA 顺序 插 人 载体 和 克 隆 化 的 技术 ,以 有 利于 进一步 的 分 析 和 操作 。 在 来 源 DNA 不 复杂 的 情况 或 特定 顺序 高 度 富 集 的 情况 ,直接 分 离 所 要 的 供 体 DNA 片段 ,将 它 插 入 载体 进行 克隆 是 可 能 的 。 这 在 来 自 小 基因 组 中 基因 组 DNA 片段 (例如 质粒 一 些 病 毒 和 动物 线粒体 ) 和 已 经 获得 的 克 隆 、PCR 产物 和 特定 组 织 中 代表 性 的 高 度 富 集 的 EDNA( 如 珠 和 蛋白、 卵 清 蛋白 ) 中 有 应 用 。 在 更 多 的 情况 中 ,特定 目标 序列 的 来 源 是 很 复杂 的 (例如 人 类 基因 在 基因 组 DNA 中 平均 是 百 万 分 之 一 )。 这 就 需要 构建 一 个 DNA 文 库 ,汇集 特定 来 源 的 所 有 克隆 在 载体 中 DNA 片 段 。 文 库 主要 有 两 类 :从 所 有 基因 组 DNA 中 制备 的 基因 组 文库 (genomic li- braries) 和 由 mRNA 分 子 反 转 录制 备 的 EDNA 文库 (cDNA libraries)。 在 多 余 序 列 的 背景 中 (通常 是 大 量 的 ) 需 要 通过 称 为 筛选 (screening) 的 过 程 鉴别 出 感 兴趣 的 序列 。 根 据 所 提 供 的 信息 选择 筛选 方法 ( 表 24.4)。 基因 组 文库 ”基因 组 文库 的 大 小 (代表 整个 基因 组 所 需要 的 单个 克隆 的 数量 ) 不 仅 依赖 于 供 体 DNA 片段 的 平均 大 小 和 基因 组 的 大 小 ,而 且 依 赖 于 基因 组 中 特定 区 域 出 现 的 概 率 。 基 于 每 个 顺序 出 现 一 次 的 原则 ,文库 构建 并 不 简单 。 因 为 不 同 的 克隆 效率 和 载体 构 建 和 基因 导 和 人 宿主 细胞 时 取样 误差 ,而 存在 有 些 序列 出 现 不 止 一 次 而 有 些 根本 不 出 现 的 情况 。 也 有 一 些 重 春 的 片段 的 存在 ,这 样 有 利于 排列 克隆 重 笃 群 而 产生 完整 的 物理 图 谱 和 基因 序列 ( 见 基因 结构 和 作 图 )。 平 均 大 小 适当 的 重 又 片段 可 以 通过 基因 组 DNA 的 随 机 剪 切 或 用 四 碱 基 限 制 性 内 切 酶 的 少量 消化 (这 些 酶 切 位 点 在 DNA 中 有 很 多 ,分 布 非常 随机 ,通过 在 这 些 位 点 罕有 的 剪 切 产生 随机 和 重 和 至 的 片段 )。 后 一 种 策略 更 方便 ,因为 片 段 末 端 是 粘性 的 , 供 体 DNA 可 以 直接 与 载体 连接 。 “306 ” TS ed 表 24.4 根据 所 提供 的 来 源 和 信息 ,从 cDNA 或 基因 组 文库 中 分 离 基因 的 策略 所 提供 的 信息 筛选 策略 功能 克隆 一 一 不 需要 表达 转录 本 在 特定 来 源 组 织 中 高 度 “丰富 克隆 一 一 从 cDNA 文库 中 随机 选择 克隆 ,测序 确定 产物 富 集 部 分 核 苷 酸 顺 序 已 知 用 守 核 苷 酸 探 针 筛选 * 可 用 的 部 分 克隆 (如 用 cDNA 筛 。” 在 低 严 格 条 件 * 下 用 克隆 的 片段 或 同 源 基 因 筛 选 。 选 基因 组 文库 ) ,或 根据 同 源 性 筛选 相关 克隆 序列 已 知 部 分 多 肽 序列 用 简 并 性 寡 核 苷 酸 i[ 猜 测 体 *(guessmers) ]2 筛 选 文库 两 种 组 织 中 差异 表达 加 减 筛选 通过 消减 杂交 * 可 得 到 富 含 差 异 表达 克隆 的 丰富 文库 (参见 差异 克隆 ) 涉及 cDNA 表达 的 功能 克隆 提供 突变 通过 对 突变 表 型 的 互补 筛选 ( 表 型 恢复 ) 提供 抗体 用 免疫 检测 筛选 文库 特殊 特性 的 产物 通过 特殊 技术 筛选 文库 ,如 对 DNA 结合 蛋白 的 southwestern 杂交 ,相互 作用 和 蛋 定位 克隆 白 的 酵母 双 杂 交 体 系 ( 人 参阅) ,通过 酶 转化 底 物 提供 结构 突变 如 果 突 变 由 缺失 引起 ,从 基因 组 消减 文库 克隆 (参见 差异 克隆 ) 由 转 座 子 插 人 引起 的 突变 如 果 突 变 由 转 座 因 子 的 插 人 而 引起 ,用 转 座 子 序列 作为 探 针 筛选 突变 体 文 库 ， 通过 质粒 拯救 分 离 克 隆 (参见 转 座 子 标记 、 质 粒 拯救 ) 基因 在 染色 体 上 的 位 置 通过 与 标记 或 染色 体 断 点 相连 接 的 染色 体 步 移 (chromosome walking, 人 参阅) 定 位 克隆 ,标记 可 能 是 增强 子 包 载 载体 (参见 ) 的 转 座 因 子 非 筛 选 方法 基因 组 作 图 和 测序 对 跨越 整个 基因 组 的 克隆 进行 系统 化 分 析 ( 见 基因 结构 和 作 图 ) 表达 序列 标记 对 随机 cDNA 克隆 的 大 量 克 隆 和 分 析 ( 参 见 表 达 序 列 标记 ) a 以 PCR 为 基础 的 方法 也 可 应 用 (参见 第 21 章 PCR)。 下 面 的 公式 用 来 预测 克隆 的 总 数目 六 ,能 以 概率 妨 获 得 达到 文库 包含 了 所 有 序列 的 可 能 性 ,” 是 覆盖 基因 组 一 次 理论 上 要 得 到 的 克隆 数目 ,也 就 是 基因 组 当量 (genome equivalent) : 二 好 人 ln(1 一 1Xz ) 预期 序列 有 95% 的 可 能 性 包括 在 文库 中 需要 预测 3 一 4z 的 克隆 ,而 达到 99% 的 可 能 性 (经 常 是 最 佳 标准 ) ,文库 必须 包含 4 一 5z 克隆 。 构 建 在 入 载体 上 的 一 个 大 肠 杆菌 基因 组 文库 (平均 插入 大 小 为 20kbp) 需 要 800 一 1000 个 克隆 ,而 相对 的 人 的 文库 需要 大 于 0.5 百 万 克隆 才能 达到 同样 的 概率 含有 特定 的 基因 。 文库 大 小 可 以 通过 用 构建 在 大 容量 载体 (如 粘 粒 或 人 工 染 色 体 ) 上 的 大 插入 片段 作为 起 始 筛选 来 降低 。 如 果 所 待 测 基因 染色 体位 置 已 知 , 有 可 能 通过 分 离 单个 染色 体 并 构建 染色 体 专 一 性 基因 组 文库 (chromosome-specific genomic libraries) ,从 中 进行 克隆 。 染 色 体 分 离 可 以 通过 荧光 激活 的 染色 体 分 选 (fluorescence-activated chromosome sorting，FACS ) 达到 ,分 离 染色 体 是 根据 染色 体 与 特定 染料 的 不 同 结合 能 力 , 或 用 单 娄 色 体 体 细 胞 杂交 (参阅 )。 同 样 有 可 能 产生 染色 体 特 定 区 域 的 文库 ,或 是 用 含 缺 失 的 染色 体 作 为 文库 构建 的 材料 ,或 是 通过 染色 体 显 微 解剖 (chromosome microdissection ) 。 cDNA 文库 cDNA 是 互补 DNA, 也 就 是 说 与 mRNA 互补 的 DNA。cDNA 文库 是 通过 1) 用 于 基因 克隆 的 低 简 并 性 赛 核 苷 酸 探 针 ,其 序列 按 已 知 的 氨基 酸 序列 推导 ,但 仅 采 纳 据 猜 测 最 可 能 与 目的 基 因 配 对 的 密码 子 。 一 一 译 者 注 “有 有” 反 转 录 的 mRNA 群体 ,并 制备 双 链 cDNA (double stranded cDNA) 来 构建 的 。 这 样 cDNA 文库 在 顺序 表现 度 .基因 序列 结构 和 所 使 用 的 筛选 方法 上 与 基因 组 文库 不 同 : (1)cDNA 文库 代表 了 mRNA 的 来 源 , 其 中 一 些 特定 的 转录 本 丰富 而 另 一 些 很 少 。 这 样 不 像 基 因 组 文库 ,理论 上 均等 地 代表 了 所 有 基因 序列 ,cDNA 文库 对 一 些 顺 序 相 对 丰 富 而 另 一 些 缺 乏 。cDNA 文库 可 用 来 分 离 丰 富 的 cDNAs, 而 另 一 方面 分 离 稀 少 转录 本 的 EDNASs 是 困难 的 。 从 不 同 细 胞 类 型 (或 不 同 发 育 阶 段 ,或 不 同 处 理 的 细胞 ) 制 备 的 cDNA 文库 会 包含 一 些 共 同 序 列 和 一 些 独特 序列 。 这 可 被 用 于 分 离 差 异 表达 的 基因 (参见 差异 克隆 )。 (2)cDNA 文库 代表 的 是 表达 的 DNA, 它 们 缺乏 内 含 子 、 调 节 元 件 和 基因 间 DNA。 在 研究 基因 结构 和 调节 中 cDNA 文库 用 处 不 大 ,但 它 一 般 比 基因 组 克隆 要 小 , 且 真 核 生 物 cDNA 可 以 在 细菌 中 表达 (它们 不 能 剪接 内 含 子 )。 不 同 的 剪接 产生 不 同 的 但 部 分 重 丢 的 cDNA 克隆 。 (3) 基 因 组 文库 通过 杂交 筛选 。 而 因为 cDNA 可 以 在 细菌 中 表达 ,表达 文库 (参阅 ) 可 用 于 多 种 筛选 策略 ,如 免疫 筛选 和 互补 筛选 ( 表 24.4)。 制备 一 个 cDNA 文库 (图 24.3) 涉 及 分 离 代 表 细 胞 中 主要 mRNA 的 poly(A)”RNA (rRNA 和 tRNA 因 其 丰富 和 大 小 的 一 致 性 ,可 以 通过 分 级 分 离 直接 分 离 )。Poly(A) RNA 的 选择 可 以 通过 多 抽 提 核糖 体 得 到 或 者 更 经 常 的 是 将 细胞 总 RNA 经 过 一 个 基质 上 含有 多 尿 喀 啶 或 多 胸腺 喀 啶 的 柱子 ( 亲 和 选 择 ) 来 分 离 。 纯 化 的 poly(A) -RNA 然后 被 反 转录 。 一 个 共同 的 策略 是 用 oligo(dT) 引 物 引发 EDNA 第 一 链 的 合成 用 ,尽管 这 样 最 终 文 库 倾 向 于 产生 3 末端 ,因为 长 的 mRNA 没有 被 完全 反 转 录 。 另 一 种 策略 是 使 用 随机 六 核 苷 酸 引物 ,在 所 有 RNA 的 随机 位 置 退火 ,产生 重 雪 的 cDNA 片段 ,最 终 可 以 组 建成 全 长 cDNA。 第 二 链 cDNA 的 合成 是 可 被 自身 引发 的 ,因为 第 一 链 倾向 于 折 回 形成 发 夹 。 这 可 用 于 cDNA 的 定向 克隆 (图 24.3) ,但 会 丢失 一 些 $ "顺序 。 一 个 更 有 效 的 方法 是 在 cDNA 第 一 链 加 尾 ( 如 多 聚 胞 喀 啶 ) ,然后 用 oligo(G ) 为 引物 起 始 第 二 链 的 合成 。 这 样 产生 的 双 AAAAAAAA 。 mRNA (a) 随机 六 碱 基 (b) 窒 聚 (dT) 引 物 第 一 条 cDNA 链 的 合成 AAAAAAAA AAAAAAAA 人 INNNNN sTTTTTTTT (c) 发 夹 引物 (d) 同 聚 物 加 尾 反 应 第 二 条 cDNA 链 的 合成 TTTTTTTT 666666 一 一 TTTTTTT CCCCCC | 加 接头 1 | | 切除 发 夹 通过 以 下 途径 将 全 长 cDNA 插入 载体 中 ; 一 一 rmrca (0) 平 端 克隆 GD) 加 接 3 | 加 接头 2 (ii 进一步 进行 同 聚 物 加 尾 反应 ETF 一 一 一 从 人 ICETCI 通过 酶 切 接头 进行 定向 克隆 图 24.3 cDNA 克隆 。cDNA 第 一 链 的 合成 是 用 (a) 随 机 六 碱 基 或 (b) 寡 聚 (T) 引 物 通过 反 转 录 poly(A)*RNA。 第 二 链 的 合成 可 以 用 (c) 自 身 引 物 或 (d) 第 一 链 的 加 尾 的 互补 引物 。 自 身 引物 由 于 核酸 酶 的 处 理会 失去 一 些 5$ 顺序 ,但 使 定向 克隆 成 为 可 能 。DNA 以 粗 线 表 示 ,RNA 以 细 线 表示 。 5 链 cDNA 可 以 通过 加 接头 连接 物 或 同 聚 尾巴 插 人 载体 。 筛选 策略 经典 的 筛选 策略 需要 基因 的 生化 知识 或 一 些 序列 信息 ,或 者 利用 产物 的 性 质 能 够 使 基因 在 表达 文库 中 分 离 。 这 些 应 用 列 在 表 24.4 功能 克隆 (function cloning ) 中 ， 不 需要 任何 关于 基因 的 位 置 情况 。 相 对 的 方法 是 定位 克隆 (positional cloning ) ,是 无 需 任 何 生化 或 功能 信息 ,但 要 了 解 染 色 体 图 谱 中 大 致 位 置 的 基因 分 离 。 尽管 功能 克隆 和 和 定位 克隆 的 策略 都 是 有 用 的 ,但 基因 分 离 还 是 艰 若 的 工作 ,它们 正 被 最 近 发 展 的 工厂 式 非 筛选 策略 (nonscreening strategies) 所 取代 ,这 种 策略 涉及 系统 化 克隆 和 分 析 基 因 组 DNA 和 cDNA。 这 已 被 基因 组 计划 中 出 现 的 知识 和 人 类 表达 序列 标记 ( 参 阅 ) 的 分 析 所 证 实 ( 见 基因 结构 和 作 图 ) 。 功能 克隆 ”功能 克隆 策略 可 以 分 为 三 个 方面 :四 利用 序列 信息 一 一 这 不 需要 克隆 基因 的 表达 ;G@ 利 用 基因 表达 的 信息 一 一 这 不 需要 克隆 基因 的 表达 ;和 人 @@ 利 用 蛋白 功能 一 一 这 需要 克隆 基因 的 表达 ,只 适用 于 cDNA 文库 。 传统 的 序列 为 基础 的 方法 包括 用 部 分 序列 信息 通过 杂交 分 离 克隆 ( 见 文 框 24.3)。 一 个 简单 的 例子 是 用 cDNA 克隆 分 离 相关 的 基因 组 克隆 或 反之 亦 然 。 另 一 种 情况 ,克隆 可 以 通过 已 经 克隆 的 与 其 有 同 源 性 但 不 完全 一 样 的 序列 (如 同一 个 多 基因 家 族 中 的 另 一 个 成 员 ,或 不 同 物种 中 的 类 似 基因 ,或 高 度 保 守 的 组 件 , 如 同 源 异 形 盒 ) 进 行 分 离 。 如 果 多 肽 序列 已 知 , 寡 聚 核 苷 酸 探 针 可 以 根据 对 应 的 核酸 序列 设计 ,这 种 情况 存在 一 些 简 并 性 (参阅 ) 因 此 必须 考虑 到 在 探 针 设计 中 编码 同样 肽 段 的 所 有 可 能 的 密码 子 。 利用 基因 表达 信息 ,而 不 需要 克隆 确实 被 表达 的 方法 ,是 用 特定 EDNA 克隆 表现 度 的 差异 ,反映 了 来 源 材料 中 对 应 RNA 的 丰富 度 。 这 样 的 方法 包括 特定 文库 中 极其 丰富 基 因 的 克隆 ( 富 集 克隆 ) 和 利用 文库 和 RNA 来 源 差 异 来 分 离 差 异 表 达 的 基因 (参见 差异 克隆 )。 建立 在 cDNA 表达 上 的 筛选 策略 利用 编码 多 肽 的 结构 和 功能 。 这 些 方 法 中 最 直接 的 是 对 表达 文库 的 免疫 筛选 ,用 标记 的 抗体 鉴定 表达 特定 多 肽 的 克隆 。 类 似 的 不 同 的 其 他 分 子 也 可 以 作为 探 针 ,包括 检测 核酸 结合 蛋白 的 DNA 和 RNA 及 检测 蛋白 -蛋白 的 相互 作用 的 蛋白 。 蛋 白 的 活性 也 可 以 被 筛选 ,如 用 进行 特定 反应 的 能 力 或 测定 突变 表 型 的 恢 复 来 测定 编码 酶 的 克隆 。 定位 克隆 如果 基因 的 大 致 位 置 知道 , 它 可 以 在 需要 序列 或 生化 功能 知识 的 基础 上 被 克隆 。 定 位 克隆 从 鉴定 附近 已 经 克隆 的 标记 开始 。 目 标 基 因 近 的 标记 (如 人 类 遗传 疾病 的 已 知 相关 基因 ) 可 以 通过 连锁 分 析 或 低 分 辨 率 物 理 作 图 来 确定 (参见 基因 组 和 作 图 )。 在 人 类 和 其 他 动物 ,定位 克隆 的 第 一 步 是 染色 体 步 移 (chromosome walk)。 这 包括 用 邻近 的 标记 作为 探 针 在 基因 组 文库 中 筛选 重 肆 克 隆 。 阳 性 克隆 可 作为 下 一 步 的 探 针 , 直 到 作 图 基因 区 域 被 覆盖 ,一 系列 邻近 克隆 跨越 了 感 兴 趣 的 区 域 。 步 移 的 方向 和 进度 可 通 过 中 期 染色 体 的 原 位 杂交 确定 。 这 种 技术 在 原理 上 很 简单 ,但 大 范围 的 染色 体 步 移 有 技 术 上 困难 ,因为 有 重复 DNA 或 不 能 克隆 顺序 (在 文库 中 不 存在 的 顺序 ) 存 在 ,这 样 的 障碍 通过 染色 体 跳 查 (chromosome jumping) 能 有 效 地 克服 :基因 组 DNA 的 大 片段 克隆 在 粘 粒 载体 中 , 这样 原 来 在 基因 组 中 距离 很 多 kbp 远 的 DNA 顺序 当 载 体 闭合 时 被 带 到 一 起 。 邻近 位 置 的 DNA 可 以 被 亚 克 隆 产生 跳跃 文库 (jumping library) ， 跳 妈 文 库 快 速 沿 染色 体 进行 。 重 复 DNA 的 效应 通过 与 Cot-1 DNA 的 竞争 性 杂交 得 到 相当 程度 控制 ,Cot-1 DNA . 309 ， 对 应 于 卫星 DNA 和 超 高 丰 度 因子 ,在 复 性 实验 (参见 Co 分 析 ) 中 迅速 退火 。 一 旦 作 图 的 基因 座 被 克隆 ,有 很 多 技术 可 用 于 在 区 域 中 鉴定 候选 基因 (candidate genes)( 见 表 12.10)。 然 而 随 作 图 和 克隆 基因 数目 的 增加 ,通过 扫描 已 被 步 移 确定 覆盖 区 域 的 基因 组 数据 库 来 选择 一 组 候选 基因 的 可 能 性 大 为 增加 。 一 旦 一 组 这 样 的 候选 基因 被 鉴定 ,就 需要 通过 受 影响 的 个 体 有 突变 ,而 不 受 影响 个 体 没 有 突变 ,来 确定 它们 中 哪 一 个 是 目标 基因 。 一 些 突变 筛选 的 方法 在 表 24.5 中 列 出 。 1 在 植物 中 ,大 量 重 复 DNA 使 染色 体 步 行 不 能 进行 ,但 在 很 多 物种 中 以 RAPDs( 参 阅 ) 为 标记 作出 的 高 密度 物理 图 谱 的 有 效 性 意味 着 这 些 标记 对 于 那些 基因 常常 靠 得 很 近 , 足 有 以 将 它们 包含 在 同一 基因 组 克隆 中 。 因 此 ,这 些 过 程 使 得 一 个 适当 的 标记 可 直接 用 作 折 1 描 基 因 组 文库 的 探 针 ,此 过 程 被 命名 为 染色 体 登 陆 (chromosome landing) ,与 转 座 子 标记 本 技术 (参阅 ) 类 似 。 表 24.5 鉴定 克隆 DNA 突变 的 突变 筛选 技术 检测 的 基础 在 整个 基因 组 中 检测 不 同类 型 的 突变 技术 细胞 遗传 学 作 图 通过 细胞 遗传 学 鉴定 染色 体 畸 变 。 可 以 显示 表 型 和 特定 重 排 间 的 联系 比较 基因 组 杂交 竞争 性 原 位 杂交 的 形式 ,鉴定 不 同 扩 增 的 基因 。 在 检测 引起 癌症 的 扩 增 突变 中 非 常 有 用 ( 见 第 18 章 癌 基 因 与 癌 ) 确定 特定 DNA 片段 中 点 突变 和 插入 及 缺失 突变 定位 的 高 分 辩 率 技术 RFLP 分 析 分 析 克 隆 DNA 限制 性 酶 切片 段 长 度 多 态 性 (参阅 ) ,多 态 性 由 限制 性 位 点 的 产生 / 缺失 (点 突变 ) 或 重复 扩充 /收缩 ( 插 人 和 缺失 突变 ) 引 起 变性 梯度 凝 胶 电 泳 (denaturing “” 双 链 DNA 在 增加 变性 剂 的 梯度 凝 胶 中 迁移 ,直到 标准 分 子 分 离 。 不 同等 位 基因 gradient gel electrophoresis， 的 同 源 双 链 和 异 源 双 链 在 细微 差别 条 件 下 变性 ,产生 不 同 的 条 带 DGGE) 持续 变性 毛细 管 电泳 (con- “不 同等 位 基因 的 同 源 双 链 和 异 源 双 链 在 一 定 变性 条 件 下 ,部 分 变性 时 在 胶 中 有 不 stant ”denaturant capillary 同 的 移动 能 力 electrophoresis，CDCE) 单 链 构象 多 态 性 分 析 (single- DNA 单 链 片段 由 PCR 扩 增 并 在 非 变 性 胶 中 分 离 。 点 突变 影响 单 链 所 采用 的 四 级 strand conformational poly- 结构 和 它们 的 迁移 。 这 种 技术 不 能 精确 地 确定 突变 位 置 ,但 因为 它 只 适用 于 morphism，SSCP) 短片 段 (<300nt) ,所 以 在 基因 中 能 作 突 变 扫 摘 限制 性 内 切 酶 指纹 (restriction ”更 精炼 的 SSCP 分 析 ,从 不 同等 位 基因 扩 增 的 DNA 用 限制 性 酶 消化 产生 含 突变 endonuclease fingerprinting ) 的 不 同 大 小 片段 ,至 少 其 中 一 个 显示 构象 多 态 性 。 突 变 位 置 可 以 通过 限制 性 图 届 EAI AAAEODAEFA 人 ee 二 GT 谱 ( 参 阅 ) 确 定 蛋白 截断 测试 与 cDNA 克隆 的 体外 转录 和 翻译 相连 ,用 电泳 分 析 蛋 白 。 检 测 由 缺失 / 重 排 和 点 突变 引起 的 蛋白 截断 DNA 片段 中 检测 点 突变 的 精确 位 置 的 技术 ， 错 配 的 化 学 前 切 异 源 双 链 DNA 在 错 配 的 胞 喀 啶 (通过 哌 吓 和 凑 胺 的 修饰 ) 和 胸腺 喀 啶 (由 四 氧化 钱 ) 被 特异 前 切 ,片段 在 测序 胶 上 通过 电泳 分 离 确定 错 配 位 置 酶 错 配 前 切 异 源 双 链 DNA 被 T4 内 切 酶 VII 前 切 , 接 着 如 上 进行 电泳 分 离 和 分 析 错 配 修复 酶 前 切 通过 错 配 修复 酶 对 异 源 双 链 DNA 的 前 切 。 例 如 大 肠 杆菌 MutY 检测 A:G 和 A:C 错 配 。 其 他 酶 可 用 于 检测 不 同 的 错 配 碱 基 。 接 着 如 上 进行 电泳 分 离 和 分 析 测序 比较 测序 ,直接 鉴定 插 人 和 缺失 突变 和 错 配 位 置 注 :突变 筛选 用 于 鉴定 未 知 突变 ,突变 检测 (参阅 ) 用 于 鉴定 已 知 突变 。 很 多 高 分 辩 率 的 筛选 技术 是 利用 异 源 双 链 DNA, 不 是 作为 错 配 确定 突变 就 是 通过 它们 与 同 源 双 链 在 电泳 腕 上 不 同 的 迁移 作 比 较 。 异 源 双 链 DNA 来 源 反映 了 共同 的 从 杂 合子 中 扩 增 DNA 库 的 策略 ,这 种 策略 是 用 PCR 在 热 循环 中 随机 与 野生 型 和 突变 链 相 联系 。 站。 差异 克隆 差异 克隆 是 利用 来 源 不 同 DNA 之 间 的 表现 度 差异 来 分 离 差 异 表 达 基 因 的 功能 克隆 方法 。 在 任何 组 织 中 主要 表达 的 基因 是 管家 基因 ,在 大 多 数 cDNA 文库 中 都 出 现 。 为 了 专 一 性 触发 独特 的 基因 , 称 为 差异 筛选 (differential screening) 和 加 减 筛 选 (plus and minus screening) 技 术 , 包 括 用 两 个 不 同 组 织 来 源 的 标记 mRNA 或 cDNA 筛选 两 个 重 复 文库 。 从 一 个 文库 来 源 的 标记 mRNA 与 大 多 数 克隆 杂交 ,而 从 第 二 个 来 源 的 标记 mR- NA 只 和 部 分 克隆 杂交 ,这 些 代 表 了 共同 的 管家 基因 。 被 一 个 探 针 鉴定 而 不 与 另 一 个 杂 交 的 克隆 是 差异 表达 的 ,可 以 分 离 以 进行 进一步 分 析 。 一 个 更 有 效 的 鉴定 差异 表达 基因 的 途径 是 构建 独特 克隆 丰富 的 文库 。 这 可 以 通过 扣 除 杂 交 (subtractive hybridization ) 得 到 , 用 一 个 来 源 的 cDNA 去 除 第 二 个 来 源 中 共同 的 RNA, 留 下 独特 的 RNA 用 于 文库 的 构建 。 对 生物 素 标 记 的 cDNA 与 亲 和 素 亲 和 捕 捉 ( 文 框 24.4) 对 发 展 这 项 技术 是 非常 有 价值 的 。 一 种 来 源 的 cDNA 是 用 失信 生物 素 标 记 核 苷 酸 制备 的 。cDNA 通过 变性 与 第 二 个 来 源 的 mRNA 混合 杂交 。 如 果 应 用 过 量 的 标记 cDNA, 大 多 数 的 共同 RNA 会 形成 EDNA:RNA 蜡 源 双 链 ,与 cDNA 同 源 双 链 和 单 链 一 起 ,通过 固定 化 的 亲 和 素 玻璃 珠 的 亲 和 吸 附 分 离 。 经 过 几 轮 这 样 的 消减 (加 入 新 鲜 的 cDNA) ,保留 的 mRNA 是 独特 转录 本 的 高 度 富 集 , 可 用 于 构建 消减 EDNA 文库 。 同样 的 策略 可 用 于 在 基因 组 文库 中 定位 克隆 那些 根据 染色 体 缺 失 分 析 确 定 的 基因 。 如 果 基 因 组 DNA 能 从 正常 和 突变 (缺失 ) 的 来 源 中 制备 , 消减 杂交 能 够 富 集 跨越 缺失 区 域 的 基因 组 克隆 。 这 种 技术 成 功 地 克隆 了 杜 兴 氏 肌 营 养 不 良 (Duchenne muscular dystro- phy,DMD) 基 因 。 不 同 的 克隆 可 以 通过 以 PCR 为 基础 的 技术 获得 (参见 表现 度 差 异 分 析 、 差 异 显 示 , 抑 制 PCR )。 24.3 克隆 DNA 的 性 质 限制 性 图 谱 PC 一 旦 分 离 得 到 一 个 新 的 克隆 ,分 析 的 第 一 步 就 是 做 限制 性 图 谱 , 限 制 性 图 谱 是 不 同 限制 性 内 切 酶 相对 位 置 的 物理 图 谱 。 载 体 以 一 系列 限制 性 内 切 酶 消化 ,限制 性 片段 用 凝 胶 电 泳 ( 参 见 文 框 24.2) 分 离 。 每 个 限制 性 位 点 的 位 置 通过 单 酶 切 、 双 酶 切 和 部 分 酶 切 产 生 的 片段 大 小 来 确定 (一 个 例子 显示 在 图 24.4 中 )。 与 通过 电泳 的 简单 分 析 一 样 , 未 端 标记 的 供 体 DNA 确定 图 谱 的 边界 ,单个 的 限制 性 片段 可 以 被 标记 ,通过 Southern 杂交 ( 文 框 24.3) 鉴 定 重奏 的 片段 。 限 制 性 图 谱 显示 了 供 体 DNA 的 大 小 ,并 可 鉴定 用 于 亚 克 隆 的 位 点 。 产 生 的 限制 性 片段 的 带 型 可 用 来 鉴定 用 于 重 又 群 作 图 的 重 玲 克隆 (参见 限制 性 片段 指纹 )。 像 EcoRI 和 殉 zdIII 这 样 的 标准 六 碱 基 剪 切 酶 在 质粒 和 鸣 菌 体 克隆 作 图 中 非常 有 用 ,因为 这 样 的 限制 性 位 点 平均 4kbp 出 现 一 次 。 对 于 像 粘 粒 和 人 工 染 色 体 这 样 的 大 载体 要 用 稀少 的 切 点 ( 文 框 24.1) ,此 被 称 为 大 尺度 限制 酶 切 作 图 (long range restriction map- ping) 需 要 特殊 的 电泳 方法 来 分 离 所 产生 的 大 片段 ( 文 框 24.2)。 克隆 DNA 的 最 终 分 析 是 确定 它 的 核 苷 酸 顺 序 。 这 对 于 大 的 殉 隆 来 说 是 不 可 能 的 ， 它 必 须 被 亚 克 隆 来 提供 直接 测序 所 需 的 小 片段 。DNA 测序 技术 和 它 在 基因 组 分 析 中 的 作用 已 经 被 重视 起 来 ( 见 文 框 12.2) 。 . 311 ， (9) 辣 tn | in [和 攻 修 立民 只 | 5 芯 吕 避 18 生 吕 四 邓 1.7 B 33 B H 图 24.4 限制 性 作 图 的 基本 原理 。 通 过 一 系列 限制 性 酶 消化 载体 ,根据 限制 性 位 点 产生 物理 图 谱 。 通 过 分 析 单 酶 切 和 双 酶 切 产 生 的 电泳 条 带 的 大 小 (a) ,能 够 推导 不 同位 点 的 相对 位 置 (b) 形 成 完整 的 质粒 图 谱 。 限 制 性 内 切 酶 以 它们 起 始 字母 表达 (B= BaxmzHI, 下 = EcoRI 和 H= 于 xdIII; BH,BE 和 EH 是 双 酶 切 ;M 是 分 子 量 标准 泳 道 , 用 已 知 大 小 的 限制 性 片段 作为 对 照 )。 片 段 大 小 用 kb 表示 。 注 意 当 产生 类 似 大 小 的 不 同 片段 ,它们 在 胶 上 一 起 迁移 ,在 BaxzHIVZEcoRI 双 酶 切中 就 有 这 种 情况 。 转录 分 析 ”转录 分 析 是 在 RNA 水 平 研究 基因 结构 和 表达 。 对 基因 结构 和 表达 的 分 析 很 重要 ,所 使 用 的 方法 在 表 24.6 中 讨论 。Northern 杂交 是 检测 一 个 基因 在 给 定 组 织 中 是 否 表 达 和 表达 水 平 如 何 的 有 效 方法 。 它 也 显示 转录 本 的 大 小 和 不 同 的 产物 (也 就 是 不 同 的 剪接 ) 。 基 因 分 析 中 重要 的 一 步 是 确定 转录 起 点 和 终止 (或 多 腺 苷 酸化 ) 位 点 以 及 内 含 子 / 外 显 子 的 边界 。 这 样 精确 的 结构 细节 可 以 通过 核酸 酶 作 图 (nuclease mapping) 和 引物 延伸 (primer extension) 获 得 ,它们 是 利用 mRNA 和 对 应 基因 组 DNA 之 间 结 构 差异 的 技 术 ( 图 24.5)。 最 有 效 的 转录 本 分 析 技 术 之 一 是 原 位 杂交 , 它 能 确定 RNA 在 细胞 和 亚 细 胞 中 的 表达 方式 的 特点 ( 见 文 框 24.3)。 表 24.6 在 RNA 水 平 上 分 析 基 因 结构 和 基因 表达 的 技术 方法 原理 和 在 RNA 结构 和 表达 研究 中 的 作用 Northern 杂交 原理 :总 RNA 或 poly(A)*RNA 电泳 分 离 后 转移 到 滤 膜 上 ,与 互补 的 探 针 杂交 结构 :显示 转录 本 大 小 和 是 否 存在 不 同 的 剪 切 ,但 只 对 相对 丰富 的 RNA 有 用 表达 :提供 了 在 不 同 细胞 株 或 组 织 中 RNA 水 平 的 粗略 比较 核酸 酶 作 图 原理 :是 利用 剪 切 单 链 核酸 但 不 作用 双 链 的 酶 [来 自 于 稻 曲霉 ( Aspergillus oryzae ) 的 核酸 酶 S1， (图 24.4) RNaseA]。 将 基因 组 限制 性 片段 标记 与 RNA 杂 交 。 双 链 区 域 ( 基 因 组 DNA 和 RNA 相 共 线 ) 受到 保护 , 免 受 核酸 酶 活性 作用 ,但 RNA 单 链 中 尾巴 不 受 保护 结构 :比较 核酸 处 理 和 未 处 理 样品 变性 片段 大 小 的 区 别 , 能 确定 转录 / 非 转 录 序 列 的 边界 (也 就 是 转录 起 点 ) 和 内 含 子 / 外 显 子 边 界 表达 :RNase 保护 分 析 也 可 以 作为 确定 RNA 水 平 的 敏感 方法 人 方法 引物 延伸 (图 24.5) 原 位 杂交 RT-PCR 续 表 24.6 原理 和 在 RNA 结构 和 表达 研究 中 的 作用 原理 :引物 ( 守 核 苷 酸 引物 或 一 个 克隆 的 限制 性 片段 ) 在 mRNA 的 5 端 附近 退火 ,通过 反 转 录 延 伸 结构 :对 延伸 和 未 延伸 的 样品 变性 片段 大 小 差异 作 比 较 ,确定 转录 起 始点 。 在 5 异 质 性 和 起 点 选择 中 尤其 有 用 (参见 多 起 始 位 点 \ 不 同 启动 子 选 用 ) 原理 :用 标记 的 cRNA 探 针 与 内 源 性 RNA 进行 原 位 杂交 ,也 就 是 在 正常 细胞 中 定位 表达 :在 细胞 和 亚 细 胞 水 平 确定 表达 模式 的 有 效 方法 。 这 种 技术 可 用 于 组 织 切片 ,分离 的 细胞 或 更 小 的 样本 ,全 样 载 片 (需要 非 同 位 素 探 针 )。 对 组 织 切片 或 分 离 细胞 的 原 位 杂交 可 用 于 确 定 表达 水 平 原理 :以 mRNA 反 转 录 产 生 的 cDNA 为 模板 进行 PCR 结构 : 反 式 PCR( 参 阅 ) 通 过 外 显 子 专 一 性 引物 的 扩 增 来 确定 内 含 子 / 外 显 子 结构 。PCR 最 重要 的 应 用 是 转录 本 分 析 ,通过 RACE( 参 见 ) 分 离 全 长 的 稀有 cDNA 区 隆 表达 :定量 RT-PCR 可 用 于 确定 特定 RNA 分 子 , 即 使 它们 量 很 少 。 原 位 PCR 确定 表达 模式 。 这 些 技术 进一步 的 讨论 见 聚 合 酶 链 式 反应 (PCR) 见 图 24.5 核酸 酶 作 图 和 引物 延伸 分 析 的 一 些 例子 。 图 24.5 5 未 端 DNA 限 制 性 片段 被 标记 有 8R 针 5 RNA 丢 退火 5 AAAAAAA 1 5 一 一 人 AAAAAAA +SI 核酸 酶 | | 到 转录 酶 +aNrps 二 2 S 2 基因 转录 起 始 位 置 的 转录 本 分 析 。 末 端 标记 的 限制 性 片段 变性 后 反 义 DNA 链 与 RNA 杂交 。 在 核酸 酶 保护 实验 中 ,限制 性 片段 在 起 点 外 保持 单 链 的 部 分 被 单 链 专 一 性 核酸 酶 (如 S1 核酸 酶 ) 所 降解 。 在 引物 延伸 实验 中 ,任何 限制 性 片段 引物 之 外 的 单 链 DNA 可 以 通过 引物 的 反 转录 复制 延伸 来 复制 。 在 两 种 情况 中 都 可 以 比较 处 理 和 未 处 理 样品 电泳 中 大 小 区 别 大 致 确定 转 录 起 始点 。 若 在 相 邻 泳 道上 的 片段 为 序列 梯 (sequencing ladder)2 就 可 以 得 到 转录 起 始 精确 位 置 。 同样 的 技术 可 用 于 确定 RNA 和 DNA 任何 结构 的 差别 ,如 内 含 子 / 外 显 子 边界 。DNA 以 粗 线 表 示 ,RNA 以 细 线 表示 。 24.4 克隆 DNA 的 表达 克隆 DNA 表达 的 基本 原理 上面 讨论 的 载体 设计 用 于 DNA 片段 克隆 和 分 离 , 很 多 质粒 和 和 载体 有 功能 性 调节 元 件 , 使 供 体 DNA 得 到 表达 。 表 达 克 隆 的 基因 有 几 个 目的 :中 产生 大 量 标记 cRNA 作为 探 针 使 用 ;@ 构 建 表达 文库 (expression libraries) (cDNA 文库 中 克隆 的 供 体 DNA 是 被 表达 的 ,能 够 根据 所 编码 多 肽 结构 或 功能 的 性 质 可 进行 筛选 );@) 在 蛋白 水 平 上 分 析 和 利用 基因 的 功能 ;@ 商 业 性 生产 蛋白 ;@ 和 制备 抗体 ;@ 捕 捉 相互 作用 的 分 子 。 1) 序列 梯 是 DNA 测序 凝 胶 的 放射 自 显影 影 象 。 一 一 译 者 注 ” 33. 在 大 肠 杆 菌 中 进行 表达 克隆 较为 方便 ,因为 它 是 主要 的 克隆 宿主 ,通过 基本 克隆 载体 上 加 上 合适 的 转录 和 翻译 调控 顺序 使 它 变 为 表达 载体 ,有 利于 供 体 DNA 的 过 度 表 达 。 大 肠 杆菌 质粒 表达 载体 带 有 强 启动 子 , 经 常 是 可 诱导 的 ,如 rac 或 trzbp 操纵 子 的 启动 子 或 T7 晚期 启动 子 (T7 RNA 聚合 酶 基因 从 可 诱导 的 启动 子 表 达 )。 表 达 载 体 还 包含 了 转录 终止 子 和 含有 保守 Shine-Dalgarno 的 顺序 核糖 体 结合 位 点 。 这 些 元 件 的 排列 通过 优化 产 生 稳定 的 RNA 和 大 量 的 蛋白 。 各 种 表达 策略 中 的 共同 问题 是 表达 载体 的 稳定 性 。 表 达 大 量 外 源 蛋 白 ( 或 即使 是 内 源 蛋白 ) 的 细胞 比 野 生 型 细胞 生长 缓慢 ,因此 存在 对 表达 载体 丢失 或 表达 水 平 下 降 突变 的 选择 。 可 诱导 启动 子 的 使 用 有 助 于 避免 这 一 问题 , 当 大 量 含 载体 细胞 培养 后 能 够 生长 , 表 达 可 被 诱导 并 很 快 被 收集 。 表 达 策略 另 一 重要 方面 是 控制 载体 分 配 和 设计 限制 可 能 自发 产生 结构 突变 的 表达 载体 。 在 载体 上 加 入 前 导 肽 (参阅 ) 序 列 使 表达 的 蛋白 从 细胞 中 分 这 出 去 。 这 可 以 通过 将 过 度 表达 的 蛋白 从 细胞 内 环境 中 排除 而 增加 稳定 性 ,如 果 表 达 的 蛋 白 是 有 毒性 的 话 ,对 这 对 细胞 的 存活 可 能 是 必要 的 。 无 论 如 何 , 分 刻 有 利于 从 培养 细胞 中 纯化 蛋白 。 在 表达 克隆 位 点 的 上 游 含有 前 导 肽 的 载体 称 为 分 泌 载 体 (secretion vector) 。 天 然 和 融合 蛋白 ”根据 特 定 的 应 用 ,克隆 基因 可 以 表达 产生 天 然 蛋白 (以 其 自然 状态 存 在 ) 或 融合 蛋白 ,融合 蛋白 是 将 外 源 多 肽 融合 到 载体 编码 的 多 肽 一 起 ,如 细菌 的 前 导 肽 (如 上 文 所 讨论 的 ) 或 象 B- 半 乳糖 背 酶 这 样 大 蛋白 的 一 个 片段 。 天 然 蛋白 更 适合 治疗 用 途 ， 因为 融合 蛋白 可 能 是 对 人 体 有 免疫 原 性 。 然 而 融合 蛋白 在 大 肠 杆菌 中 经 常 更 稳定 ,因为 它们 类 似 于 内 源 性 蛋白 ,而 天 然 蛋 白 可 能 引起 降解 。 融 合 蛋 白 还 有 其 他 优点 :它们 易于 纯 化 (如 和 识别 载体 携带 多 肽 的 抗体 的 亲 和 性 ) 和 载体 多 肽 的 功能 在 融合 产物 得 以 保留 ,使 其 可 以 作为 报告 分 子 (reporter)。 有 时 可 以 用 特殊 的 蛋白 酶 将 载体 衍生 多 肽 从 融合 蛋白 上 切 下 ,产生 天 然 蛋 白 。 对 于 天 然 蛋 白 的 合成 , 供 体 cDNA 插 在 表达 载体 转录 和 翻译 调节 元 件 的 下 游 , 并 经 常 携带 它 自身 的 起 始 密码 子 。 对 融合 蛋白 的 合成 , 供 体 DNA 的 开放 阅读 框 插 和 人 时 必须 与 载体 基因 片段 读 框 一 致 ,这 样 它们 能 被 连续 阅读 。 这 可 以 通过 小 心地 选择 亚 克 隆 的 策略 来 达到 ,但 更 方便 是 用 随机 方法 产生 一 个 正确 的 阅读 框架 。 合 适 的 策略 包括 使 用 三 个 不 同 阅读 框架 克隆 位 点 的 载体 ,使 用 下 游 的 融合 蛋白 并 筛选 对 插入 片段 通读 的 克隆 ,或 通过 将 供 体 DNA 插 人 有 随机 长 度 同 源 多 聚 尾巴 的 载体 中 , 它 可 以 产生 随机 长 度 的 同 源 多 聚 物 的 连接 。 在 大 肠 杆菌 表达 克隆 的 缺点 ”虽然 克隆 的 基因 在 大 肠 杆菌 中 的 过 度 表 达 有 利于 工业 规 模 合成 很 多 原核 和 真 核 蛋 白 ,但 这 种 体系 还 是 有 很 多 的 问题 。 如 上 所 述 ,天 然 真 核 蛋白 可 能 在 大 肠 杆菌 中 不 稳定 ,降低 蛋白 产生 的 量 , 有 时 达到 非常 低 的 水 平 。 另 一 个 问题 是 过 度 表达 的 外 源 蛋 白 可 能 会 形成 包涵 体 (inclusion bodies) ,包涵 体 必 须 通 过 强烈 的 化 学 处 理 才 能 打破 ,尽管 包涵 体 的 大 小 和 数目 能 通过 在 较 低 温度 下 生长 和 大 肠 杆菌 分 子 伴 侣 (参阅 ) GroEL 和 GroES 的 过 度 表 达 得 到 改善 。 即使 外 源 蛋白 表达 成 功 , 但 它 可 能 没有 像 天 然 的 内 源 性 合成 的 蛋白 同样 的 功能 。 一 些 过 量 表 达 的 真 核 蛋 白 以 活性 形式 存在 (如 集落 刺激 因子 ) ,而 很 多 则 不 是 (如 表皮 生长 因 子 EGF) ,反映 了 缺乏 正确 的 翻译 后 加 工 。 一 旦 一 个 多 肽 被 表达 , 它 必 须 正 确 折 和 友和 加 工 . 314 才 具 有 功能 ( 见 第 22 章 蛋 白质 :结构 、 功 能 与 进化 )。 然 而 大 肠 杆菌 经 常 不 能 折 释 和 加 工 真 核 蛋白 一 一 它 不 能 对 有 蛋白 剪 切 或 糖 基 化 ,或 不 能 形成 正确 的 二 硫 键 , 可 能 是 由 于 缺乏 真 核 细胞 中 存在 的 分 子 伴 侣 (参阅 )。 即 使 多 肽 能 有 效 表 达 和 稳定 存在 ,在 这 些 任何 步骤 中 的 缺陷 都 可 能 使 蛋白 没有 功能 。 大 肠 杆菌 中 表达 的 活性 蛋白 可 能 反映 了 它们 有 限 的 结构 限制 ,例如 一 些 糖 蛋 日 , 像 白介素 - 3 无 论 是 否 糖 基 化 都 有 相当 的 活性 。 真 核 表 达 宿 主 当 细 菌 细胞 不 能 正确 地 加 工 表 达 蛋 白 时 , 真 核 细胞 可 用 作 表 达 的 宿主 细胞 。 在 真 核 细胞 中 表达 蛋白 也 使 蛋白 分 析 能 在 真 核 环 境 中 进行 ,使 用 细胞 内 的 信和 号 序 列 使 蛋白 导向 于 特定 的 细胞 器 中 ( 见 第 22 章 蛋 白质 :结构 、 功 能 与 进化 ) 。 三 种 类 型 的 真 核 宿 主 细胞 用 于 蛋白 表达 :酵母 昆虫 和 哺乳 动物 细胞 ,各 有 与 之 适应 的 表达 载体 和 收获 策略 。 酵母 经 常 是 表达 那些 在 细菌 中 表达 效果 较 差 的 真 核 基因 的 第 一 个 选择 ,酵母 是 微 生 物 ,遗传 背景 清楚 、 易 于 操作 ,能 用 于 大 规模 培养 。 酵 母 不 仅 能 表达 外 源 真 核 蛋白 ,而 且 它 们 提供 了 研究 真 核 蛋白 功能 的 合适 环境 [替代 遗传 学 (surrogete genetics) ] ,以 及 研究 蛋白 一 蛋白 相互 作用 的 体系 (参见 酵母 双向 杂交 体系 ) ,最 后 它们 提供 了 用 于 基因 组 分 析 的 大 容 量 克 隆 载体 (参见 酵母 人 工 染 色 体 )。 所 以 人 们 对 发 展 酵 母 克隆 和 表达 载体 有 特殊 的 兴趣 ( 文 框 24.5)。 酵 母 表达 载体 经 常 是 基于 2w 质粒 (YEps) ,尽管 YIps 可 用 来 将 DNA 稳定 整合 到 基因 组 中 。 表 达 载 体 包 含 强 的 组 成 型 或 可 诱导 的 酵母 转录 控制 序列 (如 磷酸 甘油 酸 激酶 基因 启动 子 ) ,经 常 与 2 质粒 终止 子 和 酵母 营养 缺陷 型 (参阅 ) 恢 复 的 筛选 标记 结 合 在 一 起 。 酵 母 蛋白 很 少 分 刻 , 但 大 多 数 翻译 后 加 工 发 生 在 分 刻 途 径 中 ,所 以 需要 用 酵母 分 泌 载 体 来 表达 糖 基 化 的 哺乳 动物 蛋 自 (毒性 蛋白 也 是 如 此 )。 这 样 的 载体 携带 酵母 $ 前 导 肽 信号 序列 ,这 序列 是 用 于 分 记 交 配 因子 信息 素 ( 参 见 交 配 类 型 选择 )。 酵母 细胞 不 能 提供 哺乳 动物 蛋白 功能 所 需 的 所 有 正确 翻译 后 加 工 。 很 多 哺乳 动物 蛋 白 的 功能 与 不 同 的 糖 链 结构 的 模式 是 相关 联 的 ,但 这 些 表 达 产 物 如 果 发 生 不 正确 的 加 工 ， 用 于 治疗 经 常 有 免疫 原 性 。 酵 母 糖 基 化 突变 体 的 使 用 有 时 可 以 解决 这 一 问题 。 杆 状 病毒 表达 系统 (baculovirus expression system) 提 供 了 在 昆虫 细胞 培养 中 ,多 角 体 蛋白 基因 强 启 动 子 控制 下 表达 外 源 基 因 的 途径 。 在 这 种 体系 中 产生 的 蛋白 是 惊人 的 一 一 从 10? 感染 细 胞 中 有 高 达 100wg 的 重组 蛋白 一 一 翻译 后 加 工 的 程度 也 得 到 了 很 好 的 证 实 。 杆 状 病毒 系 统 的 其 他 优点 包括 它 的 容量 一 一 大 到 20kbp 的 插 和 人 顺序 可 以 被 成 功 地 克隆 一 一 多 个 外 源 基因 可 以 同时 表达 ,能够 对 蛋白 复合 物 进 行 表达 和 分 析 。 哺乳 动物 细胞 提供 了 人 类 治疗 蛋白 表达 的 最 佳 体系 ,但 效率 较 低 。 很 少 哺乳 动物 表 达 载 体 是 以 基因 组 外 的 形式 存在 ,所 以 长 期 表达 需要 构建 整合 到 基因 组 中 的 载体 (参见 皮 时 转化 稳定 转化 ) 。 哺 乳 动 物 表 达 载 体 的 构建 是 基于 细菌 质粒 , 转 染 细胞 的 质粒 或 哺乳 动物 病毒 ,它们 将 DNA 导入 细胞 中 。 大 多 数 病毒 载体 是 重组 的 整合 病毒 (如 反 转 录 病 毒 、 腺 病毒 ) ,尽管 含 疱疹 病毒 复制 起 点 的 载体 是 基因 组 外 存在 的 。 有 效 的 哺乳 动物 表达 载体 携带 强 的 组 成 型 病毒 启动 子 ( 如 SV40 的 早期 启动 子 和 增强 子 ) 或 可 诱导 的 启动 子 (如 热 休 克 启 动 子 或 修饰 的 大 肠 杆菌 zac 启动 子 )。 蜡 源 的 可 诱导 启动 子 的 优点 在 于 只 有 外 源 基因 被 诱导 ,而 其 他 内 源 性 哺乳 动物 基因 不 能 被 诱导 。 表 达 载 体 同 时 也 携带 了 强 翻 译 起 始 顺序 (参见 kozak 保守 序列 )、 多 腺 苷 酸化 位 点 ,经 常 还 有 对 有 些 基因 有 效 表达 很 重 要 的 一 个 内 含 子 。 有 些 基因 通过 药物 选择 能 有 效 维持 很 高 的 拷贝 数 ,如 二 氢 叶 酸 还 原 酶 . 315 ， (DBFR ) 基 因 在 细胞 中 能 暴露 在 氨 甲 蝶 叭 中 ( 见 文 框 13.3)。 对 扩 增 区 域 ( 扩 增 子 ,ampli- cons) 的 分 析 显 示 它 们 比 扩 增 基因 本 身 包 含 更 多 的 DNA, 也 就 是 说 非 选 择 的 DNA 被 一 起 扩 增 了 。 人 含有 外 源 基 因 克 隆 位 点 邻近 的 DEFR 基因 载体 被 整合 进 基 因 组 内 ,并 进行 选择 性 扩 增 。 外 源 基 因 被 与 DBFR 一 起 被 扩 增 , 得 到 很 强 的 表达 。 24.5 基因 调节 的 分 析 报告 基因 克隆 基因 表达 的 基本 原理 是 将 基因 亚 克 隆 在 有 合适 调节 元 件 的 载体 中 ,与 此 类 似 通过 将 被 克隆 的 调控 元 件 亚 克隆 到 一 个 提供 可 调节 合适 基因 的 载体 中 也 可 得 到 表 达 , 有 利于 分 析 基 因 的 调节 。 从 原理 上 讲 , 任 何 基因 都 适用 ,但 使 用 一 个 用 简单 的 测定 方 法 就 能 检测 和 定量 的 基因 更 方便 ,而 且 它 的 产物 在 宿主 细胞 中 又 不 存在 。 报 告 基因 (re- porter genes) 的 例子 在 表 24.7 的 目录 中 列 出 。 不 同 的 报告 载体 对 于 分 析 不 同 的 调节 元 件 是 有 利 的 :启动 子 探测 (promoter probe) 载 体 含 有 一 个 报告 基因 在 多 克隆 位 点 中 ,用 于 择 和 人 和 测定 假定 的 启动 子 元 件 ;增强 子 探 测 (enhancer probe) 载 体 包 含 由 基本 启动 子 驱动 的 报告 基因 和 一 个 插入 了 假定 增强 子 元 件 的 多 克隆 位 点 。 也 有 终止 子 探查 (enhancer probe) 载 体 , 用 于 分 析 细 菌 转录 终止 子 。 表 24.7 报告 基因 的 比较 报告 基因 (和 产物 ) 使 用 来 自 大 肠 杆菌 的 /zcZ(B- 广泛 使 用 的 报告 体系 。 酶 将 发 色 底 物 X-gal 在 基因 表达 的 位 置 转化 成 蓝 色 沉淀 。 通 过 半 屯 糖苷 酶 ) ONPG 转变 成 可 定量 可 溶性 黄色 产物 。 由 IPTG 诱导 (参见 Jac 操纵 子 ) 来 自 草 火 虫 的 /uc (荧光 “” 当 暴 露 于 荧光 素 底 物 中 时 ,产生 生物 荧光 的 高 灵敏 报告 基因 素 酶 ) 来 自 大 肠 杆菌 To9 中 的 体外 分 析 中 非常 有 用 的 报告 基因 ,但 在 原 位 分 析 中 分 辩 率 低 。CAT 乙酰 化 氯 霉 素 , 乙 cot ( 氯 霉 素 乙酰 转移 酰 化 产物 可 以 通过 CAT 测定 (CAT assay) 中 的 薄 层 层 析 被 鉴定 酶 ,CAT) 来 自 大 肠 杆 菌 的 CUS(B- 一般 在 植物 系统 中 用 的 报告 基因 , 酶 将 发 色 底 物 X-gluc 在 基因 表达 的 位 置 转化 成 蓝 色 葡 糖 醛 酸 糖苷 酶 ) 沉淀 来 自 水 母 g 久 (绿色 荧光 ”一 种 报告 分 子 , 因 其 自身 荧光 用 在 活体 系统 中 有 独特 的 优点 蛋白 ) 必 -gal= 5- 省 -4 氯 -3 吧 唆 -BD- 半 弛 糖 苷 ;X-gluc= 5- 溴 -4 氯 -3 中 | 噪 -BD- 葡 糖苷 酸 ;ONPG= 邻 硝 基 苯 -B-D- 半 乳 吡 喃 糖苷 ;IPTG= 异 两 基 硫 代 -B-D- 半 乳糖 苷 。 基因 调节 的 分 析 涉 及 一 系列 报告 结构 (有 上 游 克 隆 调 节 元 件 的 报告 基因 ) 活 性 的 比 较 , 其 中 调节 元 件 可 以 通过 体外 诱 变 ( 参 阅 ) 进 行 修饰 。 这 样 的 分 析 可 以 通过 用 不 同 的 细 胞 提取 物 进 行 体外 转录 ,或 将 报告 基因 结构 瞬时 转 染 到 细胞 中 或 多 细胞 生物 中 以 及 生 将 细胞 系 ( 报 告 转基因 ,参见 转基因 动物 和 植物 )。 体 外 转录 和 细胞 系 的 方法 是 简单 的 实验 ， 所 能 提供 的 信息 是 有 限 的 。 细 胞 系 方法 的 一 个 特别 的 缺点 是 瞬时 的 基因 组 外 载体 不 能 精 确 表明 体内 的 调节 条 件 , 因 缺 乏 染色 质 结 构 和 远 处 顺 式 调节 元 件 水 平 的 调节 。 另 外 ,载体 的 高 拷贝 数 会 抵 销 转录 因子 (参见 压制 )。 报 告 转基因 生物 提供 了 内 源 性 基因 调节 更 精确 的 表现 度 ,使 调节 元 件 的 空间 和 时 间 的 效应 能 够 显露 出 来 。 然 而 ,报告 转基因 可 能 有 位 置 和 剂量 效应 ,产生 额外 或 限制 的 表达 模式 和 不 同 的 表达 水 平 。 316 ， SEE DNA -蛋白 相互 作用 比较 带 有 不 同 突变 的 报告 基因 结构 有 可 能 非常 精确 地 确定 假定 的 调节 元 件 的 位 置 。 然 而 ,为 了 精确 定义 这 些 元 件 ,报告 基因 结构 必须 得 到 如 下 补充 :OO 顺序 分 析 确 定 功能 性 ;@ 证 明和 蛋白 - DNA 相互 作用 的 实验 。 有 几 种 体外 的 技术 用 来 分 析 蛋白 - DNA 的 结合 ,包括 电泳 迁移 率 变动 分 析 (electrophoretic mobility shift assay)、DNase I 足 迹 法 (DNase footprinting) 和 甲 基 化 和 干扰 (methylation interference)( 这 些 技术 的 进一步 讨论 见 核酸 结合 蛋白 )。 对 DNA 中 蛋白 结合 基 序 的 鉴定 也 提供 了 分 离 编码 新 的 转录 因 子 克 隆 的 直接 途径 。 对 应 于 假定 的 调节 元 件 的 寡 核 苷 酸 能 够 被 标记 , 并 用 来 在 表达 文库 中 筛选 相互 作用 蛋白 ,这 样 的 方法 称 为 southwestern 筛选 ( 见 第 17 章 核酸 结合 蛋白 )。 包 载 载体 ”报告 基因 被 广泛 用 于 分 析 克 隆 的 调节 元 件 ,但 它们 还 可 以 用 于 分 析 未 知 内 源 基因 的 表达 模式 。 包 载 载体 (entrapment vectors) 是 包含 报告 基因 的 结构 , 它 整合 到 基 因 组 的 随机 位 置 ,通过 产生 报告 基因 的 表达 模式 ,对 附近 的 顺 式 作用 调节 元 件 作 出 反应 。 有 三 类 包 载 载体 (图 24.6) ,它们 的 性 质 列 在 表 24.8 中 。 这 种 技术 最 早 被 用 于 果 蝇 中 使 用 的 重组 P 因子 载体 ,但 现在 已 应 用 到 其 他 生物 ,包括 植物 (Ac-Ds 因子 ) 和 小 鼠 (重组 体 反 转 录 病 毒 或 者 简单 随机 整合 的 DNA; 参 见 随机 插入 转基因 )。 包 载 技 术 的 发 展 产 生 了 改进 的 基因 包 载 载体 , 它 可 以 作用 特定 类 型 的 基因 ,如 那些 编码 分 刻 和 蛋白 的 基因 。 P A 信 王 包 用 下 -E 盖 -PIC 奖 全 [一 ATG 启动 包 载 内 源 基因 通过 转 座 诱 变 或 基因 包 载 而 插 和 人 失 活 通过 突变 体 表 型 和 /或 报告 基因 的 表达 模式 来 鉴别 一 用 限制 性 内 切 酶 来 消化 总 的 基因 组 DNA CE 2 本 0 本 < < (a) 转 座 子 标记 (b) 质粒 拯救 损 于 向 PCR 全 去 光 轨 二 W 区/ 他 议和 和 这 生 表 人 性 兵 P)， 尘 和 基因 组 探 针 或 反 向 PCR 筛 查 | 后 示 记 ), 那么 DNA 人 人 到 的 图 24.6 包 载 载体 。(a) 有 三 类 包 载 载体 :增强 子 包 载 (enhancer trap) ,携带 一 个 基本 的 启动 子 ， 对 内 源 性 增强 子 元 件 反应 ;基因 包 载 (gene trap) ,携带 一 个 剪接 受 体 位 点 ,对 内 源 性 剪接 供 体位 点 反应 使 内 含 子 插 人 ;和 启动 子 包 载 (promoter trap) ;携带 一 个 简单 的 起 始 密码 子 , 被 插 和 人 的 第 一 个 外 显 子 激活 。(b) 克 隆 包 载 基因 的 策略 包括 从 基因 组 文库 中 分 离 标记 的 DNA( 通 过 杂交 或 反 向 PCR) 和 质粒 拯救 。 增 强 子 包 载 载体 可 能 整合 在 受 增强 子 影 响 内 源 性 基因 的 远 处 ,对 内 源 性 基因 的 克隆 涉及 染色 体 步 移 。 “3 表 24.8 包 载 载体 包 载 载体 ”结构 性 质 增强 子 包 载 ”报告 基因 上 游 有 ”通过 插 人 内 源 性 增强 子 的 邻近 位 置 激活 。 方 向 是 独立 的 ,不 一 定 依赖 于 内 源 性 基本 启动 子 靶 基 因 的 表达 。 偶 尔 有 突变 产生 。 经 常 可 能 通过 从 基因 组 文库 中 载体 插入 位 点 的 染色 体 步 移 来 克隆 内 源 性 基因 (参见 定位 克隆 ) 基因 包 载 ”报告 基因 上 游 有 ”通过 插 和 人 内 含 子 激活 。 取 决 于 周围 基因 的 方向 \ 阅 读 框 架 和 表达 。 经 常 由 于 外 剪接 受 体位 点 显 子 插 人 而 突变 。 基 因 可 以 通过 基因 组 或 cDNA 文库 的 转 座 子 标记 (参阅 ) 被 克隆 启动 子 包 载 ”报告 基因 上 游 有 “通过 插 人 外 显 子 激活 。 依 赖 于 周围 基因 的 方向 \ 阅 读 框架 和 表达 。 经 常 由 于 外 翻译 起 始 位 点 显 子 插 人 而 突变 。 基 因 可 以 通过 基因 组 或 EDNA 文库 的 转 座 子 标记 (参阅 ) 被 克隆 基因 和 启动 子 包 载 载 体 产 生 融合 蛋白 ,并 且 是 阅读 框架 和 方向 依赖 性 的 。 报 告 基因 上 游 对 内 部 核糖 体 (参阅 ) 进 人 位 点 的 应 用 可 以 消除 这 些 限 制 。 使 用 任何 一 种 包 载 载体 ,都 有 可 能 直接 克隆 激活 包 载 的 内 源 性 基因 ,因为 它 已 经 被 载 体 顺序 所 标记 (tagged)\ 图 24.6)。 转 座 子 标记 是 分 离 转 座 子 插 人 引起 基因 突变 的 广泛 使 用 的 技术 , 包 载 载体 (其 中 很 多 是 重组 转 座 因 子 ) 能 以 同样 的 方式 起 作用 。 载 体 作为 筛选 基因 组 文库 的 探 针 ,分 离 包含 载体 序列 和 携带 基因 组 DNA 侧翼 插 人 位 点 的 基因 组 克隆 。 这 被 用 于 鉴定 重 又 基因 组 克隆 和 同类 的 cDNA。 如 果 载 体 包 含 质粒 克隆 载体 的 骨架 序 列 ,简单 地 消化 基因 组 DNA 会 产生 包含 两 侧 基 因 组 DNA 的 质粒 。 这 种 技术 称 为 质粒 拯 救 ,能 快速 对 感 兴趣 突变 和 报告 基因 的 表达 模式 进行 分 子 水 平 的 分 析 。 24.6 蛋白 分 析 与 蛋白 间 相 互 作用 的 分 析 用 抗体 检测 和 纯化 蛋白 ”抗体 与 其 对 应 抗原 之 间 的 相互 作用 是 高 度 灵敏 和 专 一 的 。 与 核 酸 探 针 DNA 和 RNA 水 平 的 应 用 方法 相同 ,抗体 可 以 作为 探 针 在 蛋白 水 平 上 研究 基因 表达 。 原则 上 ,抗体 有 三 种 用 途 :中 分 离 和 纯化 蛋白 (如 亲 和 层 析 和 免疫 共 沉 淀 );@ 在 膜 上 或 原 位 检测 蛋 日 (如 western 杂交 ,表达 文库 的 免疫 化 学 和 免疫 学 筛选 );@ 干 扰 或 修饰 蛋白 功能 ( 参 见 体 内 和 抗体 酶 )。 对 这 些 技术 的 进一步 讨论 见 第 22 章 蛋 白 : 结 构 、 功 能 与 进化 。 酵母 双向 杂交 体系 分析 蛋白 -蛋白 相互 作用 的 传统 方法 包括 免疫 共 沉 淀 (抗体 结合 后 沉淀 抗原 , 洗 脱 和 分 析 任 何 相互 作用 的 蛋白 ) 和 对 抑制 基因 和 增强 子 突变 的 筛选 (与 特 定 突变 相 联系 的 表 型 分 别 改 善 或 增强 , 常 鉴定 相互 作用 的 蛋白 , 见 文 框 13.4)。 酵 母 双向 杂交 系统 是 基于 表达 文库 体系 ,用 来 分 析 蛋 白 - 蛋白 相互 作用 。 它 利用 真 核 蛋 白 基 序 性 质 的 特点 ,特别 是 转录 因子 的 DNA -结合 区 和 激活 结构 域 可 以 单独 起 作用 的 特点 (参见 结构 域 交换 )。 进 而 几 个 转录 因子 被 鉴定 ,它们 的 DNA -结合 区 和 激活 结构 域 被 分 离 的 基因 所 编码 ,如 此 非 共 价 的 结合 有 利于 转录 激活 (如 Oct - 1 和 单纯 疱疹 病毒 VP16 反 式 激活 子 ; 见 转录 )。 酵 母 双向 杂交 体系 检测 与 一 个 已 经 克隆 基因 产物 相互 作用 的 蛋白 ,使 分 离 编码 这 些 未 知 作用 蛋白 的 EDNA 变 得 容易 (图 24.7)。 已 知 的 基因 以 与 经 典 的 DNA- 结 合 结构 域 ,如 GAL4 ,形成 融合 蛋白 的 形式 表达 一 一 这 是 相互 作用 的 诱饵 。 构 建 的 表达 文 库 中 cDNA 以 与 转录 激活 结构 域 融合 蛋白 的 形式 存在 ,任何 相互 作用 因子 , 即 与 诱饵 相互 作用 的 蛋白 ,将 激活 结构 域 带 到 DNA -结合 结构 域 一 起 。 体 系 的 最 后 成 分 是 报告 基因 ， 它 被 杂交 的 转录 因子 激活 。 相 互 作用 因子 这 样 通过 报告 基因 的 表达 来 鉴定 ,而 对 应 的 318 ， cDNA 可 以 被 分 离 鉴 定 。 图 24.7 酵母 双向 杂交 体系 的 原理 。 实 验 的 目的 是 鉴定 与 诱饵 蛋白 相互 作用 的 蛋白 (B)。 它 以 与 DNA -结合 结构 域 (DNAB) 的 融合 蛋白 来 表达 。 表 达 文 库 的 克隆 是 构建 成 与 转录 激活 结构 域 (ACT) 的 融合 蛋白 。 用 文库 中 的 表达 载体 和 包含 诱饵 蛋白 DNA 结合 结构 域 结 合 位 点 的 报告 结 构 来 转化 表达 诱饵 融合 蛋白 的 细胞 。 无 论 是 诱饵 蛋白 或 假定 的 相互 作用 蛋白 ( 工 ) 都 不 能 单独 激 活 报告 基因 。 然 而 任何 与 诱饵 蛋白 相互 作用 并 能 激活 报告 基因 的 转录 的 文库 蛋白 ,可 被 克隆 而 得 到 鉴定 。 噬菌体 展示 “通过 将 寡 核 苷 酸 克 隆 到 鸣 菌 体 衣 壳 蛋 白 基 因 的 读 框 中 ,使 外 源 多 肽 表达 在 噬菌体 的 表面 的 技术 。 产 生 的 融合 噬菌体 保留 了 它们 的 感染 性 ,能 以 正常 方式 形成 叹 菌 斑 。 吃 菌 体 展示 文库 (phage display library) 像 常规 表达 文库 一 样 可 用 抗体 或 其 他 蛋白 作为 探 针 进 行 筛选 。 鸣 菌 体 展 示 技 术 的 主要 用 途 是 筛选 通过 随机 突变 产生 的 多 肽 ,改进 其 亲和力 或 结合 的 专 一 性 。 这 在 蛋白 质 工程 中 有 用 ,如 改进 有 重要 商业 价值 的 酶 的 性 能 等 ,和 构建 重组 抗体 。 在 后 面 一 种 情况 , 喉 菌 体 展示 等 同 于 人 工 亲 和 力 成 熟 (参见 体 细胞 过 度 突变 ) ,避免 对 杂交 瘤 细 胞 株 的 依赖 。 相 互 作用 的 鸣 菌 体 颗粒 可 以 从 高 达 108 的 非 相 互 作用 鸣 菌 体 的 背景 中 纯化 得 到 。 24.7 体外 诱 变 改变 克隆 的 基因 ”一旦 一 个 DNA 分 子 被 克隆 ,体外 诱 变 技术 能 被 用 于 导入 顺序 的 改 变 。 这 可 以 是 :中 比较 野生 型 克隆 和 突变 体 功能 的 特定 突变 ,也 就 是 鉴定 重要 氢 基 酸 残 基 或 调节 元 件 ;@ 在 一 个 特定 区 域 随机 突变 ,筛选 变异 体 , 也 就 是 说 鉴定 那些 性 能 改善 的 突 变 (参见 噬菌体 展示 )。 为 了 在 体内 检测 功能 ,体外 诱 变 的 DNA 可 用 来 替代 细胞 基因 组 中 的 或 整个 动物 或 植物 中 的 同 源 序 列 ( 参 见 置 换 、 基 因 寻 靶 )。 这 是 经 典 遗 传 分 析 的 相反 过 程 , 它 在 随机 突变 中 产生 和 筛选 突变 来 选择 感 兴趣 的 基因 或 系统 (参见 站 传 第 选 )。 导入 特定 的 点 诱 变 在 克隆 DNA 分 子 中 特定 位 点 导 人 特异 碱 基 来 蔡 换 或 产生 小 的 缺 失 称 为 定点 诱 变 (site-derected mutagenesis) ,有 多 种 应 用 途径 。 盒 式 诱 变 (cassette mutage- nesis) 是 将 供 体 DNA 片段 用 限制 性 内 切 酶 剪 切 ,并 用 含 所 需 突变 的 合成 寡 核 苷 酸 来 替代 它 。 另 一 种 考核 背 酸 诱 变 (oligonucleotide mutagenesis) 需 要 将 供 体 DNA 克隆 在 噬 菌 粒 载 体 中 ,以 产生 单 链 DNA。 包 含 所 需 突变 的 寡 核 苷 酸 与 单 链 载 体 退火 ,产生 一 个 不 配对 位 置 。 赛 核 苷 酸 起 DNA 合 成 引物 的 作用 ,所 以 载体 的 复制 形式 (参阅 ) 是 异 源 双 链 , 含 一 条 “319 。 有 突变 的 链 和 一 条 野生 型 链 [PCR 诱 变 ( 人 参阅 ) 也 是 应 用 类 似 的 引物 不 配对 策略 ]。 接 下 来 的 复制 产生 同 源 双 链 的 野生 型 和 突变 载体 ,后 者 通过 杂交 分 析 被 鉴定 。 这 是 产生 突变 的 有 效 机 制 ,但 需要 关闭 宿主 细胞 的 错 配 修复 系统 和 在 野生 型 中 筛选 出 突变 载体 。 很 多 链 选择 策 略 (strand selection strategies) 使 这 一 过 程 更 为 容易 ,如 用 抗 限 制 性 酶 切 的 硫 代 核 苷 酸 保护 突变 链 ,使 野生 型 链 被 降解 。 系统 化 突变 分 析 ”例如 DNA 中 调节 序列 的 功能 分 析 往 往 从 大 的 缺失 和 取代 突变 开始 (用 限制 性 内 切 酶 或 外 切 酶 ) ,来 确定 重要 区 域 的 位 置 。 缺 失 诱 变 (deletion mutagenesis) 涉 及 用 限制 性 酶 从 克隆 中 切除 供 体 DNA 的 一 部 分 。 单 向 缺失 (unidirectional deletions) 能 通 过 象 大 肠 杆菌 外 切 酶 VII 这 样 的 外 切 酶 产生 ,这 样 的 外 切 酶 作用 于 特定 类 型 DNA 末端 的 底 物 。 单 向 缺失 可 以 产生 一 系列 的 骨 套 突变 (nested set of deletions) (一 个 末端 是 共同 的 , 另 一 个 是 可 变 的 )。 这 在 分 析 调 节 元 件 和 对 点 突变 作 图 是 有 用 的 。 筛 选 突变 (scanning mutagenesis) 是 系统 化 地 对 克隆 的 每 一 部 分 替代 ,来 决定 它 的 功能 。 在 分 析 调 节 元 件 时 ， 接头 筛选 诱 变 (linker scanning mutagenesis) 可 以 进行 小 片段 的 缺失 , 延 着 克隆 在 每 个 位 置 被 寡 核 苷 酸 接头 替代 ,保留 了 剩余 DNA 基 序 的 空间 关系 。 在 蛋白 功能 分 析 中 , 同 源 筛 选 突变 (homologscanning mutagenesis) 涉 及 将 蛋白 的 每 个 片段 都 用 相关 蛋白 的 同 源 区 域 蔡 代 , 来 鉴定 功能 特异 性 的 残 基 。 这 一 技术 可 以 延 用 到 通过 定点 诱 变 系 统 地 将 不 同 的 残 基 替代 每 个 氨基 酸 (参见 结构 域 交换 )。 合式 话 变 。 切除 限制 性 避 9 以 突变 接头 取 估 它 复制 产生 野生 型 旺 放贷 寡 核 苷 酸 异 源 双 链 of REF DNA 合 成 图 24.8 ”定点 诱 变 。 为 了 在 体外 导 人 特定 的 点 突变 ,小 的 限制 性 片段 可 以 切除 ,并 被 包含 所 需 突 变 的 合成 接头 所 替代 ( 盒 式 诱 变 )。 如 果 这 不 能 办 到 , 插 人 片段 可 以 克隆 到 产生 单 链 的 噬 菌 粒 载 体 中 ,由 错 配 引物 指导 复制 型 的 合成 。 这 样 产生 一 个 异 源 双 链 的 复制 型 ,在 下 面 的 复制 循环 中 产 生 野 生 型 和 含 突变 的 复制 型 。 随机 诱 变 ”定点 诱 变 能 精确 地 导入 一 个 特定 的 点 突变 ,随机 诱 变 (random mutagenesis) 是 分 析 大 量 不 同 突变 体 效 应 的 最 快速 的 方法 。 随 机 点 突变 适 于 不 精确 的 条 件 下 和 在 所 有 DNA 修复 系统 被 关闭 的 宿主 细胞 中 ,可 通过 使 用 有 倾向 差错 的 DNA 聚合 酶 (如 反 转 录 酶 ,Tag DNA 聚合 酶 ) 来 导 人 。 随 机 突变 也 可 以 用 简 并 (参阅 ) 朝 核 苷 酸 ,以 盒 式 诱 变 、 守 。 320 ， 核 苷 酸 诱 变 或 PCR 诱 变 , 定 向 于 特定 区 域 。 最 近 通 过 体外 重组 对 基因 随机 片段 ,以 PCR 介 导 修复 的 技术 已 经 被 发 展 起 来 。 尽 管 还 未 被 广泛 应 用 ,但 这 种 技术 已 经 成 功 地 产生 了 活性 大 大 高 于 野生 型 酶 的 B- 内 酰胺 酶 的 变异 体 。 24.8 转基因 :基因 转移 到 动物 和 植物 基因 转移 到 高 等 真 核 生 物 细胞 的 机 制 分子 克隆 最 重要 的 基本 技术 之 一 就 是 将 DNA 转 导 进 入 细胞 。 如 上 文 所 讨论 的 ,有 几 种 常规 使 用 的 高 效 方法 可 以 将 DNA 导 和 人 细菌 和 酵母 细胞 ,促进 了 动物 和 植物 基因 的 克隆 和 表达 。 然 而 ,对 动物 和 植物 DNA 的 功能 分 析 经 常 需要 将 克隆 的 DNA 重新 导 和 人 原先 的 物种 中 。 有 一 系列 技术 可 以 将 DNA 导入 真 核 细胞 ( 表 24.9) ,大 多 数 涉及 强迫 细胞 吸收 裸露 的 DNA( 转 染 ), 但 有些 基因 转移 技术 是 基于 包装 在 病毒 衣 壳 中 DNA 的 转 导 ,而 在 植物 中 有 一 种 独特 的 基于 细菌 质粒 接合 转移 的 方法 (参见 第 10 章 细菌 中 的 基因 转移 )。 表 24.9 DNA 导 入 真 核 细 胞 的 方法 方法 评论 细胞 转 染 方法 (吸收 裸露 的 DNA) 聚 乙 二 醇 原生 质 体 融合 或 在 Ca 离子 和 聚 乙 二 醇 存在 的 情况 下 直接 吸收 DNA。 在 酵母 和 植物 中 ， 需要 从 原生 质 球 / 原 生 质 体 中 重新 产生 细胞 ,有 效 但 费力 化 学 转 染 有 很 多 方法 ,如 酵母 的 乙酸 锂 转 染 ,动物 细胞 的 磷酸 钙 或 DEAE -糖苷 转 染 。DNA 通过 内 吞 吸收 。 这 些 方法 一 般 对 瞬时 和 稳定 转 染 都 有 效 ,除了 DEAE -糖苷 转 染 动物 细胞 ,对 稳 定 转 染 效率 较 低 脂 质 体 转 染 法 DNA 与 阳离子 脂 质 体 形成 的 复合 物 被 内 吞 吸收 。 此 是 转 染 动物 细胞 、 酵 母 和 植物 原生 质 球 / 原 生 质 体 的 高 效 方法 。 经 常 在 其 他 方法 不 能 起 作用 的 哺乳 动物 细胞 中 能 发 挥 作用 电 穿孔 通过 高 电压 短暂 冲击 产生 瞬时 小 孔 吸 收 裸露 的 DNA。 是 转 染 酵 母 \ 植 物 和 动物 细胞 非常 有 效 的 方法 直接 注射 是 将 DNA 导 人 细胞 十 分 费力 的 方法 但 有 100% 效 率 。 通 常用 于 动物 卵 母 细胞 .卵细胞 和 合子 ,以 及 其 他 方法 转移 困难 的 细胞 微 弹 (生物 弹 ) 使 用 显 微 注射 (microprojectiles) , 以 多 或 金 的 颗粒 包 被 DNA, 用 基因 枪 (gene gun) 高 速 打 人 细胞 (原先 是 改进 的 短 枪 ,但 近来 发 展 了 用 空气 或 放电 的 高 压 冲击 波 更 精制 的 装置 )。 不 需要 去 除 细胞 壁 ,能 对 植物 细胞 有 效 转 染 。 也 能 用 于 转 染 整个 植物 和 动物 组 织 转 导 方法 (DNA 在 病毒 衣 克 中 转移 ) 重组 病毒 主要 用 于 哺乳 动物 的 病毒 载体 。 几 种 病毒 能 被 用 作 载 体 一 一 疱疹 病毒 在 基因 组 外 存在 , 反 转录 病毒 和 腺 病毒 整合 到 基因 组 (参见 杆 状 病毒 表达 系统 )。 植 物 病 毒 也 被 发 展 成 载体 ， 但 由 于 到 载体 的 成 功 ,所 以 植物 病毒 没有 被 广泛 应 用 。 病 毒 启动 子 经 常 被 用 在 表达 载 体 中 ,驱动 结构 基因 的 大 量 表 达 接合 方法 (DNA 通过 细菌 接合 转移 到 真 核 细胞 中 ) Ti 载体 用 根瘤 农 杆菌 的 Ti 质粒 切 得 的 工 - DNA 转化 培养 的 活体 植物 和 植物 细胞 。 重 组 的 工 - DNA 是 高 效 的 基因 转移 载体 ,尽管 只 有 双子 叶 植物 能 被 转化 ( 文 框 24.6) 转 染 (transfection) : 当 用 于 真 核 细 胞 时 ,任何 裸露 DNA 的 吸收 都 称 为 转 染 (不 是 噬菌体 DNA 在 细菌 中 的 情况 )。 相反 ,转化 (transformation) 是 指 通过 DNA 整合 到 基因 组 中 改变 基因 型 (在 细菌 中 ,转化 是 将 裸露 的 非 病 毒 DNA 导 人 细胞 的 过 程 , 与 真 核 生物 转 染 类 似 )。 转 染 和 转化 在 酵母 中 的 使 用 是 类 似 的 。 大 多 数 细菌 和 酵母 载体 是 游离 在 细胞 质 中 ,也 就 是 作为 自身 复制 子 在 基因 组 外 维持 。 相反 ,高 等 真 核 生物 缺乏 核 质粒 和 潜在 的 游离 在 细胞 质 中 的 DNA 病毒 (哺乳 动物 中 疱疹 病 。 3。 毒 为 基础 的 载体 是 例外 )。 这 样 的 DNA 在 高 等 真 核 生物 中 不 能 像 细 菌 和 酵母 那样 以 基因 组 外 的 形式 存在 。 在 有 些 情 况 下 ,这 并 不 重要 ,因为 DNA 不 需要 被 稳定 地 维持 :很 多 实验 ,如 报告 基因 分 析 在 相对 快速 和 瞬时 转 染 中 就 能 进行 ( 当 DNA 导入 细胞 后 逐渐 因 稀 释 和 降解 所 减少 )。 如 蛋白 过 度 表达 需要 稳定 转 染 (stable transfection) ,在 没有 游离 载体 的 情况 下 ,一 般 通过 DNA 稳定 整合 到 基因 组 中 达到 目的 。DNA 直接 转 染 高 等 真 核 细 胞 时 频繁 地 随机 整合 到 基因 组 中 ,提供 了 在 培养 的 动物 和 植物 细胞 中 遗传 转化 的 相对 简单 的 机 制 。 转基因 动物 和 植物 在 多 细胞 生物 中 ,将 上 面 所 讨论 的 基因 转移 技术 应 用 到 全 能 (totipotent, 参 阅 ) 细 胞 中 ,能 够 产生 体 细 胞 基因 型 有 相同 改变 的 动物 和 植物 。 这 样 的 生物 被 称 为 转基因 的 @ (transgenic) ,可 通过 生殖 系统 以 简单 的 孟 德 尔 特征 传递 它们 新 获得 的 遗传 性 状 。 转基因 植物 的 路 线 相 对 简单 ,因为 Ti 质粒 是 自然 发 生 的 其 主要 基因 转移 系统 是 高 效 的 。 还 因为 分 化 的 植物 细胞 是 全 能 性 的 ,至 少 在 有 些 物种 中 ,能 够 在 合适 的 条 件 下 重新 产 生 整 个 成 熟 的 植物 ( 文 框 24.6)。 相 反 分 化 的 动物 细胞 的 全 能 性 有 限制 ,因此 转基因 动物 必须 通过 对 卵细胞 或 从 早期 豚 胎 得 到 的 细胞 进行 操作 才能 产生 。 有 三 种 方法 可 以 产生 转 基因 动物 ( 文 框 24.7)。 使 用 最 广泛 的 是 直接 将 DNA 注射 到 卵细胞 的 细胞 核 中 , 导致 DNA 随机 整合 到 基因 组 中 。 在 小 鼠 中 ,转基因 技术 更 精细 ,胚胎 干细胞 (ES) 的 基因 寻 壮 (gene targeting, 人 参阅) 能 够 进行 特殊 的 遗传 改造 。 与 胚 系 转化 一 样 ,基因 转移 到 活体 体 细 胞 的 技术 也 被 开发 出 来 。 体 细胞 转基因 (somatic transgenesis) 最 雄心 勃勃 的 应 用 是 基因 治疗 (gene therapy) ,是 用 核酸 治疗 甚至 纠正 人 类 疾病 ( 文 框 24.8)。 转基因 动物 和 植物 提供 了 研究 基因 功能 的 难以 比拟 材料 。 与 类 似 的 体外 或 在 培养 细 胞 中 进行 的 研究 不 同 ,在 转基因 生物 插入 的 遗传 物质 ,转基因 (transgene) 能 在 整个 生物 体 不 同 阶段 被 研究 ( 即 不 同 的 空间 和 发 育 阶 段 的 表达 )。 这 可 以 用 于 分 析 缺 失 和 获得 基因 所 产生 的 功能 效应 并 可 检测 调节 元 件 。 尤 其 重要 的 是 可 以 用 转基因 小 鼠 作 为 人 类 疾病 和 肿 瘤 的 模型 。 另 一 个 转基因 技术 的 重要 用 途 是 大 量 表 达 外 源 蛋 白 。 动 物产 药 (animal pharming) 是 表述 在 动物 的 乳液 中 生产 有 商业 价值 蛋白 的 委婉 用 词 特别 是 药物 一 一 通过 内 源 性 乳液 蛋白 基因 启动 子 驱 动 的 转基因 。 这 种 方法 提供 了 一 个 丰富 和 可 再 生 的 重 组 蛋白 来 源 , 这 种 重组 蛋白 是 以 易于 纯化 的 状态 存在 。 类 似 的 转基因 植物 提供 了 生产 化 学 制品 ` 燃料 .药物 和 新 型 食品 的 来 源 。 转 基因 技术 还 能 通过 加 进 新 的 特征 增加 商业 上 重 要 的 动 植物 的 性 状 (如 对 除草 剂 和 害虫 的 抗 性 ) 和 对 已 存在 的 性 状 能 进行 改进 (如 水 果 、 谷 物 、 肉 类 和 牛奶 的 产量 和 质量 )。 转移 到 真 核 细胞 中 的 DNA 的 命运 ”如 上 文 所 讨论 的 ,转移 到 真 核 细胞 的 DNA 很 少 游 离 存 在 于 细胞 质 中 ,而 是 整合 到 基因 组 内 。 外 源 性 DNA 能 以 三 种 方式 与 基因 组 DNA 相 互 作用 :中 非法 地 重组 随机 整合 ;@ 它 可 以 通过 单个 交换 的 同 源 重 组 整合 到 一 特定 位 点 ( 共 整 合 或 融合 );G9) 它 可 以 通过 双 交 换 同 源 重组 或 基因 转变 来 替代 基因 组 的 一 个 片段 (置换 )。 @ 转基因 以 前 定义 为 外 源 基 因 ( 即 来 自 于 不 同 物质 的 基因 ) 导 和 一 个 动物 或 植物 的 胚 系 中 ,而 现在 的 定义 已 变 成 涵盖 了 各 种 形式 的 胚 系 操作 ,包括 一 个 内 源 基 因 额 外 拷贝 的 导入 ,定向 破坏 及 反 义 基因 的 导 人 。 有 些 研究 者 用 定向 这 个 术语 而 不 用 转基因 来 描 令 动物 和 植物 ,即使 它们 的 胚 系 差异 是 微小 的 (以 双重 取代 的 策略 来 产生 点 突变 ) ,或 者 即 使 是 有 关 基 因 来 源 于 同一 物种 。 全” 在 酵母 中 , 同 源 重组 尤其 有 效 ,大 多 数 基因 组 的 整合 是 单 交 换 或 置换 。 在 哺乳 动物 中 ,由 于 高 活性 的 末端 连接 修复 系统 的 存在 ,非法 重组 比 同 源 重组 发 生 频率 高 10` 倍 。 因 此 ,大 多 数 导入 动物 和 植物 细胞 的 DNA 是 随机 整合 在 偶尔 发 生 的 DNA 链 断 口 位 点 ,对 很 少 的 同 源 重组 需要 仔细 选择 策略 (图 24.9)。 全 (b) 寻 靶 载体 寻 秀 载体 关 同 源 靶 同 源 靶 “ 兴 尖 一 5 1 一 一 | 整合 (末端 内 ) 置换 (末端 外 ) | 通天 原本 | ET 志 天 和 | RE 服 国 这 齐 第 二 轮 置换 载体 | 全 全 人 含有 细微 突变 ) 用 对 G148 抗 性 进行 正 选择 用 对 g- 鸟 嘎 叭 ) 敏感 性 进行 负 选 择 存活 死亡 图 24.9 基因 寻 和 靶 。 定 向 DNA 的 整合 可 以 通过 两 类 剔除 载体 中 的 一 种 :(a) 插 人 载体 ( 靶 的 内 部 带 有 未 端 单 交 换 位 点 ) 或 (b) 置 换 载 体 ( 靶 的 外 侧 带 有 末端 双 交换 位 点 )。 插 人 载体 完全 整合 到 基 因 组 中 ,而 置换 载体 用 同 源 的 载体 序列 替代 基因 组 的 部 分 序列 。 在 两 种 情况 中 ,载体 的 大 片段 留 在 基因 组 中 ,因为 需要 使 用 显 性 选择 标记 (箭头 表示 )。 为 了 完成 精细 的 定向 诱 变 ,如 点 突变 (以 Mx 表示 ) ,需要 第 二 轮 蔡 代 (c)。 在 哺乳 动物 基因 组 中 , 同 源 重 组 很 少 发 生 ,而 随机 整合 很 平常 。 使 用 双 正 = 负 选 择 (d) ,如 用 大 肠 杆菌 的 zeo 基因 和 疱疹 病毒 灵 基因 。 正 选择 的 zeo 基因 对 抗 生 素 G418 有 抗 性 ,而 克 基因 对 胸 苷 类 似 物 9-[1,3- 二 羟 -2- 丙 氧 甲 基 ] 乌 味 叭 1 敏感。 灰 基因 位 于 寻 靶 载 体 的 同 源 结构 域 侧 外 ,所 以 只 能 通过 随机 插 人 导入 基因 组 中 。 只 有 那些 进行 同 源 重 组 的 细 胞 才能 对 9-[1,3- 二 羟 -2- 丙 氧 甲 基 ] 鸟 味 哈 0 和 G418 有 抗 性 。 专门 设计 用 来 将 DNA 导入 基因 组 的 载体 称 为 基因 送 递 载体 (gene delivery vector) 或 自杀 载体 (suicide vector)( 后 者 的 意思 是 因为 它 既 不 够 维持 也 不 能 恢复 )。 如 果 笨 主 基 因 组 和 载体 有 同 源 ,相互 之 间 会 有 同 源 相 互 作 用 ,这 样 的 相互 作用 被 载体 的 线性 化 所 促进 ， 1) 9-[1,3- 二 羟 -2- 丙 氧 甲 基 ] 鸟 味 叭 (ganciclovir,GCV) 是 无 环 鸟 苷 (ACV) 的 类 似 物 ,但 在 抗 巨细 胞 病毒 方面 更 为 有 效 。GCYV- 三 磷酸 通过 抑制 病毒 DNA 聚合 酶 而 抑制 病毒 DNA 的 合成 。 原 文 写成 gancylovir。 译 者 注 “> 这 是 因为 线性 化 的 DNA 通过 侵入 同 源 双 链 启动 重组 ( 见 第 25 章 重 组 )。 随机 整合 转基因 一 一 获得 功能 效应 ”诱导 动物 或 植物 基因 组 改变 的 最 简单 策略 是 将 外 源 DNA 随机 整合 。 这 对 大 多 数 生 物 系统 是 唯一 的 有 效 手 段 , 且 足 以 研究 或 得 到 那些 转 基因 整合 产生 的 功能 获得 和 显 性 功能 丢失 两 效应 。 获得 功能 的 效应 不 仅 是 由 于 在 基因 组 中 导 人 一 个 外 源 基因 ,还 可 以 增加 了 一 个 内 源 性 基因 的 表达 水 平 或 范围 (如 通过 导 和 人 在 强 病毒 司 动 子 控制 下 的 额外 拷贝 一 一 过 度 表 达 研究 一 一 或 不 同 的 细胞 类 型 专 一 性 启动 子 一 一 异 位 表达 研究 )。 外 源 基因 的 表达 经 常 是 生物 技术 工程 的 基本 目的 ,然而 研究 机 构 倾向 于 分 析 基 因 功 能 和 调节 。 对 在 正常 或 经 过 修饰 的 调节 元 件 控制 下 报告 基因 表达 的 分 析 在 研究 基因 调节 中 被 广泛 应 用 。 转基因 的 随机 整合 方法 有 几 个 相关 问题 :中 转基因 经 常 有 位 置 效应 ,可 能 引起 沉默 、 改变 异 位 表达 或 限制 表达 模式 和 改变 表达 水 平 ;@O 转 基因 有 剂量 效应 一 一 不 能 控制 整合 的 拷贝 数 ;G) 在 哺乳 动物 中 ,特别 是 在 植物 中 ,在 基因 组 中 整合 了 多 拷贝 DNA 序列 会 引 起 外 遗传 沉默 现象 ( 见 DNA 甲 基 化 和 外 遗传 调节 ) ;@ 田 可 能 对 内 源 性 基因 的 表达 有 非 专 一 性 的 效应 。 最 近 转 基因 技术 的 改进 有 助 于 减弱 整合 的 位 置 效 应 。 这 些 反映 了 :整合 位 点 的 异 源 调节 元 件 和 染色 质 功能 域 结构 的 影响 ;@O 转 基因 通常 较 小 且 缺 乏 远 距离 调节 元 件 ,在 正 常情 况 下 使 这 些 位 置 不 依赖 调节 元 件 。 在 动物 和 植物 中 发 现 ,通过 在 转基因 两 侧 加 上 边 界 元 件 (参阅 ) 可 以 降低 位 置 效应 ,可 能 是 由 于 将 转基因 特定 作为 独立 的 染色 质 结构 域 所 致 。 最 近 发 展 的 YAC 转基因 ,小 鼠 携带 酵母 人 工 染 色 体 转基因 ,使 大 片段 的 DNA 能 进入 小 鼠 基 因 组 ,这样 ,基因 有 机 会 受到 各 种 内 在 调节 元 件 的 影响 。YAC 转基因 对 大 基因 和 大 范围 调节 现象 的 研究 有 极 大 的 价值 ,如 基因 座 控制 区 域 和 增强 子 的 活性 染色 质 结构 域 效应 ,亲本 印迹 和 体 细胞 的 超 变 。 随机 整合 转基因 一 一 失去 功能 效应 ”对 失去 功能 效应 的 研究 经 常 需要 定向 破坏 特定 的 基因 ,接着 繁殖 产生 纯 合 体 ( 见 下 一 部 分 )。 然 而 随机 整合 转基因 也 能 用 于 基因 功能 失去 的 研究 ,尽管 经 常 只 在 是 对 野生 型 显 性 的 情况 下 (因为 导 人 一 个 隐 性 突变 等 位 基因 到 基因 组 不 会 有 效果 )。 偶 尔 一 个 随机 整合 的 转基因 会 碰巧 打 断 一 个 内 源 性 基因 ( 播 入 失 活 ) ,在 这 些 情况 下 杂 合体 [ 显 性 突变 经 常 是 由 于 单 倍 体 机 能 不 全 (naploinsufficiency) ] 或 纯 合 体 ( 隐 性 突变 ) 中 可 产生 表 型 。 这 是 诱 变 的 初步 和 偶然 的 形式 ,是 不 定向 的 。 然 而 转基因 整 合 的 随机 插入 诱 变 原理 可 用 于 大 规模 的 遗传 筛选 (参见 转 座 子 标记 ,基因 包 载 )。 显 性 功能 丢失 效应 能 够 通过 多 种 途径 产生 :@ 如 果 一 个 突变 等 位 基因 以 显 性 失 活 方 式 作 用 ,一 个 随机 整合 转基因 会 破坏 野生 型 等 位 基因 的 功能 ;@ 选 择 性 细胞 部 分 切除 (cell ablation) 可 以 通过 表达 一 个 在 组 织 特异 性 启动 子 控制 下 的 毒 蛋 白 , 象 草 麻 毒素 ;这 可 用 于 研究 表达 特定 基因 的 各 种 细胞 杀伤 效应 ; @ 显 性 或 部 分 显 性 的 基因 击 倒 (gene knock- down) 效 应 可 以 通过 表达 反 义 RNA 或 核 酶 结构 寻 靶 于 一 个 特定 基因 来 达到 一 一 这 可 以 通过 降解 或 灭 活 mRNA 来 抑制 基因 功能 ( 文 框 24.8);@ 轩 类 似 的 是 在 蛋白 水 平 的 基因 击 倒 可 以 通过 表达 一 个 重组 抗体 来 达到 ,结合 并 抑制 特定 蛋白 的 活性 ( 见 文 框 24.8)。 通过 同 源 重 组 进行 基因 寻 靶 基因 寻 靶 (gene targeting) 是 体内 定点 诱 变 的 一 种 形式 ， 涉及 到 含有 一 个 等 位 基因 的 寻 靶 载体 (targeting vector) 和 具有 不 同等 位 基因 内 源 基 因 间 。324 ， 的 同 源 重 组 。 有 两 类 寻 驾 载体 供 使 用 :整合 载体 (末端 -内 侧 载体 ,ends-in vectors) ,在 同 源 结构 域 中 剪 切 ,促进 产生 一 次 单 交 换 ,使 整个 载体 整合 ;置换 载体 (末端 -外 侧 载体 ,ends- out vectors) 在 同 源 结构 域外 侧线 性 化 和 双 交 换 或 在 同 源 结构 域内 发 生 基因 转换 以 载体 的 同 源 区 域 蔡 代 基 因 组 的 一 部 分 (图 24.9)。 基因 寻 靶 有 多 种 应 用 : (1) 基 因 剔 除 (定向 破坏 ) 可 以 通过 在 整合 载体 中 任何 位 置 或 在 置换 载体 的 同 源 结构 域 中 插入 一 个 DNA 盒 来 完成 (在 图 24.9 中 黑色 箭头 表示 )。 这 个 DNA 盒 经 常 是 一 个 显 性 选择 标记 ,如 细菌 的 zeo 基因 ,能 够 用 来 选择 靶 细胞 。 (2) 等 位 基因 替代 。 一 个 等 位 基因 被 另 一 个 替代 ,如 用 来 研究 精细 突变 的 效应 。 这 和 需 要 两 轮 替 代 , 因为 选择 的 需要 意味 着 整合 载体 和 置换 载体 在 基因 组 中 留 下 载体 顺序 (图 24.9)。 (3) 基 因 打 入 (gene knock-in) 是 用 一 个 基因 替代 另 一 个 基因 的 新 应 用 。 这 通过 将 进 人 基因 作为 盒子 插入 同 源 结构 域 来 实现 ,这 在 多 基因 家 族 中 不 同 成 员 间 的 交换 非常 容易 。 (4) 基 因 治 疗 。 在 这 种 情况 中 ,突变 的 无 效 等 位 基因 被 正常 等 位 基因 所 替代 ( 见 文 杠 24.8)。 基因 寻 划 在 酵母 中 是 一 个 有 效 的 方法 , 正 被 积极 用 于 系统 化 剔除 所 有 6300 个 基因 的 计划 。 在 小 鼠 中 ,基因 寻 靶 是 通过 转 染 ES 细胞 进行 , 比 随机 整合 效率 低 。 正 负 策 略 需要 选 出 很 少 的 目标 细胞 ,图 24.9 中 显示 。 尽 管 这 些 限 制 ,这 种 技术 在 分 析 基 因 功 能 ,包括 很 多 在 发 育 过 程 中 起 重要 作用 的 基因 上 还 是 非常 有 价值 ,然而 从 这 种 实验 中 得 到 了 意 想 不 到 的 发 现 ,发 育 基因 高 水 平 的 遗传 丰 余 结果 是 很 多 小 鼠 的 无 效 突变 体 显示 出 令 人 惊奇 的 中 性 表 型 (参见 丰 余 )。 可 诱导 的 转基因 活性 ”通过 将 转基因 生物 置 于 可 诱导 控制 下 ,可 将 调控 的 额外 水 平 设 计 引 入 转基因 生物 中 。 通 常 有 两 种 形式 的 调控 被 使 用 :@ 转 换 基 因 表 达 开 或 关 的 可 诱导 启动 子 ; 和 @ 可 诱导 的 位 置 专 一 性 重组 体系 ,不 仅 有 利于 控制 基因 表达 ,而 且 也 可 以 用 干 细胞 类 型 专 一 性 基因 缺失 和 染色 体重 排 。 可 诱导 的 转基因 广泛 用 于 过 度 表 达 和 蜡 位 表达 的 研究 。 热 休克 诱导 经 常用 在 果 蝇 和 植物 中 。 在 小 鼠 中 很 多 不 同 的 体系 经 试验 得 到 不 同 的 结果 。 蜡 源 调节 体系 最 成 功 ,因为 很 少 残留 活性 并 且 诱 导 是 专 一 性 针对 转基因 而 不 会 同时 激活 内 源 性 基因 。 例 子 中 包括 果 蝇 的 晓 皮 激素 启动 子 , 它 对 果 蝇 旷 皮 激素 反应 ,而 Tet 体系 对 四 环 素 诱 导 作出 反应 。 位 点 专 一 性 重组 (参阅 ) 是 涉及 短 的 保守 序列 (重组 子 ) 和 识别 并 催化 它们 间 重 组 的 酶 (重组 酶 ) 的 重组 形式 。 成 对 重组 子 元 件 特定 排列 可 以 促进 缺失 \ 倒 位 和 易 位 ( 共 整 合 ) 发 生 ( 见 文 框 25.4)。 如 果 重 组 酶 基因 和 由 编码 酶 识别 的 重组 子 元 件 被 插 和 人 转基因 生物 中 ， 会 发 生 DNA 定向 重 排 。 定 向 缺失 可 用 于 基因 剔除 (如 通过 整个 基因 缺失 ) 或 基因 重新 激 活 (通过 缺失 由 启动 子 分 离 的 插入 基因 )。 定 向 染色 体重 排 也 可 能 产生 。 这 种 技术 的 能 力 来 源 于 对 重组 酶 的 控制 。 重 组 酶 基因 可 以 细胞 类 型 专 一 性 方式 或 可 诱导 控制 被 激活 。 在 第 一 种 方式 中 ,可 以 产生 细胞 类 型 专 一 性 的 基因 剔除 ;而 在 第 二 种 类 型 中 ,可 以 在 生物 生 命 周期 的 任何 阶段 产生 基因 剔除 , 即 若 基 因 被 剔除 则 有 多 效 效应 (参阅 ) 但 是 胚胎 致死 时 非常 有 用 。Cre-oz 重组 酶 被 广泛 使 用 ,特别 是 在 转基因 小 鼠 中 ,酿酒 酵母 的 20 质粒 FLP-FRP 系统 在 果 蝇 中 得 到 良好 的 发 展 。 这 些 系统 内 在 功能 在 文 框 23.4 中 讨论 。 。 息 25 。 文 框 24.1 关键 工具 和 技术 工 :限制 性 内 切 本 酶 类 型 ”特征 IT 型 三 亚 基 复 合 物 ,分 别 有 不 同 的 识别 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 活性 Mg ,ATP 和 S- 腺 苷 甲 硫 氨 酸 (SAM) 为 活性 所 需 识别 位 点 是 二 部 分 组 成 的 , 剪 切 发 生 在 随机 位 点 >1kb 远 开 型 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 相 分 离 , 单 亚 基 酶 识别 相同 目标 顺序 活性 需要 Mg 识别 位 点 经 常 是 二 重 对 称 的 一 一 根据 识别 位 点 结构 有 多 种 亚 型 。 剪 切 发 生 在 两 条 链 识别 位 点 的 附近 亚 型 在 双 亚 基 复 合 物 中 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 分 开 , 其 中 一 个 亚 基 是 相同 的 活性 需要 Mg2+ 和 ATP,SAM 刺激 并 不 关键 识别 位 点 是 单个 的 。 前 切 位 点 是 可 变 的 ,大 约 在 识别 位 点 下 游 23Sbp。 前 切 只 在 一 条 链 发 生 。 限制 性 内 切 酶 的 类 型 ”限制 性 内 切 酶 (限制 性 酶 ) 是 细菌 识别 特殊 核酸 序列 (限制 性 位 点 ) 的 内 切 酶 ,经 典 的 识别 位 点 是 长 4 一 8 碱 基 对 。 限 制 性 酶 的 生理 作用 是 宿主 控制 的 限制 和 修饰 (参阅 )， 因此 每 个 限制 性 酶 都 与 相同 的 DNA 甲 基 化 酶 相 结合 来 保护 宿主 DNA 免 受 自我 限制 。 至 少 有 三 类 限制 性 酶 ( 见 上 表 ) ,但 只 有 开 型 酶 对 构建 重组 DNA 分 子 有 作用 :它们 经 常 精确 地 在 限制 性 位 点 相关 的 磷酸 二 酯 键 前 切 DNA 产生 确定 的 产物 一 一 限制 性 片段 。 命名 法 ”限制 性 内 切 酶 由 物种 三 字母 以 斜体 命名 (如 有 o = 下 . coi ,再 m = 互 . 识 Juerzae) ,如 果 需 要 ,限制 性 表 型 是 由 质粒 或 噬菌体 赋予 的 ,用 更 多 的 字母 或 罗马 数字 表明 株 系 或 载体 (如 EcoRI, 苹 md, Ba H)。 最 后 ,如 果 同 一 细胞 中 多 于 一 个 限制 性 体系 存在 ,它们 就 用 罗马 字母 加 以 区 别 , 如 下 zd 焉 。 如 有 必要 ,一 个 限制 性 修饰 系统 的 内 切 酶 和 对 应 甲 基 化 酶 可 以 通过 前 级 R 和 M 分 别 定义 ,如 R. Ba HI,M. BaxzHI。 开 型 限制 性 位 点 的 分 布 和 剪 切 频率 I 型 限制 性 内 切 酶 剪 切 DNA 的 频率 是 依赖 于 限制 性 位 点 的 大 小 ( 酶 可 以 被 称 为 4 -切割 ,6 -切割 等 )。 在 随机 DNA 序 列 任何 基 序 中 的 频率 是 1/4",z 是 基 序 的 大 小 。 因 此 4 -切割 酶 如 Sax3AI(GATC) 倾 向 于 每 大 约 250bp 中 剪 切 DNA 一 次 ,而 6- 切 割 的 像 KoRI(GAATTC) 产 生平 均 4kbp 大 小 的 片段 ,如 NorI(GCGGCCGC) 的 8- 切割 则 平均 65kbp 产 生 片 段 。 片 段 的 大 小 也 依赖 于 底 物 的 碱 基 组 成 。 稀 有 切割 有 大 的 识别 位 点 或 识别 位 点 只 在 特定 基因 组 中 出 现 。NotI 是 8- 切割 ,限制 性 位 点 是 GC 丰富 的 ( 较 少 出 现在 哺乳 动物 基因 组 中 一 一 40%GC) ,包含 两 个 CpG 基 序 (在 哺乳 动物 DNA 中 是 很 缺乏 的 )。 因 此 NoxI 消化 哺乳 动物 DNA 预计 的 平均 片段 大 小 是 大 约 953kbp。 稀 有 切割 在 制备 粘 粒 文库 和 大 范围 限制 性 图 谱 有 用 (参见 内 含 子 - 编 码 内 切 酶 \HO 内 切 酶 )。 开 型 限制 性 位 点 的 属性 和 限制 性 片段 II 型 限制 性 位 点 是 二 重 对 称 的 。 如 果 剪 切 发 生 在 对 称 轴 上 产生 则 平 末 端 。 如 果 前 切 位置 不 直接 彼此 相对 , 则 产生 一 个 交错 的 断口 ,是 $ 或 3 突出 末端 (粘性 末端 ) 。 一 般 情 况 下 相同 酶 产生 的 限制 性 片段 是 匹配 的 而 不 同 酶 产生 的 不 匹配 。 一 些 例外 在 下 面 讨 论 。 相同 的 限制 性 内 切 酶 不 总 是 产生 匹配 的 片段 。 限 制 性 位 点 可 以 是 专 一 性 的 ,其 前 切 核 苷 酸 顺 序 是 不 变 的 ,产生 匹配 的 末端 (如 下 xzd 亚 经 常 在 顺序 AAGCTT 前 切 )。 其 他 位 点 包括 一 个 或 多 个 ~ IEC 双关 的 核 苷 酸 , 增 加 了 随机 DNA 顺序 中 的 前 切 频率 ,但 意味 着 酶 产生 的 末端 并 不 总 是 匹配 的 (如 玫 zdI 在 顺序 GTYRAC 剪 切 ,产生 四 种 不 同类 型 的 粘性 末端 )。 限 制 位 点 是 单个 的 ,限制 序列 也 许 是 连续 的 或 是 二 重 的 ,也 许 显示 不 完善 两 侧 对 称 (如 及 oNI 在 顺序 CCTNNNNNAGG 前 切 ,N 可 以 是 任何 核 苷 酸 )。 由 于 中 心 核 苷 酸 的 随意 特性 ,在 双向 位 置 上 剪 切 不 产生 广泛 匹配 的 片段 。 在 次 理想 条 件 下 ,一 些 限 制 性 内 切 酶 的 专 一 性 会 被 降低 ,只 有 部 分 正常 识别 位 置 被 识别 。 此 称 为 星 状 活性 (star activity)( 如 在 次 理想 的 pH 下 ,通常 识别 GAATTC 位 置 的 FeoRI 只 识别 内 部 的 AATT 顺序 )。 酶 BigI 是 一 个 独特 的 酶 , 它 在 DNA 的 每 条 链 前 切 两 次 ,产生 包含 识别 位 点 的 小 片 段 。 而 TaaII 是 唯一 识别 两 个 不 相关 位 点 的 酶 。 不 同 的 限制 性 内 切 酶 可 以 产生 匹配 的 片段 。 识 别 不 同位 点 的 限制 性 内 切 酶 有 时 可 以 产生 匹 配 的 粘性 未 端 。 这 可 以 发 生 在 一 个 酶 的 识别 位 点 包含 在 另 一 个 大 的 位 点 中 ,是 一 个 丹 套 式 位 点 (nested site)。Baxm HI 识别 顺序 GGATCC 和 Sax3AI 识别 内 部 的 四 核 苷 酸 GATC; 二 者 都 产生 匹 配 的 GATC 的 $ 突出 。 连 接 后 产生 可 以 被 原始 酶 的 一 个 或 两 个 识别 的 杂种 位 点 (hybrid site) ,或 者 两 个 酶 都 不 能 识别 (在 所 举例 子 中 , Sax3AI 前 切 BamHIXSax3AI 杂种 位 点 ,但 BamHI 的 剪 切 依 赖 于 两 侧 核 苷 酸 ) 。 不 同 来 源 的 限制 性 酶 也 可 以 识别 同样 的 位 点 。 这 样 的 酶 称 为 前 切 相 同位 置 的 同 切 点 酶 (isoschizomers) 和 剪 切 不 同位 置 的 新 切 点 酶 (neoscizomers) 或 异 切 点 酶 (heteroscizomers) 。 SmaI 和 XzzaI 都 识别 六 碱 基 位 点 CCCGGG。 然 而 SaI 在 对 称 轴 剪 切 产生 平 端 而 XzaI 在 第 一 和 第 二 个 胞 喀 啶 间 剪 切 产 生 CCGG 的 5 突出 。 甲 基 化 敏感 ”每 个 限制 性 内 切 酶 都 有 相关 的 甲 基 化 酶 (cognate methylase) ,在 宿主 基因 组 中 通过 甲 基 化 修饰 限制 性 位 点 ,阻止 自我 限制 (参见 宿主 限制 和 修饰 )。 这 样 所 有 的 限制 性 内 切 酶 都 有 一 定 程度 的 甲 基 化 敏感 性 。 一 些 限 制 性 酶 由 于 它们 识别 位 点 的 特性 ,对 基因 组 范围 的 甲 基 化 敏感 ， 如 大 肠 杆菌 基因 组 的 Dam 和 Dcm 的 甲 基 化 ,和 真 核 生 物 基 因 组 中 CG 或 CNG 基 序 的 甲 基 化 ( 见 第 7 章 DNA 甲 基 化 及 外 遗传 调节 )。 甲 基 化 敏感 性 不 同 的 内 切 酶 对 甲 基 化 DNA 作 图 非常 有 用 。 如 HpaII 和 MsbI 识 别 CCGG 顺序 ,但 只 有 前 者 对 内 部 胞 喀 啶 的 甲 基 化 敏感 。 这 些 酶 可 用 于 确定 高 等 真 核 生 物 中 甲 基 化 的 CpG 基 序 位 置 (参见 HIF 岛 )。 文 框 24.2 ”关键 工具 和 技术 开 : 凝 胶 电 泳 凝 胶 电 泳 ”电泳 (electrophoresis) 是 根据 分 子 的 电荷 和 大 小 在 电场 中 分 离 分 子 方法 。 凝 胶 电 泳 (gel electrophoresis) 是 分 离 大 分 子 混合 物 的 标准 方法 (如 蛋白 质 和 核酸 ) ,因为 在 凝 胶 中 没有 对 流 ， 单独 的 片段 形成 清晰 确定 的 条 带 。 样 品 上 样 在 凝 胶 一 端 狭 窗 区 域 , 这 是 在 配置 凝 胶 时 形成 的 孔 。 电场 穿 过 凝 胶 ,样品 根据 大 小 和 电荷 以 不 同 的 速度 从 孔 中 移出 。 因 为 所 有 的 核 苷 酸 在 磷酸 骨 染 上 有 同样 的 负电 荷 ,它们 的 迁移 率 只 取决 于 分 子 大 小 和 形状 。 蛋 白 有 不 同 的 电荷 ,根据 带电 和 大 小 分 离 ,但 在 去 垢 剂 十 二 烷 基 克 酸 钠 存在 下 变性 蛋白 电荷 一 致 化 ,按照 分 子 量 大 小 分 离 ( 参 见 western 杂交 )。 用 于 核酸 的 标准 凝 胶 电 泳 。 DNA 和 RNA 分 子 从 守 核 苷 酸 到 20kbp 的 限制 性 片段 可 以 在 标准 电 泳 胶 上 分 离 。 使 用 的 电泳 方法 有 两 类 :水 平 的 琼脂 糖 凝 胶 有 中 等 分 辩 率 ,用 于 分 析 和 制备 100bp 到 20kbp 大 小 片段 ,而 垂直 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 具 有 单 核 苷 酸 的 分 辨 率 , 用 于 分 析 和 制备 小 分 子 (如 可 满足 DNA 测序 的 需要 )。 在 两 种 情况 下 凝 胶 的 平均 孔径 大 小 可 以 通过 改变 浓度 改变 ,并 且 不 同 浓度 人 用 来 分 离 不 同 大 小 范围 的 核酸 。 在 琼脂 糖 凝 胶 上 的 核酸 经 常用 内 挨 染 料 溴 乙 啶 染色 检测 , 它 在 UV 光 下 发 荧光 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 的 条 带 经 常用 放射 自 显影 ,尽管 也 可 以 使 用 银 染 。 适用 于 大 的 DNA 分 子 ”核酸 在 凝 胶 中 移动 时 改变 它们 的 构象 ,在 伸展 和 压缩 形式 之 间 变 化 。 它们 的 速度 依赖 于 凝 胶 孔 径 大 小 和 核酸 紧密 形式 球状 大 小 之 间 的 关系 ,大 的 分 子 移动 更 慢 一 些 。 一 且 到 达 临 界 大 小 ,紧密 分 子 太 大 不 能 通过 任何 孔径 ,只 能 以 延伸 的 大 分 子 移动 ,这 样 的 过 程 称 为 胞 行 (reptation)。 在 这 点 上 ,DNA 的 移动 率 不 依赖 于 大 小 ,使 所 有 大 分 子 一 起 迁移 。 为 了 分 离 如 YACs 和 长 的 限制 性 片段 DNA 分 子 , 电 泳 以 脉冲 电场 进行 。 短 暂 的 电场 引起 DNA 分 子 重新 改 变 方向 ;长 分 子 比 短 分 子 重新 排列 需要 更 多 时 间 ,这 样 延 迟 了 它们 通过 凝 胶 的 时 间 ,使 它们 能 够 分 离 。 达 到 200Mbp 的 DNA 分 子 已 经 被 不 同 的 以 脉冲 电场 为 基础 的 方法 所 分 离 ( 在 下 文中 总 结 ) 。 2-D 电泳 ”电泳 在 两 个 方向 进行 ,利用 在 每 个 方向 分 子 的 不 同属 性 ,得 到 更 好 的 分 辨 率 。2-D 蛋白 电泳 涉及 第 一 相 的 等 电 聚 焦 ( 根 据 在 pH 梯度 电荷 电 分 离 ) ,接着 加 上 SDS 在 第 二 相 上 根据 分 子 量 分 离 。DNA 的 2-D 电 泳 使 相同 分 子 量 但 不 同 构象 的 分 子 能 够 分 离 ( 如 拓扑 异 构 体 、 构 象 异 构 体 ` 复 制 中 间 物 )。2- 了 电泳 涉及 第 一 相 根据 分 子 量 分 离 ,接着 加 入 省 乙 喧 诱导 构象 变化 ,在 第 三 相 中 分 离 结构 异 构 体 。 方法 (GE= 凝 胶 电泳 ) 简单 表述 恒定 电场 方向 方法 脉冲 电场 (PFGE) 应 用 短 脉冲 电场 ,分 子 分辩 率 400kbp 电场 反 转 (FIGE) 脉冲 和 变 极 性 的 电场 ,分 辩 率 <800kbp 电场 方向 变化 的 方法 脉冲 电场 梯度 (PFGGE) 。” 脉冲 和 直角 交 变 的 电场 ,分 辨 率 <2Mbp 直角 交 变 电场 (OFAGE) ”与 上 同 , 改 变 角 度 是 45" 而 不 是 90" ,改进 了 条 带 迁 移 的 表现 反 向 交 变 电 场 (TAFGE) ”与 PFGGE 一 样 , 角 度 变 化 是 整个 凝 胶 反 转 钳 位 均匀 电场 (CHEF) 和 凝 胶 以 多 边 形 方式 被 多 个 电极 包围 ,分 辨 率 <7Mbp 程序 自动 化 控制 电极 (PACE) 文 框 24.3 ”关键 工具 和 技术 下 :核酸 杂交 核酸 杂交 单 链 核酸 间 互 补 碱 基 对 成 为 一 些 最 重要 的 生物 过 程 的 基础 :复制 .转录 、` 蛋 白 合成 和 调节 、RNA 剪接、 重组 和 DNA 修复 。 核 酸 杂 交 (nucleic acid hybridization) 是 描述 一 系列 技术 ,它们 利用 双 链 核酸 进行 变性 (denaturation) 或 熔 解 (melting) (分 离 成 单 链 ) 和 互补 单 链 自发 退火 (anneal) 形成 双 链 的 能 力 。 双 链 DNA 可 以 被 变性 ,并 且 同 样 的 链 可 以 重新 退火 (reanneal) 或 复 性 (renature) 形成 同 源 双 链 (homoduplexes)。 另 外 , 单 链 可 以 与 其 他 互补 的 对 应 物 退 火 , 如 标记 的 核酸 探 针 形成 杂种 双 链 (hybrid duplex) 或 异 源 双 链 (heteroduplex) 。 这 种 技术 的 能 力 是 可 以 用 标记 的 核酸 探 针 以 ”8 ， 高 度 专 一 性 和 灵 人 敏 度 在 复杂 混合 物 中 检测 互补 分 子 。 杂 交 可 以 发 生 在 DNA 与 DNA\DNA 与 RNA 或 RNA 与 RNA 之 间 , 也 可 以 是 分 子 内 或 分 子 外 。 杂 交 可 以 发 生 在 溶液 中 的 核酸 或 在 溶液 中 与 被 固定 分 子 之 间 ( 在 固体 支持 上 或 固定 在 细胞 原 位 上 )。 杂交 参数 ” 双 链 核酸 的 稳定 性 取决 于 内 在 和 外 在 因素 。 影 响 双 链 稳定 性 的 内 在 属性 反映 了 固 定 两 条 单 链 的 氢 键 数目 ,包括 双 链 长 度 、.GC 含量 和 互补 双 链 间 错 配 的 程度 。 双 链 越 短 、GC 含量 越 低 、 错 配 越 多 ,固定 两 条 链 的 氢 键 也 就 越 少 ,它们 就 更 容易 变性 。 影 响 双 链 稳定 性 的 外 在 属性 反映 了 与 氢 键 作用 的 环境 因素 。 增 加 温度 引起 氢 键 的 破坏 ,因此 双 链 在 温度 增加 时 熔 解 ( 热 熔 解 )。 化 学 环境 同样 很 重要 :Na- 离子 增加 双 链 的 稳定 性 ,而 去 稳定 的 试剂 破坏 氢 键 。 假定 双 链 的 内 在 属性 是 不 变 的 ,所 以 其 稳定 性 的 维持 能 力 被 外 在 条 件 所 控制 ,总称 为 严格 性 (stringency) 。 双 链 内 在 稳定 性 可 以 在 不 变 的 化 学 环境 中 ,通过 熔 解 温度 (Tu) 测 定 来 度量 。 双 链 核酸 的 变性 引起 在 260nm 波长 紫外 吸收 的 变化 , 即 可 以 在 适合 波长 (ODz) 下 测定 的 减 色 效应 (hypochromic effect) 。Tm 是 对 应 于 50% 变 性 的 温度 定义 的 ,也 就 是 说 ODz 处 在 双 链 和 单 链 DNA 数值 中 间 的 时 候 。 完 全 互补 双 链 的 Tu 值 可 以 通过 下 面 的 方法 计算 。T。 值 每 有 1% 的 错 配 就 下 降 1 度 ,在 甲 酰胺 杂交 溶液 中 是 0.6 度 。 核酸 杂交 实验 通过 测定 Tu 能 用 来 确定 两 个 核酸 间 的 互补 性 。 相 反 , Tu 可 以 用 来 指导 杂交 在 精确 的 严格 性 下 进行 ,与 一 些 分 子 杂 交 而 不 与 另 一 些 分 子 杂 交 。 在 有 些 条 件 下 ,希望 只 检测 完 全 互补 的 顺序 ,就 用 高 度 严 格 的 条 件 。 在 希望 检测 完全 互补 和 相关 序列 的 其 他 情况 下 ,选择 低 严 格 条 件 来 检测 特定 程度 的 互补 性 。 DNA: T,=81.5+16.6(logio[Na+ ])+0.41(%GC) -500 人 发 度 RNA;RNA-DNA: T,_ =79.8+18.5(logio[Na+ ])+0.58(%GC)+11.8(%GC) -820 人 长 度 守 核 苷 酸 : Tua=2(AT 碱 基 对 数目 ) + 4(GC 碱 基 对 数目 ) 溶液 杂交 在 溶液 中 两 种 核酸 混合 ,可 以 研究 顺序 复杂 性 基因 组 组 成 和 基因 结构 。 在 过 去 , 研 究 基因 组 复杂 性 和 基因 分 布 状 态 的 Cot 分 析 和 研究 转录 本 丰 度 和 表达 参数 的 Reot 分 析 是 溶液 杂交 的 主要 应 用 ( 见 文 框 12.1) ,但 随 着 基因 组 作 图 和 测序 计划 进展 这 类 实验 废弃 不 用 了 。 然 而 任何 涉 及 单 链 核酸 在 溶液 中 退火 分 子 反 应 都 是 利用 浴 液 杂交 的 (包括 对 PCR 的 引物 、 体 外 突变 、 引 物 延 伸 、. cDNA 合成 和 随机 引发 以 及 如 消减 和 杂交、 核酸 酶 保护 和 同 源 多 聚 尾巴 等 技术 )。 简单 滤 膜 杂交 。 滤 膜 或 膜 杂交 通过 将 变性 的 靶 核 酸 固定 化 在 固体 支持 物 上 改进 了 对 杂交 分 子 的 检测 。 将 核酸 转移 到 支持 物 上 的 过 程 称 为 印迹 (blotting) ,这 些 支 持 物 经 常 是 硝酸 纤维 素 膜 或 尼 龙 膜 。 印 迹 最 简单 形式 是 变性 样品 直接 放 在 膜 上 (斑点 印迹 )。 另 外 , 靶 核 酸 可 以 通过 一 个 狭 线 ， 使 被 靶 核 酸 覆 盖 的 膜 区 域 被 确定 ( 狭 线 印迹 ) 。 一 旦 转移 后 ,核酸 在 膜 上 就 不 可 移动 。 尽 管 尼龙 膜 可 以 自发 结合 核酸 ,但 经 常 是 通过 烘 烤 或 紫外 光 交 联 。 这 时 将 膜 与 含有 探 针 的 杂交 液 孵育 ,杂交 进行 几 个 小 时 。 然 后 洗 膜 和 检测 探 针 ( 探 针 合成 和 检测 的 讨论 参见 核酸 探 针 )。 这 是 确定 靶 序 列 中 是 否 存在 特定 序列 的 快速 诊断 技术 。 Southern 和 northern 杂交 在 印迹 前 加 上 了 在 凝 胶 中 电泳 分 离 DNA 片段 或 RNA 的 步 又。 电泳 分 离 的 DNA 从 凝 胶 到 固体 支持 物 的 毛细 管 转 移 最 先是 由 Edward Southern 发 明 的 ,所 以 称 为 Sounthern 印迹 。 延 伸 开 来 ,类 似 的 固定 电泳 分 离 的 RNA 的 方法 称 为 northemn 印迹 "!。 这 些 技术 所 依赖 的 原理 是 DNA 片段 或 RNA 分 子 在 滤 膜 上 的 位 置 代 表 了 凝 胶 上 的 位 置 ,反映 了 分 子 量 的 大 小 。 1) 此 方法 是 由 J.C.Alwine 等 人 在 Southern 印迹 的 基础 上 发 展 起 来 的 , 故 十 分 风趣 地 称 这 种 方法 为 northern (北方 ) 印迹 。 一 一 译 者 注 ”3 Southern 印迹 有 多 种 用 途 , 可 分 成 两 组 :@ 简 单 的 Southern 杂交 和 @ 基 因 组 Southern 杂交 。 简 单 的 Southern 用 来 完成 克隆 DNA 的 限制 性 图 谱 的 研究 ,鉴定 重 秋 片 段 和 装配 克隆 重 释 群 。 基 因 组 Southern 杂交 涉及 整个 基因 组 DNA 的 消化 和 电泳 分 离 。 对 大 多 数 基因 组 而 言 ,用 6-- 切割 酶 消 化 产生 不 同 大 小 的 上 百 万 片段 ,在 电泳 凝 胶 上 产生 一 个 无 法 分 辩 的 分 散 分 布 , 但 杂交 可 以 确定 单 个 片 仆 。 基 因 组 Southern 的 一 个 主要 应 用 通过 限制 性 片段 大 小 的 改变 ,鉴定 基因 组 间 的 结构 变化 (限制 性 片段 长 度 多 态 性 ,RFLP)。 很 多 人 类 致 病 突变 可 以 通过 这 种 方式 的 Southern 印迹 被 鉴定 。 点 突变 可 以 产生 或 消除 限制 性 位 点 ,然后 改变 观察 到 的 条 带 模式 。 大 的 缺失 可 以 失去 两 个 相 邻 的 限制 性 位 点 ,此 后 整个 限制 性 片段 缺失 (参见 杂 合 子 寺 失 )。 当 DNA 整合 到 基因 组 中 时 ,可 以 看 到 限制 性 片段 大 小 的 增加 ,如 通过 转 座 因 子 或 外 源 DNA 插入 到 转基因 小 鼠 中 。 高 度 变化 的 DNA 中 RFLPs 分 析 可 以 分 析 微 卫星 多 态 性 (参见 DNA 分 类 )。 基 因 组 Southem 的 第 二 个 主要 的 应 用 是 研 究 相 关 DNA 序列 的 家 族 。 一 个 探 针 不 仅 鉴定 它 同 类 目标 ,而 且 可 以 鉴定 未 知 的 其 他 目标 , 随 严格 性 下 降 ,被 鉴定 的 目标 数 也 增加 。 同 样 严 格 的 条 件 可 以 用 来 筛选 DNA 文库, 试图 分 离 代表 多 基因 家 族 新 成 员 的 相关 克隆 。 同 样 的 技术 也 可 用 于 鉴定 不 同 物种 间 的 相关 序列 [参见 动物 印迹 (zoo blot) ]。 *Southern 印迹 是 根据 发 明 者 命名 的 ,经 常用 大 写字 母 ,但 northern 印迹 (RNA 的 ) 和 western 印迹 (和 蛋白 的 ) 是 根据 类 似 命名 的 ,不 用 大 写 。 很 多 人 试图 使 eastern 印迹 流行 起 来 ,这 是 近来 发 展 的 一 种 脂 的 分 离 和 固定 化 技 术 , 但 这 个 命名 未 被 广泛 接受 。 还 有 southweatern 和 northwestern 印迹 是 对 western 印迹 的 修改 , 探 针 是 标记 的 核酸 ,用 来 检测 核酸 结合 蛋白 (参见 wester 印迹 )。 等 位 基因 专 一 性 杂交 DNA 印迹 (Southern 印迹 和 northern 印迹 ) 的 主要 应 用 是 在 分 析 人 类 疾 病 基因 组 ,以 等 位 基因 专 一 性 杂交 。 者 核 苷 酸 探 针对 碱 基 错 配 极度 灵敏 ,并 且 杂 交 条 件 可 以 被 控 制 使 单个 错 配 导致 杂 交 失 败 。 这 样 可 以 用 来 检测 由 点 突变 产生 的 特殊 的 等 位 基因 (突变 检测 , 参 见 突变 第 选 )。 类 似 的 以 PCR 为 基础 的 技术 涉及 不 能 与 单 碱 基 错 配 杂 交 的 引物 (参见 等 位 基因 专 一 性 PCR、 寡 核 苷 酸 连 接 分 析 和 连接 酶 链 式 反应 )。 反 向 杂交 经典 的 Southern 和 northern 杂交 用 一 个 简单 的 同 源 探 针 筛选 包含 固定 靶 分 子 的 复 杂 混 合 物 。 反 向 杂交 (reverse hybridization， 反 Southern、. cDNA Southern) 涉 及 到 相反 的 过 程 ,这 个 过 程 是 将 克隆 的 DNA 固定 化 与 探 针 复合 物 如 标记 的 全 部 RNA 或 cDNA 混合 杂交 。 这 样 的 技术 对 快速 高 产量 的 表达 研究 非常 有 用 ,可 以 多 个 克隆 被 同时 测试 ,如 确定 每 个 克隆 的 基因 在 特定 组 织 中 是 否 表达 ,而 不 需要 分 别 杂 交 。 菌落 印迹 和 噬 菌 斑 挖 取 核酸 印迹 的 另 一 个 例子 是 用 来 产生 精确 图 谱 的 菌落 印迹 (colony blot) 或 噬 菌 斑 挖 取 (plaque lifts) 。 在 这 些 用 来 筛选 DNA 文库 或 分 析 克 隆 实 验 结果 的 技术 中 ,硝酸 纤维 素 膜 或 尼龙 膜 覆 盖 在 平板 的 细菌 菌落 或 鸣 菌 班 上 ,将 一 些 细胞 或 噬菌体 转移 到 膜 上 。DNA 然后 被 变性 和 固定 化 ,用 特定 的 供 体 DNA 通过 杂交 筛选 。 阳 性 信号 对 应 于 原始 平板 的 菌落 或 叹 菌 斑 可 以 移出 培养 ,分离 大 量 的 供 体 DNA。 原 位 杂交 。 原 位 杂交 是 核酸 探 针 与 保持 在 正常 细胞 位 置 的 靶 进行 杂交 。 这 种 技术 主要 有 三 种 应 用 一 一 克隆 基因 在 染色 体 上 的 细胞 遗传 作 图 (对 染色 体 异 常 分 析 也 有 用 ;参见 FISH) ,检测 病毒 基因 组 和 mRNA 表达 的 定位 。 后 者 是 确定 基因 表达 分 布 的 有 力 而 快速 的 技术 ,对 用 抗体 检测 蛋白 表达 是 一 种 补充 。 细 胞 或 组 织 作为 组 织 切片 或 整个 标本 被 固定 ,与 反 义 RNA 或 赛 核 苷 酸 探 针 渗 透 和 孵育 。 非 同位 素 探 针 技 术 的 发 展 允 许 用 不 同 的 发 色 测定 ,同时 分 析 几 个 基因 的 表达 。 * 330 ， Southerm 印迹 “Northern 印迹 斑点/ 狭 线 杂 交 ”菌落 / 鸣 菌 斑 转移 获得 | | 限制 酶 切 消 化 核酸 长 一 一 5 | bo3y SA YA (CC “转移 到 男 体 介质 上 杂交 ` 洗 膜 、 烤 膜 达 一 和 人 7” 区 >) 隔 文 框 24.4 关键 工具 和 技术 区 :核酸 探 针 探 针 结构 。 探 针 是 被 标记 的 核酸 ,也 就 是 以 一 些 方式 经 化 学 修饰 后 与 其 杂交 的 任何 物体 都 可 以 被 检测 到 。 有 三 种 主要 类 型 的 探 针 :化 学 合成 和 末端 标记 的 志 核 将 酸 探 针 ;DNA 探 针 是 克隆 的 DNA 或 PCR 产物 , 且 可 以 末端 标记 或 在 体外 复制 时 进行 内 部 标记 ;cRNA 探 针 (互补 RNA 探 针 、 核 糖 探 针 ) 是 体外 转录 克隆 DNA 时 内 部 标记 的 探 针 。RNA 探 针 和 守 核 苷 酸 探 针 一 般 以 单 链 分 子 标 记 。DNA 可 以 标记 成 单 链 , 也 可 以 是 双 链 ,但 只 有 单 链 时 才能 作为 探 针 发 挥 作 用 ,所 以 必须 在 使 用 前 变性 。 探 针 标记 产生 探 针 的 不 同方 法 在 下 面 的 表 中 表示 。 最 高 的 专 一 性 活力 (每 群 探 针 中 挫 人 标记 的 比例 ) 的 探 针 通过 内 部 标记 产生 的 ,很 多 标记 的 核 苷 酸 在 DNA 或 RNA 合成 时 挫 人 。 末 端 标记 涉及 DNA 3“ 末 端 加 上 标记 核 苷 酸 或 交换 5 磷酸 基 团 。DNA 探 针 也 可 以 为 特别 的 应 用 末端 标记 ， 如 鉴定 分 子 的 一 个 末端 是 重要 的 (参见 限制 性 图 谱 \DNase 足迹 、 转 录 分 析 )。 同位 素 和 非 同位 素 标记 体系 ”通常 核酸 是 用 放射 性 同位 素 标记 , 如“P 和 “”S( 和 最 近 的 ”P) ,可 以 通过 放射 自 显影 检测 。 这 些 放射 性 探 针 非常 灵敏 ,但 它们 的 操作 必须 有 严格 的 安全 防范 ,并且 信号 消失 相对 较 快 。 最 近 ,一 系列 的 非 同位 素 标记 系统 发 展 起 来 ,它们 产生 发 色 或 化 学 荧光 信号 。 广泛 使 用 的 标记 是 地 高 辛 配 基 (digoxigenin) ,是 从 洋 地 黄 中 分 离 的 植物 省 类 。 它 可 以 与 核 苷 酸 交 联 并 挫 和 人 DNA、RNA 或 寡 核 苷 酸 ,然后 用 抗体 检测 。 另 一 个 系统 是 用 生物 素 , 它 是 一 种 维生素 , 细 菌 蛋 白 亲 和 素 以 强 亲和力 与 其 结合 。 生 物 素 标记 的 核 苷 酸 作为 标记 挫 人 ,用 亲 和 素 检测 。 检 测 的 分 子 可 以 与 荧光 染料 或 酶 偶 联 , 便 于 信号 的 检测 。 这 些 体系 的 优点 是 它们 还 可 以 用 来 从 复杂 的 混 合 物 中 抽 提 核酸 [ 亲 和 捕 捉 (affinity capture)] 。 生 物 素 / 订 和 素 体系 广泛 用 来 从 复杂 混合 物 中 捕捉 和 抽 提 特异 DNA 片 段 (参见 消减 杂交 、 捕 捉 PCR)。 挂 锁 探 针 。。 探 针 技术 的 最 新 发 展 是 探 针 结构 由 与 靶 互 补 的 两 个 片段 组 成 ,它们 通过 一 个 非特 异 的 接头 连接 。 探 针 的 两 端 与 靶 的 邻近 片段 杂交 (末端 进入 片段 中 部 ) ,通过 DNA 连接 酶 连接 形成 和 环绕 靶 DNA 的 拓扑 结构 闭合 的 环 。 这 样 挂 锁 探 针 (padlock probes) 极 其 灵敏 ,因为 锁 上 的 探 针 即使 在 非常 严格 的 洗 脱 条 件 下 ,还 保持 与 靶 序 列 的 联结 。 与 需要 精确 控制 严格 条 件 的 等 位 基因 专 一 性 杂交 (参阅 ) 相 比 , 阻 止 连接 的 点 突变 可 被 这 种 方法 简单 地 检测 到 。 标记 方法 ” 探 针 评论 5 末端 标记 Oligo/DNA 用 标记 的 游离 核 苷 酸 的 7 -磷酸 基 团 由 T4 多 核 苷 酸 激酶 催化 取代 5 “磷酸 基 团 3 末端 标记 Oligo/DNA 用 末端 转移 酶 以 标记 的 核 苷 酸 加 尾 缺口 平移 DNA 由 DNase I 在 双 链 DNA 中 导 人 缺口 ,自由 的 3 末端 由 DNA 聚合 酶 I 用 标记 的 核 苷 酸 延 伸 随机 引发 DNA 短 的 随机 引物 与 变性 DNA 退火 ,由 DNA 聚合 酶 用 标记 的 核 苷 酸 延 伸 。 比 缺口 平移 产生 更 高 专 一 性 活力 引物 延伸 DNA 如 上 ,但 用 特异 性 引物 。 如 用 于 热 循环 中 标记 PCR 产物 单 链 合成 DNA “用 标记 的 核 苷 酸 由 M13/ 鸣 菌 粒 载体 或 不 对 称 PCR( 参 阅 ) 产 生 单 链 DNA。 链 专 一 性 体外 转录 RNA 用 标记 的 核 音 酸 ,通过 体外 转录 产生 单 链 RNA, 链 专 一 性 文 框 24.5 ”酵母 克隆 载体 主要 的 酵母 载体 的 分 类 和 应 用 第 一 个 酵母 载体 ,酵母 整合 质粒 (yeast integrative plasmid， YIps) ,是 基于 大 肠 杆菌 质粒 载体 的 ,因为 很 少 能 随机 整合 到 酵母 基因 组 , 故 转化 细胞 效率 低 。 所 有 的 酵母 质粒 载体 都 有 大 肠 杆 菌 复 制 起 始点 (参见 穿梭 载体 ) ,一 个 或 多 个 在 酵母 和 大 肠 杆菌 中 起 作用 的 选择 标记 (经 常 是 筛选 营养 缺陷 型 恢复 的 标记 ) 和 让 供 体 DNA 插 和 人 的 一 个 多 个 克隆 位 点 。 其 他 酵母 质粒 与 Yips 不 同 在 于 含有 酵母 复制 起 始点 (除了 大 肠 杆菌 复制 起 始点 ) ,允许 在 酵母 基因 组 外 维持 。 酵 母 附加 型 质粒 (yeast episomal plasmid，YEps) 携 带 从 酿酒 酵母 2 质粒 的 复制 起 始点 。 这 样 的 载体 在 胞 质 内 以 高 拷贝 维持 ,并 高 效率 转化 酵母 细胞 。 酵 母 复 制 质 粒 ( yeast replicating plas- mid, YRps) 包 含 ARS 元 件 (参阅 )、 酵 母 染色 体 复制 起 始点 :这 些 元 件 不 稳定 ,在 出 芽 时 经 常 保 留 在 母 细 胞 中 ;偶尔 它们 会 像 Yips 一 样 整 合 。 酵 母 着 丝 粒 质粒 (yeast centromere plasmids，YCps) 包 含 一 着 丝 粒 。 它 们 以 低 拷 贝 存在 , 像 备 德尔 性 状 一 样 传递 。 酵 母 人 工 染 色 体 ( yeast artificial chromo- somes,YAC) 包 含 中 心 粒 一 个 ARS 元 件 和 端 粒 。 这 些 大 容量 载体 用 来 克隆 大 片段 的 DNA( 表 24.3) ,以 及 近来 用 于 转基因 小 鼠 。 基 于 反 转 录 转 座 子 Ty 的 酵母 载体 通过 转 座 在 基因 组 中 扩 增 ， 使 整合 的 基因 高 水 平 表 达 。 酵 母 载体 的 基本 特性 在 下 面 的 表 中 总 结 。 酵母 寻 葛 载体 Yips 含有 与 内 源 基 因 同 源 区 域 ,可 用 于 基因 寻 靶 。 两 种 载体 类 型 被 使 用 。 标 准 的 YIps 在 同 源 区 域 中 有 单一 的 限制 性 位 点 ,有 利于 单 交 换 然 后 插 人 整合 到 靶 基 因 座 中 。 多 拷贝 整合 载体 是 用 这 一 原理 发 展 起 来 的 ,通过 对 重复 rRNA 基因 的 寻 丢 。 第 二 类 载体 (酵母 置换 质粒 ) 促进 双 交 换 , 置 换 了 染色 体 DNA 的 一 部 分 ,在 特定 位 点 产生 稳定 的 单 拷贝 整合 。 类 似 的 原理 用 于 哺乳 动物 寻 靶 载体 (参见 基因 了 寻 靶 ) ,在 哺乳 动物 基因 组 中 ,尽管 同 源 重组 比 随机 整合 事件 相 比 要 少 得 多 。 酵母 转化 DNA 可 以 象 在 细菌 中 一 样 ,有 多 种 方法 被 导 人 酵母 细胞 。 一 个 有 效 的 方法 是 用 完整 细胞 在 0.1mol]L 乙酸 锂 悬浮 ,加 DNA 和 聚 乙 二 醇 (PEG) ,接着 热 休 克 。 酵 母 细 胞 也 可 通过 电 转 化 。 ”了 2 一 个 高 效 但 费力 的 方法 是 去 除 细胞 壁 ,产生 球 丁 (spheroplasts) ,在 钙 离子 和 PEG 存在 下 吸收 DNA。 完 整 细胞 的 方法 适合 于 大 多 数 应 用 ,但 球 芽 为 转化 YAC 载体 所 需 。 载体 组 成 特性 应 用 YIp/YTp ”大 肠 杆 菌 质粒 复制 ” 低 转 化 效率 。 在 细胞 质 中 不 能 维持 游离 状 “稳定 转化 起 始点 态 ,只 作为 整合 的 元 件 (不 能 恢复 ) 具有 替代 遗传 学 的 用 途 2 质粒 起 复制 始点 ”高 转化 效率 ,以 大 约 每 个 细胞 100 拷贝 稳定 ”互补 功能 分 析 维持 在 细胞 质 中 酵母 染色 体 ARS 元 ”高 转化 效率 ,但 因 与 母体 细胞 结合 而 不 能 稳 。” 互补 功能 分 析 ,或 稳 件 定 维持 定 整 合 以 整合 元 件 维持 ( 见 Yip) 酵母 染色 体 ARS 元 ”高 转化 效率 ,以 低 拷贝 数 稳定 地 维持 在 细胞 ”功能 分 析 ,特别 是 基 件 和 着 丝 粒 质 中 因 剂 量 效应 有 害 时 酵母 着 丝 粒 、ARS 如 果 染 色 体 长 度 为 50kb 左右 , 则 稳定 维持 ， 提供 最 大 容量 的 克 元 件 和 端 粒 每 个 细胞 1 一 2 个 拷贝 隆 载体 ,具有 制备 大 的 真 核 基 因 组 文库 的 用 途 Ty Ty 反 转录 转 座 子 在 YEps 中 被 解 离 的 Ty 载体 是 强 表达 结构 。 “高 效率 表达 Ty 载 体 自发 整合 到 宿主 染色 体 中 文 框 24.6 植物 的 遗传 操作 冠 瘦 病 根 癌 农 杆 菌 (agropacterizzz 妃 zzor1jociers ) 是 一 种 革 兰 氏 阴 性 土壤 细菌 ,在 很 多 双子 叶 植物 中 引起 冠 冲 病 (crown gall disease) 。 细 菌 在 土壤 中 感染 受伤 细胞 (植物 根 冠 细胞 ) ,引起 它们 生 长 形成 瘤 或 菌 瘦 。 玩 瘦 细胞 证 明 有 两 种 新 的 属性 :它们 可 以 在 缺乏 植物 生长 激素 下 增生 和 它们 合 成 了 一 个 或 多 个 修饰 的 氨基 酸 称 为 冠 继 碱 (opines) 。 Ti 质粒 根 癌 农 杆菌 的 肿瘤 生成 能 力 来 源 于 质粒 ,Ti(tumour-induced) 质 粒 , 它 根据 不 同 株 系 其 区 域 大 小 在 5 一 450kbp 之 间 变 化 。 有 两 类 Ti 质粒 ,每 种 诱导 不 同类 型 的 冠 组 碱 ,章鱼 碱 (octap- ines) 或 胭脂 碱 (nopalines) 的 合成 。 一 般 所 有 的 T 质粒 都 有 四 个 保守 区 域 。 其 中 最 重要 的 是 TDNA, 它 携带 编码 植物 激素 和 冠 级 碱 合成 的 酶 。 冠 瘦 病 是 由 植物 基因 组 被 这 部 分 质粒 以 类 似 于 细菌 接合 (参阅 ) 的 过 程 转化 所 致 。 这 需要 质粒 的 第 二 个 区 域 , 即 含 有 侵入 性 基因 (virulence genes) 的 wir 区 域 。 第 三 个 区 域 携带 与 细菌 间 质 粒 的 转移 有 关 的 接合 基因 。 最 后 一 个 区 域 编码 的 功能 与 冠 组 碱 利用 有 关 。 因 此 通过 感染 和 转化 受伤 植物 细胞 ,杆菌 将 植物 根 冠 细胞 转变 成 生产 它们 能 利 用 的 特定 营养 的 安全 避难 所 和 工厂 。 工 DNA 的 结构 ” 开 质 粒 的 工 DNA 区域 是 根据 25bp 不 完善 的 正 向 重复 序列 定义 的 。 在 章鱼 碱 和 爵 脂 碱 质粒 中 的 TDNA 结构 是 不 同 的 。 在 前 者 , 工 DNA 分 为 携带 植物 激素 基因 的 和 编码 章鱼 碱 合 成 酶 的 Ti ,以 及 和 携带 合成 其 他 和 冠 妇 碱 ,如 农 杆 氨 酸 的 基因 的 T 两 个 部 分 。 胭 脂 碱 质粒 TDNA 是 单个 片段 ,在 其 右 侧 有 植物 激素 和 胭脂 碱 合成 酶 基因 ,而 在 其 左 侧 有 编码 其 他 冠 组 碱 合成 基因 。 TDNA 转移 到 植物 基因 组 “转移 过 程 ( 见 图 ) 由 位 于 质粒 wr 区 域 的 侵 和 人 性 基因 所 控制 。wzrA 和 wzrG 编码 对 受伤 植物 细胞 释 放 的 酚 类 化 合 物 反 应 调节 因子 。VirA 是 受 配 基 刺 激 自 身 磷 酸化 的 “ 303 受 体 ,并 将 磷酸 基 团 转移 给 VirG 蛋白 , VirG 是 留 在 wr 基因 座 上 的 转录 激活 因子 ,其 中 每 个 操纵 子 都 含 多 个 开放 阅读 框架 。 已 知 几 个 下 游 wr 基因 的 功能 。VirD1 和 VirDz2 形成 核酸 内 切 酶 ,在 TDNA 上 产生 缺口 并 启动 转移 。TDNA 以 被 wrE2 编码 蛋白 包 被 的 单 链 形式 (T= 链 ) 转 移 。 VirE2 蛋白 有 核定 位 序列 ,负责 将 TDNA 转移 到 植物 细胞 核 中 。T-DNA 整合 到 植物 基因 组 中 有 精确 的 右手 边界 ,在 25bp 重复 顺序 的 1 一 2bp 位 置 ,但 可 变 的 左 侧 边界 可 以 定位 在 左 侧 2Sbp 重复 顺序 上 或 在 TDNA 内 部 100bp。 邻 接 右 手边 界 的 顺序 称 为 超 驱动 (overdrive) , 它 增强 转移 过 程 并 与 wirC 操纵 子 编码 的 蛋白 结合 。 开 质粒 作为 植物 基因 转移 载体 Ti 质粒 高 效 的 转移 外 源 DNA 进入 植物 基因 组 的 能 力 ,使 其 成 为 植物 基因 转移 有 吸引 力 的 载体 。 天 然 质 粒 不 适合 作为 载体 有 两 个 原因 :第 一 它们 可 生产 肿瘤 ;第 二 它们 太 大 不 适合 体外 操作 。 肿 瘤 生成 问题 通过 瘤 基因 已 被 破坏 或 缺失 的 去 毒 匡 质粒 (disarmed Ti plasmid) 得 到 解决 。TDNA 携带 的 基因 在 转化 宿主 基因 组 的 能 力 中 不 起 作用 ,所 以 内 部 区 域 可 以 被 任意 操作 。 冠 级 碱 合成 酶 的 强 启动 子 用 来 表达 新 的 转基因 和 和 钟 选 重组 的 显 性 选择 标记 。 质 粒 太 大 的 问题 有 两 种 方法 解决 。 在 第 一 种 策略 中 , 工 DNA 区 域 克隆 在 中 间 载 体 中 操作 后 再 导 人 根瘤 农 杆 菌 中 与 内 源 性 Ti 质粒 重组 。 在 第 二 个 策略 中 ,二 元 载体 系统 是 TDNA 在 小 的 质粒 中 克隆 和 操作 ,而 uir 基因 由 第 二 个 质粒 反 式 提供 。 在 两 种 情况 下 , 工 DNA 的 对 植物 基因 组 的 转移 都 有 效 。 对 双子 叶 和 单子 叶 的 转化 ”转化 双子 叶 植物 的 一 般 策 略 是 切割 叶片 (引起 细胞 损伤 ) ,与 携带 重 组 消除 Ti 载体 的 根瘤 农 杆菌 孵育 。 叶 片 转移 到 茎 干 -诱导 培养 基 中 ,同时 对 工 - DNA 携带 标记 进行 筛选 。 几 周 后 , 葵 干 生成 后 转移 到 根 -诱导 培养 基 中 ,再 过 几 周 后 可 以 转移 到 土壤 中 。 尽 管 下 质粒 为 基础 的 转化 系统 是 基因 转移 的 有 效 和 广泛 方法 ,但 它 限制 在 对 感染 敏感 的 双子 叶 植物 中 。 为 了 对 其 他 植物 进行 操作 (包括 主要 的 谷类 :大 米 小 麦 、 玉 米 ) ,发 展 了 另 一 些 技 术 。 原 生 质 体 的 电 穿孔 适用 于 这 些 物 种 ,尽管 这 些 物种 并 不 都 能 从 单个 细胞 中 重新 生成 。 应 用 最 广泛 的 技术 是 显 微 弹 转 染 ,可 以 用 来 转化 双子 叶 和 单子 叶 植 物 ,包括 大 米 \ 小 麦 和 玉米 。 | Ti 质粒 DNA 人 | VirD1/2 切 口 酶 VirE2DNA 结 合 蛋 白 (核定 位 信号 ”) AAAAAAAAAAA EECLLLLLLLLL AAANAAAAAAAI AAAAAAAAAN T-DNA 转移 到 植物 基因 组 中 1) 核定 位 信号 (nuclear localization signal) ,原文 误 为 nuclear localisation signal。 一 -一 译 者 注 站 334 ee 文 框 24.7 转基因 动物 动物 胚 系 细胞 转化 路 线 ”与 植物 细胞 不 同 ,分 化 的 动物 细胞 不 能 重新 产生 整个 有 机 体 。 转 基因 动物 必须 从 全 能 性 细胞 的 操作 产生 ,如 卵细胞 和 非常 早期 胚胎 的 细胞 。 一 般 , 三 种 形式 的 遗传 操 作 被 用 来 产生 转基因 动物 ( 见 图 ) :ODNA 微 注射 ;@ 重 组 反 转 录 病 毒 感染 ;@ 对 胚胎 干细胞 的 转 化 。 所 有 三 种 途径 都 可 以 用 于 产生 转基因 喘 齿 动物 ,但 微 注射 是 其 他 转基因 动物 的 主要 途径 。 DNA 显 微 注射 ”为 了 通过 这 种 方法 得 到 转基因 小 鼠 ,DNA 直接 显 微 注射 到 刚 受 精 的 卵 的 雄 前 核 中 (选择 雄性 前 核 是 因为 它 比 肉 性 前 核 大 )。 受 精 卵 是 从 解剖 交配 不 和 久 的 超 排卵 肉 性 动物 的 输 卵 管 中 取 出 。 只 需 将 转基因 注射 ( 即 不 需要 载体 )。 存 活 的 胚胎 被 培养 直到 胚 泡 期 被 植 人 假 孕 的 代孕 肉 性 动物 中 。DNA 的 整合 经 常 以 串联 排列 发 生 (转基因 组 ) ,通过 非法 重组 , 注 人 DNA 片段 的 产生 末端 连接 。 经 常 只 有 一 个 整合 位 点 ,转基因 组 以 备 德 尔 方式 传递 ,大 到 50% 的 后 代 可 以 是 被 转基因 的 。 偶 尔 , 直 到 一 个 或 两 个 早期 细胞 分 裂 后 ,整合 才 发 生 ,在 这 种 情况 下 小 鼠 是 遗传 内 合 体 。 随 机 整合 位 置 和 拷贝 数 意味 着 转基因 经 常服 从 于 位 置 和 基因 剂量 效应 。 它 们 偶尔 也 可 能 破 坏 内 源 性 基因 。 卵细胞 或 早期 胚胎 的 显 微 注射 用 来 产生 转基因 牛山 羊 、 纺 羊 、 猪 ,非洲 爪 蟾 (Xerotxs) 鱼 (如 斑马 鱼 , zegraFi)、 蠕 虫 (Caerorhapditis ) 和 果 蝇 (Droxopjpiie )。 在 果 蝇 中 , 胚 系 转化 是 通过 重组 体 缺陷 了 -因子 介 导 的 ,P- 因 子 被 克隆 在 质粒 中 ,与 第 二 个 含有 顺 式 缺 陷 型 (前 翅 )P 因子 (参阅 ) 的 质 粒 一 起 注入 胚胎 ,也 就 是 说 一 个 在 反 式 提供 转 座 酶 但 不 能 移动 其 本 身 。 如 果 将 重组 的 P 因子 导 和 人 M- 细 胞 型 的 胚 系 中 (其 缺乏 内 源 性 P 因 子 , 因 此 没有 内 源 性 转 座 酶 活性 ) ,转基因 稳定 整合 到 基 因 组 中 (参见 杂种 不 育 )。 卵 母 细胞 | | 胚 泡 转基因 鼠 遗传 戏 合 体 转基因 鼠 的 产生 途径 “5 反 转 录 病 毒 转 导 ” 植 人 前 的 小 鼠 胚 胎 暴露 于 反 转 录 病 毒 中 ,经 常 将 一 个 拷贝 的 原 病毒 整合 到 一 个 或 多 个 细胞 中 。 携 带 转基因 的 重组 缺陷 病毒 这 样 可 以 将 外 源 DNA 整合 到 小 鼠 的 基因 组 中 。 与 原核 显 微 注射 方法 相 比 , 反 转 录 病 毒 有 几 个 缺点 。 转 基因 DNA 必须 克隆 在 容量 限制 在 8 一 9kbp 的 合适 的 载体 中 ,整合 需要 辅助 病毒 (除了 预防 措施 , 它 可 能 导致 在 转 导 后 病毒 增生 ,引起 任何 基 因 的 破坏 ) ,因为 整合 原 病毒 的 重新 甲 基 化 ,转基因 可 能 不 表达 ( 见 DNA 甲 基 化 及 外 遗传 调节 )。 反 转 录 病 毒 因此 对 有 些 应 用 有 效 ,但 对 制备 转基因 小 鼠 不 是 万 能 的 。 胚胎 干 (ES) 细 胞 ”第 三 个 产生 转基因 小 鼠 的 方法 涉及 全 能 性 胚胎 干细胞 (embryonic stem cells) 的 使 用 ,胚胎 干细胞 是 从 早期 胚胎 内 细胞 团 衍 生 的 无 限 增殖 化 细胞 。 这 样 的 细胞 可 以 用 裸露 DNA 转 染 或 重组 反 转 录 病 毒 转 导 ,并 且 转 化 的 细胞 可 以 注入 赛 胚 泡 , 与 胚胎 合并 参与 到 发 育 的 小 鼠 中 。 ES 细胞 方法 优越 性 有 几 个 理由 :转移 到 胚胎 前 ,可 以 选择 成 功 转 化 的 细胞 ,所 以 成 功率 较 高 ,并 且 ES 细胞 可 以 用 来 检测 很 少 的 同 源 重 组 ,适合 产生 定向 突变 小 鼠 ( 见 正文 )。ES 细胞 注入 囊 胚 泡 产 生 细 胞 峙 合 的 小 鼠 ,所 以 用 来 作为 生育 的 母 小 鼠 必 须 在 胚 系 转基因 转移 前 交配 。ES 细胞 优点 还 在 于 性 别 和 毛皮 颜色 可 以 用 作 细 胞 和 遗传 标记 。 如 果 从 小 鼠 129 株 ( 有 显 性 野 鼠 色 毛 皮 表 型 ) 取 得 的 雄性 ES 细胞 注入 峻 性 C57B10/ 母 鼠 ( 隐 性 黑 表 型 ) 的 宫 胚 泡 中 ,那么 第 一 代 小 鼠 是 细胞 其 合 的 ,也 就 是 说 它们 根据 每 种 细胞 系 的 克隆 分 布 有 不 同 颜色 的 斑纹 。 转 基因 的 胚 系 转移 可 以 通过 第 二 代 的 野 鼠 色 表 型 而 被 建立 ,成 功 的 转移 通过 骨 合 雄 鼠 与 黑色 母 鼠 的 交配 系 增加 ,因为 雄性 的 ES 细胞 可 以 有 产生 艇 合 的 生殖 组 织 。 文 框 24.8 ”基因 治疗 基因 治疗 的 范围 ”重组 DNA 技术 以 很 多 针对 人 类 疾病 新 方法 丰富 了 医学 领域 。 除 了 提供 新 的 诊断 方法 和 动物 疾病 模型 以 外 ,从 克隆 和 操作 人 类 基因 直接 提出 了 很 多 新 的 治疗 策略 。 这 包括 表 达 克 隆 人 类 基因 产物 ,发展 新 的 疫苗 和 治疗 性 抗体 的 工程 化 。 一 种 涉及 用 DNA 治疗 的 完全 不 同 的 方法 可 用 来 减弱 疾病 。 这 样 的 基因 治疗 (gene therapy) 可 涉及 患者 体内 细胞 的 遗传 修饰 (体内 基 因 治疗 ) 或 对 培养 细胞 的 遗传 修饰 ,在 重 输 给 患者 (体外 基因 治疗 )。 体 内 基因 治疗 同时 包括 了 目 标 细 胞 的 遗传 修饰 ( 体 细 胞 转基因 ) 和 用 DNA 作为 基因 组 外 处 理 的 治疗 (不 改变 核 苷 酸 顺 序 )。 这 样 的 治疗 能 用 来 缓解 或 纠正 人 类 基因 突变 引起 的 症状 ,或 阻止 感染 性 疾病 (如 干扰 病毒 的 生命 周 期 )。 基因 增 大 治疗 ”常规 的 基因 治疗 方法 是 将 DNA 加 到 基因 组 中 ,以 替代 缺失 的 功能 ,这 被 称 为 基 因 增 加 治疗 (gene augmentation therapy，GAT)。 基 因 增 加 治疗 的 目的 是 通过 加 入 一 个 有 功能 的 等 位 基因 ,纠正 功能 失去 的 效应 ,如 有 缺失 引起 的 。 转 移 的 基因 可 以 稳定 地 整合 到 基因 组 中 (在 这 种 情况 下 ,可 能 可 以 永远 校正 缺陷 ,特别 是 干细胞 被 转化 ) 或 者 以 游离 在 细胞 质 中 的 形式 维持 (在 这 种 情况 下 ,不 可 避免 有 基因 表达 的 下 降 ,治疗 需要 反复 进行 )。 几 种 GAT 临床 试验 正在 进行 ,包括 圳 性 纤维 化 、 腺 苷 脱 氨 酶 缺陷 和 家 族 性 高 胆固醇 。 在 核酸 水 平 的 基因 抑制 治疗 ”为 了 治疗 显 性 失 活 功 能 缺失 突变 和 功能 获得 突变 ,基因 增加 治疗 就 不 是 那么 有 效 : 加 上 功能 失常 基因 的 功能 性 拷贝 对 表 型 不 会 有 影响 。 按 理 治 疗 这 样 疾病 的 有 效 方法 是 定向 纠正 (等 位 基因 替代 ) 或 基因 剔除 来 去 除 突变 的 等 位 基因 。 然 而 在 实际 上 这 是 效率 低 下 的 过 程 ,即使 在 培养 的 细胞 中 ,将 其 应 用 到 在 很 多 体 细 胞 ,特别 是 在 体内 ,纠正 遗传 缺陷 还 有 待 ”85 ee eye 一 于 技术 的 进一步 改进 。 一 个 有 望 将 来 在 基因 治疗 中 发 挥 作用 的 新 方法 是 用 核 酶 或 RNA 编辑 酶 在 RNA 水 平 纠正 致 病 性 mRNA。 在 另 一 个 目前 正在 对 多 种 类 型 癌症 临床 试验 的 策略 中 ,是 用 核酸 抑制 基因 表达 。 这 种 方法 的 优点 是 抑制 物 可 以 定位 抑制 特定 等 位 基因 ,所 以 正常 功能 的 等 位 基因 表达 不 受 影响 。 反 义 基因 的 导 和 人 能 产生 稳定 和 不 断 的 反 义 RNA 的 表达 ,与 (突变 )mRNA 结合 并 抑制 其 翻译 ( 它 也 可 以 定向 地 将 突变 mRNA 降解 ) 。 更 进一步 的 是 用 含有 核 酶 的 反 义 结构 ,使 所 结合 的 mRNA 降解 。 袁 核 苷 酸 可 以 被 用 作 基 因 组 外 的 基因 治疗 (如 不 涉及 改变 基因 组 的 治疗 ) 并 且 可 以 以 两 种 方式 进行 。 反 义 守 核 苷 酸 与 反 义 RNA 一 样 起 作用 ,通过 与 mRNA 结合 引起 抑制 和 降解 (在 这 种 情况 下 ,可 以 通过 消化 DNA:RNA 杂 种 中 RNA 链 的 RNaseH) 。 第 二 , 喀 啶 丰富 的 寡 核 苷 酸 能 够 与 味 叭 丰富 的 DNA 链 形成 三 链 结构 (通过 Hoogsteen 碱 基 配 对 ,参阅 ) ,抑制 转录 (三 链 治疗 )。 肽 核酸 (peptide nucleic acid,PNA) 是 DNA 类 似 物 , 它 的 磷酸 骨架 被 中 性 的 肽 链 骨架 所 替代 。PNA 守 核 背 酸 可 用 作 探 针 和 基因 治疗 的 试剂 。 它 们 形成 非常 稳定 的 三 链 结构 。 在 蛋白 水 平 上 的 基因 抑制 治疗 ”定向 抑制 基因 表达 可 以 在 蛋白 水 平 上 发 挥 作用 ,通过 在 细胞 内 表达 遗传 工程 的 抗体 (内 在 抗体 ) ,抗体 结合 并 使 突变 的 蛋白 失 活 。 抗 体 并 不 是 发 展 用 于 蛋白 水 平 基因 治疗 的 唯一 分 子 。 任 何以 多 聚 体 发 挥 作 用 的 蛋白 都 是 显 性 失 活 抑制 蛋白 的 潜在 目标 ,这 种 策 略 可 以 被 用 于 阻止 病毒 衣 壳 蛋白 组 装 ,包括 HIV 的 蛋白 。 一 个 新 的 进展 是 用 简 并 宾 核 苷 酸 鉴定 与 蛋白 相互 作用 的 特定 序列 。 这 些 寡 核 苷 酸 或 aptamers, 可 以 用 来 灭 活 特定 的 突变 蛋白 。 基因 转移 和 表达 的 方法 ”最 有 效 的 基因 转移 载体 是 哺乳 动物 病毒 为 基础 的 ,特别 是 反 转 录 病 毒 、 腺 病毒 和 腺 伴随 病毒 (adeno-associated viruses) (整合 到 基因 组 中 ,可 以 介 导 遗传 缺陷 的 永久 纠 正 ) 和 疱疹 病毒 (神经 营养 性 和 游离 型 的 )。 最 直接 的 基因 转移 方法 包括 注射 (如 肌肉 ) 和 成 功 产生 转基因 动物 和 植物 的 显 微 注射 技术 。 一 个 包括 脂 质 体 包装 DNA 在 内 的 转移 过 程 在 癌症 基因 治疗 中 得 到 广泛 应 用 ,尽管 效率 较 低 。 治疗 基因 表达 的 专 一 性 可 能 是 疾病 控制 或 纠正 的 重要 因素 。 转 移 的 基因 可 以 与 细胞 类 型 专 一 性 的 启动 子 相连 ,但 这 种 调节 由 于 受 整合 基因 内 源 性 影响 较 弱 。 专 一 性 可 以 通过 特定 细胞 以 某 种 方式 定向 达到 。 直 接 寻 靶 对 特定 类 型 细胞 是 可 能 的 ,通过 利用 病毒 的 营养 特性 ,DNA 与 细胞 类 型 专 一 性 受 体 的 配 基 接 合 (通过 受 体 介 导 内 大 吸收 DNA) 或 通过 控制 转移 位 置 (注射 和 显 微 注射 方 法 )。 汽 雾 也 被 用 于 将 重组 病毒 载体 导入 肺 中 (如 对 吉 性 纤维 化 的 治疗 )。 ( 陈 淳 译 ) . 337 . 第 25 章 基本 概念 和 定义 。 ”重组 (recombination) 是 已 经 存在 的 遗传 物质 产生 新 的 组 合 的 过 程 。 分 子 间或 染 本 色 体 间 重 组 通过 混合 离散 染色 体 产 生 新 的 组 合 ( 真 核 染色 体 减 数 分 裂 时 独立 分 配 和 病毒 基因 组 片段 的 重新 分 配 ) ,而 分 子 内 或 染色 体内 重组 是 酶 依赖 的 过 程 ,新 的 遗传 物质 通过 DNA 的 前 切 和 连接 产生 。 有 五 种 类 型 的 分 子 内 重组 ( 表 25.1) , 尽 管 每 种 情况 中 分 子 反 应 一 一 DNA 剪 切 、 双 链 间 的 链 交换 、DNA 修复 和 去 除 是 相似 的 。 重组 和 突变 被 认为 是 遗传 变异 的 两 种 截然 不 同 的 机 制 : 重 组 是 已 经 存在 的 信息 重 排 ,而 突变 是 在 基因 组 中 导入 新 的 信息 。 尽 管 这 些 定 义 十 分 有 用 ,突变 和 重组 在 分 子 水 平 上 是 相互 关联 的 。 很 多 重组 事件 (特别 是 引起 转 座 和 不 正常 重组 ) 会 导 致 基因 破坏 ,被 描述 成 突变 。 相 反 的 ,一 些 重组 为 修复 潜在 突变 或 致死 DNA 损 伤 所 必需 。 重组 以 两 种 方式 被 应 用 :对 遗传 座位 作 图 和 基因 及 基因 组 的 操作 。 遗 传 作 图 根据 染色 体 上 两 个 基因 座 距 离 越 远 越 容 易 发 生 同 源 重 组 的 原理 进行 。 因 而 一 个 特定 杂交 的 重组 产物 的 比例 提供 了 对 物理 距离 的 估 测 ( 见 基因 结构 和 作 图 一 章 )。 同 源 重 组 可 被 用 于 基因 寻 和 部 ,而 位 点 专 一 性 重组 可 以 诱导 缺失 和 染色 体重 排 。 转 座 和 不 正常 重组 也 被 用 来 基因 转移 和 整合 ( 见 重组 DNA 和 分 子 克 隆 , 可 移动 的 遗 传 因子 各 章 )。 表 25.1 分 子 内 重组 的 不 同类 型 同 源 重组 重组 对 之 间 需 要 有 同 源 性 。 调 节 这 一 过 程 的 蛋白 (如 大 肠 杆菌 中 的 RecA) 不 是 序列 专 一 性 的 ,而 是 同 源 依赖 的 。 经 常 涉及 长 的 同 源 区 域 ( 如 减 数 分 裂 中 ) 。 位 点 特异 性 重组 重组 对 之 间 不 需要 同 源 性 。 调 节 这 一 过 程 的 蛋白 (位 点 特异 性 重组 酶 ) 在 供 体 和 受 体 分 子 中 识别 短 的 ,特异 DNA 序列 ,这些 蛋白 之 间 的 相互 作用 帮助 重组 。 供 体 和 受 体位 点 之 间 经 常 存在 同 源 性 ,因为 同样 的 重组 酶 蛋白 可 结合 两 者 的 识别 位 点 。 转 座 重组 对 之 间 不 需要 同 源 性 。 调 节 这 一 过 程 的 蛋白 ( 转 座 酶 ,整合 酶 ) 识 别 重组 分 子 中 的 短 特 异 序列 ,这 样 的 序列 称 为 转 座 因子 (识别 位 点 经 常 是 转 座 因子 和 宿主 DNA 之 间 的 接合 处 ) 。 受 体位 点 一 般 在 序列 上 相对 非特 异 ,重组 将 可 转 座 因子 整合 到 宿主 DNA 中 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 )。 不 正常 重组 重组 对 之 间 不 需要 同 源 性 或 少量 同 源 性 ,是 异常 细胞 作用 的 结果 。 包 括 复制 中 不 正常 末端 连接 , 链 滑 动 或 成 环 。 不 等 交换 (人 参阅) 经常 被 描述 成 不 正常 ,尽管 其 机 制 是 正常 的 (但 在 错误 的 地 方 发 生 ) 同 源 重组 。 人 工 重组 体外 用 纯化 的 酶 和 底 物 进行 的 DNA 连接 (参阅 ) 引 起 的 重组 ( 见 重组 DNA 一 章 )。 = 23S.1 同 源 重 组 同 源 重 组 一 一 作用 和 机 制 同 源 重组 是 同 源 性 依赖 的 ,但 不 是 序列 依赖 的 ,所 以 任何 两 个 具有 相关 序列 的 DNA 分 子 可 以 通过 这 个 过 程 进行 重组 。 同 源 重 组 有 两 个 基本 功能 ， 遗传 混合 和 DNA 修复 ,尽管 这 一 过 程 首 先行 使 哪 一 种 功能 还 不 清楚 。 其 他 加 工 也 依赖 于 同 源 重组 : 转 座 因子 的 被 动 运动 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 )、 特 定 喉 菌 体 的 复制 ( 见 病毒 一 章 ) 酵母 交配 类 型 的 转换 和 相关 表 型 ( 见 下 文 ) ,以 及 减 数 分 裂 时 染色 体 的 分 配 ( 见 下 文 )。 同 源 重组 被 用 于 真 核 基因 组 的 遗传 作 图 (参阅 )( 见 基因 结构 和 作 图 ) 和 基因 寻 靶 (参阅 ) 一 一 将 DNA 人 工 导 入 细胞 ,将 一 个 等 位 基因 用 另 一 个 替代 ( 见 第 24 章 重 组 DNA 与 分 子 克隆 )。 同 源 重 组 的 模型 分 成 三 类 :拷贝 -选择 模型 ,重组 在 DNA 复制 中 发 生 : 新 生 链 延伸 时 转换 为 新 的 模板 。 断 裂 和 重新 连接 模型 中 ,重组 在 没有 DNA 复制 时 发 生 :DNA 链 打 断 在 双 链 间 交 换 和 重新 连接 。 还 有 杂 合 模型 是 结合 了 上 面 两 种 模型 的 特征 。 所 有 三 种 类 型 的 重组 在 不 同 的 环境 中 发 生 。 减 数 分 裂 时 发 生 的 同 源 重组 基本 上 是 通过 链 断 裂 和 重新 连 接 , 而 通过 重组 的 DNA 修复 涉及 拷贝 选择 和 杂 合 机 制 。 同 源 重 组 的 步骤 同 源 重组 分 成 四 个 阶段 : 联 会 、 链 转移 、 修 复 和 分 解 。 联 会 和 链 转移 在 图 25.1 中 显示 。 E 殉 (al): 联 会 。 同 源 双 链 配对 。 (b) :起 始 。 缺 刻 链 从 起 始 双 链 侵入 到 受 体 双 链 中 ,置换 原 有 链 。 ET 《c): 链 的 交换 。 被 置换 链 填补 到 起 始 链 的 缺口 中 交换 点 即 霍 利 迪 连接 被 建立 。 《d) :分 支 移动 。 通 过 双 链 间 链 的 交换 霍 利 迪 连接 可 从 它 原来 的 位 置 移 开 , 根 据 移动 的 方向 可 增加 或 减少 异 源 双 链 的 量 (图 中 显示 分 支 以 箭头 所 示 的 减少 异 源 双 链 量 的 方向 移动 )。 图 25.1 完整 双 链 间 同 源 重组 的 堆 利 迪 模型 (Holliday model) ,显示 了 联 会 和 链 转移 阶段 。 经 典 的 模型 包括 对 等 位 置 有 缺口 的 双 链 。 然 而 这 不 是 经 常 发 生 的 情况 一 “正常 情况 下 ,只 有 双 链 中 一 条 链 是 有 缺口 的 ,侵入 的 链 以 拓 扑 封闭 单位 取代 对 应 的 链 一 -形成 D 环 ( 取 代 环 ) 。 重 组 也 可 以 发 生 在 两 条 完整 的 双 链 中 ,这 种 情况 需要 拓扑 异 构 酶 使 交换 的 链 与 它们 互补 的 分 子 缠绕 (参见 平行 接合 、 相 编 接合) 。 (1) 在 联 会 中 , 同 源 双 链 排列 。 (2) 在 链 转移 中 ,一 条 DNA 链 从 一 条 双 链 转移 到 另 一 双 链 中 。 当 第 一 条 链 进 入 同 源 双 链 (如 果 受 体 双 链 是 完整 的 ) 并 取代 停留 的 链 时 ,标志 着 重组 的 起 始 。 这 样 的 过 程 可 以 产生 一 个 短 区 域 的 异 源 双 链 DNA: 含 有 从 不 同 亲 本 分 子 来 源 链 的 双 链 DNA, 可 能 包含 有 。 339 ， 不 配对 碱 基 ,反映 了 亲本 链 的 序列 差别 (不 同 的 等 位 基因 )。 如 果 受 体 双 链 是 完整 的 ,取代 的 停留 链 能 够 与 起 始 双 链 的 自由 链 配对 。 两 条 转移 链 相 互 交 换 ,形成 称 为 交换 桥 、 交 换 分 支 或 霍 利 迪 连接 的 结构 。 霍 利 迪 连接 的 位 置 可 以 通过 不 断 的 双 链 间 交 换 , 相 对 起 点 位 置 发 生 移动 。 这 就 是 分 支 移 动 ,可 以 增加 或 减少 异 源 双 链 DNA 的 数量 。 (3) 修 复 和 解 离 在 图 25.2 和 图 25.3 中 显示 ;它们 不 以 固定 的 顺序 进行 ,因为 这 依赖 于 重组 对 伙伴 和 能 和 否 得 到 合适 的 酶 。 修 复 指 三 个 不 同 的 过 程 。 在 最 简单 的 例子 中 , 重组 双 链 是 完整 的 (也 就 是 说 任何 双 链 都 没有 遗传 信息 的 丢失 ) ,修复 涉及 打 断 链 的 重 接 。 这 就 是 保守 重组 。 霍 利 迪 连接 可 以 以 两 种 平面 被 解 离 , 如 图 25.2 所 示 ,产生 两 个 产物 中 的 一 个 一 一 非 重 组 背景 中 的 一 小 段 (patch) 异 源 双 链 DNA, 或 者 有 重组 标记 的 异 源 双 链 的 人 八 局 o 一 一 一 二 一 一 一 一 本 本 CT a b 链 交换 后 连接 ,在 箭头 “aa - 要 交 作 所 指 位 置 通过 剪 切 而 人 一 发 生 分 解 … 一 = = a b < a b | … 裂口 被 封闭 … 过 B mA IT 人 一 -一 二 … 被 解 离 的 产物 或 形成 ”二 日 b 上 1 片段 异 源 双 链 DNA ，, 或 形 全 成 连接 异 源 双 链 DNA 6 注 A 有 和 b 一 意 只 有 前 接 解 离 才 涉及 侧 必 片段 标记 的 重组 。 本 0 图 25.2 在 两 个 平面 上 霍 利 迪 连接 的 分 解 ,产生 不 同 的 产物 。 只 有 一 种 分 解 途径 产生 有 标记 和 A 和 了 B 的 重组 分 子 , 尽 管 两 种 途径 都 产生 异 源 双 链 DNA, 称 为 联 片 (splatch) [是 片 (patch) 和 剪接 (splice) 的 组 合 ]。 然而 ,如 果 双 链 中 的 任 一 条 丢失 了 遗传 信息 ( 即 如 果 有 单 链 缺口 或 断裂 ),DNA 修复 合成 用 来 自 同 源 双 链 的 信息 为 模板 来 取代 丢失 的 信息 (图 25.3)。 含 有 新 DNA 合成 的 重 组 称 为 不 保守 重组 。 在 极端 的 例子 中 ,整个 染色 体 片 段 丢 失 , 霍 利 迪 连 接 的 解 离 产生 了 一 个 能 复制 丢失 片段 的 复制 叉 ( 见 第 14 章 诱 变 和 DNA 修复 )。 第 三 种 类 型 的 DNA 修复 为 异 源 双 链 DNA 错 配 修复 , 它 的 方向 通常 是 随机 的 (参见 复制 后 错 配 修复 ), 可 能 引起 基因 转变 ( 见 下文 )。 同 源 重组 的 分 子 基 础 ”大肠 杆菌 中 负责 重组 所 有 主要 阶段 - 联 会 、 链 交换 、 分 枝 迁 移 和 霍 利 迪 连接 、 解 离 的 蛋白 已 经 被 发 现 ( 文 框 25.1)。 对 于 重组 来 说 还 需要 单 链 DNA， 它 看 来 由 多 个 重奏 的 途径 来 提供 。 RecBCD 途径 是 大 肠 杆菌 重组 底 物 的 主要 来 源 。 基 因 recB recC 和 recD 的 产物 结合 产生 大 的 复合 物 , RecBCD 酶 或 外 切 酶 V, 它 有 三 种 活性 :DATP 依赖 的 外 切 酶 活性 ;@O 一 全 通过 断 末 端 侵入 完整 双 链 Di 天 过 修复 合成 之 半生 链 的 交 交 0 生境 上 和 人 的 形成 和 分 解 2 图 25.3 作为 修复 损伤 DNA 机制 的 同 源 重 组 。 单 链 缺 口 (a) 和 双 链 断口 (b) 的 修复 涉及 用 未 损 伤 双 链 的 一 条 链 为 模板 新 复制 的 链 交 换 损伤 链 。 复 制 完成 后 接着 进行 链 连接 、 形 成 如 图 25.2 所 显示 的 霍 利 迪 连 接 。 重 组 包括 一 个 (c) 产 生 霍 利 迪 连接 中 间 体 的 部 分 染色 体 , 这 个 中 间 体 形成 复 制 叉 。 箭 头 表 示 新 DNA 合成 的 方向 。 ATP 增强 的 内 切 酶 活性 ;GOATP 依赖 的 解 旋 酶 活性 。 称 为 chi(GCTGGTGG) 的 顺 式 作用 位 点 促进 重组 ,它们 在 大 肠 杆 菌 基 因 组 大 约 每 Skbp 出 现 一 次 ,代表 了 内 切 酶 倾向 性 的 剪 切 位 点 。RecBCD 以 方向 依赖 的 方式 在 3 端 大 约 S$ 个 碱 基 位置 剪 切 含 有 chi 序列 的 链 。chi 位 点 因此 是 重组 热点 (人 参阅)。 平 未 端的 线 性 双 链 DNA 是 解 旋 酶 活性 的 底 物 。 酶 与 DNA 结合 ,不 断 解 链 ,在 它 经 过 的 地 方 产生 单 链 环 。 这 些 环 偶尔 被 酶 的 内 切 酶 活性 剪 切 ,接着 进一步 解 旋 产 生 重 组 所 需要 的 单 链 尾巴 。 尽管 RecBCD 途径 对 重组 是 重要 的 ,recBC 突变 保留 高 达 10% 的 同 源 重组 活性 ,表明 存在 着 其 他 途径 产生 重组 DNA。 另 外 ,通过 在 其 他 基因 座 的 突变 ,如 spcA 、spcB 和 spcC， 几乎 可 以 完全 恢复 ecBC 突变 的 重组 能 力 。 分 析 带 有 基因 型 recBC , spcBC 的 突变 株 有 助 于 发 现 进 一 步 的 重组 基因 。 它 们 有 重 琶 的 功能 ,总 称 为 RecF 途径 。 通 过 研究 recBC sbcA 突变 体 发 现 另 一 个 系统 ,涉及 recE 基因 的 上 升 调节 。 这 些 重组 基因 和 它们 的 可 能 的 JJ 在 表 25.2 中 列 出 。 其 中 很 多 是 SOS 诱 导 的 (参见 SOS 反 应 ) ,说 明 它 们 在 细胞 中 的 表 25.2 大 及 生 肌 中 网 只 昌 组 DNA 产 生 的 重组 基因 基因 RecBCD 途径 recB、recC yecD RecBCD 是 ATP 依赖 的 外 切 酶 和 解 旋 酶 (外 切 酶 V) , 它 与 双 链 断口 结合 , 解 开 DNA 并 导 人 裂口 ,其 倾向 性 位 点 称 为 chi( 参 见 重 组 热点 )。RecBCD 酶 产生 RecA 可 以 作用 的 底 物 RecF 途径 recF 、recO recR 帮助 链 配 对 recN 在 双 链 断口 修复 中 起 作用 recj 5 一 3 单 链 核酸 酶 recP 不 清楚 recQ 解 旋 酶 RecE 途径 7ec 忆 外 切 酶 出 7ecT 与 RecE 协同 作用 的 同 源 链 配对 蛋白 ”和 正常 功能 是 重组 介 导 DNA 修复 。 有 些 用 于 分 子 克 隆 的 细菌 株 (参见 第 24 章 重 组 DNA 与 分 子 克 隆 ) 所 有 重组 基因 是 缺陷 的 ,这 是 为 避免 在 大 质粒 中 或 在 质粒 和 染色 体 间 发 生 重 组 。 2$.2 同 源 重组 和 遗传 作 图 连锁 ”连锁 (linkage) 这 个 术语 在 遗传 学 上 有 三 种 不 同 含义 。 首 先 表示 卷曲 的 双 链 DNA, 用 来 确定 双 链 DNA 拓扑 学 参数 ( 见 核酸 结构 )。 第 二 连锁 表明 当 一 个 特定 基因 ( 延 伸 一 下 ,联系 到 它们 相关 的 表 型 ) 在 特定 染色 体 上 被 发 现 ,如 X 染 色 体 上 基因 和 它们 控制 的 性 状 称 为 是 X- 连 锁 的 (参见 性 连锁 遗传 )。 最 后 ,遗传 连锁 指 倾向 于 作为 一 个 单位 遗 传 而 不 是 独立 分 配 的 。 这 反映 了 紧密 的 物理 连锁 ,也 就 是 说 这 些 基 因 彼 此 物理 连接 处 于 同一 染色 体 上 。 与 遗传 连锁 相关 的 名 称 在 表 25.3 中 定义 。 表 25$.3 与 遗传 连锁 相关 的 一 些 术 语 术语 定义 连锁 两 个 基因 座位 于 同一 染色 体 上 的 紧密 物理 关系 ,可 阻止 不 相关 的 分 配 。 相位 双 杂 合 等 位 基因 之 间 的 连锁 特点 。 如 果 两 个 显 性 等 位 基因 和 两 个 隐 性 等 位 基因 一 起 分 离 ,这 两 个 基 因 座 的 相位 是 相 引 (coupling)( 或 顺 式 构象 ) ,或 者 如 果 一 个 基因 的 显 性 等 位 基因 与 另 一 个 的 隐 性 等 位 基因 一 起 分 离 , 称 为 相 斥 ( 或 反 式 构象 ) 。 单 倍 体型 ”一 条 染色 体 上 等 位 基因 的 特定 顺序 和 构象 。 同 线性 (1) 同 线性 基因 位 于 同一 染色 体 上 。 它 们 可 能 或 不 可 能 被 证 实 是 连锁 的 一 较 广 泛 分 散 的 基因 受到 多 次 交换 (参阅 ) 的 影响 ,给 人 们 的 印象 是 不 连锁 的 。 《2) 同 线性 是 描述 在 不 同 物种 中 染色 体 上 基因 以 相同 顺序 排列 的 术语 。 不 同 物种 对 应 的 染色 体 片 段 是 同 线 区 域 (参见 比较 基因 组 )。 连锁 群 证 明 是 连锁 并 在 一 起 作 图 的 一 群 基因 。 在 物理 名 称 上 ,一 个 连锁 群 等 价 于 一 条 染色 体 。 连锁 平衡 / 在 一 个 群体 中 两 个 或 更 多 的 多 态 性 基因 座 ,配子 中 存在 所 有 等 位 基因 的 组 合 称 为 连锁 平衡 (linkage 不 平衡 equilibrium) 。 在 单个 基因 座 上 的 一 对 等 位 基因 在 随机 交配 群体 中 一 代 后 达到 平衡 。 在 这 个 群体 中 当 同 时 考虑 两 个 或 更 多 个 基因 座 时 ,如 果 等 位 基因 的 特定 组 合 比 其 他 组 合 更 普遍 这 就 开始 存在 连锁 不 平衡 。 如 果 基因 是 不 连锁 的 ,平衡 可 以 通过 多 代 建 立 , 如 果 基 因 是 连锁 的 则 需要 更 长 的 时 间 ,因为 这 依赖 于 它们 之 间 的 交换 。 因 此 ,两 个 基因 座 越 近 ,不 平衡 的 时 间 也 越 长 。 在 自然 种 群 中 的 连锁 不 平衡 表明 最 近 产 生 了 突变 或 对 特定 单 倍 体型 的 选择 。 假 连锁 在 不 同 染色 体 上 的 基因 座 表现 类 似 连 锁 的 情况 。 这 在 易 位 杂 合子 中 可 以 发 现 , 当 一 四 倍 体 物 种 进行 二 倍 化 时 ,四 个 相关 染色 体形 成 不 同 的 同 源 配对 中 也 可 以 观察 到 。 真 核 中 的 连锁 和 减 数 分 裂 ”在 有 性 生殖 中 ,二 倍 体 细 胞 为 了 使 染色 体 数 目 减 半 和 产生 受精 所 需 的 单 倍 体 生殖 细胞 ,进行 特殊 的 分 裂 形式 一 一 减 数 分 裂 。 减 数 分 裂 涉 及 两 轮 分 裂 中 间 没 有 插 和 人 DNA 复制 周期 (参见 减 数 分 裂 ) ,第 一 次 分 裂 是 还 原 分 裂 (reduction divi- sion) ,这 时 同 源 染色 体 分 离 到 纺锤 体 相 反 两 极 。 第 二 次 分 裂 与 有 丝 分 裂 相 同 ,姐妹 染色 单 体 分 离 。 第 一 次 减 数 分 裂 与 有 丝 分 裂 有 几 方 面 的 不 同 。 (1) 减 数 分 裂 工 经 常 具有 延长 的 前 期 ,根据 染色 体 的 行为 和 外 观 分 成 五 个 阶段 一 一 细 线 期 (leptonema) 、 偶 线 期 (zygonema)、 粗 线 期 (pachynema) 双 线 期 (diplonema) 和 终 变 期 “34 人 4，…， (diakinesis)0) 。 染 色 体 在 细 线 期 第 一 次 变 得 可 见 。 (2) 在 偶 线 期 阶段 , 同 源 染 色 体 成 对 排列 。 这 个 过 程 称 为 联 会 (synapsis) ,对 它 了 解 得 还 很 不 清楚 , 它 涉 及 一 个 在 两 对 姐妹 染色 单 体 间 形成 的 蛋白 质 联 会 复合 物 。 联 会 可 能 是 在 端 粒 (人 参阅) 起 始 的 含有 两 个 同 源 染 色 体 的 四 链 结构 称 为 二 价 体 。 (3) 在 大 多 数 生物 中 , 同 源 重 组 发 生 在 联 会 的 染色 体 之 间 , 这 是 正确 分 离 所 必需 的 。 这 个 过 程 发 生 在 粗 线 期 阶段 ,涉及 含有 重组 酶 的 被 称 为 重组 结 (recombination nodules ) 的 大 和 蛋白 复合 物 。 (4) 减 数 分 裂 工 的 分 离 机 制 是 独特 的 ,涉及 联 会 2 的 解 离 而 不 是 着 丝 粒 的 分 裂 。 联 会 复合 物 在 双 线 期 被 破坏 , 同 源 染 色 体 因为 交叉 (chiasmata)( 交 换 发 生 的 位 点 ) 保 持 联系 。 在 终 变 期 去 联 会 (desynapsis) 持 续 进 行 ,染色 体 变 得 完全 浓缩 。 染 色 体 排列 在 中 期 板 上 ， 重组 中 间 体 的 解 离 是 进入 后 期 的 标志 ,在 此 时 同 源 染 色 体 已 分 离 。 如 果 两 个 标记 位 于 分 离 的 染色 体 上 (也 就 是 如 果 它 们 不 是 物理 连锁 的 ) ,根据 和 孟 德尔 第 二 定律 (参阅 ) 它 们 独立 分 配 。 这 可 以 在 双 杂 合体 中 观察 到 ,这 种 情况 下 等 位 基因 的 亲 组 合 和 重组 组 合 的 频率 是 相同 的 (图 25.4)。 相 反 , 如 果 两 个 标记 位 于 同一 染色 体 上 ,在 每 条 同 源 染 色 体 等 位 基因 会 作为 一 个 单位 分 离 ,因为 它们 物理 连接 在 一 起 。 可 预期 在 所 有 的 减 数 分 裂 产物 中 都 发 现 亲 组 合 的 等 位 基因 ,但 这 样 的 完全 连锁 (total linkage) 很 少 发 生 , 这 是 因为 在 减 数 分 裂 前 期 联 会 的 同 源 染 色 体 间 经 常 发 生 交换 。 交 换 crossover 就 是 染 色 体 断裂 和 链 互 换 一 一 分 子 术 语 中 的 霍 利 迪 连 接 一 一 导致 亲本 染色 体 之 间 的 重组 ,从 而 产生 等 位 基因 的 同 源 重组 (图 23.4)。 连锁 和 遗传 作 图 。” 减 数 分 裂 中 同 源 重 组 的 发 生 绝 大 部 分 是 随机 的 一 一 这 种 表述 过 于 简 单 化 ,但 一 般 是 适用 的 (参见 重组 热点 和 冷 点 ) 一 一 因此 任何 两 个 杂 合 标记 间 发 生 重组 的 可 能 性 越 大 ,它们 在 染色 体 上 的 距离 越 远 。 重 组 频率 (参阅 ) 以 特定 杂交 中 重组 后 代 的 比 例 测定 ,因此 反映 了 标记 间 的 物理 距离 。 利 用 减 数 分裂 对 真 核 基因 座 作 图 的 原理 在 其 他 部 分 详细 讨论 ( 见 基 因 结 构 和 作 图 ) ,尽管 由 于 克隆 技术 日 益 进步 ,遗传 图 谱 的 使 用 逐渐 被 大 力 进 行 的 物理 作 图 方法 所 替代 。 连 锁 可 以 用 于 以 其 他 方式 对 基因 作 图 ,如 参见 随机 杂 交 作 图 ,HAPPY 作 图 ,中 断 杂 交 作 图 , 共 转 化 和 共 转 导 作 图 。 有 丝 分 裂 重 组 ”尽管 真 核 生物 的 同 源 重 组 经 常 发 生 在 减 数 分 裂 ( 当 同 源 染 色 体 配对 时 ) , 联 会 和 交换 也 在 其 他 时 期 发 生 ,特别 是 在 如 果 蝇 这 样 的 物种 中 , 同 源 染色 体 配 对 与 体 细胞 相关 。 任 何不 在 减 数 分 裂 中 发 生 的 重组 (也 就 是 说 在 没有 有 性 生殖 的 情况 ) 称 为 准 性 交换 (parasexual exchange) ,这 主要 指 是 在 细菌 中 遗传 交换 的 形式 ( 见 第 10 章 细菌 中 的 基 因 转移 ) 。 在 真 核 生 物 中 的 准 性 交换 发 生 在 细胞 器 基因 (人 参阅) 中 和 体 细胞 的 细胞 核 染色 体 间 (有 丝 分 裂 重 组 )。 同 源 染色 体 间 的 有 丝 分 裂 重组 可 以 导致 有 丝 分 裂 分 离 , 杂 合 基因 座 分 配 到 子 代 体 细 胞 中 ,产生 根据 它们 不 同 表 型 确定 的 受 体 同 源 克隆 。 第 一 个 有 丝 分 裂 重组 的 证 据 来 自 果 蝇 , 受 体 同 源 组 织 的 邻近 片段 [ 挛 生 斑 (twin spots) ] 在 杂 合 背 景 中 观察 到 。 如 同 其 他 异常 1) 前 期 减 数 分 裂 可 分 为 五 个 阶段 , 细 线 期 , 偶 线 期 , 粗 线 期 , 双 线 期 和 终 变 期 。 细 线 , 偶 线 , 粗 线 , 双 线 这 些 术 语 是 广泛 使 用 的 ,而 上 述 的 这 些 术 语 有 严格 的 限制 。 2) 此 处 应 涉及 联 会 染色 体 的 解 离 ,原文 为 涉及 重组 解 离 (resolution of recombination) 可 能 有 误 。 一 一 译 者 注 . 343 ， (b) 25.4 连锁 和 染色 体 分 离 。 同 源 染 色 体 在 减 数 分 裂 前 期 配对 ( 父 本 染色 体 以 黑色 表示 , 母 本 染 色 体 以 白色 表示 )。 每 个 染色 体 上 只 有 一 条 链 在 这 个 阶段 显示 出 来 ,尽管 这 时 有 两 个 姐妹 染色 体 , 每 个 携带 一 个 双 链 DNA 分 子 。 进 行 减 数 分 裂 的 个 体 在 A 和 了 B 两 个 基因 座 上 是 杂 合子 ,亲本 单 倍 体型 是 AB( 父 本 ) 和 ab( 母 本 )。 方 框 代 表 子 代 细胞 。(a) 如 果 基 因 位 于 两 条 染色 体 上 ,它们 会 独立 分 配 。 亲 组 合 (AB,ab) 和 重组 合 (Ab,aB) 的 等 位 基因 组 合 以 相同 频率 出 现 ,反映 了 中 期 板 〈 细 线 ) 上 染色 体 配 对 的 随机 性 。(b) 如 果 两 个 基因 位 于 同一 染色 体 上 ,等 位 基因 的 亲 组 合 预期 是 100% ,因为 每 个 亲本 单 倍 型 是 物理 连接 的 (连锁 )。 然 而 ,因为 联 会 染色 体 的 同 源 重组 (c) ,可 能 产 生 等 位 基因 的 重组 合 。 的 染色 体 行 为 ,有 丝 分 裂 重组 可 由 X 射 线 的 照射 产生 双 链 DNA 断裂 诱发 。 说 明 这 个 过 程 可 能 是 DNA 修复 的 副产品 。 同 源 染 色 体 间 的 有 丝 分 裂 重 组 能 够 用 来 进行 遗传 作 图 。 这 与 减 数 图 谱 相 类 似 ,但 对 遗传 距离 的 计算 不 完全 一 样 , 表 明了 至 少 推动 减 数 和 有 丝 分 裂 重组 的 因子 是 不 同 的 。 这 被 在 酵母 中 发 现 的 减 数 分 离 或 有 丝 分 裂 重 组 基因 所 证 实 ( 文 框 257 芭 吉 第 二 种 有 丝 分 裂 重 组 的 形式 不 是 发 生 在 同 源 染 色 体 之 间 , 而 是 姐妹 染色 体 之 间 一 一 姐妹 染色 单 体 交 换 (SCE) 。 这 也 是 为 DNA 损伤 所 促进 的 , 且 它 相对 上 面 讨 论 的 非 姐 妹 染 色 体 交换 占 优势 ,反映 了 细胞 周期 后 期 相关 姐妹 染色 体 更 近 的 物理 关系 (参见 花 斑 染 色 、 DNA 修复 紊乱 )。 2$.3 随机 和 程序 化 非 交 互 重 组 非 交 互 重 组 ”交互 重组 (reciprocal recombination ) 是 对 称 和 保守 的 ,也 就 是 说 信息 在 双 链 间 交换 ,没有 丢失 或 获得 。 因 此 如 果 重 组 在 携带 等 位 基因 AB 和 ab 的 亲本 染色 体 间 发 生 , 交 互 重组 是 Ag 和 aB。 非 交互 重组 (nonreciprocal recombination) 涉 及 信息 的 单方 向 传 递 。 非 交互 重组 的 例子 是 上 述 的 杂交 将 产生 A2 和 AB ,信息 单方 向 从 A 传递 到 wa 等 位 。 344 。 II 基因 ,wa 等 位 基因 丢失 了 。 这 种 类 型 的 重组 也 称 为 基因 转变 (gene conversion) ,因为 它 看 上 去 是 一 个 等 位 基因 转变 成 另 一 个 。 非 交互 重组 或 基因 转变 在 两 种 环境 中 发 生 。 第 一 ,考虑 在 单 链 侵 入 和 分 枝 迁 移 中 产生 的 异 源 双 链 DNA 的 命运 , 当 霍 利 迪 结 构 解 离 , 含 有 错 配 碱 基 的 异 源 双 链 DNA 可 以 成 为 错 配 修复 (参阅 ) 的 目标 。 修 复 可 以 是 两 种 方向 的 ,因为 减 数 分 裂 链 交换 发 生 复制 后 ,细胞 不 再 分 辩 亲 本 链 和 子 代 链 (参见 复制 后 错 配 修复 )。 要 发 生 基因 转换 事件 ,基因 座 必须 位 于 分 枝 迁 移 区 域内 的 链 交换 位 点 附近 ,这 个 现象 经 常 在 重组 紧密 连锁 的 标记 间 观 察 到 。 因 为 修复 是 无 方向 性 的 ,基因 转变 可 能 因 为 处 于 各 个 修复 过 程 中 具有 相同 机 率 的 大 量 减 数 分裂 产 物 中 无 法 辨识 。 而 在 真菌 代表 单 个 减 数 分 裂 中 的 四 分 染色 体 中 很 容易 观察 到 (参见 四 分 体 分 析 )。 第 二 ,基因 转变 发 生 在 缺口 和 断裂 的 重组 修复 中 。 单 链 缺 口 可 能 在 修复 前 就 被 同 源 双 链 中 一 条 链 补 平 (图 25.3) ,这 样 , 如 同上 面 讨论 的 ,产生 在 两 个 可 能 方向 上 被 修复 的 异 源 双 链 。 双 链 断 裂 经 常 是 外 切 酶 的 靶 位 点 ,因此 在 修复 前 可 能 有 信息 的 丢失 (图 25.3)。 在 这 种 情况 下 ,基因 转变 经 常 是 同方 向 的 ,也 就 是 说 向 同 源 (未 损伤 的 ) 染 色 体 方向 ,因为 这 是 唯一 可 获得 的 信息 。 在 DNA 被 环境 中 的 试剂 损伤 的 情况 下 ,染色 体 断 裂 可 被 基因 转变 来 修复 ,转变 也 是 遗传 重 排 的 一 种 机 制 。 可 保守 移动 的 转 座 利用 基因 转变 增加 它们 的 拷贝 数目 (参见 被 动 转 座 、 移 动 内 含 子 ) 。 基 因 盒 的 开关 ,如 特殊 的 酵母 交配 型 或 免疫 球 蛋白 结构 也 是 以 这 种 过 程 形成 的 ( 见 下 文 )。 信息 盒 转换 非 交 互 重 组 可 以 程序 化 发 生来 改变 在 特定 基因 座 出 现 的 信息 。 这 种 基因 调节 的 机 制 称 为 转换 , 它 需要 一 个 信息 能 表达 的 活性 基因 座 和 多 个 具有 不 同形 式 信息 的 称 为 盒子 (cassettes) 的 沉默 基因 座 , 在 沉默 基因 座 中 ,信息 以 结构 性 不 表达 的 状态 储存 。 沉默 基因 座 和 活性 基因 座 之 间 的 非 交 互 重 组 可 以 由 活性 基因 座 中 起 始 重组 修复 和 基因 转 变 的 双 链 断裂 所 诱发 。 盒子 转换 是 细胞 指导 的 被 动 转 座 的 一 种 形式 。 它 不 同 于 活性 转 座 和 其 他 形式 的 信息 交换 ,如 细菌 整合 子 中 用 不 同 的 抗生素 抗 性 盒子 的 蔡 换 ,此 是 由 于 重组 机 制 的 不 同 。 在 活 性 转 座 和 整合 调节 中 (涉及 位 点 专 一 性 重组 ), 盒 子 整 合 的 基因 座 起 始 是 空 的 。 在 转换 的 情况 中 ,信息 总 是 存在 于 活性 基因 座 中 ,也 就 是 说 转换 是 一 个 取代 过 程 而 不 是 整合 过 程 。 酵母 的 交配 型 转换 ”酵母 中 的 交配 型 转换 是 一 种 简单 的 分 化 形式 (参阅 )。 在 酿酒 酵母 中 ,两 种 交配 型 称 为 a 和 a。 交 配 类 型 的 表 型 反映 了 细胞 表达 的 特定 的 信息 素 和 受 体 ,由 MAT 基因 座 决 定 , MATza 或 MATz 等 位 基因 以 相互 排斥 方式 表达 。 在 同宗 配合 的 酵母 中 (它们 高 频率 发 生 交配 型 转换 ) ,一 个 位 于 BO 基因 座 的 功能 性 等 位 基因 编码 具有 长 的 攻 位 点 的 内 切 酶 ,在 MAT 基因 座 特 异性 剪 切 DNA, 产 生 一 个 双 链 断裂 。 BFO 基因 受到 SWIS 调节 ,SWIS 是 以 细胞 周期 依赖 方式 的 合成 的 转录 因子 ,这 就 把 交配 型 转换 与 细胞 周期 调节 联系 在 一 起 ( 见 细 胞 周期 )。 重 组 可 以 在 MAT 基因 座 以 及 位 于 MAT 左 侧 与 右 侧 几 千 kb 的 沉默 信息 盒子 EMLa 和 EMRc 中 之 间 发 生 。MAT 、HMLa 和 EMRa 的 结 构 是 相似 的 ,在 图 25.5 中 显示 。 有 四 个 同 源 区 域 ,a 和 au 等 位 基因 只 在 含有 调节 和 编码 信息 的 立 区 域 有 差别 。24bp 的 HO 内 切 酶 靶 位 点 处 于 YY 和 2Z 的 交界 处 ,在 沉默 交配 型 盒子 和 MAT 基因 座 中 是 相同 的 。 沉 默 的 机 制 并 非 沉默 交配 型 盒子 的 内 在 性 质 ,而 与 位 于 沉默 区 域 两 侧 可 调节 染色 质 结 构 的 SIR 蛋白 的 靶 位 点 有 关 。 “34S 。 IE 转换 由 HO 诱导 的 双 链 断裂 起 始 , 非 交 互 重组 涉及 MAT 和 沉默 盒子 之 一 。 异 源 重 组 有 90% 的 发 生 率 ,表明 立 区 域 所 采取 的 结构 表现 出 底 物 倾向 性 。 破 坏 沉默 的 突变 使 沉 默 盒子 在 基因 转变 中 起 到 受 体 的 作用 。 因 此 基因 沉默 和 沉默 交配 型 盒子 的 异 源 染色 体 化 的 机 制 也 负责 保护 它们 免 受 内 切 酶 作用 。 < | ! 有 二 [硬是 ， 上 HBMLa 1 W XxX Ya ziZ HMRa 七- 工 -| wr 七 一 人 1 E 克基 鸡 生 区 和 逐 大 这 = 二 站 一 人 图 25.5 酵母 交配 型 基因 座 MAT 和 沉默 信息 盒子 HMLa 和 HIMRea 的 结构 和 活性 。 这 三 个 基因 座 结 构 类 似 ,每 个 都 含有 一 系列 的 同 源 序 列 块 ,尽管 EMRa 比 HMLa 短 。 交 配 类 型 是 由 出 现在 MAT 基因 座 的 立 区 域 决 定 。 沉 默 盒子 和 MAT 之 间 的 重组 经 常 是 通过 粗 箭头 表示 的 途径 发 生 的 而 产生 交配 型 转换 。 大 约 10% 的 重组 事件 涉及 断 稍 头 所 示 的 途径 , MAT 等 位 基因 被 同样 的 等 位 基因 所 取代 。 重 组 起 始 于 立 和 Z 边界 处 由 HO 内 切 酶 产生 的 双 链 断口 。 沉 默 信息 盒子 的 表达 和 内 切 酶 的 前 切 都 是 通过 它们 被 抑制 的 染色 质 结构 所 阻 断 。 锥 虫 抗 原 变异 ”抗原 转换 描述 的 是 锥 虫 和 包 柔 氏 螺旋 体 ( Borrelia ) 中 避免 引发 它 们 的 兰 椎 动物 宿主 免疫 反应 的 保护 机 制 。 这 个 机 制 涉 及 覆盖 细胞 表面 蛋白 的 结构 改变 ， 只 有 一 个 抗原 暴露 给 宿主 。 在 锥 虫 中 ,这 是 可 变 表面 糖 蛋白 (variable surface glycoprotein， VSG) ,而 在 包 柔 氏 螺旋 体 中 是 可 变异 主要 蛋 自 (variable major protein) 。 转 换 经 常 在 感染 时 发 生 ,被 抗原 识别 和 破坏 的 病原 体 通过 转换 产生 不 同性 质 的 抗原 发 动 第 二 次 感染 。 抗 原 转换 加 工 可 以 在 感染 中 发 生 很 多 次 ,产生 一 系列 变异 抗原 类 型 ( variant antigenic types， VATs)。 锥 虫 (Trytparzosomza brxcei prucei ) 有 很 多 表现 VSGs 的 基因 和 基因 片段 ,很 多 位 于 不 重要 的 微 染色 体 上 ,这 样 的 微 染 色 体 似乎 除了 携带 VSG 基因 没有 其 他 功能 。 基 因 组 中 可 能 有 几 千 个 VSGs 顺序 ,但 只 有 一 百 个 左右 被 表达 ,因此 产生 的 所 有 潜在 抗原 类 型 称 为 血 清 同类 群 (serodeme)。 在 表达 的 基因 中 ,只 有 一 个 是 表达 连锁 拷贝 或 称 表 达 相 关 基 因 , 它 在 任 一 时 刻 都 有 活性 。 表 达 连 锁 拷贝 总 在 几 个 端 粒 表达 位 点 中 的 一 个 中 发 现 ,尽管 这 些 位 点 的 位 置 本 身 不 如 在 端 粒 和 内 部 位 置 发 现 的 转录 沉默 的 基本 拷贝 那么 重要 。 抗 原 转 换 以 两 种 方式 发 生 : 第 一 可 能 发 生 基 因 转 换 ,包括 一 个 基本 拷贝 被 转移 到 表达 位 点 。 这 在 机 制 上 类 似 于 酵母 交配 类 型 转换 ( 见 上 ) ,涉及 很 多 VSG 基因 片段 的 重组 ,进一步 增加 了 表 面 蛋白 的 潜在 变异 性 。 第 二 ,转换 可 以 通过 关闭 一 个 表达 位 点 而 激活 另 一 个 位 点 达到 目 的 。 涉 及 这 一 过 程 的 精确 机 制 还 不 清楚 ,但 控制 表达 位 点 活性 的 区 域 已 经 被 发 现 , 如 同 醇 母 交配 类 型 转换 一 样 ,这 种 机 制 也 涉及 染色 质 结构 的 改变 。 2$.4 位 点 专 一 性 重组 位 点 专 一 性 重组 反应 位 点 专 一 性 重组 ( site-specific recombination) 要 求 在 供 体 和 靶 分 . 346 ， 子 中 包含 有 短 的 特定 DNA 序列 ,被 特定 的 识别 这 些 序 列 的 蛋白 重组 酶 所 催化 。 位 点 专 一 性 重组 不 同 于 同 源 重 组 在 于 它 需 要 特定 的 重组 序列 ,而 供 体 和 靶 分 子 间 的 同 源 性 对 重 组 并 非 关 键 。 根 据 重组 所 涉及 的 体系 和 重组 位 点 的 方向 ,位 点 专 一 性 重组 可 以 介 导 三 类 反应 : (1) 分 子 间 位 点 专 一 性 重组 产生 整合 或 融合 ; (2) 重 组 位 点 的 正 向 顺序 间 的 分 子 内 位 点 专 一 性 重组 产生 剪 切 和 解 离 ,是 整合 和 融合 的 相反 过 程 ; (3) 重 组 位 点 的 反 向 重复 顺序 之 间 的 分 子 间 重 组 产生 倒 位 。 位 点 专 一 性 重组 系统 分 成 两 类 。 和 整合 / 切 离 反应 (入 整合 酶 家 族 ,和 integrase family) 要 求 松 弛 的 拓扑 学 结构 ,能够 进行 上 述 三 种 反应 中 的 任何 一 种 。 和 整合 酶 类 系统 包括 酿 酒 酵母 2w 质粒 的 FLPARP 重组 酶 系统 和 大 肠 杆菌 基 因 组 中 抗生素 抗 性 盒 在 整合 位 点 的 整合 ( 见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因子 ) 。Tn3 解 离 反应 (Tn3 解 离 酶 家 族 ) 要 求 精确 的 拓 提 学 结构 ,获得 的 反应 产物 是 精确 定义 的 。Tn3 解 离 酶 类 体系 包括 沙门 氏 菌 属 (Salmazozellia tyzpjpizzz7ix7z ) 和 叭 菌 体 Mu 的 宿主 范围 中 控制 相 变 (phase variation) 的 可 倒 位 基因 组 片段 。 了 解 得 较 清楚 的 位 点 专 一 性 重组 系统 在 文 框 25.2 中 讨论 。 2$.3 免疫 球 蛋 白 的 产生 和 个 -细胞 受 体 的 多 样 性 抗原 受 体 多 样 性 中 重组 的 作用 “ 状 椎 动物 免疫 系统 产生 两 种 类 型 的 抗原 识别 蛋白 : 作 为 膜 结 合 B 细胞 受 体 (BCRs) 或 是 作为 分 泌 性 抗体 的 免疫 球 蛋 白 (Ig) ,以 及 工 细 胞 受 体 (TCRs)( 文 框 23.3)。 抗 原 识别 蛋白 可 以 根据 任何 获得 的 抗原 产生 ,也 就 是 说 免疫 系统 必须 识别 109 到 10” 不 同 分 子 构 型 。 这 种 显著 的 多 样 性 反映 了 相应 基因 的 基本 多 样 性 ( 胚 系 的 多 样 性 ) ,和 单个 淋巴 细胞 通过 位 点 专 一 性 重组 来 重 排 基因 片段 产生 新 的 组 合 ( 体 细胞 多 样 性 ) 的 能 力 。 抗 原 特异 性 的 独特 型 多 样 性 (idiotypic diversity) 反 映 了 体 细胞 重组 活性 和 单个 淋巴 细胞 的 特性 。 Igs 和 TCRs 证 明 存 在 异型 多 样 性 (allotypic diversity)( 物 种 个 体 间 的 多 样 性 ,反映 了 等 位 基因 的 变化 ,也 就 是 多 态 性 ) 和 同型 多 样 性 (isotypic diversity) (物种 所 有 个 体 的 多 样 性 ,通常 反映 了 紧密 相关 基因 的 表达 或 不 同 的 剪接 变化 )。 在 免疫 球 蛋 白 重 链 基因 座 中 ， 新 型 的 同型 多 样 性 也 是 通过 位 点 专 一 性 的 重组 产生 的 。 这 决定 了 每 个 Ig 分 子 恒定 区 的 结构 (也 就 是 说 这 个 区 域 和 效应 功能 有 关 而 和 抗原 识别 无 关 ) 。 通过 V(D)J 重 组 的 独特 型 多 样 性 Ig 和 TCR 的 抗原 结合 专 一 性 (独特 型 多 样 性 ) 是 由 可 变 区 决定 的 ,可 变 区 是 通过 体 细胞 重组 由 V\(D) 和 本 片段 拼接 产生 的 ,也 就 是 说 重组 在 前 B 和 前 工 细胞 中 发 生 , 而 不 是 在 种 系 中 发 生 。 在 三 个 高 度 可 变 的 分 子 互补 性 决定 区 域 中 (complementarity-determining regions) ,CDR1 和 CDR2 由 V 片段 决定 而 CDR3 显示 了 更 多 的 可 变性 ,由 V(D)J 拼 接 。 多 样 性 不 仅 通 过 特定 的 V-、(D) 和 本 片段 选择 产生 ,而且 也 通过 它们 不 精确 的 连接 一 一 在 编码 接头 的 变化 可 以 产生 核 苷 酸 的 捅 和 人 或 缺失 ( 表 25$.4)。 进 一 步 的 多 样 性 是 通过 可 变 区 的 随机 突变 产生 的 〈 参见 体 细 胞 超 突 变 )。 多 样 性 片段 中 ,D-J 先 连接 ,接着 V 片段 加 到 DJ 拼接 块 上 ;连接 反应 后 于 并 依赖 于 前 重 排 基 因 的 转录 反应 。 特 定 重 排 中 使 用 的 片段 是 随机 选择 的 ,尽管 对 某 些 组 合 可 能 有 倾向 性 。 34 表 25.4 在 抗原 - 受 体 基 因 产 生 独 特 型 多 样 性 的 机 制 多 样 性 机 制 分 子 基础 组 合 多 样 性 不 同 V,(D) 和 丁 片段 的 使 用 多 D 片 段 的 使 用 连接 多 样 性 外 切 酶 在 编码 接头 处 降解 ,导致 基因 片段 连接 处 位 置 的 变化 | N 区 域 多 样 性 通过 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 在 编码 接头 挫 人 随机 核 苷 酸 V 基 因 取 代 在 一 个 已 拼接 的 但 为 非 生产 性 的 V(D)J 外 显 子 和 剩余 的 V 片段 之 间 进 一 步 的 重组 体 细 胞 超 突变 可 变 区 中 的 点 突变 ,有 助 于 亲和力 成 熟 ;只 发 生 在 免疫 球 蛋 白 基 因 座 ( 见 突变 和 选择 ) V(D)J 重 组 的 机 制 V(D)J 重 组 是 V-,D- 和 本 片 段 两 侧 的 重组 信号 序列 (RSSs) 位 点 专 一 性 的 重组 反应 。RSSs 在 V 片段 下 游 J 片段 上 游 和 D-= 片段 两 侧 发 现 。RSS 含有 七 聚 体 回 文 顺 序 和 富 含 AT 的 九 聚 体 ,它们 分 别 含有 保守 顺序 CACTGTG 和 GGTTTTTGT。 七 聚 体 总 是 邻近 于 基因 片段 ,通过 一 个 不 保守 的 大 约 12bp 或 23 一 24bp( 分 别 对 应 于 一 个 和 两 个 螺旋 转角 ) 的 片段 与 九 聚 体 间隔 开 。 重 组 只 发 生 在 有 不 同 间隔 的 RSSs 之 间 , 称 为 12 - 23 原则 。 两 个 RSSs 在 包含 RAG1 和 RAG2 蛋白 的 联 会 复合 体 中 排列 ,导致 在 每 个 七 聚 体 和 基因 片段 接头 处 前 切 DNA( 图 23.6)。 转 酯 反应 在 两 个 基因 片段 间 形 成 编码 接 本， somenan 有 人 和 于- RECTG GTGACRAC “"p CR En ae | RAG1, RAGC2， HMG172 DNA 依 赖 蛋白 激酶 (RK) ni ee --- 一 vv TIE 编码 接头 (不 精确 ) 7 12/23 9 信号 接头 (精确 ) 图 25.6 在 IgL 基 因 座 中 VJ 重 组 机 制 。 有 不 同 大 小 间隔 的 重组 信和 号 顺序 (RSSs) 在 含有 RAG1L、 RAG2 和 HMG 蛋白 的 复合 物 中 联 会 ,使 DNA 在 RSS 和 V 和 本 片段 之 间 前 切 。 这 样 形成 精确 的 信和 号 接头 ( 沿 残 基 重 组 复合 物 被 弃 去 ) 和 不 精确 的 编码 接头 (外 切 酶 降解 的 目标 和 可 插 人 非 模 板 的 N 核 苷 酸 )。 ”348 头 并 在 七 聚 体 模 体 间 形成 信号 接头 。 信 和 号 接头 是 十 分 精确 的 , 环 化 的 DNA 片段 从 基因 组 中 被 剪 切 出 来 并 降解 。 相 反 编 码 接头 是 不 精确 的 。 可 通过 不 特异 的 外 切 酶 活性 从 编码 末端 去 除 长 至 10 核 苷 酸 或 通过 未 端 脱氧 核 苷 酸 转 移 酶 加 上 10 个 核 苷 酸 ( 这 些 非 模 板 残 基 含 有 N- 区 域 )。 在 培养 的 非 淋 巴 细胞 中 RAG1 和 RAG2 蛋白 足以 提供 V(D)J 重 组 酶 活性 ,用 克隆 的 RSSs 在 体外 可 以 有 效 发 生 V(D)J 重 组 。RAG1 有 螺旋 -转角 -螺旋 基 序 (参阅 ) ,与 RSS 九 聚 体 顺 序 结合 而 不 论 间 隔 的 大 小 。 如 果 间 隔 为 12 碱 基 ,RAG2 被 高 效 征集 到 RAG1- RSS 复合 物 中 ,这 是 12 - 23 原则 的 分 子 基础 。RAG 蛋白 的 结合 为 HMG1 和 HMG2 所 促 进 (参见 高 泳 动 蛋 白 ) ,它们 可 以 弯曲 DNA, 并 可 能 有 助 于 不 同 顺 式 作 用 位 点 间 的 相互 作 用 。 剪 切 后 ,RAG 和 HMG 蛋白 的 联 会 复合 体 仍 保持 与 信号 接头 的 结合 ,而 编码 接头 被 释放 ,这 可 能 保护 信和 号 接头 免 受 外 切 酶 和 末端 脱氧 转移 酶 作用 。 V(D)J 重 组 体 的 解 离 阶段 不 是 由 特定 的 重组 酶 进行 的 ,而 通过 细胞 中 共有 的 一 般 双 链 断 口 修复 (DSBR) 机 制 进行 ( 见 诱 变 和 DNA 修复 )。V(D) 本 重组 和 DSBR 之 间 的 联系 是 通过 小 鼠 SCID 细胞 了 对 X 射线 的 敏感 性 ,以 及 在 转 染 RAG1 和 RAG2 cDNA 的 SDBR 缺陷 细胞 中 不 能 进行 VID)J 重 组 而 确立 的 。 小 鼠 Scid 基因 编码 DNA 依赖 蛋白 激酶 多 聚 体 的 一 种 成 分 ,这 一 复合 物 被 征集 到 损伤 的 DNA 处 ,这 个 酶 的 其 他 成 分 由 对 X 射 线 敏 感 的 XRCC 基因 编码 。 等 位 基因 和 同型 排斥 ”单个 B 细 胞 和 工 细 胞 是 单 特 异性 的 (monospecific) ,也 就 是 说 它 们 产生 针对 单个 抗原 特异 性 的 免疫 球 蛋 白 或 受 体 。 然 而 ,因为 淋巴 细胞 是 二 倍 体 , 有 两 个 免疫 球 蛋 白 轻 链 基 因 座 ,在 理论 上 通过 不 同 多 肽 链 的 组 合 , 有 可 能 产生 八 种 类 型 功能 性 免 疫 球 蛋白 和 四 种 类 型 的 工 细 胞 受 体 。 观 察 到 的 单 特 异性 反映 了 等 位 基因 排斥 (allelic ex- clusion)( 每 个 基因 只 表达 一 个 等 位 基因 ) ,而 且 在 IgL 基因 座 中 还 发 生 同 种 型 排斥 (iso- typic exclusion)( 只 表达 一 个 轻 链 基因 )。 排 斥 机 制 目前 还 不 完全 清楚 ,但 它 是 随机 的 ,可 被 与 B 或 工 细 胞 受 体 结合 的 抗原 所 激活 。 最 可 能 的 机 制 是 每 个 基因 座 第 一 次 产生 的 重 排 使 它们 合成 受 体 , 被 抗原 结合 激活 后 通过 BCR 或 TCR 信和 号 传导 反馈 抑制 了 进一步 的 V(D)J 重组 。 通过 类 别 转换 产生 的 同 种 型 多 样 性 ”免疫 球 蛋 白 的 效应 功能 由 免疫 球 蛋 白 重 链 (CH ) 的 恒定 区 决定 。 有 五 种 亚 型 的 免疫 球 蛋白 :IgM、\IgD、IgG、IgE 和 IgA，IgG 与 IgA 还 有 不 同 亚 类 。B 细胞 合成 的 免疫 球 蛋白 类 型 由 特定 的 位 于 V(D)J 重 组 外 显 子 下 游 的 C 基 因 片 段 决 定 。C 基因 片段 代表 的 每 个 类 型 和 亚 类 型 (小 鼠 中 8 个 ,人 类 中 9 个) 是 串联 排 列 的 (图 25.7)。 类 别 转换 涉及 转换 区 域 (switch region,S regions) 之 间 的 重组 ,转换 区 域 位 于 除了 Cs 所 有 C 基因 片段 上 游 。 这 过 程 首 先 缺失 内 部 DNA, 将 合适 的 C 基因 片段 连 接 到 VDJ 外 显 子 中 ; 剪 切 下 来 的 DNA 呈 环 状 被 释放 。 重 组 的 VDJ 基因 片段 以 Cu 起 始 表达 ,产生 免疫 球 蛋 白 亚 型 IgM。 转 换 重 组 可 以 在 Cw 上 游 的 转换 区 域 和 除了 C8 外 任何 3'C 基因 上 游 的 转换 区 域 之 间 进 行 (IgM 到 IgD 的 类 型 转换 不 是 通过 基因 座 重 排 , 而 是 通 G@SCID 是 重度 联合 免疫 缺陷 ,也 就 是 说 细胞 调节 和 体液 免疫 都 有 缺陷 。SCID 可 由 很 多 缺陷 引起 ,如 B 细 胞 和 工 细胞 发 育 失败 。 在 人 类 中 30% 的 SCID 病例 是 由 RAG1 或 RAG2 的 基因 突变 引起 的 ,它们 控制 早期 的 V(D) 丁 重组。 在 小 鼠 中 ,SCID 的 主要 形式 涉及 DSBR 缺陷 ,DSBR 涉及 晚期 V(D)J 重 组 ,效应 不 仅仅 限于 淋巴 细胞 。 . 349 ， 人 类 IgH VDj 5 已 G5 ED GinwYes :Co JANE CI C 诅 Ce Ca2 小 鼠 IgH VDJ Ch Ci Ci CTY1 CY2b CTY2a ”Ce Ca 图 25.7 人 和 小 鼠 IgH C 基 因 片 段 的 组 成 , 黑 圈 代表 转换 区 域 。 人 类 IgH 基 因 座 含有 两 个 假 基 因 ,跨越 大 约 1.2Mbp DNA。 重 组 在 Cw 转换 和 其 他 3 端的 转换 之 间 进 行 。 接 着 进一步 的 转换 重 组 以 $ 一 3 方向 发 生 。 过 选择 性 的 RNA 加 工 ,引起 Cry 片段 在 RNA 水 平 去 除 。 在 IgH 基 因 座 的 RNA 加 工 也 用 来 产生 分 沁 和 膜 结 合 的 免疫 球 蛋 白 亚 型 )。 几 个 顺序 进行 的 转换 重组 事件 也 可 能 发 生 , 通 常 是 以 5 一 3 注 向 ,产生 不 同 亚 型 的 抗体 而 不 影响 它们 的 抗原 特异 性 。 转 换 区 域 是 含有 简单 串联 重复 序列 的 1 一 10kbp 的 顺序 。 与 VDJ 重组 不 同 , 转 换 重 组 可 以 在 转换 区 域内 很 多 位 点 发 生 。 转 换 区 域内 和 上 游 的 很 多 顺 式 作用 元 件 被 发 现 可 作为 蛋白 结合 位 点 , 尽 管 已 分 离 鉴 定 了 几 个 结合 蛋白 [包括 NF-kB,NF-Sm(SNUP) ,LR1 和 Pax-5] ,它们 在 重组 及 其 调节 中 的 作用 还 不 清楚 。 转 换 似 乎 不 是 程序 化 的 ,但 特定 的 重 排 的 进行 能 够 被 细胞 因子 调节 ,因此 细胞 可 以 左右 特异 球 蛋 白 类 型 和 亚 型 的 产生 。 转 录 在 重组 之 前 发 生 ,但 顺 序 剪接 对 转换 的 发 生 很 重要 。 这 可 能 反映 了 转录 时 剪接 因子 将 重组 蛋白 征集 到 DNA 上 ,形成 三 链 的 RNA-DNA 结构 或 者 将 DNA 置 于 细胞 核 内 正确 部 位 使 转换 可 以 发 生 。 转换 伴随 着 转换 接头 两 侧 DNA 的 突变 ,说 明 有 错误 倾向 的 DNA 合成 形成 了 重组 机 制 的 一 部 分 。 转 换 重组 因此 可 能 涉及 拷贝 -选择 机 制 (参阅 )。 在 其 他 背 椎 动物 中 免疫 球 蛋白 的 多 样 性 ”上 文 讨 论 的 免疫 系统 多 样 性 的 机 制 是 哺乳 动 物 特有 的 ,特别 是 在 小 鼠 和 人 类 中 。 在 其 他 销 椎 动物 中 ,甚至 是 其 他 哺乳 动物 所 涉及 的 机 制 有 微妙 的 差别 。 如 在 鸡 中 ,尽管 免疫 球 蛋 白 基因 座 类 似 其 他 哺乳 动物 ,分 成 不 连续 的 片 段 ,每 个 类 型 片段 只 有 一 个 特定 拷贝 是 持续 表达 的 ,通过 涉及 V-,(D) 和 丁 片段 多 沉默 拷 贝 的 基因 转换 产生 免疫 球 蛋 白 的 多 样 性 。 这 些 曾 被 定义 为 假 基因 ,但 从 原理 上 与 酵母 沉 默 交 配 类 型 盒子 和 锥 虫 的 VSG 盒子 ( 见 上 文 ) 没 有 区 别 。 在 低 等 脊椎 动物 中 ,似乎 有 可 观 的 预先 存在 的 胚 系 多 样 性 。 在 这 些 动物 体内 也 有 V-,D- 和 丁 片段 ,但 在 很 多 情况 下 ,似乎 在 胚 系 中 已 经 重 排 ,不 是 已 经 连接 在 一 起 ,就 是 以 只 有 一 种 重 排 是 可 能 的 方式 紧密 相 联 。 尽管 组 合 多 样 性 受到 限制 ,但 编码 的 连接 是 不 精确 的 一 一 如 同 它 在 哺乳 动物 中 那样 通过 缺失 和 插入 核 苷 酸 可 产生 可 观 的 连接 多 样 性 。 23.6 非常 规 重 组 末端 连接 ,异常 复制 和 重组 非常 规 重 组 (illegitimate recombination ) 摘 述 了 混杂 的 重组 机 制 ,重组 伙伴 之 间 需 要 很 少 甚或 不 需要 同 源 性 ,通常 代表 了 使 用 不 正确 底 物 的 正常 细胞 加 工 。 非 常规 重组 经 常 导 致 基因 破坏 而 引起 突变 ,在 人 类 遗传 疾病 和 癌症 中 占 主要 地 位 。 在 表 25.5 中 总 结 了 非常 规 重 组 的 部 分 机 制 。 “ 光 30i” 表 25.5 非常 规 重组 的 机 制 机 制 分 子 基础 不 正常 末端 连接 在 真 核 细 胞 中 经 常 发 生 的 反应 ,通过 直接 重 接 末 端 来 修复 双 链 染色 体 断 裂 。 通 过 连接 修 复 被 认为 是 先进 的 ,因为 在 高 等 真 核 生 物 的 高 度 重复 基因 组 中 进行 同 源 寻 找 是 困难 的 且 有 错误 倾向 。 当 加 工 确实 出 错时 ,丰富 的 非 编码 DNA 降低 了 基因 被 破坏 的 危险 , 另 外 因为 当 DNA 包装 到 染色 质 时 , 打 断 的 染色 体 末 端 可 能 通过 高 级 结构 保持 在 一 起 。 当 修 复 系 统 可 以 作用 于 不 正常 末端 时 ,可 能 会 引起 易 位 和 其 他 重 排 。 这 种 机 制 还 允许 线性 DNA 转 染 并 整合 到 基因 组 中 (参见 转 染 \ 转 基因 小 和 所)。 末 端 连 接 在 原核 生物 中 较 少 ,在 原核 生物 中 不 能 连接 没有 粘 端的 DNA。 非常 规 复制 这 发 生 在 重复 DNA 和 形成 稳定 二 级 结构 (发 夹 . 十 字形 ) 的 DNA。 引 物 链 从 带 有 模板 的 固定 位 置 中 跳出 并 产生 插 人 和 缺失 。 能 刺激 产生 不 正常 复制 的 重复 顺序 和 自身 互补 的 基 序 经 常 是 突变 热点 (参见 复制 的 保 真 度 、 三 核 疹 酸 重复 综合 征 )。 非常 规 链 交 换 所 有 三 种 正常 重组 - 同 源 、 位 点 专 一 性 和 转 座 一 一 产生 作为 反应 中 间 体 的 单 链 。 当 这 些 游离 链 连接 到 错误 的 位 置 , 不 正常 的 链 交换 就 会 发 生 ,如 一 单 链 正 好 位 于 反应 附近 的 情 况 。 这 也 可 能 在 通常 不 涉及 重组 的 系统 中 发 生 ,如 拓扑 异 构 酶 (参阅 ) 和 起 始 质粒 复制 的 缺口 酶 (人 参阅 )。 不 等 交换 如 果 由 于 存在 重复 DNA, 同 源 双 链 突出 固定 位 置 。 解 离 之 后 , 它 在 一 条 链 产生 插 人 ,而 在 另 一 条 链 产生 缺失 ,从 而 发 生 不 等 交换 。 尽 管 不 等 交换 是 异常 的 ,但 机 制 是 正常 的 同 源 重组 而 不 是 不 正常 的 重组 一 一 它 的 发 生 需 要 同 源 性 。 异常 位 点 识别 重组 基于 特定 序列 被 蛋白 识别 时 邻近 DNA 出 现 类 似 序列 (隐蔽 识别 位 点 ) 有 时 造成 涉及 额外 DNA 的 不 正常 反应 。 这 种 类 型 的 重组 导致 大 多 数 涉及 转 座 和 位 点 专 一 性 附加 体 的 不 正常 切 离 事件 。 非常 规 V-(D)-J 连 免疫 球 蛋 白 的 RSS 元 件 和 TCR 基因 座 和 在 基因 组 别处 的 隐蔽 元 件 间 的 不 正常 重组 可 导 接 致 与 淋巴 瘤 相 关 的 染色 体 畸 变 谱 型 。 另 外 ,在 正常 情况 下 在 B 和 T 开 细胞 发 育 中 表达 的 重组 酶 基因 若 在 异 位 激活 会 产生 肿瘤 。 隐 蔽 的 RSS 元 件 在 抗原 受 体 基 因 座 本 身 可 以 发 现 。Kappa 缺失 元 件 就 是 这 样 的 隐蔽 位 点 , 它 涉及 的 重组 引起 IgLx 恒定 区 的 缺失 ， 在 小 鼠 中 称 为 RS 重组 的 过 程 。 类 似 的 delta 缺失 元 件 引 起 TCR8 链 的 丢失 。 在 SCID 小 鼠 中 , 当 DJ 连接 阻 断 时 ,外 切 酶 活性 异常 ,在 IEH\TCRB 和 TCRY 的 DJ 编码 接头 两 侧 发 生 缺 失 ,结果 不 能 产生 成 熟 的 B 和 工 细胞 。 文 框 25.1 负责 同 源 重组 的 基因 大 肠 杆 菌 中 的 重组 蛋白 :RecA 是 多 功能 蛋白 ,帮助 联 会 和 链 交换 ,在 SOS 修复 中 也 起 主要 作用 。 recA 突变 体 不 能 进行 重组 ,也 不 能 诱导 SOS 反应 (参阅 ) ,因此 对 DNA 损伤 试剂 非常 敏感 。RecA 可 以 和 单 链 或 双 链 DNA 形成 复合 物 ,而 其 中 单 链 DNA 是 更 有 效 的 底 物 。RecA 沿 DNA 多 聚 化 形 成 螺旋 状 , 突 触 丝 (presynaptic filaments) 中 的 DNA 较 大 程度 地 解 盘 旋 ( 比 正常 长 50% )。RecA- DNA 复合 物 与 双 链 DNA 相互 作用 ,形成 四 元 复合 物 ,如 果 发 现 有 同 源 区 域 ,就 起 始 链 转移 。 四 元 复合 物 也 可 以 在 没有 顺序 相似 性 的 情况 下 形成 ,这 被 认为 反映 了 通过 蛋白 寻找 同 源 性 的 恶果 。 蛋 白 丝 有 明确 的 极 性 ,与 $ 一 3 的 进入 和 取代 链 的 极 性 相 一 致 。 蛋 白 促进 单 链 和 同 源 双 链 中 的 互补 链 的 碱 基 配 对 ,首先 通过 形成 含有 RecA 和 重组 对 的 四 元 复合 物 ,然后 作为 尾 或 环 取代 受 体 双 链 原 先 的 一 条 链 。 这 个 反应 被 认为 涉及 三 链 DNA 和 可 能 的 异常 碱 基 配对 ( 见 核酸 结构 )。 进 入 和 取代 链 的 链 进 入 和 取代 以 5 一 3 人 方向 进行 。 起 先 ,配对 必须 是 完全 的 ,但 一 旦 链 开始 转移 , 错 配 可 以 被 忍受 ,导致 异 源 双 链 DNA 的 产生 。 一 旦 链 转移 开始 ,在 起 始 复合 物 中 RecA 蛋白 可 以 催化 取代 链 转移 到 不 配对 的 链 ,因此 产生 霍 利 迪 接 头 。RuvAB 蛋白 在 RecA 链 延 伸 的 方向 促进 分 枝 迁 移 ,而 RecG 促进 分 枝 向 相反 方向 迁移 。RuvC 剪 切 霍 利 迪 接 头 ,以 相同 频率 产生 短片 段 型 和 拼接 型 重组 体 (参见 D- 环 诱 变 )。 2 真 核 重组 蛋白 分 离 酵 母 DNA 损伤 修复 和 减 数 分裂 阻 断 突变 体 可 促进 重组 基因 的 鉴定 。 RAD52 上 位 性 群 (参阅 ) 基 因 涉 及 重组 修复 。 这 些 基因 中 占 优 势 的 是 RAD51, 它 与 大 肠 杆菌 recA 同 源 。RAD51 的 同 源 物 在 很 多 真 核 生 物 中 被 发 现 ,酿酒 酵母 的 RAD51 被 DNA 损伤 诱导 。 在 每 个 物种 中 似乎 都 有 几 个 RADS51 的 同 源 物 。 如 在 酿酒 酵母 中 ,DST1 编码 类 RAD51 产物 , 它 的 活性 限 于 减 数 分 裂 细 胞 。 其 他 基因 有 突变 体 表 型 ,表明 它们 在 减 数 分 裂 和 有 丝 分 裂 重 组 中 都 起 一 定 的 作 用 。RAD50 编码 一 DNA 结 合 蛋白 , 它 的 功能 是 在 有 丝 分 裂 细 胞 中 修复 双 链 断裂 点 ,并 在 减 数 分 裂 细胞 中 诱导 和 加 工 这 些 断 裂 点 。RAD52 的 产物 对 有 丝 分 裂 和 减 数 分 裂 重 组 , 双 链 DNA 断裂 点 的 修复 和 交配 类 型 的 转换 都 很 重要 ; 它 与 RAD51 相互 作用 。RAD54 编码 一 解 旋 酶 ,为 重组 和 其 他 形 式 的 DNA 修复 所 必需 。 文 框 25.2 ”位 点 专 一 性 重组 系统 入 叭 菌 体 的 整合 和 切 离 ”在 整合 和 切 离 中 需要 两 个 入 编码 的 蛋白 ,Int 和 Xis (关于 它们 在 入 感染 循环 中 的 表达 和 调节 讨论 见 病毒 一 章 )。 它 们 与 宿主 的 IHF 和 FIS 联合 调节 称 为 附着 位 点 (at- tachment site) 序 列 间 的 位 点 专 一 性 重组 ,这 些 位 点 是 鸣 菌 体 附 着 位 点 azP 和 细菌 附着 位 点 atB。 整合 需要 Int 和 IHF ,而 切 离 还 需要 加 上 Xis(FIS 有 促进 作用 ,但 对 切 离 不 是 关键 的 ) 。 链 交换 反应 是 按 顺 序 进行 的 ,首先 是 在 附着 区 域 的 左 侧 接着 通过 分 枝 迁 移 到 第 二 链 转移 发 生 的 右 侧 。 这 些 反 应 通过 一 DNA 与 Int 结合 的 共 价 中 间 体 进行 。 在 噬菌体 入 整合 和 切 离 中 的 位 点 专 一 性 重组 。 叭 菌 体 附 着 位 点 attP 有 POP 结构 ,P 和 了 "是 含有 Int\Xis 和 FIS 结合 位 点 的 复杂 元 件 ,而 O 是 位 于 链 转 移 位 点 间 的 重 委 区域 。 细 菌 附 着 位 点 atzB 简单 些 ,有 结构 BOB' ,其 中 B 和 了 B 是 Int 的 结合 位 点 。 位 点 专 一 性 重组 产生 在 入 原 叹 菌 体 两 侧 的 杂 合 位 点 aitL(BOP' ) 和 atiR(POB' )。 1 Hame 和 > 一 3 四 现 呈 启动 也 有 - <- 寻 jiixL hrixR 了 Hin CEy7) 启动 子 别 | 殉 7 个 - | jiixL jxR 沙门 氏 菌 的 相 转变 。 沙 门 氏 菌 的 鞭毛 主要 由 蛋白 鞭毛 蛋白 组 成 ,这 种 蛋白 有 两 个 不 同 的 抗原 形式 , HI ( 特 殊 相 位 抗原 ) 和 E2 ( 群 相 位 抗原 )。 瑟 ; 和 2 由 不 共 表 达 的 不 同 基因 编码 ,因为 本 2 基因 座 与 第 三 个 基因 rHI 紧密 连锁 ,>B1 编码 瓦 1 表达 的 抑制 因子 。B2 和 1 的 启动 子 位 于 心 zL 和 号 zxzR 位 点 间 的 倒 位 了 = 片段 中 ,可 在 Hin 的 控制 下 进行 位 点 专 一 性 倒 位 。 在 一 个 方向 上 ,启动 子 驱 动 E2 和 zl 的 表达 ,抑制 五 。 在 另 一 方向 , 互 2 和 >51 缺乏 启动 子 , 因 此 三 不 表达 而 GI 表达 去 抑制 。 宿 主 蛋白 FIS 通过 与 有 7 基因 中 的 增强 子 结合 促进 反 转 。 ww 旭 人 > 鸣 菌 体 Mu 的 宿主 范围 变化 。 在 叭 菌 体 Mu 中 有 两 种 尾 丝 基因 (S 和 U)。S 基因 有 一 个 位 于 可 倒 位 G 区 域外 侧 的 不 变 部 分 (Sc) 和 位 于 其 中 的 不 同 的 可 变 部 分 (Su、`Sv)。 不 同 版 本 的 U(U、 U ) 也 位 于 G 区 域 中 。G 区域 的 倒 位 由 和 蛋白 Gin 催化 ,Gin 帮助 两 侧 gizR 和 &izL 位 点 间 的 重组 。 宿主 蛋白 FIS 通过 与 G 区 域外 侧 gzz 基因 中 的 增强 子 结合 刺激 倒 位 。 通过 位 点 专 一 性 倒 位 发 生 表 型 变化 ”在 有 些 系统 中 ,如 在 沙门 氏 菌 中 的 相 转 变 和 叭 菌 体 Mu 的 宿主 范围 的 变化 ,不 同 的 基因 表达 模式 依赖 于 小 的 遗传 元 件 的 倒 位 。 这 样 的 倒 位 因 Tn3 解 离 酶 类 型 的 位 点 专 一 性 重组 系统 而 促进 ,利用 可 倒 位 元 件 两 侧 的 反 转 重复 顺序 进行 。 相 转变 和 Mu 宿主 范围 变化 的 机 制 在 下 图 中 显示 ,类 似 的 系统 控制 噬菌体 P1 和 大 肠 杆菌 基因 组 中 未 知 功能 的 小 DNA 片 段 倒 位 。 涉 及 这 些 系统 的 重组 酶 ,Gin Cin\Hin 和 Pin 是 彼此 同 源 且 功能 可 以 互 换 的 ,但 涉 及 倒 位 的 顺 式 作 用 元 件 不 是 这 样 。 在 叭 菌 体 Mu 和 P1 的 Gin/Cin 系统 中 ,重组 酶 的 基因 也 含有 倒 位 的 顺 式 作用 增强 子 ,并 位 于 可 倒 位 片段 的 范围 之 外 。 在 沙门 氏 菌 的 Hin 系统 中 ,重组 酶 和 增强 子 在 倒 位 片段 内 而 涉及 的 变异 基因 位 于 片段 之 外 。 通过 位 点 专 一 性 重组 解 离 转 座 子 Tn3 从 一 个 基因 组 到 另 一 个 发 生 复制 转 座 之 后 ,产生 含有 一 个 转 座 子 的 正 向 重复 顺序 的 共 整 合 (参见 复制 转 座 , 共 整合 )。 在 转 座 因子 内 部 res 位 点 发 生 位 点 专 一 性 重组 ,来 共 整合 两 个 各 携带 一 个 Tn3 拷贝 的 DNA 片段 。 这 个 重组 反应 由 转 座 子 编码 的 解 离 酶 (resolvase) 和 蛋白 催化 。 与 入 的 整合 和 切 离 不 同 , 解 离 酶 的 活性 是 有 方向 性 的 。 栅 合 (整合 ) 反 应 不 是 由 这 个 酶 催化 的 ,反映 了 系统 的 特定 的 拓扑 学 需要 。 这 表明 Tn3 在 体外 分 解 经 常 产生 同样 拓 扑 学 状态 反应 产物 。 反 应 经 历 两 条 链 交换 反应 ,涉及 共 价 结合 的 DNA - 解 离 酶 中 间 体 。 另 一 个 控 制 解 离 的 位 点 专 一 性 重组 是 喉 菌 体 Pl 的 Cre- JoxP 系统 。 它 完全 不 依赖 于 上 面 描述 的 Cin-cizL AR 系统 , 它 的 基本 功能 是 解 离 质粒 二 聚 体 , 以 协助 细胞 分 裂 时 的 精确 分 离 (噬菌体 P1 以 低 拷贝 数 质 粒 形式 存在 ,在 处 于 溶 原状 态 时 以 下 质粒 同样 方式 繁殖 ; 见 质粒 病毒)。Cre 重组 酶 作用 于 正 向 重 复 的 /ozP 重组 位 点 ,帮助 解 离 ,但 也 能 催化 线性 叭 菌 体 基 因 组 的 环 化 和 (很 罕见 ) 可 能 将 质粒 整合 到 宿主 基因 组 中 。 酵 母 2 质粒 的 FLP-FRP 系统 也 被 认为 在 分 解 质粒 多 聚 体 中 发 挥 功能 ,也 可 能 在 增加 拷贝 数 中 起 作用 。 与 Tn3 解 离 酶 和 Cre 不 同 ,FLP 重组 酶 属于 入 整合 酶 家 族 ,除了 协助 解 离 还 催化 倒 位 和 融合 。 在 这 些 系统 中 ,FLP-FRP 和 CreloxP 已 经 被 广泛 用 作 基 因 组 操作 和 基因 调 节 的 工具 (参见 转基因 动物 、 剔 除 小 息 )。 3 文 框 25.3 抗原 受 体 和 它们 的 基因 蛋白 免疫 球 蛋白 和 了 细胞 受 体 分 别 是 由 也 淋巴 细胞 和 工 淋 巴 细胞 合成 的 抗原 结合 蛋白 。 免 疫 球 蛋 白 可 以 作为 B 细胞 受 体 出 现在 细胞 表面 或 作为 抗体 分 泌 :两 种 分 子 都 有 基本 的 异 源 二 聚 体 结构 ,两 个 相同 的 重 链 和 两 条 相同 的 轻 链 ,由 二 硫 键 稳定 。 只 有 一 种 重 链 类 型 (IgH) ,而 存在 两 种 轻 链 类 型 (IgL k 和 IgL 》) ,其 中 任何 一 种 都 可 以 组 成 免疫 球 蛋 白 分 子 。 有 四 种 TCR 单 体 (ac BY 和 8) ,这 些 形成 两 种 类 型 的 异 源 二 聚 体 (aBTCR 和 7 STCR)。 免疫 球 蛋白 和 TCR 链 有 类 似 的 组 织 构成 ,一 个 负责 抗原 结合 的 N 端 可 变 区 (variable region) 和 负责 效应 功能 的 C 端 恒定 区 (constant region) (这些 对 所 有 给 定 亚 型 都 是 共同 的 ,无 关 抗原 的 专 一 性 ) 。 一 个 免疫 球 蛋 白 的 整个 结构 是 Y 型 的 ,这 是 因为 重 链 的 匀 链 区 域 :Y 形 又 含有 重 链 和 轻 链 的 可 变 区 和 与 抗原 结合 的 钳子 结构 。 可 变 区 包括 中 等 可 变 的 框架 区 域 (framework regions) 和 超 变 区 域 (hypervariable regions) 或 者 互补 决定 区 域 (complementarity determining regions，CDRs) ,前 者 以 正确 的 三 维 构象 与 后 者 联系 ,直接 与 抗原 相互 作用 。 有 些 不 同类 型 和 亚 类 型 的 免疫 球 蛋 白 在 免疫 系统 中 有 不 同 的 功能 ,抗体 类 型 是 由 不 变 区 的 结构 决定 的 。 不 同 的 恒定 区 也 可 以 在 TCR B 和 TCR 7 分 子 中 发 现 。 下 图 反映 了 一 般 免 疫 球 蛋白 和 7Y STCR 的 结构 ,标明 了 恒定 区 和 可 变 区 的 位 置 。 基因 哺乳 动物 免疫 球 蛋白 和 TCR 基因 是 唯一 的 在 体 细 胞 中 将 由 胚 系 提供 的 一 系列 可 选择 性 的 不 连续 的 “建筑 块 "组 合 而 成 。 所 谓 的 胚 系 构 型 (germline configuration) 是 非 功 能 的 ,基因 重 排 对 产生 功能 的 受 体 和 抗体 是 关键 的 。 每 个 分 子 的 恒定 区 是 位 于 每 个 基因 座 3` 末 端的 C 片段 决定 的 (在 免疫 球 蛋 白 基 因 座 ,C 片段 串联 排列 代表 了 每 个 亚 型 的 恒定 区 )。IgH 和 TCR 8B 和 YY 基因 的 可 变 区 是 由 三 种 类 型 的 基因 片段 组 建 的 一 一 V( 可 变 ) 片 段 ,D( 多 样 性 ) 片 段 和 本 连接 ) 片 段 。V-,D- 和 了 本 片段 排列 使 不 同 结构 的 可 变 区 可 以 通过 重组 连接 产生 。IgL 和 T 细 胞 c 和 8 基因 的 可 变 区 仅 由 V 和 了 林 片段 拼接 产生 。 各 片 段 的 性 质 和 数目 在 不 同 基因 座 不 同 ,从 小 鼠 和 人 类 基因 组 得 到 的 片段 在 下 表 中 显示 。 一 般 , 免 疫 球 蛋白 基因 相对 结构 简单 ,是 不 同 的 片段 以 同样 的 顺序 拼接 。T 细胞 受 体 有 更 复杂 的 结构 。 TCRD 基因 处 在 TCRA 基因 中 ,V 片段 混合 排列 。 另 外 ,V 片段 位 于 对 应 C 基 因 片 段 的 上 游 和 下 游 , 涉 及 下 游 V 基因 的 重 排 会 引起 大 的 反 转 。 N . 354 . 片段 的 基因 座 和 数目 ] JC 重 组 预先 决定 4 4(+1d) 1 4 JC 重 组 预先 决定 ( 陈 淳 译 ) SS 第 26 章 基本 概念 和 定义 e 复制 (replication) 可 广义 地 定义 为 基因 组 复制 ,是 细胞 基因 组 和 那些 “分 子 寄生 虫 " 一 一 病毒 .质粒 和 转 座 因子 繁殖 的 重要 步 又。 被 复制 的 基因 组 称 为 亲本 基因 组 ,而 复制 产物 是 子 代 基因 组 。 所 有 细胞 基因 组 都 是 双 链 DNA。 然 而 有 单 链 DNA 和 RNA 基因 组 的 病毒 和 其 他 遗传 元 件 也 必须 被 复制 ,传染 性 海绵 状 脑病 (参阅 ) 的 传播 媒介 被 认为 是 在 蛋白 水 平 上 的 一 种 复制 。 在 生物 化 学 水 平 上 ,复制 被 定义 为 模板 指导 的 核酸 合成 反应 ,模板 和 新 生 链 是 相 同类 型 的 核酸 。 这 与 一 条 链 是 DNA 而 另 一 条 链 是 RNA 的 转录 和 反 转 录 不 同 ( 文 框 26.1)。 双 链 DNA 的 复制 以 亲本 双 链 分 成 两 条 链 为 开始 ,每 条 作为 模板 在 一 步 加工 过 程 中 产生 两 个 一 样 的 子 代 双 链 , 称 为 直接 复制 (direct replication, 图 26.1)。 两 个 子 代 双 链 互 为 姐妹 双 链 (因此 和 象 姐 妹 染 色 单 体 交 换 一 样 称 呼 )。 然 而 ,因为 每 个 新 合成 的 链 是 与 亲本 链 互 补 ,而 不 是 与 其 完全 一 样 , 单 链 基因 组 的 复 制 必 须 通过 两 步 加 工 的 过 程 , 第 一 个 合成 反应 产生 与 亲本 链 反 义 的 中 间 体 ,中 间 体 本 身 可 以 作为 模板 产生 亲本 链 的 复制 分 子 。 这 样 称 为 非 直接 复制 ,可 以 涉及 任 何 四 种 核 苷 酸 合成 反应 (图 26.1)。 复制 是 一 个 多 聚 化 反应 ,可 以 分 成 起 始 、 延 伸 和 终止 阶段 。 延 伸 的 复制 中 心 需要 很 多 不 同 酶 活性 的 协同 作用 ,总 称 为 复制 体 。 26.1 复制 的 策略 DNA 复制 的 模型 ”细胞 DNA 的 复制 起 先 被 认为 有 两 种 模式 :全 保留 和 分 散 模 型 。 根 据 全 保留 复制 模式 ,亲本 DNA 保持 不 变 , 进 入 一 个 子 代 细胞 ,而 新 合成 的 DNA 进入 另 一 个 细胞 。 根 据 分 散 复制 模式 ,新 合成 的 DNA 和 亲 代 DNA 相间 排列 ,每 条 子 代 DNA 链 ! 接受 了 亲本 和 新 合成 DNA 的 混合 物 。 第 三 种 机 制 半 保留 复制 模型 是 由 James Watson 和 Francis Crick 根据 他 们 所 阐明 的 双 螺 旋 DNA 结构 提出 的 ,亲本 链 保持 不 变 , 但 双 链 分 成 两 半 。 每 个 亲本 链 作 为 模板 复 制 , 子 代 双 链 包含 一 条 亲本 链 和 一 条 子 代 链 。 半 保留 复制 模型 适用 于 细胞 DNA, 但 病毒 1) 此 处 应 为 DNA 方 合理 ,原文 误 写成 细胞 (cell) 。 一 一 译 者 注 天 亲 代 TITTTTTTTITIT JUUUUUUU 子 代 二 双 链 ”JU 。 双 螺 旋 解 TITTTTTTTTTTTTT 及 适 DNA 在 每 条 链 上 复 抽 TITTTTTTTTTT 3 链 TITITTIIT Tri TITTTTTTTT TITTTTT DNA 复 制 RNA 复制 (第 一 轮 ) (第 一 轮 ) 上 转录 上 反 接 录 中 间 体 JU LU LU JUUUUUUUUUUUU DNA 复 制 RNA 复制 (第 二 轮 ) (第 二 轮 ) | 反 转 录 | 大 过 了 链 TITTTTTTTTTT Tri TITTTTTTIT 下 rrTTTTTTTT 图 26.1 单 链 和 双 链 基因 组 的 复制 。 双 链 DNA 基因 组 的 复制 涉及 一 轮 DNA 复制 ,不 需要 中 间 体 。 单 链 基 因 组 的 复制 涉及 任何 类 型 的 核酸 合成 反应 ,因为 它 涉 及 中 间 体 。 黑 线 是 DNA, 白 线 是 RNA。 和 一 些 质 粒 的 单 链 基因 组 是 全 保留 复制 的 一 一 亲 本 链 的 结构 通过 复制 保持 不 变 。 [Meselson-Stahl 实验 :在 1958 年 ,Matthew Meselson 和 Franklin Stahl 证 明细 菌 染 色 体 DNA 的 复制 是 半 保 留 的 。 大 肠 杆菌 在 含 SN 的 培养 基 中 生长 ,所 以 它们 的 DNA 被 广泛 标记 上 同位 素 ( 重 DNA)。 然 后 细胞 被 转移 到 含 正 常 ”N 的 培养 基 中 ,DNA 从 经 过 一 到 两 轮 复制 的 细胞 中 分 离 出 来 。DNA 用 浮力 密度 离心 分 析 ,分 辩 重 链 DNA, 正 常 的 轻 链 DNA 和 包含 一 条 重 链 和 一 条 轻 链 的 中 间 体 DNA。 在 一 轮 复制 之 后 ,DNA 都 是 处 于 中 间 体 的 密度 中 ,而 在 两 轮 复制 后 ,有 等 量 DNA 处 于 中 间 体 和 轻 链 密度 。 这 些 结果 只 与 半 保 留 复 制 模型 相符 。 所 有 细胞 基因 组 都 是 半 保 留 复 制 的 。 在 真 核 生物 中 , 半 保 留 复制 可 以 通过 将 溴 脱氧 尿 苷 挫 人 到 染色 体 DNA 中 来 证 明 。 两 轮 复制 的 挫 人 可 以 根据 一 半 DNA 姐妹 染色 单 体 两 条 链 含 省 脱氧 尿 苷 ,而 其 他 只 在 一 条 链 含 省 脱氧 尿 苷 来 分 辨 。 染 色 单 体 的 染 色 是 不 同 的 (参见 斑 条 染色 )]。 半 保 留 复 制 Watson 和 Crick 的 DNA 复制 半 保 留 模型 预见 有 复制 叉 的 存在 ,复制 又 是 由 亲本 双 链 DNA 构成 桶 状 和 子 代 双 链 构成 手臂 的 动态 的 Y 型 结构 ,每 个 子 代 双 链 由 一 个 亲本 链 和 一 个 子 代 链 组 成 (图 26.2)。 在 复制 又 的 中 心 ,亲本 双 链 会 解 链 ,核酸 加 到 生 长 中 的 子 代 链 上 。 复 制 叉 的 存在 通过 在 复制 的 细菌 DNA 中 挫 人 放射 性 核 苷 酸 和 在 电子 显微镜 下 观察 到 中 间 体 的 结构 得 到 直接 证 明 。 然 而 这 个 模型 提出 了 以 下 的 明确 结论 : (1) 细胞 DNA 是 半 保 留 复 制 的 ; (2) 两 条 子 代 链 是 同时 延伸 的 ; (3) 亲本 双 链 是 反 平 行 的 ; (4) DNA 聚合 酶 只 以 $ 到 3 人 方 向 延伸 DNA。 当 亲 代 模 板 有 相反 的 极 性 ,两 条 子 链 在 复制 叉 如 何 同时 促进 $ -3 的 延伸 呢 ? 这 是 通过 半 保 留 复制 完成 的 ,其 中 一 条 链 连 续 延 伸 ,而 另 一 条 是 短片 段 的 集合 而 不 连续 合成 。 ”37 = DNA 复制 的 半 保 留 机 制 被 表示 成 先导 链 -后 滞 链 模式 (leading strand-lagging strand model) 。 先 导 链 (leading strand) 是 在 复制 又 移 动 方向 连续 合成 的 新 生 链 ,因为 它 的 3 末 端 暴 露 于 与 DNA 聚合 酶 。 先 导 链 的 模板 因此 是 正 向 模板 (forward template)。 后 滞 链 (lagging strand) 是 另 一 条 新 生 链 ,因为 它 的 $ 末端 方向 不 能 延伸 ,因此 是 与 复制 叉 相 反方 向 进行 不 连续 合成 的 。 后 滞 链 的 模板 因此 是 逆向 模板 (retrograde template) 。 整 个 机 制 可 以 总 结 如 下 : 当 复制 叉 向 前 移动 ,先导 链 延 伸 ,一 部 分 逆向 模板 露出 来 。DNA 聚合 酶 在 复 制 叉 前 进 的 反方 向 移动 ,合成 一 小 片段 DNA, 称 为 冈 崎 片段 (Okazaki fragment)。 之 所 以 称 为 后 滞 链 是 因为 先导 链 必 须 先 合成 以 使 后 清 链 模板 对 应 部 分 暴露 出 来 。 当 多 聚 酶 到 达 前 面 一 个 已 经 合成 好 的 冈 崎 片段 时 它 从 模板 上 解 离 下 来 ,而 这 时 另 一 部 分 的 逆向 模板 已 经 暴露 出 来 。 这 样 酶 就 重新 起 始 合成 一 新 的 囚 崎 片段 。 通 过 重复 这 样 的 “ 回 针 ”过程 ,后 滞 链 在 表面 上 是 以 3 一 5 方向 合成 的 (图 26.2)。 因 为 DNA 聚合 酶 不 能 从 头 起 始 链 的 合 成 ,每 个 囚 崎 片段 需要 独立 引发 。 解 离 -重新 结合 的 循环 因此 需要 引发 (参阅 ) 的 步骤 。 “下 TUTTITTTTTTTUTTUTTTTT 5 3 图 26.2 在 复制 叉 处 DNA 半 保 留 合成 的 模型 。 复 制 体 包 含 在 同一 位 置 起 始 的 两 个 DNA 聚合 酶 。 当 双 链 解 链 ,先导 链 的 合成 是 以 复制 又 移动 方向 延续 的 。 这 样 露出 一 部 分 后 滞 链 模板 ,第 二 个 DNA 聚 合 酶 以 复制 又 移动 的 相反 方向 合成 一 短 的 冈 崎 片段 。 当 其 到 达 前 面 的 冈 崎 片段 时 , 酶 就 解 离 而 到 其 他 模板 上 未 被 覆盖 的 起 始 位 点 。 值 得 注意 的 是 尽管 两 个 酶 的 相对 方向 是 不 同 的 ， 但 它们 不 一 定 在 物理 上 是 分 离 的 。 酶 周边 的 反 向 模板 成 环 可 获得 这 样 的 结果 。 黑 线 是 亲本 DNA, 白 线 是 先导 链 , 灰 线 是 后 滞 链 。 圆 环 代表 DNA 聚合 酶 (合成 和 多 聚 酶 的 移动 的 方向 以 小 箭 头 和 大 箭头 分 别 表示 )。 为 了 清晰 ,RNA 引物 没有 表示 出 来 。 支持 先导 链 -后 滞 链 模型 的 证 据 包括 细菌 和 真 核 生 物 复制 叉 处 复制 体 中 引发 酶 的 存 在 。 同 时 ,复制 体 都 是 不 对 称 的 ,反映 了 存在 一 先导 链 的 高 度 推进 的 DNA 聚合 酶 和 一 后 滞 链 分 步 性 的 DNA 聚合 酶 。 脉 冲 追 踪 实 验 确认 细胞 复制 中 新 生 DNA 的 50% 是 低 分 子 量 的 片段 。 5 ,六 取代 复制 ”细胞 基因 组 和 很 多 DNA 病毒 和 质粒 的 复制 是 使 用 上 述 的 半 保 留 复制 的 机 制 ,它们 子 代 两 条 链 同 时 延伸 ,需要 复制 又 。 另 一 种 双 链 DNA 复制 子 使 用 不 同 的 策略 ， 起 始 只 有 一 条 链 作为 模板 ,新 生 链 连续 延伸 取代 另 一 条 亲本 链 。 这 是 取代 复制 (displace- ment replication) ,代表 连续 合成 新 生 链 的 位 置 的 动态 结构 称 为 取代 复制 叉 (displacement fork) 。 在 很 多 这 样 的 复制 子 中 (如 质粒 ColE1) ,被 取代 的 链 最 终 作 为 不 连续 合成 的 模板 ， 而 整个 机 制 与 半 保 留 复 制 一 样 。 而 在 其 他 一 些 情况 中 (如 线粒体 DNA 和 腺 病毒 基因 组 ) ,先导 链 的 连续 合成 暴露 了 被 取代 的 亲本 链 的 第 二 个 起 始点 ,有 利于 在 相反 方向 的 连 续 合 成 。 在 这 种 情况 下 不 需要 冈 崎 片段 ,没有 后 兆 链 ; 这 样 的 过 程 定 义 为 连续 复制 (con- tinuous replication ) 。 一 种 特殊 类 型 的 取代 复制 是 通过 在 一 环 状 双 链 基因 组 中 产生 缺口 ,在 自由 的 3 末端 延伸 。 在 这 种 情况 下 , 链 的 延伸 将 取代 原先 的 亲本 链 ,通过 循环 多 次 利用 模板 连续 取代 ， 推出 多 聚 的 产物 , 它 作为 第 二 链 合 成 的 模板 。 这 种 滚 环 复 制 (rolling-circle replication ) 的 策略 在 很 多 喉 菌 体 和 格 兰 氏 阳 性 细菌 中 占 优势 。 单 链 基因 组 的 复制 ” 单 链 DNA 和 RNA 基因 组 的 复制 经 常 涉及 基因 组 反 义 [ 有 时 称 为 反 基 因 组 (antigenome) ] 的 复制 中 间 体 。 复 制 中 间 体 可 以 作为 子 代 基因 组 合成 的 直接 模 板 ,或 者 是 基因 组 和 反 基 因 组 相互 作用 形成 双 链 的 复制 型 (replicative form) ,从 而 子 代 基 因 组 通过 取代 复制 产生 。 在 逆转 录 病 毒 的 特殊 例子 中 ,一 旦 DNA 反 基 因 组 合成 完成 , 亲 本 RNA 基因 组 被 破坏 ,被 第 二 条 DNA 链 所 取代 - 子 代 基 因 组 通过 这 种 双 链 原 病毒 的 转 录 产 生 。 进 一 步 的 讨论 见 病 毒 。 26.2 细胞 复制 体 和 迁 伸 的 酶 学 复制 体 ”复制 体 (replisome, 或 称 复制 复合 物 ,中 心机 器 等 ) 是 延伸 的 复制 又 中 酶 和 其 他 蛋白 的 动态 复合 物 。 尽 管 复 制 机 制 非常 简单 ,连续 精确 的 DNA 合成 需要 很 多 酶 活性 协 同 作 用 。 超 螺旋 DNA 解 旋 需 要 极 大 的 能 量 ,在 真 核 生 物 中 ,DNA 组 织 成 染色 质 必 须 与 复 制 体 相 协调 ( 见 第 3 章 染 色 质 )。 细 胞 复制 体 的 成 分 和 功能 在 表 26.1 中 列 出 ,细菌 和 真 核 生物 复制 体 成 分 的 比较 在 表 26.10 中 。 在 起 始 时 ,复制 体 由 它 的 成 分 组 建 ,只 在 复制 又 中 发 现 其 存在 一 一 它 在 细胞 中 不 作为 一 个 独立 的 实体 存在 。 简 单 的 复制 子 可 能 需要 少量 的 复制 体 成 分 ,最 低 的 要 求 是 一 个 简单 的 聚合 酶 。 复制 缺陷 突变 ”原核 和 真 核 复制 体系 统 成 分 的 阐明 依赖 于 DNA 复制 缺陷 突变 体 的 分 离 。 复 制 是 一 非常 重要 的 过 程 ,所 以 相关 和 蛋白 经 常 是 通过 温度 敏感 的 条 件 突 变 ( 参 阅 ) 来 鉴定 。 在 细菌 中 ,复制 突变 分 成 两 类 : 快 停 和 慢 停 。 快 停 突 变 (quick-stop mutant) 当 转 移 到 不 允许 的 温度 时 ,不 能 完成 目前 一 轮 的 复制 ,可 鉴定 得 到 对 延伸 重要 的 基因 。 慢 停 突 变 (slow-stop mutant) 能 完成 这 轮 复制 ,但 不 能 再 起 始 下 一 轮 复制 ,可 鉴定 起 始 或 终止 相关 的 基因 。 有 些 基 因 同 时 是 快 停 和 慢 停 的 等 位 基因 ,因此 可 能 在 多 个 阶段 起 作用 。 有 些 是 突 变 子 等 位 基因 (参阅 ); 它 们 影响 DNA 复制 的 精确 性 或 DNA 修复 (参阅 )。 值 得 一 提 的 是 很 多 复制 缺陷 突变 体 在 DNA 代谢 的 其 他 方面 也 有 缺陷 (重组 、 修 复 、 转 录 ) ,表明 有 些 基 因 在 DNA 加 工 中 有 普遍 的 作用 。 表 26.2 提供 了 鉴定 复制 体 成 分 的 一 系列 正 . coii 复制 ”得 59 突变 体 。 表 26.1 细胞 复制 体 的 遗传 成 分 复制 体 成 分 DNA 解 旋 酶 在 复制 中 的 功能 使 复制 又 前 面 的 DNA 解 链 DNA 连接 酶 DNA 聚合 酶 DNA 引 发 酶 DNA 拓扑 异 构 酶 RNaseH 单 链 结合 蛋白 复制 体 的 特殊 成 分 。 表 26.2 一 些 屯 . coii 复制 缺陷 突变 体 和 每 个 基因 座 的 功能 基因 座 caA daB aaC DrzaE(zolC ) aaCr draN 连接 已 修复 的 后 滞 链 片段 DNA 合 成 ,后 滞 链 缺口 的 修复 。 复 制 体 可 能 含有 几 种 不 同形 式 的 DNA 聚合 酶 ,一 种 负责 先导 链 的 合成 , 另 一 种 负责 后 滞 链 的 合成 ,还 有 一 种 负责 后 滞 链 的 修复 引发 冈 崎 片段 的 合成 释放 因 解 旋 酶 的 活性 而 造成 的 扭曲 的 链 。 复 制 后 使 连接 的 环 去 链接 (参见 DNA 拓扑 学 ) 从 后 滞 链 中 去 除 RNA 引物 稳定 复制 叉 的 单 链 区 域 。 可 能 与 复制 体 其 他 成 分 相互 作用 促进 其 活性 拓扑 异 构 酶 在 复制 又 处 没有 被 发 现 ,但 在 扭曲 浓缩 DNA 的 复制 中 是 不 可 缺少 的 。 见 表 26.10 中 细菌 和 真 核 生 物 表 型 慢 停 快 停 快 停 和 慢 停 等 位 基因 快 停 快 停 快 停 快 停 和 突变 子 等 位 基因 慢 停 快 停 快 停 与 慢 停 等 位 基因 快 停 与 慢 停 等 位 基因 修复 缺陷 致死 (不 是 条 件 性 ) 修复 缺陷 稳定 复制 快 停 无 无 功能 起 始 蛋 白 解 旋 酶 与 DnaB 解 旋 酶 形成 复合 物 , 辅助 起 始 位 点 的 定位 多 聚 酶 III 全 酶 的 亚 基 引发 酶 多 聚 酶 III 全 酶 的 B 亚 基 多 育 酶 III 全 酶 的 e 亚 基 引发 体 成 分 多 聚 酶 III 全 酶 的 Y 和 亚 基 DNA 回旋 酶 亚 基 DNA 回旋 酶 亚 基 B DNA 连接 酶 复制 起 点 DNA 聚合 酶 I RNase H 单 链 结合 蛋白 复制 终止 终止 蛋白 此 表 列 出 了 那些 在 复制 叉 或 起 始终 止 中 起 作用 的 顺 式 作用 元 件 和 基因 。 影 响 DNA 代谢 或 噬菌体 或 病毒 基因 组 复制 能 力 的 基因 没有 列 出 。 DNA 聚合 酶 在 DNA 模 板 上 催化 DNA 合 成 的 酶 是 DNA 事 合 酶 。 它 们 在 细胞 中 行使 两 个 基本 功能 :基因 组 复制 时 的 DNA 合成 和 损伤 或 重组 后 (以 及 后 滞 链 引物 切除 后 ) 缺 少 的 DNA 的 重新 合成 。 在 原核 和 真 核 生 物 中 ,特定 的 DNA 聚合 酶 致力 于 复制 和 修复 功 能 ,前 者 有 时 称 为 DNA 复制 酶 (DNA replicases)。 所 有 的 DNA 聚合 酶 都 有 5 一 ~3“ 多 事 酶 活性 和 焦 磷酸 化 酶 活性 ,都 促进 DNA 合成 。 与 RNA 聚合 酶 不 同 的 是 ,DNA 聚合 酶 不 能 “0 ” 从 头 起 始 链 的 合成 ,需要 引物 。 大 多 数 DNA 聚合 酶 也 有 进一步 的 内 在 活性 ( 表 26.3)。 最 重要 的 是 3 一 5 外 切 酶 活性 ,是 校正 功能 的 基础 ( 见 诱 变 和 DNA 修复 中 复制 保 真 度 的 有 关 讨 论 )。 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 ”大肠 杆菌 基因 组 编码 三 个 DNA 聚合 酶 (DNA 聚合 酶 工 , 工 和 亚 ,或 者 表示 为 pol I ,pol 工 和 pol 焉 )。 这 些 酶 的 性 质 在 表 26.4 中 总 结 。pol 工 和 pol 开 是 单 链 多 肽 ,其 基本 功能 似乎 与 DNA 修复 有 关 。pol 工 ( 也 称 为 Kornberg 多 聚 酶 ) 是 细 胞 中 主要 的 聚合 酶 ,有 独特 的 $ 一 3 外 切 酶 活性 ,这 种 活性 可 以 在 体内 修复 合成 中 帮助 从 后 滞 链 切除 引物 (参见 缺口 平移 )。 尽 管 所 有 的 pol I 酶 活性 存在 于 109kDa 的 单一 多 肽 链 中 ,每 一 种 酶 活性 都 是 从 特定 的 结构 域 中 产生 的 ,蛋白 酶 前 切 可 以 产生 一 个 大 的 C 末 端 片段 (Klenow 片段 ,Klenow 多 聚 酶 ) , 它 缺 乏 $ 一 3 外 切 酶 活性 ,在 体外 不 希望 前 切 的 实验 操作 中 非常 有 用 (参见 随机 标记 、 体 外 突变 )。Klenow 聚合 酶 是 通过 表达 截断 的 to/ A 基因 生产 的 。 表 26.3 ”DNA 聚合 酶 相关 的 内 在 酶 活性 DNA 聚合 酶 活性 功能 DNA 聚合 酶 活性 功能 所 有 DNA 聚合 酶 的 活性 有 些 DNA 聚合 酶 相关 活性 模板 结合 活性 底 物 识 别 3 一 $ 外 切 酶 活性 校正 核 苷 酸 结合 活性 底 物 识别 5 一 3 “外 切 酶 活性 引物 切除 和 修复 5 一 3 多 聚 酶 活性 DNA 合成 引发 酶 活性 引物 合成 焦 磷 酸 酶 活性 DNA 合 成 表 26.4 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 性 质 的 比较 聚合 酶 I 聚合 酶 机 聚合 酶 开 5 一 3' 多 聚 酶 。/ 区 V 3…5' 外 切 酶 则 细 5-3' 外 切 酶 。 x 大 肠 杆菌 基因 oA po0B AR 2 功能 基本 的 修复 聚合 酶 和 引物 切除 “错误 倾向 修复 聚合 酶 (SOS 诱导 ) 基本 的 复制 聚合 本 pol 开 是 细胞 正常 生长 中 一 种 次 要 成 分 ,被 SOS 反应 (参阅 ) 所 诱导 。 它 似乎 允许 核 苷 酸 失 人 AP 位 点 的 对 面 (参阅 ) ,也 就 是 说 , 阻 断 pol 工 和 pol 下 的 损伤 处 一 一 因此 有 利 于 反 损 伤 合成 (translesion synthesis， 人 参阅 )。 大 肠 杆菌 的 基本 DNA 聚合 酶 是 pol 亚 , 它 与 其 他 酶 不 同 , 是 多 亚 基 复 合 物 , 称 为 pol 下 全 酶 ( 表 26.5)。 全 酶 在 复制 叉 上 以 异 源 复合 体 发 挥 功能 ,每 个 单 体 看 来 与 一 子 代 链 的 合成 有 关 。 在 体外 ,ae 和 6 亚 基 组 成 核心 酶 ,包含 主要 的 酶 活性 。 其 他 亚 基 的 添加 促进 二 聚 化 和 增加 了 酶 活性 。 体 内 全 酶 的 组 建 是 这 样 的 :8B 亚 基 以 二 聚 体 发 挥 功能 ,形成 一 个 环 或 夹 可 以 沿 单 链 DNA 滑动 。 这 是 推移 因子 ,使 核心 酶 附着 在 模板 上 。8B 亚 基 通 过 7y 复 合 物 定位 在 模板 -引物 上 ,这 是 一 个 依赖 AIP 的 过 程 ,形成 起 始 前 复合 物 .8B 亚 基 的 定位 使 6 和 LE 。 表 26.5 ”大肠 杆菌 pol III 全 酶 的 亚 基 和 推测 的 功能 亚 基 基因 性 质 和 推测 的 功能 核心 亚 基 a dmnaE(zol C) 5 一 3“ 多 聚 酶 活性 ,DNA 合成 所 需 E anaQ(zzxutD ) 3 一 5 外 切 酶 活性 ,校正 所 需 6 未 鉴定 功能 不 确定 ,可 能 帮助 其 他 亚 基 的 组 建 附属 亚 基 r caX DNA 依赖 的 ATP 酶 ,起 始 所 需 , 促 进 二 聚 化 与 四 个 多 肽 ( 见 下 ) 相 结合 形成 DNA 依赖 的 ATP 酶 , 称 为 7 复合 y 物 ,起 始 所 需 ,帮助 B 的 结合 3,3 ，X 由 未 鉴定 与 了 结合 形成 Y 复合 物 ( 见 上 ) B anaN 增加 全 酶 进行 性 的 “滑动 严 "。8B 与 DNA 结合 形成 起 始 前 复合 物 ,这 一 过 程 需要 依赖 ATP 的 yY 复合 物 的 活性 , draN 被 SOS 反应 ( 参 阅 ) 所 诱导 核心 酶 能 够 结合 ,z 亚 基 的 添加 有 利于 二 聚 化 。 完 整 全 酶 的 结构 在 图 26.3 中 表示 。 全 酶 除了 Y 复合 物 外 是 对 称 的 ,7 复合 物 只 与 一 个 单 体 结合 。B 亚 基 在 DNA 上 定位 和 解 离 都 需要 7 复合 物 ,因此 7Y 复合 物 控 制 了 酶 的 进行 性 。 当 聚合 酶 遇 到 逆向 模板 上 前 面 合成 的 囚 崎 片段 时 ,7 复合 物 的 存在 允许 B 亚 基 从 模板 引物 上 解 离 。 这 样 当 核心 酶 完成 了 冈 崎 片段 ,将 从 后 滞 链 的 全 酶 中 释放 出 来 ,与 下 一 个 由 DNA 引发 酶 提供 的 模板 引物 的 起 始 前 复合 物 结合 。 图 26.3 大 肠 杆菌 pol III 异 源 二 聚 体 的 组 建 刺激 先 导 链 和 后 滞 链 的 合成 。 其 他 细菌 的 DNA 聚合 酶 类 似 于 大 肠 杆菌 的 聚合 酶 ,事实 上 ,所 有 的 DNA 聚合 酶 可 以 根据 六 个 保守 结构 域 的 结构 分 类 。 最 值得 注意 的 多 聚 酶 是 嗜 热 的 和 嗜 温 热 的 原核 生 物 ,它们 可 以 在 高 于 100 时 催化 合成 DNA, 大 大 超过 DNA 的 T, 值 。 在 这 样 的 生物 中 ， DNA 的 解 链 可 能 是 被 动 发 生 的 ,但 聚合 酶 必须 有 将 引物 固定 在 模板 上 的 能 力 以 延伸 它 。 Taq DNA 聚合 酶 起 先是 从 栖 热 菌 属 ( Thermzs aqxwaticws ) 中 提取 得 到 的 ,被 广泛 用 于 聚合 酶 链 式 反应 (参阅 ) , 它 通 过 在 大 肠 杆菌 中 的 过 量 表达 进行 商业 化 生产 。 它 与 大 肠 杆菌 s pol 工 同 源 ,但 它 缺 乏 3 一 5 外 切 酶 活性 ,不 能 进行 校正 。 其 他 耐 温 的 DNA 聚合 酶 有 校正 活性 (如 从 Pywrococcws fuxrosxs 得 到 的 Pfu 多 聚 酶 )。 真 核 生物 DNA 聚合 酶 ”” 真 核 细胞 含有 四 种 细胞 核 DNA 聚合 酶 和 第 五 种 负责 细胞 器 基因 组 复制 的 多 聚 酶 ( 表 26.6)。 细 胞 核 酶 是 DNA 事 合 酶 \B`.3 和 se。DNA 聚合 酶 cc 和 负责 染色 体 复制 。DNA 聚合 酶 有 相关 的 引发 酶 活性 ,但 没有 3 一 5 外 切 酶 活性 ,而 DNA 聚合 酶 》 有 校正 功能 。DNA 聚合 酶 $ 与 称 为 增殖 细胞 核 抗 原 (proliferating cell nu- clear antigen，PCNA) 的 辅助 因子 结合 ,PCNA 是 与 大 肠 杆菌 聚 合 酶 III 的 B 亚 基 类 似 的 细 胞 周期 依赖 蛋白 , 它 以 滑动 环 的 方式 增加 酶 的 进行 性 。DNA 聚合 酶 8 合成 先导 链 和 后 消 链 。DNA 聚合 酶 w 的 功能 是 在 后 滞 链 上 延伸 RNA 引 物 ,为 复制 因子 C(RF-C) 提 供 模板 ， RF-C 的 功能 可 能 类 似 于 大 肠 杆 菌 y 复合 物 , 即 DNA 聚合 酶 的 定位 和 控制 后 滞 链 上 复制 的 进行 性 。DNA 聚合 酶 s 的 功能 还 不 清楚 。 它 的 结构 类 似 于 DNA 聚合 酶 》, 但 不 与 PCNA 结 合 。 它 可 能 在 复制 又 上 发 挥 作 用 ,或 者 像 DNA 聚合 酶 B 一 样 涉及 DNA 的 修复 。 B 是 五 个 酶 中 最 小 的 酶 ,其 保 真 度 和 进行 性 是 最 低 的 。DNA 聚合 酶 Y( 类 似 于 大 肠 杆 菌 pol IJ) 负责 线粒体 DNA 的 复制 ,类似 的 酶 从 植物 叶绿体 中 也 分 离 得 到 。 表 26.6 ” 真 核 生物 DNA 聚合 酶 的 性 质 和 可 能 的 功能 哺乳 动物 中 的 名 称 a. B 7 8 E 酵母 中 的 名 称 poll pol4 PolM pol3 pol2 酵母 基因 POL1 POL4 MIPI1 POL3 POL2 定位 细胞 核 细胞 核 线粒体 细胞 核 细胞 核 亚 基 数目 4 2 2 > 于 5 一 3 多 聚 酶 V/ V/ V/ V/ V/ 3 一 5 外 切 酶 久 XX V/ V/ V/ 引发 酶 、/ XX X 及 X 相关 因子 没有 没有 没有 PCNA 没有 进行 性 中 等 低 高 有 PCNA 时 高 高 功能 后 滞 链 引发 修复 聚合 酶 细胞 器 聚合 酶 基本 复制 聚合 酶 ”不 清楚 DNA 引发 酶 ” DNA 引发 酶 (DNA primase) 是 在 DNA 合成 中 合成 RNA 引物 (参阅 ) 的 酶 (它们 可 以 用 NTPs 和 dNTPs 作为 底 物 ,经 常 合成 混合 引物 )。 引 发 酶 行使 两 个 功能 。 首先 是 它们 在 起 点 处 起 始 先导 链 的 合成 (这 需要 进行 一 次 ); 第 二 是 它们 在 延伸 中 帮助 内 崎 片段 的 反复 起 始 。 对 细胞 基因 组 ,两 种 功能 使 用 同样 的 引发 策略 ( 见 下面 的 引物 和 引发 部 分 ) 。 在 大 肠 杆 菌 中 ,DNA 引发 酶 是 dwraG 基因 座 编码 的 。 对 oriC 型 复制 子 的 复制 (如 染 色 体 本 身 ) ,引发 酶 的 有 效 引 发 活性 依赖 于 Dna B 解 旋 酶 。 引 发 酶 和 解 旋 酶 形成 功能 复合 物 , 称 为 引发 体 (primesome) 。 叭 菌 体 复制 子 有 不 同 的 引发 酶 要 求 。 喉 菌 体 G4 的 复制 起 点 被 引发 酶 直接 识别 ,但 没有 引发 体 。 冬 型 复制 子 ( 如 鸣 菌 体 几 174) 需 要 复杂 的 引发 体 , 它 含有 6 个 预 引发 蛋白 :DnaB( 解 旋 酶 ) ,DnaC,DnaT,PriA,PriB 和 PriC。PriA 为 起 点 (或 者 是 引发 体 装配 位 点 ,pas) 识 别 所 必需 ,但 PriB 和 PriC 和 DnaT 的 功能 还 不 清楚 。 这 些 因 子 组 建 形 成 预 引发 体 ,被 DnaG 引发 酶 识别 。 在 两 类 起 点 中 ,引发 体 是 可 移动 的 复合 “363 物 , 以 ATP 依赖 的 方式 沿 复制 又 运动 方向 在 DNA 上 移动 (也 就 是 说 与 后 滞 链 合成 的 方向 相反 ) ,设置 每 个 冈 崎 片段 的 RNA 引物。 在 真 核 生 物 中 ,两 个 与 DNA 聚合 酶 "结合 的 多 肽 有 引发 酶 活性 。 这 是 真 核 和 细菌 引 发 体 的 基本 差别 ,也 就 是 说 大 肠 杆菌 的 单个 基本 的 复制 DNA 聚合 酶 (pol 亚 ) 延 伸 两 条 链 ,而 在 真 核 生 物 中 不 同 的 酶 在 后 滞 链 上 延伸 引物 ,只 有 它 需要 与 引发 酶 结合 。 细 胞 引发 酶 和 解 旋 酶 可 相互 作用 ,但 它们 是 不 同 的 酶 。 然而 , 几 种 真 核 病毒 编码 的 蛋白 同时 有 解放 酶 和 引发 酶 活性 。 DNA 解 旋 酶 “ DNA 解 旋 酶 (DNA helicases) 是 沿 单 链 DNA 移动 的 酶 , 它 利 用 ATP 水解 得 到 的 能 量 打 断 氢 键 ,分 离 双 链 分 子 。 解 旋 酶 是 很 多 细胞 过 程 所 要 求 (参见 如 核 苦 酸 切除 修复 、 同 源 重 组 、 转 录 终 止 . 接 合 Ti 质粒 ) ,也 是 复制 过 程 中 提供 单 链 模板 所 必需 的 一 一 它们 是 进入 复制 体 的 第 一 个 成 分 。 解 旋 酶 经 常 只 沿 DNA 一 个 方向 移动 ,可 根据 它们 5 一 3 或 3 一 5 的 极 性 分 类 。 在 拓扑 学 上 扭转 DNA 中 、 解 旋 酶 和 拓扑 异 构 酶 协同 作用 释 放 扭 曲 的 链 。 有 些 细 菌 和 真 核 复制 解 旋 酶 的 性 质 在 表 26.7 中 列 出 。 表 26.7 复制 解 旋 酶 和 它们 的 功能 解 旋 酶 极 性 和 功能 细菌 复制 解 旋 酶 DnaB 蛋白 5 一 3 极 性 。 大 肠 杆菌 中 染色 体 复 制 主要 的 解 旋 酶 ;dnaB 有 快 停 表 型 ( 表 26.2) ,并 且 是 体 外 系统 中 唯一 需要 的 解 旋 酶 PriA 蛋白 (mn ,Y) 3 一 5 极 性 。 引 发 体 的 成 分 Rep 3 一 5 极 性 。 滚 环 复制 必需 。 在 细胞 复制 中 的 作用 不 清楚 真 核 复 制 解 旋 酶 * DNA 解 旋 酶 A 从 酵母 和 小 牛 胸腺 中 提取 。 与 DNA 聚合 酶 :引发 酶 一 起 纯化 DNA 解 旋 酶 》 5 一 3' 极 性 。 与 DNA 聚合 酶 8 共 纯 化 DNA 解 旋 酶 下 3 人 一 $ 极 性 。 与 DNA 聚合 酶 s 共 纯化 RF-A 相关 解 旋 酶 从 不 同 物种 中 得 到 的 几 个 酶 ,或 者 是 与 RF-A 共 纯化 ,或 者 被 其 促进 RF-C 相关 解 旋 酶 与 复制 因子 C 共 纯化 在 细菌 中 ,复制 和 其 他 解 旋 酶 的 功能 研究 得 较 清 楚 。 在 真 核 生物 中 ,发 现 有 多 于 30 种 解 旋 酶 活性 ,并 且 在 酵母 基 因 组 序列 中 还 有 另外 的 假定 的 解 旋 酶 ,但 只 有 少数 功能 被 精确 描述 。 a 与 复制 蛋白 共 纯化 的 解 旋 酶 。 DNA 拓扑 异 构 酶 DNA 拓扑 异 构 酶 是 催化 DNA 拓扑 异 构 体 (DNA 不 同 的 拓扑 异 构 形式 , 见 第 16 章 核酸 结构 : 文 框 16.2) 相 互 转换 的 酶 ,在 复制 中 需要 它们 释放 解 旋 酶 解 链 产生 的 扭曲 的 张力 ;它们 在 转录 和 重组 中 行使 类 似 的 功能 。 它 们 也 去 除 和 解 离 复制 和 重 组 中 产生 的 节 和 环 ( 中 间 阻 断 环 ) 。 在 大 肠 杆菌 中 ,很 多 涉及 核酸 (包括 复制 ,转录 、 同 源 重 组 和 可 移动 元 件 的 转 座 ) 的 反应 是 倾向 于 负 超 螺旋 的 (参阅 )。 在 真 核 生 物 中 拓扑 异 构 酶 是 细胞 核 骨架 的 一 部 分 ,有 利于 将 DNA 组 织 成 功能 结构 域 ( 见 第 3 章 染 色 质 ); 它 们 在 有 丝 分 裂 中 姐妹 染色 体 的 分 离 中 也 起 主要 作用 。 拓扑 异 构 酶 可 以 分 成 两 类 功能 类 型 ( 表 26.8) ,其 差别 主要 在 于 反应 的 机 理 : I 型 拓 扑 异 构 酶 只 前 切 一 条 链 ,因此 只 能 连接 /去 连接 含有 缺口 的 底 物 ; T 型 拓扑 异 构 酶 可 以 同 时 前 切 两 条 链 ， 因 此 可 以 连接 /去 连接 共 价 闭环 链 。 大 多 数 拓 扑 异 构 酶 催化 超 螺旋 的 释 。， 364 。 表 26.8 大肠 杆菌 和 真 核 拓 扑 异 构 酶 I 型 拓扑 异 构 酶 型 拓扑 异 构 酶 剪 切 一 条 链 二 条 链 AL 1 步 2 步 机 制 “， 酶 非 共 价 与 DNA 结合 。 一 条 链 被 前 切 ,3' 磷 酸 “ 酶 非 共 价 与 DNA 结合 。 两 条 链 都 被 前 切 ,5 克 基 团 共 价 与 活性 位 点 的 酷 氨 酸 残 基 结 合 。 完 “ 酸 基 团 共 价 与 活性 位 点 的 酷 氨 酸 残 基 结 合 (这 整 的 链 从 缺口 处 通过 。 打 断 的 链 重新 连接 。 涉及 对 回旋 酶 和 真 核 拓 扑 异 构 酶 开 有 4bp 交 错 )。 一 完整 的 双 链 从 缺口 通过 (通过 包括 ATP 结合 的 构象 改变 而 得 以 进行 )。 打 断 的 双 链 重 新 连接 ,DNA 释放 。 需要 ATP 不 是 大 肠 杆 菌 topo 工 (o 和 蛋白 ) 回旋 酶 (topo I )。 诱 导 负 超 螺旋 topo 焉 topo JW 。 去 连接 连锁 的 环 释放 负 超 螺旋 真 核 拓扑 异 构 酶 工 。 释 放 正和 负 超 螺旋 拓扑 异 构 酶 开 。 释 放 正 和 负 超 螺旋 四 释放 负 超 螺旋 ( 弱 活 性 ) ,不 去 连 人 释放 负 超 螺旋 ,可 能 也 能 释放 正 AL ,连接 数 的 改变 (参阅 ) 放 , 但 不 能 在 松弛 的 DNA 中 引入 超 螺旋 。 大 肠 杆 菌 DNA 回旋 酶 (DNA gyrase) 是 个 例 外 , 它 可 以 产生 负 的 超 螺旋 ,从 硫化 裂片 菌 属 (Svwzjolopus acidocaldarius ) 中 分 离 的 反 回 旋 酶 (reverse gyrase) 可 以 产生 正 的 超 螺旋 。 回 旋 酶 的 作用 似乎 是 维持 DNA 处 于 能 量 有 利 的 状态 。 反 回旋 酶 的 功能 更 不 清楚 , 它 可 能 与 在 S. acidocaldarixs (参见 耐 温 多 聚 酶 ) 生活 的 高 温 环境 中 维持 染色 体 双 链 构 象 有 关 。 单 链 结合 蛋白 ” 单 链 结合 蛋白 (SSBs) 是 缺乏 酶 活性 的 复制 辅助 蛋白 ,但 是 复制 体 其 他 酶 有 效 活 性 所 必需 的 ( 表 26.9)。SSBs 在 细胞 内 行使 很 多 涉及 单 链 区 域 稳定 性 的 功能 (如 同 源 重 组 ,也 见 hnRNP 有 蛋白 )。 在 复制 中 ,这 包括 稳定 熔 解 起 点 ,维持 螺旋 酶 的 活性 ,从 DNA 模板 上 去 除 二 级 结构 (参见 框架 移动 保 真 度 ) 和 抑制 核酸 酶 活性 。SSBs 对 单 链 DNA 有 很 高 的 亲 和 性 ,但 对 双 链 DNA 和 RNA 没有 亲和力 。 它 们 与 DNA 协同 作用 ,将 DNA 包 被 上 蛋白 聚合 体 。 它 有 某 些 碱 基 组 成 的 倾向 性 ,但 很 少 有 顺序 专 一 性 结合 。 表 26.9 大 肠 杆 菌 和 真 核 生物 单 链 DNA 结合 蛋白 的 性 质 大 肠 杆菌 真 核 生 物 蛋白 SSB( 单 链 结合 蛋白 ) RP-A( 复 制 蛋 白 A) 或 HSSB( 人 SSB) 结构 19KkDa 亚 基 的 同 源 四 聚 体 70kDa,30kDa 和 1SkDa 亚 基 的 异 源 三 聚 体 功能 ”复制 .重组 和 修复 中 稳定 单 链 区 域 MI13 相关 基因 组 起 点 直接 引发 在 引发 体 复 合 物 中 与 PriB 相 结合 (可 能 有 引发 功 能 ) 在 复制 、 重 组 和 修复 中 稳定 单 链 区 域 与 pol 相互 作用 :引发 酶 阻 断 非特 异性 引发 事件 与 转录 因子 修复 蛋 白 XP-A 和 几 种 解 旋 酶 相互 作 用 (在 转录 和 修复 中 可 能 有 特定 的 作用 ) 性 质 ”ssDNA 专 一 性 ,但 没有 顺序 特异 性 。 协 同 结合 ssSDNA 专 一 性 ,部 分 顺序 专 一 性 。 活 性 通过 磷酸 化 调节 基因 ss RPAT ,RPA2 ,RP-A3 ”368。 SSBs 也 直接 与 复制 体 的 不 同 成 分 相互 作用 以 刺激 它们 的 活性 。 在 大 肠 杆 菌 和 真 核 生物 中 ,SSB 与 引发 酶 或 引发 体 的 成 分 相互 作用 将 促进 特定 的 引发 活性 。 大 肠 杆 菌 SSB 也 可 通过 覆盖 除 复制 起 点 外 的 单 链 基因 组 所 有 位 置 , 指 导 其 引发 ,复制 起 点 位 置 是 以 发 夹 的 二 级 结构 为 特征 的 。 噬 菌 体 T4 和 T7 编码 的 SSBs 直接 刺激 鸣 菌 体 编 码 DNA 聚合 酶 的 活性 。 核酸 酶 ”核酸 酶 (nucleases) 是 通过 水 解 磷酸 二 酯 键 消 化 核酸 的 酶 。 核 酸 酶 如 果 底 物 是 DNA 就 是 脱氧 核糖 核酸 酶 (DNase) ,如 果 底 物 是 RNA 就 是 核糖 核酸 酶 (RNase)。 外 切 核 酸 酶 需要 游离 的 末端 ,逐步 消化 分 子 ,而 内 切 核 酸 酶 能 够 水 解 内 部 磷酸 二 酯 键 , 可 以 将 共 价 闭 环 的 模板 作为 底 物 。 切 除 核酸 酶 帮助 释放 寡 核 苷 酸 片段 。 核 酸 酶 在 它们 的 底 物 专 一 性 上 变化 很 大 。 外 切 酶 可 以 是 单 链 或 双 链 专 一 性 的 ,可 以 有 特定 的 极 性 ,可 以 需要 特定 末 端 结构 起 始 消化 。 内 切 酶 也 可 以 有 单 链 或 双 链 底 物 倾向 性 ,可 以 有 不 同 程度 的 顺序 专 一 性 ;切口 酶 (nickase) 是 剪 切 双 链 中 一 条 链 的 内 切 酶 。 核 酸 酶 在 很 多 系统 中 起 重要 作用 ( 参 见 限制 性 内 切 酶 \UvrABC 核酸 酶 .RecBCD 核酸 酶 \ 反 转录 病毒 。 接 合 .cDNA 合成、 重组 DNA、RNA 加 工 、 转 座 酶 .整合 酶 、 核 酶 .剪接 体 )。 在 复制 中 需要 几 种 来 源 的 核酸 酶 活性 。 一 般 情况 下 ,通过 DNases 和 RNases 回收 的 核 苷 酸 为 复制 和 转录 提供 了 底 物 (补救 途径 ,salvage pathways) ,控制 这 些 途径 的 基因 突变 产生 快 停 的 表 型 (参阅 )。 在 复制 中 需要 三 个 特定 的 核酸 酶 活性 。 校 正 需要 3 一 外 切 酶 活性 ,这 是 DNA 聚合 酶 的 内 在 活性 ( 见 上 文 )。 引 物 的 去 除 需 要 RNaseH (从 DNA:RNA 杂交 链 上 特异 性 消化 RNA 链 的 酶 ) 和 一 个 $ 一 3 外 切 酶 活性 的 组 合 。 在 大 肠 杆菌 中 ,后 者 是 基本 修复 酶 DNA 聚合 酶 I 的 内 在 活性 ,而 在 真 核 生 物 中 , 它 是 由 外 切 酶 MF-1 提 供 。RNaseH 在 大 肠 杆 菌 中 不 足以 去 除 引 物 ,在 真 核 生 物 中 推测 也 是 如 此 ,因为 它 不 能 剪 切 连接 核糖 核酸 和 脱氧 核糖 核酸 的 磷 酯 键 。RNaseH 消化 引物 因此 至 少 留 下 一 个 核糖 核 苷 酸 残 基 附 着 在 办 崎 片段 上 ,并 且 由 于 DNA 引 发 酶 对 脱氧 核糖 核酸 和 核糖 核酸 的 混用 ， 因此 可 能 有 几 个 内 部 的 核糖 核酸 残 基 需 要 被 去 除 。RNaseH 也 加 工 ColE 质粒 复制 的 先 导 链 引物 ( 见 第 20 章 质 粒 )。 DNA 连接 酶 ” DNA 连接 酶 是 在 双 链 DNA 中 催化 相 邻 核 苷 酸 形成 磷酸 二 酯 键 的 酶 。 它 要 求 5 的 核 苷 酸 必须 有 完整 的 磷酸 基 团 而 3 ` 核 苷 酸 必 须 有 完整 的 羟基 。 在 细菌 中 ， DNA 连接 酶 需要 NAD 辅助 因子 ,而 在 真 核 生 物 和 古 细菌 中 , 连接 酶 需要 ATP。 无 论 是 何 种 情况 ,辅助 因子 提供 了 与 酶 活性 位 点 共 价 结合 的 腺 苷 基 团 。 然 后 这 个 基 团 转移 到 3 核 苷 酸 上 ,接着 被 邻近 核 苷 酸 的 3 羟基 进攻 形成 磷酸 二 酯 键 。DNA 连接 酶 控制 所 有 DNA 修复 途径 的 最 后 阶段 , 即 双 链 DNA 中 一 条 链 的 缺口 修复 。 哺 乳 动物 似乎 至 少 有 四 种 连 接 酶 活性 ,DNA 连接 酶 I 是 涉及 后 清 链 修复 的 基本 酶 (参见 噬菌体 T4 DNA 连接 酶 )。 细菌 和 真 核 细胞 复制 体 的 比较 ”细菌 和 真 核 复制 体 在 结构 和 功能 上 存在 着 重要 的 平行 关系 :它们 不 对 称 的 结构 、 存 在 高 进行 性 的 聚合 酶 和 分 步 进行 的 聚合 酶 分 别 合成 先导 链 和 后 清 链 ,以 及 类 似 的 酶 学 性 质 。 它 们 也 存在 重要 的 区 别 ,如 后 滞 链 引发 和 修复 的 策略 。 这 些 策略 的 比较 见 表 26.10。 细 菌 和 真 核 生物 在 细胞 分 裂 周期 中 DNA 复制 的 组 织 也 存在 着 显著 的 差异 一 一 讨论 见 细胞 周期 。 "366 。 表 26.10 细菌 和 真 核 复制 体 的 成 分 和 性 质 复制 体 性 质 / 成 分 细菌 真 核 生 物 一 般 性 质 的 比较 复制 起 点 单个 很 多 延伸 速度 100kbp min 1 2 kbp min 1! 冈 崎 片段 1 一 2kbp 100 一 200bp 引发 策略 引发 酶 产生 引物 ,由 pol 亚 延 伸 引物 酶 产生 引物 ,由 pol 延伸 ,由 pol 8 完成 复制 多 育 酶 有 不 同 进行 性 单 体 的 异 源 二 聚 体 每 条 链 有 不 同 的 酶 ,有 不 同 的 进行 性 拓扑 学 松弛 和 卷曲 之 问 存在 平衡, 净 负 超 螺旋 疙 可 在 让 人 生生 复制 体 成 分 的 比较 复制 多 聚 酶 pol 焉 全 酶 pol 8S。pol a 进行 性 因子 B 亚 基 PCNA 定位 因子 7Y 复 合 物 RF-C 引发 酶 DnaG pola: 引 发 酶 解 旋 酶 DnaB( 定 位 需要 DnaC) ? 几 个 候选 者 引物 去 除 RNaseH 和 pol 工 RNaseH!L 和 MF - !1 核酸 酶 后 滞 链 修复 pol 工 和 DNA 连接 酶 polSpols 和 DNA 连接 酶 I 拓扑 异 构 酶 DNA 回旋 酶 topo 工 单 链 结合 SSB RF-A 26.3 复制 的 起 始 起 始 的 一 般 原则 基因 组 复制 开始 于 一 个 或 多 个 顺 式 作用 位 点 , 称 为 复制 起 始点 (简单 地 称 为 起 点 )。 它 们 通过 提供 复制 所 需 蛋 白 因子 和 酶 的 装配 位 置 而 增加 起 始 的 效率 ,否则 这 些 因 子 和 酶 将 随机 与 DNA 结合 。 在 起 始 的 静态 蛋白 集合 称 为 起 始 体 (orisome) , 当 它 开始 从 起 点 移动 时 成 为 复制 体 。 起 点 也 提供 复制 调节 的 靶 位 点 ,因此 起 始 是 复制 调节 的 主要 阶段 。 复 制 起 始 被 起 始 因子 所 控制 ,但 也 可 以 受 其 他 蛋白 和 DNA 本 身 的 性 质 影响 。 起 点 可 以 通过 用 电镜 检查 标记 的 复制 中 间 体 ,通过 标记 和 分 离 标记 新 生 DNA 链 或 者 通 过 双向 电泳 分 离 DNA 结构 来 鉴定 其 物理 位 置 ( 文 框 26.2)。 与 很 多 其 他 顺 式 作用 元 件 一 样 , 起 点 可 以 通过 体外 诱 变 ( 人 参阅) 功能 性 作 图 。 在 细菌 染色 体 、 病 毒 基因 组 和 质粒 中 ,单个 起 点 被 用 来 起 始 复制 "。 这 样 的 元 件 构成 了 单个 复制 子 (replicon) ,定义 为 在 保守 序列 控制 下 的 复制 单位 。 更 大 的 真 核 生物 染 色 体 有 多 个 起 点 ,可 以 被 看 成 是 复制 子 的 串联 排列 。 起 点 的 性 质 和 起 始 的 策略 ”复制 模型 ( 表 26.11) 依 赖 于 起 点 的 性 质 和 分 布 及 其 起 始 策 略 。 在 双 链 DNA 基因 组 中 ,起 点 是 双 链 开始 解 链 的 位 置 。 在 大 多 数 情 况 下 , 随 着 引物 合 @ 很 多 质粒 和 病毒 可 以 有 几 个 选择 性 的 起 点 ,但 只 有 一 个 在 复制 循环 使 用 。 连 续 复制 的 双 链 DNA 基因 组 (如 线 粒 体 DNA) 有 两 个 起 点 ,每 条 链 上 一 个 ,可 以 看 成 两 个 复制 子 。 "368 表 26.11 复制 模型 ,反映 了 起 点 定位 和 解 旋 酶 定位 的 性 质 复制 模型 机 制 举例 半 保 留 复制 机 制 偶 联 双向 的 解 旋 酶 定位 到 两 条 链 , 组 建 两 个 复制 复合 物 oriC 序列 双向 的 一 解 旋 酶 定位 于 起 始 位 置 ,促进 单 向 复制 直到 第 二 个 引发 位 置 暴露 出 来 ， R6K 质粒 开始 相反 方向 的 复制 单 向 的 起 点 只 有 一 个 解 旋 酶 定位 ,不 连续 合成 链 ,在 起 点 处 终止 ColE1 质粒 取代 机 制 单 向 取代 在 解 旋 酶 定位 前 起 点 熔 解 ,并 被 内 切 酶 剪 切 了 pT181 成 而 发 生 解 链 ,尽管 对 于 滚 环 复制 ,一 条 链 被 切 开 提供 了 引物 末端 。 对 单 链 DNA 基因 组 , 解 链 和 切口 并 不 是 必需 的 ,起 点 只 是 引物 合成 的 位 置 。 在 每 种 情况 中 ,起 点 的 精确 位 置 对 应 于 新 生 DNA 合成 的 开始 ,是 引物 末端 产生 的 位 置 。 在 实际 上 ,起 点 经 常 不 能 准确 定位 :引物 长 度 在 一 个 短 的 范围 内 变化 (8 一 10 个 核 苷 酸 ) ,因为 DNA 引发 酶 对 核 苷 酸 使 用 的 不 专 一 性 ,引物 经 常 由 混合 的 核糖 核酸 和 脱氧 核糖 核酸 亚 单位 组 成 。 在 RNA 复制 中 ,起 点 与 启动 子 同 义 (参阅 ) ,也 就 是 说 RNA 复制 酶 能 够 与 其 底 物 结合 并 起 始 合成 的 位 置 。 对 双 链 DNA 基因 组 的 半 保 留 复 制 ( 所 有 细胞 基因 组 和 很 多 质粒 和 病毒 ) 而 言 , 在 起 点 处 双 链 打开 建立 一 个 或 二 个 复制 叉 。 解 链 经 常 被 特定 的 起 始 蛋白 所 调节 ,它们 征集 解 旋 酶 和 引发 酶 ,尽管 在 有 些 体系 中 (如 ColE1 相关 的 质粒 )RNA 聚合 酶 行使 这 一 功能 并 有 引物 合成 的 作用 。 解 旋 酶 对 亲本 链 的 连续 解 链 是 必需 的 ,起 始 蛋白 的 一 个 重要 功能 是 将 解 旋 酶 征集 到 复制 叉 中 (偶尔 起 始 蛋 白 本 身 有 解 旋 酶 活性 ,如 SV40 工 抗原 )。 在 大 多 数 起 点 处 , 解 旋 酶 定位 到 两 条 链 上 ,产生 两 个 复制 叉 , 复 制 是 双向 的 。 在 有 些 质粒 体系 中 , 单 个 解 旋 酶 定位 且 复 制 叉 是 单 向 的 。 经 常 先导 链 被 引发 ,延伸 一 段 距 离 后 后 滞 链 的 第 一 个 囚 崎 片段 在 反 向 模板 上 被 引发 。 对 于 连续 复制 只 需要 单个 的 引发 事件 (对 双 链 基因 组 每 条 链 上 一 个 )。 单 链 DNA 基 因 组 的 引发 位 置 经 常 通过 其 二 级 结构 识别 ,对 于 线性 的 质粒 和 病毒 基因 组 而 言 ,起 点 是 每 条 链 的 3 末端。 在 双 链 基因 组 中 ,建立 取代 复制 叉 允 许 在 一 个 方向 连续 合成 ,不 断 取代 一 亲本 链 。 在 有 些 阶 段 ,被 取代 链 上 另 一 个 起 点 暴露 出 来 ,使 第 二 链 的 合成 可 以 开始 。 这 个 策略 在 线粒体 DNA 复制 和 腺 病毒 和 有 末端 蛋白 的 几 种 相关 线性 质粒 的 复制 中 使 用 。 细菌 复制 起 点 大肠 杆菌 染色 体 起 点 了 定义 为 oriC , 它 对 正常 复制 非常 重要 。 最 小 的 序列 是 245$bp 长 ,含有 一 系列 串联 重复 元 件 , 即 含有 四 个 九 聚 体 和 三 个 13 聚 体 的 重复 区 (iterons) 。 九 聚 体 是 DnaA 起 始 子 的 结合 位 点 ,分布 在 “识别 位 点 ”上 ;三 个 13 聚 体 往往 在 富 含 AT 的 区 域 邻 近 。cazaA 突变 等 位 基因 是 慢 停 表 型 ,表明 DnaA 蛋白 的 功能 局 限于 起 始 。DnaA 以 ATP 依赖 的 方式 与 它 的 识别 位 点 协同 结合 ,所 以 最 后 出 现 30 个 DnaA 分 子 。DnaA 的 结合 促进 在 低 扭曲 稳定 性 的 三 个 13 聚 体 处 双 链 解 旋 。 然 后 DnaBC 解 旋 酶 复合 物 定位 ,这 个 过 程 被 作用 于 两 个 邻近 启动 子 上 的 RNA 聚合 酶 作用 所 促进 (参见 细菌 人 工 染 色 体 )。 起 始 序列 在 表 26.12 中 总 结 。 @ 细 菌 质粒 和 鸣 菌 体 复 制 起 点 在 其 他 部 分 讨论 一 一 见 质粒 病毒 各 章 。 358…。 表 26.12 ”大肠 杆菌 复制 起 始 的 阶段 起 始 阶段 性 质 起 始 复合 物 DnaA 与 九 聚 体 DnaA 盒 结 合 不 需要 ATP 开放 复合 物 DNA 在 13 聚 体 处 熔 解 需要 ATP 和 控制 DNA 结构 的 HU 蛋白 (参见 类 核 ) 预 引 发 复合 物 DnaBC 解 旋 酶 定位 。DnaC 从 复合 物 中 释放 引发 复合 物 DNA 被 DnaB 解 链 , 加 上 引发 酶 和 pol III 延伸 征集 拓扑 异 构 酶 和 SSB, 延 伸 开 始 oriC 一 个 显著 的 特点 是 存在 14 个 Dam 甲 基 化 位 点 。 半 甲 基 化 的 起 点 是 复制 起 始 后 直接 产生 ,不 能 促进 重新 起 始 ,并 与 细胞 膜 结合 。 有 可 能 DNA 的 甲 基 化 (参阅 ) 有 助 于 在 细胞 分 裂 中 控制 复制 的 时 间 。 上 面 描述 的 排列 结构 在 其 他 革 兰 氏 阴 性 细菌 的 复制 起 点 中 中 高 度 保守 。 重 复 区 的 序列 以 及 它们 的 空间 排列 看 来 都 很 重要 的 。 在 革 兰 氏 阳 性 细菌 中 ,序列 有 差异 ,但 结构 保持 相同 。 滚 环 起 点 和 8 起 点 的 结构 不 同 ,尽管 它们 都 有 起 始 蛋 白 的 结合 位 点 和 易 熔 解 的 AT 丰富 元 件 。 熔 解 暴露 了 链 剪 切 位 点 ,从 而 产生 了 引物 末端 。 除 了 这 些 区 别 ,在 所 有 细菌 复 制 子 中 起 始 的 过 程 是 类 似 的 ,包括 起 点 的 识别 和 解 旋 酶 定位 后 的 解 链 。 真 核 系统 的 起 点 ”简单 真 核 体 系 (质粒 \ 病 毒 和 单 细 胞 真 核 生 物 ) 的 起 点 类 似 于 原核 起 点 的 模式 ( 表 26.13)。 通 常 ,它们 含有 一 个 核心 序列 (ori-eore) ,ori-core 含有 起 点 识别 元 件 , 一 个 DNA 解 链 元 件 和 AT 丰富 元 件 。 在 核心 序列 外 有 一 个 或 多 个 辅助 元 件 ,是 转录 因子 的 结合 位 点 。 它 们 被 认为 是 以 影响 转录 起 始 同样 的 方式 增加 了 复制 起 始 的 效率 , 即 通过 与 系统 核心 成 分 ,起 始 体 (orisome) 的 相互 作用 (参见 基本 转录 装置 )。 简 单 的 起 点 可 作为 自动 复制 序列 (autonmomously replicating sequences,ARSs) 起 作用 ,也 就 是 说 如 果 在 细胞 中 一 个 序列 与 任何 其 他 DNA 片段 连锁 时 将 赋予 它 自 动 复 制 的 能 力 ,那么 连锁 的 DNA 片段 从 该 序列 中 获得 了 ARS( 参 见 酵母 克隆 载体 )。 表 26.13 ”简单 真 核 生 物 起 点 的 成 分 起 点 成 分 功能 起 点 核心 起 点 识别 元 件 (ORE) 起 始 因子 开始 结合 的 位 点 一 一 有 助 于 DNA 解 链 和 复制 体 成 分 的 定位 DNA 解 链 元 件 (DUE) DNA 解 链 和 复制 体 进 入 双 链 的 位 置 AT 丰富 元 件 与 简单 起 点 相 联系 的 基 序 , 有 工 丰 富 和 人 A 丰 富 的 链 。 容 易 发 生 弯曲 ,有 助 于 在 DUE 处 DNA 的 熔 解 和 ORE 与 起 始 蛋白 的 相互 作用 起 点 辅助 辅助 元 件 转录 因子 结合 位 点 ,如 果 与 转录 因子 结合 则 增加 复制 起 始 效率 。 可 能 用 转录 因子 控 制 复制 的 调节 ,使 复制 能 以 细胞 类 型 专 一 性 的 方式 和 发 育 程 序 化 方式 调节 (不 同 的 激活 可 以 控制 转录 活性 和 抑制 染色 质 ) 早 期 和 晚期 复制 。 转 录 因 子 能 够 通过 帮 助 起 始 蛋白 的 结合 改变 它们 的 活性 或 调节 染色 质 的 结构 或 DNA 的 结构 来 增强 复制 。 在 线粒体 DNA 中 ,它们 可 以 在 起 点 产生 引物 支持 转录 多 细胞 生物 染色 体 起 点 ”与 简单 起 点 比较 ,后 生动 物 染 色 体 起 点 分 析 较 困难 。 功 能 研 究 表明 DNA 的 长 度 对 复制 是 关键 因素 ,而 不 是 任何 特异 的 序列 。 然 而 通过 PCR 鉴定 复 制 起 始 处 的 序列 经 物理 分 析 表 明 这 涉及 序列 特异 性 。DNA 开始 合成 的 位 置 , 初 始 起 点 *。， 369 ， (或 者 双向 复制 起 点 一 一 大 多 数 初始 起 点 是 双向 的 ) 两 侧 有 一 些 二 级 起 点 。 初 始 起 点 经 常 为 0.5 一 2kbp 长 ,而 二 级 起 点 可 跨越 S0kbp, 因 此 称 为 起 始 地 带 (initiation zone)。 已 知 的 后 生动 物 复制 起 点 ,只 有 一 些 当 克隆 到 质粒 中 时 方 证 明 有 ARS 活性 ,因此 染 色 体 结构 被 认为 在 起 点 功能 中 有 重要 的 作用 。 在 起 点 两 侧 经 常 发 现 转录 因子 结合 位 点 ， 尽管 转录 本 身 对 起 始 不 是 关键 的 。 然 而 ,这 些 因 子 为 起 始 因子 组 建 提供 开放 的 染色 质 结 构 域 ,也 可 能 直接 帮助 组 建 的 过 程 一 一 这 直接 类 似 与 它们 在 转录 中 的 功能 。 尽 管 简单 起 点 的 AT 丰富 元 件 没 有 报道 ,潜在 的 DNA 解 链 元 件 在 几 个 起 点 处 都 被 发 现 。 还 存在 具有 形成 功能 还 不 清楚 的 十 字形 结构 的 潜在 能 力 的 二 重 对 称 位 点 。 也 有 细胞 核 基质 附着 位 点 (参阅 )。 两 个 极 头 结构 起 点 的 显著 特点 是 100 一 500bp 的 高 密度 的 甲 基 化 岛 (densely methy- lated island，DMI) ,其 中 两 条 链 所 有 的 脱氧 胞 喀 啶 都 被 甲 基 化 。 这 不 是 哺乳 动物 中 经 典 的 CpG 甲 基 化 模式 ,因为 甲 基 化 胞 喀 啶 的 前 后 序列 似乎 不 是 很 重要 (参见 CpG 岛 )。 这 些 起 点 甲 基 化 功能 还 不 清楚 ,但 它 可 能 影响 染色 质 结构 或 转录 因子 的 结合 ,或 者 它 可 能 调 节 复 制 的 时 间 ,如 同 在 细菌 中 的 情况 。 26.4 引物 和 引发 引发 的 基本 原理 ” DNA 合成 对 引发 的 需要 可 能 反映 了 校正 功能 的 进化 。 校 正 是 通过 DNA 聚合 酶 不 能 延伸 不 与 模板 配对 的 引物 来 实现 的 ,但 在 每 次 链 合成 的 起 始 中 ,因为 没 有 引物 来 延伸 , 酶 为 了 开始 合成 ,必须 容忍 一 些 不 精确 性 。 对 于 先导 链 的 合成 ,突变 会 在 起 点 处 积累 。 然 而 ,对 于 后 滞 链 的 合成 ,一 个 没有 引物 的 机 制 将 在 整个 基因 组 中 导 和 人 周期 性 的 突变 。 引 发 以 一 小 段 RNA 开始 ,使 复制 体能 够 确定 起 始 可 以 发 生 的 不 精确 区 域 ,并 当 有 DNA 引物 末端 存在 时 ,以 DNA 来 替代 它们 。 这 样 引 发 保持 了 基因 组 的 完整 性 。 引发 策略 ”在 细胞 DNA 引发 酶 合成 的 RNA 引物 中 被 用 于 先导 链 和 后 滞 链 的 合成 。 通常 引物 或 起 始 RNA(initiator RNA, iRNA) 长 约 10 核 苷 酸 。 在 原核 生物 中 ,引物 直接 由 DNA 聚合 酶 下 延伸 ,而 在 真 核 生 物 中 ,DNA 聚合 酶 v 在 每 个 引物 加 上 4 一 5 脱氧 核 苷 酸 [这 称 为 起 始 DNA(initiator DNA,iDNA)],DNA 引物 末端 由 DNA 聚合 酶 c 延伸 。DNA 引发 酶 合成 的 短 RNA 引物 是 后 淆 链 合成 的 通用 引发 机 制 。 非 细胞 复制 子 发 展 了 一 系列 不 同 的 先导 链 起 始 引发 的 策略 ( 表 26.14)。 表 26.14_ 在 复制 起 点 上 先导 链 引 发 的 机 制 引发 机 制 细节 举例 RNA3 引 物 DNA 引 发 酶 合成 的 短 新 生 大 核 苷 酸 细胞 DNA RNA 聚合 酶 合成 的 特殊 转录 本 线粒体 DNA,ColIE 质粒 预先 形成 的 tRNA 引物 的 退火 逆转 录 病 毒 的 反 转 录 发 夹 引发 有 反 转 的 未 端 重复 顺序 的 单 链 模板 可 以 反 转 形成 发 来 疱疹 病毒 内 切 引发 内 切 酶 前 切 双 链 DNA 产生 缺口 。 暴 露 的 3- OH 可 以 作为 很 多 革 兰 氏 阳性 细菌 质粒 的 滚 引物 末端 环 复制 人 侵 引 发 一 3“ 末端 通过 同 源 重组 导 人 完整 的 双 链 T4 晚期 复制 未 端 蛋 白 引发 ”有些 线性 复制 子 由 未 端 核酸 结合 蛋白 帮助 引发 腺 病毒 守 核 苷 酸 引发 ”在 体外 延伸 时 赛 核 苷 酸 退 火 到 模板 上 聚合 酶 链 式 反应 \ 随机 引发 、 cDNA 合成 (参阅 ) . 370 ， 26.5 复制 的 终止 环 状 模板 复制 的 完成 ”对 于 大 肠 杆菌 染色 体 和 有 些 质粒 , 环 状 基因 组 的 复制 可 以 在 终 止 区 域 (terminus region, ter ) 的 特定 序列 终止 。 此 外 , 当 两 个 复制 叉 从 相反 方向 前 进 相遇 时 ,复制 可 以 被 简单 地 停止 ,如 SV40 基因 组 。 大 肠 杆菌 染色 体 的 终止 区 域 含 有 两 对 反 向 重复 顺序 。 它 们 与 抑制 复制 叉 前 进 的 结合 蛋白 Tus 结合 , 解 旋 酶 活性 的 抑制 促进 了 这 一 过 程 。 终 止 区域 将 大 肠 杆 菌 基 因 组 分 成 两 半 , 称 为 复制 分 布 (replichores) ,每 个 都 在 双向 起 点 开始 而 在 末端 终止 。zer-Tus 阻 断 复制 的 能 力 是 方向 依赖 性 的 。 特 定 终止 策略 的 优 点 还 不 清楚 :在 大 肠 杆菌 中 缺失 ter 位 点 或 tus 基因 都 没有 影响 。 终 止 可 能 提供 了 互 锁 环 去 连接 的 调节 机 会 。 线性 模板 复制 的 完成 ”线性 基因 组 需要 特殊 的 策略 来 完成 它 的 $ 末端 。DNA 聚合 酶 只 能 以 5$ 一 3 方向 合成 DNA, 并 需要 一 个 预先 形成 的 引物 ,因而 不 能 完成 每 个 后 滞 链 尽 头 的 5 末端 ,因为 它 没有 上 游 供 引 物 结合 的 位 置 (图 26.4)。 没 有 特殊 的 完成 策略 ,染色 体 在 每 轮 复制 后 将 变 短 。 环 形 基因 组 在 这 方面 有 优势 ,很 多 线性 复制 子 通过 在 它们 的 复 制 循环 中 采取 一 环形 构象 来 解决 未 端 问题 (如 入 喉 菌 体 )。 进 化 产生 了 很 多 涉及 后 滞 链 的 合成 更 精细 的 策略 ,被 列 在 表 26.15 中 。 图 26.4 线性 模板 末端 的 复制 问题 。(1) 向 右 侧 进行 的 复制 叉 有 一 条 先导 链 ( 上 ) 和 一 条 后 滞 链 (下 )。 亲 本 链 是 黑色 ,新 生 链 是 白色 ,引物 是 阴影 的 ;注意 在 先导 链 上 只 有 一 个 引物 而 在 后 滞 链 上 有 多 个 引物 。(2) 先 导 链 的 3 末端 到 达 模 板 的 5 末端 。 其 间 最 后 的 后 滞 链 引物 被 合成 ,后 滞 链 上 最 后 的 冈 崎 片段 被 引发 。(3) 没 有 位 置 供 下 一 个 引物 结合 ,所 以 后 滞 链 的 最 后 部 分 没有 完成 ， 染色 体 保持 在 (2) 的 状态 。 真 核 生物 通过 在 染色 体 末端 加 上 核 苷 酸 形成 端 料 ( 参 阅 ) 来 解决 复制 问题 。 端 粒 的 重 复 顺 序 是 通过 特殊 的 酶 , 端 粒 酶 (参阅 ) 添 加 来 维持 染色 体 长 度 。 最 近 产 生 的 端 粒 酶 基因 吉 除 小 鼠 表 型 是 正常 的 ,但 突变 的 效应 在 六 代 后 出 现 , 存 在 的 端 粒 渐 至 完全 缺失 的 。 除 了 端 粒 基因 的 缺失 效应 ,突变 的 小 鼠 表现 出 染色 体 罕 变 ,如 融合 和 异 位 ,反映 了 端 粒 的 另 一 个 功能 一 一 区 别 自 然 染 色 体 未 端 和 随机 的 断裂 。 对 端 粒 的 进一步 讨论 , 见 染 色 体 结构 和 功能 。 . 371 ， 表 26.15 “完成 线性 基因 组 5 末端 的 策略 策略 机 制 和 举例 共 连 接 线性 基因 组 有 宛 余 末端 , 允许 进行 环 化 或 共 连 接 。 这 样 的 结构 可 以 被 剪 切 产生 有 5 突出 未 端的 单个 基因 组 ,这样 的 末端 可 以 被 常规 DNA 合成 补 平 。 如 鸣 菌 体 T7 和 末端 蛋白 引发 以 末端 蛋白 起 始 链 合成 的 病毒 不 需要 特殊 的 末端 机 制 :它们 在 5 末端 起 始 每 一 条 链 ,能 够 在 3 末端 完成 ,如 腺 病毒 ,噬菌体 电 9 发 夹 引 发 从 链 额 外 5 末端 起 始 链 合成 的 引发 策略 共 价 补 平 策略 有 些 病 毒 表面 上 是 线性 双 链 ,有 一 个 共 价 补 平 的 末端 ,因此 熔 解 产生 一 个 单 链 环 , 可 以 象 环 形 复制 子 一 样 复制 ,如 类 病毒 端 粒 称 为 端 粒 酶 的 酶 将 寡 核 苷 酸 加 到 线性 染色 体 的 未 端 。 尽 管 在 这 种 方法 中 额外 的 "顺序 丢 失 , 复 制 后 的 端 粒 酶 活性 可 以 补充 端 粒 ,所 以 在 连续 复制 循环 后 没有 真正 的 基因 丢失 ( 见 5 色 体 结构 和 功能 26.6 复制 的 调节 复制 的 时 间 控 制 ”所 有 的 细胞 将 基因 组 复制 与 细胞 周期 相 协调 ,以 阻止 DNA 的 丢失 或 过 剩 ( 见 第 2 章 细胞 周期 ) ,而 质粒 的 复制 经 常 是 拷贝 数 依赖 的 ( 见 第 3 章 质粒 )。 延 伸 速度 慢 和 基因 组 大 的 真 核 生物 ,通过 增加 每 条 染色 体 上 有 功能 的 起 点 来 加 快 复制 (如 爪 蟾 发 育 中 的 剪 切 阶段 )。 真 核 生物 复 制 是 时 间 控 制 的 ,所 以 不 是 所 有 的 起 点 同时 激活 ,基因 组 不 同 区 域 以 被 调节 的 时 间 顺 序 复制 。 复 制 的 时 序 调 节 与 遗传 活性 相对 应 ,也 就 是 说 管 家 基因 复制 较 早 ,而 细胞 类 型 特异 的 基因 在 它们 表达 处 一 般 复制 早 ,而 在 转录 沉默 的 细胞 中 复制 较 晚 。 时 间 控 制 是 发 育 调节 的 :很 多 细胞 类 型 特异 的 基因 在 胚胎 中 是 晚 复制 的 ,但 是 当 合适 的 细胞 类 型 分 化 后 转变 成 早 复制 ;X 连锁 基因 当 X 染色 体 失 活 (参见 X 失 活 ) 后 从 早 复制 转变 成 晚 复 制 。 复制 时 间 的 区 域 性 质 可 以 通过 S 期 中 脉冲 标记 娄 色 体 来 研究 。 早 期 复制 DNA 用 省 脱氧 尿 喀 喧 标记 ,产生 与 淡 G 带 和 DNase 工 敏感 区 域 相 一 致 的 带 型 [参见 染色 体 带 型 .等 分 布 (isochore)]。 因 此 早期 复制 的 DNA 似乎 是 富 含 基因 染色 体 的 活性 区 域 。 对 前 中 期 染色 体高 分 辩 率 带 型 分 析 显 示 了 将 主 带 分 成 1 一 2Mb 长 度 区 域 的 亚 带 带 型 。 哺 乳 动物 染 色 体 复制 子 长 度 为 50 一 300kb ,说 明 每 个 复制 时 间 区 含有 许多 同步 的 起 点 ,这 被 通过 放射 自 显 影 观 察 到 的 串联 起 点 所 证 实 。 易 位 表明 复制 的 时 间 不 是 很 多 特定 起 点 的 内 在 性 质 ,而 是 位 置 依赖 性 的 。 因 此 时 间 的 控制 可 能 由 顺 式 作用 位 点 调节 。 几 个 候选 元 件 已 经 被 发 现 ,包括 端 粒 序列 和 珠 蛋 白 基因 座 的 基因 座 控制 区 域 (参阅 )。 在 哺乳 动物 中 ,可 能 因为 与 细胞 核 基质 的 普遍 相互 作 用 ,时 间 相同 的 复制 又 在 细胞 核 中 作为 复制 焦点 (replication foci) 和 披 此 成 科 。 复 制 时 间 、 染 色 质 结构 DNA 甲 基 化 和 转录 活性 的 相互 关系 已 经 建立 。 然 而 这 些 成 分 的 因果 关系 还 不 清楚 。 1)X 鸣 菌 体 是 以 6 型 和 型 两 种 形式 进行 复制 的 ,不 存在 线性 DNA 的 复制 ,故此 例 可 能 有 误 。 一 一 译 者 注 “省 文 框 26.1 核酸 合成 模板 指导 的 核酸 合成 在 模板 指导 的 合成 (template-directed synthesis) 中 , 原先 存在 的 核酸 作为 模板 将 核 苷 酸 组 装 形成 新 的 链 ,通过 碱 基 配 对 指导 挫 人 的 序列 。 这 是 核酸 信息 转移 的 基础 。 有 两 种 类 型 的 核酸 ,DNA 和 RNA, 那 么 就 有 四 种 类 型 的 核酸 合成 反应 ,每 个 由 特定 的 模板 依赖 核酸 聚 合 酶 (或 合成 酶 ) 催 化 ,如 下 文 所 述 。 这 些 酶 在 模板 使 用 方面 是 特异 , 酶 本 身 决 定 了 底 物 的 专 一 性 。 如 表 中 所 使 用 的 ,DNA 聚合 酶 和 RNA 聚合 酶 的 名 称 是 令 人 误解 的 。 一 个 DNA 聚合 酶 (DNA polymerase) 是 限制 在 DNA 合成 活性 的 酶 (也 就 是 说 这 个 名 称 包括 了 反 转 录 酶 和 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 和 DNA 复制 中 的 DNA 聚合 酶 )。 同 样 RNA 聚合 酶 (RNA polymerase) 是 有 RNA 合成 活性 的 酶 (包括 转录 酶 病毒 RNA 复制 酶 ,DNA3 引 发 酶 和 多 腺 味 叭 聚合 酶 )。DNA 聚合 酶 也 称 为 DNA 复制 酶 (DNA replicase) ,而 RNA 聚合 酶 也 称 为 转录 酶 (transcriptase)。 一 种 酶 可 以 有 多 种 聚合 酶 活性 ， 如 大 多 数 转 录 酶 有 另外 的 DNA 依赖 的 DNA 聚合 酶 活性 。 聚合 酶 反应 ”所 有 模板 指导 的 核酸 合成 反应 涉及 称 为 模板 引物 (template primer) 的 结构 。 引 物 是 新 生 链 ,之 所 以 这 样 呼 法 是 因为 它 通 过 提供 延伸 的 末端 引发 连续 延伸 ;模板 链 提供 了 引物 延伸 的 信息 。 反 应 的 底 物 是 核 苷 酸 三 磷酸 :延伸 涉及 引物 链 未 端 3 羟基 对 挫 人 核 苷 酸 的 磷酸 基 团 的 亲 核 攻击 。 这 样 形 成 一 5 一 3 ` 磷 酯 键 ,释放 焦 磷 酸 ,表示 成 : NA.+NTP 一 ~NAL,;+PPi 拷贝 过 程 酶 :系统 定名 (普通 名 称 ) DNA 一 ~DNA(DNA 复制 ) DNA 依赖 的 DNA 聚合 酶 (DNA 束 合 酶 ) RNA 一 ~RNA(RNA 复制 ) RNA 依赖 的 RNA 育 合 酶 (RNA 复制 醇 ) DNA 一 ~RNA( 转 录 ) DNA 依赖 的 RNA 聚合 酶 (RNA 事 合 醇 ) RNA 一 ~DNA( 反 转录 ) RNA 依赖 的 DNA 聚合 酶 ( 反 转 录 酶 ) 在 体外 系统 中 加 入 过 量 的 焦 磷 酸 使 反应 向 反 向 进行 ( 焦 磷 酸 解 作用 ,pyrophosphorylysis)。 在 体内 焦 磷酸 通过 转变 成 无 机 磷酸 从 细胞 中 除去 ,使 反应 不 可 逆 。 通 过 形成 5 一 3 磷酸 二 酯 键 的 延 伸 使 链 只 能 以 $ 一 3 方向 生长 ,这 称 为 尾 的 生长 (tail growth) 。 聚 合 酶 反应 可 以 是 进行 性 的 (如 果 不 释放 酶 进行 很 多 多 聚 化 步骤 ) 或 者 是 分 散 性 的 (如 果 酶 在 每 次 挫 人 后 解 离 )。 聚 合 酶 经 常 被 发 现 与 其 他 蛋白 相 结合 ,通过 调节 酶 或 模板 结构 来 增强 酶 的 进行 性 。 DNA 和 RNA 合成 的 差别 ”尽管 所 有 的 核酸 合成 反应 都 是 类 似 的 机 制 ,DNA 合成 与 RNA 合成 有 三 个 方面 的 重要 差异 。 首 先 使 用 不 同 的 底 物 一 一 DNA 合成 使 用 脱氧 核糖 核 背 三 磷酸 而 RNA 合成 用 核糖 核 苷 三 磷酸 。 第 二 ,在 起 始 阶段 ,RNA 聚合 酶 可 以 是 从 头 开始 反应 ,也 就 是 说 酶 可 以 在 没有 预先 存在 引物 的 情况 下 在 模板 对 应 位 置 挫 人 第 一 个 核 苷 酸 。。RNA 链 的 第 一 个 核 苷 酸 保留 它 的 5 三 磷酸 ,作为 进一步 延伸 的 引物 。 相 反 DNA 聚合 酶 反应 不 能 从 头 开始 ,需要 一 个 已 经 存在 的 引物 。 所 有 的 DNA 聚合 酶 (包括 反 转 录 酶 ) 都 需要 引物 ,只 有 一 个 例外 是 脉 钨 菌 属 中 的 线粒体 逆 转录 酶 。 在 细胞 中 ,引物 是 在 复制 中 心 由 指定 的 酶 合成 的 短 RNA 分 子 。 对 其 他 基因 组 有 不 同 的 引发 策略 ( 表 26.14)。 引 物 增加 了 DNA 复制 的 保 真 度 ,但 使 线性 产物 5 末端 的 完成 复杂 化 ( 见 正 文中 的 讨论 ) 。 最 后 ,因为 DNA 合成 是 基因 组 复制 的 基本 方式 ,而 RNA 合 成 是 基因 表达 的 基本 方 式 , 很 多 (不 是 所 有 )DNA 聚合 酶 有 相关 的 内 切 酶 活性 进行 校正 一 一 在 引物 末端 鉴定 和 去 除 错 配 核 苷 酸 。RNA 聚合 酶 没有 这 样 的 活性 。 = 且 Y“。 非 模板 核酸 合成 ”在 不 依赖 模板 的 合成 (template independent synthesis) 中 , 核 苷 酸 不 需要 模板 的 指导 ,就 可 以 添加 到 已 经 存在 的 核酸 末端 。 这 样 的 反应 分 成 两 类 : 底 物 由 酶 选择 的 专 一 性 反应 和 可 使 用 任何 核 苷 酸 产生 随机 序列 的 非 专 一 性 反应 。 一 些 不 依赖 模板 的 酶 和 它们 的 细胞 功能 在 下 表 中 列 出 。 未 端 脱氧 核 背 酸 转移 酶 。 负责 在 VD 重组 中 在 接头 处 加 上 额外 核 背 酸 ( 见 第 25 章 重组 ); 在 (TaT) DNA3' 羟 基 上 非特 异性 加 上 脱氧 核 苷 酸 (参见 标记 、 同 源 多 聚 尾 ) 多 腺 嘎 叭 聚合 酶 (PAP) 。 。 负责 在 真 核 生 物 mRNA 3' 未 端 加 上 腺 顺 叭 残 基 ( 参 见 多 聚 腺 音 酸 化 ) mRNA 乌 苷 转移 酶 负责 真 核 生 物 mRNA 5 末端 加 上 7- 甲 基 鸟 味 叭 帽 (参见 加 帽 ) 多 核 背 酸 磷酸 酶 细菌 非特 异 核 苷 酸 多 聚 酶 。 特 点 是 用 核 苷 二 磷酸 而 不 是 三 磷酸 作为 底 物 文 框 26.2 复制 策略 和 复制 中 间 体 复制 中 间 体 ”复制 中 间 体 是 当 基 因 组 部 分 复制 时 观察 到 的 结构 (参见 复制 中 间 体 )。 它 们 可 以 通过 将 放射 性 核 苷 酸 挫 人 到 复制 的 DNA 中 ,然后 分 离 复制 子 并 通过 放射 自 显影 观 察 到 。 复 制 中 间 体 的 分 析 能 够 确定 复制 的 机 制 ,也 能 用 于 对 复制 起 点 作 图 。 6 和 结构 双 链 DNA 的 环 状 复制 子 可 以 形成 四 种 主要 类 型 的 中 间 体 ,分 属 6 结 构 和 结构 。 6 类 型 结构 是 在 内 部 起 点 起 始 产生 的 。 经 典 的 6 结构 与 希腊 字母 6 形状 相似 ,表明 半 保 留 复制 , 半 保留 复制 可 以 称 为 6 复制 或 Cairns 复制 。 类 似 的 结构 可 以 通过 内 部 取代 复制 产生 ,尽管 被 取代 的 环 没有 被 标记 ,所 有 中 间 体 在 第 一 轮 复 制 中 表现 为 一 个 环 ,在 第 二 轮 中 表现 为 6 型 。 这 称 为 取代 环 (D 环 ) ,类 似 有 自由 DNA 链 的 重组 中 所 看 到 的 ( 见 重组 )。G 类 型 结构 也 有 两 种 变化 。 经 典 的 6 结 构 与 希腊 字母 c 形状 相 似 , 表 明 滚 环 复制 ,字母 的 尾巴 代表 了 伸 出 的 连接 链 。 滚 环 复制 有 时 称 为 6 复制 。 在 有 些 进行 滚 环 复制 的 复制 子 中 ,取代 链 通 过 一 个 蛋白 保持 与 新 生 链 的 联系 ,形成 双环 的 中 间 体 , 称 为 索 套 结构 (lariat structure) 。 线性 复制 元 的 中 间 体 ”内 部 起 始 的 早期 复制 根据 是 环 状 复制 子 还 是 线性 复制 子 产 生 一 复制 眼 (replication eye) 或 复制 泡 (replication bubble)( 参 见 转录 泡 )。 然 而 在 线性 复制 子 中 , 内 部 泡 可 以 相 遇 产 生 更 大 的 泡 ,或 者 到 达 末 端 产 生 立 结构 。 一 个 立 结构 也 可 以 通过 当 一 条 链 剥 出 后 在 内 部 取代 产生 ,尽管 这 与 D 环 一 样 ,在 第 一 轮 复制 中 不 能 观察 到 ,因为 取代 链 没 有 被 标记 。 ( 陈 淳 译 ) . 374 . 第 27 章 RNA 加 工 基本 概念 和 定义 RNA 加 工 (RNA processing ) 描 述 了 新 合成 的 RNA 分 子 在 结构 和 化 学 方面 的 成 熟 。 这 些 修饰 过 程 发 生 在 转录 过 程 中 ,[ 共 转录 修饰 (cotranscriptional modifica- tion) ] 和 转录 后 [转录 后 修饰 (posttranscriptional) ];RNA 加 工 或 是 对 RNA 的 功能 极其 重要 或 是 代表 了 一 类 基因 调控 的 机 制 。 这 类 反应 分 成 10 类 , 见 表 27.1。 从 DNA 模板 复制 的 RNA 分 子 称 为 转录 本 (transcript)。 在 转录 过 程 中 ,产生 的 是 新 生 转录 本 (nascent transcript) , 当 转 录 完 成 后 为 初级 转录 本 (primary tran- script) 一 一 它 是 被 转录 DNA 的 一 个 精确 拷贝 。 经 过 一 些 修 饰 后 ,产物 为 成 熟 转 录 本 (mature transcript) ,不 再 与 DNA 完全 一 样 。 并 不 是 所 有 的 RNA 都 要 经 过 修饰 :细菌 mRNA 很 少 加 工 (实际 上 往往 在 转录 完 成 之 前 蛋白 合成 就 开始 了 ) , 真 核 生物 的 SS rRNA 转录 完成 后 就 有 成 熟 的 末端 。 完全 加 工 和 有 功能 RNA 分 子 的 前 体 称 为 前 体 RNA(pre-RNA)。 真 核 生 物 的 前 体 mRNA 又 称 为 核 内 不 均一 RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。 它 不 同 于 其 他 形式 的 核 内 RNA, 其 分 子 大 小 变化 很 大 ,反映 了 基因 大 小 的 差异 和 部 分 加 工 的 分 子 的 存在 。 在 真 核 生物 核 内 ,转录 和 RNA 加 工 不 是 在 核 中 自由 发 生 的 , 而 是 在 核 基 质 中 固 定 的 位 置 进行 。 特 定 的 mRNA 加 工 因 子 (特别 是 剪接 体 和 多 腺 苷 酸化 酶 ) 与 延伸 复合 物 中 RNA 聚合 酶 下 的 C 末端 作 用 ,所 以 转录 和 加 工 是 相关 联 的 。mRNA 加 工 复合 物 在 核 基 质 中 的 定位 可 能 有 利于 产物 的 输出 。 在 核 内 和 细胞 质 中 RNA 和 蛋白质 相 结合 ,形成 核糖 核 蛋 白 颗粒 。 表 27.1 RNA 加 工 反 应 的 分 类 加 工 反应 举例 剪 切 使 RNA 和 tRNA 从 多 顺 反 子 转录 本 中 释放 真 核 生 物 mRNA 转录 的 终止 内 切 降 解 加 工 rFRNA 和 tRNA 产生 成 熟 末 端 核 苷 酸 转移 转移 CCA 到 某 些 TRNA 的 3 末端 碱 基 化 学 修饰 mRNA 和 rRNA 中 偶发 的 甲 基 化 tRNA 和 snRNA 中 的 普遍 碱 基 修饰 核 苷 酸 切 除 和 替换 。” tRNA 乌 味 叭 的 高 度 修饰 产生 二 氢 尿 喀 啶 (Q) 和 假 尿 喀 啶 (W) 加 帆 在 真 核 生 物 mRNA 5 末端 加 上 7 - 甲 基 乌 味 叭 多 腺 苷 酸化 在 大 多 数 真 核 生物 和 少数 细菌 mRNA 3 末端 加 上 多 腺 苷 酸 尾巴 剪接 ( 转 接 ) 去 除 大 多 数 内 含 子 (经 常 是 顺 式 ,偶尔 反 式 ) 剪接 (连接 ) 去 除 tRNA 内 含 子 通过 碱 基 修 饰 改 变 mRNA 所 携带 信息 ,在 编码 区 中 插 人 或 缺失 碱 基 > 27.1 非 翻 译 RNASsS 的 成 训 tRNA 前 切 和 成 熟 一些 tRNA 基因 可 以 被 单独 转录 ,其 他 则 作为 多 顺 反 子 的 一 部 分 转录 。 在 大 肠 杆菌 中 ,一 些 tRNA 与 IFRNA 基因 在 共同 的 操纵 子 中 一 起 转录 。 根 据 其 来 源 不 同 ,前 体 tRNA 可 能 要 经 过 七 种 不 同 的 加 工 反应 。 多 顺 反 子 RNA 或 RNA 和 TRNA 混合 转录 本 中 ,单个 的 tRNAs 通过 在 成 熟 的 5 端 (经 常 是 鸟 味 叭 ) 切 除 而 释放 。 在 大 肠 杆 菌 中 , 这 个 功能 由 核糖 核酸 酶 P 完 成。 未 成 熟 的 3 末端 由 外 切 酶 (可 能 涉及 核糖 核酸 酶 D) 降 解 ,直到 出 现 三 核 苷 酸 基 序 CCA。 如 果 没 有 CCA 的 基 序 ,那么 就 通过 tRNA 核 苷 酸 转移 酶 (tRNA nucleotidyltransferase) 在 分 子 的 3 末端 加 上 三 核 苷 酸 。 所 有 成 熟 的 RNA 末端 都 有 CCA。 在 真 核 生物 和 古 细 菌 中 ,有 些 tRNA 基因 含有 需要 切除 的 内 含 子 , 这 就 涉及 前 切 .未 端 修饰 和 RNA 连接 (参见 RNA 核 内 含 子 ) 。 前 体 tRNA 还 需要 碱 基 修 饰 加 工 过 程 :tRNA 中 的 碱 基 大 多 数 是 主要 碱 基 ( 人 参阅) ,但 大 约 10% 在 tRNA 合成 中 被 修饰 ， 通常 在 原 位 通过 转录 后 化 学 修饰 完成 。 鸟 味 叭 高 度 修饰 的 衍生 物产 生 二 氢 尿 喀 啶 和 假 尿 喀 啶 ,通过 类 似 与 DNA 中 切除 修复 (参阅 ) 的 核酸 切除 和 置换 反应 而 插 和 人。 核 内 小 分 子 核 RNA 中 的 尿 喀 喧 也 被 广泛 修饰 ,所 以 也 称 为 U-RNA。 rRNA 的 剪 切 和 成 熟 ”细菌 和 真 核 生物 都 合成 多 顺 反 子 rRNA 转录 本 。 在 细菌 中 有 七 个 rRNA 操纵 子 (rrnz ) ,包含 编码 所 有 三 种 rRNA 的 基因 以 及 某 些 tRNA 基因 。16S 和 23S 前 体 rRNA 通过 碱 基 配 对 形成 葵 环 结构 。 这 可 能 是 核酸 酶 亚 的 底 物 ,核酸 酶 亚 对 蔡 部 剪 切 后 释放 单个 前 体 。 成 熟 的 末端 是 通过 外 切 酶 的 加 工 完成 的 。 在 哺乳 动物 中 ,由 RNA 聚合 酶 亚 转 录 成 单 顺 反 子 SS rRNA 单位 ,转录 成 一 成 熟 分 子 ,不 需要 加 工 。RNA 聚合 酶 工 合成 的 45S 的 pre-rRNA, 包含 5.8S, 18S 和 28S 的 rRNAs。 偶 尔 在 多 顺 反 子 的 转录 本 中 核糖 部 分 被 甲 基 化 ,其 中 大 多 数 在 成 熟 RNA 中 保 留 ,说 明 它 们 的 功能 可 能 是 决定 转录 本 的 哪 部 分 保留 ,哪些 部 分 需要 去 除 。 在 合成 过 程 中 ,45S rRNA 在 核 内 与 核糖 核 蛋白 复合 物 缔 合 , 加 工 也 在 此 处 发 生 。 这 样 的 复合 物 称 为 加 工 体 (processosome) 或 核 内 小 分 子 核糖 核酸 蛋白 (snorp)( 后 者 是 small nucleolar ribonu- cleoprotein ,snoRNP 的 缩写 ,并 包含 U3 snRNA)。 加 工 中 间 体 的 大 小 表明 外 切 剪 切 产 生 了 成 熟 的 终点 和 必须 进一步 加 工 的 初步 片段 。 在 剪 切 的 同时 ,一 些 低 等 的 真 核 生物 rRNAs 含有 自身 剪接 的 内 含 子 , 要 产生 有 功能 的 rRNA 这 些 内 含 子 所 必须 被 去 除 。 27.2 mRNA 的 末端 修饰 和 甲 基 化 细菌 和 真 核 生 物 mRNA 的 加 工 ”细菌 的 mRNA 一 般 不 稳定 ,很 少 被 修饰 一 一 它 经 常 在 几 分 钟 内 完成 合成 、 翻 译 和 降解 的 过 程 。 相反 , 真 核 生物 的 mRNA 较 稳 定 , 转 运 前 它 在 核 内 被 广泛 地 加 工 。 真 核 生 物 的 pre- mRNA 可 以 进行 几 种 类 型 的 加 工 反应 :未 端的 加 帽 和 多 腺 苷 酸化 ;内 部 的 剪接 和 编辑 等 修饰 ;内 部 腺 味 吟 甲 基 化 的 化 学 修饰 (这 种 加 工 的 功能 还 不 清楚 )。 真 核 生 物 的 mRNA 前 体 在 核 中 并 不 是 以 裸露 的 核酸 形式 存在 ,而 是 与 很 多 的 高 丰 度 蛋白 缔 合 形成 不 均一 的 核 糖 核酸 蛋白 体 (heterogenous ribonucleoproteins，hnRNPs)。 交 联 有 助 于 我 们 分 析 这 些 蛋 。 总 YO“。 白 ; 它 们 有 RNA 结合 的 基 序 (参见 核酸 结合 蛋白 ) ,但 以 不 同 的 专 一 性 与 RNA 结合 ,反映 了 对 不 同 碱 基 组 成 的 倾向 性 。 和 蛋白 可 能 以 与 单 链 DNA 结合 蛋白 (参阅 ) 相 同 的 方式 作 用 ,消除 RNA 的 二 级 结构 ,使 其 与 剪接 装置 的 成 分 相互 作用 。 它 们 也 可 以 作为 特殊 的 RNA 加 工 因 子 如 剪接 恒 日 的 特殊 停泊 位 点 等 。 加 帽 “一旦 转录 起 始 ,新生 真 核 生 物 mRNA 通过 在 $ 端 加 上 倒转 的 乌 核 苷 酸 三 磷酸 而 加 帽 (在 细菌 中 还 未 见 加 帽 的 例子 ) 。 这 个 快速 反应 由 乌 苷 酸 转 移 酶 (mRNA guanyltrans- ferase) 催 化 ,产生 一 特殊 的 5$ 一 5 磷酸 二 酯 键 。 这 个 酶 可 能 与 RNA 聚合 酶 开 起 始 复合 物 中 的 成 分 结合 ,因为 不 仅 mRNA 要 加 帽 ,RNAP 开 转 录 的 snRNA 也 被 加 帽 (RNA 聚合 酶 亚 转 录 的 saRNA 如 U6 snRNA 不 加 帽 )。 此 结构 (5 帽子 或 简单 地 称 为 帽子 ) 是 通过 乌 嘲 叭 甲 基 转 移 酶 (guanine methyltransferase) 在 G" 位 甲 基 化 ,产生 0 型 帽子 (type zero cap ) ， 这 在 酵母 中 占 绝对 优势 。 在 更 高 等 的 真 核 生 物 中 ,在 下 一 碱 基 的 核糖 O? 位 置 加 上 甲 基 (转录 本 中 第 一 个 残 基 , 对 应 位 置 为 +1) ,产生 1 型 帽子 (type 1 cap)。 如 果 这 个 位 置 是 腺 叮 叭 ,NE 位 的 碱 基 也 可 能 被 甲 基 化 。 在 有 些 物 种 中 , + 2 位 的 碱 基 也 被 甲 基 化 ,同样 也 是 在 核糖 的 O? 位 置 上 产生 2 型 帽子 (type 2 cap)。 真 核 生 物 中 端的 帽子 对 几 种 RNA 的 功能 是 很 重要 的 。 它 是 运 出 核 孔 所 必需 的 ; 对 于 核糖 体 结合 ,防止 RNA 5 端 降解 也 很 重要 ,这 可 以 解释 为 什么 几乎 所 有 真 核 生物 的 mRNA 都 是 单 顺 反 子 (参见 蛋白 合成 , 反 式 剪接 ,内 部 核糖 体 进入 位 点 )。 加 帽 反 应 可 以 用 来 调节 蛋白 合成 ,一 些 动物 中 卵细胞 成 熟 过 程 就 使 用 这 种 策略 。 大 多 数 RNA 病毒 对 它们 的 基因 组 和 mRNA 加 帽 ,但 是 细小 核糖 核酸 病毒 的 感染 策略 是 避 开 缺乏 加 帽 的 能 力 , 在 它们 的 基因 组 的 $ 末端 加 上 病毒 蛋白 。 正 粘 病毒 也 不 能 在 基因 组 中 加 帽 ,但 可 以 从 宿主 mRNA 中 偷 取 帽 子 ,这 样 的 过 程 称 为 抢 帽 (capsnatching)。 多 腺 苷 酸化 真 核 生 物 中 RNA 聚合 酶 下 转录 终止 发 生 在 成 熟 转录 本 的 3 端 下 游 几 千 碱 基 之 后 ,其 精确 机 制 目前 还 不 清楚 。3 端 通 过 内 切 ,接着 进行 多 腺 苷 酸化 (polyadeny- lation) ,加 上 不 同 数量 (经 常 为 200 个 左右 ) 的 腺 味 叭 ,形成 多 腺 哇 叭 尾巴 (polyadenylate or polyA tail) 。 在 高 等 真 核 生 物 中 , 多 腺 苷 酸化 发 生 在 高 度 保守 的 多 腺 苷 酸化 位 点 (AAUAAA) 后 10 一 30 个 碱 基 。 酵 母 中 的 多 腺 苷 酸化 位 点 变化 较 大 。 剪 切 和 多 腺 苷 酸化 是 由 多 亚 基 的 复合 物 进 行 ,复合 物 中 三 聚 的 剪 切 多 腺 苷 酸化 专 一 性 因子 (cleavage polyadenylation specificity factor，CPSF) 识别 多 腺 苷 酸化 位 点 ,由 两 个 剪 切 因 子 (cleavage factor) 组 成 的 内 切 酶 ,进行 剪 切 反应 ,多 腺 味 叭 聚合 酶 (polyadenylate polymerase，PAP) 催 化 加 腺 味 叭 复合 物 中 还 有 其 他 一 些 未 知 成 分 。 这 些 成 分 中 ,被 认为 包含 聚合 酶 开 的 延伸 成 分 ,并 与 其 磷酸 化 的 羧 端 相 作用 。 多 腺 苷 酸化 起 始 时 进行 较 慢 , 因 为 PAP 每 加 上 一 个 腺 味 叭 后 都 要 解 离 。 但 当 形 成 一 小 段 多 腺 味 叭 后 , 另 一 成 分 多 腺 嘲 叭 结合 蛋白 (polyadenylate binding protein,PABP) 与 尾巴 结合 并 加 快 了 PAP 的 进度 。PABP 通过 一 未 知 的 机 制 ,控制 多 腺 味 叭 尾巴 的 最 大 长 度 。 多 腺 苷 酸化 具体 的 功能 还 不 清楚 。 它 可 能 影响 转录 本 的 稳定 性 ,在 一 些 例 子 中 , 它 在 翻译 过 程 中 起 重要 作用 。 例 如 果 蝇 的 bicoid mRNA 直到 受精 后 ,三 种 蛋白 促进 多 腺 味 吟 尾巴 延伸 后 才 开 始 翻译 。 很 少 真 核 生物 的 转录 本 不 进行 多 腺 苷 酸化 ,最 值得 一 提 的 是 组 蛋白 的 mRNA 和 一 些 植物 病毒 的 基因 组 。 组 蛋白 的 转录 本 的 二 级 结构 负责 3 端的 成 熟 ， = 3 。 这 涉及 U7 snRNA 和 相关 和 蛋白。 大 多 数 细菌 没有 多 腺 味 叭 尾巴 ,但 在 一 些 物种 中 也 发 现 了 短 的 和 相对 不 稳定 的 寡 聚 腺 嗓 叭 尾巴 ,如 Methazrococcws vazzzzie1ii。 利用 多 腺 苷 酸化 ,与 其 配对 的 合成 多 聚 胸腺 喀 啶 可 在 体外 扩 增 或 纯化 RNA。 用 这 种 纯化 方法 ,得 到 的 大 部 分 是 mRNA, 称 为 多 腺 味 叭 RNA 组 份 L[poly(A)” RNA fraction] ,其 余 成 分 为 不 含 多 腺 味 叭 成 分 ,如 IRNA,tRNA 等 。 因 为 mRNA 在 总 RNA 中 比例 很 小 (<5% ) ,所 以 这 一 技术 在 纯化 mRNA 中 很 有 用 (如 转录 分 析 ,cDNA 克隆 , 反 转 录 PCR)。 27.3 RNA 剪接 内 含 子 和 剪接 反应 ”内 含 子 是 高 等 真 核 生物 基因 中 主要 的 非 编 码 元 件 , 在 低 等 真 核 生 物 和 有 些 细菌 中 也 发 现 有 内 含 子 (参见 内 含 子 \ 断 裂 基因 ) ,RNA 剪接 (RNA splicing) 就 是 内 含 子 精确 去 除 。 内 含 子 根据 剪接 方式 的 不 同 ,分 为 四 种 类 型 ( 表 27.2)。 除 了 tRNA 前 体内 含 子 , 所 有 的 剪接 机 制 都 涉及 一 对 按 顺 序 进行 的 转 酯 反应 。 在 第 一 个 反应 中 ,一带 有 自由 羟基 的 核 苷 酸 进攻 连接 内 含 子 和 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 。 这 样 释 放 了 携带 其 本 身 羟 基 的 3 端 外 显 子 。 在 第 二 个 反应 中 ,自由 羟基 进攻 连接 内 含 子 和 下 一 个 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 。 第 二 个 反应 将 外 显 子 连接 在 一 起 ,并 释放 内 含 子 。 三 类 转 酯 内 含 子 有 不 同 结构 ,起 始 羟基 供 体 不 同 ,形成 中 间 体 性 质 不 同 ,在 反应 是 否 是 自身 催化 或 需要 有 反 式 剪接 体 提 供 等 方面 也 存在 差异 。 自 身 催 化 内 含 子 称 为 自我 剪接 内 含 子 , 可 以 被 认为 是 核 酶 (ribozymes， 参阅 )。 表 27.2 不 同类 型 内 含 子 和 它们 剪接 方式 的 总 结 内 含 子 类 型 内 含 子 性 质 和 剪接 机 制 转 酯 内 含 子 一 一 内 含 子 中 的 剪接 识别 位 点 核 pre-mRNA 内 含 子 结构 变化 自由 羟基 的 起 始 供 体 由 内 部 分 支 位 点 腺 味 叭 提供 形成 套 索 结构 的 中 间 体 需要 装配 大 的 反 式 作用 的 剪接 体 I 型 自我 剪接 内 含 子 保守 的 二 级 结构 鸟 味 叭 核 苷 酸 辅 因子 是 自由 羟基 供 体 没有 套 索 结构 形成 自我 剪接 型 自我 剪接 内 含 子 保守 的 二 级 内 部 腺 味 叭 是 自由 羟基 供 体 形成 套 索 结构 的 中 间 体 自身 催化 剪接 亚 型 自我 剪接 内 含 子 与 了 型 内 含 子 类 似 , 但 较 小 (100 一 200bp) 包 含 数 量 有 限 的 结构 域 迹 生 内 含 子 多 其 合 自我 剪接 内 含 子 , 常 为 卫 型 或 开 型 和 亚 型 混合 , 经 常 以 特定 的 顺序 剪接 。 非 转 酯 内 含 子 一 一 剪接 识别 涉及 外 显 子 结构 细胞核 tRNA 内 含 子 剪接 机 制 类 似 于 tRNA 成 熟 一 一 涉及 前 切 后 的 连接 没有 中 间 体 形成 一 一 内 含 子 以 线性 片段 切除 需要 几 种 反 式 作用 的 加 工 酶 注 : 细 胞 核 mRNA 内 含 子 和 开 型 自我 剪接 内 含 子 使 用 非常 类 似 的 剪接 机 制 ,尽管 后 者 是 自身 催化 。 = 细胞 核 pre-mRNA 内 含 子 ” 真 核 生物 核 基因 组 中 的 大 多 数 内 含 子 都 不 能 自身 催化 剪 接 , 称 为 核 premRNA 内 含 子 (nuclear pre-mRNA introns)。 它 们 在 大 小 和 结构 上 有 很 多 差异 ,但 已 鉴定 了 一 些 短 的 保守 的 、 控 制 剪接 的 顺 式 作用 位 点 (参见 图 27.1)。 在 这 些 剪 接 反应 中 ,直接 涉及 供 体 位 点 (donor site,$” site,left splicing site)、 受 体位 点 (acceptor site， 3 ” site， right splice site) 和 分 枝 点 (branch site) 。 供 体位 点 和 受 体位 点 具有 位 于 保守 程度 稍 差 的 序列 中 的 高 度 保守 的 保守 序列 GU 和 AG, 称 为 GU-AG 原则 (GU-AG rule) 。 这 些 位 点 决定 了 内 含 子 的 边界 ,其 改变 或 缺失 的 突变 会 破坏 剪接 (如 不 正常 的 剪接, 见 下 文 )。 酵母 中 的 分 支 位 点 具有 UACUAAC 的 序列 ;但 高 等 真 核 生物 中 除了 提供 起 始 羟基 的 腺 嘲 叭 (在 酵母 序列 中 以 斜体 表示 ) ,此 序列 的 保守 性 很 差 。 剪接 反应 以 下 面 的 方式 进行 (总 结 在 图 27.1)。 分 支 处 活性 的 腺 味 叭 的 自由 2 凑 基 进攻 连接 上 游 外 显 子 和 内 含 子 的 磷酸 二 酯 键 。 第 一 个 转 酯 反应 通过 5 一 2 磷酸 二 酯 键 ， 连接 内 部 的 腺 味 叭 与 $ 剪接 位 点 的 鸟 味 叭 ,并 形成 套 索 结构 。 上 游 外 显 子 3 端 羟基 进攻 连接 内 含 子 和 下 游 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 。 在 3 剪接 位 点 进行 的 第 二 个 转 酯 反应 将 两 个 外 显 子 连接 起 来 ,并 将 内 含 子 以 套 索 结构 的 中 间 体 (lariaf intermediate) 形 式 释放 出 来 , 接 着 中 间 体 被 线性 化 (去 分 支 ) 并 降解 。 D B A 5 GU 一 一 UACUAAC 一 YYYYYY 一 AG 3' 7 毅 式 电 和 Ch 局 G 一 一 (6) 27.1 通过 套 索 结 构 中 间 体 的 剪接 。 顶 端的 图 显示 了 细胞 核 pre-mRNA 内 含 子 的 典型 结构 ， 显示 了 供 体 (D) ,分 支 顺 序 (B) 和 受 体 (A) 位 点 。 在 受 体 位 点 上 游 有 多 聚 喀 啶 区 域 ,是 剪接 因子 的 识别 位 点 。 下 面 的 图 显示 了 剪接 反应 ,内 含 子 末端 的 鸟 味 哈 和 分 支 位 点 的 活性 腺 味 叭 形 成 环 状 结构 。 开 型 自我 剪接 内 含 子 也 遵循 类 似 的 途径 。 对 细胞 核 内 含 子 而 言 ,反应 由 反 式 作用 的 剪接 体 催 化 , IT 型 内 含 子 由 RNA 自身 催化 反应 。 剪接 体 (spliceosome) 是 40S 一 60S 的 核糖 核 蛋 白 复 合 物 ,在 pre-mRNA 转录 时 形成 ， 催化 剪接 反应 。 剪 接 体 包含 了 核 内 小 分 子 核糖 核酸 蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins ) (snRNP,snurps) ,这 种 蛋白 每 个 都 由 多 个 蛋白 和 一 到 两 个 核 内 小 分 子 RNA(snRNA) 组 ”加 网。 成 。 如 上 文 所 述 , snRNA 常 被 称 为 U-RNA, 因 为 它 含有 修饰 的 尿 喀 了 啶 ,分 为 UL1\U2 RNA 等 。snRNP 是 根据 它 所 含有 的 U-RNA 特殊 种 类 而 命名 。 那 些 在 剪接 中 发 挥 作 用 的 snRNP 分 别称 为 U1\U2、U4/U6( 含 两 个 snRNA) 和 US。 每 个 snRNP 都 包含 10 到 20 个 蛋白 ,其 中 有 些 是 在 所 有 的 snRNP 都 存在 。 其 他 一 些 蛋 白 瞬 时 与 剪接 体 结合 ,但 其 本 身 不 是 snRNP 的 成 分 , 称 为 剪接 因子 (splicing factors)。 剪 接 途 径 和 剪接 体 的 基本 功能 以 及 剪接 因子 在 表 27.3 中 总 结 。 核 前 体 mRNA 的 剪接 最 显著 的 特征 是 在 给 定 的 种 属 信号 下 ,大 部 分 基因 都 能 以 精确 的 方式 进行 剪接 。 所 有 的 剪接 位 点 基本 相同 ,这样 理 论 上 任何 $ 位 点 可 以 与 任何 3 位 点 连接 。 但 在 大 多 数 有 多 个 内 含 子 的 基因 中 通常 不 发 生 外 显 子 跳 过 (exon skipping) ,只 利 用 基本 的 剪接 位 点 ,而 不 是 隐蔽 的 位 点 (参见 下 文 的 选择 性 剪接 ,alternative splicing)。 对 剪接 中 间 体 的 研究 揭示 了 很 多 基因 的 前 接 途 径 。 剪 接 位 点 的 选择 可 能 是 转录 本 的 内 在 性 质 ,可 能 反映 了 剪接 发 生 时 的 二 级 结构 的 变化 ( 即 剪接 的 顺序 和 专 一 性 可 能 通过 将 非常 规 剪接 位 点 放 到 二 级 结构 中 使 其 不 能 被 利用 来 控制 ,一 旦 一 个 剪接 成 功 地 完成 ,构象 的 改变 使 进一步 的 剪接 位 点 暴露 出 来 )。 精 确 识别 的 基础 目前 还 不 清楚 ,但 有 可 能 是 通过 称 为 SR 蛋白 (因为 它们 富 含 丝氨酸 / 精 氨 酸 ) 的 剪接 因子 调节 ,SR 蛋 白 与 UL snRNP 和 U2AF 相互 作用 。 这 种 相互 作用 可 以 通过 两 种 方式 调节 :SR 蛋白 铺展 于 内 含 子 上 ,确定 RNA 的 哪些 部 分 需要 被 去 除 (内 含 子 桥 连 ，intron bridging) 或 者 是 铺展 于 外 显 子 上 ,确定 哪些 部 分 的 RNA 需要 保留 (外 显 子 限 定 ,exon definition)。 既 然 外 显 子 比 内 含 子 相 对 要 小 ,所 以 外 显 子 限 定 的 机 制 更 为 可 能 。U1 snRNP 刺激 U2AF 与 上 游 3 剪接 位 点 的 结合 ,支持 了 这 种 理论 。 表 27.3_ 核 premRNA 内 含 子 的 剪接 一 一 剪接 途径 和 基本 成 分 的 功能 前 前 接 复合 物 基本 成 分 和 事件 下 复合 物 (早期 或 定 ”UL 和 U2AF 型 复合 物 ) Ul 与 供 体位 点 结合 剪接 因子 U2AF 与 受 体 位 点 附近 的 喀 啶 富 集 序列 结 合 ( 这 是 下 一 步 U2 结合 所 需 的 ) A 复合 物 U1L、U2 和 U2AF Uz2 与 分 支点 结合 需要 ATP 水 解 Bl 复合 物 U1、U2,U4/U6、US5 和 U2AF U4/U6/U5 与 前 剪接 复 合 物 结 合 U5 与 5 端的 外 显 子 作 用 ,U4/U6 与 U2 结合 B2 复合 物 U2,U4/U6、U5 和 U2AF Ul 从 前 剪接 复合 物 中 释放 出 来 U5 再 定位 于 内 含 子 U6 与 供 体位 点 结合 需要 ATP 水 解 Cl 复合 物 U2、US、U6 和 U2AF U4 释放 US 再 定位 于 受 体位 点 第 一 次 转 酯 反应 发 生 需要 ATP 水 解 C2 复合 物 第 二 次 转 酯 反应 发 生 剪接 因子 与 套 索 结构 中 间 体 一 起 释放 剪接 体 在 细胞 中 不 是 作为 一 个 事先 形成 的 复合 物 存在 ,而 是 在 一 定 阶段 被 组 装 , 称 为 前 剪接 复合 物 前 体 。 [型 自我 剪接 内 含 子 ” 贡 型 内 含 子 在 植物 和 低 等 真 核 生 物 的 细胞 器 基因 组 中 发 现 。 同 SU 工 型 内 含 子 ( 见 下 文 ) 一 样 ,它们 也 能 自身 剪接 ,但 与 工 型 内 含 子 不 同 的 是 它们 的 剪接 机 制 与 核 mRNA 前 体内 含 子 使 用 的 机 制 密切 相关 。 剪 接 从 内 部 腺 味 叭 的 2 羟基 进攻 连接 内 含 子 与 上 游 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 开 始 ,产生 套 索 结构 和 末端 是 3 羟基 的 游离 外 显 子 。 这 个 羟基 在 第 二 次 转 酯 反应 中 进攻 连接 内 含 子 和 下 游 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 ,使 两 个 外 显 子 连接 并 释放 套 索 结构 的 中 间 体 (参见 图 27.1)。 开 型 自我 剪接 内 含 子 的 催化 活性 来 自 于 其 特征 性 的 包含 六 个 柄 环 结构 域 的 二 级 结构 ,使 外 显 子 距离 拉 近 。 开 型 自我 剪接 内 含 子 的 二 级 结构 类 似 于 核 内 含 子 的 分 支 位 点 和 U2、U6 snRNAs, 说 明 该 内 含 子 可 能 通过 将 催 化 功能 由 自身 转移 到 反 式 作用 的 调节 复合 物 ,而 由 开 型 自我 剪接 内 含 子 进化 而 来 。 细 胞 核 mRNA 前 体内 含 子 在 大 小 和 结构 上 变化 较 大 ,而 开 型 自我 剪接 内 含 子 保 持 均 一 性 (内 含 子 的 进化 的 讨论 参见 第 22 章 蛋 白质 :结构 、 功 能 和 进化 )。 工 型 自我 剪接 内 含 子 工 型 自我 剪接 内 含 子 在 线粒体 基因 组 中 发 现 ,也 存在 于 极 少数 单 细 胞 真 核 生物 ( 如 嗜 热 四 膜 虫 的 rRNA 基因 中 ) 的 核 基因 组 中 。 原 核 体系 中 少数 内 含 子 也 是 工 型 内 含 子 (如 T4 史 菌 体 胸 苷 酸 合成 酶 基因 )。 工 型 内 含 子 是 自身 催化 的 ,利用 含 鸟 味 叭 的 核 苷 酸 辅助 因子 提供 自由 羟基 。 剪 接 反 应 按照 如 下 步骤 进行 。 辅 助 因 子 的 3 端 自由 羟基 进攻 连接 内 含 子 和 上 游 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 , 在 内 含 子 的 3 端 加 上 鸟 味 叭 使 其 延伸 ,并 在 上 游 外 显 子 3 端 产生 自由 羟基 。 在 第 二 个 转 酯 反应 中 ,上 游 外 显 子 进 攻 连 接 内 含 子 与 下 游 外 显 子 的 磷酸 二 酯 键 , 使 外 显 子 连接 并 将 有 鸟 味 叭 的 内 含 子 以 线性 形 式 释 放 ( 参 见 图 27.2)。 这 一 片段 可 以 通过 第 三 个 转 酯 反应 ,内 含 子 的 3 端 与 鸟 味 叭 连接 形成 环 状 结构 。 TOTTPTTTT 27.2 工 型 内 含 子 的 自身 剪接 。 详 细 的 机 制 见 正文 。 反应 的 专 一 性 由 工 型 内 含 子 高 度 保守 的 二 级 结构 所 控制 , 工 型 内 含 子 有 九 个 发 夹 结 构 , 其 中 三 个 直接 参与 外 显 子 的 识别 。 特 别 是 P1 发 夹 结构 包含 了 上 游 外 显 子 的 远 端 和 内 含 子 的 起 始 碱 基 。 这 被 称 为 内 部 引导 序列 (internal guide sequence,IGS) ,起 先 被 认为 是 通过 与 两 个 外 显 子 近 侧 区 配对 而 使 外 显 子 并 列 ,现在 认为 它 决 定 了 剪接 的 专 一 性 。 内 含 子 编码 蛋白 ”一 些 工 型 和 开 型 内 含 子 含 有 编码 促进 剪接 的 蛋白 的 开放 阅读 框架 。 这 些 蛋白 称 为 成 熟 酶 (maturases) ,它们 为 剪接 所 需 , 但 不 具有 催化 活性 (它们 在 结构 上 起 “ 3， 作用 )。 其 他 内 含 子 编码 蛋白 的 功能 与 内 含 子 的 迁移 有 关 ( 人 参见 第 13 章 可 移动 的 遗传 因 子 )。 工 型 内 含 子 经 常 编码 内 切 酶 , 专 一 性 前 切 于 DNA 内 含 子 插入 位 置 ,在 修复 介 导 的 重组 中 转移 内 含 子 到 没有 内 含 子 的 等 位 基因 上 。 这 种 过 程 称 为 归 巢 (homing) ,这 种 内 含 子 称 为 归 某 内 含 子 (homing introns, 参 阅 )。 工 型 内 含 子 编码 的 蛋白 有 反 转 录 酶 和 内 切 酶 活性 ,使 内 含 子 象 反 转录 子 (retroposon ) 一 样 迁 移 。 这 样 的 过 程 称 为 反 转 录 归 某 (retro- homing)。 也 有 些 内 含 子 编码 的 蛋白 同时 具有 归 梨 和 成 熟 酶 活性 。 在 高 等 真 核 生物 中 ,有 些 基 因 ( 含 有 其 自身 的 内 含 子 ) 以 正 向 或 反 向 完全 内 在 一 个 大 的 基因 内 含 子 中 (参见 重 登 基因、 说 套 基因 , 工 细胞 受 体 基因 )。 内 含 子 中 也 可 能 包含 转录 调节 元 件 (参见 增强 子 、 沉 黑子 )。 细胞 核 tRNA 内 含 子 ”细胞 核 RNA 基因 中 发 现 一 类 特殊 的 内 含 子 。 剪 接 不 是 通过 顺 序 的 转 酯 反应 发 生 ,而 是 剪 切 后 进行 连接 。 内 含 子 通 过 特殊 的 内 切 酶 反应 从 让 NA 前 体 中 被 切除 ,产生 5 羟基 和 3 环 磷酸 基 团 。 两 个 末端 分 别 产 生 适 合 连接 反应 的 5 磷酸 和 3 羟基 末端 。 修 饰 后 的 末端 经 过 tRNA 分 子 内 碱 基 配 对 而 并 列 , 由 连接 酶 作用 而 连接 在 一 起 。tRNA 内 含 子 的 其 他 性 质 也 不 同 寻常 , 它 在 结构 或 序列 上 没有 保守 性 ,也 就 是 对 内 含 子 的 识别 主要 是 通过 外 显 子 结构 。 在 酵母 中 ,尽管 不 同 RNA 基因 的 内 含 子 没有 关系 , 它 们 经 常 在 相同 的 位 置 被 发 现 一 一 在 反 密 码 子 的 下 一 个 碱 基 。 内 含 子 有 与 反 密 码 子 互补 的 序列 ,使 它们 能 够 与 反 密 码 子 环 配 对 。 这 样 的 二 级 结构 可 能 是 正确 剪接 所 需 的 :破坏 二 级 结构 的 突变 使 剪接 效率 下 降 。 通过 草 接 产 生 的 变化 ”对 很 多 基因 而 言 ,RNA 剪接 是 一 个 不 变 的 加 工 过 程 。 基 因 转 录 时 所 有 细胞 中 产生 同样 的 成 熟 转录 本 及 单 种 产物 。 这 称 为 组 成 型 剪接 (constructive splic- ing)。 其 他 一 些 基因 ,RNA 剪接 可 以 作为 基因 调节 的 机 制 , 也 就 是 说 在 两 种 组 织 中 同一 基 因 表达 不 同 ,尽管 它 以 相同 的 方式 和 速度 转录 。 这 样 的 调节 以 两 种 方式 发 生 。 在 第 一 种 情况 ,加 工 或 去 除 调 节 (processing or discard regulation) ,初始 转录 本 在 一 些 组 织 中 加 工 , 在 其 他 组 织 中 不 剪接 。 在 有 些 低 等 真 核 生 物 中 (如 海胆 ) ,这 是 主要 调节 机 制 。 大 部 分 基因 在 大 部 分 组 织 中 转录 ,由 RNA 加 工 调节 来 决定 那些 基因 被 翻译 。 在 果 蝇 中 ,一 个 类 似 的 机 制 用 来 控制 P 因子 转 座 酶 (参阅 ) 的 合成 ,在 这 种 情况 下 虽然 只 有 一 个 内 含 子 未 被 剪接 ,但 却 限制 了 P 因子 转 座 只 发 生 在 生殖 细胞 中 。 转 座 酶 基因 包含 三 个 内 含 子 ,在 生殖 细胞 中 产生 成 熟 的 编码 转 座 酶 的 转录 本 ,然而 在 其 他 组 织 中 ,第 三 个 含 终 止 密码 子 的 内 含 子 被 保留 ,使 转 座 酶 蛋白 截 短 , 从 而 阻止 体 细胞 中 P 因子 的 转 座 。 内 源 性 基因 也 用 同样 的 策略 ,如 哺乳 动物 GABAA 受 体 s 亚 基 的 mRNA 前 体 除 了 脑 以 外 其 他 组 织 都 不 剪接 。 在 第 二 种 情况 ,差别 或 选择 性 剪接 (differential or alternative splicing ) ,基本 转录 体 通 过 选择 使 用 外 显 子 以 不 同方 式 加 工 。 相 关 成 熟 转 录 体 家 族 产生 不 同 基 因 产 物 , 称 为 剪接 变异 体 (splice variants) 或 剪接 异 构 体 (splice isoforms)。 选 择 性 剪接 以 多 种 方式 进行 (图 Sa (1) 通 过 选择 启动 子 删 去 $ 外 显 子 ; (2) 通 过 多 腺 苷 酸 位 点 选择 删 去 3 外 显 子 (上 两 种 情况 都 是 转录 水 平 的 调节 :不 同 的 。382 。 RNA 加 工 是 选择 使 用 转录 控制 元 件 的 二 级 结果 ); (3) 在 外 显 子 确定 中 对 外 显 子 $ 或 3“ 剪接 位 点 的 选择 ; (4) 对 外 显 子 5 或 3 剪接 位 点 的 选择 , 跳 过 一 个 外 显 子 ; (5) 外 显 子 的 互 斥 效应 (mutual exclusion) 。 这 些 过 程 都 是 RNA 加 工 水 平 的 调节 ,涉及 的 因子 在 下 文中 讨论 。 5 攻 一人 gzzCAESS 人 下 HE 一 一 一 gz 大 部 分 间断 基因 2 VS 2 0 JJ 的 adj 3 。 | VSNNNN 2 | _ KUN 如 人 类 的 免疫 球 蛋 白 重 链 2 一 一 欧 攻 ss 如 果 蝇 的 zra DNS 人 ES 一 5 2 如 果 蝇 的 wx 4 | NSSNSNN [| BANG 如 大 鼠 肌 钙 和 蛋白 T 的 基因 ? | YYJIJNNNN 2 [| BA 一 志 厅 网 因子 转 应 本 图 27.3 选择 性 剪接 的 形式 。 初 始 转录 本 和 剪接 途径 在 图 左 表示 ,成熟 的 转录 本 在 图 右 显示 。 外 显 子 以 方 框 表 示 ,内 含 子 以 水 平 线 表 示 。 折 线 表示 剪接 反应 ,不 同 的 剪接 显示 在 初始 转录 本 的 上 下 ,不 同 的 产物 在 相应 的 位 置 。(1) 组 成 型 剪接 ;(2) 果 蝇 乙 醇 脱 氢 酶 基因 选择 不 同 的 启动 子 产 生 不 同 的 基因 产物 ;(3) 免 疫 球 蛋 白 使 用 不 同 的 多 腺 苷 酸化 位 点 产生 分 这 和 跨 膜 形式 的 产物 ; (4) 果 蝇 性 别 转 换 基 因 (transformer)mRNA 选择 不 同 的 3 剪接 位 点 产生 有 功能 和 没有 功能 的 产物 ; 《5) 果 蝇 两 性 基因 (doublesex)mRNA 外 显 子 的 跳 过 产生 不 同 的 产物 ;(6) 大 鼠 肌 和 钙 蛋 白 T(troponin T) 基 因 外 显 子 16 和 17 的 互 斥 效应 产生 了 不 同类 型 的 产物 ; (7) 果 蝇 P 因子 转 座 酶 因 一 个 内 含 子 能 否 剪接 ,产生 了 有 功能 和 无 功能 两 类 mRNA, 此 可 被 看 作 一 种 单个 内 含 子 加 工 的 调节 或 丢失 调 节 。 选择 性 剪接 的 控制 如 上 文中 所 讨论 的 ,定向 剪接 是 由 UL snRNP 和 剪接 因 子 U2AF 以 及 与 其 相互 作用 的 SR 蛋白 起 始 的 。 选 择 性 剪接 机 制 将 这 些 剪接 因子 导入 前 体 mRNA 的 剪接 位 点 上 ,利用 特殊 的 剪接 位 点 或 通过 刺激 ,或 通过 抑制 来 起 作用 。 有 两 种 不 同 剪接 控制 方式 :一 种 持续 作用 ,取决 于 特殊 剪接 因子 的 量 ; 第 二 种 以 组 织 特异 的 方式 作用 ,涉及 特殊 的 剪接 控制 因子 。 数量 控制 机 制 常 发 生 在 利用 5 和 3 “位 点 作 不 同 的 剪接 。 例 如 对 SV40 TA 抗原 基因 的 差异 剪接 分 析 发 现 了 一 种 选择 剪接 因子 (ASF) ,是 与 组 成 型 剪接 因子 SF2 类 似 的 SR 蛋白 。 结 果 显 示 , 当 存在 选择 性 的 $ 剪接 位 点 时 ,高 浓度 的 ASFVSF2 倾向 于 使 用 近 侧 位 点 , 低 浓 度 则 倾向 于 使 用 远 侧 位 点 。 第 二 种 因子 ,hnRNPAIL 持 抗 SF2 的 作用 。 不 同 细胞 中 这 两 个 因子 相对 量 的 不 同 可 以 解释 细胞 类 型 专 一 性 的 剪接 异 构 体 。 当前 切 异 构 体 以 严格 的 细胞 类 型 特异 的 方式 产生 时 ,数量 模型 不 能 完全 解释 。 在 真 核 生物 中 有 很 多 这 类 的 例子 ,在 果 蝇 中 ,控制 性 别 决定 的 剪接 分 阶段 调节 可 能 是 最 明显 的 " 3838， 选择 性 调节 的 例子 (图 27.4)。 组 织 专 一 性 的 剪接 因子 通过 类 似 转录 调控 的 顺 式 作用 元 件 [ 剪 接 增强 子 (splice En repressors) ] 促 进 或 抑制 特殊 的 剪接 信号 。 在 果 蝇 中 用 遗传 分 析 发 现 了 组 织 专 一 性 的 剪接 调节 因子 ,更 多 的 这 类 机 制 在 哺乳 动物 中 被 发 现 , 包 括 限 于 心 胜 和 脑 的 蛋 日 SmN。 特殊 的 剪接 途径 ”异常 剪接 (aberrant splicing) 可 以 是 由 于 野生 型 基因 剪接 位 点 突变 或 新 的 剪接 位 点 的 产生 而 引起 的 。 隐 菩 的 剪接 位 点 是 弱 的 共有 位 点 ,通过 正常 位 点 的 缺失 1 2 3 杰 5 6 了 8 X:A 比率 高 外 显 子 3 被 跳 过 是 TT2 Te 可 57 可 怪 束 Tea FE5S SR 终止 密码 子 在 外 显 子 3 中 : 被 截 短 的 全 罗 由 SxL 倾向 于 远 端 的 9LLLsT4] CL2TaT14]cCcf 早 终止 Se 区 沿 区 滞 柜 风 区 声 区 轴 ，eA 图 27.4 有 果 蝇 的 性 别 决 定 。 性 别致 死 基因 (szxz ) 外 显 子 3 的 不 同 剪接 在 肉 性 中 产生 活性 蛋白 而 在 雄性 中 是 截 短 的 没有 功能 的 蛋白 。Sxl 是 促进 本 身 基 因 和 下 游 性 别 转换 (tra ) 基 因 剪 接 的 剪接 因子 。 在 Sxl 的 影响 下 ,za 的 mRNA 前 体 剪 接 倾向 于 远 端的 3 剪接 位 点 ,去 除了 会 引起 功能 失 活 的 2 号 外 显 子 ,Tra 也 是 剪接 因子 ,与 另 一 剪接 因子 Tra2 一 起 改变 了 两 性 基因 (dsz ) 雄 性 专 一 性 的 分 化 。 Sxl 产生 依赖 于 果 蝇 中 性 别 决 定 的 平衡 机 制 (参见 第 6 发 ? ) 此 显露 出 来 。 几 个 隐蔽 位 点 经 常 同 时 出 现 ,产生 多 种 异常 的 外 显 子 序列 缺失 或 内 含 子 保留 的 成 熟 转 录 本 。 很 多 形式 的 地 中 海 贫血 可 追踪 为 剪接 位 点 突变 而 产生 异常 球 蛋 白 的 转录 本 (参见 文 框 15.1)。 另 一 种 形式 的 特殊 剪接 是 反 式 剪接 (trans-splicing) ,使 不 同 RNA 的 外 显 子 被 连接 在 一 起 , 即 在 两 个 或 更 多 不 同 的 基因 的 初始 转录 本 (通常 剪接 应 该 是 顺 式 剪 接 ) 之 间 发 生 。 反 式 剪接 发 生 在 一 些 叶 绿 体 基因 组 中 ,分隔 的 基因 (参阅 ) 以 不 同方 向 ,分 散 排 列 的 外 显 子 的 形式 存在 (参见 细胞 器 基因 组 基因 )。 反 式 剪接 也 发 生 在 低 等 真 核 生物 的 细胞 核 基因 组 中 : 锥 虫 中 提供 了 一 个 极端 的 例子 ,同样 35 个 碱 基 的 拼接 前 导 RNA(spliced leader RNA, SL RNA) 通 过 加 工 加 在 所 有 的 mRNA 上 。 线 虫 中 有 22 碱 基 的 SL RNA 加 到 一 些 mRNA 上 ,包括 三 个 肌 动 蛋白 。 这 种 情况 下 ,可 选择 的 反 式 前 接 使 多 顺 反 子 的 mRNA 前 体 可 以 产生 多 种 形式 的 可 翻译 成 熟 转录 本 (参见 操纵 子 )。 通 常 , 反 式 前 接 的 引导 部 分 有 5 前 接 位 点 而 没有 3 受 体 位 点 ,3 端的 基因 有 上 游 不 配对 的 受 体位 点 。SL RNA 拥有 三 下 384 se 个 茎 环 和 单 链 区 的 二 级 结构 ,被 认为 与 UL snRNP 以 同样 的 方式 起 作用 。 感 冒 病毒 的 抢 帽 (参阅 ) 也 是 反 式 剪接 的 一 种 形式 。 27.4 RNA 编辑 RNA 编辑 ”在 大 多 数 情况 下 ,编码 蛋白 基因 的 信息 直到 翻译 并 不 改变 。 基 因 可 以 被 那 些 将 被 剪接 去 除 的 内 含 子 所 打 断 ,基因 的 信息 可 以 被 选择 性 的 使 用 ,信息 的 确切 意义 没有 改变 。RNA 编辑 (RNA editing) 是 改变 mRNA 外 显 子 信息 的 协同 转录 或 转录 后 的 机 制 。 这 过 程 主要 限于 细胞 器 基因 组 ,虽然 也 有 几 个 哺乳 动物 细胞 核 mRNA 的 局 部 编辑 的 例 子 。RNA 编辑 产生 的 基因 称 为 隐蔽 基因 (cryptogenes) :基因 产物 的 结构 不 能 从 基因 组 DNA 序 列 中 推导 得 到 。RNA 编辑 在 进化 中 的 作用 还 不 清楚 。 喀 啶 插 和 人 是 主要 的 编辑 过 程 ,因而 编辑 可 能 是 将 喀 啶 导 和 人 味 叭 丰富 序列 的 一 种 机 制 。 编 辑 能 够 产生 重要 的 功能 性 结果 ,如 在 哺乳 动物 中 它 决定 了 一 些 离子 通道 和 G 蛋白 偶 联 受 体 的 性 质 。 主 要 有 四 种 类 型 的 RNA 编辑 ( 表 27.4)。 表 27.4 四 种 RNA 编辑 机 制 编辑 过 程 性 质 举例 机 制 简单 编辑 单 碱 基 转 变 的 转录 后 “”C->U 转换 ,哺乳 动物 载 酯 蛋白 特殊 的 胞 喀 啶 脱 氨 酶 修饰 调节 A 一 G 转换 ,哺乳 动物 谷 氨 酸 受 ”由 双 链 RNA 脱 氨 酶 将 腺 味 叭 转 体 亚 基 和 5 - 羟 色 氮 受 体 。 编 变 成 次 黄 味 叭 。 发 现 三 个 基 辑 也 发 生 在 内 含 子 因 CU 转换 ,在 植物 细胞 器 中 不 清楚 插 人 编辑 插入 单个 核 苷 酸 或 少 “ 副 粘 病毒 P 基因 转录 时 G 的 插 ”转录 链 的 跳 格 量 核 苷 酸 的 丢失 , 协 人 同 转录 泛 编 辑 插 人 /缺失 多 个 尿 喀 啶 U 搬 人 /缺失 , 椎 虫 动 基体 编辑 序列 由 外 源 反 义 引 导 RNA 核 苷 酸 ,转录 后 mRNA( 参 见 动机 体 DNA) (gRNA) 提供 , gRNA 在 编辑 体 (editosome ) 核 蛋白 颗粒 中 与 前 编辑 mRNA 配对 ,鉴别 作为 错 配 的 位 点 进行 编辑 。 gRNA 有 多 尿 喀 啶 尾巴 , 提供 以 3 一 5 极 性 插入 的 尿 喀 啶 C 插 人 至 少 在 四 种 Phisarwm “不 清楚 插 人 多 个 胞 喀 喧 zolycetppalxzz 的 线粒体 mRNA 中 多 聚 腺 味 叭 编辑 在 转录 本 末端 加 腺 味 “并 椎 动物 线粒体 mRNA 的 多 聚 。 缺少 终止 密码 子 的 前 体 mRNA 叭 完 善终 止 密码 子 腺 苷 酸化 被 多 聚 腺 苷 酸化 ,由 第 一 或 第 二 个 腺 味 吟 提供 缺少 的 信息 泛 编 辑 详细 情况 可 参见 动 肌 体 DNA。 27.$ 后 加 工 调节 RNA 转运 和 亚 细 胞 定位 ” 真 核 生物 中 mRNA 在 细胞 核 合 成 ,必须 转运 到 胞 浆 中 进行 翻译 。 人 们 认为 RNA 加 工 复 合 物 被 限制 在 细胞 核 内 对 于 下 一 步 将 RNA 运输 出 核 孔 起 到 重要 作用 。 运 输 的 具体 机 制 还 未 完全 研究 清楚 。 目 前 知道 是 有 选择 地 转运 mRNP, 并 385 ， 需要 ATP 水 解 。5 端 帽子 对 转运 很 重要 (不 加 帽 的 转录 本 ,如 rRNA 和 U6 snRNA 不 被 转运 ) ,剪接 体 成 分 的 存在 阻 断 转运 (这 样 可 以 避免 对 部 分 被 剪接 的 转录 本 进行 翻译 )。 在 转运 前 ,一 些 hnRNP 蛋白 从 转录 本 上 被 切除 , 另 一 些 在 转运 过 程 中 解 离 下 来 ,返回 细胞 核 。 加 工 后 的 mRNA 离开 细胞 核 后 立即 与 核糖 体 结合 。 在 真 核 生 物 中 ,RNA 从 细胞 核 转运 过 程 是 潜在 的 调节 对 象 ,但 到 目前 为 止 只 有 病毒 RNA 是 以 这 种 方式 调控 。 研 究 的 最 清楚 的 是 HIV 基因 组 , 它 的 RNA 剪接 和 转运 由 Rev 蛋 自 和 内 含 子 中 顺 式 作 用 元 件 (Rev 相应 元 件 ) 调 控 。Rerv 似乎 帮助 结合 有 剪接 体 的 RNA 转运 ,并 人 允许 部 分 剪接 的 HIV RNA 转运 。 目 前 还 不 清楚 Rev 蛋白 是 如 何 避 免 正 常 细胞 对 这 种 转运 的 抑制 作用 (参见 文 框 30.3)。 一 旦 进入 细胞 质 ,mRNA 与 核糖 体 结合 就 可 以 自由 扩散 或 被 定位 于 细胞 内 某 一 特殊 区 域 。 部 分 被 翻译 的 编码 分 泌 蛋 白 的 转录 本 经 常 运输 到 粗 面 内 质 网 的 膜 附 近 ,这样 多 肽 可 以 被 易 位 入 这 种 细胞 器 的 腔 内 (参见 信号 肽 ) 。 这 依赖 于 多 肽 的 定位 信和 号 或 RNA 本 身 所 携带 的 信号 (RNA 导向 ,RNA targeting)。 某 些 转录 本 与 细胞 骨架 相 缔 合 , 定 位 于 细胞 的 特殊 区 域 。 后 者 在 动物 发 育 过 程 是 一 个 普遍 的 现象 , 它 提 供 了 在 卵细胞 中 作为 细胞 质 决定 (参阅 ) 的 定位 信和 号 的 机 制 ( 如 果 蝇 发 育 中 的 bicoid 和 zaxzos mRNA; 非 洲 爪 蟾 发 育 中 的 vg-1 的 mRNA)。 在 其 他 情况 下 ,定位 直接 与 功能 有 关 ( 如 成 肌 细 胞 分 化 中 = 肌 动 蛋 白 和 8B- 肌 动 蛋白 的 mRNA 定位) 或 对 细胞 的 生存 至 关 重 要 (如 艇 磷脂 基本 和 蛋白 翻译 的 错 误 定位 是 致死 的 )。 在 所 有 情况 下 ,定位 信和 号 都 被 发 现在 转录 本 的 3 非 翻 译 区 ,并 与 一 个 或 多 个 定位 所 需 蛋 白 结合 。 mRNA 更 新 ”特定 转录 本 的 丰 度 决定 于 它 的 合成 速度 和 稳定 性 ,稳定 性 反映 了 降解 速 度 。mRNA 的 稳定 性 决定 了 当 转 录 的 速度 改变 时 , 稳 态 的 mRNA 的 变化 情况 以 及 提供 用 于 蛋白 合成 的 量 。 如 同 其 他 基因 调节 一 样 ,RNA 的 稳定 性 可 以 是 不 变 的 也 可 以 是 被 调 节 的 。RNA 的 半衰期 (mRNA half-life) 也 就 是 mRNA 降解 速度 的 变化 ,可 以 快速 和 瞬时 改变 特定 mRNA 的 量 而 不 改变 其 转录 活性 。 细菌 中 的 mRNA 更 新 和 反 上 向 调节 ”细菌 mRNA 的 半衰期 较 短 ,大 多 数 稳定 的 转录 本 是 几 分 钟 , 这 样 可 以 通过 调节 转录 速度 使 蛋白 合成 速度 对 环境 作出 快速 反应 。 原 核 生物 mRNA 的 降解 由 RNA 内 切 酶 (也 称 为 RNA 限制 性 内 切 酶 ) 和 3 ' 一 5 外 切 酶 所 调节 。 mRNA 的 二 级 结构 是 决定 稳定 性 的 主要 因素 ,大 多 数 稳定 的 转录 本 在 3 端 非 翻 译 区 拥有 多 个 发 夹 和 荃 环 结构 ,保护 其 免 受 外 切 酶 作用 。 含 有 内 切 酶 作用 位 点 的 转录 本 特别 不 稳 定 。 尽 管 破坏 大 肠 杆菌 的 核 烽 核酸 酶 下 使 RNA 稳定 性 增加 2~3 倍 , 但 细菌 中 降解 RNA 的 酶 目前 还 不 得 而 知 。 细菌 中 转录 蛋白 合成 和 降解 的 紧密 关联 使 其 能 够 通过 称 为 反 向 调节 (retroregula- tion) 的 特殊 方式 进行 基因 表达 调节 ,RNA 降解 在 转录 终止 水 平 上 进行 调节 。 基 因 表 达 取 决 于 转录 的 基因 下 游 是 否 存在 顺 式 作用 元 件 。 如 果 存 在 ,新 生 的 RNA 的 结构 有 利于 快 速 降解 , 阻 断 翻 译 的 进行 。 如 果 转 录 在 这 一 位 点 前 终止 ,RNA 就 相对 稳定 ,蛋白 合成 得 以 进行 。 例 如 入 叭 菌 体 就 用 反 向 调节 控制 整合 酶 基因 的 表达 (参见 文 框 30.1)。 真 核 生物 mRNA 的 更 新 ” 真 核 生物 mRNA 比 细菌 转录 本 稳定 得 多 。 酵 母 mRNA 半 误 期 约 在 5 到 45 分 钟 ,后 生动 物 则 更 稳定 ,平均 在 10 小 时 左右 ,反映 了 多 细胞 生物 细胞 的 *。， 386 ， 环境 是 相对 稳定 的 。 哺 乳 动物 mRNA 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 和 维持 尾巴 长 度 的 PABP 结合 占 稳定 性 有 关 。 去 腺 苷 酸化 或 PABP 减少 时 哺乳 动物 细胞 mRNA 快速 降解 ,但 在 酵母 中 ， PABP 的 出 现 是 降解 的 信号 ,所 以 它 精确 的 作用 还 不 清楚 。 真 核 生物 中 外 切 酶 对 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 的 降解 是 mRNA 降解 的 第 一 步 。 没 有 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 的 组 蛋白 mRNA 为 特殊 的 内 切 酶 降解 。 有 证 据 表 明 真 核 细 胞 中 存在 内 切 酶 活性 。 一 些 真 核 生物 的 调节 和 蛋白 需要 瞬时 爆发 活性 ,所 以 它们 的 mRNA 与 细菌 转录 本 一 样 不 稳定 。 这 包括 很 多 立即 早期 基因 的 转录 本 ,这些 基 因 被 信号 传导 通路 诱导 ,需要 产生 短 期 的 调节 反应 (参见 c- jos ,c-jxwnz ; 见 细胞 周期 , 癌 基 因 和 癌症 ,信号 传导 各 章 )。 很 多 真 核 生物 不 稳定 的 mRNA 都 有 特殊 的 不 稳定 元 件 , 经 常 是 AU 丰富 元 件 (AUREs,AREs) ,如 多 拷贝 的 AUUUA 序列 ,一 般 在 3 非 翻 译 区 (如 白介素 1, 干 扰 素 B 和 c- jos 的 mRNA)， 也 有 的 位 于 编码 区 (如 B 微 管 蛋白 和 c-xzyc 的 mRNA)。 尽 管 这 些 不 稳定 性 所 依赖 的 机 制 还 不 清楚 ,AUREs 有 助 于 形成 葵 环 结构 的 能 力 说 明 影响 RNA 折 释 的 因子 可 能 调节 RNA 的 稳定 性 。 不 稳定 元 件 看 来 像 是 相对 独立 的 ,因为 当 它 们 插入 异 源 mRNA 的 3 “ 非 翻 译 区 时 会 引起 不 稳定 。 稳 定性 可 能 取决 于 二 级 结构 或 上 下 游 序 列 ,很 多 稳定 的 转录 本 中 发 现 了 相似 的 元 件 , 如 神经 元 专 一 性 的 烯 醇化 酶 mRNA。 少数 真 核 生物 mRNA 的 稳定 性 可 能 受到 与 不 稳定 元 件 结合 的 反 式 作用 因子 的 调节 。 在 细胞 内 离子 水 平 过 量 的 情况 下 , 运 铁 蛋 白 的 受 体 mRNA 发 生 降 解 。 据 推测 可 能 是 按照 上 述 组 成 型 不 稳定 转录 本 降解 调节 相同 的 过 程 进 行 。 当 离子 水 平 下 降 ,一 个 因子 结合 转录 本 铁 效应 元 件 (iron response element，IRE) 上 ,并 阻止 其 降解 。IREs 是 30 碱 基 的 基 序 ,形成 含有 不 稳定 元 件 的 葵 环 结构 。IRE 结合 蛋白 的 存在 被 认为 阻 断 了 不 稳定 元 件 。 在 其 他 转录 本 中 ,同样 的 IRE 用 来 调节 翻译 ( 见 第 23 章 蛋 白质 合成 )。 ( 陈 淳 译 ) .387 . 第 28 章 信号 传导 基本 概念 和 定义 细胞 通过 重新 组 织 它们 的 结构 、 调 节 和 蛋白 活性 和 改变 基因 表达 模式 来 对 环境 作出 反应 。 这 种 对 反应 的 刺激 称 为 信号 (signal) ,信号 可 以 是 小 分 子 \ 大 分 子 或 物理 试 剂 , 如 光 。 信 和 号 通过 称 为 受 体 (receptors) 的 分 子 与 反应 的 细胞 作用 。 小 分 子 经 常 以 可 扩散 的 信号 起 作用 。 在 单 细 胞 生物 体 中 ,可 扩散 的 信号 可 以 是 起 源 于 环境 或 由 其 他 细胞 释放 的 (如 酵母 的 交配 型 信息 素 、 网 柄 菌 属 (ZDic- tyosteliz7z ) 的 cAMP)。 在 后 生动 物 中 ,信号 可 以 从 邻近 的 细胞 中 释放 ,在 短 臣 离 上 传播 ( 旁 分 泌 信 号 ,paracrine signaling) ,或 者 由 远 处 的 细胞 分 泌 ,通过 血管 系统 达到 它们 的 目标 (内 分 泌 信 号 ,endocrine signaling)。 大 分 子 信 号 经 常 与 细胞 外 基 质 相 联 系 ,或 出 现在 邻近 细胞 的 表面 ( 近 分 泌 信 和 号 ,juxtacrine signaling)。 一 个 与 受 体 结合 的 信号 分 子 称 为 配 体 (ligand)。 信号 可 以 通过 三 种 途径 起 作用 。 某 些 化 学 信号 可 以 穿 过 细胞 质 膜 与 内 部 受 体 相 互 作用 (如 省 类 、 氧 化 氮 )。 大 多 数 信号 是 保留 在 细胞 外 的 亲 水 分 子 。 它 们 与 跨 膜 ( 穿 膜 的 ) 或 膜 相 关 受 体 作 用 ,引起 受 体 结构 的 改变 。 这 样 的 相互 作用 产生 信号 传 输 , 也 就 是 说 信号 分 子 内 化 ( 受 体 构 象 改变 或 产生 一 个 小 孔 引 起 的 运输 ,如 在 离子 通道 的 情况 中 或 通过 受 体 介 导 的 内 吞 )。 此 外 , 受 体 构象 的 改变 可 以 诱导 细胞 内 酶 的 活性 , 介 导 下 游 效 应 , 而 配 体 留 在 细胞 的 外 部 (信号 传导 , signal transduc- tion) 。 物 理 刺激 也 可 以 与 受 体 作 用 或 直接 调节 它们 的 效应 。 当 光子 引起 光敏 感 分 子 11 - 顺 式 视 黄 醛 改变 为 全 反 式 构象 , 光 刺 激 G 蛋白 与 视 紫 红 质 和 视 锥 蛋白 受 体 连 接 。 相 反 ,对 热 休 克 和 类 似 刺 激 的 反应 是 通过 细胞 内 变性 蛋白 的 增加 直接 介 导 的 。 信和 号 传导 涉及 顺序 酶 激活 和 称 为 第 二 信使 的 小 分 子 水 平 的 调节 。 这 样 使 原始 信 号 得 以 放大 (直接 扩散 和 信号 传输 只 是 线性 反应 )。 信 和 号 传导 途径 可 以 是 会 聚 的 或 分 散 的 ,使 多 种 刺激 产生 类 似 的 反应 或 单个 信号 产生 不 同 的 反应 。 进 一 步 的 分 散 由 对 刺激 长 度 和 强度 的 不 同 反 应 ,细胞 类 型 特异 合成 的 不 同 受 体 和 信和 号 分 子 而 产生 。 信 号 传导 途径 由 复杂 的 调节 网 络 控制 ,对 刺激 的 反应 决定 于 细胞 相反 力量 之 间 的 平衡 。 信和 号 的 交付 涉及 对 转录 因子 酶 和 细胞 结构 成 分 的 激活 或 抑制 ,这 经 常 是 通过 改 变 它们 的 磷酸 化 状态 来 达到 。 二 28.1 受 体 和 信号 途径 细胞 表面 的 受 体 和 它们 的 配 体 ”细胞 对 广泛 的 信和 号 反应 是 通过 同样 广泛 的 受 体 进 行 。 在 后 生动 物 中 ,很 多 信和 号 是 小 的 多 肽 。 短 距离 ( 旁 分 记 ) 作 用 的 多 肽 信和 号称 为 生长 因子 (growth factor) (或 在 造血 系统 中 为 细胞 因子 ) ,它们 可 根据 结构 或 功能 的 类 似 性 分 为 不 同 的 家 族 。 这 些 分 子 不仅 与 细胞 生长 有 关 ,而 且 与 分 化 .迁移 和 其 他 细胞 功能 有 关 。 激 素 是 分 泌 信号 分 子 , 其 中 很 多 是 类 似 生 长 因子 的 多 肽 ,但 也 有 大 的 糖 蛋白 激素 和 类 固 醇 激 素 ,后 者 能 够 直接 通过 细胞 质 膜 扩 散 ,与 细胞 质 或 细胞 核 内 的 受 体 作用 。 另 一 类 重要 的 多 肽 信号 分 子 是 神经 肽 (neuropeptides) ,它们 在 中 酌 和 外 周 神经 系统 介 导 神经 传导 和 神经 调制 。 细 胞 可 以 对 很 多 小 分 子 , 如 氮 基 酸 、 核 苷 酸 和 生物 活性 胺 ,和 细胞 外 基质 或 邻近 细 胞 表面 控制 细胞 运动 以 及 黏附 的 大 分 子 发 生 反 应 。 一 些 受 体 与 邻近 细胞 的 反 受 体 (con- tra-receptors) 结 合 ,这 样 细胞 间 的 相互 作用 诱导 了 交互 信和 号。 受 体 多 样 性 比 它 们 的 配 体 要 小 一 些 , 因为 细胞 反应 的 种 类 比 刺 激 少 一 些 。 这 样 很 多 刺激 可 产生 同样 类 型 的 反应 (生长 抑制 、. 生 长、 特定 基因 的 转录 ), 这 是 通过 将 很 多 信号 归 人 共同 的 途径 而 产生 的 。 这 样 ,任何 类 型 受 体 都 有 配 体 结 合 多 样 性 结构 域 , 但 是 受 体 作为 一 个 整体 可 以 归 和 少数 有 共同 效应 结构 和 信和 号 机 制 的 家 族 。 目 前 对 研究 人 员 来 说 一 个 问 题 是 为 何 有 如 此 之 多 的 看 来 是 起 同样 作用 的 受 体 亚 型 。 几 种 常见 受 体 家 族 的 结构 和 活性 在 下 面 将 作 讨 论 。 离子 通道 ” 离子 通道 是 细胞 膜 上 水 溶性 的 小 孔 ,它们 的 活性 通过 开放 和 关闭 控制 ,从 而 人 允许 或 阻止 离子 或 其 他 小 分 子 进 出 细胞 。 离 子 通道 在 缺乏 状态 时 是 关闭 的 ,对 特殊 信和 号 反应 后 开放 。 有 些 是 配 体 门 控 (ligand-gated) ,也 就 是 说 它们 对 特定 配 体 结 合 反 应 而 开放 [如 谷 氢 酰胺 和 7Y- 氮 基 丁 酸 (GABA) 受 体 ]。 其 他 受 体 特别 是 在 神经 元 中 发 现 的 是 电压 门 控 (voltage-gated) ,也 就 是 说 对 与 电位 作用 相关 的 电流 改变 作出 反应 而 开放 。 还 有 一 些 是 第 二 信使 门 控 (second-messenger-gated) 的 离子 通道 ,对 细胞 内 的 第 二 信使 ,如 钙 离 子 、 环 核 苷 酸 和 脂 ( 见 下 面 的 第 二 信使 ) 。 离 子 通道 允许 离子 沿 着 电化 学 梯度 正 向 移动 或 通过 活性 离子 泵 逆 梯 度 运动 ,后 者 需要 ATP 水 解 。 离子 通道 的 跨 腊 区域 包含 几 个 疏水 螺旋 (参阅 ) ,堆积 在 一 起 使 疏水 残 基 包 围 了 亲 水 残 基 。 有 些 离子 通道 是 多 个 类 似 结构 域 组 成 的 单个 大 分 子 。 另 一 些 是 多 亚 基 蛋 白 。 神 经 传递 - 门 控 离 子 通道 已 被 细致 地 分 析 , 包 含 了 五 个 类 似 的 亚 基 ,其 中 每 个 都 有 四 个 螺旋 的 跨 膜 结构 域 。 四 个 螺旋 中 的 一 个 是 双亲 性 的 ,通道 的 小 孔 是 由 每 一 亚 基 的 双亲 性 的 螺旋 排列 而 成 。 离 子 通道 的 开放 和 关闭 由 门 控 机 制 (如 配 体 结合 或 电压 改变 ) 刺 激 产 生 构 象 变 化 来 调节 。 小 孔 进口 处 带电 残 基 的 特定 排列 控制 了 通道 的 离子 选择 性 。 G -蛋白 - 偶 联 受 体 ”G 蛋白 偶 联 受 体 (GPCRs) 是 中 心 疏 水 区 域 形 成 七 次 跨 膜 结构 域 的 单个 多 肽 。 在 外 部 ,N - 端 结构 域 经 常 是 配 体 结合 结 构 域 , 尽 管 有 些 配 体 与 膜 结 构 域 结合 。 在 内 部 ,C 端 区 域 与 三 聚 体 鸟 味 吟 核 苷 酸 结合 蛋白 (G 蛋白 ) 相 结合 。 数 百 个 GPCRs 的 基 因 被 克隆 和 分 析 。 证 明 这 些 受 体 对 应 它们 配 体 的 多 样 性 的 显著 保守 性 ,它们 的 配 体 包括 小 分 子 物 质 , 如 肾上腺 素 和 5 - 产 色 胺 ,如 胰 高 血糖 素 、 神 经 激 肽 阿片 样 物 质 的 多 肽 和 像 389 ， 促 卵 泡 激 素 的 大 分 子 糖 蛋白 。 进 而 有 些 GPCPs 可 以 被 增 味 剂 和 光线 刺激 。GPCPs 也 是 广泛 分 布 的 一 二 有 上 百 种 养 椎 动物 受 体 被 发 现 ,GPCPs 与 酵母 交配 型 信号 传导 有 关 , 对 网 柄 菌 属 的 cNMP 的 反应 ， .397 ， 而 环 核 苷 酸 磷酸 脂 酶 (PDEs) 催 化 反 向 反应 。 几 种 早期 信号 途径 影响 核 苷 酸 环 化 酶 的 活 性 。G 蛋白 偶 联 受 体 的 G. 和 Gi 家 族 刺 激 和 抑制 腺 苷 酸 环 化 酶 ,相反 传导 素 (Gt) 刺 激 cGMP PDE 活性 。 少 数 细 胞 表面 受 体 有 内 在 的 乌 苷 酸 环 化 酶 活性 。 氧 化 氮 经 亚 铁血 红 素 结合 后 也 有 受 体 鸟 苷 酸 环 化 酶 活性 。 环 核 苷 酸 下 游 是 活性 依赖 于 环 核 苷 酸 的 效应 分 子 :依赖 于 cAMP 的 蛋白 激酶 A(PKA) 和 依赖 于 cGMP 的 蛋白 激酶 G(PKG) ,它们 是 具有 多 种 不 同 底 物 的 丝氨酸 / 苏 氢 酸 激酶 ( 见 下 文 )。 也 有 环 核 苷 酸 门 控 (cyclic nucleotide-gated) 的 离子 通道 和 涉及 环 核 苷 酸 依赖 的 PDEs 的 反馈 途径 。 其 他 PDEs 通过 磷酸 化 或 钙 调 蛋 白 ( 见 下 文 的 钙 信 号 ) 被 调 节 。 细 胞 中 对 环 核 苷 酸 水 平 的 控制 在 图 28.4 中 总 结 。 应 答 cNMP- 依 赖 性 离子 通道 受 体 和 胞 质 的 | 多才 环 化 本 ATP AMP 温 Ge er N cAMP cGMP ss 惑 汪 证 让 陛 图 28.4 环 核 苷 酸 第 二 信使 。 腺 苷 酸 环 化 酶 合成 AMP 受到 G 蛋白 w 亚 基 刺激 而 被 G 蛋白 亚 基 抑 制 (By 亚 基 也 可 能 影响 AC 活性 );cAMP 被 lns(145)P3 + DAG el | ee Ptdins(3)P 一 对 要 JP -一 一 一 Ptdlins(34.5)P3 -加 i os 应 等 臣 Ta Ca2+ co = 应 答 Ins(1 ;4.5) P3 让 门 控 离 子 通 道 Ca 半 + 图 28.5 细胞 中 磷脂 和 和 钙 离 子 第 二 信使 。 磷 脂 酶 CCOPLC) 将 脂 膜 成 分 PtdIns(4,5)P, 转换 成 肌 醇 - 1,4,5- 三 磷酸 [Ins(1,4,5)P3] 和 1,2 二 酰 甘 油 (DAG)。 不 同形 式 的 PLC 被 Gq 蛋白 和 激活 受 体 和 非 受 体 激酶 的 磷酸 化 残 基 刺激 。Ins(1,4,5)Ps 激活 内 质 网 (ER) 膜 上 Ins(1,4,5)P3 依赖 的 钙 离子 通道 释放 钙 离 子 进入 细胞 质 , 与 此 同时 DAG 激活 磷酸 激酶 CC(PKC)。PKC 有 很 多 底 物 ,包括 磷脂 酶 DIPLD)。Ca:* 与 钙 调 蛋白 (CaM) 结 合 ,激活 Ca /CaM 依赖 激酶 。 磷 脂 酰 肌 醇 (PtdIns) 能 够 在 几 个 位 置 上 磷酸 化 ,并 且 五 种 磷酸 化 衍生 物 可 以 相互 转换 。 磷 酸 肌 醇 3 -激酶 [PI(3)K] 在 3D 位 置 上 加 上 磷酸 基 团 ,起 始 一 系列 下 游 反 应 。 这 个 过 程 被 3 -磷酸 酶 (3- P) 逆 转 。 Ins(1,4,5)P3 通过 激活 Ins(1,4,5)P3 门 控 的 钙 离 子 通道 , 介 导 钙 离 子 从 内 质 网 或 肌 质 网 中 释放 (参见 钙 离 子 信 号 ,下 文 )。 这 样 的 效果 可 以 被 离子 载体 模拟 : 离子 载体 如 A23187 , 像 持 续 开放 的 钙 离 子 通道 一 样 起 作用 。 有 些 Ins(1,4,5)P; 可 以 进一步 磷酸 化 为 肌 醇 = 1,3,4,5 -四 磷酸 [Ins(1,3,4,5)P4], 其 效应 仍 是 未 知 的 。Ins(1,4,$)P3 还 可 以 与 不 同 蛋 白 特异 性 作用 ,包括 磷脂 酶 C8 和 SOS, 起 始 不 同 的 信号 级 联 。DAG 与 钙 以 及 其 他 膜 磷脂 磷脂 酰 丝 氨 酸 形成 化 合 物 激活 一 系列 钙 依 赖 蛋白 激酶 (PKC) 的 同 工 酶 。 这 种 效 果 可 以 被 植物 衍生 的 直接 激活 PKC 的 佛 波 酯 (phorbol esters) 所 模拟 。 至 少 有 11 种 PKC 的 同 工 酶 ,根据 结构 域 结构 分 成 四 种 主要 家 族 。 它 们 在 细胞 中 是 根据 细胞 类 型 特异 性 和 分 化 分 布 的 。 基 因 敲 除 `. 过 量 表达 和 选择 性 抑制 的 研究 表明 它们 有 重 秋 的 底 物 特异 性 ,在 不 同 的 细胞 中 有 不 同 的 调节 效果 ,但 这 样 的 研究 破坏 了 体内 亚 细 胞 定位 ,对 确定 生理 状态 下 每 种 酶 的 特异 性 目标 分 子 有 困难 。PKC 的 一 个 底 物 是 磷脂 酶 D(PLD) ,PLD 通过 末端 磷酸 二 脂 键 水 解 膜 磷脂 ,产生 磷脂 酸 (PLD 也 可 以 被 G 蛋白 激活 )。 另 一 个 细胞 内 脂 类 信和 号 体系 涉及 磷脂 酰 肌 醇 在 D3 位 置 的 磷酸 化 。 磷 酸 肌 醇 3 - 激 酶 [PI(3)K] 在 碱 性 的 PtdIns 和 PtdIns(4)P、PtdIns(4,$)P, 加 上 D3 磷酸 基 团 产生 PtdIns "399 ， (3)P、PtdIns(3,4)P, 和 PtdIns(3,4,5)P3( 图 28.5); 有 三 类 PI(3)K 使 用 不 同 磷 脂 酰 肌 醇 作为 底 物 。 这 些 脂 类 在 未 刺激 的 细胞 中 很 少 , 但 在 细胞 外 信号 和 肿瘤 转化 后 积累 。 它 们 特异 地 或 以 不 同 亲和力 与 很 多 下 游 效 应 分 子 结合 ,将 其 转移 到 膜 ,起 始 第 二 信和 号 级 联 反 应 。PtdIns(3,4,5$)P; 可 能 是 这 些 第 二 信使 中 最 重要 的 : 它 通 过 SH 和 PH 结构 域 与 多 个 靶 分 子 作 用 (如 Src、PI(3)K ,磷酸 激酶 Cs 和 入 同 种 型 (和 isoforms) ,以 及 特异 性 的 PtdIns (3,4,5)P; 依赖 蛋白 激酶 PDK-1 和 PDK-2)。PtdIns(3,4)P, 靶 分 子 与 PtdIns(3,4,5)Ps; 重 释 ,但 PtdIns(3)P 表现 出 与 蛋白 运输 有 关 的 衔接 蛋白 的 特异 性 结合 。 自 类 第 二 信使 也 可 以 在 细胞 间 传 递 信 号 。 磷 脂 酶 A2 合成 花生 四 烯 酸 和 溶血 磷脂 ， 它们 是 细胞 内 第 二 信使 。 然 而 它们 也 调节 了 前 列 腺 素 和 白 三 烯 的 产生 。 有 九 种 不 同类 型 的 前 列 腺 素 , 由 很 多 不 同 的 细胞 类 型 合成 和 分 泌 。 它 们 以 旁 信号 起 作用 ,而 不 像 大 多 数 脂 类 信和 号 蛋白 ,与 细胞 表面 的 受 体 结合 。 作为 第 二 信使 的 钙 离子 ”细胞 内 钙 离子 水 平 由 不 同 的 过 程控 制 ,包括 代谢 过 程 . 生 长 和 像 膜 兴奋 和 肌肉 收缩 等 特殊 功能 。 钙 离子 信号 途径 涉及 被 钙 离子 激活 的 钙 离 子 结合 蛋 白 , 它 与 非 活性 形式 蛋白 相 结合 ,并 刺激 它们 而 影响 许多 下 游 途径 。 细 胞 质 中 Ca 水平 通过 外 运 保持 在 较 低 的 水 平 , 但 在 细胞 外 和 特定 的 细胞 内 间隔 中 有 其 10000 倍 的 浓度 。 从 细胞 表面 起 始 的 上 游 信 号 通过 开放 钙 离子 通道 诱导 Ca 释放 进入 细胞 质 中 ,这样 增加 激活 的 钙 离子 结合 蛋白 的 量 ,诱导 下 游 信号 途径 ( 表 28.5)。 刺 激 钙 离子 释放 的 两 个 主要 途径 是 G 蛋白 偶 联 受 体 相 关 Gu 家 族 蛋白 和 RTK。 这 些 受 体 都 刺激 增加 Ins(1,4,5)Ps3 的 磷脂 酶 (图 28.5) ,导致 ER 膜 上 Ins(1,4,3$)P3 门 Ca 通道 的 开放 。 表 28.5 ”细胞质 中 钙 离 子 水 平 的 调节 Ca2+* 运输 调节 因子 从 细胞 外 空间 运 和 人 在 膜 去 极 化 后 ,电位 门 Caz+ 通 道 释放 Ca2+ 进入 细胞 在 配 体 结合 后 (如 NMDA 受 体 ) , 配 体 门 Ca 通道 释放 Ca 进入 细胞 CRAC 通道 ( 钙 离 子 释放 激活 Ca 通道 被 从 ER 中 释放 的 Ca 激活 ) 从 ER/SR 运 人 Ins(1,4,5$)P3 门 通道 Ryanodine 受 体 通过 NAD+* 衍生 环 腺 苷 二 磷酸 核糖 (CADPR ) 的 激活 释放 Ca Ca 通过 激活 上 述 通 道 释放 Ca2+ 运 出 Na / Ca 和 交换 一 一 用 顺 电化 学 梯度 运输 Na+ 的 能 量 逆 电 化 学 梯度 外 运 Ca2+ 细胞 质 和 ER/VSR 上 的 Ca2z+ ATP 酶 从 细胞 质 中 外 运 Ca2+ 细胞 质 中 有 很 多 不 同 的 针 离 子 结合 蛋白 。 尽 管 大 多 数 起 缓冲 作用 (减低 细胞 质 中 Ca 浓度 的 另 一 机 制 ), 有 些 是 作为 钙 离 子 调节 和 信和 号 蛋白 作用 。 膜 联 蛋 自 (annexins) 是 钙 离 子 依赖 膜 结合 蛋白 ,可 以 改组 细胞 骨架 的 因子 ;它们 也 抑制 磷脂 酶 A2。 主 要 的 调 节 钙 离子 结合 蛋白 属于 EF-hand 超 家 族 ( 见 蛋白 质 :结构 、 功 能 和 进化 ) ,以 及 钙 调 蛋 自 (calmodulin，CaM) 和 肌 和 钙 蛋 白 C。CaM 是 普遍 存在 和 多 功能 的 蛋白 , 肌 钙 蛋白 C 是 肌肉 特异 性 的 ,在 肌肉 收缩 时 控制 肌 动 蛋白 和 肌 球 蛋白 的 相互 作用 。CaM 激活 许多 蛋白 激酶 (CaM 激酶 开 、 延 伸 因 子 激 酶 ), 磷 酸 酶 ( 钙 调 磷酸 酶 ) 和 细胞 骨架 因子 ,并 且 还 激活 Ca 1) 一 类 被 钙 离子 活化 后 可 与 膜 磷脂 结合 的 蛋白 ,参与 膜 转 运 及 膜 表 面 其 他 一 系列 依赖 于 钙 调 蛋白 的 活动 ,分 为 IT , I , 焉 … 等 多 种 。 其 中 膜 联 蛋白 [ 即 脂 皮 质 蛋 白 ](lipocortin I ) , 膜 联 蛋白 I 即 依 钙 结合 蛋白 (calpactin ) , 膜 联 蛋 白 IV 即 内 联 和 蛋白 (endonexin), 膜 联 蛋白 V 即 内 联 蛋 昌 工 或 锁定 蛋白 (anchorin) , 膜 联 蛋白 人 即 钙 磷 脂 结合 蛋白 (cal- phobindin) 或 钙 电 蛋白 (calelectrin) , 膜 联 蛋白 灵 即 会 联 蛋 白 (synexin) , 膜 联 蛋白 难 即 会 联 蛋 白 工 。 一 一 译 者 注 *， 400 ， ATP 酶 ,促进 Ca 从 细胞 质 中 移出 。CaM 也 与 其 他 第 二 信使 系统 的 成 分 作用 ,包括 腺 苷 环 化 酶 .IP(3)K 和 和 氧化 氨 合 成 酶 。 串 话 ”” 几 个 得 到 细致 研究 的 信号 途径 和 第 二 信使 系统 在 以 上 章节 中 已 被 阐述, 但 正如 所 讨论 的 ,途径 之 间 有 广泛 的 相互 作用 ,因此 一 个 刺激 可 以 激活 细胞 中 几 个 途径 ,而 不 同 的 信号 可 以 产生 相同 的 效果 。 这 可 以 几 种 机 制 发 生 。 (1) 受 体 - 配 体 混 杂 , 配 体 激活 多 个 受 体 或 多 个 配 体 激 活 相 同 的 受 体 ,或 者 受 体 包含 多 种 不 同 信 和 号 特异 性 的 多 聚 体 。 (2) 分 歧 , 受 体 的 刺激 激活 两 个 平行 的 途径 。 一 个 例子 PITK 活性 对 Ras-Raf-MAP 激 酶 途径 和 磷脂 酶 CY[ 增 加 第 二 信使 Ins(1,4,5)P; 和 DAG 水 平 ] 的 激活 。 这 通过 不 同 信 号 分 子 所 拥有 的 结构 域 调 节 ,在 所 举例 子 中 是 SH2 结构 域 与 激活 受 体 作用 。 (3) 串 话 (cross-talk) ,是 一 个 途径 的 分 支 与 另 一 个 途径 作用 (图 28.6)。 细 胞 中 所 有 主要 的 信号 途径 都 使 用 蛋白 激酶 和 磷酸 酶 。 它 们 之 间 有 大 量 的 相互 作用 ,如 蛋白 激酶 A 被 G 蛋 白 激活 ,调节 增加 cAMP 水 平 , 灭 活 Ras。 相 反 蛋 白 激酶 C 是 钙 离 子 依赖 的 ,刺激 Ras。 细 胞 中 主要 的 第 二 信使 系统 也 是 相互 依赖 的 :Ins(1,4,5)P3 诱导 钙 离 子 从 ER 中 转 运 ,DAG 与 钙 离 子 一 起 激活 蛋白 激酶 C。 钙 离子 依赖 分 子 CaM 调节 PI(3) 激 酶 和 腺 苷 环 化 酶 活性 ,它们 分 别 再 控制 Ins(1,4,5)P; 和 cAMP 水 平 。cAMP 可 以 激活 离子 通道 , 因 此 影响 细胞 质 中 Ca 水 平 。 核 内 的 转录 调节 图 28.6 信和 号 途径 中 串 话 的 举例 。MAP 激酶 途径 可 以 被 RTK 信和 号 通过 Ras 和 Raf 激活 ,但 Ras 也 可 以 通过 由 钙 离 子 调节 的 细胞 因子 受 体 和 和 蛋白 激酶 C 的 串 话 被 激活 。 有 些 RTK 也 可 以 直接 调节 STAT( 如 EGF 受 体 )。Ras 被 蛋白 激酶 A(PKA) 灭 活 ,PAK 被 Lindahl, T, Karran, P and Wood, RD. (1997) DNA excision repair pathways. CU Opin， Genet. De 7: 158--169. Modrich P and Lahue, R. (1996) Mismatch repair in replication fidelity，genetic recombination and cancer biology. AI. Re Biocheml. 65: 101-133. Sancar A. (1996) DNA excision repair， Am ，Rev, Biochem. 65: 43--81. Walker G.C. (1995) SOS-regulated Proteins in transle- sion DNA synthesis and mutagenesis，Trends Bioche. Sci 20: 416-420. Wood, R.D. (1996) DNA repair in eukaryotes. 4， Rew. Biochemt. 65: 135--167. 第 1S$ 章 突变 与 选择 Mutation and Seliection 参考 文献 Cooper DN. and Krawczak, M. (1993) 刀 wmmamn Gene Mutation. BIOS Scientific Publishers, Oxford. Humphries, S. and Malcolm, S. (1994) From Gemrotype 推荐 读物 Britten,，R.J. (1986) Rates of DNA sequence evolution differ between taxonomic groups，3ciemrce 231: 1393-1398. Cao，A.，Galanello，R. and Rosatelli，M.C. (1994) Genotype-PhenotyPe ”correlations in B-tha- lassemias, Bljood Rev. 8: 1-12. Drake, J].W. (1991) Spontaneous mutation. 4mmu. Rev Geret. 25: 125--146. Miller J.H. (1983) Mutational specificity in bacteria. 4 Ren. Gertet. 17: 215-238. Patel，PI. and LuPski，]J.R. (1994) Charcot-Marie- Tooth disease 一 a new Paradigm for the mecha- nism of inheiited disease. Trends Genet. 10: 128-133. 第 16 章 to Phenotype. BIOS Scientific Publishers, Oxford. Li，W.-H. and Grauer D. (1991) Fundarzentals of Molecujar Evolutionm. Sinauer Sunderland, MA. Richards，R.I. and Sutherland，G.R. (1997) Dynamic mutation: Possible mechanisms and significance in human disease. Trends Biocjhermm. Sci 22: 432 一 436. Sniegowski, PD. and Lenski, R.E. (1995) Mutation and adaption 一 the directed mutation controversy in evolutionary Perspective， Am，Ren，Ecol. Systemzatics 26: 553-578. Spencer D.M. (1996) Creating conditional mutations in mamrmals. Trends Cenet 12: 181-187. Wagner S.D. and Neuberger M.S. (1996) Somatic hypermutation of immunoglobulin genes、A4IzL. Re Ji11U1OL. 14: 441 一 457. 核酸 结构 Nucleic Acid Structure 参考 文献 Blackburn，G.M. and Gait，M.J. (eds) (1996) Nucleic Acids 唐 Chemristry and Biology Oxford University .447 . Press, Oxford. Dickerson，R.E. et 4l. (1989) Dehinitioms amd momtertcla- ture of nucleic acid structure Parameters, EMBO 厂 8: 1 一 4. Kornberg, A. and Baker IT.A. (1992) DNA structure and function. In: DNA Replication， 2nd edn，PP. 推荐 读物 Doudna,，]J.A. and Cate，J.M. (1997) RNA structure: crystal clear? Curr. Op. Struct. Biol. 7: 310-316. Eaton，B.E. and Pieken，W.A. (1995) Ribonucleosides and RNA. 4rmm. Re Biocherrz. 64: 837--863， Frank-Kamenetskii，M.D. and Mirkin，S.M， (1995) Triplex DNA structures， AU，Reu，Biochemt，65: 65-95. Jaeger J.A.，Santa-Lucia，]J. and Tinoco，I. (1993) Determination of RNA structure and thermody- namics. 477UV. Re Biochemt. 62: 255--287. Lebrun, A. and Lavern R. (1997) Unusual DNA con- formations. Curr Op. Struct. Biol. 7: 348-354. Roca，]J，(1995) The mechanisms of DNA topoiso- merases. Tyrertds Biochem. Sci. 20: 156-160. Scott W.G. and Klug, A. (1996) Ribozymes 一 struc- ture and mechanism in RNA catalysis，Trerds Biocjhem. Sci 21: 220-224. 1-52. W.H. Freemam New York. Rich, A. et al (1984) The chemistry and biology of left- handed Z-DNA. 4xrmu. Re Biocjerm. 53: 791-846. Yang, Y，Westcott, TP, Pedersen, S.C., Tobias, LI. and Olson，W.K. (1995) Effects of localised bending on DNA supercoiling. Trerds Biochem. Sci. 20: 313-319. Stark，W.M. and Boocock，M.R. (1995) Topological selectivity in site-specific recombination. In: Mobite Genefic Elemtentts: Fromttiers 加 Molecylar Biology (ed. D. Sherratt) PP. 101-129. Oxford University Press, Oxford Strobel，S.A. and Doudna,，J.A. (1997) RNA seeing double: Close-Packing of helices in RNA tertiary structure. Trentds Biocheml. 5ci. 22: 262-266. Travers, A.A. (1995) DNA bending by sequence and Proteins.，In: DNA Protein: Structural JPmteractioms: Frontfiers 训 Molecviar Biology (Lilley D.MJ. ed). Oxford University Press, Oxford, PP. 49-75. Weeks,，K.M. (1997) Protein-facilitated RNA folding. CuYrr Op. Struct, Biol. 7: 336-342， 第 17 章 ”核酸 结合 蛋白 Nucleic Acid-Binding Proteins 参考 文献 Latchman, D.9. (1995) Evaryotic Transcriptiomn Factors. 2nd Edn1. Academic Press London. Liley ”D.， (ed.) (1995) DN4-Proteinm: Structural Jnteractions: Fromtiers 训 Molecujar Biology， Oxford University Press, Oxford. Nagai，K. and Mattaj，I， (eds) (1995) RNA4-Proteim 推荐 读物 Burley S.K.，Xie，X.，Clark,，K.L. and Shu，F. (1997) Histone-like transcription factors in eukaryotes. CuMrr. Opin. 5truct Biol. 7: 94--102. Choo, Y and Klug, A. (1997) Physical basis of a Pro- tein-DNA recogmnition code. CUrr Opin. Struct. BiolL. 7: 117-125. Chytil M. and Verdine, G.L. (1996) The Rel family of eukaryotic transcription factors.， CU7r OPinm. Struct Biol. 6: 91-100. Harrisom, S.C. (1991) A structural taxonomy of DNA- binding domains, Nature 353: 715-719. Nagashi，K. (1996) RNA-Protein comPlexes，Curr OPpin. Struct, Biol. 6: 53--61. Pabo，C. and Saur R.IT. (1992) Transcription factors: structural families and Principles of DNA recogni- tion. Am. Re Biocjhem. 61: 1053--1095. Raumann，B.E.，Brown，B.M. and Sauer R.T (1994) Major groove DNA recognition by 及 sheets: the "， 448 Jnteractions: Fromtiers 加 Molecujar Biology， Oxford University Press, Oxford. Ptashne, M. (1992) 4 Gemetic Srwitci PhageAand Figjer Orga1tisms，2mnd Edn， Cell Press，MA/V/Blackwell Science, MA. ribbon-helix-helix family of gene regulatory Pro- teins. CU Opin. 9truct Biol. 4: 36--43. Rhodes, D., Schwabe, ].WR., Chapmam, L and Fairall， L. (1996) Towards an understanding of Protein- DNA recognition. Pjoil. Trans. R. Soc. 351: 501--509. Schwabe, ].W.R. (1997) The role of water in Protein- DNA interactions，CUrr Opin，Struct， Biol，7: 126-134. Siomi, H. and Dreyfuss, G. (1997) RNA-binding Pro- teins as regujators of gene expression. CUrr OPiior. Genet Dev. 7: 345-353. Suzuki, M. (1993). Common features in DNA recogni- tion helices of eukaryotic transcription factors. EMBO 人 12: 3221-3226. Suzuki， M. and Giraldo，R. (1995) Zipperless bZips and zipped homeodomains. Proc. Jpn Acad. Sci. 71: 39-44. | 第 18 章 瘤 基因 与 瘤 Oncogenes and Cancer 推荐 读物 Bishop, J.M. (1995) Cancer 一 the rise of the genetic Paradigm. Cenes Dev. 9: 1309-1315. Herschman，H.R. (1991) Primary resPonse genes induced by growth factors and tumour Promoters. AU. Rew Biocjhem. 60: 281-319. Hunter T and Karin, M. (1992) The regulation of tran- scription by Phosphorylation. Cell 70: 375-387- Jacks, T. (1996). Tumor suPPressor gene mutations in mice. AM. Rew Gentet 30: 603-636. Lees, E.M. and Harlow, E. (1995) Cancer and the cell cycle. In: Cell Cycle Comtrol: Frontiers 到 Molecular Biology (eds C. Hutchinson and D.M. Glover), PP. 228-263. Oxford University Press, Oxford . Lowy D.R. (1993) Function and regulation of Ras. Al. Re Biochemm. 62: 851-891. Milner ]J. (1995) Flexibility 一 the key to p53 function Trends Biocjem. 9ci. 20: 49-51. Sherr C.J. and Roberts, J.M. (1995) Inhibitors of mam- malian Gl cyclin-dependent kinases. Cenes Dev, 9: 1149-1163. Vaux, D.L. and Strasser A. (1996) The molecular biol- 08gy of apoptosis. Proc， Natl.， Acad. Sci，1U5A4 93: 2239-2244. Weinberg, R.A. (1996) E2F and cell Proliferation 一 a world turned upside-down. Cell 85: 457 一 459. Weinberg, R.A. (1997) The cat and mouse games that genes, viruses, and cells Play. Cel 88: 573--575. Zhang，C-C. (1996) Bacterial signalling involving eukaryotic-type Protein kinases. Mol， Microbiol. 20: 9%15: 第 19 章 细胞 器 基因 组 Organelle Genomes 参考 文献 Clayton, D.A. (1992) Int Reu Cytol. 141: 217-232. 推荐 读物 Larrson，N.G. and Clayton，D.A. (1995) Molecular- genetic aspects of human mitochondrial disorders. IT. Re Cenet. 29: 151--178. Mattson, M.P (1997) Mother's legacy: Mitochondrial DNA mnutations and Alzheimer's disease， Trends Neurosci. 20: 373-375. Shadel, G.S. and Clayton, D.A. (1997) Mitochondrial DNA _ maintenance in vertebrates，A477U，Rev. Biochem. 66: 409-435. Stern，D.B.，Higgs，D.C. and Yang，J.J，(1997) Transcription and translation in chloroplasts. Tyrends Plant Sci 2: 308-315. 第 20 章 ”质粒 Plasmids 推荐 读物 Eguchi Y, Itoh, T. and Tomizawa, J. (1991) Antisense RNA. 47rmu. Rev. Biocherm. 60: 631-652. Hiraga, 9. (1992) Chromosome and Plasmid Partition in E. coji. AL. Re Biochem. 61: 283-306. Kornberg，A. and Baker TA, (1992) Plasmids and organelles，In: DNA4 Replicationm (2nd edr)，PP. 637-689. W.H. Freeman, New York. Nordstrom K. and Austin, S.J. (1989) Mechanisms that contribute to the stable segregation of Plasmids. AI. Re Genet. 23: 37--69. Summers，D. 玉 (1996) Piasrmid Biology， Blackwell Science, Oxford. 第 21 章 ， 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR) The Polymerase Chain Reaction (PCR ) 参考 文献 Innis M.A., Gelfand, D.H., Sninsky JJ. and White, TJ. (eds) (1990) PCR Protocols. 4 Guiae io Metjpods and .449 ， Applicationrs. Academic Press, San Diego CA. McPherson, M.P and Hames, B.D. (eds) (1995) PCR 2: 4 Practical 4pproach. IRL Press, Oxford. 推荐 读物 Audic, S. and Beraud-Colomb, E. (1997) Ancient DNA is 13 years old. Natttre Biotech. 9: 855-858. Caetanoanolles, G. (1996) Scanning nucleic acids by zm zitro ampPlification 一 new developments and apPli- cations. Nature Biotech, 14: 1668--1674. Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1992) Cenetic analysis Using the Polymerase chain reaction. AL，Rev Genet 26: 479-506. Jansson, JJK. and Prosser J.I. (1997) Quantification of the Presence and activity of specific microorganisms in nature. Mol. Biotecji. 7: 103-120. MecClelland, M., Mathieudauda, F and Welsh, J. (1995) RNA fingerprinting and diffterential disPlay using arbitrarily Primed PCR. Trends Cenet. 11: 242-246. Nanda, 95K. and Jain, S.K. (1995) In vitro nucjleic acid amplification systems. CUMrr 95c1L. 66: 421-429. Ohan，N.W. and Heikkila，J.J. (1995) Reverse tran- scription Polymerase chain reaction 一 an Overview of the technique and its apPlications. Biotech. 4dv. 11: 13-29. McPherson，M.P，Quirke，P and Taylor G.R. (eds) (1991) PCR: 4 Practical 4pproach. IRL Press, Dxford. Pena, S.D.J. and Chakraborty R. (1994) Paternity test- ing in the DNA era. Trends Gernet 10: 352-356. Powell]，W.，Machray，G.C. and Provan，J.， (1996) Polymorphism revealed by _ simple sequence repeats. Terds Plant 95ci. 7: 215-222. Register J.C，(1997) APProaches to evaluating the transgenic status of transformed Plants，Trends、 Biotech. 15: 141-146. ReischlU. and Kochanowski，B. (1995) Quantitative PCR 一 a Survey of the Present technology。 Mol. Biotech. 3: 55-71. Sagerstrom，C.G.，Sun，B.I, and Sive，H.L. (1997) Subtractive cloning: Past, Present and future..A77ML. Rev. Biochemt. 66: 751-783. 9Slatko, B.E. (1996) Thermal cycle dideoxy sequencing. AMol. Biotech. 6: 311-322. Whelen，A.C. and Persing，D.H. (1996) The role of nucleic acid amplification and detection in the clin- ical microbiology laboratory. Am Re ， Microbiol. 50: 349-373. 第 22 章 蛋白 质 : 结 构 , 功 能 与 进化 Proteins:Structure，Function and Evolution 参考 文献 Branden, C. and Tooze, J. (1991) Jmtroductior io Protez Structuvre. Garland Press, New York. Doolittle, R.F. (1985) Proteins. Sci. 4mer 253: 88-99. Lewin，B. (1996) Genes V]. Oxford Unmiversity Press， Oxford, PP. 663-711. Richardson，J.S.，Richardson，D.C.，Tweedy，N.B.， Gernet K.M.，Quinn,，T.P，Hecht，M.H.，Erickson， 推荐 读物 Allen，J.B.，Wallberg，M.W.，Edwards，M.C. and Eledge, SJ. (1995) Finding ProspPective Partners in the library 一 the 2-hybrid system and Phage dis- Play find a match. Trerds Biochem. Sci 20: 511-516. Britten, R.J. (1996) DNA sequence insertion and evo- luti variation in gene regulation.， Proc，Natl Acad. Sci USA 93: 9374-9377. Cooke, ]., Nowak, M.A., Boerlijst, M., and Maynard- Smith, J. (1997) Evolutionary origins and mainte- nance of redundant gene exPression during meta- zoan development. Trertds Ceneft. 13: 360-363， Cooper A.A. and Stevens, TH. (1995) Protein spPlicing 一 self-splicing of genetically mobile elements at the Protein level. Trends Biocjem., 5ci. 20: 351-356. Davidson,，J.N. and Peterson，M.L. (1997) Origin of ”450 ， B.W，Yan，Y，McClain，RD.，Donljan，M.E. and Suries, M.C. (1992) Looking at Proteins: representa- tions, folding，Packing and design. Biophys. 厂 63: 1186-1220. Stryer L. (1995) Biochemzistry (4th edm). W.H. Freemamv New York. genes encoding multirenzyme Proteins in eukary- otes. Tyrends Cenet 13: 281-285. Dibb, N.J. (1993) Why do genes have introns? FEB5 Le 化 325: 135-139. Doolittle，R.FE (1995) The origins abd evoluticn of eukaryotic Proteins，Pjzil，Tyras，R. 5oc， LOHd，349: 235-240， Evans，M.].，Carlton，M.B.L. and Russ，A.P (1997) Gene trapping and functional genomics，Trends Genet 13: 370-375. Fersht, A.R. (1997) Nucleation mechanisms in Protein folding. Cuyrr OPpim. Struct Biol. 7: 3-9. Gabor Miklos, G.L. and Rubin, C.M. (1996) The role of the genome Projects in determining gene function: Insights from model organisms. Cell 86: 521-529. Goeffeau，A.，Barrell，B.G.，Bussey et al. (1996) Life With 6000 genes. Scietce 274: 546-567. Gorlich, D. and Mattaj, I.W. (1996) Nucleocytoplasmic transport. Science 271: 1513-1518. Govindarajan, S. and Goldstein, R.A. (1996) Why are Some Protein structures So common? Proc，Natl Acad. Sci USA 98: 3341-3345. Heinkoff,，S., Greene,，E.A.，Pietrokovski, S.， Bork, P， Attwood, TK. and Hood, L. (1997) Gene families: the taxonomy of Protein Paralogs and chimeras. Sciertce 278: 609-614， Hieter P and Boguski M. (1997) Functional genomics: its all how you read it. Science 278: 601-602. Hochstrasser M. (1996) Ubiquitin-dependent Protein degradation. 477z. Re Cenet 30: 405-439. Holland, PW.H., Garcia-Fernandez, ]., Williams, N.A. and Sidow, A. (1994) Gene duPlications and the ori- gins of vertebrate development， Developmie?tt (SuppL): 125-133. Lander E.S. (1996) The new genomics: Global views of biology Science 274: 536-539. Levitt, M.，Gerstein， M., Huang，E., Subbiah, S. and Ysai，J. (1997) Protein folding 一 the endgame. AU. Rew Biochem. 66: 549-579. Loomis，W.F and Sternberg，PW. (1995) Genetic Networks. Scierce 269: 649. Martin, J. and Hartl EU. (1997) Chaperone-assisted Protein folding. Curr. Opin. Struct Biol. 7: 41-52. 第 23 章 Neupert, W. (1997) Protein impPort into mitochondria. 4 Re Biochem. 66: 863-917. Rapoport，T.A., Jungnickel，B. and Kutay U. (1996) Protein transport across the eukaryotic endoplas- mic reticulum and bacterial inmner membranes. AT. Rew. Biochem. 65: 801--848. Rechsteiner M. and Rogers，S.W.， (1996) PEST sequences and regulation by Proteolysis，Trends Biocjemt. Sci 21: 267-271. Roder H. and Colon，W, (1997) Kinetic role of early intermediates in Protein folding. CUMrr. Opzm. Stryct Biol. 7: 15--28. Rothman，J.E. (1994) Mechanisms of intracellular transport. Nature 372: 55-68. Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996) Common Princi- Ples of Protein translocation across membranmes. Science 271: 1519--1526. Tatusov R.L., Koonin, E.V. and Lipman, D.J. (1997) A genomic perspective on Protein families， Scierce 278: 631--637. Walter P and Johnson, A.E. (1994) Signal sequence recognition and Protein targeting to the endoplas- mic reticulum membrane. Ai. Rew，Cell Biol. 10: 87-119. Xue, L. and Noll M. (1996) The functional conserva- tion of Proteins in evolutionary alleles and the dom- inant role of enhancers in evolution. EMBO 厂 15: 3722-3731. 蛋白 质 合成 Protein Synthesis 推荐 读物 Farabaugh，PJ. (1996) Programmed ftranslational frameshifting. Am Re Geret. 30: 507--528. Green, R. and Noller H.F (1997) Riboscomes and trans- lation. 4 Ren Biochem. 66: 679-716. Jacobson, A. and Peltz, 9.W. (1996) Interrelationships of the Pathways of messenger-RNA decay and translation in eukaryotic cells.A7z14. Rew， Biocher. 65: 693--739. Mountford, PS. and Smith, A.G. (1995) Internal ribo- some entry sites and dicistronic RNAs in mam- malian transgenesis. Jrerds Gertet. 11: 179-184. Ruizechevarria，M.J.，Czaplinski K. and Peltz，S.W. 《1996) Making sense of nonsense in yeast， Trends Biochem. Sci. 21: 433-438. 第 24 章 ， 重 组 DNA 与 分 子 克隆 Recombinant DNA and Molecular Cloning 参考 文献 Brown, TA. (ed.) PNA Cloning: a Practical 4pproacjh. 27d Ed7m. (4 zolu1ies). ITRL Press, Oxford Brown, T.A. (ed.) Essential Molecular Biology: a Practical Approach (2 volumes). IRL Press, Oxford. Old, R.W. and Primrose, S.B. (1996) Primciples of Gene Mazipulatiom: at Jatroductiox to Genetic ESineeril18， Blackwell Science, Oxford. 推荐 读物 Allen，J.B.，Wallberg，M.W.，Edwards，M.C. and Sambrook，]J.，Fritsch，E.F. and Maniatis，T. (1989) AMolecuiar Cioming: 4 Laboratory MatMal (3 zolumtes)， Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY. Watson J.D., Gilman, M., Witkowski, J. and Zoller M. (1992) Recombinant DNA4A，2nd Edn， Scientific American Books, New York. Elledge, 9.J. (1995) Finding Prospective Partners in . 451 the library 一 the 2-hybrid system and Phage dis- Play find a match. Trends Biochem. Sci 20: 511-516. Anderson，W.F (1992) Human gene therapy. Science 256: 808--813， Beddington, R. (1992) Transgenic mutagenesis in the mouse. Tertds Genet 8: 345-347. Coutre, L.A. and Stinchcomb，D.T. (1996) Anti-gene therapy: the use of ribozymes to inhibit gene fumc- tion. Jrerds Cemnet. 12: 510-515. Evans，M.].，Carlton，M.B.L. and Russ，A.P (1997) Gene trapping and functional genomics，Trends Genet 13: 370-375. jain，S5.M. (1993) Recent advances in Plant genetic engineering. CUMrT. SciL 64: 715--724. Monaco, A.P and Larin, Z. (1994) YACs, BACs, PACs and MACs 一 Artificial chromosomes as research tools. Trends Biotecjh. 12: 280-286. Mountford, PS. and Smith, A.G. (1995) Internal ribo- some enty sites and dicistronic RNAs in mam- malian transgenesis. Trends Genet, 11: 179-184. Nielsen，PE. (1996) Peptide nucleic acids 一 a new dimension to Peptide libraries and aptames. Methods E7izyrmtoL 267: 426-433. Parimoo, S., Patanjali S.R., Kolluri R., Xu, H.X.， Wei， 第 25 章 重组 Recombination 推荐 读物 Cameriniotero, R.D. and Hsieh, P (1995) Homologous recombination Proteins in Prokaryotes and eukary- otes. 47. Re Cenet 29: 509-552， E8gleston，A.K. and West，S.C. (1996) Exchanging Partners 一 recombination in Escherichia coli. Trends Cenet. 12: 20-26. Hagmann, M. (1997) RAGged repair: What's new in V(D)J recombination. Biol. Chem. 378: 815-819. Lichten，M. and Goldman，A.S.H.， (1995) Meiotic recombination hotspots，A4mmu，Rev，Genet，29: 423-444. Rao' B.J., Chiu, SK.,， Bazemore, L.R., Reddy G. and Radding, C.M. (1995) How spPecific is the first recog- nition step of homologous recombination? Trends Biochem. 9ci. 20: 109-113. Shinagawa, H. and Iwasaki, H. (1996) Processing the Holliday junction in homologous recombination. Trends Biocjhemz. 5ci. 21: 107-111. Stavnezer ]， (1996) Antibody class switching.， Adv DJ71IMOL 61: 79-146. 第 26 章 复制 Replication 参考 文献 Baker T.A. and Wickner S.H. (1992) Genetics and enzymology of DNA replication in E. coli， Amu. Re Genet 26: 447 一 477. De Pamphilis M.L. (Ed.) (1996) DNA Replicatiomn 太 推荐 读物 Chong, JPJ., Thommes, P and Blow, JJ. (1996) The role of MCM/VP1 proteins in the licensing of DNA replication. Tyrends Biochemm. 5ci. 21: 102-106. Sousa, R. (1996) Structural and mechanistic relation- ships between mucleic acid Polymerases，Tyrends Biocjhemm. Sci 21: 186-190. Wold， M.S. (1997) Replication Protein A: A Euvkaryotic Cells，Cold Spring Harbor Press， New York. Kornberg A. and Baker T.A. (1992) DNA Replicatiom. W.H. Freemanm, New York. heterotrimeric， single-stranded DNA-binding Protein required for eukaryotic DNA metabolism. AU,. Re Biochem, 66: 61-92. Wynford-Thomas， D.，and Kipling， D. (1997) Telomerase: Cancer and the knockout mouse, Nature 389: 551--552. 第 27 章 RNA 加 工 RNA Processing 推荐 读物 Bachellerie, ].P. and Cavaille, J. (1997) Guiding ribose methylation of rRNA， Trends Biochemm，5ci，22: ， 452 . 257-261. Bass, B.L. (1997) RNA editing and hypermutation by ES 全 adenosine deamination. Jrends Biochemm，5Sci，22: 157-162. Chabot B. (1996) Directing alternative spPlicing 一 cast and scenarios. Trends Genet 12: 472-478. Chen C.YA. and Shyu, A.B. (1995) AU-rich elements 一 characterization and importance in messenger- RNA degradation. Trends Biochem. Sci 20: 465-470. Copertino, D.W. and Hallick, R.B. (1995) GroupP I and groupP III introns of twintrons 一 Potential relation- ships with muclear Premessenger RNA introns. Tenas Biochemx. Sci. 18: 467-471. Guo, Z.j. and Sherman, F (1996) 3 -end-forming sig- nals of yeast mRNA. Trends Biocjhem Sci，21: 477 一 81. Kable，M.L.，Heidmann，S. and Stuart，K.D. (1997). 第 28 章 RNA editing: Getting U into RNA. Trends Biochemt. 5ci. 22: 162-166. Ross, ]. (1996) Control of messenger-RNA stability in higher eukaryotes. Trends Genet 12: 171-175. Sarker N. (1997) Polyadenylation of mRNA in Prokaryotes. 47z1V, Rew Biochemi. 66: 173-197. Tarn, W.Y and Steitz, J.A. (1997) Pre-mRNA SPlicing: The discovery of a new spliceosome doubles the challenge. Tends Biochem. 5ci. 22: 132-137. Valcarcel J]. and Green，M.R. (1996) The SR Protein family 一 Pleiotrophic functions in Pre-messenger- RNA splicing. Trends Biocher. Sci 21: 296-301. Wahle, E. and Keller W. (1996) The biochemistry of Polyadenylation. Trends Biochem. 5ci. 21: 247-250. 信号 转 导 Signal Transduction 推荐 读物 Barford,D. (1996) Molecular mechanisms of the Pro- tein serine threonine phosphatases. Trends Biocjem. Sci. 21: 407 一 12. Bourne, H.R. (1997) How receptors talk to trimeric G Proteins. CUrr OPpin. Cell Biol. 9: 134-142. Cohen，C.B.，Ren，R. and Baltimore，D. (1995) Molecular binding domains in signal transduction Proteins. Cell 80: 237-248. Cohen, PTW. (1997) Novel Protein serine/threonine Phosphatases: Variety is the spice of life，Jyremnds Biochemm. Sci. 22: 245-251. Fauman，E.B. and Saper M.A. (1996) Structure and function of the Protein tyrosine Phosphatases. Trends Biocjhem. Sci. 21: 413-417. Houslay M.D. and Milligan，G. (1997) Tailoring cAMP-signalling responses through isoform muli- plicity Trends Biochem. Sci 22: 217-224. Jan, L.Y and Jan, YN. (1997) Receptor-regulated ion channels. CUrr OPpin. Cell Biol. 9: 155-160. Lohmann，S.M.，Vaandrager A.B.，Smolenski，A,， Walter U. and de Jonge,，H.R. (1997) Distinct and specific functions of cAMP-dependent Protein kinases, Jrerds Biochemm. 5ci. 22: 307-312. Marshall，C.J. (1995) Specificity of receptor tyrosine kinase signalling: Transient verses sustained extra- cellular signal-regulated kinase activation. Cell 80: 179-186. Morrison，D.K. and Cutler R.E. Jr. (1997) The com- Plexity of Raf-1l regulation. CUMrr OPpin. Cell Biol. 9: 174--179. Newton, A.C. (1997) Regulation of Protein kinase CC. CHMrr Opin. Cell Biol. 9: 161-167. Pellegrini, S. and Dusanter-Fourt, I. (1997) The struc- ture, regujlation and function of the Janus kinases 0UAKs) and the signal transducers and activators of transcription (SIATSs). Exr. J Biochem. 248: 615--633. Robinson，M.j. and Cobb，M.H. (1997) Mitogen- activated kinase Pathways. CUrr OPNL Cell Bio1. 9: 180-186. 9inger W.D., Brown, H.A. and Sternweis, PC. (1997) Regulation of eukaryotic Phosphatidylinositol- specific Phospholipase C and Phosphoslipase D. AU. Rev. Biochemm. 66: 475-509. Spiegel 39. Foster D. and Kolesnick, R. (1996) Signal transduction through lipid second 并 ssengers. CHMTr OPim. Cell Biol. 8: 159-167. Sprang，93.R. (1997) G protein mechanisms: Insights from structural analysis. Am，Rew，Biochemz，66:. 639-678. Ten Dijke, P, Miyazono, K. and Heldin，C.-H. (1996) Signalling via hetero-oligomeric comPlexes of typPe I and type II serine/threonine kinase receptors. CUMrr OPpin. Cell Biol. 8: 139-145. Toker A. and Cantley L.C. (1997) Signalling through the _ lipid Products of Phosphoinositide-3-OH kinase. Nature 387: 673-676. Van Haesebroeck, B., Leevers, S.J, Panayotou, G. and Waterfield, M.D. (1997) Phosphoinositide 3-kinases: A conserved family of signal transducers. Trends Biochemz. Sci. 22: 267-272. Whitman，M. (1997) Feedback from inhibitory SMADs. Nature 398: 549-551. Wittimghofer A. and Nassar N. (1997) How Ras- related Proteins talk to their effectors， Jrends Biocjem. Sci 21: 488 一 91. 第 29 章 “转录 Transcription 推荐 读物 Adhya, S. (1996) The lac and 8al operons today. In: Regulation of Gete Expressio in Escjericjia coli (eds .453 ， E.C.C. Lin and A.S. Lynch)，PP. 181-200.， R.G， Landes, Texas/Chapman & Hall, New York. Bjorklund, S. and Kim，YJ. (1996) Mediator of tram- scriptional regulation， Trends Biochem.， Sci，21: 335-337. Busby, $. and Kolb, A. (1996) The Cap modulon. In: Reguiatiomr of Gene Expressiom in Escherichia coli (eds E.C.C，Lin and A.S，Lynch)，PP. 255-280，R.CG Landes, Texas/Chapman & Hall, New York. Hannarose, W. and Hansen,，U. (1996) Active repPres- sion mechanisms of eukaryotic transcription repres- SOrS. Jrends Cenet. 12: 229-234. Henkin, TM. (1996) Control of transcriptional termi- nation in Prokaryotes. 471. Re Certet, 30; 35-57， Kamakaka，R.T. (1997) Silencers and locus control regions: OPPosite sides of the same coin， Trends Biocjhem. 95ci. 22: 124 一 128. Magasanik, B. (1996) Regulation of nitrogen assimila- tion. In: Regujation of Geie Expressiom in Escjericjria coli (eds E.C.C. Lin and A.S. Lynch), PP. 281-290 R.G. Landes, Texas/Chapman kz Hall New York . Novina,C.D. and Roy A.L. (1996) Core Promoters and transcriptional control. Trends Cenet, 12: 351-355. Ptashne, M. and Ganm, A. (1997) Transcriptional acti- vation by recruitment. Nature 386: 569-575. Reeder R.M. and Lang, W.H. (1997) Terminating tranm- Scription in eukaryotes: lessons from RNA Poly- merase I Jremds Biochem., Sci. 22: 473-477. Reines, D.,,Conaway J.W. and Conaway R.C. (1996) The RNA Polymerase II general elongation factors. Trends Biocjhem. Sci. 21: 351-355. RipPpe, K., Von Hippel PH. and Langowski, J. (1995) Action at a distance 一 DNA-looping and initiatiom of transcription. Trends Biochem. 9ci. 20: 500-506. Roberts, J].W. (1996) Transcription termination and its control，、JIn: Reguiatior of Gene Si0m in Escherichia coli (eds E.C.C. Lin and A.S. Lynch), PP. 27-46.，R.G，Landes，Texas/Chapman & Hall， New York， Roeder R.G. (1996) The role of general initiation fac- tors in transcription by RNA Polymerase I. Trends Biochem. 5ci. 21: 327-335. Svaren, ]. and Horz, W. (1997) Transcription factors ps nucleosomes: Regulation of the PHO5 Promoter in yeast. Trends Biocjhem. Sci 22: 93-97. Svejstrup, JJ.Q., Vichi, P and Egly JJM. (1996) The mul- tiple roles of transcription/repair factor TFIIHL. Tends Biochem. 5ci. 21: 346-350. Uptain, S.M., Kane, C.M. and Chamberlir, M.J. (1997) Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. 4mmV. Rev. Biochem. 66: 117--172. Van Dromme，M.，Gauthier-Rouviere，C.，Lamb，N. and Fernandez, A. (1996) Regulation of transcrip- tion factor localisation 一 fine-tuning of gene expPression. Jyends Biocjhemt. 9ci. 21: 59--64. Verrijzer C.P and Tjiam, R. (1996) TAFs mediate tram- Scriptional activation and Promoter selectivity. Trends Biocjhem. 9ci. 21: 338--342. Wood, W.G. (1996) The compPlexities of B-globin gene regulation. Tirerids Cenet 12: 204-206. 第 30 章 “病毒 与 亚 病 毒 感染 因子 Viruses and Subyviral Agents 参考 文献 Dimmock，N.J and Primrose，S.B.(1993) Am mtroductior to Modern Virology. 4th edn. Blackwell Science, Oxford Murphy EA., Fauquet, C.M., Bishop D.H.L, Ghabrial， 推荐 读物 Aguzzi A. and Weissmann, C. (1997) Prion research: the next frontiers. Nature 389: 795-798. Banenee, A.K. and Barik, S. (1992) Gene expression of vesicular stomatosis _ virus genome，Virology 188: 417 一 29. Berns，K.I，(1990) Parvovirus repPlication， Microbiol Re 54: 316-329. Caughey' B. and Chesebro, B. (1997) Prion Protein and the transmissible spongiform encephalopathies. Trends Cell Bio/. 7: 56-62. Coffin, J.M. (1992) Structure and classification of retro- Viruses. In: The Retroviridae (ed. J. Levy), vol. 1, PP. 1437-1500. Plenum Press, New York. Collmer C. and Howell S. (1992) Role of satellite RNA in the expPression of symptoms caused by Plant viruses. Au. Re Pjytopathol. 30: 419-442. Diener TO. (1991) The frontiers of life: The viroids and Viroid-like satellite RNAS. In: Viroids and Sateljlites: Molecuiar Parasites al the Frontiers of 工 泥 (ed K. Maramorosch), PP, 1-20. CRC Press, Boca Ratom, FL. . 454 ， S.A., Jarvis，A.W., Martelli， G.P, Mayo,，M.A. and Summers,， M.D. (eds) (1995) Virus Taxomormty， Sixth Report of the Jmterratiomral Comttittee OH IaxomOY of Viryses. Springer New York. Eckhart，W. (1991) Polyomavirinae and their replica- tion. In: Fuvrdamentoal Virology (eds B.N. Fields and D.M. Knipe), 2nd edn., PP. 727-741. Raven Press， New York. Estes, MK. (1991) Rotaviruses and their replication. m: Eurtdament 如 | Virology (eds B.N.， Fields and D.M. Knipe)，2nd edn.，PP. 619-642，Raven Press, New York. Gabizon, R. and Taraboulos，A. (1997) Of mice and (mad) cows: Transgenic mice help to understand Prions. Trends Genet 13: 264--269. Hendrix, R.W., Roberts,J.W., Stahl FEFW. and Weisberg， R.A. (eds) (1983) Lambda 了 Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor New York. Horwitz, M.S. (1990) Adenoviruses and their replica- tion, In: Virology (eds B.N. Fields and D.M. Knipe)， 2nd edn., PP. 1679-1722. Raven Press, New York. Joshi, S. and Joshi，R.L. (1996) Molecular biology of Human Immunodeficiency Virus type 1. Tarsfusion 93ci. 17: 351-378. Keppel RE，Fayewt， O. and Georgopoulos K. (1988) Strategies for bacteriophage DNA repPlication. In: The Bacteriopjhages (ed. R，Calendar)，Vol. 2，PP. 145-262. Plenum Press, New York. Kingsbury ，D. (ed.) (1991) Tjie ParamtyxovirWses. Plenum Press, New York. 第 1 章 参 考 网 站 On-line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): 第 12 章 参 考 网 站 Genomte Lpping datajbases Bacteria 瑟 ， infuenzae 一 mdb/hidb/hidb.html M.， 8enitalium 一 http:/V/wwwtigrorg/tdb/ mdb/mgdb/mgdb.html Ecoli 一 http://www.ncbinlm.nih.gov/ Complete_Genomes/Ecoli/ B.， subtilis 一 http://acnuc.univ-lyonl.fr/ nrsub/nrsub.html http:/V/www.tigrorg/tdb/ Yeast 5， cerevisine 一 http://speedy.mips.biochem. mpg.de/mips/yeast/ Invertebrates C. elegans ”一 http://Pprobe.nalusda.gov: 8000/Vother/aboutacedb.html Delanogaster 一 http://www.embl-ebi.ac. uk/flybase/ 第 30 章 参考 网 站 All the virology on the web: an index of virology resources and information available on the internet Luong,，G. and Palese, P (1992) Genetic analysis of influenza Virus. CU Opi. Geet De 2: 77-81. Roizmanm, B. and Sears, A.E. (1993) The replication of Herpes simPlex viruses In: The 媚 wman 再 erpesvirys (eds B. Roizman， C. Lopez and R.J. Whitley)，PP. 11-68. Raven Press, New York. http://gdbwww.gdb.org/omimdoc/omimtop.html Plants A4， thaliana 一 http://genome-www:stanford. edu/Arabidopsis/ Mammals Humans (On-line Mendelian Inheritance in Man) 一 http://gdbwww.gdb.org/omimadocy/ omimtop.html Mouse 一 http://www,jax.org/ Nucleic aciad ad protein SeqgUeHCe da 吉 bases GenBank (DNA and Protein sequences) 一 http://Vwww.ncbinim.nih.gov EMBL (DNA sequences) 一 ebi.ac.uk DDBJ (DNA database of Japan) 一 http:// www.nig.ocjp/home.html http:/ /www. 一 http://www-micro.msb.le.ac.uk/garryfavweb/ garryfavweb.html "” 453。 去 引 (中 文 按 汉语 拼音 排序 。t: 表 格 ,f: 图 ,bx: 文 框 ) a 互 补 ，o-complementation 100 一 1016x 304 a 螺 旋 ”ou-helices 226f{ 12-23 规则 12-23 rule 348 30nm 纤 丝 30 nm fiber 35 3T3 细胞 分 析 法 ”3T3 cell assay 237 208 S- 甲 基 胞 喀 啶 ”5$-methylcytosine 86,194 $ - 甲 基 胞 喀 啶 的 脱毛 ”of $-methylcytosine “85 ABLVBCR 基因 融合 ABLVBCR gene fusion 237,238 Ac-Dps 因子 Ac-ps element A-DNA 210,210f{ Alu 元 件 _Alu element 87 Aptamers (337) AP 内 切 酶 ”AP endonuclease 175 AP 位 点 AP-site 170 一 171 A 规 则 A-rule 171 A 位 点 〈 氢 基 栈 tRNA 位 点 ) A-site(amino acyl- tRNA) 核糖 体 的 ”of ribosome 288 BDNA 210f{ Beckwtih-Widedmann 综合 征 89 BRCA1, BRCA2 240 B 染 色 体 也 chromosomes 54 161,163 CARKA 29 cdc 突变 cdc mutant 22 Cz2XCDC28 基因 ”23 一 25 CDK -周期 蛋白 抑制 物 “CDK-activating kinase 25,30,240 cDNA _ 306 cDNA 捕捉 /EDNA 选择 ”cDNA capture/ cDNA selection 142 cDNA 合成 ”cDNA synthesis 306 cDNA 文库 ”cDNA libraries 305 CEPH 家 族 ”CEPH families 138 Chi 340 。 456 。 ColE1 复制 子 ”ColE1 replicon 255 一 6 cobp 突变 ”cop mutant 250,252 Cot 分 析 ”Cot analysis ”144 一 56x CpG 岛 “CpG islands 86,142 CREB( 转 录 因 子 ) 402 Cre-loxP( 酵 母 重 组 ) 系 统 “Cre-loxP system 352 C 基 因 片 段 ”C-gene segment 354 C- 值 Cvalue 123 C- 值 矛盾 “C-value paradox 125 Dcm 甲 基 化 ”Decm methylation 85 DMS 保护 分 析 法 “”DMS protection assay “231t， 3 DNA 多 型 性 ”polymorphism 204 功能 分 类 classified by function ”125 一 6t 构象 ”conformational 204 呼吸 ”breathing 204 结构 ,被 蛋白 的 识别 structure recognition by proteins 217 结构 , 双 螺 旋 ”structure double helix ”209 一 211 螺旋 形态 ”helical morphology 209 一 211 顺序 多 态 性 ”sequence polymorphism 138 拓扑 学 topology 213 一 21Sbx DNase IT 超 敏 感 位 点 “Dnase I hypersensitive site : 38 DNase 工 足 迹 法 “”DNAase I footprinting “231t， 232f DNA 病毒 ，DNA viruses ”426 一 429 DNA 测 序 DNA sequencing 148 一 150bx NA 的 传导 ( 顺 式 - 转移 ) bilization) of DNA 119 DNA 的 供 体 作用 ( 反 式 移动 ) mobilization) of DNA 110 DNA 分 布 “_DNA profiling 145Sbx DNA 复制 “DNA replication 355 一 373 怠 conduction (cis-mo- donation ( trazz5- 半 人 保留” semiconservative 355 一 356 半 不 连续 “semidiscontinuous 356 一 357 被 置换 “by displacement 359 模型 models 389 引发 ”priming 369 DNA 甲 基 化 “DNA methylation 84 一 93 细菌 “bacteria 84 一 95 转 座 因子 的 控制 control of transposable ele- ments 87,137 DNA 甲 基 化 酶 ( 甲 基 转 移 酶 ) DNA methylase (methyltransferase) 84 DNA 聚合 酶 “DNA polymerases 360 大 肠 杆 菌 ” 瓦 .Co 360t 耐 热 的 thermostable 362 在 分 子 克 隆 中 in molecular cloning 299t 真 核 生 物 eukaryote 362t DNA 连接 酶 ，DNA ligation 299 DNA 热 解 链 曲线 Thermal melting profile of DNA 330 DNA 损伤 _DNA damage 171t DNA 微 排列 “DNA microarrays 280 DNA 糖 基 化 “DNA glycosylases 176t DNA 文 库 “DNAlibrary 298,299 一 300 筛选 screening 298,299 一 300 载 网 gridded 141 DNA 腺 叮 叭 甲 基 化 酶 甲 基 化 ”Dam methylation DNA 修 复 DNA repair 173 一 183 差错 倾向 error free 173 一 183 诱 变 “mutagenesis 181 一 183 DNA 修饰 DNA modification 84 DNA 旋转 酶 ”，DNA gyrase 362 DNA 引 发 酶 ”DNA primase 363 DNA 指 纹 “DNA fingerprinting 145bx DNA 肿瘤 病毒 “，DNA tumor viruses 241 D 环 (tRNA 的 部 分 )， D-loop(as part of transfer RNA) 295 D 环 (取代 环 ) D-loop(displacement loop) 213 D 基 因 片 段 D-gene segments 354 Edman 降解 法 “Edman degeneration 282 epimutation 下 位 点 (输出 位 点 ) 核 糖 体 的 _E-site(exit site) of ribosome 288 F( 因 子 ) 转 移 区 (tra 操纵 子 ,tra 区 域 ) F transfer region(tra operon tra region) ”114 一 115bx F' 质 粒 Fplasmid 109 FLP-FRP 系统 FLP-FRP system 352 Fos c- jos 基因 ”Fos c- jos gene 235 一 239 js 突变 ”大 mutants 19 F 因子 ,在 细菌 的 基因 作 图 中 F-factor in bacteri- al gene mapping 114 一 11Sbx F 因子 下 质粒 F-factor/F-plasmid 109,114bx Go 期 20 Gil 和 G; 间 辽 期 Gi and G gap phases 20 GC 人 含量， GC content 123 一 124 G 和 蛋白 分 类 和 激活 “G-proteins classes and activi- ties 389 G 和 蛋白 偶 联 受 体 ”G-protein coupled receptors 388 一 389 G 分 带 “G-banding 53 一 54 HAPPY 作 图 “HAPPY mapping 135f Helmstetter-Cooper 模型 ”Helmstetter-Cooper model 18 一 19 HIV 感染 周期 HIV infection cycle 439 一 440 HNF3/ 又 头 家 族 ”HNF3/Fork head family 220 Holliday 模型 ”Holliday model 338 一 340 FEoz 基因 BEoz genes 275 兰 椎 动物 “vertebrate ”81 一 82bx 在 兰 椎 动物 肢 发 育 中 “in vertebrate limb de- velopment 82 一 83bx HO 内 切 酶 “HO endonuclease 344 Indel 187 IS 因 子 JIS elements 162 一 163 Jark-STAT 途径 Jak-STAT pathway 391 Jun c-7jzzz 基因 Jun c-jzz gene 235 一 9,402 本 基因 片段 J-gene segments 354 Klenovw 片段 “Klenow fragment 359 Knudson, 双击 学 说 ”Knudson two hit hypothesis 240 一 241 Kozak 共有 区 “Kozak consensus 291 K- 同 源 结 构 域 “K-homology domain 225 Lac 操纵 子 “Louc operon 421 一 422bx INES5ISI9131133 MADS 盒 ” MADS box 67 MAP 激酶 “MAP kinase 395t MAT 座位 MAT locus 344 Meselson-Sthhl 实验 “Meselson-Stahl experiment .457 ， 355- 356 mRNA 乌 苷 转移 酶 ”mRNA guanyltransferase 3 Muller 分 类 “Mauller classification 192 Myc,c-zmyc 基因 “Myc c-mmyc gene 235 一 239 MyoD 基因 家 族 ”MyoD gene family 129 M 期 M phase 20 M 期 [成熟 促 进 因子 ”M phase/maturation-pro- moting factor 22 一 23 Niewkoop 中 心 ”“Niewkoop center 73 一 74bx NOESY 284 Northern 印迹 /分 子 杂 交 Northern blot/hy- bridization 311 ,328 一 329 Northwestern 筛选 ” Northwestern screen 231， 329 和 N- 甲 酰 甲 硫 氨 酸 N-formylmethionine 120， 281 一 282 N -区 的 多 样 性 ”N-region diversity 347 N -糖苷 键 ”N-glycosidic bond 205 PL 人 工 染 色 体 (PAC) “Pl artificial chromosome (PAC) .303 p53 ”240,402 EECER 信和 202 PCR 产物 ,克隆 ”PCR products cloning 260 PCR 诱 变 “PCR mutagenesis 260 P-DNA PDNA 160 PEST 结构 域 ”PEST domain 287 POU 结构 域 POU domain 220 P 位 点 ( 肽 酰 - tRNA 位 点 ), 核 糖 体 的 P = site (peptidyl - tRNA site) of ribosome 288 P 因子“P-element 163 一 164 P 因子 诱 变 ”P-element mutagensis 316 p 依赖 性 终止 子 po-dependent termination 419 RACE 261 Raf,ra 太 基因 Raf ro gene 235 一 239 RAG 蛋白 RAG proteins 349 RAPD 标记 RAPD markers 138,259 Ras,ras 基因 “Ras ras gene 235 一 239 RB1 基因 RB1 gene 27,31,238 一 240 RecA 在 重组 中 in recombination 250bx 在 SOS 诱 变 中 in SOS mutagenesis 182 .458 . 181 RecBCD 核酸 酶 ”RecBCD nuclease 339 RECBCD 途径 ”RecBCD pathway 339 Rel 家 族 ”Rel family 224 Rep 蛋白 Rep protein 细菌 的 解 旋 酶 “bacterial helicase 364 在 质粒 复制 中 in plasmid replication 254 Rev 蛋白 Rev protein 384 RNA 204 一 205 RNA 编 辑 RNA editing 384,38St ， RNA 病毒 “RNA viruses 426,429 一 30 真 核 细 胞 中 蛋白 合成 protein synthesis in eukaryotes 433 RNA 定 向 “RNA targeting 383 RNA 加 工 RNA processing 374 一 386,374t RNA 剪接 RNA splicing 377 一 384 核 内 含 子 “nuclear introns 377 一 379 RNA 结 构 “RNA structure 208f,211 一 212 RNA 育 合 酶 ”II RNA polymerase II C 端 结构 域 ”C-terminal domain 409 RNA 聚 合 酶 “RNA polymerases 372,403 细菌 “bacterial 405 一 406 真 核 生 物 eukaryotic 407t RNA 输 出 “RNA exprot 384 RNA 稳 定性 ,调节 的 “RNA stability regulation of 384 一 386 RNA 肿 瘤 病 毒 “RNA tumor viruses 235,237， 239 RNP 结构 域 RNP domain 224 Rot(RNA 浓 度 , 时 间 ) 分 析 “Rot analysis 144 一 14Sbx R 分 带 R-banding 5S4 SAP 激酶 ，SAP kinase 395 一 396 SD 顺序 ShineDalgarno sequence 290 SH2 结构 域 ”SH2 domain 394,396,401 Shapiro 中 间 体 ”Shapiro intermediated 154f SINEs 131,133 SIR 蛋白 SIR proteins 412 SMAD 家 族 ”SMAD family 393 SOS 反 应 ”SOS response 182 噬菌体 的 诱导 183 SOS 诱 变 ”SOS mutagenesis 182 一 183 Southern 印迹 / 琴 交 Southern blot/hybridizaiton induction of bacteriophage 328 一 329 Southwestern 筛选 “Southwestern screen 329 SRY 69 SR 蛋白 SR proteins 379 SSCP 分 析 “SSCP analysis 310 SV40 428 Svedberg 单位 ”Svedberg units 294 S 期 Sphase 21 TATA 盒 TATA box 408 TATA 结 合 蛋白 (TBP) TATA-binding protein (EBP)， 223 Tat-TJar 384,439 TBP 结合 因子 (TAFs) (TAFs) 223 TFIID 409 TEFIH 409 Ti 载体 Ti vectors 320,333 主 质 粒 Ti plasmid 320,332 一 333 Tn3 解 离 酶 ”Tn3 resolvase 352 TP53 基因 TP53 gene 见 p53 tRNA Transfer RNA(CtRNA) 388 一 389 负载 charging 117 一 119 加 工 “processing 374 一 375 结构 structure 388 一 389 ,295bx 在 蛋白 合成 中 的 转 接 作用 adaptor role in protein synthesis 388 一 389 tRNA 的 内 含 子 Transfer RNA introns 381 工 细 胞 受 体 T-cell receptors 353 一 354 T 细胞 受 体 基因 T-cell receptor gene 353 一 354 工 载 体 Tvector 260 UvrABC 核酸 酶 。，UvrABC nuclease 170 一 175 UV 诱导 DNA 损伤 ”UV-induced DNA lesions 170= 75 V(D)J 重 组 V(D)J recombination 347 Vectorette PCR 261 VNTR 序列 VNTR sequences 131,138 V 基 因 片 段 V-gene segments 354 Wee 突变 Wee mutants 22 Western 印迹 Western blot 282 Want 信号 蛋白 Want signaling proteins 果 蝇 无 翅 Drosopjiz Wingless 79 一 80bx 在 脊椎 动物 的 肢 发 育 中 development “ 81 一 82bx TBP-associated factors in vertebrate limb XIST 基因 XIST gene 90 一 93 X 连 锁 遗 传 ”X-linked inheritance ”4 一 St, 15 一 10bx X 染 色 体 失 活 “和 chromosome inactivation 5， 91 一 93 X 射 线 结晶 衍射 “X-ray crystallography 283 X 失 活 中 心 ”Xinactivation center 91 YAC 转基因 鼠 “YAC transgenic mice 323 YY 连锁 遗传 Y-linked inheritance 5,15 一 16bx Z-DNA 210,210f B 链 B-strands 266 B 折 到 B-sheet 266f 8B 转 角 Btum 266 G 因 子 cr-factor 405 28 公 一 瘤 ”cancer 234 多 击 学 说 ”multiple hit hypothesis 234,239 家 族 性 ”familial 239 一 240 进行 性 肿瘤 ”tumor progression 234 癌 基 因 ”oncogenes 234 一 241 癌 基 因 激 活 “oncogene activation 机 制 “mechanisms 236 一 239tf 艾滋 病 (AIDS) AIDS 439 氨基 酸 ”amino acids 281 一 282bx 氨基 酸 顺 序 ”amino acid sequence 263 一 265 氨基 酰 -tRNA aminoacyl-tRNA 118 氨基 酰 -tRNA 合成 酶 。 aminoacyL-tRNA syn- thetase 118 巴尔 比 亚 环 balbiani rings 54 巴尔 小 体 barr body 91 靶 位 点 重复 target site duplication 152 斑点 印迹 dot blot 328 包装 比 ”packing ratio 32 包装 位 点 ”packaging site 113 包 载 载体 〈(entrapment vectors) 保守 突变 ”conservative mutative 184 一 186 报告 基因 reporter gene 315 报告 载体 ”reporter vectors 315 倍 性 (染色 体 ) ploidy 41,123 被 动 转 座 ”passive transposition 155 被 剪接 的 前 导 序 列 RNA spliced leader RNA 383 。45S9 。 比较 基因 组 的 ”comparative genomics _ 143 边界 元 件 boundary element 39 编辑 体 editosome 385 编码 区 域 ”coding region 98 变异 , 表 型 的 variation phenotypic 1,2 表达 克隆 expression cloning 311 一 314 大 肠 杆菌 ”五 .coz 312 一 313 真 核 细 胞 宿主 eukaryote hosts 313 一 314 自然 和 融合 蛋白 “native and fusion proteins 2 319 表达 序列 标记 expressed sequence tag 143,259 表达 载体 expressionvectors 312 表现 度 expressivity 8 表现 度 差 异 分 析 ysis 201 表现 型 phenotype 2 表 型 变异 ”phenotypic variance ， 16 一 17bx 表 型 模拟 “phenocopy 16 别 构 性 allostery 271 在 转录 调控 中 416f 并 连 染色 体 attached chromosome 48 病毒 ”virus 复制 的 策略 ”replication strategy 425 一 431 感染 策略 infection strategy 424 一 425 基因 表达 的 调节 sion 431 一 433 作为 基因 转移 的 载体 fer vectors 320 病毒 癌 基 因 viral oncogenes ”235 ,236t 病毒 分 类 系统 ”baltimore classification 426 病理 作 图 morbid map 46 波动 测验 法 fluctuation test 201 伯 基 特 淋巴 瘤 ”burkitt's lymphoma 238 不 等 交换 “unequal crossover Unequal exchange 190 不 等 姐妹 染色 单 体 交换 “unequal sister chromatid exchange 190 不 等 向 弯曲 “anisotropic bending 211 不 对 称 PCR asymmertric PCR 262 不 均一 核 RNA(hnRNA) RNA 374 不 稳定 突变 等 位 基因 “ unstable mutant alleles 460 ee representational difference anal- in transcriptional control regulation of gene expres- VirUses as gene trans- heterogeneous nuclear 7 不 相 容 性 ,质粒 incompatibility of plasmid 250， 入 二 2353 不 相 容 性 基因 256bx 部 分 合子 “merozygote 108 部 分 宛 余 “”partial redudancy 129 incompatibility groups “255$， 操纵 基因 “operator 410 操纵 子 operon 98 差别 克隆 difference cloning p310 差别 展示 differential display 261 长 区 域 限制 图 long range restriction map ”310 常 染色 体 autosomes 5S2 常 染 色 体 遗传 autosomal inheritance ”1Sbx 常 染 色 质 euchromatin 36 超 变 小 卫星 “DNA hypervariable minisatellite 131 超 家 族 ”superfamilies 273 超 卷曲 ”supercoiling 213,214bx 沉默 突变 silent mutation 186 简单 顺序 “DNA simple sequence DNA 131 简单 顺序 长 度 的 多 态 性 simple sequence length polymorphisms 138 ,194 沉默 子 silencers 344,402 成 对 的 家 族 ”paired family 220 成 视网膜 细胞 瘤 ” retinoblastoma 238 一 239 成 视网膜 细胞 瘤 蛋白 DT 程序 性 错 读 _programmed misreading 293 程序 性 突变 ”programmed mutation 194 ,201 一 202bx 程序 性 细胞 死亡 ”apoptosis _ 30 一 31 翅 状 螺旋 ”winged helix 220 重生 基因 nested gene 97 重 释 基因 overlapping genes 97 重复 区 iterons 255 重复 顺序 DNA Repetitive DNA 122,125,126， 130f 突变 相关 的 ”mutations involving 191 一 192 [1 retinoblastoma protein 转 座 因 子 transposable elements as 131 重组 ”DNA recombinant DNA 338 重组 recombination 不 同类 型 different classed 337 一 354,338t 分 子 基 础 ”molecular basis 350 热点 和 冷 点 “hotspots and coldspots 147 作为 一 种 修复 机 制 181 ,339 重组 片段 recombination fraction 136 重组 频率 recombination frequency 136 重组 信和 号 顺序 348 重组 选择 recombinant selection 304 穿梭 载体 shuttle vector 301,331 一 332bx 传染 性 海绵 状 脑病 transmissble spongiform en- cephalopathy 434 一 436 传统 遗传 学 分 析 196 一 198 纯 合 子 homozygous 2 刺 蛋 白 家 族 “hedgehog family proteins 果 蝇 刺 蛋 白 “Drzpsopjhzia hedgehog 79 一 80bx,127 糊 椎 动物 中 肢 的 发 育 in vertebrate limb de- velopment 82 一 83bx 脆性 -X 综 合 征 ， fragileX syndrome 49,200 脆性 位 点 fragile sites 49 错 结构 损害 ”misinstructional lesion 170 错 配 ”mismatch 178 错 配 修复 ”mismatch repair 长 补丁 long patch 178 一 180 短 补 丁 _short pathc 181 错 义 突变 missense mutation 187 as a repaire mechanism recombination signal sequence classical genetic analysis 大 分 子 “macromolecules 分 离 ” separation 294 决定 分 子 量 ” determining mass 294bx 大 沟 ” major groove 210 大 突变 (染色 体 变异 ) macromutation 185 代谢 障碍 metabolic block 198 带 - 螺 旋 - 螺 旋 基 序 ribbon-helix-helix motif 223 带 与 间 带 “band and interbands 54 单 倍 体 机 能 不 全 ”haploinsufficiency 193 单 倍 体 数 ”haploid number 123 单 倍 型 haplotype 341 单纯 疱疹 病毒 ”herpes simplex virus 感染 周期 infection cycle 440 单 等 位 基因 的 表达 monoallelic expression 5， 88 一 92 单 链 (DNA) single stranded(DNAI) 结合 蛋白 binding protein 271,364 单 链 DNA 病毒 429 一 430 单 顺 反 子 “mRNA monocistronic mRNA 96 单一 DNA 顺序 unique sequence DNA 122,125 单 杂 种 杂交 monohybrid cross “3 一 4f 蛋白 核酸 相互 作用 protein-nucleic acid interac- tion 213 ,216 一 233 蛋白 质 的 二 聚 化 “protein dimerization 225 三 级 结构 的 调节 modulation of tertiary structure 220 顺序 特异 性 ”sequence specificity 特点 “characterization of 230 一 233 有 序 的 水 分 子 226 直接 结合 direct binging 225 蛋白 降解 “protein degradation 286 蛋白 体 “proteome 264,279 蛋白 质 “ proteins 263 一 286 二 级 结构 secondary structure 265 一 266 结构 决定 structural determination 282 一 283 三 级 结构 tertiary structure 266 一 271 四 级 结构 quaternary structure 267 一 级 结构 “primary structure 263 一 265 蛋白 质 测 序 “protein sequencing 282 蛋白 质 导 向 “protein targeting 284 一 286bx 朝向 膜 to membrances 286 细胞 器 中 to organelles 286 信和 号 顺序 signal sequences 284 蛋白 质 多 态 性 ”protein polymorphisms 138,194 蛋白 质 分 泌 “protein secretion 284 蛋白 质 合 成 “protein synthesis 287 一 295 调控 ”regulation 292 一 294 机 制 的 纵览 ”overview of mechanism 290 一 291 起 始 initiation 120,291f{ 延伸 循环 elongation cycle 291 一 292 终止 termination 292f single stranded DNA viruses ordered water molecules . 461 ， 蛋白 质 家 族 protein families ”273 一 280 常规 的 ， conventional 273 一 276 艇 合 的 “chimeric 276 一 279 选择 性 扩展 selective expansion ”279 一 280 蛋白 质 平 截 测 验 protein truncation test 309 蛋白 质 修饰 protein modification 272t 蛋白 质 折 至” protein folding 270 一 271 蛋白 质 中 DNA 结 合 基 序 “DNA-binding motifs in proteins 217 一 224,218t 蛋白 质 中 的 带 状 基 序 “barrel motifs in proteins 267 一 268 蛋白 中 RNA 结合 基 序 “RNA-binging motifs in proteins 218t,224 一 225 倒 位 inversions 48 一 49f 倒转 电场 凝 胶 电 泳 field inversion gel elec- trophoresis ”326 一 327 灯 刷 染色 体 lampbrush chromosomes 55 等 臂 染 色 体 isochromosomes ”46 等 电 聚 焦 isoelectric focusing 282 等 容 线 模型 isochore model 53,132 一 133 等 位 互补 alelic complementation 100 一 102bx 等 位 基因 alleles 2,98 等 位 基因 频率 allele frequency 195 等 位 基因 取代 allele replacement 324 等 位 基因 特异 ”PCR allele-specific PCR 258 等 位 基因 特异 杂交 allele-specific hybridization 328 等 位 排斥 allelic exclusion 5 低 转 化 反 转 录 病 毒 es 239 地 高 辛 碱 基 系 统 digoxigenin system 331 第 二 位 点 突变 second site mutations 203 第 二 信使 《second messengers 396 一 399 点 突变 “point mutation 185 电 穿 孔 electroporation 303 ,333 电泳 electrophoresis 326 定向 进化 同 源 基 因 “orthologous genes 273 定位 克隆 positional cloning 308 定向 突变 targeted mutation 通过 同 源 重组 ”by homologous recombination 324 自发 的 ”spontaneous 170 定向 载体 targeting vectors ”323 一 324 .462 ， slow transforming retrovirus- 动 粒 kinetochore 55 一 56 动物 印迹 ”zoo blot 142 动 质 ( 体 ) DNA kinetoplast DNA 247 读 框 ”reading frame 117 一 118 端 粒 telomeres 56 端 粒 酶 ， telomerase 5S7f{ 短 的 串联 重复 多 态 性 short tandem repeat poly- morphism 138 断裂 剂 clastogen 5S0 断裂 融合 桥 循 环 “breakage-fusion-bridge cycle 160 对 映 效应 antipodal effects 40 多 倍 体 ”polyploidy 42 一 43 多 次 交换 “multiple crossovers 147 多 蛋白 “polyproteins 97 多 基因 家 族 multigene families 125,128,273 多 基因 效应 pleiotropy 2 多 基因 学 说 ”polygenic theory 12 多 聚 腺 苷 RNA poly(A)* RNA 377 多 聚 腺 苷 化 “polyadenylation 376 多 聚 腺 苷 化 聚合 酶 。” polyadenylate polymerase 373 ,376 多 聚 腺 苷 尾巴 ”poly(A) tail 376 多 克隆 位 点 ”multiple cloning site 301 多 联 体 ”concatemer 428 多 酶 蛋白 ”multienzyme proteins 通过 基因 融合 进化 evolution by gene fusion 277 多 起 始 位 点 ”multiple start sites 408 多 顺 反 子 “mRNA polycistronic mRNA 245 一 247 多 态 性 ” polymorphism 184 ,195 多 肽 “polypeptides 263 一 265 Nr->C 极 性 Nr->C polarity 263 一 265 其 中 的 化 学 键 chemical bonds in 265 多 线性 ,多 线 染 色 体 ”polyteny polytene chromo- somes 34 一 35 多 重 聚 合 酶 链 式 反 应 ”mnultiplex PCR 259 203 一 二 硫 键 disulfide bonds 269 二 酰 甘油 diacylglycerol 397 发 夹 结构 “hairpin 211 一 212 发 育 。 development 59 一 83 调控 regulative “61 一 62 环境 的 作用 role of environment 68 基因 调节 gene development 59 一 60 基因 组 不 等 价 59 一 00 基因 组 等 价 genomic equivalence 70bx 艇 合体 “mosaic 61 一 62 细胞 与 细胞 的 相互 作用 cell-cell interaction in 爪 蟾 早期 early Xenotuus Laevis 发 育 噪 音 ， develpmental noise _ 17 一 18bx 翻译 调控 ( 见 蛋 白 合 成 ) Translation regulation (see protein systhesis) 翻译 合成 translesion synthesis ”171,360 一 361 反 终 止 antitermination 419 反 密 码 子 anticodon 118 反 密 码 子 环 anticodon loop ”295 反 式 感觉 ”trans-sensing 7,106 反 式 激活 因子 trans-acting factors 105 反 式 剪接 trans-splicing 246 一 248 反 向 PCR inverse PCR 261 反 向 分 子 杂 交 reverse hybridization 329 反 疝 平行 链 ”antiparallel strands 206 反 向 遗传 学 “reverse genetics ”196 反 向 转录 reverse transcriptase 372,156 一 157 反选 择 counterselection 304 一 305 反 义 RNA _ antisense RNA 205 在 蛋白 合成 中 in protein synthesis 294 在 基因 表达 调控 中 ”in control of gene ex- pression 294 在 基因 治疗 中 in gene therapy 335 在 质粒 复制 中 in plasmid replication 254 一 254S 反 义 链 ”antisense strand 404 反应 的 当量 ”norm of reaction 14 反 转 录 PCR。 RT-PCR 260 一 261 反 转 录 PCR 262 反 转 录 病 毒 。 retroviruses 生活 周期 life cycle 156 一 1S7,156f{ 整合 的 机 制 genomic nonequivalence Teverse transcriptase PCR ”261 一 mechanism of integration 址 6 二 验 9 7 直 转基因 动物 的 产生 ”generation of transgenic animals 335 反 转 录 调 节 retroregulation 385 反 转 录 因 子 retroelements 165 一 167 反 转 录 转 座 retroposition 156 一 157,156f{ 反 转 录 转 座 retrotransposition ”156 一 137,156f{ 反 转 录 转 座 子 retrotransposons 165 一 166 反 转 录 子 retrons 167 反 转 录 子 retroposons 167 泛 素 ,在 蛋白 质 降 解 中 ubiquitin in protein degra- dation 285 放射 杂交 作 图 radiation hybrid mapping 135 非 保守 突变 ”nonconservative mutation 187 非 编码 区 “noncoding region 98 非常 规 重 组 illegitimate recombination “ 338， 35 苞 非 等 位 基因 的 相互 作用 人 中 一 村 拓 非 翻 译 区 “untranslated region (106) 非 复 制 型 重组 343 一 344 非 间 断 “ nondisjunction 45Sf 非 结 构 性 损害 ”noninstructional lesion 170 . 非 连接 nonconjunction 45 非 同 义 突变 ”nonsynonymous mnutation 187 非 整 倍 体 aneuploidy 43 一 45 非 指定 阅读 框 unassigned reading frame 118 非 组 蛋白 “nonhistone proteins 34 费城 染色 体 philadelphia chromosome “238 分 化 differentiation 5S9 简单 的 模型 73bx 维持 maintenance 65 一 66 分 解 代 谢 抑制 ”catabolite repression 422 分 离 ,均等 segregation equal 3 分 离 沉淀 dislodgement 250 分 子 伴侣 molecular chaperones 37,270 一 271 分 子 标记 molecular markers 138t 分 子 克 隆 molecular cloning 298 一 305 策略 strategies 306ft 基本 原理 general principles” 298 一 308 克隆 DNA 的 分 析 analysis of cloned DNA "463 ， nonallelic interactions nonreciprocal recombination simple models ”60 一 01 ,71 一 308 一 310 克隆 DNA 的 回收 recovery of cloned DNA 305 分 子 钟 ”molecular clock 196 辅 基 ”prosthetic group ”269 辅 因子 ”cofactor 268 附加 体 episomes 151 复合 染色 体 compound chromosome 48 复合 突变 complex mutant 185 复 性 动力 学 reassociation kinetics ”134, 144 一 145bx 复杂 度 ,基因 组 complexity genome 124 复制 ”replication 355 一 373 调节 regulation ”26 一 27 模型 models 367t 其 保 真 性 fidelity of 168 一 170 起 始 initiation 365 一 368 线性 基因 组 linear genomes 369t 终止 ”termination 368 一 370 复制 repliconation 110f{ 复制 又” replication fork 356 复制 的 保 真 性 fidelity of replication 168 一 170 复制 的 时 区 replication time zone 369 一 370 复制 的 跳 格 replication slipping 169,191f{ 复制 的 中 间 体 replication intermediates 373 复制 后 错 配 修复 ”post-replicative mismatch repair 86,178 一 180 复制 结合 ”replication banding 54 复制 起 始 区 ”origin of replication 367 一 369 复制 缺陷 突变 3359t 复制 体 replisome 358 一 366 原核 和 真 核 的 比较 prokaryote and eukary- otecompared 367t 复制 型 replicative form 358 复制 中 间 体 preplicative intermediates ”358 副 突 变 paramutation 7,88 replication-deficient mutants 钙 调 素 “calmodulin(CaM) 399 一 400 钙 信 号 ”calcium signaling ”399 一 400 于 涉 interference 147 一 148 干细胞 stem cell 65 杆 状 病毒 表达 系统 ”baculovirus expression 314 464 感受 态 “competence 人 工 诱 导 artificially induced 304 自然 转化 for natural transformation 110 囚 崎 片断 okzaki fragments 357 高 频 重组 品系 ”hfr strains 110 高 泳 动 蛋白 “high mobility group(HMG) 34 各 相同 性 结合 isotropic bending 211 功能 获得 gain of function 193 功能 基因 组 functional genomics 280 功能 性 克隆 functional cloning 308 供 体 接合 DNA 合成 ”doncr conjugal DNA synthe- Sis 110f{ 共 翻 译 移 框 cotranslational frameshifting (recod- ing) 293 共 合 体 cointegrate 157 共 显 性 codominance 7 共 抑 制 ”cosuppression ”106 共 转 录 调 节 cotranscriptional regulation ”415， 417 骨 形 成 蛋白 “bone morphogenetic proteins 392 一 393 窒 核 背 酸 olgonucleotides 206 守 核 苷 酸 引 物 (DOP)-PCR 259 朝 核 苷 酸 诱 变 oligonucleotide mutagensis ”327f 挂 锁 探 针 “padlock probes 331 关卡 (细胞 周期 的 ) checkpoints(of cell cycle) 21 光复 活 作 用 “photoreactivation 174 归 巢 内 含 子 和 内 和 蛋白 子 “homing introns and in- teins 104 含 硒 蛋 白质 selenoproteins 120 豪猪 ” sonic hedgehog ”82 一 83 ,127 合子 基因 , 果 蜗 zygotic genes Drosopjii 75 一 76bx 河豚 鱼 , 用 于 基因 组 分 析 genome 142 核磁 共振 波谱 学 Spectroscopy ”282 一 283 核定 位 顺序 “nuclear localization sequences 286 核 苷 ”nucleosides ”205 核 苷 酸 nucleotides 206,207t 核 苷 酸 切 除 修复 puffer fish use in nuclear magnetic resonance nucleotide excision repair La SI7S 核 骨架 ”nuclear scaffold 36 核 基 质 ”nuclear matrix 38 核 酶 ribozymes 205 核 内 小 分 子 “RNA(snRNA) small nuclear RNA (snRNA) 205 在 剪接 中 的 作用 role in splicing 378 一 379 核 仁 组 织 者 区 域 nucleolar organizer region ”53 核 受 体 家 族 “nuclear receptor family 222,393 核酸 nucleic acids 204 二 级 结构 secondary structure 208 一 212 构象 多 型 性 ”conformational polymorphism 204 骨架 backbone 206 螺旋 形态 学 “helical morphology ”209 一 211， 214bx 三 级 结构 tertiary structure 212 一 213 一 级 结构 primary structure 204 一 207， 210f 核酸 -蛋白 nucleic acid-protein 相互 作用 ( 见 蛋白 = 核酸 相互 作用 ) 核酸 的 合成 nucleic acid synthesis ”372 一 373bx 核酸 分 子 杂 交 ”nucleic acid hybridization ”327 一 330 参数“ parameters 328 在 溶液 中 in solution 328 核酸 结合 蛋白 246=233 其 中 的 识别 元 件 216 一 218 核酸 酶 ”nucleases 核酸 酶 作 图 nuclease mapping 311 生物 学 作用 ”biological roles ”365 在 分 子 克 隆 中 in molecular cloning 324t 核酸 探 针 “nucleic acid probes ”330 一 331 和 非 示 踪 标记 and nonisotopic labeling 330 核糖 体 ribosomes 205 基因 genes 53,276 加 工 ” processing 375 核糖 体 RNA(CTRNA) ribosomal RNA(IRNA) 205 核糖 体 蛋 白 “ribosomal proteins 289 核糖 体 结合 蛋白 “ribosome binding site 287 nucleic acid-binding proteins recognition elements in 核糖 体内 部 进入 位 点 internal ribosome entry site 293 核 小 体 nucleosome 33f 核心 颗粒 core particle 33 取代 _ displacement 37 相 “phasing 35 一 37 在 复制 和 转录 中 的 结构 structure during replication/transcription 37 核 型 ”karyotype 异常 的 _ abnormal 42t 正常 的 _normal 123 核 型 图 karyogram 123 盒 (DNA 或 蛋白 质 顺序 模 体 ) tein sequence motif) ”276 盒 式 诱 变 cassette mutagenesis ”318 黑 腹 果 电 ”Drosopjpilo relazogaster 分 节 。 segmentation 79 一 80bx 合 胞 体 胚 胎 中 的 模式 形成 ”pattern forma- tion in syncytial embryo 75S 一 77bx 模型 生物 ”model organism 134 同 源 异 形 基因 “homeotic genes 79 一 80bx 眼 的 发 育 eye development 78 一 79bx 很 短 补 丁 的 错 配 修复 repair 181 一 183 后 期 启动 复合 物 anaphase-promoting complex 28 后 期 滞后 “anaphase lag 46 候选 基因 ”candidate genes 309 呼 肠 病毒 ， reovirus 430 琥珀 密码 子 amber codon 117,187 玉 珀 抑制 基因 amber suppressor 203 互 变异 构 移 位 tautomeric shifts 169 互补 RNA(CCRNA) complementary RNA 互补 的 碱 基 配 对 complementary base pairs 209 互补 分 析 ”complementation analysis ”95, 101 一 102bx 互补 群 “ complementation group 101 互补 异 构 体 tautomers 169 互补 作 图 complementation map 101 互 交 reciprocal cross 4 花 斑 ”variegation 1 ,2 花 斑 染 色 ”harlequin staining 54 花 斑 位 置 效应 “position effect variegation ”39 .465 ， box(DNA or pro- very short patch mismatch 环 , 在 多 肽 中 loops in polypeptides ”266 环 核 苷 酸 cyclic nucleotided 结构 structure 207f 作为 第 二 信使 《as second messengers 396 一 398 环境 environment 12 一 14,16 一 17bx 环 状 染色 体 ring chromosome 48 回 交 backcross 3f{ 混 倍 体 ”mixoploidy 50t 混 栖 DNA( 可 同时 存在 于 和 多 种 细胞 器 的 ) promiscuous DNA 247 肌 醇 - 1,4,5 -三 磷酸 inositol-1,4, S-trisphos- phate 397 一 398 、 肌 醇 磷脂 。 inositol phospholipids ”397 一 399 基本 的 DNA 结合 结构 域 ”basic DNA-binding do- main 222 基 序 ,DNA 中 或 多 肽 序列 中 ”motif in DNA cr polypeptide sequence 276 基 序 ,蛋白 结构 中 ”motif in protein structure 267 一 268t 基因 gene 2,94 一 102 和 顺 反 子 ,结构 和 功能 的 关系 and cistrons structure/function relationship 95 一 98 命名 “nomenclature 99 术语 的 历史 history of term 94 基因 表达 gene expression ” 103 一 105 原核 和 真 核 策略 的 比较 “prokaryote and eu- karyote strategies compared ” 106 一 107 基因 表达 的 连续 分 析 “serial analysis of gene ex- pression(SAGE) 280 基因 包 载 _gene trap 281 基因 产物 gene product 103 基因 超 家 族 gene superfamily 273 基因 导向 gene targeting 322,323 基因 的 大 小 gene size 126 基因 调节 gene regulation 105 一 106 诱导 和 阻 遇 induction and repression 106 总 的 和 狭义 的 结构 域 global and narrow do- main 100 基因 毒物 “genotoxic agents 170,172t 基因 跟踪 _ gene tracking 281 基因 剂量 gene dosage 41 基因 家 族 ”gene families 262 一 280 "。 466 ， 常规 的 conventional 273 一 276 能 合 的 “chimeric 276 一 279 基因 结构 gene structure ”97 一 98 基因 扩 增 ”gene amplification 程序 性 programmed 70,202 抗 药性 ”drug resistance ”202 载体 表达 “expression vectors 314 在 癌 中 in cancer 236 一 239 基因 密度 ”gene density 127 基因 破坏 gene disruption 41 基因 融合 gene fusion 41,190 基因 数 gene number 127 基因 套数 gene batteries 417 基因 剔除 _ gene knockout 324 基因 突变 ”gene mutation ”184 基因 型 genotype 2 基因 引入 gene knock-in 324 基因 增 大 治疗 gene augmentation therapy ”335 基因 治疗 gene therapy 321,324,335 一 336 基因 重复 gene duplication 机 制 mechanisms 275 一 276 基因 重复 和 趋 异 gene duplication and divergence 263,274 一 276 基因 转变 gene conversion 191 等 位 基因 allelic 343 信息 盒 转换 information cassette 344 在 DNA 修 复 中 in DNA repair 339 在 被 动 转 座 中 in passive transposition HS54 635 基因 转移 ,细菌 。 gene transfer bacterial 116 基因 组 ”genome 122 基 8 一 基因 组 genomes 结构 和 组 成 structure and orgamization 1 了 多 六 物理 化 学 性 质 “physico-chemical properties 123 一 124 基因 组 的 ”genomics 133 一 143 基因 组 文库 ”genomic libraries 305 基因 作 图 gene mapping 细菌 ”bacteria 115 真 核 生物 eukaryotes 133 一 143 基因 座位 gene locus 2,98 吉普 赛 转录 因子 “Gypsy tansposon 39 极 性 突变 ”polar mutation 101 急性 转化 的 反 转 录 病 毒 retroviruses ”2335 剂量 补偿 dosage compensation 68 剂量 效应 dosage effects 41,190 剂量 重复 dosage repetition 277 加 帽 “capping 376 加 性 效应 additive effects 10t 家 谱 分 析 “pedigree analysis “15 一 16bx 甲 基 化 于 扰 分 析 法 “methylation interference as- 二 病 /23153232H 假 常 染色 体 区 域 ”pseudoautosomeal region 4， 52 假 常 染色 体 遗 传 “pseudoautosomeal inheritance dlS= 16 假 基 因 “pseudogene “98,129 非 加 工 (基因 ) nonprocessed processed ”129 加 工 ( 基 因 ) processed 129,152,167 假 结 “pseudoknot 213 减 数 分 裂 ”meiosis 减 数 分 裂 趋 动 ”meiotic drive 6 一 8 减 数 分 裂 作 图 meiotic map ”133 减 数 效 应 “hypochromic effect 327 剪接 体 spliceosome ”378 一 379 剪接 因子 splicing factors ”379 简 并 ,遗传 密码 degeneracy genetic code 119 碱 基 ,在 核酸 中 ”bases in nucleic acids 204 碱 基 比 ”base ratio 123 碱 基 丢 失 。 base lose 170 碱 基 堆积 “base stacking 208 碱 基 类 似 物 “base analog 170 碱 基 切 除 修 复 ”base excision repair 175 一 178 碱 基 修复 ”base pairs Hoogsteen 209 Watson-Crick 208,208f 选择 性 alternative 209 碱 基 组 成 ”base composition 123 一 124 碱 性 磷酸 化 酶 alkaline phosphatase 299 交叉 ”chiasmata 341 交叉 传递 信息 cross-talk 400 交配 型 转换 “mating type switching 344 胶 质 滚动 基 序 jelly roll motif 268 acute transforming 校正 “Proofreading 在 翻译 中 在 复制 中 in replication 酵母 的 人 工 染 色 体 (YAC) mosome(YAC) 323 一 324 酵母 克隆 载体 ”yeast cloning vectors “331 一 332 接合 conjugation 106 一 110 结构 域 ,蛋白 结构 “domains of protein structure 266 结构 域 交 换 “domian swap 229 包 载 载体 entrapment vectors 317 姐妹 染色 单 体 交 换 sister chromatid exchange 50 芭 了 解 离 , 共 合 体 的 。 resolution fo cointegrate “155 解 旋 酶 ”helicase 362 介质 mediator 401 葵 环 stem-loop ”65 精确 解 离 , 转 座 的 。 precise excision of transposons 158 巨大 质粒 ”megaplasmids 249 聚合 酶 链 式 反 应 ( 见 PCR) “polymerase chain re- action(see PCR ) 卷曲 螺旋 ”coiled coil 267 决定 ”determination 65 菌落 印迹 colony blot 329 菌 毛 pilus 109 in translation (129) 168 一 169 yeast artificial chro- 开放 阅读 框 ” open reading Frame 98,117,287 抗体 antibodies 346,353 一 354 用 于 蛋白 分 析 for protein analysis 282 抗体 酶 ”abzymes 317 抗原 转换 antigen switching 346 可 移动 的 遗传 因子 “mobile genetic elements SG67 克 兰 费 尔 特 氏 综 合 征 ”Klinefelter s syndrome 44 克隆 载体 ”cloning vectors 301 克隆 重 秋 作用 clone contig map “139 一 140 克 - 雅 病 creutzfeldt-Jakob disease 435 一 436 控制 因子 ”controlling elements 164 扣除 杂交 subtractive hybridization ”310 扩 增 子 amplicon 315 467 拉 氏 图 (指示 蛋白 质 主 链 二 面 角 允 许 范 围 的 图 形 ) Ramachandran plot 265 蓝 -白斑 选择 ”blue-white selection 304 类 别 转换 “class switching 349 类 病毒 ”viroids ”251 类 病毒 ”virion ”423 类 核 ,结构 和 组 成 zation 39 一 40 离子 反应 元 件 iron response element “294， 385 一 386 离子 通道 ion channels 388 连接 酶 链 反 应 ligase chain reaction 262 连接 数 颠 倒 现象 linking number paradox 35 连锁 linkage 9 连锁 拷贝 的 表达 expression linked copy 346 连锁 平衡 /不 平衡 linkage equilibriumvdisequilib- rium 341 连锁 作用 linkage mapping 342,135 一 139 精确 度 限 制 148bx 连接 体 linkers 301 连续 性 状 ” continuous character 11 镰刀 形 细 胞 贫血 /性 状 sickle cell anemia/trait 195 一 196 链 的 跳 格 ( 见 复制 跳 格 ) Replication slipping) 亮 氨 酸 拉链 leucine zipper 222,227 裂解 感染 lytic infection 424 裂 缺 基因 gap gene 75 一 76 邻接 基因 综合 征 “contiguous gene syndrome 46 邻近 (序列 ) 依 赖 性 调节 ”context-dependent regu- lation 415 磷酸 二 酯 键 ”phosphodiester bond ”206 磷酸 肌 醇 3 -激酶 ” phosphoinositide 3 - kinase 319f 流动 性 flow sorting 307 滤 膜 杂交 filter hybridization ”327 一 330bx 螺旋 一 环 一 螺旋 ”helix=-loop-helix 222 螺旋 一 转角 一 螺旋 ”helix-turn-helix 219 一 221 nucleoid structure and organi- ]imitations to accuracy 146 一 strand slipping ( see 脉冲 电场 凝 胶 电 泳 ”pulsed field gel electrophoresis 926 一 327 帽 cap 376 。 468 ， 帽 结合 蛋白 “cap-binding protein 291 帽 摄 取 ”capsnatching 376 酶 错 配 剪接 enzyme mismatch cleavage 309 酶 级 联 调节 enzyme cascades 细胞 内 信号 intracellular signling 393 备 德 尔 第 二 定律 ”mendel's Second Law 8 一 9 备 德 尔 第 一 定律 “mendel's First Law 3 备 德 尔 遗 传 ”mendelian inheritance 1T,11 密码 子 codon 117 定位 ”codon assignment 120 家 族 ”codon family 119 选择 /使 用 / 偏 移 usage/choice/bias/perfer- ence 120 免疫 球 蛋 白 immunoglobulins 多 样 性 diversity 免疫 球 蛋 白 基 因 immunoglobulin gene 353 一 354 命运 图 fate maps 62 模型 生物 ,基因 组 的 “model organisms genomics 122,134t 末端 元 余 terminal redundancy ”428 末端 脱氧 核 苷 酸 转 移 酶 teminal de- oOxynucelotidyl transferase 373 母体 基因 , 果 蝇 maternal genes Drosobppiza 5 母体 效应 ”maternal effect 5 一 6,61f 母体 遗传 “maternal inheritance 242,243f 拟 病毒 样 ”virusoid 434 内 共生 学 说 endosymbiont theory 247 内 含 子 introns 126 刘 剪接 ”splicing 379 一 380 起 源 和 进化 ”origins and evolution 278 相位 “phase 278 一 279 内 含 子 密码 蛋白 380 一 381 内 在 终止 子 intrinsic termination 转录 的 ”of transcription 419 逆向 转 座 inverse transposition 158 逆转 reversion “48 一 49f 乌 枪 测序 “shotgun sequencing ”150 凝 胶 电 泳 gel eleetrophoresis ”298 ,326 一 327bx DNA 大 分 子 large DNA molecules 326 一 introm-encoded proteins 327bx 凝 胶 阻 滞 分 析 法 232{ gel retardation assay “231t， 排斥 作 图 exclusion mapping 137 胚胎 干细胞 embryonic stem cells 334 一 335 配对 规则 基因 pair rule genes 76 片段 极 性 基因 segment polarity genes 66,75 平衡 机 制 ”balance mechanism 69 平衡 染色 体 “balance chromosome 47 平行 汇 接 “paranemic joint ”213 平行 进化 同 源 基因 ”paralogous genes ”273 平行 进化 同 源 染 色 体 片断 paralogous chromo- some segments “215 普遍 性 转录 因子 general transcription factor 407 启动 子 “promoter 403 启动 子 包 载 “ promoter trap ”317 启动 子 清 除 “ promoter clearance “403 起 始 NA, 在 蛋白 合成 中 的 作用 tRNA role in protein systhesis 290 起 始 密码 子 initiation codon ”117,120 起 始 因子 ,蛋白 合成 synthesis 290 前 病毒 “provirus 424 前 导 链 - 后 滞 链 模型 strand model 356 潜能 “potency “66 散 合 体 mosaic 50 艇 套 式 ”PCR nested PCR 258 亲本 印迹 ”parental imprinting ”5 在 哺乳 动物 发 育 中 的 作用 malian development 91 一 92 增强 子 竞 争 “enhancer competition ”90 氢 键 ”hydrogen bonds initiation initiation factors protein leading strand-lagging role in mam- 在 蛋白 一 核酸 结合 中 in protein-nucleic acid 5 一 22 在 蛋白 质 中 in proteins 269 在 核酸 中 in nucleic acids 209 一 210 区 域 特 化 regional specification “59 取代 的 保 真性 substitution fidelity 铀 失 环 deletion loop 46 168 一 169 染色 单 体 chromatid 5S2 染色 粒 chromomerse 53 一 55 染色 体 chromosome 52 一 58 分 类 /命名 法 SI 58 分 子 结构 “molecular structure 55 一 58 形态 学 “morphology 52 一 55 中 期 ”metaphase 36 染色 体 变 形 “chromosome derivatives “46 染色 体 不 平衡 ( 非 整 倍 体 ) chromosome imbal- ance(aneuploidy) 46,185 染色 体 步 移 chromosome walk 308 染色 体 断 裂 点 “chromosome breakpoints ”46 染色 体 分 带 ”chromosome banding 52 一 53t 染色 体 缺 失 ”chromosome deletions 46 染色 体 下 松 ”chromosome puffs 54 染色 体 数 “chromosome number 123 染色 体 跳 取 ”chromosome jumping 308 染色 体 突 变 ”chromosome mutation ”41 一 51 不 平衡 的 “unbalanced 41 一 47 构成 的 ”constitutional _ 41 一 51 结构 的 structural 41 一 51,184 一 186 平衡 的 balanced 41,47 数目 的 “numerical 41 一 46,185 体 细胞 的 ”somatic 41,51,100 一 110 染色 体 团 “chromosome painting 143 染色 体重 复 chromosome duplications ”46 染色 体 登 陆 chromosome landing 309 染色 质 ”chromatin 32 一 40 打开 的 和 抑制 的 “open and repressed 38 减少 diminution 70 结构 structure 33 一 37 结构 域 ”domains 38 一 40 在 基因 调节 中 的 作用 role in gene regulation 37 一 40 重 链 remodeling 30,38 人 工 染 色 体 载体 artificial chromosome vector 303 人 类 基因 组 计划 “human Genome Project 134 溶 原 性 lysogeny 424 融合 蛋白 fusion protein 41,189 宛 余 , 结构 和 功能 classification Momenclature redundancy structural and 。469 。 functional 129 乳白 密码 子 opal codon 117,187 乳白 抑制 基因 ”opal suppressor ”203 肝病 毒 复制 和 重 折 释 模型 refolding model of pri- on replication 435f{ 肝病 毒 假 说 ”prion hypothesis ”434 一 436 三 股 螺旋 triple helix ”212 三 股 螺旋 治疗 triple helix therapy ”335 一 336 三 联 体 triplet 117 三 联 体重 复 综 合 征 triplet repeat syndromes 201 一 202bx 扫描 学 说 ”scanning hypothesis ”291,293 扫描 诱 变 ”scanning mutagenesis ”319 杀伤 系统 Killer system 250 杀伤 性 质粒 killer plasmids ”251,252 杀伤 因子 ”killer factors 251 上 位 性 epistasis 10t 渗透 等 位 基因 leaky allele 192 生长 因子 growth factors 387 一 388 生长 转化 growth transformation 234 生物 素 - 链 霉 素 系统 biotin-streptavidin system 331 生殖 细胞 突变 germinal mutation 184 失控 复制 runaway replication 253 失 配 的 化 学 剪 切 chemical cleavage of mismatch 309 失去 功能 loss of function 192 失去 杂 合 性 loss of heterozygosity 241 示 值 读数 ,通过 蛋白 质 的 DNA 顺序 readout of DNA sequences by proteins ”228 一 330 适应 反应 ”adaptive response 175 释放 因子 release factor ”292 鸣 菌 升 高 ”plaquelift 351 鸣 菌 体 ”phagemids ”301 一 303 鸣 菌 体 展示 “phage display ”318 喉 粒 ”phasmids 301 受 体 的 酷 氨 酸 激酶 receptor tyrosine kinase 390f 受 体 的 丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶 ”receptor serine/thre- onine kinases 292t 玻 水 核心 ”hydrophobic core 269 数量 “PCR quantitative PCR ”261 。 二 70“。 数量 性 状 ”meristic character 11 数量 性 状 基因 座 quantitative trait loci ”138 一 139 数量 遗传 quantitaitve inheritance “11 一 15 衰减 、 误 减 子 调节 attenuation attenuator control 419 双 链 RNA 结构 域 dsRNA-binding domain 225 双 微 体 染 色 体 double minute chromosome 202 双 相 基因 组 组 成 ”biphasic genome 5S$3,132 双向 电泳 2- D electrophoresis ”282 双 义 基因 ambisense genome 426 双 杂 交 系 统 two hybrid system 317 双 杂 种 杂交 dihybrid cross “8 一 9%f 水 泡 状 脂 块 ”hydatidifrom moles 45 水 平 的 基因 传递 horizontal gene transfer 274 顺 反 测验 cis-trarzs test 95,100 一 102bx 顺 反 子 “cistron 95 一 97 顺 式 激 活 因子 cis-acting elements 105 顺 式 显 性 cis-dominance 101,105 顺序 定位 位 点 sequence tagged sites 141 死亡 结构 域 ”death domain “30 一 31 四 分 体 分 析 tetrad analysis “147 松弛 型 控制 ,松弛 型 质粒 relaxed control relaxed plasmid 250,255 宿主 控制 的 限制 修饰 系统 host controlled re- striction-modification systems “ 84 一 85 随机 遗传 漂 度 ”random genetic drift ”195 随机 诱 变 ”random mutagenesis ”319 损伤 ,DNA 的 lesions DNA_ 170 一 171 肽 核 苷 酸 (PNA) peptide nucleic acid(PNA) 336 肽 酰 - tRNA PeptidyL-tRNA “292 唐 氏 综合 征 ”down's syndrome 44 套 索 中 间 体 lariat intermediate 378 特 纳 氏 综合 征 turer's syndrome “44 特性 specification 条 件 的 ”conditional 62f 在 发 育 中 的 in development “66 自主 的 “autonomous ”62f 特异 性 重组 位 点 site-specific recombination 338 ,345 一 346 在 转基因 生物 中 in transgenic organism 自 WE 325 体内 的 intrabodies 336 体内 足迹 “到 vwioo footprinting 231 体外 包装 。 Im vitro packaging 304 体外 诱 变 ”到 witro mutagenesis 318 系统 的 “systematic 319 体 细 胞 高 变 ”somatic hypermutation “202 体 细胞 突变 “somatic mutation “184,234 一 239 体 细 胞 杂交 somatic cell hybrids ”140 体 细 胞 重组 somatic recombination ”346 条 件 突变 conditional mutants ”193,197 通读 readthrough(protein synthesis) ”293 通读 突变 ”readthrough mutation ”187 同胞 配对 分 析 sib pair analysis ”137 同等 位 基因 isoallele 6,193,195 同 工 tRNA isoaccepting tRNA 119 同 接合 性 autozygosity 137 同 聚 物 加 尾 homopolymer tailing 301 同 线性 synteny ”341 同型 isotypes 346 同 义 突变 ”synonymous mutation 187 : 同 源 多 倍 体 autopolyploidy 43 同 源 染 色 体 ”homeologous chromosomes 43 同 源 物 “ homology 273 同 源 性 -依赖 基因 沉默 ”homology-dependent gene silencing 106 同 源 异 型 基因 “homeotic genes 127 同 源 异 型 结构 域 ”homeodomain 219 一 220 同 源 重 组 ”homologous recombination 分 子 基 础 ”molecular basis ”339 一 340 机 制 ”mechanism 337 一 339 局 部 频繁 变异 regional frequency 148 热点 和 冷 点 ”hotspots and coldspots 148 在 遗传 作 图 中 的 作用 ping 340 一 344 同 种 (型 ) 排 斥 isotypic exclusion 347 同 种 异型 allotype 346 头 满 装 机 制 ”headful mechanism 428,429f 突变 ”mutation 168,184 功能 效应 “ functional consequences 190 结构 的 阶 元 structural categories ”184 突变 率 ”mutation rate “195 role in genetic map- 186 一 突变 频率 ”mnutation frequencey “195 突变 热点 mutation hotspots “194 突变 筛选 “mutation screening ”310 突变 体 mutant 184 突变 型 等 位 基因 ”mnutant alleles 突变 压力 “mutation pressure “195 图 式 形 成 “pattern formation ”59 脱 氨 “deamination 171t 拓扑 异 构 酶 ”topoisomerase ”363,364t 191 一 193 外 显 率 ”penetrance 8 外 显 子 exons 126 外 显 子 滑 动 exon sliding 279 外 显 子 截留 exon trapping 142 外 显 子 跳 耻 ”exon skipping 379 外 显 子 相 位 ,在 进化 中 的 作用 exon phase role in evolution 279 外 显 子 移动 exon shuffting 263,277 外 显 子 重复 exon duplication 263,277 外 遗传 基因 调节 epigenetic gene regulation 86 一 93 外 遗传 基因 信息 ” epigenetic information 84,117 外 遗传 学 epigenesis 59 网 柄 菌 属 的 生活 周期 ”Dictyostelizzzz discoiderzrz life cycle 72 一 73bx 微 弹 ”microballistics 320,330 微 了 卫星” microsatellite 131 维持 甲 基 化 酶 ” maintenance methylase 84 卫星 DNA satellite DNA 125,131 卫星 病毒 satellite viruses ”434 卫星 核酸 satellite nucleic acids ”434 卫星 连接 satellite association 5S3 卫星 区 域 satellite region 53 位 置 效应 ”position effects ”41,189 位 置信 息 ”positional information ”59,66 温和 噬菌体 temperate phage “424 文昌 鱼 ”amphioxus 275 蜗牛 中 的 螺旋 coiling in snails 61f{ 无 翅 ”wingless 78 一 79bx 无 效 等 位 基因 ”null allele “192 无 义 密码 子 “nonsense codon 117 无 义 突变 “nonsense mutation ”187 无 用 DNA junk DNA 125 . 471 ， 物理 图 physical maps “133 物理 作 图 , 低 分 辨 率 “physical mapping low reso- lution 140t 希腊 钥匙 模 体 greek key motif 267 一 268 硒 代 半 胱 氨 酸 ”selenocysteine “120 硒 代 半 胱 氨 酸 插 人 顺序 selenocysteine insertion sequence ”120 细胞 分 裂 、 细 菌 的 “cell division bacteria 19 一 20 细胞 器 基因 组 ”organelle genomes “242 一 248 细胞 器 遗传 学 ”organelle genetics 242 一 244 细胞 器 质粒 ”organelle plasmids ”247 细胞 型 cytotype 160,244 细胞 遗传 学 作 图 “cytogenetic maps 133 细胞 因子 ”cytokines 387 一 388 细胞 因子 受 体 “cytokine receptors ”390 一 391 细胞 质 决定 ”cytoplasmic determinants 61 细胞 质 遗 传 cytoplasmic inheritaqnce “ 247 一 248,242 细胞 周期 ”cell cycle 细菌 的 ”bacterial “19 一 20 真 核 细 胞 的 。 eukaryotes 20 一 31 细胞 周期 蛋白 “cyclins 23 一 24 细胞 周期 蛋白 依赖 型 激酶 cyclin-dependent ki- ESES 3 一 2 细胞 周期 起 始 START ， 22,25 一 26 细菌 的 人 工 染 色 体 (BAC) bacterial artificial chromosome 303 细菌 启动 子 的 结构 structure of bacterial ”406f{ 细菌 噬菌体 bacteriophage 423 细菌 噬菌体 M13 bacteriophage M13 218 细菌 鸣 菌 体 Mu bacteriophage Mu 424 复制 ”replication 355 一 373 宿主 范围 的 变化 host range variation 351 一 352 细菌 噬菌体 入 _bacterophage 入 436 一 441bx 基因 调节 gene regulation 430 一 431， 436 一 439bx 克隆 载体 “cloning vectors 310 一 303 整合 和 切 离 integration and excision 351 细菌 转录 调控 ”transcriptional regulation bacteia 415 一 417 lac 操纵 子 /ac operon ”421bx .472 ， B 珠 蛋白 基因 8B- Globin gene “421bx 真 核 eukaryotes ”417 一 418 细菌 转录 起 始 transcriptional initiation bacteria 405 一 407 RNA 到 合 酶 I RNA polymeraseI 408 RNA 聚合 酶 II RNA polymerase II 408 一 409 RNA 聚合 酶 III RNA polymerase III 410 细小 病毒 ”parvovirus ”428 下 位 “hypostasis 10t 先 成 论 ”preformation ”59 纤 丝 放射 fiber diffraction 284 纤 丝 荧光 原 位 分 子 杂 交 fiber FISH 140 显 性 ”dominance 1 一 2,6 一 7,192 显 性 关系 domaince relationship 7 一 8&t 显 性 激活 ”dominant positive 193 显 性 失 活 ( 失 活 显 性 ) dominant negative(trans- dominant) ”102 ,106,193 线粒体 DNA_” mitochondrial DNA 复制 replication 246 一 247 突变 体 ”mutants 244t 组 成 和 基因 表达 ”organization and gene ex- pression 244 一 246 线粒体 途径 ”mitochondriopathies -243 限制 性 酶 /内 切 酶 restriction enzymes/endonucle- ases 325 限制 性 片段 长 度 的 多 态 性 restriction fragment length polymorphism 329 限制 性 图 谱 ”restriction map 310 限制 性 位 点 retriction point 299 相 缠 连接 “plectonemic joint 213 相互 作用 陷 井 。 interaction trap 317 相 吻 复合 体 kissing complex ”255 消除 _ curing 250 小 沟 “minor groove 210 小 卫星 ”minisatellite DNA_ 131 效应 因子 response elements “417 协同 结合 ”cooperative binding 271 协同 进化 ”concerted evolution 276 协同 转 座 cooperative transposition 158 锌 双核 基因 艇 ”zinc binuclear cluster ”221 锌 指 zinc finger CyszHis 220f DNA 识别 密码 子 _DNA recognition code 229t 多 半 胱 氨 酸 ”multicysteine 221 新 效 等 位 基因 ”neomorph ”193 信和 号 转 导 signal transduction ”387 一 402 免疫 系统 immune system ”391 一 392 信号 转 导 及 转录 活化 蛋白 STATSs 391 信和 号 连接 signal joint 347 信使 RNA messenger RNA(mRNA) 205 加 工 ”processing 375 一 383 细菌 和 真 核 生 物 的 生活 周期 life cycle in bacteria and eukaryotes 287 一 288 信息 的 抑制 informational suppression 203 信息 体 informosome 375 一 376 形态 发 生 ”morphogenesis ”59,66 一 68 性 别 决定 ”sex determination ”69t 性 导 sexduction ”110,114bx 性 连锁 sex-linkage “4 一 5f,15 一 16bx 性 连锁 遗传 ”sex-linked inheritance ”4 一 5f,15 一 16bx 性 染色 体 ”sex-chromosomes ”52 性 状 character 1,2 修复 缺陷 综合 征 ”repair dificiency syndromes 174t 修复 体 ”repairosome 178 许可 因子 licensing factor 27 序列 同 质 化 “sequence homogenization 选择 压力 selection pressure “195 选择 性 剪接 alternative splicing 381 一 383 在 果 蝇 性 别 决定 中 in Drosozpjpila sex deter- mination 383 血红 蛋白 病 hemoglobinopathies ”198 一 200 血红 蛋白 紊乱 分 子 基础 ”Hemoglobin disorders molecular basis 198 一 200 循环 交替 变换 “circular permutation ”428 276,263 芽 不 能 出 ”thallasemias 11 亚 病毒 感染 因子 subviral agents 延伸 因子 elongation factors 蛋白 质 合成 ”protein synthesis 219f 转录 ， transcription 416 一 417 严 紧 (性 ) stringency ”327 严 紧 控制 , 严 紧 质粒 168 一 169 sttringent control stringent plasmids 250,255 摇摆 法 则 wobble rules ”119,207 摇摆 假说 “wobble hypothesis 119,207 野生 型 wild type 184 叶绿体 DNA 的 特点 of 245 一 倍 体 数 “monoploid number “123 一 基因 一 酶 模型 one gene one enzyme model 94 移动 ,质粒 转移 mobilization of plasmids for transfer “109 移 码 的 保 真 性 ”frameshift fidelity 169 一 170 移 码 突变 frameshift mutation 187 移 位 ”transvection 106 遗传 “heritability ”17bx 遗传 标记 “genetic markers 138t 遗传 的 染色 体 理论 ”chromosome theory of inheri- tance 32 遗传 力 “ heredity 2 遗传 连锁 genetic linkage 9 遗传 密码 genetic code 117 一 121 密码 子 排 布 的 变化 Signment 121t 通用 性 ”universal 118f 性 质 “properties 118f 遗传 筛选 genetic screens ”196 遗传 网 络 genetic networks 197,281 遗传 信息 genetic information 117 遗传 性 胎儿 血红 蛋白 住 留 ” hereditary persistence of fetal hemoglobin 200 遗传 作 图 genetic mapping 133 ,135 一 139 数量 性 状 基 因 座 下 8 一 19 乙 型 肝炎 病毒 ，hepatitis B virus 428 已 接触 抗原 质粒 “prime plasmid ”250 异 合体 “heterozygous 2 异 染 色 质 “heterochromatin 36 在 基因 沉淀 中 的 作用 role in gene silencing 40 异 时 性 突变 “heterochronic mutations 67 异 位 表达 ectopic expression 193 异 源 多 倍 体 allopolyploidy 43 异 源 峙 合体 chimera 341 chloroplast DNA properties variations in codon as- quantitative trait loci .473 ， 抑制 quenching ”414 抑制 ”suppression ”10t,203bx 抑制 结构 域 (转录 阻 遏 物 ) transcriptional repressors) 422 易 位 translocation 交互 的 reciprocal 48 一 49f 罗 伯 逊 / 整 臂 的 ， robertsonian 人 wbhole arm 48 一 49 染色 体 突 变 49f{ 在 蛋白 合成 中 in protein synthesis “292 阴 门 特 化 “vulval specification “77 一 78 引导 RNA(gRNA) guide RNA 385 引发 策略 ”priming strategies 369t 引发 体 primosome 362 引物 ”primers 任意 的 arbitrary ”261 PCR 引物 for PCR 257 引物 延伸 ”primer extension ”311 隐蔽 型 剪接 位 点 ”cryptic splice site 379,383 隐蔽 型 卫星 DNA cryptic satellite DNA 131 隐蔽 型 质粒 cryptic plasmids 249,250 隐 性 的 “recessive “1 一 2,192 印记 盒 ”imprinting boxes 89 印记 和 染色 体 失 活 “imprinting and X-chromo- some 3,91 一 93 荧光 激活 染色 体 分 选 fluorescence activated chro- Imosome sorting(FACS) 306 荧光 原 位 分 子 杂 交 ”FISH 140 营养 缺陷 型 auxotroph 198 优势 对 数 记分 lod scores 135 有 丝 分 裂 ”mitosis 28 控制 的 “control of 26 一 28 有 丝 分 裂 分 离 “mitotic segregation 342 有 丝 分 裂 重 组 “mitotic recombination ”342 有 义 链 ”sense strand ”404 有 义 密码 子 sense codon 117 诱 变 ” mutagenesis inhibition domains(of chromosome mutation “48 一 被 诱 变 induced ”168 一 172 基因 导向 gene targeting “321 在 体外 禄 vitro 318 自然 机 制 “natural mechanisms 157 一 160 诱 变 剂 ”mutagen 170,171t 。 474 ， 诱导 induction 侧 优势 lateral inhibition 63 一 64f 发 育 中 in development 63 一 64f{ 基因 表达 ”of gene expression 421bx 潜伏 病毒 的 ”of latent virus 424 群落 效应 community effect 63 细菌 噬菌体 ”bacteriophage 入 ”436 一 9 形态 发 生 素 “morphogens in 63 允许 的 “permissive 63 指令 instructive 63 自体 的 ”homeogenetic 63 诱导 契合 induced fit 226 阔 值 性 状 threshold character 11 原 癌 基 因 ”proto-oncogenes “235 一 236 原生 质 球 “spheroplasts ”332 原 噬菌体 progphage 424 原 位 PCR Jm sitx PCR 261 原 位 分 子 杂 交 Im sitw hybridization ”140 ,312， 329 原 养 型 prototroph “198 圆 二 色 性 ”circular dichroism 282 匀 染 色 区 ”homogeneously staining region 202 杂交 育种 ”cross-feeding 102 杂种 不 育 “ hybrid dysgenesis 160 省 类 受 体 steroid receptors “393 在 芽孢 杆菌 中 的 孢子 形成 ”sproulation in Baci7- Zus subii0zs 71 一 72bx 在 遗传 筛选 中 选择 selection in genetic screens 196 在 分 子 克 隆 中 选择 in molecular cloning 304 一 305 自然 和 人 工 的 选择 ”natural and artificial 17 一 18bx,195 一 196 早期 遗传 anticipation 166bx 早早 期 基因 immediate early genes 病毒 的 “viral 436,440 细胞 的 ”cellular 30,402 噪音 抑制 ”squelching 411 增 变 基 因 / 抗 增 变 基因 genes 168 增强 enhancement 10t,203 增强 体 enhancosome 412 mnutatorvantimutator 增强 子 ”enhancer 409 一 410 增强 子 捕获 _enhancer trap 317 粘 粒 cosmid 302 折 回 因子 foldback elements 162 赭石 密码 子 _ochre codon ”117 赭石 抑制 基因 ochre suppressor ”203 整个 基因 组 的 重复 ”whole genome duplication 7 整合 酶 integrase 逆转 录 病 毒 的 _ retroviral 151 噬菌体 入 bacteriophage 入 351 整合 子 integrons 164 一 165 正 负 双 重 选 择 positivenegative dual selection 322f 正 向 克隆 directional cloning 301 正 向 突变 directed mutation 195,201 一 202bx 正 向 突变 forward mutation 191 正 向 突变 位 点 sitedirected mutagenesis ”318f{ 脂 ( 质 ) 转 染 (法 ) lipofection 320 脂 类 第 二 信使 lipid second messengers 397 直接 逆向 修复 ”direct reversal repair 172 一 175 直接 显示 原 位 分 子 杂交 DIRVISH 140 质粒 ”plasmids 《249 一 256 分 类 classification ”249% 一 251 接合 与 非 接合 ”conjugative and nonconjuga- tive 250,251,2S6bx 拷贝 数 copy number 251 一 253 质粒 表 型 plasmid phenotypes “251 质粒 分 配 ”plasmid partition ”20,250 质粒 复制 plasmid replication 254 一 255 质粒 拯救 plasmid rescue ”161,317 质粒 颗粒 载体 plasmid cloing vectors 301 一 303 质粒 维持 ”plasmid maintenance “250,254t 致密 甲 基 化 岛 ”densely methylated island 368 致死 等 位 基因 lethal allele 8 置换 transplacement “322f 中 胚层 诱导 , 爪 昌 74 中 心 法 则 “central dogma 104t 中 性 突变 neutral mutation 185 中 子 扩 散 ”neutron scattering “284 终止 密码 子 stop codon ”117 终止 密码 子 termination codon ”117 mesoderm induction Xezzozpvs 肿瘤 病毒 ”tumor viruses ”425 肿瘤 抑制 基因 239t 重度 联合 免疫 缺损 SCID 347 珠 蛋 白 基 因 globin genes 突变 ”mutation 198 一 199 转录 调控 transcriptional regulation 420 一 421 转 导 transduction 303,111 一 113 普遍 性 generalized ”111,112 特异 性 ”specialized 113 转化 transformation ”303,320 人 工 转 化 大 肠 杆菌 artificial of 开 . col: 304 细菌 的 自然 转化 ”of bacteria natureal 1 | 转化 的 生长 因子 - B 亚 家 族 transforming growth factor-B superfamily 392 一 393 转换 区 “switch regions 348 转基因 ”transgenesis ”321,332 一 335 tumor Suppressor genes ”234， DNA 的 随机 整合 random integration of DNA 333 一 334 可 诱导 的 转基因 活性 inducible transgene activity ”335 位 点 特异 重组 系统 site specific recombina- tion systems “335 转基因 的 动物 和 植物 transgenic animals and 避 5ntsRnS21 交 32 335 转 接 器 adaptors 301 转录 Transcription ”403 原理 principles ”404 一 405 在 细菌 中 的 起 始 initiation in bacteria 405 一 407 在 真 核 中 的 起 始 initiation in eukaryotes 407 一 410 转录 单位 ”transcription unit 98 转录 的 延伸 调节 ， transcriptional elongation regu- lation of 。 417 一 418 转录 分 析 transcript analysis ”311t 转录 间隔 顺序 transcribed spacer sequences 98 一 99 转录 -连接 修复 transcription-coupled repair Ge 7S 转录 停滞 transcriptional arrest ”417 转录 因子 ”transcription factors DNA- 结 合 结构 域 DNA-bingding domains 2T6 一 233 s 本 。 被 蛋白 质 信号 激活 activation by signaling proteins “401 二 聚 化 结构 域 dimerization domains ”224 激活 的 调节 regulation of activity 414 一 416 激活 结构 域 activation domains “422bx 样本 和 结合 位 点 examples and binding sites 417t 重组 激活 “combinatorial activity “415 组 成 的 “constitutive “408 作用 机 制 “mechanism of action ”409 一 414 转录 终止 ”transcriptional termination ”419 转录 作 图 transcriptional map ”143 转 染 transfection ”303 ,320 细菌 的 “of bacteria 109 真 核 细胞 的 “of eukaryotic cells ”320 转 座 标 记 transposon tagging “162 转 座 酶 ， transposase ”151 保守 的 和 复制 的 “conservative and replicative 153 二 :的 3 调节 regulation ”157 一 1S9 机 制 ”mechanisms 152 一 156 效应 的 “consequences of 。 157 一 160 异常 的 transposition aberrant ”160 转 座 因子 transposable elements ”151 I 类 ( 见 反 转录 因子 ) ， class I(see Retroele- ments) I 类 ( 见 转 座 子 ) class II(see Transposons) ， 476 ， 分 类 classification 161 一 167 用 途 used 161,161t 转 座 子 transposons ”161 一 165 准 性 交换 , 细菌 的 “parasexual exchange bacteria 108 着 色 性 干 皮 病 xeroderma pigmentosum 174 着 丝 粒 centromere 55 一 56 自然 选择 ”natural selection 195 一 196 自杀 酶 suicide enzyme “175 自我 剪接 内 含 子 “self-splicing introns ”379 一 381 自在 DNA selfish DNA 126 足迹 footprints 蛋白 质 的 “of proteins 231 一 232 准确 切 离 转 座 因 子 的 “of precisely excised 1S8 组 成 型 突变 ”constitutive mutation 193 组 蛋白 “histones 核心 ”core 35,222 一 223 连接 子 linker 34 一 35,223 修饰 “modification 32,37 一 40 组 蛋白 折 释 ”histone fold 34,222 一 223 组 件 , 蛋 白 的 “modules of proteins ”263, 276 一 277 组 织 者 ”organizer 73 一 74 作 图 功能 ”mapping function 147 座位 控制 区 locus control region ”38 ,409,421 一 422 HI SO0000097 入 曙 也 本 革 估 MoLEcuULnhn BITIoloeyY 上 人 nn 1 2 四 - 尖 二 > 一 生命 科学 编辑 部 联系 电话 : 010-64012501 | 站 和 - 本 net 神经 元 : 细胞 和 分 子 生物 学 〈 翻 译 版 ) 2001 年 9 月 出 版 Neuron: CeJ1l and Molecujar 玉 Iiolocy 估价 二 了 硝 - 2 美 ITB. 全 维 坦 , 工 . 必 : 卡 兹 玛 克 著 -1 人生 斯 云 ” 包 新 民 等 书 号 本 书 7-03-009098-9/-Q . 1036 拉 是 -本 有 着 厂 - 泛 影响 的 神经 生物 学 名 著 。 它 从 细胞 及 分 子 生 物 学 的 和 角度， 介 绍 了 脑 的 结构 和 活动 规律 ， 论 述 了 神经 细胞 及 神经 胶 质 细胞 的 细胞 生物 学 特征 、 细胞 内 和 细胞 间 的 信息 传导 、 脑 高 级 功能 、 神 经 元 的 生长 发 育 与 分 化 、 可 塑性 等 等 。 读 者 在 掌握 了 本 书 的 内 容 后 ， 就 能 较 容 易 地 对 神经 系统 的 结构 、 发 育 、 生 理 、 行 为 等 开展 专门 研究 。 本 书 可 作为 神经 生物 学 的 研究 生 教 材 ， 也 可 作为 从 事 神经 科学 研究 的 科学 工作 者 的 参考 书 。 2 微生物 生物 学 〈 翻 译 版 ) 2001 年 8 月 时 版 1 EOESTUNM2 LT 本 肖 要 了 M 西 开 克 - 下 帕克 0J00 元 本 文 情 等 -7=03-008345-8/Q . 954 Prock& Biojoerrr or Hzcroore2r21srzs 是 国外 的 经 典 教 科 书 。 本 书 系 其 第 及 版 的 中 文 翻 译 版 本 ， 包 括 23 章 、 附 录 及 词汇 表 。 该 书 从 细胞 化 学 和 细胞 生物 学 类 手 ， 详尽 地 介绍 了 微生物 的 营养 、 人 代谢、 合成 ; 分 子 遗 传 和 微生物 遗传 造 传 工程 和 生物 工程 ; 生长 和 调控 ; 工业 微生物 ; 寄主 和 寄生 菌 的 关系 ; 免疫 学 和 免疫 临 床 和 诊断 微生物 ; 流行 病 学 和 公共 卫生 微生物 学 ; 主要 的 微生物 疾病 ; 微生物 代 谢 的 多 样 性 ; 微生物 生态 学 ; 分 子 体系 和 微生物 进化 ; 病毒 、 细 菌 、 十 细菌 和 真 核 微生物 等 内 容 。 该 书 尊 述 清晰 ， 条 理性 强 ， 简 明 易 懂 ， 并 附 有 图 表 ， 每 角 后 有 概括 的 内 容 总 结 ， 便 于 读者 学 习 。 ”医学 遗传 学 原理 〈 翻 译 版 ) 2001 年 3 月 出 版 Principles of Medical Genetics 三 00 元 0 区 美 ] TD. 盖 全 哈 特 F. S. 柯林斯 D. 金 斯 伯 格 一 ”和 孙 开 来 等 -” ”7-03-0b8746-1R . 586 本 书 是 世界 著名 的 遗传 学 家 ， 美 国 NIHE 人 类 基因 组 研究 所 主任 FS. colins 和 和 密 西 要 大 学 D. Gelehrter 教 授 等 编著 的 医学 遗传 学 名 著 。 近 年 来 人 类 分 子 细胞 遗传 学 迅 狐 发 展 ， 尤 其 在 人 类 基因 组 计划 方面 取得 了 重大 成 就 。 作 者 运用 这 些 新 成 就 ， 结合 牛 传 学 基本 理论 ， 系 统 而 有 重点 地 阐述 了 遗传 学 在 医学 中 的 重要 应 用 ; 书后 还 附 有 每 章 的 问题 与 答案 ， 有 助 于 加 深 对 内 容 的 理解 。 译文 较 好 地 保持 了 原 书 的 风格 ， 本 书 是 一 本 值得 推荐 的 教科 书 和 参考 用 书 。 适 合作 为 医科 院 校 的 本 科教 材 ， 也 可 供 临 床 医 生 和 医学 遗传 学 研究 人 员 及 相关 研究 人 员 人 参考 使 用 。 |SBN 7-03-008299=0 定 价 : 55.00 元 一 s 时 堆 -9 一 ff 部