®Ilf ^. P. pli ICibraro QH5e4 r.£ NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY LIBRARIES 11! 1 MI1 I M II ! il II II S01 949924 Date Due Tyi^-^' (i-\H^ 1 840Ji fnoÄSa QßiÄsisiiiiSii — HANDBUCH DER BIOCHEMISCHEN AHBEITSME1 l BEARBEITET VON Prof. Dr. E. Abderhalden, Berlin — Priv.Doz. Dr. D. Ackermann, Würzburg — Prof. Dr. Hans Aron, Manila — Prof. Dr. Baglioni, Rom — Prof. Dr. phil. Bartelt, Peking — Prof. Dr. BattelH, Genf — Prof. Dr. J. Blehringer, Brannschweig — Dr. phil. Carl Brahm, Berlin — Priv.-Doz. Dr. Theodor Brugsch, Berlin — Prof. Dr. Chodat, Genf — Prof. Dr. Cramer, Edinburgh — Prof.Dr. M. Dennstedt, Hamburg — Prof. Dr. Felix Ehrlich, Breslau — Prof. Dr. med. Embden, Frankfurt a. M. — Prof. Dr. St. Faust, Würzbnrg — Priv.-Doz. Dr. Friedenthal, Nicolassee-Berlin — Prof. Dr. E. Friedmann, Berlin — Priv.- Doz. Dr. Fuhrmann , Graz — Prof. Dr. Wm.J. Gies, New-York — Priv.-Doz. Dr. Grube , Nenenahr- Bonn — Prof. Dr. Olof Hammarsten, Upsala — Priv.-Doz. Dr. Häri, Budapest — Dr. M. Henze, Neapel — Priv.-Doz. Dr. Hildebrandt, Halle a. S. — Priv.-Doz. Dr. Rudolf Hoeber, Kiel — Prof. Dr.Jacoby, Berlin — Prof. Dr. Johannsson, Stockholm — Dr. phil. R. Kempf, Berlin — Prof. Dr. Kobert, Rostock — Priv.-Doz. Dr. Kostytschew, St. Petersburg — Prof. Dr. William Kuester, Stntt4 g) Reaktion der Ilinzelgruppen der (llykose \)b 1. Reaktion auf Tetrosen Uö 2. Reaktion der Pentosen und der (ilukuronsäure 95 a) Farbenreaktion mit l'lilorof^lu/.in. Orzin, Naplitoresorzin 1)5 ß) Furt'urol-Destillationsniethode 99 Y) Arabinoso 100 o) Xylose. Bertrands Reaktion 101 i) Gliikuronsäure 101 3. Reaktionen der Methylpentosen 103 4. Prüfung auf llexosengruppen (Lävulinsäurereaktion) 104 5. Einzelreaktionen der Hexosen 105 a) Reaktion auf Glukose und Glukosegruppen (Zuckersäurereaktion) . . . 105 [i) Reaktionen der Mannose 108 Y) Reaktionen der Fruktose 109 o) Reaktionen der Galaktose. Schleimsäurereaktion 112 e) Anhang: Reaktion des Inosits, CjHjjOg 113 G. Einzelreaktionen der Di- und Polj'sacch aride 114 a) Reaktionen des Rohrzuckers 114 (i) Reaktionen der Maltose 115 y) Reaktionen des Älilchzuckers (Laktose, Laktobiose) 11') o) Reaktionen der Ratfinose, CjgHgjOjg -|-5IIjO 117 C. Die wichtigsten Methoden zur quantitativen Bestimmung der Zuckerarten. Von Geh. Rat Prof. Dr. ß. T(. Ileus, Göttingen I JD a) Allgemeines 111' b) Bestimmung durch Polarisation HD c) Begrilf und Ermittlung der sitezilischen Drehung 120 d) Ungefähre Zahlen für (a) D der häufigeren Zuckerarten 122 e) Polarisationsap|)arate l--^ f) Ausführung der Polarisatiimen 12? ()) Spezielle Angaben über (juantitative Bestimmungen einzelner Zuckerarten . . 12S 1. Pentosen, CjHioüs und Pentosane, CgHsO^, Arabinose und Xylose sowie als Anhang Glukuronsäure 1-8 a) Arabinose und Xylose 1-«*^ 3) Furfurol-Salzsäure-Destillationsmethode 130 Y) Methyl-Pentosen.('„H,.,U5,undMethyl-Pent.sane, (', 11, „U^; Polarisation; konstante Drehungen l*j Rhamnose, CjHjjOs -f- H.U 135 1-Fukose, CeH.jOj 13(5 d-Rhodeose, CgH,,05 13C. 0) Gemenge von Pentosen und .Melliyl-Pentosen 13t') Tabelle von W.Mayer und B. Tollens 137 z) Glukuronsäure, CgH,j(), 139 GlukuronsäurelaktonoderGlukuroii. (", H^O,, und gepaarte Verbindungen der Glukuronsäure mit anderen Stolfen. Euxanthinsäure etc. . 139 VI Inhaltsverzeichnis. Seite 2. Hexosen, CgHj.Og 141 a) d-Glukose, Dextrose, Traubenzucker, Harnzucker 141 Osazonprobe 141 Gärung 141 Polarisationsmethode 143 ß) Fruktose, Lävulose, Fruchtsucker 144 Y) Glukose und Fruktose (besonders Invertzucker) 145 o) Mannose, CgHjjOg 147 £) Galaktose C6H12O6 147 3. Di-Saccharide, Cj,H„,Oi, 147 a) Rohrzucker, C^.^E^^O^^ 147 Rohrzucker-Polarisation . 149 ß) Maltose, G^.R^^O,^ 151 .y) Milchzucker, CiaH,^ O^i + H, 0 151 S) Raffinose, Melitose, Melitriose, Cjg H32 Ojg + 5H„ 0 152 Anhang: Kröbers Tabelle zur Umwandlung von Phlorogluzid in Furfurol, Pentosan etc. (s. S. 132) 154—158 Nachweis, Darstellung und quantitative Bestimmung des Glykogens. Von Privat- dozent Dr. Karl Grube, ßonn-Neuenahr 159 I. Eigenschaften 159 II. Nachweis 160 1. Mikrochemisch 160 I. mit Jod 160 II. durch einen Farbstoff 161 2. Chemischer (qualitativer) 161 III. Darstellung nach Pflüger-Nerking 162 IV. Quantitative Analyse 163 1. Aufschließung, Fällung und Isolierung 163 2. Bestimmung des Glykogens 166 a) durch Polarisation 166 b) durch Titration 166 Quantitative Zuckerbestimmung mit Hilfe der Kupfermethoden und spezielle Me- thoden zur Zuckerbestimmung in tierischen Flüssigkeiten. Von Privatdozent Dr. Karl Grube, Bonn-Neuenahr 167 I. Quantitative Zuckerbestimmung 167 Maßanalytische Methode der Zuckerbestimmung nach Fehling-Soxhlet . . . 169 Titration nach Bang 170 Titration nach Pavy 172 II. Die gravimetrische Methode der Zuckerbestimmung nach E. Püüger .... 174 Kontrolle der Methode 177 Tabelle zur Zuckerbestimmung nach Pflüger 179 Titrimetrische Zuckerbestimmung nach Bertrand 181 Tabelle zur Zuckerbestimmung nach Bertrand 183 Spezielle Methoden der Zuckerbestimmung in tierischen Flüssigkeiten . . . 183 I. Blut 183 a) Methode Patein & Dufan 183 h) Methode Scheuck 184 c) Methode Bang 184 Inhaltsverzeichnis. Y]| Seite II. Harn 18ö 1. ßestimmunf; des Traubenzuckers 185 a) Polarisation 185 h) Gäruns ' 186 c) Titration 180 2. Besitimmung der Lävulose 188 3. Bestimmung; des Milchzuckers 188 III. Milch IS'J 1. Bestimmung nach Patein 189 2. Bestimung nach Hoxhlet 189 Spaltung razemischer Monosaccharide und der Polysaccharide in die Monosac- charide durch biologische Methoden. Von Dr. phil. Hans Pringsheim, Berlin 190 1. Spaltung razemischer Monosaccharide durch Hefe 190 2. Spaltung der Polysaccharide in Monosaccharide 192 Anhang: Herstellung von Pilzpreßsäften nach Buchner 195 a) Hefepreßsaft 195 h) Pilzpreßsäfte in geringer Menge 197 c) Darstellung von Acetondauerpräparaten 197 Fette 199 Untersuchung- auf Fette. Von Prof. Dr. F. Eöhmann, Breslau 199 Gewinnung der Fette und der in Äther löslichen Bestandteile der Organe .... 199 Gewinnung der Gesamtmenge der in Äther löslichen Bestandteile der Organe . 200 Physikalische Untersuchungsmetboden der Fette, Wachse und der aus ihnen darge- stellten Fettsäuregemische 202 1. Spezifisches Gewicht 202 2. Schmelzpunkt 202 3. Erstarrungspunkt 203 4. Lichtbrecbungsvermögen 204 5. Drehungsvermögen 205 Allgemeine chemische Untersuchungsmethoden der Fette und Wachse 205 1. Säurezahl 205 2. Verseifungszahl (Köttstorferzahl) 205 3. Jodzahl 208 4. Bestimmung der Menge der Üiichtigen, in Wasser löslichen und der in Wasser unlöslichen Fettsäuren 210 a) Reichert-Meißlscbe Zahl 211 h) Bestimmung der Gesamtmenge der flüchtigen, in Wasser löslichen und der in Wasser unlöslichen Fettsäuren 212 5. Bestimmung der Menge der in Wasser unlöslichen Fettsäuren 213 6. AcetylzahJ 214 7. Bestimmung des Glyzerins 215 a) Bestimmung des Glyzerins durch Oxydation mit Permanganat . • • 215 h) Bestimmung nach dem Acetinverfahren 216 c) Bestimmung durch Überführung in Isopropyljodid nach S. Zeisel-Fanto 216 8. Bestimmung der in einem Fette enthaltenen hochmolekularen Alkohole (.,ün- verseifbares") 218 Vlll luhaltsverzeichuis. Seite Reaktionen als Vorproben bei der qualitativen Untersuchung der Fette etc .... 219 1. Elaidinprobe 219 2. Eintrocknungsvermügen 220 3. Eeaktionen auf Sesamol 220 4. Reaktion auf Baumwollensamenol 221 Gewinnung von Triglyzeriden aus Fetten 221 Trennung und Charakterisierung der Fettsäuren 222 1. Trennung der in Wasser unlöslichen gesättigten Fettsäuren von den unge- sättigten Fettsäuren 222 2. Trennung der festen gesättigten Fettsäuren 224 a) Fraktionierte Fällung 224 h) Trennung der Fettsäuren durch Destillation im Vakuum ...... 225 c) AbscheiduDg und Bestimmung der Stearinsäure 226 d) Gewinnung der Palmitinsäure 228 e) Gewinnung der Myristin- und Laurinsäure 228 3. Charakterisierung der festen Fettsäuren 229" 4. Oxyfettsäuren und deren Laktone 229 5. Dikarbonsäuren 230 6. Ungesättigte Fettsäuren 230 aj Prüfung auf Linol- und Linolensäure etc. mit Hilfe der Bromide .... 231 h) Oxydation der ungesättigten Fettsäuren mit Kaliumpermanganat nach Hazara 233 7. Untersuchung der flüchtigen Fettsäuren 234 Fettbestimmung in Organen. Von Prof. Dr. Georg Rosenfeld, Breslau 238 Untersuchung auf hochmolekulare Alkohole. Von Prof. Dr. F. Roh mann, Breslau 244 1. Darstellung der Ester hochmolekularer Alkohole aus Sekreten und Organex- trakten 244 2. Nachweis der hochmolekularen Alkohole in Fetten und Wachsen nach der Vei'- seifung 245 a) Allgemeine Methoden 245 h) Cholesterin und Phytosteriu 248 A. Cholesterin 250 B. Phytosterin 253 C. Koprosterin 254 D. Isocholesterin 255 Phosphatide. Von Prof. Dr. E. Schulze und Prof. Dr. E. Winter st ein, Zürich . . . 256 Darstellung der Phosphatide 2o7 aus Pflanzen 2o8 aus tierischen Organen 259 Spaltungsprodukte der Phosphatide 267 Anhang (Phytin) 268 Eiweiß-stoffe 270 A. Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. Von Prof. Dr. Thomas B. Osborne, New Haven, Connect., U. S. A 270 Einleitung 270 Inhaltsverzeichnis. JX Seite I. Einteilung der Saraenproteine 270 1. Globuline 270 2. Prolamine 270 3. Gluteline 271 4. Albumine 271 5. Proteosen 271 II. Chemischer Charakter der Proteinpräparate 272 III. Allgemeine Methoden zur Darstellung von ^amenproteinen 278 A. Mahlen der Samen • 274 1. Ölarme Samen 274 2. Ölreiche Samen 275 B. Extraktion des Hehles 277 C. Filtration des Extraktes 278 1. Leicht tiltrierbare Extrakte 278 2. Extrakte von an Stärke reichen Samen 280 3. Gummistofte enthaltende Extrakte 280 D. Fällung 280 1. Durch Neutralisation 280 2. Durch Dialyse 280 3. Durch Alkohol 281 4. Durch Neutralsalze 282 E. Lösen von Niederschlägen 283 1. Lösen von Niederschlägen im allgemeinen 283 2. Lösen von Globulinniederschlägen 283 3. Lösen großer Ammonsull'atniederschläge 284 F. Waschen von Niederschlägen 284 G. Trocknen von Niederschlägen 284 H. Prüfung der Reinheit der Präparate 285 1. Gebundene Säuren 285 2. Anorganische Verunreinigungen 287 3. Äthei'lösliche "S'erunreinigungen 287 4. Prüfung auf Kohlehydrate 287 IV. Spezielle Methoden zur Darstellung der einzelnen Proteine 289 I. Globuline 289 1. Edestin aus Hanfsamen (Cannabis sativa) 289 a) Darstellung von Edestin 289 h) Eigenschaften des Edestins 292 2. Excelsin aus der brasilianischen oder Paranuß (Bertholletia excelsa) . . 294 aj Darstellung des Excelsins 294 hj Eigenschaften des Excelsins 295 3. Globulin aus Kürbissamen (Cucurbita maxima) 296 a) Darstellung des Kürbissamenglobulins 296 bj Eigenschaften 297 4. Das Globulin des Baumwollsamens (Gossypium herbaceum) 298 a^ Darstellung des Baumwollsamenglobulins 298 h) Eigenschaften 300 5. Amandin aus Mandeln (Prunus amygdalus) 301 a) Darstellung von Amandin 301 b) Eigenschaften des Amandins 302 X Inhaltsverzeichnis. Seite 6. Juglansin aus Waluuß (Juglans regia) 303 a) Darstellung von Juglansin 303 h) Eigenschaften des Juglansin 304 7. Legumin aus Erbse (Pisum sativum), Linse (Ervum lens), Saubohne (Vicia faba), Wicke (Vicia sativa) 305 a) Darstellung des Wickeulegnmins 306 })) Darstellung des Legumins aus der Erbse, Saubohne und Linse . . 307 c) Eigenschaften des Legumins 307 8. Vicilin aus Erbse (Pisum sativum), Linse (Ervum lens), Saubohne (Vicia faba) 309 ü) Darstellung von Vicilin 309 h) Eigenschaften des Vicilins 310 9. Phaseolin aus Bohnen (Phaseolus vulgaris) 310 a) Darstellung von Phaseolin 311 })) Eigenschaften des Phaseolins 312 10. Glycinin aus Soyabohne (Glycine hispida) 313 a) Darstellung von Glycinin 313 h) Eigenschaften des Glycinins 314 11. Vignin aus Kuherbse (Vigna sinensis) 315 a) Darstellung des Vignins 315 h) Eigenschaften des Vignins 316 12. Conglutin aus Lupinensamen (Lupinus) 317 a) Darstellung des Conglutins aus der gelben Lupine 317 })) Eigenschaften des „Conglutin-a" 319 c) Eigenschaften des „Conglutin-ß" 319 II. Prolamine 320 1. Gliadin aus Weizen (Triticum vulgare) und Roggen (Seeale cereale) . . . 320 a) Darstellung des Gliadins aus Weizenmehl 321 &y) „ „ „ „ AVeizenglutin 322 c) ,, „ ,, „ Roggen 323 d) Eigenschaften des Gliadins 323 2. Hordein aus Gerste (Hordeum vulgare) 324 Darstellung von Hordein 324 Eigenschaften des Hordeins 325 3. Zein aus Mais (Zea Mays) 325 Darstellung des Zeins 326 Eigenschaften des Zeins 327 III. Gluteline. Glutenin aus Weizen (Triticum vulgare) 327 a) Darstellung von Glutenin 328 })) Eigenschaften des Glutenins 328 IV. Albumine 329 1. Leukosin aus Gerste (Hordeum vulgare), Roggen (Seeale cereale), Weizen (Triticum vulgare) 329 a) Darstellung von koaguliertem Leukosin . 330 h) Eigenschaften des koagulierten Leukosins 330 Inhaltsverzeichnis. XI Seite 2. Ricin aus der Ricinusbohne (Ricinus communis) 331 a) Darstellung von Ricin 332 })) Eigenschaften des Ricins • .... 333 3. Legumelin aus Erbse (Pisum sativum), Linse (Ervum lens), Saubohne (Vicia faba), Wicke (Vicia sativa), Kuherbse (Vigna sinensis), Soyabohne (Glicine hispida) 333 a) Darstellung von koaguliertem Legumelin 334 b) Eigenschaften des koagulierten Legumelins 334 B. Darstellung der Proteine der Tierwelt 335 (i) Gruppe der kristallisierbaren Eiweißstoffe. Von Prof. Dr. Fr. N. Schulz, Jena . 33.") Darstellung von kristallisiertem Eieralbumin aus Hühnereiern 335 Darstellung von kristallisiertem Serumalbumin aus Pferdeblutserum 337 Darstellung von Blutfarbstott'kristallen 339 A. Darstellung von Oxj-hämoglobin nach Hoppe-Seyler 339 B. Darstellung von Oxyhämoglobinkristallen nach dem Dialj'sierverfahren . 342 C. Das Ammoniumsulfatverfahren 343 D. Darstellung von Kristallen des Hämoglobins, Kohlenoxydhämoglobins, Stickoxydhämoglobins, Methämoglobins, Cyanhämoglobins. Cyanmethämo- globins 344 E. Kristallisation von Hämocyanin 345 \)) Gruppe der nicht kristallisierbaren Proteine 347 a) Eigentliche Proteine. V(m Privatdozent Dr. Franz Samuely, Freiburg i. B. 347 Methoden zum tjualitativen Nachweis von Proteinen 348 Fällungsreaktionen 348 Koagulation durch Hitze 348 Bestimmung der Koagulationstemperatur 349 Fällung durch konzentrierte Salpetersäure 349 Fällung mit Metallsalzen und Alkaloidreagentien 349 Fällung durch Gerbsäure, organische Säuren 350 Farbenreaktionen 350 Biuretprobe 350 Xanthoproteinreaktion 351 Millonsche Reaktion 351 Über das Aussalzen der Proteine 352 Trennung von Eiweißkörpern aus Gemischen 352 Methode zur Bestimmung der Fällungsgrenzen 353 Methode der fraktionierten Eiweißfällung durch Aussalzen mit gesättigten Neutralsalzlösungen 354 Systematik der Proteine: Identiükation eines Proteins als Glied einer bestimmten Proteinklasse 35(5 I. Die Eiweißkörper des Blutes 357 Serumalbumin 357 Serumglül)ulin 357 Darstellung von Globulin aus Blutserum durch Verdünnen oder An- säuern 360 Durch Aussalzen mit Neutralsalzen 361 XII Inhaltsverzeichnis. Seite Mit Mag'iiesiumsiilfat 361 Mit Ammonsulfat 361 DarstelhiDg vun fibrinogenfreiem Serumglobulin 362 Zerlegung des Globulins in Einzelfraktionen 362 Euglobulin. Pseudoglobulin 364 Fibrinogen 364 Darstellung aus Blutserum 364 Darstellung nach Huiscamp 366 Nachweis 367 Fibrin 368 Darstellung von Rohfibrin aus Blutplasma 368 Reindarstellung 368 Eigenschaften und Nachweis 369 Fibrinoglobnlin 369 Darstellung aus Fibrinogenlüsungen 370 Nachweis 370 Nukleoproteid aus Blutserum 370 Darstellung nach Liebermeister 371 Nukleoproteid im Blutplasmaniederschlag 372 Serummukoid 372 Methoden zur quantitativen Bestimmung der Serumproteine .... 373 Gesamteiweiß durch direkte Wägung 373 Bestimmung der koagulablen Proteine 373 Bestimmung von Albumin und Globulin 374 Bestimmung von Fibrinogen, Albumin und Globulin im Blutplasma 375 Bestimmung von Fibrinogen 375 Bestimmung von Fibrin im Blutplasma und Blut 376 II. Die Eiweißkörper des Vogeleies 377 Ovalbumin 377 Konalbumin 377 Ovoglobulin 378 Nachweis 379 Ovomukoid 379 Darstellung nach Mörner 379 Darstellung nach Willanen 380 Darstellung nach Milesi 380 Nachweis 381 Dotterproteine 381 Begriffsbestimmung 381 Vitellin aus Vogeleidotter 381 Yitellin aus Dotter von Fischeiern 382 Dotterplättchen 382 Ichthulin aus Karpfeneiern 382 Ichthulin aus Kabeljaueiern 383 III. Die Eiweißkorper der Milch 383 Kasein 384 Darstellung aus Kuh- und Ziegenmilch 384 Darstellung ans Frauenmilch 385 Darstellung von labempündlichen Kaseinlösungen 386 Inhaltsverzeichnis. XIII Seite Umwandlungsprodukte bezw. Spaltprodukte des Kaseins 380 Isokasein, Natriumkaseid 380 Parakasein 387 Qualitativer Nachweis und Darstellunj? 387 (Quantitative Bestimmung 388 Fraktionierung und Zerlegung. Parakasein A, B und C . . . . 388 Molkeneiweiß 388 Nachweis und Bestimmung 389 Molkenalbumose 389 Nachweis 390 Laktalbumin 390 Laktoglubulin 390 Opalisin 391 Kolostrumeiweißkörper 391 Quantitative Bestimmung der Proteine der Milch 391 Bestimmung des Gesamteiweißes der Milch. Fällung mit Gerbsäure 391 Fällung mit Alaun und Kupferoxydhydrat 392 Bestimmung von Kasein und Albumin -|- Globulin 392 Bestimmung von Kasein und Globulin -(- Albumin 393 Bestimmung von Albumin und Kasi'in + Globulin 393 IV. Die Eiweißkörper des quergestreiften Muskels 393 Entblutung der Muskeln 394 Muskelplasma 394 Myosin . . . .• 394 Unlösliches Myosinlibrin 395 Myogen 395 Lösliches Myogenfibrin 395 Trennung des Myosins von Myogen 395 Quantitative Bestimmung der Muskclprotcinc 396 Myoproteid 397 Nukleoproteid der (juergestreiften Muskeln 397 V. Die Eiweißkörper der glatten Muskelzellen 398 VI. Sonstige Albumine und Globuline 398 Zellglobuline 399 Darstellung derselben 399 Organeiweiß 399 Globuline der Kristallinse, a- und ß-Kristallin 400 Globulin der Thyreoidea. Thj'reoglobulin 401 .Todothyrin 402 Nndeoalbumine: Identifikation 403 Aus Rindergalle 404 Aus Synovia, Transsudaten, Blasenschleimhaut und Niere . • . 405 Para- oder Pseudonukleine 405 Generelle Darstellungsmethodo 40.i Qualitativer Nachweis 406 XIV Inhaltsverzeichnis. Seite Paranukleinsäure 406 Aus Kasein 406 Paranukleinsäure aus Vogeleidotter, sog. Avivitellinsäure . . . 408 Hämatogen 408 VII. Muzinsubstanzen 409 Delinition 409 Mukoide, Chondromukoide 409 1. Darstellung aus Schleimsubstanzen, aus Sekreten und Flüssig- keiten 410 Speichelmuzin 410 Muzin aus Trachealsekret und Sputum 411 Serummukoid 411 Ovomukoid 411 Aszitesmukoid 411 Synoviamukoid 412 Harnmukoid 412 Hyalomukoid 413 2. Schleimsubstanzen im Sekret als Hüllensubstanz 413 Eihüllenmukoid 413 Muzin der Schnecke (Mantelmuzin, Fußmuzin) 414 3. Schleimsubstanzen in pathologischen Sekreten 415 Pseudomuzin 415 Paramuzin 415 Unterscheidungsmerkmale 416 4. Schleimsubstanzen als normale Bestandteile zellreicher Gewebe und Organe. Prinzijneu der Darstellung 416 Wasserextraktion für Nabelstrangmuzin 417 Alkaliextraktion für Corneamukoid 417 Für Chondromukoid 417 Für Chondromukoid neben Glutin 418 Kalkwasserextraktion für Pseudomukoid 418 Für Osseomukoid 418 5. Schleimsubstanzen als Gewebseinlagerung 419 Amyloid 419 Nachweis 420 ß) Albuminoide. Von Prof. Dr. William J. Gies, New-York und Dr. phil. Eduard Strauß, Frankfurt a. M 421 A. Die Albuminoide der Evertebraten 421 I. Das Spongin 421 II. Das Cornein und das Gorgonin 422 III. Albuminoide im Gerüst der Eöhrenwürmer 423 IV. Das Conchiolin 423 V. Der Byssus 424 VI. Die Seide 425 aj Fibroin 425 b) Sericin 425 c) Wilde Seiden 428 Inhaltsverzeichnis. XV I ' Seite B. Die Album inoide der Vertebraten 429 I. Das Kollagen und der Leim 429 KoUagene: 1. Knochenkollagen 429 2. Sehnenkollagen a) 430 3. Sehnenkollagen b) 431 4. Kollagen aus der Hornhaut des Auges 431 Glutine: 1. Sehnenglutin nach Gies 432 2. Glutin nach Moerner 432 3. Knochenglutin nach Sadikoff 433 4. Reinigung des Glutins nach Sadikoff 434 Reticulin 434 II. Das Elastin 435 III. Die „Albumoide" und Keratoelastine 436 a) Albumoid in der Linse des Auges 436 b) Albumoide in der Linsenkapsel und in der Descemetschen Haut 437 c) Albumoid im älteren Knorpel 437 d) Chondro-Albumoid 437 e) Osseo-Albumoid 438 f) Ichthylepidin 438 g) Keratinoid 438 h) Keratoelastin 438 IV. Das Ovokeratin 439 V. Das Neurokeratin 439 VI. Die echten Keratine 440 y) Histone und Protamine. Von Prof. Dr. H. Steudel, Berlin 442 I. Histone 442 1. Histon aus Vogelblutkörperchen 442 a) Isolierung der Kerne von Blutkörperchen aus Gänse- und Schlangenblut nach Plösz 442 h) Isolierung der Kerne von Blutkörperchen aus Hühuerblut nach Plenge 442 c) Darstellung von Histon aus den Kernen von Vogelblutkörperchen nach Kossei 443 2. Histon aus der Thymusdrüse 443 a) Darstellung nach Kossei und Kutscher 443 b) Darstellung von Parahiston aus der Thymusdrüse nach Fleroff . . . 444 3. Darstellung des Globins 444 Eigenschaften der Histone 446 IL Protamine 446 Prinzip der Darstellung 446 Eigenschaften der Protamine 448 0) Nukleoproteide. Von Privatdozent Dr. Franz Samuely, Freiburg i. B. . . 449 a- und ß-Proteide 449 Nukleoproteid aus Pankreas 450 a-Nukleoproteid 450 ß-Nukleoproteid 450 Darstellung nach Gamgee und Jones 451 Eigenschaften der Proteide 451 XVI Inhaltsverzeichnis. Seite Nukleoproteid der Leber 452 Nukleoproteid aus Nebennieren 452 Nukleoproteid der Milchdrüse 453 Nukleoproteid der Submaxillardrüse 453 Nukleoproteid der Thyreoidea 454 Nukleoproteid aus Magenschleimhaut und Magensaft 454 Nukleoproteid aus Milz 455 Nukleoproteid aus Thymus und lymphatischen Organen 456 Eigenschaften 457 Identifizierung und Unterscheidung von Nukleohiston 457 Nucleoproteide aus lymphatischen Organen 458 Lymphdrüsen 458 Leukozyten 458 Kundzellensarkora 459 Identifizierung 459 Spaltprodukte der Nukleoproteide 459 Nukleine 459 Darstellung der Nukleine 460 C. Einige Umwandlungsprodukte der Proteine. Von Privatdozent Dr. Franz Samuel y, Freiburg i. B 461 Nitrierte Eiweißkörper 461 Xanthoproteinsäure 461 Aldehydeiweiße 461 Halogensubstituierte Eiweißkörper 462 Methode der Jodierung nach Hofmeister 462 Methode der Jodierung nach Hopkins und Pincus 463 Methode der Jodierung nach Blum und Vaubel 464 Desaminoproteine 464 Desaminokasein 465 Desaminoglutin 465 Desaminoglobulin 466 Eiweißartige Oxydationsprodukte der Proteine 466 Peroxyprotsäuren 466 Desaminoprotsäure 468 Kyroprotsäure 468 D. Abbau der Proteine und Isolierung der Abbauprodukte 470 Totale Hydrolj^se vermittelst Säuren 470 a) Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäuren. Von Prof. Dr. Emil Abderhalden. Berlin 470 Isolierung von Glykokoll, d-Alanin, d-Valin, 1-Leucin, 1-Prolin. 1-Asparagin- säure, d-Glutaminsäure, 1-Serin und 1-Phenylalanin 472 a) Isolierung der Aminosäureester aus den Esterchlorhydraten mit Hilfe von Natronlauge und Kaliumkarbonat und gleichzeitiger Ausätherung 475 h) Isolierung der Aminosäureester aus den Esterchlorhydraten mit Hilfe von Natriumalkoholat 477 Fraktionierte Destillation der Monoaminosäureester 477 Verarbeitung des bei der Destillation der Ester verbleibenden Rück- standes 483 Inhaltsverzeichnis. XVII Seite AViederhohing- des Yeresterungsprozesses 484 Isolierung von l-Oxyprolin 484 Isolierung von 1-Tyrosin 485 Isolierung von Cystin 487 Isolierung von l-Tryptopban 487 Isolierung des d-Glukosamins 488 Isolierung von Diketopiperazinen aus den durch kochende, rauchende Salzsäure oder durch Kochen mit 257oiffer Schwefelsäure erhaltenen Spaltprodukten 489 Gang der Untersuchung auf Aminosäuren bei geringen Substanzmengen . . 489 Besondere Methoden zur Darstellung einzelner Monoaminosäuren 490 Darstellung von Glykokoll 490 Darstellung von d-Alauin 490 Darstellung von 1-Serin 491 Darstellung von 1-Prolin 492 Darstellung von d-Glutaminsäure 492 Darstellung von 1-Tyrosin 493 Darstellung von d-lsoleucin 494 Die zur Identifizierung der einzelnen Monoaminosäuren wichtigsten Derivate . 495 1. Darstellung von ß-2saphtalinsulfoderivaten 495 2. Darstellung von Phenylisocyanatverbindungen und den entspre- chenden Hydantoinen 496 3. Darstellung von Benzoylverbindungen 496 4. Darstellung von Formylverbindungen 496 5. Darstellung von Verbindungen der Aminosäuren mit Kohlensäure . 497 üj Isolierung von Histidin , Lysin und Arginin (Ornithin und Guanidin). Von Prof. Dr. H. Steudel, Berlin 498 Prinzip der Methode 498 Entfernung der Schwefelsäure und des Huminstickstoffs. Bestimmung des Ammoniaks 499 Fällung von Histidin und Arginin als Silberverbindungen ÖOO A. Bestimmung des Histidins 501) B. Bestimmung des Arginins 502 C. Bestimmung des Lj'sins 502 Bemerkungen 504 Darstellung von Histidin 505 Histidin 505 Arginin 506 Lysin 508 Ornithin 508 Guanidin 509 Anhang 510 a) Isolierung von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. Von Prof. Dr. E. Schulze und Prof. Dr. E. Winter stein, Zürich 510 A. Über die Vorbereitung der Pflanzen für die Untersuchung und über die Darstellung der Extrakte 510 Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. U XVin Inhaltsverzeichnis. Seite B. Darstellung von Asparagin und Glutamin 511 Quantitative Bestimmung des Asparagins und des Glutamins . . . 513 Bestimmung des Ammouiakgehaltes der nicht mit Säure erhitzten Extrakte 515 C. Darstellung von Aminosäuren aus Pflanzen 515 Darstellung von Arginin, Lysin und Histidin 518 hj Isolierung von Cholin, Betain und Trigonellin aus Pfianzenextrakten. Von Prof. Dr. E. Schulze und Prof. Dr. E. Winterstein, Zürich 522 Stachhydrin 526 Guanidin 526 Partielle Hydrolyse von Proteinen. a) Isolierung von Polypeptiden unter den Abbauprodukten der Proteine. Von Prof. Dr. Emil Abderhalden, Berlin 529 b) Isolierung von Peptonen. Von Prof. Dr. iL Siegfried, Leipzig 533 1. Definition der Peptone 533 2. Darstellung der Peptone 533 Beispiel I. Darstellung von Pepsinglutinpepton 533 Beispiel IL Darstellung von Trypsinfibrinpepton a 536 3. Die Prüfung auf Reinheit der Peptone 538 c) Methode zur Darstellung von Kyrinen. Von Prof. Dr. M. Siegfried, Leipzig 542 1. Definition der Kyrine 542 2. Darstellung von Kyrinsulfat 542 3. Reinheitsprüfung des Kaseinokyrinsulfates 543 Methoden zur Synthese von Polypeptiden. Von Prof. Dr. Emil Abderhalden, Berlin 545 1. Bildung von Dipetiden durch Aufspaltung von Anhydriden 548 2. Synthese von Polypeptiden mit Hilfe von Halogenacylchloriden 549 a) Darstellung razemischer Polypeptide 549 h) Darstellung optisch-aktiver Polypeptide 550 3. Darstellung der Chloride von Aminosäuren und von Polypeptiden und deren Verwendung zur Synthese 552 a) Chlorierung der Aminosäuren 552 ß) Synthese von Polypeptiden mittelst der Chloride von Aminosäuren . . . 554 Y) Spaltung razemischer Aminosäuren in ihre Komponenten 554 Methoden zur biologischen Spaltung razemischer Aminosäuren durch lebende Organismen. Von Prof. Dr. Felix Ehrlich, Breslau 559 Spaltung durch den tierischen Organismus 560 Beispiel : d 1-Leucin ^ 561 Spaltung durch pflanzliche Organismen 561 I. Durch Pilzkultur 562 Beispiel: dl-Leucin 563 IL Durch Hefegärung 563 Inhaltsverzeichnis. XIX Seit« Beispiele der Darstellung von : 1-Alanin 568 d-Allo-Isoleucin 569 d-Serin 569 Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte 570 a) Isolierung der Nukleinsäuren und deren Abbau, Darstellung der Spaltungs- produkte. Von Prof. Dr. H. Steudel, Berlin 570 1. Isolierung und Abbau der echten Nukleinsäure aus tierischen Organen . 570 Darstellung der Nukleinsäure nach Neumann 571 Darstellung der Nukleinsäure nach Schmiedeberg 574 Eigenschaften der Nukleinsäure 575 Abbau der Nukleinsäure 576 Darstellung der Thyminsäure 582 Darstellung der Nukleothyminsäure 584 Darstellung der Spaltungsprodukte der Nukleinsäure 584 Spaltung mit starker Salpetersäure 584 Spaltung mit siedender Schwefelsäure 585 I. Verarbeitung des Phosphorwolframsäureniederschlages 586 Fällung der Alloxurbasen 586 Cjtosinfällung 587 II. Verarbeitung des Filtrats von der PhosphorwolframsäurefäUung . . . 588 Bemerkungen 589 Abbau der Nukleinsäure durch Fermente 590 Verbindungen, in denen die einzelnen Spaltungsprodukte der Nukleinsäure am besten identifiziert werden 591 Pflanzliche Nukleinsäuren 595 Hefenukleinsäure 595 Piasminsäure 595 Triticonukleinsäure ' 596 Darstellung des Nukleoproteids aus Pankreas nach Hammarsten 597 Darstellung der Guanylsäure aus dem Nukleoproteid 598 Inosinsäure 599 h) Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. Von Dr. phil. P. A. Levene, New- York 605 I. Nukleoside 605 II. d-Ribose-phos])horsäure C^ Hjj Og P 608 III. Thymo-hexose-phosphorsäure, C,j K,, Ng P 0,(, 609 c) Isolierung von Purinbasen oder Alloxurkörpern aus Pflanzen. V^on Prof. Dr. E. Winterstein, Zürich 610 Koffein 611 Theobromin 612 Theophyllin 612 Trennung der Alloxurbasen 613 AUantoin • • 615 Vernin ol*^ b* XX Inhaltsverzeichnis. Seite Das Häiuatin und seine Abbauprodukte. Von Prof. Dr. William Küster, Stuttgart 617 I. Darstellung von Rohhämin 617 Ä. Die Methode von Mijrner 618 B. Die Methode von Schalfejeff 619 II. Darstellung: A. von Dehydrochlorid-Hämin 620 B. von reinem Hämin 620 C. Eigenschaften des Hämins 621 III. Darstellung und Eigenschaften des Hämatins 622 IV. Darstellung des Hämatoporphyrins 623 Eigenschaften des H.ämatoporphyrins 624 V. Darstellung und Eigenschaften des Mesoporphyrins 625 VI. Ä. Darstellung und Eigenschaften des Hämopyrrols . . . . 625 B. Oxj'dation des Hämopyrrols zu Methyläthylmaleinsäureimid 627 VII. A. Darstellung der Hämatinsäuren 628 B. Eigenschaften des Imids der dreibasischen Hämatinsäure 631 C. Überführung in das Anhjdrid der dreibasischen Hämatinsäure . ■ • 631 D. Eigenschaften des Anhydrids der dreibasischen Hämatinsäure .... 632 E. Überführung des Anhydrids in das Imid der dreibasischen Hämatinsäure 633 F. Überführung des Imids der dreibasischen Hämatinsäure in das Imid der Methyläthylraaleinsäure 633 VIII. Bemerkungen für die Analyse von Hämin und Hämatin 634 Grallenfarbstoffe und Abbauprodukte. Von Prof. Dr. William Küster, Stuttgart . 635 A. Die Aufarbeitung von Gallensteinen 635 B. Das Umkristallisieren des Eohbilirubins 640 C. Eigenschaften des Bilirubins 641 Darstellung von ßiliverdin 642 Darstellung von Hämatinsäure 643 Darstellung von Hydrobilirubin 644 Darstellung der Gallensäuren und ilinr wichtigsten Abbauprodukte und ihr Nachweis. Von Prof. Dr. Olof Harn mar sten, Upsala 645 I. Darstellung der gepaarten Gallensäuren 645 A. Darstellung der Glykocholsäuren 645 a) Glykochol- und Glykocholeinsäure 645 hj a- und ß-Hyoglykocholsäuren 649 B. Darstellung der Taurocholsäuren 651 a) Die Taurocholsäure 6ol b) Die Taurocholeinsäure 653 C. Darstellung der Scymnolschwefelsäuren 654 II. Darstellung der Cholalsäuren und ihrer nächsten Derivate 655 a) Darstellung der Cholsäure 6oo b) Darstellung der Choleinsäure und der Desoxycholsäure 658 c) Darstellung von Dehydrochol- und Dehydrocholeinsäure 662 d) Darstellung von Bilian- und Isobilian- wie von Cholan- und Isocholansäure 663 III. Darstellung von Taurin (und Glykokoll) aus der Galle 665 Inhaltsverzeichnis. XXI Seite IV. Nachweis von Gallensäuren in tierischen Flüssigkeiten 666 a) Nachweis von Gallensäuren in Blut oder serösen Flüssigkeiten 666 h) Nachweis von Gallensäuren im Harne 668 c) Nachweis von Gallensäuren in den Fäces 669 Chlorophyll uiid seine wichtigsten Abbauprodukte. Von Prof. Dr. Richard Will- stätter, Zürich 671 Das Pflanzenmaterial 671 Gewinnung der Rohchlorophyllösungen 673 1. Doppelextrakte 673 2 Perkolate 674 Quantitative Chlorophyllbestimmung 676 1. Relative Gehaltsbestimmung 676 2. Absolute Gehaltsbestimmung 678 Kristallisiertes Chlorophyll 679 Amorphes Chlorophyll 683 Die gelben Begleiter des Chlorophylls (Carotin und Xanthophyll) 688 Chromatographische Adsorptionsanalyse des Chlorophylls nach M. Tswett . . . 690 Abbauprodukte des Chlorophylls 691 Umwandlung durch Alkalien 691 Chlorophyllinsalze 693 Rhodophyllin 696 Umwandlung durch Säuren 700 Phäophytin 702 Phäophorbin 704 Phytol 704 Quantitative Phytolbestimmung 705 Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten 708 Phytochlorin e und Phytorhodin g aus Gras 712 Phylloporphyrin 714 Tierische Pig:niente und Farbstoffe. Von Privatdozent Dr. Franz S amuely, Freiburgi. B. 717 Allgemeiner Teil 717 Spezieller Teil 720 Ä. Farbstofie in Sekreten und Gewebsflüssigkeiten 720 I. Farbstotte in Drüsensekreten 720 1. Punizin 720 2. Aplysiopurpurin 722 3. Sepiaschwarz 723 4. Lipochrome 724 II. Farbstorte im Blut 724 1. Hämocyanin aus dem Blut von Mollusken 724 2. Hämocyanin aus Crustaceenblut 725 3. Echinochrom 726 4. Chlorocruorin 726 5. Pinnaglobin 727 6. Hämerythrin 728 7. Tetronerythrin 728 8. Melanosen 728 XXII Inhaltsverzeichnis. Seite III. Farbstoffe der Galle 728 1. Darstellungsmethoden für die natürlichen Gallenfarbstoffe 729 2. Isolierung der gelösten Gallenfarbstofie 730 3. Methoden zum qualitativen Nachweis und zur Identifikation der Gallenfarb- stofie 730 Generelle Gallenfarbstofireaktion 731 4. Qualitative Speziaireaktionen und Eigenschaften der einzelnen Gallenfarb- stoffe 733 Umwandlungsprodukte des Bilirubins 735 ly. Farbstoffe im Harn von unbekannter Zusammensetzung 736 1. Urochrom 736 2. Uroerythrin . 740 3. ürorosein 741 4. Urobilin und Urobilinogen 742 V. Harnfarbstoffe der Indol- und Skatolgruppe und ihre Chromogene 747 1. Indoxyl 748 2. Sogenannte Skatolfarbstoffe (Skatolrot) 754 B. Farbstoffe in Geweben. Pigmente 756 I. Farbstoffe als Verwandte des Hämoglobins oder der Gallenfarbstoffe . . . 756 Histohämatine 756 II. Farbstoffe aus der Klasse der Purinkörper 757 III. Farbstofl'e aus der Gruppe der Lipochrome 758 Lipochrome 758 Crustaceorubin und Oyanokristallin der Panzer von Crustaceen 760 Tetronerythrin • 760 Yitellolipochrome 761 Lipochrome der Säugetiere (Luteine) 762 IV. Farbstoffe aus der Gruppe der Melanine 762 1. Methoden der mechanischen Isolierung (Pigment der Chorioidea des Auges) . 763 2. Methoden der Säurehydrolyse (Hippomelanin) 764 3. Methoden der Alkalihydrolyse und Alkaliextraktion (Melanine der Haare, der Haut, melanotischer Tumoren) u. a 765 V. Sonstige Farbstoffe zum Teil unbekannter Natui- 768 1. Sogenannte Uranidine 769 2. Gelbe Farbstoffe 769 3. Rote Farbstoffe 769 4. Blaue Farbstoffe 771 5. Grüne Farbstoffe 772 Darstellang und Eig-enscliaften der für das Nervengewebe charakteristischen Lipoide. Von Prof. Dr. W. Gramer, Edinburgh 774 Einleitung 774 Material 774 Entwässerung des Materials 775 Protagon 777 Paranukleoprotagon 782 Cerebroside. Allgemeines 784 Tabelle für Cerebroside 785 Inhaltsverzeichnis. XXIII Seite Cerebrin, Homocerebrin und Eukephalin 784 Aminocerebrininsäureglykosid 788 Cerebron 789 Tabelle für Spaltungsprodukte des Cerebrons 794 Phrenosin 793 Cerebrin azide 796 Cerebrosulfatide 797 Phosphatide 798 Tabelle für Phosphatide nach Thudichum 799 Systematische Extraktion des Nervengewebes nach Thudichum 800 Die Phosphatide von Zuelzer 801 Das Phosphatid von Koch (Kephalin) 802 Das Phosphatid von Cousin (Kephalin) 803 Das Bethesche Phosphatid und die Bethesche Kupfermethode . . 804 Quantitative Bestimmung der Phosphatide nach Koch und Woods . . . 806 Quantitative Bestimmung der Phosphatide nach Koch 809 Quantitative Bestimmung der Cerebroside 810 Quantitative Bestimmung des Protagons 812 Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. Von Prof. Dr. E. St. Faust, Würzburg . 815 Einleitung 815 Begriffsbestimmung. Was gehört zu den tierischen Giften? 816 Systematik 817 Wirbeltiere, Vertebrata : Ornithorhynchus paradoxus, das Schnabeltier 818 Adrenalin 819 Wirkungen des Adrenalins 821 Nachweis und quantitative Bestimmung des Adrenalins 823 Die Gallensäaren 824 Nachweis der Gallensäuren auf pharmakologischem Wege 825 Schlangen 826 Die Giftorgane der Schlangen 827 Physikalische und chemische Eigenschaften der Schlangengifte 828 Ophiotoxin, der wirksame Bestandteil des Cobragiftes 831 Darstellung des Ophiotoxins 832 Pharmakologische Wirkungen und Nachweis des Ophiotoxins 838 Wirkungen der Schlangengifte auf das Blut 841 Über das Schicksal der Schlangengifte im Organismus 843 Gewinnung und Sammeln der Schlangengifte 843 Eidechsen 844 Heloderma suspectum und Heloderma horridum, die Krusteneidechse . . . 844 Wirkungen des Helodermagiftes 845 Amphibien 84(> Bufo vulgaris, die gemeine Kröte 846 Bufotalin, Bufonin 847 Darstellung und Nachweis des Bufonins auf chemischem Wege 84S Darstellung des Bufotalins 848 XXIV Inhaltsverzeichnis. Seite Nachweis des Bufotalins auf pharmakülogischem Wege 849 Beziehungen des Bufonins und des Bufotalins zueinander und zum Cholesterin 850 Salamandra maculosa, der gewöhnliche Feuersalamander 852 Darstellung und Eigenschaften des Samandarins 853 Nachweis des Samandarins auf pharmakologischem Wege 854 Darstellung und Nachweis des Samandaridins 855 Samandatrin 856 Triton cristatus, der gewöhnliche Wassersalamander, Kammmolch 857 Nachweis des Tritonengiftes auf pharmakologischem Wege 857 Fische 857 Giftfische 858 Muraena helena und deren Giftapparat 858 Wirkungen des Giftsekretes von Muraena helena 859 Giftdrüsen und Giftstacheln der Acanthopteri, Stachelflosser 859 Wirkungen der Giftsekrete dieser Fische 861 Von Hautdrüsen gewisser Fische bereitete giftige Sekrete 864 Giftige Fische 864 Barbus fluviatilis, die Barbe. Barbencholera 865 Fugugift 866 Darstellung von Tetrodonin und Tetrodonsäure 867 Wirkungen des Fugugiftes 867 Giftwirkungen einiger Protamine 868 Giftwirkungen des Serums der lluraeniden. Ichthyotoxin 869 Wirbellose Tiere, Avertebrata: 871 Mytilus edulis, die Miesmuschel 871 Ursachen des Giftigwerdens der Miesmuschel 872 Über die chemische Natur des Muschelgiftes. Mytilotoxin 872 Mytilocongestin 873 Skorpione und Skoi-piouengift. Wirkungen des Skorpionengiftes 875 Spinnen, giftige 877 Nachweis und pharmakologische Wirkungen der Spinnengifte 878 Milben 880 Tausendfüßer 880 Chilognatha s. Diplopoda 881 Insekten. Bienen, Bienengift 882 Darstellung des giftigen Bestandteiles des Bienengiftes 883 Pharmakologische Wirkungen des Bienengiftes 883 Giftiger Honig 884 Ameisen, deren Giftapparat und chemische Natur des Giftes 885 Schmetterlinge, Cnethocampa processionea, C. pinivora, C. pityocampa 886 Käfer 887 Giftsekrete bestimmter Drüsen. Gifte im Blute der Käfer 888 Cantharidin 889 Wirkungen des Cantharidins 890 Nachweis des Cantharidins und der Canthariden bei Vergiftungen .... 891 Gift der Larven von Diamphidia locusta 893 Darstellung des Giftes von Diamphidia locusta 894 Wirkungen des Giftes von Diamphidia locusta 894 Iiilialtsvcrzeicliiüs. XXV Seite Würinor 895 Bothriocephalus latus, der hrcite Hanilwuriii dos Menschen 8% Ursachen der B(ithri(iCf|ilialiisanämie . H'JC) <"Hsäurc als hiimolytisclics (Jift . 8'.)C» Intoxication hyilatique . . 8117 Ascaris lumbricoides, der Spulwurm des Mensclicii . . 8'J8 Trichina spiralis 898 Ankylnstouia duodenale 898 Ilirudo niedicinalis, Hirudin 899 Karstellung wirksamer Extrakte aus Blutegeln 9(KJ Echinodermata, Stachelhäuter '.Idl Coelcnterata, Pflanzentiere '.101 Cnidarien, Nesseltiere 'MVJ Tiialassin. Hypnotoxin 9U- Kongestin 903 Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. Von Prof. Dr. J. Schmidt, Stuttgart .904 Einleitung 904 Allgemeines 904 Betrachtungen über Entstehung und Chemismus der Alkaloide in den Pflanzen 90«; Einteilung des Stoffes 908 I. Alkaloide der Pyridingruppe 908 a-Coniin 9(19 Über die Trennung der Coniiimalkaloide 909 Trigonellin 911 Piperin «.113 Arecaidin und Arcoilin '.(14 Nikotin <)1() Alkaloide der Granatbaumrinde: P.seudo-n-Methylpelletierin 92U Pelletierin 921 II. Alkaloide der Pyrrolidingruppe 921 1. Alkaloide der Solanaceen: Atropin 921 Tropeine 924 Hyoscyamin 92."> Hyoscin und Skopolanün . . .' 927 Atropamin oder Apoatropin 928 Belladonnin '.»28 2. Alkaloide der Kokablätter: Kokaine 929 Cinnamylkokaine .... 932 3. Alkaloide der Lupinenarten: Spartein und liUpinin 932 III. Alkaloide der Chinolingruppe 934 1. Chinaalkaloide: Chinin und ('inch(min 934 Conchinin oder Ohinidiii 93ä Cuprein 937 2. Alkaloide der Strychnosarten: Strycliniii '.).3S Hrucin *Ul) Curare-Alkaloide: Tubocurare, Caleba.ssencurare, Tnpfcurare 942 .\ bd r' r li n 1 (1 !• n , Ilundbuch der biorbi-tnischen ArbuiUen mit dem Destillat (Dest. llj. Am sichersten gestaltet sich der Nachweis, wenn es jetzt gelingt, den Alkohol im Destihat mit Kaliumkarbonat abzuscheiden und das resultierende Öl, in später zu beschreibender Weise, durch Frak- tionierung zu zerlegen. Nachdem man die Fraktion von 65 — 85" gesondert aufgefangen hat, verwendet man sie, oder falls die Abscheidung durch die Anwesenheit zu geringer Alkoholmengen mißlang, das Destillat II zur T Um- wandlung in den Nitrobenzoesi'iureäthylester. Hierzu wird mit käuflichem p-Nitrobenzoylchlorid erwärmt und abgekühlt. Es scheiden sich bei An- wesenheit von Alkohol KristaUe ab, die nach zweimaligem Umkristallisieren, erst aus rrasolin, dann aus Methylalkohol den Schmelzpunkt des reinen p-Nitrobenzoesäureäthylesters von 57" ergeben. Eine Stickstoffbestimmung des kristallisierten Produktes, dessen theoretischer Stickstoffgehalt 7'18"/o beträgt, sicliert vor jedem |Irrtum. Bestimmung des Äthylalkohols. Für die quantitative Bestimmung des Alkohols kommt hauptsächlich die Ermittlung des spezifischen (lewichtes seiner wässerigen Lösung in Betracht, mit Hilfe dessen man den Prozentgehalt an Alkohol dieser Lösung aus einer empirisch ermittelten Tabelle ablesen kann.i) Siehe S. 5. Zur Bestimmung destilliert mau aus der zu untersuchenden Flüssig- keit 2/5 des Volumens mit Wasserdampf über, da man nur dann sicher ist, daß aller Alkohol übergegangen ist. Bei sehr verdünnten Lösungen tut man gut daran, mit dem Destillat eine neue Destillation bis zu 3/5 des Volumens vorzunehmen. Der Gehalt der gleichfalls flüchtigen höheren Alkohole, die sich als Fuselöl bei der alkoholischen Gärung immer bilden-), hat keinen meßbaren Einfluß auf die Bestimmung des Alkohols. Dagegen muß man sich gegen das Übergehen der flüchtigen Säuren ins Destillat, welche dessen spezifisches Gemcht verändern würden, durch Neutrahsation der zu destillierenden Flüssigkeit am einfachsten durch Zusatz geringer Mengen von kohlensaurem Kalk schützen. Das spezifische Ge^^^cht wird in einem durch die Fig. 1 ver- anschaulichten Pyknometer bestimmt, das man am besten auf folgende Weise eicht. Das etwa 50 cni^ Wasser von 15" C fassende Kölbchen wird mit 50^ Wasser, die genau abzuwägen sind, beschickt, und die Eichung durch eine mit Hilfe einer Feile anzubringende Marke, die scharf den ') Auf die von B. Gaunt, „Zur Bestimmung des Alkoholgehaltes wässeriger Losungen durch den Gefrierpunkt". Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 44, S. 106 (100.')) aus- gearbeitete krj'oskopische Methode sei hier nur hingewiesen. lu der Hand geübter Experimentatoren wird sie sich für Laboratorien, die im Besitze des Bcckma unschön Apparates sind, für wissenscliaftliche Zwecke wegen ihrer Zuverlässigkeit und Schnellig- keit der Handiiabung gut eignen. -) H. F>-hif/sheini, Die Stickstoffernährung der Hefe. Teil HI. Biochem. Zeitschr. Bd. 3. S. 285 (1907). 1* 4 H. Pring-sheim. Stand des Meniskus fixiert, voraenommen. Die Gewichtsbestimmunyen sind auf der chemischen Wage mit sicherer Festlegung der dritten und möglichst genauen Ermittlung der \ierten Dezimalstelle vorzunehmen. Fig. 1. Pyknometer zur Alkohnlbestiminuiig. Das spezifische Gewicht der Flüssigkeit ^^^rd nun so bestimmt, daß man das ryknometer über die Marke hinaus mit der zu untersuchenden Flüssigkeit füUt und das gefiülte Kölbchen dann in Wasser von scharf 15" C einstellt, in dem es länger als eine halbe Stunde zu belassen ist. Während das Pyknometer noch im Wasser verharrt, saugt man mit einer engen Pipette die über der Marke stehende Flüssigkeit ab und trocknet innen mit Hilfe von Filtrierpapier. Das nach dem Entfernen aus dem Wasser auch außen gut getrocknete Pyknometer wird nun abgewogen. Das genaue Innehalten der Temperatur allein verbürgt ein zuverlässiges Resultat der Bestimmung. Das spezifische Gewicht berechnet sich wie folgt: Bedeutet a) das Gewicht des leeren Pyknometers, b) das Gewicht des bis zur Marke mit Wasser gefüUten, c) das Gewicht des mit Alkohol gefüllten, so ist das spezifische Gewicht s des Alkohols bei 15" C, bezogen auf Wasser von derselben Temperatur, _ ^ — ^ ~ b — a" Der Nenner dieses Bruches, das Gewicht des Wasserinhaltes des Pyknometers, ist bei allen Bestimmungen mit demselben Pyknometer gleich. Wenn das Pyknometer indes längere Zeit in Gebrauch gewesen ist, müssen die Gewichte des leeren und des mit Wasser gefüllten Pyknometers von neuem bestimmt werden, da sie sich mit der Zeit nicht unerheblich ändern können. Aus der hier folgenden Tabelle kann jetzt der Gewichts- oder Volumen- prozentgehalt des Destillates abgelesen werden, mit Hilfe dessen man durch Inbeziehungsetzung zum Volumen der zu untersuchenden Flüssigkeit deren Alkoholgehalt erfährt. Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen niederen Alkohole. 5 T a 1 ) eile zur Er in i 1 1 1 u u g des A 1 k o h o 1 i>' e li a 1 1 e s w ii s s e r i i»- e r F 1 ü s s i j^- k e i t e n. K. WindiscK Tafel zur Ermittluns' des Alkolioluehaltes. o - c o Ä 'S s O S o =S © o O C r ^ :t: ^ o ;: a<5 ^ Q ^ O o o =2 <1 10000 0 9999 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9989 8 7 6 5 4 8 2 T 0 0-9979 8 7 6 ö 4 3 2 1 0 0-9969 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9959 8 7 6 5 4 3 2 1 0-00 005 011 0-16 0-21 0-26 0-32 0-37 0-42 0-48 0-53 058 0-64 0-69 0-74 0-80 0-85 0-90 0 96 1-01 1-06 1-12 117 1-23 1-28 1-34 139 1-45 150 1-56 1-61 1-67 1 72 1-78 1-83 1-89 1-94 2-00 205 2-11 21 7 222 2-28 2-34 2-39 2-45 2-50 2-56 2 62 2-68 0-00 007 013 0-20 0-27 033 0-40 0-47 0-53 0-60 0-67 073 0 80 0-87 0-93 100 1-07 1-14 1-20 1-27 1-34 1-41 1-48 1-54 1-61 1-68 1-75 1-82 1-88 1-95 2-02 2-09 2-16 2-23 2 30 2-37 2-44 2-51 2-58 2-65 2-72 2 79 2-86 2-93 3-00 3-07 3-14 3-21 3-28 335 0-9950 09949 8 7 (5 5 4 o 2 1 0 0-9939 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9929 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9919 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 9909 8 7 6 5 4 3 2 1 2-73 2-79 2-84 2-90 2-96 3 02 3-08 3-14 319 325 3-21 3-37 343 3-49 355 3-60 3-66 3-72 3-78 3-84 3-91) 3-96 402 4-08 4-14 420 4 26 4-32 4-39 4-45 4-51 4-57 4-63 4-69 4-75 4-81 4-88 4-94 5-00 5-06 5-13 5-19 5-25 2-32 5-38 5-44 551 557 5-63 5-70 3-42 3-49 3-56 3-64 3-71 3-78 3-85 3-93 4 00 4-07 414 4-22 4-29 4-36 4-43 4-51 4-58 4-65 4-73 4-80 4-88 4-95 503 5-10 5-18 5-25 5 33 5-40 5-48 555 5-(i3 5-70 5-78 5-86 5-93 601 609 6-16 6-24 6-32 6-40 6-47 6 55 6-63 6-71 6-79 6-86 6-94 7-02 7-10 0-9900 0-9899 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9889 8 7 5 6 4 3 2 1 0 0-9879 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9869 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0-9859 8 7 6 5 4 3 2 1 5-76 5-83 5-89 5-96 6-02 6-09 6-15 6-22 6-28 6-35 6-41 6-48 655 6-61 6-68 6-75 6-81 6-88 6-95 7-02 7 08 715 7 22 7-29 7-36 7-42 7-49 7-56 7-63 7-70 7-77 7-84 7-91 7-98 805 8-12 8-19 8-26 8-33 8-41 8-48 8-55 8-62 8-69 8-76 8-84 8-91 8-98 9-06 913 7-18 7-26 7-34 7-42 7-50 7-58 7-66 7-74 7-82 7-90 7-99 8-07 8-15 8-23 8-31 8-40 8-48 8-56 8-64 8-73 8-81 8-89 8-98 9-06 9-15 9-23 9-32 9-40 9-48 9-57 9 66 9-74 9-83 9-91 10-00 10-09 10-17 10-26 10-35 10-43 10-52 10-61 10-70 10-79 10-88 10-96 11-05 1114 11-23 11-32 6 H. Pringsheim. Spezifisches Gewicht des Destillats Gewichts- prozente Alkohol Spezifisches Gewicht des Destillats Gewichts- prozente Alkohol "5 — c a) c P o Spezifisches Gewicht des Destillats Gewichts- prozente Alkohol Maßprozente Alkohol 0-98Ö0 9-20 11-41 0-9796 13-41 16-54 0-9742 17-90 21-96 0-9849 9-28 11-50 5 13-49 16-64 1 17-98 22-06 8 9-35 11-59 4 13-57 16-74 0 1807 22-16 7 9-42 11-68 3 1366 16-84 0-9739 18-15 22-26 6 9-50 11-77 2 13-74 16-94 8 18-23 2235 5 9-57 11-86 1 13-82 17-04 7 18 32 22-45 4 9-65 11-95 0 13-90 1714 6 18-40 22-55 3 9-72 12-05 09789 13-98 17-24 5 18-48 22-65 2 9-80 12-14 8 14-07 17-34 4 18-56 22-75 1 9-87 12 23 7 14-15 17-44 3 18-65 22-85 0 9-94 1232 6 14-23 17-54 2 18-73 221-95 0-9839 10-02 12-41 5 14-32 17-64 1 18-81 23-05 8 1010 12-50 4 14-40 17-74 0 18-89 23-14 7 1017 12-59 3 14-48 17-84 0-9729 18-98 23-24 6 10-25 12-69 2 14-56 17-94 8 1906 23-34 5 10-32 12-78 1 14-65 18-04 7 19-14 23-44 4 1040 12-88 0 14-73 18-14 6 19-22 23-54 3 10-48 12-97 0-9779 14-81 18-24 5 19-30 23-63 2 10-55 1306 8 14-90 18-34 4 19-39 23-73 1 10-63 1316 7 14-98 18-44 3 19-47 23-83 0 10-71 13-25 6 15 06 18-54 2 19-55 23-93 0-9829 10-78 13-34 5 15-15 18-64 1 19-63 24-02 S 10-86 13-44 4 15-23 18-74 0 19-71 24-12 7 10-94 13-53 3 15-31 18-84 0-9719 19-79 24-22 6 11-01 13-63 2 15-40 18-94 8 19-87 24-32 5 11-09 1372 1 15-48 19-04 7 19-95 24-41 4 11-17 13-82 0 15-56 19-14 6 2004 24-51 3 11-25 1391 0-9769 15-65 19-24 5 20-12 24-60 2 11-33 1401 8 15-73 19-34 4 20-20 24-70 1 n-40 14-10 7 15-81 1944 3 20-28 24-80 0 11-48 14-20 6 15-90 19-55 2 20-36 24-89 0-9819 11-56 14-29 5 15-98 19-65 1 20-44 24-99 8 11-64 14-39 4 16-06 19-75 0 20-52 25-03 7 11-72 14-48 3 1615 19-85 09709 20-60 25-18 G 11-80 14-58 2 16-23 1995 8 20-68 25-27 5 11-88 14-68 1 1632 2005 7 20-76 25-37 4 11-96 14-77 0 16-40 20-15 6 20-84 25-47 3 12-04 14-87 0-9759 16-48 20-25 5 20-92 25-56 2 1212 14-97 8 16-57 2035 4 21-00 25-66 1 12-20 15-07 7 16-65 20-45 3 21-08 25-75 0 12-28 15-16 6 16-73 20-55 2 21-16 25-84 0-9809 12-36 15-26 5 16-82 20-65 1 21-24 25-94 8 12-44 15-36 4 16-90 20 75 0 21-32 26-03 7 12-52 15-46 3 16-98 2086 0-9699 21-40 26-13 6 12-60 15-55 2 1707 20-96 8 21-47 26-22 5 12-68 15-65 1 17-15 21-06 7 21-55 26-31 4 12-76 15-75 0 17-23 21-16 6 21-63 26-41 3 12-84 15-85 0-9749 17-32 21-26 5 21-71 26-50 2 12-92 15-95 8 17-40 21-36 4 21-79 26 59 1 1300 1604 7 17-49 2146 3 21-87 26-69 0 13-08 1614 6 17-57 21-56 2 21-94 26-78 0-9799 13-16 16-24 5 17-65 21-66 1 2202 26-87 8 1325 16-34 4 17-73 21-76 0 22-10 26-96 7 13-33 16-44 3 17-82 21-86 0-9689 22-18 27-05 Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen niederen Alkohole. 5 O o ö s ^< OJ c =2 < O M -fcj ^ c »- o o ^ o S O s.-*i /i ^ ö J3 C N ■> C ^ N .2 0-9688 22-25 7 22-33 6 22-41 5 22 49 4 22-56 3 22-64 2 2272 1 22-79 Ü 22-87 0-9679 22-95 8 2302 7 2310 6 23-17 5 23-25 4 23-32 3 23-40 2 23-47 1 23.55 0 23-63 0 9669 23-70 8 23-77 7 23-85 6 23-92 2714 27-24 2733 27-42 27-5] 27-60 27-69 27-78 27-87 27-96 28-05 2814 28-23 28-32 28-41 28-50 28-59 28-67 28-76 28-85 28-94 29-03 29-11 0-9665 24-00 4 2407 2415 2 2422 1 24-29 0 24-37 0-9659 24-44 8 24-51 7 24-59 6 24-66 5 24-73 4 24-80 3 24-88 2 24-95 1 25-02 0 25-09 0'9Ö49 2517 8 25-24 7 25-31 6 25-38 0 25-45 4 25-52 3 25-59 29-20 2^29 2938 29-46 29-55 29-64 29-72 29-81 29-89 29-98 30(J6 3015 30-23 30-32 30-40 30-49 30-57 30-66 30-74 30-82 30 91 30-99 3107 0-9642 1 0 0-9639 8 7 6 5 4 3 ^> 1 0 0-9629 8 7 6 5 4 3 2 1 0 25-66 25-74 25-81 25-88 25-95 26-02 26-09 26-16 26-23 26-30 26-37 26-44 26-51 26-57 2(')-64 26-71 26-78 26-85 26-92 26-99 27 05 2712 2719 31-16 31-24 31-32 31-41 31-49 31-57 31-65 31-73 31-81 31-89 31-98 3206 3214 32-22 32-30 32-38 32-45 32-54 3262 32-70 32-78 32-85 32-93 Be.stimmung des Äthylalkohols in sehr verdünnten Lösungen.') Das Prinzip der Methode ist folgendes: Füat man nach und nach und in sehr aerinyen Mengen Kalium- bichromat in der Wärme zu einer sehr verdünnten Alkohoüösung, und zwar in Gegenwart von Schwefelsäure, so wird die Reduktion des lUchromates in einem bestimmten Moment von einem Farbenum schlage begleitet; im Moment, wo der Alkohol ganz oxydiert ist, wird kein lUchromat mehi- verbraucht, und ein geringer Ül)erschuß an Bichromat verleiht, dank der Intensität seiner Farbe, der blaugrünen Färbung des C-hromisulfats eine gelbliche Tönung, Avobei ein wahrhafter Farbenumschlag zustande kommt, der das Ende der Reaktion anzeigt und den man so zur Bestimmung des Alkohols verwenden kann. Man verfährt wie folct: In ein Reagenzrohr bringt man 5 mi^ der zu untersuchenden alkoho- lischen Lösung, die im Maximum 1 : 500 stark sein darf: dazu fügt man 0"1 oder 0'2 citi^ Kaliumbichromat (19/7 pi"o Liter), welche Menge für ge- wöhnlich zu gering ist, um aUen Alkohol zu oxydieren, und darauf reine ^) Maurice Xicloux, Dosagc de Talcool dans le Chloroform. Bull, do la Soc. Cliimi(iuc de Paris. (S.Serie.) T. 35. 8.330 (1906). 3 H. Priugsheim. Schwefelsäure von 66° Baume; die Lösung- erwärmt sich sehr stark und wenn genügend Säure zugesetzt ist (4"5 — 6 cm^), tritt der Farbenumschlag ein und das Bichromat entfärbt sich; aus der Bürette läßt man Bichromat nachfließen, wobei man umschüttelt und zu schwachem Kochen erhitzt, bis die Färbung von Giünblau in Gelligrün umschlägt. Man notiert dann die Menge verl)rauchter Kubikzentimeter Bichromat. Enthält die Lösung mehr als 2<'/oo Alkohol, was man leicht daran bemerkt, daß man mehr als 2 cm^ Bichromatlösung zur Erreichung der gelbgrünen Färbung verbraucht, so verdünnt nian auf weniger als 2''/ooi für welche Verdünnung der Farlienumschlag am genauesten zu beobachten ist. Die zur Titration verwandte Menge Bichromat zeigt schon fast genau den Alkoholgehalt an, weshalb 5 cm^ zur Bestimmung genügen. Um eine absolute Sicherheit zu erlangen, ist es empfehlenswert, die vorher gefundene Zald zu bestätigen. Zu diesem Zwecke fügt man zu 5 cni'^ der zu unter- suchenden Lösung die gefundene Anzahl Kubikzentimeter Bichromat, ver- mindert um O'l cm^\ man setzt die Schwefelsäure zu und kocht einen Moment lang auf. Die Lösung müßte noch blaugrün gefärbt sein. Man wiederholt dieselbe Operation und nimmt nun 0"! cm'^ Bichromat mehr als die zuerst gefundene Menge. Die Färbung muß nun gelbgrün ausfallen. Li diesem Falle ist die Bestimmung beendet und die zuerst gefundene Zahl ist exakt. Ist die zweite Färlumg auch noch blaugrün. so fügt man O'l on'^ Bichromat hinzu, worauf wieder LTmschlag eintritt. Dann bedient man sich zur Berechnung der höheren Zahl: Ist n die Zahl der gefundenen Kubik- zentimeter Bichromat, so ist der Alkoliol in Kubikzentimeter pro Kul)ik- n Zentimeter der untersuchten Losung = . Bei größerer Verdünnung als P/oo Alkohol wendet man besser eine Bichromatlösung von der halben Verdünnung (O'o^' pro Liter) an. Besonders für solche, die die Bestimmung zum ersten Male ausführen, ist die Verwendung von sechs Paar Vergleichsröhrchen empfehlenswert. Man wendet z. B. Alkohollösungen von 2, L5, L O'S, O'ö, (''2700 an^ die 2. Lö, 1, 0*8, 0"5 und 0'2 cm^ der Bichromatlösung (19 (/ pro Liter) bis zu gelb- grüner Färbung verbrauchen. Bei größerer Verdünnung als lo/oo nimint nian die halbkonzentrierte Bichromatlösung, von der man die doppelte Menge Kubikzentimeter verbraucht. Um in der zweiten Reihe von Röhrchen die grünblaue Färbung noch bestehen zu lassen, muß man jedesmal Ol cm^ Bichromatlösung weniger zusetzen. Bei der Bestimmung des Alkohols ver- wendet man dann die so vorbereiteten Röhrchenpaare als Vergleichsprolien. Man vergleicht die Färbung der zu untersuchenden Flüssigkeit nach dem Umschlag in gelbgrün mit der am nächsten Hegenden Farbeutönung der vorbereiteten Röhrchen. Der Alkoholprozentgehalt entspricht immer der Menge der verbrauchten Kubikzentimeter Bichromat und die ganze Operation dauert nur einige Minuten. Fehlergrenze. Die Fehlergrenze der Methode ist also öo/o, in geül)ten Händen wird sie geringer. Der absolute Fehler hegt bei \ loooo ^'"'^ Alkohol \:i eil weis und Bestimmung der biologisch wichtigen niederen Alkohole. ») bei Lösiiiiijeii von 1— 2^00 iii"^ ''•'! Vsoono^'^"' bei sclnvüchei-cn Lösuiiiieii. Naeii eiiteneu Erfahrungen kann die ^Methode enipfolilcii wei-don. Der Farbcnunisclilag ist ohne Schwierigkeit zu erkennen. Propyl-, Butyl- und Amylalkohole. Der normale rroini-, Isobiitvl- und Auiyhdkohol finden sich in wccli- sehidein VerhiUtnis, aber in allen Fällen in dem bei (k-r alkoholischen (i;irun<>" als Nebenprodukt entstehenden Fuselöl.') Der Auiyhdkohol ist darin als Isobutylcarbinol und sekun(hires (aktives) liutvlkavbinol enthalten, (h'ssen Nachweis und IJestimmung in (h^r Amylalkoliolfraktion auf (hiind seines optischen Drehungsvermögens gelingt.-; Die iüldung von Amylalkohol durch Bakterien ist noch nicht erwiesen; dagegen werden normaler Dutylalkohol^) und IsopropylalkohoH) von ihnen in reichhcher Menge ei'zeugt. Höher molekulare Alkohole sind in einigen Fällen im Fuselöl aufgefunden woiden; da sie jedoch nicht genau genug zu charakterisieren sind und sich nur selten vorfinden, ül)ergelien wir ihren Nachweis. Nachweis und Bestimmung der Propyl-, Butyl- und Amylalkohole. Da wir keine Methoden kennen, um die genannten Alkohole in (Je- mischen durch spezielle Methoden nachzuweisen, muß ihrem Nachweis und ihrer Bestimmung, die dann in eins zusammenfallen, immer eine Isolierung vorausgehen. Anders verhält es sich mit der Bestimmung dei' ;ds Fuselöl bezeichneten Gesamtmenge höherer Alkohole, die sich im (Järungsalkohol vorfinden. Hier behandeln wir zuerst den Fall. da(.^ die höliereu Alkohole nicht in Gegenwart größerer Meuten von Äthvlalkohol entstanden sind. »' Methode der Isolierung. 1. Das Trocknen der Alkohole. Um die Alkohole zu isolieren, destilliert man aus der zu untei'su- chenden Flüssigkeit etwa den fünften Teil ab. Das Destillat sättigt man mit wasserfreier Pottasche und trennt die Alkoholschicht im Scheidetrichtei-. Um sicher zu gehen, daß kein Propyhdkohol in der Salzlösung zurückbh'ibt. kann man aus dieser nochmals einen geringen Teil aixlestillieren und wie vorher verfahren. Der Ti'einumg des Alkoholgemisches in seine Bestandteile — und (bis Vorhandensein eines sohdien muß man immei' erwarten — hat eine scharfe Trocknung voi'auszugehen, von dei'em Gelingen die zui" Trennung an/u- ^) Unter der ausgedehnten Literatur sei liier die ausführliche Arbeit von /\'. Win- der Tetrachlorkohlenstoff nach einigem Stehen gelblich ge- färbt wird. Um den Überschub der salpetrigen Säure zu entfernen, schüttelt man den Tetrachlorkohlenstoff jetzt im Scheidetrichter mit 1'^ eiit'-^ ge- sättigter Sodalösung durch und wäscht einmal mit Wasser nach. Um die salpetrige Säure aus den Estern in Freiheit zu setzen, schüttelt man die Lösung- dann mit 25 cnt^ konzentrierter Schwefelsäure und läßt Säure und Tetrachlorkohlenstoff, unter Nachwaschen mit Wasser, gemeinsam in ein Becherglas laufen, das 100 ci;?^ Wasser und einen Teil der zur Titration zu verwendenden i/jo-Normalpeimanganatlösung enthält. Diese hält man durchNachfließenlassen aus der Bürette immer im Überschuß, was sich durch die ^^olette Färbung der Lösung zu erkennen gibt. Nach 5 Minuten langem Stehen titriert man mit einer auf die jPermanganatlösung so eingestellten schwach schwefelsaui'en Eisenferroammoniumsulfatlösuug, daß 10 f^^;^ dieser etwa 10 c/// 3 der rermaiiganatlösung entsprechen, zurück. Der Titer der Permanganatlösung wird auf Eisen eingestellt. Bei der L^mrechnung auf Amylalkohol entspricht Ol r/ Fe oder die entsprechende Menge Kaliumper- manganat 0'078658<7 Amylalkohol. Der gebrauchte Tetrachlorkohlenstoff wird zuerst eine Zeitlang unter einer Per- manganatlösung stehen gelassen, dann durch zweimaliges Schütteln mit konzentrierter Schwefelsäure. Xaclischütteln mit Wasser, verdünnter Natronlauge und wieder mit Wasser, Entwässern mit (.hlorealcium und schließliclie DestiUation gereinigt, ehe er von neuem zur Analyse verwandt werden kann. Auf dieselbe Weise bereitet man auch den billigen Tetrachlorkohlenstoff der Technik vor, dessen man sich dann gut zur Fuselölbestimmung bedienen darf. Naclnveis und Bestimmung der biologiscli Aviclitigen Aldehyde. Von Haus Pringslieim, Berlin. Für den Nachweis und die Bestimmung' der Aldehyde kommen bei biologischen Prozessen hauptsächlich Formaldehyd und Acetaldehyd in Be- tracht. Ersterer wurde häufig als Z^\1schenprodukt bei der Kohlensäure- assimilation im Chloroplasten der Pflanzen gesucht, y) Der Acetaldehyd ent- steht bei der alkohohschen Gärung, voraussichtlich als Oxydationsprodukt des Alkohols-): die nächsthöheren Aldehyde von der dritten bis zur sechsten Kohlenstotfreihe sind in der Natur kaum beobachtet worden. Die Aldehyde der höheren Reihen, wie Oenanthol. C'aprylaldehyd. Pelargonaldehyd. Caprin- aldehyd, Laurinaldehyd und Myristinaldehyd, müssen zum Nachweis isoliert und durch die gewöhnlichen Methoden der Elementaranalyse charakterisiert werden. ^ ) Wir beschränken uns daher hier auf den Nachweis und die Be- stimmung von Form- und Acetaldehyd, die jetzt so gut ausgearbeitet sind, daß diese Aldehyde in Zukunft mit gutem Erfolge bei biologischen Pro- zessen gesucht und bestimmt werden können. Formaldehyd, H — C\tt, ist bei gewöhnlicher Temperatur ein Gas, das sich bei — 21" zu einer wasserhellen Flüssigkeit verdichtet. Seine uns hier ausschlieblich interessierende wässerige Lösung riecht sehr stechend. ö^ ./O Acetaldehyd, CH3— C\jj, gewöhnlich ..Aldehyd" schlechthin genannt, ist eine farblose, sehr bewegliche Flüssigkeit, die schon bei 21° siedet und sich mit Wasser in jedem A'erhältnis mischt. Nachweis der Aldehyde.*) Zum Nachweis der Aldehyde eignet sich 1. die Reduktion ammoniakalischer Silberlösung, bei der sich ein Silberspiegel abscheidet; 1) Neuere Literatur. Vgl. CzapeTt, Biochemie der Pflanzen. Bd. 1. S. 503. Jena 1905/07. 2) Tgl. Bau in Lafars Handb. d. techn. Mykologie. Bd. 4. S. 386. ^) Vgl. Me II er- Jacobson, Lehrb. d. orgau. Chemie. Bd. I^. S. 716. Leipzig 1907. *) Vgl. ViJcfor Mcycr-Jacobson, 1. c. S. 680. Nachweis und Bestimmung der l)iologisch wichtigen Aldehyde. 15 2. die rotviolctte Färbung-, welche beim Versetzen einer durcli schweflige Säure entfärbten F'uchsinlüsung mit Aldehyd auftritt. Die Re- aktion wird jedoch auch von einigen Ketonen hervorgerufen: 3. für alle Aldehyde, welche in alkalischer Lösung einigermaßen be- ständig sind, ist folgende Reaktion sehr charakteristisch: Zu einer frisch bereiteten Lösung von Diazobenzolsulfonsäure in etwa 60 Teilen kaltem Wasser und etwas Natronlauge fügt man die mit verdünntem Alkali ver- mischte Substanz und einige Körnchen Xatriumamalgam und lälit ruhig stehen; nach kurzer Zeit tritt rotviolette Färl)ung ein. Noch verläßlicher als vorgenannte Reaktionen ist die Lsoliei'ung spe- zieller Verbindungen der Aldehyde; da wir aber für die uns hier inter- essierenden Aldehyde besondere Methoden angeben, soU dieses Verfahren hier nur erwähnt ^^erden. Unterscheidung des Formaldehyds von anderen Aldehyden, speziell Acetaldehyd.i) Löst man 1 r/ Mercurioxyd in der Wärme in einer ö^/oigen Natriumsulfitlösung, so ruft die Gegenwart einer geringen ^Menge von Acetaldehyd bei Zusatz einer sehr verdünnten alkalischen Lösung schon in der Kälte einen weißen, dichten Niederschlag hervor. Zuviel Alkali ist zu vermeiden; auch die iUdehydlösung muß genügend verdünnt werden. Der Niederschlag ist unlöslich in Wasser und Alkohol und bildet unter dem Einfluß von viel Jod in der Wärme Jodoform. Er löst sich nicht in verdünnter Schwefelsäure, dagegen in Cyankalilösung. Das ^lercurichlorid kann in der Bereitung des Reagenz das Oxyd vertreten. Alkohol beein- trächtigt die Reaktion in genügender A'erdünnung nicht. Aceton gibt sie erst, wenn durch Erhitzen aufgespalten wird. Die Reaktion ist charakteristisch für Aldehyde, die die Gruppe — CHg — COH enthalten, also nicht für Formaldehyd, den man auf diese Weise von den anderen Aldehyden, im besonderen Acetaldehyd. unterschei- den kann. Nachweis von Formaldehyd. 2) 1. Die folgende Farbenreaktion ist für den Nachweis von Formaldehyd äußerst empf indhch, aber sie ist, wie alle solchen Reaktionen, nicht absolut zuverlässig. Als Reagenz benutzt man eine Resorzinnatronlauge von 40 — öO^/o Natriumhydrat und 5Vo Resorzin. (ileiche Volumina dieser Lauge und der zu untersuchenden Flüssigkeit, die frei von Farbstoffen und Eiweiükörpern sein muß, werden im Reagenzrohr zum Sieden erhitzt und kurze Zeit (bis zu einer halben Minute) siedend erhalten. Selbst bei Gegenwart sehr ge- ringer Mengen von Formaldehyd tritt deutliche Rotfärbung ein. Die Grenze der Empfindlichkeit für reine wässerige Lösungen ist Vs '^is Vio Milliontel. ^) Ä.Leijs, Chem. Zentrall)]. Jg. 1905. H. S. 855. Journ. de pharm, et de chini. (VI. Bd. 22. S. 107 (1905). Wirkung der Aldehyde auf das Mercurioxyd in alkalischen Mitteln, Unterscheidung von Formaldehyd und Acetaldehyd. -) Lebbin, Zum Nachweis des Formaldehyds. Pharm. Ztg. Bd. 42. S. 18 (1897). 16 H. Frings he im. Die Reaktion soll außer Forjnaklehvd nur dem Chloroform und Substanzen, die mit Lauge Chloroform abscheiden, zukommen. 2. Zuverlässiger, wenn auch nicht so scharf wie vorstehende Farben- reaktion, ist die Kondensation des Formaldehyds mit p-Dihydrazinodiphenyl, welches mit ihm ein charakteristisches Hydrazon von der Formel C, H, . H . X . X = GH., Ce H, . H . X . X rn CH. bildet. 1) Zu einer ganz farblosen, nötigenfalls mit Tierkohle völlig entfärbten wässerigen Lösung des p-Hydraziuodiphenylchlorhydrats setzt man bei GO^ langsam unter Eühren die zu untersuchende Flüssigkeit. Die Lösung erfüllt sich bald mit einem voluminösen hellgelben Xiederschlag, der sich rasch absetzt. >L'in wäscht an der Saugpumpe nacheinander -mit viel heißem Wasser, Alkohol, Aceton. al)Solutem Alkohol und wasserfreiem Äther. Xur so behält die Substanz auch nach dem Trocknen im Vakuum über Schwefel- säure ihre dem Phenylglukosazon gleichende Farbe. Im Kapillarrohr färbt sich die Substanz bei 160" orange, sintert bei etwa "J02" und schmilzt un- scharf bei 220'' zu einer rotbraunen Masse, die sich bei 240'' langsam zersetzt. Die beschriebene Verbindung entsteht noch in P'ormaldehydlösungen von großer Verdünnung. Solche von 1:5000 färben sich beim Erwärmen mit einigen Tropfen der Lösung des salzsauren Diphenyldihydrazins momentan hellgelb; bis zur kristallinischen Abscheidung des Xlederschlags muli man hier jedoch einige Minuten warten. Bei Verdünnung von 1 : 8000 Anrd die Probe unsicher. Andere Aldehyde oder Ketone geben mit salzsaurem Diphenyldihydrazin in gehöriger Verdünnung überhaupt keine oder in Alkohol leicht lösliche Verbindungen. Man setzt daher zu der zu prüfenden Flüssigkeit, wenn andere Aldehyde oder Ketone zu vermuten sind, das doppelte Volumen Alkohol, wodurch die Schärfe der Leaktion nicht beeinträchtigt wird. Ist wenig Formaldehyd neben vielen anderen Alkoholen und Ketonen zugegen, so kocht man die durcJi das Hydrazinsalz gefällte Verbindung mit starkem Alkohol aus, bis der Ilückstand rein gelb ist. Für den rein qualitativen Xachweis ist die Reindarstellung des Hy- drazinchlorhydrates nicht erforderlich. Es genügt, in einem Reagenzglas eine Messerspitze R)enzidin in Salzsäure zu lösen, nach dem Erkalten unter Kühlung mit fließendem Wasser mit Xitrit zu versetzen und das Diazo- chlorid zu einer Lösung von Zinkchlorür in rauchender Salzsäure zu fügen. Nach kurzem Stehen kocht man mit Tierkohle auf. Das klare FUtrat ent- hält genügend Hydrazinchlorhydrat, doch nimmt die Formaldehydverbindung dann manchmal einen orangeroten Farbenton an. ') C. Xe\(berg, Zur Erkennung und Bestimmung des Formaldehyds. Ber. d. Deutsch. ehem. Ges. .]q. 32. S. 189, 1899, 1901. Nachweis und Bestimmung der l)iologiscli wichtigen Aldehyde. ^7 Die Methode ist bei Verwendiiiiii' des kristallisierten reinen Ilydrazin- rean-enz znr quantitativen Restinmiunii- von Fornialdehvd in (le^enwart antlerer Aldehyde und Ketone geeignet , worüber man das (Jrif^inal ver- i:;ieiche. Nachweis von Acetaldehyd. (Prüfunfi' auf Aldehyd in alkoholischen Flüssiijkeiten.) 400 — 500 cm^ der zu untersuclienden Flüssigkeit werden in eine chemisch reinen Alkohol enthaltende Vorlage so abdestilliert, daß die ersten Anteile, auch die übergehende Luft, in den Alkohol geleitet wird. Die eine Hälfte des Destillates, mit ammoniakalischer Silberlösung erwärmt, läßt bei Ausscheidung eines schwarzen Niederschlages auf Aldehyd schließen. Zur Sicherheit prüft man die andere Hälft« des Destillates ^ ), indem man zu demselben in einer weißen Porzellanschale tropfenweise von einer frisch bereiteten W^/o^gevL Lösung von reinstem Metaphenylendiamin gibt. Alde- hyd erzeugt in 2 — 4 Minuten an der I5erühi'ungsstelle beider Flüssigkeiten eine gelbrote Zone; es ist jedoch zu beachten, daß in länger als 5 Minuten dieselbe Reaktion auch bei reinem Alkohol eintritt. Mit vorgenanntem Re- agenz läßt sich noch die Anwesenheit von 1 : 100.000 Volumen Acetaldehyd erkennen. Bestimmung des Formaldehyds. 2) a) In rein wässeriger Lösung bei Abwesenheit anderer Aldehyde und Ketone. Die jodometrische Bestimmungsmethode beruht auf der Oxy- dierbarkeit des Formaldehyds in alkalischer Lösung, die er seiner Aldehyd- funktion verdankt. 3) Die zu untersuchende Flüssigkeit bringt man in eine Stöpselflasche mit gut eingeriebenem (ilasstopfen und fügt schnell ^30 cm'^ Normalnati'on- lauge hinzu, die man nur mit dem Meßzylinder abzumessen braucht. Zu- gleich läßt man unter beständigem L^mschwenken aus einer Bürette etwa 50 cm^ Vs-Normaljodlösung zufließen, bis die Flüssigkeit lebhaft gelb er- scheint. Man verstopft die Flasche, schüttelt noch eine halbe Minute lang gut um, säuert mit 40 cm^ Normalschwefelsäure (im Meßzylinder gemessen) an und titriert nach kurzem Stehen, während dessen die Flasche verstopft bleibt, den Überschuß des Jods mit i/io-Noi-malnatriumthiosulfathisung zurück. Zwei Aijuivalente verbrauchten Jods entsi)rechen einem A(iuiva- lent Formaldehyds. 1 cm^ '/ j,, -Normal jodlösung entspricht 0"73oo mg Form- aldehvd. *) Windisch, Zeitschr. f. Spiritusiiidnstrie. 1896. S. 19. ^) Über zahlreiche Mothodeu zur Formaldeliydliestimmuug vgl. Mci/cr- Jacobson, 1. c. S. 703. ^) G.BoiniJn, Über die Bestimmung des Formnldeliyds. Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 36. S. 18 (1897). Verbessert von Fresenius und (irünhuf. Zur Handelsanalyse von Formaldehyd. Ibid. Bd. U. S. 13 (1905). Abderhalden, Handbuch der biochoiuischen Arbeitsmethoden. 11. 2 jg H. Pringsheim. Auf sorgsames Arbeiten, feine Büretten, jodatfreies Jodkaliuni und nitritfreie Natronlauge ist zu achten. h) Bei Anwesenheit von Acetaklehyd bzw. Aceton- oder Benzaldehyd. Die Cyankaliunimethode beruht auf der Eigenschaft des Formaldehyds, das CyankaUum sofort zu addieren. In salpetersaurer Lösung wird von einem Äquivalent Formaldehyds 1 Äquivalent Cyankalium gebunden. Ein Überschuß von Cyankalium wird durch Silbernitrat ausgefällt und der Rest der zugesetzten Silberlösuug mit Bhodanammon nach Volhard zurücktitriert. Das Ptesultat ist folgendes: Je größer die Menge des Formaldehyds, desto mehr CyankaU wird verbraucht, desto weniger Silberlösung bleibt zurück und desto größere Mengen von Bhodanammon sind zur endlichen Titration nötig; d. h. je mehr Formaldehyd in der zu untersuchenden Flüssigkeit Avar. desto mehr Rhodanammonlösung müssen bis zur Rotfärbung (Eisenalaun als Indikator) zugesetzt werden. Bedient man sich einer Vio Normalsilberlösung, so stellt man sich die Cyankalilösung durch Lösen von :>•! g 967oig'eni Cyankali in 500 cm^ Wasser her. Der Gehalt dieser Lösung an Cyankali, welcher nicht ganz das Äquivalent der Silberlösung ausmacht , wird dadurch bestimmt, daß man 10 cm'^ ^ j ^^-IsQvmvil^iXh^YXlmm^ in einem 50 oii" fassenden Meßkolben mit 2 Tropfen 50<'/oig Tropfen Salzsäure) und dampft auf dem Wasserbade bis zur Sirupdicke ein. Der Abdampfungsrückstand wird mit -lOcnf^ Wasser aufgenommen und unter Umrühren mit 80 cm ^ Ooo/oigem Alkohol versetzt. Nach 1- bis 2stündigem Stehen wird der entstandene Niederschlag mit der Saugpumpe abfiltriert. mit Alkohol gewaschen und mit Hilfe eines l'latinspatels und durch Abspritzen mit ein wenig heißem Wasser vom Filter zurück in die Schale gebracht. Der Niederschlag wird nun mit etwa 50 cm'^ Wasser angerührt, mit \b cni^ verdünnter Schwefelsäure (1:4) zersetzt und auf dem Wasser- bade erhitzt. In die heiße Flüssigkeit läßt man sodann anfangs in kleinen, später in größeren Mengen 5''/oige Permanganatlösung zufließen, bis die Flüssig- keit dunkelrot gefärbt erscheint, und die Rotfärbung auch I)ei weiterem, 3 — 5 Minuten langem Erhitzen auf dem Wasserbade und öfterem l^m rühren anhält. Das überschüssige Permanganat beseitigt man durch Zufügen von etwas Eisenvitriol und dampft die Flüssigkeit samt dem bei der Oxydation entstandenen Braunstein auf etwa 50 cm^ ein. Die so vorbereitete Lösung bringt man jetzt mit dem Braunstein in einen kleinen, etwa 100 cw?^ fassenden Schacherhdien Extraktionsapparat (Fig. 2) und zieht sie mit reinem, mit Wasser gewaschenem, alkohol- freiem Äther aus. (Um während der Extraktion ein Emporkriechen der Bernsteinsäure an den Gefäßwänden zu vermeiden, setzt man dem Äther in dem Extraktion skölbchen etwa o Tropfen Essigsäure zu.) Nach 14- bis löstündiger Extraktion destilliert man den Äther ab, löst den Extraktions- M Ji- Kiinz, Bestimmung der Bernsteinsäure im Wein, nebst Bemerkungen über die Bestimmung der Äpfelsäure im Wein. Zeitschr. f. d. Untersucbung d. Xahrungs- u. Genußmittel. Bd. 6. S. 721 (1903). Nachweis und Bestimmiuig der biologisch wichtigen Säuren. 27 rückstaiid in wenii^' heiMeiii Wasser, filtriert nach dem Ki'kalten dnreh ein kleines angefeuchtetes Filter in eine Platinscliale und dampft auf dem Wasserbade zur Trockne ein. Die so erhaltene Bernsteinsäure wird in Wasser gelöst und mit '/lo-Nor- malnatronlauge und Phenolphtalein genau titriert. Da wähi-end der Extraktion Spui'en von Schwefelsäure mit ül)ergehen, andrer- seits auch noch geringe Spuren von P^ssig- säure zwischen den Kristallen zurückge- halten werden, so ist es notwendig, die eigentliche Bestimmung der Bernstein- säure als Silhersalz vorzunehmen. Zu diesem Zweck versetzt man die austitrierte Bernsteinsäure mit 20 bis 20 cm^ '/ji,-Normalsilberlösung, bringt alles in einen Mei»kolben und füllt auf 100 cm- auf. Nach kräftigem Umschütteln wird abfiltriert und in 50 cm^ Filtrat, wie bei der C'hlorbestimmung nach Vol- hard, in salpetersaurer Lösung mit p]isen- alaun und i/io-Normalrhodanammouium- lösung das überschüssige Silber bestimmt. Aus der Differenz der angewandten Kubik- zentimeter i/io-^ormalsilberlösung und der zum Rücktitrieren verbrauchten Bho- danlösung ergibt sich die Menge der in 100 cm'-^ der ursprünglichen Flüssig- keit, z.B. Wein, enthaltenen Bernstein- säure. 1 cm^ ^ /\,r^ovmah\\\wic\(mmi>; ent- spricht 0-00Ö9 g Bernsteinsäure. Bei einem Kontrollversuch wurde in Gegenwart anderer Säuron folgendes Resultat erhalten. Es wurden angewandt: Bernstoinsäure Weinstein Weinsäure Apfolsäure 0-1329// 0-25 ,r/ 0-10. r/ 0-20// Erhalten wurden an Bernsteinsäure: a) Durcli Titration : 0-1318//; als Silbersalz 01284// Differenz —00045//. b) „ „ : 0-1316//; als Silbersalz 0-1287// ' Differenz —00042//. Bei Prüfung wurde der Gehalt des Silbersalzes an Silber theoretisch genau be- funden und auch der Schmelzpunkt der isolierten Bernsteinsäurc kontrolliert. Die Resultate der Titration liegen den theoretischen sehr nahe. Es scheint hier ein Fehlerausgleich stattgefunden zu liaben. Aber auch die Befunde als Silhersalz weichen nur um etwa 'i'b"!^ empfehlenswert! Fig. 2. Schnchrr/t^chcv Extraktionsapparat. Milchsäure 0-50 // von dem waliren Werte ab. Die Methode ist daher durchaus 28 H. Pringsheim. Wirkungsweise des Schacherhchen Extraktionsapparates. Die zu extrahierende Flüssigkeit kommt in den Kolben C, nnd zwar muß dieser bis zum Halse, nötigenfalls durch Wasserzusatz gefüllt werden. In den Kolben J, welcher in ein Wasserbad gestellt wird, kommt das Extraktionsmittel. Die Dampfe des letzteren gehen durch das Rohr B und den Zwischenraum zwischen dem Trichter B und dem Kolbenhals zum Kühler, werden dort kondensiert und fließen in den Trichter D hinein. So- l)ald die Flüssigkeitssäule im Trichterrohr eine gewisse Höhe erreicht hat, tritt das Extraktionsmittel unten in kleinen Kügelchen aus, durchströmt die wässerige Lösung, entzieht derselben die in ihm löslichen Stoffe und sammelt sich oben an. Sobald die Höhe des seitlich einmündenden Rohres B erreicht ist, fließt das Extraktionsmittel oben in dem JNIaße in das -Kölbchen A ab, als neuer Äther durch das Trichterrohr unten austritt. Die Extraktion kann (quantitativ ausgeführt werden, die Dauer derselben ist abhängig von dem (irade der Löslichkeit des zu extrahierenden Körpers. Um die Korke zu vermeiden, empfiehlt es sich ganz besonders, Appa- rate zu verwenden, bei denen das Kölbchen A an das Rohr B ange- schliffen ist. 1 ) Da bei einer lange dauernden Extraktion das Lösungsmittel mit Hilfe eines gewöhnlichen Kühlers nur schwer zu kondensieren ist, setzt man auf den Extraktionsapparat am besten einen metallenen oder gläsernen Soxhletac\\en Kugelkühler auf. Milchsäure. Eigenschaften. Unter den Oxypropionsäuren der Zusammensetzung Cg Hß O3 hat nur die a-Säure, oder ÄthvUdenmilchsäure CH3 — CH(()H) — — COOH physiologisches Interesse. Da diese Säure ein asymmetrisches Kohlen- stoffatom enthält, kann sie als inaktive, rechts- und linksdrehende Modi- fikation vorkommen. In der Tat finden sich alle drei Formen bei Inologi- schen Prozessen; die inaktive Gärungsmilchsäure entsteht bei der großen Zahl der Kohlenhydratzersetzungen. •■) Die rechtsdrehende Tara- oder Fleisch- milchsäure ist die eigentliche ^lilchsäure des Fleischextrakts; sie scheint auch die Milchsäure zahlreicher tierischer Organe, Transsudate und Exkrete zu sein. Die Linksmilchsäure wird von verschiedenen Bakterien aus Zucker gebildet und ist zuerst von Schardinger '^) bei Vergärung von Rohr- zucker durch den Bac. acidi laevolactici erhalten worden. In vollkommen reinem Zustande ist die Milchsäure fest, kristallinisch und schmilzt bei 18". Für gewöhnlich erhält man sie aber in amorphem *) Erhältlich beim Glasbläser Paul Haack , Wien , IX/g, Gareiligasse 4 in vcr- scbiedenen Größen. ^) Vgl. 0. Enmierling, Die Zersetzung stickstofffreier organischer Substanz durch Bakterien. Braunschweig 1902. S. 25. ^) Fr.Sch(ir(Ji)H/er, Über eine neue optisch-aktive Modifikation der Milchsäiu-e, durcli bakterielle Spaltung des Rohrzuckers erhalten. Monatsli. f. Chem. Bd. 11. S. 545 (1890). Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen Säuren. 29 Zustand in Form oinos farblosen oder schwach gelblichen, sauer reaoierenden Sirups, welcher in allen \'erh;iltnissen mit Wasser, Alkohol und Äther misch- bar ist. Die spezifische Drehuns^' der aktiven Säure ist nur = ;V5''. Die zum Nachweis verwandten Zinksalze drehen umgekehrt wie die entsprechen- den Säuren. Nachweis der Milchsäuren. Dem Nachweis der Milchsäuren hat ihre Isolierung vorauszugehen, die vermittelst ihrer Löslichkeit in Äther zu erreichen ist. Handelt es sich um Gärprodukte, so kann man nach dem Entfernen der flüchtigen Säuren durch die Wasserdampfdestillation die mit Schwefelsäure angesäuerte Lösung gleich mit Äther extrahiei-en. Der Nachweis der ^lilchsäure in Organen und Geweben geschieht jedoch erst nach Beseitigung der Eiweitistoffe und Fette. Nach vollständiger Extraktion mit Wasser entfernt man das Eiweiß durch Koagulation in der Siedehitze unter Zusatz einer kleinen Menge Schwefelsäure. Die Flüssig- keit wird darauf durch Ätzbarvt im Sieden genau neutralisiert und nach der Filtration zum Sirup eingedampft. Der Rückstand wird mit absolutem Alkohol gefällt und der Niederschlag mit Alkohol vollständig erschöpft. Aus den vereinigten alkoholischen Exti'akten wird der Alkohol vollständig ab- destilliert und der neutrale liückstand zur Entfernung des Fettes mit Äther geschüttelt. Dann nimmt man den Rückstand mit Wasser auf, setzt l'hosphorsäure zu und schüttelt wiederholt mit neuen Mengen Äther, welcher die Milchsäure aufnimmt. Aus den vereinigten Ätherextrakten wird dei" Äther abdestilliert, der Rückstand in Wasser gelöst und diese Lösung auf dem Wasserbade, um den etwa zurückgel^liebenen Äther und flüchtige Säuren zu entfernen, vorsichtig erwärmt. Aus der filtrierten Lösung wird dann durch Kochen mit Zinkkarbonat eine Lösung des Zinklaktates dar- gestellt, welche zu beginnender Kristallisation eingedampft und dann über Schwefelsäure stehen gelassen wird. Zum sicheren Nachweis ist eine Analyse des Salzes unbedingt notwendig. Die freie Säure kann man vorher auf ihr Drehungsvermögen prüfen. W^eiterhin entscheidet die Analyse, welche der Milchsäuren vorlag. Das in- aktive Zinklaktat entspricht der Zusammensetzung (CV H5 O. )., Zn -f 3 H, O und enthält '27-27VoZnO und 18-18% H^ 0. Die Zinksalze der aktiven Säuren sind nach der Formel (C3 H5 03)2Zn -|- 2H2O zusammengesetzt, enthalten also 29-OVo ZnO und 12-90/o H2 Ö. Das inaktive Zinklaktat löst sich bei 15° in 58 — 60 Teilen Wasser, das Zinksalz der Paramilchsäure braucht nur 17'5 Teile Wasser zur Lösung. Bestimmung der Milchsäure in Abwesenheit anderer nicht flüchtiger Säuren. 1) Dieses hier zu beschreibende Verfahren, welches auf der Extraktion der Milchsäure mit Äther beruht, kann nur in Abwesenheit anderei" nicht *) Buclmcr und Mciseithcimcr, Die chemischen Vorgänge bei der Hefegärung. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 37. S. 495 (1904). 30 H. Pringsheim. flüchtiger Säuren angewandt werden. Trotzdem die Methode kaum ein- facher ist, als die in Anwesenheit solcher Säuren zu verwendende, bietet sie den Vorteil, daß man die Milchsäure in Gestalt ihres Zinksalzes isoliert und dann durch dessen Analyse zu größerer Verläi'ilichkeit als in dem zu zweit zu beschreibenden ^>rfahren kommt. Auch kann man durch die Di'ehungsbestimmung der Zinksalze ermitteln, ob Rechts- oder Linksmilch- säure vorlag, wenn das Salz auf zwei Moleküle Wasser stimmende Werte ergab. Zur Bestimmung verfährt man wie folgt: Zuerst befreit man die zu untersuchende Flüssigkeit mit Hilfe der W^asserdampfdestillation von den flüchtigen Säuren und dem Alkohol, dann filtriert man zur Entfernung eventuell ausgeschiedener Eiweißkörper durch ein Falteufilter, wäscht mit heißem Wasser nach und engt das hellbraune Filtrat stark ein. Dei' hinterbleibende Sirup wird, mit verdünnter Schwefel- säure angesäuert, in einen Scheidetrichter gespült und sechs- bis achtmal mit Athei* ausgeschüttelt , so daß die letzten Auszüge keine Milchsäure mehr enthalten. Mit größerer Sicherheit kann man das vermittelst des vorher S. 28 beschriebenen Schacherhchen Extraktionsapparates erreichen. Die vereinigten Ätherauszüge, mit entwässertem Natriumsulfat oberflächlich getrocknet und durch ein Faltenfilter gegossen, hinterlassen beim Ab- destillieren einen bräunbchen Rückstand. Die durch Kochen mit Bleikarbonat hergestellte und filtrierte Lösung des Bleisalzes wird durch Schwefelwasser- stoff gefällt. Nach dem Verjagen des Schwefelwasserstoffes hinterbleibt eine klare, schwach gelblich, gefärbte Flüssigkeit, welche, siedend heiß mit Zinkkarbonat versetzt, vom Überschuß des letzteren abfiltriert und auf dem Wasserbade stark eingeengt wird. Die Kristallisation des Zinksalzes befördert man durch Zusatz von Alkohol, wobei jedoch große Vorsicht nötig ist, da sonst Zinklaktat amorph ausfäUt und außerdem andere Sub- stanzen mitgerissen werden. Nach beendeter Ausscheidung wird das Salz abgesaugt und mit schwach verdünntem Alkohol ausgewaschen. Die Mutter- lauge, nochmals in ähnlicher Weise behandelt, liefert nur in wenigen Fällen noch eine geringe Menge des Salzes, die mit der ersten Kristallisation vereinigt wird. Das so gewonnene und zu wägende Zinklaktat bildet ein weißes bis gelblicliweißes Pulver oder Nadeln. Durch Trocknen des luft- trockenen Salzes bei 100" bestimmt man den Wasser-, durch Veraschen im Rorzellantiegel den Zinkoxydgehalt. Bestimmung der Milchsäure in Anwesenheit anderer nicht flüchtiger Säuren 1) (Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, z. B. im W^ein). Die Trennung der Milchsäure von den genannten Säuren beruht auf der leichten Löslichkeit des Baryumlaktates in starkem Alkohol ( 70 bis 80 Volumprozente). Da aber beim Absättigen der zu untersuchenden Flüssig- ^) Möslingcr, Über die Säuren des Weines und den Säurerückgang. Zeitscbr. f. d. Untersuchung d. Nahrungs- n. Genußmittol. Bd. 4. S. 1120 (1904). Nachweis imd Bestinnming der biologisch wichtigen Säuren. 31 keit, z. 13. des Weines, mittelst l>arvtwasser nicht hlol) die I»anniiisMl/e. sondern bei Vorhandensein orjuanisch saurer Alkalien (Weinstein. Kaliuiii- nialat usw.j auch die neutralen Alkalisalze eben dieser Säuren entstehen, so muß man entweder vor der Trennun<2,' der Barytsalze die vollständiue Überführung der Säuren in die Barytsalze durch Umsetzung mit über- schüssigem Chlorbaryum erzwingen (I.) oder die Mineralsalze entfernen (IL), welchem Wege bei X'orhandensein sehr geringer Mengen von ^lilchsäure oder bei Gegenwart größerer Mengen von Zucker der \'orzug zu geben ist. I. Aus 50 oder 100 cm'^ der zu untersuchenden Flüssigkeit ( Wein) werden in bekannter Weise die flüchtigen Säuren mittelst Wasserdam])f abdestilliert, und die zurückbleibende Flüssigkeit in einer I'oi'zellanschale mit Barytwasser bis zur neutralen Reaktion gegen Lacknnis abgesättigt. Nach dem Hinzufügen von 5 — 10 cm^ lO^j^i^av Chlorbaryumlösung wird bis auf etwa 25 cin^ eingedampft und mit einigen Tröi)fchen Barytwasser aufs neue genaue Xeutrahsation hergestellt. Man fügt nun vorsichtig in geringen Giengen unter Umrühren reinsten Oö^/oigen Alkohol hinzu, bis die Flüssigkeit etwa 70 — 80 rnf^ beträgt, und führt den Inhalt der Por- zellanschale nunmehr unter Nachspülen mit Alkohol in einen 100 r;;^3.i{^oi_ ben über, füllt mit Alkohol auf und filtriert durch ein trockenes Falten- filter, wobei der Trichter bedeckt gehalten wird. 80 cm^ oder mehr des Filtrates werden unter Zusatz von etw^as Wasser in einer Platinschale ver- dampft, der Rückstand wird alsdann vorsichtig verkohlt und — ohne die Asche weiß zu brennen, was überflüssig ist — seine Alkalität mit 1/2-Normalsalzsäure in bekannter Weise bestimmt und in Kubikzentimeter Normalalkali ausgedrückt. 1 cin'^ Aschenalkalität entspricht O'ODO// Milchsäure. IL Nach dem Abtreiben der flüchtigen Säuren wird der Rückstand in einer Schale mit etwas Weinsäure versetzt, wozu meist 0*2 bzw. 0'4 g ausreichen, und bis zum dünnen Sirup (d. h. bis auf wenige Kubikzenti- meter) eingedampft. Man gießt den Rückstand in einen mit Glasstopfen versehenen, 50 cni^ fassenden graduierten Stehzylinder, spült mit wenig Wasser, bis das Volumen der wässerigen Flüssigkeit etwa 5 nn'^ beträgt, und darauf weiter mit kleinen Mengen von 95%igem Alkohol nach, immer unter Umschütteln, bis die Flüssigkeit ;]0 on'^ beträgt; alsdann fügt man zweimal je 10 crn^ Äther hinzu , indem mau jedesmal kräftig schüttelt. Das Gesamtvolumen beträgt nunmehr 50 an.^. Man schüttelt und läßt ab- sitzen , bis die Flüssigkeit völlig klar geworden ist, gießt in eine Porzellan- schale ab und spült mit Ätheralkohol nach. Unter Zusatz von Wasser wird die Flüssigkeit nunmehr zunächst vom Äther und Alkohol durch Eindampfen befreit, alsdann mit Barytwasser neutralisiert und — ohne Zusatz von Ghlorbaryum — weiter wie unter I. verfahren. Im idlgemeinen findet man bei der Methode nur *I0 95"/o dei' wirk- lich vorhandenen Milchsäure, woinr die Gründe im Original nachzulesen sind. Ein anderes, aber weit umständlicheres Verfahren M gibt genauere Werte. ') li. Kunz, Über Vorkoniiucn und Bostimmuug der Milchsäure im Weiue. Zeitschr. f. d. Untersuchung der Nahrungs- und Geuußmittel. Jg. 4. S. 673 (1Ü04). ;-]2 H. Priugsheim. Weinsäure. Die gewühiiliclie, in den Pflanzen vorkommende Weinsäure von der Zu- sammensetzung C'iHg Og ist die d-Weinsäure folgender ProjektionsformelV): COOK H . C . OH HO . C . H COOH. Sie bildet durchsichtige, monokline hemimorphe Prismen von stark und rein saurem Geschmack und ist in Wasser ungemein leicht, auch in .Ukohol leicht und in Äther fast unlöslich. Ihr Schmelzpunkt liegt bei 170'. Nachweis der Weinsäure. Fügt man zu einer Lösung von freier Weinsäure oder zu einem Al- kalisalz der Weinsäure Eisenchlorür oder schwefelsaures Eisenoxydul, dann ein oder zwei Tropfen Wasserstoffsuperoxyd und schlielilich einen Über- schuß von freiem Alkali, so tritt eine schön violette Färbung ein.-) Dies dient besonders zum Unterschiede von Zitronensäure. Die Peaktion ist ge- eignet zum Nachweis der Weinsäure, doch muß die zu prüfende Substanz frei von Schwermetallen und oxydierenden Substanzen sein. Beim Erwärmen von Weinsäure oder Tartraten mit 1 cm'^ einer Lösung von \ (j Resorzin in 100 ,r/ Schwefelsäure (von 66" B) auf 1'25<' entsteht eine violettrote Färbung, die noch Vm >h-(7 Weinsäure nachzuweisen gestattet.^) Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure und Benzoesäure geben die Re- aktion nicht. Gehemmt mrd sie durch Nitrate oder Nitrite. Zitronensäure. Die Zitronensäure findet sich in großer Verbreitung im Pflanzen- reich*), interessant ist ihre Bildung beim Wachstum verschiedener Pilze auf Zuckerlösungen. 5) Die Zitronensäure von der Zusammensetzung Cg Hg O7 und der Formel : CH^.COOH C (OH). COOH CHo . COOH ') Vgl. Czapek, Biochemie der Pflanzen. Bd. 2. S. 432. Jena 19051907. 2) Fenton, Chemical News. Vol. 34. p.llO (1882); Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 21. S. 123 (1881). *) Ed. Molller, Sur une reaction tres sensible de Tacide tartrique. Bulletin de la soc. chimique de Paris. Ille serie. T. 4. p. 728 (1890). *) Vgl. Czapek, 1. c Bd. 2. S. 436. 5) C. Wehmer in Lafar, 1. c. Bd. 4. S. 246. Nachweis und Bestimniuiifj der biologisch wichtigen Säuren. ;-}3 bildet grolic rhoinbische rrismen. Sie kristallisiort mit oiiioin Molekül Kri- stalhvasser und ist in Wasser sehr leicht, in Alkohol ziemlich leicht und in Äther sehr schwer löslich. Nachweis der Zitronensäure. l)('i der Oxydation von Zitronensäure mit Kaliumpermanf^anat bildet sich Acetondikarbonsäure. welche mit Mercurisulfat einen charakteristischen Niederschlag folgender Zusammensetzung gibt: CH, — CO — 0 V SO /^"'"^^^Ho- 9 CO )Hg h CH, — CO — 0 Da Essigsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure. Milchsäure etc. (dy- zerin, Gummi, Glukose, Saccharose, Laktose die licaktion nicht geben, und da sich mit ihrer Hilfe sehr geringe Mengen von Zitronensäure, im Wein z.B. O'l [/ per Liter nachweisen lassen, so ist diese Methode des Nach- wTises die empfehlenswerteste. Chloride, Bromide und Jodide müssen durch Silbernitrat oder Mercuroacetat entfernt werden. LHe Oxalsäure, welche selbständig einen Niederschlag mit ^lercurisalz gibt, wird am besten zu- erst in saurer Lösung mit Permanganat zerstört, i) 1) Nachweis von Zitronensäure oder deren Salzen in wässeriger Lö- sung: Li ein Reagenzglas gibt man 5 cm^ der zu prüfenden Lösung und 1 ciit^ des Quecksilberreagenz, welches durch Lösen von 50 ry rotem Queck- silberoxyd in einer warmen Mischung von 200 cm'^ konzentrierter Schwefel- säure und 1000 cm^ Wasser hergestellt wird. ^lan bringt zum Kochen und während man die Flamme entfernt, fügt man 5—6 Tropfen einer 2:1000 Permanganatlösung zu. Die Mischung entfärbt sich schnell, und im Falle der Anwesenheit von Zitronensäure, im freien oder gebundenen Zustande, bildet sich sogleich eine Trübung oder ein Niederschlag. Bei sehi* ver- dünnten Lösungen genügt ein Tropfen Permanganat; so kann man weniger als ^2 "^'7 Zitronensäure nachweisen. Bei größerer Verdünnung fügt man nur den zehnten Teil ihres Volumens an Quecksilberreageii/ zu und man bedient sich einer Permanganatlösung von 2 oder 3 ;/ pro Liter, wie der Vi n-Norm allösung. 2) In (legenwart größerer Mengen von Weinsäure fügt man zu 5 cm^ der kalten Lösung schnell \ rm^ der Permanganatlösung (2:100) und er- wärmt, bis die Mischung Iwäunliche Farbe annimmt und einige (iasblasen entweichen; jetzt nimmt man die Flamme fort und wartet, bis die Flüssig- keit ganz entfärbt ist, was bald eintritt. Dann fügt man 1 cm^ Quecksilber- reagenz hinzu und erhitzt i)is zum Kochen. Man erhält so eine weiße Trü- bung bei 0"5 oder weniger Prozent Zitronensäure. ') G. Denif/es, Sur do nouvelles classes de combiuaisons mercurico organiciues et sur leurs applications. Annales de ehimie et de physique. (VII.) T. 18. p. 382 (1899). A bderb ul den , ilaudbiub der biochemischen Arboitsmethoden. II. 3 34 H. Pringsheim. Auf die geschilderte Weise kann man die Zitronensäure im Wein und in der ]\Iilch nachweisen. Der Wein wird erst mit Bleisuperoxyd gekocht und nachher Permanganat zugegeben. Die Milch {10 cm^) wird zuerst mit ■ 2 cm^ einer Lösung von Natriummetaphosphat (5:100) gekocht und erst nach dem Filtrieren wie vorher Permanganat zugesetzt. In beiden Fällen wurde das Quecksilberreagenz gleich zuerst hinzugefügt. Äpfelsäure. Die Äpfelsäure findet sich in krvptogamen und phanerogamen Pflan- zen. ^) Ihrer Zusammensetzung C^HeOs entspricht die Formel COOK CH, CH(()H) COOK, die sie als Öxybernsteinsäure charakterisiert. Sie bildet glänzende, gewöhn- lich zu kugeligen Massen vereinigte, zerflieüliche Nadeln, die in Wasser und Alkohol leicht, in Äther wenig löslich sind. Sie schmilzt bei 100". Nachweis und Bestimmung der Äpfelsäure.-) Im Gegensatz zu Weinsäure, Bernsteinsäure und Essigsäure reduziert die Äpfelsäure in schwach alkalischer oder neutraler Lösung in der Siede- hitze das Palladiumchlorid. Auf Grund dieser Eigenschaft wurde eine Me- thode zur quantitativen Bestimmung der Äpfelsäure ausgearbeitet, die hier angegeben sei. Da wir keine geeignetere Methode zum Nachweis dieser Säure kennen, verwenden wir ihr A'erhalten gegen Palladiunichlorid auch hierzu. Das Reduktionsvermögen der Äpfelsäure gegenül)er Palladiumchlorid hat sich folgendermaßen herausgestellt: 1 f/ Äpfelsäure reduziert aus Palladiumchlorid 0"294r/ Palla- dium. Von den Weinbestandteilen wirken ebenfalls mehr oder weniger re- duzierend die flüchtigen Bestandteile, Glyzerin, Glykolsäure, Gerbstoff, ferner Farbstoff und Zucker. Folgende Methode hat sich auf Grund zahli'eicher Versuche für die (luantitative Bestimmung der Äpfelsäure im Weine l)ewährt: „100 rm» Wein werden im Wasserbade zur Beseitigung der flüch- tigen Bestandteile bis auf ein Dritteil eingedampft und hierauf mit basi- schem Bleiacetat bis zur schwach alkalischen Pieaktion versetzt. Der er- haltene Niederschlag, der die Äpfelsäure vollkommen einschließt, wird ab- filtriert, vier- bis fünfmal mit kaltem Wasser ausgewaschen und hierauf ') Vgl. Czajjck, 1. c. Bd. 2. S. 428. ^) A. Hilf/er und H. Ley , t)ber die quantitative Bestimmung der Äpfelsäure. Zeitschr. f. d. Unters, d. Nahrungs- u. Genußm. Bd. 2. S. 795 (1899). — Ä. HiJger, Zur quantitativen Bestimmung der Äpfelsäure. Il)id. Bd. 4. S. 49 (1901). Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen Säuren. 35 in wenig siedender verdünnter Essigsäure oder Salpetersäure gelöst. Diese Lösung wird in der Siedehitze mit Natriumkarbonat bis zur alkalisehen Reaktion versetzt und gleichzeitig während des Erhitzens etwa 10 Minuten ein Strom Kohlensäure eingeleitet. Nach Trennung des basischen Bleikar- bonates durch Filtration wird das Filtrat bis auf mindestens 100 cm^ kon- zentriert, wieder mit Salzsäure neutralisiert, hierauf in einem oOOf^js fassenden Erlenmeyerkolben mit 10 crn^ einer öo/pigen Palladiumchlorid- lösum»' vermischt und hierauf 10 Minuten im Sieden erhalten. Unter leb- hafter Kohlensäureentwicklung erfolgt die Reduktion des Palladiumchlorids. Hat die Kohlensäureentwicklung aufgehört, so wird mittels Salzsäure wie- der schwach sauer gemacht und das Erhitzen auf dem Wasserbade fort- gesetzt, bis sich das Palladium zusammenballt und zu Boden setzt. Das ausgeschiedene, nun sehr gut filtrierbare Metall wird durch ein AUihniiches Rohr filtriert, vollkommen ausgewaschen, getrocknet, im Kohlensäurestrom erhitzt und nach dem Erkalten zur Wägung gel)racht. Ich bemerke noch, dal) die Zerlegung der Bleifällung auch durch Schwefelwasserstoff erfolgen kann, wodurch jedoch eine Verzögerung eintritt, da das vollkommene \'er- dampfen der gewonnenen Lösung notwendig wird. Bei Rotweinen hat sich ferner auch die Entfärbung mittelst Tierkohle vor der Konzentration des Weines bewährt, ebenso möge darauf hinge- wiesen werden, daß auch die Bestimmung der flüchtigen Säuren mit der Äpfelsäurebestimmung verbunden werden kann, indem nach Beseitigung der flüchtigen Säuren durch Destillation mittelst eines Wasserdampfstromes der Destillationsrückstand für die Äpfelsäurebestimmung geeignet ist." Um vom Glyzerin zu trennen, welches sich ja im Wein auch findet und das Palladiumchlorid ebenfalls reduziert, werden die vorhandenen Säuren mit Bleiacetat gefällt und aus dem Niederschlag mit Schwefelwasserstoff oder Kohlensäure wieder frei gemacht. Bestimmung der W^einsäure, Zitronensäure und Äpfelsäure nebeneinander. Die Bestimmung und Trennung dieser Säuren ist noch wenig aus- gearbeitet. Die früher für die Bestimmung der Zitronensäure angewandten \'erfahren haben sich als falsch erwiesen.^) Am besten wird man noch nach folgenden iVngaben verfahren 2): Verfahren zur Trennung, Bestimmung und Identifizierung der Weinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure und Äpfelsiiure in Weinen, Fruchtsäften u.dgl. Der Gang des Verfahrens, das nach vielen Versuchen in sehr ver- schiedenen Richtungen zurzeit verwendet wird, ist der folgende: ') 0. V. Spinaler, Zitronensäurebestimmuug mittelst dov Kalkmethode. Chem.-Ztg. Bd. 27. S. 1263 (1903). -) Jörgensen, t)ber die Bestimmung einiger in den Pflanzen vorkommender orga- nischer Säuren. Zeitscbr. f. d. Unters, d. Nahrungs- u. Geuußm. Bd. 13. S. 241 (1907). 3* 36 H. Priugsheim. Die Lösimg wird neutralisiert, mit Bleiacetat und Alkohol versetzt, der ausgewaschene Niederschlag wird mit Schwefelwasserstoff zerlegt, das Filtrat vom Bleisulfid wird eingeengt, mit Kaliumhydroxyd neutralisiert und mit Alkohol gefällt, wodurch die Gerbsäure zum Teil und bei Gegen- wart größerer Giengen von Schwefelsäure und Phosphorsäure auch etwas von diesen Säuren gefällt wird. Aus dem weingeistigen Filtrat wird die Weinsäure mittelst Eisessigs als saures Kaliumtartrat gefällt, worauf die Bernsteinsäure aus dem entgeisteten , mit Salzsäure versetzten Filtrat mittelst Äthers ausgeschüttelt wird. Die Mengen dieser Säuren werden durch Titration ermittelt. Die rückständige wässerige Lösung wird neu- tralisiert und mit Baryumchlorid versetzt, wodurch die Schwefelsäure, Phos- phorsäure und etwas Gerbsäure gefällt werden. Aus diesem Filtrat schlägt sich beim Versetzen mit einer geringeren Menge Alkohol das Baryumzitrat nieder und die zurückbleibende Äpfeläure wird mittelst einer größeren Menge Alkohol gefällt. Eine Aveitergehende Trennung und Reinigung dieser Säuren ist jedoch oft erforderlich. Aus den in den Baryumsalzeu vor- handenen Baryummengen werden die Mengen dieser Säuren berechnet. Als Reagenzlösungen verwendet man eine 20^0 ige Bleiacetatlösung, eine lO^'/oige Bar\Timchloridlösung und eine 4Voige Schwefelsäure. Der Alkohol hat eine Stärke von 90 — 91 ^'olumprozent; überall kommen mög- lichst kleine Füter zur Verwendung. Von Weinen verwendet man 100 cm^. von den Frucht- und Obst- säften . wie Himbeer-, Holunderbeer-, Heidelbeer- und Kirschsaft, 25 cm^ und von den süßen Sirupen 50 cm^. Diese Lösung w^ii'd, wenn sie stark zuckerhaltig ist, verdünnt und mit Natronlauge nahezu neutralisiert, mit einem Überschuß von Bleiacetat gefällt — von der 20"/oi§'eu Bleiacetatlösung reichen in der Regel 10 bis 20 oii^ aus — und nach dem Umschütteln mit dem gleichen Volumen Al- kohol versetzt. Am nächsten Tage wird der Niederschlag durch ein Filter von passender Größe filtriert und nach dem Abtröpfeln bringt man den größten Teil des Niederschlages mittelst eines Glasspatels in die Fällungs- flasche zurück, wo er mit Wasser aufgeschüttelt und darauf mit dem gleichen ^'olumen Alkohol versetzt wird. Durch mehrfaches Dekantieren und Filtrieren wird der Niederschlag ausgewaschen, bis das Filtrat bei- nahe farblos ist und nur geringe Mengen von Blei und Zucker oder an- deren organischen Steifen enthält. Drei bis vier Auswaschungen sind für gewöhnlich hinreichend, und um ein Zusammenballen des Niederschlages möglichst zu verhindern, muß der Trichter mit einer Glasplatte bedeckt werden, besonders wenn etwa der Niederschlag auf dem Filter während der Nacht stehen bleibt. Nach beendigtem Auswaschen bringt man den Niederschlag mit Wasser in die Flasche zurück, erhitzt zum Kochen und leitet einen Schwefelwasserstoff ström bis zur Erkaltung hindurch, wobei die Flüssiukeit wiederholt geschüttelt wird. Zur Vervollständigung der Zer- Setzung der Bleisalze wird noch einmal zum Kochen erhitzt und in gleicher Weise mit Schwefelwasserstoff behandelt. Nach dieser Behandlung sind die Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen Säuren. 37 Säuren fast immer völlig in Freiheit gesetzt, worauf das Bleisulfid abfil- triert und mit Schwcfohvasserstoffwasser ausgewaschen wird. Die Lösung wird auf dem Wasserbade auf i\0 — 40 on'-^ eingeeugt, dann unter Ver- wendung von Lackmuspapier mit Kalilauge neutrahsiert oder schwach al- kalisch gemacht und weiter bis auf etwa 10 cm^ verdampft. AVünscht man die Menge der Säuren zu kennen, so wird diese mit Kahlauge titriert. Die Flüssigkeit bringt man, ohne zu filtrieren, in einen jVIeßzylinder, die Schale wird mit Wasser nachgespült, bis das Volumen 15 — 20 cia'^ beträgt, und nach dem Versetzen mit dem doppelten Volumen Alkohol und kräftigem Durchschütteln wird über Nacht beiseite gestellt. In der Kegel ist diese Flüssigkeitsmenge zur Lösung des KaUumtartrats und Kaliumzitrats hin- reichend, so daß man nur den Niederschlag nach dem Filtrieren mit kleinen Mengen eines Gemisches von 2 Teilen Alkohol und 1 Teil Wasser zu waschen braucht, wenn nicht, so laugt man den Rückstand mit heißem Wasser aus und fällt noch einmal mit dem doppelten Volumen Alkohol. 1. Bestimmung der Weinsäure. Das Filtrat samt der Waschflüssigkeit, im ganzen etwa 100 cm^, wird mit ;■> cni^ Eisessig versetzt und während 48stündigen Stehens dann und wann geschüttelt. Hierdurch scheidet sich die etwa vorhandene Wein- säure in I'orm von schwach gefärbten KristaUen des sauren Kaliumtar- trats aus. die nach dem Abfiltrieren mit kleinen Mengen der ol)engenannten Alkoholmischung bis zur neutralen lieaktion gewaschen werden. Das Filter samt den Kristallen wird in die Fällungsfiasche zurückgebracht und unter Verwendung von Phenolphtalein als Indikator heiß mit ^/lo-Nonnahiatronlauge titriert, von welcher jeder Kubikzentimeter 0"015 r/ Weinsäure entspricht. Zur Identifizierung der Weinsäure versetzt man die titrierte Flüssigkeit mit etwas Calciumchlorid und filtriert sogleich. Nach dem Stehen kristallisiert das Calciumtartrat aus, welches sich als solches durch sein charakteristisches Verhalten gegen Natron erkennen läßt. Es ist in Wasser unlöslich, in kalter Natronlauge löslich und wird aus der Lösung beim Er- hitzen als Gallerte abgeschieden, löst sich aber wieder beim Erkalten. 2. Bestimmung der Bernsteinsäure. Zur Bestimmung dieser Säure verwendet man besser die vorher an- gegebene genauere Methode. Um hier die Bernsteinsäure zu entfernen, ex- trahiert man mit Äther. ;i Bestimmung der Zitronensäure und der Äpfelsäure. Die von den Ätherausschüttelungen zurückbleibende saure wässerige Lösung wird mit Natronlauge neutralisiert oder schwach übersättigt. Meistens muß man hierbei Lackniuspapier als Indikator verwenden: nur in seltenereu Fällen ist die Lösung so wenig gefärbt, daß der Übergang mittelst Phe- nolphtaleins sichtbar ist. Die Lösung, die man im Meßzyhnder bis auf 38 H. Pringsheim. 40 cm 3 ergänzt, fällt man mit Baryumchloridlösung, wozu in der Regel 10 ci)/^ der 10"/oig'en Lösung ausreichen. Ist der Niederschlag nach dem Stehen groß und voluminös, so kann er Bar\aimzitrat enthalten, und in diesem Falle spült man das Ganze in einen größeren jNIeßkolben, versetzt mit mehr BarjTimchlorid , füllt bis zur Marke auf und arbeitet nur mit einem Teil des Filtrates (z. B. 72 cm^, siehe unten). Setzt sich dagegen der Niederschlag ziemlich dicht ab, so besteht er aus den Baryumsalzen der Schwefelsäure, Phosphorsäure und der färbenden Gerbsäuren. Man fil- triert die Lösung- klar in einen lUO crn^ fassenden Meßzylinder ab und spült das Filter mit Wasser aus, bis das Filtrat 72 cm ^ beträgt. Diese 72 cm^ werden mit Weingeist bis zu 100 c;;^^ versetzt, das Ganze gut durchschüttelt und beiseite gestellt. Der Alkoholgehalt der durch Versetzen von fünf Eaumteilen Wasser mit Alkohol bis zu sieben Raurateilen erhaltenen Flüssigkeit beträgt etwa 28 Volumprozent. Die Trennung der Zitronensäure von der Äpfelsäure gründet sich auf folgende Verhältnisse: 1. Das Baryumzitrat ist in 28 volumprozentigem Alkohol sehr wenig- löslich, jedoch ist es bei großen Flüssigkeitsmengen erforderhch, auf eine ge- ringe Löslichkeit Rücksicht zu nehmen. 2. Das Baryummalat ist in 28 volumprozentigen Alkohol weit lös- licher, jedoch sind 100 cm» der Flüssigkeit nicht immer zum Lösen des vor- handenen Baryummalates hinreichend. 3. Wenn der Niederschlag von Baryumzitrat groß ist, wird Baryum- malat leicht mitgefällt; es ist daher notwendig, den Niederschlag in Wasser zu lösen und ihn nochmals mit Alkohol zu fällen. 4. Das Baryummalat ist in einem neutralen Gemisch von 1 Teil Wasser und 2 Teilen Alkohol praktisch unlöslich, während eine W/^ige Baryumchloridlösung von dem doppelten Volumen Alkohol nicht ge- fällt wird. Das weitere Verfahren muß sich deshalb nach dem Mengenverhältnis dieser beiden Säuren richten ; es können die folgenden vier Fälle vor- liegen : 1. Beträchtliche Mengen der beiden Säuren. 2. Geringe Mengen der beiden Säuren. 3. Verhältnismäßig viel Zitronensäure und wenig oder keine Äpfel- säure. 4. Verhältnismäßig viel Äpfelsäure und wenig oder keine Zitronen- säure. Erster Fall. Wie oben angegeben ist, liegen 100 cm^ einer 28 Volum- prozente Alkohol enthaltenden neutralen Flüssigkeit mit Niederschlag vor. Dieser wird nach mindestens einstündigem Stehen abfiltriert. Nach dem Abtropfen bringt man den Trichter auf den Meßzylinder zurück und löst den Niederschlag durch Aufspritzen von Wasser nötigenfalls untex Lim- Nachweis und Bestimmung der biologisch wichtigen Säuren. 39 rühren mit einem kleinen Glasspatel auf, so da(j das Flüssigkeitsvolumen wieder 72 cm^ beträgt, die noch einmal mit 28 cni^ Alkohol gefällt werden. Die Filtrate werden jedes für sich bis auf etwa 5 cm^ verdampft, wenn nötig filtriert, in einen Meßzylinder gebracht und mit Wasser bis auf etwa 17 em^ gewaschen, wonach mit dem doppelten \'olumen Alkohol gefällt wird. Solange die Filtrate beträchtliche Mengen von Bar\ ummalat enthalten, hat man das Baryumzitrat in derselben Weise zu reinigen. Eine zweimalige Fällung des Baryumzitrates dürfte al)er wohl immer ausreichen. Zweiter Fall. Liegen geringe Mengen der beiden Säuren vor, so ist eine geringere Menge Baryumchlorid hinreichend, und die Trennung mittelst 28volumprozentigen Alkohols wird in einem geringeren Flüssig- keitsvolumen vorgenommen, z. B. sind 25 cm'^ der wässerigen Lösung mit 10 cm^ Alkohol zu fällen und eine Wiederlösung des Baryumzitrates wird überflüssig sein; man kann die Beinigung durch Auswaschen mit 2^ volum- prozentigem Alkohol bewerkstelligen; alsdann wird das iKiryummalathaltige Filtrat eingeengt und mit dem doppelten Volumen Alkohol gefäht. Dritter Fall. Bei verhältnismäliig geringen Mengen Äpfelsäure wird der Baryumzitratniederschlag noch zweimal in Wasser gelöst und gefällt, und die drei Filtrate, die somit -'lOO cm^ betragen, werden zugleich ver- dampft und z. B. auf 25 cm^ gebracht und alsdann mit 10 cm'^ Alkohol gefällt. Wenn die Lösung möghchst neutral ist, kann man die Löslichkeit des Baryumzitrates vernachlässigen und das im Ultrat vorhandene Baryum- malat ausfällen. Vierter Fall. Ist die Äpfelsäuremenge nicht zu groß, so l)esteht der erste Niederschlag, der somit gering ist, aus I^)aryumzitrat, und es genügt, ihn mit kleinen Mengen 28volumprozentigen Alkohols auszuwaschen. Bei größeren Mengen Äpfelsäure fällt ein Teil mit der Zitronensäure aus und es ist daher notwendig, die Fällung nochmals zu lösen und abermals, nötigenfalls auch noch ein drittes Mal, zu fällen. Hierdurch löst sich ein wenig des Baryumzitrates, und wäre der Zitronensäuregehalt so gering, daß alles Baryumzitrat in Lösung ginge, so ließe sich die Ziti-onensäure in dieser Weise nicht nachweisen. Mag man das eine oder das andere \'erfahren zur 'rreniiiing der Zitronensäure von der Äpfelsäure benutzt haben, in allen Fällen verfährt man bei der Mengenbestimmung der Säuren in folgender Weise: Liegen mehrere Niederschläge von den Baryumsalzen vor, und ist es ohne Interesse, die Menge jedes einzelnen zu kennen, so werden sie zu- sammen behandelt ; im anderen Falle muß man jeden für sich behandeln. Das ausgeschiedene Baryummalat wird nach dem Stehen über Nacht mit einem Gemische von einem Teil Wasser und zwei Teilen Alkohol gewaschen, wonach die Niederschläge in schwach salpeteräurehaltigem Wasser gelöst und kochend heil» mit einem kleinen Überschuß von verdünnter Schwefel- säure gefällt werden. Nach hinreichendem Stehen in der Wärme, bis das Baryumsulfat grobkörnig geworden ist, und darauffolgender Abkühlung wird der Niederschlag abfiltriert, geglüht und gewogen. 40 H. Pringsbeim. 1 g Baryiimsulfat entspriclit 0*548 g Zitronensäure (wasserfrei), 1 g ,j „ 0"574 g Äpfelsäure. Beim Arbeiten mit stark gefärbten Weinen oder Säften fallen die auf diese Weise erhaltenen Ergel)nisse zu hoch aus, weil die Niederschläge von Baryumzitrat und Baryummalat geringe Mengen der Baryumsalze der färbenden Gerbsäuren enthalten, w^as sich aus der Färbung der Filtrate vom Baryumsulfat ergibt. Es ist somit erforderlich, die vom Baryumsulfat — das man in diesem Falle nicht zu wägen braucht — erhaltenen Filtrate, die die freien Säuren enthalten, einer ferneren Beinigung zu unterwerfen, und diese kann man durch Neutralisieren mit Natronlauge und Fällen mit einem passenden Überschulj von Baryumchlorid bewerkstelligen, wo- nach die beinahe farblosen Filtrate, nötigenfalls nach dem Einengen, wie oben angegeben, mit Alkohol gefällt werden, und die Mengen der so gut wie ungefärbten Niederschläge nach dem Auswaschen als Baryumsulfat bestimmt werden. Ist diese Beinigung notwendig, so ist es zweckmäßig, die zur Fällung benutzte Schwefelsäuremenge zu kennen, damit man einen passenden Über- schuß an Baryumchlorid im Filtrat erhält; man verwendet deshall) eine ab- gemessene Menge einer 4*'/oigen Schwefelsäure, die eben zur Fällung des gleichen Volumens der lOVoigen Baryumchloridlösung ausreicht. Die Filtrate von dem zur Wägung kommenden Baryumsulfat können zur Identifizierung der Säuren dienen. Oxalsäure, Die Oxalsäure kommt in Pflanzen häufig als C'alciumoxalat in Kri- stallen vor M; sie wird von Bakterien-) und Schimmelpilzen gebildet s); auch im Harn findet sie sich als physiologischer Bestandteil, während sie in den Geweben nur in einzelnen FäUen gesucht wurde.*) Die Oxalsäure von der Zusammensetzung Ca Hg O4 und der Formel COOH COOK kristallisiert in monoklinen Säulen mit einem ^lolekül Kristallwasser; ein Teil kristaUisierter Säure löst sich bei 14"5" in 10'5 Teilen Wasser. Auch in .Vlkohol und Äther ist sie, wenn auch in geringerem Grade, löslich. Nachweis der Oxalsäure. Die Unlöslichkeit des Oxalsäuren Kalkes in Essigsäure, die Lösbchkeit dieses Salzes in verdünnten Mineralsäuren, die Ausscheidung von Gips- nadeln nach Auflösen des Calciumoxalates in Schwefelsäure und dessen ^) Vgl. zahlreiche Angaben bei Czapek, Biochemie der Pflanzen. Jena 1905/07. -) Vgl. Czapek, 1. c. Bd. 2. S. 422. ») Vgl. Czapek, 1. c. Bd. 4. S. 423. Besonders C. Wehmer in Lafar, 1. c. Bd. 4. S.243. ■•) Vgl. Hammarsten, Lehrbuch der physiologischen Chemie. S. 504. Xiichwois lind Bostiiiiiiiuiiir dor biologisch widitigeu Säuren. 41 Überguug in (.'alciiiinoxyd beim (ilülicii sind lür ( )xal.s;iui'e ciuiruktcri.sti.sch. Da aber auch andere organisclie Säuren (Ai)t'elsiiure, Zitronensäure, Wein- säure) diese Reaktionen geben, ist zum unbedingten Nachweis die Extrak- tion mit Äther vorzuziehen. Zum Nachweis der Oxalsäure setzt man dem Äther etwas ^Vlkohol zu, in dem die Oxalsäure leichter löslich ist und der l)esseres Absetzen ver- anlaßt. Der Harn wird nach dem Mn'dampfen auf kleines Volumen und Ansäuern mit Salzsäure direkt mit Äther extrahiert. Die Gewebe werden mit dem mehrfachen Volumen Wasser digeriert, dann direkt zum Sieden erhitzt, kohert, abgepreßt, nachgewaschen, eingedampft, eventuell noch einmal filtriert und der stark eingeengte Auszug nach dem Ansäuern mit Salzsäure mit Äther ausgeschüttelt. Dann verfährt man wie bei der Ik'- stimmung der Oxalsäure. Destimmung der Oxalsäure bei Pilzgärungen. Hier kann man, da es sich um geringe Mengen von Oxalsäure handelt und andere nicht flüchtige Säuren in bedeutendem Maße kaum gebildet werden, so verfahren, daß man die mit Salzsäure angesäuerte Lösung zuerst zur \'er- treibung eventueller flüchtiger Säuren auf dem Wasserbad eindampft, dann filtriert und das heiße Filtrat mit Ammoniak und Calciumchlorid versetzt. Der NiederscMag, welcher sich nach 24 Stunden absetzt, wird auf einem Filter gesammelt und von dem Filter mit Hilfe der Spritzflasche in 100 cin^ auf ()()" erwärmte verdünnte Schwefelsäure gespült und sofort mit \ To-^ormal- permanganat titriert. Die Entfärbung des Permanganates fängt für ge- wöhnlich erst nach ein paar [Minuten an, schreitet dann aber bis zum Verbrauche der Oxalsäure fort. 1 ctn^ Yio-^ormalpermanganat entsprechen 45'01 in(/ Oxalsäure. Die Genauigkeit der jMethode wird etw^as dadurch beeinträchtigt, daß auch andere Säuren, die durch Chlorcalcium in ammoniakalischer Lösung ausgefällt werden, Permanganat in der Wärme, wenn auch in weit gerin- gerem ^Laße als (Jxalsäure reduzieren. Immerhin ist diese Methode für die Bestimmung der Oxalsäure bei manchen biologischen Prozessen der nächst zu beschreibenden vorzuziehen. Bestimmung der Oxalsäure im Harn und in den Geweben.^) Der Harn oder ein, wie vorher angegeben, hergestellter Gewebeauszug wird eingedampft (500 cm^ Harn auf etwa Vs seines Volumens). Man säuert mit 20 cm^ Salzsäure vom spezifischen Gewicht 1-12 an und schüttelt dreimal mit 200 cni^ eines Gemisches von 0 bis 10 Volumen Äther und 1 Volumen Alkohol (mit Voiteil kann man sich hierzu auch des vorher Seite 2S be- schriebenen Ätherextraktionsapparates bedienen). Die Ätherauszüge werden sorgfältig abgetrennt, dann noch durch ein nicht angefeuchtetes Filter filtriert und abdestiUiert. Die zurückbleibende, noch etwas Äther entlial- *) E. Salkoiciki, Über die Bcstimimiuir der Oxalsiiiire und das Vorkoinmen von Oxalsäure im Harn. Zeitsehr.f.physiol.Chem. Bd. 29. 8.437(1904). — Vgl. auch //»///; 3/ac Lean: Über die quantitative Bestimmung der Oxalsäure im Harn. Ebenda. Bd.60. 8.20(1 909). 42 H. Priiigslieim. Nachweis u. Bestimmung- d. biologisch wichtigen Säuren. tende Flüssigkeit wird in eine hocliwandige Schale gegossen und unter Zusatz von etwa 10 bis 15 cm^ Wasser auf dem Wasserbade eingeengt, die entstehende milchige Flüssigkeit weiter eingedampft, nötigenfalls unter Wasserzusatz, bis sie sich klärt und sich harzige Massen ausscheiden. Man läßt nun erkalten, wobei völlige Klärung der Flüssigkeit eintritt — das Volumen der Flüssigkeit sei etwa 20 cni^, eventueU ist etwas Wasser hinzu- zusetzen — , filtriert durch ein kleines Filterchen und wäscht ein- bis zwei- mal mit möglichst wenig Wasser nach. Das Filtrat wird mit Ammoniak leicht alkahsch gemacht, 1 bis 2 e;/^=' einer lO^/oigen Calciumchloridlösung, dann Essigsäure bis zur deutlich sauren Reaktion zugesetzt. Die Reaktion soll sauer, aber nicht zu stark sauer sein. Einen Anhaltspunkt gewährt die Beschaffenheit der Flüssigkeit nach dem Essigsäurezusatz. Da sie stets etwas rhosphorsäure enthält, so entsteht beim Zusatz von Calciumchlorid eine flockige Ausscheidung von Calciumphosphat ; man muli soviel Essig- säure hinzusetzen, daß diese sich löst. Nach mindestens 24 Stunden wird der oxalsaure Kalk in der gewöhn- lichen Weise auf einem aschefi'eien Filter gesammelt, ausgewaschen, ge- trocknet, geglüht und der zurückljleibende Ätzkalk gewogen (auch hier kann man, wie vorher angegeben, mit Termanganat titrieren). Betreffend einige bei der Ausführung der Methode auftretender Komplikationen vergleiche das Original. Kohlehydrate. A. Darstellung- und Gewinnung der luiuptsäcliliclisten Zuckerarten des Tier- und Pflanzenreiclis. Von B. ToUens, Göttingen. Vorbemerkung, In dieser Übersicht werden die Darstelluncrsmethoden und die i[ u M li t a t i V e n nnd (| u a n t i t a t i v e n B e s t i m in u n g s m e t li o d e n der meistens in Betracht kommenden Zuckerarteu möglichst in Ilücksicht auf die vor- kommenden praktischen Bedürfnisse des Pflanzen- und Tierstoffe bearbeiten- den Chemikers, Physiologen und Mediziners gebracht. Seltenere oder nur durch Synthese in wissenschaftlichen chemischen Laboratorien hervorzubringende Zuckerarten von einstweilen nur theoretischem Interesse, und so l)esonders auch die hochwichtigen synthetischen Methoden E. Fischers werden hier nicht betrachtet, und auch die übrigen Methoden sind mehr als Beispiele aus dem überreichlichen ^lateriale anzusehen, mit deren Bemitzung auch die nicht in diese Übersicht aufgenommenen Zuckerarten in analoger Weise dargestellt und untersucht werden können. Die zitierten Abhandlungen sind von mir aus den vielen vorhandenen nach dem Gesichtspunkte ausgewählt, dab möglichst diejenigen gebracht werden, welche — sei es als die ersten bahnbrechenden, sei es als die zu praktischen Zwecken brauchbarsten — mir als die wichtigsten erscheinen. ^^ollständigkeit ist also weder in Hinsicht auf das vorhandene Material noch in Hinsicht der Zitate angestrebt worden, und ich verweise in dieser Beziehung auf die vorhandenen Lehr- und Handbücher, z. B. von E. r. Lipjj- mann'^), B. ToUens-), L. Maquenne^), Frühlinr/*), J. König ^) usw.. fei'ner ^) E. V. Lippmaiu), ChQm\(^ dar Zwckf^rurton. 3. Aufl. Brauuscliweig. Vicwog. 1%4. *) B. TolUns, Kurzes Handbuch der Kohlenhydrate. I. und II. Breslau. Trcwcndt. 1895. 189S. S. a. Ladenburr/^ Handwörterbuch der Chemie. Bd. G und 13. *) L. Maquennc, Les Sucres. Paris. Carre it Naud. 1900. *) Anleitung zur Untersuchung der für die Zuckerindustrie in Betraclit kommenden Rohmaterialien, Produkte, Nebenprodukte und Hilfssubstanzen. 6. Aufl. Von Prof Dr. I{. Friih/iiif/. Braunschweig 1903. ^) ■/. König, Untersuchung landwirtschaftlich und gewerblich wichtiger Stoffe. 3. Aufl. Berlin. Parey. 1906. 44 B. Tolleiis. in Hinsicht auf das theoretische auch auf C. Xeuberg im Handbuch der Biochemie. Jena 1908. S. 151). I. Kristallisation ohne vorherige Reinigung der aus den Ausgangs- materialien gewonnenen Lösungen. Um Zuclcerarten, welche in den pflanzlichen oder tierischen Materialien in größerer Menge vorhanden sind, in reinem und, wenn möglich, kristalli- siertem Zustande zu gewinnen, muß man zuerst die Säfte oder Lösungen, welche die Zuckerarten enthalten, aus den vegetal)ilischen oder animalischen Stoffen isolieren. Es werden hierzu die Stoffe zerkleinert, sei es mittelst Fig. 3. des Messers, eines Reibeisens oder der Fleischhackmaschine, der Häcksel- schneidemaschine usw., und dann gepreßt. Als Pressen kommen entweder für geringen Druck Fruchtpressen des Haushalts oder für stärkeren Druck hydraulische Pressen oder Schraubenpressen in Anwendung, z. B. die obige (Fig. 3), welche besonders in Zuckerlaboratorien und -fabriken gebraucht wird (s. Frühling, Anleitung, S. 217). Zuerst drückt man mit der Schraubenspindel Ä den Preßstempel nach unten und nachher bewegt man mittelst der Schrauben- spindel B den Stempel E der hydraulischen Presse nach oben , wobei das Manometer den ausgeübten Druck (i)is ;iOO Atmosphären) anzeigt. Ich arbeite seit langer Zeit mit einer von Samain & Co. in Blois herrührenden, öOOO Ä-^ Druck gebenden Kniehebel-Schrauben-Presse, welche mir von C. Gerhard in Bonn geliefert wurde. Darstell, n. Gewiniiuiii,^ d. hauptsächl. Znckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 45 Bei kleiiicrcH Mciiuon boimtzt iiiiiu 'rüclier, in welche man den Drei einscliliiiit, und welche man als l'aket unter die Presse hrinjit, hei ^^i'öl'ieren Mengen ISeutel aus starkem Leinen, und ich wende zu diesem Zweck I>eutel ohne Naht an. wie sie von den IJankiers zur Versendung von (leklmünzen be- nutzt und von Wenzel tV: lloos in Lauterbach (Oberhessen) fabriziert weiib-ii. Sind, wie es häufig bei Pflanzen- und Tierstoffen der Fall ist, die zu pressenden Substanzen dickflüssig oder schleimig, so muß man sehr lang- sam und vorsichtig pressen, weil sonst alle Tücher oder P>eutel zerreißen, und man kommt in diesen Fällen meistens am besten mit einer Gewichts- presse zum Ziel. Diese konstruiert man auf die Weise, daß man unter einen schweren Schrank oder in eine Mauernische einen sehr starken Holzstock oder einen dünnen P)alken mit einem Ende steckt und nahe diesem Ende unter den P)alken ein etwas schräg liegendes, mit erhobenen Bändern und AliJaufschnauze versehenes Brett bringt. Auf dieses P>rett nnd unter den horizontal liegenden, frei schwebenden Balken und ein unter den Balken gelegtes Brettchen legt man die zu pressende Substanz, welche durch das Gewicht des schwebenden Balkens bald Flüssigkeit abgibt. Um stärkeren Druck zu erhalten, beschwert man das äußere fi'ei schwebende Ende des Balkens, indem man einen Eimer daran hängt und in diesen all- mählich Gewichte bringt. Durch diesen regelmäßigen, allmählich gestei- gerten Druck gelingt es meistens, auch die schwierigsten Stoffe ohne Bruch des Preßbeutels auszupressen. Wenn die Pflanzen- oder Tiersubstanzen nicht wasseri'eich genug sind oder wenn es sich um trockene Substanzen handelt, mulj man sie natürhch mit Wasser vermischen oder kochen, oder man wendet .\lkohol oder andere Flüssigkeiten an. Das Erhitzen mit Alkohol muß in einem Ballon am Rückflubkühler und im Wasserbade geschehen, und als Bück- flußkühler genügt häufig ein in den Kork des Ballons eingefügtes 1 ni langes und 6 bis 7 mm weites Bohr. Die durch Pressen erhaltenen, wenn nötig filtri(n-ten Lösungen dampft man dann bis zu einer gewissen Konsistenz, und zwar meistens zum Sirup ab. Wenn wenig oder keine anderen Substanzen als Wasser vorhanden sind, tritt die KristaUisation, besonders nach dem Impfen, d. h. dem Einbringen einer Spur der kristallisierten Substanz, mehr oder weniger schnell ein. Wenn aber andere Substanzen, wie sie in pflanzlichen oder tierischen Substanzen nie fehlen, in größerer Menge vorhanden sind, wird die Kristalli- sation oder die Abscheidung in anderer Form verzögert oder ganz verhindert, und dann muß eine Entfernung dieser Substanzen vorhergehen (s. später). Beispiele der direkten Kristallisation von Zuckerarten siml die KristaUisation von (ilukose( Traubenzucker) aus Honig oder aus abgedampftem diabetischen Harn, Traubensaft etc. sowie das ..Auszuckern" der Pflaumen, Datteln, Rosinen etc., welche (iemenge von (ilukose und Fruktose enthalten: ferner gehört hierher teilweise das KristaHisieren von Piohrzucker aus wenig gereinigtem Ahornsaft. 46 B. Tollens. Aus den meisten rohen Pflanzensäften oder tierischen Flüssigkeiten erhält man jedoch auf diese direkte Weise nur wenig oder gar nichts der gewünschten Zuckerarten, weil die Beimengungen das Kristallisieren der Zuckerarten hindern, und so scheiden z.B. direkt Zuckerrohrsäfte wenig und Ptübensäfte fast gar keinen Zucker ab, weil zu viel Beimengungen in diesen Pflanzensäften vorhanden sind. II. Kristallisation nach vorheriger Reinigung der Lösungen. 1. Allgemeines. Man erhält bessere Ausbeuten, wenn man die Säfte vor dem Ein- dunsten reinigt, und dies geschieht, je nach der Natur der Beimengungen, auf verschiedene Weise. Diese Reinigung ist zuweilen leicht zu bewirken, zuweilen jedoch schwer, und eine etwas ausführlichere Beschreibung der meistens ange- wandten Methoden möchte deshalb von Nutzen sein, und dies um so mehr, da dieselben Methoden auch zur Reinigung der durch hydrolytische Zer- setzung anderer Kohlenhydrate, Glykoside etc. gewonnenen Lösungen in Gebrauch sind. Aufkochen und Filtrieren von Pflanzensäften sind zuweilen vorteil- haft, weil hierbei Eiweiß etc. gefällt und entfernt wird. Besser geschieht diese Entfernung, wenn beim Aufkochen Zusätze gegeben werden. So bewirkt man die Reinigung der Zuckerrüben- und Zuckerrohrsäfte durch Aufkochen mit Kalk unter Einleiten von Kohlensäure und schwe- feliger Säure (Kohlendioxyd und Schwefeldioxyd). Hierdurch werden außer den Eiweißstoffen auch organische Säuren und anderes gefällt, und nachher werden die Niederschläge durch Filtration entfernt. Wenn ferner aus abgerahmter Milch der Milchzucker gewonnen werden soll, entfernt man den Käsestoff durch Lab und das iVlbumin durch Aufkochen, worauf eine weitere Reinigung mit Aluminiumsalz folgenkann. Zuweilen ist einfaches Klären der Lösungen genügend, oder es ist dies auch bei der Anwendung anderer Reinigungsmethoden erforderhch. '» 2. Klären trüber Lösungen. Um suspendierte sehr feine Teilcheu, wie Tonpartikelchen, Bakterien- trübungon und derartiges, zu beseitigen, genügt häufig das Passieren durch Papier nicht. Zuweilen gelingt es dann, durch Saugen durch Piikalhche Filter aus gebranntem Ton klare Flüssigkeiten zu erhalten. Am besten ist die Berührung der sehr feinen kolloidalen Teilchen mit gröberen, wohl auch mit kolloidalen, Fällung bewirkenden Teilen, welche die ersteren adsorlneren, auf sich konzentrieren und sie am Passieren der Filter hindern. So ist sehr gebräuchlich das Schütteln trüber Flüssig- keiten mit Aluminiumhydroxyd, welches man aus Ammoniakalaun mit Ammoniak fällt, sehr gut mit Wasser wäscht, und ohne es zu trocknen. Darstell, u. Gewinnung d. haiiptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 47 unter Wasser vorrätiii' hält; schon ein geringer Zusatz bewirkt, daß man schöne klare Filtrate erhält. Auch die Reinigung durch Kohle oder Metall salze (s. unten) wirkt auf ähnliche Weise. Klärung, besonders von etwas schleimigen Pflanzensäften, Honigauf- lösung etc. kann man durch Schütteln dieser Flüssigkeiten mit durch Kochen in Wasser zerfasertem Filtrier papier oder der im großen zur Klärung von Zuckersäften, Bier usw. empfohlenen Holzzellulose erreichen, und ebenfalls mit Kieselgur. Die Filtrate der mit diesen Stoffen geschüttelten Flüssigkeiten sind meistens klar. Ähnliches erreicht man seit langem, wenn man die trüben Flüssigkeiten, Z.B.Wein, mit etwas weißem Ton (Bolus) schüttelt und dann einige Tage absitzen läßt, wobei die trübenden Teile sich mit dem Ton zu Boden setzen. Nach Boyia und Michaelis^) kann man z.B. aus 100 cm^ mit Wasser stark verdünnten Blutserums durch Zusatz von 20 — 25^ Kaolinpulver das Eiweiß mit dem Kaolinpulver niederschlagen. Wenn die Gegenwart von Kalk nicht schadet, kann man durch Zusatz von wenig Kalkmilch rasches Absitzen des Tones bewirken. Wie der in kolloidaler Suspension befindhche Ton wirkt nach Michaelis und Rona^) auch kolloidal gefällter Mastix, indem er Eiweiß niederreißt und die Flüssigkeit klärt. Man setzt z. B. zu mit dem Stachen Volum absoluten Alkohols vermischtem Blut eine oOVoige Lösung von Mastix in absolutem Alkohol, darauf Wasser, bis der Alkoholgehalt der Flüssigkeit auf oOYo gesunken ist, ferner wenig Essigsäure und etwas Magnesium- sulfatlösung. Nach einiger Zeit filtriert man. 3. Reinigung durch Alkohol. Manche organische Stoffe und besonders die nicht oder schwer kri- stalUsierenden Kolloidstoffe, wie Eiweiß, Gummistoffe und manche andere, sind in Alkohol schwerer löslich als die Zuckerarten, und folg- lich werden die Säfte — sei es im ursprünglichen, sei es im eingedickten Zustande — mit starkem Alkohol so lange versetzt, wie noch eine er- hebhche Abscheidung entsteht, worauf man die Flüssigkeit so lange sich selbst überliißt, bis sie möglichst klar geworden ist. Man dekantiert dann die Flüssigkeit von festem oder flüssigem Bodensatz, filtriert, wenn nötig, und destilliert den Alkohol ab. Den so erhaltenen reineren Sirup stellt man, eventuell nach dem Impfen (s. S. 54) zum Kristallisieren beiseite. Sind nach der Behandlung mit Alkohol, Beseitigung des Nieder- schlages und Eindunstung die Sirupe noch dunkel und unrein, so wieder- ') P. Bona und L. Michaelis, Weitere Beiträge zur Mctliddik der Enteiweißung. Bloch. Zeitschr. Bd. 5. S. 367 (1907). ") L.Michaelis und P.Rona, Eine Methode zur Entfernung von Kolloiden aus ihren Lösungen, insbesondere zur Enteiweißung von Blutserum. Bioch. Zeltschr. Bd. 2. S. 219 (1907). 48 B. Tollens. holt man die Behandlung- mit Alkohol, indem man den Sirup ent- weder in der Kälte mit seinem doppelten oder mehrfachen Volum Alkohol schüttelt oder ihn am Rückflul)kühler im Wasserbade unter Schütteln er- wärmt, dann erkalten läßt, nach dem Klarwerden von meistens am (xlase festsitzendem Gummi abgießt und wieder verdunstet. Mit Vorteil setzt man der alkoholischen Flüssigkeit kleine Mengen (bis zu 1/3 oder 1/, der Flüssigkeit) Äther zu, welcher die gummiartigen Beimengungen viel leichter als der Alkohol fällt, aber, falls er in zu großer Menge zugesetzt wird, leicht großen Verlust an Zucker veranlassen kann, Figr. i. weil er aus alkoholischer Lösung manche Zuckerarten ziemlich vollstän- dig fällt. Falls die abgegossenen alkoholisch-ätherischen Flüssigkeiten noch zu unrein sind, erwärmt man sie nach dem Eindunsten von neuem mit Alko- hol, setzt nach dem Erkalten Äther hinzu, schüttelt, gießt später vom ge- fällten Gummi ab, verdunstet usw^ Man kann die ausgefäUten, dunklen, amorphen ]\Iassen mit sehr wenig Wasser durch Erhitzen im Wasserbade wieder verflüssigen, dann mit Al- kohol wieder fällen und so eine neue alkoholische Lösung, welche den bei der ersten Fällung etwa niedergeschlagenen Zucker enthält, gewinnen, doch Darstell, u. Gewinnung d. hauptsäch). Zuckerarten d. Tier- ii. Pflanzenreichs. 49 ist oft die Quantität Zucker, welche man auf diese Weise gewinnt, gering, und es sind solche Operationen nicht immer vorteilhaft. Den alkoliolischen Flüssigkeiten setzt man, um etwa vorhandene oder auftretende Spuren starker Säuren unschädlich zu machen, etwas gefälltes Caiciumkarbonat zu. Das Abdestillieren der alkoholischen Lösungen kann man aus einer großen Retorte im Wasserbade bewirken; sehr viel schneller und wegen geringerer Zersetzung vorteilhafter benutzt man jedoch hierzu einen Vakuum apparat. ¥'d\h man große Quantitäten Flüssigkeit zu bewältigen hat, benutzt man A'akuumapparate aus Kupfer, wie sie die Handlungen chemischer oder pharmazeutischer Apparate bieten; bei kleineren Quantitäten benutzt man mit ^'orteil den Apparat , welchen ich nach dem Vorbilde Soxhlets i) mir konstruiert habe -) (s. Fig. 4 auf voriger Seite). Ein gegen 5/ fassender starker Rundkolben *) wird in schräger Stel- lung auf einem Wasserbade erhitzt. Durch den gut schließenden Kautschuk- stopfen des Kolbens passieren 2 Rohre; ein engeres, zu einer Spitze aus- gezogenes, welches wenigstens zur Mitte des Kolbens reicht, und ein weiteres, kurzes, aus welchem die Dämpfe in einen sehr wirksamen Kühler geführt werden. Das enge Rohr ist oberhalb des Stopfens mit einem Stückchen Kaut- schukrohr und einem Schraubenciuetschhahn verschlossen. Der Kühler, in welchen die Dämpfe eintreten, besteht aus einem 4 m langen, zur Spirale gei)ogenen Kupferrohre, welches von einem kupfernen Mantel umgeben ist, durch welchen kaltes Wasser strömt. Dieser Kühler ist im Kautschukstopfen des mittleren Tubus einer dreihalsigen Flasche befestigt, welche den kondensierten Alkohol oder das Wasser aufnimmt; der 2. Tul)us enthält das zur Sicherheitsflasche der Strahlpumjie führende Rohr, und der B.Tubus, in welchem ein während der Destillation ver- schlossenes, nachher zu verlängerndes Heberrohr befestigt ist, dient zur Entleerung der Flasche. Da alkoholische Flüssigkeiten beim Sieden im Vakuum meistens Siede- vorzug und darauf sehr heftiges Stoßen und Aufschäumen zt'igen. bringt man mit großem Vorteil im Destillationskolben eine sehr gelinde Wasserstoff(iuelle an, indem man etwas um ein Stück Zink gewickeltes und am Zink mit einem Faden befestigtes Magnesium band an einem zwischen Kolbenhals und Kautschukstöpsel eingeklemmten Faden so ein- hängt, daß es am Boden des Kolbens liegt. Auf diese Weise findet die ^) Soxhief, Yakuumverdampfapparat für Laboratoriums;z\vecke. Cliem.-Zt!,'. Bd. 18. Jg. 1894. S. 721. -) Widtsoc und B. Tollcns, Über Arabinose, Xylose und Fukose aus Traganth. Ber. d. Doutsclieu clicm. Gosellsch. Jg. 33. S. 33. 135. Aum. 1 (lUÜO). =) Die Kundkolben, welche ich benutze, werden mir von Herrn Oppennann in Hohenbüchen bei Delligsen geliefert. A bd erb ;i 1 (Ion , Hiindbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. « 50 B. Tollens. Destillation völlig regelmäßig statt, und der Alkohol fließt, sobald das Wasserbad in gutem Sieden ist. im Strahl aus dem Kühler in die WulfsdiQ Flasche. Wenn gegen Ende der DestiUation die Flüssigkeit fast nur wässeriger Natur ist, fließt oder tropft das Kondensat langsamer, und es tritt häufig starkes Aufschäumen ein, zu dessen Mäßigung man durch gehndes Öffnen des auf dem engen Rohre befindhchen Schraubenquetschhahnes etwas Luft eintreten läßt. Wenn der bei der Destillation gebliel)ene Sirup rein genug ist, gießt man ihn in eine Schale, bedarf er noch der Reinigung, so behandelt man ihn im Kolben selbst mit Alkohol und eventuell Äther. 4. Reinigung durch Zusätze, besonders von metallischer Art. Ein sehr gebräuchliches Mittel der Reinigung ist die Anwendung von Bleisalzen, und hier benutzt man zuweilen das neutrale Bleiacetat (Blei- zucker), häufiger jedoch und mit ^'orliebe das basisch-essigsaure Blei, d. h. den sog. Bleiessig der Apotheken. Der Bleiessig gibt mit Eiweißstoffen, Farbstoffen, organi- schen Säuren, speziell mit Gerbstoffen und mit mancherlei anderen Substanzen dicke, flockige, mehr oder weniger gefärbte Niederschläge, und die Filtrate sind meistens heller oder wasserklar. Diese stets ziemlich viel Blei enthaltenden Filtrate werden mit Schwefel- säure (unter Vermeidung eines Überschusses) oder mit Schwefelwasser- stoff behandelt, worauf man das Bleisulfat oder das Schwefelblei abfiltriert. Die so erhaltene Flüssigkeit, welche besonders, falls man das Blei als Schwefelblei entfernt hat, hell und klar ist, wird mit wenig Calciumkar- bonat versetzt, um Spuren starker Säuren unschädlich zu machen, und dann eingedampft, wol)ei sie Essigsäure verliert und worauf sie kristaUi- siert, falls ihr Gehalt an Zucker nicht zu gering ist. Stärker als Bleiessig allein, wirkt ein Gemisch desselben mit Ammoniak oder aber das unter anderem von E. Fischer'^) benutzte sogenannte zwei- basische Bleiacetat (wohl C^ Ho O2 . Pb OH -f- Hg 0) oder noch stärker basische Bleiacetate, welche man direkt darstellt oder deren Bildung in der Flüssig- keit man durch gleichzeitigen Zusatz von Baryt, Ammoniak oder anderen Basen veranlassen kann. Man muß jedoch bedenken , daß durch die basischen Bleisalze nicht nur färl)ende und die Kristallisation der Zucker hindernde Stoffe, sondern auch mehr oder weniger der Zuckerarten gefällt werden können. So wird z.B. nach Bei SS ^) und nach E. Fischer 3) die Mannose und nach Rujf^) 1) E. Fischer und Oscar Pilot ij , Über eine neue Pentonsäure und die zweite in- aktive TrioxyglutarsÄure. Ber. d. Deutschen ehem. Gesellscli. Jg. 24. S. 4220 (1891). ^) Reiss, Landwirtschaftliche Jahrhüclier v. Nathusius und Ihiel. Jg. 1889. S. 711. ^) E. Fischer und Hirsclibergcr , Über Mannose III. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 22. S. 115.5 (1889). ^) Otto Buff, d- und r-Arabinose. Ber. d. Deutschen ehem. Gesellscli. Jg. 32. S. 554 (1899). Darstell, u. Gewinnung d. liauptsächl. Zuckerarten d. Tier- u, Pflanzenreichs. 51 die d-Arabinose leicht gefällt; heim Versetzen von mit Bleiessig- gereinigtem Harn mit Bleiessig und Ammoniak wird nicht nur der Inosit, sondern auch ein Teil des Zuckers gefüllt, zur Reinigung der Ribose ist die Fällung durch das zweibasische Acetat mit Baryt angewandt, und l)eim Versetzen von Rüben saften mit Bleiessig darf man, besonders bei Gegenwart von Alkohol, nicht zu viel Bleiessig anwenden, weil sonst ein Teil des Zuckers in den Niederschlag geht i) oder wenigstens die Polarisation zu niedrig ausfällt. Statt der Bleisalze mit oder ohne Zusatz von Ammoniak oder anderen basischen Substanzen kann man in manchen Fällen Schütteln mit (feucht aufbewahrtem) gefälltem Beihydroxyd anwenden. Man kann diese Methoden kombinieren, indem man z. B. den Pflanzen- saft oder den Harn usw. erst mit Bleizucker und dann mit Bleiessig fällt (siehe z.B. die Abhandlungen von Neuberg bei Glukuronsäure oder von Rosen- herg-), dann, nach Entfernung des im Filtrat von dem Bleiessigniederschlage enthaltenen Bleis, eindunstet und den Sirup mit Alkohol und eventuell etwas Äther behandelt, wodurch noch Gummistoffe entfernt werden, usw. Quecksilbersalze sind ebenfalls als Fällungsmittel für Eiweißstoffe, Amidstoffe etc. wirksam. So ist das salpetersaure Quecksilberoxyd oder Merkurinitrat von E. Schulze und seinen Mitarbeitern vielfach zur Reinigung der Pflanzen- extrakte von Amidstoffen benutzt worden. Er schüttelt das kristallisierte Merkurinitrat mit Wasser und etwas Salpetersäure, filtriert die zu ver- wendende Lösung von dem ungelösten basischen Salz ab und fügt noch Natriumkarbonat hinzu, bis sich ein Niederschlag zu zeigen beginnt. ^) Das ungelöst Gel)liebene des Quecksilbernitrates liefert gleichfalls eine zur Fällung des Glutamins geeignete Lösung, wenn man es mit verdünnter Salpetersäure erwärmt. Eine Lösung von Jodquecksilber in Jodkalium ist wie zur Reini- gung von giykogenhaltigen Flüssigkeiten von Eiweißstoffen , auch bei manchen anderen Gelegenheiten brauchbar. Von HJasiwetz und Habermaun*) ist Zinnchlorür zur Verbesserung der durch Zersetzung von Protein Stoffen mit Salzsäure erhaltenen Flüssig- keiten angewandt. Zu der Mischung von V2 f^V Kasein mit 1 l starker Salz- säure haben sie 1 Z Wasser und :■> 75 ung von ffcfarliten Flüssig- keiten durcli verschiedene Kohlen. Ann. Chem. Bd. 357. S. 95 (1908). 54 B. Tolleus. 6. Kristallisieren. Wenn man auf diese Weise zu möglichst gereinigten Sirupen ge- langt ist, wird man als Vorteil die ^Möglichkeit beti'achten, schnell ein Urteil darüber zu gewinnen, ob die Sirupe kristallisieren, und welche Zuckerart sich daraus abscheiden wird. Zu diesem Zweck bringt man auf Mikroskop-Objektträger je einen Tropfen des Sirups und impft je eine Spur verschiedener Zuckerarten mit einer Nadel in die verschiedenen Tropfend, indem man, von einer Seite des Tropfens ausgehend, einige Striche durch den Tropfen zieht. Nun überläßt man mit oder ohne Deckgläser die vor Staub geschützten Objekte einige Tage oder Wochen sich selbst und findet bei täglicher Inspizierung- unter dem Mikroskop, ob l)ei Glukose, Galaktose, Arabinose, Rohrzucker etc. Vermehrung der eingebrachten Kristalle oder die Wege der Impfnadel sichtbar sind, oder ob die eingebrachte Substanz verschwunden ist, was auf Abwesenheit erheblicher Mengen des betreffenden Zuckers deutet. Dann kann man von dem betreffenden Objekte kleine Mengen in die Hauptquantität des Sirups bringen und wird auch hier KristaUisation allmähüch eintreten sehen, und zwar je nach den Substanzen und ihrer Reinheit, nach Stunden, Tagen, Wochen oder Monaten. TägHches Umrühren der Massen beschleunigt das Kristallisieren. Besonders bei kleinen Quanti- täten Substanz muß man hierbei den Feuchtigkeitszustand der Luft berücksichtigen. In sehr trockner Luft, so im Exsikkator, trocknen manche Sirupe zu harten Massen aus, in welchen die Moleküle sich nicht mehr zu Kristallen ordnen können, in Glocken über Wasser dagegen zerfließen schon gebildete Kristalle oft wieder, es ist meistens ein mittlerer Feuchtig- keitsgrad am günstigsten, und der Feuchtigkeitsgehalt der Luft im Keller ist oft der trockneren Luft der geheizten Zimmer vorzuziehen. Eine große Erleichterung bietet beim Aufsuchen von Zuck er kri- stallen unter dem Mikroskop das polarisierte Licht, welches, bei der Anbringung des einen i\^^co/schen Prismas unter dem Objekttisch und des anderen am Okular, die Kristalle auf dunklem Grunde hell erscheinen läßt. Falls noch eine Gipsplatte am unteren Nicol eingeschaltet ist, heben sich die hellen Kristalle besonders vom blau gestellten Gesichtsfelde schön farbig ab. Zuweilen kann man auch aus den Gestalten der Kristalle, z. R den Sechsecken der Galaktose, den häufig gestreiften, breiteren Kristallen der Xylose, den feineren, meistens sternförmig gruppierten Nadeln der Ara- binose, den mehr kompakten Kristallen des Rohrzuckers, Schlüsse auf die Natur des betreffenden Zuckers ziehen. Wenn nach kürzerer oder längerer Zeit der Sirup mit Kristallen er- füllt ist, sucht man die Kristalle durch Absaugen auf einer mit einer ') J. A. Widtsoc und B. Tollen s, Über Arabinose, Xylose und Fukose aus Traganth. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 33. S. 135. Anm. 2 (1900)'. Darstell, u. Gewinnung d. liauptsächl. Zuckerarten (1. Tier- u. Pflanzenreichs. 55 Filtrierpapier belegten Porzellannutsche') (s. Fig-. 5) oder Scheibe mittelst einer kleinen Zentrifuge zu reinigen, man befeuchtet nach dem Absaugen oder Abschleudern mit einigen Tropfen verdünnten Alkohols, saugt wieder usw. Die Muttersirupe können dann weiter gereinigt werden und neue Mengen Kristalle liefern. Statt des Absaugens kann man auch die mit Sirup gemengten Kristalle in einem Leinensäckchen pressen. Kristalle enthaltenden Massen (z. B. von im Laufe Luft die Mit großem Vorteil streicht man die auf poröse Tonplatten oder Tonteller Yilleroi und Boch in Schramberg), welche einiger Tage und in nicht zu trockener Muttersirupe einsaugen. Die weitere Pieinigung geschieht durch L^m- kristallisieren aus Wasser oder, da die meisten Zuckerarten sehr leicht löslich in Wasser sind, aus verdünntem Alkohol. Zum IJnkristallisieren von z. B. Glukose bediene ich mich meistens der folgenden Methode : Man schmilzt den Zucker in Bechergläsern mit so wenig Wasser wie möglich (etwa 1/4 des Zuckergewichtsj im Wasser- bade oder vorsichtig auf einer kleinen Flamme unter fortwährendem Umrühren, setzt der so erhal- tenen, ziemhch klar gewordenen dicken Flüssigkeit ihr IV2- l^i^ 2faches Volum starken Alkohols zu, ferner Blutkohle, digeriert einige Zeit unter gelinder Erwärmung und filtriert durch ein im Heißwassertrichter befindliches Sternfilter, welches mit einer Uhrschale bedeckt wird. Um ein Entzünden des Alkohols durch die Heizflamme zu verhindern, befindet sich zwischen dem Ultriertrichter und dem Heizapparat eine Wand aus Blech. Selljstverständlich kann die Heizung des Filters auch durch umgelegte Metallröhren, durch welche Dampf streicht, durch elek- trische Heizung etc. bewirkt werden. Die meistens zuerst etwas schwärzlich durchlaufende Flüssigkeit aießt man wieder auf das Filter, bis sie klar läuft. Die Kristallisiergefäße dürfen nicht aus zu schwachem Glase sein, weil sie durch zu kräftige Kristallisationen gelegentlich gesprengt werden können. Durch Impfen und häufiges Rühren befördert man die Kristalli- sation. Schüeßlich saugt man den Zucker auf der Nutsche trocken, be- feuchtet ihn mit erst schwächerem, dann starkem Alkohol, saugt diesen und *) Die B ü c /( » e r s c h e n F i 1 1 r i e r t r i c h t e r a u s P 0 r z e 1 1 a u oder die sugenauuteu „Xutschen" sind von großem Vorteil beim Filtrieren, weil der Atmosphilrendruck die Flüssigkeit sehr leicht durch die große Filtrierfläche treibt. Apparate, welche entweder höheren Atmosphärendruck oder auch, wie in den Filterpressen der Fabriken, höheren Flüssigkeitsdruck auf die filtrierende Substanz ausüben, sind ebenfalls hier und da in Gebrauch. 56 B. Tollens. schließlich etwas Äther durch, worauf man den Zucker an der Luft oder über Schwefelsäure trocknen läßt. III. Darstellung von Zuckerarten durch Fällung derselben mittelst anderer Substanzen und Wiederabscheidung aus den Niederschlägen. 1. Fällung mittelst alkalischer Stoffe. Meistens sind die losen Verbindungen der Zuckerarten mit Kali oder Natron in Alkohol schwer löslich, man kann also beim Versetzen von diabetischem Harn mit etwas Kaliumhydroxyd und nicht zu wenig Alkohol eine sirupförmige Fällung hervorbringen, welche sich beim Schütteln an das Glas hängt, und von welcher man dann die Flüssigkeit abgießt. Aus der Alkaliverbindung kann man den Zucker durch Zusatz von Alkohol und soviel Tropfen verdünnter Schwefelsäure, daß Lackmus eben noch nicht gerötet wird , freimachen und durch Verdunsten der filtrierten Lösung reiner gewinnen (siehe Glukose). Wichtig ist die Verwendung der alkalischen Erden, Baryt, Strontian, Kalk, welche mit Fruktose und besonders mit dem Rohr- zucker in Wasser schwer lösliche oder unlösliche Niederschläge geben. Man kann Baryumhydroxyd anwenden, welches von Duhrunfaut zur Gewinnung von Rohrzucker aus Melasse empfohlen war ; meistens wendet man aber zu dem Zwecke der Entdeckung und Fällung des Rohr- zuckers, sowohl im größten Maßstabe aus der Melasse, als auch im kleinen zur Entdeckung desselben in Pflanzen Stoffen, das Strontiumhydroxyd an. Das Calciumhydroxyd kann zu dem gleichen Zwecke dienen, wird jedoch hauptsächlich zur Fällung der Fruktose benutzt. Die Verbindungen des Rohrzuckers mit den obigen Basen, die S a c- charate, scheiden sich besonders in der Hitze und bei Gegenwart von Alkohol leicht ab; sie werden durch Absaugen und Waschen mit Lösungen der Basen und eventuell Alkohol gereinigt und dann nach dem Verteilen in Wasser durch Einleiten von Kohlendioxyd oder durch Oxalsäure in Strontium- oder Calciumkarbonat resp. -Oxalat und Zuckerlösung zersetzt, welch letztere, vielleicht nach der Reinigung mit Kohle und nach dem Ein- dunsten, den Zucker liefert. Besonders E. Schulze^) hat auf diese Weise in sehr vielen Pflanzenstoffen Rohrzucker nachgewiesen. Auch mit Hilfe von Bleiessig mit oder ohne Zusatz von etwas Ammoniak lassen sich einige Zucker oder zuckerartige Stoffe fällen. Die Niederschläge werden abfiltriert, ausgewaschen, in Wasser aufgeschwemmt und mit Schwefelwasserstoff oder bequemer mit verdünnter Schwefelsäure zersetzt. Die nach dem Al)filti-ieren des Bleisulfids oder -sulfats gewonnene Flüssigkeit enthält den Zuckerstoff. \) E. Schulze, Über den Nachweis von Rohrzucker in vegetabilischen Substanzen. Landwirtsch. Vers.-Stat. Bd. 34. S. 408— 413 (1887). — E. Schulze und Th. SeUu-cuwff, Über das Vorkommen von Rohrzucker in unreifen KartoffelknoUeu. Landwirtsch. Vers.- Stat. Bd. 34. S. 403-407 (1887). Darstell, u. Gewinnung d. hanptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 57 So wird besonders der Inosit des Harns gewonnen, ebenso z. B. die d-Arabinose (siehe im speziellen Teile) und Ribose. Durch Zusatz von Kupfervitriol und Natriumhydroxyd in fast äquivalentem Verhältnis (5 Mol. CuS()4 + öHgO und 11 Mol. Na OH) werden nach Salkoivski und Yoshimato ^) alle Glykosen aus ihren Lösungen fast völlig gefällt. 2. Fällungen mittelst der Phenylhydrazine. Die Hauptrolle bei den Fällungen der Zuckerarten kommt dem von E. Fischer^} entdeckten und eingeführten Phenylhydrazin und seinen Substitutionsprodukten zu, und erst seit der Benutzung dieser Stoffe ist die Bereitung und die Entdeckung mancher Zuckerarten, selbst bei An- wendung sehr unreiner Ausgangsmaterialien möglich. Das Phenylhydrazin und die substituierten Phenylhydrazine bilden mit den Zuckerarten zwei Arten von Verbindungen: a) die Phenyl- hydrazone aus 1 Mol. Zucker und 1 Mol. Phenylhydrazin und bj die Phen y los a Zone aus 1 Mol. Zucker und 2 ^lol. Phenylhydrazin (unter Verlust von 2 Atomen Wasserstoff, welche anderweitig verbraucht werden), z. B. mit Glukose: a) CeH.oOe + CßHs.NH.NHo = C6H,2 05:N.NH.C6H5 Glukose Phenylhydrazin Glukose-Pheuvlhydrazon 6;C6Hi,()6 + 2a,H5.NH.NHo = C6HioO,(N.NH.C6H5). + 2H Glukose Phenylhydrazin Glukose-Phenylosazon. Von diesen sind die Osazone meistens die in Wasser schwerer lös- lichen A'erbindungen, und sie scheiden sich im allgemeinen leicht ab; sie sind jedoch — so brauchbar sie auch zur Entdeckung der Zuckerarten sind — nicht zur Darstellung zu benutzen, denn man kann die Phenyl- osazone zwar mit konzentrierter Salzsäure zersetzen und das Phenylhydrazin als Hydrochlorat abscheiden, aber die daneben wieder freiwerdende Sub- stanz ist nicht der ursprünglich vorhanden gewesene Zucker, sondern das 2 H weniger enthaltende () so n, welches erst beim Behandeln mit Zink und Essigsäure in Zucker übergeht. Bei diesen Zersetzungen ist zu bedenken, erstens, daß sie recht umständlich und schwer auszuführen sind, und zweitens, dal) häufig nicht der ursprünghch vorhandene Zucker, sondern ein anderer erhalten wird. So liefern z. B. Glukose, Mannose und Fruk- tose nicht drei verschiedene Phenylosazone. sondern nur eins, und aus diesem entsteht immer dasselbe Oson, Cg H^o Og, welches in allen drei Fällen mit Zinkstaub und Essigsäure dieselbe Glykose, d. h. Fruktose oder Lävulose, CgHioOe, liefert. ^j ') Salkoirski und Yoshimato, Über die Fällbarkeit von Ziickerarten durcli Kupfer- hydroxyd. Chemiker-Zeitung. Jg. 1908. Repert. S. 502. das. nach Zoitschr. f. phvsiol. Chem. Ed. 56. S. 425 (1908). ^) E. Fischer, Verbindungen des Phenylhydrazins mit den Zuckerarten. I. Siehe z.B.: Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 17. S. 579 (1884); 11. Jg. 20. S. 821 (1887). '■') E. Fischer, Über die Vorbindungen des l'henylhydrazin.s mit den Zm-kerarten. V. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 22. S. 87, 94 (1889). 58 B. Tollens. Die Phenylhydrazone sind dagegen sehr brauclibar zur Gewinnung der Zuckerarten, wenn sie, wie z.B. bei der Mann ose, sehr schwer oder, bei der Fukose. der Rhodeose, der Rhamnose, ziemlich schwer in Wasser löslich sind, denn aus den Phenylhydrazonen lassen sich die in denselben befindlichen Zuckerarten leicht wieder isolieren. Die Darstellung der Phenylhydrazone geschieht durch Mischen der Syrupe, in welchen die Zuckerarten vorhanden sind, mit nicht zu viel Wasser (dem ein- bis dreifachen Volum), etwas 'mehr Phenylhydrazin, als der vermuteten Menge Zucker entspricht und zuweilen der dem Phenyl- hydrazin ä([uivalenten Menge Essigsäure. So scheiden sich Mannose- Phenylhvdrazon und z. B. Pihamnose- und Fukose-Phenvlhvdra- z 0 n ab. Wenn die substituierten Phenylhydrazine (z.B. das Di-Phe- nylhydrazin) in Wasser schwerer löslich sind, setzt man Alkohol zu. und zuweilen muß man mehr oder weniger hoch erwärmen (siehe Arabinose- Di-Phenylhydrazon ). Die nach kürzerer oder längerer Zeit ausgefällten Phenylhydra- zone werden abfiltriert, abgesogen und, wenn es nötig ist, aus Wasser oder Alkohol umkristallisiert. Hierbei kann man nach Neuherg'^) Pyridin zusetzen, welches die meisten Hydrazone und Osazone leicht löst. Zur Abscheidung des Zuckers aus den Phenylhydrazonen kann man die letzteren nach dem ursprünglichen Verfahren von E. Fischer mit kon- zentrierter Salzsäure zersetzen, wobei salzsaures Phenylhydrazin neben dem Zucker entsteht und. nach Entfernung der Salzsäure durch Bleikarbonat und anderes, der Zucker regeneriert wird. Besser als nach dieser umständhchen Methode verfährt man aber nach den Methoden von i/er^/eW^) und von ii'?///'^), indem man die Phenyl- hydrazone mit Benzald;'ehyd und die substituierten Phenylhydrazone ( Methylphenylhydrazon, Diphenylhydrazon etc.) mit Formaldehyd zersetzt. Hierbei wandert die Phenylhydrazingruppe an den Benzaldehyd oder den Formaldehyd und der Zucker wird in Freiheit gesetzt, und so finden z. B. folgende Gleichungen statt: a) Cg H1.3 05 : X . NH . Cg H^ -f C^ H, COH = C, H^^ 0« + C^ H^ CH : N . NHC^ H, Mannose-Phenylbj'drazon Benzaldehyd Mannose Benzaldehj-d- PJienylhydrazon. h) C5 Hl, 0, : N . N (Ce R,), + CH^ O r. C^ H,o O^ -r CH.3 : X . N ( C^ H^), Arabinose-Di-Plieuylliydrazoa Formal- Arabinose r" ^rmaldcliyd- dehyd Di-Plienylhydrazon. ^)'^Neither(i, Über die Reiuiguug der Osazone und zur Bestimmung ibrer opti- scbeu Dreliungsrichtuüg. Ber. d. Deutscb. ehem. Ges. Jg. 32. S. 3384 (189U). ^) Herzfeld, Über die spezifische Drehung der Acetylmaltose und Maltose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 28. S. 442 (1895); siehe besonders die genaue unter dem Xamen cic Weit veröffentlichte Vorschrift in der Zeitschrift des Vereines der deutschen Zucker- industrie. Jg. 1895. II. S. 794. *) Btiff, \' erfahren zur Reindarstelluug und Trennung von Zucker. Ber. d. Deutsch ehem. Ges. Jg. 32. S. 3234 (1899). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsilchl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 59 Zur Zorsotziinti' mit Bonzaldehyd envärmt man im Wasst'i'hade in einer Flasche am lüieivfliiriküliler das Hydrazon mit ca. ^^ melir l')(!nz- aldehyd, als z. B. nacli dem \"erliältnis: CeH,.,(),:X.XH,.C,II, + Coli,. coli Mannose-Phcnylliydrazon Benzaldcliyd erforderlich ist, und zirka dem vierfachen (Jewichte eines Cemenges gleicher Teile Wasser und starkem Alkohol. Nach 1/2 — 1 Stunde ist die lieaktion vollendet. Man läiJt erkalten, filtriert vom ausgeschiedenen Benzaldehyd-Phenylhydrazon, schüttelt das Filtrat zweimal mit Äther aus, um Benzaldehydüberschuß etc. zu entfernen, entfärbt mit Blutkohle und verdunstet den Zucker zur Kristal- lisation. Zur Zersetzung der substituierten Phenylhydrazone übergießt man sie mit 35%i&Pni Formaldehyd und erwärmt am Bückflußkühler. Um die Zersetzung zu erleichtern und bessere Lösung zu bewirken, setzt man etwas Alkohol hinzu. Nach 1 Stunde läßt* man erkalten, schüttelt mehrmals mit Äther aus, entfärbt mit Blutkohle, dampft unter mehrmaligem Zusatz von etwas Wasser ab, bis der Formaldehyd verschwunden ist. usw. IV. Darstellung von Zuckerarten, welche in der Natur nicht frei, sondern in Verbindung mit anderen Stoffen als Glykoside und gepaarte Substanzen oder als höhere Kohlenhydrate oder Poly- saccharide (Zellulose, Hemizellulosen, Stärke, Glykogen, Pen- tosan) etc. vorhanden sind. Hydrolyse. a) Allgemeines der Hydrolysen. W^enn die Zuckerarten, besonders die Glykosen, in dei- Natur nicht frei, sondern als Glykoside vorkommen, muß ihre Verbindung mit anderen Stoffen gelöst werden , und dies geschieht fast ausnahmslos unter Auf- nahme von Wasser (Hydrolyse), hierauf reinigt und ver(himpft man. even- tuell nach Beseitigung des Paarlings, die Flüssigkeit nach den im vorigen Abschnitt angegebenen Methoden. Wenn nicht die Glykosen selbst, sondern die oben genannten höher kondensierten Stoffe vorliegen, zerlegt man die letzteren ebenfalls duich hydrolytische Operationen, indem man die Zersetzung unter Aufnahme von Wasser bewirkt. So zersetzen sich z.B. Stärke unter Bildung von d-iilukose und llohrzucker unter Bildung von d-Glukose und Fruktose. Hie Hydrolyse wird meistens durch Erhitzen mit venhinnter Schwefel- säure oder Sab^säure ])ewirkt, bei den Glukosiden und einigen Zuckerarten auch durch Fermente oder Enzyme. Die Operation läßt man am besten auf die vorher möglidist rein dargestellten zusammengesetzten Stoffe wirken, wie z. B. auf Stärke, Pen- 60 B. Tollens. tosan, Euxanthmsäiire , Glykogen, oder auf die vorher aus den Pflanzen isolierten Glykoside, me Amygdalin usw. Ist dies aus irgend einem Grunde nicht möglich, so kann man auch die rohen Pflanzenstoffe verwenden, man hat aber in diesen Fällen wegen der Beimengung \1eler anderer Stoffe zuweilen mit großen Schwierigkeiten zu kämpfen. Die Hydrolyse der Glykoside mittelst verschiedener Enzyme erfolgt in wässeriger Lösung meistens leicht, "und so zerfällt z. B. das Amygdalin mit Emulsin leicht zu Glukose, Bittermandelöl und Cyan- wasserstoff. Man beseitigt die beiden letztgenannten Stoffe durch Abfiltrieren, Ausäthern und Abdampfen und erhält den Zucker in Kristallen. Zur Hydrolyse mit Säuren benutzt man Konzentrationen, welche von einem Minimum an Schwefel- oder Salzsäure in 100 cm^, bis zu 1, 3, 5, 7 und mehr Prozenten an Säure wechseln. Zuweilen unterstützt man die Wirkung von schwacher Säure durch die höhere im Druckkessel oder Autoklaven zu erhaltende Temperatur. Dies ist bei der Darstellung von Glukuronsäure unerläCjlich. Sehr schwache Säure ist z. B. zur Zerlegung von Inulin in Fruktose sowie zur Zerlegung von Rohrzucker in Glukose und Fruktose, das heißt zur sog. Inversion, genügend, und man darf nicht mit stärkerer Säure auf 100^ erhitzen, weil sich die entstandene Fruktose sehr leicht unter Bildung von braunen Nebenprodukten zersetzt. Will man Euxant hin säure in Euxanthon und Glukuronsäure zer- legen, so kann man dies bei 135*^ C sogar mit Wasser allein liewirken, und mit ca. i/5"/oiger oder l%iger Schwefelsäure gelingt dies noch besser. Zur Hydrolyse von Hemizellulosen, wie Mannan, Galaktan, Pen- tosan etc., muß man stärkere Säuren anwenden, und es sind Schwefel- säure von 1 — lO^/o, Salzsäure von 2 — S^/o Gehalt angewendet worden. So führt Counrler'^) die Hydrolyse des Holzgummis mit Salzsäure aus, und Winterstein 2) hat gesucht, für Stachyose, Lupeose, Kaffinose, Holzgummi die besten Konzentrationen der Salzsäure zu ermitteln. Wie es von Ostuald u. a. bei der Hydrolyse (Inversion) des Rohr- zuckers nachgewiesen ist, wirkt auch bei der Hydrolyse der obigen Kohlenhydrate bei gleichen Prozentgehalten die Salzsäure stärker als die Schwefelsäure, und dies ist von Hauers und Tollens^} in betreff der Hydrolyse des Kirschgummi speziell nachgewiesen, z. B. ließen sich nach 2stündigem Erhitzen von Kirschgummi mit 4Voi8'^i' Salzsäure in der Flüssigkeit 58-68 7o des Gummi an (ilykosen nachweisen, während das Er- hitzen mit 4%iger Schwefelsäure davon nur o8-24''/o hervorgebracht hatte. *) C. Coiincler, Verzuekonnig von Holzgummi mittelst Salzsäure. Chemiker-Zeitung. Jg. 1892. S.1719. ^) E. Wintersfeh), Vhov die Inversion einiger Kohlenhydrate. Landwirtsch. Vers.- Stat. Bd. 41. S. 375 (181)2). ') Hauers und B. Tollens, Über die Hydrolyse peutosauhaltiger Stoffe mittelst verdünnter Säuren und mittelst Sulfitflüssigkeit sowie über die Isolierung von Peu- tosen. ßer. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 3306 (1903). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. Q\ Es zeigt sich bei diesen Hydrolysen, daß schon nach kürzerer Zeit viel Glykosen gebildet sind, dal] die Zunahme später langsam erfolgt und daß schließlich sich die Picduktionskraft wieder vermindert, und man sieht bei graphischer DarsteUung der Resultate von Hauers und Tollens, daß die zuerst sehr stark ansteigende Kurve nachher fast horizontal wird oder wieder fällt. Das Fallen der Kurve zeigt an, daß ein Teil der gebildeten Glykosen bei längerem Erhitzen sich zersetzt, sei es in andere Stoffe (bei den Hexosen zu Lävulinsäure und Ameisensäure, bei den Pen tosen zu Fur- furol, ferner zu Humlnstoffen). sei es, daß sog. Reversionsprodukte (siehe TFo/2/M sich bilden. Da nun schon vor der vollständigen Hydrolyse der Hemizelluloseu usw. diese Xebenzersetzungen beginnen, und die Ausbeute durch die Gegenwart von nicht kristallisierbaren Stoffen außerdem sehr geschmälert wird, so erhitzt man nicht gar zu lange und nicht mit zu konzentrierten Säuren. Beim Kirschgummi wiid man so lange erhitzen, bis die oben ge- nannte Kurve ihre Biegung in die Horizontale zum größten Teil beendigt hat, d. h. 4 — 5 Stunden bei Anwendung von 4«/oiger Schwefelsäure, und 2 Stunden bei S^/oiger Schwefelsäure. Bei anderen Stoffen müssen die passendste Konzentration der Säuren und die beste Zeitdauer durch den Versuch gefunden werden. Meistens wird man bei 4 — 6stündigem Erhitzen mit 4 — ßVoiger Schwefelsäure genügende Resultate erhalten. Die passendste Menge an verdünnter Säure ist das Tfache der zu zerlegenden Substanz; wendet man weniger an, so ist die Ausbeute an Zucker geringer. Bei sehr voluminösen Substanzen, wie Stroh u. dgl., muß man so viel Säure anwenden, daß die Substanzen wenigstens einigermaßen bedeckt werden. Da Salzsäure bei gleicher prozentischer Konzentration, wie im all- gemeinen, auch bei den obigen^Versuchen sich stärker als die Schwefel- säure erwiesen hat, so bietet ihre Anwendung in manchen Fällen Vorteile; sie hat jedoch den großen Nachteil, daß man sie schwerer als die Schwefel- säure aus den Flüssigkeiten entfernen kann, da ihre Salze mit billigen Basen nicht unlöslich oder schwer löslich sind wie Barvum- oder Galcium- sulfat. Bei kleineren Mengen bedient man sich zur Fällung der Salzsäure des Silberkarbonates, bei srößeren des Bleikarbonates; das ciit- stehende Chlorblei ist jedoch nicht so schwer löslich wie das Chlorsillter, und man muß nach der Entfernung des Chlorbleis die letzten Teile Chlor- wasserstoff dann mit Silberkarbonat fortnehmen (s. Xylosebereitung). Das Erhitzen mit den Säuren geschieht bei kleineren Mengen in Glaskolben, welche als Rückflußrohr im Korke eine im Innern 6— 7w??>? weite und i , m lange Glasröhre tragen; man befestigt den Kolben mittelst M Wohl , Zur Kenntnis der Kohlehydrate. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 2097 (1890). 62 B. Tollens. eines Halters in einem Wasserbade mit konstantem Zutrijpfeln von Wasser und Abfluß, so daß die innere Flüssigkeit ungefälir in gleicher Höhe mit dem äußeren kochenden Wasser steht. Größere Mengen der Substanzen erhitzt man in Porzellantöpfen (sog. Chlortöpfen) der Berliner königl. PorzeUanmanufaktur (s. Fig. 6). Man setzt die Töpfe in ein großes Wasserbad (eisernen Kessel mit Zuflußvor- richtung) indem man direkte Berührung mit dem Boden des Wasserbades durch Einlegen einiger Steine oder auch eines Lumpens vei'hindert. ^lan legt während des Kochens im Wasserbade den i^fach durchbohrten Deckel auf und verschließt einen Tubus des- selben mit einem Kork, den zweiten mit einem Kork und Steigrohr. Mit solchen Töpfen von 5 oder 10 l Inhalt wird man meistens aus- kommen. Man bringt z. B. zur Dar- stellung von Arabinose \kg gemah- lenes Kirschgummi und 7 / einer 4%igen Schwefelsäure (enthaltend 280 g konzentrierte reine Schwefel- säure) in den 10 Z-Topf. Von sehr voluminösen Stoffen, wie Stroh etc., nimmt man weniger als 1 kg, z. B. 800 g. Wenn die nötige Kochdauer unter zeitweiligem Umrühren verflossen ist, wird der Inhalt der Gefäße von dem unlöslichen abgepreßt, indem man ihn in einen Sack entleert und diesen in eine gute Presse (s. oben) bringt oder bei kleinen Quantitäten die blasse abnutscht. Die Säure der Flüssigkeit wird dann gesättigt, und zwar bei An- wendung von Schwefelsäure mit g e f ä 1 1 1 e m C a 1 c i u m k a r b o n a t. Das letztere muß frei von Magnesiumkarbonat sein, weil das aus dem letzteren entstehende Magnesiumsulfat die späteren Operationen hindert. (Gutes Calcinmkarbonat habe ich von der Firma Dr. L. C. Marquart in Beuel-Bonn bezogen.) Man kann die Schwefelsäure natürlich auch mit Baryumkarbonat entfernen, dies ist aber, obgleich es häufig geschieht, abgesehen von der größeren Kostspieligkeit , wenig beciuem , weil das Entfernen der großen Menge Baryumsulfat, welche oft kolloidale Beschaffenheit zeigt, viel weniger leicht ist als dasjenige des körnigen Calciumsulfates. Man trägt in die noch warme und in einer Schale auf dem Wasser- bade erhitzte Flüssigkeit allmählich etwas mehr als die für die Schwefel- Fig.6. Darstell, u. Gewiimiuig d. hauptsüclil. Ziickerarten d. Tier- n. Pflanzenreichs. ß;», säure iHM-cchiioto Monge an C'alcinnikarhonat ein. bi.s die Kolilcndio.xydent- wickluni; aufhört und die Reaktion der Fliissi Tagen filtriert man, dampft ab usw. und erliidt eine von Galaktose freie 1-Arabinose. Mit gewöhnlicher Hefe, wehdie. wenn sie Fig.: 64 B. Tolleus. auch frei von Stärke ist, doch häufig Milchsäureferment enthält, darf man nicht lange gären lassen, weil sonst auch die Arabinose sich bedeutend vermindert. Einige Kohlehydrate, und speziell die Zellulose, werden nicht von erheblich verdünnter, wohl aber von fast konzentrierter Schwefel- säure angegriffen, und man befolgt, um z. B. Glukose aus Baumwolle zu gewinnen, am besten Flechsigst) Verfahren, d. h. man vermischt die Baumwolle oder die sonstigen C'ellulosearten mit zirka dem ofachen Ge- wicht einer fast konzentrierten Schwefelsäure, und zwar entweder Schwefelsäure von 11 spez. Gew. oder (wie zur Bereitung von Pergament- papier) ein Gemisch von 4 Teilen konzentrierter Schwefelsäure und 1 Teil Wasser, oder auch von 5 Teilen konzentrierter Schwefelsäure und 1 Teil Wasser. 2) {Flechsig gab an: öOg Baumwolle, 2b0g konzentrierte reine Schwefelsäure, S4g Wasser.) Am folgenden Tage verdünnt man die dicke, dunkle blasse mit Wasser, so daß die Säure 5- oder G^/oig' wird, und kocht die Flüssigkeit, am besten im Glyzerinbade, einige Stunden am Rückflulikühler und ver- fährt dann wie bei sonstigen Hydrolysen, indem man mit Baryum- oder Calciumkarbonat sättigt, eindampft, mit Alkohol etc. reinigt usw. b) Einzeldarstellungs-Methoden. In der folgenden Übersicht der Einzeldarstellungsmethoden können nur wenige der bekannteren oder häufiger vorkommenden Zuckerarten be- sprochen werden; in betreff der übrigen muß auf den vorhergegangenen allgemeinen Teil sowie auf die Bücher von v. Lippmanyi , B. Tolleus und Maquenne verwiesen werden, und dies muß auch besonders in Hinsicht der von E. Fischer und seinen Mitarlieitern oder von anderen nach ähnlichen Methoden gewonnenen synthetischen Zuckerarten geschehen, weil die hier- bei angewandten speziellen weitläufigen Methoden und ihre Beschreibung zu viel Raum einnehmen würden. A. Monosaccharide oder Glykosen. ^) 1. Peiitosen, CsHioOg. a) l-Aral)inose oder 1-Aral)0se. Sie wird nach den von R. W. Bauer ^) und von Kiliani^') gege- benen, etwas modifizierten Vorschriften aus Kirscbgummi durch Hy- *) E. Flechsig, Über Darstellung und chemische Natur des Cellulosezuckers. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 7. S. 523 (1882/1883); s. a. J. B. Lindsey und 5. Tollens, Über Dextrose aus „Sulfitcellulose" und ausTannenholz. Annal.Chem. Bd 267. p.370(1892). 2) E. W. Tromp de Haas und B. Tolleus, Untersuchung von Kokosuußschaleu. Annal. Chem. Bd. 286. p. 305 (1895). ^) Es ist am besten, die Monosaccharide, d. h. alle Zuckerarten mit geringerer Anzahl an Kohlenstoffatomen (C3 bis i\), welche sich hydrolytisch nicht weiter spalten lassen, mit dem allgemeinen Namen Glykosen zusammenzufassen und für den T r a u b e n- zucker oder die Dextrose, welche häufig Glykose genannt wird, nach £. Fischers Vorschlage den Namen Glukose zu reservieren. *) B. W.Bauer, Journ. f. prakt. Chem. [2.] Bd. 34. S. 47 (1886). ^) Heinrich Kiliani, Über Arabinose. Ber. d. D. chem. Ges. Jg. 19. S. 3030 (1886). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerarteu d. Tier- u. Pflanzonrciclis. 65 drolyse in Schwefelsäure dargestellt. Ich lasse auf 1 kg grob g:eniahlenes Kirschgummii) 7 l Wasser, welches 280 r/ konzentrierte Schwefelsäure, also nahe 4% H2SO4, enthält, 5 Stunden lang bei Wasserbadhitze im Porzellantopfe einwirken, indem ich zuerst in sehr gelinder Wäi-me das Gummi unter häufigem Piühren völlig zum (Quellen bi'inge, so dal) es sich nicht mehr zu Boden setzen kann. Die (immer nach Furfurol riechende) Hydrolysenflüssigkeit wird noch heiß in einer Schale mit ;»0() — 320 ^r gefälltem magnesiumfreien Calcium karbonat gesättigt und durch Gießen durch einen 15eutel und Auspressen des letzteren vom Gipsniederschlage befreit. Da Kirschgummi immer oder fast immer mit Salpetersäure Schleimsäure liefert und folglich Galaktosegruppen enthält und in ihm auch Glukosegruppen vorkommen können, so bringt man in die in einer Flasche mit Kautschukstöpsel und Gärrohr (s. S. 6.')) befindliche Flüssig- keit etwas gute Preßhefe, welche bald Schainnbildung und Gärung erregt, wobei das Kohlendioxyd durch das etwas Wasser enthaltende Gärrohr ent- weicht. Nach ,') oder höchstens 4 Tagen filtriert man und dampft im Wasser- bade unter Umrühren zum Sirup ein. Mit Alkohol scheidet man mehrfach Gummisubstanzen ab, wie es im allgemeinen Teile beschrieben ist, dampft stets im Vakuum den Alkohol ab und erhält schließlich aus dem Sirup Kristalle, Avelche durch Absaugen von der Mutterlauge befreit und durch ITm- kristallisieren aus Wasser und Alkohol mit PJlutkohle gereinigt werden. Die wieder konzentrierten, mit x\lkohol möglichst von Gummistoffen befreiten Mutterlaugen liefern noch etwas A rabin ose. Die letzten Muttersirupe streicht man nach dem Kristallinischwerden auf Ton. 1 kg Kirschgummi liefert meistens ca. 150^ reine Arabinose. d-Arabinose, C5H10O5. Diese der 1-Arabinose „antiloge" oder optisch isomere Substanz von gleicher Zusammensetzung und, bis auf die entgegengesetzte Richtung der Drehung des polarisierten Lichtes, gleichen Eigenschaften ist bis jetzt allein nicht mit Sicherheit, etwa im Harn, als solche gefunden, wohl aber kommt sie im Harn bei „Pentosurie'' zugleich mit 1-Arabinose und, wie Neuherg angibt, in razemischer Verbindung mit dieser, d. h. als r-Arabinose vor, welche wegen der gegenseitigen Kompensation von 1- und d-Arabinose optisch inaktiv ist. In Auflösung, und so wohl auch im Harn, scheint die razemische Verbindung nicht beständig zu sein, und es werden statt ihrer die beiden Antilogen oder Antipoden vorhanden sein. Künstlich ist sie von Wohl-), Buff^), Neuherg*} und Woldgemuth aus 1) Von der P'irnia Ad. Abich Nachf. in Göttingen. ^) A. Wohl, Abbau des Traubenzuckers. Her. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 26. S. 730 (1893). 3) Otto Büß) d- uudr-Aral)in(.se. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 553 (1899). ^) C. Neuherg und J. Wohlgemuth, Über d-Arabinose, d-Arabonsäure und die quantitative Bestimmung der Arabinose. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 35. S. 31 (1902). Abderhalden, Handbuch der hiocheniipcheu Arbeitsmethoden. II. 5 (3g B. Tolle HS. Glukose durch ( Ixydation mittelst Wasserstoffsuperoxyd und Eisensalz oder aus Glukose durch Überführung in das Oxim und andere Stoffe, bis schließlich d-Arabinose entsteht, oder von Guerbet^) durch Kochen von gluconsaureiu Mercurisalz dargestellt worden (s. die Lehrl)ücherj. Nachdem Salkowski-) und Andere das Vorkommen von Pentosen im Harn konstatiert hatten, erkannte Neuberg^) diese als r-Arabinose, und er stellte sie auf folgende Weise her. 201 Pen tos eh am Amrden im Vakuum -auf 1/ eingeengt und mit 6V2 ^ Alkohol von 9oVo, wodurch Salze usw. gefällt wurden, versetzt. Das Filtrat sowie alkoholische Extrakte aus den Salzen wurden von Alkohol befreit, der mit Kohle möghchst entfärbte Pvückstand wurde weiter mit Alkohol von Beimengungen l)efreit und schließlich wurde die Flüssigkeit mit 2og Diphenylhydrazin erwärmt. Bald hatten sich Krusten und ein Brei von Nadeln aus Arabinose-Diphenylhydrazon abgeschieden, welche, abfiltriert, mit kaltem Alkohol gewaschen und dann getrocknet, 44*6^ reines Produkt lieferten, welches bei 206'' schmolz und beim Erwärmen mit Formaldehyd und Pyridin die inaktive 1-d- oder r-Arabinose lieferte. Mit I-lNIenthylhydrazin läßt sich nach Xeuher;/^) die d-Arabinose aus den Lösungen der r-Arabinose fällen, während die 1-Arabinose in Lösung bleibt. 2. 1-Xylose, C\E,,i\. Zu ihrer Darstellung benutzt man entweder Buchenholz gummi oder Weizenstroh. a) Darstellung aus Buchenholzgummi. Man übergießt nach Wheeler und Tollens^) ll-g Buchenholz Säge- späne mit einigen Litern 2o/oig^ii Ammoniaks, um Eiweißstoffe und sonstige Sulxstanzen zu lösen, preßt nach 24 Stunden ab, wäscht mit Wasser, preßt wieder ab, wiederholt dies ein- oder zweimal rührt die gereinigten Holzspäne mit 5«/oi8"er Natronlauge zum Brei an, läßt 24 Stunden in gehnder Wärme digerieren, preßt die alkalische Flüssigkeit ab und Avieder- ^) Marcel Gner-bet, tfberfiilirung- der a-Oxysäuren in Aldehyde durch Kochen der wässerigen Losuiip- ihrer Mercurisalze ; Auweiulmig zur Darstellung von 1-Arabinose mit Hilfe von Mcrcuriglukouat. Bull. soc. chim. [4.] T. 3. p. 427 (1908). 2) E. Salkoivski, Über das Vorkommen von Pentosen im Harn. Zeitschr. f. physiol. Cbem. Bd. 27. S. 525 (1899). 2) Carl Neuberg, Über die Harnpentose, ein optisch inaktives, natürlich vor- kommendes Kohlehydrat. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 33. S. 2243 (1900). *) Carl Neider ff, Über die Spaltung von racemischen Aldehyden und Ketonen. Ber. d. Deutsch, ehem.' Ges. Jg. 36. S. 1194 (1903). ^) H. J. Wheeler und B. Tollens, Über die Xylose oder den Holzzucker, eine zweite Pentoglukose. Annal. Chem. Bd. 254. p. 304 (1889). — Friedrich. Koch, Experimentelle Prüfung des Holzgummis und dessen Verbreitung im Pflanzenreiche. Pharmazeut. -Ztg. f. Rußland. Bd. 25. S. 619 usw. Siehe auch Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 20. Ref. S. 145 (1887). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerarten d. Tior- u. Pflanzenreichs. 57 holt das Diüerieren mit wenii^er Natronlauf^o und Abpressen einmal. Die alkalischen Anszüge läßt man in einer Flasche sich kliiren, hebert vom Bodensatz al) und versetzt sie mit ihrem gleichen Volum starken Alkohols ; das ausiiefallene Natron haltende Holztiummi sammelt man auf einem Tuch, prel'jt es ganz schwach, rührt es mit Alkohol und so viel Salzsäure oder Essigsäure, daß die Reaktion sauer wird, an, preßt nach einiger Zeit wieder aus und wiederholt das Digerieren mit Alkohol, bis die Säure ent- fernt ist. Das so erhaltene Holzgummi oder Xylan (50 — 60^) wird dann durch Hydrolyse in Xylose übergeführt. Man behandelt es ent- w'eder nach der für Arabinose gegebenen Vorschrift (s. d.) mit verdünnter Schwefelsäure oder man führt nach Coundcrs'^) Vorgange die Hydrolyse mit Salzsäure aus, indem man z. B. 15"5229r/ Holzgummi, 200 cm » Wasser und 10 cm^ Salzsäure von ri9 sp. Gew. gegen :3 Stunden im Wasserbade erhitzt. Die Flüssigkeit wird dann mit Bleikarbonat (reinem Bleiweiß) erwärmt, bis Kongorotpapier nicht mehr beim Betupfen ver- ändert wird, Ins also die Salzsäure gesättigt ist, dann wiixl filtriert, mit wenig Bleikarbonat versetzt, eingedunstet, mit Alkohol von noch fäll- baren Stoffen befreit, dann, um Pieste von Blei zu entfernen, mit Schwefelwasserstoff behandelt und bei Gegenwart von etwas Calciumkar- bonat eingedunstet. Schließlich kristalUsiert die Xylose; sie wird wie die Arabinose gereinigt. b) Darstellung aus Weizenstroh. Nach Bertrands-) und Heherts^) Vorgange stellt man Xylose aus Weizenstroh dar. C. Sclmlze und B. ToUcns*) haben Weizenstrohhäcksel mit 2''/oigem Ammoniak und nachher Wasser von darin löslichen Stoffen befreit (siehe oben Holzgummi), dann die abgepreßte Masse mit 2- oder 3 "/oiger Schwefelsäure 4 Stunden im Wasserbade gekocht, die Flüssigkeit abgepreßt, mit Calcium- karbonat gesättigt, vom Gips abgepreßt und im Vakuum eingedampft. Der durch mehrfaches Digerieren mit Alkohol möglichst vom Gummi befreite Sirup liefert schließlich 3— o^/o tles Strohs an Xylose. Aus einem alkalischen Strohextrakt kann man nach Salkoirski^) mittelst Fchliii ^ßchei' Lösung Xylan ausfällen und dies hydrolytisch in Xylose überführen. ') C. Councler, Verzuckerung von Holzgummi mittelst Salzsäure. Chem.-Ztg. Jg. 1892. S. 1719. ") G. Bertrand, Recherches sur queliiues dörivös du xylose. Bull. Soc. cliim. [3.] T.5. p. 555(1891). ^) Alexandre Hebert, Sur une nouvelle metliode d'aualyse de la paille. Conipt. reiul. T. 110. p. 909 (1890). *) C. Schulze und B. Tolle ns , Über die Xylose luul ihre Drehungserscheinungen. Annal. Chem. Bd. 271. p. 40 (1892). ^) E. Salkoirski , Über die Darstellung des Xylans. Zcitschr. f. physiol. Chem. Bd. 34. S. 162 (1901/2). 5* 68 B. Tolleus. o. Allhang zu den Pentosen. Glukuronsäure-Lakton oder Glukuron, Cg Hg Oß. Die Glukuronsäiire, Cg Hjo O7, kommt im Harn von Menschen und Tieren in Verbindung mit den verschiedensten Stoffen als ..gepaarte Glu- kuronsäure" vor, in welchen glykosidartige Bindung der Glukuronsäure mit den anderen Stoffen anzunehmen ist. Sie findet sich wach P. Mat/ er und Neuberg/), C. Tollens''-), Blumenthal '^) und anderen*) im normalen Menschenharn in geringer Menge, in gröl'ieren Mengen jedoch nach Eingabe von Chloral, Kampfer, Phenol, Kresol, Lysol usw. Sie ist eins der Zwischenglieder zwischen Glukose, CgHiaOe, und Zuckersäure. Cfi Hio Og, und entsteht augenscheinlich im Organismus durch Oxydation. Sie wird sich dort mit den normal vorhandenen oder den einge- führten oben genannten Stoffen verbinden und dann im Harn ausscheiden. Sie bildet als Anhydrid oder Lakton, CßHgOe, im ganz reinen Zustande schöne große Sechsecke. Sie dreht rechts (a)I)= + 19'4". Die gepaarten Glukuronsauren drehen links. Zur Darstellung kann man nach v. Mehrim/ und Musculus ^) und nach Külz^) Chlor alharn (welchen man von Hunden gewinnt) benutzen, welcher sie alsUrochloralsäure, CgH^ Cl^ ( )7. enthält; ergiebiger aber und bequemer erhält man sie aus dem Purree, Piuri oder Indischgelb, einer als Malerfarbe bekannten Substanz, welche in ()stindien aus dem Harn von Kühen, welche mit Mangol)lättern gefüttert werden, beim Erwärmen als Absatz ausscheidet und in anscheinend durch Al)seihen in Tüchern, Aus- drücken und Trocknen gewonnenen Kugeln in den Handel gebracht werden.'^) Das Piuri besteht der Hauptsache nach aus eux an t hin saurem M a g n e s i u m. C19 Hig Oi 1 Mg + 5 H.^ (), und die E u x a n t h i n s ä u r e oder E u X a n t h i n g 1 u k u r 0 n , €,9 Hjg Oi 1 , zerfällt bei der Hydrolyse zu Eux an t hon und Glukuronsäure, welche als Glukuronsäure- Lakton kristaUisiert. CigHigOi^ = CiaHgOi 4- CrHioOt Euxautbiusäure Euxaiitbiu Glukarousäure CßHioOT = CeHgOß + H2 0 Glukuronsäure Ghikuron- säurelakton ^) P. 3Iai/er und C. Nenherg, Über den Xacbweis gepaarter Glukuronsauren und ibr Vorkommen im normalen Harn. Zeitscbr. f. pbysiol. Cbein. Bd. 29. S.256 (1900). '^) C. Tollens, Der Nachweis von Glukuronsäure nach B. Tollens im nienscblicben Harn. Zeitscbr. f. pbysiol. Chem. Bd. 56. S. 115 (1908). ") Ferdinand Blvmenthal, Biochemische Untersuchungen über Vergiftung und Ent- giftung bei der Lysolvergiftung. Biochem. Zeitscbr. Bd. 1. S. 135 (1906). *) Siebe Zitate in der Abb. von P. Mayer und C. Neuberg. ^) i\ Mering und Musculus, t)ber einen neuen Körper im Cbloralharn. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 8. S. 662 (1875). ") Külz, Über Urochloralsäure und ürobutylcbloralsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 14. S. 2291 (1881). ') John Stenhouse , Untersuchung einer gelben Substanz, welche unter dem Namen Purree von Indien kommt. Annal. Chem. Bd. 51. p. 423 (1844). — C. Grabe, Über die Euxanthongruppe. Annal. Chem. Bd. 254. p. 265 (1889). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 69 Zur Darstellung des Glukurons scheidet man zuerst mit Salz- säure die Euxanthi nsä ure ab und zerlegt diese dann durch Er- hitzen mit Wasser oder mit schwacher Schwefelsäure auf 130". Die vom abgeschiedenen Euxanthin abfiltrierte, von Schwefelsäure befreite Lösung gibt nach dem Abdampfen Kristalle von Glukuron. Genauere Vorschriften zur Darstellung der (ilukuronsäure haben Thierf eider, Spiegel, F. Mayer ^), Külz (1. c), Mann und Tollens % Neuberg »), Lefevre und Tollens*) gegeben. Man benutzt die etwas Euxanthon enthaltende, aus dem Piuri durch Zerreiben mit Wasser und Salzsäure abgeschiedene, dann durch Abseihen, Auswaschen mit möghchst wenig Wasser und Pressen erhaltene rohe Euxanthin säure, oder man reinigt diese erst durch Lösen in warmem Ammoniumkarbonat und Wiederfällen mit Schwefelsäure. Man erhitzt sie nach Neuherr/ mit Schwefelsäure von 0-12 "/o Hg SO4 oder nach Mann, Lefevre und Tollens mit P/oiger Schwefelsäure s) im Autoklaven 1 bis ly. Stunden lang auf 180 bis höchstens 1H5^ Da die Glukuronsäure ziemUch leicht zersctzhch ist, darf man zur Hydrolyse, wie Lefevre und Tollens erfahren haben, nicht so starke Schwefelsäure anwenden, wie zur Hydrolyse mancher Kohlenhydrate er- forderlich ist. Das Filtrat vom Euxanthon wird mit Baryumkarbonat von Schwefelsäure und mit Blutkohle möglichst vom Farbstoff etc. befreit; die Lösung liefert dann nach dem genauen Ausfällen von gelöstem Baryum mit Schwefelsäure (Tüpfelprobe auf einer Glasplatte mit einerseits Chlor- baryum und andererseits mit Schwefelsäure) und dem Eindampfen schöne Sechsecke von G 1 u k u i- 0 n s ä u r e 1 a k 1 0 n. Die Mutterlaugen liefern nach dem Beinigen mit Alkohol, wobei Gummi etc. beseitigt wird, noch mehr Kristalle, doch sind diese meistens schwer in großen Individuen zu gewinnen, und sie enthalten vielleicht noch andere Stoffe. Vielleicht kann man zur Darstellung aus anderen Stoffen auch die Fällung mit p-Bromphenylhydvazin als Hydrazon oder Hydrazinsalz und die Zersetzung des letzteren mittelst Formaldehyd anwenden, ß) *) Paid Malier, Über die Phenylhydraziuvorliindungen der Glukuronsäure. Zeitschr. f. physiol. Ghem. Bd. 29. S. 62 (190o"). ^) F. Mann und B. Tollens, Über die Bildung von Furfurol und Kohlensäure aus Glukuronsäure. Ann. Chem. Vol. 290. p. 155 (1896). ^) Carl Nniherg, Zur Kenntnis der Glukuronsäure. I. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 33. S. 3317 (1900). *) K. U. Lefevre und B. Tollens, Untersuchungen über die (ilukuronsäure, ihre quantitative Bestimmung und ihre Farbenroaktionen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S. 4513 (1907). ') Nicht mit 107oiger Schwefelsäure, wie a. a. 0. durch einen Druckfehler ange- geben ist. ^) Carl Neiiberg, Über eine Verbindung der (ilukuronsäure mit p-Bromphenyl- hydrazin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 32. S. 2395 (1899). 70 B. Tollens. 4. Metliylpentosen, Cg H12 05. a) Rbamiiose, CßHjo O5 + H, 0. Isodulcit, Rhamnodulcit. Diese schön kristallisierte, in sehr vielen Glykosiden, wie Eutin, Franguün etc., ferner im Solanin und besonders in dem Farbstoff der Gelbbeeren und des Quercitron aus der Färbereiche, d. h. dem Quercitrin oder X anthorhamnin enthaltene Methylpentose ^\^rd durch Hydrolyse der genannten Stoffe mittelst verdünnter Schwefel- säure erhalten. ^ J^^an filtriert von den in Wasser unlöslichen Spaltungs- produkten der Glykoside ab. reinigt die Flüssigkeiten mit Kohle, ver- dampft, und die leichte und gute Kristalhsationsfähigkeit dieser Zuckerart ist hierbei von Vorteil. Licbermann und Hörnmnn wandten zur Zerlegung des Xanthorhamnins nahezu 47oige Schwefelsäure und zweistündiges Er- hitzen im Wasserbade an. Die Pi h a m n 0 s e wird auch im Großbetriebe als Nebenprodukt bei der Herstellung von Farbstoffen gewonnen (Anilinfarben- und Extrakt- fabriken, vormals Joh. Rud. Geigy in Basel). ß) Fukose, C,H^., O5. Die Fukose 2) stellt man aus Seetan g (Fucus vesiculosus, nodo- dus etc.) her. Getrockneter Seetang wird durch Extrahieren mit 20/oiger Schwefelsäure, Auswaschen und Pressen von löslichen Stoffen befreit und dann mit der sechsfachen Menge von ö^/oiger Schwefelsäure (je 1 1 hält 50 g konzentrierter Schwefelsäure) 8 Stunden im Wasserbade erhitzt. Dann wird abgepreßt, mit C'alciumkarbonat gesättigt, vom Gips abgepreßt, eingedampft. ^ ) Der Sirup wird dann mit Alkohol mehrfach vom Gummi befreit *), und, da er, selbst nach dem Impfen mit Fukose, nie Kristalle liefert % wird er mit gleichen Teilen Wasser und zirka seinem halben Gewicht Phenylhydrazin versetzt. Das nach 24 Stunden abgeschiedene Fukose- Phenylhydrazon, CgHig O4 iN.NH.CjHs , wird auf einer großen mit Papier bedeckten Porzellannutsche abgesogen , und die Mutterlauge wird *) Siehe z. B. C. Licberi/ian?i und P. Hürmanii, Über das Glukosid der (ielbbeeren und den Rhamnodulcit; C. Licbennann und S. Hamburger, Über die Formel des Quer- citrins und des Quercetins ; C. Liehermanti , Über einige früher beschriebene Derivate des Quercetins ; C. Liebermann und 0. Hörmann, Über die Farbstoffe und den Glukosid- zucker der Gelbbeeren. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 11. S. 952, 955 (1878): Jg. 12. S. 1178 (1879); Jg. 17. S. 1680 (1884); Ann. Chem. Voh 196. p. 299 (1879). ") Ä. Günther und B. Tollens, Über die Fukose, einen der Rhamnose isomeren Zucker aus dem Seetang. Ann. Chem. Vol. 271. p. 86; Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 23. S. 1753, 2585 (1890). ^) K. Bieler und C. Tollens, Über das „Fukusol" genannte Gemenge von Fur- furol und Methylfurfurol. Ann. Chem. Vol. 258. p. 127 (1890). *) A. Miifher und B. Tollens, Über die Produkte der Hydrolyse von Seetang (Fucus), Laminaria und Carragheenmoos. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 37. S. 298 (1904). ^) Willy Mayer und B. Tollens, Untersuchungen über die Fukose und über die Bestimmung der Methylpeutosane. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 40. 8.2434(1907); Zeitschr. d. Ver. d. deutsch. Zucker-Ind. Jg. 1907. S. 621. Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Znckerarteu d. Tier- u. Pflanzenreichs. 71 darauf geprüft, ob sie auf Zusatz von Phenylhydrazin weitere Ausschei- dung gibt. Das Hydrazon wird aus verdünntem Alkohol umkristallisiort, bis der Schmelzpunkt 170 — 171" ist, und dann nach Herzfelds \ erfuhren mit Benzaldehyd zersetzt, indem z. B. 50 (/ Fukose-rhenylhydrazoji , oO ,y Benzaldehyd, 50 (/ Alkohol, 40 g Wasser am lUickflußkühler im Wasserbade Ya Stunde bis 1 Stunde erhitzt werden. Nach völligem Erkalten saugt man die Flüssigkeit vom Benzal- dehyd-Phenylhydrazon ab, schüttelt sie mit Äther zwei Mal aus, er- wärmt sie mit Blutkohle und dunstet ein. Der Sirup kristallisiert nach dem Impfen sehr bald, und Absaugen auf Ton sowie eventuelles Umkristallisieren vollenden die Reinigung. 1 At/ Seetang liefert 3 — 8 g Fukose. Die Fukose dreht stark links {x)l) = - 75—76'' und besitzt Mehr- drehung (s. Günther und ToUens 1. c, Tolletis und Rorlve'^). Y) Rhodeose, CeH^-iOs. Diese Methylpentose ist die optisch entgegengesetzte Modifi- kation oder das Antilogon der Fukose. Sie ist von Fo^ore^•-) u. a. aus dem Convolvulin, dem Glykoside der Jalappenwurzel , hergestellt und darauf genau untersucht. Als zweites Beispiel der Darstellung der Zucker- art aus dem sie enthaltenden (ilykoside möge ihre Darstellung hier be- schrieben werden. Votocek^) löst 50^ C'onvolvulin in 375° Barytwasser, fällt durch Zusatz von Schwefelsäure die beigemengte Convolvulin säure aus, fil- triert und erhitzt das Filtrat mit 72*^/01861' Schwefelsäure 40 Stunden auf 100". Dann filtriert er, neutrahsiert mit p]ariumkarbonat und reinigt das Filtrat durch Zusatz von Bleiessig und Einleiten von Schwefelwasserstoff: das Filtrat hiervon liefert beim Verdunsten einen Sirup, welchei" auf 2 Teile Rhodeose 1 Teil Glukose enthält. Die letztere kaini man durch Hefe- zusatz, also durch Gärung zerstören. Aus der durch ^>rdunsten wieder konzentrierten Rhodeoselösung fällt man die Rhodeose durch Zusatz vcn Methyl-Phenylhydrazin, man zerlegt das Hydrazon dann durch wiederholtes Erwärmen mit Bcnz- aldehyd und läßt die verdunstete wässerige Lösung kristallisieren. Die Rhodeose dreht stark rechts, (y.)l) = + 75 — 77". 5. Hexosen, CßHi-^Oß. a) d-Olukose, Dextrose, Traubenzucker, Harnziicker, Stärke- zucker. Anhydrid, CeHj., O,. Hydrat, C, H,., Og + H., 0. -) ToUens und Borire, Über die Fukose. Ber. d. Deutsch, choni. Ges. Jg. 42. S. 2009 (19091. -) ^'otocek in r. Lippmanns Chemie der Zuckerarten. 8.193 (1904). Verschiedene Berichte der Versuchsstation für Zuckerindustrie in Prag. •') F. Salomon, Die Stärke und ihre Verwandlungen unter dem Einfluß anorga- nischer und organischer Säuren. .Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 28. S. 82 (1883). 72 B. Tollens. Die gewöhnliche oder d-Glukose wird aus Stärke in großem ]\Iaß- stabe durch Hydrolyse mit verdünnter Schwefelsäure mit oder ohne Druck dargestellt, und hierüber möge man die betreffenden Lehr- und Handbücher nachlesen. Siehe auch Salomon^) und Tollens.-) Handelt es sich darum, käuflichen rohen Stärke zu cker zu rei- nigen, so wählt man sich eine möglichst gut -kristallinische Sorte, schmilzt diese unter vorsichtigem Erwärmen in \/^ ihres Crewichtes Wasser, setzt der heißen Flüssigkeit ihr doppeltes Volum an starkem Alkohol zu, er- wärmt mit Blutkohle in einer Flasche am Rückflußkühler, filtriert durch den Heißwassertrichter, bringt nach dem Erkalten etwas Glukose- Anhy- drid ein und läßt an einem mäßig warmen Orte unter häufigem Umrühren einige Tage stehen. Der ausgeschiedene Zucker (meistens Anhydrid, zuweilen auch Hydrat) wird dann abgesogen, mit etwas Alkohol, dann Äther nachge- waschen und an der Luft getrocknet. Man kann mit Vorteil auch Methyl- alkohol zum L'mkristallisieren verwenden (Soxhlet). Hat man das Hydrat und wünscht hieraus durch Trocknen An- hydrid zu erhalten, so darf man nur sehr langsam das Hydrat er- hitzen (etwa in dünner Schicht in einem Wassertrockenschrank , der erst im Laufe einiger Stunden von der gewöhnlichen Temperatur auf GO kommt), denn sonst schmilzt oder sintert das Hydrat und verliert das Wasser nur unvollständig und bräunt sich später. Ist das Wasser fast fortgetrieben, kann man den Zucker ohne Schaden auf 90 — 100" kommen lassen. Ivleinere Mengen Glukose kann man aus llohrzucker, welcher mit starken Säuren in Berührung in Glukose und Fruktose zerfällt, nach dem Vor- gange z. B. von Schwarz, Müller, Otto und neuerdings Soxhlet'-*) darstellen. Nach Soxhlet^) rührt man in eine Mischung von VI l Alkohol von 90» Tr. mit 480 cm^ Salzsäure von 1-19 spezifischem Gewicht bei 45« all- mählich Akg liohrzuckerpulver ein. Nach einigen Stunden ist der Zucker gelöst und in Invertzucker verwandelt. Man läßt erkalten und rührt etwas reine Glukose ein, wo- durch die Kristallisation angeregt wird. Nach 1 — 2 Tagen ist viel Glukose ausgeschieden; sie wird abgesogen, mit starkem und zuletzt absolutem Al- kohol abgewaschen und darauf aus starkem Alkohol (Müller, Otto) oder aus Methylalkohol (Soxhlet) umkristallisiert. Auch aus im Handel vorkommendem eingedickten W^einmost, welcher allmählich kristallisiert, kann man reine Glukose gewinnen, indem man die dick gewordene Masse auf Ton abtrocknen läßt und sie dann um- kristaUisiert. *) B. Tollens, Über das Verhalten der Stärke bei der Hydrolyse mit ziemlich konzentrierter Schwefelsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 39. S. 2190 (1906). '^) F. Soxhlet, Das Verhalten der Zuckerarteu zu alkalischen Kupfer- und Queck- silberlösungen. Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 21. S. 242, 245 (1880). Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerartcu d. Tier- u. rtlanzeareichs. 73 Die Darstellung- von Glukose aus diabetischem Harn gelingt leicht, wenn der Harn vier oder mehr Prozent Glukose enthiilt. Mau dampft zum dünnen Sirup ab, erwärmt diesen mit starkem Alkohol, welcher Salze und amorphe Substanzen hintei-läßt, dampft wieder ab, läßt kristal- lisieren, extrahiert aus der al)gesogenen Masse mit starkem kalten Alkohol den Harnstoff und reinigt die Masse durch Umkristallisieren , und zwar wohl auch, nachdem man mit etwas Bleiessig Beimengungen beseitigt und das überschüssige Blei mit Schwefehvasserstoff entfernt hat. Wenig (ilu- kose haltender diabetischer Harn eignet sich nicht gut zur (tlukosedar- steUung, weil das nie fehlende Kochsalz leicht mit der Glukose in Ver- l)indung auskristallisiert und die Trennung beider Stoffe schwierig ist. Reaktion der Acetylierung. Liehermnnns Acetatreaktion. Hauptsächlich zum Zweck der Darstellung vonAcetaten, jedoch wohl auch zu analytischen Zwecken, um z. B. die betreffenden Stoffe durch die Eigen- schaften ihrer Acetate zu identifizieren , wird bei allen Zuckerarten die Lithermann^ohQ, Methode der Acetylierung angewandt. Wenn man Kohlenhydrate mit Essigsäureanh} drid erhitzt, tritt teil- weise Bildung von Acetat des Kohlenhydrats ein, dies wird durch Zusatz anderer (als Katalysatoren zu betrachtenden) Stoffe sehr beschleunigt. Am besten eignet sich nach Liebermann ^) und Hörmann sowie Herz- feld^) bei den Zuckerarten hierzu das entwässerte Natriumacetat; man kann statt dessen oder auch mit demselben zugleich auch ein Stückchen wasserfreies Chlorzink oder nach Franchimont-') einen Tropfen kon- zentrierte Schwefelsäure nehmen. Es bilden sich auf diese Weise Acetate mit so viel Essigsäuregruppen, wie möglich ist, indem in jedes Hydroxyl des Zuckers 1 Molekül Acetyl statt des Wasserstoffes eintritt. Glukose gibt auf diese Weise das Pentacetat, in dem entweder der Wasserstoff des Karbonyls untätig bleibt, oder die Konstitution des Acetats eine andere als diejenige der Glukose ist. *) Je nach der Art des Operierens können sich verschiedene Modifikationen der Acetate bilden, so bei Glukose das bei loO" schmelzende a-Penta- *) C. Liehermatui und 0. Hönnarui , l'ber die Formeln d(■^? Rhamiietiiis und Xun- thorhamnins. Ber. d. Deutsch, cliein. Gesellsch. Jg. 11. S. 1(31H (1878). ^) A. Herzfeld, Acetylierung einiger Kohlehydrate nach dem Liebermannschen Verfahren. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 13. S. 265 (1880). ä) Ä. P. N. Franchimont, Über die Acetylderivate der CcUulose. Ber. d. Deutsch, «hem. Gesellsch. Jg. 14. S. 1290 (1881). *) Siehe z. B. Ä. P. N. Franchimont , Über Kohlehydrate und über die Pentaace- tate der Glukose. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 12. S. 1940 (1879); Jg. 25. Ref. S. 911 (1892); Wilhelm Königs und Eduard Knorr , Über einige Derivate des Trauben- zuckers und der Galaktose. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 34. S. 974 (1901); C. Tanret , Sur les öthers acetiques de queliiues Sucres. Bull. Soc. chim. [3]. 'P. 13. p. 268 (1895). 74 B. Tollens. acetat M, (a)D=+3•66^ das bei 86*^ schmelzende ß-Pentaacetat, (a)D = = + 590, und das bei IIP schmelzende y-Pentaacetat, (a)D=: + lOl-Tö". welche zum Teil ineinander umgewandelt werden können und auf diese Weise besonders die y-Modifikation entstehen lassen. Zur Gewinnung des a-Glukose-Pentaacetats gibt Tanret folgende Vorschrift : 3 g Glukose-Anhydrid, l'b g Natriumacetat (wasserfrei), \2'g Essigsäure-Anhydrid werden in einem Fläschchen am Pdlckflulikühler auf etwas über 100" und bis die Pteaktion beginnt, und dann noch ca. 1/2 Stunde gelinde erhitzt. Dann läßt man erkalten, setzt Wasser dazu und zerreibt die blasse unter Zusatz von Soda bis zur Sättigung. Das gefällte und mit Wasser ge- w^aschene Glukoseacetat wird getrocknet und aus Alkohol von 95" Tr. umkristaUisiert, bis Schmelzpunkt und spezifische Drehung sich nicht mehr ändern. ß) Maimose, Seminose, CöHjgOe. Die Mann ose findet sich vielfach in harten Samen, wie Datteln, Kaffeebohnen etc. iVls Material zu ihrer Darstellung dienen am besten die Späne, welche beim Drehen von Knöpfen aus den Steinnüssen, den harten Samen von Phytelephas- und Coelococcusarten, alifallen. Nach der bewährten Vorschrift von E.Fischer und Hirschherger -) erhitzt man 1 Teil Steinnußspäne mit 2 Teilen (iVoirf'i" Salzsäure (spezifisches Gewicht POo) in einer Flasche mit Itückflußrohr 6 Stunden lang im siedenden Wasserliade, nutscht dann ab, wäscht den Piückstand mit etwas Wasser nach, neutralisiert die gesammelte Flüssigkeit mit Natriumkarbonat oder Natronlauge, erwärmt mit Bhitkohle, filtriert und versetzt mit gegen 30Vo ^^^ Steinnüsse an mit Essigsäure gesättigtem Phenylhydrazin. Bald scheidet sich eine dicke Masse von Mannose-Phenylhydrazon ab, welche am folgenden Tage abgesogen, gewaschen und getrocknet wird. Man kann das Hydrazon aus öO^/oigem Alkohol (mit etwas Pyridin) Um- kristallisieren, doch kann man auch aus dem rohen Hydrazon Mannose darstellen und das schwierige Umkristallisieren des schwer löslichen Hy- drazons vermeiden. Man erwärmt (siehe Fukose) bO g des Hydrazons, 40// Benzaldehyd »), 50 .<7 Alkohol und 50 ,9 Wasser im Kolben am Pvückflußkühler im Wasser- bade ca. V2 Stunde lang. Sobald sich die ganze Masse in das fein kristal- linische Benzaldehvd-Phenvlhvdrazon umgewandelt hat, läßt man er- >) Diese Zahlen bcfiiulen sich in Tanrets Abhandlung, im Luch von v. Lippmann sind die Modifikationen anders bezeichnet. 2) Emil Fischer und Joaef Hirschherger, Über Mannose IV. Bor. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. ,Jg. 22. S. 3218 (1889). ^) Siehe Dui/vene de Witt und Herzfeld, Verfahren zur Darstellung von Mannose. Zeitschr. d. \av. d. Deutsch. Zuckerindustrie. Jg. 1895. II. S. 75)4. Darstell, u. Gewinnung d. hauptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 75 kalten, saugt die Flüssigkeit ab, schüttelt sie mit Äther aus, entfärbt sie mit Blutkohle, verdunstet usw., wie es bei Fukose angegeben ist. Der wenig gefärbte Sirup kristallisiert kaum von selbst, wohl aber nach dem Impfen mit etwas nach dem Verfahren von van Ekenstein ^) her- gestellter kristallisierter Mannose. Solche kristallisierte Mannose hat van Ekenstein^) erhalten, in- dem er Mannosesirup in Methylalkohol löste, ein halbes Volum Äther hinzugal), am folgenden Tage vom ausgeschiedenen Sirup abgoß und die ätherisch-methylalkoholische Lösung längere Zeit stehen ließ. Auch Herz- feld w\\({ Rosi~) haben sie erhalten, ebenfalls Neuherg und Maf/er^), und auch mir ist es gelungen. ^lan bringt den schließlich erhaltenen Brei auf Ton und kristallisiert die schon fast reine Mannose um. Nach Bourquelot und Herissey^) erhält man Mannose vorteilhaft aus den Samen der Palme Phoenix canariense, nach Herissey^) u. a. aus Johannisbrotsamen sowohl durch Säuren als auch durch die in den Samen enthaltenen Enzyme. Y) (l-Gahikto8e, CfiHi.^Oß. (Früher wurde sie häufig Laktose genannt, jetzt versteht man unter „Laktose- den Milchzucker.) Man erhält sie durch Hydrolyse des Milchzuckers, welcher zu Glukose und Galaktose zerfäUt: C1.3 Ho., ()„ . H., 0 = Ce H, ., 0, + C, H, ., (), Milchzucker Glukose Galaktose. Die Hydrolyse geschieht meistens mit Schwefelsäure, und nach Ost^) erhitzt man 1 Teil Milchzucker mit 10 Teilen 2"/oi8er Schwefelsäure 4 Stunden im kochenden Wasserbade, worauf sich nach dem Impfen in einigen Tagen ein Teil der entstandenen Galaktose in Krusten abscheidet. Nach Soxhlef^), lündell^), Kent und Tollens^) und Anderen entfernt man nach der Hvdrolvse erst die Schwefelsäure mit Calcium- oder Barvum- 1) vaii Ekenstein, Rec. d. trav. d. Pays-Bas. T. 14. pag. 329 (1896). ^) HerzfeJcl und Böse, s. r. Lippmann, Die Chemie der Zuckerarten. S. 651 (1904:). ^) C. Neuherg und P. Mayer , Über kristallisierte d-Mannose. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 545 (1903). ■*) Em. Bourquelot und H. Hrrissei/, Sur la composition de Talbumen de la graine de Phoenix canariensis et sur les phenomenes chimiques ([ui accompagnent la germina- tion de cette graine. Compt rend. T. 133. p. 302 (1901). '") H. Herissei/ , Tnfluence du flourure de sodium sur la saccharification par la s6minase des hydrates de carbone contenus dans les albumens cornes des graines de lögumiueuses. Compt. rend. T. 133. p.49 (1901). ^) H. Ost, Die Bestimmung der Zuckerarten mit Kupferkaliumkarbonatlösung IL Ber. d. Deutsch, chem. Gesellsch. Jg. 23. S. 3006 (1890). ') F. So.rhlet, Das Verhalten der Zuckerarten zu alkalischen Kupfer- und (Jueck- silberlösungen. Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 21. S. 269 (1880). ^) Scheiblers neue Zeitschr. f. Rübenzuckeriudustrie. Bd. 4. S. 163. ^) W. H Kent und B. ToUens, Untersuchungen über Milchzucker und Galaktose. Ann. Chem. Vol. 227. p. 224 (1885). 76 B. Tollens. karbonat, dampft ein und impft mit etwas Galaktose. Die allmählich ab- geschiedenen Kristalle werden abgepreßt und umkristalUsiert, indem man sie mit wenig Wasser schmilzt und dann diese Lösung mit Alkohol ver- mischt. Die Galaktose kristallisiert leichter und schneller als die meisten anderen Glykosen. Auch durch Kochen von Mijlchz ucker mit schwacher Salzsäure, bis sich die spezifische Drehung nicht mehr ändert, und Verdunsten der Lösung auf dem Wasserbade im A'akuum labt sich ein nach Lnpfung mit Galak to se kristal- lisierender Sirup und durch Umkristallisieren reine (ralaktose gewinnen. S) d-Fruktose, Lävulose, Fruchtzucker, CgHioOe, Diese Ketohexose erhält man leicht aus dem Inulin der Dahlien- oder Georginenknollen durch Hydrolyse mit sehr verdünnter Schwefel- oder Salzsäure, wobei man bedenken muß. daß die Fruktose sehr leicht durch Säuren zersetzt wird, und man daher nur kurze Zeit erhitzen darf. Nach Honig und Jesser^) erhitzt man 1 Teil Inulin mit 5 Teilen einer VoVoiS'^ii Schwefelsäure höchstens 1 Stunde lang im Wasserbade, entfernt die Schwefelsäure mitBaryumkarbonat. dunstet das Filtrat ein. erwärmt den Sirup mit starkem Alkohol, gießt die erkaltete Flüssigkeit nach einigem Stehen vom abgeschiedenen Sirup ab und impft mit kristallisierter Fruktose. Ost'^) erhitzt 100 rj Inulin mit 250^ Wasser und V2 5' Salzsäure 1/2 Stunde im Wasserbade, neutraUsiert mit V2// Mono-Natriumkarbonat, dunstet ein, extrahiert mit absolutem Alkohol, gießt nachher vom Sirup ab, impft usav. L^m aus Gemengen anderer Zuckerarten mit Fruktose die letztere zu gewinnen, benutzt man die Eigenschaft der Fruktose, mit Kalk eine schwer lösliche Verbindung zu liefern. Man befolgt zur Darstellung von Fruktose aus Invertzucker, d.h. dem Gemenge von Glukose und Fruk- tose, welches aus Rohrzucker entsteht (s. unten), am besten die alte Vorschrift von Duhrunfaut^), Avelche Girard*) etwas vervollständigt hat. In eine Lösung von 10^ Invertzucker in lOOcw?^ Wasser, welche in Eiswasser gekühlt ist, rührt man Gg Kalkhydratpulver. Dies löst sich bald auf, und allmählich erstarrt die kalt gehaltene blasse zu einem kristal- linischen Brei von Calciumfructosat, CßHia Og . Ca(OH)o, mit, je nach den Autoren (Feligot sowie Herzfeld und Winter), 2 — 5 oder mehr Molekülen Hg 0. Man preßt dies aus, rührt mit Wasser an und preßt wieder aus, oder man schleudert die Flüssigkeiten in einer Zentrifuge fort, sättigt die wieder mit Wasser zerrührte Masse mit Kohlensäure, Oxalsäure oder Schwefel- säure, saugt ab und verdunstet die Flüssigkeit zum Sirup, aus welchem man die kristallinische Fruktose gewinnen kann. *). M. Honig und L. Jesser, Zur Kenntnis der Kohlehydrate. Ber. d. AViener Akad. Bd. 97 II. S. 534. ' ^) H. Ost, Die Bestimmung der Zuckerarten mit Kupferkaliumkarbonatlösung 11. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 3006 (1890). ^J M. Dubrunfaut, Note sur le sucre interverti. Compt. rend. T. 42. p. 901 (1856). *) Charles Girard , Pröparation de la lävulose pure. Bulletin Soc. chim. [2.] T. 33. p. 154. Darstcll. u. Gewinnung d. liaiiptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. 77 Im ijToßen Malistahe wird Fruktose von Sclu'riii^s Fuhi'ik aus Melasse durch Iiivorsiou des darin entlialteueu Kolirzuckers und nachfolgen- der Fällung mit Kalk hergestellt.') Sorbose, Sorlniiose (früher Sorbin genannt), CeHiaOß. Als Beispiel eines Zuckers, welcher anscheinend nicht als solcher in der Natur vorkommt, wohl aber leicht durch oxydierende Pilztätigkeit entsteht, möge die Sorbose kui-z genannt werden. Sie entsteht beim längeren Stehen des Saftes der N'ogelbeeren (Sorbus Ancuparia) aus dem entsprechenden Owertigen Alkohol, dem Sorbit. CßHi^Og, indem sich der Pilz Bacterium xylinum ansiedelt und durch Übertragung von 1 Atom Sauerstoff 2 H aus dem Sorbit, C'.jHiiO«, entfernt. Von Pelouze, DeJfs, Vincent, Freund ist sie früher untersucht, \uu\ Bertrand -) hat die Art ihrer Entstehung klargestellt. Sorbit ist (wie die Fruktose) eine Ketose, d. h. sie enthält nicht die Endgruppe C'OH, sondern eine mittelständige Gruppe CO. Die Sorbose ist hnksdrehend, ('/)D = — 4;)", und ihre Eigenschaften sind denjenigen der Fruktose in manchem ähnlich, so gibt sie mit Uesorzin und Salzsäure dieselbe Botfärbung. Wie Bertrand'^) fand, werden auch andere Alkohole der Zuckergruppe durch das Bacterium xylinum zu den betreffenden 2 H weniger enthalten- den Ketosen oxydiert. Zur Bereitung von Sorbose impft man mit Bacterium xylinum a) eine einige Prozente Sorbit enthaltende Lösung von (Yl fo///') eili;ilt man eine fast totale rniwand- luuii' von Stärke in Maltose, wenn man das Malz bei oÜ^C wirken lädt. und dies wird durch kleine Mengen Säure beschleunigt. (Siehe auch Maquennc und Roux.^) Soxhlef'-^), Herzfdd*) u. a. haben Vorschriften zui- Maltosedarstel- lung gegeben. Nach Herzfeld verarbeitet man \hf Stärke mit Wasser zu 10/ Kleister und digeriert diesen mit einem filtrierten Aufgul) von 200// I)a?T- malz in 1 / Wassei- mindestens eine Stunde lang bei 57 (')()"('. kocht auf, filtriert, verdampft zum dünnen Sirup und erhält aus diesem durch syste- matisches Ausziehen mit Alkohol welcher die Dextrine als Sirup ausfällt und die Maltose löst, Sirupe, welche allmählich kristallisieren. Man preßt die mit Methylalkohol angerührten kristalhnischen Massen und reinigt die Maltose durch Umkristallisieren aus Äthyl- oder Methylalkohol. /) Trehalose, Mykose, ('.aHaoOn +2H., (). Diese sich durch die Fähigkeit, scdiöne, harte Ki'istaHe zu bilden. sehr von der ^laltose unterscheidende Zuckerart hat die Formel dei' Maltose mit Zusatz von I Mol. ILO, und sie hefert. wie jene, bei der Hydrolyse, 2 Mol. d-(ilukose. Sie hat aber jedenfalls eine andere innere Konstitution, weil sie nicht reduziert, und weil die Hydrolyse mii- langsam und mit starker S-iure auszuführen ist. Sie ist zuerst von Wlgc/ns'") und MUsvlicrltcli^') aus dem Mutter- korn gewonnen imd von Berthelot'') in beträchtlicher Menge in der Tre- hala-Manua, den Cocons eines in Tersien vorkommenden Uüsselkäfers *) Ä. Fcnilxtch und ./. WoJß', Sur la transfoniiation presiiiic iiitei,'iale oii maitose des dextrines provenants de la saccharification de ramidou. Conipt. rend. T. 142. p. 121G (lyoC)). ") J,. Maqncnne und Eufj. RoK.r , Sur la Constitution, la saccharification et la retrogradation des cmpois de föcule. Bull. Soc. C'him. (3). T. 33. p. 723 (lüOr)): ('onii>t. rend. T. 142. p. 124 (19U6). ") /''. So.rlilct, Das Vorhalten der Znckerartou zu alkalischon Kupfor- und (^»ucck- silherlösuugen. Journ. f. prakt. Choniie. (2.) Bd. 21. S. 274 (1880). •*) A. Herzfeld, Über Maltose. Annal. Cheni. \ nl. 220. p. 200. 5) Wii/f/crs, Annal. Chem. Pharm. Bd. 1. 8. 173. Anni. (1832). *) Mifsr/irrlicJi, Über dio Mykose, den Zucker dos .Mutterkorns, .lourn. f. prakt. Chemie. (1.) Bd. 73. S. ()5 (1808). ') Berthelot, Annal. cliiiii. phys. (3). T. öö. p. 272 (1809). -•Vbdcrh ;i 1 de n , Haudbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. Ö 82 B. Tolleus. aufgefunden; Muntz^), Bourquelot-), Winterstein ^) fanden sie neuerdings in vielen Pilzen. Die Darstellung ist sehr einfach. Man kocht die Pilze sowohl als auch die Trehala mit starkem Alkohol mehrfach aus und läßt die leicht kristallisierbare Treh alose sich aus den Filtraten abscheiden. Aus Tre- hala erhält man bis 20Voi ^^^ frischem Steinpilz (Boletus ediüis) zirka I^/q, aus getrockneten Pilzen weniger, indem in getrockneten Pilzen anstatt eines verschwundenen Anteiles der Trehalose sich Mannit finden kann. Übri- gens erhielt Muntz aus trockenem Fliegenpilz gegen lO^o Trehalose. h 3Iilchzucker, Laktose, C12H.22O1., + H.O. Der Milchzucker wird im großen in Fabriken aus Molken, welche bei der Labkäserei abfallen, durch Aufkochen, Pteinigen, Abdampfen im Vakuum, Kristallisieren dargestellt. Zur Darstellung im kleinen kocht man die aus Magermilch durch Zusatz von Labpulver oder Labessenz erhaltenen, vom frischen Käse abgeseihten Molken auf, filtriert vom gefällten Albumin ab, setzt etwas Calciumkarbonat zu und dunstet auf dem Wasserbade zum dünnen Sirup ein. Der nach einiger Zeit auskristallisierte Milchzucker wird abgepreßt. in Wasser gelöst, die Lösung mit wenig Aluminiumsulfat und Cal- ciumkarbonat, dann mit Dlutkohle erwärmt, filtriert, verdunstet und kristallisiert. (Siehe EugJing und RüfJ) C. Tri- und Polysaccharide. 7.) Raffiiiose, Melitose, Melitriose, Grossypose, CisHooOie-föH^O. Diese im Baum wollsamen wadi Ritthausen^) \md Bahn '^), in der Pvübe nmelasse nach Loiseau'^). Tollens^) und Eischbieth. Scheihler, 1) A. Muntz, Ber. d. Deutsch, cliem. Gesellsch. Jg. 6. S. 451 (1873). ^) Em. Bourqiielot z. B. Siir le trehalose des Champignons ä jiropos d'une note de M. Wintersfein. Bnll. Soc. chim. (3.) T. 11. p. 353. ^) E. Winterstein, Zur Kenntnis der Trehalose. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 26. S. 3094 (1893). *) W. Euyling und E. Ri(f, Üher Gewinnung von rohem und raffiniertem Milch- zucker. Biedermanns Zentralbl. f. Agrikulturchemie. Jg. 1882. S. 34G. ^) H. Bitthansen, Über Melitose aus Baumwollsamen. Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 29. S. 351 (1884). ^) BöJuna.liei JI. Bitthausen und Feli.r Weger, Über Betain aus Preßrückständen der Baumwollsameu. Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 30. S. 37(1884). "') D. Loiseati , Sur une nouvelle substauce organique cristallisöe. Compt. rend. T. 82. p. 1058 (1876); Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 9. S. 732 (1876). *) B. Tollens, Über Raffinose (Melitose?), eine hochpolarisierende Zuckerart aus der Melasse. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 26, 2611 (1885). — P. Bischhieth und B. Tollens, Versuche mit Melasse und Baumwoll-Raffinose. Ann. Chem. Vol. 232. p. 173 (1885). Darstell, u. Gewinnung d. liaiiptsächl. Zuckerarten d. Tier- u. Pflanzenreichs. §3 V. Lippnionn^), Herzfeld und Anderen, und in der Eucalyptus- Manna aus Tasmanien nach Berthelot-) und nach Tollem und Rischhieth sowie Scheibler vorkommende Zuckerart läßt sich am leichtesten aus auskristal- lisierter sogenannter „R e s t m e 1 a s s e" der S t r o n t i u m -Z u c k e r- f a b r i k e u rein darstellen. Sie findet sich in sehr geringer Menge in den Zuckerrüben, und, wenn aus dem Kübensafte der Rohrzucker gewonnen wird. hiUt die Mutterlauge . d. h. die Melasse, mehr Ratfinose als der ursprüng- Kche Rübensaft. In einigen Zuckerraffinerien werden aus der Melasse Zucker und R affin ose mit Strontiumhydroxyd ausgefällt und abfiltriert. Wenn aus diesem in Wasser suspendierten und mit Kohlendioxyd zersetzten Saccha- rate durch Absaugen eine Zuckerlösung gewonnen und diese eingedampft wird, kristalUsiert der Rohrzucker aus und der ^luttersirup ist viel reicher an Raffinose als die urspi'üngliche Melasse, und wemi diese Ope- ration ein oder mehrmals wiederholt wird, resultiert schließlich die „Restmelasse'', welche 20 7q oder mehr Raffinose enthalten kann und im Laufe einiger Jahre sich mit Nadeln von Raffinose erfüllt {Tollens [siehe oben], v. Lippmann, Hersfeld). Man braucht, um die Raffinose zu ge- winnen, nur die auskristallisierte Masse nach Zusatz von etwas Alkohol und Wasser durch Pressen vom Sirup zu befreien und den Preßrückstand aus verdünntem Alkohol mit Kohle mehrfach umzukristallisieren. Auch die noch nicht auskristallisierte Strontian-Restmelasse ist nach verschiedenen Verfahren von Scheibler, Gunning , Stone u. a. zur Dar- stellung von Raffinose zu benutzen; es spielt hierbei der Umstand, daß Raffinose in wasserfreiem Methylalkohol viel löshcher ist als Rohrzucker, eine Rolle (siehe v. Lipj)mann. Zuckerarten, S. 1625). Aus Baum wo 11s am en erhält man nach den oben Genannten soA\ie Tollens Raffinose durch Extraktion mit Alkohol. Man erhitzt Baum- wollsamenmehl des Handels mit ungef-dir TOVoigeni Alkohol im Wasserbade am Rückflulikühler: vom abgepreßten Auszug wird der Alkohol abdestilliert, der Rückstand wird von Harz und Fett mechanisch sowie durch Ausschütteln mit Äther befreit und liefert durch Verdunsten Raff inosekri stalle, welche durch UmkristaUisieren gereinigt werden. Ähnlich, d. h. durch Extrahieren mit Alkohol usw., erhält man Raffinose ( Berthelots Meli tose) aus Eucalyptus- Manna. ß) Stachyose, Cg^ H,2 ().,i + 4 Ho 0. i\ls Beispiel der Darstellung einer drei oder nach Tanret vier Gruppen von je 6 C enthaltenden Zuckerart möge diejenige der Stachyose genannt werden. ^) Edmund 0. r. Lippmann, Über den sogenannten „Pluszucker" und über die Quelle der in den Produkten der Zuckerfabrikation enthaltenen Raffinose (Melitose). Zeitschr. d. Ver. d. d. Rüheuziickerindustrie. Jg. 1885. S. 257; Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd.l8. S.3Ü87; Ref. S. 188 (1885). ^) Berthelot, Ann. chim. phys. (3). T. 46. p. fi6 (185(5). 6'^ 84 B. Tolle ns. Darstell, u. Gewinnuug d. hauptsächl. Zuckerarteu etc. Stachyose findet sich nach E. Schulze'^) und v. Planta in den Knollen von Stachys tiiberifera und nach Tanref^) in den Mutter- laugen der Mannitgewinnuno- aus Eschen m a n n a. Tanret nannte sein Produkt vor der Feststellung' der Identität mit Stachyose „Manneote- trose^". Sie dreht stark rechts; (a) IJ des Hydrats = + 133.5°; sie liefert bei der Hydrolyse 2 Mol. Galaktose, 1 Mol. Glukose und 1 Mol. Fruktose (nach E. Schulze je 1 Mol. dieser Glykosen). Nach V. Planta und E. Schulze reinigt' man den Saft der Stachys- kn ollen durch Fällung erst mit Bleiessig, dann mit Quecksilbernitrat und Filtration, entfernt Blei und Quecksill)er mit Schwefelwasserstoff, neutralisiert mit Ammoniak, engt ein. fällt mit Alkohol unreine Stachyose als Sirup, löst diesen in AYasser und reinigt diese Lösung durch Fähung mit P h 0 s p h 0 r w 0 1 f r a m s ä u r e. Nach Entfernung des Niederschlages wird die Flüssigkeit mit Barytwasser und Kohlensäure von Phosphorwolfram- säure befreit, und das Filtrat liefert nach dem p]indunsten und dem Be- handeln mit Alkohol nach einiger Zeit kristalhsierte Stachyose. Tanret hat zur Darstellung der Stachyose die Eigenschaft vieler Kohlenhydrate, durch alkalische Basen mit Alkohol gefällt zu werden . l^emitzt. Er versetzte den mit Vio Volum Bleiessig heiß gefällten, vom Niederschlage abfiltrierten und mit verdihmter Schwefelsäure von Blei befreiten Stachys- saft (souie auch die Mannitmutterlaugen) mit Barytkristallen und Alkohol. Der Niederschlag ^^^rd in Wasser aufgeschwemmt und mit Kohlensäure behandelt, worauf das eingedunstete Filtrat durch Behandeln mit Alkohol kristalhsierte Stachyose liefert. 1) A.r. Planta \ii\A E. Schulze , Über ein neues kristallisierbares Kohlenliydrat; zur Kenntnis der Stachyose und über einige Bestandteile der Wurzelkuollen von Stachvs tubifera. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 1692 (1890); Jg. 24. S. 2705 (1891); Laudw. Vers.-Stat. Bd. 40. S. 277 (1892); Bd. 41. S. 123 (1893). '^) C. Tanret, Sur deux Sucres nouveaux retires de la manne , le mannöotetrose et le manninotriose. Composition de la manne. Sur le Stachyose. Bull. Soc. chim. (3). T. 27. p. 948 (1902); Bd. 29. p. 888(1903). B. Die mclitigsten Metlioden zum qualitativen Nach- weise der Zuckerarten. Von B. ToUens, Göttingen. a) Allgemeine Reaktionen. Zur Beantwortung der Frage, ob eine aus pflauzlichen oder tierischen Substanzen abgeschiedene Substanz ein Zucker oder ein Kohlehydrat ist oder diese enthält, prüft man wohl zuerst das Verhalten beim Er- hitzen im Reagenz röhr. Es kann ein Kohlenhydrat vorhanden sein, wenn Schwärzung und Verkohlung und ferner ein eigentümlich an verkohlende Weinsäure erinnernder süßlicher Geruch auftreten, welchen H. Scliiff einmal als „Karamellengeruch" bezeichnet hat. Die Zuckerarten zersetzen sich nämlich beim Erhitzen unter Ent- Avicklung mannig-facher Stoffe, ^^ie Kohlenoxyd, Kohlendioxyd, Ameisensäure, Essigsäure, Aceton, Kondensationsprodukten des letzteren, Furfurol, Alde- hyd usw., und diese besitzen zum Teil einen besonderen Geruch. Unter diesen Stoffen ist besonders das Furfurol, C5H4()2, hervorzuheben, wel- ches einen angenehmen, an Bittermandelöl erinnernden Geruch besitzt. Es ist in der kleinsten Menge leicht durch die schöne rote, von Schiff ent- deckte lieaktion mit Anilin- oder Xylidinacetat nachzuweisen, indem man ein Streif chen Filtrierpapier, auf welches ein Tropfen einer Lösung von Anilinacetat gebracht wurde, in die Mündung des Probierglases hält. Die Lösung von Anilinacetat stellt man am besten her, indem man gleiche Volume Anilin und Wasser in ein Probierrohr gibt und unter starkem Schütteln so lange tropfenweise Eisessig hinzufügt, bis die vor- her milchige Flüssigkeit plötzlich klar wird (ToUens). Wenn die Zuckerarten rein vorliegen, und auch, wenn sie in pflauz- lichen oder tierischen Stoffen, mit vielen anderen Substanzen zugleich, vorkommen, benutzt man zu ihrer Xachweisung verschiedene zum Teil recht empfindliche und charakteristische Reaktionen. b) Reduktionsreaktionen. Zuerst versucht man meistens, ob die den Glykoseu innewohnende Reduktionskraft gegenüber den alkalischen Metalllösungen oder auch ^) Hii(/o Schiß, Über Farbstoffbasea aus Furfurol. Zweite Abhandlung. Ann. Chem. Vol. 239. p. 380 (1887). 86 B- Tollens. gegenüber sonstigen Substanzen, welche, indem sie von den Zuckerarten reduziert werden, Farbenerscheinungen zeigen, vorhanden ist. Diese Reduktionswirkungen zeigen die Mono-Saccharide, d.h. die Glykosen, seien es Pentosen, Hexosen usw., direkt. Die Di-, Tri- und Polysaccharide äußern sie teilweise, wie Milchzucker und Mal- tose, direkt, meistens jedoch erst nach der durch Erhitzen mit Säuren oder durch Enzyme bewirkten Hydrolyse ; man erhitzt zu diesem Zwecke die betreffende Flüssigkeit mit ca. 1/20 ihres Volums an konzentrierter Salzsäure 5 Minuten oder auch länger im kochenden Wasserbade, neutralisiert die ab- gekühlte Flüssigkeit mit Sodalösung und prüft mit Fehling&chev Lösung. Gut ist es, beim Prüfen von Flüssigkeiten, welche neben Zucker viele andere Stoffe enthalten, vor der eigentlichen Reaktion eine Reinigung statt- finden zu lassen oder aber den Zucker möglichst vorher in einem kleinen Quantum Substanz zu konzentrieren (siehe z. B. Glukose im Harn). Außer den alkalischen Kupferlösungen (Fehlingsche Lösung, Trommersche Probe etc.) und den schwach säuerlichen Kupferlösungen, welche zum Teü als Barfoedsche oder Sohlainische Lösungen bekannt sind, und welche in einem anderen Teile dieses Handbuches beschrieben werden, ist zuerst die alkalische Quecksilberlösung, welche von Knapp'^) und von E. Sachsse ^) empfohlen wird, zu erwähnen. Sachsse löst in einer wässerigen Lösung von 25 g Jodkalium. 18 ^ Quecksilberjodid auf; setzt 50 g Kaliumhydroxyd zu und füllt zu 1 l auf. Die klare Lösung gibt mit der Zuckerlösung beim Erwärmen eine graue Trüluing von Quecksilber. Alkalische Wismutlösungen geben einen schwarzen Niederschlag; man setzt entweder der zu prüfenden Flüssigkeit, z.B. Harn, etwas Na- tronlauge und sehr Avenig weißes basisches Wismutnitrat zu und erwärmt zum Kochen, worauf Schwarzfärbung des Absatzes die Gegen- wart selbst von Spuren Zucker anzeigt, oder man wendet vorher bereitete alkalische Wismutlösungen an. So stellt Nylander^) sein längere Zeit haltbares Wismutreagenz aus 2 g basischem Wismutnitrat, 4 g Seignettesalz und 100 g SVoi&ei' Natron- lauge her. Über die Verwendung der Nylander^dhQw (nach Hammarsteu besser Ahnen^ohe genannten) Lösung berichtet Hammarsteu.-^) Man soll 1 cm^ Reagenzlösung und 10 cm^ Harn 2 bis 5 Minuten lang im Reagenzglase über einer Hamme kochen, dann 5 Minuten stehen lassen und beobachten, ob ein schwarzes Sediment sich gebildet hat. ^) Carl Kuapj), Über eine neue Methode zur Bestimmung des Traubenzuckers. Ann. Chem. Vol. 154. p. 252 (1870). 2) B.SacJisse, Die Farbstoffe und Kohlenhydrate. Leipzig, Voss. S. 213 (1877). ^) Emil Nißcnider, Über alkalische Wismutlösung als Reagens auf Traubenzucker im Harne. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 8. S. 175 (1884). ^) Olof HciDiiiinrsfeii, Vergleichende Untersuchungen über den Wert der Almen- schen Wismutprobe und der Wo;-/«-.V/7ZZerschen Kupferprol)e bei der Untersuchung des Harnes auf Zucker. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 50. S. 45, 64 (1906/1907). Die wichtigsten Methoden zum qualitativen Nachweise der Zuckerarten. g7 Das Eintreten der Eeaktion im Harn soll nach Bcchhohl^) dni'cli sehr geriniie Meni^en Quecksilber (so nach hilufiiiem Berühren der Hände mit kSuMimatlösimg) verhindert werden ; dies ist nach Hamiiiarsten -) nicht der Fall. Brücke^) wendet eine Lösunji' von Wismutnitrat und Jodkalium in Salzsäure an, mit welcher aus dem Harn erst Eiweiß etc. ausfällt. Dem Filtrat von diesem Niederschlag setzt er Natronlauge zu und kocht. Bei Gegenwart von Glukose färbt sich der bei Zusatz von Natron entstandene weibe Niedersclilag grau bis schwärzlich. Sehr leicht werden ammon-alkalisehe Silberlösungen (siehe Tollens^) von reduzierenden Zuckerarten schon in der Kälte grau oder schwarz gefärbt, und zuweilen setzt sich das Silber als Spiegel an das Glas. Da ammon-alkalische Silberlösungen jedoch ebenfalls von Alde- hyden und vielen anderen Stoffen leicht reduziert werden, darf man nicht eher auf die Gegenwart von Zucker schließen, als bis man sich von der Abwesenheit dieser anderen Stoffe überzeugt hat. Bei Gegenwart von Alkali werden auch Gold- und Platinlösungen durch Glykosen reduziert, ebenfalls Eisenchlorid (zu Ferrosalz) und Nickel- und Kobaltsalz, ferner wird durch Glykose molybdänsaures x\mmonium mit blauer Farbe reduziert, ebenfalls Methylenblau. Man sehe über diese und andere hierher gehörende lleaktionen die Bücher von V. Lipjmiann und ToUens nach. c) Phenylhydrazinreaktionen. Sehr wichtig sind zur Auffindung und Unterscheidung der Zucker- arten die von E. Fischer in die Wissenschaft eingeführten Phenyl- hydrazine, und zwar sowohl das Phenylhydrazin, CgHäNH.NH selbst als auch die asymmetrisch substituierten Phenylhydrazine, wie Methyl-Phenylhydrazin, ^J^^s)N.NH2. Benzvl-Phenvlhvdrazin, ^^ S^^N . NH„ C H Diphenylhydrazin, .^^ tt'' /N . NH2, Para-Brom-Phenvlhvdraziu, &2'tj >N.NHo, ■^ - Cy H4 Br/ G H ferner Naphtvl-Phenvlhvdrazin, p''„^%N.Mlo usw. " " " '^s ^7 ') H. Bechhold, Die Hemmung der Xt/landcr^G\\Qn Zuckerroaktion bei (Jueck- silbor- und Chloroformharn. Zeitsdir. f. physiol. Chem. Bd. 40. S. 371 (1905). '-') (Hof II(niuiuirs/( II , \'ei'gleichcndo Untersuchungen iilicr den Wert der AlDii'n- schan Wismutprobe und der Worm-MüUcr^chen Kupferprobe bei der Untersuchung des Harnes auf Zucker. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 50. S. 72 (U)0(; 1907). '*) Ernst Brücke, l'ber eine neue Art, die Böfh/ersche Zuckerjjrobe anzustellen. Zeitschr. f. anal. Chem. Bd. 15. S. 100 (1876); Wien. Akad. Ber. Bd. 72. |3.] S.20. *) B. Toll CHS, Über ammoniakalische Silberlösiing als Reagens auf Aldehyd und über das Verhalten der Dextrose zur ammoniakalisclion Sillierlösung. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 15. S. 1635(1882); ebenda .Fg. 10. S. 921 (1883). 88 B. Tollens. Wie S. 57 schon angeführt wurde, tritt beim Zusammenbringen von Glykosen mit Phenylhydrazin zuerst die Bildung von Phenylhydra- zonen ein, indem 0 des Zuckers sich mit Hg des Phenylhvdrazinstickstoffs zu H.2 0 verlnndet. So gibt Mannose nach Ce H,2 Oc + NH, . NH . C, H, = C, H,^ O5 : N . NH . C, H^ Mannose Phenylhydrazin Mannose-Phenylhydrazin das sehr schwer lösliche Phenylhydrazon, CisHigNaOg. Glukose, Galaktose, Arabinose, Pvhamnose geben zwar analoge Hydra- zone, diese sind aber fast siinitlich leichter lösUch; übrigens eignen sie sich zuweilen zur Auffindung der l)etreffenden Zuckerarten (siehe diese). Die substituierten Phenylhydrazine bilden Hydrazone, welche meistens schwerer löslich sind als die Hydrazone des einfachen Phenyl- hydrazins, und welche zuweilen zur Auffindung von Zuckerarten brauch- bar sind. So bildet nach Neuherg^), Müther"-), Maurenbrecher und ToUens^), Votocek*)\]i. a. die Abscheidung der Arabinose als Di-Phenyl-Hydrazon das beste Mittel zur ( Gewinnung und sicheren Nachweisung der verschie- denen Modifikationen dieser (Mykose. Zur qualitativen Auffindung der Zuckerarten ist jedoch besonders die meistens in der Wärme eintretende „Osazonbildung" brauchbar. Zu 1 Mol. der Zucker treten 2 Mol. der Phenylhydrazine, indem 2 Mol. HgOund weiter 2 Atome Wasserstoff (welcher anderweitig verwertet wird) austreten. So entstehen z. B. CgH.oG, (X.XH.CoHj., oder CisH-^^N^O, Glukose-Phenylosazon oder Glukosazou CBHsOafN.NH.C^H^)., oder Ci^H^oN^Og Arabinose-Phenylhydrazon oder Arabinosazon. Diese Osazone sind meistens in kaltem oder auch heißem Wasser recht schwer löslich, sie lassen sich durch Umkristallisieren reinigen, und sie sind durch ganz bestimmte Schmelzpunkte (richtiger wohl Zersetzungs- punkte) charakterisiert. Sie zeigen teilweise auch bestimmte Kristallformen und ebenfalls verschiedenes Verhalten gegen das polarisierte Licht. ') C.Ncnherfi nmlJ. IVohlgemuth, Über das Verhalten stereoisomerer Substanzen im Tierkörper. I. Mitteilung. Über das Schicksal der 3 Arabinosen im Kaninebenharn; Carl Neubrrq, Über die Isolierung der Ketosen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 35. S. 31 (1902); Ber.'d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 35. S. 959 (1902). ^) A.Müther und B. Tollens , Über einige Hydrazone und ihre Schmelzpunkte. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 87. S. 312 (1904). ^) B. Tollens und A. D. Mavrcnhrccher , Über die Diphenylhydrazone der 1-Ara- binose und der Xylose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 38. S. 500. *) E. Votocek, Beiträge zur Unterscheidung von Zuckerarten. Chemiker-Ztg. Bd. 26. Kef. S.141 (1902); das. nach Chem. Listy. Vol. 26. p. 122 (1902). Die wichtigsten Metliodeii ziiin qualitativen Nachweise der Zuckeraiteu. ^{) Sie sind nach Neuhcr;/^) zum iiTolicn Toilo optisch aktiv, und dies ist zur hhuitifizicrunii- (h'i' bctrcftcudcu Zuckorartcn zu }i:ol)rauch('ii. Wenn uuiu nach Xcuhtn/ <>-_>y «Ici- Osazonc kalt in einem (icincn^^c von 4// Pyridin und (\ (j ai)S()lutem Alkohol löst und die Fliissiirkeit dann im lUÜ »/»'-Kohr im Kreisgradapparat beobachtet, findet man foly:cnde Winkeldrehuniien: I-Ai'aliinosepheiiyjdsazoii + PK)' l-Arabinose-p-broniplienylosazon . . + 0" 2H' Xylosephenylosazon — 0" lö' Xylose-p-bromphenylosazon . . . . +0" Rliamnosephenylosazon +l"i*4' d-Glukosephenylosazon - 1 «;»()' d-(ilukose-p-l)romphenylosazon . . . — O^vU' d-(ralaktoseplienylosazon + 0" 48' Sorbinosej)henylosazon — 0" lö' Maltosephenylosazon -f 1 o ;iO' Laktobiosephonylosazon + 0*^ Glukuronsaures p-bromphenylhydrazin — 7" 2öo ( L'ber Polarisation im alliicmeinen siehe später.) Wenn es sich darum handelt, die (Jsazone iiiiltel>t der reinen Zuckeralten darzustellen, benutzt man meistens die Oriiiinalvorschrift von E. Fischer'-), indem man lg Zucker, 2 g salzsaures Plicii \ Miyd raziii. ;■)// kristallisiertes Natriumacetat (C, H3 (), . Na + :> H, ()| und iH)// Wasser V4 bis P/o Stunden unter gelegenthchem rmrühren im kochenden Wasser- bade erhitzt. Am besten geschieht dies in grol'ien. zirka r)()c/>/^ fas.senden Proiiier- röhren, welche man in durch eine Flamme erhitzten, Wasser euthaltendeii liechergläsern als Wasserbädern erhitzt. Statt dei- obigvn Mischung kann man auch direkt essigsaures Phenylhydrazin anwenden, indem man Pheny Ihy dra/i n und Kssig- säure (zirka .') Tropfen Phenylhydrazin und :» Tropfen Essigsäure) mischt. Bei der Anwendung von sultstitnierten Phenylhydrazinen veiiährt man ähnlich. Kntsteht schon nach '/, bis 1 Stunde Stehens oder nach kurzem ge- linden Erwärmen ein heller, meistens gelber Niedei'schlag . sc» kann man die (iegeiiw.irt ven Mannose vermuten. Die klare oder vom ausgeschiedenen Mannose|)henylhydrazon abfiltrierte Lösung wird nun im Wasserbade erhitzt, und sie scheidet, bei < legenwart von Fiiiktose. sein- bald, langsamer mit den anderen (Jlykosen kristallinische stark g<'Ibe Flocken ab. Mit (ihikose und Fruktose ent- ') Ciirl Xruhn-f/, i licr die Reinigung der Osazone und zur Bestimmung ihrer optischen Drehungsriclitung. Bcr. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 3384 (1899). -) Emil Fischer, Verliindungen des Phenylhydrazins mit den Zuckerarten. Her. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 17. S. 579 (1884). 90 B. Tollens. steht dasselbe Osazon (welches folglich am besten nicht Glukosazon, son- dern Glykosazon genannt wird), mit anderen Glykosen entstehen ähnhch aussehende Flocken. Bei einigen Glykosen, so bei der Galaktose, vermehrt sich die Osa- zonaiisscheidung noch beim Erkalten, und beim Milchzucker scheidet sich das Osazon erst beim Erkalten ab. Die Zeit der Abscheidung wird nach Sherman und Williams^) durch die Gegenwart anderer Zuckerarten erheblich modifiziert. Die abfiltrierten, gut ausgewaschenen, dann zwischen Papier gepreßten oder auf Ton abgesogenen Osazone kristallisiert man aus ca. öüVoigem Alkohol um und setzt, da sie meistens sich selbst beim Kochen der Flüssig- keit schwer lösen, nach Neuhercj tropfenweise Pyridin zu, bis Lösung eintritt. Aus der. wenn erforderlich, filtrierten dunklen Lösung kristalhsiert das reine Osazon. welches über Schwefelsäure oder an der Luft in ge- linder Wärme getrocknet wird. Der Schmelzpunkt wird dann bestimmt, und hierbei ist als Regel zu beachten, daß die Erhitzung schnell-) geschehen muß, da die Osa- zone meistens keine eigentUchcn Schmelzpunkte, sondern viehnehr Zer- setzungspunkte besitzen, und diese Zersetzung bei langsamem Erhitzen früher eintritt als bei schnellem Erhitzen und, sobald ein Partikelchen sich unter Schmelzung zersetzt hat, die ganze Masse schmilzt und sich unter Gasentwicklung zersetzt. Am besten geschieht die Schmelzpunktsbestimmung auf die von Müther und Tollens ^) beschriebene Weise. In ein sehr kleines, nur ';) cm^ fassendes Kölbchen mit konzen- trierter Schwefelsäure, in welche man, um sie weiß zu halten, ein Körnchen Salpeter gebracht hat, stellt man neben die etwas vom Boden des Kölbchens entfernte Thermometerkugel das sehr dünnwandige (s. u. ) Röhrchen mit der Substanz und erhitzt auf einem Drahtnetz mit mäßig kleiner Flamme, so daß das Quecksilber des Thermometers schnell steigt. Von Zeit zu Zeit mäßigt oder entfernt man die Flamme (oder man dreht an einem Brenner mit Zündflämmchen die Hauptflamme aus. so daß nur das Zündf lämmchen l)leibt), um Temperaturausgieich zu erhalten. Sobald man sich dem vermuteten Schmelzpunkte auf ca. 5 — 7^ genähert hat, hält man mit dem Erhitzen so häufig an, daß das Quecksilber nur langsam steigt. M H. C. Sherman und B.H. WiJJiams. Einfluß der V'erdünnung und der Gegen- wart anderer Zucker auf die Osazonprobe für Glukose und Lavulose. Chem. Zentralbl. Jg. 1906. II. S. 229; daselbst nach Journ. Amer. Chem. Soc. Vol. 28. p. 629 (1906). ") Emil Fischer, Verbindungen des Phenylhydrazins mit den Zuckerai'ten 11 und über die Hydrazone. Ber. d. Deutsch, chem. Ges^ Jg. 20. 8.826(1887); Jg. 21. S. 987 (1888). — K. Bei/fhien und B. Tollens, Beobachtungen über die Schmelzpunkte der Osazone und über Phenylhydrazinarbeiten. Aunal. Chem. Vol. 255. p. 217. — Maquenne, s. Tollens, Handb. d. Kohlenhydrate. II. S. 34. ^) Ä. Müther und B. Tollens, Über einige Hydrazone und ihre Schmelzpunkte. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 37. S. 314 (1904). Die wichtigsten Methoden zum qualitativen Nach\Teiso der Zuckerarten. 91 und operiert so, daß es in dem Momente des Sclimelzens der Substanz zur Ruhe kommt. Das Erllitzen von der Zimmertemperatur bis 204 ^ dauert auf diese Weise höchstens o — 4 Minuten. Die Schmelzröhrchen stellt man sich nach J5w//sews i ) Methode aus einem neuen und noch nicht zu sonstigen Zwecken gebrauchten Probier- rohr durch Erweichen in der Gebläseflamme und schnelles Ausziehen in der Weite von 1 — Vomm her. Die mit dem Schreibdiamanten geritzten und dann abgebrochenen, ca. 8 cm. langen Röhrchen werden an einem Ende zugeschmolzen und man lälit unterhalb des Raumes für die Substanz ein 4 mm langes massives Stielchen, welches die Substanz vom Boden ab und neben die Thermometerkugel bringt. Sobald die Schmelztemperatur erreicht ist, findet Aufschäumen statt, indem die flüssig gewordene Masse von dem entwickelten Gase leb- haft in die Höhe getrieben wird. Die Schmelzpunkte liegen zum Teil recht hoch, so schmilzt das Glykosazon (aus Glukose, Fruktose und Mannose) bei 204 — 205", das Galaktosazon bei IQ;')", das Arabinosazon dagegen schon bei 160". ^l So einfach wie mit den reinen Zuckern verlaufen die Phenylhydrazin- reaktionen häufig nicht mit den Naturprodukten, welche zuweilen mehrere Zucker und meist mancherlei andere Substanzen enthalten. Zuweilen scheidet sich mit der Phenylhydrazin-Acetatmischung in der Kälte oder in gelinder Wärme eine öl- oder pechartige blasse ab, von welcher man am besten die Flüssigkeit durch Abgießen befreit. Dann ist zuweilen das Osazon auch von brauner Farbe und mehr oder weniger weich, es läßt sich jedoch häufig nach dem Abfiltrieren und Auswaschen durch Umkristallisieren aus Wasser, Alkohol und wenig Pyridin in reinerer Form und zuletzt in gelben Nädelchen gewinnen. Eber solche Osazonoperationen mit gleichzeitig vorhandenen ver- schiedenen Zuckerarten findet man näheres z. B. in den Abhandlungen von Neuherg"-) und von Votocek und Vondracek.*) d) Farbenreaktionen. Zuerst möge angegeben werden, daß sämtliche Zuckerarten, welche alkahsche Kupferlösungen reduzieren — seien es ^loiiosaccharide oder Gly kosen, seien es Disaccharide (z. B. ^laltose und Milchzucker) — , sich ^) R. Bunsen, Flammenreaktionen. Ann. Chcm. Vol. 138. p. 26B (1866). ^) Eine recht vollständige Zusammenstellung der Sclimelzpunkte der bis 1903 dargestellten üsazone und Hydrazone findet sich in der Dissertation von Di\ A. Müther^ Göttingen 1903, und ist auch im Buchhandel (Göttingen, Huth) zu haben. ^) Carl Neuherg , Über die Reinigung der Osazone und zur Bestimmung ilirer optischen Drehungsrichtung. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. 8.3384(1899). ■') Emil Vofoccl- und R. Voitdraick, Über die Trennung bezw. Isolierung redu- zierender Zuckerarten mittelst aromatischer Hydrazine. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 37. S. 3854 (1904). 92 B. Tollens. in Lösung mit stark alkalischen Substanzen, wie Kaliurahydroxyd, Natriumhydroxyd, Kalk, Baryt, besonders beim Erwärmen, stark gelb bis braun färben, indem mancherlei gefärbte und nicht gefärbte Stoffe und daneben meistens Milchsäure entstehen. Es kann dies Verhalten zur Unterscheidung von (rlukose, welche sich mit Natronlauge gelb färbt, und Rohrzucker, welcher hierbei un- gefärbt bleibt, dienen. Besonders aber versteht man unter dem Namen ..Farbenreaktionen" das Verhalten der Zuckerarten zu Stoffen der Benzol- und Naph talin reihe bei Gegenwart von konzentrierter Schwefelsäure oder Salzsäure. Wie u. a. durch die Untersuchungen von ToUens und v. Grote^\ Kehrer-) und Wehmer^) sowie von Conrad und Gutzeit ^) erwiesen ist, werden die Kohlenhydrate durch die Wirkung starker Säuren unter Bildung von (neben Lävulinsäure, Ameisensäure, etwas Furfurol usw.) Huminstoffen zersetzt. Diese Zersetzung tritt bei verschiedenen Zuckern mit verschiedener Leichtigkeit auf, und zwar am leichtesten, wie es scheint, bei Fruktose und bei den, wie z. B. Rohrzucker, Fruktose enthaltenden Zuckerarten, während sie bei Glukose und Galaktose und den diese enthaltenden Disacchariden , me z. B. Milchzucker, erst bei stärkerem Erwärmen eintritt. So kann man Rohrzucker und Fruktose von Milchzucker und Glukose schnell unterscheiden, indem man in die kalten Lösungen dieser Zucker im Reagenzglase einige Kubikzentimeter Schwefelsäure so langsam am Rande einfUeßen läßt, daß sich die Flüssigkeiten nicht mischen. Bei Gegenwart von Fruktose und Rohrzucker färbt sich die Berührungs- zone braun, bei Glukose, Milchzucker usw. dagegen nicht. Sind beim Zusammenbringen von Zuckerlösungen mit konzentrierten Säuren aromatische Stoffe und besonders Phenole gegenwärtig, so verbinden sie sich mit den Huminstoffen oder sonstigen Zwischenstoffen, z. B. Oxymethylfurfurol^), zu dunkel gefärbten amorphen Substanzen.«) *) A.Freih. r. Grote und B. ToUens, Untersuchungen über Kohlehydrate. I. iHier die liei Einwirkung von Schwefelsäure auf Zucker entstehende Siiure (Lävulinsäure). Ann.Chem. Vol. 175. p. 181 (1875). 2) Ä. Freih. v. Grote und B. Tollens, Untersuchungen über die Lävulinsäure oder ß-Acetopropionsäure. I. Über Darstellung und Eigenschaften der liävulinsäure. II. Über die Bildung von Lävulinsäure aus verschiedenen Kohlehvdraten. Ann. Chem. Vol. 206. p. 207, 226 (1881). ^) r. Wehmer und B. Tollens, t)ber die Bildung von Lävulinsäure, eine Reaktion aller wahren Kohlehydrate. Ann.Chem. Vol. 243. p. 314 (188S). *) M. Conrad und M. Gutzeit, Untersuchungen über die Einwirkung verdünnter Säuren auf Traubenzucker und Fruchtzucker. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 19. S. 2569 (1886). ^) Siehe z. B. A. Miithcr und B. Tollens, Über die Produkte der Hydrolyse von Seetang (Fucus), Lamiuaria und Carragheenmoos. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 37. S. 303 (1904). ^) B. Tollens, Über das ^'erhalten des Zuckers zu Säuren und Phenol. Chemiker- Zeitung. Jg. 1887. S. 77. Die wichtigsten Methoden zum qualitativen Nachweise der Zuckerarten. 9'-^ Diese bei den obigen Reaktionen anftretenden Stoffe färben entweder die ganze Flüssigkeit oder die ISeriUirungszone zwischen der konzentrierten Scäure und der übrigen Flüssigkeit, während bei Abwesenheit von Kohlen- hydrat keine Färbung auftritt. Von diesen allgemeinen Reaktionen ist besonders die WRch Molisch ^) benannte y.-Naphtolreaktion in (Gebrauch, welche zuerst von Reichl'^), dann von IJd'^) und von Molisch, v. Udranski*) und vielen anderen studiert worden ist. Man bringt hierzu 1 — 2 cm^ der auf Zucker zu prüfenden Lösung und 1 — 2 Tropfen einer 10 — 20%igen alkoholischen L()sung von a-Naphtol in ein Probi 'rglas und läßt vorsichtig einige Kubikzentimeter konzentrierter reiner, von Salpetersäure ganz freier, Schw^efel säure so einlaufen, daß sie sich am Boden des Rohres ansammelt. Bei Gegenwart von Fruktose, Rohrzucker etc. bildet sich sogleich eine violette Zone, und bei Gegenwart von anderen Zuckern tritt beim vorsichtigen Mischen oder Erwärmen diese Färbung, sei es an der Berührungsfläche, sei es in der ganzen gemischten Flüssigkeit, auf. Die Reaktion ist recht empfindlich. Wendet man statt a-Naphtol Thymol an. so ist die auftretende Färbung rot (nach Molisch zinnoberrot) und mit Menthol, Kampfer, Resorzin, Diphenylamin etc. treten ähnhche Färbungen auf, welche von V. üdrcmski ..Furfurolreaktionen" genannt wurden. Besonders wichtig zur Untersuchung einiger Zuckerarten sind die bei Gegenwart von Phenolen beim Erwärmen mit starker Salzsäure eintretenden Färbungen; abgesehen von den mit Thymol etc. auftretenden Kohlenhydratreaktionen sind hier die mit Resorzin, (Jrzin und Naphto- resorzin erscheinenden zur Auffindung von Fruktose und anderen Ketosen^) einerseits und von Pentosen andrerseits in Benutzung ge- kommenen Speziaireaktionen von Wichtigkeit. Die Aldosen, Glukose, Mannose, Galaktose geben nach Borive und Tolleyis^) beim Kochen mit Naphto resorzin, Salzsäure und Wasser dunkle Absätze, welche nach dem Abfiltrieren und dem x\uswaschen mit Wasser sich in x\lkohol zu mißfarbenen, bei Galaktose mehr lilafarbenen Flüssigkeiten lösen, welche eine bemerkbare grüne Fluoreszenz zeigen. Im Spektralapparat zeigen die Flüssigkeiten eine Bande im ( Jrün, und daneben ^) Hans Molisch, Zwei neue Zuckerreaktionen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 19. Ref. S. 746 (1886). ^) C.Rcichl, Eine neue Klasse von Phenolfarbstoffen. J>/>?/7?fr&' polytechn. Jnurn. Bd. 235. S. 232 (ISSüj. =*) IM, Chemiker-Zeitung. Jg. 1885. S. 231; Jg. 1887. S. 2. ^) Ladislaiis v. Udranshi, Über Furfurolreaktiouen I und III. Zeitschr. f. pliysiol. Chem. Bd. 12. S. 355 u. 357 (1888); Bd. 13- S. 248 (1889). ■') d. h. die CO enthaltenden Cllykosen. s. über Aldosen, Ketosen etc. die Lehrbücher. ^) B. ToJJens und F. Borire, Über Farben- niid Spoktralreaktioneii der Zuckor- arten mit Xaphtoresorzin und Salzsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 41 . S. 1783 (1908). 94 B. Tolleiis. zeigt die von der Galaktose herrührende Flüssigkeit eine Bande im Gelb, deren Mitte auf der D-Linie liegt. Diese Bande der Galaktose tritt nicht auf, wenn Fruktose zu- gleich gegenwärtig ist. und somit zeigt sie sich nicht bei Kaff inose und Stachyose; sie tritt jedoch auf, wenn man vor dem Zusatz des Naph- toresorzin diese Zuckeraiten mit konzentrierter Salzsäure und Wasser (1:1) eine halbe Stunde im kochenden Wasserbade erhitzt, und die Flüssigkeit dann durch etwas Blutkohle und Filtration von den Zersetzungsprodukten der Fruktose befreit wird. Die mit Naphtoresorzin entstandenen dunklen Substanzen sind im allgemeinen nicht in Äther lösUch, doch bilden die aus Gliikuronsäure (s. u.) entstehenden hiervon eine Ausnahme, denn sie lösen sich beim Schütteln der beim Kochen mit Salzsäure und Naphtoresorzin entstandenen trüben und schwärzlichen Flüssigkeit mit Äther und verleihen dem letzteren eine schön violettblaue Farbe. Steensma^) hat versucht, die Farbenreaktionen der physiologischen Chemie von gemeinsamem Gesichtspunkte aus zu betrachten. e) Polarisation. Da die Zuckerarten die Ebene des polarisierten Lichtes bald nach rechts, bald nach links drehen, ist auch zur quahtativen Reaktion auf Zuckerarten die Anwendung des Polarisationsapparates von großem Nutzen (siehe später bei der quantitativen Bestimmung). f) Reaktion der Benzoylierung. Baumann-Schottensche Reaktion. Mit Ben zo vi chlor ür und Natronlauge geben nach Bmimann ^) aUe Zuckerarten ])eim Schütteln Niederschläge von Benzoaten, indem sich Chlornatrium bildet und Benzoyl au Stehe des Hydroxylwasserstoffes eintritt. Die Gleichung: Cg Hi2 0,3 + 5 Ce Hg COCl + 5 NaOH = = Cß H^ 0 (Cß H, . C02)5 + 5 NaCl + 5 H.^ 0 oder mit auseinander geschriebener Glukoseformel: CH., OH GH., () . C( )C, H, CHOH CHÖ.COCßHs CH( )H + ö Cp, H, COCl _ CHO . C()C, Hg + 5 Hg 0 CHOH + 5 NaOH -CHO.COCßHg +5NaCl CHOH CHO . COCß Ha COH COH Mürde z. B. bei den Hexosen den Verlauf der Reaktion ausdrücken, wenn sie nicht umkehrbar wäre, oder weiter eine Reaktion zwischen dem Benzoat *) F. Ä. Steensma, Die Farbenreaktioneu in der Biochemie. Biochemische Zeitschr. Bd. 8. S. 203 (1908). -) E. Batonann, Über eine einfache Methode der Darstelhing von Benzoesäure- äthern. Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 19. S. 3218 (1886). Die \vichtigsten Methoden zum ((ualitativoii Nachweise der Zuckerarten. 95 des Zuckers und der Natronlauf^e einträte, durch welche der Hexose- Benzoesäure-Ester zum Teil wieder unter Bildung' von Natriumbenzoat seiner Benzoesäure beraubt würde. ^) Infolge dieser Störungen ist die Beaktion oft nicht erschöpfend, und es bilden sich hier statt des Penta-Benzoats oft das Tetra- oder Tri- Benzoat. ■} Die Zuckei-lJenzoate sind fast oder ganz unlöslich in Wasser und ihre Bildung kann zum Nachweise, z.B. von Glukose im Harn, dienen (siehe dieses). g) Reaktionen der Einzelgruppen der Glykosen. 1. Reaktionen auf Tetrosen. Nur ganz kurz möge mitgeteilt werden, dab man wahrscheinlich auf die (iegenwart von Tetrosen schließen kann, wenn man beim Ei'hitzen der zu prüfenden .Substanz mit Salzs ure oder Schwefelsäure und Aus- schütteln der so erhaltenen Flüssigkeit Milchsäure erhält, welche sich vielleicht nach folgender (ideichung bilden kann : CHgO, ^CaHßOa + CH,() Tetrose Milchsäure Wenigstens lassen einige von Eilet und Tollens ^) angestellte Versuche dies vermuten. 2. Reaktionen der Pentosen und der Glukuronsäure. 7.) Farbenreaktioneu mit Phlorogluzin, Orziii, Naphtoresorzin. Eine sehr schöne violettrote Färbung' tritt auf, wenn man Spuren von Arabinose oder Xylose oder von Materialien, wie Kirschgummi, welche sie enthalten oder bei der Hydrolyse entstehen lassen, mit Salz- säure und Phloroglucin erhitzt, und dieselbe Färbung tritt auch beim Erhitzen von (ilukuronsäure mit Phlorogluzin und Salzsäure auf. Diese Farbenreaktionen sind früher von Ihl^) bearbeitet: die Spektral- reaktionen sind von Tollens mit Whceler^) und Allen^') aufgefunden und untersucht, sie sind neuerdings von Finoff'>) genau studiei-f. und es ist ^) Ludif'iff Kucny, Über Benzoesäureester der Kohlenhydrate, des Glukosaniins iiiul einiger Glakoside. Zeitschr. f. pliysiol. Chem. Bd. 14. S. 330 (1890). -) Zd. IL Sl-rdnp, Bcnzoylverbiiidungen von Alkoliolon, PhoiiohMi und /uckerartoii. Sitzungsber. d. Wiener Aka.l. Naturw. Klasse. Bd. 9S. IIb. S. 438 (1889). ") W. B. Ellctt und B. Tollens, Über die Bestimmung der Methylpentosane neben den Pentosanen. Ber. d. Deutsch, ehem. (iesellsch. Jg. 38. S. 499 (190ö). ^) 1hl, Chemiker-Ztg. Jg. 1885. S. 231. ^) IL B. Whccler und B. Tollens, Über die Xylose oder den Holzzucker, eine zweite Pentaglykose. Ann. Chem. Vol. 254. S. 304 (1889). ^) E. W. Allen und B. Tollens, Über Holzzucker (Xylose) und IIolzLninnni (Xylan). Ann. Chem. Vol. 260. S. 289 (1890). ■•) E. Pinoff , Studien über die lollcnssche Phlorogluzin-Salzsäurereaktion auf Pentoson, Ber. d. Deutsch, clieni. Gesellsch. Jg. 38. S. liW-, (1905). 96 B. Tollens. von letzterem die Wellenlänge der beobachteten Absorptionsbanden be- stimmt worden. Man bringt in die zu prüfende Lösung eine hanf- bis erbsengroße Menge Phlorogluzin, setzt ein der Flüssigkeit gleiches Volum konzen- trierter Salzsäure hinzu und erwärmt sehr langsam bis zum beginnenden Kochen. Allmählich tritt eine sehr schöne violettrote Färbung auf, welche sich nach und nach verstärkt. Nach einigen Minuten Stehens treten Trübung und dann Huminab Scheidung ein. Bei Anwendung von Alkohol statt Wasser und Zusatz von etwas Äther bleibt, ^\ie Pinoff fand, die Lösung tagelang klar. Bringt man die klare schön ^iolettrote Flüssigkeit vor den Spalt des Spektralapparates, so sieht man eine sehr schöne, ziemlich scharfe schwarze x4bsorptionsbande im Gelb des Spektrums zwischen den Linien I) und E, also wenn , wie gewöhnlich , der Spektralapparat das violette Ende des Spektrums an der rechten Seite zeigt, rechts von der Natriumlinie. Wenn die Lösung sich trübt, tritt allgemeine Verdunklung ein, und dies ist bei unreinen, Pentosen enthaltenden Flüssigkeiten, z.B. Harn, meist schon eingetreten, ehe sich die violettrote Farbe entwickelt hat, denn zahlreiche andere Stoffe, und so auch andere Glvkosen, geben, sei es in der Kälte oder bei gelindem Erwärmen, mit Phlorogluzin und Salzsäure Gelb- und Braunfärbung und Trübung. In diesen Fällen kann man nach Salkowski^) die zum Kochen ge- brachte, dann erkaltete Flüssigkeit mit Amylalkohol schütteln, welcher den roten Farbstoff löst, sich beim Stehen oben abscheidet und die Beob- achtung vor dem Spektralapparat zuweilen gestattet. Hierzu ist reiner Amylalkohol erforderlich, und Amylalkohol, welcher beim Zusammen- bringen mit Salzsäure und Phlorogluzin erwärmt, auch ohne die Gegen- wart von Pentosen verschiedene Spektralbanden gibt (s. auch v. üdranski), ist zu vermeiden. Will man nicht Amylalkohol verwenden, so befolgt man die Tollens- sche ..Absatzmethode'.-) Hierzu stellt man, wenn die oben besprochene Trübung, welche die Spektrumbeobachtuug verhindert, eingetreten ist, die aufgekocht gewesene Flüssigkeit 13 — 5 Minuten zur Seite, kühlt unter einem Wasserhahn völlig ab, sammelt den dunklen Absatz, Avelcher beim Auswaschen -violettlich wird, auf einem kleinen Sehnellfilter, d. h. einem mit Filtrierpapier versehenen Trichterchen, dessen sehr enges Rohr 20 — 25 cm lang und, wie ein Piccard- sches Filtrierrohr, zu einer Schleife gebogen ist. Man wäscht mit Wasser, bis das Waschwasser fast farblos ist, und gießt OöVoigen iVlkohol auf das Filter ; das alkoholische Filtrat bringt man in dem Probierrohre an den Spalt ^) E. Salkoivski, Über das Vorkommen von Peutosen im Harn. Chemiker-Zeitung. 1894. Rep. S. 237; Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 27. S. 508 (1899). ^) B. Tollens, Über den Nachweis der Pentosen mittelst der Phlorogluzin-Salz- säuremethode. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 29. S. 1202 (1896). Die wicbtigsteu Methoden ziuii (qualitativen Nachweise der Zuckerarten. 97 des Spoktralapparatos und gießt, falls sie zu dunkel ist, sehr vorsichtig Alkohol darauf, so daß sitdi hellere Zonen hildcn. welche, falls Pentose vorhanden war, die dunkle Spektralbande ixnt zeigen. Nicht nur die Ten tosen zeigen diese Reaktionen, sondern auch die (Jluknronsäure, und zwar sowohl das freie (ilukuronsäurelakton (oder das Glukuron), als auch die sogenannten gepaarten (ilukuronsäuren, wie Euxanthinsäure usw., aus denen l)eim Erhitzen mit Salzsäure die (llukuronsä nrc abgespalten wird (s. de Chalmot, Mann, Lefevre und ToUcus bei (ihikuronsäure). Ähnliche Ileaktionen wie das riilurogluzin gibt nach Allen und ToUcns^) das Orzin mit den Pentosen und der (ilukuronsäure, doch muß man nach der Absatzmethode vei'fahren. Ph'hitzt man eine Lösung der genannten Stoffe mit ihrem Volum Salzsäure von ri9 spezifischem Gewicht und einem Stückchen Orzin, so tritt nach einiger Zeit eine violettblaue Färbung auf, und die Flüssig- keit zeigt eine sehr kurze Zeit lang eine Spektralbande. Fast zugleich tritt jedoch eine bläuliche Trübung ein, und blaue Flocken scheiden sich ab. AVenn man, wie es genau bei den Phlorogiuzinproben beschrieben ist, diesen „Al^satz" nach einiger Zeit abfiltriert, auswäscht und in Alkohol h'ist. erhält man eine blaue Flüssigkeit, welche vor dem Spalt des Spek- tralapparates im Spektrum eine sehr schöne dunkle Bande liefert. Diese liegt jedoch nicht rechts von der Natriumlinie, sondern fast genau auf dieser. Die Orzinreaktion auf Pentosen und Glukuronsäure ist von Bial-) verändert und empfindlicher gemacht worden, indem ei" sie bei (Gegenwart von etwas Eisenchlorid austeilt. Er wendet als ..Orzinreagenz'' eine mit 20 Tropfen Li(|. ferri sesquichlor. versetzte Lösung von 1 g Orzin in 500 cm^ ?>0^ j ^vj^^v '^wh^iMWQ (spezifisches Gewicht l^lö) an, erwärmt ca. 4 cw^ dieser Flüssigkeit im Probierglase zum Sieden, entfernt von der Flamme und gibt einige Tropfen der zu prüfenden Flüssigkeit hinzu. Sind Pentosen vorhanden, tritt sehr bald starke Grünfärbung ein; ist jedoch nur (ilukuronsäure im Harn usw. enthalten, so findet dies nach Bial nicht statt. Die5/f//scheßeaktion ist von S'ac/^s^) näher geprüft und im allgemeinen be- stätigt worden. p]s ist neben der Grünfärbung besonders auf den zwischen den Fr aunJw/er sehen Linien C und D liegenden Absorptionsstreifen hingewiesen. ') E. W. Alldi uiul 1). Tollcns, Über liolzzuclvor (Xylose) und Ilolzguuiiiii (X\l:ui). Ann. Chem. Vol. 2()0. p. 305 (1890). -) Manfred Bial, Bemerkungen zu der Arbeit von F. Sachs: „Farbenreaktionen der Pentosen." Biochcm. Zeitschr. Bd. 3. S. 323 (1907). — Die Diagnose der Pentosurie. Deutsche med. Wochenschr. Jg. 28. S. 253 (1902). — Über die Diagnose der rentosurie mit dem von mir angegebenen Reagens. Ebenda. Jg. 29. S. 477 (1903). ") Fritz Sachs, il'hcY den Wert der verschiedenen Farbenreaktidiion zum Nach- weis der Pentosen. Biochem. Zeitschr. Bd. 1. 8. 384 (1906). Abdor)ialden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. IT. 7 98 B. Tollens. Bei einer Nachprüfnng der Binhchen Reaktion diircli Leßvre und Tollens^) hat sich ebenfalls gezeii^t, dalj die Pen tosen gut auf die obige Weise angezeigt werden, während bei verdünnter Glukuronsäure die Grünfärbung nicht oder kaum eintritt. Die Ursache dieses Nichteintretens ist, daß die Glukuronsäure sich langsamer zersetzt als die Pentosen, und daß sie in dem bald kälter werdenden Orzinreagenz nicht die Zeit hat, zu wirken. Erhitzt man länger, indem man die mit Glukuronsäure versetzte Flüssigkeit in ein kochendes Wasserbad bringt, so tritt auch mit Glukuronsäure die Reak- tion ein. Schneller als Glukm^onsäure wirkt Arabinose und noch schneller die Xylose. Die entstandenen grünen Flüssigkeiten zeigen, wenn man sie vor den Spalt des Spektralapparates bringt, zuerst eine dunkle Bande im Rot zwischen den Linien P> und C und dann eine andere auf der Xa- oder D-Linie. Andere Farbenreaktionen sind von JoUes'^} und von Nemnann an- gegeben. 3) Wie ich gefunden habe^), bietet zur Entdeckung von Glukuron- säure, besonders bei Gegenwart der Pentosen, eine Farben- und Spektral- reaktion mit Naphtoresorzin ein gutes Mittel. Arabinose, Xylose und Glukuronsäure geben beim Erhitzen mit Naphtoresorzin und Salzsäure dunkle Stoffe, von welchen die aus den Pen- tosen entstehenden in Äther unlöslich sind, die aus Glukuronsäure sich ])ildende Substanz dagegen sich in Äther löst. Diese Ätherlösung ist, wenn sie mit reiner Glukuronsäure entstanden ist, schön violettblau gefärbt, wenn Pentosen, andere Glykosen oder Stoffe des Harns gegen- wärtig sind, ist die Farbe violett, rot, rotbraun; stets zeigt die Äther- lösung im Spektralapparate eine schmälere oder breitere Absorp- tion sbande, deren Mitte etwas rechts (dem (irün zugewandt) von der D-Linie liegt. Man operiert am besten folgendermaßen: Ein höchstens hirsekorngroßes Stückchen der auf (ilukuronsäure zu prüfenden Substanzen übergießt man in einem ungefähr 16 mm weiten l'robierrohr mit 5 — 6 cm^ Wasser, setzt 1 cm- einer l^/oigen alkoholischen Lösung von Naphtoresorzin und ein der Gesamtflüssigkeit gleiches Volum Salzsäure von 1'19 spezifischem Gewicht hinzu und erhitzt vorsichtig. ') K. U. Lefevre und B. ToUcns, Untersuchungen über die Glukuronsäure, ihre quantitative Bestimmung und ihre Farbenreaktionen. Bcv. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S. 4520 (1907). -) Adolf Jolles, Über den Xach\yeis der Pentosen im Harn. Biochem. Zeitschr. Bd. 2. S. 243 "(1907). ^) Man sehe hierüber in Sachü' Abhandlung nach. *) B. Tollens, Über einen einfachen Nachweis der Glukuronsäure mittelst Naphto- resorzin, Salzsäure und Äther. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 41. S. 1788 (1908). Die wichtigsten Mctliodeii zum (qualitativen Nachweise der Zuckerarten. 99 Nach dem Beginn des Kochens erhält man dies auf einer kleinen Flamme 1 Minute lang. Die dunkel gewordene Flüssigkeit setzt man beiseite; nach 4 Mi- nuten kühlt man sie durch Schütteln unter einem Wasserstrahl völlig ab, gießt ein ihr gleiches \'olum Äther in das Probierroiu- und schüttelt grümllich. Nach dem Absitzen ist der Äther bei Anwesenheit von Gluku ron- säure in der untersuchten Substanz blau oder violett gefärbt, und er zeigt sehr deutlicli die Spektralbande au der Natriuuüinie. Wenn das Absitzen des Äthers laugsam vor sich geht, und wenn sich eine dunkle Schicht an den Wänden des Probierrohres zeigt, setzt man einen oder einige Tropfen Alkohol zu. Hat man mit Harn zu tun, so versetzt man 5 — 6 cm^ desselben mit '/2 — 1 (^"^'^ f^^i" Naphtoresorzinlösung und dem der Flüssigkeit gleichen Volum konzentrierter Salzsäure, erhitzt usw. Der Äther ist in diesem Falle mehr rot. Man verdünnt mit Äther, bis die Bande an der D-Linie sich von der allgemeinen Beschattung des Spektrums trennt. Die aus Arabinose, Xylose sowie anderen Zuckerarten entstandenen dunklen Substanzen scheiden sich zwischen dem Äther und der unteren Schicht ab. Diese Naphtoresorzin- Glukuronsä urereaktion tritt nach C. ToJlens^) mit vielen normalen Harnen und besonders stark nach dem (ienuß von Chloral, Kampfer, Lysol, Phenolen usw. auf. Ferner zeigen sie nach B. Toücns-) einige Pflanzensubstanzen, wie Fucus, Laminaria usw. ß) Furfurol-Destillationsmethocle. Im Gegensatz zu den Hexosen geben die Pen tosen und die (tIu- kuronsäure beim Erhitzen mit Salzsäure nicht LävuHnsäure (siehe unten) und iVmeisensäure, sondern Furfurol: a Hio O, = C^ H, ()., + aH.,0, Pentose Furfurol und aus der Glukuronsäure entsteht zugleich 1 Mol. Kohlensäure: Cß Hs Oß = Ca H, 0.3 + 2 H.3 0 + C().2 Glukuronsäure- E'urfurol. Lakton Das entstandene Furfurol destiUiert mit den Wasser- und Salzsäure- dämpfen über und wird im Destillat mittelst essigsauren Anilins-') nachgewiesen, welches mit Furfurol in Iku'ührung eine prächtige Kot- färbung zeigt; falls man einen Tropfen des Destillats auf ein mit essig- ') ('. 'ToUois, Der Nachweis von (ilukuronsäure oder Glykuronsäure nach Ji. Tollfiis im menschlichen Urine. Zeitschr. f. physiol. Cliem. Bd. 5G. S 115 (I'.)ÜS). -) B. Tolleiis; Über einen einfachen Nachweis der Glykuronsäure mittelst Napiito- rosorzin, Salzsäure und Äther. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 41. S. 1788 (1908). "') Sielie über die Bereitung S. 84. 7* 100 B. TolJens. saurem Anilin betupftes Papierstückelien fallen läßt, ist im Destillat Furf urol vorhanden, und dies ist aus den Pentosen usw. entstanden (siehe das Nähere bei den quantitativen Bestimnmngen). Man muß jedoch bedenken, daß nicht nur die Pentosen und Glu- kuronsäure Furfurol hefern, sondern auch geringe Mengen Furfurol aus anderen Stoffen bei der Destillation mit Salzsäure entstehen, und zwar hefern auch die Hexosen (Glukose, Galaktose etc., auch Stärke), wenn auch geringe, doch merkliche Mengen Furfurol, und dasselbe ist, wie es liesonders von Cross und Bevau^) hervorgeholten wird, der Fall mit natürlicher und durch Oxydation gewonnener Oxy Zellulose, so daß Cross und Beran, die das Furfurol liefernden Stoffe als Furfuroide oder Furoide zusammenfassen. Da jedoch bei den meisten Naturprodukten das Furfurol ganz oder fast ganz von den sehr verbreiteten Pentosen oder ihren Mutter Substanzen, den Pento sanen, geliefert wird, so spricht man fast allgemein von der Pentosen- oder Pentosauenreaktion. Der Furfuroldestillation kann man die rohen Pflanzen- oder Tier- substanzen unterwerfen, man kann aber auch die durch Hydrolyse der Ftohmateriahen erhaltenen Sirupe auf diese Weise prüfen. ]\lan benutzt zur Furfuroldestillation den bei den (luantitativen Be- stimmungen beschriebenen Apparat (siehe unten). Wenn nun die Gegenwart von Pentosen etc. konstatiert ist und man erfahren will, welche der genannten Stoffe vorhanden sind, ist natürlich das Sicherste die Abscheidung der reinen Stoffe und Untersuchung derselben. Da dies in zahlreichen Fällen nicht möglich ist, muß man Spezial- reaktionen anwenden. Y) Arabinose. Die Arabinose weist man durch Fällung der Sirupe mit Brom- phenylhydrazin^), Methylphenylhydrazin, Benzylphenylhydrazin 3) oder am besten Diphenylhydrazin*) (Neuberg) nach, dies liefert mit 1-Arabi- nose ein sehr schwer lösliches, nach Tollens und Müther^), Mauren- brecher^) und anderen bei 204 — 205'^ schmelzendes Hydrazon. ^) C. F. Cross, E. J. Bcvaii und Claiid Smith, Übei' einige chemische Vorgänge in der Gerstenpflanze und A. Schöne und B. Tollens, Lfber die Gärung der Pentosen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 28. S. 2604 (1895). — Siehe auch Journ. f. Landwirtsch. Jg. 1901. S. 39. Anm. ^) Emil Fischer, Über einige Osazone und Hydrazone der Zuckergruppe. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 27. S. 2490 (1894). ^) Otto Buff und Gerhard Ollcndorf , Verfahren zur Reindarstellung und Tren- nung von Zuckern. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 3234 (1899). ■*) Carl Neitbrn/ , Über die Harnpentose, ein optisch inaktives, natürlich vor- kommendes Kohlehydrat. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 33. S. 2243 (1900); Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 35. S. 38 (1902). '") Ä. Müther und B. Tollens, Über einige Hydrazone und ihre Schmelzpunkte. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 37. 8.312 (1904). ^) B. Tollens und A. IJ. Manrenbrecher , Über die Diphenylhydrazone der 1-Ara- binose und der Xylose. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 38. S. 500 (1905). Die wichtigsten Methoden zum (qualitativen Nachweise der /uckerarten. \()\ In den P'iltraten von Arabinose-Hydrazonen sucht man dann die Xylose auf, deren Hydrazone im allgemeinen leichter löslich siud als die- jenigen der Ar ab in ose. S) Xylose. Bertrands Reaktion. Charakteristisch für Xylose ist die Bertrcmdsche^) Reaktion mit Brom und Cadmiumkarbonat. Sie beruht darauf, daß Xylose von Brom in Xylonsäure verwandelt wird, und daß das Cadmiumsalz der Xylon- säure mit Bromcadmium ein schwer lösliches kristallisiertes Doppel salz, (C5H9 06)2Cd + CdBr., + 2H2O, bildet, während mit Ara- binose nichts Analoges zu erhalten ist. Die Reaktion wird nach Widtsoe und Tollcns-) am besten folgen- dermaßen angestellt: 0"2^ Xylose oder die doppelte Menge des zu unter- suchenden Sirups, 1 c>«3 Wasser, 0-2^ g (oder 7 bis 8 Tropfen) Brom und O'hg Cadmiumkarbonat werden in einem Probierglase unter ganz gelinder Erwärmung zusammengeschüttelt, dann wird das lose verkorkte Glas bei- seite gesetzt; am folgenden Tage wird der Inhalt in einem Schälchen fast eingetrocknet, darauf in 4 — 5 cni^ Wasser gelöst, filtriert, wieder fast ein- getrocknet und mit 1 em'^ x\lkohol versetzt. Wenn reine Xylose vorhanden war, setzen sich bald Kristalle ab. welche unter dem ^likroskop nadehg oder wetzsteinförmig sind; bei Gegenwart vieler anderer Stoffe dauert dies länger. Es ist u. a. Hauers und Tollens^) gelungen, durch Benzylphenyl- hydrazin aus den alkoholischen Lösungen der Sirupe von der Hydrolyse von Gummiarten erst Arabinose-Benzylphenylhydrazon zu fällen und im Filtrat hiervon durch Zusatz von Wasser Xylose-Benzylphenylhy- drazon nachzuweisen. £) Glukurousäure. Die im Harn, besonders nach Eingabe von Chloral, Kampfer, Menthol etc., auftretenden gepaarten Glukuronsäuren bringen die oben be- schriebenen Farbenreaktionen der (ilukuronsäure mit Phlorogluzin und Orzin und besonders die schöne, einfache und leicht auszuführende Reaktion mit Xaphtoresorzin (s. B. Tollens und C. Tollens bei den Xaphtoresorzin-Farbenreaktionen S. 97, 98) hervor, welch letztere mit den Pentosen nicht eintritt. Ferner bewirken die gepaarten Glukuronsäuren Linksdrehung der Ebene des polarisierten Lichtes, während die freie (ilukuronsäure rechtsdrehend ist. ') M. G. Bertrand, Recherches sur quelques derives du xylose. Bull. Soc. cliim. [3.] T. 5. p. 546, 554 (1891). ") J. A. Widtsoe und B. Tollens, Über Arabinose, Xylose und Fukose aus Tra- ganth. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 33. S. 136 (1900). *) //. Hauers und B. Tollens, Über die Hydrolyse pentosanhalteiider Stoffe mit- telst verdünnter Säuren und mittelst Sulfitflüssigkeit sowie über die Isolierung der Pentoseu. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 3313 (1903). 102 B. Tollens. P. Mayer ^ ) hat hierauf besonders hingewiesen ; er polarisiert den (eventuell mit Bleizucker geklärten) Harn, erhitzt ihn dann mit Schwefel- säure und polarisiert wieder. U r s p r ü n g 1 i c h e Rechts d r e h u n g und n a c h der Inversion Linksdrehung deuten also auf die Gegenwart von Ghikuronsäure. Die Nachweisung der Ghikuronsäure durch Phenylhydrazin ist nicht gut möglich, weil die entstehenden Niederschläge wechselnde Zu- sammensetzung und verschiedene Schmelzpunkte (von 114" bis zu 217") zeigen können (P. Mayer). Dagegen ist das p-Bromphenylhydrazin brauchbar, denn mit diesem bildet die Ghikuronsäure nach Neuberg'^) einen einheitlichen Niederschlags Ci2 Hj7 O^NoBr, welcher aus gelben Kristallen liesteht. Diese schmelzen als Roh])rodukt bei 200 — 206" und nach dem Umkristallisieren aus ßO^/oigeio. Alkohol bei 2')ß". Sie drehen sehr stark links. Man erhitzt die auf Ghikuronsäure zu prüfende Lösung mit etwas einer siedend heißen Lösung von bg salzsaurem p-Bromphenylhydrazin und 6 g Natriumacetat im Wasserbade auf 60" C. Die ^Mischung wird erst klar, scheidet jedoch nach 5 bis 10 Minuten gelbe Nadeln ab. Man läßt erkalten, filtriert die vermehrten Kristalle ab und erhitzt das Filtrat von neuem , wodurch neue Kristalle entstehen , welche man abfiltriert , erhitzt dann wieder usw. Die auf einem Filter gesammelten Kristalle wäscht man gründlich mit warmem Wasser und dann mit absolutem ^Vlkohol. Sie schmelzen dann bei 200 bis 216" und nach dem Umkristallisieren aus 60"/oigem Alkohol bei 2o6". 0-2// der Kristalle geben in 6 ciii^ absolutem Alkohol und -i cm^ Pyridin gelöst im lOO ;;/^/^ -Rohr und im Natriumlicht im Laurentschen oder im Lippich^nh^Yi Halbschattenapparat eine Linksdrehung von 7"42", was annähernd einer spezifischen Drehung (7.)i) = — 869" entspricht. Xeidjcrg hat auf diese Weise im normalen Harn nach verschiedenen Operationen mit Bleiacetaten usw. sclüießlich (ilukuron säure nach- gewiesen. Auch Hervieux^) hat iin Harn nach verschiedenen umständlichen Operationen schließlich mit p-Bromphenylhydrazon Ghikuronsäure nach- gewiesen. Bial*) hat in der Galle von Hunden nach Eingabe von Menthol die Mentholglukiironsäure nachgewiesen, indem er die ATrdünnte Galle mit ^) F. Maijcr uud C. Neuberg, Über den Nachweis gepaarter Glukurousäureu und ihr Vorkommen im uormalen Harn. Berlin, klin. Wochenschrift. Jg. 1899, Nr. 27 u. 28. S. 591, (J17. — Siehe auch P. Mai/er und Neuberg , Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 29. S. 256 (1900). -) Carl Neuberg, Über eine Verbindung der Glukuronsiiure mit p-Brumphenyl- hydrazin. Über Löslichkeitsverhältnisse von Osazonen. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 32. Sl 2395 (1899). — Zeitschr. f. physiol. Chem. Jg. 29. S. 261 (1900). 3j Jlcrrieiij; Bull. soc. chim. (4). T. 4. p. 349 (1908). *) Manfred Bial, Über den Befund gepaarter Glukuronsäuren in der Galle. Zeit- schrift f. physiol. Chem. Bd. 45. S. 260 (1905). Die wichtigsten Methodon zum (lualitativen Nachweise der Zuckerarten. |0?> Bleiziickor fällte, dann uns dein Filtnit mit Mleiessii^- die Meiithol- glukuroiisäure fällte und diesen Niederschlaj^- mit 4''/oi^('i' Sehwefelsäure zersetzte, darauf hat er das Filti'at 1 V.^ Stunden am liüekflur.kühler ge- kocht und aus (h'r neutralisierten Flüssigkeit mit p-Bromphenylhydra- zin die (ilukuronsäure naehi^ewiesen. In einii^en Fällen, so bei der Plienol^lukuronsäurei) und auch bei der Mentholglukuronsäure^) und der Euxanthinsäure ^ielinüt nach Xenhery und Neimann'^) der Nachweis der (ilukiii'onsäure durch Überführung- in Zuckersäure mittelst Brom: CßHsO,, + 2Jh- + HoO = CßHgO^ + 2]II!r. Glukuronsäurelakton Zuckerlaktonsäure. Man erhitzt die vorher aus dem Harn mittelst Bleiessigfällung-, Zer- legung des Bleiessigniederschlages durch Schwefelwasserstoff, Abdampfen und KristaUisieren dargestellte Phenolglukuron säure mit Bromwasser- stoff und Brom und isoliert die so gewonnene Zucker säure zuerst als basisches Baryumsalz und dann mittelst ihres Silbersalzes. 3. Reaktionen der Methylpentosen. Analog den Pentosen, welche beim Destillieren mit Salzsäure Furfurol liefern, geben die Methylpentosen (Rhamnose, Fukose, Rhodeose) l)ei dem gieichen Verfahren Methylfurfurol C5 H, (CH3) O5 = 65 H3 (CHo) (), + ;', IF () Rhamnose Methylfurfurol. Wenn man mit Salzsäure von ]-06 spez. Gew. destilliert und einen Tropfen des Destillates auf Papier mit essigsaurem Anilin fallen läßt, er- hält man nicht die schöne rote Reaktion des Furfurols, wohl aber eine viel weniger auffallende gelbliche Färbung, welche, falls Furfurol (aus Pen- tosen oder Pentosanen. welche der Methylpentose beigemengt sind) gleichzeitig vorhanden ist, völlig durch die rote Beaktion verdeckt wiivl. Man kann aber das Methylfurfurol leicht nachweisen, indem man nach Mtquenne*) Alkohol und Schwefelsäure, welche es grün färben, dar- auf wirken läßt, oder besser, indem man nach Wkltsoc und Tollcns &) einige Kubikzentimeter des Salzsäuredestillates mit ihrem gleichen Volum konzen- trierter Salzsäure gelinde erwärmt, wobei sich die Flüssigkeit gelb färbt. Oder man oi)eriert nach Oshiiini und Tollcns^) mit einem Zusatz von Phlorogluzin, wodurch die Reaktion empfindlichei' wird. ') h\ Salkoirski und ('. Ncuhcrf/, Zur Kenntnis der Phenolglukurousäure. Bioclie- mische Zcitschr. Bd. 2. S. 307 (1907)! -) Carl Nenl>cr g) s a 1 z s a u r e s P h e n y 1 h y d r a z i n und o Messerspitzen essigsaures Natron, bringt das Piohr in ein siedendes Wasserliad, setzt, falls sich die Salze beim Erwärmen nicht ganz lösen, noch etwas Wasser hinzu und setzt das Probierrohi- nach 20 bis 30 dünnten aus dem heißen Wasserbade in kaltes Wasser. Wenn eine nur einigermaßen erhebliche Menge Glukose vorhanden war, entsteht sofort ein gelber kristallinischer Niederschlag, und dieser zeigt unter dem Mikro- skop gelbe, teils einzeln, teils in Drusen befindliche Nadeln. Gelbe Plättchen oder Kügelchen sind nicht beweisend. Man soll 0'03'Vo Glukose im Harn auf diese Weise auffinden können, und in Wasser soll nach Hirschl O'OOoVo Glukose noch zu entdecken sein. Wenn die Flüssigkeiten, welche auf Glukose zu untersuchen sind, sehr wenig Zucker oder sehr viel Beimengungen enthalten, muß man suchen, den Zucker auf irgend eine Weise zu konzentrieren oder aber eine Vorreinigung eintreten zu lassen. Z. B. kann man den im normalen Harn befindlichen ..physiologischen Zucker" nach Seegen *) erst dann mit Sicherheit nachweisen, wenn man den Harn mit Knochenkohle erwärmt (wobei die letztere etwas Zucker adsorbiert), dann die Kohle al)filtriert , mit Wasser erwärmt und diese wieder abfiltrierte Lösung prüft. Eine andere Methode der Konzentrierung ist das Versetzen des Harnes mit Alkohol und etwas Kaliumhydroxydlösung; hierdurch wird Zuckerkali als Sirup, der sich der Glaswand ansetzt, gefällt: man läßt einige Stunden absitzen, dekantiert, löst den Absatz in Wasser und prüft auf Glukose.^) *) F. Penzoldf und Emil Fischer, Neue Reaktion der Aldehyde. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 16. S. ()57 (1883). '-) Petri, Zum \'erhalten der Aldehyde, des Traubenzuckers, der l'eptono . der Eiweißkörper und des Acetons gegen Diazobenzolsulfonsäure. Zeitsclir. f. physiol. (hem. Bd. 8. S. 293 (1883/1884). ^) Josef Adolf Hirschl, Über den Wert der Phenylhydrazinzuckerprobe. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 14. S. 877 (1890). *) J. Seer/eii , Zur qualitativen Prüfung des Urins auf Zucker. Zeitsclir. f. anal. Chem. Bd. 11. S. 355 (1872). ^) Siehe W. Kühne, Lehrbuch d. pliysiol. Chem. Leipzig. Jg. 1868. S. 516. 108 B. Tollens. Mau kann auch den Harn durch FäUung mit neutralem Bleiacetat (Bleizucker) reinigen und das Filtrat vom Bleiniederschlag mit basisch- essigsaurem Blei (Bleiessig) und etwas Ammoniak versetzen, wo- durch der Zucker (nebst der Glukuronsäure) (P. Mayer, Tollens) gefällt wird. Man filtriert, zersetzt den Filterinhalt durch Schütteln mit Wasser und Einleiten von Schwefehvasserstoff, filtriert vom Schwefelblei und prüft auf Glykosen (siehe Inosit). Brauchbar ist ferner die Baumann^che Reaktion des Benzoylierens (siehe S. 9o), indem sehr geringe Mengen Zucker beim Schütteln der Flüssigkeiten mit Benzoylchlorid und Natronlauge ausgefällt werden. So erhielt Bamnann^) aus einer Lösung von 1 — 2 m?// Glukose in 100 cm^ Wasser beim Schütteln mit 2 cm'^ Benzoylchlorid und Natronlauge (wohl lOVniger) einen sehr bemerkbaren flockigen Niederschlag. Nach V. Udranski und Baumann-) zeigen die durch Schütteln von verdünnten Glukoselösungen mit Benzoylchlorid und Natronlauge er- haltenen Niederschläge beim Zusammenbringen mit a-Naphtol und kon- zentrierter Schwefelsäure die rote Keaktion der Kohlenhydrate. ß) Reaktionen der Mannose. Die ^lannose zeigt die sämthchen Reaktionen der Glykosen, also die Gelbfärbung mit Natronlauge, die Eeduktionserscheinungen mit alkalischen Metallösungen, die Lävulinsäurereaktion, die Farben- reaktion mit a-Naphtol und Schwefelsäure, aber im Verhalten zu essig- saurem Phenylhydrazin zeigt sie die große Differenz von den übrigen Glykosen, daß ihr Phenylhydrazon im Wasser sehr schwer löslich ist und sich nach einiger Zeit in der Kälte und schnell bei oO — 35 " ab- scheidet. Man setzt also der zu prüfenden neutralen, nicht zu konzentrierten Flüssigkeit etwas einer Lösung von 5 Tropfen Phenylhydrin und ?> Tropfen Essigsäure in zirka 1 — 2 c?»^ Wasser zu und läßt in gelinder Wärme stehen. Ist innerhalb einiger Stunden kein Niederschlag entstanden, so ist Mannose nicht vorhanden. Ein entstandener Niederschlag wird nach Storer'^) nach dem Ab- gießen, Absaugen oder Abfiltrieren der ülierstehenden Flüssigkeit mit einer Mischung von 3 — 4 ]\Iol. starkem Alkohol und 1 Volum Wasser erwärmt, worauf der ursprünglich zum Teil unter dem Mikroskop in Kügelchen er- schienene Niederschlag deutliche mikroskopische prismatische KristaUe zeigen muß. Ferner bestimmt man den Schmelzpunkt, welcher bei umkri- stallisiertem jMannose-Phenvlhvdrazon nahe 1(S5** sein muß. ^) E. Bauiiutnn, Über eiue einfache Methode der Darstellung vou Benzoesäure- äther. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 19. S. 3218 (1886). -) L. V. Udranski und E. Bcairnann , Das Benzoylchlorid als Reagens. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 21. S. 2744 (1888). ■■') Storer, Testing for Mannose. Bulletin of the Bussey Institution in Jamaica Piain (Boston). Vol. 3. Part. II. p. 13 (1902). Chem. Zentralbl. Jg. 1902. II. S. 1155. Die wichtigsten Methoden zum qualitativen Nachweise der Zuckerarteu. I(j9 Aus einein durch Hydrolyse von Hefegumnii erhaltenen Sirup hat Oshinia^), naehdem in verdünnter Lösuni»' nichts zu erhalten war, durch ]\Iischung- von 2 (j Sirup, 2 g Wasser und 1 (/ Phenylhydrazin eine erheb- liche Füllunff von Mannose-Phenvlosazon hekomnien. "(^ y) Reaktionen der Frnktosc. Wie Sellwanoß'-) fand, tritt heim gelinden Erwärmen von seihst ver- dünnten Lösungen von freier Fruktose oder von Fruktose enthaltenden Zuckern, wie Rohrzucker, mit Resorzin und Salzsäure eine schöne, leb- haft rote Färbung ein, welche charakteristisch ist. Man vermischt am besten die in einem Probierglase befindliche Znckerlösung mit V* ihres Volums an konzentrierter Salzsäure (spezifisches Gewicht 119), setzt eine hanfkorngrol.ie Menge Resorzin hinzu und er- wärmt sehr allmählich auf kleiner Flamme.^) P)ald tritt die rote Farbe auf, welche nicht violettrot (wie die Pentosenreaktion mit Phlorogluzin), sondern mehr feuerrot ist, und sich im Laufe einiger Minuten entwickelt. Nach einiger Zeit trübt sich die Flüssigkeit, wird grau und undurchsichtig und setzt Humin ab. P)ringt man die rote Flüssigkeit vor den Spalt des Spektralappa- rates, so zeigt sich neben Verdunkelungen im roten und violetten Teil des Spektrums zwischen Grün und P)lau eine zwar nicht schöne, aber doch sichtbare dunkle P)ande. Dieselbe Reaktion tritt auch bei Gegenwart von S erbose und an- deren, die Ketogruppe, CG, enthaltenden künstlich dai-gestellten Zuckern auf, so daß sie, wie Neiiberg*) hervorhebt, eine Reaktion auf Keto-Hexosen ist. Weini man nicht, wie oben angegeben ist, nur Y^ Volum der Lösungen der obigen Zucker an konzentrierter Salzsäure, sondern ein gleiches Volum hinzusetzt, so tritt zwar die Fruktoserotfärbung sehr schön auf, aber andere Zuckerarten, so Glukose, geben dann oft auch Sjjuren von Rotfäi'bung, so dal.) man hierdurch leicht getäuscht werden kann, denn wenn man (ilukose- lüsungen mit Resorzin und mit konzentrierter Salzsäure erhitzt, tritt zwar nicht starke, aber doch deutliche Rotfärbung auf'»), und Rosh/'^) ^) K. Oslüiiia, Über Hefegummi und Ijivertin. Zeitschr. f. physiol. ( liciu. Bd. 30. S. 42 (1902). -) Tliendor SeJiirduoß', Notiz über eine Fruclitzuckerreaktion. Bcr. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 20. S. 181 (1887). 3) Tollens, Kurzes Handl). d. Kohlenhydrate. II. S. 132. *) Carl Neuherf/, Über die Farbenreaktionen von Zucker. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. Bd. 31. S. 5ü9 (1900). ^) Siehe u. a. B. Tolleiis, Kurzes Flandb, d. Kohh'niiydratc. I. 2. .\ufl. S. 91 : II. S. 132. Über das Verhalten der Starke bei der Hydrolyse mit ziemlicli konzeiiirierter Schwefelsiiuie. Bor. d. Deutsch, ciiem. (ies. Jg. 39. S. 2190 (190(;). ^} Ilei/iric/i Eosiii , Beitrag zur wissenschaftl. ^Medizin d. liioniie. Salkoirski- Festschrift. Berlin 1904. S. 10.5. Vgl. auch : Eine Verschärfung der Scliiranoß'schoi) Reaktion. Zeitschr. f. physiol. Chera. Bd. 38. 8.555(1903): Über eine Reaktion im Haiu bei BehaiuUung mit Resorzin. Ebenda. Bd. 41. S. 549 (1904). 110 B. Tollens. glaubt, daß durch das Erhitzen mit Säure und sogar mit Wasser allein Glukose in Fruktose übergeführt werde. Dies ist in der Tat wahrscheinlich, denn Ost ^) gelang es, durch Digerieren von Glukose mit kalter, ziemlich konzentrierter Schwefelsäure etwas reine Fruktose zu gewinnen. Die Resorzinreaktion der Fruktose ist mehrfach bearbeitet worden, um sie einerseits empfindlicher und andrerseits sicherer zu macheu. Hier sind die Namen Bosh)"^), Ofner, Ä. und 0. Adler ■"■), Jolles, Neumann und L. Borcliardt^) zu nennen. Es scheint am sichersten zu sein, den HCl-Gehalt der zu prüfenden Flüssigkeit auf I2V2V0 (spezifisches Gewicht 1"06) zu normieren, also z.B. zur Harnprüfung auf Fruktose gleiche Volume Harn und 25Voi8'e Salzsäure anzuwenden. Ist nach Zusatz von etwas Resorzin und dem Erwärmen die Rotfärbung aufgetreten, so schüttelt man die mit Soda gesättigte Flüssigkeit nach Bosin mit reinem Amylalkohol, welcher den roten Farbstoff löst und Spektral- und Fluoreszenzerscheinungen zeigt oder nach Borchardt, welcher Bosins Vorschrift verwirft, mit Essigäther, welcher sich, falls Fruktose vorhanden ist, gelb färbt. Nitrite und Indikan dürfen nicht gleichzeitig neben Fruktose vorhanden sein. W. Voit'') weist diese Reaktionen als nicht entscheidend zurück. MulfattV') rät, vor Anstellung der Bor char dt sehen Reaktion auf Fruktose im Harn, den Harn mit einigen Ti'opfen konzentrierter Salzsäure und dann mit starker Kaliumpermanganatlösung so lange zu versetzen, bis die rote Farbe des Permanganats nur langsam verschwindet; eine durch geringen Überschuß bewirkte Braunfärbung verschwindet beim Er- wärmen. Darauf stellt man die Borchardtsche Probe durch 1 Minute dauerndes Erwärmen mit Resorzin und soviel Salzsäure, daß die Flüssig- keit 12% HCl enthält, an. Finqf) hat die Resorzinmethode genauer gestaltet, indem er zum Erhitzen der Fruktose mit Resorzin nicht Salzsäure, sondern ein Ge- ') //. Ost, Um\vaiKllun'') prüft. Noch besser, und sogar zur quantitativen Bestimmung der Galaktose zu benutzen, ist die Methode der Anwendung des Doppelten der obigen Menge Salpetersäure und des Abdampfens auf Vs des Volums, wie sie Tollens mit Kent^\ Creydt^) und Rischhieth^) angewandt hat. 5 g der zu prüfenden Substanzen werden in Bechergiäsern von zirka 5 cm Durchmesser und 7 — 8 cm Höhe mit 60 cm^ Salpetersäure von ri5 spezifischem Gewicht übergössen und im kochenden Wasserbade unter Um- rühren erhitzt, l)is die anfänglich ca. 2'5 cm betragende Höhe der Flüssig- keit auf möglichst genau Va^ ^Iso auf 8 — 9 mm heruntergedampft ist. Man setzt dann beiseite, zerrührt am folgenden Tage mit 10 cm^ Wasser, saugt die Schleim säure ab, trocknet, wägt und untersucht sie. Wendet man nicht reine Kohlenhydrate, sondern Stoffe der Natur, welche Zellulose, Kalksalze usw\ enthalten, an, so kann die etwa entstandene Schleimsäure mit anderen Stoffen gemengt sein. Man gewinnt sie rein, indem man den erhaltenen Absatz mit W^asser und Natrium- oder Ammo- niumkarbonat kocht*), die Flüssigkeit vom Ungelösten absaugt, sie in einer Platinschale bis fast zur Trockne eindunstet und den erhaltenen Rückstand mit etwas verdünnter Salpetersäure zerrührt, w^orauf die S c h 1 e i m s ä u r e abfiltriert, getrocknet imd auf den Schmelzpunkt ca. 2 1 3 * geprüft wird. £) Aullang: Reaktion des Inosit, CgHi^O^. Der Inosit wird in kristallisiertem Zustande oder auch in Sirupform durch die rötliche Farbe nachgewiesen, welche er beim Abdampfen mit Salpetersäure und Chlor calcium infolge der Bildung von rhodizon- saurem Calcium zeigt. Scherer "->) empfahl das Abdampfen mit einigen Tropfen Salpetersäure zur Trockne, Zusetzen eines Tropfens ammoniakahscher Chlorcalciumlösung und neues Abdampfen, wobei ein rosenroter Rückstand bleibt. Seidel'^) setzt statt des Chlorcalciums essigsaures Strontium 1) W. H. Kent und B. Tollens, Untersuchungen über Milchzucker und Galaktose. Ann. Chem. Vol. 227. p. 221 (1885). ") R. Creydt und B. Tollens, Versuch , die Raffinose in Gemengen quantitativ zu bestimmen. Ann. Chem. Vol. 232. p. 205 (1885). ä) L. Rischhieth. und B. Tollens, Versuche mit Melasse- und BaumwoUraffinose Ann. Chem. Vol. 232. p. 186 (1885). ^) J. B. Lindsei/ und B. Tollens , Über Holzsulfitflüssigkeit und Lingnin. Ann. Chem. Vol. 267. p. 348 (1892). 5) J. Scherer, Über den Inosit. Ann. Chem. Pharm. Bd. 81. S. 375 (1852); Bd. 73. S. 322 (1850). *') Seidel, s. in Koherts Untersuchungen über die Darstellung und Eigenschaften des Inosits sowie dessen Verbreitung im Pflanzenreich. Chemikerzeitung. Jg. 1887. S. 676. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. 11. 8 114 B. ToUens. oder essigsaures Aluminium und Ammoniak zu, und GaUois^) dampft Inosit mit salpetersaurem Quecksilber al) . wobei ein gelber, bei stärkerem Erhitzen rot werdender Rückstand bleibt. Denigh-) erhält nach dem Abdampfen des Inosits mit Salpetersäure beim Erwärmen mit essig- saurem Quecksilberoxyd und mit essigsaui-em Barvum gelbe, rötliche, bläu- liche Farben. Mir ist die Reaktion auf die Weise, welche Salkoicski und P. Mayer ^ ) empfehlen, am besten gelungen: ..Die Sulistanz wird mit einigen Tropfen Chlorcalciumlösung zur Trockne gedampft, der Rückstand mit Salpeter- säure befeuchtet und wieder verdampft: rosenrote Färbung." 6. Einzelreaktionen der Di- und Polysaccharide. Um Naturprodukte auf Di- und Polysaccharide zu prüfen, be- dient man sich vielfach der im vorigen Abschnitt betrachteten Reaktionen auf die in den zusammengesetzten Sacchariden befindlichen Glykosen, z. B. benutzt man bei der Reaktion auf Rohrzucker die Reaktion auf Glukose und auf Fruktose, oder bei der Reaktion auf Milchzucker und auf Raffinose u. a. die Reaktion auf Galaktose. Ferner aber benutzt man einige Speziaireaktionen, welche einerseits diejenigen sind, welche bei den Darstellungen in Anwendung kommen, z. B. die Strontian-FäUungsmethode beim Rohrzucker, oder man benutzt die Polarisation der betreffenden Zuckerarten, und zwar sowohl in un- verändertem Zustande als auch nach der Hydrolyse durch Erhitzen mit verdünnter Mineralsäure oder durch Enzymtätigkeit. a) Reaktionen des Kolirzuckers. Da der Rohrzucker eine Verbindung aus Glukose und Fruktose ist, da er Fehlingsche Lösung nicht reduziert, da er eine erhebhche Rechtspolarisation besitzt, und da andrerseits das bei der Hydrolyse entstehende Gemenge von Glukose und Fruktose (d. h. der Invertzucker) stark reduziert und die Ebene des polarisierten Lichtes nach links dreht, so ergeben sich folgende Reaktionen: Man reagiert auf Fruktose mit Resorzin und Salzsäure oder (nach der Hydrolyse) mit ]\Iethylphenylhydrazin (siehe Fruktose). Auf Glukose reagiert man durch Abdampfen mit Salpetersäure und Nachweisung der Zucker säure (siehe Glukose). Man prüft die Reduktionsfähigkeit der betreffenden Flüssigkeit direkt und nach dem Erwärmen mit einigen Tropfen Salzsäure, Abkiüilen und Neutralisation mit etwas Soda, oder man bringt in die auf Rohr- ') Gallois, Über die Auffindung des Inosits im Harn. Zeitschr. f. anal. Chem. Bd. 4. 8.264(1865); das. nach ,,De Pinosurie". Paris 1864 und Schmidts iahvhüQhQY i\. ges. Medizin. Jg. 1865. S. 148. ^) G. Deniges , Nouvelles reactions de Finosite. Bull, de la Soc. chim. de France [4]. T. 1. p. lh\. ^) F. Maijcr, Über das physiologische Verhalten von Inosit. Biochemische Zeit- schrift. Bd. 2. S. 398 (1907). Die wiclitiiTsteii Motlindfii zum «[ualitativcii Nachweise der Ziickeraitfii. ] 15 /ufkiT /ii prütiMidc. vorher /ii stcrilisicrondc l-'liissiL'-kcit iiohst ciiicin 'ri(t|>t('ii Toluol etwas In vciM in ( Invertase). dii^criert einiiic Zeit nnd prüft wieder. iMe W'iricnnu' des leiiien Invertins ti'itt sehr schnell ein: so ist sie /. I!. nach Wrohlrtrski'^) mu'h ."» Minnfen schon sehr erheblich. Wonniileicli .2 On -f- H., 0 = 2 Cß H,2 Oß Maltose Glukose. Nur soll Maltose ebenso wie Milchzucker nach Wöhlk beim Erwärmen mit .\mmouiak eine krai)prote Färbimg geben (s. Milchzuckei-). Maltose dreht viel stärker rechts als die Cdukose |(a)l) = l.'iT -i:)8° gegen 52"7", siehe (juantitative I>estimmungen| und andrerseits reduziert sie Fehlinr/^vliQ Lösung schwächer als Glukose; man kann folglich, wenn man l)eide Bestimmungen ausführt, auf die Gegenwart von Maltose schlielten, falls obiges der Fall ist und falls ähnliche Stoffe nicht vorhanden sind. Wenn man Maltoselösungen mit Salzsäure erhitzt (200 cw^ der Lösung mit Ibcw^ Salzsäure von l*12ö spez. Gew. oder '2^^°/o HCl), wird die Maltose hydrolysiert. wobei die Drehung .sinkt nnd das Keduktions- vermögen gegen Fehlin(/^c\\c Lösung steigt. Zugleich tritt gegen die /> H12 Oß. Raffinose Melibiose Fruktose Die Fruktose vergirt dann. Man erhält also mit Unterhefe dreimal so viel Alkohol und Kohlensäure als mit Oberhefe, denn die drei dann frei gewordeneu Glykosen sind gärfähig. '^diOh Neuberg ^) kann man Baffinose selbst bei Gegenwart von sehr viel Bohrzucker nachweisen, indem man die von iVewierr/ gefundene Angreifbarkeit derselben durch das Enzym der süßen ]\Iandeln, das Emul- sin, benutzt, welches Baffinose spaltet, aber Bohrzucker nicht angreift. Hierbei wird die Baffinose in Bohrzucker und Galaktose ge- spalten: C18 H32 O16 + H2 0 = C12 H22 < ^n + Cß H12 0,; Raffinose Rohrzucker Galaktose. Da die Galaktose Fehlingsche Lösung reduziert, tritt beim Erhitzen der mit Emulsin digerierten Flüssigkeit mit Fehlingscher Lösung starke Kupferoxydulabscheidung ein. Man digeriert z. B. 10^ Baffinose (oder des Baffinose enthaltenden Bohrzuckers), gelöst in 100 c;u^ Wasser mit 'dg Emulsin (von dessen Brauchbarkeit man sich vorher überzeugt hat ), und einigen Tropfen Toluol bei 38° C im Brutschrank, und man bemerkt nach 24 Stunden erhebliche Beduktionskraft und Abnahme der spezifischen Drehung, da sowohl Bohr- zucker als auch Galaktose weniger stark als Baffinose drehen. Bohrzucker wird von reinem Emulsin nicht angegriffen. ') Alexander Herzfeld, Die Bestimmung des Zuckergehaltes der Handelsware. Zeitschr. d. Ver. d. deutschen Zuckerindustrie. Bd. 40. S. 197 (1890). ■'') A. Bau, Melitriose und deren quantitative Bestimmung. Chem.-Ztg. Bd. 18. S. 1794 (1894); Bd. 21. S. 188 (1897). ^) C. Neuberg, Zur Kenntnis der Raffinose. Abbau der Raffinose zu Rohrzucker und d-Galaktose. Biochem. Zeitschr. Bd. 3. S. 519 (1907). — Neuberg und Marx, Über den Nachweis kleiner Mensen von Raffinose. Biochem. Zeitschr. Bd. 3. S. 535 (1907). C. Die Aviclitigsten Metlioden zur quantitativen Bestimmung der Zuckerarten. Von B. ToUeus, Göttingen. a) Allgemeines. Die ([uaiititative Bestimmung' der in pflanzlichen und in tieri- schen Stoffen vorhandenen Zuckerarten geschieht in den meisten Fällen erstens mittelst alkalischer Metallösungen (und besonders mittelst alkalischer Kupferlösungen) und z^veitens durch die Feststellung der drehenden Einwirkung auf die Ebene des polarisierten Lichtes mittelst der verschiedenen Polarisationsapparate, und nur in einigen Fällen, wie z. B. bei den Pen tosen, der G In kuron säure, der ^lannose und der Galaktose, auf andere Weise. Die Bestimmung durch alkalische Metalllösungen ist in einem anderen Teile dieses Buches beschrieben, die Bestimmung durch Polari- sation möge dagegen hier zuerst im allgemeinen und dann in Hinsicht der speziellen Anwendungen besprochen werden. b) Bestimmung durch Polarisation. Wie Biot zuerst zeigte, sind die Zuckerarten mit drehender Kraft auf die Schwingungsebene des polarisierten Lichtes begai)t, und diese Drehung findet bald nach rechts, bald nach links statt, d. h. es wird der obere Teil der senkrecht stehend gedachten Polarisationsebene durch das Licht, welches die Zuckerlösung passiert — vom Standpunkte des Beobachters aus gerechnet — , bei Kechtsdrehung im Sinne der P.ewegung des Zeigers der Uhr gedreht, und bei Linksdrehung im entgegengesetzten Sinne. Rechtsdrehung wird mit +. Linksdrehung mit — bezeichnet. Diese Drehungen sind etwas verschieden, je nachdem im Licht von verschiedener Farbe uiul Wellenlänge beobachtet wird, und man bedient sich jetzt fast allgemein des hellen gelben Lichtes, und zwar des Lichtes von der Wellenlänge der Fraunhofcr^dion Linie D, d. h. des Lichtes einer durch Chlornatrium gelb gefärbten Flamme, welches zum Zwecke der Erreichung möglichster Homogenität noch eine am Apparate befindliche Lösung von rotem Dikaliumijyrochromat passiert. 120 B. Tollens. c) Begriff und Ermittlung der spezifischen Drehung. Um die Drehungen der einzelnen Zuckerarten ihrer Stärke nach ein- heithch zu definieren und sie vergleichen zu können, hat Biot den Begriff der spezifischen Drehung eingeführt; diese spezifische Drehung oder (a) ist der Winkel, um welchen die Polarisationsebene durch eine wasserfrei gedachte Schicht des Zuckers von 100 m«? Länge und vom spezifischen Gewicht des Wassers oder 1 gedreht wird. Wenn die Beobachtung mit Licht von der WeUenlänge D (also mit Natriumlicht) ausgeführt wird, setzt man zu (a) noch D hinzu. Man berechnet die spezifische Drehung oder (7.)D aus der Drehung einer Zuckerlösung von bekanntem Gehalt und von bekanntem spezi- fischen Gewicht mittelst der I'ormel: a.P (a)D = p.l.d worin y. die lieobachtete Drehung, P das Gewicht der Lösung, welche p Gramm Zucker enthält, d das spezifische Gewicht der Lösung und 1 die Länge in dm der Schicht Zuckerlösung, welche beobachtet wird, bedeuten. Z. B. ist bei Piohrzuckerlösung von lO^/o Gehalt, welche im 200 mm- Rohr des Polarisationsapparates beobachtet wird, das spezifische Gewicht 1"040 besitzt und lH-83'' Wiukeldrehung ergibt, die spezifische Drehung- = = 66*5 ^ denn Wenn von der Zuckerlösung bekannt ist, wieviel Gramm Zucker sie in 100 cm^ (nicht in 100 5') enthält, fäht das spezifische Gewicht aus der Berechnung fort, und es ergibt sich die einfachere Formel: worin 7. die beobachtete Drehung. V das Volumen (oder li)0 cm"^) und c die in dem Volum enthaltenen Gramm Zucker bedeuten; z. B. l)ei einer Lösung von \0 g Zucker in 100 cm» der Lösung, welche IS'o" dreht, , ,-^ ia-3M00 ^^,„ Mit Hilfe dieser Formeln kann man leicht alle in Betracht kommenden Berechnungen ausführen, und hier kommt besonders diejenige in Betracht, welche man anwendet, wenn man die Drehung einer Lösung bestimmt hat. deren Zuckerart bekannt ist, und deren Gehalt man wissen will. Findet man z.B. für eine Roh r z ucker lösung im i>00mm-Rohr eine Drehung y..\ von 1;»;»" nach rechts, so wandelt man die Formel: {y-)\) = — r ^"" "^ ^ c.l a.V , . V T^ „ . 1?/3.100 ,^ , ,..,, ,^ c=: ^— r oder m diesem Falle m c= ^^ ^ , =10 und erhalt 10 y (a)D.l 66-0.2 Die wichtigsten Methoden zur tinantitativen Bestimmung der Zuckerarten. j-JJ Ilolirzucker in 100 «u». Will man nicht diese (häufijU'. aber ungenau ..\'()liiiiiprozente" genannte) Zahl, sondcni wirkliclie l'i'ozente halien. so dividiert man noch durch das spezifische (iewicht der Lösunu. Die spezifischen Drehuniien der Znckerarten sind sehr ver- schieden, und zwar bald nach rechts, bald nach links, und zwar sind von denselben Zuckerarten stets je 2 Modifikationen vorhanden, welche gleiche Zahlen für die spezifische Drehung zeigen, aber eine Modi- fikation dreht nach rechts, die andere dreht nach links, was mit der inneren Struktur der betreffenden Moleküle zusammenhängt und besonders \'ou E. Fischer mit Anwendung der umfassenden 'J'heorien von lan't Hoff uiul Lehcl erforscht ist. Diese beiden Modifikationen der (dukosen sind in der Lage ihrer Atome in der Art verschieden, daß die atomistischen Kon- figurationen derselben sich zueinander wie das Spiegelbild eines Gegen- standes zu dem Gegenstande selbst verhält: sie sind ..optisch entgegen- gesetzt^', ..optische Antipoden", oder sie sind ,,Antiloga" derselben Substanz. Diese antilogen Znckerarten werden mit d und 1 bezeichnet: zu- weilen verbinden sich diese Modifikationen miteinander und bilden dann die ..razemische", optisch inaktive Modifikation, welche mit r bezeichnet wird; so entsteht aus d- und 1-Arabinose die r-Arabinose. Außerdem existiert aber zuweilen noch eine Form, welche optisch inaktiv ist, weil die innere Struktur des Moleküls eine Drehung nicht veranlaßt. Diese Modifikation wird mit i l)ezeichnet. \om Inosit sind diese 4 Modifikationen bekannt. Es sind somit bei den Zuckerarten die- selben ^'erh;dtnisse vorhanden wie z. B. bei der Weinsäure, von welcher man die d-Weinsäure, 1-Weinsäure, dl- oder r-Weinsäure (Traubensäure) und die i-Weinsäure (Mesoweinsäure) kennt. Über diese Gegenstände sowie über andere Feinheiten der Drehungs- erscheinungen, so über die mit der Konzentration der Zuckerlösungen etwas sich verändernden spezifischen Drehungen, sehe man die betreffenden Abhandlungen') und besonders Landolts-) Duch nach. Kurz möge noch angeführt werden, daß viele Zuckerarten gleich nach der Auflösung in Wasser einen andere Drehung zeigen als einige Stunden oder einen Tag nachher, worauf die Drehung konstant bleibt. Diese Kr- scheinung wird als ..Dirotation", richtiger wohl als ..Multirotatiou", ...Nhitarotation" oder ..Mehr- oder Wenigerdrehung" bezeichnet. Es ist bei einigen, z. B. bei der Glukose. Aral)inose. Xylose. die Drehung am .\n- fange höher, bei anderen, wie bei der Maltose, die Dichnng am .Vnfange niedriger als 12 — 24 Stunden später. Über die T^rsachen der Mutarotation und über die näheren hierbei auftretenden Erscheinungen, sowie über die auLicnommene i-Aistenz vi-r- M Z. B. E. Fischer, Synthesen in der Zuckergruppe. Her. d. l>(nitscli. ciicni. des. Jg. 23. S. 2114 (1S90). -) LandoK, Das? optisclie I)rohungsvernu)gen nriranischer Sulistanzeu und dessen praktische Anwendungen. Braunschweig IS'.IS. 2. Aufl. 122 B. Tollens. schiedener meiiiaiider übergehender Modifikationen der lietreffenden Zucker- arten sehe man näheres in den Lehr- und Handbüchern nach, sowie auch in den Abhandlungen, z. B. von Tanref^) und von Jul. Mei/er'-). Diese Erscheinung ist zur Erkennung und Charakterisierung der Zuckerarten von Wert, aber zur ([uantitativen Bestimmung der Zuckerarten unbrauchliar; man beseitigt sie durch längeres Stehenlassen oder durch Auf- kochen der frisch bereiteten Lösungen, oder man setzt nach C. Schuhe und Tollens'^) den Lösungen einige Tropfen Ammoniak hinzu, wodurch sofort die konstante Drehung hervorgebracht wird. d) Ungefähre Zahlen für (/) D der häufigeren Zuckerarten. Die ungefähren Zahlen der meistens benutzten konstanten Drehungen einiger häufiger vorkommender Zuckerarten mögen hier angegeben werden, sie entsprechen den ca. lOVoi^eii Zuckerlösungen bei mittleren Tempera- turen (gegen 20" C). Die genauen Zahlen finden sich bei den einzelnen Zuckerarten. Hexosen ^G ^12 -6 Pentosen C5 Hio O5 Methyl- Peutosen Aldosen 1-Arabinose . . . + 104" (d-Arabinose — IO40) r-Arabinose inaktiv 1-Xylose + 19" (d-Xylose —19") r-Xvlose inaktiv + 8" — 75" + 75» -F 52-5" — 52-5" Ketosen Ehamnose, Cß Hi, O5 -H IL () . . . Fukose Pihodeose d-Glukose , Dextrose , Traubenzucker l-Glukose d-]^Iannose -f- 14" d-Galaktose +81" d-Fruktose, Lävulose. Fruchtzucker — 92" Sorbose —42-5" Piohrzucker, Saccharose + 66*5" Maltose + 137— inS"' Milchzucker +53" Raffinose + 104" Trehalose (Anhydrid) +197" Anhang : Glukuronsäure + 19" ^) M. C. Tanret, Sur les modifications molöculaires et la miütirotation des sucrss. Bull. Soc. chim. [3]. T. 15. p. 195 (1896). -) Jul. Mej/cr, Zur Theorie der Rohzuckerinversion. Zeitschr. f. physikal. Cheni. Bd. 62. S. 59, 75'(190S). 3) C. Schulze und B. Tollens, Über die Xylose und ihre Drehungserscheinungen. Ann. Chera. Vol. 271. p. 49 (1892). Die wichtigsten Motliodeii zur (iuautitativen HestiiuniuiiLr tliT Ziickerartcii. ] 2;J ('in die spczifisclic Drehuiiii' iWv rein iiiid wenn inöiilicli in Kri- stallen erhaltenen Substanzen zu bestimmen, Ncrfllirt man am besten foliiiMKlermalien: Man trocknet die Ki'istalle entweder läniicre/eit übei'Schwefelsiinre oder in einem zuerst kalten, dann wärmeren Wassertrockenselii'ank, den man sehr laniisam erwärmt und im Laufe einii>er Stunden bis zurTemperatui' von TO^C brinut. worauf mau die Substanz im Exsikkator erkalten lälit. Sie darf nicht g-esintert oder geschmi>lzen sein, weil dann die Resultate wegen unreiielmäiiigen Wasserverlustes ungenau sein können. un bis 4^^//// weiten Halse uml mit (ilasstöp.sel, wägt möglichst 2;/ des Zuckers ein. bringt Wasser dazu, notiert die Zeit, löst untei" Schütteln, in-ingt etwas Aluminiumhvdroxvd dazu, füllt bis zur Marke auf, filtriert die gut gemischte Flüssigkeit, legt sie im 200 mw-Rohr sofort in den bereit stehenden l*olari- sationsapparat und polarisiert, indem man wieder die Zeit notiert. Wenn man schnell operiert, gelingt es, 5 — 7 Minuten nach der Auf- lösung die erste Polarisation auszuführen und zu konstatieren, ob Multirota- rion vorhanden ist, und bei den weiteren Ablesungen sieht man. ob die Dre- hung sich verändert. (Siehe Parcus und Tollens '), Hatnmerschmidt '), Osaka s). Wenn Konstanz eingetreten ist, berechnet man (a) D nach den oben angegebenen Formeln. '»"-»^ e) Polarisationsapparate. In Lamhilts Buch sowie in dem ebenfalls sehr empfehlenswerten Buche von Frühlwrj*) (früher Frilhliny und Schuh) findet man die ge- nauen Beschreibungen der Polarisationsapparate (siehe z. P). Fig. 8). Hier möge nur angegeben werden, daß die gebräuchlich(Mi Ajjparate nach zwei verschiedenen Prinzipien konstruiert sind, sie geben nändich einerseits direkt die Drehung der Polarisationsebene in Graden des TCreises an, und andrerseits sind Apparate im allgemeinen (iebi-auclie, bei welchen die durch die Zuckerlösung bewirkte Drehung nicht direkt, son- dern durch Kompensation, d. h. durch Einschiebung von mehr oder weniger einer entgegengesetzt der Zuckerlösung drehenden Sub- stanz, bis die Drehung aufgehoben ist, gemessen wird: diese .Vppa- rate besitzen Skalen, deren Teile man auf Kreisurade umrechnen kann. ') E. raren ■'i uml //. To/Inis, Über die Mehr- (xU'r Weuijrenlrohung (.MuUinita- tiiiu oder sog. Birotatiou uud Ilallirotatioii) der Zuekerartcn. Ann. t'hem. \(d. 257. S. 160 (1890). -) llammcrsichiindf, Zeitschr. d. \'er. d. tl. Zuciieriiidustric. Jg. 1880. S. "KV.). •*) Yiikiclii Osaka, t^her die ßirotation der d-(iluk(ise. Zeitsehr. f. pliysikal. ( Ihmii. Bd. 35. S. 663 (1900). ■•) //. Frälillmi, .Vulcituntr zur T'ntersuchun!.' der für die Zucki'riii(histrii' in Be- traciit kommenden Roiimaterialien, Produkte usw. 6. Aufl. Brannsclnvi-iir r.KCV 124 B. Tollcns. Die entgegengesetzt drehende Substanz ist der wasserhelle (^)uarz oder Bergkristall, von Avelchem bekanntlich reehtsdrehende und links- drehende Varietäten vorkommen. Eine spitz keilförmig geschliffene Quarzplatte wird in dem Apparate hin und her geschoben, bis die jeweilig im Gesichtsfelde befind- liche Dicke gerade die Drehung der Zuckerlösung tilgt oder kompensiert, und eine auf dem Quarzkeil befindliche Skala zeigt die erforderlich ge- wesene Verschiebung an. Diese ursprünglich von Soleil und Dubosq hergesteUten ..Quarzkeil- apparate" werden in den Zuckerfabriken ganz allgemein angewandt, und Fig. 8. sie sind in der Anwendung viel bequemer als die Apparate, welche direkt Grade des Kreises angeben. Die Skala der Quarzkeilapparate ist von mehr oder weniger willkürlicher Art, und sie wird den Zwecken, zu welchen die Apparate dienen sollen, angepaßt. Wenn der Apparat in den Fabriken zur Ermittlung des Iiohrzuckers dienen soll, ist die Skala nach Ventzkc- Scheiblers A'organge in Deutschland so geteilt, daß sie um lUO Teile verschoben werden muß. wenn eine Lösung von 26"048 (7 Eohrzucker. d.h. das ..Xormalgewiclit"M, in Wasser zu 100 c»»^ im 200 inni-llohY im Apparate liegt (oder von 26// Rohrzucker in Wasser zu 100 ,. wahren'' Kubikzentimetern); folglich ') In Frankreich ist ein anderes ..Normalgewicht", niimlich 16"29f/ oder auch 16'3ö r/ Rohrzucker auf 100 cnt^ gebräuchlich, dies gilit in den französischen Apparaten eine Sl^alenverschiebung von 100 Teilen, und folglich zeigt ein solcher Skalenteil 0*1629 resp. 01635 r/ Zucker an (s. auch Laiu/olf, Opt. Drehuugsverm. S. 333 Anm). Die wichtigsten Methoden zur ([uantitativen Bestimmung der Zuckerarteii. 125 zeiiit jeder Verschiebiing.steil der 8kahi ()-2604Sf/ riolirzucker in 100 cm^ Flüssigkeit an. a V Nach der oben gegebenen Formel (-/)!) =-—j- dreht im Kreisgrad- apparate eine Lösung von 26*048,9' Rohrzucker in lOOcm^im 200«Mw-Rohr nach der Rechnung: ^^ "^ ~ 26-048 . 2 oder 66-5 . 26-048 .2 _ . , - = lö^ = 04-64, 34-64 Grade; folglich sind 100 Skalenteile des Quarzkeilapparates ent- sprechend o4-64 Graden des Kreises, und man muß die Skalenteile mit 0-o46 multiplizieren, um Kr eis grade zu erhalten. Die oben angegebene Formel zur Ermittlung der spezifischen Drehung : (a)D — — ,- Wird folglich zu (x) D = , c.l c.l worin v.' die abgelesene Skalenverschiebung oder Skalengrade bedeutet. Wenn es sich, wie vielfach bei physiologischen Untersuchungen (z. B. beim Harn), darum handelt, den Prozentsatz an Zucker in Flüssigkeiten zu bestimmen, benutzt man für den Quarzkeil-Apparat die Formel 7.'. 0-346. V • XT. 1 r,, , .. - . c= — , ^ . — , worin (a)D der Glukose = + o2 — 03", und aus welcher sich für je 1 Skalenteil der Ablenkung 0-333 — 0-326^ Glukose in 100 cm^ ergibt. Bequemer aber ist es, zur Berechnung davon auszugehen, dall bei Anwendung des 200w;rt-Rohrs 1 Skalenteil 0-26048 und .") und von 4 und 6, und ihre Zahlen werden in sehr vielen Fällen der Wahrheit am nächsten kommen. Es ist zu der Tabelle zu bemerken, daß sie die Zahlen für 'AO — HOO mg Fuiiurol-Phlorogluzid enthält, d. h. für die Mengen, welche man gewöhnlich und l)ei passenden Mengen des angewandten ^lateriales bekommt. Jk'trägt das Phlorogiuzid weniger als 0"0.")0 f/, so rechnet man es nach den folgenden Formeln, in w eichen a das Phlorogiuzid l)edeutet, um : F u rf urol = ( a + 01 )0Ö2 ) . O-ö 1 70 Pentose im allgemeinen = (a + 0'00')2). 1'0170 Pentosan im allgemeinen = (a + 0'00.')2).0"8949 Beträgt es mehr als O^liOO^, so rechnet man Furf urol = ( a + 0-00Ö2 ) . O'ölS Pentose im allgemeinen = (a + 0"00r)2). 1'0026 Pentosan im allgemeinen = (a + 0"00r)2).0"8824 In diesen Formeln l)edeutet 0"0052 die bei der angegebenen Art zu arbeiten, regelmäßig in den Losungen bleibende Menge (h-'lmg) Phloro- giuzid. Die ^Methode ist genau wie oben beschrieben oder auch in anderer Form (siehe Grund auf S. DU) vielfach mit pflanzlichen Substanzen und auch mit Stoffen tierischer Herkunft ' ) mit stetem guten Erfolg ausgeführt, und sie genießt allgemeines Vertrauen. Und doch sind Bedenken gegen die völlige Richtigkeit dei-selben anzuführen, nämlich erstens das Bedenken, daß neben den Pentosanen der Natur vielfach Methylpentosane vorkommen, welche sich beim Destilliei-en mit Salzsäure analog verhalten wie die Pentosane. d. h. sie geben Methyl-Furfurol; dies wird durch Phlorogluzin ebenso wie das P'urfurol gefällt und vermehrt das Gewicht des Phlorogluzids. Diese Bedenken beseitigt man, wenn man (siehe weiter unten) auf die bei Rhamnose und Fukose beschriebene Weise das Methylfurfurol- Phlorogluzid von dem Furfurol-Phlorogluzid mittelst Alkohols trennt und beide für sich bestimmt. ') Z. B. Ernsf Bendir und Ih-ich Ebstein, Über den Pentosengelialt tierischer und menschlicher Organe. Zeitschr. f. allu-cm. Physiologie. Bd. 2. S. 1 (1902). 134 B. Tollens. Schwerer wiegt ein zweites Bedenken, nämlich, daß Furfurol auch aus anderen Stoffen als Pentosen entsteht, so ans anderen Kohlen- hydraten, aus Glukuronsäure und aus Öxyzellulosen. Hier ist zu bemerken, daß Stärke, (ilukose, Milchzucker nur sehr wenig Furfurol liefern, also von geringem Einfluß sein werden, und daß ferner der Einfluß der Glukuronsäure bestimmt werden kann (siehe weiter unten). Der Einfluß der Öxyzellulosen, welche durch verschiedene Oxyda- tionsmittel aus Zellulose gebildet werden oder auch sich in den Pflanzen finden 1), und welche nicht unbedeutende Mengen P'urfurol liefern, ist einstweilen nicht zu bestimmen, da die Öxyzellulosen wenig bekannt und nicht frei von Zellulose zu gewinnen sind, und man folglich nicht weiß, wie viel Furiurolprozente aus der reinen Oxyzellulose entstehen. Trotz dieser Bedenken wird aber, da andere Methoden fehlen, diese Pentosen- oder Pentosanbestimmungsmethode allgemein angewandt, und der Vorschlag von Gross and Bevan, nicht von „Pentosaneu" zu sprechen, sondern nur von „Furfuroiden^" oder ..Furfurol gel)enden Substanzen", wird meistens nicht befolgt. Die oben angegebene Methode der Pen tos an- und Pentosenbe- stimmung ist von Grund^) etwas abgeändert worden. Er wendet nicht 300 cm 3 Salzsäure von l'Oö spez. Gew., sondern 500 cw?^ ^n, destilliert jedes- mal nicht 30 cm*, sondern 50 cm^, ab und gießt jedesmal 50 cni^ Salz- säure zu. Das Abdestillieren von 200 cm^ soll genügen, es wird das Filtrieren des Destillates vor der Phlorogluzinfällung empfohlen. Zur Umrechnung des Phlorogluzides auf Pentosen gibt Grund folgende Formeln : Phlorogluzid x 1-14S + 0-0025 = Arabinose, Phlorogluzid x 1-045 + 0-00305 = Xylose. Um das beim Destillieren der Pen tosen mit Salzsäure entstandene Furfurol in wägbare Form zu bringen, haben Jäger und TJnger^) sowie neuerdings Fromherz*) empfohlen, nicht Phlorogluzin, sondern ])arbi- tursäure anzuwenden, welche mit Furfurol einen gelben kristaUinischen Niederschlag bildet: C, H, N, O3 -f C5 H, 0, =: Cg He X, O, -f H., O Barbitur säure Furfurol Niederschlag. ') C.F. Cross, E. J. Bcvan und ('.Beadle, Die natürlicheu Öxyzellulosen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jt^. 27. S. 1061 (1894). — Leo Vignon, Sur roxycellulose. Bull. Soc. chim. (3.) T. 19. p. 790 (1898). — 0. r. Faber und ß. Tollens, Untersuchunoen über die Oxyzellulose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 2589 (1899). ^) Georg Grund, Über den Gehalt des Organismus an gebundenen I'entosen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 35. S. 111 (1902). *) BieJiard Jäger und Ernst Vnger, Über Pentosenbestimmung. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 35. 8^4440 (1902); Jg. 36. S. 1222 (1903). *) Konrad Fromherz, Zur quantitativen Bestimmung des Methvlfurols. Zeit{;chr. f. physiol. Chem. Bd. 50. S. 241 (1906/1907). I Die wichtigsten Methoden zur iiuiiiititiitivcn Bestimmung der Xufkerarten. \';\'^ IVr Xiodorsrhla"' \vir(l nacli 24 Stiindoii in nonchtioLT'ln ahfiltriort, 4 Stunden Ix'i 10.')" uetrocknct . ^cwoiiiMi nnd mit llci'ücksicliti^iinii- von 4"9 w/7, Nvek'hc in 4(J0cm'' Destillat gelöst bleiben, nach Cyll6X2<>4:C5H4()2 auf Furfurol berechnet. Das Baibi tursiiui'everfa iii-eii soll reinere Niederschläge liefern als das riiloioiiluzinverfahren: ob dies der Fall ist, sei dahinj'estellt. Jollcs^) hat eine andere Art dei- Tentosenbestini inii ii^- gegeben, welches auch auf der Dildung von Furf u rol und Destinnnung des letzteren beruht, sich aber dadurch von der 7V>//t'?2sschen unterscheidet, dal'» die Destillation anders gestaltet wird, und daß die Destiniinung des Fur- furols nicht durch Wägung als Phlorogluzin, sondern durch Titrierung mit Jodlösung- nach Bindung des Furfurols an Natriumbisulfit erfolgt. Man bringt die Fentose oder die Pentosan haltende Substanz in einen 1' o^ enthaltenden Kolben mit 200 cw^ Salzsäure von FOB spezifi- schem (Jewicht und leitet aus einem anderen Kolben Wasserdampf ein. während man den ersten Kolben ebenfalls so erhitzt, daß die Flüssigkeit nicht unter 100 an-'' sinkt. Das Destillat soll 2 ;> / betragen, und solange wird destilliert, bis 1 cm'^ des Destillates mit 4 cm^ des j^«ö/schen ( )rzin- reagenz (s. S. 97) keine Färbung zeigt. Bei diesem Übertreiben des entstehenden Fui-fnrols mit Wasser- dampf soll keine Huminbildung stattfinden und die theoretische Menge Furfurol entstehen. Von der abgemessenen groben Menge Destillat nimmt man 100 c?».^ zur Titrierung; man n(nitralisiert mit Natronlauge, setzt allmählich einige Tropfen Halbnoi'mal-Salzsäure zu. bis Methyhu'ange eben gei'ötet wird, gibt eine überschüssige Menge Natriumbisulf it hinzu, läßt 2Stunden stehen, gibt dann i/jo-Normal-Jodlösung zu, bis die (später zugesetzte) Stärkel()sung gebläut wird. Man gebraucht weniger Jodlösung als der zugesetzten Bisulfitlösung ursprünglich entsprach, und diese Differenz ist ein Mab für das vorhan- dene Furfurol. Die Reaktion zwischen Furfui-ol und Xatriiinibi>ii!f i t geht nach Jollis nach folgender (Jleichiiiig Mn' sich: C4 H3 () . CHO + Na HS( )3 = (\ H3 () . V\\(^^]\ v-. Ob das Ai'beiten nach Jollcs mit stundenlangem Destillieren ganzei' Liter Flüssigkeit und der Titration einer kleinen Flüssigkeitsnienge und dem rnuccIuKMi auf das ganze, gegenüber der einfachen Fnrfuroldestillations- methode von ToUens und dem Filtrieren nnd Trocknen des Furfurol- Phlorogluzids ^'orteile besitzt, ist zu bezweifeln. V) Metli.yl-lVntosen, C, Hio<>5- mid Metli.vl-rentosaiie, (, iIiM<>4. Polarisation; konstante Drehungen: Rlianniose, C« Hj, <>?, + Ib. <>: (7.)D = -j- 8-.''.". anfänglich Miiideidrehung. *) Adolf Jollcs, i her ein neues \'erl;i!iroii zur cpunititativi-n Bestininnuig der Pentosen. Sitzungsber. d. Wiener Akad. Bd. 114. Uli. S. ll'.il dilOö). 'e' ir,ß B. Tollens. I-Fukose, CßHioOs: ('/)I) = — 75-5» d-Rhodeose, CgHioOs; (7.)1) = + Tö-ö». Zur annähernden Be.stimmun.o- dieser ans den entsprechenden Methyl- Pen tosanen hydrolytisch entstehenden Zuckerarten kann man den Vm- stand benutzen, daß sie mit rhenylhydrazin ziemlich schwerlösliche Hydra- zone bilden, welche vor oder nach der Keinigung' durch Umkristallisieren gewogen werden können. Genauer werden sie durch Destillation mit Salzsäure von 1-06 spezi- fischem Gewicht, wobei sie Methyl-Furfurol liefern, bestimmt, indem dies mit Phlorogluzin als M e t h y 1 - F u r f u r o 1 - P h 1 o r o g 1 u z i d niedergeschlagen wird (siehe den qualitativen Nachweis, S. 103 ). Man verfährt genau so, wie es bei der Bestimmung der Pen tosen angegeben ist. Sobald das Destillat mit Anilin ace tat keine Gelbfärbung mehr zeigt, fällt man mit Phlorogluzin das rote Methyl-Furfurol- Phlorogluzid aus, filtriert, wäscht und trocknet es am folgenden Tage und rechnet es auf Methyl-Furfurol, auf Methyl-Pentose oder auf Methyl-Peutosan um. Experimentell sind von E//eft und TolJens'^) die Methylfurfurol- Phlorogl uz id mengen, welche Phamnose liefert, ermittelt worden, und dasselbe ist fürFukose von W. Mayer und Tollens-) geschehen, und die Piesultate sind in Formeln und Tabellen niedergelegt worden. 3) h Gemenge von Pentosen und Methyl-Pentosen. Da in der Natur sehr häufig die genannten Substanzen als Pentosan und Methylpentosan zusammen vorkommen, erhält man, wie bei den qualitativen Proben angegeben ist, beim Destillieren von solchen Natur- produkten Furfurol und Methylfurfurol, und es sind, wenn man mit Phlorogluzin fällt, im Niederschlage beide Phlorogluzide gemengt. Um sie auseinander zu bringen, erwärmen Ellett, W. Mayer und Tollens sie, nach vorheriger Trocknung und Wägung, mit Alkohol von 95" Tr., welcher nur das Methylfurfurol-Phlorogluzid auflöst. Die Auflösung des Methylfurfurol-Phlorogluzids bewirkt man, indem man den Goochtiegel mit den „gemengten Phlorogluziden'' in einem Kecherdäschen mit starkem Alkohol bis fast zum Kochen erhitzt, die braune M ^V. B. FJlcft und B. Tollens, Über die Bestimmung der Methvlpentosane neben den Pentosaneii. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 38. S. 492 (1905); Über die Bestimmung der Methylpentosaue neben den Pentosanen. Zeitschr. d. Ver. d. deutsch. Zuckerindustrie. Jg. 1905. Technischer Teil. S. 19. 2) ]Vill!/ Mayer und B. Tollens, Jouni. f. Landwirtscli. Jg. 1907. S. 2G1, 269: Über die Bestimmung der Methvlpentosane und über die Fukosc. Zeitschr. d. Ver. d. deutsch. Zuckerindustrie. Jg. 1907. Technischer Teil. S.620; Über die quantitative Be- stimmung der Fukose und der Methvlpentosane. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S.2441 (1907). ^) Siehe U7/?// Mauer und B. Tollens, Über die Fukose uiul die Bestimmung der Methylpentosane. Journ. f. Landwirtsch. Jg. 1907. S. 268, 269. Die wichtigsten Methoden zur ([uantitativen Bestimmung der Zuckerarten. i;; Methyl- Phlorogluzid Fukose Grarnm Fukosan (Kol. 2X0-89 Eh am n ose nach Ellell und ToUens Rhaninnsan (Kol. 4X0-8) Methjl-Pfintopan (Mittel T. Kol. 3 u. 5) 0-010 0011 0-012 0013 0014 0015 0016 0017 0018 0-019 0-0260 00284 00307 00331 003Ö4 00377 0-0400 0-0423 00445 00467 00231 00253 00274 00295 00315 00336 00356 00376 0-0396 0-0416 0-0266 0-0279 0-0295 00311 0-0327 0-0343 00359 00375 0-0391 00407 0-0213 0-0223 00236 0-0249 0-0262 00274 00287 00300 00313 0-0326 00222 0-0238 Ü0255 00272 00288 00305 00321 0-0338 0-0354 00371 0020 0-0489 00435 0-0423 0-0338 0-0386 0-021 0022 0-023 0024 0025 0-026 0-027 0-028 0029 0-0510 00532 0 0553 0-0574 00594 00614 00634 0-0654 0-0674 00454 00473 00492 0-0511 0-0529 0-0547 00565 00583 00600 00438 00454 0-0469 0-0485 00500 00516 00531 00547 0-0562 00350 0-0363 00375 0-0388 00400 0-0413 0-0425 0-0438 0-0450 00402 0-0418 00433 00449 004(;2 0-0480 00495 00510 00525 0-030 0031 0032 0-033 0034 0035 0036 0037 0038 0-039 0-0693 0-0617 0-0578 0-0712 00731 00750 0-0768 00786 00804 00822 00839 0-0857 00634 00651 0-(J668 0-0684 00700 00716 0-0732 0-0747 00764 0-0462 00593 0-0474 0-0609 00487 0-0624 00499 0-0639 00511 00655 0-0524 00570 0-0536 00685 0-0548 00700 00560 00716 0-0573 00539 00554 0-0569 ( »-( 1584 0-0598 0-()(;i2 0-l)(')2i; 0-0640 0-0()54 0-0(;()8 0040 00874 0-0778 00731 0-0585 0-0681 0041 0-042 0-043 0044 0045 0046 0-047 0048 0-049 0-0890 0-0907 00923 0-0939 0-0954 00970 00985 01000 0-1015 0-0792 0-0807 0-0821 0-0836 0-0850 00863 0-0877 0-0890 0-0903 0-0747 0-0761 0-0775 00790 0-0803 0-0820 0-0835 00849 00864 00598 00609 0-0620 00632 00644 00()56 (1-0668 00()79 00691 00695 00708 00721 0-0734 0-0747 0-0759 00772 0 0785 00797 0050 0-1029 00916 00879 0-0703 0-0809 138 B- Tollcns. Lösung absangt nnd dies Extrahieren mit Alkohol zweimal wiederholt. Dann trocknet man den Tiegel mit dem zurückgebliebenen Furfurol-Phloro- gluzide 2 Stunden lang im Wassertrockenschrank, wägt im Filterwäge- glase usw. Die Differenz gegen das ursprüngliche Gewicht der „gemengten Phlorogluzide" entspricht dem Methyl-Furfurol-Phlorogluzid. Der Phlorogluzidrest oder das Furfurol-Phlorogluzid wird dann nach Kröhers Tabelle auf Pentosan und das Methylfurfurol-Phloro- gluzid wird nach der Tabelle auf S. 137 von W. Mayer und ToIIens auf Me thyl-Pentosan umgerechnet. Hier hat sich gezeigt, daß, ebenso wie Arabinose und Xylose etwas verschiedene Mengen Furfurol-Phlorogluzid liefern, auch Pi ha m- nose und Fukose etwas verschiedene Mengen Methyl-Furf urolphlo ro- gluzid geben, und auch hier ist deshalb eine Tabelle der Mittelwerte für Methylpen tosen (Kol. 6 der Tabelle auf S. l;->7) gegeben worden, welche man anwendet, wenn man, wie in den meisten Fällen, nicht weil'i, ob aus dem untersuchten Material Pihamnose oder Fukose (oder Kho- deose, welche voraussichtlich dieselben Zahlen wie Fukose liefern wird) hydrolytisch entstehen. Wie bei der Furfurolbestimmung statt mit Phlorogluzin die Fällung mit Parbitursäure ausgeführt werden kann, so kann nach Froniherz'^) auch das Methyl-Furfurol mit Barbiturs äure gefällt werden. Der gelbe ki'istallinische Niederschlag, Cm Hg X, 04. wird in Goochtiegeln ge- sammelt, gewaschen, 5 Stunden im Dampftrockenschrank getrocknet und, unter Berücksichtigung des Gelöstbleibens von 2"29 mg in je 100 cm^ 12Voiger Salzsäure, auf Methyl-Furfurol durch Division durch 2 umge- rechnet. Methylpen tosen kann man nach JoIIes^) auf gleiche Weise wie die Pen tosen bestimmen, denn sie liefern, bei der beschriebenen Art zu arbeiten, die theoretische Menge Methylfurfurol. und dies verhält sich dem Natriumbisulfit gegenüber analog dem Furfurol. Wenn Pen tosen und Methylpen tosen gleichzeitig vorhanden sind, riit Jo/les, die betreffende Flüssigkeit mit Barytlösung und viel starkem Alkohol zu versetzen und bei 0" IV2 — 2 Stunden stehen zu lassen, hier- durch wird die Arabinose als Barytverbindung gefällt. Man wäscht den Niederschlag mit Alkohol aus, destiUiert ihn mit Salzsäure, wie es oben beschrieben ist. Wenn man zuerst das Gemenge von Arabinose und Methylpentose (Pihamnose) und dann die wie oben gefällte Arabinose mit Salzsäure destilliert und die für Pen tose und Methylpentose erforderliche Jod- lösung bestimmt hat, so gibt die Differenz zwischen den Zahlen der beiden ') Konrad Frnmhrrz. Dissertation. S. 33. Straßhurg 1906; Zur (luantitatiwii Be- stimmung des Methylfurols. Zcitschr. f. physiol. Chem. Bd. 50. S. 241 (1906/1907). 2) Adolf Jolles, Eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Methylpeu- tosen. Ann. ciicm. Vol. 351. p. 41 (1907). Die wichtigsten Methoden zur «iiuintitativen Bestimmung der Zuckerarten. l;\(} Destillationen die der Ilhaiunose zukommende Menge, und hieraus be- rechnet man die Methyl pentoseprozente (siehe die liemerkung am Schlüsse der Pentosen, S. 185). £) Glukuroiisiiure, C^jHi^O;. Glukuronsäurelakton oder Olukuroii, (V, Hs<>i,, und gepaarte Terbin- (limgen der Glukuronsäure mit anderen Stoffen, Euxunthiusäure etc. a) Fnrf u rol-I) e s t i 1 1 a t ion sm e t h od e. Wie die Pentosen liefert (siehe (inalitative Reaktion) auch (Jlu- kuronsäure — sei sie frei als Lakton, sei sie als gepaarte Verbindung- vorhanden — beim Destillieren mit Salzsäure P'nrfurol nnd daneben 1 Mol. Kohlensäure, und man kann sie mich Lefevre und To//ens^) nnn-- seits durch Wägung des Furfurol-Phlorogluzids und andrerseits durch Wägung der entstandenen Kohlensäure bestimmen. Die Bestimmung des Furfurol-Phlorogluzids geschieht genau wie bei den Pentosen, nur mut5 das erhaltene Furfurol-P hlorogluzid anders auf (Tlukuron säure umgerechnet werden. Da Lefevre und ToUens gefunden haben, dab das (41ukuronsäure- lakton fast genau Vs seines (gewichtes an Furfurol-Phlorogluzid hefert, multipliziert man das Phlorogluzid mit :-> und erhält auf diese Weise die Milligramm (ilukuron. welche in der angewandten Substanz vorhanden sind, und zwar sowohl im freien Glukuron als auch in Euxan- thinsäure, Piuri. Urochloralsäure usw. Natürlich versagt diese Methode, wenn, wie es in Harn, Organen usw. der Fall sein kann, neben Glukuronsäure auch Pen tosen vorhanden sein können, weil man nicht wissen kann, aus welchen der genannten Sub- stanzen das Furfurol stammt. b) Kohlensäure-Abspaltungsmethode. Für diese Fälle haben Lefevre und ToUens die zweite Methode, d.h. die Kohlensäure-Abspaltungsmethode, ausgearbeitet. Hierzu kocht man das Material mit 100 cm^ Salzsäure von POl) spez. (tew. in der Kochflasche des Furfurol-Destillationsapparates, a (siehe Fig. 10). Man labt jedoch keine kondensici-l)aren Dämpfe übergehen und er- reicht dies durch Anbringung eines llückflubkühlers, />, auf der Kochflasche. So fließen Furfurol und Salzsäure zurück, und nur die Kohlensäure entweicht. Die Vi), wird durch Pöhrchen mit Wasser, c. dauii . /um ') K. U. Lefh-fc und B. Tol/ins. rntersuchungen iiher die Glukuronsäure. ilire ((uantitative Bestimmung und ihre Farhenreaktionen. Zeitschr. d. Ver. d. deutsch. Zucker- Industrie. .Tg. 1907. S. 1097; Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S. 4ölH(19U7): siehe audi A. Günther, (i. de Chabnof und B. Tolfois. (llior die Bildung von Furfurol aus Glykunm- säure und deren Derivaten, sowie aus Eiweiüstotfi-n. Ber. d. D(Mitscli. diein. (ies. .Ig. 25. S. 2569 (1892): F. Mann und ß. Tollcns , Üher die Bildung von Furfurol luid Kohlen- säure aus Glukuronsäure. Ann. (hem. Vol. 200. p. 157 (ISiKl): B.Tolhns, Zur Bestim- mung der Glukuronsäure. Zeitschr. f. piiysiol. Chem. Bd. 44. S. 388 (1905). 140 B. Tollens. Trocknen, durch ein Chlorcalciumrohr, d, geleitet und tritt schließlich in einen gewogenen Kaliapparat, e. Um alle CO.. in den letzteren überzuführen, leitet man während der ganzen, .•i'/s Stunden dauernden, Zeit einen lang- samen Strom gereinigter Luft durch den Apparat , indem ein einfacher Aspirator, g, an den Kaliapparat angeschlossen ist, er saugt die Luft heraus, und zum Ersatz derselben tritt in die Entwicklungskochflasche mittelst einer den Kautschukstopfen passierenden Röhre Luft, welche vorher durch eine wirksame Waschflasche, h, mit Kalilauge geleitet ist. /' ist ein Chlorcalciumrohr. Zahlreiche Versuche haben gezeigt, daß Glukuronsäurelakton, der Theorie entsprechend, 25''/o seines Gewichtes an CO2 entwickelt, und man multipliziert folglich die Cr e w i c h t s v e r m e h r u n g d e s K a 1 i a p p a r a t e s mit 4. Fig. 10. Wenn man mit den oben genannten Gemengen von Pen tosen (oder Pentosanen) und Glukuronsäure (oder deren Derivaten) zu tun hat. bestimmt man durch Furf urol-Salzsäuredestillation das Gewicht des zu erhaltenden Furf urol-Phlorogluzids. Darauf bestimmt man durch Kochen mit Salzsäure im soeben beschriebenen Apparate die entweichende Kohlen- säure, welche nur von dem Glukuron herrührt. Multiplikation mit 4 gibt das Glukuron, und Division durch ;') das ihm entsprechende Furfurol- 4 Phlorogluzid. also CO, X ^^ = Phlorogluzid aus Glukuron. Jetzt zieht man das so ermittelte Phlorogluzid von dem wie oben erhaltenen P^urfurol-Phlorogluzid aus Pentose + Glukuron ab und er- hält als Differenz das von den Pentosen gelieferte Phlorogluzid, und aus diesem mittelst Kröbers Tabelle die Pentosen. Die wichtigsten Methoden zur quantitativen Bestimmung .lor /uckerarten. 1^4] Die Anwciulunti' dei' COo-Methode auf llani ist noch nicht ^•ei)iüft woi'don. Vielleicht kann auch die Methode Ncuheri/s'^) der Fällung' der (ilu- kuronsäure mittelst p-Broniphenylhvdraziii zur annähernd (juantitativen He- stimmuni4' dienen. Auch die Naphtoresorzin-Keaktion der (Jlukuronsäure führt nach persönlicher Mitteilung- von C. Tolleih^ zur annähernden lie- stimnuHii»-. 2. Hexosen, CßHioOg. a) (1-Glukose, Dextrose, Traubenzucker, Ilariizueker. Meistens benutzt man die Methode der alkalischen Metallsalz- lösungen (siehe diese in einem anderen Abschnitt des Handbuchs) und der Polarisation (siehe unten). Annähernd kann man die fllukose — sei sie frei, sei sie als Glu- kosegruppen. wie in Stärke, Glukosideu usw. vorhanden — bestimmen, in- dem man sie durch Oxydation mit Salpetersäure in Zuckersäure vei'wandelt und diese als Monokaliumsalz wägt (siehe qualitative Bestimmungen). 5.9 Glukose oder auch Stärke geben meistens gegen l\)—'2(j Cß Hg Og K, doch sind die Resultate recht wechselnd. Auch aus der bei E. Fischers Osazonprobe mit Phenylhydrazin sich abscheidenden Menge Glykosazon kann man \\i\d\ M(iquenne-), und nach Lintner und Kröber ^) auf die vorhandene Menge (tIu kose schließen, denn [[/ Glukose gibt z. B. nach E. Fischer beim IVs^tündigen Erhitzen mit 2 _r/ salzsaurem Phenylhydrazin. ;> r/ Natriumacetat und 20 r/ Wasser OSö — (y^b g Glykosazon und Lintnerimd Kröher üowie Maquenne geben ebenfalls Zahlen an. Ül)rigens werden die Resultate bei gemengten Flüssigkeiten, wie z. B. Harn, nur höchst annähernd sein. (Fruktose gibt bei der gleichen Art der Versuchsanstellung stets mehr an Osazon als Glukose.) Man kann die (jlukose auch durch Gärung bestimmen, denn sie zerfällt, mit Hefe in Berührung, in Alkohol und Kohlensäure: CeHi2()6 = 'iC.,He() + 2C02 Glukose Alkohol. Das Kohlendioxyd läM sich durch Aufsaugen in einem Kaliapparat oder einem Natronkalkrohr und Gewichtsvermehrung dieser Apparate be- stimmen (siehe besonders Jodlbauer*). *) Carl Neuberg, 'Ühev eine Verbindung der (Jlukuronsäure mit p-Th-omphenyl- hydrazin. Bor. d. Deutsch, cliem. Ges. Jg. 32. 8.2395 (1899): P. Majirr und ('. Nnihrrf/, i'her (Ion Nachweis gepaarter (ilukuronsäuren und ihr Vorkommen im normalen Harn. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 29. S. 261 (1900). -) Mfi'/Kouir, Sur Temploi de la plioiiylhydracino ä la dötorminatiou des Sucres. Comptes rendus. T. 112. p. 799 (1891). ^) ('. J. Lintner und E. Kröber, Über die Verwendung des Glukosazons zur quan- titativen Bestimmung von Dextrose, Lävulose und Saccharose. Chemiker-Zeitung. Bd. 19- Rep. S. 142 (1895); das. nach Zeitschrift f. d. ges. Brauwesen. Bd. 18. S. 153 (1895). ■*) Ma.r ,Jo(Ubaiier, Ülior die Anwendbarkeit der alkoludischon (järung zur Zucker- bestimmung. Zeitschr. d. Ver. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1888. S. 308, 313, 346. 142 B. Tollens. Dies ist zwar, wenn man alle für Gasoperationen erforderlichen Be- dingnngen beobachtet, genau, doch ist es nicht sehr einfach. Nach JodJ- hauer liefert Glukose 46-54 «/o CO, und Rohrzucker 49-04 «/o CO,. Volumetrisch kann man ebenfalls die CO2 bestimmen, indem man sie in Röhren ül)er Quecksilber, etwa in einer Bunte'^Qh^w oder F7nAVerschen Gasbürette auffängt, ihr ^'olum unter Berücksichtigung von Druck und Temperatur abliest und es auf Gewicht umrechnet. Man muß bedenken, daß immer etwas der aus dem Zucker entstandenen Kohlensäure in der Gärflüssigkeit adsorbiert bleibt. Hat man die Kohlensäure in Kubikzentimetern ermittelt , so liedenkt man , daß 1 cm^ CO^ (bei 0^ und IkiOmni Druck) 1'96 m/7 wiegt und zirka A mg Glukose entspricht. Annähernd genau läßt sich die Auffangung und Messung des Kohlendioxyds mittelst der sogenannten Gärungsapparate oder Gärröhren bestimmen. Einfach sind diejenigen von Einhorn und von Fiehig; bei diesen wird das Kohlendioxyd über der Flüssigkeit, aus welcher sie sich entwickelt hat, gemessen, bei dem Apparat von Weidenkaf ^) wird Quecksilber zur Absperrung verwandt. Häufig wird der Apparat von Lohnstein ^) an- gewandt und es möge dessen abgekürzte Gebrauchs- anweisung hier folgen (siehe Fig. 11). \'or dem Gel)rauche nimmt man den Stöpsel der Glaskugel, K, ab und hängt die zweiteilige Skala oben auf das senkrechte Rohr. Man gießt dann Quecksilber ein, so daß seine Oberfläche möglichst gleich hoch wie der Nullpunkt der Skalen steht. i-ig. n. Dann bringt man von einer Mischung von 2 g Preßhefe mit 6 cm^ Wasser, welche man mit einem Mörser bereitet hat, O'l — 0*2 cw 3 in die Glaskugel, ferner 0*5 n«^ des Harns. Man setzt dann den gut eingefetteten Stöpsel in die Öffnung der Kugel und dreht ihn so, daß ein in ihm befindliches kleines Loch auf ein ebensolches Loch im Halse der Kugel paßt. Hierdurch wird ein Druck in der Kugel vermieden. Nun dreht man den Stöpsel so, daß die Löcher nicht mehr aufeinander passen und erreicht hierdurch völligen Verschluß. Man setzt das beigegebene Ge- ^^^cht auf die Kugel und überläßt (nach Abnahme der Skala) den Apparat sich selbst, und zwar entweder bei Zimmertemperatur oder bei erhöhter ^) E. Weidenkaff, Gärungssaccharometer mit Quecksilberfaug. Cheiii.-Ztg. Jg. 1908. S. 316. ") Theodor Lohn st ein ., Über (Järiiugssaccharometer nebst Beschreibung eines neuen Gärungssaccharometers für unverdünnte laine. Müncbener med. Wochenschr. Jg. 1899. Nr. 50; siehe auch Anleitung zum chemischen Arbeiten für Mediziner von Dr. /''. Eöhmann. 2. Aufl. Berlin 1904. S. 33. Die wichtigsten Methoden zur ({uantitativen Bestimmung der Zuckerarten. 14«'i Temperatur. Am folsenden Tage ist die Gänmg vollendet, das Quecksilber ist danu mehr oder weniger durch die entwickelte Kohlensäure in das aufrechte Rohr getrieben. Man liest den Quecksilberstand an der wieder übergehängten Skala ab und findet hier direkt Prozente an Zucker an- gegeben. Statt daß man aus der entwickelten Kohlensäure den Zucker be- rechnet, kann man ihn auch finden, indem man vor der Gärung und nach der Gärung das spezifische GeAvicht der Flüssigkeit bestimmt, wobei die sich zeigende Differenz ein Maß für die vergorene Glukose ist, oder aber man bestimmt den gebildeten Alkohol durch DestiUation und Er- mittlung des spezifischen Gewichtes des Destillates. Weiter existieren kolorimetrische Bestimmungsmethoden sowie sonstige Methoden, welche auf die Bestimmung des Lichtbrechungsvermögens der zuckerhaltigen Flüssigkeit gegründet sind. Hierüber sehe man im Buche von V. Lippmann, z. B. S. 577, nach. Wichtig ist die Polarisationsmethode, (a)D der wasserfreien Glukose ist = = + 52-5« + 0-018796 P -f- 0-000517 P^, worin P den Prozentgehalt der Lösung bedeutet; die spezifische Drehung steigt also etwas mit der Konzentration, und sie ist für lO^/oige Lösung + 52-7". Über die Manipulationen der Polarisation reiner Glukose siehe S. 125—127. Bei Anwendung der 200 mm langen Beobachtungsröhre ist für je 1 Grad der Ablesung in den Kreisgradapparaten mit meist genügender Genauigkeit 0-952 g Glukose in 100 cm'^ der polarisierten Flüssigkeit zu rechneu (nach Köiiir/s Handbuch, S. 2o4, sind 0-94o4<7 anzunehmen). Für je 1 Skalenteil der Ablesung in dem Quarzkeilapparate mit VentzkeficheY Zuckerskala sind 0-o268 g Glukose in 100 an^ zu rechnen. Wendet man das 100 mm-Rohr an, so sind die obigen Zahlen natür- lich zu verdoppeln. Wie früher bemerkt, sind an manchen Apparaten die Skalen so ein- gerichtet, daß sie direkt Gramm Glukose in 100 cm^ angeben, d.h. so- genannte ..Volumprozente", welche, durch das spezifische (iewicht der Flüssigkeit dividiert, wirkliche Gewichtsprozente geben. Es sind dies meistens die zu ärzthchem Gebrauch bestimmten Instrumente. Um die zur Polarisation unerläßliche Klarheit der Flüssigkeit zu erlangen, versetzt man 100 cm^ des Harns mit einigen Kubikzentimetern Bleiessig, filtriert, polarisiert und zieht die ^ olumvermehrung durch den Bleiessigzusatz in Rechnung (s. S. 127). Wenn Eiweiß vorhanden ist, kann man dies vorhei- durch Erhitzen des Harns mit etwas Salpetersäure oder Essigsäure ausfällen; übrigens wird es durch den Bleiessig entfernt. Man darf nicht mehr Bleiessig anwenden, als zui- Fällung der Bei- mengungen erforderlich ist, denn bei erheblichem Überschlug des Bleiessigs 144 B- Tollens. und besonders, wenn die Reaktion der Flüssigkeit alkalisch ist, kann be- deutende Änderung der spezifischen Drehung des Zuckers eintreten, den neuerdings besonders Grossmann ^ ) nachgewiesen hat. Wenn im Harn als Zucker nur Glukose vorhanden ist, stimmen bei sachgemäßer Ausführung die durch i^e/?/«^r/sche Lösung und durch Polari- sation ermittelten Zahlen zusammen. Wenn das letztere nicht stattfindet, wenn die Polarisation weniger Zucker angibt als FehHnrßdie Lösung, ist dies ein Anzeichen, daß andere Zucker arten (besonders Fruktose -) oder vielleicht Gluku ronsäure der ivate vorhanden sein werden. SoUte die Polarisation einmal höhere Zahlen als die Kupferbestimmung geben, so wäre Maltose oder vielleicht ein (künstUcher) Zusatz von Rohr- zucker zum Harn zu vermuten. [i) Fruktose, Lävulose, Fruchtzueker. Auch diese Hexose (welche zu den Ke tosen gehört) läßt sich mit FehlhußchQY Lösung und durch Polarisation bestimmen. Sie dreht im Gegensatz zu Glukose, Galaktose, Rohrzucker und Mal- tose stark nach links, und diese Drehung verändert sich im (Jegeusatz zu derjenigen der meisten anderen Zuckerarten stark mit der Temperatur, indem sie beim Abkühlen steigt und beim Erwärmen von 20'^ auf 90° C auf ungefähr die Hälfte sinkt. Nach Os^ 3) ist bei 20« (a) D = — OPD« + Olli p), worin p die Pro- zente Fruktose in der Lösung bezeichnet. Li lOo/oiger Lösung ist hier- nach (a)D = — 9;-')°. Nach Jungfleisch und Grimbert^) ist (a)D = — lOPoB" + 0-o6t — — 0"108 (p — 10), worin t die Temperatur und p der Prozentgehalt der Lösung ist, hiernach ist die Drehung bei 20" C und in 10**/oi8er Lösung = = — 90-18». Annähernd wird man Fruktose durch Fällung mit Kalk, Zersetzung des Niederschlages mit Oxalsäure und Polarisieren, oder aber nach Neu- berg'"") durch Fällung mit Methyl-Phenylhydrazin bestimmen können. In betreff der Kalkmethode mag auf die Darstellungsmetho- den der Fruktose verwiesen werden (siehe S. 76). Die Methyl-Phenylhydrazinmethode gründet sich darauf, daß Fruktose bei Gegenwart von Essigsäure beim gehnden Erwärmen ein ') //. Grossmann , Über die Bedeutung vou Bleisalzen für die polarimetrische Untersuchung des Harnes und der Gewebssäfte. Biochem. Zcitschr. Bd. 1. S. 338 (1906). -) Siehe besonders Bosin , Beitr. zur wissenschaftl. Med. u. Chemie. Salkoicski- Festschrift. Berlin 1904. S. 105. **) H. Ost, Drehungsvermögen der Lävulose und des Invertzuckers. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 24. S. 1636 (1891). *) E., Jungfleisch und L. Grimherf , Sur la levulose. Compt. reud. T. 107. p. 390; Sur le Sucre inverti. Ebenda. T. 108. p. 144. ^) Carl Neuberg, Über die Isolierung von Ketosen. Ber. d. Deutseh. ehem. Ges. Jg. 35. S. 960 (1902).' Die wichtigsten Methoden zur (juantitativen Bestimmung der Zuckerarten. ]^45 schwerlösliches Me thvl-Pheny 1-0 sazon,C6Hio 04. fXo S'',}J02, liefert und ^ - LHj^ daß andere Glykosen dies nicht tun sollen (siehe S. 111). Man bringt die ziemlich konzentrierte Lösung (ca. 10 — 11 nii^) mit etwas mehr als der berechneten Menge Methyl-Phenylhydrazin. soviel Alkohol wie zur (iewinnung einer klaren Lösung erforderlich ist, und 4 cm^ einer öO"/oigen Essigsäure 5 — 10 Minuten aufs Wasserbad. Am folgenden Tage hat sich das Osazon in gelbroten Nadeln abgeschieden. In reinem Zustande schmilzt es bei 158 — 1(30^ und dreht es (in Alkohol und Pyridin gelöst) rechts. Sind andere Zuckerarten zugegen, so läßt man die mit Methyl- Phenylhydrazin, aber nicht mit Essigsäure, versetzte Flüssigkeit erst 1^4 Stunden stehen, saugt das etwa ausgeschiedene Mann ose- oder Galak- tose-Methyl-Phenylhydrazin ab und versetzt dann mit Essigsäure, worauf das Methyl-Phenyl-Osazon beim Erhitzen ausfällt und am fol- genden Tage abfiltriert wird. Y) Glukose 1111(1 Fruktose (besonders Invertzucker). Sehr häufig findet sich Fruktose neben Glukose in der Xatur, z. B. in süßen Früchten, und ferner ist sie der neben Glukose aus Rohr- zucker durch Hydrolyse oder Inversion mittelst Säuren oder Ferment- tätiiikeit entstehende Zucker, welcher mit Glukose zusammen den soa. ..In- V er tz ucker" bildet. Wenn sich Fruktose neben Glukose findet, kann man sie nach Sieben ^) bestimmen, indem man zuerst mittelst FehUncßcher Lösung beide Glykosen bestimmt, dann eine andere ^lenge der Flüssigkeit mit Salzsäure von bestimmtem Gehalt o Stunden auf dem kochenden Wasserbade erhitzt, wodurch die Fruktose zerstört wird, nach dem Erkalten neutrahsiert und darauf die nicht (oder wenig) zerstörte Glukose bestimmt. Die Differenz ist die Fruktose. Das Verfahren gibt nach Herzfeld, \]'ichmann, Dainm- müUer-) nicht immer ganz gute Ilesultate, doch sind die letzteren stets annähernd gewesen. Einigermaßen genaue Piesultate gibt die Kombination der Resultate der Zuckerbestimnmng mittelst Fehlingscher Lösung und der Polari- sation. Da Glukose und Fruktose sich nicht ganz gleich gegenüber der Fehling^chen Lösung verhalten, muß man freilich beim ITmrechuen der durch Titrieren oder Bestimmung des reduziei'ten Kupfers gewonnenen Zahlen auf Glykosen intermediäre Zahlen anwenden, und dies sowie der Umstand, daß die spezifische Drehung von Glukose und Fruktose je ') Ernst Sieben, Über die Zusammensetzung des Stärkesirups, des Honigs und über die Verfälschungen des letzteren. Zeitschr. d. Ter. f. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1884. S. 837, 865. ■■^) r. Lippmann, Zuckerarten. S. 895. Abderh.alden , Handbuch der biochemiselien Arbeitsmethoden. II. JQ 146 B. Tollens. nach der Konzentration etwas wechselnd ist, macht die Methode etwas un- genau, wenn man nicht nach annähernd ermittelter Konzentration der Glykosen genauere Zahlen einsetzt, was die Methode umständlich macht. Als annähernde Polarisationszahlen kann man folgende annehmen: Bei 20'' C und bei Anwendung des 200 wi»?-Rohres ist — 1 0 Kreisdrehung = —— — - = 0-r:)o8<7 Fruktose in 100 cw^ 92'o . 2 + 1° Kreisdrehunu =^-^ — ^ = 0*952 g Glukose in 100 cm^. Gesetzt, es seien durch Bestimmung mit FehIinfßc\ieY Lösung in einem Fruchtsaft oder dergl. a Gramm (xlykosen in 100 cm^ und ferner b Grad Linksdrehung ( — ) oder Rechtsdrehung (+) gefunden und sei x die Glukose und a — x die Fruktose, so setzt man an X a— X b z= I 0-952 0-538 ' hieraus erhält man: b . 0-952 . 0-538 = 0-538 x -- 0-952 a + 0-952 x 0-5122 b = 1-490 x — 0-952 a 0-5122 b + 0-952 ar:: 1-49 X 0-5122 b + 0-952 a — — = X = Glukose 1 '■19 a — x=: Fruktose. Beide als Gramm in 100 cm 3. Dreht z. B. eine Lösung, in welcher man 15,^ Glykose auf 100 c;«^ gefunden hat, im 200 nDii-Hohr 5° nach links, so hat man 0-5122-— 5 + 0-952-15 ^ .,,. ^,, , , ,. ^ „,, X = -—- = 7-8b q Glukose und v = lo — r8b = 1-49 "^ = 7-14,(7 Fruktose. 7-86 Hierbei haben die 7*86 7 Glukose nach—-—- = 8-26" Rechtsdrehung -^ 0-952 7-14 und die 7-14 r/ Fruktose nach -^—-=: 13-27" Linksdrehung veranlaßt, 0-o38 und + 8-26"— 13-27»=:— 5-01«, d. h. 5" Linksdrehung. Hat man mit dem gewöhnlichen Quarz keilapparat gearbeitet, so multiphziert man vor der obigen Rechnung die Skalen teile mit 0-3)46, um die Drehung in Kreisgraden zu erhalten. Je nachdem man (a)D der Glykosen etwas höher oder niedriger nimmt, werden die Formeln etwas anders, und in der Tat finden sich in der Literatur verschiedene derartige Formeln. (Siehe z.B. Neubauer'^), welcher zuerst diese Untersuchungen angestellt hat, ferner Wkhmann u. a.) ^) C. Neuhfiuer , Quantitative Bestimmung der Dextrose neheu der Lävulose auf indirektem Wege. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 10. S. 827 (1877). Die wichtigsten Methodcu zur (|uiiutitativeii Bestiiniimiig der Zuciverartcii. I47 Neuerdings hat Geelmwjden'^) älmliclie Formeln zur Bestimmung von Glukose und Fruktose im Harn t;et>eben. ^) Maiiiiose, Cg H12 < \- Man versetzt mit riienylhydrazinacetat, saugt das am folgenden Tage abgeschiedene Mannose-Phenvlliydrazon, CßHioOs . N2 H . CßHg, ab, trocknet es nach dem Auswaschen, wägt es und berechnet auf CßHioOß, iiidoiii mnn 0,2 ^igNo O5 : Cg H12 Og rechnet, d. h. mit 2/.^ multipliziert. £) (Galaktose, CeHi2 06. Man führt die S. 11;) zur qualitativen Nach Weisung der Galaktose angegebene Methode sorgfidtig aus und wilgt die Schleim säure, welche man aus der abgewogenen Substanz mit dem 12fachen (in Kubikzentimetern) an Salpetersäure von 1*15 spez. Gew. durch Abdampfen auf Vs des Volums, Zerriüiren mit etwas kaltem Wasser, Abfiltrieren auf gewogenem Filter, Auswaschen, Trocknen erhalten hat. Da nach Kent'^, Rischbiet^) und Tollens Galaktose annähernd Töo/o ihres Gewichtes an Seh leim säure liefert, multipliziert man die letztere mit f', , um das Gewicht der Galaktose zu erfahren. Die Methode ist von E. Schulze und Steiger^) angewandt worden, ferner von R. Bauer ^) zur Untersuchung von Harn auf Galaktose und Milchzucker. Man bedenke, daß mit Salpetersäure aus Milchzucker Schleim- säure entsteht, und zwar nur ca. i35<'/o. NatürUch ist auch die Polarisationsmethode brauchbar. 1 Kreisgrad Rechtsdrehung zeigt bei Verwendung des 200 »^m-Rohres — -= 0"617g 81 . 2 Galaktose in lOOcrn^. 3. Di-Saccharide, C12H22O11. a) Rohrzucker, C12 H22 On- Hat man mit reinen Ilohrzuckerlösungen zu tun, so benutzt man neben der Polarisation (s. u.) die Ermittlung des spezifischen Gewichtes mittelst eines Pyknometers, z. B. des Sprengel-Landolf ■midien, oder eines Aräometers, und l)edient sich der Tabellen, welche die dem spezifischen Gewicht entsprechenden Zuckerprozente angeben. ') H. Chr. GrrlniKi/de» , Entwurf einer Methode zur quantitativen Bestimmung mehrerer Zuckerarteu nebeneinander in diabetischen Harnen. Zeitsclir. f. aualyt. (."heni. Bd. 48. S. 137 (1909). -) W. H. Kenf und B. ToIInis, Untersuchungen ühov Milclizucker und Galaktose. Ann. Chem. Vol. 227. p. 223 (1885). '^) P. Rischhict und B. Tollens. Versuche mit Melasse- und Baumwoll-Raffinose. Ann. Chem. Vol. 232. p. 187 (1885). *) E. Schulze und J'J. Sfeif/cr, Über das Vorkommen eines unlöslichen, Scliloim.siiure gebenden Kohlehydrats in Rotklee- und Luzcmepflanzon. Landw. Vers.-Stat. Bd. 30. S. 11 ; Untersuchungen über die stickstofffreien Reservestoffe der Samen vonLupinus Intens und über die Umwandlungen derselben während des Koinuingsprozesscs, das. Bd. 36. S. 4.38, 465 (1899). '") Richard Bauer., Eine expeditivc Methode zum Nachweis von Galaktose und Milchzucker im Harn. Zeitschr. f. phvsiol. Chem. Bd. 51. S. 159 (19061907). 10* 148 B. Tolleus. Sie stimmen beinahe überein, und ihre Prozentanzeigen werden al:< Grade Balllng und B^-ix bezeichnet. Diese Tabellen, besonders diejenigen von Brix, zeigen die Beziehungen zwischen spezifischem Gewicht, Zuckerprozenten usw., und sie befinden sich in den Büchern von Frühimg usw. Beipiemer sind die Aräometer, welche durch ihr Eintauchen direkt an ihrer Skala die Zuckerprozente anzeigen und Saceharometer genannt werden. Hier sind in Brauereien und Brennereien die Saceharometer von BaUiru/ \md in Zuckerfabriken die Saceharometer \on Brix in Gebrauch. Sind die Zuckerlösungen nicht rein, so wirken die Beimengungen an- nähernd wie der Zucker auf das spezifische Gewicht, und folglich bezeichnen die Grade dann nicht Prozente an Zucker, sondern Prozente an Zucker + Bei- mengungen oder Prozente an Trockensubstanz. Ferner ist zur Bestimmung des Gehaltes an Rohrzucker in Flüssig- keiten die Ermittlung des Brechungsexponenten mittelst des von Zeiss in Jena hergestellten Refraktometers nach Ahhe neuerdings eingeführt worden. Siehe u. a. StroJnner, Malier, Lange und besonders MainJ) Es gibt dieses Instrument in ganz reinen Rohrznckerlösungen nach den Tabellen der genannten Autoren den Prozent geh alt an Zucker an, in Lösungen, welche noch andere Substanzen enthalten, dagegen den Ge- halt an Zucker und den Beimengungen, d.h. den Trockensubstanz- gehalt. Es bewirkt also ungefähr dasselbe wie die Ermittlung des spezi- fischen Gewichts, die Bestimmungen sind aber be(iuem mit sehr kleinen Mengen auszuführen. Den Rohrzucker allein bestimmt man auf andere Weise. Man kann den Rohrzucker der Rüben, wie es schon Marggraf im. Jahre 1747 be- schrieb, allenfalls durch Extrahieren mit starkem Alkohol, Verdunsten des Alkohols und Wägen der nach kürzerer oder längerer Zeit abgeschie- denen Kristalle annähernd bestimmen, doch versagt dieses Verfahren häufig, weil Beimengungen sehr leicht das Kristallisieren hindern. Besser, wenn auch nicht strenge quantitativ, ist das Verfahren der Strontianfällung von E. Schuhe. -) ^lan extrahiert die gewogene getrocknete Substanz mit starkem liis absolutem Alkohol, setzt der kochenden Extrak- tionsflüssigkeit nach und nach von einer heiß gesättigten Lösung von kristallisiertem Strontiumhydroxyd zu, bis ca. 3 Teile des letzteren auf 1 Teil Rohrzucker vorhanden sind, kocht ^/g Stunde lang im Wasser- bade, saugt ab und wäscht mit Strontianlösung aus. Den Niederschlag bringt man in Wasser, sättigt mit Kohlensäuregas, saugt die Zuckerlösung vom Strontiankarbonat ab und sucht sie zur Kristallisation zu bringen. ') Hugh Main, Schnelle Wasserbestimmuug in Zuckerfabrikprodukten, wie Siru- peu, Füllmassen etc. Zeitschr. d. Ver. f. d. deutsche Zuckerindustrie. Jg. 1907. II. S. 1008. -) E. Schulze, Über den Nachweis von Rohrzucker in vegetabilischen Substanzen. Landw. Vers.-Stat. Bd. 34. S. 408 (1887); E.Schulze und S.Frankfurt, Über die Ver- breitung des Rohrzuckers in den Pflanzen, über seine physiologische Rolle und über lösliche Kohlenhydrate, die ihn begleiten. Zeitschr. f. physiol. ('hem. Bd. 20. S. 511 (1895): E. Schulze, Über den Nachweis von Rohrzucker in vegetabilischen Substanzen. Bd. 27. S. 267 (1899); Zum Nachweis des Rohrzuckers in Pflanzen sameu. Bd. 52. S. 405 (1907). 4 Die wichtigsten Methoden zur quantitativen Bestimmung der Zuckerarten. 149 Gelingt dies nicht oder nicht genügend, so sucht man es durch Zerreiben des Sirups mit absolutem Alkohol, durch Lösen in heißem starken Alkohol, durch neues xUisfiUlen mit Strontiumhydroxyd usw. zu erreichen. Schlieldlich bringt man die Kristalle auf Ton und polarisiert; es ist jedoch klar, daß bei den beschriebenen Methoden viel Zucker verloren gehen kann. Bohrzucker-Polarisatioii. Wichtiger als die obigen mehr für die ([ualitativen Bestimmungen geeigneten Methoden ist die Bestimmung durch Polarisation, ja, es ist die fast einzig angewandte. (a)I) des Rohrzuckers ist nach ToUens für 4 — 18%ige Lösungen = + 66-81 — 0-01 ö5 p — O-OOOOÖ p 2 und für 18^600/oige Lösungen — + (')(VH86 + 0-0 150 p — 0-00040 p^. und nach Schmitz ist (a) D = + 6(>-r)l + 0-0045 p — 0-00028 p-; folglich nimmt die Drehung mit zu- nehmender Konzentration etwas ab. Für annähernd lOVoige Lösungen kann man (a)I)= + {'Ay'y^ annehmen, und hieraus folgt, daß im 200 ww- Bohr 1 Kreisgrad nach rechts einer Drehung von--— — = 0-752 a 66-0 . 2 "^ Rohrzucker in 100 oh^ der Lösung entspricht. Wenn man den gewöhnlichen (^ u a r z k e i 1 - H a 1 b s c h a 1 1 e n a p p a r a t be- nutzt, so erinnert man sich des Umstandes, daß die Skala desselben so einge- richtet ist, daß im 200 »^w^-Rohr eine Lösung von 26-048,«/ (dem sogenannten j, Normalge wicht •' ) reinen Rohrzuckers in Wasser zu 100 c/y.'^ von gewöhnhcher Temperatur genau 100 Skalen teile Verschiebung bewirkt. Folglich entspricht ein Skalenteil einem Gehalt von 0-2604S ,r/ Zucker in 100 cm^ (s. S. 125). (Falls man nicht nach Mohrs Vorgange bei ll'b^ C geaichte, sondern bei 4" C geaichte Maßkolben, d. h. sogenannte „wahre 100 cm^-Kolben" ver- wendet, so ist das ,. Norm alge wicht" 26//, und 1 Skalenteil zeigt 0-26,^ Zucker in 100 crn^ an.) Vm. eine Polarisation, z. B. von Rübensaft, auszuführen, vermischt man 100 ciii'^ Saft mit so viel Bleiessig, wie zur Klärung nötig ist (10 bis 20 cm^), schüttelt, filtriert, polarisiert und zieht die Volumvermehrung durch den Bleiessig in Rechnung (siehe S. 127). Will man in pflanzlichen Materiahen, z. B. in Fabriken im Rübenbrei, den Zucker bestimmen, so stellt man aus dem gewogenen Brei ein be- stimmtes \'olum Extrakt her, klärt dies mit Bleiessig und polarisiert. Hier sind viele spezielle Vorschriften gegeben, welche man im Buche von Frühlimj^) sowie in den ,. Ausführungsbestimmungen zum Zuckergesetz" nachlesen kann. Hier möge nur angeführt werden, daß das „Normalgewicht" Brei so mit Flüssigkeit extrahiert oder digeriert wird , daß 100 cni'^ Flüssigkeit entstehen, wovon ein Teil polarisiert wird. Die Extraktion kann mit Wasser (nach Pellet) oder mit Alkohol gesche- hen, die Klärung mit Bleiessig, festem basischen Bleiacetat, Bleinitrat usw. M FriihUnf/, Anleitung zur Untersuchung der für die Zuckorindustrie in Be- tracht kommenden Rohmaterialien, Produkte, Nebenprodukte und Hiltssul)stanzen. 6. Aufl. Braunschweig 1903. 150 B. Tollens. Alle Polarisationen werden mit dem Quarzkeil- Halbschattenapparat mit Ventzke-Scheihleri^cher Skala ausgeführt, welcher das „Normalgewicht" 26'048 g zugrunde liegt (siehe oben). Wenn neben dem Piohrzueker andere optisch wirksame Glykosen, wie z.B. Glukose oder Fruktose, vorhanden, sind, muß man neben der obigen Methode, welche die ,,direkte Polarisation-' des Gemenges angibt, noch die „Inversionspolarisation' bestimmen und hierbei das Folgende bedenken: Wenn man Rohrzuckerlösung- mit Salzsäure auf 69 — 70° C er- wärmt, wird der Rohrzucker in Glukose + Fruktose zerlegt, und das Gemenge besitzt, da Fruktose stärker links als Glukose rechts dreht, eine erhebliche Linksdrehung: folglich besitzt das mit Salzsäure erhitzte Zuckergemenge Linksdrehung oder wenigstens g-eringere Rechts- drehung, und diese „Polarisations Verminderung-' ist ein Maß für den vorhanden gewesenen Rohrzucker. Nach den Untersuchungen von Creydt i) und Tollens, welche von Herz- feld"') erweitert wurden und in den „Ausführungen zum Zuckergesetz" fest- gelegt sind, entsprechen, wenn genau nach den l)etreffenden Vorschriften gearbeitet wird, je 100 Skalenteile nach rechts der „direkten Polarisa- tion" oder P, einer „Inversionspolarisation" oder J, von o2'(36 Skalen- teilen nach links, und folglich findet eine Polarisationsverminderung von 100 + 32-66 = i:32-66o Skalenteilen statt. Die Polarisationsverminderung oder P — J wird meistens mit S be- zeichnet, weil sie die Summe der ursprünglichen Rechtsdrehung oder P und der Inversionspolarisation oder J, welche, wenn annähernd reine Rohr- zuckerlösung angewandt war, Links oder — ist, bedeutet. 1 Skalenteil der Polarisations Verminderung entspricht also 0-26048 X vTT^ = 0-1963 a Rohrzucker. 132-66 '' Hierbei ist vorausgesetzt, daß alle Polarisationen auf dasselbe Volum der Flüssigkeit berechnet sind, und ferner, daß die Inversionspolarisa- tion bei 20° C ausgeführt wurde. Ist die Inversionspolarisation bei einer anderen Temperatur (t) aus- geführt, so reduziert man sie auf 20", indem man die Polarisationsverminde- rung i;)2-66 für jeden Temperaturgrad über 20° C um 0-5° verkleinert und für jeden Grad unter 20° C um 0-5° vergrößert. Folglich hat man die Formeln ,, , , (P— J).100 , S. 100 Zuckerprozent = -— oder 142-66 — 0-5 xt .__ ft — 20 lo2-66 — [^- Über die Bestimmungen von Rohrzucker mittelst i^e/^/^«^ scher Lösung nach der Inversion, sei es für sich, sei es im Gemenge mit Glukose, Fruktose etc., lese man in einem anderen Teile dieses Handbuches ^) R. Creydt, Die quantitative Bestimmung der Raffinose. Zeitschr. d. Vor. d. Deutschen Zuckeriudustrie. Jahrg. 1887. S. 153. -) A. Hcrzfeld, Zucker- bez. Eaffinnsehestimmung mittelst der Inversionsmethode. Ebenda. Jahrg. 1890, S. 194; A. Herzfeld und Danimüller, Ebeiula, Jalirg. 1888, S. 719. Die wichtigsteu Methoden zur quantitativen Bestimmung der Zuckerarten. 151 nach. Die Inversion kann nach dem obigen ^'erfahren mit Salzsäure ge- schehen, sie kann aber auch mit anderen Säuren, z. 11 Zitronensäure (siehe bei Milchzucker ) oder auch nach KiiUsch ^ ) bei ^Yeinuntersuchung■en durch Erhitzen von 100 cw-^ mit ?> g Oxalsäure geschehen. Man findet näheres über Ilohrzuckerinversion in der großen Abhand- lunjj" von Guhhe. ~) ß) Maltose, Ci^H.^oOn. Die Maltose kann man, wenn Glukose, Fruktose etc. beigemengt sind , nur sch^\ierig bestimmen , man ermittelt das Reduktionsvermögen dieser Flüssigkeiten gegen Fehlinf/&c\ie oder Knappsche Lösung, und gegen Barfoed&che Lösung. Man bestimmt die Polarisation vor und nach der Hydrolyse etc. (siehe Lippmann, Die Zuckerarten, S. 1499 ff.). Geelniuyden^) rät, durch eine besondere Hefe (Nr. 58H der Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berhn, Seestraße 65), welche die Di- saccharide — und so die Maltose — nicht angreift, die Flüssigkeit in Gärung zu versetzen, nach ö Tagen die Flüssigkeit zu polarisieren und die Drehung auf Maltose zu berechnen. y) Milchzucker, Ci-iHsoGu + H., (). (x)D des ^Milchzuckers = + 52-5;)0 (siehe Schmüger^). Folglich ist 1" des Kreisgradapparates bei Anwendung des 200 'm;;i-Uohres = — — ^^^ — — = 0"952 g Milchzucker in 100 c»^ ^ Flüssig- keit, und 1 Skalenteil des Quarzkeilapparates ist = (y:\29 g Milchzucker in 100 rm\ Wenn man trockenen oder kristallisierten iNIilchz ucker zu unter- suchen hat, muß man die Mehr drehung (wohl auch die Wenigerdrehung einer anderen Modifikation des Milchzuckers) des Milchzuckers bedenken, also bei der Auflösung erwärmen oder bis zur Ablesung 24 Stunden warten oder einige Tropfen Ammoniak zusetzen. Bei der Untersuchung der Milch kann man den Milchzucker nach Scheihe'") bestimmen, nachdem man Eiweißstoffe und Fett durch Fällung mit Jod Quecksilber- Jodkalium gefällt hat. .Jr> cm'^ Milch werden mit T'öon^ einer 20''/oigen Schwefelsäure und 1-bcm^ einer Quecksilberlösung versetzt, die wie folgt bereitet wird: 40// Jodkalium werden in 200 cm » Wasser gelöst, mit ö5 (/ (^)uecksili)erjodid geschüttelt, zu öOO cm^ aufgefüllt und von ungelöstem Quecksilber Jodid ab- 1) Ktdisch, Tätigkeitsbericht d. Yers.-Stat. Colmar i. Eis. 1904—1906. S. 81. -) 0. Guhhe, Über das optische Drehungsvermögen des Invertzuckers. Zeitschr. d. Ter. d. Deutschen Zuckerindustrie. Jahrg. 1884. S. 1345. '^) //. Chr. GeelniHijde» , Entwurf einer Methode zur (luantitativen Bestimmung mehrerer Zuckerarten nebeneinander in diabetischem Harn. Zeitschr. f. unalyt. Chemie. Bd. 48. S. 137 (1909). ■*) M. Schiiiöf/cr, Das spezifische Drehuugsvermögen dos Milchzuckers. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 13. S. 1922 (1880). ^) Dr. Anton Sclieihe, Die Bestimmung des Milchzuckers in der Milch durch Polarisation und Reduktion. Zeitschr. f. analyt. Chemie. Bd. 40. S. 1 (1901); siehe auch Königs Untersuchung landwirtschaftl. und gewerbl. wichtiger Stoffe. S. 471. 152 B. Tollens. filtriert. Nach dem Auffüllen der mit den Kliirmitteln versetzten Milch zu 100 ci)i^ ^Yil•d das Filtrat im 40()wm-Iiolir bei 17"5« polarisiert." ,.Zur Beseitigung des durch das Yolum des Niederschlags hervorge- rufenen Fehlers ist nach A. Scheibe bei Vollmilch (mit 2*8 — 4-7"/o Fett- gehalt ) der gefundene Milchzuckergehalt mit ( )-94 und bei Magermilch mit 0"97 zu multiplizieren." Bleiessig darf man nach Scheibe nicht zur Klärung der Milch an^Yenden, weil mit dem Niederschlag etwas Milchzucker niederge- schlagen werden soll. Wenn neben dem Milchzucker (wie in der kondensierten Milch) Rohrzucker vorhanden sein kann, muß man die geklärte Flüssigkeit ein- mal direkt und dann nach Inversion des Rohrzuckers prüfen. Hierzu hat Herzfeld ^) eine A'orschrift gegeben, welche ins Zuckergesetz eingeführt ist. 100 r/ kondensierter Milch werden mit Wasser und 20 cm- Blei- essig zu 500 cm 3 gebracht und filtriert. a) Direkte Polarisation: 75 cm^ des Filtrats vom Bleiessignieder- schlage werden mit etwas Aluminiumhydroxyd und Wasser zu 100 cm^ aufgefiUlt und polarisiert. h) 75 cm^ des Filtrats vom Bleiessigniederschlage werden mit 5 cm"' Salzsäure von 1"19 spez. Gew. genau, wie es zur Rohrzucker-Inversionspolari- sation vorgeschrieben ist, im Wasserbade erwärmt, dann zu 100 cm'' auf- gefüllt und bei 20*^ C polarisiert. Die Formeln zur Berechnung auf Zuckerprozente findet man a. a. (). und im Zuckergesetze. Die Methode beruht darauf, daß Milchzucker der Hydrolyse schwerer verfiUlt als der Rohi'zucker und unter den angegebenen I^edingungen nicht merldich zerlegt wird. Auch Zitronensäure bewirkt die Inversion des Rohrzuckers, ohne den Milchzucker anzugreifen. Annähernd kann man nach Bauer den im Harn befindhchen Milch- zucker durch Oxydation mit Salpetersäure zu Schleim säure be- stimmen (siehe bei Galaktose). h Rafflnose, Melitose, Melitriose, C.gHg, Ok, + •'> H. 0. Dieser in geringer Menge in den Rüben, in größerer Menge in Rübenmelasse, in Baumwollsamen und in der Manna von australi- schen Eukalyptusbäumen vorkommende Zucker enthält die 3 Glykosen: (ilukose, Galaktose und Fruktose. Seine Drehung ist recht hoch, (a)D= -f 104—105". Im 200 mm-Vvo\\Y ist je P Kreisdrehung = .—-——y = 0-479 .(7 kristallisierter Raffinose 1 Skalenteil des Quarzkeilapparates = 0-1657 5' kristallisierter Raffinose oder rr: 0-140(3^7 wasserfreier Raffinose in 100 cml Die wasserfreie Raffi- nose polarisiert also — - — — ^= l-85mal so stark als Rohrzucker. ^ 0-1406 1) Äudening der Ausführungsbestimmungen zum Zuckergesetz. Zeitschr. d. Vor. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1897. Allg. Teil. S. 366. Die wichtigsten Methoden zur quantitativen Bestimmung der Zuckerarteu. 153 Man kann die Raffinose nach Creydt^) aus der Schleimsäureaus- beute beim Oxydieren mit Salpetersäure bestimmen. Gewöhidich wird sie aber in von der Zuckerfabrikation herrührenden Sirupen nach der im Zuckeriiesetz befindlichen, von Herzfeld -'^■'■^) formu- lierten Vorschrift bestimmt (siehe auch Creijdt^). Die Methode beruht darauf, daß bei den angegebenen Bedingungen der Hydrolyse oder Inversion die anfängliche llechtsdrehung des Rohr- zuckers sich im Verhältnis + 100: -^H2'6() in Linksdrehung verwan- delt, die Rechtsdrehung der Raffinose sich aber nur im Verhältnis + 100:+öl-24 vermindert, ohne in Linksdrehung überzugehen. Hierl)ei entsteht eine Spaltung der Raffinose in Fruktose und ein aus (ilukose und Galaktose zusammengesetztes Di-Saccharid, die Melibiose, von Scheihler^) und Bau^), welch letzterer sie kristaUisiert erhielt. Man polarisiert Zucker, welcher Raffinose enthält, im ^OOmm-Piohr des Quarzkeilapparates und bei Anwendung des Normalgewichts -J&O-LSg auf 100 cm3 a) direkt = ?; h) nach der Inversion oder Hydrolyse, welche genau wie die In- version des Rohrzuckers ausgeführt wird, indem man mit dem halben Normalgewicht auf IQOcni^ operiert. Lalls man wie gewöhnlich mit dem 200 mm-Rohr arbeitet, muß man also die Drehung der invertierten Flüssig- keit verdoppeln: man hat dann die Inversionspolarisation oder J. Wenn P die I)eobachtete Polarisation vor der Inversion und J die nach der Inversion beobachtete (verdoppelte) Polarisation sind, und wennZ die Pro- zente an Zucker und R die Prozente an Raffinose bezeichnen, so hat man L P = Z + 1-852 R und IL .1 = — 0-3266 Z + LSÖ R. 0-5124 Multipliziert man die Gleichung I. mit 0-5124, so hat man: HL 0-5124 P = 0-5124 Z + 1-85 R 0-5124, zieht man IL J = — 0-3265 Z 4- 1-85 R. 0-5124 von IIL ab, so hat man: IV. 0-5124 P — J = 0-839 Z und „ 0-5124 (P— J) , , . ., , MX. , T • u u /- = — — und ferner unter Zuhilfenahme von 1. (siehe oben) O'Soy p 2^ R = -.7^^ oder nach Bauniann'') = 0-5405 (P — Z). l-8o2 Wenn, wie fast immer, J, d. h. die Inversionspolarisation, Unks ist. muß sie nicht von 0-5124 P abgezogen, sondern addiert werden (s. S. 150). ^) R. Creijdt, Die (luantitative Bestimmung der Raffinose. Zeitschr. d. \"er. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1887. S. 167. ^) Herzfdd und Da duii aller, Zeitschr. d. Ver. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1888. S. 749. 3) Herzfeld, Zeitschr. d. Ver. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1890. S. 194. *) R.Crei/dt, Die quantitative Bestimmung der Raffinose. Zeitschr. d. Ver. d. d. Zuckerindustrie." Jg. 1887. S. 155. ^) C. Scheibler und //. Mitfehueier , Weitere Beitrüge zur Kenntnis der Melitriose und der Melibiose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 1438 (1890). ^) Ärminius Bau, Über kristallisierte Melibiose. Zeitschr. d. Ver. d. d. Zuckerindu- strie. Jg. 1899. Techn. Teil. S. 850. ') BaiiDicuui, Tabellen zur Berechiuuig der Inversionspolarisation. Zeitschr. d. \ er. d. d. Zuckerindustrie. Jg. 1898. Techn. Teil. S. 78(3. 154 B. Tollens. ANHANG. Kröhers Tabelle zur Um\vandluii<>' von Phlorogluzid in Fnrfuro] Pentosan usw. (s. S. lo2). Phlorn- gluzid Furfurol Arabiuoge Araban Xylose Xylan Pentose Pentosan 0030 00182 00391 0-0344 0-0324 0-0285 0-0358 00315 0031 00188 0-0402 00354 00333 00293 00368 0-0324 0032 00193 0 0413 0-0363 0-0342 0-0301 00378 0-0333 0033 00198 0-0424 00373 0-0352 0-0309 0-0388 0-0341 0-034 00203 00435 00383 00361 00317 00398 0-0350 0035 00209 00446 00393 00370 00326 00408 0-0359 0036 00214 00457 00402 00379 00334 0-0418 0-0368 0037 0-0219 0-0468 00412 00388 00342 0-0428 0-0377 0-038 00224 00479 00422 00398 00350 00439 (J-0386 0039 00229 00490 0-0431 00407 00358 00449 0-0395 0-040 0-0235 0-0501 0-0441 0-0416 00366 00459 00404 0041 0-0240 0-0512 0-0451 00425 00374 00469 00413 0042 00245 00523 00460 00434 00382 00479 0-0422 0043 00250 00534 00470 00443 00390 00489 00431 0044 00255 0-0545 00480 0 0452 00398 00499 0 (J440 0045 00260 00556 00490 00462 00406 00509 0-0448 0046 00266 00567 00499 0 0471 00414 00519 0 0457 0 047 00271 00578 00509 00480 00422 0 0529 0 0466 0048 0-0276 0-0589 0-0519 00489 00430 00539 0-0475 0049 0-0281 00600 0-0528 00498 00438 00549 00484 0050 00286 0 0611 0-0538 00507 00446 00559 0-0492 0051 0(J292 0-0622 00548 0 0516 0-0454 0-0569 00501 0052 00297 00633 00557 0-0525 00462 ()0579 0-0510 0-053 00302 00644 00567 00534 00470 00589 00519 0054 00307 0-0655 0-0576 00543 00478 0-0599 00528 0055 00312 0-0666 0 0586 00553 00486 00610 00537 0056 0-0318 00677 00596 00562 00494 00620 00546 0057 0-0323 0 0688 00605 00571 0-0502 00630 00555 0058 00328 0 0699 00615 00580 00510 0 0640 0 0564 0059 0-0333 0-0710 0 0624 00589 00518 00650 00573 0060 00338 00721 0 0634 00598 0-0526 00660 00581 0061 00344 00732 00644 00607 00534 00670 00590 0062 00349 00743 00653 00616 00542 0-0680 00599 0-063 00354 00754 00663 00626 00550 00690 00608 0 064 0-0359 00765 0-0678 0 0635 00558 0-0700 0 0617 0065 0-0364 0 0776 00683 0-0644 00567 00710 0-0625 0-066 0-0370 00787 00692 0-0653 00575 00720 00634 0 067 00375 00^98 00702 00662 00583 0 0T30 00643 0068 00380 0 0809 0-0712 00672 00591 00741 0 0652 0069 00385 00820 00721 00681 00599 0-0751 00861 0070 0-0390 00831 00731 0 0690 00607 00761 00670 0071 00396 00842 00741 00699 0 0615 0 0771 0-0679 0072 00401 00853 00750 0-0708 00623 00781 00888 0073 0-0406 00864 00760 00717 0-0631 0-0791 00697 0074 00411 0-0875 00770 00726 0-0639 00801 00706 0 075 00416 0-0886 00780 00736 00647 0 0811 00714 0076 00422 0-0897 0 0789 00745 00655 0-0821 00722 0077 0-0427 00908 00799 0-0754 00663 00831 0 0731 0078 0-0432 0 0919 0-0809 00763 00671 0 0841 00740 0079 00437 0-0930 0 0818 00772 00679 00851 0-0749 0080 00442 0-0941 00828 0-0781 00687 00861 0 0758 0081 00448 00952 0-0838 00790 0-0695 00871 00767 0082 00453 0-0963 0-0847 00799 0-0703 00881 0 0776 0083 0-0458 0-0974 00857 0 0808 0 0711 00891 0-0785 0-084 00463 00985 00867 00817 0-0719 ooyoi 00794 Die wichtigsten Methoden znr (|uantitativen Bestimmung der Zuckerarten. 155 Phloro- gluzid P'nrfurol Arabinose Aiaban Xylose Xylan Pentoee Pentosan 0-O85 0-0468 0-0996 0-0877 0-0827 0-0727 0-0912 0-0803 0-()8G 00474 01007 0'0886 0-0836 0-0735 0-0922 00812 0-087 0-0479 0-1018 00896 0-0845 0-0743 00932 0-0821 0-088 0 0484 0 1029 0-0906 00854 0-0751 00942 0-0830 0-089 0-0489 0 1040 0-0915 00863 00759 0-0952 00838 0-090 0-0494 01051 0-0925 0 0872 0-0767 00962 0O847 0091 0-0499 0-1062 00935 0-0881 00775 00972 0-0856 0-092 0 0505 0-1073 (J0944 0-0890 0-0783 00982 00865 0093 0-0510 0-1084 0-0954 00900 00791 00992 0 0874 0-094 00515 0-1095 0-0964 00909 0-0800 0-1002 00883 0095 0-0520 0-1106 00974 0-0918 0 0808 0-1012 0-0891 0-096 00525 0-1117 00983 0-0927 0 0816 01022 0-()899 0097 00531 01128 00993 0 0936 00824 01032 00908 0098 00536 01139 01003 00946 00832 01043 0-0917 0-099 00541 0 1150 01012 00955 00840 0-1053 0-0926 0100 0-0546 0-1161 0-10-22 00964 0-0848 0-1063 0-0935 0-101 0-0551 0-1171 0-1032 0 0973 0 0856 01073 0 0944 0-102 0-0557 0-1182 01041 00982 00864 0 1083 0 0953 0103 0-0562 0-1193 01051 00991 00872 01093 00962 0104 0-0567 0-1204 01060 01000 00880 01103 00971 0105 0-0572 01215 01070 0-1010 0-0888 01113 00979 0-106 00577 0-1226 0-1080 0-1019 00896 01123 00988 0-107 0-0582 01237 01089 0 1028 00904 01133 0 0997 0108 00588 01248 01099 0-1037 0-0912 01143 0-1006 0109 00593 0-1259 0-1108 0-1046 0-0920 01153 01015 0-110 00598 0-1270 0-1118 0-1055 0-0928 0-1163 0 1023 0-111 00603 0-1281 0-1128 01064 0-0936 0-1173 01032 0 112 0 0608 01292 0-1137 01073 0-0944 0-1183 0-1041 0-113 00614 01303 01147 0-1082 0-0952 0-1193 01050 0-114 0-0619 0-1314 01156 0-1091 009ö0 0-1203 0-1059 0115 0-0624 0-1325 0-1166 0-1101 0 0968 01213 0 1067 0116 00629 0 1336 0-1176 OHIO 00976 0-12-23 01076 0-117 0-0634 0-1347 0-1185 0-1119 00984 01233 0-1085 0118 0-0640 01358 01195 01128 0 0992 0-1243 01094 0119 00645 01369 01204 01137 01000 0-1253 01103 0120 0-0650 0-1380 01214 01146 0-1008 0-1263 01111 0121 00655 01391 01224 0-1155 0-1016 0-1273 0-1120 0122 00660 0-1402 01233 01164 01024 0-1283 01129 0123 0-0665 0-1413 0-1243 01173 01032 0-1293 01138 0124 00671 0-1424 0-1253 0-1182 0-1040 0-1303 0-1147 0-125 0-0676 0-1435 0-1263 0-1192 0-1049 0-1314 01156 0126 0-0(>8l 0-1446 01272 0-1201 0-1057 01324 0-1165 0127 0-0686 01457 0-1282 0-1210 0-1065 0-1334 0-1174 0128 0-0691 0-1468 0-1292 0-1219 01073 0-1344 0-1183 0129 00697 0-1479 0-1301 01228 0-1081 01354 0-1192 0-130 00702 0-1490 0 1311 01237 01089 0-1364 01201 0-131 0-0707 01501 0-1321 01246 0-1097 0-1374 0-1210 0132 0-0712 0-1512 0-1330 01255 01105 01384 01219 0-133 00717 0-1523 0-1340 0-1264 0-1113 0-1394 0-1227 0134 0-0723 0-1534 0-1350 01273 01121 01404 01236 0135 0-0728 01545 01360 01283 01129 0-1414 0-1244 0136 00733 0-1556 01369 01292 01137 0-1424 0-1253 0-137 0-0738 0-1567 01379 01301 01145 01434 0-1262 0-138 0-0743 0-1578 01389 01310 0-1153 01444 0-1271 0139 0-0748 0-1589 0-1398 0-1319 01161 0-1454 0-1280 0140 0-0754 0 1600 01408 0-1328 01169 0-1464 0-1288 0141 0-0759 0-1611 0-1418 0-1337 01177 01474 01297 156 B. Tollens. Phloro- gluzid Furfurol Arabinose Arabnn Xylose Xylan Pentose 1 1 Pentosan j 0-142 0-0764 0-1622 01427 01346 0-1185 01484 0-1306 i 0-148 00769 0-1633 0-1437 0-1355 0-1193 0-1494 0-1315 0144 0(»774 01644 01447 0-1364 0-1201 0-1504 0-1324 0145 (J-0780 0-1655 0-1457 01374 0-1209 01515 0-1333 0-146 0-0785 (J1666 0-1466 01383 01217 01525 0-1342 0-147 0-0790 0-1677 01476 0-1392 0-1225 01535 01351 0-148 00795 0-1688 0-1486 0-1401 01233 0-1545 01360 0149 0-0800 01699 0-1495 0 1410 0-1241 Ol 555 0-1369 0150 0-0S05 0-1710 015U5 01419 0 1249 01565 01377 0151 0-0811 01721 0-1515 0-1428 0-1257 01575 0-1386 0-152 00816 01732 0-1524 0 1437 01265 01585 01395 0 153 0-0821 0-1743 0 1534 01446 0-1273 0 1595 0-1404 0-154 00826 0-1754 01544 0-1455 0-1281 0-1605 01413 0155 0-0831 0-1765 0 1554 0-1465 0-1289 0-1615 0-1421 0-156 0-0837 0-1776 0-1563 01474 0-1297 01625 01430 ■ 0-157 0-0842 0 1787 01573 0-1483 0-1305 01635 01439 0158 0-(J847 01798 0-1583 01492 0-1313 01645 01448 0-159 00852 0-1809 01592 01501 01321 0-1655 Ü-1457 0160 0-0857 01820 (J 1602 0 1510 01329 0-1665 0-1465 0161 00863 0-1831 01612 0-1519 01337 01675 0-1474 0 162 00868 0-1842 0-1621 01528 01345 01685 0-1483 0-163 00873 01853 0-1631 01537 01353 01695 0-1492 0-164 00878 01864 01640 0-1546 0-1361 01705 0-1501 0-165 00883 0-1875 0-1650 0-1556 0-1369 0-1716 01510 0-166 0-0888 01886 0-1660 0-1565 0-1377 0-1726 0-1519 0-167 00-94 0-1897 01669 0-1574 0-1385 01736 01528 0168 0O899 0 1908 01679 01583 01393 0-1746 0-1537 0169 00904 0-1919 01688 0-1592 01401 0-1756 01546 0 170 00909 01930 0-1698 0-1601 01409 0-1766 01554 0-171 0 0914 0-1941 01708 0 1610 01417 01776 01563 0-172 0-0920 0 1952 0-1717 0-1619 01425 01786 0-1572 0173 00925 01963 0-1727 0-1628 0-1433 0-1796 0-1581 0174 00930 01974 01736 0-1637 0-1441 0-1806 0-1590 0 175 (J-0935 0-1985 Ol 746 01647 01449 01816 Ol 598 0176 0-0.)4Ü 0 1996 0-1756 01656 0-1457 0-1826 0-1607 0-177 0-0946 0-2007 0-1765 01665 01465 01836 0-1616 0-178 00951 0-2018 Ol 775 0-1674 01473 0-1846 01625 0179 00956 0-2029 0-1784 0-1683 0-1481 0 1856 0-1634 0180 00961 0-2039 01794 01692 0-1489 0-1866 0-1642 0-181 00b66 0-2050 0-1804 01701 01497 01876 01651 0 182 0 0971 0-2061 0-1813 01710 01505 0-1886 0-1660 0183 0 — 4mal mit Alkohol gefällt, zuletzt mit säurefreiem Alkohol. Weil das Glykogen mit zunehmender Reinheit immer schwieriger durch Alkohol gefällt wird, düiieu die wässerigen Lösungen nicht zu verdünnt sein. Das schneeweiße Präparat wird 2 Tage konstant mit al)solutem Alkohol in folgender Weise gewaschen: Man verschließt das Abfhißi-ohr des Trichters mit einem Gummischlauch und einer Klemme, gießt Alkohol auf das Glykogen und läßt denselben nach einigen Stunden abfließen. Ebenso wird das (xlykogen mit Äther o Tage lang gewaschen. Es zerfällt dann auf dem l-'iltcr in Stücke. p]s wird dann über Chlorcalcium oder Phosphorsäureanhydrid (nicht über Schwefelsäure) in einen Exsikkatoi" gestellt, den man evakuiert. Konstantes Gewicht erzielt man durch 2tägiges Trocknen bei 100"^ C. Neuerdings stellt Fßiigcr reine (ilykogenlösung in folgender Weise dar'): \'on dem durch Zerkleinerung in der Fleischhackmaschine gewonnenen (Jrganbrei werden 500// mit 500 rms 60%iger Kalilauge ;> Stunden laug *) W. Grehc, Kritit^che Untcrsucliunioßt nun die klare, über dem Niederschlag- stehende Flüssigkeit vorsichtig ab, so daß das (Jlykogeiisediment am Boden bleibt, und filtriert die abgegossene Flüssigkeit durch ein schwedisches Filter von 15 cm Durchmesser. Wenn das Filter gut ist, so läuft die Lösung meist längere Zeit im Strahl ab. Ist das zu untersuchende Organ stark glykogenhaltig, so nimmt man nur einen Teil der alkaüschen Glykogenlösung, oder man stellt mehrere Filtrierapparate auf. Immer suche man so zu arbeiten, daß so wenig wie möglich Substanz von dem Glykogensediment auf das Filter gelangt. Nachdem die Flüssigkeit vom Sediment abgegossen ist, gießt man ein großes Volum Alkohol von ßO'^/o auf den Niederschlag, rührt mit einem Glasstab gut um und läßt A^ieder absitzen. Um dieses zu erleichtern, fügt man zweckmiißig einige Tropfen einer gesättigten Kochsalzlösung hinzu, weil dadurch das (Glykogen körnig A^ird und sich besser abscheidet. Nachdem das Glykogen sich abgesetzt hat. dekantiert man wieder, und so im ganzen ?)mal. Hierauf wiederholt man dasselbe ^>li'ahren noch 2mal mit 9G"/oigem Alkohol, Imal mit absolutem Alkohol, ;>nial mit Äther und zum Scliluß mit absolutem Alkohol. Ein Teil des Niederschlages ist jetzt auf dem Filter. ^lan nimmt das Filter vom Trichter, entfaltet es über dem Becherglas, welches das Glykogensediment enthält, und läßt den Glykogenklumpen hineinfallen. Man löst nun das Glykogen in heißem Wasser auf und spült ebenso mit heißem Wasser aus den Bechergläsern, welche die dekantierte Flüssiu'keit enthielten, sowie von dem Filter und dem Trichter aUes daran haftende Glykogen sorgfältigst in das Becherglas mit dem Glykogensediment. ]\[an rührt mit einem Glasstabe bis alles Glykogen sich gelöst hat. Die wässerige Glykogenlösung sieht jetzt gewöhnhch etwas schmutzig aus. I)as weitere Verfahren richtet sich danach, ob das Glykogen durch Polarisation direkt oder nach Invertierung als Traubenzucker bestimmt werden soll. Im ersteren Falle wird die schwach alkalische Glykogenlösung mit verdünnter Essigsäure schwach angesäuert; es entsteht ein aUmählich sich verdichtender Niederschlag leicht bräunlicher Flocken. Man spiUt die Flüssigkeit ohne zu filtrieren in einen Maßkolben von passender (iröße und füllt bis zur ^larke auf. Man hat nun das ^'oluln der Lösung, welche alles (Glykogen enthält. ^lan filtriert durch ein trockenes schwedisches Filter in einen anderen Kolben. Das Filtrat ist farblos, von leuchtender Opaleszenz, und auf dem Papier des Filters hinterbleibt ein gelblicher Hauch, der aUen Farbstoff enthält. Das Filtrat ist zur Polarisation geeignet. Soll das Glykogen nach Invertierung als Traubenzucker bestimmt werden, so neutra- Usiert man die wässerige Glykogenlösung mit Salzsäure vom spez. Gew. HO genau, die man tropfenweise zusetzt. Hierauf bringt man die neutralisierte (ilykogeulösuug durch einen Trichter unter mehrmaligem Ausspülen mit heißein Wasser in einen Kolben von 500c/;/3 Inhalt. Der im Kolben Ißß Karl Grube. Nachweis, Darstellung etc. des Glykogens. befindlichen Lösung werden jetzt 25 cm^ Salzsäure vom spez. Gew. 1-19 zu- gesetzt. Weil später uach der Invertierung die Lösung in dem Kolben neutralisiert werden muß, darf derselbe nicht bis zur Marke gefüllt werden. Die in ihm enthaltene Lösung enthält nahezu 2'2"/o CIH. Bei dem bisher beschriebenen Verfahren war von 100 ^f (Jrganbrei ausgegangen worden. Hat man nicht soviel zur Verfügung, wenn z. B. das Glykogen in einem sehr kleinen Organ oder nur in einem Teil eines Organs bestimmt werden soll, so verfährt man folgendermaßen: Es handelte sich nur um 10 y Substanz. Man bringt dieselben in einem kleinen Kölb- chen zusammen mit 10 cni^ KOH-Lauge von ßO^/o in das kochende Wasser- bad, erhitzt 3 Stunden und setzt nach Abkühhuig 40 cm^ Wasser zu und fällt mit 160 c;;/ 3 Alkohol. Im übrigen bleibt das Verfahren dasselbe wie es oben beschneiden wurde, nur wird die zu invertierende Lösung später nicht auf 500, sondern nur auf 100 oder 200 an^ gebracht. Auf je 100 aii'^ der neu- tralisierten Glykogenlösung kommen 5 cni^ Salzsäure vom spez. Gew. 1-19. 2. Bestimmung des Glykogens. a) Durch Polarisation. Die in der oben angegebenen Weise hergesteUte Glykogenlösung ist zur Polarisation geeignet. Nach Pßüger hängt die Polarisierbarkeit nicht allein vom Pi-ozentgehalt der (ilykogen- lösung ab, sondern auch von der Größe der Glykogenstäubchen. F/fiJr/er benutzte zu seinen Bestimmungen einen Polarisationsapparat nach Landolt mit 3teiligem Polarisator nach Lippich mit geradsichtigem Spektroskop und einer Ablesung von O'Ol". Er macht besonders darauf aufmerksam, daß bei jeder Bestimmung mindestens 10 Einstellungen zu machen und daß die Angaben des Apparates mit Normalquarzplatten zu prüfen seien. Auch soll man beim Vorhandensein einer hinreichend konzentrierten Lösung zur Bestätigung des Drehwinkels noch eine halbe und Mertel- konzentration untersuchen. Die durch Polarisation erhaltenen Werte wurden kontrolliert durch Titration der invertierten Lösung nach Fehhng-SoxhJet. h) Durch Titration nach voraufgegangener Invertierung des Glykogens. Diese Bestimmung ist nach Fflüger die Methode, welche am sichersten und genauesten zum Ziele führt, besonders wenn es sich um die Feststellung Meiner Unterschiede in verschiedenen Organen oder in verschiedenen Teilen desselben Organes handelt. Die 2-2'Vo HCl enthaltende Glykogenlösung wird in ein kochendes Wasserbad gebracht und die Mündung des Kolbens mit einem Uhrschälchen zugedeckt. Nach ostündigem Erhitzen läßt man abkühlen. Man bringt nun ein Stückchen Reagenzpapier hinein und läßt aus einer Bürette soviel eO^/oige Kalilauge zufließen, daß die Lösung eben alkalisch wird. Man fiült dann bis zur Marke mit Wasser auf und filtriert durch ein Faltenfilter. Diese Lösung dient nun zur gra\imetrischen Bestimmung des Zuckers nach Pjliif/er (siehe S. 174 ff.). Um den Wert für Glykogen zu erhalten, multipliziert man den durch die gravimetrische Methode erhalteneu Wert mit 0927. Quantitative Ziickerbestiiiiiiiiiiig mit Hilfe der Kiipfermetlioden und spezielle Methoden znr Zncker- bestinimnng in tierischen Flüssigkeiten. Von Karl Grube, IJonn-Xcueiiahr. I. Quantitative Zuckerbestimmung. Das Triiizip der Zuekerbestiiiiininiü: mit Hilfe der Kupfeniiethoden, (1. h. der Fchlingsdien Lösung oder Modifikationen derselben, beruht auf der sog-. Trommeri^dien Probe. Diese Probe besteht in der Reduktion einer alkahsehen Kui)ferlösung zu Kupferoxydul bzw. Kupferoxydulhydrat durch Traubenzucker. Fchlinff gab zuerst die genaue Vorschrift zur Herstellung der alkalischen Kupferlösung, wie er auch zuerst ein festes lleduktionsver- haltnis zwischen Traubenzucker und Kupferoxyd aufstellte. Eine vollständige Ivlarstellung der bei der Peduktion der alkaUschen Kupferlösung durch Zucker stattfindenden ^'o^gänge gab jedoch erst Soxhlet. 1) l)ieser wies nach, daß jede der untersuchten Zuckerarten — Invertzucker, Traubenzucker, ^lilchzucker, Galaktose, Maltose — ein anderes Peduktionsvermögen für alkalische Kupferlösungen hat, und ferner, daß das Reduktionsverhältnis zwischen Kupfer und Zucker kein konstantes, sondern ein verschiedenes ist, abhängig a) von der Konzentration der aufeinander wirkenden Lösungen oder h) von der Menge des in der Lösung befindlichen Kupfers oder, was die Pegel ist, daß beide unter a) und b) genannten Faktoren bestimmend auf das Reduktionsverhältnis einwirken. Soxhlet stellt die bei den einzehien Zuckerarten erhaltenen Haupt- resultate in folgender Weise zusammen: Traubenzucker: Q-hg in Vj^v^qy Lösung = 105'2 cw» Fehling^cXxQY Lösung unverdünnt, Q-bg in P/oigoi' Lösung = lOll tw^ FchUiigM'hoY Lösung + 4\o\. Wasser. Reduktionsverhältnis = 1 : 1(>52 — 1 : lO-lL \'er- diümung der Kupfer- und Zuckerlösung erniedrigt, Kupferüberschuß erhöht das Reduktionsvermögen. Invertzucker: O'bg in l%iger Lösung = 101'2 cm» Fehling^chor Lösung unverdünnt. O'b g in P/oifi'er Lösung = 97 "0 cm» Fe/jZ/nf/scher ^) Soxhlet, Das Verhalten der Zuckcrarteii zu alkalischeu IviipferlösuntriMi ete- Journ. f. prakt. Chemie. Neue Folge. Bd. 21. S. 227 (1880). 168 Karl Grube. Lösung + 4 \o\. Wasser. Hediiktiousverliältnis = 1 : 10"12 — 1 : 9-70. "S'er- düiniiing der Kupfer- und Zuckeiiösung erniedrigt. Kupferüberschuß erhöht das Reduktionsverniügen. Milclizucker : O'öf/ in lo/oi^ei" Lösung = 74'0rm3 Fehl/nfßdieY Lösung. Pieduktionsverhältnis = 1 : 7 "40. Verdünnung der Kupfer- undZucker- lösung hat keinen oder doch einen nur unmerkhchen Einfluß auf das Eeduktionsvermögen. Kupfertiberschuß erhöht das Pieduktionsverniögen in liel geringerem ]\Iaße als beim Trauben- und Invertzucker. Galaktose: O'bg in l°/oig'er Lösung = 98 cm» Felilingi^cheY Lösung unverdünnt. 0*5 ^^ in l%iger Lösung = 94 cw^ iTe/^/ij^y^scher Lösung + 4 Vol. Wasser. Keduktionsverhältnis = 1 : 9'8 — 1 : 9"4. Verdünnung der Kupfer- und Zuckerlösung erniedrigt das üeduktionsvermögen der Galaktose in demselben Grade wie das des Trauben- und Livertzuckers. Kupferüber- schuß erhöht das Reduktionsvermögen derselben in weit geringerem ]\Iaße wie das des Trauben- und Invertzuckers. Lävulose: Für diese berechnen sich nach den für Invert- und Traubenzucker erhaltenen Zahlen: Q-b (/ in l%iger Lösung = 97-2 cm ^ Fehhug^diei- Lösung unverdünnt, O'ö g in lo/oiger Lösung = 9;V0cw«3 FehIingi>d\QT Lösung -f- 4 Vol. Wasser. Reduktionsvermögen = 1 : 9"72 — 1 : 9";). Verdünnung und Überschuß jedenfalls wie bei Trauben- und Invertzucker wirkend. Wahrscheinhch ist das Reduktionsvermögen der Lävulose dem der Galaktose gleich. Maltose : 0-5 (/ in IVoiger Lösung = 64-2 cm» FehUngi^Qher Lösung unverdünnt. Ov> r/ in P/oiger Lösung = 67-5 cm^ Fehling^^cheY Lösung -f 4 Vol. Wasser. Reduktionsverhältnis := 1 : 6-09 — 1 : 6-4L Verdünnung der Zucker- und Kupferlösung erhöht das Reduktionsvermögen. Kupferüberschuß ist bei Anwendung unverdünnter Fehlinc/^cheY Lösung ohne Einfluß auf das Reduktionsvermögen. Kupferüberschuß erhöht bei starker Verdünnung in geringem Maße das Reduktionsvermögen. Soxhlet zeigte also die wichtige Tatsache, daß die seit Fehllng geltende Annahme, daß 1 Äquivalent Zucker 10 Äquivalente Kupfer- oxyd reduziere, nicht begründet, sondern nur ein empirischer Titer für die Fehlingsahe Lösung sei. ferner, daß bei der Einwirkung einer Zucker- lösung auf Fehlingsche Lösung beliebiger Konzentration die ersten Anteile am stärksten, die folgenden immer schwächer reduzieren, auch wenn man kalt mischt und dann erst erwärmt, daß also das Reduktionsverhältnis von der Konzentration abhänge und der gefundene Wert nur für die nämliche Konzentration gültig sei, bei der er bestimmt wurde. Pßäger hat die Soxhlet^QhQW Angaben neuerdings nachgeprüft, i) Er sagt über die Methode: ,,Die Titration soll strengstens nach den von Soxhlet gegebenen Vorschriften durchgeführt werden. Denn ich habe mich von der Klassizität derselben überzeugt." M E. Pflüger, Eine neue Methode der Glykogenanalyse. Pflik/ers Arch. Bd. 114. 242 (1906). i Quantitative Zuckerbestinimuiig mit Hilfe der Ivupfermctliodeii etc. JßQ Maßanalytische Methode der Zuckerbestimmung nach Fehling- Soxhlet. Man i'ebrauclit zwei Lösungen. Lösung I. C'liemiscli reines Kupfersulfat wird ciiiuial aus ver- dünnter Salpetersäure, dreimal aus Wasser uuikristallisiert, zwischen Fließ- papier getrocknet und 12 Stunden lang an der Luft liegen gelassen. Davon werden i^-i^6?)9f/ in destilliertem Wasser aufgelöst uud damit auf öOO cni^ aufgefüllt. Lösung IL 17;)^ Seignettesalz , das dreimal umkristallisiert ist, "werden in 400 cw'^^ Wasser gelöst und dazu 100 cwi^ Natronlauge hinzugefügt, welche im Liter 516 (/ Natriumhydrat enthält. Lösung 11 ist jedesmal frisch zu bereiten. Ausführung: aj Vorversuch. 25 cm^ der Kupferlösung + 2öcm^ der Seignette- salzlösung gemischt werden in einer TorzeUanschale oder im Erlenmcyer- schen Köllu'hen zum Kochen erhitzt und von der Zuckerlösung portionsweise so lange hinzugegeben. l)is die Flüssigkeit nach entsprechend langem Auf- kochen nicht mehr blau erscheint. Da nach Soxhlet 50 cm^ unverdünnte!' Fehlin (/Sicher Lösimg 23"75 cm^ einer P/gigen Traubenzuckerlösung reduzieren, so kann man aus der Menge der gebrauchten Zuckerlösung den ungefähren Gehalt berechnen. Man verdünnt nun die Zuckerlösung soweit, daß sie ca. P/o Zucker enthält. b) Haupt versuch. Zu bO cm^ FrA/i;?^scher Lösung werden in der Kälte ca. 2o (?«i^ der nahezu P/oigen Zuckerlösung zugesetzt und solange gekocht, als für die betreffende Zuckerart erforderlich ist (l)ei Trauben- zucker, Invertzucker und Galaktose 2, bei Maltose 4, Milchzucker 6 Minuten); man gießt dann die ganze Flüssigkeit durch ein doppeltes Faltenfilter. Sobald ;')— 5c»?^ der Flüssigkeit durch das Filter gegangen sind, säuert man mit Essigsäure an und versetzt mit Ferrocyankalium ; dunkle Pvot- färbung zeigt Anwesenheit größerer Kupfermengen, blasses Rosa Spuren von Kupfer an, verändert sich die Farl)e nicht mehr, so ist alles Kupfei' ausgefällt. War noch Kupfer in Lösung, so nimmt man zu einem neuen \'ersuch eine größere Menge der Zuckerlösung, war das Filtrat frei von Kupfer, so nimmt man 1 crn^ Zuckerlösung weniger. Man stellt so viele Ver- suche au, bis bei 2 Bestimmungen nur um O'l cm'-' verschiedene Mengen Zuckerlösung angewendet wurden uiul von den Filtraten das eine kupfer- haltig. das andere kupferfrei ist. Die zwischen diesen beiden Mengen liegende Quantität Zuckerlösung ist diejenige, welche gerade zur Zersetzung von bO €■})/■' Fehlinfßd\QY Lösung notwendig ist. üeispiel: 1 00 (^ Traubenzucker des Handels werden auf -IbOcm^ Lösung gebracht; von dieser Lösung waren im Vorversuch 8 cm'^ erforderlich, um in den 50 c«i3i^eÄ/iw,^scher Lösung die blaue Farbe zum Verschwinden zubringen. 50cm3 Fchling = 2'A-lb oder i'und 24 ^w^^ P/oiii^'i" Traubenzucker- lösung, ^ cm-^ müßten also auf 24: ciii-^ oder ^»-i) oii^ auf 250 c^;/^ aufgefüllt werden, um eine Lösung von ca. 1 % zu erhalten. 170 liavl Grube. Von dieser Lösung- werden zugesetzt zu 50 cm- Fehling 1. '2?yO cm^: Filtrat l)laugTiin, 2. :?4"0 ., : .. giiinlich, ;•>. 25'0 .. : .. gelb, keine Kupferreaktion. 4. 2-kh .. : .. gelb, mit Essigsäure und FeiTocyankali dunkelrot, 5. 24'7 .. : .. gelb, ., .. ,, ., rosarot, 6. 24'8 .. : ,, gelb, keine Kupferreaktion. Gebraucht demnaeli 24'75 cw^ Zuckerlösung. Da bO cm'^ Fehling durch 23"75 cm^ lo/^iger Traubenzuckerlösung zersetzt werden, so enthalten die 24'75 ^m^ der Zuckerlösung 0'2:'f75^ Traubenzucker. 250 cm^ =: Ho'oc?/^^ ursprünglicher Lösung enthalten 2'o99(/ Zucker; 250 c;^?^ nrsprünghcher Lösung (= 10 g käuflicher Traubenzucker) enthalten 7'2^. Die U) g des untersuchten Zuckers enthalten demnach (Z 'l^L reinen Traubenzucker. '0 Handelt es sich um kleinere Zuckermengen, so nimmt man nur 20 cm^ FehlhKßche Lösung (je 10 cm^ der Kupfer- und Seignettesalzlösung) und fügt 80 cm^ Wasser hinzu. Im übrigen verfährt man wie angegeben. Der Titer für 20 cm'^ Fehling = 0-099 g Dextrose. Ist die zu titrierende Flüssigkeit gefärbt, so kann es schwierig sein, mit der Ferrocyankaliprobe eine deutliche Reaktion zu bekommen. In solchen FäUen verfährt man in folgender Weise: Mau kocht das Filtrat im TorzeUan- tiegel oder Erlcnmegeriidiew Kölbchen mit einigen Tropfen der Zuckerlösung" etwa eine Minute, laut 1) — 4 Minuten stehen, gießt die Lösung ab und wischt nun den Boden des Gefäßes mittelst eines mit weichem Fließpapier umwickelten Glasstabes aus. War noch Kupfer in der Lösung, so ist das- selbe durch das Kochen mit Zuckerlösung als Kupferoxydul abgeschieden und färbt, da es sich während des Stehenlassens zu Boden gesenkt hat, das Filtrierpapier rot. Titration nach Bang, i) Die Methode beruht darauf, daß sich Kupferoxydul bei Gegenwart von Bhodan als Kupferrhodanür ausscheidet, wenn die Lösung keine fixen Alkalien, sondern Karbonate enthält. Versetzt man daher eine Kupfer- karbonat und Kaliumkarbonat enthaltende Lösung mit lUiodan, so scheidet sich bei der Beduktion weißes Kupferrhodanür aus, und zwar ist die Aus- scheidung quantitativ. Man verwendet nur soviel Zuckerlösung, daß nicht alles Kupferoxyd reduziert wird, daß die Flüssigkeit also blau bleibt, und titriert den Über- schuß mit einer Hydroxylaminsulfatlösung. Das Ende der Beaktion zeigt sich in der Entfärbung der l)lauen Lösung. Die Beduktion durch Hydroxylamin verläuft nach der Formel 4 Cu 0 + 2 ^^ H3 0 = 2 Cu2 0 + N2 O -H a H. ( ), so daß 1 Mol. Kupferoxyd 1 — 2 ]\lol. Hydroxylamin entspricht. ^) Zur Methode der Zuckerbestimmung. Biochem. Zeitschr. Bd. 2. S. 271 (19UG). Quantitative Zuckerbestimmung mit Hilfe der Kupfermethodeii etc. 171 Damit von der Lösuns;- von schwefelsaurem Hydroxylamin 1 cm''^ i>enaii 1 ciu" Kiipi'eiiösuni^- entspreche, müssen (j^b^^ (j des schweiclsauren Salzes zu 2 l Wasser gelöst werden. Zwei Lösungen sind notwendig. Lösung l: Kupiersulfat, gereinigt nach Soxhlet (siehe S. 169) l-''').^ Kaliumkarbonat ^öO'O// Rhodankahum 200-0// Kahumbikarl)onat oO'O // Destilhertes Wasser zu \-() l Kaliumkarbonat, Kaliumbikarbonat und Ehodankalium werden zu- sammen unter Erwärmen in ca. 000 cui'^ Wasser gelöst. Man lälJt abkühlen und das in ca. 75 cm^ Wasser gelöste Kupfersulfat langsam zufließen. Die Kupfersulfatlösung muß kalt sein, weil sich sonst Kohlensäure entwickelt. Man füllt auf zu 1 l und filtriert nach 24 Stunden. Es ist zweckmäßig, sich gleich 2 l herzustellen. Lösung II: Hydroxylamin. sulfur 6*55 rj Pviiodaiikalium 200-00 r/ DestiUiertes Wasser zu 2*00 l Ausführung: Aus einer Bürette gibt man 10 c;»- der Zuckerlösung in ein 200 cni^- Kölbchen, fügt 50 cm^ Kupferlösung hinzu, erhitzt auf einem Drahtnetz zum Kochen und läßt o Minuten lang kochen. Man kühlt rasch auf Zimmertemperatur ab und stellt unter die mit Hydroxylamin gefüllte Bürette. Man titriert, bis die Flüssigkeit farblos ist. Enthält die Zuckerlösung mehr als 60 mg Zucker in 10 cm^, so werden die öOejw» Kupferlösung vollkommen reduziert, man muß deshalb weniger als 10 cm^ verwenden. Tabelle zur B erechnung der Zuckermenge. Hydroxyl . Zucker Hydroxyl. Zucker Hydroxyl. Zucker Hydroxj'l. Zucker cm H/f/ rill mg rill mg cm mg 43-85 5 29-60 19 17-75 33 7-65 47 42-75 6 28-65 20 16-95 34 7-05 48 41-65 7 27-75 21 16-15 35 6-50 49 40-60 8 26-85 22 15-35 36 5-90 50 39-50 9 26-00 23 14-60 37 5-35 51 38-40 10 25-10 24 13-80 38 4-75 52 37-40 11 24-20 25 1305 39 4-20 53 36-40 12 23-40 26 12-30 40 3-60 54 35-40 13 22-60 27 11-50 41 305 55 34-40 14 21-75 28 10-90 42 2-60 56 33-40 15 21-00 29 10-20 43 215 bl 32-45 16 20-15 30 9-50 44 1-65 58 31-50 17 19-35 31 8-80 45 1-20 59 30-55 18 18-5Ö 32 8-20 46 0-75 60 272 Karl (xrube. Titration nach PavyJ) Man gebraucht dazu zwei Lösungen. Lösung I: Kristallinisches Kupfersulfat .... 4'158^ Destilliertes Wasser zu 500 cm'^ Lösung II: Seignettesalz 20-4: g ÄtzkaU 20-4.9 Konzentrierte Ammoniaklösung (spez. Gew. 0'88) . oOOcm^ Destilliertes Wasser zu 500 cm^ Man stellt jede Lösung für sich dar, braucht dieselben aber nicht getrennt aufzuheben, da sie auch zusammengegossen lange Zeit halt- bar sind. Das Prinzip der Methode beruht darauf, da(j das durch den Zucker reduzierte Kupferoxvd durch das in der Lösung enthaltene Ammoniak in Lösung gehalten Avird. Bei Eintritt der Reduktion tritt daher eine Ent- färbung der Lösung ein. und der Endpunkt der Reaktion ist dann erreicht, wenn die blaue Flüssigkeit gänzlich entfärbt ist. Nach H. 3L Vernon^) gibt man zweckmäßig der Lösung folgende Zusammensetzung : Kristallinisches Kupfersulfat .... 4'158^ Seignettesalz 40'8^ Ätzkah 40-8 (/ Ammoniaklösung (spez. Gew. 088) . . 600 ciri^ Destilliertes Wasser zu 1 / 10 cm 3 der Lösung entsprechen 0*005 g Dextrose. Es ist wünschenswert, sich den Titer der Lösung von Zeit zu Zeit, mit Hilfe einer Zuckerlösung von bekannter Zusammensetzung zu be- stimmen. Ausführung. In ein ca. 150 cm^ fassendes Kochfläschchen (s. Fig. 12), durch dessen Gummistopfen das Ausflußrohr der Bürette sowie ein ge- bogenes Glasrohr zum Entweichen der Luft und des Dampfes geht, werden 5 — 10 cm^ der Kupfer-Seignettesalzlösung gebracht und mit 20 — oO cm'^ destilliertem Wasser verdünnt. Die Bürette ist in 20 cm^ eingeteilt und jedes Zentimeter in Zehntel. Das Ganze mrd in einem Ständer fixiert. An Stehe des Quetschhahns verwendet Pavg eine Schraubenvorrichtung, welche den Abfluß der Flüssigkeit aus der Bürette gut zu regulieren gestattet. Nachdem die Zuckerlösung in die Bürette gebracht und nach Ent- fernung etwaiger Luftblasen genau eingesteht ist, wird die Kochflasche ') The Physiology of the Carbohvdrates. p. 71. London 1894. -) H. M. Ycrnon, The differences of action of various diastases. Journal of Physiology. Vol. 28. p. 156. 1902. Quantitative Zuckerbestimmung mit Hilfe der Kupfcrmethoclen etc. 1 ( ••> mit ihrem liilialt mit der lUiretto in \'orliin(lniiu' tioliracht und ül)or dor Oasflamme vorsiclititi' zum Kochen erhitzt. 8ui)aUl die Flüssigkeit voll- kommen am Kochen ist, läßt man aus der Bürette die Zuckerlösung zutropfen, und zwar so schnell, daii in der Mi- nute 60—100 Tropfen abfheßen. Gegen Ende der Reaktion läßt man etwas langsamer zu- laufen, um ein Hinaus- gehen über den End- punkt zu vermeiden. Ist dieser erreicht, so nimmt man die Flamme hinweg und liest an der Bürette die Menge der gebrauch- ten Flüssigkeit ab. ^lan macht 2 — :> Bestim- mungen, die höchstens 1 um V'2— Vio (^»>'^ diffe- rieren dürfen. Das Mittel davon ist der richtige Wert. Die gebrauchte Zuckerlösung enthält die Menge Traubenzucker, welche der gebi'auchten Kupfermenge entspricht, also 0-005 oder 00025 (7, je nachdem man 10 oder 5 cm^ Kupfer-Sei- gnettesalzlösung verwen- det hat. Bei dem Verfahren ist folgendes zu be- achten: Man darf nicht zu schnell aus der Bürette zulaufen lassen, da man sonst über den Endpunkt der Reaktion hinausgeht. Man darf aber andrer- seits nicht zu langsam zulaufen lassen, da sonst das Ammoniak entweicht und das Oxydul nicht in Lösung bleibt. Ferner muß man dauernd im Kochen halten, da-sonst Luft eintreten kann und dadurch eine Reoxydation des Oxyduls bewirkt^würde. Fig. 12. X74 Karl Grube. Um gegen die Gefahr eines zu schnellen Entweichens des Ammoniaks geschützt zu sein, hat Vemon die oben mitgeteilte Lösung mit einem stärkeren Ammoniakgehalt empfohlen. Um den Endpunkt der Reaktion genau erkennen zu können, ist hinter der Ivochflasche eine ^Yeiße Scheibe angebracht. Bei stärker gefärbten Flüssigkeiten ist die Methode wegen der Schwierigkeit, den Endpunkt scharf zu erkennen, nicht anwendbar. Die genauesten Werte enthält man, wenn man die Zuckerlösung so einstellt, daß 5 — 10 crn^ derselben genügen, um vollständige Entfärbung her- beizuführen. Es entspricht das einem Zuckergehalt von 0'5 — It) pro Tausend. Durch einen Tastversuch orientiert man sich daher zunächst über die Konzentration der Zuckerlösung und verdünnt dieselbe entsprechend. Die Berechnung ist sehr einfach. Um 10 cm ^ Pavi/i^chev Lösung zu entfärben, gebraucht man O'OOö g Traubenzucker. Gesetzt, es wären gebraucht Avorden Tbcm^ Zuckerlösung, so ist 7"5: O'OOö = 100 :x, x = 0"066; die Zuckerlösung war 5f ach verdünnt worden, sie enthielt also 5 X 0'066 = = 0-33Vo Zucker. II. Die gravimetrische Methode der Zuckerbestimmung nach E. Pflüger.M Diese Methode stellt eine Verbesserung der FchJimj - ÄJHhn'<,Q\\Q\\ Methode der gravimetrischen Zuckerbestimmung dar, einer Methode, die nach den Untersuchungen Pßür/ers verschiedene Übelstände hat, deren erster und wichtigster der ist. daß man bei ihr infolge von zu kurzer Ivochzeit und infolge von Gxydulverlusten beim Filtrieren zu kleine Werte erhält. Man gebraucht 2 Lösungen, welche getrennt aufzubewahren sind. Lösung I enthält in ctOO cm^ o4'639(7 Kupfersulfat mit 5 Molekülen Kristallwasser. Das Kupfersulfat wird Imal aus Salpetersäure, Snial aus W' asser auskristallisiert. Man läßt das durch gestörte KristaUisation erhaltene feine Mehl, nachdem es zwischen Fließpapier ausgepreßt wurde, auf Fheß- papier ausgebreitet 24 Stunden an der Luft verdunsten. Lösung II enthält in 500 cm^ 11?) r/ Seignettesalz und 125^ KOH. Das Seignettesalz ist 3mal aus Wasser umkristallisiert. Das KOH ist Marke la Merck. Die Lösung wird in der Weise bereitet, daß man in einem Bechergiase 150 cm^ Wasser zum Sieden erhitzt, vom Feuer entfernt und 173 <7 Seignettesalz hineinbringt und umrührt, bis Lösung erfolgt ist. Nach der Abkühlung gießt man die Lösung durch einen Trichter in einen 500 cm ^-Kolben und fügt 208 cm^ Lauge von GOVoiger KOH hinzu. Becher- glas und Trichter werden vorsichtig ausgespült und das Spülwasser dem Kolben zugefügt. Nach vollkommener Abkühlung bringt man genau auf 500, gießt in ein Becherglas und filtriert durch dichte Glaswolle in den Kolben zurück. *) Untcrsuclningen über die ({uantitative Aualj'se des Traubenzuckers. Pflügers Archiv. Bd. «9. 8.35)9^(1898). (^)iinntitativo Ziickerbestimmung mit Hilfe der Kiipfermetboden etc. 175 Die zu den \'ersuchen nötii>en Asbestfilterröhrclieii werden foljieiidei'- maßeii hergestellt: Ein vertikal fiedachtes Glasrohr von 10 on Länjj^e und l-~i cm lichter Weite läuft nach unten in eine Verjiiuiiunii- und darauf foliiende birnenförniiiie Erweiteruni^' von 1 an äuUerem Durchmesser aus. An diese Erweiterung- schließt sich abermals nach einer \'erjüngunf^' das () oii lan.i'-e Abflußrohr. Die kleine lUrne enthält den Asbest, der die Gestalt und Form einer dicken Erbse hat. Die P'üllnnti' wird in tobender Weise heri>estellt : Laniifaseriiier, weicher Asbest wird mehi-ere Taue in roter rauchender Salpetersäure iiehalten. dann vielmals mit destilliertem Wasser i>ewaschen, l)is das Wasser beim Umiiihren des Asbestes keine Spur von Trübung' mehr zeigt. Der Asbest wird getrocknet. Weiche lang- faserige Stränge dessel])en werden min auf einer Glasplatte mit l'räparier- nadeln in einzelne Fäden zerpflückt. Hat man eine griißere Anzahl dieser Fäden beisammen, so schiebt man sie auf einen Haufen und bringt sie mit einer Pinzette in das weite Ende des Filtrierröhrchens. Mit einem etwas dickeren Draht drückt man die Fäden in die Birne hinein, ohne jedoch so fest zu drücken, daß die lockere Lagerung der Fasern verloren geht. Auf diese Weise wird die Birne mit Asbestfäden ganz ausgefüllt. Um sich von der Güte der Asbestfilterröhrchen zu überzeugen, prüft man dieselben in folgender Weise: Man filtriert die heiße AlHhi^che Lauge, nachdem sie mit kaltem Wasser auf die Hälfte verdünnt ist, an der Saugpumpe, wäscht mit 100 cm^ Wasser, gießt Salpetersäui'e von 1-2 spezifischem Gewicht auf den Asbest und läßt langsam durchfiltrieren. Darauf wird der Asbest mit Wasser gewaschen und endlich mit verdünntem absoluten Alkohol und absolutem Äther. Nachdem das Iiöhrchen dann bei 100 cm^ getrocknet ist, darf es an Gewicht nicht mehr als 0'2 bis O'o m(/ verloren haben. Um sicher zu sein, daß die Eöhrchen dicht sind, macht man stets gleichzeitig zwei identische Versuche. Beide Piöhrchen müssen dann den- selben oder nahezu denselben Wert ei'geben. Ausführung : a) Vor versuch, yo cm^ Allihnsche Seignettesalzlösung werden aus einer Bürette in ein Becherglas von ca. oOO cm^ Gehalt gemessen, dazu '60 cm^ der Kupfeiiösung ebenfalls aus einer Bürette zugefügt: dazu 85 cw^ der vorher genau neutralisierten und filtrierten Zuckerlösung. Das Gesanit- volum i)eträgt 145 cm^. Man erhitzt auf einem Drahtnetz zum Kochen und kocht 2 Minuten. Dann gießt man 1 HO cm^ Wasser hinzu und wartet, bis alles ausgeschiedene Kupferoxydul sich abgesetzt hat. Ist die Flüssigkeit noch blau, so kann der eigentliche Versuch vorgenommen werden, ist sie farblos, so nimmt man nur halb so viel ZuckerKisung zu einer 2. Probe, um festzustellen, ob ein Überschuß vorhanden ist. Bei einiger Übung kann mnn auch einfacher so verfahren, daß man 5 cm^ der neutralisierten Zuckerlösung nach Worm-Müller mit der gleichen Menge Fehling^diev Lösung behandelt. Aus der Stäi'ke der Reaktion kann man ersehen, ob man die ganzen 85 cw'^ Zuckerlösung zu der Bestimmung ]^~^Q Karl Grube. braucht, oder ob man ^\eiiiger ver^Yendell soll. In letzterem Falle miiit man aus einer Bürette soviel Wasser zu, daß die Gesamtmenge wieder 145 cw» beträgt. Hat man also z.B. nur 50 r»^3 Zuckerlösung genommen, so muß man a5 eiii^ Wasser zufügen. bj Haupt versuch. Man macht stets zwei identische A'ersuche neben- einander. 2 Bechergläser aus bestem Jenaergias werden je mit 30 ctti- der AUihnsdieii Seignettesalzlösung, ?>0 cm^ Kupfersulfatlösung, 85 cm^ Zucker- lösung beschickt. Sie sind dann nahezu bis zur Hälfte gefüht. Man mischt die Flüssigkeit durch mehrmaliges Umschwenken, deckt mit Uhrgläsei-n zu und bringt sie in ein Stativ, bestehend aus einem Pietortenhalter mit 2 horizontalen Kupferringen, deren Lichtung so bemessen ist, daß die Bechergläser genau hineinpassen. Man taucht dann beide gleichzeitig in ein stark siedendes Wasserbad so tief, daß mehr als die untere Hälfte der Gläser vom Wasser umspült wird. Man läßt genau 30 Minuten koclien. hebt die Gläser gleichzeitig aus dem Wasser und gießt in jedes l:)0 cnf^ kaltes Wasser. • Während des Kochens hat man Zeit, die beiden Asbestfilterröhrchen genau abzuwiegen und auf den zugehörigen Saugflaschen anzubringen, welche durch Gummischläuche mit der Saugpumpe in Verbindung gebracht sind. Jede Saugflasche kann durch einen Glashahn der Wirkung der Pumpe entzogen Averden. Über den Röhrchen ist in einem Stativ ein Trichter angebracht, durch den man die Röhrchen aus den Bechergläsern füllt. Erst wenn die Röhrchen gefüllt sind, setzt man die Pumpe in Gang und füllt immer frisch nach, wobei zweierlei zu beachten ist: einmal, daß die Röhrchen nie trocken laufen, da sie dann leicht undicht werden, und zweitens, daß man möglichst wenig Kupferoxydul aus dem Bechergiase auf das Filter gelangen läßt. Nachdem die blaue Flüssigkeit nahezu abfiltriert ist, gießt man 100 cm.3 Wasser in das Becherglas, wobei man sich des Kunstgriffes bedient, daß man das Wasser an einem Glasstabe, dessen unteres Ende gegen den Boden des Becherglases gestemmt ist, entlang laufen läßt; das Kupfer- oxydu! bleibt dann ruhig am Boden liegen und über ihm steht das klare Wasser. Sind die 100 cm^ ebenfalls durch die Piöhrchen abfiltriert, so wird der Niederschlag von Kupferoxydul auf das Filter gebracht. Dies geschieht mit Hilfe einer Spritzflasche, welche mit zwei ca. V2 iv langen Gummischläuchen versehen ist, welche über die Enden der beiden Glasröhren der Spritzflasche gezogen sind. Der Gummischlauch, durch den das Wasser ausgespritzt wird, trägt eine in eine feine Spitze ausgezogene Glasröhre. Diesen Schlauch nimmt man in die rechte Hand und lenkt den Wasserstrahl gegen den Boden des mit der linken Hand umgekehrt über dem Trichter des Asbest- röhrchens gehaltenen Becherglases. Das Ende des anderen Schlauches nimmt man in den Mund, um den notwendigen Druck hervorzubringen. Man spült nun sorgfältig das Kupferoxydul l)is auf die letzten Stäubchen auf das Filter. Wenn das Wasser nalirzu al)filtriert ist, läßt man 2mal absoluten Alkohol und 2mal Äther durchlaufen. Die Röhrchen werden Quantitative Zuckerbestimmimg mit Hilfe der Kupfermethoden etc. 177 nun in den Trockenschrank g('l)raclit und ca. eine halbe Stunde l)ei 100 — 120" C i^etrocknet. Nachdem sie dann im Exsikkator abgekühlt sind, sind sie fertij^' zum Wiegen. Nachdem sie gewogen sind, befestigt man sie über zwei Erlenmeyer- schen Kölbchen, gießt starke Salpetersäure bis oben auf und deckt sie durch eine Glaskappe zu. Nachdem das Kupfei-nitrat abgelaufen ist, läßt man omal Wasser durchlaufen. Es ist dann alles Kupfer in den Kölbchen. Die Röhrchen werden dann an der Saugpumpe 2mal mit Wasser und je "2mal mit absolutem Alkohol und Äther gewaschen, im Trockenschrank getrocknet, im Exsikkator abgekühlt und gewogen. Sie müssen dann nahezu dasselbe Gewicht haben wie vor dem Versuch und sind für den folgenden \'ersuch fertig. Gut gestopfte Röhrchen können unbegrenzt lange Zeit gebraucht werden. Die Gewichte des Kupferoxyduls in den beiden Röhrchen dürfen nach dem Versuch nicht mehr als 1 mg voneinander abweichen. Rei guten Röhrchen beträgt die Differenz in der Riegel weniger. Kontrolle der Methode. Die soeben beschriebene gra\imetrische Zuckerbestimmung nach Pßüger gibt, wenn sorgfältig ausgeführt, sehr genaue Werte. Es können aber zu hohe Werte dadurch zustande kommen, daß das angewandte Kali durch Tonerde oder Kieselsäure verunreinigt ist, oder daß die Eiweiß- körper der untersuchten Organe nicht genügend zersetzt waren, und dadurch dem Kupferoxydul Wn-unreinigungen beigemengt sind. Für genaue Untersuchungen ist daher die Bestimmung des in dem gewogeneu Kupfer- oxydul vorhandenen Kupfers notwendig. 1 )ie Bestimmung desselben geschieht am besten nach der von Volhard angegebenen und von Pflüger nachgeprüften Methode M, die im wesentlichen darin besteht, daß das in Lösung befindliche Kupfer bei Gegenwart von schwefliger Säure durch eine im Überschuß angewandte yL-Xormallösung von Rhodanammonium als Kupferrhodanür gefällt und im Filtrat hiervon der Überschuß des Rhodanammonium mit -jL-Normalsilberlösung bestimmt wird. Die erste Bedingung für eine zuverlässige Analyse ist die genaueste Stellung der Silberlösung, weil diese auch zur Stellung der Rhodan- ammoniumlösung benutzt werden muß. Zur Titration des Kupfers sind folgende Lösungen notwendig: 1 . j-L-Xormalsilberlösung, 2. yL-Normalrhodanam moniumlösung, ?). kalt gesättigte Lösung schwefliger Säure in Wasser, 4. von salpetriger Säure freie Salpetersäure vom spez. Gew. 1-2. ') E. Pflüger, Untersuchungen über die quantitative Analyse des Traubenzuckers. Pflilgers Archiv." Bd. 69. S. 423 (1898). Abdorhalden, Handbuch der biochemiBchen Arbeitsmethoden. ET. 12 178 K^^'l Grube. Ausführuno': Die iu dem Erlenmei/erscheYi Kölbcheu aus dem Asbeströlirchen erhaltene Kupferlösunji' gießt man in eine kleine gläserne Kugelschale, berechnet, wieviel Kubikzentimeter Normalschwefelsäure zur Überführung des Nitrats in Sulfat nötig sind, fügt diese nebst einem kleinen Überschuß hinzu und dampft auf dem Wasserbad zur Trockne ab. Die in der Glasschale enthaltenen blauen Kristalle werden in wenig Wasser gelöst und durch einen Trichter in einen geeichten oOO (-««^-Kolben übergeführt und Sodalösung zugegeben. l)is Trübung eintritt. Dann füllt man die Glasschale mit 50 cm^ der Lösung schwefliger Säure und gießt sie in den Koll)en. wodurch die Kupferlösung wieder klar wird. Dann erhitzt man diese auf dem Drahtnetz über der Flamme und hält sie eine Minute am Kochen. Siedend heiß stellt man den oOO c»?^-Kolben unter die Bürette, welche das Rhodanammonium enthält, und läßt in einem Strahl ungefähr b cmß mehr ausfheßen. als zur Fällung nötig ist. Man weiß ja nach der vorhergegangenen gravimetrischen Bestimmung, ■nie"\äel Kupfer höchstens vorhanden sein kann und 1 cm^ Rhodanlösung = 6"36 mg Kupfer. Nachdem die Flüssigkeit sich vollkommen abgekühlt hat, füllt man mit Wasser bis zur ^larke auf, schüttelt gut um und filtriert durch ein trockenes schwedisches Filter. Das anfangs trübe Filtrat wird nochmals filtriert. Davon nimmt man 100 cm'-^ in ein genau geeichtes Kölbcheu, entleert dasselbe in ein Becherglas, füllt nochmals mit Wasser auf und entleert es wieder in dasselbe Becherglas. Man setzt 50 cni^ Salpetersäure von spezifischem Gewicht 1-2 hinzu und 10 cm^ einer gesättigten Lösung von Eisenammoniakalaun. Diese stark gerötete Flüssigkeit bringt man unter die Silbernitratbürette und läßt aus dieser unter Umschwenken der roten Flüssigkeit solange Silbernitrat hinzuträufeln, bis die rote Farbe verschwunden ist; dann fügt man noch bis zu 1 cin^ hinzu, um eine runde Zahl zu bekommen. Nunmehr bringt man das Becherclas '\^ieder unter die Rhodanbürette und läßt unter Umschwenken der Flüssigkeit solange Rhodan hinzutröpfeln, als die durch jeden Rhodantropfen bedingte rote Farbe noch versch\Nindet. Wenn die weiße Flüssigkeit einen deuthchen Stich ins Rote bekommen hat, ist die Reaktion abgelaufen. Man berechnet die vorhandene Kupfermenge nach folgender Formel: + Kupfer = (Rh + 3 p — 3 a) = 6-36, wobei Rh die gesamte im Überschuß bei Beginn des Versuches zugesetzte Rhodanmenge, p die Menge Rhodanlösung und t die Menge Silberlösung ist, welche für 100 cm^ Filtrat gebraucht wurden. Quantitative Zuckerbestimmung mit Hilfe der Kupfermethoden etc. 179 Tabelle der zusammengehörigen Werte für Zucker, Kupfer und Kupfer- oxydul nach Pflüger. Die Zahlen bedeuten Milligramme. Kupfer Für 0-1 Zucker Kupfer Kupfer- oxydul Für 0-1 Zucker Kupfer Oxydul Kupfer Für 0-1 Zucker Kupfer Kuxjfer- oxydul Für 0-1 Zucker Kupfer- oxydul 12 32-8 13 34-9 14 37-0 15 39-1 16 41-2 17 433 18 45-4 19 47-5 20 49-6 21 51-7 22 53-8 23 55-9 24 58-0 25 60-1 2(5 621 27 64-2 28 66-2 29 68-2 3ü 70-2 31 723 32 743 33 76-3 34 78-4 35 80-4 36 824 37 84-4 38 86-5 39 88-5 40 90-5 41 926 42 946 43 96-6 44 98 6 45 100-7 46 102-7 47 104-7 48 106-7 49 108-8 50 110-8 51 112-8 52 114-9 53 116-9 54 119-0 55 1210 56 123-0 57 125-1 58 127-1 59 129 2 60 131-2 61 133-2 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-21064 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2(J28 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-2028 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 36-8 39-2 41-6 43-9 46-3 48-7 51-0 53-4 55-8 58-1 60-5 62-9 65-2 67-6 69-9 72-2 74-5 76-8 79-1 81-3 83-6 85-9 88-2 90-5 92-8 951 97-4 99-7 101-9 104-2 106-5 108-8 111-1 113-4 115-7 118-0 120-2 122-5 124-8 1271 129-4 131-7 134-0 136-3 138-6 140-9 143-2 145-5 147-8 150-1 0-23688 0-2.3688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-23688 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-2288 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 135-3 137-3 139-4 141-4 143-4 145-5 147-5 149-6 151-6 153-6 155-7 157-7 159-8 161-8 163-8 165-8 167-9 169-9 171-9 173-9 175-9 1780 180-0 182-0 184-0 1860 188-1 1901 1921 194-1 196-1 198-2 200-2 202-2 204-2 206-2 208-3 210-3 212-3 214-3 216-3 218-2 220-2 2222 2242 226-2 228-1 2301 2321 234-1 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-204 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-202 0-198 0198 0-198 0-198 0-198 0-198 0-198 0-198 0-198 0-198 0-198 152-4 154-7 157-0 159-3 161-6 163-9 166-2 168-5 170-8 173-0 175-3 177-6 179-9 182-2 184-5 186-7 1890 191-3 193-6 195-8 198-1 200-4 202-6 204-9 207-2 209-5 211-7 214-0 216-3 218-6 220-8 223-1 225-4 227-6 229-9 232-2 234-5 236-7 239-(J 241-2 243-5 245-7 247-9 250-2 252-4 254-6 256-8 259-1 261-3 263-6 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 0-22976 ü-22976 0-22976 0-22976 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2272 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 0-2232 12* 180 Karl Ixrube. (Fortsetzung der Tabelle.) Zucker Für 0-1 Zucker Kupfer Kupfer- oxydul Für O'l Zucker Kupfer- oxydul 1 Kupfer Für 0-1 Zucker Kupfer Kupfer- oxydul Für 0-1 Zucker Kupfer- oxydnl 112 2361 0 198 265-8 0-2232 il65 335-3 0-176 377-6 0-1986 113 238-0 0 198 268-0 0-2232 166 337 1 0176 379-6 0-1986 114 240-0 0 -198 270-2 0-2232 167 338-8 0176 381-6 0-1986 115 242-0 0 198 272-5 0-2232 168 340-6 0-176 383-5 0-1986 116 244-0 0 198 274-7 0-2232 169 342-3 0-176 385-5 0-1986 117 246-0 0 198 276-9 0-2232 170 344-1 0176 387-5 0-1986 118 248-0 0 198 279-2 0-2232 171 345-9 0176 389-5 0-1986 119 250-0 0 198 281-4 0-2232 172 347-6 0176 391-5 0-1986 120 252-0 0 198 283-6 0-2232 173 349-4 0-176 393-5 01986 121 253-9 0 198 285-9 0-2232 174 351-1 0-176 395-5 01986 122 355-9 0 198 288-1 0-2232 175 452-9 0-176 397-5 01986 123 257-8 0 198 290-3 0-2232 176 354-6 0-1664 399-3 01874 124 259-8 0 198 292-6 0-2232 1177 356-2 0-1664 401-2 0-1874 125 261-8 0 197 294-8 0-2232 1178 357-9 01664 4031 0-1874 126 263-7 0 1884 296-9 0-212 i 179 359-6 01664 404-9 0-1874 127 265-6 0 1884 299-0 0-212 [180 361-2 01664 406-8 0-1874 128 267-5 0 1884 301-2 0-212 181 362-9 01664 408-7 0-1874 129 2693 0 1884 303-3 0-212 182 364-5 01604 410-6 0-1874 130 271-2 0 1884 305-4 0-212 183 366-2 0-1664 412-4 0-1874 131 2731 0 1884 307-5 0-212 184 367-9 01664 414-3 01874 132 275-0 0 1884 309-6 0-212 185 369-5 01664 416-2 0-1874 133 276-9 0 1884 311-8 0-212 186 371-2 0-1664 418-1 0-1874 134 278-8 0 1884 313-9 0-212 187 372-9 0-1664 419-9 01874 135 280-6 0 1884 316-0 0-212 188 374-5 01664 421-8 01874 136 2825 0 1884 318-1 0-212 189 376-2 0-1664 423-7 0-1874 137 284-4 0 1884 320-2 0-212 190 377-9 01664 425-6 0-1874 138 286-3 0 1884 322-4 0-212 191 379-5 01664 427-4 0-1874 139 288-2 0 1884 324-5 0-212 192 381-2 01664 429-3 0-1874 140 290-1 0 1884 326-6 0-212 193 382-9 01664 431-2 01874 141 291-9 0 1884 328-7 0-212 194 384-5 0-1664 433-1 01874 142 293-8 0 1884 330-8 0-212 195 386-2 0-1664 434-9 0-1874 143 295-7 0 1884 3330 0-212 196 387-8 01664 436-8 01874 144 297-6 0 1884 335-1 0-212 197 389-5 0-1664 438-7 01874 145 299-5 0 1884 337-2 0-212 198 391-2 01604 440-6 0-1874 146 3U1-4 0 1884 339-3 0-212 199 392-8 0-1664 442-4 0-1874 147 303-2 0 1884 341-4 0-212 200 394-5 0-1664 444-3 01874 148 305-1 0 1884 343-6 0-212 201 396-1 01572 446-1 0-178 149 307-0 0 1884 345-7 0-212 202 397-6 0-1572 447-9 0-178 150 308-9 0 1884 347-8 0-212 203 399-2 0-1572 449-6 0-178 151 310-7 0 176 349-8 0-1986 204 400-8 01572 451-4 0-178 152 312-4 0 176 351-8 0-1986 205 402-4 01572 453-2 0-178 153 314-2 0 176 353-8 0-1986 206 403-9 0-1572 455-0 0-178 154 315-9 0 176 3557 0-1986 207 405-5 01572 456-8 0-178 155 317-7 0 176 357-7 0-1986 208 407-1 ! 01572 458-5 0-178 156 319-5 i 0 176 359-7 0-1986 209 408-6 01572 460-3 0-178 157 321-2 0- 176 361-7 0-1986 210 410-2 01572 462-1 0-178 158 3230 0- 176 363-7 0-1986 211 411-8 1 0-1572 463-9 0-178 159 324-7 0- 176 365-7 0-1986 212 413-4 ! 01572 465-7 0-178 160 326-5 0- 176 367-7 0-1986 213 414-9 0-1572 467-4 0-178 ! 161 328-3 0- 176 369-6 ' 01186 214 416-5 01572 469-2 0178 ' 162 330-0 0 176 371-6 0-1986 215 418-1 0-1572 4710 0-178 , 163 331-8 0 176 373-6 0-1986 216 419-7 01572 472-8 0178 1 164 333-5 1 0- 176 375.6 0-1986 1 217 421-2 0-1572 474-6 0-178 i 1 Quantitative Zuckeibestiiumung mit Hilfe der Kupfermethodeii etc. (Schluß der Tabelle.) 181 Kupfer Für 0-1 Zucker Kupfer Kupfer- oxydul Jur 0-1 Zucker Kupfer- oxvdnl Kupfer Für 0-1 Zucker Kupfer Kupfer- oxydul Für 0-1 Zucker Kupfer- oxydul 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 422-8 01572 1 476-3 424-4 0-1572 478-1 425-9 0-1572 479-9 427-5 0-1572 481-7 4291 01572 483-5 430-7 0-1572 485-2 432-2 0-1572 487-0 433-8 0-1572 488-8 435-3 0146 490-4 436-7 0146 492-1 438-1 0146 493-7 439-6 0-146 495-3 441-1 0-146 497-0 442-6 0146 498-6 ' 444-0 0-146 500-3 445-5 0-146 501-9 446-9 0146 503-5 0-178 0-178 0178 0-178 0-178 0-178 0-178 0-178 0-1636 0-1636 0-1636 0-1636 0-1636 0-1636 0-1636 0-1636 01636 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 448-4 449-9 451-3 452-8 454-2 455-7 457-2 458-6 460-1 461-5 463-0 464-5 465-9 467-4 468-8 470-3 0-146 0-146 0146 0-146 0146 0146 0146 0-146 0-146 0-146 0-146 0-146 0-146 0146 0146 0146 505-2 0- 506-8 0- 508-4 0- 510-1 0- 511-7 0- 513-3 0- 515-0 0- 516-6 0- 518-2 0- 519-9 0- 521-5 0- 523-6 0- 524-8 0- 526-4 0- 528-1 0- 529-7 0- •1636 -1636 -1636 •1636 ■1636 -1636 -1636 •1636 •1636 -1636 -1636 •1636 •1636 •1636 •1636 -1636 Titrimetrische Zuckerbestimmung nach Bertrand. J) Die Methode beruht darauf, daß das beim Kochen mit Fehling- scher Lösung- gebildete Kupferoxydul in einer Lösung von Ferrisulfat in Schwefelsäure gelöst und das gebildete Ferrosalz mit einer auf Ammonium- oxalat eingestellten Kaliumpermanganatlösuug titriert wird. Man gebraucht 4 Lösungen. Lösung I : Reines kristalünisches Kupfersulfat . . . 40 <; Destilliertes Wasser zu 1 / Lösung II: Reines Seignettesalz 200 g Natriumhydroxvd in Stangen 150 ^ Destilliertes Wasser zu 1 / Lösung III : Ferrisulfat 50 ^ Konzentrierte Schwefelsäure 200 cm^ Destilliertes Wasser zu 1 / Lösung IV: Kaliumpermanganat ö r/ Destilliertes Wasser zu 1 ^ ') Bertrand, Le dosage des Sucres r^ducteurs. Bullet, de la Societe chimique. T. 35. p. 1285 (1906). — C. Funk, Über den Wert der zur Bestimmun!X des Haruzuckers verwendbaren Methoden. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 56. 8. 507 (1908). 132 Karl Grube. Man bestimmt den Titer der Kaliumpermangauatlösung in folgender Weise : 0'250 g Ammoniumoxalat werden im Becherglas mit 100 cm'^ Wasser und 2 cm^ konzentrierter Schwefelsäure auf 60 — 80" C erwärmt. Man läßt aus einer Bürette von der Kaliumpermangauatlösung zulaufen, bis Ptosa- färbung eintritt. Die Reaktion verläuft nach den Gleichungen 10 SO, Fe + Mn ( ) Jv + 8 SO, H, = 5 [( SOJs Fes] + SO, K2 + 2 SO, Mn + 8H2O und 5C2H., 0, + 2MnO,K + 3 SO, Hg = 10 CO.^ + 2S0,Mn + SO, Kg + 8H,0. Ein Molekül Oxalsäure, oder was dasselbe ist, ein Molekül Ammonium- oxalat, ist äquivalent 2 Fe, und diese sind nach der Gleichung Cu, 0 + ( S0,)3 Fe., + SO, H, = 2 SO, Cu + H^o + 2 SO, Fe äquivalent 2Cu. Multipliziert man die Menge des verwandten Ammoniumoxalat (0"250^) 60 "6 X 2 mit \,i).. "^ = 0"8951, so erhält man die Kupfermenge, welche der bis zur Rosafärbung gebrauchten Kaliumpermangauatlösung entspricht. Ausführung: In ein Erlenmeyerkölbchen von ca. 150 cm^ bringt man 20 cm'^ der zu untersuchenden Zuckerlösung und fügt dazu je 20 cm^ der Kupfer- und Seignettesalzlösung, erhitzt zum Kochen und läßt 3 Minuten lang vorsichtig kochen. Man nimmt von der Flamme und läßt das gebildete Kupferoxydul gut absitzen. Die Zuckerkupferlösung muß nach dem Kochen noch einen Überschuß an Kupfersulfat enthalten, d. h. blau gefärbt sein. Nachdem das Oxydul sich gut abgesetzt hat, bringt man die Flüssigkeit auf ein Asbestfilter — man kann dazu die Filterröhrchen von Pflüger oder von Soxhlet gebrauchen • — und saugt ab. Es ist darauf zu achten, daß von dem Oxydulniederschlag möghchst wenig auf das Filter kommt. Nachdem die blaue Flüssigkeit abfiltriert ist, wird der Niederschlag mit destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser aufs Filter gebracht. ^Man ent- fernt das Filter von der Saugflasche und wäscht diese mit destilliertem Wasser gut aus, so daß sie keine Spur von Kupfersulfat mehr enthält. Man bringt nun zu dem Oxydulniederschlag im Köllichen ca. 20 crn^ der Ferrisulfatlösung. Es bildet sich eine schön grüne Lösung. Diese wird auf das wieder auf der Saugflasche befestigte Filter gebracht und langsam durchgesaugt. Dabei geht das auf dem Filter befindliche Oxydul ebenfalls in Lösung. Ist noch nicht alles gelöst, so läßt man etwas mehr Ferrisul- fatlösung durchlaufen. Kölbchen und Filter werden gut mit destilliertem Wasser gewaschen, um alles Kupfer in die Saugflasche zu bekommen. Man bringt diese nun unter die Bürette mit der Kahumpermanganatlösung und titriert. Der Umschlag von Grün zu Rosa ist scharf und bei natürlichem und künstlichem Licht gut zu erkennen. Beispiel : 20 cm^ einer Zuckerlösung von OllBo/o {— 0"236 g Zucker) werden in der geschilderten Weise behandelt. Es werden zur Titration gebraucht 5'27 cni^ Kaliumpermangauat- lösung — 0-0472 y Kupfer = 01)233 g Zucker. Quantitative Zuckerbestinimun^- mit Hilfe der Kiipfcrmethoden etc. 183 ^lan eiiiiilt die besten Werte bei einer Konzentration der Zucker- lösunj;- von unter (>5Vo '■> stärkere Lösungen sind daher entsprechend zu verdünnen. Tabelle zur Bestimmung der Zuckermenge (Glykose) aus dem Kupfer nach Bertrand. Zucker in Cu in Zucker iu Cu in Zucker in Cu in Zucker in Cu in mg mg mg mfj mg mg mg mg 10 20-4 83 64-6 56 105-8 79 144-5 11 22-4 84 66-5 57 107-6 80 146-1 12 24-3 35 G8-3 58 109-3 81 147-7 13 26-3 36 701 59 111-1 82 149-3 14 28-3 87 720 60 112-8 83 150-9 15 30-2 38 78-8 61 114-5 84 152-5 16 32-2 39 75-7 62 116-2 85 154-0 17 342 40 77-5 63 117-9 86 155-6 18 36-2 41 79-3 64 119-6 87 157-2 19 381 42 811 65 121-8 88 158-8 20 40-1 43 82-9 66 1230 89 160-4 21 420 44 84-7 67 124-7 90 162-0 22 43-9 45 86-4 68 126-4 91 163-6 23 45-8 46 88-2 69 1281 92 165-2 24 47-7 47 900 70 129-8 93 166-7 25 49-6 48 91-8 71 131-4 94 168-3 26 51-5 49 93-6 72 133-1 95 169-9 27 53-4 50 95-4 73 134-7 96 171-4 28 55-3 51 971 74 136-3 97 1731 29 57-2 52 98-9 75 137-9 98 174-6 30 591 53 100-6 76 139-6 99 176-2 31 60-9 54 102-3 77 141-2 100 177-8 32 62-8 55 1041 78 142-8 I Spezielle Methoden der Zuckerbestimmung in tierischen Flüssig- keiten. Die Schwierigkeit der Zuckerbestininiung in tierischen Flüssigkeiten besteht darin, daß dieselben neben dem Zucker noch Stoffe enthalten, welche dieselben Reaktionen geben wie dieser, so z. B. die Drehung des polarisierten Lichtes oder die Reduktion der alkalischeu Kupferlüsung. Ehe man daher den Zucker bestimmen kann, müssen diese Stoffe entfernt werden, was am besten durch Ausfüllung geschieht. Hat man sich dann eine Lösung her- gestellt, welche außer dem Zucker keine die Reaktionen desselben gebenden Substanzen mehr enthält, so kann man irgend eine der früher mitgeteilten Methoden der (quantitativen Zuckerbestimmung zur Anwendung l)ringen. L Blut. a) Entfernung der Stickstoffsubstanzen nach der Methode von Patein und DiifciH mit Merkurinitrat.i) ^) G. Patein und iJiifait, De Temploi du nitrate acide de merciire dans Tanalyse des liquides sucröes. Journal de Pharmacie et de Chimie. 6. Serie. T. 15. p. 221 (1902). — 184 Karl Grube. Erforderlich sind zwei Lösungen. Lösung- I, Merkurinitratlösung. Zu 220 (/ gelbes Queeksilberoxyd fügt mau 300 — 400 cj» ^ "Wasser und allmählich unter Schütteln und Erwärmen die Menge von Salpetersäure, welche nötig ist, um dassell^e aufzulösen. Man füllt auf ein Liter auf und filtriert. Lösung II, Natronlauge vom spez. Gew. 1-3 (37 «/oj- Ausführung: bOcm^ defibriuiertes Blut werden mit der gleichen Menge destilliertem Wassers versetzt, wodurch das Blut lackfar])en wird. Man fügt dazu unter stetem LTmschütteln 40 crn^ der Merkurinitratlösung, es bildet sich ein massiger Niederschlag sämthcher stickstoffhaltiger Sub- stanzen. Man läßt ca. 5 Minuten stehen und neutrahsiert. indem man aus einer Bürette tropfenweise Natronlauge hinzufügt und füllt dann zu 150 cw^' auf. Im Filtrat darf auf Zusatz von Natronlauge kein Nieder- schlag mehr entstehen. Man nimmt einen aliquoten Teil zur Zuckerbe- stimmunff. Da das Filtrat einen Überschuß an üuecksilbersalz enthält, mui) dasselbe erst entfernt werden. Man fällt dasselbe durch Schwefelwasser- stoff und filtriert nieder. Den überschüssigen Schwefelwasserstoff entfernt man durch Durchleiten von Luft. Dann bestimmt man den Zucker durch Polarisation oder Titration. b) Fällung der Eiweißkörper durch Sublimat und Salzsäure nach Schenck. i) Man gebraucht dazu ö^/oige Sublimatlösung und 2''/oige Salzsäurelösung. Ausführung: öOcni^ defibriuiertes oder in Fluornatrium aufge- fangenes Blut werden mit Wasser auf 100 cm^ gebracht und zuerst 100 cm^ 2''/oiger Salzsäure und dann 100 cm^ öVoicer Sublimatlösung zugesetzt. Die Abmessung muß genau im Maßkolben geschehen. Man filtriert, leitet durch das Filtrat Schwefelwasserstoff. Nach 10 Minuten ist alles Quecksilber ausgefällt. Man filtriert wieder und mißt von dem Filtrat eine ali(|uote Menge ab, aus der der überschüssige Schwefelwasserstoff durch Durch- leiten von Luft mit der Wasserstrahlpumpe entfernt wird. Man polarisiert und bestimmt den Zucker durch Polarisation oder durch Titration. c) Fällung der Eiweißkörper nach Bang. -) Die Methode benutzt die von Abeles angegeliene AusfäUung der Ei- weißkörper mit einer alkoholischen Lösung von Zinkacetat. Anstatt des umständhchen Filtrierens. Auspressens, Auswaschens und Wiederfiltrierens verwendet Bang die Zentrifuge, um die zuckerhaltige Flüssigkeit von dem Niederschlag zu trennen. Ausführung: Ein Zentrifugenröhrchen von ca. 200 cm^ Inhalt wird mit 100 oit^ Alkohol und 2bg Zinkacetat gefüllt und gewogen. Man Bierrij und Portier, Sur le dosage du sucre du sang. Coinpt. rend. de la Biolog- 15. Nov. 1902. ^) F. Schenck, Über Bestimmung und Umsetzung des Blutzuckers. Pßügers Arcbiv. Bd. 55. S. 203 (1894). ^) Über die Verwendung der Zentrifuge in der quantitativen Analyse. Festschrift für 0. Hammarsten (1906). N. II. Quantitative Zuckerbestimnuiuir mit Hilfe der Kupfermethodeu etc. 185 läßt dann ca. 50^^»=^ Blut aus der Ader einfließen und \vieiit wieder. Mit einem (Tlasstal)e werden die lUutkoaüula zerteilt, bis der anfanj^s hell- rote Niederselilaii' eine i>ieiclimäßiL>' sehwar/t>:i'aue Masse bildet. Der (Uas- stab wird mit Alkohol alij^espült und das liöhix'hen damit auf (1908). "') Über eine Methode, den Stickstoffgehalt des menschlichen Harnes schnell anniiherungsweise zu bestimmen. Fßiigers Archiv. Bd. 38. S. 573 (1886). 188 Karl (irube. 2. Bestimmung- der Lävulose. Enthält der Harn nur die linksdrehende Lävulose, so hißt sich deren Menge durch Polarisation bestimmen, doch ist zu bemerken, daß die Drehung der Lä\'ulose keine konstante ist, sondern abhängt von der Temperatur und Konzentration. M Durch Vergärung- läßt sich entscheiden, ob es sich um Linksdrehung durch Lävulose oder durch andere Stoffe handelt. Im ersteren Falle verschwindet die Drehung- nach der Gärung. Chemisch prüft man auf Lävulose durch die Selivanoß'iiche Reaktion. Zu diesem Zweck werden 10 cni^ Harn mit etwas Resorziu und 2 ciu^ verdünnter Salzsäure erwärmt; bei Anwesenheit von Lävulose tritt Eotfärbung ein. Enthält der Harn sowohl Dextrose wie Lävulose, so muß neben der Polarisation noch die Titration ausgeführt werden. o. Bestimmung- von Milchzucker. Laktose kommt im menschlichen und tierischen Harn nur bei Wöchnerinnen bei Milchstauung 2), nach der innerhchen Aufnahme sehr großer Mengen und nach der subkutanen Injektion vor. 3) Der Milchzucker dreht das polarisierte Licht nach rechts und reduziert alkahsche Kupfer- lösung-. Er bildet mit Phenylhydrazin ein bei 200" schmelzendes Osazon. Hat man in einem Harne durch Kochen mit alkalischer Kupferlösung das Vorhandensein von Zucker festgestellt, so kann man sich zur Ent- Scheidung der Frage, ob es sich um Trauben- oder Milchzucker handelt, der Probe von G. Buchner bedienen. Zu dem Zwecke bringt mau in einem Pteagenzglase zu 10 cm^ Harn o Tropfen Ammoniaklösung (spezifisches Ge- wicht 096) und setzt dazu 4 — 5 Tropfen Bleizuckerlösung. Man erhitzt im Wasserbade. Bei Anwesenheit von (Tlykose färbt sich der anfangs weiße Niederschlag fleischfarbig bis ockergelb , bei Anwesenheit von Milchzucker bleil)t der Niederschlag rein weiß. ]\Iit Sicherheit weist man den Milchzucker dadurch nach, daß man ihn rein darstellt, was bei der leichten Auskristallisierbarkeit nicht so schwer ist. Nach Hofmeister verfährt man foli>endermai)en : 500 — 1000 cm 3 Harn werden mit neutralem Bleiacetat versetzt, bis keine Fällung mehr erfolgt. Der Niederschlag wird al)filtriert und ausge- waschen. Das Filtrat wird, mit Bleiacetat und Ammoniak versetzt, einige Stunden stehen gelassen. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat auf Ptechtsdrehung- und Reduktion geprüft. Wenn diese positiv, wird nochmals mit Bleiacetat und Ammoniak gefällt. Die Niederschläge werden in Wasser verteilt und mit Schwefelwasserstoff behandelt, welcher durch Durchleiten eines Luftstroms entfernt wird. Die Flüssigkeit wird mit frisch gefäUtem Silberoxyd geschüttelt und filtriert. Das Filtrat wird zur Beseitigung des Silbers wieder mit Schwefelwasserstoff ^) r. Lip2^mann, Die Chemie der Zuckerarteu. Bd. I. S. 823 (1904). -) F. Hofmeister, Über Laktosurie. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 1. S.lOl (1877). ^) F. Voif, Untersuchungen über das Verhalten verschiedener Zuckerarten im menschlichen Organismus nach subkutaner Injektion. Deutsches Archiv f. klin. Med. Bd. 58. S. 523 (1897). Quantitative Zackerbestimmung mit Hilfe der Kupfermethoden etc. Ig9 behandelt, abermals filtriert und nach Zusatz von kohlensaurem Baryt zur Bintlung- etwa vorhandener Essigsäure so weit eingedampft, daß ein sirup- artiger Iiückstand bleibt. Der Piückstand wird mit soviel OOVoig^ni Alko- hol behandelt, bis ein flockiger Niederschlag entsteht. Es wird abfiltriert und aus dem alkoholischen Filtrat scheiden sich im Exsikkator Kristalle ab, die durch Umkristallisieren, Entfärben mit Tierkohle oder dui'ch Ex- traktion mit kochendem 60 — TO^/oiS^^^ Alkohol gereinigt werden. Mit dem reinen Milchzucker stellt man dann die entsprechenden Proben an. III. Milch. 1. Bestimmung- des Milchzuckers nsiCh Patern.^) 50 cm^ Milch werden unter Umschütteln mit 10 cm^ Merkurinitratlösung (siehe S. 184) versetzt und auf 100 c»*^ mit Wasser aufgefüllt und filtriert. Das Filtrat wird mit Natronlauge vom spezifischen (iewicht UIJ bis zur schwach alkalischen Reaktion versetzt und der Zucker nach Fehling- Soxhht durch Titration bestimmt. Es ist zu bemerken, daß man nach Soxhiet den Milchzucker 6 Minuten mit der alkalischen Kupferlösung' kochen muß. Im übrigen verfährt man wie für den Traubenzucker angegeben. 2. Bestimmung nach Soxhiet.-) 25 cm 3 jMilch werden mit 400 cm^ Wasser verdünnt, mit 10 cm^ der zur Zuckerbestimmung benutzten Fehlin(jisQhen Lösung (69"28 g Kupfer- sulfat im Liter) und hierauf mit 6'5 — Tb crn^ einer Kahlauge versetzt, die so gestellt ist, daß ein Yolum derselben das Kupfer aus einem Volum der Kupferlösung gerade herausfällt. Nach dem Zusatz der Lauge muß die Flüssigkeit noch sauer reagieren und darf etwas Kupfer gelöst enthalten. Man füllt auf 50 crn^ und filtriert durch ein trockenes Faltenfilter. 100 cm^ der Lösung werden mit 50 cm^ Fehlingi^i^her Lösung- im Becherglase vermischt und zugedeckt über doppeltem Drahtnetz zum Kochen gebracht. Man kocht 6 Minuten und filtriert durch ein Asbestfilter, redu- ziert das Kupfer im Wasserstoffstrom und berechnet nach der von Soxhiet aufgestellten Tabelle : Kupfer Milchzucker m(/ mg 392-7 300 363-6 275 333-0 250 300-8 225 269-6 200 237-5 175 204-0 150 171-4 125 138-3 100 1) Dosage du Lactose dans le lait. Journal de Pharmacie et de Chimie. 6. schrie. T. 1,5. S. 505 (1902). -) Das Verhalten der Zuckerarten zu alkalischen Kupfer- und tjuccksilberlösungen. Journal für prakt. Chemie. Neue Folge. Bd. 21. S. 267 (1880). Spaltimg razemisclier Mouosaccliaride und der Poly- saccliaride in die Monosaccliaride durch biologisclie Methoden. ^ 011 Haus Pringsheim, Berlin. 1. Spaltung razemisclier Monosaccharide durch Hefe. Unter den bisher mit Sicherheit bekannten Monosacchariden sind nur die durch ihre sterische Konfifjuratiou nahe verwandten, die d-Glukose. d-Mannose und d-Fruktose, leicht, die diesen etwas ferner stehende d-Galak- tose weniger leicht durch Hefe vergärbar.i) Aui Grund dieser Eigenschaft gehngt es, die ihnen zugehörigen razemischen Formen zu spalten, d. h. aus den inaktiven SMithetischen Substanzen durch Vergärung mittelst Hefe die d-Modifikationen wegzunehmen und die in der Natur nicht vorkommen- den 1-Antipoden, an deren Vergärung die Hefe nicht angepaßt ist, zu ge- winnen. So kann man aus der d-1-Glukose die l-Glukose^), aus der d-1-Mannose die l-Mannose^), aus der d-1-Fruktose die 1-Fruktose*) und aus der d-1-Galaktose die 1-Galaktose ^} erhalten. Die Methode der Spaltung'. Zur Vergärung- der razemischen Mono- saccharide bringt man die Zucker in lO^/oiger Avässeriger Losung mit frisch gewaschener, gutwirkender Bierhefe zusammen. Am besten verwendet man zu diesem Zwecke eine Reinkultur-Preßhefe. Da aber die große Menge der vorhandenen Hefezellen, ^^ie auch das baldige Auftreten von Alkohol, die Entwicklung anderer Mikroorganismen hemmt, kann man auch mit gewöhnlicher Preßhefe auskommen. Mit Ausnahme der ^'ergärung der ^) Vgl. Emil Fischer, Bedeutimg der Stereochemie für die Phj'siologie. Zeitschr. f. physiol. Cbem. Bd. 26. S. 60 (1898/99); auch E. Abderhalden, Lehrbuch der physiolo- gischen Chemie. 11. Aufl. S. 623. ürban & Schwarzeuberg. Berlin-Wien. 1908. -) E. Fischer, Über die optischen Isomeren des Traubenzuckers der Glukonsäure und der Zuckersäure, ßer. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 2611 (1890). ") E. Fischer, Synthese der Manuose und Lävulose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 23. S. 370 (1890). *) E. Fischer, ibidem. S. 389. ^) E. Fischer und J. Hertz, Reduktion der Schleimsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 25. S. 1247 (1892). Spaltung razemischer Monosaccharide etc. IQ\ (Galaktose ist die nach kurzer Zeit einsetzende Kohlensänreentwickluu!? nach 24 Stunden beendet; bei Galaktose setzt die Gänuii»- erst nacli 1 — 2 Stunden ein und dauert dann bis zum 5. — 6. Tage fort. Die Isoheruno' der l-]\lodifikation ist nur bei der Galaktose beschrieben worden. 1) Hier wird die vergorene Lösung filtriert, zur völligen Reinigung mit etw^as Tierkohle gekocht, abermals filtriert und zum Sirup eingedampft. Der letztere scheidet im Laufe von 12 — 15 Stunden den größten Teil der 1-Galaktose in Ideinen Kristallen ab. Das .'Produkt wird durch A])saugen von dem braunen Sirup getrennt, sorgfältig mit Methylalkohol gewaschen und in verdünnter wässeriger Lösung bis zur Entfärbung mit reiner Tier- kohle behandelt. Beim Verdampfen der Lösung bleibt ein farbloser Sirup, der sehr bald kristaUinisch erstarrt. Um den mit Methylalkohol verriebenen und filtrierten Zucker aschefrei zu erhalten, löst man ihn durch längeres Kochen in viel absolutem Alkohol. Wird diese Lösung bis zur beginnenden Trübung eingedampft und dann abgekühlt, so scheidet sich ein Teil der unorganischen Beimengungen als flockiger Niederschlag aus und aus dem Filtrat kristallisiert bei längerem Stehen der Zucker in farblosen harten Krusten. Um die letzten Spuren von Asche zu entfernen, muß die Kristalhsation aus Alkohol mehrmals wiederholt werden. Die Substanz zeigt dann den Schmelzpunkt von 162 bis IBo» (unkorr.). Die 1-Glukose kann man im Anschluß an die Isoherung des auf chemischem Wege erhaltenen Produktes 2) aus dem nach dem A'erdampfen der vergorenen Lösung der d-1-Glukose erhaltenen Syrup durch Stehen- lassen kristaUinisch erhalten. Es wird zuerst auf Ton abgepreßt und nach dem I'mkristallisiereu aus sehr wenig Wasser durch Pressen auf Ton nochmals von der !Mutter- lause befreit; löst man die Substanz dann in heißem ISIethvlalkohol und füat zu der stark konzentrierten Flüssigkeit absoluten Alkohol, so beginnt nach längerer Zeit die Kristallisation der reinen wasserfreien 1-Glukose in Gestalt harter prismatischer Kristalle, die meist zu Warzen verwachsen sind und bei 141 — 14o0 ohne Zersetzung schmelzen.^) Die l-]Mannose und 1-Fruktose sind bisher noch nicht in ganz reinem Zustand erhalten worden. Zum Nachweis der Zucker kann man sich ihres \'erhaltens gegen Phenylhydrazin bedienen. Zur Entfernung der Proteine tut man gut, in 50/oiger Lösung von Natriumacetat aufzukochen und abzufiltrieren. Die so vorbereitete Lösung kann man dann gleich mit Phenylhydrazinchlorhydrat versetzen. 1-Glukose und 1-Fruktose geben in der KiUte mit einem MolekiU Phenylhydrazin keine Hydrazone. Dagegen fällt bei beiden in der Wärme ') E.Fischer, 1. c. und Untersucliungen über Kohlenhydrate und Fermente. S. 471. Berlin bei Julius Springer. 1908. ^) E. Fischer, 1. c. und Untersuchungen über Kohlenhydrate und Fermente. S. 370. '*) E. Fischer, 1. c. und Untersuchungen. S. 333. 192 ^- ri'iugsheim. mit zwei Molekülen Phenylhydrazin 1-Phenylglukosazon. das sich gegen lOö« dunkel färbt und bei 205" unter Gasentwicklung schmilzt. — Für die 1-Mannose ist das bei Zusatz von essigsaurem^ Phenylhydrazin zur wässerigen Lösung in der Kälte in feinen KristaUen auffallende 1-^Iannosephenylhydrazon, welches nach dem UmkristaUisieren aus den 40 fachen Mengen heißen Wassers bei raschem Erhitzen gegen 195" unter Gasentwicklung schmilzt, charakteristisch. Das ebenso darzusteUende, in kaltem Wasser ziemUch schwer lösliche 1-Galaktosephenylhydrazon schmilzt bei 158 — 160". Das optische Drehungs vermögen dieser Körper kann zur weiteren Charakteri- sierung- verwandt werden. M 2. Spaltung der Polysaccharide in Monosaccharide. Die bisher bekannten, natürhch vorkommenden, vergärbaren Poly- saccharide geben bei der hydrolytischen Spaltung nur solche optische Komponenten der Monosaccharide, die von Hefe vergoren werden ; es bleibt also bei der Vergärung dieser Polysaccharide kein optisch konträrer Rest, so daß die Spaltung- der natürlichen Polysaccharide durch gärende Hefe nicht in Betracht kommt. Anders kann das werden, falls die Polysaccharide der Synthese mit Hilfe rein chemischer Mittel zugänglich werden sollten; aus den so gewonnenen razemischen Produkten ließe sich dann durch Vergärung- mittelst Hefe eine Spaltung in die optisch-aktiven Komponenten bewirken. Dabei bleibt fürs erste unentschieden, ob in solchen Fällen die optischen Komponenten der natürlichen Polysaccharide als solche oder deren hydro- lytische durch Hefe unvergärbaren Spaltungsprodukte erhalten werden würden, da wir nicht \Aissen.,wie sich die Enzyme der Hefe gegen inaktive Polysaccharide verhalten. Der Vergärung der Polysaccharide geht immer eine Spaltung in die Monosaccharide voraus. 2) Man kann nun die in der Hefe enthaltenen, Poly- saccharide spaltenden Enzyme zur Zerlegung dieser in ihre hydrolytischen Abbauprodukte benutzen, wenn man die Enzyme aus der Hefe auszieht und so hydrolytisch wirksame, für die Gärung dagegen um^^rksame oder nur schwach ^nrksame Extrakte verwendet. 'An Stehe von Hefeextrakten kann man sich auch solcher von anderen Mikroorganismen, von Gersten- malz, oder tierischer Sekrete und Organe bedienen. Bei der Hefe, bei der die Verhältnisse am genauesten erforscht sind, kann das Resultat der Polysaccharidspaltung nun durch die Art der HersteUung des Extraktes beeinflußt werden. Während z. B. das Rohrzucker spaltende Enzym, die Hef einvertase , schon in den wässerigen Auszug feuchter Hefe übergeht, wird die die Maltose hydrolysierende Hefemaltase, die wir nach den neueren Anschauungen als Endoenzym bezeichnen würden, von der lebenden ^) E. Fischer, 1. c. und Untersuchungen. S. 349. '-) Vgl. hierzu E. Fischer, Bedeutung der Stereochemie für die Physiologie. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 26. S. 60 (1898). — Untersuchungen S. 126. Spaltung razemischer Monosaccharide etc. ^93 Zelle nicht abj2;ei*'eben. Euiil Fischer, dem wir diese Untersueliiini>eii ver- danken, hat die Hefe daher durch Zusatz vou Chloroform ü;etöteti) oder die Zellen durch Zerreiben mit Glaspulver i>eöffnet. 2) Wirklich verlaßliche Resultate über diese Spaltungsergebnisse können nur gewonnen werden, wenn die Spaltungsprodukte in der im Abschnitt I a) beschriebenen Weise mit Phenylhydrazin nachgewiesen werden. Bisher sind auf enzymatischem Wege acht Disaccharide und zwei Trisaccharide gespalten worden, die dabei wie folgt zerfallen: Rohrzucker in d-Glukose und d-Fruk- tose, Maltose, Isomaltose, Gentibiose, Cellobiose und Trehalose in d-(iilukose, Milchzucker und Melibiose in d-dllukosc imd d-Galaktose. Die Trisaccharide können unter dem Einfluß der Enzyme in verschiedener Weise gespalten werden. So zerfilUt die Raffinose oder !Melitriose durch Hefeenzyme in MeUl)iose und d-Fruktose 3), während Emulsin sie in Rohrzucker und d-Ga- laktose spaltet.*) Hefe und Invertin zerlegen die Gentianose in (ren- tibiose und d-Fruktose, Aspergillus niger dagegen in die drei Mono- saccharide. ^) Auf Grund dieser biologischen Spaltungen kann die Gentibiose aus der Gentianose dadurch dargestellt werden, daß aus ihrer mit Hefe ver- setzten Lösung die d-Fruktose vergoren wird, während die ungespaltene Gentibiose zurückbleibt. Ebenso läßt die Obergärhefe die aus der Raffi- nose abgespaltene Mehbiose ungespalten zurück, während die d-Fruktose der Wirkung des Gärenzyms vei'fällt. ") Die so gewonnenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zu- sammengestellt. Die dort gegebenen Resultate wurden durch die Prüfung verschiedener Hefearten bestätigt und erweitert, woi)ei auch Torula, Kahm- hefe, orangerote Hefe und Anomalushefe in den Kreis der Untersuchung gezogen wurden.') Über die mit tierischen Sekreten und Organen ausge- führten Polysaccharidspaltungen ist das Original nachzulesen, s) Zur Spaltung wendet man die Polysaccharide in lO^/oiger Lösung an. Die Menge der zuzusetzenden Enzymlösung braucht nur gering zu sein; ') E. Fischer, Einfluß der Konfiguration auf die Wirkung der Euzjnie. I. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 27. S. 2985 (1894). ^) E. Fischer, Einfluß dei Konfiguration auf die Wirkunsr der Enzyme. II. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 27. S. 3479 (1894). ^) A. Kalaufhar, Über die Spaltung vou Polysacchariden durch verschiedene Hefe- enzyme. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 26. S. 88 (1898). *) C. Nenberg, Zur Kenntnis der Raffinose. Abbau der Raffinose zu Rohrzucker und d-Galaktose. Biochem. Zeitschr. Bd. 3. S. 519 (19Ü7). ^) Bourquelot, Sur la physiologie du gentianose; son d^doublement par les fer- ments solubles. Compt. rend. de l'Academie des sciences. T. 126. p. 1045 (1898). ^) Loiseau, Beitrag zum Studium der Melibiose. Zeitschr. des Vereins der Deut- schen Zuckerindustrie. Bd. 53. S. 1050 (1903). ') Kalaufhar, 1. c. ^) E. Fischer und W. Michel, Über das Verhalten der Polysaccliaride gegen einige tierische Sekrete und Organe. Sitzungsberichte der königlich preußischen Akademie der Wissenschaften zu Berlin. 1896. Y. 73. Abderhalden, Handbuch der biochemi.schen Arbeitsmethoden. II. 13 194 H. Pringsheim. Enzvmatische Hvdrolvse der Polvsaccharide. i) « A i S o Bierhefe Frohberg -Hefe Wässeriger Auszug . . . . Auszug aus getöteter Hefe Hef eauf schwemm ung . . . Unterhefe (Frohberg. Saaz) . . Oberhefe (Frohberg, Saaz) . . Milchzuckerhefe Wässeriger Auszug Auszug aus getöteter Hefe Wässeriger Auszug aus Kefirkör Saccharomy ces Marxi anus . . Wässeriger Auszug Saccharomy ces octosporus Wässeriger Auszug Monilia Candida Wässeriger Auszug . . . Mit Glaspulver zerrieben Verschiedene Hefen*) Wässeriger Auszug Malzdiastase . Invertin Merck Emulsin Merck nern + + + + + + + + + + + + + schwaih + + + + + + + + bedeutet Hydrolyse, — bedeutet keine Hydrolyse. ') AVenn nicht anders angegeben nach IJ. Fischer, Einfluß der Konfiguration auf die Wirkung der Enzyme. I. H. III. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 27. S. 2985 und 3479 (1894); Jg. 28. S. 1429 (1895). -- E. Fischer um\ P. Lindner, Über die Enzyme von Schizosaccharomyces octosporus und Sacch. Marxiauus. Ibid. Jg. 28. 8.984(1895) und: Über die Enzyme einiger Hefen. Ibid. Jg. 28. S. 3034 (1895). -) E. F. Armstrong , Studien über Enzym Wirkung. Die synthetische Wirkung von Säuren verglichen mit derjenigen der Enzyme. Synthese von Maltose und Isomaltose. Proc. Royal Soc. London. Jg. 76. (Serie B.) S. 592 (1905). ") Bourquclot et Herissey , Action des fermeuts solubles et de la levure haute sur le gentiobiose. Remarques sur la Constitution du gentianose. Compt. rend. de l'Academie des Sciences. T. 135. p. 399 (1902). ■*) A. Kalauthar, 1. c. Spaltung razemischer Monosaccharide etc. 195 wenige oder auch 1 cui^ i>enüi'en. Durch Zusatz von 0'2Vo Tohiol hindert man die Entwickhnii^' unahiietöteter Zellen oder die von Freindorj^anisnien. Man inkuliei't hei ;>7"C. Da nacli ei<^-enen 15eohachtun,yen die .Spaltung' nach 24 Stunden häufiiJ- nocii nicht /nni Ahschluß i^ekoninien ist. muii man mindestens 48 Stunden stehen lassen. Darstellung- eines wässerigen Ilefeaus/uges. Zur Herstellung eines wässerigen Hefeauszuges bedient man sich- frisch gewaschener Hefe, die mit dem fünffachen Gewicht an Wasser etwa 24 Stunden bei 37° C im Brutraum stehen gelassen und (hinn filtriert wird. An Stelle der durch C'hloroformzusatz oder Zerreiben mit Glaspulver zu isoherenden Endoenzyme wird man sich jetzt eines nach dem Verfahren von E. Buchner hergestellten Preßsaftes bedienen, den man in so geringer Menge anwendet, daß er nur schwache, die Isolierung der Spaltungs- produkte nicht inhibierende, (iärwirkung entfaltet. Nach eigenen Ki- fahrungen kann man die Herstellung solcher Preßsäfte zur Polysaccharid- spaltung auch auf Schimmelpilze übertragen, die man sich auf steriler Nährlösung in der genügenden Zahl von Erlenmeyerkolben selbst züchtet. Die Buchner?<(^he Methode s;n hier beschrieben. Anhang. Herstellung von Pilzpreßsäften nach Büchner.^) A. Hefepreßsaft. Die Darstellung des Hefepi-eßsaftes wurde ursprünglich zur Ein- richtung der zellfreien Gärung angegeben. Dekanntlich geüngt es ohne die Zertrümmerung der Zelle nicht, der Hefe die Zvmase durch Wasser- extraktion zu entziehen, da dieses Enzym im ZeUsaft festgehalten wird. Das Zerreißen der Zellen ist also die theoretisch wichtige Grundlage der Preßsaftdarstellung ; die Trennung des Zellsaftes von den Mem- branen ist mir experimentelles Beiwerk, das allerdings für das Gehngen der hervorzurufenden emzymatischen Wirkungen von größter Bedeutung ist. Wichtig ist vor allem , daß sich die Operation in verhältnismäßig kurzer Zeit durchführen läßt, so daß die sich vermisclienden Pjizyme nicht ge- nügend Zeit haben, um sich gegenseitig zu vernichten. Nor allem unter- hegt bekanntlich die Zymase der Wirkung der proteolytischen Enzyme des Preßsaftes. In allen Fällen muß man auch hier die Entwicklung von Fremdorganismen durch einen Zusatz von 0-2Vo Tohiol hemmen, wenn man den Saft im Brutzimmer zur Wirkung bringt. Größere (laben von Toluol sind zu vermeiden, da sie die Enzyme zu stark hemmen. 1) E. Buchner, H. Buchner und M. Jlahti , Die Zymasogäruiig. Untcrsucliunsjen über den Tnlialt dor Tlcfozollcn und dio biologische Seite des GärungsproMems. R. Olden- l)ourg, ^tliinclien und Berlin lUU;}. 13* 196 H. Pringsheim. Die Darstellung des Preßsaftes zerfällt in vier Operationen: 1. Das Waschen der Hefe. 2. Das Zerreiben der Hefe mit Quarzsaud, wobei die Zellen ize- öffnet werden. ;]. Das Verreiben der mit Quarzsand zerriebenen Hefe mit Kiesel- gur. Hierbei saugt die Kieselgur vermöge ihrer großen Oberfläche und ihrer kapillaren Struktur den Zellsaft auf. 4. Durch Pressen der so entstandenen plastischen Masse in der hydraulischen Presse unter Druck bis zu HOO Atmosphären wird der Saft in geklärter und durch die Kieselgur filtrierter Form abgegeben, während die Zellmembranen zurückbleiben. 1. Das Waschen der Hefe. Die aus der Brauerei zu beziehende Hefe wird zuerst durch ein Haarsieb mittelst aufgeschwemmten Wassers in ein hohes Gefäß gespült. Hier lälU man absitzen, hebert das Wasch- wasser ab und wiederholt die Operation, bis das Wasser klar und farblos abfließt (zwei- bis dreimal). Dann filtriert man die Hefe durch ein Kolier- tuch. Um die gewaschene Hefe möglichst zu entwässern, faltet man das Koliertuch beuteiförmig, schlägt noch in ein baumwoUenes, nicht appretiertes Preßtuch (Segeltuch) ein und untei'wirft in der hydrauüschen Presse einem schließlich fünf Minuten lang aidialtenden Druck von öO Atmosphären. So erhält man einen Hefekuchen von etwa TO^/o Wassergehalt. 2. Das Zerreiben der Hefe mit Quarzsand. In einer großen Porzellanschale, die innen unglasiert sein muß, mengt man die Hefe in Portionen von 300 — 400 g mit dem gleichen (xewicht an Quarzsand, der durch ein Sieb von 200 Maschen auf 1 cm- hindurchgegangen ist. Dann be- ginnt man mit Hilfe eines schweren Pistills, das, wenn möglich, vermittelst einer Eisenstange in einer F'ührung lieweghch ist, zu zerreiben. Die Dauer dieser Operation kann nur durch die Übung ermessen werden; mit Hilfe des Mikroskops gelingt es jedoch leicht festzustehen, wann die Haupt- menge der HefezeUen aufgesprengt ist. Für 200 — oOOr/ entwässerter Hefe genügen etwa 3 — 4 Minuten. Von der Vollkommenheit der Zertrümme- rung der ZeUen hängt die Ausbeute an Preßsaft hauptsächhch ab. 3. Das Verreiben mit Kieselgur. Jetzt setzt man der Hefe in größeren Portionen, deren Abmessung sich nach der (iröße der rveil)schale richtet, den vierten bis dritten Teil des Gewichtes an Kieselgur zu und verreibt von neuem, bis die Masse ein homogenes Aussehen von grau- brauner Farbe angenommen hat und nicht mehr brüchig, sondern plastisch erscheint. 4. Das Auspressen des Saftes. Zum Zwecke des Auspressens \^ird die teigförmige Masse wieder in ein vorher angefeuchtetes, jedoch bei 50 Atmosphären Druck entwässertes, l'reßtuch eingeschlagen und unter sich langsam um je 50 Atmosphären steigerndem Druck, der bis zu 300 Atmosphären erhöht wird, ausgeprelit. Der ahf ließende Preßsaft tropft auf ein Faltenfilter und fließt von diesem in das Sammelgefäß. Die abgepreßte Spaltung razemischer Monosaccharide etc. ]^97 Hofe kann man nochmals zerreiben und von neuem bei :H)0 Atmospliilren pressen. Man i>ewinnt so auf 1 hg entwässerte Hefe 450 — 500 cm^ Treläsaft. B. Pilzpreßsäfte in geringer Menge. ^lul) man sicli die Pilze, aus denen man den Preßsaft gewinnen will, erst durch Zuclit im Laboratorium selbst herstellen, so impft man iieeii>nete Nährlösung, die man z. 1). in Erlenmeyerkolben sterilisiert hat, mit den Pik- kulturen und kultiviert bei der für das Wachstum der verwandten Pilze optimalen Temperatur. Schon nach 2 — .-') Wochen kann man so, wie mir zahlreiche Erfahriini>en gelehrt haben, genügende Mengen von Pibisubstanz, z. B. Mycel von Schimmelpilzen, heranzüchten, um daraus eine zur Zucker- oder Polypeptidspaltung etc. genügende Menge von Preßsaft zu gewinnen, i) Das Verfahren unterscheidet sich von dem vorher beschriebenen haupt- sächlich darin, daß man das gewaschene Pilzmycel nicht in der hydrau- hschen Presse entwässert, sondern nur durch den Druck der Hand vom außen anhaftenden Wasser befreit, ehe man das Zerreiben beginnt. Da- durch wird der Preßsaft zwar verdünnt; man gewinnt jedoch immer noch ]"echt wirksame Säfte. Entwässert man zu stark, so fließt beim Pressen infolge der geringen vorhandenen Flüssigkeitsmenge fast gar nichts ab; man muß dann die hervortretenden Tropfen abspülen und kommt zu keinem besseren, sondern zu einem schlechteren Resultat, da der im Innern zurückbleibende Saft nicht ausgewaschen wird. Schimmelpilzmycele sind mit Sand viel leichter als Hefe zu zerreiben; man kann schon an der P'einheit des erhaltenen Pulvers leicht beurteilen, wann man genügend Sand zugesetzt und gerieben hat. Auch die Bildung der plastischen Masse mit Kieselgur wird durch eine geringe Feuchtigkeit des zu zerreibenden Mycels sehr begünstigt. Die hydraulische Presse muß mit einem genügend kleinen durchlochten Pretikorb mit hineingepaßter Preßiplatte ausgestattet sein, wenn es sich um kleine Portionen von Säften handelt. Man kann solche Körbe speziell anfertigen lassen und sie an Stelle der größeren auf der Platte der Presse aufstellen. Aus dem in 20 Erlenmeyerkolben (1/) herangezogenen Pilzmycel kann man so leicht 10, 20 oder auch mehr Kubikzentimeter Preßsaft je nach der Art des Pilzes gewinnen und mit 1 cm^ des Saftes Zucker- oder andere Spaltungen ausführen. C. DarsteHung von Acetondauerpräparaten. In manchen Fällen ist es vorzuziehen, sich (in haltbares Fuzyni- präparat von Pilzen herzustellen, das man wie die käufüche Acetondauer- M Vgl. E. Abderhalden und H. Prinrisheim, Studien über die Spezifizitiit der pop- tolytischen Fermente Lei verscliiedenen Pilzen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 59. S. 249 (1909). 198 H. rringsheim. Spaltung razemischer Monosaccharide etc. hefe, das Zymin von Schröder in München, Landwehrstraße 45, anwenden kann. Man verfährt, wie bei der Herstelhmg- der Dauerhefe angei^eben. i ) Das zuerst unter einem Druck von 50 Atmosphären entwässerte Pilznivcel wird fein zerschnitten in Aceton eingetragen und im Aceton durch Schwem- men gut verteilt. Es l)leibt 10 Minuten im Aceton; hierauf wird nach kurzem Absetzen die FKissigkeit abgegossen und an einer Nutsche unter kräftigem Anpressen mit einem geeigneten Stempel möglichst trocken abgesaugt. Den nunmehr grob zerkleinerten Prel'ikuchen ül)ergießt man aufs neue in einer Schale mit Aceton, rührt 2 Minuten lang damit durch und saugt von neuem ah. Die Masse mrd sodann grob ge- pulvert und in einer kleinen Schale mit Äther Übergossen ; nach :-i jMinuten dauernder Einwirkung, die durch l^mrühren unterstützt wird, saugt man den Äther auf der Nutsche ab und breitet die zu einem feinen Pulver zer- riebene Masse in dünner Schicht auf Filtrierpapier aus. Xach V2 — 1 Stunde Lagern an der Luft bringt man in einen Trockenschrank und trocknet 24 Stunden bei 45o. ') Ii. AJbcrf, E. Buchner und ii*. liapp, Ber. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. Jg. 35. S. 2376 (1902). Untersuchung auf Fette. \ 011 F. Böhmaiiii, Breslau. Gewinnung der Fette und der in Äther löslichen Bestandteile der Organe. Die Fette des Fettgewebes lassen sich dureli Ausschmel/eii i>ewiiineii. ^lan zerkleinert das Fett, erhitzt, wenn es sich um kleine Mengen handelt, in einer Porzellan- oder emaillierten Eisenschale auf dem Sand- oder im Wasserbade und filtriert durch ein Faltenfilter, das sich in einem Heiß- wassertrichter befindet. (Größere Mengen werden in geeigneten Gefäßen mit Dampf erhitzt. Die pflanzlichen Öle werden aus den iilhaltigen Samen, das Palmöl aus dem Fruchtfleisch der Palmfrüchte durch Auspressen gewonnen. \'on wesentlicher Bedeutung ist hierliei die Temperatur, bei der das Auspressen geschieht. Bei niederen Temperaturen erhält man ein reineres Öl. Diesem können fettspaltende Fermente, Lipasen, beigemengt sein, welche das Fett allmählich in Fettsäuren und Glyzerin spalten, so daß die Säurezahl solcher Fette beim Lagern zunimmt. Preßt man bei höheren Temperaturen, so löst das Fett mannigfach andere Stoffe, die in den pflanzlichen Geweben enthalten waren und unter anderem durcli Nach- dunkeln die P\arbe des Öles beeinflussen. Die im Preßkuchen zurückbleibenden Fette lassen sich durch Benzin. Schwefelkohlenstoff, Äther oder Chlorkohlenstoff extrahieren. Schwefelkohlen- stoff löst hierbei auch die durch Oxydation verharzten Fette, während Benzin dies in viel geringerem Maße tut. Zur FLxtraktioii der Preßkuchen im Laboratorium dienen, wenn es sich um kleine Mengen handelt, Soxhletapparate ; für die P^xti'aktioii von größeren Mengen Extraktionsapparate, wie in Bd. L S. 184. Ein vorheriges Trocknen der zu entfettenden Substanzen ist nicht zu empfehlen. Ebenso dürfte es für chemische Untersuchungen wohl zweck- mäßig sein, die Samen nicht vor dem Entfetten fein zu mahlen, sondern erst die Hauptmenge des Öls durch Pressen oder Extrahieren zu eiittVnu'u und erst dann den Rückstand zu zerkleinern, da in ciiiein feinen Pulver durch Oxydationen — besonders bei Anwesenheit von ungesättigten Fett- säuren — leicht Veränderungen eintreten können. 200 F. Roh mann. Es seien im folf?eiideii die Eigenschaften der Avichtiiisten Extraktionsmittel angeführt. Schwefelkohlenstoff (Siedepunkt 46-2, spez. Gew. r292 bei 0" C) zersetzt sich allmählich beim Lagern, längeres Arbeiten mit ihm ist gesundheitsschädlich, mit Luft gemischt bildet er ein brennbares, explosibles Gas, er ist besonders feuergefähr- lich, da sein Dampf sich an Metallflächen, welche über 150'^ heiß sind, entzündet. B,enzin (Petroleunibenzin) besteht aus einem Gemisch der bis 150" siedenden, als Nebenprodukt bei der Petroleuml)ereitung gewonnenen Kohlenwasserstoffe. Für die Untersuchung der Fette im Laboratorium dient der Teil, der sich vom Wasserbade a.bdestillieren läßt. Will man diesen selbst im Laboratorium gewinnen, so hat dies mit besonderer Vorsicht zu geschehen. Man hat darauf zu achten, daß sehr gut gekühlt wird, da die Dämpfe der zuerst übergehenden, sehr leicht siedenden Teile, mit Luft ge- mischt, sich selbst am Sicherheitsdrahtnetz, das das Wasserbad umgibt, entzünden können. Der Vorzug des Benzins ist seine geringe Löslichkeit in Wasser. Tetrachlorkohlenstoff (Siedepunkt 7675°C bei 760^/;;» Hg, spezifisches Gewicht bei 0'' bzw. auf Wasser von 4» 1-(3319). 100// Wasser lösen bei 0" 0-097 r/. bei 10" 0083 r/. bei 20" 0080 r/, bei 30° 0 085 //. Der Tetrachlorkohlenstoff ist schwer entzündbar und auch in Dampfform nicht explosiv. Er besitzt dasseli)e Lösnngsvermögen für Fette wie Benzin und Schwefelkohlenstoff und ist mit den gebräuchlichsten Lösungs- mitteln in jedem Verhältnisse mischliar. Er ist für die Gesundheit anscheinend nicht schädlicher als die anderen Extraktionsmittel. Für die Fettextraktion ist Anwendung von vollkommen reinem Chlorkohlenstoff nicht nötig, es genügt der käufliche. Beim Verdampfen von 50 r«r darf aber kein wäg- barer Rückstand hinterbleiben. Mit konzentrierter Schwefelsäure geschüttelt, soll sich eine Probe nicht gelb oder bräunlich färben (Abwesenheit fremder Halogenverbindungen), beim Schütteln mit Silbernitrat entstehe keine weißliche Trübung durch Chlorsilber, beim Schütteln mit Jodkalium färbe sich der Schwefelkohlenstoff nicht violett infolge Anwesenheit von Chlor. Gewinnung der Gesamtmenge der in Äther löslichen Bestandteile aus Organen. Für viele Fragen der Tier- und Pflanzenphysiologie ist es notwendig, die (iesamtmenge der in Äther, Petroläther usw. lösUchen Stoffe zu ge- winnen. Eine unmittelbare Extraktion mit den Fettlösungsmitteln ist im aUgemeinen nicht ratsam und bei tierischen Organen wegen ihres Wasser- gehaltes unmöglich. Will man die Organe trocknen, so hat dies im Vakuum (siehe Bd. I. S. 16.'] ) zu geschehen, nachdem mau sie in einer Fleischmühle fein zermahlen und in dünner Schicht ausgebreitet hat (vgl. das wohl der Verbesserung fähige Verfahren von A. Erlandsen, Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 51. S. 83 [1907J). Einfacher und meist vorzuziehen ist es, die zermahlenen tierischen Organe und die abgepreßten oder ausgequetschten Samen zuerst mit Alkoliol mehr- mals auszukochen, die ausgekochten Massen gut abzupressen und bei gehnder Temperatur (Anwendung eines Ventilators V) zu trocknen, dann in einer Mühle fein zu mahlen und im Soxhletapparat mit Petroläther völlig zu extrahieren. Der heiße Alkohol nimmt hierbei auiier Fetten auch Lezithine auf und andere Stoffe, die sich iu Alkohol sowie in Fetten und Lezithinen lösen. ^Nlan dampft den Alkohol im Vakuum (siehe Bd. I. S. 152) ab, soweit als dies möglich ist, und schüttelt die wässerig alkoholische Lösung mit Petrol- Untersuchung auf Fette. 201 i^cni' äther (sioho S. 246) aus. Emulsioiioii. die sich boiiii Scliüttelii bilden, sucht man (hirch Zusatz von Alkohol oder durch liolindes Krwärnien zu trennen. Anstatt zu schütteln, kann man auch kontiiuüerlich extrahieren. Zur kontinuierlichen Extraktion eines wässeri{.i-alkohohschen Extraktes mit Petroläther kann man den Apparat von Zdmanowitz'^) bemitzen (s. Bd. LS. 181). Für kleinere Mengen genügt ein Soxhletapparat '-' ) (s. Fig. 13). Man bringt auf seinen Boden Glasperlen, füllt die zu extrahierende Flüssigkeit ein, so daß ihre ( )berfläche etwa 1 oti unter der Uudiiegung des Hebers l)leibt, und stellt einen Trichter mit entsprechend langem Ful) in den Apparat. Der Petroläther, der im Kolben vom geschützten Wasser- bade aus verdampft, wird im Kühler kondensiert, fällt auf den Trichter und gelangt durch die zu extrahierende Flüssigkeit zu deren Oberfläche, um durch den Heber abzulaufen. Der Äther und Petroläther nehmen bei der Extraktion außer Fetten und Lezithin auch eine Reihe anderer Stoffe auf: aus einer Seifenlösung Seifen, aus F]xtrakten von Lebern und manchen Samen Dextrine , Zucker u. a. m. Es ist deswegen dui'chaus nötig, den F]xtrakt vor der weiteren Unter- suchung wiederholt mit Wasser bzw. verdünntem Alkohol zu schütteln, bis in diesem nichts mehr von den Verunreinigungen nachweisl)ar ist. Bevor mau den Peti'oläther oder Äther ab- destilliert, läßt uum den F.xtrakt eine Zeitlang stehen und gießt von ausgeschiedenen Wassertropfen durch ein trockenes Filter in einen trockenen Kolben ab. Bei leicht oxydierbaren Fetten verdunstet man das Lösungsmittel im trockenen Kohlensäure- oder Wasserstoffstrome. Aufbewahrung der Fette etc. Die Fette und ätherlöslichen Bestandteile der Organe, die man erst einige Zeit nach der Gewinnung ver- arbeiten will, sind sorgfältig zu trocknen und in luftdicht verschlossenen Gefäßen vor Licht geschützt aufzubewahren. p]nthalten die Fette (Pflanzenextrakte) Lipasen. so wird es sich vielleicht in manchen Fällen empfVhleu. die Fette zuvor in einer Atmosphäre von trockener Kohlensäure auf eine höhere Temperatur zu erhitzen. -10 cm. ...t Fig. 13. Extruktioiisapiiarat nach Himhl und SpH:. ') Über einen neuen Apparat zur P^xtraktion wässeriger Flüssigkeiten mittelst Äther, Ligroin usw. Biochem. Zeitschr. Bd. 1. S. 254 (1906). ^) M. Hönif) und G. Spitz, Untersuchung von Gemengen von uuverseifbarcm und verseifbarem Fett. Zeitschr. f. analyt. Cliem. Bd. 31. S. 477 {\m2). 202 F. Röhmann. Physikalische Untersuchungsmethoden der Fette, Wachse und der aus ihnen dargestellten Fettsäuregemische. 1. Spezifisches Gewicht. Die Bestimiiiuiii)- des spezifischen Gewichtes der Fette und der Fett- säuren geschieht für gewöhidich mittelst Pyknometer (s. Bd. I. S. 440). Für die Bestimmung- fester Fette empfiehlt JJhhelohde das beistehend abgebildete Pyknometer. Pyknometer von Vbbelohde}) Der Apparat (s. Fig. 14) besitzt bei 15" einen Inhalt von 10 c»i^ und wird mit Wasser von 15" gefüllt. Das Taragewicht ist gleich dem Gewichte des mit Wasser von 15" ge- füllten Apparates. Der Ansatz des Kapillar- röhrchens ist nahe dem Boden , damit die schwimmenden Fettstücke das Röhrchon nicht verstopfen. Y e r s u c li s a u s f ü h r u n g. ^la n fügt eine gewogene Menge m in Stücken geschnittenen Stoffs durch den Hals des mit Wasser von 15" gefüllten Pyknometers ein . setzt den Stopfen auf und ermittelt das Zusatzgewicht in^. mit welchem die Wage wieder einsteht. Dieses Zusatzgewicht plus dem (Gewicht m ergibt das Volumen T' des Fettes, folglich ist das spezifische Gewicht bei 15", bezogen auf Wasser von 15", für Stoffe leichter als Wasser m/m -\- ni^, für Stoffe schwerer als Wasser nilin — m,. 'Kag'eZkömer Fig. 14. Pyknometer nach Vbbelohde. Spezifische (lewichte einiger Fette.-) Fett Spezifisches Ge- wicht bei 100" C, bezogen auf Wasser von ] ö" Kakaobutter Palmöl Japanwachs Kokosnußöl Palmkern öl Schweinefett . • . . . Rinds- und Hammeltalg Butterfett 0-857 0-857 0-8755 0-873(J 0-8731 0-861 0-860 0-865—0-868 Fett Spezifisches Ge- wicht bei lö-SOC bezogen auf Wasser von l.j-ö" Olivenöl Rüböl Arachisöl Baumwollensamenöl Leinöl Rizinusöl 0-9168 0-9168 0-9209 0-9225 0-9325 0-9679 2. Schmelpunkt. Die Fette und auch die aus ihnen gewonnenen Fettsäuregemische haben keinen .scharfen Schmelzpunkt. Man bestimmt, so genau als dies *) Yerfertiger Dr. H. Gockel, Berlin, Luisenstraße 21. ") Siehe J. Leirkoirifsch , Chem. Technologie und Analyse der öle. Fette und Wachse. Braunschweig 1905. I. S. 186. Untersuchung auf Fette. 203 «gerade niöiilich ist, die Tciiipcratiu', hei dci' die Fcttf' zu sclinicl/cii ho- »iunen und die, bei welclier das Fett vöUij^ klar .geworden ist (,,Be<>iiiii" und ,.Eiid])uiilvt" des Schinelzens). Zur Bestiminung- des Scliincizpunktes sauj>t man das g-eschniolzene P>tt in eine an beiden Enden offene Kapillare von IJ-Forni, so dal» das Fett in beiden Schenkeln lileicli hoch steht. Man liilU bis zum foli-cnden Tai>e im Kühlen liefen. Dann befestiiit man die Ka])illare mittelst eines kleinen (iummi- rinijes am Thermometei', das mittelst locker schließenden Korkens in einem weiten rteaj>enzrohre befestii^t ist und erwärmt dieses laniisam im Wasseri)ade. Statt dessen kann man auch nach Bensemann so vei'fahren, daß man in eine Kapillare mit kuiielförmiiier Erweiterun,y (s. V\ix. löj das j^eschmolzene Fett einsauo-t und es seitlich erstarren hii'it. Das eine Fudc wird zui^eschmolzen, Am folüenden Tai^e befestitit man das Röhrcheii am Thermometer und taucht dieses in ein nicht zu kleines Becheri^las mit Wasser, das man langsam unter T'mrühren erwärmt. Bei einer bestimmten Tempei-atur fließt der Troi)fen herunter, bei einer höheren wird ei- klar. 3. Erstarrungspunkt. Als wahren Schmelzpunkt hat man auch bei den Fetten diejenige Temperatur zu bezeichnen, bei welcher Wärme latent und als Erstanirngs- punkt die höchste Temperatur, bei welcher die latente Wärme frei wird. \) Es müßte, wenn man ein festes Fett mit eingesetztem Thermometer langsam erwärmt, an einem bestimmten Punkt, während das Fett schmilzt, die Temperatur stehen l)leiben. Das ist aber bei den Fetten aus bestimmten (Gründen nicht der Fall. Der Schmelzpunkt läßt sich in dieser Weise meist nicht bestimmen. Dagegen ist bei den festeren Fetten der Erstar- v/( rungspunkt häufig gut festzustellen. Hat man ein Fett bzw. das aus ihm gew^onnene Fettsäuregemisch geschmolzen und läßt es abkühlen, so sinkt die Temperatur zuerst gleichmäßig. Dann ti-itt l)ei manchen Fetten ein Punkt ein, wo sie eine Zeit- lang unverändert bleibt, während sich feste Massen aus- scheiden, und sinkt dann weiter. Der Temperaturstand, bei dem die Temperatur im erstarrenden Gemisch konstant bleibt, ist der Erstarrungspunkt. Bei weicheren Fetten bzw^ deren Fettsäuren bleibt die Tempei'atur nicht an einem Punkte stehen. F]s verlangsamt sich, während sich die festen Massen ausscheiden, nui' die (ieschwindigkeit des Sinkens. Hier ist der Ei"starrungsi)unkt nicht genau zu i)estimmen. 9 Fiff. 15. Rölirclien zur Bostim- nuing des Schmelzpunktes von Fetten nach liense- iiinnn. ^) Fr. Rüdorf, Über die Bestimmung der Schmelz- und i'jstiirruugstemperatur der Fette und anderer Verbindungen. Pogcfendorffs Ann. [5. J Bd. 20. S. 420 (1870 ). 204 F. Rö hm au 11. In gesclimolzenen festen Fetten bzw. deren Fettsäuren sinkt beim Abkühlen die Temperatur zuerst dauernd und steigt dann bei einer gewissen Temperatur wieder an. Das Fett war unterkühlt. In diesem Fall ist das Maximum der Temperatur, welches wähiTud der Ausscheidung der festen Teile erreicht wird, der Erstarrungspunkt. Zur Bestimmung des Erstarrungspunktes verfährt man bei wissenschaftlichen Untersuchungen ähnlich wie liei einer (lefrierpunkts- bestimmung. Man liringt die gut getrockneten Fettsäuren in ein entsprechend Aveites Reagenzglas und schmilzt sie mit eingesetztem, in Zehntelgrade ge- teiltem Thermometer. Dieses Reagenzglas befestigt man mittelst eines Korkes in einem weiteren Rohre, auf dessen Boden sich einige Tropfen konzentrierter ISchwefelsäure befinden. Diese sollen das Beschlagen der Wände verhindern, wenn die Erstarrungstemperatur unterhalb der Zimmer- temperatur liegt. ^lan taucht nun den Apparat in ein nicht zu kleines Becherglas mit Wasser, dessen Temperatur etwa 10° C über dem Erstarrungs- punkte des Fettes liegt und beobachtet die Temperatur des Fettes, indem man sowohl dieses als auch Wasser des Becherglases wie bei einer Gefrier- punktbestimmung rührt und in gleichen Zeiträumen die Temperatur notiert. Bei der Untersuchung von Talg in der Technik benutzt man den Apparat von Finkencr. ^) 4. Lichtbrechungsvermögen. Die verschiedenen Fette und die aus ihnen gewonnenen Fettsäuren zeigen sehr verschiedene Brechungsexponenten. Die Bestimmung des Brechungsexponenten bildet deshalb eine sehr wesentliche Vorprobe bei der Untersuchung der Fette zum Zweck der Nahrungsmittelkontrolle und könnte wohl auch mehr als bisher bei biologischen Untersuchungen verwertet werden. Die Bestimmung geschieht im Fulfrichschen Refraktometer oder bei Butteruntersuchungen im refraktometer (siehe Bd. I. Butterrefraktometer S. 568 ff.). bzw. Ämagat- Jeans Oleo- Brechungsexponenten. '^) Fett Tem- peratur Brechiings- exponent Fett Tem- peratur Brechungs- exponent Olivenöl .... Rüböl Baumwollsamenöl Sesamöl .... Rizinusöl . . . Leinöl .... Dorschleberöl Eieröl Butterfett . . . 15« ri ■>■) )i ■n 11 „ 25» 60« 1-4698— 1-4716 1-4720—1-4757 1-4743-1-4752 1-4748—1-4762 1-4799 1-4835 1-4800-1-4852 1-4713 1-4480-1-4450 Kokosnußöl . . Palmkernöl . . Kakaobutter . . Mandelöl . . . Mohnöl . . . . Sonnenblumenöl Rimlstalg . . . Hammeltalg . . Schweinefett . . 60» 1-4410 1-4431 1-4496 1-4550 1.4586 1-4611 1-4510 1-4510 1-4539 *) Siehe G.Lehhin, Amtliche üntersuchungsmethodenfiir Chemiker. Berlinl907. S.72. ''} J. LeivTcowitsch, Chemische Technologie und Analyse der Öle, Fette und Wachse. I. S. 210. Braunschweig 1905. Untersuchuug auf Fette. 205 5. Drehungsvermögen. Ausführung- der Untersuchung siehe Bell. S. 583 ff. Die polarimetrische Untersuchung kann bei der Untersuchung der Fette und des Ätherextrakts der Organe mitunter sehr wesentliche Dienste leisten, da sich in den Fetten optisch aktive Substanzen, wie Lezithine, Cholesterin und Phytosterin auflösen und in Pflanzenextrakten auch optisch aktive Fettsäuren sowie deren Ester vorkommen. Meist zeigen die natürlich vorkommenden Fette und Öle nur eine sehr geringe Links- oder Uechts- drehung. ^) Es dreht im '2 Dezimeterrohr das Öl von Erdnuß .... + 4' 20" bis 27' 20" Croton . . + 9" 10' bis 9" 20* süßen Mandeln . — 2' m" Lein . . . — Ubis3' Hanf 6' 30" Oliven . . + 9' öO" Baumwollensamen 9' Rizinus . . +8' öO" Sesam . . +44'bisl"ö'. Allgemeine chemische Untersuchungsmethoden der Fette und Wachse. 1. SäurezahL Die Säurezahl gibt die Menge Kalihydrat in IMilligi'ammen an,. Avelche erforderlich ist, um 1 g von dem in Alkoholäther gelösten Fett für Phenolphtalein zu neutralisieren. Man wiegt das Fett in einem trockenen Erlenmei/crsdien Kölbchen genau ab, löst in einem neutralen Gemisch von 2 Teilen Äther und 1 Teil Alkohol und titriert untei- Anwendung von Phenolphtalein (P/oige alkoholische Lösung) mit zehntelnormaler, alkoho- lischer oder wässeriger Kalilauge. Die Titration ist beendet, wenn das Ge- misch während einiger Minuten rot bleibt. Bei längerem Stehen entfärbt sich die Lösung wieder. 2. Verseifungszahl (Köttstorf erzähl '). Die Verseifungszahl gibt die Anzahl Milligramme Kalihydrat an,, welche von 1 g Fett bei der Verseifung gebunden werden. Erforderlich sind für die Bestimmung: 1. eine titrierte, etwa halb- normale Salzsäure. Manche ziehen wegen einer angel)lich größeren Haltbar- keit eine Schwefelsäure vor. Der Titre wird in üblicher Weise mit Soda- lösung unter Anwendung von Methylorange- oder Lakmoidlösung bestimmt; 2. eine titrierte etwa halbnormale Kalilauge. Etwa 28^ Kalium hydricum werden in 30 — 40 cm^ Wasser gelöst und nach dem Abkühlen im Liter- ') Peter, Wirkung der Öle auf polarisiertes Licht. Chemikerzeituntr. Jg. 1887. Rep. S. 267; M. Rakusin, Über das optische Drehungsvermögen der Pflanzenfette. Chem. Zentralbl. 1905 II. S. 523. -) Neue Methode zur Untersuchung der Butter auf fremde Fette. Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 18. S. 199 (1879). 206 F. Röhmann. kolbeu mit reinem Alkohol auf 1 / aufgefüllt. Am folgendeu Tage gießt man die Lauge von etwa ausgeschiedener Kaliumkarbonatlüsung in die Vorratsflasche ab. Reinigung des Alkohols nach Waller. Man versetzt mehrere Liter Al- kohol mit so viel gepulvertem Kaliumpermanganat, daß die Flüssigkeit sich dunkelrot färbt. Das Maugansuperoxyd , das sich nach einiger Zeit abscheidet, wird durch ein Faltenfilter abfiltriert. Das Filtrat schüttelt man einige Zeit mit Calciumkarbonat und destilliert dann den Alkohol nach Zusatz einiger Bimssteinstückchen aus einem großen Kolben unter Anwendung eines Fraktionieraufsatzes (siehe Bd. I. S. 12.5 ff.) langsam ab. A'om Destillat kocht man in einem Reagenzglase vorsichtig etwa 10 cdi'-^ mit 1 c.»r' sirupöser Kalilauge. Die ersten Proben färben sich braun , dann gell), dann bleiben sie farblos. Tritt auch nach 20 — 30 Minuten keine Gelbfärbung ein, so destilliert man den Alkohol nunmehr in etwas schnellerem Tempo bis auf einen kleinen Rest ab. Auch die mit solchem Alkohol hergestellte Kalilauge kann sich beim Stehen allmälilich noch gelb färben. Wenn man dies vermeiden will, so rektifiziert man den nach Waller gereinigten Alkohol noch einmal über festes Kali- oder Natronhydrat oder benutzt von vorneherein •den käuflichen 997o'gen Alkohol. Zur Titrestellung der Kalilauge entnimmt man aus der Vor- ratsflasche mit der Pipette 25 cm^ , erhitzt auf kochendem Wasserbade zum schwachen Sieden, setzt etwa 25 cm^ destilliertes Wasser und etwas Phenolphtalein hinzu und bestimmt die zur Neutralisation erforderliche Menge Halbnormalsalzsäure. Der Titre der alkoholischen Kalilauge ändert sich mit der Zeit, muß also öfters kontrolliert werden. Die Bestimmung der Verseifungszahl geschieht in folgender Weise : Man wiegt in einem 150 — 200 cm'^ fassenden Erlenmeyerkölbchen aus Jenenser Glas 1'5 — 2 g des trockenen Fettes ab und läßt mit der bei der Titrestellung gebrauchten Pipette 25 au'-^ der alkoholischen Kali- lauge zufließen. In den Hals des Kolbens wird ein kleiner Trichter gesetzt oder er wird bei Fetten, die, wie z. B. Butter, flüchtige Ester enthalten, mit einem lUickflußkühler verbunden. Man stellt das Kölbchen auf ein zuvor angeheiztes Wasserbad und erhitzt unter häufigem Umschwenken eine V4 — V2 Stunde lang zum schwachen Sieden. Die Lösung muß völlig klar sein. Etwa herumschwimmende Öltröpfchen zeigen im allgemeinen an, daß die Verseifung noch nicht beendet ist. Ist zu viel Alkohol weggekocht, so setzt man eine entsprechende Menge reinen Alkohol hinzu, ver- dünnt mit 25 cni^ Wasser und titriert nach Zusatz von Phenolphtalein die überschüssige Menge Kalilauge mit Salz- oder Schwefelsäure. Der Unter- schied zwischen der bei der Titrestellung und der nach der Verseifung verbrauchten Menge Salzsäure entspricht der Menge Kalilauge, die bei der Verseifung gebunden wurde. Man berechnet aus ihr die Anzahl Milligramme KOH und bezieht sie auf 1 (j des angCAvendeten Fettes. Bei der Titrierung von dunklen Fetten kann man zuweilen mit Erfolg statt Phenolphtalein als Indikator Alkaliblau (Farbwerke vorm. Meister Lucius & Brüning) benutzen. 2 g des Farbstoffes werden in 100 ci?i^ dO'y„\gem Alkohol gelöst und mit ver- dünnter Kalilauge bis zum Verschwinden der blauen Farbe versetzt. Je nach der Fär- bung des Fettes werden mehr oder weniger dieser ludikatorlösung zu der verseiften Lösung gesetzt.') >) Benedikt-Cher, Chemie d. Fette. Berlin 18')7. S. 133. Untersiichiiiig auf Fette. 207 Verseifuniiszalilcii v(»ii Trii^lv/critlcn. Acotin Hiityriii Valoriu Caproiii ("apivlin Capiiii Laiiiiii Myristin l'alniitin Stearin Olciii Erucin < )leo - palniito-stearin Oleodipalmitiii . . . Oloo-disteariii .... Stoaro-dipaliuitiii . . ralmito-disteariii . . Fonnol Mol,, kiilar Ijuwiclit C3 IK (OC, II, 0)3 C, II, (()(•, II, 0)3 C3lI,(()C, II„ 0), (',11, {()(•, n„o)3 (',H,(0(; II,, 0)3 (3lI,(0C,„II„0)3 (•3H,(OC,,II,3 0)3 (•3 II, (0(\, II... 0)3 Cj II, (ÜC,„ II3, U)3 C3H, (0(\3H3,0)3 C3H3(0C,3H33 0)3 C3H3(0C.,,II„0)3 (■3 IL (()(• „ H3, 0) . ((X\, II3, 0) . (OC,« H33 ()) C3 H, (OC,, H3, Ol (OC,« H33 0) ('3lI,(Or„H3,0),(OC„IL3()) C3H5(()C',,Il3,0).,(UC„Il3, ü) C3lI,(OC„Il3, 0) (0C„H3,0), ViTnei- J zahl ^'('^^('ifllng•sz;llllt•ll 1 218 1 7720 1 302 557-3 344 489-2 386 4361 470 3581 554 303-7 638 263-8 722 283-1 806 208-8 890 1891 884 190-4 1052 1600 8f)0 195-7 832 2023 888 189-5 834 201-8 862 195-2 \()ii Kstcril au.^ liocli molckiila ith uihI lioclnnolekula rcii Säincii. .Mkolinlon Ester Cetylpalmitat . . Octadecylpalmitat Cerylpalinitat . . Myricylpalinitat (My- ricin) ("etylstearat .... ("erylcoiotat .... Cliolesteriupalniitat ( linlcstoriiistearat . rliolcstcniioleat . . Formel t.6 H33 0 <^'.B H3, 0 C,«H3, 0 a« 11,30 . C„ll3. U C,e H3, O C..6H,3 0 ^'sfl ^43 0 (•„,113,0 c,,ii„o <',H 11.3 0 Molu Vcrsei- kiilar- fiings- gowicht _ EObl 480 1169 508 110-4 620 90-5 676 830 508 110 4 760 73-8 610 92-0 638 879 636 88-2 I)i(' X'cr^citiiiiüszalilcii .^^iiid. wie die Tahcllcii zci.ut'ii. in liolicm MaTic ahliiiiiLjiii von der /iisaiiiiiKMisotzniii;- dos Fottos. Für die Triirlv/cridi'. wrlclic als ciii/iLji' Säuren Palinitin-. Stearin- und ( »Isäure enthalten, lieirt die Verscifuniz-.szahl zwisclicn 1,^9-.') und 204-.".. Ist die Verseifunir.szalil LM-ülipr. so sind diesen TriLilyzeriden Säuren mit kleinerem Molekularirewiclit bzw. deren (dyzeride (oder l-lstiT niedriucrei- .Mkoliole) lieiLicineuiif. Ist sie kleiner, so entlialten die Fette l)z\v. Wachse hochmolekulari» .\lk(di(>le oiler dt-ren Ester. 208 F- Röhmanu. Bestimmt man die Verseifuni>szahl in der angegebenen Weise, so enthält sie neben der bei der Verseifung gebundenen Menge Kalihydrat auch die Menge Kalihydrat, die von etwaigen in den Fetten vorhandenen freien Fettsäuren gebunden wird. Will mau dies zum Ausdruck bringen, so subtrahiert mau von der Verseifungszahl die Säui'ezahl (siehe S. 20ö) und bezeichnet die Differenz als „Ätherzahl" oder ..Esterzahl". Bei der Piestimmuug der Verseifungszahl von Organextrakten, bei der Untersuchung der Extrakte des Kots u. a. ist auch der Oehalt an Lezithin zu berücksichtigen. Das Lezithin zerfällt beim Kochen mit alkohohscher Kalilauge zunächst in glyzerinphosphorsaures Kalium, C'holin und Kaliseifen: ()P()_()_Cl3H,.N (CH3)3()H + ^ ^^ ■'" "- ^' ^' ( )P( ), K., ^ \/ jTT Glyzerinphosphorsaures Kalium Lezithin Ci6H3i(),K + Ci8H,30.,K + 1I().UH,.X(CH3)3()H Palmitinsaures Stearinsaures Cholin Kali Kalium und das Chohn bei längerem Kochen anscheinend in Glykol und Trimethylamin. Es würden hiernach von einem Molekül Lezithin (Mol- Gew. 749) 4 Moleküle Kalihydrat gebunden werden, die Verseifungszahl wäre 299. Ein Gemisch von Fett und Lezithin müßte also eine höhere Verseifungszahl haben als Fett allein. Ist diesem Gemisch aber noch Cholesterin beigemischt, wie z. !>. in der Leber, so wird die Verseifungs- zahl wieder herabgedrückt. In der Tat wurden von I". Nukada iiiv die Verseifungszahl der im Petroläther löslichen Bestandteile von Rinds-, I*ferde- und Hammelleber trotz der Anwesenheit erheblicher Mengen von Lezithin nur Werte von 192 — 197 gefunden.') 3. JodzahL Die Jodzahl gibt die Menge des Jods an, die in Gegenwart von Quecksilberchlorid aus einer alkoholischen Jodlösung bei Zimmertemperatur von einem Fette aufgenommen wird. Sie ist ein Maß für die Menge der in einem Fette enthaltenen ungesättigten Verbindungen (Ölsäure. Linol- säure, Linolensäure, Cholesterin u. a.). Zur Bestimmung sind erforderlich: 1. Jodlösung nach v. HühL Man löst 25// Jod und ;\0g Quecksilber- chlorid je in öOO ciu^ 957nii^t'iu reinen Alkohol. Die Quecksilberlösuug wird, wenn nötig, filtriert. 24 Stunden vor dem Gebrauch werden gleiche Teile beider Lösungen gemischt, da besonders in der ersten Zeit nach der Mischung der Jodgehalt schnell abnimmt. Eine weit beständigere Jodlösung erhält *) Zur Kenntnis der tierischen Fette und des Petrolätherextraktes der Leber. Biochem. Zeitschr. Bd. 14. S. 426 (l'J08). Untersuchung auf Fette. 209 man nach Waller^), wenn man zu je 1 Z der Mischflüssigkeit 50 cm^ konzentrierte Salzsäure vom spez. Gew. ri9 hinzusetzt. 2. N a t r i u m t h i 0 s u 1 £ a 1 1 ö s u n g : etwa 20 (/ Na.2 S, ( )5 + öHg 0 (MoL- Gew. 248-3) im Liter. Zur Titrestellung löst man 16254 (/ reinstes Kaliumbijodat in Wasser und füllt auf 500 c«/^ auf. Dann bringt man 1 — 2 g reines Jodkalium in ein Becherglas, löst es in möglichst wenig Wasser, fügt 5 cm^ Salzsäure (1 : 5) hinzu und iiierauf 20 cm^ der Kaliumbijodatlösung. Es scheiden sich 20 X 12'68 wr/ Jod ab. Man verdünnt mit etwa 200 ciii^ Wasser und läßt unter Umrühren aus der Bürette Xatriumthiosulfat- lösung zufließen, bis die Lösung nur noch schwach gelb gefärbt ist, setzt jetzt etwas Stärkelösung hinzu und läßt weiter vorsichtig Thiosulfatlösimg eintropfen, bis die Blau- färbung verschwindet. Man erfährt so die Anzahl Kubikzentimeter Natriumthiosulfat- lösung, die erforderlich sind, um 0"2536 ff Jod zu reduzieren und berechnet hieraus den Titre für 1 ctn^ der Thiosulfatlösung. 3. Chloroform. 4. lO^oige Jodkaliumlösung. 5. Stärkelösung-, 0'5'7oig, am einfachsten durch Erhitzen von ..löslicher Stärke" in destilliertem Wasser. Ausführung der Bestimmung. Man bringt von trocknenden Ölen etwa 0'15 — 0*18 ^, von nicht trocknenden O'o — 0"4^, von festen Fetten 0'8— l'O^ in ein etwa 2'/2 — 3 cm hohes, an einem Ende geschlossenes Röhrchen von 1 — -V/^ cm Durchmesser, das in einem Wiegegiä sehen leer gewogen wurde und megt in demselben Wiegegläschen das Gläschen mit dem Fette. Dann läßt man das ßöhrchen mit dem Fette in eine 500 — 800 c/w» fassende, mit gut eingeriebenem Glasstopfen versehene Flasche gleiten und löst das Fett in 10 cm^ Chloroform. Nun bringt man mittelst der bei der Titrestellung benutzten Pipette 25 cm^ Jodlösuug in die Flasche, indem man die Pipette in demselben langsamen Zeitmaß wie bei der Titrestellung aus- und am Ende dieselbe Anzahl Tropfen nachfheßen läßt. Sollte die Flüssigkeit nach dem Um- schwenken nicht völlig klar sein, so Arird noch etwas Chloroform hinzu- gefügt. Tritt binnen kurzer Zeit fast vollständige Entfärbung der Flüssigkeit ein, so werden weitere 25 cm^ der Jodlösung hinzugegeben. Die Jodmenge muß so groß sein, daß noch nach IV2 — 2 Stunden die Flüssigkeit stark braun erscheint. Mindestens löO^/o Jod, bezogen auf die verbrauchte Menge, sollen im Überschuß bleiben. 2) Nach 2 Stunden ist die Reaktion bei Anwendung der v. Hühhchon Lösung meist beendet; der Sicherheit halber läßt man aber das Gemisch noch Aveitere 4 Stunden stehen. Nach dieser Zeit versetzt man mit 15 — 20 crn^ Jodkahumlösung, schAvenkt um und fügt 300 — bOOcm^ Wasser hinzu. Scheidet sich dabei ein roter Nieder- schlag von Quecksilberjodid aus, so war die zugesetzte Jodkaliummenge ^) il'ber die Hübhchos Chlorjodadditionsmethode und Vorschläge zu deren Ver- besserung. Chemikerzeitung. Jg. 1895. S. 1786 u. 1831. '^) E. Richter, Untersuchungen über die Maiiniene?,c\iQ Probe und die Jodzahlen einiger Öle. Chem. Zentralblatt. 1907. 11. S. 1935. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden, ü. 14 210 F. Röhmann. ungenügend. Man löst den Niederschlag, indem man unter kräftigem Schütteln eine weitere Menge Jodkalium zusetzt. Man läßt nun unter Umschwenken und zeitweihgem Schütteln so lange Hyposulfitlösung zu- fheßen, bis die wässerige Flüssigkeit nur noch ganz schwach gelb erscheint. Dann setzt man Stärkeldeister hinzu und weiter tropfenweise Hyposulfit- lösung bis zum Verschwinden der Blaufärbung. Neben dieser Bestimmung stellt man einen blinden Versuch ohne Fett an. Aus der Differenz der bei beiden gebrauchten Natriundiyposulfitlösung berechnet man die Menge Jod und bezieht sie auf 100 Teile Fett. Wys ^) empfiehlt an Stelle der Hüblschen Lösung das folgende Gemisch. Man löst 9'4 g Jodtrichlorid und 72 // Jod auf dem Wasserbade getrennt in Qb^j^igev Essig- säure. Die Lösungen werden alsdann in einen Literkolben gegossen und mit Essig- säure bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist auch nach den Erfahrungen von Lewkotvitscli , der Eisessig empfiehlt, haltbar. Man verwendet sie wie die Hübhche Lösung, doch braucht man vor dem Titrieren nur 10 ci»^ 10" „iger Jodkaliumlösung zu- zusetzen. Das Fett löst man anstatt in Chloroform in Chlorkohlenstoff. Diese ebenso wie der Eisessig dürfen sich mit Kaliumbichromat und Schwefelsäure nicht grün färben. Die Einwirkungsdauer ist eine viel kürzere als bei der Hübhchen und Wallerschen Lösung. Es genügen für nicht trocknende Öle 10 Minuten bis ' ., Stunde, bei trocknenden Ölen eine bis höchstens zwei Stunden. Die mit der Tl7/5schen Lösung erhaltenen Zahlen fallen aber in manchen Fällen, besonders bei Anwesenheit von Cholesterin, bedeutend höher aus als die Zahlen nach v. Hi'ibl. Der Überschuß an Jod, der unverbraucht bleibt, soll nicht mehr als 2407o ^'^"^ ^^'^' verbrauchten Menge betragen. In derselben Weise wie bei den Fetten läßt sich die Jodzahl der Fettsäuren und des Cholesterins bestimmen. Das Verhalten der Lezithine scheint noch nicht untersucht zu sein. Jodzahl berechnet für Säure für Triglyzerid Ölsäure Cjg Hg, 0, 90-07 86-20 Erucasäure C», H^^ 0, 75-15 72-43 Linolsäure Cjs H3, 0, 18142 173-58 Linolensäure Cjg H3Ö 0,' 27410 26215 Ricinolsäure C^a H34 O3 8523 8176 Cholesterin C„ H^^ (OH) 65-8 4. Bestimmung der Menge der flüchtigen, in Wasser löslichen und der in Wasser unlöslichen Fettsäuren. Von Art und Menge der in einem Fette bzw. Organextrakte ent- haltenen Fettsäuren kann man sich in verschiedener Weise eine ^'orstellung zu verschaffen suchen. Zur Prüfung auf flüchtige Fettsäuren verseift mau die Fette, übersäuert mit Schwefelsäure, destilliert und titriert das Destillat. Hierbei kann man sich darauf beschränken, aus einer bestimmten Menge Fett unter gleichen Bedingungen stets nur eine bestimmte Menge abzudestillieren (Verfahren von Reichert und Meissl), oder man ersetzt das abdestiUierte ^) J. J. A. Wys, Zur Jodadditionsmethode. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 31. S. 750 (1898). Untersuchung auf Fette. 211 Wasser und sucht die Gesamtmenge der flüchtigen Säuren durch Destilla- tion zu gewinnen. Oder man verseift eine bestimmte Menge Fett mit einei- liestimmten Menge Kalilauge, setzt durch die, dem angewandten Alkali genau ent- sprechende Menge Salz- oder Schwefelsäure sämtliche Fettsäuren in Freiheit und bestimmt entweder die in Wasser unlöshchen Fettsäuren durch Wägung (Hehnerzahl) oder Titration, oder man bestimmt im Filtrat der festen Fettsäuren die in Wasser löslichen Fettsäuren durch Titrieren. Destilliert man dieses Filtrat, so erhält man im Destillat die flüchtigen, in Wasser löslichen Fettsäuren. a) Reichert-Meisslsche Zahl. Die Reichert-Ileissische Zahl gibt die Anzahl Kubikzentimeter Zehntelnormallauge an, welche zur Neutrahsation der aus ö^ Fett nach dem Belchertschen Destillationsverfahren erhältlichen, mit Wasserdämpfen flüchtigen Fettsäuren erforderhch sind. Zur Bestimmung der i?eirA^'r^Jl/ms/schen Zahl werden b g Fett in einem Kölbchen von 200 — ooO cm^ Inhalt abgewogen. Das Kölbchen wird auf das kochende Wasserbad gestellt. Zu dem geschmolzenen Fette läßt man aus einer Pipette unter Vermeidung des Einblasens 10 cm^ einer alko- holischen Kalilauge (20/7 Kaliumhydroxyd in 100 cm^ Alkohol von 70 Volum- prozent gelöst) fließen. Während man nun den Kolbeninhalt durch Schütteln öfter zerteilt, läßt man den Alkohol zum größten Teil weggehen; es tritt bald Schaumbildung ein, die Verseifung geht zu Ende und die Seife wird zähflüssig; sodann bläst man so lange in Zwischenräumen von etwa je 1/2 Minute mit einem Handblasebalg unter gleichzeitiger schüttelnder Be- wegung des Kolbens Luft ein, bis durch den Geruch kein Alkohol mehr wahrzunehmen ist. Man läßt nun sofort 100 c>;< 3 Wasser zufUeßen und er- wärmt den Kolbeninhalt noch mäßig einige Zeit, während welcher der Kolben lose bedeckt auf dem Wasserbade stehen bleibt, bis die Seife voll- kommen klar gelöst ist. Zu der etwa 50" C warmen Lösung fügt man sofort 40 cin^ ver- dünnte Schwefelsäure (1 Eaumteil konzentrierte Schwefelsäure auf 10 Pvaum- teile Wasser) und einige erbsengroße Dimssteinstückchen. Der auf ein doppeltes Drahtnetz gesetzte Kolben wird darauf mittelst eines gebogenen Glasrohres (von 20 cm Höhe und 6 mm lichter Weite), welches an beiden Enden stark abgeschrägt ist, mit einem Kühler (Länge des vom Wasser umspülten Teiles nicht unter 50 cm) verbunden und sodann werden genau 110 0/^3 in ein kubiziertes Kölbchen abdestilliert (Destillationsdauer nicht über 1/2 Stunde). Das Destillat mischt man durch Schütteln und filtriert durch ein trockenes Filter in ein anderes Kölbchen mit :\Iarke 100 cm^ ab. Diese werden nach Zusatz von 3—4 Tropfen Phenolphtaleinlösung mit Zehntelnormal- Alkalilauge titriert. Bei jeder Versuchsreihe führt man einen blinden Versuch aus, indem man 10 cm^ der alkoholischen Kahlauge mit soviel verdünnter Schwefelsäure versetzt, daß ungefähr eine gleiche Menge 14* 212 F. Röhmann. Kali wie bei der Verseifung von 5 g Fett ungebunden bleibt und sonst wie bei dem Hauptversuche verfährt. Die bei dem blinden A'ersuche verbrauchten Kubikzentimeter Zehntelnormal-Alkalilauge werden von den bei dem Haupt- versuche verbrauchten abgezogen. Die so erhaltene Zahl ist die Reichert- 3Ieisshch.e Zalil.^) Bei der technischen Untersuchung von Fetten verwendet man neuer- dings meist das Verfahren von Leffmann-Beam.^) Verfahren von Leffmann-Beam. b g Fett werden in einem 300 c;»^ fassen- den Erlenmeyerkolben mit 20g Glyzerin vom spez. Gew. 1-26 und 2 c;w* Natronlauge (er- halten durch Auflösen von 100 // Ätznatron in 100 cw^ Wasser) unter beständigem Um- schwenken über einer kleinen Flamme vorsichtig erhitzt. Die Mischung gerät alsbald in Sieden, das mit starkem Schäumen verbunden ist. Nach dem Verdampfen des Wassers^ wozu in der Regel 3—8 Minuten langes Erhitzen erforderlich ist, tritt völlige Klärung der Flüssigkeit ein. Dies ist das Zeichen, daß die Verseifung beendet ist. Man läßt auf etwa 80" abkühlen und setzt 90 cm" Wasser von 80—90" hinzu. Aus der so erhaltenen^ nötigenfalls durcli einiges Erwärmen auf dem Wasserbade geklärten Seifcnlösung scheidet man durch Zusatz von bOcm' verdünnter Schwefelsäure (2b g konzentrierte Schwefel- säure in 1 Z Wasser) die Fettsäuren ab und destilliert wie oben nach Beichert-Meissl. h) Bestimmung der Gesamtmenge der flüchtigen in Wasser löslichen und der in Wasser unlöslichen Fettsäuren. 1. Bestimmung der in Wasser löslichen Fettsäuren. Man verfährt zunächst so A\ie bei der Bestimmung der Verseifungs- zahl, d. h. man bringt 1-5 — 2g des Fettes in einen Erlenmegetschen Kolben und verseift mit 25 om^ fjgj. halbnormalen alkohohschen Kalilauge, setzt Phenolphtalein zu und läßt aus einer Bürette genau soviel Salzsäure zufließen, daß die Flüssigkeit für Phenolphtalein neutral reagiert. Man dampft nun auf dem Wasserbade den Alkohol vollkommen ab und löst die Seife in etwa 40 crn^ Wasser. Zu dieser Seifenlösung wird eine weitere Menge von Salzsäure gesetzt, w'elche genau der bei der Verseifung gebundenen Menge Kalihydrat entspricht. Um nun die hierdurch in Freiheit gesetzten Fett- säuren, soweit sie in Wasser unlöshch sind, zur Abscheidung zu bringen, wird der Kolben mit einem Korken verschlossen, in dessen Bohrung ein U-förmiges, mit Wasser gefiültes Piohr steckt und auf dem Wasserbade vorsichtig erw^ärmt , bis sich die unlöslichen Fettsäuren an der Oberfläche angesammelt haben. Dann läßt man erkalten, filtriert durch ein nasses Filter und wäscht mit Wasser, bis dieses empfindliches blaues Lackmus- papier nicht mehr rötet, wozu etwa 100 an^ erforderlich sind. Zum Filtrat wird die im U-Bohr befindliche Flüssigkeit gegeben. Dann werden Filtrat und Waschwasser mit Phenolphtalein versetzt und mit ZehntelnormaUauge titriert. Die verbrauchten Milliüramme Kalihvdrat sind das Maß für die in der angewendeten Menge enthaltenen löslichen Fettsäuren. Berechnet man die Menge auf 1 g Fett und zieht die gefundene Zahl von der Ver- *) G. Lebbin, Amtliche üntersuchungsmethoden für Chemiker. Berlin 1907. S. 33. 2) Chem.-Ztg. Jg. 1896. S. 607. — L. rbbclohdc, Handb. d. Chemie u. Tcchnol. d. Öle u. Fette. Leipzig 1908. S. 220. Untersuchung auf Fette. 213 seifuniiszahl ab, so erhält man den Ausdruck für die Azidität der in Wasser unlöslichen Fettsäuren. 2. Um die Menge der mit Wasserdämpfen flüchtigen Fett- säuren zu bestimmen, werden 1-5 — 2g des Fettes mit 2h cm^ halbnormaler alkoholischer Kalilauge verseift. ^lan neutralisiert unter Anwendung von Phenolphtalein mit verdünnter Schwefelsäure, entfernt den Alkohol durch ^'erdunsten und bringt die Seife mit Wasser in ein Erlenmeyerkölbchen von etwa hOQ cm^ Inhalt. Dann werden 90 cm^ lO^ige Schwefelsäure und einige Stückchen Bimsstein zugefügt. Der so beschickte Kolben wird mit einem doppelt durchbohrten Gummistopfen verschlossen, durch dessen eine Bohrung der Fub eines Tropftrichters, durch dessen andere ein entsprechend gebogenes Rohr geht, das in seinem aufsteigenden Schenkel eine Schutz- kugel (siehe Kjeldahlbestimmung) hat und zur Verbindung mit dem ab- steigenden i^eft^^schen Kühler dient. Der Kolben wird auf dem Drahtnetz erhitzt. Nachdem 100 cm^ abdestiUiert sind, werden durch den Tropftrichter 50 cm^ Wasser zugefügt bOcyii^ abdestilliert, wieder bO cm'^ zugefügt usf., bis ein Tropfen des Destillats blaues Lackmuspapier nicht mehr rötet. Die gesamten Filtrate werden vereinigt, gemessen, durch ein trockenes Filter filtriert und unter Anwendung von Phenolphtalein titriert. Dampft man das neutralisierte Destillat in einem gewogenen (iefäß zur Trockne, so läßt sich aus dem Gewicht des Trockenrückstandes und der Menge des zm' Neutralisation gebrauchten ^Ukalis das mittlere Molekulargewicht der flüchtigen Fettsäuren i) berechnen. 5. Bestimmung der Menge der in Wasser unlöslichen Fettsäuren. Das Fett wird in einem Bechergläschen zusammen mit einem Glas- stabe gewogen. Von dem Öl oder dem durch Erwärmen verflüssigten Fett werden ?> — 4 g in einer PorzeUanschale von 10 an Durchmesser abgegossen. Das genaue Gewicht wird durch Zurückwiegen des Becherglases ermittelt. Das Fett in der PorzeUanschale \\ird mit 1 bis 2 g Kalihydrat und 50 cm^ Alkohol versetzt und unter öfterem Umrühren auf dem Wasserbad er- wärmt, bis das Fett vollständig verseift ist. Die Seifenlösung Avird bis zur Sirupdicke verdampft, der Rückstand in 100 bis 150 cm^ Wasser gelöst und mit Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert. Man erhitzt, bis sich die Fettsäuren als klares Öl an der Oberfläche angesammelt haben und filtiiert durch ein vorher liei 100'' getrocknetes und im geschlossenen Wiegegläschen gewogenes Filter aus sehr dichtem Papier. Um ein trübes l)urchlaufen der Flüssigkeit zu vermeiden, füllt man das Filter zunächst zur Hälfte mit heißem Wasser an und gießt erst dann die Flüssigkeit mit den Fettsäuren darauf. ]\fan wäscht mit siedendem Wasser, bis blaues Lackmuspapier vom Filtrat nicht mehr gerötet wird, wol)ei man stets dafür sorgt, daß das Filter nicht vollständig abläuft. Nach dem Auswaschen wird der Trichter *) Vgl. K. Farnsteiner, Chem. Revue über die Fett- und liarzindustrie. 1898. Heft 10. 214 F. Röhmanii. mit dem Filter in ein mit kaltem Wasser gefülltes Becherglas gestellt, so daß (wenn möglicli) die Fettsäm^en auf der Flüssigkeit schwimmend erstarren. Hierauf läßt man das Wasser vorsichtig ablaufen, bringt das Filter mit den Fettsäuren in das Wiegegläschen zurück, trocknet bei 100" C erst 2 Stunden, wiegt und trocknet noch weitere 1 — 2 Stunden. Das Gewicht, auf 100^ Fett bezogen, ist die Hehner^c\ie Zahl. Löst man das Fett unter Erwärmen iii Alkohol und titriert es nach Zusatz von Phenolphtalein mit Halbnormalkalilauge bis zur bleibenden Rotfärbung, so kann man durch Vergleich mit der Verseifungszahl feststellen, wieviel sich von den Säuren des Fettes in Wasser gelöst haben. Wenn man vor der Titrierung gewogen hat, so kann man aus der gefundenen Azidität auch erkennen, ob das Gemisch wesenthch aus den gewöhnlichen höheren Fettsäuren besteht oder ob ihnen noch andere neutrale Stoffe, besonders hochmolekulare Alkohole, 0.xyfettsäuren u. a. beigemengt sind. 6. Acetylzahl. Die Acetylzahl der Fette gibt die Anzahl von Milligrammen Kalihydrat an, die erforderlich ist, um die Menge Essigsäure zu neutralisieren, welche bei der Yerseifung eines Grammes des acetylierten Fettes abgespalten wird. Sie ist ein Maß für die in einem Fette in freiem Zustande vorhandenen Hydroxylgruppen, die sowohl in Oxysäuren wie in hochmolekularen Alkoholen enthalten sein können. Wie die Fette so kann man auch das aus ihnen durch Verseifung gewonnene Fettsäuregemisch acetylieren und seine Acetylzahl bestimmen. Ein Vergleich der Acetylzahl der Fette und der aus ihnen gewonnenen Fettsäuregemische gibt einen Hinweis auf die Menge der Hydroxylgruppen, \velche in Oxysäuren oder Alkoholen in dem Fette frei und gebunden ent- halten sind. 1) Störend kann bei der Bestimmung der Acetylzahl von Fetten ihr Gehalt an flüchtigen Fettsäuren sein, welcher, Avenn die Fettsäuren in wasserunlöslichen Verbindungen enthalten sind, die Acetylzahl zu hoch er- scheinen läßt. Die Bestimmung der Acetylzahl wurde zuerst von Benedikt empfohlen und wird nach Lewhowitsch in folgender Weise ausgeführt. Bestimmung der Acetylzahl: hg des Fettes bzw. des Fett- säuregemisches werden mit 5 // doppeltgeschmolzenem essigsauren Natrium und 15 — 20.9 Essigsäureanhydrid in einem Erlenmeyerkölbchen mit ein- gesetztem kleinen Trichter oder am Rückflußkühler eine halbe bis zwei Stunden lang zum schwachen Sieden erhitzt. Dann gießt man das Produkt in ein Becherglas mit Wasser und erhitzt bis nahe zum Sieden. Sollte sich hierbei, A\ie dies bei Gegenwart von Lezithin der Fall ist, das acetylierte Produkt nicht gut abscheiden, so erhitzt man nach Zusatz von etwas Koch- salz im Kohlensäurestrom, ij Das abgeschiedene Öl gießt man durch ein *) Y. Ntikada, Zur Kenntnis des tierischen Fette und des Petrolätherextraktes der Leber. Biochem. Zeitschr. Bd. 14. S. 419 (lüOS). . . Untersuch Uli o- auf Fette. 215 nasses Filter und wäscht mit warmem Wasser. [Verarbeitet man größere Mengen Fett, so erhitzt man im Kohlensäm-estrom und entfernt die unter der Ölschicht befindliche saure Flüssigkeit mittelst Hebers.] Das gewaschene Öl löst man in Äther, schüttelt zur Entfernung etwaiger Reste von Essig- säure noch einige Male mit Wasser und läßt die ätherische Flüssigkeit durch ein trockenes Filter in ein gewogenes Kölbchen fließen, aus dem man den Äther abdestiUiert. Den Rückstand trocknet man im Leuchtgas- strome. Aus dem Kölbchen bringt man eine Probe von 1-5 — 2 g in ein anderes Kölbchen, wägt das erste Kölbchen zmiick und bestimmt in der abgenommenen Probe 1. die Azidität nach S. 205, 2. die Verseifungs- zahl (Ätherzahl) nach S. 205, M die Menge der löslichen Fettsäuren nach 4, bi — Lewkowitschs „Filtrationsverfahren" — oder nach bg — „Destilla- tionsverfahren" — . Die nach ersterem erhaltenen Werte sind etwas höher als die nach letzterem gewonnenen. ^) Die Azidität des Filtrats bezw. De- stillats, ausgedrückt in Milligrammen Kalihydrat und bezogen auf 1 (/ Fett, ist die Acetylzahl. Acetvlzahlen. Acetat des Formel Molekular- gewicht Acetylzahl Cetylalkohols . . . Octadecylalkohols Cerylalkohols . . . Myricylalkohols . Cholesterins . . . . Glyzerins C, H33 0 . C, Hg 0 Cjg H37 0 . Cg Hg 0 C,g Hjg 0 . Cj Hg 0 c;h,,o.c,H3 0 CH.sO.CHgO C3H3(O.C,H3 0)3 284 312 424 480 428 218 197-5 179-8 132-3 1169 130-8 772-0 7. Bestimmung des Glyzerins. Eine Bestimmung des Glyzerins ist notwendig, wenn man erfahren will, wie weit ein fettähnliches Gemisch aus echtem Fett besteht. a) Bestimmung des Glyzerins durch Oxydation mit Permanganat. 1 Molekül Glyzerin liefert genau 1 Molekül Oxalsäure und 1 Molekül Kohlensäure, wenn man es in stark alkalischer Lösung mit Permanganat oxydiert: C3 Hg O3 + 3O2 r= C2H2O, + CO, + '^R^O. Dieses Verfahren kann man zur Bestimmung des Glyzerins benutzen, wenn bei der Verseifung des Fettes neben dem Glyzerin keine anderen in Wasser löshchen Stoffe entstehen, welche unter den erwähnten Bedin- gungen Oxalsäure liefern. Verfahren von Bcncdikt-Zsigmondy in der Modifikation von C. Mangold."-) 2 — -lg des Fettes werden mit Kalilauge und reinem *) Y. Nuhada, a. a. 0. '-) Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 31. S. 718 (1892). 216 F. Röhmann. Methylalkohol verseift. Der Methylalkohol wird verdunstet, die Seife in heißem Wasser gelöst und unter Erwärmen mit verdünnter Salzsäure zer- setzt. Erwartet man, daß die Fettsäuren beim Abkühlen flüssig bleiben, so setzt man ihnen etwas Paraffin hinzu. Man läßt erkalten, filtriert in einen Literkolben und wäscht die Seifen sorgfältig. Zu dem Filtrat, das bei einem Gehalt von 0'2 — O'-ig Glyzerin etwa 300 cm^ betragen soll, setzt man 10^ Kalihydi'at und in der Kälte unter Schütteln soviel einer ö^/oigen Permanganatlösung, als der lYgf'^chen Menge der nach der Theorie für die Oxydation des Glyzerins nötigen Menge (6"87 Teile Kaliumperman- ganat auf 1 Teil Glyzerin) entspricht. Man läßt alsdann eine halbe Stunde lang bei gewöhnhcher Temperatur stehen und setzt unter Vermeidung eines größeren Überschusses Wasserstoffsuperoxydlösimg zu, bis die Flüssigkeit über dem Niederschlag farblos geworden ist. Alsdann füllt man auf 1000 ow^ auf, schüttelt um und filtriert 500 cm^ durch ein trockenes Filter. Das Filtrat mrd eine halbe Stunde lang erhitzt, um alles Wasserstoffsuperoxyd zu zerstören. Man kühlt dann auf 60^ ab, säuert mit Schwefelsäure an und titriert mit entsprechend eingestellter Permanganatlösung, oder man säuert mit Essigsäure an, erhitzt zum Sieden und fällt mit 10 riii^ einer lOVoigen Calciumchlorid- oder Calciumacetatlösung zunächst die Oxalsäure aus. Der Niederschlag Avird abfiltriert. Das Calciumoxalat wird nun nicht gravimetrisch bestimmt, weil es mit Kieselsäure verunreinigt sein kann, sondern alkalimetrisch. Man glüht, löst den Palckstand in einer über- schüssigen Menge einer titrierten Salzsäure und titriert den Überschuß mit titrierter Kalilauge unter Anwendung von Methylorange oder Lak- moid zurück. 112*2 Teile KaUhydrat entsprechen 92 Teilen Glyzerin. b) Bestimmung nach dem Acetinverfahren. Man sucht nach Lewkoivitsch möglichst reines Glyzerin aus dem Fette zu gewinnen, acetyhert es und berechnet die Menge des Glyzerins aus der bei der Verseilung des Triacetins gebundenen Kahlauge. c) Bestimmung des Glyzerins durch Überführung in Isopropyl- jodid nach S. Zeisel-Fanto.'^) Das Verfahren schüeßt sich in seiner Ausführung an die Methode der Methoxyl- ( Alkoxyl-) Bestimmung von Zeisel an. Hier Avie dort erfährt das Objekt der Analyse unter der Einwirkung kochender, wässeriger Jod- wasserstoff säure vom spezifischen Ge^Aicht 1*7 eine Umwandlung in ein flüchtiges Jodalk}'l, dessen Dampf, von begleitendem Jod und Jodwasser- stoff befreit, in alkohohsche Silbernitratlösung eintritt. Mit dieser setzt es sich zur äquivalenten Menge Jodsilber um, welches zur Wägung gelangt ^) Ein Verfahren zum quantitativen Kachweis von Methoxyl. Monatshefte f. Chem. Bd. 6. S. 989 (1885). — M. Z. Stritar, Zur Methoxyl- und Glyzerinbestimmung. Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 42. S. 579. — F. Tcdu/I und Sf. Weiser, Über den Glyzerin- gehalt des Blutes. Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. Bd. 115. S. 155 (1906). Untersuchung auf Fette. 21' oder auch maßanalytisch bestiinint werden kann. Das aus Glyzerin durch überschüssige Jodwasserstoffsäure in der Hitze gebildete Endprodukt ist Iso- propyl Jodid C3 H5 (0H)3 + 5HJ = ^|{'>CHJ + 'dK,0 + 2 Jo. Für die Bestimmung ist der beistehend in etwa i/g der Naturgröße abgebildete Apparat nötig (gehefert von P. Haack, Wien, IX3, Gareiligasse 4) (Fig. 16). Beschreibung des Apparates. Er besteht aus dem Siedekolhen ^4, dem Steig- rohr B mit Aufsatz (Waschapparat) und Stopfen B, dem Vorstoß und den beiden Vor- lagen C und I). Das etwa 40 cm' fassende Siedekölbchen trägt angeschmolzen ein ge- bogenes, nahe der Schmelzstelle auf mindestens 1 mm lichten Durchmesser verengtes Rohr a zum Einleiten des Kohlensäuregases. — Der Waschapparat, ähnlich dem Schrötferschen Exsikkatoraufsatze gebaut, besteht aus dem ■die Fortsetzung des 10 cm langen und im Lichten 7 — 8 »uii weiten Steigrohres um- schließenden Mantel mit seitlichem Ansatzrohr und dem bis knapp auf den Boden des Mantel- gefäßes reichenden, dort etwas eingezogenen Eohrstopfen. — Die Abmessungen des Auf- satzes sind derart gewählt, daß er anstandslos mit mindestens 5 cm^ Waschflüssigkeit gefüllt werden kann. — Die Form des Vorstoßes ist aus der Zeichnung zu ersehen; das untere Ende des ersten Einleitrohres ist etwas er- weitert, um Verstopfung durch angesetztes Jodsilber zu verhindern. Die erste Vorlage, ein Erlenmeyerkolben mit weitem Halse, faßt bis zu einer etwa in halber Höhe angebrachten Marke 45 f;«^ ; die zweite, im allgemeinen nicht gerade notwendig aber empfehlenswert, hraucht nicht mehr als 5 o/i' zu fassen. Die einzelnen Teile des Apparates sind durch sorg- fältig hergestellte und mit Wasser gedichtete Schliffe verbunden, die zur Sicherheit noch mit an den angeschmolzenen Hörnchen sitzenden Drahtspiralen zusammengehalten werden. Erforderliche Reagenzien. 1. Jodwasserstoff: spezifisches Gewicht 1'9. 2. Silberlösung: 40;/ geschmolzenes Silbernitrat werden in 100 cni^ Wasser gelöst und mit reinem Alkohol auf 1 / aufgefüllt. Sie ist nach 24 Stunden und wenn nötig noch einmal vor dem Gebrauch zu filtrieren. 3. Roter Phosphor, mit Schwefelkohlenstoff, Äther Alkohol und Wasser gut gewaschen. Etwa Ob;/ in 5 cy«^ einer 10'*/(,igen Natriumarsenit- lüsung aufgeschwemmt, kommen in den Waschapparat B. Ausführung der Bestimmung: ö cm^ der zu untersuchenden wässerigen Glyzeriulösung mit höchstens 5"/o Glyzerin, die frei sein muß von gewissen Beimengungen (Schwefelverbindungen, die beim Kochen mit JH Schwefelwasserstoff oder Isopropylmerkaptan geben, Alkohole, Äther und Ester), werden unmittelbar nach Zusatz von Ib cm^ Jodwasserstoff- säure und einem Splitter von gebranntem Ton in das Siedekölbchen ge- bracht. Nachdem in den Waschapparat die Phosphoremulsion. in die erste Fig. 16. Apparat zur Gl3'zerinl)PStimmuDg nach Zeisel-Fanto. 21g F. Rölimann. Vorlage 45 cm^, in die zweite 5 cm^ der Silberlösimo- gebracht und die Teile des Apparates sorgfältig miteinander verbunden sind, wird durch das Seitenrohr des Siedekölbchens durch Wasser bzw. Natriumbikarbouat gewaschene Kohlensäure — etwa drei Blasen in der Sekunde — durch- geleitet und das Kölbchen vorsichtig zum Sieden erhitzt. Die Jod- wasserstoffsäure soll eben deutüch sieden, so daß sich der Siedering etwa bis zur halben Höhe des Steigrohrs erhebt. Bald trübt sich die Silberlösung in der ersten Vorlage, es scheidet sich eine deutlich kristaUi- nische, weiße Verbindung von AgJ und AgXOs aus. Diese Verbindung färlit sich oft, namentlich wenn größere Mengen Isopropyljodid in die Silberlösung gelangen, durch nur teilweise Umwandlung von AgJ gelb. Schließhch klärt sich die Flüssigkeit über dem Niederschlage. Ist die Operation nach 1 — 3 Stunden beendet, so kommt der Nieder- schlag samt Mutterlauge in ein etwa 600 cm^ fassendes Becherglas. Man gießt mit dem Spülwasser auf etwa 450 oii^ auf, setzt 10 — 15 Tropfen verdünnter Salpetersäure zu und läßt eine hall)e Stunde auf einem kochenden Wasserbade stehen. Hierbei wird die Doppelverbindung von Silbernitrat- Silber Jodid zersetzt. Der Niederschlag wird auf einen mit Asbest beschickten Goochtiegel gebracht mit Wasser und Alkohol gewaschen, bei 120 — 130'' C getrocknet und dann gewogen. 8. Bestimmung der in einem Fette enthaltenen hochmolekularen Alkohole ( ..Unverseif bares'' ). Wenn man Fette oder Ätherextrakte von Organen verseift und die Seife mit Mineralsäuren zerlegt, so erhält man ein in Wasser unlösliches Gemisch der Fettsäuren, welchen in wechselnder Menge Cholesterin, Phyto- sterin und ähnliche hochmolekulare Alkohole beigemengt sind. Die Trennung der hochmolekularen Alkohole von den Fettsäuren ist im Prinzip einfach : Man fühi't die Säuren in die Seifen über und entzieht mittelst Äther oder Petroleumäther die Alkohole. Man stößt hierbei aber auf zwei Schwierig- keiten. Der Äther oder Petroläther bildet mit den Seifen leicht Emulsionen, die sich mitunter nur sehr schwer trennen lassen. Und weiter nehmen Äther und Petroläther auch Seifen auf. Am besten ist wohl das folgende, besonders auch in der Technik bewährte Verfahren (siehe auch S. 248). Bestimmung des „Unverseifbaren" nach M. Honig und G. Spitzt) 7 — 10 g Fett werden mit 20 — 25 cni^ konzentrierter alkoholischer Kalilösung und ebensoviel Alkohol 2 Minuten lang (bei Anwesenheit größerer Mengen schwer oder unverseifbaren Fettes 5 — 10 Minuten lang) am Pvück- flußkühler gekocht, hierauf 30 — -LO cm^ Wasser zugefügt und nochmals aufgekocht. Nach dem Alikühlen wird die Seifeulösung in einen Scheide- trichter gebracht, das Kölbchen mit bO'^/oigem Alkohol und darauf mit *) Untersuchimg von Gemengen von nnverseifbarem und verseifbarem Fette. Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 31. S. 477 (1892). Untersuchung auf Fette. 219 etwa 50 civ^ Petrolätlier (Siedepunkt öO — 70") in den Scheideti'ichter hinein ausgespült, der Inhalt des Scheidetrichters kräftig durchgeschüttelt und dann der Ruhe ül)erlassen. Der Petroläther trennt sich rasch und scharf von der alkoholischen Seifenlösung. Letztere wird abgelassen, der Petrol- äther mit je 10 — 15 cm^ 50<'/oigem Alkohol 2 — 3mal gewaschen; die alkoho- lischen Waschflüssigkeiten werden mit der ursprünglichen Seifenlösung ver- einigt. Der Petroläther wird sodann in ein trockenes, tariertes Kölbchen entleert, und das Ausschütteln der alkoholischen Seifenlösung mit Petrol- äther so oft wiederholt, bis der Petroläther auf Papier keinen Fettfleck hinterläßt. Jeder der Petrolätherauszüge wird zur Entfernung aufgenommener Seife in der angegebenen Weise mit 50''/oigei« Alkohol gewaschen. In der Regel genügen drei Ausschüttelungen mit Petroläther. Die gewaschenen vereinigten Petrolätherauszüge werden abdestilliert, wobei zur Vermeidung des Stoßens ein gewogenes Bimssteinstückchen zugesetzt werden kann Die letzten Reste des Petroläthers werden aus dem Verdunstungsrückstand durch Erwärmen und Ausblasen entfernt. Dann wird der Rückstand gewogen. Statt zu schütteln, kann man auch kontinuierlich extrahieren (siehe S. 201). Gehalt an hochmolekularen Alkoholen. i) Spermacetiöl 37 — 41 Vo Döglingtran 31-7— 42-6Vo Carnaubawachs Öö^/o Wollfett 43—52% Bienenwachs 52-0— 55-6Vo Walrat 51Vo Reaktionen als Vorproben bei der qualitativen Untersuchung der Fette etc. 1. Elaidinprobe. Die Elaidinprobe beruht auf der Erfahrung, daß Ölsäure in Berührung mit salpeteriger Säure sich in die ihr stereoisomere feste Elaidinsäure verwandelt. Nach Fhikener 2) fügt man zu 10 cm^ Olivenöl in einem vei'schließ- baren Reagenzgiase 1 cm^ Salpetersäure von 1*4 spez. Gew. und 0"4 ,r/ me- tallisches Kupfer in etwa 1 min starken Spänen. Die Einwirkung der Salpetersäure auf das Kupfer beginnt sofort unter merklicher Temperatur- erhöhung und ist nach einer halben Minute wesentlich beendet. Schüttelt man den Inhalt des Reagenzglases durcheinander, so werden die roten Dämpfe, die sich oberhall) des Öls befinden, absorbiert und das Öl, auf ') L. Ubhelohde, HandlMich der Chemie und Technologie der öle und Fette. S. 260. Leipzig 1908. ^) Finkener, Anstellung der Elaidinreaktion. Zeitschr. f. analjt. Chem. Bd. 27. S. 534 (1888). 220 ^- Röhmana. 10 — 12" abgekühlt, erstarrt innerhalb oO Minuten zu einer vollständig festen Masse. BaumwoUensamenöl, Mohnöl, Leinöl erstarren nicht, andere Öle liefern mehr oder weniger weiche Massen.^) 2. Eintrocknungsvermögen. Man bringt einen Tropfen Öl auf eine Glasplatte und läßt diese an der Luft bei Zimmertemperatur oder bei 50" hegen. Ol g Öl auf eine Glasplatte von 7 cm'^ aufgestrichen, erfordern bei 50° C zum Eintrocknen: bei Leinöl etwa 12 Stunden, Maisöl 18, BaumwoUensamenöl 21, Curcasöl 24—30, Rüböl 48 Stunden, Olivenöl über 13 Tage.^) Die Eintrocknung wird beschleunigt, indem man dem Öl fein ver- teiltes Blei- oder Kupferpulver zusetzt. Die hierbei erfolgende Sauerstoffaufnahme hat man in verschiedener Weise zu bestimmen gesucht. Livaches Probe: lg Bleipulver (durch Ausfällen eines Bleisalzes mit Zink dargestellt) wird auf einem ziemlich großen Uhrglase in dünner Schicht ausgebreitet und abgewogen, wonach man auf dasselbe mit einer Pipette nicht mehr als 6 — 7 g des zu untersuchenden Öles tropfen läßt mit der Vorsicht, daß man jeden Tropfen auf eine andere Stelle des Bleis (oder Kupferpulvers) fallen läßt und dafür Sorge trägt, daß die Tropfen nicht ineinander fließen. Man läßt alsdann das Uhrgias bei gewöhnlicher Tem- peratur, dem Licht ausgesetzt, stehen und bestimmt die Gewichtszunahme. Auch die Erwärmung, welche eintritt, wenn man die Öle mit kon- zentrierter Schwefelsäure mischt {Maumenes Probe) oder wenn man C'hlor- schwefel oder Brom auf sie einwirken läßt, hat man zur Charakterisierung der Öle benutzt. 3. Reaktionen auf Sesamöl. Baudouins Probe auf Sesamöl. Man bringt O-lcrn^ einer 2<'/oigen alkoholischen Furfurollösung in ein Probierrohr, setzt 10 crn^ des Öls oder des aus ihm gewonnenen Fettsäuregemisches und 10 ciii^ Salzsäure (spez. Gew. 1-19) zu, schüttelt das Gemisch kräftig und läßt absitzen. Bei An- wesenheit von Sesamöl, selbst wenn dessen Menge weniger als 1% l^e- trägt, färbt sich die salzsaure Lösung tiefrot. SoUsiensche Reaktion auf Sesamöl. 2— o Vol. des Fettes werden in dem doppelten Volumen Benzin (Siedepunkt 70 — 80°) gelöst und mit 3 Vol. salzsaurer Zinnchlorürlösung (Bettendorfs Reagenz, herzustellen durch Sättigen konzentrierter Zinnchlorürlösung mit Salzsäuregas) bis zur gleich- mäßigen Mischung durchgeschüttelt und in ein Wasserbad von 400 einge- taucht. Nach dem iVbsetzen der Zinnchlorürlösung wird das Reagenzglas in Wasser von etwa 80<' nur bis zur Hälfte der Zinnchlorürlösung einge- ') Vgl. .1. Lidoir, Über die Elaidinrealction. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. ,Tg. 26. Ref. S. 97 (1893). — K. Farnsfeiner, Zeitschr. f. Unters, d. Nahrungs- und Genußmittel. 1899. S. 4. ^) Archbuff zitiert nach ./. LcirJcoirifsch, Handbuch d. ehem. Technol. u. Analyse d. Öle, Fette und Wachse. Braunschweig 1905. I. S. 333. Untersuclumy auf P>tte. 221 senkt, so daß ein Sieden des Benzins mög'lichst vermieden wird. Man er- Avännt so lange, bis (bei Gegenwart von Sesamöl) die Rotfärbnng der Zinn- ciilorürlösung nicht mehr zunimmt. Der Träger der Soltsienschen Fieaktion ist nicht identisch mit dem- jenigen der Baudouinschen Reaktion. 4. Reaktion auf Baumwollensamenöl. Halphens Reaktion: 1 — ?> cm^ des Öles werden in dem gleichen Volumen Amylalkohol gelöst. Hierzu werden 1 — 3 cm^ Schwefelkohlenstoff, welche IVo Schwefelblumen in Lösung enthalten, zugesetzt. Das Reagenz- rohr, welches das Gemisch enthält, wird dann in siedendes Wasser ge- l)racht und darin einige Zeit gehalten. Der Schwefelkohlenstoff verdampft und im Laufe von 5 — 15 Minuten gibt Baumwollensamenöl eine tiefrote Färbung. Gewinnung von Triglyzeriden aus Fetten. Die Trennung der in den Fetten enthaltenen Triglyzeride durch fraktionierte KristaUisstion aus geeigneten Lösungsmitteln unter Anwen- dung bestimmter Temperaturen führt nur in ganz bestimmten Fällen zu einem Ziele. Sie erfordert meist größere Mengen Substanz, ist mühsam und für die Bearbeitung biologischer Fragen meistens überflüssig. In den Fetten bildet das Triolein das Lösungsmittel für die anderen Triglyzeride. Erwärmt man ein bei Zimmertemperatur hartes Fett auf eine etwas höhere Temperatur, so geht ein gewisser Anteil des Gesamtfettes in Lösung, der sich durch Abpressen entfernen läßt. Kühlt man ein Öl auf eine niedrigere Temperatur ab, so scheiden sich häufig festere Anteile aus, die man durch Abfiltrieren gewinnen kann. Diese Fraktionen lassen sich durch geeignete Lösungsmittel weiter zerlegen. Aber selbst wenn man z. B. Haramelfett o2mal aus Äther um- kristallisiert, gehngt es nicht, das Tristearin vollkommen vom Tripalmitin zu trennen. Ebensowenig lassen sich durch UmkristaUisieren der Fette aus Alkohol, Äther, Benzol und Amylalkohol oleinfreie Kristallisationen erhalten. Eine Abtrennung der oleinhaltigen Anteile gelingt jedoch, wenn man die Substanz mit Hübhcher Jodlösung behandelt und wiederholt aus Benzol und Alkohol, dann aus Äther umkristaUisiert. Man erhält so aus Hammel- und Rinderfett Fraktionen von gleich- bleibender LösUchkeit, KristaUisation und Zusammensetzung, sowie gleich- bleibendem Schmelzpunkt, die in ihren Eigenschaften synthetischem a-Pal- mitodistearin entsprechen. Aus Talg Keß sich durch fraktionierte Kristal- hsation auch ein Oleodipalmitin, aus gewissen Pflanzenfetten ein Oleodistearin darstellen.!) Bei solchen fraktionierten Kristallisationen hat man mit der Bildung eutektischer Gemische zu rechneu. ') H. Kreis und A. Hafner, Über natürlich vorkommendes und synthetisches Palmitodistearin. Ber. d. Deutsch, ehem. Cies. Jg. 36. S. 1126 (1903). — J. Klimont, Monatshefte f. Chem. Bd. 26. S. 563 (1905). 222 F- Roll mann. Trilauriu kann man aus Lorbeeröl durch Alkohol abscheiden. Es wird durch Umkristalhsieren aus Alkohol und DestiUation im absoluten Vakuum gereini^yt (Schmelzpunkt 45"). Ähnlich wird aus Muskatbutter Trimyristin (Schmelzpunkt 45'^ j gewonnen. i) Trennung und Charakterisierung der Fettsäuren. 1, Trennung der in Wasser unlöslichen gesättigten Fettsäuren von den ungesättigten Fettsäuren. Bevor man zur Trennung der Fettsäuren schreitet, hat man sich durch Bestimmung der Jodzahl darüber unterrichtet, ob das Fettsäuregemisch ungesättigte Säuren enthält. Hierbei weist zugleich die Höhe der Jodzahl darauf hin, ob neben Ölsäure auch wesentliche Mengen von Säuren mit mehr als einer doppelten Bindung zu erwarten sind. Fehlen ungesättigte Fettsäuren oder sind sie nach der im folgenden zu erwähnenden Methode abgeschieden worden, so untersucht man auf Stearinsäure und Palmitinsäure sowie Laurin- und Myristinsäure, wie weiter unten (S. 226 ff.) beschrieben wird. Sind unaesättigte Fettsäuren vorhanden, so trennt man diese durch die verschiedene Lösüchkeit ihrer Blei- und Baryumsalze von den gesättigten Fettsäuren. Die Blei salze der Ölsäure, der Leiuölsäuren und der Kizinolsäure sind leicht löshch in Äther und Benzol. 2) Von palmitinsaurem Blei sind in 100 c;;^^ einer absolut-ätherischen Lösung 0*0184 ,9', von stearinsaurem Blei 0'0148^ enthalten. 3) In Benzol lösen sich palmitinsaures und stearin- saures Blei nur beim Erwärmen. Beim Abkühlen scheiden sie sich fast voUständig wieder aus. Auch ölsaures Kupfer, Mangan und Eisen sind in Äther löshch, da- gegen ist Silberoleat nahezu unlöslich. Calciumoleat ist in Alkohol und Äther löshch. Baryumoleat ist löshch in Äther, sehr schwer in kochendem Alkohol, fast unlöshch in Benzol. Es löst sich in Benzol, welches nur ö^/o od^i' aiich etwas weniger 95o/oigen Alkohol enthält, beim Erwärmen sehr leicht auf und scheidet sich beim Erkalten der Lösung kristalhnisch ab. Ähnlich verhält es sich zu Chloroform und Petroläther. *) Von Calciumpalmitat lösen sich in 100 Teilen absolutem Alkohol bei 200 C 0-0103 Teile, von Baryumpalmitat 0-0035 Teile, Calcium- und Baryumstearat sind in Alkohol fast unlöslich. *) F. Krafft ^ Über Reindarstellung hochmolekularer Säureester durch Vakuum- destillation, ßer. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 4344 (1903). 2) Ä. Farnsteincr, Zeitschr. f. Unters, d. Nahrungs- u. Genußm. 1898. S. 392. =*) A. Lidoiv, Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 26. Ref. S. 97 (1893). *) L. Schön , Über Nichtvorkommen der Hypogaeasäure in Erdnußöl. Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 244. S. 265 (1888) Untersuchung auf Fette. 223 Myristinsaiirer Baryt ist sehr weniii' löslich in Wasser und Alkohol, laurinsaurer Baryt löst sich in Alkohol im Verhältnis 1 : 1000. Die Baryumsalze von Liuol- und Linolensäure sind in Alkohol, Benzol, Petroläther und Äther lösUch. Die Baryum-, Blei- und Silbersalze der Elaidinsäure sind in Alkohol und Äther sehr schwer löshch.i) Die Fettsäuren bilden in bezug auf ihre Löslichkeit also folgende Gruppen : a) Fettsäuren, deren Blei salze unlöslich in Äther sind und in kaltem Benzol (Palmitinsäure, Stearinsäure); b) Fettsäuren, deren Bleisalze löslich in Äther sind und in kaltem Benzol, und zwar: a) Baryumsalze in iVlkohol und kaltem Benzol unlöslich (Ölsäure). Ji) Baryumsalze in Alkohol und Benzol löslich (Linolsäure, Linolen- säure). Eine Trennung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren ist hier- nach möghch sowohl durch Behandlung der Bleisalze mit Äther wie mit Benzol. Auf dem Verhalten zu Benzol beruht ein von Farnsteiner ^) ange- gebenes Verfahren. Für präparatives Arbeiten geeigneter ist das ältere Verfahren von Varrentrapp, welches auf der verschiedenen Löslichkeit der Bleisalze in Äther beruht, und zwar nach der Vorschrift von Fahrion. Trennung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren nach Varre?itrapp-Fahrion. In einem 300 cm ^ fassenden Erlenmeyer- kolben werden 10.^ Fett mit 60 cdi^ alkoholischer Natronlauge (etwa 3^ Na OH enthaltend) unter Umschütteln solange gehnde erwärmt, bis völlige Verseifuug eingetreten ist. Man fügt Phenolpht alein hinzu und neutrahsiert mit starker Essigsäure. Die Lösung wird mit 50 cm^ Wasser verdünnt und mit einer neutralen Lösung von 10, ^ Bleiacetat in 100 cw^ öO^/oigem Alkohol gefällt. Man erwärmt auf dem Wasserbade, bis sich die ül)erstehende Flüssigkeit völlig geklärt hat und läßt erkalten, worauf sie sich ohne Filtration abgießen läßt. Die Bleiseife befreit man möglichst vom Wasser (nach Hazura durch Pressen zwischen sauberen Holzplatten oder durch Trocknen im Leuchtgasstrome) und schüttelt, wenn nötig, unter ganz schwachem Erwärmen solange mit 100 cw^ Äther, bis sich die Brocken verteilt und die Bleisalze der festen Fettsäuren als weicher flockiger Nieder- schlag abgeschieden haben. Nach dem Absitzen derselben gießt man die ätherische Lösung durch ein trockenes Faltenfilter in einen Scheidetrichter und schüttelt sie zur Zersetzung der gelösten Bleisalze mit verdünnter Salzsäure. Nach Klärung der Schichten zieht man die untere, wässerige Schicht ab, die ätherische gießt man in einen zweiten Scheidetrichter, wo sie mit wässeriger Natronlauge (etwa 2 g enthaltend) geschüttelt wird, welcher man soviel Alkohol (höchstens 20<'/o) zufügt, daß eine scharfe ^) K. Farnsteiner, Versuche über den Nachweis und die Trennung eiuzehior un- gesättigter Säuren der Fette. Zeitschr. f. Nahrungs- u. Genußm. 1899. S. 9. ^) Zeitschr. f. Unters, d, Nahrungs- und Genußmittel. 1898. S. 290. 224 F. Röhmann. Trennung der Schichten eintritt. Die ungesättigten Fettsäui'en gehen in die alkalische Lösung über, während das Unverseifbare in der ätherischen Lösung zurückbleibt. Die erstere Lösung wird in den, unterdessen gereinigten ersten Scheidetrichter zurückgebracht, mit Wasser stark verdünnt, mit Salzsäure angesäuert und mit Petroläther geschüttelt. Der Petroläther wird bei Anwesenheit von Säuren der Linol- und Linolenreihe in einer Kohlensäure- oder Wasserstoffatmosphäre abdestilliert. Trennung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren nach Farn- steiner. Aus dem verseiften Fett werden, wie oben beschrieben, die Fettsäuren als Bleisalze abgeschieden. Die Bleiseifen werden in Benzol unter mäßigem Erwärmen ge- löst, und zwar nimmt man für die ans 1 // Fett erhaltenen Seifen 50 cm'^ Benzol. Man läßt dann die Lösung bei ge\röhulicher Temperatur etwa 15 Minuten stehen, um eine grobkristallinische Ausscheidung zu erzielen und kühlt sodann die Flüssigkeit etwa 2 Stunden auf 8 — 12" ab. Die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit wird nach J. Lcivkoiritsch am besten mittelst eines Trichterrohres mit Glockentrichter abgehebert, der mit feinem Linnen verschlossen ist (um die Kristalle zurückzuhalten) und dessen angeschmolzenes Rohr zweimal rechtwinklig gebogen ist. so daß es in eine mit der Filterpumpe verbundene Saugflasche eingepaßt werden kann. Der Niederschlag wird mit 10 cj)i^ Benzol, das eine Temperatur von 10° C hat gewaschen, noch einmal in der halben Menge Benzol unter Erwärmen gelöst, wieder abgekühlt und wie oben beschrieben filtriert. In derselben Weise führt man eine dritte Umfälluug aus, so daß im ganzen bei Verwendung von 1 r/ Fett und drei Fällungen 120 — 180 cm"^ Benzolfiltrat erhalten werden. 2. Trennung der festen gesättigten Fettsäuren, Die festen Fettsäuren gewinnt man durch Zerlegung der in Äther unlöslichen Bleiseifen (siehe oben). Man kann die Bleiseifen in Wasser suspendieren und mit Salz- oder Schwefelsäure erhitzen. Man kann sie aber auch in der Weise zerlegen, daß man sie in etwa öO^/oigem Alkohol mit Kaliumkarlionat erhitzt. Man filtriert das Bleikarbonat ab, verdünnt das Filtrat noch etwas mehr mit Wasser, zerlegt die Seifen unter Anwen- dung von Methvlorange mit Salz- oder Schwefelsäure, kühlt schnell ab und läßt zur möglichst völligen Abscheidung der Fettsäuren eine Zeitlang im Kühlen stehen. Die ausfallenden Fettsäuren saugt man ab und kiistallisiert aus xAlkohol um. Schmelzpunkt und Säurezahl des Gemisches gibt einen Hinweis auf die zu erwartende Zusammensetzung. Die weitere Trennung kann versucht werden durch fraktionierte Fällung oder fraktionierte Destillation im Vakuum. a) Fraktionierte Fällung. i) Der fraktionierten Fällung können die in Alkohol gelösten Säm'en selbst oder deren Ammoniak- oder Natriumsalze unterworfen werden. Man fällt mit einer alkoholischen Lösung von Blei- oder besser Magnesiumacetat^ oder mit einer wässerigen Lösung von Barvumacetat. ^) Heintz, Über die Zusammensetzung des Hammeltalgs, des Menschenfetts und des Wallrats. Ann. d. Chem. u. Pharm., N. T. 8. S. 297 (1852). Fr. Is^afzer, Annalen d. Chem. u. Pharm. Bd. 224. S. 225 (1884). Untersuchung auf Fette. 225 Beispiel für eine fraktionierte Füllung.^) Um zunächst zu entscheiden, ob eine einheitliche Säure oder ein Gemisch vorliegt, löst man 1 g der zu prüfenden Säuren nach Bestimmung des Schmelzpunktes und Molekulargewichts in so viel heißem Alkohol, daß beim Erkalten auf Zimmertemperatur keine Ausscheidung eintritt und ver- setzt dann noch lieiß mit einer zur vollständigen Fällung der Säure unzureichenden Menge Magnesiumacctat in Alkohol oder Baryumacetat in möglichst wenig Wasser. Schmilzt die Säure über 53", so ist das Magnesiumsalz, andernfalls das Baryumsalz zu wählen. Von diesem nimmt man etwa zwei Fünftel des Gewichts der angewandten Säuren, von jenem dagegen nur etwa ein Viertel bis ein P'ünftel. Beim Erkalten der Mischung scheidet sich nach einigem Stehen das Baryum- oder Magnesiumsalz aus. Man saugt den Niederschlag ab und zersetzt ihn durch Erwärmen mit Benzin und verdünnter Salzsäure unter häufigem Umschütteln. Die beiden Flüssigkeiten trennt man im Scheidetrichter und schüttelt die Benzinschicht nochmals mit heißer Salzsäure aus. Dann wäscht man mineralsäurefrei, dampft das Benzin ab und bestimmt Schmelzpunkt und Molekular- gewicht der so gewonneneu Säure. Das Filtrat des Magnesiumniederschlags wird mit einem Stückchen Ätznatron eingedampft, mit Wasser aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure zersetzt. Die abgeschiedene Säure wird -^ie oben auf Schmelzpunkt und Molekulargewicht geprüft. Stimmen die mit den beiden Säureportionen und der ursprüng- lichen Säure erhalteneu Werte untereinander, so liegt eine reine Säure vor. Andernfalls hat man eine Mischung vor sich. Um in einer solchen die einzelnen Säuren zu kennzeichnen, löst man 1 — 2 rj Säure wie oben in Alkohol auf und fällt heiß mit einer alkoholischen Lösung von 7^^ — Y^^ des Gewichts der angewandten Säure an essigsaurer Magnesia. Nach Abtrennen des Niederschlags wird im Filtrate die gebildete freie Essigsäure durch etwas Ammoniak abgestumpft, dann wird sukzessiv mit der gleichen Menge Magnesiumacctat weiter ge- fällt. Beim Kristallisieren darf die Temperatur nicht zu niedrig sein, da sonst Fettsäure sich mit dem Magnesiumsalz ausscheidet. Fällt das Magnesiumsalz nicht oder in un- genügender Menge aus, so wird die Lösung der Säuren etwas konzentriert. Ist keine Fällung mehr zu erzielen, so scheidet man aus der Lösung, wie oben beschrieben, die darin noch enthaltene Säure ab. Aus den einzelneu Magnesiafällungen, deren man 7 — 8 erhalten wird, werden die Säuren abgeschieden und auf Schmelzpunkt geprüft. Gleichartig schmelzende Frak- tionen werden vereinigt und zur Molekulargewichtsbestimmung benutzt. Aus Schmelz- punkt und Molekulargewicht wird mau in vielen Fällen schon Schlüsse auf die Zu- sammensetzung des Säuregemisches ziehen können. Reine Säuren kann man oft erhalten, wenn man die Endglieder der Fällung mehrfach aus Alkohol umkristallisiert. Nach D. Holde -) ermöglicht die fraktionierte Fällung der Fettsäuren nur bei Gegenwart zweier Säuren die klare Kennzeichnung beider Kom- ponenten und führt in diesem Falle auch in verhältnismäßig kurzer Zeit zum Ziel. Bei Gegenwart von mehr Säuren und besonders auch bei Be- nutzung von zu wenig Ausgangsmaterial kann sie aber sehr leicht zu irrigen Schlüssen hinsichtlich der höher schmelzenden Komponenten führen. h) Trennung der Fettsäuren durch Destillation im Vakuum.:^) Die Destillation wird ausgeführt unter Anwendung einer Wasserstrahl- pumpe bei 15 — 20 mm Hg oder mit Hilfe einer automatisch wirkenden ') l'bbelohde, Handb. d. Chemie u. Technol. d. Öle u. Fette. Leipzig 1908. Bd. 1- S. 240. *) Über die natürlich vorkommende Heptadecylsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 38. S. 1248 (1905). ^) F. Krafft-W. Ä. Dijes, Über Destillationen mit der kontinuierlich wirkenden Quecksilberluftpumpe. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. .Ig. 28, S. 2583 (1895): J. Prcchf. l'ber Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 15 226 F- Röhmauii. Quecksilberpiimpe im absoluten Yakiuim. Das Destillat wird bei nicht zu hoch schmelzenden Substanzen im BrüJihchen Apparat aufgefangen. Bei hochschmelzenden Substanzen benutzt man Siedekolben, wie Bd. I. S. 124 be- schrieben. Zweckmäliig ist es vielleicht unter Umständen, die Flüssigkeit nicht von außen zu erhitzen, sondern durch eine in der Flüssigkeit befind- liche Platinspirale, die durch den elektrischen Strom erhitzt wird. Siedepunkte der Fettsäure: bei 15 iinii Hq- im absoluten Vakuum Laurinsäure. ... 176 102 Myristinsäure . . . 106-5 121—122 Pahnitinsäure . . . 21ö 1^38—139 Stearinsäure . . . 2H2'r) 154 — 155'5 Ölsäure 2;)2-5 15;> Elaidinsäure . . . 2H4 154 Erucasäure .... 264 179 Brassidinsäure . . . 265 180 Wie die Säuren, so kann man auch die Ester der fraktionierten De- stillation unterwerfen , auch die Glykolester und die Triglyzeride bis zum Tripalmitin (/ilO — 820 Siedepunkt). Doch unterliegt dieses bereits der Zer- setzung. 1) Siedepunkte der Äthylester: bei 0 »im und 25 iniii Steighöhe Äthylstearat 139 Äthylpalmitat 122 Äthylmyristat 102 Äthyllaurinat 79 Nicht in allen Fällen ist eine Trennung durch fraktionierte Destilla- tion durchführbar. Ein Gemisch von gleichen Teilen Palmitin- und Stearin- »^ säure z. B. siedet bei nahezu 0 um/ Druck größtenteils bei 151 — 152*'.- is' c) Abscheidung und Bestimmung der Stearinsäure. Behandelt man das Fettsäuregemisch, das man bei der Zerlegung der in Äther unlöslichen Bleiseifen oder auch unmittelbar nach dem Ver- eine Abänderung der r. Bahoschan \Vasserquecksilberhit'tpumpe zur Erzeugung hoher Luft- verdünnungen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 29. S. 1143 (1896); F.Krap-H. Wcilandt, Siedetemperaturen beim Vakuum des Kathodenlichts. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 29. S. 1316 (1896); Über fraktionierte Destillation der höheren Normalparaffine aus Braun- kohle im Vakuum des Kathodenlichts. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S. 477i) (1907). ') F.KrafTt, tlber Reindarstellung hochmolekularer Säureester durch Vakuum- destillation. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 433U (190.3). -) Kreis und Hafner, Über natürlich vorkommende und synthetisch dargestellte gemischte Fettsäureglyzeride. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 2769 (1903). Untersuchung auf Fette. 227 seifen der Fette erhalten hat, mit einer gesättigten alkoholischen Lösung von Stearinsäure, so bleibt die Stearinsäure ungelöst, während Palmitin- säure und Ölsäure in Lösung gehen. Verfahren von Hehner und Mitchell^): Man stellt zunächst eine ge- sättigte Stearinsäurelösung her, indem man 3 g reiner Stearinsäure in 1 / warmem Al- kohol vom spez. Gew. 0'8183, der 944 N'olumprozent Alkohol enthält, in einer Stöpsel- flasche auflöst. Die Plasche wird in Eiswasser eingesenkt und üher Nacht in einen Eis- schrank gestellt. Nach 12stündigem Stehen filtriert man die Mutterlauge, ohne den Kolhen aus dem Eiswasser zu entfernen, mittelst eines zu einem kleinen Trichter erweiterten Rohres ab. welcher in die alkoholische Lösung eintaucht und mit feinem Linnen überzogen ist, um die ausgeschiedenen Stearinsäurekristalle zurückzuhalten. Das Trichterrohr ist zwei- mal rechtwinklig gebogen und in eine Saugflasche eingepaßt, so daß die klare Flüssig- keit mit Hilfe einer Saugpumpe abgezogen werden kann. 05 — 1 // des Fettsäuregemisches, falls es fest ist, oder b e- winnen, verfährt man nach Kreis und Hofncr^) folgendermaßen: Man be- stimmt zunächst in dem ölsäurefreien Gemisch (siehe unten) mich Hehner und Mitchell die Menge der Stearinsäure. Dann berechnet man die ^lenge von Alkohol, welche erforderlich ist, um die anscheinend vorhandene Palmitinsäure bei 0" in Lösung zu halten, indem man die P^rfahrung zugrunde legt . daß sich in 100 aii^ Alkohol von 15 \'olumprozent bei 0" C 0"56 g lösen. In dieser Menge löst man das Fettsäuregemisch und läßt 12 — 14 Stun- den bei 0" C stehen. Man filtriert. Der Filterrückstand, zweimal aus Alkohol umkristaUisiert, besteht aus reiner Stearinsäure. Das Filtrat, welches nur noch 0'12 g Stearinsäure in 100 cni^ enthält, wird auf die Hälfte konzen- triert imd mit so viel alkoholischer Magnesiumacetatlösung versetzt, als der in der Lösung gel)liel)enen Menge Stearinsäure ä(iuivalent ist. Nach 12- 14stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird von dem ausgeschiedenen Niederschlag abfiltriert. Aus dem Filtrat wird die Fett- säure abgeschieden. Die Säure wird nun wieder in so viel Alkohol ge- löst, daß sie l)ei Zimmertemperatur nicht auskristaUisiert und ein Drittel der vorher zugesetzten Menge Magnesiumacetat hinzugegeben. Nach noch- maliger Wiederholung dieser Operation und nach dem Umkristallisieren aus Alkohol erhält man reine Palmitinsäure. Palmitinsäure. CjgHjgO.,, ist trcruch- und geschmacklos, iu kaltem Alkohol nur wenig löslich, lüü Teile absoluten Alkohols von 19o° losen 932 g auf. Schmelz- punkt 62^6". Spez. Gew. bei 80" bezw. auf Wasser von 4" C 0-8412°. e) Gewinnung der Myristin- und Laurinsäure. Zur Untersuchung der Fette auf Myristin- und Laurinsäure kann man durch eine verhältnismäßig hohe Säurezahl des Säuregemisches ver- anlaßt werden. Man wird dann wohl zunächst nach c die Stearinsäure ent- fernen und könnte daran denken, Palmitin-, Myristin- und Laurinsäure mit Hilfe der verschiedenen Löslichkeit ihrer Lithiumsalze nach Fartheil und Ferie^) zu trennen zu suchen. Löslichkeit der Lithiumsalze. 100 cm^ Wasser lösen bei 18" 25» 100 cm3 Alkohol, spezifisches Gewicht 0797, lösen bei 18» 25" Lithiumlaurat . . Lithiummyristat . Lithiumpalmitat . Lithiumstearat . Lithiumoleat . . 0-158.r/ 00235 g 0011 g 001 g 0-0674 g 0176 r/ 00234 g 0018 g 0012// 0-1.32 // 0-418 r/ 0-184,r7 0 0796 ;/ 0041 g 0-9084 f/ 0-4424 g 0-22 g 009.05 g 0-0532 g 1-009/7 *) Über natiirlich vorkommende und synthetisch dargestellte gemischte Fettsäure- glyzeride. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 2769 (1903). 2) Zur Kenntnis der Fette. Chem. Zentralbl. .Tg. 1904. I. S. 220. Untersuchung auf Fette. 229 K. Farnsteiner niid W. Fahrion ^) orliiclteii jedo(;li mit der von Partheil und Ferie angeiiebenen Methode k(Miie braiu'libareii Ilesnltate. Zur Dar.stelluni>- für präparative Zwecke i>eht man von Pflanzenfetten aus, die reich an diesen Säuren sind, l)ei der Laurinsäure vom Lorbeeröl, bei der Myristinsäure von der Muskatbutter (siehe S. 222). 3. Charakterisierung der festen Fettsäuren, €„ Hon ^)>. Zur Charakterisieruno- der gesättigten, festen P^ettsäuren g-enügt im allgemeinen außer der Elementaranalyse und der Bestimmung der Azidität (Molekulargewicht) die Bestimmung' des Schmelzpunktes und der anderen pliysikalisciien Konstanten. In manchen Fällen ist es abei- notwendig, die Säuren in die ent- sprechenden Kohlenwasserstoffe überzuführen und auch diese zur Charak- terisierung mit heranzuziehen. Man destiUiert zu diesem Zwecke die Baryt- salze der Säuren mit Barythydrat bei 16mm Druck.-) 4. Oxyfettsäuren und deren Laktone. Die Anwesenheit von Oxyfettsäuren in Fetten, Wachsen etc. gibt sich zu erkennen, wenn man die Acetylzahl der Fettsäuren unter Berück- sichtigung bzw. nach Entfernung etwa gleichzeitig vorhandener hoch- molekularer Alkohole bestimmt. Auf Laktone prüft man, indem man zunächst die Azidität der in Alkohol gelösten Fettsäuren bestimmt, dann eine bestimmte ^lenge alkoholi- scher Kalilauge zusetzt, eine Zeitlang- kocht und sieht, ob Alkali gebunden wird. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß Laktone aus Oxysäuren entstehen können, wenn man die Fettsäuren, nach dem Verseifen des Fettes aus den Seifen mit Mineralsäuren in Freiheit setzt; ferner daß sich Ester bilden kömien. wenn die Zerlegung der Seifen durch Mineralsäuren bei (iegenwart von Alkohol geschieht und auch schon, wenn Fettsäuren mit Alkoholen erhitzt werden. Säureanhydride bilden sich nach Leivkowitsch aus den Fettsäuren beim Kochen mit Essigsäureanhydrid. Dargestellt sind Oxysäuren aus dem Wollfett •^). dem Wachs der Cochenille*) sowie dem Karnaubawachs. s) Li bezug auf Isolierung und Charakterisierung sei auf die Originalarbeiten hingewiesen. ') über die Lithiummetliode zur Tremnuig der gesättigten Säuren der Fette. Jg. 1904. II. S. 738. 1521. '-') /'. Kraft- jR. Schaal, Über hochschmelzende Säuren des Japanwaclisos. Bor. d. Dcnitsch. ehem. Ges. Jg. 40. S. 4787 (1907). — Siehe auch J.Mai, Über Kohleiisäure- abspaltung mit Hülfe von Natriumalkoholat. Ebenda. Jg. 22. S. 2133 (1889). ^) L. Dannstädtcr und .1 . Lifschütz, Beiträge zur Kenntnis der Zusammensetzung ac>; Wollfettes. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 28. S. 3133 (1895). Jg. 29. S. Ü18. 1474 (1896). Jg. 31. S. 97 (1898). •*) C. Liebermann, Über das Wachs und die Fette der Cochenille. Ebenda. Jg. 18 8. 1975 (1885); Jg. 20. S. 959 (1887). ■') Stiircke, Über die chemischen Bestandteile des Carnaubawachses. Ann. d. Chcm. u. l'harm. Bd. 223. S. 283 (1884). 230 F. Röhmaim. Am besten bekannt ist von natürlich vorkommenden Oxyfettsäuren die Piizinolsäure. Die Ri z i n 0 1 s ä ur e , Q,U,^ . CH (OH) . CH, . CH : CH (CH J, COOK >) . wird aus dem festen Auteil der l)eim Verseifen von Rizinusöl entstehenden P''ettsäuren erhalten. Man kühlt die Fettsäuren auf 0" ab. Die sich ausscheidenden festen Massen werden abgepreßt und in das Bariumsalz übergeführt, das man durch Umkristallisieren aus Alkohol von der anwesenden Stearinsäure und Dioxystearinsäure befreit. Die Rizinolsäure schmilzt bei 4—5", ist in Alkohol und Äther leicht löslich, [ajo + 6-25. Bei der Destillation zerfällt sie unter Bildung von Undezylensäure. Die Eigenschaften anderer Oxyfettsäuren siehe S. 234. 5. Dikarbonsäuren. Hochmolekulare Dikarbonsäuren finden sich in kleinen Mengen im Japanwachs. '-) Die aus dem verseiften Japanwachs in P'reiheit gesetzten Säuren werden unter 15 mm bei 250 " C abdestilliert. Der Itückstand wird durch Umkristallisieren aus 7ö7oigem Alkohol von harzigen Beimengungen getrennt und der Rektifikation im Vakuum bei 0 iimi unterworfen. Auch die Dikarbonsäuren lassen sich durch Destillation mit Baryt- hydrat bei vermindertem Druck in die entsprechenden gesättigten Kohlen- wasserstoffe überführen. Aus einer Dikarbonsäure des Japan wachses, deren Zusammensetzung und Derivate (Ester und Diamid) der Formel C(),H.(CH2)i9.C0.2H entsprachen, wurde ein mit dem synthetischen über- einstimmendes Normalnonadekan, Cjo H40, erhalten. 6. Ungesättigte Fettsäuren. Die ungesättigten Fettsäuren geAvinnt man aus den in Äther lös- lichen Bleiseifen (siehe oben). Man sucht eine Vorstellung von der Zu- sammensetzung des erhaltenen Öles zu gewinnen durch Bestimmung der Jodzahl und Azidität, bestimmt die Acetylzahl, prüft auf Laktone, unter- sucht auf optische Aktivität u. a. Ölsäure, CjgHg^O,. Zur Darstellung wird das Öl, welches man aus den äther- löslichen Bleiseifen des Olivenöls oder Schweinefetts gewonnen hat, in Ammoniak gelöst und die Lösung mit Chlorbarium versetzt. Das abgeschiedene Bariumsalz wird wiederholt aus Alkohol umkristallisiert und mit Weinsäure zerlegt. Die Ölsäure wird durch De- stillation im ^'akuum gereinigt.") Die Ölsäure ist in Wasser unlöslich, aber schon in kaltem verdünnten Alkohol löslich. Sie erstarrt bei 4" kristallinisch, schmilzt bei 14" C, siedet unter 100 didi Druck bei 286" C, unter 10 mm bei 223" im absoluten Vakuum bei 153". Auber der Elementaranalyse, Azidität (Molekulargewicht) und den physikalischen Konstanten dienen zur Charakteristik der ungesättigten Fett- säuren besonders die Jodzahlen, die Bromverbindungen, die durch Reduktion zu erhaltenden gesättigten Fettsäuren und die bei der Oxydation entstehen- von Kaliniiipennani>anat in alkaUseher Lösimi»' bilden. Aueh die nniiesättii'ten Kohlenwasserstoffe, die, wie bei den ,i>-es;ittii>teii Säuren, durch Destination mit Darythydrat oewoinien werden, können zur Charakterisierunj^- benutzt werden, i) Die Bromverl)induni>- und die Oxysäuren sind im l)esonderen geeiiiuet, um auf Linol-, Linolen- und Isolinolensäure zu untersuchen, die sich neben Ölsäure in trocknenden und halbtrocknenden Ölen und Ti-anen finden. a) Prüfung auf Linol- und Linolensäure etc. mit Hilfe der Bromide. Die Bromierung kann sowohl in einer Lösung von Lssigsäure wie von Chloroform vorgenommen werden. Sie scheint ziendich glatt zu ver- laufen. Zweckmäßig verfährt man so, daii man (bis Fettsäuregemisch in Chloroform löst und unter Abkühlen mit einem kleinen Überschuß des in Chloroform gelösten Broms versetzt. Dann dampft man bei Zimmertemperatur im Vakuum völlig ein. Den Rückstand löst man unter gehndem Erwärmen in Petrolätlier und stellt ins Kühle. -) Lst nur Ölsäure vorhanden, so erfolgt keine Ab- scheidung, da das Ölsäuredibromid in Petroläther (auch in Eisessig und Atlier) leicht löslich ist.M Bei Anwesenheit von Linol-, Linolensäure u.a. schei(h^t sich ein Niederschlag ab, der die Tetra-, Hexa- und Oktobromide enthält. Die Menge dieses Niederschlages, als Linolsäure berechnet, betrug nach Farnsteiner für Kottonöl 18-2 — 2:i-9Vo <1pi" flüssigen Fettsäuren, bei Sesamöl L5-2 — l(r4'Vo der Fettsäuren; aus den Fettsäuren des Erdnußöls waren bei direkter Bromierung keine Bromide zu erhalten, dagegen aus lg der Säuren, deren Barytsalz in Benzol-Alkohol löslich war, 20-ö'yo usw. Zur Orientierung über die Zusammensetzung der Bromverbindung dient neben der Brondjestimmung die Bestimmung des Molekulargewichtes durch Titrierung der Azidität. Mole k u 1 a r gewicht: Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure . 278 — 'l>^'2(j Ölsäure-Dibromid 442 g Linolsäure-Tetrabromid 600^ Linolensäure-Hexabroinid .... 708 en von K. Hazur(O), nach 0. Hehler und C. Ä. Mitchell in zweierlei Weise aus- g-eführt. a) Man löst 0-2 — O'o ,^ Fettsäuren in \0 cm^ Essigsäure und kühlt in verkorkter Flasche auf ö" ab. Alsdann fügt man tropfenweise Brom zu, bis die Bromfarbe bestehen 1)leibt. Nach o Stunden filtriert man durch einen Asbesttiegel, wäscht mit gekühlter Essigsäure, Alkohol und Äther in Por- tionen von je '^ cm^ sukzessive aus und trocknet den weilien Bückstand im Wassertrockenschrank bis zur Gewichtskonstanz. h) Man löst 1 — 'lg Öl in 40(*»«3 Äther, fügt wenige Kubikzentimeter Essigsäure hinzu, kühlt die Lösung in Eis ab, setzt Brom in kleinem Über- schulj hinzu und beläßt das Gemisch über Nacht in Eis. Man filtriert dann unter Saugen durch ein mit Putzleder überzogenes, mit Asbest beschicktes Filterrohr, wäscht viermal mit je 10 cin^ Äther von 0" C und trocknet. Hexabromidausbeuten nach Hehner und Mitchell u.a.-) in Prozenten der Glvzeride. Leinöl - . . 23 37 Dorschleberöl . 30-6 52-3 Tungöl . . 0 0-39 Haifischlelieröl . 19—22 Candelnuliöl . . 7-28— 8-21 Bobbentran . . 27-5— 27-9 Walnußöl . . . 1-4— 1-9 Walfischtran 15-5 25 Walratöl . . . 2-4— 2-6 ]\Iohnöl. Mais-, Baumwollensamen-, Paranuß-, ^Landel-, Olivenöl geben keine Hexabromide. Die aus der Linolsäure entstehende Tetrabromstearinsäure ist schwer lös- lich in Petroläther (0-014— 0021 f/ in 100 cw' von 12-5» C), leicht löslich in Äther, Eis- essig, Chloroform, Alkohol. Aus kalt gesättigter Lösung von Eisessig oder Alkohol kristallisiert sie beim freiwilligen Verdunsten des Lösungsmittels in weißen, perlmutter- glänzendcn Bliittcben, die unter dem Mikroskop sich als aus zarten, zu Büscheln gruppierten Nadeln bestehend erweisen. Schmelzpunkt 114 — 115". Das Kalisalz ist in Alkohol löslich. Durch Natriumamalgam in alkalischer Lösung, Zink in essigsaurer, Zinn und Salzsäure in alkoholischer Lösung wird das Tetraln-omid zur Linolsäure reduziert. Man löst z. B. 17 g des Bromids in 600 Alkohol und kocht mit 150 cm^ rauchender Salzsäure und Zinnfolie 36 Stunden am Rückflußkühler. Dann verdünnt mau mit AVasser und schüttelt mit Äther. In diesen geht der Ester der Linolsäure. Man schüttelt zur Ent- fernung von Säuren mit verdünntem Ammoniak und destilliert den Äther ab.'') Die aus der Linolensäure entstehende Hexabromstearinsäure ist sehr schwer löslich in Petroläther, Äther Alkohol, Eisessig, Chloroform und Benzol. Schmelzpunkt 177". Zur Bestimmung des Molekulargewichts löst man das Bromid bei etwa 75° C in der etwa öOfachen Menge Benzol, setzt die gleiche Menge heißen absoluten Alkohols hinzu und titriert heiß. Das Kalisalz scheidet sich beim Erkalten so gut wie vollständig aus (K. Farnsteiner). ') K. Hazura, Untersuchungen über die Hanfölsäure. Monatsschr. f. Chem. Bd. 8. S. 147 (1S87). ^) Ocerbeck, Über die Abkömmlinge der Ölsäure. Annal d. Chemie u. rharm. Bd. 140. S. 42. 3) K. Hazura, Über die Hanfölsäure. Monatsh. f. Chem. Bd. 8. S. 147 (1887). üntersucliung auf Fette. 2*->8 bj Oxydation der ung'esättii>teii Fettsäuren mit kaliiiiupcriiian- iiaiiat iiacli Hazttra. Die iiiii>e.sättig'ten Fettsaiiivu addici'cii iiat-li K. llazura'^) in ihren alkalischen Lösungen bei der Oxydation mit Lösuni>en von Kaliiimpei-mani>anat soviel Hydroxylgruppen, als si(» freie Valenzen enthalten und i)ilden ge- sättigte Oxyfettsäuren, welche dieselbe Anzahl Atome von Kohlenstoff im MolekiU enthalten. Verfahren von K. Hazura.'-) ;)()<7 der flüssigen Fettsäuren werden mit Vy'ocm'^ Kalilauge von der Dichte 1"27 (068^ KOII im Liter) verseifL Die Seifen werden in 2 / Wasser gelöst. Li diese Lösung läl'it man untei- fort- währendem Lühren 21 einer 1' „"/oiS'^i^ Kaliuni})ermanganatlösuiig bei Zimmertemperatur einfliel'jen. (Lei Säuren aus Tranen kühlt man auf 0" C ab und verwendet halbprozentige Permanganatlösung.) Man filtriert das Mangansuperoxyd ab und säuert das alkalische Filtrat mit Schwefelsäure an. Hierbei fällt ein Säuregemisch aus, das neben unveränderter Ölsäure Dioxystearinsäure, Sativiusäure und Liiuisinsäure enthält. Das Filtrat wird mit Kalilauge neutralisiert. Je 4 / von ihm werden auf etwa iiOO cm^ ein- geengt. Die einzelnen Portionen werden vereinigt, abermals mit Schwefel- säure angesäuert und auch das nunmehr herausfallende, aus Linusinsäure und Lsolinusinsäure bestehende Siiuregemisch H durch Filtration von der Flüssigkeit getrennt. Li Lösung bleibt Azelainsäure u. a. Das Säuregemisch I wird auf Tontellern getrocknet und zui' Ent- fernung nicht oxydierter Säuren mit Äther oder Petroläther gewaschen. Dann wird mit der lOOfaclien ^lenge kaltem Äther behandelt. Hierbei geht die Dioxystearinsäure in Lösung. Um sie zu ge- winnen, wird der Äther eingeengt. Sie fällt beim längeren Stehen ans und wird durch Lmkristallisieren aus iVlkoliol gereinigt. Der in Äther unlösliche Teil (Sativiusäure und Linusinsäure. auch etwa ungelöst gebliebene Dioxysänre) wird aus heißem Wasser fraktioniert. Will man von vorneherein nur Sativiusäure gewinnen, so tuhit man das bei der Oxvdation erhaltene Säuregemenge in das Kalisalz über und fällt mit Chlorbarium. Die Larytsalze werden durch Auskochen mit Wasser von Azelainsäure und Linusinsäure befreit. Der in Wasser uidösliche Teil wird mit Salzsäure zerlegt und die Säure aus Wasser umkristallisiert. Das Säuregemisch H wird ebenfalls auf Tonplatten getrocknet mid zur Entfernung von Azelainsäure u. a. mit Äther extrahiert. Der in Äther un- lösliche Teil wird aus absolutem Alkohol umkristallisiert. Die Kristallisationen werden dann weiter durch Kristallisation ans wenig Wasser in Liiuisin- säure und lsolinusinsäure zerlegt. -» " i\ ') A. Band- und K. Jldziira , Vhev die HantVilsänre. Monatsli. f. CluMii. IM. 7. 8.216(1896); K. Uaziira, Über Ilanfölsäure. Ebenda. l!d. M. S. 147 ff. ilHS7i: Hd. 9. S. 198 (1888). -) Mouatsh. f. Iheiu. Bd. 9. S. 198 (1888). 234 ^- R Obmann. Die Dioxystearinsiiure'), CjgHg^O, (OH)^, welche hei der Oxydation von Ölsäure entsteht, kristallisiert in rhombischen, oft an zwei gegenüber liegenden Ecken abge- stumpften Tafeln, die in Wasser unlöslich sind, leicht löslich in heißem, sehr schwer in kaltem Alkohol und heißem Äther. Schmelzpunkt 136-5". Baryumsalz unlöslich in kaltem und heißem Wasser. Sativinsäure, CjgHgg 0^ (OH)^, ist unlöslich in kaltem Wasser, Äther, Schwefel- kohlenstoff, Benzol, Chloroform, löslich in 2000 Teilen siedendem Wasser, in Eisessig, schwer löslich in Alkohol. Zu ihrer Kristallisation löst man sie in der eben nötigen Menge heißem Eisessig, fügt soviel heißes Wasser hinzu, bis eine Trübung entsteht, dann wieder soviel Eisessig, bis die Trübung verschwindet. Nach einigen Tagen scheiden sich schöne, perlmutterglänzende Kristalle ab, die unter dem Mikroskop die für Sativinsäure charakteristischen Formen zeigen . lange Nadeln und Prismen mit aufge- setzten Pyramiden (K. Hazura). Schmelzpunkt 173". Baryumsalz in kaltem und heißem Wasser unlöslich. Linusinsäure, C^gH^g 0^ (OH),., ist in heißem AVasser leichter löslich als Sativin- säure, dagegen schwerer löslich in Alkohol, unlöslich in Äther. Sie kristallisiert aus Wasser selten in Nadeln, gewöhnlich in rliombischeu Tafeln, die oft an zwei gegen- überliegenden Ecicen abgestumpft sind. Schmelzpunkt 203—205". Baryumsalz in kaltem Wasser schwer, in heißem Wasser leicht löslich. Isolinusinsäure, C^g Hg^ 0, (OH)g, ist schwer löslich in kaltem, löslich in heißem Wasser, löslich in kaltem und leicht löslich in heißem Alkohol, unlöslich in Äther, Benzol, Toluol, Schwefelkohlenstoff, Chloroform. Kristallisiert wasserfrei in kleinen, prismatischen Nadeln. Schmelzpunkt 173 — 175°. Das Baryumsalz ist in heißem Wasser leicht löslich. Azelainsäure, C- Hj^ (COOH)., . ist in heißem Wasser leicht, in Alkohul sehr leicht löslich. Schmelzpunkt 1062". 7. Untersuchung der flüchtigen Fettsäuren. Die fUk'htis>en Fettsäuren werden ans den Fetten nach der A'erseifnnti; ans anderen Objekten, z. B. (xärnngs- und Fänlnisi>emisclien, ohne weiteres nach dem Ansäuern mit Schwefelsäure durch Destillation mitWasser- d ä m p f e n ge wonnen. In den Fetten ist ihre Menge so gering, daß vor der weiteren A>r- arbeitung- die vereinigten Destillate neutralisiert und eingeengt werden müssen. ^lan übersättigt wieder mit Schwefelsäure und unterwirft die Flüssigkeit unter Nachfüllen des abdestillierenden Wassers von neuem, und zwar einer fraktionierten Destillation, indem man das Volumen jeder folgenden Destillation doppelt so groß als das der vorhergehenden nimmt. Hierbei geht zuerst Kaprinsäure, später Buttersäure, zuletzt Essigsäure über.2) Die zuerst übergehenden öhgen Anteile werden in Ammoniak gelöst und mit Silliernitrat gefällt. Die wasserlöslichen Fraktionen werden mit Silberkarl)onat erhitzt, heiß filtriert und, wenn nötig, auf dem Wasserbade zur Kristallisation eingedampft. Die nacli dem Abkühlen erhaltenen Silber- ') Srif/fzcf, Über die Oxydation der Ölsäure und Eladinsäure mit Knliuniper- manganat in alkalischer Lösung. Journ. f. prakt. Chem. [2] Bd. 33. S. 300(1886). -) A. Fitz, Über Schizomyceten-Gärungen. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 11. S. 46 (1878). üntersuclniiig auf Fette. 235 salze werden abfiltriert und im Luftbade liei 50 — 60" ijetrocknet , dann wird ihr Silberi^ehalt bestimmt, i) Hat man es, wie bei der P'äuhiis. mit ijTÖßeren flennen von flüchtiiien f'ettsäuren zu tun, so schüttelt man die Destillate mit Äther aus, trocknet diesen mit iiei>lühtem (daubersalz, verdunstet den Äther und untei'wirit den Ätherrückstand der fraktionierten Destillation.^) Die Fraktionen unterwirft man der Analyse. Man macht eine Verbrennung', bestimmt die Azidität, stellt das Silber- oder Calciumsalz dar, deren Silber- oder Kalk- bzw. Kristallwassergehalt man bestimmt und untersucht auf optische Aktivität. Zur Identifizierung der flüchtigen Fettsäuren bis zur Oenanthsäure scheint auch ihre l''berführung in Guanamine geeignet. 3) Diese duirh ihre Kristallisationsfähigkeit ausgezeichneten Körper entstehen, wenn man das Guanidinsalz der flüchtigen Fettsäure — es genügen 1 — -i^/ des Salzes — auf 220—2300 erhitzt. Die Reaktion erfolgt nach der Gleichung 2 Cn H.,„ ( )., . CH, N3 = Cn + ., H,, + 3 N, + 4 NH3 + 2 C, «.,„ ( ).,. In seinen Arl)eiten über die Gärung hat M. NencJd wiederholt von dieser Reaktion Gebrauch gemacht und gelegentlich einer Untersuchung- der flüchtigen Bestandteile der menschlichen Exkremente hat L. Bneyer"^} mittelst dieser Methode die Gegenwart der Isobuttersäure darin nach- gewiesen. Formoguanamin. Roinos kohlensaures riuanidin wird in konzentrierter wässe- riger Ameisensäure aufgelöst und auf dem Wasserbade getrocknet, bis die Flüssigkeit eine ziemlich dickliche Konsistenz angenommen hat. Hierauf wird sie in einem offenen Kolben auf dem Sandbade erwärmt. Bei 200" tritt lebhafte Gasentwicklung ein. Man erhält die Temperatur genau auf 200°, bis die Flüssigkeit sich trübt und die Ausschei- dung von Kristallen eintritt, deren Menge bei fortgesetztem Erwärmen sich noch ver- mehrt. Nach wenigen Minuten läßt man erkalten und versetzt die Schmelze mit dem gleichen A'olumen kalten Wassers. Es scheidet sich dann die Base als gelbweißer, körniger Niederschlag aus, während das unzersetzte ameisensaure Guanidin in Lösung geht. Die abgeschiedene Base wird nun am zweckmäßigsten in der nötigen Menge heißen Wassers aufgelöst und durch Zusatz einer gesättigten Oxalsäurelösung in das in kaltem Wasser unlösliche Oxalsäure Salz verwandelt. Aus diesem Salze wird durch Kali oder Natronlauge die Base in weißen, rhombischen Nadeln abgeschieden. Aus Wasser um- kristallisiert bildet sie vierseitige gestreifte Pyramiden, die zu sternförmigen Kristall- grnppen in der Weise zusammentreten, daß die Spitzen der Pyramiden gegen ein ge- meinsames Zentrum gerichtet sind (Fig. 17). Acetoguanamin. Das aus reinem kohlensauren Guanidin dargestellte essigsaure Salz wird auf dem Sandbade getrocknet und dann auf 228—230" erhitzt und eine Viertelstunde auf dieser Temperatur gehalten. Dann läßt man erkalten und zieht die M Hecht, Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 209. S. 319 (1881). -) C. Nnilicrfi und E. Rosrnhcr// , Ül)er die bei der Eiweißfäulnis auftretenden Fettsäuren. Biochem. Zeitschr. Bd. 7. S. 178 (1907). ^) Carl Haaf, Zur Kenntnis der Guanamine; M. Nencki, Opera omnia. Bd. 2. Braun- schweig 1904. S. 229. ■*) t'ber die flüchtigen Bestandteile der menschlichen Exkremente. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 10. S. 1027. 236 F. Röhmanu. Fig. 17. Formoguanamin. Fig. 18. Acetoguanamin. Fig. 21. Isobutyroguanarain. y u Fig. 2-2. Valeroguaiiamin. ^ Fig. 19. Propioguanainin. Fig. 23. Kaproguanamin, aus Natronlauge kristallisiert. Fig. 20. Butyroguanamin , avis Natronlauge kristallisiert Fig. 24. Oenanthoguanainin. Untersuchung auf Fette. 237 Schmelze mit wenig heißem Wasser aus. Man gießt von einem geringen, amorphen, un- löslichen Rückstand ah. Aus der heißen Lösung scheidet sich heim Erkalten eine Gal- lerte ah, die ahgepreßt und mit verdünnter Kali- oder Natronlauge zerlegt wird. Aus Wasser umkristallisiert hildct das Acetoguanamin sehr schein ausgehildete, glänzende^ dem Cliolcsteriu ähnliche rhombische Tafeln (Fig. 18). l'ropioguanamin durch einstündiges Erhitzen von Propionsäure und Guani- dinkarhonat auf 220—230". Die Schmelze wird mit heißem Wasser ausgezogen, es wird heiß filtriert und das Filtrat mit konzentrierter Natronlauge zerlegt. Beim Umkristalli- sieren aus Wasser erhält man äußerst wohl ausgebildete Pyramiden von (juadratischem Habitus (Fig. !{)). Butyroguanamin kristallisiert beim langsamen Erkalten ohne Verdunsten der wässerigen Lösung auf dorn Wasserbade in viereckigen Tafeln, deren Winkel rechte sind (Fig.2ü). Iso butyroguanamin kristallisiert in spitzen Rhomboedern (Fig. 21). Isovaleroguanamin, aus Isopropylessigsäure, bildet glänzende, weiße Nadeln des rhombischen Systems, die namentlich beim raschen Abkühlen radial oder längs der Hauptachse zusammengewachsen ersclieinen (Fig. 22). Kaproguanamin bildet kleine glitzernde Kristalle, die unter dem Mikroskop als wohl ausgebildete, quadratische Pyramiden, zum Teil mit einer Basisfläche abge- stumpft, erscheinen; oft bilden sie auch Zwillinge (Fig. 23). Oenanthoguanamin ist in Wasser nur wenig löslich, es kristallisiert in rhom- bischen Tafeln und Stäbchen, welche oft zu federförmigen Aggregaten zusammentreten (Fig. 24). rettbestmmiung in Organen. Von Georg Rosenfeld, Breslau. Die Scliwierigkeit, durch die gewöhnlichen Lösungsmittel, wie Äthyl- äther, Petroläther, Chloroform, die Fettmenge in Organen zu bestimmen, beruht darauf, dal') die Extraktionsmittel nicht an das in das Organmate- rial eingeschlossene Fett herankommen und es auflösen können. Es kann nun zwei Wege geben, die Zugänglichkeit der Fette zu erhöhen. Entweder löst man die Organe selbst auf — so durch Verdauung mit Pepsin und Salzsäure {Radziejeuskl^), Zaimlski-), Dor}iieyer^), Pflüger ^) oder durch Salzsäure (Nerkinf/ ^), auch durch Kalilauge {v. Lieheniiann und Szekely^) — oder man macht die Organsubstanz osmotisch zugängiger, wozu in erster Eeihe der ^Vlkohol zu verwenden ist. Die Substanz wird erst mit Alkohol kalt oder warm behandelt und dann mit Äther (Bogdanow'^'^'^), Voit'^'^), Paton) oder anderen Lösungs- mitteln — Chloroform (Rosenfeld'^^''^-) — ausgezogen. M K. Ba(Jziejei'\ski, Experimentelle Beiträge zur Fettresorption. Virchoirs Archiv. Bd. 43. S. 1868. ^) Zatvilski , Arbeiten aus dem Leipziger physiol. Institut. ^) C. Dori)iei/er, Die quantitative Bestimmung von Fetten, Seifen und Fettsäuren in tierischen Organen. Pßiif/crs Archiv. Bd. 65. S. 90 (1897). *) E. I'ßiiffer, Über die Entstehung von Fett aus Eiweiß im Körper der Tiere- Pflügers Archiv.' Bd. 51. S. 277 (1892). ^) Josef Nerking, Neue Beiträge zur Fettbestimmung in tierischen Geweben und Flüssigkeiten.' Fflügers Archiv, Bd. 73. S. 172 (1898). ^) Leo r. Liehermann und S. SzeTcelg, Eine neue Methode der Fettbestimmung in Futtermitteln, Fleisch etc. Fflügers Archiv. Bd. 72. S. 360 (1898). ') E. ^o_9rfa»o/r, Über die Fette des Fleisches. P///?//('r,s Archiv. Bd. 65. 8.81(1897) ^) E. Bogdanoir, Weitere Untersuchungen über die Fette des Fleisches. Fflügers Archiv. Bd. 68.' S. 408 (1897). ^) E. Bogdanoir, Xeuo Methode der Fettbestimmung in tierischen Substanzen. Vorl. Mitteilung. Fflügers Archiv. Bd. 68. S. 481 (1897). *") Erwin Voif, Ein Beitrag zur Methode der P'ettbestimmung. Zeitschr. f. Biol. Bd. .35. S. 555 (1897). '') Georg Rosenfeld, Zur Methodik der Fettbestimmung. Zentralbl. f. inn. Med. Bd. 21. S. 833 '(19(J0). " '^) Georg Rosenfeld, Notizen zur Fettbestimmungsmethode. Zentralbl. f. inn. Med. Bd. 26. Xr. 14 (1905).' Fettbcstimmung in OrL^aiicii. 239 Die Atifschliortiiriii' (lurcli \'('1'(1;iiiuiiü,'. durch Säure odei- Alkiili seheint die denkbar besten Resultate zu versjjreehen, und doch sind die hiermit erhaltenen Plxtraktniengen kleiner als mit anderen Methoden der zweiten Art. Außerdem wird das P'ett durch die \'erseifunf? mit KI 10 so ver- iindert. dali die Form, in der es in den Organen wirklich vorhanden ist, ganz verloren ist. Die Extraktmengen, die mit der Alkohol-Chloroform- methode erhalten werden , übertreffen alle Ergebnisse anderer \'erfaliren, wenn man dem Quantum nach urteilt. Eine zweite Schwierigkeit ist die, dal» durch alle \'erfahi-en noch an- dere Substanzen als reines Fett in das Lösungsmittel übergehen. Haben doch Lezithin, Cholesterin etc. dieselbe Lösungsfähigkeit in den Extrak- tionsmitteln wie die Fette und lösen sich außerdem in den extrahierten Fetten. P^s ist also kein Wunder, wenn in allen Extrakten Lezithin oder, wenn es verseift worden ist, dessen Komponenten, die Fettsäuren, Cliolin u. a. gefunden werden. Die Vorbereitung der Substanzen für die Fettbestimmung ist nach deren Art verschieden. Handelt es sich um einzelne Organe, wie Leber, Herz, Nicicn. Muskeln, so bedürfen sie erstlich einer anatomischen Vorbereitung. \'on ■ der Leber werden die Gallenblase und die großen Venen herausge.schnitten: es genügt, bei der gleichmäßigen Verteilung des Fettes in der ganzen Leber aus verschiedenen Leberlappen einige Stücke. 70 — 100//, abzunehmen und sie klein geschnitten bei 70 — 80'* unter mehrmaligem Emwenden im Trockenschrank lufttrocken zu machen, wozu ca. 6 — S Stunden gehören. Dann wird die trockene Substanz auf einer größeren Pfeffermühle zer- mahlen und für die Extraktion eine Menge von 5 — 20 g in die Extrak- tionspatrone hinein abgewogen, während l — 2g für die Bestimmung des Wassergehaltes der lufttrockenen Substanz bis zur Konstanz getrocknet werden (im Wägegläschen). Ist die Leber äußerst fettreich, so schmilzt bei der Erhitzung Fett heraus, das die Trocknung wie die Pulverung stören würde: da emjjfiehlt es sich, die 2 'r, Stunden getrocknete Leber — nach völliu-em Erkalten — mit Äthvläther zu übergießen, den Äther abzugießen und dann nach vorsichtigem Verjagen des Äthers fertig zu trocknen. Die Fettätherlösung wird filtriert, der Äther abdestilliert, der Rückstand getrocknet, gewogen und pro rata parte dem durch Extraktion erhaltenen Fette der trockenen Leber zugerechnet. Beim Herzen muß das ganze Epikard mit darunter liegender Fett- schicht (oft bis in die Gef ißsclieiden hinein zu verfolgen!) ausgeschnitten, die Vorhöfe l)is unter den Ansatzring sowie die Scliuenfäden und Klajjjjen abgeschnitten werden. Die Präparation der Muskeln erfordert Abtragung der Faszien und des sichtbaren Fettes, was am besten erreicht wird, wenn man den Muskel seiner anatomischen Form nach freilegt und daiui von der Faseie befreit. Das so präparierte Fleisch muli besonders fein geschnitten Averden, damit es sich leichter mahlen läßt. An den Nieren mul) das ganze 240 G. Rosenfeld. Nierenbecken mit seinen Ansätzen bis zur Grenzschicht ausgeschnitten Averden, so dal.') in der Hauptsache nur Rindensubstanz übrig bleil)t. Bei Pferdenieren ist die Ausscheidung des sichtbaren Fettes sehr schwierig. Im wesentlichen ist das Verfahren dasselbe, wenn man ganze Tiere (Hunde, Gänse, Enten) extrahieren will. Wenn sie mager sind, lassen sie sich, nachdem sie zerkleinert sind, ganz gut trocknen. Der Zerkleinerung geht zweckmäßig das Rasieren, resp. Rupfen voran. Dann wird alles von Weichteilen mit Messer und Schere grob abgetragen und zerhackt. Die Knochen werden mit dem Hackbeil möglichst zerkleinert. Auf großen Pfannen und bei öfterem Umwenden gelingt die Trocknung in mehreren Tagen. Es ist natürlich sehr angenehm, wenn man nicht das ganze Tier erst zu trocknen braucht : Wenn man nur einen Teil der Tiermasse trocknen und zur Extraktion vorbereiten will, so muß natürlich dieser Teil eine Probe des homogen gemachten Tierkörpers vorstellen. Dies gelingt auf folgende Weise: Das von Federn oder Haaren befreite Tier wird in einem Ülech- gefäß in eine um das Blechgefäß eingefüllte Kältemischung gebracht, während etwa 15 — 20 Stunden darin belassen und so ziemlich durchge- froren. Man kann jetzt die Extremitäten und andere große Teile mit dem Messer noch abtrennen, eventuell mit Zuhilfenahme der Säge, und kann in einer großen Fleischmühle die gefrorenen Tierteile mitsamt den Knochen zerkleinern. ^lan erhält auf diese Weise schließlich einen Brei , den man nur bis zur Gleichmäßigkeit zu mischen braucht, um dann seine Zusammensetzung an einer großen Teilprobe festzustellen. Die Methode ist in dieser Form nur bei mageren Tieren angängig; haben die Tiere eine sehr fette Haut, so ist es besser, sie getrennt zu verarbeiten. Sind die Tiere aber fett, so bleibt kaum etwas anderes übrig, als sie vor der Extraktion einige Tage nach der Zerkleinerung mit Alkohol über- gössen stehen zu lassen. Die Filtration und Abdampfung- des alkoholischen, oft schmierigen Auszuges ist unbequem und langAderig. Die Organmasse wird dann nach vorsichtiger Verjagung des Alkohols wie oben getrocknet. Wenn man Unterhautgewebe, Mesenterialfett oder sehr fette Organe (z. B. Haifischlebern) extrahieren a\111, so nehme man entweder nur so wenig wie möglich Substanz, da man sie doch erst in Alkohol kalt oder am Rückflußkühler behandeln muß , um die Filtration und Alxlampfung sich durch die Verwendung- geringer Mengen zu erleichtern, oder man kann diese Substanzen in etwas größerer Menge ausschmelzen. Das geschieht, indem man sie auf einen Filter bringt und das Fett in ein darunter stehendes Becherglas hineinfiltriert, wenn man die ganze Vorrichtung im Trockenschrank erwärmt. Da das Fett auch in den Depots nicht frei, sondern in Zellen eingeschlossen liegt, bedarf es nicht gar zu niedriger Temperaturen, um das Fett filtrationsfähig zu machen. Der Rest, die Grieben, werden dann in Alkohol ausgekocht. Der alkoholische Auszug wird hier- auf a])gedampft und getrocknet. Fettbestiniiming in OruMiion. 241 Beim Ti'ockncii findet, wenn die Luft Zutritt hat, eine Erhitzung des Fettes statt, die eine \'ernieiiruni: der niederen Fettsäuren auf Kosten der hohen Fettsäuren zui* Foliic liat : aucii tritt eine iJildunii von ( Ixysäui'on auf. Darum ist kalte Troeknunii' empfohh'n worch'U. inih'Ui kleine Memmen Substanz im Exsikkator i>etroeknet werden. o(h'i' die Substanz erst, in Alkohol durch mehrere Tai^c kalt stehen ^-elassen. \'om Wasser befreit wird. Sehr zweekmälUi^- ist es auch, die atinos|)härisehe Luft auszuschlielien. indem die Substanzen in Troekenscliränken. die mit Leuchtgas j^'efüUt sind. L;e- trtx'knet wei'den. Nachdem das zu i'xtrahierende lufttrockene l'nlver'i so vorbereitet ist, wird es der FAtraktion unterworfen. Von Kxtraktiousmethoden kommen in Fraise: die .Uheicxtraktion na(di Soxhlct, dk' LicbcrDiann^chc KHO-Aufschliel'iuniüsmethode und die Rosm- feldsvho Alkoholchloroformmetiiode. Die einfache Ätherextraktion liefert, bis in un^emesseue Stunden tort- gesetzt. ni(dit die gesamte in einer Substanz vorhandene Fettmasse. Neben- bei ist das Extrakt auch nicht N-frei, wie es überhaupt kein F.xtrakt ist. Somit wäi'e sie stets als ungenau zu verwerfen. Für einen Zweck wende ich sie aber oft an: wenn es gilt, näher, als das ein mikroskoi)isches Präparat kann, den \'erfettung.sgrad der Le])er in Zahlen au.szudrücken. so extrahiere ich die Leber des Hundes - — aber nur dieses Organ — und nur 4 Stunden mit Äthvläther. Da ich durch vielfache rnter.suchungen weil.^, daß die Leber des hungernden Hundes ca. 10% t'^tt (9 — 12"'„) in der lufttrockenen Substanz enthält, so ist die Tatsache, dat'i bei 4stün(liger Atherextraktion 15 — 20— 25 — 750/0 Fett gefunden werden, für viele Zwecke ausreichend orientierend. Der erhaltene in Äther gelöste Extrakt wird ab- gedampft, in reti'oläther gelöst, filtriert, der Feti-oläther verjagt. Fni die Luft von tlem sehr eingeengten Extrakte zuerst schützt ge- wissermalien die Ätheratmosphäre — abzuhalten, kann man die letzte Ein- (lani])fung auf dem Wasserbade im Erlenmeverkölbchen dem l'liilipps- becher — .so vornehmen, dal') man es mit einem dop])eltdurchbolirten (iummi- stöpsel verschlielU und durch den Kolben das Leuchtgas hindurch gehen läßt, das unter dem Wasserbade brennt. Es dürfen nur ganz geringe Mengen von .\ther odei' reti'oläther dem (läse beigemischt werden, dai-um mäßige Ei'hitzung. Diese Trocknungsmethode ist darum sehr gut. weil man den Extiakt. ohne O.xydation befürchten zu müssen, längere Zeit trocknen kann. Die Liebermann^vho Methode schliel'tt das Organpulver eist in Kali- lauge auf; die Vorschrift ist folgende: 5^ Substanz werden mit :\{) rm^ öOVoi.U'f'r Kalilauge auf Asbestpai)pe eine halbe Stunde in einem weithalsigen Kolben gekocht. Der Kolben hat unten an dem ;>•() cii/ weiten Halse eine Marke für 240 cm 3, der Hals ist ca. 20 o// lang. Dann wird die aufgeschlossene ') Es wiirc cmpfcliloiiswert, mit calisolut trockener Siijistanz zu arltcitoii. tun wa.-sei- lösliclie Stoffe auszusehlicßen, alier liei der Extraktion zielit das Orgaiipulver etwas Wasser an. Abde rbald i'ii , Haiulbiu-li dor biochnmiscben Arbeitsmethoden. II. ICi 242 ^^- Rosenfeld. Siibstaii/ (nicht iiuiiier ist alles aiitsrhließ1)ar !) abgekühlt. Jetzt werden 30 cut'-^ 90— 94"/ „igen Alkohols zugesetzt. I )as Gemisch wird hierauf etwa 10 Minuten lang erwärmt. Jetzt wieder abkühlen und vorsichtiger Zusatz von 100 cni^ 20''lf,\g^v Schwefelsäure (unter Umschwenken). Über die erkaltete Flüssigkeit schichtet man genau bO on'^ Petroläther (der beim Abdampfen keinen Rückstand hinterlassen darf), verschließt den Kolben mit einem weichen Stöpsel und schüttelt, ohne den Stöpsel zu lüften, alle 1 — 2 ^linuten 10 Sekunden lang, was man :)()nial wietlerholt. Nun füllt man mit gesättigter Kochsak- lösung soweit auf, daß die Flüssigkeit unter dem Petroläther bis Marke 240 steht, schüttelt noch einige Male und läßt dann am kühlen Orte stehen. \'on dem Petroläther werden 20 c/yr^ abpipettiert, mit -iO cm"- säurefreiem 90"/ oigem Alkohol und 1 cni^ einer 1 "/oigen Phenolphthaleinlösung versetzt und mit alkoholischer jL-NormalkaUlauge titriert. Der Petroläther + Alkohol + Phenolphthalein wird abgedampft, ge- ti'ocknet. gewogen. Die Berechiumg geschieht nach der Formel „ /S - 0-01 — (K X 0-0025ö)\ ^ = l a ) L>50, dabei ist F der Fettgehalt in Prozenten. S = der Rückstand. K = die zur Titrierung verbrauchten Kubikzentimeter y^^-Kahlauge. a = die angewandte ^lenge der Substanz in (jlrammen. Die Methode ergil)t etwa gleiche Werte mit der einfachen Äther- extraktion. Sie enthält in der Rechnung den Fehler, daß alle titrierten Säuren als Triglyzeride berechnet werden, als welche sie — z. B. Essig- säure — gar nicht vorkommen. Die liosenfeld^che Alkohol-Chloroformmethode ist sehr einfach. Man kocht in einem kleinen P»eclierglase die in einer Patrone befindliche Substanz, 5 — 20^ des trockenen Pulvers, über der man die Patrone mit einem dünnen Faden ^) zugebunden hat — damit nachher im Chloroform die spezifisch leichtere Substanz nicht auf und nieder taucht — , V4 Stunde, wobei man dafür sorgt, daß der Alkohol nicht ganz verdampft — dann wird die Patrone mit der Substanz herausgehoben, abtropfen gelassen und in das Extraktionsrohr eingeführt. Dann wird mit Chloroform 6 Stunden lang extrahiert, und wiederum V4 Stunde mit Alkohol in einem zweiten Becherglase gekocht. Hierbei ist achtzugeben, daß das Becherglas bis zum Sieden des Alkohols ein wenig umgeschwenkt wird, weil sonst die Substanz stark zu stoijen pflegt, was zu ^>rhlsten führen kann. Dann wieder herausheben, abtropfen lassen und im gleichen Extraktionsrohr mit demselben Chloroform noch (5 Stunden extrahieren. Zum Schluß Avird das Chloroform abdestilliert und der Alkohol aus den beiden Bechergläsern abgedampft. Die Rückstände werden in absolutem Äther aufgenommen und M Nicht zu (licht über dem Pulver, damit hei etwaiger Quellung des Pulvers die Patrone nicht zerreißt. Fettbestiininiiii<4 in Ortrancii. 243 in ein ,üowoi>enos Kölbchon ahfiltricrt. IW'iiii Filtrioren liibt es oinon kleinen »escliickten Trick: das Fett zielit sieli. wie bekannt, bis zum Hand des Filters in die Höhe. Wenn man es nielit mit einij^en Tropfen Äther hermiterspülen kann, so schneidet man mit Pinzette und Schere den Filterrand ab und legt ihn in die Spitze des Filters, wo er nun leicht auszu- waschen ist. Wenn man nun noch in den Extrakten die verseifbaren Substanzen, also die eii^entlichen Fette (vielleicht + Lezithin), von den unvei-seifbai-en trennen will, um die Extraktmeng'e an verseifbarem Alatei'ial zu bestimmen, so verfiihrt man fol^endermai'ien. 2 — 4r/ Extrakt kocht man mit ca.;)// Kahhydrat und öO r/ nach Wallüt i>ereinii>tem Alkohol 1 Stunde am Ilückflul)kühler. Nachdem so alles Verseifbare verseift ist, verdampft man den Alkohol und kocht den Ivückstand mit 100 — 150 . welehe der Isoherunii' der hoclimolekuiareu Alkohole vorauzuiieheu hat, geschieht iui allgemeinen durch Kochen mit alkoholi.scher Kalilauge. Hat mau kleinere Fettmeug(>u zu untersuchen, so verwendet man wie bei der Bestimmung der Vei'seifungszahl auf i' 7 Fett •2')c/y/:' halb- normaler alkoholischer Kalilauge und kocht eine \ iertel- bis halbe Stunde. Uei gröltereu Mengen Fett wiegt man die entsprechende Menge Kalihvdi-at (auf 100// etwa ."»0// Kaliiun hvdriciim) ab, löst sie in tlrv etwa einein- halbi'achen Menge Wasser, übergießt das Fett in einem Kolben mit der zehnfachen Menge Alkohol, trägt das gelöste Kalihydrat ein und erhitzt auf dem Wasserbade am Üiickflußkühlei- etwa eine Stunde zum Sieden. Nach A. Kossc/ und li. Oheriiti'üler^) kann mau auch mit Xatrium- alkoholat \'erseifi'n (si(die unten). Das A'erfahren ist teurer und scheint meistens keine wesentlichen \'orteile zu bieten. Hat man größere Mengen eines Fettes oder Wachses auf hochmole- kulare Alkohole zu verarbeiten, so empfiehlt es sich, nach der \'erseifung mit alkoholischer Kalilauge die Hauptmenge der Fettsäuren aus der alko- holischen Lösung abzusclieiden. Man kann zu diesem /weck die alkoholische Lösung mit Salzsäure neutralisieren und mittelst Chlorcalcium die Fettsäuren al< Kalksalze fällen oder man setzt die berechnete Menge liarytlivdrat. die man in heil.tem Wasser gelöst hat. hinzu und neutralisiert mit (hu* berech- neten Menge Essigsäure. .\iuh eine Verseifiing mit einer methylalkoholischen Itarytlösung im Itiuckgefäi) wäre gelegentlich zu versuchen. Die hochmolekularen .\lkohole köinien sich, wenn sie. wie in den Wachsarten, in giiilierer Menge V(M-handen sind, schon beim \ Crseifen aus der alkoholischen Lösinig ausscheiden und durch .Vbfiltriei'en gewinnen lassen. In manchen Fällen scheiden sich beim \'ei'seifen auch in .Vlktdiol schwerlösliche Kaliseifen aus, denen sie erst durch Deliaudeln mit Äther u.a. entzogen werden müssen. ') Kino neue Motliode zur Versoifuii^' von P'cttsäureätliprii. Zoitsclir. f. pliysiol. ehcmic. Bd. 14. S. 5<)',) (18'.)U): Hti. 15. S. 321 (18V)1). 240 F. Röhmann. Ist die Menge der hochmolekularen .Vlkohole geringer, so Averden sie heim \erseifen mit alkoholischer Kalilauge durch den Alkohol und die Seifen in liisung gehalten. Vm sie zu gewinnen, verfährt man wie l)ei ihrer lU'stimmung nach S. 21S. Weniger empfehlenswert ist im allgemeinen die ältere Methode, bei der z. 11 Cholesterin aus der wässerigen Seifenlösmig. also nach Verdunsten des Alkohols und Lösen des Rückstandes in Wasser, mit Äther ausgeschüttelt wurde. Hat man die Seifen als Calcium- oder Barvtseifen abgeschieden, so ist das Filtrat der Seifen nach dem Einengen mit Äther odei- Petroläther zu extrahieren, zugleich sind aber auch den Seifen die mituerissenen lUkohole zu entziehen. Man kocht sie mit Alkohol aus, engt die alkoholischen Extrakte ein und schüttelt diese nach Zusatz der entsprechenden Menge Wasser mit Petroläther. Die weitere Untersuchung auf hochmolekulare Alkohole geht fol- gendermaßen vor sich: Man prüft zu- nächst den Äther bzw. Tetrolätherrück- stand auf Seifen. Hierzu verascht man eine kleine Menge auf einem Tlatin- löffel, löst den häufig kaum sichtbaren Ptückstand in wenig Wasser und sieht, ob er rotes Lakmoidpapier bläut bzw. ob er Peaktion auf Calcium oder P)arvum gibt. Bei Anwesenheit von Kaliseifen löst man den Rückstand noch einmal in Petroläther und schüttelt mit Wasser oder verdünntem Alkohol, pjithält der Ätherrückstand Calcium- oder Barvum- seifen, so hat man ihn nach dem Lösen in Petroläther erst mit verdünnter Salzsäure und Wasser, dann mit ver- dünntem Alkali zu schütteln. In dem seifenfreien Rückstand bestimmt man den Schmelzpunkt. p]ine Probe kristallisiert man aus heißem Alkohol und untersucht die sich ausscheidenden Kristalle unter dem Mikroskop (siehe P'ig. '2i'} u. 2S) im Tageslicht und im polarisierten Licht. Hat man genügende Mengen Substanz, so bestimmt man das Drehungsvermögen und die Jodzahl und führt in das Acetat über. Man bestimmt die Acetylverseifungszahl. Aus dem \ev- gleich der letzteren mit der Jodzahl erfährt man, ob neben jodbindenden hochmolekularen Alkoholen, z. B. Cholesterin, andere nicht jodbindende Al- kohole vorhanden sind. Weiterhin stellt man sich durch Erhitzen mit den Säurechloriden Ester dar, besonders das Benzoat, und untersucht diese (vgl. Lsocholesterin S. 255). Fig. 25. Apparat zur Bestimmung hochmolekularer Fett- alkohole nach Hi Baro- meterstand. Das Gas wird unter Berücksichtigung der Tension des Wasserdampfes feucht gemessen. Besser ist es, das Gas zu trocknen, indem man das Rohr / länger wählt und über die Luftverdrängungsröhre Je noch eine Schicht stark geglühten Natron- kalks bringt. Die Menge des Wasserstoffs ist das Maß für die Menge der Fett- alkohole. Phithält das Fett bzAv. das Wachs nur einen bestimmten Alkohol, so läßt sich aus dem gewonnenen W^asserstoff seine ^lenge berechnen. Kohlenwasserstoffe, die, wie in manchen Wachsarten, neben Fett- alkoholen vorhanden sind, finden sich in der Kalischmelze und lassen sich ihr durch Extraktion mit Äther u. a. entziehen. Hierbei ist nur zu be- achten, dal) bei etwas höherer Temperatur aus den Salzen der Fettsäuren durch Erhitzen mit Alkahen auch Kohlenwasserstoffe entstehen: ir . C0( ) K -f K OH = THi -r Vi K K,. Cholesterin wird beim Erhitzen mit Alkalien nur wenig angegriffen. Leirkoirifsch'^) benutzt dies zur Trennung von Cholesterin und Fett- alkoholen. Das Erhitzen mit Kali dic^nt auch zur Iden tifizierung der Fctt- alkohole. Man erhitzt wie bei der Methode von HcU mit Kalikalk und zerlegt die Schmelze mit Salzsäure. Die Fettsäure wird abfiltriert uiul durch Umkristallisieren aus Ätheralkohol uereiniüt. Cholesterin und Kohlen- *) t'ber eine Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts und (U-r Atomig- keit höherer Fettalkohole. Ann. d, Cliem. u. Pharm. Bd. 223. S. 269 (1884). '-') Siehe rbhcJohdr, Handbuch d. Cliemie u. Technologie d. (")le und Fette. I,eipzig 1908. S. 291. ') Handbuch. I. S. 413. 248 F. RöhniaiiD. Wasserstoffe bleiben in der Mutterlauge. Es wird sich aber wohl stets emjjfehlen. die Säure noch einmal in ein Salz überzuführen und dieses mit heißem Alkohol, Äther oder Petroläther zu behandeln. Übcrfiihrnna: von O k tadezy lalkohol in Stearinsäure.^) 2// Oktadezyl- alkohol wurden etwa 20 Stunden mit 8 r/ Natronkalk auf 270— 280"^ erhitzt. Die Masse wurde mit Alkoliol verrieben und unter Erwärmen mit Salzsäure behandelt, dann mit Wasser verdünnt und abkülilen gelassen. Die rohe Stearinsäure wurde mit Wasser ge- waschen, in Methylalkoliol gelöst und durch methylalkoholische Barytlösung als Baryum- salz gefällt. Dieses wurde mit Äthylalkohol ausgekocht, dann mit Salzsäure zerlegt und mit Äther aufgenommen. Die ätlierische Lösung wurde mit Wasser geschüttelt, der Äther filtriert und der Ätherrückstand aus Alkohol umkristallisiert. lune andere Methode zur Feststellung der Natur eines Fett- alkohols beruht darauf, daß man seinen Palmitinsäureester bei erniedrigtem Druck destilliert und den hierbei gebildeten ungesättigten Kohlenwasser- stoff mit dem entsprechenden bekannten Kohlenwasserstoff vergleicht"-): ('„ H.,„ + a . COO . a H,„ + i = C„ H.3, + C„, Ho,n +1 - COOH. b) Cholesterin und Phytosterin. Zur (iewinnung von Cholesterin und Phytosterin kann man die Seifenlösung mit Wasser verdünnen und mit Äther schütteln. Hierbei bilden sich leicht äußerst lästige Emulsionen. Um sie zu vermeiden, muß man mit ganz bestimmten Mengenverhältnissen arbeiten. Verfahren von A. Bömer.^) öO (/ Fett werden in einem Erlenmeyerkolben von etwa 1 / Inhalt auf dem Wasserbade geschmolzen und mit 100 rr«^ alkoholischer Kali- lauge (200// Kalihydrat in 1 / Alkohol von 70" Tr.^) auf dem kochenden Wasserbade am Rückflußkühler — als solcher kann ein etwa ^ '^ m langes, hinreichend weites Glasrohr dienen — verseift, wobei man anfangs häufig und kräftig umscliüttelt, bis der Kolbcn- inhalt beim Schütteln klar geworden ist, und dann noch eine halbe bis eine Stunde unter zeitweiligem t'mschütteln die Seife auf dem Wasserbade erwärmt. Darauf gibt man die Seifenlösung noch warm in einen Scbütteltrichter von etwa 1 bis l^j^ l Inhalt und spült die im Kolben verbliebenen Seifenreste mit 200 cin^ Wasser in den Schüttel- trichter. Xachdem die Seifenlösung hinreichend abgekühlt ist, setzt man 500 cw^ Äther hinzu und schüttelt den Inhalt etwa eine halbe bis eine Minute unter mehrmaligem Öffnen des Hahnes oder Stopfens kräftig durch. Nachdem die Mischung 2 — 3 Minuten der Ruhe überlassen ist, hat sich die Ätherlösung vollständig klar abgesetzt. Man trennt sie in der üblichen Weise von der Seife, filtriert, wenn nötig, um etwa vorhandene ge- ringe Wassermengen zu entfernen, in einen geräumigen Erlenmeyerkolben und destilliert den Äther nach Zusatz von 1—2 Bimssteinstückchen ab. Die Seife schüttelt man noch 2- oder 3mal in derselben Weise mit 200 — 250 c>»^ Äther aus, gibt die Ätherlösung ') Dumas und Stas, Ann. d. (hem. u. Pharm. Bd. 35. S. 129 (1840). — F. L'ök- niann. Über das Sekret der Bürzeldrüsen. Hofmeisters Beiträge z. Physiol. Bd. 5. S. 116 (1U04). '-) F. Krctfit , Darstellung höherer Olefine. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 16. S. 3018 (1883). ^) Zeitschr. f. Unters, d. Nahrungs- u. Genußm. Jg. 1898. S. 38: siehe auch E. Scd- kowski, Über die Isolierung des Cholesterins aus Fetten. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 57. S. 515 (1908). •*) Es empfiehlt sich, Alkohol und Kalilauge erst vor dem (jehrauch zu mischen, und zwar 30 cm'^ Kalilauge, 2 : 3 AV asser und 70 cm^ 957oigPn Alkohol. Untersuchung auf hochmolekulare Alkohole. 24!) jedesmal zu dorn Destillationsrückstand der vorhersfchenden Ausschüttelun i:^/>. E. Ritter^) löst zur Dar- ^~- '"' - ^^^^'f stclhmg von Cholesterin und riiytosterin 50 g Fett in einer Porzellanschale auf dem Wasserbade in 100 ('>/<3 Alko- hol und fügt zur Yerseifung -^^<^c,iSäSä.£--- nach Kossei- Oher in ü//er-) Sg Fig. se. Natrium, die zuvor inl(30(';yi'3 choiesteiin. Alkohol gelöst worden waren, hinzu. Die Seife wird auf dem Wasserbade erwärmt, bis der Alkohol eut- wichen ist. Dann fügt mandas etwa eineinhalbfache (iewicht des verwendeten Fettes an Kochsalz und soviel Wasser hinzu, dal5 sich der Inhalt der Schale ganz oder zum größten Teile auflöst. Es wird nun unter häufigem T^mrühreu zur Trockne verdampft, erst über kleiner Flamme, daun auf dem Wasser- bade, schließlich im Trockenschrank bei etwa 80». .Man bringt die :Masse allmählich, indem man noch weiter im Trockenschrank, schließlich im ') E.Ritter, tJber die Methoden, die zur Abscheidung der Cliolesterine aus den Fetten und zu ihrer quantitativen Bestimmung verwendbar sind. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 34. S. 448 (1901). -) A. Kossei und K. OheymüUer , Eine neue Methode zur \erseifung von Fett- säure-Äthern. Zeitschr. f. physicd. Chemie. Bd. 14. S. 599; Bd. 15. S. 321 (1891). 250 F. Röhniann. Exsikkator über Schwofolsäiire trocknet, in riüverforin und extrahiert in einem geräuniio-en Soxhletapparat <) Stunden mit Äther. Man gießt dann den Atherextrakt in einen trockenen Erlenraeyerkolben von ^4 — 1 '' In- halt. Der Äther wird ahdestilliert und der Destillationsriickstand in ganz wenig Alkohol gelöst. Alsdann gießt man unter Umschwenken nach und nach soviel Wasser zu, bis der Erlenmeyerkolben annähernd gefällt ist, bringt die gefällte Substanz auf ein Papierfilter und wäscht mit reinem Wasser etwas nach. Zur Trennung des Thytosterins vom Stigmasterin benutzte Windaus die verschiedene Löslichkeit, welche die Bromverbindungen der Acetate zeigen, nachdem schon früher die LösUchkeit des Cholesterin- bromids in Pctroläther zui' Trennung vom Koprosterin benutzt worden war. 1) Das Cholesterinbromid ist aber bei weitem weniger beständig als das Broinid des Acetates , so daß die Bromierung der Acetate stets dei' direkten Bromierung vorzuziehen ist. wenn man das Cholesterin, ähnlich dem Stigmasterin, von anderen hochmolekularen Alkoholen trennen will. Trennung des Phytosterins vom Stigmasterin nach JViiidaus und A.lhnith.') Das aus der KalabarlMilme gewonnene Rohphytosterin wird in der üldicheu ^yeise mit Essigsüureanhydrid acety- liort. 20 // getroclvnetes Acetylprodukt werden in 200 cdi'^ Äther gelöst und mit 250 ciii'^ einer Brom-Eisessig- miscbung versetzt (bg Brom in 100 f////* derbe Eisessig). Alsbald fielen kleine Kristalle aus, die nach zweistündigem Stehen der Lösung abfiltriert wurden. Sie l)estanden aus dem Tetrabromid des Stigmasterinacetats. Das Filtrat enthalt das Bromadditionsprodukt des Phytosterins. Zu seiner Darstellung wird die Lösung in kleinen Portionen mit 200 f/ 47oigeni Natriumamalgam versetzt und darauf nach dem Entfernen des (Quecksilbers und dem Abdestillieren des Äthers noch mit 10// Zinkstaub zwei Stunden am Rückfluß ge- kocht. Nach dem Abfiltrieren des Zinkstaul)s wurde das Acetat durch Zusatz von Wasser ausgefällt und durch vierstündiges Kochen mit 200 ciii'^ einer lO'Voigeii alkoholischen Kali- lauge verseift. Beim Abkühlen der Lösung fielen glänzende Kristallldätter aus, deren Menge beim vorsichtigen Zusatz von Wasser noch vermehrt werdeu konnte. Fig. 27. Kristallfomien des Cholesterins aatli .1. Bömei-. ü) Cholesterin. Cholesterin, Co^H^sfÜH) oder C27H43(OH), ist unlöslich in Wasser, löslich in \) Teilen siedendem Alkohol von 0-84 spez. Cew.. ;rh:^ Teilen kochendem Alkohol von spez. Gew. 0-82, ist leicht löslich in Äther, Chloroform. Schwefelkohlenstoff, weniger in Petroläther. Kristallisiert aus Chloroform, seidengiänzenden Nadeln, wasserfreiem Äther oder Essigäther in feinen 0 St. Bondzi/nski und V. llionnicki. Über das Schicksal des Cholesterins im tieri- schen Organismus. Zeitschr. f. pbysiol. Chemie. Bd. 22. S. 407 (189fi). ^) A. WiHd<(us w. A. llaulh , Notiz über Phytosteriu. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 40. S. 3G81 (1907). — A.llauth, Zur Kenntnis des Phytosterins. Inaug.-Diss. Frei- burg i. B. 1907. Untersiicliuiig auf hochmolekulare Alkohole. 251 ans heißein, 94''/oit>e]n Alkohol in j^roßen, ..rhombischen Tafeln"') (siehe Fiy. 27) mit einem Molekül Kristallwasser, das in trockenci' Lnt't odci- hei 100° (' verloren i>eht. Schnielzj)Hnkt 147'r)'' (nnkorr.j |'/| I) für wasser- freies Cholesterin in 2 — er C'hlorofonnlösnnii' - -.'WrC)" + 0-249 p'M. in 2Voigei' ätherischer Lösun{>' ol-12", in üVoigci" ätherischer Lüsuiii^' -^29-(U''. (R. Burian). Reaktionen. 1. Ihinut man nnter dem Mikroskop /.ii ("holesterin- kristallen Schwefelsänre (1 Teil konzentrierte Schwefelsäni'e niid 2 Teile Wasser), so schmelzen diese, indem sich die Rändei- zuerst f>ell) bis gelbrot färben. Durch Schwefelsäure und etwas Jodjodkalinmlösun;^' färben sich die Kristalle violett, blau iirün oder rot. 2. E. Salkoivskis Probe. Löst man Cholesterin in {'hloroform und füut konzentrierte Schwefelsäni-e hinzu, so fjirbt sich die Chloi'ofoi-ml(isuni>- schnell kirschrot. Die darunter befindliche Schwefelsäure zeigt grünliche Fluoreszenz. 3. C. Lieheriiiann-Burchards Probe. Cholesterin wird im trockenen Reagenzglase in wenig Chloroform und einigen Tropfen Essigsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wird unter Abkühlen tropfenweise mit reiner konzentrierter Schwefelsaure versetzt. Sie wird zuerst rosenrot, doch verschwindet die Farbe schnell, um auf Zusatz einer neuen kleinen Menge Schwefelsäure einer schönen, ziemlich beständigen Blaufärbung Platz zu machen. Ester des Cholesterins^): Acetat, Schmelzpunkt 114—114-4, |7|I) in Chloroformlösung — 4:}-2<'. Dromcholesterinacetat, Schmelzpunkt lir)-4 bzw. 117-6. dimorph, [-/JD— 45". Es lösen sich in 100 Teilen V)4'Voig<'ii Alkohols l'l'l (j Cholesterin, 2-2 ^ Cholesterinacetat, 0-;35^ IJromcholesterin- acetat (Chosaburo-Kusumoto). Das Bromcholesterinacetat ist bestiindig. während das Cholesterindibromid allmählich verharzt. Das Benzoat schmilzt bei 145-5" zu einer trüben durchscheinenden Flüssigkeit, bei weiterem Erhitzen wird diese bei 178-5" plötzlich klar. Beim Abkühlen wird die Schmelze vorübergehend tiefblau, dann ti'übe. noch einmal violettblau und erstarrt unter VerscliAvinden der Farbenerscheinung. Ahn- lich verhalten sich beim Abkühlen auch das geschmolzene Acetat und be- sonders das Propionat. Das P)enzoat ist schwer löslich in Äther, noch schwerer in Alkohol, leicht in Schwefelkohlenstoff. Es kristallisiert in rh()nd)isclien Oktaedern. ^) Das Zinnamylat kristallisiert in charakteristischen Tafeln, Schmelz- punkt 14!»". ■') ') Vgl. A. Bönier, ('ber CJewinnung und Kristallformen von Cholesterin und l'iiUo Sterin aus Fetten. Zeitschr. f. Unters, d. Nahrungs- u. Genußm. Jg. IWM. S. 41. -) Hesse, Über Phytosterin und Cliolesterin. Ann. d. (liemii^ u. Pharm, ßd. 1U2. S. 17ö (I87S). '■'} F. h'rinilzcr, Beiträge zur Keiuituis des Cliolesteiins. Monatsh. f. Ciiem. Bd.D. S. 421 (1888); A'. Obermüller , Weitere Beiträge zur (luantitntivcii Bestimmung des Cholesterins. Zeitschr. f. physiol. Cliem. Bd. 16. S. 143 (ISUl). *) Kristallographische Untorsuchuniren von A. Fock, sielie A'. Ohrnniillrr. Inaug - Diss. Berlin 1892. S. (i2. ^) St. BondzynsTci und C. l/iiuniicki. ri)er das Schicksal des Cholesterins im tieri- schen Organismus. Zeitschr. f. pliysi(d. Ciiem. Bd. 22. S. 403 (18'.U)). Andere Ester siehe K. Obcrmiiller, Beiträge zur Keiuitnis des Cholesterins. Inaug. -Diss. Berlin 181)2. 252 F. Röhmanii. C"liolestenii)aliiiit;it: Man cihit/t 1 Teil Palmitinsäure mit 3-5 Teilen L'hok'sterin o Stunden auf 180—200", löst in Äther unter Erwärmen und fällt mit 94o/oi^"Pni Alkohol. Den Niederschlag kristallisiert man aus Äther- alkohol um. Schmelzpunkt T7"5". Cholesterylstearat wird wie das Palmitat dargestellt. Schmelziiunkt 82". Palmitat und Stearat sind schwerer löslich als das Oleat. C'holestervloleat: Man erhitzt 1 Teil Cholesterin mit o Teilen Ölsäure in einer Kohlensäureatmosphäre 3 Stunden auf 170". Nach dem Erkalten fügt man Alkohol zu dem Gemisch. Das Oleat scheidet sich als Sirup aus. der bald kristallinisch erstarrt und sich durch rmkristallisieren aus Ätheralkohol leicht reinigen läßt, i) Schmelz- punkt 41—45" [a] D— 18-80. Die Reaktion der Fett- säurecholesterinester mit C'hloro- form und Schwefelsäure verläuft ähnlicli wie beim Cholesterin, jedoch nach E. Salkoirski mit dem Unterschied, daß die Pur- purfärbung l)zw. kirschrote Fär- bung des Chloroforms nicht zur Entwicklung kommt ; die Fär- )ung bleibt vielmehr ein stumpfes Pot. Auch die Reaktion mit Jod und Schwefelsäure zeigt gewisse Unterschiede (C. Hilrtlüe). Darstellung von Cho- lesterin: a) aus Gallensteinen. Die Steine werden zerrieben und mit Äther extrahiert. Der Äther- rückstand wird aus siedendem Alkohol umkristallisiert ; h) aus Gehirn: Das frische Organ wird fein zerkleinert und mit etwas Sand und der dreifachen Gewichtsmenge Gips gemischt. Nach einigen Stunden erhärtet das Ganze zu einer festen Masse, die leicht zerrieben werden kann. Sie wird wiederholt bei Zimmertemperatur mit Aceton extra- hiert. Der nach Abdestilheren des Acetons erhaltene Ilückstand wird aus Acetonalkohol umkristallisiert. -) Fi?. 2S. Phytosterin nach J. Marcusson. ^) F. Böhiiiroin, Anleitung zum chemischeu Arl)eiten. Berlin 1904. S.63; ('. Hiir/liJr, Über die Fettsäure-Cholesteriuester des Blutserums. Zcitsehr. f. physiol. Cliem. Bd. 21. S. 349 (1895); E. Salkoivski, Arbeiten aus dem path. Institut. Berlin 1906; H. Prihrum, Beitrag zur Kenntnis des Scliicksals des Cholesterins und der Cholesterinester im tieri- schen Organismus. Biochem. Zeitschr. Bd. 1. S. 413 (1906). ^) 0. Eosenheiin , On the preparation of Cholesterin from brain. Zentralbl. f. Physiol. Bd. 20. S. 188 (1906); siehe auch B. Bilnz, Zeitschr. f. physiol. Chem. Über das Vorkommen von Cholesterinestern im Gehirn. Bd. 46. S. 48 (1905). Untersuchung auf hochmolekulare Alkohole. 253 Schmelzpunkt 187"5|a|I) i h) Phytosterine. Phytosterin (Sitosterin) Csv H43 ÜH oder 0,^ H,5 OH, kristallisiert aus Alkohol in äulierst dünnen, meistens etwas lan^L;ezof>enen Tafeln mit 1 Molekül Kristalhvasser (siehe Fig. 21») aus Äther in wasserfreien Nadeln.') 20 Vb^l^igQV ätherischer Lösung — 26*7'V in Chloroform — :);V91". Das Phytosterin gibt sehr ähnliche Farbenreaktionen wie das Chole- sterin. Ester des Phytosterins: Acetat : Schmelzpunkt 127". Penzoat: Schmelzpunkt 145-5". Es kristaUisiert aus Ätheralkohol in rechtwinkligen Täfel- chen, die im Unterschied zu den quadratischen des Cholesterinbenzoats länger als breit sind. Geschmolzenes Sitosterinacetat und -benzoat zeigen beim Abkühlen kein Farbenspiel. Phytosterinacetatprobe.^) Das aus 50 oder besser aus 100 // Fett gewonnene Rohcholesterin löst man in möglichst wenig absolutem Alkohol und führt es unter Nach- spülen mit geringen Mengen Alkohol in ein kleines Kristallisationsschälchen über und läßt kristallisieren. Man prüft die Kristalle mikroskopisch, verdunstet dann den Alkohol vollständig auf dem Wasserbade, setzt 2—3 rm' Essigsäureanhydrid hinzu, erhitzt, unter n A ^ c /^^ ^ < — » V ^ Fig. 29. Kristallformen des Phytosterins nach A. Bömer Bedeckung des Schälchens mit einem Uhrglase auf dem Drahtnetze etwa eine Yiertel- minute zum Sieden und verdunstet nach Entfernen des Uhrglases den Überschuß des Essigsäureanhydrids auf dem AVasserbade. Darauf erhitzt man den Inhalt des Schälchens unter Bedeckung mit einem Uhrglase mit soviel absolutem Alkohol, wie zur Lösung des Esters erforderlich ist und überläßt die klare Lösung — bis zum Erkalten auf Zimmertemperatur unter Bedeckung mit einem Uhrglase — der Kristallisation. Nachdem die Hälfte bis zwei Drittel der Flüssigkeit verdunstet und der größte Teil des Esters auskristallisiert ist, filtriert man die Kristalle durcli ein kleines Filter ab und bringt den noch in der Schale befindlichen Rest mit Hilfe eines kleinen Spatels und durch zweimaliges Aufgießen von 2 — 3 cm^ 95" gigem Alkohol gleichfalls auf das Filter. Den Inhalt des Filters bringt man wieder in das Kristallisationsschälchen zurück, löst denselben je nach seiner Menge in 2 — 10 cw^ absolutem Alkohol und läßt wiederum *) E. Salkowski, Beiträge zu den Untersuchungsmethoden des Lebertrans und der Pflanzenöle. Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 26. S. 557 (1887); li.Buridii, Monatsh. f. Chem. Bd. 18. S. 551 (1897); Ä. Büiiier, Zeitschr. f. Unters, d. Nahruugs- u. Genußmittel. S. 45. 1898; E. Bitter, Beiträge zur Kenntnis des Sitosterins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 34. S. 466 (1901). 2) E. Salkowski, Zeitschr. f. analyt. Chem. Bd. 26. S. 557 (1887). ->54 F. Röhmaun. kristallisieren. Nachdom der größte Teil des Esters auskristallisiert ist, filtriert man abermals ab und kristallisiert weiter in derselben Weise solange um, wie die Menge des Esters ausreicht. Von der dritten Kristallisation an bestimmt man den Schmelzpunkt des Esters und wiederholt diese Bestimmung bei jeder folgenden Kristallisation. Schmilzt das Estergemisch oberhalb 116" C, so kann es Phytosterinacetat enthalten. Stii^mastcrin M, C30 H48 0 oder C30 H^,, <>, kristallisiert wie das Phyto- sterin mit 1 Molekül Ivristalhvasser , ist dem Phytosterin isomorph und 21 bildet mit ihm Mischkristalle. Schmelzpunkt 170", ['/]D in Chloroform — 45-01, in Äther — 44"67". Es gibt die Farbenreaktionen in gleicher Weise ^^^e Cholesterin. Zu seiner l)arstelhmg wird das Tetrabromacetat, das, wie oben beschrieben, aus dem Extrakt der Kalabarlxthne gewonnen wurde, aus heiliem Chloroform unter Zusatz von Alkohol umkristaUisiert und durch Kochen mit Zinkstaub und Eisessig entbromt. Das Acetat wird mit alkoholi- scher Kalilauge gekocht, beim Zusatz von Wasser scheidet sich das Stigma- sterin aus und wird aus Alkohol umkristallisiert. Acetat: Schmelzpunkt 141". Tetrabromstigmasterinacetat zersetzt sich bei 211 — 212". Propionat: Schmelzpunkt 122", Propionattetrabromid: Schmelz- punkt 202" unter Zersetzung, Benzoat: Schmelzpunkt 1(^0". (') Koprosterin. Das Koprosterin, C.27 H47 (OH), wurde von St. Bondzynsli und V. HumnicH-) aus dem Alkoholextrakt getrockneter, menschlicher Fäzes nach dem Verseifen durch Schütteln mit Äther gewonnen und durch Um- kristallisieren aus 85 — 90"/oigem Alkohol gereinigt (Trennung von Chole- sterin, siehe oben S. 250). In ähnlicher Weise erhielten sie Hippokoprosterin aus den Fäzes der Pferde. Koprosterin ist unlösUch in Wasser, leicht löslich in Alkohol, sehr leicht löslich in Äther. C'hloroforra, Schwefelkohlenstoff, Benzol und Petrol- äther. Aus Alkohol kristallisiert es in langen feinen Nadeln. Schmelz- punkt 95 — 96". [a|D-|-24". Mit Chloroform und konzentrierter Schwefel- säure gibt Koprosterin anfangs nur eine gelbhche Färbung, welche erst aUmählich und nach längerem Stehen orangerot und dimkelrot wird, während das Cholesterin unter denselben Umständen sofort eine blutrote Färbung gibt. In Essigsäureanhydrid gelöst gibt Koprosterin bei Zusatz von kon- zentrierter Schwefelsäure sofort eine Blaufärbung, welcher bald eine Grün- färbung nachfolgt. Koprosterin addiert kein Brom oder Jod. Acetylkoprosterin , in allen gebräuchlichen Lösungsmitteln leicht lös- lich, kristallisiert in Nadeln vom Schmelzpunkt 85". Benzovlkoprosterin ist in Äther leicht, in Alkohol fast gar nicht löslich, kristaUisiert aus Äther- alkohol in rechtwinkügen Tafeln vom Schmelzpunkt 114 — 115". ^) A. Windaus, a. a. 0. -) t'ber das Schicksal des Cholersterins im tierischen Organismus. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 22. S. 396 (1896). Untersuchung auf luicliinolekulare Alkohole. 2")") /inii;nii\iko})n)st('i'iii. diuvli /iisaininciisclimclzcii (\e^ Koprostci'iiis mit Ziini.iiiiylclilorid auf I.'IO" erhalten, kristallisiert ans Atliei'alkoliol in reclit- winklit'cu Säulen vom Sclimelzpnnkt lO*)". Zinnamylkoprosterinbromid. Schmelzpnnkt lüö— KH')» C. 11 i p po k () pro Sterin sclieidet sicli aus heißer, konzentrierter all<(>linlischer Lösung als (iaUcrte ah, welcln' unter dem Mikroskop sich als aus kuizcii Xädciclien be- stehend erweist. Schmelzpunkt 74 — 75" C In t'hloroform gelöst gibt es l)ei Zusatz v(ui Essigsäureanhydrid und Schwefelsäure zuerst intensive Violett-, dann bald Grünfärbung. Es addiert kein Urom und drclit in Ätlifr gelöst schwach rechts. Es ist anscheinend kein reiner Körper. ') (1) Isocholesterin. Isoe hole Sterin, C.jg H^g (OH), wurde von E. Schulze^) aus dem Woll- fett durch Verseifen und Ausschütteln mit Äther zusammen mit C'Iiole- stei'in und anderen kohlenstoffärmeren Alkoholen gewonnen. Zur Trennuni; des IsoCholesterins von Cholesterin imd den anderen .Mkoholen dient das Benzoat. Man erhitzt das Gemisch der Alkohole mit Hcnzoylchioiid im Ölbade auf 140 -1G0"C. ^) Die Keakticm ist in weniiicn Minuten beendet. Man löst die Masse in Äther und fällt das IJenzoat mit DüVo'ii'C"^ Alkohol. Das Benzoat läßt man aus Ätheralkohol kristallisieren; das (Jholesterin- benzoat scheidet sich in .yroßen tafelförmisjen Kristallen, das Isocholesteryl- benzoat in Xadeln aus, die sich von denen des Cholesterinbenzoats (\urr\\ Schlämmen trennen lassen. Durch Verseifen des Isocholesterinbenzoats wii'd das reine Isocholesterin gewonnen. Das Isocholesterin kristallisiert aus Äther und Aceton in feinen Nadeln. Aus verdünnter alkoholischer Lö,suni>- scheidet es sich in weißen Flocken ab, eine konzentrierte alkoholische Lösung- erstarrt beim Erkalten zu einer durchscheinenden Gallerte. Schmelzpunkt DJS''). [y.jD + 59'7". Es gibt nicht die Reaktion mit Chloroform und Schwefelsäure. Mit Chloro- form und Essigsäureanhvdrid gibt es zunächst eine gelbe, dann rotgelbe Farbe mit grüner Fluoreszenz. Isocholesterin addiert zwei Atome Brom. Das Benzoat schmilzt bei D)4 -195«. ') Vgl. auch G. Gittelmacher-Wilenko, Über Hippokoprosterini'. .lalnesber. f. Tier- chemic. Bd. ;}5. S. 508 (1905). '') E. Schulze und A. ('rieh, Über die Zusammensetzung des Wollfetts. .louru. f. prakt. ehem. [2.] Bd. 7. S. 163 (1873) u. Bd. D. S. 321 (1874). — Ber. d. Deutsch. cIumu. Ges. Bd. 31. S. 1200 (1898). •') K. OhcniiiilJer, Beiträge zur Kenntnis der Cholesterine. Iiuuig.-Disseit. Berlin 1892. S. 35. Pliospliati(le.'> Von E. Schulze und E. Winterstein, Zürich. Als riiospliatide bezeichnen wir Stickstoff- und phosphorhaltige \qv- bin(hini;en , welche den Fetten in manchen physikalischen Eigenschaften mid auch in Löslichkeitsverhältnissen nahestehen. Sie unterscheiden sich aulier durch den Phosphor- und Stickstoffgehalt von den Fetten dadurch, daß sie mit Wasser kolloidale Lösungen geben, aus denen sie durch Säuren ausgeflockt werden. Man kann die Phosphatide auf Grund unserer gegenwärtigen Kenntnisse einteilen in Monophosphatide und Diphosphatide etc. Die ersteren enthalten im Molekül 1 Atom Phosphor, die letzteren 2 Atome. Es gibt Phosphatide mit einem Atom Stickstoff im ^Molekül und solche mit mehreren Atomen. Um diese Unterschiede in der Bezeichnung hervortreten zu lassen, hat man die Ausdrücke Monoaminophosphatide. Diaminophosphatide etc. vorgeschlagen. Doch benutzen wir im folgenden diese Bezeichnung nicht, da wir sie nicht für ganz einwaudsfrei halten. Die Phosphatide sind halbfeste, wachsartige oder feste, spröde, schwach gelblich oder nahezu farblose, sehr hygroskopische Substanzen, denen zu- weilen ein eigenartiger Geruch anhaftet. Mit Wasser zusammengebracht ([uellen sie auf und bilden die sogenannten Myelinformen, mit viel Wasser entstehen kolloidale Lösungen, welche in verdünntem Zustande filtrierbar sind: diese kolloidalen Lösungen gerinnen beim Kochen nicht, sie flocken jedoch bei Anwesenheit von Wasserstoffionen aus. Das am längsten bekannte Monophosphatid, das Lezithin, ist optisch aktiv, was mit der optischen Aktivität der im Lezithin vorhandenen Glyzerinphosphorsäure zusammenhängt. Über die Größe des Drehungs- vermögens lassen sich ganz zutreffende Zahlen nicht angeben, da die Phos- phatide beim Erwärmen leicht razemisiert werden. Ferner kann man nicht mit aller Sicherheit behaupten, daß die verwendeten Präparate eiidieit- ^) Speziallitcratur : ThudicJniiii, Die chemische Konstitution des Gehirns des Menschen und der Tiere. Tübingen 1901. Historische Entwickhing unserer Kenntnisse über die Phosphatide. luaugural-Dissertation von O. Hiestand. Zürich 1906. A. Erla»dspn, Untersuchungen über die lezithinartigeu Substanzen des Myocardiums. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 51. S. 71 (1907). J.Batifi, Biochemie der Zelllipoide. Ergebnisse der Physio- logie. Bd. 6. S. 131 (1907). S. Frä/ikel, Gehirnchemie. Ergebnisse der Physioh)gie. Bd. 9. S. 212 (1909). Phosphatide. 257 lieber Xatnr waren, auch muB man berücksichtigen . daß die Phosphatide, auch wenn man die Kinwirkuiiii- höherer Temperaturen ausschhelit, bei der Darstellung- gewisse Veränderungen erleiden können. Das „Lezithin" ist anisotrop. Die Phosphatide sind meistens leicht löslich in Äther, Chloroform, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichloräthylen sowie in lieißem Alkohol und Essigäther. schwer löslich dagegen in Aceton und Methylacetat. Doch kann die LösUchkeit durch das Vorhandensein anderer Substanzen modifiziert werden. Die Phosphatide sind leicht veränderliche .Substanzen, sie absoi'bieren leicht Sauerstoff!), daher ist bei ihrer DarsteUung Luft und Licht tunlichst auszuschließen, auch ist es wünschenswert, bei nicht zu hohen Tempera- turen zu arbeiten. Die Phosphatide besitzen ferner die Fähigkeit, sich mit manchen kolloidalen Stoffen zu vereinigen oder solche zu adsorbieren, aber auch mit kristallisierenden Substanzen können sie lal)ile oder auch beständige Verbindungen bilden. So können die Phosphatide die sonst durch Äther aus alkoholischen Lösungen fällbaren gallensauren Salze zum Teil in Lösung halten und um- gekehrt werden sie trotz ihrer Löslichkeit in Alkohol und Äther teilweise zusammen mit den Alkalisalzen der GaUensäuren aus alkoholischer Lösung durch Äther niedergeschlagen. Behandelt man die im Alkohol- und Äther- gemisch löslichen Stoffe der Galle mit Wasser, so gehen gleichzeitig mit den gallensauren Salzen auch Phosphatide in das Wasser über. 2) Durch Alkalien werden die Phosphatide rasch gespalten, organische Säuren scheinen in der Kälte nicht einzuwirken, anorganische Säui-en wirken zersetzend aber langsamer als Alkalien. Gewisse Fermente bewirken eine Spaltung. Manche Phosphatide, so z. B. das eigentliche „Lezithin", werden durch Platinchlorid oder Kadmiumchlorid in alkoholischer Lösung gefällt, doch erfolgt hierbei schon eine teilweise Spaltung bzw. eine Veränderung; in manchen Fällen be^^^rkt auch eine mit Ammoniak versetzte alkoholische Blei- lösung eine Fällung. Darstellung der Phosphatide. Die Untersuchungen über tierische und pflanzliche Phosphatide sind zur Zeit nicht soweit vorgeschritten, daß man zur Trennung der einzelnen Glieder dieser Stoffgruppe und zur Beseitigung der Beimengungen Methoden besitzt, die allen Anforderungen genügen und stets befriedigende Resultate hefern. Dieses möge bei der Beurteilung der nachfolgenden Mitteilung Berücksichtigung finden. *) A. Erlandscn, ibid.; J. Bang, ibid.; W. Jleubner, Betrachtuufren über die Zer- setzlichkeit des Lezithins. Arch. f. exper. Patli. u. Pharm. Bd. 59. S. 420 (1908). ^) 0. Ilammarsfeii , Zur Cliemie der Galle. Ergebnisse der Physiidogie. Bd. 4. S. 14 (1905). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden, n. X7 258 E. Scluilze und E. Wiiiterstein. Auch die (iiiantitative Bestimmung- der Phosphatide stößt auf grolle Schwierigkeiten. Im allgemeinen hat man sich darauf beschränkt, den Phosphorgehalt der äther- und alkoholischen Extrakte zu bestimmen und daraus den Phosphatidgehalt zu berechnen. Daß dieses Verfahren Fehler einschließen kann, liegt auf der Hand. I. Aus Pflanzen. 1. Aus Samen. Zur Darstellung von Phosphatiden aus Pflanzensamen kann man den bei Behandlung der fein zerriebenen Samen mit Äther verbliebenen Rück- stand verwenden, in welchem in der Pvegel noch ein; ansehnlicher^ Teil der Phosphatide sich vorfindet. Erwärmt man diesen Piückstand mit Alkohol auf 50 — (30" C, so gehen Phosphatide in Lösung, sie können aus dem Yerdampfungsrückstande des weingeistigen Extraktes durch Äther ausge- zogen werden. Ihre Isolierung mrd in diesem Falle dadurch erleichtert, daß aus dem für ihre Darstellung verwendeten Material die Glyzeride zuvor entweder vollständig oder doch bis auf einen geringen Piest entfernt worden waren ; selbstverständlich kann man aber auf solchem Wege nur den bei Behandlung des Samenpulvers mit Äther ungelöst gebUebenen Ted der Phosphatide gewinnen. Hat man es mit fettarmen Samen zu tun, so empfiehlt es sich, dieselben direkt, ohne sie zuvor zu entfetten, mit heißem Alkohol zu behandeln. Der dabei erhaltene Extrakt enthält neben Phosphatiden eine nicht unbeträchthche Quantität von Glyzeriden, deren Entfernung aber mit HiKe von Lösungsmitteln, welche diese Stoffe, nicht aber die Phosphatide auflösen, ohne Schwierigkeit geUngt. Es ist zweckmäßig, mit solchen Lösungsmitteln auch die aus zuvor entfetteten Samen dargestellten Phosphatidpräparate zu behandeln. Denn diese Präparate schheßen in der Regel kleine Mengen von Glyzeriden ein, da es sehr schwierig ist, die fein zerriebenen Pflanzensamen durch Behandlung mit Äther vollständig von Fett zu befreien. Das zur Isolierung der Phosphatide angewendete A^erfahren ist also in der Hauptsache das gleiche, mag man nun die als Material dienenden Samen zuvor entfettet haben oder nicht. Die Ausführung dieses Verfahrens geschieht in folgender Weise : Man extrahiert die fein zerriebenen Samen oder die bei Behandlung der letzteren mit Äther verbliebenen Rückstände bei 50 — 60« C mit absolutem oder mit 95''/oigem Alkohol. Der filtrierte Extrakt wird bei der gleichen Tem- peratur eingedunstet. Den Verdampfungsrückstand, der stets auch Kohlen- hydrate einschließt, behandelt man abwechselnd mit Äther und mit Wasser. Die dabei erhaltenen Lösungen werden, ohne sie stark umzuschüttein, in einen Scheidetrichter^ gebracht. Die wässerige i) Schicht wird, nachdem sie sich geklärt hat, entfernt. Die im Scheidetrichter zurückgebHebene ätherische Lösung, in der die Phosphatide sich vorfinden, schüttelt man zur Reinigung wiederholt mit Wasser. Dabei bilden sich in der Regel Emulsionen, die man beseitigen kann, indem man Kochsalzkristalle in den Scheidetrichter ^) Diese Lösung kann eine kleine Menge Phosphatid enthalten. Phosphatide. 259 bringt und dann wieder kräftig- schüttelt (statt des Kochsalzes kann man einige andere Salze, z. B. Natriunisulfat, verwenden). Die geklärte, von der wässerigen Schicht getrennte ätherische Lösung wird zur Entfernung des aufgenommenen Wassers mit wasserfreiem Natriumsulfat zusammengeln-acht, sodann filtriert und der Destillation unterworfen. Den dabei erhaltenen Rückstand behandelt man mit Aceton, welches das Fett löst, von den Phosphatiden dagegen nur einen geringen Teil aufnimmt. Um das Fett noch vollständiger zu entfernen, löst man das Phosphatid in einer nicht zu großen Quantität von Äther und fällt es in dieser Lösung durch Aceton oder durch Methylacetat wieder aus. Diese Operation wird, falls es nötig erscheint, mehrmals wiederholt. Um die Phosphatide von adsorbierten Substanzen zu befreien, kann man auch in folgender Weise verfahren: Man gießt die konzentrierten alkoholischen Lösungen in mögliehst viel destiUiertes Wasser, so daß eine stark opalisierende Lösung entsteht, diese Lösung versetzt man mit ver- dünnter Essigsäure oder besser noch verdünnter Schwefelsäure, bis die Ausflockung beginnt ; auch Einleiten von Kohlensäure in die eiskalte Lösung bewirkt ein Ausflocken. ]\Ian rührt gut um, dabei ballt sich die Ausschei- dung in der Regel zusammen, man dekantiert die Flüssigkeit rasch ab, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure durch Dekantation aus, bringt die Masse in einen Scheidetrichter und schüttelt mit soviel Äther durch, daß zwei deutliche Schichten auftreten. Man trennt die ätherische Lösung ab, trocknet sie mit Natrium sulfat. Nach dem Abdestillieren des Äthers ver- bleiben die Phosphatide als wachsartige Massen zurück, welche man durch Behandeln mit Aceton oder Methylacetat in verschiedene Fraktionen zer- legen kann. Die so aus Pflanzensamen dargestellten Phosphatide schüeßen Kohlen- hydrate ein, deren Quantität eine sehr wechselnde ist. Man kann manche dieser I'hosphatide vielleicht als Verbindungen von „eigentlichem Lezithin" mit Kohlenhydraten ansehen. Solche Phosphatide kann man als Gluko- phosphatide bezeichnen. Die aus Getreidemehl dargestellten Phosphatide besitzen eine kompUzierte Zusammensetzung. ITm über die Beschaffenheit der Phosphatide näheren Aufschluß zu erhalten, untersucht man ihre Spaltungsprodukte. 2. Aus chlorophyllhaltigen Organen. Es ist bis jetzt noch nicht gelungen, Phosphatide aus Blättern und anderen chlorophyllhaltigen Pflanzenorganen zu isolieren, da man bisher noch keine Methoden kennt, die Phosphatide von den sie begleitenden Farbstoffen zu trennen. IL Aus tierischen Organen. Die Gewinnung von Phosphatiden aus tierischen Organen und Flüssig- keiten stößt in vielen Fällen auf Schwierigkeiten, weil die Phosphatide schon beim Trocknen der Organe sowie beim Eindunsten von Flüssig- 17* 260 E. Schulze und E. Wintersteiu. keiten auch in neutraler Lösung in ihrer physikalischen und chemischen Beschaffenheit verändert werden können. Es lassen sich daher allgemein gültiu-e Methoden nicht wohl angeben. Behufs Darstellung der Phosphatide des Eigelbs kann man in folgen- der Weise verfahren: Das Dotter wird mit Äther wiederholt extrahiert, bis kein Fett mehr in Lösung geht; der hellgelbe Rückstand, welcher neben anderen Bestandteilen das „Lezithalbumin-' enthält, wird mit absolutem Alkohol erhitzt, die alkoholischen Extrakte bei möglichst niederer Tem- peratur, am besten im Vakuum, eingedunstet, der Verdampfungsrück- stand mit Äther extrahiert und die ätherische Lösung eventuell nach dem bei den Pflanzenphosphatiden angegebenen Verfahren gereinigt. Nach dem Verfahren von Bercjell^) benutzt man die Fällbarkeit des ..Lezithins'' durch Kadmiumchlorid. Man verfährt dabei wie folgt: Eigelb ^^^rd einige Stunden am Rückfluiikühler mit 95^/oigem Alkohol gekocht, die alkoholische Lösung auf 0° abgekühlt und mit einer alkohohschen Kadmium- chloridlösung gefällt, die dabei entstandene Fällung wird nach einiger Zeit auf einer Nutsche von der Flüssigkeit getrennt, mit 95'Voi»eni Alkohol ausgewaschen, sodann im Exsikkator getrocknet, darauf mit Äther ent- fettet. Nun zersetzt man die Kadmiumdoppelverbindung, indem man sie mit etwa der achtfachen Menge SOVoigen Alkohols kocht und sodann all- mählich Ammonkarbonat hinzufügt, bis in einer Probe des Filtrats kein Kadmium mehr nachzuweisen ist. Hierzu braucht man nach unserer Er- fahrung einen Überschuß von Ammonkarbonat. Die Lösung ^^ird heiß fil- triert, auf 10^ abgekühlt; der entstandene Niederschlag wird mit Alkohol durch Dekantation ausgewaschen und in Chloroform gelöst. Diese Lösung '\\1rd mit Aceton gefällt und der entstandene Niederschlag sofort von der Flüssig- keit getrennt und im Vakuum getrocknet. Nach den Beobachtungen, die wir bei LTntersuchung der Zerealien- phosphatide gemacht haben, erhält man dabei Präparate, die zuweilen kleine Mengen Kadmium einschüeßen.^) Da die Phosphatide gegen alkaUsche Flüssigkeiten sehr unbeständig sind, so ist eine teilweise Veränderung des ursprünglich vorhandenen Phos- phatids nicht ausgeschlossen.^) Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß die nach den beschrie- benen Verfahren dargestellten Präparate nicht einheitlicher Natur sind. Zu besser charakterisierten Verbindungen sind Erlandsen sowie Stern und Thierf eider bei Untersuchung der Phosphatide des Herzmuskels bzw. des Eigelbs gelangt. *) P. Bergell, Darstellung des Lezithins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 30. S. 544 (1900). ^) 0. Hiestand, Beiträge zur Kenntnis der pflanzlichen Phosphatide. Dissertation, Zürich 1906. S. 136. ^) Ä. Erlandsen, Untersuchungen über die lezithinartigen Substanzen des Myo- cardiums und der quergestreiften Muskeln. Zeitschr. f. phvsiol. Chem. Bd. 51. S. 71 (1907). Phosphatide. 261 Die BehaiiptiinjT iV^. A. Barhieris i), daß im Ei,i>elb kein Lezithin, da- gegen Ovin sich vorfinde, verdient hier keine Beachtung. Barbieri erhielt das Ovin, eine amorphe, weiße Substanz mit einem P-Gehalt von nur l-Sö^/oi Jius dem Eigelb in so geringer Menge, daß auf dasselbe nur ein sehr kleiner Bruchteil der Phosphormenge fallen kann, die im Eigelb den äther- und alkohollöshchen Phosphorverbindungen angehört. Nach Erlandsen ^) verfährt man wie folgt : Die Herzen werden sorgfältig von Peri- und Endocardium, den Klappen, vom anhaftenden Fett, Sehnen und Gefäßen befreit, sodann mit einer Hackmaschine fein zerkleinert, in dünnen Schichten auf große Glasplatten ausgebreitet, über die geneigt gestellte Platte wird mit einem kräftigen Motor ein Luftstrom geleitet. Das Austrocknen wurde durch Erwärmen des Lokals noch befördert. Nach 12stündigem Trocknen wird die Masse in Gazebeutel gebracht und in einem A'akuumwärmekasten aufgehängt; der Kasten, in welchem Chlorcalcium aufgestellt ist, wird auf 40" er- wärmt und ein trockener Luftstrom hindurchgeleitet, nach mehrstündigem Trocknen wird das ^Material abermals gemahlen und nochmals auf die gleiche Weise getrocknet; die trockene !Masse wird in Exsikkatoren auf- bewahrt. Das getrocknete Muskelpulver wird mit Äther in großen Glasgefäßen Übergossen, mit Äther einen Tag digeriert, die ätherische Lösung abge- trennt, der Piückstand ausgepreßt und die Extraktion so lange wiederholt, bis nichts mehr in Lösung geht. =!) Die ätherischen Lösungen werden im Vakuum bei 40" eingedunstet, der Sirup unter Kohlensäure im Dunkeln auf- bewahrt. Der verbüebene Rückstand enthält noch kleine Mengen ätherlöslicher Substanzen, welche erst durch monatelange Behandlung mit Äther entfernt werden können. Der vollständig mit Äther extrahierte Rückstand wird mit 95"/oigem Alkohol mehrere Male in der Kälte und dann bei 40 — 45" extrahiert. Die alkoholischen Lösungen werden gesondert im Vakuum bei 40" ein gedunstet. 'ö"- Untersuchung der ätherischen Extrakte. Die mit Hilfe von Äther und Alkohol gewonnenen Substanzen werden in folgender Weise verarbeitet. Der beim Verdunsten des Äthers verbliel)ene und im Vakuum nicht völlig getrocknete braimgelbe, sirupartige Rückstand wird in wenig Äther aufgelöst, von einer kleinen Menge unlöslicher Sub- stanz getrennt, die ätherische Lösung mit Aceton gefällt. Die Fällung wird im Vakuum bei o5 — 40" unter Durchleiten von Luft vom Aceton befreit; ') Compt. rend. de l'Acad. des sciences. Bd. 145. S. 133 (1907). Mitteilung auf dem Kongreß für angewandte Chemie in London 1909. -') Ibid. S. 13(j. ^) Bei Anwendung von 500 y dauert die Extraktion 8—10 Tage. 262 E. Schulze und E. Wiutersteiu. (laini löst mau \vieder in wasserfreiem Äther, filtriert wieder von dem weüjen Rückstand ab. Die ätherische Lösung Mird mit ca. 4 Volumina absolutem Alkohol gefällt, nach 12stündigem Stehen in der Kälte bei 0» wird die Fällung mit kaltem absoluten Alkohol gewaschen. Dieser Nieder- schlag wird abermals in Äther gelöst, mit Alkohol gefäUt. dann mrd die Fällung mit Alkohol auf 60" erwärmt, wobei sich ein weißhcher Nieder- schlag auflöst. Es hinterl)leiben bräunliche sirupartige Massen; behufs Ent- fernung der weißen Masse wiederholt man die Operationen der Auflösung in Äther und Fällung mit Alkohol noch einmal. Die nun erhaltene gelbbraune Substanz wird in absolutem Alkohol gelöst und unter CO2 aufbewahrt, die absolute ätherische, geklärte Lösung bei 0'' mit Aceton gefäUt, der von der Lösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren getrennte Nieder- schlag vän\ im Vakuum vom Aceton befreit, sodann im frisch destillierten warmen Essigäther gelöst und bei — 2" stehen gelassen, wobei sich ein bräunlicher Sirup ausscheidet. Dieses Umfallen wird eventuell wiederholt, der Rückstand nun bei 40" im Vakuum unter Dnrchleiten von Luft ge- trocknet und sodann im Vakuumexsikkator an einem dunklen Ort auf- bewahrt. Die so erhaltene Substanz weicht in ihrer Zusammensetzung vom Lezithin ab, sie enthält l'OP/o Stickstoff und 4-46''/o Phosphor. Dieses Phosphatid wird mit dem Namen Cuorin belegt. Das Cuorin enthält auf 1 Atom Stickstoff 2 Atome Phosphor. Das Cuorin, C^i HioöNPg O.21 , ist eine gelbbraune, durchsichtige, fast geruchlose, nach dem Trocknen harte, harzartige Substanz; es ist sehr hygroskopisch, leicht löslich in Äther, Chloroform, Petroläther, Schwefelkohlenstoff, unlöslich in kochendem Aceton, Methyl- und Äthylalkohol; mit Wasser bildet es eine Pseudolösung. Das Cuorin absorbiert energisch Sauerstoff aus der Luft, wobei die Jodzahl bedeutend zurückgeht. Alit Platinchlorid und Kadmiumchlorid gibt es Doppel- verbindungen. Beim Kochen mit Baryt entstehen ungesättigte Fettsäuren, Glyzerinphosphorsäure und eine Base. Es erübrigt noch, die Acetonlösung, welche die Fette und eine kleine Menge phosphorhaltiger Substanz enthält, zu besprechen. Diese phosphor- haltige Substanz ist das ..eigenthche Lezithin". Die Ätherlösung ^^^rd ein- gedampft, in absolutem Alkohol gelöst und bei 0" abfiltriert. Diese Lösung enthält das Lezithin; die alkoholische Lösung wird mit Platinchlorid gefällt, wobei man eine Fällung erhält, welche die Zusammensetzung (CgeHfiaNPOgloHaPtClß besitzt. Die größere Menge des eigentlichen Lezi- thins findet sich in der alkoholischen, vom Cuorin getrennten Lösung und wird durch Ausfällen mit Aceton gewonnen. Untersuchung der alkoholischen Extrakte. Die vereinigten Alkoholextrakte werden im Vakuum eingedunstet, der Verdampfungsrückstand sodann bei 40" in möglichst wenig absolutem Alkohol gelöst und diese Lösung unter Kohlensäure an einem dunklen Ort aufbewahrt, wobei sich eine alkohohinlösliche Substanz alisetzt. Die davon getrennte Lösung wird im Vakuum eingedunstet, der Rückstand mit ab- Phosphatide. 263 solutem Äther übergössen. Nach längerem Stehen in hohen Zylindern wird die gelbe ätherische Lösung vom Ungelösten durch Dekantation getrennt. Diese ätherische Lösung wird im ^'akuum eingeengt, sodann wird in der Kälte mit wasserfreiem Aceton gefällt. Der mit Hilfe von Aceton erhaltene Niederschlag wird mit Aceton gewaschen und im \'akuum bei 40" ge- trocknet. Diese Masse ist bis auf eine kleine Menge löslich in wenig absolutem Alkohol. Die erhaltene Lösung wird so lange mit absolutem Alkohol versetzt, bis keine Fidlung mehr auftritt. Die vom Niederschlag getrennte alkoholische Lösung enthielt die Hauptmenge des Phospha- tides. Es wird daraus auf Zusatz eines Überschusses von alkoholischer Kadmiumchloridlösung gefällt, 24 Stunden stehen gelassen. Die Fällung wird auf dem Filter mit absolutem Alkohol gewaschen, sodann noch durch Digerieren mit absolutem Alkohol getrocknet uod endlich im Exsikkator vom Alkohol befreit. Der gut getrocknete Niederschlag wird im Soxhlet-Apparat längere Zeit mit Äther extrahiert, wobei ein Teil der Phosphatidkadmium- verbindung in Lösung geht. Das Phosphatid kann aus der unlöslichen Xer- bindung durch Kochen mit Alkohol und Ammonkarbouat , wie oben be- schi'ieben, gewonnen werden; man dunstet das alkoholische Filtrat im Vakuum ein, löst es in Äther, schüttelt im Scheidetrichter mit Wasser, trocknet mit Natriumsulfat und dunstet den Äther ab. Bei diesem Ver- fahren sollen erhebliche \>rluste entstehen. Man kann daher auch in folgender Weise verfahren. Die Fällung wird pulverisiert im absoluten Alkohol suspendiert und Schwefelwasserstoff unter schwachem Erwärmen eingeleitet. Die warme Lösung wird durch einen Heißwassertrichter filtriert, die Filtrate im Vakuum unter Luftdurchleiten eingedunstet. Die Flüssigkeit wird behufs Entfernung der gebildeten (.'hlorwasserstoffsäure mit frisch gefälltem Silberoxyd geschüttelt. Die vom Silberchlorid getrennte Flüssigkeit wird wieder mit Schwefelwasserstoff gesättigt, die vom Silber- sulfid getrennte Lösung wieder im Vakuum eingedunstet. Bei allen diesen Operationen tritt aber entschieden eine Zersetzung des Phosphatides ein. Das in den Niederschlag eingegangene Phosphatid enthält auf 2 Atome Stickstoff 1 Atom Phosphor. Behufs näherer Charakterisierung der mit Kadmiumchlorid fällbaren Phosphatide spaltet man die mit Alkohol aus- gewaschenen Fällungen direkt mit Baryumhydroxydlösung. Darstellung der Phosphatide aus Eigelb i) nach Stern und Thierf eider. Frisches Eigelb wird in dünnen Schichten auf Glasplatten ausgebreitet und Luft mit eiuem Flügelventilator darüber geleitet, darauf wird es zerkleinert und im A'akuumexsikkator getrocknet. Die Trockensubstanz wird mit etwa der doppelten Menge Äther mehrere Stunden geschüttelt, die ätherische Lösung eingedunstet und mit Aceton gefällt; die Fällung wird mit Aceton durch- geknetet. Diese Behandlung des Materials wird einige Male wiederholt.-) Da- 1) über die Phosphatide des Eigelbs. Zeitschr.f. physiol. Chemie. Bd. 53. 8.370(1907). -') Die Filtration nimmt man in einer Kohlonsäureatmosphäre vor. 264 E. Schulze iiud E. Wiiiterstein. bei ijehen in die Acetonätherlösuiig Phospliatide, die noch nicht untersucht worden sind. Die mit Aceton erhaltene Fällung wird in Äther gelöst und unter Kohlensäure aufbewahrt. Man trennt die geringe Menge von suspendiertem Eiweiß eventuell durch Dekantieren oder Zentrifugieren: die ganz klare ätherische Lösung wird im ^'akuum eingeengt, mit Aceton gefäUt, die Fäl- lung mit Aceton durchgeknetet und im A^akuum getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in kleinen verschließl^aren Gläschen mit kleinen Mengen Äther behandelt, die trübe Lösung zentrifugiert und auf diese Weise wird die ganze Masse in Lösung gebracht und die sog. „weiße Substanz" abgetrennt. Die ätherische Lösung wird eingedunstet, mit Aceton behandelt, nochmals im A^akuum getrocknet und noch einmal in beschriel)ener Weise mit Äther behandelt. Auf diese Art wird jedoch die weiße Substanz, welche die Trü- bung der ätherischen Lösungen bedingt, nicht vollständig entfernt. Diese ätherische Lösung schließt neben Phosphatiden Cholesterin und natürlich auch Fette ein. Behufs Entfernung dieser Beimengungen wird die ätherische Lösung mit Aceton gefäUt, der Niederschlag mit Aceton durchgeknetet, sodann getrocknet, wieder in Äther gelöst und nochmals mit Aceton gefällt; dieses A'erfahren wird so lange wiederholt, bis die Äther- Acetonlösung beim Einengen kein Fett, sondern nur Phosphatid ausscheidet. Man erhält so eine hygroskopische, gelbbraune Substanz , welche sich nur zum Teil in Alkohol löst. Sie wird in völhg trockenem Zustande mit viel Alkohol Übergossen. Ein Teil bleibt ungelöst als klebrige Masse oder Sus- pension. Die trübe Lösung wird zentrifugiert und der Bodensatz zum I^n- gelösten hinzugefügt und dieser unlöshche Anteil in Äther gelöst. Man er- hält also eine ätherische und eine alkoholische Lösung. Die ätherische Lösung wird nach starkem Einengen mit Alkohol gefällt, der Niederschlag mit Alkohol und dann mit Aceton verrieben. Der im \'akuum getrocknete Piückstand besitzt pulverige Beschaffenheit. Die von diesem Produkt getrennte ätherische Lösung wurde zentri- fugiert, vom Ptttckstand abgegossen, die Lösung eingeengt, der Rückstand in derselben Weise mit Alkohol und Aceton behandelt und im A'akuum getrocknet. Man erhält somit eine alkoholschwerlösliche Substanz. Die alkoholische Lösung scheidet nach dem Einengen auf Zusatz von Aceton eine plastische Masse aus, welche nicht krümmehg wird. Um die noch in geringer Menge vorhandenen alkoholschwerlöslichen Beimen- gungen zu entfernen, wird die Behandlung (Zentrifugieren, Einengen, Fäl- lung mit Aceton) so lange wiederholt, bis die getrocknete Substanz sich in Alkohol löst. Man erhält nun eine alkohol- und ätherlösliche Substanz. Die äther- und alkohollöshche Substanz, welche noch kleine Beimen- gungen von der weißen und alkoholschwerlöslichen Sul)stanz, deren völlige Entfernung aber wegen der gegenseitigen Beeinflussung in derLöshchkeit sehr schwierig ist, enthält, ist das eigenthche Lezithin. Es ist eine aulierordent- hch hygroskopische, nicht pulverisierbare Masse. Die alkohohsche Lösung reagiert sauer und wird durch alkoholische Bleiacetatlösung gefällt. Phosphatide. 265 Die alkoholschwerlösliche Substanz wird als ein hellgelbes , lockeres Pulver erhalten. Sie ist auch in warmem Alkohol nur wenig- löslich. Das Verhältnis von P zu N ist wie liOTT. Die Substanz enthält P()3Vo Calcium. Dieses Phosphatid stimmt in manchen Eigenschaften mit dem Kephalin überein. Die ätherschwerlösliche Substanz. Zu ihrer Gewinnung dient die oben erwähnte ..weiße Substanz". Sie wird behufs Entfernung ätherlöslicher P»e- standteile in Äther suspendiert und dann zentrifugiert. Dann wird in Al- kohol gelöst, wobei Ideine Mengen von ViteUin zurückbleiben. Die alkoho- lische Lösung wird eingeengt und mit Aceton gefällt, der Niederschlag .abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält so eine weiße, leicht pulverisierliare, nicht sehr hygroskopische Masse, welche sich in warmem Alkohol leicht, in Äther hingegen kaum auflöst. Aus der alkoholischen Lösung scheiden sich beim Erkalten allmählich ge- rade oder gekrümmte, radiär oder rosettenförmig angeordnete Nadeln aus. Die alkoholische Lösung reagiert neutral, sie wird durch Kadmiumchlorid und durch Bleiacetat gefällt. Ln Wasser schwillt die Substanz nicht auf. Diese Substanz ist ein Monophosphatid (Cs^HinNgPOg) mit 2 Atomen Stickstoff im Molekül. Aus diesen L'ntersuchungen von Stern und Thierfelder ergibt sich also, daß die von früheren Autoren beschriebenen Lecithine ein Gemisch verschiedener Phosphatide waren. Neuerdings haben sich S. Fränkel^} und seine Schüler mit den Phosphatiden des Eigelbs beschäftigt. Es gelang ihnen, eine ki-istal- hnische Substanz, welche mit dem Namen Neothin bezeichnet wurde, darzustellen. Die Darstellung geschah in folgender Weise: Trockener Eidotter wurde mit Aceton solange warm extrahiert, als dieser sich noch färbte. Der Rückstand wurde 2 Stunden lang bei 45*' mit der doppelten Menge 95Voi8en Alkohols digeriert, warm filtriert; diese Alkoholextraktion wurde mehrmals wiederholt und die Alkoholextrakte im Vakuum eingedunstet. Aus den ersten Extrakten schied sich beim p]inengen im N'akuum ein weißer Niederschlag aus, welcher sich an der Luft nur wenig gelb färbte: dieser weiße Körper wurde aus siedendem Alkohol mehrmals umkiistalli- siert, bis er blendend weiß war. Der im Vakuum getrocknete Körper be- sitzt folgende Eigenschaften : Es ist ein blendend weißes Pulver, bei starker Vergrößerung sieht man, daß es aus einem Filzwerk feinster Nadeln be- steht. Die Substanz schmilzt bei 9P und zersetzt sich bei 190"; sie ist optisch inaktiv, unlöslich in Wasser, Äther, Petroläther, Aceton und kaltem Alkohol; löshch dagegen in siedendem, absolutem Alkohol, in kaltem Chloroform, Benzol, Toluol und Tetrachlorkohlenstoff. Dem Neothin kommt die Formel Cg* H^., N3 POje zu. *) S. Fränkel, Über Lipoide. Biochem. Zeitschr. Bd. 9. S. 44 (1908). 266 E. Schulze und E. Wiuterstein. CO-j C l>0 z/1 5> 2^ _ .. ^ o ;i^ o^ ^ ^tcl — 'S o "^ c s 3 ' -^ IC »— IC INS "4 2.2, ui in Kn K»- ?: CD p Cl. O 2. ^ ^1 O 4 — Ul j fS =2. S 13 |- o ^ 2. S- -7; 5- r^ o p 'X PV =r ^ oq 2 ll a; -■ B- ET oq 2- 5 o r- B" CD -. fo *^ ) s^ r^- -• O ^ l - S. O f^ ►- S *T< /CfO -' i^J tc ii; =r 00 ü >S - S- ^ P ' -^ E, ~ ir ^ jq 05 — ^ C_i a ^ ^ p 1-"» :5- ^ fD C/3 3- ^' '- ^ 5" EL ^ 2- ^ 5: <: CD ^ ^ O: o 2. o p g- - B- ^ ST ^' c £, P P= CO 3 X a '-I — 3 - :rorq o -.- CD S 2.^1:^ S- ^' - ►^ -^ S- '-' n — ■ ■ 'A — O: ÜjJ ^ ^ 2 0 OTQ 0 > r^ r^ So 2. Q r+- 0 o o o P 3 5:3 o -J (—1-. ?-t- UW '-».I -::• p r; oj ^ l-i l-f5 2 3 o 3 - lc^ : ä-"Jq'o — ^ 5 r^ »^ •=" 3 2 ^ a >-! CO r<- - ~ CO I-! CO r» JQ . . I- CO — 2.1-co ^3-is ~^ «Et ? ^^ '^is «• ^ > £. ' .<- O D — — . "~^ .1 crq 7 CD ' ' ciq IC }. • y. T" E — ^ — ^ ^^5 3 o B ^ 2. 3 K*- "-«" 2 S 3 2. :^ 2 • 1 ■*- ■>. j p 2 = -.5 i " -- " "h 2. 3- 2 ^ CO __ "^ ^' 3^ "^ ^ — ■CO r- ö _-; »1 CO — S Oi ■ n' >^. 2- ^_ U* tc r* c* ^-< O CO 3 >2. 3^ o 3 2- er o v; 5 ^ 3 ^ crq 2 CO '^ — S: 5 CO ^i CD < — ;r rt- •-- CD crq s -f ■ ' 7 ? ;;■ J 2. ^ -• H- f^ 35 ^ 2- :g CO S_ o p 2J :j cd ■^ ;S. "^ p= Ö^' 3 ir" f^ "^ 55 3" I ^ O CD I 'n er P ^^^ . CS CD Phosphatide. 267 Das Neothin liefert bei der Hydrolyse Fettsäuren und wahrscheinlich auch Cholin, daneben entstehen noch andere Stickstoffvei-binduniicn. Diese beiden Verfahren können als Schemata für die Trennung' und Darstellung der einzelnen Phosphatide dienen; wie man im Einzelfall genau zu verfahren hat, ergibt sich dann aus dem Verhalten des Kohmaterials gegenüber den verschiedenen Lösungsmitteln. Wertvolle Beobachtungen, die aber in mancher Beziehung einer Nachprüfung bedürfen, finden sich in dem Werk von Thudichuni. ^ ) E. Winferstein h^t im Verein mit seinen Schülern - ) schon vor langer Zeit feste, pulverisierbare Phosphatide aus Cereahen dargestellt. Die aus diesen Samen darstellbaren Phosphatide repräsentieren auch ein kompliziei'tes Gemisch. Das Kohprodukt enthält neben freien Fettsäuren, freiem Cholesterin auch Cholesterinester. Beistehendes Schema gibt die Art und Weise an, wie E. Winterstein und Sniolenski das Piohpräparat, das aus Weizenmehl ^) dargestellt worden war, in die verschiedenen Bestandteile zerlegt haben. Spaltungsprodukte der Phosphatide. Um nun die verschiedenen Phosphatide näher zu charakterisieren, muß man deren Spaltungsprodukte genau kennen lernen. Das eigentliche Lezithin liefert bekanntlich bei der Spaltung Chohn, Glyzerinphosphor- säui'e und Fettsäuren, über deren Natur man noch nicht genügend orientiert ist. Die Spaltung der Phosphatide. Man erhitzt das zu untersuchende Material mit einem Überschul) von Baryumhydroxydlösung am besten in der Weise, daß man die alkoholische oder ätherische Lösung mit der Baryumhydroxydlösung zunächst in der Kälte gut durchschüttelt, dann vor- sichtig auf dem W^asserbade unter \\iederholtem Schütteln erwärmt, bis das Lösungsmittel entfernt ist. Auf diese Weise erreicht man eine möglichst feine Verteilung des Phosphatids in der Flüssigkeit. Man kocht nun etwa 2 Stunden, filtriert von den ausgeschiedenen Barytseifen ab, leitet in die noch heiße Lösung Kohlensäure ein. Die vom Baryumkarbonat geti-enute Flüssigkeit dunstet man zum Sirup ein und extrahiert mit Alkohol das Chohn. (Vgl. beim Chohn.) Der in Alkohol unlösliche Rückstand enthält Glyzerinphosphorsäure. Die Spaltung kann man auch mit einer gesättigten methylalkohoUschen Barytlösung vornehmen.*) G. Moruzzi^) spaltet das „Lezithin'' mit der öOfachen ]\Ienge lO^/oiger Schwefelsäure, wobei liaupt- *) Die Chemie des Gehirns. Tübingen. -) Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 58. S. 502 (1909). ^) Das Weizenmehl ^yurde in bekannter Weise mit Wasser von der Stärke be- freit und der rasch getrocknete Rückstand mit Alkohol extraliiert. ■*) Weitere Versuche zur quantitativen Gewinnung von Cholin aus Lezithin. Hu(jh MacLean, Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 55. S. 360. ^) Versuche zur quantitativen Gewinnung von Cholin aus Lezithin. Ibid. S. 352. 268 E. Schulze und E. W interstein. siichlicli freie riiosphorsäiire entsteht. Um das Choliii zu iiewinueu, fällt iiiuii mit riiüsphorwolframsäure oder Sublimatlösimg (siehe beim Chohn). Winterstein'^'^--) und seine Mitarbeiter spalten die aus Weizenmehl dar- o^estellten Phosphatide durch Erwärmen mit Schwefelsäure, um gleichzeitig die dabei entstehenden Kohlenhydrate zu charakterisieren. Bei Anwendung von Basen als spaltendes Agens werden letztere bekanntlich zersetzt. Um aber genauen Aufschluli über alle Spaltungsprodukte zu erhalten, kann man eine Spaltung mit Alkalien nicht umgehen. Man verfährt wie folgt: Das Präparat löst man, wenn möglich, in kochendem Alkohol auf, gießt die Lösung in die 20 — oOfache Menge Wasser, bezogen auf die ^lenge des zu zersetzenden Präparates. Nun fügt man soviel Schwefelsäure (die man zuvor mit etwas W^asser verdünnt hat) hinzu, bis eine ca. 6 — S^/oige Lösung resultiert, wobei man tüchtig umschüttelt. Dieses Gemisch wird im Wasserbade unter kräftigem Schütteln mehrere Stunden (5 — 6) lang erwärmt. Man läßt erkalten, trennt die ausgeschiedenen Fettsäuren ab, schüttelt die saure Lösung mit Äther ^^iederholt aus und gewinnt auf diese Weise noch kleine Mengen Fettsäuren. Die saure Lösung kann man nun direkt mit Phosphorwolframsäure ausfällen und aus der gut mit 5°/oi8'^i' Schwefelsäure ausgewaschenen Fällung die Basen isoheren. Das Filtrat vom Phosphorwolframsäureniederschlag enthält neben Kohlen- hydraten noch Stickstoffverbindungen. Man neutraUsiert dieses mit Baryum- hydroxyd, trennt die Flüssigkeit vom Baryumsulfat und Bar\Timwolframat ab und dunstet die Lösung zum Sirup ein. Der Sirup wird auf Kohlen- hydrate geprüft. Oder man neutralisiert die schwefelsaure Lösung mit Baryumhydroxyd , dunstet zum Sirup ein und extrahiert den Kückstand behufs Gewinnung des Chohns mit Alkohol. In bezug auf die weiteren Details vergleiche man die Arbeit von E. Winterstein und Smolenski. ^) ANHANG. Neben den Phosphatiden findet sich in den Pflanzen eine in Alkohol und Äther unlösliche Substanz, welche bei der Spaltung mit starken Säuren oder Laugen unter Druck Phosphorsäure und Liosit liefert. Diese Substanz findet sich in den Pflanzensamen als gesättigtes, in Wasser unlösliches Ca-Mg-Salz, einer als ,. Phytinsäure" bezeichneten Säure. Das Phytin ist ein saures Ca-Mg-Salz dieser Säure. Die Phytin- säure wird .von Posternak^) als Anhydrodimethylendiphosphorsäure, von *) Dissertation. 0. Hiestand. -) E. Winterstein und 0. Hiestand, Beiträge zur Kenntnis der pflanzlichen Phos- phatide. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 54. S. 288 (1908). ^) Ibid. Bd. 58. S. 506 (1909). *) S. Posternak, Über die Konstitution der phosphororganischen Reservesäure der grünen Pflanzen und über das erste Reduktionsprodukt der Kohlensäure während der Chlorophyllassimilation. Compt.rend.de TAcad. des sciences. T. 137. p. 439 (1903). Ibid. S. 202. Über die Eigenschaften und die chemische Zusammensetzung der phos- phororganischen Reservesubstanz der Chlorophyllpflanzen. Ibid. S. 337. Phosphatide. OßO' Xeuberg'^), Winterstein-) iiiid anderen Autoren 3) als eine Inositphosphor- siiiire aniiesehen. Das Plivtin ist ein uniorplK's, weißes, in weiii.u' Wasser (1 : 2'^)) lüs- liclies l'iilver, die Lösung wird beim Verdünnen infolge Hydrolyse trüi). In Mineral- und Essigsäure ist es leicht löslich. Die essigsauren Lösungen koagulieren beim Erhitzen. Darstellung des Phytins. Es wird aus den Samen nach einer Reihe von Patenten durch Exti-aktion mit verdünnten Säuren und Wiederaus- fällen durch Neutralisation mit alkalischeu Krden gewonnen. Handelt es sich um die Darstellung der freien Säure, so fällt man aus einer mit der berechneten Menge Natriumacetat versetzten sab^sauren Lösung mit Kupferacetat das Kupferphytin aus und zersetzt dieses Sab« mit Schwefel- wasserstoff. ') C. Neuberg , Zur Frage der Konstitiitiou des .,Phytins". Biochem. Zeitschr. Bd. 9. S. 557 (1908). ^) E. Winterstein, Ein Beitrag zur Frage der Konstitution des Phytins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 58. S. 118 (1908). ■■') U. Snzi(ki, K. JosJiimura und M. Takaishi , tJber ein Enzym, Phytase, das Anhydrodimethylendiphosphorsaure spaltet. Bull, of the College of Agricult. Tokio. Imp. University" Bd. 7. S. 503 (1907). Eiweißstoffe. A. Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. Von Thomas B. Osborne, New-Haven, Connecticut, U. S. A. Einleitung. Außer den Proteinen der Pflanzenwelt sind mit Ausnahme der in den Samen vorkommenden nur wenige untersucht worden. Da der Verfasser keine eigene Erfahrung in der Darstellung von Proteinen anderer Pflanzenteile be- sitzt, so ist die Beschreibung der hier gegebenen Methoden notwendiger- weise auf die Darstellung von Samenproteinen beschränkt. Die Samenproteine können in die folgenden Gruppen eingeteilt werden. I. Einteilung der Samenproteine. 1. Globuline. Weitaus der größte Teil der Samenproteine zeigt die Löslichkeits- verhältnisse, die gewöhnlich als charakteristisch für die Globuline gelten, d. h. sie sind unlöslich in Wasser, aber löslich in neutralen Salzlösungen. Diese Samenglobuline stimmen, was ihre Fällungsverhältnisse durch Ammonsulfat betrifft, mit der gebräuchUchen Definition eines Globulins nicht überein, denn während einige schon bei halber oder noch weniger starker Sättigung mit diesem Salz ausfallen, werden andere nicht gefällt bis ihre Lösung beinahe vollständig gesättigt ist. Bei der Darstellung von Samenglobulinen muß berücksichtigt werden, daß viele nur dann die charakteristische Löshchkeit der Globuhne zeigen, wenn sie mit einer sehr geringen Menge Säure zu Proteinsalzen verbunden sind. Wenn diese Säure durch Neutralisation ganz entfernt wird, ist das Protein vollständig löshch in Wasser. In den folgenden Seiten werden solche Proteinsalze als Globuhne behandelt werden, denn die bei der Extraktion der Samen erhaltenen Proteine werden fast immer als Proteinsalze isoliert. 2. Prolamine. Verfasser schlägt vor, mit diesem Namen jene wohl charakterisierte Gruppe von Proteinen zu bezeichnen, die durch Extraktion der Samen der ZereaUen mit Alkohol von 50 — 80 Volumprozenten erhalten werden. Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 07 j Dieser Name zeigt an, daß diese l'roteine verhältnismäliifi- große Quantitäten von l'rolin und Amidstiekstoff liefern, wenn sie mit Säuren zersetzt werden. In den Samen von allen bis jetzt untersuchten Zerealien, Reis ausgenommen, wird verhältnismäßig viel Prolamin gefunden. Die Prolamine sind niciit bloß durch ihre Löslichkeitsverhältnisse und ihre physikalischen Eigenschaften charakterisiert, sondern auch durch ihre Abbauprodukte , da sie alle sehr wenig Arginin und Histidin, viel Prolin, Ammoniak, Glutaminsäure und kein Lysin liefern. 3. Gluteline. Diese Proteine sind unlöslich in allen neutralen Lösungsmitteln und können aus den Samen nur mit verdünnten Alkalien oder Säuren extra- hiert werden. Das Glutenin oder Glutenkasein des Weizens ist das beste Beispiel dieser (iruppe. Andere ähnliche Proteine existieren wahrscheinlich auch in den Samen anderer Zerealien, aber von ihnen ist wenig l)ekannt infolge der großen Schwierigkeit, sie in annähernd reinem Zustande zu isolieren. In anderen Samen als den der Zerealien bleibt auch nach wieder- holter Extraktion mit den verschiedenen neutralen Lösungsmitteln Stick- stoff im unlöslichen Rückstande des Mehles zurück. FAn Teil dieses Stick- stoffes gehört zweifellos zu den Proteinen, welche in den unverletzten Zellen zurückgeblieben und daher den neutralen Lösungsmitteln nicht zugänglich sind. Ein anderer Teil dieses Stickstoffes jedoch kann mit verdünnten alkalischen Lösungen extrahiert werden und gehört wahrscheinlich bis zu einem gewissen Grade Verbindungen der löslichen Proteine mit anderen Bestandteilen des Samens, z. B. mit Nukleinsäure, an. Es ist noch unsicher, ob etwas von diesem Stickstoff zu Proteinen gehört, welche einen anderen Charakter besitzen als die durch die neutralen Lösungsmittel extrahierten Eiweißstoffe, oder ob zu Proteinen, die ähnliche Eigenschaften, wie die Zerealiengluteline besitzen, denn die durch Alkali extrahierten und durch NeutraUsation gefällten Produkte sind zu unrein, um bestimmte, sie i)e- treffende Schlüsse zu rechtfertigen. 4. Albumine. Fast alle Samen enthalten Ol — ()"5Vo wasserlösliche, durch Hitze koaguHerbare Proteine, welche die wesentlichen Eigenschaften der animali- schen Albumine besitzen, ^'iele von diesen Samenalbuuiinen werden aus ihren Lösungen vor Halbsättigung mit Ammonsulfat gefällt. 5. Proteosen. Beinahe alle Samen, die mit Wasser oder Salzlösung extrahiert werden, liefern eine kleine Quantität von Proteinen mit Eigenschaften, die gewöhn- lich als charakteristisch für die durch Einwirkung von Fermenten auf tie- rische Proteine entstehenden Proteosen betrachtet werden. Proteosen, die 272 Th. H. Osborue. in den Eig-enschaften mit den Proto-, Deutero- und Heteroproteosen übereinstimmen, sind in kleinen Quantitäten aus Samen erhalten worden. Es ist nicht sicher, ob diese Proteosen ursprüngliche Bestandteile des Samens sind, oder ob sie durch enzymatische Wirkung während der Extraktion entstehen. M Die Gesamtquantität von den aus den Samen erliä]tlie Verstopiunji' des Filters lanj^sam wird, kann die Oberfläche mit einem passenden Instrument auti>ekratzt und die Fil- Fig. 34 tration beschleunisit werden. Wenn naeii einiiior Zeit die Filtration auch durch Aufkratzen nicht mehr lieschlenniut werih'u kann, wird das Filter entfernt, in einer frischen Meni^e des Lösunüsmittels »ewaschen und in einer hydraulischen oder Handpresse austzepreüt. Der Rest dQ» Extraktes und die Waschwässer müssen dann durch ein neues P'ilter filtriert werden. Diese Filtrationsmethode der l'roteinlösuniien hat sich als sehr eiup- fehlenswert erwiesen. Wenn richti <>• ^ehandhaht, können verhältnismäliiu' 9^0 Th. B. Osborno. liToiie Flüssiiikintsineiitieii sclinoll filtriert und viel klarer erhalten werden, als auf iriiend einem anderen bis jetzt versuchten Wege. Diese Filtrations- inethode empfiehlt sich nicht, um große Quantitäten unlöslicher Stoffe zu entfernen: hesser wird die Hauptmenge derselben durch Absetzen und Durchgielien durch ein Tuch weggeschafft. Die so erhaltene Lösung ist dann für die oben beschriebene Filtration geeignet. Ein wenig Erfahrung mit dieser Methode wird dem Experimentator iiald zeigen, wann und wie er sie anwenden soll. 2. Extrakte von an Stärke reichen Samen. Extrakte von stärkereichen Samen können nach dem Seihen durch ein Tuch nicht filtriert werden, bis der größere Teil der Stärke sich ge- setzt hat, denn die Stärkekörner sind so klein, daß ein großer Teil der- selben durch das Koliertuch geht. 3. Gummistoffe enthaltende Extrakte. Samenextrakte , die viel Gummistoffe oder sonst das Filter leicht verstopfende Stoffe enthalten , werden am besten so behandelt , daß man zum pAtrakt eine große Menge in kleine Stücke zerrissenes Filtrierpapier gibt und das Papier mit einem Glasstab oder mit der Hand zu einem Brei zerkleinert. Die angewandte Papiermenge sollte genügend sein, um alle Flüssig- keit zu absorbieren und eine halbfeste blasse zu bilden, die dann in ein Tuch gebracht und mit einer starken Hand- oder hydraulischen Presse aus- gedrückt wird. Bei großem Druck ist der ^^erlust gering, und das Extrakt wird gewöhnlich so frei von unlöslichen Bestandteilen erhalten, daß es schnell vollständig klar durch eine Schicht von Papierbrei filtriert werden kann. D. Fällung. 1. Durch Neutralisation. Fast alle Samenproteine werden aus alkalischer oder saurer Lösung gefällt, wenn ihre Reaktion schwach sauer Gemacht wird. Der Niederschlas' besteht aus einem Proteinsalz der Säure. Der Betrag dieser gebundenen Säure ist sehr Idein. Beim Neutralisieren solcher Lösungen darf Phenol- phtalein nicht angewandt werden, denn dieser Indikator zeigt einen Über- schul» von Säure erst dann an , wenn die mit dem Protein verl)undene Säure vollständig neutralisiert ist. Lackmus ist der beste Lidikator für diese Fällungsmethode der Sameneiweißkörper, denn die Fähung aus saurer j Lösung beginnt gewöhnlich, wenn die IJeaktion geaen Lackmus schwach ' sauer wird. Auch die Fällung aus alkalischer Lösung ist vollständig, wenn ' dieser Säuregrad erreicht ist. 2. Durch Dialyse. j Die Dialyse großer Flüssigkeitsmengen wird leicht durch eine Me- thode erzielt, welche seit mehreren Jahren im Laboratorium von T'ro- ' Darstellnug der Proteine der Pflanzenwelt. 281 ^^^-7?*^?^ fessor R. H. Chittenden Gebraucht wird. Man stellt einen Dialysierbeutel her. indem man ein genügend oroßes Stück gänzlich durchfeuchteten Per- gamentpapiers über den Boden einer Schüssel breitet und die zu dialy- sierende Lösung auf das Papier gießt. Die Papierränder werden dann um ein Stück Glasrohr von ca. 10 cm Länge und 1 cm Weite vereinigt und daran befestigt, indem man eine starke Schnur mehrmals außen um das Papier herumwickelt. Auf diese Weise wird ein Dialysierbeutel hergestellt, wie er in Fig. 3o dargestellt ist. Dieser Beutel muß so groß sein, daß noch genügend Baum über der Oberfläche der eingeschlossenen Flüssigkeit bleibt, um das durch die Dia- lyse vermehrte Volumen zu halten. Das Glasrohr ( 1 ) an der Mündung des Beutels bietet ein Mittel, um von Zeit zu Zeit Toluol hinzuzufügen oder Proben der Lösung oder des Niederschlages herauszunehmen. Der Dialysierbeutel muß in einem Trog aufgehängt werden, durch den man vom Bohr ( 2 ) her einen lang- samen Wasserstrom fließen läßt. Diese Gestalt des Dialysators ist besonders für große Flüssigkeits- mengen passend. Ein Stück Perga- mentpapier 70 X 100 cm bildet einen Beutel von 3 — 4 l Inhalt. Ein Extrakt, das mit lOVoigei' Koch- salzlösung erhalten wurde, wird in diesem Dialysator chlorfrei, wenn es ungefähr 5 Tage in einem lang- samen Wasserstrom gehalten wurde. 3. Dllich Alkohol. Fällung mittelst Alkohols kann häufig angewendet werden, um Samenproteine aus ihren wässerigen Lösungen zu trennen. Wenn das Flüssigkeitsvolumen groß ist, wird die Fällung am besten bewerkstel- Fig. 35. ligt, indem man die wässerige Lösung in einem Pergamentbeutel in ungefähr demselben A'olumen Alkohol suspendiert. Da das Wasser rasch in den Alkohol diffundiert, wird die Proteinlösung konzentriert und die zur vollständigen Fällung des Proteins nötige Menge Alkohol ist auf diese Weise verhält- nismäßig klein. 2f^2 Tli. B. Osborne. 4. Durch Neuiralsalze. Aimnoiiiiiiiisulfat ist das einzige Salz von praktischer Bedeutung-, das zur P'ällung von Samenproteinen angewendet worden ist. Es wird vorteil- haft verwendet, um kleine Quantitäten von Proteinen von großen Flüssig- keitsvolumina zu trennen, so daß sie wieder in einem kleineren Flüssig- keitsvolumen aufgelöst werden können. Mittelst fraktionierter Fällung durch Ammonsulfat können auch viele Proteine schnell und leicht von einander getrennt werden. Die Erfahrung hat hei den Samenproteinen gezeigt, daß die P'ällungsgrenzen, di^ Hofmeister und seine Schüler als charakteristisch für jedes Protein betrachteten, nicht so exakt sind, wie allgemein geglaubt worden ist. M Die Grenzen, zwischen denen die Fällung erfolgt, sind in weiten Grenzen abhängig von der Be- handlung, der das Protein vorher unterworfen worden ist. So wurde ge- funden, daß der innerhalb bestimmter Grenzen im Samenextrakt gel)ildete Niederschlag innerhalb weiterer Grenzen und bei niedrigerer Sulfatkonzen- tration gefällt wurde, wenn er vorher gelöst und durch Dialyse wieder- gefällt worden war. Gleichwohl ist diese Methode sehr erfolgreich bei der Trennung vieler Proteine. Das jeweilige Verfahren wird für jeden einzelnen Fall in der detail- lierten P)eschreil)ung der f^ällungsmethode angegeben werden. Um die Erzeugung einer Lösung von gegebener Ammonsulfatkonzen- tration aus einem gegebenen Volumen von bekannter niedrigerer Konzen- tration zu erleichtern, sei folgende Tabelle angegeben. Tabelle mit der in Grammen angegebenen Ammonsulfatmenge, Avelche zu jedem Liter einer Lösung von der angegebenen Kon- zentration zugefügt werden muß, um eine Lösung von be- stimmter, höherer Konzentration zu erzielen: Ursprüngliche j, 2/ 3/ 4/ 5/ 6/ 7/ 8/ 9/ 10/ Sättigung /lO '10 /lO '10 /lO /lO /lO ,10 /lO '10 00 760 1520 2280 3040 380 0 4560 532(J 6080 6840 760-0 0-1 — 73-5 146-9 220-4 2938 367-3 44()-8 5142 587-7 661-1 0-2 - _ 70-4 140-7 2111 2815 3519 4222 4926 5630 0-3 _ _ _ 67-9 1357 2036 2714 339-3 4071 4750 0-4 _ _ _ _ 65-5 131-0 196-5 2620 3275 3930 0-5 _____ 63-3 126-7 1890 2.533 3167 0-6 ______ 61-3 122-6 183-9 2452 0-7 _______ 594 118-7 178-1 0-8 ________ 57-6 115-2 0-9 _________ 55-9 Beim Gebrauch dieser Tabelle ist es notwendig, den durch das ge- löste Protein ausgeübten Einfluß auf das A'olumen der Lösung zu vernach- lässigen. Er kommt nur für konzentrierte Lösungen in Betracht. Die An- wendung dieser Tabelle sei an folgendem Beispiel erklärt: ^) Oshonir und Harris, The Precipitation Limits witli Animonium Siilphate of some Yegetable Proteins. Journ. Anier. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). — Ferner Osborne und Harris, The Precipitation Limits ^vith Ammonium Sulpliate of some Pro- teins, Second Paper. Amer. Journ. of Physiol. XIH. p. 436 (1905). Darstellung der l'nptoiiic der Pflanzenwelt. '2H?y Ein P^xtrakt wird dariiestellt , indcin man 1 /cy Sanionmehl mit ;] l einer Lösnni;,' ])ehan(l('lt, die -/lo ''*'•' ^"H" völligen Sätti^im^- nötiij-cn Ammonsulfatmen»e. d. li. ir)2_^ des Salzes in \l Wasser, (enthält. Xon diesem Extralvt werden naeli der Filtration 2 / erhalten, die auf ^/^o-Sätti- gung gel)racht werden müssen. 1 / (hu* -/lo gesättigten Lösung braucht nach der Tabelle 1407 // Sulfat . um sie */io gesättigt zu machen, daher brauchen die beiden Liter des Extraktes 281"4f/. Diese Methode, die Sulfat- konzentrationen herzustellen , ist vei\schieden von Hofmeisters Methode, bei der die Konzentrationen durch die Anzahl Kubikzentimeter gesättigter Lösung in einem ^'olumen von \i) cm'-^ angegeben wird. Durch Hofmeisters Methode wird eine ''/lo gesättigte Lösung herge- stellt mit ö cm^ der I'roteinlösung und 5 cm'^ der gesättigten Sulfatlösung. Dies gibt jedoch keine Lösung, die wirklich ^/^q gesättigt ist, wie durch das folgende Beispiel gezeigt wird. 100 cw^ gesättigter Sulfatlösung enthalten !]■') cm^ Wasser, ö cm^ enthalten o•57c«?^ die mit 5 cm^ der Proteinlösung 8"öT cw^ ausmachen. Da l cm^ Wasser 0";>S^ Sulfat löst, müssen 8"ö7 cm^ ;V26 r/ gelöst ent- halten, um Vio gesättigt zu sein. Da man öcm* gesättigter Lösung zugege- ben hat, sind bloß 2"7 c/ zugefügt worden, infolgedessen enthält die Lösung- nur 41 7o der zur völligen Sättigung notwendigen Menge. Es ist daher wichtig, sich diese Tatsachen bei den nachfolgenden Beschreii)ungen der Methoden zu merken; in diesen ist der Grad der Sättigung stets auf wirk- liche Sättigung bezogen. E. Lösen von Niederschlägen. J. Lösen von Niederschlägen im allgemeinen. Die meisten Proteinniederschläge lösen sich sehr rasch auf, wenn sie in fein verteiltem Zustande mit dem geeigneten Lösungsmittel zu- sammengebracht werden, dagegen ergeben sich Schwierigkeiten, wenn sich bei der Darstellung der Proteine Klumpen bilden. Ihre Lösung wird daher sehr erleichtert, wenn man das Gemisch in Wasser suspendiert und durch ein feines Siebtuch gehen läßt. Die ungelösten Klumpen Averden hierbei auf dem Tuch zurückgehalten und können leicht durch eine steife Borstenbürste zerkleinert werden. Wenn der Niederschlag in Wasser Kislich ist, oder wenn er durch Ammonsulfat erhalten worden ist und in der durch Behandlung mit Wasser entstehenden verdünnten Salzlösung gelöst wird, so wird er auf diese Weise rasch in Lösung gebracht werden können. .?. Lösung von Globiilinniedersclilägen. Niederschläge von Gl()l)ulinen, die in Wasser unlöslich sind, müssen immer auf obige Weise behandelt w^erden, um eine fein zerteilte wässerige Suspension zu erhalten. Das zur Lösung dienende Salz darf erst zugefügt werden, nachdem sämtliches (ilobulin durch das Tuch gegangen ist. denn wird das Salz vor dem Sieben dni'ch das Tuch zugefügt, so werden stets Klumpen gebildet, die sich nachher nur sehr langsam wieder lösen. 284 Th. B. Osborne. ^i. Lösen großer Ammonsiilfafniederschlüge. (irolio Niederschlägo, die durcli Sättitiimp; mit Amraonsulfat erhalten werden imd die von der anhaftenden Snlfatlösung- nicht befreit werden Jvönnen. ohne daß viel Zeit und absorbierendes Filtrierpapier angewandt wird, können am besten izelöst werden, wenn man sie, während sie noch viel anhaftende Flüssiiikeit enthalten, von den Faltenfiltern trennt und ge- nügend Wasser zufügt, um eine dünne Faste zu erzeugen und die Masse während unuefähr 24 Stunden dialvsiert. Auf diese AYeise wird genug Ammonsulfat entfernt, um den Niederschlag in einem viel kleineren Vo- lumen löslich zu machen, als nötig wäre, wenn so lange Wasser zugefügt würde, bis die Konzentration der anhaftenden Sulfatlösung derart vermin- dert ist, daß eine Lösung des Niederschlages möglich wird. F. Waschen von Niederschlägen. Da es gewöhnlich schwierig- ist, Niederschläge von irgendwie beträcht- lichen Mengen Protein auf den Filtern derart zu waschen, daß die anhaf- tende Mutterlauge rasch entfernt wird, müssen die Niederschläge vom Papier entfernt und in fein verteiltem Zustande in der zum Waschen be- stimmten Flüssigkeit suspendiert werden. Dies wird bewerkstelligt, indem man die Suspension durch feines Siebtuch gießt. Zur Beschleunigung des Prozesses benutzt man eine flache Borstenbürste. (ilobulinniederschläge, die durch fraktionierte Fällung aus Salzlösungen erhalten worden sind, werden zuerst mit einer Salzlösung von der Konzen- tration des Filtrates gewaschen, denn wenn Wasser angewendet wird, so kann Protein aus der Mutterlauge gefäht werden. Nachdem man das ur- sprüngliche Filtrat völlig ausgewaschen hat. wird die Salzlösung mit Wasser entfernt. Einige (ilobulinniederschläge enthalten Verbindungen des Proteins mit kleinen (^)uantitäten von Säure, welche löslich in reinem Wasser, aber unlöslich in verdünnten Salzlösungen sind. Wenn man diese Niederschläge mit Wasser auswäscht, wird ein Teil des Niederschlages gelöst, wodurch nicht bloß Verluste verursacht werden, sondern auch gewöhnlich Verstopfung der Filter erfolgt, auch wird darauffolgendes Waschen unmöglich gemacht. In solchen Fällen wird mit verdünnter Salzlösung gewaschen. Der Niederschlag wird nachher bis zur Entfernung des Salzes mit verdünntem Alkohol, dann mit stärkerem Alkohol und zuletzt mit absolutem Alkohol und Äther behandelt. G. Trocknen von Niederschlägen. Präparate, die vollständig mit absolutem Alkohol ausgewaschen worden sind, werden leicht von der noch anhaftenden Feuchtigkeit so weit befreit, daß sie in ein feines l^ulver übergeführt werden können. Wenn jedoch die Behandlung mit absolutem Alkohol nicht genügend gewesen war, werden die Präparate zäh und hart. Hierdurch wird die spätere Entfernung aller anhaftenden Flüssigkeit und die Pulverisierung- erschwert. Darstellung der Troteine der I'flanzenwelt. 285 Yorläiifiiios Trocknon wird erzielt, wenn man das Präparat entweder in einem Exsikkator oder hei mäßii-er Temperatur in einem Strom von trockener Luft in einer dünnen Schicht auf dem Boden einer flaclien Schüssel oder auf einer Schicht Filtrierpapier ausbreitet. lieim Ti'ocknen uroljer Quantitäten von Xiederschläuen müssen die iiröUeren Klumpen zerkleinert werden, sobald sie leicht zerdrückt werden können, so daß Feuclitigkeit, die nicht völlio- entfernt worden ist, durch die ganze Masse verteilt wird. Dies verhindert, daß ein Teil des Präparates in zähe und hornige Klumpen verwandelt wird. So getrocknet, bis der Alkohol größtenteils entfernt ist, sind die Präparate in geeignetem Zustand, um zu fernerem Gebrauch aufbewahrt zu werden. Die meisten Präparate halten in diesem Zustand 8—10% Feuchtigkeit und Alkohol zurück. Vollständiges Trocknen erfordert mehr- stündiges Erhitzen auf ca. 110''. Infolge der hygroskopischen Natur von völlig trockenen Proteinen müssen Präparate für Analysenzwecke wenigstens 6—8 auf einander folgende Stunden im Trockenschrank gehalten werden. Die Vollständigkeit der Trocknung muß durch ein zweites, gleich langes F^rhitzen kontrolliert werden. Wenn die zweite Periode des Trocknens von zu kurzer Dauer ist, nehmen die Präparate gewöhnlich an (xewicht zu, indem sie während des Erwärmens im Trockensclirank Feuchtigkeit aufnehmen. Sie halten diese so zähe zurück, daß mehrstündiges Erhitzen nötig ist, um sie wieder völlig auszutreiben. H. Prüfung der Reinheit der Präparate. Farbstoffe, die häufig vorhanden sind, brauchen nicht besonders nachgewiesen zu werden, da sie dem Auge leicht sichtbar sind. Die \'erun- reinigungen, nach denen hauptsächlich in den I*räparaten von Samenpro- teinen gesucht werden muß, sind: Säuren verschiedener Art, mineralische Be- standteile, Öle und andere ätherlösliche Bestandteile und Kohlehydrate Diese Verunreinigungen können durch folgende Methoden nachgewiesen werden. ]. Gebundene Säuren. Die zur Bildung von Proteinsalzen nötige Menge Säure ist sehr klein^ denn gewöhnlich braucht es wenig mehr als 1 an'^ und selten mehr als 2 cm3 i/io normales Alkali, um 1 r/ des Präparates gegenüber Phenolj)htalein zu neutralisieren. Die Menge der gebundenen Säuren kann bestimmt werden, indem man lg des Präparates in ca. 10 cw^ neutraler Kochsalz- lösung auflöst, etwas Phenolphtalein zufügt und mit i/jo normaler Kali- oder Natronlauge titriert. Die Endreaktion ist gewöhnlich schai-f. Wenn man die Reinheit der Proteinpräparate prüft, so ist die Tat- sache, daß Proteinsalze vorliegen, von großer Wichtigkeit, deini der haupt- sächlichste Zweck bei der Darstellung ist die Gewinnung von Produkten, die eine einzige Proteinsubstanz enthalten, nicht die Gewinnung einer ein- zigen bestimmten Verbindung dieses Proteins. Bei unseren gegenwärtigen Kenntnissen kann das letztere gewöhnlich nicht erreicht werden. Gorinofün-ioe Unterschiede im Gehalt an gebundener Säure können große rnterschiode in der Löslichkeit des Proteins verursachen und leicht zum Glauhen fuhren, daii ein Präparat, das in Wirkhchkeit nur ein ein- ziges Protein cnthiUt, ein Gemisch von zwei ganz verschiedenen Proteinen darstellt. So können aus Hanfsamen Präparate von Edestin erhalten werden, die in Wasser völlig unlöshch sind, während andere darin teilweise oder sogar größtenteils löshch sind. Diese Verschiedenheit rührt von der Gegen- wart eines etwas größeren Gehaltes an gebundener Säure in dem Teil, der in Wasser löslich ist, her, denn wenn dieser gegen Phenolphtalein * neutralisiert wird, wird das Produkt völlig unlöslich in Wasser. Die Tatsache, daß Proteinpräparate, wie sie gewöhnlich erhalten werden, fast immer Mischungen von solchen Proteinsalzen darstellen, verdient beson- dere Beachtung in Beziehung auf die Gegenwart des Phosphors, denn ein Phosphorgehalt schließt nicht notwendigerweise in sich, daß das fragliche Protein als Nukleoprotein oder Phosphorprotein betrachtet werden muß. In den Samenextrakten ist gewöhnlich eine nicht unbeträchtliche Menge von Phosphorsäure und zweifellos an organische Säuren gebun- dener Phosphor vorhanden. Diese phosphorhaltigen Säuren können sich teilweise oder vollständig mit dem Protein zu einem Proteinsab^ vereinigen. Dieser gebundene Phosphor verschwindet aus den Präparaten nach einer genügenden Anzahl von Fällungen und ist in solchen, wie den studierten Fällen, kein integrierender Bestandteil des Proteinmoleküls. So enthalten Edestinpräparate, die durch direkte Dialyse des Hanf- samenextraktes erhalten werden, stets einen kleinen Betrag von Phosphor. In Wasser suspendiert und gegen Phenolphtalein neutraüsiert, bleibt das Edestin ungelöst. Wenn das Edestin al)tiltriert und die Lösung zur Trockne verdampft wird, enthält der Rückstand sämthches zur Neutrali- sation erforderlich gewesene Alkali als eine Mischung von Alkalisalzen der Säuren, die vorher mit dem Edestin verbunden gewesen waren. Unter diesen ist Alkaliphosphat, was beweist, daß der im rohen Edestin enthaltene Phosphor hauptsächlich aus einer Phosphor enthaltenden Säure besteht. Wenn das rohe Edestin durch Dialyse wiedergefällt wird, so verschwindet der Phosphor größtenteils oder vollständig. Dies trifft auch für die meisten anderen Samenproteine zu, deren Darstellung in den folgenden Seiten beschrieben ist. Aus Pflanzengeweben, die, wie der Weizenembryo, reich an kern- haltigen Zellen sind, wird mit den Proteinen eine große Quantität von Kukleinsäure extrahiert, und es ist in solchen Fällen schwierig, phosphor- freie Präparate zu erhalten. Es ist jedoch wahrscheinlich, daß selbst in diesen Fällen der größte Teil dieses Phosphors in der Nukleinsäure ent- halten ist, die mit dem Protein einfach als Salz verbunden ist, denn bei fraktionierter Fällung schwankt der Gehalt an Phosphor in den einzelnen Fraktionen sehr weit, und es können Fraktionen erhalten werden, die überhaupt keinen Phosphor enthalten.') ^) Osborne and Catnphell, The Nucleic Acid of the Wheat Embryo and its Pro- lein Compounds. Journ. Amer. Chemical Society. XXII. p. 379 (1900). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 287 Rohe Proteinpräparate ans Loiiuniinosonsamen enthalten gewöhnlich eine nicht unbetriichtliclie (,)nantität von Phosphor, was zu dem weitverbreiteten (xlanben i>etiihrt hat, dali diese I'roteine i'hosphnr in ihren Molekiücn ent- halten. Wenn jedoch diese Präparate sorii'fältiLi- (hii'ch aut' einander foliicnde Fälhmacn i>ereinii>t werden, werden sie phosjjliorfrei erhalten, ohne dab sie eine merkliche ^'eränderuni>' in ihren Eijienscliaften oder ihrer Zusammen- setzunti' zeigen. Der Phosphorgehalt mub daher als Verunreiniguni; lic- trachtet werden. 2. Anorganische Verunreinigungen. Aus ►Samen dargestellte Pi'oteine enthalten gewölndich eine geringere Menge anorganischer Verunreinigungen als die aus den tiei-ischen (Jeweben dargestellten Proteine. Neben der eben erwähnten geringwi Menge anorga- nischer Säuren weisen die meisten Präparate von Samenproteinen eine geringe Menge anorganischer Stoffe auf, die als Asche erscheinen, wenn die Präparate verbrannt werden. Präparate, die 2- oder ^imal aus verhältnis- mäßig verdünnten Lösungen wiedergefällt worden sind, enthalten gewöhn- lich 0"2 — 0"4°/o Asche und bei denjenigen, die noch sorgfältiger gereinigt worden sind, sinkt der Aschegehalt sogar auf noch weniger als OP/q, so daß solche \'erunreinigungen in gut gereinigten Präparaten wenig Berück- sichtigung erfordern. 3. Atherlösliche Verunreinigungen. Die meisten der Proteine, deren Darstellung in den folgenden Seiten beschrieben wird, werden gewöhnlich frei von ätherlöslichen Beimengungen erhalten, wenn ihre Lösungen vor der endgültigen Fällung sorgfältig voll- ständig Idar filtriert werden. Die Präj)arate müssen jedoch immer mit trockenem Äther gewaschen werden. Die Abwesenheit von ätluM-löslichen Veruni-einigungen wird durch Verdunstung eines Teiles der letzten Äther- waschungen festgestellt. 4. Prüfung auf Kohlehydrate. Gut gereinigte Präparate einer großen Zahl der aus Pflanzen dar- gestellten Proteine gelien keine Reaktion mit a-Naphtol und Schwefelsäure (Molischreaktion). Diese Reaktion wird mit aUen Kohlehydraten erhalten und kann daher verwendet werden, um die (xegenwart von Kohlehydraten in den Präparaten mancher in den folgenden Seiten beschriebener Proteine nachzuweisen. Dieser Nachweis ist jedoch so empfindlich, daß große Sorg- falt angewendet werden muß, um Präparate zu erhalten, welche diese Re- aktion nicht geben, denn selbst eine geringe Quantität von Filtrierpai)ier- fasern, die dem Präparat beigemengt sind, wird eine positive Reaktion bedingen. Die Abweseidieit dieser Reaktion zeigt nicht bloß das völlige Fehlen von beigemengten freien Kohhdiydi'aten an. sondern auch dii- Al)- wesenheit von Nukleinsäuren, (ilukosiden und anderer koldehydratgebender Substanzen. 288 Th. B. Osborne. Eine Anzahl der in den folgenden Seiten beschriebenen Präparate gibt Malisch' Keaktion in geringem Grade, was zweifellos von einer Spur kohhdiydratgebender Substanz herrührt, die schwieriger zu entfernen ist, als das mit den die Reaktion nicht gebenden Präparaten vorkommende Kohlehydrat. Eine Anzahl anderer Proteine geben eine starke Reaktion mit dem ]\Iolischreagens. Vielleicht liegt hier eine Kohlehydratkomponente des Eiweißes selbst vor. Bei Anwendung der MoliscK Reaktion mub deren grolie Emjifind- lichkeit in Betracht gezogen werden, da eine ganz unbedeutende Menge von Kohlehydrat eine sehr starke Reaktion gibt. So genügen z. B. -/lo '"^ Filtrierpapier, Y,o ^^9 Arabinose oder Dextrin und ^j^^ mg Nukleinsäure, um unter den folgenden, für die Prüfung der Proteine geeigneten Bedin- gungen starke Reaktionen zu erhalten. Ungefähr öO mg des Proteins werden in 1 cm'^ Wasser suspendiert, o — 5 Tropfen einer loVoi^fn alkoholischen a-XaphtoUösung zugefügt und dami die Proteinlösung allmählich und vollständig mit )) cni^ konzen- trierter Schwefelsäure gemischt. Wenn Kohlehydrate vorhanden sind, so entwickelt sich bald nach der Zufügung der Schwefelsäure eine tiefe Purpurfärbung, deren Intensität bei der Zugabe von mehr Säure zunimmt. Die Färbung wird durch zuviel Säure zuletzt zerstört, so dab Sorge ge- tragen werden muß, daß die Säure allmählich und unter fortwähren- dem Schütteln zugefügt und die Maximalintensität der Färbung beobach- tet wird. Wenn in den Präparaten, die nach obigen Angaben Molisch' Re- aktion nicht geben, die völlige Abwesenheit jeder Kohlehydratspur bewiesen werden soll, muß die Probe mit einer größeren Menge des Präparates wiederholt werden. Ritthausens Reaktion kann ebenfalls zur Prüfung auf Kohlehydrate verwendet werden, aber das Resultat ist ungewiß, denn in denjenigen Prä- paraten, die, wie Ovalbumin. (Hukosamin enthalten, läßt sich die Kohle- hydratgruppe auf diesem Wege nicht nachweisen. Ungefähr ^lo 9 ^^^ Proteins werden in 5 c»?^ Wasser suspendiert, dann wird 5 c»? ^ konzentrierte Schwefel- säure zugefügt und die Lösung 5 — 10 Minuten gekocht. Sodann wird mit äO — 40 cm'^ Wasser verdünnt und einige Stunden stehen gelassen. Wenn die verdünnte Lösung nur w^enig gefärbt ist und klar bleibt, so darf die Abwesenheit von Stärke, Gummi etc. angenommen werden. Wenn sich ein flockiger, dunkler Niederschlag absetzt, so ist die Gegenwart dieser Kohle- hydrate wahrscheinlich. Es muß jedoch daran erinnert werden, daß alle Proteine, wenn sie lange mit siedender Schwefelsäure hydrolysiert werden, unlösliche Produkte von ähnlichem Aussehen liefern, und es ist nicht ausgeschlossen, daß derartige Produkte auch unter den oben beschriebenen LTmständen entstehen. Wenn das Präparat Fett enthält, so wird die verdünnte Lösung trüb, und es muß Sorge getragen werden, diese Trübung von dem durch die Kohlehydrate verursachten flockigen, dunkelgefärbten Niederschlag zu unterscheiden. Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 289 Die Tatsache, daß viele Samenproteine aus kohlehydratreichen Ge- weben absolut frei von diesen Substanzen erhalten werden können, ist ein starker Beweis, daß die Proteinpräparate, was adsorbierte Vei'unreinigungen betrifft, in höherem Reinheitsgrad dargestellt werden können, als von vielen auf diesem Felde arbeitenden Forschern angenommen wird. IV. Spezielle Methoden zur Darstellung der einzelnen Proteine. I. Globuline. 1. Edestin aus Hanfsamen (Cannahis sativa). Der Name Edestin ist für mehrere anscheinend ähnliche Proteine verschiedener Samenspezies angewandt worden, ist hier aber zur Bezeich- nung des hauptsächhchsten Proteins des Hanfsamens gebraucht, da deutliche Unterschiede zwischen diesem Protein und denen anderer Samen existieren. Neben Edestin, das verhältnismäßig leicht kristallisiert erhalten wird, kann durch Extraktion mit neutralen Salzlösungen nur ein sehr geringes (.Quan- tum anderer Proteinsubstanzen gewonnen werden. Diese bestehen aus Pro- teosen und aus Spuren eines Proteins, das beim Erhitzen des Kochsalz- extraktes auf ca. 86" koaguliert und das durch Sättigung mit Natrium- chlorid gefällt wii-d.i) a) Darstellung von Edestin. Die Hanfsamen werden, wie unter 1.2 a beschrieben, in einer Mühle unter Beifügung von Kerosin gemahlen. Die gemahlene Masse wird dann mit Petroläther extrahiert oder durch Druck vom größten Teil des Öles und Kerosins befreit. Die Hüllen werden durch Sieben entfernt. 100 g des feinen Mehles werden dann mit ca. 300 cm^ lOVoiger mit Phenolphtalein versetzter Kochsalzlösung behandelt und kalt gesättigte Barvtlösung all- mählich zugefügt, bis das Extrakt nach tüchtigem Durchrühren eine blaß- rote Färbung zeigt. Die hierzu erforderliche Menge Barytlösung wird notiert. 1 hg desselben Hanfsamenraehls wird dann mit 2 / 10<^/oiger Natrium- chloridlösung behandelt. Hierzu fügt man nach tüchtigem Durchrühren eine Mischung von 800 crn^ lO^/oiger Kochsalzlösung und einer Menge von Barytlösung, welche ungefähr öO^/o weniger beträgt, als die Menge, welche nötig ist, um die saure Reaktion des Samenextraktes gegen Phenolphtalein zu neutrahsieren (gewöhnlich ungefähr 200 cm^). Das Ganze wird dann nochmals tüchtig durchgerührt und auf 3 bis 4 Faltenfilter {Schleicher d: SchiUl, Nr. 580, o8 cm) gegossen, nachdem diese vorher mit lOVoigei" Kochsalzlösung befeuchtet worden sind. Nach 3 Stunden hat man ungefähr 1500 cw^^ eines leicht getrübten Filtrates erhalten, das gegen genau neutrales Lacknms- papier gerade merklich sauer reagiert. Der Rückstand wird zusammen mit dem Filtrierpapier in ein Bechergias geworfen und mit so viel zerrissenem, *) Oshorne, Crystallized Vegetable Proteins. American Chemical Jouru. XIV. p. 663. (1892). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 19 290 Th. B. Osboruc. weichem Filtrierpapior gemeugt, daß alle Flüssigkeit absorbiert und eine halbfeste Masse gebildet wird. Diese wird einem hohen Druck — am besten in einer hydraulischen Presse — ausgesetzt und so ca. 1500 cm^ eines sehr trüben Preßsaftes erhalten. AVährend dieser Rückstand ausgepreßt Avird, wird das zuerst erhaltene Filtrat auf einem 20 cm Düchnertrichter durch eine dicke Schicht von Papierbrei, wie unter C. 1 beschrieben, filtriert. Wenn dieses Filtrat voll- ständig durch die Papierschicht durchgegangen ist, wird der trübe Preß- saft auf derselben Schicht filtriert und eine etwas opaleszente, im durch- fallenden Licht aber klare Lösung erhalten. Die Zeit, die nötig ist. um den Prozeß auf diesen Punkt zu bringen, beträgt ungefähr 6 Stunden. Die Lösung wird dann, wie unter D. 2 angegeben, 4 Tage lang in einem Strom fließenden Wassers dialysiert, während welcher Zeit sich das Edestin in kristallinischem Zustande abscheidet. Der Inhalt des Dialysators wird dann in einem großen Gefäß absetzen gelassen. Nach o — 4 Stunden wird die überstehende, fast völlig klare Flüssigkeit abgehebert. Diese ent- hält zu wenig suspendiertes Edestin, um eine Filtration zu lohnen und wird, da durch weitere Dialyse kein Edestin mehr erhalten werden kann, weggeworfen. Das abgesetzte Edestin wird dann in einem BüchnerscheTi Trichter auf einem Stück gehärteten Filtrierpapier gesammelt, mit der Pumpe trocken gesogen und mit Wasser gewaschen. Dieses rohe Edestin wiegt, nachdem es mit Alkohol und Äther gewaschen und über Schwefelsäure ge- trocknet worden ist, ungefähr 125^ und ist, mit Ausnahme einer unbe- deutenden Menge, in lO^/oiger Natriumchloridlösung völlig löslich. Das Edestin kann von dem in eben beschriebener Weise dargestellten Extrakt auch so getrennt werden, daß der klar filtrierte Auszug mit so viel destilliertem, auf TO'' erhitztem Wasser verdünnt wird, daß dessen Natriumchloridkonzentration auf o^/o reduziert ist. Nachdem die Lösung im Zimmer aUmählich erkaltet ist, wird sie an einem kalten (Jrt 12 bis 20 Stunden lang aufbewahrt und auf ungefähr 5° gekühlt. Die Ausbeute nach dieser Fällungsmethode beträgt ungefähr 100 g rohes Edestin aus einem Kilo ölfreiem Mehl. Wenn das rohe Edestin gereinigt werden soll, wird es noch feucht, nach E. 2, in lO^oigei' Natriumchloridlösuug gelöst. Für 125 ' klaren Lösunp- auf ungefähr 5" scheidet sieh das Edestin in schön kristallisiertem Zustande ab. Keim Wiederholen dieses Prozesses wird ein sehr reines Produkt er- halten. Dieses wäscht man nach F. mit uni>efähr 0'5" gi^er Xatriumchlo- ridlösung-, sodann mit 50''/oiS'('in Alkohol bis zum \'erschwinden der Chlor- reaktion, nachher mit stärkerem Alkohol und zuletzt einiue Male mit ab- solutem Alkohol und mit Äther. Das Produkt wird im Plxsikkator über Schwefelsäure getrocknet. Das Edestin wird in oben erwähnter Weise mit 0"5%iger Natrium- chloridlösung gewaschen, weil ein Teil des Präparates in Wasser löslich, in verdünnter Salzlösung aber unlöslich ist. Dieser Teil enthält mehr Säure als der unlöshche Teil i) und entspricht augenscheinlich einer höheren Säure- verbindung als der letztere. Um die kristallinische Struktur des ganzen Prä- parates zu erhalten, wird eine verdünnte Salzlösung zum Auswaschen benutzt, die nachher durch verdünnten Alkohol entfernt wird. Wenn ein von se- bundener Säure freies Edestin gewäüischt wird, muß die letzte Kristalli- sation aus einer Kochsalzlösung gemacht werden, zu der vorher so viel Kalium- oder Natriumhvdroxyd zugefügt worden war. daß die Edestin- lösung gegen Phenolphtalein neutral reagiert. Dies wird am besten ei'zielt, wenn man durch Titration mit Vio normalem Alkali die erforderliche Alkalimenge für einen aliquoten Teil des Edestins bestimmt und dann die bestimmte Menge Vio normaler Lauge zu dem zur \'erdünnung der Edestinlösung nötigen Wasser fügt. Sowohl die zur Lösung des Edestins nötige Salzlösung als auch das zur Verdünnung erforderliche Wasser werden durch Sieden von Kohlensäure befreit. Die Edestinlösung wird nach dem Verdünnen in einem geschlossenen Gefäß abkühlen gelassen. Das neutrale Edestin wird so rasch, wie möglich, auf einem Büchnerscheü. Trichter abgesaugt und möglichst wenig der Luft ausgesetzt. 2) Edestin kann auch dargestellt werden durch Extraktion der Hanf- samen mit heißer o^/giger Kochsalzlösung bei 50 — 60°. In diesem Falle wird die Filtration so schnell wie möglich auf einem Faltenfilter aus weichem Papier ausgeführt unter Anwendung eines Heißwassermantels oder über einem Dampftisch, so daß die Lösung während der Filtration warm bleibt. Da der Ptückstand nach der Filtration nicht genügend ausgepreßt werden kann, ohne kalt zu werden, so ist es besser, ihn zusammen mit den Filtern in S'^/oiger auf 60'' erwärmter Natriumchloridlösung zu erhitzen und ihn '■) Oshorne, Der ])asische Charakter dos Protoinmoleküls und das \'er]Kilten des Edestins zu l)estimmton Mengen Säure und Alkali. Zcitschr. f. physiol. Chemie. XXXUI. S. 240 (1901); ebenso Oshorne, The Basic Character of the Protein Molecule and the Reaction with definite Quantities of Acids and Alkalis. Jouni. Amer. Chemical Society. XXIY. p. 39 (1902). -) Oshorne, Der basische Charakter des Proteinmoleküls und das N'oriuilten des Edestins zu bestimmten Mengen von Säure und Alkali. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XXXni. S. 265 (1901); ebenso Oshorne, The Basic Cliaracter of the Proteinmolocule and the Reactions of Edestin with definite Quantities of Acids and Alkalis. Journ. Amer. Chemical Society. XXIV. p. 50 (1902). 19* 292 Th. B. Osborne. auf frisches Filtrierpapier zu l)ringen. Beim allmählichen Abkühlen des filtrierten Extraktes scheidet sich das Edestin in Kristallen ab, die nach erfoliiter Filtration mit verdünnter Salzlösung, dann mit öOVoigem Alkohol gewaschen werden. Das so erhaltene rohe Edestin kann in der soeben beschriebenen AVeise durch Umkristallisieren gereinigt werden. h) Eigenschaften des Edestms. Elementare Zusammensetzung. Analysen von kristallisiertem Edestin von Bitthausen ^), Osborne^), Chittenden und Mendel^) und von Abderhalden*) haben folgende, gut miteinander übereinstimmende Zahlen ergeben: C 51-3, H 6-9, N 18-7, S 0*9, 0 22-2o/o- Löslichkeit. Das von Säuren oder Basen völlig freie Edestin ist gänzlich unlöslich in Wasser, aber löslich in neutralen Salzlösungen: wenn es mit einer Menge Salzsäure verbunden ist, die nicht größer ist als 0"7 cm^ Vio Normallösung pro Gramm, so ist es ebenfalls unlöslich in AVasser; mit mehr Säure verbunden wird es proportional dem vorhandenen Säuregehalt löshch. Die Salze von Edestin mit Säuren sind milöslich in sehr verdünnten Salzlösungen, hingegen leicht löslich in stärkeren Salzlösungen. Die zur Lösung erforderliche Salzmenge ist proportional der Menge der gebundenen Säure. Bei Gegenwart einer nur kleinen Menge von Säure wird ein Teil des Edestins in Edestan verwandelt, das in Salzlösungen vohständig unlös- lich ist. 5) Die Menge dieses Produktes hängt von dem Betrage der vor- handenen Säure und von der Dauer ihrer Einwirkung ab. Reines und neu- trales Edestin ist in den Lösungen der meisten Mineralsalze löshch, jedoch unlöslich in den Lösungen von KaUum-, Natrium- oder Ammoniumacetat. ß) In Lösungen von starken Basen mit schwachen Säuren, die mit alkali- scher Reaktion dissoziiert hydrolytisch sind, ist Edestin löslicher als in Lösungen von Salzen starker Basen mit starken Säuren von entspre- chender molekularer Konzentration, während es in Lösungen von Salzen ^) Bitfhmisen, Zusammensetzuug der Eiweißkörper der Hanfsamen und des kri- stallisierten Eiweiß auf Hanf und Ricinussamen. Journ. f. pralct. Chemie. (2). XXV. S. 130 (1882). ^) Oshorne, Crystallized vegetable Proteids. Amer. Chemical Journ. XIV. p. 662 (1892). *) Chittenden and Mendel, On the Proteolysis of Crystallized Globulin. Journ. of Physiol. XVH. p. 48 (1894). *) E. Abderhalden, Hydrolyse des Edestins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XXXVII. p. 499 (1903). ^) Osborne, Ein hydrolytisches Derivat des Globulins Edestin und sein Verhältnis zu Weyl's Albuminat und zur Histongruppc. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XXXIH. S. 225 (1901). — Derselbe, A Hydrolytic Derivative of the Globulin Edestin and its relation to Wei/l's Albumiuate and the Histon Group. Journ. Amer. Chemical Society. XXIV. p. 28 (1902). *) cf. Osborne and Harris, The Solubility of Globulin in Salt Solutions. Amer. Journ. of Physiol. XIV. p. 151 (1905). Darstellung der rrnteine der rflaiizenwelt. 293 schwacher Basen mit starken Säuren, die mit saurer Reaktion hydro- lytisch dissoziiert sind, weniii'er löslich ist. Edestin ist löslich in iiesättiti:ter Natriumchloridlösung, aber unlöslich in oesättigter Magnesiumsulfatlösung. Hitzekoagulation. In lOVoig^'i" Natriumchloridlösung bildet das Edestin beim Erhitzen auf 87" eine leichte Trübung, bei 94" scheiden sich Flocken al). Wenn die Lösung nach einigem Pirhitzen auf DS" filtriert wird, wird durch weiteres Erwärmen der filtrierten Lösung kein Koagulum mehr erzielt. Das nach dem Erhitzen nicht koagulierende Edestin ist wahr- scheinlich unverändert, denn es kann durch Dialyse der Lösung in unver- änderten Kristallen erhalten werden. Wenn nach dem Sieden eine sehr geringe Säuremenge zu der Lösung gefügt wird, bildet sich l)ei wieder- holtem Sieden ein zweites Koagulum und durch Wiederholung dieses Prozesses kann praktisch sämtliches Edestin in das Koagulum übergeführt werden. \) Die zur völligen Koagulation nötige Menge Säure kann nicht auf einmal von Anfang an zugefügt werden, denn diese Menge Säure würde schon vor dem Erhitzen das Edestin aus der Salzlösung ausfällen. Spezifische Rotation.-) Gelöst in lO^/oiger Natriumchloridlösung 20" ist (a) -y- = — 41-o0.-) Fällung mit Ammonsulfat.^) y^a^ch Hof) n eis fers Methode beginnt die Fällung in Yk, gesättigter Ammonsulfatlösung mit iVO cm'^ und ist vollständig mit 4*2 cm^, was 23 und 35''/o wirklicher Sättigung entspricht. 3) In lO^/oiger Natriumchloridlösung sind die Fällungsgrenzen zwischen 1'8 und 3-0 cm 3 Sättigung. P'arbreaktionen. Edestin gibt alle üblichen Farbreaktionen der Pro- teine mit Ausnahme von Molisch'' Reaktion.*) Gehalt an Aminosäuren: vgl. ^), '^\ ''). Stickstoffverteilung. 8) N als NHg l-88Vo, basischer N ;t91»/o, nicht basischer N 10-78 Vo, ^' im Mg O-Niederschlag 0-127o- ^) cf. Chittenden and Mendel, On the Proteolysis of Crystallized Globulin. Journ. of Physiol. XVII. p. 48 (1894). ^) Oshorne and Harris, The Specific Rotation of some vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). ') ()s-horne and Harris, The Precipitation IJmits witli Amnioninni Snlphate of some vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XX\'. p. 837 (1903). *) Erb, Über das Salzsäurcbindungsvermögen einiger reiner Eiweißkörper. Zeit- schrift f. Biol. XLI. S. 309 (1901), iernav Osborne and Harris, The Carbohydrate Group in the Protein Molecule. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 474 (1903). ^) E. Abderhalden , Hydrolyse des Edestins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XXXVII. S. 499 (1903) und XL. S. 249 (1903). ^) Osbnrue and fiilberf, The Proportion of Glntainiiiic acid yielded by various Vegetable Proteins when decomposed by iJoiling with Ilydrochloric acid. Amer. Journ. of Physiol. XV. p. 333 (1906). ') Kossei und Patten, Zur Analyse der Ilexonbasen. Zeitschr. f. physiol. Clu^mie. XXXVIII. S. 39 (1903). ^) Osborne and Harris, Xitrogen in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical So- ciety. XXV. p. 323 (1903). 294 Jl li- ^- Osboiue. 2. Excelsin aus der brasilianischen oder Paranuß (Bertholletia excelsa). Excelsin ist der hauptsächliche Eiweißbestandteil dieser Nuß. Es war das erste künstlich kiistallisierte Pflanzenprotein. Diese Kristalle, die durch Maschke'^) erhalten Avurden, bilden hexagonale Platten und bestehen aus einem in Wasser unlöslichen Proteinsalz. Im freien Zustand ist Excelsin löslich in Wasser. Excelsin kann daher aus den Nüssen mit reinem Wasser extrahiert werden und scheidet sich daraus, infolge der allmählichen Ent- Avicklung- von Säure im Extrakt, in Kristallform ab. Maschke erkannte die Tatsache, daß diese Kj'istalle eine Säureverbindung des Proteins sind. 2) a) Darstellung des Excelsins. Die Nüsse Averden von ihren Schalen durch Zertrümmern mit einem Hammer befreit und alle ungesunden Kerne ausgelesen. Es ist unnötig, die dunkelgefärbte äußere Samenhaut zu entfernen , denn die Ausbeute an Excelsin wird durch ihre Gegenwart nicht beeinflußt. Die Kerne werden zerkleinert und vom größeren Teil des Öles nach A. 2 h befreit. Die ölfreien ^lehle machen ungefähr IT^/o der schalenfreien Nüsse aus. Ihj Mehl wird mit ungefähr 8Z einer ßo/oigen, auf 45 — 50" er- wärmten Ammonsulfatlösung behandelt. Nach etwa einstündiger Dige- stion wird die Mischung durch feines Tuch gesiebt, der Rückstand mit Filtrierpapier gemischt und nach C. o so trocken als möglich gepreßt. Der Auszug wird dann nach C. 1 völlig klar fdtriert und nach D. 2 dialysiert. Das Excelsin, das sich in gut ausgebildeten, von amorphen Bestand- teilen völlig freien, hexagonalen Platten abscheidet, wird dann vom Dialy- sator entfernt und durch Dekantieren gewaschen; zuerst mit lOVoiS^^w Alkohol, der 0-25 Vo Natriumchlorid enthält, dann mit 20Voi"'eni Alkohol, 0"12<'/o Natriumchlorid enthaltend; hierauf sukzessive mit 40-, 75- und 90"/oigem Alkohol und zuletzt mit absolutem Alkohol. Nachdem der Alkohol in einem Büchnertrichter auf einer Schicht gehärteten Filtrierpapiers abgesaugt worden ist, wäscht man das Excelsin mit trockenem Äther und trocknet über Schwefelsäure. Die Ausbeute beträgt ungefähr 20''/o des ölfreien Mehles. Da das Excelsin das einzige Protein des Mehles ist, das durch Dialyse ge- fällt wird, und da das Volumen der Lösung, aus der es abgeschieden wird, ein verhältnismäßig großes ist, so ist das so erhaltene Produkt sehr rein. Wenn weitere Reinigung erwünscht wird, so kann das Excelsin in einer ungefähr 6%ig"^n Ammonsulfatlösung wieder gelöst (E. 2) und durch Zu- gabe von mehr Ammonsulfat zur erhaltenen Lösung bis zur Vio-Sättigung wiedergefällt werden. Der so erhaltene Niederschlag wird auf gehärteten *) Maschke, Kristallisierte Kaseinverbindung. Jouni. f. prakt. Chemie. LXXIV. S. 436 (1858). '-) Maschke, i)ber den Bau und die Bestandteile der Klebcrl liischen (Kleberkörn- chen) in Bertholletia, deren Entwicklung in Rizinus, nebst einigen Bemerkungen über Amyloübläschen. Journ. f. prakt. Chemie. LXXIX. S. 148 (1860). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 295 Faltenfiltern alifiltriert, in verdünnter Ammonsiilfatlösimi:;- gelöst (E. 1) und, wie oben beschrieben, durch Dialyse wiederg-efällt. Das so erhaltene Excelsin bildet ein dichtes, schneeweißes Pulver, das durch Glitzern im reflektierten Sonnenlicht dem l)lo(,}en Auge seinen kri- stallinischen Charakter offenbart. b) Eigenschaften des Excelsins. Elementare Zusammensetzung. ij C 52-2, H 6-9, N 18-2, S 1-1, 0 21-6«/o- Lösliehkeit. Das nach der eben beschriebenen Methode dargestellte Excelsin ist unlöslich in Wasser, aber löslich in neutralen Salzlösungen. Wird das Excelsin in destilUertem Wasser suspendiert und mit Natrium- oder Kaliumhydroxyd gegen Phenolphtalein neutralisiert, so ist es völlig löshch. Die so erhaltene Lösung ist, obgleich sie gegen Phenolphtalein neutral ist, gegen Lackmus alkalisch. Excelsin verhält sich demnach gegen Alkah analog wie Edestin, mit der Ausnahme, daß Excelsin in Wasser lös- lich wird, wenn es gegen Phenolphtalein vollständig neutralisiert wird, während Edestin unlöslich ist. 2) Es ist sehr wahrscheinhch, daß die saure Reaktion des kristallisierten Excelsins, wie schon beim Edestin bewiesen worden ist, von der gebundenen Säure herrührt, und daß das freie Excelsin in Wasser löslich ist, wiihrend seine Salze mit Säuren darin unlösUch sind. Die Excelsinsalze haben die LösUchkeit eines Globuhns. Excelsin ist löshch in gesättigten Natrium chloridlösungen. Hitzekoagulation. ä) In lOVoiger Natriumchloridlösung wird beim allmähhchen Erwärmen auf 70^ eine Trübung hervorgerufen. Bei w^eiterem Steigern der Temperatur auf 86"^ scheiden sich Flocken ab, deren Menge all- mähhch zunimmt, wenn die Temperatur auf 100" gesteigert wird. Spezifische Drehung.*) In 10%i&er Natriumchloridlösung ist 20" (7.)^ =—42-9«. Fällung nrit Animonsulfat. ^) Wird Excelsin nach der beschile- benen Methode dargestellt, so wird es nach Hofmeisters jMethode in Vio gesättigter Ammonsulfatlösung gelöst, mit 4 — b-bcni^ oder bei 32 — 46% wirkhcher Sättigung gefällt. M Oftborue, Crystallized Vegetable Proteids. Amer. Chemical Jonrn. XIV. p. 662 (1892), ferner Osborne and Harris, Precipitation Limits with Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteins, 2^ Paper. Amer. Journ. of Physiol. XIII. p. 436 (1905). ^J Osborne, Der basische Charakter des Proteinmolekiils und das Vorhalten dos Edestins zu bestimmten Mengen von Säure luul Alkali. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XXXIII. S. 240 (1901). ^) Osborne, Crystallized Vegetable Proteids. Amer. Chemical Journ. XIV. p. 662 (1892). •*) Osborne and Harris, The Specific Rotation of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). ^) Osborne and Harris, The Precipitation Limits witli Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). 296 Th. B. Osborne. Färb enreakti 011 en. Excelsin ^ibt alle Farbenreaktionen der Proteine. Gehalt an Aminosäuren: vgl. M Stickstoffverteilung'.2) N als NH3 1-48, basischer N 5-76, nicht basischer N 10-97. N im Mg ( )-Mederschlag 0-17%- 3. Globulin ans Kärbissatuen (Cucurbita maxiiua). Die Samen des Kürbis enthalten eine verhältnismäßig große Menge Protein, von dem der größere Teil leicht in oktaedrischen lüistallen er- halten wird. 3) Die Extrakte dieses Samens ergel)en auch eine sehr kleine Menge eines anderen Globulins, das bei einer niedrigeren Temperatur als das kristallinische Globulin koaguliert, und von welchem das letztere durch Umkristallisieren oder Umfallen aus verdünnten Salzlösungen getrennt werden kann. a) Darstellung des Kürhissamenglohulins. Wenn man die Samen zur Extraktion vorbereitet, ist es zur Erzielung guter Ausbeuten und farbloser Produkte nicht nötig, die voluminösen Schalen und äußeren Samenhäute vollständig zu entfernen. Will man jedoch eine Trennung herbeiführen, so geschieht dies am besten mit der Hand. Die Samen werden längs der Naht mit einem scharfen Messer aufgeschnitten und der Kern herausgenommen. Die äußere Haut des Kernes wird dann sorgfältig mit dem Messer abgeschabt. Dieser Prozeß schließt so viel Arbeit und A'erluste in sich, daß es unpraktisch ist, größere Quantitäten dieses Globulins auf diese Weise darzustellen. Größere Mengen von Kürbissamenmelil werden erhalten, indem man die Samen grob mahlt, am besten in der Kaffeemühle (S. 275). Durch Sieben des so erhaltenen Produktes auf einem groben Sieb kann ein großer Teil der Schalen entfernt werden, ohne daß man viel von den Kernen ver- liert. Das gesiebte Mehl wird dann mit Kerosin gemischt und noch einmal auf der Kaffeemühle gemahlen (vgl. A. 2 a). Nachdem man das Öl mit Petroläther extrahiert hat, kann der größte Teil der noch vorhandenen Schalen durch Sieben entfernt werden. 1 kg dieses Mehles wird mit 4 l lOVoiger Kochsalzlösung behandelt. Nach tüchtigem Umrühren wird der Auszug nach C. o filtriert. Das klar filtrierte Extrakt wird mit dem vierfachen Volumen destilliertem Wasser, das vorher auf 65" erhitzt war, verdünnt. Nach allmählichem Ab- kühlen im Zimmer auf 20" wird die Lösung im Eisschrank auf ca. 5" ge- kühlt. Das (xlobulin scheidet sich in oktaedrischen Kristallen ab und läßt eine fast klare Lösung zurück. Diese wird abgehebert und der Nieder- *) Osborne and Clapp, Hydrolysis of Excelsin. Amer. Journ. of Physiol. XIX. p. 53 (1907). ' j ^) Osborne and Harris, Nitrogen in Protein Bodics. Journ. Amer. Chemical So- ■ eiety. XXV. p. 323 (1903). 1 ^) cf. G. Grübler, Über ein kristallinisches Eiweiß der Kürbissamen. Journ. f. prakt. Chemie (2). XXIII. S. 97 (1881). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 297 schlai? auf einer Schiebt iiehärteten Filtrierpapicrs in einem BüchnerscMen Trichter o-esammelt. Nachdem man die Mutterlauge ah<>esaust hat. wird der Niederschlasi' vom Papier wegtienommen, durch ein Koliertuch in einer VaVoig'ßii Natriumchloridlösuny suspendiert und noch einmal al)^esau,ut. Dann wird er sukzessive mit 50-, 75- und 100Voi8't.'in Alkohol und mit Äther gewaschen und über Schwefelsäure getrocknet. Die Ausbeute beträgt ungefähr lOYo des Mehles und das Produkt, ob- gleich nur einmal gefällt, ist verhältnismälHg rein infolge des sehr großen Vohimens, aus dem es sich allmähbch abscheidet und infolge der dichten und festen Konsistenz des kristallinischen Niederschlages. Die Abwesenheit des löslicheren Samenglobulins wird dargetan durch die Tatsache, daß so zubereitete Lösungen des Globulins in lOVoig^r Natronlauge vollständig klar bleiben, wenn sie bis 87" erhitzt werden, während Lösungen, die nur einmal durch Dialyse des Extraktes hergestellt waren, l)ei 73° trübe werden und bei 84'^ einen flockigen Niederschlag geben. Das so erhaltene Globulin kann durch Umkristallisieren weiter ge- reinigt werden, aber dieser Prozeß bedingt gewöhnlich einen großen Materialverlust, da mehr oder weniger Protein bei dieser Fällung in neutralen Salzlösungen unlöslich wird. Wenn das Globulin umkristaUisiert werden soll, wird es vom Filter w^eggenommen und durch ein Siebtuch in Wasser suspen- diert. Das Volumen der Suspension wird auf 600 cm^ gebracht. Es werden dann 600 an^ 207oiger Natriumchloridlösung zugefügt. Nachdem das unlösliche Produkt sich abgesetzt hat, wird die Lösung sorgfältig durch ein Filter von Papierbrei filtriert. Wenn die Menge des unlöslichen Pro- duktes beträchtlich ist, wird dieses auf ein weiches Faltenfilter gebracht. Nachdem der größte Teil der Lösung abgelaufen ist, werden Niederschlag und Filter auf einer Schicht von Papierbrei abgesogen. Wenn die (^)uan- tität des unlöslichen Proteins nur klein ist , kann alles auf einmal auf dem Pllterbrei filtriert werden. Die klare Lösung wird dann mit 4 Volumen auf 65o erhitzten Wassers verdünnt und das Globuhn, wie vorher, umkristallisiert. b) Eigenschaften des Kürhissamenglobidins. Elementare Zusammensetzung.') G 51-65. H 7t)2, N 18-36, SO-86, 0 22-11 Vo. Diese Zahlen, welche das Mittel sehr nahe übereinstimmender Ana- lysen von BarUeri , Ritthausen , Chittendcn und Hartivell, Grübler und Osborne sind, stellen die Zusammensetzung dieses Proteins innerhalb sehr enger Grenzen fest, Löslichkeit.ij Völlig unlöslich in Wasser. Leicht löshch in verhält- nismäßig starken Kochsalzlösungen, aber sehr wenig löslich in 27oi8'Pii *) Osborne, C'rvstallized Vegetable Proteids. Amcr. Cheniical Journ. XI \. p. 662 (1892). 298 Th. B. Osborne. und verdünntoron Xatriumchloridlösungen. Löslich in gesättigter Natrium- chloridlösung. Tidöslich in gesättigter Magnesiumsulfatlösung. Hitzekoagulation. 1) In lOVoiger Natriumchloridlösung erfolgt Trübung beim Erwärmen auf 87 «, bei Oö« bildet sich ein flockiger Nieder- schlag. Die von diesem Koagulum abfiltrierte Lösung bleibt beim Sieden klar, gibt aber mit Essigsäure einen reichlichen Niederschlag. Spezifische Drehung.-) In lOVoig^r Natriumchloridlösung ist 200 [a] — = - 38-780. Fällung mit Ammonsulfat. 3) In \/io gesättigter Ammonsulfat- lösung beginnt die Fällung bei der Bestimmung nach Hofmeisters Methode nach Zusatz von o'o cm^ und ist vollständig mit 4'4 vm^ oder bei 26 und Bßo/o wirklicher Sättigung. Farbreaktionen. Das KürbissamenglobuUn gibt alle übhchen Farb- reaktionen der Proteine, ausgenommen MoUscK Reaktion. Gehalt an Aminosäuren: vgl. *"-5). Stickstoffverteilung. 6) N als NHg 1-28, basischer N 5*97, nicht basischer N ir04, N im Mg 0-Niederschlag 0-22o/o. ■i. Das Globulin des BauinwoUsatnens (Gossyphitu herhaceiim). Die Samen der Baumwollpflanze enthalten eine große Menge Pro- tein, das durch Natriumchloridlösungen extrahiert und durch Dialyse ge- fällt werden kann. Infolge der großen Quantität von Farbstoffen, die in diesen Samen enthalten sind, ist das so erhaltene Globulin leicht gelb ge- färbt. Bis jetzt ist keine Methode gefunden worden, nach welcher farblose Präparate erhalten werden. Neben diesem Globuhn wird durch neutrale Salzlösungen oder durch Wasser sehr wenig Protein aus den Samen extra- hiert. Fraktionierte Fällung des Globulins hat keinen Hinweis gegeben, dati es eine Mischung von zw^ei oder mehr Proteinen ist. ■^) 'ö a) Darstellung des Baumwollsamenglobulins. Die Samen werden von ihren Hüllen l)efreit, indem man sie in einer hölzernen Schale mit einem scharfen Fleischhackmesser zerhackt. Beim ') Oshorne, Crystallized Vegetable Proteids. Amer. Chemical Jouru. XIV. p. 6ß2. (1892). -) Osborne and Harris, The Specific Rotation of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (l'.tOS). ^) Osborne and Harris, Tlie Precipitation Limits with Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteids. Journ. of the Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). *) Abderhalden und Berc/hausen, Die Monoaminosäuren von aus Kürbissanieu dar- gestelltem, kristallinischem Eiweiß. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XLIX. p. 15 (1906). ^) Osborne and /'lajjj) , Hydrolysis of the Cristallized Globulin of Squash-Seed. Amer. Journ. of Physiol. XIX. p. 475 (1907). ®) Osborne and Harris, X^itrogen in Protein Bodies. Journ. of the Amer. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). ') Osborne and Voorhees , The Proteids of Cotton-seed. Journ. Amer. Chemical Society. XVI. p. 778 (1894). Darstellung der l'roteiue der Pflanzenwelt. 299 Sieben auf einem i^Toben Sieb kann der i>Tößte Teil der öli.ü-en Samen von den meisten Hüllen befreit werden. Die Kerne werden dann mit Kerosin gemischt imd in der Kaffeemühle gemahlen. Nachdem man den größten Teil des Öles durch Extraktion mit Petroliither oder durch Auspressen auf einer hydraulischen Presse entfernt hat, wird das grobe IMehl in der Kaffeemühle zu einem feinen Pulver gemahlen (S. 275). Das käufliche PJaumwoUsamenmehl , das nach dem Auspressen des Öles erhalten wird und häufig als Yiehfutter dient, kann auch zur Dar- stellung des Baumwollsamenglobulins verwendet werden und gibt, soweit bis jetzt bekannt ist, dasselbe Piesultat. Um große Quantitäten dieses Glo- bulins herzustellen, ist dieses Mehl eine geeignete Quelle. Für ein sorg- fältiges Studium der Proteine müssen jedoch die ganzen Samen verwendet werden, damit die Behandlung, der sie unterworfen werden, von Anfang des Prozesses an bekannt ist. Die Methode der Globulinbereitung ist die- selbe für beide Mehlsorten. 1 Itg Mehl wird mit ?> l 10°/oigPi" Kochsalzlösung behandelt , wobei nach C. 3 ungefähr 2o00 cm^ eines nahezu klaren Extraktes erhalten werden. Dieses wird dann nach C. 1 filtriert und nach D. 2 vier Tage lang dia- lysiert. Der größere Teil des Globulins wird so als ein etwas zusammen- hängender Niederschlag erhalten, von dem die milchige Lösung soi-gfältig abgehebert oder abgegossen wird. Letztere wird dann einige Stunden stehen gelassen. Falls sich ein genügender Niederschlag bildet, wird die Lösung abgehebert und der Niederschlag zu der Hauptmenge des Globulins gefügt. Die Menge des Proteins, die nach mehrstündigem Stehen noch in der Lösung suspendiert bleibt, ist nicht bedeutend und kann verworfen werden, denn selbst nach mehreren Tagen bleibt die Lösung noch trübe und setzt sehr wenig Globulin ab. Sättigung der Lösung mit Ammonsulfat beweist, daß nur Avenig Protein darin enthalten ist. Das abgesetzte Globulin wird dann in einem gemessenen Volumen Wasser suspendiert, E. 2, das Volumen der Suspension auf 500 cm^ ge- bracht und darin 1<6 g Ammonsulfatkristalle aufgelöst. Die so in "-/lo ge- sättigter Ammonsulfatlösung bewerkstelligte Lösung des (ilobulins wird vervollständigt, indem sie durch ein feines Siebtuch gegossen wird, um alle Klumpen zu zerteilen. Dann wii'd sie stehen gelassen , bis die unlösliche Sul)stanz sich abgesetzt hat. Die Lösung wird dann auf einem Filter von Papierbrei filtriert, wobei ein Verstopfen des Filters sorgfältig ver- hindert werden muß. Falls sich viel unlösliche Substanz absetzt, wird diese am besten auf einem Faltenfilter gesammelt. Wenn nur wenig vor- handen ist, kann direkt auf dem Filter von Pai)ierbrei abgesaugt werden. Nachdem man das Filter mit Vio gesättigter Ammonsulfatlösung ausge- waschen hat. wird das klare Filtrat gemessen und für je 100 c;»-' 2Si (7 Ammonsulfatkristalle zugegeben. Die Lösung wird so Vm gesättigt und das Globulin ausgefällt. Die Lösung bleibt mit der Fällung über Nacht stehen. In dieser Zeit zieht sich der Niederschlag zu einer dichten, zu- 300 Th. B. Osborne. sammenhaftendon :\Iasse zusammen, von der die Lösung gewöhnlich fast völlig dekantiert werden kann, ohne daß Protein verloren geht. Dieser Niederschlag wird dann in ungefähr 500 cm^ lO^/oiger Koch- salzlösung gelöst und durch Tapierbrei klar filtriert (C. 1). Nachdem man die Filter mit der Salzlösung ausgewaschen hat, werden Filtrat und Wasch- wasser 4 Tage lang dialysiert (D. 2). Der Inhalt des Dialysators wird ungefähr- eine Stunde stehen gelassen: hiernach dekantiert man die nahezu klare Lösung so vollständig als möglich. Dann wird der Nieder- schlag in einem Büchnersdim Trichter auf eine gehärtete Filtrierpapier- schicht gebracht. Nachdem beinahe trocken gesaugt ist, wird der Nieder- schlag nach F. mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag ^ird dann vom Filter weggenommen, in Alkohol suspendiert, zur feinen Verteilung durch das Siebtuch gegossen und wieder auf das Filter gebracht. j\Ian wiederholt diese Behandlung mit absolutem Alkohol, wäscht den Nieder- schlag auf dem Filter mit Äther, entfernt ihn vom Filter, zerreibt ihn zu einem feinen Pulver und trocknet über Schwefelsäure. Das so bereitete Präparat bildet ein leichtes gelbliches Pulver mit folgenden Eigenschaften. b) Eigenschaften des Baumwollsamen-Globulins. Elementare Zusammensetzung. i) C 52i6. H 6-(37, N 18*49, S 0-62, 0 22-06«/o- Löslichkeit. M Löslich in mäßig verdünnten und gesättigten Lösungen von Natriumchlorid. L'nlöshch in reinem Wasser. Hitzekoagulation. 1) Teilweise Koagiüation beim Erhitzen der 107oigeu Kochsalzlösung auf 93 — lOO*". Spezifische Drehung. Wurde nicht bestimmt. Fällung mit Ammonsulfat.^) In Vio gesättigter Ammonsulfat- lösung beginnt die Fällung bei Anwendung der Hofmeisterschen i\Iethode nach Zusatz von 4-6 cm^ und ist vollständig mit 6-4 cm^, was 38 und 56Vo wirkücher Sättigung entspricht. Farbreaktionen. Das Baumwollsamenglobulin gibt alle übhchen Farbenreaktionen der Proteine. Gehalt an Aminosäuren: vgl. ^"-^j Stickstoffverteilung.5) N als NH3 l-92<'/o^ basischer N 5-7P/o, nicht basischer N II-OP/q. *) Oshorne and Voorhees, The Proteids of Cotton-seed. Journ. Amer. Chemical Society. XVI. p. 778 (1894). ^) Oshorne and Harris, The Piecipitation Limits with Ammonium Sulphate of some vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). *) Abderhalden und Eosfoski, Die Monoaminosäuren des „Edestins" aus Baum- wollsamen und dessen Verhalten gegen Magensaft. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XLIV. p. 265 (1905). *) Oshorne, Leavenirorfh and Branffecht, The Different Forms of Xitrogen in Proteins. Amer. Journ. of Physiol. XXIII. p. 180 (1908). ^) Oshorne and Harris, Nitrogeu in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 328 (1903). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 3Q]^ 5. Aniandin ans Mandeln (Prunus amygdalus). Der größere Teil des Proteins dieses Samens besteht aus Amandin, das entweder mit Wasser oder Kochsalzlösunii- extrahiert werden kann. Extrakte mit Salzlösungen enthalten neben Amandin nur sehr wenig Proteose. ') Die Samen des Pfirsichs (Prunus persica) enthalten ein Protein, das mit dem Amandin der Mandel wahrscheinlich identisch ist. Amandin ist in Wasser löshch, wenn es von gebundener Säure durch Neutralisation mit Alkali befreit wird. Wenn es mit einer kleinen Menge Säure zu einem Proteinsalz verbunden ist, ist es unlöslich in Wasser und löslich in Salzlösungen und besitzt in diesem Zustande die Eigenschaften eines Globulins. Wässerige Extrakte der Mandel geben bei Sättigung mit Ammon- sulfat Niederschläge. Diese liefern, wenn sie in Kochsalzlösung gelöst sind nach Dialyse Amandin in Form von sehr kleinen Sphäroiden, die sich bald zu einem halbflüssigen, durchsichtigen Niederschlag vereinigen. Diese Ab- scheidung wird durch die Säure bewirkt, die sich im Extrakt entwickelt und sich mit dem Amandin zu einem Salz mit Globulineigenschaften ver- einigt. Kristallinische Präparate sind aus der Mandel nicht erhalten worden. a) Darstellung von Ämandhi. Die Schalen der Mandeln werden mit der Hand entfernt und ihre äußere Haut losgelöst, indem man die Kerne wenige Sekunden in heißes Wasser eintaucht und zwischen den Fingern preßt. Wenn sie von den Häuten befreit sind, wird der größte Teil des Öles entfernt, indem man sie nach A. 2h durch eine Fruchtpresse preßt. Das von der Hauptmenge des Öles befreite Mehl wird dann zu einem feinen Pulver zermahlen. Ein Kilogramm des Mehles wird mit 5 1 lO^/oiger Kochsalzlösung behandelt und auf große Faltenfilter von weichem Papier ( Schleicher- Schüll, Nr. 580) gebracht. Wenn die Lösung zum großen Teil durchgegangen ist, wird der Pdickstand auf dem Filter, wie unter C. ?> beschrieben, mit einer genügenden Menge Filtrierpapier gemischt und die halbfeste Masse einem hohen Druck ausgesetzt. Der Preßrückstand wird mit ;> l lO^/oiger Kochsalzlösung aufgerührt und noch einmal gepreßt. Nachdem man den ganzen Auszug durch eine Schicht von Papierbrei nach C. 1 filtriert hat, wird er mit Ammonsulfat gesättigt und die Proteinfällung auf einem großen, gehärteten Faltenfilter abfiltriert. Der Niederschlag wird dann in Wasser gelöst, dem man Koch- salz zufügt, falls das am Niederschlag haftende Ammonsulfat zur Lösung nicht gentigt. Die Lösung wird dann, ohne weitere Filtration, 4 oder 5 Tage nach D. 2 dialvsiert. ') cf. Oshorne and Campbell, Conglutin and Vitelliu. Journ. Amer. Chemical Society. XVin. p. 609 (1896). 302 Tli. B. Osborue. Das so crefällte Aniandin wird auf einem gehärteten Faltenfilter ab- filtriert und in 2 / Wasser suspendiert. Dann werden 760 g Ammonsulfat ab- gewogen und ein Teil desselben unter Aufrühren des Proteins zur Suspension hinzugegeben, bis sich alles gelöst hat. Dann wird der Rest des Sulfats zugefügt und das Amandin aus der so resultierenden halbgesättigten Lösung gefällt. Diese Fällung wird dann auf einem gehärteten Faltenfilter ge- sammelt, in 10Voi8"er Natriumchloridlösung wieder gelöst, die Lösung nach C. 1 völlig klar filtriert und nach D. 2 chloridfrei dialysiert. Das ausgefällte Amandin wird dann absetzen gelassen, die Lösung abgehebert und der Niederschlag auf einem gehärteten Faltenfilter ge- sammelt, mit Wasser und dann mit Alkohol (F.) gew^aschen, vom Filter entfernt, unter absolutem Alkohol zu einem wasserfreien Piüver zerrieben und auf einem Bächnerschen Trichter vom Alkohol abgesaugt und mit Äther gewaschen. Das Präparat ist nach dem Trocknen über Schwefelsäure ein schneeweißes Pulver, das gew^öhnlich ungefähr 2ö<'/o des ölfreien Meliles oder 12% der Mandel in natürlichem Zustande entspricht. b) Eigenschaften des Änmndins. Elementare Zusammensetzung.^) C 51-4, H 6*9, N 19'0, S 0*4, 0 22-nVo- Löslichkeit.i) Das nach obigen Angaben bereitete Amandin bildet mit kaltem Wasser eine gummiartige, plastische Masse und löst sich in ge- ringem Mabe. In W^asser von ca. 98° bildet Amandin eine durchsichtige, schleimige Masse. Ein beträchthcher Teil löst sich und scheidet sich beim Abkühlen wieder ab. Die Lösung in heißem Wasser wird beim Sieden leicht trübe. Dieser lösliche Teil des Präparates ist wahrscheinlich eine Verbin- dung des Amandins, der saurer ist als der unlösliche Teil. Der Niederschlag, der sich beim Abkühlen der heißen wässerigen Lösung bildet, ist nach Zusatz von wenig Salpetersäure völlig löslich, wird mehr Salpetersäure zugefügt, so fällt ein Niederschlag, der sich beim Erwärmen ähnhch wie eine Proteose löst und in der Kälte wieder erscheint. Amandin wird in Kochsalzlösung bei Sättigung mit Natriumchlorid nicht ausgefällt. Auch mit Merkurichlorid wird aus der Natriumchloridlösung des Amandins nichts abgeschieden. Hitzekoagulation. ^) Eine lO^oige Kochsalzlösung, die 57o Amandin enthält, wird trübe, wenn sie auf 75*' erhitzt wird. Bei 80" findet geringe Flockenbildung statt, die beim allmähhchen Steigen der Temperatur inten- siver wird. Doch wird selbst beim Sieden nur ein kleiner Teil des Aman- dins koaguliert. OQO Spezifische Drehung. 2) In lOVoiger Kochsalzlösung ist [a] "^- := = — 56-40. ^) Oshorne and Camphell, Conglutin and Vitellin. Jouru. Amer. Chemical Society. XYm. p. 609 (1896). -) Oshorne and Harris, Specific Rotation of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 303 Fällung- mit Ammonsulfat. ') Aus einer V^o gesättigten Animon- sulfatlösung wird Amandin nach Hofmeisters IJestimmungsniethode zwischen 3"5 und 5"3 cm^ gefällt, was 28 — 44^0 wirklicher Sättigung entspricht. Farbreaktionen. Amandin gibt alle übhchen P'arbreaktionen der Proteine. Die MoUschsdie Reaktion ist bei sorgfältig gereinigten Präpa- raten nur sehr schwach und ist wahrscheinlich durch eine schwer zu ent- fernende Spur von Verunreinigung verursacht. Gehalt an Aminosäuren: vgl. 2) Stickstoffverteilung. 3) N als NH^ ot);"), basischer N 4"15, nicht basischer N 1P55, N im Mg 0-Niederschlag O-lTVo- (i. Juglansin aus Walnuß (Jiiglans regia). Die Walnuß enthält eine große Menge Globulin, das leicht aus dem ölfreien Mehl der Kerne gewonnen werden kann. Es ist jedoch notwendig, vor der Extraktion die äußeren Samenhäute zu entfernen, denn diese ent- halten so viel Tannin, daß dadurch fast sämtliches Protein unlöshch wird. a) Darstellung von Juglansin. Die Nußschalen werden mit der Hand entfernt und die Kerne wäh- rend einiger Sekunden in heißes Wasser getaucht, bis die Häute gelockert werden. Diese werden dann mit einem Messer abgezogen und die Kerne schneU getrocknet, indem man sie auf Filtrierpapier oder sonst eine ab- sorbierende Substanz legt. Die Kerne werden hierauf von der größeren Menge ihres Öles befreit , entweder in der Fruchtpresse nach A. 2 h oder durch Zer mahlen und Auspressen und nachherige Extraktion mit Petroläther oder Äther. Das Mehl wird dann in der Kaffeemühle (S. 275) zu einem feinen Pulver zermahlen. 1 ä-^ Mehl wird mit ö/ lOVoiger Kochsalzlösung l)ehan- delt und der Auszug nach C. o filtriert. Das klare Extrakt wii-d dann mit iVmmonsulfat gesättigt und der Niederschlag auf gehärtete Faltenfilter gebracht und über Nacht der Filtration überlassen. Der Niederschlag wird dann in 2 / l()Voi"'ei' Natriumchloridlösung gelöst, die Lösung nach C. 1 klar filtriert und dann 5 Tage lang dialysiert, D. 2. Der Inhalt des Dialysators wird in einen Zyhnder gebracht und ab- setzen gelassen. Die Lösung Mird dann abgehebert, der Niederschlag in 2/ lO^oiger Natriumchloridlösung gelöst, E. 2. Die resultierende Lösung wird noch einmal klar filtriert, C. 1 , und noch einmal 5 Tage lang dialysiert, D. 2. Der Inhalt des Dialysators wird dann wieder in einen Zylinder ge- gossen. Nach dem Absetzen des Proteins wird die Lösung abgehebert und ^) Oshorne and Harris, The Precipitation Limits with Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). ") Oshorne and Clapp, Hydrolysis of Amandin from the Ahuond. Amer. Journ. of Physiol. XX. p. 470 (1908). ^) Oshorne and Harris, Nitrogen in Protein Bodies. Journ. Amer. Society. XX\'. p. 323 (1903). 304 Th. B. Osborne. der Niederschlag auf einer gehärteten Papierscliicht in einen Bächnersdaen Trichter so trocken wie möglich abgesaugt. Das Jug'lansin wird dann durch Suspension in 0'50/oiger Natrium- chloridlösung gewaschen. Die Suspension wird durch ein Koliertuch ge- gossen und nach dem Absetzen und Abhebern der größten Menge der Lösung auf einem lUichnertrichter trocken gesaugt. Das so gew^onnene Juglansin entwässert man dann durch sukzessives Waschen mit 50-, 75- und lOOo/oigPni Alkohol. Schüeßlich wird Äther zugegeben und das Protein in einem warmen Luftstrora oder ülier Schwefelsäure im Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute beträgt nach dieser Methode ungefähr 200^ oder 20 Vo des öl- freien Mehles. Das so bereitete Juglansin bildet ein schneeweißes, dichtes Pulver. b) Eigenschaften des Juglansins Elementare Zusammensetzung. ^^ 2) q 50-80; H 6-84; N 18-96;, SO-80; 0 22-507o- Löslichkeit. 1) Juglansin ist in Wasser unlöslich, aber leichtlöslich in neutralen Salzlösungen und in sehr stark verdünnten Säuren und Al- kahen. In Lösungen, die mit lOVoigei' Natriumchloridlösung erhalten worden sind, werden durch Sättigung mit Kochsalz geringe Fällungen erzeugt. ReicUichere Niederschläge bilden sich durch Sättigung mit Magnesiumsulfat. Hitzekoagulation. 1) 5% Juglansin, in lOVoiger Kochsalzlösung auf- gelöst, geben beim Erhitzen auf 80" eine leichte Trübung und bei 99"^ ein flockiges Koagulum. Beim Sieden koaguliert etwas mehr, doch wird Juglansin durch Hitze nur sehr langsam und unvollständig koaguliert. 900 Spezifische Drehung.^) In lOVoiger Kochsalzlösung ist [a]-— - = = — 45-21". Fällung mit Ammonsulfat.*) In Vio gesättigter Ammonsulfatlösung erfolgt die Fällung nach der Bestimmungsmethode von Hofmeister zwischen 2-8 cm» und 4*6 cm^, was 21-7''/o und o6'47o wirklicher Sättigung entspricht. Farbenreaktionen. Juglansin gibt mit Ausnahme der MoliscMchQn Reaktion die ül)lichen Farbenreaktionen der Proteine. Der Gehalt des Juglansins an Aminosäuren ist noch nicht be- stimmt worden. Stickstoffverteilung, s'^- 2) (J. nigra) N als NH3 PTT, basischer N5-61, nicht basischer N 11-33, N im MgO-Niederschlag 0*19 %• ') Osborne and Campbell, Congliitia aud Vitelliu. Jouru. Amer. Chemical Society. XVIII. p. 609 (1896). -) Osborne and Harris, The Globulin of the English AValnut, the American Black Waluiit aud the Butteruat. Jouru. Amer. Chemical Society. XXV. p. 848 (1903 >. ") Osborne and Harris, The Specific Rotation of Some Vegetable Proteins. Jouru. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). ■*) Osborne and Harris, The Precipitatiou Limits with Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteins. Jouru. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). ^) Osborne and Harris, Nitrogeu in Protein Bodies. Jouru. Amer. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. j.jQq 7. Legiimin ans Erbse (Pisiim sativiim), Linse (Ervuni lens), Saubohne (Vicia faba), Wicke (Vicia sativa). Der Name Leji-umiii wurde früher benutzt, um die Trüteinsubstanz aus einer großen Zahl verschiedener Leguminosensamen zu bezeichnen, aber spätere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Präparate aus \iei('ii dieser Samen deutliche Unterschiede zeigen. Die Präparate jedoch, vrelche aus der Erbse (Pisum sativum), Sau- bohne (Vicia faba), Linse (Ervum lens) und Wicke (Vicia sativa) erhalten werden, zeigen gleiche elementare Zusammensetzung und gleiche Reaktionen, und da der Name Legumin zuerst benutzt worden war, um diese Samenproteine zu bezeichnen, ist dieser Name für das hauptsäch- liche, aus ihnen erhaltene Protein reserviert worden. Daß das Legumin aher dieser Samen wirklich identisch ist. ist un- wahrscheinlich gemacht worden durch die Ergebnisse der Hydrolyse von aus Erbsen und Wicken gewonnenen Präparaten. Obgleich die Mengen der aus beiden Präparaten erhaltenen Aminosäuren nahezu dieselben sind, scheinen die gefundenen Unterschiede dennoch die wahrscheinlichen (Ireiizen der Analysenirrtümer zu überschreiten. Jedoch scheint es in Er- wägung der großen Ähnlichkeit der Präparate aus den vier oben genannten Samen am besten, sie vorläufig als Legumin zu bezeichnen. Die Leguminpräparate, die hier beschrieben werden, sind Protein- salze, welche die Eigenschaften von Globulinen besitzen. Wird das Legumin durch Neutralisation gegen Phenolplitalein von der gebundenen Säure befreit, so wird es löslich in Wasser. Dies erklärt die Tatsache, daß Wasser das Legumin aus frisch gemahlenen Samen extrahiert, und daß der Extrakt beim Stehen das gelöste Protein abscheidet, w^eil sich im Extrakt Säure entwickelt. Es war früher angenommen worden, daß das Legumin durch die lösende Wirkung der Alkaliphosphate in Lösung gebracht werde, und daß die Hinzufügung von Säure durch NeutraUsation Fällung erzeugt. Aus diesem Grunde nannte Liebig dieses Protein „Pflanzenkasein". Es war wiederholt behauptet worden, daß das Legumin phosphor- lialtig sei; wenn es aber sorgfältig gereinigt wird, kann es vollständig phosphorfrei erhalten werden. Es ist darum kein Nukleoprotein odei- Xukleo- cdbumin. Das Legumin l)ildet nur einen Teil des Proteins dieser Samen. In den Samen der Saubohne, der Linse und Erbse findet es sich zusammen mit einem anderen Globulin von ähnlichen Eigenschaften und ähnlicher Zusammensetzung. Dieses ist löslicher in sehr verdünnten Salzlösungen und sehr hoch konzentrierten Ammonsulfatlösungen. Dieses letztere Globulin, das Vicilin genannt worden ist, ist in den Samen der Wicken nicht gefunden worden. Alle vier Samensorten enthalten auch ein Protein , das weder durch Dialyse noch durch Verdünnung aus den Salzlösungen gefällt wird. Beim Erwärmen desselben auf 80'^ scheidet es sich jedoch ab. Dieses Protein, Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 2U 306 '^ '*■ ß- Os 1)0 nie. Legunielin. hat die Eigenschaften eines Albumins. Alle vier Samenarten geben auch eine kleine Menge von Proteosen. M a) Darstellung des Wkkenlegumhis. Legumin wird am leichtesten aus den Samen der AVicke erhalten, da diese kein \'icilin enthalten, von dem das Legumin nur schwierig völlig getrennt werden kann. Die Samen aller hier genannten Spezies werden zur Extraktion nach A. 1 vorbereitet. 1 kg Wickenmehl wird mit 4 / lOVoiger Kochsalzlösung gemischt, die genügend Baryt enthält, um das Extrakt gegen Lackmus neutral zu machen. Die notwendige Menge Baryt wird bestimmt, indem man eine Portion von 100// Mehl für sich mit einer gemessenen Menge kalt gesättigter Barytlösung neutralisiert. Die berechnete Menge Barytlösung wird dann mit einem gleichen Volumen 20''/oi»6i" Natriumchloridlösung gemischt und die Mischung mit einer lOVoigen Kochsalzlösung auf 4 l gebracht. Nachdem man das Mehl tüchtig mit der Salzlösung gemischt hat, wird sofort alles nach C. ;> behandelt. Der nach C 1 filtrierte Auszug wird dann mit Ammoniumsulfat gesättigt und die Fällung auf einem gro('»en Faltenfilter von gehärtetem Papier fil- triert. Der Niederschlag wird zusammen mit der anhaftenden Ammonsulfat- lösung nach E. 8 behandelt und die erhaltene Lösung von der kleinen Menge gewöhnlich darin enthaltener unlöslicher Stoffe abfiltriert (C. 1 ). Die klare Lösung wird drei Tage laug in laufendem Wasser dialy- siert, D. 2. Der Inhalt des Dialysators wird in einen Zylinder gebracht, ab- setzen gelassen, die Lösung abgehebert und der Niederschlag auf einem mit gehärtetem T'apier belegten BiicJmernchan Trichter so trocken wie möglich gesogen. Der Niederschlag von rohem Legumin wird dann in lOVoigei" Kochsalzlösung gelöst (E. 2), die Lösung, wenn nötig, völlig klar filtriert (C. 1) und das Legumin durch viertägige Dialyse in laufendem Wasser gefällt. Die einzigen anderen im Extrakt der Wickensamen enthaltenen Pro- teine sind eine verhältnismäßig geringe Menge von Legumelin und sehr wenig Proteosen. Das nach der eben beschriebenen Methode dargestellte Legumin ist daher nahezu rein. Die Gegenwart von beigemischtem Legu- melin wird durch Lösen einer Probe des Präparates in lO^/oiger Koch- salzlösung und Erwärmen auf 80° in einem Wasserbad nachgewiesen. Ist Legumelin vorhanden, so wird es koagulieren. W^enn eine weitere Pteinigung des Legumins erwünscht wird, kann dieses durch Wiederholung der Fällung durch Dialyse erzielt werden oder durch Fällung seiner Natriumchloridlösung mittelst Verdünnung mit so viel kaltem *) Cf. Oshor/ie and Cinii/ihcll , Legumin and other Proteids of tbe Pea and Vetch. Journ. Amer. Chemical Society. XVIII. p. 583 (1896). — Dieselben, Proteids of tlie Pea. Ibid. XX. p. 348 (1898)' — Dieselben, Proteids of the Lentil. Ibid. XX. p. 362 (1898). — Dieselben, Proteids of the Horse Bean. Ibid. p. 393 (1898). — Die- selben, Proteids of the Yetcb. Ibid. XX. p. 40G (1908). — Dieselben. Proteids of the Pea, Lentil, Horse Bean and Vetch. Ibid. XX. p. 410 (1898). t Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. ;-',Q7 destillierten Wasser. d) N = Stickstoff nach der Metliode von Dumas. 20* 308 "Th. B. Osborne. Lüslic'hkeit.') Das iiadi der beschriebenen Methode dargestellte Le- gnmin ist in Wasser mdöslich, aber in Kochsalzlösungen von zwei und mehr Prozent löslich. In stark verdünnten Salzlösungen ist es nur wenig löslich. Wird es von gebundener Säure durch Neutralisation gegen Phenol- phtalein befreit, so ist das Legurain löslich in Wasser. -) Salzlösungen von Legu- min werden durch Sättigung mit Kochsalz oder Magnesiumsulfat nicht gefällt. Hitzekoagulation. ^) Wenn Legumin völlig frei von Vicilin und Legumelin ist, so kann man seine Xatriumchloridlösungen einige Zeit lang kochen, ohne daß Trü])ung auftritt. Wenn jedoch vorher ein wenig Essig- säure zugefügt wird, so erfolgt beim Sieden eine intensive Koagulation. Spezifische Drehung.*) Das Legumin der Saubohne zeigt in lo» oiger Kochsalzlösung [a] - = — -io-Gi". Fällung mit Ammonsulfat. 5) Nach der beschriebenen Methode dargestellte Legumiupräparato werden nach Hofmeisters Bestimmungsweise zwischen 5-5 und 7'.') cm'^ gefällt, d. h. zwischen 46 und 67% wirklicher Sättigung. Farbenreaktionen. Legumin gibt alle Farbenreaktionen der Proteine. Die Reaktion mit j\[oUsc]i Reagens ist schwach und bei verschiedenen Präparaten verschieden stark. Es ist daher wahrscheinlich, daß diese Reaktion durch eine sehr geringe Verunreinigung verursacht wird. Gehalt an Aminosäuren: vgl. ''"^) Stickstoffverteilung. *^) Erbse: N als XH3 1-69; basischer N Tvll: nicht basischer N 10-97; N im MgO-Niederschlag 0*27 Vo- Linse: N als NH3 1-69; basischer N 5-16; nicht basischer X ILn;'.; X im MgO-Xiederschlag O'IL Saubohne: X^ als XH3 1-62; basischer X^4-92: nicht basischer X' ll-;>4; X im MgO-Xiederschlag O'lL Wicke: X als XH3 1-75; basischer X 5-17; nicht basischer X'^ 10-90; X im MgO-Xiederschlag 0-18. 1) Osborne aiul Campbell, The Proteids of the Pea, Leutil, Horse Bean and Vetcli. Jourii. Amer. Chemical Society. XX. p. 410 (1898). ^) Osborne, Der basische Charakter des Proteinmoleküls und das \'erhalten des Edestins gegen bestimmte Mengen von Säure und Alkali. Zeitschr. f. plivsinl. Chemie. XXXIII. p. 240 (1901). ^) Osborne a,nd. Camjybell, The Proteids of the Pea, Lcntil, Horse Bean and \'etch. Journ. Amer. Chemical Society. XX. p. 410 (1898). *) Osborne and Harris, The Specific Rotation of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). ^) Osborne and Harris, The Precipitation Limits with Ammonium Sulphate of some Vegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). *) Osborne and Hei/l, Hydrolysis of Vetch Legumin. Amer. Journ. of Physiol. XXII. p. 423 (1908). ') Osborne and C'lap}), Hydrolysis of Ijegumin from the Pea. Journ. of Biological Chemistry. III. p. 219 (1907). ^) Osborne ani Harris, Nitrogen in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 309 8. Vicilin aus Erbse (Pisiiin sativum), Linse (Ery tun Jens), Saubohne (Vicia f aha). ^'icililu (las einen Teil der Globuline diu- Erbse, Linse und Saubohne bildet, unterscheidet sich in Zusammensetzung und Eigenschaften vom Legumin und ist eine verschiedene Substanz. Vicilin enthidt ein wenig mehr Kohlenstoff, etwas weniger Stickstoff und weniger als halb so viel Schwefel wie Legumin; es ist löslicher in verdünnten Salzlösungen und durch Ammonsulfat weniger leicht wie das Legumin fällbar. Seine Ähnlichkeit mit d(^m Legumin liibt eine genetische ^'erwandtschaft vermuten, aber seine Abwesenheit im AVickensamen zeigt, daß dies offenbar nicht der Fall ist. Von den drei oben erwähnten Samen sind zahlreiche Vicilin prä parate erhalten worden, die in bezug auf Eigenschaften und Zusammensetzung sehr nahe miteinander übereinstimmen. Vicilin bietet besonderes Interesse, da es weniger Schwefel enthält als irgend ein anderes bekanntes Protein. Der Schwefelgehalt einer großen Zahl von Präparaten hegt zwischen O'l und (>25"/o- ^'^^^ Teil dieses Schwefels gibt, wie der Schwefel aller anderen Proteine, beim Sieden mit Ätzkali Sulfide. Vicihn kann aus den Kochsalzlösunaen durch fraktionierte Fällung vom Legumin getrennt werden. Diese Methode bedingt aber Verlust an Substanz und erfordert viel Zeit. Es wird leichter durch Fällung mit Ammonsulfat vom Legumin getrennt, denn bei •'/lo-Sättigung wird das Legumin gefällt, während Vicilin erst bei '/lo-Sättigung ausfällt. a) Darstellung von Vicilin. Vicilin wird am besten aus dem Plltrat der in "/lo gesättigter Ammon- sulfatlösung erfolgten ersten Leguminfällung erhalten (vgl. S. ;>07). Dieses Filtrat wird mit Ammonsulfatlösung gesättigt, der Niederschlag auf einem gehärteten Faltenfilter filtriert, das anhaftende Sulfat so gut wie mciglich durch Pressen zwischen Filtrierpapier entfernt und dann in 1/ Wasser gelöst. 400// kristalUsiertes Ammonsulfat werden dann in der Lösung ge- löst. Dies genügt, um im Verein mit der am Niederschlag haftenden ge- sättigten Sulfatlösung die Konzentration des Salzes auf nahezu 'v ,o-^;i<^tigung zu bringen. Wenn ein Niederschlag von weuig Legumin gebildet wird, wird dieser abfiltriert und das Filtrat mit Ammonsulfat gesättigt. Der Niederschlag von Vicilin, der sich nach der Sättigung mit Ammonsulfat abscheidet, wild (hmn in Wasser gelöst und die filtrierte Lösung so lange diah- siert. bis eine Probe beim Eingießen in reines Wasser keine Trüi)ung mehr gibt. Der durch Dialyse gebildete Niederschlag von \'icilin wird dann auf einem gehärteten Faltenfilter gesammelt, mit Wasser (F.) und dann nnt Alkohol gewaschen, mit absolutem Alkohol entwässert, mit trockenem Äther gewaschen und zuletzt im Exsikkator über Schwefelsäure getrocknet. K^IQ Th. B. Osborne. b) Eujensehaßen des Vicilins.'^) Elementare Zusammensetzniiff. Vicilin j ^. ^ j^ ^ ^-.(). g Q.-Lg. Q 2o.og_ P.rbse J C 5213; H T02: N 17-24; S OIT; 0 2:VU. C 52-38: H 7-04; N 17-52; S 0-15: () 2:V39. Vicilin Linse Vicilin Saubohne Lösliclikeit. Vor dem Trocknen ist Vicilin nnlöslicli in Wasser, doch ist es reichlich löslich in 1 — SVoiS^" Kochsalzlösungen. Nach Behan- deln mit Alkohol und Trocknen über Schwefelsäure ist gewöhnlich ein großer Teil des Präparates in Salzlösungen unlösUch geworden. Hitzekoagulation. Mcilinlösungen in lOVoiger Kochsalzlösung wer- den bei 90" trübe, bei 95" scheiden sich Flocken ab. Bei andauerndem Er- hitzen auf 100" wird Vicilin beinahe völlig koaguliert. Spezifische Drehung wurde nicht bestimmt. Fällung mit Ammonsulfat. Infolge der Schwierigkeit der völligen Trennung von Vicibn und Legumin sind die Fällungsgrenzen nicht genau bestimmt worden. Meilin wird meist zwischen Vio und **/io wirklicher Sättigung ausgefällt. Farbenreaktionen. Vicibn gibt alle üblichen Farbenreaktionen der Proteine. Die Reaktionen mit Molisch'' Reagens variieren bei den verschie- denen Präparaten so stark, daß es wahrscheinlich ist, daß diese Reaktion von einer leichten Verunreinigung durch Kohlehydrate herrührt. Gehalt an Aminosäuren: Vicilin (Erbse): vgl.-) Stickstoffverteilung. 3) Erbse: N als NH3 1-67, basischer X 4-92, nicht basischer N 10-58, N im Mg ( )-Niederschlag 0-2o"/o. Linse: N als XH3 1*75, basischer N 4-59, nicht basischer X 10'77, X im MgO-XiederschlagO-130/o. Saubohne: N als NH3 1-93, basischer X 4-53, nicht basischer X 10-35, N im MgO-XiederschlagO-23"/o. 9. Phaseolin ans Bohnen (Phaseollis vulgaris). Phaseohn, das beinahe die ganze Proteinsubstanz dieses Samens bildet, ist ein (ilobulin, das in verhältnismäßig verdünnten Salzlösungen löslich ist. Es war früher mit dem Legumin anderer Spezies von Legumi- nosensamen identifiziert worden. Da aber späteres Studium gezeigt hat, ^) cf. Osborne and CanqihcU , The Proteids of tbe Pea, Lentil, Horse Bean ond Vetch. Journ. Amer. Chemical Society. XX. p. 410 (1898). ^) Osborne and Hei/I, Hydrolysis of \'icilin from tlie Pea (Pisiim sativum). .Tnnrii. of Biol. Chemistry. V. p. 187 (1908). ^) Osborne and Hc(rris, Nitrogen in Protein Bodies. .Journ. Amer. (.'hemical So- ciety. XXV. p. 3-23 (1903). Darstellung der Protoiiie der rflaiizciiwclt. 3H (laß es von anderen anf ähnliche Weise erhaltenen Proteinen anclerei" Ge- nera der Leg'uminosen verschieden ist, wnrde es Thaseolin i^enannt. M Es wai'en einii^e .Male rhase()linprä])arate (lai"i>estellt worden, die hauptsächlich ans oktaedrischen Kristallen bestanden. Es konnte aber kein Präparat gewonnen werden , das nur Kristalle aufwies. Die Kristalli- sationsbedingnngen sind derart, dali es nicht ni(3giich ist, eine Methode zu beschreiben, die ein wohlcharakterisiertes Produkt gil)t. In den P>o]inenextrakten ist auch ein leichter lösliches Globulin, Phaselin, und etwas Proteose enthalten. Fraktionierte Fällungen des Phaseolins ergaben unter verschiedeuen Bedingungen Produkte von konstanter Zusammensetzung. 't^- a) Darstellung von rhaseolin. Die Dohnen werden grol) gemahlen und vom größeren Teil ihrer äußeren Samenhäute durch Sieben durch ein grobes Siel) l)efreit. Dem groben Mehl wird dann der größte Teil seines Ölgehaltes durch Extrak- tiou mit Petroläther entzogen. Nachdem der Petroläther entfernt ist, wird das grobe Mehl noch einmal zu einem möglichst feinen Pulver gemahlen. Die meisten zurückbleibenden Samonhäute werden durch Sieben eut- fernt, A. 1. 1 kg des fein gemahlenen Mehles wird mit 4 / •2%iri'Pi"- '^^if S0<^ er- wärmter Kochsalzlösung behandelt. Die Mischung von Mehl und Lösungs- mittel wird wiederholt umgerührt und mindestens 3 Stunden stehen ge- lassen, denn beim sofortigen Filtrieren scheidet sich aus dem Extrakt eine Substanz ab, welche die Filtration sehr erschwert. Die Abscheiduug dieser Substanz vor der Filtration erleichtert diesen Prozeß sehr. Die ^lischung wird dann auf Faltenfilter (Schleicher-Schiill, Xr. 580, öOc;») mit gehär- teten Spitzen gebracht. Wenn ein beträchtlicher Teil der Lösuug abfiltriert ist, wird der Piückstand ausgepreßt und der Auszug nach C. 1 \'öllig klar fütriert. Die Lösung muß im durchfallenden Licht frei von sichtbaren Be- standteilen sein, im reflektierten Licht ist sie etwas opaleszent. Sie wird 4 Tage im laufenden Wasser nach D. 2 dialysiert. Der gebildete Nieder- schlag wird aus dem Dialysator entfei'ut , absitzen gelassen , die über- stehemle Flüssigkeit abgehebert u.nd der Niederschlag auf einei' Schicht gehärteten Filtrierpapiers im Büchncr^dwn Trichter filtriert. Nachdem man so trocken als möglich abgesaugt hat, wii'd das Pha- seolin vom Papier weggenommen, in Wasser suspendiert und durch ein Siebtuch gegossen, um eine feine Verteilung zu erzielen. Das \'olumen der Sus- pension wird auf ca. 800 cm» gebracht und das (ilobuliu durch Zusatz eines gleichen Volums lO^/oiger Natriumchloridlösung in Lösung gei)racht. Es ') Os/jorne, Proteids of the Kidiiey hcaii. Journ. Amor. Cliemical Society. XVI. pp. 633. 703. 757 (1894). -) cf. üshorne, 1. c. — (Mboriir niid Clapji, Hydrolysis of riiascoliii. .\iiier. Jourii. of Physiol. XVIII. p. 295 (1907). ;.J12 Th. B. Osboriie. soll eine fast klare Lösung' entstehen. Diese wird 4 Tage lang- dialy- siert und der gel)ildete Niederschlag nach obiger Beschreibung wieder gelöst. Die Lösung wird dann stehen gelassen, damit sich unlösliche Teile absetzen können. Dann wird, Avenn nötig, nach C. 1 völlig klar filtriert. Die klai'e Lösung wird 4 Tage lang dialysiert. Der geliildete Nieder- schlag absetzen gelassen und in einem i?äcAnerschen Trichter auf einer Schicht gehärteten Papiers gesammelt. Das Phaseolin wird nach F. durch zweimalige Suspension in destilliertem Wasser gewaschen und auf einem BücJuicr^chen Trichter so trocken wie möglich gesogen, hierauf mit 50-. 75- und lOOVoigem Alkohol und zuletzt mit Äther gewaschen und über Schwefelsäure getrocknet. Das so zubereitete Phaseolin ist ein dichtes, schneeweißes Pulver. Xach der vorhergehenden Darstellungsmethode werden das leichter lösliche Phaselin und die Proteose aus dem Phaseolin entfernt. b) Eigenschaften des Phaseolins. Elementare Zusammensetzung.!) C 52-66: H 6'94; N 15-84: S 0-34; 0 24-22 Vo- Löslichkeit.-) Unlöslich in Wasser, löslich in sehr verdünnten Salz- lösungen und in sehr verdünnten Säuren und ^Ukalien. Li lOo/^iger Koch- salzlösung wird es dui'ch geringe Mengen Essigsäure, Salzsäure, Salpeter- säure und Schwefelsäure nicht gefällt, hingegen wird es mit Salzsäure aus P/oig'Pi' Natriumcliloridlösung abgeschieden. Li lO'^/oiger Kochsalzlösung wird es durch Sättigung mit Natriuinchlorid oder Magnesium sulfat nur wenig gefällt. Hitzekoagulation. ■-) Li lO^/giger Natriumcliloridlösung erfolgt bei 95" Trübung, die bei steigender Temperatur langsam zunimmt. Nach einigem Erhitzen scheidet sich ein flockiges Koagulum ab, das aber selbst nach einstündigem Erhitzen gei'ingfügig bleibt. 20° Spezifische Drehung, ^j Li lOo/oi&er Kochsalzlösmig ist [a] -=- = = —41-46«. Fällung mit Ammunsulfat. + ) Li ^/jo gesättigter Ammonsulfat- lösung beginnt die Fällung mit 6-5 cm^ und ist vollständig mit 8-2 cm^, wenn nach. Hof meisters Methode verfahren wird. Dies entspricht 57-)) und 77-oVo wirklicher Sättiomiü:. ^) Oshorne and Clapp, Hvdrolxsis of Phaseolin. Amer. Journ. of Physiol. XVIII. p. 295 (1907). -) Oshorne, The Proteids of the Kidney Bean. Journ. Amer. Clieniical Society. XVI. pp. 033. 703. 757 (1894). ^) Oshorne and Harris, The Specific Rotation of sonie Yegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). ^) Oshorne nuä Harris, The Precipitation Limits of snme Vegetable Proteins with Ammonium Sulphate. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). Darstellung der Proteine der I'fhmzenwelt. 31;; F.i rliciirc.iktioiK'ii. l'hasoolin ^iht iillc iildiclicii FarWrcaktidiicii der Proteine. (ich alt an Aniinosäui'oii: vliI. '" -i. Stickstoffvcrtciliniu-.-') X .ils MI.. TTO: l)asisclici' N '.VCrJ: nicht hasiscIuT N l()-20: X im M^O-Xieder.sclilaii- 0-;;:)Vo- 10. Glycinin aus Soyahohne (Glycine hispidu). Das hauptsäcliliclic l'rotoin der Soyaholiiic ist ein (Jlohiilin. das in Eiiienscliaftcn und Ziisaiiini{Miset>^nni>' den» Leiiinnin sein- äiinlich i-f. Es ist jcdftcli in niancliei' Hinsicht von aUcn andci'en aus Lcuiiniinosen erhaltenen l'roteinen verschieden und Itesitzt dalu'i' den Namen (ilycinin. Hiuifige fraktionierte Fällun.uen dieses (llobulins erj>al)en I'rodnkte von sein- konstanter elementarer Zusammensetzung.*) Neben (ilycinin scheint die Soyal)ohne eine kleine Men.ne eines an- deren. lei(ditei" lösiich.en (ilohuliiis zu enthalten, ferner etwas Leiiuiiieliu und sehr weiiiii- Proteose. a) Darstellung von Glycinin. l)ie .Samen werden zmiächst iii'oh tieuiahlen , wobei ein iiTobei' Teil ihrer äußeren Samenhaut in großen Stücken entfernt wird. Diese werden yröiitenteils durch einen Luftstrom entfernt oder, indem mau das zer- mahlene Material mit der Hand auf eins Hhy/ laniies \\\\^\ ca. 1 w breites Tuch wii-ft. Hierbei werden die schwereren Stücke des Endosix-rms weiter lieworfen als die leichten Sanienhäute, so dab die letzteren sich zusammen mit kleineren Endospei-mstücken auf dem Tuch in der Nähe des Ex- l)erinientators sammeln. Duich Wiedeiiiolunii dieses Prozes.ses und darauf folgendes Sieben auf einem groben Sieb kann das meiste Phulos|ierm frei von den äußeren Samenhäuten erhalten werden. Das (ianze wird dann etwas feiner gemahlen. Der Ölgehalt verhindert zunächst die (Jewinnung eines feinen Mehls. Es wird zur Entfernung des größten Teiles des (')les mit Petroläther e.xtrahiert und imn nach Befreiung von anhaftendem Petrol- äther so fein als möglich gemahlen. 1 k(i feines Mehl wird mit .'>/ lO^uiger Kochsalzlösung gemiscdit und dei' Auszug nach ('. ;> filtriert. Das filtrierte Exti-akt. das im duirh- fallenden Lichte völlig klar sein muß, ist im i'eflektierten Lichte stark opaleszent. Es wird 4 Tage lang nach D. -2 dialysiert. Das gefällte (ilo- bulin wird vom Dialysator entfernt, absetzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit abgehebert und die Fällung auf einer Papierschicht in einem ') E.Ähderhalilvii \\n(\ B. liithkiii, Die Muuoaniiiiosäiiron des Leiruniins. /eitsclir. t pliysiol. Chemie. XLVII. p. 3ö4 (1906). -) Oshorne and Clapj), Hydrolysis of Phaseolin. .\iiicr. .Inmii. of l'liysioj. Will, p. 295 (1907). •') Oshornr iiiid Harris, Nitroffen in Protein Bodies. Joiirn. .\nier. Cheniical So- ciety. XXV. p. 323 (r.l03). ■*) Oshornr and Ciniiphdl, Proteids of tlie Soy-Beiin ((.iicinc liispida). .loiirn. Amer. ( hemical Society. X.\. p. 419 (1898). 314 Th. B. Osborne. ^Tollrii BiichnersdhQn Trichter j;-('samiiielt und so trocken wie niögiich jj;e- sogen. Der Niederschlag wird dann vom Papier entfernt und durch ein Siebtuch in Wasser suspendiert. Die Khnnpen, die sich auf dem Tuch sammeln, werden durchgespült. l)is das Endvolumen 800 — 1000 cw^ ist. Durch Zufügen eines gleichen \'()lums 20Voij4"('i' Kochsalzlösung wird das Globulin praktisch voll- ständig gelöst. Die Lösung wird dann ohne Filtration, wie vorher, dialysiert. Das gefällte ( llycinin wird in der eben beschriebenen Weise wieder gelöst. Wenn mehr als eine kleine Quantität unlöslicher Materie in der Lösung- vorhanden ist, wird diese stehen gelassen, bis sich das Unlösliche abge- setzt hat. Die überstehende Flüssigkeit wird dann (C. ]) filtriert. AVeun so wenig unlösliches Material vorhanden ist. daß keine Gefahr l)esteht, daß es das Filter verstopft, wird die Lösung filtriert und die klare Lösung vier Tage lang dialysiert. Das gefällte Glycinin wird dann, wie vorher, auf einem Büchncri^chen Trichter gesammelt, trocken gesogen, in destilliertem Wasser suspendiert (F.), absetzen gelassen, noch einmal abgesaugt und das Waschen wieder- holt. Es wird dann in derselben Weise mit öO-, 75- und lOO^oigem Alko- hol gewaschen. Nach Waschen mit Äther wird das Glycinin in einem trockenen Luftstrom oder über Schwefelsäure getrocknet. Das so erhaltene Produkt stellt ein schneeweißes, feines Pulver dar. Durch die wiederholten Fällungen mittelst Dialyse wird die kleine Menge löshchen Globulins entfernt, ebenso sämtliches Legumelin und die Proteose. b) Eigenschaften des Glycinins. Elementare Zusammensetzung. M C ö2"12: H 6'9o: N IT'.');'); S 0-79: 0 22-(5:VVo. Löslichkeit. 1) ()l)gieich Wasser allein über l()7o Glycinin aus dem Mehl der Soyabohne entfernt, ist das auf beschriebene Weise zubereitete Glycinin in reinem Wasser unlöslich, aber leicht löslich in Kochsalzlösung, die mehr als 2% dieses Salzes enthält. Es ist auch in gesättigten Koch- salz- oder Magnesiumsulfatlösungen löslich. Hitzekoagulation. 1) In lOVoi^^i' Kochsalzlösung wird Glycinin auch bei längerem Sieden nicht koaguliert. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. Fällung mit Ammonsulfat. Die Fällungsgrenzen mit diesem Salz sind nicht genau bestimmt worden. Der Kochsalzauszug der Soyaljohne gibt einen reichlichen Niederschlag, wenn er mit diesem Salz »^/lo gesättigt wird, aber es kann keine wohl definierte (irenze beobachtet werden, die für Glycinin eine obere Fällungsgrenze anzeigt. Farbenreaktionen. Glycinin gibt alle gebräuchlichen Farbenreak- tionen der Proteine. I ') Osborne and ('(Uli jiljcll, Proteids of the Sov-Bean. Jotirii. Amer. Chcmicnl Society. XX. p. 419 (1898). Darstellung der rroteine der Pflanzenwelt. 'dlo Gehalt an Aminosäuren: Vi>l. ') Slickstof'fverteiluns>-.2) ;n als NH3 2il : basischer X n-l).'): nicht basischer X ll-i^T; X im MiiO-XiederschlMii' Oi-i'Vo- Jl. Vi^nin aus Kiiherhse (Vigna sinensis). Der ii-rölite Teil der Proteine dieses Samens besteht aus einem Glo- Ijuhn, welches ebenfalls ähnlich, jedoch nicht identisch mit dem Le^umin ist. Da die fraktionierte Fälluiiji^ dieses Proteins eine Anzahl aufeinander folgender Fraktionen von konstanter elementarer /usammensetzuni>- und i^leichen Eigenschaften ergeben hat und da kein Anhaltspunkt dafür vorhanden ist, dab es aus einer Mischung von zwei oder mehreren verschiedenen Proteinen besteht, ist es Vignin genannt worden. 3) Neben Vignin enthält der Auszug aus der Kuhei-bse eine kleine Menge eines anderen leichter löslichen Gloliulins, das dem Phaseolin in Zusammen- setzung und Eigenschaften sehr ähnlich ist. Ferner ist ein anderes Protein vorhanden, das dem LegumeUn aus anderen Leguminosensamen gleicht. a) Darstellung des Vignins. Die Samen der Kuherl)se werden grol) gemahlen und der gröbere Teil der äußeren Samenhäute in der bei der Soyal)ohiie beschriebenen Weise entfernt. Der Rest der äußeren Samenhäute wird durch allmähliches Zerkleinern und Sieben A. 1 abgeschieden. Das Mehl wiid zu einem feinen Pulver zermahlen. Es ist nicht nötig, das Öl aus diesem Mehl zu entfernen. 1 kg feines Mehl wird mit 4 1 r)<'/oigPi" Xatriumchloridlösung ge- mischt und der Auszug gemäb C. .•) filtriert. Dann wird das klare Ex- trakt drei Tage lang dialysiert, D. '1, der Inhalt des Dialvsatoi-s entfernt und stehen gelassen, l)is sich das Globulin abgesetzt hat. Die Eösung wird dann so vollständig, wie nn'iglich, abgehebert und das (ilobulin in Wasser suspendiert, nachdem die Klumpen durch ein Siebtuch zci-kicinci-t worden sind. Das Ganze Avird dann auf ein Volumen \()u 1 / gebracht und 50 (/ Kochsalz darin aufgelöst. Die resultierende Lösung wird dann völlig klar filtriert (C. 1) und das Filter mit ö"/oigei' Natriumchloridlösung ge- waschen. Das klare Filtrat und das Waschwasser werden mit vier \olumen destilliertem Wasser verdünnt, wobei die Konzentration des Kochsalzes auf P/o reduziert wird. Da Vignin in 1 "/oigPi' Kochsalzlösung nur wenig löslich ist, während die anderen Proteine der Kuherbse darin leicht löshch sind, wird das Vignin so ausgefällt und von dem weitaus größten Teil der übrigen Substanzen getrennt. *) Osborric and Clapp, Hydrolysis of Glycinin. Amer. Jourii. Pliysiology. XI\. p. 468 (1907). ^) Oshorne and Harris, Xitrogeii in Protein Bodies. Juurn. Amer. ( liniiicul So- ciety. XXV. p. 323 (1903). ^) Oshoriie, Tlie Proteids of the f'ow Pen. .Tourn. .\iner. Chemical Societv. XIX. p. 494 (1897). 316 Th. B. Osborne. Xacluloiii sich das A'iiiiiin abiiosetzt hat, wird die überstehende Flüssigkeit abgehebert und der Niederschlag- auf gehärteten Filtern gesammelt. Der von der Lösung befreite Niederschlag wird in Wasser suspendiert, durch ein Siebtuch gegossen und das Volumen der Suspension auf 1/ gebracht. 50^ Kochsalz werden dann in der Suspension aufgelöst und die resultierende Lösung völlig klar filtriert (C. 1) und vier Tage lang dialysiert. Der Lihalt des Dialysators wird dann in einen Topf gebracht und der Niederschlag absitzen gelassen. Die Lösung wird a])gehe])ert, die Fällung auf eine gehärtete Papierschicht in einen Biichnersdien Trichter gebracht, möglichst trocken gesogen, dann durch Suspension in Wasser gewaschen, durch ein Siebtuch gepreßt und auf dem Büchnerschen Trichter abermals trocken gesogen. Nachher wii'd auf analoge Weise sukzessive mit öO-, Tö- und lOOYoig'^in Alkohol gewaschen, der Niederschlag mit Äther extrahiert und in einem trockenen Luftstrom oder über Schwefelsäure in einem Exsikkator getrocknet. Das resultierende Produkt ist ein dichtes, farbloses Pulver, das 45 bis öOy wiegt. h) Eigenschaften des Vigniyis. Elementare Zusammensetzung. ^j C 52'64; H 6"95; N 17"25; S 0-50: 0 22-66«/o- Löslichkeit. M Li Abwesenheit von Salzen löst sich Yignin in reinem Wasser in bedeutendem Maße. Zusatz von wenig Kochsalz zu dieser Lösung fällt das Vignin, das durch weiteren Salzzusatz völlig gelöst wird. In l()o/oiger Natriumchloridlösung braucht es zur Fällung des Vignins weniger Salzsäure als beim Phaseolin, al)er mehr als i)eim Legumin. Eine verhältnismäßig große Quantität Essigsäure fällt das Vignin. während Phaseolin durch diese Säure gar nicht gefällt wird. Vignin ist löslich in gesättigten Natriumchlorid- oder Magnesiumsulfatlösungen. Hitzekoagulation. M Li 10%i8'er Kochsalzlösung entsteht beim Erhitzen auf 98'^ eine Trübung. Nach fortgesetztem Erhitzen auf dem Wasserbad gesteht die Lösung zu einer Gallerte. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. Fällung mit Ammoniumsulfat. Das mit Yio gesättigter Ammon- sulfatlösung extrahierte Vignin fällt erst , wenn die Lösung zu 80"/o ^uit Amnionsulfat gesättigt ist. Genauere Bestimmungen der Fällungsgrenzen sind nicht gemacht worden. Farbenreaktionen. Vignin gibt alle übhchen Farbenreaktionen der Proteine. Gehalt an Aminosäuren: \iA.-) 1) Osborne and Camphell, The Proteids of tlie Cow Pea. .lonrn. Amer. Chemical Society. XIX. p. 494 (1897). '^) Osborne and Heijl, Hydrolysis of Yigniii. Amer. .Tourn. of Physiology. XXII. p. 362 (1908). Darstellung der Proteine der Pflanzen weit. }]-\^'j Stickstoffverteilunii'. 'j N als NH3 1-91; basischer X 4-2S; nicht basischer N 10-81; X im Mg(J-Xiederschlag' 0-257o. 12. Conglutin aus Liipinensainen (Lnpiniis). Die Samen der verschiedenen Liipinenarten (Lnpinus) enthalten eine ^roße Quantität eines Proteins, dem durch Eitthauscn der Xame Couglutin erteilt wurde. X^ur ein unbedeutender Anteil des Proteins der gelben oder blauen Lupine ist wasserlösKch . 10%ii>e Kochsalzlösinig aber extrahiert l)einahe sämtliches Protein. M Das so extrahierte Protein ist die als Con- iiiutin bekannte Substanz. Weitgehende Fraktionierung des Conglutius der gelben Lupine zeigte, daß es eine ^lischung zweier Globuline von verschie- dener relativer Löslichkeit und verschiedener Zusammensetzung ist. '^"-^j Diese seien vorläufig als Congiutin-z und ('oiig]utin-|i bezeichnet. Das Globulin der blauen Lupine gleicht betreffs Zusammensetzung- und Eigenschaften dem weniger löslichen und häufigeren Conglutin-y. der gelben Lupine, es ist aber bis jetzt noch nicht genügend fraktioniert worden, um mit genügende)' Sicherheit als Conglutin-z bezeichnet zu werden. Das rohe (ilobulin der gelben Lupine kann aus Kochsalzlösungen durch fraktionierte Fällung oder durch fraktionierte Sättigung der Lösung- mit Ammonsulfat in die beiden oben erwähnten Teile getrennt werden. Das weniger lösliche Globulin wird durch Ammonsidfat leichter gefällt als das leichter lösliche Globulin. Durch diese Methode kann eine bessere Tren- nung erzielt werden als durch fraktionierte FiUlung aus Kochsalzlösungen. Blaue und gelbe Lupinen geben große Quantitäten rohen (ilobulins. aber die Ti'ennung in die beiden Komponenten bedingt große Arix'it und Ver- lust von l)einahe der Hälfte der Substanz. Es ist nicht klar, wodurch dieser Verlust verursacht wird. Es ist möglich, daß proteolytische Fermente diese schnellen Umwandlungen des Proteins bewirken. Dies kann auch die Gegen- wart der leichter löslichen Fraktionen erklären. a) Darstellung des Conglutins aus der gelben Lupine. Die Samen werden grob gemahlen und die meisten Samenhüllen durch ein gi'obes Sieb entfernt. Der Rückstand wird dann fein zermahlen und der größere Teil der zurückbleibenden Hüllen durch Sieben entfernt. Das feine Mehl wird nun mit 92— 947oigem Alkohol kollert, bis alles darin Lösliche entfernt ist. Xachdem der Überschuß des Alkohols auf einem Büchner^(!\\Q\\ Trichter abgesaugt ist, wird der Rückstand auf einer feinen Schicht ausgebreitet, bis der anhaftende Alkohol verdampft ist. Man behandelt 1 kg Mehl mit 5 l 10«/ni8': O L>n-iü7o- Löslit'hkeit.-) rnlöslicli in Wasser, liinji-Ofi'on leiclit lii-licli in ."»- bis l()"„i^cn Xatrininchloi-idlösnnucn. ("oii^hitin zeiiit wodei- nach JU'liandlunt;- mit Alkohol noch nach dem Trocknen das liestivhen. in Sal/lüsunizcn nnlös- licli zu werden. In dieser Hinsicht zeijit es einen ausj^esprochenen (ie^en- satz zn anderen Sameniilohnlinen. Coni^lutin-/. ist in gesättigten Koch- salz- und Magnesiinnsiilfatlösungen löslich. Ili tzekoagii lation. '-) Eine ö^/oige Lösung von Conglnfin-y. in lOVoigfr Kochsalzlösung zeigt beim Krhitzen auf 100° keine merkliche Veränderung, ausgenommen, dall sich nach einiger Zeit auf der Oberfläche eine durchscheinende Haut bildet. IJeini Kühlen gestellt die Lösuuii' zu einer (iallerte. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. Fällung mit Animonsulfat. '"• 'M In einer Vi o "'f'^^'^^if^'^^n -^"i'"f*"" sulfathisung beginnt Fällung wüt 4'2 cm'\ Sie ist praktisdi vollständig mit ~i-()citi'' {Hofmeisters Methode), d. h. die Fällung liegt zwischen H4 und (3)»% wirklicher Sättigung. Farbenreaktionen. Conglutin gibt alle gewöhnlichen Farbenre- aktionen dei- Fi'oteiue. Gehalt an Aminosäuren: vgl.-'"-^) Stickstoffverteilung.''') N als NHg 2"12; basischer N r)i'(): nicht i)asischer X 10-38; N im Mg 0-Niederschlag- 0-18. c) Eigenschaften des „Conglutin-^". Elementare Zusammensetzung. ■•^"- 6) C 49-91 : H 0-81: N ls-4(»: s i-oT: 0 i^n-mVo- LüsHchkeit. '-) Fnlöslich in Wasser, abei- leichter löslich in ver- dünnten Kochsalzlösungen als Conglutin-a. Es ist viel mehr Salzsäure oder Essigsäure nötig, um in Lösungen von Conglutin-!i eine Fällung hervorzurufen, als es bei C'ouglutin-y. der Fall ist. Löslich in gesättigter Nati-iumchlorid- oder Magnesium siilfatlösuug. ') Oshonir and llarris, Tlie l'recipitatioii Limits witii Ainiiioiiiiuii Sulpliate of some \'cgetal)le Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). ■^) Oshorne and Ca»ijjl/i 1/ , The Proteine of Lupine Seeds. Journ. Anier. Chemical Society. XIX. p. 454 (1897). •') Alis-/tor»c, Lcanitirnrlh and lirmifhrhf , The Different Forms of Xitroijen in Proteins. Amer. Journ. of IMiysiol. XXIII. p. 180 (19U8). 5) Ofihornc and Harris; Xitrotren in Protein Bodies. .lourn. Amer. Chemical Society. XXV. p. :i2:5 (1903). '•) Oslioriif and Harris, The Precipitation Limits with .\mnionium Sulphiite of some Vegctalile Proteins. Second Paper. Amer. Journ. of Physiol. .Xlll. p. 43(5 (1905). 320 Th. B. Osborne. Hitzekoatiulutioii. ') 5% Cougiutin-[i , gelöst in lOVoiger Koch- salzlösung, wird bei 94° trübe. Nach langem Erhitzen auf 99" wird ein gelatinöses Koaguknn abgeschieden. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. Fällung mit Ammoniumsulfat.-"- ^) Da Conglutin-a und Conglutin-ß nebeneinander vorkommen und da die obere Grenze der Fällbarkeit des ersteren nahe der des letzteren ist. ist keine bestimmte untere (xrenze für C'ongiutin-[i festgestellt worden. Es wird meist über 7 cm'^ nach Hofmeisters Bestimmungsmethode oder über 64"/o wirklicher Sättigung Stickstoffverteilung.*) N als NH3 2-65: basischer N 5-18: nicht basischer N 10-30: N im MgO-Niederschlag O'M. d) Darstellung des Conglutins aus der blauen Lupine. Die Darstellung des rohen Conglutins aus der blauen Lupine wird in derselben Weise geleitet, wie bei der gelben Lupine. Die Ausbeute bei der blauen Lupine ist etwas geringer als bei der gelben Art. Da der Ver- fasser bis jetzt keine Erfahrung mit der fraktionierten Fällung des Con- glutins der blauen Lupine durch Ammonsulfat besitzt, so kann er keine Angaben über diesen Prozeß machen. Aus demselben Grunde gibt er keine bestimmte Feststellungen über Präparate aus anderen Lupinenvarietäten. IL Prolamine. 1. Gliadin ans Weizen (Triticum vulgare) und Roggen (Seeale cereale). Gliadin bildet ungefähr die Hälfte der Eiweißsubstanz des Weizen- samens (Triticum vulgare) und bildet, zusammen mit einer ungefähr gleichen Menge Glutenin , den größeren Teil des Glutens (Ivleber), welcher durch Waschen mit Wasser aus Weizenmehl erhalten werden kann. Das Endosperm des Samens enthält das Gliadin , das daher am besten aus Weizenmehl erhalten wird, von dem die anderen Samenteile völlig ent- fernt sind, was durch die üblichen Prozesse bei seiner DarsteUung ge- schieht. Die (yliadinmenge variiert stark in verschiedenen Weizensorten, aber das Verhältnis des Gliadins zu den anderen Proteinen ist beinahe dasselbe. Der Gliadingehalt ist daher dem Stickstoffgehalt des Samens nahezu proportional. Gliadin zeichnet sich von anderen Proteinen durch seine leichte Lös- hchkeit in Alkohol von 70 — SO'^/o aus. Obgleich Gliadin in absolutem Alkohol 1) Oshorne and Harris, The Precipitation Limits with Ammonium Sulpliate nf some Yegetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 837 (1903). ^) Osborne a,nd Harris , The Precipitation Limits with Ammonium Sulphate of some Vegctable Proteins. Second Paper. Amer. .Journ. of Physiol. XIIL p. 436 (1905). *) Osborne and CaDiphell , The Proteine of Lupine Seeds. .Journ. Amer. Chemical Society. XIX. p. 454(1897). ^) Oshorne and Harris, Nitrogen in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). Darstelluiiij der Proteine der Ptlanzemvelt. 321 vöUifi' Tinlöslicli ist und sich in Wasser nur wenig' löst , löst es sich leicht in ^Mischuniicn dieser l)eidon Flüssi.ekeiten. Der Löslichkeitsgrad wechselt mit dem relativen Verhältnis von Alkohol und Wasser, ei- nimmt bis zu einem gewissen ^laximum bei /ufügung von Wasser zum Alkohol zu und dann ab. Das optimale Verhältnis von Alkohol und Wasser wurde nie be- stimmt, doch hegt es nicht weit von T07o Alkohol; über 90''/o oder unter 50 ^'olumprozent wird nur wenig Gliadin gelöst. Neutrale Salzlösungen lösen nur wenig (xliadin, aber Wasser, das freie Säuren oder Alkalien enthält, löst es leicht. Von melireren Forschern ist bezweifelt worden, ob (Jliadin das ein- zige alkohollösliche Weizenprotein ist. Die meisten von ihnen, die neuer- dings diese Frage studiert haben, glauben, daß nur ein solches Protein im Weizensamen vorkommt. Auch des Verfassers ausgedehnte Untersuchung dieser Frage spricht nicht für das Vorkommen eines weiteren Proteins im alkoholischen Extrakt. Die Unterschiede der Löslichkeit in vei'schieden starkem Alkohol und die Unterschiede in der Zusammensetzung, die lütt- hausen die Gegenwart von Glutenfibrin und von Mucedin vci'inuten ließen, sind zweifellos verursacht durch die Bildung verschiedene!' (iliadinsaize mit aus dem Samen extrahierten Säuren und durch Verunreinigungen der Prä- parate mit verschiedenen, nicht eiweißartigen Substanzen. Das hiei- unter dem Namen Gliadin beschriebene Protein stellt daher sämthches mit Alkohol aus dem Weizensamen extrahierbare Protein dar. a) Darstellung des Gliadins ans Weizenmehl. Gliadin wird entweder dargesteUt durch direkte Extraktion des Mehles mit TO'^/oigem Alkohol oder durch Extraktion des durch Wasser aus dem Mehl gewaschenen Weizenklebers. In jedem FaU wird ein stickstoffreiches Mehl die beste Ausbeute geben. Vier gleiche Portionen Mehl werden mit 70°/oigem Alkohol extrahiei't, indem man den Auszug der ersten Portion zum Meld der zweiten füut und den Prozeß fortführt, bis das Extrakt in Derühiung mit mindestens vier Portionen frischen Mehles gewesen ist. Die extrahierten Rückstände werden auf ähnliche Weise sukzessive gewaschen, bis jeder mit den Extrakten der vorausgegangenen Extraktionen und zuletzt mit TC/oigem Alkohol be- handelt worden ist. Die für jede Portion nötige Menge Alkohol beträgt ungefähr das fünffache Gewicht des Mehles und die Extraktion jeder Portion wird am besten \\\wy Nacht ausgedehnt. Auf diese Weise kann jeden Tag ein ein- heitliches Extraktquantum gewonnen werden . ohne daß zu viel Zeit ver- wendet werden muß. So kann eine starke Gliadiidösung erhalten werden, welche, wie unter C. 1 beschrieben ist, vollständig klar durch eine Sehicht von Papierbrei filtriert Avei'den muß. Der klare Auszug wird unter vermindertem Druck auf einem Wasser- bad von 70° konzentriert. Die Konzentration und die weitei-e Behandlung kann gleichzeitig mit der Extraktion vorgenommen werden. Wenn die Kon- Al)derh iil den , Haudbuih dor bioclieinischcu Arbeitsmethoden. IT. 21 322 Th. B. Osborne. zentration so weit vorgeschritten ist, daß die Lösimg des Gliadins trübe wird und zu schäumen beginnt, müssen neue Portionen von Extrakt oder starkem Alkohol zugefügt werden, um das Gliadin wieder in Lösung zu bringen. p]s muli während dieser Konzentration Sorge getragen werden, daß das Gliadin in Lösung bleibt, und daß die Temperatur des Wasser- bades nicht über 70" steigt, denn bei zu langem oder zu hohem Erhitzen mit verdünntem Alkohol koaguliert das Gliadin. Wenn sämtliche Auszüge zu einem dicken Sirup konzentriert sind, gießt man ihn unter konstantem Umrühren in einem feinen Strom in das sechs- oder achtfache Volumen eiskalten destiUierten Wassers, dem man zur völligen Abscheidimg des Gliadins einige Gramm Kochsalz zufügt. Nachdem sich das Gliadin in zusammenhängender Schicht abgeschieden hat, wii'd die wässerige Lösung so vollständig als möglich dekantiert, der Niederschlag zur Entfernung anhaftender Lösung oberflächlich mit Wasser gewaschen und dann durch Zugabe einer geringen Menge starken Alkohols in Lösung gebracht. Wenn das vom Güadin zurückbehaltene Wasser nicht genügt, um Lösung zu bewirken, muß noch etwas Wasser zugefügt werden. Diese Lösung wird dann unter vermindertem Druck zu einem Sirup konzentriert und das Gliadin auf die eben beschriebene Weise durch Piingießen in Wasser noch einmal gefällt. Durch diese Behandhmg werden die wasserlöslichen Kohlehydrate, Salze und andere wasserlösliche Proteine vom Gliadin getrennt. Das Gliadin wird noch einmal in der oben beschriebenen Weise in Alkohol gelöst und die Lösung zu einem dicken Sirup konzentriert, indem man von Zeit zu Zeit Alkohol zufügt, um die Menge des Wassers auf eine Quan- tität zurückzuführen, die eben genügt, um das Ghadin in Lösung zu halten. Der Sirup wird dann in feinem Strom unter konstantem Piühren in das acht- bis zehnfache Volumen sehr starken Alkohols gegossen, wobei das Gliadin als zähe Masse gefällt wird, deren größter Teil in einem Ivlumpen am rührenden Glasstab hängt. Das so gefäUte Gliadin wird am besten unter absolutem Alkohol in kleine Stücke zerteilt und dann mit absolutem Alkohol digeriert, bis es in eine leicht zerreibUche Masse übergeführt ist. Der Alkohol wird dann durch schnelles Filtrieren unter Vermeidung von Luftfeuchtigkeit entfernt und das Güadin mit trockenem Äther gewaschen und ül)er Schwefelsäure getrocknet. Deim Trocknen in gewöhnlicher Zimmerluft nimmt das mit abso- lutem Alkohol imprägnierte (Uiadin Feuchtigkeit auf und wird zähe, so daß schließlich eine hornartige Masse resultiert, die nicht leicht zerrieben werden kann. Wenn jedoch das Gliadin in der beschriebenen Weise vom Alkohol befreit wird, kann es nach dem Trocknen leicht zu einem feinen Pulver zerrieben werden. h) Darstellung von Güadin aus Weizengluten. Um das Ghadin aus Weizenkleber darzustehen, wird das Mehl mit so viel Wasser gemischt, daß es einen zusammenhängenden Teig bildet und Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 323 in einem langsamen Strom von Wassei' so lange gewaschen, bis die Stärke fast völlig entfernt ist. Das zurückbleibende Gluten wird, noch feucht, in möglichst kleine Stücke zerteilt. Um aus großen (Quantitäten von Gluten verhältnismäßig kleine Stücke zu erhalten, ist es am besten, das Gluten durch die unter k. 2h beschriebene Fruchtpresse durchzupressen. Das zer- teilte Gluten wird dann gewogen und sein Wassergehalt als zwei Drittel des Gesamtgewichts des feuchten (ilutens bestimmt. 200 cm'^ 92<'/oigon Alko- hols werden für je lOO^o anwesenden Wassers zugefügt und das (jHuten unter häufigem Umrühren während 24 Stunden digeriert. Besser ist es, wenn man die ungelöste Masse mit der Hand durcharbeitet und durch- knetet. Das Gluten wird dann auf ein Tuch abgegossen und durch Druck so weit wie möglich von der anhaftenden Lösung befreit. P]s wird dann wieder so lange mit TOVoig^"! Alkohol extrahiert, als eine genügende Menge Gliadin in Lösung geht. Das so erhaltene Extrakt wird völlig klar filtriert und in gleicher Weise, wie bei der direkten Extraktion des Mehles, mit Alkohol behandelt. Da die wasserlöslichen Bestandteile des Mehles bei- nahe vollständig durch Auswaschen des Glutens entfernt sind, genügt eine einmalige Fällung des Gliadins durch Ausgießen seiner konzentrierten alko- holischen Lösung in ein großes Volumen Wasser, um die geringe Menge wasserlöslicher Bestandteile , die der Auszug enthalten kann , zu ent- fernen. c) Darstellung des Gliadins aus Roggen. Das alkohollösliche Protein des Boggens ist dem des Weizens so ähnlich, daß bis jetzt keine genügenden L^nterschiede entdeckt werden konnten, die eine LTnterscheidung der beiden Proteine lechtfertigen würden. Ihre Identität ist jedoch auch noch nicht erwiesen. Da Boggenmehl keili zusammenhaftendes Gluten bildet, ist es notwendig, das GHadin aus diesem Samen durch direkte Extraktion zu gewinnen. Das Gliadin ist daher aus Roggenmehl in derselben Weise dargestellt worden, wie es für die direkte Extraktion aus Weizenmehl beschrieben wurde. d) Eigenschaften des Gliadins. Elementare Zusammensetzung. i) C 52-72; H 6*86; N 17-66; S 1-03; 0 21-73%. Löslichkeit.i) Das nach der beschriebenen Methode dargestellte Gliadin ist gewöhnlich rmr in geringem Maße wasserlöslich, in Wasser, das anorganische Salze enthält, ist es noch weniger löslich. In absolutem Alkohol ist es gänzlich unlöslich, aber in Mischungen von Alkohol und Wasser ist es bis zu dem Verhältnis von ca. 70vol. Voig^'i^ Alkohol und 30 Vo Wasser zu- nehmend löslich. In verdünnten Lösungen von Ätzalkalien ist Gliadin leicht ') Oshornc vi.\u\ Yorhees , The Proteids of the Wheat Kernel. Amer. Cliem. Journ. XV. p. .392 (1893). 21* ,H24 l'h- ß- Osboine. löslich lind fällt ans solchen Lösungen durch Kohlensäure oder Natrinm- bikarbonat. (iliadin ist auch in verdünnten Säuren löslich. In Äther, Chloro- form, ISenzin und beinahe allen wasserfreien Lösungsmitteln ist es ganz unlöslich. Hitzekoagulation. M (iliadin ^nrd auch durch lange dauerndes Sieden seiner Lösung- in TO^/oigem Alkohol nicht verändert. In Wasser oder in sehr verdünntem Alkohol wird es durch Sieden koaguliert. Spezifische Drehung.-) Gelöst in 80vol. 7oigeii^ Alkohol ist [a] = — 92-3'' 2). Farbenreaktionen: Gliadin gibt sämtliche gewöhnliclien=Farbenreak- tionen der Proteine. Gehalt an Aminosäuren: vgl. s. 4u. s) Stickstoffverteilung. 6) N als NHg 4-nn; basischer NO-98; nicht basischer X 12-21: N im MgO-Niederschlag 0-UVo- 2. Hordeiu ans Gerste (Ilordeiiin vulgare). Hordein macht 3 — 4% des Mehles aus. Neben Hordein enthält dieser Same, wie der des Weizens, eine Ideine ]\Ienge Albumin, Globulin und Proteose, die zusammen etwa P/o des Samens bilden. Neben diesen Proteinen enthält das Gerstenmehl wahrscheinlich noch andere Eiweißstoffe, denn nach der Extraktion obiger Proteine bleibt noch im ungelösten Pückstand des Mehles eine beträchtliche Quantität Stickstoff, von dem ein Teil durch ver- dünntes Alkali extrahiert und durch verdünnte Säuren gefällt werden kann. Da das Gerstenmehl viel Gummi enthält, der in verdünnten, alka- lischen Lösungen auch löslich ist, gelang es bis jetzt nicht, Präparate dieses in neutralen Lösungen unlöslichen Proteins zu erhalten, die für weiteres Studium geeignet wären. Es ist daher nichts Bestimmtes über das Rest- protein dieses Samens bekannt. Es ist jedoch nicht unwahrscheinlich, daß diese unbekannte Proteinsubstanz dem Weizen-Glutenin ähnlich ist. a) Darstellung von Hordein. Die Gewinnung des Hordeins erfolgt in genau derselben Weise, wie die Darstellung des mit TO^/oigem Alkohol aus dem Weizenmelü extrahierten Ghadins (s. S. 321). ^ ^) Oshorne and Vorhees, The Proteids of the Wheat Kernel. Amer. Cham. Journ. XV. p. 392 (1883). ^) Osborne and Harris, The Specific Rotation of Some Vcgetable Proteins. Journ. Amer. Chemical Society. XXY. p. 842 (1903). ^) Ähdcrhalden und Saniuehj, Die Zusammensetzung des „Gliadins" aus AVeizen- mehl. Zeitschr. f. physiol. Chemie. XLIV. S. 276 (1905). ^) Kossei and Kntscher, ibid. XXXI. p. 165 (1900). ^) Osborne and Clapp, The Chemistry of the Protein Bodies of the Wheat Kernel. Part III. Amer. Journ. of Physiol. XYII. p."^231 (1906). ^) Oshorne and Harris, Nitrogeu in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical Society. XXY. p. 323 (1903). Daistelhiiig der Proteine iIit Pflanzenwelt. ;;•>') h) Ei;/cnsch(ijten des Hordeins. ElciiH'iitarc /usiiiinnciisct/iiiij^-. 'j C ')4'2'.): II il-sfi: N 1 TiM : S (»-s;;; () 20-8 7 Vo- Löslichkeit. ' ) has nach der fl»('ii boscliricbcucn Methode (hii.tic- stellte Hofdciu ist in Wasser wenii»' löslich nnd ^ibt Lösnni^on, die diiicli Znsatz von Kochsalz gefällt \verden. Die gelöste Menge ist sehr klein und die Lösliclikeit in Wasser scheint etwas geringer zu .sein, als die des (xliadins. In verdünntem Alkohol verschiedene)' Konzentration löst sich Hordein in ungefähr gleichem Malie wie (ilindin. In sehr veidiinnten Lö- sungen von Säuren oder Ätzalkalien ist das Hordein leicht löslich und wird durch XeutraUsation gefällt, ohne seine Löslichkeit in Alkohol zu ver- hören. Hitzekoagulation.') Hordein wird durch Kochen der TOVoig'^i ^^^f^- holischen Lösung nicht verändert, heim Erhitzen mit Wasser oder mit verdüimtem Alkohol wird es koagulicMt. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. Farbenreaktionen. Hordein gibt alle gewöhnlichen iieaktioueu der Proteine, möglicherweise mit Ausnahme von 3Io/isch' Reaktion. Da Hordein mit Schwefelsäure allein eine starke rote Färbung gibt, die beim /ufiigen von a-Xajditol anscheinend nicht geändert wird, ist es schwierig zu ent- scheiden, ob es die .MoHschreaktion gibt oder nicht. Gehalt an Aminosäuren: vgl. 2"-3) Stickstoffverteilung.^) X als XH^ 4t)l: basischer X()-77: nicht basischer X r2-04. X^ im MgO-Xiederschlag 0*2:>. 3. Zeil! ans Mais (Zea Mays). Zein ist das hauptsächliche Protein der Maissamen, von denen es ungefähr ö^/o ausmacht. ¥s ist charakterisiert durch seine bedeutende Lösliclikeit in verhältnismäbig stai'kem Alkohol, ol)gleich es in absolutem Alkohol oder in Wasser völlig unlöshch ist. Aus vei'dünntem Alkohol wird Zein gefällt, wenn das Verhältnis von Wasser zu Alkohol in der Lösung einen l)estinimten Wei't erreicht hat. Li alkoholischer Lösung erleidet das Zein eine langsame Umwandlung, indem konzentrierte Lösungen, die zuerst ganz flüssig waren, nach einigen Tagen dui-chsichtige (iallerten bilden, die bei längerem Stehen härter werden. Xachdein diese Lmwamllung vor sich gegangen ist, kann das Zein ») 0.st nur wenig Zein. In '^/^o'^/oVj:o\' Kalihydrat- lösung ist Zein leicht lösüch und wird durch Neutrahsation unverändei't wieder gefällt. In 'YioVoig^i' Natriumkarbonatlösung oder -/lo^/oiger Salz- säure ist Zein selbst beim Erwärmen auf 40° unlöslich. Hitzekoagulation. Durch fortgesetztes Sieden mit Wasser oder sehr verdünntem Alkohol wird Zein alhnählich koaguliert und in Alkohol unlösüch. 20" Spezifische Drehung.^) In DOVoigem Alkohol ist [a] — = — 28». Farbenreaktionen. Zein gibt die übhchen P'arbenreaktionen der Proteine, ausgenommen die Molischreaktion und die Reaktion für Tryp- tophan. Gehalt an Aminosäuren: vgl.*) Stickstoffverteilung. ^) N als NH3 2-97; basischer N 0-49: nicht basischer N 12"51; N im MgO-Niederschlag 016°/o- in. Gluteline. Glutenin ans Weizen (Triticum vulgare). Glutenin macht ungefähr die Hälfte der Eiweil'isubstanz des Weizens aus und l)ildet zusammen mit dem Gliadin beinahe das ganze durch Aus- waschen des Weizenmehles mit AVasser erhaltene (iluten. (liutcnin kommt ') Chittendcn and Oshorne, A Study of the Proteids of the Corn or Maize Kernel. Amer. ChemicalJourn. XIII. p. 453. 529 (1891) und XIV. p. 20 (1892). -) Osborne, The Amount and Properties of the Proteids of the Maize Kernel. Jouru. Amer. Chemical Society. XIX. p. 525 (1897). 3) Os/ionie and Harris, The Specific Rotation of some Vegetable Proteins, .lonrn. Amer. Chemical Society. XXV. p. 842 (1903). *) Osborne and Clapp, Ilydrolysis of the Proteins of Maize. Anicr. Journ. of Physiology. XX. p. 477 (1908). ^) Osborne and Harris, Nitrogen in Protein Bodies. Journ. Amer. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). 328 '^'^^' ^- Osboriie. im Endosporm der Samen vor mid kann daher aus dem käuflichen AVeizen- mehl erhalten werden. Wie beim Gliadin variiert die Menge des Glutenins stark bei den verschiedenen Weizenvarietäten und ist am größten in den stickstoffreichsten. Glutenin ist das in Wasser, Salzlösungen und Alkohol unlöshche Weizenprotein. Es kann nur in verdünnten, kaustischen Alkahen oder Säuren gelöst werden. ()l)gleich Glutenin und Gliadin dieselbe elementare Zusammensetzung haben, siud sie doch deuthch verschiedene Proteine, wie das llesultat der totalen Hydrolyse beider Eiweißarten deutlich zeigt. a) Darstellung von Glutenin. Glutenin wird am besten aus Gluten dargestellt, so daß der (Uuten- rückstand, der nach der x\lkoholextraktion des Ghadins hinterbleibt, für diesen Zweck gebraucht werden kann. (S. o21.) Nach der Extraktion des fein zerteilten Glutens mit Alkohol Ins zur völligen Entfernung sämtlichen Ghadins wird der ungelöste Rückstand bei Zimmertemperatur getrocknet und möglichst fein gemahlen. Das resul- tierende Pulver wird mit Alkohol und Äther so lange extrahiert, als etwas gelöst wird. Der Alkohol wird dann 1)ei Zimmertemperatur verdampft und das zurückbleibende Pulver mit soviel YioVo^&ei' Kalihydroxydlösung be- handelt, als zur Lösung nötig ist. Die erhaltene trübe Lösung wird dann auf einem Breifilter', wie unter C. 1, filtriert und, wenn die Lösung voll- ständig klar ist, mit sehr verdünnter Salzsäure neutralisiert. Der Nieder- schlag wird dann mit lO^joi^nw Alkohol so lange, als Ghadin in Lösung geht, extrahiert. Dann wird nochmals in einer möglichst geringen ^lenge ^/loVoi"'*^!" Kalihydroxydlösung gelöst, die Lösung, wenn nötig, klar filtriert und noch einmal mit sehr verdünnter Salzsäure gefällt. Nachdem man, um sich von der voUständigen Wegnahme sämtlichen Gliadins zu überzeugen, wieder mit 70%igem Alkohol extrahiert hat, wird das Glutenin voUständig mit absolutem Alkohol entwässert, mit Äther extrahiert und über Schwefel- säure getrocknet. Wenn die alkalische Lösung, aus der das Glutenin ge- fällt wird, nicht völlig klar ist, so ist das erhaltene Produkt nicht rein und enthält weniger Stickstoff und mehr Kohlenstoff, als in vöUig ge- reinigten (jlluteniu Präparaten gefunden wird. Das so gewonnene Glutenin ist ein weißes, voluminöses Piüver., h) Eigenschaften des Glutenins, Elementare Zusammensetzung. M C 52'o4; H 6'83; N 17"49; S 1-08; 0 22-26 Vo- Löslichkeit.i) Glutenin ist in kaltem Wasser oder in kaltem verdünnten Alkohol praktisch unlöshch. Bei der Behandlung mit warmem Wasser oder 1) Osbornc and Voorhees, The Proteids of the Wheat Kernel. Amer. Chemical Journ. XV. p. 392 (1893). Darstellung der Proteine der Pflanzenwelt. 329 mit warmem Alkohol löst sich jedoch eine sehr geringe Menge, die sich l)eim Abkühlen wieder abscheidet. In sehr verdiiiniten Lösungen von kau- stischen Alkalien oder Säuren ist (Uutenin leicht löslich und wird bei Neu- trahsation l)is zur ganz schwachen, sauren Ileaktion mit unveränderten Eiuenschaften wieder gefällt. Hitzekoagulation. In siedendem Wasser koaguliert (Hutenin und wird in sehr verdünnten Säuren oder Alkalien unlöslich. Spezifische Drehung. Sie wurde nicht bestimmt. F" a r b e n r e a k t i 0 n e n. Glutenin gibt sämtliche bekannten Farbenreak- tionen der Proteine. Gehalt an Aminosäuren: vgl. i-su. 3) Stickstoffverteilung.*) X als XH^ :V;;0; basischer N 2Vb: nicht basischer X 11-95; X im MgO-Xiederschlag 0-19''/o- IV. Albumine. J. Leukosin ans Gerste (Hordeuni vulgare), Roggen (Seeale cereale), Weizen (Triticiini vulgare). Im Gersten-, Roggen- und Weizensamen sind ungefähr 0'4"/o Albumin. Leukosin. vorhanden. Die elementare Zusammensetzung und die Eigen- schaften des Leukosins von jedem dieser Samen sind dieselben, s) Das aus diesen Samen erhaltene einzige andere wasserlöshche Protein ist eine sehr geringe ^lenge von Proteose, von der das Leukosin getrennt wird, in- dem man den Auszug bei ca. 65" koaguliert. Da Leukosin einen so geringen Teil der ganzen Körner bildet, ist es kaum empfehlenswert, große Quantitäten direkt aus den Samen darzu- stellen. Da aber der ölfreie Embryo des Weizens ungefähr ICo Leukosin enthält, so lassen sich verhältnismäßig große Mengen schnell aus den käufhcheu .AVeizenkeimen'% die bei; der DarsteUung des Weizenmehles ge- Avonnen werden, gewinnen. Dieses aus Mühlen zu erhaltende l'rodukt be- steht zum größten Teil aus dem Embryo, enthält aber auch ein wenig Endosperm und Kleie. Da diese 'Embryonen zwischen Pollen in ie wiisseritic Lösuni;- wird jedoch durch SiUtiuunii- mit Kocjisalz oder Mnu'- iiesiunisulfat gefüllt. Hitzekoagulation.M Loukosin scheidet sich aus seinen wiisserigeii Lösungen heim langsamen Erhitzen auf 02" als flockiger Niederschlag ab, hei rascherem Ph'hitzen erfolgt die Abscheidung bei höherer Temperatur. \ollständige Koagulation wird nur schwierig bewirkt. Um eine praktisch vollständige Abscheidnng herbeizuführen, ist längeres Erhitzen auf (iöo nötig. Zusatz von Kochsalz fördert die Abscheidung des Koaguhims. Wird das wässerige Extrakt während einiger Zeit auf t);")" erhitzt, vom koagulierten Leukosiii filtriert und auf 75" erhitzt, so wird eine sehr kleine Menge Koagulum erhalten. Dieses ist vielleicht ein anderes Albumin, doch kann es auch der liest des bei der niedrigen Temperatur nicht koagulierten Leukosins sein. Fällung mit Aninionsulfat. Unkoaguliertes Leukosin wird bei halber Sättigung mit diesem Salz gefällt, d. h. durch Lösen von ;'>S y Aninionsulfat in lUO cm'^ der Lösung. Farbenreaktionen. Leukosin gibt sämtliche Farbenreaktioiien der i'roteiue, Gehalt an Aminosäuren: vgl. 2) Stickstoffverteilung.3) N als NH3 ITG; N als basischer N -VöO; nicht basischer X 11-83; X im MgO-Xiederschlag o^l-iVo- 2. Riciii ans der Ricinushohiw (Ricinus conimiinis). Es war schon lange bekannt, dab die Samen der Iiicinusölpflanze (Uicinus communis) eine sehr giftige Substanz enthalten, die zusammen mit den Proteinsubstaiizen extrahiert und abgeschieden werden kann. Die gewöhnlichen Präparate vom sogenanntennvicin bestehen aus einer Mischung verschiedener Proteine zusammen mit mehr oder weniger von der toxischen Substanz. Eine sorgfältige und weitgehende Fraktionierung derl\icinusi)roteine hat gezeigt ■*)• daß der gröbere Teil des Proteins dieses Samens keine toxische Wirkung hat und daher sorgfältig entfernt werden sollte bei iler Dar- stellung von Piicinpräparaten hoher (Giftigkeit. Die Proteine der Kicinns- boliue bestellen aus einem (dobnlin. das durch Dialyse leicht gefällt wird, aus einem oder mehreren Albuminen, die unter SO" koagulierbar sind, und aus einer verhältnismällig groben Menge Proteosen. ') Onhonic, The Proteids of Barlcy. Joiirn. Anicr. ( hcinical Societv. X\ II. p. ö3ü. (1895). ■') Ofihonie and Clapp, Cheniistry of the Protein Hodies of th* Wheat Kornel. Part UI. Amer. Journ. of Physiol. XVII. p. 231 (19(1(5). ') Osbornc and Harris, Xitrogeu in Protein Bodies. Journ. .\nier. Chemical Society. XXV. p. 323 (1903). *) Oshortic, Mendel and Harris, A Study of tho Proteins of tiie Castor-lii-an with Especial Reference to the Isolation of Ricin. Amer. Jouru. of Physiol. XIV. p. 209 (190.'i). 332 Th. B. Osborne. Die dem Üiciii eigeiitümlicheu toxischen Eigenschaften finden sicli nur in den rroteinpräparaten der Ricinusbohne, welche das Albumin ent- halten , und es ist sehr wahrscheinlich . daß die Toxizität eine Eigenschaft des Albumins ist, obgleich die Möglichkeit nicht ausgeschlossen ist, daß die toxischen Eigenschaften einer nicht eiweißartigen Substanz zukommen, die unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen mit dem All)umin verbunden ist oder gefällt wird. Die enorme Giftigkeit der so dargesteUten Kicin Präparate und die Bedingungen, unter denen sie erhalten werden, machen jedoch diese letztere Annahme unwahrscheinlich. Die Pticinpräparate bestehen aus einer ^lischung von ungefähr 70Vo koagidierbarem Albumin und 30^0 Proteose. Ob die letztere ein wesentlicher Bestandteil oder eine Beimischung ist, bedarf weiterer Unter- suchung. Die Ricinpräparate zeigen alle charakteristischen Eigenschaften wahrer Proteinsubstanzen. a) Darstellung von Rieh/. Die Samen von Ricinus communis var. zauzibarensis, eine kultivierte Varietät von stattlicher (xröße, werden zertrümmert und vom größten Teil des Öles nach A. 2 b befreit und der Rest des Öles mit Äther extrahiert. Es ist nicht nötig, die Samenschalen zu entfernen. Nach feinem Zermahlen des ölfreien Mehles \\ird 1 k;/ mit 4600 cni^ lOo/oiger Kochsalzlösung extrahiert und der Auszug durch Filterbrei völlig klar filtriert und nach D. 2 vier Tage in fließendem Wasser dialysiert. Das gefällte (xlobuhn wird auf gehärteten Faltenfiltern ab- filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschwasser werden auf 11 500 cm^ gebracht. Darin werden 5050 ^ Ammonsulfat gelöst, was annähernd •45Vo völliger Sättigung mit diesem Salz entspricht. Der Niederschlag wird auf einem gehärteten Faltenfilter abfiltriert und in einem Bächnersdien Trichter so trocken als möglich gesogen, dann in einem Liter Wasser gelöst und 500 cm^ einer gesättigten Ammonsulfat- lösung zugefügt. Der resultierende Niederschlag wird auf einem gehärteten Faltenfilter abfiltriert und in 250 cm^ Wasser gelöst. Seine Lösungen werden hierauf 11 Tage lang dialysiert. Der Niederschlag, der sich bei der Dialyse bildet, wird abfiltriert und das Filtrat in einer niederen Schale mit flachem Boden in einem trockenen Luftsti'om von nicht über 50° verdunstet. Das Filtrat des vorhin erwähnten Niederschlages mit Ammonsulfatlösung wird mit 500 cw?* ge- sättigter Ammonsulfatlösung weiter behandelt und der gebildete Nieder- schlag in Wasser 11 Tage dialysiert. Nach dem Abfiltriereu von dem durch die Dialyse gebildeten Niederschlag wird dieses Filtrat auch bei 50° in einer flachen Schale verdunstet. Die beiden Rückstände in den Schalen werden dann entfernt , indem man so viel Petroläther darüber gießt, daß sie völlig bedeckt sind und sie dann mit einem Spatel abkratzt. Der Petroläther wird zugefügt , um das äußerst giftige Ricin beim Abkratzen am Herumspritzen zu verhindern. Darstellung der Prutcinc ilcr i'flauzenwelt. ;',;',3 Dies kann man woitorhin verhüten, indem man glciclizeitio- während des Abkratzens eine Glasscheibe über die Scliaie legt. Diese Operation muß im P'reien ausgeführt werden, damit jede Moghclikeit des Verlustes von Partikeln im Laboratorium vei mieden wii'd. Mit Hinsieht auf die große Giftigkeit des Iiieins sind äußerste Vorsichtsmaßregeln gegen jede zufällige Vergiftung mit der Substanz zu treffen. Wenn die Rückstände von den Schalen abgekratzt sind , werden sie mit Hilfe des Petroläthers in weithalsige Flaschen gegossen und derPetroläther bei niedriger Temperatur aligedunstet. Der Paickstand der ersten Schale wiegt ungefähr 12 g , der der zweiten ungefähr 20// oder nahezu ^'ö^/o des Samens. b) Eigenschaften des RiciyiH.^') Elementare Zusammensetzung. Das giftigste bis jetzt erhaltene Ricinpräparat hatte folgende Zusammensetzung: C 5201; H 7'02; N 16"56; Sl-29; PO-00: 0 23-12o/o- Löslichkeit. VöUig löslich in reinem Wasser. Fällt durch Sättigung mit Magnesiumsulfat. Fällt mit Alkohol und wird hierdurch in Wasser mehr oder weniger in einem von der Konzentration und der Einwii'kungszeit des i\Jkohols abhängigen (xrade unlöslich. Hitzekoagulation. Die Koagulationstemperatur hängt zum großen Teil von der Konzentration der Lösung und der Gegenwart von Salzen ab. Wässerige Lösungen geben bei langsamem Erhitzen bei 60 — 70° ein flockiges Koagulum. Das am meisten aktive Ricinpräparat ergab ca. 70% Koagulum und oO^o Proteose. Die Giftigkeit der Ricinpräparate ist pro- portional ihrem Gehalte an koagulablem All)umin. Albuminfreie giftige Pro- teinfraktionen sind aus den Ricinussamen nicht ei'halten worden. 20" Spezifische Drehung. In wässeriger Lösung ist [a] — = — 28"85". Fällung mit Ammoniumsulfat. Fällt zwischen Vs ^"ilol)ine dienen. Hämoglobinkristalle werden nach Nencki und Sieber ^) heriiestellt , indem man Kristalle von Pferde- oxyhämoglobin in lauwarmem Wasser l()st und dann mit etwas faidendem Blut versetzt und dann in einer Flasche mit doppelt durchbohrtem Stopfen, der Zu- und Ableitungsrohr trägt, durch einen Wasserstoffstrom von Luft befreit. Während der Wasserstoffdurchleitung werden die Leitungsröhren zugeschmolzen und die Flasche dann 8 — 14 Tage lang bei 20 — 25° ge- lassen. Die Bakterien verzehren während dieser Zeit den Sauerstoff, die violettrote Lösung enthält nur reduziertes Hämoglobin. Man zieht über das Ableitungsröhrchen dann einen Gummischlauch, der in al)gekiüilten absoluten Alkohol eintaucht, öffnet die Spitze des Al)leituugsrohres durch Abbrechen und saugt durch abwechselndes Erwärmen und Abkühlen der Flasche 2o Volumprozente Alkohol zu der Hämoglobiidösung. Nach 12- bis 24stündigem Stehen bei 5 — 10° ist das reduzierte Hämoglolün in schönen gUtzernden Tafeln und Prismen auskristallisiert. Für Kohle noxydh ä- moglobin gilt die gleiche Vorschrift wie für Oxyhämoglobin. Zur Über- führung von Oxyhämoglobin in Kohlenoxydhämoglobin genügt wegen der eintretenden festen Bindung das Durchleiten von CO durch eine genügend konzentrierte Oxyhämoglobinlösung. Das gleiche gilt für Stickoxyd- hämoglobin. Zur Darstellung von Methämoglobin und C'yauhämoglobin (Cyanmethämo- globin \on Koherf) gibt r. Zeynch-) folgende Vorschriften: Eine möglichst konzentrierte Lösung von kristallisiertem Pferdeoxyhämoglobin wurde mit frisch bereiteter Lösung von rotem Blutlaugensalz, welches durch l'm- kristallisieren gereinigt war, und dann im Dunkeln aufliewahrt wurde, ver- setzt, bis völlige Umsetzung in Methämoglol)in erzielt w^ar. Aus der al)- gekühlten Lösung wird durch etwa 25% kalten Weingeistes das Methämo- globin in der ül)lichen Weise kristallinisch abgeschieden. 'Die mit der Zentrifuge abgetrennten Kristalle werden mit eiskaltem Wasser gewaschen, ein- bis zweimal umkristallisiert und nun mit einer i/Woi""^^! P)lausäure- lösung versetzt. Fast momentan löst sich der Kristallbrei auf den Zusatz der Blausäure auf, gleichzeitig schlägt die rehbraune Farbe in Kot um. welches dem einer Oxyhämoglobinlösung bis auf einen Stich in Gelbe gleicht. Die so erhaltene Lösung wurde mit destilliertem Wasser so weit verdünnt, bis der Farbstoffgehalt 25 — 30% betrug, und dann mit \ ^ \'olum ab- gekühlten Alkohols versetzt. Es bedurfte meist einer Tenijxrntur von — 10", um in 1- 2 Tagen eine reiche Ausscheidung mikroskopischer Kristalle von Cyanhämoglobin zu erzielen. E. Kristallisation von Hämocyanin. Der im Blute von ( »ctopus vulgaris vorkommende kupf erhaltige Eiweißkörper, dessen sauerstoffhaltige ') M. Nencki und N. Sicher, Venöse Hämoglobinkristalle. Ber. d. Deutschen Chem. Gesellsch. Bd. 19. S. 128—130 (1886). 2) E. r. Zri/iicl; Liber kristallisiertes Cyanhämoglobin. Zeitschr. f. physiol. Cliem. Bd. 33. S. 426-450 (l'JOl). 346 Fr. N. Schulz. Darstellung der Proteine der Tierwelt etc. A'erhiiidong (Oxyliämocyanin) sich durch ihre tiefblaue Farbe auszeichnet, ist von Heiize^) zuerst kristallisiert dargestellt worden, indem er (an- lehnend an das A'eriahren von Hopkins und Pinkus zur Darstellung von Eieralbuminkristallen) das Blut zuerst mit konzentrierter Lösung von Ammoniumsulfat bis zur beginnenden Trübung versetzte, die Trübung mit wenig Wasser wieder auflöste und dann tropfenweise verdünnte Essigsäure zusetzte, bis von neuem eine geringe Füllung eintrat. Nach i/., stündigem Stehen setzte sich ein kristalUnischer Niederschlag am Boden al). Aus der dekantierten Flüssigkeit ließ sich durch etwas Ammoniumsulfatlösung ein weiterer Kristallniederschlag erzielen. Die Kristalle sind gut ausgeprägt und zeigen schöne Doppelbrechung. ^) M. Henze, Zur Kenntnis des Hämocyanins. Zeitschr. f. physiol. Cbem. Bd. 33. S. 870-384 (1901). b) Gruppe der niclit kristallisierbaren Proteine. a) Eigentliclie Proteine. Von Franz Samuely, Freibur«^' im Breisgau. Die Proteine finden sich im tierischen Organismus — von ganz wenigen Ausnahmen abgesehen — in kolloider Lösung. Aus diesen Lö- sungen können wir die Proteine isoUeren, indem wir sie aus dem Sol- zustand in den Gelzustand überführen. Erst die aus den Lösungen gefidlten Proteine können dann einer weiteren PieinißunQ' unterzoi>(Mi wei'den. Nur fih' eine beschränkte Zahl von Eiweirikörpern ist bis jetzt die Überführung iu einen kristaUisierten Zustand gelungen. ( >ffenbar sind die kiistallisatious- fähigen Substanzen solche Proteine, die bei der mit ihnen voi'genommcucn Fällung einheitlich ausfaUen und durch die Prozesse der IsoUerunu' in ihren Eigenschaften wenig oder gar nicht verändert werden. Die über^^^egende Zahl von Proteinen ist nui- iu amorpher Foiiii darstellbar. Die Momente, welche eine Kristallisation verhindern. las>en sich nicht übersehen. Gewiß fehlt es für manche Substanzen bis jetzt au den geeigneten Methoden, da es z. B. bis jetzt nicht gelungen ist. das in der Natur in Kristallform vorkommende Ichthulin nach seiner Isoherung wieder in den kristallisierten Zustand überzuführen. Ebenso sicher aber liegt die wesentUche Störung der Kristallbildung in der nianii-einden Einheitlich- keit und der leichten ^'eränderlichkeit der isoherten ani()ri)iieii Proteine. Erfahrungsgemäß ist für die Gruppe der (dobuline sogar (h'r Kontakt mit Wasser different, so daß diese Proteingattung hierbei irreversibel dena- turiert, d. h. unlöslich wird. Enter diesen Bedingungen versteht sich die Schwierigkeit der Kristalll)ildun,u- von selbst. Andrei-seits wissen wir. wie häufig geriniifügige Kolloid- oder Salzbeimengungen die Eigenschaften eines anderen Kolloids beeinflussen. Nun pflegen wir die Proteine meist aus salzhaltigen Lösungen von Proteingemischen zu isoUeren, deren (|uantita- tive Trennung kaum vollständig gelingt. Die kleinsten Spuren eines Proteins als Beimengung eines anderen können dessen Kristallisationsvermögen ab- solut verhindern. Unsere Methoden der Peinigung von solchen Beimen- gungen aber sind häufige Umfällungen oder Fraktionierung, d. h. Pro- zeduren, die ein Protein nicht unl)eeinflu(it lassen, so daß wir wiederum in den ersten Fehler im ^\n■such der Kristallerzeu'>uug verfalh'U. 348 F^- Samuely. Wenn wir uiiii hinzufügen, daß unsere heutigen Methoden zur Dar- stelhnig amorpher Proteine in den wenigsten Fällen zu absolut reinen, einheitlichen Proteinkörpern führen, so wird es begreif hch, daß auch die Mehrzahl der Proteine bisher der Kristallisation widerstanden hat. Aus diesen einleitenden Worten geht aber l)ereits der Hinweis hervor, daß die in diesem Kapitel zu besprechenden Substanzen noch keineswegs als che- mische Individuen in sensu stricto, sondern nur als mehr oder weniger gut studiei'te und erforschte Vertreter bestimmter Proteingattungen und Proteingruppen aufzufassen sind. Methoden zum qualitativen Nachweis von Proteinen.') AVir kennen als Mittel des qualitativen Eiweißnachweises zwei ver- schiedene Arten chemischer Pveaktionen: 1. Koagulations- und Fällungs- reaktionen und 2. Farl)enreaktionen. ^'ou jeder dieser beiden Gruppen sind Proben verwertbar ; es muß aber bei jedem Proteiunachweis eine Mehrzahl von Pteaktionen angestellt werden, um vor Täuschungen und Fehlschlüssen sicher zu gehen. So gibt es Proteine, die keineswegs in der Hitze koagu- lieren und doch die Farl)enreaktionen geben. Andrerseits sind in der großen Gruppe der Eiweißkörper solche vorhanden, denen diese oder jene Farlien- reaktion fehlt. Schließlich gibt es eine Anzahl organischer Substanzen, welche die Fällbarkeit durch l^estimmte Reagenzien oder manche Farbenreaktion mit den Eiweißkörpern teilen, ohne selbst Proteine oder Proteide zu sein. Daraus folgt aber die Notwendigkeit, sich niemals mit einer einzigen Probe zu begnügen; der negative Ausfall einer solchen entscheidet nicht unbedingt gegen eine Eiweißnatur. Auch hat die Anwendung mehrerer Eiweißreaktionen zugleich den Vorteil, über die Natin- und Stellung eines Proteins in deren üblichem System Aufschluß zu geben. Und die Kenntnis von der Natur eines fragliclien Proteins ist gewiß von größerem liio- chemischen Interesse, als die einfache Feststellung einer Substanz als „Eiweiß". Fällungsreaktionen. 1. Koagulation durch Hitze. Man erhitzt eine auf Eiweiß zu prüfende Lösung in der Flamme zum Kochen und fügt nach dem Kochen wenige Tropfen einer sehr verdünnten Säure (am besten Essigsäure oder Salpeter- säure) hinzu. Bleibt bei schwach saurer Reaktion eine vorher auftretende Trübung in flockiger Form bestehen, so liegt ein koagulables Eiweiß vor; durch Farbenreaktionen des abfiltrierten oder in Alkali bzw. Säure als Alkali- bzw. Säurealbuminat gelösten Körpers ergänzt man die Fest- stellung. Im allgemeinen wird man stets solche Lösungen prüfen, die als physiologische oder pathologische Flüssigkeiten oder als künsthche Extrakte ') Anmerkung: Diese Ausführungen mehr allgemeinerer Natur gelten im wesent- lichen für die ganze Gruppe der Proteine. Sie sind an dieser Stelle erwähnt, weil die meisten Beobachtungen zuerst an Proteinen der Tierwelt gemacht worden sind und für die Pflanzenproteine manche Verhältnisse anders liegen. Der Herausgeber. Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisiei-bare Proteine. Ji49 bereits salzhaltii>- sind. Handelt es sich aber \m\ salzfreie oder sehr salz- arme Lösnn^en, in welchen die sichtbare Fälhnifi' des dni'ch die Hitze denaturierten Eiweißes ausl)leibt, so fügt man vor der Erhitzung- ein Salz, z. B. Kochsalz, Kalinmphosphat oder Natriumsnlfat, hinzu. Die Proteine koagulieren bei bestimmten Koagulationstempera- turen, die für einzelne Proteine spezifische Konstanz aufweisen. Bestimmung der Koagulationstemperatur. Man bringt die zu prüfende EiweißKisung in eine mittelgroße Eprouvette. Die Höhe der Eiweiß- lösung in derselben soll etwa ö — 6 cm betragen. Dieses Reagenzglas taucht man in ein mit Wasser gefülltes Becherglas derart, daß der äußere Wasser- spiegel das Niveau der Eiweil'dösung um weniges überragt. In die Außen- flüssigkeit und in die Eiweißlösung taucht ein Thermometer. Eür gute Temperaturablesungen ist es auch zweckmiißig, das Thermometer nicht in die Eiweißlösung selbst, sondern in ein mit AVasser gefüUtes zweites Pteagens- gias tauchen zu lassen, das ebenso wie jene die Eiweißlösung beherbergende Eprouvette in das Becherglas versenkt ist. Das in diesem Wasserbad be- findliche W^asser wird nun vorsichtig und langsam unter gutem Durch- mischen mit einem (ilasring erwärmt, wie dies bei den Schmelzpunkts- bestimmungen geschieht. Der Beginn der Koagulation ist an einer milchigtn Trübung erkennt- hch, die mit Aveiterem Steigen der Temperatur einer absoluten Tudurch- sichtigkeit der Lösung und mit beendeter Koagulation einer flockigen Ab- scheidung weicht: für aUe drei Stadien der Eiweißfällung' sind die Tempei'a- turen zu notieren. Desgleichen wiederholt man die Bestimmung bei schnellem Erwärmen des Wasserbades und nach Eintauchen der Proteinlösung in das bereits bis nahe an die Koagulationstemperatur vorgewärmte AVasserbad. Man hat daran festzuhalten, daß die Koagulationstemperatur von zahlreichen ^Momenten nach oben oder unten l)eeinflußt wii-d . so von der Schnelligkeit des Erwärmens, dem Salzgehalt und der Pieaktion der Lösung, sowie von der Konzentration des gelösten Eiweißes selbst. \ov allem muß im Gegensatz zu früheren Gewohnheiten, w-enn mög- lich, jede gefundene Koagulationstemperatur (d. h. die Temperatur der flockigen Fällung) mit einem Vermerk über den Salzgehalt der Lösung und die Eiweißkonzentration versehen werden. 2. Fällung durch konzentrierte Salpetersäure. Man unter- schichtet die Eiweißlösung mit einer kleinen Menge kalter konzenti'iei-ter Salpetersäure. An der Berührungsfläche l)eider Flüssigkeiten entsteht hei Anwesenheit von Eiweiß ein weißer Ring- eines Niederschlags. Es ist stets ratsam, diese sogenannte Hell ersehe Probe durch Schichtung: auszuführen. Da es Proteine gibt, z. B. Albumosen, deren Fällung im Säureübei-schuß löslich ist, so bewahrt die Schichtprobe vor L-rtümern. Andrerseits kann man sich durch Umschütteln der Lösungen nachträglich noch über ein«' eventueUe Löslichkeit des Präzipitats unterrichten. o. Auch aUe folgenden Eiweißproben durch Fällung mit M e t ;i 1 1- salzen oder sogenannten Alkaloidreagenzien sind vorsichtig erst mit 350 Fr. Samuely. kleineu Zusatzmenyen imd dann erst mit einem Überschuß des Fällungs- mittels auszuführen. Als solche dienen : Kupfersulfat, Kupferacetat. Queck- silberchlorid. Eisenchlorid. Eisenacetat, Bleiacetat, Zinkacetat, Uranylacetat, Platinsalze und Kobaltsalze. Da sich die verschiedenartigen Eiweißkörper gegen diese Metallsalze sehr verschiedenartig verhalten, so werden diese Reagenzien weniger zum qualitativen Nachweis des Eiweißes, als \delmehr zur Feststellung ihrer rirnppenzugehörigkeit verwendet. Die gebräuchlichen ..Alkaloidreagenzien" sind: Wasserstoffplatinchlorid, Wasserstoff quecksilberjodid. Wasserstoffwismuthjodid, Metaphosphorsäure, Molybdänsäure , Phosphormolybdänsäure, Wolframsäure, Phosphorwolfram- säure, Allotellursäure. FeiTocyanwasserstoffsäure und Gerbsäure. A'on diesen komplexen organischen Säuren, die alle in stark sauren Eiweißlösungen von großer Verdünnung Fällungen erzeugen, sind für den rohen ([ualitativen Nachweis nur die beiden letzteren praktisch verwertbar. 4. Man säuert die fragliche eiweißhaltige Lösung mit Essigsäure oder Salzsäure stark an und fügt zu ihr einige Tropfen einer loo/gigen Lösung von Ferrocyankalium. Eine sofort mit jedem Tropfen zunehmende Trübung beweist die Anwesenheit von Eiweiß. Auch hier ist in der Menge des Fällungsmittels Vorsicht geboten, da es Proteine gibt, welche im Über- schuß des Fällungsmittels löslich sind. Das auf dem Filter gesammelte Präzipitat gibt noch die Farbenreak- tionen des Eiweißes. ö. Die (xerbsäure wird am zweckmäßigsten in Form der sogenannten Almeni^chen Lösung verwandt , welche 4 r/ Gerlisäure in 8 cm^ 2öo/oiger Essigsäure + \90 cm^ 40— oOVo Alkohol enthält. Die Probe ist für ge- nuine Eiweißkörper außjerordeutlich empfindlich. 6. Fällung durch organische oder anorganische Säuren (Essig- säure. Salzsäure etc.). Von den bisher genannten Fällungen ist diejenige Niederschlagsbildung zu unterscheiden, die auf dem Zerlegen eines Alkali- eiweißsalzes in das freie Eiweiß mit Säurecharakter durch eine stärkere Säure beruht. Man achte in jeder Eiweißprobe auf diese Erscheinung, da auf diesem Weg der erste Anhaltspunkt über die Oruppenzugehörigkeit eines Proteins gewonnen \\ird. Eine solche Fällung ist eine reversible, d. h. der Körper ist nicht denaturiert und wieder in Alkalien löslich. Jede solche Fällung hat mit einem Minimum von Säurezusatz zu be- ginnen, um die Möglichkeit einer Lösung im Säureülierschuß zu vermeiden bzw. später zu konstatieren oder Verwandlung in Umwandlungsprodukte (Acid- oder Alkalialbuminat) zu verhindern. Eiweißfarbenreaktionen. 1. Biuretprobe. Mau führt die Probe nur an Eiweißlösungen aus. Liegt ein wasser- oder alkaliunlöslicher Körper vor . so verwandelt man ihn durch Kochen mit heißer Lauge in ein lösliches Albuminat. Zu I Darstelluug der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. ;J51 der gesättigten Salz- lösung zu jeder Filtratprobe. Das hierbei zuerst vollständig klar gebliebene Gemisch zeigt die Probe an, in welcher die obere Sättigungsgrenze für den ursprünglich in Lösung gegebenen Körper erreicht war. Um die notierten Sättigungsgrenzen vergleichbar zahlenmäßig auszu- drücken, bezeichnet man dieselben mit derjenigen Anzahl Kubikzentimeter der gesättigten Salzlösung, die in einem Gesamtvolumen von 10 cjd'^ eine erste Trübung erzeugt oder zur (luantitativeu Abscheidung ausgereicht hat. Wenn also in einer l°/oigen Eiweißlösung von 2 cm\ die mit 5'2 cm^ Wasser versetzt war, durch 2"8 cm^ gesättigter Salzlösung die erste Trübung entsteht, so ist die untere Fällungsgrenze für den in Frage stehenden Kih'per 2'8 oder 28Vo. Bei Bestimmung solcher Zahlen ist es aber dringend nötig, dieselbe durch Angabe der Eiweißkonzentration und Reaktion der ursprünglichen Eiweißlösung zu ergänzen, da diese Fällungsgrenzen keines- wegs physikalische Konstanten sind. W^ohl zu unterscheiden von diesen so bestimmten Zahlen sind jene Grenzwerte, die etwa durch Fällungen mit gepulvertem Salz in Substanz bestimmt sind. In solchen Fällen drückt man die Sättigungsgrenzen eines Proteins nicht in Kubikzentimetern einer gesättigten Salzlösung, sondern durch den al)soluten Prozeutgehalt der Eiweißlösung an zugesetztem Salz aus. Methode der fraktionierten Eiweißfällung durch Aussalzen mit gesättigten Neutral Salzlösungen. Sind in einer Lösung zwei oder mehrere Eiweißkörper enthalten, deren obere bzw. untere FäUungsgrenzen miteinander nicht zusammenfallen, so kann man dieselben fraktioniert aussalzen, d. h. man fügt zu der in Frage stehenden Lösung soviel gesättigter Salzlösung hinzu, daß die obere Sättigungsgrenze des ersten Körpers erreicht ist, filtriert ihn ab, wäscht mit einer dieser Sättigungsgrenze entsprechend verdünnten Salzlösung aus, und steigert nun in den vereinigten Filtraten den Salzgehalt derart, daß die Sättigungsgrenze des zweiten Proteins überschritten wird. Vielleicht ist es zw^eckmäl/iig, an dieser Stehe die mathematischen Formeln wiederzugeben, nach denen man die Mengen der gesättigten Salz- Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. ;]dÖ lösimg ])estimint, die nötii^' sind, um eine Kiweißlösinin- auf einen gewünschten Sattio-ungsfirad, d. li. Gehalt an 5>esättif>ter Lösunu-. oder eine bereits zu einem bekannten IVozentsatz mit Salzlösunj> gesättigte Lösung auf einen nächst höheren, gewünschten Sättigungsgrad zu bringen. Wir eiiunern dabei daran, daU sich der liegriff »Sättigung in I'rozenten uiclit auf den Gehalt an Animonsulfat, sondern auf die \olumina gesättigter Salzlösung l)ezieht. I. Es sei A die Menge einer beliebigen P^iweißlösung in Kubikzenti- metern. Dieselbe soll durch Z c;m^ einer gesättigten Salzlösung zu ' ge- sättigt werden. Dann ergibt sich A + Z b £ , ^ r, a . A — P7 — = ~, woraus folgt: Z = , Z a " b — a II. Es sei A eine Menge einer EliweiliKisung in Kubikzentimetern, die bereits zu ' = s mit einer Salzlösung gesättigt ist. Dieselbe soll durch Zusatz einer unbekannten Menge Z der gleichen, gesättigten Salzlösun ()' auf ein Sättiaungsverhältnis von .' ' gebracht werden. Dann ercibt sich: . * b, A-hZ _bi A.{\\ s — aQ —. r7 — — 1 diso /j — A . s + Z ai ai — b^ Beispiel. Es sollen aus einer Eiweißlösung von 100 cw^ 2 Eiweißkörper gefällt werden, deren erster bei einer Sättigung von Vs' 'l- ^i- ßö^ß^/o ge- sättigter Ammonsulfatlösung, und deren zweiter bei einer solchen von */^, <1. h. 80 Vo Salzlösung gefällt wird. 2 100 Z=- — ^=200. Ich füge also zu lOOcm^' Eiweißlösung 200 cm ^ 6 — 2 der gesättigten Anij S04-Lösung. luden entstehenden HOO cm^ sind 200 «»^ gesättigter Salzlösung enthalten, also die Sättigung beträgt 2/3- If'^ filtriere von dem Niederschlag ab und wasche mit einer 2/3 gesättigten Ani-^SOi- Lösung gut aus. (Die Lösung wird hergestellt aus 2 Teilen gesättigtei- Salz- lösung + 1 Teil destillierten Wassers.) Das (iesamtvolumen des gewonnenen Filti'ates beträgt 400. 400. (5. 1-4) -266-7 ^ .,,... Z = ; z = Z = -f- 2( )() i . 4 — o — 1 Ich füge also zu den -iOO cm^ noch 266-7 cm » der gesättigten Salz- lösung hinzu. Es fällt das ZAveite Protein aus, denn die entstehenden 666-7 cm^ der Flüssigkeit enthalten 266*7 an^ Salzlösung von der /w(Mt(Mi Fällung + 266-7 cm'-^ von der ersten Fällung samt dei- Verdünnung, d. li. im ganzen 53o-4 cm^ gesättigter Am., SG^-Lösung, d.h. die Lösung ist zu Vö gesättigt. 23* .■'>56 Fr. Samuely. Zur Systematik der Proteine. Identifikation eines I*roteins als (llied einer bestimmten Proteinklasse. Die Methoden, welche das in der Überschrift bezeichnete Ziel ver- folgen, ergeben sich aus den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Proteine, aus dem einfachen Grunde, weil unsere Systematik willkür- lich nur aus der Kenntnis dieser Eigenheiten aufgebaut ist. Wenn es auch den Anschein hat, dali chemische Differenzen tatsächlich die vorläufig ge- bildeten Gruppen auszeichnen, so müssen wir doch eingestehen, daß unsere Systematik von heute nur den Versuch einer Gliederung der so vielseitigen Eiweißkörper darstellt. Auf Seite 358 u. o59 geben wir eine Tabelle wieder, in der die großen Gruppen der Proteinsubstanzen verzeichnet sind, und in die zugleich die- jenigen Eigenschaften aufgenommen sind, welche heute die Anhaltspunkte für die Zusammengehörigkeit solcher Gruppen liefern. Daß selbst inner- halb der GUeder einer einzigen Gruppe Unterschiede der Eigenschaften vorkommen, versteht sich. Wir kennen fließende Übergänge von einer Gruppe zur anderen. Es ist daher auf die Mitteilung von Speziaireaktionen verzichtet. Nur diejenigen Reaktionen und Eigenschaften sind verzeichnet, die von a-enereller Bedeutung sind. .Man ersieht aus der Tabelle, daß gerade diejenigen Pteaktionen für eine Identifizierung wesentlich sind, die wir bereits zum qualitativen Xachweis dieses Proteins und zur Reinigung und IsoUerung eines solchen angeführt halben. Je genauer diese dort beschrie!)enen Proben und ^lethoden befolgt werden und je zahlreicher die ausgeführten Vorproben sind, um so leichter wird die Identifikation eines Proteins ge- lingen, und nur in wenigen Fällen wird eine Analyse des dargestellten Proteins nötig werden. ^lan wird nach Ausführung der Vorproben in der Tabelle sofort die Zugehörigkeit eines Proteins zu dieser Gruppe feststellen oder sicher zu anderen Gruppen ausschließen können. Man bestimme die folgenden Punkte: 1. Feststellung, ob ein durch Hitze koagulables Eiweiß vorliegt und Bestimmung, ob im Filtrat dieses koagulablen Proteins noch ein anderer nicht koagulabler Eiweißkörper enthalten ist. (Anstellung der Biuretprobe und Ferrocyankaliprobe.) 2. Wiederholung dieses Versuches unter Anwendung von absolutem Alkohol im (''berschulj als denaturierendes Agens. i\. Feststehung der SalzfiUlbarkeit des fraglichen Proteins durch Zu- satz gesättigter Saklösungen (mindestens 2 Salze: MgSOi und Am.2S(;)i) in verschiedenen Volumverhältnissen (Halbsättigung , 2/3-Sättigung, Gauzsätti- gung) unter Untersuchung der Filtrate auf Fraktionen, die erst bei höherer Salzsättigung ausfallen. 4. Kontrolle über die Löslichkeit der durch Aussalzen gewonnenen Körper, in Alkali, Säure, in salzhaltigem Wasser oder salzfreiem Wasser Darstellung- der Proteine der Tierwelt: Xiclit kristullisierbare Proteine. :'',57 (durch Dialyse der salzhaltigen Lösung). Der Dialysenversuch kann auch mit der ursprünglichen Lösung der Proteine ausgeführt werden. 5. Feststellung der Fälll)arkeit des nun in Lösung befindlichen Proteins durch Säuren oder Alkalien (NH,), d. h. ob das fragliche Protein von stärker basischem oder stärker sauerem Charakter ist. Die Probe ist auch an der genuinen ursprünglichen Eiweiülösung zu prüfen, ist aber erst ein- deutig zu verwerten, wenn durch die Methoden der Salzfällungen Gemische von Proteinen getrennt sind. Bei Fällungen ist die Reaktionsveränderung mit Lackmuspapier genau und schrittweise zu kontrollieren und zugleich (üc Löslichkeit in Säure- oder Alkaliüberschüssen festzustellen. 6. Feststellung über den Schwefel und Phosphorgehalt der durch Salz- fällung oder Säure- bzw. Alkahfällung isolierten Substanz. Der Bestimmung mulj eine Pteinigung durch mehrfach wiederholte L-mfällung vorangehen. 7. Feststellung über den Gehalt einer Kohlehydratgruppe oder von Purinbasen in den Hydrolysenlösungen der durch Säuren zerlegten Sub- stanzen. Farbenreaktionen auf Kohlehydratgruppen sind allein nicht ent- scheidend. S. Speziaireaktionen durch Fermente (Thrombin, Lab, Pepsin. Trypsin). Die methodischen Hinweise für die Ausführung dieser 8 Aufgaben ergeben sich zum Teil aus den vorangehenden Kapiteln, zum Teil aus den Details der Darstehungen in den folgenden Absätzen und Kapiteln. Die Tabelle soll nur die rasche Identifikation einer Proteingruppe ermöglichen. Alle Speziaireaktionen sind in den deskriptiven Handbüchern der Biochemie aufzufinden. Wir gehen nun zu der Besprechung der speziellen Darstellungs- methoden der tierischen Proteine über. Aus praktischen Gründen ist das Material zunächst so geordnet, daß erst die Methoden zur biochemischen Aufarbeitung solcher Gewebsflüssigkeiten, Sekrete und Organe behandelt Averden, die auf ihren Eiweißgehalt genau analysiert und untersucht sind und deren Proteine das größte praktische Interesse haben. Die Methoden stellen zum Teil geradezu typische \'orbilder dar. nach denen die LTntersuchung jeder proteinhaltigen Lösung vorgenommen wer- den kann. L Die Eiweißkörper des Blutes. Im Blut kommen folgende Eiweißkörper vor: Serumalbumin, Serum- globuline, Fibrinogen, Fibrinoglobulin , Serumnukleoproteid, Serummukoid. 1. Serum albumin, vgl. S. ?>;37. 2. Serumglobulin ist der Hauptvertreter der Gruppe der Globuline. Es hat die Eigenschaften dieser Proteinklasse: Unlöslichkeit in Wasser (vgl. unten). Löslichkeit in verdünnten Neutral-Salzlösungen und Alkalien, Fäll- barkeit durch schwache, verdünnte Säuren, Löslichkeit im Säureüberschul». Aus diesen wesentlichsten p]igenschaften ergeben sich die Prinzipien der Serumglobuhndarstellung und Pteinigung. Man hat zwei Arten der 358 Fr. Samuelv. Keasenzion Albumine (i 1 ob ul i n e Nnkleo- al bum i ne Vit eil ine Speziaireaktionen Wasser Kochen Alkohol 5— 107oige Lösung von Neutralsalzen gesättigte Lösung von KaCl desgleichen von MgSO, desgleichen von Am, SO. verdünntes Alkali XaOH oder NH, verdünnte Säuren konzentrierte Mineralsäuren konzentrierte Salpetersäure Ferro cyankali + Essigsäure Gerbsäure + Mineralsäure Phosphor- wolfrarasäure löslich koaguliert nur bei Salz- gegenwart gefällt und koaguliert meist unlöslich koaguliert bei Salzanwesen- heit löslich bis 100° „ nicht gefällt*; bis lOO^'o nicht gefällt*) bei lOOö/o ganz gefällt löslich, in Al- kalialbumiuat übergehend gefällt und koaguliert löslich zum Teil 1007o gefällt lÜ07o gefällt 50% gefällt löslicli. sehr leiclit in Acid- albuminat übergehend gefällt gefällt, Wärme unlöslich refällt gefällt gefällt hislicb. verw. in Alkalialb uminat fällbar aus alka- lischer Lösung. Überschuß löslich zu Acidalliumiuat gefällt Wärme unlöslich gefällt gefällt gefällt Paranuklein bei Verdauung, phosphorhaltig unhislich nicht koaguliert, nur die Salze koagulieren gefällt und koaguliert unlöslich als Salze fällbar als Salz fällbar als Salz fällbar löslich gefällt, schwerlös- lich im Überschuß von CHgCOOH löslich gefällt, löslich im Ülierschuß gefällt gefällt gefällt P-haltig. zum Teil eine Kohle- hydratgruppe enthaltend unlöslich koaguliert gefällt, nicht koaguliert loslich in 107^ NaCl, sonst un- löslich*) löslich gefällt aus alka- lischer Lösung, im Überschuß zum Teil löslich gefällt gefällt gefällt Bemerkungen *)bei saurer Re- aktion durch 1007o ^'aCl oder MgSO^ gefällt Kristalline sind in Wasser l()slich Die Pieaktionen sind nur mit den wasserlöslichen Alkalisalzen ausführbar *) Ichthulin in verdünnten Xeu- tralsalzeii löslich Die Protamine und eiweißartigen Abbauprodukt Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kiistallisierhiue I'roteiiie. r,59 Nuklen Proteide Schleim Substanzen A 1 b u m o i d e Hi Btone P-haltig. Pnriii- basen-, Pyrimidin- basen-, Knble- hvdrathaltig unlöslich, Salze sind löslich nicht koaguliert gefallt, nicht koaguliert unlöslich refällt gefällt gefällt löslich unlöslich, d. b. aus Salzen fällbar, zum Teil schwer löslich im Überschuß von Essigsäure gefällt gefällt gefällt enthalten zum Teil tilukosamiii und zum Teil Choudroitin- schwefelsäure löslich nicht koaguliert, zum Teil leicht verändert gefällt, nicht koaguliert löslich fällbar fällbar fällbar löslich gefällt, unlöslich im Überschuß nicht gefällt (Aus- nahmen vorhanden !) gefällt gefällt zum Teil gegen Fer- mente resistent meist unlöslich nicht fällbar, nicht koaguliert zum Teil aus saurer Lcisung fällbar unlöslich zum Teil fällbar (Kollagen) zum Teil fällbar (Kollagen) zum Teil fällbar unlöslich, nur als Salze löslich gefällt, Koagulat leicht löslich in Säuren refällt unh'islich löslich gefällt gefällt gefällt trefällt wenn wasserlöslich, gefällt zum Teil gefällt gefällt 'S vr, gefällt " 1-5 gefällt 2 unltislicb auch im NHj-Überschuß*) löslich nicht fällbar fällbar, löslich in der Wärme, wiederkeh- rend in der Kälte gefällt geben bei l'epsin- HCl- Verdauung Xukleine bzw. durch Säurehydrolyse Nukleinsäuren Pseudomuzin ist mit Essigsäure nicht fällbar ") In Überschuß von fixem Alkali loslich (Albumosen und Peptone) sind nicht verzeichnet. 3gQ * Fr. Samuely. IMethoden zu unterscheiden : 1. Die Methode der SäurefäUung. 2. Die Methoden, welche die zur Lösung des Glolnilins optimale Salzkonzentration nach unten durch starkes Verdünnen, nach oben durch Salzzusätze (Neutral- salze) verschieben. In der jüngsten Zeit haben sich immer mehr Stimmen erhoben, welche die Einheitlichkeit des von Fannum entdeckten Serumglol)ulins bezweifeln, da man einerseits wasserlösliche Anteile dieses Globulins neben wasserun- löslichen fand, da man ferner durch die Methode der fraktionierten Aussalzung mit Ammonsulfat oder Kaliumazetat Fraktionen von deutlich verschiedenen Fällungsgrenzen und spezifischen biologischen Eigenschaften isolieren konnte. Es soll hier diese Frage nicht kritisch behandelt werden. Wir geben die gebräuchlichen ^lethoden wieder mit dem Hinweis, daß bei der Kompliziertheit der Verhältnisse ein abschließendes Urteil bis jetzt nicht möglich ist. I. Darstellung von Globulin aus Blutserum durch Verdünnen oder Ansäuern nach Hanimarsten.^} Frisches, zellfreies Rinderlilutserum wird mit der 10 — löfachen Menge Wasser verdünnt. Durch Einleiten von CO., während V2 — 2 Stunden ent- steht ein Niederschlag. Statt der CU).^ -Fällung kann man vor ^>rdünnen schon mit verdünnter Essigsäure schwach ansäuern. Nach 24 Stunden filtriert man vom Niederschlag ab, wäscht ihn mit Wasser aus. löst ihn dann in möglichst wenig verdünntem x\lkali und fällt erneut mit wenig Essigsäure. Diese Umfällung wird mehrfach wiederholt. Statt der Reinigung durch Umfallen aus alkalischer Lösung kann man den Niederschlag auch in verdünnter Kochsalzlösung lösen und erneut durch Zusatz von viel Wasser abscheiden. Der Niederschlag wird dann auf dem Filter salzfrei gewaschen, even- tueU durch Alkohol denaturiert und nach Ätherbehandlung getrocknet. Beurteilung: Die Methode führt in relativ kurzer Zeit und ein- facher W^eise zu einem Globulinprä parat, das aber nicht frei von Fibrinogen und Fibrinoglobulin ist. ^lan gewinnt auch nicht die Gesamtmenge des Globulins. Hulscamp -) hat ferner neuerdings darauf hingewiesen, daß man zwischen einem durch Essigsäure fällbaren Globulin und einem beim Ver- dünnen ausfallenden Globulin unterscheiden müsse. Das letztere, das Salz- globulin, fällt dann aus, wenn die Serumflüssigkeit einen Salzgehalt von 0-30/0 enthält, ein Zustand, der durch den Prozelj der ^>rdünnung erreicht wird. AVenn wirklich beide Körper chemisch verschiedene Substanzen dar- stellen, so gewinnt man bei der obigen Methode sicher ein Gemisch. ^) O.Hammarsten, Über das Parasrlobnlin. 1. P///^/r>-Ä Archiv. Bd. 17. 8.413(1878). — Derselbe, Über das Paraglobulin. II. Ebenda. Bd. 18. S. 38 (1878). — Derselbe, Über das Fibrinogen. Ebenda. Bd. 22. S. 431 (1880). ^) W. Hiii.^ einen nenen Körper ab, dessen Sättigung mit 46'yo (<^l"'^o durch Zufügen von eineui drittel Volumen ge- sättigter Salzlösung zum jetzt vorhandenen A'olumen der Sakgiabulinlösung) beendet ist. Er stellt das Pseudoglobulin dar. Die Reinigung erfolgt in gleicher Weise. Die Fraktionierung' von Euglobulin und Pseudoglobulin durch Ilalb- sättigung mit Kaliuniacetat bietet keine \'orteile vor der \'erwenduug von Ammonsulfat. ?). Kombination der Salzfällung und Dialyse nach Freund und Joachim J) Man trennt in der nach 2. beschriebenen Weise in Eu- und Pseudoglol)ulin. Beide Niederschläge werden in Wasser gelöst, zweckmäbig zu der ursprünglichen Konzentration der Ausgangslösung- an Eiweiß, und 2 3mal durch Fällen mit AnuSOi und Lösen in Wasser g-ereinigt. Die Pseudoglobulinlösung ^^ird vor der weiteren Verarbeitung durch 1/3 Am., SOi- Sättigung noch einmal auf Euglobulinbeimengungen geprüft und. wenn nötig, durch Filtration davon befreit. Beide Lösungen (Euglobulin = I, Pseudoglobulin = II) werden nun 4 ß Wochen lang der Dialyse gegen strömendes Wasser unterworfen. In I und II kommt es zur Abscheidung' eines unlöslichen Globulins, während ein zweiter Globulinanteil in Lösung bleibt. Es wird vom Eingelösten abfiltriert. Der Filterrückstand wird bis zum Ablaufen abiureter Waschflüssigkeiten gewaschen, danach solange mit 0"6''/n Kochsalzlösung extrahiert, als noch Eiweiß in Lösung geht. Bei dem unlös- lichen (ilobulin von I und II bleibt ein Teil in Kochsalz ungelöst; derselbe wird aber durch ()"25o/o Na., CO^-Lösung gelöst. Beurteilung: Inwieweit bei der letzten Fraktionierungsmethode sekundäre Veränderungen nur eine Vielheit spezifischer (dobuline vor- täuschen oder wirklich chemisch differente Individuen vorliegen, entzieht sich vorläufig der sicheren Beurteilung (Taylor). Einige Eigenschaften der Serumglobuline und ihrer Einzelfraktionen: Die mittlere Zusammensetzung eines nach Hamniarsten dargestellten Globubns beträgt C 52-71, H T'Ol, N irr85, S PlP/o, nach il/örwer l-02«/o ^ und O-I^TVo bleischwärzender Schwefel. Koagulationstemperatur in lOVoig'^i' NaCl-Lösung 69— 76^ meist 75". (a)ü = — 47-8''. Eine Beteiligung eines Kohlehydrats am Aufbau des Sei-umglol)iilius. die wiederholt behauptet Avurde, scheint nicht zu existieren. Ilcduzierende Sul)stanzen, die unter den Produkten dei- Säure- oder Baryts}>altung- ge- funden wurden, dürften Verunreiniuungen entstamincn. i\ ') E. Freund nnä J. Jonchiii/, Zur Kenntnis der Senungloliiiline. Zoitsclir. f. pli.v: Chem. Bd. 36. 8.407 (^1902). ;-J54 Fr. Samuely, Eugiobiiliii fällt bei Halbsättiiiuno- seiner Lösung mit Kalium- acetat und ist durch Essigsäure und Dialyse fällbar (Spiro). Pseudoglobulin zeigt diese drei Eigenschaften nicht. Außer diesen beiden Fraktionen haben Spiro und Porges^) durch Ammonsulfatfraktionierung ein drittes (xlolmlin bestimmt, so daß sich für sehr verdünnte Lösungen des Globulins die folgenden I'ällungsgrenzen mit Ammonsulfat ergeben und die folgenden Globuline ausfallen: C H X s (^)d 30— 37«/o Sättigunu- 52-68 7-65 i(;-03 1-13 49" ] Koag.-Temp. in 37-440/0 50-48 7-78 15-5 0-98 41« 5''/oig"erAm2S(V 44-5OV0 47-52 8-14 14-4 0-92 42» 1 Lösung 70—750. Qualitativer Nachweis eines Globulins. Man fällt das Globulin aus der zu prüfenden eiweißhaltigen Lösung durch Halbsättigung mit Ammonsulfat. Der entstehende Niederschlag wird abfiltriert, mit halbgesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und in wenig Wasser gelöst. Mau bestimmt den Koagulationspunkt der Lösung. Tempe- raturen zwischen 65 — 76" zeigen die Gegenwart eines (ilobulins an. Trü- bungen, die bei 55° entstehen, entstammen dem Fibrinogen. Eine andere Probe der fraglichen Eiweißlösung wird dialysiert. Ein Niederschlag, der in verdünnten Salzlösungen löslich und durch Verdünnen und Ansäuern fällbar ist, beweist die Anwesenheit eines (Tlobulins. Über Nachweis und die quantitative Bestimmung siehe bei den Organ- nnd Körperflüssigkeiten (S. 327f.). Fibrinogen ist ein Protein mit (Tlobulineigenschaften. das durch die \Yirkung eines Fibrinfermentes in Fibrin übergeht. Eeindarstellung aus Blutserum nach Haiiniiarsten-) (das klassische Verfahren hat durch Heuhner^) einige Ergänzungen erfahren). Mehrere Liter des frischen, durch Zusatz von 0-3 — 1% Kaliumoxalat oder 0-2 — O-;')"/,, Ammoniumoxalat ungerinnbar gemachten Pferdeblutes werden scharf abzentrifugiert. Das Oxalatplasma bleibt über Nacht bei kühler Temperatur (Kühlraum oder Eisschrank) stehen und wird nach 24 Stunden durch Abhebern und Zentrifugieren von Zellresten und einem sich l)eim Stehen abscheidenden, profermenthaltigen Niederschlag getrennt. (Das Absetzen dieses Niederschlags ist abzuwarten, da sonst keine proferm entfreien Lösungen entstehen!) l'nter Umständen kann das frische Gxalatblut auch sofort durch 1 — 2 stündiges Zentrifugieren von körperlichen Elementen befreit werden. *) 0. Porr/es und ('.Spiro, Die (Tl(>l>uliiie des Blutserums. Hofmeisterfi Beiträge. Bd. 3. S. 277 (1902). -) (). Haiinuarstoi, l'lier die Bedeutuns' der löslichen Kalksalze für die Faser- stoffgerinnung. Zeitschr. f. phys. Cbem. Bd. 22^ S. 333 (18%). ^) W. Heuhner, Die Spaltung des Fibrinogens bei der Fibringerinnuug. Arch. f. exp. Pharm, u. Path. Bd. 49. S. 229 (1903). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. ;i55 Das filtrierte, stark alkalisch reagierende rferdehlutplasma wird (frühestens o — 4 Stunden nach der lUntentnahme) vollständii>' mit kalk- freiem Kochsalz g-esättigt. Das hierbei ausfallende (ilobnlin- und Fibri- nogengemisch steigt an die Oberfläche und wird abfiltrierf. Es wird als- dann in wenig o"/oicC^i' Kochsalzlösung gelöst und mit dem gleichen Vo- lumen gesättigter Kochsalzlösung versetzt (Halbsättigung). Der entstehende Niederschlag besteht aus Rohfibrinogen. Heuhner empfiehlt bei der Halb- sättigung eine strenge Kontrolle des Salzgehaltes mit Hilfe des Aräometers vorzunehmen, um einen Überschuß von Kochsalz zu vermeiden. Ein zu Wenig an fTdlendem Salz ist unschädlich. Der Niederschlag wird dekantiert, filtriert und mit Filtrierpapier al)geprei»t, alsdann in einer 5 — SVoii^en Kochsalzlösung gelöst und durch Halbsättigung mit Kochsalz erneut ge- fäUt. Diese Umfällung wird o — 4mal in gleicher Weise wiederholt, so daß das Filtrat der letzten Fällung nahezu eiweißfrei ist. Die zuletzt gewonnene Kochsalzlösung wird abfiltriert, gut mit Filter- papier abgepreßt, mit Hilfe der noch anhaftenden Salzreste in wenig Wasser gelöst und gegen ganz schwache Natronlauge 2 Tage bei 0" dialy- siert (0-00o% Na OH). Es entstehen so etwa 0-9 Vo enthaltende Fil)i-inogen- lösungen, die nahezu salzfrei sind. Die nicht dialysierten Lösungen enthalten 1 — 2''/o Fibrinogen nel)en 1 — 2Vo Kochsalz und Spuren Kaliumoxalat. Zur Hebung der Ausbeute, besonders aber bei Verwendung von ßinder- blut ist es zweckmäßig (Heuhner), die jeweiligen Niederschläge der Koch- salzhalbsättigung in der S^/oigen NaCl-Lösung durch Zusatz einer Spur von Naa CO3 bei alkalischer Reaktion zu lösen, die erneute Kochsalzfällung aber erst nach genauer Neutralisation dieser Lösungen mit Essigsäure zu vollziehen. Um das L'nlöslichwerden von Fibrinogenanteilen zu vermeiden, darf man die Niederschläge der Salzfällungen nicht unter Wasser stehen lassen. Aus der nahezu salzfreien Lösung kann das Fibrinogen durch Koagu- lieren, d. h. Erhitzen auf 58 — 60" während mehrerer Minuten, oder durch Alkoholzusatz denaturiert dargestellt werden. Zur äußersten Reinigung des Fibrinogens von Fibrinogiobulinbei- mischungen wird die salzfreie Fibrinogenlösung mit dem doppelten Volumen einer gesättigten Natriumfluoridlösung gefäht. Der Niederschlag (gallertig bei Pferdefibrinogen, flockig l)ei Rinderfibrinogen) wird in Wasser, das 0-057o Ammoniak enthält, gelöst. Nach Zusatz von o — 5o/o Kochsalz kann diese Reinigung durch abermaliges Fällen mit Natriumfluorid wieder- holt werden. Aus den NH3-, NaC'l- und NaFl-haltigen Lösungen wird das Fibrinogen durch Erhitzen auf öH — 58° während 5 Minuten auskoaguliert iHuiscamp'^). Alle auskoagulierten Fibrinogene werden mit heißem Wasser. Alkohol und Äther gewaschen und schließlich bei 110'^ zur Gewichtskonstanz ge- trocknet. M W. lltdscawp, Zur Fibrinoglobulinfrage. Zcitschr. f. phys. (bom. Bd. 44. S. 182 (1904). ';\QQ Fr. Samuely. Im alliicineinen wird man für praktische Arbeiten nur die Darstellung reiner Lösungen erstreben. Keindarstelhing nach Bei/e (I.e. S.3ü2, Note 1). Frisches, durch Zu- satz von Natriumfluorid (0-56 — 0'6"/o) wngerinnbar gemachtes Blut wird durch Zenti-jfugieren von Blutkörperchen befreit. 1'2 Teile Plasma werden dann mit .'K) Teilen Wasser verdünnt. Diese Verdünnung ist nötig, um für die folgende Salzfällung das Kollidieren der Fällungsgrenzen von Fibrinogen und Globulin etc. zu verhindern. Zu der verdünnten Lösung fügt man nun 16 Teile einer neutralen gesättigten Ammonsulfatlösung. Der entstehende, sich bald absetzende Niederschlag wird abfiltriert, eventuell aus ö^/oiger NaCl-Lösung in der gleichen Weise mit Am, SO^ neu gefällt und schlieblich auf dem Filter mit einer entsprechend ver- dünnten Ammonsulfatlösung (nicht über ^S^/oi") ^^^^ '^iti^i A'erschwinden der Biuretreaktion im Filtrat gewaschen. Der Filterrückstand, meist ein schneeweiber. flockiger Niederschlag, wird an der Luft getrocknet, bei 80" koaguliert und mit heißem Wasser nahezu salzfrei gewaschen, schlieblich zur Gewichtskonstanz bei 110° getrocknet. Beurteilung: Zur Darstellung ist die alte Methode nach Hammarsten vorzuziehen. Zur (juantitativen Bestimmung relativer Fibrinogenmengen hat sich die Methode von Heye bewähi't. Darstellung von Fibrinogen nach W. HuiseanipJ) Das Pferdeblut wird in l7oi"'P"i Kaliumoxalat aufgefangen und etwa 1/2 Stunde nach der Blutentnahme zentrifugiert. Das noch nicht ganz Idare Plasma wird abgehebert und nach 2 — 27., Stunden abermals zentrifugiert. Wichtig ist, daß die Berührung von Plasma und Formelementen des Blutes nur kurze Zeit andauert. Das klare Plasma wird nun mit dem gleichen \'olumen gesättigter, kalkfreier Kochsalzlösung versetzt. Der entstehende, gallertige Niederschlag wird durch Zentrifugieren während lö Minuten zusammenge])aUt, mit dem Glasstab herausgenommen und mit Filtrierpapier abgepreßt. Nach möglichster Befreiung von Flüssigkeit wird er in Wasser gelöst. Die ihm noch lieigemenaten Salzmeimen genüaen zur Lösunu'. In der neuen Lösung wird die Fällung durch Halbsättigung mit Kochsalz wiederholt. Der jetzt entstehende Niederschlag setzt sich sofort zäh am Boden ab. Man preßt ihn in wenigen Augenblicken am Boden des Gefäßes zusammen, nimmt ihn dann heraus und löst ihn abermals ohne Verlust in Wasser. Auch diese Prozedur wird wiederholt. Schließlich resultiert eine bläuhche, opalisierende Lösung von reinem Fibrinogen. Was die Ausbeuten an Fibrinogen betrifft, so kann man bei schnellem Arbeiten und bei der Verwendung großer Blutplasmamengen zu etwa IVoigen Fibrinogenlösungen gelangen. Die Ausbeute nimmt erheblich mit der Reinigung ab, so daß die Lösungen oft auf einen Gehalt von O'l — O'^^/o ^) W. Hais-camp, Bemerkungen zur Fibrinoglobuliufrage. Zeitschr. f. pliysiol. t'hera. Bd. 46, S. 273 (1905). Darstelluug der I'roteiuc der Tierwelt: Nicht kristallisierliare Proteine. ;\Q1 Fibriiio^oii liorabsiiikoii und selbst dubci noch ?> ö»/,, XaCI als Ascho enthalten. Natüiiich ist aueli die Iveinheit von der Natur des Ansfi-an^s- niaterials abhanuii;'. Fibiänouen aus Transsudaten ist bisher wohl noch kaum oanz lecithintrei darj^estellt worden. Eigenschaften. Fibrinogen hat die allgemeinen Figenschaftcn der (dobuline. Es ist in feuchtem Zustand elastisch, zäh, klumpig zusammen- l)allen(l. Lösungsmittel sind verdünnte Salzlösungen und Alkalien. Fällungs- mittel sind u. a. Kohlensäure und verdünnte Säuren sowie Neuti-alsalze. Die Fällung durch Magnesiumsulfat und Kochsalz ist schon vor Halbsättignng beendet. Die untere Fällungsgrenze des im Plasma gelösten Fil)rinogens gegen gesättigte Ammonsulfatlösung beträgt Vö VI, die obere Sättigungs- grenze 2-5— 2-7 bei Fällung von 2 ctn^ Dlutplasma in dem Gesamtvolum von 10 cw3 Flüssigkeit (Plasma + Wasser + gesättigter Am., SO^-Lösung). Calciumchlorid erzeugt in ganz schwach alkalischer, salzfreier Lösung einen Niederschlag, der in Salzen und im Überschuß des Kalksalzes löslich ist. Reine Fibrinogenlösungen gerinnen nicht spontan, sondern bleiben tagelang flüssig. Die Koagulationstemperatur liegt bei einem Kochsalzgehalt der Lösung von 5— 107o bei 52— 05», bei einem Salzgehalt unter 2Vo bei 56". (,>uantitativ wird es auskoaguliert durch Erwärmen auf öH" während 5 Minuten. Ein Fibrinogen aus Krebsblut koaguliert bei (k')». (>.)i, = —52-5 für Pferdefiln-inogen. (a)D = — 3(5-S für Piuderfii)rin()-en. Als mittlere Zusammensetzung wird angegeben: C 52i)H, II 69, X 16-66. S 1-25, 0 22'26Vo- lJlutserum. auch niederer Tiere, der Chvluslymphe, in einigen Trans- und Exsudaten, im Knochenmark, in lymphoiden Organen und in der Vesicula seminalis des ^leerschweinchens. Qualitativer Nachweis. Auf das A'orhandensein von Fibrinogen kann überall da geschlossen werden, wo Spontangerinnungen von tierischen (Gewebsflüssigkeiten vorkommen, oder wo solche Gerinnungen durch Znsatz von Fibrinferment oder fermenthaltiger Flüssigkeit (frisches Blutserum) zu erzielen sind. Nur die Spontangerinnung von myosinhaltigen Flüssig- keiten kann zu Verwechslungen fiüiren. Für Fibrinogen entscheidet iV^v Fermentversuch und die Koagulationstemperatur. Qualitative Probe durch P^ibrinfermentwirkung. Man prüft zweckmäßig so, daß man eine Probe der Gewebsflüssigkeit oder eines Organextraktes in physiologischer Kochsalzlösung der Spontan- gerinnung überläßt und zu einer anderen Probe eine alicpiote Menge frischen. vom Fibrin durch Schlagen befreiten und filtrierten lUutsei-ums setzt (siehe unten). Die Proben werden bei ;)5o während 12 Stunden belassen und nachher auf das \'orhandensein von Fibrin geprüft. Zur Ausfühi'ung dieser an sich wenig sicheren Probe ist die Anwemlung größerer Mengen Gewebsflüssigkeit (bis zu 100 cm'^) nötig. 368 Fr. Samuel y. Eine zweite Probe liegt in der Prüfung der Koagulations- temperatur. Das Auftreten einer Trübung in der Lösung bei 52 — 55" spricht für das Vorliandensein von Fibrinogen. In nicht zu komplizierten Eiweiligemischeu ist die Probe verwertbar, natürlich unter Anwendung aller Kautelen, die einer Kojgulationstemperaturbestimmung die (Objektivität garantieren (siehe hierzu S. -'U*)). Die Methode der DarsteUung nach Heye gestattet auch den Fibrinogen- nachweis im Blutserum. Fibrin ist ein wasserunlösliches Umwandlungsprodukt des Fibrinogens und entsteht aus diesem unter dem EiiifluL) des Fibrinfermentes. Darstellung von Piohfibrin aus P)lutplasma. .Vis Ausgangs- material wählt man große Mengen frischen Pferdel)lutes. Für die Isolierung möglichst zellfreien, reinen Fibrins empfiehlt sich die Verarbeitung von fibrinogenhaltigen Transsudaten oder von Oxalatplasma. aus dem man die Oxalsäure mit Ca-Salzen entfernt. Während des Gerinnungsprozesses werden größere ^Mengen frisch aufgefangenen Blutes mit einem rauhen Holzstabe, Fischbeinstäben oder einem Drahthaarpinsel energisch geschlagen. Das Fibrin scheidet sich dabei als fadige, elastische Strähne ab. Mit der Fortdauer dieser Prozedur wird es immer fester und kohärenter. Schließlich entfernt man die Fibrinmassen, die sich um das Instrument, mit dem man das Schlagen bewirkt hat, aufgewickelt halben, manuell und extrahiert sie unter häufigem Umrühren und Durchkneten tagelang mit großen Mengen häufig eiiieuerten Wassers. Mit zunehmender Beinigung und Entfärbung wird das Fibrin schneeweiß, verliert aber unter Quellung erheblich an Elastizität. Der ersten Extraktion mit Wasser läßt man eine Extraktion mit physiologischer und mit lO^/oiger Kochsalzlösung folgen. Hierauf extrahiert man ai)ermals mit Wasser und schheßlich 3 Tage lang mit 0'02''/o Ammoniak (zur Befreiung von Fibrinoglobulin!). Die ganze Fibrindarstellung muli bei niederer Tempera- tur vorgenommen werden, um Fäulnisprozesse zu vermeiden. Für A'erdauungsversuche kann man das Bohprodukt des Fibrins ver- wenden. Zum Zweck der Beindarstellung al)er müssen alle Extraktionen peinlich durchgeführt werden. Zuletzt denaturiert man durch Behandeln mit Alkohol oder durch Erhitzen auf 75 o, wodurch das Fibrin an Dehn- barkeit und Diaphanität seiner Farbe verliert. Man verdrängt zuletzt den Alkohol mit Äther und trocknet im ^'akuum. Bein dar st eilung kleiner Fibrin mengen \\vi.c\\ Heuhner (I.e. 8.364, Note 3). Man fängt das Pferdeblut in soviel Kochsalzlösung auf, daß eine Lösung von OO^/o Blutplasma mit 4% Kochsalz entsteht. .Alsdann werden die Blutkörperchen durch energisches Zentrifugieren beseitigt. Man ver- dünnt nun mit Wasser derart, daß ein (Terinnungsoptimum hergestellt wird. Alsdann versetzt man die Lösung mit soviel Ammoniak, daß die Lö- sung einen NHo-Gehalt von O'00140/o gewinnt und rührt das Ganze sofort mit dem mechanischen Bührer im kalten Kellerraum durch. Nach 48 Stunden ist die Gerinnung beendet. Die Fibrinfäden finden sich um das Piührwerk Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. -iö^J gewickelt, von dem sie leiclit mechanisch entfernt werden können. Sie werden hierauf fein zerschnitten, mit lOo/oiger Kochsalzlösung- bis zum Verschwinden der Biuretreaktion gewaschen, mit Wasser salzarm gewaschen und bei 110° getrocknet. Ebenso reines Fibrin läiJt sich natürlich durch Zusatz von Fibriu- ferment oder fermenthaltigem Material zu den oben beschriei)enen Fibri- nogeulösungen darstellen. Es scheidet sich dann das Fibrin in feinen Fäden al), die sich leicht am Glasstab fixieren lassen und dann kurz mit verdünnter NaCl-Lösung oder direkt mit heißem Wasser und Alkohol und Äther behandelt werden. Beurteilung: Keine der eben genannten IsoHerungsmethoden garan- tiert die Gewinnung eines unveränderten Fibrins im strengsten chemischen Sinne. Die ausgedehnten Extraktionen zur Befreiung von morphologischen Elementen oder von Fermenten liedingen zumeist eine partielle Dena- turierung des Fibrins oder eine Spaltung, sind also nicht absolut indifferent. Eigenschaften. Fibrin steht in seinen Löslichkeitsverhältnissen den koagulierten Eiweißkörpern sehr nahe, unterscheidet sich aber von ihnen durch seine relativ leichte Veränderlichkeit durch Salzlösungen. Die Eigen- schaften der Elastizität und des physikalischen Verhaltens sind von dem Aggregatzustand, d. h. von seiner Dichte außerordentlich abhängig. Mit Salzbehandlung oder Alkoholbehandlung geht die Elastizität unter gleich- zeitiger Schrumpfung verloren, im Kontakt mit AVasser kehrt sie partiell unter Quellung wieder. In HCl oder Na OH quillt Fibrin gallertig auf. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Änderung der äußeren physikalischen Eigen- schaften die Begleit- oder Folgeerscheinung einer chemisch molekularen Veränderung des Fibrins ist. Mittlere Elementarzusammensetzung: C 52-68, H6-83, N 16-91. SMOVo- Koagulationstemperatur 75 ". Qualitativer Nachweis. Niederschläge in Gestalt von Fetzen oder Flocken, die in Gewebsflüssigkeiten vorkommen, werden durch Aufschlemmen in Wasser und Waschen mit 5 — lO^oig'^r thymolisierter Kochsal^dösung von anderen Proteinen befreit. Man prüft dann das Verhalten gegen 0-1 "/o Salzsäure (Quellung!) oder die leichte Verdaulichkeit durch Pepsinsalzsäure (Magensaft). In der Wärme geht der Körper zum Teil in eine Lösung, welche die Eiweißfarbenreaktionen gibt, über. 4. Fibrinoglobulin galt bald als ein im Blutplasma präformiertes Glol)ulin, bald als ein aus dem Fibrinogen beim Übergang in Fil)rin neben diesem entstehendes Protein (Schmiedeberg , Heuhner). Mit allergi'öl.Uer Wahrscheinlichkeit besteht die erstgenannte x\uffassuug zurecht (vgl. 1. c. S. 364. Note 3, S. 365, Note 1 und S. 366, Note 1 ). Das Fibrinoglobulin findet sich im Serum. Wegen seiner gleichen Eigenschaften gegen die fällende Wirkung von Kochsalz ist in allen nach HaiHinnrsten aus Blutplasma bereiteten Hbrinogenlösungen das gesamte Fibrinoglobidin des Plasmas enthalten. Die Trennung beider Körper mit Abderhalden, Handbxicli der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 24 370 Fr. Samuely. Hilfe der Fällung- durch Xatriiimfluorid (vgl bei Fibriiiog-en) gelingt nur inso- fern, als man giobidinfreies Hbrinogen darstellen kann, aber kein fibrinogen- freies Globulin, da die Fallung des Fibrinogens mit NaF keine quantitative ist. Darstellung von Fibrinoglobulin aus Fibrinogenlösungen nach Hammarsten.^) ]\lan löst das genuine Fibrinogen in verdünnter Koch- salzlösung und l)ringt dasselbe durch Zusatz von Ferment oder ferment- baltiger Lösung oder auch durch partielles Erwärmen auf 5(3" als Fibrin- bzw. Fibrinogenkoagulat zur Ausfällung. Das Filtrat dieses Niederschlags enthält das Fibrinoglobulin, das man entweder durch weiteres Erhitzen der Lösung auf 64" in denaturierter oder durch Sättigen der Lösung mit Kochsalz in genuiner Form zur Abscheidung bringt. Statt Kochsalz kann man auch Ammonsulfat verwenden. Die P'äUungsgrenze des Fibrino- giobulins liegt bei SS^/o Salzsättigung. Die Fällung wird in der für Globu- line üblichen Weise gereinigt (Umfällung, Dialyse, Alkoholfällung). Die Darstellung aus spontan von Fibrinogen befreiten Lösungen, d. h. aus Blutserum, erfolgt in ganz derselben, eben beschriebenen Weise. Die Elementaranalyse ergab die Werte: C 52-70, H6-98. X 16-06 Vo- Koagulationstemperatur 64 — 66*'. Der qualitative Nachweis ergibt sich aus den hier geschilderten Darstellungsmethoden. Die Koagulationstemperatur von 64 — {')'6^ ist für das fibrinogenfreie Fibrinoglobulin charakteristisch, natürlich nur dann, wenn die in Frage kommende Eiweißlösung frei von Muskeleiweißkörpern ist. Da aber Fibrinoglobuhn stets neben Fibrinogen vorkommt, so ül)er- zeugt man sich zuerst von der Anwesenheit des letzteren durch einen Fermentversuch mit reinem Fibrinferment. 5. Nukleoproteid aus Blutserum. Ein von Pekelharinr/ im Rinderblutserum entdecktes Nukleoproteid wird heute zweckmäßig nach Angaben von Huiscan/p'-} oder von Lieher- meister ^) isohert. Der Körper scheint mit einem Proteid identisch, das Freund und Joachiw (1. c. S. 361, Note 1) bei der Aufteilung der Serum- globuline von Mensch, Pferd und Pvind fanden und als Nukleoproteid bezeichnen (vgl. hierzu Serumglobulin, S. o57f.). Zur Darstellung dieses Körpers müssen große Mengen Serum ver- Avendet werden, da derselbe normalerweise höchstens zu 0-15 — 0-2Voo ^^ ihm enthalten ist. 1 Volumen Kinderblutserum wird mit 2 Volumen Wasser verdünnt und alsdann mit verdünnter Essigsäure bis zu deutUch saurer Reaktion versetzt. ') 0. Hammarsten, Weitere Beiträge zur Kenntnis der Fibrinbildimg. Zeitschr. f. : phys. Chem. Bd. 28. 8.98(1899). — Derselbe, Über die Bedeutung der löslichen ' Kalksalze für die Faserstoffgerinnung. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 22. S. 333 (1896). — , Ferner Mahjs Jahresb. 1882. S. 11. " \ -) W. Huiscamp, tJber die Eiweißkörper der Thymusdrüse. Zeitschr. f. physiol. i Chem. Bd. 32. S. 191 (1901). " ' '\ *) G. Liebermeister, Über das Nukleoproteid des Blutserums. Hofmeisters Beiträge. , Bd. 8. S. 439 (190G). Darstellimg der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbarc Proteiue. ;^^]^ Der entstehende flockige Niederschlag, bestehend aus Globulin und Nukleo- proteid. wird nach dem Absetzen dekantiert und auf ein Filter gebracht. Alsdann wird der Filterrückstand mit möglichst wenig Ammoniak in Wasser gelöst. Nach dem Filtrieren dieser das Proteid enthaltenden Lösung wird durch Zusatz einer Lösung von Calciumchlorid eine Fälkmg erzeugt. Der entstehende Niederschlag wird auf ein Filter gebracht, mit Wasser nach Zusatz von 2 Tropfen Ammoniak gelöst, filtriert und nochmals mit Calcium- chlorid gefällt. Der jetzt entstehende Niederschlag wird auf dem Filter mit Alkohol so lange gewaschen, bis der abfließende Waschalkohol kein Calciumchlorid mehr enthält. Hierauf bringt man den Niederschlag unter Äther und läßt ihn schließlich lufttrocken werden. Das so dargestellte Proteid enthält l-853"/o Asche, OtioO^/o Kalk und nur wenig Phosphor. Ol) der Körper ganz rein von Globulinbeimischungen darstellbar ist, bleibt zweifelhaft. Er ist wie durch CaClg auch durch BaCl.^ und MgS04 fällbar. Ln Überschuß des Ca Cl, ist er nicht ganz unlöslich, daher ist bei der Fällung mit diesem Salz ein Überschuß zu vermeiden. Methode nach Liehermeister. '^) Je 1 / Pferdeblutserum wird mit 20 / Wasser verdünnt. In diese Lösung wird Kohlensäure eingeleitet. Es entsteht eine Trübung, die sich bald zu Boden setzt. Sie besteht aus Euglobulin und dem gesuchten Nukleo- proteid. Man hebert die über dem Bodensatz stehende Flüssigkeit ab, zentrifugiert den feuchten Niederschlag in flachen Zentrifugiergläsern scharf ab. Nun setzt man zu dem am Boden des Gefäßes befindlichen Nieder- schlag vorsichtig die öfache Menge einer lo/gigen Kochsalzlösung unter Überschichtung zu und läßt ruhig stehen. Meist nach (> Stunden ist der größte Teil des Niederschlags (das Globulin) in Lösung gegangen. Nach vorsichtigem Abgießen dieser Lösung hinterbleibt ein glasiger, schleimiger fadenziehender Bodensatz. Dieser wird in P/giger Kochsalzlösung nach Zusatz einer ausreichenden Spur von Natriumkarbonat gelöst, und aus der Soda- lösung mit wenig verdünnter Essigsäure gefällt. Nach einigem Stehen wird der flockige Niederschlag al)filtriert, auf dem Filter durch Übergießen mit absolutem Alkohol koaguliert und schließlich mit heißem Wasser ge- waschen. Nachdem der Filterrückstand lufttrocken ist, wird er im Soxhlet- apparat zur Befreiung von Fett und Cholesterin 12 Stunden lang mit Alkohol und mehrere Tage mit Äther extrahiert. Die Behandlmig mit Äther ist so lange fortzusetzen, bis eine Probe des Ätherextraktes keinen phosphor- haltigen Bückstand mehr hinterläßt. Dann folgt eine zehnstündige Extraktion mit Chloroform und Trocknen bei 100». Die Ausbeuten betragen etwa 2*5 (^^ aus 15/ normalem Blutserum des Pferdes. In pathologischen Fällen (septische Eiterungen) kann die Aus- ') G.Liihprmehter, Über das Nukleoproteid des Blutserums. Hofmeisters '^c'xirÄgQ. Bd. 8. S. 439 (19U6). 24* 372 Fr. Samuely. beute auf 20/00 steigen. Die krankhaften Vermehrungen des Proteidgehaltes sind noch nicht eingehend studiert Avorden. Eigenschaften: Der Körper hat im allgemeinen die Eigenschaften eines Nukleoproteids. Er ist löshch in Soda und fixen Alkalien soväe in einem großen Überschuß von Essigsäure. Er ist unlöslich in Wasser, P/f.iger Kochsalzlösung und verdünnter Essigsäure. Seine Zugehörigkeit zu dieser Gruppe der Proteide ist weniger durch seinen relativ niederen Thosphor- gehalt, als durch den (lehalt von Nuklein- bzw. Purinkörpern bewiesen. Diese werden durch Behandeln mit kochender 10"/oiger Salzsäure während 4 Stunden abgespalten und sind mit ammoniakalischer Silbernitratlösung fällbar. Von den Eiweißfarbenreaktionen fehlt die Reaktion nach Hopkins- AdomJdewicz. Die mittleie Elementarzusammensetzung wurde gefunden zu: C 51-65, H 7-24, N 13-88, P 0-079, S etwa PO^, Asche O^SHO/V Das Nukleoproteid im Blutplasmaniederschlag (Bang^). ^lan zentrifugiert Blut (am besten Pferdeblut), dem man O-o^/o Aramoniumoxalat zugesetzt hat. Das Plasma wird abgetrennt und filtriert. Nach 48stiindigem Stehen im Eisschrank hat sich ein Niederschlag gebildet, der durch Zentrifugieren gesammelt wird. ^lan löst denselben nach Mög- lichkeit in Wasser — ein Teil bleibt ungelöst — , filtriert und gewinnt durch Zusatz von Ca CL oder wenig verdünnter Essigsäure eine reichhche Fällung. Dieser entstehende Säureniederschlag wird abzentrifugiert, in wenig O-OP/oiger Natronlauge gelöst. Die meist zuerst schleimige Lösung wird nach einiger Zeit klar und dann flüssig unter Zusammenballen des Niederschlags als Schleimflocken. Diese Flocken wickelt man um einen Glasstab und löst sie in 0-5°/oig*ei' H Cl. Dabei geht ein Teil durch Spaltung des ursprünglichen Nukleoproteids in ein lösliches Album inat in Lösung. (Die Identifikation desselben vergleiche bei Thymusproteid.) Inwie- weit dieser Körper im Plasma oder Serum präformiert ist, ist nicht entschieden. Jedenfalls dürfte er mit dem Proteid Liebermeisters nicht identisch sein. Der beim Stehen ausfaUende Niederschlag- ist sehr reich an Prothrombin (vgl. hierzu Darstellung von Fibrinogen und Fibrinferment). 6. Serum mukoid nach Zanetti.-) 1200 c*» 2 Blutserum vom Rind wTrden mit 2 Volumen einer l-5*^'/oigeu Kochsalzlösung versetzt. Aus dieser Lösung entfernt man das Albumin und Globulin durch Auskoagulieren in der Hitze nach Zusatz der geeigneten Menge Essigsäure (vgl. Kapitel: Enteiweißung). Das klare Filtrat wird im Vakuum bis 45" auf ein kleines Volumen eingedampft und mit Alkohol gefällt. Der entstehende, etwas gefärbte Niederschlag wird wiederholt auf dem Fdter mit Alkohol und Äther ausgewaschen, bis er nahezu farlilos ist. ^) J. Bang, Chemische Untersuchungeu der lymphatischen Organe. III. Mitteilimg. | Hofmeisters Beiträge. Bd. 4. S. 362 (1904). j ^) C. U. ZcDH'ffi, Über das Ovomiikoid und über ein neues Glykoproteid des Blut- i Serums. Ann. di Chini. e di Farm. Yol. 26. p. 12 (1897j. — Vgl. hierzu auch //. W. Bij- \ waters, Über Seromukoid. Biochemische Zeitschr. Bd. 15. S. 322 (1909). Dai^tolliuig der l'roteiuc der Tierwelt: Nicht kristallisicrliaro Prott'iiio. .';7,", Dann liist man wu-dcr in Wasser und ilialysicrt die Lösunii" ^m'^-cm laiifciidcs und iiciicn dostillici'tcs ^Vasst'l•. l)as I)ialysat cni^t man wicdci- auf oiii kleines \'()lumcn ein und fällt mit Alkohol. Lösunji: und Fiilluny' die>cr Art worden ;> — 4nuü wiedei'liolt. I»er zuletzt ahfiltrierte Niedersclilaü" wird im Vakuum über Sclnvefelsäure itetroc'knet. hei' resultierende Körper ist ein meist noch LidMichc- uml Iricht liyiiroskopisches Pulver. Elementarzusammonsetzunii' C4T-()0. II Tlo. N I2-1):;. S 2-;')S. Asche O^S^/o- (tjber die Eiüenschaften vi>l. Kai)itel Mucinsuhstanzen.) Methoden zui- <|uantitativen Bestimmuiii'' der hiri- <):enann- ten Proteine im Hlutseiiim und in andeicn serösen und eiweiCihaltii^cn Flüssiukeiten. Da es sich bei den foluendeu Methoden im wesentlichen um die P»e- stimniuna' von (Globulinen neben Ali)uminen handelt, so sind die am lllut- serum als brauchbar erpi-obten Methoden auch für andeiv Proteinlösuu^cn anwendbai'. also für Transsudate und Exsudate oder eiweüihal- tigen Harn. 1. P>estimmunj? des Gesamteiweißsjehalts duich direkte "Wäpunii: Man fällt das Eiweiß aus einer abgewogenen oder abiuemessenen Blutserum- oder P)Uiti)lasma menge, (20 — 50 cm^) die durch Zentrifugieren und Filtrieren vollkommen geklärt ist. mit dem 4fachen Volumen .\lkohol aus. läl'tt die Mischung mehrere Stunden stehen und bringt dann den Niedei-schlag^ auf ein trocken gewogenes, aschefreies Filter. Auf dem Filter wäscht man mit heißem Alkohol. Äther, dann wieder mit Alkohol und zuletzt mit kochen- dem Wasser sorgfältig- aus. Dieser Filterrückstand enthält die in Was.ser bzw. Alkoliol unlöslichen Proteine und Salze, bisweilen Spuren von Farl)- stoffen. Man entfernt die letzten AVasserspuren durch Xachwasi-hen mit Alkohol und trocknet im Wärmeschrank (Temperatur bis auf 120" gestei- gert). Nachdem man g:ewogen hat. verascht man und zieht die nach der Veraschung verbleibende Aschemenge von lU'Ui < lewicht ih'> Filteri'ück- standes ab. L)er gefundene Wert bezeichnet die Proteinmenge. {Kleine Mengen Proteine gehen nicht selten beim Auswaschen in die wässerig alkoho- lische Lösung über, weshalb der hier gefundene Wert etwas zu klein ausfällt.) PeintriliiiiL: : Diese Methode der Alkoliolfällung gestattet die Be- stimmung auch der unkoagulablen Proteine, also der Mukoide. Nukleoproteide und einiger Albumosen. Ist man durch qualitative \'orproben darüber orientiert, daß die in Frage kommende eiweißhaltige Lösung, z. I!. Harn. albumosenfrei ist. so kann man das (iesamteiweiß auch durch Koagulieren nach einer der auf S. -M)) und .")T4 angegeltenen Methoden bestimmen. 2. <,>uantitative Bestimmung der koagulablen i'roi.inc (Albumin + (ilobnlin + Fibrinogen im Srrnni. .Vlbumin - (ilobnlin im llain) in seröx'ii Flüssigkeiten. Man eihitzt öO 100 cm-' Was.«^er in einer Porzellanschale oder in einem Becherglas zum gelinden Kochen und läßt aus einei- Pipette lö- 20 cni^ der zu untersuchenden, klar filtrierten Flüs- siukeit lan<2sam in die kochende Lösunu zuflielien. Dann erhält man einige 374 Fr. Samuoly. Minuten im Sieden, wiihi-end dessen man solange aus einer Kapillarpipette verdünnte Essigsäure zuflieljen läßt, bis die Gerinnung grobflockig und die Flüssigkeit klar erscheint. Bei diesem Sieden der Lösung hat man sorg- fältig darauf zu achten, daß nicht Koagulate am Boden haften und etwa festkleben und verbrennen können. Man kann, um dies zu vermeiden, den Säurezusatz auch vornehmen, während die Fällungsmischung auf dem kochenden Wasserbad steht. Bisweilen gibt sich der Punkt der ([uautitativen Ausflockung, d. h. der Punkt des optimalen Säuregehaltes auch daran zu erkennen, daß sich der Niederschlag plötzlich in Form einer gröberen Flockeumasse zu Boden senkt, ^lan filtriert alsdann noch heiß auf ein trocken gewogenes, aschefreies Filter, indem man zugleich Sorge trägt, daf) die Koagulatflocken nirgends am Glas antrocknen können, (ribt das klar ablaufende Filtrat noch eine deutliche Fällung mit Ferrocyankalium und Essigsäure, so ist die Bestimmung zu verwerfen. Man führt dann besser eine neue Bestimmung aus. Ist die Flockung gut gelungen, so mul') das Filtrat leicht und wasserklar ablaufen und darf nicht schäumen. Den Filter- rückstand wäscht man gut mit heißem Wasser, heißem Alkohol und Äther aus und trocknet zur Gewichtskonstanz Ijei 120". Dann verascht man und bringt das Gewicht der Asche von dem Gewicht des getrockneten Nieder- schlages in Abzug. Die Bestimmung in serösen Flüssigkeiten geschieht in der gleichen Weise. 3. Quantitative Bestimmung von Albumin und Globulin im Blutserum und in serösen Flüssigkeiten (S. o61, Note o). Man mißt oder wiegt 20 — 50 nn'-^ klarer Flüssigkeit ab und fügt zu derselben das gleiche Volumen einer neutralen, gesättigten Ammonsulfat- lösung hinzu. Nach einstilndigem Stehen hat sich der gebildete Nieder- schlag abgesetzt. Längeres Stehenlassen erleichtert die folgende Filtration. Nunmehr filtriert man durch ein aschefreies, gewogenes Filter (juantitativ ab und wäscht der Filterrückstand solange mit dieser halbgesättigten Ammonsulfatlösung aus, bis eine kleine Probe der abfließenden Flüssigkeit keine Trül)ung mit Ferrocyankalium + Essigsäure gibt. Der Niederschlag enthält die Globuline und eventuell bei Verarbeitung von Plasma Globu- line + Fibrinogen. Das gesamte Filtrat enthält das x^lbumin. Aus dem Filtrat fällt man das x\lbumin, indem man die Lösung zum Sieden erhitzt und mit Essigsäure in der sub 2 beschriebenen Weise fällt. Die Weiterverarbeitung (Filtration, Auswaschen mit heißem Wasser, Entwässern, Trocknen, Wägen, Veraschen, Wägen) geschieht ganz in der dort beschriebenen Weise. Der Globulinniederschlag wird einige Zeit zur Koagulation auf 110° im Lirttbad erhitzt, dann mit kochendem Wasser von Salzen, mit Alkohol von Wasser und mit Wasser von Alkohol befreit. Hierauf trocknet man bei 120° im Luftbad zur Gewichtskonstanz, verascht quantitativ und zieht den gefundenen Aschewert von dem Wert des getrockneten Nieder- schlages ab. Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. ;-375 Führt man diese Bestimmimg am eiweißhaltigen Harn aus, so ver- wendet man 50 — 100 cm^ klar filtrierten Harn, den man vorher mit ver- dünntem Ammoniak bis zum Verschwinden der sauren Reaktion versetzt hat. Im übrigen befolgt man die vorangehenden Vorschriften. 4. Bestimmung von Fibrinogen, Albumin und (Jlobulin im Blutplasma 1) (1. c. S. 362, Note 1). Frisch aus dem Gefäß entnommenes Blut läßt man in ein mit S^/oiger Fluornatriumlösung beschicktes Gefäß laufen. Man verwendet soviel der Salzlösung, daß eine 0'5 — O'ßVoi&e Fluornatriumplasmalösung entsteht. Statt dieses frischen Plasmas kann natürlich auch etwas Oxalatplasma ver- arbeitet werden. 100 cm^ des Fluoridplasmas werden mit 2o cm'^ destil- hertem Wasser und lo"4 cni^ gesättigter neutraler Ammonsulfatlösung ver- setzt. Der sich beim Stehen in der KiUte bald abscheidende Fibrinogen- niederschlag wird auf ein gewogenes Filter quantitativ aljfiltriert (Fibri- nogen l). Der Niederschlag wird mit entsprechend verdünnter Ammon- sulfatlösung solange gewaschen, bis das Filtrat auch keine Spur einer Trül)ung beim Zusatz von Essigsäure + Ferrocyankalium und keine mit Barvumchlorid nachweisbare Schwefelsäure mehr enthält. Der dann mit Alkohol und Äther nachgewaschene Niederschlag wird bei 105'' zur Ge- wichtskonstanz getrocknet und gewogen. Das Filtrat des Fibrinogens, mit allen Waschwässern vereinigt, wird nun mit soviel gesättigter Ammon- sulfatlösung versetzt, daß das Gesamtvolumen eine Halbsättigung mit Am- monsulfatlösung erhält. (Über die Berechnung bei der Verwandlung einer Sättiguuü' von ~ iu eine solche von I^-Sättigung siehe Seite ?)bb.) Das bei b bi der Halbsättigung ausfallende Globulin wird, wie sub 3 beschrieben, ver- arbeitet und schließlich gewogen. Das im Filtrat der Globuline l)leil)ende Albumin wird nach dem sub 2 geschilderten Verfahren auskoaguliert und zur Wägung vorbereitet. Beurteilung: Ob diese Art der Fibriuogenbestimmung eine (luantita- tive ist, bleibt vorläufig unentschieden. Jedenfalls aber gibt sie bei mehreren Reihenversuchen relative Zahlenwerte. Die Methode ist außei- für Blut- plasma auch für vergleichbare Organ- und Knochenmarkextrakte anwendbar. 5. Isolierte Fibrinogenbe Stimmung. Man bringt die aus dem Fibrinogen durch Fibrinferment gebildete Fibrinmenge zur Wägung und setzt den gefundenen Fibrinwert als Näherungswert der vorhandenen Fibri- nogenmenge gleich. Als fibrinfermenthaltige Lösung benutzt man frisches Blutserum, das man aus Blutplasma durch Schlagen von Fibrin befreit. Von dem aus- geschiedenen Fibrin filtriert man durch ein Leintuch ab und zentrifugiert zur Klärung. Nun setzt man zu 50— lOOc///^ der fraglichen fibrinogen- haltigen Flüssigkeit, die man in ein Becherglas genau abmißt, die gleiche 1) L. Langstci» und .U Mai/cr, Über das Vorhalten der Eiweißkörper des Blut- serums bei experimentellen Infektionen. Hofmeisters Beitr. Bd. 5. S. G9 (1904). 376 Fr. Samuel)'. Menge dieses frischen ferraenthaltigen Blutserums. Zugleicli stellt man mehrere Kontrollproben mit steigenden Mengen des Serumzusatzes an, um in jedem Fall auch zur Fibrinl)ilduug ausreichende Fermentmengen zu- zusetzen. Nachdem man die Mischung 24 Stunden bei 20 — 30** belassen hat, bringt man durch Schlagen mit einem Glasstab das ausgeschiedene P'ibrinnetz zum Zusammenballen, sammelt den Niederschlag auf einem ge- wogenen Filter, wäscht dann aufeinander folgend mit P/oiger Na Cl -Lö- sung, Wasser, heißem Alkohol und Äther und trocknet vor der Wägung bei 1200 2ur Gewichtskonstauz. Die Fibrinmengen müssen in den verschiedenen Kontrollproben die gleichen sein, wenn die Fibrinogenumwandlung wirklich quantitativ abge- laufen ist. 6. Quantitative Bestimmung von Fibrin aus Blutplasma und Blut. In ein kleines Becherglas von 100 cm^ Inhalt reicht ein ruderförmiges Fischbeinstäbchen, das durch eine das Becherglas abschließende Gummikappe durchgesteckt ist (Fig. 41). Das so vorbereitete Glas wird trocken gewogen. In dasselbe fängt man direkt aus dem P>lutgefäß 10 bis 40 cni^ Blut auf. Zur Bestimmung in Plasma wird eine abgemessene Menge des auf Eis aufbewahrten Plasmas verwandt. Nach vollständigem Verschluß mit der Kaut- schukkappe schlägt man das Blut etwa 10 Minuten lang durch schnellende Bewegungen des Fischbein- stäbchens , natürlich ohne Lockerung des die Ver- dunstung verhindernden Kautschukverschlusses. Nun- mehr wird der ganze gefüllte Apparat zur Bestimmung des Blutgewichts kalt gewogen. Hierauf öffnet man und füllt das (jlas fast vollständig mit Wasser an, rührt kräftig um und wartet, bis sich die Fibrinflocken zu Boden gesetzt haben. Hierauf gießt man das über- stehende Wasser vorsichtig ab, ersetzt es durch neues, dem einige Tropfen Kochsalzlösung zugesetzt sind und rührt aufs neue gut um. Nach dem Ab- setzen trennt man die oberen klaren Flüssigkeitsmengen wiederum durch Abgießen und fährt mit diesem Dekantieren solange fort, l)is das Fibrin hell und vor allem die über ihm stehende Flüssigkeit fast farblos geworden ist. Erst dann spült man das Fibrin (luantitativ auf ein kleines gewogenes Filter. Die an dem Stäbchen haftenden Fibrinfasern werden mit einer Pinzette gleichfalls auf das Filter übertragen. Dann wäscht man das Fibrin mit NaCl-haltigem Wasser bis zur Farblosigkeit oder nur noch Hellrosa- färbung, übergießt dann zur Entfernung von Fetten und Extraktivstoffen mit siedendem Alkohol und Äther und trocknet das Ganze bei 110—120". Nach dem Trocknen und Abkühlen im Vakuum wägt man. Fif?. 41. Darstelluiiir ült riuteine der Tierwelt: Xiclit kristallisicrbare Proteine. .j t ( Yerarbpilet man das lilut von \'öiieln, Amphibioii oder FischeiK so venvondet man als Waschflüssigkeit besser eine 1— o^/oige Lösung von Xatrinmsulfat an Stelle einer Kochsalzlösung. P)enrteilnng: Die Methode liefert nur Annäherungswerte, ist aber zur Iiestimmung relativer Fibi-jnmengen gut verwertbar. Sie liilit sich bei richtigem Waschen durch ergiebiges Dekantieren, von der Ti-ocknungszeit abgesehen, in wenigen Stunden l)eeuden. Die Resultate werden nicht durch das Phänomen der Fibriuolyse fehlerhaft beeinflußt. IL Die Eiweißkörper des Vogeleies. Im Weißen des Hühnereies kommen voi': Ovalbumin. Konalbumin, Ovoglobulin und Ovomukoid. Im Gelben des Eis, d. h. im Eidotter, sind vorhanden die Vi teil ine. Als Eihülleu kommen vor: Albumoide (Ovokeratin) un'l Mukoide. Proteine des Eierweißes: 1. Ovalbumin vgl. das Kapitel der kristallisierenden Proteine, S. ;\:\?). Die Menge beträgt etwa öO'^/o der Eiweißproteiue. Konalbumin. Mit diesem Namen bezeichnet man ein nicht kri>talli- sierendes Albumin, das angeblich ein vom Ovalbumin verschiedenes Albumin sui generis darstellt. Darstellung aus Eierweiß {Längstem^). Man verwendet die Mutterlaugen des durch Kristallisation abge- schiedenen Ovalbumins. Zu diesem Zweck befreit man Eierklar durch Schlagen von seinen Membranen und versetzt das klare Fütrat mit dem gleichen ^'olum einer gegen Lakmoid absolut neutral reagierenden, gesättigten Ammonsulfatlösung. Man filtriert von dem Niederschlag, der das Ovoglobulin enthält (siehe unten), ab und kristallisiert aus dem Filtrat das Ovalbumin nach einer der vorbeschriebenen Methoden aus. Nachdem sich aus der Mutterlauge auch nach Wochen keine Albuminkristalle mehr alischeiden. wird die filtrierte Lösung gegen fließendes Wasser bis zur fast vollständigen Entfernung der Schwefelsäurereaktion dialysiert und hierauf bei öO — (jO" auf dem Wasserbade erhitzt. Hierbei scheiden sich die Peste von Albumin aus, die aus unbekannten Gründen der Kristallisation entgangen sind. Nach dem Abfiltrieren derselben erhitzt man die Lösung höher bis auf 90" und erhält das Koagulat des Konalbumins. Dasselbe wird abfiltriert, tagelang bis zum \'erschwinden der Schwefelsäurereaktion und dem \"er- sageh einer Phosphorwolframsäurefällung im Filtrat mit heißem Wasser gewaschen und schlieCilich bei 110" getrocknet. Nach anderer .Methode haben Oshor)it und ('(implidV-) ein Konalliumin dargestellt. ') L. Laiif/sfriii, Über die gerinnbaren Stoffe des Kieriilars. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. 82 (r.JU2). '■') Th. B. Oshonir und (i. F. CanipheU, Die Proteinbestandteile des Eierei weißes. Journ. Amer. Chem. Soc. Vol. 22. p.422 (190Ü). — Rep. Connecticut Agriciilt. exp. Station. Vol. 23. p. 348 (1900). 378 Fr. Samuely. Beurteilung: Ob dieser Körper ein einheitliches spezifisches Protein darstellt, ist unbestimmt. Es besteht immer die Möizlichkeit. daß Beimen- gungen eines dritten, ovomukoidartigen Körpers die KristalUsation dieser P'raktion verhindern, seine veränderte Salzfallbarkeit, spezifische optische Drehung und seine verschiedene Elementarzusammensetzung bedingen. Zusammensetzunff des Ovalbumins, n er at o / m-. kristallisiert Oshorne und Camphell 52-82 7-03 15-32 1-59 — 29— ;-iO<> Lcmystein 52-46 7-19 15-29 l-r.4 des Konallminiiis Oshorne und Camphell 52-25 6-i»9 1(3-11 1-70 — o6— o9'^ Lanystcin 52-2o 6-9(3 15-98 r75 2. Ovolglobulin. 1. Darstellung nach Lrtwy.sft'f;?. ') Eine filtrierte Eierklarlösung, die vorher durchschlagen von Membranen befreit ist, wird mit dem gleichen Volumen gesättigter, neutraler Ammon- sulfatlösung versetzt. Nach kurzer Zeit filtriert man den entstehenden Niederschlag ab, löst ihn in einer verdünnten Salzlösung und reinigt ihn durch mehrfach wiederholtes Ausfällen mit dem gleichen Volumen gesättigter Ania SOj-Lösung aus solcher Lösung. Diese Umfällungen führen zu großen Verlusten, da ein Teil des Glolnilins sehr bald in verdünnten Salzlösungen unlöslich wird und dann beim Filtrieren sehr hindernd wirkt, ^lan behilft sich daher mit Zentrifugieren. Der unlöshche Globuliuanteil ist bis jetzt nicht genauer untersucht. Er stellt möglicherweise kein besonderes Globubn, sondern nur ein ver- ändertes Glol)ulin dar (vgl. hierzu bei Serumglobuline). Der lösliche, mehrfach umgefällte und so gereinigte Anteil des Gesamt- ulol)ulins wird mit Alkohol aus seiner Lösung auskoaauliert, bis zum ^'er- schwinden einer Schwefelsäurereaktion gewaschen und bei 110*' getrocknet. Will man keine Fraktionierung vornehmen, so reinigt man das Gesamt- glol)ulin .der erstmaligen Ammonsulfatfällung derart, daß man den Nieder- schlag auf dem Filter mit einer Ammonsulfatlösung von 40*'/o Sättigung wäscht. Nach ;3 — 4 Tagen sind die ablaufenden Filtrate biuretfrei. Man nimmt das Globulin vom Filter, verreibt es von neuem in einer Pieib- schale mit einer Ammonsulfatlösung von der genannten Konzentration, filtriert und wiederholt die Prozedur o — 4mal, um alles Ovalbumin und Ovomukoid zu entfernen. 2. Darstellungsmethode eines (ilobulins nach Oshorne und Camphell. ^) Man fällt, wie sub 1 beschrieben, durch Halbsättigen mit Ammonsulfat, wäscht den Niederschlag gut mit 50Voioer gesättiger Am., SO4- Lösung *) L. Lanqstein, ÜLer die gerinnbaren Stoffe des Eierklars. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. 82 (1902). -) Th. B. Oshorne und G. F. Camphell, Die Protoinbcstandteile des Eiereiweißes. Journ. Amer. Chem. Soc. Vol. 22. p. 422 (1900). — Rep. Connecticut AtTricult. exp. Station. Vol. 23. p. 348 (1900). Darstolluiig der rioteiuL' der Tierwelt: Niclit kristuUisierbare Proteine. ;',7«> aus, löst ihn in wenig- verdünnter Salzlösung und unterwirft die Lösung der Dialyse. Es fällt alsbald ein gummiartiger Niederschlag aus. der alt- filtriert und mit Wasser und Alkohol gewaschen wird ((ilohulin I = ( )vo- niucin im Sinne von Eirhholz^). Im Filtrat dieses Niederschlags findet sich ein zweites, wasserlösliches Globulin, das mit AmmonsuJfat durch Sättigung gefällt und ganz wie das „Gesamtglobuliu" nach Lanas klare l'iltrat. 1) A. EichhoJz, Die Hvdrolvse der Alhuniinstoffe. Jouni. f. Physiol. Btl. '2:\ S UV^ (1898). ^) C. Th. Mörner, t)her eine im Hühnereiweiß in reichlicher Menge vorkouimendo Muzinsuhstanz. Zeits^chr. f. phys. Chem. M. 18. S. b2b (1894). 380 Fr. Samnely. das keine Heller&che Reaktion mehr zei^t, wird mäßig konzentriert und mit Alkohol niedergeschlagen: den Niederschlag preßt man ab, löst ihn erneut in Wasser und fällt in analoger Weise noch zweimal mit Alkohol um. (Die auch von Nönier angegebene Fähung durch Aussalzen mit NagSOi erübrigt sich heute.) 2. Nach Willanen.'^) Man verdünnt Hühnereiweiß mit dem vier- fachen \'olumen Wasser, schüttelt gut durch, kollert ab und gießt die klare Lösung unter Zusatz von Essigsäure bis zu eben saurer Reaktion in das li/gfache A^olumen kochenden Wassers. Unter gutem Umrühren erhitzt man zuletzt zum starken Sieden und filtriert dann ab. Das Filtrat, das mit Quecksilberchlorid und Salpetersäure keinen Niederschlag gibt, wird auf dem Wasserbad auf ein kleines Volumen eingedampft, filtriert und in die fünffache Menge absoluten Alkohols gegossen. Durch mehrfaches Lösen des abfiltrierten Niederschlags in Wasser und erneutes Fällen mit Alkohol, zuletzt durch Nachwaschen mit alisolutem Alkohol und Äther entsteht ein trockenes Ovomukoidpulver. o. Darstellung aus bereits koaguliertem (xesamteierweiß (Wilhmen). ]\lau zerschneidet Hühnereiweiß fein, zerreibt es in einer Reibschale unter Zusatz von einer kleinen Menge Essigsäure mit einem großen Volumen Wasser und kocht dann auf. Ohne Essigsäurezusatz resultiert kein klares Filtrat. Sonst geschieht die Behandlung des Filtrates wie sul) 2. beschrieben. 4. Nach MUesi.-) Man koaguUert das Gesamteiweiß des Eierweißes durch Zusatz eines großen Überschusses von OO^/oigem Alkohol, filtriert die Fällung ab und trocknet sie im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur. Das gewonnene Pulver wird dann mit wenig kaltem Wasser extrahiert. Die Extraktionsflüssigkeit wird mit Alkohol nach 2. Aveiterbehandelt. Beurteilung: Alle genannten Methoden führen zu Präparaten, die im wesentUchen einheitlich sind: C H N S P o/o Elementarzusammensetzung: 48"79 6'96 1251 '2"2)\ + Langstein 12-68 2-2 Mörner. Das Mukoid enthält eine Kohlehvdratgruppe, u. zw. C'hitosamin, in einer Menge von H4'9'^/o ^^^^ Traubenzucker berechnet, das durch Säurespaltung, Pepsinverdauung und Fäulnis abgespalten werden kann. Dieses Chitosamin ist das einzige in dem Mukoid enthaltene Kohlehydrat (Neuherg und Wolf). Das Mukoid enthält keine Chondroitinschwefelsäure. Von den 2*22 7o Schwefel sind l-;-)9 — l'4;j"/o leicht abspaltbar. Von Eiweißreaktionen faUen positiv aus : die Xanthoprotein- und M//o»sche Re. ktion, die Liehe nvann^aha Reaktion, die Reaktion nach Adanikiewicz, letztere nur bei ^>rwendung von (llyoxylsäure enthaltenden Eisessig. ^) K. Willanen, Über das Verhalten des Ovoniukoids im Organismus. Biochem. Zeitscbr. Bd. 1. S. 109 (190()). -) C. Milesi, Di an corpo pliosphorato isolati) dairAlbume d'iiovo presentante i caratteri cbim. di im mucnide. Bollet. della soc. med. (hirurür. l'avia 1898. Darstellung der Proteiue der Tierwelt: Xiclit kristallisierbarc Proteine. ;j31 Qualitativer Nachweis. Man beseitigt in der fraglichen Lösung' die T'roteine durch Auskoagulieron. Im Filtrat, das selbst niclit reduzieren soll, fällt man mit Alkohol und prüft den entstandenen Niederschlag auf den Gehalt einer Kohlehydi-atgruppe. indem man ihn mit H« „iger Salzsäure ;\ Stunden lang kocht und die neutralisierte Lösung mit Fchliny^chdr Lösung auf Reduktion sfähigkeit prüft. IL Proteine des Eidotters. Man bezeichnet die Dotterproteine als Vitelline. Es sind dies Eiweißkörper mit Globuliiieigenschaften. Im Gegen- satz zu diesen aber sind sie durch Kochsalz nicht fällbar. Da die Vitelline in der Form und Ueinheit, die wir nach den gebräuchlichen Methoden zu erreichen vermögen, Phosphor enthalten, glaubte man, die \'itelline in die Gruppe der Nukleoalbumine einreihen zu müssen. Da sie ferner, wie die Nukleoalbumine , bei der Spaltung durch Pepsinsalzsäure oder gelinde hydrolytische Agentien Paranukleine bzw. Paranukleinsäuren liefern, schien diese Gruppierung zu den Nukleoalbuminen um so nu'hr be- rechtigt. Es mag wohl sein, daß einige der Eiervitelliiie, vielleicht jene der Fischeier, den Nukleoalbuminen nahestehen: trotzdem ist der Hinweis nötig, daß die Beteiligung des Phosphors am organischen Aufbau dieser Proteine noch keineswegs sichergestellt ist. Es fehlt bis heute an der Methode, diese Frage im positiven oder negativen Sinn zu entscheiden, und die Möglichkeit, daß der Phosphor einer Lezithin- oder Nukleoproteidverun- reinigung entstammt, muß stets in Betracht gezogen werden. l. Darstellung von Vitellin aus Vogeleidotter (Wei/I).^) Man er- schöpft den Dotter vom Hühnerei lange Zeit mit Äther. Die zurückbleibende weiße Masse wird in möglichst wenig 10"/oiger Kochsalzlösung gelöst und aus der filtrierten Lösung mit AVasser gefällt. Man erhält dabei einen Niederschlag, den man möglichst bald (noch vor dem Absitzen) abfiltriert, da er wie die Globuline sehr schnell seine Löslichkeit in Salzlösungen verliert. Das Lösen in Na Cl-Lösung und Fällen mit viel Wasser wird ein zweites Mal wiederholt. Zur Lösung braucht man meist nur wenige Tropfen der Kochsalzlösung. Die zuletzt gefällte Masse wird mit Alkohol extrahiert (zur Befreiung von Lezithin!) und mit Äther getrocknet, her Körper stellt ein durch die Alkoholbehandlung sicher verändertes üoh- vitelhn dar. Darstellung nach Levene und Älsheni.-) Der Eidotter wird mechanisch vom Eiweiß getrennt, mit (Umu gleichen Volumen lOVoiger Na Cl-Lösung gemischt, mit Äther kräftig geschüttelt und 24 Stunden stehen gelassen. Der abgeschiedene Äther wird beseitigt, die Lösung erneut mit Äther geschüttelt und wieder 24 Stunden sich selbst ') Th. Weiß, Beitrag zur Kenntnis tierischer und pflanzliclicr Eiweißkdrper. Zcitschr. f. phys. (hem. Bd. 1. S. 74 (1878). -) P. L. Lerem' und C. Alshrrf/, Zur Chemie der Paranukleinsiinre. Zeitscli. f. pliys. Chem. Bd. 31. 8. 543 (1901j. 382 Fr. Samuely. Überlassen. Nach /imaliiier Wiederholung dieser Ätherextraktion entsteht eine durchsichtige, leicht filtrierende Lösung, aus der Farbstoffreste durch erneute Ätherextraktion entzogen werden. Zu der NaCl-Lösung setzt man das 20fache Volumen Wasser. Nach- dem sich der entstehende Niederschlag etwas gesenkt hat, hebert man das überstehende Wasser ab, ersetzt es durch frisches Wasser, rührt auf, läßt wieder absitzen und filtriert nach mehrmaligem Waschen in dieser Art zuletzt ab. Der Filterrückstand wird wieder in IQo/oiger NaCl-Lösung gelöst und im Scheidetrichter nochmals mit Äther, wie oben beschrieben, durchgeschüttelt. Dann filtriert man die vom Äther getrennte Lösung und fällt mit einem großen Überschuß AVasser. Der Niederschlag wird dann mit kaltem oder heißem Alkohol extrahiert, mit Äther nachbehandelt und diese Extraktion so lange fortgesetzt, bis eine Äther- bzw. Alkoholprobe keinen Rückstand hinterläßt. Beurteilung: Man gelangt zu einem Präparat, das 0'S4 — l"2P/o Phosphor enthält. Elementarzusammensetzung (Osborne und Campbell'^} C 51-24, H. 7-16, N 16-38, S 1-04, P 0-94, Fe -f «/o- Über die Paranukleinsäure des Yogelvitellins siehe bei Nukleoall)uminen. 2. Vitelline aus Dotter von Fischeiern. Die sogenannten Dotterplättchen des Fischrogens stellen kristalli- siertes ..Vitellin" dar. Dieselben lassen sich in kristallisierter Form präpa- rativ und zu Demonstrationszwecken darstellen. Isolierung der Dotterplättchen: Man zerdrückt die Eier der Knorpelfische oder des Karpfens mit Wasser. Dabei scheiden sich reichlich Eiweißkörper ab. Diese werden mit Wasser geschlemmt und mit Alkohol und Äther gewaschen. Es werden so ..regelmäßige tafelförmige Körnchen" bzw. rektanguläre oder nahezu quadratische, platte Täf eichen gewonnen {Valencicnnes und Fräny-). Radlkofer^). Die Körper sind identisch mit dem folgenden, als I cht hui in bezeichneten Dottereiweißkörper. o. Ichthulin. Darstellung aus Karpfeneiern {Walter^). Die Eierstöcke der Karpfen werden aus der sie umgebenden Haut heraus präpariert und mit Wasser abgespült. Alsdann wird der Rogen gut mit ausgewaschenem Sand zerdrückt und mit Wasser zu einem dünnen ') Th. Oshorne uud G. F. Camphell, Die Proteide des Eidotters. Rep. of Connecticut Agricultur. exp. Station. Yol. 23 (1900). — Journ. of Americ. ('hem. Soc. Voi. 22. p. 413 (1900). -) A. Yalenciennes und FreDii/, Recherches sur la composition des oeufs dans la sörie des animaux. C. r. T. 38. p. 471 (1854). l ^) L. EadJl-ofer, Über Kristalle proteinartiger Körper pflanzlichen und tierischen i Ursprungs. Leipzig 1859. i *) G. Walter, Zur Kenntnis des Ichthulins und seiner Spaltprodukte. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 15. S. 477 (1891). i I I Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. ;3}>53 Brei angerührt. Nach einer Stunde wird koliert und filtriert. Die Filtrate sind i>elbbraun, opalisierend, trübe. Sie werden unter Umrühren in große Mengen Wasser eingegossen; die massige Trübung setzt sich nach Ein- leiten von Kohlensäure als flockiger Niederschlag ab. Das Rohichthulin ballt sich dann zu einer rötlichweißen, klebrigen Masse zusammen. Die über- stehende Flüssigkeit wird abgegossen, der Rest wird filtriert. Den Filter- rückstand löst man in der ausreichenden Menge einer sehr verdünnten Magnesium Sulfatlösung und filtriert aufs neue. Das Filtrieren der klebrigen Lösung geht langsam vonstatten. (Da sich mit längerer Dauer der Salz- und Wasserwirkung ein beträchtlicher Anteil von Ichthulin als nunmehr unlöslicher Körper abscheidet, so gehen erhebliche Mengen bei dieser Filtration verloren. ) Das Filtrat wird erneut mit viel Wasser gefällt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird dann mit Alkohol und Äther auf dem Filter ausgewaschen. Das Ichthulin stellt dann ein weißes, hygroskopisches Pulver dar, das sich beim Trocknen (110") etwas gelblich färbt. Elementarzusammensetzung: C 53-52, H 7-70, N 15-64, S 0--tl, P 0-4o, Fe O-lO'Vo im Mittel. In den Säurezersetzungsflüssigkeiten findet sich eine die Fehlinf/sche Lösung reduzierende Substanz. Über das Paranuklein siehe die Nukleo- albumine. Darstellung aus Kabeljaueiern (Levene'^). Der Fischrogen wird gut mit Sand zu einem Brei verrieben und in einer Handpresse ausgepreßt. Eier- und Sandgemisch werden in größeren Flaschen mit 5"/oiger Chlorammoniumlösung übergössen und erst allein, dann nach Zusatz großer, mehrfach gewechselter Äthermengen geschüttelt. Über Nacht hat sich der Äther abgetrennt. Die wässerige Schicht wird filtriert und mit dem 20fachen \olumen Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wird auf einem Filter mit Wasser gewaschen und in gleicher Weise behandelt (Lösen in MgCla-Lösung, Schütteln mit Äther, Filtrieren, Fällen mit Wasser). Nun wird die Fällung bis zum Verschwinden der Biuretreaktion gewaschen. Es folgt eine Extraktion mit heißem und kaltem Alkohol, wodurch der vorher weiße Niederschlag orangegelb wird d). Da- nach wird nochmals mit absolutem Alkohol und mit Äther getrocknet. Das Ichthulin des Kabeljaueis enthält im Gegensatz zu jenem aus Karpfeneiern keine Kohlehydratgruppe. Über die in ihm enthaltene Paranukleinsäure vgl. die Nukleoalbumine. Die Elementaranalyse ergibt die Zusammensetzung: C 52-44, H 7-45, N 15-96, S 0-92, P 0-65Vo. in. Die Eiweißkörper der Milch. In der :\Iilch sind die folgenden Eiweißkörper genauer bekannt : Kasein, Laktalbumin, Laktoglobulin und Opalisin. Es liegt kein ^) P. A. Lerenc, tjber das Ichthulin des Kabeljaus. Zeitschr. f. physiol. ( honi. Bd. 32. S. 281 (1901). 384 Fr. Samnely. (n-imd vor. in der ]\Iik'h aiiiier den sen^-nnten Körpern noch andere, bis- her nicht isoUerte Milchproteine anzunehmen. 1. Kasein ist ein Protein, das in der übüchen Systematik der Eiweiß- körper zur Gruppe der Nukleoalbumine zählt, d. h. zu Proteinsubstanzen, die im wesentlichen Ähnlichkeit mit Glolnilinen aufweisen und durch den Gehalt an Phosphor ausp'ezeichnet sind. Das Kasein verschiedener Tier- gattungen scheint verschieden zu sein. Darstellung aus Kuh- oder Ziegenmilch nach Hannnarsten.'^) ]Man verdünnt die nach Möglichkeit schon etwas abgerahmte Milch mit dem 4 fachen Volumen Wasser. Zu diesem Gemenge setzt man so viel Essigsäure, daß die verdünnte Lösung einen Gesamtsäuregehalt von 0-75 bis P/oo Essigsäure gewinnt. Das sich alsbald abscheidende Kasein wird zu- gleich mit dem niedergerissenen Milchfett über Leinwand abfiltriert, da- nach in einer Iieil)schale unter Wasser möglichst fein zerrieben, und unter Dekantieren der jeweils überstehenden Wassermenge möglichst zuckerfrei gewaschen. Nun wird mit Hilfe von möglichst wenig verdünntem Alkali (XH3 oder Vio^-^^-OH) gelöst. Die Kaseinlösungen werden filtriert. Ein Teil des Milchfettes wird bei dieser Filtration von den Filterporen zurück- gehalten. Der größere Teil wird bereits vor dieser P'iltration durch Ab- schöpfen beseitigt. In dem klaren oder nur leicht opalisierenden Filtrat wird die Kaseinfällung durch Zusatz von sehr wenig verdünnter Essig- säure wiederholt. Das Lösen des wieder abfiltrierten Kaseins und Fällen wird ein drittes Mal wiederholt. Die zuletzt entstehende Kaseinfällung wird auf dem Filter mit reichlichen Mengen destillierten Wassers gründ- lich von den letzten Spuren Essigsäure l)efreit. Der P'ilterrückstand wird hierauf mit 977oigem Alkohol in kleinen Portionen zu einer Emulsion ver- rieben. Den sich bald absetzenden Kaseinanteil trennt man möglichst schneU von dem darüber stehenden Alkohol. Dieses Waschen mit Alkohol wird möglichst lange fortgesetzt. Zuletzt werden die Kaseinmengen auf dem Filter durch Waschen mit Äther von Alkohol befreit und hierauf in offenen Schalen innig mit Äther zerrieben. Dann wird das fein zerriebene Kasein im Soxhletapparat einer energischen Ätherextraktion unterworfen. Dieselbe muß so lange fortgesetzt werden, bis eine Probe der Extraktions- flüssigkeit keinen Pdickstand hinterläßt. Das nunmehr fettfreie Kasein wird im Vakuum oder bei einer Temperatur von 60 — ^70" getrocknet. Eine Modifikation dieser Methode, welche die Entfettung erleichtert, haben Danileivslxi und RadcnJiausen'^) angegeben. 2 l Milch werden mit 8 / Wasser verdünnt und mit 10 oh Eisessig versetzt. Das Kasein wird sofort gefällt. Xach Senkung desselben wird ^) 0. Hammarsten, Zur Kenntnis des Kaseins und der Wirkung des Labfermentes. Nov. Act. Reg. Soc. Sc. Upsala. Jg. 1877. Autoreferat. Mahjs .Jahresbercht. Jg. 1877 . S. 158. — Ferner vgl. daselbst: J/r////.s- Jahresbericht. Jg. 1872. S. 118 undi Jg. 1874. S. 135. ^) A. Danihicslci und F. liadejihauseH, Untersuchungen über die Eiweißstoffe der Milch. :SM!js Jahresbericht. Jg. 10. S. 186 (1880). - Forschungen aus dem Gebiete der Viehhaltung. Bremen. Jg. 1880. S. 9. Darstelluug der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 5^5 die saure Molke abgeheboit. Das Kasein wiid sofort mit 2 — 4 / destil- liertem, schwach angesäuertem Wasser gewaschen und über einem Lein- wandtuch gut a1)gepreßt. Der Rückstand wird in einer Reibschale mit einer geringen Menge einer 1 — 2"/oigen Ammoniaklösimg gut verrieben. Der dicke Brei wird alsdann mit derselben AmmoniakUisung auf 1000 bis 1500 cm^ aufgefüllt, wobei er allmählich in Lösung geht. Hierl)ei scheidet sich das Milchfett sehr vollständig an der Flüssigkeitsoberflächc ab und wird leicht nach 24 Stunden abgerahmt. Durch Zusatz von 10 — 12 cm^ Eisessig zur abgerahmten Lösung entsteht abermals eine Kaseinfällung, die noch 2 mal in der beschriebenen Weise in 1 — 2Voigeni NHg gelöst und mit Essigsäure wieder gefällt wird. SchlieiUich wird die letzte Säurefälbmg mit destilliertem Wasser auf Leinwand bis zur Neutrahtät der ablaufen- den Flüssigkeit gewaschen , im Soxhletapparat gut mit Alkohol und Äthei* erschöpft und an der Luft getrocknet. Die mehrfache I^mfällung aus schwach ammoniakahscher Lösung er- höht ohne Zweifel die Kaseinreinheit und erleichtert auch das Entfernen des Fettes, das sich in der ammoniakalischen Lösung leicht absetzt. Großes Gewicht ist auf eine ergiebige Ätherextraktion zur Ent- fernung der letzten Fettspuren zu legen. Eine Kontrolle am Abdampfrück- stand von Proben der Extraktionslösung ist immer geboten. Es sei ferner betont, dalj selbst die als Caseinum purissimum nach Hammarsten (Merck) im Handel befindlichen Präparate keineswegs absolut fettfrei sind ! Es muß daher eine solche Ätherextraktion oft tagelang fortgesetzt werden. Darstellung von Kasein aus Frauenmilch nach Kobrak.^) Man versetzt die zentrifugierte Milch mit 1/5 ihres Volums 1/10 n-Essig- säure und unterwirft diese Lösung 5 Tage lang im Pergamentschlauch der Dialyse gegen täglich erneuertes Chloroformwasser. Nach dieser Zeit erst hat sich das Kasein abgeschieden. ^Lan zentrifngiert die Fällung aus, wäscht sie auf einem Papierfilter gut mit schwach angesäuertem (Essig- säure) Wasser, behandelt dann mit Alkohol und mit Äther und läßt eine energische Ätherextraktion im Soxhletapparat nachfolgen. Schließlich trocknet man im ^^akuum. Die Elementaranalysen maximal gereinigter Kaseine ergaben folgende Werte: C H N S P «/o 52-96 705 15-65 0-758 0-847 Hammarsten. 15-45 0-75 0-77 LfKjiieur u. Sackiir 53-a 7-07 15-91 0-82 0-84-0-89 Chittenden u. Painter. Aus Frauenmilch: 52-24 7-;i2 14-97 1-12 0-68 Asche P/o- Für Kuhmilch beträgt (-/)d = — 80" in neutraler, — 76" in alkalischer. — 91" in salzsaurer Lösung. Lo^nj fand (a)j) = — 97-8 — UPS" in Vio u-NaOH-Lösung. Aus Kuhmilch: 1) E. Kohrak, Beiträge zur Kenntnis des Kaseins der Frauenmilcli. /'jlii;/,r.-< Arcli. Bd. 80. S. 69 (1900). Abderhaldun, Handbuch der biorboinischeii Arbeitsmethoden. II. 25 386 Fr. Samuely. Reaktionen znr Feststellung eines Körpers als Kasein: Man löst den fraglichen Eiweißkörper in verdünnten Alkalien oder Alkalikarl)onaten zu einer auf Lackmus neutral reagierenden Lösung und fällt ihn mit Essigsäure. Ist durch mehrfaches Wiederholen dieser Prozedur der Körper einigermaüen gereinigt, so überzeugt man sich, daß seine salzfreie Lösung bei ' Erhitzung nicht koaguliert. Eine Probe des Körpers wird auf den Gehalt an Phosphor geprüft. Fällt diese Probe positiv aus, so bestimmt man, um sich vor einer Verwechslung mit einem Nukleoproteid zu schützen, ob der betreffende Körper Nukleinbasen enthält. Ist diese Probe negativ ausgefallen, so ist das Vorhandensein des Nukleoalbumins sichergesteUt. Der endgültige und eindeutige Nachweis des Kaseins geschieht durch den Nachweis der Ge- rinnbarkeit des gelösten Kaseins mit Labfermeut. Darstellung von Kaseinlösungen, die mit Lab gerinnen, nach Courant.^) Man löst ein nach Hannnarsten dargestelltes Kasein in Kalkwasser und neutralisiert mit Phosphorsäure oder Salzsäure : z. B. 0"o // Kasein werden in 10 cm^ gesättigtem Kalkwasser gelöst. Zu dieser Lösung fügt man 2"9 cni'^ i/j^ n-Schwefelsäure. Will man statt dessen zur Neutralisation Phosphorsäure verwenden, so ist soviel Säure zuzusetzen, als nötig ist, um das nicht an Kasein gebundene Calcium in Tricalciumphosphat umzuwan- deln. Eine solche Lösung gerinnt aber mit Lal) noch nicht. Erst das Hin- zufügen von mehr HaPO^ führt zu diesem Ziel, dadurch, daß auch der an Kasein gebundene Kalk in das Triphosphat verwandelt wird. Beispiel : O'H g Kasein in 10 cm^ gesättigten Kalkwassers + Sl cm^ i/io n-Phosphorsäure. Im allgemeinen erhält man gut gerinnende Lösungen, wenn man mit dem Säurezusatz bis zur Neutralisation gegen Lackmus als Indikator fortschreitet. Statt Kalkwasser kann man auch Natriumkarbonat als Lösungsmittel verwenden; in dem Falle löst man das Kasein in soviel stark verdünnter Sodalösung, daß eben eine gegen Lackmus neutral oder amphoter reagierende Lösung entsteht. Solche Lösungen von Kasein gerinnen aber nach Be- handeln mit wirksamem Lab erst dann . wenn ein lösliches Kalksalz. z. B. Ca Cl,, zugefügt wird. Umwandlungs- beziehungsweise Spaltprodukte des Kaseins. 1. Durch Erwärmen auf 94 — 100" und darüber hinaus erleidet das Kasein eine Spaltung. Es entsteht ein in verdünnten Laugen lösliches Iso- kasein (A) und ein in Laugen unlösliches, in ihnen nur gallertartig queUendes iVlbuminat, das Natriumkaseid (B). Laqueur und Saclmr.-) M G. Courant, l'ber die Reaktion der Kuh- und Frauenmilch und über ihre Bezie- hungen zur Reaktion des Kaseins und der Phosphate. Pflügers Archiv. Bd. 50. S. 109 ( 1891). ^) E. Laqueur und D. Sacknr, Über die Säurceigeuschaften und das Molekular- gewicht des Kaseins und seine Spaltung beim Trocknen. Hofmeisters Beiträge. Bd. 3. S. 193 (1903). Daistelluiig der rroteiiic der Tierwelt: Nicht kristallisioibare Proteine. ;JST Trennlinie' beider Körper: Man erwärmt das trockene Kasein im Wärmeschrank während 12 — 18 Stunden anf 102 — 107". Das so vorbe- handelte Präparat wird in Vio n-Natronlango anfi>escliwemint. Es geiit A in Lösnnti'. B bleibt als ziemlich feste, nicht iiallertartiue Masse, am Boden des (iefäl)es sich absetzend, zurück. Dieser Hückstand wird solange mit <:anz verdünnten Laui^en (n/200) gewaschen und wieder dekantiert, bis sich ein mit rhenolphtalein versetztes Wasser beim Aufschwemmen mit einer Probe des Kückstandes I> von selbst rot färbt. Hierauf filtriert man B auf der Xutsche ab, Aväscht mit groüen Mengen Alkohols und Äthers und pulverisiert den Rückstand zu einem staubfreien gelblichen Pulver. A kann in der für das Kasein beschriebenen Weise aus seiner Alkali- lösung mit verdünnter Essigsäure gefällt werden. Die Peinigung erfolgt wie dort durch mehrfaches Umfallen. 2. Parakasein ist derjenige Eiweißkörper, der aus Kasein unter dem aller Wahrscheinhchkeit nach spaltenden Einflul.) von Labferment entsteht, und der bei Labwirkung auf genuine ^lilch in Form des unlöslichen para- kaseinsauren Kalkes (Käse) ausfällt. Darstellung von Parakasein aus reinem Kasein.i) Man löst reines Kasein nach Hammarsfeti in der zur Lösung eben nötigen Menge verdünnter Natronlauge. Zu dieser Natriumkaseinlösung von nahezu neutraler lleaktion setzt man eine ausreichende Menge von wirksamem Labferment (Magensaft, Magenschleimhaut usw., am besten Labpulver) und hält die Lösung etwa 10 Minuten im Brutschrank bei 37''. Alsdann zerstört man das Lab durch Erhitzen auf 90« und verdünnt mit dem \ierfachen ^'olumen Wassei'. Nun versetzt man die Lösung vorsichtig mit sehr verdünnter Essigsäure bis zu beendeter FäUung, filtriert den flockigen Niederschlag ab und löst ihn wieder in ganz verdünnter Natronlauge. Die Emfällung mit verdünnter Essig- säure aus der alkalischen Lösung wird zweimal wiederholt. Der zuletzt ent- stehende Niederschlag wird auf dem Filter gut mit Wasser gewaschen und rasch mit Alkohol und Äther nachbehandelt. Wenn es sich nicht um die Reindarstellung des Parakaseins handelt, so kann man den Körper aus seiner Lösung durch Neutralsalze (Halbsättigung mit Ammonsulfat, (lanzsättigimg mit rohem . d. li. kalkhaltigem Kochsalz) aussalzen. Die Salzfällung wird der Dialyse unterworfen, wobei Lösungen von reinem Parakasein entstehen. Eine Darstellung des Parakaseins aus seinem Kalksalz, d. h. aus dem Kasein etwa durch Lösen mit Soda und Fällen desselben mit Säure führt nicht zu einem unveränderten Parakasein. Elementarzusammensetzung: C r);V9-4, H 714, N 15"14, S POl, Pi-n%. Qualitativer Nachweis des Parakaseins (zugleich als Kasein- nachweis verwertbar). Zu der bei Im" belassenen kalkfreien Lösung von ') H. Kopster, Einige Beiträge zur Kenntnis des Kaseins und seiner (ierinnnng mit Labferment. Ipsal. lälcaref. Forh. S. 1(5; J/a^ys Jaiiresberielit. Bd. 11. S. U (1881). 25* 388 Fr. Samuely. Kasein mit Labferment setzt man eine Spur eines löslichen Kalksalzes, am besten Calciurachlorid. Bei einem Gehalt von 0'2''/o Chlorcalcium erfolgt sofort eine Abscheiduug in Form des flockigen Käses. Quantitative Bestimmung des Parakaseins. Man bestimmt in einer abgemessenen Probe der der Labwirkung unterworfenen Kaseinlösung den Gesamtstickstoffgehalt. Eine Multiplikation dieses Wertes mit 6'24 ergibt den Gehalt an Eiweiß (Kasein). In einer gleichgroßen l'robe fällt man das entstandene Parakasein mit Essigsäure. Die entstandene FäUung bringt man (luantitativ auf ein Filter und wäscht den Pllterrückstand solange mit Wasser aus, bis die Waschflüssigkeiten keine Biuretreaktion mehr geben. Den Niederschlag verascht man alsdann feucht und bestimmt den N-Gehalt nach KjeldahL Der gefundene Wert, mit 6'o7 multiphziert ergibt die Menge Parakasein. Die Methode gestattet das Auffinden von Annäherungswerten über die Mengenverhältnisse, in denen sich das Kasein in Parakasein und andere Proteinbestandteile (s. u.) zerlegt. Versuche der Zerlegung des Parakaseins in einzelne Frak- tionen (nncli V. Henrtrdcn'^) scheinen zu beweisen, daß auch das durch Essigsäure fällbare Parakasein aus 2 Körpern besteht. Man läßt Lab auf eine ganz schwachsaure Natriumkaseinatlösung 3 Stunden einwirken. Hierauf unterbricht man die Fermentwirkung durch Erwärmen auf 90" und fällt das gebildete Parakasein mit Essigsäure. Nun löst man den von Essigsäure durch Waschen befreiten Niederschlag mit ganz verdünnter Natronlauge bis zu schwachsaurer Pieaktion der Lösung und fällt nun mit einem Überschuß von CaCl.,. Dieser Niederschlag stellt die Kalkverbindung eines Parakaseins A dar. Im Filtrat dieser Fällung läßt sich ein durch Ca-Salz nicht mehr fällbares Parakasein B mit verdünnter Essigsäure ausfäUen. Diese Fällung hat vorsichtig zu erfolgen, in der Weise, daß soviel Essigsäure verwandt wird, um in dem Filtrat der Fällung die Pieaktion mit Ferrocyanwasserstoff eben zum Verschwinden zu bringen. Im Filtrat des erstmalig durch Essig- säure gefällten Parakaseins A -f B ist ein Parakasein C enthalten . das durch Sättigen der Lösung zu 60'Vo gesättigter Ammonsulfatlösung oder durch Tannin ausgefällt wird. Die :-) Körper sind bisher nur quahtativ bestimmt und differenziert. 3. Das Molken ei weiß (Hemikaseinalbumose, Laktoserumproteose). Mit diesem Namen bezeichnet man die Gesamtheit der Eiweißkörper, die sich in dem Filtrat eines durch Labwirkung aus Kasein entstandeneu Parakaseins finden und nach der Beseitigung des Parakaseins als Kalksalz oder durch Essigsäurefällung gelöst bleiben. Aller Wahrscheinlichkeit handelt es sich um eine Mehrzahl von Protein- körpern, deren Menge und Natur von der Dauer der Labwirkung, d. h. dem Grade der Kaseinzerlegung in Parakasein und Molkeneiweibe abhängt. *) M.v.Henverden, Beiti'ag zur Kenntnis der Labwirkuiig auf Kasein. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 52. S. 184 (1907). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Xicht kristallisierbare Proteine. 389 Qualitativer Nachweis und quantitative Bestimmung des Molkeneiweißes.''") Man stellt sich eine Lösung von reinem Kasein dar, indem man dasselbe in der eben ausreichenden Menge einer l"/„igen Na^CJOg- Lösung auflöst. Diese frisch bereitete Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt. Abgemessene Prol)en werden mit einer frischen Lablösung (1 Teil käufhches Labpulver auf 10.000 Teile Wasser) versetzt und auf ein gleiches Volumen aufgefüllt. Nach beliebigen Verdauungszeiten (bei 37") unterbricht man die Labwirkung durch Erhitzen auf 90 — 95" und fällt das gebildete Parakasein durch Zusatz des gleichen Volums einer gesättigten Ammonsulfat- lösung zu der Labprobe aus. Das Filtrat dieses Niederschlags wird durch Zufügen von Am., SO^ auf (lanzsättigung gebracht. Hierdurch entsteht ein zweiter Niederschlag aus Molkeneiweiß ((jualitativer Nachweis!). Will man relative Werte zur Bestimmung des gebildeten Molkeneiweißes erhalten, so bestimmt man in den unverdünnten Filtraten des Parakaseins die Stickstoff- menge. Sind 90 ciit^ einer 2°/oigen Natriumkaseinatlösung der Labwirkung ursprünghch ausgesetzt, so fügt man dieser Lösung nach Zerstören des Labs 4:0g festes Kochsalz (Rohsalz mit im Mittel 0"4*'/o Ca und O'Ob^/a Mg) zu, filtriert von dem sich abscheidenden Parakasein ab und bestimmt in bOcm''^ des nicht verdünnten Filtrates (= entsprechend 90 cm^ ursprüng- Hcher Lösung) den Stickstoffgehalt nach Kjehlahl. Man gewinnt so rela- tive Zahlenwerte über die nach wechselnden Zeiten gebildeten Molken- eiweißmengen. Bei allen diesen Versuchen ist die Wirksamkeit des Labs zu kon- trollieren. Man verwendet am besten die 2 — ofache Menge einer Lablösung, die zur Parakaseinbildung binnen 10 Minuten benötigt wird. Der N-Gehalt der Lablösung (0"005'V'o> darf vernachlässigt werden. Molke nalb um ose. Man versteht unter dieser Bezeichnung einen Eiweißkörper, der von Fuld aus den ^lolkeneiweißen isohert worden ist. Bei ihrem Nachweis läßt Fuld die Parakaseinbildung unter besonderen Be- dingungen vor sich gehen, die eine sekundäre Hydrolyse vollständig aus- schließen. Darstellung und Nachweis einer Molkenalbumose nach FuIdJ) Man geht von einer nach Courant (vgl. S. 386) dargestellten Kasein- lösung aus. Auch Kaseinpräparate der P'irma Pthenania in Aachen sind verwertbar. Kasein, meist 10 g, wird mit einer geringen Menge Kalk- wasser angerührt und unter Umrühren und Erwärmen auf dem Wasserbade fast vollständig in Lösung gebracht. Dann neutralisiert man die Lösung mit einer stark verdünnten Phosphorsäure unter Kontrolle des Neutralisatiouspunktcs durch Tüpfeln auf Lackmuspapier. Die bleibende milchweiße Lösung wird mit reinen Eis- ^) E.Petry, Über die Einwirkung von Labfermeut auf Kasein. Hofmeisters Bei- träge. Bd. 8. S. 339 (1906). -) 5'. Schmidt -Nielsen, Die Beziehung des Molkcnciweißes zur Labgerinnung (Parakaseinbildung). Hofmeisters Beiträge. Bd. 9. S. 322 (1907). »j E. Fidd, Über die Molkenalbumose. Biochem. Zcitschr. Bd. 4. S. 488 (1907). ;-590 Fr. Samuely. Stückchen rasch unter 10° abgekühlt und mit einer ausreichenden Menge trockenen Labpulvers versetzt. Nun wird die Lösung im Eisschrank bei einer unter 10" hegenden Temperatur belassen. Diese künstliche Milchlösung gerinnt in der Kälte. Das voluminöse Gerinnsel wird auf ein schneU filtrie- rendes Filter gebracht und aus der klar abfließenden Molke das noch gelöste Kasein und das schon gebildete, aber noch nicht ausgefallene Para- kasein mit Essigsäure gefäht. Der Zusatz der Essigsäure hat vorsichtig zu geschehen, um jeden (Jberschuß zu vermeiden. Es genügen zur Fällung ganz geringe ]\Iengen verdünnter Säure, deren Wirkung noch durch das Frei- werden der in Freiheit gesetzten zweiten Phosphorsäurevalenz erhöht wird. Nun wird das Filtrat dieser SäurefäUung zur quantitativen Beseitigung der Kasein- bzw. Parakaseinreste auf dem Wasserbade auf 70" erhitzt, eventuell, wenn nötig, mit weiteren geringen Mengen Essigsäure versetzt. Das nunmehr gewonnene Filtrat enthält die ]\Iolkenalbumose, die entweder indirekt durch N-Bestimmungen oder direkt durch (lualitative Reaktionen nachweisbar ist. Eine Reindarstellung der Molkenalbumose aus dieser Lösung, etwa durch Aussalzen, ist wegen des gleichzeitigen (tehalts an Calcium oder Phosphorsäure nicht möglich. Der quahtative Nachweis einer Molkenalbumose wird durch die folgenden Reaktionen erbracht. Mit Essigsäure tritt weder in der Wärme noch in der Kälte eine Fällung auf. Mit Salpetersäure entsteht eine Trübung, die sich beim Erwärmen klar löst und beim Abkühlen wiederkehrt. Die Reaktion ist auch in verdünnten Lösungen positiv. In gleicher Weise wirkt die Salzsäure. Für diesen durch Mineralsäuren fällbaren Anteil des Gesamtmolkeneiweißes wählt Fuld den Namen der Molkenalbumose. Aus dem Gehalt an Stickstoff im Gesamtmolkeneiweiß des letzten Filtrates und dem der Mineralsäurefällung ergibt sich, daß die fällbare ^lolkenalbu- mose nur etwa die Hälfte des Molkeneiweißes darstellt. 2. Laktalbumin. Die Isoherung erfolgt analog den Seite :);)5 ff. beschriebenen All)uminen. o. Laktoglobulin. DarsteUung nach SebeUcn.'^) Man befreit zunächst die Milch von Kasein. Man sättigt zu diesem Zweck die Milch, die man vorher zu amphoterer Reaktion neutralisiert hat, mit pulverisiertem Kochsalz in Substanz unter gutem Umrühren. Von der Fällung, die ganz aus Kasein, zum geringsten Teil aus Spuren von Glol)ulin besteht, filtriert man ab. Das klare Filtrat sättigt man mit pulverisiertem Magnesiumsulfat, wobei eine flockige Fällung entsteht. Der Körper wird auf dem Filter gesammelt, zwischen Piltrierpapier abgepreßt, in wenig Wasser gelöst (die noch anhaftenden Salzmengen genügen zur Lösung des Globulins) und aus dieser Lösung erneut mit MgSG^ bei Ganzsättigung gefällt. Den 2mal umgefällten Körper löst man in Wasser und unterwirft ihn der Dialyse. ^) J. Sehelien, Beiträge ziu Kenntiiii? der Eiweißkörper der Kulimilch. Zeitsclir. f. phys. Chem. Bd. 9. S. 453^(1885). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare l'roteine. ;J91 Aus der Lösung scheidet sich das Globulin beim Dialysieren meist nicht aus, höchstens entsteht eine Trübung, die durch eine Spur Kochsalz meder in Lösung- geht. Die Lösung fällt man mit Alkohol und trocknet das gefällte Globulin in der üblichen Weise mit Alkohol und Äther. Die Darstellung eines reinen Globulins aus Molke, d. h. aus dem Filtrat einer Käsefällung, ist nicht ratsam, da auch Anteile des Molken- eiweißes oder nicht gefällte Parakaseinanteile bei einer MgSOi-Sättigung mit ausfallen können. Der Körper scheint mit dem Serumglobuhn identisch zu sein. Koagu- lationstemperatur 72" in 5 — lO'^/oiger NaCl-Lösung. 4. Opalisin ist ein nicht globulin- oder albuminartiger Köi'per, der sich in den Mutterlaugen des durch Essigsäure gefällten Kaseins von Frauen-, Stuten- und Kuhmilch findet. Am reichsten ist seine Ausbeute aus Frauenmilch, am geringsten aus Kuhmilch. Die Mengen und Eigenschaften dieses Körpers, ebenso wie die von Wroblewski^) angewandte Darstellungsmethode sind so wenig präzisiert, daß die Besprechung dieses atypischen Proteins hier übergangen werden darf. Die Eiweißkörper des Kolostrums sind nach den für die Milch gültigen, oben beschriebenen Methoden darstellbar: Tiemann^), Sebelien (1. c. S. ;i90, Note 1 ). Das Kolostrumkasein ist in Spuren vorhanden und mit dem der Milch identisch. Das Kolostrumglobuün, nach der Methode von Sehdieji dargestellt, scheint, nach der Elementarzusammensetzung zu scliließen (C 49*83, H T^TT, X 15*28, S 1-24, C 25-88''/o)5 von dem der Milch verschieden. Indeß ist zu bedenken, daß das von SeheHeu analysierte Präparat keinen Anspruch auf absolute Reinheit machen kann, oder daß in dem von Ticiuann analysierten Kolostrumgiobulin nur ein Globuhnanteil, etwa der wasserlösliche Anteil, vorgelegen hat. (Vgl. hierzu den Absatz über die Mehrzahl der Serum- globuhne.) ^Methoden zur quantitativen Bestimmung der Proteine in der Milch. 1. Bestimmung des Gesamteiweißgehaltes der Milch. Fällung mit Gerbsäure: Sebelien J) Man verdünnt ö oder 10 cw^ Milch mit dem ttfachen Volumen Wasser, fügt etwas physiologische Kochsalzlösung hinzu und setzt nun einen Überschuß, etwa das P/ofache Volumen der ange- wandten unverdünnten Mischung an Almenscher Gerbsäurelösung hinzu. Diese Lösung bereitet man sich, indem man 4 g Gerbsäure in 8 cm^ 25"; oiger ') A. Wrohlewski, Ein neuer eiweißartiger Bestandteil der Milch. Zcitschr. f. phys. Chem. Bd. 26. S. 308 (1893). ") U. TicniaiiH , Untersuchungen über die Zusammensetzung des Kolostrums mit l)esonderer Berücksichtigunsr der Eiweißkörper desselben. Zeitschr. f. phvs. Chem. Bd. 25. S. 363 (1898). ^) J. Schellen , Studien über die analytische Bostimmungsweise der Eiweißkörper mit besonderer Berücksichtigung der Milch. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 13. S. 157 (1889). 392 Fr. Samnely. Essigsäure löst und hierzu \90 cni^ von 40 — 5ü%i8'em Alkohol zusetzt. Die durch die Gerbsäure entstehende Fällung läßt man absitzen; dann trennt man die überstehende Flüssigkeit ab, schickt diese durch ein gewogenes, trockenes Filter, filtriert und spült dann den Niederschlag quantitativ nach. Der Filter- rückstand wird mit kaltem Wasser nachgewaschen. In ihm wird nach Kjeldahl der Stickstoff bestimmt. Der gefundene X-Wert, mit (j'oT multi- pliziert, ergibt den (behalt an Gesainteiweilj. 2. Fällung mit Alaun und Kupferoxydhydrat Ritthansen-Munk.^) Man verdünnt 10 cm" Milch in einem 2b0 cdi^ fassenden Becherglas auf 100 crn^ mit Wasser, neutralisiert die möglicherweise alkahsch reagierende Lösung und erhitzt. Vor dem beginnenden Sieden fügt man 1 — 2 cm^ Alaunlösung zu, bei eben beginnendem Sieden 2 — 5 cm^ von aufgeschwemmtem, alkalifreiem Kupferoxydhydratbrei. Dann kocht man einige Minuten lang. Der feinflockige Niederschlag der Fällung setzt sich schnell nach Entfernen der Flammen ab. Man filtriert noch warm, wäscht den Filterrückstand mit heißem Wasser aus, verascht den Niederschlag mitsamt dem Filter feucht und bestimmt den Stickstoff nach Kjeldahl. Der gefundene N-Wert ergibt, mit 6"o7 multipliziert, den gesuchten Proteingehalt. 3. Bestimmung von Kasein und Albumin + Globulin in Tier- milch (mit Ausnahme der Eselinnenmilch). Man mischt 20 cm^ Milch mit ^SO ciH^ Wasser und fällt unter Umrühren solange mit verdünnter Essig- säure, bis sich ein flockiger Niederschlag bildet. Man beendet hierauf die Kaseinfällung durch Einleiten von Kohlensäure während i/o Stunde. Hierauf läßt man bis zum anderen Tag stehen. Da die Kaseinfällung nicht unter allen Umständen so gelingt, daß sich der Niederschlag gut zu Boden ab- setzt, so macht man diese Säurefällung gleichzeitig an 3 verschiedenen Milchproben imd wählt dann die bestgelungene zur weiteren Verarbeitung. Man filtriert zunächst die klare Flüssigkeit, dann den Niederschlag quanti- tativ durch ein N-freies Filter und wäscht den Filterrückstand gut mit Wasser aus. Dieser Filterrückstand wird mit starkem Alkohol übergössen. Die erst trübe durchlaufenden Filtrate werden wieder aufgegossen, bis ein klar ablaufendes Filtrat entsteht. Ist der Filterrückstand gut mit Alkohol durch- gefeuchtet, so läßt man diesen erst bei 40" verdunsten und wäscht dann mit Äther nach. Nun bringt man das gesamte Filter mit dem Rückstand in die Hülse eines Soxhletapparates und extrahiert lange Zeit mit Äther. Das nun entfettete Kasein wird mitsamt dem Filter verascht und auf seinen N-Gehalt nach Kjeldahl untersucht. Der N-Wert x 6"37 = Kasein- wert. Das Filtrat der ersten Kaseinfällung Avird auf Albumin und Globulin verarbeitet, indem man beide Eiweißkörper durch Erhitzen der Lösung auskoaguliert, auf einem Filter (juantitativ sammelt, auswäscht und dann nach Kjeldahl auf ihren N-Gehalt bestimmt. Dieser Wert x 6-o7 = Albu- min + Globulinwert. *) 7. Munk, Die /-MVasser verdünnt, auf dem Wasserbad auf 40" erwärmt und mit 1 ciii'' einei- konzentrierten Lösung von Kalialaun versetzt. Erfolgt nicht alsbald unter Umrühren eine inittel- flockige Abscheidung, so fügt man in Abständen von je ^/o -Minute noch 1/2 ('w*=> Alaunlösung hinzu, bis das gewünschte Ziel erreicht ist. (Ein Alaun- überschuß von mehr als 1 cm^ ist zu vermeiden.) Während der Fällung soll die Temperatur dauernd 40" betragen. Xun filtriert man (|uantitativ durch ein stickstofffreies Filter, bis man ein klar abflieljendes Filtrat ge- winnt, und wäscht den P'ilterrückstand gut mit Wasser aus. Eine N-I5estimmung nach Kjcldahl im Filterrückstand ergibt den Kaseingehalt ( siehe sub 3). Das klare I'iltrat der Alaunlösung wird mit 10 ein-' J/;y/enscher Gerb- säurelösung versetzt und nach der sub 1. beschriebenen Methode weiter verarbeitet. ö. Bestimmung von Albumin und Kasein 4- Globulin. 10 (///•= Milch werden mit oO — 40 c/v^^ einer gesättigten Mg8()4-Lösung versetzt. Hierauf trägt man l)ei einer Temperatur von 40" portionenweise fein pulverisiertes ^lagnesiumsulfat bis zur Sättigung ein. Von dem (ilobulin- und Kaseinniederschlag filtriert man nach einigen Stunden durch ein N-freies Filtei' ab und wäscht mit gesättigter MgS04-Lösung nach. (Die Filtration geht sehr langsam vonstatten!) Aus dem Filtrat, das man mit Wasser verdünnt, fällt man das Albumin durch Hitzekoagulation unter Essigsäurezusatz. Der sich abscheidende X'icdfi- schlag wird auf einem N-freien Filter (luantitativ gesammelt, gut ausge- waschen und auf seinen N-Gehalt nach Kjeldahl verarbeitet. Der ^'-^\■ert X (3*;m ergibt den Albumingehalt. Die Mg S()4 -Fällung wird nach einer der vorbeschriebenen Methoden entfettet und nach Kjeldahl auf den N-(iehalt untersucht. Dieser Wert, mit C);')! multipliziert, ergibt den Wert für (Jlobulin -1- Kasein. IV. Proteine des quergestreiften Muskels. Als Muskelproteine sind bekannt das Myosin (Myosinfibrin), Myogen (lösliches Myogenfibrin, unlösliches Myogenfibrin) und Myoproteid (^Xukleo- proteid). Die Körper in Klammern sind Umwandlungsprodukte der voran- gestellten Proteine. Als Ausgangsmaterial der Darstellung dieser Proteine dient ein Muskelplasma, das aus vollkommen blutfreien Muskehi gewonnen wird.') ') A. SchlossDKiJDi , Ülicr Eiweißstofl'e der iMileh iiiul die metliodisclie Trennung derselben. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 22. S. 221 (1.S97). -) 0. r. Fürth, Über die Eiweißkörper des Muskelplasmas. Arcli. f. exp. rbarni. u. Path. Bd.%. S. 231 (1895). 394 Fr. Samuely. Entbliituiig'. In die Jutiiilarvene eines Tieres lälU man 250 — 400 n«3 einer auf 35 — 40^ erwärmten physiologischen Kochsalzlösung einflieljen. Bei einem Verbrauch von 100—200 cm'^ beginnt ein Zittern des Tieres, doch wird die Prozedur im ganzen gut ertragen. Das Einfließen hat langsam zu erfolgen und muß bei Herzarhythmie oder verlangsamter Herz- aktion für einige Minuten unterbrochen werden. Nach dem Verbrauch dieser ^Nlenge {-iOO cm^) und bei noch guter Herzaktion läßt man aus der Karotis verbluten, während gleichzeitig der Rest der Kochsalzlösung nun- mehr schnell nachfließt. Zugleich macht man tüchtige Herzmassage. \oy dem Todeseintritt sollen zweckmäßig 300 — 600 cm^ Na Cl-Lösung bereits zugeflossen sein. Sofort nach dem Tode eröffnet man das Abdomen, präpariert die Aorta frei, bindet unterhalb des Abgangs der Nierenarterie eine Kanüle ein und läßt unter erheblichem Druck solange Kochsalzlösung zufUeßen. bis die aus der Hohlvene ablaufende Flüssigkeit farl)los bleibt. Unter Beuge- und Streckbewegung der Extremitäten beschleunigt man diesen Prozeß. Meist genügen im Maximum 1200 cm^ als Spülflüssigkeit. Muskelplasma. Man präpariert die Muskeln der Extremitäten ab, zerkleinert sie mit dem Wiegemesser (keine Fleischhackmaschine verwenden!), zerhackt sie mit dem Wiegemesser fein und zerreibt den Gewebebrei mit Bimsstein und einer O'O böigen Kochsalzlösung zu einem Brei. Dieser wird sofort oder nach iVufheben im Eisschrank in ein Kolier- tuch eingeschlagen und in der Tinkturenpresse ausgepreßt. Die ablaufende Flüssigkeit wird durch Faltenfilter filtriert. Bei einiger Geschicklichkeit läßt sich die ganze Prozedur vom Beginn der ersten Durchspülung in 25 bis 30 Minuten ausführen. Die Flüssigkeit stellt das Muskelplasma dar, das frei von Albumin sein soll. ^lan überzeugt sich von diesem Freisein. Das Plasma reagiert frisch meist schwach alkalisch oder neutral, wird aber beim Stehen in Zimmertemperatur meist sauer. Handelt es sich nicht um die Darstellung der von v. Fürth nähei* präzisierten Proteinkörper, so läßt sich ein Muskelplasma auch durch Extrahieren mit anderen Neutralsalzlösungen gewinnen. Man verwendet alsdann 12 — lÖ^oige Ammoniumchloridlösung oder 5o/oige Lösungen von Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat. Die Methodik bleibt in der Aus- führung die oben beschriebene. I. Darstellung und Trennung des Myosins und Myogens durch fraktionierte P'ällung mit Ammonsulfat (siehe S. :')93, Note 2). 1. Myosin (= Paramyosinogen von HalUhurton.'^) Man versetzt das albuminfreie Muskelplasma mit einer gesättigten Ammonsulfatlösung, und zwar so, daß auf 2 Teile Plasma P5 Teile Salzlösung kommen. Der entstehende Niederschlag setzt sich flockig ab. Die Flüssigkeit darüber wird abgegossen. Den Niederschlag löst man in einer verdünnten Kochsalzlösung, in der meist ^) W. D. Hallibiirfou, On musele proteids . . . Journ. of phys. Vol. 8. p. 331 (1887). IJarstelliiiig der rrütciuc der Tierwelt: Nicht iinstallisierlt;iro rroteinc. ;\\)'y f'iii Teil ii]ii>elöst bleibt, und filtriert die Lösung- ab. Das opaleszente Filti-at wird mit V^ seines \'olnmens gesättigter Aninionsulfatlösung versetzt, wodurch das Myosin erneut gefällt wird. Nach dem Abtrennen von dci- überstellenden Flüssigkeit löst man den Niedersehlag wieder in Wasser und fällt, falls eine Isolierung beabsichtigt wird, unter Denaturieren mit Alkohol. Das ausgefällte ]\Iyosin wird gut mit Wasser salzfrei gewaschen. Die genannten Manipulationen sind alle möglichst schnell durchziifidireu. da sich das Myosin durch Spontangerinnung — sichtbar an der Trübung seiner Lösungen — in unlösliches Myosinfibri ii verwandelt. 2. Myogen (= Myosinogen von Halliburton). Das ammonsulfathaltige Filtrat der eben genannten Myosinfällung wird auf eine Sättigung von oO^o Ammonsulfat gebracht. Verzichtet man auf die Darstellung des Myosins . so setzt man zum vornherein dem Muskelj)lasma das lV4foche seines Volums an gesättigter Ammonsulfatlösung zu und filtriert von dem entstehenden Niederschlag ab. Wenn das Filtrat dieses Niederschlags wirklich luyosinfrei ist, so darf eine kleine Probe desselben, auf 50° erhitzt, keine Abscheiduug mehr ergeben. Nunmehr sättigt man die Lösung durch Fin- trageu von feingepulvertem Ammonsulfat in Substanz, filtriert von dem gebildeten Niederschlag ab, wäscht diesen mit gesättigter k\\\ SO^-Lösung aus, preßt ihn ab und löst ihn in Wasser. Die klar filtrierte Lösung erhitzt man auf 40°, um dadurch lösliches Myogenfibi-in zu beseitigen (siehe unten). Eventuell kann dann eine UmfäUung mit Ammonsulfat voi'genommen werden. Aus der Lösung läßt sich das Myogen zuletzt mit Alkohol fällen, salzfrei waschen und unter Denaturierung mit Alkohol und .'Ulier trocknen. Lösliches Myogenfibrin findet sich nicht im frischen .Muskel- plasma der Warmblüter, w^ohl aber in älteren, 1 — 2tägigen riasmen. da es sich beim Stehen des Plasmas allmählich aus Myogen bildet. Im Muskel- plasma der Kaltblüter (Fische und Amphibien) ist das lösliche Myogen- fibrin ein präformierter Bestandteil. Man fällt aus diesem Plasma das Myosin durch Ilalbsättiguiig mit -Vnnnonsulfat. Die von dem Niederschlag abfiltrierte Lösung wird auf 40" erwärmt. Das Auftreten einer Trübung oder Flockung zeigt die Anwesen- heit des Myosinfibrins an. IL Trennung des Myosins vom Myogen: a) Durch Dialyse: h) durch fraktionierte Wärmekoagulation. Xi\a) Dialyse: Man füllt das ali)uminfreie ]\Iuskelplasma in Dialysen- schläuche aus Pergament und dialysiert 12 — 24 Stunden gegen laufendes, dann ebenso lange gegen destilliertes Wasser. Der entstehende Niederschlag. (las ;Myosin, wird abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und eventuell nach Wunsch durch Erhitzen auf 45 — 50» in Myosinfibrin ver- wandelt. Das Filti-at. wek-hes Myogen (und lösliches ^Myogenfibrin ) enthält, wird, wie oben beschrieben, weiter behandelt, eventuell sofort mit .Vlkohol gefällt. Ad />^ Fraktioniertes Auskoaguliei-en. Die genannten Eiwcifi- körper haben sehr verschiedene, miteinamler nicht zusammenfalleude Koa- 396 Fr. Saniuely. gulationstemperatureii. Im Plasma gerinnt Myosin bei 47 — 50'\ Myogen gerinnt bei 55 — (jö" und Icisliches Myogenfibrin bei 40". Es ist daher die Möglichkeit vorhanden, die verschiedenen Proteine durch Koagulieren in einem Muskelplasma nebeneinander präparativ, quali- tativ imd (quantitativ zu bestimmen. Wir beschreiben sofort die quantitative Bestimmung, aus der die Bedingungen für die Methodik der Darstellung oder Trennung sowie für den (qualitativen Nachweis Idar hervorgehen: Quantitative Bestimmung der Muskelproteine. M Man erhitzt eine Probe von 10 cni^ frischen Muskelplasmas einige Zeit auf 100°. Die Menge des ausfallenden Koagulates stellt das Gesamteiweiß dar. Eine zweite Probe von 10 cni^ wird während 5 ^Minuten auf 40" er- hitzt. Es koaguliert das präformierte, lösliche Myogenfibrin. 10 cm^ werden während 5 Minuten auf 50" erhitzt. Es fällt das Myosin + lösliches Myogenfibrin aus. Eine vierte Probe, auf 70" erhitzt, enthält Myosin und das Myogen als unlösliches Myosin- bzw. Myogenfibrin. Zum Zweck gleichmäßiger Gerinnungsbediugungen bringt man die einzelnen 5 Proben in gleich große Zentrifugengläschen von gleicher Wand- stärke und taucht sie in ein auf die gewünschte Temperatur gebrachtes Wasserbad ein. Die Temperatur kontrolliert man mit einem Thermometer, das nicht in eine der Proben selbst, sondern in ein sechstes, mit Wasser gefülltes Pvöhrchen eintaucht. Natürlich muß auch die Badetemperatur direkt am Thermometer gemessen werden. Die Temperaturschwankungen dürfen bei gutem Umrühren im Wasserbad 1" nicht ül)ersteigen. Die Niederschläge werden dann in der Zentrifuge dekantiert, mit destiUiertem Wasser unter Aufschwemmen und durch erneutes Zentrifugieren chlorfrei gewaschen. Die Waschwasser schickt man zur Sicherung vor Ver- lusten durch vorher gewogene Filter und spült schließlich die Niederschläge quantitativ auf die Filter; dann wäscht man mit Alkohol und Äther nach, trocknet bei 110" und wägt nach dem Erkalten. Die Tabelle gibt die Resultate für ein normales Kaninchenmuskelplasma wieder (Steyrer). Niederschlag Niederschlag in "L des Myosin : In lU cDi^ Plasma in Gramm U (xes. -Eiweiß Myogen Gesamteiweiß . . 100" 0-My2';) 100 Myosin + ^lyogen . 70" 0-3490 96-33 Myosin 50 'J 0-0637 18-25 18:78 löslich. Myogenfibrin 40" 0-0061 1-68 Albumin .... 3-67 Die absoluten Mengen der Muskelproteine lassen sich durch Subtraktion einer Fraktion der Tabelle von der nächst höheren der Tabelle bestimmen. *) H. Steyrer, Ein Beitrag zur Chemie des entarteten Muskels. Hofmeisters Bei- träge. Bd. 4. S. 234 (1904). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare rrotciuc. 397 das eventuell vorhandene Albumin resultiert aus der Differenz der letzten Koagulationsfraktion (70") vom Gesamteiweiß (lOO*^). Für die ([ualitative oder präparative Bestimmung verfährt man so, daß man hintereinander auf 40°, öO» und 70" erhitzt und vor jeder Koagulation bei der nächst- höheren Temperatur von dem abgeschiedenen Koagulat abfiltriert. 3. Myoproteid ist ein Körper, der im Muskelplasma der Warmblüter nicht vorkommt. Er findet sich mit Sicherheit nur im Fischmuskel (siehe S. n98, Note 1). Darstellung: Aus blutfreien Muskeln des Karpfens oder aus käuf- lichem Fleisch von Seefischen, aus denen genau wie aus Warmblütermuskoln ein Plasma hergestellt wird. ^lan versetzt das Plasma vorsichtig mit verdünnter Essigsäure bis zu eben saurer Pieaktion und kocht dann 10 Minuten lang. Nach dem Abfil- trieren von dem entstandenen Koagulum bleibt ein klares, goldgelbes Filtrat, das nach dem Abkühlen mit Essigsäure zu stark saurer Reaktion ver- setzt wird. Das weiße, flockig ausfallende Proteid läßt man absetzen und dekantiert es wiederholt mit Wasser. Dann löst man in verdünnter Am- moniaklösung, fällt wieder mit Essigsäure, filtriert und löst nach gutem Abpressen mit verdünnter NHy-Lösung. Hierauf neutralisiert man die Lösung mit Essigsäure, fällt mit Alkohol und behandelt den abfiltrierten Nieder- schlag mit heißem Wasser, Alkohol und Äther. 4. Das Nukleoproteid der quergestreiften Muskeln {Pekel- haring^). Man tötet das Tier (Hund , Kaninchen) durch Verbluten und durch- spült von der Aorta abdominalis mit physiologischer Kochsalzlösung. Läuft die Spülflüssigkeit klar und farblos aus der Vene ab, so präpariert man die Muskehl der unteren Extremitäten frei von Fett und Bindegewebe und zerhackt sie fein. Darauf extrahiert man mit 0"löo/oiger Na., COj -Lösung. Die Extrakte, die nach einigen Stunden aus den Muskeln durch geringen Druck ausgepreßt werden (etwa 11 auf 500^ Fleisch), werden durch Filter ge- saugt und bis zu ziemhch stark saurer Pieaktion mit Essigsäure versetzt. Es bildet sich ein Niederschlag, der in der Zentrifuge von der Flüssigkeit getrennt und aus sehr verdünnter NHa-Lösung mit Essigsäure umgefidlt wird. Der Körper wird wiederum in der Zentrifuge ausgeschleudert, abfiltriert und erst mit 85o/oigem, dann mit absolutem Alkohol und Äther gewaschen. Ausbeute aus 548(7 Fleisch: i2 g lufttrockenes Proteid. Der Gehalt an Phosphor beträgt 0-7%, Asche 0-4()"/o. Der Körper, der, wie die Nukleoproteide mit Pepsinsalzsäure behandelt, ein säureunlösliches Nuklein abspaltet, enthält Alloxurbasen. Identifiziert ist nur das Guanin. Das Nuklein enthält 3-5% Phosphor. Die Beziehung dieses Proteids zu dem Myoproteid v. Fürths ist nicht festgestellt. Vielleicht sind beide Körper identisch. i^ '■) C. A. Fel-elhari))fi, l'ber das YorhaiideHsein eines Nuklooproteids in den Muskeln. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 22. S. 245 (1897). :-',98 Fr. Samnely. V. Proteine der glatten Muskelzellen. Es liegen Untersuchungen von Velichi^ Capelli, Swale, Vincent, Lewis und V. Fürth vor. ^Methodisch bieten die Untersuchungen nichts Neues im Vergleich zu den bereits genannten Darstellungsmethoden. Die Prinzipien sind die einer Extraktion des Muskelmagens vom Schwein, von der Gans oder vom Schaf, von Uterusmyomen, von Stichopusarten (Seewalze) und von Cephalopoden\) mit physiologischer NaCl-Lösung und Trennung durch Dialyse in ein fällbares Globulin und ein gelöstes Albumin (V), oder fraktioniertes Koagulieren oder Fällen mit Am., SO^ nach v. Fürth. Die technischen Details solcher Untersuchungen sind die sub 11 a, I> beschrie- benen (S. 395). Die isolierten Fraktionen stimmen nicht mit den durch r. Fürth so gut definierten Proteinen der quergestreiften Muskeln überein. VI. Sonstige Albumine und Globuline. Wir sind bisher in der Besprechung der nicht kristallisierenden tierischen Proteine so vorgegangen, daß wir nicht die Reihenfolge der üblichen Pro- teinsystematik eingehalten haben. Wir haben es vorgezogen, die Besprechung an der Hand von einigen Körperflüssigkeiten durchzuführen. Die Berechti- gung hierzu glauben wir darin zu finden, daß diese Gewebssäfte hinsichtlich der in ihnen vorkommenden Proteine wohl am besten erforscht sind, und daß wir auch annnehmen dürfen, daß die in ihnen enthaltenen Proteine endgültig qualitativ und quantitativ bestimmt sind. Es fäUt dabei auf, daß wir es hier mit Flüssigkeiten oder mit Organen zu tun hal)en, die in ihrem Proteingehalt sehr konstant zusammengesetzt sind (Serum, Eier, Milch). Bei weitem geringere Erfolge weist die Forschung im Studium der Organ- und Zelleiweiße auf. Wir müssen gestehen, daß wir heute noch nicht imstande sind, etwa chemisch von einem Organ ei weiß, d. h. etwa von einem speziellen Lebereiweiß oder Niereneiweiß zu sprechen. Wir wissen nur, daß in den Organen und in einigen Sekretprodukten drüsiger Organe oder in unseren Stützgeweben noch eine Ileihe von Eiweißkörperu vorkommen. In der Besprechung dieser Proteinsubstanzen müssen wir uns aber an die alte, klassische Systematik der Proteine halten. Denn wir können von diesen Proteinen nur sagen, daß sie auf Grund dieser oder jener Eigenschaften in diese oder jene Proteingruppe einzuordnen sind, nicht aber, daß sie etwa die speziellen Eigenschaften einer Organzellart aufweisen. Der Besprechung dieser Körper schließen wir in einem Anhang die Abhandlung jener Proteinsubstanzen an, die durch sekundäre Veränderung genuiner Proteine, einerlei welcher Klasse und Herkunft, entstehen, d. h. die eiweißartigen, künstüchen Umwandlungsprodukte der Proteine. ^) 0. V. Fürth, Über die Eiweißkörper der Kaltbliitermuskeln und ilire Beziehungen zur Wilrmestarre. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 31. S. 238 (1900). I I Darstellung der rroteiiie der Tierwelt: Nicht kristaliisicrbaie l'roteiue. :',{)[) Albumine. Außer den bereits genannten Albuminen in Serum. C'iiyhis, Mik'li und Ei sind keine weiteren all)uminartigen Proteine bekannt. (xruppe der Globuline. Außer den genannten Globulinen im Blut. FA, Milch, Kolostrum und Muskel sind eine ganze Reihe von Zellglobulinen isoliert. Wir erwähnen die Darstellungsmethode solcher Globuline, fügen aber hinzu, daß ihre Präexistenz im Gewebe nicht garantiert ist, und daß die Spezifität und Einheitlichkeit solcher Körper bis jetzt ganz unbewiesen ge- blieben ist. Generelle Darstellungsmethode der Zellg-lobuline. DarsteUung nach Hnlliburfon'^): Die Niere oder Leber wird in situ post mortem von der Aorta abdominalis aus mit (Xj^/oigei" Kochsalz- lösung blutfrei gespült. Die Organe werden hierauf fein zerkleinert und mit 5"V'oiger Magnesiumsulfatlösung kalt extrahiert. In den kalten p]xtrakt- lösuuüen kann man sich durch fraktionierte Bestimumng von Koaiiulations- temperaturen über die Zahl und vielleicht auch über die Natur der in ihnen gelösten Proteine orientieren, auch durch Versuche der Salzfällung die P'ällungsgrenzen dieser Körper genauer festlegen. Nach Pohl-): Man befreit das zu verarbeitende Organ nach Mög- lichkeit von Blut, indem man es in situ von den zuführenden Arterien aus so lange mit O'So/oiger Kochsalzlösung durchspült, bis die Spülflüssig- keit aus den al)führenden oder entfernteren ^>nen farblos abläuft. Bei der Leber z. B. schickt man die Lösung rückläufig durch die \'eua Cava ascendens und läßt durch die abdominellen Gefäße ablaufen, indem man temporär die Gefäße am Leberhilus, die ^'enae gastroduodenales und die Cava ascendens mit Klammern verschließt, um die Elüssigkeit vorübergehend zu stauen. Das ganz entblutete Organ zerkleinert man zu einem feinen Brei und schüttelt diesen nach Toluolzusatz tüchtig mit O'S^/niger NaC'l-Lösung durch. Nach 24stündigem Stehen in der Kälte wird durch Filtration ein Plasma gewonnen, das nach wiederholtem Zurückgießen der ersten Filtratportionen klar und durchscheinend ist, neutral reagiert und die Farbe von Blutserum hat. Das Verhalten dieser Eiweißlösung gegen Neutralsalze spricht für einen Gehalt an Globulinen, ohne daß es bisher möglich wäre, verschiedene Organ- globuline zu unterscheiden. Zu ihrer F)arsteUung säuert man mit Ol — 0-2«/oJ"'('^" Essigsäui-e schwach au. Es entsteht sofort ein (im Säureüberschuß unlöslicher!) Niederschlag. Dieser Niederschlag kann zur Peinigung in verdünnten Alkalien gelöst werden. (Im Gegensatz zur Globulinnatur ist der Körper in Neutralsalz- lösungen unlöslich!) Durch erneuten Säurezusatz wird das Organeiweiß wieder gefällt. Da Spontangerinnungen der Lösungen leicht eintreten, so ist schnelles Arbeiten angezeigt. M W. D.Hallihurton, The proteids of kidney and liver cells. Journ. of physiol. Vol. 13. p. 808 (1880). -) J. Fohl, Über Orgaueiweiß. Hofmeisters Beiträge. Bd. 7. S. 381 (1906). 400 Fr. Samnely. Eine Fraktioiiieriiiiii' dieser Glol)iiline, etwa diiix-h Dialyse, gelingt nicht Die Lösungen trül)en sich Ijei wochenlaugem Dialysieren, verlieren die Fähig- keit, bei 40" zu koagulieren und werden unfälll)ar durch Salzsäure (Gegen- sätze zu echten Globulinen). Elementarzusaramensetzung eines Leberglobulins der Pferdeleber: C 47-21— 48-43, X 16-35. H (3-79, S 0-99, V 1-;',, Fe -f «/o Der Phosphorgehalt schwankt zwischen 0-28 — l'3°yV Globuline der Kristallinse: a- und ß-Kristallin. Darstellung eines Plasmas durch Wasserextraktion der Linse nach Mör)ier.^) Die Linsen (ca. 30^) werden mit destiUiertem Wasser oder Vi -gesättigter Kochsalzlösung (10 cm^ auf \g Linsensubstanz) in einer Flasche geschüttelt. Nach iV.jtägigem Schütteln haben sich alle Linsenfasern in Wasser aufgeschwemmt. Die nicht zerstörten Linsenkerne werden in einer Reibschale zerdrückt. Dann wird das Schütteln fortgesetzt, bis die ganze Linsenmasse gleichmäßig im Wasser verteilt ist. Nach Verlauf eines Tages hat sich die Hauptmasse der Fasern zu Boden gesenkt. Die überstehende Flüssig- keit wird al)filtriert. Der Bodensatz wird dann wiederholt noch so oft in der beschriebenen Weise mit der Salzlösung zur Extraktion geschüttelt, bis die Filtrate keine Beller^clie Eiweißprobe mehr geben. Das Ungelöste wird zur Isolierung von Albumoiden verwandt. Das Linsenplasma, das auf (Tlobuline verarbeitet werden soll, wird zweckmäßig mit Wasser, nicht mit Kochsalzlösung hergestellt. 1. a-Kristallin: Man stellt das Extrakt in der beschriebenen Art aus der ganzen Linse, oder nur aus ihrer äußeren Hälfte dar. Das klar filtrierte Extrakt wird mit Essigsäure gefäUt, so dal'i die Mischung 0-02 — 0-04''/o an Essigsäure enthält. Der feinflockige Nieder- schlag wird abfiltriert, was leicht geschieht. Dann läßt man eine 2 — ;>malige Umfällung durch Lösen in O-OP/ßigem Ammoniak und Fällen mit äußerst verdünnter Essigsäure folgen. Die letzte P'ällung wird auf dem Filter mit Alkohol und Äther l)e- handelt und getrocknet. Zur Ausführung von Pieaktionen wird der Körper vor der Alkoholbehandlung zu neutraler Lösung in äußerst verdünntem Ammoniak gelöst. 2. [i-Kristallin wird aus den Wasserextrakten der inneren Linsenteile dargestellt. Durch Schütteln in der oben beschriebenen Weise wird ^/^ bis V5 der Linsenmasse erst entfernt; die Linsenkerne werden dann abfiltriert und genau in der beschriebenen Weise getrennt weiter verarbeitet. Die Reini- gung des mit Essigsäure gefällten Körpers geschieht durch L^mfällen oder Alkoholzusatz. Eigenschaften. Die Kristalline verhalten sich gegen Am^ SC)^ oder MgSO^ wie echte Globuline. Abweichend von Globulineigenschaften ist die *) C. Th. Mörner, Untersuchungen über die Proteinsubstanzen in den lichtbrechen- den Medien des Auges. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 18. S. 61 (1894). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 401 Erscbeinniig', dali sie aus ihrer Lösiin{.i' weder durch Verdünnung' noch durch (Janzsättigung' mit Kochsalz fällbar sind. a-Krislallin: C Ö2-8H, H 6-94, N 16-68, 8 0-ö6Vo. (z)„ = — 46-9" (in ;')-29Voiger Lösung). Koagulationsteuiperatur: T;')<* in l-Mo^/oiger Lösung. ß-Kristallin.: X 17-4. S 1-27. Koagulationstemperatur 6:;". (x)o =r — 4:3-1— 43-^] (in 1-80— H-12o/oiger Lösung). Das Totaleiweiß der Linse besteht aus :)2''/o ß- und 19-50/0 z-Kristallin neben 0-5Vo Albumin und 48% Albumoid. Globulin der Thyreoidea. Thyreoglobulin ist ein natürliches Halogeneiweiß mit typischen (Tlobulineigenschaften. Durch Säurehydrolyse läßt sich aus ihm das Jodothyrin gewinnen. Darstellung nach Osivald^: Als Ausgangsmaterial wählt man am besten Schilddrüsen vom Schwein (da die Thyreoglobuline verschiedener Tiere nicht den gleichen Gehalt an Jod aufweisen, so nuiß man, wenn man etwa später die Darstellung einer größeren Menge Jodotliyrius erstrebt, eine möglichst jodreiche Drüse verarbeiten. Am reichsten jodhaltig ist das Globulin des Ochsen, O-860/o^ ''^"^ ärmsten das des Hammels, 0-:-39Vo- Innerhall) derselben Tierart schwankt der Jodgehalt mit der geographi- schen Verbreitung des Tieres und mit dem physiologischen Zustand der Drüse). Die frische, fettfrei präparierte Schilddrüsenmasse wird fein zerhackt, im Mörser mit (^)uarzsand zerstoßen und hierauf mit physiologischer Koch- salzlösung angerührt. Den dünnen Ib'ei läßt man nach Zusatz von etwas Thymol in Substanz oder in alkoholischer Lösung 24 Stunden im Eis- schrank stehen. Alsdann koliert man durch ein Tuch und versetzt das rötliche, ti-übe Extrakt mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Ammon- sulfatlösung. Der entstehende Niederschlag setzt sich uacli einiger Zeit zu Boden, wird auf einem Filter gesammelt, mit halbgesättigter Anig SO^- Lösung gewaschen, bis seine rötliche Farbe in eine graue Farbe um- geschlagen ist. Dann löst man in Wasser und filtriert die trübe Lösung durch zahlreiche Faltenfilter. Jedem Trichterinhalt setzt nnm etwas Thymol zu. Die ersten trüben Filtratanteile werden wieder auf den Trichter gebracht. Da die Filterporen meist verstopfen, küivt man das langwierige Filtrieren, indem man die Filter täglich erneuert. Es dürfen zur weiteren Verarbeitung nur unbedingt klare, zellfreie Filtrate verwandt werden. Zu den vereinigten Filtraten setzt man das gleiche \'obimen ge- sättigter Ammonsulfatlösung. Der jetzt schneeweiße, sich bald zusammen- ballende Niederschlag dieser Fällung wird auf einem Seidenfilter gesanmielt, als- ')A.OsiraJd, Die Eiweißloirper der Sdiilddnise. Zeitsclir. f. pliysi.d. (licmie. Bd.27. S. 64 (1899). — Zur Kenntnis des Thyrcoglol.idins. ll.id. Bd. 32. S. 121 (1901). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. 11. 2G 402 Fr. Samuely. dann in Wasser gelöst, bis zur Schwefelsäurefreilieit der Lösung dialysiert. hierauf mit 96%i8'^ii^ Alkohol aus seiner Lösung gefällt. Der Körper wird dann auf Seidenfilter gesammelt und mit Alkohol und Äther nachbehandelt. Anstatt der Ammonsulfatlösung läßt sich das Thyreoglobulin aus den klaren Drüsenextrakten auch mit Essigsäure fällen. Man setzt solange verdünnte Essigsäure zu. bis der entstehende Niederschlag flockig wird. (Ein Säureüberschuß ist zu vermeiden!) Der auf einem Seidenfilter gesammelte Niederschlag v,'ird aus seiner Lösung in sehr verdünntem Alkali (ITeil Na OH auf 1000 Teile Wasser) abermals mit Essigsäure ge- fällt, mit angesäuertem Wasser dekantiert, auf dem Filter gesammelt und getrocknet. Das Filtrat der erstmaligen Fällung dieses Globulins wird zur Verarbeitung auf das Nukleoproteid der Thyreoidea verwendet. Eigenschaften. Der Körper hat in seinem Verhalten gegen Salz- lösungen Globulineigenschaften, verhält sich aber nur insofern abweichend, als er aus seinen mäßig salzhaltigen Lösungen durch Zusatz verdünnter Säuren ausfällt. Koagulationstemperatur 05'' in einer lOVoigen Mg SOi-Lösung . in salzfreier Lösung tritt keine Hitzekoagulation ein. Der Körper enthält eine Kohlehydratgruppe, die keine Pentose ist. Elementarzusammensetzung im Mittel: C 52-01, H 6-93, N 16-61, J 1-57, S 1-95, (0 20-85), Asche 0-42 bzw. C 51-96. H 6-68, N 16-54, J 1-75, S 1-77, Asche 0-47Vo- Darstellung von Jodothyrin (Thyreo jodin) direkt aus der Schild- drüse (Baumami). '^) Man kocht am besten Hammelschilddrüsen oder stark jodhaltige Strumen während 15 Stunden mit lO^/oiger Schwefelsäure. 4 Gewichtsteile Säure auf 1 Teil Drüseugewebe. Aus der abgekühlten Lösung wird das Fett mechanisch oder durch Kolleren entfernt. Der in der Lösung befindliche flockige Jodothyrinniederschlag wird auf dem Filter gesammelt. Ausbeute ^4 — lV2*'/o des Drüsengewichts. Durch Einengen des in seiner sauren Reaktion abgestumpften Filtrates, noch besser nach Entfernen der Schwefelsäure mit Baryumkarbonat werden noch geringe Mengen Jodothyrin ausgefäUt. Die vereinigten feinsten Niederschläge werden wiederholt mit 90Voigem Alkohol ausgekocht. Die alkoholischen Extrakte werden eingedunstet. Der Rückstand wird mit der lOfachen Menge Milchzucker zerrieben und mit Petroläther, dann mit einem Ge- menge von wasserfreiem Äther mit Petroläther ausgezogen. Nach Entfer- nung des Milchzuckers mit der 7fachen Menge heißen Wassers wird in Na OH gelöst (5<'/oi&) und mit Essigsäure gefällt. Lösung und Fällung werden wiederholt. ^) E. Balimann, t)ber das normale Yorkommen von Jod im Ticrknrper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 21. S. 319 (1895). — E. Baumann und E. Boos, ibidem. Bd. 21. S.481 (1896): ferner Bd. 22. S. 1 (1896). — E. Boos. Über die Wirkung des Thyreo- jodins. Ibidem. Bd. 22. S. 16 (1896). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierhare Proteine. 40;j Elementarzusammensetzung: C 58*2, HT'4, N S^O, S 1-4. J J4-:J, Asche 0-4Vo- Ein dem Thyreojodin Baumanns ähnlicher, vielleicht mit iliiii iden- tischer Körper läßt sich durch Hydrolyse von Thyreoiiiobnlin nach Osir/ihn) isoheren. Die Einheitlichkeit und Reinheit beider Körper ist nicht gesichert. Gruppe der Nukleoalbumine. Man bezeichnet mit diesem Namen giobuliiuiliuliche Proteine, die durch den Gehalt an Phosphor, einige wenige auch durch den Gehalt einer Kohlehydratgruppe ausgezeichnet sind. Der Begriff Xukleoall)U- mine ist scharf von dem der Xukleoproteide zu trennen, denn es fehlt den ersteren das Charakteristische der letzteren, die im Molekül enthaltenen Purinbasen. Da man aus einer x\nzahl von Xukleoalbuminen durch Verdauung mit Pepsinsalzsäure oder durch andere gelinde hydrolytische Büttel einen in verdünnten Säuren und Wasser unlöslichen Körper gewinnen kann, der in seinen äußeren Eigenschaften an das aus den echten Xukleo- proteiden unter gleichen Bedingungen entstehende X^iklein, bzw. die aus diesem hervorgehende Nukleinsäure, erinnert, so bezeichnete man die X^ukleoalbumine auch als Paranukleoproteide, und jene abspaltbaren Körper als Para- oder Pseudonukleinsäure. bzw. Paranuklein. Auch glaubte man in dem Entstehen eines solchen Paranukleins eine für die Körperklasse der X^ukleoalbumine charakteristische Eigentündichkeit zu erkennen. Die Bezeichnung ..Nukleoalbumin" ist eine unglückliche, und die angebliche Spezifität der Paranukleine ist nicht vorhanden. Der x\ufbau eines Nukleoalbumins aus einer Nukleinsäure bzw. einem Nuklein und einer Eiweißkomponente im Sinne einer proteidartigen Bindung ist ganz unbewiesen. Man täte gut, den Namen Nukleoalbumine, der durch das Wort ..Nukleo" zu ^'erwechslungen führen könnte, ganz durch das Wort Phosphoglobulin zu ersetzen (Cohnheim). Enthält ein solches (Globulin auch ein Kohlehydrat, so spricht man von einem Glykophos- phoglobulin. Wie wir die durch Spaltung der „Xukleoalbumine" entstehenden „Paranukleine" auffassen sollen, ist noch unentschieden. Wir können in diesen Substanzen nur besonders geartete, komplizierte P>ruchstücke des ursprünglichen Proteins sehen, deren Zusammensetzung offenbar von der Darstellungsmethode, d. h. dem angewandten hydrolytischen Agens und der Intensität seiner Wirkung mehr abhängig ist, als von der verarbeiteten Muttersubstanz selbst. Die Feststellung eines Proteins als Nukleoalbumin geschieht durch den Xachweis des Phosphorgehalts bei gleichzeitigem Fehlen von ') A. Oswald, Die Eiweißkörper der Schilddrüse. Zeitschr. f. pliysiol. Cliemie. Bd. 27. S. 14 (1899); Zur Kenntnis des Thyreoglobulius. Ibidem. Bd. 32. S. 121 (1901). 26* 404 Fr. Samnely. Purinbasen nach vorangegangener Hydrolyse. AVichtig ist ferner, daß Nukleoalbumine in neutraler Lösung, d. li. die Salze der Nukleoalbumine, in der Hitze nicht koagulieren. Das Entstehen eines Paranukleins unter Pepsinsalzsäurewirkung kann ebenfalls zur Identifikation verwertet werden. Das Ausbleiben einer solchen Paranuklein])ildung spricht aber nicht gegen die Xukleoalbuminnatur. Alle übrigen Eigenschaften der Löslichkeit in Alkali, Fällbarkeit mit verdünnten Säuren sind für eine Feststellung nicht verwendbar, da die Nukleoalbumine in dieser Beziehung sich wie manche Xukleoproteide oder Mukoide verhalten. Die Abgrenzung von den letzteren, deren Alkalisalzlö- sungen keineswegs immer schleimig und fadenziehend sind, ist bisweilen schwierig oder unmöglich, da es ja auch kohlehydrathaltige Nukleoalbumine (Ichthuline) gibt, ebenso wie auch phosphorhaltige Mukoide ( Helikoproteid) existieren. 1. Nukleoalbumin aus PJndergalle (sog. Gallenmuzin ). Darstellung nach FaijlifU^): Rindergalle wird mit dem 5fachen Volu- men absoluten Alkohols gefällt. LTnmittelbar nach voUzogener Fällung wird zentrifugiert. Nach 10 Minuten hat sich ein Niederschlag abgesetzt, so daß man die überstehende Lösung abgießen kann. Der zu einem festen Klumpen zusammengeballte Bodensatz wird herausgenommen, mit Filtrier- papier oberflächlich getrocknet und in Wasser gesteckt. Es entsteht schnell eine opalisierende, schleimig fadenzichende Lösung. Zur Befreiung von gallensauren Salzen fällt man den Körper aus seiner Lösung aber- mals mit absolutem Alkohol, trennt in der Zentrifuge und löst wieder in Wasser. Aus dieser wässerigen Lösung fällt man den Körper durch vorsich- tigen Zusatz von verdünnter Essigsäure (kein l''berschuß ! ) und dekantiert den Niederschlag gut mit Wasser; dann löst man mit Hilfe von wenig Alkali bis zu neutraler Reaktion und fällt von neuem mit Essigsäure. Dieses Lösen und Fällen wird ein zweites Alal wiederholt. Die zuletzt entstehende, möglichst konzentrierte Lösung mrd mit viel Alkohol unter Zusatz von ein wenig Essigsäure gefällt. Der Niederschlag wird dann wochenlang mit oO^oig^i^ Alkohol in zu erneuernden Mengen digeriert, bis in dem farb- losen Waschalkohol keine Gallensäuren mehr vorhanden sind. Danach trocknet man mit Äther und zuletzt im Vakuum bei 110". Das fragliche Nukleoalbumin läßt sich auch aus der Gallenblasen- schleimhaut selbst darstellen. ]\Ian befreit die abpräparierte Mukosa durch Waschen von anhaftender Galle und extrahiert die Schleimsubstanz, indem man die unbeschädigte innere Oberfläche der Schleimhaut 2 Tage laug mit Wasser in Kontakt beläßt. Die aus solchen Extrakten dargestellte Substanz ist reiner, als das immer noch gelblich gefärbte Präparat aus der Galle selbst. ^) L. Z. Paijkull, Über die Schleimsubstauz der Galle. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 12. S. 196 (1887). Darstellung clor Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 405 Eigenschaften. Der Körper hat in seinem Verhalten zu Alk.ilien und Säuren iMuzineigenschaften. Es fehlt ihm aber die für ^Müzine charak- teristische Kohlehydratg-ruppe. Auch enthält derselbe Phosphor und liefert mit Pepsinsalzsäure ein phosphorreiches Nuklein. Elementarzusammensetzung': Cö0"89, H(V7, N l(yl4, >S POO»,,,. Der Körper koaguliert in salzfreier Lösung nicht, wohl aber nach Zusatz einer Spur Essigsäure. 2. Dem sog. Nukleoalbumin der Galle schließt sich hier eine kleine Zahl von Körpern an, die, wie die vorbeschriebene Substanz, große äußere Ähn- lichkeit mit ^Müzinen bzw. mit Mukoiden haben, die aber durch ihren Phosphorgehalt und die Erscheinung der Abspaltung eines phosphorreicheren Paranukleins der bisher gültigen Definition eines Nukleoalbumins gerecht werden. Das Interesse, das diesen Körpern gebührt, ist kein geringes, da wir dieselben meist im Gefolge pathologischer entzündlicher Prozesse in Se- kreten und Exsudaten auftreten sehen (Harn, Trans- und Exsudate, Synovia). P)ie Darstellungsweise dieser Substanzen aus Synovia (Hammarsten), Transsudaten (Faijkull), Blasenschleimhaut und Niere (Lörmherg) ist einheitlich. Man stellt aus den zerkleinerten ( )rganen kalte oder heiße Wasser- bzw. Alkali- (0-05 — O'lVo) Extrakte dar und fällt in diesen die nmzinähnlichen Körper mit verdünnter Essigsäure. Durch wiederholtes Lösen in ganz verdünntem Alkali und Fällen mit Essigsäure in der oben wiederholt beschriebenen Weise kann man eine Reinigung der Substanz erstreben. Die Identifikation mit einem sogenannten Nukleoalbumin kann stets nur eine indirekte sein, indem man das Bestehen eines Nukleoproteids durch den negativen Ausfall des Purinbasennachweises und das eines Muzins durch das Fehlen einer reduzierenden Komponente nach vorangegangener Hydro- lyse mit 0"oVoig"€'i' Salzsäure feststellt. Das Auftreten eines ..Nukleins" bei der Spaltung mit Pepsinsalzsäure, das sich aus allen ..Nukleoalbuminen", aus den genannten Körperflüssigkeiten und Organen isoHeren heli, ist kein definitives Beweismittel für die chemische Natur oder wenigstens chemische Rangordnung des fraglichen Körpers. I. Die sogenannten Para- oder Pseudonukleine der Nukleoal- bumine. Generelle Darstellungsmethoden. Man versetzt eine Lö- sung der zu prüfenden Substanz oder den ungelösten Körper am besten mit einem wirksamen natürlichen Hundemagensaft oder mit einer Mi- schung von O'iVoiger Salzsäure mit wirksamem käuflichem Pepsin. Das Gemisch oder die Lösung bleibt einige Zeit bei ;)7" im Ih-utschrank stehen. (Um zu gleichmäßig zusammengesetzten Körpern zu kommen, wird man wohl stets gleichlange Verdauungszeiten und Konzentrationsbedingungen einhalten, da die Paranukleine keineswegs absolut fermentresistent zu sein scheinen; so sah SaR-owsU bei A'erdauung von 1 Teil Kasein mit öOO Teilen Verdauungslösung alles Paranuklein verschwinden, unter Abspaltung des in ihm enthaltenen Phosphors als Phosphorsäure.) Man filtiiert nach einer geraumen Zeit den am Boden befindlichen Niederschlag al), wäscht ihn mit 406 Fr. Samuely. Wasser aus und unterwirft ihn unter Umständen nochmals einer Verdau- ung. Alsdann filtriert man das Ungelöste ab und wäscht es bis zum Verschwinden der Biuretreaktion in den Waschflüssigkeiten mit Wasser aus. Man reinigt durch wiederholtes Lösen in einer zur Lösung eben aus- reichenden ^lenge von stark verdünntem Alkali und erneutes Fällen mit verdünnten Säuren. Die letzten Fällungen werden auf dem Filter auf einander folgend mit heißem Wasser, Alkohol und Äther behandelt. Der ([ualitative Nachweis eines Paranukleins geschieht durch den Nachweis des Phosphors, das Fehlen von Nukleinbasen und redu- zierender Komponenten in den Zersetzungsflüssigkeiten nach Zerkochen mit Salzsäure. Eventuell beigemengte echte Nukleine können von Paranukleinen da- durch getrennt werden, daß man mit kaltem Barvtwasser behandelt. In diesem gehen nur die Paranukleine in Lösung. Aus der Lösung fällt man wieder mit verdünnter Säure und reinigt durch energisches Waschen von den Barytsalzverunreinigungen. Paranukleine sind dargestellt aus Kasein, Vitellin, Ichthulin und den muzinähnlichen Sekret- und Gewebsnukleoalbuininen. IL Paranukleinsäure. L'nter dem Einfluß lange dauernder Fer- ment-(Pepsin)-hydrolyse oder direkt durch gelinde Hydrolyse mit kaltem Ammoniak können einzelne Nukleoalbumine noch tiefer gespalten werden, wobei neben All)umosen, Peptonen (und Paranuklein) eine Substanz ent- steht, die den Namen Paranukleinsäure führt. Der Name ist in Ana- logie zu dem Zerfall echter Nukleine in Nukleinsäure und Albumosen ge- wählt und basiert auf der Vorstellung, daß auch Paranuklein sekundär in die besagte Säure und weitere Albumosenbruchstücke zerfallen sollte. Diese Anschauung ist im ganzen wenig begründet, vor allem ist es unbewiesen, ob dieser als Paranukleinsäure bezeichnete Komplex ein primäres Spalt- produkt des ..Nukleoalbumins" oder erst ein sekundäres ül)er den Weg des Paranukleins gebildetes Hydrolysenprodukt darstellt. 1. Paranukleinsäure aus Kasein. Darstellung nach Salkoicski^): Man versetzt Caseinum technicum oder purissimum (30^) mit 1 / 0'2%iger Salzsäure, in der man vorher 2"5 g Pepsin gelöst hat und schüttelt mehrere Stunden in der Schüttelmaschine. Durch Filtration dieser Emulsion gewinnt man ein klares Filtrat , das man mit 0"2%i8'6i' Salzsäure auf 2 / auffüllt und bei 40** der \'erdauung überläßt. Man kann die Verdauung bereits nach 48 Stunden unterbrechen (die Abscheidung eines unlöslichen Nukleins ist weder nach 48 Stunden noch nach Monaten zu beobachten). Das klare Filtrat stumpft man mit Natronlauge oder Natriumkarbonat zu ganz schwach saurer Pteaktion ab und dampft zur Hälfte auf dem Wasserbad ein. Dann neutrali- siert man ganz und filtriert. Enthält das Filtrat freie Phosphorsäure, d. h. entsteht in einer Probe mit NHg und Ca Clo eine Fällung, so versetzt man *) E. Salkoir.'^ki, Über die Paranukleinsäure aus Kasein. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 32. S. 245 (1901). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 407 das f^anze Filtrat mit CaCl., und NHg, filtriert vom Gefiilltoii C'alciiim- phosphat al) und neutralisiert aufs neue. Die möglichst genau neutrali- sierte Lösung, in der Menge von zum mindesten 1^, wird mit 200 ciu^ einer ö^/o'igen Ferriammonsulfatlösung versetzt. Die klare Lösung wird alsdann auf dem Wasserbad oder auf freier Flamme zum Sieden erhitzt. Unter Auftreten einer stark sauren Pteaktion scheidet sich ein feinflockiger Niederschlag ab, der sich zusammenballt. Er wird abgesaugt, auf der Nutsche solange mit warmem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser mit HCl und BaCl2 geprüft, al)solut klar bleibt, dann mit Alkohol und Äther entwässert. Der feinste Eisenniederschlag wird mit 100 cin^ Wasser in einer Reibschale zu einer Suspension zerrieben und bei Zimmertemperatur mit 80 — 90 cm^ 1/2 n-XaOH durchgerührt. Es entsteht eine klare Lösung, die erhitzt wird. Sobald sich durch Umsetzung der paranukleinsauren Eisenverliindung mit Natronlauge Eisenhydroxyd abscheidet, filtriert man möglichst schnell heiß in einen Kolben ab, der 3/4 der zur Sättigung der angewandten Menge Natronlauge nötigen Essigsäure enthält, so dal'i in dieser sauren Lösung eine weitere Zersetzung der Nukleinsäure nicht zu befürchten ist. Eine Probe dieser Lösung muß, wenn die Umsetzung gelungen sein soll, mit Ba(l)H)o -Wasser alkaUsiert, klar bleiben. (Freisein von Phosphor- säure!) Nunmehr fällt man die saure Lösung mit Kupferacetat (5"/oige Lösung), solange noch ein Niederschlag entsteht; den sich absetzenden Niederschlag wäscht man durch Dekantieren, l^iingt ihn in eine lleibschale und entkupfert ihn unter gleichzeitigem LTmrühren mit Schwefelwasserstoff. Das Filtrat von CuS wird durch einen Luftstrom von H2S befreit, auf dem Wasserbad auf 60 cm^ eingeengt, filtriert und mit dem mehrfachen Volum absoluten Alkohols versetzt. Die entstehende Fällung wird auf dem Filter mit Alkohol und Äther entwässert. Sie wird bei 110 — 115" getrocknet. Elementarzusammensetzung: C 42-73, H im, N 13-40, P 4-18%. Der Körper gibt Biuretreaktion und ist durch Ammonsulfat fällbar. Darstellung nach Eeh^): Die klar filtrierte Verdauungslösung wird auf die Hälfte eingeengt und erneut filtriert. Die phosphorsäurefreie Lö- sung wird mit Essigsäure stark angesäuert und mit einer konzentrierten Lösung von Uranylacetat solange versetzt, bis kein Niederschlag iih'Iii' entsteht. Nach vollständigem Absitzen filtriert man. Zur Reinigung wird der weiße gelatinöse Niederschlag in lOo/oigei' Salzsäure gelöst und nach dem Filtrieren vom Ungelösten mit Uranylacetat und hierauf bis zu ])eginnender Trübung mit Natronlauge versetzt. Nun wird bis zu beendeter Fällung konzentrierte Natriumacetatlösung zugesetzt. Diese Prozedur wird mit dem jeweils abfiltrierten l^ranniederschlag so oft wiederholt, bis die Filtrate nach dem Natriumacetatzusatz keine Biuretreaktion mehr geben. Der über einem ') A.Reh, Über die Polypeptidphosphorsäure (Paranukleinsäure des Kaseins). Hofmeisters Beiträge. Bd. 11. S. 1 (1908). 408 Fr. Samuely. gehärteten Filter auf der Xutsche gesammelte Niederschlag -svird durch Auswaschen mit Wasser von Uransalzen und Acetaten befreit, auf Ton- platten getrocknet und zu einem gelblichen Pulver verrieben. Eine Um- Setzung dieses Uransalzes in die freie Paranukleinsäure ist bisher nicht ausgeführt. Eleraentarzusammensetzung: C 2404. H 4-0, N 7-59, V 4-27. 0 26-84. ü 33-33 ö/o. 2. Paranukleinsäure aus Vogeleidotter, Avivitellinsäure nach Levene und Aisberg. ^ ) Das rohe oder gereinigte Mtellin wird in Wasser aufgeschwemmt (für das Vitellin aus 100 Eiern genügen 400 fw?^ Wasser) und mit dem halben A'olumen einer 2r)<'/oigen Ammoniaklösung versetzt. Das Gemisch bleibt 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Alsdann neutralisiert man langsam ohne Erwärmung mit Essigsäure (unter Zufügen von Eisstücken!). Nachdem die Reaktion neutral oder nahezu neutral ist, fällt man mit einem Überschuß einer gesättigten Pikrinsäurelösung ( 100 cm^) und säuert dann mit Essigsäure stark an. Die Filtrate dieser Fällung werden mit dem mehr- fachen Aolumen Alkohol versetzt. Der entstandene abfiltrierte Niederschlag wird in Wasser gelöst und mit Essigsäure angesäuert. In einer kleinen Probe dieser klaren Lösung bestimmt man die Menge O-o^/^ HCl enthalten- den Alkohols, die als Zusatz nötig ist, um der Probe eine auf Kongo saure Reaktion zu geben. Entsprechend dieser Menge versetzt man die ganze Lösung der gesuchten Substanz mit der berechneten Menge salzsauren Alkohols (0-5''/oig). Der gebildete Niederschlag wird auf dem Filter auf ein- ander folgend mit 500/oigem, SOVoigeni und 95%igem Alkohol bis zur Chlor- freiheit gewaschen und hierauf mit kochendem Alkohol und Äther extrahiert. Elementarzusammensetzung im Mittel: C o2-31 , H 5-ö8, N 13-13, P 9-88, S 0-33, Fe 0-57Vo- 3. Hämatogen. Der durch peptische Verdauung von rohem Eidotter gewonnene Körper scheint eine den Paranukleinen des A'itellins ähnUche Substanz zu sein. Die Analogie ist nicht nur durch die Bedingungen seines Entstehens aus einem Vitellin, sondern auch durch die Erscheinung begründet, daß dieses Hämatogen durch gelinde sekundäre Hydrolyse auch weiter in eine Paranukleinsäure gespalten werden kann (Milroy). Darstellung aus Rohdotter (nicht aus Vitellin) nach Bunge.-) Man befreit den Dotter von Eiweiß und extrahiert ihn mit Äther. Der äther- unlösliche Rückstand wird in IVoo HCl gelöst und so lange mit l%oi8'Pi" Salzsäure versetzt, bis eine leicht filtrierende, opaUsierende Lösung entsteht. Das Filtrat bringt man auf einen (lehalt von 2-ö<'/ooiger Salzsäure, fügt wirksames Pepsin hinzu und beläßt die Mischung einige Zeit bei 37''. Der sich alsl)ald abscheidende, schwach gelblich gefärbte Niederschlag wird zuerst ^) P. A. Levene uud C. Alsber;/, Zur Chemie der Paranukleinsäure. Zeitsclir. f. physiol. Chemie. Bd. 31. S. 543 (1900). -) G. r. Bnm/e, Über die Assimilation des Eisens. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 9. S. 49 (1885)". Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 409 mit P/ooig'^'i' Salzsäure, dann mit Wasser ausgewaschen, mit Alkohol ausge- kocht und mit Äther extrahiert. Man löst darauf in wässerigem Ammoniak, filtriert und fällt das klare Filtrat mit Alkohol. Diesen Niederschlag wäscht man mit .Vlkohol aus, suspendiert ihn dann in Alkohol und fügt hierzu Salz- säure bis zu stark saurer Keaktion. dann wäscht man den Niederschlag auf dem Filter nochmals mit heißem Alkohol chlorfrei, digeriert ihn mit Äther und trocknet nach dem Filtrieren im \'akuum und zuletzt hei 110". Elementarzusammeusetzung: C 42-11. H 6-08. X 14-78, S O-öö. 1' :>■][). Fe 0-290/0- VII. Muzinsubstanzen. Man faßt in dieser Gruppe solche Proteine zusammen, die sich, wie man glaubte, proteidartig aus einem Eiweißkomplex und einer Kohlehydrat- komponente zusammensetzen. Die neuere Forschung hat nun nachgewiesen, daß diese Zuckerkomponente, die sich erst nach vorangegangener Hydro- lyse dieser Proteine durch ihre Reduktionsfähigkeit manifesvf.irt, das (ilu- kosamin ist. Dieses nimmt aber zwischen den Aminosäur n und Kohle- hydraten eine Zwischenstellung ein und ist im Protein höchst wahr.schein- hch ebenso gebunden, wie die anderen Aminosäuren. Es liegt daher kein Grund vor, in diesen Muzinsubstanzen, etwa in Analogie zu den Nukleo- proteiden. einen proteidartigen Aufbau anzunehmen. Insofern ist der bis jetzt übliche Name der Glykoproteide zu verwerfen. i) Die äußeren physikalischen Eigenschaften und gerade der Ge- halt eines solchen die Reduktion vermittelnden Komplexes aber berech- tigen dazu, diese Körper in einer gemeinschaftlichen Gruppe zusam- menzufassen. Eine Abgrenzung von den übrigen Proteingruppen gelingt eicht. Gewisse Übergänge scheinen nur zu den schleimai-tigen Nukleo- alliuminen zu bestehen, die vor den meisten Muzinsubstanzen durch den Phosphorgehalt ausgezeichnet sind. Die Eigenschaften dieser ..Glykoproteide" oder besser Muzinsubstanzen. welche für ihre Isolierung vei'wertbar sind, sind die folgenden: Die ^luzin- substanzen bilden lösliche Alkali- bzw. Erdalkalisalze, können also, wenn sie nicht gelöst als solche in Sekreten vorliegen, dem (iewebe mit schwachen Alkalilösungen entzogen werden. Die echten Muzinalkalisalze bilden in Wasser fadenziehende, schleimige Lösungen. Die Muzinsubstanzen sind ferner in verdünnten Säuren unlöslich, daher durch Fällung ihrei- AlkaHsalzlösung mit Säuren zu reinigen. Da das Verhalten gegen Säuren variiert, unter- scheidet man: echte Müzine, die mit Essigsäure fällbar und in über- schüssiger Essigsäure nicht lösUch sind, und Pseudomuzine, die aus salzfreier, wässeriger Lösung durch Essigsäure nicht mehr fällbar sind. Zwischen beiden (iruppen stehen die Mukoide bzw. Muzinoide, denen einige der typischen :\Iuziureaktionen, z. B. die Unlöslichkeit im Essigsäure- überschuß, fehlen. ^) Vgl. hierzu Emil Abderhalden , Lehrbuch der physiologischen Chemie. 2. Aufl. S. 191 ff. Urban & Schwarzenberg. Berlin und Wien (1909). 410 Fr. Samuely. Ferner haben die Elementaranalysen nnd Ergebnisse hydrolytischer Aufspaltung gelehrt, daß man in der großen Gruppe der ]\Iuzine bzw. Mu- koide Substanzen unterscheiden muß, welche in ihrem Molekül eine Chon- droitinschwefelsäure enthalten, und solche, denen diese Komponente fehlt. Die ersteren Averden daher als Chondroproteide bzw. ..Chondroglyko- proteide"' bezeichnet. Inwieweit es sich bei diesen verschiedenen Schleimsubstanzen um spezifische Organeiweißkörper handelt, steht nicht fest. Es ist denkbar, daß zwischen den Müzinen und ^Mukoiden Übergangsglieder vorkommen, die nur einen anderen physiologischen Zustand der die Muzinsubstanzen produzierenden Zellen darstellen. Darstellungsmethoden für: I. Schleimsubstanzen aus schleimhaltigen Sekreten und Flüssigkeiten. Muzin iiji Speicheldrüsensekret, Trachealsekret und Sputum. Mukoid imSf'um, x\szites, Harn, Ei, Synovia, Glaskörper. Pseudo- muzin aus kolloidem oder flüssigem Ovarialzysteninhalt, Para- muzin aus Gallertinhalt von Kystomen oder malignen Geschwül- sten der Ovarien. 1. Darstellung von Speichelmuzin nach Hamniarsten'^): Man zerschneidet die frische, von Bindegewebe, Blut und Fett befreite Sub- maxillardrüse möglichst fein und extrahiert diese mit so viel kaltem Wasser, daß ein dünnflüssiges filtrierbares Extrakt entsteht. Die klaren Wasserextraktfiltrate (Filtrieren durch ein sehr dichtes Filterpapier!), die noch durch Zentrifugieren geklärt werden, versetzt man mit so viel Salzsäure, daß die Lösung Ol — 0'15% davon enthält. Die zuerst reichlich auftretende ]\luzinf;\llung löst sich fast sogleich beim Umrühren. Unmittelbar darauf fügt man zu der Lösung das vierfache A'olumen de- stillierten Wassers und rührt mit einem Glasstab gut um. Das Muzin windet sich dal)ei als zäher Klumpen um den Stab. Durch Umrühren dieser am Stab haftenden Masse in Ol — Olö^oig^i" Salzsäure wird das Muzin sofort wieder gelöst. ^lan filtriert dann rasch und fällt wieder durch Verdimnen mit W^asser. Dieses Lösen und FäUen wird ein zweites Mal wiederholt. Das Muzin wird nun mit Wasser durchgeknetet und vollständig gewaschen. Hierbei wandelt sich das Muzin in weiße, gequollene Fädchen um, die zuletzt durch Dekantieren mit W^asser gewaschen werden. Alsdann ent- wässert man mit Alkohol, behandelt mit Äther nach, zerreibt das Muzin zu einem staubfreien Pulver und erschöpft nochmals mit x\lkohol und Äther. Als ^'orl)ehandlung der Drüsen empfiehlt Levene 2) das folgende Ver- fahren. Die Drüsen werden sofort nach dem Tode des Tieres in Äther auf- bewahrt, dann werden sie in einer Fleischhackmaschine zerkleinert. Den ') 0. Hammarsten, Über das Muzin der Submaxillardrüse. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 12. S. 163 (1888). -■) R. A. Levene, Zur Chemie der Müzine. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 31. S. 395 (1901). I Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 411 Gewebsbrei mazeriert man 24 Stunden lang- mit destilliertem Wasser, dem man eine größere Menge Chloroform zugesetzt hat. Nach einem Tage filtriert man durch Gaze und schüttelt dann das Filtrat im Scheideti'ichter gut mit Äther durch. Nach 24 Stunden haben sich der Äther, das Fett und die Gewebsteile an der Oberfläche abgeschieden. Der untere Teil der Flüssig- keit wird leicht klar filtriert und nach Hammarsten auf Muzin verarbeitet 2. Darstellung aus Trachealsekret und Sputum wach Fr.Mül- lerJ) Man sammelt das Sputum in Flaschen und versetzt mit 75 — SOVoifi'Pni Alkohol. Unter kräftigem Durchschütteln verwandelt sich die Schleimsub- stanz in derbe Fäden, die zumeist zu Boden sinken. Das gebildete Sediment bleibt beim Filtrieren durch ein grobmaschiges Koliertuch auf diesem zurück, während die Zellen und feineren Niederschläge das Tuch passieren. Nun schüttelt man die Muzinfäden mit neuen Mengen 75<'/oigem Alkohol durch und kollert von neuem ab. Diese Alkoholextraktion und das Filtrieren wieder- holt man mehrfach, schUeßlich schüttelt man das Muzin in einem großen Kolben mit 0"5°/oigei' Salzsäure durch. Hierbei lockert es sich ein wenig und quillt etwas auf. Nun kollert man al)ermals oder filtriert ab. Die nun zum größten Teil von Nukleinen bzw. Nukleoalbuminen befreiten Muzinfäden und Muzinkörner werden mit einer sehr verdünnten Salzlösung durchge- schüttelt, wobei das Muzin zu sagoartigen Körnern an(|uillt, die wiederum auf einem Koliertuch gesammelt werden. Nun schüttelt man die so ge- wonnene Muzinmasse abermals mit 0"5°/oig7"P. Der Körper zeigt nach erfolgter Säurespaltung eine reduzierende Kohlehydrat- oder kohlehydratähnhche Komponente. Er enthält keine Chondroitenschwefelsäure. 8. Hyalo mukoid aus dem Glaskörper des Auges (nach MüDitr^). Man zerschneidet den Glaskörper mit der Schere, treibt die Masse durch ein Sieb und filtriert durch ein Papierfilter die wasserklare, nicht fadenziehende Flüssigkeit, die mit Essigsäure zunächst keine Fällung gibt. Man verdünnt die Lösung mit 2 — 3 Vol. Wasser und erhält jetzt durch Essigsäurezusatz eine Fällung, wenn die Mischung etwa l^j^ Säure enthält. Nach 2 Tagen dekantiert man die über der Fällung stehende, noch trübe Flüssigkeit ab. Der grauweiße, festklebende Bodensatz wird in schwachem Alkali gelöst und durch 2 — omahges Ausfäüen aus solcher Lösung mit Essigsäure gereinigt. Elementarzusammensetzung: N 12*27, S l*19Vo- IL Schleimsubstanzen im Sekret als Hüllensubstanz. 1. Eihüllenmukoid. Darstellung nach v. Fürth:-) Die Eihtille der Amphibieneier (z. B. Frosch) oder niederer Tiere (z. B. Sepien) bestehen aus ..Glukoproteiden". Durch leichten Druck kann man die Eihüllen von den frischen Eiern abtrennen, nachdem man die Spitze der Eihülle angeschnitten hat. Die schleimige Masse, die natürlich * ) V. Th. Mörner, Untersuchungen über die Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges. III. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 18. S. 244 (1894). ^) O.r. Fürth, Über Glykoproteide niederer Tiere. Hofmeisters Beitrage. Bd. I. S. 252 (1901). 414 Fr. Sainuely. frei von Farbstoffen nnd Pigmenten sein muli, wird mit Alkohol versetzt, getrocknet und dann nnt kochendem Wasser. Alkohol und Äther erschöpft. Ein Muzin der Sepien zeigte die Zusammensetzung: C 49"70. H 6-96. N lO'750/o- erinnert also an das Pseudomuzin (siehe unten), ein Muzin der Froscheihüllen ergab: C 52-7, H 7-1. N 9-oo/o (Giacosa). 2. Muzin der Schnecke (Mantelmuzin, Fußmuzini). Mantelmuzin von Helix pomatia (Weinbergschnecke). Man gewinnt das Muzin durch mechanische Reizung der physiologischen Sekretion der Eiweißdrüse. Zu diesem Zweck legt man das äußerlich mechanisch gereinigte Tier in Wasser von 20 — 30°. Wenn nach geraumer Zeit das Tier den Fuß in ganzer Länge ausgestreckt hat, so umfaßt man den Fuß mit einem Tuch so fest, daß sich das Tier nicht wieder in das Gehäuse zurückziehen kann. Der Teil der ^lanteloberfläche. an dem der Ausführungsgang der „Eiweißdrüse" sitzt, liegt dann frei. Man reizt denselben mit einem abgerundeten Glasstab, und läßt dann das sich abscheidende, rahmähnliche Sekret sich direkt mit Wasser mischen. Man erhält so eine weißliche . stark schleimige . ge- quoUene Masse. Diese wird mit Wasser zu einer gleichförmigen Emulsion zerrieben, sofort mit überschüssiger Essigsäure versetzt und tüchtig durch- gerührt. Das sich in feinen Klümpchen abscheidende Muzin wird auf dem Filter gesammelt, sobald diese im Kontakt der Essigsäure hart und fest geworden sind. Dann zerreibt man sie fein und wäscht durch Dekantieren mit essigsäurehaltigem Wasser, bis sich die Waschwässer, mit oxalsaurem Ammon geprüft, als kalkfrei erweisen. Hierauf entfernt man durch Waschen mit Wasser die Essigsäure und extrahiert den Rückstand mit warmem Alkohol und Äther. (Durch Zusatz von Essigsäure klärt sich die Lösung insofern, als unter COa-Entwicklung die anorganischen Anteile in Lösung gehen und sich die muzinähuliche Substanz zu Fasern oder Klümpchen zu- sammenballt.) Zur Gewinnung eines unveränderten Muzins ist es zweckmäßig, das frisch sezernierte Mantelmuzinogen nicht zu lange im Kontakt mit Wasser zu lassen. Man verarbeitet zweckmäßig auf einmal je 100 Schnecken und dann sofort das aus ihnen gewonnene Sekret in der beschriebenen Weise. Diese hier beschriebene Methode zur Darstellung eines Sekretmuzins niederer Tiere dürfte auch für andere, bisher nicht untersuchte Müzine von Weichtieren im Prinzip geeignet sein. Li allen Fällen aber muß man sich davon überzeugen, wie die Löslichkeitsverhältnisse des Muzins sind, ehe man an die Darstellung größerer Mengen geht. Auch ist es Avichtig, sich im Verlauf der vorzunehmenden Operationen zu überzeugen, daß die Muzinfällungen ihre genuine Löslichkeit bewahrt haben, also keine sekun- dären Veränderungen erleiden. Fußmuzin. In Fällen, in denen sich das muzinhaltige Sekret nicht direkt aus dem Drüsenausführungsgang einer isolierten Drüse isoheren läßt, ^) 0. Hammarsten , Studien über Muzin und muzinähnliche Substanzen. Pfliigers Archiv. Bd. 36. S. 373 (1885). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbarc Proteine. 415 verwendet man das muzindrüsentragende Gewebsstück als ganzes, indem man dasselbe durch einen Scherenschlag von dem Tiere trennt und mit ganz verdünnter Lauge (0-01 — O'O'iVo KOH) in der Kälte extrahiert. (In dieser Weise verfuhr Haminarsten zur Isolierung- des Schneckenfulimuzins.) Auch hier ist es nötig, sich vor Verunreinigungen mit (iewebeproteinen. die aus der Wundfläche abtropfen können, zu schützen. Man muli diese vor der weiteren Verarbeitung gut mit einem Tuch trocknen. Schliei'ilich ist auf die absolute Freiheit der ^luzinlösungen von morphologischen Elementen zu achten. Man muß, um klar filtrierende Lösungen zu erhalten, oft enorm verdünnen, so verdünnte Hammarsten das Alkaliextrakt von 60 — 70 Schnecken mit 9 — 12 l Wasser. Im übrigen ist die Isolierung' eines Muzins die für das Mantelmuzin angegebene Methode von Hauunarsten. Ist man sicher, daß das Muzin relativ alkaUresistent ist, so versucht man die Reinigung durch Lösen in starkem Alkali und Fällen mit Essigsäure. III. Muzinsubstanzen in pathologischen Sekreten. 1. Pseudomuzin. Für die Darstellung dieses Körpers kommt die von HaniuMrsten^) ausgearbeitete Methode in Detracht. ^lan fällt eine größere Menge der nach Möglichkeit dünnen und klar filtrierten Zystenflüssigkeit mit dem 2 — ofachen Volumen Alkohol, l'nter Umrühren mit dem Glasstab windet sich der entstandene Niederschlag um den Glasstab. In dieser Weise wird der Körper sofort aus der sonst noch durch feine Flocken getrübten Lösung herausgenommen, abgepreßt und unter xAlkohol fein verteilt. Der Alkohol wird alsdann durch Äther verdrängt und die stark gepreßte Masse nach Verdunsten des Äthers zu einem staub- feinen Pulver zerrieben. Dieses Pulver wird in Wasser zu einer schleimigen Lösung gebracht und. wie oben, erneut mit Alkohol gefällt und mit Äther gereinigt. Der Körper verliert nach längerem Liegen seine Löshchkeit in kaltem und warmem Wasser, so daß ältere Präparate zu Vergieichszwecken mit einem etwa fraglichen Pseudomuzin nicht verwertbar sind. Elementarzusammensetzung: C 49-44— 50-05, H 6-84— 7-11, X 10-26 bis 10-30, S l-25Vo- 2. Das Paramuzin findet sich nicht in dem zähschleimigen Zysten- inhalt, sondern in der festen, zitternden kolloid- und gallcrtähnlichen Ky- stomflüssigkeit der ()varialkystome (Mitjukoß'-). Darstellung. Da dieses Rohsekret nicht filtrierbar ist, so bringt man die gesamte Masse (nach Entfernen etwa bluthaltiger Partieen) durch Zusatz von einer beträchtlichen Menge von salzsäurelialtigem Wasser zum Schrumpfen. Das Wasser soll so viel Salzsäure enthalten, daß Kongopapier eben blau gefärl)t wird. Die sich nunmehr faserig oder bröckelig abschei- ^) 0. Hammarsten, Metalbumin und Paralbumin. Ein Beitrag zur Chemie der Kystomflüssigkeiten. Zeitschr. f. physinl. Chemie. Bd. 6. S. 194 (1882). 2) K. Mitjiikof, tJber Paramuzin. Inaug.-Dissertation. Bern 1895. Arch. f. Gynä- kologie. Bd. 49. S. 278 (1895). 416 Fr. Samnely. deiide Masse wird nun mit ebenso schwach salzsäurehaltiiiem Alkohol gewaschen, bis die Waschalkohole ungefärbt (häniatinfreil) abfließen. Zu diesem Zweck muß die Substanz mit Alkohol innig verrieben werden. Hierauf behandelt man mit absolutem Alkohol, verdrängt den Alkohol mit Äther und trocknet im Vakuum über Schwefelsäure zu einem nun leicht pulverisierbaren Körper. Zusammensetzung: C 51, H 7-76, N 10-70, S l-09Vo. Unterscheidungsmerkmale von Pseudomuzin und Paramuzin. Das Paramuzin ist durch Essigsäure und Mineralsäuren aus seinen Lösungen, d.h. den wässerigen Lösungen seiner Alkalisalze fällbar. Das Pseudomuzin wird durch Essigsäure nicht gefällt. Das Paramuzin ist im Überschuß von Essigsäure wieder löslich. Es muß aber bemerkt w^erden, daß die Artverschiedenheit beider Körper keine absolut gesicherte ist. Die Alkaliempfindlichkeit des Paramuzins ist eine so große, daß möglicher- weise schon die Lösung desselben in der zur Lösung nötigen Alkalimenge eine Spaltung herbeiführt, und damit die Bedingung für das vom Pseudo- muzin verschiedene A'erhalten gegen Essigsäure erfüllt wird. IV. Schleimsubstanzen als normale Bestandteile zellreicher Gewebe und Organe. In einer ganzen Reihe von Organen, die selbst keine Schleim sezer- nierende Drüsen besitzen, sind echte Müzine und Mukoide vorhanden. Man kennt ein Muzin des Nabels tranges, der Sehnen, ein Mukoid der Cornea und Mukoide der Knorpel, Knochen, Sehnen. Die letzteren zählen dmx-h ihren Gehalt an Chondroitinschwefelsäure zur Spezialgruppe der sog. C'hondroproteide. Auch die gallertige Grundsubstanz mancher niederer Tiere, wie die des Gallertschwamms , zählt zu diesen Substanzen. Prinzipien der Darstellung. Die Isolierung dieser Muzinsubstanzen erfordert eine Extraktion der muzinhaltigen (Tewel)e. Die Aufgabe der ver- wertbaren Methode l)eruht nun darin, das geeignete Extraktionsmittel zu verwenden, das möglichst wenig andere, nicht muzinartige Proteine oder Proteide in Lösung bringt, zugleich aber keine sekundäre Veränderung der in Lösmig gehenden Schleimsubstanzen verursacht. Die bisher ül)lichen Methoden erfüllen nun diese beiden Postulate nicht vollständig, und wenn man die Analysenergebnisse der nach verschiedenen Methoden dargestellten Körper, besonders den variablen Gehalt an Schwefel berücksichtigt, so drängt sich der Gedanke auf, daß die Methoden der Extraktion die Xatur und Zusammensetzung der isolierten Substanzen nicht unwesentlich be- einflussen. Als Extraktionsmittel sind zu verwenden allein oder in sich abwech- selnder Kombination: Wasser oder stark verdünnte Alkalilösungen (Na OH oder Ca[0Hj2). Bei manchen Organen muß der Extraktion eine vorbereitende Entkalkung mit Säuren vorangehen. Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisicrbare Proteine. 417 1. Wasserextraktion, verwendbar für Xabelstrangmuzin (Jern- ströiii ' ) : Aus möglichst frischen Xabelsträngcn präpariert man die Tlefäße heraus, zerkleinert hierauf das salzige Gewebe fein und behandelt längere Zeit mit häufig erneuertem, kaltem Wasser. Die gewonnenen vereinigten Lösungen werden filtriert. Durch Essigsäure wird ein fadenziehender Körper gefällt. Ein Überschuß von Essigsäure schadet nicht, da sich der Körper wie ein echtes Muzin im Säureüberschul) nicht löst. Dieser Körper wird in der wiederholt beschriebenen Weise durch Aufwickeln um einen Glasstab aus der Flüssigkeit genommen und durch Lösen in Wasser und l^mfällen mit Essigsäure etc. gereinigt. Auch die für das Submaxillarmuzin angegebene Methode ist verwertbar (vgl. S. 410, N. 1). 2. Alkali ex traktion verwendbar für Korneamukoid. 2) ^^on der herausgeschnittenen Hornhaut des Rinderauges entfernt man mit einem Hornmesser das Epithel und die Descemetsche Membran und zerkleinert die Kornea in der Fleischhackmaschine (man verarbeitet am besten 100 — 300 Stück). Hierauf schlemmt man den Gew^ebebrei in einer ()02"/oigen Kalilauge oder in Q-O^'^/oigem Ammoniak auf. Auf jede Kornea sind 10 cm^ der Extraktionslösung zu verwenden. Nach 2 — ätägiger Extrak- tion bei Zimmertemperatur trennt man durch Filtration und gewinnt ein klares, dünnflüssiges, nicht fadenziehendes Filtrat. Nun setzt man etwas verdünnte Essigsäure oder verdünnte Salzsäure zu. Der zuerst feinflockige, später gröbere Niederschlag setzt sich nach einem Tag als zusammen- hängende Masse ab. Den Bodensatz löst man nach Abgießen der Flüssigkeit mit wenig Alkali zu einer neutral reagierenden Lösung, fällt vereint mit Säure und reinigt durch mehrfache Umfällung und Behandeln mit Alkohol und Äther. Zusammensetzung: CöO-16, H 6-97, N 12-79, S 2-07o/o- Für Chondro mukoid nach C. Th. MörnerJ) I. ^lan digeriert den zerkleinerten Trachealknorpel mit thymolhal- tigem Wasser {^/^l auf 100 .(/ Knorpel) bei 40". Nach mehreren Tagen trennt man das Wasserextrakt durch Filtration von den Knorpelteilen. Das dick- flüssige, aber nicht fadenziehende Filtrat wird bis zu 0-'2'^/q mit Salzsäure versetzt und auf dem Wasserbad erwärmt. Erst bei dem Erwärmen beginnt sich die Flüssigkeit zu trüben und läßt alsbald einen flockigen Niederschlag absitzen. (Der Salzsäurezusatz allein erzeugt wegen der fäl- lungshemmenden Wirkung der Chondroitinschwefelsäure noch keine Nieder- schlagsbildung! ) Der Niederschlag wird auf dem Filter gesammelt und mehi-- fach aus seiner Lösung in schwachem Alkali mit Salzsäure grobflockig gefidlt. 1) E. Ä. Jernström, Einige Beiträge zur Kenntnis des Muzins. Upsal. läkarcf. För- handl. Bd. 15. S.434 (1880). Mahis .Tahresb. 1880. S. 34. -) C. Th. Monier, Untersuchungen über die Proteinsubstanzen in den lichtbre- chenden Medien des Auges. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 18. S. 213 (1894). ») C. Th. Monier, Chemische Studien über Trachealknorpel. Skand. Arch. f. Phys. Bd. 1. S.210 (1889). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 27 418 Fr. Samuely. Nach dem Auswaschen mit Wasser, Alkohol und Äther trocknet man im Vakuum. IL DarsteUung des Mukoids neben Glutin. Man digeriert die fein zu Spänen zerschabten Trachealknorpel kurz mit destilliertem Wasser. Dann digeriert man längere Zeit bei 40" mit Ol — 0"2''/niger Salzsäure und filtriert von den glutinhaltigen Digestionsflüssigkeiten ab. Die zurückbleibenden Knorpelspäne werden kurz mit Wasser von 40'' gewaschen und hierauf in O'Oö — O'P/oiger Kalilauge eingetragen. Hierbei wird das Mukoid herausgelöst. Ton dem ungelösten, in Form eines zier- lichen Balkennetzes zurückbleibenden Albumoid trennt man durch Filtration. Die Filtrate werden mit Säure gefällt, das ausgeschiedene Mukoid wird, wie oben, Aveiter gereinigt. Elementarzusammensetzung im Mittel: C 47-30, M 6-42, N 12-5S. S 2"42"/o- Das Mukoid enthält Chondroitinschwefelsäure als organisch ge- bundenen Molekiüanteil. o. Extraktion mit Kalkwasser. Für Sehnenmuzin (Tendomukoid) nach Cutter und Gies.^) Als Ausgangsmaterial dient die iVchillessehne des Rindes. Das Ge- webe wird sofort post mortem sauber präpariert und fein zerschnitten. Die Stücke werden hierauf mit Wasser gewaschen und der Extraktion mit halbgesättigtem Kalkwasser {2 cm^ auf lg Sehne) überlassen. Von Zeit zu Zeit ist die Extraktionslösung gut durchzuschütteln. Das klar filtrierte Extrakt wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, so daß die Lösung 0"2"/o HCl enthält. Der Niederschlag wird auf Seiden- oder Papierfiltern zuerst mit verdünnter Salzsäure, dann mit Wasser eiweiß- bzw. salzsäure- frei gewaschen. (Die Waschflüssigkeiten dürfen keine Biuretreaktion geben und müssen chlorfrei sein.) Nun wiederholt man Lösung in verdünnter Lauge. Fällen mit verdünnter Salzsäm'e und ausgiebiges Waschen, und reinigt dann, zur Entfernung von Extraktivstoffen und von Fett, mit großen Mengen heißen Alkohols und Äthers. Man trocknet im Vakuum. Elementarzusammensetzung: C 47'47, H 6(58, N 12'58, S2-4D'V Die Einheitlichkeit des so dargestellten Körpers ist fraglich. Die Sehnen enthalten anscheinend mehrere Mukoide. Für Knochen mukoid (Osseomukoid ) nach Hawk und Gies.^) Die Femurknochen frisch geschlachteter Tiere werden sofort aus dem Gewebe und Periost herauspräpariert, durch Ausspiüen mit fließendem Wasser während 24 Stunden vom Knochenmark befreit und nach dieser Zeit nochmals sorgfältig durch Abschaben von Bindegewebsresten gereinigt. Nunmehr entkalkt man, indem man die Knochen mehrere Stunden in einer einigemal erneuerten Lösung von 0'2 — O'ö^oiger Salzsäure liegen ^) W.D. Cutter und W.J. Gies, Das Muzin des weißen, fibrösen Bindegewebes. Journ. exp. Med. I. S. 186 (1896). — Die Zusammensetzung des Sehnenmukoids. Amer. Journ. of Phys. Vol. 6. p. 155 (1901). ^) P. B. Hawk und W. J. Gies, Chemische Studien über Osseomukoid mit Bestim- mung der Verbrennungswärme etc. Amer. Journ. of Phys. Bd. 5. S. 387 (1901). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nicht kristallisierbare Proteine. 419 läßt. Danach schabt man die oberflächlich entkalkten Schichten mit einem scharfen Skalpell ab. Dann wiederholt man die Kntkalkun^' für einige Stunden und schabt wiederum die Knochensubstanz ab. Also fährt man fort, bis nur noch eine kleine dünne Knochenlade vorhanden ist. Das durch Abschaben gewonnene Produkt, das man in einer 0-2Voigen Salzsäure gesammelt hat, wird dann vereinigt (1700^ aus 24 Femur- knochen in 14 Tagen gewonnen), mit fließendem Wasser chlorfrei ge- waschen und dann unter häufigem Schütteln mit halbgesättigtem Kalk- wasser extrahiert (2 — 5 fw^ Lösung auf 1^/ Knochensubstanz). Die Extraktion setzt man 48 Stunden lang fort. Nach dieser Zeit filtriert man und fällt das Filtrat mit 0"2'7oigt?r Salzsäure. Die weitere Reinigung erfolgt in der für Sehnenmukoid beschriebenen Weise. \. Schleim Substanzen als r4ewebseinlagerung (Amyloid). 1. Mechanisch isoliertes Amyloid (0. Haussen ^). Man zerschneidet die amyloid degenerierten Milzen in Lamellen und drückt aus diesen die Sagokörner mit der Pinzette oder dem Skalpell heraus. Den gesammelten Brei schüttelt man längere Zeit auf der Schüttelmaschine mit destilliertem Wasser. Dann verdünnt man die Lösung mit Wasser, so daß sich die Amyloidkörner aus der Suspension zu Boden senken. Durch Dekantieren trennt man den Bodensatz von der Gewebsfetzensuspension, dann reinigt man durch häufiges Aufrühren und Dekantieren mit Wasser. Die letzten (Jewebsfetzen werden mit der Pinzette entfernt. Es hinterbleibt das Amyloid zuletzt in Form homogener, runder oder ellij) tischer Körner. Man wäscht dieselben mit destiUiertem Wasser, trocknet bei 40'\ pulverisiert und trocknet abermals im Vakuum über Schwefelsäure. Das so dargestellte intakte Amyloid enthält keine C'hondroitin- schwefelsäure. Das intakte Amyloid ist also mit der nach Krmvkoic isolierbaren Substanz nicht identisch. Diese ist ein durch die Verdauung verändertes, durch andere Körper gewiß auch verunreinigtes Amyloid. 2. Amyloid nach KraivkowJ) Die amyloid entartete Leber oder Milz (oder normales Aortengewebe) wird von der Kapsel und von Gefäßen befreit und dann gut zerkleinert. Den Gewebebrei riUirt man zuerst mit kaltem Wasser und hierauf mit schwachem Ammoniak an. Nach einigen Stunden gießt man die NHg-haltige Lösung ab und zei'i-eibt den Kückstand (buch ein dichtes Nickeldrahtnetz. Die zerriebene Masse wird mit venüiiuitom Ammoniak angerührt und mit dieser oft erneuerten Lösung durch Dekantieren so lange gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten klar und farblos geworden sind. Die letzten Filtrate müssen auch frei von Chondroitinschwefelsäure ') 0. Haussen, Ein Beitrag zur Chemie der amyloidcn Entartung. Biochem. Zeitschr. Bd. 13. S. 185 (1908). ^) A. P. Krairk-oir, Beiträge zur Chemie der Amyloidentartung. Arch. f. e.\p. Pharm. Bd. 40. S. 195 (1898). 420 Fr. Samuely. Darstellung der Proteine der Tierwelt etc. sein. (Man prüft auf diese Säure, indem man diese Probe mit verdünnter Salzsäure kocht und danach auf die Anwesenheit einer durch Hydrolyse al)gespaltenen Schwefelsäure mit Baryumchlorid prüft.) Nach der Ammoniakl)ehandlunti' wäscht man den Gewebsrückstand mit Wasser und unterwirft ihn einer 4tägig'en ^'erdauung■ mit wirksamem Magensaft (Infus einer Magenschleimhaut mit 0"4%iger Salzsäure). Der unverdaute Rückstand, der aus Amyloid und Xukleinen besteht, wird zuerst mit schwacher Salzsäure, dann mit Wasser auf dem Filter ausgewaschen. Hierauf versetzt man die Masse mit sehr verdünnter Ammoniaklösung, in welcher sich das durch Verdauung wohl irgendwie veränderte ..Amvloid-' 'ö nunmehr zum größten Teil auflöst. Aus der filtrierten ammoniakalischen Lö- sung fällt man mit verdünnter Salzsäure einen reichlichen, flockigen — bis- weilen auch gallertigen — Niederschlag, den man einer zweiten Pepsinsalz- säureverdauung unterwirft. Den unverdauten Piückstand bringt man auf ein Filter, wäscht mit Wasser aus, löst ihn in Ammoniak und fällt wiederum mit Salzsäure. Den Niederschlag sammelt man auf einem Filter, wäscht ihn mit Wasser frei von Ammonsalzen und i)ehandelt ihn mit einer verdünnten Barythydratlösung. Hierdurch geht das Amyloid in Lösung und wird durch Filtration von ungelösten Nukleinresten getrennt. Aus der Paryt- lösung fällt man wiederum mit Säure und behandelt den abfiltrierten Niederschlag mit Wasser, Alkohol und Äther. Das so dargestellte Amyloid ist kein intaktes Gewebsamyloid. Ln Gegensatz zu dem nach Hanssen dargestellten Körper enthält er Chon- droitinschwefelsäure, ist also, so weit sich beurteilen läßt, nicht rein. Die Elementarzusammensetzung ist im Mittel: C 46-92, H6*60, N 14'16, p rieVo. Analytisch sind sehr inkonstante Werte gefunden worden. Es ist wahr- scheinlich, daß auch der hohe Phosphorgehalt die Folge einer Beimengung eines Nukleoproteids ist. Nachweis von Amyloid in Organen. Man versetzt das Pohorgan oder einen dünnen Schnitt desselben a) mit Jod: es entsteht eine rötlich- braune bis violette Färbung, h) mit Jod und Schwefelsäure: es entsteht eine violette bis blaue Färbung, c) mit Methylviolett: es bildet sich eine rote oder rötliche Farbe. Die Jodreaktionen fallen nicht bei allen Amyloidorganen positiv aus. Anmerkung: Ein großer Teil der hier beschriebenen Proteine sind auf ihren Gehalt an Aminosäuren untersucht worden. Vergleiche hierüber die Zusammenstel- lung bei Emil Abderhalden: Lehrbuch der physiologischen Chemie. 2. Aufl. S. 233 ff. Urban & Schwarzenberg, Berlin und Wien, 1909. Neuere Ergebnisse auf dem Gebiete der speziellen Eiweißchemie. S. 74 ff. Gustav Fischer. Jena 1909. ß) Albuminoide. Von William J. Oies, New -York und Eduard Strauß, Frankfurt a. M. Die Zusammenstellung der sogenannten Albuminoide in einer beson- deren Gruppe läßt sich heute nur noch durch den Hinweis rechtfertigen, dal) sie sich zumeist als Gerüstsubstanzen der tierischen Organismen cha- rakterisieren lassen, sowie, dal) sie sich alle durch eine besonders hohe Resistenz gegenüber denjenigen Agentien auszeichnen, welche die nativeu Eiweißkörper leicht lösen und verändern. Aus diesem letzteren Gesichts- punkt ergibt sich schon ganz allgemein für ihre Darstellung bzw. Iso- lierung, daß man die Ausgangsmaterialien auf einander folgend mit ver- schiedenen eiweißlösenden Agentien (Säure, Alkali, Verdauungsfermente) zu behandeln hat, um zu den eigentlichen Albuminoiden zu gelangen. Daß die hierbei erhaltenen Substanzen nicht unbedingt einheitlich sein können, ist sicher. Da wir eine chemische Einteilung dieser (xruppe veränderter Eiweißkörper nicht zu geben vermögen, weil sie ja nach den Untersuchungen Fischers^), Abdtrhaldois-) und ihrer Mitarbeiter sicherlich in chemischer Beziehung die größten ^'erschiedenheiten aufweisen, befolgen wir in dieser Darstellung eine Einteilung nach rein zoologischen Gesichtspunkten. \\"\v schildern demnach zuerst die Darstellung der Albuminoide der Wirbellosen, sodann die der Albuminoide der Wirbeltiere. A. Albuminoide der Evertebraten. I. Das Spongin. Spongin ist die von den protoplasmatischen Elementen befreite (te- rüstsubstanz der Spongien, und zwar speziell die des Badeschwammes, der Euspongia. Zur Reindarstellung des Materials verfährt man folgendermaßen {Strauß^): Die Schwämme werden in sehr kleine Stücke geschnitten, durch Klopfen von Staub und Konkrementen möglichst vollständig Iiefreit ') Vgl. E. Fischer, Untersuchungen i'iher Aminosäuren etc. Berlin 1906. 2) Vgl. E. Abderhalden, Lehrbuch der physiol. Chemie. 2. Aufl. Berlin 1909. ^) E. Strauß, Studien üher die Alhuminoide usw. Winter. Heidelberg 1904. 422 ^^- J- ^^^^s und E. Strauß. und sodann mit Wasser gut gespült. Die Schwammstücke werden nun H — 4 Tage lang in der Kälte mit einer 10 — 15''/oigen, jeden Tag ge- Avechselten Salzsäure digeriert. Nach gutem Abpressen der Säure werden die Stücke zuerst mit heißem, dann mit kaltem Wasser abgespült, bis die Salzsäure versch^yunden ist, sodann mit Alkohol und schließlich mit Äther gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung der Kakospongien ist die ötägige Verwendung einer 20"/oigen Salzsäure nötig. Die verbleibende feste, schwarze, faserige Masse wird mit Wasser völlig ausgewaschen und dann noch 2 Tage lang mit kalter ö^/oiger Kalilauge digeriert. Verfährt man sodann, wie oben geschildert, weiter (Waschen mit Wasser, Alkohol und Äther j, so er- hält man schließlich das Spongin in erwünschter Reinheit. Cber die Resultate der Totalhydrolyse des Spongins vgl. i) und -). IL Das Cornein und das Gorgonin. Cornein nennt man nach VaJenciennes^) die organische Grundsub- stanz der Korallen. Kru'kenherg '^) hat das Cornein dargestellt, indem er Achsenskelette von Ripidogorgia flabellum. Gorg. verrucosa, Antipathes mit verdünnter Salzsäure entkalkte, dann mit Alkohol Äther, Pepsin, Trypsin, 10— SO^/oiger Natronlauge digerierte und schließlich mit Wasser abspülte. Einfacher ist die Methode zur Darstellung des von Drechsel'"'), später von Henze^') untersuchten Gorgonins, der albumoiden (irundsubstanz von Gorgonia Cavollini. Die Gorgonia Cavollini ist eine Weichkoralle, deren rote Polypenmasse sich leicht mechanisch von dem hornartigen Achsen- skelett abtrennen läßt, welches sodann in lufttrockener Form zu den Unter- suchungen dient. Zur Reinigung des Gorgonins verfährt man folgendermaßen: Die Gorgoninstücke werden zuerst einem Prozesse zur Entfernung der ver- schiedenen anhaftenden Substanzen, speziell der unorganischen Stoffe unter- worfen. Nach vorläufigem Aufweichen in iVoi&^i' Essigsäure und sorg- fältiger Behandlung mit einer rauhen Bürste und darauf folgendem Ab- *) E. Abderhalden und E. Strauß, Die Spaltprodukte des Spongins mit Säuren. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 48. S. 49 (1906). '^) A. Kossei und F. Kutscher, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 31. S. 214 u. 205 (1901). ^) Valenciennes, Extrait diine monographie de la famille des Gorgonides de la Classe des Polypes. Comptes rendus de l'Acad. des sciences de Paris. T. 41. p. 11 (1855). ■1) Krukenberg, Cornein. Vgl. Studien. I.Reihe. 5. Abt. S. 2— 1(5 (1881). —Der- selbe, Über das Cornein. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 17. S. 1843—184(3 (1884). — Derselbe, Vorträge. S. 209 — 211 (1886). — Derselbe, Fortgesetzte Untersuchungen über Skeletine. Zeitschr. f. Biologie. Bd. 22. S. 251 — 254 (1886). ^) E. Drechsel, Beiträge zur Chemie einiger Seetiere. I. Über das Achsenskelett von Gorgonia Cavollini. Über das Jod im Gorgonin. Die Leibessubstanz der Gorgonia. Zeitschr. f. Biologie. Bd. 33. S. 90-107 (1896). ^) M. Henze, Zur C'hemie des Gorgonins und der Jodgorgosäure. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 38. S. 60 (1903) u. Bd. 51. S. 64 (1907). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Albumiuoide. 423 spülen mit Wasser ist das Coenenchvma voUständifi- entfonit. Das Skelett wird sodaun mit 1° oi&er Essigsäure in (Gegenwart von Toluol bei 40" C extrahiert. (Halogenwasserstoffsiuire ist zu vermeiden, wenn man in dem Produkt das Jod bestimmen will.) Die Säure wird in /wisehenriinmen von einigen Tagen erneuert, bis die Extrakte kein Calcium mehr ciitlialten. Diese Reinigung wird längere Zeit fortgesetzt und schließlich durch Dialyse vervollständigt. III. Albuminoide im Gerüst der Röhrenwürmer. Aus den Hornröhrchen des Röhrenwurmes Onuphis tubicola gewann Schmiedeberg ^) neben einem kohlenhvdratartigen Körper, dem Onuphin, durch wiederholte Extraktion der Röhrchen mit Salzsäure und Kalilauge ein Albuminoid in Form von lockeren, papiermachi'artigen Lamellen. Dieses Albuminoid stellt von den 42*o9''/o organischer Substanz, welche die luft- trockenen ( )nuphisröhrchen enthalten, 3-84''/o dar. Auch in den Röhren der lederartigen Hülle von Spirographis Spalanzanii hat Schmiedeberg neben einem onuphisartigen einen Albuminoidbe.standteil nachgewiesen. Er isolierte denselben durch auf einander folgende Behandlung mit Alkalilauge und '>a\z- s'Aure. Krukenberg-) bezeichnete die nach dem Auskochen der Spirographis- hülle mit Wasser hinterbleibende, durch Trypsin nicht verdauüche Substanz als Spirographin. Er löste diese Substanz in starkem Alkali und erhielt bei der Neutralisation der Lösung ein weiteres Produkt, das Spirographein, welches beim Erhitzen mit Wasser unter Druck albumoseartige Produkte und Brenzkatechin lieferte (?). IV. Das Conchiolin. Mit dem Namen Conchiohn bezeichnet Fremij^) die Gerüstsubstanz der Lamellibranchiaten. Diese Substanz ist von Schloßberger*), später von WetzeV") untersucht worden und sicher nicht einheitlich. Löst man nach Schloßberger die Muschelschale in verdünnter Salz- säure, so unterscheidet man an dem ungelöst bleibenden Schalenteil nach ') 0. Schmiedeherg, Über die chemische Zusammensetzung der Wohnröhren von Onuphis tubicola Mueller. Mitteilungen a. d. Zool. Station zu Neapel. Bd. 3. S. 373—392 (1882). 2) E. Ki-ukcnhcry, Vgl. Studien. I.Reihe. 5. Abt. S. 28— 30 (1881). — Derselbe, Zur Kenntnis der organischen Bestandteile der tierischen Gerüstsubstanz. Vgl. Studieji. II. Reihe.- 1. Abt. S. 49—58 (1882). 3) E. Frenui, Recherches chimiques sur les Os. Comptes rendns de IWcid. des Sciences de Paris. T. 39. p. 1053—1058; Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 64. S. 263 (1854); Annales de (himie (3). T. 43. p. 96—99 (1855). *) 0. Schloßberfier, Zur Kenntnis der ISIusclielschalen des Byssus und der Cliitin- frage. Liehif) ferner d-Alaiiin, 1-Asparaginsäure iiml auffallend viel Prolin. Norliandeii sind höchst^vahrscheinlieh \'alin. Leucin und Phenvlalanin. VI. Die Seide. Die Seide ist ein von Lepidoi)ter('nraupen behufs Bildung der Kokons abgesondertes Sekret. Am eingehendsten untersucht ist die Seide von Bombyx niori. dem Seideuspinner. Das Sekret sell)st lälit sich darstellen, indem man frische Seidendrüsen mit ir)"/,|iger PottascheHisung mazeriert. Man erhält hierbei eine Flüssigkeit, die beim Schütteln ein (Terinnsel ab- setzt. Dieselbe Erscheinung tritt auch unter LuftabschkU) ein. besser aber bei Gegenwart von Sauerstoff {Dubais^). Trägt man den Seidensaft in Alkohol ein, so erstarrt er {Bolhy-). Durch Auskochen mit Wasser lälit sich die Seide in zwei Teile zerlegen, das Fibroin, welches unverändert zurückbleibt, und den Seidenleim (Sericin), welcher in Lösung geht. Zur Darstellung des P'ibroins verfährt man in folgender \\'eise (Methode von Cramer, modifiziert von Emil Fischer'^): Man erhitzt gell)e Iiohseide oder technisch degommierte Seide in einem 5/ fassenden Porzellantopf von der Form eines Becherglases in einem Autoklaven mit dei- ^öfachen Menge Wasser 3 Stunden auf 117 — 120'^. Diese Operation wird 1 — 2mal wieder- holt, bis keine Gewichtsabnahme mehr stattfindet. Bei technisch degom- mierter Seide genügt zweimaliges Kochen mit ^^'asser. Die Menge des rückständigen Fibroins beträgt GS'ö"/,, der angewandten P»ohseide. Das Fibroin kann zur weiteren Reinigung 24 Stunden lang in P'Joer Salzsäure eingeweicht werden. Sodann wird es mit Wasser vollständig frei von Sericin und Säure gewaschen, mit Alkohol entwässert und schlielilich mit Äther in einem Soxhletapparat von Lipoiden befreit {Bondi*). Nach Fischers x\ngaben besitzt derartig dargestelltes Fibroin wesent- lich andere Eigenschaften als dasjenige, welches nach Städelev) durch Behandlung mit 5o/„iger Natronlauge entsteht. Die Resultate der Totalhvdrolyse vgl. bei Fischer und Skita.'^) Der Seidenleim (Sericin) wird nach Cramer''') gewonnen, indem man die durch Auskochen gelber Rohseide mit Wasser über 1U0° erhaltene Lösung noch warm mit basischem Bleiacetat fällt, den Niederschlag ait- filtriert und auswäscht, bis das Filtrat bleifrei ist, mit Schwefelwasserstoff zerlegt, vom Schwefelblei abfiltriert und das Filtrat mit Alkohol fällt. Die ') B. Dubois, Sur la secretion de la soie chez Bombyx mori. Compt. rend. T. 111. p. 206 (1890). -) IMfei/, Zur Genesis der Seide. Journ. f. prakt. Chem. Bd. 93. S. 847 (18C)4l. ") E. Fischer und A. Skita, Über das Fibroin der Seide. Zcitsclir. f. pbysi(d. ("heui. Bd. 33. S. 177 (1901) und Bd. 35. S. 221 (1902). •*) .S'. Bondi, Studien idier Seidenleim. Zoitscbr. f. physiol. fbemie. Bd. 34. S.481 (1902). 5) G.Stäclcler, Untersuchunrun- reinigungen und Puppenresten gesäubert. Kokons, die nicht vollständig davon zu befreien sind, werden nicht verwandt. Die Seidenkonkons werden 2 Tage mit gewöhnlichem Wasser und dann in l^/oigeii Saksäurebädern geweicht, in welchen sie 24 Stunden liegen bleiben. Nach dem Abgießen der Flüssigkeit werden die Kokons, solange noch Säurereaktion nachweis- bar ist, in fließendem Leitungswasser, nach dem Verschwinden der Säure- reaktion mit oft zu wechselndem destillierten Wasser chlorfrei gewaschen. Nun wird durch Kochen der Kokons mit Wasser, am besten in einem Glaskolben mit Rückflußkühler, das Sericin in Lösung gebracht. Bei gleich- zeitiger Verarbeitung größerer Mengen kann auch in einem emaillierten oder verzinkten Metallkessel gekocht werden. (Vgl. Fischers x\ngaben.) Es ist darauf zu achten, daß durch öfteres Zuführen von Wasser das Flüssig- keitsniveau sich stets auf der gleichen Höhe hält, da sonst an den Kessel- wänden über der Flüssigkeit schwer lösliches Sericin sich festsetzt. Die Kokonmenge wird zwei- oder dreimal, aber immer nur eine Stunde gekocht ; durch längeres Kochen kann die Gelatinierfähigkeit des Sericins beeinträchtigt werden. Beim Kochen wird 20- oder oOmal soviel Wasser verwandt, als das Gewicht der trockenen Kokons beträgt. Der Versuch, ein viertes Mal die Kokons zu kochen, ist wertlos, denn die dabei erhaltene Lösung enthält nur noch 1 — 2Voo Sericin. Die heiße Lösung wird von den Kokons abgegossen und durch ein Wärmefilter filtriert, da beim Erkalten leicht fein verteilte Ausscheidungen entstehen. Das Filtrat wird in Porzellanschalen auf dem Wasserbad zur Trockne verdampft. Der Rückstand haftet der Schale in Form von spröden gelbbraunen Lamellen an und lassen sich diesell)en am besten mit einem Metallspatel herunternehmen. Er wird in der Reibschale zerrieben und stellt dann ein gefärbtes grobes Pulver dar, welches sich zur weiteren Reinigung besser eignet als größere Stücke, indem es den Reinigungsflüssigkeiten eine viel ausgiebigere Einwirkung gestattet. Je 50 — 40^ des gepulverten Seidenleims werden in einem Becher- glas mit einem Liter destillierten Wassers übergössen, mit einem Rührer ') G. Wetzcl, Ein Beitrag zur Kenntnis der in der Seide enthaltenen eiweißartigen i Stoffe. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 26. S. 535-542 (1899). i -) E. Fischer, Nachtrag zur Hydrolyse des Caseins und Seidenfibroins durch ! Säuren. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 39. S". 155 (1908). Darstellniig der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 4->7 vorsichtig- aufgerührt uiid einen Tag hing mit (iciu Wasser in IJeriilirung gelassen. Nach dem Abgießen der Fhissigkeit wird der \'organg unter erneutem Wasserzusatz 2 — 3mal wiederholt. In iilinlicher Weise wird der so gewaschene Leim mit lO/„iger Kalilauge durch zwei Tage l)ehandelt, worauf Waschen mit destilliertem Wasser, einmalige kurzdauernde Waschung mit verdünnter p]ssigsäure behufs Neutralisation des Alkalis und schlielilich mehr;naliges Waschen mit destilliertem Wasser folgen. Der Seideideim (|uillt bei der lieinigung sehr stark. -2—3 Tage langes Stehenlassen unter täglich gewechseltem Alkohol l)ringt das Präparat wieder auf das ur- sprüngliche \'olumen. Hierbei geht schon ein Teil des Farbstoffes in den Alkohol über. Die vollständige Befreiung von färbenden liestandteilen geüngt durch einstündiges Kochen mit 70 — 80%igem Alkohol, l'm die geringe Menge des anhaftenden Fetts sowie den Alkohol vollständig zu beseitigen, wird das Pulver noch mehrere Tage mit wasserfreiem Äther extrahiert. Nach dem \'erdunsten des Äthers erhält man das reine Sericin in Form eines nicht mehr oder nur noch wenig gefärbten Pulvers. Dieses Produkt ist jedoch ein Gemisch der in Wasser leicht löslichen Sericin- Modifikation und der schwer lösKchen Modifikation, welche durch das Eindampfen entstanden ist. Zur Isolierung des leicht löslichen Sericins wird eine kleine Menge des Pulvers in einem Glaskolben mit Steigrohr mit der 20fachen Menge Wasser auf dem Wasserbad 2 Stunden lang erhitzt. Die Flüssigkeit wird noch heiß abfiltriert und nach dem Ph'kalten mit einer mehrfachen Menge Alkohol gefällt. Nach 24 Stunden läßt sich die überstehende Flüssigkeit größtenteils vom Niederschlag abgießen. Gut ist es, den Niederschlag noch weitere 24 Stunden mit absolutem Alkohol stehen zu lassen und erst dann zu filtrieren. Man wäscht mit wasser- freiem Äther nach und bringt den nach Al)tropfen der Flüssigkeit konsistenter gewordenen Niederschlag in ein Schälchen, digeriert mit wasserfreiem Äther, gießt diesen ab und bringt nun das Schälchen zum Eintrocknen in eine (ilasglocke über Chlorcalcium. Nach \erlauf einer Woche lassen sich die durch starkes Schrumpfen entstandenen weißen Schollen zerreiben. Der Seidenleim wird stets in Form eines ungefärbten Pulvers erhalten, welches in heißem Wasser vollständig löslich ist. Diese Lösung gibt alle Pieaktionen des Seidenleims und bildet nach dem Erkalten bei genügender Konzentration eine feste Gallerte. Bondi gibt auch folgende ökonomischere und raschere Methode an: Man setzt dem Dekokt der Seidenkokons (welches CVö- 1 l betragen mag) vorsichtig, am besten kubikzentimeterweise, 1" „ige Essigsäure zu. Nach Zusatz jedes Kubikzentimeters rühre man um und warte einige Zeit. Hat man genug Essigsäure zugesetzt (4 — >^ cm'\ so findet eine .\bsclieidung des Seideideims statt. Er setzt sich in Form größerer Flocken zu P.odeii. während die überstehende Flüssigkeit klar und farblos wird. Durch tagelanges Dekantieien des Niederschlages mit destilliertem Wasser kann man ihn von der Essigsäure und auch noch von viel Asche befreien. Den hierbei ziemlich gequollenen Flocken läl'd sich durch fbcr- 428 "^^'^ •^- <^ies; und E. Strauß. gießen mit Allvohol und mehrmaligen "Wechsel desselben sehr viel Wasser entziehen. Auskochen in Alkohol nimmt den Farbstoff fort. Die noch mit Äther behandelte Masse li'ilit man dann über Chlorcalcium eintrocknen. Es entsteht ein farbloses Produkt, welches zu Pulver zerrieben wird. Das Pulver gleicht, soweit es bisher untersucht wurde, der leicht löslichen Modifikation des Seidenleims; es ist in heißem Wasser löslich, die Lösung gibt die Pieaktionen des Seidenleims und erstarrt bei genügender Konzen- tration zu einer (Gallerte. Kurz erwähnt sei hier, daß auch aus sogenannter wilder Seide in ähnhcher Weise Fibroin und Sericin gewonnen worden sind iBolley^), Bastoic und Appleyard'^). E. Abderhalden und Auguste Billiet^) haben in neuester Zeit die .,Xew-Cliwang" -Seide untersucht und das rohe Gespinst folgendermaßen gereinigt : Zuerst wurde die ungefärbte Seide mechanisch durch Zerzupfen und Ausschütteln von Staub und sonstigen Beimengungen sorgfältig befreit. Dann wurde das Gewicht der Seide festgestellt und nunmehr der Seiden- leim durch Auskochen mit Wasser in einem Porzellangefäß im Autoklaven (vgl. Fischers ^Methode) entfernt. Das Wasser wurde so lange erneuert, bis beim Eindampfen kein erheblicher Ptückstand mehr blieb. Etwas ging immer noch in Lösung. Es scheint, daß das Seidenfibroin trotz aller Vor- sichtsmaßregeln — Anwendung von destilliertem Wasser und Benutzung eines Porzellangefäßes — beim Erhitzen mit Wasser unter Druck ange- griffen wird. Die Seide verlor nach viermaligem, H — östttndigem Auskochen mit je :-> — 4 l Wasser 20"/,, Leim, beim Trocknen bei 120° verlor sie durch- schnittlich lOO/o an Gewicht. Sie enthielt ca. 57o Asche, in welcher Eisen, Calcium. Phosphorsäure und Salzsäure qualitativ nachgewiesen werden konnten. Erwjlhnt sei noch die L^ntersuchung von K^dl Fischer über die Zu- sammensetzung der Seide der Spinne Xephila madagascariensis. ^) Gleichfalls erwähnt werden möge ein Produkt des Follikelepithels des Ovariums von Bombvx mori, welches Tlchomiroß''") darstellte, indem er es von anderen morphologischen Beimengungen durch Digerieren mit Ol^/o Salzsäure, sodann durch Erwärmen auf dem Wasserbad und nachfolgende Verdauung mit Pepsinsalzsäure befreite. M Bolle 11, Untersuchungen über Jama-may-Seide. Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 108. S. 364 (1869). ' -) E. Bastoic und J. R. Applei/ard, Zur Chemie der Tussaseide. Chemiker-Zeitung. Bd. 12. S. 209 (1888). ^) E. Abderhalden und Aitcfnste Rilliet, Die Monaminosäuren der „New-Chvraug"- Seide. Zeitschr. f. physiol. Chemie". Bd. 58. S. 337 (1909). *) E. Fischer, Über Spinuenseide. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 53. S. 137 (1907). '") A. Tichomiroff, Chemische Studien über die Entwicklung der Insekteneier. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 9. S. 518 u. 566 (1885). Darstelluug der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 429 B. Die Albuminoide der Vertebraten. I. Das Kollagen und der Leim. Das Kollagen bildet die Hauptmenge der die Bindegewebszellen um- gebenden (rrundsubstanz im lockeren Bindegewebe, in den Fascien, r)iindern, ferner die organische Grundsubstanz der Knochen und einen Teil derselben in der Kornea und in den Fischschuppen. 1. Zur Darstellung von Knochen kollagen verwendet man am besten Schenkelknochen des Ochsen. Dieselben werden sorgfidtig auf mechanischem Wege zunächst von den anhaftenden Geweben und vom Periost befreit und die reinen Knochen sodann durch Eintauchen in große Mengen verdünnter Säure (ü"l — 0'2"/oige Salzsäure) entkalkt. Stärkere Säuren bewirken leichtere Zersetzlichkeit des Kollagens. Nach 6 stündiger Einwirkung der Säure ist besonders bei gelegentlichem Umrühren der Säure die Oberfläche der Knochen merklich entkalkt, und durch Abkratzen mit einem gewöhnlichen Skalpell können lange Stücke elastischer Späne von Ossein erhalten werden. Durch abermaliges Eintauchen in frische Säure wird eine weitere Schicht entkalkt; der Prozeß kann zweimal im Tage wiederholt und so weit geleitet werden, daß der Knochen vollständig entkalkt und in Ossein- späne umgewandelt ist. Die ersten drei oder vier Portionen der Ossein- späne sollten aus dem weiteren Gang der Präparation ausgeschaltet werden, um sicher zu gehen, daß alle anhaftenden Stoffe entfernt sind. Jede Portion der Späne muß in einer Fleischmaschine zerkleinert und von den un- organischen Stoffen durch Behandeln mit 0"05— 0-01%iger häufig erneuerter Salzsäure oder durch Dialyse in Salzsäure oder durch beides befreit werden. Diese Behandlung zur Entfernung aller oder nahezu aller unorganischen Substanzen ist zu der nun folgenden vollständigen Entfernung des Mukoids nötig. Nach Sammlung der gew^ünschten ^lenge des mit Säure gewaschenen Osseins muß dieses vom Osseomukoid befreit werden. ^ ) Dies geschieht am besten in der Weise, daß man zuerst die Substanz wiederholt einige Tage mit viel Wasser wäscht, bis alle Säure entfernt ist, und sie dann in ver- schlossenen Flaschen einer Extraktion mit einem großen Überschuß von 0'05 — Olo/oiger Natronlauge (10 — 15 (»^3 Lösung pro Gramm) unterwirft. Zu den Extrakten setzt man Toluol zu, schüttelt kräftig und erneuert das Alkali mehrere Male in einem Zwischenraum von 48 — 72 Stunden. Das ver- dünnte Alkali entfernt nicht nur alles Osseomukoid, sondern auch anhaftende Spuren von Xukleoprotein- und Hämoglobinzersetzungsprodukten; es ver- ändert das OsseokoUagen nicht. Man entfernt sodann elastische Fasern, Osseoalbumoid 2), Rückstände von Blutgefäßen etc., indem man das Ossein ^) Hairk und Gies, Chemical studies of osseomucoid , with determinations of the heat of comlnistion of some eonnective tissue glncoprotoids. American Journal of Physiol. Vol. 5. p. 387 (1901). — Seifert und Gies, On the distribution of osseomucoid. Ibid. Vol. 10. p. 146 (1903). -) Hawic und Gies, On the composition and chemical properties of osseoalbumoid, "with a comparative study of the albumoid of cartilasre. Americ. Journ. of. Physiol. \'id. 7. p. 340 (1902). 4?,0 ^^'. J. Gies und E. Strauß. der Einwirkung einer stark aktiven Trvpsinalkalilösung (0"25o/„ Soda) bei 38 — 40^0 unterwirft. (Dieser Prozelj darf nicht vor der Entfernung des Osseomukoids in Anwendung kommen.) (Vgl. Posner und Gies.'^) Die Di- gestion wird 4 — 5 Tage unter Gegenwart von Toluol mit täglicher Erneue- rung der Trvpsinflüssigkeit fortgesetzt. Am Ende des trvptischen Yerdauungsprozesses, der das Kollagen nicht merldich beeinflulit. ist das (Jssein frei von allen Proteinen mit Ausnahme des OsseokoUagens selbst. Die schuppigen Teile besitzen trotz- dem noch fast alle ihre ursprünglichen Eigenschaften. Man reinigt dieselben von verschiedenen Digestionsprodukten sorgfältig durch wiederholtes und langes x'Vuswaschen. zuerst mit großen Mengen von Ö-Oö^/oiger Salzsäure und dann mit Wasser in Gegenwart von Toluol. Nun wird das säurefreie Produkt an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet. Die gelben Schuppen werden dann gepulvert. Das gepulverte Material wird in Wasser aufgeweicht und wieder mehrmals in O'OöVoiger Salzsäure gewaschen und in Säure dialysiert — beides in Gegenwart von Toluol — , bis in den Außenwässern der Dialyse keine unorganischen Bestandteile mehr nachweisbar sind. Das Pulver wird sodann aufeinander folgend mit Alkohol. Alkoholäther und scliließ- lich mit Äther behandelt, um Lipoide zu entfernen und es zu entwässern. Die Ätherextraktion muß sorgiältig ausgeführt werden, da in den Partikeln beträchtliche Mengen von ätherlöslicher Substanz zurückbleiben. Im ^'akuum über Schwefelsäure getrocknet, bildet das Phidprodukt ein weißes oder gelbliches Pulver. {Gies hat gefunden, daß in dieser Weise präparierte Produkte eine Elementarzusammensetzung haben, welche praktisch mit der des SehnenkoUagens identisch ist ; auch hat er beobachtet . daß die Elementarzusammensetzung des Glutins aus Sehnenkollagen praktisch die- selbe ist, wie die des (xhitins aus OsseokoUagen.) (Nicht veröffentlicht.) 2. Zur Darstellung von Sehnenkollagen wählt man am besten als Ausgangsmaterial die Achillessehne des ()chsen. Das Material wird von anhaftendem Gewebe sorgfältig befreit und in sehr dünne transversale Stücke geschnitten. Zur Zerkleinerung ist es nötig, lange scharfe und sehr dünne Messer zu verwenden. Die groben Stücke werden nun zunächst mit Wasser blutfrei gewaschen. Will man gleichzeitig das Sehnenmukoid aus den folgenden Alkaliextrakten erhalten, so ist es nötig, diesen Waschprozeß in verschlossenen Flaschen unter Gegenwart von Toluol vorzunehmen, bis kein Hämoglobin oder koagulables Eiweiß mehr ausgezogen werden kann (Posner und Gies-). Sodann werden die Stücke einer ca. 4 Tage dauernden Extraktion mit einer täglich mehrmals gewechselten O'Oö — 0"1 "/„igen Natron- lauge unter Toluolzusatz unterzogen, um so noch anhaftende Spuren von Blut und Lymphe zu entfernen und das Sehnenmukoid abzutrennen. Letzteres erhält man aus diesem Extrakt durch Behandlung mit einem *) Posner und Gies, Vorläufige Untersuchung über die Verdaulichkeit des Biude- gewebsmukoids in Pepsinsalzsäure. Amerie. Journ. of Physiol. Bd. 11. p. 330 (1904). °) Posner und Gies, Verliinden sich die Mukoide mit anderen Proteinstoffen? Amerie. Journ. of Physiol. Vol. 11. p. 404 (1904). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 4;;i mäßigen Überschuß von 0"2"'„iger Salzsäure {Cutter und Gies^). Elastische Fasern {Bürger und Gies-), IJberhlei bsel von Blutgefäßen etc. werden sodann in derselben Weise, wie oben für das Ossein l)eschriel)on. durch trvptische Verdauung entfernt, wobei auch hier die Sehnenstücke ihr Aussehen nicht verändern. Zu iMide des tryptischen Prozesses hinterbleibt nichts außer Sehnenkollagen. Nun werden die Sehnenstücke in der Fleischhackmaschine zerkleinert. (Dieses darf wegen des leichten Zusammenballens des Materials in alkalischen Flüssigkeiten erst an dieser Stelle vorgenommen werden.) Das ^laterial wird jetzt durch lang anhaltendes Waschen mit Wasser und schUeßhche Dialyse von allen anhaftenden Substanzen befreit. In dieser Form kann es. wie auch das beschriebene Osseokollagen . zur Darstellung des betreffenden Glutins dienen. Nach sorgfältiger Elntfernung unorganischer Stoffe wird das faserige Kollagen sorgfältig mit Alkoholäther und Äther gewaschen und im A'akuum über Schwefelsäure getrocknet. Ks besteht schließlich aus einer schneeweißen Masse sehr dünner Fasern. Das so erhaltene Produkt hat angenährt dieselbe Elementarzusammensetzunu- und ^'erbrennungswärme, wie das daraus dargestellte Sehnenglutin (Manning und Gies^), Emmef und Gies*). 3. Aus Sehnen läßt sich das Kollagen nach Sadikoß'^) auch gewinnen, wenn man die fein zerhackten Sehneu mit schwacher Alkalilösung behandelt, mit kaltem W^asser wllscht und die Masse mit einem Glasstab unter Wirbelbewegungen schlägt. ^lan kann dabei die ganze Kollagenmenge um den Glasstab zusammenwinden. 4. Aus der Hornhaut des Auges erhält man das Collagen nach Mörner^) in folgender Weise: Man schneidet den mit der Hornhaut zusammenhängenden Teil der Sehnenhaut ab, schabt das Epithellager und die JJescemetsche Haut mit einem Hornmesser ab. zerkleinert die aus Grundsubstanz bestehenden Scheiben in der Fleischhackmaschine und extra- hiert in schwacher Alkalilösung (0-02" 0 Kalilauge oder 0'02—0"2Vo Ammoniak, in Partien von 100 — oOO Stück) 2 — 3 Tage lang bei Zimmertemperatur. Sobald die Reste bei öfterem Wechsel der Flüssigkeit keine durch Essig- ') Cutter und Gies, The compositiou of tendoii mucoid. Anieric. Jouni. ot l'h} siol. Vol. 6. p. 155 (1901). -) Bürger und Gies, The chemical constitueuts of tendinous tissue. Araeric. Journ. of Physiol. Vol. 6. p. 219 (1901). ■■) Manning und Gies, i'roceedings of the society for experimeutal Biology and Medicine. Vol. 4. p. 160 (1907). ■■) Emmit und Gies, Relation of Collagen and (ielatin. Proceedings of the Aniericaii Society of Biological Chemistry. Vol. 1. p. 42 (1907). — Journal of Biological Chemistry. Vol. 3 p. 33. (1907). — American Journal of Physiol. Vol. 19. p. 11 (1907). — Vgl. auch F. Hofmeister, Über die chemische Struktur des Kollageus. Zeitschr. f. physiol. Cliem. Vol. 2. p. 299—322 (1878). - Ferner: Gies, Proceedings of the American Chemical Society, Biologial Section, Science. Vol. 24. p. 463 (1907). '") W. L. Sadikoff, Untersuchungen über tierische Leimstoffc. \. Mitteil. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd.48. S. 130— 139 (1906). ^) C. Th. Mörner, Untersuchungen der Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges. I. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 18. S. 213-256 u. S. 61 — 106 (1894). 4o2 ^V. .T. Gies und E. Strauß. säure fällbare Substanz mehr abgeben, werden sie durch Behandlung mit destilliertem Wasser erst bei Zimmertemperatur, später bei 30 — 40*^ vollständig von Alkali befreit. Die reinweiße gleichartige Masse kann nun durch stundenlanges Erwärmen mit destilliertem Wasser bei 105 — IIP in eine klare dünnflüssige, bei Abkühlung gelatinierende Lösung verwandelt werden oder aber durch Alkohol- und Ätherbehandlung zur Trockne gebracht werden. Die Kollagene gehen durch Lösen in siedendem Wasser in Glutine über, welche bei Zimmertemperatur zu Gallerten erstarren. 1. Sehnenglutin. Zur Darstellung des Glutins aus Sehnen verwendet man das SehnenkoUagen, welches in der bereits beschriebenen Weise dargestellt ist und unterwirft es vor seiner Behandlung mit Alkohol und Äther ( Tehh ^ ) direkt der Einwirkung von Wasser. Das Wasser Avird zweckmäßig mit einer sehr geringen Menge Salzsäure angesäuert (Emniett und Gies loc. cit.). Das Gemisch wird nun am Rückflußkühler gekocht. In Intervallen von einer Stunde gießt man die Lösung ab und ersetzt sie durch frisches, schwach angesäuertes Wasser. Dieser Prozeß wird fortgesetzt, bis alles Kollagen in Glutin übergegangen ist. Die (ilutinlösung wird nun möglichst neutralisiert, durch rasche Verdampfung auf dem Wasserbad stark eingeengt und schließlich mit so\1el Alkohol versetzt, daß eine reichliche aber unvollständige Fällung entsteht. Es bilden sich stets während des Umbildungsprozesses des Kollagens in Glutin Glutosen. Wenn die gerade eben nötige Menge von Alkohol zur Fällung des Glutins angewendet wird, so bleibt die größte Menge der Glutinösen in Lösung. Zweckmäßigerweise löst man die Niederschläge abermals in Wasser und fidlt nochmals mehrere Male wie beschrieben. Von der letzten Fällung filtriert man die Lösung durch ein Heißwasserfilter und dialysiert einige Tage lang unter Gegenwart von Toluol gegen fließendes Wasser. Zur endgültigen Fällung ist es am besten, den Niederschlag in möglichst wenig Wasser unter Erwärmung zu lösen, so daß eine dicke viskose Lösung entsteht. Läßt man dieselbe ein wenig erkalten und gießt sie sodann in diümem Strahl in ein 15 — 20faches Volumen 90 — 95'^ nigen Alkohols, so erstarrt die Masse und das ganze Glutin verwandelt sich in eine voluminöse weiße fibröse Masse, welche sich an einen Stab beim Rühren anhaftet und so aus der Alkoholflüssigkeit herausgenommen werden kann. Diese so gewonnenen Glutinstreifen wäscht man sodann mit frischem Alkohol, welcher sie etwas steifer und härter macht. Sodann extrahiert man sie wiederholt mit Äther zur Entfernung von Lipoiden und Alkohol und trocknet sie schließhch im Vakuumexsikkator. {Van Name-), Sadikqf^). 2. Reinigung nach Mörner. Zur Reinigung der käuflichen Gelatine dient folgende Vorschrift: Die Gelatinescheiben werden während einiger ') Tehh, Journal of Physiology. Vol. 27. p. 463 (1892). -) Van Name, Journal of experimeutal Medicine. Vol. 2. p. 117 (1897). ^) W. L. Sadikoff, Untersuchungen über tierische Leimstoffe. I. II. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 39*. S. 396—422 (1903). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 433 Tage mit ätherhaltigem destilliertem Wasser (zu antiseptischen Zwecken) ausgewaschen, dann mit Kalilauge (von einem bis ein paar Zehntel Prozent) während einiger Wochen, oder bis das Glutin so locker geworden ist, daß bei einem Durchsieben ein nennenswerter Verlust eintritt, danach mit destilliertem Wasser, sehr verdünnter Essigsäure und schließlich wieder mit destilliertem Wasser behandelt. Das Auswaschen findet bei Zimmer- temperatur statt, die Erneuerung der Extraktionsflüssigkeit — H auf 25 — 30^ Glutin — geschieht täghch oder jeden zweiten Tag, wobei die Gallerte vermittelst eines porzellanenen Siebes gesammelt wird. Nachdem die stark ge(iuollene Gelatine mit Alkohol gehärtet worden ist (gewöhnlich ist zwei- bis dreimalige Erneuerung des Alkohols erforderlich), erhält man die Gelatinmasse in erstarrtem Zustande. Sie kann, falls der spezielle Zweck dies benötigt, wiedei-um durch Lösen in warmem Wasser, Filtrieren und Fällen mit Alkohol, Trocknen, Pulverisieren, Extraktion mit Äther usw. behandelt werden. Als Endprodukt erhält man bei diesem Verfahren ein Glutin, welches eine beachtungswerte Garantie für die Abwesenheit nahezu jeder Vei'unreinigung darbietet, — ausgenommen einen gewöhnüch nicht hochgradigen (0'25 — 0*75Vo) Gehalt an mineralischen Bestandteilen — und das zugleich keiner chemischen Veränderung unterzogen worden ist. Wünscht man das demgemäß von organischen fremden Stoffen l)efreite Glutin möglichst aschearm darzustellen, so wird in der Wärme eine starke (10 — 15^0 ) wässerige Lösung bereitet und behufs Gelatinierens abseits gestellt. Die (lallerte wird in dünne Scheibchen zerschnitten, welche Wochen hindurch mit reichlichem, oftmals erneuertem (ätherhaltigem), destiUiertem Wasser ausgewaschen werden. Der Gehalt an Asche kann hierdurch von P877o in (ler ursprünglichen Gelatine auf 0*16 — O'lHö/o im Glutinpräparat herabgesetzt werden (Mörner)^) ?). Knochenglutin nach Sadikof. Eine Methode zur Keindarstellung des Glutins gibt Sadikof-) an: Nicht entfettete Knochen werden zerkleinert, eventueU zu einer breiartigen Masse zenjuetscht. Der Brei wird dann mit Salzsäure (l:o) so lange behandelt, als noch Salze extrahiert werden kön- nen. Dies geschieht unter l^mrühren und mehrmaligem Wechsel der Säure. Die auf der Oberfläche sich abscheidende Fettschicht wird al)gehoben und die hyaline Masse, die nach 7 — 8 Tagen ziemlich vollständig von Salzen und Fett befreit ist, einigemal mit kaltem Wasser nachgewaschen und in eine 1 — 3%^^^ Lösung von Natronlauge eingetragen. Hierbei lösen sich alle Albumin Stoffe, Mucin, Nucleoproteide usw. Außerdem geht eine \'erseifung der geringen noch anhaftenden Fettreste vor sich, und Überreste des phosphorsauren Calciums fallen aus. Nach dreimaligem Wechsel der Alkali- lösung und kurzem Nachwaschen mit Wasser sind alle eventuell noch an- haftenden Eiweißsubstanzen und Seifen beseitigt. Die Glutinmasse wii-d in 1) C. Th. Mörner, Beitrag zur Kenntnis einiger Eigenschaften des Glutins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 28. 8.471—523(1899). (Mit ausführlichem Literatur- verzeichnis.) ^) loc. cit. Abderhalden, Handbncb der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 28 434 ^^ ■ J- t'ies und E. Strauß. eine siedende P/oige Lösung- von Monochloressigsäure gebracht: hierbei wandelt sich die leimgebende Substanz in den Leimstoff um. Die heilte konzentrierte Lösung wird durchgeschlagen, eventuell alifiltriert, mit Mag- nesiumsulfat ausgesalzen und mit kaltem Wasser und Alkohol von Säuren und Salzen befreit. 4. Reinigung nach Sadikqff. Eine weitere Reindarstellung des nor- malen Glutins schildert der genannte Autor (loc. cit.) in folgender Vor- schrift: (ilutin wird mit kaltem Wasser, darauf mit kalter 20''/oiger Lösung von ^lagnesiumsiüfat gewaschen, dann unter Erwärmung auf dem Wasser- bad in "iO^/oiger Magnesiumsulfatlösung gelöst und heiß filtriert. Nach dem Erkalten wird ohne vorheriges Filtrieren 0'5"/„ige Mineralsäure, welche in 20%iger Magnesiumsulfatlösung bereitet ist, hinzugegeben. Die voluminöse Fällung wird abfiltriert, mit kaltem W^asser gewaschen, dann in heißem Wasser gelöst, abgekühlt und mit schwacher Salzsäure versetzt, wobei die Gesamtkonzentration der Salzsäure l"/o nicht übersteigen darf. ]Man gibt dann ?> — 4 Volumina starken Alkohols hinzu, so daß der Leimstoff in 70 — SO^'/nigem Alkohol gelöst ist. ^lan schlägt das gesarate Glutin durch NeutraUsation mit Ammoniak nieder, läßt alisitzen, gießt den x\lkohol ab und wäscht mit Wasser oder Alkohol nach. Vgl. über die Totalhvdrolyse des Leims Fischer, Levene und Äders'^), Abderhalden'^), E. Hart^) und E. Fischer.*) Das Reticulin, welches möglicherweise nur ein verändertes, schwerer in Glutin überführbares Kollagen ist (Tcbh^). steUte Siegfried^} aus der Mukosa des Schweinedünndarmes dar. Schweinedünndarm wird in der Fleischhackmaschine fein zermahlen und sodann mit Wasser und 0"25''/oiger Sodalösung gewaschen, bis keine säure- fällbaren Substanzen mehr entfernt werden können. Nun wird die Masse bei Gegenwart von Toluol mehrere Tage lang einer intensiven trvptischen Verdauung unterworfen. Die Verdauungsrückstände werden mit W^asser und Alkohol gewaschen und in einem Soxhlet-Apparat mehrere Tage mit Äther extrahiert. Nach Wiederholung der Behandlung mit Trvpsinalkali. Wasser, Alkohol und Äther hinterbleibt eine leichte, graue, faserige Masse. Dieses Material wird zunächst mit kochendem Wasser eine halbe Stunde lang be- handelt, wobei es schnell seine Struktur verliert und, während ein Teil als Glutin in Lösung geht, in ein körniges lockeres Produkt verwandelt wird. ^) E. Fischer, P. A. Levene und B. H. Aders, Über die Hydrolyse des Leimes. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 35. S. 70 (1902). ^) E. Fischer und E. Abderhalden, Notizen über die Hydrolyse von Proteiustoffeu. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 42. S. 540 (1904). ^) E. Hart, Über die quantitative Bestimmung der Spaltungsprodukte von Eiweiß- körpern. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 23. S. 347 (1901). *) E. Fischer, Über das Fibroin und den Leim der Seide, loc. cit. 5) Tehb, Journ. of Physiol. Vol. 27. p. 463 (1892). *) Siegfried, Habilitationsschrift. Leipzig 1892. — Sitzungsberichte d. sächs. Ges. d. Wisseuscli. 1892. — Journ. of Physiol. A'ol. 28. p. 319 (1893). — Halliburton, Ten lectures on biochemistry of muscle and nerve, p. 54. London 1904. l)arstelliing der Tioteine der Tierwelt : Alliuiniiioido. 4;-3f) Diese Behandhing wird so lange fortgesetzt, bis sich kein Olutin mein- löst, der endgültige Rückstand gegen Wasser dialysiert und mit Aikolioi und Äther gewaschen und getrocknet. IL Das Elastin. Das Elastin ist die Orundsubstanz des elastischen (iewehes, beson- ders des zu einem derben Strang entwickelten Ligamentum nuchae. Pls findet sich auch in den Wänden der Gefäße, besonders der Aorta und in Form von Einzelfibrillen im gewöhnlichen P)indegewebe eingelagert. Hor- baczeivski^) unterwarf zur Reingewinnuug des Elastins das Nackeni)and folgenden Prozeduren: Zuerst wird dasselbe in kleine Stücke geschnitten. ;-i — 4 Tage mit Wasser ausgekocht, dann mit l^oigei' Kalilauge digeriert, und abermals mit Wasser ausgekocht, dann mit iVoiger Essigsäure behandelt, mit Wasser ausgekocht, mit öVoi^ei" Salzsäure 24 Stunden lang digeriert, mit Wasser gewaschen und schließlich mit Alkohol und Äther erschöpfend ex- trahiert. Diese letzte Extraktion dauert, wenn sie vollkommen sein soll. 2 Wochen lang, selbst wenn man das Material vorher pulverisiert hat. ^didh Richards i\\\A Gies"^) verfährt man zur Darstellung' des Elastins aus dem Ligamentum nuchae folgendermaßen: Das Nackenband wird in Streifen geschnitten, diese in der Fleischhack- niaschine möglichst fein zerkleinert und die Masse in ()egenv^•art von Toluol 24 — 48 Stunden gut mit Wasser gewaschen. Das so gereinigte Gewebe führt man nun in große verschlossene Flaschen über und unterwirft es 48 — 72 Stunden lang der Extraktion mit einem großen Überschuß von kaltem halbgesättigtem Kalkwasser (unter Toluolzusatz). Diese Extraktion wird mehrfach wiederholt und schließlich das Alkali durch sorgfidtiges Waschen mit Wasser entfernt. Die Substanz wird dann mit wiederholt er- neutem kochendem Wasser behandelt, bis nur noch Spuren gelösten Ei- Aveißes (Elastose) im Waschwasser auftreten. Nun wii-d zunächst wenige Stunden mit kochender 10%iger Essigsäure, sodann gleich lange Zeit mit öo/oiger Salzsäure bei Zimmertemperatur extrahiert. Diese Extraktion wird alternierend wiederholt und der Rückstand durch Wasser und nach- herige Dialyse säurefrei gewaschen. Schließlich wird das Produkt mit kochendem Alkohol und Äther ausgezogen und getrocknet. So gewonnene Elastinpartikel können leicht in einem Mörser zu einem cremefarbigen Pulver zerrieben werden. Zur Darstellung des Elastins aus Arterien bedient man sich am besten der Aorta des Ochsen. Dieselbe wird fein zerkleinert, zuerst mit kaltem *) J. Horhaczeirski, Über das Verhalteu des Elastins l)oi der repsinvordauung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 6. S. 330 (1882). 2) Bichards und Gies, Chemical studies of elastiu, mucoid aiid otlier proteids in elastic tissue with some iiotes on ligameut extractives. American Jourual of l'hysiol. T. 7. p. 93 (1902). 28* 4r,(T W. J. Gies uikI E. Strauß. Wasserund dann mehrere Stunden mit häufig erneuertem kochendem Wasser behandelt. Die Rückstände werden sodann 1 oder 2 Tage lang unter Toluol- zusatz mit 0"25''/oigerSodalüsung digeriert, mit schwach angesäuertem Wasser gewaschen und 48 Stunden lang der Einwirkung einer starken Pepsinsalz- säurelösung ausgesetzt, welche bei Beginn des zweiten Tages erneuert wird. Hierauf wird der Rückstand mit ganz schwach alkalischem Wasser (Soda) gewaschen und nach sorgfllltigem Auswaschen 6 Stunden lang mit oft er- neuertem Wasser (am Rückf lußkühler ) gekocht. Xach dem Filtrieren und Waschen mit Wasser wird die so erhaltene Substanz bei 100'^ getrocknet, in kleine Stücke gebrochen und der beschriebene Prozeß wiederholt. Bei diesem Prozeß werden Kollagen, Muskelelemente und andere nicht ela- stinartige Substanzen entfernt. Aber außer dem Elastin befindet sich in der Aorta noch eine andere Proteinsubstanz, welche dem Elastin in ihrem Widerstand gegen obigen Reinigungsprozeß gleicht, und welche sehr schwer zu entfernen ist. Zu ihrer Beseitigung bedient man sich folgender Methode: Das trockene ^Material wird fein gepulvert und das Pulver so lange mit großen Mengen häufig erneuerten kochenden Wassers behandelt , als noch organische Substanz in Lösung geht. Die ungelöste Masse wird dann 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur mit ö^/oiger Salzsäure behandelt, durch Wasser und darauf folgende Dialyse von der Säure befreit und mit kochendem Alkohol entwässert. Schließlich wird das Produkt o Tage lang mit täglich gewechseltem Äther extrahiert, um Fettsubstanzen zu entfernen. Das trockene Elastin ist ein braungelbes Pulver {ScJurarz'^). Vgl. die Resultate der Totalhydrol^se des Elastins bei Abderhalden und Schittenhelm^), H. Schwarz^), Kossei und Kutscher*) und Mörner.^) III. Die „Albumoide" und Keratoelastine. a) In der Linse des Auges fand Mörner'^) ein ..Albumoid" in einer Menge von IT^o der frischen Linse. Dargestellt wird es in folgender Weise: Durch fleißiges Umschütteln der in einer Glasflasche enthaltenen Linsen mit 1/4 gesättigter Kochsalzlösung werden die Linsenfasern Schicht für Schicht in der Flüssigkeit aufgeschlemmt. Durch Filtrieren wird das lös- liche Eiweiß zum größten Teil entfernt, worauf die auf dem Ulter ge- sammelte Linsenmasse in einer reichlichen Menge Kochsalz aufgeschlemmt 1) 7/. iS'cÄH'ar^-, Untersuchungen über die chemische Beschaffenheit der elastischen Substanz der Aorta. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 18. S. 487—507 (1894). — Vgl. auch Bergh, Untersuchungen über die basischen Spaltungsprodukte des PJlastins beim Kochen mit Salzsäure. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 23. S. 337 (1898). -) E. Abderhalden und A. Schitfoihcl»/, Die Abbauprodukte des Elastins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 41. S. 293 (1904). ^) H. Schwarz, loc. cit. *) A. Kossei und F. Kutscher, Über die Bildung von Arginin aus Elastin. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 25. S. 551 (1898). ^) C. Th. Mörner, Untersuchung der Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges. I. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 18. S. 61—106 (1894).— Vgl. auch über Kollagen. Darstellung der Proteine der Tierwelt : Alltiiminoide. 457 wird. Nach ^'el•lauf eines Tages wird die überstehende Flüssigkeit abde- kantiert und das Aufschlemmen so lange Aviederholt, bis die Flüssigkeit kein Eiweiß mehr gelöst enthält. Das Kochsalz wird nun aus der Substanz durch gi-ündliches Waschen mit destilliertem Wasser entfernt und die Sub- stanz selbst auf einem Filter gesammelt. Sie kann ohne vorherige Alkohol- und Ätherbehandlung getrocknet werden. h) Zwei Albumoide hat Mörner (loc. cit.) in den Grundsubstanzen der Linsenkapsel und der DescemeUQ]\Q\\ Haut nachgewiesen (tierische Mem- lu'anine) und in folgender Weise dargestellt: Das rein präparierte Material wird mit 0"l%igei" Kalilauge, welche in einem Zwischenraum von 1 — 2 Tagen erneuert werden muß, extrahiert, bis die Extraktionsflüssigkeit keine Ei- weißreaktion mehr gibt und sodann das Alkali durch Auslaugen mit einer großen Menge destillierten Wassers zuerst bei Zimmertemperatur, dann bei 30^ -40" entfernt. Die Membran behält bei dieser Behandlung vollständig ihr ursprüngliches Aussehen bei; sie wird mit Alkohol und Äther ausge- waschen und im Exsikkator getrocknet. c) Im Balkennetz des älteren Knorpels wies Mörner 1) ein Albumoid nach, welches durch Tropäolin gefärbt wird. Man stellt es aus Tracheal- knorpel dar, indem man denselben mit 0*2 — 0'5Voi»er Kalilauge extrahiert, mit Wasser auswäscht und den Rückstand mit Wasser unter Druck zer- kocht (bei 110 — 120'^). Zusammen mit den Knoi'pelzellen hinterbleibt dabei das Albumoid als schwammige Masse. d) Ein Chondro-Albumoid läßt sich (nach Mörner, loc. cit.) auch fol- gendermaßen darstellen: Man benutzt dazu das Septum nasale von Schweinen oder Ochsen. Die Knorpel werden von den anhaftenden Geweben befreit, in der Fleischmaschine zerkleinert und die Masse mehrmals zur Entfer- nung des löslichen Eiweißes mit 0"1 — 0'27oi8"^i' Salzsäure gewaschen. Danach wird die Salzsäure weggewaschen und die übrigen anhaftenden Substanzen, wie Chondromukoid, Xucleoprotein etc., durch anhaltende Ex- traktion mit O'Oö — 01"/oi&Pi' KaUlauge in Gegenwart von Toluol entfernt, bis keine säurefällbare Substanz mehr nachgewiesen werden kann. Sodann beseitigt man das Alkali durch Waschen mit Wasser in Gegenwart von Toluol. wo- rauf der Rückstand der Behandlung mit kochendem Wasser und dem weiter unten beschriebenen Prozeß zur Darstellung des Osseoalbumoids unter- worfen wird (Haivk und Gies, loc. cit.). e) Zur Darstellung eines „Osseoalbumoids" verfährt man auch in folgender Weise: Man stellt sich Ossein dar (wie gelegentlich der Kollagen- gewinnung beschrieben), wobei man die (Jsseinspäne in 0-2'%iger, häufig erneuerter Salzsäure aufbewahrt. Nachdem das Ossein, wie bereits ange- geben, mukoidfrei gewaschen und mit häufig erneuerter 0-2Voiger Salzsäure bis zur Entfernung der Mineralbestandteile (Phosphate) behandelt ist, wird die Salzsäure durch Waschen mit Wasser und durch Dialyse entfernt. Das voU- M C.Th. Mörner, MaJi/s Jahresbericlite. Bd. 18. — Derselbe, Skandinav. Archiv für Physiologie. I. S. 234 (1889). 438 '^'^'- -T- ^'ies und E. Strauß. kommen säurefreie Ossein ^vird sodann mit kochendem Wasser behandelt, bis das KolLigen größtenteils in Glutin übergeführt ist und nur ein ge- ringer Anteil unlöslicher Substanz hinterbleibt. Das Wasser wird bei diesem Prozeß häufig erneuert und das Kochen mit Wasser so lange fortgesetzt, bis die Lösung mit Pikrinsäure oder Quecksilberjodidjodkali nur noch schwache Trübungen gibt. Die schließlich hinterbleibende flockige gelb- weiße Masse wird nun zuerst mit 0"2"/oiger Salzsäure, dann mit Wasser, dann mit 0*5o/oi&er Soda, wieder mit Wasser, schließlich mit Alkohol und Alkoholäther gewaschen. Endlich wird sie noch einmal im Soxhlet mit Äther extrahiert und getrocknet. Das Osseoalbumoid stellt ein leichtes, nicht hygroskopisches, gelbweißes Pulver dar (Hawk und Gies, loc. cit.). f) Ichthylepidin nennt Mörner'^) ein neben dem Kollagen in den Schuppen vieler Fische vorkommendes Albumoid. Die Darstellung desselben gelingt in folgender Weise : Nachdem die mit dem Messer losgemachten Schuppen von groben Verunreinigungen durch Aufschlemmen mit Wasser und durch Auslesen mit einer Pinzette von Beimengungen befreit worden sind, werden sie bei niederer Temperatur sukzessive mit 0"5Voiger Salzsäure, O'OöVoig'^r Kahlauge, O'Ol^/oiger Essigsäure und destilliertem Wasser aus- gelaugt — alles in großen Quantitäten — und jede der genannten Flüssig- keiten mehrere Tage hindurch unter häufigem Wechsel angewandt. Die auf diese Weise entkalkte Schuppenmasse wird während einiger Tage mit 0"l"/oiger täglich gewechselter Salzsäure und schließlich mit Chloroform- wasser digeriert, bis die Flüssigkeit bei der Färbung mit Lackmus keine Säurereaktion mehr anzeigt. Der säurefreie Paickstand wird nun mit Alkohol und Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. E. Abderhalden und A. Voitinovici^) hydrolysierten das Ichthylepidin. g) Keratinoid. Hedenius^) stellte aus der Hornschicht des Muskel- magens der Hühner ein Keratinoid dar, indem er diese Schicht durch sehr verdünntes Ammoniak, essigsäurehaltiges Wasser, destiUiertes Wasser, Alkohol und Äther erschöpfte. Die Substanz kann, ohne zerstört zu werden, zu weiterer Pteinigung auch noch der Wirkung von Yerdauungsfermenten ausgesetzt werden. h) Kerato elastin. l)ie Eihüllen einiger monotremer Säugetiere sowie diejenigen verschiedener Reptilien und Fische, nehmen eine Z^^^schen- stellung zwischen dem Elastin und den Keratinen ein. Die Reingewinnung dieser Substanzen ist einfach. Zum Zwecke neuerer L'ntersuchungen haben *) C. Th. Mörner, Die organische Grundsulistanz der Fischschuppen vom chemi- schen Gesichtspunkt aus betrachtet. Zeitschr. f. physio]. Chemie. Bd. 24. S. 125 (1898). — Vgl. auch: E. H. Green und R. W.Tower, Ichthylepidin in den Schuppen amerikani- scher Fische. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 35. S. 196 (1907). ^) E. Abderhalden und A. Voitinorici , Weitere Beiträge zur Kenntnis der Zu- sammensetzung der Proteine. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 52. S. 368 (1907). *) Hedenius, Skandinav. Archiv f. Physiologie. Bd. 3. S. 244 (1891). — Vgl. dazu: A'. ß. i/o/manw und F. Pre///, Über Koilin. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 52. 8.448(1907). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 459 Pregl und Buchtala^) die Eihäute von Scyllium stellare, Pristiurus melano stomis und Scyllium canicula zuerst in l^/oiger Salzsäure mehrere Tage quellen lassen, nach erfolgter Quellung abgespült, aufgeschlemmt und vom zurückgebliebenen gallertartigen Inhalt mechanisch unter dem Wasserstrahl befreit. Nachdem die Eihäute an der Luft getrocknet waren, wurden sie mit Alkohol, sodann mit Äther und schheßhch an der Luft völlig getrocknet. Pi-effl (loc. cit.) hydrolysierte die Eihäute von Scyllium stellare. Die Zusammensetzung der Eihäute von Testudo graeca ist von Abderhalden und Strauß^-) untersucht worden. h' IV. Das Ovokeratin, die Hornsubstanz der Schalenhaut der Vogeleier, wird, wie folgt, dargestellt {Abderhalden'^), LindwaU*), Strauß, loc. cit.): Die Eierschalen werden mechanisch zerkleinert und hierauf in Wasser mehrere Stunden mit einem großen Rührer in beständiger Bewegung gehalten. Hierbei bleiben die Schalenhäute zum großen Teil am Piührer hängen, während die Schalen- stücke sich am Boden des Gefäßes absetzen. Die von den anhaftenden Schalenteilen so weit als möglich gereinigten Häute werden mit ö"/oiger Salzsäurelösung zwei Tage stehen gelassen, dann mit b°l ^iger Essigsäure auf dem Wasserbade gekocht und dann so lange mit Wasser ausgewaschen, bis das Filtrat keine Säurereaktion mehr gibt. Durch W^aschen mit Alkohol und Äther erhält man die Substanz schließlich trocken. Die Blättchen lassen sich zu einem feinen gelblichen Pulver zerreiben. V. Das Neurokeratin. ist die von Kühne und Ewald'") entdeckte, von Kühne und Chittenden^) weiter untersuchte, in den markhaltigen Nerven und in den nervösen Zentralorganen vorkommende Substanz, welche in iVlkohol und Äther, in Magen- und Pankreassaft und in verdünntem Ätzkali unlöslich ist. Argiris') ') F. Pregl, Über die Eihäute von Scyllium stellare Guenth. und ihre Aliliau- produkte. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 56. S. 1—10(1908). — //. Buchtala, Elenien- taranalyse der Eihäute von Scyllium stellare, Pristiurus melanostomis und Scyllium cani- cula und Verteilung des Stickstoffes in denselben. Ibid. S. 11 — 17. -) E. Abderhalden und E. Strauß, Die Monaminosäuren des Keratins aus Eiern von Testudo graeca. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 48. S. 525 (1906). ^) E. Abderhalden und E. Ebstein, Die Monaminosäuren der Schalenhaut des Hühnereies. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 48. S. 530 (190(5). *) V. Lindwall, Beitrag zur Kenntnis des Keratins. Laekaref. foerh. 16. Upsala. — Mahjs .Jahresberichte. Bd. 11. S. 38 (1881). '") Kühne und Eicald , Verhandlungen des Xaturw.-mcdizin. \creins. Heidelberg 1877. Neue Folge. I. S. 357. 6) Kühne und Chittenden, Zeitschr. f. Biologie. Bd. 21. S.291 (1899). Vgl. auch Bd. 26 und 2\eunieister, ibid. Bd. 31. ') A. Argiris, Zur Kenntnis des Xeurokeratins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 54. S. 86 (1907). 440 ^^'- J- Gies und E. Strauß. (vgl. auch Steel und Gies^) verfulir zu seiner Darstellung aus Gehirn in folgender Weise: Das Gehirn (Schale) wird nach Beseitigung der Häute und des anhaftenden Blutes durch die F'leischmaschine zerkleinert, mit Aceton H— 4mal behandelt und durch ein feines Haarsieb gerieben. Der Brei wird durch wiederholtes Schütteln mit neuen Äthermengen erschöpft, mit 750/Qigem Alkohol bei -lO" so oft behandelt, bis das Filtrat beim Eindampfen keinen nennenswerten Rückstand hinterläßt und schließlich mit einer Mischung gleicher Teile Benzol und Alkohol am Ilückflußkühler ausgekocht. Die al)filtrierten Massen werden in Wasser suspendiert, in flachen Schalen durch Erhitzen auf dem Dampfbad von Benzol befreit, darauf in großen Zylindergläsern mit Wasser und soviel Soda, daß der (Tchalt etwa O'öVo beträgt, versetzt und nach Zufügen von Pankreatin zwei Wochen bei einer Temperatur von o9" gehalten. Die Verdauungs- flüssigkeit wird mehrfach abgehebert und ersetzt. Das schließlich als Bodensatz verbleibende feine Pulver wird nach Beseitigung der alkalischen Reaktion durch vorsichtigen Zusatz von Salzsäure mit soviel Alkohol gemischt, daß der Prozentgehalt an Alkohol etwa 75% beträgt und am Rückflußkühler gekocht. Nach der Alkaliextraktion wird die Substanz mit Benzolalkohol in gleicher Weise extrahiert und nun abermals die tryptische Verdauung eingeleitet. Verdauung und Extraktion werden so lange alternierend wiederholt, bis die Verdauungsflüssigkeit keine MyeUn- substanzen mehr enthält. Der feine Brei wird nun mit OP/oiger Salz- säure behandelt, mit Wasser säurefrei gewaschen und schließlich mit Alkohol und Äther durchgespiüt. Das Neurokeratin wird alsdann in der Reibschale fein zerrieben und durch ein engmaschiges Seidenfilter gesiebt. Es entsteht ein hellgelbes geruchloses Pulver. VI. Die echten Keratine sind die Grundsubstanzen der verhornten epithelialen Gewebe, und zwar diejenigen der Kutisgebilde. Da sie alle von ihrer Unterlage leicht zu isolieren sind, beschränkt sich ihre DarsteUung meistens auf eine eingehende Reinigung durch Extraktion mit Wasser, Alkohol und Äther. Zur Isoherung der Hornhaut (Cuticula) ist es jedoch nötig, die Haut einer lang an- dauernden Pepsin- und Trypsinverdauung zu unterwerfen; hierbei hinter- bleibt die eigentliche Hornschicht, welche dann mit Wasser gründlich gewaschen und mit Alkohol und Äther getrocknet wird. Nach Gies stellt man reines Keratin aus weißem Ochsenhorn in folgender Weise dar: Man schabt mit einem scharfen Stahlskalpell von reinem frischen Hörn möglichst dünne Späne ab und zerkleinert dieselben sodann so weit als möglich in einer Pulvermühle. Das Material ^^ird 24 Stunden lang mit wechselnden Mengen x\lkohol und Äther zur Ent- fernung des Fettes extrahiert und dann zur Aufweichung der Partikelchen ') Sfeel and Gies, On the chemical nature of paiaiiucleoproteid, a new product froni hrain. American Journal of Physiol. Vol. 20. p. 378 (1907). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Albuminoide. 441 einige Stunden mit Wasser von 40" C behandelt (kochendes Wasser ist zu vermeiden). Nun wird die Substanz einer längeren Einwirkung von Pepsin- salzsäure (0-'2°/oige Salzsäure) bei 08 — 40° und hierauf nach sorgfältiger Entfernung der Säure einer Einwirkung von stark aktivem Trypsinalkali (0*25'VoiS'es Soda) unterworfen. Die beiden Yerdauungsprozesse müssen über eine Woche hindurch in Gegenwart von Toluol und mit mehrfach ge- wechselter Verdauungsflüssigkeit vorgenommen werden. Der Rückstand wird nun durch Waschen, dann durch Dialyse säurefrei gemacht und schließlich am Rückflußkühler mit einem Alkoholäthergemisch extrahiert. Nach Aus- waschen mit warmem Äther wird das Produkt im Exsikkator getrocknet. Über die Resultate der hydrolytischen Spaltung liegen für verschiedene Keratine Angaben vor. ^' -> ^' *> ^' ^) *) E. Fischer und Th. Dörpinghaus , Hydrolyse des Horns. Zeitschr. f. plivsiol. Chem. Bd. 36. S. 462 (1902). -) E. Abderhalden und Ä. Voitinovici, Hydrolyse des Keratins aus Hörn und Wolle. Ibid. Bd. 52. S. 348 (1907). ^) E. Abderhalden und E. R. Le Count , Die Monoaminsäuren des Keratins aus Gänsefedern. Ibid. Bd. 46. S. 40 (1905). *) E. Abderhalden und H. (t. Wells, Die Monoaminsäuren des Keratins aus Pferde- haaren. Ibid. Bd. 46. S. 31 (1905). -') E. Abderhalden und D. Fuchs, Der Gelialt verschiedener Keratinarten an Glut- aminsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 57. S. 339 (1908). ^) H. Buchtala , Über das Mengenverhältnis des Cystins in verschiedenen Horn- substanzeu. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 52. S. 474 (1907). t) Histoiie und Protamine. Von H. Steudel, Berlin. I. Histone. Prinzip der Darstellung der Histone. Die zerkleinerten Organe werden mit stark verdünnter Salzsäure extra- hiert und aus dem Filtrat wird durch Zusatz von Ammoniak oder Natronlauge (ev. unter Zuhilfenahme von Alkohol) ein Niederschlag von Histon erzeugt. 'ö* 1. Histon aus Yogelblutkörperchen. Isolierung der Kerne von Blutkörperchen aus Gänse- und Schlangenblut nach Plösz.'^) Das defibrinierte Blut wird mit der zehnfachen Menge einer NaCl- Lösung von o^/o zur Senkung der Blutkörperchen hingestellt; der durch Abgießen der Flüssigkeit erhaltene Brei der Blutkörperchen wird mit Äther und Wasser geschüttelt, wodurch die Kerne von den umhüllenden Zell- teilen befreit werden und sich an der Berührungsfläche zwischen Äther und Wasser zusammenballen. Zur weiteren Reinigung von den Hüllen sowie von dem darin haftenden Blutfarbstoffe wird diese Prozedur mit neuen Äther- und Wassermengen einige Male wiederholt, hierauf die Masse mit verdünnter Salzsäure, heißem Alkohol und Äther gewaschen, wodurch die Kerne von den daran haftenden Zellresten vollständig befreit werden. Oder: Die Blutkörperchen werden nach dem Behandeln mit Wasser und Äther in künstliche Verdauungsflüssigkeit gebracht und unter öfterem Erneuern 40 — 60 Stunden der Wirkung derselben ausgesetzt, dann mit verdünnter Salzsäure, iVlkohol und Äther gewaschen. Isolierung der Kerne von Butkörperchen aus Hühnerblut nach Plenge.^) Das unter Umrühren fibrinfrei gewonnene Blut wird möglichst frisch mit 0*9Voiger Na Cl-Lösung verdünnt und in einer 4 / fassenden Zentrifuge ^) P. PUsz, Über das chemische Verhalten der Kerne der Vogel- und Schlangeublut- körperchen. Hoppe-Set/Icrs med.-chem. Untersuchung. S. 461. Berlin, Hirschwald (1866/71). ^) D. Ackermann, Zur Chemie der Vogelblutkerne. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S. 300 (1904). I Darstellung der Proteine der Tierwelt: Histone und Protamine. 44H ausgeschleudert. Die abgesetzten Blutkörperchen werden noch einmal mit O-Oo/oitier Na Cl-Lösung aufgeschwemmt und zentrifugiert. Die gewaschenen Blutkörperchen werden je nach der Menge in 1 oder 2 Scheidetrichtern von je 2 l Inhalt eingebracht und in jedem mit loOO cm» Wasser von 40" geschüttelt. Nach einiger Zeit werden zu je löOOrm'' Wasser o00cm3 Na Cl-Lösung von ^'öVo hinzugefügt. Dann wird zentiifugiert. Die abgesetzten Kernmassen werden von neuem in einem Scheidetrichter in 1500 cm^ Wasser von 40*' unter Umschütteln suspendiert. Nach Hinzufügen von bOOcm^ NaCl-Lösung von 3-6"/o wird wiederum zentrifugiert. Dies Vorgehen wird so oft wiederholt, bis die Masse ein farblos glasiges Aussehen ohne rote Streifen hat und an die Kochsalzlösung keinen Blutfarbstoff mehr abgibt. Dann wird die Kernmasse wiederum in Wasser zum Aufquellen gebracht und mit dem doppelten \'olumen Alkohol zur Schrumpfung gebracht, zentrifugiert, in 96o/oigen Alkohol gebracht, ai)ge- saugt, noch einmal mit 96Voi&<^in Alkohol verrieben und abgesaugt, dann in absolutem Alkohol und darauf in Äther getrocknet und abgesaugt. Die ganzen Manipulationen dürfen bis zum Einbringen in Alkohol nicht mehr als o Tage in Anspruch nehmen. Es empfiehlt sich, die Kern- massen nachts über nicht mit Wasser allein, sondern nach Zufügung der Na Cl-Lösung an einem kühlen Platze aufzubewahren. Darstellung von Histon aus den Kernen von Yogelblut- körperchen nach Kassel.^) Die auf die eine oder andere Weise gewonnenen Kerne werden mit 0"8"/oir^r Salzsäure extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat das Histon durch Eintragen von Steinsalz ausgefällt. Der reichlich entstehende Nieder- schlag wird abfiltriert, mit salzhaltiger Säure ausgewaschen, in Wasser aufgeschwemmt und nun der Dialyse unterworfen. In dem Malle, wie das Salz durch Diffusion entfernt wird, geht die Substanz im Innern des Dia- lysators in Lösung. Aus der neutralen salzfreien Lösung wird das Histon durch vorsichtigen Zusatz von Ammoniak ausgefällt, abfiltriert und mit Alkohol und Äther getrocknet. 2. Histon aus der Thjimisdrüse. Darstellung nach Kossei und Kutscher.'-) Das feinzerhackte Thymusgewebe wird mit etwa der doppelten Menge Wasser bei gewöhnhcher Temperatur ausgezogen und das wässerige Extrakt mit Salzsäure versetzt, bis der Gehalt an Salzsäure 0-8Vo beträgt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren und Filtrieren entfernt und das ') A. Kossei, über einen peptonartigen Bestandteil des Zellkerns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 8. S. 511 (1884). -) Ä. Kossei und Fr. Kutscher, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitschr. f. phjsiol. Chemie. Bd. 31. S. 188 (1900). 444 H. Stcudel. klare Ultrat mit Ammoniak gefällt. Das ausgefällte Histon wird mit aramoniakhaltigem Wasser ausgewaschen, in Alkohol gebracht und sodann mit Alkohol, zuletzt mit Äther völlig extrahiert. Darstellung von Parahiston aus der Thymusdrüse nach Fleroff.'^) Nimmt man statt der frischen Thymusdrüse das zerkleinerte, mit Alkohol und Äther erschöpfte Gewebe und extrahiert dieses 48 Stunden lang mit 27oi8er Schwefelsäure, auf je 100// 1000 cm^ H, SO^ , so erhält man in dem Auszuge durch die dreifache Menge 96"/oigen Alkohols einen Niederschlag, der in heißem Wasser gelöst und mit Natriumpikrat aus- gefällt wird. Das Pikrat wird mit Äther und ^o/^iger Schwefelsäure von der Pikrinsäure befreit und die Lösung mit Alkohol gefällt. Das durch wieder- holtes UmfäUen gereinigte Sulfat gibt, in heißem Wasser g'clöst, mit über- schüssigem Ammoniak einen Niederschlag (Histon), von dem abgetrennt wird. Aus dem Filtrat erhält man durch Fällung mit Alkohol das Para- histon, das nach einmahgem T^mfällen und Filtrieren mit Alkohol und Äther getrocknet wird. In gleicher Weise wie aus A'ogelblutkörperchen läßt sich nach Kossei und Rutscher-) aus den reifen Spermatozoen von Gadus (Kabliau) ein Histon gewinnen — Gadushiston — , aus dem reifen Sperma von Lota vulgaris nach Ehrströni ^) ebenso das Lotahiston. Das unreife Sperma scheint häufig ein Histon zu enthalten (Scombron*), Lachsalbuminose. ^) Das reife Sperma von Arbacia vulgaris (Seeigel) liefert ein Histon. das x\r- bacin.'') 3. Darstelliiug des Olobiiis. Zu den Histonen gerechnet wird ferner von einigen i\.utoren unrichtiger- weise das Globin. der Haupteiweißkörper des Hämoglobins (Fr. N. Schulz^). Das Globin gibt die Pteaktionen der Histone nicht '' ) und unterscheidet sich von ihnen auch wesentlich durch seinen Hexonbasengehalt (siehe S. 446). *) J. Flet-oß', Über einen histonähnlichen Körper aus Thymus. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 28. S. 307 (1899). ^) A. Kossei und Fr. Kiitscher, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 31. S. 188 (1900). '*) 7?. Ehrström, Über ein neues Histon aus Fischsperma. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 32. S. 351 (1901). 4) J. Bang, Studien über Histon. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 27. S. 463 (1899). ^) Fr. Miescher, Chemisch-physiologische Untersuchungen über die Lachsmilch. Archiv f. experim. Pathologie u. Pharmakologie. Bd. 37. S. 151 (1896). ^) A. Matheics, Zur Chemie der Spermatozoen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 23. 8.399(1897). ') Fr. X. Schulz, Der Eiweißkörper des Hämoglobins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 24. S.449 (1898). 8) A. Kossei, Über das Histon. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 49. S. 314 (1906). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Histone und rrotamiue. 445 Setzt man zu einer Hämoglobinlösuno' eine sehr gering-e Menge stark verdünnter Salzsäure, so entsteht eine flockige, braune Fällung, die sich im geringsten Überschulj von Säure sofort leicht löst. Die so erhaltene Lösung zeigt nicht mehr die schöne rote Farbe der ursprünglichen Hämo- globinlösung, sondern einen braunen Farbenton; jedoch wird (hidurch nicht nur die Lösung in ihrer Farbe verändert, sondern es ist auch eine kom- plete Trennung zwischen Eiweißkörper und Farbstoff eingetreten. Setzt man nämlich zu einer solchen Lösung, die eben sauer reagiert, Alkohol (ca. Vs^ol.) und schüttelt nunmehr mit Äther aus, so tritt der ganze Farbstoff in den Äther über, während die untenstehende, wässerig-alkoho- lische völlig klare Lösung den entfärbten Eiweißkörper enthält. Diese Spal- tung und Trennung vollzieht sich mit ganz überraschender Leichtigkeit, wenn man einige Vorsichtsmaßregeln beobachtet. Zunächst muß die Hämo- globinlösung salzfrei oder doch sehr salzarm sein. Verwendet man eine salzreichere Lösung, so tritt, wenn man nicht außerordentlich vorsichtig verfährt oder mit verdünnten Lösungen arbeitet, auf Säurezusatz nicht eine vorübergehende, sondern eine bleibende, im Überschuß von Säure unlös- liche Fällung auf. Diese bleibende Fällung erfolgt auch in salzfreien Lösungen, wenn man, nachdem der zuerst sich bildende Niederschlag durch einen sehr geringen Überschuß von Säure gelöst ist, nunmehr eine größere Menge von Säure hinzusetzt. — Ein stärkerer Salzgehalt wirkt auch beim Aus- schütteln der durch vorsichtigen Säurezusatz erhaltenen Lösung mit Alkoholä ther störend. Die Trennung des Farbstoffes vom Eiweißkörper vollzieht sich zwar auch hier glatt, aber der Eiweißkörper bleibt nicht in Lösung, sondern wird ausgefällt und nunmehr durch die Einwirkung des Alkohols leicht koaguliert. hl betreff des Ausschütteins mit Äther ist zu bemerken, daß sich die Trennung des Äthers von dem wässerigen Alkohol leicht und sehr glatt vollzieht, wenn ein bestimmtes Verhältnis zwischen Wasser, Alkohol und Äther besteht, welches man am besten in jedem Versuche ausprobiert. Mau setzt zunächst ca. Vs^ ol. SOVoig'^n Alkohols zu der Hämoglol)inlösung hinzu und versucht dann mit dem halben Volumen Äther auszuschütteln. Scheidet sich die Ätherschicht nicht sofort nach dem Schütteln glatt ab, so setzt man von neuem etwas Alkohol hinzu und versucht, ob sich nun- mehr der Äther auch nach heftigem Schütteln sofort abscheidet. Ist dies nicht der Fall, so setzt man so lange vorsichtig Alkohol hinzu, bis eine rasche und glatte Abscheidung eintritt. Arbeitet man mit sehr konzen- trierten Lösungen, so ist es zweckmäßig, wenn man kurze Zeit heftig geschüttelt hat, den Äther zu erneuern. Man erhält so eine klare, mehr oder weniger braungelb gefärbte, wässerig-alkoholische, schwach saure Lösung. Aus dieser fällt beim Xeutra- hsieren mit Ammoniak ein schwach gelb gefärbter, grobflockiger Nieder- schlag aus, der sofort abgesaugt wird. Dann wird er in \^■asser unter Zu- satz einiger Tropfen Essigsäure gelöst und durch mehrtägiges Dialysieren die Essigsäure entfernt; man erhält so eine völlig neutrale, absolut klare, schwach gefärbte Globinlösung. Histon aus Thymus*) Gadushiston^) Lotahistnn ^) Glolnn*) Histidin 1-21 2-34 2-85 10-96 O — Argiiiiii 14-36 15-Ö2 12-00 5-42 -' CA Lysin 8-30 317 4-28 x 'T 446 H. Steudel. Eigenschaften der Histone. Sämtliche Histone sind stark l)asische Eiweißkörper, die ihrem Bau nach zwischen den einfachen Eiweißkörpern, den Protaminen und den kom- plizierten Eiweißkörpern stehen. Sie sind relativ stickstoffreich. IT bis 20Vo ^^ 1 und liefern bei der Hydrolyse verhältnismäßig reichliche Mengen von Hexonbasen: a: Ihre Basizität ist der Grund , daß sie. ähnlich wie die Protamine, schon aus neutraler Lösung durch die Alkaloidreagenzien (phosphorwolf- ramsaures, phosphormolybdänsaures, pikrinsaures Natron, Ferrocyankalium) ausgefällt werden. L)ie meisten Histone sind fäUbar durch Ammoniak, geben mit Salpetersäure einen Niederschlag, der in der Wärme verschwindet und beim Erkalten wieder erscheint, und gerinnen beim Erhitzen einer salzhal- tigen, neutralen Lösung. Mit den komplizierteren Eiweißstoffen geben sie in Wasser unlös- liche Niederschläge. Durch Pepsinsalzsäure werden sie zerlegt unter Bildung eines als Histopepton bezeichneten albumoseartigen Produkts, das die basischen Eigenschaften der Histone ebenfalls besitzt (Fällung durch Na- triumpikrat in neutraler Lösung). Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Histon sind die Blutkör- perchenkerne von ^'ogelblut, die Thymusdrüse und die reifen Spermatozoen einiger Fischarten (z. B. Gadus, Lota). IL Protamine. Prinzip der Darstellung.^) Die Spermatozoen werden aus den reifen Fischhoden isoliert und mit verdünnter Schwefelsäure extrahiert : aus dem Extrakt wird das Protamin- 1) Ä. Kossei uud Fr. Kutscher, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitsclir. f. physiol. Chemie. Bd. 31. S. 191 (1900) — Vgl. auch Emil Abderhalden uud Peter Bona, Die Abbauprodnkte des „Thymushistons". Ebenda. Bd. 41, S. 278 (1904). «) A. Kossei und Fr. Kutscher, I.e. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 31. S. 195 (1900). ") R. Ehrström, Über ein neues Histon aus Fischsperma. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 32. S. 351 (1901). *} E. Abderhalden, Hydrolyse des kristallisierten Oxyhämoglobins aus Pferdeblut. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 37. S. 493 (1903). ^) A. Kossei, iJber die basischen Stoffe des Zellkerns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 22. S. 178 (1896). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Histone und Protamine. 447 siilfat mit Alkohol ausgefällt und dieses weiter gereinijrt (Ausscheidung als Öl, Fallung- als Pikrat und Wiedergewinnung des Sulfats). Die reifen Testikel werden zerhackt. Die zerhackte Masse wird mit Wasser anhaltend geschüttelt, durch ein Tuch geseiht und die milchige, kolierte Flüssigkeit mit einigen Tropfen Essigsäure versetzt. Hierdurch bewirkt man, daß die im Wasser suspendierten mori)hotisclu'n Elemente sich zu- sammenballen. Die Flüssigkeit wird filtriert, der Filterrückstand niclirnial> mit Alkohol ausgekocht, sodann mit Äther extrahiert und bei Zimmer- temperatur getrocknet. Je 100 (/ dieser Spermamasse werden mit 500 cm^ lo/oiger Schwefel- säure V4 Stunde lang auf der Schüttelmaschine ausgeschüttelt, auf der Nutsche abgesaugt und diese Extraktion noch dreimal mit der gleichen Menge Schwefelsäure wiederholt. Die vereinigten Filtrate werden mit der dreifachen Menge Alkohol gefällt, die Flüssigkeit nach 12 bis 24 Stunden dekantiert und der Niederschlag, welcher aus schwefelsaurem Protamin besteht, abgesaugt. Die Ausbeute an diesem Pohprodukt beträgt etwa 200/0 der trockenen Spermamasse. Zur weiteren Reinigung löst man den Nieder- schlag in heißem Wasser und wiederholt die Alkoholfällung. Wenn man jetzt den Niederschlag in etwa 1 ^/.^ / heißen Wassers löst und im Scheide- trichter erkalten läßt, so scheidet sich ein kleiner Teil des Protaminsnlfates als gelb gefärbtes Öl ab. Dieser am schwersten lösliche Teil des Sulfates Avird abgetrennt, die über dem Öl stehende Flüssigkeit auf ein kleines Volumen eingedampft und im Scheidetrichter zur Ausscheidung der Haupt- menge des Öls stehen gelassen. Der nunmehr gewonnenen Fraktion des Protaminsulfats haftet hartnäckig etwas Nukleinsäure an. Um das Prota- min hiervon zu befreien, wird es wieder in warmem Wasser gelöst, mit Natriumpikrat ausgefällt , der Niederschlag abgesaugt . gut ausgewaschen und möglichst bald durch Ausschütteln mit Äther bei Gegenwart von Schwefelsäure von der Pikrinsäure wieder befreit. (Läßt man das Protamin- pikrat längere Zeit stehen, so ist es schwer, die Pikrinsäure nachher völlig wieder zu entfernen und zum Schluß rein weiße Präparate zu bekommen.) Das nunmehr erhaltene Sulfat wird wieder mit Alkohol ausgefällt und die Alkoholfällung noch einmal wiederholt. Das Sulfat soll ein lockerer, weißer Niederschlag sein, fäUt es klebrig aus, so muß das Lösen in Wasser und Fällen mit Alkohol wiederholt werden. Nach dieser Methode können Salm in und Clupein in gleicherWei.se gewonnen werden, bei der Darstellung von Sturin und Accipeuserin muß die Lösung des Sdfats wegen der größeren Löslichkeit dieser Salze weiter eingedampft werden. Die Lösung des Cyclopterinsulfats ») muß bis auf 2« abgekühlt werden, damit sich alles Protaminsulfat als Öl ab- scheidet. *) N. Morkoiriii, Ein Beitrag zur Kenntnis der Protamine. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 28. S. 313 (1899). 448 H. Steudel. Darstellung der Proteine der Tierwelt etc. Eigenschaften der Protamine. Die Protamine sind stark basisclie, Stickstoff reiche (20 — oO^/q) Eiweiß- körper, die bei mäßiger Hydrolyse Protone M und bei vollständiger Spaltung in großer Menge Arginin hefern, daneben in weit geringerer Quantität Histidin, Lysin und einige wenige Monoaminosäuren, Prohn, Alanin, Amino- valeriansäuren. Das Cyclopterin enthält auch Tyrosin. Die Protamine geben in neutraler Lösung mit den Alkaloidreagenzien Niederschläge und bilden in ammoniakalischer Lösung mit den komplizierteren Eiweißkörpern etc. unlösliche Verbindungen. Sie sind optisch aktiv: Salminsulf at: y-D = — 80*8 Clupeinsulfat: 7.d = — 85-49 ^) Skombrinsulfat: a^ = — 71-81 2). Ausgangsmaterial: Die reifen Testikel von Lachs, Hering, Stör, Makrele usw. \) M. Goto, Über die Protamine. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 37. S. 106 (1902). A. Kossei- und H. Pringle, Beitrag zur Kenntnis der Protone. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. Bd. 49. S. 311 (1906). -) D. Kurajeß', Über das Protamin aus den Spermatozoen der Makrele. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 26. S. 528 (1898). ^) Nukleoproteide. Von Franz Sauiuely, Freiburg. Man bezeichnet mit dem Sammelnamen „Nukleoproteide'- solche Eiweißkörper, die sich aus einer Proteinkomponente und einem nicht protein- artigen Anteil zusammensetzen. Der letztere ist dadurch ausgezeichnet, daß an seinem Aufbau Purinkörper, Pyrimidinbasen, Phosphor m (lestalt von Phosphorsäure und ein der Pentosengruppe angehörendes Kohlehydrat beteiligt sind. Man bezeichnet diesen in seiner Konstitution erst zum Teil aufgeklärten Körper wegen seiner sauren Eigenschaften und seiner Pro- venienz als Nukleinsäure, deren es eine ganze Reihe verschieden zusammen- gesetzter Arten gibt. Die eiweißartige Komponente, die mit der Nukleinsäure in mehr oder weniger fester Verbindung steht, ist nur für eine beschränkte Auzahl dieser Substanzen aufgeklärt. Man fand als solchen Proteinanteil eiu durch ganz spezifische Reaktionen ausgezeichnetes Protein, das Histon, weshalb uian eine besondere Gruppe als Nukleohistone abgetrennt hat. Dieselben fiudeu ihre Besprechung zusammen mit den Histonen (vgl. S. 442 £f.). Alle übrigen Körper dieser Gruppe tragen schlechtwTg den Namen eines Nukleo- proteids. Ob die Eiweißkomponente allemal eine gleichartige ist, ist sehr zweifelliaft. Auch die Mengen der in einem solchen Proteid vorkommenden Eiweißkörper variieren erheblich, so daß die Eigenschaften und die Zu- sammensetzung erhebliche Unterschiede zeigen. Man bezeichnet daher jedes Nukleoproteid vorläufig nach dem Organ, aus dem es dargestellt wird. Die Nukleoproteide, die wir mit unseren Methoden darstellen, sind keine nativen Nukleoproteide, d. h. sie erleiden durch die Art der Isolierung zumeist eine sekundäre Veränderung. Man unterscheidet: -/.-Nukleoproteide. Sie werden bei Anwendung kalter, indifferenter Extraktions- und Lösungsmittel gewonnen. ß-Nukleoproteide, von wesentHch anderer Zusammensetzung als die a-Körper. Sie werden bei Verwendung heißer Lösungsmittel isoliert. Sie entstehen aus den a-Proteiden dadurch, daß diese in der Hitze in einen auskoagulierenden Eiweißkörper und das lösliche [i-Proteid zerfallen. Li der Regel begnügt man sich mit der Gewinnung der ß-Proteide. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 29 450 Fr. Samuely. Unter dem Eiiifliil) gelinder II\drolyse mit Hilfe von proteolytischen Fermenten (Pepsin) werden die Xukleoproteide gespalten. Es entstehen bei der Pepsin Verdauung intermediär sogenannte Nukleine, welche immer noch Verbindungen von Eiweiß mit Nukleinsäure darstellen, also noch Purinbasen und Phosphor enthalten, und die Purinbasen erst bei weiterer, tieferer Spal- tung (Trypsin oder Säuren) frei werden lassen. Die Nukleine kommen im Organismus nicht vor (Besprechung siehe 8.4(30). Die Darstelluugsmethoden beruhen im Prinzip alle auf den Eigen- schaften der Nukleoproteide. in verdünnten Alkalien als Alkaliverbindnngen oder in stark verdünnten Neutralsalzlösungen lösüch zu sein und nach Zu- satz einer verdünnten organischen Säure als wasserunlöslich auszufaUen. Die Mehrzahl dieser Proteide ist auch im Überschuß von Essigsäure un- löslich. Eine andere weniger zw^eckmäßige Darstellung beruht auf der Aus- salzung mit Neutralsalzen (Ammonsulfat). Wir geben die Isolierungsmethoden einiger Nukleoproteide zunächst ausführlich wieder: Nukleoproteid des Pankreas. I. ß-Nukleoproteid aus Pankreasgewebe nuch HarnnKosfen^). Frisches Pankreasgewebe vom Pdnd wird möglichst rein präpariert, zerschnitten und fein zerhackt. Es wird alsdann rasch mit Wasser aufge- kocht und heiß filtriert. Es entsteht ein blaßgelbes Filtrat. Nach dem Er- kalten säuert man mit Salzsäure oder Essigsäure an, so daß die Lösung 1 — 2''/oo HCl oder 5 — lO^/co Essigsäure enthält. Es entsteht sofort ein reichlicher Niederschlag, der sich weiß und flockig zu Boden setzt. Er wird abzentrifügiert oder abfiltriert. Der Filterrückstand wird in möglichst wenig Alkali gelöst. Statt stark verdünnter Natronlauge kann man Ammoniak verwenden und gelangt so sofort zu farblosen Lösungen. Die Lösung des Alkalinukleoproteids wird erneut mit Essigsäure gefäUt. Lösung und Fällung werden o — 4rnal wiederholt. Der gewonnene Niederschlag wird zuletzt auf dem Filter mit ganz schwach essigsaurem Wasser, dann mit Alkohol und Äther behandelt und schließlich im Vakuum getrocknet. Der Körper zeigt die Zusammensetzung: C 43'62, H o-4ö, N 1T'H9, S 0-72, P 4-48, Fe + Vo- ll. y.-Nukleoproteid des Pankreas nach Umher^). Die frische, zerkleinerte Pankreasdrüse wird kalt mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert. Das klare Filtrat wird, wie oben, mit Essigsäm'e ausgefällt, der entstehende Niederschlag wird häufig mit essigsaurem Wasser dekantiert. Zuletzt wird er in Wasser aufgeschwemmt, unter Zusatz von möglichst wenig Soda gelöst, schneU filtriert und durch Ansäuern gefällt. ') 0. Hammarsten, Zur Kenntnis der Nukleoproteide. Zeitschr. f. phys. Cliem. Bd. 19. S. 19 (1894). — Vgl. ibidem, Bd. 35. S. 111 (1902). ^) F. Umher, Das Nukleoproteid des Pankreas. Zeitschr. f. kliu. Med. Bd. 40. S. 464 (1900). — Über die fernieutative Spaltung der Nukleoproteide etc. Ibidem. Bd. 43. S. 282 (1901). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Xukleoproteide. 45] DieFmfällung wird wiederholt und schlielilich, wie oben beschrieben, mit Allvohol und Äther entfettet und getroclvuet. Es muü besonders bemerkt werden, daC» alle diese Operationen bei niederer Temperatur auszufüliren sind. Der Körper zeigt im Mittel die Zusammensetzung: C ")! )')"). H (3H1. N 17-12, V 1-67, S 1-29, Fe Q-W/,. Durch Kochen dieses Proteids in Wasser entsteht ein Koagnlat. Aus dem Filtrat kann in der sub I beschriebenen Weise ein neues Nukleoproteid isoliert werden von der Zusammensetzung: C 43-62, H5-45, N 17-39, P4-48, SO-72Vo. Der Körper ist mit dem direkt nach I dargestellten ß-Proteid identisch. Ein von Gamgee und Jones nach dieser Methode dargestelltes ß-Nukleo- proteid aus Schweinepankreas hatte die Zusammensetzung: C 4r)-(S)), 11 6'2t), PÖ-Oo, X 17-42Vo- III. Darstellung des a-Xukleoproteids nach Gamgee und Jones ^). Gut zerkleinertes, frisches Pankreasgewebe vom Schwein wird sukzessive mit 50-, 7ö-, 90- und Qb^/oigQ.m Alkohol und schUeßlich mit Äther extrahiert. Der trockene Pdickstand wird in der Kälte entweder mit 20 Teilen Wasser oder mit einer ö'YoigP^ Ammoniumacetatlösung extrahiert. Im ersteren Fall wird das klare Filtrat tropfenweise mit Essigsäure bis zu einem Gesamtgehalt von l^/o Säure versetzt. Der weilSe. flockige Niederschlag wird abzentrifugiert, in Wasser aufgenommen und mit Ammoniak bis zu gegen Lackmus neutraler Pveaktion versetzt. Der Niederschlag geht schon vor Erreichung des Neutralpunktes in Lösung. Alsdann wird filtriert, mit sehr geringen jMengen Essigsäure erneut gefällt und diese Reinigung durch Lösen und Fällen mehrfach wiederholt. Die zuletzt entstehende Lösung des Ammonsalzes wird in die ofache Menge 95"/oigen Alkohols gegossen. Hat man Ammoniumacetatlösung zur Extraktion benutzt, so werden die klar filtrierten Extrakte sofort mit dem 4— öfachen Volum BOVoi^eii Alkohols versetzt. Die in beiden Fällen durch Alkohol erzeugten Niederschläge werden mit großen Mengen gö^/oigen Alkohols dekantiert, schließlich auf dem Filter mit Äther gewaschen und im Vakuum über Schwefelsäure getrod'uet. Eine Methode zur Darstellung des ß-Proteids nach Levene und Stookey bietet keine praktischen Vorzüge. Sie extrahieren mit 5"/oiScr kochender Xatriumkarbonatlösung, verfahren sonst in der beschriei)enen Weise. Eigenschaften der Pankreasnukleoproteide: a-Proteid: (ab = + 38-1» (37-50) in einer Spur Nil, gelöst. Bei der Verdauung mit Pepsinsalzsäure oder Trypsin entstehen Albii- mosen, Peptone neben Guanylsäure. Ein durch kurzdauernde Pepsinwirkung abgespaltenes Nuklein enthält 5-2Vo Pi'oteid. Das Proteid ist also nicht ab- solut fermentresistent unter Abspaltung eines resistenten Nukleins (Milroii-). M A. Gamgee und W. Jones, Über die Nukleoproteide des Pankreas, der Thymus und der Nebenniere, mit besonderer Berücksiebtigung ihrer optischen Aklivilat. Hof- meisters Beiträge. Bd. 4. S. 10 (1904). -) Th. Milroi/, Über die Eiweißverbindung der Nukleinsäuren undThymussäurcn usw. Zeitscbr. f. physiol. Cbem. Bd. 22. S. 307 (1897). 2V) * 452 Fr. Samnely. Darstellung- des Nukleins siehe S. 460. Als Produkte der Säurehydrolyse wurden Guanin, eine Pentose, Phosphorsäure und Aminosäuren aufgefunden. ß-Proteid (a)o=^ -t- 6-J:*4''. Die Spaltprodukte sind die gleichen, wie diejenigen des a-Proteids. Nukleoproteid der Leber. Darstellung nach W 'olt Igcmuth. \) 2V2 — »> kg frische Pvinderleber werden zu Brei zerdrückt und mit 5 — 6? Wasser 10 .Minuten lang im Blechtopf gekocht. Hierauf wird die Flüssigkeit abfiltriert und die Leber 2— omal dieser Prozedur unterworfen. Nach dem Abkochen werden die Filtrate mit verdünnter Essigsäure so lange versetzt, bis kein Niederschlag mehr entsteht. Es bilden sich Flocken, die sich schnell zu Boden senken. Bleilit die Flockung aus, so kann sie durch Erwärmung angeregt werden. Die Niederschläge werden auf einem Filter gesammelt, mit ganz schwach saurem Wasser gründlich gewaschen, auf Filtrierpapier abgepreßt und mit 96Voigein Alkohol zerrieben. Unter vorsichtigem Dekantieren wird der Alkohol oft gewechselt. Alsdann wird mit Oy'So/üigem Alkohol, unter mehr- maligem Wechseln desselben übergössen und mehrere Tage stehen gelassen, um die letzten Farbstoffe und Fettreste zu entfernen. Es folgt eine mehr- tägige Ätherextraktion im Soxhletapparat. Ausbeute: 1 kg Leber liefert o— 4 ^9 Substanz. Will man die Pieinigung bis zur Konstanz des Phosphorgehaltes fort- setzen, so löst man den Körper kalt in sehr verdünnter Sodalösung, filtriert und fällt im Filtrat mit verdünnter Essigsäure. Diese Prozedur wird 2 — 3mal wiederholt. Das Präparat wird mit Alkohol und mit Äther gewaschen und bei 60" getrocknet. Der Körper zeigt die Zusammensetzung: C 45 22, H 5-72, N 16-67, P ;-V06, S 01387 «/„• Nukleoproteid aus Nebennieren.-) Frische Nebennieren werden gesammelt, von Fett befreit, in der Hack- maschine zerkleinert und mit 70"/oigeni Alkohol aufbewahrt. Hat man hin- reichend Material, so filtriert man ab und extrahiert den Gewebeln'ei auf einander folgend mit Oö^/oigem Alkohol, absolutem Alkohol und Äther. Danach trocknet man und pulverisiert die Gewebsmasse fein. Jede Erwär- mung bei dieser Prozedur ist zu vermeiden. Die trockene Drüse läßt man für 1 Stunde mit 2Vo'&^"i x\mmoniak in der Kälte stehen, dann filtriert man durch ein Koliertuch ab und extrahiert den Kolierrückstand in der gleichen Weise mit Wasser. Die vereinigten Extrakte, die nicht durch Filtration oder Zentrifugieren klärbar sind, werden in der Kälte tropf en- ') ./. Wolilgcmuth , Über das Nukleoproteid der Lel)er. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 475 (19Ü3). - IL Ibid. Bd. 42. S. 519 (1ÜÜ4). ^) W. Jones und G. H. Wliipiüe, Das Nukleoproteid der Nebenniereudrüse. Amer. Jüurn. of Phys. Vol. 7. p. 423 (1902). Darstellung der Proteine der Tierwelt: Nukleoproteide. 453 weise bis zu eben saurer Reaktion mit verdünnter Essigsäure versetzt. Die nun stark sich bräunende Lösun.y- läßt ein dunkles, spärliches Präzipitat ausfallen. Das P'iltrat desselben wird in 9ö7oi&Pn Alkohol (4faches Volumen) gegossen. Es entsteht eine weiße Fällung, welche mehrfach mit Oo^/oigem Alkohol dekantiert, dann mit absolutem Alkohol, zuletzt mit Äther gewaschen wird. Dieses Ammonsalz löst man in Wasser und fällt das freie Proteid mit Essigsäure. Das gefäUte Proteid wird gut mit schwach essigsäurehaltigem Wasser gewaschen und in hohen Glaszylindern durch Dekantieren mit Oö^/oigem und absolutem Alkohol und Äther gewaschen. Die Ausbeute beträgt im Maximum 6'() r/ aus 100 r/ trockener Drüsen- substanz. Das Proteid hat die Zusammensetzung: C 45-2 — 4(rS, H (ylO— (rHB, P 4-7— 5-0, XI 7-0 — 17-4Vo- Unter den basischen Hydrolysenprodukten wurden identifiziert: Guanin, Aden in, Thymin. Da sich bei der Nebennierenautolyse auch Hypoxanthin und Epi- guanin finden, so muß die Drüse noch ein oder mehrere andere Nukleo- proteide enthalten. Nukleoproteid der Milchdrüse {Odenius'^). Die Darstellungsmethode ist im wesenthchen jene von Hammarsten für das Nukleoproteid des Pankreas. Das fein zerhackte Gewebe eines Kuh- euters wird mit Wasser ausgekocht. Das kalte, klare Filtrat des Extraktes wird mit verdünnter Essigsäure gefällt. Zur Pieinigung wird mehrfach in möglichst wenig Alkali gelöst und mit Säure gefällt. Es folgt eine Extrak- tion mit Alkohol und mit Äther. Das Nukleoproteid ist relativ leicht zer- setzlich, daher darf die erste Exti'aktion mit siedendem Wasser nicht allzu lange andauern. Der Körper enthält im Mittel: 17-28VoN, 0-89o/o S und 0-l>77Vo P und gibt bei der Säurehydrolyse eine Pentose und Guanin, aber keine anderen Nukleinbasen. Da aber durch Mandel und Levene und Loebisch aus der ^Milchdrüse eine Nukleinsäure isoliert worden ist, welche (iuanin. Thymin uml Cytosin enthält, so muß in diesem Organ noch ein Nukleo- proteid enthalten sein, das bis jetzt nicht isoliert ist. Nukleoproteid der Submaxillardrüse { ffohiujren-). Der Extrak- tion des Proteids hat eine Entfernung des Drüsennnizins voranzugehen. Die sehr fein zerschnittenen Drüsen werden gut mit Wasser ausgewascheu, hierauf gefroren und in diesem Zustand mit Sand innig verrieben. Zu dieser blasse wird Wasser hinzugesetzt und so oft nach Abzentrifugieren jeweils erneuert, bis die letzten Waschflüssigkeiten keine Trübung mehr mit Essigsäure geben. (Ob es gelingt, auf diesem Wege alle Muzinspuren zu beseitigen, scheint zweifelhaft.) Hierauf folgt eine Extraktion mit OOöo/o Ammoniak während 24 Stunden. Mit Essigsäure wird das I'roteid gefällt und durch mehrfaches Umfallen aus schwach NHa-haltiger Lösung gereinigt. ') B. OdrtiiKs, Einige Untersuchungen über ein Nukleoproteid der Milchdrüse. Upsal. läkaref. Förhandl. N. F. 5: Malf/s Jahreshericlit. 1900. S. 39. ■-) E. Hohngrni, Über das Vorkommen eines sogenannten Muziuogens in der Speicheldrüse. Upsal. läkaref. Förhandl. N. F. 2; Malys Jahresbericht. 1897. S. 36. 454 Fr. Samuely. Das Proteid entliält lö^/o N, 2'9<'/o P, eine Kolilehydratgruppe und Purinbasen. Das Nukleoproteid der Thyreoidea nach Oswald (siehe 8. 401, Note 1 ). Das Proteid ^Yi^d der Schilddrüse zugleich mit dem Thyreoglobulin durch Extrahieren mit physiologischer Kochsalzlösung entzogen und findet sich nach dem Entfernen dieses Globulins in Lösung. Über die Methode dieser Trennung und Darstellung siehe bei Thyreoglobulin Seite 401. Die Filtrate des durch Halbsättigen mit Ammonsulfat von Thyreo- globulin befreiten Extraktes werden durch Eintragen von Ammonsulfat in Substanz beinahe zur Ganzsättigung gel)racht. Es scheidet sich ein Nieder- schlag ab. Derselbe wird abfiltriert, in Wasser gelöst und diese Lösung der Dialyse unterworfen. Im Dialysenschlauchinhalt bleibt eine Lösung, aus der das Proteid durch Zusatz von Oö^/oig^n Alkohol gefällt wird. Die Methode von Hammarsten ist zur Darstellung dieses Nuldeopro- teids nicht geeignet. Eigenschaften: Der Körper ist jodfrei; er enthält nur O^lBVo Phos- phor; er liefert mit Pepsinsalzsäiire ein ungelöst bleibendes Nuklein; er enthält eine Kohlehydratgruppe, die nicht den Pentosen angehört, und ferner Nukleinbasen. Nukleoproteid aus Magenschleimhaut und Magensaft (Pel-eJharing'^), Nencki und Sieher-). Darstellung aus Schleimhaut {Fekelharing'^). Die Schleimhaut von 10 Schweinemagen (Fundusteil) wird zerhackt und mit 6 l O'b^/oiger Salzsäure 5 Tage lang bei 37° digeriert. Die Flüssigkeit wird über einem mit Filtrierpapierschuitzeln bedeckten Konus oder einer Filterplatte unter vorsichtigem Saugen al)filtriert. Die vöUig geklärte Ver- dauungsflüssigkeit wird in Pergamentschläuchen gegen strömendes Wasser 24 Stunden lang dialysiert. Es trübt sich nach dieser Zeit der Schlauch- inhalt. Durch Zentrifugieren desselben wird eine Abscheidung gewonnen. Dieselbe wird eine Stunde lang mit ;-)0 — 40 cui^ einer 0"27oi&en Salzsäure bei 30" digeriert und bei dieser Temperatur danach filtriert. Das klare Filtrat von gelbhcher Farbe trübt sich beim Abkühlen. Es wird dann abermals lö — 20 Stunden lang dialysiert und der Schlauchinhalt filtriert. Der Filterrückstand wird abermals unter den beschriebenen l'edingungen in 0"2Vo HCl gelöst und nun gegen destilUertes Wasser dialysiert; dann wird der entstandene, meist feinkörnige Niederschlag auf ein Filter ge- bracht, mit wenig destilliertem W^asser gewaschen, vom Filter entfernt und über Schwefelsäure getrocknet. Aus der ursprünglichen, zur ersten Dialyse angesetzten Lösung dieses Körpers scheidet sich bei der ersten Dialyse nicht der gesamte Körper *) C. A. Pelcclharing , tJber eine neue Bereituugsweise des Pepsins. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 22. S. 2:33 (1896). ^) M. NencJci und N. Siehcr, Beiträge zur Kenntnis des Magensaftes und der chemi- schen Zusammensetzung der Enzyme. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 32. S. 291 (1901). ( Darstellung der Proteine der Tierwelt: Xukleoproteide. 455 ab. Der noch in Lösung befindliche, dem obigen identische Bestandteil wird folgendermaßen gewonnen: Die Flüssigkeit ^Yird zentrifngiert und mit XH3 und basischem Blei- acetat versetzt. Der voluminöse Niederschlag, der entsteht, wird filtriert, vom Filter entfernt und mit einer gesättigten Oxalsäurelösung versetzt. Nach einigem Stehen scheidet sich vom Bleioxalat eine gelbbraune Flüssig- keit ab, welche abfiltriert wird. Die Menge derselben beträgt 200 — 400 cm^. (Die Menge des Dialysats beträgt 6 — 7 /.) Das stark saure Filtrat wird gegen Leitungswasser dialysiert. Der Niederschlag, der im Schlauchinhalt ausfällt, wird durch Zentrifugieren von der Flüssigkeit getrennt, bei 37", wie oben schon beschrieben, in 0"2Vo HCl gelöst, durch Dialyse gegen destiUiertes Wasser erneut gefällt und in der schon beschriel)enen Weise gewaschen und getrocknet. Die trockene, bräunlich gefärbte Substanz ist pulverisierbar, aber leicht hygroskopisch. Eigenschaften: Ausbeute 0*5 e waschen!). Den Eückstand laugt •&" man alsdann mit stark verdünntem Ammoniak (0"05"/„) aus. Das Filtrat wird mit Salzsäure versetzt, wobei ein Niederschlag entsteht, der zur Be- freiung von Eiweißresten abermals mit ^lagensaft verdaut wird. Der nun- mehr verbleibende Eückstand wird auf dem Filter gut ausgewaschen und durch mehrfaches Lösen in wenig stark verdünnter Lauge und Fällen mit einer verdünnten Essigsäure gereinigt. Hierauf wird auf dem Filter mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen. Besonders die Behandlung mit Alkohol und mit Äther hat im Soxhlet- apparat solange zu geschehen, bis die letzten Beste von Lipoiden, Lezithin und Organphosphatiden entfernt sind. Am besten geht man bei der Dar- steUung eines Nukleins von einem bereits dargesteUten . gereinigten Nu- kleoproteid aus. C. Einige UmwaiuUimgsprodiikte der Proteine. Von Franz Samuely, Freiburg. An die Schilderung der Methoden zur Darstellung von Proteinen und Proteiden der Tierwelt sei eine kurze Besprechung von Methoden angereiht, welche die Darstellung von Umwandlungsprodukten der Proteine er- möglichen. Diese Substanzen kommen in der Natur nicht vor. Sie haben alle noch einen chemischen Aufbau, welcher dem der Proteine im Prinzip entspricht, sie geben auch einige der bekannten Eiweißfarbenreaktionen. Nitrierte Eiweißkörper. Außer einigen nitrierten Albumosen bzw. Peptonen ist eine als Xantho- protein säure bezeichnete Substanz genauer studiert, welche durch Nitrieren von Kasein neben diesen Albumosen durch Eintritt einer Nitrogruppe in einen nicht genauer bekannten Komplex des Kaseins entsteht. Darstellung nach v. Fürths), ^lan trägt fein gepulvertes, entfettetes Kasein vorsichtig und portionenweise in das doppelte Gewicht einer reinen, konzentrierten Salpetersäure ein. Die Säure enthält zur Bindung etwa ent- stehender salpetriger Säure einige Gramm Harnstoff. Jede Erwärmung ist bei dieser Nitrierung zu vermeiden. Man gewinnt so eine klare, gelbliche Lösung, die man unter guter Kühlung in einem feinen Strahl in das mehr- fache Volumen gut gekühlten Wassers fUeßen läßt. Es entsteht ein heUgelber Niederschlag, den man auf dem Filter sammelt und gut mit Wasser aus- wäscht. Hierauf löst man den Körper in Natronlauge, in der er sich mit rotbrauner Farbe löst, und fällt ihn durch Zusatz von Essigsäure. Dieses Lösen und Fällen wird mehrfach wiederholt; zuletzt befreit man dui'ch Dia- lyse von Salzbeimischungen und trocknet nach Vorbeliaiuilunu' mit Alkohol und Äther. Addition von Aldehyden. Aldehydeiweiße sind iukoagulable Proteine, die aus genuinen Eiweiß- körpern durch Anlagerung eines Aldehyds entstehen. Die Eigenschaften dieser Substanzen sind erheblich verschieden von denen der Muttersubstanz. ') O.r. Fürth, Einwirkungen von Salpetersäure auf Eiweißstoffe. Haliilit:itions- sclirift. Straßliurg 1899. 462 Fr. Samuely. Darstellung von Aldehydeiweißen nach Schwarz^). Man läßt eine Lösung' eines gereinigten Eiweißes, zu der man wenige Tropfen einer 40'Voigen Formaldeliydlösung oder irgend eines anderen Aldehyds zugesetzt hat, ge- raume Zeit stehen und fährt dann je nach Wunsch mit dem Aldehydzusatz so lange fort, bis die Lösung nach einiger Zeit ihren Aldehydgeruch bei- behält. Dann läßt man 2 ^Monate stehen, fügt unter Umständen der i\.ldehyd- eiweißlösung noch einen kleinen Aldehydül)erschuß zu und fällt nach der ge- nannten Zeit das in Lösung befindliche, inkoagulal)le Aldehydeiweiß durch ein Gemisch gleicher Mengen Alkohol und Äther. Zur Analyse werden die Fällungen mit Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum über CaClg getrocknet. Erhitzen ist zu vermeiden, da sonst der Aldehyd wieder abgespalten wird. Die Zusammensetzung dieser Substanzen hängt von der Dauer bzw. der Menge des zur Addition disponiblen Aldehyds ab. Die verschiedenen Proteine nehmen in gleichen Zeiten ungleiche Mengen Aldehyd auf und verhalten sich gegen homologe Aldehyde verschieden. Halogensubstituierte Eiweißkörper. Künstliche Jodeiweiße entstehen, wenn man Jod auf Eiweißkörper einwirken läßt. Die dabei entstehenden halogenhaltigen Körper sind keine unveränderten, nur durch das neu eingetretene Halogenradikal ausgezeich- neten Körper, sondern es sind jodierte Bruchstücke des ursprünghchen Ei- weißmoleküls, die während der Jodierung durch unvermeidliche hydrolytische oder oxydative Nebenreaktionen entstehen. ITnsere ^lethoden zur DarsteUung solcher künstlicher Halogeneiweiße sind im Verhältnis zu den komplizierten Prozessen, die sie vermitteln, primitiv. Nur diejenigen Methoden sind bio- chemisch von Interesse, welche sekundäre Spaltungsprozesse durch etwa gebildeten Jodwasserstoff oder ( )xydationsprozesse anderer Art nach Möglich- keit vermeiden oder zurückdrängen. Als Beispiel führen wir die von Hofmeister''^) und die von Hopkins und Finciis*) geübten ^Methoden an. Als Jodzufuhr dient Jod neben Jodkalium oder neben Jodkalium und jodsaurem Kalium. Die Jodierung selbst kann man bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion vor sich gehen lassen, indem man zur Bindung des während des Jodierungsprozesses entstehenden Jodwasserstoffes dem Reak- tionsgemisch von vornherein Mg CO3 oder Naj CO3 bis zu schwach alkalischer Reaktion zusetzt. Andrerseits muß man bei Verwendung von JK neben JKO3 durch Zusatz einer geeigneten Menge Schwefelsäure für das Frei- ') L. Schivarz, Über Verbindung der Eiweißkörper mit Aldehj'den. Zeitschr. f. pbys. Chem. Bd. 31. S. 460 (1900). ^) F. Hofmeister, Untersucbungeu über Proteinstoffe. t)ber jodiertes Eieralbumin. Zeitscbr. f. phys. Chem. Bd. 24. S. 159 (1898). ■') D. Knrajeff, tTber Einführung von Jod in das kristallisierte Serum- und Eier- albumin. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 26. S. 462 (1899). *) F. G. Hopkins und S. N. Pinciis, Zur Kenntnis der Einwirkung der Halogene auf Proteine. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 31. S. 1312 (1898). Umwandlungsprodukte der Proteine. 4(3;.^ werden des Jods Sorge tragen. Den Jodiernngsprozeß selbst läßt man am besten bei Zimmertemperatnr oder etwa bei 40" vor sich gehen und unter Umständen sich über mehrere Tage ausdehnen. Es läßt sich nun für die Darstellung der Jodeiweiße keine einheitliche Vorschrift geben, da jede Variation einer der vier wichtigsten Faktoren: Reaktion, Temperatur. Zeitdauer und Jodzufuhr zu einem verschieden zu- sammengesetzten Produkt führt. Wir geben daher ein Beispiel wieder, aus dem die Arbeitsmethode hervorgeht. Ungefähr 5-0 . Das Filtrat dei* oben als lileiniederschlag 1 bezeichneten Fällung wird mit Quecksilberacetat gefällt ((^)necksilberniederschlag 11). Der entstehende Niederschlag wird wie die Fällung der vorgenannten Peroxypi'otsäure H liehandelt. Das Filtrat des HgS und PbS enthält die l'eroxyprot.<;äure ('. Aus dieser wässerigen Lösung fällt man die Säure wiederum mit Queck- silberacetat im Überschuß. Den voluminösen Niederschlag wäscht man auf dem Filter gut mit Wasser aus. Dann verteilt man ihn in Wasser und bringt ihn durch Zusatz von Salpetersäure zum grollten Teil in Lösung. Die klar filtrierte Lösung versetzt man durch Zusatz von Natronlauge bis zum Neutralpunkt und gewinnt eine gelatinöse Fällung des Quecksilber- salzes der Peroxyprotsäure C. Den Niederschlag bringt man auf ein Filter. l)ehandelt ihn mit Alkohol und Äther, so daß eine pulverisierbare Masse entsteht. Diese wäscht man nach kurzem Trocknen mit Wasser gründlich salzfrei, dann entwässert man mit Alkohol, zuletzt mit Äthei* und trocknet über Schwefelsäure im Vakuum. Um das Verfahren dieser zahlreichen, zeitraubcMub'n Fidhuigen ai)zu- kürzen, kann man auch so verfahren: Das als Bleiniederschlag I bezeichnete Gemisch der Säure A und 15 wird in trockenem Zustand mit alkoholischer Salzsäure (10 Teile absoluter Alkohol + 1 Teil mit gasförmiger Salzsäure gesättigter Alkohol) l> Stunden lang am Pvückflußkühler gekocht. Die klare gelbe Lösung der Peroxyprotsäureester wird im \'akuum bei i^O 40 mm Druck von Alkohol befreit. Der sirupöse Pückstand wird in AVasser übertragen und durch energisches Durchrühren und Durch- kneten mit häufig gewechselten Portionen Wasser in eine teigige Masse verwandelt. Den äußerlich getrockneten lUickstand löst man in Chloroform. Die C'hloroformlösung wird durch wasserfreies Kupfersulfat entwässert und mit dem 5fachen Volumen wasserfreien Äthers gefällt. Durch häutiges Wechseln des Äthers erhärtet die erst teigige Fällung und läßt sich nach Be.seitigen des Äthers und Trocknen im Vakuum über Paraffin tnnl Schwefel- säure in ein zerreibliches Pulver verwandeln. (Ausbeute H4 ,r/ aus 2 kr/ feuchtem Bleiniederschlag I.i Dieses Estergemenge verseift man durch 1 L\stün(liges Kochen mit starkem Ammoniak. Die Lösung der Säuren wird filtriert, mit Tier- kohle entfärbt und eingedunstet. Den Bückstand löst man in Wasser 30 • 468 Fr. Samuely. und befreit ihn nach dem Ansäuern mit Salpetersäure durch vorsichtigen Zusatz von AgNOg von Chloriden. Das Ultrat des C'hlorsilbers wird vorsichtig neutralisiert. Durch erneuten Zusatz von Silbernitrat fällt man das Silbersalz der Säure A. Aus der Silberfällung kann man die freie Säure in der oben beschriebenen Art isolieren. Zu Analysenzwecken reinigt man das Silbersalz selbst, indem man die Fällung auf dem Filter gut auswäscht und mehrfach aus seiner Lösung in verdünnter Salpetersäure durch vorsichtigen Zusatz von Am- moniak fällt. Jede Fällung wird jedesmal auf einem gehärteten Filter ge- sammelt, gewaschen und vor der erneuten Lösung in verdünnter Salpeter- säure mit Wasser gut angerieben. Der zuletzt gewonnene Niederschlag wird durch Yer\Yeilen unter abso- lutem Alkohol gehärtet und entwässert. Nach dem Verdrängen des Alkohols durch Äther wird das staul)fein zerriebene l*rodukt mit viel Wasser salz- frei gewaschen, auf dem Saugfilter gesammelt und in der üblichen Weise mit Alkohol und Äther nachbehandelt. Schließlich wird im Vakuum ge- trocknet. Die Peroxyprotsäuren werden durch Barytspaltung in Desaminop rot- säuren, Oxalsäure und basische Komponenten zerlegt. Im Prinzip gestaltet sich die Darstellung der Desaminoprotsäuren folgendermaßen: Das Silbersalz der Peroxyprotsäure A, oder das Quecksilber- salz der Säure C, oder das Piohgemenge der Säure A + B wird ';] Stunden lang mit Ätzbaryt gekocht (20 r/ Silbersalz + 15 (7 BafOH).,). Von dem aus- geschiedenen Silberoxyd und Baryumoxalat wird durch Filtration getrennt. Das alkaUsch reagierende Filtrat wird mit einem Überschuß von Queck- silberaeetat gefällt. Der voluminöse Niederschlag ward auf einem Saug- filter durch häufiges Verreiben mit Wasser barytfrei gewaschen und dann, in Wasser suspendiert, durch H2S zersetzt. Das von H.^S befreite Filtrat des HgS wird abermals mit Barytwasser 6 Stunden lang gekocht. Die filtrierte Lösung wird von überschüssigem Baryt mit CO., befreit, etwas eingeengt und dann filtriert und abermals mit Quecksilberacetat gefällt. Das entstehende Quecksilbersalz der Desaminoprotsäure wird weiter wie das Hg-Salz der Peroxyprotsäure C (siehe oben) gereinigt. Ausbeute: l'2g Hg-Salz aus 20 g peroxyprotsaurem Silber A, 9"4^ Hg-Salz aus per- oxyprotsaurem Quecksilber C. Während die Peroxyprotsäuren einer weiteren Oxydation widerstehen, lassen sich die Desaminoprotsäuren zu Kyroprotsäuren weiter oxydieren. Darstellung von Kyroprotsäuren. Man geht nicht von den iso- lierten Desaminoprotsiiuren. sondern von den Peroxyprotsäuren selbst aus. Man löst das Rohprodukt von Peroxyprotsäure A -f B (gewonnen aus dem oben genannten „Bleiniederschlag P" durch Entbleien und Eintrocknen der Filtrate) in Wasser und kocht 2 Stunden lang mit der gleichen Menge Barythydrat. Hierauf fügt man zu der in Eis gekühlten Lösung portionen- weise Calciumpermanganat (auf 200 7-01 ^ PeroxyprotsäureB (Hg-Salz) . 20-07 2-24 4-26 0-49 19-81 ^ ö.-Via Peroxyprotsäure C 2n-57 2-87 7-40 0-52 17-17 — 48-47 Desaminoprotsäure A 21-92 n-08 4-84 — 18-:19 — 51-77 DesaminoprotsäureC 19-69 2-47 4-4o 0-:-36 16-6;-3 56-42 Kvroprotsäure A 20-50 2-42 5-28 0-32 16-72 — ö7-76)ko°n. ) stant Kyroprotsäure B ....... . 22*91 2-69 2-81 20-81 ^ 50-78. D. Abbau der Proteine und Isolierung der Abbau- produkte. Totale Hydrolyse vermittelst Säuren. a) Allgemeine Teclmik und Isolierung der Monoaniino- säuren. Von Emil Abderhalden, Berlin. Zur vollständigen Aufspaltung der Proteine zu den einfachsten Bau- steinen, den Aminosäuren, wird meistens entweder rauchende Salzsäure vom spez. Gew. 1-19 verwendet oder 25Voige Schwefelsäure. Letztere wird mit Vor- teil dann benutzt . wenn es sich um eine direkte Isolierung von Amino- säuren handelt, wie z. B. bei der Bestimmung des Tyrosins. Wird zur Dar- stellung der Aminosäuren die unten beschriebene Estermethode angewendet, so wird die Hydrolyse mit rauchender Salzsäure bevorzugt. Es sei gleich erwähnt . daß selbstverständlich die Estermethode auch dann Verwendung finden kann, wenn zur Hydrolyse Schwefelsäure benutzt worden ist und ebenso kann nach der Aufspaltung der Proteine mit rauchender Salzsäure eine direkte Bestimmung der Aminosäuren erfolgen. So läßt sich z. B. das Tyrosin ohne weiteres nach erfolgter Entfernung der Salzsäure zur Ab- scheidung bringen. Dieser Weg wird jedoch zu quantitativen Bestimmungen von Tyrosin kaum eingeschlagen, weil er sehr umständlich ist. Während die Entfernung der Schwefelsäure mit Baryt sehr leicht und (|uantitativ gelingt, erfordert diejenige der Salzsäure mehrere Operationen. Am besten mrd zunächst die Hauptmenge der Salzsäure durch Eindampfen der Hydro- lysenflüssigkeit unter vermindertem Druck entfernt. Durch wiederholtes Aufnehmen des Destillationsrückstandes mit Wasser und erneutes Ein- dampfen läßt sich ein weiterer Teil der Salzsäure vertreiben. Schließlicli wird der verbleibende Ptückstand in wenig Wasser aufgenommen, durch Kochen mit Tierkohle entfärbt und nunmehr nach Bestimmung des Chlor- gehaltes mit der berechneten Menge Natronlauge versetzt. Bessere Ile- sultate erzielt man bei Anwendung von viel Eiweiß und dementsprechend auch von viel Salzsäure, wenn ein weiterer Teil der noch vorhandenen Salz- AllgenieiiK.' 'rochiiik mul [solicniiiir der Moiioaiiiiuosüiircii. 471 säure durch Schütteln der Lösung des erwähnten Destilhitionsrückstandes mit Kupferoxydul gebunden wird. Sobald die Lösung eine grün])lau(' Fär- bung ainiinimt, wird abfiltriert und der lUiekstand so lange mit Wasser gewaschen. l)is eine verdampfte Probe keinen oi-ganischen lüickstand mehr hinterläßt. Die vereinigten Filtrate werden nun mit Schwefelwasserstoff von gelöstem Kupfer befreit. Ans dem meist hellgelb gefäri)ten Filtrat vom Kupfersulfid wird der Schwefelwasserstoff durch Durchleiten von Luft ent- fernt. Jetzt stellt man entweder titrimetrisch oder gravimetrisch den Chlorgehalt der Lösung fest und setzt entweder die berechnete Menge von Natron- oder Kalilauge zu oder aber man schüttelt die Lösung mit der berechneten Menge Silberkarbonat. Aus der von Salzsäure vollständig be- freiten Lösung läßt sich das Tyrosin durch Einengen leicht abscheiden. P^s ergibt sich ohne weiteres, daß diese Methode sehr umständlich ist. und aus diesem Grunde wird die Hydrolyse mit Salzsäure fast ausschlielilicli dann angewandt, wenn auf eine direkte Isolierung von Tyrosin und auch von Lysin, Arginin und Histidin verzichtet wird. Die verschiedenartigen Proteine lösen sich sehr verschieden leicht in rauchender Salzsäure und in 25*'/oiger Schwefelsäure. Am besten wird zu- nächst die Säure abgemessen und dann in einen ausreichend großen Pund- koll)en eingefüllt. Im allgemeinen wird von der rauidienden Salzsäure das dreifache Gewicht der angewandten Eiweißmenge und von der Schwefelsäure das fünf- bis zehnfache Gewicht davon verwendet. Löst ein bestimmtes Protein sich sehr schwer in den genannten Säuren oder ([uillt es sehr staik auf. so wird man unter Umständen auch größere Säuremengen anwenden. Es wird imnmehr das Protein in die Säure eingetragen, und zwar unter beständigem Umschütteln. Geht es direkt in Lösung, so kann sofoi't das Kochen am Kückflußkühler angeschlossen werden. Sehr oft (piillt jedoch das Protein nur auf. In diesem Falle wird es mit der Säure so lange auf dem Wasser- bade erhitzt, bis voUständige Lösung eingetreten ist. Genügt das Erhitzen auf dem Wasserbade nicht, so wird im Ölbade weiter gekocht. Manche Eiweißkörper, z. B. manche Seidenarten, gehen seli)st nach mehrstündigem Kochen im (")lbade nicht ganz in Lösung. In diesen Fällen ist es i-atsam, größere Säuremengen zu wählen und das Kochen länger als sonst ül)lich auszudehnen. Verwendet man Schwefelsäure, so kommt man in solchen FäUen rascher zum Ziele, wenn das Protein zunächst bei gewöhnlicher Tem- peratur mit TOVoigei" Schwefelsäure ül)ergossen wird. Es tritt dann bei wiederholtem Umschütteln bald Lösung ein. Nunmehr wird die Lösung mit soviel Wasser verdünnt, bis sie auf einen Gehalt von 25o/o an Schwefelsäure gebracht ist. Beim Auflösen dei' Proteine mit Säuren tritt stets eine mehr oder weniger starke Färbung der Lösung ein. Bald erhält man \i(ilettgefärbte Lösungen, bald mehr brauugefärbte. Sobald die Lösung des Proteins eine vollständige oder doch nahezu vollständige ist, beginnt man mit dem Er- hitzen im Luftbade auf dem Baboblech. Bei Verwendung von rauchender Salzsäure genügt im allgemeinen ein Kochen während sechs Stunden 472 E. Abderhalden. gerechnet vom Beginn des Kochens an — , wird dagegen 25''/üi8e Schwefel- säure benutzt, so muß der ganze Prozeß auf ca. 1(3 Stunden ausgedehnt werden. Zur Prüfung, ob die Hydrolyse eine vollständige ist, besitzen wir keine bestimmten Anhaltspunkte. Man begnügt sich mit der Feststellung, daß die Hydrolysenflüssigkeit keine P)iuretreaktion mehr gibt. Die weitere ^'erarbeitung ist verschieden, je nach der Ai't der ge- wählten Säure und der Art der zu isolierenden Spaltprodukte. An Stelle von Säuren können zur Hydrolyse auch Kali- resp. Natron- lauge (20 — 3o0/oige Lösungen) oder eine heiß gesättigte Barytlösung an- gewendet werden. Die auf diesem Wege gewonnenen Spaltprodukte sind dieselben, wie bei A'erwendung von Säuren'), nur sind sie optisch inaktiv. Hat man l)arytlösung zur Hydrolyse benutzt, so entfernt man den Baryt (juantitativ mit Schwefelsäure. Komplizierter gestaltet sich die weitere Verarbeitung l)ei AuAvendung von Alkalilauge. Man verwendet berechnete Giengen von Lauge und neutralisiert diese nach erfolgter Hydrolyse mit Salzsäure. Das Tyrosin läßt sich dann durch Einengen der Lösung ab- scheiden. Die weiteren Monoaminosäuren werden mit Hilfe der Estermethode gewonnen. Endlich läßt sich die Hydrolyse mancher Proteine auch mit Hilfe von proteolytischen Fermenten und speziell durch Kombination von Pan- kreas- und Darmsaft herbeiführen. Die Verarbeitung auf die einzelnen Aminosäuren erfolgt auch hier am besten nach den unten beschriebenen Methoden. Bei vorsichtiger Durchführung und vor aUen Dingen möglich- ster Fernhaltung von Wasser ist auch bei \^erdauungsversuchen die Ester- methode die vorteilhafteste. Isolierung von Glykokoll, d-Alanin, d-Valin, 1-Leucin, 1-Prolin, 1-Asparaginsäure, d-Glutaminsäure, 1-Serin und 1-Phenylalanin. Alle diese Aminosäuren werden mit Hilfe der von Emil Fischer'^) aus- gearbeiteten ..Estermethode" isoliert. Zur Hydrolyse des Proteins wird, wie schon erwähnt , am vorteilhaftesten rauchende Salzsäure verwendet. Die auf die oben geschilderte Art erhaltene Hydrolysenflüssigkeit wird zunächst abfilti'iert. um sie von etwa gebildeten Huminsubstanzen zu be- freien. Am besten wird hierzu eine Nutsche und als Filter engmaschiges Koliertuch benutzt. Der meist dunkelbraun bis schwarz gefärbte Pdick- stand wird so lange mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat farblos ab- läuft. Nunmehr werden die gesamten Filtrate in einem Destillations- kolben unter vermindertem Druck eingedampft. Der Kolben nuiß so groß ^) Emil Ahderluildcti, F. Medigrcccanu und L. Pincussohn, Vergleichende Hydro- lyse von Seide durch kochende rauchende Salzsäure, 257oige Schwefelsäure, 25'\'oige Natronlauge und heiß gesättigte Barvtlösung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 61. S.203 (1909). -) Einil Fischer, Ühcr die Hydrfilyse des Kaseins durch Salzsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 33. S. 151 (1901)." Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäuren. 47;->, gewählt werden, daß er beim Einfüllen der dreifachen Menjie des (ie- wiclits des Ptückstandes an Alkohol höchstens etwa zu zwei Drittel aii- gefUllt wird. Ist das zur Untersuchung;- vorliegende Protein reich an (ilutaniin- säure, so kann sie direkt als salzsaures Salz abg-eschieden werden. In iliescni Falle wird das Hydrolysat nicht sofort zur Trockne verdampft, sondern mir eingeengt und die Lösung unter Kühlung mit Eis aufbewahi-t. Das ausgeschiedene Glutaminsäurechlorhydrat wird auf Koliertuch abgenutscht und mit Salzsäure gewaschen. Durch weiteres Einengen der Mutterlauge der ersten Kristallisation lassen sich noch weitere Mengen erhalten. Schließ- Uch wird die Mutterlauge der letzten Abscheidung- untei' vermindertem Druck verdampft, nachdem man die Mutterlauge des umkristallisierten. rohen reste- rung des erwähnten Rückstandes zur Abscheidung bringen. Das d-^Uanin gewinnt man aus der ^lutterlauge des (ilykokollesterchlorhvdrates, indem man diese zur Trockene verdampft und dann die Ester in der oben be- schriebenen Weise mit Alkali und Kaliumkarbonat in Freiheit setzt. Auch hier wird der Ester in Äther aufgenommen, und dieser nach erfolgter Trocknung mit Natrium sulfat abdestilliert und (]ev verl)leiben(le Rückstand unter vermindertem Druck destilliert. Der auf diese Weise erhaltene Ester Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosiuircn. 477 wird durch Kochen mit der lOfachen Menge Wasser verseift und das d-Alanin durch Eindampfen der Lösung- erhalten. Wenn das Abdestillieren des Äthers aus der ätherischen Lösung der Gesamtester mit genügender Vorsicht ausgeführt worden ist, enthält übrigens der Äthei- nui- ganz ge- ringe Mengen von Aminosäureestern. Nach P. A. Levene kann man an Stelle von Natronlauge und Kalium- karbonat mit Vorteil wasserfreien Baryt verwenden. Diese .Methode ist besonders dann empfehlenswert, wenn man den nach der Ausätherung der Ester zurückbleibenden Rückstand noch weiter verarbeiten will. Der IJarvt wird dann mit Schwefelsäure quantitativ entfernt und das P'iltrat vom Baryumsulfat eingedampft. b) Isolierung der Aminosäureester aus den Esterchlorhydrateu mit Hilfe von Natriumalkoholat. i) Der nach dem Abdestillieren des Alkohols verl)leibende, die Esterchlor- hydrate der Aminosäuren enthaltende Rückstand wird in absolutem Alkohol gelöst, filtriert und die klare Lösung in einem Meßkolben auf ein bestimmtes Volumen gebracht. Li einem ali(iuoten Teil wird der Chlorgehalt durch Titration oder besser gravimetrisch ermittelt und nunmehr die berech- nete Menge Natrium in so viel Alkohol gelöst, daß eine etwa 2V2%ige Lösung entsteht. Nachdem die Natriumalkoholatlösung sich abgekühlt hat, wird sie der alkoholischen Lösung der Esterchlorhydrate der Aminosäuren zugesetzt. Es fällt Kochsalz aus. Seine Abscheidung kann durch Zusatz von Äther vervollständigt w^erden. Erwähnt sei noch, daß jeder Überschuß an Natrium vermieden werden muß, und es besser ist, etwas weniger als die berechnete Menge Natrium anzuwenden; ferner soll die Natriumalko- holatlösung immer frisch bereitet werden. Das ausgefallene Kochsalz läßt sich oft schwer filtrieren. Wird das (jemisch auf Eis gestellt, so setzt sich das Kochsalz bald ab und nimmt eine körnige Beschaffenheit an. Jetzt läßt sich das Kochsalz leicht durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernen. Die alkoholische Lösung der Ester wird nunmehr der fraktionierten Destil- lation unterworfen. Die erste Fraktion bis 40« bei 10 mm Druck enthält fast ausschließlich Alkohol. Sie wird mit wässeriger Salzsäure versetzt und zur Trockene verdampft und der Rückstand genau so behandelt, wie es oben für die aus dem ätherischen Destillat gewonnenen salzsauren Amino- säuren geschildert wurde. Die weitere ^'erarbeitung der Aminosäureester ist genau dieselbe, wie bei den nach Methode a) isolierten. Fraktionierte Destillation der Monoarainosäureester. Die Erfahrung hat gelehrt, daß im allgemeinen -eine einmalige Destil- lation der Ester genügt, und ferner hat sich ergeben, daß folgende Art der Fraktionierung meistens ausreichend ist. Die 1. Fraktion wird bis 60" des •) Emil Abderhalden und Otto Rostoski , Beitrag zur Konntuis des lience-Jones- schen Eiweißkörpers. Zeitschr. f. physiol. Cheni. Bd. 46. S. 125 (1905). 478 E. Abderhalden. Wasserbades bei 10 — 15 mm Druck aufgefangen und die 2. Fraktion bis lOO'^ des Wasserbades bei ebenfalls 10 — 12 mm Druck. Die Destillation erfolgt am besten aus einem Claisenkolben (vgl. Bd. I, 8. 123, Fig. 251). Die Destillate werden in einfachen Destillierkolben aufgefangen (vgl. Bd. I. S. 152, Fig. 317). Die Vorlagen werden vor der Destillation gewogen, um die Ausbeute an Estern feststellen zu können. Die Vorlage ^ird mit einer Kältemischung gekühlt und die Destillation bis zu einer be- stimmten Temperatur so lauge fortgesetzt, bis keine Ester mehr übergehen. Es ist zweckmäßig, ein Thermometer einzuschalten und eventuell die Ein- teilung der Fraktionen nach den Siedepunkten vorzunehmen. Man beobachtet ab und zu, daß der Quecksilberfaden des Thermometers plötzlich sinkt, ein Zeichen, daß in diesem Augenblicke offenbar bei der momentanen Temperatur des Bades nichts mehr übergeht. Die Pause benutzt man zweckmäßig zur Einschaltung einer neuen Vorlage. Da die Ester die Kautschukstopfen an- greifen, ist es zweckmäßig, sie mit einer Korkscheibe nach unten abzu- schließen. Das Destillat muß ganz farblos sein. Die Destillation erfolgt ohne Kapillare. Um Siedeverzug zu vermeiden, fügt man Siedestäbchen oder Siedesteinchen zu. Letztere sind jedesmal zu erneuern, wenn die Destillation unterbrochen wird. Bei den zwei folgenden Fraktionen wird unter stark vermindertem Druck destilliert. Entweder verwendet man eine Ölvakuumpumpe (vgl. Bd. I, S. 151ff. ) oder ein nach W7)JiI und LosanitscJi erzeugtes Vakuum. Auf beide Arten erhält man eine Druckverminderung auf O'l — 0"5 mm. Zu- nächst wird bei diesem Druck aus dem Wasserbade bis 100" destilliert und dann eine vierte Fraktion unter Verwendung eines Ölbades von 100 bis 180*^ aufgefangen. Die drei ersten Fraktionen werden in gleicher Weise sofort verseift, und zwar durch Kochen mit der etwa lOfachen Menge Wasser am Rück- flul.)kühler. Den Grad der Verseifung kontrolliert man durch Prüfung der Beaktion der Flüssigkeit. Solanue sie alkaUsch reaiiiert. sind noch unver- seifte Ester vorhanden. Gewöhnlich ist die Verseifung nach (3 — 8 Stunden beendet. Am besten werden nun alle drei Fraktionen unter vermindertem Druck — jede für sich — im gewogenen Kolben vollständig zur Trockene verdampft. Nur dann, wenn nach dem Abkühlen der verseiften Frak- tionen eine kristallinische Abscheidung erfolgt ist, lohnt es sich, diese zunächst abzufiltrieren und dann das Filtrat einzuengen. Bei leucinreichen Proteinen enthält die 2. und namentUch die 3. Fraktion viel Leucin, und es fällt dann diese Aminosäure beim Abkühlen der verseiften Fraktionen aus. Die gewogeneu, eingedampften Fraktionen werden nun mit absolutem Alkohol ausgekocht, um das Prolin in Lösung zu bringen. Das Aus- kochen \nrd wiederholt. Die alkoholischen Lösungen trüben sich meistens beim A])kühlen. Es scheiden sich in absolutem Alkohol uidösliche , mit dem Prolin mitgelöste Aminosäuren aus. Sie werden alifiltriert, und dann die aus allen drei Fraktionen vereinigten alkoholischen Plltrate unter ver- minderten! Druck zur Trockene verdampft. I)er Ilückstand wird wiederum Allgemeine Technik und Isolierung der Mouoaminosäureu. 47<) in ahsohitein Alkohol anfiioiioniinen. Es verbleibt ein uiijöslieher Uück- staiid. Dieser Prozeli wird so oft wiederholt, bis alle in Alkohol milös- lichen ISestaiidteile niöiiiichst entfernt sind, i) Diese Ueini.uiuiLi- des Prolins ist von gröbter "NViehtigkeit. Man würde einen groben Fehler begehen. woUte man den raickstand des ersten Alkoholanszuges ohne weiteres als Prolin in Piechnung' bringen. Das anf die genannte Art erhaltene Prolin wird nunmehr gewogen und dann durch Kochen mit einem Cberschub von frisch gefälltem Kupferoxyd in das Kupfersalz verwandelt. Die tiefblaue Flüssigkeit wird vom ungelösten Kupferoxyd abfiltriert und dann unter vermindertem Druck zur Trockene verdami)ft. Der Rückstand wird zur Trennung des 1-Prolinkupfers vom razemischen Salz mit absolutem Alkohol ausgekocht. Das erstere Kupfersalz geht in Lösung und kann aus der eingeengten Flüssigkeit in Kristallform erhalten werden. Fin Teil des aktiven Prolinkupfers bleibt meist aiii(tr])h. '/mv Identifizierung und Analyse wiid meist das razemische Prolinkupfer verwendet. Es ist einmal durch seinen (behalt an Kristalhvasser charakterisiert. Das lufttrockene Präparat enthält 2 Mol. Kristallwasser. Es entweicht ei'st nach längerem Erhitzen auf 120° im Yakuumtrockenapparat (vgl. IJd. I, S. 296, Fig. 429). Das wasserfreie Kupfersalz ist violett, während das wasserhaltige blau ge- färbt ist. Beim ^'erbrennen des Kupfersalzes entstellt ein charakteristi- scher Geruch. Die Kupferbestimmung ist auch sehr geeignet, um das l'rolinkupfer zu identifizieren. Schlieblich kann nuin auch das Prolin aus dem Kupfersalz in Freiheit setzen, indem man dieses in Wasser suspendiert und Schwefelwasserstoff in die Lösung einleitet. Das Filtrat vom Kupfersulfid wird eingeengt und schließlich mit Alkohol gefällt. Das l-Pi'olin schmeckt süb und löst sich in Wasser und Alkohol liMcht. Es schmilzt bei 206—209« und zeigt [a] ,^ == — 77-40o. Es kristaUisiert aus Alkohol in flachen Nadeln. Zur weiteren Identifizierung können Derivate des Prolins dargestellt werden. Sehr schöne Eigenschaften zeigt das aus der Phenyl- isocyanatverbinduug dargestellte Hydantoin. Die drei mit Alkohol ausgekochten Fraktionen werden nunmehr in der Weise verarbeitet, daß der in Alkohol unlösliche Teil in Wassei- gelöst und, wenn nötig, die Lösung durch Kochen mit Tierkohle entfärbt wird. Jetzt werden alle drei Fraktionen für sich bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Dieser Prozeß wird nach dem Abfiltrieren der Kristalle solange wiederholt, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist. Alle Kristallfrak- tionen werden nunmehr systematisch untersucht. Sie werden zunächst ge- trocknet und gewogen, dann ihr Schmelz- resp. Zersetzungspunkt bestimmt. Es sei gleich bemerkt, daß fast alle Aminosäuren beim I-h-hitzeu sich zersetzen und keinen eigentlichen Schmelzpunkt besitzen. P>ei der Pestimmung des Zersetzungspunktes ist es erforderlich, rasch zu erhitzen. Die in der ') Hierliei ist zu beachten, daß das razemische Proliii in ahsohiti'in .Mkohcd ziemlich schwer loslich ist. Man darf aus diesem Grunde nicht zu geringe .Mengen an Alkohol anwenden. 480 K. Abderhalden. Literatur niedergelegten Werte für die Zersetzuiigspunkte der Aminosäuren sind alle durch rasches Erhitzen gewonnen worden. Aus den Zersetzungs- punkten können schon mancherlei Schlüsse gezogen werden. Glykokoll zer- setzt sich gegen 240^ Alaningegen 297° und ebenso hoch zersetzt sich Leucin. Der Zersetzungspunkt des Valins liegt gegen 315°. Anhaltspunkte gibt auch der Geschmack: Glykokoll und d-Alanin schmecken ausgesprochen süß, während d-^^alin nur schwach süß schmeckt und einen bitteren Nach- geschmack zeigt. 1-Leucin schmeckt fad und leicht bitter. Gewöhnlich er- hält man einige Kristallfraktionen (die ersten!), die fast ganz aus Leucin bestehen. Es läßt sich leicht durch Umkristallisieren aus heißem Wasser reinigen. Sehr charakteristisch ist . auch sein Kupfersalz. Es wird in gleicher Weise gewonnen , wie es beim l'rolinkupfer geschildert worden ist. Das Leucinkupfer ist in Wasser sehr schwer löslich. Das ungelöste Kupferoxyd muß energisch mit Wasser ausgekocht werden, sonst erleidet man leicht Verluste. Das Leucinkupfer ist blaßl)lau. fast weiß. Schwieriger zu trennen sind ^Mischungen von Leucin und X'aliii. Hier führt die fraktionierte Kristallisation oft zum Ziele und auch diejenige des Kupfersalzes. Das d-Vahn löst sich ferner in Methylalkohol, während 1-Leucin unlöslich ist. Störend Avirkt hier die Anwesenheit des Isoleucins, das in der Hitze auch in Methylalkohol sich löst und aus der Mischung mit Valin i)eim Abkühlen nicht ausfällt. An und für sich ist d-Isoleucin in kaltem Methylalkohol so gut wie unlöslich. Es ist bis jetzt nicht geglückt, eine zuverlässige (quantitative ^lethode zur Trennung von Valin, Leucin und Isoleucin auszuarbeiten. i) Gewöhnlich werden Leucin und Lsoleucin zusammen bestimmt. Anhaltspunkte dafür, wie rein eine bestimmte Kristallfraktion ist. gibt die Bestimmung der spezifischen Drehung. Sie beträgt für d- Alanin in Wasser -f 2'7" und für das salzsaure Salz 4- lO-;-)«, für d-Valin + 28-8<> in 20%iger Salzsäure und + 6-42° in Wasser, für 1-Leucin — 10'o4° in Wasser und + IfrO" in 20Voiger Salz- säure, für d-Isoleucin -H 9*74° in wässeriger Lösung, -f o6'80° in 207oi&Pi" Salzsäure und + ll"09"inn-Xatronlauge. Ferner können verschiedene Derivate zur Identifizierung und auch zur Trennung verwendet werden. Weniger Schwierigkeiten bereitet im allgemeinen die Trennung von Valin und Alanin. Beide i)ilden zwar Mischkristalle. Es geUngt jedoch durch sorgfältiges KristaUisieren und Umlösen, diese beiden Aminosäuren in reinem Zustande zu erhalten. Gute Methoden besitzen wir zum Nachweis und zur ') Nach einer mündlichen Mitteilung von P. A. Lci-ene gelingt die Bestimmung dieser drei Aminosäuren auf folgendem AVege. Man bestimmt zunächst die elementare Zusammensetzung der gewonnenen Kristalle und berechnet aus den erhaltenen Werten das Verhältnis, in dem Valin und Leucin und Isoleucin vorhanden sind. Nun gibt man die für das Leucin berechnete Menge einer 257oigen Bleizuckerlösung zu (ein Über- schuß ist zu vermeiden). Das ausfallende Bleisalz gibt bei der Analyse auf Leucin resp. Isoleucin stimmende Werte. In der Mutterlauge findet sich das Valin , das nach Entfernung des Bleies mit Schwefelwasserstoff leicht zu gewinnen ist. In dem Ge- misch von Leucin und Isoleucin können endlich durch Bestimmung des Drehungswin- kels die Mengenverhältnisse dieser beiden Aminosäuren festgestellt werden. Allgemeine Technik und Isolierung der Monoamiiiosäuren. 4^] Abtrennung des GlykokoUs. Wie schon erwähnt, bildet es ein in ubsobitcm Alkohol schwer lösliches Esterchlorhydrat. Zur Prüfung auf GlykokoU werden die tief schmelzenden Kristallfraktionen verwendet. Sehr rasch läßt sich die Frage entscheiden, ol) neben GlykokoU noch andere Aminosäuren vor- handen sind. Es genügt, das optische ^'erllalton der Lösung zu pi-üfcn. Meist findet sich neben GlykokoU noch d-Alaiiin. Zur Trennung beider Aminosäuren wird entweder die ganze Kristallfraktion oder ein aliiiuoter Teil derselben mit der 5fachen Menge des Gewichtes der angewandten, fein gepulverten »Substanz an absolutem Alkohol übergössen. Nun wii-d in die Suspension so lange trockene, gasförmige Salzsäure eingeleitet, bis Sätti- gung eingetreten ist. Hat sich nicht alles gelöst, so wird auf dem Wasser- bad solange gekocht, bis alles in Lösung gegangen ist. Nunmehi- wird die Lösung auf Eis abgekühlt, mit einem Kriställchen von Glykokollester- chlorhydrat geimpft und gut verschlossen auf Eis aufbewahrt. Von den ausgeschiedenen Kristallen wird nach 12 Stunden abfiltriert. Durch Ein- engen der Mutterlauge können weitere Abscheidungen bewirkt wei'den. Das (ilykokollesterchlorhydrat schmilzt gegen 144". Aus der Mutterlauge der letzten Abscheidung setzt man die Ester in der oben geschilderten Weise in Freiheit, destilliert die Ester und verseift sie durch Kochen mit Wasser und gewinnt dann durch Verdampfen der Lösung die noch vorhandenen Aminosäuren. Sehr oft erhält man auf diese Weise reines d-Alanin. Zur Trennung von GlykokoU und Alanin ist auch das Pikrat sehr geeignet.!) Man löst die zu untersuchende KristaUfraktion in wenig heißem Wasser und vermischt sie mit der einfachen Gewichtsmenge Pikrinsäure in alkoholischer Lösung. Beim Abkühlen kristallisiert GlykokoUpikrat vom Schmelzpunkt 190" aus, während das Alaninpikrat in Lösung bleibt. Bei sorgfältiger Fraktionierung der x\minosäureester sind in den drei erwähnten Esterfraktionen außer den genannten Aminosäuren keine anderen vorhanden. Eine ganz andere Art der Verarbeitung tritt bei der 4. Esterfrak- tion (Ölbad von 100—180°, Ol— 0-5 mm Druck) ein. Sie enthält die Ester des Phenylalanins, der Glutaminsäure, der x\sparaginsäure und des Serins. Zu- nächst wird der Phenylalauinester abgetrennt. 2) Er ist in Äther leicht htslich. Die Esterfraktion wird zunächst mit dem fünffachen \'olumen Wasser ver- setzt. Gewöhnlich trübt sich hierbei die Lösung, indem dei- Phcnylalaninester sich in Form von feinen Tröpfchen abscheidet. Nunmehr wii'd die Lösung mit dem gleichen Volumen Äther im Scheidetrichter ausgeschüttelt. Die wässe- rige Lösung verhert ihre Trül)ung. Sie wird jetzt abgelassen. Die ätherische Lösung enthält den Phenylalauinester und aul'ierdem noch geringe Mengen der anderen Aminosäureester. Um diese zu entfernen, wird die ätherische Lösung wiederholt mit Wasser gewaschen. Die gesamten wässerigen Lösungen werden vereinigt und durch Kochen mit Baryt verseift. Man nimmt uiiuofähi- 1) P.A. Let-me^GlycocollPicrate. The Journal of Biol. Cheniistry. Vol. 1. ]i. -llSl l zersetzt und in alkalischer Lösung (o Mol.-Gew. Xa[OH]) [y-] "r! =^ — ^'oT" besitzt, in saurer Lösung (3 Mol.-Gew. HCl) ist die spezifische Drohung = 4- 2(r4T°. Die 1-Asparaginsäure schmeckt und reagiert sauer. Die d-Cjlutamin- säure schmilzt gegen 24o^ Sie hat einen ganz eigenartigen, für sie charakteristischen Geschmack. Sie schmeckt schwach sauer und hat einen leicht adstringierenden Nachgeschmack, [x] . .„ zi: +10"r)'^ in wässeriger D Lösung. Das sabisaure Salz zeigt [y.] ,^ = +o0"45^ Es ist oben erwähnt woi'den, daß der Phenylalaninester durch Aus- äthern von den übrigen Aminosäureestern der vierten Esterfraktion getrennt i\ird. Der Äther wird abdestilliert und der Rückstand, der den Phenyl- alaninester enthält, gewogen. Er Avird durch Verdampfen mit rauchender Salzsäure verseift. Das salzsaure Phenylalanin lilßt sich leicht aus Salz- säure Umkristallisieren und reinigen. Es kann entweder direkt analysiert werden, oder man setzt die freie Aminosäure durch Zusatz von Xatrium- acetat oder Ammoniak in Freiheit. Das 1-Phenylalanin kristallisiert in perlnmttergiänzenden Blättchen. Es ist in kaltem Wasser schwer löslich. 9Qü Es zersetzt sich gegen 283 "^ und zeigt [^^\>. = — o5'l" in wässeriger Lösung. Es schmeckt leicht bitter. Beim Erhitzen von Phenylalanin mit 25"/niger Schwefelsäure und einem Körnchen Kaliumbichromat entsteht der charakteristische Geruch nach Phenylacetaldehyd. Verarbeitung des bei der Destillation der Ester ver- bleibenden Rückstandes. Bei der Destillation der Ester verbleibt stets ein mehr oder weniger großer, meist dunkelbraunrot gefärbter, entweder zähflüssiger oder harter Rückstand. Oft beobachtet man an den Wänden des Destillationskolbens kristallinische Abscheidungen. Diese lassen sich zum Teil mit Essigäther in Lösung bi'ingen und bestehen aus x4nhydriden von Aminosäuren. So erhält man beim Aus- kochen mit Essigäther z. B. Leucinimid M bei an Leucin reichen Proteinen. Der Rückstand enthält bei Anwendung von Seide stets größere Mengen \on Serinanhydrid'f), und zwar ein Gemisch von razemischem und aktivem Serinanhydrid. Ferner finden sich meist wechselnde Giengen von Tyrosin- ester und schließlich lassen sich durch längeres Kochen des Paickstandes mit konzentriertem Barvtwasser größere Mengen von Glutaminsäure gewinnen.'') ') Emil Ahderhaldcn, Hydrolyse des kristallisierten Oxyhämoglobins aus Pferde- blut. Zeitsehr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 484 (1903). ') Emil Fischer, Vorkommen von 1-Serin in der Seide. Ber. d. Deutsch, ciiem. Ges. Jg. 40. S. 1501 (1907). ') Emil Abderhalden und Otto RostosU, Die Monoaminosäuren des „Edestins" aus Baumwollsamen und dessen Verhalten gegen Magensaft. Zeitsehr. f. physiol. Chemie. Bd. 44. S. 265 (1905). 31* 484 E. Abderhalden. Bei der Verarlieitung des Destillatiousrückstandes wird am besten so voi'gegangen , daß er zunächst mit siedendem Essigätlier möglichst er- schöpft ^Yird. Dann gibt man etwa die zweifache Menge des Gewichtes des Rückstandes an Baryt zu und kocht nach Zusatz von Wasser 16 Stunden am Piüclvfhilikühler. Der Baryt Avird nun (juantitativ mit Schwefelsäure entfernt, das Filtrat vom Baryumsulfat stark eingeengt und durch Ein- leiten von gasförmiger Salzsäure die (xlutaminsäure als salzsaures Salz zur Abscheidung gebracht. Es kann auf diesem Wege die Ausbeute an Glutaminsäure ganz erheblich gesteigert werden. Auch Leucin, Phenyl- alanin und Asparaginsäure lassen sich nachweisen. Man kann den Destillationsrückstand nach der Behandlung mit Baryt und dessen Ent- fernung mit Schwefelsäure auch nach der Estermethode auf vorhandene Aminosäuren untersuchen. Der direkte \ ersuch hat ergeben, daß eine solche Aufarbeitung sich im allgemeinen nicht lohnt. Wiederholung des Veresterungsprozesses. Es gelingt nicht, bei der Anwendung von Alkali- und Kaliumkarbonat die Aminosäureester quantitativ zu gewinnen. Ein Teil der Ester bleibt in Wasser gelöst und ein Teil wird ohne Zweifel unter dem Einfluß des Alkalis verseift. Einen erheblichen Teil von Aminosäureestern kann man noch gewinnen, wenn die Veresterung wiederholt wird.i) Zunächst wird das bei der Infreiheitsetzung der Ester aus den Hydrochloraten verbliebene Gemisch in Wasser gelöst, vorsichtig Salzsäure zugegeben und schließlich gasförmige Salzsäure eingeleitet. Vom ausfallenden Chlorkalium wird ab- filtriert und das Filtrat eingeengt, bis Kristahisation erfolgt. Der ganze Prozeß wird so oft wiederholt, als die abfiltrierten Kristallmassen sich noch frei von organischer Substanz erweisen. Schließlich wird die stark eingeengte Masse mit Alkohol übergössen und gasförmige Salzsäure ein- geleitet. Die organische Substanz geht vollständig in Lösung. Von den ungelösten anorganischen Salzen (KCl) wird abfiltriert. Das Filtrat wird dann unter vermindertem Druck bei 40'' des Wasserbades zur Trockene verdampft und die ^'eresterung wiederholt. Im übrigen wird genau so verfahren, wie es oben geschildert worden ist. Es werden die Ester wieder in Freiheit gesetzt, fraktioniert, destiUiert, verseift und schließhch die Aminosäuregemische getrennt. Der ganze Prozeß kann schließlich auch ein zweites Mal wiederholt werden. Isolierung von 1-Oxyprolin. 2) Das 1-Oxyprolin läßt sich aus dem von Aminosäureestern und von Salzen in der oben beschriebenen Weise möglichst befreiten Ptückstande *) Emil Abderhalden^ Hydrulyse des kristallisierten Oxyhämoglobius ans Pferde- ' blut. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 37. S. 484 (1903). — Derselbe, Hydrolyse des 1 Edestins. Ebenda. Bd. 37. S. 499 (19Ü3). ^) Emil Fischer, Über eine neue Aminosäure aus Leim. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 35. S. 2660 (^1902). Allgemeine Technik und Isolierung der Mouoaminosäuren. 4)^5 verhältnismäßig leicht gewinnen. Die Veresterung wird nicht wiederholt, sondern der in Wasser gelöste lUickstand unter vermindertem Druck ver- dampft, um möglichst viel Salzsäure zu entfernen. Die verbleihende Lösung wird dann in so viel \y asser gelöst, daß die Lösung etwa l^/o an organischer Substanz enthält und so viel Schwefelsäure zugefügt, bis die Lösung etwa 5Vo davon aufweist. Nun wird mit einer etwa lOVoigen Lösung von Phosphorwolframsäure gefällt, der Niederschlag scharf abgenutscht und schließlich bei etwa 300 Atmosphären Druck auf der hydraulischen Presse ausgepreßt. Es hinterbleibt eine steinharte Masse, die sich leicht pulvern läßt. Durch Zerlegen mit Baryt können aus dem Phosphorwolframsäurenieder- schlag die unter dem Namen ..Hexonbasen" zusammengefaßten Aminosäuren isoliert werden, nämlich Histidin, Lysin und Arginin. Die Methoden der Darstellung dieser Verbindungen sind an anderer Stelle beschrieben. Im Filtrat der Phosphorwolframsäurefällung wird durch Baryt die überschüssige Phosphorwolframsäure gefällt, und der überschüssige Baryt quantitativ mit Schwefelsäure entfernt. Das Filtrat vom Baryumsulfat wird unter vermindertem Druck stark eingeengt. Die Lösung enthält noch Salzsäure. Um diese zu entfernen, schüttelt man die Flüssigkeit mit überschüssigem Silbersulfat, filtriert dann ab, fällt das gelöste Silber genau mit Salzsäure und die Schwefelsäure mit Baryt. Das Filtrat vom Baryum- sulfat wird nunmehr unter vermindertem Druck möglichst stark eingeengt und dann im Vakuumexsikkator über Schwefelsäure vollends bis zum Sirup eingedunstet. Nach längerem Stehen tritt Kristallisation ein. Zum Nachweis des Oxyprolins ist die [i-Naphtalinsulfoverbindung sehr geeignet. Einfacher gestaltet sich die Isolierung des Oxyprolins, wenn die Aminosäureester mit Hilfe von Natriumalkoholat in Freiheit gesetzt werden. Das Oxyprolin findet sich dann im Destillationsrückstand. Er wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Phosphorwolframsäure gefällt und das Filtrat der Fällung in ganz analoger W^eise, wie es eben beschrieben worden ist, auf Oxyprolin verarbeitet. Das 1-Oxyprolin kristallisiert in farblosen Tafeln. Es schmeckt süß 900 mid zeigt [7.]"v: = — 81'04'' in wässeriger Lösung. Schmelzpunkt gegen 2700 unter Aufschäumen und Bräunung. Mit der Beschreibung der Isolierung des 1-Oxyprolins haben wir bereits eine x\minosäure erwähnt, die nicht direkt mit Hilfe der Ester- methode isoUert werden kann. Es sind noch eine Reihe von einfachen Spaltprodukten der Proteine bekannt, die zu ihrer Isolierung besonderer Methoden bedürfen. Hierher gehören 1-Tyrosin, Cystin, l-Tryptophan, d-Glukosamin und ferner Histidin, Lysin und Arginin. Die Isolierung der letzten drei Verbindungen wird an anderer Stelle geschildert. Isolierung von Tyrosin. Zur quantitativen Bestimmung des Tyrosins wählt man am besten die Hydrolyse mit 2byoiger Schwefelsäure. l(3stündiges Kochen um lUickfluß- 486 K. Abderhalden. kühler genügt. Das meist dunkelgelb gefärbte Hydrolysat wird mit Baryt quantitativ von der Schwefelsäure befreit und der abfiltrierte oder besser abzentrifugierte Baryumsulfatniederschlag so lange mit Wasser ausgekocht, bis eine Probe des Filtrats keine Keaktion mit MUlons Reagenz mehr gibt. Nun werden die Waschwässer mit dem ersten Filtrat des Baryumsulfat- niederschlages vereinigt und eingeengt, bis Kristallisation eintritt. Dieser Prozeß Avird nach Entfernung der Kristalle Aviederholt und z^Yar so lange, als die jeweilige Mutterlauge noch eine Reaktion auf Tyi'osin gibt. Die vereinigten Kristallmassen, die noch sehr unrein sind, werden aus heißem Wasser unter Anwendung von Tierkohle umkristaUisiert. Die Mutterlauge des Tyrosins kann, wie oben erwähnt, zur Darstellung von Glutaminsäure verwendet werden, auch können die übrigen, oben erwähnten Aminosäuren unter Anwendung der Estermethode bestimmt werden. Erwähnt sei, daß mau das Tyrosin auch dann isoheren kann^), wenn zur Hydrolyse rauchende Salzsäure verwendet worden ist. In diesem Falle wird das Hydrolysat unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand wiederholt in Wasser aufgenommen und die Lösung wieder verdampft, um möglichst viel Salz- säure zu entfernen. Nun wird der Rückstand wieder in Wasser gelöst,, die Lösung mit Tierkohle gekocht, filtriert und das Filtrat auf ein be- stimmtes Volumen gebracht. In einem aliquoten Teil der gesamten Flüssig- keit wird der Chlorgehalt titrimetrisch festgestellt und nun durch Zusatz der berechneten Menge ;-]37oi8'ei" Natronlauge in der KiÜte die Salzsäure in der Hauptmenge der Flüssigkeit neutrahsiert. Es fäUt sofort Tyrosin aus. Das Rohtyrosin ist meist sehr unrein und oft sehr schwer zu reinigen. Diese Beobachtung wurde speziell bei dem aus Kasein gewonnenen Tyrosin gemacht. Ihre weitere Verfolgung ergab, daß dem Tyrosin Körper bei- gemischt waren, die mit Phosphorwolframsäure fällbar sind. ZAvei dieser Verbindungen sind isoliert worden. Die eine erwies sich als Lysin und die andere zeigte die Zusammensetzung C^s H-^gN.! O5. Das erstere, das an und für sich in Wasser leicht löslich ist, war offenbar in Form einer schwer löslichen Kombination dem Tyrosin beigemischt gewesen. Sie tritt offenbar nicht immer auf, denn sie ist später nur noch einmal zur Beob- achtung gelangt. Die Menge des Lysins war auch gering. Die andere, er- wähnte Verbindung, die gleichfalls durch Fällung mit Phosphorwolfram- säure vom Tyrosin abgetrennt werden kann, ist schwer löslich in Wasser und tritt in größerer Menge auf (im Kasein ist etwa P/o davon enthalten). Sie wird aus dem Phosphorwolframsäureniederschlag durch dessen Zerlegung mit Baryt gewonnen. Zunächst läßt sich durch Umki-istallisieren des Roh- tyrosins aus heißem Wasser ein Teil des TjTosins leicht entfernen, die Mutterlauge gibt dann Fraktionen, die mit Phosphorwolframsäure fallen. Am besten wird die ^Mutterlauge der ersten reinen Tyrosinfraktioneu nach Zugabe von Schwefelsäure, bis die Lösung 50/0 davon enthält, direkt mit ') Emil Abderhalden und Yufaka Teruurhi , Notiz zur Darstelhing von Tyrosin ans Seide. Zeitschr. f. piiysiol. Chemie. Bd. 48. S. 528 (1906). Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosüuren. 4j^7 Phosplionvolframsäure gefällt. Die Verbindung CiaHoßNaOß ist offenbar nicht die einzige vorhandene Verbindung dieser Art. In ihrer Mutterlauge scheinen sich noch andere, noch nicht genau untersuchte, homologe \^er- bindungen zu befinden. Das 1-Tvrosin ist durch seine Schwerlöslichkeit in Was.ser charakte- risiert , ferner durch verschiedene Farbeureaktionen. So färbt sich seine Lösung mit Millons Reagenz intensiv i'ot. Wird Tyrosin in einigen Troiifen warmer konzentrierter Schwefelsäure gelöst, die Lösung in Wasser ge- gossen und mit Barvumkarbonat neutralisiert, filtriert und zu dem neu- tralen Filtrat ein Tropfen neutraler Eisenchloridlösung zugesetzt, so tritt eine schön violette Farbe auf (Pirias Probe). Gibt man fei'uer etwas festes Tyrosin zu einigen Kubikzentimetern einer aus 1 Volumen Formalin, 4o Vo- lumen Wasser und 55 Volumen konzentrierter Schwefelsäure bestehenden Lösung, so erhält man beim Sieden eine Grünfärbung (DcnUjes-Mörner). 1-Tyrosin zersetzt sich gegen 314— 318o. W "j ) = —8-64" in 2VU\s:^y Salzsäure und — 13-2" in 4Voiger Salzsäure. Isolierung des Cystins. ' ) Auch hier wird am besten mit rauchender Salzsäure iiydi'olysiert. Das meist cbmkel gefär])te Hydrolysat wird durch Kochen mit Tierkohle möglichst entfärbt und das Filtrat mit 33Voig6r Natronlauge bis zur schwach sauren Reaktion versetzt. Nach längerem Stehen in der Kälte tritt Kristallisation ein. km besten wartet man mehrere Tage zu uml filtriert dann ab. Der Filterrückstand enthält im wesentlichen Tyrosin und Cystin. Um die beiden Aminosäuren zu trennen . wird das Gemisch in heißem, lOo/oigem Ammoniak gelöst, die Lösung abgt^kühlt und nun Eis- essig bis zur schwach alkaüschen oder neutralen Reaktion zugegeben. Es fällt zunächst Tyrosin aus. Zur Abscheidung des Cystins wird die Mutter- lauge des Tyrosins mit Eisessig übersättigt. Das erhaltene Cystin daii' mit Millons Reagenz keine Reaktion mehr geben. Tritt Rotfärbung ein. dann muß die Abtrennung in gleicher Weise nochmals wiederholt werden. Isolierung des Tryptophans.'^) Zur Gewinnung des Tryptophans ist die Hydrolyse der Proteine mit Säuren nicht geeignet. Zu seiner Darstellung verweiuiet man am besten ') K. A. II. Moerner, C'vstin, ein Spaltungsprodukt der Ilornsubstanz. Zoitscl-.r. f. physiol. Chemie. Bd. 28. S. 595 (1H9'J). — Zur Kenntnis der Bindung des Schwefels in den Proteinstoffen. Ebenda, Bd. 34. S. 207 (190102). — E. Friedmann, Beiträge zur Kenntnis der physiologischen Beziehungen der schwefelhaltigen Eiweißaltköniinliiige. 1. Mitteilung. Über die Konstitution des Cystins. Ilofnicixfcrs Beiträge. Bd. 3. S. 1 (1902). — Emil Abderhalden, Hydrolyse des kristallisierten Oxyhümoglobin aus l'ferde- hlut. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd.'ST. S. 484 (1903). -) F.Gotcland Hopkins and Sudncn W.Cole, A contrihution to tlie chcniistrj ol Proteids. I. Preliminary study of a hitherto uudescribed product of tryptic digestion. 488 E. Abderhalden. durch Trypsin verdautes Eiweiß. 6 — Stägige Dauer der Fermentliydrolyse genügt meist. Eine Kontrolle, ob genügend Tryptophan abgespalten ist, gibt die Bromreaktion, die nur von der freien Aminosäure gegeben wird und deren Intensität uns einen ungefähren Anhaltspunkt gibt, wann die größte Menge Tryptophan frei in der Verdauungsflüssigkeit vorhanden ist. Nun wird die Verdauungsflüssigkeit auf 80" erwärmt, filtriert und dann das klare Filtrat mit 5 Volumprozent Schwefelsäure und einem Überschuß einer lO/oigen Quecksilbersulfatlösung in 5 volumprozentiger Schwefel- säure versetzt. Es entsteht ein voluminöser Niederschlag. Er wird abge- saugt, mit r)0/(,iger Schwefelsäure gewaschen, dann in Wasser suspendiert und unter Erwärmung mit Schwefelwasserstoff zerlegt. Nach Vertreiben des Schwefelwasserstoffs aus dem Filtrat des Quecksilbersulfids durch Kohlen- säure wird die Lösung wiederum mit o^o ihres Volumens an Schwefel- säure versetzt und mit so viel Quecksilbersulfatlösung, daß sich gerade ein zusammenhängender Niederschlag bildet. Dieser wird nach einer halljen Stunde abgesaugt. Es gelingt so, das zuerst ausfallende Cystin und ferner Verharzungsprodukte zu entfernen. Das Filtrat vom genannten Niederschlag wird nun weiterhin mit überschüssiger Quecksilbersulfatlösung gefäUt, die Fällung abgesaugt und mit ö^/oiger Schwefelsäure so lange gewaschen, als das Waschwasser sich mit Millons Eeagenz rot färbt. Der Niederschlag wird mit Schwefelwasserstoff zerlegt, dann wird filtriert und im Filtrat die Schwefelsäure ([uantitativ mit Baryt gefällt. Nun wird unter vermindertem Di'uck nach Zusatz von Avenig Alkohol eingeengt. Die Temperatur des Wasser- bades soll hierbei 40*' nicht übersteigen. Bald beginnt dann die Abscheidung von Tryptophan. Durch UmkristaUisieren aus verdünntem (50°/oigem) Alkohol unter Zusatz von Tierkohle wird es ganz rein erhalten. Erwähnt sei, daß häufig und vielleicht immer eine Verbindung von der Zusammensetzung Cji Hi.2 N.2O3, vorläufig Oxytryptophan genannt, zur Beobachtung kommt, das seiner SchA\erlöslichkeit wegen sich leicht vom Tryptophan al)trennen läßt. Die Darstellung des Tryptophans läßt sich insofern noch vereinfachen, als zur Zerlegung des Quecksilbersulfatniederschlages fein gepulvertes Baryumsulfid verwendet w.rden kann.i) Isolierung des d-Glukosamins. Für den qualitativen und quantitativen Nachweis des d-Glukosamins unter den Spaltungsprodukten der Proteine besitzen \r\.Y zurzeit noch keine so guten Methoden, v.ie für die Gewinnung der Aminosäuren. Sehr häufig ist der Gehalt von Proteinen an „Kohlehydraten" nur indirekt erschlossen worden. Im Prinzip sind alle Methoden zum Nachweis des d-Glukosamins Journ. of physiol. Vol. 27. p. 418 (1901). — IL The Constitution of tryptophane, and the j action of bacteria upon it. Ebeudo. Vol. 29. p. 451 (1903). — Vgl. auch: f^mil Ahder- j halden und Martin Kenrpe, Beitrag zur Kenntnis des Tryptophans und einiger seiner | Derivate. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 52. S.207 (1907). i 1) Emil Ähderhalden, Weiterer Beitrag zur Kenntnis von 1-Tryptophan enthalten- j den Polypeptiden. 3, Mitt. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 42. S. 2331 (1909). i Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäureu. 489 und verwandter Substanzen gleichartig.^) Die Hydrolyse der Proteine wird stufenweise durchgeführt, um eine Zerstörung von etwa vorhandenen Kohle- hydraten und speziell von Glukosamin zu vermeiden. Zur Hydrolyse wird 5 — 10"/oi^'P Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure oder auch .Vlkali verwendet. Die komplizierteren Eiweißabbauprodukte werden dann ausgefällt, z. D. mit Alkohol, und im Filtrat, dessen Reduktionsvermögen geprüft wird, das vor- handene Kohlehydrat nach weiterer Hydrolyse mit verdünnter Säure, z. B. öVoiger Schwefelsäure, z. B. als Benzoylverbindung isoliert. Nach allen Er- fahrungen ist das Glukosamin im Eiweiß und speziell in den Müzinen in Form komplizierterer Verbindungen vorhanden. Im xhischluß an die erwähnten Aminosäuren sei noch kurz erwähnt, daß bei der Spaltung der Proteine mit Säuren neben den Aminosäuren noch Produkte auftreten, die in die Reihe der Diketopiperazine gehören. Isolierung von Diketopiperazinen aus den durch kochende, rauchende Salzsäure oder durch Kochen mit 25" „iger Schwefel- säure erhaltenen Spaltprodukten.-) Die Hydrolyse wird in der schon erwähnten Weise durchgeführt. Hat man Salzsäure verwendet, so wird die Hydrolysenflüssigkeit, nachdem sie filtriei-t worden ist, unter vermindertem Druck verdampft, der Rückstand mehrmals in Wasser gelöst und wieder zur Trockene eingeengt. Dann wird der sirupöse Rück- stand am besten mit geglühter Kieselgur vermischt und die nunmehr bröckhge Masse im Soxhlet mit Essigäther extrahiert. Hat man mit Schwefelsäure liy- drolysiert, so wird diese zunächst quantitativ mit Baryt entfernt, und das Filtrat vom Baryumsulfat unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird dann, wie oben beschrieben, behandelt. Der Essigäther wird verdunstet. Es bleiben Anhydride von Dipeptiden zurück. Sie werden durch Kristallisieren aus Wasser, Alkohol, Aceton usw. getrennt und gereinigt. Erwähnt sei noch, daß das bei der Hydrolyse der Proteine stets in mehr oder weniger großen Mengen sich bildende Ammoniak nach den gewöhnlichen ^lethoden der Ammoniakbestimmung bestimmt wird. Gang der Untersuchung auf Aminosäuren bei geringen Substanzmengen. Bei sehr geringen zur Verfügung stehenden Substanzmengen wird sich oft die Notwendigkeit ergeben, möglichst viele Aminosäuren wenigstens ') Vgl. bierzu : F. Müller, Untersuchungen über die ph^^siologiscbe Bedeutung und die Chemie des Schleimes der Respirationsorgane. Sitzungsber. d. Gesellsch. zur Bcf. d. ges. Naturwiss. zu Marburg. 1896. Kr. 6 und Die Chemie des Muzins und der Mukoide. Ebenda. 1898. K'r. 6. — Beitrüge zur Kenntnis des Muzins und einiger damit verwandter Eiweißstoffe. Zeitschr. f. Biol. Bd. 42. S. 468 (1901). — Leo Langstein, Die Kohlehydrate des kristallinischen Serumalbumins. Hofmeisters Beitr. Bd. 1. 8. 2.59 (1901). — Die Kohle- hydrate des Serumglobulins. Monatshefte f. Chem. Bd. 24. S. 445 (1903). 2) Emil Abderhalden und Casimir Funk, Beitrag zur Kenntnis der beim Koclien von Kasein mit 25''/oiger Schwefelsäure und mit starker Salzsäure entstehenden Spaltungs- produkte. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 53. S. 19 (1907). 490 E. Abderhalden. qualitativ nachzuweisen. Li diesem Falle wählt man zur Hydrolyse 25''/oige Schwefelsäure. Will man das Tryptophan mitbestimmen, so kann man auch eine Verdauun£>- mit Pankreassaft voranschicken und den mit Quecksilber- sulfat nicht fällbaren Teil der Verdauungsflüssigkeit nach P^ntfernung des gelösten Quecksilbers mit Schwefelwasserstoff, mit Schwefelsäure hydrolysieren. Zunächst wird die Hydrolysenflüssigkeit nach 16stündigem Kochen mit so- viel Wasser versetzt, daß ihr Gehalt an Schwefelsäure nur noch 5"/o beträgt. Nun werden die ..Diaminosäuren" mit Phosphorwolframsäure gefällt. Das Filtrat der Fällung wird nach Entfermmg der überschüssigen Phosphor- wolframsäure mit Baryt und Fällung von dessen Überschuß mit Schwefelsäure zunächst auf Tyrosin verarbeitet. Die Mutterlauge vom Tyrosin wird stark eingeengt und nun durch Einleiten von gasförmiger Salzsäure die Glutamin- säure als salzsaures Salz abgeschieden. Die Mutterlauge vom Glutaminsäure- chlorhydrat wird zur Trockene verdampft. Der Rückstand dient nun nach er- folgter \'eresterung zur Bestimmung der oben angeführten, mit Hilfe der Estermethode nachweisbaren Monoaminosäuren. Der Phosphorwolframsäure- niederschlag wird zerlegt und auf Histidin, Lysin und Arginin verarbeitet. Besondere Methoden zur Darstellung einzelner Monoamino- säuren. Zur Darstellung von synthetisch aufgebauten Polypeptiden und speziell von optisch-aktiven Formen sind größere Mengen von Aminosäuren nötig. Es sind zur Gewinnung einzelner besondere Materialien ausgesucht und zum Teil auch besondere Methoden ausgearbeitet worden, so für das Gly- kokoll, d-Alanin, 1-Serin, 1-Proliu, d-Isoleucin, 1- Tyrosin und für die d- Glutamin säure. Diese Methoden seien hier kurz beschrieben. 1. Darstellung von Glykokoll. Am besten geht man von Seidenabfällen, eventuell auch von Leim aus. Die Hydrolyse wird in der erwähnten Weise mit der ofachen Menge rauchender Salzsäure ausgeführt und schließlich das Hydrolysat zur Trockene verdampft und der Rückstand verestert. Das Glykokoll wird als Esterchlor- hydrat abgeschieden und durch I^mkristallisieren aus heißem Alkohol unter Anwendung von Tierkohle in ganz reinem Zustande erhalten. Die Mutter- lauge des GlykokoUesterchlorhydrats kann, wenn Seide als Ausgangsmaterial diente, noch zur Darstellung von d-Alanin verwendet werden. 2. Darstellung von d-Alanin. i) Hierzu eignet sich die Seide am besten. Es wird zunächst in der oben beschriebenen Weise das Glykokoll als salzsaurer Ester möglichst vollständig abgetrennt. Je besser es gelingt, das Glykokoll zu entfernen, um so reineres d-Alanin erhält man. Die Mutterlauge der letzten Abschei- dung von Glykokollesterchlorhydrat wird unter vermindertem Druck völlig *) Vgl. Emil Fischer, Synthese von Polypeptiden. XIV. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. XXXIX. S. 453 (1906). Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäuren. 49]^ zur Trockene verdampft. Nunmehr werden die Ester nach einer der oben beschriebenen Methoden in Freiheit gesetzt. Die Aminosäureester werden dann bei einem Druck von 10 — Ib mm destilliert. Bis 40" des Wasserbades geht hauptsächUch Alkohol über. Dieser \'orlauf wird für sich aufgefangen. Von öo« an beginnt dann die Hauptmenge des d-Alaiiinesters überzugehen. Man läßt die Temperatur bis 80" ansteigen und destilliei-t so lange, bis bei dieser Temperatur nichts mehr tibergeht. Das Destillat wird in der gewohnten Weise durch Kochen mit Wasser verseift und aus der wässerigen Lösung das d-Alanin durch fraktionierte Kristallisation gewonnen. Die Reinheit des d-Alanins wird am besten durch Bestimmung des spezifischen Drehungsvermögens seines salzsauren Salzes bestimmt. Aus 1000 r/ Seidenabfällen erhält man 2bO-~'i)00 g Glykokoll und etwa 150^ reines d-Alauin. Die Ausbeute an diesen Aminosäuren hängt natürhch ganz wesentlich von der Beschaffenheit der Seidenabfälle ab. 3. Darstellung von 1-Serin.^) Wir besitzen zurzeit noch keine Methode , um größere Mengen von 1-Serin aus Proteinen direkt zu isolieren. Vorläufig sind wir auf den folgenden Weg zur Gewinnung von 1-Serin aus den Spaltungsprodukten der Proteine angewiesen. In Betracht kommt als Ausgangsmaterial nur die Seide. Sie enthält ziemlich viel Serin. Die Seide wird in der ge- wohnten Weise auf Aminosäuren verarbeitet. Die Aminosäureester werden destilliert. Im Destillationskolben verbleibt ein ziemlich beträchtlicher Rück- stand. Er ist dunkelgelbbraun gefärbt und zunächst dickflüssig. Nach einiger Zeit tritt Kristallisation ein. Sie kann durch Erhitzen des Rückstandes auf dem Wasserbade beschleunigt und vervollständigt werden. Diese Kristalle erwiesen sich als Serinanhydrid, und zwar findet man neben aktivem (1-) Serinanhydrid auch die razemische Form. Hat man Kristalle gewonnen, so kann man leicht aus der Mutterlauge weiteres Serinanhydrid in Kristall- form erhalten, indem man die dickflüssige Masse in der 2 — ofachen jVIenge absoluten Alkohols löst und nun nach erfolgter Abkühlung einige Kristä li- ehen vom Serinanhydrid einträgt. Nach 24stündigem Stehen im Eisschrank haben sich weitere Kristallmassen abgeschieden. Die erwähnten beiden Formen von Serinanhydrid lassen sich verhältnis- mäßig leicht durch fraktioniertes Kristallisieren aus Wasser trennen. Das inaktive Serinanhydrid ist in Wasser schwerer löslich als das aktive. Letz- teres dient zur Bereitung von 1-Serin. Es wird das 1-Serinanhvdrid 4 Stun- den mit der lOfachen Menge 48Voi8ei" Bromwasserstoffsäure auf 100" erwärmt. Die Lösung wird dann unter einem Druck von 12 — Ibmm zum Sirup verdampft, dieser in der etwa 40fachen Menge Alkohol gelöst und nun tropfenweise wässeriges Ammoniak in einem kleinen Überschuß zu- gefügt. Das 1-Serin fällt knstallinisch aus. Die Ausbeute an 1-Serin ist nicht sehr groß. Sie beträgt etwa 1 g aus 100 g Seide. 1) Emil Fischer, Vorkommen von l-Serin in der Seide. Ber. d. Dcutscli. choni. Ges. Jg. 40. S. 1501 (1907). 492 E.Abderhalden. 4. Darstellung von 1-Prolin.ij Sehr geeignet zur Gewinnung von l-Prolin ist die Gelatine. Sie ist leicht zugänglich und enthält relativ viel von dieser Aminosäure. Zur Iso- lierung des Prolins wird ebenfalls die Estermethode angewandt. Die Ester werden aus den Esterchlorhvdraten nach einer der beiden ol)en geschildei'ten Methoden in Freiheit gesetzt, nachdem der Äther und der Alkohol bei 10 — 12 mm Druck und 40" des Wasserbades abdestilliert worden sind, ohne weitere Fraktionierung bei O'l — 0'5 mm Druck bis lOO" des Wasserbades abdestilUert und sofort durch Kochen mit der 8 — lOfachen Menge Wasser verseift. Die wässerige Lösung der Aminosäuren wird nun- mehr unter vermindertem Druck eingedampft und der verbleibende lUick- stand , mit absolutem Alkohol wiederholt ausgekocht. Das Prolin geht in Lösung. Es löst jedoch auch andere, an und für sich in dem angewandten Lösungsmittel unlösliche Aminosäuren mit. Ein Teil davon fällt schon beim Abkühlen der Lösung aus. Zur weiteren Pieinigung des Prolins wird seine alkoholische Lösung so oft unter vermindertem Druck eingedampft, bis der jeweilen verbleibende Piückstand sich leicht in Alkohol löst. Das so erhaltene Prolin besteht aus wechselnden Mengen 1- und dl-Prolin. Ein Teil des letzteren kann dadurch entfernt werden, daß das erhaltene Roh- prolin mit kaltem Alkohol ausgelaugt wird. Das razemische Prolin ist in Alkohol schwerer löshch als das 1-Prolin. Rascher kommt man zum Ziel, wenn man das gesamte Rohprolin durch Kochen mit überschüssigem Kupferoxyd in das Kupfersalz verwandelt und nach dem Filtrieren die tiefblaue Lösung unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft. Nun wird der Rückstand mit absolutem Alkohol ausgekocht. Das aktive Prolin- kupfer geht in Lösung. Es scheidet sich beim Einengen der Lösung in langge- streckten P.lättchen und Prismen ab. Die Kristalle werden abfiltriert, in Wasser gelöst und mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Das Filtrat vom Kupfersulfid ent- hält das reine 1-Prolin. Es läßt sich durch Eindunsten der Lösung in Kristall- form erhalten. Am besten kristallisiert man es aus Alkohol um. Die Aus- beute an 1-Prolin schwankt. Aus 1 kg Gelatine erhält man etwa ()0 g ge- reinigtes Rohprohn (Gemisch von 1- und dl-Prolin). Daraus lassen sich zirka 40 g rohes 1-Prohn isolieren. Ein beträchtlicher Teil des aktiven Prolin- kupfers kristallisiert nicht. Aus diesem Grunde schrumpft schlielilich die Ausbeute an aktivem Prolin auf etwa 20—30 g zusammen. 5, Darstellung von d-Glutaminsäure. Zur (iewinnung von d-Glutaminsäure verwendet man am besten die, an dieser x\minosäure reichen Pflanzeneiweißstoffe , wie z. B. das Ghadin. Es ist vorteilhaft, möglichst reine, an Kohlehydraten und sonstigen Bei- mengungen arme Proteine zu wählen. Gliadiu aus Weizenmehl liefert z. B- •) Emil Fischer uud Emil Abderhalden, Synthese von Polypeptiden. V. Derivate des Prolins (a-Pj-rrolidinkarbonsäure). Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 37. S. 8072 (1904). Allgemeine Technik und Isolierung der Monnamiiiosäuren. 49;; 30 — 37 Vo i'eine Glutaiuinsäure, je nach seiner Reinlieit. Zur Isolierung der Glutaminsäure hydrolysiert man das Protein am besten mit rauchender Salzsäure. Die Hydrolysenflüssigkeit, die meist dunkel gefärbt ist, wird mit ziemlich viel Tierkohle aufgekocht, filtriei't und unter vei'mindertem Druck stark eingeengt. Nach Einleiten von gasförmiger Salzsäure wird die salz- saure Lösung nach Einimpfen eines Kriställcliens von Glutaminsäurechlor- hydrat bei 0° aufbewahrt. Bald erfolgt Kristallisation. War die Lösung nicht zu stark eingeengt und nicht zu sehr verunreinigt, so gelingt es leicht, große, reine Kristalle von Glutarainsäurechlorhydrat zu gewinnen. Im anderen Falle erhält man sehr feine Kriställchen. Diese schließen stets Mutterlauge ein und lassen sich meist nicht gut absaugen und al)])ressen. Oft erfolgt auch die Kristallisation recht unvollkommen. P^s tritt diese Erscheinung besonders unangenehm dann auf, wenn die salzsaure Lösung sehr dunkel gefärbt ist. In diesen Fällen wird die Lösung mit Wasser verdünnt, unter vermindertem Druck völlig eingedampft, der Itückstand in Wasser gelöst und wieder verdampft, um möglichst viel Salzsäure zu entfernen. ]Man kann nun oft durch Kochen mit Tierkohle völlige Entfärbung herbeiführen. Gelingt dies nicht, dann wird die Lösung mit Kupferoxydul im Eberschuß geschüttelt und so die Hauptmenge der Salzsäure entfernt. Die filtrierte, schwach grünblau gefärl)te Lösung wird dann durch Ein- leiten von Schwefelwasserstoff vom gelösten Kupfer befreit. Nach der Fil- tration erhält man nun eine nur leicht gelb gefärbte Lösung, aus der nach dem Einengen und Einleiten von gasförmiger Salzsäure nunmehr die Glut- aminsäure leicht und vollständig in mehreren Kristallfraktionen abzuscheiden ist. Schließlich werden diese vereinigt und aus Salzsäure umkristallisiert. Es ist klar, daß nur das ganz reine Produkt als Ausbeute berechnet werden darf. Das unreine Produkt enthält, stets Beimengungen. F^s sei noch erwähnt, daß man auch nach erfolgter Hydrolyse mit Schwefelsäure in gleicher Weise die Glutaminsäure bestimmen kann, indem man nach Ent- fernung der Schwefelsäure mit Baryt in das stark konzentrierte Eiltrat des Baryumsulfats gasförmige Salzsäure bis zur Sättigung einleitet. 6. Darstellung von 1-Tyrosin. Zur Gewinnung von 1-Tyrosin sind am besten Seidenabfälle geeignet. Entweder führt man die Hydrolyse in der oben beschriebenen Weise mit 25Voig'er Schwefelsäure durch und isoliert dann das Tyrosin durch Einengen der mit Baryt quantitativ von Schwefelsäure befreiten Flüssigkeit. Handelt es sich um rasche Darstellung größerer Mengen von 1-Tyrosiu, so wird mit Vorteü folgendes Verfahren angewandt.^) Die Seidenabfälle werden in der üblichen Weise durch Gstündiges Kochen mit rauchender Salzsäure hydro- lysiert. Die Hydrolysenflüssigkeit wird dann nach erfolgter Filtration unter 1) Emil Ähdrrhalden uud Yntaka Trruuclii, Notiz zur Darstellung von Tyrosin aus Seide. Zeitschr. f. physiol. Cüiom. Bd. 42. S. 540 (19U4). 494 E.Abderhalden. vermindertem Druck völlig zur Trockene verdampft und der Rückstand in möglichst Avenig- Wasser aufgenommen und die Lösung eventuell noch einmal eingedampft. Schließlich wird in der Lösung der Chlorgehalt festgestellt und dami die berechnete Menge Natronlauge zugegeben. Das Tyrosin fällt als braunschwarze Masse aus. Sie wird abfiltriert und in siedendem Wasser gelöst und die Lösung durch Kochen mit Tierkohle ent- färbt, ^lan kann die Hydrolysenflüssigkeit auch nach einmaligem Ver- dampfen unter vermindertem Druck direkt mit so\iel Natronlauge ver- setzen, bis eine Fällung auftritt. Die Ausbeute an Tyrosin schwankt bei Verwendung von 1000 .9' Seide zwischen 40 und 60 f/. Die Mutterlauge des Tyrosins kann auf GlykokoU und d-Alanin weiter- verarbeitet werden. Sie wird unter vermindertem Druck zur Trockene ver- dampft, der Rückstand mit Alkohol Übergossen und gasförmige trockene Salzsäure bis zur Sättigung eingeleitet. Von den ungelöst bleibenden Salzen wird abfiltriert und nun in der gewohnten Weise das Glykokollesterchlor- hydrat abgeschieden und aus dessen ^Mutterlauge das d-Alanin aus dem in Freiheit gesetzten und destillierten Ester dargestellt. 7. Darstellung von d-Isoleucin.i) Bis jetzt ist d-Isoleucin fast ausschlietilich aus Melasseschlempe ge- wonnen worden. Unz^^•eifelhaft kommt Isoleucin auch in anderen Eiweißarten vor, und vielleicht findet es sich stets mit der Aminoisobutylessigsäure, dem gewöhnlichen Leucin, zusammen. Einstweilen ist eine gute, allgemein ver- wendbare Lsoüerungsmethode für Isoleucin nicht ausgearbeitet. Die Anwesen- heit von Valin stört die Reindarstellung von Isoleucin. Es sei deshalb nur das Darstellungsverfahren von Isoleucin aus Melasseschlempe geschildert. Am besten wird konzentrierte Strontian-Melasseschlempe verwendet. Sie ent- hält in gröberer Menge kristallinische Produkte, die durch x^bsaugen ent- fernt werden. Es verbleiben 15 — 20''/o <^ler Trockensubstanz der Strontian- Melasseschlempe auf dem Filter. Der Rückstand besteht zu etwa 2,3 aus organischer Substanz. Er enthält noch Mutterlauge und wird, ohne diese ganz zu entfernen, am besten in einer Kugelmühle zu je ll-g mit 21 95Voigem Alkohol und lOOcm^ 250/oigera wässerigem Ammoniak überschichtet und tüchtig geschüttelt. Nach \U_ — 1 Stunde ist das Leucin in Lösung ge- gangen. Das ammoniakalisch-alkoholische Extrakt wird nun abgegossen, mit Tierkohle aufgekocht und die filtrierte Lösung unter vermindertem Druck eingeengt, bis aller Alkohol entfernt ist. Aus dem verbleibenden Sirup scheiden sich bald Kristalle ab, und nach einigem Stehen bei niedriger Temperatur ist die ganze Masse erstarrt. Sie wird abgesaugt, scharf abgepreßt, mit Alkohol gewaschen und schließlich bei 100^ getrocknet. Das so gewonnene Rohleucin enthält nur Spuren von Asche. Aus 1 kg des breiigen Nieder- 1) Felix Ehrlich, Über das uatürliche Isomere des Leiicins. Ber. d. Deutsch, chein. Ges. Jg. 37. S. 1809 (1904). Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäureu. 495 Schlages der Melasseschlempe erhält man so ehva 25 — 30,(/ eines ziemlich reinen Rohlencins. Aus diesem wird nun das Isoleucin in folgender Weise abgetrennt. Das Rohleucin wird in Wasser gelöst, mit überschüssigem, frisch gefälltem Kupferoxyd gekocht, die heiloe Lösung filti'iert und der Filter- rückstand wiederholt mit W^asser ausgekocht, bis das Filtrat keine blaue Farbe mehr zeigt. Die vereinigten Flüssigkeiten werden nun unter ver- mindertem Druck völlig zur Trockene verdampft und der lUickstand mit reinem, konzentriertem Methylalkohol, am besten in einem Extraktionsapparat, extrahiert. Hierbei geht das Isoleucinkupfer in Lösung. Durch Verdampfen der tiefblauen Lösung und Lösen des llückstandes in OOVoig'^ni Methylalkohol läßt sich das Kupfersalz in reinem Zustand gewinnen. Durch Lehandeln der wässerigen Lösung des Salzes mit Schwefelwasserstoff erhiUt man das freie Lsoleucin. Es läßt sich aus verdünntem Alkohol Umkristallisieren. Die Eigenschaft des Isoleucinkupfers, in wasserfreiem ^lethylalkohol löslich zu sein, ist vorläufig das wesentlichste Mittel, um Isoleucin von gewöhnlichem Leucin zu trennen. Die zur Identifizierung der einzelnen Monoaminosäuren wichtigsten Derivate. 1. Darstellung von [i-Naphtalinsulfoderivaten.M Die Kuppelung der Aminosäuren mit [i-Naphtalinsulfochlorid wird unter folgenden Bedingungen herbeigeführt. 2 Mol.-Gew. ganz reines [i-Xaphtalin- sulfochlorid werden in Äther gelöst und zu einer Lösung der Aminosäure in der für ein ^lolekül berechneten Menge Xormalnatronlauge hinzugefügt. Am besten verwendet man eine gewöhnliche Stöpselflasche. Das Gemisch wird nun auf der Schüttelmaschine bei gewöhnlicher Temperatur geschüttelt. In IntervaUen von ein bis anderthalb Stunden fügt man dann noch dreimal die gleiche Menge Normalalkali zu. Nun wird die ätherische Schicht abge- hoben, die wässerige Lösung filtriert und mit Salzsäure ül)ersättigt. Dabei fällt die schwerlösliche Naphtalinsulfover1)indung aus. Je nach der Art der Aminosäure tritt mehr oder weniger leicht Kristallisation ein. Die erhaltenen Produkte lassen sich durch ihre Eigenschaften und ihre Schmelzpunkte und vor allem durch die Analyse leicht identifizieren. Es ist im allgemeinen nicht ratsam, diese Derivate zur Trennung von Gemischen verschieden- artiger Aminosäuren zu verwenden. Während es verhältnismäßig leicht gelingt, eine bereits möglichst gut gereinigte Aminosäure mit Hilfe der ß-Naphtalin- sulfoverbindung zur KristaUisation zu bringen, ist es recht schwierig, ein Gemisch zu trennen, ^'or allem zeichnet sich ein solches durch die Schwierig- keit aus, in Kristallform überzugehen. ') Emil Fischer und Peter Ber ff rU, Über die ß-Napbtalijisulf.idorivate tlcr Amiiiu- säuren. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 35. S. 3779 (1902). 496 E. Abderhalden. 2. Darstellung von Phenylisocyanatverbin düngen und der entsprechenden Hydantoine. Beispiel: Phenvlisocyanatverbindung des 1-Prolius i): IS g 1-Prolin werden in 15 cin^ Normalnatronlauge gelöst und nach guter Ab- kühlung 2,(7 Phenyhsocyanat in kleinen Portionen unter dauerndem, kräftigem Schütteln zugefügt. Zum Schluß wird die Lösung mit etwas Tierkohle durch- geschüttelt, filtriert und angesäuert. Die Phenylcyanatverbindung fällt als harzige Masse. Sie zeigt wenig Neigung zum Kristallisieren und wird des- hall) sofort in das Hydantoin übergeführt. Die Phenylcyanatverbindung wird in 4Voigei' Salzsäure gelöst und die Lösung auf dem Wasserbade eingeengt. Es treten bald Kristalle auf. In manchen Fällen besitzt auch die Phenylcyanatverbindung gute Eigen- schaften und läßt sich leicht in Kristallform gewinnen. Zur Trennung von Aminosäuregemischen dürften sich die Hydantoine in bestimmten Fällen als ganz brauchbar erweisen. Meist wird man jedoch die Aminosäuren als solche trennen und erst zur Identifizierung die Phenyl- cyanatverbindung darstellen. 3. Darstellung von Benzoylverbindungen. Beispiel: Darstellung von Benzoyl-alanin."-) o ^ Alanin werden in 30 cwA^ Wasser gelöst, dann 22 // gepulvertes Natriumbikarbonat und in kleinen Portionen 14"5<7 Benzoylchlorid (3 Mol.) hinzugegeben. Nun wird bei Zimmertemperatur tüchtig geschüttelt. Nach ca. 1 Stunde wird die filtrierte Flüssigkeit mit Salzsäure übersättigt. Es scheidet sich ein dicker Kristall- brei ab. Er besteht aus Benzoylalanin und Benzoesäure. Das Gemisch wird nach einigem Warten abfiltriert, gewaschen, getrocknet und dann zur Entfernung der Benzoesäure mit Ligroin ausgekocht. Es ist sehr wesentlich, daß bei der Darstellung der Benzoylverbindungen der Aminosäuren an Stelle des sonst zur Benzovlierung übhchen Alkalis , Natriumlnkarlionat verwendet wird. 4. Darstellung von Formylverbindungen. Beispiel: Formyl-leuciu. ^j Leucin wird mit der iV-.fachen Menge wasserfreier, käirülicher Ameisensäure (von 98*5 Vo) •> Stunden auf dem | Wasserbade erhitzt, wobei es genügt, den Kolben mit einem kurzen, zu einer Kapillare ausgezogenen Steigrohr zu versehen. Dann verdampft ■ man unter einem Druck von etwa 20 mm das Lösungsmittel möglichst ' ') \<:]. Emil Fischer, Über die Hydrolyse des Kaseins durch Salzsäure. Zeitschr. f. physiol. Clicm. Bd. 33. S. 151 (1901). ") Emil Fischer, Über die Spaltung einiger razemischer Aminosäuren in die optisch-aktiven Komponenten. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 2451 (1899). ^) Emil Fisrlicr und Otto IVarhiirr/, Spaltung des Lcucins in die optisch-aktiven Komponenten uiittelst der P^ormylverbindung. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 38. S. 3997 (1905). j Allgemeine Technik und Isolierung der Monoaminosäuren. 497 vollständig. Die zurückbleibende Lösung wird abermals mit der gleichen Menge Ameisensäure o Stunden auf 100" erhitzt, dann wieder abdestilliert und diese Operation mehrmals wiederholt. Beim Verdampfen erstarrt der Eiickstand kristallinisch. Der Kristallbrei wird abfiltriert und mit ungefähr der 1 i/.^f fit-lieii Menge eiskalter n-Salzsäure verrieben, um das noch unveränderte Leucin zu lösen, dann scharf abgesaugt und mit wenig Wasser gewaschen, um alle Salzsäure zu entfernen. Das Rohprodukt wird aus der Sfachen Menge Wasser unter Anwendung von Tierkohle um- kristaUisiert. 5. Darstellung von Verbindungen der Aminosäuren mit Kohlen- säure. 1) Beispiel: Glykokollkarbonsaures Calcium. Die wässerige Lösung von Glykokoll wird unter Kühlung mit Kohlensäure gesättigt und dann Kalkmilch zugefügt. Sie löst sich zunächst auf. Nun wird wieder Kohlen- säure eingeleitet und dies einigemal wiederholt. Zuletzt wird Kalkmilch und kiistallisiertes Calciumkarbonat eingetragen, geschüttelt und filtriert. Das völlig klare Filtrat wird mit gekühltem Alkohol l)is zur starken Trübung versetzt. Es scheidet sich nun das Kalksalz der Glykokollkarbon- säure aus. Weitere zur Identifizierung geeignete Derivate sind die 4-Xitro- toluol-2-sulfoderivate"-) und die a-Naphtylisocyanatverbindungen.3) Zur Identifizierung des Serins ist die p-Nitrobeuzoylverbindung ganz besonders geeignet.*) &) M M. Siegfried, Über die Bindung von Kohlensäure durch amphotere Amido- körper. Zeitsclir. f. physiol. Chem. Bd. 44. S. 85 (1905) und Bd. 46. S. 401 (1905). -) M. Siegfried^ Über Derivate von Aminosäuren. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 43. S.68 (1904). ") Carl Xeuherg und A. Manasse, Die Isolierung der Aminosäuren. Ber.d. Deutsch, chem. Ges. Jg. 38. S. 2359 (1905). — Carl Neuberg und E. Rosenberg, Über die a-Xaphtylisocyanatverbindungen einiger Aminosäuren. Biochemische Zeitschr. Bd. 5. S.456 (1907). ••) Emil Fischer und 'Walter Ä. Jacobs, Spaltung des razemischeu Serins in die optisch-aktiven Formen. ^) Ülier die Eigenschaften der einzelnen Derivate siehe die Zusammenstellung von Emil Abderhalden, Neuere Ergebnisse auf dem Gebiete der speziellen Eiweißchemie. Gustav Fischer, Jena 1909. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 32 b) Isolierung von Histidin, Lysin und Arginin') (Ornithin nnd Guanidin). Von H. Steudel, Berlin. Prinzip der Methode. Das Prinzip der Isolierung besteht darin, die drei Basen aus der zu untersuchenden Flüssigkeit mit Phosphorwolframsäure abzuscheiden und dann die aus dem Niederschlag wieder durch Baryt in Freiheit gesetzten Basen mit Hilfe von Silbernitrat, respektive Silbersulfat, und Baryt zu trennen in eine unlösliche Fraktion (Silbersalze des Histidins und Arginins) und in ein Filtrat, aus dem durch Phosphorwolframsäure und endlich durch Pikrinsäure das Lysin gewonnen werden kann. Man kann unter Umständen auch so vorgehen, daß man aus der zu untersuchenden Flüssigkeit erst das Histidin und Arginin als Silberverbindungen entfernt und nun im Filtrat mit Phosphor- wolframsäure und Pikrinsäure das Lysin gewinnt. Man hat in diesem Falle nicht die erste Phosphorwolframsäurefällung nötig. Histidin und Arginin werden in Form ihrer Silberverbindungen getrennt, von denen die erste bei Zusatz von Baryumkarbonat ausfällt, die zweite aber erst in stark al- kalischer Lösung durch Baryt niedergeschlagen wird. *) Die Methode ist geschildert nach F. Weiß , Uutersachuii£reii über die Bildung des Lachsprotamins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 52. S. 108 (1907). Die Fällung des Arginins durch Silberuitrat oder Sulfat und Barytwasser ist zuerst von A. Eossei in der Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 25. S. 177, die Ahscheidung des Lysins ebenda, Bd. 26. S. 586 beschrieben. Die Trennung von Arginin und Histidin sowie die beute gebräuch- liche Methode in ihren wesentlichen Grundzügen ist zuerst beschrieben von A. Kossei und Fr. Kufsclicr, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 31. S. 165 (1900). Hinzugekommen sind einige Verbesserungen: Trennung des Histidins und Arginins als Silberverbindungen durch Baryumkarbonat {A. Kossei und H. Pringle, Über Protamine und Histone. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 49. 8.318, 1906), ferner Wägung der Pikrolonate des Arginins luid Histidins {H. Steudel, Das Verhalten der Hexon- basen zur Pikrolonsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 219 (1903); Bd. 44. S. 157 (1905). Isolierung von Histidin, Lysin und Argiuin (Ornithin und Giianidin). 499 Zur (luantitativen Bestimmung vun Histidin. Lysin und Arginin im Eiweiß mittelst Hydrolyse Avird der zu untersuchende Eiweillkürper in einer entsprechenden Menge, je nach dem Stickstoffgelialt, z.B. 20 — öOy, mit einer Mischung der dreifachen jNIenge seines Gewichtes konzentrierter h^chwefel- säure und der sechsfachen Menge seines Gewichtes Wasser 14 Stunden am Rückflul'tkühler gekocht. Es ist zweckmäßig, zmiächst auf dem Wasserbade so lange zu erhitzen, bis alles in Lösung gegangen ist und das lilstige Schäumen aufgehört hat (1 — l^/o Stunden). Dann setzt man den Kolben in ein Ölbad und reguliert dessen Temperatur sorgfältig, so daß kein Stoßen eintritt. Die Spaltungsflüssigkeit wird sodann mit Wasser verdünnt, filtriert, zum Liter aufgefüllt und zur Feststellung des Gesamtstickstoffs in 10 cm^ derselben der Stickstoff nach Kjeldahl bestimmt.* Entfernung der Schwefelsäure und des Huminstickstoffs. Bestimmung des Ammoniaks. Die schwefelsaure Lösung wird zum Sieden erhitzt und zwecks Ab- stumpfung der zur Spaltung in Verwendung gebrachten Schwefelsäure nach und nach bis zur schwach sauren Beaktion mit einer kochend heißen konzen- trierten Ätzbarytlösung versetzt. Der entstandene Niederschlag von schwefel- saurem Baryt, von dem auch stickstoffhaltige Körper, die sogenannten Huminstoffe, mit niedergerissen und festgehalten werden, wird abgesaugt, dreimal mit Wasser verrieben und ausgekocht, abgenutscht und so lange mit kochendem Wasser ausgewaschen, bis die abtropfende Flüssigkeit mit Phosphorwolfram säure keine Fällung mehr gibt. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und durch Eindampfen auf 1 / gebracht. Alsdann wird in 10 cm^ der Flüssigkeit nach Kjeldahl der Stickstoff bestimmt. Zieht man die so gefundene Stickstoffmenge von dem Gesamtstickstoff ab, so erhält man den im Barytniederschlag zurückgeblie- benen ..Huminstickstoff I". Die gesamte Flüssigkeit versetzt man nun mit verdünnter Atzbaryt- lösung bis zur eben neutralen Beaktion, dann mit ungefähi' ') g B)aryum- karl)onat. das zuvor in der ßeibschale fein zerrieben und mit Wasser zu einem dünnen Brei aufgeschwemmt w^ar. Das bei der Spaltung gebildete Ammoniak wird beim Erhitzen der Flüssigkeit dadurch in Freiheit gesetzt und kann durch Destillation mit Wasserdampf übergetrieben und durch Auffangen in ^-Normalsäure zur Titration gebracht werden. Es ist dabei natürlich notwendig, aus dem Destillat die mitübergegangene Kohlensäure zuerst durch Aufkochen zu entfernen. Die auf diese Weise behandelte Flüssigkeit wird filtriert, das auf dem Filter l)leibende Gemisch von Baryumkarbonat und -sulfat dreimal mit Wasser ausgekocht und mit heißem Wasser nachgewaschen. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt, mit Schwefelsäure angesäuert, stark eingedampft. n()tigen- 32* 500 H. Steudel. falls nochmals filtriert und zum Liter aufgefüllt. In 10 cm » der Flüssigkeit wrd dann der Stickstoff nach KjeJdahl bestimmt. Aus dieser Bestim- mung erfährt man unter Berücksichtigung des gefundenen Ammoniaks die Menge des im alkalischen Barvtniederschlag verbliebenen ..Huminstick- stoffs ir'. Fällung von Histidin und Arginin als Silberverbindungen. Die nunmehr erhaltene schwefelsaure Flüssigkeit wird in einen ge- räumigen Kolben gebracht und kalt mit kochend heißer Sili)ersulfatlösungi ) versetzt. Das Hinzufügen dieser Lösung geschieht allmählich unter zeitweisem kräftigem Umschwenken so lange, bis die Menge des zugesetzten Silbers ausreicht. Wann letzteres der FaU ist, kann, wie folgt, ermittelt werden. In ein Uhrglas auf schwarzer Unterlage gibt man Barytwasser. Wird durch einen mittelst Glasstab zugefügten Tropfen obiger Flüssigkeit im Baryt- wasser ein rein weißer oder heUgelber Niederschlag erzeugt, so genügt die Menge des zugesetzten Silbersnlfats nicht. Diese reicht aus, wenn durch die Tropfenprobe im Barytwasser ein braungelber Niederschlag entsteht. Trifft dies zu, so kühlt man die Flüssigkeit gut ab, sättigt sie mit gepulvertem Ätzbaryt, d. h. man fügt so lange von dieser Substanz zu, bis diese auch nach längerem Umschwenken ungelöst am Boden des Gefäßes liegen bleibt, läßt den entstandenen Niederschlag absitzen und nutscht ihn alsdann ab. Dann reibt man denselben samt Filter in einer Eeibschale unter Zuhilfenahme von mittelst Säure gereinigtem Seesand mit Barytwasser bestens an, saugt ihn nochmals ab, wäscht ihn mit l)arythaltigem Wasser gründlich aus und schwemmt ihn schließlich samt Filter in schwefelsäurehaltigem Wasser bis zur sauren Reaktion auf. Der Niederschlag wird nach A und B, die abgenutschte Flüssigkeit nach C behandelt. A. Bestimmung des Histidins. Der mit schwefelsäurehaltigem Wasser unter Zuhilfenahme von Sand fein zerriebene und aufgeschwemmte Niederschlag wird mittelst Schwefel- wasserstoffs zerlegt; die Flüssigkeit wird nach beendetem Einleiten zur Ent- fernung des Schwefehvasserstoffs gekocht, der Schwefelsilber und Baryum- sulfat enthaltende Niederschlag abgenutscht, wiederholt ausgekocht und bis zum Ausbleiben der I'hosphorwolframsäurereaktion sorgfältig heiß gewaschen. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und durch Eindampfen auf 1 / gebracht. Alsdann wird in 20 cm^ nach Kjeldahl die Menge des Stickstoffs der durch Silber und Baryt fällbaren Substanzen bestimmt. I ^) Bei nicht quantitativen Bestimmungen mit Silbernitrat. Isolierung von Histidin, Lysin und Arginin (Ornithin und Guanidin). 501 Die Flüssigkeit wird nun mit l^aiytwasser genau neutralisiert, gelöstes Baryumnitrat zugesetzt, solange noch die Entstehung eines Niederschlags zu beobachten ist, filtriert und der Niederschlag bestens ausgewaschen. Das Filtrat wird durch Eindampfen auf 300 cm^ gebracht und in einem Koch- koll)en nach dem Ansäuern mit Salpetersäure mit einem kleinen fber- schuß. d. h. so lange mit einer konzentrierten Lösung von Silbernitrat ver- setzt, bis eine Tropfenprobe in IJarytwasser einen braungelben Niederschlag erzeugt. Ist dies erreicht, so wird mit Barvtwasser nochmals schwach sauer oder e1)en neutral gemacht, aufgeschwemmtes Baryumkarbonat zugesetzt. die Flüssigkeit zunächst im Wasserbade angewärmt, dann auf dem Draht- netz zum einmaligen Aufkochen erhitzt und zum Absetzen und Erkalten beiseite gestellt. Der Histidinsilber haltende Niederschlag wird nun abfiltriert und kalt mit schwach barythaltigem Wasser (5 — 6 Tropfen einer öo/oigen Ätz- barytlösung auf 100 ciii^ Wasser) bis zum Verschwinden der Salpeter- säurereaktion sorgfältig ausgewaschen. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und zur Argininbestimmung reserviert. Der argininfreie Niederschlag wird im Kolben mit schwefelsäure- haltigem Wasser zur sauren Reaktion erhitzt, mit Schwefelwasserstoff zer- setzt, die Flüssigkeit zur Entfernung des Schwefelwasserstoffs gekocht, das Schwefelsilber abfiltriert, wiederholt ausgekocht und mit siedendem Wasser bis zum Verschwinden der Phosphorwolframsäurereaktion völlig erschöpft. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und durch Eindampfen auf 2b0 ciit'^ gebracht; alsdann wird in 25 — 50 oii^ der Stickstoff nach Kjeldahl bestimmt. Aus dem durch diese Bestimmung gefundenen N-Wert wird das Histidin berechnet. Der Best der Flüssigkeit wird mittelst Ätzbaryt heiß von der über- schüssigen Schwefelsäure, durch Kohlensäure vom überschüssigen r)aryt befreit, eingedampft und vom ausgeschiedenen Baryumkarlionat und -sulfat abfiltriert. Filtrat und Waschwasser des wiederholt heiß gewaschenen Niederschlages werden vereinigt, nochmals eingedampft, nötigenfalls durch wenige Tropfen verdünnter Schwefelsäure von den letzten Spuren Baryt befreit und auf etwa 10 cin^ gebracht. Diese Flüssigkeit dient zur genaueren Bestimmung des Histidins in Form des gut kristallisierenden und schwerlöslichen Salzes mit Tikrolon- säure, die von Steudel in die physiologische Chemie eingefiüirt worden ist. Nach Maßgabe der vorher ausgeführten Kjeldahll)estimmung kaim man die Menge der zur AusfäUung erforderlichen Pikrolonsäure berechnen. Man fügt einen geringen Überschuß der in wenig heißem Alkohol gelösten Pikrolonsäure hinzu, saugt das entstandene Pikrolonat nach ;> Tagen ab, wäscht es mit wenig Wasser aus, trocknet bei 100» und bringt es zur Wägung. Das Histidin ist nach der Formel C,o HsNiüg . CeHgNa 0., aus dem Pikrolonat zu berechnen. 502 H. Steudel. B. Bestimmung des Arginins. Zu der A^om Histidinsilbcr abfiltrierten Flüssigkeit gibt man bis zur völligen Sättigung gepulverten Ätzbaryt, saugt den entstandenen Xiedersclilag ab, reibt diesen unter Zuhilfenahme von Seesand samt Filter nochmals mit Barytwasser gut an und wäscht ihn damit bis zum Yerscliwinden der Salpetersäurereaktion völlig aus. Dann wird der Niederschlag mit schwefelsäure- haltigem Wasser zur sauren Reaktion angerieben und mit Schwefelwasser- stoff zersetzt. Die Flüssigkeit wird alsdann zur Entfernung des Schwefel- wasserstoffs gekocht, das Schwefelsilber abfiltriert, wiederholt ausgekocht und mit siedendem Wasser völlig erschöpft. Filtrat und Waschwasser w^erden vereinigt, durch Eindampfen auf bOOcm^ gebracht und in 25 — öOcjit^ der Stickstoff nach KJeldahl bestimmt. Aus dem gefundenen Stickstoff- wert wird das Arginin berechnet. Der Rest wird mittelst Baryumhydroxyds heiß von der überschüssigen Schwefelsäure, durch Kohlensäure vom über- schüssigen Baryt befreit, eingedampft, vom abgeschiedenen Baryt abfiltriert, das Filtrat mit dem Waschwasser des wiederholt heiß gewaschenen Nieder- schlages nochmals eingedampft, nötigenfalls mit wenigen Tropfen verdünnter Schwefelsäure von den letzten Spuren Baryt befreit und auf 10 cm- gebracht. In dieser eingeengten Lösung wird das Arginin nach dem von Steudd angegebenen Verfahren mittelst der berechneten Menge Pikrolonsäure, die zuvor in wenig heißem x\lkohol gelöst ist, gefällt. Die abgeschiedenen schwefelgelben Nadeln werden nach Ablauf einiger Tage auf dem Filter gesammelt, zunächst wiederholt mit der Mutterlauge, dann mit wenig Wasser gewaschen, bei 110° getrocknet und gewogen. Die Löslichkeit dieses Pikrolonates in Wasser ist sehr gering und beträgt nach Steudel 1: 1124. Hieraus läßt sich der in der Mutterlauge verbhebene Rest des Pikrolonats leicht berechnen. Ebenso kann man die Reinheit des Pikrolonats durch die Schmelzpunktbestimmung leicht prüfen. Diese gewichtsanalytische Methode gibt, verglichen mit den l)ei der Kjeldahlbestimmung gefundenen Werten, beim Arginin sehr gute, beim Histidin zufriedenstellende Resultate. C. Bestimmung des Lysins. Das Filtrat von dem Niederschlag, der Arginin und Histidin als Silber- verbindungen enthält, säuert man zur Entfernung des Baryts mit Schwefel- säure an und befreit es durch Einleiten von Schwefelwasserstoff vom überschüssigen Silber, dann kocht man den Schwefelsilber enthaltenden Barytniederschlag nochmals aus und wäscht ihn mit siedendem Wasser gründlich nach. Filtrat und Waschwasser werden auf 500 cw^ gebracht; dann versetzt man die Flüssigkeit, nachdem ilir Stickstoff gehalt zur Kontrolle, ob der Barytniederschlag völlig erschöpft ist, festgestellt wurde, mit Schwefelsäure bis zu 4 Volumprozent, fällt unter Vermeidung eines größeren Überschusses mit Phosphorwolframsäure, d. h. fügt solange von einer Lösung dieser Substanz zu, bis die vom gebildeten Niederschlag Isolierung von Histidin, Lysin und Arginin (Ornithin und Gimnidin). 503 abfiltrierte Flüssigkeit auf weiteren Zusatz von Phosphorwolfranisäure 10 Sekunden Mar bleibt, und untersucht den PhosphorwoltVanisänrcnieder- schlag" auf seinen Lvsing-ehalt. Er wird nach 24stimdigem Stehen abgesaugt, vom Filter genommen, in der Reibschale mit 4 volumprozentiger Schwefelsäure angerieben und mit dieser sorgfältig gewaschen. Filtrat und Waschwasser werden ver- einigt und auf ein bestimmtes Volumen gebracht; in dieser Flüssigkeit wird alsdann nach Kjeldohl der Stickstoffgehalt der durch Phosphorwolfram- säure nicht gefällten Stoffe festgestellt. Der Phosphorwolframsäureniederschlag wird nun, nachdem er zuvor mit Wasser zu einem gleichmäßigen Brei angerieben worden ist, in kochendes Wasser eingetragen; diese heiße Flüssigkeit wird bis zur stark alkalischen Reaktion mit einer heißen konzentrierten Ätzbarytlösung versetzt. Das unlös- liche Barvtsalz wird abgesaugt, mehrmals unter Zusatz von Ätzbarvt ausge- kocht und bis zum Ausbleiben der Phosphorwolframsäurereaktion mit heißem Wasser gewaschen. Die alkalischen Filtrate werden sofort durch Einleiten von Kohlensäure vom überschüssigen Baryt befreit, zunächst auf freiem Feuer eingeengt, filtriert, dann auf dem Wasserbade fast zur Trockene eingedampft, mit Wasser aufgenommen, vom kohlensauren Baryt abfiltriert, nochmals eingedampft, auf ein bestimmtes Volumen aufgefüllt und noch einmal der Stickstoff nach Ejeldahl in einer gemessenen Menge bestimmt. Der in seinem xlussehen harzig erscheinende Rückstand wird nun mit einer geringen Menge alkoholischer Pikrinsäurelösung unter Zusatz von Alkohol angerührt. Zu dieser alkoholischen Lösung setzt man am besten in einer weißen Schale nach und nach jeweils in kleinsten Mengen solange eine konzentrierte alkoholische Lösung von Pikrinsäure, als die Bildung eines Niederschlages zu beobachten ist. Das ausgeschiedene Pikrat wird nach 24 Stunden abfiltriert, mit sehr wenig absolutem Alkohol gewaschen, in siedendem Wasser gelöst, die Lösung nötigenfalls filtriert und durch Eindampfen auf ein Ideines Volumen gebracht. Beim Erkalten scheidet sich das Lysinpikrat in nadeiförmigen Kristallen ab, die auf gewogenem Filter gesammelt, mit wenig Alkohol gewaschen, getrocknet und gewogen werden. x\us diesem Pikrat berechnet sich das Lysin nach der Formel: Ce H, N2 0, . C„ H, (NO2 ")., OH. Die Mutterlaugen werden vereinigt, durch Erhitzen vom Alkohol be- freit, mit Schwefelsäure bis zu einem Gehalt von 4 \'olumprozent ange- säuert und durch Äther von der ausgeschiedenen Pikrinsäure befreit. Hier- auf wird die durch Erwärmen ätherfrei gemachte Lösung nochmals mit Phosphorwolframsäure gefällt und der gebildete Niederschlag nach iler oben geschilderten Methode auf Lysin verarbeitet. Dieses Verfahren wird solange Aviederholt, als durch alkoholische Pikrinsäure noch Niederschläge von Lysinpikrat erzielt werden. \W\ vor- sichtigem Zusatz von Pikrinsäure in den vorhergehenden Fällungen, d. h. bei Vermeidung eines wieder lösend wirkenden Überschusses derselben, 504 H. Steudel. pflegt die Ausbeute an Lysinpikrat aus dem dritten Phosphorwolfrainsäure- niedersclilag bereits so gering zu sein, daß sie vernachlässigt werden kann. Bemerkungen. Will man die einzelnen Basen nicht (quantitativ bestimmen, sondern sie nur präparativ darstellen, so ist diese geschilderte ^lethode ebenfalls zu empfehlen, man kann dann statt des Silbersulfats das leichter lösliche Silbernitrat nehmen, desgleichen ist sie gut geeignet zur Aufteilung des Gemisches, das z. B. durch fermentative Einwirkung auf Eiweißkörper entsteht. Zu beachten ist aber, daß dann in die einzelnen Fraktionen unter Umständen auch noch andere Körper hineingehen können, so daß eine sorgfältige Reinigung der kristallisierten Salze der Basen und Unter- suchung der verbliebenen Mutterlaugen notwendig ist. So können in der Histidinfraktion, sobald nicht reines Eiweiß als Aus- gangsmaterial genommen wurde. Thymin, Uracil und Cytosin ge- funden werden; die Argininfraktion, mit Pikrolonsäure ausgefällt, hinter- läßt eine Mutterlauge, aus der eventuell GuanidinM als Pikrat isoliert werden kann. Pveines Guanidin gibt ein schwer lösliches Pikrat, die Fällung wird aber durch die Gegenwart von Arginin verhindert 2), so daß sicherst nach Entfernung des Arginins das Guanidin nachweisen läßt. Ferner findet sich bei dem beschriebenen analytischen Gang in der Lysiufraktion gegebenenfalls das Ornithin vor, das aus Arginin durch Einwirkung von Alkalien ») oder durch Fermentwirkung*) (Arginase) ent- steht. Hier kann unter Umständen auch Cholin^) (entstanden durch Spaltung des Lecithins) isoliert werden, zuweilen auch die durch Phosphor- wolframsäure fällbaren Monoaminosäuren. Handelt es sich um die präparative Darstellung einer einzigen Base in größeren Mengen, so ist die beschriebene Methode für die Gewinnung von Arginin oder Lysin durchaus zweckmäßig, für die Bereitung von ') J. Otori, Die Spaltung des Pseudomucius durch starke siedende Säuren. I. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 42. S. 458 (1904). — Fr. Kutscher und J. Otori, Der Nachweis des Guanidins unter den bei der Selbstverdauung des Pankreas entstehenden Körpern. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S. 98 (1904). -) Fr. Kutscher und J. Otori, Der Nachweis des Guanidins unter den bei der Selbstverdauung des Pankreas entstehenden Körpern. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S. 101 (1904). *) E. Schulze und Winterstein, Über die Bildung von Ornithin bei der Spaltung des Arginins und über die Konstitution dieser beiden Basen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 26. S. 1 (1898). Siehe auch ^1. Kossei und Fr. Weiss, Über die Einwirkung von Alkalien auf Proteinstoffe. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 60. S. 313 (1909). *) Ä. Kossei und H. I). Dahin, Über die Arginase. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 41. S. 321 (1904). Weitere Untersuchungen über fermentative Harnstoffbildung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 42. S. 181 (1904). ^) Fr. Kutscher und Ä. Lohmann, Die Endprodukte der Pankreas- und Hefe- selbstverdauung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 39. S. 162 (1903). Isolierung vou Histidiu, Lysiii imd Arginin (Oriiithin und (iuanidiu). 505 Histidiu in größerer Quantität eignet sich besser folgende Angabe unter Benutzung des iiosse/schen Quecksilberchloridverfahrens i): Darstellung von Histidin. Rohes Einderblut wird mit gasförmiger Salzsäure gesättigt und bis zur vollständigen Lösung im Ölbade gekocht, oder es wird direkt auf zwei Teile Blut 1 Teil konzentrierter Salzsäure genommen und dios(» ]\Iischung 10 Stunden gekocht. Dann wird der größte Teil der Salzsäure fortgedampft, mit Soda bis zur schwach sauren Reaktion neutralisiert und filtriert. Das Filtrat wird weiter mit Soda deutUch alkalisch gemacht und durch Kochen das Ammoniak vertrieben, filtriert und nun bei dauernd schwach alka- üscher Reaktion mit Quecksilberchlorid ausgefällt. Der Niederschlag wird noch einmal in wenig Salzsäure gelöst, filtriert und wieder mit Soda, Sublimat und viel Wasser ausgefällt, gut gewaschen und mit Schwefel- wasserstoff zersetzt. Das Filtrat liefert bei der Konzentration Histidin- monochlorhvdrat. Ausbeute: 10 l Blut liefern 70 — 90 g Histidinmono- chlorhydrat. H i s t i d i n. 2) Das Histidin (ß-Imidazolalanin) kristallisiert in tafelförmigen Kri- stallen, die in Wasser leicht löslich sind, schwer löslich in Alkohol. Die wässerige Lösung reagiert alkalisch. Co Hg Ng Og. MG = 155-10. l.M. = 1 9061. ^) 46-45«/o C. 5-810/,^ H. 27-lOVo N. Es verbindet sich mit 1 und 2 Molekülen Säure. Histidinmonochlorhydrat: CeHgNgOa.HCl + HoO. MG ="209-58. l.M. = 32185. 34-370 'o C. 5-72Vo H. 20-05'Vo N. 16-94«/„ Cl. 8-59Vo H2O. Das Kristalhvasser entweicht bei 135" unter schwacher Braunfärbung der Substanz. Diese Verbindung kristallisiert gewöhnlich aus: hat man einen Überschuß von Salzsäure in Lösung, so erhält man : M H. Pauli/, Über die Konstitntion des Histidins. I. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 42. S. 514 (1904). — Fr.Knoop, Abbau und Konstitntion des Histidins. Beiträge zur chemischen Physif^logie und Pathologie. Bd. 10. S. 115 (1907). -) Beschreibung des Histidins und seiner Salze : A. Kossei, Über die basischen Stoffe des Zellkerns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 22. S. 182 (1896). — ,S. Hedin, Zur Kenntnis der Spaltungsprodukte der Proteinkörper. Zeitschr. f. physiol. Cliomie. Bd. 22. S. 191 (1896). — Fr. Kutscher, Über Histidindichlorid. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 28. S. 383 (1899). — A. Kossei, Über das optische Drehungsvermögen des Histidins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 28. S. 382 (1899). — U. Stcmlel, Das Verhalten der Hexonbasen zur Pikrolonsäure. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 37. S. 219 (1903) und Bd. 44. S. 157 (1905). ^) Die Molekulargewichte usw. sind unter Zugrundelegung der logarithmischen Rechentafeln für Chemiker von F. W. Küster (7. Aufl. 1907. Leipzig. Veit c't Co.j jerechuet. 506 H. Steudel. Histidindiclilorhydrat: CßHgNs O2 . 2HC1. MG = 228. IM = 35793. 31-58''/o C. 4-82Vo H. 18-42Vo N. 31-14o/o Cl. Es sintert bei 225» und schmilzt bei 231 — 233". Die freie Base dreht nach links [y.]^ = — 39"74«, die salzsaure Lösung nach rechts, und zwar nimmt die Drehung mit der Menge der Salzsäure zu. Das Histidin bildet mit Salpetersäure, mit Platinchlorid und mit Silbernitrat gut kristallisierende Doppelsalze. Versetzt man eine Lösung von Histidin mit Silbernitrat und dann vorsichtig mit Ammoniak, Xatronlauge oder Barytwasser, so erhält man einen weißen, gelatinösen Niederschlag, der im Überschuß von Ammoniak leicht löslich ist und folgende Zusammensetzung hat : Cß H7 Ag., N3 0.3 . Ho 0. MG = 387. 1. M. = 58 7 7 L 18-60Vo C. 2-33o/o H. 55-81«/o Ag. Das Histidin gibt mit Diazobenzolsulfosäure in sodaalkahscher Lösung intensive (dunkelkirschrote) Diazoreaktion. mit Bromwasser beim Erwärmen rötUche bis dunkelweinrote Färbung.^) Zur Identifizierung des Histidins dient das Pikrolonat: Cjo Hg N, O5 . Cß Hg N3 0... MG = 419-20. IM. = 62242. 45-80Vo C. 4-09Vo H. 23-44 »/o N (gelbe Nadeln), in Wasser schwer löshch. F.F. = 225". A r g i n i n (Guanidin-cc-Aminovaleriansäure ). ") Das bei der Hydrolyse von Eiweibkörpern gewonnene Arginin ist gewöhnlich rechtsdrehend, es kristallisiert in rosettenförmigen Drusen von prismatischen Nadeln, reagiert stark alkalisch und zieht begierig Kohlensäure an, die beim Verdampfen der Lösung wieder entweicht. F.F. = 207". Leicht löslich in Wasser, unlöshch in Alkohol. ^) Fr. Knoop, Eine Farbenreaktion des Histidins. Beiträge zur ehem. Physiologie und Pathologie. Bd. 11. S. 336 (1908). -) Beschreibung des Arginins und seiner Salze: E. Schulze und E. Steiger, Über das Arginin. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 11. S. 43 (1886). — S. G.Hcdin, Über ein neues Spaltungsprodukt der Hornsubstanz. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 20. S. 186 < (1895). — S. G. Hcdin, Über die Bildung von Arginin aus Proteinkörpern. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 21. S. 155 (1895). — W. Guleivitsch, Über das Arginin. Zeitschr. f. . physiol. Chemie. Bd. 27. S. 178 (1899). — W. Gidcirifsch, Nachtrag zu meiner Mitteilung j über das Arginin. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 27. S. 368 (1899). — D. Laicrow, \ Über Benzoylierung der Hexoubasen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 28. S. 585 (1899). — H. Steudel, Das Verhalten der Hexoubnsen zur Pikrolonsäure. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 37. S. 319 (1903) und Bd. 44. S. 157 (19Ü5). — 0. Bicsser, Zur Kenntnis der optischen Isomeren des Arginins und Ornithins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. B. 49. , S. 211 (1906). — Fr. Kutscher, üie Überführung des rechtsdrehenden Arginins in die optisch inaktive Modifikation. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 32. S. 476 (1901). - E. Schuhe, Einige Bemerkungen über das Arginin. Zeitschr. f. ph\siol. Chemie. Bd. 29. S. 329 (1900). rt Isolierung von Histidin, Lysin und Arginin (Ornithin und Guanidin). 507 Lösungen von freiem Arginin liefern, an der Luft eingeengt, Kristalli- sationen von Argininkarl)onat. Neutrales Argininnitrat, C« Hj, N^ 0, HXO3 + V2II2O, leicht lös- lich in Wasser, wird zur Reinigung am besten aus heißem verdünntem (85o/oi8'en) Alkohol umkristallisiert. Verliert bei 110" ;')-()(')0/o H^O. Berechnet für Cß E,,, ^rj),,, MG = 246. l.M.G = -59094. 29-27Vo C. 6-50o/o H. 28-45"/o X. F.F. = 175", wenn vorher längere Zeit bei gö» getrocknet. Saures Argininnitrat, Co H^^ N, 0, . 2 HNO3, kristalhsiert bei einem Wierschuß von Salpetersäure beim Verdampfen im Vakuum. F.F = 144-5~-145". MG = aOO. 1. M. = 47712. 24-OVo C. 5-3aVo H. 28-04Vo N. Argininchlorhydrat. Fhomboederähnliche, in Wasser leicht lösliche Kristalle, in heißem 85Voigem .Ukohol schwerer löshch als in kaltem. CßH^.X.O^.HCl + HäO. 7-88 Vo H2 0. Das Kristalhvasser entweicht bei 100": CeH^^N^ ()., .HCl. MG = 210-5. 1. M. = 32325. 34-20Vo C. 7-13V0 H. l(;-83o/o Cl. Argiuinkupfernitrat: CufNCgja + 2 C^ Hj^X^ O, + 3 ll^ O. F.F. = 112— 1140 wasserhaltig, 234" wasserfrei. Arginiukupf er Sulfat: CuSO^ + 2C6Hi,X, Oa + 51/2 Hg 0. Pikrat : C, R,, X, O^ . Co H, (XOoJg OH. F.F. = 205—206". Silbersalze: AgXOs + CoHi^N.O, -f V2 H.2 0; AgN03 + CeH,,N,(X.F[X()3. Zur Identifizierung des Ai-ginius dient das Fikrolonat: Cio Es X4 O5 . Ce H,, X, 0.3 + H, 0. Das Kristallwasser entweicht bei 110". Für CioHgXi O5 . CoHi^Xt (),. MG=438-2. l.M.=:64167. 43-82"/o C. 5-06"/oH. 25-62VoX (gelbe Xadeln). Löslichkeit in kaltem Wasser bei Zimmertemperatur 1:1124, in 96"/oigem Alkohol 1:2885. F.F. = 225" (unkorr,).i) Durch Silbernitrat allein wird das Arginin nicht gefällt, wohl alicr fällt nach Zusatz von X'^atronlauge oder Barytwasser die Silberverbindung als vo- luminöser amorpher Xiederschlag aus, im Überschuß von Barytwasser unlöslich. Mit Benzoylchlorid entsteht Dil)enzoylarginin, Cg H12 (Ce H5 . C())o X4 (h. 62-78VoC. 5-80"/oH. 14-69"/o X. F.F. = 217— 218".' Mit ß-Xaphtalin- sulfochlorid ß-Xaphtalinsulfoarginin Cß E^^ X^ O., . SO., E^ C^o- 52-75" „ C. 5-49"/o H. 8-79"/o S. Das Arginin, aus der Hydrolyse von Eiweiß mit Miui-ralsäure gewonnen, ist rechtsdrehend (z.B. das HCl-Salz in 10"/oiger Lösung [a]u = 10-70"), durch Racemisierung erhält man das inaktive Arginin"-), *) Der von Biesscr angegebene Schmelzpunkt ist nicht richtig. Zcitschr. f. pliysiol. Chem. Bd. 49. S. 220. Siehe dazu auch F. Weiß, Zeitschr.f.physiof.Chem. Hd.52. S. 114. -) F. Jüffscher, Die tJberführung des rechtsdrehenden Arginins in die optisch inaktive Modifikation. Zeitschr. f. physiol. Chom. Bd. 32. S. 470 (11)01). 508 H. Steudel. aus dem das 1-Arginiii i ) erhalten av erden kann, wenn man z. B. Leber- preltsaft darauf einwirken liiljt. der das d-Arginin zersetzt vermöge seines Gehaltes an Arginase. Lysin (z, s-Diaminocapronsäure). 2) Es wird gewöhnlich als rechtsdrehendes Lysin gewonnen, durch Eacemisierung und durch Synthese kann man inaktives Lysin erhalten. Die freie Base kristallisiert nicht. Lysinchlorhydrat: C^ Hi.Ns O2 . 2 HCl, verliert leicht 1 Mol. HCl beim Umkristallisieren aus Lösungen, die keine Salzsäure enthalten. F. P. = 192 — Ulo". Leicht in Wasser löslich, schwer löslich in Alkohol. n2\s67o C. 7-31% H. 32-42Vo Cl. Spezifische Drehung für 2 — öVoige Lösungen [aji,— + 14 — 15*3ö. Lysinplatinchlorid: C^Hj^N, 0., . 2 HCl . PtCU + C.HßO, gelbrote Prismen aus alkoholischer Lösung: 15-99Vo C. 3-66Vo H. 4-66«/o N. 32-35Vo Pt. 35-34Vo Cl. Lysinpikrat: Cg H14N2 O2 . Co H2 (N03)2 OH, gelbe Xadeln, ziemlich schwer in Wasser löslich, löslich im Überschuß von Pikrinsäure. 38-40Vo C. 4-53% H. 18-67«/o N- Zur Identifizierung ist das Pikrat am besten geeignet. Das Karbonat, Nitrat, Sulfat kiistallisiert gleichfalls. Lysin wird im Gegensatz zu Histidin und Arginin nicht durch Silbernitrat und Baryt respektive Ammoniak gefällt: es bildet mit Silber- nitrat 2 Salze, die den Argininsaken entsprechen und in Wasser ziemlich leicht löslich sind (Cß H^^Ns O2 • AgNOg und AgNÜs + C, Hi^N, 0, . HNÜ3J. Mit Phenvlisocyanat entsteht ein Hydantoin C20H22N4O3. F. P. = 183—1840. 65-57 Vo C. ' 6-01 «/o H. 15-30«/o N. Mit alkohohscher Pikrolonsäure liefert Lysin in wässeriger Lösung kein schwer lösliches Salz. O mithin ( a-r^-Diaminovaleriansäure ). ^ ) Das gewöhnliche Ornithin ist rechtsdrehend, die freie Base kristalUsiert nicht, ihre Salze sind in Wasser meist leicht löslich, in Alkohol schwer M 0. Biesser, Zur Kcniituis der optischen Isomeren des Arginins und Ornithins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 49. 8.211(1906). '■'] Beschreibung des Lysins und seiner Salze: E. Drechsel, Der Abbau der Eiweiß- stoffe: Zur Kenntnis der Spaltungsprodukte des Kaseins. Archiv für Anatomie und Pliysiologie. S. 254 (1891). — E. Drechsel und Th. R. Krüger, Zur Kenntnis des Lysius. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 25. S. 2454 (1892). — S. G. Hedin, Eine Methode, das Lysin zu isolieren, nebst einigen Bemerkungen über das Lysatinin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 21. S. 297 (1895). — A. Kossei, Über die Darstellung und den Nachweis des Lysins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 26. S. 586 (1899). — O. Herzog, Über den Nachweis von Lysin und Ornithin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 34. S. 525 (1902). — I'. Henderson, Ein Beitrag zur Kenntnis der Hexonbasen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 29. S. 320 (1900). ^) Beschreibung des Ornithins und seiner Salze: M. Jajf'e, Über das Verhalten der Benzoesäure im Organismus der Vögel. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 10. S. 1926 Isolierung von Histidin, Lysin und Arginin (Ornitliin und Guanidin). 509 löslicli. Das Ornithin entsteht aus Arginin dureh Sieden mit liarvtwasserJ) oder durch Einwirkung von Arginase. 2) Zur Identifizierung dient das Nitrat C5H10X.2 O, . HNOa, die Di- benzoylverbindung C19H20N2O4, F. P. = 184", oder das Hydautoin der Phenylisocyanatverhindung 3) C„ Hgo N^ O3. F. P. = 191—192«! Salze des inaktiven Ornithins*): dl-Ornithiunitrat : C,H„X,0., HXO3. F. P. 18:5«. nO-77Vo C- 6-66Vo H. 21-540/0 X. dl-Ornithinchlorhydrat : CgHj.X.OsHCl. F. P. 215". l(y62''/oX. dl-Ornithinoxalat : (C5Hi.,X2'02)2 (COOH),. F, P. 218". 4067 «/o C. 7-34Vo H. lö-82«/o X. dl-Ornithinmonopikrat : CBH32X2O2 .C6H3N3O7. F.P.igö». 19-39ö/o ^'• dl-Ornithinpikrolonat : C5 Hi2 X2 Ö2 . C^o Hg X^ O^ + 1 V2 H, 0. F. P. 220 bis 221". 6-38VoH2 0. C5H12X2O2 . CioHsX.O^. 40-45 "/o C. 5-05Vo H, 2P21V„X. dl-Ornithinacetat : C'sHioX.O., .C^H^Oo. 1 4-580/0 N. dl-Ornithinkupfersulfat : (C5Hi2N2 02)2 CuSO, + H2O. F. P. 204—205". 4-07Vo H2 O. Wasserfrei 14-990/« Cu. dl-Örnithinkupfernitrat : (C5Hi2X2 02)2 Cii(X03)2 + V2H2O. F.P. 167". P95o/oH2 0. H2 0-frei 14-06o/o Cu. dl-Ornithinsilbernitrat : C5 H^o X., O2 HXO, + AgXO.. F. P. 175". 29-60o/o Ag. Guanidin. Zur Identifizierung des Guanidins dient das Pikrat: CX3 H5 . Co H2 (X0.;)3 OH (F. p. = 3150) oder das Pikrolonat CX3 H^ . C^o HgX, Og^) (F. P. = 272— 274"). (1877). — Derselbe, "Weitere Mitteilungen über die Ornithursäure und ihre Derivate. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 11. S. 40(5 (1878). — M. Joffe und li. Cohn , Über das Verhalten des Furfurols im Stoffwechsel der Hühner. Ber. d. Deutsch, clicm. Ges. Bd. 21. S.3464 (1888). ^) E. Schulze und E. Wiiifersfci», Über die Bildung von Ornithin bei der Spaltung des Arginius und über die Konstitution dieser beiden Basen. Zeitschr. f. physiol. L'hem. Bd. 26. 8.1(1898). — Dieselben, trber die Konstitution des Arginins. Ber. d. Deutsch. ehem. Ges. Bd. 31. S. 3191 (1899). ^) A. Kosscl und //. D. Dakiii, t)ber die Arginase. Zeitschr. f. physiol. Glicm. Bd. 41. S. 321 (1904). — Weitere Untersuchungen über forraentative Harnstoffbilduug. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 42. S. 181 (19(J4). — A. Kossei und Fr. Weiss, Über die Einwirkung von Alkalien auf Proteinstoffe. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 60. S. 313 (1909). =) O.Herzog, Über den Nachweis von Lysiu luid Ornithin. Zeitsclir. f. physiol. Chem. Bd. 34. S. 525 (1902). *) Fr. M'eiss, Über einige Salze des inaktiven Ornithins. Zeitschr. f. physi.d. Chem. Bd. 59. S. 499 (1909). ^) M. Sehende, Über das Guanidinpikrolonat. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 44. S.427 (1905). ANHANG. a) Isolierung yoii Aminosäuren, you Asparagin und (llutaniin aus Pflanzen. A. Über die Vorbereitung der Pflanzen für die Untersuchung und über die Darstellung der Extrakte. Von E. Schulze und E. Wintersteiu, Zürich. Die Zerkleinerung' von trockenen Pflanzen und Pflanzenteilen kann mittelst einer Mühle geschehen. In ein staubfeines Pulver können die meisten Substanzen mit Hilfe der nach Angaben M.Maerckers vom Mechaniker Dreef s in Halle konstruierten Pieibe verwandelt werden. Um dieses Ziel vollständig zu erreichen, muß man aber aus dem bei der ersten Zerldeinerung er- haltenen Pulver die feinsten Partikelchen absieben, die auf dem Sieb ge- bhebenen gröberen Teile wieder auf die Pteibe bringen und diese Operation eventuell noch mehrmals wiederholen. Das Zerreiben der pflanzlichen Sub- stanzen gelingt leichter, wenn man dieselben zuvor unter Anwendung einer erhöhten Temperatur getrocknet hat. Fettreiche Pflauzenteile, z. B. fettreiche Samen, lassen sich in ein feines Pulver erst verwandeln, nachdem sie vom größten Teil des Fettes befreit worden sind; letzteres läßt sich durch Be- handlung des gröblich zerkleinerten Materials mit Äther oder Petroläther erreichen. Frische Pflanzen oder Pflanzenteile werden, je nach ihrer Beschaffen- heit, mit Hilfe einer Mühle oder in einem ^Mörser zerkleinert. Das Zer- reiben im Mörser kann durch Zusatz von reinem Sand erleichtert werden. Bei Darstellung wässeriger Extrakte aus frischen oder getrockneten Pflanzen oder Pflanzenteilen ist das Gemisch der zu extrahierenden Sub- stanzen mit dem Wasser auf mindestens 50° C zu erwärmen, falls nicht besondere Gründe das Einhalten einer niedrigeren Temperatur wünschens- wert machen. Bei stärkemehlfreien oder an Stärkemehl sehr armen Sub- stanzen kann man stärker erwärmen und unter Umständen die Temperatur bis auf den Siedepunkt des Wassers steigern. Längeres Kochen mit W^asser ist aber im allgemeinen zu vermeiden, da leicht zersetzliche Pflanzenbestand- teile dabei eine Veränderung erleiden können. Auch darf man annehmen. Isolierung- von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. 5^1 daß die Pflanzenbestandteile, auch wenn sie in reinem Zustande in Wasser schwer löslich sind, meistens bei einer Temperatur von r)0'' leicht in Lösunu' gehen. Denn ihre Auflösung wird durch das Vorhandensein anderer leiclit löslicher Substanzen in der Regel sehr befördert. Das Gleiche gilt für die Extraktion mit Alkohol; Pflanzenbestandteile, die nach der Reindarstellung sich in Alkohol sehr wenig lösen, können aus den zerkleinerten Pflanzen durch kochenden 90— 92o/oigen Alkohol meistens ohne Schwierigkeit in Lösung gebracht werden. Bei Trennung der Extrakte von den Rückständen ist die Anwendung einer Presse zu empfehlen. ^Yenn die Extrakte trübe von der Presse ab- fließen, so ist dies mit einem Nachteil nicht verbunden, falls die Extrakte, wie es meistens geschieht, durch Versetzen mit Bleiacetat oder ähnlichen Fällungsmitteln einer Reinigung unterworfen werden. Bekannt ist, daß man mit Hilfe einer stark wirkenden Presse aus frischen Pflanzen oder Pflanzenteilen ohne Schwierigkeit den Saft ge- winnen kann. Das Trocknen frischer Pflanzen geschieht am besten bei einer 'J>ra- peratur von 60 — 70". Bei Anwendung höherer Temperaturen ist gnißere Gefahr, daß leicht zersetzliche Pflanzenbestandteile eine Veränderung er- leiden. Diese Gefahr wird zwar noch mehr verringert werden, wenn man das Trocknen bei einer Temperatur von ca. -40'^ vornimmt: doch ist es dann eher möglich, daß während des Trocknens eine Zersetzung gewisser Pflanzenbestandteile durch die neben ihnen sich vorfindenden Enzyme be- ginnt. Denn die angegebene Temperatur ist für die Wirkung der meisten Enzyme günstig; auch geht bei derselben selbstverständlich das Trocknen nur langsam vor sich. Ein rationelles Verfahren zur Entwässerung frischer Pflanzen besteht darin, daß man letztere in OoVoigem oder in absolutem Alkohol bi'ingt und sie darin einige Wochen lang beläßt. Nach dem Abgießen der wein- geistigen Extrakte lassen sich die vom größten Teile des ^'eg•etationswassers befreiten Pflanzen in gelinder Wärme, zuweilen schon bei gewöhnlicher Temperatur im Exsikkator ohne Schwierigkeit trocknen. Es ist anzunehmen, daß nach dem Einl)ringen in den /Vlkohol die Lebenstätigkeit in den Pflanzen sehr bald erlischt und daß die Entwässerung ohne Zersetzung von Pflanzen- bestandteilen erfolgt. Selbstverständlich aber muß man bei der Unter- suchung nelien den getrockneten Pflanzen auch die Bestandteile der wein- geistigen Extrakte berücksichtigen. In diese Extrakte geht meistens ein ansehnlicher Teil der löslichen Pflanzenbestandteile über, da der Alkohol durch das Vegetationswasser der Pflanzen verdünnt wird. B. Darstellung von Asparagin und Glutamin. Die Darstellung von Asparagin aus etioherten Keimpflanzen, Kartoffel- saft und anderen asparaginreichen Objekten gelingt sehr leicht, da dieses Amid in kaltem Wasser ziemlich schwer löslich ist (ein Teil bedarf zur Lösung 512 E. Schulze und E. Winter st ein. 47 Teile Wasser von 20'') und ferner die Eigenschaft hat, auch aus Extrakten, welche viele Xebenbestandteile enthalten, sich in gut ausgebildeten Kristallen abzuscheiden. Man kann die asparaginhaltigen Säfte und Extrakte, nachdem sie durch Erhitzen von den koagulierbaren Eiweißstoffen befreit worden sind, direkt zur Sirupskonsistenz eindunsten: nach einiger Zeit beginnt dann die Aus- scheidung von Asparaginkristallen. Letztere lassen sich in der Regel leicht von der Mutterlauge trennen und durch Umkristallisieren reinigen. Man kann aber auch die Säfte und Extrakte mit Bleiessig versetzen, die von den lUei- niederschlägen abfiltrierten Flüssigkeiten sodann mittelst Schwefelwasserstoff vom gelösten Blei befreien, sie hierauf mit Natronlauge neutralisieren und nun zur Sirupskonsistenz eindunsten; auch dann erhält man Asparaginkri stalle. Hat man es mit asparaginarmen ( Ibjekten zu tun, so empfiehlt sich die Ausfällung des genannten Amids durch Mercurinitrat. ]Man versetzt den Saft oder Extrakt mit Bleiessig in schwachem Überschuß, entfernt den Bleiniedersehlag durch Filtration und fügt dem Filtrat Mercurinitrat zu (man verwendet dazu eine durch Behandlung des käuflichen Mercurinitrats mit Wasser unter Zusatz von etwas Salpetersäure hergestellte Lösung). Man kann die Ausfällung des Asparagins vollständiger machen, indem man die Azidität der Flüssigkeit durch Zusatz von etwas Natronlauge abstumpft. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen, zwischen Fließpapier abgepreßt, dann in Wasser verteilt und durch Schwefelwasserstoff zersetzt. Man neutrahsiert das Filtrat vom Quecksilbersulfid mit Ammoniak und dunstet es sodann in geünder Wärme zum Sirup ein (während des Eindunstens fügt man von Zeit zu Zeit etwas Ammoniak zu, um die Flüssig- keit neutral zu erhalten). Der Sirup liefert beim Stehen Asparaginkristalle, letztere können durch Tyrosin, Vernin oder Allantoin verunreinigt sein, falls diese Substanzen neben Asparaginen in den Extrakten sich vorfanden. Tyrosin und Vernin lassen sich wegen ihrer Schwerlöslichkeit ziemlich leicht vom Asparagin trennen; die Trennung des Asparagins vom Mantoin läßt sich am besten durch Fberführung in das in Wasser sehr schwer lösliche Asparaginkupfer bewerkstelligen. In jedem Falle müssen die Asparagin- kristalle durch Umki'istalhsieren gereinigt werden. Die Asparaginkristalle sind leicht zu identifizieren. Beim Erhitzen auf 100'^ werden sie weiß und undurchsichtig und verlieren 12<'/o an Gewicht. Beim Kochen mit verdünnter Natronlauge entwickeln sie Ammoniak. Aber auch beim Erhitzen mit stark verdünnter Salzsäure oder Schwefelsäure werden sie unter Ammoniakbildung zersetzt. Dies läßt sich nachweisen, indem man die mit verdünnter Säure erhitzte Lösung nach dem Abkühlen mit Natronlauge neutralisiert und sodann Neßler&ches Reagenz zusetzt. Eine wässerige Asparaginlösung löst in der Wärme Kupferhydroxyd. Aus der tiefblauen Flüssigkeit scheidet sich beim Erkalten kristallinisches Asparagin- kupfer ab. Diese Verbindung läßt sich auch durch Erhitzen der Asparagin- lösung mit Kupferacetat erhalten. Das Asparagin läßt sich auch mikrochemisch nachweisen. Wenn man asparaginhaltige Pflanzenteile in iVlkohol legt, so scheiden sich in den Zellen Isolierung von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. 513 Asparaginkristalle ab, die an ihrem Aussehen und an einigen anderen Eigen- schaften erkannt werden können. Obwohl das Glutamin ziemlich schwer löslich in kaltem Wasser ist (1 Teil bedarf bei Zimmertemperatur 25 Teile Wasser zur Lösung-), so ge- lingt es doch nicht, dieses Amid durch Kristallisation aus den zur Sirnp- konsistenz eingedunsteten Pflanzensäften direkt zu gewinnen; man kann es aber leicht mit Hilfe von Mercurinitrat zur Abscheidung bringen. Man verfährt dabei ganz ebenso, wie es oben für das Asparagin angegeben ist. Da das Glutamin beim Kochen mit Wasser leichter zersetzt wird als das Asparagin, so empfiehlt es sich, die glutaminhaltigen Lösungen, die man bei Zerlegung der Mercurinitratniederschläge erhält, in gelinder Wärme einzudunsten. Man befreit die aus diesen Lösungen erhaltenen Glutamin- kristalle mit Hilfe einer Tonplatte von der Mutterlauge und reinigt sie sodann durch UmkristaUisieren aus warmem Wasser. Beim letzten Umkri- stallisieren kann man, um die Ausscheidung des Glutamins zu befördern, der Lösung Alkohol zusetzen. Das Glutamin labt sich sehr leicht vom Asparagin unterscheiden, da es im Gegensatz zu diesem in feinen, weißen Nadeln ohne Kristallwasser kristallisiert. Im übrigen gibt es die gleichen Reaktionen wie das Asparagin. Das in Wasser sehr schwer lösliche Glutaminkupfer, (G, Hg Na O.jg Cu, hat eine blauviolette Farbe. Zum sicheren Nachweis des Glutamins kann man das freie Glutamin oder das Glutaminkupfer der Analyse unterwerfen. Au(;h die Überführung des Glutamins in Glutaminsäure, C4H9N()4, kann dem gleichen Zwecke dienen. Wenn man das Glutamin bis zum Aufhören der Ammoniakentwicklung mit Barytwasser kocht, die Flüssigkeit sodann mit Hilfe von Schwefelsäure vom Baryt befreit und nun stark einengt, so scheiden sich bald Kristalle von Glutaminsäure aus. Hin und wieder treten Asparagin und Glutamin nebeneinander in einer Pflanze auf. Die bei Zerlegung des Merkurinitratniederschlags er- haltene Lösung liefert dann in der Regel zuerst Asparaginkristalle, wäh- rend das leichter lösliche Glutamin sich erst später ausscheidet. Aus einem Gemenge von Asparagin- und Glutaminkristallen kann man die letzteren durch Abschlemmen mit Hilfe der Mutterlauge bis zu einem gewissen Grade von den weit größeren Asparaginkristalleu trennen. Daß in solchen Lösungen Mischkristalle entstehen, die zugleich Asparagin und (Jlntamin enthalten, ist bis jetzt nicht beobachtet worden. Quantitative Bestimmung des Asparagins und des Glutamins. B. Sachsses^) Verfahren zur (puintitativeu Bestimmung des Aspara- gins gründet sich auf die Tatsache, daß dieses Amid beim Kochen mit verdünnter Salzsäure oder Schwefelsäure unter Wasseraufnahme nach der Gleichung 1) Journal für praktische Chemie. [2.] Bd. 6. S. 118. — Man vgl. auch die Ab- handlung von E. Schuhe. Ebenda. [2.] Bd. 31. S. 233. Abderhalden, Handbuch der biochemischen ArbeitRinethoden. II. 33 514 E. Schulze uiul E. Winterstein. in Asparaginsäure und Ammoniak zerfällt, wobei 132 Teile wasserfreies Asparagin 17 Teile Ammoniak liefern. Das Verfahren läßt sich auch zur : Bestimmung des Glutamins verwenden, da dieses Araid bei gleicher Be- handlung in Glut.'imiusäure und Ammoniak zerfällt, nach der Gleichung C3 H, NH.,<^:J^^j|{-^ + H.,() = C3 H, NH,<[jJ^J]J{ + NH3. wobei 146 Teile Glutamin 17 Teile Ammoniak hefern. Bei Ausführung des Verfahrens setzt man dem asparagin- oder gluta- minhaltigen Extrakt pro 100 «»^ ^ — 10 011^ konzentrierte Salzsäure oder 2V2 — •» t'*^^^ konzentrierte Schwefelsäure zu und kocht sodann ca. 2 Stunden lang am Rückflulokühler. Nach dem Erkalten wird die Flüssigkeit mit Natronlauge annähernd neutrahsiert und hierauf unter Zusatz von Magnesia der Destillation unterworfen; das übergehende Ammoniak fängt man in titrierter Säure auf. Es ist zweckmäßig, das Austreiben des Ammoniaks durch Einleiten von ammoniakfreier Luft zu befördern oder die Destillation mit Magnesia im A'akuum vorzunehmen. Bei Berechnung des Asparagin- oder Glutamingehalts des Extrakts muß man sell)stverständlich das vor dem Erhitzen mit Säure schon vorhandene Ammoniak, dessen Bestimmung weiter unten besprochen werden soll, in x\brechnung bringen. Die für die Bestimmung zu verwendenden asparagin- und glutamin- haltigen Extrakte müssen von anderen, beim Erhitzen mit verdünnten Säuren ammoniakliefernden Substanzen so vollständig Avie möglich befreit werden. Proteinstoffe kann man durch Zusatz von reinem Tannin ent- fernen ; um die dadurch erzeugten Niederschläge besser al)filtrieren zu können, fügt man einige Tropfen Bleiacetat zu. Man kann zur Ausfällung der Proteinstoffe auch Phosphorwolframsäure verwenden; das Filtrat muß dann vor dem Erhitzen mit Säui'e von dem genannten Reagenz befreit werden, was durch Zusatz von Bleiacetat geschehen kann. Eine beim Kochen mit Säuren ammoniakliefernde Verbindung, die sich aus den Ex- trakten nicht entfernen läßt, ist das Allan to in; findet sich dasselbe neben Asparagin oder Glutamin in den Extrakten vor, so bedingt dies einen Fehler bei Ausführung der Bestimmungen. Da es möglich ist, daß manche Extrakte noch andere, bisher nicht isolierte Stickstoffverbindungen von gleichem Verhalten einschließen, so kann das beschriebene Verfahren eigent- lich nur als eine Methode zur Bestimmung der aus Amiden abspaltl)aren Ammoniakmeuge bezeichnet werden. Nur unter gewissen Voraussetzungen läßt sich aus dem Ergebnis die im Extrakt enthaltene Asparagin- oder Glutamiucjuantität genau berechnen. Finden sich Asparagin und Glutamin nebeneinander vor, so kann man, wie kaum gesagt zu werden braucht, den Gesamtgehalt des Extrakts an diesen beiden Amiden nur appro- Isolierung von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. 515 ximativ berechnen. In der Eegel findet sich aber bei gleichzeitigem Vor- handensein der beiden Amide das eine, entweder das Asparagin oder das Ghitaniin nur in sehr kleiner Menge vor; nur selten hat man beobachtet, daß beide nebeneinander in ansehnlicher Quantität auftreten. Die Darstellung der für diese Bestimmungen zu verwendenden Ex- trakte muß in solcher Weise geschehen, daß dabei eine Zersetzung: von Asparagin und Glutamin so vollständig wie möglich vermieden wird. Frischen Pflanzen oder Pflanzenteilen fügt man, nachdem sie zerrieben worden sind, etwas Wasser zu und erwärmt dann eine halbe Stunde lang auf mindestens 50" C ; getrocknete Pflanzen werden unter Hinzufügen einer etwas größeren Wasserquantität in der gleichen Weise behandelt. Bei stärkemehlfreiem oder an Stärkemehl sehr armen Objekten kann man die Flüssigkeit kurze Zeit bis zum Siedepunkt erhitzen; längeres Kochen ist wegen der Leicht- zersetzlichkeit des Glutamins zu vermeiden. Reagieren die Extrakte stark sauer, so fügt man Alkali zu, bis die Pteaktion fast neutral geworden ist. Als Extraktionsmittel statt des Wassers stark verdünnten Weingeist an- zuwenden, scheint keinen Vorteil darzubieten. Bestimmung des Ammoniakgehalts der nicht mit Säure erhitzten Extrakte. Man unterwirft den Extrakt unter Zusatz von Magnesia der Destil- lation im Vakuum bei einer Temperatur von ca. 40'^ und fängt das ül)er- gebende Ammoniak in titrierter Schwefelsäure auf. Man kann sich dabei des durch eine Skizze auf S. 527 veranschauhchten Apparates i3edienen. C. Darstellung von Aminosäuren aus Pflanzen. Es ist nur selten möglich, aus den stark eingeengten Pflanzensäften Monoaminosäuren durch Kristallisation direkt zu gewinnen ; am leichtesten geUngt dies noch beim Tvrosin. Besser ist es, für die Darstellung dieser Stoffe weingeistige Pflanzenextrakte zu verwenden. Man extrahiert die getrockneten, fein zerriebenen Pflanzen und Pflanzenteile mehrmals mit kochendem 90 — 92Voigera Alkohol. Der Extrakt wird der Destillation unterworfen, der dabei verbliebene Piückstand mit Wasser l)ehandelt, die trübe Flüssigkeit mit Bleiessig versetzt. Der durch dieses Reagenz entstandene Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat mittelst Schwefel- wasserstoff vom Blei befreit und sodann zum Sirup eingedunstet. Enthält die Flüssigkeit Monoaminosäuren in nicht zu geringer Menge, so erhält man eine aus solchen Stoffen bestehende Ausscheidung, die häufig schon während des Eindunstens eintritt und dann meistens eine Haut auf der Oberfläche der Flüssigkeit l)ildet. Man bringt sie nach Verlauf von einigen Tagen zur Entfernung der dickflüssigen Mutterlauge auf eine Tonplatte und trocknet sie sodann im Exsikkator. 33* 516 E. Schulze und PI Winterstein. Das in dieser Weise gewonnene Rohprodukt kann Tyrosin, Phenyl- alanin, Leucin, Isoleucin, Valin und einige andere Monoaniinosäuren enthalten, schUeßt aber hin und wieder auch Asparagin in kleiner ]\Ienge ein. Die genannten Stoffe sind zwar in reinem Zustande wenig löslich in Alkohol, lösen sich aber, wenn sie im Gemenge mit anderen Pflanzen- bestandteilen sich vorfinden, in kochendem 90 — 92o/oigem Weingeist ziemlich leicht auf; dies gilt selbst für das Tyrosin, welches in reinem Zustande sich gar nicht in Alkohol löst. Nachdem dieses Pvohprodukt zerrieben worden ist, übergießt man es mit Alkohol, erhitzt letzteren bis fast zum Sieden und fügt dann konzentrierte i\.mmoniakflüssigkeit in kleinen Anteilen zu. Die Mono- aminosäuren lösen sich in dem heißen Gemisch von Alkohol und Ammoniak- flüssigkeit teils leichter, teils schwieriger; am schwersten löst sich darin das Tyrosin. Letzteres bleibt daher größtenteils zurück, wenn man das genannte Gemisch nicht in großem Überschuß anwendet und das Erhitzen nicht zu lange fortsetzt; das gleiche gilt auch für etwa beigemengtes Asparagin. ^lan trennt die weingeistige Lösung von dem aus den genannten Stoffen bestehenden Rückstände und überläßt sie in einem Becherglase unter einer Glasglocke über konzentrierter Schwefelsäure der Verdunstung, wobei die in Lösung gegangenen x\miuosäuren sich langsam in Kristallen abscheiden; diese Kristalle sind meistens farblos; sie werden, falls es nötig erscheint, unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels noch einmal umkristallisiert. Wie man das auf diesem Wege erhaltene Aminosäurengemenge weiter zu behandeln hat, das hängt von der Beschaffenheit der darin sich vorfindenden Stoffe ab. Besteht das Gemenge, wie es hin und wieder der Fall ist, vorzugsweise aus Phenylalanin und ^'alin, so erhitzt man seine wässerige Lösung mit Kupferhydroxyd. Der dabei zum Teil schon in der Wärme, vollständiger beim Erkalten entstehende kristallinische Niederschlag besteht vorzugsweise aus der Kupferverbindung des Phenyl- alanins, während die davon abfiltrierte tiefblaue Lösung vorzugsweise Valinkupfer enthält; diese Lösung liefert erst nach starkem Einengen eine kristallinische Ausscheidung. Das Phenylalanin läßt sich reinigen, indem man seine Kupferverbindung mittelst Schwefelwasserstoff zerlegt und die vom Schwefelkupfer abfiltrierte Lösung, nachdem sie stark ein- geengt worden ist, mit Kupferacetat erhitzt, wobei reineres Phenylalanin- kupfer sich ausscheidet. Enthält das Aminosäurengemenge auch Leucin in größerer Quantität, so kann man auf dem angegebenen Wege das Phenyl- alanin meistens nicht rein gewinnen. Valin läßt sich vom Leucin trennen, indem man beide Stoffe in Kupferverbindungen verwandelt und letztere mit Methylalkohol behandelt, worin Leucinkupfer unlöslich ist, während VaUnkupfer sich löst. Doch kann man auf diesem Wege das Valin nicht vom Isoleucin trennen, da die Kupferverbindung des letzteren sich ebenfalls in Methylalkohol löst. Ein Gehalt jenes Gemenges an Tyrosin läßt sich wegen der Schwerlösüchkeit dieser Aminosäure in Wasser sowie in Eis- Isolierung von Aminosäuren, von Asparugin und (ilutaniin aus Pflanzen. ölT essig leicht erkennen; selbstverstäiidlieh können zu diesem Zweck auch die bekannten Tvrosinreaktionen dienen. Wenn man das in der beschriebenen Weise erhaltene Gemenge von Aminosäuren in genügender Quantität zur Verfügung hat, so empfiehlt es sich, nach der von E. Fischer gegebenen Vorschrift die Aminosäuren in Ester zu verwandeln und letztere der fraktionierten Destillation im Vakuum zu unterwerfen. Wie man dabei zu verfahi-en hat. brnuclit hier nicht näher angegeben zu werden: es kann auf die an anderer Stelle gemachten Angaben verwiesen werden. (Vgl. S. 470 ff.) Auch die Mittel, deren man sich zur Identifizierung der einzelnen Aminosäuren bedient, brauchen hier nicht besprochen zu werden. Wenn die weingeistigen Pflanzenextrakte neben Aminosäuren Kohlen- hydrate in bedeutender Quantität enthalten, so gelingt es in dci' Kegel nicht, aus den bei der Verarbeitung dieser Extrakte erhaltenen sirupösen Flüssigkeiten Aminosäuren durch Kristallisation zu gewinnen. Es ompfiohlt sich in diesem Falle, die in jenen sirupösen Flüssigkeiten enthaltenen Aminosäuren unter Befolgung der von /.'. Fischer gegebenen ^'orschl•ift in Ester zu verwandeln und letztere durch Destillation im \'akuum von den übrigen Extraktbestandteilen zu trennen. Tyrosin läßt sich aus Pflanzensäften und wässerigen Pflanzenextrakten auch durch Fällung mit Merkurinitrat zur Abscheidung bringen. Man ver- setzt jene Flüssigkeiten mit Bleiessig in schwachem Überschuß, entfernt die dadurch hervorgebrachten Niederschläge und fügt den Filtraten Mei-kuri- nitrat zu. Die durch dieses Pveagenz hervorgebrachten Fällungen können neben Asparagin. niutamin, Arginin usw. auch Tyrosin einschließen. Wenn man diese Niederschläge mittelst Schwefelwasserstoff zersetzt, die vom Schwefelquecksilber abfiltrierten Fhissigkeiten mit Ammoniak neutralisiert und sodann stark einengt, so scheidet sich das Tyrosin, falls seine (^)uan- tität nicht zu gering ist, in der Piegel vor den anderen Bestandteilen der Lösung in feinen Kristallen aus. L)och geht in die in solcher Weise durch Merkurinitrat erhaltenen Niederschläge stets nur ein Teil des im P^xtrakt vorhandenen Tyrosins ein. Man kann mehr Tyrosin erhalten, wenn man der vom Alei-kurinitratniederschlage abfiltrierten Flüssigkeit noch etwas Merkurinitrat und hierauf Natronlauge bis zum Eintreten einer schwach alkalischen Pveaktion zusetzt. Der in solcher Weise erhaltene Niederschlag wird dann zur Gewinnung des darin enthaltenen Tyrosins ganz eltenso behandelt, wie es oben für den zuerst dargestellten Niederschlag angegeben ist. Die zweite, unter Zusatz von Natronlauge erhaltene Fällung kann neben Tyrosin auch Leucin. unter Umständen aucli noch andere .\mino<äui-en. einschließen. fber die Anwendbarkeit des ß-NaphtalinsuIfochlorids zur Absclieidung von Aminosäuren aus Pflanzenextrakten läßt sich zurzeit ein bestimmtes Urteil nicht fällen, da darüber nur wenige Versuche gemacht wor- den sind. 518 E. Schulze und E. Winterstein. Darstellung von Arginin, Lysin und Histidin. Zur Darstellung dieser Basen aus Pflanzenextrakten verfährt man in folgender Weise: Der Extrakt wird mit Bleiessig in schwachem Überschusse versetzt, das Filtrat vom Bleiniederschlage bei neutraler oder schwach saurer Reaktion im Wasserbade stark eingeengt, dann mit Schwefelsäure stark an- gesäuert i), filtriert und nun mit einer konzentrierten Lösung von Phosphor- wolframsäure vermischt. Der dadurch hervorgebrachte Niederschlag wird nach längerem Stehen mit Hilfe eines Filters oder einer Nutsche von der Flüssigkeit getrennt und mit 57oiger Schwefelsäure gut ausgewaschen. 2) Dann übergießt man ihn mit Wasser und fügt unter Umrühren soviel zerriebenes Baryum- hydroxyd zu. daß letzteres im Überschuß vorhanden ist, was sich daran er- kennen läßt, daß im Filtrat beim Einleiten von Kohlensäure ein Niederschlag sich bildet. Ehe man die unlöslichen Baryumverbindungen abfiltriert, entfernt man das in der Flüssigkeit enthaltene Ammoniak. Dies darf nicht durch Erhitzen geschehen. Denn die in den Pflanzenextrakten durch Phosphor- wolframsäure erzeugten Niederschläge enthalten fast immer auch Kali. Wollte man nun die beim Zerreiben der Niederschläge mit Baryumhydroxyd und Wasser erhaltene Masse erhitzen, so würde durch das bei Einwirkung des Baryts aus dem Niederschlage frei gemachte Kali das Arginin zersetzt werden. jNIan muß also das Ammoniak ohne Anwendung von Wärme aus- treiben. Dies kann durch längeres Durchblasen von Luft erreicht werden. Rascher gelangt man zum Ziele, wenn man das Gemisch des Nieder- schlags mit Wasser und Baryumhydroxyd in eine flache Glasschale bringt und es sodann mit einem, durch eine Turbine getriebenen Rühr- werk behandelt, bis das Ammoniak abgedunstet ist; man beendigt diese Operation, wenn die Flüssigkeit nicht mehr nach Ammoniak riecht und wenn ein über ihr aufgehängtes feuchtes, rotes Lackmuspapier sich nicht mehr bläuet. Nach dem Austreiben des Ammoniaks entfernt man die unlöslichen Baryumverbindungen durch Filtration. In das Filtrat wird zur Entfernung des darin noch enthaltenen Baryumhydi'oxyds Kohlensäure eingeleitet. Nach dem Abfiltrieren des Baryumkarbonats neutralisiert man die Flüssigkeit mit Salpetersäure und engt sie hierauf im Wasserbade stark ein; wenn sie während des Eindunstens wieder alkahsch wird, so setzt man noch ein wenig Salpetersäure zu. Die in dieser Weise erhaltene Basenlösung gibt in der Regel mit Silberuitrat einen Niederschlag, der Alloxurbasen enthält. Aus dem Filtrat ') Man kann soviel Schwefelsäure zusetzen, daß die Quantität der letzteren bis auf 57o gesteigert ist. ^) Es ist z^Yeckmäßig, den Niederschlag nach dem Ablaufen des Filtrats iu einer i Schale mit 5%iger Schwefelsäure anzurühren und ihn dann wieder auf das Filter oder die Nutsche zu bringen. Isolierung von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. 519 fällt man unter Befolgung' der von Kossei und Kutscher'^) gegebenen Vor- schrift durch Silbernitrat und Barytwasser zuerst das His tidin, dann das Argini n aus (da diese Vorschrift an anderer Stelle mitgeteilt worden ist, so brauchen hier nähere Angaben über dieselbe nicht gemacht zu werden). Die ,,Histidinfraktion" des Niederschlags wird durch Schwefelwasser- stoff zersetzt. Aus der vom Schwefelsilber abfiltrierten Flüssigkeit sucht man durch Fällung mit Quecksilbersulfat nach der von Kossei und Patten'^) gegebenen Vorschrift reines Histidin zu gewinnen. Dies gelingt nicht immer: die ..Histidinfraktion" enthält häufig Nebenbestandteile, welche die Bein- darstellung des Plistidins sehr erschweren. Die ,,Argininfraktion'' des Niederschlags wird unter Zusatz von etwas Schwefelsäure durch Schwefelwasserstoff zersetzt. Man befreit das Filtrat vom Schwefelsilber, nachdem es im Wasserbade eingeengt worden ist, mittelst Baryumhydroxyd von der Schwefelsäure, leitet in das Filtrat zur Ent- fernung des überschüssigen Baryts Kohlensäure ein und dunstet die Flüssig- keit sodann im Wasserbade auf ein geringes Volumen ein. Nachdem sie durch Filtration von dem während des Eindunstens ausgeschiedenen B»aryum- karbonat befreit worden ist, neutralisiert man sie mit Salpetersäure und dunstet sie hierauf zum Sirup ein. Der Sirup liefert in der Regel bald Kristalle von x4rgininnitrat; häufig verwandelt er sich vollständig in eine Kristallraasse. Das Arginin kann durch Überführung in die schwerlösUche Verbindung mit Kupfernitrat gereinigt werden; man erhält diese Verbindung, indem man in die heiße wässerige Lösung des Nitrats Kupferkarbonat oder Hydroxyd einträgt. Bei der Identifizierung des Arginins stützt man sich, falls man nicht eine Analyse ausführen will, auf den Schmelzpunkt des Argininkupfernitrats (112—114") und auf die Eeaktionen des Arginin- nitrats. Das Filtrat vom Arginin-Silberniederschlage, welches neben Lysin noch andere Basen, z. B. Chohn, Betain und TrigonelHn. enthalten kann, wird durch Zusatz von etwas Salzsäure vom Silber befreit, dann mit Schwefel- säure neutrahsiert und im Wasserbade stark eingeengt. Hierauf fügt man Schwefels;! ure zu, bis der Gehalt davon etwa ö^/o beträgt, entfernt das Baryumsulfat durch Filtration und fügt nun eine konzentrierte Phosphorwolf- ramsäurelösung zu. Der dadurch erzeugte Niederschlag wird abfiltriert, mit 50/oiger Schwefelsäure gut ausgewaschen, dann durch Verreiben mit Baryum- hydroxyd und Wasser zerlegt. Die von den unlöslichen Baryumverbindungen abfiltrierte Lösung wird mittelst Kohlensäure vom Baryt befreit, dann mit Salzsäure übersättigt und eingedunstet. Den Verdampfungsrückstand trocknet man im ^'akuumexsikkator, dann behandelt man ihn zuerst mit kaltem, dann mit kochendem Alkohol. Die Chloride des Cholins, Betaiiis und Tri- gonelUns gehen in Lösung, während Lysinchlorid wenigstens zum grölUen ') Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitscbr. f. pliys. ( heni. lid. ;J1. S. 105 (1900). ^) Zur Analyse der Hexonbasen. Ebenda. Bd. 38. S. 39 (1903). 520 E.Schulze und E. Winterstein. Teile zurückbleibt (ein Teil dieses Salzes kann in Lösung gehen). Die zuerst genannten Chloride können aus der weingeistigen Lösung durch Merkuri- chlorid gefällt werden (cf. den nachfolgenden Abschnitt), während Lysin- chlorid in Lösung bleibt. Der größte Teil des Lysinchlorids wird sich in der Regel in dem bei der Behandlung mit Alkohol ungelöst gebliebenen Salzrückstand, der fast immer auch C'hloralkalien enthält, vorfinden; man kann es daraus durch Methylalkohol ausziehen. Am zweckmäßigsten ist es wohl, den lysinhaltigen Salzrückstand in Wasser zu lösen, die Lösung mit der von den Quecksilberdoppelsalzen des Cholins, Betains und Trigonellins abfiltrierten Mutterlauge zu vereinigen und sodann das Lysin durch Mer- kurichlorid und Barytwasser auszufällen. Man zerlegt den dabei erhaltenen Niederschlag unter Zusatz von etwas Schwefelsäure durch Schwefelwasser- stoff, fällt aus der vom Schwefehiuecksilber abfiltrierten Lösung das Lysin wieder durch Phosphorwolframsäure , zerlegt den Niederschlag mittelst Baryumliydroxyd und führt das in Freiheit gesetzte Lysin in bekannter Weise in das leicht kristallisierende Pikrat über. Aus dem Pikrat kann man, durch Schütteln dieses Salzes mit Salzsäure und Äther, Lysinchlorid darstellen. Zur Identifizierung führt man dieses Salz in das leicht kristalli- sierende Chloroplatinat über, welches 35"05"/o Platin enthält. Das Histidin läßt sich in manchen Fällen ohne Schwierigkeit ge- winnen, indem man die he\ Zerlegung des Phosphorwolframsäurenieder- schlages mittelst Baryumhydroxyds erhaltene Lösung, nachdem sie zuvor durch Einleiten von Kohlensäure vom Baryt befreit worden ist, mit einer wässerigen Merkurichloridlösung versetzt, die dadurch hervorgebrachte Fällung abfiltriert und sodann mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Die vom Schwefehpiecksilber durch Filtration getrennte Lösung Meiert beim Ein- dunsten in der Regel Kristalle von Histidinchlorid. Zur Identifizierung des Histidins bestimmt man den Silbergehalt des nach bekanntem Verfahren dargestellten Histidinsill)ers. Das Arginin kann aus den Pflanzenextrakten, nachdem letztere von den durch Bleiessig fällbaren Stoffen befreit worden sind, durch Merkuri- nitrat partiell gefällt werden, i) In die Merkurinitratniederschläge gehen, wie aus den oben gemachten Angaben hervorgeht, auch Asparagin und Glutamin, außerdem noch manche andere Stoffe (x\lloxurbasen, Vernin usw.) ein. Aus den bei Zerlegung dieser Niederschläge mittelst Schwefelwasser- stoff erhaltenen Lösungen läßt sich in manchen Fiillen Argininnitrat kri- stallisiert erhalten. Die Bedingungen für die Gewinnung dieses Salzes sind selbstverständlich nicht besonders günstig, wenn die bezüglichen Nieder- schläge reich an Asparagin oder Glutamin sind: doch kann man das Ar- gininnitrat vom Asparagin ziemUch leicht trennen, weil es sich in heißem Weingeist leichter löst, als das genannte Amid. Immerhin ist es weit zweckmäßiger, zur Darstellung von Arginin den zuerst beschriebenen Weg ') Ganz reines Argininnitrat wird durch Merkurinitrat nicht gefällt; gewisse Neben- bostandteile der Extrakte müssen also hier von Einfluß sein. Isolierung von Aminosäuren, von Asparagin und Glutamin aus Pflanzen. 521 (Ausfällimg durch Phosphorwolframsäure usw.) zu benutzen. Bei Anwendung dieses Verfahrens kann man auch den Arginingehalt der Extrakte wenigstens approximativ bestimmen, indem man das in oben beschriebener Weise erhaltene Argininnitrat wägt. Selbstverständhch sind aber die auf diesem Wege erhaltenen Zahlen etwas zu niedrig, da Substauzverluste nicht ganz zu vermeiden sind. Zur Bestimmung der Ausbeute kann man statt des Argininnitrats auch das aus letzterem dargestellte Argininkupfernitrat wägen. Doch ist darauf aufmerksam zu machen, daß durch das Vorhandensein von Bei- mengungen in manchen Fähen dieses Produkt am vollständigen Auskri- stallisieren verhindert wird. b) Isolierung Yon Clioliu, Betaiii und Trigonellin aus Pflauzeuextrakteu. Von E. Schulze und E. Winterstein, Zürich. Die in den Pflanzenextrakten durch Phosphorwolframsäure hervorge- brachten Niederschläge enthalten in sehr vielen Fällen auch Cholin, CsHisNO^; nicht selten wird dasselbe begleitet von Betain, C^HnNO^, oder von Trigonellin, C^H^NO^ (daß diese beiden Basen neben- einander auftreten, ist bisher nicht beobachtet worden ). Bei Verarbeitung jener Niederschläge nach dem im vorigen Abschnitt beschriebenen Ver- fahren gehen die genannten drei Basen neben dem Lysin in das Filtrat vom Argininsilberniederschlage ein. Wie oben angegeben ist, führt man die in diesem Filtrat enthaltenen Basen, nachdem sie wieder durch Phos- phorwolframsäure ausgefällt worden sind, in die salzsauren Salze über; die wässerige Lösung der letzteren wird eingedunstet, der Verdampfungsrück- stand nach völligem Austrocknen mit kaltem absoluten Alkohol behandelt, wobei vorzugsweise Cholinchlorid in Lösung geht; auf Zusatz von al- kohoüscher Mercurichloridsolution scheidet sich das Chohn fast vollständig in Form des in Alkohol fast unlöslichen Cholinquecksilberchlorids aus. Dieses Doppelsalz Avird unter Zusatz von etwas Mercurichlorid aus Wasser um- kristallisiert, dann mittelst Schwefelwasserstoff zerlegt. Die vom Schwefel- quecksilber abfiltrierte Lösung A\ird eingedunstet, der Verdampfungsrück- stand im Vakuumexsikkator vollständig ausgetrocknet, dann mit ganz wasserfreiem Alkohol in der Kälte behandelt. Die so erhaltene Lösung wird wieder eingedunstet, der Pdickstaud wieder in ganz wasserfreiem Alkohol aufgenommen. Dann führt man das Chlorid in das Chloroplatinat über, indem man seine alkoholische Lösung mit einer alkoholischen Platinchlorid- solution versetzt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird, nachdem er ab- filtriert und mit Weingeist gewaschen worden ist, in Wasser gelöst, die Lösung zur Kristallisation gebracht. Falls es nötig erscheint, wird das Produkt noch einmal aus Wasser umkristalhsiert. Bei der Zerlegung mittelst Schwefelwasserstoff liefert das Chlorplatinat reines, in zerfließlichen dünnen Prismen kristallisierendes Cholinchlorid. Zur Identifizierung des C'holins kann man den Platingehalt des Chloroplatinats oder den Goldgehalt des Isolierung von Cholin, Botaiii und 'irigonollin aus Pflanzenextrakten. ;')•>;.; aus dem Chloiid darg-estcllten Cliloraurats bostiuimcii; auch können iür diesen Zweck die Keaktionen des Chlorids zu Hilfe {•euonniicn wcKh-n. Don in kaltem absoluten Alkohol unlösliehen Teil des (icmenj^es der Chloride hchandelt man mit koehendcm *.);')" „i;.icn Alkohol, um Üctain- ehlorid und Trigonellinehlorid /u extraliieren. l)ie dabei ei-haltcm-n Lösun^n-n versetzt man mit einer alkoliolischeii Mercuriehloridsolution. Ik-tain und Trif^onellin scheiden sich in Form von (.Miccksillx'rdoppelsalzen aus. Das Trigonellimiuecksilberchlorid ist in Alkohol sehr wenig löslich, wiihi-cnd das Betainciuecksilberchlorid sich darin etwas nichi- löst; es empfiehlt sich daher, die von letzterem abfiltrierte Lösung- einzuengen, um das darin ent- haltene Doppelsalz noch größtenteils zu gewinnen. Heide Dopiiclsalzc wer- den unter Zusatz von etwas Mercurichlorid aus Wasser umkristallisieit, dann mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Die vom Schwefehiuecksilber ab- filtrierten Lösungen werden zur Kristallisation gebracht, die Kristalle, falls dies nötig erscheint, noch einmal aus Wasser umki'istallisiert. Zur Identifizierung des Betains stellt man das in lliiittchen und Nadeln kristalUsierende Chloraurat dar und unterwirft dasselbe der Ana- lyse. Selbstverstiindlich können behufs der Identifizierung auch die Keak- tionen des Chlorids zu Hilfe genommen werden. Auch bei der Identifi- zierung des Trigonellins ist die Lntersuchung der (rolddoppelsalze von Wichtigkeit. Versetzt man eine konzentrierte wässerige Lösung von IVi- gonellinchlorid mit Goldchlorid, so scheidet sich ein neutrales Chloi-aurat aus, welches aus Wasser unter Zusatz von etwas Goldchlorid umkristalli- siert werden kann, ohne eine Änderung in seiner Zusammensetzung zu erleiden; dieses Chloraurat schmilzt bei IW°. Wenn man dasselbe aus Wasser umkristallisiert, so verwandelt es sich in ein basisches >^n\/.. (Cy HyNOali (HCl Au Clgls, welches konstant bei 180 — ist)» schmilzt und 37-7 «/o Gold enthält. W'enn es sich darum handelt, aus einem Phosphorwolframsäure- niederschlage Cholin, Betain und Trigonellin zu isolieren, so ist es nicht erforderbch, zunächst die Alloxurbasen , das Arginin und das Histidin zu entfernen und erst das Filtrat vom Argininsilberniederschlage auf die i:e- nannten drei Basen zu verarbeiten: man kann das folgende kürzere \'er- fahren anwenden: Der Niederschlag wird durch \'eireiben mit l'.arvum- hvdroxvd und Wasser zerlegt, das Ammoniak in fridier beschriebener Weise ausgetrieben; dann entfernt man das phosphorwolframsaure Ilarvum durch Filtration, befreit das Filtrat durch Einleiten von Kohlensäure vom liaryt und übersättigt es sodann mit Sabcsäure. Die in dieser Weise er- haltene Lösung der Chloride wird eingedunstet, dei- Nerdampfnngsrück- stand getrocknet. Man kann diesen Rückstand zunächst zur Lösung des Cholinchlorids mit kaltem absoluten Alkohol, ilann zur Lösung von lletain- chlorid und Trigonellinchlorid mit kochendem ii:)" „igem Alkohol behandeln. Da aber in diesem Falle eine scharfe Trennung des Cholinchloiids von den anderen Chloriden nicht zu erzielen ist, so ist es ebenso be(|uem, jenen Rückstand direkt mit gSVoigt'"» Alkohol zu erhitzen und aus der 524 E.Scliulze und E. Winterstein. daboi erhaltenen Lösnng Cholin. Betain und Trigonellin durch Zusatz von alkoholischer Mercurichloridsolution zusammen zu fällen. Die in dieser Weise erhaltenen Quecksilberdoppelsalze werden aus heißem Wasser umkristalli- siert, AYobei man durch fraktionierte Kristallisation eine partielle Trennung des schwerer löslichen C'holinquecksilberchlorids von den anderen Queck- sill)erdoppelsalzen erreichen kann; dann werden sie mit Schwefelwasser- stoff zersetzt, die vom Schwefehiuecksilber abfiltrierten Lösungen einge- dunstet, die dabei zurückbleibenden Chloride im\'akuumexsikkator getrocknet. Diese Chloride behandelt man sodann, um das C'holinchlorid in Losung zu bringen, mit wasserfreiem Alkohol. Da das Betainchlorid und das Trigo- nellinchlorid darin zwar sehr schwer löslich, aber doch nicht ganz unlös- üch sind i), so behandelt man die Cholinchloridlösung in der oben schon angegebenen Weise; man dunstet dieselbe ein. trocknet den Rückstand im Vakuumexsikkator und nimmt ihn sodann wieder in wasserfreiem Alkohol auf; diese Operation wird, falls es nötig erscheint, noch einmal wieder- holt (selbstverständlich wendet man dabei nur soviel Alkohol an, als zur Lösung des Cholinchlorids eben erforderlich ist). Die bei der Behandlung mit Alkohol ungelöst gebliebenen Chloride des Betains und des Trigonehins werden aus Wasser umkristallisiert. Die »Schwerlöslichkeit der Quecksilberdoppelsalze des Cholins, Betains und Trigonellins macht es möglich, diese Basen auch ohne Anwendung von Phosphorwolfram säure aus den Extrakten zur Abscheidung zu bringen. Wenn man einen wässerigen, von den durch Bleiessig fällbaren Substanzen be- freiten Extrakt eindunstet, den Verdampfungsrückstand mit kocliendem 95"/oi"'pn Alkohol liehandelt und der in dieser Weise erhaltenen Lösung eine alkohohsche Mercurichloridsolution zufügt, so werden, falls Cholin, Betain und Trigonellin vorhanden sind, diese Basen als Quecksilberdoppelsalze gefällt; diese Doppelsalze können durch Umkristallisieren aus Wasser ge- reinigt werden. Doch ist dieses Verfahren zur Darstellung der genannten Basen weniger empfehlenswert als das vorher beschriebene (Fällung mit Phosphorwolframsäure usw. ). Man kann zur Darstellung der drei Basen auch alkoholische Extrakte aus Pflanzen oder Pflanzenteileu verwenden. Diese Extrakte werden ein- gedunstet, die Verdampfungsrückstände mit Wasser behandelt, die dabei erhaltenen trüben Flüssigkeiten mit Bleiessig versetzt, nach dem Allfiltrieren der Bleiniederschläge durch Schwefelwasserstoff von Blei befreit und schließ- hch eingedunstet. Die Verdampfuugsrückstäude behandelt man mit heißem Alkohol und versetzt die dalx'i erhaltenen Lösungen zur Fällung der ge- nannten Basen mit einer alkoholischen Mercurichloridsolution. Doch ist es keineswegs sicher, daß bei Behandlung getrockneter Pflanzen oder Pflanzen- teile mit kochendem Alkohol die genannten Basen vollständig in Lösung gehen; für das Cholin wenigstens ist bestimmt nachgewiesen worden, daß dies nicht immer der FaU ist. 1) Zeitsclir. f. pliysiol. Chemie. Bd. 00. S. 168 ff. (1909). Isolierung von Cholin, Bctaiii und Trigonellin aus Pflanzenextrakten. f,25 Zur ßestimnninii- der aus oinom Untersucliuuj'sobjcktc crlialtcucn Ausbeute au Cholin wägt mau das iu oben l)eschriebeiu'r Weise ciiialtcue Clioliuchlorid unter den erfordeiiichen Vorsichtsiuaüreiiclu (bcUauutlicIi ist dieses ISalz sehr hyi>T()sk()pis('li ). (iesctzt aber auch. (hUl mau zur (icwiuiiuufr des ChoHus das beste Yeri'aliren (^Fälliiui>' mit rhosphorwolt'ramsiiure usw.) verwendet und sorüfältii^' arbeitet, so sind doch kh'ine Substauzvcriuste uiclit zu vermeiden. Wenn aueh ans einer reinen, mit Schwefelsäure genüifend stark angesäuerten ('holiuchloridlösuni>' das Cholin diii'ch Phosiilidiwoltram- säure bis auf einen sehr geringen Rest gefällt wird"), so uiub mau doch annehmen, daß die Fällung der Hase aus l'flauzenextrakten infolge des Vorhandenseins anderer Kxtraktbestandteile eine weniger vollständige ist; auch durch Mercurichlorid wird die genannte IJase aus alkoholisciiei- Lösung nicht ganz vollständig gefällt. Mau hat daher anzunelnnen. dalJ die Aus- beute an Cholin hinter der im Untersuchungsobjekt vorhandenen Choliii- menge stets etwas zurückbleibt. Das gleiche gilt für die Zahlen, die mau bei Bestimmung der Ausbeute an Betain und Trigonellin erhält. Auch diese Bestimmung wird am besten in der Weise ausgeführt, dal) mau die zur Ausscheidung gebrachte Quantität von lietaiuchlorid und Tiigonclliu- chlorid wägt. Nach Stanek'^) kann man aus den Pflanzene.xtrakteu Cholin und Betain auch durch Kaliumper Jodid fällen. Nach der von Ä. Kiesel^) au.s- geführten Prüfung steht dieses Verfahren aber hinter dem gewöhnlich angewendeten an Brauchbarkeit zurück. Denn die dui'ch das Kaliumtrijodid in den Extrakten hervorgebrachten Niederschläge besitzen häufig eine (ilige, ihre Verarbeitung erschwerende Beschaffenheit und schliellen ferner neben Cholin und Betain in vielen P'ällen noch andere Stickstoffvei-binduugen ein. deren Trennung von den genannten lUisen beträchtliche Mühe verursacht. Nach Sfnneks Angaben kann sein \'erfahreu aber auch zur Trennung von Cholin und Betain benutzt werden, da die zuletzt genannte Base nur in saurer, das ChoHu dagegen auch in alkalischer Lösung durch das eben genannte Pieagenz gefällt wird. Darstellung aus den Bockshornsamen*) (Trigonella foenum graecum). Die gepulverten Samen werden mit TO^/oigom Weingeist ausge- zogen, der vom Alkohol durch Destillation befreite L]xtrakt wird mit Plei- essig unter Zusatz von Soda gereinigt. Das vom Blei befreite Filtrat winl ') In Yersnclien. die von fj. Schulze und G. Trier ausgefiilirt wiirdoii. gingen unter den oliou angegebenen Bediiigunireii zirka 97" „ des Cliolins in den riiospliorwcilfram- saureuiedcrschlag ein. Fast die gleielic Zalil ergab sich fiu- Betiiin un.l TrlL'unellin in Versuchen, in denen die Fallbarkeit dieser Hasen durch l'hosphorwolfninisiiure ge- prüft wurde. •^) Zeitschr. f. pliysiol. Chein. Bd. 4(). S. 280: Hd. 47. S. S3 un.l I?d. 4.S. S. 3;U. •') Ebenda. Bd. 53. 8.215. ■*) E. Jahns, Über die Alkaloide de;, Bockshornsaniens. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 2518 (1885). 526 E.Schulze und E. Wi uterstein. zum dünnen Sirup eingedunstet und die Basen durcli Jodkalium-Wismuth- jodid unter Zusatz von Schwefelsaure gefällt. Dieser Niederschlag enthält neben den Basen auch Eiweißstoffe, es ist daher wohl angezeigt, die Ex- traktion der Samen mit 957oigeii^ Alkohol in der Wärme vorzunehmen. Die mit Jodkalium-Wismuthjodid auftretende Fällung erfolgt nicht vollständig, erst nach längerem Stehen. Der entstandene Niederschlag ^ird mit Soda zersetzt, das vom Wismuthniederschlag getrennte Filtrat wird mit Schwefel- säure genau neutralisiert und dann mit soviel Quecksilberchloridlösung gefällt. l)is kein überschüssiges Jodnatrium mehr vorhanden ist und der entstehende hellgelbe Niederschlag einen rötlichen Ton annimmt. Die dabei auftretende Fällung schließt das Cholin ein, man filtriert ab, säuert mit Schwefelsäure an. wobei sich das Trigonellin-Quecksilberjodid in öligen, bald kristallinisch erstarrenden Tropfen ausscheidet. Aus der Mutterlauge können durch weiteres Konzentrieren und Zusatz von Quecksilberchlorid eventuell noch weitere Mengen davon erhalten werden. Aus dem Quecksilber- doppelsalz wird die Base in bekannter Weise erhalten. Staclij drill. Das Stachydrin, CVHihNO.,, welches bis jetzt nur in zwei Pflanzen- arteni) gefunden wurde, ist in seinem Verhalten dem Betain sehr ähnlich; es wird durch Phosphorwolframsäure gefällt und gibt mit ÖMerkurichlorid ein schwer lösliches Doppelsalz. Zu seiner Darstellung aus Pflanzenextrakten kann man ebenso verfahren, wie. es oben für das Betain angegeben worden ist. Da aber das salzsaure Stachydrin in kaltem al)Solutem Alkohol ziemlich löslich ist, so kann man es nicht scharf mit Hilfe dieses Lösungsmittels vom Cholin trennen; das genannte Salz läßt sich jedoch von dem in Wasser sehr leicht löslichen Cholinchlorid befreien , indem man es aus Wasser umkristallisiert und die dabei erhaltenen großen luftbeständigen Prismen durch Abpressen zwischen Fließpapier oder durch Aufbringen auf eine Tonplatte von der ^lutterlauge trennt. Auch kann man das Cholin aus einer alkalisch gemachten Lösung durch Kaliumtrijodid fällen, wobei das Stach}drin in Lösung bleibt. Zur Identifizierung des Stachydrins ist die Untersuchung seines Chlorplatinats zu empfehlen. Letzteres scheidet sich aus, wenn man die alkoholische Lösung des Stachydrinchlorids mit Platin- chlorid versetzt. Aus Wasser kristallisiert das Chloroplatinat bei langsamem Verdunsten der Lösung in großen rhombischen Kristallen, die von K. v. Haus- hofer-) gemessen worden sind; es enthält 27*94''/o Platin. Guauidin. Die in den Pflanzenextrakten durch Phosphorwolframsäure hervor- gebrachten Niederschläge können Guauidin, CH5N3, enthalten. Verarbeitet *) Es ist in den Wurzelknollen von Stachj^s tuberifera und in den Blättern der Orange gefunden Morden. •') Archiv der Pharmazie. Bd. 231. Heft 4. S. 310. Isolierung von Choliu, Betain und Trigonelliu aus rtlanzenextrakteu. 527 man solche Niederschläge in der oben beschriebenen Weise, so kann das Guanidin partiell in den durch Silbernitrat und Barytwasser erzeugten Argininsilberniederschlag- eingehen. Führt man das Arginin in die schwer lös- Hche Verbindung mit Kupfernitrat über, so bleil)t das Guanidin in dei- Mutterlauge; wenn man diese Mutterlauge mittelst Schwefelwasserstoff vom Kupfer befreit und sodann mit Natriumpikrat versetzt, so scheidet sich Guanidinpikrat aus. Was den im Filtrat vom Argininsilberniederschlag- noch enthaltenen Teil des Guanidins betrifft, so kann man für seine Trennung vom Cholin. Betain und Trigonelliu den Umstand benutzen, daß das Guanidin in alko- Fig. 43. a "Waschflasche mit verd. Schwefelsäure, h Wasserbad mit Destillationsknibon, in welchen das gepulverte Material mit Hilfe eines auf den Boden des Koll)ens reichenden Trichters eingefüllt wird, c Kühler mit dem Absorptionsgefäß direkt verbunden, d Absorptions- ge£üß mit i/jo N. -Schwefelsäure, e Vakuurameter. / Sicherheitsflasche mit der Wasser- stralilpumi^e verbunden. holischer Lösung durch Merkurichlorid nicht gefällt wird. NOm Lysin- chlorid hißt sich das in Alkohol leicht lösliche Guanidinchlorid mit Hilfe dieses Lösungsmittels trennen. Bei der Identifizierung des Guanidins kann die Darstellung- und Untersuchung seines Chloraurats gute Dienste leisten. Aus etioherten Keimpflanzen von Vicia sativa konnte Guanidin isoliert werden, indem man einen weingeistigen Extrakt aus den getrockneten Pflänzchen eindunstete, den Verdampf ungsrückstand mit Wasser behan- delte, die mittelst Bleiessig gereinigte Lösung mit Bhosphorwolframsäure versetzte, den dabei erhaltenen Niederschlag mit Baryumhydroxyd zerlegte und die dabei gewonnene Basenlösung- mit Salpetersäure neutralisierte: diese 528 E.Schulze u.E. Win terstein. Isolierung v. Cholin etc. aus Pflanzenextr. Lösung lieferte beim Eiiidunsten Kristalle von Guanidinnitrat. Ohne Zweifel wird dieses Verfahren zur Isolierung des Guanidins nicht brauchbar sein, falls die genannte Base nur in sehr kleiner Menge sich vorfindet. Quantitative Bestimmung des Ammoniaks in pflanzlichen Organen. 2 — ?>g Substanz übergießt man mit ca. 100 cm^ Wasser in einem Frak- tionierkolben, füUt mit Hilfe eines breiten bis auf den Boden des Kolbens reichenden Trichters gut gewaschene Magnesia und destilliert im Vakuum etwa 80 c»/ 3 Flüssigkeit ab. Um das Aufschäumen zu verhindern, fügt man 1 — 2 Tropfen filtriertes Butterfett hinzu. Die übergehende Flüssigkeit wird in einer mit 10 cw?^ Ygii-Schwefelsäure versehenen Vorlage aufgesammelt. Sind die Extrakte bzw. ist das Gemisch mit Wasser stark sauer, so neutrali- siert man zuvor mit Soda. Die Einrichtung, wie sie Fig. 43 zeigt, hat sich bei uns sehr gut bewährt. Partielle Hydrolyse von Proteinen. Von Emil Abderhalden, Berlin. a) Isolierimg von Polypeptiden unter den Abbau- prodnkten der Proteine. Die zur Isolierung von Polypeptiden unter den Abbaupro- dukten der Proteine') bisher angewandten Methoden sind dreierlei Art. Die eine stützt sich auf die Eigenschaft der Ester der Dipeptide. nament- lich der aus den einfachen Aminosäuren aufgebauten, leicht in das 2-5-Di- ketopiperazin überzugehen. Eine zweite Methode beruht auf der Dar- stellung schwer löslicher Derivate von Polypeptiden, wie z.B. der ß-Naphtalinsulfoverbindung, und ein dritter AVeg ist die direkte Isolierung der Polypeptide selbst. Die Isolierung von Dipeptiden mit Hilfe von deren Ester und den daraus darstellbaren Anhydriden war bis jetzt am erfolgreichsten. Der Gang einer derartigen Untersuchung ist folgender. Der zu untersuchende Eiweilikörper wird nicht mit Säuren gekocht, sondern mit diesen bei Zimmertemperatur oder höchstens bei HT*^ aufbewahrt. Zur Hydrolyse werden rauchende Salzsäure vom spez. Gew. DH) und TC/oige Schwefel- säure benutzt. Die Dauer der Einwirkung dieser Säuren ist je nach dem gewählten Protein eine ganz verschiedene. Es muß in jedem Einzelfalle durch einen direkten Versuch ausprobiert werden, welches die besten Versuchs- bedingungen sind, da auf diesem Gebiete jede Erfahrung fehlt. Nach (h'u gemachten Beobachtungen wird man dann die Dauer der Einwirkung der gewählten Säure, deren Konzentration und die Temperatur. i)ei (k-r die Hydrolyse vor sich gehen soll, bestimmen. So wurde z.B. gefunden, dal.i beim Seidenfibroin fünftägiges Stehen mit der sechsfachen Menge 7(,)"/'oig<'r Schwefelsäure bei 18" eine gute Ausbeute an Dipeptiden liefert. Wählt man andere \'ersuchsbedingungen , dann erhält man entweder wenig Dipeptide ') Emil Fiftchrr und Edu'I Abderhalden, Bildung eines Dipeptids liei der Hydro- lyse des Seideufiliroins. Berichte d. Deutschen ehem. tiesellsch. Jg. IVJ. S. 752. IDUü. — Bildung von Dipeptiden bei der Hydrolyse der Proteine. Ebenda. Jg. 39. S. 2315. 1906. — Bildung von Polypeptiden bei der Hydrolyse der Proteine. Ebenda. Jg. 40. S. 3544. VM)1. Abderh ;i 1 d i-n , Handbuch der biocheroischen Arbeitsmethoden. II. 34 530 E.Abderhalden. und gröliere Mengen komplizierter gebaute Produkte oder umgekehrt viele Aminosäui'en , wenn die Hydrolyse eine vollständigere ist. Hat man zur Hydrolyse Schwefelsäure gewählt, so wird diese quantitativ mit Baryt entfernt. Ist die Hydrolyse durch Salzsäure herbeigeführt worden, so wird deren Hauptmenge mit Kupferoxydul gebunden. Es lohnt sich in beiden Fällen, das ganze Gemisch von Spaltungsprodukten mit Phosphorwolfram- säure zu fällen und das Filtrat des Niederschlages für sich zu untersuchen. Es gehngt so bis zu einem gewissen Grade, die komplizierteren Produkte von den einfacheren zu trennen. Der Phosphorwolframsäureniederschlag wird mit Baryt zerlegt und aus dem Filtrat der Phosphorwolframsäure- fällung wird der Überschuß des Fällungsmittels mit Baryt, und dessen Überschuß mit Schwefelsäure genau entfernt. Zur w^eiteren Trennung der Abbauprodukte wird die Estermethode angewandt, und zwar wird die Ver- esterung in genau derselben Weise durchgeführt, wie es bei der Isolierung der Aminosäuren geschildert worden ist, mit der Ausnahme, daß hier die gasförmige, trockene Salzsäure unter Kühlung eingeleitet wird. ^lit ganz besonders großer Sorgfalt wird jede höhere Temperatur auch beim Ein- dampfen der alkoholischen, die Esterchlorhydrate der Abbauprodukte ent- haltenden Lösung ausgeschlossen. Das Verdampfen erfolgt bei 10 — Ibmm Druck imd einer 40" nicht übersteigenden Temperatur des Wasserbades, aus dem destilliert wird. Die Veresterung wird wiederholt, und schließlich werden die Ester mit der auf den Chlorgehalt berechneten ]\Ienge Xatrium, gelöst in Alkohol, in Freiheit gesetzt, und die Ester destilliert, und zwar bis lOO** des Wasserbades. Es gehen hierbei die Ester der ]\Ionoamino- säuren über, während die Ester der komplizierteren Spaltprodukte und vor allem auch die Dipeptidester nicht destillieren. Um noch die erst bei höherer Temperatur siedenden Aminosäureester zu entfernen, wird der Destillationsrückstand mit trockenem Äther ausgeschüttelt, und dann der ungelöste Piückstand in Alkohol gelöst. Beim Stehen scheiden sich bald aus dem Alkohol Substanzen ab, zum Teil in kristallisiertem, zum Teil in amorphem Zustand. Es sind dies die Anhydride, die sich aus den Dipeptid- estern bilden. Ihre Entstehung kann durch Erwärmen der Lösung und vor allem durch Einleiten von Ammoniak beschleunigt werden. Im alluemeinen empfiehlt es sich, die Anhydride durch einfaches Stehenlassen zur Ab- scheidung zu bringen. Auf diesem Wege gelingt es, die einfachen Aminosäuren, die Dipeptide und die komplizierter gebauten Produkte zu trennen. Durch eingehende Kontrollversuche wurde die Bildung der beobachteten Anhydride aus den Aminosäureestern ausgeschlossen. Sie stammen unzweifelhaft von im Hydro- lysat vorhandenen Dipeptiden. Die eben geschilderte Methode zum Nachweis von Polypeptiden hat zwei Nachteile. Einmal ist sie nur auf Dipeptide anwendbar und dann ergibt sie nicht, welches Dipeptid in Wirklichkeit bei der Hydrolyse ent- standen ist. Wird z. B. Glycyl-d-alaninanhydrid isoUert, so bleibt die Frage offen, ol) dieses aus Glycyl-d-alanin oder aus d-Alanyl-glycin entstanden ist. Isolierung vou Polypeptiden unter den Abbauprodukten der Proteine. 53^ Es läßt sich in diesem Falle nur aussagen, daß ein aus Glykokoll und d-xVlanin bestehendes Dipeptid aufgefunden worden ist. Wird zur Isolierung von Polypeptiden ß-Naphtalinsulfochlorid angewendet, so wird in genau der gleichen Weise vorgegangen, wie bei der Darstellung von fi-Naphtalinsulfoderivaten der Aminosäuren (vgl. S. 405). Die ß-Naphtalinsulfoverbindungen der Polypeptide haben noch eine ganz besondere Bedeutung durch die Beobachtung erlangt, daß es gelingt, bei der totalen Hydrolyse unter bestimmten Bedingungen die Polypeptidkette so zu sprengen, daß die Bindung der ß-Naphtalinsulfogruppe mit der Amino- säure erhalten bleibt. Wird z. B. ß-Naphtalinsulfo-glycyl-d-alanin mit lO^/oiger Salzsäure gekocht, so entsteht neben d-Alanin ß-Naphtalinsulfo-glycin. Bei Dipeptiden läßt sich auf diese Weise die Struktur feststellen, und bei höheren Polypeptiden kann man wenigstens die Stellung der mit dem ß-Naphtalinsulfochlorid reagierenden Aminosäure genau bestimmen. Kompli- ziertere Verhältnisse treten dann ein, Avenn Tyrosin am Aufbau eines Poly- peptids beteihgt ist. Es kann je nach seiner Stellung im Polypeptid eine oder zwei ß-Naphtalinsulfogruppen aufnehmen. Sehr schwierig gestaltet sich die direkte Isolierung von Poly- peptiden aus den Abbauprodukten einer partiellen Hydrolyse. Wir sind einstweilen auf tastende Versuche angewiesen. Bestimmte Hegeln lassen sich nicht angeben, i) In erster Linie wird man nach typischen Fällungs- reaktionen suchen. Sehr zweckmäßig wird zunächst eine Trennung der ver- schiedenartigen Abbauprodukte durch Phosphorwolframsäure herbeigeführt und dann mit Quecksilbersulfat (vgl. Tryptophan S. 487) auf tryptophan- haltige Produkte und mit Silbernitrat nach vorheriger Neutralisation mit Ammoniak auf Abbauprodukte, an deren Aufbau Glutaminsäure be- teihgt ist, gefahndet, ferner wird man Subhmat zum Nachweis histidin- haltiger Körper verwenden usw. Eine systematische Anwendung aller be- kannten Fällungsreaktionen gestattet wenigstens, das große Gemenge von Spaltprodukten in mehr einheitliche Gruppen zu trennen. Es wird wohl selten gelingen, ein komplizierteres Spaltprodukt direkt nach seinem Aufbau aufzuklären. In allen Fällen wird man ein isoliertes Produkt so lange reinigen und von Beimengungen trennen, bis es auf eine bestimmte Koml)i- nation von Aminosäuren passende Analysenzahlen gibt und auch das Molekulargewicht und das Resultat der totalen Hydrolyse in Einklang mit der angenommenen Verbindung steht. Mau wird dann versuchen , durch partielle Hydrolyse zu einfacheren Produkten zu gelangen und ferner vor allem auch den Verlauf des fermentativen Abbaus verfolgen. In letzter Linie sind wir auf die synthetisch dargestellten Polypeptide angewiesen und erst, wenn ein erhaltenes Produkt mit einem solchen in jeder Beziehung übereinstimmt, wird man von einem Abbauprodukt bekannter Art si)rechen dürfen. Hervorgehoben sei noch, daß in manchen Fällen die Einführung ') \g\. hierzAi Emil Abderhalden, Partielle Hydrolyse einiger Proteine. Zoitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 58. S. 386 (1909). 34* 532 E. Abderhaldeu. Isolierung v. Polypeptiden unter d. Abbauprod. d. Proteine. von Halogen, speziell von Jod oder Brom von großem Werte sein kann. So sind z. B. die jodierten tyrosinhaltigen Polypeptide in Wasser sehr schwer löslieh, ferner kann der Halogengehalt von Abbauprodukten einen Aveiteren Anhaltspunkt für die Molekulargewichtsbestiramung geben. In manchen Fällen wird man zur partiellen Hydrolyse mit Vorteil Natron- resp. Kalilauge und noch besser gesättigte Barytlösung anwenden. Im letzteren Falle läßt sich der Baryt leicht quantitativ mit Schwefelsäure entfernen, und man kann dann versuchen, durch Kristallisation oder durch Fällungsmittel zu geeigneten Produkten zu gelangen. Die Identifizierung der erhaltenen Verbindungen mit synthetisch dargestellten Polypeptiden stößt nur insofern auf Schwierigkeiten, als die durch Abbau mit Baryt erhaltenen Produkte entweder vollständig oder doch zum größten Teil razemisiert sind und gerade dem Drehungsvermögen eine sehr große Be- deutung bei der Feststellung der Art eines isolierten Körpers zukommt. In einem solchen Falle dürfte der Abbau durch Fermente eine Entscheidung bringen. So würde z. B. bei der Auffindung eines aus Glykokoll und dl-Alanin bestehenden Dipeptids die Frage, ob Glycyl-alanin oder Alanyl-glycin vor- liegt, dadurch zu beantworten sein, daß man eine Lösung des optisch inaktiven Dipeptids mit Erepsin spaltet. Es wird nur diejenige Kombination von Aminosäuren gespalten, die den in der Natur vorkommenden Kompo- nenten entspricht, d. h. die Spaltung erfolgt asymmetrisch. Wir würden also entweder Glycyl-1-alanin resp. 1-Alanyl-glycin übrig behalten. Das Vor- handensein der einen oder anderen Verbindung müßte sich an der Art und dem (xrade des Drehungsvermögens der Lösung des Dipeptids nach erfolgter asymmetrischen Spaltung kundgeben.^) 1) Vgl. hierzu: Emil Abderhalden; Weiterer Beitrag zur Kenntnis der bei der partiellen Hydrolyse von Proteinen auftretenden Spaltprodukte. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 61 (19U9). b) Isolierung a oii Peptonen. Von M. Siej^fried, Leipzig. 1. Definition der Peptone. Peptone sind Säuren, welche bei der Einwiikiiii^- von protcoh tischen Fermenten auf Proteinkörper entstehen, durch Animoniumsultat unter keinen BedinfTungen aussalzbar sind und durch siedende Mineralsäuren unter llil- dung- von Aminosäuren gespalten werden. 2. Darstellung von Peptonen. Es kommen hier nur Methoden in Betracht, welche Peptone als soldie darstellen lassen. Da die älteren Verfahren der Fällung durch Alkohol nach Entfernung der durch Ammonsulfat fällbaren Substanzen unzulänulich sind, ist nur die „Eisenmethode" M zu liesprcchen. Beispiel I. Darstellung von Pepsinglutinpepton.-i A. Herstellung der Verdauungslösung. Als Ausgangsmaterial ist die reinste Gelatine des Handels, d. i. die aus Häuten hergestellte, sogenannte Ledergelatine, der ersten Abkochungen zu verwenden. Diese Sorten besitzen das größte Gelatinieruiigsvennögen und geben fast klare, wässerige Lösungen von selbst 20% <'elatine. (Eine solche Gelatine ist die von der Firma Theuerkanf und ^chcibnor. Leipzig, käufliche' Marke: Gelatina alba 00.) 1 l-g Gelatine wird in ca. 8 l kaltem Wasser über Xaclii iiuellcn ge- lassen, das Wasser wird abgegossen und noch 2mal erneuert. Nach Abgielien des letzten Waschwassers wird die gequollene Gelatine auf dem Wasserliade erwärmt, wodurch eine Lösung entsteht, die zu einem \ (dum von ca. lö/ mit Wasser verdünnt wird. Der Lösung wird soviel CIA:^ cw^) 2öVoiger Salzsäure zugefügt, daß die Konzentration an HCl 0-4«/ o beträgt. Die Lösung wird auf Körpertemperatur gebracht und mit ör/ ..Pepsinum purissimunr* (Dr. G. Grübler) und 10 — loc/y/^^ Toluol vermischt. Die \ erdauung geschieht ^) M. Sicfifried, über Autipcpton. Zcitsclir. f. pliysiol. Cheni. Bd. .'Jö. S. 1()4 (r.t02). -) W. Scheermesser, Über ropsiiifrlntiupoptoii. Zeitscbr. f. piivsitil. ( bt-iii. Bil. 41. S. 68 (190-4) und M. Siegfried und //. Schmit:, nocb nicht verüffcutlidit. 534 M.Siegfried. am besten in einem Yerdammg'sai)parate, der mit einem durch einen Elektro- motor getriebenen liührwerk versehen ist; in Ermanglung eines solchen in einem Glaskolben, der sich in einem Wasserbade von 40° oder in einem Verdauungsschrank befindet und tägUch mehrere Male umgeschüttelt wird. Ist das Gefäß nicht vollständig verschlossen, so werden täglich von neuem 10 — 15 cm3 Toluol zugegeben. Nach je 5 Tagen werden ^neder hg Pepsin zugefügt. Sobald das Verdauungsgemisch Kongopapier nicht mehr deutlich bläut (in der Regel nach 3 Tagen), wird soviel 27oige Salzsäure zugesetzt, daß die ganze Flüssigkeit O'o"/o HCl enthält. Ist die Reaktion auf Kongopapier \^ieder sehr schwach geworden (in der Regel nach 8 weiteren Tagen), so wird soviel 2°/oige Salzsäure zugefügt, daß die Konzentration der ganzen Flüssig- keit an HCl 0"2"/o beträgt. Nach abermaligem Verschwinden der Kongo- reaktion (in der Regel nach weiteren 12 Tagen) wird die Flüssigkeit durch Zusatz 2Voig'er Salzsäure O'lVo HCl-haltig gemacht. Die Maximalausbeute an Pepton wird gewöhnlich nach oOtägiger Ver- dauung erhalten. Da sie aber von der Qualität des Pepsins abhängig ist, wird die Bildung des Peptons in folgender Weise kontrolliert: B. Kontrolle der Verdauung. Von Zeit zu Zeit, nach Stägiger Verdauung beginnend, werden der Verdauungsflüssigkeit oOcm^ entnommen, mit kristallisiertem AmmonsuUat gesättigt, mit wässeriger Ammoniaklösung, die mit Ammonsulfat gesättigt ist, neutraüsiert und filtriert. Vom Filtrate werden je 10 cm^ mit einer Lösung von folgender Zusammensetzung titriert: 10 g Ferriammoniumsulfat, 200 g Ammoniumsulfat, 250 5^ Wasser. Diese Lösung wird aus der Bürette zugesetzt, bis keine Fällung mehr entsteht und die Tüpfelprobe mit Rhodankalium gerade das Vorhandensein von Ferriionen erkennen läßt. Die ]\Ienge der verbrauchten Titerlösung ist proportional der Menge des vorhandenen Peptons. C. Isolierung des Peptons. Nimmt die Menge des gebildeten Peptons bei weiterer Verdauung nicht mehr zu, so Avird die Verdauungsflüssigkeit bei 40° mit kristallisiertem, asche- und Cl-freiem Ammonsulfat gesättigt. Es werden ca. i:-) l-g dieses Salzes gebraucht. Nach dem Erkalten wird filtriert, das Filtrat geprüft, ob es auf Zusatz von ammonsulfatgesättigtem, wässerigem Ammoniak eine Aus- scheidung gibt. Ist dies der Fall, so wird die ganze Lösung mit ammonsulfat- gesättigtem Ammoniak versetzt, bis keine Trübung mehr entsteht. Ferner wird geprüft, ob ammonsulfatgesättigte, verdünnte Schwefelsäure eine Fällung gibt. Ist dies der Fall, so wird so lange mit ammonsulfatgesättigter Schwefel- säure versetzt, bis kein Niederschlag mehr entsteht. Isolierung von Peptonen. 535 Ist in keiner Weise mehr eine Albunioseausscheidun^' zu erreichen, so Avird das ganz klare Filtrat mit ammorisulfatgesättigtem Ammoniak neu- trahsiert und in dasselbe so lange unter ständigem llühren feingepulvertes Ferriammonsolfat eingetragen, bis eine filtrierte Probe mit ammonsulfat- gesättigter, wiisseriger Ferriammonsulfatlösung keine Fidlung. sondci-n mit I{hodankaliundösung eine schwache liotbraunfiirbung gibt. Es werden ca. 100 (/ Eisenammoniakalaun gebraucht. Der Niederschlag wird auf der Nutsche zunächst ohne Ansaugen filtriert , dann al)gesaugt und mit ge- sättigter Ammonsulfatlüsung chlorfrei gewaschen. Zur Entfernung derletzten Albumosereste wird derNiederschlagfolgender- maßen umgefäUt: Der Niederschlag wird mit 2 1 Wasser gut verrieben, wobei er sich fast vollständig löst. Hierauf wird erst wenig wässeriges Ammoniak zugegeben, wodurch eine klare Lösung eintritt, und hierauf ca. 50 crn^ konzentrierten (20Yü); wässerigen Ammoniaks. Hat sich das gebildete Eiseuoxydhydrat ab- gesetzt, wird filtriert und der Niederschlag mit Wasser ausgewaschen. Das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wird mit Schwefelsäure neutralisiert und bei 40" mit Ammonsulfat gesättigt. Das Filtrat der erkalteten Lösung wird so lange mit ammonsulfat- gesättigter, verdünnter Schwefelsäure vermischt, bis keine Trübung mehr entsteht. Nach Absetzen der ausgeschiedenen Albumosen wird filtriert und das Filtrat geprüft, ob es mit ammonsulfatgesättigtem Ammoniak eine Fällung gibt. Ist dies der Fall, so wird das Filtrat solange mit ammonsulfatgesättigtem Ammoniak vermischt, bis keine Trübung mehr entsteht, und wieder filtriert. Wenn sich nur geringe Mengen Albumosen ausscheiden, was nament- hch oft bei der durch Schwefelsäure bewirkten Ausfällung der l''all ist, so lassen sich diese schwer filtrieren, da sie die Filter verstopfen. Man hilft sich durch folgenden Kunstgriff: Schnitzel von Filtrierpapier werden in gesättigter Ammonsulfatlösung ausgekocht und in der durch ausgeschiedene Albumosen trüben Flüssigkeit anhaltend verrührt. Die Albumosen haften dann an den Schnitzeln an, die Flüssigkeit wird klar und liißt sich leicht filtrieren. In die jetzt albumosefreie, ammonsulfatgesättigte Lösung, die durch ammonsulfatgesättigtes Ammoniak bzw. ammonsulfatgesättigte Schwefel- säure neutralisiert ist, wird wieder feingepulvertes FerriammonsuLfat ein- getragen, bis eine filtrierte Probe mit ammonsulfatgesättigter Lösung von Ferriammonsulfat keine Fällung, mit Rhodankalium eine schwache Ferrireak- tion gibt. Der entstandene Niederschlag wird abgenutscht, mit gesättigter Ammonsulfatlösung sorgfältig gewaschen und mit ca. 2 / Wasser und etwas Ammoniak bei 40" verrieben, wobei sich der Niederschlag zunächst löst. Hierauf wird unter stetem kräftigem llühren fein gepulvertes Haryt- hydrat (aschefrei ! Das gewöhnliche sogenannte reine Barythydrat ist nicht aschefrei) solange eingetragen, bis eine filtrierte Probe mich geringe SuM'at- reaktion gibt. Ein Überschub von Barythydrat ist zu vermeiden. Hierauf 536 M.Siegfried. saugt mau ab, wäscht deu Niederschlag gut mit Wasser aus uud gibt zu dem mit den Waschwässern vereinigten Filtrate kalt gesättigtes Barvt- wasser im geringen Überschusse. Hierauf wird filtriert und das Filtrat durch etwas Ammoniumkarl)onat vom Baryum befreit. Das Filtrat vom Baryumkarbonat wird im luftverdünnten Räume eingedampft, wobei die Temperatur der Flüssigkeit 40" nicht überschreiten soll. Das Niveau des Wassers, durch das der Siedekolben erwärmt wird, muß stets niedriger als das Niveau der Flüssigkeit im Kolben sein. Der erhalteue Sirup wird in ca. 40 cm^ Wasser gelöst. Zu der gemessenen Lösuug wird solange absoluter Alkohol gegeben, bis die zunächst entstehende Trübung beim Umschwenken el)en wieder gelöst wird. Diese Lösung wird tropfenweise in absoluten (99%) Alkohol, der beständig gerührt wird, ein- getragen. Dabei wird für je 15 on^ der wässerigen Peptonlösung (also auf das Volum vor dem Alkoholzusatz berechnet) 1 l Alkohol genommen. Das ausgefällte Pepton wird abgesaugt, mit 99°/oigem Alkohol und dann wasser- freiem Äther gewaschen und über Schwefelsäure im A'akuum getrocknet. Hierauf wird es umgefäUt, indem auf 10 (7 Pepton 20 cni'^ Wasser und 1 cm^ 25"/oiger Essigsäure zur Lösung genommen werden und diese mit 15 cm3 99"/oigeü Alkohols vermischte Lösung in 2 l 99o/oigen Alkohols ver- rührt werden. Es kommt häufig vor, daß das in Alkohol gefällte Pepton sich nicht völlig auch bei wochenlangem Stehen absetzt. Bisweilen wird dann das Absetzen dm'ch Zusatz einiger Tropfen Essigsäure erreicht oder durch Sieden im Vakuum. Am zweckmäßigsten verfährt man jedoch in einem solchen Falle so, daß man die trübe Lösung abgießt, zunächst den Niederschlag auf die Nutsche bringt und über diesem die trübe Lösung absaugt. Auf diese Weise läßt sich das Pepton, wenn auch langsam, vollständig absaugen. x\usbeute an umgefälltem Pepton : ca. 40 ^. Beispiel II. Darstellung von Trypsinfibrinpepton /. M A. Herstellung der Verdauungslösung.-) 8*7 kg in fließendem Wasser ausgewaschenes und abgepreßtes Blut- fibrin (aus Rinderblut) = ca. 1-7 kg trockenes Fibrin werden in ]o l Wasser, in dem 20 005" beträgt. Bisweilen kommt es vor, daß auch reine Peptone eine zu hohe Drehung besitzen. In diesem Falle be\^irkt das Berühren der Lösung mit einem in Essigsäure eingetauchten Glasstab das Zurückgehen der Drehung. b) Die Bestimmung des Baryumgehaltes des Baryumsalzes. Hierzu wird die zur Polarisation verwendete Lösung, vorausgesetzt, daß diese nicht mit Essigsäure berührt war, benutzt. Die Lösung wii-d mit etwas überschüssigem Barytwasser vermischt ; bei gewöhnlicher Tem- peratur wird Kohlensäure eingeleitet, bis Lackmuspapier eben noch alka- lisch reagiert, darauf wird schnell aufgekocht und filtriert, das Filtrat auf dem Wasserbade in gewogenem Platintiegel eingedampft, der Rückstand bei 70 — 80" bis zum konstanten Gewichte getrocknet. Man erhält so das Gewicht des Baryumsalzes. Hierauf wird verkohlt, mit Schwefelsäure ab- geraucht und aus dem Baryumsulfat das Baryum berechnet. cj Die Bestimmung des Quotienten ^^ bei der Carbamino- reaktion.2) CO Der Quotient -^ zeigt an, auf wieviel Atome Stickstoff des Peptons jS 1 Molekül Kohlensäure bei der Carbaminoreaktion aufgenommen wird. ]Man löst vom Trypsinfibrinpepton ca. O-'dg, vom Glutmpepton 1 // der im Trockenapparate bei ca. 70" bis zum konstanten (Jewichte ge- trockneten Substanz in ca. 160—200 cm^ Wasser. Zu der in Eiswasser ab- gekühlten Lösung gibt man einige Tropfen einer frisch bereiteten Lösung von Phenolphtalein in Kalkwasser und ca. 10 cnt'^ einer ebenfalls abüekiddten 1) M. Siegfried, ÜberKaseinokyiin. Zeitsclir.f. pliysiol.Clieniic Htl.43. S. 50 (l'.)04). 2) M. Sicf/fried und C. Ncummin, Über die Bindung von lü.liliMisiiurc diiirl» amphotere Aminokörper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 54. S. 424 (1908). 540 M. Siegfried. Kalkmilch (200^ Ätzkalk aus Marmor in II Wasser). Unter stetem Um- schwenken leitet man Kohlensäure ein, Ins die rote Farbe des Indikators fast verschwunden ist, gibt 10 cm^ Kalkmilch hinzu, leitet wieder, wie vorher, Kohlensäure bis zum ^'erblassen der roten Farbe ein, gibt wieder 10 cm^ Kalkmilch hinzu, leitet wieder, wie vorher, Kohlensäure ein und schüttelt nach weiterem Zusätze von ca. 20 cm^ Kalkmilch kräftig durch. Während des ganzen Versuches wird gut in Eiswasser gekühlt; als Reaktionsgefäß verwendet man vorteilhaft ein Pulverglas mit eingeschliffenem Glasstopfen. Hierauf wird auf einer kleinen Nutsche abgesaugt, das Filtrat, welches völlig klar sein muß, in einen ca. 11 fassenden Erlenmeyer übergeführt und mit ca. 300 cm ^ ausge- kochtem Wasser vermischt. Der Erlenmeyer wird sogleich mit einem Gummi- stopfen verschlossen, durch dessen Bohrung ein nach abwärts umgebogenes Natronkalkrohr geführt ist. Der Kolben wird zum Sieden erhitzt. Nach Er- kalten wird auf bei 120° getrocknetem, gewogenem Gooch- oder bequemer Neubauertiegel abgesaugt, hierbei der Kolben sorgfältigst mit einem Gummi- wischer von etwa anhaftendem Calciumkarbonat befreit. Nach Auswaschen mit kaltem Wasser wird der Tiegel bei etwa 120" getrocknet; die Gewichts- zunahme gibt das gesuchte Gewicht Calciumkarbonat. Das Filtrat vom Calciumkarbonat wird nach Zusatz von 20 cm^ kon- zentrierter Schwefelsäure und etwas Kaliumsulfat im Kjeldahlkolben ein- gedampft und schließlich unter Zusatz von Kaliumpermanganat fertig kjeldahlisiert. Man erhält so die gesuchten Kubikzentimeter Säure. CO Berechnung des Quotienten -~: CO 1 Setzt man den Quotienten -^ = -, so gibt x an, wieviel Atome Stickstoff des Peptons auf ein Molekül aufgenommener und beim Kochen abgespaltener Kohlensäure kommen. Die molekularen Mengen Kohlensäure und die atomistischen Mengen Stickstoff erhält mau zunächst durch Division der absoluten Mengen Calcium- karbonat durch sein Molekulargewicht und der absoluten Giengen des Stick- stoffs durch sein Atomgewicht, also: CO2 _ ^CaCOg: 100-1 _ g Ca CO3 : lOO'l ~N~ ~ ^ N : 14-1 ~ cm^ y'V-Säure x 0-00141 : 14-1 _ (/CaCOg: 100-1 ~ crn^ y\- Säure X O'OOOl Dividiert man Zähler und Nenner durch die molekularen ]\lengen CO2, CO., 1 so wird -^ = — und x gefunden durch den Bruch: N X cm^ y\- Säure x O'OOOl (/Ca 003:100-1 ■ Da es für die Genauigkeit der Berechnung genügt, das iMolekularge^icht des Calciumkarbonats = 100 zu setzen, so erhält man: Isolierung von Peptonen. 54J^ _ cm 3 -jP^- Säure x O'Ol ^ ~ ^CaCOg ■ Beispiel [0"3200(/ angewandtes Pepton]: Gefunden: CaCOs — 0-0805 cm^ j^-Smre = 19-8 X =: 2-46 dj Durch Reaktionen. 1. Die Peptone müssen auch nach dem Trocknen ganz khir in ge- sättigter Ammonsulfatlösung löslich sein. Diese Lösung darf nicht durch tropfenweisen Zusatz von ammonsulfatgesättigter verdünnter Schwefelsäure getrübt werden. 2. Die Peptone dürfen nicht beim Kochen mit Natronlauge unter Zu- satz eines Tropfens Bleiacetatlösung (bei Verwendung von mehr Bleiacetat ist die Probe weniger empfindlich) eine Braun- bzw. Schwarzfärbung geben. c) Methode zur Darstellung von Kyriuen. Von M. Siegfried, Leipzig. 1. Definition der Kyrine. Kyrine sind intermediäre Eiweißspaltiingsprodukte , die durch Ein- wirkung von Säuren auf Proteinkörper oder Peptone entstehen, von aus- gesprochenem basischem Charakter. 2. Darstellung von Kyrinsulfat.O Beispiel: Darstellung von Kaseinokyrinsulfat. O'ö g (fast) fettfreies Kasein nach Hammarsten von E. Merck in Darmstadt werden in einer 5— 6 1 fassenden Glasbüchse mit eingeschliffenem Stopfen mit 2-5 l 25Voig'er Salzsäure Übergossen, durchgeschüttelt und bei gewöhnlicher Temperatur 1 Stunde quellen gelassen. Darauf werden 2 / Wasser dazu gegeben. Die Büchse wird o Wochen in den Brutschrank ge- stellt; täglich wird mindestens einmal umgeschüttelt. Steht ein geeigneter Verdauungsapparat mit Rührwerk zur Verfügung, so wird die Zersetzung vorteilhaft in diesem vorgenommen. Nach 3 Wochen wird die Mischung filtriert, das Filter mit .3 l Wasser nachgewaschen; das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wird unter kräftigem Umrühren mit Phosphorwolframsäure gefiUlt, bis kein Nieder- schlag mehr entsteht. Es werden ca. 2 l-g Phosphorwolframsäure verbraucht, von der die erste Hälfte in ca. 10<'/oiger wässeriger Lösung, die zweite in ca. 30°/oiger Lösung zugesetzt wird. Die käufliche Phosphorwolframsäure ist vor der Verwendung nach Drechsel zu reinigen. Alan schüttelt die konzentrierte wässerige Lösung der Säure zunächst direkt, dann nach Zusatz 50%igNH + H/) = XH2 . CH, . CO . NH . CH, . CDOH. -^ ^ ^ • ^ ^^ Glycyl-glycin Glycinanhydrid Diese Methode zur Darstellung von Polypeptiden hat einen nur sehr beschränkten Wert. Einmal führt sie nur zu Dipeptiden, und dann macht die Aufspaltung der 2'5-Diketopiperazine der höheren Aminosäuren Schwie- rigkeiten. Ein weiterer tibelstand zeigt sich bei der Spaltung gemischter Diketopiperazine, d. h. von solchen Anhydriden, die zwei verschiedene Amino- säuren enthalten, wie das folgende Beispiel zeigt. Glycyl-alaninanhydrid .CH,. CO JI NH ^^NH )^C0 . C'H . CH, Glycyl-alaniu-anhydrid. entspricht zwei Dipeptiden, einmal Glycyl-alanin and ferner Alanyl-glycin. Beide können aus dem genannten Anhydrid entstehen, und zwar ersteres, wenn die Spaltung bei I erfolgt und letzteres, wenn sie bei II eintritt. In der Tat erhält man auch bei der Aufspaltung von Glycyl-alaninanhydrid sowohl (Tlycyl-alanin als auch Alanyl-glycin. also ein (Jemisch, das sich recht schwer trennen läßt. Zu dieser Schwierigkeit kommt noch hinzu, daü bei der Aufspaltung optisch-aktiver Anhydride durch Alkali die Gefahr einer teilweisen Ptazemisierung nicht ausgeschlossen ist. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 35 546 E. Abderhalden. In ihrer Anwendung einstweilen beschränkt geblieben ist eine zweite, anssichtsvoUe Methode, nämUch die Synthese von Polypeptiden mittelst der Ester. Sie gründet sich auf die auch bei den Estern der höheren Polypeptide noch vorhandene Neigung. Alkohol abzuspalten. "Wird z. B. der Methylester des Diglycyl-glycins auf 100° erwärmt, so erhält man den Methylester von Pentaglycyl-glycin und durch dessen Verseif ung das Hexa- peptid selbst. 2 NH^ . CH, . CO . NH . CH, . CO . NH . CH., . COOCH^ = CH3OH 4- XH, . CH. . CO . ( NHCHoCO )4 . XH . CH., . COOCH3. Die meiste Anwendung hat bis jetzt die folgende Methode zur Dar- stellung von Polypeptiden gefunden. Sie beruht auf der Kuppelung von Aminosäuren und von Polypeptiden mit Halogenacylverbin- dungen. Als einfachstes Beispiel dieser Art von Polypeptidsynthesen sei die Bildung von Glycyl-glycin aus Glykokoll und Chloracetylchlorid und nachträglicher Einwirkung von Ammoniak auf das zunächst entstehende Chloracetyl-glycin erwähnt. Cl . CHo . CO Cl + XH., . CH„ . CO OH = Cl . CH, . CO . XH . CH., . CO OH + HCl. Chloracetyl- Glycin Chloracetyl-glycin Chlorid Cl . CH, . CO . XH . CH, . CO OH + 2 XH3 = Chloracetyl-glycin XH, . CH, . CO . XH . CH, . CO OH + XH.Cl. Glycyl-glycin In ganz gleicher Weise lassen sich auch Dipeptide mit anderen Aminosäuren darstellen unter Anwendung der entsprechenden Halogeu- acylverbindungen, so dient zur Einführung von Alanyl Brompropionylljromid, zur Einführung von Leucyl y.-Bromisocapronylchlorid. zur Einführung von Phenyl-alanyl a-Brom-hydrozimtsäurechlorid , von Prolyl %. r^-Dibrom-valeryl- chlorid etc. In entsprechender Weise kann ein Dipeptid in ein Tripeptid und ein solches in ein Tetrapeptid etc. übergeführt werden. Es lassen sich auf diesem Wege lange Polypeptidketten mit den verschiedenartigsten Amino- säuren darstellen. Die genannte Methode hat auch dazu gedient, um optisch-aktive Polypeptide zu gewinnen. Am einfachsten liegt der Fall bei der Einfüh- rung von (Hycyl. Das entsprechende optisch-aktive Polypeptid wird durch Kuppelung der optisch-aktiven Aminosäure mit Chloracetylchlorid erhalten. Durch Einwirkung von Ammoniak entsteht dann das Dipeptid. So sind z. B. Glycyl-1-tyrosin und Diglycyl-cystin erhalten worden. Viel größere Schwierigkeiten bietet die Einführung von optisch-aktiven Halogenacylen. Diese werden aus optisch-aktiven Aminosäuren gewonnen. Die Methode der Synthese optisch-aktiver Polypei)tide mittelst optisch- aktiver Halogenacyle sei an einem Beispiel erläutert. Zur I)arstelluug Methoden zur Synthese von Polypeptiden. 547 von d-Alanyl-d-alanin werden d-Alanin und 1-Alanin verwendet. Letzteres wird aus dl-Alanin am besten nach der Methode von Ehrlich durch Ver- gärung mit Hefe dargestellt. Durch Einwirkung von Stickoxyd und I»rom erhält man aus 1-Alanin d-Rrompropionsäure. Diese läl)t sich nun leicht in das Chlorid verwandeln. Durch Kuppeluni;- von d-Alanin mit dem so erhaltenen d-Brompropionylchlorid erhält man zunächst d-Brompropionyl-d-alanin und hieraus durch Einwirkung von Ammoniak d-Alanyl-d-alanin. In ganz gleicher Weise lassen sich auch die meisten der übrigen Aminosäuren einführen. Verwendet man zur Spaltung der razemischen Aminosäuren nicht eine biologische Methode , wobei stets die in der Natur vorkommende Kom- ponente des Razemkörpers verloren geht, sondern eine chemische, z. B. die Spaltung der Formyl- oder Benzoylverbindung der razemischen Aminosäure mit Hilfe eines Alkaloidsalzes, dann kann man in vielen Fällen beide Kom- ponenten zur Synthese verwenden, und zwar die in der Natur vorkommende Komponente direkt und den Antipoden durch Überführung in die ent- sprechende Bromfettsäure mit Hilfe von Nitrosylbromid , nachfolgende Chlorierung und Kuppelung. Die folgende Übersicht soll die Synthese von d-Alanyl-d-alanin veranschaulichen : dl-Alanin Mit Hefe vergoren 1-Alanin + (NOBr) d-Brompropionsäure + (Thionylchlorid) d-Brompropionylchlorid + d-Alanin (aus Seide) d-Brompropionyl-d-alanin + (NH3) d-Alanyl-d-alanin. Durch die Methode der Synthese von Polypeptiden mittelst der Halo- genacylverbindungen ist es nicht möglich, die Polypeptidkette auf der Seite des Karboxyls zu verlängern, ein Umstand, der für die Darstellung vieler Kombinationen hindernd ist. Diese Schwierigkeit wurde durch die Beob- achtung Emil Fischers beseitigt, daß die Polypeptide resp. deren Halogen- acylverbindungen sich chlorieren lassen. So erhielt Emil Fischer bei der Behandlung von a-Bromisocapronyl-glycin mit Acetylchlorid und Phosphor- pentachlorid das entsprechende ' Chlorid : C^ Hg . CHBr . CO . NHCH, CüCl. 35* 548 E.Abderhalden. Diese Verbindung- läßt sicli nun mit den Estern von Aminosäuren und vor allem auch mit Polypeptiden kuppeln. Läßt man z. B. auf das genannte Produkt Glycin-ätlivlester einwirken, dann erhält man: C4 Hg . CHRr . CO . XHCH^ CO . XHCH^ COOC, H5. Nimmt man an Stelle des Glykokollesters Glycyl-glycinäthylester, so resultiert: C4 Hg . CHBr . CO . NHCH, CO . NHCH, CO . NHCH2 COOC2 H^. Beide Verbindungen lassen sich leicht verseifen, und durch Einwirkung von Ammoniak gelangt man dann zu den entsprechenden Polypeptiden, also in dem einen Falle zu Leucyl-giycyl-glycin und im anderen Falle zu dem Tetrapeptid Leucyl-diglycyl-glycin. Von ganz besonderer Wichtigkeit ist es, daß die Chlorierung auch bei den Aminosäuren selbst ausführbar ist. So ist es möglich, z. B. zwei optisch- aktive Aminosäuren ohne den Umweg über die entsprechende Bromfettsäure und deren Chlorierung zu kuppeln. d-Alanyl-d-alanin läßt sich nach dieser Methode aus d-Alanin in folgender Weise darstellen. d-Alanin wird mit Phosphorpentachlorid und Acetylchlorid in das Chlorid verwandelt und nun direkt mit d-Alaninester gekuppelt. Durch Verseifung des entstehenden Dipeptidesters wird sofort das freie und optisch-aktive Dipeptid erhalten. Im Anschluß an diese Übersicht der zur Synthese von Polypeptiden vorhandenen Methoden seien einige Beispiele i) angeführt. 1. Bildung von Dipeptiden durch Aufspaltung von Anhydriden. Die Darstellung von Diketopiperazinen ist bei den verschiedenen Aminosäuren eine verschieden leichte. Bei den einfacheren Aminosäuren genügt das Stehenlassen ihrer Ester. Besonders einfach ist die Gewinnung des Glycinanhydrids.2) Es werden zu seiner Darstellung z. B. 560 ^ Glykokoll- esterchlorhydrat in einem dickwandigen Becherglase mit 280 cm^ Wasser Übergossen. Das Gemisch wird in einer Kältemischung gut gekühlt. Nun werden unter kräftigem Turbinieren o20 cm^ IPöfach n-Natronlauge im Laufe von einigen Stunden zugetropft, wobei die Temperatur der Flüssig- keit nicht über — 5" steigen soll. Das Esterchlorhydrat geht allmählich in Lösung, während etwas Kochsalz ausfällt. Dann läßt man, nachdem die Lauge ganz eingetragen worden ist, die Flüssigkeit bei gewöhnhcher Temperatm* stehen. Schon nach einigen Stunden beginnt die Abscheidung von Glycinanhydrid. Nach 24 Stunden ist die Kristallisation gewöhnlich beendet. Man Idihlt nunmehr stark ab und nutscht den KristaUbrei ab. Das zugleich ausgefallene Kochsalz Avird durch Waschen des Filterrückstandes mit eiskaltem Wasser entfernt und nunmehr das rohe Glycinanhydrid aus ^) Sie sind alle den an Ort und Stelle zitierten Arbeiten von Emil Fischer ent- nommen und zum größten Teil wörtlich wiedergegeben. ^) Emil Fischer, Synthese von Polypeptiden, X^'. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 39. S. 930 (1906). Methoden zur Synthese von Polypeptiden. 54.9 der ßfachen Menge heißen Wassers unter x\nwendung von Tierkohle um- kristaUisiert. Ausbeute ca. 100 r/. Zur Aufspaltung des Glycin anhydrids verwendet man Alkali. ^ 1 r/ fein gepulvertes Glycinanhydrid wird mit 10 cm'^ n-Natronlauge (berechnet für 1 Mol. 8-8 cm^) bei gewöhnlicher Temperatur geschüttelt. Es geht rasch in Lösung und nach ca. 20 Minuten ist die Umwandlung in Glycyl-glycin vollzogen. Man neutralisiert nun mit 10 cm^ n-Salzsäure , dampft unter vermindertem Druck auf wenige Kubikzentimeter ein und läßt nun das Glycyl-glycin auskristallisieren. Erwähnt sei, daß man Glycin anhydrid direkt zur Kuppelung mit Halogenacylchloriden verwenden kann. Es spaltet sich während der Operation auf, und man erhält bei Verwendung von z. B. Chloracetylchlorid Chlor- acetyl-glycyl-glycin. Zur Isolierung mancher aus x\nhydriden gewonnenen Dipeptide wird mit Vorteil zur Neutralisation des Alkalis n-Jodwasserstoffsäure verwendet. Es gilt dies für Dipeptide, die in Wasser leicht löslich, dagegen in abso- lutem Alkohol unlöslich sind. Es wird dann nach dem Eindampfen der Flüssigkeit der Rückstand mit absolutem Alkohol ausgekocht und das ge- bildete Jodnatrium so entfernt. Zurück bleibt das reine Dipeptid in sehr guter Ausbeute. Wir haben schon hervorgehoben, daß diese Methode im allgemeinen zur Darstelkmg von Dipeptiden nicht sehr vorteilhaft ist. Ein ganz besonderer Nachteil ist vor allem der, daß die Anhydride der höheren Aminosäuren, so z. B. Leucinimid, nur sehr schwer aufspaltbar sind und ganz besonders muß hervorgehoben werden , daß optisch-aktive Anhydride bei der Auf- spaltung mit Alkali ganz beträchtlich razemisierte Dipeptide Uefern. 2. Synthese von Polypeptiden mit Hilfe von Halogenacylchloriden. a) Darstellung razemischer Polypeptide. Beispiel: dl-Leucyl- glycin.2) 10 ff GlykokoU werden in Vy,U-tn^ (1 Mol.) n-Natronlauge gelöst und unter kräftigem Schütteln abwechselnd 220 cm^ n-Natronlauge und 34 mm geht der allergrößte Teil zwischen 90 und 92° über. Es bleibt nur ein geringer, dunkelbrauner Bückstand. Umwandlung der d-Bromisocapronsäure in d-Bromiso- capronylchlorid. 25^ frisches und ganz rasch zerkleinertes Phosphorpenta- chlorid (1-2 ^lol.) werden in einem Gefäß mit Glasstopfen durch eine Kälte- niischung sorgfältig abgekühlt und dazu 20,r/ d-Bromisocapronsäure zugegeben. Es findet sofort eine lebhafte Entwicklung von Salzsäure statt. Später ist es nötig, die Masse V4 Stunde zu schütteln, zuletzt bei gewöhnlicher Tem- peratur, um eine vöUige Umsetzung herbeizuführen; dann kühlt man wieder stark, um den Überschuß des Phosphorpentachlorids in fester Form ab- zuscheiden, fügt jetzt das gleiche Volumen über Natrium getrockneten Äther hinzu, filtriert von dem Phosphorpentachlorid in einen Fraktionier- kolben, verdunstet den Äther unter 15—20 mm Druck und schließlich das Phosphoroxychlorid unter 0-5 mm Druck l)ei gewöhnlicher Temperatur. Das zurückbleibende d-Bromisocapronylchlorid wird schließlich bei demselben Druck destilliert. Bei 0-bmm Druck geht es bei 40—42» über. Das d-Bromisocapronylchlorid kann nun mit einer Aminosäure in genau der gleichen Weise gekuppelt werden, wie wir es bei der Synthese des dl-Leucyl-glycins geschildert haben. In ganz analoger Weise läßt sich aus 1-Alanin d-Brompropionsäure und daraus d-Brompropionylchlorid gewinnen.-) Die \ orschrif t für die Darstellung dieses Chlorids sei ihrer Wichtigkeit wegen kurz angeführt. 1) Emil Fiseli-;iktive a-Brompropionsäure. Lichir/s Aniuü. d. Chem. u. Pharm. Bd. 340. S. 123 1 19ü.')). Vi;]. ferner: Emil Fisclnr und Karl Jiaskc, Bcitra.sf zur Stereochemie der 2-ö-L)ilvetopipera- zine. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Jjj. 39. S. 3995 (190ü). 552 E.Abderhalden. Darstellung' von d-Brompropionylclilorid. hg 1-Alanin werden mit einem Gemisch von 55 cj konzentrierter Schwefelsäure und 15 cm^ Wasser übergössen und dazu unter Kühlung in einer Kältemischung 7'5 (7 Bronikali und 12,9 Brom gegeben. In das mit Eis gekühlte Gemisch leitet mau H Stunden einen kräftigen Strom von Stickoxyd, gibt dann Avieder 4 g Brom zu und setzt das Einleiten des Gases noch 2 Stunden fort. Um die Hauptmenge des Broms zu entfernen, wird Luft durch die Flüssig- keit geleitet und der liest des Broms durch Versetzen mit schwefUger Säure entfernt, dann die Brompropionsäure mit Äther ausgeschüttelt, die mit Chlorcalcium getrocknete ätherische Lösung verdunstet und der Rück- stand bei 0"1 mm Druck destilhert. Die Umwandlung der d-Brompropion- säure in das Chlorid erfolgt in der gleichen Weise, wie es oben für die d-Bromisocapronsäure beschrieben worden ist. 3. Darstellung der Chloride von Aminosäuren und von Polypeptiden und deren Verwendung zur Synthese.^ -j a) Chlorierung einer Aminosäure: Beispiel: Salzsaures Leucylchloridi), C^Hg .CHlNHg C1).C0C1. Beines l-Leucin^^) wird sorgfältig gepulvert, durch ein feines Siel) ge- trieben und völlig getrocknet, bg werden mit 100 c»?^ frischem Acetylchlorid in einem Glaszylinder von 2Q0cm^ mit gut schließendem Glasstöpsel Über- gossen, abgekühlt, dann 8<7(lMol.) frisches und rasch zerkleinertes Phosphor- pentachlorid zugegeben und 2 Stunden bei gewöhnhcher Temperatur auf der Maschine geschüttelt. Der Chlorphosphor verschwindet dabei vöUig, und die Aminosäure verwandelt sich in das salzsaure Chlorid, das die Flüssig- keit als sehr feiner, dicker, aber kristallinischer Brei erfüllt. Zur Isolierung des Produktes ist nur noch Filtration und Auswaschen mit Acetylchlorid und Petroläther nötig. Dabei muß Feuchtigkeit völlig ausgeschlossen sein. Da die sehr lockere Masse wegen Verstopfung des Filters schlecht zu filtrieren ist, so ist es vorteilhaft, den folgenden, von Emil Fischer ange- gebenen Apparat zu benützen (Fig. 44). a ist der S^öpselzylinder, in welchem die Reaktion vorgenommen wird, und h der Tonzyünder, in den mittelst eines Gummistopfens das Bohr c, das fast bis zum Boden reicht, eingesetzt ist. Die Flasche a ist mit einem doppelt durchbohrten Gummistopfen Aerschlossen, durch den einerseits das Rohr c und andrerseits das Rohr d durchgehen, d verzweigt sich in e und /, die beide mit Glashähnen versehen sind; / dient dazu, die Waschflüssigkeit aus der Flasche g zu entnehmen, c führt zu dem mit Phosphorsäureanhydrid gefüllten Turm h und der mit Schwefelsäure gefüUten Flasche i. die dazu *) Vgl. hierzu: Emil Fischer, Syüthese von Polypeptiden. IX. Chloride der Amino- säuren und ihrer Acylderivate. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 38. S. 605 (^1905 1. '^) Emil Fischer, Synthese von Polypeptiden. XIII. Chloride der Aminosäuren und Polypeptide und ihre Verwendung zur Synthese. Ehenda. Jg. 38. S. 2914 (^1905). ^) In der Originalarheit von Emil Fischer ist die Methode für salzsaures dl-Leucin- chlorid hcschriebeu. Methoden zur Synthese von Polypeptiden. 553 dienen, einen trockenen Lnftstrom in a hineinzuleiten. Das Rohr c steht durch den Guinmischlauch k mit der Saiigilasche l in \'erbin(lung. Wird bei / evakuiert, so geht die in der Flasche a enthaltene FUissigkeit durch die Tonzelle und das Rohr c dorthin. Gleichzeitig läßt man durch e einen laugsamen, getrockneten Luftstrom in das Gefäß eintreten. Der größte Teil des Niederschlags setzt sich fest an die Tonzello an. Um zu waschen, schließt man den Hahn bei e und öffnet bei f. worauf die Waschflüssigkeit aus der Flasche g nach a übertritt, g enthält frisches Acetylchlorid, sie wird später durch eine andere mit Petroläther, der über Phosphorsäurcanhydrid ge- trocknet ist, ersetzt. Damit das Übersteigen der Waschflüssigkeit erleichtert wird, ist es ratsam, die Flasche a, in der bei der hohen Tension der ver- Avendeten Flüssigkeit nur sehr geringer Minderdruck herrscht, durch Ein- stellen in eine Kältemischung oder durch Aufspritzen von Äther momentan abzukühlen. Noch bequemer wird die Operation, wenn in die Flasche a ein Fig. 44. drittes, in der Zeichnung fehlendes Rohr mit Hahn einmündet, das direkt mit der Saugpumpe verbunden werden kann. Einmahges Waschen mit so viel Acetylchlorid, daß die Flasche a bis zur Höhe des Niederschlages damit ge- füllt ist, und zweimaliges Waschen mit der gleichen Menge Petroläther ge- nügen, um ein analysenreines Präparat zu gewinnen. Zum Schluß wird scharf abgesogen unter gleichzeitigem Zutritt des getrockneten Luftstromes, dann der Niederschlag möglichst rasch in einen mit Phosphorpentoxyd be- schickten ^^akuumexsikkator übergeführt und hier etwa 1 Stunde zur Ent- fernung der letzten Reste des Petroläthers getrocknet. Das erhaltene salz- saure 1-Leucylchlorid kann nun direkt zur Kui)pelung mit Aminosäuren und mit Polypeptiden verwendet werden. Ebenso können in genau der gleichen Weise auch Polypeptide chloriert werden. Von großem Literesse ist die Beobachtung, daß die Art der Gewinnung der x\minosäuren und der Polypeptide von größter Bedeutung für den Er- folg der Chlorierung ist. So gelang es nicht, aus Wasser kristallisiertes 554 E. Abderhalden. Glykokoll in das Salzsäure Salz zu verwandeln, wurde das Glycin dagegen in wenig warmem Wasser gelöst und mit einem großen Überscliuß von Alkohol gefällt, so ließ sich das fein pulverisierte Glycin sehr leicht chlorieren. ß) Synthese von Polypeptiden mittelst der Chloride von Aminosäuren: Die salzsauren Aminosäurechlcride und die salzsauren Chloride der Polyi^eptide lassen sich direkt mit Aminosäuren und Polypeptiden kuppeln. Als Beispiel einer derartigen Synthese sei diejenige des d-Alanyl-glycins angeführt: irSf/ salzsaures d-x\lany]chlorid werden in eine auf 0" gekühlte Lösung von Sg GlykokoUester, der durch Baryumoxyd sorgfältig getrocknet war, in SO cm^ trockenem Chloroform in 5 Portionen eingetragen. Beim jedesmaligen klüftigen Schütteln geht das Chlorid fast völlig in Lösung. Die Mischung bleibt dann bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen, wobei manchmal Kri- stahisation des salzsauren GlykokoUesters eintritt. Sie wird nun ohne Filtration unter stark vermindertem Druck verdampft, der Pvückstand zuerst mit Petroläther gewaschen, dann in bO cni^ Methylalkohol gelöst und in einer kleinen Menge der abgemessenen Flüssigkeit das Chlor maßanalytisch bestimmt. Zu dem Hauptteil der Lösung fügt man nun die für das Chlor berechnete Menge einer verdünnten Natriummethylatlösung. Nach einstündigem Stehen bei 0" wird das Kochsalz abfiltriert, die Flüssigkeit unter geringem Druck verdampft und der Pückstand wieder zur Entfernung des freien GlykokoUesters mit Petroläther mehrmals sorg- fältig gewaschen, dann mit 5 cm^ absolutem Alkohol aufgenommen und die vom Kochsalz allfiltrierte Lösung mit Äther und viel Petroläther versetzt. Hierbei scheidet sich ein Öl ab, das nach einstündigem Stehen von der Lösung getrennt und zur Yerseifung in 40 c/w 3 kalter Normalnatronlauge gelöst wird. Die Flüssigkeit bleibt V/^ Stunden bei Zimmertemperatur stehen, wird dann nach Zusatz von 40 cin^ Normalschw^efelsäure unter vermindertem Druck stark eingedampft und zur Fällung des Natriumsulfats mit dem 5fachen Volumen heißen Alkohols vermischt. Die heiß filtrierte Flüssigkeit scheidet beim Eindampfen auf dem Wasserbade schon in der Wärme das d-Alanyl- glycin kristaUinisch al). y) Spaltung razemischer Aminosäuren in ihre Komponenten: Zur Darstellung der optisch-aktiven Polypeptide bedarf es ganz reiner, optisch-aktiver Aminosäuren. Manche davon lassen sich aus Proteinen ge- winnen. Wir haben an anderer Stehe (S. 490) die zu ihrer DarsteUung die- nenden ^Methoden angeführt. Einige Aminosäuren lassen sich aus den Spalt- produkten eines vollständig hydrolysierten Proteins entweder nur schwer reinigen, oder aber sie kommen in sehr geringen Mengen vor, sehr häufig sind sie auch zum Teil razemisiert. Es lassen sich ferner nicht alle iVmino- säuren gleich gut in das Chlorid umwandeln, so daß der Synthese von optisch-aktiven Polypeptiden in manchen Fällen eine Grenze gesetzt wäre, wenn sie nur auf die Chloride der Aminosäuren zur Einführung neuer optisch-aktiver Bausteine angewiesen wäre. Wie liereits erwähnt worden ist, Methoden zur Synthese von Polypeptiden. 555 hat Emil Fischer durch die Darstellung optisch-aktiver Halogenacylchloride eine weitere, sehr fruchtbare Methode zur Polypeptidsynthese geschaffen, und zwar kann zu deren Gewinnung, wie oben erwähnt, sehr oft diejenige optisch-aktive Form der Aminosäure verwendet werden, die in der Natur nicht vorkommt. Wir brauchen somit in vielen Fällen beide optisch-aktiven Formen der einzelnen Aminosäuren. Sie lassen sich verhältnismäl»ig leicht aus den synthetisch dargesteUten , optisch-inaktiven Aminosäuren durch Spaltung gewinnen.!) Als Beispiel einer solchen Zerlegung einer razemischen Aminosäure in ihre Komponenten sei die Spaltung des dl-Leucins an- geführt: Zunächst wird die Benzoylverbindung des dl-Leucins dargestellt, und zwar nach dem folgenden Beispiel: 20 g dl-Leucin werden in 1 53 cm ^ ( 1 Mol. ) Normalnatronlauge und 400 cm^ Wasser gelöst, hierzu 76 g Natriumbikarbonat gegeben und 64 g Benzoylchlorid in kleinen Portionen eingetragen. Nach jedesmahgem Zusatz des Chlorids wird heftig geschüttelt, bis der Geruch verschwunden ist. Die Operation dauert 4 Stunden. Zum Schluß ist die Flüssigkeit durch eine geringe Menge eines Öles getrübt. Sie wird deshalb mit wenig Tier- kohle geschüttelt, filtriert, mit einem Überschuß von Schwefelsäure ver- setzt und der Kristallbrei , nach zweistündigem Stehen in Eis , filtriert. Das Gemisch von Benzoesäure und Benzoylleucin wird in dünner Schicht ausgebreitet und an der Luft getrocknet und dann zur Entfernung der Benzoesäure wiederholt mit größeren Mengen Ligroin (Siedepunkt 65 — 72") ausgekocht. Der Rückstand löst sich in etwa 20 Teilen warmem Äther. Nach Zusatz von warmem Ligroin zu der durch Eindampfen etwas konzentrierten Flüssigkeit bis zur beginnenden Trül)ung scheidet sich beim Abkühlen das dl-Benzoylleucin in farblosen, rhombenähnlichen Platten oder kurzen, zu Drusen vereinigten Prismen ab. Die Ausbeute an diesem reinen Produkt beträgt 70 — 75'»/,, der Theorie. Darstellung von Benzoyl-d-leucin aus Benzoyl-dl-leucin: 30^ Benzoyl-dl-leucin und 37-7 (7 Cinchonin (molekulare Mengen) werden fein zerrieben und in 3 / siedendem Wasser gelöst. Beim Erkalten scheidet sich zunächst eine kleine Menge des Salzes als zähe Masse ab, dann aber folgen feine, farblose Nadeln. Ihre Menge beträgt nach zwölfstündigem Stehen etwa 25 g. Aus der Mutterlauge gewinnt man noch 5 g, so daß die Gesamtausbeute 88 «/o ^^ei' Theorie beträgt. Zur Peinigung wird das Salz aus 100 Teilen siedendem Wasser umkristallisiert, wobei die erste Kri- staüisation, welche ungefähr 60^/ 0 des gelösten Salzes beträgt, ganz rein ist, während aus der Mutterlauge noch etwa 250/o weniger reines Material erhalten werden. 1) Vgl. Emil Fischer, Üher die Spaltung einiger razemischer Amidosäuren in die optisch -aktiven Komponenten. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 32. S. 2451 (1899). — IL Mitteilung. Ebenda. Jg. 31. S. 3638 (1900). — III. Mitteilung. Ebenda. Jg. :33. S. 2370 (1900). — IV. Mitteilung (mit A. Mounctjrat). Ebenda. Jg. 33. S. 2383 (1900). — V. Mit- teilung (mit Rudolf Hagenbach). Ebenda. Jg. 34. S. 3764 (1901). 556 E. Abderhaldeu. Das Salz bildet farblose, meist zu Büscheln vereinigte Nadeln, welche nicht ganz scharf bei 85" schmelzen. Aus verdünnter Lösung scheidet es sich manchmal bei längerem Stehen in großen, rautenförmigen Blättern oder Prismen ab. In heißem Alkohol ist es sehr leicht löslich und kristalli- siert beim Abkühlen in liiegsamen Nadeln. Von Äther wird es etwa ebenso leicht, wie von heißem Wasser gelöst. Zur Gewinnung des Benzo\ 1-d-leucins werden 20 r/ fein gepulvertes Salz in 500 c?» 3 Wasser suspendiert, mit 50 cm^ Normalkahlauge versetzt und auf dem Wasserbade unter kräftigem Schütteln digeriert, bis vom ursprüng- lichen Salz nichts mehr zu bemerken ist. ]\Ian läßt erkalten, filtriert vom Cinchoniu ab, fügt zur Mutterlauge 54 cm° Normalsaizsäure und verdampft im ^'akuum auf etwa 40 cni^. Dabei fällt das Benzoyl-d-leucin größtenteils als harzige Masse aus. Dasselbe wird ausgeäthert, die ätherische Lösung konzentriert und ])is zur Trübung mit Ligroin versetzt. Beim völligen Er- kalten scheidet sich in der Regel ein dickes Öl ab, das l)ei starker Ab- kühlung in einer Kältemischung und beim häufigen Ptcilien nach ein bis zwei Tagen kristaUisiert. Ist man einmal im Besitz der Kristalle, so kann man weitere Kristallisationen durch Impfen außerordentlich beschleunigen. Die kurzen derben Prismen enthalten y, Mol. Kristalläther, welcher beim Erwärmen im Vakuum auf 50° entweicht. Bei gewöhnlicher Temperatur entweicht der Äther im Vakuum nur unvollständig. Die ätherhaltige Substanz schmilzt unscharf gegen 60", die ätherfreie Verbindung bei 104 — 106° (105 — 107° korrigiert). Letztere läßt sich auch direkt aus der Lösung in Ätherhgrom durch Einimpfen von ätherfreien Kristallen gewinnen. Zur Lösung bedarf die Verbindung ungefähr 120 Teile kochenden Wassers; beim Erkalten fällt sie daraus zunächst als Öl, das jedoch bald zu kurzen, dicken Prismen erstarrt. Darstellung von d-Leucin aus dem Benzoyl-d-leucin: Erhitzt man die Benzoylverbindung mit der hundertfachen Menge 10°/oiger Salz- säure am Piückflußkühler , so tritt nach etwa l^/a Stunden völlige Lösung des geschmolzenen Benzoylkörpers ein, und nach 7 Stunden ist die Hydrolyse beendet. Die Flüssigkeit wird im Vakuum auf den zwanzigsten Teil ein- gedampft, dann zur völligen Entfernung der Benzoesäure mehrmals aus- geäthert und nun wieder im Vakuum zur Trockene verdampft. Das zurück- bleibende salzsaure Leucin wird in der üblichen Weise durch Kochen der Wtässerigen Lösung mit gelbem P)leioxyd entchlort, das Filtrat mit Schwefel- wasserstoff entbleit und die Mutterlauge verdampft, bis der größte Teil des d-Leucins auskristallisiert ist. Darstellung von Benzoyl-1-leucin aus Beuzoyl-dl-leucin: Zur Gewinnung desselben dienen die ersten Mutterlaugen vom Cinchoninsalz des optischen Isomeren. Sie werden zunächst mit einem kleinen Über- schuß von Normalkalilauge zur Fällung des Cinchonins versetzt, dann das Filtrat mit Normalsalzsäure schwach übersättigt. Läßt man jetzt die Flüssigkeit 12 Stunden stehen, so scheidet sich das noch in Lösung befind- liche razemische Benzoylleucin. welches namentlich in kaltem Wasser \iel Methoden zur Synthese von Polypeptiden. 557 schwerer löslich ist, als die aktive Form, zum t^rößten Teile ab. Seine Menge beträgt etwa 20Vo des angew^andten Razemkörpers. Die Mutterlauge wird im Vakuum stark eingedampft, bis der größte Teil des Benzoyl- 1-leucins abgeschieden ist. Man gießt dann den Rest der Flüssigkeit weg, löst das abgeschiedene Harz in wenig Alkali und fällt wieder in der Kälte mit Säure ; nach kurzer Zeit erstarrt der Niederschlag kristallinisch. Zur völligen Reinigung wird das Produkt in das Chinidinsalz verwandelt. Zu dem Zweck werden 16 f/ Benzoylleucin mit 25 (/ der kristallisierten Base in 4V2 ^ heißem Wasser gelöst. Beim Erkalten scheiden sich davon 21 g des Salzes in farblosen, ziemlich dicken Prismen odei- rechteckigen Tafeln ab. Die Mutterlauge gibt, in geeigneter Weise konzentriert, noch eine zweite, nicht unbeträchtliche Kristallisation. Zur völligen Reinigung ist es ratsam, das Salz noch einmal aus heißem Wasser umzukristallisieren. Für die Rückverw^andlung in Benzoyl-1-leucin dient das bei dem Cinchonin- salz der isomeren Substanz beschriebene Verfahren. Die Verbindung schmilzt, ebenso wie der optische Antipode, im äther- haltigen Zustand gegen 60** und getrocknet bei 105 — 107" korr. Darstellunti' von l-Leucin aus Benzovl-I-leucin: Sie erfolgt in genau der gleichen Weise, wie diejenige des d-Leucins aus Benzoyl-d-leucin. An Stehe der Benzoylverbindung kann mit Vorteil die Formyl ver- bin düng verwendet Averdeni): Darstellung von Formyl-dl-leucin. Vgl. S. 496. Das Formyl-leucin zeigt keinen konstanten Schmelzpunkt: es wird bei 1120 ^veich und schmilzt bei lU— 115" (115—1160 korr.). Es löst sich sehr leicht in absolutem Alkohol und heißem Wasser, und ziendich leicht in heißem Essigester ; ziemlich schwer in Äther, Benzol und Chloro- form; in Petroläther ist es fast unlöslich. Beim langsamen Al)kidilen in wässeriger Lösung kristaUisiert es in schön ausgebildeten Formen, die unter dem Mikroskop an Oktaeder mit häufig abgeschrägten Ecken erinnern. Es reagiert sauer und löst sich leicht in ^Vlkalien und Ammoniak. Spaltung des Formyl-dl-leucins mit Brucin: Zu einer Lösung von 50^ Formyl-dl-leucin in 4/ absolutem Alkohol setzt man 1 24 , folgenden Tagen je V4— V2 Stunde lang zum Sieden erliit/t. Die abge- kühlten Lösungen werden dann wie üblich mittelst eines ausgeglühten Platindrahts mit der Kcinkultur des betreffenden Pilzes geimpft und schliei;- lich bei Zimmertemperatur oder im Brutschrank bei dem Temperatur- optimum des angewandten Mikroorganismus sich selbst überlassen. Die Entwicklung des Pilzes beginnt bereits nach einigen Tagen. P^s zeigen sich dann gewöhnlich weißliche Flecke auf der Oberfläche der Flüssig- keit, die sich nach und nach vollständig mit einer sporentragenden Pilz- decke überzieht. Ein Teil des Pilzmycels entwickelt sich untergetaucht in der Lösung am P)oden des Gefäßes. I^ei Anwendung von Hefe ti'iibt sich der Kolbeninhalt allmählich unter Aufsteigen von (iasblasen. Die Versuche können als beendet gelten, wenn die Pilzdecke kein merkliches Wachstum mehr zeigt und eine Gasentwicklung in der Flüssig- keit nicht mehr zu beobachten ist. Die Dauer der Pilzspaltung ist eine sehr verschiedene und von vielen Zufälligkeiten abhängig. Sie kann 4 bis 12 Wochen im ganzen betragen. Doch ist auch häufig nach dieser Zeit die Aminosäure nicht optisch rein, sondern noch mit dem Pvazemköi-per ge- mischt wieder zu gewinnen und muß dann, wenn dies erforderlich, noch ein zweites Mal nach Zugabe von neuer Nährlösung und wiederholter Sterilisierung mit dem betreffenden Pilz angesetzt werden. Zur Isolierung der unangegriffenen optisch aktiven Aminosäure wird das Pilzmycel durch Filtration entfernt und die farblose bis gelblich gefärl)te Flüssigkeit auf dem Wasserbad zur Trockne verdampft. Aus dem Rück- stand extrahiert man die Aminosäure durch Kochen mit Alkohol, dem etwas konzentrierte Ammoniakflüssigkeit zugesetzt ist. Oder man fällt aus der ursprünglichen filtrierten Lösung die Schwefelsäure und Phosphorsäure mit Barvtwasser, kocht das Filtrat mit frisch gefälltem Kupferoxyd und scheidet durch Eindampfen die Aminosäure in Form ihres Kupfersalzes ab, das in üblicher Weise weiter verarbeitet wird. Beispiel: Die Lösung von og dl-Leucin in bOO cm^ Wasser wird nach Zusatz von 10 cw^ der erwähnten Nährsalzflüssigkeit in iMilaskolben verteilt, sterilisiert und mit Penicillium glaucum geimpft. Nach 6 Wochen wird die Lösung filtriert, eingedampft und der Rückstand mit wässerigem Ammoniak enthaltendem Alkohol ausgekocht, so daß die Salze ungelöst zurückbleiben. Die aus dem Extrakt beim Verdunsten erhaltene rohe Amino- säure liefert umkristaUisiert 0-9 r/ reines d-Leucin. II. Spaltung durch Hefegärung. M Für diese Methode der Aminosäurenspaltung dient ausschliel'dich gut ausgewaschene und abgepreßte, möghchst eiweißarme obergärige ') Felix Ehrlich, t)l)er eine Methode zur Spaltung razemischer Aminosiiuren mittelst Hefe. I. Biochem. Zeitschr. Bd. 1. S. 8 (1906); II. Biochem. Zeitschr. Bd. H. S. 438 (1908). — Derselbe, LHjcr das natürliche Isomere des Lcucins. II. Bor. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 40. S. 2538 (1907). — Felix Ehrlich und A,lnlf Wnidcl, Zur Kenntnis der Leucinfraktion des Eiweißes. Biochem. Zeitsclir. Bd. 8. S. 399 (1908). 36* 564 Felix Ehrlich. Preßhefe. Eine solche wird von Preßhefefabriken aus Getreidewürzen für die Zwecke der Spiritusbrennereien und Bäckereien im großen reingezüchtet und ist unter dem Namen „Peine Getreidepreßhefe" im Handel leicht erhältlich. Besonders bewährt haben sich bisher die o])er- gärigen Preßhefen, Passe XII, II und M, die in Blechbüchsen eingestampft von der Berliner Hefenzuchtanstalt des A^reins der Deutschen Spiritiis- fabrikanten in den Handel gel)racht werden, i) Sie enthalten durchschnitt- lich 250/0 Trockensubstanz und 2°/o Stickstoff, d. h. also im Mittel zirka 8"/o Stickstoff in der Trockensubstanz. Infolge ihres relativ geringen Eiweißgehalts reichern sich diese Hefen bei Gegenwart einer genügenden Menge Zucker sehr leicht mit dem Stickstoff der Aminosäuren an und besitzen dementsprechend für die Pazemverbindungen der verschiedensten Aminosäuren ein großes Spaltungsvermögen. Man kann indes für die Spaltung ebensogut Getreidepreßhefe verwenden, wie sie in jedem Bäcker- laden zu kaufen ist, mu(i aber hierbei darauf achten, daß die Hefe keinen Zusatz von Stärkemehl enthält und vorher nicht zu lange warm gelagert war. Am besten vergärt man die Aminosäuren mit möglichst frisch be- reiteter Hefe. Diese kann man aber lange, sogar bis zu 4 Wochen, in ihrer Frische erhalten, wenn man sie sofort nach der Bereitung in gut ver- schließbare Blechbüchsen mit einem Pistill fest einpreßt und dauernd in einem kühlen und trockenen, möglichst steril gehaltenen Räume aufbewahrt, doch so, daß sie nicht gefriert. Von derartig gelagerter älterer Hefe ent- fernt man vor Gebrauch vorsichtig ungefähr 1 cm der oberen, nach längerer Zeit häufig mit Schimmelpilzen durchsetzten Schicht und benutzt zur Spal- tung nur die darunter l)ef indliche , normal schwach gelblich gefärbte Hefe. Nach Entnahme derselben, am besten mit einem Metallspatel, muß der übrige Teil wieder gut eingestampft werden. Bei der Ausführung des Spaltungsverfahrens selbst ist jede Sterili- sierung der Gefäße und Flüssigkeiten sowie jede Anwendung von Nähr- salzen überflüssig. Die Vergärung wird in großen Stehkolben oder Flaschen vorgenommen, die nur zu zwei Drittel oder höchstens drei Viertel ihres Inhalts mit Lösung gefüUt werden, damit später für die gärende Flüssigkeit ein genügender Steigraum freibleibt und ein Überschäumen vermieden wird. Für sehr große Flüssigkeitsmengen benutzt man vorteilhaft die bekannten, in Flaschenkörlie eingesetzten Säureballons. Die razemische Aminosäure kann in Mengen von 1 — 100// und mehr auf einmal gespalten werden. Sie wird zur Gärung am besten in ca. i^VoigGr Lösung angesetzt, der Zucker in 10 — lö'^/oigQi' Lösung. Im allgemeinen genügen für 10 g Aminosäure 200 — 300 (/ Zucker und 2 — 3/ gewöhuUches Leitungswasser. Als Zucker verwendet man möglichst ungebläute (ultramarin- freie) Raffinade des Handels. Da die Aminosäuren sich meistens in Zucker- lösungen viel leichter als in reinem Wasser lösen, so verfährt man bei ^) Zu beziehen vom Institut für Giiruugsgewerbe. Berlin N., Seestr. 65. Methoden zur hiologischeu Spaltung razemischer Aminosäuren etc. 565 Herstellung- der Gärflüssigkeiten geeigneterweise derartig, daß man in den 'Gärkolben zunächst den Zucker abwiegt, dann die Aminosäure und das Ganze schließlich mit der erforderlichen Menge Wasser übergießt, wobei mau die oben im Gefäß haftenden Substanzteile hinunterspült. Der Kolben wird nunmehr eventuell unter Erwärmen auf dem Wasser- oder Dampf- bade so lange geschüttelt, bis vollständig klare Lösung eintritt. Ist die Aminosäure sehr schwer löshch, so daß sie beim Erkalten zum Teil wieder auskristallisiert, so gibt man mehr Wasser und eventuell auch noch Zucker hinzu und erhitzt von neuem. Mitunter befördert die Lösung auch ein Zusatz von einigen Tropfen Essig- oder Milchsäure, mit denen man die Flüssig- keit stets schwach ansäuern muß, im Falle die wässerige Lösung der Aminosäure alkalisch reagiert. In die abgekühlte Lösung wird darauf die Preßhefe eingetragen. Die Menge der anzuwendenden Hefe richtet sich im wesentlichen nach der Menge und dem Stickstoffgehalt der zu vergärenden Aminosäure. Ist der f^iweiß- gehalt der Hefe ein normaler, so genügen gewöhnUch zur totalen Spaltung von 10/7 razemischer Aminosäure 100 — 200^ Preßhefe. Bei höherem Eiweiß- gehalt der Hefe wird man unter Umständen entsprechend mehr anwenden müssen, da sonst die Spaltung leicht unvollständig verlaufen kann. Das- selbe kann eintreten, wenn der Hefe zur Vergärung zu wenig Zucker geboten wird, dessen Menge mindestens das Doppelte der angewandten Quantität Hefe betragen soll. Ein zu großer Überschuß au Hefe und Zucker schadet insofern, als dadurch auch der Antipode der natürlichen Amino- säure merklich angegriffen und seine Ausbeute eine entsprechend ge- ringere wird. Das Eintragen der abgewogenen Hefe geschieht entweder direkt mit einem Spatel, oder indem man die Hefe vorher mit einem Teil der be- reiteten Flüssigkeit in einer Schale gründlich anrührt und dic^ses Gemisch in die Hauptlösung einträgt. Im Koll)enhals hängenbleibende Hefeteile werden mit destilliertem Wasser hinuntergespritzt. Durch gutes Schütteln des Gefäßes muß dafür Sorge getragen werden, daß die Hefe namentlich anfangs emulsionsartig in der ganzen Flüssigkeit verteilt ist. Der Gär- kolben oder -ballon wird dann durch einen Kautschukstopfen mit einem Meisshchen Gärverschluß verschlossen (Fig. 45). Einen einfachen Gär- verschluß kann man sich auch selbst leicht herstellen, indem man ein gebogenes Glasrohr in ein Reagenzglas durch einen Korkstopfen einführt, der an einer Stelle seitlich eingekerbt ist, um die Gase entweichen zu lassen (Fig. 46). Es genügt, die Gärverschlüsse mit destilliertem Wasser zu beschicken, da sie im wesentlichen hier nur den Zweck halieu. den Gärverlauf besser beobachten zu können. Die in dieser Weise fertig hergestellten, mit Hc^fe versehenen Zucker- Aminosäurelösungen werden zur Gärung im Laboratorium bei gewöhnlicher Zimmertemperatur, d. h. zwischen 15—22» C angesetzt. Höhere Tempei-a- turen wirken eher schädlich, da die Flüssigkeiten dann zu stark schäumen und aus der Hefe infoke ihrer gesteigerten autolytischen Tätigkeit zu viel 566 Felix Ehrlich. Substanzen in Lösung gehen, die auf die Aminosäuren später kristalli- sationshindernd wirken. Die Gärung setzt meistens schon nach V4 Stunde mehr oder minder intensiv ein und ist ge^YÖhnlich in 2 — 4 Tagen beendet. Es empfiehlt sieh dabei, das Gärgefäß hin und wieder zur Verteilung der Hefe und zur besseren Entfernung der gelösten Kohlensäure gut zu schütteln. Die Gärung muß stets so lange durchgeführt werden, bis auch die letzten Eeste des Zuckers verschwunden sind. Man erkennt diesen Zeit- punkt äußerlich bereits daran, daß die Hefe nach längerer Ruhe sich fast vollständig zu Boden setzt, und daß auch bei starkem Schwenken des Kolbens nur wenige Gasblasen entweichen. Doch muß stets, bevor der Versuch ab- gebrochen wird, eine hefefreie, wasserklare Probe der Flüssigkeit, wie sie durch Filtration unter Zusatz von frisch gefälltem Tonerdehydroxyd oder Kieselgur leicht zu erhalten ist, erst mittelst Naphtolreaktion auf Zucker untersucht werden. Bei negativem Ausfall der Zuckerreaktion wird die ver- gorene Lösung am besten sofort filtriert. Dies geschieht bei kleinem Volumen unter Zusatz irgendwelcher mechanisch klären- der Mittel, wie Tonerdebrei, durch geräumige Faltenfilter , wobei Fig. 45. Fig. 46. die Hefe auf dem Filter mehrmals gründlich mit Wasser ausgewaschen und die abfließende Lösung eventuell noch einmal filtriert werden nmß. Für größere Quantitäten der hefehaltigen Flüssigkeit hat sich die Filtrier- vorrichtung sehr bewährt, die aus Fig. 47 ohne weiteres zu ersehen ist. Als Filter dienen hierbei dünnwandige unglasierte Tonflaschen oder -kolben , wie sie die Kgi. Porzellan-Manufaktur in Berlin in den Handel bringt. Die Tonflasche wird durch eine zweimal knieförmig gebogene Glas- röhre mit einer Saugflasche in A'erbindung gesetzt, die an eine Wasser- strahlpumpe angeschlossen ist. Als Verschlüsse benutzt man Kautschuk- stopfen. Die vergorene Flüssigkeit wird mitsamt der Hefe in ein Becher- glas gegossen, in das man die Tonzelle, wie die Figur zeigt, einsenkt. Der Wasserhahn zur Pumpe wird dann leicht geöffnet, wodurch die Flüssigkeit Methoden zur biologischen Spaltung razemischer Aminosäuren etc. 567 erst in den Tonkolben und von da sofort wasserklar in die Saugf'lasche übergesaugt -wird, aus der man sie von Zeit zu Zeit entfernt. Nach völliger Trennung der Lösung von der Hefe wird diese, wenn sie fast trocken gesaugt ist, noch ein- oder zweimal mit Wasser nachgewaschen. Die Ton- kolben , die sich erst nach längerem Gebrauch mit Hefe allmäliMch v(!r- stopfen, können schnell wieder gebrauchsfähig gemacht werden, indem man sie einige Stunden in angesäuerter Bichromatlösung erhitzt und dann gut durchwässert. Die hefefreien Filtrate der vergorenen Flüssigkeit werden in Porzellan- schalen zunächst über freier Flamme und dann auf dem Wasserbade auf ein kleines Volumen eingedampft , darauf noch einige Zeit zur Klärung und Entfärbung mit Tierkohle warm digeriert, filtriert und nunmehr bis zur Bildung einer Kristallhaut zum dünnen Sirup eingeengt. Zu starkes Tonftlt zurLufilpumpe Fig. 47. Eindampfen empfiehlt sich dabei nicht, da die dicken Sirupe in diesem Falle schwer von d€^n Aminosäuren zu trennen sind. Die Fösungen enipfind- Ucher Aminosäuren konzentriert man am besten im Vakuum bei nicdi-iger Temperatur. Im Falle Gefahr vorliegt, daß die aktive Aminosäure sich durch Einwirkung der bei der Gärung entstandenen Säuren in der Hitze wieder razemisieren kann, ist es vorteilhaft, ihre Lösung beim Kin- dampfen durch wiederholten Zusatz von wässerigem Ammoniak dauernd schwach alkalisch zu halten. Aus den durch Verdampfen gewonnenen Sirupen kristallisieren die meisten aktiven Aminosäuren sehr leicht, gewöhnlich schon sofort nach dem Erkalten aus. Die Abscheidung ist meist bereits nach 24 Stunden eine annähernd vollständige. Man saugt die Kristalle auf der Nutsche ül)er Fheßpapier oder manchmal besser über feinem Haarfilz scharf ab und be- freit sie durch Pressen auf Ton von den letzten Resten der Mutterlauge 568 Felix Ehrlich. möglichst vollständig. Das Filtrat ergibt gewöhnlich eingedampft noch eine kleine Menge Aminosäure. Aus den Mutterlaugen leichter löshcher Amino- säuren lassen sich nach mehrwöchentlicher Aufbewahrung bisweilen noch geringe Reste Substanz abscheiden. Das auf Ton getrocknete Rohprodukt wird me übhch aus Wasser oder Alkohol umkristallisiert. Um hierbei auch geringe, aus der Gärung herstammende Verunreinigungen sicher zu entfernen, empfiehlt es sich in der Weise zu arbeiten, daß man die rohe Aminosäure zunächst in der genügenden Menge 95'^/oigen Alkohols suspendiert . am Rückflußkühler aufkocht und nunmehr unter stetem Kochen allmählich soviel Wasser portionsweise zugibt, daß die Kristalle der Aminosäure gerade gelöst sind, während die Verunreinigungen als Trübungen und Hocken in der Flüssigkeit herumschwimmen, einen Punkt, den man bei einiger Übung leicht erkennen kann. Die Lösung wird dann noch mit Tierkohle versetzt, kurze Zeit aufgekocht, filtriert und das Filtrat mit konzentriertem Alkohol bis zur beginnenden Kristallisation übersättigt. Ist die Aminosäure ausnahmsweise durch Eindampfen der vergorenen Flüssigkeit nicht kristaUisiert zu erhalten, so muß ihre Isolierung durch irgend eine andere der sonst ül)hchen Methoden vorgenommen werden. Am meisten empfiehlt sich in diesem Falle die Abscheidung über das Kupfer- salz, auf dessen eventuelle Löslichkeit in Methyl- oder Äthylalkohol besonders zu achten ist. Ergibt die Bestimmung des optischen Drehungsvermögens der iso- herten Aminosäuren, daß diese nicht, wie gewünscht, optisch rein, sondern noch mit dem Razemkörper gemengt erhalten worden ist, so muß die Aminosäure noch einmal vereoren werden, wobei man sie dann zweck- mäßig nur etwa mit der Hälfte der vorher angewandten Mengen Hefe und Zucker behandelt. Die Ausbeuten an reiner optisch aktiver Aminosäure bei dem be- schrie])enen Gärverfahren betragen gewöhnlich 2/3 bis ^4 von der Menge der theoretischen , da bei Anwendung von soviel Hefe . wie nötig ist , um nur genau die eine Komponente der Razemverl)indung abzubauen, stets auch eine geringe Quantität der anderen Komponente mitangegriffen wird. Die Hefegärmethode eignet sich besonders zur Darstellung von 1-Alanin, 1-Valin, d-Leucin, d-Allo-Isoleucin , 1-Isoleucin, Kilutaminsäure, d-Histidin. d-Phenylalanin und d-Serin. Beispiele. 1- Alan in. 100 f/ dl-Alanin werden zusammen mit 3 Ar/ Zucker in einem großen Glasballou in 2rW Wasser gelöst und mit Vi.lr/ frischer Preßhefe ver- goren. Nach :] Tagen ist die Gärung beendet und die Lösung zuckerfrei. Die Hefe wird abfiltriert, das klare Filtrat auf ein kleines Volumen ein- geengt, durch Kochen mit Kohle geklärt und zum dünnen Sirup verdampft, der über Nacht kristallisiert. Die direkt und nach weiterer Konzentriernng der Mutterlauge erhaltenen abgesaugten Kristalle werden auf Ton gepreßt, Methoden zur biologischen Spaltung razemischer Aminosäuren etc. 569 nach dem Trocknen in wenig heißem Wasser gelöst und aus der Lösung mit Alkohol gefällt. Ausbeute an reinem 1-Alanin 25 — :iO r/. d-Allo-Isoleucin. bg eines Gemisches von d-Isoleucin und d-Allo-Isoleucin , das durch 20stündiges Erhitzen von d-Isoleucin mit Barvtwasser auf 180" hergestellt ist, werden in einem o ^Stehkolben zusammen mit 200 ,9 Zucker in 2 / Wasser gelöst und mit 100 f/ frischer Preßhefe vergoren. Nach 2tägiger Gärung ist kein Zucker mehr in der Lösung nachzuweisen. Die von der liefe ab- filtrierte Flüssigkeit ergibt nach der Behandlung mit Tierkohle auf dem Wasserbade verdampft einen schnell kristallisierenden Sirup. Das nach zwei- tägigem Aufbewahren daraus durch Absaugen und Abpressen auf Ton er- haltene Kristallmehl liefert nach zweimaligem Umkristallisieren aus heißem Alkohol unter tropfenweisem Zusatz von Wasser rs^/ reines d-Allo- Isoleucin. d-Serin. 10 f/ dl-Serin werden in einem 4 /-8tehkoll)en zusammen mit :\{)0 g Zucker in o^ Wasser gelöst und die Lösung mit 200 ^r frischer Preßhefe vergoren. Die Gärung ist in 1^/2 T'agen beendet. Die abfiltrierte zucker- und hefefreie Lösung wird unter vermindertem Druck bis auf ein kleines Volumen eingeengt und nach Behandlung mit Tierkohle auf dem Wasser- bad vorsichtig zum Sirup verdampft. Nach zwölfstündigem Stehen unter starker Kühlung mit Eis und häufigem Peiben trül)t sich der Sirup all- mählich und scheidet schließlich einen feinen Kristallbrei ab. Dieser gibt scharf abgesaugt und auf Ton gepreßt 2-S g eines weißen Pulvers. Das Rohprodukt wird in wenig Wasser gelöst und unter schwachem Erwärmen mit Tierkohle gereinigt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen verdampft und die konzentrierte Lösung mit ab- solutem Alkohol bis gerade zur beginnenden Abscheidung der Aminosäure versetzt. Nach 12stündigem Stehen kristallisiert das Serin in feinen Nadeln aus, die al^gesaugt, mit al)solutem Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum über Schwefelsäure getrocknet werden. Ausbeute 2-5^ reines d-Serin. Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte. a) Isolierung der Nukleinsäuren und deren Abbau, Darstellung der Spaltungsprodukte. Von H. Steudel, Berlin, I. Isolierung und Abbau der echten Nukleinsäure aus tierischen Organen. Echte Nukleinsäuren, d. h. Nukleinsäuren, die nach dem Typus der Nukleinsäure aus der Thymusdrüse aufgebaut sind, kommen in den Zell- kernen fast aller Organe vor. Ihre Menge ist dort aber für gewöhnlich nur sehr gering, so daß die IsoUerung einer reinen und unzersetzten Nuklein- säure z. B. aus Leber umständlich ist. Die meisten Organe eignen sich deshalb nicht zur präparativen Darstellung der Nukleinsäure. Ein gutes Ausgangs- material für die Gewinnung der echten Nukleinsäure ist nur das reife Fisch- sperma (Miescher, Noll, Steudel'^), die Thymusdrüse (Kossei und Neumann-) und von pflanzlichen Zellen die Hefe (Hoppe- Sc ijler, Altmami^). Am ein- fachsten liegen die Verhältnisse beim reifen Fischsperma; die Spermatozoen- köpfe enthalten außer Nukleinsäure und Protamin nichts Wesentliches, aber auch aus den Zellen der Thymusdrüse läßt sich mit Leichtigkeit die gleiche ^) Fr. Miescher, Die Spermatozoen einiger Wirbeltiere. Verhandlungen der natiir- forschenden Gesellschaft in Basel. 1874. Auch Gesammelte Abhandlungen. Bd. 2. S. 55. Leipzig, E\ W.Vogel, 1897. — Derselbe, Physiologisch- chemische Untersuchungen über die Lachsniilch. Gesammelte Abhandlungen. Bd. 2. S.359. — Alfred Noll, Über die Bildung von Lävulinsäure aus Nukleinsäuren. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 25. S. 430 (1898). — H. Stcmhl , Über die Oxydation der Nukleinsäure. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 48. S. 426 (1906). — Derselbe, Die Zusammensetzung der Nukleinsäuren aus Thymus und aus Heringsmilch. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 49. S. 406 (1906). ^) A. Kossei und A.Nenmann, Über das Thymin. ein Spaltungsprodukt der Nuklein- säure. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 26. S. 2753 (1893). — Dieselben, Darstellung und Spaltungsprodukte der Nukleinsäure (Adenylsäure). Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 27. S. 2215 '(1894). ^) F. Hoppe-Seiilcr, Über die chemische Zusammensetzung des Eiters. Med. -ehem. Untersuchungen. Berlin, A. Hirschwald, 1866— 1871. S. 500. — Derselbe, Über Lecithin und Nuklein in der Bierhefe. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 2. S. 427 (1878/79). — R. Alt- mann, Über Nukleinsäuren. Arch. f. (Anat. und) Physiologie. S. 525 (1889). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Nukleinsäuren. 571 Nukleinsäure me aus den Spermatozoen der Fische darstellen, trotzdem hier die physiolooisch-chemischen Verhältnisse durch die Gegenwart von Nukleo- proteiden, von Nukleohiston usw. theoretisch komplizierter hegen. Zur Darstellung von Nukleinsäure extrahierte Miescher^) mit Alkohol entfettetes Sperma vom Lachs (60 — 10 g) bei 0» mehrere (4 — 5) Male mit Salzsäure (jedesmal 700 cm» O-o^/o) zur Entfernung des Protamins, löste den Rückstand in Natronlauge, filtrierte und fällte das Filtrat mit dem doppelten Volumen salzsauren, starken Alkohols. Weil man dauernd bei 0'' arbeiten muß, alle Reagentien auf 0° abkühlen und die Arbeit möglichst an einem Tage beenden muß, dabei aber doch nicht sicher ist, daß die Salzsäure die Nukleinsäure zersetzt, so ist die Methode heute ganz ver- lassen; sie hat nur noch historisches Interesse und zeigt, mit wie großen Schwierigkeiten im Anfang die Gewinnung auch nur kleiner Mengen Nuklein- säure verknüpft war. Es bedeutete einen großen Fortschritt, als Kossei und Neumann-) zeigten, daß die Nukleinsäure, die gegen freie Mineralsäuren selbst bei Eises- kälte äußerst empfindlich ist, als Alkalisalz respektive als Erdalkalisalz in wässeriger Lösung zum Sieden erhitzt werden kann, ohne sich zu verändern. Neumann^) hat dann weiter konstatiert, daß man selbst in alkalischer Lösung die Nukleinsäure erwärmen kann, ohne befürchten zu müssen, daß sie sich zersetzt, und auf dieser Beobachtung beruht die bei weitem beste Methode zur IsoUerung der Nukleinsäure, nach der man sich beliebige Mengen Sub- stanz bereiten kann, die an Reinheit und Einheitlichkeit jeden Vergleich mit Nukleinsäurepräparaten anderer Darstellung*) aushalten können, ja andere Präparate wesentlich übertreffen. Darstellung der Nukleinsäure nach Neumann, 1 kg frische, rein präparierte Thymusdrüsen werden in schwach essig- saurem Wasser rasch aufgekocht. Die Operation hat nur den Zweck, die nun folgende Zerkleinerung der Drüsen zu erleichtern. Sobald die Drüsen durch und durch hart geworden sind, hört man mit dem Sieden auf und gibt nun das Material durch eine gute Fleischhackmaschine. Dann wird der feingehackte Brei mit einer Vl^/oigen Natronlauge im siedenden Wasser- bade erwärmt; dazu nimmt man auf 1 ät/ Reinthymus 2 /Wasser und 100 nn^ 33Voiger Natronlauge, dem man zweckmäßig noch 200g Natriumacetat hinzu- fügt. Das Erwärmen nimmt man am besten in einem gut glasierten Emailtopf ') Fr.Miescher, Physioloffisch- chemische Untersuchungen iilier die Lachsmilch. Gesammelte Abhandlungen. Bd. 2. S. 371. I 2) A. Kossei und A.Neinnann, Darstellung und Spaltungsprodukte der Nuklein- säure (Adenylsäure). Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 27. 8.2210 (1894). 3) Ä.'Xeumann, Zur Kenntnis der Nukleinsubstanzcu. Arch. f. (Anat. und) Phy- siologie. S. 374 (1898). — Derselbe, Verfahren zur Darstellung der Nukleinsäuren a i und h und der Nukleothyminsäure. Ebenda. Supplementband. S. 552 (1899). •*) H. Sfeiidel, Zur Kenntnis der Thymusnukleinsäuren. III. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 46. S. 335 (1905). 572 H. Stendel. vor, den man in einen größeren Topf mit siedendem Wasser hineinhängt. Ein gut passender Deckel erfüllt vollkommen den Dienst eines ßückfluß- kühlers. Nach etwa halbstündigem Erhitzen hat sich alles bis auf geringe Reste von Bindegewebe mit brauner Farbe gelöst, und will man die gelati- nierende Säure a haben, so unterbricht man jetzt das Erhitzen; will man die nicht gelatinierende Form b haben, so erwärmt man noch ca. 1 — 1^/2 Stunden weiter. Die fernere Verarbeitung ist in beiden Fällen dieselbe. Man neu- trahsiert die Natronlauge — auf je 100 «n^ SSVoig^i' NaOH IbOcrn^ 50'Yoiger Essigsäure — , läßt den entstehenden Niederschlag von Eiweiß in der "Wärme sich absetzen, gießt zuerst die überstehende klare, hellgelbe Flüssigkeit und dann den Bodensatz auf ein Faltenfilter, das in einem Heißwassertrichter liegt. Nachdem man dann die Flüssigkeit auf dem Wasserbade eingedampft hat (2 / Ausgangsvolumen auf etwa 7-2 0^ läiit man sie auf etwa 40" er- kalten und gießt sie unter Umrühren in das gleiche Volumen Oß^/oigen Alkohols. Dabei fällt das nukleinsaure Natron als zähe, fadenziehende Masse aus. Nach dem vollständigen Erkalten und Klarwerden gießt man die Flüssig- keit ab, filtriert den Niederschlag durch Leinwand und löst ihn in Wasser (in unserem Falle bOOcrn^). Nun erhitzt man auf dem Wasserbade, bis sich aus der trüben Flüssigkeit ein leicht filtrierbarer Niederschlag al)geschieden hat, und die Lösung klar geworden ist. Man filtriert und fällt mit Alkohol. Das reine Natronsalz gibt mit Alkohol keine Fällung; dieselbe entsteht jedoch, wenn man eine konzentrierte Lösung von Natriumacetat in geringer Menge hinzufügt. Nachdem man eventuell durch nochmaliges I^mlösen reines Natron- salz gewonnen hat, kann man zwecks Konservierung dieses mit absolutem Alkohol und Äther trocknen. Man erhält dann ein schneeweißes, staubendes Pulver, das sich beliebige Zeit hält. Zur Gewinnung der freien Säure löst man das Natronsalz mit Wasser und fällt durch verdünnte Salzsäure; die Substanz wird dann mit absolutem Alkohol getrocknet. Gießt man die Lösung des gereinigten Natronsalzes in die dreifache Menge Alkohol, den mau vorher mit konzentrierter Salzsäure {2 ciii^ auf 100 cm^ Alkohol) versetzt hat, so erhält man eine weiße Fällung der freien Säure, die sich lancsam zu Boden setzt. Die klare Flüssickeit wird alsdann abgegossen und der Niederschlag ebenfalls einige Zeit unter starkem Alkohol stehen gelassen. In beiden Fähen wird nach dem Plltrieren so lange mit absolutem Alkohol nachgewaschen, bis die saure Reaktion verschwunden respektive das Filtrat chlorfrei ist. Will man aus dem Natronsalz das Kupfersalz resp. ein anderes schwerlösliches Metallsalz gewinnen, so ist es zweckmäßig, die siedend heiße Lösung des nukleinsauren Salzes in dünnem Strahl in die ebenfalls siedend heiße Metallsalzlösung hineinzugießen (Steudel). Nur so erreicht man eine voUständige Umsetzung, -weil unter anderen LTmständen das schwer- löshche nukleinsaure Kupfer resp. Blei, Zink usw. jeden neu in die Reak- tionsflüssigkeit fallenden Tropfen der Metallsalzlösung resp. der Lösung von nukleinsaurem Natron mit einer dicken undurchdringlichen Hülle über- Nukleinsäuren und deren Al)l)auprodukte : Isolierung der Nukleinsäuren. oTvl zieht, die eine weitere Einwirkuni»- verhindert nnd die Präparate vei-un- reinigt. Sowohl hei der Darstolhm«^' des Natronsulzes sowie des Kiipfersalzes ist darauf zu achten, daß zum SclduLi (Uis Wasser soriL^fältij^' aus (h-r feiu- verteilten Substanz durch Alkohol entfernt wird ; das ^^eschieht am besten durch wiederholtes Verreiben unter Alkohol. Man erhält sonst leicht tiiasioe oder harzii>e, zum Schluß steinharte Massen, die nicht weiter verarbeitet werden können oder doch noch eiiimnl uclöst und wieder unif^efällt werden müssen. Das Kupfeisalz kann mau auch au der Luft ti'ockuen lassen, wenn man nur auf sorgfältige Zei'bröckeluug' der größeiT'U Stücke dauernd achtet. Ausbeute an reiner Nukleinsäure nach diesem Verfahren : Aii> je \ hj Reinthymus 30 bis 35 (j. Von Neumann wurden nach dieser Methode Nukleinsäuren erhalten aus Thymus, Milz, Pankreas und Stierhoden ; nach Steudel eignet sie sich auch zur Darstellung der Nukleinsäure aus Fischsperma. Schmiedehcrg hat früher M Wert darauf gelegt, daß die Nukleinsäure nach dem sogenannten Kupferkahverfahren l)ei'eitet werde : das \ertahren ist umständlicher wie das von Neiinionn und gestattet nicht, größere Mengen von Ausgangsmaterial auf einmal in Angi'iff zu nehmen. Außerdem sind die Ausbeuten an reiner Nukleinsäure zum Schluß sehr gering, dazu kommt ferner, daß die Verwandlung des erhaltenen Kupfersalzes in leicht in Wasser lösliche Verbindungen, z. B. Na-Salz, Schwierigkeiten macht, so daß sich Schmiedehcrg in seiner letzten Arbeit 2) auch an dix^ Xctiniami^choXev- iahYen anlehnt. Freilich vermeidet er noch (un Erhitzen des Ausgangs- materials in alkalischer Lösung in der Furcht , dadurch die Nukleinsäure zu zerstören und melaninartige Pi-odukte zu bekommen. Diese Annahme ist uidiegründet ; wie die Analysen 3) von Präparaten zeigen, die nach der Xeuman7ischen Methode gewonnen waren, unterscheiden sich diese in inchts von den Substanzen, die nach dem Schmiedehergsi-hen Kupferkaliverfahren bereitet waren. ^) Der Nachteil aber, in neutraler Lösung zu arbeiten, besteht darin, daß ein Teil der Nukleinsäure nicht aus seiner \'ei-bindung mit Eiweiß gelöst wird und nun als unlöslicher Körper nicht weiter verarbeitet *) 0. Schmicdt'bcrß, Über die Nukleinsäure aus der I.:iclisniilcli Arcli. f. cxpciini. Pathol. u. Pharm. Bd. 43. S. 57 (1899). ^) 0. Schmiedeberg , Beiträge zur Kenntnis der tierischen Nukh'insäurc. .\n-li. f. experira. Pathol. u. Pharm. Bd. 57. S. 309 (1907). 8) //. Steudel, Zur Kenntnis der Thyinusnukleinsäuren. III. Mitteilung. Zeitsclir. f. physiol. Chem. Bd. 46. S. 33ö (1905). •*) Früher hat Srliiiii,>/rher;/ nichts gcfi^n d;is Krwärnien in nicht zu stark alkalischer Lösung einzu\vendeu gehabt. Arch. f. e.xpcrm. Path. u. Pharm. Bd. 43. S. 58: „K> ergab >^ich, daß die Nukleinsäure in neutraler und niclit zu stark alkalischer Lösung sehr beständig ist und selbst in der Siedehitze keine oder wenigstens keine loiclitc und rasche Zersetzung erleidet." Ebenso hat er Alshen/ (Beiträcre zur Kenntnis der Nukleinsuure. Arch. f. Path. u. Pharm. Bd. 51. S. 239 [1904J) mit Baryumhydroxydlösung bei GO— 80'^ arbeiten lassen. 574 H. Steudel. wird (die sogeiiaunte „Proteinnukleinsäure" Schmiedebergs) oder doch die weitere Verarbeitung' umständlich macht. Der Vollständigkeit halber sei hier eine Vorschrift von Schmiedeberg (Arch. f. exp. Path. u. Pharm. Pd. 57. S. 321 ff.) wiedergegeben : Darstellung der Nukleinsäure nach Schmiedeberg. „Möglichst von Blut und Bindegewebe befreite und feingehackte Thymusdrüsen werden mit dem mehrfachen Volumen Wasser angerührt und in einem Glasballon stark geschüttelt, bis die Drüsensubstanz eine ziemlich gleichmäßige schleimige Beschaffenheit angenommen hat. Sodann wird die Masse mit Essigsäure neutralisiert, doch so, daß sie auch beim Erhitzen etwas sauer reagiert. Man erhitzt zum Sieden, bis das Eiweiß koaguliert und die Flüssigkeit klar geworden ist, die man dann abfiltriert. Die abge- gekochte, mit heißem Wasser ausgewaschene und von der Flüssigkeit abgepreßte Drüsenmasse wird mit einer mäßigen Menge halbgesättigter Kochsalzlösung zum Sieden erhitzt und letzteres solange unterhalten, bis die anfänglich gallertartige Masse sich unter Abscheiduug von Gerinnseln verflüssigt hat. Hierauf wird in einem Heißwassertrichter filtriert und das Filtrat, welches gelatiniert, noch heiß mit dem 3 — 4fachen Volum Alkohol versetzt, wodurch das nukleinsaure Natrium gefällt wird, während Eiweiß- substanzen usw. in Lösung bleiben. Durch Umfallen aus siedender Kochsalzlösung mit Alkohol kann das nukleinsaure Natron völlig frei von Eiweiß erhalten werden. Es besteht aber jetzt, zum Teil wenigstens, noch aus der gelatinierenden Nukleinsäure a. Um sie in die nicht gelatinierende b überzuführen, wird sie mit einer mäßigen Menge Kochsalzlösung von 10 — 15% so lange im Sieden erhalten, bis sich eine geringe Menge einer flockigen Substanz abgeschieden hat und eine herausgenommene Probe beim Erkalten nicht mehr gelatiniert. Dennoch enthält die Lösung noch einen Rest der gelatinierenden Modifikation, den durch längeres Sieden umzuwandeln nicht zweckmäßig ist, weil dabei die Nukleinsäure leicht eine gelbliche Färbung annimmt. Das Filtrieren kann warm oder kalt vorgenommen werden. Aus dem wasserklaren Filtrat wird das nukleinsaure Natrium durch Alkohol ausgefällt und durch Lösen in Wasser und Umfallen vom Kochsalz befreit. Doch ist das nicht leicht zu erreichen. Deshalb ist es zweckmäßig, das Kochsalz durch Dialyse zu entfernen und dann mit Alkohol zu fällen. Eine in der Wärme dargestellte, konzentrierte Lösung dieses Präpa- rates gelatiniert aber beim Erkalten, weil es noch einen Rest der a-Nukleinsäure enthält. Dieser nicht aufgeschlossene Anteil läßt sich durch fraktionierte Fällung mit Alkohol leicht entfernen, indem er nach Zusatz von ein wenig Alkohol zu der wässerigen Lösung zuerst gefällt wird. Der in Lösung bleibende, aufgeschlossene, nicht gelatinierende Anteil wird dann nach dem Absetzen des ersteren aus der abgegossenen Flüssigkeit durch einen weiteren Zusatz von Alkohol ausgefällt und erst durch Dekantieren und schließlich auf dem Filter mit Alkohol ausgewaschen." Legt man wirklich Wert auf die vollkommene Trennung der gelatinierenden und der nicht gelatinierenden Form der Nukleinsäure, so ist es bequemer, statt des SchmiedebergschenYeriiihYejiS die vonKostgtschew^) angegebene Methode zu benutzen, die auf den verschiedenen Eigenschaften j der Barytsalze der beiden Nukleinsäuren beruht. Für praktische Zwecke \ ist diese absolute Trennung übrigens nicht notwendig, durch kurzes Sieden I (V2 Stimde) nach Neumann erhält man fast nur a-Nukleinsäure, während , längeres Sieden (1 — IV2 Stunden) b-Nukleinsäure liefert. | ') »S*. Kostytschetv , Über Thymusnukleinsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 39. S. 545 (1903). I Nukleiusäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Nukleinsäuren. 075 Eigenschaften der Nukleinsäure. Die auf die eine oder andere Weise gewonnenen NukleinsiUuL-n sind weiße, pulverförmige, amorphe Sul)stanzen, in kaltem Wasser schwer lösUch, in Alkohol und Äther unlöslich. Sie existieren in zwei verschiedenen Modifikationen, a- und b-Säure, respektive a- und 'i-Säure, von denen die a-Form schwerer in Wasser löslich ist wie h. In heißem Wasser lösen sie sich unter Zersetzung- auf. Ihre Alkalisalze sind in Wasser leicht löslich, eine mindestens r^Voige Lösung des a-iiiikleinsauren Natrons erstarrt in der Kälte zu einer klaren festen diinlisichtigen (iclatine. Die Säuren sind gleichfalls in Ammoniak, Alkalikarbonaten und -acetateu leicht löshch und werden durch Essigsäure nicht aus ihren Lösungen gefällt, dagegen durch Mineralsäuren. Mit Schwermetallen geben sie in Wasser unlösliche Salze, desgleichen mit Erdalkalien schwer lösliche basische Salze. Als Zeichen, daß sie eiweißfrei sind, dürfen sie keine Biuretreaktion geben, ein anderes Zeichen ihrer Reinheit ist, daß eine Lösung von i-eincm nukleinsaurem Natron mit Alkohol allein keinen Niederschlag gibt, sondern erst auf Zusatz einiger Tropfen konzentrierter wässeriger Natriumacetat- lösung. Mit Gerbsäure, Pikrinsäure und Lhosphorwolf ramsäure geben sie keine Fällung, dagegen tritt nach Araki mit Gerbsäure ein Niederschlag bei Gegenwart von Natriumacetat ein. i) Die nukleiusäuren Salze, z. B. das Cu-Salz, lassen sich bei 90 — 95" bis zur Gewichtskonstanz ohne Zersetzung trocknen ; bei höhei-er Temperatur tritt weitere Gewichtsabnahme ein. dann färiien sich die Präparate aber braun, ein Zeichen beginnender Zersetzung. Den Ergebnissen der quantitativen analytischen Untersuchung der Spaltungsprodukte der Nukleinsäure entspricht am besten die Formel C43H57N15O30P4, MG. = i;')87-6, l.M. = 142:M)2), sie ist eine vierbasische substituierte Phosphorsäure, in der 4 Wasserstoffatome durch Metall ersetzbar sind. Das neutrale Natriumsalz hat also die Zusammensetzung C43 H53 NX Ni5 ^30 1'4, (Las Kupfersalz C43 H53 Cu., N,, O30P,. Die quantitative Untersuchung der Spaltungsprodukte hat auch den endgültigen Beweis geliefert, daß die Nukleinsäure aus Thymus und aus Fischsperma identisch sind. Die Ergebnisse der Elemeutaranalyse allein würden bei so kompliziert zusammengesetzten Substanzen zu einem solchen Schluß nicht berechtigt haben. Die Elementarzusammensetzung der freien Säure ist berechnet: C nT-lSVo, H 4-14«/o, N lö-i4'>/o, L 8-940/0- Für diese Berechnung stimmen auch die von Schmied vberg aus- geführten zahlreichen Analysen gut, deren Mittel beträgt: (' .".(itiöo^o, *) über enzyniatische Zersetzung der Nukleinsäure. Zeitschr. f. piiysiid. Cheni. Bd. 38. S. 93. Anmerkung. -) Die Molekulargewichte, Prozentzahlen und Logaritinnen sind berocliin't wordm nach: /'. W.Küster, Logarithmische Rechentafeln für Chemiker, rharmazeuten, Modi/iiMT und Physiker. 7. Aufl. Veit & Co., Leipzig 1907. 576 H. Steudel. H 4-67 Vo. N 15-1 70/0, P 9-370/0 0' so daß kein Grund vorliegt, eine andere Formel zu wählen. Die echte Nukleinsäure ist optisch-aktiv, sie dreht die Ebene des polarisierten Lichtes nach rechts, die Drehung ist abhängig von der Konzentration und der Azidität, respektive Alkaleszenz der Lösung. 2) In essigsaurer Lösung gil)t die Nukleinsäure mit Eiweiß einen Niederschlag (sogenanntes künstUches Nuklein), der in Salzsäure schwer löslich ist. Sie reduziert nicht FehUngsche Lösung, auch nicht nach dem Kochen mit Mineralsäuren, wohl aber erhält man eine der Pentosenreaktion ähnhche Färbung, wenn man Nukleinsäure mit Salzsäure (spez. Gew. 1'19) zum Sieden erhitzt, Phloroglucin hinzufügt, durchschüttelt und sofort abkülilt. Die Flüssigkeit färbt sich kirschrot, doch läßt sich im Gegensatz zur Pentosenreaktion der Farbstoff nicht mit Amylalkohol der Flüssigkeit entziehen. ^) Die echte Nukleinsäure ist eine Tetrametaphosphorsäure, die, ähnlich der Glyzerinphosphorsäure, an jedem Phosphor- atom eine Hexosengruppe enthält, an die dann je ein Molekül Guanin, Adenin, Thymin und Cytosin gebunden ist. Abbau der Nukleinsäure. Der Abbau der Nukleinsäure kann nach verschiedenen Grundsätzen erfolgen. Entweder sucht man durch vorsichtige Einwirkung von Spaltungs- mittelu einzelne Teile von dem großen Molekül loszulösen, um dann Sub- stanzen zu erhalten, die der ursprünglichen Nukleinsäure noch relativ nahe stehen, oder man spaltet sofort das ganze Molekül bis in seine einfachen Bruchstücke auf. Dies letztere geschieht am besten dm'ch siedende Mineralsäuren. Jodwasserstoff säure*), Salzsäure^) oder Schwefelsäure ^j, als deren zweck- mäßigste und am mildesten wirkende sich die Schwefelsäure») erwiesen hat. Früher hatten KosscJ und Neumann, lediglich um einfachere Bedingungen in der resultierenden Zersetzungsflüssigkeit zu haben, die Nukleinsäure mit starker (20 Volumprozent) Schwefelsäure unter Druck bei 150" erhitzt. Dabei werden die Alloxurl)asen ganz oder doch fast ganz zerstört'') und ^) 0. Schmiedeberff , Beiträge zur Kenntnis der tierischen Nukleinsäure. Archiv? f. exper. Pathol. und Pharm. Bd. 57. S. 328 (1907). : 2) W.Jones, On the Ideutity of the nucleic Acids of the Thymus, Spleen and; Paucreas. The Journal of Biological Cliemistry. Vol. 5. pag. 11 (1908). .• ^) H. Steudel, Üher die Kohlenhydratgruppe in der Nukleinsäure. II. Mitteilung.! Zeitsehr. f. physiol. Chem. Bd. 56. S. 215 (1908). I ■*) IL Steudel, Zur Kenntnis der Thymusnukleiusäuren. I. Mitteilung. Zeitsehr. f. j physiol. Chem. Bd. 42. S. 165 (1904). ' ^) H. Steudel, Zur Kenntnis der Thymusnukleinsäuren. IL Mitteilung. Zeitsehr.!.^ physiol. Chem. Bd. 43. S. 402 (1904). " i ^) //. Steudel, Zur Kenntnis der Thymusnukleinsäuren. III. Mitteilung. Zeitsehr.' f. physiol. Chem. Bd. 46. S. 332 (1905). Niikleinsilureu und deren Abbauprodukte : Isolierung der Nukleinsäuren. 577 Spaltungsprodukte der Nukleinsäure. Name des Spaltungsprodukts Als Spaltungsprodukt der Nuklein- säure nachgewiesen von Konstitution nachgewiesen von I. Alloxurbaseu: Hj'poxanthin A.Kossd 1879 (Zeitschr. f. phys. Chem. III. S. 291) 6-Oxypurin E. Fischet- 1897 (Ber. d. Deutsch, chcni. Ges. Bd. 30. S. 2228) Xauthin A.Kossd 1880 (Zeitschr. f. phys. Chem. IV S. 292) 2'6-Dioxypurin E. Fischer 1897 (Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30. S. 2235) Guauin A.Kossd 1882 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 7. S. 15) 2-Amino-6-oxypurin E. Fischer 1897 (Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 30. S. 2253) Adenin A.Kossd 18«5 (Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 18. S. 79, 1928) 6-Aminopuriu E. Fischer 1897 (Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 30. S. 2241) II. P y r i m i d i n k ö r p e r : Thymin A. Kossei und A. Nettmann 1894 (Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 27. S. 2215) 5-Methyl-2-6-dioxypyrimidin H. Steudd i901 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 32. S.'241) üracil A. Ascoli 1900 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 31. S."l61) 2-6-Diox3rpyrimidin H. Steudel 1901 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 32. S. 244) Cytosin A. Kossei und //. Steudd 1902 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 37. S."l77) 6-Amino-2-oxypyrimidin A.Kossd und H. Steudd 1903 (Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 37. S. 377. Bd. 38. S. 49) hindern dann nicht die Isoherung der anderen Produkte. Aber um nur eine vollkommene Spaltung zu erreichen, ist solch ein eingreifender Prozeß nicht nötig, es genügt ein mehrstündiges Sieden mit rniUöig starker Schwefelsäure unter gewöhnlichem Druck. Unter solchen Umständen zerfällt die Nuldeinsäure in eine ganze Reihe von Spaltungsprodukten, die sich zweckmäßig in o Gruppen anordnen lassen. 1. Gruppe: Alloxurbaseu: Guanin, Adenin, Xantliin, Hypoxanthin. 2. Gruppe: Pyrimidinkörper: Cytosin, Uracil, Thymin. 3. Gruppe: Kohlenhydratderivate: Ameisensäure, Lävidinsäure, ferner Ammoniak und Phosphorsäure. Ahderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. IT. 37 HN- -CO OC C NH >CH HN- C N Xanth in CsH.X.Üs 2.6-Dioxyp>uiü. 57g H. Steudel. Konstitution der stickstoffhaltigen Spaltungsprodukte der echten Nukleinsäure. P u r i n b a s e n. HN — CO N = C — NH, (H2N)C C— NH HC C — XH 'II il >CH II II >CH N— C — N N — C — X^ Guanin C5H5N5O.1) Adenin C5H5X5.2) 2-Amiuo-6-Oxypuriii. 6-Aminopuriii. HN — CO HC C — NH il II \r'"H II II ^^'^ N — C — N H y p 0 X a n t h i n C5 H^ N^ 0. * ) G-Oxypuriii. ') A. Sirecker, Verwandlung des Guanins in Xauthin. Ann. d. Chem. Bd. 108. S. 141 (1859). — A. Strecker, Untersuchun,o-en über die Beziehungen zwischen Guaniu, Xanthin, Theobromin, Kaffein und Kreatinin. Ann. d. Chem. Bd. 118. S. 151 (1861). — E. Fischer, Umwandlung des Xanthins in Theobromin und Kaffein. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 15. S. 453 (1882). — C. Wulf, Beiträge zur Kenntnis der Xukleinliaseu. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 17. S. 468 (1892). — E. Fischer, Synthese des Hypoxan- thins, Xanthins, Adenins und Guanins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30. S. 2253 (1897). — E. Fischer, Synthesen in der Puringruppe. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 32. S. 445 (1899). -) A. Kossei, Über eine neue Base aus dem Tierkörper. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 18. S. 79 (1885). — A. Kossei, tJber das Adenin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 18. S. 1928 (1885). — A. Kossei, Über das Adeuin. Zeitschr. f. pliysiol. Chem. Bd. 10. S. 250 (1886). — A. Kossei, Über das Adenin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 12. S. 241 (1888). — G. Brithns, Über ein Bromierungsprodukt des Adenins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 16. S. 4 (1892). — M. Krüger, Zur Kenntnis des Adenins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 16. S. 167 (1892). — E. Fischer, Synthese des Hypoxanthius. Xanthins. Ade- nins und Guanins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. "Bd. 30. S. 2241 (1897). ^) F. Wöhler und J. Liehip, Untersuchungen über die Xatur der Harnsäure. Lieljigs Km\^\. d. Chem. u. Pharm. Bd. 26. S. 340 (1838). — Scherer, Über Hypoxanthiii. Xanthin und (iuauiu im Tierkörper und den Reichtum der Pankreasdrüse an Leuciu. Liebigs Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 112. S. 257 (1859). - G. Städeler, Über das Xanthin. Liebigs Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 111. S. 28 (1859). — A. Strecker, Ver- wandlung des Guanins in Xanthin. Liebigs Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 108. S. 141 (1859). — E. Fischer, Synthese des Hypoxanthins, Xanthins, Adenins und Guanins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 30. S. 2235 (1897). *) Seherer, Über einen im tierischen Organismus vorkommenden, dem Xauthin- oxyd verwandten Körper. Liebigs Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 73. S. 328 (1850). — A. Strecker, Verwandlung des Guanins in Xanthin. Liebigs Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 108. S. 156 (1859). — A. Kossei, Über Xanthin und Hypoxanthin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 6. S. 428 (1882). — M. Krüger, Zur Kenntnis des Adenins und Hypoxanthins. III. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 18. S. 422 (1893). — M. Krüger, Die Kon- stitution des Adenins und Hypoxanthins. IV. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 18. Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Xukloinsäurcii. äYQ Pyrimidinkörper. HN-CO N=C.ML II II" OC C.CH3 OC CH HN-CH HN-CH Thymin C^ H^ N., (),. ' ) Cytosin C, H, N, O. '-) 5-Methyl-2.6-dioxypyrimidin. B-Oxy-G-aminopyrimidin. HN — CO I I OC CH HN — CH Uracil CiH.NoOaJ) 2.6-Dioxypyrimidin. Der gesamte l*liosphor der Nukleinsäure erscheint in der Zersetzungs- flüssigkeit als Phosphorsäure ^Yieder, die übrigen Spaltungsprodukte sind, wie Untersuchungen der Nukleinsäure mit anderen Aiethoden (Einwii-kung von starker Salpetersäure*) resp. Salzsäure*) bei niederer Temperatur gelehrt haben, nicht alle primär im Molekül der Nukleinsäure vorgebildet, S. 459 {1893). — E. Fischer, Synthese des Hypoxanthins, Xanthius, Adenins und Gua- nins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30. S. 2228 (1897). ') .4. Kofisel und Ä. Neumann, Über das Thyniin, ein Spaltungsprodukt der Xu- kleinsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 26. S. 2753 (1893). — Ä. Kossei und A. Xeu- mann, Darstellung und Spaltungsprodukte der X'ukleinsäure (Adenylsäure). Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 27. S. 2215 (1894). — //. Sfciidel und A. Kossei, Über das Thymiu. Zeitschr. f. physiol. Ghem. Bd. 29. S. 303 (1900). — H. Stcmlel, Über die Kon- stitution des Thymins. Zeitschr. f. physiol. Ghem. Bd. 30. S. 539 (1900). — H. Sfeudel, Die Konstitution des Thymins. Sitzungsber. d. Maiburger Ges. zur Bef. d. ges. Xatur- wissensch. 23. Januar 1901. — //. Steudel, Die Konstitution des Thymins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 32. S. 241 (1901). - E. Fischer und G. Reeder, Synthese des Uracils, Thymins und Phenyluracils. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 34. S. 3751 (1901). — 0. Gcrngroß, Über eine Synthese des Thymins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 38. S. 3408 (1905). ^) A. Ko^si'I und A. Neumann, Darstellung und Spaltungsprodukte der X'uklein- säure (Adenylsäure). Ber. d. Deutsch, chem. Ges. ^Bd. 27. S. 2215 (1894). — A. Kossei und H. Sfeudel, Über einen basischen Bestandteil tierischer Zellen. Zoitschr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 177 (1902). — A. Kossei und H. Steudel, Über das Cytosin. Zeitschr. f- physiol. Chom. Bd. 37. S. 377 (1903). — A. Kossei und Jf. Sfeudel, Weitere Unter- suchungen ül)er das Cytosin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 38. S. 49 (1903). — //. L. Wheeler und T.B.Johnson, Synthese von Aminooxypyrimidinen, 2-Amino-()-oxypynmidiu inid 2-Oxy-G-aminopyrimidin. American chemical Journal. Vol. 29. p. 492 (1903). ") A. Ascoli, Über ein neues Spaltungsprodukt des Hefenukleins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 31. S. 161 (19ü0'01). — ff. Sfeudel, Über die Konstitution des Thy- mins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 30. S. 539 (1900). — //. Steudel, Die Konstitution des Thymins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 32. S. 244 (1901). ■*) H. Sfeudel, Über die Oxydation der Nukleinsäure. I. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 48. S. 426 (1906). 580 H. Steudel. soudern teilweise erst sekundär durch die Einwirkung der siedenden Schwefelsäure auf die primären Spaltungsprodukte durch Ammoniakabspaltung entstanden. So läßt sich das Xanthin auf das Guanin, das Hypoxanthin auf das Adenin und das Uracil auf das Cytosin zurückfuhren, ebenso ist das bei dieser desamidierenden Wirkung der Schwefelsäure freiwerdende Ammoniak ein sekundäres Zersetzungsprodukt. ]\Ian findet über das Vor- kommen der einzelnen Xukleinl)asen und ihre ^lengenverhältnisse die wider- sprechendsten Angaben in der Literatur. Häufig hat man Resultate, die mit alten, unvollkommenen ^Methoden gewonnen waren, kritiklos neben andere gesetzt, die mit den Hilfsmitteln einer mehr und mehr vervollkommneten Technik erhalten worden sind. So könnten die Angaben mancher Lehr- bücher den Anschein erwecken, als ob die größte Verwirrung in den An- schauungen über den Alloxurbasengehalt der Nukleinsäure besteht. Dazu kommt ferner, daß man früher die echte Nukleinsäure nicht streng genug von den ihr nahestehenden Substanzen (Guanvlsäure, Inosinsäure) geschieden hat, die in der Tat einen anderen Alloxurbasengehalt an (^Hialität und Quantität haben wie die echte Nukleinsäure. Nach den Ergebnissen meiner Untersuchungen bleiben als primäre Bestandteile des NukleinsäuremoleküJs von stickstoffhaltigen Substanzen Guanin, Adenin, Thymin und Cytosin übrig, die in molekularem Verhältnis in der Nukleinsäure vorkommen. Einige Forscher hatten gemeint, offenbar beeinflußt durch theoretische Erwägungen, die durch die alte Sckn/icdchercjfsche Formulierung der Nuklein- säure veranlaßt waren , daß die Pyrimidinkörper, besonders das Cytosin, sich erst sekundär aus den Purinbasen bildeten. ' ) Das ist nicht der Fall; sämtUche Versuche sprechen dagegen, speziell liefern die Alloxurbasen selbst beim Sieden mit Schwefelsäure und eventuell Zusatz eines Kohlen- hydrates keine Pyrimidinkörper.-) Die Körper der dritten Gruppe sind Derivate einer Hexose, deren nähere Definition noch aussteht; man kann aber aus der Menge der ge- bildeten Lävulinsäure den Schluß ziehen, daß 4 Moleküle der Hexose in der Nukleinsäure vorhanden sind. Von der Hexose ist bisher bekannt, daß sie bei der Spaltung mit Schwefelsäure Ameisensäure und Lävulinsäure, bei der Spaltung mit Sal- petersäure Oxalsäure und Epizuckersäure liefert. Nach Abtrennung der Alloxurbasen läßt sich das Pveduktionsvermögen der Hexose nachweisen, ebenso wie ihre Piechtsdrehung. Das Drehungsvermögen der Nukleinsäure selbst ist wahrscheinhch durch diese rechtsdrehende Hexose bedingt. *) Schmiedeberg hatte seine Formel der Nukleinsäure nur auf 14 Stickstoffatome berechnet ; zog man hiervon die 10 Atome N ab, die im Guanin und Adenin ziisammeu enthalten waren, so reichten die 4 übrigbleibenden nicht für den Stickstoffgehalt des Thymins und Cytosins, die zusammen 5 N-Atome haben. Diese Überlegung ist gewiß das Haupthindernis gewesen, das der allgemeinen Anerkennung des Cytosins als primären Spaltungsproduktes der Nukleinsäure anfangs im ^^'ege gestanden hat. ^) H. Steudel, JJhQv die Bijdungvon Pyrimidinderivateu aus Purinkörpern. Zeitschr. f. physiol. Chera. Bd. 53. S. 508 (1907). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Nuldeinsäuren. 581 In manchen Lehrbttchern findet man die Angabe, daß die Nuklein- säure auch eine Pentose in ihrem Molekül enthalte. Man hat hier entweder die echte Nukleinsäure mit der (tuanylsäure oder Inosin säure verwechselt oder hat die von Nemnann angegebene Reaktion der Nukleinsäure mit Phlorogluzin und Salzsäure auf Pentose bezogen. Aber der Ausfall der Farbenreaktion ist nicht der gleiche wie bei einer Pentose und vor allem sind die Mengen Furfurol, die sich bei der Destillation von Nukleinsäure mit Salzsäure bilden, so minimal, daß sich daraus der Schluß auf das Vor- kommen einer Pentose in der Nukleinsäure nicht rechtfertigen läßt. ^) Demnach würde sich das Bild von der Zusammensetzung der Nuklein- säure folgendermaßen gestalten : Guanin lO'HSVo Adenin 9-73«/o Cytosin 7-99Vo Thymin 9-087o Hexose 5P90Vo Phosphorsäure (PoO^) 20-46 Vo C43H„N,5 03oP4 + 8H.,0 -f 2 0 = CgH.N.O + QH^N^ + CsHeN^O, + Nukleinsäure Guanin Adeuin Thymin CHsNsO + 4 C„H,,()e + 4 HPO3. Cytosin Hexose Tetrameta- phosphorsäure Über die Art der Verknüpfung der einzelnen Bruchstücke unter- einander ist noch nichts Sicheres bekannt; wahrscheinlich ist das Kohlen- hydrat an die Phosphorsäure in ähnlicher Weise gebunden -), wie das Gly- zerin in der Glyzei-inphosphorsäure , von der Art und dem Ort der P)in- dung der Pyrimidinkörper weiß man nichts; von den Alloxurbasen ist nur soviel sicher, daß bei ihrer Loslösung aus dem Molekül der Nuldeinsäure durch Salpetersäure die reduzierende Gruppe des Kohlenhydrates^) frei wird, daß also dort eine Bindung vorhanden sein muß. Ob dabei das N-Atom 7 der Purinbasen eine PtoUe spielt, mag dahingestellt bleiben*). Jedenfalls ist es wenig wahrscheinlich, daß an das N-Atom 7 eine Phos- phorbindung herantritt, da die Alloxurbasen unter dieser ^'oraussetzung noch an einer anderen Stelle mit dem Kohlenhydrat in Verbindung si'in müßten. Nach den Untersuchungen von H. Fischer ^) findet der Eintritt 1) //. Steudel, Über die Kohlenhydratgruppe in der Nukleinsäure. II. Mitteilung. Zeitschr. f. physinl. Chem. Bd. 56. S. 213 (1908); siehe auch ./. Baiu/, Chemische Unter- suchung der lymphatischen Organe, lieitr. z. chem. Phys. u. Path. Bd. 4. 8. 341 (l'JU4). 2) H. Stendel, Über die Oxydation der Nukleinsäure. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 48. S. 429. Zusatz (1906). ^) H. Sfeudel, Über die Kohlenhydratgruppe in der Nukleinsäure. 1. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 55. S. 410 (1908). *) />'. Bufian, Zur Kenntnis der Bindung der Purinbasen im Nukleinsäuremolekiil. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 37. S. 708 (1903). ') H. Fischer, Zur Frage der Bindung der Purinbasen im Nukleinsäurcmolekül. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 60. S. 69 (1909). 582 H. Steiulel. der Diazogruppe in die Piirinbasen (Theophyllin, Xanthin, Guanin) übrigens bei Stellung 8 statt ; danach könnten die Purinbasen im Nukleinsäure- molelvtü entweder bei 7 oder 8 gebunden sein. Endlich scheinen die Amidogruppen der Purin- und I'vrimidinbasen nicht endständig und frei im Molekül der Nukleinsäure vorhanden zu sein, da bisher noch keine Verbindungen der Nukleinsäure mit Säuren beob- achtet sind. Die Purinbasen sind nur äußerst locker im Verbände des Nuklein- säuremoleküls befestigt. Dm'ch Behandlung freier Nukleinsäure mit starker Salpetersäure oder Salzsäure in der Kälte respektive bei Zimmertemperatur kann man leicht die gesamten Purinbasen als Nitrate respektive Chloride abspalten. ^lan erhält dann im Filtrat einen Körper, der noch die gesamte Phosphorsäure in organischer Bindung enthält: hatte man Salpetersäure zur Abspaltung der Basen angewandt , so reduziert das Filtrat kräftig Fehlingsche Lösung, ein Zeichen, daß die Basen irgendwie mit der redu- zierten Gruppe des Kohlenhydrates in der unzersetzen Nukleinsäure in Ver- bindung sein müssen. Wendet man zur Aufspaltung starke Salzsäure an, so bräunt sich die Zersetzungsflüssigkeit sehr bald und sie reduziert nicht. Hier wird die Kohlehydratgruppe rasch weiter verändert, man erhält zum Schluß Melanin und Lävulinsäure. Man findet häufig in der Literatur irrtümlicherweise ^) angegeben, daß die Pyrimidinkörper erst bei tiefgreifender Spaltung aus dem Molekül der Nukleinsäure hervorgingen. Veranlaßt ist diese falsche Ansicht wahr- scheinlich dadurch, daß Kossei und Neumann im Anfang sich eines Zer- setzungsverfahrens mit Schwefelsäure bei 150" bedient haben, um Cytosin und Thymin zu isolieren. Dies ^"erfahren war aber nur gewählt, um ein- fachere Bedingungen in der zu untersuchenden Flüssigkeit zu haben — das Guanin und Adenin wird auf diese Weise wohl zerstört, aber nicht in Cytosin verwandelt, wie man fälschlich geglaubt hat. Den nach Entfernung der AUoxurbasen verbleibenden Körper hat man Thym in säure genannt. Seine Gewinnung ist von Kossd'-) und Nenmann beschrieben worden, eine nähere Untersuchung steht noch aus, Darstellung der Thyminsäure. Man erwärmt auf einem Wasserbade 500 cm^ Wasser in einem Becher- giase. Wenn die Wasserbadtemperatur erreicht ist, so gibt man 10 g Nu- kleinsäure in der Weise hinzu, daß nichts an den Wandungen des Gefäßes hängen bleilit. erhitzt etwa 10 Minuten unter I^mrühren weiterhin auf dem ^) B. Burian, Pyrimidinderivate aus Pmiubaseii. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 51. S.438. — O. Schiniedeberg, Beiträge zur Kenntnis,der tierischen Nukleinsäure. Arch. f. exp. Path. u. Pharm. Bd. 57. S. 330. „Bei der Einwirkung- konzentrierterer Säuren in der Siedehitze wird die Nukleinsäure nicht hydrolytisch gespalten, sondern geradezu zer- trümmert, wobei auch Reduktionsvorgänge beteiligt sind." ") A. Kossei und A. Neumann , Über Nukleinsäure und Thyminsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 22. S. 74 (1896). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Nukleinsäuren. 5g;-5 Wasserbade imd gießt die trübe Flüssigkeit diircli ein Faltenfilter. Man prüft nun das Filtrat, indem man eine Probe desselben im lieagenzglas mit 1 Tropfen Salzsäure versetzt. Es darf kein Niederschlag von Nuklein- säure entstehen, sonst hat man zu kurze Zeit erhitzt und mub die Flüssig- keit für einige Minuten aufs Wasserbad zurückbringen. Darauf fügt man zu der Probe Barytwasser im Überschuß, es darf sich kein P)arvumphosphat abscheiden, sonst hat man zu lange erhitzt und ein Teil der Thyminsäure ist unter Abspaltung von Phosphorsäure ^Yeiter zerlegt worden. Man setzt zu dem Filti'at kalt gesättigtes Barytwasser bis zur bleibend schwach alkahschen Peaktion hinzu und läßt l)is zum nächsten Tage stehen. Die Flüssigkeit trübt sich langsam und scheidet sämtliches Guanin (vermischt mit Baryumkarbonat) ab. Die vom Guanin abfiltrierte Lösung wird in die IVsfeche Menge Alkohol hineingegossen. Entsteht kein Niederschlag, sondern nur eine milchige Trübung, so fügt man einige Tropfen einer wässerigen Lösung von C'hlorbaryum hinzu. Man läßt bis zum nächsten Tage stehen, damit das durch das Erhitzen auf dem Wasserbade abgespaltene iVdenin und Cytosin vollständig in den Alkohol hineingehen. Der thyminsäure Baryt hat sich in etwas klebrigen Massen am Boden des Gefäßes abge- schieden. Er wird im Gefäß mit Alkohol ausgewaschen und sodann in etwa 200 cm^ Wasser gelöst. Diese Lösung gießt man in die dreifache Menge Alkohol und fügt nötigenfalls etwas Chlorbaryum hinzu, um eine vollständige Abscheidung des Niederschlages zu bewirken. Man wiederholt dies Umlösen so lange, bis man eine rein weiße, pulverige Fällung erhält. Die Analysen Kassels und Neumanns ließen eine Formel berechnen: CißHosNg P.2 ()i.2 , die verdoppelt (CsoHsoNpPi O..^) annähernd der Formel entsprechen würde, wenn die Thyminsäure sich aus der Nukleinsäure C43H57N15O30P4 durch Austritt von 1 Molekül Guanin und 1 Molekül Adenin hydrolytisch bilden würde; hierfür berechnet sich C33 H5-1 Nf, I^Ogj. \\mQ ähnliche Formel gibt auch Schmiedeherg^) an: G30 H46 N4 P4 O.25. Genau kann die Formel der experimentell dargestellten Thyminsäure nicht mit der von der Theorie geforderten stimmen, da sich aus der Nukleinsäure bei der Darstellung auch etwas Cytosin abspaltet. Läßt man nun auch noch Thymin oder Cytosin aus dem Verbände der Nukleinsäure austreten, so kann man hierfür ebenfalls hypothetische Formeln ableiten, die bisher aber experimentell nicht bewiesen sind. Ebenso mangel- haft ist unsere Kenntnis der Körper, die durch ganz geringe Veränderungen der ursprünglichen Nukleinsäure entstehen. Daß die nicht gelatinierende Form b der Nukleinsäure ein Depolymerisationsprodukt der gelatinierenden a ist, ist äußerst wahrscheinhch und wird allgemein und ohne Widerspruch angenommen: streng bewiesen ist es aber noch nicht. Tber die Stellung und den besonderen Charakter eines anderen Zwischenproiluktes. der Nu- kleo thyminsäure, herrscht gänzliche Unklarheit. ') 0. ,SW*»H'«/e/ve/Y/, tiber die Nukleinsäure aus der Lachsmilcii. Arcli. f. cxp. Tatli. u. Pharm. Bd. 43. S. 72 (1899). — C. L. Älsberg , Beiträge zur Kenntnis der Nuklein- säure. Arch. f. exp. Path. u. Pharm. Bd. 51. S. 239 (1904). 584 H. Steudel. Darstellung der Nukleothyminsäure.M Zur Darstellung der Nukleotliyminsäure wird freie Nukleinsäure unter heftigem Rühren in der zwanzigfachen Menge Wasser von 60" so schnell wie möglich gelöst, die Lösung filtriert und nach vöUigem Erkalten in die dreifache Menge Alkohol gegossen , dem man pro Liter etwa 15 cm^ kon- zentrierte Salzsäure hinzugefügt hat. Man erhält einen weißen Niederschlag, welcher säurefrei gewaschen, in kaltem Wasser gelöst und wieder dm'ch alkoholische Salzsäure gefällt wird. Die Nukleotliyminsäure ist in Wasser ziemlich leicht löslich, enthält aber noch Alloxurbasen in ihrem Molekül zum Unterschied von der Thyminsäure. Darstellung der Spaltungsprodukte der Nukleinsäure. Zur Gewinnung der AUoxurbasen aus der Nukleinsäure ist die Spaltung mit Salpetersäure resp. starker Salzsäure bei gewöhnlicher Temperatur am besten geeignet. Spaltung mit starker Salpetersäure.') Lufttrocknes nukleinsaures Kupfer resp. freie Nukleinsäure (z. B. 10g) wird mit einer Salpetersäure vom spez. Gew. 1-2 {20 cm^) Übergossen (10 cm^ konzentrierter Salpetersäure spez. Gew. 1'4 + 10 cm^ Wasser). Es fäht die freie Nukleinsäure als zähe Masse zu Boden und es beginnt all- mählich eine langsame und stetige Gasentwicklung der niederen O.xyde des Stickstoffs, wobei die Nukleinsäure nach und nach in Lösung geht. Nach 24 Stunden ist sie fast ganz verschwunden und an ihrer Stehe findet sich ein reichlicher kristahinischer Bodensatz, über dem eine etwas viskose Flüssigkeit steht. Öfteres rteil)en mit einem Glasstabe befördert die Ab- scheidung der Kristalle. Trennt man nach mehrtägigem Stehen den Boden- satz von der Flüssigkeit, so erhält man ein grauweißes Pulver, das mit verdünnter Salpetersäure gewaschen, mit Alkohol und Äther getrocknet werden kann. Man löst sodann die KristaUe vorsichtig in heißem Wasser und übersättigt mit Ammoniak, wol)ei man einen dichten, weißen, amorphen Niederschlag von Guanin erhält, den man eine Zeit auf dem Wasserbade digeriert und dann filtriert. Durch Auflösen in Natronlauge und Wieder- ausfällen mit Essigsäure kann man das Guanin genügend rein erhalten. Das ammoniakahsche Filtrat vom Guanin wird auf dem Wasserbad zur Trockne gebracht, mit Wasser aufgenommen und mit pikrinsaurem Natron ausgefällt. Das ausfallende Adenin pikrat soll einen Schmelzpunkt von 280" zeigen und muß nötigenfalls umkristahisiert v/erden durch Lösen in einer gemessenen ]\Ienge Natronlauge von bakanntem Gehalt, Filtrieren und WiederausfäUen durch Zusatz einer entsprechenden ]\Ienge Salzsäure. ^) A. Ncumann, Verfahren zur Darstellung der Nukleinsäuren a und b und der ^ Nukleothyminsilure. Arch. f. (Anat. u.) Physiol. Supplementband S. 552 (1899). 1 -) H. Steudel, tJber die Oxydation der Nukleinsäure. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. [ Bd. 48. S. 426 (1906). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodukte. 585 Die nach der Kristallisation der Nitrate der Alloxiirbasen verbleibende Flüssigkeit läßt sich bei niederer Temperatur des Wasserbades von der Salpetersäure durch wiederholtes Abdampfen annähernd befreien. Wenn die AUoxurbasen als Nitrate nicht gleich im Anfang quantitativ abgetrennt \\()rden sind, kann an dieser Stelle Xanthin- und Hypoxanthinnitrat auskristalli- sieren. Nach dem Auflösen in Wasser und nach Entfernung der Phosphorsäure mit Barytwasser, des überschüssigen Baryt mit CO2 erhält man eine Lösung, die beim Einengen Thymin und Uracil auskristallisieren läßt. Saugt man diese Kristalle ab, so läßt Zusatz von Alkohol zu dem nunmehrigen Filtrat epizuckersaures Baryum^) als amorphen, flockigen Niederschlag aus- fallen; diesen kann man zur Reinigung wiederholt in Wasser auflösen und mit Alkohol wieder ausfällen (es zeigt dabei eine große Neigung, in wässeriger Lösung zu gelatinieren), dann den Baryt quantitativ mit Schwefelsäure ent- fernen, die freie Säure mit Chinin neutralisieren, um so das in schönen Nadeln kristallisierende Chininsalz '^2) der Epizuckersäure zu erhalten, das in kaltem Wasser schwer, in heißem leicht löslich ist und sich gut zur Eein- darstellung der Epizuckersäure eignet. Hat man eine Zersetzungsflüssigkeit von Nukleinsäure aufzuteilen, die durch Hydrolyse mit z. B. siedender Schwefelsäure erhalten wurde, so emp- fiehlt sich folgender Gang der Analyse: Spaltung mit siedender Schwefelsäure.*) Zunächst wird die Schwefelsäure und die Phosphorsäure durch Zusatz von heißem Barytwasser, solange noch ein Niederschlag entsteht, vollkommen ausgefällt. Das Baryumsulfat und -phosphat wird mit W^asser in einer Pteib- schale zu einem dünnen Brei angerührt und in einem guten Emailtopf mit Wasser dreimal sorgfältig ausgekocht. (Es ist sehr schwer, das (luanin aus diesem Niederschlag wieder herauszubekommen.) Die ablaufenden Filtrate werden auf ein handhches Volumen konzentriert, mit Schwefelsäure auf einen Gehalt von etwa ö^/o gebracht und in dem von Kutscher und SteudeV->) ange- gebenen Ätherextraktionsapparat einer energischen Ätherextraktion unter- worfen. In das Ätherextrakt geht die Lävulinsäure und ein Teil des Thy- mins hinein. Sobald der Äther nichts AYesentliches mehr aufnimmt, läßt man den Äther aus der Extraktionsflüssigkeit durch mäßiges Erwärmen verdunsten und fällt aus der erkalteten Lösung die Basen mit Phosphorwolframsäure heraus. Hierbei ist zum Schluß sehr vorsichtig zu verfahren, die Fällung soll 1) //. Steudel, Über die Oxydation der Nukleinsäure. II. Mitteilung. Zeitscbr. f. physiol. Cbem. Bd. 50. S. 538 (1907). 2) H. Steudel, Zur Analyse der Nukleinsäure. Zeitscbr. f. pbysiol. Chem. Bd. 52. S. 62 (1907). '■') H. Sieudcl, Die Zusammensetzung der Niüdeinsäureu aus Tbynius luid aus Heringssperma. II. Mitteilung. Zeitscbr. t. pbysiol. Chem. Bd. 53. S. 15 (1907). *) H. Steudel, Zur Kenntnis der Thymusnukleinsäuren. I, II. III. Zeitscbr. f. physiol. Chem. Bd. 42. S. 133 (1904). Bd. 43. 8.402 (1904). Bd. 46. S. 332 (1905). ^) Fr. Kutscher und H. Steudel, Beschreibung eines Ätherextraktionsapparates. Zeitscbr. f. physiol. Chem. Bd. 39. S. 473 (1903). 586 H. Stendel. vollständig sein, aber ein Zuviel von rhosphorwolframsilure läßt auch das Thymin mit in den Niederschlag hineingehen, dessen weitere Verarbeitung es nachher stören Avürde. Man hört zweckmäßig mit dem Zusatz des Fällungs- mittels auf, sobald der Niederschlag anfängt, seine dickflockige Beschaffenheit zu verlieren und feinpulverig vrird. Niederschlag und Flüssigkeit werden durch Ab- saugen getrennt und der Niederschlag durch wiederholtes Anreiben in der Reib- schale mit 5 Volumprozent H, Sü^-haltigem Wasser und Absaugen gewaschen. I. Verarbeitung des Niederschlages. In ihm sind die Alloxurbasen und das Cytosin enthalten. Man reibt den Niederschlag mit heißem Wasser zu einem dünnen Brei an, den man in einer großen Porzellanschale auf dem Wasserbade warm hält, und setzt portionsweise heißgesättigte Barytlösung hinzu, bis sämthche Phosphor- wolframsäure an Baryt gebunden ist. Dies zeigt sich durch einen Farben- umschlag von Blau in Gelb in der Flüssigkeit an; man erwärmt zum Schluß noch einige Zeit weiter, um die Umsetzung ganz zu vollenden; dann gibt der in der Flüssigkeit vorhandene überschüssige Baryt in einer heraus- genommenen Probe einen dicken Niederschlag von BaCOg mit einer Lösung von Natriumkarbonat. Der phosphorwolframsaure Baryt wird abgesaugt und dreimal mit heißem Wasser angerieben und ausgekocht, aus den eingeengten Filtraten der überschüssige Baryt mit Schwefelsäure vorsichtig unter Ver- meidung eines Überschusses entfernt, dann mit Salpetersäure schwach sauer gemacht und mit einer 20"/oigen Silbernitratlösung eine Fällung der Alloxur- basen erzeugt. a) Fällung der Alloxurbasen.^ Die Fällung wird auf einem Falterfilter gesammelt und, sobald der größte Teil der Flüssigkeit abgelaufen ist, auf der Saugpumpe scharf ab- gesaugt und mit silbernitrathaltigem Wasser gewaschen. Man bringt dann den Niederschlag in stark ammoniakhaltiges Wasser und digeriert ihn hiermit einige Zeit in der Wärme. Dabei gehen die Silbernitratverbindungen der Alloxurbasen in die Silberverbindungen über; sie werden abgesaugt und so lange mit ammoniakhaltigem Wasser gewaschen, bis sie salpetersäure- frei sind. Dies ist sehr wichtig, weil die Salpetersäure sonst leicht die weitere Verarbeitung stören kann. Der Filterrückstand Avird nunmehr in siedendem Wasser fein verteilt, durch Zusatz von Salzsäure das Silber aus- gefällt und die Basen in ihre Chloride verwandelt, das Chlorsilber abgesaugt und das Filtrat auf dem Wasserl)ade vorsichtig zur Trockne gebracht, zum Schluß bei niederer Temperatur und unter häufigem Umschwenken der Schale. Die blasse wird nun mit Wasser siedend heiß gelöst und in der Wärme mit 10''/oigem Ammoniak im Überschuß versetzt. 2) Der sofort eut- l^ -1/. Kriif/er und G. Salomon , Die Alloxurbasen des Harnes. II. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 26. S. 373 (1898). ^) M. Krüger und ^-1. ScJiittenhelm , Die Purinkörper der menschlichen Fäces. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 35. S. 153 (1902). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodukte. 5^7 stehende Niederschlag von Guanin wird nach 24st(indii>ein Stehen abfiltriert, noch einmal mit 2"/oi8'em iVmmoniak in der Wärme digeriert, wiederum abfiltriert und endlich zur Reinigung in verdünnter Natronlauge gelöst und durch Ansäuern der alkalischen Lösung mit Essigsäure wieder ausgefällt. Zur Identifizierung kann das Guanin in das in langen Nadeln kristaUisierende Sulfat übergeführt werden. Die ammoniakalischen Filtrate vom Guanin werden zur Trockne ge- bracht, nach Entfernung des Ammoniaks mit schwach salzsäurehaltigem Wasser aufgenommen und mit einer gesättigten Lösung von Natriumpikrat so lange versetzt, als noch ein weiterer Zusatz des Fällungsmittels zu einem Teile des Filtrates sofort eine Fällung erzeugt. Der Niederschlag von pikrin- saurem Adenin wird sofort mit Hilfe einer Saugvorrichtung abfiltriert. Zur Reinigung wird das Adeninpikrat in heißem Wasser unter Zusatz der be- rechneten Menge Normalnatronlauge gelöst, dann die der Lauge entsprechende Menge an Normalsalzsäure hinzugefügt und diese Lösung mit Tierkohle behandelt. Aus dem Filtrate scheidet sich dann das Adeninpikrat in langen, glänzenden Nadeln ab. F. P. 281". Der Rest der neben (nianin und Adenin vorhandenen Rasen wird aus dem ammoniakalisch gemachten Filtrate vom Adeninpikrat durch ammoniakalische Silberlösung ausgefällt. Der gut mit ammoniakaUschem Wasser salpeter- säurefrei gewaschene Niederschlag wird mit Salzsäure zersetzt, das Chlor- silber entfernt, die Lösung der Chloride vorsichtig zur Trockne gebracht und die überschüssige Salzsäure durch mehrmaliges Abdampfen mit Wasser unter häufigem Umschwenken der Schale und zum Schluß bei niederer Temperatur entfernt. Digeriert man nun den Rückstand mit Wasser bei 40", so geht das Hypoxanthinchlorid vöUig in Lösung, während das Xanthin größtenteils ungelöst zurückbleibt. Zur Identifizierung wird es in das schwer lösliche Nitrat verwandelt. Das Hypoxanthin wird mit Hilfe seines pikrinsauren Salzes gereinigt und dann in das Nitrat verwandelt. h) Cytosinfällung. Die von den Silbernitratverbindungen der Alloxurbasen abgelaufene Flüssigkeit enthält das CytosinM; man erhält es in Form seiner Silber- verbindung, wenn man die schwach saure Flüssigkeit so lange mit weiteren Mengen von Silbernitratlösung versetzt, bis eine herausgenommene Probe, in Rarytwasser hineingetropft, nicht mehr einen weißen, sondern einen schwarzbraunen Niederschlag von Silberoxyd ausfallen läßt. Ist dieser Punkt erreicht, so wird die Flüssigkeit solange mit Barytwasser versetzt, bis sie gegen Phenolpht alein anfängt alkahsch zu reagieren. Den Nieder- schlag saugt man ab, wäscht ihn gründlich mit schwachem Barytwasser aus, zersetzt ihn mit Salzsäure, bringt etwa vorhandenes Baryum im Filtrat durch Schwefelsäure zur Abscheidung und fällt das Cytosin mit 0 F. Kutscher, Eine Methode zur Darstellung des Cytosins. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 38. S. 170 (1903). 588 H. Stendel. Platinchlorid oder Natriumpikrat aus. Letzteres wird wie das Adenin umkristallisiert. Andere Körper sind in dieser Fraktion nicht enthalten, das vom Cytosinsilber ablaufende Filtrat enthält keine mit Phosphor- wolframsäure fällbaren Basen mehr. II. Verarbeitung des Filtrats von der Phosphorwolframsäure- fällung. Die überschüssige Phosphorwolfram säure und die Schwefelsäure werden wie im Anfang mit Baryt entfernt, der Niederschlag quantitativ aus- gekocht, aus dem Filtrat das Baryum (juantitativ mit Schwefelsäure nieder- geschlagen und die Lösung eingeengt. Es kristallisiert das Thymin aus, das aus Alkohol umkristallisiert werden kann. Die letzten Fraktionen der KristaUisationen enthalten das Uracil; seine Gewinnung in reinem Zustande ist sehr umständlich und mit großen A'erlusten verbunden. Eine Methode, Thymin und Uracil besser zu trennen, ist von T. B. Johnson'^) angegeben, doch stehen Erfahrungen darüber noch aus. Will man nur einzelne der Spaltungsprodukte aus der Zersetzungs- flüssigkeit isolieren, so lassen sich die obigen Vorschriften zweckmiiliig abändern. Will man die Alloxurbasen allein haben, so lassen sie sich aus der ammoniakalisch gemachten Zersetzungsflüssigkeit, die durch Kochen mit ]\Iineralsäuren erhalten wurde, mit ammoniakahscher Silberlösung aus- fällen, viel leichter und bequemer aber erhält man sie durch Spaltung der Nukleinsäure mit Salpetersäure; ^\^ll man Thymin und Cytosin haben, so ist es zweckmäßig, die Alloxurbasen durch Spaltung mit Schwefelsäure unter Druck zu zerstören, dann die Schwefelsäure und die Phosphorsäure mit Baryt herauszuschaffen und aus der nachher mit Salpetersäure schwach angesäuerten Flüssigkeit Thymin und C'ytosin mit Silber und Baryt zu fällen nach der oben beschriebenen Methode. Die Angabe von Jones ^), daß zur Fällung des Thymins sehr ^äel weniger Silber ausreiche, hat einer Nachprüfung nicht Stand gehalten. Als ich mir das Thymin für meine Untersuchungen über seine Konstitution darsteUte, fand ich, daß man große Verluste hat, wenn man nicht so viel Silbernitrat zusetzt, bis gegen Barytwasser freies Silberoxyd ausfällt. Leichter läßt sich auch hier aus der Zersetzungsflüssigkeit mit Salpetersäure das Thymin ohne Anwen- dung von Silber und Baryt gewinnen. Das Cytosin kann man even- tuell aus schwach 3 — 4"/oi8 Nukleinsäure und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodnkte. 59] Verbindungen, in denen die einzelnen Spaltungsprodukte der Nukleinsäure am besten identifiziert werden: 1. Guanin. Entweder als freie Base, CsHgNsO, M(r.= 151-09, l.M.r= 17923. C = 39-71Vo, H = S-ßS"/«, N = 46-36o/o: oder besser als Sulfat: (C5 H- N, 0), H, SO, 4- 2 H^ (), MG. = 436-29. 1. M. = 6397S. H2 0 = 8-26 Vü (bei 140« getrocknet). H, SO, = 22-48 «/o- N = 32-llVo- Auf kristalhvasserfreies Salz berechnet: (05115X50)2112804. MG. = 400-26, 1. M. = 60235, C = 29-98Vo, H = 3-02Vo ^ N = 35-OOVo, Ha SO, = 24-50''/o- Das Guaninsnlfat zersetzt sich mit Wasser in freies Guanin und in Schwefelsäure, die noch etwas Guanin gelöst hält. Gibt in sodaalkalischer Lösung mit einer Lösung- frisch bereiteter Diazobenzolsulfosäure intensive Rotfärbung. \) Darstellung- der Diazobenzolsulfosäure"^): 2 (j feingepulverte Sulfanilsäure werden mit 3 cm ^ Wasser und 2 ciii^ konzentrierter Salzsäure zu einem Brei geschüttelt und in kleinen Portionen innerhalb einer ^linute mit einer Lösung- von 1 c/ frischem Kaliumnitrit in 1 — 2 cni^ Wasser versetzt, woImm nach jedem Zusatz mit kaltem Wasser gekühlt wird. Die Sulfanilsäure geht größtenteils rasch in Lösung und an ihre Stelle tritt alsbald ein dichter, weißer, kristallinischer Niederschlag von Diazobenzol- sulfosäure, der nach einigen Minuten abgesaugt und mit wenig Wasser ausgewaschen wird. Unveränderte Sulfanilsäure beeinträchtigt die Reaktion nicht. Die WeideJsche Probe fällt beim Guanin negativ aus. Weidelsche Probe : Man löst ein wenig Substanz in frisch bereitetem Chlorwasser in der Wärme in einer Porzellanschale, dampft die Lösung im Wasserbade zur Trockne und setzt den weißen oder schwach gelben Rückstand unter einer Glocke einer Ammoniakatmosphäre aus. Bei positivem Ausfall dunkelrosarote bis purpurrote Färbung, die in zweifelhaften Fällen durch leichtes Anwärmen und Betupfen mit wenig Ammoniak deutlicher gemacht werden kann. Zusatz von Natron- oder Kalilauge (in der Wärme) gibt eine blauviolette Farbe. (Die Probe ist eine Murexidprobe ) ( siehe dazu S. 593). Die Xanthinprobe mit Salpetersäure fällt positiv aus. Xanthinprobe: Eine kleine Menge Substanz wird in wenig- Salpeter- säure ri2 spez.Gew. heiß gelöst in einer Porzellanschale auf dem Wasserbade zur Trockne gebracht. Es hinterbleibt bei positivem Ausfall der Probe ein zitronengelber Fleck, der sich in Kali- oder Natronlauge mit etwas dunklerer gelber Farbe löst und beim Erwärmen sich violettrot färbt und einen purpurroten Rückstand hinterläßt. Bei längerem Trocknen auf demWasser- ') B. Burian, Diazoaminoverbindungen der Imidazole und der Purinsubstauzeu. Ber. d.Deutscb. ehem. Ges. Bd. 37. S. 698 (1904). '^) H. Pauli/, tjber die Konstitution des Histidins. Zeitsclir. f. physiol. Chem. Bd. 42. S. 516 (1904). 592 H. Steudel. bade färbt sich der beim Abdampfen der Salpetersäure erhaltene pelbe Rückstand meist röthch, sobakl die zu untersuchende Substanz auch nur Spuren von Chlor') oder eines Chlorides enthielt, Ammoniak liefert dann beim Befeuchten eine dunkelrosenrote bis purpurne Färbung, Kahlauge eine l)lauviolette Farbe (Murexidprobe), siehe dazu S. 59?). Unter dem Mikroskop zeigt das salzsaure Guanin vierseitige, schlanke Säulen, die Auslöschungsrichtung bildet mit den Kanten in den meisten Fällen einen Winkel von 27^ bei einzelnen beobachtet man auch einen solchen von oO".-) 2. Adenin: Pikrat: C^H^N^ .CHjNaO-, MG.=:a64-14, 1. M.= 56127, Schmelzpunkt 280» (unkorr.). C = 36-25o/o, H = 2-21Vo, N =: SO-TSVo- FäUt beim Umkristallisieren kristahwasserfrei in makroskopischen Prismen aus. Löslichkeit in Wasser 1 : 3500 bei Zimmertemperatur. Sulfat: (CsH^NsJaH-^SO^ + 2H2O. MG. - 404-29, 1. M. ^ 60669, H2O — 8-91''/o (bei HO« getrocknet), N = 34-65 Vo , H.^SO, = 24-26'Vo. Löslichkeit in Wasser 1 : 15.3 bei Zimmertemperatur. Zersetzt sich nicht beim Umkristallisieren. Das wasserfreie Salz (C5H5N5),H2S04, MG. = 368-26, 1. M. = 56616, verlangt: C=32-59Vo, H = 3-28o/o, N = 38*04 "/o, H^SO, = 26-63Vo. Zur Erkennung kleiner Adeninmengen eignet sich das Salz mit Gold- chlorid, das unter dem Mikroskop charakteristische Formen zeigt. Die Aus- löschungen liegen bei den Skelettformen sowie bei den prismatischen Ge- stalten parallel der Längsrichtung. Die Kristalle des salzsauren Salzes sind derl)e Prismen, die oft einen Winkel von 137" zeigen, ^j Das Adenin gibt in sodaalkalischer Lösung keine Pveaktion mit Diazobenzolsulfosäure 3), TUeic^e^sche Pteaktion und Xanthinprobe fallen negativ aus. 3. Xanthin wird identifiziert am besten als freie Base. Es fällt entweder amorph wasserfrei aus oder kristaUisiert mit 1 Mol. Kristall- wasser, das es bei 125—130" abgibt. Löshch in 13.000—14.000 Teilen kaltem, in 1300 — 1400 heißem Wasser, schwer löslich in Alkohol, leicht löslich im Überschuß von Ammoniak und Alkalihvdrat. CsH.N, O2, MG. = 152-07, 1. M. = 18204, 39-46«/o C 2-65«/o H, 36-857o N. Es gibt die Xanthin- und die WeldeUdV^ Probe. 4. Hypoxanthin erkennt man ebenfalls am besten als freie Base, farblose, mikroskopische Kristalle, löslich in etwa 1400 Teilen kalten, in 70 Teilen heißen Wassers, fast unlöshch in Alkohol, leicht löshch in ver- dünnten Säuren und Laugen. *) M. Stadfhafifn, Über das Vorkommen der Harnsäure in verschiedenen tierischen Organen, ihr Vorkommen bei Leukämie und die Frage ihrer Entstehung aus den Ötick- stoffbasen. Virchows Archiv. Bd. 109. S. 39.5 (1887). ^) Behrens, Kossei nnd Seh iejf'erdecker, Das Mikroskop und die Methoden der mikro- skopischen Untersuchung. Braunschweig. Harald Bruhn. 1889. S. 278, 280. ^) //. Steudel, Über die Oxydation der Nukleinsäure. I. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 48. S. 428 (1906). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauproduktc. Ö9:j CsH.N.O, xMG. = 136-07, 1. M. = imi6, UW/o C, 2-SH]^/o H, 4M97„N; oder als in Salpetersäure schwerlösliches Nitrat: CsH.N.O.HNO, + 11,0. Gibt sein Kristallwasser bei 105" ab. 8-29ö/o H2O. Bei 120" gibt das Salz schon Salpetersäure ab. C,H,N,0.HN03, MG. = 199-01), l.M.^r 29905, ;iO-14V„C. 2-53«/o H, 35-18«/o N. Das Hypoxanthin gibt weder die T-Feif^e/sche noch die Xanthiii[)i()be. Stellt man die Reaktionen der einzelnen Basen der Xanthin- (X) und der Weidehchen (W) Probe gegenüber zusammen, so erhält man folgendes Bild : Guanin: Wo . X + Adenin : W 0 . X 0 Xanthin : W + . X + Hypoxanthin : Wo . X 0 Harnsäure: W + . X + Cytosin : W + . X + Uracil: W + .X + Thymin: Wo .X 0. Aber eine Unterscheidung der einzelnen Purinkörper nach diesem Schema und etw^a gar nach dem Ausfall der Farbennuancen bei Über- sättigung mit Alkali oder NH3 ist gänzlich problematisch, es wäre am besten, für die beiden Proben die gemeinsame Bezeichnung ..Murexid- probe'' einzuführen. Siehe dazu auch E. Fischer.'^) Man führt die Probe am besten so aus, daß man wenige Körnchen der zu untersuchenden Substanz mit frisch bereitetem Chlorwasser oder Salzsäure und etwas Kaliumchlorat in einem kleinen Porzellanschälchen bis zum gehnden Sieden über einer kleinen Flamme erwärmt und darin auf dem Wasserbade zur Trockne verdampft. Eine zweite Substanzmenge be- handelt man in gleicherweise mit Salpetersäure von PTi spez. (iew. Den eventuell gelblich gefärbten Pückstand betupft man mit wenig Ammoniak und erwärmt noch einmal wieder gelinde. In manchen Fällen kommt dann die purpurrote Färbung rascher zum Vorschein. Eine andere Stelle des lUick- standes prüft man mit Natronlauge oder Kalilauge. 5. Cytosin wird identifiziert entweder als Platinchlorhydrat: (C, H5 0N,)2 Pt Cl, 2 HCl, MG. = 6:U-6, 1. M. = 80044, C = 15-19Vo, H = l-90Vo, N = 13-31"/o, Pt=:30-84%, Cl=33-68Vo; oder als Pikrat: CiHäONa.C.HaO^Ns, MG. = 340-12, 1. M. = 53163, C =: 35-26 »/o, H rr 2-370, 0, ;f^ =, 24-75Vo. Hellgelbe, glänzende Nadeln, die bei 255" sich bräunen und bei 270» (unkorr.) unter Zersetzung schmelzen. ^) E. Fischer, Synthese des Hypoxantliiiis, Xanthins. Adenius und (iuanins. Bcr. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30. S. 2236 (1897). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 38 594 H. Stoudel. Das Cytosin gibt die W^cidehc\\Q Probe. Das Platindoppelsalz des Cvtosins zeigt doppeltbrechende Zwillings- formon. die so aneinander gelagert sind, daü die Auslöscliungsrichtung in dem einen Kristall einen Winkel von 53" mit der Auslöschiingsriclitimg des anderen Kristalls bildet. ^) 6. Thymin: Die Identifizierung des Thymins kann nur durch die Elementaranalyse geschehen. Erleichtert wird die Erkennung der Substanz durch seine Sublimationsfähigkeit und durch den charakteristischen Winkel 2) seiner Kristalle (60°). CHeN-jO.,, MG. =:l-i(VOT. l.M. = 10062, C = 77-600/o. H = 4-80Vo, N = 22-22«/o. Löslichkeit in Wasser bei Zimmertemperatur 1 : 350 H., t ). in heißem Wasser und heißem Alkohol leicht löslich. 7. Das Uracil liKJt sich gleichfalls nur durch die Elementaranalyse erkennen. Es gibt die Weidehche Probe und kristaUisiert häufig in kreidig aus- sehenden Scheiben, die aus konzentrisch angeordneten Nä deichen bestehen. C,H,Ü.,X.,, MG. = 11205. l.M. = 04940, C = 42-82o/o- H = 3-59»/o, N = 25-05 Vo. 8. Die L ä V u 1 i n s ä u r e kann als S i 1 li e r s a 1 z bestimmt werden. C5H7O3 Ag — charakteristischer, kristallinischer Niederschlag, aus Wasser in Blättchen, löslich in 150 Teilen Wasser bei 17° C = 26'9lVo, H=3-14«/o, Ag = 48'43o 0, oder als Hydrazon durch Zusatz von essigsaurem Phenyl- hydrazin zur Lösung von Lävulinsäure, CjiHi^NgG.,, C=:64'07Vo5 H=r6'79Vo) N = 13-59 Vo, F. P. = 108". Die Kristalle zersetzen sich schon beim Aufbewahren im Exsikkator. 9. Epiz ucker säure wird als Chininsalz identifiziert. (Bei 90" getrocknet. ) ( C.,« H.., N., O.^ k C^ H^o ( )8 , MG. = 858-48 , 1. M. = 93373, C=:64-28"/o^ H = 6-81«/o, N = 6-54Vo- Lange Nadeln, in kaltem Wasser schwer, in heißem leicht löslich; leicht löslich in Alkohol. Die Erkennung resp. Identifizierung der echten Nukleinsäure selbst in Gemischen unbekannter Körper ist sehr schwer. Man unterwirft die Flüssigkeiten eventuell dem Neumann^clien \'erfahren und sieht, ob man auf diese Weise einen Niederschlag bekommt. Kriterien der Pieinheit der Nukleinsäure sind: Freiheit von jeglicher Eiweißreaktion: nukleinsaures Natron gibt, wie schon S. 575 erwähnt, mit Alkohol allein keinen Nieder- schlag, sondern erst auf Zusatz weniger Tropfen einer konzentrierten Na- triumacetatlösung. Der entstandene Niederschlag muß, eventuell nach Über- führung in das Kupfersalz, auf seinen Phosphor- und Stickstoffgelialt quantitativ untersucht werden. Hat man genügend Substanz zur Verfügung^ ') A. Kosscl und 7/. Steudel, Über das Cytosin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 37. S. 379 (1903). 0 W. GnUwitsch, Über das Thymin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 27. 8.292(1899). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Al)bauprodukte. 595 SO ist noch eine quantitative Bestimmung der Alloxurhasen (als Nitrate) nach der Salpetersäiu'emethode anzuschließen. Pflanzliche Nukleinsäuren. Von den im Pflanzenreich vorkommenden Nukleinsäuren sind bisher nur die aus Hefe und die aus Weizenembryonen näher untersucht. Hefenukleinsäure. An die Isolierung und Erforschung- der Hefenukleinsäure hat man sich sehr frühzeitig gemacht ; Methoden zu ihrer Darstellung sind von Altinann^), Herlant'^) und Slade^) angegeben. Hier sei die Methode von Slude Aviedergegeben : Frische Brauereihefe wird mit ri"/o ihres Gewichts an Ätznatron lebhaft verrührt, in wenig Wasser gelöst und das 2- bis :-)fache an kristalhsiertem Natriumacetat in Substanz zugesetzt. Gewöhnlich kommen auf 100 Pfd. Hefe 2*8 Pfd. Natriumacetat. Die Lösung bleibt 24 Stunden stehen bei gewöhnlicher Temperatur und wird dann 1 Stunde lang gekocht. Die heiße Lösung wird mit Eisessig bis zur schwach sauren Reaktion neutrali- siert und zum erkalteten Filtrat wird Magnesium sulfat in Substanz (5'% der Lösung) und dann Salzsäure unter L'mrühren hinzugesetzt, bis ein flockiger Niederschlag entsteht. Der Niedersclilag ist im Überschuß der Säure zu einer milchigen Flüssigkeit löshch. Ist dies der Fall, so muß mit Natronlauge wieder neutralisiert und noch einmal gefällt werden. 2'5Vo starker Salzsäure in der Flüssigkeit genügen im allgemeinen zur voll- kommenen Ausfäilung. Ausbeute 0"5Vo dei' in Angriff genommenen Hefe. Phosphorgehalt des Produktes etwa T^/q. Der Abbau der Hefenukleinsäure und die Darstellung der Spaltungs- produkte erfolgt nach denselben Grundsätzen und Methoden wie bei der tierischen Nukleinsäure, mit der sie vielleicht identisch ist. Ob die Hefe- nukleinsäure eine Pentosegruppe*) und eine reduzierende Hexose*) in ihrem Molekül enthält, bedarf weiterer Untersuchung. Piasminsäure. Die Isoherung der zuerst von Kossei beschriebenen Plasm insäur CiäHasNßPeOao, die aus der Hefe dargesteUt werden kann und über deren 1) R. Altmann, trber Nukleinsäuren. Arch. f. (Anatomie und) Physiologie. 1889. S. 525. '-) L. HerJant, Untersuchungen über die Nukleinsäure aus unrcitor Laclisniilcli, aus Kalbsthymus und aus Hefe. Arch. f. exper. Path. u. Pharm. U<\. 44. S. 157 (U)(»0). ») H. B. Stade, Bemerknno- zur Darstellung von Nukleinsäure. Am. .Tourn. of Physiol. Vol. 13. p. 464 (1905). *) A. Kossei, Über die Nukleinsäure. Arch. f. (Anatomie und) Physiologie. 1893. S. 159. — Nach Levene und Jacobs, Ülter Hefenukleinsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 42. S. 2703 (1909) soll die Pentose d-Ribose sein. 3S* 596 H. Steiulel. genetische Beziehung zur Hefenukleinsäure vorläufig nichts bekannt ist, geschieht am besten nach folgender Methode. i) 12 / untergärige gepreßte Hefe werden in 3 / HO'^/oiger Natronlauge gelöst, nach etwa einer Mertelstunde die Lösung mit 2 l Wasser verdünnt, mit 2 l 48''/oiger Eisenchloridlösung gefällt und die Masse durch Spitz- beutel filtriert. Das etwa 4 — 5 l betragende braune Filtrat wird in das gleiche Volumen einer ^lischung von konzentrierter Salzsäure und 85"/oigem Alkohol unter Umrühren hineingegossen. Die Salzsäuremenge muß eben ausreichen, um die Flüssigkeit sauer zu machen und wird jedesmal durch Titrierung des alkaüschen Filtrates ermittelt. Man läßt den Niederschlag sich absetzen, hebert die darüber stehende Flüssigkeit ab, zentrifugiert den Niederschlag, wäscht und trocknet ihn mit Alkohol und Äther und bringt ihn in das Vakuum. Die Ausbeute an diesem Rohprodukt {X} beträgt 40— 80f/, sein Phosphorgehalt 5— lOVo, im Mittel 7o/o- Es wird mit Wasser extrahiert, darauf filtriert ; das gelbe Filtrat von neuem mit Salz- säure und Alkohol, dem etwas Äther zugesetzt wird, gefällt, der Nieder- schlag mit Alkohol und Äther gewaschen, getrocknet und ins Vakuum gebracht. Die Ausbeute an diesem zweiten Produkt (B) beträgt 5 — 10 g, sein Phosphorgehalt lo — 23"/o. gewöhnhch 14"/ o- Wird B mit OlOVoiRer wässeriger Salzsäure extrahiert, das opalisierende Filtrat durch Alkohol und etwas Äther gefällt, der Niederschlag mit Alkohol und Äther gewaschen und getrocknet, so erhält man die Piasminsäure ; der in wässeriger Salz- säure ungelöst bleibende Teil, der auch ganz fehlen kann, ist Nukleinsäure. Ausbeute an Piasminsäure 4—5 g aus 12 l Hefe. Triticonukleinsäure. Die Nukleinsäure aus dem Weizenembryo, Triticonukleinsäure, wurde von Oshorne und Harris -) dargestellt und untersucht. Auch hier schließen sich die Methoden der Isolierung der Spaltungsprodukte ziendich an die oben beschriebenen an, so daß von einer ausführlichen Darstellung Abstand genommen werden kann. Als Spaltimgsprodukte der Triticounkleinsiiure sind gefunden: Guanin, Adenin, Cytosin, üracil. Phosphorsäure und eine l'entose ; Thymin und ein Hexakohleuhydrat sollen fehlen, auch soll in dieser Nukleinsäure das Uracil nicht aus dem Cytosin durch desamidierende Wirkung der Schwefelsäure sekundär hervorgehen, sondern im Molekül präformiert vorhanden sein. Die Verhältnisse sind aber noch nicht genügend geklärt, so hat z. B. Oshorne in seinen quantitativen Berechnungen der Spaltungsprodukte der Triticonukleinsäure eine unbekannte Größe x (das damals nicht genügend bekannte Cytosin) eingeführt und damit eine eigentliche quantitative Bestimmung illusorisch gemacht. Die Formel der Triticonukleinsäure wird von Oshorne und Harris zu C^j Hgj y,g P4 O3, angegeben. Da bei der Spaltung aus ihr 1 Molekül Guanin und Adenin und 2 Moleküle Uracil hervorgehen sollen, so bleiben, da die Summe der Stickstoffatome dieser Spaltungs- produkte 14 beträgt, für das Cytosin nur noch 2 Stickstoff atome übrig; Cytosin enthält ^) A.Ascoli, Über die Piasminsäure. Zeitschr. f. physiol. Chem.Bd.28. 8.4:26 (1899). j '') Tli. B. Oshorne und J. F. Harris, Die Nukleinsäure des Weizenembryos. Zeitschr. | f. physiol. Chem. Bd. 36. S. 85 (1902). j Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodukte. 597 aber 3 N- Atome. Nach seinen neueren Angaben ist Oshorne^) geneigt, auf 4 Phosphor- atome 1 Molekül Guanin, Adeuin, Cytosin und Uracil anzunehmen; dann erhält man als Summe der Stickstoffatome der Spaltungsprodukte 15 und es wäre in seiner Formel ein Stickstoffatom zu viel. Außerdem würde zu einer solchen Annahme nicht die Aus- beute an Uracil stimmen, die Oshorne und Harris früher erhalten haben (ll'/o), denn für 1 Molekül Uracil sind nur 8° g berechnet und Oshorne und Harris haben es früher für wahrscheinlicher gehalten, daß sie mit Verlust gearbeitet haben, und geglaubt, ihre Ausbeute von IP/o Uracil passe besser zu einem Gehalt von 2 Molekülen Uracil in der Triticonukloinsäure (berechnet 16" q). Eine Berechnung der C- Atome führt ebenfalls zu keinem befriedigenden Ergebnis: Für 1 Molekül Guanin, Adenin, 2 Moleküle Uracil und 3 Moleküle einer Pentose ergeben sich 33 C- Atome ; da in der Formel 41 vorhanden sind, blieben für das unbe- kannte Spaltungsprodukt x 8 übrig. Setzt man für die Formel des Cj-tosins (C^ H5 ON3) ein, so müßten 2 Moleküle davon in der Triticonukleinsäure vorhanden sein — dazu paßt aber wieder nicht der Stickstoffgehalt. Rechnet man aber als Spaltungsprodukte 1 Molekül Guanin, Adenin, Cytosin und Uracil, wie dies Oshorne ^) und Heiß tun (und 3 Moleküle Pentose), so ergeben sich ebenfalls 33 C-Atome und die Schwierigkeit bleibt dieselbe. Hier müssen also weitere Untersuchungen Klarheit schaffen. Daß ferner das Uracil gerade bei der Triticonukleinsäure nicht von dem primär vorhandenen Cytosin stammen soll, ist nach meinen bisherigen Erfahrungen an der echten Nukleinsäure sehr unwahrscheinlich. Guanylsäiire und Inosinsäure. Den Nukleinsäuren nahe stehen zwei Substanzen, die ebenfalls substi- tuierte Derivate einer Phosphorsäure sind, die Guanylsäure und die Inosinsäure. Die Guanylsäure wurde zuerst von Bang-) aus dem Nukleoproteid des Pankreas dargesteht; sie ist aueli in anderen Organen ^) aufgefunden worden. Das von Bavg und Raaschou *) angegebene Verfahren eignet sich nicht zur Gewinnung einer reinen Guanylsäure. Darstellung des Nukleoproteids aus Pankreas nach Hamniarsten/") Frische Drüsen, direkt aus dem Schlachthaus bezogen, werden zer- kleinert und mit Wasser rasch zum Sieden erhitzt; nach dem Erkalten \\ird filtriert und aus dem hellbernsteingelben Filtrat das Nukleoproteid durch Zusatz von 5— lOVooi^ei' Essigsäure ausgefällt. Die Fällung wird zur Reinigung in Wasser gelöst und noch einmal mit Säure wieder ausgefällt. 1) Th. B. Oshorne und F. TU. Hcifl. Die Pyrimidinderivate der Nukleinsäure. Am. Journ. of Physiol. Bd. 21. S. 157 (1908). -) ./. Bang, Die Guanylsäure der Pankreasdrüse und deren Spaltungsprodukte. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd' 26. S. 133 (1898). =) \V.. Jones und L. G. Rowntree, On the guauylic acid of the spieen. Journ. of biological chemistry. Bd. 4. S. 2!^9 (1908). — P. A. Levene und ./. }fandcl, Zur Chemie der Lebernukleoproteide. Über die Guanylsäure. Biochem. Zeitschr. Bd. 10. S. 221 (1908). *) J. Bang und C. A. EaascJwu, Ülior die Darstellung der (uiaiiylsäure. Beiträge zur chem. Physiol. u. Path. Bd. 4. S. 175 (1903). °) 0. Hammarsten, Zur Kenntnis der Nukleoproteide. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 19. S. 19 (1894). 598 H. Steudel. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Alkohol imd Äther getrocknet. Es resultiert ein feines, staubendes, weißes Pulver ; Phosphorgehalt durch- schnitthch 4-5Vo P-') Darstellung der Guanylsäure ^) aus dem Nukleoproteid. Portionen von je 12 g Proteid werden mit 400 c^/;^ SVoigei" Kalilauge versetzt und eine halbe Stunde lang im siedenden Wasserbade gehalten, dann mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert und kochend heiß filtriert. Am nächsten Tage hat sich ein Bodensatz abgeschieden, der filtriert und aus heißem Wasser umgelöst wird. Dann wird der Niederschlag in P/oiger Kalilauge gelöst, vom Ungelösten filtriert und zum Filtrat 50/'oige Essigsäure im gei'ingen Überschuß zugesetzt, der Niederschlag filtriert, mit Alkohol gewaschen und mit Äther getrocknet. Ausbeute ca. lO"^/,, des Ausgangs- materials. Phosphorgehalt des Präparates ca. T'ÖVo, Stickstoffgehalt IS^/o-^) Eigenschaften der Guanylsäure. Die Guanylsäure ist im Gegensatz zur echten Nukleinsäure in Essig- säure unlöslich, in Salzsäure leicht löslich. Beim längeren Stehen in salz- saurer Lösung wird sie zersetzt. In warmem Wasser ist sie leichter löshch wie in kaltem, sie fällt also beim Abkühlen der L()sung teilweise aus, Löslichkeit in kaltem Wasser O'Ho/o- Die Alkalisalze sind leicht in Wasser löslich, die Schwermetallsalze in Wasser nicht löslich. Die Guanylsäure wird nach Bang von Gerbsäure und Pikrinsäure, ebenso von Phosphorwolframsäure in saurer Lösung gefällt. Sie gibt keine Millonsdie und Biuretreaktion; sie reduziert FehVing- sche Lösung nicht, wohl aber nach dem vorherigen Kochen mit Salzsäure oder Schwefelsäure und Entfernung des Guanins. Die Guanylsäure ist rechtsdrehend. Als Spaltungsprodukt der Guanylsäure bei der Hydrolyse mit Schwefel- säure hat man als einzigen stickstoffhaltigen Körper Guanin aufgefunden, außerdem entsteht Phosphorsäure und eine Pentose, die nach Nenherg^) 1-Xylose. nach Levene *) d-Pdbose sein soll. Glyzerin ist kein Bestandteil der Guanylsäure. ■') Die Darstellung der Spaltungsprodukte geschieht am besten nach folgender Vorschrift ^j: ') Siehe auch H. Sfendd, Üher die Guanylsäure aus der Pankreasdrüse. Zeitschr. f. physiol. ehem. Bd. 53. S. 54U (1907). -) J. Bang , Die Guanylsäure der Pankreasdrüse und deren Spaltungsprocliikte. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 26. S. 133 (189S). ^) C. Nenberg, Üher die Konstitution der Pankreasproteidpentose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 35. IL S. 1467 (1902). *) P. A. Levene und W. Ä. Jacobs, Über Hefeuukleinsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 42. S. 2703 (1909). ^) IL SteudcJ, Über die Guanylsäure aus der Pankreasdrüse. Zeitschr. f. physiol. Chera. Bd. 53. S. 541 (1907). Xukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodukte. 599 10 f/ Guaiiylsäure werden mit 500 cm^ öVoiger Schwefelsäure 3 Stunden lang im siedenden Wasserbad erwärmt. Beim Abkühlen scheidet sich Guanin- sulfat in langen Nadeln aus. Die Reaktionsflüssigkeit wird dann einer energischen Ätherextraktion in dem von Kiitscher und Stcudel beschriebenen Apparate unterworfen. In das Ätherextrakt geht Furfurol über. Nach der Extraktion mit Äther wird die Zersetzungsflüssigkeit mit Natronlauge genau neutraüsiert , worauf sich fast sämtliches Guanin als amorpher, flockiger Niederschlag ausscheidet. Das Filtrat vom Guanin zeigt starkes Reduktionsvermögen gegen FeJiling&che Lösung. Aus ihm kann ein Osazon dargestellt oder ein Derivat der Pentose in Form von 1-Xylonsäure durch Oxydation mit Brom^) ge- wonnen werden, doch macht die Darstellung Schwierigkeiten. Die Elementarformel der Guanylsäure (von Bang-) zu C44H6r, N.^o l\ (J34 angegeben) entspricht nicht den Resultaten meiner Untersuchungen und bedarf einer Richtigstellung. Die von Bany^) vorgeschlagene Bezeichnung x- und [i-Guanylsäure ist besser fallen zu lassen, die a-Guanylsäure ist nichts anderes wie echte Nukleinsäure, die ß- Guanylsäure ist die gewöhnliche Guanylsäure. Inosinsäure. Der Guanylsäure ganz analog zusammengesetzt ist die Inosinsäure, sie ist eine Hypoxanth}lsäure. Sie wurde von Liebig ^) im Fleischextrakt aufgefunden, ihr Phosphor- gehalt aber erst von Baiser-') entdeckt. Die Darstellung der Inosinsäure geschieht am besten nach der von Haiser angegebenen Methode: 1 kg Fleischextrakt wird am Rückflußkühler mit mehrfacb (ß — 4mal) gewechseltem absoluten Alkohol (je S 1} ausgekocht, bis der Rückstand eine zerreibliche blasse geworden ist. Sie wird in mäßig warmem Wasser (2 — H /) gelöst, filtriert und das Filtrat vorsichtig mit Barytwasser ausgefällt, bis sämtliche anorganischen Phosphate niedergeschlagen sind. Da die Inosin- säure ein schwer lösliches basisches Baryumsalz bildet, so hegt die (Gefahr nahe, daß in den Barytniederschlag auch die Inosinsäure mit hineingeht. Man prüft also von Zeit zu Zeit während des Barytzusatzes, ob das Filtrat noch ehie starke Phosphorsäurereaktion zeigt, und betrachtet in dem Zoit- 1) C. Neubcrg, t)ber die Konstitution derPankreasproteidpentose. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 35. II. S. 1467 (1902). "-) J. Bain/, Chemische und physiologische Studien über die Guaiiylsiuire. I. Teil. Chemische Studien. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 31. S. 411 (1901). 3) J. Bang und C. Ä. Raaschou, Über die Darstellung der (iuanylsäure. Beitrüge zur chem. Physiol. u. Pathol. Bd. 4. S. 175 (1903). *) ./. Liebig, Über die Bestandteile der Flüssigkeit des Fleisches. Liebigs Anualen Bd. 62. S. 317 (1847). ^) F. Haiser, Zur Kenntnis der Inosinsäure. Sitzungsberichte der kais. Ak. d. \\iss. zu Wien. Mat.-nat. Klasse. Bd. 104. Abteilung IIb. S. 205 (1895). (Monatshefte für Chemie. Bd. 16. S. 190.) 600 H. Steiulel. punkt die P'ällung als beendet, Menn die Reaktion nur noch äußerst schwach auftritt. Der entstandene Niederschlag besteht vorwiegend aus phosphor- saurem und Spuren von schwefelsaurem Baryt. Das Filtrat, welches nun stark alkalisch reagiert, ^^ird mit verdünnter Schwefelsäure genau neutrali- siert, und hierauf mit einer konzentrierten Lösung von Silbernitrat so lauge versetzt, bis durch weiteren Zusatz desselben die Bildung eines Nieder- schlages nicht mehr erfolgt. Die Ausscheidung besitzt anfänghch eine gelb- braune Farbe, ist sehr voluminös und verändert beim längereu Stehen, namentlich am Lichte, ihre Farbe. Man filtriert deshalb rasch, wäscht mit kaltem Wasser so lange, bis die Hauptmenge der Lauge entfernt ist, und zersetzt den Niederschlag in der Kälte mit Schwefelwasserstoff. Dabei scheidet sich das Schwefelsilber meist so fein ab, daß eine Abtrennung desselben durch Filtration nicht durchführbar ist. Nach beendeter Zersetzung verdrängt man den Schwefelwasserstoff durch anhaltendes Durchleiten eines Luftstromes, liringt dann die Masse in eine Schale und erwärmt, nachdem man vorher kohlensaures Baryum eingetragen hat. Daß das Erwärmen erst nach dem Zusätze des letzteren erfolgen darf , kann nicht genug hervorgehoben werden , da Lösungen von freier Inosinsäure sich in der Hitze ziemlich rasch zersetzen. Nach dem Aufkochen zeigt die Flüssigkeit neutrale Reaktion und läßt sich nunmehr in der Regel vom Schwefelsilber und dem Überschuß des Baryumkarbonates filtrieren. Die Lösung wird hernach auf dem ^Yasserbade, bei etwa 80", auf ca. 250 crn^ eingeengt. Wenn nun die Flüssigkeit einige Zeit gestanden hat, beginnt die Ausscheidung von prächtig glänzenden Blättchen, die vorwiegend aus inosinsaurem Baryt bestehen. Sie werden, wenn sie sich nicht mehr ver- mehren, was nach ca. 12 Stunden der Fall ist, von der Mutterlauge durch Absaugen getrennt. Diese besitzt meist eine dunkle Farbe und liefert beim weiteren Eindunsten nur höchst unbedeutende ]\Iengen des Salzes. Die abgesaugte Masse löst man in Wasser von 80" und eiitfäi'bt mit Tierkohle. Nach dem Filtrieren beginnt bei entsprechender Konzentration der Lösung eine reichliche Ausscheidung \ierseitiger Blättchen, die Perlmuttergianz besitzen und die sich so rasch vermehren, daß nach kurzer Zeit das Ganze zu einem Kristallbrei erstarrt. Nach dem Trocknen der von der ]\Iutter- lauge getrennten Kristalle hat die Substanz das Aussehen von poliertem Silber, eine Eigentümlichkeit, die auch LithUj betont. Ausbeute: Aus 1 kg Fleischextrakt 5 — 7 g reines Barytsalz , doch enthält das Fleischextrakt nicht immer diese Mengen Liosinsäure. Eine andere Methode zur Darstellung der Inosinsäure ist von Bauer'^) angegeben : 500 7 Liehigsi^hes Extrakt werden in 2\ , ^ Wasser gelöst, die Lösung mit 40 (/ Tierkohle verrührt und im Brutschrank (bei 87") unter oftmahgem Umrühren sich selbst überlassen. Dann wird die Flüssigkeit V2 Stunde ang mit der Schüttelmaschine geschüttelt, hernach sofort filtriert. Das M Fr. Bauer, LTber die Konstitution der Inosinsäure und die Muskelpeutose. Beiträge zur Physiol. u. Pathol. Bd. 10. S. 345 (10O7). Nukleinsäuren und deren Abbauprodukte : Isolierung der Abbauprodukte. (301 Filtrieren nimmt lange Zeit in Anspruch; es wird dadurch die Lösung von allerhand ^>runreinigung•en befreit, vor allem von gei-ingen Mengen einer kolloidalen Sul)stanz, die sonst das weitere Arbeiten aurieroi-deutiicli erschwert. Das Filtrat, eine dunkelrote bis braune Flüssigkeit, die ganz klar sein soll, wird mit \Yasser auf 5 / verdünnt. Nun werden die anorganischen Phosphate durch Fällung mit einer 20"/oigen Lösung von Baryumacetat beseitigt, doch soll ein Überschuß an Acetat vermieden werden. Dann wird von einer kaltgesättigten Lösung von Barvumhydroxyd so lange zugesetzt, bis die vorher saure Reaktion schwach alkalisch zu werden beginnt. Es wird dann filtriert und das Filtrat noch genau auf die Anwesenheit von Phosphorsäure geprüft, doch darf bei den Phosphorproben mit konzentrierter Salpetersäure und molybdän- saurem Amnion nicht zu stark erhitzt werden, da sonst organisch gebundener Phosphor frei wird. Wird noch anorganischer Phosphor nachgewiesen, so muß derselbe durch nochmaligen Zusatz von Baryumacetat und Baryum- hydroxyd beseitigt werden. Die vom Phosphat befreite Lösung gibt nach dem Kochen mit kon- zentrierter Salpetersäure neuerUch eine starke Phosphorsäurereaktion mit molybdänsaurem Ammoniak durch Abspaltung des organisch gei)un(lenen Phosphors. Es wird nun eine Lösung von basischem Bleiacetat so lange zugesetzt, bis keine weitere Fällung mehr entsteht, der Niederschlag von der Flüssig- keit durch Filtrieren oder noch besser durch Zentrifugieren getrennt, schliei)Iich auf dem Saugiilter abgesaugt. Der Niederschlag wird einer drei- mahgen Waschprozedur unterzogen, deren genaue Ausführung sehr wichtig für die Erzielung einer guten Ausbeute ist. Der Niederschlag wird mit etwa l',../ Wasser in der Pveibschale sorgfältig verrührt und auf der Nutsche abgesaugt; beim dritten Waschen kann man den Niederschlag nur absaugen, wenn man auf das Nutschfilter eine Schicht fein gepulverten Baryumkarbonats gestreut hat. Der so mit Baryumkarbonat vermengte Niederschlag wird wieder verrieben, aufgeschwemmt und mit Schwefelwasserstoff zerlegt, das Filtrat nach Beseitigung des Schwefelwasserstoffs in der Kälte nochmals mit basischem Bleiacetat bis zur vollständigen Ausfällung versetzt. Der Nieder- schlag wird wieder, wie oben beschrieben, dreimal durch Aufschwemmen gewaschen, wieder mit Schwefelwasserstoff zerlegt, wobei man ein schwach gelb gefärbtes Filtrat erhält. Dieses wird nach Entfernung des Schwefel- wasserstoffs bei niederer Temperatur (etwa 40») langsam eingedampft. Dazu werden große, etwa 4— 5 ? fassende Schalen mit flachem Boden be- nutzt, die am besten in einen großen Brutraum, der 40o hält, hineingestellt werden. Es treten allmählich am Boden Kriställchen auf, die zum Teil kugehge Drusen bilden. Lst der Schaleninhalt bis auf etwa 30 n»» einge- dampft, so wird die ganze Masse in ein Spitzglas gebracht, nach dem .\b- setzen der Kristalle der überstehende Sirup abgegossen und die zarte Kristallmasse durch mehrmaliges Aufschwemmen mit ganz wenig Wasser 602 H. Steudel. von den Resten des Sirups annähernd befreit; sie stellt dann eine lachs- rote Masse dar, die durch Umkristallisieren aus heißem ^Vasser von der rot gefärl)ten Substanz befreit ^vird und dann millimeterlauge schöne Nä- delcheu bildet, die durch nochmaliges Umkristallisieren schneeweiß erhalten ■werden. Ausbeute: 3f/ Barvtsalz aus 1 hy Fleischextrakt. Haiser hat neuerdings eine andere Methode zur Darstellung der Inosin- säure angegeben : Das Extrakt wird in etwa 5 Teilen warmen Wassers von ungefähr 40" gelöst und Barvthydrat zugesetzt, bis kein Niederschlag erfolgt. Man scheue sich nicht davor, daß im Filtrate Baryt erscheint, sondern setze so lange Baryt zu, als im Filtrate noch ein Niederschlag entsteht. Es ^^^rd hierbei aus so verdünnter Lösung weder Inosinsäure noch Karnin gefällt, was bei Inosinsäure wenigstens in konzentrierterer Lösung der Fall wäre. ^ ) Nach dem Absaugen des Barytuiederschlages, der übi-igens nach dem Auswaschen mit heißem Wasser nur Spuren von organischen Substanzen enthält, wird die starke alkalische Flüssigkeit mit Essigsäure neutralisiert. Sodann wird in der Kälte mit Bleiessig ausgef^iUt, indem man so lange davon zusetzt, bis eben kein Niederschlag mehr entsteht. Ein Überschuß ist zu vermeiden, da dieser lösend auf den Niederschlag wirkt. Aus dem mit kaltem Wasser gut ausgewaschenen Niederschlage gewinnt man nach Zerlegung mit Schwefelwasserstoff in der Kälte, Aufkochen mit Baryumkarbonat und Ein- kochen des Filtrates im Vakuum den inosinsauren Baryt, und zwar 5 — i6g aus einem Pfund Fleischextrakt. Die Ausbeute hängt ganz von der Frische desselben al); aus alten dunkelbraunen Sorten wurde oft nicht die Spin- gewonnen, aus ganz frischen hellgelben dagegen 7 g. Das Filtrat von der Bleiessigfällung wird mit Ammoniak versetzt, wobei abermals ein Bleiniederschlas' entsteht, der das Karnin enthält. Der Niederschlao- wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und mit Schwefelwasserstoff zerlegt. Dies kann in der Hitze voraenommen werden, geschieht jedoch zweckmäßiger auch in der Kälte, damit etwa entstandene freie Säuren keine Zersetzung hervorrufen. Noch vor dem Abfiltrieren des Bleisulfides werden die Säuren mit Baryumkarbonat neutralisiert, hierauf wird filtriert und zum Sirup eingedampft. Nach dem Lnpfen mit Karnin- kristallen oder nach 24stündigem Stehen kommt die ganze Masse zur Kristallisation. Die Kristalle werden abgesaugt, kalt gewaschen und drei- bis viermal unter Eindampfen mit wenig Tierkohle aus Wasser um- kristallisiert. Die Ausbeute beträgt ebenfalls 5 — Ög pro Pfund frischen Fleischextraktes. Dieses Karnin ist entgegen der bisherigen iVnsicht nicht einheitlich, sondern ein Gemenge aus Hypoxanthin und einem Derivat der Inosinsäure. dem Inosin. Das Inosin ist derjenige Teil des Inosinsäuremoleküls , der nach Abspaltung der Phosphorsäure übrig bleibt, und besteht aus Hypo- xanthin und einer Pentose, MG. = 268. ') F. Haiser und F. Wenzel, Über Kaniin uud Inosinsäure (I. Mitteilung). Monats- hefte für Chemie. Bd. 29. Heft II. S. 157 (1908). Nukleinsäuren luid deren Abbauprodukte: Isolierung der Abbauprodukte. QQ}] Inosin (feine, seiclenglänzende Nadeln): CjoHi,N,05 44-770/oC, 4-47 jet/t tlrei tlurcli .Viibau von Nukleinsäuren in reinem, kristallinischi'in Zustande isoliert worden, nämlich das Inosin. das (luanosin und das .Vdenosin. Aus der (irujjpe der Kohlehydratphosphorsäureii ist bis jetzt nur eine erhalten worartielle Hydi"oIy.se ist ferner aus der 'rhyiiKunikleinsäure die 'riiMiio-i^iyko-phospliors.iure in vcr- liältnismälJi«.; reinem /ii-^taiide erhalten wenden. I. Nukleoside. 1. Inosin, {',„ 11,.^ N4 ( >:,. ist von IJaisrr\uu\ HV;/ct/' ) im Kleiseliexlrakte entdeckt und v' ii'i m l»'iit«..ii im in «tii Jl'. 42. S. 33.') und 11 '.)S d '.)()'.( i. 606 P. A. Leveue. die Hydrolyse bei möglichst neutraler Reaktion ausführen. Bei saurer Reaktion wird ein Teil der Nukleinsäure vollständig- zersetzt. Gegen AlkaUen ist sie, wie die anderen Nukleinsäuren, sehr resistent. 50 g ihres Baryumsalzes werden in 200 cm^ Wasser aufgenommen und im zugeschmolzenen Rohre 4 Stunden auf Ujö" erhitzt. Die vom Baryumphosphat befreite Lösung wird hierauf bis auf ?)00cm'^ eingeengt und die noch nicht zerlegte Inosinsäure, nach dem \'erfahren von Haiser und Wenzel, mit Bleicssiglösung gefällt. Zum Filtrate von diesem Niederschlag werden dann abwechselnd wässerige Ammoniaklösung und Bleizuckerlösung zugegeben, uud zwar solange, als dabei sich noch ein Nieder- schlag bildet. Dieser Niederschlag wird dann in heißem Wasser suspendiert und mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Das Filtrat vom Bleisulfid wird nun unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur von etwa 45° eingedampft. Beim Abkühlen scheiden sich lange, tyrosinähnliche Kristalle des Inosins ab. An der Luft getrocknet enthält die Substanz 2 Moleküle Kristallwasser. — Schon beim Trocknen im Vakuumexsikkator über Schwefelsäure wird das Wasser ab- gegeben. Die Inf ttrockene Substanz sintert bei 85" und schmilzt bei 89—90". Der wasserfreie Körper zersetzt sich unter Verkohlen bei 215". Das Drehungsvermö- 900 gen der wässerigen Lösung ist [aj "r^ = — 49'2". Spaltung des Inosins und Gewinnung der kristallinischen d-Ribose. 5 _r/ Inosin werden in 500 c/^^^ Schwefelsäure aufgelöst und 1 Stunde am Rückflußkühler erhitzt. Zu der Lösung wird ein kleiner Über- schuß an Silbersulfat zugefügt und das Reaktionsgemisch über Nacht stehen gelassen. Vom Silberpurin wird abfiltriert und im Filtrat das gelöste Silber durch Schwefelwasserstoff und die Schwefelsäure mit Baryumkarbonat entfernt. Es ist wichtig, um die Pentose kristallinisch zu erhalten, jede Verunreinigung fern zu halten. Schon eine kleine Beimischung von Mineralsalzen hindert oft das KristaUisieren vollständig. Man benutzt des- wegen zum Entfernen der Schwefelsäure Baryumkarbonat, welches aus um- kristallisiertem Baryumhydrat frisch bereitet worden ist. Das Filtrat vom Baryuni Sulfat wird unter vermindertem Druck zur Sirupkonsistenz ein- gedampft und mit absolutem Alkohol ausgezogen. Die alkoholische Lösung wird , im Vakuumexsikkator langsam eingedunstet und der Rückstand, wenn mög- lich, mit einem KristäUchen von d-Ribose geimpft. Der Sirup erstarrt in ganz ; kurzer Zeit zu einer kristalUnischen Masse. Die Substanz kann dann aus j heißem absolutem Alkohol umkristaUisiert werden. Schmelzpunkt = 87". Das 90« i Drehungsvermögen beträgt [a] ^j. = — 19' 2". I 2. Guanosin. C10H13N5 Ob^), wurde bei der partiellen Spaltung von j Guanylsäure und von Hefenukleinsäure erhalten. Das Verfahren zur Ge- ) winnung des Guanosins war bei beiden Nukleinsäuren ein ähnliches. j Da ziu- Darstellung des Guanosins größere Mengen von Guanylsäure nötig sind, j sei hier ein von Lerciic und Jacobs^) ausgearbeitetes Verfahren zur direkten Gewinnung ^) P. A. Levene und W. A. Jacobs, Über Guanylsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 42. S. 2469 (1909) und Über die Hefe-Nukleinsäure. Ebenda. Jg. 42. S. 2474 (1009). Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. ,•(.- dieser Säure aus der Pankreasdrüse an?e?eben. Die Drüsen werden zerliackt mit Wasser aufgekocht und in die Miscliun- Kaliuniacetat bis zu einem Gehalt von ö» ' eingebracht Zu der noch warmen Lösung wird eine konzentrierte Lösung von Kalilauire" bis zu einem Gehalt von ö^ des Alkalis zugegohen und das Reaktionsgemisch über Nacht stehen gelassen. Es wird dann das Eiweiß mittelst Pikrinsäure und Essigsäure entfernt D'is eiweißfreie Filtrat enthält dann .lie Thymonukleinsäure und die Guanylsäure Vm diese zu trennen, wird in das Filtrat eine 25%ige Bleizuckerlösung eimretragen, solange sich ein Niederschlag bildet. Dieser besteht aus dem Bleisalz der Thvmnnukh'insäure'. Aus dessen Filtrat fällt bei Zugabe von wässerigem Ammoniak ein zweiter Niedersclila-r Er enthält das Bleisalz der Guanylsäure. Dieses Salz wird in heißem Wasser aufgenora'men Der Kolben mit der Suspension wird nun in ein kochendes Wasserbad eingestellt und dann Schwefelwasserstoff durch die Aufschwemmung durchgeleitet. Die vom ßleisulfid ab- filtrierte Lösung wird bei vermindertem Druck und etwa 60" bis zum dicken Sirup eingedampft und dann im Kälteraum bei 1» C stehen gelassen. Die rohe Guanylsäure scheidet sich dabei in gelatinöser Form aus. Zur weitereu Reinieun? kann man die Substanz in heißem Wasser lösen und mit Alkohol fällen. Dieser Niederschlair ist biuret- frei und kann direkt zur Darstellung des Guanosins benützt werden. Man erhält al)er das kristallinische Guanosin leichter, wenn man von gereinigten Präparaten ausgeht. Zu diesem Zweck wird der mit Alkohol erzeugte Niederschlag mehreremal in hemem Wasser gelöst und durch Abkühlung niedergeschlagen. Zur Darstellung- des Guanosins aus Guanylsäure wird diese in einem kleineu Überschuß von Kaliumliydrat gelöst (etwa 3 g der Substanz in 100 cm 3 Lösung) und mit Essigsäure genau neutralisiert. Nun wird im eingeschlossenen Rohre 4 Stunden auf mö« erhitzt. Ist die ang-ewandte Guanylsäure rein gewesen, dann scheidet sich beim Abkühlen der Lösimg das Guanosin in Form einer Gallerte aus, welche mikroskopisch ein filz- förmiges Aussehen besitzt. Beim UmkristaUisieren dieser Substanz bekommt man dann das reine Guanosin. Wird aber die Hydrolyse mit der \\o\\- substanz ausgeführt, dann bleibt die Gallerte auch nach mehrfachem Umfallen amorph und in diesem Falle tut man besser, die Gallerte in heißem Wasser auf- zulösen und mit Rleiessig', Avie es beim Inosin beschrieben ist. zu reinigen. Auch das Guanosin kristalUsiert in langen tyrosinähnlicheu Kristallen. An der Luft getrocknet enthält es zwei Moleküle Kristallwasser. Schmelz- punkt = 237" (unter Verkohlen). Das Drehungsvermögen beträgt (in j^ -Natronlauge gelost) [-/] j^ = — 60-52o. Zur Gewinnung der d-ltibose aus Guanosin wird geradeso verfahren, wie es beim Inosin beschrieben worden ist. o. Adenosin, CioHijNsO^, und dessen Trennung von (iuauosin. Das Adenosin ist bis jetzt nur aus Hefenukleinsäure gewonnen worden. Da es für die Gewinnung des Nukleosids wichtig ist, die angewandte Nuklein- säure in möglichst reinem Zustande zu haben, so sei hier das von Lcreiie und Jacohs angewandte Verfahren zur Darstellung der Hefenukleinsäure angegeben.*) Käufliche Substanz wird in möglichst wenig heißem Wasser aufgelöst, die Lösung mittelst einer Saugepumpe abfiltricit und das Elitrat dann mit einem großen Überschuß an Eisessig gefällt. Die Fällung wird über Seide aligesaugt. mit Alkohol und Äther gewaschfu und getrocknet. Die auf diese Weise dargestellte Substanz eignet sich gut zur (iewinniing der Nukleoside. ') P. Ä. Levene, tJber die Hefenukleinsäure. Biochem. Zeitschr. Bd. 17. S. 120 ( 1909). P.Ä.Levene und TF. yl. Jacofts, I.e., Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 42. S.2474u.2703 (1909)- (308 P- -A- Levene. Zur Gewinnung des Adenosins werden etwa ob'O g der Nukleinsäure in AVasser. unter Zuhilfenahme von Kalilauge, aufgelöst. Die Lösung wird auf Lackmus genau neutralisiert und auf ein Volumen von 1 / gebracht 15'0r/ Kaliacetat werden nun in die Lösung eingetragen und diese dann 8 Stunden im Autoklaven bei einer Temperatur von 180 — 190" des Ölbades erhitzt. Nach dem Abkühlen des x\utoklaven wird das Reaktionsprodukt in eine Kältemischung eingestellt. Nach einigem Stehen scheidet sich das Guanosin fast (quantitativ aus. Dieses Guanosin enthält noch kleine Verunreinigungen, welche das Kristallisieren des Nukleosids bis zu einem gewissen Grade hindern. Will man die kristallinische Substanz ohne Zeitverlust erhalten, so macht man auch hier Gebrauch vom Bleiverfahren. Das Filtrat vom Guanosin wird zur Darstellung der anderen Nukleoside benutzt. Zu diesem Zwecke wird die Lösung mit einer 25''/oigen Lösung von Bleizucker behan- delt, solange sich ein Niederschlag bildet. In das Filtrat werden dann vor- sichtig und abwechselnd wässeriges Ammoniak und Bleizuckerlösung ein- getragen. (Das Verfahren unterscheidet sich von dem von Haiser und Wenzel angegebenen nur dadurch, daß Bleizucker an Stelle von Bleiessig gebraucht wird). Der entstehende Niederschlag wird auf die übliche Weise von Blei be- freit und die Lösung dann unter vermindertem Druck bis zu einem ganz kleinen Volumen fetwa 20 cm^) eingedampft. Jetzt wird sie im Kälteraum über Nacht stehen gelassen. War nicht alles Guanosin bei der ersten Fällung abgeschieden worden, so fällt es bei dieser Operation aus. Nunmehr werden o g Pikrinsäure in möglichst wenig heißem Wasser gelöst und in die guanosinfreie Lösung eingetragen. Bei langsamer Abkühlung scheidet sich das Pikrat des Adenosins kristallinisch aus. Bei rascherem Abkülilen fällt es amorph. Will man das Adenosin ganz aschefrei erhalten, so ist es vorteilhaft, das Pikrat aus Wasser umzukristaUisieren. Das Pikrat sintert bei 180" und schmilzt bei 185" (korr.). Zur Darstellung des freien Nukleosids wird das Pikrat in heißem Wasser gelöst und die Lösung nach dem Abkühlen mit verdünnter Schwefelsäure bis zur saueren Keaktion auf Kongo angesäuert. Die Pikrinsäure wird dann mit Äther ausgeschüttelt. Die wässerige Lösuny wird darauf mit frisch bereitetem Barvumkarbonat von Schwefelsäure befreit und ninter vermindertem Druck bis auf ein ganz kleines Volumen (etwa 10 — 15 cm 3) eingedampft. Beim Stehen im Kälte- raume bei etwa -f P scheidet sich das Adenosin in tyrosinartigen Kristallen aus. An der Luft getrocknet, kristaUisiert die Substanz mit Vb Molekülen Kristalhvasser. Schmelzpunkt der trockenen Substanz = 229" (korr.) bei 900 raschem Erhitzen. Das Drehungsvermögen beträgt: [a] " = — ÖT'oO". n. d-Ribose-phosphorsäure, CalluGgPM. Diese Verbindung ist in Form des Baryumsalzes, C5 Hg Og P Ba -f 5 Hj 0, bei der Spaltung der Inosinsäure erhalten worden. 10*0 r/ des inosinsauren ^) P. A. Levene uud W. Ä. Jacobs, Ül)or die Inosinsäure. Bcr. il. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 41. S. 2703 (1908). Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. jjgtj Baryumsalzos werden in 200 cw^ öVoi^er Schwefelsiiiirc aufj^elöst uinl in einem "Wasserbade bei 50" solanp:e erliit/t. bis die urspriiiiirlich biiks- (Irehende Lösung eine Iconstaiite IJechtsdrchuiiii' erreiclit hat. I)a/ii sind etwa 12 Stunden erforderlich. I)as Keaktioiisgcniisch wird dann v(tn Hypoxanthin mit Silbersulfat, dann von Silber mit Schwefelwasserstoff und von Schwefelsäure inittelst frisch bereiteten, chemisch reinen Harvnni- karbonates befreit. Das Ultrat vom Harvuinsulfat und r>arvnmkarbonat wird unter vermindertem Druck und etwa 30" bis auf ein kleines \olunien ein- j^^edampft. JJeim Abkühlen scheidet sich das Barvumsalz der noch unzerset/t ^ebhebenen Inosinsäure aus. Dieses wird abfiltriert. Die Mutterlauge wird im Iv\sikkator über Schwefelsäure aufbewahrt und im Kälteraum bei + 1" stehen •••elassen. Nach einigen Wochen scheidet sich das kristallinische IJaryumsalz au.s. An der Luft getrocknet enthält die Substanz ;"> Moleküle Kristallwasser. Die Substanz reduziert Fehlüic/sche Lösung. Bei weiterer Hydrolyse wird sie in die Pentose und in Phosphorsäure zerlegt. IIL Thymo-hexose-phosphorsäure, r,i llj; N., !'(),„.') Diese Verbindung ist bisher noch nicht in kristallinischer Form erhalten worden. Das liegt wahrscheinlich an der noch nicht völligen lleinheit der gewonnenen Produkte. 80"0<7 der Thymonukleinsäure, aus der Milz dar- gestellt, werden in löOO c/m^— -Scliwefelsäure 4 Stunden am Kückflul'.- kühler erhitzt. Das Pieaktionsgemisch wird dann filtriert und im Filtrate ein iMierscliuri von Silbersulfat aufgelöst. Es scheiden sich dalx-i beim 24stündigen Stehen die Silberpurine vollständig aus. Das Filtrat von diesem Niederschlage wird mit Darytwasser neutralisiert. Dabei bildet sich ein zweiter Niederschlag. Dieser wird von Silber mittelst Schwefelwasserstoffs und von überschüssigem Baryt mittelst Kohlensäure befreit. Das schließlich erhaltene FUtrat wird dann unter vermindertem Druck bis zur Sirup- konsistenz eingedampft und mit Alkohol gefällt. Nach längerem Aufi»ewaliren unter Alkohol geht ein Teil der Substanz in eine unlösliche Form über. In dieser Hinsicht verhält sie sich ähnlich den P.aryumsalzen anderer gepaarter Phosphorsäureverbindungen. Diese Substanzen besitzen alle die Figenschaft, beim Kochen ihrer Lösung oder beim .Vufbewahren in Alkohol in eine unlöshche Form überzugehen. Das unlösliche Baryumsalz besitzt die Zusammensetzung des Salzes der Thymo-glyko-phosphorsäure. Beim Spalten mittelst 250/oiger Schwefelsäure lassen sich aus der Substanz Thymin und Lävulinsäure gewinnen. Das Filtrat von dem unlöslichen Salze kann wieder mit Alkohol gefällt werden. Durch mehrmaliges Inifällen erhiUt mau luch auf diese Weise ein Baryumsalz von der Zusammensetzung des Salzes 1er Thymo-glyko-phosphorsäure. ') P. A. Lcrene und J. A. MaiulcJ . Cl.er die Konstitution der Tliymoniikleinsaiire ':ier. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 41. S. 1900 (1908). — Carl Luca Alsbcr) Zeitschr. f. pbysiol. (hem. Bd. 21. S. 275 (1896). Isolierung- vuu Purinbaseu oder AUoxiirkörpern auspflanzen. {\\\ Stoff befreiten Lösungen fällt man sodann mit ammoniakalischem Silher- nitrat aus. Man kann aber auch die Fällbarkeit der Alloxurbasen durch Phos- phorwolframsäure benutzen. Zu diesem Zwecke reinigt man die I'flanzen- extrakte mit fJleiessig, fällt das Blei mit Schwefelsäure aus und fügt zu der vom Bleisulfat getrennten Flüssigkeit konzeutriei'te l'hosphoi-woifram- säurelösung hinzu, bis keine Fällung mehr auftritt. Der Nieders(;lilag wird nach 24stündigem Stehen auf die Nutsche gebracht, mit ö'Yoiger Schwefel- säure ausgewaschen. ^lan zersetzt die Fällung mit einem t'^berschurj von Baryt, saugt die Lösung al) und entfernt den überschüssigen Baryt mit Kohlensäure: die vom Baryumkarbonat getrennte Lösung neutralisiert man nahezu mit Salpetersäure, dunstet auf dem Wasserbade ein und fällt aus' der konzentrierten Lösung mit Silbernitrat aus. Ob hierbei, ohne Zusatz von Ammoniak, die Alloxurbasen quantitativ gefällt werden, ist nicht bekannt. Ob man, wie beim Teextrakt, die Alloxurbasen direkt mit Silbernitrat und Ammoniak ausfällen kann, ist nicht untersucht worden. Doch dürfte dieses Verfahren wohl öfters auf Schwierigkeiten stoßen. d;i l'tlanzenextrakte gewöhnlich Stoffe enthalten, welche Silbernitrat reduzieren. Nach M. Krfif/er^) verfährt man in folgender Weise: Verdünnte Teelauge wird mit verdünnter Schwefelsäure von den IIu- minsubstanzen befreit. Das Filtrat wird mit Natronlauge nahezu neutrali- siert, die Flüssigkeit zum Sieden erhitzt und die Basen durch Kupfersulfat und Natriumbisulf it als Kupferoxydulverbindung ausgefällt. Es bilden sich braune Flocken, welche sich allmählich absetzen. Dieser Niederschlag wird in heißem Wasser mit farblosem Natriumsulfid in geringem Überschult zersetzt. Das Filtrat wird eventuell nochmals in der angegel)enen AVeise mit Kupfersulfat und Bisulfit gefällt. Der nun erhaltene Niedersehlag wird gut ausgewaschen. Dieser Niederschlag enthält die .Uloxurbasen auller Koffein und Theobromin. Über die Trennung der im Niederschlag ent- haltenen Basen siehe weiter unten. Das Koffein, CgHn, N'iO^-f H2O, bildet feine, seidenglänzende Nadeln; es sublimiert ohne Zersetzung und schmilzt bei 2;i5". Es wird durch Phos- phorwolframsäure gefällt, nicht durch ammoniakalische Silberlösung und Kupferoxydul. Koffein ist leicht löslich in heißem Chloroform. lUdinfs Identifizierung bestimmt man den Schmelzpunkt und führt die Murexid- probe aus. Aus Kaffee kann die Base wie folgt dargestellt werden : die ge- mahlenen Bohnen werden mit Wassei- dreimal ausgekocht, die Extrakte mit Bleiessig, unter Vermeidung eines Überschusses, ausgefällt, das vom Bleiniederschlag getrennte Filtrat mit Hilfe von Schwefelwasserstoff vom lilei befreit und die vom Bleisulfid getrennte Lösung unter Zusatz von reiner Magnesia und etwas Sand zur Trockne eingeduustet, der Trockenrückstand im Soxhlet mit Cliloroform extrahiert. Nach dem \'erdampfen (\o>< ("hloro- M M. Kriif/rr, Die Gewinnung flos Adenins aus Teextrakt. /eitsi-hr. f. pliysiol. Chem. Bd. 21. S.' 278 (1896). 39* n^.) E. Winterstein. torms bleibt das Koffein in nahezu reinem Zustand zurück Man remigt es durch Umkristallisieren aus Chloroform . Wasser oder Alkohol ^ach diesem Verfahren labt sich das Koffein nahezu quantitativ abscheiden Oder man bereitet sich einen Teig aus 5 Teilen gemahlenem Kaffee und 1 Teil Magnesia, trocknet, pulverisiert das Gemisch und extrahiert mit Chloro^orm.^_^ «luantitative Bestimmung des Koffeins sind verschietlene Methoden vorgeschlagen worden, auch das obige Verfahren von A. Hüger und E Friche^) gibt befriedigende Resultate. Nach Angaben mehrerer Autoren soll das von KaU angegebene Verfahren die besten Resultate hefern. Das Katz-Beitter,^^-) Verfahren ^vird Avie folgt ausgeführt: Mm^ schüttelt 10 q des Drogenpulvers ;J0 Minuten lang mit 200 g C hloio- form und 5 r/ Ammoniak, filtriert die Lösung ab. dunstet 1^0^ des er- haltenen Filtrates ab, löst den Rückstand in etwa 5 m^ Äther, fugt 20 cm 0-5olioer Salzsäure hinzu, verdunstet den Äther auf dem ^\ asserbade fil- ü^rt ^ie Lösun. nach dem Erkalten ab, wäscht das Filter mrt O"^ „iRer Salzsäure aus: die vereinigten Lösungen werden 2 Stunden im Ex xaktion.- apparat mit Chloroform ausgezogen. Die Ghloroformlosung wud abge- dunstet, der Rückstand wird gewogen. Auch aus Teeblättern kann das Koffein nach den beschriebenen Me- thoden gewonnen werden. , Theobromin, C,HsN,0„ bildet mikroskopische, bitterschmeckeide KristaUe des rhombischen Systems; es subhmiert ohne zu schine zen bei 9C)0-295o In siedendem Chloroform ist es viel schwerer löslich als Koffern Z ist unlöshch in Tetrachlorkohlenstoff wie auch in Benzol und kann durch diese Lösungsmittel vom Koffein getrennt werden. Es wird durch Phosphoi- wolf ramsäure aefällt, nicht durch ammoniakalische Silberlösung und auch nicht durch Kupferoxvdul (Kupfersulfat und Natriumbisulfit). Das Theobromin wird am besten aus entfetteten Kakaobohnen nach dem beim Koffein angegebenen Verfahren gewonnen. Nach Decker ^) emp lelüt es sich, die gepulverten Bohnen mit der halben Menge Magnesia und dti dreißigfachen Menge Wasser eine Stunde am Rückflulikühler zu kochen, (knn zu filtrieren, einzudunsten und den Rückstand mit Chloroform aiiszukochen. Man trennt das m Lösung gegangene Koffein mit Hilfe von Tetrachloi- ^'"jTheophvllin, C.H.N.O, + H,0, bildet deutliche, makroskopisch sichtbare, dünne Tafeln des monosymmetrischen Systems. Es schmiß bei 264«- es ist löslich in heißem Wasser. Es wird durch ammoniaka isches Silbernitrat gefällt. Es gibt die sogenannte TU^i^e/scdie Reaktion. I^ampt man die Lösung mit Chlor- oder Bromwasser zur Trockne em, so nute bleibt ein scharlachroter Rückstand, der sich mit Ammoniak violett faibt I 1) Arcliiv der Pharm. Jg. 1885. S. 827. oj io s qs9 •3 Ber d pharm. Geselkch. Bd.l2. S. 250(1902). - A.Beitter, ibid. ßd.l2. S. doJ. 3) Rec. trav. chim. P. B. T. 22. p. 142 (1903). Isolierung von Purinhasen oder AUoxnrkörpern aus Pflanzen. 615 und durch überschüssige Natronlauge entfärbt wird. Das gleiche Verhalten zeigt auch Theobromin. Darstellung des Theophyllins. Der mit Wasser verdünnte Teextrakt wird zunächst durch Zusatz von Schw^efelsäure von einer harzigen Substanz liefreit. Die davon getrennte Flüssigkeit wird mit Ammoniak stark alkalisch gemacht und sodann mit ammoniakahschem Silbernitrat gefällt. Der dabei entstandene Niederschlag wird nach vierundzwanzig Stunden von der Flüssigkeit getrennt, sodann mit warmer Salpetersäure digeriert, i) Beim F]rkalten scheiden sich Silberdoppelverbindungen des Adenins und iivpo- xanthins aus. Sie werden durch Filtration getrennt, das Filtrat mit Ammoniak übersättigt: es scheidet sich alsbald ein aus Xanthiu- und Theophyllinsilber bestehender Niederschlag aus. Dieser Niederschlag wird nach einigem Stehen abfiltriert, ausgewaschen und nach dem Ansäuern mit Salpetersäure, mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Beim Eindampfen scheiden sich zuerst kleine Mengen von Xanthin aus, nach weiterem Konzentrieren scheidet sich das TheophyUin in Nadeln oder rhombischen Kristallen aus. Man kann auch die Fällbarkeit des Theophyllins durch Mercurinitrat bei fiegenwart von Natriumkarbonat zu dessen Darstellung aus konzentrierten Lösungen benutzen. Trennung der Alloxurbasen. Die von M. Krüger und G. Salo- jiion^) angegebene Trennungsmethode der AUoxurkörper des Harns dürfte sich auch für die Trennung der in den Pflanzen vorhandenen Purinbasen eignen. Sie sei daher hier kurz erwähnt. Sind die Alloxurbasen durch ammoniakahsche Silberlösung gefällt worden, so wird der gewaschene Niederschlag in einem im siedenden Wasserbade befindlichen Ilundkolben durch verdüimte Salzsäure zersetzt, bis die voluminöse Silberverbindung verschwunden ist; dann erhitzt man auf freier Flamme, gibt die gleiche ^lenge der vorher verbrauchten Salzsäure hinzu, filtriert heil.) und wäscht den Niederschlag mit stark verdünnter Salzsäure aus. Hat man die Alloxurbasen mit Kupfersulfat und Natriumbisulfit gefällt, so wird der mit heißem Wasser gewaschene Niederschlag ebenfalls im Rundkolben mit Wasser erwärmt, mit Ammoniak schwach alkalisch gemacht, dann mit Salzsäure schwach angesäuert, Schwefelwasserstoff ein- geleitet und die Lösung heiß filtriert. Das salzsaure Filtrat wird durch wenig Tierkohle entfärbt. Die Lösung wird imn auf dem Wasserbade bei gelinder Temperatur eingedunstet. ]\Lan befördert das Eindunsten durch Darüberleiten eines kräftigen Luftstromes. Um die Salzsäure möglichst zu entfernen, dunstet man noch -Jnial mit Wasser und zuletzt unter Zusatz von Alkohol ein. Der \'erdampfungs- rückstand wird sodann mit Wasser bei 40° digeriert, nach mehrstündigem *) Dabei können einige AUoxurkörper infolge Bildung vou freier salpetriger Säure Veriinderung erleiden. M. Krüger, Die Gewiinuing des Adenins aus Teextrakt. Zeitsclir. f. phys. Chem. Bd. 21. S. 275 (1896). ') M. Krüger und G. Salonion, Die Alloxurbasen des Harns. Zeitschr. f. pliys. Chem. Bd. 26. S. 373 (1898). (314 E. Winterstein. Stehen abfiltriert, mit Wasser, dann mit Alkohol und Äther getrocknet. Aus den Filtraten kann man durch nochmaliges Konzentrieren eine kleine JNIenge Basen erhalten, welche mit den ersten vereinigt werden. Der ungelöste Teil enthält das Xanthin und Heteroxanthin, in die wässerige Lösung gehen über: Adenin, Hypoxanthin und Paraxanthin. Trennung der ersten Fraktion, der sogenannten Xanthin- fraktion: Das Gemenge der Basen wird in der fiinfzehnf achen Menge 3";)"/„iger, salzsäurefreier Natronlauge heiß gelöst. Innerhalb 24 Stunden scheidet sich das Natriumsalz des Heteroxanthins in reinem Zustand fast vollständig aus. Je 60 cm^ des auf 60'' erwärmten Filtrates werden in ein kaltes Gemisch von 20 cm^ konzentrierter Salpetersäure und 20 cm'^ Wasser langsam unter Umrühren eingetragen ; innerhalb mehrerer Stunden scheidet sich beim Stehen in der Kälte salpetersaures Xanthin aus. Um es zu reinigen, löst man in wenig Natronlauge und fällt wieder bei 60" mit Salpetersäure aus. Zur Darstellung des freien Xanthins wird die ammoniakalische Lösung des Nitrats eingedampft, wobei sich die Base in amorphen Krusten abscheidet. Trennung der zweiten, der Hypoxanthinfraktion. Die salzsaure, vom Xanthin und Heteroxanthin getrennte Lösung wird mit Ammoniak in geringem Überschuß versetzt, wobei Epiguanin sich in kleinen glänzenden Prismen ausscheidet. Das Filtrat wird durch Erhitzen vom Ammoniak befreit und die nicht zu konzentrierte Lösung in der Kälte vorsichtig mit l'l'^/oiger Pikrinsäurelösung in geringem Überschuß versetzt und das ausgeschiedene Adeninpikrat sofort abgesogen. Man versetzt das Filtrat mit Schwefelsäure und schüttelt die Pikrinsäure mit Benzol aus, nun fällt man die noch vorhandenen Basen durch ammoniakahsche Silberlösung oder durch Kupfersulfat und Bisulfit wieder aus, zersetzt die Fällung mit Schwefelwasserstoff und dampft ein. Man löst den trockenen Bückstand in der dreiund dreißigfachen Menge heißer verdünnter Salpetersäure (90 cm'^ Wasser und 10 cm" konzentrierter Salpetersäure). Beim Erkalten scheidet sich Hypoxanthinnitrat in reinem Zustand aus. Das Filtrat enthält noch etwas Hypoxanthin, Heteroxanthin und das Paraxanthin; um letzteres zu isolieren, fällt man nochmals als Silber- oder Kupferoxydulverbindung, aus der Fällung werden die Basen, wie angegeben, isoliert. Alan dampft die salzsaure Lösung ein und behandelt den Bück- stand mit wenig Wasser, dabei geht das Paraxanthin nebst dem Hypo- | xanthin in Lösung. (Man fällt eventuell nochmals als Silber- oder Kupfer- oxydulverbindung.) Sodann kristallisiert man das Gemisch der beiden Basen ; aus verdünnter Salpetersäure um und scheidet aus der Mutterlauge vom j Hypoxanthin das Paraxanthin als Natriumsalz in der Kälte aus. i Ist Guanidin vorhanden, so geht dieses in beide Fraktionen, l^m es aus der Xanthinfraktion zu erhalten, wird diese mit Ammoniak behandelt, wobei Guanidin ungelöst bleibt. In der Hypoxanthinfraktion findet es sich neben dem Epiguanin und kann von letzterem durch Behandeln mit heißem Wasser oder heißem verdünnten Ammoniak getrennt werden. Isolierung von Purinbaseu oder Alloxurkürpcni aus Pflanzen. (515 Das Adeniu gewinnt man am besten aus Teextrakt durch Fällen mit ammoniakalischem Silbemitrat oder Kupferoxydul, Avie oben Seite 61o angegeben ist. Man zersetzt den voluminösen Niederschlag unter Erwärmen mit verdünnter Salzsäure, entfärbt das Filtrat mit Tierkohle und dampft zur Trockne ein. Der Piückstand wird dann unter Zusatz von wenig Salz- säure in Wasser gelöst, die Lösung mit Ammoniak oder Ammonkarbonat schwach alkalisch gemacht und 24 Stunden stehen gelassen : es scheidet sich Adenin aus, welches auf dem Filter mit Wasser, Alkohol und i^ither gewaschen wird. Um es aus der Kupferoxydulfällung darzustellen, zersetzt man diese mit farblosem Schwefelammon und verdampft zur Trockne. Der Rückstand wird unter Zusatz von Ammonkarbonat mit Wasser aufgekocht; nach ■J-i: Stunden hat sich das Adenin ausgeschieden. Das Rohprodukt kann durch l'borführen in das Sulfat, welches wohlausgebildete ckarakteristische Kristalle bildet, gereinigt werden. Das x^Uantoin, C^Hr, X4O3, kristallisiert in kleinen seidenglänzenden Prismen, welche sich sehr schwer in kaltem, leichter in kochendem Wasser lösen. Es wird durch Silbernitrat auf Zusatz von Ammoniak und auch durch Mercuriuitrat gefällt. Beim Kochen mit Natronlauge entsteht Ammoniak und Oxalsäure. Darstellung.!) Die mit Hilfe von Wasser oder verdünntem Alkohol erhaltenen Pflanzenextrakte reinigt man mit Bleiessig und fällt die vom Bleiniederschlag getrennte Flüssigkeit mit Mercurinitrat aus. Der gut aus- gewaschene Niederschlag wird mit Schwefelwasserstoff zersetzt, die vom Schwefelquecksilber getrennte Flüssigkeit wird mit Ammoniak neutrahsiert und die neutrale Lösung bei gehuder Wärme eingedunstet. Die Lösung enthält das Allantoin neben dem Asparagin. Um beide Körper voneinander zu trennen, sättigt man diese Lösung in der Hitze mit Kupferhydroxyd und läßt erkalten, wobei sich das Asparagin als Kupfersalz ausscheidet: man fütriert davon ab und befreit das Filtrat mit Hilfe von Schwefel- wasserstoff vom Kupfer, dunstet die Lösung ein ; das Allantoin kristalhsiert alsbald aus. Zuweilen kann auch AUantoin zusammen mit Asparagin aus- kristaUisieren, man trennt dann beide durch T'mkristallisieren. Das Asparagin ist leichter löshch als das Allantoin. Das Yernin. Diese von E. Schulze und E. Boßhard-) aufgefundene Substanz kann man als ein Glykosid der Purinreihe bezeichnen, da es bei der Spaltung mit Säuren Guanin und eine Glukose =^) liefert. Das Verniu, CioHigNgOs, bildet feine, atlasglänzende, lauge, äußerst dünne Prismen. Das Vernin scheidet sich aus konzentrierten Lösungen äußerst schneU aus. *) E. Schulze und E. Boßhard, Zur Kenntnis des Vorkommens von Allantoin, Asparagin etc. in den Pflanzen. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 9. S. 430 (1885). 2) Über einen neuen stickstoffhaltigen Pflanzenbestandteil. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 10. S. 80 (1886). ä) Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 41. S. 457 (1909). 616 E. Wintert ein. Isolierung von Purinkörpern oder Alloxurkörpern etc. Es ist schwer löslich in kaltem, leicht löslich in heißem Wasser, unlösüch in Alkohol, löslich in Ammoniak und in Salzsäure. In der wässerigen Lösung des Vernins erzeugt Silbernitrat eine gallertartige, durchsichtige Fällung, welche in Ammoniak lösUch ist. Mit Mercurinitrat entstellt ein weißer flockiger Niederschlag. Phosphorwolframsäure in saurer Lösung gibt einen gelblichen Niederschlag. Es gibt die Murexidreaktion. Darstellung: Die getrockneten und zerriebenen Pflanzen werden mit Wasser extrahiert, die Extrakte mit Pleiessig gereinigt, die vom Blei- niederschlag getrennte Lösung mit Mercurinitrat ausgefällt. Der da- durch hervorgebrachte Niederschlag wird mit kaltem Wasser ausgewaschen und mit Schwefelwasserstoff zerlegt. Die vom Schwefehiuecksilber getrennte Lösung wird mit Ammoniak neutraUsiert und vorsichtig konzentriert. Nach dem Erkalten scheidet sich zuweilen eine Gallerte aus, welche kleinere Mengen von Asparaginkristallen einschließt. Die Ausscheidung wird auf einem Filter gesammelt, mit kaltem W^asser oder verdünntem Weingeist ausgewaschen. Um die beigemengten Asparaginkristalle abzutrennen, kristallisiert man das Ptohprodukt aus Wasser um. wobei das Vernin, infolge der schweren Löslichkeit, sich zuerst ausscheidet. Eventuell kann man die Fällbarkeit des Vernins durch Silbernitrat zur Trennung vom Asparagin benutzen. Sind dem Vernin Alloxurbasen beigemengt, so können diese durch Ausfällen mit Silbernitrat und Ammoniak entfernt werden, da die Silberverbindung des Vernins in Ammoniak löslich ist. Das Hämatin und seine Abbauprodukte. Von William Küster, Stuttgart. Die eisenhaltige Komponente des Hämoiiloliins, dem Gewicht nach etwa 4''/o des grolien Moleküls ausmachend, wird aus diesem bei der Ein- wirkung von Säuren abgespalten und gewöhnlich in Form eines chlorhaltigen Kunstproduktes, des sogenannten Hämins, gewonnen, entweder dadurch, daß das Globin, der Eiweißkörper des Blutfarbstoffes, in lösliche Substanzen übergeführt wird, während das Hämin zurückbleibt, oder dadurch, daß der eisenhaltige Anteil herausgelöst und vom Globin durch Filtration getrennt wird. Wir bedienen uns also recht eingreifender Mittel zur Dar- stellung des gesuchten Körpers, und dem ist es wohl zuzuschreiben, daß bereits das erste hier zu beschreibende Produkt, das Hämin, gegenüber der eisenhaltigen Komponente der lebenden roten Blutkörperchen, chemische Verschiedenheiten aufweist. Diese von Hoi^pe-Seyler^) Hämochromogen genannte Substanz vermag ja unter anderem Sauerstoff und andere Gase zu absorbieren-), welche Eigenschaft dem Hämin nicht zukommt. I. Darstellung von Rohhämin. Zur Darstellung von rohem Hämin dienen die Methoden von Mörner^) und von Schalfejef^). Die erstere ist dann zu empfehlen, wenn im längere Zeit fortzusetzenden Betriebe große Mengen von Blut verarbeitet werden sollen, die Methode Schal fejeß's zeichnet sich dadurch aus, daß sie nur wenige, immer vorhandene ^Apparate erfordert. M F. Hoppe-Sei/hr, Beiträge zur Kenntnis des Blutes des Menschen und der ^Yirl)eltiere. Med. -ehem. Unters. Heft 4. S. 544 (1871). — Dersellte. Beitrii ' Dehydrochloridhämin nud das Hämatin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 40, S. 408/11 ' (1904). _ I -) IV. KU fiter und K. Fuchs, t^her ein neues kristallisiertes Derivat des Hämins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 40. S. 2021 (1907). Das Hämatin und seine Abbauprodukte. (]') ] 5 Minuten lang geschüttelt, dann durch ein Kreppfilter von Dreverhojf' filtriert und mit Chloroform nachgewaschen. Das erhaltene Filtrat wird in je IhOcm^ mit Kochsalz gesättigten Eisessigs, der während des Lösens des Farbstoffs auf 105—110" erhitzt worden ist, unter beständigem Rühren eingetragen, wobei das Chloroform teilweise verdampft. Noch während des Erkaltens erscheinen dann die ersten Häminkristalle, zur Vollendung der Ausscheidung läßt man aber mindestens einen Tag bei kühler Außentemperatur stehen, filtriert dann und wäscht die Mutterlauge (sie kann nach Vertreibung des Chloroforms noch ein zweites Mal zur Umscheidung von Rohhämin benutzt werden, die in ihr gelöst bleibenden Anteile des Farbstoffs lassen sich wenigstens teilweise wiedergewinnen) mit verdünnter Essigsäure, die etwas Salzsäure enthält, aus; die Kristalle werden erst auf Fheßpapier, dann im Vakuum neben Kaliumhydroxyd getrocknet. Statt Chinin kann auch Pyridin verwendet werden , von dem aber auf lg Farbstoff erst etwa 7'5 cm» ausreichen, auch muß dann die Chloro- formmenge auf ca. 40 cm- vermehrt werden und zum Eisessig setze man kurz vor dem Eintragen der Farbstofflösung 1/2 — 1 cni^ konzentrierter Salzsäure. Ausbeute: 0"6 — 0"8^. C.Zusammensetzung: C34 H32 04N4FeCl. Das Molekulargewicht ist nicht ermittelt; bei Annahme von zweiwertigem Eisen müßten 00 H-Atome vorhanden sein. Das Hämin bildet dünne Blätter und Säulchen des triklinischen Sy- stems; die größten von ihnen sind 0"2 nutt lang und iYOb nun breit, der Habitus der Kristalle und ihrer sternähnlichen Durchkreuzungsviellinge erinnert an die Gipsgestalten. Im auffallenden Lichte erscheinen sie schwach metallisch glänzend, im durchgehenden Lichte dunkelbraun uud wenig durchsichtig. Im Kapillarröhrchen erhitzt, sintert das Hämin gegen 240" und schmilzt seli)st bei oOO" nicht. Das Hämin besitzt saure Eigenschaften, löst sich demnach in ver- dünnten Alkalien, auch in Karbonaten und organischen Basen auf, es ent- hält zwei durch Metalle noch vertretbare Wasserstoffatome, auch zur Bil- dung von Estern oder Ätliern ist das Hämin befähigt.') Mit verdünnten Säuren bildet es keine Salze, löst sich also auch in ihnen nicht, dui-ch konzentrierte Schwefelsäure wird es unter Entwicklung von Chlorwasserstoff gelöst, wobei auch Hämatoporphyrinbildung eintritt und das Eisen zum größten Teil herausgelöst wird. Von organischen Solventien löst nur 70— SOVoiger Alkohol, aber auch nur sehr schwer, reichlichere Lösung tritt auf Zusatz von Schwefel- säure ein. ^) M. Nencki und ,/. Zaleski, Uutersuchuugcü über deu Blutfarbstoff. Zeitschr. f. pliysiol. Chem. Bd. 30. S. 390 {190Ü). 622 William Küster. III. Darstellung von Hämatin. j Wird Hämin in einem Alkali gelöst, so tritt außer der Salzbilduno' \ auch ein Ersatz des Chlors, das wahrscheinlich mit dem Eisen verbunden * ist, durch Hvdroxyl ein. Und während dann die löslichen Alkalisalze durch \ Säuren wieder zerlegt werden, ist es nicht ohne weiteres möglich, das [ herausgelöste Chlor wiederum an Stelle des Hydroxyls einzuführen. Der [ Grund für dieses Verhalten ist noch nicht aufgefunden worden, mr müssen \ an eine unter dem Einfluß des Alkalis eintretende Polymerisation der \ Molekel oder an eine intramolekulare Verschiebung von Atomgruppen denken. \ die um so rascher sich vollzieht, je stärker das Alkali ist. Jedenfalls erhält man auf Zusatz von Säuren, auch von Salzsäure, zu einer Lösung des Hämins in z. B. Natronlauge nicht Hämin zurück, sondern einen chlorfreien Körper von ganz anderen Eigenschaften, den man den Namen „Hämatin" gegeben hat. Zur Darstellung von ..Hämatin" werden z.Kbg reines Hämin mit ein wenig Alkohol in einer Schale angerieben und mit einer Auflösun;? von lg NaÖH in bOO cm^ eiskaltem Wasser in eine Flasche übergespült, in der dann die vollständige Lösung des Farbstoffs durch kurzes Schütteln erreicht wird. Man filtriert dann durch ein Kreppfilter in einen hohen Literzylinder, wäscht mit kaltem Wasser nach, fügt 100 cvi^ einer 1 volum- prozentigen Schwefelsäure hinzu, schüttelt um, läßt das gefällte Hämatin absitzen und dekantiert zweimal mit kaltem Wasser. Nun wird nochmals in reiner Natronlauge gelöst — es genügen jetzt 0"67^ Na OH — und wieder mit Schwefelsäure gefällt. Es geschieht dies, da durch einmahge Behandlung mit dem Alkali eine vollständige Herausnahme des Chlors nicht erreicht wird. Der am l)esten abermals durch öfteres Dekantieren gereinigte, sehr voluminöse Hämatinschlamm wird schließlich auf ein gehärtetes Filter (Dreverhoff Nr. 495 ) gebracht und mit kaltem Wasser S( )4-frei gewaschen, dann abgesaugt, zunächst auf P'ließpapier, dann im Vakuum oder bei ge- linder Wärme getrocknet. Die Zusammensetzung des Hämatins läßt sich durch die Formel C34 H33 O5 N4 Fe wiedergeben, es ist amorph, dürfte also aus einem Gemenge bestehen, das dunkel stahlblaue, metallisch glänzende Stücke bildet, die sich zu einem fast schwarzen, spezifisch schweren Pulver zerreiben lassen. Des Verhaltens des Hämatins gegen konzentrierte Schwefelsäure ist bereits beim Dehydrochloridhämin gedacht worden. In jedem Alkali löst sich Hämatin auf, eine sehr verdünnte Lösung in Natronlauge zeigt im Spektrum ein breites, mattes Band, zwischen C und D. Setzt man zu einer ammoniaka- lischen Lösung des Hämatins ein Reduktionsmittel , z. B. Kaliumsuhhydrat oder am besten eine Hydrazinlösung, so färbt sich die Lösung purpurrot. Sie enthält nunmehr das sogenannte Hämochromogen^), dessen Spektrum zwei Bänder zA^ischen D und E zeigt. Der erste Streifen ist dunkler und scharf begrenzt. ') B. V. Zei/nek, Über das Hämocliromogen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 25. S. 492 (1898). Das Hämatiu iiiul seine Abbauprodukte. (i-)-.' IV. Darstellung von Hämatoporphyrin. Während konzentrierte Schwefelsäure Hämin nur /um kleinsten Teil in einem eisenfreien Farbstoff verwandelt, von Hoppe-Seyler Hämatopor- phyrin o-enannti), der neben den sauren noch basische F.igenschaften be- sitzt und mit Säuren wasserlösliche Salze bildet, deren Lösungen stark gefärbt sind, gelingt die Darstellung eines solchen, von Nencki ebenfalls Hämatoporphyrin genannten Körpers leicht unter dem Kiuflul'» von Mrom- wasserstoff.2) Bemerkenswert ist, daß Hämatiu bei der gleichen üchandlung ein Produkt liefert, das mit Halogenwasserstoffsäure kein lösliches Salz gibt, während Dehydrochloridhämin sich dem Hämin an die Seite stellt. Zur Darstellung des Hämatoporphyrins beschickt man eine Anzahl von Kölbchen zu je 300 ««^ Inhalt mit je 75 cm^ Eisessig, der bei 10" mit Bromwasserstoff (es ist nicht ratsam, eine Säure mit höherer Konzenti-ation in bezug auf Bromwasserstoff anzuwenden, da die Menge des Nebenpro(hikts um so größer wurde, je konzentrierter die Säure war) gesättigt ist. und trägt in jedes Kölbchen allmählich und unter fortwährendem Schütteln je ö (j bei lOO" getrocknetes Hämin ein. Man läßt nun o — 4 Tage bei Zimmertemperatur stehen, während welcher Zeit die Masse des öfteren bewegt wird, bis sich alles Hämin gelöst und die Lösung die schön rote Farbe des Hämatoporphyrins angenommen hat. Jetzt wird der Kölbcheninhalt in 1/2 Liter destilliertes Wasser eingetragen, wobei ein Niederschlag entsteht, der ein Xebeupi-odukt des Hämatoporphyrins von nicht einheitlicher Art vorstellt, während der ge- wünschte Farbstoff selbst als Salz in Lösung geht. Die nach einigen Stunden filtrierte Lösung wird so lange mit Natronlauge versetzt, bis aller Brom- wasserstoff neutralisiert ist. wobei der in verdünnter Essigsäure unlösliche Farbstoff fast vollständig ausfällt. Man läßt absitzen und wäscht den Niedei- schlag durch Dekantation Br-frei. worauf er in reiner verdünnter Natron- lauge gelöst wird; es geschieht dies, um geringe Giengen beigemischten Eisensalzes zu entfernen. Die Lösung wird also filtriert und das l''iltrat wiederum durch Essigsäure gefällt, das al)geschiGdone Hämatoporphyrin auf ein gehärtetes Filter gebracht, rein ausgewaschen, abgesaugt, vom Filter abgehoben und mit wenig Wasser in einer Schale zu einem dicken Brei angerührt. LIntei- Umrühren versetzt man nun mit kleinen Portionen Salz- säure so lange, bis der Farbstoff in Lösung gegangen ist. wobei man auf 75" erwärmen kann. Es ist zu beachten, daß das Hämatoporphyi'iu in Salzsäure von ca. 0'7"/„ am leichtesten löslich ist. Nach ei iolgter Lösung filtriert man von geringen harzigen lUickständen und fügt zum Filtrat etwa Vio Vol. 40"/oiger Salzsäure, wodurch die Löslichkeit des Farbstoff- M F. Hoppc-Sei/ler, Beiträge zur Kenntnis des Blutes des Menschen und diT Wirbel- tiere. Med. ehem. Unters. Heft 4. S. 544 (18711. '^) M. Xoicki und X. Sicher, tjber das Iliiniatoporpliyrin. Arcli. f. exp. I'.ifii. u. Pharmak. Bd. 24. S. 430 (1888). — Monatshefte f. Chem. Bd. 9. S. 115. Bd. 10. 8. 5r.8. — M. Nencki, Omuia opera. II. S. 74 und 754. — 3/. Nencki und ./. Zahski, Untersuchungen über den Blutfarbstoff. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 30. S. 390 (1900). (324 William Küster. Salzes herabgedrückt wird. Sollte jetzt sogleich noch ein harziger Nieder- schlag entstehen, so filtriert man von neuem davon ab und stellt das Filtrat im ^'akuum über Schwefelsäure 2 — 3 Tage auf, wonach die aus- geschiedenen Kristalle abgesaugt und mit lO^/oiger Salzsäure nachgewaschen Averden. Ausbeute nach Nencki O^Vo des verwendeten Hämins. Durch einmaliges Umlösen mit Hilfe von auf Tö** erwärmter, O^T^/oiger Salzsäure und Zusatz von i/io ^^olumen konzentrierter Salzsäure (l'19)wird das salzsaure Hämatoporphyrin rein erhalten (Za/esH '). Die Kristalle, lange dünne, nach beiden Enden zugespitzte, zu Büscheln vereinigte Nadeln. werden zwischen Fließpapier abgepreßt, sodann im Exsikkator über Schwefel- säure und Natronkalk bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Jedes Er- wärmen ist zu vermeiden, da unter Entweichen von Chlorwasserstoff Zer- setzung eintritt, auch erleiden die Kristalle beim Lösen in Wasser hydro- lytische Spaltung. Ihre Lösung in Wasser w^eist zwei Absorptionsbändor auf, einen schmalen, nicht sehr dunklen Streifen im Orange zwischen C und D nahe an D, und einen zweiten breiteren, dunklen zwischen D und E. Der Kaum zwischen beiden zeigt matte, schwache Absorption. Auf Zusatz überschüssiger Natronlauge verändert sich das Spektrum und man beobachtet nun vier Streifen im Rot, Gelb und Grün, von denen der zwischen E und F liegende am breitesten ist. Eine solche Lösung enthält das ebenfalls kiistallinisch gewinnbare Natriumsak; des Hämato- porphyrins, welcher Kcirper also auch saure Eigenschaften besitzt. Im freien Zustande ist es l)isher nur im amorphen Zustande erhalten worden, und zwar dadurch, daß man die Lösung des salzsauren Salzes in schwach an- gesäuertem Wasser mit Natriumacetat versetzt. Das in braunroten amorphen Flocken abgeschiedene Hämatoporphyrin wird dann auf einem Filter ge- sammelt, vollständig ausgewaschen und im A'akuum über Schwefelsäure bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Ein Erhitzen im Luftbade bei 100'* verträgt es nicht. Außer in Alkalien, auch in Karbonaten, und in verdünnten Mineralsäuren löst sich Hämatoporphyrin auch in Alkohol; in Äther, Chloro- form, Amylalkohol ist es unlöslich. Nach den Ergebnissen der Analyse und den am Mesoporphyriu, das unter ähnhchen Bedingungen wie das Hämatoporphyrin bei der Eiuwirkunji von Jodwasserstoff entsteht und sich nui' durch einen Mindergehalt von zwei Sauerstoff atomen unterscheidet, von Zaleski^) ausgeführten Molekular- gewichtsbestimmungen kommt dem Hämatoporphyrin die durch die Formel C34H38O6N4 ausdrückbare Zusammensetzung zu. Es ist eine zweibasisclic Säuie, von der sich kristallisierte Ester oder Äther herstellen lassen, und es enthält zwei dreiwertige Stickstoffatome, das salzsaure Salz ist also nach der Formel C34 H38 0^ N^ 2 H Cl zusammengesetzt. Nach allem kann die Bildung des Hämatoporphyrins durch die Gleichung C34 H32 G^ N4 Fe Cl + 2 H Br + 2 H, 0 = Fe Br., Cl + C34 Hg^ Oß N^ wiedergegeben "werden. (Bei Zu- M J.Zaleslci, Untersuchungen über das Mesoporphyrin. Zeitschr. f. physiol. Cbeni Bd. 37. S. 59/61 (1902). Das Hämatin und seine Abbauprodukte. JJ25 grundeloüiiiif? der Formel C34 H33 (\N4FeCl mit zweiwertigem Eisen, für welche spricht, daß jedenfalls ein Teil des Eisens durch den Brom Wasser- stoff als Ferrosalz abgespalten wird, würde die (ileichung lauten: C3, H33 0, N, Fe Cl + H Br + 2 H^ () = C3, H3« ()„ N, + Fe Cl Br.j V. Darstellung des Mesoporpliyrins. Für die Darstellung des schon erwähnten Mesoporpliyrins CaiHjaO^Ni. das in jeder Beziehung dem Hämatoporphvrin gleicht, gibt Zaleski^) die fol- gende Vorschrift: 2 (/ Hämiu (auch hier ist es empfehlenswert, nui- gelinge ]\Iengen von Hämin auf einmal in Arbeit zu nehmen) werden in einem kleinen Kölbchen mit oO cm^ Eisessig und 6 ern^ Jodwasserstoffsäure (1-7) behandelt ; das Kölbchen wird über stark kochendem Wasserbade bis zu vollständiger Lösung des Farbstoffes gelassen, was bei öfterem Umschütteln des Kölbchens 1/4 Stunde in Anspruch nimmt. Es werden dann der Lösung 3 cw'^ Wasser zuge- setzt und dann wirft man nach und nach Phosphoniumjodid in kleinen Portionen hinein. Man muß fortwährend den Inhalt des Kölbchens schütteln und dasselbe auf einem nur mäßig warmen Wasserbade erwärmen. Xach \'er- lauf einer Viertelstunde, wenn die Menge des hinzugefügten Phosphonium- jodids 2 — 2'5 g beträgt, wird der Inhalt des Kölbchens in 2 Wasservolu- mina hineingegossen und mit 60 cm^ 20°lo^ger Natronlauge behandelt. Der Farbstoff schlägt sich sofort nieder. Die Aufgabe besteht nun darin, diesen Niederschlag möglichst schnell auf ein Filter zu bringen und aus Salzsäure umzukristallisieren, da er sich nach längerem Stehen zersetzt und es nach einigen Stunden unmöglich ist, daraus Kristalle zu erhalten. Man sammelt also den Farbstoff mit Hilfe der Saugpumpe auf einem Filter, wäscht zweimal mit Wasser aus, überträgt ihn in einen KoIIhmi. setzt ^L_l P/oig'^i" Salzsäure hinzu und erhitzt bis zum Kochen. Man muß dann noch 20 cm^ 40o/o5g'er Salzsäure hinzufügen, filtriert, setzt, wenn sich die Flüssigkeit ein wenig abgekühlt hat, noch 50 cm^ starker Salzsäure hinzu und bringt sie dann in einer Schale in das \'akuum, wonach das salzsaure Mesopor- phyrin allmähüch kristaUisiert. Ausbeute: 10— oO'Vn vf^m verwendeten Hämin. Vi. Darstellung des Hämopyrrols. A. Das Hämopyrrol Xend-is-) bildet sich nur bei sehr energischer Beduktion des Hämins und wurde bisher in einer Menge erhalten, aus der man schließen kann, daß die Hälfte des Häminmoleküls in das flüchtige Beduktionsprodukt übergeführt werden kann. ') ./. Meriinoincz und ,/. Zaleski, Uutersnchungen über Hauiiue. Extrait du Bulletin de TAcademie des Sciences de Cracovie. Juli 1007. p. 64f) 1. ") M. Neiicki und .7. Zaleski, Über die Kednktiousprodukte des Ilämins durch Jodwasserstoff und Jodphosphonium. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 34. S. 997 (1901). Omnia opera M. Nencki. II. S. 792. AbdorhaUlen, Handbuch der biochemischen ArbeitsmethoUen. 11. 40 ^)26 William Küster. Zur Darstellung des Hämopyrrols V) werden 5 g getrocknetes, möglichst reines Hämin mit 100 cni^ Eisessig in einem Erlenmeyerkolben übergössen und dann bO cni^ Jodwasserstoff säure (spez. Gew. 1-96 — 2'0) hinzugefügt. Man läßt die Masse 4^ Stunden unter öfterem Schütteln stehen, nach welcher Zeit sich der größte Teil des Hämins gelöst hat. Zur vö Eigen Lösung erwärmt man nun eine Viertelstunde auf stark siedendem Wasser- bade und voUendet die Reduktion alsdann in einer weiteren Viertelstunde durch allmähliches Eintragen von Phosphoniumjodid, wovon 10 g ausreichen, um die anfangs dunkelrotbraune Färbung der Lösung in eine braungelbe umschlagen zu lassen. Wenn jetzt eine Probe der Flüssigkeit auf Zusatz von Wasser nicht getrübt wird (im anderen Fall muß das Erwärmen und der Zusatz von Phosphoniumjodid noch fortgesetzt werden), versetzt man die ganze Menge dersell^en mit 20 cm^ eiskalten Wassers , wonach eine klare, hellgelbe Lösung resultiert. Diese wird durch eine Kältemischung auf 0" abgekühlt, worauf mit der NeutraUsation der Jodwasserstoffsäure begonnen werden kann, die durch Zufügen von 50 cni" einer 40 volumprozentigen Natronlauge unter Um- rühren und mit der Vorsicht erfolgt, daß die Temperatur nicht über 10" steigt. Die alsdann nur durch eine kleine Menge eines hellroten Harzes schwach getrübte Flüssigkeit wird darauf in einen Pvundkolben von ca. 800 ('»<=* Inhalt gebracht, der mit einem dreifach durchliohrten Stopfen versehen ist. Durch diese Bohrungen führen die Zuleitungsröhren für den Wasser- dampf, eine Trichterröhre und eine die ^^erbindung mit einem guten, langen Kühler herstellende Pöhre. Während nun sofort Wasserdampf ein- geblasen wird, läßt man durch die Trichterröhre noch 110 c»*^ der Lauge im Laufe einer Stunde eintröpfeln und erhitzt mit Hilfe der Neutralisations- wärme die Flüssigkeit rasch, so daß die Abdestillation des Hämopyrrols mit einem Teil der Essigsäure und dem Wasserdampf in kurzer Zeit ein- tritt. Von letzterem lasse man nur einen mäßigen Strom eintreten, so daß nach einer Stunde nur etwa :>50 — 400 c»?^ Destillat erhalten werden. In dieser Zeit ist dann das gebildete Hämopyrrol auch so gut ^^^e voll- ständig abgeblasen worden, was daran zu erkennen ist, daß Sublimatlösung im Destillat keine Fällung, sondern nur noch Opaleszenz gibt. Ferner hat sich das übergegangene Hämopyrrol, das zunächst in Form öliger Tropfen erscheint, die leicht an ihrem charakteristischen, zugleich an Indol und Naphtalin erinnernden Geruch zu erkennen sind, nun auch in der ver- dünnten Essigsäure völlig gelöst. Diese Lösung nimmt an der Luft und im Licht schnell eine bräunliche Färbung an: das Hämopyrrol ist ein äußerst leicht zersetzlicher Körper, der bisher auch nur in Form von ^Verbindungen zur x\nalyse gebracht werden konnte. Als solche sind ein Doppelsalz mit Quecksilberchlorid und ein Azofarbstoff aufzuführen, der mit Hilfe von ^) W. Küster, Über die Konstitution des Hämopyrrols. Ber. d. Deutsch, cliom. Ges. Bd. 35. S. 2953 (1904); Liebif/s Ann. d. Chemie. Bd. 346. S. 1 u. 23. — Derselbe, Bei- träge zur Kenntnis des Hämatins. Zeitschr. f. pbysiol. Chemie. Bd. 55. S. 526 (1908). Das Humatin uiul seiuo Ahbauproilukto. (;->■ Hen/oldiazoniumclilorid ') erhalten wird. Die erste \ei'l)iiidiii|o erhält man durch Znsatz von Subliinatlösung zu der essigsauren Lösun»- des Hämo- pyrrols als weißen amorphen Niederschlaii. der sich i>nt filtrieren und durch Wasser auswaschen lallt, er wird dann zunächst auf Fließpapier, sclilielj- lich im A'aknum über Schwefelsäure geti-ocknet. wobei man zweckmäßig- das Licht ausschließt. Die Zusammensetzung läßt sich nach Scjtck/ duicli die Formel (CgHi-, N).. Hg, 4Hg-Cl2 wiedergeben. Durch Oxydation mit Chromsäure geht das Hämopyrrol in Methyl- äthylmaleinimid übei'. Zur Darstellung- desselben fängt man nach W. Küster-) das aus ö (/ Hämin entwickelte Hämopyrrol in 100 cur^ einer 20 volum- prozentigen Schwefelsäure auf, und zwar leite man die Destillation so, daß in 1 Stunde höchstens -100 nu'^ übergangen sind, die Menge des Destillats also nicht mehr als ^a ^ beträgt. Diese stark saure Flüssigkeit schüttle man nun o — 4mal mit je 200 em^ Äther aus, wodurch Essigsäure und ein Bestandteil des Nenckisc\\en Hämopyrrols - das sogenannte saure Hämo- pyrrol — entfernt werden. Der Äther wird dann sofort abdestilliert, der stark gefärbte Fuickstand mit 20 — '60 cm^ To^oiger Essigsäure in ein Becherglas ges])ült und sofort 2 crn^ lO^/niger C'hromsäurelösung zugefügt. Ist nach \erlauf von ca. 10 Minuten die Chromsäure verbraucht, d. h. gibt ein Tropfen der Lösung mit Bleiacetat keine gelbe Fällung mehr, so trage man von neuem 2 cm'^ des ( )xydationsmittels ein und fahre mit dem Zu- satz so lange fort, bis sich auch nach Stunden noch eine positive Reaktion mit der Bleilösung einstellt. Dazu werden etwa 10 oii'-^ der Chromsäure- lösuug erforderlich sein, so daß jedenfalls am Tage nach Beginn der Oxy- dation die weitere Verarbeitung erfolgen kan]i, die darin besteht, daß die Essigsäure unter vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand in wenig warmem Wasser gelöst, die Lösung filtriert und mit Sodalösung gerade alkalisch gemacht wird. Extrahiert man jetzt ei\scliöpfeiid mit Äther, trocknet den ätherischen Auszug mit Natriumsulfat und destilliert das Lösungsmittel ab, so kristallisiert der in eine kugelförmige Kristallierschale gebrachte Rückstand sehr bald in langen noch gelb gefärbten Tadeln, von sehr charakteristischem, an Jodoform erinnernden Geruch. Ausbeute: ca. 0-4 <7. Zur Reinigung wird das Rohimid in Äther aufgenommen und diese Lösung mit 40"/„iger Salzsäure ausgeschüttelt, so lange diese noch Farbstoff wegnimmt, wozu im ganzen nur wenige Kubikzentimeter der Säure nötig sind. Die fast entfärbte ätherische Lösung wird dann mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, darauf verdampft. Jetzt hinterbleiben beinahe farblose Nadeln, welche nach dem Aufstreichen auf ') L. Marchlcirski, Untersaclimiffeu ül)er (h-ii Blutfarl>stoft'. Zoitsclir. f. pliysiol. Chemie. Ed. 45. S. 182; Bd. 47. S. 331; Bd. 51. S. 404; Bd. 54. S. 151. — Derselbe, Zur Kenntnis des Hämopyrrols. Biochem. Zeitschr. Bd. 10. S. 437. ^) W. Küster, Über die Konstitution des Hämopyrrols. Ber. d. Deutsch, cbem. Ges. Bd. 35. S. 2953 (1904); Liehii/s Annal. d. Cbem. Bd. 340. S. 1 u. 23. — Dersoli)e, Beiträge zur Kenntnis des Hämopyrrols. Zeitschr. f. pbysiol. Chemie. Bd. 55. S. 526 (1908). 40* 628 AVilliam Küster. Ton und Betupfen mit reinstem Äther den Schmelzpunkt 67 — 68°, der für das Methvlathyhnalemimid charakteristisch ist. aufweisen. Während die Oxydation des sauren- Hämopyrrols bereits in Angriff genommen Avird, schreitet man auch sofort zur Isoherung eines zweiten Bestandteils des Nenckiiicheiii Hämopyrrols, der noch in der sauren Lösung enthalten ist, aus der das ..saure Hämopyrrol" durch Äther ent- fernt wurde. Sie wird stark abgekühlt und dann durch Zusatz von ca. 90 cm" einer 40 volumprozentigen Natronlauge mit der ^'orsicht alkalisch gemacht, daß sich die Flüssigkeit nicht bis zum Sieden des Äthers erwärmt. Sobald alka- lische Reaktion eingetreten ist. wird auch diese Lösung drei- bis viermal mit je 200 c>;^ 3 Äther extrahiert, wodurch nun das ..basische Hämopyrrol" entfernt wird. Auch hier vrirä der Äther sogleich abdestiUiert, der intensiv gefärbte Rückstand in ca. 40 cm^ Töo/oiger Essigsäure gelöst, darauf alle die Operationen von der Oxydation durch Chromsäure an bis zur Reinigung des Rohimids vorgenommen, wie sie beim sauren Hämopyrrol soeben ge- schildert wurden. Die Ausbeute an Rohimid beträgt ca. 0";") f/, das gereinigte Luid erweist sich durch seinen Schmelzpunkt und durch die Analyse eben- falls als mit dem Methyläthylmaleinimid identisch. Nach diesen Befunden darf das NencJdsche Hämopyrrol als ein Gemisch aufgefaßt werden, in welchem ein Körper vorhanden ist mit ausgesprochen basischen Eigenschaften, während bei einem zweiten der basische Cha- rakter gegenüber schwach sauren Eigenschaften zurücktritt. Da beide Pyr- rolderivate sind, worauf die Rotfärbung eines mit Salzsäure befeuchteten Fichtenspans und die Fähigkeit mit Benzoldiazoniumchlorid zu reagieren hinweisen und die Oxydation es bestätigt, kommt für das ..basische Hämo- pyrrol" die Konstitution eines z-Methyl-ßfi'-Methyläthylpyrrolins, für das saure die eines gleich substituierten Pyrrols in Betracht. Die Oxydation "\Alirde sich dann nach folgendem Schema vollziehen: H3C — C = C.CH3 H3C — C — CO I >NH ). !| >NH. H5C2 — C = CH H5C2— C — CO VII. Darstellung der Hämatinsäuren. Die Hämatinsäuren C^HgO^N und CgHgOä, erkannt als Imid und als Anhydrid einer dreibasischen Säure, die als l-^rethyl-2-Carboxyäthyl- maleinsäure bezeichnet werden kann, entstehen bei der Oxydation des Hämins, Hämatoporphyrins und des Hämatins durch die verschiedensten ^Mittel — Salpetersäure, Wasserstoffsuperoxyd. Chromsäure in essigsaurer. Natriumhypobromit , Ferricyankalium , Kaliumpermanganat in alkahscher Lösung seien genannt — , und zwar bilden sich im allgemeinen um so größere Mengen von Hämatinsäure, je größer die Menge des Oxydationsmittels in bezug auf das zur Verwendung gelangende Hämatin ist, erst von einer be- stimmten Grenze an wird wieder eine Herabminderunu- der Ausbeute be- Das Humatin und seine Abbauprodukte. ß9q merkbar, dann zeigt aber auch sogleich das reichliche Auftreten von Bern- steinsäure und Kohlensäure, daß dies durch eine Zerlegung primär ent- standener Hämatinsäure bedingt ist. Des weiteren ist aber bemerkenswert, daß schon sehr geringe Mengen von Sauerstoff hinreichen, um in saurer Lösung Hämatinsäure zu bilden, allerdings in geringer Menge, während in alkalischer Lösung wenige Atome Sauerstoff von der Molekel Hämatin zunächst einmal aufgenommen werden, ohne daß es zu ihrem ZerfaU und zur Bildung von Hämatinsäure kommt (W. Küster'^). Zur Herstellung größerer Mengen von Hämatinsäuren bedient man sich am besten der (Jxydation mit Chromsäure in essigsaurer Lösung und verfährt wie folgt: 25 9 Rohhämin mich Mörncr werden in einer lieibschale mit Alkohol angerieben und mit ca. 2V2 ^ 0"2'7oiger Natronlauge in eine Flasche über- gespült, die alsdann geschüttelt wird, bis vollständige Lösung erfolgt zu sein scheint. Man filtriert durch ein Kreppfilter (Dreverhoff), bringt noch nicht gelöstes Hämin durch Zusatz neuer Xatronlauge völlig in Lösung, fällt (las P'iltrat durch Essigsäure im l'berschuü und bringt den sehr volu- minösen Hämatinschlamm auf große gehärtete P'ilter (Dreverhoff Nr. 49o), wonach er mit lauem Wasser ausgewaschen wird. Man saugt nun noch ab und breitet auf Fließpapier aus, um die Hauptmenge des anhängenden Wassers zu entfei'nen ; nach einigen Stunden ist dann der Kuchen — er mag noch ca. öO"/o Feuchtigkeit enthalten ■ — bröckhg geworden und läßt sich mit einem Porzellanspatel gut abheben. Das aus der angegebenen Menge Hämin erhaltene Hämatin wird nun in Lö l f]isessig von 100"/o eingetragen, die sich in einem Becherglase mit ca. o — 4/ befinden; beim vorsichtigen Umrühren und XTm schwenken löst sich das Hämatin rasch auf oder verteilt sich wenigstens so fein, dal) beim Filtrieren meist nur ein geringer Rückstand bleibt, der bei weiterer Behandlung mit Eisessig ebenfalls in Lösung geht. Man kann also die Filtration unterlassen, die Lösung aber durch mäßiges Erwärmen auf dem Wasserbade beschleunigen, muß aber dann vor dem Eintragen der Chromsäure wieder auf Zimmer- temperatur abkühlen lassen. Zur Oxydation verwendet man am besten 21 Atome Sauerstoff auf die Hämatinmolekel, bei 20/7 Hämin wird die ent- sprechende Sauerstoffmenge von 5ö<7 reinem Chromtrioxyd geliefert, die in Eisessig gelöst auf einmal in die Hämatinlösung eingetragen werden. Man sorgt bei Zimmertemperatur für gehörige Mischung uml beginnt sogleich mit dem Abdestillieren der Essigsäure unter vermindertem Druck. ^) ir. Küster, t)ber die Konstitution der Hämatinsäuren. Liebüfs Annal. Bd. 315. 174(1900); Bd. 345. S. 1 (1905); Ber. d. Deutscli. ehem. Ges. Bd. 33. S. 3021 : Bd. 35. 2948. — Derselbe, Spaltungsprodukte des Häniatins und Hämatoporpliyrins. Zeitschr. physiol. Chemie. Bd. 28. S. 1 und 34; Bd. 29. S. 185(1899/1900). — Derselbe, Beiträge ;nr Kenntnis des Hämatins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 44. S. 391 (1905). — Der- elbe, Ülier einige Salze, Ester und Anilinderivate der Hämatinsäuren. Zeitschr. f. hysiol. Chemie. Bd. 54. S. 501 (1908). (380 William Küster. wobei zweckmäßig zwei Fraktionskolben von je 1 / Inhalt gleichzeitig in bekannter Weise benutzt werden; das Erhitzen geschieht im Wasserbade. Während die Essigsäure abdestiUiert, was etwa 3/^- ^/^ Stunden in Anspruch nimmt, vollzieht sich die Aufnahme des Sauerstoffs, so daü der Tiückstand an heißes Wasser, in welchem er bis auf geringe Reste löshch ist. sobald 21 Atome Sauerstoff pro Hämatinmolekül verwendet worden sind, meist keine freie Chromsäure mehr al)gibt. Ist das doch der P'all (vgl. S. 627. Z. 2 V. 0.), so kann sie durch eine zweite Destillation der wässerigen Lösung- unter vermindertem Druck sicher beseitigt werden. Nachdem dann der liückstand von neuem mit heißem Wasser aus dem Fraktionskolben heraus- gespült worden ist. filtriert man von den nicht gelösten Anteilen ab, die. wie erwähnt, im gegebenen Falle nur gering sind, d. h. etwa 5Vo vom verwendeten Hämatin betragen und eisenhaltig sind, und erhitzt das Filtrat solange unter Erneuerung des verdampfenden Wassers auf dem Wasser- bade, bis der Geruch nach Essigsäure auch aus der schheßlich konzentrierten Lösung verschwunden ist, was 2 — 4 Tage in Anspruch nehmen kann und wonach sich noch unlöshch gewordene Partikel abgeschieden haben, von denen filtriert wird. Zum Filtrat wird zunächst die ^lenge Schwefel- säure hinzugefügt, welche nötig ist, um alles Chrom in Chromisulfat über- zuführen, in unserem Fall also 410^ 20''/oigPi' Säure, und das Verdampfen fortgesetzt, bis die in Freiheit gesetzte Essigsäure ebenfalls vollständig ent- Avichen ist, wobei es zu einer geringen Harzabscheldung kommen kann, von der wiederum filtriert wird, worauf das Filtrat noch mit einem Üljer- schuß von Schwefelsäure, von etwa 200 g 20''/oi8'Pi' Säure versetzt und nochmals längere Zeit auf dem Wasserbade digeriert wird, wobei man auf ein kleines Volumen, etwa 1/, eindampft. Die erkaltete Lösung wird mit etwa dem gleichen A^olumen Äther mehrere Male ausgeschüttelt, Ins sich der Äther nicht mehr färbt. Oft gibt eine bereits erschöpfend mit Äther extrahierte Lösung von neuem Substanz an diesen ab, nachdem sie von neuem nach Zusatz von etwas Schwefelsäure auf dem Wasserbade erwärmt wurde. Nach Abdestillation des Äthers erhält man dann die rohe Hämatin- säure, ca. 15^, bei Verwendung von 25^ Hämin. LTm schwerer in Äther lösliche Säuren, die ebenfalls bei der Oxydation des Hämatins entstanden sind, zu gewinnen, empfiehlt es sich , die Extraktion mit Äther in einem der zu diesem Zweck konstruierten Apparate vorzunehmen. Die Reinigung beginnt damit, daß man die rohe Säure in kalter Sodalösung aufnimmt und diese alkalische Lösung mehrere Male mit Äther extrahiert, wodurch sehr geringe Mengen basischei' Substanz von norh nicht aufgeklärter Zusammensetzung entfernt werden. Die durch schwaches Erwärmen vom gelösten Äther befreite Flüssigkeit wird nun mit verdünnter Schwefelsäure ziemlich stark sauer gemacht und einen Tag sich selbst überlassen, wonach eine klare Lösung resultiert, die von einem abgesetzten, harzigen Produkt abgegossen werden kann, worauf sie von neuem mit Äther extrahiert wird, nach dessen Abdunsten eine gereinigte Rohsiiiue erhalten wird (etwa lo-5//). Diese löst man nunmehr in kaltem Wasser Das Hämatiii niul seine Abbanprotlnkte. f;;',] iHul setzt 0'6r/ fein gesdilämintes Calciuiiikarboiiat liiiizn , welche etwa dem sechsten Teil der zur völligen Neutrahsation nötigen Menge entsprechen, falls die gesamte gereinigte Eohsäure aus der einbasischen Substanz l'gHgO^N bestehen würde. Das ist nicht immer der P'all. vielmehr enthalt sie geringe Mengen von Bernsteinsäure und andere Säuren von noch nicht bekannter Zusammensetzung, daneben häufig größere Mengen der zweiten Hämatinsäure CgHgOj. Alle diese werden als Säuren von stäi'ker saurem Charakter wie die stickstoffhaltige Hämatinsäure in Salze iil)ergefiihi-t. so (lall nunmehr Äther die letztere in fast reinem Zustande aufnimmt. Die aus- geätherte Kalksalzlösung gibt beim Erhitzen auf dem Wasserbade dann einen Ausfall, wenn grötiere Mengen der stickstofffreien Hämatinsäure vor- handen sind, was eintreten kann, wenn bei der Oxydation die Temperatur zu hoch war. In diesem Fall kann der ätherische Extrakt auch nach der ersten Behandlung mit Calciumkarbonat noch beide Hämatinsäuren enthalten, so daß es sich empfiehlt, die soeben beschriebene Behandlung mit Calcium- karbonat zu wiederholen. Aus den Kalksalzen sind beide Hämatinsäuren nach dem Lösen in Salzsäure durch Extraktion mit Äther leicht wiedei-- zugewinnen. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels bleibt sie denn auch schon in großen, allerdings noch gelb gefärbten Kristahen zurück, welche durch Umkristallisation aus etwa der gleichen Menge heißen Wassers leicht gereinigt werden können. B. Das Imid der dreibasischen Hämatinsäure H3C— C^CO CsHgO.X =, ii >NH C0( )H— CH2— CH,— C- CO kristallisiert in monoklinen Prismen, die zu Zwillingen derartig verwachsen sind, daß die Kristalle rhombischen Habitus erhalten. Die Substanz ist in Wasser, Alkohol. Äther, Essigester, namenthch in der Wärme, leicht löslich und schmilzt bei 114". Sie verhält sich wie eine einbasische Säure und gibt mit einer Anzahl zweiwertiger Metalle, z. B. Ca. Zn, Cd, gut kristalli- sierende Salze von der allgemeinen Formel (CgHgOiN), Me". Silber kann nicht nur den Wasserstoff der Karboxylgruppe , sondern auch den der Imidgruppe vertreten, doch entsteht beim Fällen einer mit Ammoniak neu- tralisierten Lösung der Säure in absolutem Alkohol mit einer weingeistigen Silbernitratlösung in der berechneten jNIenge neben dem Salz CsH7'Ag2^>4N auch noch ein Salz CgHgAgjOsN, was mit einer Aufspaltung der Imidgruppe zusammenhängen muß. Wie denn überhaupt die letztere leicht verseift wird und schon beim Eindampfen einer wässerigen Lösung des Kalksalzes immer ein kleiner Teil derselben in das unlösliche Kalksalz der Hämatinsäure CgHgOg übergeht. Nebenbei sei bemerkt, daß die eben erwähnte Lösung ein ganz vorzüglicher Nährboden für allerhand Pilze sein dürfte. C.Zur Überführung des Imids in das Anhydrid der dreibasischen Häma- tinsäure bedient man sich am besten des Barytwassers. Eine wässerige Lösung der stickstoffhaltigen Säure wird damit stark alkalisch gemacht 632 William Küster. und dann auf dem Wasserbade erhitzt; unter Ammoniakentwicklung fällt allmählich das in der Hitze unlöslich werdende Barvumsalz der stickstoff- freien Säure aus. Da die letztere dreibasisch ist, das Imid, CsHgO^N, aber nur einbasisch, so wird, falls nicht von vornherein ein großer Überschuß von Baryt ver- wendet worden ist, im Laufe der Umsetzung, die schon bei Verwendung von 2 g des Imids 4 — 5 Stunden dauert , vielleicht die alkalische Reaktion versehenden, die alsdann durch Zusatz von Barytwasser wieder herzu- stellen ist. Sobald sich kein Ammoniak mehr entwickelt, dampft man zur Trockne ein, nimmt den Bückstand mit verdünnter Salzsäure auf und ex- trahiert die Lösung erschöpfend mit Äther. Der Bückstand der ätherischen Auszüge besteht zum größten Teil aus dem Anhydrid, CsHgOä: zur Ab- trennung etwa noch vorhandener unverseifter Substanz löst man ihn in der o — 4fachen Menge heißen Wassers und lasse unter stetem Umrühren erkalten, wobei sich die Hauptmenge des Anhydrids in feinen Kristallen abscheidet, die durch Absaugen von der Mutterlauge getrennt und durch Nachwaschen mit eiskaltem AYasser gereinigt werden können. Die Mutter- lauge sättigt man darauf in der Kälte mit Barytwasser und erhitzt die Salzlösung auf dem Wasserbade, worauf sich der Best der Säure CgHgÜr, als unlöshches Baryumsalz al)scheidet, aus dem, wie schon angegeben, die Säure regeneriert wii'd, wonach sie durch Umkiistallisieren aus heißem Wasser gereinigt wird. D. Das Anhydrid der dreibasischen Hämatinsäure Cg Hs O5 kann in recht verschiedenen Kristallformen auftreten, je nach den Bedingungen, unter denen es sich abscheidet, und je nach dem verwendeten Lösungs- mittel. Beim langsamen Verdunsten einer ätherischen Lösung können bis 15 mm. große rhombische Kristalle von teils kurzprismatischem, teils dick- tafelförmigem Habitus erhalten werden. Der Schmelzpunkt der Substanz hegt bei OT^QS'', in den meisten organischen Solventien ist sie namentUch in der Wärme leicht löslich; daß man sie zweckmäßig aus der dreifachen Menge heißen Wassers umkristallisiert, wurde bereits angegel)en, hierbei scheidet sich oft zuerst ein Öl aus, das allmählich in die Kristalle übergeht. Li wässeriger Lösung verhält sich das Anhydrid Cg Hg ( )& wie eine dreibasische Säure C8Hio(J6' '^'fn der sich auch das beim Eingießen der berechneten Menge Silbernitratlösung in eine durch Ammoniak neutralisierte Lösung des Anhydrids entstehende Silbersalz ableitet, dem also die Zusammen- setzung C'gH^Ag.Öß zukommt, auch ein Trimethylester ist bekannt, die Säure selbst hat alier bisher noch nicht dargestellt werden können. Sehr charakteristisch ist das Verhalten der Erdalkalisalze und das des Kupfer- salzes; die wässerige Lösung des Anhydrids CgHgOg zersetzt die Karbonate der erwähnten Metalle unter lebhafter Kohlensäureentwicklung, man erhiUt in der Kulte eine klare Lösung, die beim Erwärmen eine fast ([uantitative Ausscheidung der Salze gibt. Dieser Niederschlag ist, wenn er ein Erd- alkalimetall enthält, kristaUisiert und enthält auf 4 Moleküle Cg Hg Og ö Atome Metall, so daß die Zusammensetzung z. B. durch die Formel CssH.jgCaäOss Das Häniatin uud seine Abfallprodukte. ß'^)\ dder CajHgoBasOoi wiedergegeben werden kann. Im (Gegensatz zu den prwähnten Salzen fallen die des Magnesiums, Zinks und Cadmiums beim Erwärmen ihrer kalt bereiteten Lösungen nicht aus. E. Die Umwandlung des Anhydrids in das Imid der dreibasisehen Hämatinsäure kann entweder durch Erhitzen mit alkoholischem Ammoniak auf 110° erfolgen oder mit Benutzung der Ester der Säuren auf folgen- dem Wege: 10^ CgHgOj werden in 40// absoluten Alkohols gelöst und so viel möghchst konzentrierte Salzsäure hinzugegeben . daß die Lösung ca. 2Vo Chlorwasserstoff enthält, worauf ö Stunden am Kückflußkühler erhitzt wird: nun wird der Alkohol vollständig abdestilliert und der Rückstand mit etwa 100 t'>^^^ Wasser versetzt. Das abgeschiedene Estergemisch wird im Scheide- trichter von der wässerigen Lösung, Avelche unveränderte Hämatinsäui'e in geringer Menge enthält, getrennt, darauf in Äther gelöst, die ätherische Lösung mit wässerigem Ammoniak ausgeschüttelt, die wässerige Lösung von der ätherischen getrennt (in der ätherischen Lösung verbleibt der Diäthylester der dreibasischen Hämatinsäure, der durch Ammoniak nui- langsam gelöst und dabei wieder zu Hämatinsäure verseift wird) und im Wasserbade zur Trockne verdampft. Der Rückstand ist nunmehr in Wasser unlösKch geworden , löst sich aber in Äther und stellt den Äthylester des Imids der dreibasischen Hämatinsäure vor. Durch die Veresterung haben sich vornehndich 2 Derivate von Cg Hg 0-„ gebildet, ein Monoäthylester des Anhydrids CinHi.205 und ein aus zwei solchen Molekülen unter Hinzutritt von Wasser gebildetes Produkt C'.^o H..fi( )„ : beide Ester werden durch wässeriges Ammoniak in das Diammoniumsalz des Monoäthylesters der dreibasischen Hämatinsäure CjoHaoOgNa über- geführt, das alsdann beim Eindampfen seiner Lösung unter Verlust von Wasser und Ammoniak den Äthylester des Imids CioHigO^X liefert: CO\n COO XH, H^CsCO/^' + 2NH3 + H.,0 = H,C,CO()NH, CÜOaHs COO Ca H, COONH, ^'^K\u H.CsCOONH, — NH3 — H,() = H^C^CO/^" COOCH^ ' COOC^H, Zur Verseifung des öUgen Esters wird 1 (iewichtsteil desselben mit LG Gewichtsteilen lOO/oiger Schwefelsäure auf dem Wasserbade eine halbe stunde lang erwärmt, bis klare Lösung eingetreten ist. die dann nach dem Erkalten ausgeäthert wird, wobei reine Hämatinsäure CsHyO^N er- lalten wird. F. Zur Überführung des Imids der dreibasischen Hämatinsäure ^sHgO^N in das Imid der Methyläthylmaleinsäure C^HgO-^N werden ö^/ les ersteren in einem kleinen Fraktionierkolben auf dem Sandbade erhitzt, obei unter Entwicklung von Kohlendioxyd die Hauptanteile bei ca. IIK)" ibergehen. Das Destillat, ;i— ;Vö g, ist dickflüssig und stark gefärbt, riecht ß34 \Mlliam Küster. Das Humatin und seine Abbauprodukte. brenzlicli und zugleich an Jodoform erinnernd. Durch eine zweite Destillation unter vermindertem Druck wird eine gelbe, ölige Fhissigkeit erhalten, welche heim Erkalten bereits in spitzen Nadeln kristallisiert. Die Reinigung der- selben kann, wie auf Seite 627, Z. 6 v. u. bereits angegeben, erfolgen: alle Eigen- schaften weisen darauf hin. daß in ihnen das Imid der ^lethyläthylmalein- H3 C . C — CO. säure || ^NH vorliegt. Durch ^'erseifung dieses Imids H5 Co . C — CQ/ oder durch trockene Destillation des Anhydrids der dreibasischen Hämatin- säure kann das Anhydrid der Methyläthvlmaleinsäure C; Hg Og erhalten werden, ein bei 2-)0° siedendes Öl von ganz charakteristischem, lange aidiaftendem Ceruch. Bemerkungen für die Analyse von Hämin und Hämatin. Alle Häminpräparate verbrennen im offenen Rohr beim Überleiten I von Sauerstoff vollständig , neben der Kupferspirale lege man noch eine ' Silberspirale vor, doch verkürze man hierdurch die Schicht des Kupferoxyds , möglichst wenig. Hämatin verbrennt schwieriger: es mul) für die Analyse \ vor allen Dingen aufs feinste gepulvert sein und dann wird es am besten \ mit Kupferoxyd gemischt verbrannt. Man kann aber auch im Schiffchen i im Sauerstoffstrome verbrennen, dann muß dies aber rasch geschehen, soj daß sich entwickelndes Kohlenoxyd mit Flamme verbrennt. Als Absorptions- mittel für das Kohlendioxyd diene Natronkalk. Das im Schiffchen zurückbleibende Eisenoxyd kann meist zu einer Eisenbestimmung verwendet werden, man löse es dazu in Salzsäure auf' und fälle mit Ammoniak, es ist nämlich nicht ausgesclilossen , daß aJsi Yerbrennungsrückstand wenigstens teilweise FcgO^ erscheint, wodurch sich ein zu niedriger Eisengehalt berechnet, wenn dies unter der Annahme.^ die Asche bestehe aus Fcg O3, geschieht. j Die Stickstoffbestimmung nach Dumas erfordert ziemlich langes und, heftiges (jlühen, man sorge also für recht schwer schmelzbare ^'erbrennlmgs-, i'öhren: nach Kjeldahls Methode werden nur dann richtige Werte erhalten.! wenn zum Zerstören von je 0"! ^ Substanz 10 an^ rauchende Schwefelsäure- unter Zusatz eines Körnchens Kupferoxyd verwendet wurden und das p]rhitzen mindestens 24 Stunden dauerte. Zur Zerstörung der Hämine durch Salpetersäure bei Cariusbestiinmun-| gen, die hier jeder anderen Art vorzuziehen sind, genügt ostündiges Er-i hitzen auf loO**, natürlich labt sich im Filtrat vom Chlorsilber auch nocli; das Eisen bestimmen. Gallenfarbstoffe und Abbauprodukte. Von William Küster, Stuttgart. A. Die Aufarbeitung von Gallensteinen. Bei der Darstellung' von (lallenfarhstoffen erweist es sich als nützlich, die als Lösungsmittel dienenden Flüssigkeiten, wie Alkohol, Eisessig, Chloro- form, in einem sehr großen Überschuß anzuwenden; eine glatte Filtration gehngt in den meisten Fällen nur bei Beobachtung dieser \'orsichtsmaßregel, aus dem Filtrat wird dann zunächst das Lösungsmittel bis auf einen ge- ringen Rest abdestiUiert. Zur Gewinnung von Galleufarbstoffen i) eignen sich am besten Gallen- steine aus der Gallenblase des Rindes, die immerhin häufig vorkommen und meist in reichlicher Menge Farbstoff enthalten, während das Cholesterin zurücktritt. Die Farbe solcher Konkremente ist ziegelrot, die (iröße der- selben wie ihre (Gestalt wechselt, am häufigsten erscheinen sie als kugel- förmige Gebilde mit konzentrischer Schichtung bis zu 5 cw Durchmesser, selten sind vollkommen ausgebildete Tetraeder von fast gleicher Länge der Seitenkante; eine Schichtung ist auch hier zu erkennen. In den Gallengängen von Pferden können sich ebenfalls Konkremente finden {W. Küster'^), die zum größten Teil aus Farbstoff bestehen, sie sind von geringerem Umfang als die Gallensteine, etwa von Johannisbeer- bis Kirschkerngröße, und tief braun gefärbt. Auch die Gallensteine, welche sich so häufig in dei' (iailenbiase des Menschen finden und gewöhnlich die Form von Tetraedern I)esitzen. ent- halten Farbstoff, doch tritt die Menge desselben gegenüber dem Cholesterin ganz zurück. Staedeler-) hat doch seine Untersuchungen mit Hilfe mensch- licher Gallensteine ausgeführt und die Formel (Cie Hjg üg Ng) für das Bilirubin festgestellt, wie sie noch heute angenommen wird, während zuerst Yahu- •) WiUiam Küster, Beiträge zur Kenntnis der Gallenfarbstoffe. Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 26. S. 314 (1898); Bd. 47. S. 294 (190(3). Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. .'{5. S. 1268 (1902). ^) bis 8 angegebene Verfahren wiederholt wird, wobei dann auch weitere Mengen von Choleprasin gewonnen werden. Denn von dem ursprünglich in .Vi'beit genommenen Pulver (150^) ist sicherlich nach all den beschriebenen Operationen noch ein Drittel übrig, in dem noch reichlich Farbstoff steckt, wovon man sich leicht durch Behandlung einer Probe mit warmer Natrium- karbonatlösung, die allmählich die Farbstoffe löst, überzeugen kann. Auch ist immer noch dasselbe Gemisch von Choleprasin und Bilirubin der Haupt- sache nach vorhanden, und es kann durch fortgesetzte Behandlung mit all den angegebenen x4gentien gelingen, die Farbstoffe herauszuschälen, allerdings, ehe die restlose Aufarbeitung vollendet ist, kann ein Jahr ver- gangen sein. Durch die Einwirkung von Alkali geht die Aufschließuug zwar rascher vonstatten, doch wird dabei ein Teil der Farbstoffe zersetzt. B. Das Umkristallisieren des Rohbilirubins. Wie soeben erwähnt bestehen die Fraktionen I und H des Rohbili- rubins bereits aus fast reinem Farbstoff, nur ist derselbe nicht deutlich kristallinisch. Gut ausgebildete Kristalle werden erst beim Umkristallisieren des Bilirubins aus siedendem Dimethvlanilin erhalten, wobei allerdings ein Teil des Farbstoffs eine Zersetzung erleidet. Das Verfahren gestiiltet sich wie folgt: Je i^ (/ bei 110° getrocknetes, fein gepulvertes Bohbilirubin werden in 93^ (1 Teil Bilirubin lost sich etwa in 31 Teilen siedenden Dimethvl- anilins; bei Zimmertemperatur ist das Verhältnis etwa 1 : 112'6) auf dem Babo zum Sieden erhitztes Dimethvlanilin (es empfiehlt sich, das käufliche Dimethvlanilin gut zu trocknen) eingetragen, worauf noch 5 Minuten im Sieden erhalten Avird. dann mrd siedend heiß filtriert. Die Filter Nr. 5!)7 i von Schleicher cV: SchüU eignen sich gut , für jede Portion von 3 g muß j ein besonderes Filter genommen werden. Aus dem Filtrat haben sich nach j mehrtägigem Stehen Kristalle abgesetzt (Fraktion I), die abfiltriert und j mit kaltem Dimethvlanilin nachgewaschen werden, bis der Ablauf durch I Alkohol nicht mehr getrübt wird. Aus dem gesamten Filtrat wird dann! unter vermindertem Druck das Dimethvlanilin bis auf Ve der vorhandenen Menge abdestilliert, worauf nach 2 — .'Uägigem Stehen eine zweite Kristal- lisation (Fraktion H) erfolgt, die, wie bei der ersten angegeben, getrennt und gereinigt wird. Das Filtrat von Fraktion H wird dann in die acht- fache Menge absoluten Alkohols eingetragen, der entstandene Nieder- schlag (Fraktion HI) nach eintägigem Stehen filtriert, vom Filtrat der Alkohol abdestilliert und der Piückstand durch verdünnte Salzsäure gefüllt (Fraktion IV). Gallenfarbstoffe und Abbauprodukte. cai Die vom siedenden Dimetliylanilin bei der ersten Einwirkuno' nicht gelösten Anteile werden zweckmäßig noch ein zweites Mal mit dem lisiiiigs- mittel behandelt, und zwar nimmt man für die Rückstände aus 2 Portion^en wieder 93^; was dann noch nicht gelöst wurde, gibt bei einer 2. Wieder- holung des Verfahrens immer noch weitere Mengen von kristallisiertem Bili- rubin. Die Ausbeuten an letzterem, also an den Fraktionen I und II zusam- mengenommen, stellen sich dann auf etwa 2/3 des in Arbeit genommenen Rohbiürubins, wovon Vs a"f Fraktion I kommen; Fraktion III ist undeutlich kristallisiert und stellt schon ein Zersetzungsprodukt des Bilirubins vor das letztere gilt auch für Fraktion IV und für den Anteil, der sich auch' nach 3maliger Behandlung mit Dimethylanilin nicht gelöst hat. C. Eigenschaften des Bilirubins. Nachdem das umkristallisierte Bilirubin vom anhängenden Dimethvl- anilin befiTit worden ist, was durch langes Schütteln mit kaltem Alkohol aUmählich gelingt, gibt es bei der Analyse Werte, die zur Aufstellung der Formel (C,6Hi8 03N2)x. (das Molekulargewicht hat direkt noch nicht^'f est- gestellt werden können, Orndorf und Teeple^) schheßen aus dem Bestehen eines Monoazoprodukts (C32H35()6N,)N2R auf die verdoppelte Formel) be- rechtigen. Bilirubin kristallisiert aus heißem Dimethylanilin meist in großen breiten rhombischen Säulen, es können aber auch langgestreckte Nadeln (namenthch in Fraktion II) und andere Formen auftreten. Seiner chemischen Natur nach verhält es sich wie eine Säure (auf 16 C-Atome ist 1 ver- tretbares Wasserstoff atom vorhanden B. Küster % es bildet also mit Basen Salze, von denen die der Alkalien in Wasser löslich sind. Basische Eigenschaften besitzt das Bihrubin nicht; durch Eisessig wird es nicht verändert, wohl aber durch konzentrierte Salzsäure, die in der Hitze Stickstoff herausnimmt, und durch konzentrierte Schwefelsäure, deren Einwirkung vielleicht zur Bildung einer Sulfonsäure führt. Bilirubin ist ein sehr leicht veränderlicher Körper; schon beim Auf- bewahren in trockenem Zustande tritt eine Umwandlung ein, die von einer Änderung der Farbe begleitet ist. Die anfänglich schön braunrote Farbe bekommt einen gelbbraunen Ton, solche Präparate pflegen an Eisessig etwas grünen Farbstoff abzugeben — es dürfte also eine Oxydation an der Oberfläche eingetreten sein --, außerdem zeigt sich die Löslichkeit in Chloroform ganz beträchtlich vermindert. 1 (lewichtsteil eines frisch um- kristallisierten Bilirubins löst sich nämlich schon in etwa 120 (iewichts- M W. R. Orndorf und ,/. E. Teej)le , On Bilirubin, the red coloriug matter of the nie. Americ. Chem. Journ. Vol. 26. p. 86(1901); Vol. 33, p. 215 (1905). —Dieselben, Beiträge zur wissenschaftlichen Medizin und Chemie. Salkouski, Festschrift 1904. S. 301 ! ') B. Kostet; Kritische und experimentelle Beiträge zur Kenntnis der Galleufarb- toffe. Inaug.-Dissert. Rostock 1901. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden, ü. 4J 642 William Küster. teilen Chloroform auf, schon nach 6 Wochen sind über oOO Teile erfor- derlich und nach einem Jahre etwa ist ein Bilirubin entstanden, das sich im Verhältnis von etwa 1 : 800 in Chloroform löst. Dementsprechend ver- hält sich auch bereits das „Bilirubin" der Gallensteine, ein Teil dessell)eii wird leicht durch Chloroform gelöst und ist von dunkelroter Farbe, die Teile aber, welche nach z. B. (3tägiger Extraktion am 7. Tage herausgelöst werden, sind orange gefärbt und zeigen eine Löslichkeit im Verhältnis von etwa 1 : 1100. Beide Formen des Bilirubins haben aber die gleiche prozentische Zusammensetzung. Worin die ^>riinderung besteht, welche das Bilirubin erleidet, ist noch nicht sicher liekannt, man kann daran denken, daß sich der F"arbstoff polymerisiert und daß andrerseits beim Umkristal- lisieren aus siedendem Dimethylanilin (Temperatur 192°) wieder eine De- polymerisation eintritt. Viel rascher vollzieht sich die Oxydation des Bilirubins durch den Sauerstoff der Luft, wenn es sich in Lösung befindet. Beim Verdampfen einer Lösung von Bilirubin in Chloroform wird immer namentlich am Licht ein Teil des roten Farbstoffes in einen grünen verwandelt, der sich in Eisessig löst. Wahrscheinlich handelt es sich aber auch hier bereits um ein Gemisch, da sich zersetzendes Chloroform wie Chlor wirken dürfte und durch Thudichum zuerst nachgewiesen Avurde, daß Halogene auf Bihrubin substituierend wirken. Hat man es aber mit einer wässerigen Lösung des Bilirubins in einem Alkali zu tun, so dürfte neben der Oxydation eine Hydrolyse des Bilirubins eintreten, so daß dann auch hier ein Gemenge von grünen Farbstoffen entsteht, die zur Kategorie des Biliverdins gehören, lauter ganz besonderen Bedingungen kann es allerdings auch einmal ge- lingen, einen Körper zu erhalten, der bei der xinalyse mit der Formel CieHigO^No übereinstimmende Werte gibt. Kristallisiert konnte dieses Oxydationsprodukt des Bilirubins bisher aber nicht erhalten werden, und es ist daher nicht sicher, ob nicht doch ein Gemenge vorliegt. Will man „Biliverdiu" aus Bilirubin darstellen, so verfahre man nach allem wie folgt: 1 (j Bilirubin wird in 35 cm^ ^/lo n-KOH (das entspricht für die Formel CjeHjgOgN, 1 Molekel KOH) unter Zusatz von i/W Wasser zur Lösung gebracht, die Lösung filtriert und das Filtrat in einer großen Schale drei Wochen der Einwirkung des Luftsauerstoffs ausgesetzt, dabei darf aber die Temperatur nicht über 5" C steigen. Die grün gewordene Lösung wird dann durch einen geringen Über- schuß von Salzsäure (es genügten schon ?A'q cm^ ^/iqN.HCI, ein geringer Überschuß bewirkt aber besseres Absetzen des Niederschlages) gefällt, derj Niederschlag filtriert, ausgewaschen und noch feucht in einem Überschuß von x\lkohol gelöst. Wenn die Oxydation vollständig geworden ist und sich nur „Biliverdin" gebildet hat, wird völlige Lösung erfolgen. Man filtriere, dampfe den größten Teil des Alkohols unter vermindertem Druck| ab und gieße den Rückstand in Wasser, woliei das Biliverdin ausfällt und^ dann gesammelt werden kann. (Ausbeute fast lg.) , Gallenfarbstoffe und Abbauprodiikte. ,•!... Jeder Überschuß an Alkali und jede Temperaturerhöhnn.- hodin-t einen anderen Verlauf der Reaktion, sichtbar /. 15. daian, dal', das saure Filtrat vom Büiverdin deutlich gefärbt ist und Aninioniiimsal/ enthält Wirkt ein Überschuß auch nur von Alkalikarbonat bei 10" auf liijinibin drei Wochen ein, so wird die Ausbeute an grünem Farbstoff vielleicht nur noch ÖO'Vo vom verwendeten l^ilirubin betragen, auch ist es sicher ?in Gemenge mehrerer Substanzen, daneben hat sich ein wasserlöslicher [uirper von brauner Farbe gebildet, der die sogenannte Pyrrolreaktion beim Erhitzen der Substanz [ohne Zinkstaub] treten Dämpfe auf, die inen mit Salzsäure befeuchteten Fichtenspan intensiv röten) außer- n-dentlich stark gibt. Zu seiner Darstellung macht man das Filtrat vom mgebUchen Büiverdin wieder alkahsch. engt es . stark ein und füllt nun uit einer Säure aus. Ein Mitl-1, den Körper zu reinigen, ist noch nicht )ekannt. Das Filtrat gibt alsdann an Äther verschiedene Körper ab, leren Trennung aber ebeufalls noch nicht gelungen ist. Es zerfällt also das Bilirubinmolekül unter dem Einflui; von Alkalien ußerordentlich leicht, wobei eine Mitwirkung des Luftsauerstoffs allerdings loch nötig ist. Setzt man daher zu der alkalischen Lösung des Bilirubins ■in Oxydationsmittel, so tritt die Umwandlung uoch rascher ein und jetzt )efinden sich reichhche Mengen von Hämatinsäuren unter den entstehenden rodukten. 10^ RohbiUrubin werden z.B. in 200^ öVoiger Natronlauge gelöst md 2(j Natriumsuperoxyd in die Lösung eingetragen, worauf 60 Stunden m siedenden Wasserbade erwärmt wird. Die Zersetzung des Farbstoffes ollzieht sich hierbei unter Ammoniakentwicklung, dessen ]ilenge etwa inem Atom Stickstoff, auf das Molekül Cg^HseOeNi bezogen, entspricht. Die alkalische Lösung wird nun mit Schwefelsäure angesäuert, wobei eichhche Mengen von Kohlendioxyd entweichen, und mit Wasserdämpfen ie flüchtigen sauren Zersetzungsprodukte, unter denen sich Essigsäure nd wahrscheinlich auch Ameisensäure befinden, aogeblasen. Jetzt kann lit Äther die Boh-Hämatinsäure entzogen werden, deren Trennung in nteile, die schwerer in Äther löslich sind, z. B. Bernsteinsäure, und in eine Hämatinsäuren nach dem auf S. 630 und 631 besprochenen \('i-- ihren leicht bewerkstelligt werden kann, doch erhält mau mir etwa •> rj ?ine Hämatinsäure CgHgOs. Da die angewandten '2 g Natriumsuperoxyd nur etwa einem Atom auerstoff auf das xMolekül Cn-, 11,8 Os N, entspi'echen, so dürfte die Zer- ^tzung des Bilirubins hauptsächlich durch das Alkali erfolgen. Durch ieses Verhalten unterscheidet sich der rote Gallenstoff scharf vom ämatin, das in alkalischer Lösung einige Atome Sauerstoff pro Molekül ifzunehmen vermag ohne eine Zerlegung zu erfahren. Durch Oxydation von Biliverdin in eisessigsaurer Lösung mit Cliroiii- lure wird ebenfaUs Hämatinsäure gebildet, doch beträgt ihre MiMigc im sten FaU 40Vo vom verwendeten Gallenfarbstoff. Durch Ileduktiou in 41* ß44 William Küster. Gallenfarbstoffe und Abbauprodukte. alkalischer Lösung durch Natriumamalgam geht Bilirubin nach R. MaJi/^) in das „Hydrobilirubin C32H40O7N4 über, das er für identisch mit Jaß's Urobilin hielt. Man suspendiert BiHruliin in Wasser und versetzt mit Natriumamalgam, worauf sich der Farbstoff löst und zugleich reduziert wird, was am Eintreten einer helleren Farbe zu beobachten ist. Nach 2 — 4 Tagen, während welcher Zeit man häufig schüttelt und zuletzt im Wasserbade erwärmt, ist die Reduktion vollendet, worauf die vom Queck- silber abgegossene Lösung durch Salz- oder Essigsäure gefällt wird. Hierbei tritt dunkelgranatrote Färbung ein und der Farbstoff fällt all- mählich in dunkelrotbraunen Flocken aus. Das Hydrobilirubin ist noch nicht kristaUisiert erhalten worden, es löst sich in Alkohol, Chloroform, Eisessig. Die alkahschen Lösungen des Farbstoffs sehen gelb aus, sauer reagierende dagegen rot, auch zeigen letztere einen deutlichen Absorptions- streifen, während ammoniakalische einen solchen erst auf Zusatz von etwas Zinksulfatlösung hervortreten lassen; zugleich tritt grüne Fluoreszenz der im durchgehenden Lichte granat- bis rosenroten Lösung ein. M R- Müh/, über die Umwandlung von Bilirubin in Harnfarbstoff. Liehigs Annal. d. Chem. Bd. 163. S. 77. \ Darstellung der Gallensäuren und ihrer wichtigsten Abbauprodukte und ihr Nachweis. Von Olof Hammarsten, Upsala. l. Darstellung der gepaarten Gallensäuren. A. Darstellung der Glykocholsäuren. a) Glykochol- und Glykocholeiusäure. Als Rohmaterial dient am besten die Rindergalle, die man indessen erst mit Alkohol von dem sog. Schleime befreit. Wenn man zur Aus- fällung der Glykocholsäuren die schleimhaltige Galle direkt mit einer Säure versetzt, so wird nämüch immer das Nukleoalbumin (der sog. Schleim) gefällt, und infolge der eiweißfällenden Eigenschaft der Taurocholsäure wird die letztere zum Teil mit ausgefällt und kann durch Zersetzung unter Cholalsäurebildung während der fortgesetzten Arbeit die Reindarstellung der Glykocholsäuren erschweren. Von der schleimfreien, von Alkohol be- freiten GaUe bereitet man eine wässerige Lösung, die nicht mehr als S^/o gallensaure Salze enthält. Wenn eine kleinere Portion dieser Lösung, mit Äther und Salzsäure (bis zu ■2"/o) versetzt, sogleich getrübt wird und innerhalb 12 Stunden reichhche Mengen von Kristallen oder einen mit harziger Masse gemengten Kristallbrei abgesetzt hat, so ist die Lösung direkt zur Darstellung der Glykocholsäure geeignet, und man verfährt in dem Falle, wie unten an- gegeben wird. Wenn dagegen die Probe klar bleibt oder nur opalisierend wird, so bedeutet dies, daß die Galle verhältnismäßig reich an Taurochol- säure, welche die Ausfällung der Glykocholsäm'en verhindert, ist. In diesem Falle kann man allerdings zum Ziele kommen, wenn man nach dem älteren Verfahren von Strecker^) eine größere Menge Säure zusetzt, bis eine bleibende Trübung entsteht; aber hierbei kann infolge der Einwirkung der Säure allmählich eine Abspaltung von Cholalsäure aus der Taurocholsäure stattfinden, und es ist deshalb besser, erst eine glykocholsäurereichere Fraktion aus der Galle darzustellen. ') Adolph S'frccJcer, Untersuchuug der Ochsengallc. Purste Abhandlung. Annalea ier Chemie und Pharmazie, herausgegeben von Friedrich Wöhlcr und Jitsfus Licbif/. Bd. 65. S. 1—37. Heidelberg 1848. g46 ^^^^^ Hammarsteu. Zu diesem Zwecke fällt mau die oben genamite Lösimg mit Bleizucker- lösung oder mit einer Ö^oigen Lösung von Eisenclilorid, trennt den Nieder- schlag durch Filtration oder Zentrifugieren von der Flüssigkeit, zerlegt ihn in der Wärme mit Natriumkarbonat in Wasser, filtriert und verdunstet fast zur Trockene. Der Rückstand wird in Alkohol gelöst, von dem Natrium- karbonate abfiltriert, von neuem eingetrocknet und in Wasser (zu einer 2 — B^/oigen Lösung) gelöst. Diese Lösung ist nun zur Ausfällung der Gly- koch Ölsäuren fertig. Die Menge und Zusammensetzung der obigen Blei- bzw. Eisenfällung wechselt selbstverständlicb mit der Beschaffenheit der verarbeiteten Galle, und trotzdem das reine Taurocholat nicht von den genannten Reagenzien gefällt wird, enthält sowohl die Blei- wie die Eisenfällung immer ein Gemenge von Glyko- und Taurocholaten. Der Bleiuieder- schlag enthält oft 60— 70*'/p Glykocholsäure, während die Eisenfällung selten mehr als 50% '^'on ihr enthält. Es ist in der Regel auch leichter, eine reichliche Kristallisation von Glykoch Ölsäuren zu erhalten, wenn man von der Bleizuckerfällung, als wenn man von der Eisenfälluug ausgeht. Aus dem Grunde ist auch im allgemeinen die Fällung mit Bleizucker vorzuziehen, wenn auch die Eisenfällung regelmäßig einen viel größeren Bruchteil der gesamten Gallensäuren enthält. Zur Ausfällung der zwei Glykocholsäuren wird nun die oben genannte, direkt (aus der Galle) oder indirekt (aus der Blei- bzw. Eisenfällung) er- haltene, höchstens H7oige Lösung von gallensauren Salzen in einem passenden, mit Stöpsel versehenen Glasgefäße mit soviel Äther versetzt, daß nach Sättigung damit eine wenigstens zentimeterhohe Ätherschicht über die^ Flüssigkeit stehen bleibt. Man setzt nun Salzsäure bis zu 2°/o hinzu, schüttelt tüchtig um und läßt in einem kühlen Zimmer stehen. Die Kristallisation I fängt regelmäßig schon nach kurzer Zeit an und ist meistens in weniger als 24 Stunden beendet. Die gefärbte Ätherschicht , welche Fettsäuren enthält, wird entfernt, die Kristallmasse geschüttelt, abgesogen, in Wasser | verteilt, von neuem abgesogen, mit Wasser nachgewaschen und stark aii.s- j gepreßt. Diese Masse stellt ein Gemenge von überwiegend kristallisierter j Glykocholsäure mit amorpher, harziger Glykocholeinsäure dar. Die Glykocholsäure, C26H43NO6, gewinnt man in folgender Weise,' aus diesem Gemenge. Man verteilt die Masse fein in Wasser ( 1 : 100), er- j hitzt zum Sieden und filtriert siedendheiß im Heißtrichter. Die Haupt- j menge der Glykocholsäure geht hierbei in Lösung und scheidet sich ausj dem Filtrate als eine Masse von langen, fast farblosen Nadeln aus. Aus dem in dem Kolben und auf dem Filter gebliebenen Rückstände, welcher aus Glykocholeinsäure, Paraglykocholsäure, etwas Glykocholsäure und Farb- stoff l)esteht, kann durch neues Auskochen mit Wasser noch etwas Glyko- cholsäure gewonnen werden. Sämthche so gewonnene Säure soll nun aus heißem Wasser umkristaUisiert werden; aber hierbei bleibt immer ein Teil ungelöst, der abfiltriert wird. Die nun aus dem Filtrate umkristallisierte Säure ist regelmäßig schneeweiß und anscheinend rein. Versucht man aber dieselbe in heißem Wasser zu lösen, so gehngt dies regelmäßig nicht voll- ständig, selbst dann nicht, w^enn man eine größere Menge Wasser als die,| aus welcher sie au.skristaUisiert hatte, verwendet, und dieses Verhahen kann l)ei erneuerten Umkristallisationen sich wiederholen. Darstellung der Gallensäureu nud ilirer wichtigsten Abbauprodiikte etc. (j47 Der Grund hierzu ist nicht ganz klar. Nach Strecker^) soll die par- tielle Unlöslichkeit durch die Entstehuni^' von rarnnlvkochols<äurc bedingt sein; aber diese Frage scheint einer ^Yeitercn Prülung bedürftig zu sein. Jedenfalls erschwert dieser Umstand in hohem (irade die Ueindarstellung der Säure durch Umkristallisieren aus Wasser, und es ist darum besser, die zweimal aus Wasser kristallisierte, ganz trockene, vorher mit Äther extrahierte Säure in Alkohol (1:10) zu lösen und diese Lösung mit Wasser bis zur bleibenden Trübung zu verdünnen. Die Säure kristallisiert leicht und kann in dieser Weise, wenn nötig, durch nochmaliges Umkristallisieren rein erhalten werden. Aus der schleimfreien Menschengalle kann die (ilykocholsäure gewöhn- hch direkt, ohne vorherige Fällung mit Dleizucker, durch Äther und Salz- säurezusatz gewonnen werden. Dieses Verfahren, iusoferne als es für glykocholsäurereiche Gallen direkt paßt, rührt von Hiifner'-) her. Ein abgekürztes Verfahren zur Gewinnung dieser Säure aus dem Bleizuckerniederschlage hat Strecker^) angegeben. Es besteht darin, daß man den Niederschlag mit Alkohol auskocht, siedend iieiß filtriert und mit Schwefelwasserstoff das Filtrat entbleit. Durch Verdünnung des Alkohols mit Wasser wird die Säure in Kristallen erhalten. /-. Gorup-Besunez^) hat ein anderes abgekürztes \'erfahren angegeben, dessen Prinzip darin besteht, daß man aus der Galle die Farbstoffe mit Kalkmilch fällt und dann mit Schwefelsäure bis zur bleibenden Trübung versetzt. Endlich ist eine Me- thode, welche auf der Ausfällung der Farbstoffe mit Uranacetat und darauffolgender Fällung mit Eisenchlorid beruht, von M. Bleibtreti*) angegeben und von H. Bontemps^) weiter ausgearbeitet worden. Eigenschaften. Die Glvkocholsäure kristaUisiert in feinen Nadeln. Nach Emich ^) löst sie sich in kaltem AVasser in dem Verhältnisse O';');'»: 1000 und in siedendem in dem Verhältnisse 8'o:1000. Leicht löslich in starkem Alkohol, nur sehr wenig lösüch in Äther, Chloroform und Benzol. Geschmack süßhch bitter. Die Salze mit AlkaUen und alkahschen Erden sind in Wasser leicht löslich; von Salzen der Schwermetalle werden diese Lösungen gefällt. Die Säure und ihre Salze sind rechtsdrehend. Nach Hoppe-Seyhr'» ) ist für ') Adolph Strecker, Untersuchung der Ochsengalle. Erste Abhandlung. Annaleu der Chemie und Pharmazie, herausgegeben von Friedrich Wähler und Justuf! Liebig. Bd. 65. S. 1— 37. Heidelberg 1848. ^) Gtcsfar Hiifncr, Schnelle Darstellung von Glykocholsäure. Journ. f. prakt. Chem. Bd. 118 (N. F. Bd. 10). S. 267—268. Leipzig 1874. ^) E. V. Gorup-Besauez, Eine vorteilhafte Darstellungsweise der Glykocholsäure. Annalen der Chemie u. Pharmazie, herausgegel)en von Friedrich ]\'ölilcr und Jiisfus Liehig. Bd. 157 (X. K. Bd. 81). S. 286—287. Leipzig und Heidelberg 1871. *) Mar Bleibfreu, Vorläufige Mitteilung über eine neue Methode zur Darstellung der Glykocholsäure aus Rindergalle. Arch. f. d. ges. Physiologie. Von F. I'ßlUjer. Bd. 99. S. 187--19Ü. Bonn 1903. ■') Hans Bontemps, Beiträge zur Darstellung der Glykocholsäure aus Rindergallc nebst Beobachtungen über die fällende Wirkung der üransalze auf Gallensäuren. Iiuiug.- Dissert. Greifswald 1905. S. 1—38. ") Friedrich Emich, tlber das Verhalten der Rindergallc zu der Bii/iierf^chcn Reaktion und einige Eigenschaften der Glykocholsäure. Monatshefte f. Chemie. Bd. 3. Jg. 1882. S. 325—342. Wien 1883. ') F. Hoppe-Seyler, Über die Zirkumpolarisationsverhältnisse der Gallensäuren und ihrer Zersetzungsprodukte. Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 89. S. 257— 281. Leipzig 1863. 648 Ölof Hammarsten. das Natriumsalz, imabliängig von der Konzentration, in alkoholischer Lö- sung (a) D = + 25-7<' und für die wässerige Lösung + 20"8°. Die aus Wasser kristallisierte Säure hat keinen scharfen Schmelzpunkt (Bondi und Müller). Schmelzpunkt nach Emich^) 132 — KU", nach Medivedew'^) 138 bis 140^ nach Bondi und Müller^) 152» (erweicht bei ISS"). Die mehr- mals aus Alkohol durch Wasserzusatz kristallisierte Säure zeigte ein kon- stantes ^'erhalten (Verf.). Nach dem Trocknen bei 100 — 105" sinterte sie bei 125 — 127^ je nach der Geschwindigkeit des Erhitzens, und schmolz unter Aufblähen bei 126 — 128'^ zu einer beim Erkalten glasigen Masse. Die Glykocholeinsäure, C26H43NO5 , stellt man nach folgendem. im wesentlichen von Wahlgren,*), dem Entdecker dieser Säure, angegebenem Verfahren her. Die oben (siehe S. 6-46 ) erwähnten, nach der Glykocholsäuredar- stellmig zurückgebliebenen, aus Glykocholeinsäure, Paraglykocholsäure und ein Avenig Glykocholsäure nebst viel Farbstoff bestehenden Reste löst man in Wasser mit Hilfe von Natriumkarbonat, filtriert, trocknet ein, extrahiert den Rückstand mit Alkohol, filtriert von dem Karbonate, verdunstet den Alkohol und löst in Wasser. Dieser Lösung setzt man eine 15 — 20''/oig'e Lösung von Chlorbaryum hinzu, bis die erst verschwindende Trübung bleibend wird und der Niedersclilag sich nicht merkbar vermehrt. Wenn nach 24 Stunden die klare oder fast klare Flüssigkeit nicht mehr von Chlorbaryum gefällt wird, filtriert man von dem Niederschlage ab (aus dem Filtrate kann man mit Salzsäure und Äther ein, meistens kristallisieren- des Gemenge der zwei Glykocholsäuren erhalten, das zusammen mit an- deren ähnlichen Portionen nach dem für Glykocholsäure angegebenen Ver- fahren verarbeitet werden kann). Die Barvumsalzfällung wird zur Trennung des Glykocholeinates von Baryumseifen mit Wasser ausgekocht und die Filtrate mit Salzsäure gefällt. Die Fällung, welche regelmäßig noch recht \1el Glykocholsäure enthält, wird von neuem mit Natriumkarl)onat in das Alkalisalz übergeführt und die Lösung mit Tierkohle entfärbt. Nach dem Eintrocknen wird mit Alkohol extrahiert, das neue Filtrat eingetrocknet und der Rückstand in so viel Wasser gelöst, daß die Lösung höchstens l^/o enthält. Die Lösung wird nun mit Äther und Salzsäure bis gegen iVo versetzt, umgeschüttelt und stehen gelassen. Fällt man aus einer mehr konzentrierten Lösung, so scheidet sich die Glykocholein- säure zu großem Teil als Tropfen aus, die sehr langsam kristallisieren. Die Kristallmasse wird nach dem Auswaschen mit Wasser mit Wasser gekocht, um verunreinigende Glykocholsäure zu entfernen. Darauf 1) Friedrich Emich, Über das Verhalten der Riudergalle zu der i?/(/'/?frschen Reaktion und einige Eigenschaften der Glykocholsäure. Monatshefte f. Chemie. Bd. 3. Jg. 1882. S. 325—342. Wien 1883. ^) An. Medwedeto, Darstellung der Glykocholsäure aus Rindergalle. Zentralbl. f. Physiologie. (Literatur 1900.) Bd. 14. S. 289—291. Leipzig und Wien 1901. ä) S. Bondi und Ernst Müller, Synthese der Glykocholsäure und Taurocholsäure. Hoppe-Sei/lers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 47. S. 499—507. Straßburg 1906. ^) T'. Wahlgren, Über^Glykocholsäure. Hopije-Seylers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 36. S. 556-567. Straßburg 'l902. Darstellung der Gallensäurea und ihrer wichtigsten Ahbauprodukte etc. 649 wird sie in Wasser mit etwas Ammoniak gelöst und mit Chlorbar\um gefällt. Das gefällte Baryumsalz wird in das Alkalisalz übergeführt und aus dessen P/oiger Lösung in Wasser die Säure durch Zusatz von Äther und Salzsäure wie oben zur KristaUisation gebracht. Die Glykocholsäure ist so schwer zu entfernen — sei es, daß sie so leicht in Paraglvkocholsäure übergeht oder daß sie zusammen mit der Olykocholeinsäure auskristallisiert — . daß man die Umwandlung der Säure in das Baryumsalz 4 — 5mal wieder- holen muß, bevor man in oben angegebener Weise aus dem Alkalisalze eine Kristallmasse von dem konstanten Schmelzpunkte 175 — 176" erhält. Aus dem Grunde ist auch die Reindarstellung dieser Säure eine sehr beschwerliche, mit großen Verlusten verknüpfte Arbeit und die Ausbeute ist eine kleine. Die Säure kann aus der konzentrierten, alkoholischen Lösung durch Zusatz von Wasser zu beginnender Trübung umkristallisiert werden. Eigenschaften. Feine Nadeln oder etwas dickere prismatische Nadeln, die zu Drusen vereinigt sind; auch einzelne kürzere Prismen. Fast unlöslich in kaltem Wasser und sehr schwer löslich, viel weniger löslich als die Glykocholsäure, in heißem. Geschmack stark l)itter ohne süßen Neben- geschmack. Leicht löslich in Alkohol; wenig löslich in Äther oder Aceton ; fast unlöslich in Benzol und Chloroform. Alkalisalze in ^^'asser leicht lös- lich: die Lösungen werden von Salzen der Erdalkalien und der Schwer- metalle gefällt. Schmelzpunkt der kristallisierten, bei 100^105" C ge- trockneten Säure 175 — 176". b) a- und ß-Hyoglykocliolsäureu. Neben der von Giindelach und Strecker"^) in der Schweinegalle nach- gewiesenen Hyoglykocholsäure kommt. wieJolin-) gezeigt hat, eine zweite Glykocholsäure vor, die er als ß-Hyoglykocholsäure beschrieben hat. Die Strecker^che Säure nennt er a-Hyoglykocholsäure. Diese zwei Säuren unter- scheiden sich voneinander unter anderem auch dadurch, daß ihre Alkali- salze von Neutralsalzen verschiedener Art ungleich leicht ausgesalzen werden, und auf ihrer verschiedenen Aussalzbarkeit durch Natrium sulfat gründete Min sein Verfahren zu ihrer Trennung. Eine Trennung und Reindarstelluug der beiden Säuren ist äußerst schwer zu erzielen, und John hat keine de- taillierte Methode mit Angaben über die zur Trennung geeigneten Salz- mengen ausgearbeitet. Aus dem Grunde hat Verfasser versucht, wenigstens die Hauptzüge eines Verfahrens auszuarbeiten, welches einer \'erbesserung fähig sein dürfte. Dieses Verfahren basiert auf der vei'schiedenen Fällbarkeit der Alknli- salze der beiden Säuren durch kalkfreies NaGl. Bei Sättigung mit NaC"l werden beide Salze fast vollständig ausgesalzen: während aber das a-Salz ') C. Giuidelach und Jd. Strecker, Unfprsucliung der Scliweiuegalle. Annalen der Chemie und Pharmazie. Bd. 62. S. 205-232. Heidelberg 1847. 2) Severin Jolin , Über die Säuren der Schweinegallc. Iloppe-Seiihrs Zeitschr. f. 1. Chemie. Bd. 12. S. 512-557. Straßburg 1888 und Bd. 13. S. 205-247. Straßburg 188i). physiol. 650 Olof Hammarsteu. schon mit o — 5% NaCl eine reichliche P'ällung' gibt, wird das ^i-Salz (in 2yoiger Lösung) kaum von lOVo ^aCl gefällt. Die Galle soll man ganz frisch in Arbeit nehmen und mit ^Vlkohol von dem „Schleime"' reinigen. Die alkohoUsche Lösung kann dagegen ohne Sehaden monatelang aufbewahrt werden. Eine höchstens 2Voige Lösung der schleimfreien Galle in Wasser versetzt man mit dem gleichen 'S'olumen ge- sättigter (kalk- und magnesiafreier) Kochsalzlösung unter starkem Umrühren und läßt 12 — 24 Stunden stehen. Der gelbgefärbte Niederschlag, welcher 50 — 60% der Gallensalze enthält, wird durch Filtration leicht von der stärker gelbgefärbten Lösung getrennt. Der Niederschlag wird auf a-Hvo- giykocholsäure und das Filtrat auf ß-Hyoglykocholsäure verarbeitet. Die a-Hyoglykocholsäure, C27H43NO5. Den mit dem Filtrum stark ausgepreßten Niederschlag löst man in so viel Wasser, daß die Lösung zwischen 1 und 2Vü, jedenfalls nicht mehr als 2% enthält, was leicht un- gefähr berechnet werden kann, da der Niederschlag 50 — 6O0/0 cler in Arbeit genommenen Menge beträgt. Diese Lösung wird mit 1/5 ihres Volumens gesättigter NaCl-Lösung unter LTmrühren versetzt, wobei der Gehalt an NaCI also etwas mehr als 5% beträgt. Man erwärmt nun das Ganze, wobei der Niederschlag sich vollständig löst und die Flüssigkeit etwas grünheh wird. Beim Erkalten scheidet sich das Hyoglykocholat wieder aus, man filtriert aber erst nach 12 bis 24 Stunden. Bei der mikroskopischen Untersuchung findet man, daß die Fällung aus lauter dünnen Blättchen und Pseudokristallen besteht, und die oberste Schicht enthält Insweilen Drusen von lang ausge- zogenen, spießigen Blättchen. Von einer Beimengung des ß-Salzes, welches als Tropfen sich ausscheidet, ist meistens nichts zu sehen. Die abfiltrierte, stark ausgepreßte FäUung wird in starkem Alkohol gelöst, von etwa unge- löstem NaCl filtriert, das Filtrat eingetrocknet und von dem Piückstande eine 2''/oige Lösung in Wasser bereitet, die in obiger Weise mit 5^0 ^^^Cl gefällt wird. Das Salz ist nun regelmäßig frei von dem ß-Salze (so weit man dies aus dem Aussehen des Niederschlages mit dem Mikroskope er- sehen kann). Der Sicherheit halber kann man aber die Lösung und Fällung noch einmal wiederholen. Zur Darstellung der freien Säure löst man das Salz, welches rein weiß ist oder einen Stich in Bläuhchgrün zeigt, in Wasser zu einer Lösung von höchstens 0'5°/o. Die Lösung wird in einer Flasche mit überschüssigem Äther geschüttelt und darauf Essigsäure zu 0*5 bis höchstens l^/o zugesetzt und umgeschüttelt. Die Säure scheidet sich an der Ätherschicht nach und nach in kleinen Drusen von Kristallen und in der Flüssigkeit als ein kri- staUinisches Pulver aus. Nach dem Abfiltrieren, Auspressen und Trocknen wird die Säure mit Äther extrahiert, um etwa verunreinigende Fettsäuren zu entfernen. Durch Auflösen in Alkohol und Zusatz von Wasser zur be- ginnenden Trübung kann sie wenigstens zum großen Teil in Drusen oder Ballen von meistens (jseitigen Blättchen gewonnen werden. Besser und voll- ständig gelang die Umkristallisation aus einem Gemenge von Alkohol und Aceton unter Wasserzusatz. Darstellung der Galleusäuren und ihrer wiclitigsten Abbaiiprodukte etc. (jf)] Über die Eigenschaften der in dieser Weise dargestellten Säure liegen noch keine eingehenden Untersuchungen vor. Die Angaben von Gundelnch und Strecker und von Jolin beziehen sich auf die amorphe Säure. Sp.Drclmiig der freien Säure in absolutein Alkohol bei etwa 24'' nach Jolin (a)I) = +9-7o. Schmelzpunkt nicht genau l)estimmbar, gegen 150". In Wasser sehr schwer löslich; leicht löslich in Alkohol, nicht ganz unlöslich in Äther. Alkalisalze aussalzbar durch Neutralsalze, fällbar durch Salze der Erdalkalien und dei" Schwer met alle. Die ß-Hyoglykocholsäure, C26H43NO5 (V), erhält man aus dem oben- genannten, mit NaCl halbgesättigtcn Filtrate. Man fällt dieses vollständig mit Eisenchlorid ohne großen Überschuß. Den mit Wasser ausgewaschenen Niederschlag zersetzt man in der Wärme mit Sodalösung, filtriert, trocknet ein, löst in Alkohol, filtriert, trocknet von neuem ein und löst in Wasser zu einer 2%igen Lösung, die noch einmal mit dem gleichen \'olumen ge- sättigter NaCl-Lösung gemischt wird. Die, meistens nicht reichliche Fällung besteht regelmäßig aus lauter Tropfen des ß-Salzes und wird nach 24 Stunden abgetrennt. Das neue Filtrat kann nun als frei von 7. -Säure angesehen werden. Es wird von neuem mit Eisenchlorid gefällt und wie oben behandelt. Die Hauptmasse der Farbstoffe ist während dieser Prozeduren entfernt worden, den Rest entfernt man nötigenfalls mit Tierkohle. Aus der wässe- rigen Lösung des AlkaUsakes wird nun durch Zusatz von Salzsäure die ß-Hyoglykocholsäure als eine flockige, käsige Masse ausgefällt. Sie wird mit Wasser gewaschen, getrocknet, in Alkohol gelöst und aus dieser Lösung mit Äther (zur Entfernung der Fettsäuren) gefällt. Die so gefällte Säure enthält auch Hyotaurocholsäure. Zur Entfernung derselben wird sie in Alkohol gelöst und aus dieser Lösung mit Wasser gefällt. Hierbei erhält man jedoch keine flockige Ausfällung, sondern eine kolloidale Lösung, aus welcher selbst nach mehreren Tagen nur ein Teil der Säure als ein feiner Schlamm sich abgesetzt hat. Durch Zusatz von NaCl-Lösung (1 — 2Vn) scheidet sie sich jedoch als flockige, käsige Massen aus, die leicht gewaschen und ge- trocknet werden können. Selbst in dieser Weise hat Verf. sie bisher jedoch nicht frei von Taurocholsäure (oder richtiger schwefelfrei) erhalten können. Auch die von JoHn dargestellte Säure war schwefelhaltig inid kristalli- sierte nicht. Die [i-Säure ähnelt sehr der a-Säure: da sie aber bisher nicht rein dargestellt wurde, sind ihre Eigenschaften nicht näher bekannt. B. Darstellung der Taurocholsäuren. a) Die Taurocholsäure (C.« H.sNSO/). Als Rohmaterial eignet sich am besten schleimfreie Ilundegalle. Eine 2— öVoige Lösung in Wasser versetzt man mit einer T)« oig^'i» Lösung von Eisenchlorid, bis in der sauer gewordenen Lösung keine Fällung mein- entsteht. Der abfiltrierte Niederschlag enthält Farbstoff und Taurocholein- säure und wird zur Darstellung der letzteren verwendet. '652 Olof Hammarsten. Das Filtrat -wird mit Sodalösung oder verdünnter Natronlauge zur Abstumi^fung- der sauren Reaktion, aber nicht zu neutraler Reaktion ver- setzt und von der neu entstandenen Eisenfällung abfiltriert. Das Filtrat wird noch einmal mit Eisenchlorid versetzt, mit Wasser etwas verdünnt und (ohne Filtration von dem hierbei etwa entstandenen Niederschlage) mit Soda wie oben versetzt. Der dann abfiltrierte Niederschlag wird zusammen mit den anderen Eisenfällungen zur Darstellung von Tauro- choleinsäure benutzt. Das Filtrat ist allerdings noch nicht ganz frei von Taurocholeinsäure, die Menge derselben ist aber nicht so groß, daß sie die Reindarstellung der Taurocholsäure verhindert. Das Filtrat wird nun mit Soda schwach alkalisch gemacht, das Eisenhvdroxyd wird abfiltriert und das neue Filtrat bei Zimmertemperatur mit NaCl gesättigt. Das Taurocholat scheidet sich hierbei als eine grob- flockige FäUung aus, die, von dem gefärbten Filtrate getrennt, ausgepreßt und in Wasser gelöst, durch neues Aussalzen regelmäßig rein weiß erhalten wird. Durch wiederholte Alkoholbehandlung von dem beigemengten Koch- salze getrennt, kann das Taurocholat leicht in reinem Zustande gewonnen werden. Zur Darstellung der freien Säure ^) löst man das Taurocholat in möglichst wenig absolutem Alkohol und versetzt die Lösung mit schwefel- säurehaltigem Alkohol, bis zu 2 — o^o Säure, oder mit Salzsäure bis zu 2% in der Lösung. Das hierbei ausfallende Sulfat, bzw. Kochsalz, wird al)fi]triert und das Filtrat mit überschüssigem Äther gefällt. Wenn man €s schwer findet, das Taurocholat ohne Anwendung von ziemlich viel Alkohol zu lösen, so kann man auch in der Weise verfahren, daß man das fein zerriebene Taurocholat direkt mit säurehaltigem Alkohol behandelt. Hierbei wird die Taurocholsäure frei, von dem Alkohol gelöst, und Anrd wie im ersten Falle durch überschüssigen Äther aus dem Filtrate amorph ausgefällt. Von der amorph ausgefällten Säure kann die Flüssigkeit gewöhnlich ohne Verluste einfach abgegossen werden, widrigenfalls wird filtriert. Die amorphe Säure wird nun in wenig Alkohol gelöst, die filtrierte Lösung mit ein wenig Wasser versetzt und darauf Äther bis zur bleibenden Trübung zugefügt. Die Säure scheidet sich bald in Nadeln oder Prismen und Drusen von solchen aus. Da die Kristallisation aufgehört hat, fügt man neuen Äther, bis zur neuen Trübung hinzu, wartet die neue Kristallisation ab und wiederholt dieses Verfahren, bis keine Kristalle mehr entstehen. Die Säure kann man aus Alkohol, der etwas Wasser enthält, durch Äther- zusatz wiederholt umkristalhsieren. Die Darstellung der Taurocholsäm^e aus Rindergalle ist schwer in- folge der Schwierigkeit, das Taurocholat vollständig von dem Glykocholate zu reinigen. Man kann zwar durch wiederholte Fällung mit Eisenchlorid. *) Olof Hammarsten, Über die Darstelhing kristallisierter Taurocholsäure. Hoppe- SeyUrs Zeitschr. f. pliysiol. Chemie. Bd. 43. S. 127—144. Straßburg 1904,1905. i Darstelhmg der Gallensäuren und ihrer wichtigsten AI)hanprodukto etc. ß53 teils allein, teils nach Zusatz von Soda wie oben und teils nach \'erdiinnung mit Wasser, zuletzt dahin kommen, daß man ein von Glykocholat freies Taurocholat aussalzen kann; aber dies gelingt nicht immer. Das von Bang^) angegebene Verfahren, die Taurocholsänre aus saurer Lösung mit Eiweiß zu fällen, welches Verfahren darauf basiert, daß nur die Taurochol-, nicht aber die Glykocholsäure von Eiweiß gefällt werden soll, ist nicht zu empfehlen. In einer sauren Lösung von Glyko- und Taurocholat ist nämlich die Taurocholsäure das Lösungsmittel für die Glykocholsäure; und wenn man die erstere mit Eiweiß ausfällt, kann die in Wasser äußerst schwer lösliche Glykocholsäure nicht mehr in Lösung bleuten, sondern wird ebenfalls ausgefällt. Zur Reindarstellung der Taurocholsäure ist deshalb die Rindergalle wenig geeignet. Ein vorzügliches Material ist dagegen die Fischgalle, wenn man solche in größerer Menge erhalten kann. Eigenschaften: Nadeln oder vierseitige, zu Drusen vereinigte Prismen, die luftbeständig sind. Die Säure wird schon unter 100" gelb bis bräunlich und zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt. Leicht löslich in Wasser, löslich in Alkohol und fast unlöslich in Äther. In Wasser löshche Salze mit Alkahen, Erdalkalien und vielen Schwermotallen. Sp. Drehung des Natriumtaurocholates in Wasser nach Hoppe-SeyUr-) (7.)D = + 21'5o. Nach Verf. 3) ist die Drehung abhängig von der Kon- zentration: (-/)D= +2a-27'' (c = 2-;>2%) und = + 22-14o (c = 5-420/0)- Geschmack süß, nur schwach bitter. b) Taurocholeinsäure (aeH^gNSOe?) stellt man nach folgendem, teils vom Verfasser*) und teils von GuUhring'") herrührenden Verfahren dar. Die bei Darstellung der Taurocholsäure erhaltenen Eisenfällungen Averden mit Soda in warmem Wasser zerlegt, die Lösung abfiltriert, ein- getrocknet und der Rückstand mit Alkohol extrahiert, wobei ein recht bedeutender Teil des Farbstoffes ungelöst zurückbleibt. Die mit Tier- kohle entfärbte alkoholische Lösung wird zur Trockene verdunstet und in ganz derselben Weise, wie für die Darstellung der Taurocholsäure an- gegeben wurde, mit säurehaltigem Alkohol zersetzt und mit Äther behandelt. Wenn man hierbei so weit gekommen ist, daß keine Kristalle von Taurochol- säure sich mehr ausscheiden, sondern nur eine honig- oder harzähnliche Bodenschicht sich absetzt, gießt man den Alkoholäther ab, führt tue Säure in das Natriumsalz über und fällt die wässerige Lösung des letzteren mit Eisenchlorid. Hierbei wird die Taurocholeinsäure gefällt, w'ährend die kleinen Reste der Taurocholsäure in Lösung bleiben. Aus der EisenfiUlung *) har Bang, Über die Darstellung der Taurocholsäure. Beiträge zur chemischen Physiologie und Pathologie von F. llofincister. Bd. 7. S. 148—149. BrauuschM-eig 1906. ") F. Hoppe-Seyler, tJber die Zirkumpolarisationsverhältnisse der Gallensäuren und ihrer Zersetzungsprodukte. .Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 89. S. 257— 281. Leipzig 186;^. ^) Nicht veröffentlichte Untersuchung. ^) Olof Hammarsten, Über die Darstellung; kristallisierter Taurocholsäure. Hoppe- Sei/lers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S. 127— 144. Straßburg 19041905. ^) Alf GuUbring, Über die Taurocholeinsäure der RindcrgaUe. Hoppe-Scyler» Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 45. S. 448-458. Straßburg 1905. ß54 ^^*^^ Hammars teu. Stellt man von neuem das Natriumsalz dar, löst es in absolutem Alkohol, zerlegt es mit säurehaltigem Alkohol und fällt das Filtrat mit über- schüssigem Äther. Die Säure setzt sich dabei als eine sirup- oder honig- ähnliche Schicht zu Boden und ist bisher nicht in Kristallen erhalten worden. Zur Darstellung der Säure aus lündergalle benutzt man den nach möglichst vollständigem Auskristallisieren der Taurocholsäure zurückge- bliebenen Alkoholäther, aus dem man mit Sodalösung und Verdunsten das Natriumsalz erhält. Aus diesem wird dann die Eisenverbindung darge- steht und wie oben (in der letzten Phase der Methode) verfahren. Alle die bei Darstehung der Taurocholsäure aus Eindergalle in Betracht kommenden Schwierigkeiten machen sich auch bei Darstellung der Taurocholeinsäure geltend. Eigenschaften: Die Säure löst sich leicht in Wasser oder Alkohol, nicht in Äther. Geschmack intensiv widrig bitter. Die Alkalisalze werden in wässeriger Lösung von Eisenchlorid gefällt. Die Eigenschaften der noch nicht sicher rein dargesteUten Säure sind im übrigen nicht studiert. C. Darstellung der Scymnolschwefelsäuren. In den Gallen der bisher untersuchton Phigiostomen kommen nach den Unter- suchungen des Verfassers*) statt der gewöhnlichen gepaarten Gallensäurcn Schwefel- säureester von zwei, der Cholalsäure und dem Cholesterin, wie es scheint, verwandten Stoffen, die wahrscheinlich Alkohole sind, vor. Es kommen als Alkalisalze in der Hai- fischgalle zwei solche Schwefelsäureester \'or, die als a- und ß-Scymnolschwefelsäure bezeichnet wurden. Die Darstellung geschieht in folgender Weise. Die Lösung der schleim- freien Galle in Wasser wird mit Bleiessig und x\mmoniak gefällt, woliei die reichlichen Harnstoff mengen in Lösung bleiben. Aus dem Bleinieder- schlage stellt man in gewöhnlicher Weise mittelst Sodalösung die Nati'ium- salze dar, die, nach dem Eintrocknen, durch Extraktion mit Alkohol ge- reinigt werden. Die o — ö^/oige Lösung der Alkalisalze in Wasser \vird dann mit dem gleichen Volumen Kalilauge von 40Vo gemischt. Hierbei scheidet sich das Salz der a-Säure als eine reine weiße Masse ab, die aus mikroskopischen Nadeln besteht, während das fi-Scymnolsalz mit etwas a-Salz in Lösung bleibt. Man trennt das Salz von der Lauge durch Zentri- fugieren. Das a-Salz reinigt man durch zweimal wiederholtes Auflösen in Wasser und Ausfällung mit Kalilauge wie oben. ]\lan löst dann in Wasser, neutrahsiert den größten Teil des Alkalis mit verdünnter Schwefelsäure und leitet überschüssige Kohlensäure durch. Darauf wird mit Alkohol die Haupt- menge des Sulfates ausgefäUt, filtriert, eingetrocknet, in Alkohol gelöst, von Sulfat und Karbonat abfiltriert, eingetrocknet und von neuem mit Alkohol behandelt, bis aUes Sulfat und Karbonat entfernt worden ist. Zu- ') Olof Hammarsten, Über eine neue (iruppe gepaarter Gallensäurcn. Hoppe- Seylers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 24. S. 322—350. Straßburg 1898. Darstellung der Gallensänreii imcl ihrer wichtigsten Abbauproclukte etc. (',05 letzt fällt man das Salz aus alkoholischor Lösung mit Äther, saugt nach einiger Zeit ab, wäscht mit Äther nach, preßt aus und läßt im Exsikkator trocknen. Das ß-Salz gewinnt man aus der obengenannten, abzentrifugierten Lauge. Man verdünnt etwas mit Wasser, neutralisi(>rt langsam und vor- sichtig (unter Kühlung) fast vollständig mit Schwefelsäure und zuletzt mit Kohlensäure. Man konzentriert, fällt die Hauptmasse des Sulfates mit Al- kohol, filtriert, verdunstet zur Trockene und extrahiert mit Alkohol. Das Gallensalzgemenge wird nun in Wasser (zu 4Vo) gelöst und mit starker Lauge bis zu 30Vo ii^ dem Gemenge versetzt, um das verunreinigende a-Salz zu entfernen. Dann wird mit der abzentrifugierten Lauge wie oben verfahren und die Prozedur wiederholt, bis man eine Lösung erhält, welclie bei einem Gehalt von äO^/o KOH nicht getrübt wird. Aus dieser Lösung wird das ß-Salz in derselben Weise, wie oben für das a-Salz angegeben worden, gewonnen. Zur Darstellung der Scymnole wird jedes Salz für sich etwas mehr als 1 Stunde mit lOVoiger Kalilauge gekocht. Es findet hierbei vollständige Zersetzung statt, und die Scymnole scheiden sich als ölige Massen aus. Das y.-Scymnol kann nach dem Lösen in kochendem Wasser beim Erkalten in nadeiförmigen Kristallen sich ausscheiden und in dieser AVeise gereinigt werden. Man kann es auch aus seiner Lösung in kaltem Alkohol durch Zusatz von Wasser bis zur bleibenden (Opaleszenz Umkristallisieren. Das ß-Scymnol kann aus alkoholischer Lösung mit Wasser ausgefällt werden und ist bisher nicht ganz rein, nur als amorphe Masse erhalten worden. Eigenschaften: a-Scymnol, C.2-H46 G5, feine Kristallnadeln, die bei 100 — 101 "C schmelzen; zersetzen sich erst oberhalb i:),')". Leicht löshch in Alkohol, Äther und Aceton, nur sehr schwer löslich in kaltem Benzol oder Chloroform. Gibt eine schöne Pette7tkofersdie Reaktion, die Schiß'sche Cholesterinreaktion, und eine der Liebermann- Burcharchdwn Cholesterinreaktion ähnliche Reaktion: ^lit Salzsäure von 25o/o gil)t es bei Zimmertemperatur nach einiger Zeit eine prachtvoll indigblaue Lösnng. Das [i-Scymnol, C.gHsoOr,, gibt unter ähnlichen Umständen eine grünbch- braune Lösung. Die Alkalisalze der Scymnolschwefelsäuren geben eine entsprechende Färbung. Sie sind löslich in Wasser oder Alkohol, nicht löslich in Äther. Geschmack bittersüß; das ß-Salz hat einen mehr bitteren Nebengeschmack. Ihre Lösungen in Wasser werden nicht von Salzen der Erdalkalien oder Schwermetalle, mit Ausnahme von Eisenchlorid und basi- schem l)leiacetat, gefällt. II. Darstellung der Cholalsäuren und ihrer nächsten Derivate. a) Darstellung der Cholsäure, Das ursprüngliche Verfahren von Ad. Strecker M ist im Laufe der Zeit in dem einen oder anderen Punkte von anderen Forschern, unter 0 Adolph Strecker, Untersuchungen der Ochsengalle. Zweite Alihandlmig. Annal. der Chemie u. Pharmazie. Bd. 67. S. 1—60. Heidelberg 1848. 656 Olof Hammarsten. denen besonders Mylius^), Latschinof'^), Lassar-Cohn^). Pre(jl*), Vahlen^) und Langheld ^) zu nennen sind, abgeändert worden. Nach Prüfung ver- schiedener Methoden hat Verf. das folgende Verfahren, welches im wesent- lichen mit demjenigen von Pregl übereinstimmt, als das einfachste und beste gefunden. Von der schleimfreien Galle wird eine 5Voige Lösung in Wasser be- reitet, mit 1/4 Volumen Natronlauge von oOVo gemischt und 30 Stunden in einem eisernen Gefäße, am einfachsten in einem größeren Autoklaven gekocht. Nach dem Erkalten wird die Hauptmasse des Alkalis neutrali- siert, filtriert und darauf mit Salzsäure die Rohsäure gefällt. Nach dem Abgießen der Flüssigkeit und Nachspülen mit Wasser löst man die Roh- säure mit Hilfe von Ammoniak und fällt aus einer Lösung, die nicht mehr als 2<'/o Gallensäure enthält, mit einer 207oigen Lösung von Chlorbaryum, bis nach vollständiger Klärung der Flüssigkeit neue Zusätze von Chlor- baryum keine Fällung erzeugen. Man filtriert von der Baryumf ällung, welche zur Darstellung von Cholein- und Desoxycholsäure dient, ab und fällt aus dem Filtrate die Rohsäure mit Salzsäure. Sobald die Rohsäure einen festen Kuchen oder eine sandige Masse darstellt, wird die Flüssigkeit abgegossen bzw. abfiltriert, die Säure mit Wasser fein zerrieben und durch Waschen von Salzsäure befreit. Sie wird nun wiederholt mit starkem Alkohol in kleinen Mengen unter Umrühren oder Kneten versetzt, bis sie in einen Brei von Kristallen sich verwandelt hat. Man kann aber auch die vorher an der Luft getrocknete oder fein zerriebene Rohsäure mit Alkohol von 95°/o (höchstens 2 Teilen) mischen. La beiden Fällen saugt man den Alkohol von der Kristallmasse ab, wäscht mit ein wenig Alkohol nach, zerreibt noch einmal mit Alkohol, saugt ab und wäscht mit Alkohol nach. Die Säure ist nun regelmäßig fast weiß und ') F. Mijlius, über die Cholsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 19. S. 369—379. Berlin 1886. — Derselbe, Notiz über die Darstellung und Zusammensetzung der Chol- säure. Zeitschr. f. physiol. Chemie von F. Hoppe-Seyler. Bd. 12. S. 262—266. Straßburg 1888. -) P. Latschinqf, Über die Cholsäure, welche feste Fettsäuren enthält. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 13. S. 1911-1915. Berlin 1880. ^) Lassar-Cohii, Zur Kenntnis der Säuren der Rindergalle. III. Mitteilung. Zeit- . Schrift f. physiol. Chemie von F. Hoppe-Se>/ler. Bd. 17. S. 607—615. Straßburg 1893. — I Derselbe, Die Säuren der menschlichen Galle. Ebenda. Bd. 19. S. 563— 573. Straß- ' bürg 1894. ^) Fritz Fregl, Über die Darstellung und einige Reaktionen der Cholalsäure. : Arch. f. d. ges. Physiologie von^". Pflüger. Bd. 71. S. 303—317. Bonn 1898. — Derselbe, | Über Isolierung von Desoxycholsäure und Cholalsäure aus frischer Rindergalle und über : Oxydationsprodukte dieser Säuren. Sitzungsber. d. Kais. Akad. d. Wissensch. Mathem.- ! naturw. Klasse. Bd. 111. Abt. IIb. S. 1024—1071. Wien 1902. i ') E. Vahlen, Die spezifische Rotation der Cholalsäure, Choleinsäure und Desoxy- cholsäure. Hoppe - Seglers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 21. S. 253—273. Straßburg 1895/96. I ^) K. Langheld, Über die Bestandteile der Rindergalle. I. Ber. d. Deutsch, ehem. \ Ges. Bd. 41. S. 378—385. Berlin 1908. Darstellung der Gallensäuren und ihrer wichtigsten Abbauprodukte etc. ß57 ■wird aus heißem Alkohol iimkristallisiert, bis sie bei 195 — 19(30 schmilzt. Aus den Kristallisationsmutterlauiien erhält man durch Konzentration neue Mengen Säure, die umkristallisiert werden, bis man eine weiße Säure von dem obigen Schmelzpunkte erhält. Die Ausbeute an reiner Säure, als kri- stallalkoholfrei berechnet, beträgt gewöhnlich 40 — 45 bis gegen 5()''/o von der Rohsäure. Die zuletzt erhaltenen, nicht kristalhsierenden alkoholischen Mutter- laugen werden auf die anderen Cholalsäuren verarbeitet, wobei man noch etwas mehr Cholsäure erhält. Die zuerst abgesogene, fast schwarzbraune alkoholische Lösung, welche ebenfalls etwas Cholsäure, aber verhältnismäßig viel Desoxycholsäure (bzw. Choleinsäure) enthält, wird ebenfalls, wie später angegeben werden soll, auf die anderen Cholalsäuren verarbeitet. Beim Verarlieiten von Sommergallen kann es nach Prefjl und Lmuj- held sich ereignen, daß die aus dem Filtrate von der Barvumfällung oder die direkt gefällte Rohsäure keinen festen Kuchen absetzt, sondern weich bleibt und mit Wasser eine emulsionähnliche Masse gibt, die weder feucht noch nach dem Trocknen in eine kristallinische Masse beim Reiben mit Alkohol übergeht. Verf. hat keine eigene Erfahrung hierüber; Prccjl kam aber in solchen Fällen auf folgende Weise zum Ziele. Die aus dem Filtrate von der Baryumfälluag ausgefällte Säure wurde getrocknet, pulverisiert, in Wasser zu einer l^/oigen Lösung unter Zusatz von Ammoniak gelöst und dann so A^ollständig wie möglich mit Chlor- baryumlösung von 207o gefüllt (eine mehr konzentrierte Lösung des Gallen- salzes gab keine Fällung mit Chlorbaryum). Hierbei wurden die störend wirkenden dyslysinartigen Stoffe gefällt und aus dem neuen Filtrate konnte nun mit Salzsäure eine Rohsäure gefällt werden, die, in obiger Weise mit Alkohol behandelt, kristallinisch wurde und die er durch Umkristallisieren rein erhielt. Nach Langheld, welcher die Rohsäure direkt, ohne vorausgegangene Fällung mit Chlorbaryum verarbeitet, soll man in folgender viel einfacherer Weise zum Ziele kommen. Zu der alkoholischen Lösung der Rohsäure setzt man überschüssiges Natriumhydroxyd, in wenig Wasser gelöst und erwärmt 1 — 2 Stunden auf dem Wasserbade. Während dieser Zeit scheidet sich das cholsäure Natrium nahezu quantitativ ^ ) in Gestalt kleiner weißer Na- deln ab. Es ^^^rd mögUchst heiß abgesaugt und mit del siedendem Alkohol gewaschen. Aus dem Salze wird dann die Cholsäure freigema''ht, getrocknet lind mit dem doppelten Gewichte Alkohol vermengt, wobei sie Kri>tallalkohol aufnimmt. Eigenschaften: Tetraedrische Kristalle mit 1 Mol. Kristallalkohol 3der Prismen mit 1 Mol. Wasser (aus Eisessig durch Xerdünnuiig mit 1) Dies klingt sonderbar, da das cholsäure Natrium in Alkohol, besonders in leißem löslich ist. In den vom Verf. bisher ausgeführten Kontrollversuchen mit Chol- äure in alkoholischer Lösung und Natriumliydroxyd konnte von einer naliczu qiian- :itativen Ausfrülung keine Rede sein. Da es hier um eine Konzentrationsfrage sidi han- lelt, sind weitere quantitative Versuche notwendig. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. IT. 42 *) P. Latschnwß', Über eine der Cholsäure analoge Säure. Ber. d. Deutsch, ehem.' Ges. Bd. 18. S. 3039— 3047. Berlin 1885. — Derselbe, Über die Choleinsäure. Ebenda.' Bd. 19. S. 1140 (1886). — Derselbe, Über die Gallensäuren. Ebenda. Bd. 20. S. 1043, bis 1053 (1887). — Derselbe, Über die Kristallform der Choleinsäure. Ebenda. Bd. 20. S. 1053-1056 (1887). 2) F. Mi/lius, Über die Cholsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 19. S. 369-379.; Berlin 1886. — Derselbe, Über die Cholsäure. IV.Mitt. Ebenda. Bd.20. S. 1968-1989.! Berlin 1887. ; ^) Lassar-Cohn , Zur Kenntnis der Säuren der Rindergalle. Zeitschr. f. physiol.; Chemie von F. Hoppe-Seijler. Bd. 17. S. 607—615. Straßburg 1893. i *) E. Vahlen , Die spezifische Rotation der Cholalsäure, Choleinsäure und ües-j' oxycholsäure. Hoppe-Seijlers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 21. S. 253—273. Straßbuia 1895/96. I ^) Fritz Prer/I, Übör Isolierung von Desoxycholsäure und Cholalsäure aus frischeil Rindergalle und über Oxydationsprodukte dieser Säuren. Sitzungsber. d. Kais. Akad. d' Wissensch. Mathem.-naturw. Klasse. Bd. 111. Abt. IIb. S. 1024— 1071. Wien 1902. ") K. Langheld, Über die Bestandteile der Rindergalle. I. Ber. d. Deutsch, chem' Ges. Bd. 41. S. 378-385. Berlin 1908. ß5g Olof Hammarsten. Wasser) oder nach Mylius kristallwasserfrei (aus siedendem Wasser). Schmelzpunkt 195—196°. Gibt mit Jod eine blaue Verbindun.s". LösUch in 4000 Teilen kaltem und 750 Teilen siedendem Wasser. Löslich in Alkohol (in mehr als 20 Teilen nach MijUus), schwer lösUch in Äther und Aceton. Geschmack ])itter und süßlich. Alkalisalze leicht löslich in Wasser, weniger leicht in Alkohol. Baryumsalz löslich in Alkohol und in 30 Teilen kaltem Wasser, leichter in heißem. Spezifische Drehung in alkoholischer Lösung nach Vahlen für die tetraedri.sche Säure (a) I) — + 31-55", für die kri- stallwasserfreie = 4- ?)7'02". Für das Kaliumsalz in o%i2;'ei' Lösung (a) D = : = + 27 — 27*6<'; für das Natriumsalz in Wasser, 4Voi8'e Lösung, (a)D = = + 27-6«. b) Darstellung der Choleinsäure und der Desoxycholsäure. Nachdem Latschino/f'^) ( 1885) in der Tündergalle eine zweite Cholalsäure, die er Choleinsäure nannte, entdeckt und dann in weiteren Arbeiten näher beschrieben hatte, gelang es MyJius-) aus gefaulter Galle eine Cholalsäure zu isolieren, die er als durch Reduktion aus der Cholsäure ! entstanden sich vorstellte und deshalb Desoxycholsäure nannte. f Die Frage, ob es wirklich zwei verschiedene solche Säuren gibt oder ob nicht beide identiscli sind, ist lange strittig gewesen. Latsch inoff, dem sich Las.mr-Cohn^) i anschloß, erklärte beide für identisch. Mf/lius und Vahlen ■*) erklärten beide für ver- schieden. Ohne auf die strittige Frage näher einzugehen, muß Verf. hier nur folgendes hervorheben. Daß in der Rindergalle eine Säure von den Eigenschaften der 3i^?Jwsschen | Desoxycholsäure präformiert vorkommt, hat Pi-egl '') in unzweifelhafter Weise bewiesen. ; Das Vorkommen einer präformierten Säure von den Eigenschaften der LafscJiinoß'ichen . Choleinsäure ist ferner von vielen Forschern bestätigt worden und in neuester Zeit hat Langheld ^) beide Säuren aus derselben Galle isoliert. Dassell)e ist auch dem Verf. ge- ' luugen; die Desoxj-cholsäure kam jedoch in viel reichlicher Menge vor oder war jeden- falls leichter rein darzustellen. Beide Säuren geben Baryumsalze, die viel schwerlöshcher in Wasser als das Barvuinsalz der Cholsäure sind, und auf diesem Verhalten kann! Darstellung der Gallensäureu uuil ihrer wichtigsten AlibaiiprixUiktc etc. ijf)«) man ihre Trennung? von der Cholsänre gründen. Für die Trennung' der Barvumsalze der Cholein- und Desoxycholsiiiire voneinander findet man dagegen keine geeigneten Vorschriften, nnd man erhalt deshalb gewöhidich ein (iemenge von Ikirvnmsalzeii bzw. ein (iemenge der aus ihnen frei- gemachten Säuren. Das komidizierte Verfahren von Laiuiluld hefert auch nur ein (iemenge der zwei Säuren und bietet infolgedessen keine besonderen \'orteile vor der Ausfälhmg der Säuren als Barvumsalze. Das vom Verf. ausgearbeitete Verfahren, welches im wesentlichen auf den Angaben oder Methoden der oben (S. 658) zitierten Forscher basiert, ist folgendes. Die C'holeinsäure, C24H4o()4 (oder C25 H4.2 O^ nach L(iisrhiit<>ff'\ er- hielt Verf. auf folgende Weise. Bei der Darstellung der ('li(»lsäure (vgl. oben) erhält man eine Baryumfällung der Rohsäuren (die als ll(dibar_vum- fällung bezeichnet wird), ferner stark gefärbte alkoholische Extrakte nach der ersten Alkoholbehandlung und der ersten Umkristallisation der Rohsäure (als Rohextrakte bezeichnet) und endlich nur wenig gefärbte alkoholische Mutterlaugen nach der UmkristaUisatiou der gereinigten Säure. Dii^ letzteren werden nicht mit den Rohextrakten zusammengemischt, sondern gesondert verarbeitet. Diese letzten Mutterlaugen und ebenso etwaige letzte Chol- säurekristallisationen, die lücht aus rein tetraedrischen Kristallen bestehen und die nicht den richtigen Schmelzpunkt zeigen, löst man in Wasser mit Hilfe von Ammoniak und fällt mit Chlorbaryum so vollständig wie möglich. Die Barvumfällung, die oft ohne weiteres kristallisiert, löst man in heiliem Alkohol. Beim Firkalten kristallisiert das Salz und im Laufe von ein paar Tagen ist alles in einen dicken Brei verwandelt. Man saugt ab. wäscht mit Alkohol ein paarmal nach und preßt aus. Das Biaryumsalz löst man noch einmal in heiljom Alkohol, nötigenfalls mit Wasser verdünnt, weil die Lösung nicht immer gelingt, wenn man starken Alkohol nimmt. Das umkristallisierte Baryumsalz zersetzt man in Wasser mit Salzsäure, filti'lert die freie Säure ab, wäscht sie mit Wasser, preßt aus und trocknet über Schwefelsäure. Die getrocknete Säure löst man in wenig heiltem absoluten Alkohol, filtriert wenn nötig und lälit erkalten. Fs scheiden sich lierbei Kristalle von Choleinsäure ab, die im Laufe von einiiren Tagen sich .veiter vermehren. Die Kristalle haben bisweilen direkt den Schmelz|)unkt ISO — 187^ sonst werden sie aus heii'iem Alkohol und den ükohoHschen Filtraten kann man dui'ch weitere Konzentration noch eine 'ortion Kristalle erhalten, die aber leicht von Desoxycholsäure verunreinigt ein können und dementsprechend auf Schmelzpunkt geprüft bzw. um- ristallisiert werden müssen. Die bis zu dünnem Sirup konzentrierten alko- olischen Mutterlaugen werden, wenn sie keine Kristalle mehr absetzen, uf Desoxycholsäure verarbeitet. Aus den bei der Umkristallisation der Barvumsalze zurückbleibenden Ikoholischen Mutterlaugen kann man mit Wasser und Salzsäure Reste der äuren gewinnen, die nach dem obigen l'rinziix' (Kristallisation aus .Mkohol) erarbeitet werden. Die aus dem Filtrate von der ersten Baryunif;illung 42* 560 ö^of Hammarsten. mit Salzsäure zurückgewonnene Säure besteht zum großen Teil aus Chol- säure. Die Ausbeute an Säure aus den wenig gefärbten, alkoholischen Mutter- laugen ist nicht groß, man erhält aber die Säure fast sogleich weiß und rein. Die Verarbeitung der gefärbten alkoholischen Extrakte ist umständ- licher. Man macht sie schwach alkalisch, treibt den Alkohol weg und kocht dann, wie Pregl^) behufs Darstellung der Desoxycholsäure vorge- schrieben hat, mit Alkalilauge etwa 24 Stunden. Dann fällt man, wie bei der Cholsäurebereitung, die Ptohsäure mit Salzsäure aus, löst in Ammoniak und fällt möglichst vollständig mit Chlorbaryumlösung von 20'Vo- Diese Baryumfällung wird mit der obengenannten Rohbaryumfällung vereinigt oder sie werden jedenfalls beide in derselben Weise verarlieitet. Man löst die Baryumfällung in kaltem Alkohol filtriert von dem stark gefärbten Niederschlag (Baryum seifen, Karbonat u. a.) ab, zersetzt das Filtrat mit überschüssiger Sodalösung in der Wärme, trocknet ein, zerreibt möglichst fein und erschöpft die Masse mit Alkohol. Es werden hierbei neben den Karbonaten gewöhnlich sö\1el Farbstoffe zurückgehalten, daß eine weitere Entfärlning, trotz der noch ziemhch stark braungelblichen Farbe des Fil- trates, nicht notwendig ist. Behufs weiterer Entfärbung kann man Tier- kohle verwenden oder auch das siedend heiße alkoholische Filtrat mit einer kleinen Menge einer siedend heißen alkoholischen Lösung von Bleiacetat i versetzen und siedend heiß filtrieren. Überschüssiges Blei wird mit AlkaU- ' karbonat entfernt. Eine nicht zu starke Färbung des Filtrates hindert jedoch die folgenden Operationen nicht. Aus den so geAvonnenen Alkalisalzen der Gallensäuren in Wasser wird , das Säuregemenge mit Salzsäure ausgefällt; der Niederschlag wird genau i gewaschen, ausgepreßt und an der Luft oder im Vakuum getrocknet. Das feingepulverte Säuregemenge wird nun mit Eisessig zu einem , Brei zerrieben. Hierbei werden Farbstoff und Cholsäure gelöst. Man saugt ; ab und zerreibt noch einmal mit Eisessig, wobei man das Säuregemenge ; fast weiß erhält. Wenn das Zerreiben mit Eisessig nicht gut geht, indem ' eine mehr zähe Masse sich bildet, löst man statt dessen in möglichst wenig , heißem Eisessig, wobei die Cholsäure gelöst bleibt, während die anderen • Säuren bein: P]rkalten herauskristallisieren. Zur Trennung und weiteren Reinigung der beiden Säuren kann man ] nun in verschiedener Weise verfahren. Man kann das in Eisessig ungelöste! Säuregemenge in Wasser mit Hilfe von etwas Alkah lösen^ verdünnen, die Säuren mit Salzsäure ausfällen, die gewaschenen, getrockneten Säuren m'< heißem absoluten Alkohol lösen, wie oben, und das Auskristallisieren derj Choleinsäure abwarten. Dies gehngt jedoch nur gut in dem Falle, daß das) Gemenge nicht zu wenig Choleinsäure im Verhältnis zu der Desoxychol- säure enthält. I ^) Fritz Pregl, Über Isolierung von Desoxycholsäure und Cholalsäure aus fri-j scher Rindergalle und über Oxydatiousprodukte dieser Säuren. Sitzuugsber. d. Kais.j Akad. d. Wissensch. Mathem.-naturw. Klasse. Bd. 111. Abt. IIb. S. 1024—1071. Wien 1902 j Darstellung der Gallensäuren und ihrer wichtigsten Ahbauprodukte etc. 661 Bei Gegenwart von verhältnismäßig- wenig C'holeinsäure, wenn also keine oder eine nur spärliche Kristalhsation aus Alkohol erfolgt, muü man die nach Darstellung der Desoxycholsäure erhaltenen Eisessigmutterlaugen (siehe unten Desoxycholsäure) auf Choleinsäure verarbeiten. Man fällt zu dem Zwecke aus ihnen die Säure mit Wasser, kocht sie mit Natronlauge 12 bis 24 Stunden, um etwa gebildete Acetylderivate zu zersetzen, fällt dann mit Salzsäure, wäscht genau, trocknet und löst in siedendem Alkohol wie oben. Eigenschaften: Aus Alkohol, Avasserfrei, hemiedrische Kristalle des rhoml)ischen Systemes. Schmelzpunkt 185 — 187°. Wasserhaltig (nach Latschi- noff) erweicht sie bei 125", schmilzt bei 135 — 140". Geschmack intensiv bitter. Keine blaue Jodverbindung. Sehr schwer löslich in Wasser (1 : 22.000). Leicht lösUch in heißem iVlkohol, schwer löslich in kaltem. Baryumsalz schwer löslich in kaltem Wasser (1:1200); kristalhsiert aus siedendem Alkohol beim Erkalten in Aggregaten von radiär gestellten Nadeln. Sp. Drehung in alkoholischer Lösung nach Latschinoff (y.) D = + 56'4'^ (c = Ö'067o)5 nach Vahlen (a)D = + 48-87'' (c — 2-5'Vo)- Die Desoxycholsäure, C24H40O4, kann man aus den oben S. 659 erwähnten, nicht mehr kristaUisierenden Mutterlaugen von der auskristal- lisierten Choleinsäure erhalten, wenn man dieselben mit Äther versetzt. Man reinigt die Säure durch Umkristallisieren aus schwachem Alkohol und Ätherzusatz (Prcgl). Leichter erhielt Verf. die Säure aus den fast einge- trockneten Mutterlaugen durch Kneten mit Eisessig, Umkristallisation aus Eisessig und zuletzt Umkristallisation aus heißem Aceton. Zur Darstellung der Desoxycholsäure kann man auch mit großem Vorteil das oben, bei der Darstellung der Choleinsäure erwähnte, mit Eis- essig gereinige Säuregemenge verwenden. Ohne dieses, wie dort angegeben, in Wasser mit Alkali zu lösen kristallisiert man es direkt aus Eisessig um, bis man Kristalle erhält, die bei 144— Uö^'C schmelzen. Aus Aceton um- kristaUisiert sollen sie den Schmelzpunkt 172 — HH» C haben. Die Eisessig- mutterlaugen werden auf Choleinsäure verarbeitet (s. ol)en). Zur Darstellung von Desoxycholsäure allein, ohne Berücksichtigung der Choleinsäure, aus den Mutterlaugen nach der Cholsäuredarstellung hat Pregl ein genau ausgearbeitetes Verfahren angegeben. ') Eigenschaften. Nadeln mit 1 Molekül Essigsäure: Schmelzpunkt 144 )isl45; mit Kristalläther 153— 155« (Pregl). Aus Aceton und wasserfrei Schmelzpunkt 172—173". Geschmack intensiv bitter. Keine blaue Jodver- )indung. Sehr schwer löslich in Wasser ; leicht löslich in Alkohol, aber etwas ichwerlöslicher in Eisessig als die Choleinsäure. Baryumsalz sehr schwer öslich in Wasser; kristallisiert aus siedendem Alkohol beim Erkalten. Sp. Jrehung nach Vahlen^) (a)D= + 49-86» (c = UÖGS"/.,)- ») Fritz Pregl, Über Isolierung von Desoxycholsäure und Cholalsäure aus fri- cher Rindergalle und über Oxvdationsprodukte dieser Säuren. Sitzungsl)or. d. Kais, ikad. d. Wissensch. Mathem.-naturw. Klasse. Bd. 111. Abt. IIb. S. 1024-1071. Wien 1902. 2) E. Vahlen, Die spezifische Rotation der Cholalsäure, Choleinsäure und Desoxy- holsäure. Hoppe- Seylers Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 21. S. 253-273. Straßburg 895/96. 662 Olof Hammarsteu. c) Darstellung von Dehydrochol- und Dehydrocholeinsäure, Als erstes Oxydationsprodukt der Cholsäure erhielt Ham morsten^) die um sechs Wasserstoffatome ärmere Dehydrocholsäure, CjiHa^ O5. Nach demselben Verfahren erhielt dann Latschinoff-) aus seiner Choleinsäure die entsprechende Dehydrocholeinsäure, CoiHg^O^, und endlich hat Preyl^) gezeigt, daß auch die Desoxycholsäure bei gelinder Oxydation Dehydrocholeinsäure liefert. Zur Darstellung der letztgenannten Säure kann man also ebensowohl der Desoxycholsäure wie der Choleinsäure sich be- dienen. Beide Säuren, die Dehydrochol- und Dehydrocholeinsäure, werden in ganz derselben Weise nach dem folgenden Verfahren dargestellt. Man be- reitet eine lOo/oige Lösung von Cholsäure (bzw. Choleinsäure oder Desoxychol- säure) in Eisessig und ferner eine lOVoig«? Lösung von Chromsäure in Eisessig. Die letztere Lösung läßt man aus einer Bürette in die erstere unter Umrühren vorsichtig einfließen, unter Beachtung, daß die Temperatur nie 50° übersteigt. Bei Verarbeitung von Cholsäure sind auf je 10 cm^ ihrer Lösung ungefähr 9 und bei ^Erarbeitung von den zwei anderen Säuren ungefähr 8 cm^ der Chromsäurelösung erforderlich. Die Lösung nimmt, wenn die Reaktion beendet ist, eine mißfarbige, gelbhche Nuance an, und nach Zusatz von mehr Chromsäurelösung steigt die Temperatur nicht mehr. Man verdünnt nun mit dem vielfachen Volumen Wasser und filtriert nach einiger Zeit. Wenn die Säure sehr fein verteilt und schwer abzufiltrieren ist, erwärmt man einige Zeit im Wasserbade, da die Säure kristallinisch wird. Man wäscht mit Wasser, löst in verdünnter Sodalösung, kocht auf, filtriert vom Chromoxydhydrat usw. ab und fällt mit Säure. Man kristaUisiert die Dehydrocholsäure aus siedendem Wasser oder aus heißem Alkohol. Die Dehydrocholeinsäure kristallisiert man aus Alkohol durch Zusatz von Wasser bis zu beginnender Trübung um. Eigenschaften. Dehydrocholsäure: Feine Kristallnadeln; Schmelz- punkt 228" nach Latschinoff, 222° nach Lassar Cohn*). Keine Pettenkofer- sche Reaktion. Geschmack intensiv bitter ohne süßlichen Nebengeschmack. Sehr schwer löslich in Wasser, ziemhch schwer löslich in kaltem Alkohol, ■ noch weniger löslich in Äther. Alkahsalze löslich in Wasser oder Alkohol. Baryum- und Calciumsalze schwerlöslicher in heißem als in kaltem Wasser. Dehydrocholeinsäure Kristallnadebi oder unregelmäßige Kristalle, schein- ; bar sechsseitige Tafeln. Schmelzpunkt 183 — 184". Keine Fetttnkofersche *) olof Hammarsten, Über Debydrocholalsäure, ein neues Oxydationsprodukt der Cbolalsäure. Ber. d. Deutscb. cbem. Ges. Bd. 14. S. 71 — 76. Berlin 1881. -) P. Latscliinoff, Über eine der Cbolsäure analoge Säure. Ber. d. Deutscb. ehem. Ges. Bd. 18. S. 3039-3047. Berlin 1885. ^) Fritz Pregl, Über Isolierung von Desoxycbolsäure und Cbolalsäure aus frischer Rindergalle und über Oxydationsprodukte dieser Säuren. Sitzungsber. d. Kais. Akad. d. Wissenscb. Matbem.-naturw. Klasse. Bd. 111. Abt. IIb. S. 1024—1071. ^Vien 1902. , ■*) Lassar Colin, Über die Cbolalsäure und einige Derivate derselben. Zcitschr. f. ! physiol. Cbemie von F. Hoppe-Seijler. Bd. 16. S. 487—504. Straßburg 1892. Darstellung der Gallensäureu und ihrer wichtigsten Abhauprodukte etc. ßg;-^ Reaktion. Noch schwerlöslicher in den genannten Lösungsmitteln als die vorige Säure. Die Salze ebenfalls schwerlöslicher. d) Darstellun g von Bilian- und Isobilian- wie von Cholan- und Isocholansäure. Bei stärkerer Oxydation liefert die Cholsäure die von Cleve^) entdeckte Bilian säure, C24HS4OS, und die ihr isomere, \on La tschinoß'-) entdeckte Isobilian säure. Die Choleinsäure und die Desoxycholsäure hefern unter entsprechenden Verhältnissen die Tapjjeinersche^) Cholansäure, C24H34O7, und die isomere Isocholansäure Latsch inoffs^). Zur Darstellung dieser Säuren benutzte man früher Oxydation der entsprechenden Gallensäuren mit einem Gemenge von Kaliumdichromat und Schwefelsäure in der Wärme nach den etwas abweichenden A'orschriften von Tappeiner , Latschinof, Bulnheim^), Mylius^) u. a. Am besten ist es, das von dem Entdecker der Säure, Cleve, verwendete Oxydationsmittel Kaliumpermanganat zu benutzen, wobei mau mit ^'orteil nach dem Verfahren von Lassar Colin') die Man- ganniederschläge mit Xatriumbisulfit löst. Die Isosäuren werden gleich- zeitig mit den anderen Säuren gebildet, und zu ihrer Abscheidung benutzt man die Schwerlöslichkeit ihrer Baryumsalze in der Wärme. Das Verfahren bei der Darstellung ist ganz dasselbe für die BiUan- und Cholansäure. und es dürfte deshalb genügend sein, die Darstellung des einen Säurepaares — der Bilian- und der Isobiliansäure — zu beschreiben. Zur Oxydation ist etwa die doppelte Gewichtsmenge Permanganat rforderhch, und beim Verarbeiten von z.B. 100// Gallensäure (kristall- Ikoholfrei) braucht man also etwa 200^ Permanganat. von dem man junmittelbar vor dem Gebrauche eine lOVoige Lösung mit warmem Wasser bereitet. Die Cholsäure wird in Wasser mit Hilfe von Natriumkarbonat jelöst und mit Wasser zu 2°/o verdünnt, in dem obigen Falle also zu ö /. Man kann die ganze Menge Kaliumpermanganatlösung auf einmal zu- iiischen: es ist aber besser, nach dem Vorgange Freei Gegenwart von 012''/„ Gallensäure erhalten. Strassburg dagegen versetzte den Harn mit etwas Rohrzuckerlösung, tauchte einen Streifen Fließ- papier in denselben ein und ließ das Papier trocknen. Betupfte er darauf den Streifen mit einem Tropfen konzentrierter Schwefelsäure und ließ die letztere etwas abfließen, so entstand bei Gegenwart von Gallensäuren nach einiger Zeit eine schöne violette Färbung. Mit dieser Probe konnte er 00.37o Gallensäure nachweisen. Diese Methoden sind nicht zu empfehlen, einerseits weil der normale Harn leicht eine Färbung gil)t, welche zur Verwechslung führen kann, und andrerseits, weil diese Proben zwar bei absichtlichem Zusatz von Galle zu normalem Harn gelingen können, bei Untersuchung von stark gefärl)tem oder ikterischem Harne dagegen leicht mililingeu. Will man die Gallen- säuren mit Sicherheit in dem Harne nachweisen, so mub man sie zuerst womöglich isolieren, was in folgender Weise durch Ausfällung als Bleisalze geschehen kann. Man verfährt gewöhnlich nach den Angal)en von Neukomm ^). Man verdampft den Harn (oOOcm^ oder mehr) im Wasserbade bis fast zur Trockene und extrahiert den Rückstand mit Alkohol von 95 — 96"/o- Das Filtrat wird wieder eingetrocknet und der Rückstand, mit absolutem Alkohol gelöst. Man filtriert, verdunstet den Alkohol, löst den Rückstand in Wasser und fällt mit schwach aramoniakalischem Bleiessig unter Vermeidung von einem CberschulJ. Der Niederschlag wird nach 12 — 24 Stunden abfiltriert, gewaschen und zwischen Fließpapier mit dem Filtrum gepreßt. Dann kocht man die Bleifällung mit siedendem Alkohol aus, filtriert siedend heiß, setzt ein wenig Sodalösung hinzu, verdunstet zur Trockene und extrahiert mit absolutem Alkohol. Diese Lösung ist bisweilen so rein und so wenig gefärbt, daß ihr Rückstand zu der Pettenkofcrschen Probe benutzt werden kami. Gewöhnlich und besonders bei Gegenwart von nur sehr wenig Galle ist es jedoch notwendig, noch einmal mit Bleiessig zu fällen und wie oben zu verfahren. Xach dieser Methode kann man 1 Teil Gallensäure in 10.000 bis 20.000 Teilen Harn nachweisen. ') Laclislaus v. Vdransskij , tTber Furfurolreaktionen. Der direkte Nachweis von Gallensäuren im Harn. Zeitschr. f. physiol. Chemie von F. Hoppc-Seijlcr. Bd. 12. S. 355 bis 376 (S. 373). Straßburg 1S88. '^) Gustav Strassburg, Modifizierte Pettenkofcrsche Probe zum Nachweis der Galleu- säuren im Harne. Archiv f. d. ges. Physiol. von E. Pflügcr. Bd. 4. S. 461—465 (1871). •■) J. Ncukomm, Über die Nachweisung der Gallensäuren und die Umwandlung der- selben in der Blutbahn. Beicherts und Du Bois Beymonds Archiv für Anatomie, Physiologie und wissenschaftliche Medizin. Leipzig. Jg. 1860. S. 364—386. Darstellung der Gallensäuren und ihrer wichtigsten Ahbaiiprodukte etc. 669 Ist der Harn eiweißhaltig, so wird vorgeschrieben, das Eiweiß erst durch Sieden unter Essigsäurezusatz zu entfernen. Dies ist aber nach dem Verf. weder notwendig noch empfehlenswert. Mit dem Eiweiß kann näm- lich ein Teil der Gallensäuren ausfallen und verloren gehen. Es ist besser, den Harn sehr schwach alkalisch zu machen, so daß das Eiweiß nicht gerinnt und dann einzutrocknen. Das Eiweiß wird dann leicht durch die Alkohol- behandlung entfernt. Bei Verarbeitung von großen Harnmengen erschwert die reichliche ^lenge Harnstoff die Extraktion mit Alkohol nicht unwesent- lich. Etil- solche Fälle hat Verf. die Hauptmasse des Harnstoffes aus der alkoholischen Lösung durch einen Überschuß von Oxalsäure in Alkohol aus- gefällt, das Filtrat mit einem kleinen Überschuß von Soda eingetrocknet und dann mit Alkohol behandelt, K.MöfHcr^) konnte in dem Harn Taurocholsäiire durch Dialyse und Essigsäure- zusatz, woliei die Taurocholsäure in Verbindung mit dem Eiweiße ausfällt, nachweisen. Auch Vital i") und A. Jollcs^) haben die Ausfällung der Gallensäuren mit Hilfe von Eiweiß vorgeschlagen. Da aber diese Vorschläge eigentlich auf den Xachweis von Tauro- cholsäure sich beziehen, und da man noch nicht geprüft hat, inwieweit auch andere Gallensäuren, wie Glykocholsäure und Cholsäure, durch Eiweiß ausgefällt werden können, müssen diese Methoden noch weiter geprüft bzw. ausgearbeitet werden. Das von Dragendorff '^) angegebene Verfahren, die Gallensäuren aus dem Harne mit Chloroform, nach vorgängigem Ansäuern mit Salzsäure, auszuschütteln, gelingt nach Verf. zwar gut bei absichtlichem Zusatz von nicht zu wenig Gallensäuren zu normalem Harn. Bei Gegenwart von wenig Galleusäure und viel Farbstoff ist es weniger anwend- bar und es ist nach Verf. Ansicht weniger zuverlässig als die obige Methode mit Blei- fällunff. '&• c) Nachweis von Gallensäuren in den Fäces.^) Man extrahiert die Fäces mit Alkohol, filtriert, dampft unter Zusatz von etwas Essigsäure auf dem Wasserbade zum Sirup ein und zieht den Rückstand mit kaltem Wasser aus. Das Ungelöste wird mit Barvtwasser Libergossen und nach Zufügen von etwas Wasser erwärmt. Man leitet jetzt Kohlensäure ein, erhitzt zum Sieden, filtriert heiß, erschöpft den Rück- stand durch Auskochen mit heißem Wasser und dampft die vereinigten, lieiß filtrierten Auszüge auf ein kleines Volumen ein. Nach dem Erkalten >) K. A. H. Mörner, Untersuchungen über die Proteinstoffe und die eiweißfällen- len Substanzen des normalen Menschenharns. Skandinav. Arch. f. Physiol. Bd. 6. S.332 bis 437 (18Ü5). 2) Originalabhandlung nicht zugänglich. Referat in Zeitschr. f. analyt.Chem. Bd. 31. 3. 725. Wiesbaden 1892. 8) Adolf Jolles, Über eine neue Gallensäurereaktion untl über den Xachweis der jallensäuren im Harn. Hoiipe-SenJers Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 57. S.30— 34. Straß- Hirg 1908. *) Originalabhandlung nicht zugänglich. Referat in Zeitsclir. f. analyt.Chem. Bd. 8. 5. 102—103. Wiesbaden 1869. ') Da Verf. nicht Gelegenheit gehabt hat, die hier in Frage kommenden Metho- len zu prüfen, A\ird hier einfach das in Hoppe-Senler-Thierfclders Handbuch der piiy- üologisch und pathologisch chemischen Analyse, 7. Aufl. (1903), 8.555 beschriebene Verfahren mitgeteilt. ß70 Olof Hammarsten. Darstellung der Gallensäuren etc. wird etwas Äther und dann Salzsäure hinzugefügt, gut umgerührt und eine Zeitlang stehen gelassen. Man filtriert die ausgeschiedene Cholsäure ab, wäscht mit Wasser, löst in Alkohol, dampft die alkoholische, nötigenfalls mit Tierkohle entfärbte Lösung auf ein kleineres Volumen ein und läßt zur Kristallisation stehen. Die Kristalle werden auf Cholsäure geprüft. Dieses Verfahren bezweckt zunächst den Nachweis von Cholsäure. Zum Nachweis von dieser Säure nebst den gepaarten Galleusäuren extrahiert man die Fäces mit Alkohol, filtriert, entfernt den größten Teil des Alkohols durch Eindampfen, macht mit Salz- säure sauer, dann mit Barytwasser stark alkalisch, leitet Kohlensäure ein. erhitzt zum Kochen, filtriert heiß und kocht den Rückstand noch mehrmals mit Wasser aus. Die vereinigten Filtrate werden auf ein kleines Volumen eingedampft. Beim Erkalten schei- det sich cholsaurer Baryt ab, während glykochol- uud taurocholsaurer Baryt in Lösung bleiben. Den cholsauren Baryt führt man durch Behandeln mit Salzsäure (siehe oben) in Cholsäure über. Zur Trennung der Glykochol- und Taurocholsäure kann ihr ver- schiedenes Verhalten gegen Bleiacetat benutzt werden. Zur Identifizierung der Säuren dienen ihre oben beschriebeneu Eigenschaften und besonders die Prüfung auf Schwefel. Da die Trennung der verschiedenen Gallensäuren, selbst wenn sie in ziemlicli reinem Zustande nebeneinander vorkommen, nach der nun beschriebenen Methode nur bei Gegenwart von vei'hältnismäßig großen Mengen annähernd gelingt, findet Verf. es ■wenig wahrscheinlich, daß man bei der Untersuchung von Fäces nach dieser Methode zu guten Resultaten gelangt. Chlorophyll und seine wichtigsten Abbau- produkte. '^ Von Richard Willstätter, Zürich. Chlorophyll ist ein kollektiver Begriff. Man versteht unter Chlorophyll oder Chlorophyllen die grünen Pigmente, welche in den kohlensäureassimi- lierenden Pflanzen enthalten sind. Für die Untersuchung des Chlorophylls ist es notwendig, den Farb- stoff aus der Pflanze zu isolieren. Es ist möglich, dal'» daljei kleine \'er- änderungen im Molekül des Chlorophylls stattfinden. Auch die aus den Pflanzen isolierten Pigmente bezeichne ich als Chlorophylie, wenn sie noch Magnesiumverl)indungen ohne sauere und ohne basische Eigenschaften und wenn sie grün sind, d. h. wenn ihre Al)sorptionsspektren grolle Ähulichkt'it zeigen mit dem Spektrum lebender Blätter. Das Pflanzenmaterial. Fast alle Forscher, die über Chlorophyll arbeiten, schreiben vor. für die Darstellung von Chlorophyllösungen Pflanzenmaterial in frischem Zu- stand zu verarbeiten. Es wird empfohlen (z. B. von B. Sachsse 2), A. Hansen 3), ähnlich von A. Tsckirch*), frisches Gras mit Wasser auszukochen, es ab- zupressen und mit Alkohol in der Wärme zu extrahieren. F. Hoppe-Seyler^) ') L. Marchleirskis Monographie ,,Chloropliyll" (iu Boftcoe-SchoHciiinicrs ausführ- lichem Lehrbuch der Chemie, herausgegeben von J. W. Brühl, Bd. 8. S. 839—913) hat im Jahre 1901 den Stand der Methodik vollständig dargestellt und die Arbeitsweise von E. Schunch und L. Marchhirski besonders berücksichtigt. Unter ausdrücklichem Hinweis auf diese Quelle der älteren Literatur teile ich deshalb in dem vorliegenden Kapitel hauptsächlich meine eigenen Erfahrungen mit. 2) B. Sachsse, Phytochemische Untersuchungen. I. Chemische Untersuchungen über das Chlorophyll. Leipzig 1880. 3) A. Hansen, Die Farbstoffe des Chlorophylls. Darmstadt 1889. *) A. Tschirch, Untersuchungen über das Chlorophyll. Berlin 1884. — Der (^»uarz- spektrograph und einige damit vorgenommene Untersuchungen von rflanzenfarl)stoffen. Ber. d. Deutscheu botan. Gesellsch. Bd. 14. S. 76 (189G). 5) F. Hoppe-Sei/Ier, Über das Chlorophyll der Pflanzen. I. Abh. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 3. S. 339 (1879). 672 R- Willstätter. wäscht zur Darstellung von Chlorophyllan frisches Gras mit Äther und zieht » es mit siedendem Alkohol aus. E. Schunck und L. MarcJilewski^) gewinnen Phyllocyanin sowie Alkachlorophyll durch Extrahieren von frischem Gras mit Alkohol bei Wasserbadtemperatur. L. Mcu-chlewski und C. A. Schunck-) \ arbeiten auf die Darstellung von reinem Chlorophyll hin durch Extrahieren i der frischen Blätter von Ficus repens mit 82''/oigem Alkohol; sie halten diese Isolierungsweise für eine Methode, welche ..Garantie dafür bietet, dal) das Chlorophyll selbst chemisch nicht verändert wurde". Meine Abänderungen der Isolierung des Chlorophylls bestehen : I 1. In der Anwendung des I'flanzenmaterials in getrocknetem 3) Zu- stand und gepulverter Form.*) Es wird auf diese Weise möglich, Chlorophyll und seine Abbaupro- dukte in erheblichen Mengen zu gewinnen, wie sie für die chemische Unter- j suchung erforderlich sind. Da die ^Mengen der Präparate nicht mehr einen kleinen Bruchteil, sondern einen großen Teil des in der Pflanze vorhandenen Chlorophylls repräsentieren, ist es möglich geworden, hinsichthch der Aus- beute an Chlorophyll und seinen Derivaten Angaben zu machen, die bisher in der Literatur fast ganz gefehlt haben. Der Verlust an Chlorophyll durch die Trocknung der Pflanzen erweist sich als gering; der quantitative kolorimetrische Vergleich ergibt z. B., daß die Ausbeute an Chlorophyll im alkoholischen Extrakt getrockneter Brenn- nesselblätter 95-7Vo und aus getrockneten Galeopsisblättern 94-5" o beträgt vom Chlorophyll, das die frischen Blätter an Alkohol abgeben. &) Als das geeignetste Ausgangsmaterial erweist sich für die meisten Abbau- produkte das Kraut der Brennessel (Herba Urticae), das schön getrocknet zu billigem Preise käuflich ist. ^) Auch Gras von reinem Parkrasen ist ein gutes Ausgangsmaterial, aber es ist schwerer schön grün zu trocknen als Brennesseln. 100 (/ frische Brennesselblätter geben litEttrocken 24 — 2b lätter verschiedener Pflanzen mit Alkohol betupfte und die Präparate unter Deckgläsern langsam aus- trocknen ließ. iV. Ä. Monteverde -) hat später das kristallisierte Chlorophyll iurch die Beschreibung seines Spektrums und seiner Löslichkcitsverhält- aisse genauer gekennzeichnet. M J. Borodin, Über Chloropbyllkristalle. Sitzungsberichte der botanischen Sektion ier St. Petersburger Naturforscher-Gesellschaft. Botanische Zeitung. Bd. 40. S. 608(1882). •■') X A. Monteverde, Das Absorptionsspektrum des Chlorophylls. Acta horti Pe- Topolitani. Vol. 13. Nr. 9. p. 123 (1893). 680 R. Willstätter. Nachdem diese Angaben lange Zeit keine Beachtung und keinen Glauben gefunden hatten, ist es mirM vor kurzem (gemeinsam mit M. Benz) gelungen, eine ^lethode auszuarbeiten, nach welcher sich diese wunder- schöne Substanz rein und in beliebiger Menge gewinnen läßt. Während aber Borodin angibt, daß ihm unter 776 Pflanzenarten, die mikroskopisch untersucht wurden, 190 Arten Chlorophyllkristalle in größerer oder kleinerer Menge geliefert haben und Avährend auch Monteverde den kri- staUisierten Farbstoff in Pflanzen aus einer Anzahl ganz verschiedener Fa- milien angetroffen hat, finde ich nur einige Tubifloren für die Gewinnung des kristallisierten Chlorophylls brauchbar. Von vielen Pflanzen, mit wel- chen Versuche ausgeführt wurden, hat sich Galeopsis tetrahit L. als be- sonders geeignet für die Gewinnung des kristallisierten Chlorophylls in größerem Maßstal) erwiesen. Das Kraut von Galeopsis habe ich kurz vor und während der Blüte- zeit gesammelt. Die Blätter werden von den Stengeln getrennt, getrocknet und mit der Steinmühle gemahlen. Zum Ausziehen des Chlorophylls eignet sich am besten Alkohol; Äther extrahiert das kristaUisierte Chlorophyll nur recht träge und unvollständig. Bei der Gewinnung der alkoholischen Ex- trakte ist der Zusatz von geschlämmter Kreide oder von Magnesia car- bonica zur Neutrahsation von Pflanzensäuren empfehlenswert. 10 kg Mehl der Galeopsisblätter werden mit einem Zusatz von Schlämm- kreide in Stöpselflaschen mit 20 l 96Voigein Alkohol unter häufigem Um- schütteln 2 — 3 Tage lang ausgezogen, dann auf der Steinzeugnutsche ab- gesaugt und mit 8 l Alkohol nachgewaschen. Aus der alkoholischen Lösung des Rohchlorophylls mache ich eine ätherische durch Vermischen des Ex- traktes mit 20 — 25 l Äther und Hinzufügen der zur Beseitigung der Haupt- menge des ^ykohols gerade zweckmäßigen Menge Wasser; das sind etwa 60 l Wasser mit '/* l gesättigter Kochsalzlösung. Die Ätherlösung ist zwar gewöhnlich frei von Pflanzensäureu, aber sie enthält noch als eine sehr unangenehme und recht schwierig zu ent- fernende Verunreinigung eine farblose, indifferente, schleimige Substanz. Sie verursacht, sobald man den Alkohol aus der Ätherlösung vollständig herauszuwaschen versucht, hartnäckige Emulsionen. Zur Beseitigung des Schleimes ist es nützlich, die Lösung eine Pieihe von Malen stundenlang mit Klärmitteln an der Maschine zu schütteln; ich wende 3 — 4mal ein ganzes Kilo Talk oder Kieselgur an. Ein Ptest der Verunreinigung bleibt allerdings auch dann noch im Äther zurück, aber er verursacht beim Aus- schütteln mit Wasser keine lästigen Emulsionen mehr und wird dabei nahezu entfernt. Die Lösung wird 5mal mit je 20 l Wasser durchge- schüttelt und ihr Volumen bei allen Operationen durch Nachfüllen von Äther unvermindert erhalten. Schließlich engt man die ätherische Lösung im Wasserbade auf 3 — 4 l ein. Gegen Ende des Eindampfens beginnt oft 1) B. Willstättrr und M. Benz, Über kristallisiertes Chlorophyll. Aun. d. Chem. Bd. 358. S. 267 (1908). Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. Q^i die Flüssig-keit infolge der Ausscheidimg- von Kristallen zu stoßen. Die Hauptnienge des Chlorophylls kristallisiert dann beim Stehen in einigen Stunden aus; es wird abfiltriert und auf dem Filter zur Beseitigung an- haftender :\Iiitterlauge, namentlich zur Befreiung von den gelben Beglei- tern ausgewaschen, bis die Waschfliissigkeit rein grün abläuft. Die äthe- rische Mutterlauge hefert bei stärkerem Einengen noch weitere Kristalli- sationen, die an Reinheit ein wenig hinter der Hauptportion zurückstehen. Die Ausbeute schwankte bei verschiedenen Ernten , sie betrug z. B. 17 /7, wovon l:') rmischen mit Äther und Herauswaschen des Alkohols mit Wasser erhält man leicht üliersättigte ätherische Lösungen, aus denen sich das Chlorophyll schnell abscheidet. In kleinerer Menge läßt sich das Chlorophyll sehr gut unikristalli- sieren, und zwar besonders aus Methylal; schwerer gelingt das l^mkristalli- sieren größerer Mengen, da sich die Substanz in Lösungen, namentlich beim Erhitzen, leicht verändert und ihr Kristallisationsvermögen einbüßt; in alkohoHscher Lösung tritt schon bei gewöhnlicher Temperatur bei län- gerem Stehen Veränderung ein. Zur Kristallisation aus Methylal wird die Lösung bei Siedetemperatur rasch hergestellt und sogleich stark eingeengt. Aus xUher kann man das Chlorophyll umkristaUisieren, indem man mit einem Überschuß des Lösungsmittels aufnimmt und zu starker Konzen- tration abdampft. Eigenschaften. Das kristallisierte Chlorophyll bildet scharf begrenzte sechseckige und gleichseitig dreieckige Täfelchen, die sehr wahrscheinlich dem hexagonaleuA System angehören und trigonal hemiedrisch zu sein scheinen. Die Fig. 49 stellt die Form eines typischen Pvohproduktes , die Fig. 50 ein aus Methylal umkristallisiertes Präparat in schwacher Vergröße- rung dar. 082 E. Willstätter. Die Kristalle zeigen blauschwarze Farbe und den lel)liaftesten metal- lischen Glanz und besonders im Sonnenlicht wunderbare Reflexe. Das Pul- Fig. 49. ^ i> * f t l Flg. 50. ver ist dunkelgrün. Die Kristalle sind weich und haften an Glas und Papier. Sie be- sitzen keinen Schmelzpunkt, beim Erhitzen tritt unter Aufblähen Zersetzung ein. Das kristalhsierte Chlorophyll ist leicht lösUch in absolutem Alkohol, Holzgeist und in Aceton, ziemlich schwer in Äther, viel beträchtlicher in Methylal, näm- lich lg beim Kochen in 40 — -ib cm^, kalt nur wenig schwerer. Es löst sich reichlich in Chloroform, namenthch beim Erwärmen (1 g in ca. 16 cm^\ aßCD EbF G 50 »IUI 100 mm 200 mm Fig. 51. verändert sich aber leicht darin. In Benzol ist es heiß ziemlich leicht, kalt schwer löslich, in Petroläther unlösüch. Chlorophyll uud seine wichtigsten Abbauprodukte. 683 Die Lösung-en besitzen rein grüne Farbe und starke rote Fluoreszenz. Sie zeigen im sichtbaren Spektrum (Fig. 51) 6 Absorptionsbänder mit der Reihenfolge der Intensität: I, VI. V, II, III, IV. Ol g Chlorophyll in 5 / Alkohol. Schicht in vim 10 40 Band I Ä* „ II \ „ III X " ^\ ~^ „ ^' \ „ VI 1 Endabsorption X 672 658 680 — 6ö6 650 619 . . 610 472 . . 458 446 — 688 — (538 622 605 589 . . 575 542 . 531 484 — * Die Zahlen der Wellenlängen (in \x [x] werden mit den Zeichen ver- bunden : — für sehr dunkel, für ziemlich dunkel, . . . weniger ge- schwächt. . . wenig geschwächt, . sehr wenig geschwächt. Zusammensetzung: Das Chlorophyll hinterläßt ölißVo Asche von reiner Magnesia. Die Analyse umkristallisierter Präparate (exsikkator- trocken) ergab folgende Mittelwerte: Gefunden C 65-83 H 6-15 N 8-24 Mg 3-40 0 16-38 Berechnet für Cg^H^, 0. X^Me 66-01 6-13 8-13 3-53 16-20 Amorphes Chlorophyll. Das Chlorophyü der meisten Pflanzen unterscheidet sich von dem be- schriebenen durch den Mangel des Kristallisationsvermögens und durch seine Löslichkeitsverhältnisse: es ist in Äther und auch in Petroläther sehr leicht löslich. Dieser Unterschied könnte bedingt sein durch geringere Rein- heit des amorphen Chlorophylls. Aber ich finde einen sicheren Unterschied darin, daß das kristahisierte Chlorophyll kein Phytol enthält, das nicht kri- staUisierende, leicht lösliche hingegen ein Ester des Phytols ist. Gemeinsam ist dem amorphen imd dem kristallisici-ten Chlorophyll der Gehalt an komplex gebundenem Magnesium. \) Entfernt man aus beiden 1) Daß Chlorophyll eine Magnesiumverl)indung ist. wurde in meiner Untersuchung „Zur Kenntnis des Chlorophylls" ^Ann. d. Chem. IJd. 350, S. 48 [1906]) gefunden. Die Monographie „Chlorophyll", in welcher L. Marchlewski im Jahre 1901 (in Roscoe-Schor- lemmer, herausgegeben von .7. IV. Brühl, Bd. 8. S. 839—913) unsere Kenntnis von dem 684 ■ R- Willstätter. das Metall, so entstehen Umwandlungsprodukte, die keine Asche geben Phäophorbin und Phäophytin. Das erstere enthält kein Phytol, das letztere ca. aoVo- ]\leine Methode der Untersuchung von Pflanzen auf das Vorkommen von amorphem und von kristallisiertem Chlorophyll besteht darin, daß ich durch Behandlung des alkoholischen Bliltterauszuges mit (Jxalsäure das magnesiumfreie Derivat des Chlorophylls abscheide und dieses nach Um- fallen mit Alkohol aus Chloroformlösung der quantitativen A>rseifung unter- werfe. Auf diese Weise habe ich in 80 Pflanzen aus 40 Familien Chloro- phyll mit einem Phytolgehalt von ungefähr oO°/o angetroffen. Das kristallisierte Chlorophyll enthält an Stelle des Phytolrestes (C.20 Hg;, — ) die Methylgruppe. Die Methoxylbestimmung i) ergibt , daß in ihm auf 1 Atom Magnesium zwei OCH, -Gruppen enthalten sind, desglei- chen 2 OCH3 in Phäophorbin, dagegen im Phäophytin eine OCHg-Gruppe. KristaUisiertes Chlorophyll enthält 8-50/0 OCH, Phäophorbin „ ö-ß^/o 7, Phäophytin (aus Gras) „ 3"5o/o Das amorphe Chlorophyll ist noch nicht rein dargestellt worden. Die Blätterauszüge enthalten Chlorophyll vermischt mit einem Vielfachen von gelben Verbindungen (Carotin, Xanthophyll) und von farblosen Stoffen (z.B. von Fetten, Wachsen, Zuckern); die Trennung von diesen begleitenden Substanzen ist bis jetzt immer an drei Eigenschaften des amorphen Chlo- rophyUs gescheitert, an seiner Leichtlöshchkeit, Zersetzlichkeit und chemi- schen Indifferenz. Das Chlorophyll ist weder basisch noch sauer; sobald man es in Verbindungen überführt, hat man nicht mehr Chlorophyll selbst in Händen, sondern ein Produkt der Hydrolyse.^) Blattfarbstoff zusammengefaßt bat, enthält das Wort Magnesium nocb an keiner Stelle. Vor wenigen Jabren ist es noch strittig gewesen, ob im Chlorophyll Eisen und Phosphor enthalten sind. H. Molisch (Die Pflanze in ihren Beziehungen zum Eisen. Jena 1892) hatte es zwar schon wahrscheinlich gemacht, daß Chloroph3ll frei von Eisen ist. Dem stand aber die Angabe von E. Schiinck entgegen, daß die Asche des Phylloxanthins Eisenoxyd als integrierenden Bestandteil enthalte (Contributions to the Chemistry of Chlorophyll. Nr. 4. Roy. Soc. Proc. Vol. 50. p. 302 [1891]) und das Ergebnis der ein- gehenden Untersuchungen von Ä. Hansen, daß Chlorophyll Eisen enthalte (cfr. z.B. Ä. Hansen, Die Farl)Stoffe des Chlorophylls. Darmstadt 1889. S. 58). Die Angabe, Chloro- phyll sei eine Phosphorverbindung, ist hauptsächlich von J. Stoklasa gemacht worden und wird heute noch von ihm und seinen Schülern leidenschaftlich vertreten (cfr. J. SfohJasa, V. BrtUik und J.Just: Ist der Phosphor an dem Aufbau des Chlorophylls beteiligt? (Ber. d. Deutsch, botan. Gesellsch. Bd. 26. S. 69 [1908]); die Angabe ist aber in meiner zitierten Arbeit widerlegt worden. ') Mitgeteilt aus einer unveröffentlichten Arbeit von B. WiJlsfäfter und E. Hug. 2) Ä. Hansen (Die Farbstoffe des Chlorophylls. Darmstadt 1889) hat versucht, Chlorophyll durch die Bildung von Alkalisalzen zu reinigen. W.X.Hartlcy (The Spectra of blue and yellow Chlorophyll, with some observations on leaf-green. .Journ. Chem. Soc. Vol. 59. p. 106. 1891. — The Spectrum generally attributed to „Chlorophyll" and its relation to the spectrum of living green tissues. Journ. Chem. Soc. Vol. 85. p. 1607. 1904) hat Chlorophyll als Baryumverbindung abgeschieden. Bei solcher Behandlung wird der Ester Chlorophyll verseift. Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. ßgo Abscheidung. Amorphes Chlorophyll läßt sich intakt, aber verdünnt durch Beimischungen isolieren durch Fällen der alkoholischen Rohchloro- phyllösung mit wenig Wasser, zweckmäßig unter Zusatz einer kleinen Menge Kochsalz oder unter Zufügen a'ou Kieselgur, wodui-ch das sirupöse Produkt gut filtrierbar gemacht wird. Ich verwende für 1 / Perkolat aus 1 Ä-(/ Brennesseln 1400 bis 1600 cin^ Wasser und bO oir Kochsalzlösung oder 20(7 Kieselgur. Mit dem alkoholisch-wässerigen Filtrat wird wenigstens ein Teil der Verunreinigungen (z. B. die Zucker) beseitigt. Diese Mutterlauge aus 1kg Brennesseln gab beim Verdampfen auf dem Wasserbad ca. 23<7 Bückstand. Ein anderer Teil der Beimischungen läßt sich fernhalten, wenn mau das Pflanzenmehl mit Petroläther, der fast nichts vom grünen Farbstoff daraus aufnimmt, gründlich perkoliert, ehe man es auf Chlorophyll ver- arbeitet. Der Waschpetroläther von 1 kg Brennesseln liefert bei 100" im Vakuum lo'b g Rückstand. Zwei Reinigungsmethoden habe ich angewendet, um das amorphe Chlorophyll für manche analytische Zwecke von einem Teil seiner Bei- mischungen zu befreien, beispielsweise für die Prüfung auf Magnesium, Phosphor und Eisen. Reinigung durch die kolloidale Lösung.^ Chlorophyll ist in Wasser koUoidal löslich, und zwar mit ganz anderen Farberscheinungen, als die Lösungen in organischen Solventien zeigen. Lösungen von Chlorophyll und ähnlich von einigen Chlorophylldei'ivaten in Alkohol, Holzgeist oder Aceton geben beim Verdünnen mit viel Wasser keine Ausscheidung, sondern mattgrüne, fluoreszierende kolloidale Lösungen. Dieselben geben bei vorsichtigem Ausätliern kein oder fast kein Chloro- phyll ab, hingegen nimmt der Äther, indem er sich gelb färbt, einen Teil der Verunreinigungen auf. Ein anderer Teil davon hinterbleibt in der wässerigen Mutterlauge, wenn man durch Aussalzen und Ausäthern das Chlorophyll wieder isoliert. 250 cm^ Acetonextrakt aus 500 g Brennesselblättern wurden mit 800 cm^ Wasser verdünnt und die entstandene kolloidale Lösung dreimal mit je 12bO ciii^ Äther unter nicht zu kräftigem Schütteln gewaschen. Reinigung nach dem Prinzip der Entmischungsmethode von Kraus. Der grundlegende Versuch von G. Kraus-) besteht darin . daß der alkoholische, natürlich wasserhaltige Blätterauszug mit Benzol durchge- schüttelt wird. Die benzolische Schicht färbt sich blaugrün, die weingeistige ') i?. WiUstätter, Zur Kenntnis der Zusammensetzung des Chlorophylls. Ann. d- Chem. Bd. 350. S. 48 (1906). ^) G. Kraus, Zur Kenntnis der Chlorophyllfarbstoffe und ihrer Verwandten. S. 88. Stuttgart 1872. 686 R. Willstätter. goldgelb. Eine ähnliche Scheidung erzielt man nach H. C. Sorby^) mit alkoholischem Extrakt und Schwefelkohlenstoff. B. Sachsse ") ersetzte bei dem AVawsschen Versuche das Benzol durch Benzin. L. Marchlewski und C. Ä. Schunck ^) haben die Verfahren von Kraus und namentlich von Sorhij verbessert, um Lösungen von Chlorophyll für die spektroskopische Untersuchung zu reinigen. Ferner hat ^V. A. Monte- verde^) gründliche Angaben über die Anwendung der AVc«/sschen Methode gemacht. Er erhielt in wechselnder Menge, je nach dem Pflanzenmaterial, zwei grüne Farbstoffe, deren einer von Benzin aufgenommen wird, während der andere in die alkohohsche Schicht geht. Die Entmischung führt zwar leicht zu chlorophyllfreien, also farb- reinen Lösungen der gelben Chlorophyllbegleiter, aber es gelingt nicht, auf diese Weise das amorphe Chlorophyll frei von Verunreinigungen zu erhalten. Auch bei oftmaliger Wiederholung des Verfahrens bleibt das Chlorophyll sehr stark vermischt mit Begleitstoffen, die sich in ähulicliem Verhältnis zwischen den angewendeten Lösungsmitteln verteilen. Eine Verbesserung des Verfahrens von Kraus finde ich in der An- wendung von Holzgeist statt des Äthylalkohols. Im wasserhaltigen Holzgeist löst sich, wie ich mit folgendem Ver- gleich zeige, viel weniger Petroläther als in Weingeist. hO cm^ absoluter Alkohol und andrerseits 50 cm ^ Methylalkohol (käuf- lich) werden mit 50 cm'^ Petroläther vom Siedepunkt 30 — 50« vermischt. Auf Zusatz von Wasser wird Petroläther in folgendem Maße abgeschieden: Petroläther aus der Petroläther aus der Mischung mit Methylalkohol Mischung mit Äthylalkohol 10 cni^ 0 20 „ 0 40 „ 0 45 ,, 22 cm^ 50 ,, 43 ,,, Die methylalkoholische Lösung des Farbstoffs läßt sich infolgedessen leichter und schärfer fraktioniert entmischen als die äthylalkohoüsche und es ist beim Holzgeist nicht notwendig, so stark mit Wasser zu verdünnen wie bei Äthylalkohol, um einen großen Teil des Chlorophylls in Petroläther zu überführen; daher kann mehr von den Beimischungen mit der methyl- alkoholischen Schicht abgetrennt werden. Wasserzusatz 0-7 cm^ 1 V Q O V 5 ?7 10 ?; *) H. C. Sorhy, On a definite method of qualitative analysis of animal and vegetahle colouriug-matters by means of the spectrum microscope. Proc. Royal Soc. Vol. 15. p. 43a ! (1867). — On comparative vegetable chromatology. Proc. Royal Soc. Vol. 21. p. 442 (1873). ] 2) i?. Sachsse, Die Chemie und Physiologie der Farbstoffe, Kohlehydrate utul ^ Proteinsubstanzen. S. 23. Leipzig 1877. • '■') L. MarchJcirsll und C. J. Schmick, Zur Kenntnis des Chlorophylls. Journ. f. prakt. Chem. [2.] Bd. 62. S. 247 (1900). I ■*) X. A. Mouteverde, Das Absorptionsspektrum des Chlorophylls. Acta horti Pe- 1 tropolitani. Vol. 13. Nr. 9. p. 154 (1893). ' Chlorophyll uml seine wichtigsten Abhauprodukte. (1^7 Methylalkoliolischer Extrakt (2/) aus eiiioni Ivilonrainui lüättonnclil wird mit dem yleicheu Volumen von rektifiziertem, niedrifi; siedendem Petrolätlier vermischt und dann mit 400 on^ Wasser versetzt. Die wässeri;:- liolzgeistige Schicht scheidet sicli stark grüngelh gefärbt aus und wird abgelassen. Dann schüttelt man die Petroliltherschicht mehrmals mit wasser- haltigem Holzgeist durch, z. 15. mit 1700 cm» .Metliylalkohol + y>00 mi^ Wasser, darauf mit 1000 cm» ^lethylalkohol + 200 oii-^ Wasser, schlieCilich mit 1000 «»3 Methylalkohol +100c>».ä Wasser. Die (Tasolinlö.sung befreit man durch vorsichtiges Schütteln mit Wasser von aufgenommenem Alkeliol (bei kräftigem Durchschütteln wird ein Teil der gelösten Substanz in i^rüncn Plocken gefällt); nach dem Trocknen mit geglühtem Xatriumsulfat wird sie im Vakuum bei gewöhnlicber Temperatur eingedampft. Der llückstan'. WiUi^tiitto- und /•.'. //»/'/. 688 R- Willstätter. Die gelben Begleiter des Chlorophylls (Carotin und Xanthophyll). Die gelben Begleiter des Chlorophylls lassen sich in zwei Gruppen einteilen: es sind in Benzin leicht, in Alkohol schMer lösliche, andrerseits in Benzin sehr wenig, in Alkohol leicht lösliche Verlnndungen. Von jeder der beiden Gruppen ist ein kristallisierender Repräsentant in reinem Zn- stand bekannt geworden i) : nach diesen A^rtretern ist es zweckmäßiu-, die zwei Gruppen der gelben Pigmente als Carotin- und als Xanthophyli- gruppe zu bezeichnen. Zur ersteren gehören die benzinlöslichen, zur zweiten die alkohollöslichen gelben Farbstoffe der Blätter. Bei den Bestrebungen, ..ReinchlorophyU" aus den alkoholischen Blätter- extrakten durch Abtrennen der gelben Begleiter zu isolieren, haben die Entmischungsmethoden von Kraus und von Sorhy die wichtigste Rolle gespielt. Nach dem /vrawsschen Verfahren ist es nun aber, auch wenn die Fraktionierung mit Hilfe von Petroläther und wasserhaltigem Holzgeist mehr als zwanzig Male ausgeführt wurde, nicht gelungen, ChlorophvUösungen frei von Carotin zu erhalten. Daß in der Tat die Abtrennung des Carotins vom Chlorophyll dabei unmöghch ist, läßt sich zeigen, indem man die jetzt rein isolierten Stoffe Carotin und Xanthophyll unter den Versuchsbedin- gungen von Kraus und von Sorht/ prüft. -) ^lan gewinnt dadurch ein sicheres Urteil über die Leistungsfähigkeit der beiden Entmischuugsmethoden. 1. Die Lösung von Carotin in Petroläther wird so mit Holzgeist ver- setzt, daß sich die beiden Lösungsmittel nicht mischen. Carotin bleibt größtenteils im Petroläther, die holzgeistig-petrolätherische Schicht wird wenig angefärbt. Auf Zusatz einer Spur Wasser wird die methylalkoholische Schicht farblos. Wendet man Methylalkohol oder Äthylalkohol an, so daß eine klare Mischung mit der petrolätherischen Lösung von Carotin entsteht, so tritt auf Zusatz von wenig Wasser Entmischung ein : die alkoholische Schicht ist farblos. Man kann bei diesem Versuche ebensogut von einer alkoholischen Carotinlösung ausgehen : man kann auch Benzol anwenden. 2. Zur alkoholischen Carotinlösung wird Schwefelkohlenstoff gegeben. Auf Zusatz von ganz wenig Wasser trennt sich der Schwefelkohlenstoff ab. Er enthält quantitativ das Carotin. o. Die alkohohsche Lösung des Xanthophylls wird mit Petroläther vermischt und mit wenig Wasser entmischt : der weitaus größte Teil des Xanthophylls befindet sich in der weingeistigen Schicht. 4. Man vermischt die alkoholische Xanthophyllösung mit Schwefel- kohlenstoff und trennt die beiden Solventien mit wenig Wasser, Xanthophyll verteilt sich zwischen beiden Schichten. i 1) B. Willstätter und W. Mieg, Über die gelben Begleiter des Chlorophylls. Ann, d. Chemie. Bd. 355. S. 1 (1907). 2) B. Willstätter und W. Mieg, 1. c. S. 8. Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 689 Hierdurch wird gezeigt, daß das Verfahren von Kraus (richtig aus- gearbeitet) der Methode von Sorhy überlegen ist für die Abtrennung des Xanthophylls vom Chlorophyll. Und insbesondere, daß es unmöglich ist, mit einer von diesen Entmischungsmethoden Carotin zu beseitigen. Es geht nicht in den Alkohol. Die Reindarstellung von Chlorophyll durch derartige Entmischung mit Schwefelkohlenstoff haben neuerdings namentlich L. March- lewski und C. Ä. Schunck i) angestrebt. Sie führen Chlorophyll aus einem Blätterextrakt in Schwefelkohlenstoff über und reinigen diese Lösung durch mehrmahges Ausschütteln mit S-iVoigem Alkohol. Das Ende der Operation wird spektroskopisch daran erkannt, daß eine alkohohsche Ausschüttelung- an Schwefelkohlenstoff keine gelben Farbstoffe mehr abgibt und nichts mehr von einem zweiten grünen Farbstoff, den Marchlewski und Schunck als Allochlorophyll bezeichnen. Es ist nun erwiesen, daß man auf diese Weise das Carotin beim Chlorophyll läßt; man kann es mit Alkohol ebensowenig aus Schwefelkohlen- stoff herausholen als aus Benzol oder Benzin. Noch weit mehr bleibt aber das Chlorophyll bei dieser Reinigung mit farblosen Substanzen verdünnt, und zwar mit einem Vielfachen seines Gewichtes. Bei dem Arbeiten mit Pflanzenextrakten ist die Kenntnis der Eigen- schaften von Carotin und Xanthophyll von großem Nutzen; die wichtigsten Angaben der Arbeit von WiUstätter und Mieg sind in folgender Tabelle zusammengestellt: Carotin Xanthophyll Formel C40H56 ^40 H56 O2 Aussehen kupfrige Blättchen pleochromatische, duukel- braunrote Täfelchen Kristallhabitus bei mikro- skopischen Kristallen beinahe quadratische Form trapezförmig, mit häufiger Zwillingsbildung Farbe in der Durchsicht rot gelb bis orange Schmelzpunkt (unter Zersetzung) 167-5-168° 172° Löslichkeit in niedrig- siedendem Petroläther beträchtlich löslich unlöslich T .. ,. 11 -x • 111 u 1 ' kalt fast unlöslich, Loshchkeit in Alkohol j ^^^^ ^^^^, ^^j^^^^. i^^u^i^ kalt ziemlich schwer löslich, heiß ziemlich leicht Löslichkeit in Aceton recht schwer löslich leicht löslich Löslichkeit in kaltem Schwefelkohlenstoff spielend löslich ziemlich schwer löslich ') L. Marchlewski und CA. Schunck, Zur Kenntnis des ChlorophyJls. Journ. f. prakt. Chemie. [2.] Bd. 62, S. 247 (1900) und Boscoe-Schorlemmer-Brtthl, Bd. 8 (1901). Kapitel „Chlorophyll" von L. Marchlewski. S. 857. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 44 590 ^- Willstätte.r, Die Isolierung- von Carotin aus Blättern beschreiben A. Amaud^) sowie R. WiUstätter und W. Mieg 2), die Isolierung des Xanthophylls Will- stätter und Mieg. ^) Cliromatographische Adsorptionsanalyse des Chlorophylls nach M. Tswett. ') Als Prinzip seiner Methode gibt M. Tswett an, daß Farbstoffe und farblose Substanzen, die in organischen Flüssigkeiten wie Benzol, Benzin, Schwefelkohlenstoff gelöst sind, sich durch pulverförmige Körper mehr oder weniger vollständig niederschlagen lassen, indem sie an der ( )berfläche der letzteren adsorbiert werden. Aus den dabei gebildeten physikalischen Ad- sorptionsverbindungen kann man die Stoffe mit Hilfe von Alkohol Aceton, Äther oder Chloroform wieder herausholen. Man verwendet z. B. eine Lösung von Chlorophyll in Petroläther. Schüttelt man sie mit einem Überschuß von pulverförmigem Calciumkarbonat, so werden nach Tswett alle Farbstoffe außer Carotin niedergerissen; es genügt aber, dem Lösungsmittel einige Tropfen Alkohol zuzusetzen, um momentan alle Farbstoffe wieder in Lösung zu bringen. Läßt man die petrolätherische Lösung durch eine Säule von Calcium- karbonat filtrieren, so werden die Farbstoffe also physikalisch niederge- schlagen. Dabei verdrängen sie sich aber gegenseitig aus ihren Adsorptions- verbindungen, und zwar einer gewissen Reihe, der Adsorptionsreihe, gemäß und sie ordnen sich in so viele verschieden gefärbte Zonen, als Teilfarb- stoffe vorhanden sind. Es bleibt nur noch die tingierte Säule (das ..Chro- matogramm") mit dem Skalpell methodisch zu zerlegen und die verschiedenen Farbstoffe mit passenden Lösungsmitteln zu extrahieren. Mit Hilfe dieser Adsorptionsmethode hat Tswett die Zusammensetzung des Blattpigmentes untersucht, allerdings nur spektralanalytisch. Er fand ^) A. Arnaiid, Recherches sur les niatieres colorautes des feuilles; ideutite de la ! matiere rouge orangö avec la Carotine, Ci^H^^O. Compt. rend. de l'Acad. des Sciences. T. 100. p. 751 (1885). — Recherches sur la composition de la Carotine, sa fouctiou chimique 1 et sa formale. Elienda. T. 102. p. 1119 (1886). — Dosage de la Carotine contenu dans : les feuilles de vegetaux. Ebenda. T. 104. p. 1293 (1887). — Recherches sur la Carotine; ; son role physiologique dans la feuille. Ebenda. T. 109. p. 911 (1889). —Sur la Carotine, j Bull. Soc. Chim. Paris. Nouv. Serie. T. 48. p. 64 (1887). 2) E. WiUstätter und W. Mieg, Über die gelben Begleiter des Chlorophylls. Ann. d. Chemie. Bd. 355. S. 1 (1907). ^) El)enda. *) M. Tsirett, Physikalisch-chemische Studien über das Chlorophyll. Die Adsorp- tionen. Ber. d. Deutsch, botan. Gesellsch. Bd. 24. S. 316 (1906). — Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls. Ebenda. Bd. 24. S. 384 (1906). — Spektralanalytische Untersuchungen über die Chlorophylhne und deren nächste Säure clerivate (Chlorophyllane). Ebenda. Bd. 25. S. 137 (1907). — Über die Spektrophotometrie der Chlorophylline und die Energetik des Chlorophylls. Ebenda. Bd. 25. S. 388 (1907). — Zur Chemie des Chlorophylls. Über Phylloxanthin, Phyllocyanin und die Chlorophyllane. Biochem. Zeitschr. Bd. 5. S. 6 (1907). Chlorophyll und seine wichtigsten Abhauprodukte. 691 darin ein Gemisch von wenigstens sieben Farbstoffen. Fünf waren gelbe Farbstoffe, die zwei übrigen bildeten zusammen die ..grüne Komi)()nente'. Der eine von diesen (a), und zwar der ([uautitativ überwiegende, besab in konzentrierter ätherischer Lösung eine rein indigoblaue Farbe, während der zweite (ß) chlorophyllgrüne Färl)uiig aufwies. Die Absorptionsspektren der beiden grünen Farbstoffe bestehen zwischen den Frauiihof ersehen Linien 15 und G aus 6 Bändern. Absorptionsspektra der Chlorophyllfarbstoffe a und ,'i in .\tlior nach Tswett. Konzentration : Band I . . . Band II . . . Band III . . . Band \\ . . . Band V . . . Band VI . . . Endalisorption 655—667 426—438 von 415 4X 648—672 600—620 Spuren Spuren von 445 16 X 640-6851 595-630/ 560-.585} 520-538 485-.500 von 470 < 456 Konzentration : Band I . . . Band II . . . Band III . . . Band I\' . Band V . . . Band VI . . . Eudabsorption 4X Spuren 448-462 von 430 < 636—647 von 470 Intensitätsskala bei a : VI, I, II, III, IV, V. „ [i: VI, I. 111. V, 11 = IV I6X 630-650 610-615 585—600 560-570 532—550 von 475 Abbauprodukte des Chlorophylls. Umwandlung durch Alkalien. Es ist lange bekannt, daß Chlorophyll durch Säuren zerx'tzt und lange umstritten, ob es auch von Alkalien augegriffen wird. Darüber, wie das Chlorophyll reagiert, über die Art des Angriffes sauerer und alkalischer Reagenzien hat bis vor kurzem völliyes Dunkel geherrscht. Der Nachweis des Magnesiumgehaltes von Chloroi)hyll führt zur Er- kenntnis, daß die Abbauprodukte des Chlorophylls sich in zwei Klassen einordnen : 1. :\Iagnesiumhaltige Derivate, das sind die Produkte der Einwirkung von Alkalien. 44» 692 E. Willstätter. IL Magnesiumfreie Derivate, das sind die Produkte der Einwirkung von S'.luren. Die Chlorophylle sind Ester. Sie werden von Alkalien in der Kälte unter Abspaltung von Phytol und von Holzgeist verseift zu Alkalisalzen von Verbindungen mit saurem Charakter, sogenannten Chlorophyllinen. Aber schon der Verlauf dieser Pieaktion ist sehr kompliziert. Ehe die chloro- phyllgrünen Alkalisalze entstehen, beobachteten Willstätter und Pfanvensfiel'^) beim amorphen, Willstätter und Benz-) beim kristallisierten Chlorophyll eine sehr merkwürdige Zwischenphase: die Farbe schlägt in Braungelb um und geht dann in einigen Minuten wieder in tiefes Grün zurück. Beim Erhitzen von Chlorophyllin mit konzentriertem methylalkoholi- schem Kali im geschlossenen Gefäß bleibt bis 240'' das Magnesium in seiner komplexen Bindung. Dabei entsteht sukzessive eine Reihe von blauen und roten komplexen Verbindungen, die noch ähnliche Fluoreszenzerscheinungen zeigen wie Chlorophyll selbst. Diese magnesiumhaltigen Verbindungen sollen durch Namen mit der Endung ..Phyllin" gekennzeichnet werden. Über eines von diesen Phyllinen, RhodophyUin, sind bis jetzt genaue Angaben veröffent- hcht worden. ^) Eine noch unveröffentlichte Arbeit von Willstätter und H. Fritzsche hat die Isolierung und Beschreibung der bei 140 — 240" ent- stehenden vier Phylline: Glaukophyllin, RhodophyUin. PyrrophyUin, Phyllophyllin *) zum Gegenstand gehabt. Bei der Einwirkung von Säuren wird aus den Phyllinen das Magne- sium abgespalten. Die Reihe der so entstehenden Verbindungen, welche au Hämatoporphyrin erinnern und zu denen auch das von Hoppe-Seyler^) sowie von Schunck und Marchlewski'^) entdeckte Phylloporphyrin gehörte, ' soU als ..Porphyringruppe" bezeichnet werden. Den angeführten Phyllinen entsprechen: j Glaukoporphyrin, Alloporphyrin ( besser künftig Rhodoporphyrin zu nennen),' Pyrroporphyrin, Phylloporphyrin. j Da für die ganze Klasse der magnesiumhaltigen Ablmuprodukte die ' ChlorophyUinsalze als Ausgangsmaterial sehr wichtig sind , sei ihre Ge- . I ') B. Willstätter uud A. Pfannenstiel, Über RhodophyUin. Aim. d. Chem. Bd. 358. i S. 217 (190S). ' ^ i ■^) B. Willstätter und M. Benz, Über kristallisiertes Chlorophyll. Ann. d. Chem. j Bd. 358. S. 282 (1908). ' \ ^) B. Willstätter und A. Pfannenstiel, Über RhodophyUin. Ann. d. Chem. Bd.358-; S. 205 (1908). " ' j ■*) "Wie der Name Phyllophyllin sagt, ist in diesem Phyllin die Magnesiumvor- 1 bindung aufgefunden ■worden, die zu dem bekannten Phylloporphyrin gehört und das-| selbe durch Eliniinierung des Magnesiums bildet. i 5) F.Hoppe-Se>ßer, Über das Chlorophyll der Pflanzen. II. Zeitschr. f. physiol.Chem.j Bd. 4. S. 193 (1880). ' i ^) E. Schunck und L.Marchleicski, Zur Chemie des Chlorophylls. Zweite Ahhand-| luug. Ann. d. Chem. Bd. 284. S. 81 (1894). — Contributiou to the chemistry of Chloroj phyll. Nr. 6. Roy. Soc. Proc. Vol. 57. p. 3U (1895). i Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. ßgg winnung genau beschrieben. Von den Phyllinen soll das Rhodophyllin als Beispiel für die Methode der Gewinnung und Untersuchung dienen. Chlorophyllinsalze. Chlorophyllinkalium. a) Aus ätherischen Extrakten, i) Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Rhodophyllin (und für die Porphyrine) ist es zweckmäßig, das Kaliumsalz aus ätherischen Blätterauszügen zu fällen. Wenn man das so gewonnene Salz nicht reinigt, etwa durch Anrühren mit Alkohol, dann ist es allerdings viel mehr durch Beimischungen verdünnt als bei der Ab- scheidung aus alkoholischer Lösung. Aber man hat den großen Vorteil, in einer Operation den gesamten Chlorophyllgehalt der Extrakte in einer Form abzuscheiden, die sich für die weitere Bearbeitung mit Alkalien eignet. Die Extraktion des Chlorophylls mit Äther in der Kälte erfolgt übrigens schwie- riger - ) als mit Alkohol ; wenn man nicht mit dem Perkolator arbeitet, empfiehlt es sich, das Brennesselmehl mehrere Tage lang unter häufigem Durchschütteln der Flaschen mit Äther zu bearbeiten und nur einfache Extrakte herzustellen. Die Brennesseln wurden in Portionen von 4 kg mit Äther extrahiert und die Chlorophyllösungen mit geglühtem Natriumsulfat getrocknet. Beim Schütteln der ätherischen Lösung mit der zur Verseifung erforderlichen Menge konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge (28 — 30 cm^ 28V()ig'er Lauge) schlägt die Farbe zuerst in (lelbbraun um und geht dann in einigen Minuten wieder in tiefes Grün zurück. Das Produkt der Verseif ung bleibt im Äther gelöst. Durch vermehrten Zusatz der Lauge wird es in flockiger Form abgeschieden, es ist äußerst hygroskopisch und schwierig zu fil- trieren. Deshalb stelle ich nach Beendigung der Verseifuug durch Zusatz von 80 (V/^^ der Lauge in einem Gusse und unter kräftigem Schütteln eine Ausscheidung her, die sirupös ist und an der Glaswand festhaftet. Wenn hin und wieder unter diesen Bedingungen das Salz dennoch eine feinflockige Suspension bleibt, so bedarf es noch eines weiteren Zusatzes von 10 — 20, selten von 40 cm^ Kalilauge. Die ätherische Mutterlauge be- hält fast rein gelbe Farbe; sie wird dekantiert. Das dickflüssige Kaliumsalz wird mit der zur Erhitzung im Auto- klaven nötigen Menge methylalkoholischer Kalilauge (ca. 150 — 180 on^) aus der Flasche herausgelöst und durch Einblasen von Luft unter Erwär- men auf dem Wasserbad von anhaftendem Äther befreit. *) R.WiUstätter und A. Pfannenstiel, loc. cit. S. 215. -) Sie ist weniger vollständig wie die folgenden Versuche zeigen: 1. Aus 4 A-// Brennesselpulver, die schon mit 5 l Äther 24 Stunden extrahiert waren, wurde noch ein Auszug mit Alkohol gewonnen und auf Phäophytin verarbeitet. Nach der Reinigung durch Fällen aus Chloroformlösung mit Alkohol betrug die Ausbeute 40,9 Phäopliytin. 2. 4Ä-,^ Brennesseln wurden nach 96stündigem Ausziehen mit Äther noch weiter auf Phäophytin verarbeitet. Ausbeute nach der Umfällung 11 y. 694 R. Willstätter. h) Aus alkoholischen Extrakten.^) Bei der Verseifung von alko- holischen Piohchlorophyllösungen fällt nur ein Teil des ChlorophyUinkaliiims aus; wie in dem Kapitel „Quantitative Chlorophyllbestimmung" gezeigt worden ist, betrug der ausgeschiedene Anteil fast 400/0 vom ChlorophyU- gehalt des Extraktes. Für die Ausbeute an Kaliumsalz ist es wichtig, daß die Extrakte nicht sehr feucht sind; andrerseits dürfen sie auch nicht absolut wasser- frei sein. Beim Verarbeiten von nur wenigen Kilogrammen Blätter habe ich erhalten : Pro 1 'kg Brennesseln: 3-75 ei der DarsteUung von Phylloporphyrin nach den Literaturangaben fand ich es unmöglich, in gläsernen Röhren reine (aschefreie) Substanzen zu gewinnen. Bei Versuchen in kleinem Maßstab verwende ich einen engen hohen Silbertiegel, der in einem vertikal stehenden Einschlußrohr erhitzt wird; zu präparativen Arbeiten findet ein silberner Becher von 325 c/«^ Inhalt Verwendung, der in einem Pfungst^oh^n Autoklaven erhitzt wird. Die gewöhnliche Charge für Rhodophyllin bestand in 25 g Chloro- phyllinkalium oder im Chlorophyllinsalz aus dem Ätherextrakt von 4 hg Pflanzenmehl, aufgelöst in 150 — 180 cm'^ konzentrierter methylalkohohscher Kalilauge. Die Füllung reichte bis 5 cm unterhalb des Randes. Es gelang aber auch mit der nämlichen Menge Lauge in einer Füllung bis zum doppelten Quantum Chlorophyllinsalz zu verarbeiten. Der Autoklav wurde in das schon angeheizte Ölbad eingesenkt und 2 Stunden lang auf 140" erhitzt; dann ließ man während 2 Stunden die Temperatur allmählich auf IGO" ansteigen und hielt schließlich noch 31/2 Stun- den das Ölbad zwischen 190» und 200": das Manometer zeigte ungefähr ') Nach R. Willstätter und A.Pfanncnstiel, Über Rliodophylliu. Ana. d. Chem. Bd. 358. S. 205 (1908). Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. ßyj 20 Atmosphären au. Abweichungen von dieser ausprobierton Art des Kr- hitzens waren unvorteilhaft. Das Rhodopliyllin ist säureempfindlich. Sucht man es durch Neutra- lisation der ganzen Alkalimenge und Ausäthern zu isolieren, so sind die Ausbeuten schlecht. Das Verfahren der Isolierung zielt dabei- liin auf die Abtrennung des Rhodophyllinkaliums von der Hauptnienge des Atzkalis. Zugleich erreicht man die Scheidung des Rhodophyllins von zwei anderen roten Magnesiumverbindungen, Phyllophyllin und Pyrrophyllin. Der Inhalt des Silbertiegels wiid mit dem doppelten \oluim'ii Wasser in einen Scheidetrichter gespült. Die Kaliumsalze der Magnesiumverbin- dungen werden durch das Ätzkali ausgesalzen. Wenn man die Flüssigkeit nun mit V2 ^ Äther durchschüttelt, so sammeln sich in etwa 7, Stunde die Salze als Schicht von Flocken zwischen dem Äther und dci- nur schwach rotgefärbten wässerig-alkalischen Mutterlauge an. Mitunter ist es erforder- lich, durch Zusatz von Kochsalzlösung die wässerige Schicht zu kläi'en. Diese wird abgelassen, dann lälit man die Kaliumsalze, die mit etwas ^yasser und Äther emulsioniert sind, in einen Kolben abfließen und sam- melt noch im Scheidetrichter mit ein wenig Wasser den letzten Anteil der Salze, um ihn zur Hauptmenge zu fügen. Das Volumen der Salzemulsion beträgt ungefähr V4 ^- ^^an vermischt sie mit \/^ / Alkohol und verjagt den Äther auf dem Wasserbade. Dabei scheidet sich das Kalium salz des Ehodophyllins als bräunlichrotes Pulver verunreinigt mit fai-blosen Substanzen ab, während die Salze der daneben gebildeten Magnesiumvcrbindungcn mit dunkelroter Farbe vollständig in Lösung gehen. Das unlösliciie Salz wird auf der Nutsche abgesaugt und mit Alkohol nachgewaschen. Das Filtrat enthält nur dann Rhodophyllin, wenn beim Sammeln der Kaliumsabce zu- viel Wasser angewandt worden ist. Um das Rhodophyllin frei zu machen, wird das Salz in feine Ver- teilung gebracht, indem man es mit Wasser in der Reibschale zu einem gleichmäßigen Brei verrührt, wobei schon viel mit gelbstichig roter Fai-be in Lösung geht. Der feine Brei wird mit Wasser in den Scheidetrichter gespült und mit V* '' Alkohol verdünnt , nicht um die Lösung zu vervoll- ständigen, sondern zu dem Zweck, die Ausscheidung des Rhodophyllins in Flocken zu verhüten und seine Auflösung in Äther zu erleichteiMi. Man säuert bei Gegenwart von o 1 Äther unter Schütteln mit einigen Kuliik- zentimetern konzentrierter Lösung von ^lononatriumphosphat an: die äthe- rische Lösung wird mit Wasser gewaschen und dabei von den darin sus- pendierten wenig gefärbten Flocken befreit. Die phosphorsaure Mutterlauge lohnt die Verarbeitung auf Porphyrine. Zur Reinigung wird das Rhodophyllin durch Ausschütteln mit sehr verdünntem, nämlich mit ca. O'Oo'Voigcm Ammoniak dem .\thei- entzogen und dann abermals in ätherische Lösung übergeführt durch erneutes \\\- säuern mit Phosphat bei Gegenwart von etwas Alkohol und viel .\ther. Aus der Ätherlösung wäscht man den Alkohol gründlich heraus: nach dem Trocknen mit Natriurasulfat wird sie im Wasserbade auf etwa lOitc///» 698 R. Willstätter. bis höchsteus 50 cm^ eingeengt. Schon während des Abdampfens scheidet sich der größte Teil des lihodophyllins aus in schönen, gUtzernden Kri- stallen von blauer Oberflächenfarbe. Die Kristallisation vervollständigt sich bei kurzem Stehen. Die Substanz wird auf dem Filter mit Äther nachge- waschen. Die Mutterlauge liefert bei starkem Konzentrieren nur noch eine - kleine Menge brauchbarer Kristallisation. Nach diesem Verfahren habe ich Rhodophyllin aus Grünalgen, Laul)- ■ moos, Farnkraut, Schachtelhalm, Gras und mehreren Dicotyledouen darge- i stellt, hauptsächlich (und zwar über 200 g) aus Brennesseln. ■ Die Mengen der neben Rhodophyllin entstehenden roten Magnesium- Verbindungen sind sehr beträchtlich : bei den Brennesseln machte Rhodo- phyllin etwa Va^ bei Gras V41 ^^i Farnkraut Ve der ganzen Ausbeute an roten Chlorophyllderivaten aus. 48 Ä-r/ Brennesseln (1907) gaben in 12 Chargen IT'Oö^ reines Rhodo- phyUin. Bei einer unveröffentlichten Versuchsreihe, ausgeführt gemeinsam mit Herrn M. ützinger, wurde die ^Mutterlauge des Rhodophyllins, wie oben erwähnt, auf Porphyrine verarbeitet, dabei lieferten : Allopor- Phvllo- P^^""^ Rhodo- ' . und pbyllin ? ■ Glauko- ^ *' porphy- rin 100// Chlorophyllinkalium (^S-SVo) ->^ ö'O ry + ?yQ cj + 2-Qxj plus 250// Chlorophyllincalciumf 18-2 Vo)->- 3-1 (/ -f ^-b (j 4- 2'?)^ (und eine Mutterlauuenportion ) ~ r TT", , 7^- — L - —y 9-1,7 -f b-\(j + 4v)^. Brennesseln Diese Ausbeuten sind oft erheblich übertroffen worden: Die besten; Ausbeuten betrugen ol // Rhodophyllin aus 25 r/ (40 bis 45%) Chlorophyllin' kalium und bei Verarbeitung von ätherischem Blätterextrakt 0'46^ bii' 0'50 g Rhodophyllin aus 1 kg Blätter. Eigenschaften. Rhodophyllin kristallisiert in Prismen von gips: ähnlichem Habitus, wahrscheinlich monoklin, oft bildet es spindelähnlich' Formen. Die Kristalle zeigen in der Aufsicht tiefstahlblaue bis rötlichblaiii Farbe, in der Durchsicht je nach ihrer Dicke olivgrüne bis rötlichbraun'! und rubinrote Farbe. Die Lösuniren sind blaustichig rot, kirschsaftähnlicl gefärbt und besitzen intensive blutrote Fluoreszenz. i Rhodophyllin ist leicht löslich in absolutem Alkohol (1 g heiß in 250 m^ schwerer in Äther {lg erfordert zum x4uflösen IV2 ^ feuchten Äther). E besitzt sauren Charakter; 0'01%i8'e Natronlauge und auch sehr verdünnte Ammoniak entziehen die Substanz auf einmal vollständig ihrer alkalische^ Lösung. I Charakteristisch ist das Verhalten von Rhodophyllin gegen Eisessifl Darin lösen sich die Kristalle zunächst mit schön dunkelroter Farbe au Chlorophyll imd seiue wichtigsten Ahbauprodukte. 699 Nach einigen Augenblicken, bei größter Verdünnung nach ein paar Minuten, trübt sich die Flüssigkeit unter quantitativer Abscheidung des magnesium- freien AUoporphyrins in Form eines prächtig flimmernden, kristallisierten Niederschlages von rötlichvioletter bis grauvioletter Farbe. Das Absorptionsspektrum des Phvllins erinnert sehr an Hämin, es besteht aus zwei scharf begrenzten starken Bändern im Orange bis Gelb und im Grün, denen noch ein sehr viel schwächeres Band im Grün folgt (Fig. 52). L)er Hauptunterschied vom Hämin besteht darin, daß das Band ÜC 100 mm 200 nun Fig. 52. des Hämins im Orange nach rechts gerückt ist und fast das ganze Gelb umfaßt. Die Lösung von 0-1 ^r Ehodophyllin in bl Alkohol zeigt in 100 wm Schicht Band I bei a 610—581, Band H 568—532, Band HI 520.512, Endabsorption von 488 an. Die Figur zeigt in a) das Spektrum dieser alkohoüschen Losung, in b) das Spektrum auf Zusatz von Ätzkali. Zusammensetzung. Die Analyse umkristallisierter Präparate ergab die Mittelwerte: C 68-64 H 602 N 10-18 Mg 4-28, welche ungefähr der Formel C38H34 0iN4Mg entsprechen. 700 R. Willstätter. Umwandlung durch Säuren. Die Einwirkimg von Säuren auf Chlorophyll und auf die Phylline be- steht darin, daß das komplex gebundene Magnesium quantitativ abgespalten wird; es wird dabei einfach durch Wasserstoff ersetzt. Die entstehenden Produkte sind frei von Mineralbestandteilen. Wird die Reaktion mit Säure vorsichtig ausgeführt, so bleiben die Estergruppen im Chlorophyll intakt, was z. B. aus der Methoxylzahl des Phäophorbins hervorgeht. Als Ausgangsmaterial für viele magnesiumfreie Derivate des Chloro- phylls eignet sich am besten das Spaltungsprodukt, das ich durch Ein- wirkung von Oxalsäure auf Kohchlorophyllösungen erhalten habe. Da es in Alkohol sehr schwer löslich ist, gelingt es, in dieser Form fast den gesamten Chlorophyllgehalt des Extraktes in reiner Form abzuscheiden. Die Zersetzlichkeit des Chlorophylls durch Säure ist seit vielen Jahr- zehnten bekannt. Aber es war l)is in die jüngste Zeit nicht gelungen, ein reines Spaltungsprodukt he\ der Einwirkung von Säure zu isoheren und dadurch zu dem in der Natur so außerordentlich verbreiteten Chlorophyll- alkohol zu gelangen, der etwa BO^/o des amorphen Chlorophylls ausmacht. Die Einwirkung von Säure auf die Blätterextrakte ist zumeist so gehandhabt worden, daß die Chlorophyllsubstanz dabei verdorben wurde , z. B. bei der DarsteUung von Phylloxanthin mit gasförmigem Chlorwasserstoff. Die von verschiedenen Autoren durch saure Hydrolyse erhaltenen Spaltungsprodukte des Chlorophylls müssen, da ihre Eigenschaften und ihre Zusammensetzung wesentlich differieren, mit verschiedenen Namen gekennzeichnet werden. Das aus amorphem Chlorophyll bei vorsichtiger Behandlung mit Oxalsäure in der Kälte gebildete Spaltungsprodukt habe ich Phäophytin, das in der Zusammensetzung wesentlich davon abweichende Derivat des kristallisierten Chlorophylls Phaeophorbin genannt. Die folgende Tabelle dient für den Vergleich des Phäophytins mit dem Phylloxanthin E. Schuncks^) und mit dem Chlorophyllan von Koppe- Seyler^-), welches durch freiwillige Zersetzung des Chlorophylls in Gras- dekokten erhalten worden ist. Phäoijbytiu Phylloxanthin Chlorophyllan Darstellung Einwirkung von wenig Oxalsäure in der Kälte auf den kalt hergestellten alkoholischen Blätter- extrakt Eindunsten Einleiten von Chlorwasser- i eines bei Siede- stoff in den heiß ge- ' hitze dargestell- wonuenen weingeistigen , ten alkohoh- Bli'itterextrakt scheu Extraktes von Gras M E. Schuiick, Contributions to the chemistry of Chlorophyll. Nr. I\. Roy. Socj Proc. Vol. 50. p. 302 (1891). — E. Schunck und L. Marchleicski, Zur Chemie des Chloroi phylls. Ann. d. Chem. Bd. 278. S. 329 (1894). ! -) F. Hojjpe-Seißer, Über das Chlorophyll der Pflanzen. T. Abh. Zeitschr. f. physiol| Chem. Bd. 3. S. 339 (1879). j Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 7U1 Phäophytin rhylloxanthin ChlorojphyUau Reinigung Lösen in Chloroform. Ab- filtrieren der mineralischen Beimischungen, Fällen mit Alkohol Ausschütteln der ätheri- schen Lösung mit kon- zentrierter Salzsäure zur Abtrennung von Phyllo- cyanin. Dann Fällung mit Alkohol aus Chloroform- lösung, wiederholtes Her- auskommenlasseu aus siedendem Eisessig sowie aus Äther Umkristallisieren aus Alkohol und Äther Asche Gibt keine Asche Gibt Asche, die stets einen integrierenden Gehalt an Eisen aufweist Gibt Asche. Sie enthält l-38"/„P und 0-34''/oMg Zusammen- setzung Frei von Fett. Analyse der Präparate aus Gras: C75-6 H 8-4 X 6-4 0 9-6 Fettsubstanz enthaltend. Analysen nicht bekannt. Als isomer angesehen *) mit Phyllocyaniii. dessen Zusammensetzung nach Tsckirch-) ist: C69-8-69-9 H 6-5- 6-9 X 7-4— 7-7 015-5— 16-3 C 73 3 H 9-7 X 5-7 Kristallisier- barkeit Amorph, manchmal mit Übergängen zu kristallini- scher Struktur Amorph Gut und voll- ständig kristalli- sierend Löslichkeit in Petroläther Äußerst schwer löslich — leicht löslich Reaktion in Eisessig mit Zinkacetat Gibt sehr leicht eine intensiv blaugrüne, stark rot fluoreszierende kom- plexe Verbindung Reagiert nicht ^) — Reaktion in Eisessig mit Salpetersäure Tiefblaue Farbe, die über Rotbraun allmählich in j Gelbbraun übergeht Tiefgelbe Färbung — n E. Sc Proc. Vol. 50. ] Vol. 6. p. 236 ( ■') A. Ts forscher und 1- und einige dam botan. Ges. Bd. ä) E. Si Proc. Vol. 50. Vol. 6. p. 237 Ann. d. Chem. hi(nck, Contributions to the cbemistry of Chlorophyll. Nr. IV. Roy. Soc. x307 (1891). — The cbemistry of Chlorophyll. II. Annais of Botany. 1892). cMrch, Über die Phyllocyaninsäure. Verhandl. d. (iesellsch. Deutsch. Natiir- irzte. Wiener Versammlung 1894. II. S. 380. — Der Qnarzspektroirrapli it vorgenommene Untersuchungen von Pflauzenfarbstoffen. Ber. d. Doutsdi. 14. S.87 (1896). ^hi(nck\ Contributions to the cbemistry of Chlorophyll. Xr. IV. Roy. Soc. p. 810(1891). — The cbemistry of Chlorophyll. II. Annais of Botany. 1892). E. ScJmnck und L. MarchUicski, Zur Chemie des Chlorophylls. 3d. 278. S. 335 (1894). Entgegen diesen Angaben publiziert neuerdings 702 R- Willstätter. Phäophytin. Darstellung nach B. Willstätter und F. HochederA) Die P'arbe der alkoholischen Chlorophyllösung- schlägt bei der Ein-* Wirkung von Säuren schnell um in Dunkelbraun und zugleich verschwindet; die starke Fluoreszenz. Die Reaktion wird durch Zufügen einer in derj Kälte frisch bereiteten konzentrierten Lösung kristalhvasserhaltiger Oxal-; säure in 9(3"/oigera Alkohol bewirkt. In der Regel sind 2h bis hg Oxal-, säure für den Liter Doppelextrakt erforderUch. Zunächst versetzt man die: Chlorophyllösung auf einmal mit 2'5^ Oxalsäure pro Kilogramm Pflanzen-i material und fügt, wenn daraufhin in einer Viertel- bis halben Stunde kein gänzlicher Wechsel der Farbe eingetreten ist, weiter in kleinen Por- tiouen mit Pausen die noch zur A'ervollständis'uno- des FarbenumschlaRs erforderliche Säuremenge hinzu. Schon während des Zufügens der Oxalsäure beginnt das Ausfallen; eines flockigen Niederschlages , der hauptsächlich aus Phäophytin und! Oxalsäuren Salzen, namentlich von Magnesium und Calcium, ferner voe^ Kalium und Aluminium besteht. Bei eintägigem Stehen wurde die Ab-i Scheidung vollständig und der Niederschlag setzte sich so dicht zu Bodenf dal.i sich die Hauptmenge der Flüssigkeit dekantieren Heß. Die Mutterlaug(| enthielt nur noch wenig von schwer löslichem Phäophytin. aber doch keiu(| ganz geringe Menge von Chlorophyllderivaten. Eine L'^olieruug der letzterer! in reinem Zustand ist noch nicht erreicht worden. Im übrigen enthält di« Phäophytinlauge sehr viel von den gelben Begleitern des Chlorophyllsf aber man bekommt sie daraus nicht in kristallisiertem Zustand. \ Das ausgeschiedene (jemisch von Phäophytin und Oxalaten wirf an der Nutsche abgesaugt, mit Alkohol mehrmals nachgewaschen und in Vakimmexsikkator getrocknet. Zur Beseitigung der Salze und ersten Pieiiii gung diente immer eine Umfällung aus Chloroformlösuiig durch Alkoholi die Metallverbindungen hinterldieben beim Auflösen und die Mutterlaugj hielt organische Verunreinigungen zurück. Nur bei Gewinnung von Phäoj phytin in sehr großem Maßstab war es lohnend, noch eine Laugenportioi aus der Chloroform-Alkoholmischung zu isolieren. | Die Filtration der Chloroformlösung ist schwierig- und erfordert zieni lieh große Verdünnung: zunächst wurde mit großen Nutschen an dö Pumpe gearbeitet, danach war, da etwas von dem feinen Niederschlag mij gerissen worden, noch drei- bis viermaliges Filtrieren durch glatte Filtq I L. MarcMeirski (L. Hildt, L. Marchlewski uud J. BoheJ, Über die Umwandlung d\ Chlorophylls unter dem Einflüsse von Säuren. Extrait du Bulletin de TAcad, des Scieiic^ de Cracovie. p. 295. April 1908), daß auch Phylloxanthin mit Zinkacetat eine komples Verliindung gebe. Aber die angeführte alte Angabe hat E. Srhioick so naclulriicklid zu wiederholten Malen als Merkmal des Phylloxanthins bezeichnet, daß man eben e| Präparat, das mit Zinkacetat reagiert, nicht als Phylloxanthin ansehen darf. ^) i?. Willstätter und F. Hocheder, tjber die Einwirkung von Säuren und Alkali» auf Chlorophyll. Ann. d. Chem. Bd. 354. S. 205 (1907). ^ , Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 7Q)3 notwendig, um das Phäophytin aschefrei zu erhalten. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck i)ei gewöhnlicher Temporatur stark eingeengt und die dicke, fast schwarze Lösung mit dem fünf- bis zeiinfachen \'olumeu Alkohol (von DÖVo) gefäUt. Phäophytin ist nicht in deutlich kristallisierter Form erhalten worden. Für die präparativen Zwecke ist das Rohprodukt genügend rein : zum Nach- weis seiner Homogenität kann man es durch Auflösen in siedendem Alko- hol, Filtrieren und Herauskommenlassen nach Ai't des T^mkristallisierens. durch sogenanntes ..Umscheiden" M, weiter reinigen oder fraktionieivn. Die Ausbeute an Phäophytin betrug bei Verarbeitung vieler ver- schiedener Pflanzen gewöhnlich ca. 3 g aus 1 kg des trockenen Krautes. 100% Brennesseln lieferten 424^ Phäophytin (ohne Verwendung der Mutterlaugen). Da 1 A:^/ käufliche getrocknete Brennesseln ca. 6^ amorphes Chlorophyll enthalten, entsprach diese Ausbeute 72'5Vo der Theorie. Eigenschaften: Phäophytin ist ein Wachs, zäh, schwierig zu pulvern. Es ist blauschwarz gefärbt, in Lösungen olivbraun und bei großer Schicht- dicke in der Durchsicht rot. Es ist in heißem Alkohol zieudich schwer, in kaltem sehr schwer löslich, in Äther träge, aber beträchtlich, in Eisessig ziemhch leicht, in Chloroform spielend, in Benzol sehr leicht löshch, in Petroläther fast unlöslich. Phäophytin ])esitzt wieder basische noch saure Eigenschaften. Es verbindet sich leicht mit Metallsalzen zu intensiv gefärbten, sehr beständigen Komplexverbindungen. Mit Ferrisalz entsteht sofort in dei' Kälte eine schön grünsticliig blaue Lösung, die sehr schwach fluoresziert. Zinkacetat gibt eine schön blaugrüne, in der Durchsicht rote Flüssigkeit, die sich durch starke Fluoreszenz auszeichnet. Kupferacetat verwandelt das Braun des Phäophytins auch in großer Verdünnung in intensives Grün: die Lösung fluoresziert nicht. Konzentrierte Salpetersäure zerstört Phäophytin beim Kochen, auf der hellen Flüssigkeit schwimmt dann als farblose Ölschicht ein stickstoff- haltiges Derivat des Phytols. Charakteristisch ist auch die Reaktion der ätherischen Phäophytin- lösung mit konzentrierter Salpetersäure: beim Schütteln färbt sich der Äther blau, während die Säure nichts Gefärbtes aufnimmt: beim Waschen mit Wasser nimmt die ätherische Lösung wieder die m'sprüngliche ( )livfarbe an. Absorptionsspektrum in ätherischer Lösung (0*1^ in ö/i: in mittlerer Schicht treten in der sicht])aren Region fünf breite Streifen auf. Reihenfolge der Intensität: I, IV, II, V, HI. I X 688—640, 11622—097. HI 569— 556 (mit Schatten bis 551), IV 542—525, V 515—488, Endabsorption von 479 an. Zusammensetzung. Phäophytin aus Gras, durch Umsclieidi-u ge- reinigt, enthielt 75-1 Vo C, 8-4 H, 6-7 N. ») B. Willstätter und F. Hocheder, Über die Einwirkung von Säuren miil Alkalien auf Chlorophyll. Ann. d. Chemie. Bd. 354. S. 221 (1907). 704 R. Willstätter. Phäophorbin. Das magnesiurafreie Derivat des kristallisierten Chlorophylls wird (nach R. Willstätter und M. Benz^) ähnlich wie Phäophytin gewonnen. Wenn man 5"/oige wässerige Oxalsäure zur Lösung des Chlorophylls in OßVnig^i^i Alkohol zufügt, so ist die für den Magnesiumgehalt des Chloro- phylls berechnete Menge der Säure ausreichend, während die Reaktion bei' Ausschluii von AYasser einen beträchtlichen Überschuß an Säure erfordert. Beim Versetzen von '^g Chlorophyll in 800 cm^ Sprit mit 28'75 cm^ der Oxalsäurelösung erfolgt sofort die Abscheidung der Hauptmenge in dunkel- braunen Flocken. Diese sind aber nicht etwa fertiges Phäophorbin, sondern ein eigentümliches Zwischenprodukt, das noch mit grüner Farbe in Alkohol löslich ist. In einigen Stunden verwandelt es sich in Phäophorbin, das sich in Alkohol wenig löst und dessen Lösungen olivbraun gefärbt sind. Beim Aufnehmen mit Chloroform hinterbleibt reines Oxalat (Mg Cj O4 2H.2O); durch Alkohol wird Phäophorbin gefällt. Zum Unterschied vom Phäophytin ist Phäophorbin gut kristallisier bar. Während das erstere neben Phytol nur ein Molekül Methylalkoho enthält, spaltet Phäophorbin bei der Hydrolyse zwei Moleküle Holzgeist ab Phytol. ') Nach R. Willstätter und F. Hocheder wird Phäophytin wie irgenij ein anderes Wachs von alkohoüschen Alkalien leicht verseift. Während di, Zusammensetzung des sauren Komplexes, nämlich der empfindhchen stick; stoffhaltigen Spaltungsprodukte, ungemein abhängig ist von den Bedinguuge:' der Verseifung, beeinflussen diese gar nicht die Zusammensetzung des al:,. gespaltenen Alkohols und nur wenig die Ausbeute an demselben. Da in der Kälte leicht Klümpchen von Phäophytin unangegriffej bleiben, ist es vorzuziehen, die Verseifung in der Wärme auszuführen unj das Phäophytin dafür so fein wie möglich zu pulvern, was allerdings bi.' der zähen Beschaffenheit des Materials Geduld erfordert. 200^^7 Phäophytin werden mit l'Ö l methylalkoholischer Kahlaug (200r/ im Liter enthaltend) im Wasserbad zwei Stunden lang gekoch Nach dem p]rkalten fügt man zu der dunkelgrünen Lauge, die eine starl, Ausscheidung von rotbraunem Kalisalz enthält, mehr als das gleiche Volumq Äther hinzu und soviel Wasser, daß sich gerade die ätherische Schieß klar abtrennt. Sie wird abgehoben und die Lauge noch mehrmals mit vi Äther ausgeschüttelt; man vereinigt die Ätherextrakte. Dieselben sind brai gefärbt durch eine Beimischung von stickstoffhaltigen Substanzen, die si am besten durch aufeinanderfolgende Bearbeitung mit Alkali, Salzsäu ^) R. WiUstätter und M. Benz, Über kristallisiertes Chlorophyll. Ann. d. Chem| Bd. 358. S. 267 (1908). ' i -) R. Willstätter und F. Hocheder, Über die Einwirkung von Säuren und Alkah' auf Chlorophyll. Ann. d. Chemie. Bd. 354. S. 240 (1907). Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 705 und Tierkohle beseitif^en lassen. Zunächst schüttelt man die ätherische Lösung- mit sehr verdünnter Lauge durch und eine Keihe von Malen an- haltend mit wenig konzentrierter Salzsäure, die sich blaugrüu anfärbt. Dann wird der Äther oft mit viel Wasser gewaschen und auf etwa Lö/ eingeengt. Schließlich werden die letzten färbenden Verunreinigungen durch stunden- langes Schütteln mit guter, reiner Tierkohle an der Maschine entfernt. jDie ätherische Lösung trocknet man mit. Xatriumsulfat, dann wird .sie konzentriert und im Vakuum ganz eingedampft. Um die letzten S|)uren iVom Lösungsmittel zu verjagen, erwärmt man den Eindampfrückstand mit eingetauchter Kapillare 3/4 Stunden lang im Vakuum auf l)()o. Die Tierkohle hält etwas Phytol zurück; bei den gröliei'en \'ersucheii und bei genauen Ausbeutebestimmungen') ist sie besonders mit Äther zu extrahieren, sie gibt aber nur einen Teil des absorbierten Phytols (nämlich Ol — 0"5o/o vom Phäophytin) wieder ab. Die Lsolierung des Phytols ist beinahe (juantitativ; die Ausbeute be- trägt ungefähr l-iO^/o vom Phäophytin. Eigenschaften. Phytol ist ein aliphatischer, ungesättigter, primärer Alkohol von der Formel C20H40O. Seine Kohlenstoffkette enthält Ver- zweigungen; nach einer Untersuchung von B. WülstäUer und E. W. Mayer ^) hegt die Doppell)indung sehr wahrscheinlich zwischen dem fünften und sechsten Kohlenstoff atom (vom hydroxyltragenden an gerechnet). Phytol ist ein farbloses, ziemlich dickes Öl, das sich mit allen üblichen organischen Solventien mischt. Es siedet nur in hohem Vakuum unzersetzt, Siedepunkt unter 0-03— 0-04 ww^ Druck Uö". Dyi= 0-864. 4 Das Xatriurasalz des Phytols ist leicht löslich in Äther. Die Phtalester- säure ^) bildet ein sehr charakteristisches Silbersalz : Prismen vom Schmelz- punkt 119", die sich in Äther und Benzol leicht lösen. Das Phenylurethan schmilzt bei 26 — 28"8''. Phytol addiert ein Molekül Brom. Es ist autoxydierbar. Quantitative Phytoibestimmung. Vom kristallisierten Chlorophyll unterscheidet sich das amorphe durch seinen Gehalt an l'hytol. Meine Methode der T'ntersuchung von Pflanzen auf ihren Gehalt an kristallisiertem und an amorphem Chlorophyll l)est('lit in der ^) Um bei den quantitativen Phytolbestimmungen die Verluste an Phytol bei der Reinigung- durch Tierkohle möglichst gleichmütig zu machen, werden immer gleiche Mengen von Tierkohle und gleiche Konzentration der Phytollösuugen angewendet. Für die Absorption des l'hytols durch Tierkohle ist folgender Versuch von Interesse: 5'7f/ Phytol wurden in Oo l Äther mit 11 // getrockneter Tierkohle 5 Stunden geschüttelt: die Tierkohle hatte 1'38 .(7 Phytol aufgenommen. Bei sechsstündigem Kochen mit 05 / Äther gab sie nur 0-54 g Phytol wieder ab. -j Unveröffentlicht. ^) In der ersten Arbeit über Phytol war die Isolierung der Piitalestersiinre an den irreführenden Löslichkeitsverhältnissen ihrer Salze gescheitert; in der Untersuchung mit Herrn E. Mayer ist die Darstellung der Verbindung gelungen. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbnitsinethoden. II. 45 706 R- Willstätter. Abscheidiing des Phäophytins aus der Rohchlorophyllösun^' und quantitativen Verseifung desselben (Bestimmung der ..Phytol- zahl"). Diejenigen Pflanzen, welche das amorphe Chlorophyll enthalten, liefern ungefähr 30% (28 — 33Vo) des Phäophytins an Phytol ; diejenigen Pflanzen, welche über\Yiegend das kristallisierte Chlorophyll enthalten, Uefern wenia oder fast kein Phytol. Eine Probe von Galeopsis tetrahit ergab die Phytolzahl: PS. Wenn die Phytolzahl normal gefunden wird (ca. 30), so ist das aus- schließliche Vorkommen von amorphem ChlorophyU (Phytolesterchlorophyll) in der untersuchten Pflanze unzweifelhaft. Anders wenn die Phytolzahl zu niedrig gefunden wird. z. B. zwischen 15 und 257o- Dann ist das Resultat stets unsicher. In solchen Fällen ist es angezeigt, die Prüfung der betreffenden Pflanze mit verschiedenen Ernten und namentlich mit ungetrocknetem oder mit sorgfältigst getrocknetem Material zu wiederholen, um festzustellen, ob wirklich die niedrige Zahl eine Konstante für die untersuchte Pflanze ist. Eine Probe von Tussilago Farfara gab Phäophytin mit nur 17'l»/„ i Phyto), ich wiederholte mit einer anderen Ernte die Untersuchung und fand i 27"77o Phytol. Solche Beobachtungen beweisen, daß mitunter beim Aufbe- • wahren und Trocknen der grünen Blätter Veränderungen im Chlorophyll eintreten, bei welchen Phytol abgespalten oder oxydiert wird. Wahrschein- , lieh ist der Phytolverlust eine Folge von Enzymwirkungen oder auch von | Gärungs- und Fäulnisprozessen in den Blättern. | i Um die Verbreitung der verschiedenen Chlorophylle kennen zu lernen, habe ich eine Untersuchung gemeinsam mit den Herren F. Hocheder und i E. Hng begonnen, i) Bei dem Vergleich der Phäophytine aus Ernten ver- 1 schiedener Jahre und Jahreszeiten traten bei Gras, Brennesseln, Platane t keine erheblichen Unterschiede auf. Auch Kulturbedingungen und Staudort ' waren ohne Einfluß. , Platane Zürich August 1906 Phvtolzahl 30-2 }■) Juni 1907 30-6 Oktober 1907 31-2 Halle a. S. Sommer 1907 „ 30-6 Zürich September 1908 „ 31-0 ,?j Anfang Juni 1908 31-6 77 Ende September 1908 31-3 Gras Nach dieser Methode der Phytolbestimmung wurde das kristallisierende Chlorophyll bis jetzt nur bei einigen Tubifloren nachgewiesen, im ül)rigen ^) Unveröffentlicht. Chlorophyll uud seine wichtigsten Abbauprodukte. 707 aber bei Pflanzen aus den verschiedensten Klassen und Ordiiuntion der- selbe Alkohol Phytol in meistens derselben Menge angetroffen, so zum Beispiel in: Illva lactuca (Chlorophyceae) .... 29-6 Vo vom Phäophytin Hyloconium (Musci ) 29*4 ,. „ Adiantuni capillus Veneris (Filicales) . 30*6 „ „ Equisetum arvense (E(iuisetak's) . . . 30"2 „ „ Lycopodium clavatum (Lycopodiales) . 33'6 Taxus baccata (Coniferae) 30"5 ,, „ 7? V ,'J Quercus (Fagaceae) 30*5 „ „ Corylus avellana (Betulaceae) .... 30*5 ,, „ „ Nasturtium officinale (Cruciferae) . . 30*2 „ „ „ Rubus idaeus (Piosaceae) 32'0 „ ,, ,, Cassia angustifolia (Leguminosae) . . 28"8 ,. „ Althaea officinahs (Malvaceae) . . . 29*4: .. ,,. ,, Viola odorata (Violaceae) 30*2 „ ,, „ Apium graveolens (Umbelliferae ) . . . 29'0 .. .. „ Mentha piperita (Labiatae) 30*8 ,, „ „ Pulmonaria officinalis (Borraginaceae) . 3r6 ,. „ „ Digitalis purpurea (Scrophulariaceae) . 28'3 ,, ., ., Tanacetum vulgare (Compositae) . . . 301 „ ,. „ Für die quantitative Verseifung des Phäophytins diente im wesent- lichen dasselbe ^'erfahren wie bei der Phytolgewinuung, und zwar in zwei Ausführungs weisen : a) für die Verseifung von kleinen Mengen (0'3 bis ca. Icf) Phäophytin zur ungefähren Ermittlung des Phy t olgehalte s (Fehler: Pliytol- verlust von 0'2 — l'Vo vom Phäophytin je nach der Sorgialt bei der Aus- führung) und h) ^'erseifung von 2 — 5_r/ Phäophytin zur genauen Bestimmung der Phytolzahl und z. B. zum Vergleich verschiedener Ernten der näm- Uchen Pflanze (Fehler: Phytolverlust von 0-2 — OvoVo des Phäophytins). a) Das feingepulverte Phäophytin wird mit 24o/oiger methylalkoholischer Kalilauge (5 — 6 cm^ für 1 ff) in einem reageusgiasähnlichen Gefäl) (30 bis 4:0 cm^ Inhalt) mit etwas verjüngtem Hals und aufgeschliffenem Kühlrohr zwei Stunden lang im Wasserbad gekocht. Darauf wird im nämlichen Ge- fäß ohne Zusatz von Wasser fünf bis sechsmal ausgeäthert. Dabei ist die Masse, welche zäh Avird, jedesmal mit dem Äther gut zu verrühren und anzuschüttein: der Äther wird einfach dekantiert. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden nur mit Wasser mehrmals gewaschen und mit geglühtem Natriumsulfat getrocknet. Dann werden sie mit reiner, aber nicht besonders getrockneter Tierkohle 15 Minuten geschüttelt, und zwar bei einei- Kon- zentration von 200cin^ für 1^ angewandtes Phäophytin mit O'l.^/ Tierkohle. Die abermals filtrierte Lösung wird eingedampft: endlich spült man den 45* Fig. 53. 708 R- Willstätter. Rück.^taud mit wenig Äther (quantitativ in ein tariertes leichtes 15 cm,s- Kölbchen mit langem Halse (um Verspritzen auszuschließen) und aufue- schliffenem Helm (siehe die Fig. 53). Der Äther wird durch »/i Stunden langes Erwärmen im Vakuum auf 90° mit eingetauchter Kapillare verjagt und das Phytol auf der analytischen Wage gewogen. h) Die A'erseifung wird in einem Rund- kölbchen mit aufgeschliffenem Kühlrohr aus- geführt; dann wird das Phytol im Tropf trichter unter Zusatz von Wasser vier- bis fünfmal mit Äther extrahiert. Diese Art des Ausätherns ist weniger bequem und zeitraubender, weil oft Emulsionen auftreten; aber man vermeidet die Möglichkeit, daß die Masse Spuren von Phytol zurückhält. Die Isolierung erfolgt wie bei a). Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyll- derivaten. Beim Abbau des Chlorophylls entstehen im allgemeinen Gemische von Spaltungsprodukten, für deren Trennung und Reinigung bis vor kurzem keine Methoden existiert haben und deren Erkennung sehr unsicher ge- wesen ist. Diese hochmolekularen Sul)stanzen besitzen oft gleiche, oft sehr ähnliche Zusammensetzung und zeigen in ihren Reaktionen , ihren Farb- erscheinungen, sowie im Verhalten gegen Lösungsmittel große Überein- stimmung. Solange solche Reaktionsprodukte gemischt vorliegen, ist ihre Kristallisation erschwert. Die übliche üntersuchungsweise derartiger Chloro- phyllderivate, in den Händen vieler Forscher sogar die einzige Methode, war die Spektralanalyse, und zwar nicht die viel zu schwierige vollständige Beobachtung der Absorption, sondern nur die Feststellung der Maxima. Die Methode hat auf diesem Gebiete nicht vor den schwersten Irrtümern geschützt. Sie gibt, so lange die Konstanten der reinen Stoffe nicht be- kannt sind, wenig Aufschluß darüber, ol) die Verbindungen einheitlich und rein sind oder ob sie in Gemischen vorliegen. Während die spektralanaly- j tische Methode für manche Veränderungen und Zersetzungen reiner Sub- | stanzen einen übertriebenen Ausdruck gibt, ist sie gänzlich unanwendbar i für kompliziertere ^lischungen von Verbindungen, deren Reinisolierung in j Angriff genommen werden soll. ! Sehr viele Abbauprodukte des Chlorophylls ändern beim Abdampfen j der ätherischen Lösungen oder beim Umkristallisieren oder beim Trocknen j im Exsikkator ihre Farbe, also ihr Absorptionsspektrum wesentUch, und | zwar oft nur infolge von sehr geringfügigen Änderungen in ihrem ^lolekül, | wie z. B. durch Abspaltung von Wasser. So werden die Lösungen von ■ Glaukophyllin, welche frisch wunderschön Idau sind, beim Eindampfen und , Chlorophyll uud seine wichtigsten Abbauprodukte. 7Q9 Wiederaufnehmen mit Äther mehr und mehr rhodophylliniihnlich, also rot. Spektroskopisch ist dieser Effekt viel größer als etwa der einer ^'erun- reinigung durch Rhodophyllin. Bei der Charakterisierung der Chlorophyll- derivate durch ihre Absorptionsspektren ist daher der Zustand der Prä- parate viel sorgfäUiger zu berücksichtigen, als dies nach den Literaturan- gaben geschehen ist. In einer gemeinsam mit Herrn W. Miey'^) ausgeführten Unter- suchung bin ich zu einer von der Spektralanalyse unabhiingigen Trennungs- und Untersuchungsmethode gelangt, die sich auf die eigentümliche ba- sische Natur vieler Chlorophyllderivate gründet. Sie ist anwendbar für die Phytochlorine, Phytorhodine und für die Porphyrine. Chlorophyll selbst ist allerdings weder Base noch Säure. Die mit Al- kalien entstehenden Abbauprodukte, die Phylline, haben nur sauren Cha- rakter; so lange das Molekül komplex gebundenes Magnesium enthält, kann man es nicht mit sauren Agentien Ijerühren, ohne Zersetzung zu bewirken. Phäophytin und Phäophorbin enthalten keine saure Gruppe und sind auch so schwach basisch, daß sie sich nur in starker Salzsäure, und zwar unter Veränderung lösen. Beim Verseifen von Phäophytinpräparaten mit alkoholischem Kali treten zwei Pveihen von Verbindungen auf, die zugleich schwach sauer und schwach basisch sind: die Phytochlorine, welche in indifferenten Solventien oUvgrüne bis grüne, in saurer Lösung blaugrüne bis blaue Farbe zeigen und die Phytorhodine, die in saurer Lösung blau bis grün, in neutraler Lösung prächtig rot gefärbt sind. Phytochlorine sind auch erhalten worden durch Einwirkung von Al- kaUen auf chlorophyllanartige Extrakte, Phytorhodine durch Behandlung von Chlorophyllinen mit alkoholischer Chlorwasserstoffsäure. Von der ersten Gruppe habe ich bis jetzt (> GUeder ( Chlorine a — f), von der zweiten 8 Repräsentanten (Pihodine a — h) beschrieben. Zugleich sauer und basisch sind ferner die Porphyrine. das sind die rot gefärbten Verbindungen, welche aus den PhyUinen durch den Austritt von Magnesium entstehen. Die Phytochlorine und Phytorhodine sind in Wasser unlöslich, in or- ganischen Solventien mehr oder weniger löslich. Als schwache Säuren lösen sie sich in Alkalien, auch in Ammoniak und Bikarbonat und werden von diesen aus ätherischer Lösung quantitativ aufgenommen. Sie enhalten nur esterifizierbare saure Gruppen, ihre Ester sind nämlich alkaliiinlöslich. Alle sind schwache Basen, deren Salze durch Wasser vollständig zerlegt werden. Dabei sind ihre basischen Eigenschaften ungleich differenzierter als ihre sauren und zeigen Unterschiede und Abstufungen, wie sie bei schwa- chen organischen Basen noch nicht beobachtet worden sind. Um aus ätherischer Lösung in Salzsäure, die im Überschusse ange- wandt wird, überzugehen, erfordern diese Verbindungen Säure von be- M R. Willstätter und W. Mieg, tJber eine Methode der Trennung und Bestim- mung von Chlorophyllderivaten. Ann. d. Chem. Bd. 350. S. 1 (1906). 710 R. AVillstätter. stimmter Konzeutration. Schwefelsäure und gar Pliosphorsäure sind prak- tisch weniger gut anzuwenden, weil die nötigen Konzentrationen recht hoch sind. Für jede einzelne Substanz sind Grenzen charakteristisch, so zwar, daß Salzsäure bis zu einer gewissen Stärke der ätherischen Lösung nichts oder nur Spuren, eine etwas konzentriert ere einen großen Teil, endlich eine noch stärkere so gut wie alles bei einmaligem Durchschütteln ent- zieht. Die Konzentration der ätherischen Lösung und die Menge der Sak- säure üben selbstverständlich auf das Resultat einen erheblichen Einfluli aus, den man bei der praktischen Anwendung wohl berücksichtigen muß. Natürlich rücken die Grenzzahlen, je stärker die Basen sind, desto enger zusammen, wenn man nicht die relative Konzentration der Chlorwasser- stoffsäure, sondern den Prozentgehalt der Salzsäure in Betracht zieht. Über die Grenzen bei den Phytochlorinen orientiert folgende Tabelle: Phytochlorin Spuren gehen in Salz- säure von Gellt sehr reichlich in Salzsäure von Geht fast vollständig in Salzsäure von a b c d e f 3-5 1-5 0-5 015 1 9 6-5 35 1-5 0-5 2-75 11 (0 5 2 1 4 12 Den Beobachtungen liegen folgende normale Arbeitsbedingungen zu- grunde: 1 — 2 (ym^ ätherische Lösung, die 0'2 — 0'3^ Substanz in 100 cm» enthält, werden mit demselben Volumen Salzsäure einmal durchgeschüttelt. Mit verdünnteren Lösungen wurde für die Phytochlorine a und b die Ver- teilung zwischen Äther und Salzsäure quantitativ untersucht. Drei Portionen von je O'lOOf/ wurden in je 100 cm- Äther gelöst und mit je 100 cm^ Salzsäure 5 Minuten lang durchgeschüttelt. Dann trennte man die Schichten und dunstete die mit wenig Wasser gewaschene äthe- rische Lösung vorsichtig ein ; der Päickstand wurde im Vakuum über Schwefelsäure zur Konstanz getrocknet. Die nachstehende Tabelle ver- zeichnet die von den verschiedenen Salzsäuren aufgenommenen Anteile. Phvtochlorin a a a b b b Prozentgehalt der Salzsäure 8 7 6 5-5 4 2-5 Aufgenommene Substanz in Prozenten 84-1 73-8 60-7 74-4 54-7 26-4 Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 7] X Auf der verschiedenen Basizität beruht die Möglichkeit der Trennung. Das Beispiel der Phytochlorine a und b diene wiederum zur Beschreibung. Man erhält sie gemengt mit schwächer basischen Substanzen. Schüttelt man die ätherische Lösung i) wiederholt mit 47oiger und T^/oiger Salz- säure durch und wäscht man die beiden sauren Lösungen gründlich mit Äther, um die in jedem FaU mit aufgenommenen schwächeren Basen wieder herauszuholen, so gelingt es, einen ansehnlichen Teil von a und b in ziem- hch reinem Zustande zu isolieren. Viel besser ist eine zweite Ausführungsweise der Fraktionierung. Ihr Prinzip besteht darin, die Verbindungen in der Reihenfolge ihrer Basizität mit so schwachen Säuren zu extrahieren, daß von den nächst schwächeren Basen nur minimale Spuren gelöst werden können. Natürlich muli man die stärksten Säuren anwenden, die dieser Bedingung noch genügen. So isohert man im gegebenen Falle Phytochlorin b mittelst 3'Voigei' Salzsäure. Da diese aber b nicht quantitativ aus dem Äther herausholt, ist es not- wendig, danach durch wiederholtes Ausschütteln mit 4-5''/()iger Säure eine ^littelfraktion abzutrennen, ehe man an die Extraktion von a geht. Hier- für dient nunmehr 6Voige Säure. Auch diesmal sind die (:')- bzw. 6Voigen) salzsauren Lösungen der Phytochlorine mit Äther zu waschen. Dann er- hält man schon bei der einmaügen Fraktionierung die Substanzen in reinem Zustande. Etwas abgeändert wird das Verfahren, um die Chlorophyllderivate vollkommen zu reinigen, wenn sie schon in ziemlich reinem Zustande vor- hegeu, beispielsweise so, wie sie bei der ersten, hinsichtlich der Ausbeute vorteilhafteren Art des Trennungsverfahrens erhalten wurden. So löst man Phytochlorin a in Äther auf, wäscht die Lösung wiederholt mit 4'5''/oigei' Salzsäure durch und extrahiert dann die Base mit G^Ö^/giger Säure. Auf dieselbe Weise werden auch die schon gereinigten Substanzen wieder in Fraktionen zerlegt und deren Identität bewiesen. Anwendbar ist die Methode gerade bei diesen gefärbten Stoffen. Es ist nur hier ein Leichtes, für jeden Fall die zur Isolierung geeigneten Säuren auszuprobieren und nach der Farbintensität der Auszüge den ex- trahierten Anteil zu schätzen. Dabei ist es wichtig, verschiedene Auszüge einer Substanz hinsichtlich der Farbnuance zu vergleichen, um zu beur- teilen, ob sie einheitlich ist. Eine ähnliche Trennung der Chlorophyllderivate mit Alkalien ist nicht möglich, da ihre Alkahsalze im allgemeinen weit weniger hydrolytisch ge- spalten werden, aber man kann, allerdings viel weniger gut, mit Hilfe von Alkalien nach den gemeinhin üblichen Methoden fraktionieren. So wurde z. B. bei der Reinigung von Phytorhodin f , dem nach einer rohen Frak- tionierung mit Salzsäure noch recht ähnlich basische ^'erbindungen beige- mengt waren, derart verfahren, daß man den zur Neutralisation erforder- lichen Betrag von Alkah sehr verdünnte, in eine Reihe von Portionen teilte ^) Es ist natürlich nicht notwendig, mit der Lösung des Gemisches zu arbeiten, aber die Anwendung in gepulverter Form führt schwerer zum Ziele. 712 R- Willstätter. und mit diesen sukzessive die ätherische Lösung ausschüttelte. Dann wurden die wieder in Äther gebrachten Fraktionen nach ihrer Farbe beurteilt. Eine solche Ergänzung der in saurer Lösung ausgeführten Fraktio- nierung ist nur ausnahmsweise nötig gewesen. Fast stets erhielt ich dabei die Verbindungen in einheitUchem Zustande, so daß sie ohne weitere Rei- nigung aus ätherischer Lösung gut kristallisierten. Die farblosen Verun- reinigungen der Chlorophyllderivate, wie Fette, Wachse, die sich durch bloßes Umkristallisieren schwer abtrennen lassen, sind durch das Aufneh- men mit verdünnter Säure beseitigt. Nicht weniger wertvoll als für die Trennung ist die Fraktionierungs- methode für die qualitative Analyse, nämlich die Bestimmung der Ab- kömmlinge des Chlorophyhs. Bei allen möglichen Ileaktionen, die zu einiger- maßen basischen Stoffen führen, kann man die Reaktionsprodukte schon im Reagenzglas i) untersuchen, indem man die ätherischen Lösungen mit Salzsäuren von abgestufter Konzentration durchschüttelt. ^lau beobachtet, ob die Produkte Gemische oder einheitlich sind und vermag sie nach ihrer Basizität einzuordnen. Die geringsten Veränderungen der beschriebenen Chlorophyllderivate lieim Trocknen in der Wärme oder beim Aufbewahren wurden dadurch auffällig. L"m die beschriebene Methode zur Untersuchung des Rhodophylhns und anderer Phylline anzuwenden, zersetzt man dieselben mit Säuren und prüft die entstehenden Porphyrine; aus der Basizität eines Porphyrins und aus seiner Einheitlichkeit kann man auf das zugrunde hegende Phyllin zurückschUeßen. Basizität der Porphyrine "^j: Glaukoporphyrin geht sehr reichlich in o'/sVoig^r Salzsäure Rhodoporphyrins) ,, „ ,, „ 3Vo ,; Pyrroporphyrin ., „ „ „ IV2V0 ;, Phylloporphyrin ,, „ „ „ ViVo r, v Phytochlorin e und Phytorhodin g aus Gras. Als Beispiel für die Anwendung der Trennungsmethode von Will- stätter und Mieg mögen Phytochlorin e und Phytorhodin g dienen, die von den vielen Verbindungen der beiden Gruppen die wichtigsten sind. Sie sind von WillstätUr und Hocheder^) als Hauptprodukte der Spaltung von Phäophytin aus Gras durch Alkalien erhalten worden. In einer noch un- veröffentlichten Fortsetzung der Arbeit hat es sich gezeigt, daß die Phäo- ') Ich verwende Tropftrichter in Reagenzglasform. 2) Die Tabelle ist einer unveröffentlichten Arbeit von R. Willstätter und H. Frifzsche £ntnommen. '') Die Angabe von Willstätter und Pfannenstiel über die Basizitätszahl des ' AUoporphyrins wird hierdurch berichtigt. | *) k. Willstätter und F.Hocheder, Über die Einwirkung von Säuren und Alkalien 1 auf Chlorophyll. Ann. d. Chem. Bd. 354. S. 232 (1907). Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. 7I3 phytine aus den meisten untersuchten Pflanzen gerade diese beiden Abbau- produkte liefern. Phäophytin aus Brennesseln macht dabei eine Ausnahme. Aber aus mehr als 50 verschiedenen Pflanzen wurden allerdiui^^s in schwan- kenden Mengenverhältnissen immer wieder und wieder das Phytochlurin e und Phytorhodin g bei der aufeinander folgenden Einwirkung von Säure und von Alkali erhalten. Phäophytin aus Gras (38-7 5^) wurde mit Hilfe von Seesand und Äther in feine Verteilung gebracht, da es sehr schwer pulverisierl)ar war, und mit der dreifachen Gewichtsmenge konzentrierter methylalkoholischer Kali- lauge nur 1/2 Stunde lang gekocht. Nach dem Aufnehmen mit Wassei- und Extrahieren des Phytols wurde die alkalische Flüssigkeit sehr schwach an- gesäuert und mit viel Äther (26 /) ausgeschüttelt. Außer ätherunlöslichen schwächer basischen Produkten waren hauptsächlich zwei schöne \'erbiu- dungen entstanden: ein Chlorin. welches von :>Voiger Salzsäure sehr reich- lich, von 20/oiger schon beträchthch aus Äther extrahiert wird und ein Phytorhodin, das aus der ätherischen Lösung reichlich von 9«/oiger Salz- säure aufgenommen wird; von 6o/oiger Salzsäure wird es spurenweise, von IP/oiger fast vollständig extrahiert. Die ätherische Lösung wird ohne Pücksicht auf die reichliche Menge von Flocken, die darin suspendiert ist, mit ßo/oiger Salzsäure wiederholt ausgezogen, dann wird sie auf das Phytorhodin weiter verarbeitet. LTm das von der Salzsäure aufgenommene Phytochlorin zunächst von schwächeren Basen zu reinigen, verdünnt man die Lösung auf einen Ge- halt von 4" 0 Salzsäure und schüttelt sie 2mal mit Äther aus. Was in den Äther geht, kann man verwerfen. Dann wird die salzsaure Lösung neu- tralisiert und gründlich ausgeäthert; das Phytochlorin geht nur schwierig aus schwach salzsaurer Lösung heraus. Die letzte Reinigung des Phytochlorins erfolgte so, daß die Substanz nochmals aus der Ätherlösung, die gegen 14 l betrug, in 8"/„ige Salzsäure gebracht wurde. Die salzsaure Lösung wurde diesmal, um stäi'ker basische Beimischungen zu beseitigen , nur annähernd . nämlich auf einen C'hlor- wasserstoffgehalt von O'^o/oi neutralisiert und wieder mit Äther extrahiert. Die Lösung, nach dem Waschen und Filtrieren im Vakuum eingeengt, schied vier Fünftel des Phytochlorins (3-8^) kristallisiert ab; die ätherische Muttei-- lauge hinterließ beim Abdampfen im Vakuum noch 1 g etwas weniger reiner Substanz. Nach dem Extrahieren des Phytochlorins mit Hilfe von 6" „iger Salz- säure wäscht man die rote Ätherlösung, die das Phytorhodin enthält, noch einige Male mit ßVoiger Salzsäure und schüttelt sie dann mit U'Vüigci' Salzsäure wiederholt aus. Aus dieser Säure entfernt m.in durch Waschen mit Äther schwächer basische Verunreinigungen. Dann wird die Lösung mit Wasser auf das Doppelte verdünnt und das Phytorhodin mit Äther extrahiert ; diese Isolierung bezweckt zugleich eine Reinigung nach der Seite der stärkeren Basen, die von 4-5o/oiger Salzsäure zurückgelialt(>n werden. 714 R. Willstätter. Die ätherische Lösung wird mit Wasser gewaschen. Man darf sie nicht mit Natriumsulfat troclvnen. Die Substanz zeigt die EigentümUchkeit, sehr schnell vom Natrium sulfat aufgenommen zu werden ; man kann sie dann nur durch Schütteln mit verdünnter Säure und Äther wieder heraus- holen. Die verdünnte Ätherlösung scheidet schon beim Stehen schön kri- stallisiertes. reines Phytorhodin g aus und gibt nach dem Einengen im Vakuum noch eine zweite Kristallisation. Zur Ausbeute an reiner Substanz (1"2 g) kam noch eine weniger reine Mutterlaugenportion (0"9 (/) aus der mit 9"/oiger Salzsäure nur unvollständig verwerteten ursprünglichen Ätherlösung. Die wesentlichen Merkmale der Ijeiden Spaltungsprodukte — die Farbeigenschaften sind für die Klassen der Phytochlorine und Phytorhodine typisch — sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: Phytochlorin e Phytorhodin g Ungefähre empirische Formel C30 H3, 0, N, Prozentgehalt der Salz- säm-e, die aus Äther sehr reichlich extra- hiert Kristallisation aus Äther Farbe in Äther Farbe in Salzsäure Farbe in Eisessig Löslichkeit in Alkohol 2-75 metallisch glänzende , rechtwinklige Täfelchen olivstichig grün, dunkel- rot fluoreszierend blau, wenig grünstichig tiefblau heiß leicht, kalt schwer C HON dunkelrote, derbe, schief endigende Prismen dunkelwein rot, dunkel- rot fluoreszierend smaragdgrün blaustichig tief rot ziemlich leicht Phylloporpliyrin. F. Hoppe-Sei/ler^) hat bei hohem Erhitzen von Chlorophyllan mitj Ätzkali ein Abbauprodukt erhalten, das dem Hämatoporphyrin optisch sehrj ähnlich war : er bezeichnete es als Phylloporphyrin. E. Schunck und L.March- leioski-) haben diese Verbindung eingehender untersucht. Die folgende neue; 1) F.Hoppe-Seißer, Über das Chlorophyll der Pflanzen. II. Zeitschr.physiol.Chem.i Bd. 4. S. 193 (1880). — Siehe auch A. Tschirch, Untersuchungen über Chlorophyll. Ber-j lin 1884. S. 84. | •-) E. Schunck und L.MarchUwski, Zur Chemie des Chlorophylls. II. Abhandlung.i Ann. d. Chem. Bd. 284. S. 81 (1894). — Contributions to the Chemistry of Chlorophyll-i Nr. 6. Roy. Soc. Proc. Vol. 57. p. 314 (1895). Chlorophyll und seine wichtigsten Abbauprodukte. ~\') Methode zur Darstellung des Thv lloporphyrins ist vor kurzem von L. March- lewski^} angegeben worden; die wesentlichen Verbesserungen bestehen in der Verarbeitung der beschriebenen Doppelextrakte aus getrockneten Blättern, in der Anwendung des Autoklaven 2) an Stelle der gläsernen Röhren und hauptsächlich in der Fraktionierung des entstehenden (lemisches nach der Methode von Wilhtätter und Mieg. MarchlewsH beschreibt die Gewinnung des Phylloporphyrins fol- gendermaßen: Ein Doppelextrakt aus getrocloieten Blättern wird mit einem geringen Überschuß von gesättigter Baryumhydroxydlösung versetzt. Der gebildete Baryumlack wird abfiltriert, in Alkohol von IKJ" „ s'ispf'iidicrt und vorsichtig mit konzentrierter Schwefelsäure tropfenweise versetzt. Das gi*- bildete Baryumsulfat reißt einen Teil des Farbstoffes zu Boden, der Haupt- teil bleibt jedoch in Lösung. Die alkoholische Lösung wie auch der Nieder- schlag können weiter getrennt verarbeitet werden, und zwar winl die alkoholische Lösung bei ganz schwach saurer Reaktion stark konzentriert, mit 10o/oi"€'r alkohoUscher Kaliumhydroxydlösung versetzt und sodann im Autoklaven auf 200o während 4 Stunden erhitzt. Der Niederschlag wird in lOVoig'Pi" alkoholischer Kalilauge suspendiert mid ebenfaUs unter Druck auf 200" erwärmt. Die weitere Verarbeitung ist in beiden Fidlen gleich. Die im Autoklaven verbleibende Masse wird mit Essigsäure neutralisiert, mit Alkohol verdünnt und auf dem Wasserbade erwärmt. Das gebildete rhylloporpliyrin geht in Lösung, während ein Gemisch von braunen Kör- pern ungelöst zurückbleibt. Die alkoholische Lösung wird sodann auf dem Wasserbad stark konzentriert, mit Wasser verdümit und mit Äther aus- geschüttelt. Das Phylloporphyrin und gewisse ("hlorophyllderivate gehen in Lösung. Die ätherische Lösung wird sodann mit einer ö°/o\gen Salzsäure durchgeschüttelt. Das Phylloporphyrin geht in die Säure über, begleitet von einem kleinen Teil' der Verunreinigungen. Die 5''/oige salzsaure Lösung wird nun mit Natriumacetat versetzt, wodurch das Phylloporphyrin in Foi-m eines rotbraunen Schlammes abgeschieden wird. Die erhaltene Suspension wird von neuem mit Äther extrahiert und die ätherische Lösung des Phyllo- porphyrins wiederum mit Salzsäure, aber diesmal nur einer 1 "/„igt'», diuch- geschüttelt. Jetzt geht das Phylloporphyrin, nicht mehr von Beimengungen begleitet, in die Säure über. Die saure Lösung wird mit einer kleinen ^lenge Äther durchgeschüttelt, wobei etwas Porphyrin wiedei- entzogen wird, der Hauptteil bleibt aber in der Säure gelöst. Die saure Lösung wird nun mit Natriumacetat versetzt und das abgeschiedene Pori)hyi-in in Äther aufgenommen. Die ätherische Lösung wird verdamiift und tier llück- stand 2mal aus Alkohol umkristaUisiert, wobei prächtig schimmernde riätt- chen erhalten werden. ') L.Mardilcirski, Über eine einfache Methode zur Darstellunir des Phyllopor- phyrins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 41. S. 847 (1908). =) Nach R.Willstätter und A. Pfannenstiel, Über Rhodopliyllin. Ann. d. Cbem. Bd. 358. S. 208 (1908). 716 R. ^Yillstätter. Chlorophyll und seiue wichtigsten Abhaixprodukte. ; Hinsichtlich der verarbeiteten Mengen und der Ausbeuten fehlt es an ; Angaben. l Ich bediene mich für die Gewinnung der Porphyrine eines ein-; fächeren Verfahrens, das sich eng an die Methode zur Gewinnung des Rhodo- phyllins anlehnt. ; Chlorophyll oder Chloroph}llinsalz wird mit konzentriertem methvl- alkoholischem Kali im Silbertiegel mittelst des P/'m^r/s^Autoklaveu erhitzt. ; Anstatt das Reaktionsprodukt nach vorsichtigem Ansäuern auf Rhodo- phyllin zu verarbeiten, wird die beim Ansäuern erhaltene Fällung in Salz-' säure aufgelöst. So entstehen aus den PhyUinen die Porphyrine; das Ge- ; misch derselben wird nach der Methode von WiUstätter und Mieg frak- tioniert. Die Zusammensetzung des Gemisches ist von der Dauer und Höhe des Erhitzens abhängig; beim Erhitzen wie zur Darstellung von Rhodo-' phyUin besteht das Gemisch nach Abspaltung des Magnesiums überwiegend aus Rhodo- und Phylloporphyrin, die sich leicht mit der Salzsäuremethode. trennen lassen. j Eigenschaften. Phylloporphyrin kristallisiert nach E. Schunck und^' L. Marchlewski^) in dunkelviolett gefärbten Prismen, die sich ziemlich schwer in Alkohol und Äther mit karmoisinroter Farbe und mit roter Fluoreszenz lösen. Es besitzt basische und saure Eigenschaften. Das Spektrum des Phylloporphyrins in Äther besteht nach Schunck und MarchleivsM aus 7 Bändern: 11630 bis ). 622, II 615 bis 612. III 600! bis 595, IV 576 bis 566, V 568 bis 558, VI 537 bis 512, VII 505 bis 473.: Dieses Absorptionsspektrum stimmt mit dem des Hämatoporphyrins gänz- lich überein, nur sind bei dem letzteren alle Bänder ein wenig nach Rotj hin verschoben. ^ Zusammensetzung. Schunck und Marchlewski finden C 75"98.' H7-10, N 11-02 o/o und stellen die Formel C32H3 4 0.,X4 auf, die March- lewski durch den Ausdruck (CigHigGNols ersetzt. j ') Loc. cit. und E. Schunck und L. Marchlewski, Contributions to the Chemistrjl of Chlorophyll. Xr. 7. Roy. See. Proc. Vol. 59. p. 233 (1896). — Zur Chemie des Chloro- phylls. IV. Abhandlung. Ann. d. Chem. Bd. 290. S. 306 (1896). — ¥(^vmv L. Marchlewski. in Eoscoc-ScJwrlemmcr-BrHhl. Bd. 8. S. 884 (19Ü1). Tierische Pigmente und Farbstoffe. Von Frauz Samuely, Freiburjj- i. B. Allg^emeiner Teil. Das Kapitel der ..tierisclien Farbstoffe •■ ist ein Kapitel der Entsagung chemischer Analyse und biochemischer Forschung. Das heute vorliegende Material über tierische Farbstoffe, über ihre Verbreitung im Tierreich und über ihre physiologischen Beziehungen ist ein umfangreiches. Gegenüber der Fülle dieser Beobachtungen ist unser Wissen über die chemische Natur der meisten Farbstoffe und Pigmente ein bedauerlich geringes. Die Armut unserer Kenntnisse erklärt sich gewiß zum größten Teil durch die Schwierigkeit, ausreichendes und reines Material darzustellen. Die in den Geweben vorhandenen Farbbestandteile genügen oft nur, um ihre Existenz und einige ihrer Eigenschaften in geeigneten Lösungsmitteln nachzuweisen. Aber auch in Fällen größerer Materialvorräte hat bis jetzt entweder die Labilität der Substanzen oder die auliergewöhn- liche Eesistenz derselben gegen chemische Agentien jede ersprießliche che- mische Bearbeitung unmöglich gemacht Es wird daher alles das, was wir über die Methoden der Isolierung und Analyse tierischer Fai'bstoffe, lie- sonders von den vielartigen Farbstoffen in der niederen Tierwelt berichten können, nur geringen Baum ausfüllen. Aber selbst da, wo es sich um die Bearbeitung von Pigmenten und Farbstoffen aus Sekreten und Gewebs- flüssigkeiten von Vertebraten handelt (Galle, Harn, Blut), steht bis heute nur das Methodische im Vordergrund. Die Konstitutionsaufklärung auch dieser Körper bewegt sich zum Teil noch in den ersten Anfängen. Wir müssen es uns an dieser Stelle versagen, die qualitativen Eigen- schaften der Farbstoffe wiederzugeben. In diesem Punkt muß auf die Hand- bücher und Lehrbücher verwiesen werden. Für die Farbstoffe der niederen Tiere ist vor allem die Monographie von <). F»WA ' ) maßgebend, in welcher der Chemiker auch die Fundorte der Tierspezies erschöpfend beschrieben findet. 1) 0. r. Fiirfh, Vergleichende chemische Physiologie der niederen Tiere. Fischer. 1903. (Ausführliche Literatur vgl. besonders Kap. IX. S. 491 ff.) 718 Fr. Samuely. Zur Methodik der Farbstoffisolierung seien einige Bemerkungen vorausgeschickt: Liegen die Farbstoffe in Lösungen vor, d. h. in Sekreten oder Exkreten, so besteht die Aufgabe der Darstellung in einer Fällung derselben in unlöslicher Form oder in einer Extraktion durch geeignete indifferente Lösungsmittel. Farbstoffe aber, die sich in Geweben amorph vorfinden, werden den feinzerteilten, eventuell vorher bei niederer Tem- peratur getrockneten und gepulverten Organteilen durch geeignete Lösungs- mittel entzogen. Man versuche in allen Fallen zuerst Wasser und dann organische indifferente Solventien, und vermeide nach Möglichkeit Alkalien oder Säuren, da diese leicht sekundäre Veränderungen hervorrufen. Doch sind auch Farbstoffe bekannt, die ohne Änderung ihrer Eigenschaften in Säuren oder AlkaUen primär löslich sind. Andere hingegen, und dies gilt vor allem von den dunkelschvrarz gefärbten Pigmenten in der Tierreihe, sind nur durch eine Veränderung ihrer primitiven chemischen Xatui" in Alkalien lösUch. Die Wahl des geeigneten Extraktionsmittels entscheidet bisweilen die Möalichkeit einer ReindarstellunQ' und einer Kristallisation des tierischen Farbstoffes, da diese letztere nur bei Abwesenheit von kristallisationshem- menden Körpern (Eiweiß, Fette, Lipoide) gehngt. Gehen gleichzeitig mehrere Farbstoffe in einem Extraktionsmittel in Lösung, so kann man durch Extraktion bei alkahscher oder saurer Lösung eine Trennung versuchen. ' Jedenfalls versuche man zur ursprünglichen Extraktion möghchst nele Solventien, allein oder in gegenseitiger Kombination. [ Gewinnt man reine Lösungen, deren Rückstand nicht kristallisations- ' fähig ist oder (juantitativ nur spärlich ausfällt, so ist man auf die Fest- ' Stellung (jualitativer Reaktionen angewiesen. Spezialreaktiouen bestimmter chemischer Farbstoffgruppen sind bis jetzt kaum bekannt. Nur für ganz ^ wenige Substanzen, wie die Lipochrome, oder die I'ranidine sind einige j Klassenmerkmale vorhanden, die mehr oder weniger willkürlich eine Gruppen- ; Zugehörigkeit eines Farbstoffes gestatten oder einem Pigment eine spezifische i Natur zuzuschreiben erlauben. Die Mehrzahl qualitativer Reaktionen beruht auf Farbenände- ; rung durch äußere Faktoren. Als solche kommen das eine Abblassung oder ; Metachromasie bedingende Licht und der Sauerstoff der Luft in Betracht. Ge- ; wisse Farbstoffe, wie die Lipochrome, sind außerordentlich lichtempfindhch. ; Bisweilen führt die Einwirkung von Licht ( Sonnenlicht ) auch zur Farbeuver- ' äuderung oder Farbenvertiefung. Man bedenke in diesem Fall die Möghch- ; keit einer Farbenbildung aus einem unuefärbten Chromogen, wie dies für j ürobilin und Purpurin festgestellt ist. In solchen Fällen versuche man das j Chromogen bei diffusem Petroleumhcht oder im Dunkeln darzustellen. Andere | Veränderungen der ursprünglichen Eigenfarbe werden sehr leicht durch j Wärme, Säuren oder Alkalien hervorgerufen. Auch hier ist zu beachten,! ob es sich z. B. nach Ansäuern nur um einen Farlienumschlag handelt, t der durch Neutralisieren der Lösung der ursprünglichen Farlie wieder weicht. ■ Tierische Pigmente und Farbstoffe. 7J9 In solchen Fällen kann der Farbstoff unter Umständen durch Lösen und I^mf allen aus Alkalien mit Säuren !iereinii>t Averden. Die ^dehrzahl der Farb- stoffe niederer Tiere aber wird durch diese Agentien in ihrer elementaren Natur verändert. Die Farbenveränderung", die durch Alkalien, bisweilen aber schon durch Alkohol oder Äther auftritt, ist für manche Farbstoffe, wie z. B. die Uranidine. als Klassenmerkmal verwendet worden. Das wertvoUste Material der Farbstoffanalyse und Identifikation bietet die spektroskopische Beobachtung. In der Tat zeigen besonders die Farbstoffe der höheren Tiere (Blutfarbstoffe) und der Pflanzen (Chlorophyll) ganz spezifische und charakteristische Absorptionsspektren. Weniger günstig liegen die Verhältnisse bei den chemisch unaufgeklärten Farbstoffen aus der niederen Tierreihe. Doch sind auch hier die Spektralerscheinungen zum mindesten verwertbar, um einem Pigment eine Sonderstellung oder eine spezifische Natur zuzuerkennen. Man beachte dabei stets die ^'eränderungen der Absorptionsstreifen bei den durch Alkali oder Säure vermittelten Farb- umschlägen, und prüfe auf die Wiederkehr des ursprünglichen Spektral- l)ildes nach Neutralisation der Lösung. Liegen Farbstoffe vor, die in keinem der bekannten Lösungsmittel ohne Änderung ihrer chemischen Zusammen- setzung löslich sind, so kann man diese Substanzen (Pigmentkörner) als Rückstand gewinnen, indem man vorher Fettsubstanzen durch Alkohol- Ätherextraktion und Proteinsubstanzen durch Zerkochen mit kochenden Säuren oder durch proteolytische Fermente beseitigt und den Pigment- rückstand schließlich gut wäscht. Befindet sich das Pigment nur locker in Gewebslücken enthalten, so kann man dasselbe auch mechanisch heraus- lösen, und dann die Beseitigung der Proteinverunreinigungen in der eben genannten Weise folgen lassen. Es ist klar, daß bei mangelnden chemischen Kenntnissen über die tierischen Farbstoffe von einer Systematik derselben keine Rede sein kann. Eine Anordnung der hier in Frage stehenden Substanzen nach zoologischen Gesichtspunkten ist den speziellen Lehrbüchei'n dieser Wissenschaft vor- behalten. Eine Reihenfolge andrerseits, die nur nach dem Gesichtspunkt der Farl)ennuance gebildet ist, würde keinesfalls glücklich sein, wenn sie auch für die Pigmente der niedersten Tiere kaum zu vermeiden ist. Wir folgen daher einer Anordnung von eher physiologischen Rücksichten und besprechen die Farbstoffe in der Reihenfolge: A. Farbstoffe in Sekreten und Gew^ebsflüssigkeiten (Drüsen- sekrete, Blut, GaUe, Harn). B. Farbstoffe in Geweben. In der zweiten (huppe trennen wir in chemisch besser bekannte Gruppen: 1. Farbstoffe der Hämatin- reihe, 2. Verwandte der Gallenfarbstoffe, 3. Farbstoffe der Harn- säuregruppe, 4. Lipochrome und ö. Uranidine. Für den .Rest der Substanzen 1)leibt nur eine Reihenfolge nach Grundfarben, wobei wir die schwarzgefärbten Produkte als Melanine zusammenfassen. Wir liemerken aber ausdrücklich, dal» wir keineswegs die Methoden für jeden bereits mit einem oft schön klingenden Eigennamen l)elegten 720 Fr. Samuely. Farbstoff wiedergeben, sondern nur die wirklich besser bekannten ^'ertreter jeder Gruppe , und zwar nur die methodisclie Gewinnung mit kurzer An- gabe ihrer Eigenschaften erwähnen werden. Über das Vorkommen der Farbstoffe in der Tierreihe vgl. die Tabellen bei V. Fürth (S. 517 1. c. 1, S. 551—560). Spezieller Teil. A. Farbstoffe in Sekreten und Gewebsflüssigkeiten. I. Farbstoffe in Drüsensekreten, Bei einzelnen niederen Tieren sind gefärbte Substanzen in spezifi- schen Drüsensekreten enthalten. Zu erwähnen sind das sogenannte Pur- purin, der violette Farbstoff im Driisensekret mancher Purpursclmecken und das Aplysiopurpurin im Sekret mancher Aplysien arten. Bei beiden Tieren enthält die Drüse ursprünglich ein oder mehrere Chromogene, die durch bestimmte äußere Einflüsse (Licht, Ferment) erst in den Farbstoff übergehen. In beiden Fällen handelt es sich um gelöste Farbstoffe. Ein unge- löster schwarzer Farbstoff, das sogenannte Sepia, findet sich im Tinten- beutelsekret mancher Sepienarten. Im Prinzip stellt auch der gelbe oder grüne Farbstoff der Seide (Seidenlipochrom) ein Sekretprodukt dar. Es ist denkbar, dali auch andere Farbstoffe, die sich in der Haut oder den Integumenten abgelagert finden, das Produkt besonderer Se- ' kretions- oder Exkretionsorgane sind. Wir fassen hier nur die nach außen j sekretorisch abgeschiedenen Farbstoffe zusammen. f 1. Punizin. Darstellung des Bohfarbstoffes aus dem bereits durch die Lufteinwirkung gefärbten Sekret, z.B. von Murex trun- culus (A. und G. de Xegri^): Die von der Muschel abgelösten Purpurdrüsen ! werden zerrieben, der Sonnenbestrahlung ausgesetzt und nach dem Violett- 1 werden eingetrocknet. Der dann feingepulverte Gewebsrückstand wird mit i heißem Eisessig behandelt, wobei der Farbstoff in Lösung geht. Die filtrierte Eisessiglösung wird mit Wasser verdünnt und der sich hierbei abscheidende ' Farbstoff in Chloroform aufgenommen. Als Verdunstungsrückstand des Chloroforms (bei Zimmertemperatur im ^'akuum) hinterbleibt eine raetall- glänzende, blaurote Masse. Die Sul)stanz scheint nicht einheitlich zu sein, da ein Teil derselben, mit roter Farbe in Äther löslich ist, während ein zweiter ätherunlöslicher [ Teil von blauer Farbe aus .Alkohol kristaUisiert erhalten werden kann. j Darstellung aus dem Chromogen von Purpura lapillusj (Schimek-). Die Purpurdrüsen der Schnecke werden im Dunkeln mit Alkohol *) A. und G. de Xegri, Della materia colurante dei Miirici e della porpora degli autichi. Atti della R. Universitä di Geuova. Vol. 3. p. 96 (1875). ") E. Schunck, Note on the purple of the ancients. Journ. ehem. Soc. Vol. 35. j p. 589 (1879); Vol. 37. p. 613 (1880). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 7.^1 versetzt und dann erst der Lichtwirkung- ausgesetzt. Aus dci- alkoholischen Lösung scheidet sich hierbei der Purpurfarbstoff ah (etwa aus 400 Schnecken 1mg), der aus heißem oder siedendem Anilin beim Abkühlen in Form von mikroskopischen, purpurfarbigen Sternchen ausfällt. Das Produkt soll einheithch sein, doch wird diesem Pefund von Letellier') widersprochen. Auch die Beobachtung- von Negri von der Existenz zweier Köri)er steht hiermit im Widerspruch, steht aber mit der Möglichkeit, zwei diffe- rente Chromogene darzustellen, in guter Übereinstimmung. D a r s t e 1 1 u n g d e r C h r 0 m 0 g e n e ( Letellier - ). Das Farbstoff chromogen befindet sich in dem gelbhchweiben Pand, das bei Purpura lapillus am Ptektum entlang läuft. Einige Hunderte dieser Bänder werden im Aakuum getrocknet und mit Äther extrahiert. Das Ätherextrakt wird mit Kalilauge aufgenommen. Aus dieser Lösung- fäUt mit Essigsäure ein gelber Farb- stoff, der aus Äther in Prismen des trikhnen Systems kristallisiert. Zwei andere Chromogene werden dem Gewebe im Dunkeln durch Chloroform oder Petroläther entzogen. Der Rückstand der Extrakte wird immer noch im Dunkeln mit Wasser in eine wasserlösliche aschgraue Substanz und eine schwerer lösliche apfelgrttne Substanz fraktioniert. Beide werden wie- derum in Chloroform aufgenommen. Die erstere kristallisiert in orthorhoni- bischen, die letztere in klinorhombischen Prismen. Ihre Trennung ge- hngt auch durch die fraktionierte Extraktion, da Petroläther leichter die apfelgrüne, Chloroform leichter die aschgraue Substanz aufnimmt. Qualitativer Nachweis des Chromogens (Schunck). Man erschiJpft die Purpurdrüsen der Schnecke im Dunkeln mit Alkohol und Äther. Die gelben Extraktlösungen enthalten das Chromogen, das sich bei der Sonnen- bestrahlung erst grün färbt und dann in ein sich abscheidendes purpur- farbenes Pulver verwandelt. Einige Eigenschaften des Farbstoffes: Löslich in Chloroform, heißem Alkohol, Eisessig, Anihn, Essigsäureanhydrid. Grünfärbung beim Erwärmen mit konzentrierter Schwefelsäure, Blaufärbung beim \'erdünnen dieser Lösung mit Wasser. Empfindlichkeit unter Entfärbung gegen Oxy- dantien. Keine charakteristische Absorptionsstreifen. Über die chemische Natur des Farbstoffes steht nichts Sicheres fest. Diese Eigenschaften sind alle nur wenig gesichert, nachdem Letellier^) wenigstens für Purpura lapiUus die Existenz dreier Pigmente festgestellt hat, von denen das eine gelb und lichtunempfindlich ist, das zweite, tiefgrüne in der Sonne blau und das dritte aschgrau, an der Luft karminrot wird. *) Ä. Letellier, Untersuchungen über den Purpur von Purpura lapillus.Arch.de zool. exp. et gen. Notes et revue. (4.) T. 1. p. 25 (1903). 2) A. Letellier, Untersuchungen über den Purpur von Purpura lapillus. Compt. rend. de l'Acad. des Sciences. T. 109. p. 82 (1890); T. 111. p. 307 (1891); Arch. de zool. exp. T. 8. pag. 361 (1889). ^) A. Letellier, Untersuchungen über den Purpur von Purpura lapillus. Arch. de zool. exp. et gen. Notes et revue. (4.) T. 1. p. 25 (1903). Abderhalden, Handbuch der biochemi.schenArbeitsmethoden.il. 46 722 Fr. Samuely. Purpurfarbstoff von Murex brandaris ist durch Friedländer '^) als 6.6'-I) i b r 0 m i n d i g o aufgeklärt. Darstellung: Die herauspräparierte Drüse der Schnecke wird auf Filtrierpapier gestrichen und durch Sonnenbestrahlung während einer Stunde der Farbstoff entwickelt. Danach wird die gefärbte Papiermasse durch hall)- stündiges Erwärmen auf dem Wasserbad mit verdünnter Schwefelsäure (l:"i) mazeriert. Der Brei wird alsdann mit heißem Wasser gewaschen, auf der Nutsche gesammelt und zur Entfernung von Vermireinigungen im Soxhlet mit Alkohol erschöpft. Hierauf wird der Farbstoff mit kochendem Benzoe- säureäthylester extrahiert, aus welchem er beim Erkalten in flimmernden, kupferglänzenden Kristallen ausfällt. Die Umkristallisation erfolgt aus Benzoe- äther oder Chinolin, wegen der Schwerlöslichkeit am besten durch Extraktion aus einer Soxhlethülse, die in dem Kolben unter dem Kühler aufgehängt ist. Ausbeute 1-4,9' ^us 12.000 Schneckendrüsen. Die Eigenschaften und die analytischen Zahlen dieses Körpers stimmen vollkommen mit dem 6.6'-Dibromindigo überein. C 45-92, H 2-13. X 6-6o. Br o7-40Vo, unlöslich in der Mehrzahl-) organischer Solventien, löslich in der Hitze in Nitrobenzol, Anilin, Benzoesäure, Chinolin, Acetylentetrachlorid. In letzterem Lösungsmittel zeigt er bei 120 — 130° einen Absorptions- streifen im Orange (X = 608 [j-y-) allmählich bis \ = 565 [j.[j.. Inwieweit bereits Schunck den gleichen Körper aus Purpura lapillus in Händen hatte, läßt sich nicht entscheiden. Auch ist es denkbar, daß andere Purpur- schneckenarten einen anders zusammengesetzten Farbstoff enthalten. Jeden- falls aber dürfte auch dieser zu den Indigofarbstoffen zählen. 2. Aplysiopurpiirin. Im Sekret der Drüsen von Bohafsch der Aply- sien findet sich ein Chromogen, das allmähhch von kastanienbraunen über blaue, blaurotviolette in gelbbraune Farbentöne übergeht. An der Farb- bildung sind vermutlich Luftsauerstoff und Fermente beteiligt. Isolierbar ist der blaue Farbstoff durch Ausschütteln der ange- säuerten Lösung mit Chloroform und Abdunsten des Chloroforms. =>) Der \iolette Farbstoff (das Aplysiopurpurin) kann in Alkohol {Moseht/*} oder Wasser aufgenommen werden. Er ist aus alkoholischer Lösung durch Koch- salz ( Ziegler »), aus wässeriger Lösung durch Ammoniumsulfat {2Iac Munn ") bei Ganzsättigung fällbar. ') P. Friedländer, Über den antiken Purpur. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges., Bd. 42. S. 785 (1909); vd. hierzu Monatsh. f. Chem. Bd. 28. S. 991 (1907). "') Fr. Sachs und B. Kempf, Chem. Ber. Bd. 36. S. 3303 (1903). - Fr. Sachs und E. Sichel, ibidem. Bd. 37. S. 1868 (1904). ^) A. und G. de Xec/ri , Über die färbende Substanz der Aplysien. Atti della R. Universitä di Genova. T. 3. p. 11 (1875). *) H.X. Moselei/, Über Farbstoffe verschiedener Tiere. Quart. Journ.Microsc. Science. T. 17. p. 12 (1877). ' I ^) M. Ziegler, Bemerkung über das natürliche Anilin. Bull, de la Soc. industrielle , de Mulhouse. T. 37. p. 283 (18^87); Journ. f. prakt. Chem. Bd. 103. S. 63 (1868). j ^) C.H.Mac-Munn, Die Pigmente von Aplysia punctata. Journ. of Phys. Vol. 24 p. 1 (1899). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 70;.>, Über die chemische Natur dieser Substanz ist bei ihrer Labilität nichts bekannt. Die Zugehörigkeit zu Anilinfarbstoffen ist hypothetisch. Sie zersetzt sich in der Lösung auch im Dunkeln unter Bildung eines äther- löslichen Aplysiocyanins. Spektral verhalten: (Mac Munn-Moseley) in wässeriger Lösung: Breites Absorptionsband bei F, ein heller Streifen zwischen D und E, der in großer Verdünnung verdoppelt erscheint. Für das rote Pigment von Aplysia depilans und Aplysia punctata gibt Briot^) ein anderes Spektral- bild an: 2 Absorptionsstreifen, die zwischen D und E und zwischen b und F liegen. In saurer, wässeriger Lösung ist der erste Streifen nach E ver- breitert, der zweite Streifen unverändert, in ammoniakalischer Lösung be- steht nur 1 Streifen. Das Farbenspiel des natürlichen Sekretes erinnert an die interessan- ten Beobachtungen von Abderhalden und Guggenheim -) über die Färbungen von tyrosinhaltigen Polypeptiden durch Tyrosinaseferment. Auch dort sind schöne Farben beobachtet. Es wäre denkbar, daß sich auch in den Aply- siensekreten solche Polypeptide vorfinden, deren Färbung durch Fermente des Sekretes hervorgerufen würden. Jedenfalls ist hier auffallend, daß die Farbenveränderung nicht durch Licht oder Luft bedingt ist, da die Um- setzung auch bei Ausschluß derselben fortschreitet. 3. Sepiaschwarz im Tintensekret der Cephalopoden (z. B. Oc- topus vulgaris). Der als Sepia bezeichnete schwarze Farbstoff, der vermut- lich durch einen Fermentvorgang (tyrosinaseähnliches Ferment) aus einem ungefärbten Chromogen (vermutlich ein tyrosinhaltiges komplexes Eiweilt- derivat) entsteht, findet sich in Form feinster Pigmentkörnchen ungelöst im Tintenbeutelsekret. Darstellung: Die ein Filter leicht passierenden Körnchen werden durch Aufkochen unter Zusatz einiger Tropfen Kalilauge filtrierbar gemacht (vielleicht geht hierbei schon eine chemische Veränderung vor sich). Das abgesetzte Pigment bleibt dann tagelang unter verdünnter K(3H und ver- dünnter HCl stehen und wird dann mit Wasser ausgewaschen und ge- trocknet. Nach Girod^) behandelt man der Pteihe nach mit Alkohol. Äther. Wasser, Eisessig, verdünnter Kaliumkarbonatlösung, verdünnter Salzsäure und zuletzt warmem Wasser. Der Piückstand ^^^rd zuletzt getrocknet. Nencki und Sieher*) behandeln das Tintenbeutelsekret oder die ge- trockneten, fein zermahlenen Tintenbeutel mit lOVoi^"^!" Kalilauge bei ') A. Briot, Über das rote Sekret der Aplysien. Compt. rend. soc. biol. T. 56. p. 899 (1904). 2) E.Abderhalden m\& M. Guggenheim, Versuche über die Wirkung der Tyrosiiiase ausRussula delica auf Tyrosin, tyrosinhaltige Polypeptide und einige andere \erbindungen unter verschiedenen Bedingungen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 54. S. 331 (1907). ^) P.Girod, Chemische Untersuchungen über das Sekretionsprodukt des Tintcn- beutels bei den Cephalopoden. Compt. rend. de l'Acad. des Sciences. T. 93. p. 9G (1881); T. 101. p. 1372 (1885). *) M.Nencki und N. Sieher, Weitere Beiträge zur Kenntnis der tierischen Mela- nine. Arch. f. exp. Pharm, u. Pathol. Bd. 24. S. 21 (1887). 46^^ 724 Fr. Samuely. Wasserbacltemperatur. Das in Lösung gehende Pigment (Sepiasäure) ist ein Umwandlungsprodukt des Sepiascliwarz und wird durch Umfallen mit Säure aus alkalischer Lösung in Na( )H, später in XHg gereinigt und zur Abscheidung gebracht (vgl. hierzu den Abschnitt: Melanine, S. 762, wo sich eine Kritik dieser Methoden findet). Zusammensetzung nach Girod : C 5o'6, H 4*02, N 8'67o, Nencki und Sieber: C 56-:-i6, H :3-56, N 12-21, SO-öP/o. 4. Lipoclirome der Seide (vgl. bei Lipochrome, S. 758). Ein grüner P'arbstoff der Seide von Antherea, Yama-]\Iai und Rhodia fugax i) geht in Alkohol über, und kristallisiert aus Alkohol in blauer, aus Wasser in grüner Farbe. Das Spektrum in alkoholischer Lösung gleicht jenem des Chlorophylls, verschwindet aber mit Alkalien und Schwefelammonium (Villard)^) IL Farbstoffe im Blut. Hämoglobin und seine Derivate sind in einem besonderen Kapitel besprochen. Im lUut niederer Tiere finden sich außer dem mit dem Warmblüter- hämoglobin identischen Hämoglobin einige gefärbte Substanzen, die nicht der Gruppe der Hämatinderivate angehören, vielmehr, soweit unsere Kennt- nisse reichen, chemisch eigenartige Substanzen darstellen. Zu erwähnen wären ein Echinochrom gewisser Echinodermen. ein Chlorocruorin im Blut von AnneUden (Siphonostoma), ein Hämerythrin einiger Sipunculus- arten, das Hämocyanin gewisser Mollusken und Crustaceen, das Hämo- rrhodin der Aplysia depilans, das Tetronerythrin bei höher organi- sierten Crustaceen, die Melanosen in der Körperflüssigkeit der Insekten und die Lipochrome im Blutserum der Warmblüter. Einzelne dieser Körper erwiesen sich bei genauerer LTntersuchung als schwermetallhaltige Eiweißkörper, die zwar die Fähigkeit der Sauerstoffbin- dung wie das Hämoglobin besitzen, aber nur zum Teil einen dem Hämoglobin oder Hämatin ähnlichen Aufbau aus einem metallhaltigen Chromogen und einer globinähnlichen Eiweißkomponente aufweisen. Die Darstellung dieser Körper ist eine relativ leichte und eiiolgreiche. Ihre Besprechung sei daher vorangestellt. 1. Hämocyanin aus dem Blut von Mollusken (z. B. Octopus) ist der Träger der blauen Farbe im arteriellen Molluskenblut. Über die techni- schen Einzelheiten zur Gewinnung von Octopusblut vgl. bei v. JJcxküll. 2) Darstellung aus arteriellem Octopusblut ((9r///«7Äs 3); Man fängt das Blut durch Anschneiden des arteriellen Gefäßes auf und zentrifugiert 1) ./. Villard, Über das an^eWiche Chlorophyll der Seide. Compt. rend. soc. biol. T. 56. p. 1034 (1904); Compt. rend. de l'Aead. des Sciences. T. 139. p. 165 (1904). -) L. Fredericq, Recherches sur la physiologie de ponlpe cominiin. Arch. de Zool. expör. T. 535 (1878); vgl. auch hierzu Biochem. Zeitschr. Bil. 19. pag. 393 (1909). - Vgl. bei J. Hyde, Beobachtungen über die Sekretion der sogenannten Speicheldrüse von Octopus. Zeitschr. f. Biol. Bd. 35. S. 459; vgl. S. 717. Nr. 1. S. 279 u. 62. ") Ä. B. Griffiths, Über die Zusammensetzung des Hämocyanins. Comptes rend. de l'Acad. des Sciences. T. 114. p. 496 (1892). Tierische Pigmente imd Farbstoffe. 72,") scharf ab. Das Blut wird alsdann mit einer gesättigten ^lagnesiumsulfatlösung tiefällt. Der entstehende Niederschlag wird auf dem Filter gesammelt und mit gesättigter MgSO^-Lüsung gewaschen, hierauf in Wasser gelöst und entweder durch Alkohol oder durch Koagulation (Koag.-Temp. 6S — 70") oefällt. Nach Heuze fällt man das Hämocyanin nach ^'er(lünnen des ^entrifugierten und filtrierten Blutes mit Wasser durch Alkohol und gleich- zeitiges Erwärmen. Durch mehrfaches Dekantieren wird der fein verteilte Niederschlag gewaschen und auf einem Seidenfilter mit Wasser, Alkohol Luid Äther behandelt. Der Körper ist einheitlich, da er das einzige Blutprotein des Tieres ist. Darstellung in kristallisierter f^orm (He)ize^). Das zentrifugierte klare Octopusblut wird mit so^'iel gesättigter Am., SO4 -Lösung versetzt, :laß eben eine Niederschlagstrübung eintritt: diese wird eben wieder durch Wasserzusatz gelöst. Durch Zusatz von wenigen Tropfen verdünnter Essig- ^äure wird eine neue Trübung erzeugt. Nach halbtägigem Stehen hat sich 'in Kristallbrei zu Boden gesetzt, der auf einem Seidenfilter gesammelt nid mit einer Lösung von 7 Teilen Wasser und o Teilen gesättigter Ammon- 6 Fr. Samuely. f i des Schütteln. Es entsteht eine Fälkmg (quantitativ nur durch MgSO^), die '' man auf dem Filter mit gesättigter Mg SO4 -Lösung wäscht und in Wasser ! wieder löst. Eine Abscheidung erfolgt dann durch Koagulation bei 65 bis 1 70°. Zur vollkommenen Abscheidung ist mehrstündiges Erwärmen auf diese ! Temperatur nötig. | Die an der Luft blaue Substanz ist, wie das Hämocyanin der Mol- lusken, ein Metallalbuminat-ähnlicher Körper. Die Einheitlichkeit des so dargestellten Körpers ist nicht gesichert. Da der Körper durch Dialyse, Wasserverdünnung und COa-Sättigung seiner Lösung und auch durch ver- dünnte Essigsäure gefällt wird, scheint er Globulincharakter zu besitzen, vorausgesetzt, daß er nicht einem fremden (ilobulin nur beigemischt ist, und diese Möglichkeit ist noch nicht im negativen Sinne entschieden. Das Sauer- stoffbindungsvermögen, gemessen an der Leichtigkeit der Sauerstoffabgabe durch reduzierende Mittel, scheint ein von Spezies zu Spezies verschiedenes. Die Identität mit ]\Iolluskenhämocyaniu ist nicht sicher, eine Ent- scheidung wird erst möglich, wenn eine Ileindarstellung des Crustaceen- hämocyanins gelungen ist. Die folgenden gefärbten eiweißhaltigen Substanzen haben gleichfalls die Fähigkeit der Sauerstoffbindung, haben also biologisch respirato- rische Pigmentfunktion. Sie sind bisher nicht mit Sicherheit rein darge- stellt. Durch die Analyse der Spektroskopie aber ist ihre Verwandtschaft mit dem klassischen Hämatinkomplex sehr wahrscheinlich gemacht. | o. Ecliiiiochrom findet sich in den Zellelementen der Perivisceral- 1, flüssigkeit gewisser Echinodermen(u. a. Sphaerechinus sphaera) (i/ac Mimn^), l Grifiths "). Zur Darstellung bereitet man ein Extrakt des die gefärbten Zellen | einschließenden, vorher getrockneten Blutgerinnsels mit Wasser, Alkohol, Äther, \ Chloroform oder Benzin oder Schwefelkohlenstoff. Eine Analyse des amorphen | Abdampfrückstandes aus Chloroform, Benzin oder Schwefelkohlenstoffextrakten führt zu der bis jetzt unbewiesenen Formel C120 Hg-j NjaFe SgOi«- Das Spektralverhalten wechselt mit dem Lösungsmittel. Durch Kochen mit Mineralsäuren soll das Spektrum des Hämochromogens bzw. Hämato- porphyrins entstehen. Eine respiratorische Funktion kommt dem Farbstoffj nicht zw (Winterst (An). '^) \ 4. Chlorocruorin ist ein grüner Farbstoff, der aus dem Blut mancher Anneliden gewonnen werden kann (u. a. Siphonostoma, Spirographis Spallan zani, Sabellaarten ), Lancester*), Griß'iths^). 1) C. A. Mac Munn, Über die Färbuug des Blutes einiger Avertebraten. QuartJ Joiirii. (if microsc. Science. T. 25. p. 469 (1885). j -) A. B. Grifiths, Über Echinochroni, ein respiratorisches Pigment. Comptes rendj de l'Acad. des Sciences. T. 115. p. 419 (1892). | 3) H. Winterstein, Zur Kenntnis der Blutgase wirbelloser Seetiere. Biochemj Zeitschr. Bd. 19. S. 348 (1909). J ^) H. Lancester, Journ. of Anat. u. Phys. Vol. 2. p. 114 (1867); ibid. \o\.6 p. 119 (1870); vor allem Vol. 4 p. 119 (1869). ^) A. B. Griftiths, Über die Zusammensetzung des Chlorocruorins. Comptes rend; de l'Acad. des Sciences. T. 114. p. 1277 (1892). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 727 Man fällt das Blut z. B. von Sabella mit Alkohol. Die entstehende Fallung löst man in einer verdünnten Lösung von MgSÜ4. Durch Sättigen mit Mg SO^ erhält man einen gefärbten Niedersclilag, der auf dem Filter mit gesättigter Magnesiumsulfatlösung gewaschen wird. Die Lösung des Filter- rückstandes in Wasser wird durch Erwärmen auf 56 — 57" koaguliert. Das grün gefärbte Filtrat dieser Proteinkoagulate wird mit Alkohol gefällt. Der entstandene Niederschlag wird mit Alkohol und Äther gewaschen und ge- trocknet. Elem. Zus.: C 54-25, H 6-82, X 16-1(5, Fe 0-45, SO-TSVo- Die Rein- heit des Körpers ist durch diese Darstellungsmethode nicht garantiert. Der Körper hat wie das Hämoglobin ein Sauerstoffbindungsvermögen und zeigt in wässeriger Lösung spez. Absorptionsstreifen eines Chlorocruorins und eines Oxychlorocruorins: Oxychlorocruorin: 1 Streifen zwischen C und D (k 618 — 598), ein zweiter Streifen zwischen D und E (1 576 — 584), in ihrer Lage nicht mit den Streifen des Oxyhämoglobins übereinstimmend. Durch vorsichtige Reduktion entsteht ein Streifen des Chloro- cruorins, entsprechend den oben genannten dunkleren Streifen zwischen C und D. Durch vorsichtige weitere Reduktion entsteht anscheinend ein reduziertes Chlorocruorin (Laficester ), durch noch weitere Reduktion mit Schwefelammonium erscheinen schlielilich die Absorptionsstreifen des redu- zierten Hämatins. In Analogie zu diesen (|ualitativen Proben stehen die Beobachtungen (Griff Iths), dalü Chlorocruorin durch Einwirkung von Säuren oder Alkalien in Eiweil», Hämatin und Fettsäuren gespalten wird. 5. Pinnaglobiii im Blut von Pinna squamosa (Griff'iths)^): Das defibrinierte Blut wird mit Alkohol gefällt. Der abfiltrierte Niederschlag wird in verdünnter Magnesiumsulfatlösung gelöst und durch Sättigen mit MgSO^ wieder ausgefällt. Der neue Niederschlag wird auf dem Filter mit gesättigter Salzlösung gewaschen, in Wasser gelöst und durch Erhitzen der Lösung auf 56° von Albuminstoffen befreit. Das in Lösung befindliche Globulin des Filtrates wird zur Reinigung mit Alkohol gefällt, mit Wasser gewaschen und bei 60'^ dann im Vakuum getrocknet. Das Pinnaglobulin, das im Blut in farbloser Vorstufe vorhanden ist, und erst durch die Sauer- stoffbindung an der Luft in ein bräunliches Pigment übergeht, ist wie das Hämocyanin ein respiratorisches Pigment. Es enthält als Metallkoniponente Mangan. Elementare Zusammensetzung: C 55-7, H 6*24, N 16,24, S 081, :\In 0-35, U 21-29'Vo- Ähnliche respiratorische Globuline finden sich im Blut von Gastro- poden: Patella vulgata, Chiton, Doris und verschiedenen Tunicaten (letztere als Y-Achroglobine2) bezeichnet). Diese respiratorischen Substanzen sind ») A.B. Griffiths, Über die Zusammensetzung von Pinnaglobin, ein neues Globulin. Comptes rend. de l'Acad. des Sciences. T. 114. p. 840 (1892). •-) (rfitfiihs, Comptes rend. de l'Acad. des Sciences. T. 115. p. 359, 474. 738 (1892). T. 116. p. 1206 (1893j. 728 F^- Samuely. ungefärbt und metallfrei. Ihre Darstellung erfolgt nach der für Pinna- giobulin angegebenen I\Iethode. Die Achroglobine sind mangaufrei. Die Existenz solcher Körper ist bis jetzt unbewiesen. (3. Hämerythriii ist ein roter Farbstoff in den lUutkörperchen und der perienterischen Flüssigkeit mancher Würmer (Sipunculus nudus, Sipuii- culus Gauldii, Phascolosonia). Seine Darstellung versuchte Griff iths^) nach dem für Chlorocruorin mitgeteilten ^'erfahren. Der Körper kann (lualitativ leicht nachgewiesen werden, da er durch Verreiben der Blutzellen (die sich aus dem spontan gerinnenden Blut oder der perienterischen Flüssigkeit als obere Schicht absetzen) mit Wasser in Lösung geht. Der Körper ist eisenhaltig und schwefelhaltig, gibt aber kein cha- rakteristisches Absorptionsspektrum. Der Körper hat jedenfalls ein hohes Sauerstoffbindungsvermögen, so daß er Oxyhämoglobin zu reduzieren ver- mag (Krukenberc/). 7. Tetronerythrin ist ein roter Farbstoff, der sich in wechselnder Menge im hämocyaninhaltigen Blut höherer Crustaceen vorfindet. Darstellung aus Krabbenblut (Halliburton).-) ^lan fängt das Blut frisch auf und versetzt es zu maximaler Fällung mit Alkohol. Das rot gefärbte Filtrat der Eiweibfällung wird eingedampft, wobei sich der Farbstoff flockig abscheidet. Derselbe wird in Alkohol oder Äther gelöst und nach dem für Lipoehrome gültigen ^■erfahren (vgl. S. 758 ff.) gereinigt. Der Körper zeigt vollständig die Eigenschaften der Lipoehrome und Tetronerythrine anderer Provenienz (vgl. daher bei Lipochromen S. 758 ff.). Der Körper hat, soweit bis jetzt bekannt, keine respiratorische Pig- mentfunktion. Er ist ])ei Crustaceen außer im Blut auch im Skelett und der Hypodermis enthalten (siehe Crustaceorul)in S. 760). 8. Melanosen im Blut und der Hämolymphe von Insekten sind Chro- mogene, die unter dem Einfluß tyrosinaseähnlicher Fermente in dunkel bis schwarz gefärbte Pigmente übergehen. Über ihre chemische Natur ist nichts Sicheres bekannt (v. Fib-th). Vermutlich handelt es sich um kom- plexe, Tyrosin oder zum mindesten aromatische Kerne enthaltende Eiweiß- derivate. 9. Über die Farlistoffe im Warmblüterblut (Hämoglolnn etc.) und über Lipoehrome s. S. o89 und S. 617. III. Farbstoffe der Galle. Die Methoden der Darstellung von (Tallenfarbstoffen sind in dem Spezialkapitel: „Gallenfarbstoffe und Abbauprodukte" (vgl. S. 635) einge- ') A. B. Griffifhs, Das Hämerythrin, ein respiratorisches Pigment im Blut gewisser Würmer. Comptes rend. de TAcad. des Sciences. T. 115. p. 6(j'J (1892). -) ir. IJ. llaUlburton, .Tourn. of phys. Vol. 6. p. 300 (1885); l c S. 725. Note 3. Tierische Pigmente und Farbstoffe. 729 lu'ud beschrieben. Es erübrigt sich hier eine eingehende liesprechiing. Hin- gegen sollen die Derivate dieser Farbstoffe, und vor allein die Methoden ihrer Darstellung aus tierischen Flüssigkeiten, ihrer ([ualitativen und luantitativen Bestimmung besprochen werden. Die Galle der Menschen und Tiere hat eine goldgelbe oder grüne Farbe, die durch die Anwesenheit mehrerer Gallenfarbstoffe bedingt ist. Kur ein Teil dieser gefärbten Substanzen ist bis jetzt aus der frischen, physiologischen Galle isoliert. Die Mehrzahl derselben ist aus der Leichen- galle oder aus pathologischen, die Farbstoffe eiuschlielöenden Konkrementen dargestellt. Als Gallenfarbstoffe sind isoliert und genauer studiert: Das iüli- rubin, Biliverdin (beide auch in der normalen Galle enthalten), das Choleprasin, Bilifuscin, Biliprasiu, Bilicyanin und Choletelin. Außer diesen Substanzen sind noch ein Cholohämatin und ein Bilipurpurin dargestellt worden. Ob die genannten Farbstoffe alle mehr oder weniger oxydierte Deri- vate eines einheitlichen, als Muttersubstanz fungierenden Bilirubins sind. ist noch nicht mit aller Sicherheit festgestellt. Nur für einige von ihnen gilt diese Genese als bewiesen. Daß die Gallenfarbstoffe im weiteren Sinn I)erivate und Verwandte des Blutfarbstoffs sind, darf auf Grund der chemi- schen Studien über die Konstitution dieser Körper bzw. ihrer einfacheren Derivate als sichergestellt gelten. Ebenso ist eine Beziehung zu pflanzlichen Chlorophyllen wahrscheinlich. Allen drei Farbstoffen ist ein gemeinsamer Grundkomplex der Konfiguration eigen. Die Konstitution der Gallenfarb- stoffe sell)st ist aber noch nicht aufgeklärt. I. Darstellungsmethoden für die natürlichen Gallenfarbstoffe. Bilirubin, das sich physiologisch in der Lebergalle aller Vertebraten. der Blasengalle des Menschen und der Fleischfresser, im Dünndarmiuhalt. im Blutserum des Pferdes, in ikterischen Geweben und Harn findet, wird nm besten aus Kalkkonkrementen der Gahenblase . in denen es als Bili- rubinkalk enthalten ist, dargesteht. Die größten Ausbeuten liefern die selteneren Gallensteine des Rindes und des Pferdes. Detaillierte Be- schreibung der Methode in Kap. Gallenfarbstoffe etc., S. 635 ff. Biliverdin findet sich neben Bilirubin im ikterischen Harn, in der ( )chsengalle und am Rande der Hundeplazenta. Eine Isolierung aus dieser natürlichen Form als reiner Körper ist noch nicht gelungen. Als oxyda- tives Umwandlungsprodukt ist Biliverdin zugänglicher (siehe unten). Choleprasin!) findet sich neben Bilirubin in Gallensteinen vom Kind. Über seine Darstellung siehe Kap. (lallenfarbstoffe etc.. S. tiHT. ') Tf. Küster, Beiträcre zur Kenntnis der Galleufarbstoffe. Zcitscbr. f. pbysiol. Chemie. Bd. 47. S. 294—322 C19UG). 730 Fr. Samuely. : Bilifuscin (v. Zuiiibusch)^) , Biliprasin (Staedeler-), Dastre vmd' Floresco)^), Bilicyanin (Heynskis \mA Canijjbell)'^) und Choleverdin oder' Cholecyanin (Stokvis)^) sind Ltieichfalls Farbstoffe, die aus Galle oder! Gallensteinen dargestellt sind. Es ist unwahrscheinlich, daß diese Substanzen ' primäre spezifische Gallenfarbstoffe sind. Vielmehr muß man sie als Um-; Wandlungsprodukte des vorgenannten primitiven Gallenfarbstoffes, des Bili- rubins, auffassen. Küster hält dieselben nicht für chemische Individuen,! sondern für Gemische. ( Die Besprechung dieser mangelhaft untersuchten Körper erübrigt^ sich an diesem Ort. 2. Isolierung der gelösten Gallenfarbstoffe. Um die Gallenfarbstoffe aus Lösungen (frische Galle, ikterischer Harn. Mageninhalt, wässerige Auszüge von Geweben oder Fäces) zu isolieren und; unter Umständen (jualitativen Proben oder der Identifikation zugängUclj zu machen, fällt man die Lösung mit einer mäßigen Menge von Kalkmilcl| unter kräftigem Um schütteln (fürchtet man die Anwesenheit von Blutfarb! Stoff, der durch überschüssige Kalkmilch in Hämatin verwandelt würde und durch seine Kalkfällbarkeit die (Jallenfarbstoffe verunreinigen respi ihre qualitativen Proben zweideutig gestalten könnte, so leitet man soforj nach der Kalkfällung zur Bindung des überschüssigen Kalkhydrates gas| förmige Kohlensäure ein). Den entstandenen Niederschlag wäscht man au dem Filter gut aus, bringt ihn unter Alkohol, fügt dann Chloroform hinzi und zersetzt in dieser Mischung die Kalksalze mit Essigsäure, hierau^ bringt man durch Wasserzusatz den Chloroformextrakt zur Abscheidung filtriert ihn und überläßt ihn der Verdunstung. Der Verdunstungsrückstami, wird durch Waschen mit Alkohol und Äther gereinigt. Schnelles Arbeitej ist ratsam. Ist die als Kalksalz gefällte Gallenfarbstoffmenge eine große, so kauj man die Kalkfällung nach dem Waschen trocknen und die ganze Salzmasf; nach der für Kalkkonkremente gültigen Methode weiter verarbeiten. 3. Methoden zum qualitativen Nachweis und zur Identifiki tion der Gallenfarbstoffe. Es liegt außerhalb des Rahmens dieser Abhandlung, die große Za der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Gallenfarbstoffe (BiJ 1) L.R.r. Zumhusch, Über (las Bilifuscin. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd S.446 (1901). 2) G.StaedeUr, Annalen der Chemie. T. 132. p. 328. =*) A. Düstre und X Floresco , Neue Gallenfarbstoffe. C. r. de TAcad. T. 11 p. 581. 1897. ^) A.Heipisms und G. Campbell, Pßligers Archiv. T. 4. S. 497 (1871). 5) B.Sfokris, Zentralbl. d. med. Wissensch. S. 241 (18fi8). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 73]^ rubin) wiederzugeben. Wir teilen nur diejenigen Reaktionen mit, die dem Nachweis direkt dienlich sind und fügen einige für die Identifikation ver- wertbare Daten (Spektralerscheinungen , Löslichkeit , charakteristische Salze) bei. Zum Nachweis der Gallenfarbstoffe in tierischen Flüssigkeiten und Geweben verwandelt man dieselben (lUlirubin, Choleprasin, Biliverdin etc.) durch Oxydation in andere Farbstoffe von charakteristischer P'arbemiualität. In manchen Fällen kommen diese Proben direkt an dem gefärbten Sekret zur Ausführung, in anderen Phallen (Blut, Anwesenheit von lUutfarb- stoff) müssen die Gewebsflüssigkeiten erst vorbereitet werden. Üci der Anstellung der Proben sind folgende Punkte vorher zu berücksichtigen: 1. In nicht zu eiweißreichen, tierischen Flüssigkeiten, die frei von Blutfarbstoff sind, stört der Eiweißgehalt nicht. 2. Die Anwesenheit von Blutfarbstoff erfordert eine Fällung der Gallen- farbstoffe als Kalksalze (siehe oben sub II). Aus dem entstehenden Nieder- schlag werden die Farbstoffe in der beschriebenen Weise extrahiert. Man kann auch die Proben direkt mit dem Niederschlag ausführen oder den- selben in dem Ptcagens von Hammarsten lösen (siehe unten). 3. In eiweißreichen Flüssigkeiten (Blutserum) fällt man die Protein- stoffe mit Alkohol. Die Lösung wird dann mitsamt dem Niederschlag mit einer Spur von Salzsäure oder Schwefelsäure gekocht. Das smaragdgrüne Filtrat kann dann direkt geprüft werden. 4. Stark ikterischer Harn bedarf keiner weiteren Vorliereitung. Man kann die Farbenproben direkt an einer Harnprobe oder an dem Rückstand eines Chloroformextraktes oder an einer Kalkfällung der Farbstoffe vornehmen. Die Eigenfarbe des Harns oder der Indikanreichtum ist bisweilen für die Wahl der zur Verfügung stehenden Proben entscheidend. 5. Den tierischen festen Geweben entzieht man den Farbstoff (Bili- rubin) durch Kochen mit Alkohol. Generelle GallenlarbstofTreaktioii. 1. Die Reaktion nach Gmelin. Eine kleine Menge der zu prüfen- den wässerigen Lösimg wird vorsichtig mit einer Lösung von konzentrierter Salpetersäure, welche etwas salpetrige Säure enthält, unterschichtet. An der Berührungsstelle beider Flüssigkeiten treten nacheinander Rinue von farbigen Schichten auf, die von oben nach unten gerechnet die Reihen- folge von Grün, Blau, Violett, Rot und Rotgelb aufweisen. Charakteristisch ist die Grünfärbung und das Rotviolett, da ohne diese eine Verwechs- lung mit Lipochromen möglich ist. Die ganze Reaktion soll langsam im Farbenspiel fortschreiten, was nur durch ein gewisses Minimum von sal- petriger Säure zu erreichen ist. Alkoholanwesenheit stöi-t die Beurteilung der Probe. Die Empfindlichkeit ist eine außerordentliche (1 P,ilirul)inali■) Bosi)ii>c]\e Probe. 2) Man verwendet als Oxydans des angesäuerten ikterischen Harns eine l'Voise alkoholische Jodtinktur. An der (irenze der tiberschichteten Flüssigkeiten entsteht ein grüner, lange haltbarer Farbring. Für Hupperts Reaktion: Die bereits erwähnte Modifikation von Xakatjama (siehe S. 732, Note :•]), besonders für indikanreichc dunkle Harne i^erwertbar. Für Hmmnarstens Vrohe'^): Man fällt in 10 cm^ ikterischen Harns die Farbstoffe mit einigen Kubikzentimetern ßaClo-oder CaClo-Lüsung, mischt gut durch und zentrifugiert. Die trübe, überstehende Flüssigkeit wird ab- gegossen. Dann werden 1 — •2cm^ des Säurereagens (siehe oben) zugefügt, stark durchgeschüttelt. Nach abermaligem Zentrifugieren ist die über- stehende Flüssigkeit grün. Bei Anwesenheit von wenig Gallenfarbstoff ver- wendet man ein Säuregeraisch von 1:99 statt 1:19 (Salpetersäure: Salz- säure). 1. Qualitative Speziaireaktionen und Eigenschaften der ein- zelnen Gallenfarbstoffe. Für Bilirubin: 1. Die wässerige Bihrubinlösung ist noch in größter ^^erdünnung (1:500.000) gelb, sie zeigt keine Absorptionsstreifen, son- lern eine kontinuierlich vom roten zum violetten Ende fortschreitende V'erdunklung. Eine alkalische Bilirubinlösung in Wasser färbt sich nach Zusatz von iberschüssigem Ammoniak und Chlorzink erst tief orange, alsbald oliven- )raun, zuletzt grün. Im Spektrum dieser Lösung treten die Streifen les alkalischen Cholecyanins im Rot zwischen C und D, nahe bei C auf. Aus einer wasserfreien Chloroformlösung von Bilirubin fällt Brom in ]hloroform gelöst ein schwarzblaues Pulver eines Trii)rombiliriibins, das in Vlkalien dunkelblau löslich ist. ') 0. Rosenbach, Zur Untersuchung des Harns auf Gallenfarbstoff. Centralbl. f. I. med. Wissensch. Nr. 5 (1876). ^) //. Bosin, Eine empfindliche Probe für den Nachweis von Gallenfarbstoff im larn. Berliner klin. Wochenschr. Nr. 30. S. lOG (1893). ') 0. Hammarsten, Centralbl. f. med. Wissensch. Nr. 55(1876); vgl. Hoppe-Sei/ler, niierfelder, Chemische Analyse. S. 456 (1903); vgl. auch Skand. Arch. f. Phys. Bd. 9. 1. 313 (1899). 734 Fr. Samuely. Mit Diazo verbin düngen kondensiert sich Bilirubin zu scliöneii Farbstoffen {Ehrlich [siehe S. 732, Note 4], Pröscher'^), Orndorff und Tee^ple "■). Nachweis nach £'/?rZ/cA. 3) Man versetzt eine Lösung von Bilirubin in Chloroform (bzw. einen Alkoholauszug eines mit Ammonsulfat gesättigten ikterischen Harns) mit dem doppelten Volumen einer Sulfodiazobenzol- lösung (dargestellt aus 1 g p-Anilinsulfosäure (-Sulfanilsäure) in 1000 cm^ Wasser + 9*1^ Na NC),) und soviel Alkohol, daß eine homogene Mischunfi entsteht. Die bei dieser Mischung aus Gelb in Rot umgeschlagene Färbung geht durch tropfenweisen Zusatz von konzentrierter Salzsäure über Violett in ein intensives Blau über. Der Farbstoff kann mit Chloroform extrahiert werden oder bei Anstellung der Probe mit Harn durch Sättigen mit Koch- salz ausgesalzen werden. Auf AlkaUzusatz entsteht durch Rot eine Grün- färbung. Der Umschlag läßt sich durch Überschichtung mit Kalilauge schön verfolgen. Der Nachweis von Pröscher durch Kuppelung mit Diazoacetophenon bietet vor der Probe nach Ehrlich kaum Vorzüge. Bilirubin färbt sich an der Luft oder beim Erwärmen grün. 2. Für Biliverdin. Dasselbe ist unlöslich in Chloroform (Gegensatz zu Bilirubin), aber leicht löslich mit blaugrüner Farbe in Alkohol (des- gleichen Gegensatz zu Bilirubin). Die alkoholische Lösung wird mit Säure smaragdgrün (vgl. Hammarsten- und Huppert-VroW). Auch die AlkaUsalze des Bilirubins sind grün. 3. Für Choleprasin. Es scheint die Löslichkeit mit grüner Farbe in Eisessig und der Schwefelgehalt charakteristisch. 4. Für Bilifuscin. Gut löslich in Eisessig, unlöslich in Wasser. Die Lösungen der Alkalisalze sind tiefbraun. Die Gmelinsche Gallenfarbstoff-j reaktion und die sonstigen Proben versagen, nur die alkalischen wässerigen, Lösungen zeigen einen Absorptionsstreifen zwischen C und D. I 5. Für Biliprasin. Ist wie Biliverdin mit grüner Farbe in Alkohol löslich. Die Lösung A\ird aber durch Ammoniakzusatz braun, durch nach-| folgendes Ansäuern wieder grün. Nur die Lösung der Alkalisalze zeigt einen: Absorptionsstreifen zwischen C und D. I 6. Für Bilipurpurin. Die Lösungen in Chloroform sind dichroitischl jNIit konzentrierter Schwefelsäure entsteht eine grüne, mit verdünntem Alkali eine blaugrüne Farbe. Es zeigt 3 Absorptionsstreifen, einen im Gelb, zwei im Grün. ^) F. Pröscher, Über Azetophenonazobilirubin. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 29; S. 411 (1900). 2) W. B. Orndorff und J. E. Teeple, Über Bilirubin, den roten Farbstoff der Galle »S'aZfco?rsÄ;i-Festschrift. Berlin 1904. S. 289. I ^) F. Pröscher, Über den Nachweis von Bilirubin im Harn mittelst der Ehrhch\ sehen Diazoreaktion. Centralbl. f. inn. Med. Xr. 22. S. 169 (1901). Tierische Pigmente luul Farbstoffe. 7tj5 5. Quantitative Bestimmuno' der Gallenfarbstoffe im Harn. Eine exakte Methode der Bestimmung existiert bis heute iiiclit. nie ierzu angegebenen Wege von JoUes^) zur Bestimmung von Bilinibin und ie klinische kolorimetrische Bestimmung nach Bouma-) führen niu- zu unäherungswerten. Wir übergehen daher ihre Besprechung. ümwaudluugsprodukte des Bilirubins. Oxydation. Es unterliegt wohl keinem Zweifel, daß das für die hnelin^oh^ Probe charakteristische Farbenspiel durch das Entstehen von )xydationsprodukten des Bilirubins bedingt ist. Das erste Oxydationsprodukt teilt das grüne Biliverdin dar, das vielleicht schon unter pliysioh)gischen iJedingungen sein Vorkommen nur der leichten Oxydierbarkeit des Bili- ubins verdankt. In welcher Beziehung aber das grüne Choleprasin und [as gleichfalls grüne Biliprasin, beide in der natürlichen Galle l)z\v. deren Konkrementen enthalten, zu dem Biliverdin stehen, ist nicht aufgeklärt. )urch weiter fortschreitende Oxydation von Bilirubin oder Biliverdin ent- teht ein blauer Farbstoff, das Cholecyanin bzw. Bilicyanin. schbolilich äldet sich über den Weg eines noch nicht studierten roten Farbstoffes das gelbbraune Choletelin (Maly). Das als Bilixanthin bezeichnete Oxydations- irodukt ist vielleicht auch in diese Pieihe einzufügen. Die Einheithchkeit der hier angeführten Substanzen und ihre che- nische Individualität ist durch die chemische Analyse wenig begründet. ^]ine Beurteilung der Analysenzahlen oder der Eigenschaften dieser Körper ällt um so schwerer, als sie gewiß nicht immer aus einem einheitlichen Bilirubin dargestellt sind. Charakteristisch und die spezifische Verschieden- leit dieser Körper beweisend aber ist das Verhalten ihrer spektralanalytisch estgestellten Absorptionsstreifen. Einige kurze Daten über die Darstellungsmethoden dieser Gallenfarb- toffderivate seien hier mitgeteilt. Darstellungsmethoden. Biliverdin. Man überläßt eine alkalische Bilirubinlösung in dünner schiebt am Boden einer Schale ausgebreitet der Autoxydation an der Luft. )ie allmählich brauugrün gewordene Lösung wird mit verdüiniter Salz- ;äure gefällt. Das ausfallende, amorphe Produkt wird auf einem Filter )der durch Dekantieren chlorfrei gewaschen und zur Reinigung mehr- ach mit Wasser aus seiner alkoholischen Lösung ausgefällt. Zur Trennung 'on nicht umgewandelten Bilirubin extrahiert man den gewonnenen Ktirper lusgiebig mit heißem Chloroform. ^) Ä. Jolles, Beiträge zur qualitativen und quantitativen Gallenfarlistoffliestimniung m Harn. Zeitschr. f. pliys. Chemie. Bd. 27. S. 83 (1899). -) J. Bouma, Über eine klinische Methode zur quantitativen Bestimmung der Gallen- arbstoffe im Harn. Deutsch, med. Wochenschr. Bd. 30. S. 884 (1904). 736 Fr. Samuely. Statt der Autoxydation kann man schneller nach Hugoimenq und Doi/on ^) mit Natriumperoxyd in schwach salzsaurer Lösung oxydieren. ]\lan mischt zu diesem Z\Yeck das trockene Bilirubin mit nicht zu I viel Natriumperoxyd, gibt hierzu tropfenweise Wasser und dann verdünnte Salzsäure bis zur Sättigung und dann bis zu dem Auftreten einer grünen Farbe. Alsdann filtriert man schnell und wäscht mit Wasser bis zum i Versch^^^nden der Säurereaktion. Den Pigmentrückstand kristaUisiert ' man aus absolutem Alkohol um. (lenaues zur Methodik siehe S. 642. • Auf eine Besprechung der als Cholecyanin und Choletelin^.s,^^ > bezeichneten Oxydationsprodukte kann hier verzichtet werden. Die sehr veralteten Angaben über diese Substanzen bedürfen einer dringenden Revision, nachdem jetzt erst absolut einheitliches Ausgangsmaterial von Bilirubin vorliegt. IV. Farbstoffe im Harn von unbekannter Zusammensetzung. Im normalen und pathologischen Harn kommen mehrere Farbstoffe vor. Bekannt, isohert und eingehender studiert sind: das Urochrom, das Urorosein, das Uroroerythrin und schließhch das Urobilin. Keiner dieser Farbstoffe ist bis jetzt in sicher analysenreinem Zustand isoUert, von keinem ist die Konstitution oder chemische Gruppenzugehörig- j keit aufgeklärt. Außer einigen Versuchen, das Urobilin als ein Derivat der! Gallenfarbstoffe zu erklären, herrscht noch vollständige Unsicherheit über die physiologische Genese dieser Substanzen. [ Die Darstellung dieser Farbstoffe erfolgt mit Hilfe geeigneter Extrak-I tionsmittel aus dem Harn bzw. der eingeengten Harnflüssigkeit, oder durch Extraktion von künstlich erzeugten, den Farbstoff adsorbierenden Salzfällungen. Die Identifikation und der quahtative Nachweis geschieht durch charak-j teristische Farbenreaktionen , Farbeneigenschaften und Farbumwandlungenj der Salze und Spektralerscheinungen der Farbstofflösungen in orgauischenl Solventien. Da die verschiedenen Methoden der Isolierung keineswegs zij konstant zusammengesetzten Körpern führen, da andrerseits auch nur du] Elementarzusammensetzung bis jetzt ein Kriterium der Pieinheit und Em- heitlichkeit der fraghchen Substanzen darstellt, so müssen wir in diesem Zusammenhang eine Mehrzahl von Darstellungsmethoden mitteilen. 1. Uroclironi ist der Farbstoff des normalen und pathologischei| Harns. Normale Menge etwa 0"15''/o. 1) L. Hugounenq und M. Do>/on, Über ein neues Verfahren zur Darstellung voil Bilirubin. Compt. rend. soc. biol. f. 48. p. 430 (1896); Arch. de phys. (5.) T. 8. j ==) A. Heynsius und F. Campbell, Die Oxydationsprodukte der Gallenfarbstoffe uu'j ihre Absorptionsstreifen. Pflügers Arch., Bd. 4. S. 497 (1872). — A. Heijnsius, Über Cliolc cyan und Choleteliu. Ffiügers Arch. Bd. 10. S. 246. =>) B. J. Stokris, "Zentralbl. med. Wissensch. S. 785 (1872); Bd. 211. S. 449 (1873. *) M. Joffe, Beitrag zur Kenntnis der Gallen- und Harnfarbstoffe. Ibid. (1868). \ Tierische Pigmente und Farbstoffe. 7;-37 Darstellungsmethode nach Garrod.^) Größere Harnmengen werden n Portionen von ca. je 11 mäßig erwärmt und mit fein gepulvertem festem Vmmonsulfat gesättigt. Zu der klar filtrierten Flüssigkeit setzt man '4 ihres .'olums absoluten Alkohol. Hierbei scheidet sich eine alkoholisch wässerige •Schicht ab, welche den Farbstoff enthält. Diese wird in viel kaltes Wasser ein- regossen. Die entstehende Lösung wird abermals mit Ammonsulfat gesättigt. - scheidet sich wiederum eine alkoholische Farbstofflösung ab, die man durch Vufgießen auf festes Ammonsulfat in einem Standgefäß bei gelinder Wärme ■ntwässert. Die überstehende alkoholische Lösung wird hierauf abgetrennt ind bei alkalischer Reaktion unter häufigem Zusatz von Ammoniak auf lern Wasserbad eingetrocknet. Der braune Abdampfrückstand, der noch \iiimonsulfat und Indoxylschwefelsäure enthält, wird 1 — :>mal mit Essig- tlier gewaschen (Indikanbeseitigung) und dann längere Zeit unter absolutem Vlkohol belassen. Die schön gelb gefärbte Alkohollösung wird bis zur Orange- Tirbung eingeengt und mit dem gleichen Volumen Äther versetzt. Der lockig abgeschiedene Farbstoff wird auf dem Filter mit Äther gewaschen, getrocknet und nochmals mit Chloroform und Äther extrahiert. Das Urochrom unterbleibt als eine amorphe braune Substanz. Methode nach Thudichum.'^) 'Sinn fällt aus dem Harn durch Zusatz von Ätzbaryt und Baryum- icetat die Salze und die etwa beigemengten Blutfarbstoffe. In dem Filtrat ällt man nach 24 Stunden das Urochrom und Indoxyl mit Bleiacetat und Simmoniak. Den entstehenden Bleiniederschlag wäscht man auf dem Filter gut \ns und zerreibt ihn mit verdünnter Schwefelsäure. Das Filtrat des Baryum- uid Bleisulfates wird mit Baryumkarbonat von überschüssiger Schwefelsäure icfreit, abermals filtriert und mit Kohlensäure von Baryt befreit. Das ge- .irbte Filtrat wird nun mit festem essigsaurem Quecksilberoxyd versetzt. )('r entstehende Niederschlag wird auf dem Filter mit heißem Wasser ge- va sehen. Die gelb gefärbte Quecksilberfällung wird, in Wasser fein ver- ("ilt, mitH-^S von Quecksilber befreit. Die gelbe, durch einen Luftstrom von 1., S befreite Lösung, welche noch Spuren von Essigsäure und Sahnen ent- lält, wird mit frisch gefäUtem Silberoxyd geschüttelt und filtriert. Das Mitrat wird mit H., S von Silber befreit und eingedunstet. Es hinterbleibt 'in Urochrom in Form einer festen, gelben Substanz zurück, das anscheinend on der Substanz von Garrod verschieden ist. Methode von Schunck. 3) Man fällt den Harn maximal mit Bleizucker, las gefärbte Filtrat wird mit Bleiessig gefäUt und auf dem Filter gut waschen. Hierauf zerleot man den Niederschlag unter Wasser mit Schwefei- re ') A. E. Garrod, Beitrag zum Studium des gelben Farbstoffs des Urins. Proc. of H' Roy. Soc. Vol. 55. p. 394 (1894). =) J.L.W.Thudichum, Chemische Studien über den Harnfarbstoff. Brit. med. Journ. .509 (1864); Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 104. S. 257 (1868). ») Schunck, vgl. Huppert-Neubauer, Analyse des Harns. 10. Aufl. S.509. — Original: 'lue. roy. soc. Vol. 16. p. 85 (1867). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. 11. 47 738 Fr. Samuely. Wasserstoff und dampft das gefärbte Filtrat des Schwefelbleis zur Trockene. Der Abdampf rückstaud wird mit absolutem Alkohol extrahiert und nach der Methode von Garrod mit Äther gefällt. Auch dieses ätherunlösliche Uro- chrom ist von der Garrodi^oh^w Substanz verschieden. Ein Teil bleibt äther- löslich. Methode nach Bondzt/nskL Domhrowski und Panel-^) Bei der Darstellung der Alloxyproteinsäure wird ein Urochrom ge- wonnen. Als Ausgangsmaterial dienen die Gemenge von Calciumsalzen der Säuren der Alloxyproteinsäuregruppe. Die chlorfreien Salze werden in Wasser und Essigsäure zu neutraler Reaktion gelöst und mit einer Kupfer- acetatlösung versetzt. Der entstehende reichliche Niederschlag wird nach einiger Zeit auf dem Filter gesammelt, mit Schwefelwasserstoff alsdann in der Wärme bei 45" zerlegt. Es entstehen braunrot gefärbte Lösungen des Urochroms. Die Identität dieses Körpers mit dem klassischen Urochrom steht noch nicht fest. Darstellung nach Domhrowski^) als Silbersalz. Aus dem Harn werden Schwefelsäure, Phosphorsäure und Harnsäure zunächst mit ammoniakalischem Baryum- und Calciumacetat gefällt. Auf 101 Harn mg Ca-Acetat + b?) g Ba-Acetat + 4H cm^ 21 "/o NH3. Die Flüs- sigkeit wird mit Essigsäure neutralisiert und filtriert, aus dem schwach angesäuerten Filtrat wird das Urochrom mit Kupferacetat gefällt. Der graugrüne Niederschlag wird nach 24 Stunden auf dem Saugiilter ge- sammelt, gut gewaschen und in Wasser fein verteilt mit HgS entkupfert. Nach Entfernung des HaS-Überschusses durch Vakuumdestillation in einer | COa-Atmosphäre bei gelindem Erwärmen wird die gelblichrote Flüssigkeit • mit einem geringen Überschuß von Baryt gefällt. Das Filtrat des geringen gelben Niederschlags wird durch CO, von Baryum befreit, im ^'akuum zum Sirup eingedickt und mit starkem Alkohol ausgefällt. Die Fällung wird als- , dann in Wasser gelöst durch Zusatz von Natriumsulfat (ohne Überschuß) ' in das Natriumsalz verwandelt; die Lösung dieses Salzes wird im Vakuum \ eingeengt und durch Zusatz von Silbernitrat von Chlor befreit. Aus dem ' Filtrat des Chlorsilbers wird das Silbersalz des Urochroms durch Zusatz von , Alkohol und einen Überschuß von konz. Silbernitratlösung gefällt. Das Salz wird zur Entfernung von Nitrat in Wasser gelöst und mi t starkem Alkohol ; gefäUt. ' j Methode von Hohlweg.^) Die Methode hat den Vorzug, den Farb-| Stoff ohne Einwirkung chemischer Agentien durch Adsorption anzureichern, j M A. BondzynsM, H. Dornhrowslci und K. Panek, Über die Gruppe von im nor- 1 malen Menschenharn enthaltenen Säureu. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 46. S. 83! (115). 1905. ' I ') St. Domhrowshi, Über die chemische Natur des spezifischen Farbstoffes des j Harns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 54. S. 188 (1907); vgl. auch H. Liehcrmann, t)ber | die Gruppe schwefel- und stickstoffhaltiger Säuren im normalen Menscheuharu. Zeitschr. , f. physiol. Chemie. Bd. 52. S. 129 (1907). | ^) H.Hohlweg, Zur Kenntnis des Urochroms. Biochem. Zeitschr. Bd. 13. S. 198 j (1908). — Vgl. ibidem, Bd. 13. S. 205. 208 (1908). Tierische Pigmente uud Farbstoffe. 7^^«) ie führt jedoch bis jetzt nur zu einem Kohurochrom . das aher einer veiteren Verarbeitung für etwaige KonstitutionsnachAveise sehr zugäng- ich ist. Der eingeengte Harn oder das saure Filtrat des vorher bei ammonia- [alischer Lösung mit Baryum- und Calciumacetat ausgefällten und von Jiaryt nit CO2 befreiten Harns filtriert in langsamem Strom durch eine Schicht ^on Tierkohle , die sich in 5 cm breiten, 5 cm langen Glasröhren befindet. Venu die Tierkohle mit adsorbiertem Farbstoff gesättigt ist, was an den arbig abtropfenden Filtraten erkenntUch ist, wird sie herausgenommen, getrocknet und in neuen Rohren mit Eisessig extrahiert. Das strohgelbe )is braunrote Extrakt wird im Vakuum bei 40" eingeengt und zu nahezu ^ständiger Entfernung des Eisessigs zum Sirup eingedickt. Der Sirup tvird dann mit wenig Wasser dickflüssig angerührt und mit dem lOfachen Volumen Äther gefäUt. Es bildet sich bei Verwendung größerer Massen eine larzige Masse — der überstehende Äther ist meist ungefärbt — , die nach L2 Stunden erstarrt und bei 40" getrocknet wird. Aus 25 l unverdünnten Harns werden etwa ol g trockene Substanz iieses Rohurochroms gewonnen. Zur Darstellung von Derivaten, Saken oder Bromsubstitutionspro- lukten ist eine wässerige Lösung des sirupösen Rückstandes der Eisessig- jxtrakte direkt verwertbar. Eigenschaften des L^rochroms. Die nach verschiedenen Methoden iargestellten Farbstoffe zeigen keine übereinstimmenden Eigenschaften. Das Präparat nach Garrod und Hohlweg ist unlöslich in Alkohol. Amylalkohol. A.ceton, Benzol, Chloroform, Ligroin, Äther und F^ssigäther. Mischungen von Äther oder Chloroform mit Alkohol lösen. Fällungsmittel sind: Phosphorwolframsäure und Phosphormolyb- länsäure. Die wässerige Lösung zeigt keine Absorptionsstreifen. Als einigermaßen bezeichnende Probe gilt das Auftreten einer starken, grünlichen Fluoreszenz nach ^'ersetzen einer LIrochromlösung mit einem Acetaldehyd, kurzem Erwärmen und nachfolgendem Chlorzinkammo- liak. Die Fluoreszenz wird nach 48 Stunden besonders deutlich. Ein für Harnurobilin (s. dort) charakteristischer Absorptionsstreifen m Blau entsteht hierbei nicht. Die Derivate verschiedener Urochrome, wie das Uromelanin, l'ro- )ittin (Thudichum) oder das Urianin bzw. Urian (Schunck) sind so wenig eingehend untersucht, daß auf ihre Besprechung verzichtet werden darf. Für ein Urochromkupfer ergab sich die Elementarzusammensetzung: C 36-76 H3-56 N 9*72 8 2-57 Cu 20-10 t^. c (Doinbrowski etc.)- ür ein Ca-Salz: C 40-39 H 4-85 N 9*02 Asche 4-86 Ca 6-88 (Snlomonson); ür das freie Urochrom aus einem Silbersalz: C 43-1 H 5-1 N 11-1 S 5-1 0 35-5o/o- 47* 740 Fr. Samuel}'. Quantitative Urochrombestimmung. 1. Eine von Klemperer^) ausgearbeitete kolorimetrische Methode zur annähernden (juantitativen Urochrombestimmung hat mehr kUnisches In- teresse. 2. Der mit Barythydrat und Baryumacetat vorbehandelte Harn wird in abgemessener Portion mit Kupferacetat gefällt, der Niederschlag in einer bekannten Menge Ammoniak gelöst. Nun fällt man die Purinkörper mit am- moniakalischer Silberlösung. Der Stickstoffgehalt der gut mit Wasser ge- waschenen Kupferfraktion und der aus der entsprechend großen Harnmenge gewonnenen Silberfraktion wird bestimmt. Die Differenz beider Werte gibt den Urochrorastickstoff (vgl. Dombrowski). ^) 2. Uroerythrin (Purpurin, rosige Säure) ist der rote Farbstoff, der durch Adsorption an dem sogenannten Sedimentum lateritium, d. h. den spontanen Uratniederschlägen des Harnes haftet. Er wird aus diesem Urat- sediment isoliert. Er findet sich im normalen Harn, wird aber anscheinend durch allerlei Krankheiten, besonders solchen, welche eine Stauung des Leberkreislaufes herbeiführen, vermehrt. Genaue und sichere klinische Daten zu dieser Frage liegen nicht vor. Methode der Isolierung nach GarrodJ) Das gesammelte Uratsediment wird unter gelindem Erwärmen in wenig Wasser gelöst. Durch Sättigen mit festem Ammoniumchlorid werden die gefärbten Urate wieder gefällt. Man filtriert ab und entfernt durch tüchtiges Waschen mit einer gesättigten Ammoniumchloridlösung andere etwa anhaftende Harnfarbstoffe (Urobilin!). Den Niederschlag digeriert man dann im Dunkeln einige Stunden lang mit heißem, absolutem Alkohol, filtriert dann ab und verdünnt mit dem doppelten Volumen Wasser. Die entstehende Lösung wird zur Sicherheit mit Chloroform ausgeschüttelt (Entfernung von ' Hämatoporphyrin), dann mit Essigsäure schwach angesäuert und abermals \ mit Chloroform erschöpft. Die jetzt uroerythrinhaltige Chloroformlösung- i wird mit Wasser säurefrei gewaschen und bei niedriger Temperatur im , Dunkeln verdunstet. Qualitativer Nachweis. Uroerythrin ist aus genuinem Harn mit Amylalkohol auszuschütteln. (Vorsicht vor Verwechslungen mit Urorosein.) j Die Lösung wird durch konzentrierte Schwefelsäure karminrot, durck starke, ; fixe Alkahen über purpur und blau schnell grün gefärbt. Lösung wie | Lösungsrückstand verblassen leicht im Licht. 1) G.Klemperer, Die Messung des Harnfarbstoffes. Berliner klin. Wocheuscbr. | S. 313 (1903). j -) St. Dombrowski, Die Ausscheidung des Urochroms im Harn von gesunden I Menschen, sowie in einigen Krankheitsfällen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 54. S. 390 ^ (1907). . I 3) A.E. Garrod, A contribution to the study of uroerythrin. Journ. of physiol | Vol. 17. p. 439 (1895). Tierische Pigmeute und Farbstoffe. 74;^ Mit Chlorzinkammoniak entsteht keine Fluoreszenz (Gegensatz zu Urochrom bzw. Urobilin). Geeignete Lösungsmittel sind : Essigäther, Chloro- form, Alkohol, Wasser. Spektralprobe. In verdünnter alkohohscher Lösung eine breite Lichtabsorption, die in der Mitte zwischen D und E beginnt, genau bis F reicht und zwischen Eb eine kleine, schwache Aufhellung zeigt (das nach violett gelegene Band ist etwas dunkler). Konzentrierte Lösungen zeigen einen zusammenhängenden, kontinuierlichen Schatten , der bei 1 = 002 beginnt. 3. Uroroseini) ist ein roter Farbstoff des Harns, der aus einem farblosen Chromogen durch Behandeln des Harns mit starker Salzsäure oder gleichzeitigem Zusatz einer Spur Chlorwasser oder Chlorkalk oder Nitrit als Oxydans entsteht; seine Menge ist bei Kranken vermehrt, sein Chromogen aber in jedem normalen Harn enthalten. Es ist sehr wahr- scheinlich, daß dieser Farbstoff mit dem sogen. Skatolrot identisch ist. Nach den jüngsten Beobachtungen Hertcrs ist der Körper mit der Indol- essigsäure identisch (vgl. S. 755 bei Skatolrot). Darstellung des Chromogens nach Äosiw.2) Eine größere Harn- menge wird mit Bleizucker versetzt; die Fällung wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit Ammoniak versetzt, die neue Fällung wird mit der ersten Fällung vereinigt und bei mittlerer Temperatur getrocknet. Die fein zerriebenen Pulver extrahiert man am Pdickflußkühler mit absolutem Alkohol. Die Ex- traktion wird so lauge fortgesetzt, als noch eine Alkoholprobe nach Zu- satz von Chlorkalk und von Salzsäure Piotfärbung zeigt. Aus den unge- färbten alkoholischen Lösungen entfernt man Spuren von P)lei mit Schwefel- wasserstoff. Die alkoholischen Filtrate werden hierauf konzentriert, mit Äther gefäUt und dann durch Verdunsten vom Äther befreit. Die Kück- stände werden dann gut mit Äther zur Befreiung von Phenolen erschöpft und hierauf wiederum in gauz wenig Alkohol gelöst. Zu dieser Lösung wird Äther bis zu eben beginnender Trübung zugesetzt. Beim Stehen scheiden sich farblose Nadelkristalle des Chromogens ab. Ein kristallisiertes Chro- mogen erhielt auch Herter als Piückstand der Chloroformextrakte der ent- bleiten, nach Rosin vorbereiteten, farblosen Flüssigkeiten. Qualitativer Nachweis im Harn und Lsolierung des Frö- re sein s. Man versetzt den Harn mit konzentrierter Salzsäure und Chlorkalk. Gewisse Harne geben je nach dem Pieichtum an Chromogen und einem Ge- halt an Nitraten die Rotfärbung schon nach Mineralsäurezusatz allein. In diesen Fällen wird die Oxydation durch Abspaltung von Nitriten durch die starke Säure oder durch bereits vorher bakteriell im Harn gebildete Nitrite vermittelt {Herter^). Das frei werdende Indigo wird durch Chloroform ^) M. Nencki und X. Sieber, Uroroseiii, ein neuer Harnfarbstoff, .lourn. f. prakt. Chemie. 26. 333 (1882). ^) H.liosin, Ein Beitrag zur Lehre von den Harufarbstoffen. Deiitsclio med. Wochenschr. S. 51 (1893); Zentralbl. f. klin. Med. S. 510 (1889). ') C. A. Herter, Die Beziehung von nitrifizierenden Bakterien zur l'roroseinreak- tion von Nencki und Sieber. Journ. of biol. Cheni. Vol. 4. p. 239 (1908). 742 Fr. Samuely. entfernt. Der rosa gefärbte Harn gibt den Farbstoff beim Durchspülen an Amylalkohol. Die rot gefärl)te Amvlalkohollösung entf ärlit sich unter Bildung ungefärbter Salze beim Durchschütteln mit Lauge; die klare Amylalkohol- lösung , Avelche jetzt den reinen Farbstoff ohne beigemengte Pigmente enthält, färbt sich beim Ansäuern wieder rot. Von Indigrot kann man auch auf folgendem Weg trennen: Der farbige, uroroseinhaltige Harn wird alkalisch gemacht und bei dieser Reaktion mit Äther ausgeschüttelt. Es geht das farblose Natronsalz des Uroroseius mit Indigrot in Lösung. Nun schüttelt man mit Säure aus. Es bleibt das Indigrot in ätherischer Lösung, während das freie Urorosein die Säure rosa förbt. Spektralprüfung. Die Lösungen in Amylalkohol geben einen scharf begrenzten Absorptionsstreifen bei 1 = 557 ^j-jj. im Grün zwischen D und E, und zwar näher an D. Diese Probe ist zur sicheren Identifikation unerläßlich. 4. Urobilin und Urobilmog:en ist in jedem normalen, entleerten Harn enthalten. Seine Menge ist bei Fieberkranken, Ikterischen and Leber- kranken sowie sonstigen pathologischen Prozessen vermehrt. Sicher aber ist der Farbstoff ein physiologisches Produkt; ITrobilin entsteht aus einem färb- j losen Chromogen unter dem Einfluß des Sonnenlichtes. j Außer im Harn kommt es im Dünndarm, Dickdarm, in den Fäzes (nicht ' im Meconium) vor, wo es durch reduzierende Mikroorganismen aus Deri- | vaten des Gallenfarbstoffes entsteht. Es ist ferner in der Kuhmilch, in menschlichen Plazenten und im Gewebssaft von Gastropoden enthalten. Die Beziehung dieser Substanz zum Hydrobilirubin ist noch nicht ( sichergestellt. i Darstellung aus Harn. Methode nach Garrod und Hopkins.'^) i Man sättigt größere Harnmengen mit Salmiak und filtriert von der i abgeschiedenen Harnsäure ab. Aus dem Filtrat wird das La'obiliu durch ! Sättigen mit Ammonsulfat ausgefällt. Den entstandenen Niederschlag sammeh man auf einem Filter und trocknet. Aus dem trockenen Sul)stanzgemenge ' wird das Urobilin mit viel Wasser extrahiert und aus seiner Lösung aber- mals durch Sättigen mit Ammonsulfat gefällt. Die Sakfällung wird hierauf I im Scheidetrichter mit einer Mischung von 1 Teil Chloroform und 2 Teilen \ Äther durchgeschüttelt. Der Chloroformlösung wird der Farbstoff mit ; schwach ammoniakhaltigem Wasser entzogen und eventuell nochmals mitj Arag S( )4 gefällt und schließlich wieder in Chloroform aufgenommen. Der ' Chloroformrückstand wird schließlich in Alkohol gelöst. Der Rückstand deri filtrierten Alkohollösung ist reines LTrobilin. i ^Methode nach Ja/'/V.^) Der Harn, am besten Fieberharn, Anrd mit Bleiessig gefällt. Der abfiltrierte Niederschlag wird mit Wasser gewaschen. 1) A. E. Garrod und F.G.Hopkins, Über Urobilin. Journ. of physiol. Vol. 20.1 p. 112 (1898) und Vol. 22. p. 451 (1898). | -) M. Jaffe, Zur Lehre von den Eigenschaften und der Abstammung der Harn-| pigmeute. Virchows Archiv. Bd 47. S. 405 (^18G9j. Tierische Pigmente und Farbstoffe. 745 l)ci Zimmertemperatur getrocknet und mit Alkoliol energisch ausgekocht, licr verbleibende Rückstand wird mit kaltem, schwefelsäurehaltigem Alkohol zerlegt und in Lösung gebracht. Die filtrierte Lösung wird kräftig mit Ammoniak alkalisch gemacht und mit Chlorzink ausgefällt. Der entstehende Niederschlag wird nun mit Wasser chlorfrei gewaschen, mit kochendem Alkohol erschöpft, bei Zimmertemperatur getrocknet, in Ammoniak gelöst und erneut mit Bleizucker gefällt. Der neu entstandene Niederschlag wird wiederum mit Wasser gewaschen, mit Alkohol ausgekocht und durch schwefelsäurehaltigen Alkohol zerlegt. Die abfließende alkoholische Lösung mrd mit dem halben Volumen Chloroform versetzt und mit Wasser vorsichtig, ohne starkes Schütteln, erschöpft. Die mit Wasser gewaschene Chloroformlösung wird abgetrennt. Der Destillationsrückstand ist Urobilin. In urobihnreichen Harnen ((lualitative Yorprobe!) kann man die erste ßleifällung unterlassen und sofort mit Chlorzinkammoniak ausfällen und. wie beschrieben, weiter behandeln. Die Ausbeuten sind gering, die Reinheit des Farbstoffs aber eine große. Methode von Hnppert und Müller.'^) Aus dem Harn fällt man zunächst Harnsäure und etwa vorhandene Blutfarbstoffe mit alkalischer Chlorbaryumlösung (1 Volumen gesättigter BaCU-Lösung auf 2 Volumen gesättigter Barytlösung, hiervon 30 Teile auf 100 Teile Harn). Aus dem Filtrat dieser Fällung beseitigt man den Baryt durch konz. Natrium sulfat- lösung, dann neutralisiert man nahezu mit Schwefelsäure, filtriert und fällt erneut durch Ganzsättigung mit Ammonsulfat. Eine eventuell auftretende saure Reaktion wird mit NH3 abgestumpft. Die Fällung wird nach einigen Stunden auf Faltenfiltern gesammelt und mit gesättigter Ammonsulfat- lösung gewaschen, an der Luft ohne Erwärmen getrocknet und dann warm und noch feucht mit einer Lösung von 1 Teil Äther mit 2 Teilen Alkohol heiß extrahiert. Alsdann mischt man die Extrakte in der bereits beschrie- benen Weise mit Chloroform und schüttelt im Scheidetrichter mit dem doppelten Volumen Wasser durch. Die abgetrennte Chloroformlösung wird noch mehrmals mit Wasser gewaschen. SchheßUch entzieht man das Uro- biUn der Chloroformlösung durch Schütteln mit ammoniakhaltigem Wasser. Das Urobilin bleibt als Abdampfrückstand der Ammoniaklösung. Besser ist es, den Farbstoff mit Säure zu fällen, abermals in Chloroform aufzunehmen und als Cliloroformrückstand bei gewöhnlicher Temperatur zu gewinnen. Darstellung von ürobilinogen nach SailletJ) Der eiweißfreie Harn {100 cm ^) wird im Dunkeln entleert, mit 10 Tropfen Eisessig versetzt und mit dem gleichen Volumen Essigäther ausgeschüttelt. Den Essigäther 1) H. Hnppert, Analyse des Harns. 10. Aufl. S. 527. — Vgl. hierzu G. Hoppe- Seyler, l)her die Ausscheidung des Urobilins in Krankheiten. Virchoirs Archiv. Bd. 124. S. 34 (1891). -) Saillet, Über das Urobilin im normalen Harn. Revue de med. T. 17. p. 109 (1897). 744 Fr. Samuely. verwendet man jeweils zur Extraktion neuer Harnportionen, indem mau Verluste durch neuen Zusatz ergänzt. Durch Schütteln mit wenig Wasser entzieht man dem Essigäther etwa bereits vorhandenes Urobihn. Im Falle seiner Anwesenheit färbt sich das Wasser braun. Den Nachweis des Uro- bilinogens erbringt man nun, indem man die Essigätherlösung der Licht- wirkung aussetzt und das sich bildende Urobilin wiederum mit ange- säuertem Wasser extrahiert und nach einer der folgenden Methoden quali- tativ identifiziert. Qualitativer Nachweis und Identifikation des Urobilins. Von den äußeren Eigenschaften des Urobilins ist die Fluoreszenz- erscheinung seiner alkalischen Lösung und das charakteristische Spektral- bild der Absorptionsstreifen verwertl)ar. Letzteres ahein gestattet die Identi- fikation des isoUerten Farbstoffes. I. Im Harn: 1. Man versetzt den Harn mit einigen Tropfen Schwefelsäure und prüft spektroskopisch (s. u.): stark dunkelgefärbte Harne verhindern bis- weilen die spektroskopische Analyse. In diesem Falle beseitigt man die Farbstoffe (Gallenfarbstoffe) durch Zusatz von dem halben Volumen an Deniges' Reagenz {p g HgO in 20 cm'^ Schwefelsäure + 100 cm'^ Wasser) und prüft das Filtrat der entstehenden Fällung. 2. Man versetzt den Harn mit Ammoniak, filtriert und setzt etwas (10% ) C'hlorzinklösung zu. Das Auftreten einer rotgrünen Fluoreszenz zeigt Urobilin an. Die Prolie wird durch spektroskopische Prüfung der fluores- ' zierenden Lösung kontrolliert. \ Man kann auch nach Schlesinger'^) derart verfahren, daß man zu ( dem Harn das gleiche Volumen einer 10'' oigen, absolut alkoholischen Zink- ' acetatlösuug zufügt und dann filtriert. Die leichteste Fluoreszenz läßt sich mit einer Konvexlinse beobachten. r>. Sind die Flame dunkel gefärbt oder urobilinarm, so extrahiert; man das Urobilin, indem man etwa 50 cm^ Harn mit einigen Tropfen Salz- 1 säure ansäuert und mit 25 cm^ Amylalkohol unter geUndem Durchmengen j extrahiert.-) Die beiden Lösungen schickt man durch ein kleines Fiher und prüft dann die abgetrennte amylalkoholische Schicht spektroskopisch! und auf Fluoreszenz nach Zusatz einer alkoholischen Chlorzink- oder Zink- ! acetatammoniaklösung. lg Chlorzink in 100g ammoniakhaltigem Alkohol.! Die Methoden der Extraktion sind mannigfaltig modifiziert worden : \ Nach JRoman und Deluc^): Man säuert 100 cm^ Harn mit 8 bis| 10 Tropfen Salzsäure an und schüttelt vorsichtig mit 20 cni^ Chloroform aus.; Von der durch ein Asbestfilter geschickten Chloroformlösung werden 2 cm^l *) IV. Sclilesinger, Zum klinischen Urobilinnachweis. Deutsche med. AVochenschr. S. 561 (1903). ^) M. Nenchi und Ä. Eotscluj, Zur Kenntnis des Hämatoporphyrins und des Bili- rubins. Monatsb. f. Chemie. Bd. 10. S. 568 (1889). ''^) Th.BoDia» und G.Dchic, Nachweis von Urobilin im Harn. Jouru.de Pharm et Chim. (6. Serie). Vol. 12. p. 49 (1900); ibidem Vol. 19. S. 425. Tierische Pigmente und Farbstoffe. 745 mit dem doppelten Volumen einer Oio/nii^en alkoholischen Zinkacetatlösunü überschichtet. An der ßerührungsstelle heider Flüssigkeiten entstellt ein grüner Ring. Beim Umschütteln tritt grüne Fluoreszenz in der ganzen Mischung auf. (Grün im auffallenden, rot im durchfallenden Licht.) Andere Methoden, die keine Vorzüge bieten, sind von Gr'nithert und Jolles 1 ) angegeben. Versagen auch diese Proben, so ist die Isolierung aus größeren Harn- mengen nach einer der beschriebenen Methoden am Platz. Spektroskopische Prüfung. Verdünnte Säurelösungen zeigen einen Absorptionsstreifen zwischen C und F, mehr an F und etwas über I" hin- ausgehend. In alkaUscher Lösung ist der Streifen weniger stark und mehr nach C gerückt, am schwächsten in aminoniakalischer Lösung. In Anwesen- heit von Chlorzink aber ist der Streifen sehi- deutlich. Hat man einen bereits isolierten Farbstoff als Urobilin zu identi- fizieren, so ist das spektroskopische Verhalten besonders charakteristisch. 1. In saurer oder neutraler Lösung in Alkohol oder Chlorofoiin: breiter Streifen zwischen E und F, der, bei starker Konzenti-ation etwas über F hinausreichend, gleichmäßig in die Verdunklung im Molett übergeht. 2. Nach Alkalisieren verdünnter Lösungen: ^'ersch winden des ge- nannten Streifens. Nach Zusatz von Chlorzink Auftreten eines einzigen breiten Streifens ziemlich in der ]\Iitte zwischen E und F, näliei' dem Hot zu gelegen, ohne \'erdunklung in Violett. :■). In konzentrierten Lösungen: Nach Ansäuern einer konzentrierten iTobihnlösung in schwacher Lauge mit Schwefelsäure zu eben beginnender Trübung entsteht ein neues Band an der Linie E neben dem Spektrum des sauren Urobibns (sub 1 ). Der Streifen ist mit y durch einen Schatten verbunden. Handelt es sich um die Isolierung oder den Nachweis von Urobilin in Fäzes oder anderen Gewebssäften , so ist eine Darstellung des Farb- stoffs durch vorangehende Isolierung immer zweckmäl^ig. IL Aus Fäzes. Man extrahiert die Fäzes durch Zerreiben mit schwefel- haltigem Alkohol, engt das Extrakt bei 40 — 50" ein und nimmt, wie bei der Isoüerung nach Huppert, in Chloroform auf. Die spektroskopische Probe und Fluoreszenzprüfung entscheidet dann. Tritt keine Fluoreszenz auf. so überzeugt man sich, ob nicht nach Zusatz von 1 Tropfen Jodtinktur zu lOcyy/3 Alkoholextrakt Urobihnogen in Urobilin übergeht, Stecnsmtt.'-) In anderen Fällen extrahiert man die Fäzes mit verdünnter Schwefel- säure (2 p. m.) und isoliert durch Fällung mit Ammonsulfat nach Oarr()d{s. o.). Ohne Isolierung kann man Frobilin in Fäzes nach Angaben von Schmidt^) feststellen. In einem kleinen, weißen Porzellanschälchen verreibt ') L. Grimbert, Aufsnchung von rrol)iliii im Urin. Compt. rond. de la soc. de biol. V. 56. p. 599 (1904). -) F. Ä. StecHsma, Über die Untersuchung der Fäzes auf Urobilin. Nederl.Tijdschr. f. Geneesk. I. S. 273 (1907). ^) A.Schmidt, Ülier HydroliilirubiiiliildunL^ im Organismus unter iiormahMi Ver- hältnissen. Verbandl. d. 13. Kongresses f. innere Med. S. 320 (189.'i). 746 Fr. Samuely. man die Fäzesprobe mit gesättigter, wässeriger Sublimatlösung und läßt dann in einem Uhrschälchen 24 Stunden lang bedeckt stehen. Rote bis tiefrote Teile, die makroskopisch oder auch mikroskopisch erkennthch sind zeigen Urobilin, grüne Teile Bilirubin an. Versuche quantitativer Urobilinbestimmungen im Harn: a) Gravimetrisch nach Ho})pe-Seyler (siehe S. 74o, Note 1). In einer abgemessenen Harnmenge wird das Uroliilin nach Garrod bei schwefelsaurer Reaktion mit Ammoniumsulfat gefällt. Der nach ge- raumer Zeit abfiltrierte Niederschlag wird auf einem Filter gut mit ge- sättigter Ania SO^-Lösung gewaschen, oberflächhch getrocknet und in gleichen Teilen Alkohol und Chloroform aufgenommen. Im Scheidetrichter bringt man durch Wasserzusatz das Chloroform zur Abscheidung. Nach vollständiger Klärung derselben führt man dieselbe in ein gewogenes Hecherglas über, läßt abdunsten und trocknet schließlich bei 100". Hierauf extrahiert man abermals mit Äther und filtriert den Äther ab. Der Filter- rückstand (das Urobilin) wird nun, in Alkohol aufgenommen, in dem früheren Hecherglas gesammelt. Nach Verdunsten und Trocknen wird das Urobihn gewogen. h) Spektrophotometrische Bestimmung nach Saillet (siehe ^. 743, Note 2). In einer sauren Urobilinlösung mit einer Dicke der Flüssigkeitsschichte von lö mm liegt die Grenze der Wahrnehmbarkeit des Absorptionsbandes bei einer Konzentration von 1 mr/ Urolnlin in 22 cm^ Lösung. Man ver- dünnt daher die fragliche, urobilinhaltige Lösung bis zu der Grenze der eben verschwindenden Wahrnehmbarkeit eines Absorptionsstreifens bei einer Flüssigkeitsdichte von 15 mm und berechnet aus dem vorhandenen Gesamtvolumen der Flüssigkeit die Urobilinmenge. NatürUch müssen zu dieser Bestimmung reine Urobilinlösungen verwandt werden. Zu diesem Zweck sammelt man den Harn bei Petroleumlicht, säuert ihn mit Essig- säure an und extrahiert das I'robilinogen mit Essigäther. In der abge- trennten Lösung wird durch Schütteln mit Salpetersäure das Chromogen zu Urobilin oxydiert. Durch Schütteln mit ammoniakalischem Wasser geht dieses quantitativ in die wässerige Lösung über. Nun säuert man abermals! mit Salzsäure an und verdünnt mit Wasser bis zu der oben genannten^ Grenze unter Kontrolle im Spektroskop. Kennt man die Schichtdicke der; untersuchten Lösung E und die Menge derselben V, so ergibt sich die' Urobilinmenge aus der Formel: x = ^— x 'ö^ 22 c>«3 E Qualitativer Nachweis des Urobilinogens. Der nicht dem Licht ausgesetzte Harn wird angesäuert. Durch Extraktion mit Essigäther oder Chloroform, Ätheramylalkohol entstehen^ Lösungen, mit denen die Urobilinprol)en gelingen, wenn das Chromogeni durch Oxydantien (Jod, Permanganat, Salpetersäure) in den Farbstoff; Tierische Pigmeute und Farbstoffe. 747 verwandelt ist. Beim Versetzen mit ParadimetliylaminobcnziildchydM imd nachträglichem Erhitzen entsteht eine Uotfärhung mit einem l)n'iten Al)- sorptionsstreifen zwischen I) und E im ( )range {Neuhauer '), Hildehnindt u. a.-j Nachweis von Urobilinogen in Fäzes. Aus einer Probe von Fäzes werden Indol und Skatol durch Verreiben mit Ligroin entfernt. Der Eückstand wird mit Alkohol extrahiert. Mit dei- filtrierten Probe des Extrakts wird die Reaktion mit p-I)imethvlaminobenzaldehyd angestellt (die Probe ist aber nicht absolut eindeutig, da sie auch mit den duirh Pieduktion von Bilirubin, Hämatoporphyrin, Humatin und Chlorophyll ent- stehenden Körpern — die allerdings vielleicht mit Irobilinogen identisch sind — positiv ausfällt). V. Harnfarbstoffe der Indol- und Skatolgruppe und ihre Chromogene. Das Tryptophan des Eiweiß erleidet im Darmkanal durch die Fäul- nisbakterien eine tiefgreifende Veränderung. Als Endprodukte dieses Ab- baus entstehen schlieiilich Indol und Skatol. Beide Körper werden resor- biert und im intermediären Stoffwechsel zu Indoxyl bzw. Skatoxyl oxydiert. Diese Oxydatiousprodukte werden schlieliUch durch Paarung mit Schwefel- säure oder Glukuronsäure entgiftet und in dieser gepaarten Form im Harn aus dem Körper entfernt. Diese gepaarten Indoxyl- oder Skatoxylsäuren sind nun die Chro- mogene für eine Anzahl blauer und roter Farbstoffe, die aus ihnen durch Spaltung und nachfolgende Oxydation des Indoxyl- bzw. Skatoxylpaarlings entstehen können. Bisweilen finden sich die Farbstoffe im Harn i)ereits vor, d. h. sie entstehen ohne äußere experimentelle Eingriffe durch abnoiine. pathologische Zersetzungen der Harne, oder sie werden aus dem im llaru präexistierenden Chi-omogen durch äußere Mittel erst dargestellt. Man kennt ein Indigblau (Indigotin) von der Formel .CO. /CO. C«h/ >C:C< >CeH, und ein mit diesem isomeres Indigrot (ludirubin) von der Formel /CO. /C(OHk CeH,< >C:C< >N, \NH/ ^ Cß H, / die beide durch Oxydation des Indoxyls (Indikan) entstehen. Ein als Skatolrot bezeichneter roter Farbstoff ist hinsichtlich seiner (ienese noch nicht ganz aufgeklärt. Er wurde von manchen Autoren als ein dem Indi- ') M. Neubauer, Über die neue Ehrlichsche Reaktion mit Dimethylaminobonz- aldehyd. Sitzungsber. d. Cies. f. Morphol. u. Physiol. München. Juli 19(l3. -) iV. Hildebrandt, Studien über Urobilinurie und Ikterus. Zeitsclir. f. klm. Med, Bd. 59. S. 351 (1905). 748 Fr. Samuely. rubin analoges Derivat eines hypothetischen Skatoxyls aufo-efaßt, von anderen als der Aiikömmling eines spezifischen, andersartigen Chromogens aufgefaßt (Mcdllard, Staal) oder als mit dem Urorosein des Harns identisch erklärt (Porcher, Hervieux-Grosser). Herter hält den Körper für Indol- essigsäure. Die jNIengen, in denen diese drei Farl)stoffe im Harn auftreten oder entstehen können, sind abhängig von der Menge ihrer Chromogene, die ihrerseits von dem Maß der Darmfäulnis, der Eiweißfäulnis und mithin von der Ernährungsweise oder der Tierspezies wesenthch beherrscht werden. Da es nun durch experimentelle Bedingungen gelingt, die präformierten Chromogene quantitativ in die Farbstoffe umzusetzen, so besitzen wir in der Darstellung dieser Farbstoffe ein INIittel, das Chromogen qualitativ und quantitativ zu bestimmen, den Farbstoff quantitativ zu isolieren und denselben, d. h. also auch sein Chromogen chemisch zu identifizieren. 1. Iiidox.vl. 1. Qualitativer Nachweis von Indoxyl durch Überführung in Indigblau (Indikanreaktionen). Methode nach JaffL^) Man fügt zu einer Probe des Harns (etwa 10 cm'^), der eventuell vorher von Eiweiß befreit ist. das gleiche Volumen konzentrierter Salzsäure, hierauf unterschichtet man mit 2 — 8 cm'^ Chloro- form. Das durch die Salzsäure in Freiheit gesetzte Indoxyl wird nun durch vorsichtiges Zufügen von 1 — o — 5 Tropfen einer kalt gesättigten Chlor- kalklösung zu Indigblau oxydiert. Durch vorsichtiges aber häufiges Um- drehen des verschlossenen Reagenzglases wird der blaue Farbstoff von dem die Flüssigkeit passierenden Chloroform aufgenommen. Die Färbung des Chloroforms ist von der ^lenge des vorhandenen Indoxyls und von der In- tensität seiner Oxydation abhängig. An Stelle des Chlorkalks sind andere Oxydationsmittel empfohlen: z. B. lO^/oige Natriumpersulfatlösung. Ammoniumpersulfat, f/oiB'^ KaHum- chloratlösung, Wasserstoffsuperoxyd oder Eisenchlorid. Die Wahl eines dieser Oxydantien steht natürlich frei. Wichtig ist nur, die Menge des Oxydans so zu wählen, daß die Zerstörung des bereits gebildeten Indigblaus oder seine Umwandlung in das Indirubin verhindert wird. Ein Überschuß vermag das Indigo sehr rasch in farbloses Isatin zu verwandeln. Mit Bücksicht darauf dürfte sich die Wahl eines gelinden Oxydans eher empfehlen, das in der Probe nach Ohcrmayer mit Eisen- chlorid seine Anwendung findet. Methode nach Ohermayer.-) Man fällt den Harn zuerst mit der Hälfte seines Volumens mit lOVoiger Bleizuckerlösung, filtriert und schüt- telt die Probe mit dem gleichen Volumen rauchender Salzsäure, welche ^) M.Jafe, Nachweis und quantitative Bestimmung des Indikans. Ffl ii gers Arch. Bd. 3. S. 448 (1870). -) F. Ohermayer, Modifikation der Ja^eschen Indikanprobe. Wiener klin. Wochen- schrift 1890. S. 176. Tierische Pigmente und Farbstoffe. ~^i) 2 p. m. Eisenchlorid enthält. Man wiederholt dann das Umschiitteln nach Zusatz einiger Kubikzentimeter Chloroform. Die Probe ist entschieden jener von Jafe vorzuziehen, da man durch die Bleifällung von störenden Einflüssen anderer Farbstoffe befreit ist, uinl da eine Emulgierung der beiden Flüssigkeiten beim Umschwenken des Ue- aktionsgemisches weniger leicht erfolgt. Immerhin tst man aber auch bei Anwendung besonders älterer Lösungen des Reagens nach Ohermayer auch nicht vor Cberoxydation sicher. Natür- lich ist die Anwendung des Eisenchloridreagens bei Harnen mit T'hosphat- reichtum oder bei Vorhandensein von Acetessigsäure, Antipyrin, Salicylaten nicht am Platze (Gnezda). Methode von Ehrlich.^) Man erhitzt eine Plarnprobe mit der gleichen Menge einer Lösung von 0"oo g Dimethylparaaminobenzaldehyd in 50 c»* 2 AVasser 4- bO cui^ konzentrierter Salzsäure zum Sieden und alkali- siert die abgekühlte Lösung mit Kalilauge oder Ammoniak. Uotfärbiuig beweist ludikananwesenheit (Gallenfarbstoff und urobilinogenhaltige Harne sind zu dieser Probe nicht zu verwenden). Bei allen quahtativen Proben darf nur mit Vorsicht aus der Inten- sität der Chloroformfärbung auf den Indikangehalt geschlossen werden. Einesteils können durch Bildung von Indigrot neben Indigblau (Indigrot. entstanden durch Kondensation des durch l'beroxydation erzeugten Isatins mit Indoxyl) Tuschfarben entstehen, zum anderen aber ist die In- tensität der Färbung auch von dem spezifischen Gewichte des Harnes ab- hängig, indem sie unabhängig von dem wirklichen Indikangehalt mit dem Steigen des spezifischen Gewichtes des Harns an Intensität zu- bzw. ab- nimmt (Serl-otvski). Auch wird diese Beurteilung bisweilen dadurch erschwert, daß sich anstatt der Blaufärbung der Chloroformextrakte eine violette Mischfarbe einstellt; dieselbe ist die Folge einer Ül)eroxydation und spontanen Bildung von Indigrot, oder von einer Isatinbildung und Kondensation desselben mit präformiertem Indoxyl zu Indigrot. 2. Quantitative Bestimmungen des Indoxyls bzw. Indig- blau s (Indikan). Methode nach Wang.'^) Dieselbe beruht im Prinzip darauf, dal', das gesamte Indoxyl nach Ohermayer in Indigo, dieses dann in Indigblau- sulfonsäure umgewandelt wird, und die Menge der letzteren durch Titration mit Kaliumpermanganat bestimmt wird. Man überzeugt sich durch quahtative Vorproben über den Beich- tum des Harns an Indikan und wählt je nachdem die Menge Ausgangs- ') P. Ehrlich, Über die Dimethylaminobenzaldehydreaktion. Deutsche med. Wochen- schrift 1901. Nr. 15. — J. Gnedza, Nachweis von Indoxyl in gewissen pathologischen Harnen. Compt. rend. de l'Acad. de Sciences. T. 136. p. 1406 (1903); Chem.-Ztg. Bd. 27. S. 676 (1903). -) E. Wang, t)ber die quantitative Bestimmung des Harnindikans. Zcitschr. f. physiol. Chem. Bd. 25. S. 406 (1898); vgl. daselbst: Bd. 27. S. 135 (1899); Bd. 28. S.576 (,1899). 750 Fr. Samuely. material (25 — tiO crn^ Harn hei Indikanreichtum , oOO cm^ normalen Harn). Die 300 cm^ Harn werden dann portionenweise mit 25 bis bO cm^ einer 20o/oigen Bleiaeetatlösung versetzt und filtriert, 250 cm» des Filtrates werden in einem Scheidetrichter mit 250 crn^ von Oberinai/ers Reagens (konzentrierter HCl mit 2 . p. m. Eisenchlorid) und 30 cm^ Chloro- form versetzt und je^veils 1 Minute geschüttelt. Hierauf läßt man die Chloroformschicht vorsichtig ab und wiederholt die Ausschüttelungen mit neu zugefügten Chloroformmengen, bis die Chloroformextrakte farblos bleiben. Im allgemeinen genügen drei Ausschüttelungen. Die in einem Kölbchen gesammelten Chloroformextrakte werden zur Reinigung und Be- freiung von salzsauren und organischen Verunreinigungen (Urobilin, Kre- sole, Phenole, aromatische Säuren, Oxysäuren) 2 — 3mal mit reinem Wasser und dann mit Natronlauge (1 : 1000) geschüttelt (Maillard'^), Gnezda). Durch Waschen mit Wasser werden die letzten Spuren Alkali entfernt. Hierauf wii'd die Chloroformlösung durch etwas Asbest filtriert. Das Filtrat wird durch Destillation von Chloroform befreit, der Rückstand kurze Zeit auf dem Wasserbad getrocknet und dann noch warm mitlOcm^ konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Nachdem sich durch vorsichtiges Schütteln und Erwärmen auf dem Wasserbad während 10 Minuten alles gelöst hat, verdünnt man vorsichtig mit einer größeren Wassermenge. Geht nicht der gesamte Chloroformrückstand in Lösung, so filtriert man die verdünnte Lösung quantitativ von braunen Flocken ab und wäscht das Filter gut mit heißem Wasser aus. Nunmehr titriert man die schön blaue durchsichtige Lösung mit einer Kaliumpermanganatlösung , die auf eine Oxalsäurelösung von bekanntem Gehalt eingestellt ist. Man verwendet am besten ein Gemisch von 5 cm^ einer 3 p. m. KMnOi-Lösung -f 195 crn^ Wasser, deren Titer vorher bestimmt ist. Die Titrierung ist beendet, wenn eine grünliche Färbung verschwunden oder Gelbfärbung bzw. Farblosigkeit eingetreten ist. Durch Multiplikation des Oxalsäurewertes der Titerlösung mit 1"04: ergibt sich die gefundene Indigomenge. Beispiel : 1 cm^ KMnOi-Lösung (etwa 3 p. m.) = 0-00596 r/ Oxalsäure 1 „ „ = 0-0062 ,, Indigo 1 „ der verdünnten KMnOi-Lösung (5 : 195) = 0-00015^ „ Es seien verbraucht •4-3 cm^ K Mn 04-Lösung = 0-00065 ,. „ von dem ursprünglichen Flüssigkeitsvolumen (300 Harn + 25 cm^ Bleizucker- lösung) wurden verwendet 250 cm^. Also : 250 : 0-00065 = 325 : x. x = 1-3 . 0-00065 = 0-000845.(7 Indigo in 300 cm^ Harn. ^) L. C. Maülard, Über die Entstehung der Indoxylfarbstoffe und die Bedeutung des Harnindüxyls. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 41. S. 437 (19U4). — E. Salkotrski, In- dikanbestimmung. Ibid. Bd. 42. S. 213 (1904). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 75]^ Methode nach Bouma^) Sie beruht im Prinzip darauf, dal) sich das durch Säurespaltung' in Freiheit gesetzte Indoxyl mit Isatinsalzsäure zu dem einheitlichen Indigorot umsetzt, das nachher mit einer auf reines Indigrot eingestellten Kaliumpermanganatlösung titrieil wird. Auch hier überzeugt man sich durch kolorimetrische Norproben von dem bestehenden Indoxyh'eichtum , indem man gleiche Mengen Harn und Isatinsalzsäurereagens (20 mg Isatinum Merck purissimum in 1000 cm^ chemisch reinster, eisenfreier konzentrierter Salzsäure) kocht und mit et- was Chloroform ausschüttelt. Indikanreichtum veranlaßt eine dunkelwein- rote, Indikanarmut eine helle rosarote Färbung des Chloroforms. Im er- steren Falle verarbeitet man 25 — 50 cm'^. im letzteren Falle ;»00 cm'^ Harn. Diese 300 cw^^ ^verden mit 30 cm^ basischem Pjleiacetat gefällt: von dem klaren Filtrat werden 275 cm^ (= 250 em^ Harn) abgemessen und ' ^ Stunde lang mit dem gleichen Volumen der Isatinsaksäurelösung auf dem AVasser- bad erhitzt. Die abgekühlte Flüssigkeit wird dann in der oben l)eschrie- benen Weise (Methode von Wang) mit 3mal 30 cm^ Chloroform erschöpft. Nach dem Absetzen gieüt man die Chloroformlösung vorsichtig in ein Kölbchen, destiUiert die Hauptmasse Chloroform am Wasserbad ab und trocknet 2 Stunden bei HO''. Aus dem lUickstand entfernt man das über- schüssige Isatin und die Salzsäure durch mehrfaches Waschen mit heiiJem Wasser. Das Residuum trocknet man abermals, löst wie bei Wang (siehe oben) in Schwefelsäure, verdünnt und titriert mit Perraanganatlösung. Die Indigolösung sowie die Titrierflüssigkeiten müssen vollkommen klar sein. Die Verdünnung der Indigrotf lüssigkeit soll die Verdünnung von 1 g Indigrotdisulfonsäure auf 20000 ««^ Wasser nicht überschreiten. Erfolgt beim Titrieren eine Braunfärbung durch Abscheidung allerfeinsten Mangan- dioxyds, so ist der Säuregrad mit starker Schwefelsäure zu erhöhen. Die Berechnung der gefundenen Indigomenge erfolgt in der Weise, daß man die Permanganatlösung vorher auf eine Lösung von reinem In- digorot einstellt. Diese Lösung bereitet man sich derart, daß man käufliches Indigorot in Chloroform löst, aus dem Verdampfungsrückstand das reine Indigrot in Äther aufnimmt, und den getrockneten Ätherrück- stand (= gereinigtes Indigrot) in einer Menge von 5 oder 10 mg genau abwägt und in konzentrierter Schwefelsäure löst. Hierzu fügt man zu iie- liebiger Verdünnung Wasser und bestimmt durch Titration mit einer Per- manganatlösung (siehe bei Wang) diejenige Menge Permanganat, welche 1 mg Indigrot entspricht. Bei der Umrechnung der im Hauptversuch der Indoxylbestimmung ver])rauchten Permanganatmenge (ausgedrückt in Kubik- zentimeter der verbrauchten, vorher eingestellten Lösung) ist die Hälfte von dem gefundenen Wert für die Menge präformierten Indoxyls in Rech- nung zu setzen, da ja die Hälfte des Indigrotmoleküls von dem im \er- such zugeführten Isatin geliefert worden ist. 1) J.Bouma, Über Bestimmung- des Harnimlikans. Zeitschr. f.physiol.rhcm. Hd. 32. S. 82 (1901). — Nachtrag zur Methode der Indikaubestimmung im Harn. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 39. S. 356 (1903). 752 Fr. Samuely. Beide Methoden, die von Wan(/ und Bouma, sind zu klinisch ver- wertbaren Bestinimungsmethoden ausgearbeitet worden, indem die aus dem Harn gewonnene blaue Chloroformlösung- kolorimetrisch mit einer Testlö- sung von Indigotin in Chloroform {H. Strauße), jene des Indigrots mit einer Standartlösung von Indigrot {Bouma -) verglichen wird. Die Bestim- mung nach Bouma, die die Benutzung eines käufüchen Indikanurometers erfordert, scheint sehr exakte Resultate zu geben (Verum). Die Beschrei- bung der Methode mag mit Rücksicht auf die dem Apparat beigegebene Gebrauchsanweisung hier übergangen werden. Methode von Ellinger.^) Im wesentlichen wird die ^lethode von Wang beibehalten. ^lan verwende sauer reagierenden bzw. mit Essigsäure schwach angesäuerten Harn, dessen spez. Gew. 1020 nicht überschreiten soll. Durch 7io Volumen Liquor, plumbi subacetici wird eine abgemessene Harnmenge erst gefällt. Ein abgemessenes Filtratvolumen wird dann nach Wangs Vorbild mit frisch bereitetem Reagens von Obermager und Chloro- form behandelt. Der nach Wang gewonnene Trockenrückstand der Chloro- formextrakte wird mit Wasser gut gewaschen und nach Lösen in 10 c))i^ Hg SO^ und Verdünnen mit 100 cm^ Wasser mit KMnO^ titriert. Der Titer der Stamralösung des Permanganats (ca. og auf 100 cnt^ Ha O) wird auf reines Indigotin eingestellt. o. Qualitativer Nachweis von Indoxyl durch Überführung in Indigorot (Indirubin, L'rorubin, Indigpurpurin). Auch das Indigorot ist im normalen Harn nicht präformiert. Bereits bei Besprechung des Indigblaus und seiner Darstellung durch Oxydation von Indoxyl ist die Tatsache erwähnt, daß neben Indigblau leicht Indig- rot auftreten kann. In der Tat ist bewiesen, daß das dem Indigblau iso- mere Indigorot durch langsame Oxydation aus dem Chromogen, dem In- doxyl, entsteht (Maillard). Es besteht daher die Möglichkeit, das Chromogen auch durch Überführung in Indigorot nachzuweisen. Man erreicht diese, für den qualitativen Indoxylnachweis allerdings wenig verwertbare LTmwandlung durch Erwärmen des Harns zum Kochen mit oder ohne Salzsäure (Rosin). Darstellung des Indigorots aus Harn (i^osiw). *) Große Mengen indoxylreichen Harns werden zu Portionen von 5 l mit Bleiessig gefällt. *) H. Strauß, Zur Methodik der quantitativen Indikanbestimmung. Deutsch, med. Wochensclir. Bd. 29. S. 299 (1902). -) J. Bouma, t)ber eine bisweilen vorkommende Abweichung bei der Bestimmung des Harnindikans als Indigorot mittelst Isatinsalzsäure. Deutsche med. Wochenschr. Bd. 28. S. 705 (1902). — H.P. T. Verum, Quantitative Indikanbestimmung mit dem Meis- linf/schen Kolorimeter. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 45. S. 459 (1905). ^) A.Ellinger, Zur Methodik der Indikanbestimmung im Harn. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 38. S."l92 (178) (1903). ■*) //. Rosin, Über das Indigorot (Indirubin). Virchows Archiv. Bd. 123. S. 519 (1891). Tierische Pigmente uud Farbstoffe. T?»-.» Aus den Filtraten wird ein Bleiüberschnß mit Salzsäure entfernt. Die vom Bleichlorid abf'iltrierte Lösung wird mit Salpetersäure angesäuert (-JO cm^ auf je 1 l) und gekocht. Ist eine dunkelrote Farbe eingetreten, so kühlt man schnell ab, stumpft die Reaktion mit Soda zu schwacher Azidität ab und filtriert die sich hierbei flockig abscheidenden Farbstoffe auf ein Filter ab. Der Filterrückstand wird mit Sodalösung und Wasser gewaschen und nach dem Trockn£ji am Rückflubkühler mit Chloroform extrahiert. Aus der blaugefärbten Lösung wird das Chloroform am Wasserbad abdestilliert, bis sich eine flockige Abscheiduug einstellt. Diese sammelt man nach dem Erkalten der Flüssigkeit auf einem Filter. Der Filterrückstand wird mit kaltem Chloroform nachgewaschen, bis sich das ablaufende Cldoroform eben rot färbt. Dann kocht mau den Füterinhalt auf dem Wasserl)ad mit Äther aus, wobei das Indigrot in Lösung geht. Als Verdunstungsrückstand des Äthers hinterbleiben Kristalle, die nach 1 — 2tägigem Stehen in der äthe- rischen Mutterlauge aus Äther umkristallisiert werden. 4. Identifikation der blauen und roten Indigoharnfarbstoffe. Bisweilen begegnet man in frischen, häufiger in pathologisch veränderten Harnen (Groeher, Wang u. a.), auch im Schweiß, zersetztem Mageninhalt, oder in Harnkonkrementen l)ereits fertig gebildetem Indigblau bzw. Indigrot. Zur Identifikation dieser Farbstoffe verfährt man folgendermaßen: Für Indigblau: Man sammelt den meist ungelösten Farb.stoff durch Filtration auf einem im Trichterhals liegenden Asbestpfropf (eventuell extrahiert man den Harn direkt mit Chloroform und verwendet den Chloro- formrückstand) und reinigt ihn durch Waschen mit Wasser und Alkohol (der Alkohol löst hierbei das meist als Begleiter des Indikans vorhandene Indigrot), hierauf trocknet man bei mäßiger Temperatur und benutzt den Pfropf zu folgenden, für Indigblau charakteristischen Reaktionen. Durch Erhitzen auf 300" bildet sich durch Sublimation ein purpur- roter Dampf, der sich an den kalten Stellen des Gefäßes in Form von metallisch glänzenden Kristallen abscheidet. Die Kristalle zeigen im auf- fallenden Licht Kupferglanzfarbe, im durchfallenden Licht eine tiefi)!aue Färbung. ]Mit einer stark alkalischen Traubenzuckerlösung unter Abschluß von Luft (Ein])ringen des Pfropfes in eine bis zum Hals gefüllte Flasche) tritt Entfärbung ein (Bildung von Indigweiß). Beim Schütteln und an der Luft erfolgt unter Rückbildung des Indigotins wieder Blaufärbung. Eine Lösung in Chloroform weist einen scharfen Absorptionsstreifen zwischen C und D auf. Eine Lösung in konzentrierter Schwefelsäure (Bil- dung von Indigblaudi- und -monosulfosäure) zeigt gleichfalls einen Streifen zwischen C und D, der bei größerer Konzentration über I) hinausreicht. Auch die Alkalisalze der Sulfosäuren gehen beim Kochen mit Soda und Traubenzucker in die farblosen Indigweißsulfosäuren über, um sich beim Kontakt mit dem Luftsauerstoff wieder zu bläuen. Für Indigrot. Man neutrahsiert den Indigrot enthaltenden Harn mit Soda und nimmt den Farbstoff durch Ausschütteln in Äther auf Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. 11. 48 754 Fr. Samuelj'. (Trennung- vom ätherunlöslichen Urorosein). Der Verdunstungsrückstand des Äthers vdrd qualitativ geprüft. In gleicher Weise wird auch der Rück- stand der Alkohohvaschflüssigkeiten des Indigblaus (siehe oben) geprüft. Charakteristisch für Indigrot sind: Die Löslichkeit in Alkohol, die Entfärbung dieser Lösung beim Erwärmen mit Traubenzucker und Soda. Die Wiederfärl)ung im Kontakt mit der Luft, die Bildung einer in Schwefel- säure löslichen Sulfosäure, der Absorptionsstreifen der alkoholischen Lösung im Grüngelb. IL Sogenannte Skatolfarbstoffe (Skatolrot). Wohl fälschlicherweise hat man einen als Skatolrot bezeichneten Körper als ein Derivat einer hypothetischen, im Harn vermeintlich zur Ausscheidung kommenden Skatoxylverbindung gehalten Durch MaiUard und Staal ist diese Anschauung widerlegt, während Porcher und Hervieux an der Skatoxylprovenienz festhalten. Die Violettfärbung des Chloroforms bei der Indikanprobe oder die spontane Rot- bis Violettfärbung des Harns bei Salzsäurezusatz, die Kirsch- rotfärbung mit Salzsäure bzw. das Dunkeln beim Stehen an der Luft werden nicht durch Zersetzung einer fraglichen Skatoxylverbindung ver- anlaßt. Vielmehr sind andere Farbstoffe an diesen Farbenänderungen be- teiligt. Das Skatolrot selbst ist in jüngster Zeit durch Herter'^) als ein Indolderivat aufgeklärt, sein Chromogen war bereits vorher von Staal isoliert. Die Identität des Körpers mit dem Urorosein von XencH und Sieber (siehe dort) ist außerordentlich wahrscheinlich. Darstellung des Chromogens aus normalem Harn nach Staal^) (bzw. Stokvis). Der Harn wird mit Ammonsulfat gesättigt und nach maximaler Fällung aller Farbkomponenten filtriert. Das auf dem Wasserbad eingeens-te Filtrat wird von ausgeschiedenem Ammonsulfat ab- getrennt, mit Essigsäure angesäuert und mit Essigäther ausgeschüttelt. Durch Ausschütteln des Essigätherextraktes mit Wasser wird das Indikan beseitigt. Man setzt dieses Ausschütteln solange fort, bis eine Probe des Wassers keine Reaktion mit Isatinsalzsäure mehr gibt. Hierauf entzieht man dem Essigäther das Skatolrotchromogen durch Ausschütteln mit Kahlauge und neutralisiert die Lösung mit Essigsäure. Eine Reindarstellung dieses Chromogens ist bis jetzt aus der wässe- rigen Lösung nicht geglückt. Hingegen gelingt eine Darstellung als Mg- Verbindung direkt aus dem Essigätherextrakt : Man läßt den von Indikan befreiten Essigäther 24 Stunden lang unter zeitweiligem Umschütteln in einem Kolben mit MgCOg stehen. Hierauf läßt man den Essigäther in einer Schale verdunsten und extrahiert den Rückstand mit 90Voigem Alkohol. Das filtrierte Alkoholextrakt wird ^) C. A. Herter, tJber Indolessigsäure als Chromogen des Uroroseins des Harns. Journ. of Biol. ehem. Bd. 4. S. 253 (1908). ^) ./. Ph. Staal, Über das Chromogen des sogenannten Skatolrots im normalen Menschenharn. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 46. S. 236 (1905). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 7-..--, abermals zur Trockene verdunstet, der lUickstand nochmals mit QOVoigeni Alkohol aufgenommen, filtriert und wiederum eingedunstet. Weder diese Mg-Chromogenverbindung noch das Chromogen des Alkaliextraktes (das durch beträchtliche Mengen von Hijjpursäure ver- unreinigt sein kann) sind bis jetzt als chemische Individuen erwiesen. Der Körper aber, der nach Staal keine gepaarte Schwefelsäure (bzw. (;iu- kuronsäure) und kei-n Skatol enthält, ist dadurch ausgezeichnet, dal) er mit Salzsäure und einem Oxydans (z. B. 1—2 Tropfen O'öo/oiges KNOj) in einen Farbstoff übergeht, der in Äther und Chloroform unlöslich (Gegensatz zu Indigrot), in Amylalkohol löslich ist und dessen rote Farbe in saurem Wasser durch Alkali in Braun umschlägt, durch Zink entfärbt wird und beim Ansäuern bzw. durch Oxydation wiederkehrt. Die frische Farbstoff- lösung zeigt 2 Absorptionsstreifen zwischen D und E. Die Eigenschaften erinnern lebhaft an jene des Uroroseins (siehe dort). Darstellung des sogenannten Skatolrots aus Harn nach Ska- tolfütterung (Grosser'^) bzw. Einspritzungen (Porcher und Hervieux-). a) Qualitativer Nachweis: Harn der Skatolperioden (auch sicher indikanfreier Harn) wird mit ca. 1/10 seines Volumens lileiessig gefällt, filtriert und mit dem gleichen A'olumen Salzsäure versetzt. Nach einigen Stunden hat sich eine tiefrote Färl)ung gebildet. Der Farbstoff kann mit Amylalkohol gänzlich, mit Essigäther partiell extrahiert werden und zeigt die oben für den aus dem Chromogen dargestellten Farbstoff bereits auf- gezählten Eigenschaften (vgl. bei Urorosein). Die Angaben von Porcher und Hervieux enthalten im wesentUchen die gleichen Daten. h) Versuch einer Isolierung: Der Harn wird mit Vg seines Volumens rauchender Salzsäure zum Sieden erhitzt, mit 200 nn^ heißer Ba CL-Lösung versetzt und 10 Minuten gekocht. Nach 24 Stunden hat das sich abscheidende BaryumsuLfat den Farbstoff niedergerissen. Das auf dem Filter gesammelte und mit heißem Wasser gewaschene Salz gibt den Farb- stoff an heißen Alkohol. Die alkoholische Lösung wird eingedunstet und der Trockenrückstand zuerst mit Chloroform von Indikanbeimischungen gereinigt. Hierauf läßt man eine Extraktion mit Aceton folgen, wobei ein Anteil in Lösung geht und gewinnt eine alkohollösliche und eine alkohol- und acetonlösliche Fraktion. Von diesen bisher nicht weiter erforschten Substanzen (oder Substanzmengen) scheint die alkohollösliche ein Skatol- derivat zu sein; der Befund steht also in gewissem (Jegensatz zu den Beob- achtungen von Staal. Nach den jüngsten Beobachtungen i/()- 4U° getrocknet, die trockene Masse wird zu einem Pulver zerrieben und mit absolutem Alkohol extrahiert. Der heiße alkoholische Auszug wird mit heißem Barytwasser gefällt. Es entsteht ein Niederschlag der Barytver- bindung des Yitellorubins. Derselbe wird noch heiß auf dem Filter ge- sammelt, mit Alkohol gewaschen und mit verdünnter Salzsäure zerlegt. Es kommt hierbei zur Abscheidung einer rot gefärbten, wasserunlösliciien Masse, die zugleich mit unlöslichen Fettsäuren auf der Flüssigkeit schwimmt. Dieselbe wird abgeschöpft und feucht mit :\Iagnesia usta innig verrieben. Die so gewonnene Masse wird erst mit kaltem Alkohol gewaschen und dann mit Äther oder Chloroform extrahiert. Die rot gefärbte Lösung wird mit Alkohol gefällt. Das gefäUte Magnesiumsalz wird mit Salzsäui-e zersetzt und dann mit Äther extrahiert. Der Ätherrückstand stellt das reine Lipochrom dai". Das Vitellolutein. dessen Barvumsalz in Wasser löslich ist. wird in dem *) W. Zopf, Beiträge zur Physiologie und Morphologie niederer Tiere. LeipziL'. 3. Heft. Über Produktion von carotinartigen Farbstoffen bei niederen Tieren. S. 2C. (1893). -) B.Mahj, Über die Dotterpigmente. Monatsh. f. Chemie. Bd. 2. S. 18 (1881). 762 Fr. Samuely. Filtrat der ersten Barytfällimg mit Salzsäure in Freiheit gesetzt und mit Ligroi n extrahiert. Beide Körper scheinen verschieden zu sein. Nur das Yitelloruhin er- füllt alle Lipochromeigenschaften, da es im Gegensatz zu dem Vitellolutein die Verlnndung mit Alkalien und alkalischen Erden eingeht. Vitellorubin zeigt einen breiten xlbsorptionsstreifen bei F, Vitellolutein zwei Streifen, der eine bei F, der andere zwischen F und G. Die oben geschilderte Darstellungsmethode dürfte auch für andere Lipochrome erfolgreich anwendbar sein. Lipochrome der Säugetiere werden auch als Luteine bezeichnet. Sie sind die Träger der gelben Farbe so mancher Gewebe und finden sich im Fettgewebe, im Eigelb, im Blutserum^) und im Corpus luteum. Eine Reindarstellung dieser Körper ist bis jetzt nur für das Lutein der Corpora lutea der Kuh, und zwar in Kristallform gelungen. Die Isolierung einheitlicher Körper ist hier vor allem durch den lieichtum an Fetten oder Lipoiden gestört, die sich kaum oder nur schwer beseitigen lassen. Lutein wird aus frischen, fein zerkleinerten Corpora lutea mit heißem Chloroform extrahiert (Stacdeler und Holm -). Aus dem schon spontan kristallisierenden A'erdunstungsrückstand können Fettbestandteile durch vorsichtiges Waschen oder Abspülen mit verdünntem Alkohol oder Äther notdürftig beseitigt werden. Aus dem hier Gesagten geht deutlich hervor, daß die Erforschung der Luteine noch dringender Bearbeitung bedarf, die durch das Vorhan- densein von hinreichendem ^Laterial nur begünstigt würde, ^lan wird die ^lethoden erheblich erweitern und spezialisieren müssen; das hier erwähnte soll nur Anhaltspunkte bieten. Eine scharfe Abgrenzung von den noch zu besprechenden anderen gelben Farbstoffen existiert noch nicht. IV. Farbstoffe aus der Gruppe der Melanine. Li dieser Gruppe faßt man eine Anzahl schwarzer oder schwarz- brauner Körper zusammen, die bei Wirbeltieren und Wirl)ellosen unter normalen und pathologischen Bedingungen vorkommen. Die Zusammenge- hörigkeit der schwarzen Pigmente zu einer einheitlichen Gruppe ist nicht allein durch das Farbenmerkmal, sondern auch durch die höchstwahr- scheinliche generelle Übereinstimmung ihrer Zusammensetzung aus zykli- schen, dem Eiweißmolekül entstammenden Komplexen gerechtfertigt. Sie entstehen zum Teil aus farblosen Chromogenen, die ebensolche aromatische und heterozyklische Eiweißderivate sind und bei ihrer meist fermentativen Umwandlung in ^lelanine unter gewissen Bedingungen auch akzessorische Gruppen (S- oder P'e-haltige Komplexe oder auch verzweigte aliphatische ') U.a. L.Zoja, Über die Gegenwart von Bilirnl)in und Lutein im menschlichen Serum. Real. Istit. Lombardo d. scienze e lettere (2). T. 27. p. 839 (1904). ■-) G. Sfaedeler, Xotiz über den Farbstoff des Eigelbs. Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 100. S. 148 (1866). Tierische Pigmeute und Farbstoffe. 7ßy, Ketten) in diesen Umwandhmgsprozeß durch Kondensation einbeziehen können. Die Darstellung reiner Melanine ist wegen ihrer I'nlöslichkoit in indifferenten Lösungsmitteln eine schwierige. Die Schwierigkeit wird erhöht durch die nur schwer zu beseitigende Anwesenheit von Eiweibbeiniischungen und die relative Labilität der Melanine gegen Alkali. Man hat früher Im Prinzip zwei Darstellungsmethoden eingehalten: Im einen Fall hat man die schwarzen Pigmente durch Behandeln mit kalter oder warmer Lauge in Lösung gebracht und so von Eiweißkörpern getrennt. Eine Reinigung hat man alsdann durch wiederholtes Umfüllen der Melanine mit Säuren aus alkalischer Lösung zu erzielen versucht. Im anderen Fall hat man die säureunlöslichen Körper dadurch vom Eiweilj befreit, daß man die pigmenthaltigen Gewebsbestandteile durch Hydrolyse mit starken Säuren vom Eiweiß trennte, eventuell die Säurehydrolyse der Proteine mit einer Fermenthydrolyse (Pepsin, Trypsin) kombinierte und so einen in Säuren unlöslichen Pigmentrückstand gewann. Diesen Rück- stand hat man schheßhch zur Reinigung mit Alkali behandelt und durch Umfallen mit Säure gereinigt. Schon die ^'ergleichung von Analysenzahlen der nach beiden Methoden dargestellten Präparate hat keine restlose Übereinstimmung dieser Körper gezeigt. Die Differenzen werden dadurch erklärt, daß die Mehrzahl der Melanine offenbar durch die Behandlung mit Alkali eine Veränderung ihrer Zusammensetzung erleidet. Das genuine Melanin geht hierbei in eine alkali- lösliche ..Melaniusäure^' über, die andere Zusammensetzung aufweist. Mit Rücksicht darauf ist ein Vergleich aller dargestellten Melanine, die bald mit, bald ohne Verwendung von Alkalibehandlung dargestellt sind, un- statthaft. Wir sehen daher an diesem (,)rt davon ab, alle Methoden der Dar- stellung, die für schwarze Pigmente der verschiedensten Herkunft von den verschiedenen Autoren angewandt sind, detailliert zu besprechen. (Eine Zusammenstellung der älteren Arbeiten findet sich bei v.Fürflt^) und bei V.Fürth und Jerusalem^), vgl. auch S. 765, Note 4). Wir begnügen uns vielmehr, für eine Darstellungsmethode einige Beispiele zu geben, die eine allgemeine Anwendung mit dem Resultat relativ reiner Endpi'odukte gestatten. Vorbereitungen: Bei der IsoKerung von Melaninen aus tierischen Geweben werden diese zuerst zur Befreiung von Fetten einer Extraktion mit Alkohol und Äther unterworfen. L Methoden der mechanischen Isolierung (anwendbar für das Chorioidealpigment ). ') O. r. Fürth, Physiolotrische und chemische Untersuchungen über melanotische Pigmente. (Sammelreferat.) Zentralbl. f. allg. Pathoh u. pathol. Anatomie. Bd. 15. S. 617 (1904). , , .• , n- * 1 =) 0. V. Fürth und E. Jerusalem, Zur Kenntnis der melanotischen I igmente und der fermentativen MeLaninbilduug. Hofmeisters Beitr. Bd. 10. S. 131 (1907). (Literatur.) 764 Fr. Samuely. Aus der Chorioidea des Auges, i) Man eröffnet frische Rinder- auo-en durch einen Scherenschlag-, teilt dann das Auge in zwei Hälften und entfernt die Glaskörperteile durch leichtes Schwenken unter Wasser. Hierauf entfernt man unter Wasser durch Auspinseln mit einer Feder- fahne oder durch gelindes Keiben mit einem armierten Glasstab die Pigment- körnchen aus den dunkel gefärbten Teilen der Augenhäute. Hierbei wird der größere Teil des Pigmentes, besonders der Anteil des Corpus ciliare in Wasser aufgeschwemmt; nur sehr langsam setzt sich das Pigment zu Boden. Die vereinigten tiefschwarzen Flüssigkeiten werden durch ein Seidenfilter geschickt. Durch Zusatz des gleichen A'olums einer auf 80" erwärmten gesättigten Ammonsulfatlösung und längeres Erwärmen auf dem Wasserbad wird das Pigment ausgeflockt, so daß es sich zu Bo- den senkt. Ein nicht unbeträchtlicher Pigmentanteil läßt sich aus der Chorioidea bulbi nicht herauspinseln. Um ihn zu gewinnen, zieht man die Chorioidea mitsamt der Retina von dem Bulbus ab, zerkleinert die Gewebsfetzen fein und unterwirft die ganze Masse einer mehrtätigen Verdauung mit Pepsinsalzsäure und dann mit Trvpsin. Hierbei scheidet sich das Pigment zuletzt in feinen Körnchen am Gefäßl)oden ab. Durch Dekantieren und langdauerndes Waschen mit Wasser, Abschleudern in der Zentrifuge und schließliches Nachbehandeln mit Alkohol und Äther gewinnt man ein hell- braunes, staubfeines Pulver. Eventuell wiederholt man an diesem die Trypsin- verdauung oder auch die genannte Reinigung durch Umfallen aus Alkali- lösung mit Säure. n. Methode der Säurehydrolyse (anwendbar für Hippomelan in melanotischer Drüsen des Pferdes oder melauotischer Tumoren anderer Herkunft nach v. Fürth und Jerusalem -). Die Methode führt zu unverändertem Pigment. Frische, melanotische Lymphdrüsentumoren von Schimmeln werden von anhaftendem Gewebe befreit und bis zu ihrer Verarbeitung in Alkohol aufbewahrt. Die zerkleinerte Tumorenmasse wird alsdann mit konzentrierter, rauchender Salzsäure zerkocht. Die Pigmentkörner bleiben hierbei voll- kommen ungelöst und werden nach Wasserzusatz zu der Hydrolysen- mischung auf einem gehärteten Filter gesammelt und durch Waschen mit Wasser von löslichen braunen Bestandteilen befreit. Hierauf wird nochmals mit kochender rauchender Salzsäure extrahiert, abfiltriert, mit Wasser ver- rieben und ausgekocht, dann abermals abgesaugt, hierauf wird mit heißem siedendem Alkohol und Äther extrahiert und getrocknet. Das so dargestellte Produkt ist sicher von dem Phymatorhusin von XencH und anderen Autoren verschieden, da es in Alkalilauge ganz un- löslich ist. Dadurch ist es auch von den ,.Melanoidinsäuren'' aus Eiweiß ') E. Landolt, Über die Melanine der Augenhäute. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 28. S. 407 (1899). ^) 0. r. Fürth und E. Jerusalem, Zur Kenntnis der melanotischen Pigmente und der fermentativen Melanin))ildung. Hofmeisters Beitr. Bd. 10. S. 131 (1907). Tierische Pigmente uud Farbstoffe. 765 zu unterscheiden. Der Körper geht in eine alkahlösliche Modifikation (Me- laninsäure) erst durch eine mehrstündio-e Behandhuig mit der 6 — lOfachen Menge Ätzkali über. Er gewinnt dann die Eigenschaften jener Melanine, welche z. B. Nencki, Berdez und Sieher als Hippomelanin dargestellt haben. Es muß daher für alle älteren Präparate geschlossen werden, daß sie erst durch sekundäre Veränderung der Zellpigmente entstanden sind. III. Methoden der Alkalihydrolyse und Alkaliextraktion (an- wendbar für Melanine der Haare, der Haut {Abel und Davis^\ melano- tische Tumoren (Phymatorhusin von Xencki"^), Zuinbusch^) u.a.). Darstellung aus Haaren nach SpierjlerJ) Große Mengen Poliliaar (5 kg) werden mit ^/aVoigei' Sodalösung gewaschen und sodann mit der öfachen Menge ö^/oigei' Kahlauge bis zu ihrer Lösung gekocht. Nach etwa 4 Stunden wird das Pigment aus der erkalteten Lösung durch einen großen Überschuß von konzentrierter Salzsäure als eine teigige, sich am Boden bald absetzende Masse gefällt. Durch Kolleren wird diese Masse von der Flüssigkeit getrennt, mit AYasser und verdünnter Salzsäure gut gewaschen und schließhch nochmals zur Befreiung von Eiweißresten 8 — 10 Stunden mit ö^/oiger Salzsäure auf dem Sandbade unter Bückflußkühlung gekocht. Hierauf filtriert man noch heiß und trocknet den feinen braunen Filter- rückstand in einer Schale auf dem Wasserbad. Zur weiteren Reinigung verreibt man den trockenen Körper in einer Reibschale mit konzentriertem wässerigem Ammoniak. Die tiefbraune ab- filtrierte Lösung wird mit Salzsäure gefäUt, der ausfallende Pigmentkörper abfiltriert. Lösen und Fällen wird ein zweites und drittes Mal wiederholt. Die letzte Fällung wird auf dem Filter gesammelt, auf dem Wasserbad und im Toluolbad getrocknet und dann zu einem feinen Pulver zerrieben. Hierauf löst man durch Zerreiben in konzentrierter Schwefelsäure, filtriert über Glaswolle und scheidet das Pigment durch Eingießen der Filtrate in viel kaltes destilliertes Wasser ab. Den pulverigen Niederschlag wäscht man bis zur Schwefelsäurefreiheit der Waschflüssigkeiten und trocknet dann. Die Umfällung aus konzentrierter Schwefelsäure wird ein zweites Mal wiederholt. Zur Befreiung von elementarem Schwefel wird schließlich das trockene Pigment aufeinanderfolgend mit Alkohol, reinem Schwefelkohlen- stoff und Äther extrahiert. Elementarzusammensetzung : aus Pferdehaar C 60-;i6, H 5-80, N 11 -^C), S :-i-22; aus SchafwoUe „ 50-91, ;, 615, „ 10-21, „ 2-91. 1) J. Ahel und W. S. Davis, On the pigments of the negros sldn and hair. Joiirn. of exp. Med. Vol. 1. p. 361. ■^) Berdez und M. Nencki, Über die Farbstoffe melanotischer Sarkome. Arch. f. (exp. Pharm, u. Path. Bd. 20. S. 346 (1886). — M. Nencki und .Y. Sieber, Weitere Bei- träge zur Kenntnis der tierischen Melanine. Ibid. Bd. 24. S. 17 (1887). ä) L. V. Zumhusch, Beiträge zur Charakteristik des Sarkomehuiins v(mi Menschen. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 36. S. 511 (1902). ^) E. Spiegier, l)ber das Haarpigment. Beitr. z. chem. Pliys. u. Path. Bd. 4. b. 4U (1904). 766 ^^- Samuely. Ein farbloses Chromogen (Pigmentsäure) läßt sich in analoger Weise aus Schimmelhaaren und weißer Schafwolle darstellen (Spieglet-). Die Darstellung gleicht der vorgenannten, nur darf das nur grau gefärbte Pigmentpulver nicht mit Ammoniak behandelt werden, da es sich hierbei ganz schwarz färbt. Man reinigt daher diesen Körper nur durch Ausfällen mit viel Wasser aus der Lösung in konzentrierter Schwefelsäure. Das hier- bei frisch gefällte Pulver ist nahezu weiß, nimmt aber nach längerem Stehen eine dunklere, graue Färbung an. Elementarzusammensetzung : aus Schimmelhaaren C 48-51, H 7-06, N 12-58, S 2-80Vo aus Schafwolle ,, 55*45, „ 7-38, „ 10-87, „ 2-30Vo Die Darstellungsmethoden aus Haarpigment, welche u. a. von Sieber und von Abel und Davis i) verwendet wurden, führen zu anderen Pigmenten inkonstanter Zusammensetzung (siehe oben). Aus Negerhaar C 52-74, H 3-53, N 10-51 (Abel und Davis). Exakte Pigmentstudien über Federnpigmente von A'ögeln liegen nicht vor (Krukenberg). Darstellung von Phymatorhusin (Berdez und Nencki-) aus mela- notischen Geschwülsten des Menschen. Das fein zerhackte melanotische Tumorgewebe wird ausgiebig mit heißem 93Voigem Alkohol und dann mit Äther und der trockene Ge- websrückstand mit l%igeT Kahlauge im 4fachen Gewicht extrahiert. Die Extrakte werden abgegossen und die noch gefärbten Gewebsreste mehrfach wiederholt mit der Laugenlösung behandelt. Die filtrierten ver- einigten Lösungen werden mit Salzsäure gefäUt. Der flockig ausfallende Farbstoff wird abfiltriert und auf dem Wasserbad (nachdem er vorher vom Filter abgelöst ist) getrocknet. Dann folgt ein Extrahieren mit kalter iVoigei" Kalilauge, erneutes Fällen, Auswaschen und Trocknen, und zur Be- seitigung von Eiweißresten eine 2 — ostündige Hydrolyse mit kochender lOVoiger Salzsäure in 20facher Menge. Der ungelöste Rückstand wird dann säure- und chlorfrei gewaschen, mit Alkohol und Äther behandelt und bei 110° getrocknet. (Diese Methode ist auch für Chorioidealpigment und für Hippomelanin anwendbar.) Darstellung von Pigment aus Melanosarkom (Zumbusch. Wolf) durch kombinierte Proteolyse und Sodaextraktion. Wir geben die Methode von Wolff^) wieder, die im Prinzip einer älteren Methode von Brandt und Pfeiffer folgt. Gerade aus den folgenden ^) J.Abel und W.S.Davis, On the pigments of the negros skiu and hair. Jouru. of exp. Med. Yol. 1. p. 361. ^) Berdez uud M. Nencki, Über die Farbstoffe melauotiseher Sarkome. Arch. f. exp. Pharm, u. Path. Bd. 20. S. 346 (1886). — 31. Nencki und ^V. Sieber, Weitere Bei- träge zur Kenntnis der tierischen Melanine. Ibid. Bd. 24. S. 17 (1887). ") H. Wolf, Zur Kenntnis der melanotischen Pigmente. Hofmeisters Beiträge. Bd. 5. S. 476 (1904). (Literatur!) Tierische Pigmente und Farbstoffe. -,;- Daten geht hervor, wie weit die Anwendung von Alkidien (Soda oder At/- kali) Veränderungen hervorruft. Andrerseits geht daraus auch hervor, (hili genuine Melanine schon a priori eine verschiedene Alkahresistenz hesit/.en, und dal,} die ^"erschiedenheit der Elementarzusammensetzung auch von (Um- Methode unabhängig sein kann. Die gut zerkleinerte Leber wird mit Pepsinsalzsäure l)ei llrutschraiik- temperatur behandelt; 'die Pepsinlösung wird so oft durch Dekantieren und Wiederzusatz neuer Lösung gewechselt, als noch Albuniosen in Lösung nachweisbar sind. Der zuletzt mit Wasser gut gewaschene schwarze Paick- stand wird solange mit HVoigei' Sodalösung extrahiert, bis die Extrakte farblos ablaufen. Aus den gesammelten Filtraten wird das Melanin mit Essigsäure ge- fällt und durch wiederholtes Lösen und Fällen gereinigt, zuletzt bei llo" getrocknet (Präparat A). In einem Fall kann nun die Gesamtheit des vor- handenen Pigmentes in Lösung gehen, in anderen Fällen bleibt ein be- trächtlicher sodaunlöslicher Piückstand. Dieser wird mit öVoi?*"!' Natron- lauge bei 50 — 60^ gelöst und aus dem Filtrat dieses Extraktes mit Salz- säure (nicht fällbar durch Essigsäure) gefällt. Die Fällung wird nun durch Lösen in Sodalösung (in der dieser Körper jetzt wieder löslich geworden ist) und Fällen mit Essigsäure wie oben gereinigt (Präparat 15). Zusammensetzung von A: C 48-68, H 6-00, Fe 2-63, S 2-51, N 9-7ö, Asche 3-24o/o B: „ 50-59, „ 5-92, „ — (Spur), ,, 10-24, .. - - «'o Präparat eines Tumormelanins, dessen Acetat in Soda löslich war: C 57-28, H 5-41, Fe — S 1-67, N [YW^/o- Zusammenfassend sei hier noch einmal darauf hingewiesen, dal'i die Anwendung von Alkahen bei der Melanindarstellung (also z. P». bei Kom- bination der sub II und III genannten ^letliode) unbedingt zu veränderten Produkten führt. Die Einwirkung von Alkali durch Konzentration uiul Dauer entzieht sich jeder methodischen Kontrolle. Aber ebenso bedarf die Anwendung der ausschlieblichen Säurehydrolyse nach v. Fürth und Jerusalem einiger Rücksicht. Bekanntlich entstehen aus Eiweißkörpern durch Säure- hydrolyse schwarze Substanzen, sogenannte ..Melanoidin.-'iuren", die je nach ihrer vorhandenen Menge amorph ausfallen oder im Hydrolysengemisch ge- löst bleiben. Diese Körper gehen leicht als Säuren mit Alkalien (Atzalka- lien, starkes Ammoniak) in Lösung und verhalten sich dann wie Melanin- säuren selbst, die durch Alkali aus genuinen Pigmenten entstehen. Im Falle der Hippomelanindarstellung hat man diese Substanzen als \'erunreinigung wenig zu befürchten, da sie leicht mit Alkali beseitigt werden können (sofern sie überhaupt amorph ausgefallen waren), während das Ilii»p(mie- lanin erst durch mehrstündige Behandlung mit der 6 — lOfachen Menge ÄtzkaU in Lösung geht. Hingegen ist es wohl denkbar, dal) ein genuiiu's Melanin weniger alkahresistent sein könnte, so daß es mit den Melanoidin- säuren gemeinsam gelöst würde. Mau wird in jedem Fall die Säurehydro- 758 Fr. Sainuely. lyse nur dann anwenden, wenn die vorhandene Eiweißmenge (wie in rae- lanotischen Drüsen) im Vergleich zum Pigmentgehalt eine sehr geringe ist, so daß keine Gefahr vorliegt, daß die geringe Spur entstehender Me- lanoidine ungelöst ausfiele. In allen anderen Fällen wird vorläufig eine Alkalibehandlung kaum zu umgehen sein. Nur dürfen in diesen Fällen Analysenresultate, beson- ders auch für Eisen- und Schwefelgehalt, nicht zu hoch bewertet werden. Die Darstellung von Melaninen aus Geweben der niederen Tierwelt geschieht im Prinzip nach den eben genannten Methoden. Besondere Be- rücksichtigung bedarf nur noch die Darstellung und der Nachweis von Melanin und Melanogen aus pathologischem Harn. Melanin und Melanogen in Harn. Mau überzeuge sich zunächst im Falle eines dunkel entleerten oder beim Stehen nachdunkelnden Harns von der Abwesenheit einer Alkaptonurie (Pieduktionsproben, Eisenchlorid- probe, Isolierung der Homogentisinsäure). Zur Darstellung des echten Harn- melanins (bei Trägern melanotischer Tumoren beobachtet) fällt man den Farbstoff mit essigsaurem Blei. Der Bleiniederschlag wird mit Schwefel- wasserstoff zersetzt. Der Rückstand des Filtrates von dem schwarzbraun ge- färbten Blei Sulfidniederschlag stellt das Melanin dar. Einfacher ist eine Fällung des Harns mit Barytwasser. Der braun- gelb gefärbten Barytfällung wird der Farbstoff mit Sodalösung entzogen, aus der er mit Mineralsäiuren ausgefällt wird. Wiederholtes Lösen und Fällen aus Lauge mit Säure führt zu reineren, aber keineswegs einheit- lichen Produkten. Bisweilen wird anstatt des Melanins dessen farbloses Chromogen aus- geschieden. Nachweis. Man bewirkt eine L'msetzung in Melanin durch Zusatz eines oxydierenden Mittels (Eisenchlorid, Kaliumdichromat, Salpetersäure, Brom- oder Chlorwasser -f Schwefelsäure unter Vermeidung eines Über- schusses). Ein Überschuß des stärker wirksamen Chlor- oder Bromwassers führt zur Bildung eines schmutziggelben Niederschlages. V. Sonstige Farbstoffe zum Teil unbekannter Natur. Wir beschließen das Kapitel mit einer kurzen Besprechung der mannig- faltigen ,. sonstigen" tierischen Farbstoffe, bei denen sogar die Versuche einer Gruppenzuweisung nach chemischen Gesichtspunkten bisher nur will- kürlich oder gar nicht gelungen sind. Für ihre Systematik bleibt daher nur die Einteilung nach den ihnen eigenen Grundfarben übrig. Daß hier- bei vollständig heterogene Substanzen vereinigt werden, ist unzweifelhaft. Bei der Darstellung dieser Körper müssen ganz besonders die im allge- meinen Teil eingangs erwähnten Anweisungen und methodischen Rück- sichten beachtet werden. Eine detaillierte Beschreibung der Eigenschaften dieser Körper findet sich bei v. Fürth (siehe S. 717, Note 1). Nur für ein- zelne dieser Substanzen sind genauere methodische Details hier am Platze. Die Mehrzahl dieser Substanzen findet sich bei niederen Tieren. Tierische Pigmente und Farbstoffe. (09 1. Sogenannte Uranicline bilden eine Gruppe, die rein \villkiiriicli und durch wenige Klassenmerkmale charakterisiert und abgegrenzt ist {Kruken- hery i) : Gelbe Farbstoffe, die auf Alkalizusatz eine grün oder blaugriine Fluoreszenz annehmen mid sich unter dem Einfluß von Licht odei- Sauer- stoff leicht zu dunkel gefärbten Produkten und)ilden, werden als l'r.suiilinc bezeichnet. Die Labilifät dieser Körper, auch schon gegen Alkohol, Alkalien oder Wärme ist eine so große, daß eine chemische Charakterisienmg bis jetzt nicht möghch ist. Die frischen Lösungen zeigen keine Absorj)- tionsstreifen. Methodisches läßt sich über diese Substanzen wenig berichten. Mm\ schließt auf die Existenz dieser Körper, wenn entweder das gefäi'bte (Je- webe oder Extrakte mit neutralem, besser saurem Alkohol oder Chloro- form, Äther oder Benzol an der Luft oder nach Erwärmen den obenge- nannten Farbenwechsel durchmachen. Am stabilsten sind noch Extrakte mit schwach saurem Alkohol (für Holothurien) , aus denen iVmmoniak das gelbhch gefärbte Pigment aus- flockt. Solche Körper fanden sich bei Aplysien, Korallen, Holothurien- und Arenicolaarten. 2. Gelbe Farbstoffe. Bei der Untersuchung solcher Substanzen ist vor allem eine Zugehörigkeit zu Lipochromen auszuschließen, die z. B. für das sogenannte Athalioflavin aus AethaUum septicum (Protozoon) und das Aply siofulvin mancher Aplysienarten (Spongien) gelungen ist. 3. Rote Farbstoffe, die bei niederen Tieren weit verbreitet sind, sind zum größeren Teil in Wasser löslich und daher frei von anderen Pigmenten (Lipochromen) darstellbar. Man zerkleinert das fragliche Organsubstrat, bringt Eiweißkörper durch Erhitzen zur Unlöshchkeit, trocknet und exti-a- hiert mit kaltem oder leicht vorgewärmtem Wasser. Nach dieser Art sind mehrere besser charakterisierte Farbstoffe gewonnen, u. a. die sogenannten Floridine aus Spongien und Korallen (Knikenberg-). Für die Floridinö ist der Farbenwechsel in Grünblau und die Fäll- barkeit durch Ammoniak sowie das Bleichen beim Erwärmen der violett bis grün fluoreszierenden Lösungen charakteristisch. Den Floridinen feld(Mi die für Hämatinderivate typischen Absorptionsstreifen. Gleichfalls wasserlöslich ist der als Antedonin bezeichnete rote Farb- stoff der Haarsterne. Im Gegensatz zu den Floridinen weist eine Lösung des roten Antedonins :•) Absorptionsstreifen zwischen D und F auf. Nach Säurezusatz verändert sich mit einem gleichzeitigen Farbenumschlag in Orange das Spektralbild. Es finden sich nur 2 Bänder um E und F. Am- moniak fällt aus wässeriger Lösung einen Körper, der trocken ein violettes Pulver darstellt. Eine Analyse der Antedonine liegt nicht vor. ') E. Krukenberg, Die Pigmente. Vergleicheud-physiologischo Studien. I. Reihe. Abt. 3. S. 111. II. Reihe. Abt. 3. S. 41. A1)t. 4. S. 172. Ai)t. 2. S. .Ö3. 2) R. Kriücenberg, Ibid. II. Reihe. Abt. 3. S. 36 (1882). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. \\) 770 Fr. Samuel}. In ammoniakalischem Wasser löslich erwies sich ein Actiniochrom und Purpuridin manclier Actinien. in saurem Alkohol löslich ist ein P e n t a c r i n i n zahlreicher Tief seepentacrinusarten. Die mehr violetten bis blau- \doletten Farbstoffe der Echinidienarten hinwieder werden von verdünnter Säure aufgenommen. Das violette Pelagein der Medusa pelagia geht in organi- sche Lösungsmittel ( Alkohol Äther. Eisessig, besonders Schwefelkohlenstof f ) über {Griffiths und Platt ^). Manche rote Farbstoffe in Tegumenten oder Schalen von Molluskenarten sind erst nach Aufschluß der Gehäuse mit Säuren in Alkohol, Äther oder Chloroform löslich. Im einzehien sind füi- Identifikationen die Absorptionsspektren der Farbstofflösungen zu studieren: Das Actinochrom {Moselij-), Mac Murin '^) zeigt ein dem Hämatin ähnhches Spektrum, doch liegt ein Band dem Violett näher. Purpuridin weist keine Streifen auf. Pentacriniu {Mosel i/^) zeigt 3 Streifen, und zwar zwischen D und E und zwischen b und F. Durch Ammoniakzusatz erfolgt ein Umschlag in Blaugrün und das Verschwinden der Absorptionsstreifen bis auf ein Band vor B. Weit verbreitet sind rote Farbstoffe bei Insekten. Cochenillefarbstoff. Karminsäure aus Coccus cacti wird nach Schunk und Marchleirsk}'') rein dargesteUt. Die käufliche, aus den flügellosen Weibchen des Insekts bestehende Cochenille ^^ird fein gepulvert und mit kochendem Wasser extrahiert. Die filtrierte Lösung wird mit Bleiacetat gefällt, wodurch der Farbstoff nieder- geschlagen wird. Der feuchte Bleisalzniederschlag mrd in absolutem Al- kohol fein zerteilt und durch tropfenweisen Zusatz von konzentrierter Schwefel- säure in Lösung gebracht. Die durch Filtration von Bleisidf at getrennte, gelbrote Lösung wird bei niederer Temperatur am schneUsten im Vakuum zur Trockene gedampft. Den Trockenrückstand löst man in kaltem absolutem Alkohol. Aus dieser Lösung wird der tiefrote Farbstoff mit dem mehr- fachen Volumen Äther, Benzol oder Chloroform gefällt und auf dem Filter mit dem Fällungsmittel gewaschen. Zur Darstellung von Kristallen über- läßt man eine alkoholische oder stark essigsaure Lösung der langsamen Verdunstung im Vakuum über konzentrierter Schwefelsäure. Der Säure kommt wahrscheinhch die Formel Cjy HisÜjo zu, sie dürfte ein Hvdrindenderivat sein. ') A. B. Griffiths und Flatt, Sur la coinpositiou de la Pelageine. Compt. leud. de l'Acad. des Sciences. T. 121. p. 451 (1895); Journ. Am. Chem. Soc. Yol. 17. p. 877. ^) U. X. Moseleij, On Actiniochrom a colouring matter of Actiuias which gives an Absorptionsspectrum. Quart. Journ. Micr. Science. Vol. 13. p. 143 (1873). '*) C. A. Mac Mitnn, Observations on the chromatology of Actiniae. Proc. Roy. Soc. Vol. 38. p. 86 (1885); Philos. Transactions. Vol. 176. p. 641 (1885). ■*) H. N. Moselej/, On the colouring matters of various auimals. Quart. Journ. Micr. Science. Vol. 17. p. 5 (1877). ^) E. Schunk und L. Marchlewski, Zur Kenntnis der Karminsäure. Chem. Ber. Bd. 26. S. 2647 (1893); Bd. 30. S. 1759; u. a. vgl. hierzu: 0. Dimroth, Zur Kenntnis der Karminsäure. Chem. Berichte. Bd. 42. S. 1611 (19ü9). Tierische Pigmente und Farltstoffe. ( « Die alkoholische Lösung- zeigt drei unscharf begrenzte Absorptidiis- streifen, einer in Grün, zwei in P)lau. Roter Farbstoff der Kermesschildlaus (Lecanium ilicis). Die Methode der Darstellung sei hier mitgeteilt, da sie möglicherweise gene- relle Anwendimg für andere Farl^stoffe finden kann. Die gepulverten und getrockneten Insekten werden durch Atlicr- extraktion von Fetteir befreit und dann mit schwefelsäurehaltigem Alkf)h()l extrahiert. Zu der alkoholischen Lösung setzt man Äther und soviel Wasser, daß es zu einer Äthertrennung kommt, wobei der Farbstoff in die äthe- rische Schicht übergeht. Die abgetrennte Ätherlösung wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wässerigen Lösung von Natriumacetat au.s- geschüttelt. Die abgetrennte Acetatlösung, die violettrot gefärbt ist. wird mit Schwefelsäure zersetzt, woliei sich aus der nun ziegelroten Lösung nach einiger Zeit ein kristallinischer oder flockiger Farbstoffniederschlag abscheidet. Die Fällung wird gesammelt und aus säurehaltigem Wasser umkristallisiert (Heise^). Der Farbstoff ist von Karminsäure leicht unterscheidbar, da er in Äther und Amylalkohol leicht löslich ist. Auch der Farbenumschlag in Violett mit schnell folgendem Abblassen durch Alkali, die schwarze P'ällung mit Eisenacetat, die violette mit Bleiacetat und die rotviolette mit Kupfer- sulfat sind recht charakteristisch. Rote, purpurrote Farbstoffe finden sich auch bei Warmblüteiii und Vertebraten. Sehpurpur der Retina. ') Die möglichst frischen Netzhäute werden mit einer alkoholfreien wässerigen und schwach alkalisch reagierenden Lösung von gallensaurem Natron extrahiert. Aus dieser Lösung fällt man den Farbstoff mitsamt den Cholaten als harzige Masse mit gesättigter Magnesiumsulfatlösung. Diese blutfarbstofffreie Masse \x\y(\ abgeti'ennt. in Wasser gelöst und durch Dialyse von gallensaui'en Salzen befreit. Hierbei fällt der Farbstoff flockig aus. Er ist dann in Wasser mit Purpurfarbe wieder löslich, aber gegen Luft, Wärme, saure Alkalien, auch gegen or- ganische Solventien sehr empfindhch. Dabei geht eine Entfärbung übei- Rot, Orange und Gell) vor sich. 4. Blaue Farbstoffe. Auch diese bis jetzt studierten Farbstoffe sind zumeist wasserlöslich und daher den sie enthaltenden Geweben leicht extrahierbar. Unter ihnen sind besonders das Cyanein aus dem Schirm lilauer Medusen (Rhizostoma u. a.), der Farbstoff in den Flossen von Crenilabrus pavo und das Hämocyanin des Cephalopodenblutes genauer studiert. Diese Körper erwiesen sich ihrem Verhalten nach als Eiweilikörper sui generis. die aber keinen etwa dem Hämoglobin ähnhchen Aufbau aus einer globin- M R. Heise, Zur Kenntnis des Kcrmesbeeren- und Kermesscliildlausfiirbstoffes. Arb. a. d. Kaiserl. Gesundheitsamt. Bd. 11. S. 513 (1895). ") IV. Kühne, Zur Darstellung des Selipurpurs. Zeitschr. f. Hiol. Hd. 32. >. 2\ (1895). 4'.»* 772 Fr- Samuely. ähnliclien Eiweißkoinpouente und einer organischen metallhaltigen Chro- mogenkomponente besitzen. Das Hämocyanin ist bereits S. 724 ff. erwähnt. Darstellmigsmethoden. C van ein. Man verarbeitet die periphere Zone des blauen Medusenschirnis, den man etwa in einer Breite von 5 mm ab- schneidet. Die Gewebsstücke legt man in destilliertes Wasser, wodurch das. Gewebe zum Absterben kommt und der freie, vorher körnig abgelagerte Farbstoff in Lösung geht. Die Lösung ist durch eine Fluoreszenz nach dem Rot und durch drei Absorptionsstreifen ausgezeichnet. Einer im Orangegelb zwischen C und D, einer im Gelbgrün hinter D und einer im Grünblau. Durch Alkahen ist ein farl)loses amorphes Pulver fällbar, das sich in Säuren wieder mit roter Farbe löst. Die wässerige primitive Lösung wird durch Säuren gleichfalls rot. Ein Schwermetall (Cu) findet sich nicht in Lösung. Der blaue Farbstoff von Crenilabrus pavo {Zeyneck'^) findet sich neben anderen roten und gelben Pigmenten im Schuppenkleid dieses. Fisches. Man befreit die blau gefärbten Partien von Schleim durch Ab- schwemmen mit Wasser und extrahiert dann ergiebig mit Aceton, wo- durch ein roter Farbstoff in Lösung geht. Dann läßt man eine Waschung mit trockenem Äther folgen. Nach dieser Vorbehandlung geht der blaue Farbstoff mit destilliertem Wasser in Lösung. Die reinsten Lösungen lassen sich aus den Flossen gewinnen, wenn man die Wasserextraktion nicht allzu lange fortsetzt. Eine DarsteUung gelingt dann durch Fällung der wässerigen Lösung des Farbstoffes mit 10 — lö^/oigem Am^ SO^, Sammeln und Lösen des Niederschlages, Reinigen durch mehrtägige Dialyse und Einengen der wässerigen Lösung. Der gewiß noch nicht rein dargestellte Körper scheint ein Eiweiß- körper zu sein. Er erwies sich als metallfrei. Über Cyanokristallin siehe S. 7(30. 5. Grüne Farbstoffe. Auch hier gilt das im allgemeinen Teile besprochene Prinzip, zu einer Darstellung oder einer Isoherung das geeignete Lösungsmittel zu wählen. So kann das Bonellein aus BoneUia viridis (Ivlasse der Würmer) mit Alkohol oder Äther entzogen werden. Wasserzusatz fäUt aus salzsaurem Alkohol einen grünen Flockenniederschlag {Gottlieh Schunk^), Sorhy^). Der Körper zeigt ein charakteristisches spektroskopisches Verhalten. 4 Bänder (zwischen C und D, bei D, zwischen E und b und zwischen E und F), *) R. V. ZeijuecJc, Über dea ])lauen Farbstoff aus den Flossen von Crenilabrus Pavo. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 34. S. 148 (lOulj; ibid. Bd. 36. S. 568 (1902). ^) Schunh, Der grüne Farbstoff von BoneUia viridis. Sitzuoffsber. d. Wiener Akad. d. Wissensch. Math.-nat. Kl. Bd. 72. II. S. 581 (1875). ^) Sorhy, On the colouring matter of BoneUia viridi?. <^)uart. Journ.^Iicr. Science. Vol. 15. p. 166 (1875). Tierische Pigmente und Farbstoffe. 77;; deren Lage aber von jenen einer Chlorophvllösung versehieden ist. Auch das stabile Verhalten in alkoholischer Lösung gegen Säuren (Purpurtarbung) und Alkalien (Rückbildung des ursprünglich grünen Farbstoffesj untoi-- scheidet von Chlorophyll. (ileichfalls in Alkohol löslich ist der grüne Fari)stotf Chätopterin {Baij-Lancester'^) aus Chaetopterus. Er zeigt vier anders gelegene Ab- sorptionsstreifen und 'Nvird auf Säure indigoblau, nach Alkalizusatz zitronen- gelb. Ein grünes Pigment aus Phyllodoce viridis zeigt in Alkohol keine Absorptionsstreifen und wird durch Säure braungellt, durch .Vin- moniak schön rot. Andere grüne Farbstoffe sind in verdünnten Säuren löslich und durch Alkalizusatz unter Purpurfärbung fällbar (aus Aedosonia tenebi-ariuni. Klas.se der Oligochäten). Auf die Frage nach der Darstellung und den Nachweis von tierischem Chlorophyll kann hier nicht eingegangen werden. Es sei nur hervorgehoben, daß die Identifikation als echtes Chlorophyll nur durch die exakteste spek- troskopische Beobachtung und Analyse gestattet ist (Engebnann) oder die direkte Bestimmung einer Sauerstoffausscheidung und eines Kohlensäure- verbrauchs, und dal) daneben der sichere zoologische Nachweis eritracht werden muß, daß der fragliche Körper nicht ein von außen eingeführtes und etvra umgeformtes Chlorophyll, sondern ein selbstgebildetes Chlorophyll darstellt (vgl. hierzu die Derivate des Chlorophylls und Hämoglobins und die chemischen Beziehungen beider). M Baij-Lancester, On the green Pigment of tlie intestinal wall of tlie Anneliil Chaetopterus. Quart. Journ. Micr. Science. Vol. 40. p. 447 (1898). Darstellung und Eigenschaften der für das Nerven- gewebe charakteristischen Lipoide. Von W. Cramer (Edinburgh). Einleitung. Die Lipoidsiibstanzen des Gehirns lassen sich in 8 Gruppen trennen: die phosphorfreien stickstoffhaltigen Galaktoside, die sog. ,.Cerebroside"', die stickstoffhaltigen Derivate der Glycerophosphorsäure, die „Phosphatide"' und das Protagon, welches die einzige bisher bekannte schwefelhaltige Li- poidsubstanz ist und sich in Cerebroside und Phosphatide spalten läßt. Die Einteilung des folgenden Kapitels ist dementsprechend erfolgt. Widerspruchsvolle Angaben sind im Gebiete der Gehirnchemie leider besonders häufig. Dies rührt zum Teil davon her, daß verschiedene Autoren verschiedene Substanzen, die auf verschiedene Weise erhalten wurden, oft mit dem gleichen Namen belegt haben. Es hat sich daher für die Behand- lung dieses Gegenstandes als zweckmäßig erwiesen, die von verschiedenen Autoren dargestellten Substanzen, wenn nötig, getrennt zu behandeln, ohne auf die ihnen beigelegten Namen Piücksicht zu nehmen. Die Identifikation verschiedener Präparate ist nach streng chemischen Gesichtspunkten er- folgt, d. h. durch Vergleichung der Analysenzahlen und physikalischen Kon- stanten. Es ist nötig, dies hier besonders hervorzuheben, da diese Gesichts- punkte oft zugunsten oberflächlicher Ähnlichkeiten im Aussehen oder in der Darstellungsmethode vernachlässigt worden sind, was zu groben Irr- tümern Anlaß gegeben hat. Material. Zu den meisten Untersuchungen sind Schafsgehirne oder Piinder- gehirne verwendet worden. Die aus diesem Material erhaltenen Produkte scheinen identisch zu sein. In einzelnen Fällen ist auch menschliches Ma- terial zur Verwendung gekommen, wobei geringe Unterschiede aufgefunden worden sind. So soll z. B. das aus Menschengehirn dargestellte Cerebron einen anderen Schmelzpunkt haben als das aus Schafsgehirnen erhaltene Cerebrin (Kork) und das aus Menschengehirn dargestellte Protagon soll Darstellung ii. Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. 775 etwas mehr Schwefel enthalten. Wenn man jedoch bedenkt, daß die von verschiedenen Autoren aus dem gleichen Material erhaltenen Produkte ebenso große Unterschiede aufweisen und daß die aus dem Menschengehirn dar- gestellten Substanzen noch dazu mittelst anderer Methoden erhalten werden, so kann man den beobachteten Verschiedenheiten vorläufig keine Bedeu- tung zumessen. Der Unterschied im Schmelzpunkt des Cerebrins aus Schafs- hirn (nach Koch) und-des Cerebrons aus Menschengehini (nach Thierfdder) ist jedenfalls nicht so zu deuten, daß hier verschiedene Substanzen vorüegen, da das von Gamgee aus Pdndergehirn isolierte Cerebron denselben Schmelz- punkt hatte, wie das von Thierfelder aus menschlichem Material erhaltene. Entwässerung des Materials. Da die für das Nervensystem charakteristischen Substanzen in Wasser unlösüch sind und durch Extraktion mit kaltem oder heißem Alkohol oder Äther gewonnen werden müssen, so ist es zweckmäßig, das Wasser zuerst zu entfernen. Dabei dürfen jedoch physiologische Temperaturen nicht über- schritten werden. Zur Entfernung des Wassers sind eine Pieihe von ^Methoden verwendet worden. Handelt es sich um sämtliche sowohl in kaltem wie heißem Äther und Alkohol löshche Gehirnbestandteile, so kann man das Verfahren von Baumstark oder das schnellere Verfahren von Erlandsen anwenden. Das Wesenthche dieser Methoden besteht darin, daß zuerst mit Äther und dann erst mit Alkohol extrahiert wird. Die durch Alkoholextraktion hervorge- rufene Abspaltung ätherlöslicher Substanzen wird dadurch ausgeschaltet. Nach Baumstark.^) Das frische Gehirn wird in engmaschiger Gaze möglichst unversehrt in eine weithalsige Stöpselflasche (oder Exsiccator), die etwa Vs ihres Vo- lumens Äther enthält, gehängt oder auf einen durchlöcherten Einsatzboden gelegt. War das Gehirn frisch, so tropft eine l)luthaltige, wässerige Lösung rasch aus dem Gehirn ab. Der Äther wird ab und zu erneuert. Ist alles Blut abgeflossen, so wird das Gehirn von der äußeren Haut befreit und in größere Stücke zerschnitten und die in Gaze gewickelten Stücke in Äther gelegt, so daß derselbe 1 — 2 cm über der Gehirnmasse steht. Der Einsatz- boden soll ungefähr 5 cm hoch sein, so daß das Gewebe über der abfließen- den wässerigen Lösung hegt. Die wässerige Lösung wird alle S, später alle 14 Tage abgehebert und der Äther frisch aufgefüllt. Die Entwässerung ist nach 2—3 Monaten voUendet. Durch Anwendung verminderten Druckes wird die Diffusion beschleunigt. Die Gehirnstücke werden in flache Scheiben geschnitten. Die Ätherextraktion wird dann mit mehr Äther 2 Monate lang fortgesetzt. Der Äther wird alle 8—14 Tage erneuert. Dann wird die Gehirnmasse in 80Voigeu Alkohol gebracht. Nach 24 Stunden wird die anhaftende Flüssigkeit gelinde al)gepreßt , ohne das ') F. Baumstark, Über eine neue Methode, das Gehirn chemisch zii_ erforschen und deren bisherige Ergebnisse. Zeitscbr. f. phys. Chemie. Bd. 9. S. 158 (1885). 776 ^^ • Gramer. Gewebe zu zerquetschen. Dann wird zweimal mit Oö^/digem Alkoliol extra- hiert, unter kräftigem Druck der Alkohol entfernt, wobei man einen trockenen, zähen, faserigen Preßkuchen erhält, der zerldeinert mit absolutem Alkohol einige Tage lang extrahiert wird. Der Alkohol wird abgegossen, der Rückstand ausgebreitet und an der Luft getrocknet. Es muß dann eine graue, trockene, leicht pulverisierbare, nicht hygroskopische Substanz zurückbleiben, die sich längere Zeit aufbe- wahren läßt. Diese Methode ist sehr langwierig und umständlich. Sie ist jedoch besonders wertvoll, wenn man die in irgend einem Organ vorgebildet vor- handenen wasserlöslichen Substanzen untersuchen und daher jegliche Zer- setzung durch Manipulation oder Extraktion ausschheßen väW. Diese Sub- stanzen finden sich dann nämlich in der unter dem Äther sich sammeln- den wässerigen Flüssigkeit. Zu diesem Zwecke ist diese ^lethode zuerst für das Gehirn verwendet worden ^), ist jedoch in gleicher Weise für andere Organe anwendbar. Schneller kommt man zum Ziel, wenn man 2) das zerkleinerte Gewebe in dünnen Schichten auf geneigten Glasplatten ausbreitet und mittelst eines Ventilators einen kräftigen Luftstrom darüber leitet. Durch leichte Erwär- mung des Raumes und wiederholte Wendung des Materiales wird die Aus- trocknung beschleunigt, so daß die Hauptmenge des Wassers innerhalb 12 Stunden abgegeben wird. Die dann hinterbleibende zusammenhängende Masse wird in kleine Stückchen geschnitten, in einen Gazebeutel gebracht und in einem auf 40" erwärmten Vakuumkasten aufgehängt. Durch den evakuierten Wärmekasten, in welchem Schalen mit Chlorcalcium aufgestellt sind, wird ein Strom trockener Luft gesaugt. Nach 4 — (3 Stunden kann das Material zu einem feinen Pulver zerrieben werden, welches sogleich noch einmal der Vakuumtrocknung unterworfen wird, so daß schließlich ein feines, leicht stäubendes Pulver erhalten wird, das hygroskopisch ist und an der Luft sich leicht oxydiert. Es muß daher im Vakuum über Schwefel- säure aufbewahrt werden, falls es nicht sofort der Extraktion durch Äther unterworfen wird. Eine sehr rasche und einfache Vorbereitungsmethode besteht darin, daß man das zerkleinerte Gewebe mit ungefähr der anderthalbfachen Menge wasserfreien Natriumsulfats verreibt und durch ein Sieb reibt. Man erhält so ein trockenes Pulver, das sofort der Extraktion mit Äther oder, falls das Cholesterin zuerst entfernt werden soll, mit Azeton unterworfen wer- den kann. Diese Methode ist bisher nur zur Darstellung von Cholesterin 3) *) S. Vincent and W. Cramer, The nature of the physiologically active substauces in extracts of nervous tissues and blood with some remarks on the methods of testing for choline. Journ. of Physiol. Vol. 30. p. 151 (1904). ^) A. ErJandsen, Untersuchungen über die lezithinartigen Substanzen des Myo- cardiums und der quergestreiften Muskeln. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 51. S. 70 (1907). ^) B. Biinz , Über das Vorkommen von Cholesterinestern im Gehirn. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 46. S. 48 (1905). Darstellung u. Eigeuschafteu d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipriidc. t I I und Protagon!) (siehe unten) verwendet worden. Ob sie sicli /.iii- I»;ii-- stellung der Phosphatide eignet, ist noch nicht festgestellt worden. Hat man größere Gewebemengen zu verarbeiten, so hat diese >h'- thode den Nachteil, daß das Volumen des zu verarbeitenden Materiales zu große Dimensionen annimmt. Protagon. Allgemeines. Es ist hier nicht der Ort, auf die Streitfrage, ob das Protagon eine \Cr- binduug von Phosphatiden und Cerebrosiden ist, oder ob es ein (ieinenge dieser Substanzen darstellt, einzutreten. Für den Zweck des vorliegenden Werkes genügt es festzustellen , daß reines Protagon eine Substanz von ganz kon- stanter Zusammensetzung ist, sich beliebig oft unverändert Umkristallisieren läßt, und durch seine chemischen und phvsikahschen Eigenschaften ebenso scharf charakterisiert ist als irgend eine aus dem Nervengewebe oder aus irgend einem anderen Gewebe isolierte Substanz. Daß neben dem I'rotagon noch andere phosphorhaltige Lipoide im Nervengewebe vorkommen, ist bereits von Gamgee, Kossei und Frei/tag, Noll u. a. erkannt worden. In der Literatur finden sich zahlreiche Angaben über Präparate, die mit dem Protagon im Aussehen oder in der Darstellungsweise eine ober- flächliche ÄhnUchkeit haben, aber sich vom Protagon in ihren chemischen oder phvsikahschen Eigenschaften scharf unterscheiden. Da die.se Sub- stanzen, welche entweder ein stark verunreinigtes oder zersetztes Protagon darstellen, fälschhcherweise -) für Protagon gehalten worden sind, so finden sich in der Literatur die widerspruchsvollsten Angaben über Protagon und es ist der Anschein erweckt worden, als ob diese Substanz eine ganz ver- änderliche, unbestimmte Mischung darstellt. Die Angal)en über solche Prä- parate sind im folgenden nicht berücksichtigt worden. Die unten gegebenen Eigenschaften beruhen im wesentlichen auf Angaben von Gamijec und auf eigenen Beobachtungen. Darstellung. Bei der Darstellung des Protagons ist besonders darauf zu achten, daß eine längere Behandlung mit warmem (4ö") oder heißem Alkohol vermieden wird, da dadurch Zersetzung herbeigeführt wird, wie neuerdings auf einwandfreie Weise durch Bestimmung der physikalischen Konstanten nachgewiesen worden ist.^) Dabei spaltet sich das Protagon in *) Lochhead and W. Cramer, ün tlie phospliorus perceutage of varioiis saniplos of Protagon. Biochemical Joiiru. Vol. 2. p. 85(J (li)ü7). -) Dieser Irrtum beruht zum Teil darauf, daß die aus dem reinen alkoliolischeii Extrakt beim Erkalten ausfallende Substanz schlechtweg als Protagon bezeichnet worden ist, während es in Wirklichkeit nur ein Rohprodukt darstellt, welches nobon l'rotaijon andere Phosphatide und Cerebroside entliält und aus welchem durch weitere Ik'arbei- tung reines Protagon gewonnen werden kann. ä) Wilson and Cramer, On Protagon: its chemical composition and plivsical con- stants. its behaviour towards alcohol aiul its individuality. Quart. .lourn. of E.xperinientai Physiology. Yol. 1. p. 97 (19U8). 778 W. Gramer. eine phospliorreicliere, in kaltem Alkohol leichter lösliche Substanz und in eine phosphorarme, schwerer löshche Substanz (oder Substanzen). ^ ) Eine Zersetzung eines Teiles des Protagons läßt sich wahrscheinlich bei keiner der unten angegebenen Methoden ganz vermeiden, so dali keine derselben zu den quantitativen Methoden gerechnet werden kann. Nach Wilson und Gramer.-) Diese Methode ist die einfachste und sicherste ^lethode zur Darstellung des Protagons. Das von Blut und den Gehirnhäuten möglichst befreite und zerkleinerte Gehirn wird in einer weit- halsigen Flasche mit 90— 96Voigeni Alkohol bei möghchst niedriger Tem- peratur extrahiert. Die Extraktion wird durch Schütteln beschleunigt. Nach dem Absetzen und Dekantieren des Alkohols wird die Extraktion mit frischem Alkohol 8 — 4mal wiederholt. Die Masse wird durch Filtrieren vom Alkohol befreit und die Extraktion zuerst mit einer Mischung von gleichen Teilen Alkohol und Äther, dann mit Äther allein bis zur völligen Erschöp- fung fortgesetzt, was ungefähr 3 — 4 Extraktionen in Anspruch nimmt. Nach dem Abfiltrieren des Äthers wird die Masse ausgebreitet und an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet. Bei richtiger Behandlung läßt sich die zurückbleibende braune Masse leicht in ein feines, trockenes graues Pulver zerreiben. Fühlt sich die zurückbleibende Masse fettig an und läßt sich dieselbe nicht leicht pulverisieren, so ist es besser, das 31aterial zu verwerfen. Aus dem Pulver kann dann entweder durch Extraktion mit warmem Alkohol, wie bei Gamgees Methode (siehe unten), oder mit kochendem x\l- kohol das Protagon gewonnen vv erden. Im letzteren Falle wird der vorher zum Sieden gebrachte Alkohol auf das Pulver gegossen, die Mischung im Wasserbade unter Umschütteln 1 — 2 Minuten lang erhitzt und die heiße alkoholische Lösung durch einen Heißwassertrichter in ein durch Eis ge- kühltes Bechergias abfiltriert. Die Extraktion mit kochendem Alkohol wird in der gleichen Weise noch zweimal wiederholt. Das aus der alkohoUschen Lösung ausfallende Piohprodukt, welches Cerebron und Protagon enthält, wird mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zur Reinigung wird das Rohprodukt aus einer geringen Menge kochenden absoluten Alkohols wiederholt umkristallisiert. Auch hier wird der vorher zum Sieden erhitzte x\lkohol auf die Substanz gegossen und die heiße Lösung, ^\ie oben beschrieben, schnell abfiltriert. Bei der ersten UmkristaUisation bleiben beträchtliche Mengen einer gelblich-weißen, in kochendem Alkohol schwer löshchen Substanz zurück. Auch bei der zweiten UmkristaUisation bleiben oft geringe Mengen dieser Substanz zurück. Beim dritten Mal löst sich jedoch in der Regel bei richtigem Arbeiten das Pro- tagon leicht und ohne einen Rückstand zu hinterlassen, in einer geringen ') Chittendcn and Frissel, Procced. Amer. Phys. Science. Vol. 5. pag. 901 (1897). E. R. Posner and IV. Gies, Is Protagon a mechanical mixture of substauces or a defiuite Chemical Compound? Journ. of biolog. chemistry. Vol. 1. p. 59 (1905). ') Wilson and Cramer, On Protagon : its chemical composition and physical con- stants, its behaviour towards alcohol and its individuality. (^uart. Journ. of Experimental Physiology. Vol. 1. p. 97 (1908). Darstellung u. Eigeuschafteu d. für tl. Nervengewebe charakterist. Lipoide. 77t» Menge kochendem Alkohol auf. Die dann auskristallisierende Substanz, welche z\yeekmä[iig zum schnelleren Trocknen mit kaltem Äther f,'e\vaschen wirtl, ist ein reines Produkt, \Yelches durch weiteres l'mkristjülisieren nicht weiter in seiner Zusammensetzung verändert wird. Es sei nochmals darauf hingewiesen, daß auch beim UmkristaUisieren eine längere Ik'handiung mit heißem Alkohol zu vermeiden ist, da sonst Zersetzung eintritt und ein vorher reines Präparat wieder Cerebron enthält. Diese Methode ist besonders dann zu empfehlen, wenn mau größere Organmengen zu verarbeiten hat (10—20 oder mehr Gehirne), da sich l)ei der Vorbehandlung mit Alkohol und Äther das Volumen stark vermindert. Hat man kleinere Organmengen zu verarbeiten , so kommt man schneller zum Ziel, wenn man das zerkleinerte Gewebe mit so \iel wassei'freieni Natriumsulfat verreibt 1), daß ein trockenes Pulver erhalten wird , welches dann mit kaltem Äther bis zur völligen Extraktion von Lezithin und Chol- esterin etc. erschöpft wird. Aus dem Ptückstaud wird dann durch kochenden Alkohol in der oben angegebenen Weise das Protagon ausgezogen und durch Umkristallisieren gereinigt. Gai)i(/ees Methode. -) Bei dieser Methode, welche bisher fast aus- schließlich zur Darstellung des Protagons in Anwendung gekommen ist. wird die zerkleinerte Gehirnmasse mit warmem 85"/oi"'Pm Alkohol bei 40" mehrere Stunden lang digeriert. Die alkoholische Lösung wird abfiltriert und das Filtrat abgekühlt; der Rückstand wird wiederum ein- oder zwei- mal mit warmem Alkohol extrahiert. Die beim Abkühlen ausfallende Substanz wird durch wiederholtes Waschen mit Äther von Cholesterin, Lezithin etc. befreit. Der Rückstand wird durch wiederholtes Umkristallisieren aus warmem Alkohol bei 45'' gereinigt. Diese Methode beruht auf der Annahme, daß bei 40» eine Zersetzung des Protagons vermieden werden kann. Dies ist jedoch nicht der Fall, so daß auch bei dieser Methode die Behandlung mit warmem Alkohol so viel als möglich abgekürzt werden muß. Es ist überhaupt zwi-ckmäliiger. diese Methode so zu modifizieren, daß das Wasser und die in kaltem Alkohol imd Äther löshchen Substanzen zuerst entfernt werden, wie oben für die H'ilso)i- Cramer&che Methode angegeben ist. Das so erhaltene trockene Pulver wird dann durch einmalige Behandlung mit warmem Alkohol, der auf 4.')" erwärmt woi'den ist, ausgezogen. Das lieim Abkühlen auskristahisierende Rohprodukt wird in warmem Alkohol gelöst und auf diese Weise 2— Hmal umkristallisiert. Eine von Cramer^) ausgearbeitete Methode besteht darin, die zer- kleinerte Gehirnmasse mit einer konzentrierten Natriumsulfatlösung zu er- 1) Lochhead aud Cramer, The phosphorus percentage of various samples of Pro- tagon. Biochemical Journ. Vol. 2. p. 353 (1907). 2) Gamgee und Blankenhom , tjber Protagon. Zeitschr. f. physiol. Cberaio. Bd. 3. S. 260 (1879). — Gamgee, Textbook on the Physiological Chemistry of the aninial body. London 1880. p. 427. 2) Cramer, On protagon, choline and iieurine. .Journ. of i'bysiology. \ Teilen Chloroform und 1 Teil ]\Iethyl- alkohol. Es ist leicht löslich in heißem Methyl- und Äthylalkohol Chloroform, Eisessig, kaum löshch in kochendem Äther und Azeton. Li cholesterin- haltigem und kephalinhaltigem Äther soll es löshch sein. Diese Angabe bedarf jedoch noch der Bestätigung, da die in einer solchen Lösung vor- handenen und als Protagon angesprochenen Substanzen niemals genau untersucht worden sind. Es läßt sich am besten aus warmem oder kochendem Äthylalkohol Umkristallisieren, aus welchem es sich beim langsamen Al)kühlen in zu Rosetten vereinigten Nadeln, bei schnellem Abkühlen in amorphem Zu- stande ausscheidet. Durch längeres Erwärmen mit Alkohol wird es langsam zersetzt. Nach dem Trocknen ist es ein weißes, nicht hygroskopisches, stäubendes Pulver. Mit Wasser quillt es auf. Beim Schmelzen hinterläßt es einen stark sauer reagierenden Rückstand, der ausschließlich aus Meta- phosphorsäure besteht. Beim Schmelzen mit Kali x\'ird Kaliumsulfat gebildet. Beim Erhitzen färbt sich Protagon zwischen 150" und 160" gelblich, er- weicht zwischen 170" und 180" und schmikt scharf bei 200" zu einem braunen Sirup. Optisches Drehungsvermögen ^ ) [y.]^" =4-8 (in 5"/oiger Pyridinlösung) [a]3o= + 6-8, 3"/o , Brechungskoeffizient einer rV/oigen Pyridinlösung bei 30" = P5034 (Pyridin = 1-.X)62). Die reinsten bisher erhaltenen Präparate geben die folgenden Ana- lysen : Analysen C H N P S Gamgee und f 2mal umkristallisiert 6634 10-56 240 1032 - Blankenhorn {1819) [?, ,, „ 66-30 10-47 2-29 1-027 — Cramer (1904) . . 3 „ „ 66-37 10-82 2-29 1-04 071 Wilson \m& Cramer \ 4 .. l 6664 10-92 241 092 — (1908j ( 5 ,, ,. 66-57 10-98 239 093 0 73 ^) Wilson aiicl Cramer, On protagoii etc. loc. cit. — A criticism of some recent ■work on protagon. Quart. Journ. of Experimental Pbysiology. Vol. 2. p. 91 (1909). Darstellung u. Eigenschaften d. für d. Nerveugewelje cliarakterist. Lipoid". 7s 1 Spaltung des Protagons. Durch Barytspaltung wird das Protagon in Cerebro.side (sielic unten i. Glycerinphosphorsäure, eine der Stearinsäure jdinliclie Fettsäure, und ('lidliii gespalten. Aus 10 g reinem Protagon wurden (y^i) c/ Cholinplatinchlorid erhalten, i) Benutzt man eine wässerige Lösung, so mul') man das Protagon erst mit wenig WassQi- zu einem feinen Brei anrühren, dem zuerst Wasser und dann Barythydrat zugesetzt wird, und den Brei mehrere Stunden lang kochen. Der gebildete Niederschlag, der aus Barytverbindungen der C'erebrinc (über deren Gewinnung siehe unten) und der Fettsäure oder Fettsäui-cn besteht, wird durch Filtrieren entfernt, das Baryt aus dem heilien Filtrat durch Kohlensäure abgeschieden und die wässerige Lösung, welche Cholin und Glyzerinphosphorsäure enthält, abgedampft. Der Rückstand wird mit kaltem absoluten Alkohol ausgezogen, der Alkohol verdampft, der basische Rückstand mit Salzsäure vorsichtig neutralisiert, in wenig absolutem .\1- kohol aufgenommen und durch eine absolute alkoholische Lösung von Platiu- chlorid gefällt. Die Reinigung des Salzes erfolgt durch Zei-setzen durch Schwefelwasserstoff in der heilien wässerigen Lösung, Verdampfen des Fil- trates. Aufnehmen in absoluten Alkohol und abermaliges Fällen und aber- malige Zersetzung. Das so erhaltene Cholinchlorid wird in wenig Wasser gelöst und mit einer konzentrierten wässerigen Lösung von (^oldchloi'id gefällt. Das so erhaltene Salz hat den Schmelzpunkt 2?)S — •2o9<' bei schnellem Erhitzen. Die Base ist reines ChoHn. Neurin wird gar nicht erhalten. ^) GegenteiUge Angaben sind irrtümlich. Analysen C H Au N Gefunden U'U ;-^-16 44-47 ;il6 Berechnet für Cs Hl, N0C1+ Au CI3 i;V78 ?>-U 44-4;-'. HiO Nach Eosenheim und Tebh-) soll auch Sphingosin gebildet worden. x\naly tische Belege und experimentelle xVngaben fehlen. Die Barytspaltung ward durch Benutzung einer methylalkoholischen Barytlösung beschleunigt (siehe unten bei Cerebrin). Durch 20stündiges Kochen mit O'Töo/oiger Salzsäure wird (ialaktose quantitativ abgespalten. Bestimmt man das Reduktionsvermögen, so redu- zieren 0-2^ Protagon O'Ob g Kupfer. 3) Diese Tatsache ist zur (luantitativen Bestimmung des Protagons benutzt worden (siehe unten i)ei (luaiititativer Bestimmung des Protagons). Während bei der Zersetzung mit Baryt die Phospliatidgruppe des Protagons zerstört wird und nur die Cerebrosidgruppe erhalten bleibt, werden bei der Zersetzung durch Alkohol beide Gruppen erhalten. Man erhält dann Cerebron und ein oder mehrere Phosphatide, welche noch nicht genauer ') Gramer, On protagon, choline and neurine. 1. c. S. 779. ■-) liosenheim and Tebb , The non-existence of protagou as a defiuite chcmical Compound. Journ. of Physiol. Vol. 36. p. 17 (1907). «) NoU, Ül)er die quantitativen Beziehungen des Protagons zum Nervenmark. Zeit- schrift f. physiol. Chemie. Bd. 27. S. 370 (1899). 782 ^^ ■ Cr am er. untersucht worden sind. Nach den Angaben von Thudkhuin, der jedoch nicht mit reinem Protagon, sondern mit einem Rohprodukt gearbeitet hat. müßte sich ein kristaUinisches Phosphatid, das Diamidomonophosphatid Sphingomyelin. aus dem durch Alkohol zersetzten Protagon isolieren lassen. Die sogenannte ..fraktionierte KristalUsation des Protagons", welche von Thudichmn und anderen Forschern i) ausgeführt wurde, um die nicht einheitliche Natur des Protagons zu erweisen, ist weiter nichts als eine Zer- setzung des Protagons durch lang andauernde Behandlung mit warmem Alkohol unter Entstehung eines oder mehrerer Phosphatide und Cerebroside. Aus einem durch solche Behandlung zersetzten Protagon lassen sich durch kalten Alkohol und Äther Substanzen ausziehen, die sich durch ihren Phosphorgehalt vom Protagon unterscheiden. Pieines unzersetztes Protagon gibt an kalten Alkohol und Äther solche Substanzen nicht ab. Paranukleoprotagon. -) Das Protagon soll in dieser Form an einen Eiweißkörper gebunden im nervösen Gewebe vorhanden sein. Die zerriebene Gehirnmasse '^ird mit Chloroform gemischt und 1 bis 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Aus dieser Mischung läßt sich das Chloroform schwer abtrennen. Durch Erwärmen auf 45" er- folgt aUmählich eine Abscheidung des Chloi'oforms, so daß dasselbe durch Filtrieren abgetrennt werden kann. Das aus dem Chloroform extrakt sich abscheidende Wasser wird mittelst eines Scheidetrichters abgetrennt: die Chloroformlösung wird mit Essigäther versetzt, bis kein Niederschlag mehr erfolgt. Das erfordert ein ungefähr gleiches Volumen Essigäther. Der sich abscheidende zähe gelbliche Niederschlag sammelt sich an der Oberfläche an und kann so leicht entfernt werden. Er wird zuerst wiederholt mit kaltem Äther gewaschen und dann in einem Soxhletapparat mit Äther und zuletzt mit Chloroform behandelt. Der Rückstand wird im Vakuumexsi- kator getrocknet und läßt sich dann pulverisieren. Zusammensetzung : C H X P 60-79 8-74 6-20 P62 Dieses in Chloroform nicht lösliche Produkt wird nach Behandlung mit SO^/oigem Alkohol bei 45° chloroformlöshch, so daß Protagon in das Chloro- form übergeht, während ein unlösliches Paranuklein zurückbleibt. Zur Spal- tung des Paranukleoprotagons wird dasselbe mit SO^/oigem Alkohol behan- delt, ohne zu filtrieren auf 0" abgekühlt und filtriert. Es wird nicht ange- geben, wie lange die Behandlung mit Alkohol dauern soll. Steel und Gies ^) ^) Siehe z. B. Posner and Gies, Is protagon a mechanical mixture of substances or a definite chemical Compound? Journ. of hiological chemistiT. Vol. 1. p. .59 (190Ö). ■^) VJpiani e Ijelli, Sul un nuovo proteide del cervello. Gazetta chimica italiana. Vol. 32 (I). p. 466 (1902). •*) M. Steel and W. J. Gies, On tlie chemical nature of paranucleoprotagon, a uew product from braiu. Amer. Journ. of Physiology. Vol. 20. p. 378 (1907/()8). Darstellunff n. Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. 7^3 ließen den Alkohol 20 Stunden lang einwirken, wodurch etwa vorhandenes Protagon wenigstens teilweise zersetzt werden würde. Die feste, auf dem Filter verbleibende Substanz wird in einem Soxhlet- apparat mit Chloroform extrahiert. Aus dem Chloroformextrakt wurde durch Essigäther eine Substanz ausgefällt, aus welcher durch Kochen mit Salz- säure ein Fehlingsche Lösung reduzierender Körper abgespalten werden kann. Diese ausgefällte Substanz soll Protagon sein. Analyse C H N P 66-07 10-50 2-57 1-31 Der bei der Chloroformextraktion zurückbleibende Rückstand ist un- löslich in Alkohol, Äther und Chloroform, lösUch in schwachen Alkalien, aus denen es durch Säuren wieder ausgefällt wird. Es gibt die Biuret- und llillon^che Probe und wird von Pepsin nicht angegriffen. Durch Kochen mit 10"/()iger Schwefelsäure wurden Purinbasen nicht abgespalten. Beim Kochen mit Kalilauge wird es in Phosphorsäure und Albumin gespalten. Analyse C H N P 54-43 7-71 11-41 1-88 Alle diese Substanzen sind schlecht charakterisiert, und es ist sehr fraglich, ob es sich um einheitliche Substanzen handelt, und ob die abue- spaltene chloroformlösliche Substanz mit Protagon identisch ist und nicht ein Gemisch von Zersetzungsprodukten desselben darstellt. Nachprüfungen der Angaben durch Steel und Gies haben zu Körpern geführt, die einen ganz anderen Phosphorgehalt haben. Das kann zum Teil daran liegen, daß die Angaben von UlpUmi und Ldli über die Darstellung der verschiedenen Substanzen experimentelle Einzelheiten vermissen lassen. Weitere Unter- suchungen sind hier erforderlich. Cerebroside. Allgemeines. Zu dieser Gruppe gehören eine Reihe von Substanzen, welche von verschiedenen Autoren auf verschiedene Weise aus verschiedenem Aus- gangsmaterial hergestellt worden sind: nämlich die Cer^brine verschiedener Autoren, das dem Cerebrin nahestehende Homocerebrin (oder Kerasin) und das Enkephalin, das Pseudocerebrin, das Cerebron und das Phrenosin. Nach Ansicht des Verfassers sind diese Substanzen in folgender Weise zu grup- pieren und werden dementsprechend abgehandelt: Das Pseudocerebrin und Cerebron, über deren von Gramer^) aufge- deckte Identität kein Zweifel besteht 2), scheinen reine Präparate zu sein. Diese Substanz wird unter dem Namen Cerel)ron behandelt. 1) Cramer, ün Protagon, Cholin and Xeurine. 1. c. S. 780; Lochhead and Crumcr, On the phosphorus percentage of varions samples of protagon. 1. c. S. 779, Note 1. 2) Thierf eider, Üher das Cerebron. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S. 21 (1904). 784 ^V. Gramer. Die durch Barytspaltung erhalteneu Cerebrine von Parcus und von Kossei und Freytag zeigen vollkommene Identität und scheinen ebenfalls reine Präparate zu sein. Dieselben sind dem Cerebron sehr ähnlich und unterscheiden sich von letzterem nur durch Unterschiede im Schmelzpunkt und Stickstoffgehalt. ]Man kann dieselben daher nicht ohne weiteres mit dem Cerebron identifizieren, wie Gies i) will. Es ist vielmehr wahr- scheinlich, daß diese Substanzen aus dem Cerebron durch Einwirkung starker Reagenzien (Baryt) bei der Darstellung entstanden sind. Die Cere- brine anderer Autoren (Müller, Geoghegan) sind als stark verunreinigte Präparate aufzufassen und werden nur kurz angeführt werden. Das von Koch aus Eisessig erhaltene und Cerebrin benannte Produkt steht dem Cerebron am nächsten und wird dort behandelt werden. Das Phrenosin ist entweder ein unreines Cerebrin oder ein unreines Cerebron. -) Zu der Gruppe gehören auch das Aminocerebrininsäuregiycosid, welches dem Homocerebrin am ähnhchsten ist und dort Erwähnung findet, und die Cerebrinazide, welche jedenfalls ganz unreine Produkte sind. Sämtliche Cerebroside spalten beim Kochen mit verdünnter Schwefel- säure Galaktose ab. Mit konzentrierter Schwefelsäure verrieben, geben sie zuerst Gelbfärbung, die ungelösten Flocken färben sich allmähhch purpur- rot. 'Mit konzentrierter Schwefelsäure und liohrzuckerlösung tritt sofortige Purpurfärbung auf. Die Analysen und Schmelzpunkte sind in der oben gemachten An- ordnung in folgender Tabelle (S. 785) zusammengestellt. Cerebrin, Homocerebrin und Enkephalin. Das von Müller ^) dargestellte und Cerebrin genannte Präparat wurde durch Kochen des mit Barytwasser angeriebenen Gehirnbreies und Extrak- tion des dabei erhaltenen Niederschlages mit heißem Alkohol erhalten. Die auskristallisierende Substanz wurde durch Ätherwaschung von Cholesterin etc. befreit und aus kochendem Alkohol umkristaüisiert. Es ist ein stark ver- unreinigtes Präparat. Geoghegan *) erhielt ein Cerebrin von anderer Zusammensetzung da- durch, daß mit kaltem Alkohol und Äther erschöpftes Gehirn mit xVlkohol gekocht wurde. Die aus der heiß filtrierten alkoholischen Lösung beim Abkühlen ausfallende Substanz wird mit Äther gewaschen, eine Stunde lang mit Barytwasser gekocht und nach Entfernung des überschüssigen Baryts durch Kohlensäure aus heißem Alkohol umkristallisiert. *) Posner aud Gies, Is protagou a mechauical mixtiire of substances or a defiuite Chemical Compound? Jourii. of biological chemistry. Vol. 1. p. 59 (1905). -) H. Thierf eider , Phrenosin und Cerebron. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 46. S. 518 (1905). ^) Malier, tlber die chemischen Bestandteile des Gehirns. Liebigs Annalen der Chemie und Pharmacie. Bd. 105. S. 361 (1858). •*) Geoghegan, Über die Konstitution des Gehirns. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. Bd. 3. S. 332 (1879). Darstellung u. Eigeuschaften d. für d. Ncrveugewelje charakterist. Lipuide. 785 5 J. u - M C' (» ■ ■ ■ ^_ •" — — — ■*■ ^ fc« 0 -r Cj i) — iS 5 - ? "? s .i^ t. ^ ^'i ^ © '3'' a «> T 0 « 0 .s 1 li >^ -3 4) -^ Ol 2 .- s 0 t = E ix 0 ■ 0 1 <>~ ^ ^ ■^ -c .-' 1»/ « I o 1^- ;:: 'M " 1— ! - ^3 o 1 Ol 1 1 ~ 0 1 0 e 0 w5 1 1 0 -^ 5 ■£ tc z> Gvi 1 T— t 1 i> t^ 1 0 0 c^ 1 1 [> .>- -^- = S o ■^^ •'-' 1—1 i-H T-^ — = =„ = 71 Oi — in ^ _ C c 0 s^ =-3 ei ' O rt TT- V.-3 0 CS -1 i^ 0 cc 0 X ^^ cc ^ 1^ ^ 000 ^ ^ j^; ■^ ^ ^ >^ ^ •^ B 1 oc 1 1 1 ' Cl C-1 M 0 Th c -r 0 CO 0 -r 0 ^t 1 cc 00 0 CS ^ — ^ ?, o l-H l-i-. HH c TT 0 0 s bß '■i 0 0 n 0 -T ^ '^ r» 1 -^ 0 •- s^ .^ , ,"• CT- C- 30 0 Q 0 0 ^ -^ -ro o (M 0 ^ CO lO -Ttl CO -fi CO 2 0 0 ^ .-. 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Nach Parcus ^) wird das mit kaltem Wasser geAvascliene Gehirn durch einen linnenen Sack gepreßt und mit konzentriertem Barvtwasser unter Umschüttehi zum einmaligen Aufkochen erhitzt. Die Mischung wird stehen gelassen, bis sich das Koagulum abgesetzt hat und die überstehende Lösung klar ist. Ist dieselbe trüb, so muli nach Zusatz einer weiteren Menge von Baryt noch einmal bis zum Aufkochen erhitzt werden. Es wird filtriert, der Niederschlag mit heißem Wasser ausgewaschen, getrocknet und mit kochendem Alkohol unter Schütteln 5— 6mal extrahiert und heiß filtriert. Das ausfallende Cerebrin wird durch andauernde warme Ätherwaschung von Cholesterin befreit. 90 Ochsengehirne gaben 250 .r/ Rohcerebrin. Das- selbe wird durch wiederholtes Umkristallisieren aus Alkohol gereinigt bis keine gallertartigen Ausscheidungen mehr auftreten. Aus der Mutterlauge setzt sich nach zweitägigem Stehen eine Gallerte ab, welche aus Cerebrin, Homocerebrin und Enkephahn besteht. Die Gallerte wird von der Flüssigkeit getrennt. Durch langsames Erkaltenlassen der heißen alkoholischen Lösung kann das zuerst ausfallende Cerebrin entfernt Averden. Das Homocerebrin wird vom Enkephalin durch UmkristaUisieren aus Aceton getrennt. Die von der Gallerte getrennte alkohoHsche Lösung enthält weitere Mengen Homocerebrin und Enkephalin, die nach dem Verdampfen des Alkohols durch Umkristalüsieren aus Aceton getrennt werden. Das so erhaltene Cerebrin enthält stets noch Baryum in lockerer Bindung und muß zur vollständigen Reinigung mit Wasser angerieben und durch Kohlensäure vom Baryt befreit werden. Homocerebrin ist in geringeren Mengen im Gehirn enthalten als Cere- brin, so daß nur ein Viertel der Ausbeute des Cerebrins erhalten wird. Enkephalin entsteht wahrscheinlich aus dem Cerebrin durch Einwirkung des Baryts (wie auch von Salzsäure). Dieselben Substanzen können leichter in reinem Zustande erhalten werden % wenn man von dem bei der Protagondarstellung erwähnten Roh- produkt ausgeht, Melches aus dem heißen alkoholischen Gehirnextrakt aus- kristallisiert (in der Literatur oft irrtümlich reines Protagon genannt) und Cerebron enthält. Die Spaltung von sorgfältig gereinigtem Protagon ist noch nicht ausgeführt worden. Das Rohprodukt wird in Methylalkohol gelöst, die Lösung auf dem Wasserbad mit einer methylalkoholischen Lösung von Ätzbaryt versetzt, wobei ein Niederschlag entsteht, und einige Minuten lang auf dem Wasserbad dige- riert. Der Niederschlag, welcher aus einer Verbindung der Cerebroside mit Baryt besteht, wird abfiltriert, mit barythaltigem Methylalkohol einmal gewaschen, in Wasser aufgeschwemmt und vom Baryt durch Durchleiten von Kohlensäure befreit. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Alkohol ge- ^) Parcus, Einige neue Gehirnstoffe. Journ. f. prakt. Chemie. Bd. 24. 8.310(1881). ^) Kossei und Frcijtag, Über einige Bestandteile des Nervenmarks und ihre Ver- breitung in den Geweben des Tierkörpers. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 17. S. 431 (1893). Darstellung n. Eigeaschaften d. für d. Nerveugewebe charakterist. Lipoide. 7,S7 waschen und mit absolutem Alkohol hei 50" ausgezogen. Bei Iimehaltung dieser Temperatur sollen die Barytseifen nicht mit in den Alkohol ühergehon. Der alkoholische Extrakt wird auf Zimmertemperatui- abgekühlt, wo- bei sich zuerst Cerebrin ausscheidet, welches nach 2 Stunden abfiltriert wird, Avährend die Abscheidung des Homocerebrins erst nach 5 — 6 Tagen beendet ist. Die Mutterlaugen werden nach dem Eindampfen auf weitere Mengen Cerebrin und Homocerebrin verarbeitet. \'öliige Reinigung erfolgt durch wiederholtes Umkristallisieren aus Alkohol. Ausbeute an Cerebrin und Homocerebrin öO^/o des Ausgangsmaterials. Cerebrin und Homocerebrin bilden eine lockere Verbindung mit Barvum. Eigenschaften. Abgesehen von den angegebenen typischen Cere- brosidreaktionen — Purpurfärbung mit konzentrierter Schwefelsäure und Abspaltung von Galaktose beim Kochen mit Salzsäure — zeigen diese Substanzen die folgenden Eigenschaften: Cerebrin kristaUisiert aus Alkohol in schwach hchtbrechenden. radiär gestreiften KnöUchen mit glatten Rändern. Aus Azeton fällt es in Flocken aus. Getrocknet ist es ein weißes, lockeres, schwach hygroskopisches Pulver, leicht löslich in kochendem Alkohol sowie in heißem Benzol, Chloroform, Aceton, Eisessig. Unlöshch in heißem Äther. Homocerebrin. Löst sich in allen Lösungsmitteln des Cerebrins, außerdem noch in heißem Äther. Es ist in absolutem Alkohol leichter lös- hch als Cerebrin und scheidet sich beim raschen Abkühlen aus diesem Lösungsmittel in Flocken, beim langsamen Abkühlen in Form von Gallerten ab, was für diese Substanz charakteristisch ist. Diese Gallerten bestehen aus mikroskopisch feinen, langen Nadeln. Nach dem Trocknen ist es eine wachsartige, schwer zerreibliche Masse (Unterschied von Cerebrin), welche Alkohol zurückhält. Das Cerebrin und Homocerebrin quellen mit Wasser auf, werden aber durch Kochen der wässerigen Lösung nicht zersetzt. Mit Barytwasser bilden sie lockere Baryumverbindungen. Durch andauerndes Kochen mit Baryt- wasser sollen sie zersetzt werden (V). In Benzol aufgeschwemmt addieren sie o Moleküle Brom und gehen in Lösung. Wird das Benzol an der Luft verdunstet, so bleibt eine glasige, durchsichtige Schicht zurück, die sich nach dem Trocknen pulverisieren läßl und den folgenden Bromgehalt hat: Bromcerebrin .... le-eöVo und lÖ-oO^/o Bromhomocerebrin . . 17'25% „ 16*93% Die Bromverbindungen sind in Äther und Alkohol, besonders leicht in Benzol löslich. Sie sind optisch aktiv. Tribromhomocerebrin [7.]d = —12-48« in If/oiger Benzollösung bei Zimmertemperatur. Das Molekulargewicht des Homocerebrins wurde durch Erhöhung des Siedepunktes der Lösung in Eisessig bestimmt. Drei Bestimmungen ergaben: 945, 972, 1027. 50* 69 700 19-23«/ü 69—70" 68" 19-48% 73g W. Gramer. Spaltung. Bei der Spaltung durch Salpetersäure wurde eine Fett- säure gebildet, welche für Stearinsäure gehalten wurde. Diese Annahme, welche von Thudichum scharf bekämpft wurde, der die Säure für ein bei 84*^ schmelzendes Isomeres der Stearinsäure hielt, stützt sich auf die folgenden Angaben: o 1 1 , , Barvurnbestimmuno- ^ des Barytsalzes Fettsäure aus Cerebrin . . . ,. „ Homocerebrin . ,. „ Stearinsäure . . Eine Fraktion der Fettsäure zeigte einen höheren Schmelzpunkt, 73 bis 75" und 75 — 78", was auf Beimischung unveränderten Cerebrins resp. Homocerebrins zurückgeführt wird. Durch abermaliges Kochen mit Sal- petersäure wird der Schmelzpunkt auf 69 — 70" erniedrigt. Die Menge der abgespaltenen Stearinsäure ist aus Cerebrin . . . 68"/o .. Homocerebrin . 74"/o was 3 Molekülen Stearinsäure aus 1 Molekül Cerebrin resp. Homocerebrin entspricht. Die Spaltung mit Salpetersäure wird in folgender Weise ausgeführt: Ca. \cj Cerebrosid wird mit 15 cm^ konzentrierter Salpetersäure (spezifisches Gewicht 1-52) übergössen, umgeschüttelt und 45 cm'^ Wasser zugefügt. Das Gemisch wird unter Umschütteln am Rückflußkühler auf dem Wasserbad er- wärmt, wobei zuerst eine heftige Reaktion auftritt. Wenn die Gasentwicklung- nachläßt, wird die Plüssigkeit über Meiner Flamme mehrere Stunden lang in schwachem Sieden erhalten. Nach dem Erkalten wird die Säure von der er- starrten Masse abgegossen und letztere einige Male mit Wasser ausgekocht. Eine systematische Untersuchung der Spaltungsprodukte des Cere- brins und Homocerebrins ist noch nicht ausgeführt worden. Unter Anwen- dung der für die Spaltung des Cerebrons angegebenen Methoden wäre es möglich, mit Sicherheit festzustellen, in welcher Beziehung sich das Cere- bron vom Cerebrin und Homocerebrin unterscheidet. Enkephahn verhält sich in bezug auf seine Löshchkeit wie Homo- cerebrin und kann wie dieses aus dem Alkohol als Gallerte ausfallen. In reinem Zustande kristaUisiert es aus Alkohol in leicht gekrümmten Blätt- chen. Mit heißem Wasser quillt es auf und bildet einen Kleister, der auch nach dem Erkalten bestehen bleibt. Aminocerebrininsäureglykosid. Diese anscheinend dem Homocerebrin ähnliche Substanz wurde von Bethe^) durch eine eigentümhche Kupfermethode erhalten. Diese Methode ^).Bethe, Über einige Edukte des Pferdegehiriis. Archiv f. experim. Path. ii. Phar- makologie. Bd. 48. S. 73 (1902). Üarstclluuir ii. EigLMiscliaftLMi .1. Uiv .1. NcrveiitfowolM« chanikti-riM. Lipoi.U- sowie die Darstelluiij: dieser Siihstaiiz wird weiter unten hei den Phos- j)liatiden liej^ehen. Eigeiiscliafteii. Kristallisiert ans neutralem Aikoli.u m .>hm > .saurem Alkohol in Sphiin»krisinlU-ii. LiislicJi in jlenzol. Chloroform iiii*i ;,.... ni Alkohol, schwer löslich in kaltem Alk(tliol. nnlöslich in Athvlnther und Petroläther. liildet Salze mit llarviim und Kn|)t('r. welche in hciUMu Alkohol unlöslich sind. Spaltinij^'. iHirch V4'^fiiii(liges Kochen mit Salzsäure im Koh' Strom wird anlier (ialaktose eine stickstofffreie Siiure und ein stick haltiiier Köi-per erhalten. Bei zu lan;iem Kochen mit Salzsiiure treten wciici- gehende Zersetzungen auf. Die stickstofffreie Säure, welche den Namen C'erehrininsiiure erhi««f soll mit Thudichtuns Neurostearinsäure identisch sein. Sie zeij^t die fol-.. Zusammensetzung und Schmelzpunkt: Gefunden c H Sclimelzpiiukt 76-96 l-i-71 7H« 76-99 IHöO SO« "iliVl 1-jii; Berechnet für (",9 ITi,-, <>2 Die Reinheit dieses Produktes wird vom \ei-fasser seihst kvweifelt. Die stickstoffhaltige Suhstanz hat schwach hasische und schwach saun- Eigenschaften und soll mit dem Sphingosin identi.sch sein. Es wird als salzsaures Salz erhalten (Schmelzpunkt lu.') loT"). weh-hes in Äther un- lö.slich. in heißem Alkohol lö.slich ist und daraus heim Erkalten in S|)h:tro- kristallen oder -Nadeln sich ausscheidet. P)eim Kochen mit Kalilauge wiitl Ammoniak abgespalten und bei 84" schmelzende Cerehrininsäure bleibt zurtkk. .so daß also die stickstoffhaltige Substanz AinidocerebrininsiUir' Cerebron. Diese Substanz kommt in dem bei der Protagondarstellung erhaltenen üohprodukt vor, welches aus dem heißen alkoholischen (iehirnextrakt Erkalten auskristallisiert und von vielen Autoren irrtümlicherweise als reine.-« Protagon angesehen wird. Aus diesem Hohprodukt erhielt (in '; das ("ei'ebron derart, dali der beim Auskristallisieren zurückbleibende i. • ■•"' mehrfach aus ^Vlkohol umkristallisiert wurde, bis die ansf.dleiideii ^ phosphorfrei war. In ähnlicher Wei.se erhielt A'oc/j 2) eine wahrscheinlich mit den» IVivbron identische Substanz durch wiederholtes rmkristallisieren des mit Aß gekochten Rohproduktes aus Eisessig. Spätere Angalien^i .scheinen an/u- *) A.Ganif/ec, TcxtliooU im tlie l'liysiel- '■■■ '' .•li.'M.kiiv ,,f ih,- ii.mh .J 1....l\ Vol. 1. p. 441. Lüii(l(.n 188U. ^) W.Koch, Zui- Ivcmitnis des Lezitliins, Koplialins »mi i errlmn». / ; pliysiol. Clu-inio. Hd. :W. S. 134 (H)02). ') Koch, Sonio choinical clistMvatioiis nn tlic nen"fuis system in ccrtain fnrtno« of iiisaiiity. Archivcs of Neurology. Vol. 3. p. 332 (ISKiTi 790 W. Gramer. deuten , daß dieses Cerebrin noch unrein war und betraclitliclie Mengen SchAvefel (0-8Vo) enthielt. Die Ausbeute an Cerebron ist um so besser, je länger der Gehirn- brei bei der Extraktion mit warmem oder kochendem Alkohol behandelt worden ist. Wird reines Protagon durch stundenlang andauernde Behandlung mit warmem oder kochendem Alkohol zersetzt, so kann aus dem Zersetzungs- gemisch Cerebron isoliert werden. Am besten wird die Substanz nach Thierf eider ^) auf folgende Weise erhalten : Der mit Azeton entwässerte Gehirnbrei wird mit Ither völlig extra- hiert. Die aus den ätherischen Auszügen bei 0" auskristallisierende blasse wird dem Gehirnbrei zugefügt und die Masse mit 85Voigem Alkohol bei 45 — 50" wiederholt ausgezogen. Die Ausscheidungen werden gesammelt, mit Äther gewaschen, getrocknet und in Tö^/o Chloroform enthaltendem Methyl- alkohol gelöst, und zwar werden 100 Teile des ausgeschiedenen Rohproduktes in 500 Teilen dieser Mischung unter leichtem Erwärmen gelöst. Nach dem Filtrieren wird die Flüssigkeit in einem verschlossenen Kolben bei Zimmer- temperatur 24 Stunden lang stehen gelassen. Die sich an der Oberfläche ausscheidende weiße Masse wird von der Lösung durch Filtrieren getrennt, das Filtrat abgeküldt und die dabei ausfallende Masse durch wiederholtes Umkristallisieren aus der Chloroform-Methylalkoholmischung gereinigt, bis die Abscheidung wieder in Form einer harten weißen Kruste an der Ober- fläche erfolgt. Die Mutterlaugen können nach dem Abdampfen im Vakuum in gleicher Weise verarbeitet werden, so daß weitere Mengen der oben beschriebenen, charakteristisch an der Oberfläche sich abscheidenden Sub- stanz erhalten werden. All diese Abscheidungen werden vereinigt und in der sofachen Menge einer Mischung von 1 Teil Chloroform und 4 Teilen Methylalkohol heiß gelöst. Das beim Erkalten sieh ausscheidende Cerebron wird weiter gereinigt mittelst einer Lösung von Zinkhydroxyd in ^lethyl- alkohol, welche durch Einleiten von Ammoniak in das in Methylalkohol suspendierte Zinkhydroxyd und Zufügen von Ammoniumazetat liereitet wird. Dieses Ileagens wird heiß zu einer heißen Lösung des Cerebrons in lOVo Chloroform enthaltendem Methylalkohol zugefügt. Die Mischung wird ge- kocht, bis sich die entstandene Trtibung zu einer flockigen ]\lasse zu- sammengeballt hat, welche fast alle phosphorhaltigen Verunreinigungen enthält. Der aus dem klaren Filtrat beim Erkalten sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert und aus der Chloroform-^Methylalkoholmischung- (1:10) noch einmal umkristalhsiert , wobei nur noch eine geringe Menge einer zink- und phosphorhaltigen Substanz ungelöst zurückbleiben soll. Beim Erkalten des Filtrates kristallisiert das Cerebron in gUtzernden Kri- stallblättchen aus. ') Kitagawa und Thierf eider, tJber das Cerebron. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 49. S. 286 (1906). ' Darstellung u. Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipuido. 7<(i Eigenschaften des Cerebrons. M Die Chloroformlüsung des Cerebrons nimmt Brom auf. Die llrom- verbindung- bleibt beim Verdunsten als spröde, amorplie Masse zurück. Ks ist optisch aktiv [a]^^ = + 7-6" in öVoigor chloroform-methvlalkoliobsclu'r Lösung. Cerebron ist in reinem sowie in benzol- oder chloroformlialtigem Alkohol in der Wi'rme. löslich und scheidet sich beim Erkalten aus. Aus 50o/o Benzol enthaltendem Alkohol scheidet es sich in knollenartigen Formen ab, aus 20Vo Chloroform enthaltendem Azeton kristallisiert es in Form von konzentrisch angeordneten Nädelchen oder Blättchen. Die Kristallform scheint sehr wechselnd zu sein. Durch einstündiges Kochen mit kalt- gesättigter Barvtlösung wird es nicht verändert. 2) Wird das amorphe Cerebron in 85o/oigem Alkohol aufgeschwemmt und auf ÖO« 1 Stunde lang erwärmt, so backt die Masse zusammen und lagert sich allmählich in nadel- oder blättchenförmige Kristalle um, die aus den Knollen herausgewachsen sind. Wird das Erwärmen noch länger fortgesetzt, so sind aUe knollenartigen Gel)ilde verschwunden und alles ist in feine, durcheinander geschobene Blättchen, die h'ufig als unvollkommen ausgebildete Tafeln mit ganz scharfen Begrenzungslinien erscheinen, ver- wandelt. Makroskopisch sieht man die Flüssigkeit von prachtvoll glänzen- den Flitterchen erfiült. Der Anbhck erinnert an Cholesterin. Getrocknet ist es eine weiße, verfilzte, glänzende Masse von elastischer Beschaffenheit. Bei dieser für das Cerebron charakteristischen rmlagernnu- wird Wasser aufgenommen, wie die Analyse zeigt: C 67-99Vo H ll-TöVo. Das Cerebron gibt die typische Cerebrosidreaktion mit konzentrierter Schwefelsäure und spaltet Galaktose ab. Spaltung des Cerebrons. 3) 2 g Cerebron werden mit 110— 150 eo?^ Methylalkohol, welcher lOVo konzentrierte Schwefelsäure enthält, am Hückfluükühler auf dem Wasser- bad erhitzt. Es tritt zuerst eine heftige Beaktion ein, dann löst sich die Substanz vöUig auf. Nach 4stündigem Erhitzen kühlt man die Mischung bis unter 0° durch Einstellen in eine Kältomischung ah. Cerebronsäure. Nach erfolgter Abscheidung wird die schneeweiße Masse abgesaugt und mit schwefelsäurehaltigem Methylalkohol ausgewaschen, in warmem Äther gelöst und die ätherische Lösung von der sich absetzenden Schwefelsäure getrennt. Nach dem Verdunsten des Äthers wird der Bück- ') Wörner und Thierfelder , Über die chemische Zusammensetzung des Gehirns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. *Bd. 30. S. 542 (1900). ") Privatmitteiluug von Prof. Thierfelder. ») Thierfelder, Über das Cerebron. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 43. S.21 (1904). — Thierfelder, Über das Cerebron. II. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Cliemie. Bd. 44. S. 366 (1905). — Kitagcura und Thierfelder, Ül)er das Cerebron. III. Mitteilung. Zeit- schrift f. physiol. Chemie. Bd. 49. S. 286 (1906). 792 W. Gramer. stand wiederum in Äther gelöst und das Verfahren fortgesetzt, bis die Schwefelsäure völlig entfernt ist. Die so erhaltene Substanz ist ein Gemisch der freien Cerebronsäure, welche nur bei saurer Reaktion in Äther löslich ist, und des Cerebronsäuremethylester, welcher auch bei alkalischer Reaktion in den Äther übergeht. Zur Trennung wird die ätherische Lösung mit alkoholischer Natron- lauge alkalisch gemacht, der entstehende Niederschlag abfiltriert, mit Äther gewaschen, in Wasser aufgeschwemmt und nach Zusatz von Schwefelsäure durch Schütteln mit Äther gelöst. Der durch Verdunsten des Äthers er- haltene Rückstand stellt nach dem Umkristallisieren aus heißem Alkohol Cerebronsäure dar. Das Filtrat, welches den Methylester enthält, wird mit Wasser geschüttelt, verdunstet und der Rückstand aus warmem Oß^/oigem Alkohol umkristallisiert. Der Ester wird durch halbstündige Verseifung mit Natrium alkoholat Ci-ö^/'o Na, gelöst in Alkohol) auf dem Wasserbad in die freie Säure übergeführt. Galaktose, Sphingosin und namenlose Base. Die Flüssigkeit, welche von der ausgeschiedenen Cerebronsäure und ihrem Ester getrennt worden war, enthält Galaktose als Methylgalaktosid. das Sulfat des Sphin- gosins und das Sulfat einer anderen, dem Sphingosin, ähnlichen Base. Zur Trennung, und Bestimmung der Galaktose wird die Lösung in einem Kolben nach Zusatz von 300 cni^ Wasser 5 Stunden zuerst auf dem Wasserbad erhitzt und nach weiterem Wasserzusatz bis auf 120 cm ^ eingedampft. Aus der klaren Flüssigkeit scheidet sich beim Erkalten das Gemisch der Basen- sulfate als eine leicht rötlich gefärbte weiße Masse ab , die sich im Zu- sammenhang herausheben läßt. Die Flüssigkeit enthält nur Galaktose, deren Menge durch Titrieren ermittelt werden kann (21*837o des Cerebrons). Das ausgeschiedene Gemenge der Sulfate wird mit Wasser gewaschen, bis das W'aschwasser nur noch eine schwache Schwefelsäurereaktion Q:ibt. Nach dem Trocknen im Vakuum wird die Masse mit Äther extrahiert. Der Rückstand wird in reinem absoluten Alkohol gelöst, filtriert, eingeengt nnd im Vakuum getrocknet. Die Substanz besteht zum größten Teil aus Sphingosinsulfat, welchem das Sulfat einer anderen dem Sphingosin ähnlichen Base in geringer Menge beigemischt ist. Das Sulfat der zuletzt erwähnten Base ist leichter löslich in heißem iVlkohol als Sphingosinsulfat und kri- stallisiert auch in anderen Formen (siehe Tabelle S. 794 u. 795). Das Sulfatgemenge der Basen kann durch fraktionierte Kristallisation in das Sphingosinsulfat und das Sulfat der namenlosen Base getrennt werden. Zur weiteren Reinigung der letzteren wird das Sulfat in alkoholi- scher Natronlauge gelöst, aus der Lösung durch Aäel Wasser und Natron- lauge die freie Base ausgefällt und dieselbe dann mit Äther ausgeschüttelt. Nach dem Abdampfen des Äthers wird der Rückstand in w^armem Alkohol gelöst und tropfenweise unter Rühren und Reiben der Wandung mit einem Glasstab alkoholische Salzsäure zugesetzt. Nach einiger Zeit scheiden sich glitzernde Blättchen ab, deren r^ildung bei weiterem Zusatz der Salzsäure Darstellung u. Eigenschaften d. für (I.Nervengewebe charakterist. Lipoide. 795 bis zur schwach alkalischen oder neutralen Reaktion zunimmt. Aus doi- Mutterlauge können durch Ätherzusatz und starkes Abkühlen weitere Mengen des Chlorids erhalten werden. Aus dem gereinigten Chlorid kann in der schon angegebenen AN'eisc die freie Base in ätherischer Lösung erhalten werden, aus welcher sie sich beim Einengen in großen Kristallen abscheidet. Aus der alkoholischen Lösung der Base wiixi durch Zusatz von alkoholischer Schwefelsäure oder alkoholischer Salzsäure das Sulfat resp. das Chlorid abgeschieden. Bei einstündiger Spaltung des Cerebrons mit der '2r)fachen Menge wässeriger T^/oiger Schwefelsäure scheint nur der schwerer lösliche Anteil des Basengemisches, das Sphingosinsulfat , gebildet zu werden. Weitere Untersuchungen über die vollkommene Identität der beiden Sphingosine stehen noch aus. Die in der Tabelle angegebenen Daten beziehen sich auf das durch wässerige Schwefelsäurespaltung erhaltene Sphingosinsulfat. Die Spaltung mit wässeriger Schwefelsäure wird in einer Druckflasche in kochendem Wasserbade unter beständigem Schütteln ausgeführt. Phrenosin. Die ursprünglich M von Thudichmn mit dem Namen Phrenosin be- zeichnete Substanz war ihrer Darstellung nach ein stark verunreinigtes oder zersetztes Protagon, deren Phosphorgehalt übersehen wurde. Später-) wurde zugegeben, daß diese Präparate bis 0"78"/o Phosphor enthielten und der unten angegebene Weg zur Entfernung der Phosphatide eingeschlagen. Der Name Phrenosin wurde dann ohne weiteres auf dieses ganz verschiedene phosphorarme Präparat übertragen. Die Reindarstellung ist jedoch nie völlig gelungen und die Zusammensetzung wurde aus den Spaltungspro- dukten ermittelt. Das Phrenosin ist entweder mit dem Cerebron oder mit dem Cerebrin identisch, welche jedoch beide besser definiert sind. Es hat denselben Schmelzpunkt wie das Cerebrin, 17(3". Da das Phrenosin selbst in den Händen seines Entdeckers solchen radikalen Umwandlungen unter- legen ist, ohne daß schUeßlich ein reines Präparat erhalten wurde, so wäre es zweckmäßig, den Namen überhaupt fallen zu lassen. Die Darstellung erfolgt aus der Substanz, die sich beim Auskochen des Gehirns mit Alkohol aus der alkohoUschen Lösung beim Erkalten ab- setzt. Diese Substanz wird im Mörser mit einer alkoholischen Lösung von ») Thudichum, Researches on the chemical Constitution of the brain. Reports ot tbe Medical Officer of the Privy Counceil and Local Government Board. New Series No. in. p. 185, 186. London 1874. 2) Thudichmn, Further Researches on the chemical Constitution of the brain. Kinth Annual Report of the Local Government Board (1879—1880). Supplement con- taining the Report of the Medical Officer for 1879. p. 143. London 1880. Thudichum hat eine endgültige Zusammenfassung seiner Anschauungen in einem 1901 veröffent- lichten Buch .,Uber die chemische Konstitution des Gehirns des Menschen und der Tiere" (Tübingen) gegeben. Die im Folgenden gemachten Hinweise auf Thndichmns Angaben beziehen sich auf dieses Werk. 794 W. Gramer. Spaltungsprodukte Spaltungs- produkt CerebroD- säure Derivate Analysen Gefunden (Mittel) Berechnet für Schmelzpunkt Xatronsalz Azetyl- verbiudung Methylester C 75-337o H 12-507o j^J5-257o '•^^l5-637o Analysiert als Xatronsalz G 70007o H 11 -3070 Na 5-147o G 75-857o H 12-53«/„ 75-387o .0 G,,H,gXa03 5-487o C,,H,,03Na(CH3GO) 70-137o ll-04«/o i-987o ^25 H49 O3 . CH3 75-73''/o 12-62''/ 990 65° G a 1 a k 1 0 s e S p h i u- g 0 s i u Sulfat G 61 -0970 H 10-877o N 4-087e, H,SO^ 14-857o (G„ H3. XOJ, H, SO, 61-087; 10-787o 4-197o U-677o Bei 240—250" unter Gasent- wicklung zer- setzt, ohne zu schmelzen Namenlose Base (aus unreinem Sphingosin- sulfat isoliert) Ghlorid Sulfat G 72-587o H 12'687o 72-760 12-547, ^'l9 Hgg NO, G 65-54''/o 65-187o H ir467o 11 -5270 X 4-147o 4-01 7o Gl 10-277o 10-l37o HCl 87" 132—133« Darstellung U.Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. TOTi des ('erebrons. Eigenschaften und Kristallforra Löslichkeit Ausbeute Schneeweiße, leicht pulverisierbare, nicht hygroskopische Substanz. Runde oder ovale, manchmal gelappte, radiär gestreifte Gebikfe. Schneeweiße, stark elektrische Substanz. Aus Alkohol in Nadeln , zu Sternen ver- einigt oder , wenn einzeln liegend , stark gebogen. Auch in knoljenartigen Gebilden. Die konzentrierte alkoholische Lösung er- starrt beim Erkalten zu einer Gallerte, die aus sehr feinen, langen Fäden besteht. Das Natronsulz kristallisiert aus Alkohol in sehr feinen Nädelchen oder Prismen. Nicht hj'groskopisch. Aus 967oigem Alko- hol in langen, geraden, zu lockeren Sternen vereinisrten Nadeln. Leicht löslich in Äther bei saurer Reaktion und in warmem Alkohol. In Wasser unlöslich , in heißem Alkohol schwer löslich. Leicht löslich in Alkohol, Methylalkohol , Äther, Chloroform. Löslich in Äther, auch bei alkalischer Reaktion, und in warmem Alkoh(jl. 481070 (Freie Säure und Methylestcr) 21 -SS" Weiße, undeutlich kristallinische Masse von alkalischer Reaktion. Kristallisiert nicht. Die alkoholische Lösung gibt mit Schwefelsäure einen Niederschlag, der beim geringsten Überschuß der Schwefel- säure wieder verschwindet. Beim Erhitzen auf dem Platinblech tritt ein Geruch nach verbranntem Fett auf. Weiße, stark hygroskopische Substanz, die in ganz trockenem Zustande sich leicht pulverisieren läßt. Kristallisiert aus Alko- hol in spießigen , mit kleineu Nadeln lie- setzten Kristallen oder in zu Rosetten vereinigten Nädelchen. Addiert Brom. Leicht löslich in Äther, Alkohol, Mcthyhxlkohol, Aceton, Petroläthcr. In Wasser unlöslich. In Wasser und Äther un- löslich, in kaltem Chloro- form wenig, in warmem leicht löslich. In kaltem Alkohol schwer löslich; Zusatz einiger Tropfen H, SO, bewirkt sofortise Lösung. In heißem Alko- hol leiclit l()slich. 41-37'' 0 (rohes Sphiu- gosinsulfat, verunreinigt mit etwa i^/o des Sulfates der iKimeu- losen Hase Aus warmem Äther in großen, zentimeter- langen nadelförmigeu Kristallen, welche aus langen schmalen Blättchen bestehen. Leicht pulverisierbar. Die alkoholische Lösung addiert Brom. Beim Erhitzen tritt ein Geruch nach verbranntem Fett auf. Kristallisiert aus Alkohol in großen, glas- hellen, durcheinander geschobenen, recht- winkeligen Tafeln mit geraden Begreu- zungslinien. Mikroskopisch uiul makro- skopisch dem Cholesterin ähnlich. Im trockenen Zustande eine zusammenhän- gende, stark silberglänzende Masse, die sich nur schwer zerreiben läßt. Addiert Brom. In knolligen drüsigen Massen aus Alkohol. In Wasser unlöslicli , in kaltem Äther schwer, in warmem Äther leicht löslich. In Wasser und Äther un- löslich, in kaltem Alkohol etwas, in warmem Alko- hol leicht löslich. Leichter löslich in heißem Alkohol als Sphinirosin- sulfat. /o 796 W. Gramer. Bleizucker, der kleine Mengen von Ammoniak beigesetzt sind, verrieben und in heißen 85o/oigen Alkohol eingetragen. Dann wird Bleizucker und Ammoniak zugesetzt, solange noch ein Niederschlag entsteht, filtriert und der Niederschlag mit kochendem Alkohol ausgekocht. Beim Erkalten des Filtrates bis 28" fällt Phrenosin aus. bei weiterem Abkühlen Homocerebrin (Kerasin), welch letzteres auch aus den Mutterlaugen bei längerem Stehen sich absetzt. Durch 6 — 8mal wiederholte fraktionierte Kristallisation läßt sich auf diese Weise das Phrenosin vom Homocerebrin trennen. Die so erhaltenen Phrenosinpräparate waren stets noch mit einem Phosphatid behaftet. Bei der Spaltung mit Säure entstehen Sphingosin, Galaktose und Neurostearinsäure. Die letztere hat den Schmelzpunkt 84" und die folgende Zusammensetzung: C 75-88"/o H 12-85% Thudichum hält die Säure für eine Isomere der Stearinsäure. Sie ist wohl entweder mit der aus Cerebron erhaltenen Cerebronsäure identisch, in welchem Falle das Phrenosin ein unreines Cerebron ist, oder mit der aus dem Cerebrin erhaltenen Fettsäure identisch, in welchem Falle das Phre- nosin als ein unreines Cerebrin anzusehen wäre. Thudidmm gibt merkwürdigerweise an, daß das Phrenosin durch Baryt leicht zersetzt wird, was weder für das Cerebron noch für das Cerebrin gilt. Bei der partiellen Hydrolyse des Phrenosins mit Barythydrat unter Druck oder mit alkohohscher Schwefelsäure soll Psychosin gebildet werden. Das salzsaure Salz dieser Base ist in Wasser leicht löslich und unter- scheidet sich dadurch vom Sphingosin. Bei weiterer Spaltung zerfällt Psy- chosin in Sphingosin und Galaktose. Analvse: C 61 "59 H 10-09 N 2-96 Bei der Hydrolyse mit Salpetersäure entstehen Neurostearinsäure, Schleimsäure und Phrenyhn, welches aus Alkohol in gekrümmten Nadeln kristallisiert, bei 115 — 130" schmilzt, 2"/o Stickstoff enthält und die Petten- Ä;o/ersche Keaktion gibt. Cerebrinazide. 0 Die Substanzen bilden Verbindungen mit Schwermetallen und finden sich in dem Niederschlag, der, wie bei der Darstellung des Phrenosins be- schrieben, durch Bleizucker in der heißen alkoholischen Lösung der Cere- broside hervorgebracht wird. Nachdem das Phrenosin und das Homocere- brin durch kochenden Alkohol aus diesem Niederschlag ausgezogen worden sind, bleibt ein unlöslicher liückstand der Bleisalze der Cerebrinazide. ^) Thudichum, Chemische Konstitution des Gehirns des Menschen und der Tiere. S. 220—224. Tübingen 1901. Darstellung u. Eigenschaften d. für d. Nervengewebe cliarakterist. Lipoide. 71)7 Cerebrinsäure. Ein Teil der Bleisalze wird durch kalten IWmi/oI ausgezogen. Das Benzol wird abdestilliert, der Kückstand in heil'ieni Al- kohol aufgeschwemmt und durch Schwefelwasserstoff zersetzt. xVus der heilien alkoholischen Lösung kristallisiert beim Erkalten die Cerebrinsäure in Nadeln aus, die durch Umkristallisieren aus Alkohol gereinigt wurden. Mit konzentrierter Schwefelsäure gibt es nur schwache Purpurfärbung. Analyse: C 67-00 H irae N 1-59 Sphärocerebrin. Der in Benzol unlösUche Teil der Bleisalze wird durch Kochen mit einem Überschuß von Oxalsäure in alkoholischer Lösung zersetzt, heiß filtriert, die ausgeschiedene kristallinische :\Iasse nach dem Trocknen mit kaltem Benzol ausgezogen und aus heißem Benzol auskri- staUisiert. Die ausgeschiedenen Kristalle wurden dann in einem großen Volumen absoluten Alkohols gelöst und auf 38" abgekühlt, wobei sich schwere, dem Glas anhängende Sphärokristalle absetzten. Die Mutterlauge wird bei 40" abgegossen. Durch zweimahges Umkristallisieren und Abkühlen auf 40" können die Kristalle gereinigt werden. Die Kristalle bestehen aus runden Ballen, die sich durch leichten Druck in drei keilförmige Segmente spalten lassen, welche aus fächer- förmig zusammenliegenden Nadeln gebildet sind. Mit konzentrierter Schwefelsäure gibt es nur schwache Purpur- färbung. Analyse: c 62-75 H 11-08 N 1-23 Thudichum gibt selbst an, daß diese beiden Cerebrinazide jedenfalls nicht in reinem Zustande erhalten wurden. Sie sind wvw in sehr geringen Mengen im Nervengewebe vorhanden und sind wahrscheinHch Zersetzungs- produkte. Cerebrosulfatide. Thudichum ij und neuerdings Koch -) haben versucht, eine schwefelhaltige Lipoidsubstanz aus dem Nervengewebe zu isolieren. Alle diese Bemühungen sind bis jetzt erfolglos gewesen. Hätten sich diese Forscher nicht so sehr von vorgefaßten Meinungen über das Protagon leiten lassen, so hätten sie in dieser Substanz das Cerebrosulf atid , nach dem sie suchten, gefunden. In der Tat ist die einzige wohldefinierte schwefelhaltige Lipoidsubstanz, die Koch isolieren konnte, eine Substanz von der Zusammensetzuni:' des Protagons gewesen. Merkwürdigerweise zieht aber dieser Forscher vor. das 1) Thudichum, 1. c. S. 225. 2) Koch, Zur Kenntnis der Schwefelverbindungen des Nervensystems. Zeitsclir. f. physiol. Chemie. Bd. 53. S. 496 (1907). — Sonie chemical observations on the norvous System in certains forms of insanity. Archives of Neurology. Vol. 3. p. 331 (t'.lilT). 798 ^V- Gramer. Protagon als ein Gemisch zurückzuweisen und das Vorhandensein einer hypothetischen sch\Yefelhaltigen Substanz, die noch niemand hat isoheren können, zu postulieren. Phosphatide. Allgemeines. Neben dem Lezithin, welches an anderer Stelle behandelt worden ist, kommen nach Thudichum im Gehirn noch eine große Anzahl ähnhcher Verbindungen der Glyzerinphosphorsäure ^ ) vor. Die Trennung dieser Ver- bindungen voneinander und die Reindarstellung bieten jedoch, wie Thu- dichum selbst angibt, große Schwierigkeiten dar, und viele der von diesem Autor dargestellten Präparate machen nicht den Eindruck einheithcher Substanzen. Während neuere Arbeiten über die Phosphatide anderer Gewebe die Anschauung TJmdicJmms bestätigt haben, daß neben dem Lezithin noch andere Phosphatide existieren, haben sie zugleich gezeigt, daß die von Thudichum angewendeten Methoden der Extraktion und Trennung Zer- setzung herbeiführen. Es ist daher sehr wahrscheinhch , daß eine große Anzahl der Thudichumscheio. Edukte Gemische von Zersetzungsprodukten darstellen. Eine eingehende Behandlung dieser Edukte wüi-de daher dem Zwecke dieses Werkes nicht entsprechen. Es ist jedoch neuerdings Mode geworden, mit den Namen, welche Thudichum seinen zweifelhaften Pro- dukten beigelegt hat , Substanzen von verschiedener Konstitution , welche von anderen Autoren isoliert worden sind, zu bezeichnen. So wird der Name Kephahn. den Thudichum einem Phosphatid beigelegt hat, welches bei der Verseif ung Neurin und zwei andere N-haltige Basen liefert, von Koch für eine Substanz gebraucht, welche gar keine Trimethyl-Ammoniumbasen ent- hält, während das Kephalin von Cousin das Cholin als einzige N-haltige Base enthält. Alle diese ..Kephaline"' sind nach verschiedenen Methoden dargestellt und haben nur das gemeinsam, daß sie in Äther leicht, in kaltem Alkohol schwer löslich sind, und daß das Atomverhältnis N:P=1:1 ist. Es soll daher zur Orientierung hier nur eine kurze Übersicht über die von Thudichum erhaltenen Edukte sowie über ihre Verteilung in den verschiedenen Lösungsmitteln gegeben werden. Das Verhältnis der Anzahl Stickstoffatome zu der Anzahl der Phos- phoratome gestattet, die Phosphatide in Gruppen einzuteilen. Dies ist von praktischer Bedeutung insofern, als man die Darstellung und Reinigung von Phosphatiden durch Bestimmung ihres Stickstoff- und Phosphorgehaltes kontrollieren kann. Bei einem reinen Produkt muß sich das Verhältnis einem einfachen Wert (z.B. 1:1. 2:1 etc.) nähern. Es sei deshalb hier darauf hingewiesen, daß man in der von Neu- mann ausgearbeiteten Säuregemischveraschung eine genaue und rasche *) Thudichum definiert die Phosphatide als Derivate der Phosphorsäure, da er in dem Sphingomyelin ein Phosphatid gefunden hat, welches kein Glyzerin enthält. Siehe auch die Cerebrininphosphorsäure von Bcthe. Darstellung u. Eigenschafteu d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. 7 inj Methode der Phosphorbestiinmimg zur Verfügung hat, wobei besondf-r.'^ darauf zu achten ist, daß man nicht mehr als 40 cm» des Säuregemisches zusetzt und daß vor der Fällung die Lösung einen Gehalt von IC/o -^i"- moniumnitrat hat. Die Bestimmung wird beträchtlich beschleunigt M, \vt'nn man den Niederschlag von Ammoniumphosphomolybdat durch eine Filter- röhre filtriert, in welche ein durchlöchertes Platinblech, welches mit Asbest oder Filtrierpapier bedeckt wird, eingeschmolzen ist. An Stelle des einge- schmolzenen Platinbleches kann man auch eine lose, gut passende, durch- löcherte Porzellanplatte verwenden. Das Filtrieren und Waschen nimmt dann nicht mehr als 5 Minuten in Anspruch. Mit Wasser quellen die meisten Phosphatide und bilden eine kolloi- dale Lösung. Phosphatide nach Thudichum/-) Monoamidomonophosphatide (N:P=: 1:1). Berechnete Formel Analysen in Prozenten C H N P Cd (1 Lezithine C^, Hg^ NPO^ nicht angegeben Kephaline: Kephalin^j C,., H,g NPO,^ 60-00 938 IßS 4-27 - - Oxykephalin*) C^, H,g KPOi, (als Kadmiumsalz) 48-12 7-55 1-43 3-52 1005 7-40 Peroxykephalin^) C.^'agNPOj, 57-75 S-'JO 1-57 3-G8 - — Myelin«) c/oH^NPO,« 63-41 9-83 1-79 4-09 - - Paramyelin ') (Ochs) C3, H,5 NPO9 (als Kadmiumsalz) 49-29 830 160 3-40 — 825 Monoamidodiphosphatide (N: P =1:2). Diamidomonophosphatide (N:P = 2:1). Amidomyelin») C,^ H^g N., PO^ Nicht angefidirt Sphingomvelin'')(Ochs) C,„H.o,N, PO, 65-37 11-29 2-96 ;3-24 - - Apomyelin ■«) (Mensch) C,, H,og N, PÜg 67 0111-35 3-00 3-23 - — Diamidodiphosphatide (N:P = 2:2). C H N P Pt Cl ( C,, Hg, K P, O3 (als Platinsalz) 49-25 8-74 250 6-52 9-03 1027 Assurin»') w, „ x" p' n 49-01 885 230 606 857 955 ') Aders Flimmer and Bayliss, The Separation of phosphorns from caseinogcn by the action of enzymes and alkali. Jouru. of Physiology. Vol. 33. p. 441 (19estim- mung der Phosphatide). Bei der Verseif ong mit Barytwasser wurde eine Base erhalten, die nicht mit dem Gholin identisch war, aber nicht genügend rein er- halten wurde. Dieses Kephalin soll ein Dioxystearylmonomethyllecithin sein. Analysen C H X P CH, Berechnet für CoHgoNPOia 60-06 9-77 1-67 3-70 1-78 Gefunden 59-50 9-80 1-75 3-83 1-72 Die von Koch erhaltenen Resultate über das Verhalten der in Ke- phaUn enthaltenen Methylgruppen stehen in einem merkwürdigen Wider- spruch zu den Beobachtungen von Cousin (siehe unten), der aus dem Kephalin allen Stickstoff als Cholin abspalten konnte, so daß demzufolge das Keplialin wie das Lecithin drei Methylgruppen aus Stickstoff enthalten sollte. Mög- licherweise sind diese beiden Kephaüne nicht identisch. Das Phosphatid von Cousin 0 (Kephalin). Entwässertes Gehirn wird mit Chloroform ausgezogen, die Lösung von Chloroform durch Abdampfen befreit und aus dem Rückstand das 1) Cousin, Sur les acides gras de la cephaliue. Journnl de Pliarmacie et de Chimie. T. 24. p. 101 (1906). 51* 804 W. Gramer. Cholesterin durch kochenden Aceton ausgezogen. Der cholesterinfreie Piückstand wird mit dem doppelten Gewicht Äther behandelt, wobei bis auf einen geringen Rückstand alles in Lösung geht. Aus der ätherischen Lösung wird durch das 4 — 5fache Volumen Alkohol ein Phosphatid nieder- geschlagen, während Lecithin in Lösung bleibt. Das rohe Phosphatid wird durch Lösen in Äther und Fällung durch Alkohol, sowie durch Behandlung mit kochendem Alkohol (Einzelheiten sind nicht angegeben) gereinigt. Ausbeute: öO g aus 1000^ Gehirn. Eigenschaften. Das so erhaltene Kephahn ist eine wachsartige gelbe Masse, die sich nach einiger Zeit rotbraun färbt. Es ist unlöslich in Aceton, kaum lösUch in Essigäther und kaltem Alkohol, löslich in warmem Alkohol. Analysen: N l-84''/o P 3-8%. Zu der Hydrolyse durch Säuren und iVlkalien wurden neben Glycero- phosphorsäure flüssige ungesättigte Fettsäuren, die zur Linolsäurereihe gehören, und feste gesättigte Fettsäuren, die zum größten Teil aus Stearin- säure bestehen, erhalten. Ölsäure wurde nicht gefunden. Der gesamte Stickstoff wird als Cholin abgespalten. Cholin ist die einzige stickstoffhaltige Base, die bei der Verseif ung durch Barytwasser oder bei der Hydrolyse durch Salzsäure gefunden wurde. 1) Die von Thudichum und Koch erhaltenen basischen Produkte soUen Zersetzungsprodukte sein, welche durch zu lange Einwirkung des Alkalis aus dem Chohn entstanden sind. Es ist jedoch auch möghch, daß das von Cousin isoherte Phosphatid ein reineres oder weniger zersetztes Produkt darstellt. Das Bethesche Phosphatid und die Bethesche Kupfermethode. ^j Zerkleinertes Gehirn Avird unter Zusatz von wenig Wasser mit Kupfer- chlorid angerührt, einige Tage stehen gelassen und so lange Kupferchlorid zugefügt, bis der Brei auch nach längerem Stehen eine deuthch grüne Farbe behält. Dann wird Kahlauge bis zur deutlichen Violettfärbung zugefügt und stehen gelassen. Nach 24 Stunden wird Alkohol zugesetzt und gerührt, wobei eine flockige Abscheidung erfolgt, die bei weiterem Rühren zu einem Kuchen verklebt. Der Kuchen wird mit Salzsäure an- gerührt, eventuell Kupferchlorid zugesetzt und wie vorher mit Kalilauge und Alkohol behandelt , wobei Cholesterin und einige Phosphate in Lösung gehen. Diese Behandlung wird noch zwei- bis dreimal wiederholt. Dann wird der Kuchen mit Essigsäure angesäuert, mit Alkohol entwässert, der *) H. Cousin, Sur la nature des produits azotes form^s dans la d^composition de la c(5phaline. Journal de Pharmacie et de Chimie. T. 25. p. 177 (1907). — Derselbe, Sur la nature des produits azotes obtenus dans la sapouification. Comptes rendus de la See. de Biologie. T. 62. p. 238 (1907). ^) Bethe, Über einige Edukte des Pferdegehirns. Archiv f. exper. Pathologie und Pharmakologie. Bd. 48. S. 73 (1902). Darstellung ii. Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. «uö Alkohol abgepreßt und die Masse mit warmem Cliloroform e.xtrahiert. Die dunkelgrüne Lösung wird stark eingeengt und tropfenweise in Äther ein- getragen, wobei ein Niederschlag erfolgt, den man im p:iss('hrank sich absetzen läßt. Die über dem Niederschlag stehende Lösung wird al)g('liobert und darf auf Zusatz von Äther keinen Niederschlag gel)en. Der Niederschlag wird in Äther gewaschen, bis die Waschflüssigkelt farblos abläuft, in w^nig heißem Chloroform gelöst und tropfenweise in heißen Alkohol eingetragen, wobei ein grüner Niederschlag ausfällt, der heiß abfiltriert wird. Niederschlag. Durch wiederholtes Lösen in Chloroform und Fällen mit Alkohol wird der Niederschlag gereinigt, wodurch er schließlicli in Chloroform unlöslich wird. Die Substanz wird dann in heißem Alkohol aufgeschwemmt und vorsichtig Salzsäure zugesetzt, bis der Körper in Lösung geht. Beim Erkalten scheiden sich Kristalle ab, die durch Waschen mit verdünntem Alkohol vom Kupferchlorid befreit werden. Zur weiteren Reinigung wird die Substanz aus heißem Alkohol durch IJaryt als Barvum- salz ausgefällt, heiß abfiltriert und mit heißem Alkohol gewaschen, (luich Kohlensäure zersetzt und aus Alkohol umkristallisiert. Die Substanz miil^ gereinigt werden, bis dieselbe keinen Phosphor mehr enthält. Die Substanz ist das dem Homocerebrin ähnliche oder damit identische Amido-Cere- brininsäureglycosid (siehe oben unter Cerebrosiden). Filtrat. Das vom Niederschlag heiß abfiltrierte Filtrat scheidet beim Erkalten einen dicken Kristallbrei aus, der in Alkohol heiß gelöst Avird. Zusatz von wässeriger Barytlösung fällt ein schmieriges zusammen- klumpendes Barytsalz, von welchem die Lösung heiß abfiltriert wird. Die beim Erkalten sich ausscheidende Substanz wii'd in heißem Alkohol gelöst, von Baryt durch Schwefelsäure befreit und heiß filtriert. Die beim Erkalten sich ausscheidenden Kristalle werden durch mehrfaches Umkristallisieren aus Alkohol gereinigt. Die so erhaltene Substanz ist die dem S])hingo- myelin ähnliche Cerebrininphosphorsäure. Aus dem Barytsalz kann durch Aufschwemmen in warmem Alkohol und Zusatz von Schwefelsäure eine Substanz freigemacht werden, die durch Lösen in Chloroform und Fällen mit Äther sowie durch Emki'istallisiercu aus Alkohol gereinigt werden kann. Dieselbe gehört zu den stickstoftlialtigi-ii. phosphorfreien Lipoidsubstanzen und erhielt den Namen Phrenin. Die Ausbeuten der Cerebrininphosphorsäure und des Phrenin schwanken. Das erstere wurde nur in geringen Mengen erhalten. Das letztere wurde überhaupt nicht regelmäßig gefunden, während gelegentlich Vb (j und 2ö g aus 1kg Gehirn erhalten wurde. Dies deutet wohl daranf hin, daß wir es beim Phrenin jedenfalls mit einem Zersetzungsprodukt zu tun halien. Koch^) erhielt in der Tat eine ähnliche Substanz durch Kochen von Cerebrin mit verdünnter Salzsäure. Es erscheint daher sehr fraglich, ob 1) Koch, Methods for the quantitative analysis of the braiu and cord. American Journal of Physiology. T. 11. p. 310 (1901). gQß W. Gramer. nicht auch die Cerebrininphosphorsäure als ein Zersetzungsprodukt anzu- sehen ist; besonders da dasselbe nur in geringer Menge erhalten ^Yurde. Der Wert der ganzen Methode ist daher zweifelhaft. Cerebrininphosphorsäure kristallisiert aus Alkohol in kleinen, breiten, gebogenen Nadeln. Es ist schwer löshch in kaltem Äther, leichter löslich in warmem Äther, sehr leicht löslich in heißem Alkohol und Chloroform. Analysen (Mittel) C H N P N:P Schmelzpunkt 71-13 12-08 2-97 2-71 2:1 161—162" Beim Kochen mit Kalilauge wird Ammoniak und Phosphorsäure ab- gespalten. Glyzerinphosphorsäure ist nicht vorhanden. Beim Kochen mit Salzsäure sollen neben Galaktose und Phosphorsäure noch Cerebrininsäure und Amidocerebrininsäure gebildet werden. Die Spaltungsprodukte wurden jedoch nicht genauer identifiziert. Phrenin kristallisiert aus Alkohol in langen verfilzten Nadeln. Es ist unlöslich in Äther. Beim Kochen mit Kalilauge Avird Ammoniak abge- spalten. Durch Kochen mit Säuren wird keine reduzierende Substanz ab- gespalten. Analysen: C H N Schmelzpunkt 71-90 11-95 1-49 96—101" Quantitative Bestimmung der Phosphatide nach Koch und Woods. ^) Diese Methode beruht auf Extraktion der Phosphatide mit .Vlkohol und Äther und Trennung der Lecithine von den Kephalinen durch alko- holische Bleiacetatlösung , wodurch fast ausschheWich Kephalin niederge- schlagen wird. \ov der Behandlung mit Bleiacetat werden die Phosphatide von unorganischen Phosphaten und phosphorhaltigen Extraktivstoffen ge- trennt, indem sie aus der wässerigen, sauren Lösung durch Chloroform niedergeschlagen werden. Die Kephaline und Lecithine werden schließlich durch Phosphoranalysen bestimmt. Eine besondere Korrektion muß noch angebracht werden, da die Kephaline und Lecithine mit einem schwefel- haltigen Körper behaftet sind, der ebenfalls Phosphor enthält. Eine Schwefel- bestimmung ist daher erforderlich. (Bei anderen als nervösen Geweben ist diese Korrektion nicht erforderlich.) Gegen die Berechnung der Phosphatide aus Phosphorbestimmungen ist jedoch einzuwenden, daß die Versuche von Erlandsen '^) erwiesen haben, daß in den Geweben Phosphatide von sehr verschiedenem Phosphorgehalt vorkommen, welche bei der Berechnung nach Koch und Woods nicht be- rücksichtigt werden. Tatsächlich hat Erlandsen'^) allein aus dem Äther- ^) W.Koch and H. S.Woods, The quantitative estimation of the lecithans. Journ. of Biological Chemistry. Vol. 1. p. 204 (1906). -) Erlandsen, Untersuchungen über die Iczithinartigeu Substanzen des Myokar- diums und der quergestreiften Muskeln. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 51. S. 96 (1907). Darstellung u. Eigenschaften d. füi- d. Nervengewebe charakterist. I,i|,.,i,l, 'M, extrakt des Herzmuskels mehr Phosphatide isolieren können, als Koch und Woods für den gesamten Herzmuskel fanden. Solange unsere Kenntnisse der Gehirnphosphatide so unznliinghch und voll von Widersprüchen sind, müssen Versuche, dieselben (luuntitativ zu bestimmen, vertViilit ei-sclieiiien. Man soUte sich damit begnügen, den in Lipoidform gebundenen Phosphor zu bestimmen und davon den Phosphor, der in dem, einer (|ii;intitaliven Bestimmung zugängli'chen , Protagon gebunden ist. abziehen. Auf diese Weise hat NoU >) gezeigt, daß nur etwa 18Vo des Lipoidphosphors auf die Rechnung der im Protagon gebundenen Phosphati(lgru])pe kommen. Da die von Koch-Woods angewendete Technik der Extraktion der Lipoide sehr zweckmäßig erscheint und sich auch für die Bestinunung des Lipoidphosphors verwenden läßt, so ist die ganze Methode hier im einzelnen angegeben. Die Trennung der Kephalinen von den Lecithinen sowie die Berechnung müssen jedoch wohl verworfen werden. Methode. Apparat. Der Extraktionsapparat besteht aus einem 250 fm^ fassen- den Kolben mit Piückflußkühler , der eine eingeschliffene (dasverbindung hat. An der Kühlröhre ist mittelst Platindrähten ein 15 cw^ fassender Goochtiegel so aufgehängt, daß er ungefähr 2 — 3 cm vom Boden der Fläche sich befindet. Der Boden des Gooclitiegels ist mit Filtrierpa])ier oder As- best bedeckt. Der Apparat wird auf dem Wasserbad oder Dampfbad erwärmt. Extraktion. Das zu analysierende Gewebe wird von Blut befreit, zerkleinert, etwa 10,7 in einem Erlenmeyerkolben abgewogen und ilOcw' absoluter Alkohol zugesetzt. (Wird die Analyse nicht sofort vorgenommen, so wird das Material in eine gut schließende Flasche gewogen und mit 60 ciii^ absolutem Alkohol versetzt.) Der Kolben wird eine halbe Stunde lang bis fast zum Kochen erwärmt und der Inhalt dann in den (looch- tiegel übergeführt, so daß das Filtrat in den Kolben des Extraktionsappa- rates abfließt. Das Material wird 8 Stunden lang extrahiert. Nötigenfalls muß noch mehr Alkohol zugesetzt ^Yerden. Dann wird der in dem Kolben befindliche Alkohol vorsichtig verdunstet, Äther zugesetzt und mit Äther 8 Stunden lang extrahiert. Der im Goochtiegel befindliche Pückstand wird dann im Mörser zerrieben, wieder (piantitativ in den Tiegel zin-ückgebracht und 6 Stunden lang mit Alkohol und 4 Stunden lang mit Äther extrahiert und der Alkohol und Äther vorsichtig abgedunstet. Emulsierung und Niederschlagen der Phosphatide. Der vom Alkohol und Äther völlig befreite Rückstand wird in dem Extrakt ions- kolben mit 40 cni^ destiUiertem W^asser versetzt und stehen gelassen, ai^er nicht länger als 24 Stunden. Der Rückstand und die wäs.serige Liisuiig werden dann in einen 100 c/y^3.^[eßkolben idiergeführt, so dall (1er Kolben ungefähr 90 crn^ enthält. Ist viel Fett zugegen, so wird die rberführung ^ö'- 1) NoU, Über die quantitativen Beziehungen des Protagons zum Nervenmark. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 27. S. 370 (1899). g08 ^^^- Gramer. etwas erschwert und kann durcti Zufügen von 1 — 2 cm^ Chloroform und Schütteln erleichtert werden. Der MeOkolben wird kräftig geschüttelt und die Flüssigkeit mit 1 — 2 cm^ konzentrierter Salzsäure und 2 — 4 cm^ Chloro- form versetzt, wieder geschüttelt und bis zur Marke aufgefüht und stehen gelassen, bis der sich ausscheidende Niederschlag von Lipoiden (Phospha- tiden, Cholesterin, Cerebrin etc.) sich abgesetzt hat, was 1 — 14 Tage dauern kann. Dabei ist zu beachten, daß das Absetzen verzögert ^ird, wenn der zur Extraktion verwendete Alkohol nicht vöUig entfernt worden ist. Ferner muß genügend Säure und Chloroform zugesetzt werden, um völlige Ab- scheidung und Klärung zu erreichen. (Je mehr Fett vorhanden ist, um so mehr Chloroform und Säure ist erforderlich.) Trennung der Kephaline. Nach dem Absetzen des Lipoidnieder- schlages wird die klare überstehende Flüssigkeit durch ein 6 — 8 cm asche- freies Filter dekantiert und der Niederschlag im Kolben mit 10 cni^ Wasser, dem 0*1 cm^ starker Salzsäure zugesetzt ist, und durch Schütteln gewaschen. Nach dem rasch erfolgenden Absetzen des Niederschlages wird das Wasch- wasser wieder durch das Filter abgegossen. Der Niederschlag wird im Kolben in heißem Alkohol gelöst und in einen 300 — 500 cm^ fassenden, langhalsigen Jenakolben übergeführt. Der Extraktionskolben und das Filter werden mit heißem Alkohol wiederholt gewaschen und schließlich mit einer geringen Menge Äther ausgespült. Alkohol wird zugesetzt, so daß das Vo- lumen der Lösung ungefähr 100 cm^ beträgt und die Lösung zur Entfer- nung des Äthers auf dem Wasserbad erhitzt. Dann werden 5 cm^ einer heiß gesättigten alkoholischen Lösung von Bleiacetat unter beständigem Schwenken zugesetzt, das Gemisch 10 Minuten lang auf dem Wasserbad erwärmt, 1 cm^ einer öO^/oigen Ammoniaklösung zugegeben und nach kräf- tigem Schütteln noch 5 Minuten lang erwärmt. Dann läßt man das Ge- misch 24 Stunden lang stehen. Die klare überstehende Flüssigkeit wird dann durch ein kleines, asche- freies Filter in einen gleich großen, langhalsigen Jenakolben abgegossen, der Niederschlag mit heißem Alkohol gewaschen, die Waschungen mit dem Filtrat vereinigt und der Alkohol auf dem Wasserbad aus dem Kolben ab- gedampft. Der Rückstand soll die Lecithine enthalten. Der auf dem Filter befindliche Niederschlag wird durch Durchstoßen und Auswaschen des Filters mit einer möglichst kleinen Menge heißen Wassers mit der Hauptmenge des Niederschlages vereinigt. Das Wasser wird durch vorsichtiges Erhitzen über freier Flamme abgedampft, wobei ein Verkohlen des Niederschlages vermieden werden muß. Der Rückstand soll die Kephaline darstellen. Die Phosphorbestimmung der Lecithine und Kephahne wird nach der Neumannschen Methode ausgeführt. Dabei ist zu beachten, daß von dem gebildeten Bleisulfat abfiltriert werden muß. Der abgesaugte Niederschlag wird mit möghchst geringen Mengen verdünnter Schwefelsäure (1 Teil Schwefelsäure und 20 Teile Wasser) sorgiältig gewaschen und die Waschungen mit dem Filtrat vereinigt. Darstellung u. Eigeuschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. HOi> Berechnung. Die zur Lösung des pho.spho-molvhdeinsaurcn Niodcr- N Schlages nötige Menge —-Natronlauge wird mit 0-553 niiiltipli/icrt. Dies gibt die gefundene Menge Phosphor, welche, nach der Korrektion mit 25-75 multipliziert , die Menge Lezithin resp. Kephalin angibt. Das Molekular- gewicht der Phosphatide wird zu 800 angenommen. Der für Phosphoi' gefundene Wert muß durch eine SchwefeUiestiin- mung sowohl der Kephaline wie der Lecithine korrigiert werden. Die lie- stimmung erfolgt durch Schmelzen mit einer Mischung von 7 TtMlen Natriumkarbonat und 1 Teil Kaliumnitrat. Die geschmolzene Masse wiid in Wasser gelöst, mit Salpetersäure angesäuert und mit 1 %iger Parvum- nitratlösung gefällt. Für je 2 Moleküle S soll je 1 ^lolekül Phosphor abire- zogen werden. Diese Berechnung setzt die Existenz eines h\i)otli('ti.sch('n Cerebrosulfatids voraus. Es ist bereits oben bei den Cerebrosulfutiden aus- geführt worden, daß eine solche Annahme vorläufig nicht gerechtfertigt ist. Quantitative Bestimmung der Phosphatide nach Koch. ') Eine andere Methode beruht auf der quantitativen Bestimmung der mit Jodwasserstoff abspaltbaren Methvlgruppe nach der Methode von Herzig und Meyer. Die nur eine Methylgruppe enthaltenden Kephaline (Kephaün, Myehn) spalten dasselbe quantitativ unter 240'' ab. Die drei Methylgruppen enthaltenden Lecithine spalten ein Methyl (piantitativ unter 240° und zwei Gruppen quantitativ zwischen 240° und ^iOO" ab. Das ab- gespaltene Methyljodid wird in einer Silbernitratlösung aufgefangen und das ausgefällte Silberjodid als solches gewogen. Zur .Vusführung der Be- stimmung wird der wie oben erhaltene Lipoidniederschlag zuerst langsam mit x\mmoniumjodid und Jodwasserstoffsäure (spez. (iew. 1-5) im Sandbad erhitzt. Bei ungefähr 160" trübt sich die Silbernitratlösung. Nach zirka 20 Minuten weiteren Erhitzens hat sich der Niederschlag abgesetzt. Wenn die Temperatur 240" erreicht hat, wird eine frische Silbernitratlösung vor- gelegt und die Temperatur weiter gesteigert. Bei ungefähr 2S()o tritt wieder Trübung auf. Die Temperatur wird langsam bis auf 320° gebracht, wodurch alles Methyl abgespalten wird. Das über und unter 240« ausgefällte Sill)erjodid wird getrennt be- stimmt. Die in der Vorlage befindiiche Silbernitratlösung wird mit dem Niederschlag in das dreifache Volumen Wasser gegossen, auf dem Wasser- bad vom Alkohol, mit Salpetersäure angesäuert, filtriert und nach dem Trocknen gewogen. Die erste Bestimmung unter 240" gibt mit 3-325 multii)li/.iert die Gesamtmenge der Phosphatide. Die zweite Bestimmung bis 240°-:'.(M)" gibt mit 1-661 multipliziert die Menge der Lecithine. Di(> Differenz der 1) Koch, Methods for the quantitative chemical analysis of the braiii and cord. Amer. Journ. of Physiol. Vol. 11. p. 333 (1904). 810 W. Gramer. Werte gibt die Menge der Kephaline und Myeline. Man kann das größere Molekulargewicht der Kephaline und Myeline derart korrigieren, daß man den gefundenen Wert durch- 01)2ö dividiert. Die Diamidoraonophosphatide und die Diamidodiphosphatide werden überhaupt nicht berücksichtigt. Durch die kürzlich veröffentlichten Befunde von Cousin (siehe oben unter Kephalin), der aus dem Kephalin allen Stickstoff als Cholin ab- spalten konnte, ist ferner das ganze Prinzip dieser Methode erschüttert worden. Die Methode war schon vorher von Koch selbst zugunsten der Methode von Koch und Woods aufgegeben worden, die jedoch aus oben angegebenen Gründen ebenfalls nicht einwandfrei ist. Quantitative Bestimmung der Cerebroside nach Koch/) Diese Methode ist eine ^lodifikation der ursprünglich von NoU aus- gearbeiteten Methode zur ([uantitativen Bestimmung des Protagons im nervösen GeAvebe. Sie beruht darauf, daß sämtliche Cerebroride beim Kochen mit verdünnten Säuren Galaktose abspalten, die durch ihr lleduktionsver- mögen quantitativ bestimmt werden kann. Bestimmungen über die Menge Galaktose, welche von reinem Cerebron abgespalten werden, gestatten die Aufstellung einer Tabelle, welche die einer gefundenen Menge Kupferoxydul entsprechende Menge Cerebron gibt. Der so gefundene Wert gibt die Ge- samtmenge der Cerebroside ausgedrückt als Cerebron. Von den Gesamtcerebrosiden läßt sich ein Teil getrennt bestimmen, nämlich die Cerebrinsäuren , welche in heißem Alkohol unlösliche Bleisalze geben und sich so vom Cerebron, Cerebrin, Kerasin etc. unterscheiden. Die Differenz der Kupferbestimmungen für die Gesamtcerebrosiden und die Cerebrinsäuren gibt die dem Cerebron, Cerebrin, Homocerebrin etc. entsprechende Menge Kupferoxydul. Da die verschiedenen Cerebroside sich in ihrer chemischen Zusammensetzung sehr ähnlich sind und ungefähr die gleiche Menge Galaktose abspalten, so kann man die gefundene Menge Kupferoxydul, ohne große Fehlerquellen einzuführen, auf Cerebron umrechnen. Die Ausführung der Bestimmung ist wie folgt: Gesamtcerebroside. Nachdem man in der für die Phosphatidbe- stimmung angegebenen Weise den Lipoidniederschlag erhalten hat und die überstehende Flüssigkeit durch Filtrieren und Waschen entfernt hat, wird der Ptückstand in heißem Alkohol gelöst, in einen 200 cm^ fassenden Kolben übergeführt und der Alkohol al)gedampft. Der Rückstand wird am Rück- flußkühler 20 Stunden lang mit f/oigei" Salzsäure gelinde gekocht. Die Flüssigkeit wird in einen Maßkolben übergeführt und mit einer gesättigten Natrium Sulfatlösung versetzt, bis sich die Flüssigkeit klar und schnell filtrieren läßt. Ein abgemessener Teil des klaren Filtrates wird mit Natron- \) ir. Koch, Methods for the quantitative chemical aiialysis of the braiu and cord. American Journal of Pliysiology. Vol. 11. p. 303 (1904). Darstellimg U.Eigenschaften d. für d. Nervengewebe charakterist. Lipoide. i-;ii lauge neutralisiert und mit 10 — 20 cm^ kalter Fehängscher Lösung versetzt, wobei die Lösung klar bleiben muß. Die Lösung wird auf dem Wasserljadc erwärmt, über freier Flamme zum Kochen erhitzt und dann mehrere Stunden lang auf dem Wasserbade erwärmt, so daß sich ein grobköi-niger, ziegel- roter Niederschlag bildet. Es ist unbedingt nötig, mit einem großen Überschuß Fehlingschev Lösung zu arbeiten. Die über dem Niederschlag von Kupferoxvdul stehende Flüssigkeit muß ihre tief dunkle Farbe beibe- halten; nimmt sie eine grünliche Färbung an, so ist zu wenig FehlingschQ Lösung verwendet worden. Die Lösung soU nicht mehr als O'20/o Zucker enthalten. Das abgeschiedene Kupferoxydul wird auf einen (ioochtiegel gesammelt, mit heißem Wasser gewaschen, getrocknet, geglüht und gewogen. Aus der so erhaltenen Menge Kupferoxvdul läßt sich die Menge der Ge- samtcerebroside, berechnet für Cerebron, aus der folgenden TabeUe ablesen. Diese Tabelle beruht auf Bestimmungen der Galaktosemeugen, welche aus dem Kochscheji Cerebrin (siehe dieses) durch Salzsäure abgespalten werden. Tabelle zur Berechnung des Cerebrons aus gefundenen Mengen Kupferoxyd (gilt auch für Cerebrin, Homo cerebrin und Cerobrinaci de)- CuO mgr 6. 7. 8. 9. 10. 11 . 12. 13. U . 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Cerebron CuO >>'!!>' ntgr 18-4 27. 20-7 28. 230 29. 25-3 30 276 31 29-9 32. 32-2 33. 34-4 34. 36-7 35. 38-9 36. 41-2 37. 43-4 38. 45-7 39 47-9 40 50-2 41 52-4 42 54-7 43 56-9 44 59-2 45 61-4 46 63-7 47 Cerebron mgr 65-9 68-2 69-5 72-8 751 77-4 79-6 81-9 841 86-4 88-6 90-8 931 95-4 97-6 99-9 1023 104-6 106-8 109-1 111-3 CuO mgr Cerebron 48 113-6 49 115-8 50 118-0 51 120-2 52 122-5 53 124-7 54 127-0 55 129-2 56 131-5 57 133-7 58 136-0 59 138 2 60 140-5 61 142-7 62 1450 63 147-3 64 149 6 65 151-8 66 1540 67 1563 68 158-6 CuO mgr 69 . 70 . Cerebron mgr . . 160-9 . . 163-2 71 165-5 72 167-8 73 1701 74 172-4 75 174-7 76 1770 77 179-3 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 181-5 183-8 186-1 188-4 190-7 192-9 195-2 1975 199-8 202-1 2044 206-7 Cerebrinsäuren. Eine abgewogene Menge des Gewebes wird mit Alkohol und Äther extrahiert, wie für die Phosphatidbestimmung auge- geben ist. Nach dem Verdunsten des Äthers wird die warme alkoholische Lösung mit etwas Ammoniak versetzt und ein Überschuß einer alkoholischen Bleiacetatlösung zugefügt. Der Niederschlag wird in einem großen Gooch- tiegel gesammelt und mit heißem Alkohol behandelt, bis sich nichts mehr löst. Der im Goochtiegel befindliche Paickstand wird dann in der für die 812 W. Gramer. Gesamtcerebroside angegebenen Weise mit verdünnter Salzsäure zersetzt. Die so ertialtene Menge Kupferoxydiil gibt die Menge der vorliandenen Cerebrinsäuren an, die ^ aus der obigen Tabelle, als Cerebron berechnet, abgelesen werden kann. Die Menge der vorhandenen Cerebrinsäuren ist so gering, daß die Berechnung als Cerebron keinen großen Fehler einführt. Es sei hier noch einmal daran erinnert, daß dieselben ^^elleicht sekundäre Zersetzungsprodukte sind, so daß in diesem Falle ihre besondere Bestim- mung unnötig wird. Cerebron, Kerasin etc. wird aus der Differenz der Kupferoxydul- bestimmung für die Gesamtcerebroside und Cerebrinsäure mittelst obiger Tabelle berechnet. Quantitative Bestimmung des Protagons. Bei der quantitativen Bestimmung der Phosphatide und Cerebroside wird das Protagon nicht berücksichtigt, sondern die im Protagon enthal- tenen Phosphatide und Cerebroside werden als solche bestimmt. Dagegen wäre nichts einzuwenden, wenn die Phosphatide wohl definierte und durch- weg in reinem Zustand isolierte Substanzen wären. Dies ist jedoch durch- aus nicht der Fall, und es ist oben ausgeführt worden, daß die bisher ausgearbeiteten Methoden zur Bestimmung der Phosphatide infolge unserer lückenhaften Kenntnisse der Phosphatide ganz unzuverlässig sind. Dagegen haben wir im Protagon eine sehr scharf definierte und genau untersuchte Substanz, die sich daher besonders gut zur (juantitativen Bestimmung eignet. Nun enthält das Protagon einen Teil der im Nervengewebe vor- handenen Phosphatidgruppen, die schwefelhaltige Gruppe und, wie weiter unten ausgeführt wird, entweder einen Teil oder sämtliche Cerebrosid- gruppen. Eine quantitative Bestimmung des Protagons gibt daher Auf- schluß über einen Teil der Lipoidsubstanzen. Bestimmt man zugleich den Phosphorgehalt der alkohol-ätherlöslichen Substanzen und berechnet man die der gefundenen Protagonmenge entsprechende Menge Phosphor, so gibt die Differenz die Menge Phosphor, welche als freies Phosphatid, nicht im Protagon gebunden, vorkommt. [Für die quantitative Bestimmung des Protagons kommt die Streit- frage, ob das Protagon eine einheitliche Substanz oder eine Mischung von Phosphatiden, Cerebrosiden und Cerebrosulfatiden ist, gar nicht in Be- tracht, da selbst, wenn man das Protagon als eine Mischung solcher Sub- stanzen auffaßt, angenommen werden muß, daß es eine Mischung in ganz konstanten Mengenverhältnissen ist. Man würde also nur dieses Mengen- verhältnis festzustellen haben, um aus der Protagonbestimmung sofort die im Protagon enthaltenen Mengen Phosphatid, Cerebrosid und Cerebro- sulfatid zu berechnen. Da sich ein solches Gemisch ganz anders verhält, wie das Protagon und sich durch kalten Alkohol und Äther teilweise in seine Bestandteile trennen läßt, so erscheint diese mit so großer Heftig- keit vertretene Anschauung hinfällig.] Darstellung u. Eigenschaften d. für d. Xervenge. ehe d.arakterist. Lipoide. s 1 •; Die von. Yo/^) ausgearbeiteto Methode zur .,uantitativ.-n l'rota ,- bes immiing beruht auf der Bestimmung der durch Salzsäure abgr-spaltnien /iickermenge. Diese Methode ist von Koch zur Bestimn.umr d.'r r.TH.ro- side venvendet worden (siehe dort). Die Ausführunn- der I-rotagonbestinunung geschieht daner in der dort angegebenen Weise, nur ist die Tabelk- zur \W rechnung des Cerebrons durch eine andere Tabelle zu ersetzen In der beistehenden TabeUe find die einer bestimmten Menge Kupfer w.^IcIm. ;imt- hche im nervösen Gewebe enthaltenen Cerebroside enthielte. Das steht je doch vorläufig nicht fest. Wir wissen vielmehr, daß bei der Extraktion des Protagons zugleich Cerebron in den warmen oder kochenden .Mkohol über- geht. Dieses Cerebron ist daher entweder im Gehirn als solches vorhanden neben dem Protagon oder es hat sich infolge der Einwii-kung des .Alkohols aus dem Protagon gebildet. Im ersteren Fall lieDe sich das Protai.'-on nicht ohne weiteres aus der Menge des abgespaltenen Zuckers bestimmen, iüs diese Frage gelöst ist, ist daher die lYo/Zsche Berechnung nicht anwendiiar. Dagegen dürfte der Schwefelgehalt des Protagons eine einfaclu' Be- stimmung des Protagons zulassen. Das Protagon ist die einzige schwefel- haltige Lipoidsubstanz, die bisher aus dem Gehirn isoliert worden ist, Eine Bestimmung des Schwefels in dem ..Lipoidnieder.schlag- (siehe Bestimminig der Phosphatide) gestattet daher eine Berechnung des Protagons. Der ge- fundene Schwefel multipliziert mit i:)S.8S gibt die .Menge Protagon. Diese Berechnung ist merkwürdigerweise niemals ausgeführt worden. Koch be- ') Noll, über die quantitativen Beziehungen des Protagons zum Neivcnmark. Zeitscbr. f. physiol. Chem. Bd. 27. S. 370 (1899). 314 ^^ • Crainer. Darstellung und Eigenschaften der für das Nervengewebe etc. rechnet den von ihm o-efundenen Schwefel für ein hypothetisches Cere- brosulfatid, das bisher niemand isoUeren Ivonnte. Bei'echnet man die von Koch gefundene Menge Lipoidschwefel in der eben angegebenen Weise, so erhält man für das Rückenmark 9"/o Protagon, während man nach der i\'o//schen Berechnung 8'5"/o Protagon erhält. Diese bemerkenswerte Übereinstimmung zeigt, daß im liückenmark die Cerebro- sulfatidgruppen und Cerebrosidgruppen in den gleichen Mengenverhältnissen vorhanden sind, wie im Protagon. Dasselbe gilt auch für das Corpus callosum, in welchem das Verhältnis Cerebrin : Schwefel — 86 : 1, während im Protagon Cerebrin : Schwefel ■= 83 : 1. Die graue Substanz ist arm an Lipoidschwefel und an Cerebrosidgruppen. Diese Betrachtungen machen es sehr wahrscheinlich, daß sämtliche Cerebroside des nervösen Gewebes im Protagon gebunden sind, so daß also dann die Noihche Methode zulässig wäre. Es wäre jedoch interessant, diese ]\Iethode zu gleicher Zeit durch eine Lipoid-Schwefelbestimmung zu kontrollieren. Es heße sich so feststellen, ob die schwefelhaltigen Lipoidgruppen und die Cerebrosidgruppen in allen Teilen des Nervengewebes in dem- selben Verhältnis zusammen vorhanden sind. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. Von Edwin Staiiton Faust, \\ iirzhuiy. Unsere Kenntnisse der chemischen Eii^enschaftcH iiikI der iili.iiina- koloijischen Wirkungen tierischer Gifte sind noch sehi- lückenhaft, h.iiaii trügt wohl die Hauptschukl die Schwierigkeit und Kostspieligkeit der Beschaffung des für solche Untersuchungen in grol'.cn Mengen erforderlichen Materials. Während die Gifte pflanzlichi-n l'rsprnngs in der Regel leicht zu beschaffendem frischen oder trockenem Material entstammen und letzteres, ohne Gefahr \>rändernngen zu erleiden, im allge- meinen lange Transporte aus den entferntesten Ländern verträgt, kommt es bei Untersuchungen über tierische Gifte darauf an, die giftigen Vn»- dukte dem noch lebenden oder wenigstens vor sehr kurzer Zeit getöteten Tiere zu entnehmen und sie in möglichst frischem an- stände zu untersuchen. Die Nichtbeachtung dieser Vorsichts- maßregel kann leicht zu groben Irrtümern führen, weil nach dem Tode bald Zersetzung der Gewebsbestandteile eintritt, sei es unter dem Einfluß von autolytischen Fermenten oder von Bakterien und auth-ren Mikroorganismen, welche die tierischen Gifte zerstören oder selbst (Jifte bilden. Die Wirkungen der letzteren können dann die des gesuchten, im lebenden Tiere vorhandenen Giftes wesentlich l)eeinilussen . in manchen Fällen vielleicht sogar ganz verdecken. Es besteht demnach die Forderung, das lebende Material an Ort und Stelle der auszuführenden Unter'^uchung zu ver- arbeiten, soweit es sich um das Verarbeiten von ganzen Tieren handelt, oder mindestens dem lebenden Tiere die Giftsubstanz zu ent- nehmen, falls sie sich in einem bestimmten Sekret oder Organ findet. Zur Erreichung dieses Zieles müssen gegebene, giftige, tierische Produkte, welche in den meisten Fällen in Form eines Sekretes, d. h. eines Gemisches verschiedenartiger, wirksamer und unwirksamer Stoffe, vorliegen, chemisch zerlegt, giftige von ungiftigen Bestandteilen getrennt und die giftigen Bestandteile rein dargesteUt und chemisch und pharmakologij^ch genau charakterisiert werden. Was haben wir unter dem l'.egriffe ,. tierisches (iit'f zu verstehen? Es ergibt sich da zunächst dieselbe Schwierigkeit, welcher 816 E. St. Faust. wir bei der Definition des Wortes „Gift" im alliiemeinen begegnen. Üenn jedes der im tierischen Organismus vorkommenden Stoffwechselprodukte kann, wenn es in genügend großen Mengen dem Körper in geeigneter Weise einverleibt wird, deletäre Wirkungen bedingen und hervorrufen, ebenso wie dies bei der Einverleibung großer Mengen der für gewöhnlich ganz ungiftigen Substanzen (z. B. Chlornatrium) der Fall ist. Halten wir daran fest, daß das Charakteristikum eines Giftes darin zu suchen ist, daß es auf chemische oder physikalisch-chemi- sche Art seine schädliche Wirkung hervorbringt, und berück- sichtigen wir, daß die Giftigkeit einer Substanz lediglich von quan- titativen Verhältnissen abhängig ist, d. h., daß es auf die einver- leibten Mengen der betreffenden Sul)stanz ankommt, so können wir bei den Giften tierischen Ursprungs ebensowenig wie in der Toxikologie im allgemeinen eine für alle Fälle gültige und feststehende Definition geben. Nicht weniger schwierig ist es zu entscheiden, ob ein bestimmtes Tier als ..giftig" oder „ungiftig" zu bezeichnen ist. Als bewegliches und selbständig handelndes Individuum kann ein mit einem Giftapparate ausgestattetes Tier sich willkürlich dieses Apparates zum Schaden seines Gegners oder Angreifers bedienen. In diesem Falle ist das Tier ohne Zweifel als ..giftig'' zu bezeichnen. Allein wir kennen andrerseits eine nicht geringe Anzahl von Tieren, welche giftige Stoffwechselprodukte enthalten, jedoch nicht imstande sind, diese Giftkörper einem anderen Tiere will- kürlich beizubringen. Derartige Verhältnisse finden wir z. B. bei unserer gewöhnlichen Kröte, welche in ihrem Hautdrüsensekret giftige Substanzen produziert, aber aktiv von letzteren keinen Gebrauch machen kann. Ge- wisse Schlangen, welche keine Giftzähne besitzen, produzieren ebenfalls in bestimmten Drüsen ein giftiges Sekret, dessen wirksame Bestandteile auch in ihrem Blute enthalten sind. Es empfiehlt sich daher, zu unterscheiden zwischen „aktiv" und „passiy" giftigen Tieren. Als Typus der ersteren Gifttiere sind die „Giftschlangen" (im populären Sinne) anzusprechen, welche ihren Giftapparat willkürlich in Funktion treten lassen können. Passiv giftig wären in diesem Sinne z. B. die Gauthariden und alle Giftpflanzen. In einer Zusammenstellung der Gifte tierischen Ursprungs müssen demnach nicht nur diejenigen Giftstoffe, welche von Tieren, die mit einem Apparate zum Einverleiben des Giftes versehen sind, berücksichtigt werden, sondern auch solche giftige Stoffe tierischer Herkunft, die von Tieren stammen, welche eines derartigen Apparates ermangeln. Zu den tierischen Giften gehören demnach alle pharma- kologisch wirksamen Stoffe, die von Tieren direkt, d. h. physio- logischerweise, produziert werden, nicht aber solche, welche durch Bakterien und andere Mikroorganismen im Tierkörper entstehen oder, von letzteren produziert, in fertigem Zustande von außen aufgenommen werden. Milzbrand, Rotz und die Wutkrankheit sind z. B. keine \'ergiftungen, sondern Infektionskrankheiten, welche unter dem Namen „Zoonoseu" zusammengefaßt werden und für sich besprochen werden müssen. Darstellung imd Xachweis tierischer Gifte. gl7 Die giftigen Zersetzungsprodukte toten, tierischen Materials gehören ebensowenig wie die unter dem Einflüsse von Mikroorganismen im leben- den Organismus gebildeten giftigen Stoffe zu den tierischen Giften. Auch hier handelt es sich nicht um physiologischerweise im Organismus gebildete giftige Stoffwechselprodukte. Die hauptsächlichste und häufigste Quelle der Vergiftuiisxeu durch tierische Gifte ist die zufällige Verwundimg durch Bisse oder Stiche giftiger Tiere, welchen außer den Eingeborenen besonders Reisende in den Tropengegenden, Naturforscher, Arbeiter, meistens Neger auf den Zuckerplantagen, Jäger, sogenannte Schlangeiiheschworer. Jongleure usw. ausgesetzt sind. Die praktische Bedeutung dieser Kategorie von Ver- giftungen durch tierische Gifte geht schon aus der Tatsache hervor, daß in Indien allein jährlich etwa 20.000 Menschen an den Folgen von Schlangenbissen zugrunde gehen. Systematik. Bei dem gegenwärtigen Stande unserer Kenntnisse der tierischen Gifte ist eine Einteilung des Stoffes nach pharmakologischen Gesichts- punkten nicht durchzuführen. Es fehlen bislang die erforderlichen Kennt- nisse der Wirkungen und Eigenschaften der wirksamen Substanzen. In der großen Mehrzahl der Fälle bedienen und begnügen sich die Autoren bei ihren Versuchen noch gegenwärtig mit der x\nwendung von mehr oder weniger unreinen Gemischen und Extrakten. Infolge dieser Verhiiltnisse läßt sich auch nur in vereinzelten Fällen ein klares Bild der chemischen Eigenschaften und der Giftwirkung eines gegebenen Stoffes gewinnen, weshalb eine lüassifizierung nach pharmakologischen Prinzipien untunlich erscheint. Ebensowenig durchführbar ist aus denselben Gründen eine Einteilung nach chemischen Eigenschaften, abgesehen davon, daß eine Klassifikation auf chemischer Basis sehr verschiedenartig wirkende Stoffe in einer (Jruppe vereinigen könnte. Es ergibt sich daraus die Notwendigkeit, einer Klassifikation der tierischen Gifte vorläufig die Stellung des das Gift liefernden Tieres im zoologischen System zugrunde zu legen. Sie ist nach Lage der Dinge zur- zeit die einzig durchführbare. Säugetiere. Ornithorhynchus paradoxus, Piatypus. Das Schnabeltier, zur Ordnung der Monotremata gehörig, deren eine Gattung Ornithorhynchus von diesem allein gebildet wird, nimmt im zoolo- gischen System eine SondersteUung ein und beansprucht als einziges, aktiv giftiges Säugetier ein besonderes Interesse. Das männliche Schnabeltier besitzt an beiden Hinterfüßen je einen an der Spitze durchlöcherten und von einem feinen Kanal von etwa 2 mm Durchmesser durchzogenen, beweglichen Sporn, welcher vermittelst emes längeren (5 cm) Ausführungsganges mit einer, in der Hüftgegend gelegenen, Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. O. 52 818 E. St. Faust. etwa 3 cm langen und 2 ein breiten lobulären Drüse kommuniziert, i) Die beiden Drüsen liefern ein eiweißreiches Sekret, welches durch den Aus- führungsgang zum Sporn gelangt und durch den letzteren nach außen befördert werden kann. Seine Zusammensetzung und Wirkungen sind von C.J.Martin und Frank TidswelV-) und später von F.Noc^) untersucht worden. Schon im Jahre 1822 berichtet Dr. Patrick RHU) über Mitteilungen eines Eingeborenen, nach dessen Angaben eine Verwundung durch das männliche Schnabeltier sehr schmerzhaft und von Anschwellen des ge- troffenen Gliedes gefolgt sein soU ; von einem letalen Ausgang bei einer derartigen Verwundung eines Menschen hat er nichts erfahren. Für die Giftigkeit des Sekretes und die Verwendung des ganzen Apparates als Waffe sprechen neben den Erfahrungen von Hill die An- gaben von Blainville^), Meckel, B. Knox^) und Sjncer^). Anderson Stuart^) berichtet schheßhch noch über die Wirkungen dieses Sekretes an Jagd- hunden. Vier verwundete Tiere gingen unter den auch am Menschen beobach- teten Symptomen in soporösem Zustande zugrunde; ein Hund erholte sich. 0. J. Martin und Tidsivell hal)en dann das Sekret der Glandula femorahs des Ornithorhvnchus chemisch und pharmakologisch untersucht. Nach diesen Autoren charakterisiert sich das Sekret chemisch als eine Lösung von Eiweißstoffen; in größter Menge findet sich ein zur Klasse der Albumine gehöriger Eiweißkörper, daneben eine geringe Menge einer Albumose. Nukleoalbumine fehlen. Welchem der Bestandteile das Sekret seine pharmakologischen Wirkungen verdankt, ist unentschieden. Für ihre Tierversuche verwendeten Martin und Tidsivell Lösungen des durch Alkohol aus dem Sekret von drei Paar Drüsen gefällten Sub- stanzgemenges, dessen Gewicht nach dem Trocknen bei 40^ 0"4^ betrug. Die Substanz stellte ein in Wasser und verdünnten Salzlösungen zu einer opaleszierenden, neutral reagierenden Flüssigkeit lösliches, weißes Pulver dar. Nach subkutaner Injektion von 0*05^ dieser Substanz entwickelte sich l^ei einem Kaninchen innerhalb 24 Stunden in der Umgebung der ^) Auatomiscbes bei Meckcl, Deutsches Archiv f. Physiologie. Bd. 8 (1823) und Descriptio anatomica Oruithorhyuchi paradoxi. Lips. 1826. — Vgl. auch Martin uud Tidsivell a. a. 0. ^) Observations on the femoral gland of Ornithorhynchus and its secretion etc. Proc. of the Linn. Soc. of New South Wales. July 1894. ^) Note sur la secretion veniineuse de 1" Ornithorhynchus paradoxus. Soc. de Biol. T. 56. p. 451 (1904). *) ()n the Ornithorhynchus paradoxus, its venomous spur and general structure. Trans. Linn. Soc. A^ol. 13. p. 622 (1822). 5) Bull. Soc. Philomatique. p. 82. Paris 1817. ^) Observations on the Anatomy of the Duckbilled Animal of New South Wales. Mem. Wernerian Soc. Nat. Hist. (1824). ') On the effects of wounds iuflicted by the spurs of the Piatypus. Papers and Proc. Roy. Soc. p. 162. Tasmania 1876. *) Royal Society of New South Wales. Anniversary address by the President, T. P. Anderson Stuart (1894). Darstellimg und Xachweis tierischer Gifte. ,S1M Injektionsstelle eine umfangreiche Geschwulst. Bald nach der Injektion und an dem darauffolgenden Tage verhielt sich das Tier sehr ruhig und frall wenig. Geringe Temperatursteigerung. Eine Blutprobe gerann noi-nial und zeigte unter dem Mikroskop nichts Besonderes. Am fünften Tage nach (h'r Injektion war die Geschwulst vollständig verschwunden und das \'ersuchs- tier scheinbar ganz normal. Bei intravenöser Applikation von Om c/ sank der Blutdruck unmittel- bar von 97 auf 60 mm, nach 90 Sekunden auf 27 wm Quecksilber. Die Respiration war zunächst sehr beschleunigt und vertieft und sistierte plötzlich um dieselbe Zeit, als der Blutdruck auf 27 mm gesunken war. Bei der sofortigen Öffnung des Tieres schlug das Herz noch schwach. Im rechten Herzen und im ganzen venösen System war das Blut geronnen. Die subkutane AppUkation des Giftes bewirkt also diesellien Erschei- nungen, wie sie nach Verwundungen von Menschen und Hunden durch die Sporen des Ornithorhynchus beobachtet wurden. Das Gift wird Mahrscheiu- lich nur langsam resorbiert. Bei der intravenösen Einverleibung sind die Wirkungen wohl als Folge der intra vaskulären Gerinnung des Blutes aufzufassen. Darauf deuten u. a. die dyspnoischen Krämpfe und das anfangs sehr rasche, dann, ins- besondere nach kleineren Gaben, aber langsame Sinken des Blutdrucks. In diesen Punkten bietet das Ornithorhynchusgift eine weitgehende Ähnlichkeit mit dem Gifte von Hoplocephalus und anderer australischer Giftschlangen, welches aber das Gift des Schnabeltieres um das 5000fache an Wirksamkeit übertrifft. F. Koc fand, daß das Gift auch in vitro einige Eigenschaften der Schlangengiftsekrete zeigt. W^ie das Gift von Bothrops lanceolatus. ruft es Gerinnung des mit Oxalsäure versetzten Plasmas hervor. Plrhitzen auf 80*^ hebt die koagulierende Wirkung auf. Im Gegensatz zum ^■ipern- und Botliropsgift entbehrt aber das Ornithorhynchusgift der hämolytisclien und proteolytischen Eigenschaften. Im Organismus der Säugetiere finden sich zwei sehr genau charak- terisierte, giftige Stoff Wechselprodukte, deren eines bereits grolie i)r ak- tische Bedeutung erlangt hat Das Suprareuin.M Das Suprarenin (v. Fürth), auch Adrenalin (Takaminei und Kpiue- phrin (Abel) genannt, findet sich in den Nebennieren. ') Literatur bis 1899 iu der ausfübrliciien M(>nograi>liie von IluUnrni und Anderson, Studien über die Physiologie und Anatomie der Nebennieren. Skandinavisches Archiv f. Physiologie. Bd. 9. s/72— 313 (1899). — Literatur chemischen Inhalts bis P:ndc 1903 iu dem Sammelreferat von 0. v. Fürth. Biochemisches Zentralblatt. Bd. 2. Nr. 1 (1904). — Literaturzusammenstellung bis August 1907. Albrrt C. Crairford. The use of suprareual glands iu the physiological testing of drug plants. ü. S. Department of 52* 320 K. St. Faust. Es wurde zum ersten ]\Iale von /. Takamine'^) (1901) in kristallini- scher Form dargestellt; fast gleichzeitig mit Takamine und unabhängig von ihm gewann auch Aldrieh ^-) diesen Körper in wohl ausgebildeten Kristallen. Die ^Methode der beiden letztgenannten Forscher beruht im wesent- lichen darauf, dal.) aus sehr stark eingeengten und von unwirksamen Pro- dukten durch Alkohol oder Bleiacetat größtenteils befreiten Nebennieren- extrakten sich die blutdrucksteigernde Substanz auf Zusatz von konzen- triertem Ammoniak in Form von mikrokristallinischen Körnern abscheidet. Die so erhaltenen Präparate können durch wiederholtes Lösen in Säure und Fällen mit Ammoniak gereinigt werden und erscheinen dann als Kristalldrusen, die aus wohl ausgebildeten, prismatischen Nadeln oder rhombischen Blättchen zusammengesetzt sind. Diese Substanz ist jetzt unter dem Namen Adrenalin im Handel zu haben. Aus Nebennierenbrei stellte Äbel^) das Epinephrin dar durch Ex- traktion mit alkohohscher Trichloressigsäurelösung und Zusatz von Ammoniak zu den filtrierten und unter vermindertem Druck eingeengten Auszügen, während v. Fürth*) bei der Darstellung des Suprarenins zer- kleinerte Rindsnebennieren mit angesäuertem Wasser unter Zusatz von Zinkstaub extrahierte, um Veränderungen (Oxydation) des leicht zersetz- lichen wirksamen Stoffes vorzubeugen, ß) Das Adrenalin löst sich schwer in kaltem, etwas reichlicher in heißem Wasser. Es löst sich leicht in verdünnten Säuren unter Bildung von Saken und reagiert schwach alkahsch auf Lackmuspapier. In Alkohol ist es schwer löshch; unlöshch in Chloroform, Amylalkohol, Schwefelkohlenstoff, Äther, Aceton und Petroleumäther. In kaustischen Alkalien ist das Adrenalin ent- sprechend seiner Phenolnatur löslich, nicht aber in Alkalikarbonaten und Ammoniak. Es wird durch Kahumquecksilberjodid, Pikrinsäure, Gerlxsäure, Phosphormolybdän- und Phosphorwolframsäure und Quecksilberchlorid nicht gefäUt und reduziert Fehlingsche und ammoniakalische Silberlösung. Die wässerige Lösung färbt sich an der Luft rot und wird später braun; auf Zusatz von Eisenchlorid entsteht die für diese Substanz charakteristische Grünfärbung. Jod, Salpetersäure, Kahumbichromat, Ferricyankabum und Goldchlorid geben Botfärbung. Die Zusammensetzung des Adrenalins entspricht der empirischen Formel C9 H13 N3 0, welche durch zahlreiche Elementaranalysen und Alole- Agriculture. Bureau of Plant Industrj'. Bulletin. No. 112. Washington 1907. — Vgl. auch S. Moeller, Kritisch-experimentelle Beiträge zur Wirkung des Nebennierenextraktes (x\drenalin). Inaug.-Diss. AVürzburg 1906. *) American Journal of Pharmacy. Vol. 73. November 1901. — Therapeutic Gazette. Vol. 25. p. 221 (1901). ^) American Journal of Physiology. Vol. 5. p. 457 (1901). ') John J. Abel, Weitere Mitteilungen über das Epinephrin. Ber. d. Deutschen ehem. Ges. Jg. 36. S. 1839 (1903). ■*) 0. V. Fürth, Zur Kenntnis des Suprarenins (Adrenalins). Monatshefte f. Chemie. Bd. 24. S. 265 (1903). 5) Vgl. auch D. R. P. Nr. 160.397 ; Nr. 167.317. Darstellung uud Nachweis tierischer Gifte. ^^i kulargewichtsbestimmimgen (Aldrich, Takamine, v. Fürth, Pauli/'), JoucW-), Bertrand^), Stoh^), Abderhalden und Ber(/eU->) begründet ist. nie Kon- stitution«) dieser Verbindung findet ihren Ausdruck in der Formel: HOf^^CH . OH . CH, . NH . CH,, welche die Bildung der Spaltungs- und üxydationsprodukte und ihre P.cak- tiouen in befriedigender Weise erklärt. Die von F. Stolz und von F. Friedmann zur Aufklärung der Konsti- tution des Adrenalins unternonimenen Versuche bestätigen die folgenden, durch V.Fürth festgestellten Tatsachen: 1. Das Adrenalin enthält einen Benzolkern, welcher in 2-. .')-, G-Stel- lung substituiert ist. 2. In seinem Molekül sind drei Hydroxylgi-uppen (OH) vorhanden, wovon zwei sich in 5-, 6-Stellung am Benzolkern finden. 3. In dem Adrenalinmolekül ist eine Methylimidgruppe enthalten. Durch Einwirkung von Methylamin auf Chloracetobrenzkatechin Ce H3 (OH), CO . CH, . ^ Ci + H 1 NH . CH3 erhielt Stolz das Methylaminoketobrenzkatechin: Cß H3 (0H).3 . CO . CH2 . NH . CH3 + HCl, welches nach Untersuchungen von H. Meyer '^) quaUtativ wie das Adrenalin wirkt. Durch Reduktion des ]\Iethylaminoketobrenzkatechins bilden sich Produkte, deren Wirkungen sich denjenigen des Adrenalins ([uantitativ nähern. ^) Die Wirkungen des AdrenaHiis betreffen in erster Linie das Ge- fäßsystem und das Herz und äußern sich in einer hochgradigen Stei- gerung des Blutdruckes. Diese beruht auf der Verengerung der peri- pheren Gefäße und wahrscheinlich auf einer erregenden Wirkung des Adrenalins auf die motorischen Apparate des Herzens sowie auf die Herz- muskulatur selbst. Wenn man das Adrenalin auf gefäßreiche Stellen, namentlich auf Schleimhäute appliziert, so beobachtet man, daß diese Stellen blutleer werden; daß also das Adrenahn ganz lokal eine Verengerung der kleinsten 1) Ber. d. deutschen ehem. Ges. Jg. 36. S. 2944 (1903); Jg. 37. S. 1388 (19Ü4). -) Transactions of the Chemical Society. \'ol. 20. p. 18. London 1904. s) Compt. rend. T. 139. p. 502 (1904). ') Ber. d. Deutschen ehem. Ges. Jg. 37. S. 4149 (1904). 5) Abderhalden uud Bergell, Ber. d. Deutschen ehem. Ges. Jg. 37. S. 2022 (19041 «) E. Friedmann, Die Konstitution des Adrenalins. luaug.-Diss. Straßburg 190(5. ') Pliysiologisches Zentralhlatt. Bd. 18 (16). S. 501 (1904). Vgl. auch (K Lonri xmA II. Meyer, Über die Wirkungen synthetischer, dem Adrenalin verwandter Stoffe. Archiv f. exp. Pathol. u. f. Pharmak. Bd. 53. S. 213 (1905). 8) Vgl. auch H. D. Dahin, Synthese von dem Adrenalin verwandter .Substanzen, l'roc. Chem. Soc. Vol. 21. p. 154 (1905) uud Proc. Roy. Soc. London. Vol. 76. Serie B. p. 491 bis p. 503 (1905); ref. in Chem. Zentralblatt. 1905. IL S. 57 und 1458. g22 E. St. Faust. Gefäße, feinen Arterien, arteriellen Kapillaren und Kapillaren im allge- meinen hervorruft. Daraus geht hervor, daß es eine besondere, eigenartige Wirkung auf die Wandungen dieser Gefäßgelnete ausübt. In den Lungengefäßen und in dem rechten Herzen, d. h. in dem kleinen Kreislauf, wird der Blutdruck durch Adrenalin nur wenig, wenn überhaupt, gesteigert [G'erÄarc?^!); Fe/icÄ 2)]. Die Gefäße der Niere scheinen besonders empfindlich für die Adrenalinwirkung. ^) Die Zerstörung des Adrenahns im Organismus ist nach G. Emhden und 0. V. Fürth*) auf die Alkaleszenz des Blutes und der Gewebe, nicht aber auf eine durch Fermente bewirkte oxydative Zerstörung desselben (Lancjlois, AtJianasiu) zurückzuführen. &) Eine 0"17oi8"e Sodalösung hebt bei einer Temperatur von 40" die Wirksamkeit des Adrenalins schneller auf als Pferdeserum oder Rinderblut unter gleichen Bedingungen. Daß das schnelle Abkhngen der Adrenahnwirkung nicht durch die rasche Ausscheidung der wirksamen Substanz durch die Nieren bewirkt wird, geht aus Versuchen von Czyhulski ^) hervor ; in dem kurze Zeit nach der intravenösen Einverleibung größerer Mengen von Adrenalin aus der Blase entnommenen Harne findet sich keine blutdrucksteigernde Sub- stanz. ') Die tödliche Dosis beträgt bei intravenöser Applikation 0"1 bis 0*2 mg pro Kilogramm Körpergewicht für Kaninchen und Hunde % bei sub- kutaner Einverleibung etwa 6 mg pro Kilogramm Hund. ^) Die praktische Bedeutung und die therapeutische Verwendung des Adrenahns beruhen auf der gefäßverengernden Wirkung desselben. Diese tritt auch bei lokaler Apphkation des Mittels ein und ist daher nützlich bei chirurgischen Eingriffen, wo es darauf ankommt, ein möglichst blut- leeres Operationsgebiet herzusteUen, Blutverluste zu vermeiden oder Blu- tungen zu stillen, respektive bestehende Hyperämie zu beseitigen. Die subkutane oder intravenöse Injektion des Adrenalins zu thera- peutischen Zwecken am Menschen ist nicht ohne Gefahr. Auch dann nicht, wenn akute Erscheinungen vollständig ausbleiben. Aus den Versuchen Ger- 1) Archiv f. exp. Pathol. u. f. Pharmak. Bd. 44. S. 173 (1900). 2) Wiener med. Wocbenschr. (1898). Nr. 26. ^) D. JoncscH, Notiz über eine besondere Affinität der Xierengefäße zu Adrenalin. Wiener klin. Wocbenschr. Bd. 21. Nr. 14 (1908). *) Hofmeisters Beiträge zur ehem. Physiologie u. Pathologie. Bd. 4. S. 421 (1903). ^) W. Krefschmer, Dauernde Blutdrucksteigerung durch Adrenalin und über den Wirkungsmecbanismus des Adrenalins. Über die Beeinflussung der Adrenalinwirkaug durch Säure. Archiv f. exp. Patholog. u. Pharmak. Bd. 57. S. 423—440 (1907). ß) Gazeta Lekarska. Nr. 12 (1895). (Polnisch.) Vgl. Physiolog. Zentralblatt. Bd. 9. S. 172 (1895). ') G. Emhden und 0. v. Fürth, a. a. 0. S. 427. *) J. Lcsar/e, Recherches expörimeutales sur l'adrenaline. Arch. Internat, de Pharmacod. T. 13. p. 245 (1904). ^) S. Amberg , Über die Toxicität des wirksamen Prinzips der Nebennieren. Ar- chives internationales de Pharmacodynamie et de Therapie. T. 11. p. 57—100 (1902). Darstellung iiiul Nachweis tierisclier (iifte. H*>". hardts an Hunden geht hervor, dal.i bei der Adrenahnwirkimi: dir ll.T/aktion ganz plöt/Uch versagen kann, wiihrend (k'r i;hit(h-nek hoch über (h-r N«»rni sU-ht. Nachweis und (luaulitutive Hestimniuni? des Adreiialiii>. Die Farheureaktionen, weU'he das AdrcnaHn mit Flisenrhlorid (ltuiu und mit Jod (rosarot) gibt, eignen sich nur dann zur ([uantitativcn ko- lorimetrischen Bestimmung dieses Körpers, wenn die Substanz in reinem Zustande vorhegt bei annähernd neutraler Reaktion. Anwesenheit von viel freier Säure und andere Umstände können den Ausfall (h'r Ile- aktion mit Eisenclilorid stören. i) Die bekannte Kotfiirbung längen- Zeit aufbewalirter Lösungen des Adrenahns stört bei der Jodn'aktion ebenfalls; doch hal)en Ahelous, Soulir und Toujan-) diese lieaktion zur (piantitativcn Bestimmung des Adrenalins benutzt, indem sie die Farbe dei- zu bestim- menden Lösung mit derjenigen einer frisch hergestellten Lösiinii von be- kanntem Gehalt an reinem Adrenalin nach Jodzusatz verglichen. Die Wertbestimmung von AdrenalinlüsuiiLien und der Nach- weis des Adrenalins geschieht aber am sichersten durch den Tierversuch. 1. Durch Messung der Blutdrucksteigerung nach intravenöser Injektion von Adrenalin oder eines Auszuges aus Nebennieren. 2. Reaktionen am Auge: a) Verdünnte Lösungen von Adrenalin in den Konjunktivalsack geträufelt bewirken Blutleere und daln^r Blässe der Konjunktiva. später Pupillenerweiterung. 3 ) Die Wirkung auf die Konjunktiva tritt noch bei einer Verdünnung von 1 : 120.000 ein. h) Am enucleierten Bulbus (Froschauge) sah Ehntintw*) selb.st bei intensiver Beleuchtung nach 0-000025 »?'. Houlwl et B. Faifol, Sur le dosage colorimetrique de radreiialiiie. Ebenda. T. 55. p. 3.')8 (r.KJ3). — I.D. Cameron, On the niethods of standardising suprareiial prcparatioiis. Proc. Roy. Soc. Edinburgh. Vol. 2«). p. 157 (1906). — 0. r. Fürth, Zur Kenntnis der bren/katorhin- ähnlichen Substanz der Nebeinu'eren. Zeitschr. f. physiolog. Cbeniic. Hd. 29. S. 115 (19UÜ). — Zur Kenntnis des Suprarenins. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. :J44 (1902). -) J. E. Ahelous, A. SouUe et G. Tanja», Dosage colorinu-triquc par riodo de l'adrenaline. Compt. rend. Hebd. Soc. de Biologie. T. 59. p. nlM (1905). - Sur un pro- cede de controle des dosages cliimique et physiologique de radrciialine. Compt. n-nd. Hebd. Soc. de Biologie. T. 60. p. 174 (1906). — C. E. VauHrkhal , Metliod for tlio prc- paration of the active principle of tlie suprarenal gland. l'harmaceutical Kra. N «d. 86. p. 478 (1906). =*) S. J. Meltzer and K. M. Auer, Über den Einfluß des Nebcniiicreiiextraktcs auf die Pupille des Frosches. Zentralblatt f. Physiologie. Bd.l8. S.317 (1904). - fULKahn, Über die Beeinflussung des Augondrucives durch Extrakte chrimiaffint-n C ' (.\drp- nalin). Ebenda. Bd. 20. S. 33 (190G). — M. Leirainloirsk,, , Cber die ^\ > . ii des Nebennierenextralvtes auf die glatten Muskeln, im besonderen des Auges. Archiv f. Anat. u. Physiologie. Physiolog. Abt. S. 360 (1899). 4) B. Ehrmaiiu , Über eine phvsiologisclie Wertbestimniung dos .\'h"' 'bns. Arrhiv f. exp. Patholog. und f. I'harnuik.dogie. Bd. 53. S. 97 (1905). - Zur Pi •• und exp. Pathologie der Adreualinsekretion. Ebenda. Bd. 55. S. 39 (1906). 824 E. St. Faust. pillenerweiterung; O'OOOOl mg bewirkten unter diesen Beclinn:iinRen noch deutliche Erweiterung der Pupille, während O'OOOOOö mg keine wahr- nehmbare Wirkung zeigten. c) Bei normalen Menschen, Hunden und Katzen ist Adrenalininstilla- tion in den Konjunktivalsack ohne Einfluß auf die Pupillenweite. Unter besonderen Verhältnissen tritt aber nach 0. Loewi^) Mydriasis ein, so z. B. nach Totalexstirpation des Pankreas (bei Hunden und Katzen), bei manchen diabetischen Menschen und bei manchen Fcällen von Basedow. 3. Direkte Messung der gefäßverengernden Wirkung: a) Durchl^lutung von Fröschen mit Adrenalinlösungen nach Läiven."-) h) Wirkung auf in Ringer&dieY Lösung aufbewahrte Querschnitte (Ringe) der überlebenden Arteria subclavia von Ptindern nach O.B. Meyer '^), welcher bei Verdünnungen der AdrenaUnlösungen von 1 : 100,000.000 an diesem Versuchsobjekt die gefäßverengernde Wirkung noch eintreten sah. 4. Wirkungen des Adrenalins auf die Sekretionen. Das Adrenalin verursacht eine Steigerung der Sekretion der Speicheldrüsen *) und der Hautdrüsen des Frosches &), nicht aber der Schweißdrüsen. Atropin unterdrückt diese Sekretionen nicht, so daß es sich, wie beim Physostigmin, um eine Wirkung auf das Drüsenparenchym handelt. Die gefäßverengernde Wirkung des Adrenalins erinnert am meisten an die des Hydrastins und Hydrastinins, doch fehlen dem Adrenalin, wie es scheint, die Wirkungen der letzteren Stoffe auf das Zentralnervensystem, und umgekehrt jenen die lokale, gefäßverengernde Wirkung. Die Gallensäuren. Die der Galle der höheren Tierklassen eigentümlichen Stickstoff- und zum Teil schwefelhaltigen organischen Säuren, welche darin in Form ihrer leicht kristallinisch zu erhaltenden Natriumsalze vorkommen und vom phy- siologischen Standpunkte als die wichtigsten Gallenbestandteile zu be- trachten sind, müssen als tierische Gifte im weiteren Sinne hier l)esprochen werden und verdienen auch wegen ihrer eigentümlichen Wirkungen unter pathologischen Verhältnissen beim Ikterus des Menschen ein besonderes Interesse. \) (). Loeiri, Über eine neue Funktion dos Pankreas und ihre Beziehung zum Diabetes mellitus. Archiv f. exp. Patholog. u. Pharmak. Bd. 59. S. 83 (1908). ^) A. Läiven, Quantitative Untersuchungen über die Gefäßwirkung von Suprarenin. Archiv f. exp. Patholog. u. Pharmak. Bd. 51. S. 422 (1904). ^) 0. B. Mei/er, Über einige Eigenschaften der Gefilßmuskulatur. Zeitschr. für Biologie. Bd. 48. S. 365 (1906). ^) ./. N. Langley, Observations on the physiological action of extracts of the suprarenal bodies. Journal of Physiology. Vol. 27. p. 237 (1901). ^) R. Ehrmann, Über die Wirkung des Adrenalins auf die Hautdrüseusekretion des Frosches. Archiv f. exp. Pathol. u. Pharmak. Bd. 53. S. 137 (1905). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^o') Neuere Untersuchungen ^ ) machen es sehr wahrschciiiUcli . (l.-iii ,lio Cholsäure dem Cholesterins) chemisch nahe verwandt ist. Pharmakologische Wirkungen der Gallensäuren, welche zum Nachweis derselben dienen können. Die Wirkungen der Gallensäuren betreffen das Nervensystem, die Muskeln, den Zirkulationsapparat und das IJlut. Die Galle sowohl als die reinen GaUensäuren und deren Natriumsalze wirken hämolvsierciid. Diese Wirkung ist zuerst von Hiinefekr^) beobachtet und von Eyivosrh'] genauer untersucht worden. Letzterer führte vergleichende Untersuchungen iil)er den Grad der hämolytischen Wirkungen der verschiedenen gallensauren Salze aus und fand dabei folgendes Verhältnis in der Intensität der hämo- lytischen Wirkung der verschiedenen Gallensäuren. Glykocholsaures Natrium =: 1 Hyocholsaures Natrium = 4 Cholsaures Natrium = 4 Choloidinsaures Natrium = lu Taurocholsaures Natrium =: 12 Chenochol saures Natrium = 14 Demnach scheint für den Grad der hämolytischen AVirknuL! der GaUensäuren nicht allein der Cholsäurekompouent maßgebend zu sein: auch der Paarung und die Art der Bindung desselben an die Cliolsäure scheinen dabei eine Rolle zu spielen. Die hämolytische Wirkung der GaUensäuren scheint auch im lebenden Organismus, aber nur bei ihrer Injektion in das lUut zustande zu kommen und den Übergang von Hämoglobin in den Harn (Hämoglol)inurie) zu verursachen, welch letzterer dann auch Harnzylinder und Eiweill enthalten kann. Die w^eißen Blutkörperchen sowie ferner Amöi)en und Infusorien werden ebenfalls durch die GaUensäuren geschädigt. Die Gerinnung des Blutes wird durch die GaUensäuren (tauro- und chenocholsaures Natrium), wenigstens im Beagenzglasversnche, in der Konzentration von 1 : öOO beschleunigt, bei der Konzentration 1 :•_>.")() da- gegen vollständig aufgehoben (Ui/wosch). Die Wirkungen auf die Muskeln äußern sich zunächst in einer Aer- minderung der Pteizbarkeit (Irritabihtät), welche bis zur vollständigen Lähmung fortschreiten kann. "■) IT. Schroffer, B.Weizenhröch und R.Wiff, Boiträge zur Kenntnis des ('hole Sterins und der Cholalsäure und über ein gemeinsames Ahbauprudukt derseilien. Sitzungsberichte d. Kaiserl. Akad. d. Wissenschaften in Wien. Bd. 117. S. 1 (190S). -) A. Windaus, t}ber Cholesterin: Berichte der Deutscli. i-licm. (ics. Jp. 41 S. 2558 (1908). ä) HüHcfeld, Der Chemismus in der tierischen Organisation. Leipzig 1S40. *) D. Riiirosch, Vergleichende Versuche über die giftitre Wirkung der (lallonsiiuren. Arbeiten des Pharmakologischen Instituts zu Dorpat. Herausgegeben von h'. Ko/>,rf. Bd. 2. S. 102 (1888). Daselbst auch die ältere Literatur ausführlich zusammengestellt. 826 E. St. Faust. Das Zentralnervensystem erleidet unter dem Einfluß der gallensauren Salze eine Herabsetzung- seiner Funktionsfähigkeit bis zur vollständigen Lähmung. Die Wirkung der Gallensäuren auf den Zirkulationsapparat sind seit den Untersuchungen von Röhriy ^) vielfach experimentell bestätigt worden. Sie äußern sich in einer Verkleinerung des Pulsvolumens und Verminderung der Pulsfrequenz, welch letztere besonders beim Ikterus häufig beobachtet wird und von Frerichs zuerst als eine Folge der Gallenwirkung bei dieser Krankheit vermutet wurde. Das Sinken des Blutdruckes nach der Injek- tion von gallensauren Salzen ist eine Folge der Herzvrirkungen. VieUeicht ist dabei auch eine Gefäßwirkung im Spiele. Die an Tieren beobachteten Allgemeinerscheinungen nach der sub- kutanen Injektion von gallen sauren Salzen bestehen in Durchfall, ^lattig- keit, Somnolenz, verminderter Puls- und Atemfrequenz; Einverleibung von größeren Mengen bewirkt allgemeine Lähmung. Nach intravenöser Injektion sind mehr oder weniger heftige Krämpfe, Erbrechen, verlangsamtes Atmen und Tod unter asphyktischen Erschei- nungen und tetanischen Krämpfen beobachtet worden. Bei intravenöser Injektion betragen die tödhchen ^Mengen pro Kilo- gramm Körpergewicht : Kaninchen Hunde Taurocholsaures Natrium O'oo^/ 0'6 — 0*7^ Glykocholsaures Natrium 0'50„ 0"8 — 1*0 ,, Die Gallensäuren lassen sich nach ihren Wirkungen im pharmako- logischen System am besten der Gruppe der „Saponinsubstanzen" anreihen. Mit diesen haben sie qualitativ die Wirkungen auf die Blutkörperchen, die Muskeln, den Zirkulatiousapparat und auf das Nervensystem gemein. Schlangen, Ophidia. Die Giftorgane der Schlangen.-) Die bei den Proteroglyphen gefurchten, bei den Solenoglyphen von einem Kanal durchbohrten Giftzähne dienen zur Einverleibung des Giftes. Die Stellung und die Größe der Giftzähne ist bei den verschiedenen Giftschlangen eine sehr verschiedene. Diese beiden für den Grad der Gift- wirkung wichtigen Faktoren scheinen in einer gewissen Beziehung zu der Wirksamkeit des Giftes zu stehen. 3) Die Giftdrüsen hegen in der Regel auf beiden Seiten des Über- kiefers hinter und unter den Augen und sind von sehr verschiedener *) A. Röhrig, Über den Einfluß der Galle auf die Herztätigkeit. Leipzig 1863. ^) Über „giftige" und „ungiftige'" Schlangen vgl. E. St. Faust, Die tierischen Gifte. S. 32. Braunschweig 1906. ^) Faust, 1. c. S. 40 und 50. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^o": Größe und F'orm, im allgemeinen aber der Größe des Tieres eiitsprcchciul. Bei manchen Schlangen erstrecken sie sich jedoch auch auf den Kücken und bei Gallo phis liegen sie innerhalb der Bauchhöhle, wo sie sich auf ein Viertel bis die Hälfte der Länge des ganzen Tieres als langgestreckte drüsige Organe ausdehnen. Ihr Bau charakterisiert sie als acinöse Drüsen und ist den Speicheldrüsen der höheren Tiere analog. Das von diesen Drüsen abgesonderte Grift häuft sich in den Acini und dem an der Basis des Giftzahnes ausmündenden Ausführungsgang an. Die Drüsen sind von einer fibrösen, kapselartigen Membran überzogen, in welche die Sehnen des Musculus masseter teilweise übergehen, so daß bei der Konti-aktion des genannten und unter Mitwirkung anderer Muskeln der dadurch auf die Drüsen ausgeübte Druck die Entleerung des Giftes nach außen veranlaßt. Die ,. ungiftigen" Schlangen besitzen ebenfalls eine Ohrspeicheldrüse (Parotis) und Oberlippendrüsen, deren Sekrete mehr oder weniger giftig sind; nur fehlen diesen die für die Einverleibung des Giftes nötiucu Vor- richtungen, d. h. die Giftzähne. Besondere Beachtung verdient die Tatsache, daß das F)lut bzw. das Serum auch ungiftiger Schlangen (]ualitativ wie das Sekret ihrer Speichel- drüsen (Giftdrüsen) wirkt. Es drängt sich daher der Schluß auf, daß die im Blute vorhandene und somit im ganzen Organismus der Schlan- gen verteilte giftige Substanz von den Speicheldrüsen „selektiv aus dem Blute aufgenommen und sezerniert wird, nicht aber infolge einer „inneren Sekretion" der betreffenden Drüsen von diesen in das Ülut übergeht. Die Vorgänge und die an den Giftdrüsen bei der Sekretion des (iiftes zu beobachtenden Erscheinungen, zum Teil unter dem Einflüsse pharma- kologischer Agenzien, sind von Lindemami^) , Beichel'^), Launij-^) u.a. studiert und beschrieben w^orden. Die Mengen des abgesonderten Giftes stehen in einem gewissen \v\-- hältnis zur Größe der Giftdrüsen, somit im allgemeinen zur Gröl'.e der betreffenden Schlange. Bei einem bestimmten Tiere ist die Menge des auf einmal bei einem Bisse gelieferten Giftes eine sehwankende, je nach- dem es längere oder kürzere Zeit nicht gebissen hat, doch sind ancii andere, schwer zu bestimmende Einflüsse von Bedeutung für diese \ ."i- hältnisse, so vielleicht das Allgemeinbefinden der Schlange, nervöse Einflüsse, die Heftigkeit des Bisses, die Temperatur der lingebnng, Wasser- und Nahrungsaufnahme und die Art der Nahrung sowie die Gefangenschaft. 1) Archiv f. mikr. Anatomie. Bd. 53. S. 313—321 (1898). =) Morpholoo-. Jahrb. Bd. 8 (1882). , ^ , . ^„ ,, , . ^) Contril.uti'on ä l'etiide des Phönomenes nncldaires de la Secretion (CeUulcs 4 venin. — Cellules ä Enzyme). These de Paris (1903). Literatur. 828 E. St. Faust. Über die Natur der Schlangengifte. Physikalische und chemische Eigenschaften. Das frische, der lebenden Schlange entnommene Sekret stellt eine klare, etwas viskose Flüssigkeit von hell- bis dunkelgelber, manchmal auch grinilicher Farbe und neutraler oder schwach saurer Reaktion dar, deren spezifisches Gewicht zwischen l'OoO und l'OöO schwankt. Es löst sich in Wasser zu einer trüben, opaleszierenden Flüssigkeit von sehr schwachem, fadem Geruch, die beim Stehen einen mehr oder weniger voluminösen Niederschlag fallen läßt. Dieser besteht aus Eiweiß oder eiweißartigen Stoffen, hauptsächlich Globulinen, Mucin, Epithelzellen oder deren Trümmern. Die wässerigen Lösungen schäumen beim Schütteln stark und zer- setzen sich unter der Einwirkung von Fäulnis- oder anderen Bakterien unter Entwicklung von Ammoniak und von höchst unangenehm riechen- den, flüchtigen Fäulnisprodukten, je nach der Temperatur, nach längerer oder kürzerer Zeit, wobei die Wirksamkeit der Lösung aUmählich abnimmt und schließlich ganz verloren gehen kann. Beim Eintrocknen der Schlangengifte bei niederer Temperatur, am besten im Vakuumexsikkator über konzentrierter Schwefel- säure oder geschmolzenem Chlorcalcium, hinterbleibt eine dem Gewichte nach sehr stark variierende Menge Trockensubstanz, deren quantitative Zusammensetzung außerordentlichen Schwankungen unterworfen ist. Die Hauptl)estandteile eines derartigen Trockenrückstandes, welcher, ohne an Wirksamkeit einzubüßen ^ ), anscheinend unbegrenzt lange Zeit aufbewahrt werden kann, sind: 1. durch Hitze koaguUerbares Eiweiß (Albumin, Glo- bulin); 2. durch Hitze nicht koaguherbare Eiweißderivate (Albumosen und sogenannte Peptone); ?>. Mucin oder mucinartige Körper; 4. Fermente; 5. Fett; 6. geformte Elemente; Epithel der Drüsen und der jMundhöhle und Epitheltrümmer: 7. Mikroorganismen, welche wohl ZufäUigkeiten ihre Anwesenheit verdanken; 8. Salze, Chloride und Phosphate von Calcium, Magnesium und Ammonium. Der Trockenrückstand hat etwa die Farbe des ursprünglichen frischen, nativen Giftsekretes und hiuterbleibt gewöhnlich in Form von Schüppchen oder Lamellen, welche kristallinische Struktur des Piückstaudes vortäuschen können. Aus dem nativen Gifte oder aus einer Lösung des eingetrockneten Giftes in Wasser fällt Alkohol bei genügender Konzentration die wirksame ') Diese Tatsache gebietet beim Hautiereu mit Giftzähueu von Schlangen oder auch Schädeln mit erhaltenen Giftzähnen in Museen, im Laboratorium usw. Vorsicht, weil an den Zähnen eingetrocknetes, aber noch wirksames Gift anhaften kann und weil es bei etwaigen, ziemlich leicht erfolgenden Verletzungen mit den sehr spitzen Zähnen zur Resorption von Gift und schweren A'ergiftungserscheinuugen kommen kann; sogar längere Zeit in Alkohol aufbewahrte Giftschlangen können noch zu Vergiftungen Ver- anlassung geben, wie der Fall eines Assistenten am Museum in Petersburg zeigt. Der Betreffende starb infolge einer Verletzung durch den Zahn einer Giftschlange, mit welcher er in unvorsichtiger Weise hantiert hatte. Darstellung uuil Nachweis tierischer Gifte. 829 Substanz aus. Der Niederschlag- ist in Wasser löslicli und hat. wi-im .I.t Alkohol nicht durch zu langes Einwirken Koagulation des Eiweilios und Einschluß eines Teiles der Giftsubstanz in dem geronnenen Eiweil'. verur- sachte, an Wirksamkeit nicht eingebülit. Die Einwirkung der Wärme auf die Schlangengifte ist bei .b-ii von verschiedenen Schlangen stammenden (iiften sehr verschieden. Das Gift der C o 1 u b r i d e n (Naja, Bumjarus. Hoplocephalus, Pscudcrliis) kann Temperaturen bis lOO" ausgesetzt werden und verträgt sogar kuiv- dauerndes Kochen, ohne daß seine Wirksamkeit abgeschwächt wird. Durch längeres Kochen oder Erhitzen auf Temperaturen über lUO« wird di.- Wirk- samkeit vermindert und schließlich bei 120" vernichtet. Wenn man durch Erhitzen auf geeignete Temperaturen ( Tö bis S.')«) die koaguherbaren Eiweißkörper des Colubridengiftes ausscheidet und das geronnene Eiweiß durch Filtration entfernt, so erhält man eine klare Flüssigkeit, welche die wirksame Substanz enthält und sich beim Kochen nicht mehr trübt. Der abfiltrierte und gewaschene Eiweil luiederschla^- ist nicht mehr giftig. Aus dem in den meisten Fällen noch Diurcti-eaktion gebenden Filtrate fällt Alkohol einen die wirksame Substanz entliultcnilcn Niederschlag, welcher sich auf Zusatz von Wasser wieder löst. Das Viperngift (Botlirops, Crotalus, Vipern) ist gegen Tem])eratur- einflüsse viel empfindlicher. Erwärmen bis zur Gerinnungstemperatur, etwa 70^ schwächt die Giftigkeit ab und bei 80 bis 85" wird diese vollkommrn vernichtet. Das Bothropsgift verliert seine Wirksamkeit teilweise schon bei 60'^ (Calmette). Die Schlangengifte dialysieren nicht. In diesem Verhalten schließen sie sich den Eiweißkörpern eng an, deren bekanntere Ueaktionen ilinen ebenfalls zukommen. Alle bisher untersuchten Schlangengifte geben die Biuret-, Millon- und Xanthoproteinreaktion und werden durch Sättigung ihrer Lösungen mit Ammonium- und Maunesiumsulfat abgeschieden: auch durch Schwermetallsalze werden diese Gifte gefällt. Alkalien und Säuren beeinflussen bei gewöhnlicher Temperatur und bei nicht zu lange dauernder Einwirkung und mäßiger Konzentration die Wirksamkeit der Schlangengifte nicht. Gegen oxydierende chemische Agentien scheinen dieseliteii jedoch sehr empfindhch zu sein. Die Wirksamkeit wird wesentlich herabgesetzt oder gänzlich aufgehoben durch Kaliumpermanganat fLflccrrf«;, Chlor {Lenz, 1832), Chlorkalk oder schneUer noch durch unterchlorigsaures Calcium (Calmette), Chromsäure (Kaufmann), Brom, Jod (Braimrd) und Jodtrichlorid (Kanthack). Die genannten Körper hat man wegen dieser schädigenden oder zerstörenden Wirkungen aufdasCiff auch thera- peutisch zu verwenden gesucht. Elektrolyse des Schlangengiftes vernichtet dessen Wirksamkeit, wahrscheinlich infolge der Bildung von freiem Chlor aus den C'hloriden und von Ozon (Oxydation). Bei Yermeiduno: jeglicher Temperatursteigerung wird das Schlangen- gift durch Wechselströme nicht verändert (Marmier'^). Der Einfluß des Lichtes, welcher beim trockenen Gifte gleich XuU ist, macht sich nach Cahnette beim nativen oder gelösten Gifte in der Weise bemerkbar, daß die Lösungen nach und nach weniger wirksam werden. Bei Luftzutritt bevölkern sich dieselben außerdem rasch mit den verschiedenartigsten ^Mikroorganismen, für welche das Schlangengift, wahr- scheinlich wegen des Eiweißgehaltes und der darin enthaltenen Salze, ein guter Nährboden zu sein scheint und welche dann ihrerseits vieheicht die Zersetzung der wirksamen Bestandteile beschleunigen. Durch Chaml)erland- oder Berkefeldfilter filtriert und bei niedriger Temperatur in gut verschlossenen Gefäßen aufbewahrt, sollen sich dagegen Giftlösungen mehrere Monate lang unverändert aufbewahren lassen. Die Konservierung von Giftlösuugen kann auch in der Weise geschehen, daß man ihnen in konzentriertem Zustande das gleiche Volumen Glycerin zusetzt. Indessen wird man wohl, besonders wenn es sich um später mit dem Gifte vorzunehmende chemische Untersuchungen handelt, dem Eintrocknen des nativen flüssigen Giftes und der Aufbewahrung desselben im trockenen Zustande den Vorzug geben. Unsere Kenntnisse über die cliemisclie Natur der wirksamen Be- standteile der giftigen Schlangensekrete sind noch sehr unvollkommen. Sicher ist, daß es sich nicht um fermentartig wirkende Körper handelt, weil die Wirksamkeit der Fermente durch Erhitzen ihrer Lösungen auf Temperaturen, die die Schlangengifte unter Erhaltung ihrer Wirksam- keit noch vertragen, vernichtet wird und weil die Intensität der Schlangen- giftwirkungen in einem direkten Verhältnisse zur einverleibten Menge des Giftes steht. Seit den Untersuchungen von Luden Bonaparte (1843) und von S. Weir Mitchell und Reichert (1876 und 1886), welche zuerst die chemi- sche Natur, ersterer des Viperngiftes, letztere speziell des Klapperschlangen- giftes kennen zu lernen suchten, wurde aUgemein angenommen, daß die wirksamen Substanzen der Schlangengifte giftige Eiweißkörper oder den Eiweil.)körpern nahestehende Derivate (Albumosen), sogenannte „Toxalbu- mine" sind. S. Weir Mitchell und Beichert^) fanden als wirksame Bestandteile des Klapperschlangengiftes verschiedene Globuline und ein ..Pepton''. C.J.Martin und J.McGarvie Smith^) isoherten aus dem Gifte der australischen „black snake", Pseudechis porphyriacus, eine Hetero- albumose und eine Protalbumose, deren Wirkungen sie genauer untersuchten und mit denjenigen des nativen Giftes übereinstimmend fanden. fe 1) Annal. de Tlnstit. Pasteur. T. 10. p. 469 (1896). 2) Smithsonian „Contributions to Knowledge". Researches upou the Venoius of Poisonous serpents. Washington 1886. 3) Proc. Roy. Soc. New South Wales. 1892 und 1895. Journal of Physiology. Vol. 15. p. 380 (1895). Darstellung und Nachweis tierischer Ciiftc ., i Die unter Ehrlichs Leitung aust^'oführten rntcrsiiclinn;.r(.ii von Prrsfon Ki/es^) und von Ki/es und Sachs^-) erstrecken sich :iuf (loD.i('ni},n'n nestaiid- teil des Kobrao-iftes, welcher seine Wirkuni>en auf das llliit '^imd (!.•>. .-ii o-eformte Elemente ausübt und welcher von Kt/ts in Form ciiicr \rrbin- dunii' mit Lecithin, einem sos>enannten Lecithid, isolici't wurde. Die /ii- sammensetzung- und die chemische Natur derartiger aus Kobragift iiikI Lecithin dargestellten '\erbindungen hat Ki/es'^) später genauer untei-sueht und dabei Verbindungen erhalten, welche bei der Elementaranalyse kon- stante prozentische Zusammensetzung und konstante phvsikalisclie Eigen- schaften zeigten. Die Untersuchungen von P. Ki/es und Ki/rs und Sachs haben or- geben, daß der Bestandteil des Kobragiftes, welchem die hänioh fische Wirkung zukommt, nicht ein sogenanntes ..Toxalbumin- ist. Ich habe dann das auf das Zentralnervensystem wirkende Gift, in dessen Wirkmigen bei dieser Vergiftung ohne Zweifel die Todesursache zu suchen ist. von den eiweißartigen Stoffen und anderen Bestandteilen des eingetrockneten Kobragiftes getrennt und chemisch und pharmakologisch genauer unter- sucht. ^) Es gcUngt also, den auf gewisse Gebiete des ZiMitralnervonsystems lähmend und auf die peripheren, motorischen Endap])ai-ate curai'iii;iitiLr wirkenden Bestandteil des Kobragiftes in eiweißlreiem und ivirksaiuein Zustande zu erhalten. Diesen Körper, dessen Zusammensetzung der Formel C,; H.,« (>,,> ''"^- spricht, habe ich Opliiotoxiii genannt. Die aus stark wirksamen Lösungen des Ophiotoxins beim Einengen derselben zur Trockne erhaltenen Rückstände sind stickstofffrei. Das (Jphiotoxin ist nicht flüchtig und dialysiert nicht. WässeriL'«' Lösungen des Ophiotoxins schäumen stark beim Schütteln. Der Rückstand aus solchen Lösungen ist in Alkohol schwer, in Wasser inivollkommen löslich; in den übrigen gewöhnlichen Lösungsmitteln unlöslich. I'.ei der subkutanen Injektion des Ophiotoxins sind bedeutend gröbere Mengen ei- forderhch, um den gleichen Grad der Wirkung wie bei der invravenösen Injektion zu erzielen, vielleicht weil es bei ersterer Art der Einverleibung an Gewebseiweil) gebunden oder fixiert wird. lUü seiner intravenösen Kin- verleibung kommen die charakteristischen Wirkungen sehr rasch zustande, wie sie nach einer subkutan oder intravenös injizierten Lösung des ganzen Trockenrückstandes des Giftsekretes beobachtet werden. 1) Berl. kliu. Wochenschr. Nr. 38 und .39 (11102); Nr. 42 und 43 (l'.'U3): .Nr. lU (1904). — Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 41. S. 27B (19(j4). 2) Berl. klin. Wochenschr. Nr. 2 bis 4 (1903). ^) Presfon Ki/es , Über die Lecithide des Schlaivürenirittes. Ijiocliciiiisclie /..iiM-nr. Bd. 4. 8.99—123(1907). — Bemcrkunseu ül)er die Lecithidl)ildun^^ Bioclieiiiisciie Zei(M-|ir. Bd. 8. S. 42 (1908). Vgl. aber hierzu auch: Ivar Bau;/, Kobrairift und Ilänx.lysp. Bio- chemische Zeitschr. Bd. 11. S. 521 (19(38) und Bd. 18. S. 441 (1909). *) E. St. Fmist, Über das Ophiotoxin aus dem Gifte der ostiudisclien Hnllcn- schlange. Archiv f. exp. Path. und Pharmakologie. Bd. 50. S. 23G (1907). 832 E. St. Faust. Aus dieser Tatsache geht hervor, daß der Eiweißkomponent des nativen Giftes auf die Piesorptiousverhältmsse von Einfluß ist, d. li. die Resorption ermöglicht und begünstigt. Aus meinen Untersuchungen geht ferner hervor, daß im nativen Gifte das Ophiotoxin wahrscheinlich salz- oder esterartig an Eiweiß oder eiweißartige Stoffe gebunden ist und daß es durch die Art der Bindung vor den in freiem oder ungebundenem Zustande leicht eintretenden und sein Unwirksamwerden herbeiführenden Veränderungen im ^lolekül ge- schützt ist. Darstellung des Opliiotoxiiis. 10 g getrocknetes Kobragift werden mit 500 cm^ Wasser übergössen und über Xacht stehen gelassen, morgens die Flüssigkeit von dem ungelöst gebhebenen Anteil abfiltriert. Das Ungelöste ist im wesentlichen organischer Natur und besteht aus Epithelzellen oder Trümmern dersell)en. Das klare, hellgelb gefärbte Filtrat wird mit einer Lösung von neutralem Kupfer- acetat oder mit chemisch reinem, namentlich völlig eisenfreiem Kupferchlorid versetzt und dieser kupf erhaltigen Lösung nach einiger Zeit verdünnte, etwa 57oige Kali- oder Natronlauge tropfenweise zugegeben bis zur bleibenden, schwachen, aber deutlich erkennbaren alkahschen Reaktion, wobei die Flüssigkeit eine intensive Biuretfärbung annimmt und ein Niederschlag ausfällt, welcher zum größten Teil aus Kupferoxydhydrat besteht. Wenn bei eingetretener alkalischer Reaktion auf Zusatz von Natron- lauge keine weitere Fällung erfolgt, läßt man absitzen und filtriert dann von dem Niederschlage ab. In dem tief violett gefärbten Filtrate entsteht auf Zusatz von verdünnter Essigsäure ein Niederschlag von Eiweiß oder eiweißartigen Stoffen, welcher pharmakologisch vollkommen wirkungslos ist. Der erste Kupferniederschlag wurde in schwach essigsäurehaltigem Wasser gelöst, die Lösung filtriert und das Filtrat durch vorsichtigen tropfenweisen Zusatz von Kali- oder Natronlauge alkahsch gemacht, wobei wiederum ein Niederschlag ausfällt, während die Flüssigkeit, in der Eiweiß- stoffe zurückbleiben, die Biuretfärbung zeigt. Man filtriert den Nieder- schlag nach dem Absitzen möglichst schnell ab. Das Filtrat hat nur noch eine sehr schwache Biuretfärbung, zuweilen auch keine mehr. Gegebenen- falls muß das Lösen in essigsäurehaltigem Wasser und die FäUung- durch Alkali wiederholt werden. Hat man auf diese Weise den Kupferkah- oder Kupfernatronnieder- schlag von biuretreaktiongebender Substanz und dmxh wiederholtes Waschen von überschüssigem Alkah befreit und neutral gewaschen, so handelt es sich dann darum, den gesuchten wirksamen Körper vom Kupfer zu befi-eien. Dieses kann nach einem der folgenden Verfahren geschehen. A. Man spült den klebrigen, gelatinösen Niederschlag mit Wasser vom Filter in ein geeignetes Kölbchen von passender Größe, verteilt ihn durch Darstellung imd Nachweis tierischer tiiftc. 833 anhaltendes, kräftiges Schütteln in dem Wasser und leitet einen kräfti-ren Schwefelwasserstoffstrom in die den Niederschlag in möglichst feiner Sus- pension enthaltende Flüssigkeit. Durch einen kräftigen J.nftstrom wird der Überschuß von Schwefelwasserstoff entfernt und nun vom .L'ehildeten Schw^efelkupfer abfiltriert. Das wasserhelle, klare, biuretfreie Filtrat erweist sich beim \'ersuch am Kaninchen und 'am Frosch in demselben Sinne wirksam als die ur- sprüngliche, eiweißhaltige wässerige Lösung des nativen (liftes. Heide Tier- arten zeigen die für das Kobragift charakteristische Lähmnnir, imd das Kaninchen geht an Respirationsstillstand zugrunde. Bei i)eiden Tierarten muß aber die Einspritzung dieser eiweißfreien Ciftlösvmg direkt in das Blut erfolgen, und auch dann ist die Wirkung einer der nrsj)ning- hchen, eiweißhaltigen Kobragiftlösung äquivalenten Menge dieser in quanti- tativer Hinsicht nicht gleich. Entweder enthält demnach das Filtrat vom Schwefelkupfer nicht die Gesamtmenge der in dem Kupferaikahniederschlag enthaltenen Giftsubstanz, oder es ist ein Teil der letzteren (hnrh die ge- schilderte Behandlungsweise verändert und unwirksam geworden. Die quantitativ verschiedene, quahtativ jedoch gleiche Wirkunir des eiwTißfreien Filtrates vom Schwefelkupfer im Vergleich zur ursprüng- lichen Giftlösuug ist höchst wahrscheinlich auf eine teilweise Neränderunt: der wirksamen Substanz, verursacht durch die angegebene Behandhmg, zurückzuführen. Insbesondere fragte es sich, ob nicht vielleicht dasOphio- toxin durch die Alkaliwirkung bei gewöhnlicher Zimmertemperatur chemisch verändert wird und dadurch an Wirksamkeit verliert. Das uative, eiweißhaltige Kohragrift erleidet iu 2'^l(,iger Lösung durch einstilndige Einwirkung eines gleichen Volumens b°lQ\gov Kalilauge bei Zimmertemperatur keine Veränderung seiner Wirksamkeit. Ich habe die Versuche mit dem KupferkaUverfahren bei niederer Temperatur wiederholt, indem alle Lösungen und (iefäße vorher auf 0" abgekühlt und die Filtrationen ebenfalls bei der Temperatur des schmel- zenden Eises vorgenommen wurden. Die auf diese Weise erhaltenen eiweiß- freien Lösungen des Ophiotoxins erwiesen sich beim Tierversuch ebenfalls weniger wirksam, als dem Volumen nach äquivalente Mengen der ui-sprüng- hchen Kobragiftlösungen. Dampft man derartige eiweißfreie, stark wirk- same und neutral reagierende, wässerige Ophiotoxinlö.sungen im Vakuum- exsikkator über Schwefelsäure bei gewöhnhcher Temperatur ein, so pflegen diese Lösungen allmähUch immer weniger wirksam zu werden niid «ler schüeßlich in sehr geringer Ausbeute erhaltene, in Form eines amorphen, weißen Körpers in der Glasschale zurückbleibende Rückstand erwies sich mehrmals als vollkommen unwirksam. Einengen der wirksamen Lösuni: bei 0° im Vakuumexsikkator über Schwefelsäure ändert hierbei an dem Endresultat nichts. Beim Eindampfen wirksamer Lösungen des Ophiotoxins wird kein Stickstoff in Form basischer, flüchtiger Verbindung abgespalten. Das Ophio- toxin ist also sicher stickstofffrei, und das Unwirksamwerdeu beim Ein- Abderhalden, Handbuch der biocüemischon Arbeitsmethoden. U. 53 834 E. St. Faust. dampfen seiner Lösungen ist nicht durch Abspaltung- von flüchtigen Stick- stoffverbindungen bedingt. * * Zur Vermeidung der durch Anhaften des Ophiotoxins am Schwefel- kupfer ^) oder durch Eindampfen der wässerigen Lösungen entstehenden Verluste an wirksamer Substanz habe ich weiter folgendes Verfahren ein- geschlagen. B. Der alkali- und biuretfreie, gewaschene Kupferniederschlag wird mit Alkohol vom Filter abgespült und zur vollständigen Entfernung von Wasser längere Zeit unter wiederholt gewechseltem Alkohol von 96% auf- bewahrt. Durch vorsichtigen Zusatz alkoholischer Salzsäure zu dem tiberstehenden Alkohol und fleißigem Umschütteln des Alkohols wird der Kupferniederschlag zerlegt. Das hierbei gebildete Kupferchlorid löst sich im Alkohol, während das vorher an Kupfer gebundene Ophiotoxin, nun- mehr in freiem Zustande, in Form von leichten, gell)lichweißen Flocken im Alkohol ungelöst und suspendiert bleibt und sich dann allmählich ab- setzt. Die Ausscheidung des Ophiotoxins kann durch Zusatz von wasserfreiem, frisch destiUiertem Äther beschleunigt und begünstigt werden, doch ist darauf zu achten, daß hierdurch nicht gleichzeitig Kupfer- chlorid abgeschieden wird. Man läßt das ausgeschiedene Ophiotoxin ab- sitzen, entfernt durch Dekantieren den kupferchloridhaltigen Alkohol und wiederholt diesen Vorgang, bis der abdekautierte Alkohol sich chlorfrei er- weist oder durch die Ferrocyankaliumprobe die Abwesenheit von Kupfer erkennen läßt. Nach nochmaliger Behandlung mit Alkohol und Absitzen- lassen des leichtflockigen Ophiotoxins löst man dasselbe im Wasser. Die auf das ursprüngliche ^'olumen der angewandten nativen Kobragiftlösung gebrachte Lösung erweist sich bei intravenöser Injektion als wirksam, ist aber jener an Wirksamkeit quantitativ nicht gleich. Das freie, nicht mehr wie in dem nativen Kobragift an Eiweiß ge- bundene Ophiotoxin wird also durch Einwirkung von Alkali, sowohl bei Zimmertemperatur als auch bei 0" verändert; schon länger dauernde Ein- wirkung von Wasser genügt, um Veränderungen im Molekül, die durch Unwirksamwerden des Ophiotoxins kenntlich werden, hervorzurufen. Es gelingt also auch nach diesem Verfahren, eiweißfreie und wirksame Lösungen des Ophiotoxins zu gewinnen, nicht aber letztere ohne Beimengung unwirksam gewordener Sub- stanz zu erhalten. Die oben geschilderten Verhältnisse und die angegebenen Eigen- schaften des Ophiotoxins veranlaßten mich, die unsichere und jedenfalls nur mit großen Verlusten an wirksamer Substanz auszuführende Dar- ^) Das Anhaften kolloidaler Stoffe an den verschiedensten in ihren wässerigen Lösungen erzeugten Niederschlägen ist eine häufig beobachtete und oft sehr störende Erscheinung, wodurch die Ausbeuten an gesuchter, reiner Substanz stark herabge- setzt werden können. \ gl. L. Bosenf heiler^ LTber Sapotoxine. Habil.-Schrift. Straßburg 1900. Darstellung uiul Xadiuci.s licrix-li.T (,iti.'. HH.') stellimgsinethode zu vorlassen und ansclilirlM.n.l .-ni rM-ol.aclitun^'cii frUlicrer Autoren die Reindarstelluni^- des Ophiotoxins auf aiid.-r.-ni Wcfr,. ^u er- reichen. Die die Biuretreaktion gebenden l'.estandtcile des Kobra-riftes hcstfhoii aus P^iweiß und aus albuniose- oder ])ei)tonartigen Eiwcibdcrivatcn, welche durch Wärniewirkuni;- nicht koa-uliert werden. Kiii T.-il dr'r in dem Giftsekret enthaltenen Eiweillstofie kann also durch llrliif/.in auf ^M-ciLMu-t«' Temperatur und nachherige Filtration entfernt Avcrdcn. I»cr auf das Nerven- system wirkende Bestandteil des Kobrauiftes ei-leidet durch 1.') .Miimfon langes Erhitzen auf 90« in wässeriger, nicht zu verdünnter Lösunj.' keine Verminderung seiner AVirksamkeit. C. \0 fj eingetrocknetes Kobragift werden in looc^;^^ Was.ser mdö.st, mit Essigsäure sehr schwach angi'Säuert und dann auf lieni Wasserbade 15 Minuten auf 90— <)5o erhitzt, während man gleichzeilig Kochsalz bis zur Sättigung einträgt. Hierbei scheidet sich die Haui)tnienge des in dem nativen Kobragift enthaltenen Eiweißes in Foim von groben Flocken aus, und die Flüssigkeit läßt sich nach dem Absitzen des ausgeschiech-nen Ei- weißes leicht und schnell abfiltrieren. Das auf dem Filter gesammelte Eiweiß ist nach einmaligem Auswaschen mit AVas.ser vollkommen wir- kungslos. Durch die Sättigung der Flüssigkeit mit Korjisalz wird die Absclicidiuig des Ki- weißes eine vollständigere und die Filtration wesentlich erleichtert iiud bcKchleunigrt. Magnesium- und Ammouiumsulfat sind zu diesem Zwecke heim Koliragift niclit zu ge- brauchen, weil durch sie, zusammen mit P^iweiß, auch die Hauptmenge des Ophiotoxins gefällt wird. Das hellgelb gefärbte Filtrat vom geronnenen Eiweiß ist ebenso wirk- sam wie die ursprüngliche (üftlösung. Es enthält alier neben dem ( »phio- toxin und anderen Stoffen noch biuretartig reagierende Substanzen. Zur Entfernung des zugesetzten Kochsalzes un auf das Volumen des ni-sprünglichen Filtrates, besser imd be«|iiemer für die folgenden Manipulationen durch Eindami)fen unter den oben genannten Ö3» 836 E. St. Faust. Bediiiguniren auf etwa 50 cm^ zu briutien. Hierbei pflesien die Lösungen sich mehr oder weniger zu trüben ; zuweilen kommt es auch zur Aus- scheidung eines geringfügigen Niederschhigs, welcher die Biuretreaktion gibt, aber nicht giftig ist. Zur Entfernung der biuretartig reagierenden Substanzen wird die eingeengte und filtrierte Flüssigkeit vorsichtig mit einer lOVoigen Lösung von Metaphosphorsäure versetzt. Es entsteht auf Zusatz der genannten Säure ein grobflockiger Niederschlag, der sich rasch absetzt und dann gut abfiltrieren läßt. Ein Überschuß des Fällungsmittels ist sorgfältig zu vermeiden, weil der Niederschlag im Überschuß etwas lösüch ist und die Entfernung der überschüssigen Metaphosphorsäure beträchtliche Schwierigkeiten macht. Doch muß nach vohständiger Ausfällung der die Biuretreaktion gebenden Stoffe aus gleich zu erörternden Gründen in der überstehenden klaren Flüssigkeit so viel freie Metaphosphorsäure vorhanden sein, daß eben noch schwach saure Reaktion besteht. Die von dem Metaphosphorsäurenniederschlag abfiltrierte Flüssigkeit ist biuretfrei und äußerst wirksam sowohl beim Frosch als auch beim Kaninchen und beim Hunde, doch muß die Einverleibung des Giftes durch direkte Einspritzung der Giftlösung in das PJlut ge- schehen. Bei den weiteren Versuchen zur Isolierung des Uphiotoxins in fester Form zwecks Vorbereitung desselben zur Elementaranalyse zeigte sich dann, daß das Einengen seiner wässerigen Lösungen nur dann ohne Gefahr mehr oder weniger weitgehender Zersetzung und Abnahme seiner Wirksamkeit erfolgen kann, wenn die Lösungen sehr schwach sauer reagieren. Abgesehen von ihrer sauren Natur, scheint aber die Meta- phosphorsäure noch durch andere, vorläufig unbekannte Eigenschaften oder Fernstände das Ophiotoxin vor chemischen Veränderungen beim Ein- dampfen seiner wässerigen Lösungen zu schützen, denn sie kann hier nicht durch andere beliebige Säuren ersetzt werden. Schwefel-, Salz-, Salpeter- und ( )rthophosphorsäure vermögen ebensowenig wie Weinsäure und Oxalsäure das Ophiotoxin in wässerigen Lösungen beim Eindampfen an der Luft und im Vakuum vor Zersetzungen zu schützen. Aus den in schwach metaphosphorsaurer Lösung auf ein Volumen von etwa 10 — 15 cm'^ eingedampften eiweißfreien und stark wirksamen Lösungen des Ophiotoxins fällt Alkohol die wirksame Substanz in Form grober, weißer Flocken, die sich nur sehr langsam absetzen. Man sammelt deshalb die Substanz am vorteilhaftesten in der Weise, daß man die AlkoholfäUungen in hohen und relativ engen Reagenzgläsern vornimmt. Die an den Wandungen des Reagenzglases anhaftenden Flocken lassen sich durch schnell rotierende Bewegungen des Glases von diesen loslösen und sinken dann langsam zu Boden. Hat man größere als zur FäUung der die Biuretreaktion gebenden Substanzen und zur Erhaltung der sehr schwach sauren Reaktion nötige Mengen Metaphosphorsäure zugesetzt, so wird bei einer gewissen Alkohol- Darstellung imd Nachweis tierischer Gifte. 88' koiizentration auch Metaphosphorsäure gefällt. Das Ophiotoxin fällt jedoch zuerst und seine flockige FäUung ist leicht von der in Tropfeiifonn er- folgenden und eine milchige Trübung der Flüssigkeit verursachenden Fällung der Metaphosphorsäure zu unterscheiden. Die uoerstehende wässerig-alkohoUsche Flüssigkeit wird nini von dem Ophiotoxin vorsichtig abgehebert oder abpipettiert, der Niederschlag in möghchst wenig destilliertem Wasser gelöst und durch Zusatz von Alkohol wieder gefällt. Diese Manipulationen werden so oft wiederholt, bis in der überstehenden Flüssigkeit Phosphor nicht mehr nachzuweisen ist. Znr\'er- meiduug von Substanzverlusten tut man gut, Lösung und P'ällung stets in demselben Gefäß vorzunehmen: auch empfiehlt es sich, die schlieb- hche Fällung des Ophiotoxins in demselben Ileagenzglase zu belassen und in diesem zu trocknen, weil die feuchte Substanz beim Trocknen am Filtei' hartnäckig festklebt und nur unter großem Verlust an reiner Sul)stanz und unter unvermeidlicher Verunreinigung durch Papierfasern von ersterem entfernt werden kann. Das Trocknen geschah im \'akuum über Schwefelsäure bei einer Temperatur von oö — 40*' \); Gewichtskonstanz der Präparate wurde unter den genannten Bedingungen nach 8 — lOtägigem Trocknen erreicht. Die analysenfertige Substanz stellt ein leichtes, schwach gelblich ge- färbtes, amorphes Pulver dar. Sie hinterläßt beim Glühen auf dem Platin- blech zunächst eine voluminöse Kohle, welche ohne Hinterlassung eines Rückstandes verbrennt. Sie enthält keinen Stickstoff. Die Substanz löst sich nach scharfem Trocknen nur sehr langsam in Wasser. Die wässerige Lösung erweist sich beim Tierversuch bei intravenöser Einverleibung sehr wirksam. Zusatz von Natronlauge zu wässerigen Lösungen reinen Ophio- toxins macht das Ophiotoxin sehr bald unwirksam. Die Elementaranalyse des Ophiotoxins ergibt für dasselbe die em- pirische Formel C^y Hog Ojo. Die wässerigen Lösungen des Ophiotoxins reagieren auf Lackmus sehr schwach sauer. Natriumkarbonat wird durch Ophiotoxin nicht zerlegt; das letztere ist also eine schwächere Säure als Kohlensäure und vermag diese nicht aus ihren Salzen auszutreiben. Aus seinen wässerigen Lösungen wird das Ophiotoxin durch Sättigung der Flüssigkeit mit Ammoniumsultat abgeschieden; Kochsalz und Natriumsulfat fällen es dagegen nicht. Sdnver- metallsalze — Kupfer, Blei, Quecksilber — fällen dasselbe in alkalischer, nicht aber in saurer Lösung. Die oben aufgesteUte empirische Formel des Ophiotoxins. insbesondere sein hoher Sauerstoffgehalt, erinnern an die Zusammensetzung bekannter pflanzlicher Glykoside und es fragt sich, ob nicht ein Teil des Sauerstoffs einem im Molekül vorhandenen Kohlehydratkomplex eigen ist, in dem 1) Man bedient sich zum Trocknen kleinerer Mengen wärmeempfind- licher Substanzen über konzentrierter Schwefelsäure bei bebebigor. niedorer Tem- peratur zweckmäßig des von der Firma Franz Müller, Geisslers Nachf.. Bonn hergestellteu Trockeuapparates nach Hans Mei/er. 838 E. St. Faust. Ophiotoxin also ein tierisches Glykosid vorliegt. Ich habe wässerige Ophiotoxiulösmigen mit konzentrierter Salzsäure längere Zeit, bis zu einer Stunde, gekocht, konnte aber in keinem Falle nach Zusatz von Natron- lauge und Kupfersulfat zur erhitzten, stark sauren Flüssigkeit Keduktion des Kupferoxyds zu Oxydul beoliachten. Das Ophiotoxin enthält also keine Gruppe, die bei einstündigem Kochen mit Salzsäure reduzierenden Zucker gibt; allenfaUs könnte es sich um einen nur schwer reduzierenden Zucker liefernden Kohlehydratkomplex handeln. Die Schwerlöslichkeit des Ophio- toxins in Alkohol könnte durch eine derartige Kohlehydratgruppe, deren Nachweis unmittelbar nicht gelingt, bedingt sein. Pharmakologische Wirkungen und Nachweis fies Ophiotoxins. In Ermangelung charakteristischer chemischer Reaktionen des Ophio- toxins ist man für dessen Nachweis auf den Tierversuch angewiesen. Injiziert man einem Kaninchen 0"08o— 0"10 w?,r/ Ophiotoxin pro Kilogramm Körpergewicht in eine Ohrvene, so sind im Verlauf der ersten 12 — 20 Minuten nach der Injektion keinerlei äußerhch erkennbare Wir- kungen zu beobachten. Das Tier verharrt ruhig im Käfig oder in normaler hockender Stellung auf seiner Unterlage und reagiert prompt auf mechanische Reize durch Abwehrbewegungen oder Fluchtversuche. Nach Ablauf der genannten Zeit beobachtet man zunächst Veränderungen in der Respiration, welche weniger frequent und zeitweise auffallend vertieft wird. Gleichzeitig be- mächtigt sich des Tieres eine nicht zu verkennende Mattigkeit, die Fortbewegung scheint erschwert und erfolgt nur langsam unter scheinbar mühsamem Anziehen der gestreckten Hinterextremitäten, welche auch auf Kneipen der Hinterpfoten träger als normal reagieren. Diese Lähmungs- erscheinungen machen sich dann auch bald an den vorderen Extremi- täten und dem A^orderteil des Körpers bemerkbar, das Tier liegt mit ge- spreizten Beinen und zur Seite geneigtem oder auf die Unterlage ge- stütztem Kopf ganz ruhig, während die Frequenz und die Tiefe der Atmung allmählich abnehmen, bis schheßlich, etwa 45 — 60 Minuten nach der In- jektion, die Respiration zum Stillstand kommt und der Tod in soporösem Zustande erfolgt. Nach Eintritt des Respirationsstillstandes schlägt das Herz noch einige Zeit fort. Beim Hunde kommt die periphere Lähmung nicht in dem Maße wie beim Kaninchen zustande. Die kleinsten tödlichen Mengen von Ophiotoxin sind beim Hunde etwas größer als beim Kaninchen. Nach meinen Versuchen töten 0*10— 0*15 utg Ophiotoxin pro Kilogramm Hund bei Einspritzung in das Blut in etwa 45 — 50 Minuten. Beim Frosche genügen O'Obnig Ophiotoxin in die Vena abdominaUs injiziert, um das Tier nach 10 Minuten vollkommen zu lähmen. Der Tod erfolgt in der Regel aber erst nach 12 — 16 Stunden. Das Herz schlägt noch kräftig, wenn die vollständige Lähmung des Tieres bereits eingetreten ist. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. yijjg Das reine Ophiotoxin wirkt also nach seiner Resorption auf das Nervensystem; in erster Linie auf diejenigen Apparate des Zentralnerven- systems, welche die Respiration beeinflussen und rej,'ulieren. Diese erfahren eine Heral)setzung ihrer Funktionsfiihigkeit, die bis zur vollständigen Liih- mung vorschreitet, und der Tod erfolgt beim Warmhlüter durch Re- spirationsstillstaud, während beim Frosche die allgemeine Läh- mung des Zentrarne rvensystems mit einer curarinartigen Läh- mung der motorischen Endapparate einhergeht und der Tod durch erstere bedingt ist. Die Vergiftungserscheinungen gleichen also sowohl beim Warmblüter als auch beim Kaltblüter denjenigen einer fortschreitenden allgemeinen Parese und schlieblicher allgemeiner Paralyse. Nach subkutaner Injektion geringerer Mengen Ophiotoxin. 2 nifj beim Kaninclien, 4wr/ beim Hund, erfolgte der Tod nach ati— 72 Stunden, nachdem an der Injektionsstelle Rötung, Schmerzhaftigkeit. öde- matöse Schwellung, in einzelnen Fällen mit hämorrhagischer Infil- tration der Gewebe und aseptischer Abszeßbildung einhergehend, sich entwickelt haben. Das reine Ophiotoxin vermag bei genügend langer Wirkungsdauer die roten Blut- körperchen gewisser Tierarten, wenigstens im Reageuzglase , zu lösen. Diese Wirkun^j kann nicht auf einer Beimengung und Verunreinigung durch „Hämotoxin" lieruhen. weil letzteres nach den Angahen der Autoren durch Erwärmen auf 90" zerstört oder ver- ändert wird und seine AYirksamkeit einbüßt. Das Ophiotoxin ist derjenige Bestandteil des Kobragiftes, welchei- auf das Nervensystem wirkt und beim Warmblüter durch Lähmung des Re- spirationszentrums den Tod herbeiführt. Beim Kaltblüter (Frosch) ist neben der zentralen Lähmimg auch noch eine curarinartige Lähmung der motorischen Endapparate nachzuweisen. Die lokalen Wirkungen des Ophiotoxins, zu denen auch die blutkörperchenlösende Eigenschaft ge- hört, sind nur Begleiterscheinungen, sogenannte „Neben^Yirkungen•■, und kommen als Todesursache nicht in Betracht. Mit den unter dem Sammelnamen der „Sapotoxine" l)ekamiten. im Pflanzenreich weit verbreiteten Stoffen hat das Ophiotoxin folgemle Eigen- schaften und Wirkungen gemein: 1. Die Löslichkeit in Wasser zu schäumenden Lösungen und die Tn- löslichkeit in Äther. 2. Die schwere Resorbierbarkeit von Schleinihautflächen (.Magen, Darm ). 3. Die lokalen Wirkungen nach der Injektion in das Unterhautzell- gewebe, welche hier wie dort in Schwellung, Rötung, Blutaustritt. Schmerz- haftigkeit der Injektionsstelle und deren Umgebung und der manchmal eintretenden Entwicklung aseptischer Abszesse bestehen. 4. Die blutkörperchenlösende Eigenschaft, Hämolyse. 5. Die Wirkungen auf das Zentrahiervensystem, insbesonilere auf this Respirationszentrum. 6. Die zentralen Wirkungen der Sapotoxine kommen, wie das auch beim Ophiotoxin der FaU ist, entweder nur nach der Injektion in das 840 E. St. Faust. Blut oder nach der sul)kutanen Einspritzung relativ großer Mengen zu- stande. 7. Sapotoxine sind wie das Ophiotoxin stickstofffrei. 8. Sapotoxine und Ophiotoxin dialysieren nicht. 9. Beide sind amorphe, kolloidale Substanzen, sie kristallisieren sehr schwer oder überhaupt nicht. Dagegen unterscheidet sich das Ophiotoxin von den meisten Sapotoxinen durch: 1. Seine Unlöslichkeit in Alkohol. 2. Das Ophiotoxin ist kein Glykosid, jedenfalls enthält es keine un- mittelbar nachweisbare reduzierende Kohlehydratgruppe. 3. Die am Kaltblüter beobachtete curarinartige Wirkung des Ophio- toxins fehlt den Sapotoxinen. * * * Die empirische Zusammensetzung des Ophiotoxins ist, abgesehen von einem Atom Wasserstoff weniger, die gleiche wie diejenige der QuiUaja- säure, welche aber ein Glykosid ist. Doch deutet der hohe Sauerstoffgehalt des Ophiotoxins darauf hin, daß in ihm wohl auch eine Kohlehydratgruppe enthalten ist, die aber keinen reduzierenden Zucker liefert. Weiter erinnert die oben für das Ophiotoxin berechnete und aufgesteUte Formel an ein von mir rein dargestelltes, nicht glykosidisches und stark wirksames tieri- sches Stoff Wechselprodukt , das in dem Hautdrüsensekret der Kröte ent- haltene Buf otalin. i ) Ophiotoxin und Bufotalin enthalten nach meinen Ana- lysen die gleiche Anzahl von Kohlenstoffatomen, aber das erstere gerade doppelt so viel Sauerstoffatome als das letztere. Es erscheint nicht aus- geschlossen, daß das Kolilenstoffskelett der beiden Verbindungen das gleiche ist. Möglicherweise sind in dem Ophiotoxin mehr Hydroxylgruppen ent- halten als in dem Bufotalin. Eine derartige Annahme würde in ungezwun- gener Weise den Mehrgehalt des Ophiotoxins an Sauerstoff und seine größere Labilität in chemischer Beziehung gegenüber dem Bufotalin, damit aber wahrscheinlich auch seine viel größere Wirksamkeit erklären. Die Laliilität und die hochgradige chemische Reaktionsfähigkeit mehrfach hydro- xylierter Verbindungen ist sowohl bei den aliphatischen als auch bei den aromatischen Verbindungen bekannt. Vielleicht handelt es sich um eine Analogie der Stoffwechselvorgänge beider diese Stoffe produzierenden Tier- klassen — der Amphibien und der Reptilien. Die Ähnlichkeiten der Stoffe der Digitalingruppe mit den Sapotoxinen, sowohl in chemischer als auch in pharmakologischer Beziehung, bilden einen weiteren Stützpunkt für diese Annahme. Es erscheint daher berechtigt, das Ophiotoxin als ein tierisches Sapotoxin anzusprechen und dasselbe in die pharmakologische Gruppe der Sapotoxine einzureihen. 1) Vgl. unten S. 847. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^4^ Nachdem ich bei meinen Untersuchungen iil)er (his Krötenfrift nach- gewiesen habe, daß das Bufotalin wahrscheinlich ein ()x.vdati()ns|)r(t(hikt des Bufonins, eines im Organismus der Kröte vorkommenden Honioloirons des menschlichen Cholesterins ist, wiire es von besonderem vci-iiieiciii-iid physiologisch-cliemischem Interesse, zu untersuchen, ol) im Schlaiiirmorga- nismus sich nicht auch ein dem Bufonin der Kröte ähnliclics. den Ophidicrn aber eigentümliches, cholesterinartiges Stoff wechselprodiikt findet, welciies vielleicht durch Oxydation das äußerst wirksame Ophiotoxin liefern könnte. Wirkungen der Schlangengifte auf das lUiit. Die Wirkungen der Schlangengifte M auf das Blut sind höchst kom- plizierte und betreffen sowohl die geformten Elemente als auch das Plasma. a) Einfluß auf die Gerinnbarkeit des Blutes. Hinsichtlich dieser Wirkung der Schlangengifte zerfallen dieselben in folgende Kateiiorien : 1. KoaguUerende oder koagulationsfördernde Schlangengifte. 2. Koagulationshemmende oder -hindernde Schlangengifte. 1. Koagulationsfördernde Schlangengifte. Noc'^) hat im Laboratorium von Calmette neuerdings Versuche über diese Wirkungen verschiedener Schlangengifte angestellt und konnte die Angaben früherer Autoren über die koagulierende Wirkung der Yiperngifte vollkommen bestätigen. Diese wird durch Erwärmen der Giftlösungen abgeschwächt oder ganz aufge- hoben. Auch mit Oxal- oder Zitronensäure versetztes I^lasma wirtl durch die genannten Giftsekrete zur Gerinnung gebracht. Noc hat die (|uantita- tiven und zeitlichen Verhältnisse bei dieser Wirkung einiger Mperngifte genauer untersucht. 2. Koagulationshemmende Schlangengifte. In diese Gruppe gehören die Giftsekrete aller Colubriden und als Ausnahmen die Gifte einiger nord- amerikanischer Crotaliden, Ancistrodon piHcioorns und A.con fort rix. Die- selben heben die Gerinnungsfälligkeit des Blutes auf^). sowohl in vitro als auch im Organismus, im letzteren Falle jedoch nur dann, wenn eini' ge- nügend große Menge des Giftes einverleibt wurde. Ein eigenartiges \qy- halten in dieser Hinsicht zeigt nach C.J. Martin^) das Gift der australi- schen Colubridenspezies , Pseudechis j^orphyriacus , welches bei der intra- venösen Injektion von großen Mengen im Tierexperiment oder nach dem Biß kleiner Tiere durch eine Schlange, momentan intravaskuläre (ierinnung des Blutes bewirkt, dagegen bei der Injektion von kleinen Mengen in das Blut die Gerinnung voUkommen aufhebt. Die Injektion weiterer Mengen "■) Unter „Schlangengift" ist hier das Sekret der Giftdrüsen und nicht ein einzelner wirksamer Bestandteil zu verstehen. 2) Sur quelques Propri^tes physiologiques des differents Venins des Scrpcuts. Annal. de llnstitut Pasteur. T. 18. p. 387— 406 (1904). 3) Vgl. hierzu P. Morawitz, Über die gerinnungshemmende \\ irkuni,^ des Kohra- giftes. Deutsches Arch. f. kliu. Med. Bd. 80. S. 340-355 (1904). Literatur. *) On the physiological action of the Vcnom of ti.e Australian Bhick Snake. Read before the Royal Society of New South Wales. Jnly 3. 1895. 842 E. St. Faust. des Giftes bewirkt dann Iveine Gerinnung des Blutes. (Positive und nega- tive Phase der Blutgerinnung.) h) Wirkung der Schlangengifte auf die roten Blutkörper- chen. Hämolyse. Die Schlangengifte haben mit einer ganzen Anzahl zum Teil chemisch genau charakterisierter Stoffe (Sapotoxin, Gallensäuren, Solanin, Ölsäure, Helvellasäure) die Eigenschaft gemein, auf die roten Blutkörper- chen in der Weise einzuwirken, daß das Hämoglobin aus diesen austritt. Über das Wesen dieses Vorganges und der hierher gehörigen Wir- kungen verschiedener Schlangengifte liegen eingehende Untersuchungen ^) aus letzter Zeit vor. Die hämolvtische Wirkung eines bestimmten Schlau- gengiftsekretes ist bei verschiedenen Blutarten eine quantitativ wechselnde. c) Dasselbe gilt von der mit dem Namen „Agglutination*^ bezeich- neten Wirkung mancher Schlangengifte. Diese Wirkung, welche auch ge- wissen Bakterientoxinen eigen ist, äuüert sich in dem Zusammenkleben (Agglutinieren) der roten Blutkörperchen. d) Anders verhält es sich vielleicht mit dem von S. Flexner und H. Noguchi'^i nachgewiesenen und mit dem Namen ..Hämorrhagin" be- zeichneten, al)er nicht isolierten Bestandteile mancher Schlangengifte, welcher seine Wirkungen auf das Gefäßendothel entfalten soll. Die Folgen der Wirkungen eines derartigen Körpers könnten begreiflicherweise zu schweren Störungen im Organismus führen, sei es durch A^eränderungen in der Gefäßwand selbst oder durch Blutaustritt infolge der letzteren. Flexner und Xo(/uchi fassen das .,Hämorrhagin" als ein spezifisch oder elektiv auf Endothelzellen wirkendes „Cytolysin" auf. e) Schließlich findet sich in verschiedenen darauf untersuchten Schlangengiften angebhch noch ein ..Thrombokinase" genanntes Ferment, welches in eigenartigerweise auf das Fibrinferment „aktivierend" wirken soll. M P. Kl/es und K>/es und Sachs, Vgl. Anmerkung- 1 und 2 auf 831. — Kan- thacl-, Scientific Memoirs by Medical Officers of the Armv of India. Pra-t 9 (1895) and Part 11 (1898). — Olinto Pascucci, Die Zusammensetzung des Blutsclieibenstromas und die Hämolyse. Hofmeisters Beiträge. Bd. 6. S. 543— 566 (1905). — Stephens a.nä Mj/ers, Brit. med. .Tonrn. p. 621 (1898). — M>/ers. Journ. of Path. and Bact. Vol. 6. p. 415 (1899/1900). — Stephens, ibid., Vol. 6. p. 273 (1899/1900). — Calmette, Compt. rend. de l'Acad. des Sciences. T. 134. p. 1446 (1902). — G.Lamb, On the action of the Venoms of the Cobra and of the Daboia on the red blood corpuscles and on the blood plasma. Scientific Memoirs by officers of the Medical and Sauitary Departments of the Go- vernment of India. Xr. 4. Calcutta (1903). — S. Fle.rner und S. Flexner und H. Koguchi, Vgl. unten Anm. 2. — G. Lamb, Indian Med. Gaz. Vol. 36. p. 443 (1901). — C.PhisaUx, Compt. read, de la soc.de biol. T. 51. p. 834. 865 (1899). — C.J. Martin and Mc G. Smith, Journ. and Proc. Royal Soc. of Xew South Wales. Vol. 26. p. 240 (1892). — Nofficchi, Journ. oi Ex]). 'Sied. Vol. 7. p. 191— 222 (1905). — H. Noguchi, On extracellular aud intracellular Venom activators of the blood, with especial reference to lecithin and fatty acids and their Compounds. Journ. of cxperim. Med. Vol. 9. p. 436 (1907). ^) Snake Venom in Relation to Haemolysis, Bacteriolysis and Toxicity. Univ. of Pennsylvania Med. Bulletin. Vol. 14. p. 438 (1902); Journ. of Exp. Medicine. Vol. 6. p. 277 (1902). Ferner: The Constitution of Snake Venom and Snake Sera. Univ. of Pennsylvania Med. Bulletin. Vol. 15. p. 345—362 (1902) and Vol. 16. p. 163 (1903). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. g43 Über das Schicksal der Schlangeii£::ifte im Orj^animus ist wenig bekannt. Sie sollen zum Teil unverändert in den Harn übergehen und beim Menschen auch in den Sekreten mancher Drüsen in unver- änderter und wirksamer P'orm ausgeschieden werden. Der Hauptausschei- dungsweg des Giftes scheint aber nach den Untersuchungen von AU ^) der Magendarmkanal zu sein. Die Versuche über die Wirkungen der Schlangengifte an Tieren er- fordern selbstverständlich einen Vorrat dieses schwierig zu erlangenden Materials, dessen Gewinnung und Kostbarkeit, soweit dasselbe ül)erhaupt käuflich zu erwerben ist, besonders der chemischen Untersuchung dieser Gifte, für welche das Material in großen Mengen erforderlich ist, fast un- überwindhche Schwierigkeiten bereiten. Die genauere, pharmakologische Erforschung der Wirkungsweise dieser Gifte ist aber abhängig von der vorhergehenden chemischen Untersuchung, deren Endz;iel das Zerlegen der unter dem Namen ..Schlangengift" bekannten Gemenge in die einzelnen wirksamen Bestandteile und die chemische Charakterisierung der letzteren sein muß. Mit Rücksicht auf die praktische Bedeutung dieser Kenntnisse und in Anbetracht des hohen wissenschaftlichen Interesses, welches die Lösung dieser Fragen beansprucht, mögen hier die Methoden für die Gewinnung und das Sammeln der Schlangengifte kurz besprochen werden. 1. Man faßt die Schlange mit der rechten Hand dicht hinter dem Kopfe am Halse und läßt dieselbe dann in ein in der linken Hand ge- haltenes Uhrglas beißen. Hierbei fließt, ganz so, wie wenn das Tier frei- wiUig seine Beute ergreifen will, aus den Giftzälmen das Giftsekret auf das Uhrglas. Das ausgeflossene Gift soll nun, zwecks Konservierung des- selben, getrocknet werden. Das Trocknen muß bei niederer Temperatur geschehen, am besten über konzentrierter Schwefelsäure oder Chlorcalcium im Vakuumexsikkator. 2. Eine zweite jVIethode zur Gewinnung des Giftsekretes besteht darin, daß man die in dem Käfig befindliche Schlange reizt und sie dann in einen mit einer dünnen Gummimembran überzogenen Glastrichter von angemessener Größe beißen läßt. Diese Methode bietet gegenüber der ersten den Vorteil, daß das Giftsekret reiner erhalten wird, weil es nicht mit den Sekreten der anderen, im Maul vorhandenen Drüsen ver- unreinigt Avird; jedoch besteht bei diesem Verfahren die Gefahr des Abbrechens der Giftzähne, wenn die Schlange heftig beißt. Das an den inneren Wandungen des Trichters anhaftende oder, falls es sich um größere Mengen Giftes handelt, durch das Trichterrohr ablaufende Sekret wird dann wie unter 1. getrocknet. ') AU, üntersuchungeu über die Ausscheidung des Schlangengiftes durch den Magen. Münchner med. Wochenschr. Nr. 4 (1892). 844 E. St. Faust. o. Läßt man die im Käfig befindliche Schlange anstatt wie unter 2. in einen Glastrichter, in einen Wattebausch oder ein Schwämmchen beißen, so vermeidet man dadurch die Gefahr des Abbrechens der Gift- zälme; doch muß das Gift aus den genannten Objekten nachher mit Wasser extrahiert werden. Es ist daher das Eintrocknen einer größeren Flüssig- keitsmeuge unvermeidlich und wird dadurch die Möglichkeit einer Zer- setzung des wirksamen Bestandteiles oder der wirksamen Bestandteile des gewonnenen Sekretes erhöht. Bekanntlich erschöpft die Schlange durch wiederholtes Beißen sehr bald ihren Giftvorrat. Es empfiehlt sich daher, zur Gewinnung eines mög- üchst stark wirksamen Sekretes, die Tiere nicht öfter als einmal pro Woche beißen zu lassen. 4. Verfügt man über eine beüebig große Anzahl von Giftschlangen, so kann man das Gift schließlich in der Weise sammeln, daß man die Tiere tötet, die Giftdrüsen herauspräpariert, diese mit einer Nadel an- sticht und den Inhalt auspreßt und trocknet. Eidechsen, Sauria. Heloderma suspectum und H. horridum, die Krusteneidechse. Der weit verbreiteten Anschauung gegenüber, daß die Schlangen die höchststehenden, spezifisch und aktiv giftigen Tiere sind, dürfte die Tat- sache von besonderem Interesse sein, daß es auch unter den Eidechsen, die entwicklungsgeschichtlich den Schlangen nahe stehen, wenigstens eine Gattung gibt, die sicher zu den Gifttieren zu rechnen ist. Diese eigen- artige Gattung ist mit dem Namen Heloderma belegt worden. Das Ex- periment hat die Giftigkeit des Tieres mit Sicherheit nachgewiesen. Die Zähne, sowohl des Unter- als auch des Oberkiefers des Helo- derma, sind gefurcht und unterscheiden sich dadurch von den Zähnen sämtlicher bisher beschriebenen Eidechsen, mit Ausnahme einer seltenen, von Steindachner beschriebenen, auf Borneo einheimischen Eidechse, Lan- thanotus borneensis, deren Kieferzähne ebenfalls seicht gefurcht sind. Während bei den übrigen Eidechsen die Speicheldrüsen nur schwach entwickelt sind, erreichen die Unterkieferdrüsen des Heloderma eine relativ enorme Größe und Ausbildung. Sie liegen unter dem Unterkiefer und münden an der Basis der gefurchten Zähne. Um das Giftsekret zu sammeln, ließen S. Weir Mitchell und Reichert ^) ein in Gefangenschaft befindUches Heloderma in den Rand einer Unter- tasse beißen. Das Tier hielt den Gegenstand lange Zeit sehr fest im Maule. Dabei träufelte ein klares Sekret, welches aufgefangen wurde, in kleinen Mensren aus dem Maule. Die Flüssigkeit verbreitete einen schwachen, nicht •^»^ 1) Medical News. A'ol. 42. p. 209 (1883); Science. Vol. 1. p. 372 (1883); Amoricaii Naturalist. Vol. 17. p. 800 (1883). Vgl. auch ^'. Weir Mitchell, Century Magazine. Vol. 38. p. 503 (1889). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 845 unangenehmen, aromatischen Geruch; die Reaktion derselben war deutlich alkalisch. Mitchell und Reichert stellten ihre Versuche teils mit unverändertem, frischem (nativem), teils mit eino-etrocknetem und in Wasser wieder auf- gelöstem Sekret an Fröschen, Tauben und Kaninchen an. Einer Taube wurden 0*24 cm^ Gift in die Brustmuskeln injiziert. Nach wenigen Minuten' fing das Tier an zu wanken, die Respiration wurde zuerst beschleunigt, dann langsamer und nach sechs Minuten traten Krämpfe ein. In der siebenten Minute nach der Injektion starb das Tier. An der Injektionsstelle war eine lokale Wirkung des Giftes nicht zu er- kennen. Zwei Kaninchen, von welchen das eine vagotomiert war, erhielten je 10 mg des getrockneten Helodermagiftes in die N'ena jugularis. Das vago- tomierte Tier starb nach IV2 Minuten, das nicht vagotomierte nach 19 Mi- nuten; beide Tiere verendeten unter Konvulsionen. Die Resultate von Mitchell und Reichert haben in bezug auf die Giftigkeit des Heloderma 6%mic/?ras^\), Boulenger-), Ä. Dugh^) , Garman*) und Bocourt'") durch eigene Versuche an Tieren bestätigt. Beim Menschen hat man nur starke Schmerzhaftigkeit und heftiges Anschwellen des betroffenen Gliedes oder Körperteiles nach Helodermabiß beobachtet. Die Wirkungen des Giftsekretes von Heloderma suspectum Cope haben dann noch C. G. Santesson^), J. van Denhiiryh und 0. B. Wighf) untersucht. Nach Santesson wirkt die aus einem, von einem Heloderma ange- bissenen Schwämmchen mit physiologischer Kochsalzlösung ausgelaugte Flüssigkeit, Fröschen, Mäusen oder Kaninchen sulikutan beigebracht, immer tödlich. Die Wirkung besteht in einer sich schnell entwickelnden, walir- scheinUch zentralen Lähmung, die anfänglich den Charakter einer Narkose zeigt. Die Ursache der Lähmung- ist nicht eine Folge der darniederliegenden Zirkulation; beim Frosch beobachtete Santesson totale Lähmung, während das Herz noch schlug. Die Wirkung des Giftes erstreckt sich jedoch nicht nur auf das Zentralnervensystem; früher oder später gesellt sich zu der zentralen Lähmung noch eine langsam sich entwickelnde Lähmung der motorischen Nervenendigungen, also eine curarinartige Wirkung. *) Sumichrast, Note on the hahits of some Mexican reptiles. Annais and Maga- zine of Natural History. Vol. 13. Ser. 3. p. 497 (1864). 3) Proc. Zoolng. Soc. p. 631. London 1SS2. -) Cinquantinaire de la Soc. de Biologie. Volume juhilaire puhlic par la Soci(5te. p. 134. Paris 1899. *) Bulletin of the Essex Institute, Salem, Mass. Vol. 22. p. 60—69 (1890). ^) Compt. rend. de Tacad. des Sciences. T. 80. p. 676 (187.')). *) C. G. Santesson, Über das Gift von Heloderma suspectum Cope, einer giftigen Eidechse. Nordiskt Medicinskt Archiv. Festband tillegnadt Axel Key. Nr. 5 (1896). ') American Journal of Physiology. Vol. 4. p. 2U9 (1900). — Zentralld. f. Physiol. Bd. 14. S. 399 11900). 846 E. St. Faust. Bei der subkutanen Injektion des Giftes sah Santesson an Fröschen lokale Wirkuniien des Giftes, bestehend in Schwellung-, Ödem und Blutungen. Die Beobachtungen und Versuche, bei welchen Menschen und größere Tiere von Helodermen gebissen wurden, sprechen entschieden dafür, daß das Heloderniagift, ähnlich wie das Gift mancher Schlangen, Lokalerscheinungen bewirkt. Nach J. van Denhurgh und 0. B. Wlyht löst das Gift von Heloderma suspectum im Reagenzgias die roten Blutkörperchen i) auf, macht das Blut ungerinnbar nach vorausgegangener Thrombenbildung und wirkt zuerst er- regend , dann lähmend auf das Zentralnervensystem. Atembewegungen und Herzschlag werden erst beschleunigt, dann zum Stillstande gebracht, das Herz auch durch lokale Giftwirkung gelähmt. Speichelfluß, Erbrechen, Al> gang von Kot und Harn charakterisieren die ersten Stadien der Vergiftung: der Tod tritt nach diesen Autoren entweder infolge von Atemstillstand oder durch Thrombenl)iklung oder Herzlähmung ein. Über die chemische Natur und Zusammensetzung des wirk- samen Bestandteils des Helodermagiftes wissen wir nur, daß der Giftkörper Kochen in schw^ach essigsaurer Lösung ohne Almahme der Wirksamkeit verträgt und deshalb nicht zu den Fermenten gezählt werden kann. Santesson glaubt sich auf Grund einer orientierenden chemischen Untersuchung zu der Annahme berechtigt, daß toxisch wirkende Alkaloide in dem Giftsekrete wahrscheinlich nicht vorhanden sind, und daß die hauptsächhchen giftigen Bestandteile des Helodermaspeichels ihrer chemischen Natur nach teils zu den nukl ein- haltigen Substanzen, teils zu den Albumosen gehören. Die Wirkungen des Giftsekretes scheinen sich qualitativ den Wir- kungen der Schlangengiftsekrete zu nähern. '»^ Amphibien, Lurche, Amphibia. Die Hautdrüsensekrete einer Anzahl von nackten Amphibien enthalten giftige Substanzen. 1. Ordnung: Anura, schwanzlose Amphibien. Gattung Bufo. Bufo vulg'aris Liii., die gemeine Kröte, wird bereits von Nikander als giftig bezeichnet. Die Angaben der älteren Autoren über die Giftigkeit der Kröten sind sehr widersprechender Natur, was darauf zurückzuführen ist, daß diese keine Tierversuche ausführten , oder , falls letzteres geschah , sie nicht mit dem Hautdrüsensekret, sondern vielmehr mit dem Harn oder dem Darminhalt dieser Tiere ihre Versuche anstellten. ^) Vgl. hierzu A\ Cooke aud Leo Loeb, Haemol\ tic actiou of the Venoui of Helo- denna suspectum. Proc. of the Soc. f. exp. Biology and Mediciue. Vol. 5. p. 104 (1908). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^47 Die Giftigkeit des Hautdrüsensekretes der Kröte wurde an ver- schiedenen Tieren sicher und einwandfrei durch Gratiolet \im\ Cloez (ISol) und dann durch die Untersuchuntien von Vulpian^) (1854) festgesteUt. Calniels-) beschäftigte sich im Jahre 1884 mit der chemischen Natur des Krütenhautdrüsensekretes und gab an, darin Methylkarbylamin 2) *iind Isocy an essigsaure gefunden zu hal)en. Ersteres soll dem Sekrete, wenigstens zum Teil, seinen charakteristischen Geruch verleihen und die Giftwirkung bedingen. Auch beim Wassersalamander oder Kammmolch will Calmels eine Isocyanverbindung im Hautsekret gefunden haben, und zwar in diesem Falle die a-Isocyanpropion säure. Phisalix und Bertrand haben 1893 das Blut von Bufo vulgaris auf giftige Bestandteile untersucht und fanden, dab der von den Hautdrüsen dieser Tiere sezernierte giftige Körper sich auch in ihrem Blute nachweisen läßt, jedoch in weit geringerer Menge darin vorhanden ist. Die Gegenwart des wirksamen Körpers im Blute wurde durch Tierversuche nachgewiesen. Die Ursachen der Widerstandsfähigkeit der Kröte gegen die Stoffe der Digitalingruppe und andere Gifte hat 0. Heuser''^} studiert. In dem Sekret der Bauch- und Rückenhaut der Feuerkröte, Bom- binator igneus, und der gemeinen Kröte. Bufo vulgaris s. cinereus wies Fr. Pröscher^) ein von ihm Phrynolysin genanntes, hämolytisch wirkendes Gift nach, welches aber nicht isohert und chemisch untersucht w^urde. Das Phrynolysin spielt bei dem Zustandekommen der charakte- ristischen Herzwirkung des Krötengiftes keine Rolle. * * * Bei der chemischen Untersuchung des Krötenhautdrüsensekretes ge- lang es Faust, den von ihm Bufotaliii genannten, digitaUnartig wir- kenden Bestandteil und einen diesem chemisch nahestehenden, ähnlich, aber viel schwächer wirkenden Körper, das Bufonin, zu isolieren und rein darzustellen. Fast gleichzeitig veröffentUchten Phisaliv und Bertrand ^) ihre Untersuchungen über denselben Gegenstand. Diese Autoren beschreiben die Wirkungen eines nicht isolierten und chemisch nicht charakterisierten Körpers, den sie „Bufotenine"' nennen. Von dem Vorhandensein dieses Stoffes im Hautsekrete der Kröten hat sich Verfasser bisher w^der auf chemischem noch auf pharmakologischem W^ege überzeugen können.") *) Ausführliches Literaturverzeichnis bis 1902 bei E. St. Faust, Über Bufonin und Bufotalin, die wirksamen Bestandteile des Krötenhautdrüsensekretes. Archiv f. exper. Path. u. rharmak. Bd. 47. S. 278 (1902). ^) Sur le venin des Batraciens. Cumpt. rond. de Tacad. des Sciences. T. 98. p. 436 (1884). ^) (>. Heuser, tlber die Giftfestigkeit der Kröten. Arch. intcr. de Pharmacodyna- niie etc. T. 10. p. 483 (1902). ^) Fr. Fröscher, Zur Kenntnis des Krötengiftes. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. 575 (1902). •^) Compt. rend. T. 135 (1). p. 46—48 (19021. «) Archiv f. exp. Path, u. Pharmakol. Bd. 49. S. 1 (1902). 848 E. St. Faust. Das Bufonin kristallisiert aus den alkoholischen Auszügen der Kröteuhäute beim Einengen der ersteren in feinen Xadeln oder derberen Prismen, die nach wiederholtem Umkristallisieren den Schmelzpunkt 152° zeigen und bei der Elementaranalyse und Molekulargewichtsbestimmung nach BaouU- Beck mann für die Formel C34 H54 O3 gut stimmende Werte gaben. * Das Bufonin ist leicht löslich in Chloroform, Benzol und jieißem Alkohol, schwerer löslich in Äther, sehr wenig löslich in kaltem Alkohol und Wasser. Es ist eine neutrale Verbindung, unlösUch in Säuren und in Alkalien. Nachweis des Bufonins auf chemischem Wege. Löst man ein wenig des Bufonins in Chloroform und schichtet darunter konzentrierte Schwefelsäure, so entsteht zunächst an der Berührungsfläche der beiden Flüssigkeiten eine dunkelrot gefärbte Zone, die an Ausdehnung allmählich zunimmt. Mischt man die beiden Flüssigkeiten, so i'Arht sich das C'hloroform zuerst hell-, dann dunkelrot, schließlich purpurfarbig. Die Schwefelsäure zeigt eine grünliche Fluoreszenz. In Essigsäureanhydrid gelöst und mit konzentrierter Schwefelsäure ge- mischt, zeigt das Bufonin ein ähnliches Farbenspiel wie das Cholesterin, mit dem Unterschiede, daß das Auftreten der rosa und roten Färbung des Gemisches von Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure sehr vorübergehend ist, manchmal sogar ausl)leil)t. Die schließliche Farbe des Gemisches ist hier dunkelgrün. Das Bufotaliii geht bei der Behandlung der Ptückstände alkoholischer Auszüge von Krötenhäuten mit Wasser in letzteres über und kann nach vorhergehender Beinigung solcher Lösungen mit Bleiessig, Entfernung des überschüssigen Bleies mittelst Schwefelsäure usw. aus diesen durch Kalium- quecksilber Jodid gefällt werden. Aus diesen Fällungen wird es dann in der üblichen Weise mit Silberoxyd freigemacht und hierauf mit Chloroform ausgeschüttelt. Aus seiner Lösung in Chloroform wird das Bufotalin durch Petroläther gefällt. Durch fraktionierte Fällungen mit Petroläther erhält man amorphe , aber in ihrer Zusammensetzung konstante Analysen- präparate, welche auf die Formel C34 H4,i Ojo sehr genau stimmende Werte geben. Das Bufotalin ist leicht löslich in Chloroform, Alkohol, Eisessig und Azeton, unlöslich in Petroläther, ziemlich schwer löslich in Benzol und in Wasser. Eine gesättigte wässerige Lösung desselben enthält im Kubik- zentimeter 0"0026 g. Die LösUchkeit des Bufotalins in Wasser ist also etwa 2V2 pi'o Mille. Seine wässerige Lösung reagiert sauer. In wässerigen Alkalien, Natronlauge, Kahlauge, Natriumkarbonat und Ammoniak ist das Bufotalin leicht löshch. Seiner sauren Natur gemäß verbindet es sich mit den oben genannten Basen zu Salzen. Die wässerigen Darstcllmiijr und Nachweis tierischer (üfte. ^49 Lösungen der Alkalisalze reagieren alkalisch, zeigen eine schwache Opa- leszenz und schmecken stark bitter. Das ]>ufotahn scheint keine Hydroxylgruppen im Molekül zu ent- halten, wie das bei dem Bufonin der Fall ist. \ersuche, durch Azylierung zu einem kristallinischen Derivat zu gelangen, führten nicht zum Ziele. Als das Dufotalin nach der Methode von Liehermann mn\ Höruiann'^) mit Essigsäureanhydrid uujl Natriumazetat längere Zeit am Ilückflubkühler er- hitzt wurde, konnte dasselbe fast (luantitativ unverändert zurückgewoinien werden. Beim Kochen mit konzentrierter Salzsäure während fünf Minuten erlitt das Bufotalin keine Veränderung. Auch trat bei dieser Behandlung keine Farbenreaktion ein. Die nach dem Kochen mit Salzsäure alkaUsch gemachte Flüssigkeit reduzierte Kupferoxyd nicht. Von den Fällungsreagentien für das Bufotalin ist noch das Tannin zu erwähnen. Aus seiner wässerigen Lösung fällt Tannin das Bufotalin in groben Flocken. Es gelingt jedoch nicht, das letztere aus seiner Tannin- verbindung nach der gewöhnlichen ^Methode mittelst Zinkoxyd oder B>lei- oxyd zu isolieren, weil das Bufotalin mit den genannten Metallen schwer lösliche oder unlösliche Verbindungen bildet. Nachweis des Bufotalins auf Grund seiner pharmakologischen Wirkungen. Die Wirkung des reinen, der Zusammensetzung Cg^H^gOio ent- sprechenden Körpers deckt sich im wesentlichen mit derjenigen, welche frühere Experimentatoren für das ganze Sekret beschrieben halben, d. h. das Bufotalin entfaltet seine Wirkung, abgesehen von einer lokalen Heizung, ausschließlich auf das Herz, und diese Wirkung stimmt mit der Digitalinw^irkung dem Charakter nach in allen Punkten überein. Dementsprechend vermindert es die Zahl der Pulse, bewirkt eine Verstärkung der Systolen, welcher dann die unter dem Namen ..Herzperistaltik" bekannten Unregelmäßigkeiten der Herzkontraktionen folgen, und führt schließlich beim Frosche zu systolisehem Stillstand des Herzens. Der ganze A'erlauf dieser Erscheinungen am flerzen ist genau wie nach einem der Stoffe der Digitalingruppe , namentlich schlagen die Vorhöfe noch kurze Zeit nach eingetretenem A'entrikelstillstand fort, indem sie sich dabei prall mit Blut füllen, bis auch sie zum Stillstand kommen. Rana esculcnta reagiert auf Bufotalin, wie das für diese Froschart von Schniii'dchcrfi für das Ditritaliii festgestellt worden ist, in etwas anderer "Weise. Elienso wie beim Digitalin kommt auch i)eim Bufotalin der systolische Her/stillstand am Es- culentaherz nicht so ausgesprochen zustande wie bei Rana temporaria. Entweder steht der Ventrikel überliaupt nicht vollständig in Systole still oder der systolische Still- stand erfolgt erst nach bedeutend gnißeren (laben. ') C. Liehermann und (>. Hönnann , tiber die Formeln des Rhamnetins und Xanthorhamnins. Ber. d. Deutschen ehem. (ies. Jahrg. 11. S. 1619 (1878). Abd eih al (1 1' II , Handbuch dpi- biocheniischt'n Arbeitsmethoden. II. 54 850 E. St. Faust. Schon 0'04 bis O'Oömg Bufotalin, in 50 cw?^ Nährflüssipkeit gelöst, bewirken am isolierten Froschlierzen eine bedeutende Zunahme des Pulsvolumens und eine Abnahme der Pulsfrequenz. Das BufotaUn hat keine Wirkung auf das Nervensystem. Eine Wir- kung- auf die Skelettmuskeln ist ebenfalls nicht nachzuweisen. An einem in physiologischer Kochsalzlösung befindlichen Zupfpräparat vom Frosch- muskel sieht man unter dem Mikroskop auf Zusatz von Bufotalinlösung keinerlei Veränderung der Muskelfasern eintreten. Nach der subkutanen Injektion \on ir'2 mg traten bei einem Kanin- chen von 2050^ Körpergewicht die Vergiftungserscheinungen nach 40 Mi- nuten und der Tod nach einer Stunde ein. Bei einem Versuch an einer Katze von 2-?) kg Körpergewicht er- folgte der Tod nach subkutaner Injektion von 2-6 mg Bufotalin unter Konvulsionen in vier Stunden. Erbrechen machte den Beginn der A'ergif- tung bemerkbar. Dasselbe dauerte während des ganzen Versuches fort. Die letale Dosis des Bufotalins für das Säugetier ist bei sub- kutaner Applikation annähernd 0'5 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Bei Fröschen tritt der systolische Herzstillstand nach Einverleibung von O'bmg innerhalb 10 Minuten ein, doch genügt schon die Hälfte dieser Menge, um an dem Herzen in situ die \'eränderungen im Ilhythmus und im Pulsvolumen deutlieh hervortreten zu lassen. Nach 20 Minuten habe ich auch nach 0"25 mg systohschen Herzstillstand eintreten sehen. Das Bufonin hat quaütativ die gleiche Wirkung wie des Bufotalin. Die Wirkung ist aber eine sehr schwache. Das Bufotahn bildet, seiner chemischen Natur nach, eine Ausnahme unter den Stoffen der Digitaliugruppe; während letztere, abgesehen vom Erythrophlein, neutrale, stickstofffreie Verbindungen sind, ist das Bufotalin eine Säure. Ob der von Capparelli (vgl. S. 857) im Hautsekrete von Triton cristatus aufgefundene Körper, welcher ebenfalls saure Eigenschaften zeigte und an Fröschen systolischen Herzstillstand hervorrief, mit dem Bufotalin identisch ist, muß vorläufig noch dahingestellt bleiben. Über die Beziehungen des Bufonins und des Bufotalins zu- einander und zum Cholesterin. Ein Vergleich der beiden für das Bufonin und das Bufotalin oben aufgestellten Formeln läßt es wahrscheinlich erscheinen, daß es sich beim letzteren um ein Oxydationsprodukt des ersteren handelt. Es ist mir durch Oxydation mittelst Kaliumbichromat in schwefelsaurer Lösung ge- lungen, aus dem Bufonin einen Körper zu erhalten, der, wenigstens in bezug auf die Wirkung, mit dem lUifotalin übereinstimmte. Versuche, das Bufotalin durch lleduktion in das Bufonin überzu- führen, blieben erfolglos. Die verschiedensten Reduktionsmittel lieferten Darstellung und Nachweis tierischer (iifte. ^51 unter verschiedenen Yersuchsbedingungen entweder unansehnliche Produkte, aus denen keine wohlcharakterisierten Verbindungen isoliert werden konnten, oder sie ließen das Bufotalin zum größten Teil unverändert. Die oben (S. 848) beschriei)enen Farbenreaktionen ließen an die Mög- lichkeit denken, daß das Ikifonin vielleicht dem Cholesterin chemisch nahe verwandt ist. Auch mußte die einfache, aus den Analysenzahlen zunächst berechnete, halbierte Formel in dieser Hinsicht auffallen, insbesondere wenn man anstatt C17 H,^ () = C17 Uo^A )H schreibt. Daß es sich um ein verdoppeltes Molekül eines Cholesterinhomologons handelt, lehrt folgendes Versuchsergebnis. Bufonin wurde mit Phosphorpentachlorid in einer kleinen Porzellan- reibschale innig vermischt. Es bildete sich ein Chlorid des Bufonins, wel- ches aus Alkohol in wohlausgebildeten federartig gruppierten Xadeln kristallisierte. Die A'erbindung zeigte nach wiederholtem Umkristallisieren den Schmelzpunkt lOo". Analyse: Gefunden Cl = lo'lÖVo- Berechnet für C,^ H52 CI2 ; Cl = 18-37Vo- Das Molekulargewicht dieser Chlorverbindung (531), die Bufonylchlorid heißen mag, bestimmte ich zu 522 und 5;U, im Mittel also 528, woraus hervorgeht, daß es sich weder um Cholesterylchlorid (Molekulargewicht 404'5), noch um ein der halbierten Formel C^y Hog — OH entsprechendes Chlorderivat (Molekulargewicht 265*5) handeln kann. Es gelingt nach der von Mauthncr und Suida'^) beim Cholesteryl- chlorid eingeschlagenen Methode, das Chlor der Chlorverbindung des Bufo- nins durch Wasserstoff zu ersetzen und so zu einem ungesättigten Kohlen- wasserstoff zu gelangen. Ich habe indessen den dem Bufonin entsprechenden Kohlenwasserstoff nicht isoliert, sondern nur festgestellt, daß der durch Einwirkung von Natrium in äthylalkoholischer Lösung auf das oben be- schrieliene Chlorderivat entstehende Körper Brom ohne Bromwasserstoff- entwicklung zu binden vermag, wenn man eine Chloroformlösung desselben mit Brom versetzt. Das Bufonin ist keine esterartige Verbindung des Cholesterins, wie solche von Hürthle-) aus Blutserum dargestellt worden sind. Nach längerem Kochen mit alkoholischem Natriumhydroxyd konnte ich das Bufonin fast quantitativ unverändert zurückgewinnen. Aus diesen Piesultaten ergibt sich, daß das Bufonin ein cholesterin- ähnhcher Körper ist, zusammengesetzt aus zwei Atomgruppen C, 7 Hoß. OH, welche durch Kohlenstoff atome verbunden sind, so dab die beiden Hydro- xylgruppen frei und durch Chlor ersetzbar bleiben: H0.HogCi7 — CiyHoß.OH. Die Ergebnisse dieser ^'ersuche mußten die \'ürstellung erwecken, daß vielleicht auch gewisse Derivate des Cholesterins ähnliche Wirkungen wie die des Bufonins und Ikifotalins zeigen würden. 1) Mauthner und Snida, Beiträge zur Kenntnis des (.'liolesterius. Monatshefte f. Chemie. Bd. 15. S. 87 (1895). '-) lliii-thJe, Über die Fettsiiurecholesterinester des Blutserums. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. Bd. 21. S. 331 (1895/96). 54* 852 E. St. Faust. In dieser Richtung von mir unternommene Versuche haben ergel)en, daß in der Tat gewissen Derivaten des menschlichen, aus Gallensteinen gewonnenen Cholesterins eine eigenartige Herzwirkung neben anderen Wirkungen zukommt. Auch verschiedene von A. Windaus ^) dargesteUte und mir zur phar- makologischen Prüfung überlassene saure (jxydationsprodukte des mensch- lichen Cholesterins zeigten dieselbe Wirkung auf das Froschherz wie die von mir dargestellten Präparate, bewirkten aber an Fröschen bei der sub- kutanen Injektion ihrer Xatriumsalze tiefgreifende lokale Veränderungen (Gewebsnekrose) an der Injektionsstelle und ihrer Umgebung. 2. Ordnung: Urodela, geschwänzte Amphibien. Gattung Salamandra. S a 1 a m a n d r a m a c u 1 o s a L a u r., der gewöhnliche F e u e r s a 1 a m a n d o r. bereitet in gewissen Hautdrüsen der Nacken-, lUicken- und Schwanzwurzd- gegend ein rahmartiges, dickflüssiges Sekret, welches zwei pharmakologisch sehr wirksame Stoffe enthält. Der Salamander gehört zu den ..passiv- giftigen Tieren; er vermag das Sekret der Hautdrüsen nicht willkürlich auszuspritzen. Die chemische Untersuchung des Hautsekretes von Salamandra maculosa unternahm zuerst Zaleski/-), der auch in seiner Arbeit die früheren Publikationen zusammengestellt hat. Er isolierte aus dem Sekret eine organische Base, deren Wirkung sich mit derjenigen des ganzen Sekretes deckte und nannte dieselbe Samandarin. Im Jahre 1899 gelang es E. SL Faust ^ bei der Verarbeitung eines großen Materials (1600 Feuersalamander) zwei wirksame Basen in Form kristallinischer Sulfate darzustellen, indem aus den mit Chloroform getöteten und dann zerkleinerten Tieren durch Extraktion des Salamander- breies mit schwach essigsaurem Wasser bei Siedehitze, Fällung des Aus- zuges mit Bleiessig. Entfernung des überschüssigen Bleies aus dem Filtrat durch Schwefelsäure, Fällung der Basen mit Phosphorwolframsäure. Zer- legung des Phosphorwolframsäureniederschlages mittelst Barythydrat und Entfernung der noch vorhandenen, die Biuretreaktion gebenden Substanzen durch ein besonderes Verfahren 3) Lösungen der beiden Basen erhalten wurden. Die Entfernung der letzten Spuren biuretgebender Sub- stanzen wurde in der Weise erreicht, daß die die Biuretreaktion geben- den Lösungen des Samandarins in einem Mörser mit feingepulvertem Ätzharyt verrieben werden. Man setzt so lange Baryt zu, bis die Masse 1) Bcr. d. Deutschen ehem. Gesellsch. Jg. 36. S. 3752 (1903); Jg. 37. S. 2027. 3699. 4753 (1904). -) Hojjjje-Sejjlers med. -ehem. Untersuchungen. Heft 1. S. 85. Berlin 1866. ^) E. St. Faust, Beiträge zur Kenntnis des Samandarins. Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 41. S. 229 (1898) und Beiträge zur Kenntnis der Salamanderalkaloide. Ebenda. Bd. 43. S. 84 (1899j. Dai'stellung luid JS'achweis tierischer Gifte. 85lj eine teii^artige, steife Konsistenz annimmt und extrahiert dann die Masse mit Alkohol von 9G"/o' Isabel s>eht das Samandarin in Lösuni^, während die Biuretreaktion gebenden Stoffe, wahrscheinlich in Form von liarvum- verbindungen, ungelöst zurückbleiben. Überschüssiges, in den Alkohol übergehendes Barvumhydroxyd wird durch Kohlensäure und eventuell durch Schwefelsäure entfernt. Diese biuretfreien Samandarinlösungen wurden mit Schwefelsäure an- gesäuert und nochmals mit chemisch reiner Phosphorwolfram säure gefällt, der Niederschlag auf dem Filter gesammelt, gut ausgewaschen, dann mit chemisch reinem Ätzbaryt in der üblichen Weise zerlegt, die Flüssigkeit abfiltriert und aus dem Filtrat das Baryum mittelst Kohlen- und Schwefel- säure genau ausgefällt. Neutralisiert man die in dieser Weise erhaltene wässerige, alkahsch reagierende Lösung des Samandarins genau mit Schwefelsäure und dampft bei mäßiger Wärme bis zur Trockne ein, so hinter!)leibt ein schwach gelblich gefärbter, amorpher Rückstand, der in Alkohol löslich ist. Als die alkoholische Lösung mit Äther bis zur eben bleibenden Trübung der Flüssigkeit versetzt wurde, schieden sich nach einigen Tagen bei niederer Temperatur sehr feine, mikroskopische Kristall- nädelchen des Sulfats der Base aus, welche meist zu Büscheln oder auch zu sternartigen Aggregaten vereinigt waren. Der kristallinische Nieder- schlag wurde auf einem kleinen gehärteten Filter gesammelt, mit einem (xemisch von Alkoholäther (in denselben Mengenverhältnissen wie in der Mutterlauge) gewaschen, dann getrocknet und aus Wasser, in welchem das Sulfat schwer löslich ist, umkristallisiert. Läßt man eine nicht zu konzentrierte, durch Erwärmen hergestellte Lösung von Samandarinsulfat langsam erkalten, so scheidet sich das Salz in feinen, bis zu 1 Y« '^>^>' hangen, schönen Nadeln aus. Diese Kristalle ent- halten Kristallwasser und verwittern an der Luft, wenn man sie aus der ]\Iutterlauge entfernt. Gewöhnlich kristallisiert das Samandarinsulfat jedoch in kleinen, mit dem bloßen Auge immerhin deuthch erkennbaren Kristall- nadeln, die sich meistens büschel- oder sternförmig gruppieren und kristall- wasserfrei sind. Aus den bei den Elementaranalysen und den Schwefelsäurebestim- mungen gewonnenen analvtischen Daten berechnet sich für das Samandarin- sulfat die Formel (C.,6 H40 \0\ + H, SO,. Auf Zusatz von Platinchlorid zur salzsauren, wässerigen Lösung des Samandarins fällt bei genügender Konzentration das Platindoppelsalz als voluminöser, hellbrauner Niederschlag aus, welcher bei dem A'ersuch, ihn durch Erwärmen zu lösen und umzukristallisieren, sich zersetzt. Das reine, kristallisierte Samandarinsulfat wurde deshalb in das Hydrochlorat umge- wandelt und dieses mit Platinchlorid gefällt, der amorphe Niederschlag abfiltriert, mit Salzsäure gewaschen und dann im \'akuumexsikkator über Schwefelsäure getrocknet. Beim Trocknen verlor die Verbindung Salzsäure. so da(j an Stelle der zu erwartenden Verbindung ((V, II40 N., O . IICU^ . PtCl^ die ^'erbindung (C.,^ H^n N, Oja • l'tCl^ vorlag. Ähnliche Verbindungen von 854 E. St. Faust. bekannteren Alkaloiden liegen ja auch vor im Pilokarpincliloraurat und im Ecgonincliloroplatinat. Versetzt man die wässerige Lösung des Samandarinsulfats mit Soda oder Natronlauge, so fällt die freie Base als schwach gelblich gefärbtes Öl aus. Selbst nach zweiwöchentlichem Stehen im Eisschrank erstarrte dasselbe nicht. Das Samandarinsulfat ist optisch aktiv. Es dreht die Ebene des polarisierten Lichtes nach links. 1-0886.9 Substanz, gelöst in 20-94 .7 Wasser, gaben im 200 mm-Uolvc eine Ablenkung von — 5-06" als Mittel der beol)achteten Drehung in den vier Quadranten. Das spezifische Gewiclit der Lösung bestimmte ich zu DOL Aus diesen Daten berechnet sich die spezifische Drehung des Samandarinsulfats a^ = — 5o-69'\ Übergießt man eine geringe Menge der Samandarinsulfatkristalle im Eeagenzglase mit konzentrierter Salzsäure und erhält die Flüssigkeit einige Minuten im Sieden, so färbt sich dieselbe zunächst violett, um dann bei längerem Erhitzen eine tiefblaue Farbe anzunehmen. Zum Zu- standekommen dieser Blaufärbung scheint jedoch Luftzutritt erforderlich zu sein. Es ist dies eine sehr charakteristisclie Reaktion des Samandarins. Eine so ausgesprochene Farbeureaktion mit konzentrierter Salzsäure erhält man bei den ])ekannteren Alkaloiden nur mit dem Yeratrin. welches unter diesen Bedingungen eine kirschrote Flüssigkeit gibt. Beim Kochen des Samandarins mit konzentrierter Salzsäure spaltet sich ein ölartiger Körper ab, über dessen Natur vorläufig bestimmte An- gaben nicht gemacht werden können. Nachweis des Samandarins auf pharmakologischem Wege. Die Wirkungen des Samandarins betreffen das Zentralnervensystem und äußern sich zunächst in Steigerung der Reflexerregbarkeit, welche später vermindert ist und zuletzt gänzlich verschwindet. Das Samandarin wirkt zuerst erregend, dann lähmend auf die in der Medulla gelegenen automatischen Zentren, insbesondere auch auf das Piespirationszentrum. Die Folgen der Erregung des Zentralnervensystems sind zu erkennen in den heftigen Konvulsionen, die namentlich an Fröschen schließlich mit Tetanus gepaart sein können. Die Erregung der in der ]Medulla gelegenen Zentren zeigt sich in beschleunigter Respiration, Erhöhung des Blutdruckes und Abnahme der Pulsfrequenz. Die Todesursache ist beim Warmblüter in der Lähmung des Respi- rationszentrums zu erbhcken. Die genannten Wirkungen des Samandarins begründen dessen Ein- reihung in dem natürlichen pharmakologischen System in die Gruppe der sogenannten Krampfgifte, zu welcher das Pikrotoxin, das Coriamyrtin, das Digitahresin und das Toxiresin gehören. Jedoch unterscheidet es sich von diesen dadurch, daß die Konvulsionen mit tetanischen Krämpfen unter- mischt sind. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. gö5 Die Dosis letalis des reinen Samandarins beträi>'t für den Hund hei subkutaner Applikation 0"0007 bis O'OOO*.) // pro Kilogramm Körpergewicht. Kaninchen erwiesen sich im Vergleich zum Körpergewicht relativ noch empfindlicher gegen das Gift. Samandaridin. Außer dem Samandarin findet sich im Organismus des Feuersala- manders noch ein zweites Alkaloid, welches seiner Zusammensetzung so- wohl als auch seiner pharmakologischen Wirkung nach zum Samandarin in naher P^eziehung steht. Ich erhielt dieses Alkaloid, für welches ich den Namen Samandaridin vorgeschlagen habe, in Form seines sehr schwer löslichen schwefelsauren Salzes, als ich, nach der Fällung mit Phosphor- wolframsäure und der Zersetzung des Phosphorwolframsäureniederschlages mittelst Barvthydrat, die mit Schwefelsäure neutralisierte, vom Bariumsulfat al)filtrierte Flüssigkeit stark einengte. Es schied sich das Samandaridin- sulfat aus der heißen, noch die Biuretreaktion gebenden, neutralen Lösung kristallinisch aus. Ich habe diesen Körper dann aus viel heißem Wasser umkristallisiert und nach dem Trocknen bis zur Gewichtskonstanz der Elementaranalyse unterw^orfen, wobei auf die Formel (Coo HjiNOjo + H. SO4 gut stimmende Werte erhalten w'urden. Setzt man zu der wässerigen Lösung des Chlorhydrats dieses Alka- loids Goldchlorid hinzu, so fällt die Goldverbindung der Base kristallinisch aus. Die Analyse dieses Golddoppelsalzes bestätigt die für das Alkaloid oben aufgestellte Formel. Das Samandaridin scheint im Organismus des Feuersalamanders in l)edeutend größerer Menge enthalten zu sein als das Samandarin. Wenigstens habe ich aus 800 Stück dieser Tiere fast -ig dieses Alkaloids in Form des schwefelsauren Salzes erhalten, während die Ausbeute an reinem kristalli- sierten Samandarinsulfat nur etwa l'^ g betrug. Die Wirkungen des Samandaridins unterscheiden sich von den- jenigen des Samandarins nur in quantitativer Beziehung; es sind etwa die sieben- bis achtfachen Mengen des ersteren erforderlich, um die gleiche Wirkung hervorzurufen. (Qualitativ ist die Wirkung die gleiche. Hier wie dort stellen sich allgemeine Konvulsionen ein. Das Samandaridinsulfat kristallisiert in mikroskopischen, rhombischen Plättchen oder Täfelchen. Es unterscheidet sich demnach vom Samandarin- sulfat sowohl durch seine Kristallform als auch durch seine Schwerlöslich- keit in Wasser. Auch in Alkohol ist es schwer löslich. Das Samandaridin ist optisch inaktiv. Beim Kochen mit konzentrierter Salzsäure verhält sich dieser Körper wie das Samandarin; bei längerem Kochen wird die Flüssigkeit tief blau. Bei der trockenen Destillation mit Zinkstaub liefert das Samandaridin ein stark alkalisch reagierendes Destillat, dessen Geruch Pyridin oder Chinolin vermuten läßt. Bei der Behandhmu' des Destillats mit salzsäurehaltigem W^asser ging der größte Teil desselben leicht in Lösung. Die saure Lösung » 856 E. St. Faust. wurde mit Äther ausj^e.schüttelt. der Äther abii"eürossen und der wässerige Rück- stand mit Tierkohle liehandelt. Nach dem Abfiltrieren von der Kohle wurde dem noch heißen sauren Filtrat Platinchlorid zugesetzt. Beim Erkalten der Flüssig- keit schieden sich feine, dunkelgelbe, nadeiförmige Kristalle aus, welche nach dem Umkristalhsieren aus Wasser den Schmelzpunkt 26P zeigten; 0"1622(/ dieser Substanz hinterheßen beim Glühen 0*04-l:4f/Pt = 27-:)6Vo- Der Schmelzpunkt und der Platingehalt des Doppelsalzes dieses Zer- setzungsproduktes des Samandaridins charakterisieren dasselbe als Iso- cliinolin. Für das Chloroplatinat des Isochinolins finden sich angegeben der Schmelzpunkt 26;-'." und die Zusammensetzung (L\, H- X . HCl)., . Pt CI4 + 2H2 O. Diese Formel verlangt einen Platingehalt von 27'ö9%- Crefunden Pt = 2T"o67*'- Hiermit ist der Beweis erbracht , daß das Samandaridin ein Derivat eines hexazykhschen, Stickstoff im Kern enthaltenden Kohlenwasserstoffs ist. Unter den flüchtigen Zersetzungsprodukten des Samandaridins ließ sich durch die bekannte Fichtenspanreaktion die Anwesenheit von Pyrrol konstatieren. Beziehungen des Samandarins zum Samandaridin. Wenn man von der einen Formel die andere subtrahiert, so ergibt sich eine Differenz von Cg Hg N. Man darf wohl vermuten , daß es sich hier um eine Methylpyridingruppe — C5H4(CH3)N — handelt, die das Samandarin mehr besitzt als das Samandaridin. Ob im Organismus das eine Alkaloid aus dem anderen entsteht, z. B. das Samandarin aus dem Samandaridin durch Synthese, das letztere aus jenem durch Spaltung, läßt sich zurzeit nicht entscheiden. Es ist nicht unwahrscheinlich, da so der aromatische Kern der Eiweißstoffe die Mutter- substanz für beide bilden könnte. Bisher nahm man an, daß nur im Pflanzenorganismus den Chinolin- derivaten angehörende , giftige Alkaloide gebildet werden. Durch die Rein- darstellung des Samandarins und des Samandaridins und ihre Charakte- risierung als Isochinolinabkömmhnge ist diese Fähigkeit auch für den tierischen Organismus dargetan. Die Muttersubstanzen für solche Produkte stammen allerdings in letzter Linie aus dem Pflanzenreich. Bei der Untersuchung des Giftes von Salamandra atra Laur- (Alpen Salamander) fand NetoJitzky'^) eine von ihm ..Samandatrin" genannte, in Form ihres schwefelsauren Salzes gut kristaUisierende , in Wasser schwer lösliche Base, deren Zusammensetzung vielleicht der Formel C^iHg^NaOa entspricht und welche sich von dem Samandarin und dem Samandaridin des Feuersalamanders hauptsächlich durch ihre Löshch- keit in Äther unterscheiden soll. Die Wirkungen des „Samandatrins" stimmen mit denjenigen der Alkaloide von Salamandra maculosa überein. 0 F. KctoUtzlcji, Untersuchimgon über den iriftigeii Bestaiulteil des Alpensala- manders. Archiv f. exper. Path. n. Pharmak. Bd. 51. S. 118 (1904). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. y57 Gattung Triton. Triton cristatus Laur., der gewöhnliche Wassersalamander, Wassermolch oder Kammmolch, sondert in gewissen Hautdrüsen ebenfalls ein rahmartiges, dickflüssiges Sekret ah, welches nach den I'ntersiichungen von Vidpian'^) und von Cd/jparelli^) giftige Stoffe ent- hält. Das Sekret reagiert in frischem Zustande sauer. \'on ;»()() 'J'i'itoncn konnte Cnpparelli -LO g des Sekretes gewinnen. Dieser P'orscher unter- suchte das Sekret nach der Stas-Otfo sehen Methode und fand: 1. dal) der wirksame Bestandteil nur aus saurer Lösung in Äther üiierging, 2. dali derselbe stickstofffrei ist und o. daß außerdem ein bei gewöhnlicher Tem- peratur flüchtiger, Lackmuspapier rötender Stoff mit dem Äther überging. über die chemische Natur des wirksamen Bestandteiles ist nichts näheres bekannt. Nachweis des Tritonengiftes auf pharmakologischem Wege. Die Wirkungen des Tritonengiftes untersuchte CajjparelU an Fröschen. Meerschweinchen, Kaninchen und Hunden. WnrmbUiter starben infolge von Zirkulations- und Eespirationsstörungen schneller als Frösche. Die Wirkung auf das Froschherz äußerte sich in Abnahme der Pulsfrequenz. Herzperistaltik und systolischem Stillstand des Herzens. Beim Warmblüter erfolgt Steigerung des Blutdruckes mit nach- folgender Herzlähmung. Auf die roten Blutkörperchen wirkt das Tritonengift hämolytisch und bietet hierin (vgl. Phrynolysin S. 847) eine weitere ÄhnUchkeit mit den Wir- kungen des Krötengiftes, mit welchem es auch in den Wirkungen auf die Zirkulation übereinstimmt. Vielleicht ist der für die letztgenannten Wir- kungen verantwortliche Körper identisch oder chemisch nahe verwandt mit dem lUifotalin. Fische, Pisces. Den Arbeiten von Bt/crlci/^), Günther*). Gressin'") und ^o^^arc?'') ver- danken wir in der Hauptsache unsere heutigen Kenntnisse über die Gift- fische und deren Giftapparate. M Compt. rend. et Memoires de la Societe de Biologie. T. 2 (3). p. 125 (1856). 2) Arch. ital. de Biologie. T. 4. p. 72 (1883). ^) Bj/rrJci/, Proceodings of the Litcrary and Philos. Soc. of Liverpool. Nr. 5. p. 15(5 (184'J). *) A. (iiinther, Catalogue of P'ishes in the British Museum. London 1859 — 1870. The Study of Fislies. Edinburgh 1880. Artikel „Iclithyology in der Eneyclopaodia Britanuica (1881). On a poison orgau iu a genas of Batrachoid Fishes. Proc. Zoolog. Society, p. 458 (1864). ^) L. Grcssin , Contribution ä l'etude de Tapparcil ä venin chez les poissons du Genre .,Vive" (Trachinns). These de Paris (1884). ^) A. Bottard , Les poissons venimeux. These de Paris (1889). — Vgl. auch ./. Fellegrin , Los poissons vöneneux. These de Paris (1899). — II. Coutih-e , Poissons venimeux et Poissons veneneux. These de Paris (1899). — .V. l'arkcr, On tlie poison Organs of Trachinus. Proc. Zool. !Soc. London, p. 359 (1888). 858 E. St. Faust. Es empfiehlt sich, die Begriffe „Oiftflsclie" und „giftiaje Fische*' scharf zu unterscheiden und auseinander zu halten. I. Unter Giftfischen, Pisces venenati s. toxicophori, ..Poissons venimeux" der französischen Autoren, sind nur diejenigen Fische zu ver- stehen und zu klassifizieren, welche einen besonderen Apparat zur Erzeugung des Giftes und dessen Einverleibung (Inokulationj be- sitzen. IL Unter ,,giftige Fische'', schlechtweg ..Poissons veneneux'' der französischen Autoren, sind dagegen zu verstehen und einzureihen alle Fische, deren Genuß auch in frischem Zustande nachteilige oder gesundheitsschädliche Folgen haben kann. Diese Kategorie zerfällt wiederum in zwei l^nteral)teilungen : a) Fische, bei welchen das Gift auf ein bestimmtes Organ beschränkt ist (Barbe), h) Fische, bei welchen das Gift im ganzen Körper verbreitet ist (Aalblut). I. Giftfische, Pisces venenati sive toxicophori. Bei den mit einem Giftapparate ausgestatteten Fischen unterscheidet man nach dem A'organge Bottards und analog der Klassifikation der (Tift- schlangen zweckmäßig nach gewissen charakteristischen, morphologischen Kennzeichen der Giftapparate mehrere Unterklassen. Zunächst sind zu unter- scheiden : A. Fische, welche durch ihren Biß vergiften können; B. Fische, welche durch Sticliwunden (mit (xiftdrüsen verbundene Stacheln) vergiften können; C. Fische, welche ein giftiges Hautsekret in besonderen Hautdrüsen bereiten. A. (Ordnung Physostomi, Edelfische. P'amilie Muraenidae. Gattung Muraena. ^luraena helena L., die gemeine Muräne, findet sich im Mittel- ländischen Meere als einzige Art der Gattung Mureana. Der am Gaumen befindhche, wohl ausgebildete Giftap parate von Muraena helena besteht aus einer ziemlich großen Tasche oder Schleim- hautfalte, welche bei einer etwa meterlangen ^luräne V2 ^"^^ ^^ift ent- halten kann und mit vier starken, konischen, leicht gebogenen, mit ihrer Konvexität nach vorn gerichteten, beweglichen und erektilen Zähnen ver- sehen ist, die eine gewisse Ähnlichkeit mit den Giftzähnen der Schlangen zeigen, jedoch nicht wie diese gefurcht oder von einem zentralen Kanal durchbohrt sind. Die Gifttasche ist mit den das Gift sezernierendeu Epithel- zellen ausgekleidet. Die Gaumenschleimhaut umschließt scheidenartig die Giftzähne und das Gift fließt zwischen den letzteren und jener in die ') Vgl. hierzu H. M. Coutii-re, Siir la uon-existence d'un Appareil ä vcniii clioz la Murene Helene. Compt. rend. de la Soc. de Biologie. T. 54. p. 787 (1902). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. g59 Wunde, wobei die Entleerung' des Giftsekretes nicht wie bei den Schlau ^-en durch Kontraktion einer besonderen ^Muskulatur bewirkt oder befördert wird. Die ganze Anordnung des Giftapparates erinnert sehr an denjenigen der Schlangen und obgleich genauere Berichte über Vergiftungen durch den Biß dieser Tiere fehlen, so unterliegt es doch wohl kaum einem Zweifel, daß dieselben schwere Verwundungen verursachen können, die nicht nur auf rein mechanische Weise zustande kommen. Über die Natur ides (liftes und seine chemische Zusammensetzmii^- ist nichts bekannt. Die Wirkungen des Gift Sekretes von Muraena helena sind bis- her an Tieren nicht untersucht. In einem von F. Vaülant^) beschriebenen Falle soll ein Artillerist nach dem Bib dieses Fisches in eine stundenlanii- andauernde Ohnmacht (Syncopc) verfallen sein. Ob diese als lähmende Wirkung des Giftes oder als die Folge des angeblich starken Blutverlustes aufzufassen ist, läßt sich nach der Beschreibung des Falles nicht beurteilen. Die in den Tropen lebenden Arten von Muraena sollen mit ihrem kräftigen Gebiß selbst den ^Menschen angreifen. B. Ordnung Acanthopteri, Stachelf losser. Die in dieser Unterklasse der Giftfische aufgezählten Fische besitzen mit besonderen Griftdrüseii in Verbindung stehende Stacheln, welche entweder auf dem Rücken in Verbindung mit den Ilückenflossen oder am Kiemendeckel oder auch am Schultergürtel sich befinden. An der Basis der Stacheln finden sich die das Giftsekret enthaltenden Behälter oder Reser- voire, welche mit dem sezernierenden Epithel ausgekleidet sind. Bottard, welcher die Giftorgane eingehend untersucht hat, unter- scheidet nach morphologischen Merkmalen ihrer Giftapparate folgende Klassen von Giftfischen. a) Der Giftapparat ist nach außen geschlossen. Es bedarf eines kräf- tigen mechanischen Eingriffes oder eines stärkeren Druckes auf die Stacheln oder auf die Giftreservoire, um die Entleerung des Giftes zu bewirken. Synanceia brachio, (liftstachelfisch, „ verrucosa, Zauberfisch, riotosus lineatus, Bagrus nigritus, Stachelwels. h) Der Giftapparat ist halb geschlossen : Thalassophryne reticulata, maculosa (Muraena helena), vgl. oben. c) Der Giftapparat ist offen: Trachinus vipera, Trachinidae, draco, radiatus, araneus. Queisen. ') Bottard, a. a. 0. S. 153. 860 E. St. Faust. Cottus scorpius, Seeskorpion, „ bubalis, Seebulle, „ gobio, Kaulkopf, Koppen, Callionymus l}Ta, Leierfisch, Uranoscopus scaber, Himmelsi.j'ucker, Sternselier, Trig'la hirundo, c-emeine Seeschwalbe, gunardus, grauer Knurrhahn, Scorpaena porcus, Meereber, ,, scrofa, Meersau, Pterois volitans, Rotfeuerfisch, Truthahnfisch, Pelor filamentosus, Sattelkopf, Amphocanthus lineatus (Perca fluviatilis). Flußbarsch. a) Synanceia brachio Lacep. M Der Giftapparat, welcher aus einem die Ein- verleibung des Giftsekretes ermöglichenden Stachel, dem Giftreservoir und der Giftdrüse besteht, findet sich an der Rückenflosse. An letzterer befinden sich 13 starke und harte Stacheln, welche auf beiden Seiten in ihrer Längsachse mit Rinnen versehen sind. Im Ruhezustande liegen die Stacheln dem Rücken dicht an; sie werden aufgerichtet, wenn der Fisch bedroht wird oder sich zur Verteidigung anschickt. Die die Stacheln verliin- dende Membran umschließt diese scheidenartig und bedeckt die Spitzen derselben mit einem fibrösen, knopfartigen Gebilde. Zu lieiden Seiten der Basis jeder der dreizehn Stacheln befinden sich die zylindrischen Giftroservoire, welche unter sich nicht in Ver- bindung stehen. Jeder Stachel hat demnach zwei Giftreservoire, so daß die Gesamtan- zahl derselben 26 beträgt. Die Rinnen der Stacheln reichen bis an das Giftreservoir. Wenn von oben her ein genügend starker Druck auf den Stachel ausgeübt wird, so platzt das Giftreservoir und das in letzterem enthaltene Gift fließt den Rinnen entlang in die durch den Stachel verursachte Wunde. Zur Entleerung des Giftreservoirs ist demnach eine kräftige Druckwirkung von außen unerläßlich. Die Giftreservoire einer 45 cm langen Synanceia brachio enthalten je etwa ^l^^cm"^ (V\i\\ die dem zweiten und dritten Stachel zugehörigen Re- servoire sind am besten entwickelt und diese Stacheln zeichnen sich auch durch ihre Größe und ihre Erektihtät bis zur Vertikale vor den übrigen Stacheln aus. Infolge dieser Verhältnisse finden denn auch die Verwun- dungen vorwiegend durch diese Stacheln statt. Das in den Reservoiren enthaltene giftige Sekret ist klar, beim lebenden Tier schwach bläuüch gefärbt, besitzt keinen charakteristischen Geruch und reagiert sehr schwach sauer. Nach Bottard wird das Sekret nur sehr langsam, wenn überhaupt regeneriert, falls das Reservoir einmal entleert wurde. Die Entleerung des Giftes nach außen erfolgt je nach dem auf das Reservoir ausgeübten Drucke mehr oder weniger heftig. Bottard sah das Gift bei dem Drucke, wie er durch Daumen und Zeigefinger auf das Re- servoir ausgeübt werden kann, bis Im hoch herausspritzen. 1) Beschreibungen und Abbildungen der genannten Fische finden sich bei: Ijacc- pUe, Histoire nat. des Poissons. 22 Vols. Paris 1798—1805. — Bottard, a. a. 0. — v.Limfoir, Die Gifttiere und ihre Wirkung auf den Menschen. Berlin 1894. — Brehms Tierleben. — P. Savtschenko , Atlas des Poissons ven(§neux (1886). Text russisch und französisch. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^(j|^ Plotosus liueatus C. etV. 'j, im Indischen Ozean und den tropisclien Getren- den des Pazifischen Ozeans vorkommend, besitzt zwei Giftapparate, von denen der eine vor den Brustflossen, der andere vor der ersten Rückenflosse liegt. Dieselben bestehen aus den Drüsen und den zugehörigen, sagezahnartig gezackten, dünnen und leicht zer- brechlichen Stacheln, welche von einem bis fast an die Stachelspitzon reichenden Kanal dorchbohrt sind. Dieser kommuniziert frei mit dem Giftreservoir. Für die Ent- leerung des Giftsekretes in die Wunde ist es wegen des Verschlusses des Kanals an der Stachelspitze erforderlich, daß der Stachel in der Wunde al)gebrochen wird, was infolge seiner Beschaffenheit und «eines Baues auch immer erfolgt. Der Giftapparat ist wie bei Synanceia nur defensiv zu verwenden und hat mit dem letzteren den kompletten Abschluß nach außen i>emein. h) Thalassoplirjne reticiilata Günther, an der Küste von Pa- nama, und T. maculosa trimtlier, hauptsachlich im Golfe von Bahia vor- kommend, besitzen einen doppelten (iiftapparat, einen an dem Kiemen- deckel und einen zweiten auf dem Rücken dicht hinter dem Kopfe. Das Os operculare , der Kiemendeckelknocheu, besitzt an seinem Rande einen etwas nach oben gebogenen, konischen, stilettartigen Fortsatz oder Stachel, welcher von einem zentralen Kanäle durchbohrt ist. Der Stachel steht in Verbindung mit dem Giftreservoir, so daß das in dem Reservoir befindliche Giftsekret durch den Kanal nach außen entleert werden kann. Eine besondere Muskulatur für die Entleerung des Giftes scheint nicht vorhanden. Der auf dem Rücken befindliche Giftapparat besteht aus zwei mit entsprechen- den Reservoiren kommuniziei'enden und ebenfalls zentral durchbohrten Stacheln. Letztere sind durch eine Membran verbunden und bilden so die erste Rückenflosse. Werden die Stacheln aufgerichtet, so fließt aus der peripheren Öffnung des zentralen Kanales das Gift aus. Es handelt sich also bei Thalassophryne um den halb offenen Typus der Giftapparate bei Fischen. c) Als charakteristisches Beispiel für den Bau und die morphologi- schen Verhältnisse der offenen Giftapparate kann der (riftapparat von Trachinusarten dienen. Trachiuus tlracoL., das Peter mann chen. findet sich häufiii- an den europäischen Küsten und besizt wie Plotosus und Thalassophryne zwei (üft- apparate, von welchen sich der eine am Kiemendeckel, der andere an der ersten Ptückenflosse befindet. Ersterer ist der größere und die durch den- selben hervorgebrachten Wunden sind gefährlicher als die durch den dor- salen Apparat verursachten. Der Kiemendeckelstachel ist oben und unten mit Rinnen oder Furchen versehen (kanelliert). Die Rinnen stehen in Verbindung mit einem konischen, in dem Kiemen- deckelknocheu liegenden Hohlraum. Die Kiemenmembran überzieht den Stachel schei- denartig bis fast an seine Spitze. Die innere Fläche des durch diese Scheide und durch den Kiemenboden sowie durch den konischen Hohlraum gebildeten Blindsacks ist mit sehr großen sezernierenden Zellen ausgekleidet, durch deren Einschmelzen oder Ver- flüssigung -) das Gift entsteht. Das Gift fließt zwischen der von der Kiemenmembran gebildeten Scheide und der Stütz- oder Basalmembran der sezernierenden Zelleu luicli außeu ab. M Beschreibung und Abbildung bei ('iirier et \'alencien>ies, Histoire nat. des Poissons. T. 15. p. 420—421. Paris 1828—1849. 2) Bottard, a. a. 0. S. 113—114. ^62 E. St. Faust. Der dorsale Giftapparat besteht aus 5—7 Stacheln, welche durch eine Membran Yerbuuden und von dieser scheidenartig umschlossen sind. Die Scheide ist mit den kanellierten , d. h. mit Rinnen versehenen (gefurchten) Stacheln verwachsen und nicht, ■uie das bei Sj-nanceia ])rachio der Fall ist, bis zur Stachelbasis zurückstiilpbar. Jeder Stachel ist auf beiden Seiten tief kanelliert. Über die Stachelrinnen zieht sich lirücken- artig die die Stacheln verbindende Membran, den Rändern der Rinnen fest anliegend. Durch den so gebildeten Kanal gelangt das Gift nach außen. Die in der Tabelle auf S. 859 unter c) angeführten Fische weisen in dem Bau ihrer Giftapparate im allgemeinen analoge Verhältnisse auf. wie wir sie eben bei Trachinus ckaco kennen lernten. * Ganz allgemein scheinen Giftapparate nur bei kleinen und schwachen Giftfischen vorzukommen. Knochenfische sind häufiger mit diesen Schutz- mitteln versehen als Knorpelfische. Unter den Knochenfischen finden wir bei den Acanthopteri die meisten Giftfische. Nicht alle mit Stacheln aus- gerüsteten Fische haben Giftdrüsen. Xackthäuter besitzen solche Organe viel häufiger als die beschuppten Fische. Die Wirkungen der giftigen Sekrete der genannten Fische bieten, soweit dieselben genauer untersucht sind, in ihren Grundzügen ähn- liche Erscheinungen, die sich, wie es scheint, nur in quantitativer Hin- sicht unterscheiden. Die lokalen Wirkungen bestehen in heftiger Schmerzempfindung und schnellem Anschwellen der Umgebung der Wunde. Diese Erscheinungen können sich über das ganze betroffene Glied er- strecken. Die Umgebung der Stichwunde färbt sich bald blau, nekrotisiert und wird gangränös. Häufig entwickeln sich Phlegmonen, die den Verlust eines oder mehrerer Phalangen eines verwundeten Fingers bedingen können. Die Wirkungen des Giftes nach der Resorption sind noch nicht genügend erforscht, um ein abschließendes Urteil über das Wesen derselben zu gestatten. Nach den Angaben der meisten Autoren scheinen sie beim Warmblüter in erster Linie das Zentralnervensystem zu betreffen. Es treten Krämpfe ein, die vielleicht auf eine primäre Erregung des Zen- tralnervensystems zurückzuführen sind, worauf später Lähmung folgt. Meerschweinchen und Ratten starben in der Regel nach einer Stunde, manchmal aber erst nach 14 bis 16 Stunden unter anscheinend heftigen Schmerzen, Konvulsionen und Lähmungserscheinungen, i) Die Wunden und deren Umgebung waren heftig entzündet und wurden gangränös. Gelegentüch breitet sich die Gangrän weiter aus, oder es treten Geschwüre und Phle- bitis an dem betroffenen Ghede auf. Vergiftungen bei Menschen, besonders bei Badenden, Fischern und Köchinnen, sind häufig. Die meist an den Füiien und Händen gelegenen Wunden werden rasch sehr empfindlich , die ganze Extremität schmerzt *) J. Dunbar-Brunton, The poison-bearing fishes, Trachinus draco and Scorpaena scropha ; the cffects of the poison on mau and animals and its uature. Lancet (1890). 29. August. Zentralbl. f. inn. Med. Nr. 51, S. 1318 (1896). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 86;-J heftiii', Erstickungsnot und Herzbeklemmung' treten ein, der Puls wird unregelmäßig, es folgen Delirien und Konvulsionen, die im Kollaps zum Tode führen oder nach stundenlanger Dauer langsam verschwinden können. Verwundungen durch Synanceia brachio haben beim Menschen schon wiederholt den Tod herbeigeführt. Botfard^) berichtet ü])er fünf letal en- dende Fälle, welche sicherlich durch das Gift dieses Fisches verursacht waren und ohne weitere Komplikationen rasch tödlich verhefen. Bei Fröschen sah Pohl"), der an diesen Tieren mit Trachinus- und Scorpaenagift experimentierte, niemals Krämpfe auftreten: auch konnte dieser Autor in keinem Falle eine anfänghche Steigerung der Pieflexerregbarkeit wahrnehmen. Pohl stellte fest, daß beim Frosch die Herzwirkung des Giftes vonTrachinus das ganze Vergiftungsbild beherrscht und daß die Symptome der Vergiftung — das Ausfallen spontaner Bewegungen, die Hypnose und die schließliche Lähmung auf Zirkulationsstörungen zurückzuführen sind. Die Wirkung des Trachinusgiftes auf das Herz äußert sich in der \'erlangsamung der Schlag- folge bei anfänglich kräftigen Kontraktionen, die allmählich schwächer werden und schUeßlich ganz aufhören, wobei das Herz in Diastole still steht. Der Herzmuskel ist dann mechanisch, nur lokal oder überhaupt nicht mehr erregbar. Atropin und Koffein änderten an dem Verlauf der Vergiftung nichts; der Herzstillstand ist daher nicht auf eine Wirkung des Giftes auf die nervösen Apparate des Herzens zurückzuführen. Das Trachinusgift wirkt auf den Herzmuskel direkt lähmend. Die Erregbarkeit der Skelettmuskeln und der motorischen Nerven erleidet keine Änderung. Die chemische Xatur dieser Gifte ist ganz unbekannt. Ihr Nachweis läßt sich nur auf pharmakologischem Wege erbringen. Die am Frosche gewonnenen Resultate erklären die beim Warmblüter gemachten Erfahrungen in befriediuender Weise. Es sind demnach die Krämpfe nicht auf eine direkte Wirkung- des Trachinusgiftes auf das Zentralnervensystem zurückzuführen; sie sind vielmehr als Folgen des Darniederliegens der Zirkulation aufzufassen, infolgedessen es zu Er- stickungskrämpfen kommen kann. Das Gift von Scorpaena porcus wirkt nach Pohl qualitativ ganz wie das Trachinusgift, nur viel schwächer, und zeigt außerdem, auch beim Frosche, eine ausgesprochene lokale Wirkung. Letztere scheint nach Briot^) von einer nicht mit dem Herzgift identischen Substanz al)hängig zu sein. ^) a. a. 0. S. 78. Daselbst Zusammenstellung zahlreiclior Vergiftungsfälle infolge von Verwundungen durch Synanceia brachio und andere Giftfische. -) J.Pohl, Beitrag zur Lehre von den Fischgiften. Prager med. Wocheuschr. Nr. 4 (1893). =) Compt. rend. soc. biolog. T.5-1, p. 1169— 1171. 1172—1174 (1902) und T.55. p.G23 (1903). Journ. de physiol. T. 5. p. 271— 282 (1903). 864 E. St. Faust. C. Cyclo stom ata, Rundmäuler. Das Gift wird von Hautdrüsen bereitet. Es fehlen besondere Appa- rate, welche das Giftsekret dem Feinde einverleiben. Petromyzon fluviatilis Liii., Flußneun aui^e, Pricke und Petro- myzoii marinus Lin. , Me ernenn äuge, Lamprete. Die Neunaugen sondern in gewissen Hautdrüsen ein giftiges Sekret ab, welches nach Prochoroiv^) und Cavazzani-) gastroenteritische Erscheinungen, mit heftigen, bisweilen blutigen, ruhrartigeu Diarrhöen, verursachen kann. Die chemische Natur der wirksamen Sulistanz ist unbekannt. Sie scheint durch Erhitzen nicht zerstört zu werden, da der Genuß einer aus Neunaugen bereiteten Suppe schwere Yergiftungssymptome an einer Frau und deren Kindern hervorrief. Die Neunaugen waren in diesem Falle nicht, wie das sonst üblich ist, vorher mit Salz bestreut und dann in einem Gefäße mit Wasser geschüttelt oder ,. gereinigt", d. h. von dem giftigen Hautsekret befreit worden. n. Giftige Fische. a) Das Gift ist nicht in besonderen Giftapparaten, sondern in einem der Körperorgane enthalten, nach deren Entfernung der Genuß des Fisches keinerlei nachteihge oder gesundheitsschädhche Folgen hat Hierher gehören: Barbus fluviatihs Agass. s. Cyprinus barbus L., die Barbe. Schizotliorax planifrons Heckel. Cyprinus carpio L., der Karpfen. Cyprinus Tinea Cuv., die Schleie. Meletta thrissa Bloch s. Clupea thrissa, die Borstenflosse. Meletta venenosa Cuv. s. Clupea venenosa, die Giftsardelle. Sparus maena L., Laxierfisch. Abramis brama L., der gemeine Brachsen. Balistes capriscus Gmel., der Drückerfisch. Balistes vetula Cuv., die Vettel, Altweiberfisch. Ostracion quadricornis L., der gemeine Kofferfisch, Vierhorn. Thynnus thynnus L. s. Th. vulgaris C. ^^, gemeiner Tun. Sphyraena vulgaris C. V., der gemeine Pfeilhecht. Esox lucius L., der gemeine Hecht. Tetrodon pardahs Schlegel und andere Tetrodonarten , Kröpfer oder Vierzähner. Orthagoriscus mola Bl. Seh., der Sonnenfisch, Meermond. Mondfisch, Schwimmender Kopf. Bei den genannten Fischen ist das Gift hauptsächlich auf die Geschlechtsorgane oder deren Produkte beschränkt, doch enthalten auch andere Organe, vornehmlich die Leber sowie Magen und Darm, zuweilen das Gift, dann aber in viel geringerer Menge. ') Pharm. Jahresber. (1883/84). S. 1187. -) VirchoHS Jahresber. (1893). I. S. 431. Darstellung uiul Nachweis tiorisclior Gifte. 355 Die durch diese Kategorie von Fischen verursachten Vergiftungen hat man auch mit dem Namen „Ciguatera" bezeichnet. Unter diesem, von spanischen Ärzten auf den Antillen eingeführten und von den französi- schen Autoren 1) übernommenen Namen sind alle durch den Genuli von frischen, vor kurzem dem Wasser entnommenen Fischen verursachten Ver- giftungen zu verstehen. Es handelt sich demnach um Vergiftungen durch im (Jrganismus lebender Fische normaler-, d. h. phvsiologischerweise ge- bildete Stoffwechselprodukte. Ciguatera und Ichthyismus sind also nicht identische Begriffe. Baiims fluviatilis Agass, s. C.ypriims barhus L., die gewöhn- liche Barbe, ist der bekannte giftige Fisch, welcher die soGenannte Barbencholera verursacht. 2) Während man früher die Erkrankungen nach dem GenuC) der Barbe auf Krankheiten des Fisches selbst oder auf die Beschaffenheit seiner Nahrung zurückführen woUte, steht jetzt die Tatsache fest, daß nur nach dem Genuß des Barbenrogens die Erscheinungen, welche man unter dem Namen Barbencholera zusammenfaßt, beobachtet werden. Die Symptome der Vergiftung bestehen in Übelkeit, Nausea. Er- brechen, Leibschmerzen und Diarrhöe und sind denjenigen der Cholera nostras ähnlich. Hesse experimentierte mit Barbenrogen an Menschen und Tieren. Er berichtet im ganzen über 110 Versuche an Menschen, wobei in 67 Fällen keinerlei oder doch nur sehr leichte Erscheinungen auftraten. In zwei von Trapenard^) beschriebenen schweren Fällen waren un- stillbares Erbrechen und profuse Diarrhöen mit darauf folgender, lange dauernder Somnolenz die Hauptsymptome. In der Literatur finden sich keine Angaben über letal verlaufene Fälle. Die Barbe bzw. deren Rogen ist am giftigsten zur Laichzeit, wes- halb es in Italien verboten ist, um diese Zeit — ^lärz bis ^lai — Barben zum Verkauf zu i)ringen.*) Massenvergiftungen durch Barbenrogen sind in Deutschland und in Frankreich verschiedentlich beobachtet und be- schrieben worden. Die chemische Natur der wirksamen Substanz ist unbekannt. Ordnung Plectognathi, Haftkiefer. Familie Gymnodontes. Die Gattungen Tetroden, Triodon und Diodon kommen hauptsächlich in den tropischen Meeren, aber auch in den gemäüigten Meeren und in Flüssen vor und zeichnen sich außer durch ihre Giftigkeit durch ihr ab- sonderliches Äußeres aus. Sie sind häufig mit mehr oder weniger zahl- reichen Stacheln ausgerüstet. Tetroden Honkenyi Bloch, welcher am Kap 1) Cotitiere, p. 107—14:3. Pellegrin, p. 16. Vgl. S. 857. Aum. 6. -) Die ältere Literatur siehe bei II. F. Autenrieth, Das Gift der Fische. S. 42 bis 46 (1833), sowie bei Carl Gnsfar Jfes-se, i)ber das (Jift des Rarbeiirogcns (1835). ^) Journal de Chimie med. p. 584 (1851). *) Robert, Über Giftfische und Fischgifte. Vortrag. S. 14 (1905). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 55 SQ6 E- St. Faust. der guten Hoffnung und in Neu-Kaledonien vorkommt, i.st dort unter dem Namen ..Toad-fisli" bekannt. Sein Genuß hat wiederholt schwere Vergif- tungen verursacht. Das Vorkommen von Fischen, welche unter allen Umständen giftige Eigenschaften besitzen, ist durch die eingehenden Untersuchungen des in Japan unter dem Namen Fugugift bekannten und sehr wirksamen, dort zahlreiche Todesfälle verursachenden Giftes verschiedener Tetrodon- und Diodonarten durch Ch. Benuj'^) und D. TakaJiashi und Y. Inoko^) sicher festgestellt. Die verschiedenen Spezies von Tetrodon enthalten alle, mit Ausnahme von T. cutaneus, qualitativ gleich wirkende Gifte. Von den einzelnen Organen ist der Eierstock bei weitem am gif- tigsten, bei T. cutaneus ist er jedoch giftfrei. Der Hoden enthält bei manchen Spezies nur sehr geringe Mengen des Giftes. Die Leber ist weniger giftig als der Eierstock. Die übrigen Eingeweideorgane zeigen im allgemeinen eine minimale Giftigkeit und sind bei einigen Arten ganz un- giftig. In den Muskeln aller untersuchten Spezies war das Gift nicht nach- zuweisen. Im Blute von Tetrodon pardalis und T. vermicularis fanden sich geringe Mengen des Giftes. Die chemische Untersuchung der frischen Ovarien von T. vermicu- laris ergab, daß das Gift in Wasser und wässerigem Alkohol, nicht aber in absolutem Alkohol, Äther, Chloroform, Petroleumäther und Amylalkohol löshch ist. Dasselbe wird weder durch Bleiessig noch durch die bekannten Alkaloidreagenzien gefällt, diffundiert sehr leicht durch tierische Membranen und wird durch kurzdauerndes Kochen seiner wässerigen Lösung nicht zerstört. Aus diesem Verhalten des Giftes ergibt sich, daß das Fugugift weder ein Ferment noch ein Toxalbumin noch eine organische Base ist. Durch längere Zeit fortgesetztes Erwärmen auf dem Wasser- bade, besonders in saurer, aber auch in alkalischer Lösung, wird das Gift in seiner Wirkung abgeschwächt und kann schUeßlich ganz zerstört werden. Zur Darstellung des wirksamen Körpers verfuhren Takahashi und Inoko in der Weise, daß sie die frischen Eierstöcke zuerst mit Äther, dann mit absolutem Alkohol erschöpften : hierauf wurde das zerkleinerte Material mit destiUiertem Wasser bei Zimmertemperatur extrahiert, die wässerigen Auszüge mit Bleiessig gefällt, das Filtrat vom Bleiniederschlag durch Schwefelwasserstoff von überschüssigem Blei befreit und hierauf mit Phosphorwolframsäure, Kaliunnjuecksilberjodid oder Quecksili)erchlorid die durch diese Reagenzien fällbaren Substanzen, hauptsächhch Cholin, entfernt. Die Filtrate von den letztgenannten Fällungen wurden im Vakuum- exsikkator über Schwefelsäure zur Trockne abgedampft und der Rückstand 1) Ch. lienuj, Compt. lend. de la Soc. de Biolo.nio (7. ser.). T. 4. p. 263 {1883). -) Archiv f. exp. Path. Bd. 26. S. 401 und 453 (1890). Vgl. auch Mitteilungen der med. Fakultät Tokio. Bd. 1. S. 375 (1892). Daselbst selir gute farbige Abbildungen dieser Fische und Kasuistik der Veririftuniren beim Menschen. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 867 mit absolutem Alkolioi mehrmals extrahiert. Der in absolutem Alkohol unlösliche Teil des iiückstandes stellte eine mit anoriianischen Salzen ver- mengte, gelblich gefärbte, amorphe Masse dar und erwies sich als stark giftig. Y. Tahara'^) hat die von Takahashi und Inoko begonnene chemische Untersuchung des Fugugiftes fortgesetzt und dabei einen pharmakologisch stark wirksamen, in faiiblosen Nadeln kristallisierenden Körper von neutraler Beschaffenheit, das Tetrodoiiin , und eine amorphe, ebenfalls stark wirk- same Substanz von saurem Charakter, die Tetrodonsäure, gefunden. Aus den Dialysaten von zer([uetschtem Itogen des frischen Fisches hat Tahara, nach dem Heinigen mittelst Bleiessig, durch Zusatz von Alkohol eine kristallinische Masse erhalten, die ein (iemenge von Tetro- den in und Tetrodonsäure darstellte. Die Trennung dieser beiden Sub- stanzen geschah durch Behandlung der wässerigen Lösung der Kristall- masse mit Silbe racetat, wobei das schwer lösliche tetrodonsäure Silber ausfiel. Aus dem Filtrat von letzterem wurde das Tetrodonin durch Fällung mittelst Alkohol gewonnen. Das Tetrodonin ist geruch- und geschmacklos, reagiert neutral, löst sich leicht in Wasser, schwer in konzentriertem Alkohol. Es ist unlöslich in Äther, Benzol und Schwefelkohlenstoff. Die wässerige Lösung wird nicht durch riatinchlorid, Goldchlorid, Phosphorwolf ramsäure , Subhmat und Pikrinsäure gefällt. Die Wirkungen des Fugugiftes bestehen in einer bald eintreten- den und sich bis zur vollkommenen Funktionsunfähigkeit steigernden Lähmung gewisser (lebiete des Zentralnervensystems, wobei zuerst das Bespirationszentrum und dann das vasomotorische Zentrum betroffen wird. Gleichzeitig entwickelt sich eine curarinartige Lähmung der peri- pheren motorischen Nervenendigungen, welche beim Frosche eine vollständige werden kann. Das Herz wird von dem Gifte nicht direkt beeinflul'it und schlägt noch nach bereits eingetretenem Atemstillstande. Infolge der Lähmung des Gefäßnervenzentrums sinkt der Blutdruck. Der Puls erfährt eine allmähliche Yerlangsamung. Krämpfe treten im ganzen Verlaufe der ^'ergiftung nicht ein, was wahrscheinlich auf die bestehende Lähmung der motorischen Endapparate zurückzuführen ist. Die Sektionsbefunde ließen keinerlei charakteristische Veränderungen an den Organen erkennen. Die bei Vergiftungen von Menschen mit Fugugift beobachteten Symptome stimmen im wesenthchen mit den Ergebnissen der Tierversuche von Tdkahashi und Inoko überein. Gastro-enteritische Erscheinungen sind beobachtet worden, fehlen aber meistens. Die lebensgefährliche, rasch töd- hch verlaufende ^'ergiftung, die sich durch Cyanose, kleinen Puls. Dyspnoe. Schwindel, Ohnmacht, Sinken der Körpertemperatur kennzeichnet, läiit die Wirkung des Giftes auf das Zentralnervensvstem deutlich erkennen. *) über die giftigen Bestandteile des Tetrodon. /eitschr. d. med. Ges. in Tokio. Bd. 8. Heft 14. Ref. bei Mal;/, Jabresber. üiier die Fortschritte der Tierehcmie. Bd. 24. S. 450 (1894). 55* 868 E. St. Faust. In den männlichen rTeschlechtsprodukten einiijer hieranf untersuchter Fische finden sich g-ewisse Protamine, weiche in dem Sperma an Nuklein- säure gebunden sind und sich leicht rein darstellen lassen. A. Kossei und seine Schüler haben die oben genannten Körper, mit Ausnahme des Protamins von Miescher, zuerst genauer untersucht und auf ilu'B pharmakologischen Wirkungen geprüft. Sie fanden, daü das Clupciii bei intravenöser Injektion in Mengen von 015 — 0*18 f/, das Sturin in Mengen von 0-20 — 0"25 g an etwa 10 kg schweren Hunden bedeutende und rasch eintretende Erniedrigung des Blutdruckes und gleichzeitig Zunahme der x\tmungsfrequenz mit Vertiefung der einzelnen Ilespirationen bewirkten, i) Größere Gaben als die genannten führen unter allmählicher Abnahme der Frequenz und der Tiefe der Atmung zum Respirationsstillstand und zum Tode. Die Endprodukte der hydrolytischen Spaltung der Protamine, die von Kossei „Hexonbasen" genannten Körper Arginin, Histidin und Lysin, zeigten keine Wirkung auf Blutdruck und Ptespiration. Die oben geschilderten Wirkungen des Clupeins und des Sturins sind also dem ganzen Protaminmolekül eigen. Sie betreffen anscheinend das Zentralnervensystem. Die bakterizide Wirkung des Sturins wurde von H. Kossei-) im Jahre 1898 studiert. h) Das Gift ist im ganzen Organismus verbreitet. Ordnung Phy so stomi, Famihe Muraenidae. Neuere Untersuchungen s) haben gezeigt, daß in dem Blute aller darauf untersuchter Muräniden ein Stoff vorhanden ist, welcher bei subkutaner, intravenöser und intraperitonealer Injektion den Tod derA'ersuchstiere herbei- führen kann; aber auch nach stomachaler Einverleibung ist das Aalblut, faUs es in genügend großer Menge in den ]\Iagen gelangt, für den Menschen giftig, M'ie ein von F. Pennavaria*) beschriebener Fall iKnveist. Ein Mann, welcher das frische Blut von 064% Aal mit Wein vermischt trank, erkrankte schwer. Die Symptome bestanden in heftigem Brech- durchfall, Atmungsbeschwerden und cyanoti scher Verfärbung des Gesichtes. Das Serum des Muraenidenblutes unterscheidet sich schon durch einen nach 10 — oO Sekunden wahrnehmbaren brennenden und scharfen G e s c h m a c k von dem Serum anderer Fische. Vielleicht handelt es sich dabei eher um eine lokale Reizung als um eine Geschmacksempfindung. Der im Serum vorhandene giftige Körper, welchem A. Mosso den Namen „Ichtlijotoxlii"' beigelegt hat, muß vorläufig zur Gruppe der *) W. H. Thompson, Die physiologische Wirkung der Protamine und ihrer Spal- tungsprodukte. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 29. S. 1 (1900). 2) Zeitschr. f. Hygiene und Infektionskrankheiten. Bd. 27. S. 36 (1898). ^) A. Mosso, Die giftige Wirkung des Serums der Muraenideu. Archiv f. exp. Patholog. u. Pharmak. Bd. 25. S. 111 (1888). Springfeld, 'Wirkung des Blutserums des Aales. Inaug.-Diss. Greifswald 1889. 4) II Farmacisto italiano. Vol. 12. p. 328 (1888). Darstellung und Nachweis tiorisclier (iiftc. ,S(;<) sogenannten Toxalbumine gezählt werden. Erhitzen des Serums vernichtet dessen Wirksamkeit; gleichzeitig geht der brennende Geschmack verloren. Seine Wii'ksamkeit wird durch organische Säuren, schneller und voll- ständiger durch Mineralsäuren, aber auch durch f]in\virkung von Alkalien aufgehol)en. Tepsin-Salzsäure (künstliche \'erdauung) vernichtet nach r. J/o.ssoM ebenfalls seine Wirksamkeit. Der wirksame Bestandteil ist in Alkohol unlöslich und dialysiert nicht. Er verträgt das Eintrocknen bei niederer Temperatur. "* Intraperitoneal oder subkutan injiziert, tötet das Serum die ^'ersuchstiere rasch. Das Serum von Conger myrus und Conger vulgaris ist weniger wirksam als dasjenige von Anguilla und Muraena. Über die chemische Natur des Ichthyotoxins ist nichts Näheres bekannt. Die Wirkung-en des Serums von Anguilla, Conger und Muraena hat Mosso an Hunden , Kaninchen , .Meerschweinchen , Tauben und Fröschen studiert. Diese Wirkungen können auch zum Nachweis von Aalserum und dessen Gift dienen. Ein Hund von 15'2 kg Körpergewicht wurde nach der Injektion von (Yb cm^ frischem Anguillaserum in die Vena jugularis sofort sehr unruhig und Ivonnte sich bald nicht mehr aufrecht halten. Nach zwei Minuten traten Konvulsionen ein und die Respiration stand still. Nach fünf Minuten war der Kornealreflex erloschen. Die Sektion lieb, wie in allen weiteren Versuchen, keine für diese \'ergiftung charakteristischen Veränderungen erkennen, abgesehen von dem Blute, welches nicht geronnen war. W^eitere ^'ersuche ergaben, daß schon O02 cm^ des Serums pro Kilo- gramm KörpergeAvicht genügen, um bei Hunden den Tod herbeizuführen. Bei einem l-OI» kg schweren Kaninchen bewirkten 0*;> cm^ Muraena- serum, in die Jugularis injiziert, den Tod in 2V2 Minuten. Die Respirations- frequenz war gleich nach der Injektion gesteigert; das von den Fesseln be- freite Tier fiel auf die Seite und war nach kurzdauernden Krämpfen gelähmt. Meerschweinchen gingen V2 — 1 1/2 Stunden nach der Injektion von 2 bzAv. 1 cm'^ Anguillaserum in die Bauchhöhle unter Dyspnoe und Respirations- stillstand zugrunde. Auch bei diesen Tieren zeigten sich die bei Hunden und Kaninchen beobachteten Lähmungserscheinungen und Respirations- anomalien. Das Herz schlug noch nach bereits eingetretenem Resi)irations- stillstand. liei dieser Art der Einverleibung zeigte sich, wie auch meistens nach der subkutanen Injektion, eine lokale Wirkung des Giftes. Die Injektionsstelle und die derselben benachbarten Gewebe waren entzündet; in der Bauchhöhle fand sich blutig gefärbtes Exsudat. An Fröschen bewirkt die subkutane Injektion von Aalserum eine Herabsetzung der Erregbarkeit der motorischen Nerven und der Muskeln. Auf das Herz dieser Tiere scheint das Aalserum nicht direkt zu wirken. ') r. Mos!io, Ricerclie sulla natura dcl veleno che si trova nel sangue ilel- languilla. Rendiconti della R. Accadcmia dei Lincei. Vol. 5. p. 804—810 (1889). 870 E. St. Faust. Eine genauere Analyse der Wirkungen des Muraenidenserums auf Warmblüter ergibt folgendes. Die Piespiration wird zunächst beschleunigt, später herab- gesetzt. Diese Wirkung beruht anscheinend auf einer primären Erregung und darauffolgenden Lähmung des Respirationszentrums. Künstliche At- mung vermag, wenn nicht allzu große (laben injiziert wurden, das Leihen zu erhalten. Die Zirkulation wird durch kleinere, nicht tödliche Gaben in weit geringerem Maße als die Respiration beeinflußt. Bei Hunden erfolgt zuerst eine Verstärkung der Herzschläge und eine Abnahme ihrer Fre- quenz. Später wird der Puls stark beschleunigt. Diese Erscheinungen be- ruhen wahrscheinhch auf einer anfänglichen Erregung mit darauffol- gender Lähmung des Vaguszentrums. Größere Gaben wirken direkt lähmend auf das Herz. Der Blut- druck sinkt dann sehr rasch. Ülier das Verhalten der Gefäße lassen sich aus den bis jetzt vorliegenden Versuchen keine sicheren Schlüsse ziehen. Das Ichthvotoxin hebt die Gerinnbarkeit des Blutes auf. Die Wirkungen des Muraenidenserums auf das Nervensystem äußern sich in L ä hm ungs er scheinungen der verschiedenen Gebiete, bei deren Zustandekommen jedoch auch die direkte Wirkung des Giftes auf die Muskeln (vgl. oben Frosch) berücksichtigt werden muß. Die Wirkungen auf das Nervensystem sind direkte und unabhängig von der Zirkulation. Beim Frosche kann z. B. die Erregbarkeit des Nervus ischiadicus total erloschen sein zu einer Zeit, da das Herz noch kräftig schlägt. Die Wirkungen des jNIuraenidenserums erinnern in manchen Punkten stark an die Wirkungen der Schlangengifte, insbesondere bezüglich der Wirkung auf die Piespiration. auf den Blutdruck und auf das Blut. Die schon oben (S. 804) angeführten Neunaugen, Petromyzon flu- viatilis und Petromyzon marinus, besitzen nach den Angaben einiger Autoren wie die Muraeniden in ihrem Blute ein dem Ichthyotoxin ähnlich wirkendes Gift, welches im Serum gelöst enthalten ist. Cavazzani'^) ex- perimentierte an Fröschen, Kaninchen und Hunden und sah l)ei diesen Tieren nach Injektion von Petromyzonserum Somnolenz und Apathie soAvie die charakteristischen Wirkungen des Muraenidenserums auf die Respiration eintreten. Das Serum von Thynnus thynnus L. s. Th. vulgaris C. et V.. des gemeinen Tuns und anderer Tunarteu bewirkt nach Maracci-) bei seiner intravenösen oder intraperitonealen Lijektion an Hunden älinliche V'ergif- tungserscheinungen wie das Aal- und Petromvzonserum. ') E. Cavazzani, Arch. ital. de Biologie. T. 18. p. 182—186 (1893). ^) Maracci, Sur le pouvoir toxique du sanff du Thon. Arch. ital. de Biolotrie. T. 10. p. 1 (1891). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 37 ;[ Wirbellose Tiere, Avertebrata. Ordnung Asiphoniata. Muscheltiere, Lamellibranchiata. Eine große Anzahl älterer Beobachtungen über Miesmusehelvergif- tungen findet sich in einer im Jahre 1851 erschienenen Arbeit von Chevalier und Duchesne^) sowie auch bei Orfila. '^) Es kann nach diesen Ilerichten nicht daran gezweifelt werden, daß ganz frische, lebende Muscheln, bei welchen postmortale Zersetzungen oder Veränderungen als Ursache der Giftigkeit sicher ausgeschlossen waren, unter bestimmten, noch nicht näher bekannten Bedingungen und \'erhältnissen giftige Eigenschaften annehmen können, und zwar schon in dem Wasser, in welchem sie leben. Meistens werden ganze Familien oder sonst wie zusammen hausende Menschengruppen vergiftet. Es kommt dann zu den wiederholt beobach- teten Massenvergiftungen durch Muscheln. Das größte Interesse bietet eine Reihe von Muschelvergiftimgen, denen im Oktober 18 80 mehrere Werftarbeiter auf der Kaiserlichen Werft in Wilhelmshaven zum Opfer fielen. Die Willielmshavener Fälle wurden von Schmidt mann beobachtet und dessen an Virchow gemachte Mitteilungen von letzterem veröffentlicht. =*) Von den am Boden einiger Schiffe anhaftenden Muscheln nahmen mehrere Arbeiter verschiedene ]Mengen mit nach Hause, kochten und aßen dieselben mit ihren Familien. Im Laufe der Nacht erkrankte eine ganze Anzahl der Arbeiter und ihrer Familienmitglieder. Im ganzen wurden 19 Fälle beobachtet, von denen vier letal verliefen. Die Symptome waren in allen Fällen die gleichen und bestanden in friiher oder später, je nach der Menge der verspeisten giftigen Muscheln, auftretendem Gefühl des Zusammenschnürens im Halse, Stechen und Brennen zunächst in den Händen, später auch in den Füßen, Benommensein und einem eigenartigen Gefühl iu den Extremitäten, .,als wollten sich die Glieder heben". Der Puls war hart, die Frequenz desselben 80 bis 90. Körpertemperatur normal; die Papillen groß und reaktionslos, die Sehkraft nicht vermindert. Das Sprechen war sehr erschwert. Gefühl der Schwere und Steifheit in den Beinen, Fehlgreifen beim \'ersuch Gegenstände zu fassen, Übelkeit und Erbrechen waren weitere Symptome der Vergiftungen. Die Patienten litten an Angstantälleii und klagten über Kältegefühl bei gleichzeitigem, reichlichem Schweiß. Der Tod erfolgte bei vollem Bewußtsein innerhalb 45 Minuten bis 5 Stunden nach dem Genuß der Muscheln. Die Organe der Verstorbenen wurden von Virchoir luitersucht. Kr berichtet darüber: „Die Dünndarmschleimhaut war stark geschwollen und rot, auch war eine reichliche Menge schleimiger, epithelhaltiger Massen abgesondert. Das Bild deutet auf einen starken Irritationszustand der Schleimhaut. Weiter war die starke Milz- schwellung auffallend; es bestaiul Hyperplasie der Milz mit starker Vergrößerung der Follikeln, also ebenfalls ein Zustand, der auf starke Irritation deutet. Die Leber zeigte hämorrhagische Infarkte. Am Gehirn war, abgesehen von einer mäßigen Hyperämie, nichts Abnormes wahrzunehmen. ') Ann. d'Hygiene publique, p. 387 (1851). -) Orßla, Traite de poisons. p. 508—518. Paris 1818. ^) Deutsche med. Wochenschr. 11. November und 2. Dezember 1885. 872 E. St. Faust. Die oben geschilderte Symptomatologie ist charakteristisch für die paralytische Form der Vergiftmigen dm'ch Muscheln ij, ^velclle sich durch akute periphere Liihmungserscheinungen kennzeichnet und manche Ähnlichkeit mit der Curarevergiftung aufweist. Die Ursachen des Giftigwerdens der Muscheln-) sind noch nicht mit Sicherheit festgestellt. Es existiert darüber eine Menge Erklärungsver- suche, welchen jedoch vorläufig nur die Bedeutung von Hypothesen bei- gelegt werden kann. Den Beweis dafür, daß die Stagnation des die Muscheln um- gebendenWassers die Ursache derGiftigkeit sein kann, erbrachte in Übereinstimmung mit den früheren Angaben von Criiwpc und Permewan ^) Schmidtmann *) , indem er giftige Muscheln aus dem Hafen in offenes See- wasser brachte und umgekehrt frische , ungiftige Muscheln in den Binnen- hafen überführte , wobei er nach längerem Aufenthalte der Tiere am neuen Standorte im ersteren Falle die Giftigkeit verschwinden, im letzteren Falle eintreten sah. Zum gleichen llesultate gelangte kürzlich Thesen^) in Christiania. welcher auch nachwies, dali die Bodenbeschaffenheit an dem Standorte der ^Muscheln für das Giftigwerden derselben ohne Bedeutung ist. Wir müssen jetzt annehmen, daß in dem die Muscheln umgebenden stagnierenden Wasser eine bestimmte, nicht zu jeder Zeit vorhandene Verunreinigung sich findet, welche entweder durch a) Hervorrufen einer Krankheit bei den Muscheln die Bildung des Giftes im Organismus verursacht, oder daß b) die in dem Wasser vorhandene ^'erunreinigung selbst das Gift ist. und daß letzteres von den Muscheln nur aufgenommen und aufgespeichert wird. Die Fähigkeit der Muschehi, aus dem Wasser nicht allein das atropin-curarin- artig wirkende, für die Wirkung an Menschen und Tieren verantwortliclie, spezifische (Tift, sondern auch andere stark wirksame Substanzen (Curare. Strychnin) aus dem Wasser aufzunehmen und aufzuspeichern, hat Thesen durch Aquariumversuche dargetan. Hierbei l)lieben die Muscheln scheinbar ganz gesund. Über die chemische Natur des Giftes ist wenig bekannt. Salkowski'^) fand, daß dasselbe mittelst Alkohol aus den Muscheln extra- hiert werden kann und durch Erhitzen auf 110° seine Wirksamkeit nicht verliert, während Einwirkung von Natriumkarbonat in der Wärme das Gift zerstört. Brieger^) isolierte aus giftigen Muscheln einen von ihm ..Mytilo- toxin" genannten Körper von der Formel CßHigNOa, welcher nach diesem Autor das spezifische, curarinähnlich wirkende Gift der Miesmuschel sein ^) Vgl. hierzu besonders .7. Thesen, Über die paralytische Form der Vergiftung durch Muscheln. Archiv f. exp. Patholog. u. Pliarmak. Bd. 47. S. 311 (1902). -j Vgl. Husemann, Handbuch der Toxikologie. S. 277 (1862). ") Lancet. Vol. 2. p. 568 (1888). ■*) Zeitschr. f. Medizinalbeamte. Nr. 1 und 2 (1887). Vgl. auch ]'irchotrs Archiv. Bd. 112. S. 550 (1888). 5) Archiv f. exper. Path. u. Pharmak. Bd. 47. S. 311—359 (1902). 8) Virchows Archiv. Bd. 102. S 578—593 (1885). ') Deutsche med. Wochenschr. Bd. 11. S. 907. Xr. 53 (1885). Die Ptomaine. Bd. 3. S. 65-81 (1886). Virchous Archiv. Bd. 115. S. 483 (1889). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^7;', soll, ein in Würfeln kristallisierendes (xolddoppelsal/ vom Schmelzpunkt 182" bildete und bei der Destillation mit Kalilaui>e Triniethvlamin abspaltete. Ob in dem „Mytilotoxin" in der Tat der wirksame Körper der giftigen Muscheln vorhegt , muß vorläufig- noch dahingestellt bleiben. Thesen ' ) konnte bei der Verarbeitung eines groben Materials, in Portionen von je ö k(/ giftiger Muscheln, in keinem Falle das „Mytilotoxin" aus diesen isolieren. Mäuse gingen an den Wirkungen des von Thesen nach dem Ver- fahren von Brieger aus Giftmuscheln dargestellten (xiftes an Herzlähmung zugrunde: die von den Autoren beschriebene curarin-atropinartige, lähmende Wirkung des Muschelgiftes auf die Respiration sah Thesen bei seinen Tier- versuchen mit dem gereinigten Gifte nicht eintreten. Pilch(i-) bat neuerdings einen von ihm ,,Mytilocoiii2:estiu" genannten Körper, angeblich in ^luscheln vorkommend, als Träger der Giftwirkung beschrieben. Die Lokalisation des Giftes im Organismus der Muschel betreffend, ist zu sagen, daß Wolf'^) dasselbe ausschließlich in der Leber fand. So- fern es sich um die Aufnahme des präformierten Giftes aus dem Wasser handeln sollte, würde sich eine derartige Lokahsation des Giftes im Ein- klänge mit den Erfahrungen mit mancherlei Giften bei anderen Tieren finden. Die Tatsache, daß die Leber die verschiedensten Gifte zurückhalten kann . steht fest. Bei den Vergiftungen mit Aiistcru, Ostrea edulis, ist es nach dem vorliegenden literarischen Material schwer zu entscheiden, inwiefern die Erscheinungen bei derartigen Fällen auf die Anwesenheit eines spezifischen, dem Muschelgift ähnlichen , vielleicht mit diesem identischen Gifte oder aber auf Fäulnisgifte zurückzuführen sind. Gliederfüßer, Arthropoda. L Klasse. Spinnentiere. Arachnoidea. Die Giftigkeit mancher Arachnoideen ist durch zahlreiche Unter- suchungen und ^Mitteilung \ieler glaubwürdiger Beobachtungen heute mit Sicherheit festgestellt. Die Giftapparate sind ebenfalls genauer untersucht und nur über die chemische Natur der betreffenden (iifte sind unsere Kenntnisse noch mangelhaft, was wohl hauptsächlich auf die große Schwierigkeit der Beschaffung ausreichender Mengen des nötigen Tiermaterials zurückzuführen ist. Am besten bekannt und in bezug auf die uns hier interessierenden Verhältnisse am genauesten untersucht ist die. eine Ordnung der Arachnoideen bildende 1) a. a. 0. S. 359. -) Compt. rend. soc. biolog. T. 02. p. 358— 60; Aiiual. de riustitnt l'axtciir. T. 21 (1907). Malijs Jahresber. Bd. 37. S. 802 (1908). ^) M. Wolf, Die Lokalisation des Giftes in den Miesmuscheln. I7rc/io/r.s' Arcliiv. Bd. 103. S. 187-203 (1886). 874 E. St. Faust. a) Ordnung Scorpionina. Arthrogastra, Glieder spinnen. Der Giftapparat der Skorpione liegt in dem letzten Segmente des aus zahlreicheren Gliedern zusammengesetzten , schmalen und sehr beweg- lichen Abdomens und besteht aus einer das Gift sezernierenden, paarigen, birnförmigen , in eine harte Hülle eingeschlossenen Giftdrüse und dem Stachel. Die kapselartige Hülle endigt in einer scharfen, gekrümmten Spitze. Die Ausführungsgäuge der Drüse liegen in dem Stachel und münden unterhalb der Stachelspitze mit zwei kleinen Öffnungen. Die Drüse ist von einer Schicht quergestreifter Muskeln umgeben, durch deren willkürlich erfolgende Kontraktion das Giftsekret nach außen entleert werden kann. Die Einverleibung des Giftes geschieht in der Weise, daß der Skorpion das Abdomen hoch emporrichtet und dann bogenförmig nach vorn biegt, während er seine Beute mit den Kiefern festhält, das zu stechende Tier also vor sich hat. Nach erfolgtem Stiche, durch welchen das Gift dem Beutetier oder dem Gegner einverleibt wird, bleibt der Stachel meistens noch geraume Zeit in der Wunde , während das Sekret der Giftdrüse durch den mittelst Kontraktion der sie umhüllenden ^luskulatnr l)ewirkten L)ruck in die Stich- wunde gepreßt wird (Joijeux-Lajfuie).'^) Die chemische Natur der in dem Giftsekret der Skorpione vorkommenden wirksamen Stoffe ist unbekannt. Die Wirkungen des Sekretes sind dagegen durch Beobachtungen an vergifteten Menschen und durch Versuche an Tieren in ihren (h-und- zügen bekannt, doch fehlt bis jetzt eine genauere pharmakologische Ana- lyse derselben. Dabei ist zu berücksichtigen, daß. wie bei den Schlangen- giften, auch hier die Gifte verschiedener Spezies wahrscheinlich quantitative und ([ualitative Unterschiede in ihren Wirkungen aufweisen und daß die Lokalität der Stichwunde, die Menge des einverleibten Giftes, die Jahres- zeit-) und andere Umstände eine Rolle spielen können. Der Stich des in ganz Südeuropa vorkommenden Scorpio europaeus scheint beim Menschen nur Schmerz, Kötung und Schwellung, also nur lokale Erscheinungen zur Folge zuhaben, während der bedeutend größere, eine Länge bis zu 8V2 cw^ erreichende, ebenfaUs in Südeuropa, aber weniger häufig vorkommende Scorpio occitanus durch seinen Stich äußerst heftige Schmerzen, phlegmonöse Schwellung der ganzen betroffenen Extremität und außerdem entferntere Wirkungen: Erbrechen. Ohnmacht, ]\luskelzittern und Krämpfe hervorrufen kann, ^j M Sur l'appareil venimeux et le venin du Scorpion. Archiv de Zoolno-ie exp. T. 1. p. 733 (1884) und (Jompt. rend. T. 95. p. 866 (1882). -) (t. Sa»a)-cJIi, Über Blutkörpcrchenveränderiino-cn bei Sknrpionensticli. Zentrnl- blatt f. klin. Med. Bd. 10. S. 153 (1889). ^) Joiisset de Bcllcsme, Essai sur le venin du scorpion. Aniial. des sciences natur. Zool. (5.) T. 19. p. 15 (1874). Darstelluiig und Nachweis tierischer Gifte. 375 Tödlich verlaufene Vergiftungen von Menschen durch Skor- pionenstiche sind in der Literatur in ziemlicher Anzahl beschrieben, doch handelt es sich in diesen Fällen um die iiTolien, in tropischen Ländern einheimischen Skorpionenarten. Gui/on^) berichtet über sechs innerhalb 12 Stunden tödUch verlaufene Fälle, und Cavaroz'^) iiil)t an, daß in der (legend von Durango in Mexiko jährlich etwa 200 ^lenschen infolge von Skorpionenstich zugrunde gehen. Dieser Autor sah dort ?> Fälle mit töd- lichem Ausgang, wovon zwei Erwachsene betrafen. Dalange^) berichtet über drei in Tunis an Kindern beobachtete F'älle von Vergiftungen durch Androctoiius funestus und A. occitanus. Zwei dieser Kinder starben innerhalb 6 Stunden, das dritte Kind blieb am Leben. Die Symptome der schweren, durch die großen tropischen Skorpione verursachten ^ ergiftungen bestehen in heftigen Lokalerscheinungen und nach der Resorption des Giftes in Trismus, schmerzhafter Steifheit des Halses, welche sich bald auch auf die Muskeln des Thorax fortpflanzt und schließHch in allgemeinen tetani sehen Krämpfen, unter welchen, an- scheinend durch Iiespirationsstillstand, der Tod erfolgt. Aus dem li). Jahrhundert liegen Untersuchungen vor von Bert*). Valentin'''), Joyeiix-Lafuie^), denen zufolge das Gift seine Wirkuns^eii nach Art des Strychnins auf das Nervensystem entfaltet, während Jousset de Bellesme'') und Sanarelli^) in demselben ein Blutgift erblicken wollen. Die Wirkungen des Skorpionengiftes auf das Blut beobachtete Jousset de Bellesme an Li IIa viridis, einer durch Pigmentarmut ausge- zeichneten und deshalb zu diesen Experimenten besonders geeigneten Froschart. Die Haut der durch den Skorpionenstich verletzten Extremität färbte sich bald rotviolett; diese Färbung, welche nach genanntem Autor auf kapillare Hyperämie zurückzuführen ist, dehnte sich dann bald über den ganzen Rumpf aus. Li den oberflächhchen Gefäßen schien das Blut geronnen, während an gewissen Schleimhäuten Ecchymosen auftraten, woraus man vielleicht auf eine Veränderimg in den Wandungen der Ka- pillaren schließen darf. Die roten Blutkörperchen werden durch das Gift ^) Gwjon, Du danger pour rhoramc de la piqüre du graiid scorpion du nord de l'Afrique (Androctonus funestus). Compt. rend. T. 59. p. 533 (18G4). Sur uu phenoniene produit par la piqüre du scorpion. Compt. rend. T.ti4. p. 1000 (1867). Vgl. auch Compt. rend. T. 60. p. 16 (1865). -) M. Cararoz, Du scorpion de Durango et du Ccrro de los remedios. Recueil de Memoires de Medecine militaire. (3.) T. 13. p. 327 (1865). ^) DaJa)ige, Des piqüres par les scorpions d'Afrique. Memoires de Mödecine mi- litaire. Nr. 6 (1866). Gui/on, Compt. rend. (1864.) •*) P.Berf, Venin du scorpion. Compt. rend. Soc. Biol. 1865 und Gaz.med.de Paris, p. 770 (1865); Compt. rend. Soc. Biol. p. 574 (1885). *) G.Valentin , Einige Erfahrungen üher die (jiftwirkung des nordafriknuisclieu Skorpions. Zeitschr. f. Biol. Bd. 12. S. 170 (1876). ") loc. cit. ') loc. cit. ^) loc. cit. 876 E. St. Faust. in der Weise beeinflußt, daß sie zunächst ihre Form und Konsistenz än- dern, klebrig werden und infolge der Bildung einer formlosen, viskosen ]\lasse die Gefäße verstopfen (Embolie). Sanarelli konnte bei Säugetieren keine derartige A'eränderung der Erythrozyten beobachten; an den gekernten roten Blutkörperchen von Am- phibien, Fischen und Vögeln trat die hämolytische AVirkung deutlich hervor. Über die für verschiedene Tiere tödlichen Mengen des Skorpionengiftes stellten P.Bert, Culmette^), Fhisalix und Varigny-), Joyenx-Lafuie Versuche an. Calmette fand , daß 0'05 my Trockenrückstand des Giftsekretes von Scorpio (ButLiis) afer weiße Mäuse, 0'5 mg Kaninchen unter ähnlichen Erscheinungen wie ..Schlanu'engift"' töteten. Phisalix und Voriyny sammelten die auf elektrische Reizung in Tropfenform am Stachel austretende viskose Flüssigkeit auf einem Uhr- glas, ließen das so gewonnene Sekret im A'akuumexsikkator eintrocknen und bestimmten den Trockenrückstand , von welchem OT mg ein ^leer- schweinchen tötete. Die oben geschilderten Erscheinungen treten nur nach subkutaner oder intravenöser Einverleibung des Giftes ein. Bei der Einverleibung per OS scheinen keinerlei Wirkungen zu erfolgen. Die Skorpione besitzen eine hochgradige, aber nicht absolute Immu- nität gegen ihr eigenes Gift {Boiirne^). Die Möglichkeit einer Gewöhnung an das Skorpionengift oder einer Immunisierung gegen dasselbe ist bisher an Tieren noch nicht experimen- tell geprüft worden, doch ist hier der Angabe von Calmette^) zu gedenken, daß das Serum eines gegen Kobragift immunisierten Kaninchens die Wir- kungen von Skorpionengift zu neutralisieren vermag. Gegen Mperngift immunisierte Aleerschweinchen vertrugen 1 — 2 my Skorpionengift, von welchem sonst Oi my diese Tiere tötete. h) Ordnung Araneiua. Der Giftapparat der echten Spinnen besteht aus der oberhalb des starken, kräftig entwickelten BasalgUedes der CheUzeren (klauenförmige Mandibeln. Kieferfühler) oder in demselben liegenden, länglichen und von Muskeln umgebenen Giftdrüse und deren Ausführungsgang, welcher so- wohl das Basalglied als auch das klauenförmige, zum Verwunden dienende, aber viel kleinere Endglied durchsetzt und in einer länglichen Spalte an dessen Spitze mündet. 1) Calmette, Contributious ä retude des veuins etc. Auual. de Plastitut Pasteur. T. 9. p. 232 (1895). ^) C. Phisalix et H. de VarigHi/, Recberches exp. sur le veiiiu du scorpioii. Bull, du Musöum d'Histoire Natur. T. 2. p. 67— 73. Paris 189G. ^) Ä.G.Bourne, Scorpion virus. Nature. Vol. 38. p. 53 (1887). The reputed sui- cide of Scorpions. Proc. roy. Soc. Vol. 42. p. 17 — 22 (1887). ■•) Calmette, loc. cit. Darstellung nnd Nachwois tiorischor Gifte. 37" Das Sekret der Giftdrüse, das Spiimen^irt , ist eine klare, ölige Flüssigkeit, reagiert sauer und schmeckt stark bitter. Wie bei den Schlangen wird der Giftvorrat durch wiederholte, rasch aufeinander folgende Bisse bald erschöpft. Die Einverleibung des giftigen Sekretes erfolgt beim Beißen in die durch die Chelizeren gemachte Wunde. Die chemischen Eigenschaften und die Natur der wirk- samen Bestandteile des Spinnengiftes sind unbekannt. Das wirk- same Prinzip soll weder ein Alkaloid, noch ein Glykosid, noch eine Siiure sein. Es dialysiert nicht und wird beim Eintrocknen unwirksam. Das Sekret der Giftdrüsen und die wirksamen wässerigen Extrakte aus den in Betracht kommenden Körperteilen der Spinnen lassen die Gegenwart von Eiweiß oder eiweißartigen Stoffen durch die bekannten Fari)en- und Fällungsreaktionen erkennen. Man nimmt daher an, daß es sich hier um die Wirkungen eines Toxalbumins oder eines giftigen Enzyms handle (Kobcrt^). Die wichtigsten und bekanntesten Giftspinnen sind: Nemesia caementaria Latr., die Minier- oder Tapezierspinne. Theraphosa avicularia Linn. s. Avicularia vestiaria de (ieer.. die Vogelspinne. Theraphosa Blondii Latr., die Buschspinne. Theraphosa Javanensis Walck. Die drei genannten Spinnenarten sind stark behaart und haben ihrer Körpergröße entsprechend große Giftapparate und daher auch einen größeren Giftvorrat. Es ist nicht bekannt, ob das Gift auch quantitativ wirksamer ist als das der anderen (iiftspinnen. Sie sollen selbst kleine Warmblüter überfallen und töten. Sie gehören zur Gruppe der sogenannten „Mygalidae", Riesenspinnen oder Würgspinnen und finden sich nur in tropischen Ländern. Cremer-) berichtet über tödlich verlaufene Bisse bei vier Mitgliedern einer Familie. Chiracanthium nutrix Walck. Theridium tredecim guttatum F. s. Lathrodectes tredecim guttatus, die Malmignatte, deren Biß bei 12 "/o der gebissenen Ilinder den Tod (Szczesnowicz) verursacht. Theridium lugubre Koch s.Lathrodectes lugubris, L. Erebus^), die Karakurte. Das Gift ist nicht allein in der Giftdrüse vorhanden; es findet sich in den verschiedenen Körperteilen der Spinne und konnte auch in den Eiern nachgewiesen werden. Es diffundiert nicht und wirkt nur bei subkutaner oder intravenöser Einverleibung. Lycosa Tarantula L. s. Tarantula Apuliae Bossi, die süd- itahenische Tarantel. Bir Biß ist wenig gefälniicli und verursacht mir lokale Erscheinungen an der Bißstelle, niemals aber Allgemein- 1) R. Kobert, Beiträge zur Kenntnis tler Giftspinnen. Stuttgart lüül. 2) Schmidts Jahrbücher. Bd. 225. S. 239. Siehe auch Bd. 146. S. 238. '^) Vgl. hierzu Thoreil, Remarks on Synonyms cf European Spiders, p. 509. London 1870—73. 378 E. St. Faust. erscheiiiuiigeii, die auf resorptive Wirkungen zurückgeführt weiden könnten. Lycosa singoriensis Laxmann s. Trocliosa singoriensis, die russische Tarantel. Bei subkutaner und intravenöser Injektion der durch Extraktion dieser Spinnen mit physiologischer Kochsalzlösung oder Alkohol gewonnenen Auszüge ließen sich an Katzen keinerlei Erscheinungen wahrnehmen ( Robert ). Epeira diadema Walck., die gewöhnliche Kreuzspinne. Die Giftigkeit der Kreuzspinne ist vielfach bezweifelt worden, neuer- dings aber von Robert^ welcher mit wässerigen Auszügen dieser Spinne an Tieren experimentierte, bestätigt worden. Die Wirkungen des Giftes sind denjenigen des Karakurtengiftes ähnlich: letzteres wirkt jedoch stärker als das Kreuzspinnengift. Dieses findet sich auch in den Eiern der Spinne. Die in einer einzigen weiblichen Kreuzspinne enthaltene Giftmenge soll genügen, um 1000 Katzen zu vergiften [Kobert, loc. cit. S. 184). Nachweis imd pharmakologische Wirkuugen der Spinueugifte. Die nach dem Bisse giftiger Spinnen beobachteten Erscheinungen sind bedingt durch lokale und resorptive Wirkungen. Die lokalen Wirkungen bestehen in mehr oder weniger heftiger Schmerzempfindung, Rötung und Schwellung der Bißstelle und deren Um- gebung, erstrecken sich aber auch in manchen Fällen auf das ganze be- troffene Glied. Die resorptiven Wirkungen des Spinnengiftes, welche nur nach subkutaner und intravenöser Injektion, nicht aber nach der Einver- leibung per OS zustande kommen, betreffen das Zentralnervensystem, die Kreislauf Organe und das Blut. Nach den an verschiedenen Tierarten mit dem Gifte der Karakurte in großer Zahl ausgeführten ^\n■suchen scheint das Gift dieser Spinne, welches in Ermangelung mit den Giften anderer Spinnenarten ausgeführter Untersuchungen vorläufig als Prototyp für die Wirkungen der Spinnengifte im allgemeinen gelten muli, mancherlei Ähn- lichkeiten mit den Wirkungen des Ilicins und Abrins zu zeigen (Kobert). Die Wirkungen des Karakurtengiftes auf das Blut (Hund) äußern sich in der Auflösung der roten Blutkörperchen und dem Austritt des Hämoglobins aus den letzteren (Hämolyse). Diese Wirkung tritt noch liei einer Verdünnung des Giftes von 1:127.000 ein. In wässerigen Auszügen von Kreuzspinnen findet sich nach Sachs eine ,.Arachnolysin'' genannte Substanz, welche ebenfalls die Erythrocyten bestimmter Tierarten (Mensch, Kaninchen, Ochs, Maus, Gans) zu lösen vermag^), während die roten Blutkörperchen anderer Tiere (Pferd. Hund, Hammel, Meerschweinchen) nicht angegriffen werden. ^) Sachs, Zur Kenntnis des Kreuzspinueiigiftes. Hofmeisters Beiträge zur chemi- schen Physiologie usw. Bd. 2. S. 125 (1902). Darstellung und Xachweis tierischer Cüfte. g79 Außerdem steigert dasselbe, wenigstens auljerhalb des Organismus im Reagenzglasversuche, die Gerinnbarkeit des Blutes (Pferd). Diese letztere Wirkung, welche noch bei einer Konzentration von 1 : 60.000 eintritt, kommt vielleicht auch im Organismus des lebenden Tieres zustande und ist dann für die bei manchen Tierversuchen, aber nicht regelmällig beobachtete intravaskuläre Gerinnung des Blutes verantwortlich. Diese würde ungezwungen das Zustandekommen der ebenfaUs nicht regelmäßig l)eol)- achteten Konvulsionen erklären (vgl. die Versuchsprotokolle Koherts). Die Konvulsionen wären dann als Erstickungskrämpfe zu deuten, bedingt durch das Darniederliegen der Zirkulation. Diese Annahme findet eine Stütze in der von Kohert gemachten Erfahrung, daß künstliche Be- spiration den letalen Ausgang nicht hinauszuschieben oder zu vei'hindern vermag. Der (xrad der gerinnungsbefördernden "Wirkung im Organismus ist vielleicht abhängig von der Menge des einverleil)ten oder resori)ierten Giftes (vgl. unter Schlangengift, Pseudechis porphyriacus, S. 841 ). Auf das isoherte Froscliberz wirkt das Karakurtengift lähmend : diese Wirkung tritt noch bei einer Verdünnung des Giftes von 1 : 100.000 ein. Die Ursachen der Herzlähmung sind entweder in der Lähmung der motorischen GangUen dieses Organes oder in einer direkten Wirkung auf den Herzmuskel, vielleicht in beiden der genannten Wirkungen zu suchen. Die Folgen der letzteren äußern sich in dem Sinken des Blut- druckes. Seitens des Gefäßsystems scheinen besonders die kleinsten Arterien und die Kapillaren von der Wirkung des Giftes in der Weise betroffen zu werden, daß die Wandungen derselben Veränderungen erleiden und infolgedessen das Blut bzw. Serum durchlassen. Daher treten punktförmige und zirkumskripte Blutungen und Ödeme auf. Am häufigsten uud am besten sind diese Ödeme in dem lockeren Lungen- gewebe zu erkennen: man findet deshalb bei der Sektion die Lunge häufig mit lufthaltiger, schaumiger und manchmal blutiger Flüssigkeit infiltriert. Auch im ]\Lagen und im Darme treten derartige Erscheinungen auf, wo sie in der Hegel an der Schwellung und Rötung der Schleimhaut zu er- kennen sind: manchmal kommt es auch hier zum Blutaustritt. Throml)Osie- rung der Gefäße kann dabei wohl auch eine Rolle spielen, doch würde die Verstopfung der Gefäße aUein kaum die Blutextravasate usw. ei'klären können. Die Wirkungen des Karakurtengiftes auf das Zentralnerven- system äußern sich in Lähmungserscheinungen, über deren Ursachen vor- läufig ein sicheres Urteil nicht gefällt werden kann. Vielleicht handelt es sich um eine direkte lähmende Wirkung, doch ist zu berücksichtigen, daß die oben geschilderten Kreislaufstörungen ähnliche Erscheinungen seitens des Zentralnervensystems bewirken könnten. Insbesondere findet in dieser Annahme das Auftreten von Krämpfen eine befriedigende Erklärung, nach- dem doch eine erregende Wirkung des (iiftes auf das Zentralnervensystem nicht beobachtet wurde. Die tödlichen Meugeu des Giftes sind bei seiner Injektion in das Blut äußerst kleine. Katzen sterben schon nach intravenöser ySO E. St. Faust. Einverleibung von 0'20 — 0"o5 m^^ organischer Trockenrückstiincle wässeriger Spinneuausziige pro Kilogramm Körpergewicht; Hunde scheinen weniger empfindlich zu sein. Der Igel ist auch diesem (üfte gegenüber resi- stenter als andere Tiere. Frösche werden erst durch die oOfaclie Menge der für Warnd)lüter pro Kilogramm letalen Menge getötet. Durch wiederholte Einverleibung nicht tödlicher Mengen kann an- gebhch G-e Wohnung an das Spinnengift eintreten. Über die am Menschen nach dem Bisse giftiger Spinnen, ins])eson- dere der Lathrodectesarten beobachteten Symptome hat Robert in seiner Monographie Berichte aus Asien, Austraüen und Europa zusammengestellt. Die an zahlreichen ( )rten am Menschen gemachten Beobachtungen stimmen im wesentlichen mit den \ ersuchen an Tieren überein. Die Symptome dieser Vergiftung beim Menschen bestehen in heftigen Schmerzen, zu welchen sich auch Btötung und Schwellung (Lymphangitis und Lymph- adenitis) gesellen kann. Die Schmerzen sind nicht auf die Bißstelle und das betroffene Glied beschränkt. Erbrechen, Angstgefühl, Dyspnoe und Be- klemmung, Ohnmachtsanfälle, Parästhesien , Paresen und zuweilen auch Krämpfe sind die am häufigsten beobachteten Erscheinungen. Die völlige Rekonvaleszenz erfolgt in manchen Fällen nur langsam, wobei große Mattig- keit und Abgeschlagenheit noch lange Zeit bestehen können. c) Acarina, Milben. Die Mundteile sind mit gewissen \'orrichtungen ausgestattet , mit welchen die Tiere beißen, stechen oder saugen können. Über das Gift der Milben und dessen Natur ist nichts be- kannt. Die immerhin nicht geringfügigen und lange dauernden Erschei- nungen nach ihrem Bisse machen die Anwesenheit eines reizenden Stoffes, welcher beim Biß oder Stich in die Wunde gelangt, sehr w-ahrscheinlich. 2. Klasse. ^lyriapoda, Tausendfüßer. a) Ordnung Chilopoda. Die der Ordnung der Chilopoden angehörigen Myriapoden sind mit einem Giftapparate ausgestattet, dessen sie sich zum Erlangen ihrer Beute bedienen. Die Beute wird durch Biß getötet. Spinnen und Käfer sind gegen den Biß der Myriapoden sehr empfindlich, Skorpione scheinen der Wir- kung des Giftes nur schwer, die ]\Iyriapoden selbst derselben kaum zu er- liegen. Der Oiftapparati) der Scolopendra besteht aus einer zylindri- schen, sich nach vorn verschmälernden (Tiftdrüse und ihrem Ausfüh- rungsgange, welcher an der Spitze des Kieferfußes in einer kleinen 1) O.Dubosq, La glande venimeuse de la Scolopeiidre. These de Paris (1894). Compt. rend. T. 119, p. 355 (1895). Arch. de Zool. experim. (3.) T. 4. p. 575. Les glandes ventrales et la glande venimeuse de Chaetochelyux vesuviana. Ygl.Zool.Zentralbl. Bd.3. S. 280. Kecherches sur les Chilopodes. Arch. de Zool. experim. T. 6. p. 535 (1899). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ggj^ Öffnung- mündet. Der ganze Giftapparat liegt innerhalb der KiefeiiiUie, welche umgebildete oder modifizierte Brustbeine (erstes Paar) darstellen. Die chemische Natur des Sekretes der Giftdrüse und der Avirksamen Bestandteile dieses Sekretes ist unbekannt. Beim Menschen verursacht der BiC) einheimischer Scolopendren nur lokale Erscheinungen. Es bildet sich meistens nur eine kleine Quaddel an der Bißstelle, doch süll im Sommer der Biß oft Entzündungen von erv- sipelartigem Charakter verursachen, so daß die zunächst an der Bißstelle auftretende Schwellung und Piötung sich über die ganze betroffene Ex- tremität verbreiten kann. Allgemeine Erscheinungen treten nie auf (Duhosq). Eine in Indien einheimische Art, welche eine Länge von 2 Fuß erreichen soll, tödet angeblich durch ihren Biß auch Menschen. M Mäuse und Murmel- tiere werden durch den Biß von Scolopendren gelähmt und gehen an den Wirkungen des Giftes zugrunde {Joiirdain-). h) Ordnung Chilognatha s. Diplopoda. Eine Anzahl der Ordnung der Chilognathen angehörige Myriu})oden besitzen in dem Sekrete gewisser Hautdrüsen Schutzmittel gegen P'einde. Diese Sekrete enthalten flüchtige, zum Teil unangenehm riechende, manch- mal auch ätzende Stoffe und werden durch Poren, sogenannte ..Foramina repugnatoria"' ^j, welche auf beiden Seiten des Rückens liegen, nach außen entleert. Über die chemische Natur derartiger von Myriapoden ausgeschie- dener, flüchtiger Stoffe liegen in der Literatur mehrere Angaben vor, nach welchen es sich bei Fontaria gracilis*) und Fontaria virginica^) um einen in Benzaldehyd und Blausäure spaltbaren Körper, bei Julus terre- stris^) um Chinon und bei Polyzonium rosalbum-) um einen nach Kampfer riechenden Stoff handeln soll. Spirostrephon lactarima sezer- niert ein milchiges, sehr übelriechendes Sekret. Ein besonderes Interesse beansprucht die Angabe, daß gewisse in den Tropen einheimische Geophilusarten in bestimmten, an der Bauch- fläche gelegenen Drüsen ein zu einer viskosen Masse erstarrendes Sekret 1) O.r.Linstow, Die Gifttiere. S. 111. Berlin 1894. 2) S. Jourdain, Le venin des Scolopendrcs. Compt. rend. T. 131. p. 1007 (1900V 3) M. Weher, Über eine Cyanwasserstoff bereitende Drüse. Archiv f. niikr. Auatomio. Bd. 21. S. 468-475 (1882). *) C. Guldensteeden-Egeling , Über die Bildung von Cyanwasserstoffsäure bei einem Myriapoden. Ffliif/ers Archiv. Bd. 28. S. 57(5 (1882). 5) E.D. Cope, A Myriapod, which produces Prussic Acid. Amer. Naturalist. Vol. 17. p. 337 (1883). — E. Hause, Eine Blausäure produzierende Myriapodenart, Paradesmus gracilis. Sitzungsber. d. Ges. naturforsch. Freunde. S. 97 (1889). ß) r.Phisali.r, Un venin> volatil, secretiou cutanec du Julus terrestris. Compt. rend. T. 131. p. 955 (1900). — Belial und Phisalix, La quinone, principe actif du venin du Julus terrestris. Compt. rend. T. 131, p. 1004 (19(_)0). ') 0. F. Cool; Camphor secreted by an aninuil (Polyzonium). Science, N. S. Vol. 12. p. 516 (1900). Abderhalden, Handbuch der biochemisphen Arbeitsmethoden. II. 56 882 E. St. Faust. bereiten, welches prachtvoll phosphoresziert, und die Tiere daher hei ihren Bewegungen einen Lichtstreifen nach sich zu ziehen scheinen. \) 3. Klasse. Hexapoda, Insekten. a) Ordnung Hymenoptera, Hautflügler. Unterordnung Äcideata, Stech-Immen. Familie Apidae, Bienen. Aculeaten nennt man diejenigen Hymenopteren (Hautflügler), welche mit einem Stachel (Aculeus) versehen sind und mittelst dieses Stachels Stichwunden verursachen können. Gleichzeitig mit dem Stich erfolgt auch eine Entleerung giftiger Flüssigkeit in die Wunde. über die anatomischen Verhältnisse des Stachelapparates, auf welche hier nicht eingegangen werden kann, finden sich ausführliche Angaben bei Sollmann, Zeitschr. f. Wissenschaf tl. Zoologie. S. 528 (1863) und bei Kraepelin, ebenda. S. 289 (1873). Über die chemischen Eigenschaften des Bienengiftes Hegen Unter- suchungen von Brandt und Batzeburg"), von Paul Bert ^), dessen Angaben sich auf das Gift der Holzbiene (Xylocopa violacea) beziehen, und von Carlet^) vor. Den eingehenden und sorgfältigst ausgeführten Untersuchungen von Josef Langer^) verdanken wir aber in erster Linie unsere Kenntnisse über die chemische Natur und die pharmakologischen Wirkungen des Giftes unserer Honigbiene. Langer sammelte das Gift der Bienen (im g:anzen von etwa 25.000 Stück) in der Weise , daß er das dem Bienenstachel entquellende Gifttröpfchen in Wasser brachte, oder aber, was eine bessere Ausnutzung des Materials gestattete, die dem Bienenkörper fi'isch entnommenen, mit einer Pinzette herausgerissenen Stachel samt Giftblasen in Alkohol von 96% brachte, in welchem sich der wirksame Bestandteil des Seki'etes der Giftdrüse nicht löst. Seine Löslichkeit in Wasser erleidet durch die Alkohol- behandlung keine Veränderung und die charakteristischen Eigenschaften bleiben vollkommen erhalten. Der in Alkohol unlöshche Paickstand wurde bei 40" getrocknet, zu einem feinen Pulver verrieben und dann mit Wasser ausgezogen. Der fil- trierte wässerige Auszug stellte eine klare, gelbhch braune Flüssigkeit dar, welche die für das ganze Giftsekret charakteristischen Wirkungen zeigte. Die Wirksamkeit solcher wässerigen Lösungen des Bienengiftes wird durch zweistündiges Erhitzen auf 100° nicht vermindert. Das frisch entleerte Gifttröpfchen, dessen Gewicht zwischen 0*2 bis Q'?>mg schwankt, ist wasserklar, reagiert deutlich sauer, schmeckt bitter ^) O.F.Cook, a.a.O. 2) Medizinische Zoologie. Bd. 2. S. 198 (1833). ^) Gazette medicale de Paris, p. 771 (1865). ^) Compt.rend. T. 98. p. 1550 (1884). ^) Archiv f. exp. Pathologie. Bd. 38. S. 381 (1897). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. gg3 und besitzt einen eigenartigen, aromatischen Geruch; sein spezifisches Gewicht ist llolS. Beim Eintrocknen bei Zimmertemperatur hinterläßt das native Bienengift etwa 30% Trockenrückstand. Die saure Reaktion des nativen Giftes ist wahrsclieinHch durch Ameisensäure bedingt, welche aber für die Wirkungen des Giftsekretes nicht in Betracht kommt (vergl. Langer, a. a. 0. S. ;>87). Letzteres gilt auch für den flüchtigen Körper, welcher den fein aromatischen Geruch des Giftsekretes bedingt und beim Öffnen einer gut bevölkerten Bienen- wohnung wahrgenommen wird. Zur Darstellung des giftigen Bestandteiles des Sekretes sam- melte Langer 12,000 Stachel samt Giftblasen in Alkohol von 96^0 ; vom Alkohol wurde abfiltriert, die Stachel bei 40" getrocknet und zu einem Pulver zerrieben, letzteres sodann mit Wasser extrahiert. Der klare, bräunlich gefärbte, filtrierte, wässerige Auszug wurde durch Eintropfonlassen in Alkohol von 96 Vo gefällt , der Niederschlag gesammelt, mit absolutem Al- kohol und Äther gewaschen. Nach dem Verdunsten des Äthers hinterbUeb eine grauweiße Substanz in Lamellen, welche noch Biuretreaktion zeigte. Zur weiteren Pteinigung dieses Produktes wurde dasselbe in möglichst wenig reinem oder schwach essigsäurehaltigem Wasser gelöst und durch Zusatz von einigen Tropfen konzentrierten Ammoniaks die wirksame Substanz nach mehrmaligem Lösen und Fällen in eiweißfreiem Zustande erhalten. Die charakteristischen Wirkungen des ganzen Sekretes waren dieser asche- freien Substanz eigen. Die schwach essigsaure Lösung dieses Körpers zeigte keine der bekannten Eiweißreaktionen. Mit einer Pteihe von Alkaloid- reageuzien dagegen gab dieselbe Fällungen. Man ist daher wohl berechtigt, die wirksame Substanz des Bienengiftes als eine organische Base anzu- sprechen. Die nähere chemische Charakterisierung der Base steht infolge der Schwierigkeiten der Beschaffung des zu diesem Zwecke erforderlichen Materials noch aus. Das Bienengift wird zerstört oder seine Wirksamkeit vermindert durch gewisse oxydierende Agenzien, insbesondere durch Kalium- permanganat, aber auch durch Chlor und Brom und ferner durch die Einwirkung von Pepsin, Pankreatin und Labferment, i) Die pharmakologisclien Wirkungen des Bienengiftes charak- terisieren sich als heftig schmerz- und entzündungserregend. Außerdem verursacht es an der Injektionsstelle und deren Umgebung lokale Gowebs- nekrose. Li der Umgebung des nekrotischen Herdes entwickeln sich Hyper- ämie und Ödem. Am Kaninchenauge bewirkten 0'04 mg des nativen Giftes, auf die Konjunktiva appliziert, Hyperämie, Chemosis und darauf eitrige oder kruppöse Konjunktivitis. Auf die unversehrte Haut appliziert, ist das native Bienengift sowie auch eine 2o/oige Giftlösung ohne jede Wirkung. Die Schleim- häute der Nase und des Auges reagieren dagegen in spezifischer Weise. M J. Langer, Ahschwächuug und Zerstörung des Bienengiftes. Archives inter- nationales de Pharmacodynamie et de Therapie. T. 6. p. 181—194; (1899). 56* 884 E. St. Faust. Bei der intravenösen Applikation von 6 cni^ einer l"5"/oi2.'en Gift- lösung (auf natives Gift berechnet) an einem 4*ö kr/ schweren Hunde er- folLiten bald klonische Zuckuniien, die sich sehr rasch zu wiederholten Anfällen von allgemeinen klonischen Zuckungen mit Trismus, Nystagmus und Emprosthotouus steigerten. Das Tier ging unter Respirationsstillstaud zugrunde. Bei der Wirkung am Hunde verdient die Blutkörperchen lösende Eigenschaft des Bienengiftes im Organismus hervorgehoben zu werden. Im mikroskopischen lUutpräparate fanden sich nur wenige intakt erhaltene Erythrocyten; das lackfarbene Blut enthielt sehr viel gelöstes Hämoglobin und zeigte, spektroskopisch untersucht, die Anwesenheit von ^Nlethämoglobin. Die Sektionsbefunde an dem betreffenden Versuchstiere lielien in aUen Organen, mit Ausnahme der Mik, starke Hyperämie und Hämorrhagien erkennen. Pharmakologisch ist das Bienengift vorläufig in die Gruppe der diffu- siblen, Nekrose erzeugenden, nicht flüchtigen Reizstoffe einzureihen, deren Hauptrepräsentant das Cantharidin ist. Von hohem wissenschaftlichen Interesse und von praktischer Bedeu- tung ist die den Imkern schon lange bekannte und von Langer^) genauer studierte Möglichkeit der GeAvöhnung an das Bienengift. Die Immunität gegen das Bienengift scheint niemals eine absolute zu werden. Die Möglichkeit der Immunisierung gegen das in minimalen Mengen wirksame Bienengift ist von wissenschafthcher Bedeutung, weil es sich hier um eine, wenigstens bis zu einem gewissen Grade, chemisch charakterisierte Substanz handelt, die jedenfalls kein Eiweilikörper, kein sogenanntes ,.Toxalbumin" ist. Sollte es gelingen, ein gegen die Wirkungen des Bienengiftes aktives „Antiserunr' zu gewinnen, so wäre damit der Beweis erbracht, daß auch gegen chemisch defiuierbare Körper eine so- genannte ..Antitoxinbildung" möglich ist. Der von den Bienen bereitete Honig besitzt zuweilen giftige Eigen- schaften, welche zu gefährlicher Erkrankung, manchmal sogar zu Todes- fähen Veranlassung geben können. Das \'orkommen giftigen Honigs kann keinem Zweifel unterliegen. W. J. Hamilton^) hat die Erzählung Xcnophons von der (liftwirkung des Honigs zu Trapezunt durch Untersuchungen an Ort und Stelle be- stätigt. Burton^) teilte 1790 viele Fälle von Vergiftungen durch Honig in Pennsylvanien und Florida mit. In Brasilien ist die Vespa Lecheguana wegen ihres giftigen Honigs berüchtigt. In Altdorf in der Schweiz starben (1817) zwei Hirten durch den Genuß des Honigs von Bombus ter- restris. ^) J. Langer, Bienengift und Bienenstich. Bienenvater. Jg. 33. Xr. 10. S. 190— 195 (1901). — Derselbe, Der^Aculeatenstich. Festscliiift für F.J.Pick (1898). -) Reise in Klcinasien usw. Deutsch von Schonibiu-fih. Leipzig 1843. ^) Th. und IL Ilusemann, Handbuch der Toxikologie. S. 274. Berlin 1862. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. j^85 Nach Auhen^) sind in Neu-Seeland, hauptsächlich unter den Maoris, Verg-iftunosfillle durch wilden Honiii- nicht selten. Bei schweren Fällen tritt der Tod schon nach 24 Stunden ein. 2) Der Grund für die Giftiiikeit liegt in dem Umstände, daß die Bienen aus den Blüten gewisser Pflanzen giftige Pflanzenstoffe aufnehmen. Von solchen Giftpflanzen, deren (xiftstoffe durch die Bienen in den Honig übergehen können, sind besonders solche aus den Familien der Apocyneae, Ericaceae^), Kanunculaceae zu nennen. Familie Formicidae, Ameisen. Die nach dem Bisse einheimischer Ameisen auftretenden lokalen Erscheinungen sind sehr unbedeutende. An der Bißstelle pflegt sich nur eine geringfügige Entzündung und höchstens Quaddelbildung zu ent- wickeln. Die durch gewisse tropische Ameisen verursachten Verletzungen sind dagegen ernsterer Natur und können Allgemeinerscheinungen, Ohnmacht, Schüttelfrost und vorübergehende Lähmungen verursachen {Husemann*). Manche Arten von Ameisen (Myrmica, Ponera) haben einen dem Giftapparat der Bienen analogen Stechapparat, d. h. sie besitzen einen mit einer Giftdrüse verbundenen (xiftstachel. Bei anderen Arten Hegt die Giftdrüse in der Nähe des Afters; diese spritzen das Sekret der Giftdrüsen in die durch ihren Biß verursachte Wunde, indem sie den Hinterleil) nach oben und vorn biegen. Die morphologischen \'erhältnisse des Giftapparates der Ameisen hat Forel^) eingehend untersucht und beschrieben. Die chemische Natur des in dem Giftsekret der Ameisen ent- haltenen wirksamen Körpers ist nicht mit Sicherheit festgestellt. Man nahm an, daß die in dem Sekrete in großer Menge vorhandene Ameisen- säure das giftige Prinzip sei, wie das auch bei dem Gifte der Honigi)iene früher geschah. Die schwache, lokal reizende Wirkung des Giftes unserer einheimischen Ameisen könnte allenfalls durch die lokale, ätzende Wirkung der Ameisensäure bedingt sein; für die schwereren, durch gewisse exotische Arten verursachten Erscheinungen kann die Ameisensäure jedoch kaum verantwortlich gemacht werden. Dafür spricht auch die Angabc Sta?ilei/s, der zufolge gewisse afrikanische Völkerschaften sich des (üftes bestimmter roter Ameisen als Pfeilgift ß) bedienen. Durch solche Pfeile verursachte \'er- ») Auhen, British Medical Journal. 1 (1905). Zitiert nach Kiilni. 2) W.Külin, Pharmazeutische Zeitung. Bd. 50. S. 642 (19051. ^) Vgl. hierzu Archangelshji, Über Rhodndendrol, Rhododendrin und Andromedro- toxiu. Archiv f. exp. Patholog. Bd. 46. S. 313 (1901). *) Th. und H.Husemann, Handbuch der Toxikologie. S. 275— 276. Berlin 1862. ^) A. Forel, Der Giftapparat und die Analdrüsen der Ameisen. Zeitschr. f. wissen- schaftliche Zoologie. Bd. 30. Supplement. S. 28 (1878). ") H. M. Sfcoilei/s Briefe über Emiu Paschas Befreiung. Herausgegeben von J. Scott Keltie. Deutsche Übersetzung von H. r. Woheser. 5. Aufl. fc5. 48. Leipzig 1890. 886 E. St. Faust. Avundungen sollen rasch den Tod herbeiführen. Es handelt sich wahrschein- lich um die Wirkungen einer noch unbekannten Substanz, welche vielleicht nach Art des in den Brennhaaren der ostindischen Juckbohne \) ( Negretia pruriens ) oder in der Brennnessel 2) (Urtica dioica) enthaltenen Stoffes wirkt. h) Ordnung Lepidoptera, Schuppenflügler, Schmetterlinge. Die Raupen mancher Schmetterlinge sind nach neueren Untersuchungen unzweifelhaft Gifttiere. Hierher gehören die Raupen von: Cnethocampa processionea Lin., Eichen-Prozessionsspinner, Cnethocampa pinivora Tr., Kiefer-Prozessionsspinner, und Cnethocampa pityocampa Fabr., Pinien-Prozessionsspinuer. Die durch die Prozessionsraupen hervorgerufenen Krankheitserschei- nungen sind seit den Untersuchungen von Beaumur (1756), welcher diese Tiere und ihre Lebensgewohnheiten zuerst genauer beschrieb, gut bekannt. Sie bestehen nach den übereinstimmenden Angaben von Beaumur^), Brock- hause?i*), Morren°), Fabre'^) und anderer Autoren in mehr oder weniger heftiger Entzündung und Schwellung, insbesondere der Schleimhäute der Konjunktiva, des Kehlkopfes und des Rachens; doch kann auch die äußere Haut durch das Eindringen der Haare in einen Zustand ent- zündlicher Reizung (Urticaria) versetzt werden. Die Frage nach der Ursache der geschilderten Wirkungen der Haare dieser Raupen ist durch die Untersuchungen von Fahre entschieden. Nach diesem Autor verursachen die mit Äther sorgfältig extrahierten Haare, die bei dieser Behandlung die Widerhaken nicht verloren, nach der Applikation auf die menschliche Haut keinerlei Erscheinungen, während der nach dem Verdunsten des Äthers zurückbleibende Stoff auf der Haut Schwellung und Bläschenbildung verursachte. Die gleiche \Yirkung auf die intakte Haut zeigte auch das Blut dieser Raupen und in weit höherem Grade die Rückstände von Ätherauszügen der Exkremente dieser Tiere. Fahre dehnte seine Untersuchungen auch auf eine Reihe anderer Lepidopteren aus und fand in dem Harn aller darauf untersuchter Schmetteriinge einen Stoff, welcher auf der Haut heftige Entzündung ver- ') Vogel, Über Ameisensäure. Sitzungsber. d. Akad. d. Wissenschaften in München. Mathem.-phys. Klasse. Bd. 12. S. 344— 355 (1882). -) G. Ilaherlandt , Zur Anatomie und Physiologie der pflanzlichen Brennhaare. Sitzungsbericht d. Wiener Akademie. (93.) Bd. 1.' S. 130 (1886). ^) ReaHinur, Des chenilles qui vivent en societe. Mt^moires pour sen'ir ä l'Histoire des insectes. T. 2. p. 179 (1756) (Morren). *) M. B. Brockhausen, Beschreibung der europäischen Schmetterlinge. Bd. 3. S. 140 (1790). ^) CJi. Morren, Observations sur les moeurs de la processionaire et sur les mala- dies qu'occasionne cet insect malfaisant. Bull, de l'Acad. roy. de Beige. (1.) T. 15. (2.) p. 132—144 (1848). '^) H. J. Fahre, Un virus des Insectes. Annal. des sciences nat. (8.) T. 6. p. 253 ä 278 (1898). Darstellung uacl Nachweis tierischer Gifte. 887 lirsachte. Demnach ist das Vorkommen eines lokal reizenden und Entzün- dung erregenden, nach Art des Cantharidins wirkenden Stoffes nicht auf die Prozessionsraupen allein beschränkt, sondern auch bei anderen Lepi- dopteren erwiesen. Derartig wirkende Stoffwechselprodukte finden sich auch bei anderen Insekten als den darauf untersuchten Lepidopteren und Coleopteren. Fahre hat bei einigen Hymenopteren und Orthopteren eben- falls einen blasenziehenden und sogar Geschwürsbildung verursachenden Stoff nachw'eisen können. Es fragt sich aber, warum von den behaarten Raupen die Prozes- sionsraupen allein die geschilderten Krankheitserscheinungen verursachen. Fahre findet die Erklärung für diese Frage in der Lebensw^eise dieser Tiere, welche sich tagsüber dicht gedrängt in ihren mit Exkrementen stark verunreinigten Nestern aufhalten. Die Exkremente haften an den Haaren der Raupen fest und werden dann mit diesen im Freien zerstäubt, so daß auch ohne direkte IJerührung der Tiere der entzündungserregende Stoff auf die äußere Haut und die Schleimhäute gelangt und dort seine Wir- kungen entfaltet. Für das Vorkommen von lokal reizend wirkenden Stoffen auch bei anderen als den von Fahre untersuchten Lepidopteren sprechen ferner gewisse , bei den in Seidenfabriken beschäftigten Arbeiterinnen gemachten Erfahrungen. An den Händen der Arbeiterinnen, welche mit dem Abspinnen der in heißem Wasser aufgeweichten Kokons beschäftigt sind, bilden sich häufig Bläschen und Pusteln, wobei es zur Eiterung kommen kann und die Hände stark schmerzen [Potton^), Mekhiori")]. Vielleicht handelt es sich hier um die Wirkungen eines im Kokon vorhandenen und aus dem Organismus des Seidenspinners (Bombyx mori) oder dessen Raupe stammenden cantharidinartig wirkenden Stoffwechselproduktes. Zu den aktiv giftigen Lepidopteren sind die Larven der Gattung Cerura Sehr. s. Harpyia Ochs. (Gabelschwanz) zu zählen, welche sich (Juni bis August) an Weiden, Pappeln und Linden finden und bei der Berüh- rung aus einer Querspalte des ersten Ringes unter dem Kopfe (Prothorax) eine stark saure, ätzende Flüssigkeit hervorspritzen. Von Meldola auf ^'er- anlassung von Poulton^) ausgeführte Analysen des Sekretes (Dicranura) er- gaben einen Gehalt desselben von 33— 40Vo wasserfreier Ameisensäure. c) Ordnung Coleoptera, Käfer. Zahlreiche Käferarten besitzen eigenartige Vorrichtungen zur Be- reitung und Absonderung von defensiv zu verwendenden Stoffwechselpro- 1) Potton, Recherches et observations sur le mal de vers ou mal de bassine, eruption vesico-pustuleusc qui attaque exclusivement les fileiises de cocons de vers ä soie. Annal. d'hygiene. T. 49. p. 245—255 (1853). ") G. Melchiori, Die Krankheiten an den Händen der Seidenspinnerinnen. Schmidts Jahrb. Bd. 96. S. 224— 226 (1857). =*) E.B.Foidton, The secretion of pure aqueous formic acid by Lepidopterous Larvae for the purpose of defence. Brit. Ass. Report, p.765 (1887). Trans. Entomological Society. London 1886. 888 E. St. Faust. dukten. Es kann sich dabei um Sekrete bestimmter Drüsen handeln oder aber um Giftstoffe, die im ganzen Organismus der Käfer verl)reitet sind. Im ersteren Falle sind es meistens Anal-, Speichel- oder Tegument- drüsen, die ein spezifisches Sekret von höchst unangenehmem Gerüche oder auch von ätzender AVirkuug liefern. Im zweiten Falle ist das Gift im Blute enthalten. Das Blut kaun an bestimmten Stellen des Körpers, meistens an den Gelenken, an die Oberfläche treten und wirkt dann infolge seines Gehaltes an gewissen Stoffen als Abwehr- oder Yerteidigungsmittel. Virey^) beobachtete zuerst, daß der Maiwurm (Meloe majalis) beim Anfassen eine gelbe Flüssigkeit aus den Beingelenken austreten läßt, Avelche einen ,.scharfen" Stoff enthält. Dieser Autor machte auch darauf aufmerksam , daß gerade diese Käferart, ebenso wie die Canthariden, bei denen eine ähnliche Erscheinung bekannt ist, zu medi- zinischen Zwecken als entzündungserregendes und blasenziehendes Mittel verwen- det wird. Lei/dif/'-) wies dann (1859) an bestimmten Arten von Coccinella, Timarcha uod Meloe nach, daß die aus den Gelenkspalten austretende Flüssigkeit dieselben morpho- logischen Elemente enthält wie das Blut der genannten Käfer, und Cxenot^) konnte sich davon überzeugen, daß dieser wahrscheinlich reflektorische Blutaustritt, von ihm als .,SaigDÖe reflexe" bezeichnet, bei den verschiedensten Chrysomelideu, Coccinelliden und Vesicantien sowie auch bei gewissen Orthopteren (Eugaster und Ephippiger) zu lie- obachteu ist. Auch bei einzelnen Carabiden ist dieser Vorgang beobachtet worden.^) Die Art und Weise, wie das Blut aus dem Körper austritt, ist noch nicht mit Sicher- heit festgestellt. Ist man auch über den Mechanismus des Blutaustrittes noch nicht im klaren, so darf man doch wohl kaum daran zweifeln, daß das auf die eine oder die andere Weise an die Körperoberfläche gelangte Blut eine Schutzwirkung gegenüber den Feinden dieser Tiere entfaltet. Die Ergebnisse und Beobachtungen der diese Tatsache begrün- denden Tierversuche von Cncnot und von Bcaiircgard'') lassen kaum eine andere Deu- tung zu. Die chemische Natur der im Blute der genannten Insekten vorkom- menden scharfen, entzündunsserregenden Stoffe ist mit Ausnahme des im Blute von Lytta vesicatoria L. sich findenden Cantharidins völlig un- bekannt. Über das Cantharidin sind wir al)er chemisch und pharma- kologisch genau unterrichtet. Das Cantharidin wird aus verschiedenen, der Familie der Pflaster- käfer, Vesicantia, angehörenden Lytta-, Mylabris- und Meloearten ge- wonnen. Von diesen ist Lytta vesicatoria. Spanische Fliege, die bekann- teste Art; in getrocknetem Zustande steht dieser Käfer das offizineile Prä- parat „Cantharides'' der deutschen Pharmakopoe dar, welches bis in die neueste Zeit als Diuretikum gegen Wassersucht, bei Krankheiten der Harn- ') ./. ./. Virei/, Bull, de Pharmacie. T. 5. p. 108—109 (1813). 2) Leydig, Archiv f. Anat. S. 36 (1859). ») L. Cuchtot, Bull, de laSoc. zoolog. de France. T.15. p. 12G (1890). Compt.rend. T. 118. p. 875 (1891) und T. 122. p. 328 (1896). Arch.de Zoolog, exper. (3.) T. 4. p.655 (1896). •*) Vgl. Zoolog. Jahresbericht (1895). (C.E.Porter.) ^) Compt. rend. de la Soc. de Biol. (7.) T. 6. p. 509 (1884). Journ. de l'Anat. et de Physiol. T. 21. p. 483 und T. 22. p. 83—108, 242—284 (1886). Les insectes vesicants. Paris (1890). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. gg9 und Geschlechtsorgane, gegen Gicht, bei Bronchitis und vielen anderen Krankheiten innedich angewendet wurde. M Yorgiftungeu mit Canthariden sind keineswegs selten. In der Statistique criminelle von Brunef sind für Frankreich allein für das Jahr 1847 und einige Jahre vorher 20 Giftmorde oder Giftmordversuclie mit Canthariden aufgezählt. In einem Falle wurden während eines Monates hald kleinere, bald größere Mengen von Canthariden in Pulverform den Speisen oder Getränken zugesetzt; in einem anderen Falle, der be- kannten „Affaire Poirier",,war Cantharidenpflaster der Suppe beigemischt worden.-) Auch Selbstmorde durch innerlichen Gebrauch des Cantliaridenpulvers und des Pflasters sind bekannt. Der Mißbrauch von Canthariden zur Herbeiführung von Abortus hat ebenfalls zur Vergiftung mit tödlichem Ausgange geführt. Technische Vergiftungen. Bei der Herstellung der verschiedenen pharma- zeutischen Cantharidenpräparate kann es leicht zu mehr oder weniger schweren \or- giftungen kommen infolge des Einatmens des beim Zerreiben und Pulvern der Can- thariden auftretenden Staubes. Medizinale Vergiftungen durch Canthariden waren früher häufig. Das Cantharidin ist derjenige Bestandteil der Lytta vesicatoria und verwandter Käferarten, welcher die charakteristischen Wirkungen hervorruft. Dasselbe kristallisiert in trimetrischen Tafeln, deren Schmelz- punkt bei 218" liegt und deren empirische Zusammensetzung der Formel C10H1.2O4 entspricht. Es ist in Wasser schwer lösUch, leichter löslich in Alkohol, Schwefelkohlenstoff, Äther und Benzol, sehr leicht löshcli in Chloro- form , Essigsäther und in fetten Ölen. Das Cantharidin hat saure Eigenschaften: aus kohlensauren Alkalien macht es Kohlensäure frei unter Bildung von Alkalisalzen , welche ebenfalls sehr wirksam sind. Durch Säuren wird das Cantharidin aus wässerigen Lösungen seiner Alkalisalze abgeschieden. Nach Untersuchungen von H. Met/er ^) ist das Cantharidin , entgegen filtheren Annahmen , nicht ein Säureafihydrid , sondern ein ß-Lakton einer Ketonsäure, für welches der genannte x\utor die Konstitutionsformel M CH Ho Cr H,c[ GH., ., . CHo ^ GOGH C— GG aufsteht. GH., ') StfidcJ, Über die innere Anwendung der Canthariden. Eine historisclie Studie. Dissert. Berlin 1891. — L. M. v. Galippe , Etüde toxicologique sur rempoisonnement par la cantharidine et par les preparations cantharidiennes. Paris 1876. — Kobevt, Hist. Studien. Bd. 4. S. 119. — B.Forsten, Disquisitio medica Cantharidum. historiam naturalem, chemicam et medicam exhibens. Straßburg 1776. — c. Ä7(ro//', Lehrbuch der Pharmakologie. 4. Aufl. S. 398 (1873). *) Taylor, Die Gifte. Bd. 2. S. 553 (1863). ») Monatsh. f. Chemie. Bd. 18. S. 393—410 (1897) und Bd. 19. S. 707-726 (1898). *) Über die Konstitution des Cantharidins; vgl. auch Picea rcl, llomoJka, Ainler- lini, Spiegel. g90 E. St. Faust. Die Titration ergibt die Amvesenlieit von nur einer Karboxylgnippe. Das Cantharidin ^Yird durcli kocliende Soda-Permanganatlösung nicht verändert, woraus auf einen vollständig hydrierten Kern geschlossen werden kann. Der Cantharidingehalt der verschiedenen Coleopteren variiert inner- halb ziemlich weiter Grenzen , auch bei derselben Art. Warner ^ ) , Bluhm '-), Rennard ^), Beauregard*) u. a. haben die Mengen des Cantharidins quanti- tativ bestimmt. Der brasihanische Tflasterkäfer , Epicauta adspersa, soll 2-5Vo Can- tharidin und Meloe majaUs über 1% enthalten. &) Die Wirkung-en des Cantharidins bei äußerhcher Anwendung charakterisieren sich durch äußerst heftige Entzündungen an der Appli- kationsstelle. Schon in Mengen von weniger als O'l mg in Öl gelöst auf die menschliche Haut gebracht, bewirkt es nach einigen Stunden Blasen- bildung. Infolge seiner Nichtflüchtigkeit durchdringt das in einem die Haut- schmiere lösenden Vehikel auf die Haut gebrachte Cantharidin nur langsam die Epidermis und erzeugt in der Cutis , zunächst aber nicht in den tieferen Schichten, eine exsudative Entzündung, welche zur Bildung von Blasen führt. In ähnlicher Weise wirkt das Cantharidin nach der KesorptJon, auch in Form seiner Alkalisalze , auf die verschiedensten drüsigen Organe, seröse Höhlen und Schleimhäute , wo es zur Ausscheidung kommt und verursacht da eine entzündliche Pteizung. Die Hauptmenge des resorbierten Cantha- ridins wird durch die Nieren ausgeschieden und deshalb kommt es leicht nach Anwendung von Cantharidenpf lästern zu Niere nreizung mit Eiweiß- ausscheidung im Harn und später zur ausgebildeten Nephritis. Außer den oben beschriebenen Wirkungen des Cantharidins auf die genannten Organe wirkt dasselbe nach seiner Resorption aber auch direkt auf das Zentralnervensystem. Katzen und Hunde erbrechen heftig nach subkutaner Injektion von wenigen Milligramm eines Alkalisalzes des Cantha- ridins, die Respiration wirkt stark beschleunigt, dann tritt Dyspnoe und durch RespirationsstiUstand der Tod ein, welchem heftige Konvulsionen vorausgehen können. Gewisse Tiere zeigen gegen das Cantharidin eine relative Immu- nität Frösche und Hühner sind nach den Untersuchungen YonRadecki^) sehr wenig empfindlich. Gaben von 15 — 30 mg Cantharidin, als Kalium- ^) Vierteljahrsschr. f. prakt. Pharmazie. Bd. 6. S. 86—89 (1857). Vgl. auch American Jouru. of Pharmacy. Yol 28. p. 193 (1856). -j C. Bh(hm, Beiträge zur Kenntnis des Cantharidins. Vierteljahrsschr. f. prakt. Pharmazie. Bd. 15. S. 361—372 (1866). ^) E. RenHcird, Das wirksame Prinzip im wässerigen Destillate der Canthariden. Inaug.-Diss. Dorpat 1871. ^) H. Beaurecjard , Recherches sur les insectes vösicants. Journ. de TAnat. et de Physiol. T. 21. p. 483-524 und T. 22. p. 83—108, 242-284 (1886). 5) Bernatzik-Vogl, Lehrhuch der Arzneimittellehre. 3. Aufl. S. 542 (1900). ^) Radecki, Die Cantharidinvergiftung. Inaug.-Diss. Dorpat 1866. — J. Sussnitskij Das Verlialten dei* Hühner gegen Cantharidin. Inaug.-Diss. Königsberg 1903. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. go]^ salz subkutan injiziert, verursachen bei Hühnern keinerlei Wirkung:?; ebenso können Hühner Canthariden und Cantharidin ohne Schaden fressen. Versuche \on Harnack, Horvath, Lewin mu\ ElUnger ^ } ergaben, daß auch der Igel sehr resistent gegen das Cantharidin ist. Ein Igel von 700 ^r zeigt nach intravenöser Injektion von 20 mg keine Nierenstörung. Bei diesem Tiere rufen bei subkutaner Applikation 30 — 50 mg nur eine geringe Nierenschädigung hervor; 100 mg verursachen schwere Nephritis und führen nach einigen Tagen zum Tode. Am Kaninchen bewirkt schon (yi n>g Cantharidin, subkutan in- jiziert, Nephritis und VO mg pro Kilogramm Tier führt den Tod herbei. Die tödliche Dosis für den Menschen ist nicht mit Sicherheit fest- gestellt. Die Autoren nehmen dieselbe allgemein zu etwa O'Oo^ an. Nach den bei der Liebreich sehen Tuberkulosebehandlung mit dem Kaliumsalz des Cantharidins gewonnenen Erfahrungen rufen bereits 0'2 mg häufig Albuminurie hervor. An der Hand folgender Zahlen läßt sich eine Vorstellung von dem Grade der Resistenz verschiedener Tierarten gegenüber dem Canthaiidin gewinnen. 1 g Cantharidin ist eine krankmachende Dosis für 350,000 kg Mensch, 20,000 kg Kaninchen , weniger als 35 kg Igel. lg Cantharidin ist die tödUclie Dosis für 20,000 Ä-(/ Mensch, bOOkg Kaninchen , 7 kg Igel. Ellinger stellte bei bei seinen Versuchen fest, daß beim Igel fast die ganze Menge des einverleibten Giftes durch die Nieren unverändert ausgeschieden wird. Eine Zerstörung des Cantharidins im Orga- nismus des Igels, eine Entgiftung auf chemischem Wege findet also nicht statt. Daraus folgt, daß die Igelniere dem Cantharidin gegen- über im hohen Grade widerstandsfähig ist. Diese Widerstandsfähigkeit der Igelniere scheint eine spezifische für das Cantharidin zu sein, denn ein anderes „Nierengift", das chrom saure Kali nur" , mit welchem Ellinger einen Versuch zur Pjeantwortung dieser Frage anstellte, tötete in der gleichen Dosis, welche für ein Kaninchen letal ist, auch einen Igel, dessen Nieren bei der Sektion die gleichen Veränderungen zeigten, wie sie für diese Verbindung für die Kaninchenniere beschrieben worden sind. Eine Gewöhnung an das Cantharidin tritt auch bei längere Zeit fortgesetzter Einverleibung nicht ein. Der Nachweis einer stattgehabten Vergiftimg mit Canthariden oder Cantharidin für forensische Zwecke gelingt leicht: im ersteren FalK» durch die Auffindung der glänzenden, grünUch schillernden Teilchen der Flügel- decken im Erbrochenen, sowie im Magen- und Darminhalt. Diese werden nur sehr langsam, wenn überhaupt verändert und können noch lange Zeit nach dem Tode nachgewiesen werden. Der Darm wird zweckmäßig auf- *) Ä. Ellinger, Studien über Cantharidin und Cantharidinimmunität. Archiv f. exper. Path. u. Pharmak. Bd. 45. S. 89 (1900) und Bd. 38. S. 424 (1908). 892 E- St. Faust. geblasen, getrocknet und dann mit der Lupe untersucht, falls die Unter- suchung des Darminhaltes nicht schon die Anwesenheit der charakteristi- schen, kaum zu verkennenden Körperteile von Canthariden ergab. Über den chemischen Nachweis des Cantharidins und die Isolierung des letzteren aus dem Inhalt des Magendarmkanals finden sich ausführhche Angaben bei Dragendorff.'^) Auch aus dem Harn kann das Cantharidin in manchen Fällen isoliert werden, wenn große Mengen ein- verleibt wurden. Der Nachweis des Cantharidins kann durch Auftragen seiner Lösung in Olivenöl auf die Haut (Kaninchenohr oder mensclüiche Haut) ei'bracht werden. Zu diesem Zwecke braucht man nur I>ruchteile eines MiUigramm in Olivenöl zu lösen und auf die Haut einzureiben. Es zeigen sich dann nach kurzer Zeit die lokalen, e n t z ü n d 1 i c h r e i z e n d e n AVi r k u n g e n des Cantharidins. Entsprechend seinen Wirkungen gehört das Cantharidin im pharma- kologischen System in die Gruppe der sogenannten „Phlogotoxine", welcher neben demselben noch das Euphorbin des Euphorbiumharzes , das im spanischen Pfeffer enthaltene Capsaicin, das Mezerein der Seidel- bastrinde (Daphne mezereum), das Anemonin verschiedener Anemone- und Pianunculusarten und besonders noch das in den Anacardiumfrüchton und dem Giftsumach (Rhus toxicodendron) vorkommende Cardol angehören."') Das Bienengift, welches mancherlei Ähnlichkeiten mit dem Cantharidin in pharmakologischer Hinsicht aufweist, findet auch in dieser Gruppe des natürlichen Systems vorläufig seinen Platz. Brachinus crepitans L., der Bombardierkäfer, und andere der Gattung Brachinus angehörige Arten spritzen angreifenden Feinden einen dampfförmigen Stoff aus dem ^lastdarme entgegen. Die dampfförmige Ejakulation stammt aus zwei in den Mastdarm mündenden Drüsen, die ein flüchtiges Sekret bereiten. Auf die Zunge gebracht, soll der Inhalt einer solchen Drüse schmerzhaftes Brennen verursachen und einen gelben Fleck, wie nach der Einwirkung von Salpetersäure, hinterlassen. Die Substanz erzeugt augebhch auch auf der Haut Jucken und Brennen und färbt die- selbe braunrot. Karsten'^) gibt au, daß das in der Drüse wasserhelle Sekret an der Luft vielleicht Sauerstoff aufnimmt unter Bildung von Stickoxyd und von salpetriger Säure. Der ausgespritzte Dampf reagiert sauer und riecht nach salpetriger Säure. Schlägt sich der ausgespritzte Dampf auf kalte Gegenstände nieder, so bilden sich gelbe, ölartige Tropfen, die in einer wasserhellen Flüssigkeit schwimmen. Bei dem Zerreißen des Sekret- behälters braust der Inhalt auf und der flüssige liückstand färbt sich rot. Dieselbe Farbe nehmen Wasser und Alkohol an, wenn man das Organ in 1) Dragendorff, Ermittelung von Giften. 4. Aufl. S. 321— 324 (1895). -) Scfuiiiedeherff, Grundriß der riiarmakologie. 5. Aufl. S. 347 (190G). ^) H. Karsten, Harnorgane des Brachinus complanatus. Archiv, f. Anat. u. Physio- logie. S. 368-374 (1848). Mit Tafeln. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. ^93 diese Flüssigkeiten bringt. „Die alkoholische Lösung nimmt den Geruch des Saljjeteräthers an." ^'on hervorragendem biologischen Interesse wäre die Nachprüfung und Bestätigung einer Angabe von Loman^), nach welcher Cerapterus (luatuormaculatus, ein zur Familie der Paussiden gehöriger Käfer, eine Bombardierflüssigkeit ausspritzt, die freies Jod enthalten soll! Lomans Angabe über-die Anwesenheit von freiem Jod in dem Sekret von Cerapterus quat norm aculat US stützt sich auber auf der Bläuung von Stärkepapier auf das Verhalten desselben zu Alkohol und Äther. Auch bei Paussus Favieri, einem in der algerischen Provinz Oran einheimischen Paussiden. hat Escherich') das Ausspritzen einer Stärke- papier bläuenden Explosions- oder Bombardierflüssigkeit beol)achtet. Gift der Larven von Diamphidia locusta. Pfeilgift der Kalachari. In seinem Pieisewerk über Deutsch-Südwestafrika'') berichtet F.Schinz über die Verwendung einer Käferlarve als Pfeilgift seitens der Buschmänner. Mit dem von Schinz ihm überlassenen Materiale, bestehend aus einer Anzahl Kokons (Puppen) und mehreren isolierten eingetrockneten Larven von Diamphidia locusta, sowie einigen, zur vollen Entwicklung gelangten Käfern, stellte B.Böhm*) zunächst fest, dal] die Kokon schalen, die die Larven einhüllenden Häutchen, und auch die zur vollen Entwicklung gekommenen Käfer un giftig sind. In der trockenen Larve behält das Gift jahrelang seine Wirksamkeit. Zur Darstellung von Lösungen des Giftes mazerierte Böhm die unzerkleinerten Larven in destilUertem Wasser, wobei eine durch Papier leicht filtrierbare klare Flüssigkeit von hellgelber Farbe resultiert, welche das in Wasser leicht lösliche Gift in reichlicher Menge enthält. Zur Ver- hinderung der sonst rasch eintretenden Zersetzung des Giftes infolge der Entwicklung von Fäulniskeimen, die der Oberfläche der Larven anhaften, wird der Giftlösung zweckmäbig etwas Chloroform zugesetzt. Die Intensität der Giftwirkung stellte Böhm in der Weise annähernd fest, daß er den Trockenrückstand einer Mazeration einer bestimmten iVnzahl von Larven in der gleichen Anzahl Kulükzentimeter Wasser bestimmte. Durch zw'eimalige Extraktion mit Wasser wurden aus den Larven in zwei Versuchen 29 und 20Vo des Larvengewichtes gelöst. Durch Salzlösungen ließ sich nicht mehr Gift extrahieren als durcii Wasser. Die Menge des in 1) C. Lomaii, Tijdschrift d. neederl. Dicrk. Verccn. (2.) Vol. 1. p. 106-108 (1887). .Tourn. Itoyal Microsc. Soc. p. 581 (l887). -) K. Escho-ich, Zur Naturgeschichte von Paussus Favieri Fairm. Ncrhandlunircn der k. k. zoolog.-botan. Ges. in Wien. ») Deutsch-Südwest-Afrika. Forschungsreisen durdi die deutschen Schutzgebiete 1884—1887. Oldenburg und Leipzig. *} E.Böhm, Über das Gift der Larven von Diampliidiii locusta. Archiv f. e.\p. Pathologie. Bd. 38. S. 424 (1897). 894 E. St. Faust. einer einzelnen Larve enthaltenen Giftes variierte von Fall zu Fall, viel- leicht infolge der Zersetzlichkeit des Giftes. Eine genaue Dosierung des Giftes war unter diesen Umständen nicht ausführbar. 0"5 — l'O cni^ einer nach obigem Verfahren (1 rw3 Wasser auf eine Larve) hergestellten ersten Mazeration wirkte bei Kaninchen ausnahmslos tödlich. Die kleinste Menge, welche bei Kaninchen den Tod herbeiführte , war 0'25 cm^ , entsprechend etwa 0-0015— 0-0028 (/ Trockenrückstand. Die Mazerationsflüssigkeit reagierte stets deutlich sauer; beim Er- wärmen trübte sich die Lösung und schied beim Kochen flockige Ge- rinnsel ab. Alkoholzusatz liewirkte eine flockige Fällung. Die Lösung gab alle die bekannten Reaktionen auf Eiweil5; ihre Wirksamkeit wurde durch Kochen aufgehoben. Der Giftstoff ist durch Ammoniumsulfat aussalzbar und dial}'siert nicht. Diesem chemischen Verhalten gemäß mußte der Gift- stoff der Larven von Diamphidia locusta vorläufig der Gruppe der „Tox- albumine" eingereiht werden. Neuerdings ist es aber W. Heubner'^) unter Anwendung der Metapliosphorsäure als eiweißfällendes Reagens (vgl. oben S. 836) gelungen, aus dem Pfeilgift der Kalachari die wirksame Substanz in eiweißfreiem und wirksamem Zustande zu erhalten. Die Wirkungen des Giftes der Larven von Diamphidia locusta hat zuerst F. Star cke-) eingehend studiert. Nach subkutaner Einverleibung diesesGiftes zeigtenKaninchen, Hunde undKatzen niemals stürmische Vergiftungs er scheinungen. Als erste Symptome der Wirkung treten Abnahme der Munterkeit, verminderte Freßlust, später Entleerung von blutig und ikterisch gefärbtem Harn ein. Bei Katzen können schon nach 1 — 2V2 Stunden paretische Erscheinungen in den hinteren Extremi- täten sich einstellen. Im Harn finden sich reichliche Giengen von Eiweiß und Hämogiol)in, rotes, flockiges Sediment, aber keine unveränderten Ery- throzyten: Leukozyten und Epithelialzylinder fehlten im Harn. Blutige Darmentleerungen kamen bei Hunden und Katzen nicht vor, bei Kaninchen wurden die Fäzes bei längerer Versuchsdauer weich und breiig. Der Tod erfolgt schheßlich unter fortschreitender allgemeiner Lähmung, nachdem, insbesondere bei Katzen und Hunden, sich als charakteristisches Symptom im Laufe einiger Stunden eine zur vollkommenen Reaktionsunfähigkeit führende Abnahme der Sensibilität entwickelt hat. \'on der Injektionsstelle ausgehend wurden die anliegenden Gewebspartien in weiter Ausdehnung verändert; diese Veränderungen charakterisieren sich je nach der Dauer und Intensität der Wirkung als diffuse, blutig-ödematöse Infiltra- tion oder als eitrige Entzündung. Auch wenn der Einstich sorgfältig nur unter die Haut geschah, pflanzten sich doch wiederholt die Verände- rungen, in die Tiefe gehend, durch die ^luskeln und Fascien bis in die Brust- oder Bauchhöhle fort. *) W. Heuhner, Über das Pfeilgift der Kalahari. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 57. S. 358 (1907). ^) F. Sfarcke, Über die Wirkungen des Giftes der Larven von Diamphidia locusta. (Pfeilgift der Kalachari). Arch. f. experim. Path. Bd. 38. S. 428 (1897). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. y95 Wie die Hämoglobinurie während des Lebens zu den charakte- ristischen Symptomen der Vergiftung mit dem Larvengifte gehört, so zeigen auch von den inneren Organen die Nieren regehnällig bei der Sek- tion die auffallendsten pathologischen ^'eränderungen, welche als Folge der durch das Gift bedingten Hämoglobinurie aufzufassen sind. Das Larven- gift verändert den Blutfarbstoff nicht; es bewirkt nur dessen Austritt aus dem Blutkörperchen in das Plasma; die Hämolyse erfolgt sowohl intra vitam als auch extra corpus im Reagenzglase. Versuche, welche Starcke mit dem Larvengifte an der Konjunktiva und am Ohre von Kaninchen ausführte, ergaben, daß dasselbe in typischer Form den Symptomenkomplex der Entzündung hervorruft. Die weite A'erbreitung der entzündlichen Wirkung spricht dafür, daß das (iift mit dem Lymphstrom sich auf größere Entfernungen unverändert verbreiten kann. Hierdurch unterscheidet es sich wesentlich von anderen Entzündung erregenden Stoffen, deren Wirkung eine weit mehr lokali- sierte oder zirkumskripte ist. Die charakteristischen Wirkungen des Giftes der Larven von Diamphidia locusta sind also Lösung des Hämoglobins und Erregung von Entzündung. Die Symptome der Vergiftung während des Lebens und die Sektionsbefunde sind ungezwungen auf diese beiden Wirkungen zurückzuführen. Die in manchen Fällen beobachteten Erscheinungen seitens des Zentralnervensystems sind nach Heubner von der Blutveränderung un- abhängig; eine spezifische Einwirkung des Giftes auf die Nervenzellen ist nicht ausgeschlossen. Die Einverleibung des Giftes per os blieb bei einigen an Vögeln angestellten Versuchen ohne schädhche Folgen für diese Tiere. Bei intra- venöser Apphkation traten bei Hunden die ^'ergiftungserscheinungen nicht früher als bei subkutaner Einverleibung ein. ^Ö Termes, Würmer. Klasse der Plathelminthes, Plattwürmer. Cestodes, Bandwürmer. In den meisten Fällen verursachen die Bandwürmer nur verhältnis- mäßig leichte Beschwerden 1); zuweilen kann sich jedoch auch ein schwerer Krankheitszustand ausbilden. Man hat beobachtet, daß bei Anwesenheit von Bothriocephalus latus im Darme, viel seltener bei Anwesenheit von Taenien, sich eine sehr schwere Anämie entwickeln kann, ganz nach Art der sogenannten „perniziösen Anämie". Wird der Bandwurm recht- zeitig abgetrieben, so tritt rasche und vollständige Erholung ein. 1) E.Peiper, Tierische Parasiten des Menschen. Ergebnisse der allgemeinen Pa- thologie usw. von Luharsch und Osfcrfa;/. Bd. 3. S. 22—72 (1897). — E.J'cipcr, Zur Symptomatologie der tierischen Parasiten. Deutsche med. Wochensclir. Bd. 23. S. 763 (1897). 896 E. St. Faust. Die Ursachen dieser schweren Erscheinungen haben E. St. Faust und T. W. TdUqvist 1) auf experimentellem Wege aufgeklärt , indem sie das in Äther lösliche, stark hämolytisch wirkende „Lipoid" des Bothrio- cephalus latus chemisch eingehend untersuchten und als einzigen hämoly- tisch wirksamen Bestandteil desselben Ölsäure isoherten und erkannten. Die Ölsäure ist im Bothriocephalusorganismus als Cholesterinester ent- halten. Dieser wird im Darm durch Desintegrationsvorgänge im Bothrio- cephalusorganismus frei, wird dann wahrscheinlich fermentativ gespalten und die Ölsäure resorbiert, worauf diese im Blute ihre Wirkungen auf die roten Blutkörperchen entfaltet. Die geschädigten Erythrocyten ver- schwinden aus dem Blute und es kommt dann zu einer beträchthchen Ab- nahme sowohl der Zahl der roten Blutkörperchen als auch des Hämoglobingehaltes des Blutes-), sofern nicht die blutbildenden Or- gane eine energische regeneratorische Tätigkeit entfalten und den Ausfall an Erythrozyten kompensieren. Durch längere Zeit fortgesetzte Verfütterung von Ölsäure ließen sich bei Hunden die gleichen Erscheinungen hervorrufen. 2) Über den Gift geh alt der Taeiiieu liegen Untersuchungen von Messineo und Calamida^) vor. Die Würmer wurden mit Sand fein ver- rieben und mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert. Die durch Ton- zellen filtrierten oder auch durch Salzfällung gereinigten Extrakte wurden den Versuchstieren nach den üblichen Methoden einverleibt. Die genannten Autoren glauben nach ihren Versuchen die Gegen- wart eines spezifischen Giftes in den Taenien annehmen zu dürfen, obwohl die beobachteten p]rscheinungen, sogar nach der intravenösen In- jektion, wenig charakteristisch waren. Die Extrakte sollen Wirbeltier- blut hämolysieren und im Organismus des lebenden Tieres auf die Leukozyten positiv chemotaktisch wirken. Ficou und Ramond^) beobachteten, daß Auszüge von Taenien nur sehr schwer, wenn überhaupt faulen und daß dieselben eine ausgesprochene bakterizide Wirkung zeigen. Taeiiia ecliinococcus v. Siel)., der Hülsenbandwurm, Echino- kokkusbandwurm lebt im ausgewachsenen Zustande im Darme des Hundes. Geschlechtsreife Proglottiden und Eier dieses Bandwurmes gelangen *) E. St. Faiisf uud T. W. Tallqrist, tiber die Ursaclicii der Bothriocephalusauämie. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 57. S. 367—385 (1907). ") E. Sf. Faust und Ä. ScJimitickc , Über chronische ülsäurevergiftung. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Supplemeutband. Schmied('hcr(/-Fe?,i^chrih. S. 171 (1908). Vgl. auch TaUqrists ausführliche Monographien: Über experimentelle Blutgiftauämien. Berlin (Hirschwald) 1900. Zur Pathogenese der perniziösen Anämie mit besonderer Berücksichti- gung der Bothriocephalusanämie. Zeitschr. f. klin. Med. Bd. (il (1907). Literatur! ^) E. Mcssituo und I). Calaiiiida, Über das Gift der Taenien. Zentralbl. f. Bakt. Abt. 1. Bd. 30. S. 34(3 (1901). — I). Calaiiiida , Weitere Untersuchungen über das Gift der Taenien. Ebenda. S. 374. *) li. Ficou und F. Eainoud, Action bactericide de l'extrait de Taenia inerme. Compt. rend. de la Soc. de Biol. T. 51. p. 176—177 (1899). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. j^()7 durch die Hundefäzes zur Ausscheidung und entwickeln sich im Organismus verschiedener Haustiere, aber auch des Menschen zur Finne, welche schwere, unter Umständen tödlich verlaufende Erkrankungen verursachen kann. Diese Finne, Echinokokkus, Hülsenwurm, ist in einer Blase. Echinokokkusblase, eingeschlossen. Diese kann die Grobe eines Men- schenkopfes erreichen und enthält eine größere oder kleinere Menge meistens eiweißfreier Flüssi-gkeit, in welcher Bernsteinsäure und Zucker vorzukommen pflegen. Echinokokkusblasen finden sich am häufigsten in der Leber, können aber auch in anderen Organen vorkommen. Die Punktion oder spontane Kuptur einer Echinokokkenblase oder -Cyste kann auch beim Menschen Vergiftungserscheinungen hervorrufen ( Intoxieation hydatiiiue i). Am häufigsten kommt es bei der Punktion oder Piuptur von Leberechinokokken-) zu p er itoui tischen Erschei- nungen und fast regelmäßig entwickelt sich eine Urticaria. Versuche an Tieren haben ergeben (llourson und Schlaydcn- huufen^), Humphreij^), daß nach intraperitonealer, intravenöser und sul)- kutaner Injektion von Echinokokkusflüssigkeit Kaninchen und Meerschwein- chen bald starben. Nach subkutaner Lijektion von filtriertem Inhalt einer Echinokokkusblase sah Debove-') bei zwei Individuen Urticaria auftreten. Die chemische Natur der wirksamen Substanz der Echino- kokkusflüssigkeit ist unbekannt. Brieger'^) isolierte daraus die Platin- verbindung einer Substanz, welche Clause schnell tötete. Die der Ordnung Turbellaria, Strudelwürmer, angehörigen Planarien verbreiten einen sehr starken, wahrscheinlich von einer flüch- tigen Base herrührenden Geruch. Bei der Destihation von Planarien mit Kalk wurde Dimethylamin erhalten.'^) Planarien sollen, auf die Zunge ge- liracht. Brennen und Schwellung der Schleimhaut verursachen. Diese Würmer besitzen nach Moseley^) in der Haut eigenartige Gebilde (Stäbchen, Körper- chen), vergleichbar den Nesselorganen der Coelenteraten. *) ('. Achard, De Tintoxication hydati(iue. Archive generale de raedeciue (7). T. 22. p. 410—432 uud p. 572—591. Paris 1887. (Literatur.) -) C. Langcnhuch, Chirurgie der Leber und Gallenblase. 1. Teil. Der Leberechino- kdkkus. S. 36— 198 (1894). — Vgl. auch .4. Gocllner, Die Verbreitung der Echinokokken- krankheit in Elsaß-Lothringen. Inaug.-Diss. Straßburg 1902. — J'ossclf, Die geogra- phische Verbreitung des Blasenwurmleidens. Stuttgart 1900. — A. Becker, Die Verbrei- tung der Echinokokkenkrankheit in Mecklenburg. Beiträge z. klin. Chirurgie. Bd. 56. S.l (1907). ^) Moiirson und SchlagdenJimtffen, Nouvelles recherches chimiques et physiolo- giques sur quelques liquides organiques. Corapt. rend. T. 95 (2). p. 793 (1882). ^) Humphreji, An inquirj- iuto the severe Symptoms occasionally following punc- ture of hydatid cysts of the liver. Lancet. Vol. 1. p. 120 (1887). ^) M. Debove, De l'intoxication hydatique. Bulletins et nu^moires de la Soc. med. des höpitaux. 9 Mars 1888. ") Langenbuch, a. a. 0. S. 109 u. 110. ') Geddes, Sur la chlorophylle animale. Archiv de Zoolog, exp. T. 8. p. 54—57 (1878/1880). **) //. N. Moselei/, Urticating organs of Planarian worms. Nature. \ol. IG. p. 475 (1877). Abderhalden, Handbuch der bincheinischen Arbeitsmethoden. II. 57 898 E. St. Faust. Klasse der Nemathelminthes, Rundwürmer. Nematodes, Fadenwürmer. Ascaris liimbricoides Liii., der Spulwurm des Menschen, ver- ursacht bei Kindern vielfach nervöse Erscheinungen, Konvulsionen, Er- nährungsstörungen und Anämie. Es fragt sich aber, ob diese Symptome auf reflektorischem Wege zustande kommen oder auf ein von diesen Würmern produziertes Gifti) zurückzuführen sind. In den Ascariden findet sich nach v. Linstow 2) ein flüchtiger Körper von eigenartigem und unangenehmem, pfefferartigem Geruch, welcher die Schleimhäute heftig reizt. Der genannte Autor hatte Gelegenheit, die lokalen Wirkungen des Stoffes an sich selbst kennen zu lernen, indem ihm etwas davon ins Auge kam, worauf heftige, langdauernde Konjunk- tivitis und Chemosis des betroffenen Auges erfolgten. Ärthus und Chanson ^) sahen drei Personen, die von Pferden stammende Ascariden zergliedert hatten, an Konjunktivitis und Laryngitis er- kranken. Diese Autoren injizierten auch Kaninchen lebenden Spulwürmern entnommene Flüssigkeit und sahen die Tiere nach subkutaner Einver- leibung von 2cw3 derselben innerhalb 10 Minuten zugrunde gehen. Trichina spiralis Owen verursacht schwere Erkrankungen, die sogenannte Trichinosis*) , bei welcher man anfangs Magendrücken, Nausea, Erbrechen, später Durchfälle beobachtet, die zuweilen so heftig werden können, daß die Erscheinungen denjenigen der Cholera ähnUch sind. Es folgen dann die bekannten Erscheinungen seitens der Muskeln und später ein Stadium, welches durch das Auftreten von Ödemen und Hautausschlägen charakterisiert ist. Nelken diesen Symptomen bestehen gewöhnüch auch schwere Allgemeinerscheinungen, besonders Fieber, welches zeitweise eine beträchthche Höhe erreichen kann. Diese Symptome zusammen mit den Erscheinungen seitens des Zentralnervensystems (Kopf- schmerzen, Benommenheit, Insomnia) und den Störungen in der Zirkulation sowie gewisse pathologisch-anatomische Befunde (fettige Degeneration der Nierenepithelien ) können wohl kaum eine befriedigende Erklärung in der Invasion der Trichinen in die Muskeln finden. Sie nötigen vielmehr zur Annahme einer von den Trichinen bereiteten giftigen Sub- stanz, über welche jedoch bis jetzt nichts Sicheres bekannt ist. Die schweren Erscheinungen, welche durch Aiikylostoma duo- denale Leuck. hervorgerufen werden, legten auch hier den Gedanken an die Produktion eines Giftstoffes seitens dieser Parasiten nahe (Bohland^); ^) G. H. F. Nnffall, The poisou given off by parasitic worms in man and ani- mals. American Naturalist. Vol. 33. p. 247 (1899). ^) 0. r. Linstotv, Über den Giftgebalt der Helminthen. Intern. Monatsschr. f. Anatomie u. Physiologie. Bd. 13. S. 188 a896). Die Gifttiere. S. 128 (1894). ^) Arfhus et Chanson, Accideuts produits par la manipulation des Ascarides. Medecine moderne, p. 38 (1896). Zentralbl. f. Bakteriologie. Bd. 20. S. 264 (1896). *) Vgl. Feiger, a. a. 0. S. 51—59. ^) K. Bohland, Über die Eiweißzersotzuncr bei Ancbylostomiasis. Münchner med. Wochenschr. Jg. 41. Nr. 46. S. 901—904 (1874)! Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 399 neuerclinps hat L. Preti^) ein hämolytisches Gift nachj^ewieson, indem er von Menschen stammende Ankvlostomeu mit physiologischer Kochsalz- lösung in einem Mörser zerrieb. Die auf diese Weise erhaltene , neutral reagierende, trübe Suspension wirkte auf Erythrozyten verschiedener Tier- arten hämolysierend. Die wirksame Substanz ist löslich in Alko- hol und in Äther, unlöslich in Wasser. Sie ist hitzebeständig und wird durch Trypsinvei'dauung aus dem ..Lipoid" abgespalten und wasser- löslich. Filarisi (Dracunculus) medinensis Gm. (Guineawurm), schma- rotzt im UnterhautzeUgewebe des Menschen und verursacht Geschwür- bildung. Das Zerreiben des Wurmes beim Herausziehen desselben ver- ursacht angebhch heftige Entzündung mit nachfolgender Gangrän. Inwieweit ein ..Toxin" für diese Wirkung verantwortlich ist-), bleibt vor- läufig unentschieden. Klasse der xAnnelida, Ringelwürmer. Lumhricus terrestris L., der gemeine Regenwurm, enthält, wie auch bei anderen, sonst mmiftigen Tieren nachgewiesen ist, nach den Angaben von Pauli/ ^) während der Brunstzeit einen giftigen Stoff. Paul;/ verfütterte einigen Enten eine größere Anzahl Regenwürmer. Die Tiere wurden von Krämpfen befallen. Gänse und Hühner starben bei ähnlichen Fütterungsversuchen mit Regenwürmern nach einigen Stunden. Das Gift ist in den bei der Sexualfunktion beteiligten Ringen enthalten; von den wässerigen Auszügen dieser Körperteile töteten einige Tropfen Sperhnge: Kaninchen gingen nach der Einverleibung größerer Mengen des wässerigen Auszuges ebenfalls zugrunde. Die Natur des giftigen Stoffes ist un- bekannt. In den Mund- und Schlundteilen unseres gemeinen Blutegels, Hirudo mediciualis L., findet sich eine Hirudin genannte Substanz, welche wegen ihrer A'erwendung bei Versuchen im Laboratorium hier be- sprochen werden soll. Das Hirudin ist kein tierisches (üft: es kann ohne Schaden für das Tier direkt in das Blut gespritzt werden, wirkt aber dabei auf das Blut in eigenartiger Weise ein, so daß das Blut eines mit Blut- eselextraktM oder Hirudin^) behandelten Tieres seine Gerinnbar- ») L.rrcfi, Hämolytische "Wirkung von Ankylostoma duodenale. Münchner med. Wochenschr. Nr. 9. S. 436 (1908). 2) r. Linstoir, Über den Giftgehalt der Helminthen. Internat. Monatsschr. f. Anat. u. Physiol. Bd. 13. S. 188—205 (1890). ^) M. Paiüy, Der Regenwurm. Der illustrierte Tierfreund. S. 42 u. 79. Graz 1896. zit. n. Physiol. Zentralhl. Bd. 10. S. 682 (1896). *) John B. Haycraft, Über die Einwirkung eines Sekretes des offizinellen Blut- egels auf die Gerinnbarkeit des Blutes. Archiv f. experim. Path. u. Pharm. Bil. 18. S"; 209 (1884). ^) Franz Friedrich, Über den die Blutgerinnung aufhellenden Bestandteil des medizinischen Blutegels. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 49. S. 342 (1903). or 900 E. St. Faust. keit auf längere Zeit einbüßt; dabei veranlaßt die wirksame Substanz keine weiteren, direkt wahrnehmbaren Veränderungen des Blutes. Auf Crustaceeublut ist sie ohne Einfluß, ebenso auf die Gerinnung der Milch. In dem Maße, wie die koagulationshemmende Substanz durch die Nieren ausgeschieden wird oder im Organismus Veränderungen erleidet, wird auch das Blut wieder gerinnungsfähig. Das Hirudin scheint eine Deoteroalbumose (V) zu sein. Es löst sich in Wasser und verdünnten Lösungen von Neutralsalzen, nicht al)er in Alkohol, Äther und Chloroform. Es gibt die für Eiweißstoffe charakteri- stischen Farbenreaktionen und wird durch nicht zu lange dauerndes Kochen bei schwach essigsaurer Reaktion nicht unwirksam, ist also kein Ferment, dialysiert nur sehr langsam und nimmt dabei an Wirk- samkeit ab. Die gerinnungshemmende Wirkung des Blutegelextraktes und des Hirudins scheint noch nicht genügend aufgeklärt, um eine in allen I*unkten befriedigende Erklärung des ^'organges geben zu können. ^ ) Bei experimentellen, physiologischen und pharmakologischen Arbeiten kann sie aber des öfteren von praktischem Nutzen sein, so z.B. wo es sich um Untersuchungen am lebenden Tiere oder überlebenden Organen handelt, bei denen Kanülen in Gefäße eingebunden und längere Zeit dort belassen werden sollen, bei Durchl)lutungsversuchen-) und bei Untersuchungen des (normalen) Blutes außerhalb des Organismus. Das fertige, sehr wirksame (aber teure!) Präparat ,,Hirudin" wird von der Firma E. Sachsse & Co. 3) in Leipzig-Reudnitz in den Handel gebracht. Im Laboratorium stellt man sich genügend wirksame Extrakte wie folgt her: Darstellung wirksamer Extrakte aus Blutegeln. Die abgeschnittenen Köpfe der Blutegel, auf 1 kg Körpergewicht des Versuchstieres 3 Köpfe, werden mit trockenem Sand oder Glaspulver ver- rieben und für je einen Kopf l cm^ Chlornatriumlüsung von OwO^o hinzu- gefügt. Man läßt das Gemisch unter öfterem Umschütteln 2 Stunden stehen und zentrifugiert dann. Die überstehende Flüssigkeit kann direkt verwendet werden, nimmt aber beim Aufbewahren an Wirksamkeit ab. Das gesamte Blut eines Kaninchens kann für längere Zeit ungerinnbar gemacht werden, wenn man dem Tier ein Extrakt von o Köpfen pro Kilogramm *) Andreas Bodong, Über Hirudin. Archiv f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 52. S.242 (1905). — Ä. Schittenhelm und A. Bodong , Beiträge zur Frage der Blutgerinnung mit besonderer Berücksichtigung der Hinidimvirkung. Archiv f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 54. S. 217 (1908). — E. Fuld und K. Spiro, Der Einfluß einiger gerinnungshemmender Agenzien auf das Yogelplasma. llofnieistcrs Beiträge. Bd. 5. 8.171(1904). — Leo Loeb, Einige neuere Arbeiten über die Blutgerinnung bei Wirbellosen und bei Wii'beltieren. Biochem. Zeutralbl. Bd. 6. S. 893 (1907). ^) Johannes Bock, Untersuchungen über die Wirkung verschiedener Gifte auf das isolierte i^äugetierherz. Archiv f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 41. 6. 160 (1898). 3) Deutsches Keichs-Patent Nr. 136, 103. Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. tjyj^ Tier in das Blut spritzt. Beim Aufbewahren in der Kälte nimmt das Ex- trakt weniger schnell an Wirksamkeit ab. Echinodermata, Stachelhäuter. 1. Asteroidea, Seesterne. Einige Berichte -tiber Fütterungsversuche') mit Seesternen an Hunden und Katzen, bei welchen die letzteren entweder schwer erkrankten oder starben, scheinen den Verdacht auf die Giftigkeit gewisser Seestenie zu rechtfertigen. Genauere Untersuchungen hegen über diese Frage nicht vor. 2. Echinoidea, Seeigel. Gewisse Seeigel besitzen wohl ausgebildete Giftapparate, deren sie sich zur Verteidigung und zum Erlangen ihrer Beute bedienen. Frouho-) und besonders v. UexhVl^) haben diese Apparate, deren Funktion und Art und Weise ihres Gebrauches genauer untersucht. An den Spitzen der Giftzangen oder ,.gemmiformen" (v. Uexküll) Pedicellarien tritt da- in den früher irrtümhch als Schleimdrüsen betrachteten Giftdrüsen be- reitete giftige Sekret aus. Das Gift bzw. der Inhalt der Giftdrüse ist eine klare, leicht beweghche, nicht viskose oder fadenziehende Flüssigkeit, welche schwach sauer reagiert und nach der Entleerung aus der Drüse gerinnt. Die W^irkungen des Giftsekretes scheinen das Zentralnerven- system der vergifteten Tiere zu betreffen. Bei Fröschen sah v. Uexküll nach Bissen, welche das Piückenmark trafen, ,,allgemeine Krämpfe" auftreten und ..kleine Aale von 2 bis 3 cm Länge ringelten sich nach dem Bisse zusammen und schlugen wild umher: traf sie der Biß in die Medulla, so war er tödlich" (v. Uexküll). 3. Holothuriodea, Seewalzen, Seegurken. Die C'w.?;?"erschen Organe gewisser polynesischer Arten, nahe verwandt oder identisch mit Holothuria argus, sollen auf der menschlichen Haut schmerzhafte Entzündung und, wenn sie in das Auge gelangen, Er- blindung verursachen.*) Coelenterata (Zoophyta), Pflanzentiere. Die Coelenteraten zeichnen sich durch den Besitz der nur bei den Schwämmen fehlenden Nesselkapseln aus. 1) C. A. Parker, Poisonous qualities of the Star-fish. The Zoologist. Vol. 5. p. 214 (1881). Zoolog. Jahresbericht. Bd. 1. S. 202 (1881). —//»sewn««, Handbuch der Toxi- kologie. S. 242 (1862). 2) H. Frouho, Du röle de pedicillaires gemmifornies des oursius. Compt. rond. T. 109. p. 62 (1890). 3) J. r. Uexküll, Die Physiologie der Pedicellarien. Zeitschrift f. Biologie. Bd. 37. (N. F. 19.) S. 334— 4C3 (1899)." *) Vgl. b. W.Sarillc-Kent, The greatBarrier Reef of Australia. p. 293. London (1893). 902 E. St. Faust. Diese sind bei den Cnid.arien, Nesseltiereii, am vollkommensten entwickelt. Wird das Tier gereizt oder will es sich seiner Beute bemäch- tigen, so wird der Nesselfaden hervorgeschnellt, wobei die neben dem Faden in der Kapsel enthaltene viskose oder gallertige, giftige Masse auf die Oberfläche oder infolge des Eindringens der Fäden in die Tiefe, in den Organismus des Beutetieres oder des Feindes befördert und über- tragen wird. Die lokalen Wirkungen der Sekrete dieser Tiere auf die Haut des Menschen sind allgemein bekannt; sie bestehen in mehr oder weniger heftigem Jucken und Brennen der betroffenen Hautpartie; diese Erschei- nungen verschwinden nach längerer oder kürzerer Zeit. Bei kleinen Tieren kann allgemeine Lähmung und der Tod folgen (Biyelow \), aber auch beim Menschen scheinen, besonders durch das Gift der groben Schwimm- polypen (Siphon ophora), welche einen Durchmesser von 25 — 30cm er- reichen, schwere, \ielleicht resorptive Erscheinungen nach der Be- rührung mit diesen Tieren eintreten zu können, Avie der von Meyen -) be- schriebene Fall beweist. Der Betreffende erkrankte schwer an „Entzün- dungen und Fieber"'. Ähnliches berichtet auch E. Forbes^) über Cyanea capiUata. Die chemische Natur des Giftes der Coelenteraten haben Portier und Bichet^) zuerst untersucht. Sie verrieben Filamente (Nesselfäden) von Phys allen und anderen Nesseltieren mit Sand und Wasser und erhielten so giftige Lösungen, mit welchen sie an Tieren Versuche anstellten. Die wässerigen Auszüge wirkten tödlich, die Tiere wurden somnolent und der Tod erfolgte durch Lähmung der Respiration. An der Applikationsstelle schien das Gift keine Schmerzempfindung hervorzurufen. Portier und Eichet nannten die wirksame Substanz ,,Hypnotoxin''. Eichet 5) ist es gelungen , aus den Tentakeln von Aktiuien , durch Behandlung mit Alkohol und Wasser, einen aus Alkohol kristallisieren- den, aschefreien Körper, das Thalassin, zu gewinnen, welcher unter Zer- setzung und Abspaltung vonCarbylamin und Ammoniak bei 200" schmilzt. Das Thalassin enthält 10% Stickstoff, scheint aber keine Base zu sein, da es durch Phosphorwolframsäure, Jod-Jodkalium, Platinchlorid und Silber- *) R. P. Bigelow, Physiology of the Caravclla maxima (Physalia Caravella). Johns Hopkins University Circular. Vol. 10. p. 93 (1891). ") Vgl. 0. Schmidt und W. Marshall, Brehms Tierlebeu (niedere Tiere). 3. Aufl. S. 552 u. 553 (1893). ^) E. Forbes, Monograph of the British naked-eved Medusae. p. 10 — 11. London (1848). ■*) F. Portier und C. Eichet, Sur les effects physiologiques du poison des filaments pecheurs et des teutacules des Coelenteres (Hypnotoxine). Compt. rend. T. 134. p. 24:7 bis 248 (1902). ^) Charles Pichet , Compt. rend. soc. biol. T. 55. p. 246— 248. 707—710. 1071 ä 1073. Vgl. auch Mahjs Jahresbericht über die Fortschritte der Tierchemie. Bd. 33. S. 709 (1904). Darstellung und Nachweis tierischer Gifte. 903 nitrat nicht gefällt wird. In wässeriger Lösung zersetzt sich das Thalassin rasch unter Entwicklung von Ammoniak. Erhitzen des Thalassins auf 100'' zerstört dasselbe dagegen nicht. Intravenös injiziert soll das Thalassin bei Hunden schon in Mengen von O'l mg pro Kilogramm Körper- gewicht heftiges Hautjucken, Urticaria und Nies sen verursachen, je- doch sind auch 10«h Es würde also nach dieser Hypothese der in den Blättern als erstes Assimilationsprodukt entstehende Formaldehyd methyUerend auf die in den Geweben durch Zerfall der Proteinstoffe primär auftretenden Phenole und sekundären Basen wirken. So würden die so häufig in den Pflanzen vor- kommenden Methoxy-, ^Nlethylendioxy- und N-Methylverbindungen entstehen. Man muß zugestehen, daß die Möglichkeit einer solchen Methylierung durch Formaldehyd nach den Arbeiten von Tollens^), Frud'honinu-) und Escli- u-eiler ^) gegeben ist. 3. Alkaloide, die den P>rrolkern enthalten, bilden sich I)ei dem Zer- fall von Proteinstoffen. Bekanntlich hat ja E. Fischer die Pyrrolidin--J-kar- bonsäure (Prolin) als Spaltungsprodukt verschiedener Eiweilikörper bei der Hydrolyse durch Salzsäure gefunden, so daß sie als ein wichtiger Baustein des Eiweißmoleküls betrachtet werden darf. \o\\ Xrticki, Zalcski , Marrh- leirski und U\ Küster wurde der Zusammenhang des Blutfarbstoffes Hämo- globin und auch des Blattfarbstoffes Chlorophyll mit Pyrrolabkönimlimicn dargetan und man kann demnach wohl annehmen, daß Pyrrolderivate in den Pflanzen weit verbreitet sind. 4. Die zahlreichen, den Pyridinkern enthaltenden Alkaloide dürften nach Pictet nicht wie die Alkaloide der Pyrrolgruppe die direkten fber- bleibsel des Zerfalles komplizierterer Substanzen repräsentieren, sondern ') Tollens, Über Rohformaldcliyd und OxymotliyliMi. Her. d. Deutsch, chcni. lu-s. Bd. 16. S. 919 (1883). 2) Frud'homme, Eine neue Methode der Motliylierung. Bull. Soc. Chim. 13.] T. 23. p. G9 (1900). =*) Eschweiler, Ersatz von an Stickstoff gebundenen Wasserstoffatonien durcli die Methylgruppe mit Hilfe von Formaldehyd. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 38. S. S80 (1905). 908 Jiüius Schmidt. erst aus diesen Überbleibseln durch sekundäre Phänomene entstehen, die den ursprünglichen Kern verändern. Auch bei diesen Veränderuniien soll der Formaldehyd eine große Rolle spielen. Er soll auf die Pyrrolkörper zunächst methyherend einwirken und die so entstehenden Methylpyrrole sollen dann durch Umlagerung den Pyridinkern liefern. (Jder einfacher — es könnte das Kohlenstoffatom des Formaldehyds direkt in den Pyrrolkern eintreten , wie dasjenige des Chloroforms oder des Methylenjodids bei den bekannten Synthesen von Ciamictcm und seinen Schülern es auch tut und diesen Pyrrolkern zu einem Pyridinkern erweitern. Was die Einteilung des Stoffes anbetrifft, so ist die chemische Klassi- fikation der in manchen Lehr- und Handbüchern angewandten botanischen Einteilung vorzuziehen. Wir werden also von den Alkaloiden die wichtigeren auswählen und sie mit Bezug auf ihren basischen Bestandteil klassifizieren. Dabei ordnen sich meistens die von einer und derselben Pflanze erzeugten, also die einer und derselben natürlichen Gruppe angehörigen Basen, auch in eine und dieselbe chemische Gruppe, weil eben die von einer und der- selben Pflanze erzeugten Verbindungen meist eine analoge chemische Struktur haben. Die wichtigen Alkaloide sind also bei der nachfolgenden Besprechung in folgende Gruppen eingeteilt: I. Alkaloide der Pyridingruppe. II. Alkaloide der P}rrolidingruppe. III. Alkaloide der Chinolingruppe. IV. Alkaloide der Isochinolingruppe. V. Alkaloide der Phenanthrengruppe. VI. Alkaloide der Puringruppe. Pilocarpin soll im Anschluß an die Alkaloide der Puringruppe behan- delt werden. VII. Verschiedene Alkaloide, meistens unbekannter Konstitution. Wie jeder Einteilung haftet auch dieser eine gewisse Willkür an. So läßt sich einwenden, daß die in der Pyrrohdingruppe behandelten Alkaloide Atropin und Kokain auch einen Pyridinkern enthalten und deshalb auch in die Pyridingruppe hätten eingereiht werden können. Indessen erscheint es zweck- mäßiger, diese Verbindungen in eine Gruppe für sich zusammenzufassen. Bei V. ist es besser, die Bezeichnungsweise nach dem basischen Kom- plex, der den Alkaloiden zugrunde liegt, zurzeit nicht anzuwenden. Denn es herrschen noch Zweifel darüber, welcher Art der stickstoffhaltige Piing ist, der den hierher gehörigen ( )piumalkaloiden iVIorphin, Kodein und The- bain zugrunde liegt. Dahingegen wird zurzeit allseitig die Annahme ge- macht, daß sie einen Phenanthrenkern enthalten. I. Alkaloide der Pyridingruppe. Von den zahlreichen Alkaloiden, die einen Pyridinkern enthalten, sind vor allem die im Schierling vorkommenden Basen Coniin (in der d- und 1-Form ), Methylconiin (in der d- und 1-Form ) . p-Conicein . C'onhydrin und Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. QQq Pseucloconhvdrin zu nennen. Sie finden sich in allen Teilen der Pflanze an Äpfelsäure und Kaffeesäure gebunden, besonders in den Früchten vor ihrer vollständigen Reife. Der ^Vlenge nach vorwiegend ist das Coniin. a-Coniin. d-, a-, n-Propylpiperidin. Ho C CHg H2CX /CH — CH2.CH2.CH3 NH Zur Abscheidung der Base aus den Früchten des Schierlings werden dieselben zerquetscht und mit Kalilauge oder Sodalösung versetzt. Die wahrscheinlich an Apfelsäure gebundene Base wird dadurch frei gemacht und mit ^Yasserdampf abdestilliert. Um sie von Ammoniak zu trennen, wird das Destillat mit Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert und die Lösung zur Trockene verdampft. Dem Abdampfungsrückstand entzieht man die Salze der organischen Basen mit Alkohol oder Äther. Die Salze werden mit Kali zerlegt und die entstehenden Basen durch Ausschütteln mit Äther gesammelt. Schließlich Avird die Kohbase durch Destillation im Wasserstoff- strom fraktioniert. Unter einem Druck von 759 mm geht das Coniin bei 165— 166" über. Um reines d-Coniin zu gewinnen, fügt man nach Wolfenstein^) l'dö-D g des laiuflichen Produktes zu einer Lösung von d-Weinsäure (160^) in Wasser (450 7) unter Kühlung und führt in diese Lösung einen Kri- stallsplitter von d-Coniinbitartrat ein. In Präparaten, die an Conicein reicher sind, trennt man die Basen mittelst der salzsauren Salze. Das Hydroclüorid des Coniins ist nämlich in Aceton schwer lösHch, während das Salz des y-Coniceins in Lösung bleibt. Das reine d-Coniin ist eine farblose Flüssigkeit vom spez. Gewicht D^o = 0-8440 und dem Brechungsexponenten Ud = 1-4505.-) Es destilliert unzersetzt von 165-7 — 165-9o bei lo9mm. Die spezifische Drehung [a]^9 = + 15-7". In der Kälte erstarrt die Base zu einer bei —2» sich verflüssigenden Kristallmasse. Sie ist in Wasser nur wenig (1:90) löslich; ihre kaltgesättigte Lösung trübt sich beim Erwärmen. Coniin reagiert alkalisch, ist sehr giftig und oxydiert sich an der Luft. Über die Trennung der Coniumalkaloide. ») Die im Schierling vorkommenden Alkaloide Coniin (in der d- und 1-Form), Methylconiin (in der d- und 1-Form), y- Conicein, Conh yd r in 1) Wolfenstein, Über Coniin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 27. S. 2615 (1894). 2) Semmler , Xotiz über einige flüssige Allcaloide. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 2428 (1904). ^) J. r. Braun, Über die Trennung der Coniumalkaloido. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 38. S. 3108 (1905). 910 Julius Schmidt. und Pseudoconhydrin konnten bisher kaum oder doch nur in sehr um- ständlicher Weise quantitativ getrennt werden. Nachdem die größte Menge des Hauptalkaloids, des Coniins, herausfraktioniert ist, liegt ein an Neben- alkaloiden (Conicein, Methylconiin , Conhydrin, Pseudoconhydrin) reiches Gemenge vor. Aus ihm kann Methylconiin , da es unter diesen Basen die einzige tertiäre ist, und Conhydrin soNvie Pseudoconhydrin wegen des hohen Siedepunktes (224—2260 ^esp. 229— 23P) leicht isoliert werden. Dahin- gegen ist eine quantitative Isolierung des Coniceins und des noch vor- handenen Coniins durch fraktionierte Kristallisation ihrer Salze, wie sie bisher versucht worden ist, recht mühsam und läßt sich nicht vollständig erreichen, i) V. Braun fand nun, daß das schon seit längerer Zeit bekannte Ben- zoylconiin^) sich in charakteristischer Weise von dem Benzoyherungs- produkt des Coniceins, dem Benzoyl-4-aminobutylpropylketon = = Cg Hg . CO . NH ( CHa)^ . CO . C3 U^ (s. spätere Ausführungen beim y-Coni- cein, unterscheidet. Während das letztere nicht destillierbar, in Äther schwer löslich, in Ligroin unlöslich ist, wird das Benzoylconiin von diesen beiden Lösungsmitteln sehr leicht aufgenommen und läßt sich unzersetzt destillieren. Es ist eine glyzerinähnliche, farblose Flüssigkeit, welche unter 16 mm Druck bei 203 — 204° siedet. Da nun aus beiden Benzoyherungs- produkten durch \'erseifung die zugehörigen Basen leicht wieder gewonnen werden können, so läßt sich die Benzoylierung zu einer Trennung der beiden Amide verwenden. Die Trennung von Alkaloidgemengen , wie sie bei der Coniinfabri- kation abfallen, gestaltet sich demnach folgendermaßen: Nachdem das hoch- siedende Conhydrin bei der fraktionierten Destillation entfernt worden ist, benzoyhert man in alkalischer Lösung, schüttelt die vorhandene tertiäre Base mit verdünnter Säure aus, hat dann nur das Gemenge der beiden Benzoylverbindungen voneinander zu trennen und aus diesen die Basen durch V erseif ung wieder zu regenerieren. Synthese des Coniins. Die vor 20 Jahren von Ladenhurg durch- geführte Synthese des Coniins, welche als die erste künstliche Darstellung eines Alkaloids großes historisches Interesse beansprucht, ist erst in alier- jüngster Zeit von Ladenburg vohkommen zum Abschluß gebracht worden. '^) Während früher Picolin und Paraldehyd auf 200 — 260" erhitzt und so di- rekt in Allylpyridin (besser Lsoallylpyridin), NC5 H4 . CH: CH . CJHj, verwandelt wurden, hat jetzt Ladenhurg a-Picohn mit ^Udehyd und Wasser nur auf ^) Ä. W. Ilofmann, Zur Kenntuis der Couiingruppe. Ber. d. Dentscli. ehem. Ges. Bd. 18. 8.108(1885); B. Wolffenstein, Über Coniumalkaloide. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 28. S. 302 (1895). ^) Schöffen unä Baum, Über die Oxjdation des Piperidins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 17. S. 2549 (1884); Ladenhurg, Über das Isocouiin und den asymmetrischen Stickstoff. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 26. S. 854 (1893). ^) Ladenhurii, Über des Isconiin uiul die Sjnthese des Couiins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 39. S. 2486 (1906). Methoden zur Darstelhmg von Alkalniden. ()] \ 150" erhitzt imd so das von ihm früher dar^estellto Met h\ii)ic()lylalkiii (Kp. 116-120" unter V) mm Druck), KC^ H,.('H.,.C'H (()I1).'('H,. -owonm-n. dem dann durch Erliitzon mit konzentrierter Salzsäure Wasser ontzo;;eii wurde. So entsteht Allylpiridin, i-emen^t mit ('hl(jrpr()|)ylp\ ridiii. KC5H4.CH, .C'HCl.CHa, welches Gemen<^e durch Deduktion mit Natrium und Äthylalkohol inaktives (razemisches) ("oniin vom Kp. KW. if.S" liefert. Die Base wurde durch ^Veinsäure gespalten. Man erhiilt das d-Iso- coniinbitartrat in gut ausgebildeten Kristallen vom Fp. ö()0. Das daraus gewonnene d-Isoeoniin hat das spezifische Drehungs- vermögen [x]]f =r 19-2", während reinstes d-C'oniin das Drehungsvermögeii 15-6" besitzt. Jjmnandlunr) von Isoconiin in d-Couiin. Zur \'erv()llst;in(lii:ung der Synthese des Isoconiins war es nötig, das Isoconiin in d-C'oiiiin zu ver- wandeln. Es gehngt dies leicht durch Erhitzen von Isoconiin mit festem Kali zum Sieden oder durch Erhitzen desselben für sich auf etwa :UX)". Trigonellin. Methylbetaiii der Nikotiiisäure: CH HC^^C — CO HC'< CH N 0 CH3 Trigonellin findet sich neben Cholin in den Dockhornsamen (von Trigonellum foenum graecum), in den Samen der Erbse (Pisum sativum) und den Samen von Strophantus hispidus und Strophantns Komlx'. 'i Der zerkleinerte Bockhornsamen wird , um das Alkaloid daians zu isolieren, mit Alkohol extrahiert. Aus dem Extrakt werden nach .\ltilam|)frii des Alkohols und Fällen mit Bleiessig und Soda die Alkaloide durch .lod- kaUumwismutjodid und Schwefelsäure abgeschieden. Der Niederschlag wini zur Entfernung von Eiw-eißstoffen mit Soda zerlegt, die filtrierte Flüssig- keit mit Schwefelsäure neutralisiert und mit Quecksilberchloridlösung ge- fällt, wobei sich aus der neutralen Lösung nur das ( holin ausscheidet. Erst beim Ansäuern der abfiltrierten Flüssigkeit mit Schwefelsäure kommt das Trigonenin(|uecksilberjodid zur Ab.scheidnng. Aus ihm wird die Base durch Zerlegen mit Sulfiden oder einer alkalischen Fösun^: von Zinuowdid erhalten. Zur Darstellung von Choün. Betain, Trigonellin aus Samen und Keimpflanzen, insbesondere auch aus den als Abfall ^vs Müllereiprozcsses *) //. Thoms, über das Vorkommen von (holin und Tritroncllin in Stroplianthus- samen und über die Darstellung von Strophanfhiii. Bcr. d. Deutsch, clicm. (Jos. Hd. 31. S. 271 u. 404 (1898). 912 Julius Schmidt. erhältlichen ,,Weizenkeimeii- empfiehlt E. Schulze'^) foliiendes Verfahren: Die wässerigen Extrakte werden zunächst von den durch Bleiessig' fäll- baren Bestandteilen befreit, dann entweder die von Blei befreite Flüssig- keit eingedunstet, der Yerdanipfungsrückstand mit siedendem Alkohol behandelt, die abfiltrierte alkoholische Lösung mit einer alkoholischen Mercurichloridlösung versetzt, oder die Bagen aus dem Extrakt mit Phos- phorwolframsäure gefällt, der mit Kalk oder Baryt zerlegte Niederschlag unter Chlorwasserstoffzusatz verdunstet , der Verdampfungsrückstand mit heißem Alkohol behandelt und die Lösung mit Mercurichlorid versetzt. Aus der bei der Zerlegung des Phosphorwolframsäureniederschlages er- haltenen, mit Salpetersäure neutralisierten Lösung werden durch Silber- nitrat die x\lloxurbasen, dann durch Silbernitrat und Barytwasser Histidin und Arginin gefäüt. Die im Filtrat vom Argininsilberniederschlage noch enthaltenen Basen werden wieder in Phosphorwolframsäureverl)indungen übergeführt, die nach Zerlegen mit Baryt erhaltene eingedunstete Lösung nach Entfernung des Baryts und Chlorwasserstoffzusatz zur Trockene ein- gedampft, die Basenchloride mit Alkohol behandelt, die Lösung mit Mercuri- chlorid versetzt. Die Quecksilberdoppel salze von Chohn, Betain. Trigonellin werden durch Umkristallisieren aus heißem Wasser unter Zusatz von etwas Mercurichlorid gereinigt, mit Schwefelwasserstoff zerlegt, das eingedun- stete Filtrat im Vakuumexsikkator vollständig o-etrocknet, dann zur Extrak- tion des salzsauren Cholins mit kaltem, absolutem Alkohol behandelt; diese Prozedur wird noch einmal wiederholt. Der so gewonnene Rückstand besteht entweder aus dem Chlorid des Betains oder aus demjenigen des Trigonellins. Ein gleichzeitiges Vorkommen dieser beiden Basen in einer Pflanze wmxle bisher niemals beobachtet. Um das Betainchlorid und das TrigoneUinchlorid von Cholin vollständig zu befreien, werden diese aus Wasser oder verdünntem Alkohol umkristallisiert ; das Chohnchlorid geht dabei in die Mutterlauge über. Synthetisch ist das Trigonellin von Hantzsch-) dargestellt worden entsprechend dem Schema: CO., H CH3J -COOCH3 ^^oH —CO N N N 0 /\ CH3 CH3 J Außerdem entsteht es durch Oxydation von Xikotinisomethylammo- niumhydroxyd mit Kaliumpermanganat. =^) ') E. Schulze, Über die zur Darstellung von Choliu, Betain und Trigonellin aus Pflanzen verwendbaren Methoden und fdier die quantitative Bestimmung dieser Basen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 60. S. löö (1909). -) Hcmtzsch, Synthese des Trigonellins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 19. S. 31 (1886). ^) I'icfet und Geneipiatid, Oxydation des Nikotinisomethylhydroxyds. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 30. S. 2122 (1897j. Methoden zur Darstellung von Alkaloideii. 9]^;.j Triffonellin kristallisiert mit 1 Mol. Kristalhvasser aus 96Voi^'eHi Alkohol in farblosen Prismen, ist hygroskopisch, sehr leicht in Wasser, leicht in heißem Alkohol löslich, unlöshch in Äther, Chloroform und Uenzol. Beim Erhitzen verliert es erst Wasser und schmilzt dann etwa bei 1 aO" in seinem Kristallwasser. Entwässert färbt es sich bei 200'* dunkel und schmilzt bei 218" unter Zersetzung. Piperin. CH.3 H, C CH, CH N HC,/ ^C(K i >CH, CO . CH : ( 'H . CH : CH — L\ ,, C( )/ CH Die Früchte und Samen verschiedener Pfefferarten enthalten neben einem Terpen eine ziemlich bedeutende Menge (7 — 9"/o) Piperin (mono- kline Säulen vom Schmp. 128-429"), welches von Oersted 1819 entdeckt wurde. Zu seiner Darstellung verfährt man zweckmäßig folgendermaßen M: Die Mischung von Pfefferpulver (am besten eignet sich weißer Pfeffer) und dem doppelten Gewicht gebraunten Kalkes wird mit wenig Wasser zum homogenen Brei angerührt und die Masse während 15 Minuten zum Sieden erhitzt. Die auf dem Wasserbad gut getrocknete und nochmals pulverisierte Masse ward mit Äther extrahiert und die Lösung nach Abdampfen der Hauptmenge des Lösungsmittels der freiwilligen Verdunstung überlassen. Hierbei scheidet sich Piperin in Form dicker, gelb gefärbter Prismen aus, die durch Umkristallisieren aus Alkohol gereinigt werden. Synthese des Piperins. Durch Kochen mit alkohoUschem Kali wird das Piperin gespalten in Piperidin und Piperinsäure. Aus diesen Spaltungs- produkten kann das Alkaloid wieder aufgebaut werden, indem man Pipe- ridin in Benzollösung mit Piperinsäurechlorid erhitzt. -) Das Piperidin ist bekanntlich schon vor längerer Zeit von Ladenhurg synthetisch dargestellt worden. Auch die Synthese der Piperinsäure hat Ladenhurg in Ciemein- schaft mit SchoUz^) ausgeführt, so daß die Synthese des Piperins eino vollständige genannt werden kann. *) Cazeneure ot CaiJJot, Über Darstellung von Tipcrin. Bull. soc. cliim. [2.] T. 27. p. 290 (1877). 2) Rügheimer, Künstliches Piperin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 15. S. 139U (1882); Ann' d. Chem. Bd. 159. S. 142 (1883). '-') Ladenburg und Scholtz, Synthese der Piperinsäure und des Piperins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 27. S. 2958 (1894). Abderhalden, Handljuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 58 914 Julius Schmidt. Arecaidin Arecolin oder oder N-Methyl-A3-tetrahydroniko- N-Me th vi- A^-tetraliydr oni ko- tin säure: tinsiiuremethylester. CH CH ^C . COOK H, C^Nc . COO CH, H.C CHo Hg C' CH, N.CH, N.CH, Die Areca- oder Betelnüsse, die Samen der Arecapahne (Areca Ca- tecliu) enthalten die folgenden \aer Alkaloide, welche sich darin in Verbin- dung mit Gerbsäure neben einer kleinen Menge Cholin vorfinden: Arecaidin C^HiiNOj, Arecohn CgHigNOo, Guracin CgHgNUo, Arecain C^ H„ XO,. Man kultiviert die Arecapahne in Vorder- und Hinterindien, da die Betel- nuß in großen Quantitäten zum Betelkauen verbraucht wird. Zu dem Ende werden die Nüsse mit etwas Kalk und den Blättern des Betelpfeffers ge- kaut. Die berauschende Wirkung, die dem Betelkauen folgt, ist aber nur teilweise den in der Betelnuß vorhandenen Alkaloiden zuzuschreiben. ^ ) Das Arecolin ist das Hauptalkaloid der Betelnuß und findet sich darin in einer Menge von 0"P/n- Es ist eine öhge, färb- und geruchlose Flüssig- keit vom Siedepunkt 200*', die mit Wasserdämpfen flüchtig ist. Das Are- caidin kommt in einer Menge von etwa 0"07"/o in der Betelnuß vor. Es kristallisiert mit einem Molekül Kristallwasser in Tafeln; nach dem Ent- wässern schmilzt es unter Zersetzung bei 223 — 224°. Es löst sich leicht in Wasser, sehr schwer in absolutem Alkohol gar nicht in Äther, Chloro- form und Benzol. Zur Isolierung der Basen wird das Gemenge derselben mit Wasser, dem man auf 1 kg Samen 2 g konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt hat, dreimal kalt ausgezogen, die abgepreßten und filtrierten Auszüge bis etwa auf das Gewicht des angewandten Rohmaterials eingedampft und nach dem Erkalten und abermaligen Filtrieren mit Kaliumwismutjodid und Schwefel- säure gefäUt; hierbei ist ein Überschuß des Fällungsmittels, welches lösend auf die abgeschiedenen Doppelsalze wirkt, zu vermeiden. Der rote, kristal- linische Niederschlag wird nach einigen Tagen abfiltriert, ausgewaschen und durch Kochen mit Bariumkarbonat und Wasser zerlegt, wobei die Al- kaloide in Lösung gehen. Die Flüssigkeit wird auf ein kleines A^olumen eingedampft und mit genügend Bariumhydroxyd versetzt. Durch wieder- holtes Ausschütteln mit Äther wird dann Arecolin ausgezogen. Die rückständige Flüssigkeit wird hiernach mit Schwefelsäure neu- tralisiert und die Alkaloide durch aufeinander folgende Behandlung der- selben mit Silbersulfat, Baiiumhydroxyd und Kohlensäure frei gemacht. Die zur Trockene verdampfte Lösung der reinen Alkaloide wird mit kaltem. *) Tschirsch, Indische Nutz- und Heilpflanzen. Methoden zur Darstellung von Alkaloidcn. yjf) absolutem Alkohol oder Chloroform ausgezogen. Cholin geht hierbei neben Farbstoffen und anderen Körpern in Lösung, während Arecain ungelöst bleibt. Die Ausbeute an Arecolin ])eträgt 0-07— Ol , die an Arecain etwa Ol o/o- Außerdem enthält die Droge Arecaidin in kleinen Mengen, welches leichter durch Verseifen von Arecohn erhalten wird, und Guvacin. Das Arecaidin bleibt in den Mutterlaugen des Arecains zurück. Die beiden Basen lassen sich durch Behandlung mit Methylalkohol und Salzsäure trennen, wobei Arecaidin in Arecolin übergeht, während Arecain nur in das salz- saure >Salz verwandelt wird. Guvacin scheint das Arecain in manchen Sorten der Samen in wech- selnden ]\I engen zu vertreten. Es ist in Wasser und verdünntem Alkohol etwas schwerer löshch als Arecain und Arecaidin und scheidet sich daher aus der Lösung des Gemenges zuerst aus. Salzsäure und Methylalkohol greifen es ebenfalls nicht an, wodurch es sich von Arecaidin trennen läßt. Die erste Synthese des Ar ecaidins durch Jc/Awsi) gelang von der ß-Pyridin-karbonsäure (Xikotinsäure) aus auf folgendem Wege: Getrocknetes nikotinsaures Kahum wird mit einem Tberschuß von ]\Iethyljodid auf 150" erhitzt: es bildet sich ein zuerst von iiTaw^aisc^ 2) tiargestelltes Jodmethylat des Nikotinsäuremethylesters, das mittelst Ghlorsilber in das Hydrochlorid übergeführt wird. Bei der Reduktion des letzteren mit Zinn und Salzsäure wird der Ester verseift unter gleichzeitiger Anlagerung von Wasserstoff an den Pyridinkern und es bildet sich gleichzeitig Methyltetrahydronikotin- säure und ^lethylhexahydronikotinsäure. Eine zweite Synthese des Arecaidins und Arecolins ist in der Neu- zeit von Wohl und Johnson 3) durchgeführt worden. Dieselbe geht aus vom Methylamido-[i-dipropioualdehyd-teträthylacetal TH -vvCH., .CH.T . CH(OCo Hj), ^ • ^CHa . CH.3 . CH (OCo H5 ).: Es liefert bei der Einwirkung von konzentrierter Salzsäure den N-Methyl-A3-tetrahydropyridinaldehyd, H2 C C n2 CH3.N<^ ^CH . H2C C.CHO Das Hydrochlorid desselben läßt sich über das Oxim und Nitril in guter Ausbeute in die zugehörige Säure überführen und diese erwies sich mit dem natürlichen Arecaidin in allen Punkten identisch. Arecolin entsteht svnthetisch durch MethvUeren des Arecaidins. 0 Jahns, Über die Alkaloide der Arekauuß. Arcli. d. Pharm. Bd. 229. S. 669. ") Hantzsch, Über Ammoniumderivate von Säureäthern des Pyridins und Chinolins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 19. S. 31 (1886). ^) WoJd und Johnson, Über Arecaidin und Arecolin. Ber. d. Deutsch, choni. Ges. Bd. 40. S. 4712 (1907). 58* 916 Julius Schmidt. Nikotin. ]-Methyl-2-.i-P.yri(lyl-PyiT0li(liii. CH3 CH N HC HC N C CH CH H,C CH. CHo Das Nikotin findet sich, an Apfelsäure und Zitronensilui'e gebunden, in den Tabaksblättern fXicotiana Tabacum). Obige Konstitutionsformel ist im Jahre 1893 von Finner ^) aufge- stellt und vor kurzem von A. Pictet -) und Rotschi/ durch die vollständige Synthese des Alkaloids endgültig bewiesen worden. Das 1-Nikotin ist das in der Natur vorkommende Alkaloid und kann auch erhalten werden durch Spaltung des synthetischen i-Nikotins mit Weinsäure. Es kommt je nach der Art des Tabaks in Mengen von 0"6 bis S^/o vor. In Pfeifentabaken variiert die Menge von 0'öl8 — 0'854"/o, in Zigarren von 0"801— 2-8877o- Im allgemeinen enthalten die feinen Tabak- sorten weniger Nikotin als die gewöhnlichen. Um die Base aus der Pßanze zu isolieren, werden die PJlätter mit Wasser, eventueU unter Zusatz von wenig Salzsäure oder Schwefelsäure ausgezogen, die Lösung wird auf ein Drittel eingedampft und der Rück- stand nach Zugabe von Kalk (lOVo) destiUiert. Die übergehende Base wird in das Oxalat verwandelt, mit KaU wieder abgeschieden, mit Äther auf- genommen und nach Verdunsten des Äthers im Wasserstoffstrome de- stilliert. Noch einfacher erhält man das Alkaloid aus dem sog. Tabaks- extrakt, welcher fabriksmäßig zur Imprägnierung von Kautabak durch Ex- traktion sehr nikotinreicher Rohtabake mit kaltem Wasser und Abdampfen der Lösung hergestellt wird. Derselbe enthält ca. 8 — lO^o Nikotin. Er wird zunächst mit Wasser verdünnt, dann zur Entfernung von Kohlenwasser- stoffen aus saurer Lösung mit Äther extrahiert, mit Alkali übersättigt. Das freie Nikotin wird hierauf durch wiederholte Ätherextraktion gesammelt, der Ätherextrakt wird getrocknet und fraktioniert destilliert. ^) Synthese des i-Nikotins. Pictet und Crepieiix stellten durch Erhitzen von [i-Aminopyridin (I) mit Schleimsäure das N-ß-Pyridylpyrrol (II) dar. Nach Analogie mit dem entsprechenden Acetyl- und Phenylpyrrol lagert sich das N-ß-Pyridylpyrrol ^) Pinner, Über Nicotin. Die Konstitution des Alkaloids. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 26. S. 294 (1893). -) A. Pictet und jRotschi/, Synthese des Nicotins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 1225 (1904). =*) Baumann, Darstellung von Nikotin. Arch. d. Pharm. Bd. 231. S. 378 (1893). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 9r beim Erhitzen auf höhere Temperatur (Destillation durcli schwach fjlühende Köhren) in a, [i-Pyridylpyrrol (III) um, aus dem mit Jodmethvl eine Ver- binduni^- entsteht, die mit Xikotyrinjodmethylat (IV) identisch ist. L CH IL HC HC N C . NH, CH HL CH HC<^Nc- CH CH N z/'- HC'I 'CH N CH CH /\i -C N H N C IV. HC — C iCH CH N CH3 J CH3 Nikotyrinjodmethylat. Von diesem aus konnte Fidet nunmehr weiter zum Nikotin eelanuen. Durch Destillation mit Kalk konnte er der Verbindung- Y\ 1 Mol. Jodmethyl entziehen. Die so erhaltene Base (V) ist identisch mit dem Xikotyrin, welches Etard durch gemäßigte ( )xydation des Nikotins darstellte. Es war nunmehr die Rttckverwandlung des Nikotvrins in Nikotin (VI) zu bewerksteUigen. V. CH C CH CH /\c N CH, VI. CH2— — C CH., CH, N CH3 \/ CH3 \/ N N Nikotyrin Nikotin. Da die beiden Basen zueinander in derselben Beziehung stehen wie Pyrrol und Pyrrolidin, hat man zu diesem Zwecke vier Wasserstoffatome in den Pyrrolkern des Nikotyrins einzuführen, ohne zu gleicher Zeit den Pyridinkern zu hydrieren. Diese Reduktion einer Hälfte des Moleküls erwies sich aber als nicht direkt ausführbar, da sich die beiden ungesättigten Ringe des Nikotyrins bei der Hydrierung durchaus ähnlich verhalten. Bei Anwendung schwacher Reduktionsmittel wird keiner angegriffen, bei energischer Hydrierung werden aber stets beide gleichzeitig- reduziert. Man kommt aber zum Ziele, wenn man zuerst ein Atom Jod in den Pyrrolkern einführt, was leicht durch Behandlung des Nikotvrins mit Jod 918 Julius Schmidt. in alkalischer Lösung geschieht. Das so geAvonnene Jodnikotyrin läßt sich dann schon durch Zinn und Salzsäure reduzieren, wobei ein Dihydroniko- tyrin (VII) entsteht, welches verschieden ist sowohl von dem Dehydro- nikotin von P'mner und Wolfenstein, wie auch von dem Nikotein, welches Fidet und Rotschy im Tabak aufgefunden haben. ^Nlit Ph'om behandelt, liefert dieses Dihydronikotyrin ein Perbromid (VIII). VII HC — C N N CH3 /\c N VIII. BrC CH, — C\ /CH2 N H CH, Br.Br, Dieses läßt sich mit Zinn und Salzsäure weiter reduzieren ; es ent- steht eine Base, die alle Eigenschaften des Nikotins, das Drehungsver- mögen ausgenommen, besitzt. Zur Gewinnung des l-Nikotins aus i-Xikotin verfährt man folgender- maßen. 1) Das i-Nikotin (1 Mol. Gew.) wird zu einer Lösung von Ilechts- weinsäure (2 Mol. Gew.) in möglichst wenig Wasser gegeben. Die sich aus- scheidenden Kristalle werden so lange umkristallisiert, bis sie den Schmelz- punkt 88—89'' vom Bitartrat des l-Nikotins zeigen. Dann wird aus dem Salze die Base durch Natronlauge in Freiheit gesetzt, mit Äther extrahiert, über Kali getrocknet und destilliert. Das 1-Nikotin ist, frisch bereitet, ein farbloses Öl, das sich in Wasser leicht löst und einen unangenehmen, betäubenden, in reinem Zustande nicht an Tabak erinnernden Geruch und brennenden Geschmack besitzt. Es ist nur im Wasserstoffstrome oder im Vakuum unzersetzt destillierliar: an der Luft bräunt es sich bald und verharzt. Der Siedepunkt-) liegt bei 246'1 bis 246-20 unter ToO'ö mm Druck. Das spezifische Gewicht 2) d^^^" = 1-0180, d;0 =z 1-0097. Das spezifische Drehungsvermögen 2) [x]^ = — i66-39o. Bre- chungsexponent bei 20" = 1-5280. Die Base ist außerordentlich giftig. Die Salze derselben sind zweisäurig, leicht löslich, schwer kristallisierend und drehen die Ebene des polarisierten Lichtes nach rechts. Physiologische Eigenschaften der beiden aktiven Nikotine. A.Mayor^) hat bei der physiologischen Prüfung der beiden aktiven Nikotine folgende Resultate erhalten: Sowohl beim Meerschweinchen als beim Kaninchen sind die Wirkungen äußerst verschieden, je nachdem liechts- oder Linksnikotin zur Anwendung ^) Pictet und Rotschy, Synthese des Nikotins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 1230 (1904). -') Synthese des Nikotins. Ebenda. S. 1231. ») Synthese des Nikotins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 1233 (1904). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 95^9 kommt. Vor allem ist festzuhalten, daß Linksnikotin eine zweimal stärkere allgemeine Giftigkeit besitzt als Rechtsnikotin, wenn man als Versuchstier das Meerschweinchen benutzt und wässerige Lösungen unter die Haut ein- spritzt, welche IVo durch Salzsäure genau neutralisiertes Alkaloid enthalten. Für das Linksnikotin beträgt die tödhche Dosis bei Meerschweinchen von nicht über :iOO g Gewicht 1 mg pro 100 g. üeim Eechtsnikotin braucht es 2 mg pro 100 g Gewicht, um den Tod herbeizuführen. Außerdem ist das Vergiftungsbild ganz bedeutend verschieden. Das Linksnikotin, und zwar sowohl das natürliche als das künstliche, bewirkt beim Meerschweinchen sogleich nach der Einspritzung eine gewisse Er- regung; das Tier stößt Schreie aus, was auf heftigen Schmerz schließen läßt. Die Einspritzung von Rechtsnikotin scheint dagegen schmerzlos zu sein. Nach Vergiftung mit Linksnikotin treten alsbald Lähmungserschei- nungen auf; die hinteren Extremitäten sind zuerst ergriffen, die anderen folgen bald nach. Die Atmung verschnellert sich, sie wird tief, ausgezogen und mühsam. Bald darauf durchlaufen kleine Zuckungen den Rumpf und die Glieder und schließhch tritt ein heftiger Krampfanfall auf. Wenn die verabreichte Dosis tödlich ist, lassen dann die Krampferscheinungen all- mählich nach; die Atmungsbewegungen werden immer seltener, das Herz schlägt langsamer und der Tod tritt durch Stillstand der Atmung ein. Ganz anders verhält es sich mit dem Rechtsnikotin. Die gleiche Dosis von Img pro 100 g Versuchstier bewirkt nichts anderes als ein Sträuben des Felles und ein leichtes Zittern. Auch diese geringfügigen Symptome zeigen sich nur vorübergehend , und das Tier kehrt darauf ziemlich schnell in seinen Normalzustand zurück. Vergrößert man die Dosis bis zu Vhmg, so ver- stärkt sich nur das Zittern, nach und nach erholt sich aber das Tier. Nimmt man Kaninchen zu diesen Versuchen und spritzt man das (nft in die hintere Randvene des Ohres ein, so findet man den gleichen Unter- schied in der Wirkungsweise der zwei Nikotinarten. Pktet und Rotschy machen darauf aufmerksam (l. c). daß in der verschiedenen Wirkung der beiden Nikotine auf den tierischen ( )rganisnms wohl ähnliche Verhältnisse vorliegen wie im Verhalten optischer Antipoden gegen organisierte und nicht organisierte Fermente, welche besonders durch die Arbeiten von Pastcur und E. Fischer bekannt geworden sind. Alkaloide der Oranatbaumrinde. Die Rinde des (iranatbaums (Punica (iranatum L., Familie der Myr- taceen) enthält mehrere Alkaloide, denen sie ihre schon lange bekannte Wirkung als wurmabtreibendes Mittel verdankt. Tamrt fand diese Alkaloide im Jahre 1877 auf, und zwar konnte er die folgenden vier isolieren: Relletierin CgHisNO, Lsopelletierin CsHigNÜ, Methylpelletierin C9H17NO, Pseudopelletierin CoH,5N(). Die Sulfate und Tannate der Tawre^schen Alkaloide, die nach dem französischen Chemiker Pelletier be- nannt sind, werden statt der Granatrinde als Bandwurmmittel benutzt. 920 Julius Schmidt. Die Konstitution des Pseudopelletierins oder Methvlgranatonins wurde von Ciamician^) und Silber festgestellt. Es ist ein Azelaon mit einer Stickstoff brücke , eine polyzyklische Verbindung entsprechend der Formel: HoC CH CH, H,C H,C CHo Um die Base zu gewinnen, wird nach Tanref^) die zerkleinerte Gra- natbaumrinde mit Kalkmilch vermischt und das Gemenge mit Chloroform ausgezogen. Die Chloroformlösung schüttelt man mit überschüssiger ver- dünnter Schwefelsäure durch. Aus der schwefelsauren Lösung scheidet man die Basen vermittelst Natronlauge ab und nimmt sie in Äther auf. Beim A'erdunsten des Lösungsmittels hinterbleibt ein Piiickstand, aus dem sich Kristalle ausscheiden. Sie werden von der Mutterlauge durch Absaugen getrennt und nach dem Trocknen aus siedendem PetroUlther kristallisiert. Die Base scheidet sich in wasserfreien, prismatischen Tafeln ab, die bei 48^ schmelzen. Die übrigen, oben erwähnten Alkaloide der Granatwurzelrinde werden folgendermatjen erhalten. Man extrahiert aus der mit Kalkmilch vermischten fein pulverisierten Rinde zunächst sämthche Basen mit Chloroform und entzieht sie der Chloroformlösung mit Salzsäure. Vermischt man nun die so erhaltene Lösung der Salze mit überschüssigem Natriumkarbonat, so nimmt Chloroform aus derselben Meth}l- und Pseudopelletierin auf. Ätzkali scheidet dann aus der extrahierten Flüssigkeit Pelletierin und Lsopelletierin ab. welche nun ebenfalls mit Chloroform ausgeschüttelt werden können. Letztere lassen sich mittelst ihrer neutralen Salze, wenngleich schwierig, trennen, indem das Lsopelletierinsalz im Gegensatz zu dem l'elletierinsulfat zerfliel')- lich ist und daher, wenn das Gemisch derselben, z. B. zwischen Filtrier- papier, feuchter Luft ausgesetzt wird, in das Papier allmählich übergeht. Erstere dagegen können durch Äther getrennt werden, aus welchem das Pseudopelletierin ziemhch leicht kristaUisiert. Da Methylpelletierin bei 21 5^, Pseudopelletierin bei 246" siedet, lassen sich beide auch durch fraktionierte Destillation trennen. ^) Ciamician und Silber, Über Pseudopelletieriu, ein Alkaloid aus der Graiiat- wurzelrinde. Ber. d. Deutsch, ehem. Ge?. Bd. 25. S. 1601 (1892); Liber das Pseudopelletierin. Bd. 26. S. 156 ; Über die Alkaloide der Grauatwurzelrinde. S. 2738 (1893) : Über die Alkaloide der Granatwurzelrinde. Bd. 27. S. 2850 (1894); Über die Alkaloide der Granat- wurzelrinde. Bd. 20. S.481; Über das n-Methyltroponin. S. 490: F. GareUi xmA. Ciamician, Kryoskopische Versuche zur Lösung fl^r Fraire nach der Konstitution der Tropanin- und Grenatinbasen. S. 2972 (1896). -) Tanref, Bull. soc. chim. T. 32. p. 466 (1879); Compt. rend. T. 88. p. 716; T. DO. p. 695. Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. qoi Pelletieriii, CsHigNO, ist eine ölige Flüssigkeit, die unter 100 »/;y/ bei 125% anter gewöhnlichem Druck bei 195" siedet. Eine Lösung des Sulfates zeigt [a]« = — aO». — Isopelletierin, CgHi^NO, zeigt gleichen Siedepunkt und gleiche Löslichkeit wie Pelletierin, ist aber optisch inaktiv. — Methylpelletierin, CgHi,^), ist flüssig, leicht löslich in Alkohol- Äther und Chloroform, siedet bei 215^ Das salzsaure Salz zeigt eine Drehung von |7.!d = + 22". . II. Alkaloide der Pyrrolidingruppe. Es gehören hierher Alkaloide der Solanaceen, Kokaalkaloide und solche der Lupinenarten. 1. Alkaloide der Solanaceen. In manchen Solanumarten, wie Atropa helladomia (Tollkii'sche), Dafura stranmonium (Stechapfel), Hyoscyamus nujer (Bilsenkraut), finden sich mehrere in ihren Eigenschaften und ihrer chemischen Konstitution einander sehr nahe stehende Alkaloide, von denen vor allem die beiden Isomeren: das optisch-inaktive Atropin Ci^HasNOa und das linksdrehende Hyoscjamin „ zu nennen sind. Es mag hier sogleich erwähnt werden, daß Atropin nichts anderes ist als die razemische ^lodifikation des Hyoscyamins, wie insbe- sondere aus den der Neuzeit entstammenden Untersuchungen von Gachtmrr und Ämenomiija'^') hervorgeht. Atropin. r-Tropasäure-i-tropinester. CHa CH CH, N.CH3 CH.O.CO — CH — CßH-, CR, CH CH, CH, . ( )H. Vorkommen, (Gewinnung und Eigenschaften desselben. Die Base kommt in der Tollkirsche (Atropa belladonna), dem Stech- apfel (Datura strammonium) sowie in der Wurzel von Scopolia japonicavor. Zur Extraktion derselben aus Atropa belladonna wird folgendes Ver- fahren, das auf den Arbeiten von Rahoiirdhi, Gerrard, Pesci, Procter u. a. beruht, empfohlen. Zwei- bis dreijährige, völlig trockene und fein ge[)ulverte Belladonnawurzel wird zweimal mit DOVoJi^"^'"^ Alkohol unter gelindem I^r- wärmen ausgezogen. Die filtrierten alkoholischen Extrakte versetzt man ^) Gadamer und Aineno»n'i/a, Die Bezieluins-cn des Hyoscyamins zu Atropin und des Skopolamins zu i-Skopolamin. Arcb. d. Pliaim. Bd. 239. S. 2'J4, 321 (l'JOl); Bd. 240. S.498 (1902). 922 Julius Schmidt. mit wenig — ungefähr 4*'/o des in Arbeit genommenen Wurzelpiilvers — gelöschtem Kalk, läßt 24 Stunden stehen und filtriert. Das Filtrat wird bis zur schwach sauren Reaktion mit verdünnter Schwefelsäure versetzt. Man läßt das Calciumsulfat absetzen, dekantiert und destilliert den Alkohol im Wasserbade ab. Nach Befreien des sauren Destillationsrückstandes durch Schütteln mit Äther oder Petroläther von Harz und Fett versetzt man mit Kaliumkarbonatlösung bis zur schwach alkahschen Reaktion, d. h. bis zur beginnenden Trüi)ung. Nach 24stündigem Stehen hal)en sich die letzten N'erunreinigungen als harzige, aber atropinfreie Masse ausgeschieden. Aus dem Filtrate wird das Atropin durch Ül>ersättigen mit Kaliumkarl )onat ausgefällt. Die nach 24stündigem Stehen vollständig abgeschiedene Rohbase wird abgepreßt, zwischen Filtrierpapier getrocknet, in wenig Wasser ver- teilt, nochmals abgepreßt, hierauf in Alkohol gelöst und mit Tierkohle entfärbt, die Lösung filtriert und eingeengt. Auf Zusatz von ca. dem sechs- fachen A'olumen Wasser scheidet sich das Atropin nach längerem Stehen in kristaUinischen, konzentrisch gruppierten Krusten ab. Der Atropingehalt verschiedener Pflanzenteile wechselt je nach der Wachstumsperiode sehr beträchtlich. Nach Mehi^) enthalten 1000 Teile getrockneter Belladonna- wurzel etwa iVi] Teile Atropin. Das Atropin ist optisch inaktiv, kristallisiert aus Alkohol und Chloro- form in Prismen vom Schmelzpunkt 115 — 116°. Seine Lösungen schmecken scharf und bitter, es ist ein starkes Gift und verdankt seine weitverbreitete medizinische Anwendung seiner Eigenschaft, die Pupille zu erweitern (My- driasis). Es vermag den durch Muskarin hervorgerufenen Stillstand des Herzens zu heben. Das inaktive Atropin entsteht auch, wie Will-) und Schmidt') ge- funden haben, aus seinem Stereoisomeren, dem Hyoscyamin, beim Erhitzen desselben unter Luftabschluß auf 110° oder aus seiner alkoholischen Lösung beim bloßen Stehen durch Zusatz einiger Tropfen Alkali, wie auch schon beim längeren Aufbewahren für sich.*) Es ist dies, wie beim Hyoscyamin näher ausgeführt wird, nichts x4nderes als eine Razemisierung. Beim Behandeln mit Salpetersäure-^) sowie beim Erwärmen mit Essigsäure — resp. Beuzoesäureanhydrid oder Phosphorpentoxyd auf So"") verhert Atropin ein Molekül Was.ser und bildet Apoa tropin. CiyH-^iNOa, welches mit dem natürlichen Atropamin identisch befunden wurde. Dasselbe ') Mein, trber die Darstellung des Atropins in weißen Kristallen. Ann. d. Cliem. u. Pharm. Bd. 6. S. 67 (1833). -) IVill, Atropin und Hyoscyamin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 21. S. 1717; Will und Bredig, Umwandlung von Hyoscyamin in Atropin durch Basen. Zur Kenntnis der Massenwirkung. S. 2777 (1888). ") Schmidt, Umwandlung von Hyoscyamin in Atropin. El)enda. 1829. ■*) (). Hesse, Zur Kenntnis einiger Solonaceenalkaloide. Atropin. Ann. d. Chem. Bd. 309. S. 75. ') Pcsci, Gaz. chim. ital. Vol. 11. p. 538 (1881); Vol. 12. p. 60 (1882). ") 0. Hesse, Zur Kenntnis der Atropa-Alkaloide. Ann. d. Chem. Bd. 277. p. 202 (189-t). Methoden ziu- Darstellung von Alkaloiden. <»•>;; kristallisiert in Prismen vom Schmelzpunkt 60 bis 62" und zeigt keine Mydriasis. Erhitzt man Atropin auf IHO", so erfährt dasselbe eine Wasser- abspaltuno' in etwas anderer Richtunsi'. indem sich ein gewisser Anteil in Belladonnin, eine unkristallisierbare, firnisartige Masse, umwandelt. Die Atropinsalze zeigen nur geringes Kristallisationsverniiigen. l)as in der Augenheilkunde verwendete Atropinsulfat , (Cj^ H.v, NO3)., II^SO^ + + H.. 0, wird kristallinisch erhalten, wenn man eine absolut alkoholische Lösung von Schwefelsäure (1 Teil auf 10 Teile Alkohol) in eine Lösung von 10 Teilen Atropin in trockenem Äther eintröpfelt. Das Sulfat scheidet sich hierbei in Nadeln aus. — Das Platinsalz ^), (C17H23 XOj .HCllj-^rtCl^, bildet, durch freiwilliges Verdunsten der verdünnten Lösung bereitet, inonokline Tafeln, die bei 207 — 208° unter Zersetzung schmelzen. - Das GohlsaU-). (Ci7 HogXOg .HCljAuClg , ist für das xllkaloid charakteristisch. Es fällt meist ölig aus, erstarrt aber bald und läßt sich aus heibem Wasser unter Zusatz von etwas Salzsäure umkristalUsieren. Beim Erkalten trübt sich die Lösung und erst nach längerer Zeit beginnt die Ausscheidung kleiner, zu Warzen vereinigter Kristalle. Nach dem Trocknen bildet das Salz ein glanz- loses Pulver, das bei i;>5 — loT'^ schmilzt. Synthese des Atropins. Beim Kochen mit Barytwasser wird Atropin in Tr()i)in und Tropa- säure zersetzt. Ci, H.,3 N(J. + H2 O =^ Cs H,5 NO + C, Hio O3 Atropin Tropin Tropasäure. Die der Gleichung entgegengesetzte Reaktion führte Ladenburg ^) 1879 zur partiellen Synthese des Atropins, er konnte durch Behandeln des tropa- sauren Tropins mit Salzsäure das Atropin regenerieren. Die Synthese der Tropasäure wurde \on Lndenburg unt] Bii(/heiui er*) durchgeführt. Viel später als die Konstitutionserforschung und Synthese der Tropa- säure ist diejenige des zweiten Spaltungsproduktes des Atropins, des Al- kohols Tropin, gelungen. Die gesamte Atropiiisyiithese stellt sich nunmehi- in folgender Weise: 1) E. Schiuidf, Über die Alkaloidc der Belladonnawurzel und des Stechapfelsamens (Atropin, Daturin, Hyoscyamin). Ann. d. Chem. Bd. 208. S. 196 (1881). ') Ladenbnrti, Die natürlich vorkommenden mydriatisch wirkenden Alkaloide. Ann. d. Chem. Bd. 206. S. 278 (1881). ^) Laden biirq, Künstliches Atropin. Ber. d. Deutsch, chem. (ies. Bd. 12. S. 941 (1879); Künstliche Alkaloide. Bd. 13. 8.104(1880); Die Konstitution des Atropins. Ann. d. Chem. Bd. 217. S. 78 (1883). ^) Ladeii/jiin/ und Bii!/heinier, Künstliche Bildung der Tropasäure. Ber. d. Deutsch. chem. Ges. Bd. 13. "s. 373 (1880) : Spieffel, Synthese der Tropasäure ans Acetophenon. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 14. S. 236 (1881); Kraut mu\ Mo-lin,/. Addifinnsprodnkte der Atropasäure. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 14. S. 330 (1881); M>rU)iy, ("her Additionsprodukte der Atropasäure. Ann. d. Chem. Bd. 209. S. 3 (1881). ()24 Julius Schmidt. 1. Syntlie.se des Glyzerins (Faraday, Kalbe, Melsens, Boerhuve, Friede! und Silva). 2. Aus Glyzerin: Glutarsäure (Berthelot und de Lucu , Cahours und Hoßnmin, Erlenmeycr, Lcrnumtoff und Markownikof). o. Glutarsäure in Suberon (C. Broun und Walker., Boussingault). 4. Suberon in Tropidin (Willstätter) . 5. Tropidin in Tropin (Willstätter, Ladcnhurg). 6. Synthese der Tropasäure (Berthelot, Fittifj und Tollens , Friedet. Ladenburg und Eügheimer). 7. Aus Tropin und Tropasäure: Atropin (Ladenlnirg). Die TropeineJj Nach Ladenburg bezeichnet man als Tropeine allgemein die Säure- ester des Tropins. ^Yir haben im vorhergehenden erwähnt, dali sich die Tropasäure mit diesem Alkohol leicht zu Atropin verbindet. Ähnlich rea- gieren andere Säuren. Im nachfolgenden seien einige wichtigere Tropeine kurz angeführt. Homatropin oder Phenylglycolyltropein^), CißHaiNOa, ist wegen seiner physiologischen Wirkung neben Atropin und Hyoscyamin die wich- tigste Verbindung der Tropeingruppe. Sie entsteht aus Tropin und Mandel- säure, kristallisiert aus absolutem Äther in giashellen Prismen, die mit Wasser zerflieblich sind und bei 95-5 — 98*5o schmelzen. Hydrohromid des Homatropins, CigHaj NO3 .HP)r, kristallisiert in rhombischen Platten und ist in kaltem Wasser nur mäßig löshch. Nach Untersuchungen von Volkers'^) und seinen Schülern wirkt das Homatropin in Gestalt seines Hydrobromides fast ebenso energisch erwei- ternd auf die menschliche Pupille ein wie das Atropin, doch verschwindet diese Wirkung verhältnismäßig sehr rasch wieder. Es zeigte sich, daß man bei Einträufelung eines Tropfens einer l%igen Homatropinlösung in das Auge nach 5 — 10 Minuten Mydriasis bemerkt, welche nach einer Stunde etwa ihr Maximum {S mm) erreicht und nach 20 Stunden verschwunden ist. Die Atropinwirkung selbst einer sehr schwachen Lösung (V2V00) dauert viel länger, et^va 6 — 9 Tage. Ähnlich verhält es sich mit der Akkommo- dationslähmung. Es kommt hinzu, daß das Homatropin ein weit schwächeres Gift ist als Atropin und so hat denn das Homatropin Eingang in die Augenheilkunde gefunden. Pseudo^tropinoder Atrolactvltropeins), CitHojNOs, mit Atropin /CH3 isomer, bildet sich durch Behandlung von Atrolactinsäure: CeHg.C— OH \C().3H und Tropin mit verdünnter Salzsäure, glänzende, l)ei 119—1200 schmelzende Nadeln, seine mvdriatische Wirkung gleicht auffallend der des Atropins. ') Ladenbnrg, Die Konstitution des Atropins. Ann. d. Chem. Bd. 217. 8.82(1883). -) Völkers, Über Homatropin. Ann. d. Chem. Bd. 217. S. 8G (1883). ") Ladenbnrc/, Die Konstitution des Atropins. Ann. d. Chem. Bd. 217. 8.82(1883)- Methoden zur Darstellung von Alkaluiden. ijo.') Die Fähigkeit der Tropeine, myclriatiseh zu Avirkcn, hänot nach (h-n Untersuchungen von Ladenhury und Völkers nicht aUein vom Vorhanih'ii- sein des Tropinrestes im Molekül derselben ah. Ijm sie hervorzurufen, muli der Tropinrest am besten mit einer Oxysäure, welche also ein alkoholisches Hydroxyl enthält, vereinigt sein. Allerdings sind auch Ausnahmen von dieser Gesetzmäßigkeit bekannt. Hyoscyamin. l-Tropasäure-i-tropiiiester. Das Hyoscyamin wurde 1833 von Geiger und Hesse ') aus dem P>ilseu- kraut erhalten. Außerdem kommt es noch in verschiedenen anderen I*flanzen vor. So wurde es von Dunstan und Brown 2) im Hyoscyamus muticus. von Thoms und Wentzel 3) in der Mandragorawurzel aufgefunden. Nach Unter- suchungen von Ernst Schnddt *) und seinen Mitarbeitern enthält die Atropa Belladonna in allen ihren Organen als Mydriatikum im wesentlichen nur Hyoscyamin, und zwar wurden gefunden: in trockenen, reifen Früchten 0'476''/o, in unreifen Früchten 0"884Voi ii^ Kelchen mit jungen Frucht- knoten 0"797Vo' in reifen Samen des Handels 0"831''/o5 in der Blunien- krone 0-39 % Alkaloid. Seine Eigenschaften sind denen des Atropins sehr ähnlich. Es kri- stallisiert aus Alkohol in Nadeln vom Schmelzpunkt lOS';")". In seinem scharfen und durchdringenden Geschmack gleicht es dem Atropin , auch seine Wirkung auf die Pupille ist dieselbe: Hyoscyamin l)ewirkt wie Atropin eine Erweiterung der Pupille. Der Hauptunterschied beider Alkaloide be- ruht in der optischen Aktivität des Hyoscyamins, welches linksdrehend ist im Gegensatz zu dem inaktiven Atropin; bei p = 3'*22 und t = lö ist ['/]ü r= _ 20-3. Die Darstellung des Alkaloids aus Mandragorin z. B. gestaltet sich folgendermaßen. Die zerkleinerte Wurzel wird im Perkolator mit weinsäurc- haltigem Alkohol extrahiert, von den vereinigten Auszügen der Alkohol im Vakuum abdestilliert und der nach dem Durchkneten mit Sand verteilte harzige Päickstand mit kaltem Wasser ausgezogen. Die filtrierte wässerige Lösung wird zunächst mit Petroleumbenzin, hierauf mit Äther mehrmals durchgeschüttelt, wobei ein auch in der Belladonnawurzel vorkommender Schillerstoff, die Chrysatropasäure , ein Methyläskuletin, zum größten Teile entfernt wird. Die mit Kaliumkarbonat alkalisierte Lösung gibt sodann beim Schütteln mit Äther das Alkaloid an diesen ab. Aus der ätherischen ') Geiger und Hesse, Atropin. Ann. d. Cheni. Bd. 5. S. 43 (1833). 2) Dunstan and Brown, Vorkommen von Hyoscyamin in dem indischen Hyos- cyamus muticus. Journ. chom. Soc. Vol. 75. p. 72 (1899). ") Thoms und Wenfzel, Über Mandragorin. Her. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 31. S.2031 (1898). •*) Ernst Schmidt und Mitarbeiter, Über die Alkaloido einiger mydriatiscli wirkender Solanaceen. Arch. d. Pharm. Bd. 243. S. 3U3; Über die mydriatisch wirkenden Alkaloide der Samen von Datura alba. S. 309; Über Skopolin. S. 328(1905). t)26 Julius Schmidt. Lösung wird durch Schtttteln mit verdünnter Schwefelsäure das Alkaloid in diese übergeführt, abermals die schwefelsaure Lösung mit Kaliumkar- bonat übersättigt und mit Äther ausgeschüttelt. Diese Überführung von Äther in saure, wässerige Lösung wird ömal wiederholt, wodurch es ge- lingt, anhängende harzige Bestandteile und den Schillerstoff aus dem Alkaloid zu beseitigen. Nach dem Abdunsten der ätherischen Lösung des Alkaloids im ^^akuum hinterbleibt ein nur schwach gelb gefärbter Sirup, der über Schwefelsäure zu einer glasartigen festen Masse von schwach narkotischem Geruch eintrocknet. Die Umwandlung von Hyoscyamin in Atropin (Razemisierung) läßt sich nach WiU und E. Schmidt ^) durch einfaches Schmelzen sowie nach dem ersteren durch Zufügen kleiner Mengen Alkalien zur alkoholi- schen Lösung der Base bewerkstellisen. Als Nebenreaktion tritt hierbei hydrolytische Spaltung beider Alkaloide zu i-Tropin und Tropasäure ein. In der Neuzeit hat dann Gadamer 2) gefunden, daß in alkoholischer Lösung Hyoscyamin schon von selbst langsam, fast ohne hydrolytische Spaltung, in Atropin umgewandelt wird, was sich durch Tropinzusatz beschleunigen läßt. Durch den von Gadamer erbrachten Nachweis, daß das Tropin im Hyoscyamin ebenso Avie im Atropin inaktiv ist. daß also die Isomerie von Atropin und Hyoscyamin einzig und allein auf die Inaktivität bzw. Aktivität des in diesen Basen enthaltenen Tropasäurerestes zurückzuführen ist, war theoretisch die Überführbarkeit des Atropins in d- und 1-Hyoscya- min gegeben. Experimentell ausgeführt wurde diese Umwandlung von Ämenomiya ^) dadurch, daß er zunächst käufliches Atropin in Tropin und r-Tropasäure verseifte, letztere nach dem ^'erfahren von Ladenburg und Hundt ^) in d- und 1-Tropasäure zerlegte und schließlich das Tropin wieder mit d- oder 1-Tropasäure vereinigte. Auch die vollständige Synthese des Hyoscyamin s ist nunmehr durchführbar. Sie gestaltet sich analog derjenigen des Atropins, nur ist die Tropasäure vor der Vereinigung mit Tropin in die aktiven Komponenten zu spalten. Die von Cushny s) ausgeführte Untersuchung über die pharmakologi- sche "Wirkung des Atropins, d- und 1-Hyoscyamins hat Ergebnisse geliefert, welche in Einklang stehen mit der Annahme, daß Atropin razemisches Hvoscvamin ist. ') Will und E. Schmidt , Atropin und Hyoscyaiiiiü. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 21. S. 1717 ; Will und Brcdig , Umwandhing von Hyoscyamin in Atropin durch Basen. Zur Kenntnis der Massenwirkung. S. 2797 (1888). ^) J. Gadamer, Die Beziehungen des Hyoscyamins zu Atropin und des Skopolamins zu i-Skopolamin. Arch. d. Pharm. Bd. 239. s!'294, 321 (1901). *) Amrnomii/a, Üherführung des Atropins in d- und 1-Hyoscyamin. Arch. d. Pharm. Bd. 240.. S. 498 (19U2). *) Ladenhurr/ und Hundt, Darstelhing optisch aktiver Tropasäure und optiscli aktiver Atropine. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 22. S. 2590 (1889). ^) C'ushni/, Atropin und Hyoscyamin. Eine Untersuchung über die Wirkung von optisch Isomeren. Jouru. of Physiol. Vol. 30. p. 176 (1903). Mctliodcn zur Darstellung von Alkaloiden. tC>7 Durch wasserentziehende Mittel wird das Hyoscyamiii in Atropainiii und Belladonniii üliergeführt , welche Alkaloide auch bei der analogen Be- handlung' des Atropins entstehen. M Die beiden Solanaceenalkaloide Hyosciii und Skopolainin (Atroscini von der Formel CiyKsiXO^, deren Konstitution noch nicht vollstiindii: aufgeklärt ist, sind optisch isomer. Das Ilyoscin laßt sich in Sk()i)ohmiin überführen. Letzteres- liefert bei der Hydrolyse Tiopasäure und Skopolin. ist also Tropasäure-skopolinester. Das Skopohn, CgHigNO-j, zeigt groüe Ähnlichkeit mit dem Tropin, CsHijXO. Der wesentliche Unterschied beider besteht in dem Ersatz zweier Wasserstoffatome des Tropins gegen ein Sauerstoff atom im Skopolin. Dasselbe ist nicht in Form von Wasser ab- spaltbar und befindet sich wahrscheinlich in äthei-artiger Binchmg. Man wird also nicht fehlgehen in der Annahme, da(j Skopolin dem Tropin ähn- lich konstituiert ist und wie dieses einen Pyrrolidinring enthält. Die physiologische Wirkung des Hyoscins und Skopolamins ist be- ruhigend, ohne schädliche Xebenreaktionen wie beim Atropin; auch die mydriatische Wirkung übertrifft die des Atropins um das Mehrfache. Das Skopolamin ist dem Hyoscin vorzuziehen. Zur Darstdliüu/ von Skopolamin benutzt man die bei der Hyoscya- mingewinnung aus dem Hyoscyamussamen oder den Blättern resp. Wurzeln von Duboisia myoporoides abfallenden Mutterlaugen. Nach dem Auskristalli- sieren des Hyoscyamins erhält man durch weiteres Verdampfen die sog. amorphen Hyoscyamusrohbasen , deren salzsaure Lösung mit (ioldchlorid ausgefällt wird. Durch Umkristallisieren des zuerst sich ausscheidenden Goldsalzes werden bei 198 — 199*' schmelzende Prismen erhalten. Man fällt aus der wässerigen Lösung derselben das Gold mit Schwefelwasserstoff, erhält aus dem Filtrat durch Eindampfen das salzsaure Salz und schlielj- lich die Base selbst. Das in Deutschland offizineile Hydrobromid. C,7 H,, NO4. HBro + äHsO, löst sich in 4 Teilen Wasser von 15" und wird in der Therapie der Augenkrankheiten und bei gewissen Nervenaffektionen an- gewandt. Die \0M E. Schmidt -) und seinen Mitarbeitern ausgeführte Unter- suchung über den ^Vlkaloidgehalt einiger Datnraarten, hat als wichtigstes Erge])nis die Erkenntnis geliefert, daß Datura Met'^1 eine typische Skojjo- laminpflanze ist. Sie enthält in ihren krautigen Teilen als Haui)talkaloid reines 1-Skopolamin. E. Schmidt weist besonders auf die praktische Bedeu- tung hin, welche demzufolge Datura Metel hat, da nach den Untersuchungen von R. Robert reines 1-Skopolamin den Augenärzten dringend zur Benutzung empfohlen wird. 0 O.Hesse, Zur Kenntnis der Atropa-Alkaloide. Ann. d. Cliem. Bd. 277. S. 2'.)(» (1893); E.Schmidt, Über das Skopolamin. Arcli. d. Diarm. Bd. 232. S. 409. -') E. Schmidt und Mitarbeiter. Über die Alkaloide einiirer niydriatisch wirkender Solanaceen. Arcb. d. Pliarui. Bd. 243. S. 3ü3; Über die niydriatiscli wirkenden Alkaloide der Samen von Datura alba. S. 309; Über Skopolin. S. 328 (1905). 928 Julius Schmidt. Atropamin oder Apoatropin. Itropasäure-tropinester : H.X CH CH2 CH, X.CH, CH.O.CO.C.C.H,. H, C CH CH, Das Atropamin oder Apoatropin. ^Yelches ein Molekül Wasser weniijer enthält als Atropin, wurde zuerst von Pesci^) dargestellt durch Behandeln von Atropin mit Salpetersäure. Das Alkaloid entsteht stets aus dem Atropin oder Hyoscyamin bei der Ein^Yirkung• Avasserentziehender ]\Iittel, wie Schwefel- säure, Anhydride der Phosphorsäure, Essigsäure etc.^) Es wird auch zeit- weise in der Wurzel der Tollkirsche angetroffen, in welchem Falle es sich dann in den Mutterlaugen von der Atropindarstellung findet. 3) Es kristaUi- siert aus ätherischer Lösung in Prismen vom Schmelzpunkt 60 — 62". be- sitzt keine mydriatischen Eigenschaften und ist optisch inaktiv. Beim Erhitzen wird das Atropamin in sein Isomeres, das Belladonnin, umgelagert. Auch beim Erwärmen mit Salzsäure, beim Auflösen in konzen- trierter Schwefelsäure, beim Kochen mit Alkalien und Barytwasser tritt diese Umlagerung ein. Gleichzeitig spaltet sich dabei ein Teil des Alkaloids in Tropin und Atropasäure: Ci,H.,iN02 + H.3O =: CgHisNü + CgHsUo Apoatropin Tropiu Atropasäure. Durch Umkehi^ung dieser Pteaktion konnte Ladenburg *) eine partielle Synthese des Atropamins erzielen, indem er ein Gemenge von Tropin und Atropasäure mit Salzsäure erhitzte. Nachdem nunmehr das Tropin und die Atropasäure synthetisch zugänglich sind, ist in der Neuzeit die vollstän- dige Synthese des Apoatropins möghch geworden. Das Hydrochlorid des Apoatropins, Ci^ Hoi NO2 . HCl, kri- stallisiert in Blättchen, die bei 237 — 239'^ schmelzen. — Das Hydro- bromid, C17 H.,i NOg . HBr, schmilzt bei 230—231». — Das Goldsalz, (Ca.HsiNOo.HCljAuClg, bildet Nadeln, die bei 110-112° schmelzen. — Das Platinsalz, (CiyHäiNOg.HCljaPtCli, kristallisiert in Schüppchen vom Schmelzpunkt 212—214". Belladonnin.') Dasselbe ist wahrscheinlich ein Stereoisomeres des Atropamins. Es findet sich in sehr geringer Menge in der Tollkirsche (O'Ol — 0'04Vo) und ^) Pcsci , Darstellung von Atropamin. Gaz. chim. ital. Vol. 11. p. 538 (1881); Vol. 12. p. 60 (1882). ^) 0. Hesse, Zur Keuntnis der Atropa-Alkaloide. Aiiiial. d. Chem. Bd. 277. S. 2!)(3 (1893). 3) O.Hesse, Annal. d. Chem. Bd. 261. S. 87 (1891). ^) Ladenhurff, Die Konstitution des Atropins. Auual. d. Chem. Bd. 217. S. 290. '^) Merling) Über Belladonnin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 17. S. 381 (1884). — Hesse, Annal. d. Chem. Bd. 281. S. 87 (1891); Zur Kenntnis einiger Solanaceenalkaloide. Bd. 127. S. 123 (1892); Zur Kenntnis der Atropa-ilkaloide. Bd. 277. S. 295 (1893). Methoden zur Darstell uui;- von Alkiiloideii. ()-)i| entsteht, wie oben erwähnt, aus seinem Isomeren, dem Atropamin, durch Erhitzen sowie durch Einwirkung von Säuren oder Ätzl)arvt. Man kann auch direkt vom Atropin zum Belladonnin gehangen, nämlich durch Er- hitzen des Atropins auf V\0" oder durch Auflösen desselben in konzen- trierter Schwefelsäure und kurzes Stehen der Lösung. Bei der Hydrolyse Uefert es schließlich dieselben Verbindungen wie das Atropamin, also Atropasäure und Tropin. Das Belladonnin bildet eine unkristaUisierbare , firnisartige Masse, deren Einheitlichkeit von verschiedenen Forschern noch in Zweifel gezogen wird. Es löst sich leicht in Alkohol, Äther, Chloroform und Benzol, wenig in ^^'asser. 2. Alkaloide der Kokablätter. Die Blätter von Erythroxylon Coca enthalten eine größere Anzahl von Alkaloiden. Es sind außer den weniger wichtigen Hygrinen die folgenden: Kokain C^ H21 XO^ Cinnamylkokain .... C^g H23 XO^ '/.-Truxiliin (CigHg^NOj. ß-Truxillin (C19H.23XO4)., Benzoylecgonin C^e H^g NO4 Tropakokain C15 H^g XO2 Alle diese Alkaloide sind Propanderivate, enthalten also den Pyrro- lidinkern. Sie liefern mit Ausnahme von Tropakokain alle ein und dasselbe Spaltungsprodukt, nämlich Ecgonin, und stehen, wie schon mehrmals er- wähnt, in naher Beziehung zu den Solanaceenalkaloiden. Von allen Kokaalkaloiden besitzt nur das 1-Kokain therapeutischen Wert, die anderen sind ohne besondere physiologische Wirkung. Doch kann man diese unwirksamen Xebenalkaloide, da sich aus ihnen nach Liebermann 1-Ecgonin gewinnen läßt (siehe S. 9ol), jetzt auch nutzbar machen. Kokaine. Beiizoylecgoniiimethylester : HgC CH CH.COOCH3 X.CH3 CH.O.CÜCßHs I I H,C CH CK, Entsprechend den verschiedenen stereoisomeren Ecgoninen existieren auch drei stereoisomere Kokaine, nämlich 1-Kokain. d-Kokain (d-'i/-K okain) und r-Kokain; dazu kommt noch das vom a-Ecgonin sich ableitende strukturisomere a-Kokain. Unter diesen stellt das 1-Kokain das wei-tvoUste und wichtigste dar. Es ist ein geschätztes lokales Anästhetikum und wird wegen der kurzen Abderhalden, Handbiicli der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 59 9o0 Julius Schmidt. Dauer seiner Wirkungen namentlich in der Therapie der Augenkrankheiten und in der zahnärztlichen Praxis angewandt. Zu länger andauernder An- ästhesie kann es wegen seiner Giftigkeit nicht benutzt werden. Es kommt als Hydrochlorid zur Verwendung. Vorkommen, wichtige Spaltungen und Darstellung des l-Ko- kains. Das 1-Kokain wurde im Jahre 1860 von Niemomi'^) aus den peru- anischen Kokablättern aus Ervthroxylon coca isoliert. Schon durch Kochen mit Wasser wird es in Methylalkohol und Benzoylecgonin gespalten -) : Ci7H.,iN04 + H.,() =:3 C.eHjgNO, -f CH. f )H Kokain Benzoylecgonin. Bei kräftigerer Hydrolyse durch Mineralsäuren, Barytwasser oder AlkaUlaugen entstehen, indem das Benzoylecgonin weiter zerlegt wird, 1-Ecgonin, Benzoesäure und Methylalkohol ^j: Ca,H.,,NO, -f- 2H2O = C9H15NO3 + C.H.O, + CHgOH Kokain Ecgonin Benzoesäure Methylalkohol. Aus diesen Spaltungen konnte geschlossen werden, daß das Kokain Benzoylecgoninmethylester ist und es lag der Gedanke nahe, es aus dem Ecgonin darzustellen. Die so angeregte partielle Synthese des 1-Kokains wurde zuerst von Merck ^) ausgeführt durch Erhitzen von 1-Ecgonin mit Benzoesäureanhydrid und Jodmethyl: CsH,3N<^j^^^ + fC,H,C0).3 0 + CH3J = Ecgonin CsH.aN/^^^^^^'^^jj^ + HJ + Co H,. CO OH Kokain. Auch nach anderen Methoden der Esterifizierung läßt sich die Über- führung von Ecgonin in Kokain bewerkstelligen. ^j Nach Liehermann^') 1) Niemann, Über (las Kokain. Annal. d. Chem. Bd. 114. S. 218 (1860). -) Paul, Pharmaceutical Journal. Vol. 3. p. 325. — Einhorn, Kokain. Ber. d. Deutsch, ehem. (ies. Bd. 21. S. 47 (1888). ^) LosKcn , Über das Kokain. Annal. d. Chem. Bd. 133. S. 351. — Calmels und Gossin, Comptes rendus de l'Acad. des sciences de Paris. T. 132. p. 971. *) Merck, Künstliches Kokain. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 18. S. 2264; Über die künstliche Darstellung von Kokain und seineu Homologen. S. 2952 (1885). ^) Einhorn, Über die technische Darstellung des Kokains aus seinen Neben- alkoloiden. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 21. S. 47; Einhorn und Klein, Einwirkung von Saurechloriden auf salzsaure Ecgoninmethylester. S. 3B35 (1888); Ref. Bd. 22. S. 619 (1889); Technische Darstellung des Kokains aus den Nebenalkaloiden. Bd. 27. S. 1523: Über die technische Darstellung des Kokains aus seinen Nebenalkaloiden. S. 296U; Darstellung von Isoeugenol aus Eugenol. Ref. S. 957 (1894). ^) Liehermann, Über eine neue technische Darstellung und teilweise Synthese des Kokains. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 21. S. 3196 (1888); Zur Abhandlung von Ein- horn und Willstätter , Über die technische Darstellung von Kokain aus seinen Neben- alkaloiden. Bd. 27. S. 2051 (1894). Methoden zur Darstellung von Alkaloideii. 9;>| verlauft dieselbe in guter Ausbeute, wenn man 1-Ecgonin dureh Kinwiikung von Benzoesäureanhydrid in konzentrierter wässeriger Lösung zunächst in 1-Benzoylecgonin überführt und letzteres mit Methylalkohol und Salzsäure oder Schwefelsäure methyliert. Dieses Verfahren gewinnt erhöhte Bedeutung dadurch, weil so das aus den medizinisch unbrauchbaren Kokaneben- alkaloiden darzustellende 1-Ecgonin nutzbar gemacht und in 1-Kokain über- geführt werden kaiML So gewinnt man eine gröliere Menge von reinem 1-Kokain, als überhaupt ursprünglich in der Pflanze gebildet war. Die Isolierung des 1-Kokains aus den Kokablättern gescliiclit mit Hilfe von hochsiedendem Petroleumäther nach der Methode von Bif/noi. Die gepulverten Kokablätter werden unter mäßigem Erwärmen und beständigem Schütteln mit einem Gemisch von verdünnter Sodalösung und Petroleumäther (Siedepunkt 200 — 250°) behandelt, wobei der letztere die abgeschiedenen Basen aufnimmt. Die Masse wird alsdann abgepreßt und die geklärten Flüssigkeitsschichten werden getrennt. Man neutralisiert die Petroleumätherlösung mit verdünnter Salzsäure und erhält so das rohe Kokainchlorhydrat in Form eines weißen Niederschlages, der abgepreßt und getrocknet wird. Die letzten gelöst bleibenden Anteile der Base gewinnt man durch A'erdampfen der wässerigen Flüssigkeit. Die Isolierung der Bohbase aus der Droge wird an Ort und Stelle ausgeführt, und das Chlorhydrat der Bohbase gelangt aus Amerika in die europäischen Fabriken, in denen die weitere Verari)eitung auf reine Base respektive deren Salze vorgenommen wird. In den besten (,)ualitäten der Piohliase finden sich bis zu 94% i'eines 1-Kokain vom Schmelzpunkt 08", in den minderwertigen nur ca. 78 — TOo/o. Die Bohbase enthält Becht.s- kokain, Benzoylecgonin, Cinnamylkokain, Hygrin, Truxilline und noch unliekannte Säurederivate des Ecgoninesters. d-Kokain (d-y-K okain, welches, wie ervrähnt, das gewöhnliche 1-Kokain begleitet und in den bei dessen Darstellung abfallenden Neben- produkten zu finden ist, kann in analoger Weise wie das 1-Kokain aus dem d-Ecgonin durch Esterifizierung mit ^lethylalkohol und darauf folgende Benzoylierung erhalten werden. Durch Esterifizierung des d-Ecgonins mit anderen Alkoholen stellten EinJwrn und Marquardt verschiedene andere Ecgoninester dar, und aus denselben durch Benzoylierung die entsprechenden homologen d-Kokaine. Mit Ausnahme des Benzoyl-d-ecgoninäthylesters, CgH.g (O.C.HsO) (C(),.C,H/)N, welcher bei 75» schmilzt, sind alle diese Körper Öle, die nicht kristallisiert erhalten werden konnten. r-Kokain ist auf vollkommen synthetischem Wege von li. WUlstätter^) hergestellt worden. Der Methylester des r-Ecgonius läßt sich ulatt benzovheren und so in r-Kokain überführen. Die Spaltung 1) E. Wülstätter, Synthesen in der Tropingruppc. Synthese von r-Kokain. Annal d. Chem. Bd. 326. S. 42 (1903). Ö9^ 932 Julius Sclimidt. desselben in optische Antipoden ist bislier niclit gelungen. In Wasser ist das synthetische Kokain so gut M'ie unlöslich, in absolutem Alkohol und Äther auch in der Kälte äußerst leicht löslich. Es besitzt bitteren Geschmack und ruft auf der Zunge genau wie das gewöhnliche Alkaloid ein intensives pelziges Gefühl hervor. Es bewirkt ausgesprochene Anästhesie und besitzt (wie ge- wöhnliches Kokain) bei subkutaner Einverleibung toxische Eigenschaften. y.-Kokain ist mit den vorstehend beschriebenen Kokainen struktur- isomer, indem es im Gegensatz zu diesen die Karboxymethyl- und Benzoyl- hydroxylgruppe am nämlichen Kohlenstoffatom 3 des Tropankernes gebunden enthält. Ho C CH CH. Ho C- X . CH. CH- ' /O.COCoHs ^COUCH, -CH. 7.-Kokain. Es leitet sich ab vom a-Ecgonin und wurde von WiUstätter^) aus diesem durch Esterifizierung und Benzoylierung mit Hilfe der Methoden, welche zum Aufbau des 1-Kokains aus seinen Spaltungsprodukten gedient haben, erhalten. Die anästhesierende Wirkung des 1-Kokains fehlt diesem Isomeren völlig. Cinnamylkokaine. Ciiinamylecgouinmethylestei". H., C CH CH . COO CH3 H,C N. CH3 CH . 0 . CO . CH : CH . C^ H5. CH- ^-CH^ Das 1-Cinnamylkokain findet sich in fast allen Kokavarietäten, besonders in der von Java. Es wurde von Giesel-) im Eohkokain nachge- wiesen, von Liehermann ") untersucht und aus dem 1-Ecgonin dargestellt durch Einwirkung von Zimtsäureanhydrid und darauffolgende Esterifizierung des Cinuamylderivates mit Methylalkohol und Salzsäure. Es kristallisiert aus der heißen Benzol-Ligroinlösung in Nadeln, die bei 121*' schmelzen. 3. Alkaloide der Lupiuenarteu. Spartein und Lupinin. Das Spartein Ci5H,6N2 wurde im Jahre 1851 von Stenhouse im Besenginster entdeckt. Um dasselbe darzusteUen, werden die +*flanzenteile M ii*- Wnisfättcr, t^hei- ein Isomeres des Kokains. Ber. tl. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 29. S.221G (1896). -) Giesel, Ciunamvlkokain. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 22. S- 2G61 (1889). 3) Liebermann, Annal. d. Chem. Bd. 241. S. 3373 (1888). Metliodcn zur Darstellung von Allvaloidcii. 9;>,}i mit schwefelsäurelialtigem Wasser ausgezogen, die Lü.siiiig koii/eiitriert und mit Natronlauge destilliert. Das Destillat wird mit überschüssiger Salzsäure eingedampft und der Iliickstand mit festem Kali destilliert. Das übergegangene Öl wird durch Erhitzen mit Natrium von den letzten Sijurcn AVasser befreit und dann im Wasserstoffstrom destilliert. 75 kg Pflanze liefern ca. 22 cm^ Spartein. Es ist ein farbloses öl, das bei ;-311 — :>ll-5" (72:) imn) oder bei 180 — 181" (20 mm) siedet. Das Drehungsvermögen in alkoholischer Lösung ist [a]D = ^ — 14-60. Die Lösungen des stark narkotisch wirkenden Alkaloids reagieren deutlich alkalisch. In seinen toxischen Wirkungen nähert es sich teils dem Coniin, teils dem Nikotin. Die Konstitution des Sparteins steht noch keineswegs fest, es scheint aber, daß es den Pyrrolidinkern enthält. Bei einer Untersuchung über die Ursache der Lupinenkrankheit der Schafe isoherte G. Lichscher aus dem Samen der gelben Lupine zwei Alkaloide: das sauerstoffhaltige kristalhsierende Lupinin und das sauer- stofffreie flüssige Lupinidin. Letzteres erwies sich bei näherer Untersuchung durch WiUstäfter und Marx'^) als identisch mit Spartein. Ijisere Kenntnis von dem Alkaloidgehalt der verschiedenen Lupinen- arten, den E. Schmidt-) und seine Schüler gründlich untersucht haben, ist hierdurch wesentlich vereinfacht und geklärt. Es kommen vor: 1. Lupinin, CioHjyON, in Lupinus Intens und Lupinus niger. 2. Spartein, CijH.^eNa, in Lupinus luteus, Lupinus niger. o. Lupanin, Ci-^H-^^ONo, und zwar in razemischer und linksdrehender Form, in Lupinus albus, Lupinus angustifolius, Lupinus perennis. Die Auffindung des Sparteins in der gelben Lupine bietet auch praktisches Interesse im Hinblick auf die Lupinenkrankheit der Schafe, deren Ursachen noch nicht genügend aufgeklärt worden sind. Zur Verarbeitung auf die Alkaloide extrahiert man die Lupinenkörner mit salzsäurehaltigeni Alkohol (Oö^/o mit 17„iger HCl). Nach dem Ab- destiUieren der Hauptmenge des Alkohols wird von Fett und anderen un- löslichen Substanzen abfiltriert, das Filtrat mit Natriumhydroxyd neutrali- siert und zur Sirupkonsistenz eingedampft. Nach abermaligem Filtrieren wird der gelbbraune Extrakt mit Natronlauge stark alkalisch gemacht und ausgeäthert. Die alkaloidhaltigen , von Äther befreiten Extrakte werden mit Salzsäure und konzentrierter Quecksilberchloridlösung versetzt, so lange ein Niederschlag entsteht. Hierdurch wird das Spartein ausgefällt. Man filtriert das Quecksilberdoppelsalz ab, fäUt im Filtrat das Quecksill)er ') Willstätfcr und Marx, Lupiuiiliu und Spartein. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 2351 (1904). -) E. Schmidt und Mitarbeiter, Über die Alkaloide der Lupinensnnien. Arch. d. Pharm. Bd. 235. S. 192 (1897); Über die Lupinenalkaloide. Bd. 242. S. 409 (1904). — Uer(/h, Über die Alkaloide der Lupinenarten. Ebenda. S. 41G. — Man vgl. auch E. Schulze, Einige Notizen über das Lupcol. Zeitschr. f. physi bis 68° schmelzen. Im Wasserstoffstrome erhitzt, siedet die Base bei 255" bis 257°. Sie hat einen angenehm fruchtartigen Geruch und intensiv bitteren Geschmack. III. Alkaloide der Chinolingruppe. 1. CMiiaalkaloide. Chinin und Cinchonin: H, C CH CH . CH : CHo HC 6= N C.OCH3 \CH ;^ ' \C— CH — HC \ / I HC CH 6h CH.3 CH, N — CH, Chinin^ H.,C- HC CH HC^ ^CH n/ N,C — CH — HC N HC CH OH CH CH.CH:CH„ CH, CH, Cinchonin') CH, Von verschiedenen, besonders in Bolivia und Peru vorkommenden Chinchonaarten: Chinchona Cahsaya, C. lancifolia. C. Pitagensis u. a. Rubia- ceen, stammt die Chinarinde her. Sie enthält außer einem Gerbstoff eine Pteihe von Alkaloiden in Form von Salzen der Chinasäure, Chinagerbsäure und Chinovasäure. Von denselben sind das Chinin C.20H.24X.2 Gg und Cin- chonin Ci9 Hg, Ng 0 die wichtigsten. Das Chinin, das häufig- mit drei Mole- külen Wasser kristallisiert, schmilzt wasserfrei bei 177" und l)ildet. aus Alkohol und Äther kristallisiert, seideglänzende Nadeln. Das Cinchonin bildet durchsichtige Prismen oder Nadeln, die bei 220"^ zu sublimieren beginnen *) Wir geben hier die Formeln wieder, welche habe aus seinen in der Neuzeit ausgeführten Untersuchungen abgeleitet hat. Man vgl. P. Rabe, Über die Konstitution des Cinchonins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 41. S. 62 (1908). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. ();.)5 und erst bei 255-4" schmelzen. Bei der Chinindarstellunii- aus Chinarinde führt man die in dieser enthaltenen Basen zunächst in Sulfate über. Letz- tere lassen sich dann auf Grund der verschiedenen Löslichkeit in Alkohol und in Wasser voneinander trennen. Chininsulfat ist in den genannten Lösungsmitteln schwer, Cinchoninsulfat dagegen leicht löslich, so dal'j es in den Mutterlaugen von der Chinindarstellung angereichert wird. FiUlt man letztere mit Na,tronlauge, so entsteht ein Niederschlag, der aus viel Cinchonin und wenig Chinin etc. besteht. Durch Behandeln mit Alkohol, in dem das Cinchonin schwer löslich ist, kann ihm das Chinin entzogen werden. Das Cinchonin wird wieder in Sulfat übergeführt, letzteres durch Umkristallisieren gereinigt, mit Ammoniak zerlegt und das Cinchonin aus Alkohol umkristaUisiert.i) Um Cinchonin aus (Jemengen von Chinin und Cinchonin. in welchen das letztere vorwiegt, rein darzustellen, läßt sich auch die SchwerlösHchkeit des Cinchonins in Alkohol und in Äther benutzen. Das Cinchonin bildet also ein Nebenprodukt bei der Chinindarstellung. Da die Chininpräparate in bezug auf therapeutische Bedeutung denen aus Cinchonin weit überlegen sind, so ist das Cinchonin viel billiger als das Chinin. Das Drehungsvermögen des Cinchonins ist von der Natur des Lösungs- mittels und von dem Vorhandensein einer Säure beeinflußt. Für eine ab- solut alkohohsche Lösung (Oi bis 015^ in 20 cm^ gelöst) wurde gefunden [y-]D = + *228'2°. Die Cinchoninlösungen besitzen , abweichend von denen des Chinins, keine Fluoreszenz. Zur Darstellung des Chinins aus Chinarinde wird diese mit verdünnter Schwefelsäure oder Salzsäure wiederholt ausgekocht und die Lösung mit Kalk oder Xatriumhydroxyd gefällt. Der Niederschlag wird in 75 — SOVoi^if'ni Weingeist gelöst, mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert und der Alkohol abdestilliert. Das ausgeschiedene Sulfat wird von der Mutterlauge getrennt und wiederholt aus Wasser umkristallisiert, wobei, wie vorstehend erwähnt, das Chininsulfat zunächst auskristallisiert, während die Sulfate der übrigen Chinabasen in Lösung bleiben. Lst die Fände sehr cinchoninhaltig, so wird der durch Alkali erhaltene Niederschlag mit S;')- bis DC/nigeui Alkohol ausgekocht, wobei beim Erkalten das in ^Alkohol schwerer lösliche Cinchonin zum Teil sich ausscheidet. Erst dann wird mit Schwefelsäure neuti-alisiert Für die Trennung kleinerer Mengen Chinin und Chinchonin läßt sich auch die Schwerlöslichkeit des letzteren in Äther benutzen. Aus der Lösung des schwefelsauren Chinins in verdünnter Schwefelsäure fällt Ammoniak amor- phes, wasserfreies Chinin aus. Ein sehr reines Chinin wird durch Zerlegen des Jodsulfats ( Herapathits ) mit Schwefelwasserstoff gewonnen. Conchinin oder Chinidin: CsoHo^NoO.,. Dieses Stereoisomere des Chinins findet sich in den meisten echten Chinarinden, namentlich aber in den Rinden von Cinchona pitagensis. 1) Hesse, Über Cinchonin. Ann. d. Chem. Bd. 122. S. 227 (1862); Ann. d. Chem. Bd. 225. S. 218 (1884). 9;j6 Julius Schmidt. Cincliona amygdalifolia und einer auf Java unter dem Namen Cinchona Calisaya kultivierten Cinchone, in letzterer bis zu 3%. Das Conchinin bleibt bei der Darstellung des Chininsulfats in dessen Mutterlauge und geht schließlich in das Chinoidin über, ^Yelch letzteres daher ein geeignetes Material zur Darstellung von Conchinin ist. Aus dem rohen Chinoidin kann das Conchinin gewonnen werden, indem man die alkoholische Lösung desselben mit Jodwasserstoff sättigt; nach einiger Zeit kristallisiert das Jodwasserstoff saure Conchinin aus. ^Rch Hesse ^) ist es zweckmäßig, das gepulverte Chinoidin mit Äther zu behandeln, die von demselben aufgenommenen Alkaloide an Schwefelsäure zu binden, die neu- trale Lösung zur Beseitigung des etwa vorhandenen Chinins und Cincho- nidins mit Seignettesalz auszufällen und das Conchinin aus dem mit Tierkohle behandelten Filtrat mit Jodkalium niedergeschlagen. Das Jod- hvdrat wird dann mit Ammoniak zersetzt, die Base in essigsaurer Lösung mit Tierkohle entfärbt, mit Ammoniak wieder gefällt und aus kochendem Alkohol umkristallisiert. Das Conchinin kristallisiert aus weingeistiger Lösung in großen, glän- zenden Prismen mit 2V2 Mol. H2O, die an der Luft verwittern unter Abgabe von 1/2 Mol. Wasser. Die getrocknete, wasserfreie Base schmilzt bei 172". Über die Wirkung des Conchinins liegen Beobachtungen vor aus der Zeit, als der Preis des Chinins sehr hoch war. Man suchte dabei* nach einem Ersatz für dasselbe und Jobsf in Stuttgart machte auf das damals wesentlich billigere Conchinin für diesen Zweck aufmerksam. Macchiavelli hatte 1878 in italienischen Miütärhospitälern bei der Behandlung von Malaria mit Conchinin sehr gimstige Ptesultate erhalten, v. Ziemsen und Freudenher g er wandten Conchinin in der Münchener Klinik in den Jahren 1875 — 1880 gegen Malaria und Abdominaltyphus an und fanden dasselbe ebenso wirksam wie das Chinin. Nur berichten Freudenberger sowie Strümpell , daß sich bei den Patienten häufig — etwa V2 Stunde nach Darreichung des Conchininsulfats — Erbrechen einstellte. Von den zahlreichen sonstigen Alkaloiden, die sich in der Chinarinde finden, sei zunächst noch das Hydrochinin , CsoHoßNoO-j, erwähnt. Es kommt in der Chinarinde vor und wurde zuerst von Hesse aus den Mutter- laugen des Chininsulfats isoliert. Durch die leichtere LösUchkeit seines Monosulfates kann es von dem Chininsulfat annähernd getrennt werden. Vollkommen kann das Chinin aus einem Gemisch der Sulfate der beiden Basen entfernt werden, indem man die Lösung derselben mit Kaliumper- manganat behandelt. Dabei verbrennt das Chinin, während das Hydrochinin unangegriffen l)leibt. Das Hydrochinin kristallisiert aus Chloroform in Nadeln, welche bei 168*' schmelzen. Die physiologische Wirkung des Hydrochinins ist der des Chinins vollkommen gleich, so daß es als ein nützlicher Begleiter der letzteren Base angesehen werden muß. 1) Hesse, Ültpr Conchinin. Liebigs Annal. d. Cliem. u. Pharm. Bd. 146. S. 357 (1868). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. '.>;'. 7 HC CH COH Cuprein : H2C — C---C ^\ A' HC CH -CH- 1 OH HC CH- CH, CH, X CH.CH:CH. CH. Das Cuprein, das entmethylierte Chinin, ist 1884 in China cnprea, einer von Ueniija pednncnlata abstammenden Rinde auftrefnnden und als Cuprein bezeichnet worden. Es findet sich darin in molekuhirer \erbin- dung- mit dem Chinin. Bei der Darstelhmg des Cnpreins verfährt man zunächst wie bei derjenigen des Chinins, löst das Sulfatgemisch in verdünnter Schwefelsäure, übersättigt mit Alkali und zieht das Chinin mit Äther aus. Das Cujirein bleibt als Phenol in der alkalischen Flüssigkeit gelöst. Man säuert dieselbe mit Schwefelsäure an nnd zerlegt das ausgeschiedene Sulfat mit Ammoniak. Das Cuprein kristallisiert aus Äther und Alkokol in konzentrisch gruppierten Nadeln, die 2 Mol. H.jO enthalten, bei 120 — 125« wasserfrei Averden und bei 198" schmelzen. Es ist in Äther und Chloroform schwer, in Alkohol leicht löslich. Die alkoholische Lösung- reagiert stark basisch und färbt sich auf Zusatz von Eisenchlorid dunkelrotbraun , auf Zusatz von Chlor und Ammoniak intensiv dunkelgrün wie Chinin. Seine schwefelsauren Lösungen fluoreszieren aber im Gegensatz zu denjenigen des Chinins nicht. Durch Erhitzen mit Chlormethyl (oder besser mit Metliylnitrat). Natriummethylat und Methylalkohol im Einschmelzrohr auf 100" wird es in Chinin übergeführt: H0.C,9H.,,N,() + 3CH3J + KOH = CH3().C,9H,,N2().2CH3J Cuprein Chininjodmetlivlat + K J ■ + H., ( ). Hieraus ergibt sich mit aher Sicherheit, daß das Chinin der Methyl- äther des Cnpreins ist; es steht also zu diesem in derselben Heziehung wie das Anisol zum Phenol und wie das Kodein zum Morphin. Vom Cin- chonin unterscheidet sich also das Cuprein dadurch, daß es in der Pai'n- stellung des Chinolinringes noch eine Hydroxylgruppe «Mithält. Indem Grimaux und Arnaud das Cuprein mit Äthyl-, Propyl- oder Lsopropylnitrat oder mit Amylchlorid und den entsi)i-echeuden Xatrinm- alkylaten und Alkoholen erhitzten, gewannen sie den Äthyl-. Propyl-. Amyl- äther des Cnpreins: das ..Chinäthyliu", ..Chinpropylin -, ..Chinamylin". Die so erhaltenen höheren Alkylderivate des Cnpreins wirken noch stärker als Chinin, anscheinend um so stärker, je leichter oxydierbar das am Hydroxyl haftende Alkyl ist, je vollständiger also vermutlich die \v\- bindung zu Cuprein gespalten wird. Das hat zu dem Schluß geführt'). 1) Spiegel, Chemische Konstitution und physiologische Wirkung. Stuttgart 19^). pag. 82. 938 Julius Schmidt. daß die geringe febrifuge Wirkung des Cinchonins nicht diesem selbst zukomme, sondern dem Cuprein, dessen Bildung durch HydroxyUerung des Cinchonins in p-Stellung innerhalb des Organismus wahrscheinlich ist. 2. Alkaloide der Strycliiiosarteii. In den Strychnosarten kommen hauptsächlich drei Alkaloide vor: das Strychnin, das Brucin und das Curarin. Am reichsten an Strychnin und Brucin ist die Brechnuß (Strychnos nux vomica) sowie die Ignatiusbohne, der Samen von Strychnos Ignatii. Die beiden Basen sind nur selten in allen Teilen derselben Pflanze vorhanden. Sie sind wenigstens teilweise an Apfelsäure resp. Kaffeegerbsäure gebunden. Strychnin. Es besitzt die von Regnault ermittelte Formel C21 H.,., N.2 O.2 und bildet trotz des Gehaltes an zwei Stickstoff atomen nur mit einem Äquivalent Säure beständige Salze. Der Abbau des atomreichen ^Moleküls ist mehrfach in x\ngriff ge- nommen worden, sowohl durch Oxydation als durch Erhitzen mit Zinkstaub und durch Destillation mit Alkahen und alkalischen Erden. Indessen haben die dabei erlangten Besultate bis jetzt keinen sicheren Aufschluß gegeben, weder über die Art der Kohlenstoff Verkettung , noch über die Bolle der Sauerstoff- und Stickstoffpaare des Moleküls. Nur die nächsten l'mwand- lungsprodukte des Strychnins sprechen dafür, daß das eine Stickstoffatom einem hydrierten Chinolin- oder Indolring angehört und seinen basischen Charakter durch Verbindung mit einer CO-Gruppe eingebüßt hat. In neuerer Zeit ist das Strychnin eingehend von J. Tafd untersucht w^orden. Er studierte insbesondere die Einwirkung von Jodmethyl auf Strychnin und seine Derivate, die Reduktion des Strychnins und seiner Derivate und das Verhalten des Strychnins gegen Salpetersäure. ^ ) Nach den Ergebnissen dieser Studien wird man im Molekül des Strychnins einen Anihnrest, wahrscheinlich in Form einer Tetrahydrochino- lingruppe. anzunehmen haben, an deren Stickstoffatom ein im übrigen noch ringförmig verkettetes Carbonyl gebunden ist, so daß also das Strychnin als ein kompliziertes Säureanilid erscheint. Die Studien von H. Leuchs-) nebst seinen Schülern scheinen be- merkenswerte Aufschlüsse über die Konstitution von Strychnin und Brucin zu bringen. 1) ./. Tafel, tiber Strychnin. Ann. d. Chem. Bd. 264. S. 33: Über Strychnin. Bd. 208 (1892) S. 229; "über Strychniu. Bd. 301. S. 285 (1898). -) H. Leuchs und Mitarbeiter, Oxydation des Brucins und Strychnins nach einer neuen Methode. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 41. S. 1711: Ül)er ein neues Verfahren zur Darstellung von Sulfosäureii. S. 4393 (1908); Reaktionen der Brucinonsäure und eine Spaltung des Brucinmoleküls. Bd. 42. S. 770 (1909). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 9;.',() In den Brechnüssen findet sich Strvchnin an If,^asursäure j^^ehundcn in Öltröpfchen gelöst vor, welche in dem Inli;ilt der Endospernizclien suspendiert sind und es zum Teil an Äther abgeben. ' ) Seine Menge beträgt in den Brechnüssen von Madras 0-28— 0-(;25o/o, in denen von Ceylon i:y2 bis l-80Vo (bei einem (Tesamtalkaloidgehalt der letzteren von 4-24 :)-:»4'Vo- in dem Samen von Strychnos TienU r47o/o, in den St. Ignatiusbohiion nach Pelletier l-öVoT nach PeUenkofev r4o/o (bei einem (iesamtalkaluid- gehalt von 2— :3"/c,). Sandor'^) fand in den Brechnüssen 2-78— ;)-i:-iVo- in den St. Ignatiusbohnen o-ll— 3-22Vo Alkaloide, davon in den Alkaloiden der ersteren 4o-9— 45-9%, in den letzteren 60-7— 62-8Vo Strychiiiii. Zur Darstdlumj des Strychnins im großen dienen mir die Brech- nüsse. Coriol^) kocht diese bis zum Erweichen mit Wasser, lallt sie dann mahlen, bringt die zerquetschten Massen zurück in das Wasser, prebt und macht noch eine zweite Abkochung davon. Es werden dann die Lösungen zum Sirup verdunstet und mit Weingeist vermischt, wol)ei die Alkaloide sowie etwas Fett in den letzteren übergehen. Die weingeistige Lösung wird abermals verdunstet, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit Kalkmilch gefällt. Der abgepreßte und getrocknete Niederschlag wird dann mit 8öo/oigem Weingeist behandelt, welcher das Brucin und den Farbstoff löst und das Strvchnin zurückläßt. Merck ^) kocht die Brechnüsse, um deren Zerkleinerunu' zu erleichtern, anhaltend mit schwefelsäurehaltigem Wasser, mahlt sie dann und preßt sie im feuchten Zustande, kocht die Masse nochmals mit Wasser, preßt aber- mals und fällt die vereinigten Flüssigkeiten mit Kalk. Der Niederschlag wird hierauf nach dem ^'el■fahren von Corriol behandelt. Nach Polenskc '->} wird gegenwärtig das Strvchnin in einer nord- amerikanischen Fabrik in der Art gewonnen, daß die Brechnüsse in ganzer Form mit oVoig'^r Schwefelsäure anhaltend gekocht werden. Nach :'. Tagen sind dieselben vollkommen erweicht und geben einen klaren, tieflirauneu Auszug, der mit heißer Kalkmilch und etwas Ätznatron gefällt wird. Die Nüsse werden nochmals so behandelt, während ein dritter Auszug nicht mehr lohnt. Der Niederschlag enthält etwa 90°/o der Gesamtalkaloidaus- beute; den Rest entzieht man der vom Niederschlag befreiten Flüssigkeit durch Petroleum. Aus dem Niederschlag selbst gewinnt man die Alkaloide durch drei- oder viermalige Extraktion mit Fuselöl, dem sie dureh ver- dünnte Schwefelsäure entzogen werden, aus welcher Lösung dann durch weiteren Zusatz von Schwefelsäure das Strychninbisulfat gefällt wird, das durch Umkristallisieren vom Brucin vollkommen befreit und durch Kolile gereinigt, durch Ammoniak nun zersetzt wird. ') Gerock und Skippari, Sitz der Alkaloide in Strychnossanien. Arcii. d. i'liarni. Bd. 230. S. 55 (1893). -) Sandoi-, Beiträge zur Kenntnis der Strychnosdrogen. Chem. Zentralbl. Jg. 1897. I. S. 475. •^) Corriol, Darstellung von »Strychnin. Jouni. f. Pliarin. Bd. 11. S. 492. *) Merck, Darstellung von Strvchnin. Trommsdorß's Journ. d. Pharm. Bd. 20. S. 1. ^) Folenfike, Darstellung von Strychnin. Pharm. Zeitg. Bd. 41. 8.177. 940 Julius Sclimidt. Zur Trennung' des Strvchnins vom Brucin empfiehlt Horsley ^ ) das verschiedene Verhalten derselben in essigsaurer Lösung in Kaliumdichromat. In der betreffenden Industrie dient jedoch ander dem Bisulfat zur A1)schei- dung des Brucins noch die leichte Lüslichkeit des letzteren in Alkohol oder des Nitrats desselben in Wasser. Das aus beiden Salzen durch Ammoniak abgeschiedene Alkaloid wird alsdann durch Umki'istaUisieren aus heißem Alkohol in die im Handel gangbare Form gebracht. Das Strvchnin kristallisiert beim freiwilligen ^'erdunsten seiner alkoholischen Lösung in körnigen Kristallen. Unter Umständen l)ildet es auch lange, seidenglänzende Nadeln. Schmilzt nach den Angaben von Beckurts bei 26.0". Das Strvchnin ist licht- und luftbeständig; linksdrehend, und zwar beträgt [a]r in weingeistiger Lösung — 1.')2"07'' bis — loG'TS"; weit schwächer ist [zjr jedoch in den sauren Lösungen. Brucin. Das Brucin findet sich, wie vorstehend erwähnt, häufig gemeinsam mit dem Strvchnin im Holz und in den Samen verschiedener Strvchnos- arten und hat die Formel CggHooNat^- Die physiologische Wirkung des Brucins entspricht — jedoch in ge- milderter Form — derjenigen des Strvchnins. Es ist daher auch weniger giftig als dieses. Das Brucin ist ebenfalls Avie das Strvchnin eine einsäurige, tertiäre Base. Das gemeinschaftliche ^'orkommen von Strvchnin und Brucin und ihre gemeinschaftliche Eigentümlichkeit, trotz des Gehaltes an zwei Stickstoff atomen nur mit einem Äquivalent Säure beständige Salze zu bilden, führten sehr frühzeitig zu der Vermutung, daß die beiden Alkaloide nahe verwandte chemische Individuen seien. Tatsächlich lassen die gesamten Reaktionen des Brucins die Annahme wohl zu, daß dasselbe Dimethoxylstrvchnin sei, beweisen dieselbe aber keineswegs. Der bündigste Beweis für diese Auffassung wäre das Gelingen der Überführung von Strvchnin in Brucin oder umgekehrt. Um Brucin darzustellen, werden nach Shenstone-) die zerkleinerten Samen von Nux vomica mit Alkohol erschöpft, der alkoholische Auszug wird mit i/fi Wasser versetzt und der Alkohol abdestilliert. Zum Bückstand fügt man Wasser und verdünnte Schwefelsäure und fällt die filtrierte saure Lösung mit Soda. Der Niederschlag wird in Ghloroform gelöst, die Lösung mit verdünnter Schwefelsäure geschüttelt und die saure Flüssigkeit mit Ammoniakdämpfen in der Kälte behandelt; im Filtrat von dem genannten Niederschlag sind noch Alkaloide vorhanden . die durch Schütteln mit Chloroform ausgezogen werden. Das gefällte Alkaloid wird mit wässerigem Alkohol behandelt und das aus dem Alkohol umkristallisierte Brucin mit ^) Horsley, Trennung von Strychnin und Brucin. Journ. f.prakt.Cheni. Bd. 72. S. 314. -') Shcnstonc, Die Alkaloide you Nux vomica. Journ. Cliem. Soc. Vol. 39. p. 4.");:} (1881); Brilstcw, Handb. 3. Aufl. III. S. 944. Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 941 soviel verdünuter Schwefelsäure behandelt, daß die Lösung- noch deutlich alkalisch bleibt. Nun wird durch Kaliumiodid das Brncin gefüllt, der Nieder- schlag wiederholt aus Alkohol umkristallisiert und dann mit Soda und Chloroform behandelt. Aus dem Chloroform führt man das Brucin in ver- dünnte Säure über und fällt es dann mit Ammoniak. Zur Trennung des Strychnins vom Brucin kann man die essigsaure Lösung der beiden Busen mit Kaliumchromat versetzen, wodurch zuerst nur Strychninchromat ausfällt. Oder man verdampft die essigsaure Lösung der beiden Basen im Wasserbad, wobei Strvchninacetat alle Essigsäure ver- liert. Durch Übergießen mit Wasser wird aus dem Bückstand nur Brncin- acetat ausgezogen. 1) P>rucin kristalüsiert in wasserhellen, monoklinen Brismeu oder in glänzenden Blättchen und enthält, aus Wasser kristallisiert, entweder 4 oder 2 Moleküle Kristallwasser, aus Alkohol kommt es mit der letztgenannten Wassermenge heraus {To/el und Movfang -). Es schmilzt wenig über 100" in seinem KristaUwasser, während die Avasserfreie Verbindung den Fp. 178° zeigt. Die Base ist linksdrehend; ihre Chloroformlösung zeigt, je nach der Konzentration, die Drehung [7.]:, = — 119 — 1270 (Oudemans).^) Sie ist in Wasser und Alkohol leichter löslich als Strychnin und bleibt deshalb in den Mutterlaugen der Strychnindarstellung. Die Trennung des Brucins vom Strychnin. ^ ) Wenn Salpetersäure unter geeigneten Bedingungen auf ein Gemisch von Strychnin und J^rucin einwirkt, wird das Brucin in nicht basische, stark gefärbte Substanzen zersetzt, während Strychnin unverändert bleibt, knl diese Weise können beide Alkaloide voneinander getrennt werden. Beine salpetrige Säure scheint ohne Einwirkung auf Brucin zu sein, bei Gegenwart von Salpetersäure be- schleunigt sie dagegen dessen Oxydation. Für die Bestimmung des Strych- nins ergibt sich folgendes: Auf eine Gesamtmenge von 0^4 // Alkaloid soll die einwirkende Lösung wenigstens 7Vo Salpetersäure enthalten. Die Re- aktion muß nach 10 Minuten unterbrochen werden. Die Temperatur soll 250 nicht übersteigen. Zum Ausfällen des Strychnins wird zweckmäßig Natronlauge oder Kalilauge benutzt. Die Salpetersäure soll als Säure von der Dichte 1*42 zugesetzt werden. Bei Anwendung verdünnterer Säure fügt man eine Spur Mtrit bei. 1) FUiclciger, Trennung von Strychnin und Brucin. Jahresber. Jg. 1875. S. 983; vgl. auch Dunsfan und Short, Ein neues Glycosid aus Strychnos Nux vomica. Ebenda. Jg. 1883. S. 1615. -) Tafel xmd Moufmiff, Über Brucin. Ann. d. Chom. u. Pharm. Bd. 304. S.37 (1899). ^) Oudemans, Über den Einfluß inaktiver Lösungsmittel auf das spezifische Drehungsvermögen aktiver Substanzen. Ann. d. Chem. u. Pharm. Bd. 166. S. G9 (1873). ^) Rejinolds and Sutdife, Die Trennung des Brucins vom Strychnin. Einfluß der salpetrigen Säure bei der Oxydation durch Salpetersäure. Journ. See. Chem. Ind. Vol. 25. p. 512 (190(3); Farr und Wrir/hf, Das Salpetersäureverfahren für die Bestimmung des Strychnins. Pharm. Journ. [4.] Bd. 23. S. 83 (1906). 942 Julius Schmidt. Curare-Alkaloide. Aus Curare, dem Pfeilgift der Eingel)orenen Südamerikas, lassen sich nach Untersuchungen von Böhn verschiedene giftige Alkaloide isolieren. M Böhm untersuchte drei Sorten Curare, die nach ihrer Original-A'erpackungs- art bezeichnet werden als: Tuhocurare (in Bambusröhren verpackt), Calc- bassencurare (in Flaschenkürbissen verpackt), Topf curare (in ungebrannten Tontöpfchen verpackt). Zur Darstdlmig von Calehassencurarin z. B. verfährt man folgender- maßen: Durch Ausfällen der wässerigen Lösung mit Platinchlorid gewinnt man zunächst das Platinsalz der Base. Es wird in Alkohol suspendiert, in der Hitze mit Schwefelwasserstoff unter Zusatz von etwas alkoholischem Ammoniak zersetzt, aus der alkoholischen Lösung wird die Base durch Zusatz des fünffachen \'olumens Äther gefällt. Zur Reinigung wird es in einem Gemische von 4 Teilen Chloroform und 1 Teil absolutem Alkohol gelöst; die filtrierte Lösung wird an der Luft verdunstet. Man löst den zurückbleibenden roten Lack in absolutem Alkohol und fällt die Lösung mit Äther. Durch öfteres Wiederholen dieser Operation reinigt man das Curarin so lange, bis 0"34w^ für 1kg tödliche Dosis sind. Die so darge- stellte Substanz ist leicht löslich in Wasser, Alkohol, Methylalkohol, unlösUch in Äther, Chloroform, Benzol, Petroläther, Aceton. Sie wird niemals kristalli- nisch erhalten , schmeckt intensiv bitter, zersetzt sich oberhalb löO". Li ihr liegt nicht die Base selbst, sondern das Chlorid vor, welches wechselnde Mengen Salzsäure sehr fest gebunden enthält. Aus dem Curarinplatindoppel- salz ergibt sich die Formel des Curarins CjgH.iuNgO. IV. Alkaloide der Isochinolingruppe. In diese (Gruppe sind drei Opiumalkaloide, nämlich Papaverin. Xar- kotin und Xarcein einzureihen. Die beiden ersten sind direkt Abkömmlinge des Isochinolins, während das letztere zu demselben in gewisser Beziehung steht. Außerdem gehören hierher die in der Wurzel von Hydrastis cana- densis auftretenden Alkaloide Hydrastin und Berberin. Papaverin.-) Tetrametboxybeuzylisocliiuolin: ().CH3 HC C CO. CH, HC V X. CH C — CH., CH CH Hc/HK\c.o, N \/c\y -C CH CH, C.O.CH, 1) B. Böhm, Anual. d.Pharui. Bd. 235. S. 6G0 (lilü5); Das südamerikanische Pfeilgift Curare in chemischer und phai'makologischer Beziehung. Ahh. kgl. Sachs. Ges. Wissensch. Bd. 24. S. 1 (1897). Methoden zur Darstellung von Alkaloiclcn. ()4;j Das Papaveriii wurde im Jahre 1848 von Mercl- ans dein Opium, in dem es in geringer Menge (0-8- P/,,) enthalten ist. abgeschieden. Ks kristallisiert in Prismen und schmilzt bei 147», ist in Wasser und in Alkalien fast unlöslich. Die vorstehend angeiuhrte Konstitution desselben folgte aus den schönen und umfassenden Arbeiten von Guido (it,lä- schmkdt.^) Das Papaverin findet sich neben Narkotin und anderen Hasen in der Mutterlauge des aus dem Opiumauszuge ausgeschiedenen Mor- phins und kann von Narkotin durch Oxalsäure getrennt werden. Das Papaverin gibt ein schA\er lösliches Dioxalat. während Narkotin in Lösung bleibt. Hesse-) trennt die aus der Mutterlauge vom salzsauren Morjdiin er- haltenen Alkaloide zunächst in benzin- oder ätherlösliche und darin nnlös- liche, dann die ersteren in Alkali lösliche und unlösliche und letztere in solche, die Essigsäure neutralisieren und solche, welche das nicht tun. /n den ()piumalkaloiden der letzteren Art gehört nun untei' den obwaltenden A'erhältnissen das Narkotin, Papaveramin, Papavei'in nnd Pseudopapaverin. Das Gemisch (100 Teile) wird an Oxalsäure (^T Teile Hj C, O* + 2 11,0) in heißer wässeriger Lösung gebunden, worauf sich beim Erkalten die saui-en Oxalate der letzteren drei Alkaloide nahezu vollkommen al)scheiden. Durch wiederholtes ITmkristaUisieren derselben aus Wasser erhält man schlielJlich das Papaverinoxalat. Es wird mittelst Chlorcalcium in das salzsaure Salz üi)ergefülii't. die Base aus der Lösung desselben mit Ammoniak gefällt und aus Alkohol umkristallisiert. Zur Trennung von Papaverin und Narkotin kann man auch die Tat- sache benutzen, daß aus einem Gemenge der beiden Alkaloide Ferricyan- kalium nur Papaverin fällt. 3) Die Synthese von Substanzen, welche in ihrer Konstitution dem Papa- verin nahestehen, ist in der Neuzeit von verschiedenen Foi'schern durch- geführt worden.*) ') G. Goldschmiedt , Untersuchungen über Papaverin. Wioner Monatsli. f. Ciiom. Bd. 4. S. 704: B. 6. S. 372, 667, 954; Bd. 7. S. 485; Bd. 8. S. 51U; Bd. 9. S. 42. 327. 34i». 679, 762, 778; Bd. 10. S. 673, 692 (1883-1889). ^) Hesse, Beiträge zur Kenntnis der Opiniuliaseu. Annal. d. ( licni. Hd. 153. S. 75 (1870). ^).Phiffge, Über eine neue Tn-nuungsmethode der Opiuraalkaloide. Koc. trav. chini. T. 0. p. 157 {1887). -*) 'Sinn. \ gl. Decker, P.9f/(orr und ^litarbeiter. Über einige .Vnnuoninnivcrbindiuiiron: Synthese einer Oxydihydrobase. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 575 ; Bildung sauerstofffreier tertiärer Basen aus den Cyclammoniumhydroxyden. S. 1564; Über die Einwirkung von Benzylmagnesiumchlorid auf Cyclaniinoue. S. 3396 (1904). A.l'irtet. Synthese des Laudauosins. Cheni.-Zeitiin?. Bd. 33. S. 329 (1909). 94. Julius S c h m i d t. Laudanosin. rt-N-Methyltetrahydropapaverin ; OCH3 C HC/^C.OCH, HC-l J'GVL C C'H, CH H.,C CH, . X CHo- C C CH C.OCH, C . OCH, CH Unter den Alkaloiden des Opiums finden sich verschiedene, die in der Droge in ganz untergeordneter Menge enthalten und deshalb auch wenig untersucht worden sind. Zu diesen meist von 0. Hesse isolierten Basen gehört das Laudanosin. Es findet sich neben Papaverin, Xarkotin etc. in der Mutterlauge des aus dem Opium auszuge ausgeschiedenen Morphins. X'ach der Nar- kotin-Papaverinkristallisation ist es in der essigsauren Lösung neben Thebain und Crvptopin vorhanden und kann von diesen getrennt werden durch seine Leichtlöslichkeit in Äther und die Fähigkeit, durch Jodkaiium aus seinen Lösungen gefällt zu werden. A. Pktet und B. Athanasescu erhielten das Laudanosin, indem sie das Chlormeth>'lat des Papaverins mit Zinn und Salzsäure reduzierten und das Produkt (razemisches Methyltetrahydropapaverin) mittelst Chinasäure in seine beiden optischen Modifikationen spalteten ; die rechtsdrehende ^lodifikation erwies sich als identisch mit dem Opiumlaudanosin. Diese partielle Synthese stellte die Konstitution des Laudanosins fest. Es ist dann Pictef^) in Gemeinschaft mit Frl. M. Finkenstein lungen, die Total synthese des Laudanosins zu bewerkstelligen, lange Reihe der Operationen, die zu diesem Ptesultat führte, kann folgt zusammengefaßt werden : 1. Darstellung des Homoveratrylamins : ( CH3 0)2 Cg H3 . CH2 . CH, . NH2, durch Einwirkung von unterbromigsaurem Natrium auf Dimeth}lhydro- kaffeesäureamid : ( CH3 OJ2 Cg H3 . CH, . CH., . CO XH., , welches selbst * aus Methylvanillin durch bekannte Pieaktionen gewonnen wurde. 2. Darstellung der Homoveratrumsäure aus Eugenol nach Vor- schrift von Tiemann und Überführung derselben in ihr Chlorid: (CH3 0)2CgH3.CH2.COC1. o. Zusammenbringen des Homoveratrylamins und des Homoveratrum- säurechlorids in Gegenwart von Natronlauge, wobei H 0 m 0 v e r a t r y 1 - h 0 m 0- V e r a t r u m s ä u r e entsteht : ( CH3 0)2 L\ H3 . CH. . CH2 . XH . CO . CH, . C, H, (OCHj),. Die wie ^) A. Pictet und Marie Finkenstein, Synthese des Laudanosins. ehem. Ges. Bd. 42. S. 1979 (19Ü9). Ber. d. Deutsch. Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 1)4;') 4. Behandlung dieser letzten Verbindung mit Phosphorpentoxvd. wo- bei Wasserentzieliung- unter Ringschlioßung stattfindet und Dilivdr..- pap averin nacli folgender Gleichung gebildet wird: CH3 0'^^ CH, 0 CO CH >s"H CH3 0' CH,0 CH, N C CHo + II..(). OCH, OCH, \/ OCH, OCH, 5. Überführung des Dihvdropapaverins in sein Chlormethylat und Reduktion desselben mit Zinn und Salzsäure. Das Produkt dieser Opera- tion erwies sich als identisch mit dem ^lethyltetrahydropapaverin aus Papaverin. Da das Methyltetrapapaverin in seine rechtsdrehendo Modifika- tion umgewandelt werden kann und diese sich mit dem natürlichen Lau- danosin als identisch erwiesen hat, so ist die vollständige Synthese dieser Base erreicht. Laudanosin stellt das erste Opiumalkaloid , dessen künsthche Dar- stellung gelungen ist, dar. Es kristaUisiert in Nadeln, welche bei 89" schmelzen und in Alkali unlösKch sind. Narkotin und Hydrastin: 0 . CH3 /\ HC— 0 O.CH3 — C:0 H,C.O I HC H,C< '0— ^0— N.CH, .0— HX JCH, \ 0- CH, Narkotin-Mekoninhydrokozarnin-Methoxy- hydrastin Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II O.CH3 I /\_0.CH3 J-C:0 I HC — 0 HC N . CH3 CH, CH2 Hvdrastin. 60 946 Julius Schmidt. Das Narkotin wurde im Jahre 1817 von Robiquet isoliert. Es findet sich im Opium im freien Zustande und kann daraus durch Aus- kochen mit Äther gewonnen werden. Wird Opium mit Wasser extrahiert, wie das für die Gewinnung von Morphin geschieht, so bleibt das Narkotin hauptsächlich in dem Rück- stande oder Opiummark, dem es mit verdünnter Salzsäure entzogen werden kann. Letztere Lösung wird dann mit Natriumbikarbonat gefällt und die Base dem Niederschlage mit heißem SO^/oigen Weingeist entzogen, welcher sie beim Erkalten in Kristallen abscheidet. Bei der Darstellung des Mor- phins nach dem Verfahren von Rohertson-Gregortj (siehe S. 953) bleibt das ]\lorphin in der dunkel gefärbten Mutterlauge vom Morphinchlorhvdrat ge- löst und kann daraus mit Ammoniak gefällt werden. Der harzige Nieder- schlag wird in heißer alkoholischer Lösung mit Essigsäure bis zur neu- tralen Reaktion l)ehandelt, worauf beim Erkalten ein Gemisch von Nar- kotin und Papaverin kristallisiert. Letzteres ist, wie aus den Darlegungen S. 94o hervorgeht, leicht mittelst Oxalsäure zu trennen. Von Morphin kann das Narkotin auch leicht durch Kalilauge geschieden werden, da die erst- genannte Base in kalter Kalilauge löslich, die letztere aber darin unlöslich ist. Das Narkotin bildet farblose glänzende Kristalle, und zwar teils platte Nadeln, teils derbe rhombische Prismen, ist geruch- und geschmacklos. Es schmilzt bei 176° und erstarrt beim Erkalten strahUg kiistallinisch. Das Hydrastin kommt in der Wm'zel von Hydrastis canadensis L., einer zu den Ranunculaceen gehörigen, in Nordamerika einheimischen Pflanze, vor. In dem Hydrastisrhizom findet sich das Hydrastin teils frei, teils an Säuren gebunden. Außer ihm kommt darin auch Berberin und in geringer Menge ein drittes Alkaloid, das Canadin. vor. Der Gehalt der Wurzel an Hydrastin beträgt etwa l-ö^o-M Die Aufklärung der Konstitution des Hydrastins erfolgte in den letzten 20 Jahren durch die Arbeiten von E. Schmidt^) und insbesondere durch die von Martin Freund^) und seinen Schülern. Zur Darstellung der Base extrahiert man die fein gepulverte Wurzel von Hydrastis canadensis L. mit Äther, wobei nur das Hydrastin auf- genommen wird. Man dunstet die ätherische Lösung ein, löst den Rück- stand in heißem Alkohol und filtriert die heiße Lösung. Das Filtrat scheidet beim Erkalten Kristalle von Hydrastin in fast reinem Zustande ab. Das Hydrastin schmilzt bei 132^, ist in Wasser fast unlöslich, in Chloroform und Benzol leicht, in Äther und Alkohol schwerer löslich. Die Lösungen sind optisch aktiv. Bei gelinder Oxydation zerfällt das Hydrastin fast quantitativ in Opiansäure und Hydrastinin: C.nH,iNOe + H.O + O ^ C.oHioOs + CiiH,3N03 Hydrastin Opiansäure Hydrastinin. 1) Wilhehn, Über Berberisalkaloide. Arch. d. Pharm. [3.] Bd. 24. S. 323 (1888). 2) E.Schmidt, Über Berberisalkaloide. Arch. d. Pharm. Bd. 224. S. 974; Bd. 226. S. 329: Bd. 228. S. 49, 241 n. 596; Über das Hydrastin. Bd. 231. S. 541 (1893). ^) Martin Freund und Mitarbeiter, Beiträge zur Kenntnis des Hydrastins. Ann. d. ehem. Bd. 271. S. 311 (1893). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 947 Der Extrakt der Wurzel Hydrastis canadensis, aus dem das Hydrastin gewonnen wird, hat in Amerika schon lange therapeutische Verwendung gefunden J) Im Jahre 1883 ist er von Miatz als Mittel zur Bekiiniitfimg uteriner Blutungen empfohlen worden und hat sich dann schnei! Kiiigaiig in den Arzneischatz verschafft. Da die Droge hauptsächlich IJerberiii (4"/o) und Hydrastin (ca. l^/o) enthält und andere Kerberin enthaltende Pflanzen eine Anwenflung als Styptica nicht erfahren haben, lag die ^'er- mutung nahe, daß die Wirksamkeit der Hydrastiswurzel ihrem Gehalt an Hydrastin zuzuschreiben sei. Die pharmakologische Untersuchung des Hydrastins hat ergeben, daß dasselbe klinisch nicht zu verwenden ist. Nun ist aber die Wirkung der Hydrastis eine kumulative; das Mittel wirkt kaum oder doch nm' recht unsicher bei bereits eingetretener Blutung, während es gute Resultate erzielt, wenn es längere Zeit hindurch vor Eintritt der Blutung gegeben wird. Dieses Verhalten rief die Vermutung hervor, dal) das Mittel erst dann seine Wirkung entfalten kann, wenn unter dem langsam oxydierenden Einfluß des Organismus eine Spaltung des Hydrastins in Opian- respektive Hemipinsäure und Hydrastinin ein- getreten ist, daß also die letztgenannte Base die eigentlich wirksame Sabstanz der Hydrastis sei. Das Hydrastinin, welches nach der Formel: CH C<^ n_c^^^ NH.CH, CHo< ^0 — C CH, CH CH, als ein Piperonal aufzufassen ist, das in der Orthostellung zur Aldehyd- gruppe eine stickstoffhaltige Seitenkette trägt, wurde von Fritsch synthetisch dargestellt. -) Narcein: CH,< CH3 0 .0. ^0. CO CH, \ / OCH, N/CH3 CH, HO OC 0 CH, CH, ^) E.Falk, Hydrastin und Hydrastinin. Virchoivs Archiv. 13d. 190. S. 399. — Derselbe Über Hydrastinin und dessen Anwendung bei Uterusblutungen. Therapeut. Monatsh. Jg. 1890. S. 19. Arch. f. Gynäk. Bd. 37. S. 295. - Abel, Hydrastinin bei Gebär- mutterblutungen. Berl. klin. Wochenschr. Jg. 1892. 2) Fritsch, Über substituierte Isochinoliuc und deren Tetrahydroderivate. byntliese des Hydrastinins. Ann. d. Chem. Bd. 286. S. 18 (1895). 60* 948 Julius Schmidt. nur 140- M. Freund^) hat für das Xarcein auf Grund eingehender Unter- suchungen die vorstehende Formel abgeleitet, nach der es als substituiertes Phenylbenzylketon erscheint. Damit stehen auch alle seine Reaktionen in bestem Einklang. Das Narcein bildet weiße Kristalle vom Fp. 17P und findet sich in kleiner Menge (OlVo) ™ Opium. Das bei 100° vollkommen entwässerte Narcein schmilzt schon bei 145«. Bei der Gewinnung des Morphins nach dem später zu behandelnden Verfahren von Bobertson-Grer/ori/ findet sich das Narcein neben anderen Alkaloiden in der dunkelgefärbten Mutterlauge vom Morphin- und Kodein- hydrochlorid. Man übersättigt dieselbe mit Ammoniak und fällt mit Blei- zucker. Nach Entfernung des überschüssig zugesetzten Bleies aus dem Filtrate wird die vom Bleisulfat abfiltrierte Lösung konzentriert, wobei schließlich ein Gemenge von Narcein und Mekonin kristallisiert. Dieses Gemenge kann mittelst Äther in seine Bestandteile getrennt werden, da derselbe nur das Mekonin aufnimmt, während das Narcein ungelöst zurück- bleibt. Letzteres läßt sich durch UmkristalUsieren aus kochendem Wasser reinigen. Berberin: 0-CH, C H, CO . C CH C H,CO.C HC CO CH C CHo CH CH I CH, OH3 Das Berberin kann außer nach der vorstehenden Formel mit der Gruppe — CH = N(OH) — GH., — auch als Aldehyd mit den Gruppen — CH:() und — NH — CH2 — reagieren, wenn auch die Aldehydabkömm- linge von geringer Beständigkeit sind. Das Berberiniumhydroxyd von obiger Formel ist nur in Lösung bekannt, dagegen in fester Form nicht existenz- fähig, da es beim Eindunsten der Lösungen unter gleichzeitiger tiefgehender Zersetzung in die Pseudoform mit der Aldehydgruppe übergeht; doch leiten sich von ihm verschiedene Berberinderivate ab. 2) ^) M. Freund und Mitarbeiter, Untersuchungen über das Narcein. Ann. d. Chem. Bd. 277. S. 20 (1893); Untersuchungen über das Narcein. Bd. 286. S. 248 (189Ö); Unter- suchungen über das Narcein. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 40. S. 194 (1907). 2) J. Gadamer, tjber das Berberin. Arch. d. Pharm. Bd. 243. S. 31 (1905). Methoden zur Durstellung von Alkaloiden. ()4() Das Berberil! ist eines der wenigen Alkaloide, die sieh in f^^anz ver- schiedenen Pflanzenfamilien vorfinden. Es ist im Jahre 1H26 aus der Rinde von Xanthoxylum clava Herculis von Chevallier uml l'clldun dar- gestellt worden, welche ihm den Namen „Xanthopicrit" gaben. Büchner be- merkte es 18;>7 in der Wurzel der Berberitze. Perrins gewann es aus der Wurzel von Hydrastis canadensis, wo es das Hydrastin begleitet. Andere Beobachter begegneten ihm auch in einer großen Zahl von l'flanzen aus den Gattungen Coptis, Cocculus, Cocciniuni, Cociocine, (xeoffroya etc. Zur Darstellung von Berberin aus der Wurzelrinde von Berberis vul- garis i) wird der durch Digestion mit warmem Wasser erhaltene Auszug verdampft, der Ilückstand mit Alkohol ausgezogen und die alkoholische Lösung zur Kristallisation eingeengt. Die kristallinische Masse wird zuerst durch Auswaschen mit kaltem Wasser und Abpressen von einem Teil der Mutterlauge befreit. Hierauf stellt man durch Auflösen in Säure ein Salz dar, das durch UmkristalUsieren gereinigt wird und aus dem man schlieli- lich das Berberin mittelst einer Base abscheidet. Die vielfach als Arzneimittel gebrauchte Columbowurzel wird zur Ge- winnung von Berberin mit Alkohol extrahiert und das alkoholische Extrakt nach dem Abdampfen und Trocknen in der Wärme mit Kalkwasser be- handelt. Beim vorsichtigen Neutralisieren mit Salzsiiure entsteht in der braunroten Lösung ein gefärbter amorpher Niederschlag. Nach dem Über- sättigen mit Salzsäure scheidet sich aus dem Filtrat beim mehrtägigen Stehen eine Kristallisation von Berberinchlorhydrat ab. Nach Merril"-) wird das wässerige Extrakt der Wurzel von Hydrastis canadensis mit Alkohol ausgezogen. Man versetzt die Tinktur mit etwas Wasser, destilliert den größten Teil des Alkohols ab und säuert die Flüssig- keit mit Schwefelsäure an. Das beim Stehen kristallisierende Berberinsalz wird in Wasser gelöst und mit etwas überschüssigem, frisch gefälltem Blei- oxyd digeriert. Aus dem Filtrat kristallisiert Berberin aiis. Zur Eeindarstellung des Berberins aus dem Bohprodukt wird zweck- mäßig die schwer löshche Acetonverbindung, C20H17NO4.C3 H„(). benutzt. Sie fällt als zitronengelbes Kristallpulver aus, wenn man eine heiße Lösung von 50^ kristallisiertem Berberinsulfat in 1 l AVasser mit öOO^ Aceton und Natronlauge bis zur alkalischen Beaktion versetzt. T'm daraus das Berberin wieder abzuscheiden, kocht man 2// der Verbindung mit :^0 rw'^ absolutem Alkohol und 5 nn^ Chloroform während 12 Stunden. Nach di'in Verdunsten des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Wasser umkri- stallisiert. Das so gereinigte Berberin bildet gelbbraune Nadeln oder feine Prismen, die 6 Mol. Kristallwasser enthalten. Es schmilzt bei 14ö«, zersetzt sich oberhalb 150« und ist inaktiv. In heißem Wasser uml Alkohol ist (^s I(>icht. in Äther, Essigäther, Benzol, Chloroform und Ligroin schwer löslich. 1) J.A. und L.A. Buchner, tiber das Berberin. Ann. d. C'bom. u. Pharm. Bd. 24. S. 228. -) MerriJ, Jahresber. Jg. 1864. S. 452. 950 Julius Schmidt, Synthesen von Ähkömmlinf/en des Dihydroherherins wurden in der Neuzeit von M. Freund und seinen ^Mitarbeitern mit Hilfe der Organo- magnesiumhaloide durchgeführt, i) Corydalisalkaloide. Die Wurzel von Corydalis Cava (Familie der Fumiariceen) enthält mehrere Alkaloide. von denen bisher acht isoliert worden sind 2), nämlich: Corydalin, Corybulbin, Corycavin, ßulbocapnin, Corytuberin, Isocorybulbin, Corycavanin und Corydin. Sie lassen sich nach ihrem chemischen Verhalten in die Corydalin-, Corycavin- und Bulbocapningruppe einteilen und am besten untersucht ist von ihnen das Corydalin von der Formel: C.OCHa HC^^C.OCH, CH3O.C H.C CH.o.c^'^c/Xcr ^C CH HC HC CH, CH, CH, Es kristallisiert aus Alkohol in Prismen vom Fp. 134 — lo5^ ist un- löslich in Wasser und Alkalien, ziemlich löslich in Alkohol, leicht löslich in Äther, Chloroform und Benzol. Zur Isolierung der Corydalisalkaloide kann folgendes Verfahren dienen : Die zerkleinerten Wurzelknollen werden mit Alkohol extrahiert, der Alkohol abdestilliert, die zurückbleiliende, schwach sauer reagierende wässerige Lö- sung abfiltriert, mit Ammoniak übersättigt und mit Äther ausgeschüttelt. Nachdem die ätherische Lösung stark eingeengt ist, scheidet sich eine Fraktion aus, die bei etwa löO** schmilzt und aus etwa 6OV0 Bulbocapnin, 30°/o Corydalin und 10"/o Corycavin besteht. Nach weiterem Einengen der ätherischen Mutterlauge und Versetzen derselben mit Alkohol wird eine Fraktion erhalten, die zu fast gleichen Teilen aus Bulbocapnin und Cory- dalin besteht und etwa bei 126 — 130" schmilzt. Die letzte Mutterlauge liefert schließlich eine amorphe, bei 50 — 60^ schmelzende Masse, die die übrigen x41kaloide enthält. Die Alkaloide der beiden ersten Fraktionen können nach Freund und Josephl folgendermaßen voneinander getrennt werden. 3) Man trägt die salz- ^) M. Freimd und Mitarbeiter, Versuche zur Herstellung von Alkaloiden der Isochinolinreihe. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 37. S. 3336 ; Über a-Methyltetrahydro- berberin. Bd. 38. S. 2652 (1905); Über eine Reibe neuer, vom Dibydroberberin sich herleitender Basen. S. 4673 (1904); Über Homologe des Berberins und Canadins. Bd. 40. S. 2604 (1907). -) J.Gadamer, Über Corydalisalkaloide. Arch. d. Pharm. Bd. 243. S. 147 (1905). ^) Freund und Josephi, Untersuchungen über die in der "Wurzel von ( 'orydaliscava (Schwgg.) enthaltenen Alkaloide. Ann. d. Chem. Bd. 277. S. 19 (1893). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 951 saure Lösimg des Gemisches in überschüssige 5Voige Natronh^uge ein. Avobei Corydalin und Corycavin ausfallen. Dahingegen bleibt das Bulbocapnin gelöst und kann aus der Lösung durch Einleiten von Kohlondioxyd oder durch Zusatz von Chlorammonium abgeschieden werden. Da Corydalin in Alkohol leichter löslich ist als Corycavin, so kann die Mischung beider dui-ch fraktionierte KristaUisatiou aus absolutem Alkohol in die Komponenten zerlegt werden. Auch durch Behandeln des Gemisches mit verdünnter Salzsäure läßt sich die Trennung durchführen. Dabei wird zunächst das Corycavinsalz abge- schieden, während Corydalin gelöst bleibt und aus der Mutterlauge von ersterem zu fällen ist. Aus 10% Corydahsknollen entstehen gegen 90 (/ Corvdalin. Neuerdings hat K. Makoshi die Isolierung der Alkaloide aus chine- sischen Corydahsknollen (Corydalis ambigna) eingehend beschrieben, i) Die physiologische Untersuchung der acht CorydalisaJkaloide hat Peters'^) durchgeführt. Die an Kalt- und Warmblütern ausgeführten ^'er- suche haben gezeigt, daß die von Gadamer getroffene Einteilung der acht Alkaloide Corydalin, Corybulbin, Corycavin, Bulbocapnin, Corytuberin, Iso- corybulbin, Corycavanin und Corydin nach ihrem chemischen ^'erhalten in die Corydalin-, Corycavin- und Bulbocapningruppe im allgemeinen richtig ist. Nur das Corytuberin nimmt in pharmakologischer Beziehung eine ähn- liche Sonderstellung ein wie in chemischer. Während alle anderen Alkaloide morphiumartig wirken und das Herz angreifen, ist dies beim Corytuberin nicht der Fall. Im übrigen unterscheiden sich die drei chemischen (iruppen in ihrer physiologischen Wirkung derart, daß die Corydalingruppe eine Lähmung des Rückenmarks, die Corycavingruppe eine Erregung motorischer Zentren und die Bulbocapningruppe, wenigstens bei Fröschen, eine Steige- rung der Beflexerregbarkeit hervorruft. In praktischer Richtung dürfte nur das Bulbocapnin in Betracht kommen, und zwar wegen seiner Eigenschaft, auf Katzen und vieUeicht auch auf Pferde, Rinder u. a. m. beruhigend zu wirken. V. Alkaloide der Phenanthrengruppe. Es wird zurzeit allseitig die Annahme gemacht, daß die nunmehr zu besprechenden Alkaloide Morphin, Codein und Thebain einen Phenanthreu- kern enthalten. Dahingegen herrschen noch Zweifel darüber, welcher Art der stickstoffhaltige Ring ist, der diesen Alkaloiden zugrunde liegt. Die von Knorr begründete und von vielen geteilte Ansicht, daß sich diesellien von der Morpholin genannten Base herleiten, hat in neuerer Zeit mit dem Anwachsen des experimentellen Materials immer mehr und mehr an 15c- deutung verloren und ist schließlich von Knorr selbst vollständig aufgegeben M K. Makoshi, Über die Alkaloide der chinesischen Corydalisknolle. Arch. d. Pharm. Bd. 246. S. 381 ; Über das Protopin der japanischen CorydalisknoUen: Corydalis Verny. S. 401 (1908). -) Peters, Pharmakologische Untersuchungen über Corydalisalkaloido. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 51. S. 130 (1904). 952 Julius Schmidt. worden. Die Untersuchungen von Pschorr machen es höchst wahrscheinlich, daß auch in diesen Verbindungen ein Pyridinring anzunehmen ist, doch sind andere Möglichkeiten noch nicht vollkommen ausgeschlossen. Es er- scheint deshalb zweckmäßig, die Bezeichnungsweise nach dem basischen Komplex, der den Alkaloiden zugrunde liegt, zurzeit hier nicht anzuwenden und Avir haben dafür die in der Überschrift angeführte gewählt. Morphin. Das Morphin ist die Hauptbase des Opiums (3 — 23%). Es ist das erste aus dem Pflanzenreich gewonnene Alkaloid. Seine Entdeckung durch den Apotheker Sertürner stammt aus dem Jahre 1806. Die von Laurent bestimmte Zusammensetzung entspricht der Formel Ci^ Hig NO^ + H.. 0. Es kristalhsiert aus Alkohol in kleinen Prismen, welche bei 230'' unter Zer- setzung schmelzen, ist sehr wenig in Wasser löshch, geruchlos, von bitterem Geschmack, linksdrehend und von narkotischer Wirkung. Sein salzsaures Salz, CijHigXOo.HCl + 3H2O, Morphium hvdrochloricum , bildet seiden- glänzende, feine Nadeln und findet bekanntlich vielfache Anwendung als schmerzstillendes, schlaferregendes Mittel. Zur Frage nach der Konstitution des Morphins haben insbesondere die aus der Neuzeit stammenden Untersuchungen von L. Knorr, von Von- gerichten und von Pschorr reichhaltiges experimentelles Material geliefert. Doch läßt sich das letzte Wort über die Konstitution desselben noch nicht sprechen. Die drei Sauerstofatome des Morphms, Cjy HigNOg + H., 0, besitzen verschiedene Funktionen. Eines gehört einem Phenolhydroxyl an, das dem Morphin den sauren Charakter verleiht. Der Wasserstoff dieses Hydroxyls ist durch Metalle, durch Säurereste und durch Alkyle substituierbar. Im Kodein, das wir weiter unten behandeln werden, ist dieses Wasserstoff- atom durch ein Methyl ersetzt. Das Kodein stellt also einen ]Methylester des Morphins dar. Die Frage nach der Konstitution des Kodeins fällt so- mit mit der nach der Konstitution des Morphins zusammen. Das zweite Sauerstoffatom des ^lorphins gehört einer Alkoholgruppe an. Das dritte Sauerstoffatora verhält sich indifferent und ist nach Vongerichten wie in den Äthern zweifach mit Kohlenstoff verbunden — ..Brückensauerstoffatonr\ Der Stickstoß' des Morphins steht in einem Ringe; er ist dreifach an Kohlenstoff gebunden, also tertiär. \o\\ den 17 Kohlenstoff afotneu des ^lorphins gehören 14 einem Phenanthrenkern an, da die stickstofffreien Spaltungsprodukte stets Derivate des Phenanthrens sind. Unter Berücksichtigung des gesamten bisher vorliegenden experi- mentellen Materials hat L. Knorr^) vor kurzem folgende „Brückenring- formeP' des Morphins aufgestellt: *) L. Knorr, Über die Haftstellen des stickstoffhaltigeu Xebeuriuges im Kodein und über die Konstitution der Morphiumalkaloide. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 40. S. 3341 (1907). Methoden zur Darstellung von Alkaloiilen. fjr^-, H2 H H / CH..N/\ H OH \ / H(»I1 .0. Das Morphin findet sich im :\Iik'hsafte der Papaver soninifcniiiKL.), namentlich reichlich in dem der Samenkapseln etwa K) Taire nach deFn Abfallen der betreffenden lUumenblätter. .Man hat es auch in eini-rcn anderen Pflanzen aufgefunden, so im Ari>emone mexicana L. (Familie der Papavrra- ceen) und im wilden amerikanischen Hopfen') (Uunmlus lupulus L.. Familie der Cannabinaceen). Zur Darstellung des Morphins im großen eignet sich nur das Opium. Letzteres wird aus dem Milchsafte, der aus den angeritzten Mohn- kapseln ausfließt, in verschiedener Weise gewonnen'-): es enthält dement- sprechend wechselnde Mengen (von Spuren bis gegen 21" „) Moridnn. welches in demseli)en an Mekon- und Schwefelsäure gebunden ist. Zui- (Je- winnung dieses Alkaloids sind verschiedene \erfahren angegeiten worden. Nach dem von Gregory^) verbesserten Bohertsonsc\\('n \'erfahren wird zerschnittenes Opium mit Wasser von 38" extrahiert. Weil die Alkaloide nicht frei, sondern an Säuren gebunden vorliegen, gehen sie hierbei in Lösung über. Der Auszug wird unter Zusatz von gepulvertem .Marmor zum Sirup verdampft, dazu überschüssiges Chlorcalcium gebracht und damit einige ^linuten lang gekocht. Die Basen werden hierdurch in C'hlor- hvdrate übergeführt. Nach dem \'erdünnen der erkalteten Flüssigkeit mit etwas Wasserscheiden sich Flocken von mekonsaurem Calcium und braunen *) Ladenhurr/, Über das Hopeiu. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. lid. 19. S. 7S3 (ISStJi. -) Über die Opiumgewinnung in Persieu macht J. /'. .sv»//// iCliciu. Zeitsclir. Bd. 64. S. 804 [1908]) folgende Mitteilungen: Was die Kultur des Mohnes anbetrifft, so kann dieselbe zwecks Upiumgowinunng nur dort unternommen \Ycrdeu, wo im Frühjahr fast keine atmosphärischen Nieder- schläge bei hoher Temperatur vorkommen. Der Mohn wird im November ausgesät und im Mai geerntet. Je hellere Farbe das Produkt hat. desto höher steht es im Werte. Daher werden die Einschnitte in die Mohnköpfe bei Sonnenuntergang gemarlit uml der ausgeflossene verdickte Saft vor Sonnenaufgang eingesammelt, da sonst das Somienliriit verdunkelnd auf das Produkt wirkt. Dieser Schire-Teriak (von Schir = Milch) wird in kupfernen Kesseln verschiedener Größe gesammelt, wobei die Kessel mit /iegenhäuton verschlossen werden, luid kommt so in den Handel. Die weitere Verarbeitung des Schire-Opiums hängt davon ab, ol» es für den Ex- port oder den Verbrauch im eigenen Lande bestimmt ist. Im ersteron Falle wird das Schire-Opium auf etwa 7^ seines Quantums unter beständigem Uühren auf leichtem Kohlenfeuer eingekocht und erhält darauf einen Zusatz von Weintraubensaft und anderen nicht näher bekannten Ingredienzien. Darauf wird diese Mischung etwa drei Stunden lang bei beständigem Rühren langsam eingekocht, die so gewonnene Paste <:eknetet und zu kleinen Stangen ausgerollt, die in Papier gewickelt auf den Markt kommen. ä) Gregory, Neue Methode zur Abscheidiuig des Morpliins aus dem Opium. Ann. d. Chem. Bd.V. S. 261. 954 Julius Schmidt. harzartigen Substanzen ab. Man filtriert und dampft das Filtrat zur Kri- stallisation ein. Es scheidet sich ein (xemenge der Chlorhvdrate von Mor- phin, Kodein und bisweilen Pseudomorphin ab, während die übrigen Alkaloide, wie im vorhergehenden wiederholt erwähnt wurde, in der schwarzen Mutterlauge gelöst bleiben. Die Kristalle werden durch Umkri- stallisieren aus Wasser oder Alkohol gereinigt und aus ihrer wässerigen Lösung das Morphin durch Ammoniak gefällt. Aus dem Filtrat vom Mor- phin kann das Kodein mit Kalilauge abgeschieden werden. Merck^) extrahiert zur Morphingewinnung zerkleinertes Opium mit kaltem Wasser, verdampft den Auszug bei einer 60° nicht übersteigenden Temperatur zur Sirupdicke und trägt dann gepulvertes Natriumkarbonat ein, so lange sich noch Ammoniak entwickelt. Nach 24 Stunden wird der Niederschlag gesammelt, zunächst mit kaltem Wasser, dann mit SO^oigem Weingeist gewaschen, schließlich in Essigsäure unter Vermeidung eines Überschusses davon gelöst Aus der mit Tierkohle entfärbten Lösung wird die Base mit Ammoniak gefällt. Nach Mohr~) wird ein Teil in Scheiben zerschnittenes Opium eine halbe Stunde lang mit 3 Teilen Wasser gekocht, dann nach dem Kolleren und Auspressen noch zweimal in ähnlicher Weise mit lauem Wasser be- handelt. Man dampft die gesamte Lösung auf die Hälfte des Gewichtes vom Opium ein und kocht den so erhaltenen llückstand mit V4 Teil in Kalkbrei verwandelten Ätzkalk. Hierauf A\1rd durch Leinwand kollert, der Rückstand ausgepreßt, noch zweimal mit Wasser angerührt und wieder gepreßt. Die gewonnenen Morphincalcium enthaltenden Flüssigkeiten werden auf das doppelte Gewicht des augewandten Opiums eingeengt, mit Vi 0 Teil Salmiak vermischt und damit kurze Zeit gekocht. Nach acht Tagen wird das in braunen Körnern ausgeschiedene Morphin gesammelt und durch Überführung in das Chlorhydrat gereinigt. Bei diesem Verfahren bleibt in der basischen, Chlorammonium enthaltenden Lösung nicht selten eine erhebliche Lösung Morphin gelöst, die, indem sie den Salmiak zersetzt, Morphinchlorhydrat zurückbildet, das sich in feinen Nadeln abscheidet. Da der Wert des Opiums wesenthch durch dessen Gehalt an Morphin bedingt wird, so sind zur Ermittlung der Morphinmenge in demselben zahl- reiche Methoden in Vorschlag gebracht worden. Am meisten zu empfehlen ist die von Dieterich auf Grund langjähriger Versuche ausgearbeitete Me- thode, welche gestattet, das Alkaloid in reiner kristallisierter Form quanti- tativ abzuscheiden und zur Wägung zu bringen. 3) ^) Merck, Über die verschiedenen, gegenwärtig im Handel befindlichen Opium- sorten und deren Gehalt an organischen Basen. Ann. d. Chem. Bd. 18. S. 79; Über bengali- sches Opium und einen bei der Untersuchung desselben aufgefundenen eigentümlichen Stoff. Bd. 21. S. 202; Über A'(/Ä-?as Verfahren zur Darstellung eines reinen und kristalli- sierten essigsauren Morphins. Bd. 24. S. 46. '^) Mohr, Über die Darstellung des Morphins und seiner Salze. Ann. d. Chem. Bd. 35. S. 119. ^) E. Dieterich, Über die Bestimmung des Morphins. Pharm. Zentralh. Bd. 31. S. 591 (1890); Zeitschr. f. anal. Chem. Bd. 29. S. 484 (1890). — C. Pape, Über die Be- stimmung des Morphins. Apoth.-Zeitung. Bd. 24. S. 70 (1909). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. (j^r, Das Morphin kristallisiert aus der alkoholischen Lösmif? meistens in farblosen Säulen, verliert sein Kristalhvasser bei 90—100«, schmilzt unter Zersetzung gegen 2?>()^, ist geruchlos und von anhaltend bitterem Ge- schmack. Es ist unlöslich in reinem Chloroform, retroliither. licnzin. spärlich löslich in Äther.i) Alkohol löst das Morphin in der Kälte schwer, iiedeutend leichter beim Kochen. Morphin löst sich ferner in 1000 Teilen kalten, in 400 Teilen kochenden-Wassers. In Alkalihydroxyden löst sich das .Morphin leicht, in Ammoniak dagegen schwierig. Säuren nehmen Morphin leicht auf, besonders Essigsäure. Kodein. Das Kodein, CigHoiNOg, ist, Avie auf S. 952 hervorgehoben wurde, der Methyläther des Morphins, steht also demselben chemisch sehr nahe. Es ist ein steter Bestandteil des Opiums, und zwar findet es sicli im smyrnaer zu 0"2 — O-S^/o, im bengaUschen zu Of)" q. im Ijesten persischen zu etwa 0-5— 0-6Vo- Bei der Darstellung des Kodeins aus Opium erhält man rs nach dem Verfahren von Boherts und Grefiorijy wie auf S. 953 näher dargelegt wurde, gleichzeitig mit dem Morphin in Form von Chlorhydrat.-) Aus der wässe- rigen Lösung dieses Gemisches wird auf Zusatz von Ammoniak nur das Morphin gefällt, während Kodein in Lösung bleibt. Aus dem Eiltrat vom ^lorphin scheidet man das Kodein mit Kalilauge ab. Zur Keinigung wird es noch einmal in Salzsäure gelöst, mit Wasser und Äther gewaschen und schließlich aus Äther umkristallisiert. Zur Trennung von Morphin und Kodein kann auch die Tatsache benutzt werden, daß in genügend verdünnten Lösungen Rhodankahum niu" Kodein, nicht aber Morphin fällt. =*) L. Fouquet *) hat festgestellt , daß das Anisol zur Trennung beider Alkaloide sehr geeignet ist, da Morphin in kaltem Anisol unlöslich. Kodein dagegen ziemlich leicht löslich ist. Die künstliche Darstellung des Kodeins ist leicht verständhch, wenn man berücksichtigt, daß in ihm der Methyläther des Morphins vor- liegt. Man kann demnach das Morphin durch verschiedene Methylierungs- mittel in Kodein überführen. Diese Umwandlung ist zuerst Grimaux &) gelungen. Er erhielt Kodein durch Behandlung des Morphins mit Jodmethyl in Gegenwart von Alkali: Ci,Hi,N0(0H).3 + CH3J + KOH = KJ + H,0 + C,;Hi;NO(OH)(OCH3). •) M. Marchionneschi , Über die Löslichkeit von Morphin in Äther. Boll. Chini. Farm. Vol. 46. p. 389 (1907). *) Gregory, Ann. d. Chem. Bd. 26. S. 44. ^) Pluf/f/e, Über eine neue Trenuungsmethode der Opiunuillwiloidc. Kec. trav. cliini. T. 6. p. 157 (1887). ^) L. Fouquet, Über ein Lösungsmittel zur Trennung von Kodein und Morphin. J. Pharm. Chim. [6.] T. 5. p. 49 (1897)'^ 5) Grimaux, Über die Umwandlung des Morphins in Kodein und in homologen Basen. Compt. rend. T. 92. p. 1140, 1228 (1881); T. 93. p. 157, 217. Ö91 (1882). 956 Julius Schmidt. Nach dieser ]Methode werden gleiche Moleküle Morphin, Natrinm- methylat und Methvljodid in methylalkohoUscher Lösung auf 60" erhitzt. Nach Abdestillieren des Alkohols wird das Eeaktionsprodukt mit Äther ausgezogen. An Stelle von Jodmethyl können auch andere Methylierungsmittel Verwendung finden. So wird bei der technischen Gewinnung des künst- lichen Kodeins nach KmAl das Morphin in alkoholischer Lösung mit Ka- liumhydroxyd und der berechneten Menge Kaliummethylsulfat einige Zeit rückfließend gekocht. Nach dem Abdestillieren des Alkohols fügt man zur Reaktionsmasse Wasser, fällt das unveränderte Morphin mit Ammoniak aus und entzieht der Lösung das Kodein mit Benzol. Auch das Diazomethan kann zur Methylierung des Morphins dienen. Dabei wird zweckmäßig die Erzeugung des Diazomethans und die MethyUerung des Morphins zu einer Operation vereinigt, indem man in ein durch Zu- satz der berechneten Menge Nitrosomethylurethan zu einer Lösung von Morphin erhaltenes Gemisch langsam die Lösung einer Base. z. B. eine alkohohsche oder wässerige Kalilösung, einlaufen läßt. Hierbei tritt das durch Einwirkung der Base auf das Nitrosomethvlurethan frei werdende Diazomethan im statu nascendi mit dem Morphin in Reaktion.^) Da das giftige und leicht zersetzliche Nitrosomethylurethan für das Arbeiten im großen wenig geeignet ist, sind an seiner Stelle für die Darstellung von Kodein aus Morphin die leicht zugänglichen und sehr beständigen Nitroso- verbindungen der Monoalkyl- und Dialkylharnstoffe in Vorschlag gebracht worden. 2) Das Kodein scheidet sich aus seiner Lösung in wasserfreiem Äther oder heißem Benzol in kleinen wasserfreien, stark glänzenden Kristallen ab, welche bei 15o^ schmelzen. Aus Wasser und wasserhaltigem Äther kri- stallisiert es mit einem Molekül Kristallwasser. Wie das Morphin wirkt Kodein stark narkotisierend. Apomorphin. Ho N.CH, Apomorphin H.C.O H3C.() CH, N CH CH CH. . 0 ähnlich dem 0 . CH3 Papaverin. \) Farbenfabriken vorm. Friedr. Bayer u. Co., Klberfeld, D. R. P. 95.G44 ; Ver- fahren zur Darstellung von Kodein. Chem. Zentralbl. Jg. 1898. I. S. 812. ^) D. R. P. 189.843; Verfahren zur Darstellung von Alkyläthern der aromatischen Reihe. Chem. Zentralbl. Jg. 1907. II. S. 2005. Methoden zur Darstellung von Alkaloideu. «);,7 Das Apomorphin, Ci^H.^NOo entsteht durch Eiiiwiikuii^^ wasser- entziehender Mittel auf Morphin: Ci.HigNO, = Ci.Hi^NO, + H,(). Man erhält es z. B. durch Erhitzen von ^Morphin mit :i5"/oiger Salzsäure im geschlossenen Rohr auf 140—1500, ferner beim Erhitzen des Morphiu- hydrochlorids mit Chlorzinklösung i) auf 120- 1 HO«. Apomorphin ist 'ein amorpher, weißer Körper, welcher an der Luft grün wird. In Wasser ist es wenig, in Alkohol und Äther leicht löslich, wodurch es sich gut vom Morphin unterscheidet. Durch Cberführung des Apomorphins in die verschiedenen (juaternären Salze sind neuerdings Präparate erhalten worden, die die spezifische Rrechwirkung des Apo- morphins besitzen, vor diesem indes den Vorzug haben, in Wasser äußerst leicht löslich zu sein und (mit Ausnahme des Jodmethylats) in Substanz wie in Lösung eine erhöhte Haltbarkeit zu zeigen.'') Am geeignetsten für therapeutische /wecke erwies sich das Apu- morpliiiibrommethylat, welches unter dem Namen Euporphin in den Handel gebracht wurde. Es besitzt vor dem Apomorphin den Vorzug, in geringerem Grade Brechreiz hervorzurufen, auf das Herz bedeutend weniger einzuwirken und länger ohne Schaden für die Kranken gebraucht werden zu können. Die Darstellung des Apomorphinbrommethylats erfolgt nach Fsrhorrs Verfahren folgendermaßen: Apomorphin wird mit Dimethylsulfat behandelt: das zuerst entstaiidi-nr methylschwefelsaure Salz des Methyl-Apomorphins wird sodann mit einer gesättigten Bromkaiiumlösung umgesetzt und gleichzeitig ausgesalzen: /CHg Ci^Hi^OoN + (CH3),S0, = C„Hi,02N< \S0,.CH3 /CH3 /CH3 C,, Hl, O2 X< + K Br = Ci, H„ 0., N< + C'Hs SO, K. \S0, CH3 ^Br Der entsprechende Abkömmling des Kodeins, das Kodeinbrom- methylat, kommt unter dem Namen Eukodin in den Handel. Thebain. Das Thebain. CigHaiNOg oder CH3 .N.C15 H,, OlOC"!!,).,, welches sich im Opium in einer Menge von etwa 1" „ findet, steht in nächster Beziehung zum Morphin und Kodein. Es unterscheidet sich vom Morphin dadurch, daß es zwei additioneile Wasserstoff atome weniger besitzt und ') Mayer, Einwirkung von Zinkclilorid, salpetriger Säure, Salzsäure und Chlor- kalk auf Morphin. Bor. d. Deutsch, ehem. (Jes. Bd. 4. S. 121 (1871). '') R. Fschon-, Verfahren zur Herstellung leicht löslicher, haltharer Alkylapo- morphiniumsalze. D. R. P. Kl. 12 p. Nr. 158.620 vom 30. Juli 1903. ( hem. Zentralhl. Jg. 1905. I. S. 702. — J.D. Riedel, Aktieugesellsrliaft in Berlin. Verfahren zur Her- stellung leicht löslicher, haltharer Alkylapomorphiniunisalze. Zus. Tat. zu Nr. 158.G2U. Chem. Zentralhl. Jg. 1906. I. S. 1067. 958 Julius Schmidt. an Stelle der beiden Hydroxyle zwei Methoxyle enthält. Mit der Auf- klärung seiner Konstitution haben sich insbesondere AI. Freund und seine Schüler beschäftigt, ^j Zurzeit stehen für Formeln zur Diskussion: CH dasselbe noch die beiden folgenden CH, 0 . C CH CHo N . CH3 HC^^C^\'H^^' CH C CH,O.C C C CH CH, CH, 0 C CH und C CH CH 0 HC\^/CH 0 CH, / CH2 CH2 \ CH^ \ CHaO.C^ H, ^ CH CH folgendermaßen Die Darstellung des Thebains aus Opium gestaltet sich Beim Behandeln des wässerigen Opiumauszuges, welcher alles Thebain enthält, mit überschüssigem Kalk geht das Thebain in der Hauptsache in den Kalkniederschlag über, dem es mit Weingeist entzogen werden kann. Der nach Abdestillieren des Alkohols verbleibende Rück- stand gil)t an Äther das Thebain ab. Die ätherische Lösung hinterläßt beim Verdunsten das Thebain als braune Kristallmasse. Doch sind noch andere Alkaloide beigemengt, von denen es, wie unten näher auszuführen ist, mit Hilfe von Weinsäure getrennt werden kann. Nach Anderson scheidet man das Thebain aus der schwarzen Mutterlauge vom ^lorphin- und Kodeinchlorhydrat ab, welche bei dem auf S. 95o geschilderten Verfahren von Robertson-Gregory erhalten wird. Diese Mutterlauge wird mit Wasser verdünnt, mit Ammoniak gefällt und der harzige Niederschlag mit Weingeist behandelt. Dabei bleiben Narkotin und Papaverin in der Hauptsache zurück, während Thebain in Lösung geht. Der beim Verdunsten des Weingeistes l3leibende Piückstand wird mit heißer Essigsäure behandelt, die Lösung mit Bleiessig vermischt. Hierbei fallen Harz, Narkotin und Papaverin aus. Aus dem Ultrat von diesen wird das Thebain mit Ammoniak abgeschieden und durch Um- ^) M. Freund und Mitarbeiter, Untersuchungen über das Thebain. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 27. S. 2961 (1895) ; Untersuchungen über das Thebain. Bd. 30. S. 1357 (1897); Untersuchungen über das Thebain. Bd. 32. S. 168 (1899); Untersuchungen über das Thebain. Bd. 38. S. 3234 (1905): Untersuchungen über das Thebain. Bd. 39. S. 844 (1906). Methoden zur Darstellung vou Alkaloideu. (j.')t) kristallisieren gereinigt, ^essei) trägt die oben genannte schwarze Mutter- lauge in überschüssige Alkalilauge ein, wobei das Thebain mit in den Medersclilag übergeht. Beim Behandeln des letzteren mit vcidiinuter Essigsäure löst sich das Thebain, wälirend Narkotin und amlcre Alkaloide ungelöst bleiben. Nach Behandeln der Lösung mit Tierkoldc triiiz-t man in dieselbe pulverisierte Weinsäure ein. Nun scheidet sich Thebaintartnit aus, welches nach Beseitigung der Mutterlauge durch rmkristallisieren aus kochendem Wasser gereinigt wird. Aus dem Tartrat setzt man das Alkaloid mit Hilfe von Ammoniak oder Natronlauge in Freiheit und erhält es durch Umlösen aus heißem Alkohol völlig rein. Nach Plugge^) kann man das Thebain auch in Form des SaHcvlates abscheiden. Doch ist dabei Bedingung, daß in der Mischung nur die sechs wichtigsten Opiumalkaloide Morphin, Kodein, Thel)ain, NarlC'H CH3.N C— N Das Kaff ein. CgHioN^O,, auch Koffein, Teein genannt, ist von den natürhch vorkommenden Methylderivaten das älteste und wichtigste. Es findet sich in den Blättern und Bohnen des Kaffoeliaumes (Ov)"/o), im Tee (2—40/;), im Paraguaytee von Hex paraguayensis , in der Guarana. einer aus den Früchten von Pauhnia sorbilis gewonnenen Masse (gegen öVo) "»'1 in den Colanüssen (gegen 3Vo)- In geringer Menge kommt es auch im Kakao vor. Zur Darstellung von Kaffein aus den eben genannten Ma- terialien sind zahlreiche Vorschriften angegeben worden.») Sie haben im 1) Hesse, Beiträge zur Kenntnis der Opiiimbaseu. Ann. d. ( liem. Bd. 153. S. Gl.^ -) Flug(/e, Beiträge zur Kenntnis der wichtigsten Opiumalkaloide. Nieuwe Tijd- schrift voor de pharmacie en Xeedorland. 1887. p. 1()B. ■') Peligot, Ann. chim. pliys. [3.j T.ll. p.l39: Miüdcr, Poc/ffrin/orjls Ann. Bd. 43. S. 162; Stahischmidt , PoygcHdorffs Ann. Bd. 112. S. 441; Thompson, Ann. d. Chem. ii. Pharm. Bd. 158. S. 365; Heijnsius, Pharm. Zentralbl. Jg. 1850. S. 78. 960 Julius Schmidt. allgemeinen dieselbe Grundlage, indem das Kaffein von der Gerbsäure und anderen Extraktivstoffen durch Fällen der letzteren mittelst Bleioxyd oder anderen Rasen getrennt wird. Für die Darstellung benutzt man, soweit sie nicht auf unten beschriebenem synthetischen Wege erfolgt, grünen oder schwarzen gemahlenen Tee (Teestaub). Die Blätter werden mit Wasser aus- gekocht, die Flüssigkeit kollert, mit etwas überschüssigem Bleiessig gefällt oder mit Bleiglätte versetzt. Das Filtrat wird mit Schwefelwasserstoff be- handelt und die vom Schwefelblei abfiltrierte Flüssigkeit verdampft, wobei die Base kristallisiert. Oder man dampft die Flüssigkeit zum Sirup ab und zieht diesen mit Benzol, mit Äther oder mit Chloroform und Äther aus. Thompson fällt den Teeauszug mit Bleiessig und versetzt das Filtrat nach dem Eindampfen mit überschüssigem kohlensauren Kali, wodurch das Kaffein zur Abscheidung kommt. Die unreine Base wird durch Umkri- stallisieren aus Alkohol, Benzol oder Chloroform mit oder ohne Zusatz von Tierkohle gereinigt. Gegenwärtig wird das Kaff ein in der Technik synthetisch aus Harnsäure dargestellt, die zu diesem Zweck aus Guano gewonnen wird. Dieser Erfolg ist auf die bekannten Untersuchungen von E. Fischer in der Puringruppe zurückzuführen. Der Gang des von der Firma C. F. Bohr in g er c^- Söhne ausgeübten Fabrikationsverfahrens für das Kaffein ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet: Harnsäure ^ 8-Methylxanthin >- 1 , 3, 7, 8-Tetramethylxanthin >- 1, 3, 7-Trimethyl-8-trichlormethylxanthin ^ Kaffein. Die diesen Verfahren zugrunde liegenden Methoden sind in den nach- stehenden Deutschen Reichspatenten beschrieben: D. R. P. 121.224, 128.212, 146.714, 146.71Ö, 151.113. Kaffein kristallisiert in weißen, langen, seidenartigen Nadeln. Das aus W^asser kristallisierte Kaffein enthält 1 Mol. Kristallwasser, welches erst über 120^ vollständig entweicht. Kaffein schmilzt wasserfrei bei 234 — 235^ sublimiert und destilliert ohne Zersetzung. Es ist wenig löslich in kaltem Wasser, Alkohol und Äther; dagegen löst es sich in Chloroform und Benzol. Bekanntlich ist es schon seit längerer Zeit als nervenerregendes und die Herztätigkeit belebendes Mittel im Gebrauch. Theobromin. 3, 7-Dimetliyl-2,6-Dioxji)uriii (3, 7-DimethylxaiitLiii): HX CO OC C-N.CH ^CH 3 CH3.N c— / Das Theobromin, C7H4N4O2, wurde 1842 von Woskresenskij in den Kakaol)ohnen, und zwar in den Kotyledonen derselben entdeckt, dann von Methodeu zur Darstellung von Alkaloideu. ij^ji Blei/ in deren Schalen nachgewiesen und später von Sehlagdenhaujfni in den Kotyledonen der Colanüsse aufgefunden. Man kann es aulier auf syn- thetischem Wege aus der käuflichen entölten Kakaomasse darstellen. i)i(' gebräuchlichen Kakaoarten enthalten 1 — 2% Theobroniin. MitscherUch'^) kocht die entfettete Kakaomasse mit verdünnter Schwefelsäure (30 Wasser:! Schwefelsäurehydrat) bis zur völligen Umwand- lung des Stärkemehls- in Zucker und kocht dann die Masse mit kohlen- saurem Blei. Die Lösung wird alsdann durch Hefe in Gärung versetzt, nach Beendigung derselben mit Soda neutralisiert und konzentriert. Das sich ausscheidende Theobroniin wird durch wiederholtes Auflösen in Salpeter- säure und Fällen mit Ammoniak gereinigt. E. ScJumdt und Pressier'^ vermischen die entfettete oder durch Aus- pressen vom Fett mögUchst befreite Kakaomasse mit der Hälfte ihres Ge- wichtes an frisch bereitetem Kalkhydrat und extrahieren diese Mischung mit 80%i»em Alkohol am Rückflußkühler. Beim Erkalten der nahezu farb- losen Flüssigkeit kristallisiert ein Teil des Theobromins aus. Der Rest des- selben wird durch Verdunsten des Alkohols erhalten und durch Umkri- stallisieren gereinigt. Synthesen des Theobromins. Das Theobroniin kann nach ver- schiedenen Methoden synthetisch dargestellt werden. Man kann von Guano als dem geeignetsten Rohmaterial zur Gewinnung von Harnsäure und Guanin ausgehen. Guanin wird durch salpetrige Säure in Xanthin verwandelt und beim Erhitzen von Xanthinblei mit Jodinethyl entsteht Theobroniin: Cg H, Pb X, (), + 2 CH3 J = C5 H., (CHs), X4 0, + Pb J^ Die Synthese aus der 3, 7-Dimethylharnsäure verläuft folgendermaßen 3): Bei der Behandlung mit einem Gemisch von Phosplioroxychlorid und -poiita- chlorid verliert dieselbe das Sauerstoffatom 6 und das hierbei entstehende 3, 7-Diinethyl-2, 8-Dioxy-6-Chlorpurin wird durch Erhitzen mit Ammoniak in die entsprechende Aminoverbindung ;>, 7-Dimethyl-6-Amino-2, 8-Dioxy- purin verwandelt. Bei abermaliger Behandlung mit Phosphoroxychlorid wird in dieser Aminoverbindung das in Stellung 8 befindliche Sauerstoffatom gegen Chlor ausgetauscht und durch Reduktion des so entstehenden Chlo- rids bildet sich dann das 3, 7-Dimethyl-6-Amino-2-()xypurin. Diese Base verliert endlich bei der Behandlung mit salpetriger Säure die Aminogrupiie und es entsteht 3, 7-Dimethyl-2, 6-Dioxypurin oder Theobroniin. Zwei andere einfache Verfahren bestehen darin, daß nach dem einen die 3, 7-Dimetliyl- harnsäure durch Kochen mit Phosphoroxychlorid in Chlortheobromin über- geführt wird und daß nach dem anderen die :>-Metliylharnsäure, welche ') Mitscherlich, Der Kakao und liie Schokolade. 1859. 2) E. Schmidt und Pressler, Zur Kenntnis des Theobromins. Ann. d. Cliem. Bd. 217. S. 288 (1873). ") E. Fischer, Synthese des Theobromins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30. S. 1839 (1897). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. II. 61 gß2 Julius Schmidt. durch direkte Methvliening der Harnsäure entsteht, in Methvlchlorxanthin und dieses durch Methylierung in ChlortheolDromin verwandelt wird. ^) Einige Jalire nach dem Erscheinen der eben skizzierten E. Fischer- schen Arbeiten hat W. Traube eine Methode gefunden, die Xanthinbasen direkt , d. h. ohne Vermittlung der Harnsäure , sjaithetisch aus einfachen Verbindungen aufzubauen. 2 ) Das aus dem symmetrischen Dimethylharnstoff und Cyanessigsäure gewonnene 4-Amino-l, 3-dimethyl-uracil lieferte ihm das 1, 3-Dimethylxanthin oder Theophyllin und das 4-Amino-o-methyl-uracil aus Monomethylharustoff das 3-Methylxanthin , welches sich nach E. Fischer durch Einführung weiterer Methyle leicht in Theobromin und Kaffein ver- wandeln läßt. Theobromin und TheophylUn werden nunmehr von den Farbenfabriken vo]-m. Friedr. Bayer & Co. in Elberfeld auf direktem , synthetischem Wege fabrikmäßig hergestellt, nachdem in dem wissenschaftlichen Laboratorium der genannten Fabrik die Traubeschen ^lethoden zur Darstellung der beiden Verbindungen weiter ausgearbeitet und in wesentlichen Punkten verbessert worden sind. Das Theobromin wird von Friedrich Bayer & Co. in der Form von Agurin in den Handel gebracht, welches die Doppelverbindung des Theo- brominnatriums mit Natriumacetat darstellt und als Diui'eticum Anwen- dung findet. Theobromin stellt ein weißes, kristallinisches Pulver dar, sublimiert unzersetzt bei etwa 290^ ohne vorher zu schmelzen. Es verbindet sich mit stärkeren Säuren zu Salzen, welche meist gut kristaUisieren. Andrerseits liefert es auch mit Basen salzartige Verbindungen. Theophyllin, 1, 3-Dimethyl-2, 6-Dioxypuriii (1, 3-Dimethylxanthiu) CH3.N CO OC C— NH I I >CH CH3.N C— N Das dem Theobromin isomere Theophyllin wurde von Kossei ^) 1888 im Tee-Extrakt entdeckt, in welchem es außer von etwas Kaffein von ge- 1) E. Fischer uud F. Ach, Weitere Synthesen von Xanthinderivateu aus methylierteu Harnsäuren. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 31. S. 1980 (1898). *) W. Traube, tjber eine neue Synthese des Guanins uud Xanthins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 33. S. 1371; Der synthetische Aufbau der Harusiiare . des Xanthins, Theobromius, Theophyllins und Kaffeins aus der Cyanessigsäure. S. 3035 (1900); Der Aufbau der Xanthinbasen aus der Cyanessigsäure. Synthese des Hypoxanthins und Adenins. Ann. d. Chem. Bd. 331. S. 64 (1904). ^) Kossei, Eine neue Base aus dem Pflanzenreich. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 21. S. 2164 (1888); Über Theophyllin, einen neuen Bestandteil des Tees. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 13. S. 298. Methoden zur Darstollung von Alkaloiden. 9ß;-i ringen Mengen Xanthin und Adenin begleitet ist. Die mit Wasser ver- dünnte Lösung wird mit verdünnter Scliwefelsäure versetzt, von harzigen Bestandteilen abfiltriert, dann mit Ammoniak übersättigt und mit ammo- niakalischer Silberlösung ausgefällt. Beim Digerieren des so erhaltenen Niedersclilages mit warmer Salpetersäure gehen Theophyllin und Xanthin in Lösung. Man fällt aus der Lösung das Silber mit Schwefelwasserstoff und dunstet das mit Ammoniak übersättigte Filtrat vom Schwefelsilber ein. Hierbei scheidet sich zuerst das Xanthin, dann Theophyllin aus. Das in der letzten Mutterlauge noch enthaltene Theophyllin wird in Form der Quecksilberchloridverbindung zur Abscheidung gebracht. Nach Pommerehne i) wird die dem Tee-Extrakt zugefügte Schwefelsäure mit Bariumkarbonat entfernt, alsdann mit Quecksilberchlorid versetzt, wo- durch zunächst das Adenin beseitigt wird. In der Mutterlauge hiervon ist das Theophyllin sowie etwas Xanthin enthalten, deren Abscheidung mittelst Silbernitrat in ammoniakahscher Lösung und Auflösen des Niederschlages in warmer Salpetersäure erfolgen kann. Für die synthetische Gewinnung des Theophyllins aus der Harnsäure ist der Fabrikationsgang analog demjenigen, wie er auf S. 960 für das Kaffein geschildert wurde, mit der Abänderung, daß das 8-Tri- chlormethylkaffein ( == l,o, T-Trimethyl-8-trichlormethylxanthin ) durch weitere Chlorierung in 1, o-Dimethyl-7-chlormethyl-8-trichlormethyl\anthiii überge- führt wird, welches dann bei der Hydrolyse Theophyllin liefert. Die Synthese des Theophyllins nach Traube, der ebenfalls technische Bedeutung zukommt, wurde bereits oben behandelt. Das Theophyllin, welches nach den pharmakologischen Untersuchungen von Schmiedeberg ^) , Ach^) und Dreser^) in seiner diuretischen Wirkung das Theobromin übertrifft, wird von den Elberfelder Farbenfabriken unter dem Namen Theocin in den Handel gebracht, nachdem die Resultate der pharmakologischen Prüfung durch klinische Untersuchung Bestätigung ge- funden haben. Pilokarpin : Cn H^g Ng 0,. Das Pilokarpin leitet sich zwar nicht vom Purin ab. Es steht aber zum Theobromin, Theophyllin und Kaffein insofern in Beziehung, als es, wie in den letzten Jahren gefunden wurde, gleich diesen einen GlyoxaUn- ring enthält. Aus diesem Grunde scheint seine Besprechung an dieser Stelle gerechtfertigt. ^) Pommerehne, Über Pseudotheobrorain und die damit isomeren Verbindungen. das Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin. Arch. d. Pharm. Bd. 236. S. 113. 2) Schmiedebety , Vergleichende Untersuchungen über die pharmakologischen Wirkungen einiger Purinderivate. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 34. S. 255Ü (1001). ^) Ach, Über die diuretische Wirkung einiger Purinderivate. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 44. S. 319. *) Dreser, Über das 1, 8-Dimethylxauthin und seine diuretische Wirkung beim gesunden Menschen. Berliner klin. Wochenschr. Jg. 1903; Pflügers Arcli. Bd. 102. S. 1 (1904). 61* 964 Julius Schmidt. Die Jaborandiblätter (von Pilocarpus pennatifolius ) enthalten drei Alkaloide, Pilokarpin, Pilokarpidin nnd Jaborin, die untereinander nahe verwandt sind. Die Trennung des Pilokarpins vom Jaborin in Form ihrer Nitrate durch Alkohol liefert zwar ein von amorphen Jaborandi- basen freies Pilokarpin, jedoch ist dieses nicht ganz rein. Dagegen bietet die Fähigkeit des Pilokarpins und Pilokarpidins, sich mit fixen Alkalien zu vereinigen und dabei basische, in Äther und Chloroform unlösliche Ver- bindungen zu liefern, die Möglichkeit dar, zunächst diese beiden Basen von den übrigen rein abzuscheiden.^) Man fügt der Basenmischung einen Über- schuß von Natronlauge zu und schüttelt die Lösung mit Chloroform aus. Letzteres löst alle anderen Basen. Li wässeriger Lösung befindet sich das Pilokarpin und Pilokarpidin, die man durch Ansäuern regeneriert. Die Trennung des Pilokarpins und Pilokarpidins ist wegen ihres analogen che- mischen Verhaltens mit Schwierigkeiten verl)unden. Am besten läßt sie sich noch erreichen durch fraktionierte Kristalhsation der Chlorhydrate aus Alkohol. Das durch Zersetzung seines Chlorhvdrates erhaltene Pilokarpin bildet einen farblosen Sirup, ist leicht löslich in Chloroform, löshch in Alkohol und Wasser, schwer löslich in Äther, sehr schwer löslich in Petroläther. Das Drehungsvermögen des Pilokarpins beträgt für 2o/oige wässerige Lösungen bei 18" C [ajo = +106«. Es ist eine einsäurige Base. In neuerer Zeit ist es hauptsächlich von A. D. Jowcti -) sowie von A. Pinner 3) und seinen Mitarbeitern eingehend studiert worden. Man kann Dank dieser Studien mit großer Wahrscheinlichkeit annehmen, daß ihm die Formel H..HC ■-0 OC CH.CH^.C CH., CH N.CH3 "^^CH N (J zukommt. CR. MarshaU*) hat die Bestandteile der Jaborandiblätter einer physio- logischen Prüfung unterzogen. Pilokarpin wirkt auf die sogenannten Nerven- ') Ä. Petit und M. Polonorski , Beitrag zum Studium des Pilokarpins und Pilo- karpidins. .1. Pharm. Chim. [6.] T. 5. p. 370, 47.ö (1897). 2) A.D.Jowctt, Über Pilokarpin und die Alkaloide der Jaborandiblätter. Journ. ehem. Soc. Lond. Vol. 77. p. 473; Die Konstitution des Pilokarpins. S. 851 (1900); Die Konstitution des Pilokarpins. Vol. 79. p. 580, 1331 (1901); Die Konstitution des Pilo- karpins. Vol. 83. p. 438 (1903); Die Konstitution des Pilokarpins. Überführung von Iso- pilukarpin in Pilokarpin. Proceedings Chem. Soc. Vol. 21. p. 172 (1905). =*) A. Pinner und Mitarbeiter, Über Pilokarpin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 33. S. 1424, 2357 (1900); Über Pilokarpin. Bd. 34. S. 727 (1901); Über Pilokarpin. Bd. 35. S. 192; Ül)er Pilokarpin. Konstitution des Alkaloids. S. 2441 (1902); Über Pilokarpin und dessen Umwandlung in eine neue Modifikation. Bd. 38. S. 2560 (1905). ■•) C. E. Marshall, Physiologische Wirkung der Alkaloide der .laborandiblätter. Journ. (.f Physiology. Vol. 31. p. 120 (1904). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. cjgr^ endigimgen des Herzens; seine Wirkung ist in fast allen Punkten vergleich- bar der elektrischen Reizung des Vagus. Pilokarpin und Atropin sind physio- logische Antagonisten; eine kleine Dosis Atropin hebt die Wirkuim grolier Mengen Pilokarpin auf. Isopilokarpin wirkt wie Pilokarpin, abei- schwiicher. Noch weniger wirksam, aber im gleichen Sinne, erweist sich Pilokarpidin. VII. Verschiedene Alkaloide. Hordenin. HC CH HO-C^ ^C-CH,.CH.,.N(CH3).3 Hd'^^'H Das Hordenin, ein Alkaloid aus Gerstenraalz, stellte (r«eW ' i in der Weise dar, daß er lufttrockenes Malz mit 96Voigem Alkohol extrahierte, das Extrakt eindickte und nach dem Lösen in Wasser und Zusatz von Kaliumkarbonat oftmals mit Äther ausschüttelte. Das rohe Hordenin wurde durch Umkristallisieren aus absolutem Äther sowie mit Hilfe von Tierkohle gereinigt. Es bildet weiße Kristalle vom Fp. llT-ö" C und ist eine tertiäre Base mit ausgesprochenem Phenolcharakter. Durch das Methvlieren des Hordenins mit Dimethvlsulfat und darauffolgende Oxydation in alkalischer Lösung mit Kaliumpermanganat wurde das Hordenin in Anissäure über- geführt, die als solche sicher charakterisiert werden konnte. Mit Hilfe des Hofniannschen Abbaues (Methylieren mit Jodmethyl, Zerlegen mit Silber- oxyd und trockene Destillation) wurde aus dem Hordenin Trimothylamin erhalten. Aus diesen Versuchen geht mit hoher Wahrscheinlichkeit hervor, daß das Hordenin als p-Oxyphenyldimethyläthylamin aufzufas.sen ist. Gaehel ist der Ansicht, daß das Hordenin nicht ein direktes stickstoff- haltiges Endprodukt der Zelltätigkeit der Pflanze ist, sondern daß es aus den durch Eiweißspaltung primär entstandenen Amidosäuren durch sekun- däre Reaktionen sekundär gebildet wird. Das Hordeninsulfat ist physiologisch von Camus untersucht worden, welcher fand, daß es den Blutdruck erhöht und die Harnausscheidung ver- mehrt. Fortgesetzte Einnahme bewirkt Verstopfung. Es wirkt auch auf die Galle und ruft Erbrechen hervor. Das Hordeninsulfat ist ein gutes Mittel gegen folgende Krankheiten: Hypochlorhydrie, Asystolie, Diarrhoe in heißen Ländern, Säuglingsdiarrhoe und Dysenterie, kurz, es gibt überall dort gute Resultate, wo die Gerste mit Erfolg angewandt wurde. Auf die Herztätigkeit wirkt das Hordeninsulfat nicht mit der flnei'gie von Digitaüs u.a.; es hat den Vorzug einer weit geringeren (Üftigkeit. 1) Gaehel, Über das Hordenin. Arcli. d. Pharm. Bd. 244, S. 485; vgl. auch Pharm. Zentralhalle. Bd. 48. S. 427. 710 (1907). 9(36 Julius Schmidt. Die gefährliche Dosis ist beim Menschen etwa 60^ per os und 20^ bei Injektionen.!) Solanin. Über das Solanin finden sich in der Literatur noch ganz unterein- ander abweichende Angaben, die wohl darauf zurückzuführen sind, daß das Solanin verschiedener Provenienz, entgegen der bisherigen Annahme M, ver- schiedene Produkte darstellt. Vielleicht enthalten auch die Solanum arten je nach dem A^egetationszustande ^'erbindungen von analogem Verhalten, aber verschiedener Zusammensetzung. Bei der Extraktion von Solanum sodo- macum Li/^^i. nach verschiedenen Methoden, z.B. durch längeres Mazerieren mit 910/oigem Alkohol, Behandeln mit IVoiger Essigsäm-e, dann Kalkwasser und Kochen des Niederschlags im Kohlensäurestrom mit 80o/oigem Alkohol, erhielten G. Oddo und A. Colomhano^) 2-6o/oo eines Solanins der Zusammen- setzung (C23H39 08N).2H20 bzw. uach dem Trocknen bei lOö« C.^s H39 Og N, aus SOVoigem Alkohol weiße, dünne Nadeln, bei 2300 ^\^.\^ bräunend und bei 245 — 250" unter Zersetzung schmelzend, sehr schwer löshch in absolutem Alkohol, mit 90Voiseni Alkohol gelatinierend, löslich in wässerigem Alkohol, leicht löslich in verdünnter Essigsäure, schwer löslich in Eisessig, fast un- löslich in Äther und Ligroin, schwer löslich in Aceton, ziemlich löslich in Methylalkohol. Aus dieser Lösung scheiden sich nach einiger Zeit beim Ver- dunsten Kristalle, Fp. 275—2800, ab. Am besten wird zur Darstellung dieses Alkaloids folgendermaßen verfahren*) : Die Solanumbeeren werden in einem großen Marmormörser sorgfältig zerrieben und 24 Stunden in einem großen Gefäß zur Mazeration mit einer solchen Menge gewöhnlicher 2-5"/oiger Schwefelsäure stehen gelassen, daß sie vollständig davon bedeckt sind. Von Zeit zu Zeit schüttelt man die Masse durch, die alsbald schleimig wird. Nach der angegebenen Zeit filtriert man durch Wollsäckchen, drückt den Rückstand mittelst einer Presse aus, wäscht gut mit Wasser und unterwirft ihn dann einer zweiten Mazeration mit einer neuen 2"5o/oigen Säurelösung. Das Filtrat, das eine fast klare, gelbgefärbte Flüssigkeit darstellt, macht man mit Natron- oder Kalilauge stark alkahsch. Wird die Reaktion alkalisch, so nimmt die ganze Masse eine intensive, blutrote Färbung an und auf noch weiteren Zusatz von Alkali bildet sich sogleich beim Schütteln ein reichlicher, dichter, volumi- nöser Niederschlag, der sich auch gut auf Sackfiltern aus Wollgewebe sammeln läßt; nach dem Waschen mit Wasser, bis dieses fast farblos ab- *) J. Sahrazes und G. Guerice, Therapeutischer Wert des schwefelsauren Hordeuius. Compt. rend. de l'Acad. des sciences. Vol. 147. 1076 (1908). 2) Vgl. z. B. Beilstein, III. Aufl. Bd. 3. S. 612. *) G. Oddo und A. Colornbano, Über das Solanin aus Solanum sodomacum Linn. Gaz. chim. ital. Vol. 35. I. S. 27 (1905). *) Oddo und Colornbano, Über die Produkte, die man aus Solanum sodomacum Linn. extrahiert. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 38. S. 2756 (1905). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 9(37 läuft, breitet man den Niederschlag auf gi'oPien Bogen Filtrierpapier aus und läßt ihn an der Sonne oder auch auf dem Ofen trocknen. Das so er- haltene Produkt wird gepulvert und mit viel gewöhnlichem Alkohol kochen gelassen. Aus der filtrierten Lösung destiUiert man etwa die Hälfte des Lösungsmittels ab, fügt zum Rückstand Wasser, bis ein Niederschlag sich zu bilden beginnt, läßt von neuem kochen und filtriert durch Papier. Beim Abkühlen setzt sich ^sogleich das Solanin in langen, flockigen, schönen, schmutzigweißen Nadeln ab, die man auf dem Filter sammelt und gut mit Alkohol und Wasser wäscht; man erhält sie so alsbald nur noch wenig gefärbt. Man reinigt sie durch wiederholte Kristallisation aus etwa sO«/oi^eiii Alkohol. Aus Solanum tuberosum konnte Colomhcmo ein Solanin isolieren, welches von dem eben beschriebenen verschieden ist und die Formel C3.3 H51 Oi^ N hat.i) Cytisin, CnHiiN^O. Über das Cytisin, das zum ersten Male im Jahre 1864 von Htise- mann und Marme aus dem Goldregen — Cvtisus laburnum — isoliert wurde, liegen eine Reihe von Untersuchungen -) vor, die über manche P^igen- schaften dieser in ihrer Konstitution noch wenig bekannten Base Auf- schlüsse geben. Cytisin wird nach folgendem, von Partheil^) ausgearbeiteten Ver- fahren aus Cytisus laburnum isoliert. Die gröblich gepulverten Samen werden mit 60Voigem Alkohol, welcher mit Essigsäure angesäuert ist, extrahiert, der Alkohol abdestilliert und das in W^asser gelöste Extrakt, um Fettsubstanzen zu entfernen, durch ein genäßtes Filter filtriert. Das Filtrat \Alrd zur Ausfällung des größten Teiles des Farbstoffes mit Blei- acetat versetzt, die filtrierte Lösung mit Kaülauge alkalisch gemacht und mit Chloroform ausgeschüttelt. Die Ausbeute beträgt pr)%. Buvlika und Magelhaes*) erhielten eine Ausbeute von ca. 30/0 durch Ausziehen der ge- mahlenen Cytisussamen mit verdünnter Salzsäure und Extrahieren der durch Eindampfen konzentrierten und alkalisch gemachten Lösung mit 1) Colonibano, Über das aus den Samen von Solanum tuitcrosum Lin. extrahierte Solanin. Atti R. Accad. dei Lincei, Roma. [5.] Vol. 16. II. p. 683 u. 755. Chem. Zentralbl. Jg. 1908. I. S. 473 u. 651. ^) A. Fartheil, Über Cytisin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 23. S. 3201 (18i)0); Über Cytisin. Bd. 24. 8.634(1891); Cytisin und Ulexin. Arch. d. Pharm. Bd.230. S. 231. — V. Buchka und 31agelhacs, Über Cytisin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 24. S. 253. 674 (1891). —Flügge, Über die Identität von Saphorin und Cytisin. Arch. d. Pharm. Bd. 232. S. 444. — M. Freund und A. Friedmann, Zur Kenntnis des Cytisins. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 34. S. 605 (1901). — E. Maaß, Beiträge zur Kenntnis des Cytisins. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 41. S. 1635 (1908). ä) A. PartheiJ, Über Cytisin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 24. S. 634 (1891). *) Buchka und Magelhaes, Über Cytisin. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 24. S. 255 (1894). 968 Julius Schmidt. Chloroform. Das Alkaloid bleibt beim Verdunsten des Chloroforms als ein beim Erkalten schnell kristallinisch erstarrendes Öl zurück. Es wird durch wiederholtes UmkristaUisieren aus absolutem Alkohol nahezu farblos er- halten. Cytisiu kristallisiert in großen, wasserklaren Kristallen vom Siede- punkt 152 — 15?)0 (unkorrigiert). Es ist sublimierbar, sehr leicht löshch in Wasser, Alkohol, Benzol, Chloroform, ziemlich leicht in Äther, Amyl- alkohol, Aceton, aber unlöslich in Schwefelkohlenstoff, kaltem Ligroin und Tetrachlorkohlenstoff. Kochendes Ligroin löst die Base unter Zurücklassung der Farbstoffe und scheidet sie beim Erkalten wieder ab, weshalb sich dieses Lösungsmittel zur Reinigung kleiner Mengen gut eignet. Cytisin ist optisch aktiv, und zwar zeigt eine l-BOVoige Lösung bei 17** die Dre- hung [y-]D = — 119^57'. Eine l-985o/oige Lösung des Nitrates zeigt bei 17« [7.]d=— 82«37^ Cheirolin, C.HgO^NSo. Dieses dürfte wohl die erste in einer Droge gefundene, schwefel- haltige Pflanzenbase sein. Ähnliche Verbindungen scheinen in geringer Menge in vielen Cruciferenarten vorhanden zu sein, und auf ihre Anwesen- heit ist wohl die Schwefelreaktion von verschiedenen Ölen zurückzuführen. Das CheiroUn wird aus dem Samen des Goldlacks (Cheirantus cheiri) gewonnen. Die Extrakte dieser Pflanze wurden schon lange in der Medizin verwendet und das Streben der Forscher ging dahin, die wirksame Sub- stanz dieses Extraktes zu isoheren. Zuerst gelang es Rech'^), aus dem Samen des Goldlacks einen Cheirinin benannten Körper vom Schmelzpunkt 73 bis 74« C zu isoUeren. Fh. Wagner-) verfuhr anfangs nach Reehs Angdiben, konnte aber nur sehr geringe Mengen des von ihm beschriebenen Körpers gewinnen. Reeb extrahierte die Samen des Goldlacks zur Entfernung des darin enthaltenen Öles zuerst mit Benzin, zog den Pvückstand mit Alkohol aus und isolierte daraus sein Cheirinin. Auf (-Irund verschiedener Beob- achtungen schlug Wagner das im folgenden beschriebene Verfahren ein und erhielt dabei größere Mengen des neuen schwefelhaltigen CheiroMns. Die Samen des Goldlacks wurden fein gestoßen, mit einer öVoig^n Soda- lösung befeuchtet und direkt mit Äther erschöpft. Dieser nimmt das Öl der Samen mit dem Alkaloid auf. Letzteres wird der eingeengten ätheri- schen Lösung mittelst b^/oiger Schwefelsäure entzogen. Nachdem sich die Säure von dem gelbgefärbten, stark ölhaltigen Äther getrennt hat, wird sie abgelassen, filtriert und nach Zusatz ca. by'oiger Sodalösung mit wenig Äther geschüttelt. Das xUkaloid geht in den Äther über, der nach dem AbdestiUieren einen klaren, beim Reiben mit dem Glasstab erstarrenden Sirup hinterläßt. Dieser wird unter Anwendung von Tierkohle aus Äther ö ^) Beeb, Weitere Untersuchungen üher die wirksamen Bestandteile des Goldlacks (Cheiranthus Gheiri L.). Arch. f. experim. Path. Bd. 43. S. 131. ^) Ph. Wagner, Über Cheirolin, ein schwefelhaltiges Alkaloid. Chem.-Zeitg. Bd. 32. S. 76 (1908). Methoden zur Darstellung von Alkaloiden. 90«) umkristallisiert. Die filtrierte Ätherlösung scheidet beim Stehen große, farb- lose Kristalle von Cheirolin aus. Dieselben schmelzen nach dem Trocknen im Exsikkator bei 46 — 480. Die Ausbeute beträgt V4 — V2V0 der angewen- deten Samen. Dem Cheirolin, das antipyretische, chininähnliche Wirkung aufweist, kommt nach Untersuchungen von Schneider'^) die Formel Cr, IlgOoNS, zu. Unter Berücksichtigtmg der von ihm festgestellten Tatsache, daß das Cheirolin eine chemisch neutrale Substanz ist, wird sich die ol)en beschriebene Darstellungsweise erhebüch vereinfachen lassen. 2) 1) W. Schneider, Zur Kenntnis des Cheirolins, des scliwefelhaltigen Alkaloids aus dem Goldlacksamen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 41. S.4466 (1908): Bd. 42. S. 341() (1909). 2) W. Schneider, Zur Kenntnis des Cheirolins, des schwefelhaltigen Alkaloids aus dem Goldlacksamen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 41. S. 44(56 (1908). Darstellung der Sapouine. Von R. Kobert. Unter Saponinen oder Saponinsubstanzen versteht man eine Gruppe von stickstofffreien Glykosiden, welche durch eine Reihe physikalischer, chemischer und physiologischer Eigenschaften ^) , falls man diese alle zu- sammen berücksichtigt, genügend charakterisiert sind, während wir über die Struktur ihrer Kernsubstanzen so gut wie nichts wissen. Und doch haben die Sapouine ein erhebliches pflanzenphysiologisches Interesse, da sie sich in 52 Familien der Mono- und Dikotylen finden. Um die Darstellungsmethoden verständlich zu machen, sind die nach- stehenden Vorbemerkungen erforderlich. Was die physikalischen Eigenschaften anlangt, sind die Sapo- uine farblose, bis auf Digitonin, PariUin, Sarsasaponin und Cyclamin amorphe und kolloide Substanzen des Pflanzenreiches, welche sich in Wurzeln (Senega, Saponaria rubra, Saponaria alba, Chamaelirium), Zwiebeln (Chlorogalum), Knollen (Cyclamen), Fänden (Quillaja, Guajacum), Früchten (Sapindus), Samen (Aesculus, Thea, Entada, Agrostemma), Stengeln (Dulcamara), Blättern (Guajacum), manchmal auch in der ganzen Pflanze (x\nagallis, Herniaria) finden. Optisch sind sie teils linksdrehend (Sarsaparillglykoside), teils rechts- drehend (Kornradensaponine), teils inaktiv (Assamin). Den Eiweißstoffen ähneln sie in mehreren Beziehungen. Erstens dialysieren nämlich ihre Lö- sungen nur sehr schwer und unvollkommen. Zweitens lassen sie sich aus wässerigen Lösungen zum Teil sehr leicht, zum Teil schwerer aussalzen. Drittens halten sie energisch kleine Mengen anorganischer Substanzen fest, so oft man sie auch durch Dialvse oder Umfällunw reinigen mag. Viertens reißen sie beim Ausfallen analog einzelnen Eiweißstoffen gewisse gelöste Farbstoffe begierig an sich. Fünftens teilen sie mit den Eiweißarten die Neigung, in neutralen und namentlich in schwach alkalischen Lösungen seifenartig zu schäumen und in konzentrierten Lösungen wie Gummi ara- bicum Gegenstände aus Papier, Holz, Kork etc. aneinander zu kitten. Von ihrer seifenähnlichen Verwendbarkeit haben einige ihrer Stammpflanzen die Namen Saponaria, Sapindus, Sapota, Quillaja (d. h. Waschmittel) und die Glykoside selbst den Namen Sapouine. Die Verwendbarkeit unserer Drogen als Waschmittel haben unabhängig von einander die verschiedensten *) i?. Kohert, Beiträge zur Kenntnis der Saponinsubstanzen. Mit 6 Figuren und 13 Tabellen. Stuttgart 1904. Darstellung der Saponine. ((-j Urvölker entdeckt. Da die empfindlichsten Farben der zu waschenden Ge- webe und die feinsten Gewebsfäden von den Saponinen nicht anjre<^M-iff('n und verändert werden, haben sie vor Seifen gewisse Vorzüge, und dies' sichert ihnen dauernde Verwendung in der Technik und im Haushalt bei der Reinigung kostbarer Gewebe. Auch als schaumerzeugende Mittel für Schaumgetränke werden sie trotz polizeilicher Verbote immer wieder bennutzt. Da alle stark schäumenden Substanzen große Emulsionskraft besitzen, wer- den die Saponine auch zum Emulgieren von Fetten, wie Lebertran und Rizinusöl, weiter von Harzen und Teerpräparaten benutzt. Mit der emul- gierenden Eigenschaft hängt die Fähigkeit unserer Substanzen zusammen, einerseits kristallinische Substanzen am Auskristallisieren zu hindern und andrerseits fein verteilte Pulver und CO, in wässerigen Medien susjjendiert zu halten, so daß also beispielsweise Bleisulfid und Raryumsulfat in saponinhaltigeu wässerigen Lösungen nicht ordentlich ausfallen und COo nicht entweicht. Von den physiologischen Eigenschaften, an denen die meisten Saponine leicht zu erkennen sind, sei ihre ganz spezifische Giftigkeit für Fische, ihr scharfer, nachhaltig kratzender Geschmack, ihre entzündung- erregende Wirkung auf die verschiedensten Schleimhäute, auf das l'nter- hautzeEgewebe , auf die Niere etc. der Warmblüter und ihre farbstoffent- ziehende Ej'aft für rote Blutkörperchen hervorgehoben. Nur 2—3 von allen Saponinen sind von Haus aus fast oder ganz ungiftig. Cber die Entgiftung der von Haus aus giftigen wird noch gesprochen werden. Von chemischen Eigenschaften werden die wichtigsten bei den Darstellungsmethoden erwähnt werden. Hier seien nur folgende im vor- aus besprochen. Unsere Stoffe sind teils von neutraler, teils von saurer Reaktion. Merkwürdigerweise kommen in mehreren Pflanzen gleichzeitig je ein saures und ein neutrales Saponin vor, z. B. im Kraute von Anagallis. in der Quillajarinde, in der Senegawurzel, in den Samen des chinesischen Tees und des Assamtees, in den Kornradensamen, in der Guajakrinde etc. Die Azidität der sauren Saponine ist aber nicht durch ein Karboxyl be- dingt und daher meist recht schwach. Von alkalisch reagierenden Saj)onineu kann man nur im erweiterten Sinne des Wortes reden, insofern die ein- zige hierher gehörige Substanz, das Solanin, nicht stickstofffrei ist und ihre Basizität natürlich gerade diesem Stickstoffgehalte verdankt. Das So- lanin bildet somit die Brücke zwischen den eigentlichen Saponinen und den Alkaloiden. Ein Vorkommen von echten Saponinstoffen neben Fetten, äthe- rischen Ölen, Harzen etc. ist in den Mutterdrogen nicht selten. Ein Vor- kommen neben Alkaloiden ist, falls man vom Solaniu absieht. i)ei unseren Stoffen sehr selten, so daß man den Eindruck gewinnt, daß beide Gruppen von Substanzen sich gegenseitig ausschließen. In Äther, Petroläther, Benzol, Chloroform sind die echten primären Saponine fast unlöslich, die nicht kristallinischen auch in absolutem kalten Alkohol. In W^asser sind die neutral reagierenden, nicht kristallinischen leicht löslich, ja zum Teil sind sie sehr hygroskopisch und zerfließen an der Luft. In heißem verdünnten Alkohol und in heißem Methylalkohol scheinen alle 972 R. Kobert. Saponine löslich zu sein. Die sauer reagierenden Saponine werden in Wasser zum Teil erst bei Zusatz von Spuren von Alkali klar und leicht löshch. Es gibt ?) Methoden der Entgiftung der Saponine auf chemischem Wege. Erstens bilden sämtliche Saponine mit den Cholesterinen und Phvto- sterinen, wie Bansorn^) für ein Saponin fand und Hausmann"^) , Ahder- hdlden und Lc Count^). Kobert*) u.a. jenen Fund erweiternd bestätigt haben, ungiftige Verbindungen von zum Teil so labilem Charakter, daß mittelst Äther sich das Cholesterin der Verbindung wieder entziehen läßt. Eine dieser Verbindungen, die von Digitonin und Cholesterin, läßt sich je- doch nach Windaus ^) mittelst einfacher Ätherbehandlung nicht zersetzen. Sie ist ferner bis jetzt fast das einzige kristallinische Saponincholesterid. Es bildet sich aus einem ]\Iolekül Digitonin und einem Molekül Cholesterin ohne Wasseraustritt nach der Formel C55 H94 O28 + C27 H^g 0 = C82 H^o O.^g. Eine zweite Methode der Entgiftung wohl sämtlicher Saponine besteht in Erhitzung derselben mit heißer Barythydratlösung und nachheriger Wieder- abtrennung vom Baryt durch Kohlensäure und Schwefelsäure. Eine dritte Methode der Entgiftung besteht in der Umwandlung der Saponine in Acetyl- saponin und Regenerierung daraus. Ich komme auf diese beiden Methoden unten bei den Darstellungsmethoden zu sprechen. Hier sei nur bemerkt, daß sich unverändertes giftiges Saponin nur aus den nach der ersten Methode entgifteten Saponinen wieder gewinnen läßt. Von Gruppenreaktionen der Saponine nenne ich folgende: 1. Eine frisch hergestellte Lösung von Ferricyankalium, der ein Tropfen Eisenchlorid zugesetzt worden ist, färben sie langsam schon in der Kälte und schnell beim Erwärmen erst grün, dann blau. Ohne Zweifel beruht diese Färbung auf einer Reduktion entweder des Eisenchlorids oder des Ferricyankaliums. Ebenso wird Kaliumpermanganat schon in der Kälte reduziert. 2. Eigentliche Zuckerreaktionen geben sie mit Silbersalzen, Kupfersalzen etc. an sich bei vorsichtigem Erhitzen nicht, wohl aber nach hydrolytischer Spaltung sehr stark. Fehlingsche Lösung wird von konzentrierteren Saponinlösungen wenn nicht schon in der Kälte so doch wenigstens lieim Erwärmen getrübt und durch Bildung von Saponin- kupfer gallertig gefällt. Einzelne Saponine, und zwar besonders das Assamin. färben nach Halberkann ß) die Fehlingsche Lösung intensiv grün, und zwar noch bei 6000f acher Verdünnung. Nickel- und Kobalt Salzlösungen geben ebenfalls charakteristische Färbungen, und zwar gelbe. ^) Ransom, Saponin und sein Gegengift. Deutsche med. Wochenschr. 1901. S. 194. ^) Hausmann, Über die Entgiftung des Saponins durch Cholesterin. Hofmeisters Beiträge. Bd. 6. S. 567 (1905). ^) Abderhalden und Le Count, Zeitschr. f. experim. Path. u. Thcr. Bd. 2. S. 199. *) Kobert, Beiträge etc. S. 52. ^) A. Windaus, Über die Entgiftung der Saponine durch Cholesterin. Ber. der Deutsch, ehem. Ges. Jg. 42. S. 238 (1909). ") Halberkann , Beiträge zur Kenntnis der Saponinsubstauzen der Samen des Assamtees. Biochem. Zeitschr. Bd. 19. S. 313 (1909). Darstellung der Saponine. t)-;.j 3. Werden Saponinlösungen mit Siihlimatlüsuiij,^ ciiii^rc Zvh ^,^.. kocht, so erfolgt beim Erkalten Trübung und Abscheidung eines weilion, sich mit Ammoniak schwärzenden Niederschlags. Es hat also Ueduktiou /ii Kalomel stattgefunden. 4. Erhitzen mit Xesskrs Reagens färbt nach Vunxakns') farblose Saponinlösungen erst gelb, dann grau und trübt sie alsdann. Falls reich- lich Saponin anwesentl war, entsteht ein grauei- Niederscldag. und die dar- über stehende Flüssigkeit gelatiniert nach Halberkann.-) 5. Gerbsäuren, wie die aus (ialläpfeln, Katechu, Dividivi. Eichen- rinde, Myrobalanen. Quebracho und Sumacli. fällen konzentrierte Lösungen nur einzelner Saponine. wie z.B. der Guajaksaponine : wohl aber wirkt Bleiessig auf sehr viele fällend. Neutrales P.leiacetat läl'.t die Lösungen der neutralen Saponine klar, fällt aber die sauren. Einige wcniüc Sapoiiinc sind durch Bleisalze überhaupt nicht fällbar. 6. Konzentrierte Lösung von Baryumhydroxyd bringt in nicht zu verdünnten wässerigen Lösungen aller durch Bleiessig fällbaren Saponine einen weißen Niederschlag von Barytsaponin hervor. Diese Reaktion wird auch mikrochemisch zur Drogenuntersuchung nach Comhes'^) verwendet. Man trägt die Schnitte in Barytwasser ein, wäscht sie mit Kalkwasser aus und legt sie dann in Lösung von Kaliumdichromat. Dabei bilden sich in saponinhaltigen Zellen meist Kristalle von Baryumchromat. HnWcrkanu *) hat die Brauchbarkeit dieser Methode bestätigt. 7. Mit konzentrierter Schwefelsäure färben sich nach Rosoir->) alle Saponine, wenn dieses Gemisch, auf Llirglä sehen ausgebreitet, der Luft ausgesetzt wird, unter Wasseranziehung langsam von den Rändern her rot. Einige zeigen besonders mit Selenschwefelsäure (Meckes Reagens) eine Yiolettfärbung, so z. B. die Guajaksaponine nach Friehocs ''') und die Assamteesaponine nach Halberkanu. ^) Schwefelsäure, der Alkohol und eine Spur Eisenchlorid zuge- setzt worden ist (La/ons Reagens), färbt einzelne Saiumine ') blaugrün oder blau oder gibt eine grüne Fluoreszenz. «) Zum Nachweis von Saponinen in Schnitten von Drogen sind La/ons Reagens und für einzelne auch Merkes Reagens recht brauchbar. ') Vamvakas, Aiinal. Chim. anal. appl. p. IGl (1906); ref. in M, rcks Reagenzieu- verzeichnis. II. Aufl. Berlin 1908. S. 204. ■') Halberkaim, Biochem. Zeitsclir. Bd. 19. S. 312 (1909). 3) Combes, Comptes rendus de l'acad. de sciences. T. 145. p. 1481; Jonrn. de Pharm, et de Chim. T. 27. p. 247 (1908). ■») Halberkann, Biocliem. Zeitschr. Bd. 19. S. 13 des erweiterten Sop.-Alulr. (liXliM. 5) Alex. Rosoll, Beiträge zur liistochemie der Pflanzen. Sitz.-Ber. d. Wiener Akad. d. Wisseusch. Bd. 89. II. Abt.' S. 143 (1884). 6) Walther Frieboes, Beiträge zur Kenntnis der Guajakpräparate. Mit \ orwort von R. Kobert. Stuttgart 1903. S. 55. ') R. Kobert, Zur La/o«schen Digitalinreaktion. Pharuiaz. Zeitg. .lg. 1885. Nr.lu. Frieboes, 1. c. S. 55. 8) Halberkann, Biochem. Zeitschr. Bd. 19. S. 311 (1909). 974 ß- Kobert. Was die chemische Zusammensetzung der Saponine anlangt, so ist in dieser Beziehung dank Kiliani^) am genauesten die des Digi- tonins bekannt. Das im Handel befindliche Präparat ist amorph und wasser- löslich, aber nicht rein. Das ganz reine bildet in Wasser schwer lösliche, in starkem Alkohol aber gut lösliche Kristalle von der Formel Cg^ Hgo < )-28 oder CösHgiOos- Diese gründet sich sowohl auf Analyse und Molekular- gewichtsbestimmung des Digitonins selbst als auf quantitative Bestimmung seiner Spaltstücke. Bei Hydrolyse mittelst verdünnter Salzsäure in der Hitze zerfällt es nach Kiliani ^ ) nach der Formel C54 H«, (:).,8 + 2 H^ 0 = C30 H,8 0,3 + 2 Cs H12 Oe + 2 Ce H,^ 0« Diffitoniu Diffitoseniu Glukose Galaktose. Von den Abbauprodukten des Digitogenins hat Kiliani eine ganze Anzahl in Kristallen darstellen können, so die Digitogensäure, Desoxydigi- togensäure, Oxydigitogensäure, Digitsäure, Anhydrodigitsäure, Digsäure, Di- gitosäure, Hydrodigitosäure u. a. Von den sonstigen Saponinen ist in che- mischer Hinsicht vor kurzem das Agrostemmasapotoxin durch Brandl'-) sehr eingehend untersucht worden: auch gelang es ihm, ein kristallinisches Spaltungsprodukt zu ge>\innen. Die chemische Zusammensetzung der übrigen Saponine ist zwar für viele durch die Elementaranalyse ermittelt worden; jedoch bilden die so gewonnenen Zahlen meist nur Annäherungswerte. Stellt man diese nach ihrem Kohlenstoff- gehalt geordnet nebeneinander, so ergeben sich zwei natürliche Reihen, in welche sich die Mehrzahl dieser Substanzen annähernd einreihen lassen. Die eme \onFlückiycr'^) aufgestellte hat die allgemeine Formel Cn Ho n-10 Oig und umfaßt bis jetzt nur Avenige Glieder; die andere, von mir*) aufgestellte, hat die Formel CnHo^.sOio und umfaßt eine weit größere Anzahl von Gliedern. Die Molekulargewichtsbestimmung zeigt, daß ])ei mehreren Saponinen, wie z. B. bei denen der Sarsaparille % das Molekül ein größeres ist als der einfachste Ausdruck dieser Formel vermuten läßt. Die hydrolytische Zer- legung beim Kochen mit verdünnten Mineralsäuren ergibt stets eine sauer reagierende, in angesäuertem Wasser unlöshche Substanz, die die Gruppen- bezeichnung Sapogenin führt, sowie mehrere Zuckerarten, die keines- wegs bei allen Saponinen dieselben sind. Wie oben angeführt wurde, liefert das Digitonin Glukose und Galaktose. Galaktose konnte Hoß'mann^) 1) Kiliani, Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. J?. 23. I. S. 1555 (1890); Jg. 24. I. S.339 uud IL S. 3951 (1891); Jg. 32. S. 341 und 2202 (1899); Jg. 34. S. 3562 (1901); Archiv d. Pharm. Bd. 231. S. 448 (1893). — Wiiidaus freilich bevorzugt die andere Formel (s. das Zitat auf S. 972). ^) J. Brandl, Über Sapotoxin und Sapogenin von Agrostemma Githago. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 54. S. 245 (1906); Bd. 59. S. 245 (1908); Bd. 59. S.299 (1908). ^) A. FUickiger, Über das Saponin der Sarsaparille. Arch. d. Pharm. Bd. 210. S. 532 (1877). *) B. Kobert, Über die allgemeine Saponinformel. Arbeiten d. pharmakol. Institutes zu Dorpat. Bd. ö. S. 29 (1891). ^) W. V. Schulz, Zur Kenntnis der Sarsaparille. Ebenda. Bd. 14. S. 28 (1896). ^) P. Hoff mann, Über die Quillajasäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 2734 (1903). Darstellung der Saponine. 97f, auch aus der Quillajasiiure reichlich abspalten neben einem nicht verj^iiibaren Zucker, der unabhängig von ihm auch von Plzak^) und später von Jiosen- thaler% May% Brmidl, Halberkami*) etc. gefunden wurde und der sicli als Pentose (Arabinose) erwies. Sein Vorkommen ist bis jetzt scliun in 14 ver- schiedenen Saponinen sichergestellt. AuchMethylpentosen sclicincn in Sapo- ninen vorkommen zu können. Von Saponasen, d. h. von Kiizymcn. welche die Zerlegung der Saponine in ihren Stamm pflanzen in Sapogeniii und /ucker- arten auszuführen vermögen und die gewiß in größerer Zahl existieren, kennen wir noch kein einziges genauer. Bakterien- und Scliimnielpilzenzyme scheinen dazu befähigt zu sein. Gonncrnumn-') konnte mittelst Kniulsiii und Tyrosinase eine kräftige Zuckerabspaltung aus von mir dargestelltem Quillajasapotoxin bewirken. Ebenso hatte dieser Autor bei \'ei-suclien an Organen von Säugetieren ein positives Resultat zu verzeichnen, da er mit- telst Hasenleber sterile Spaltung von Sapotoxin auszuführen vermochte. Viele Sapogenine sind in Alkohol und in Eisessig gut löslich, schwerer in Äther und in Chloroform und unlöslich in Ligroin und in Wasser. Bratidl^) reinigte das Kornradensapogenin durch Lösen in Essigäther. Auch in freien Alkahen sind die Sapogenine bis zum gewissen Grade löslich. Vom chemischen Standpunkte aus sind die Sapogenine noch weniger ein einheitUcher Begriff, als die Saponine es sind, da nicht nur die Sapogenine verschiedener Saponine verschieden sind, sondern da aus einem und dem- selben Saponine je nach dem Druck, unter dem die Spaltung vorgenommen wird, ferner je nach der angewandten Säure, nach deren Konzentration und nach der Länge des Kochens recht verschiedene Sapogenine erhalten werden, wie Halberkann'') soeben von neuem festgestellt hat. Der genannte Autor konnte zeigen, daß bei energischem weiteren Kochen mit Mineral- säuren (H2SO4) auf dem anfänglich abgeschiedenen Sapogenin des Assa- mins eine Fettsäure abgespalten wird. Bei der Spaltung des Solanins haben Hilger und MerÄrem ^) Krotonaldehyd als Spaltungsprodukt bekommen. Die Sapogenine lassen sich zum Teil in Kristallen gewinnen; auch eine als Sapogeninkalium bezeichnete Verbindung zeigt nach einigen Autoren ki'i- stallinischen Charakter. Brandl^)\i?ii beim weiteren Abbau des Sapogonins der Kornradensaponine durch Zusammenschmelzen mit Kaliliydrat eine in Sodalösung leicht lösliche Säure C3oH4r, O4 erhalten, deren Entstehen er 1) Fr.Plzak, Über Cyclamin. Ber. d. Deutsch, clicni. Ges. Jg. 36. S. 171)1 11903). ^) Leop. Bosenthaler, Pentosenreaktioneu von Sapouincn. Archiv dor l'liarniazie. Bd. 243. S. 247 (1905). ^) Otto May, Chemisch-pharmakognostische Untersuchung der Früchte von .Sapin- dus Barak. Dissert. Straßburg 1905. *) Halberkann, Biochem. Zeitschr. Bd. 19. S. 324 (1909). 5) M. Gonnermann, Über das Spaltuugsvermögen von Leberhistozym und einiger anderen Enzyme für Glykoside und Alkaloido. Pjlr, p er s Ar q\\\\. Bd. 113. S. 185 (lOiK)). 6) Brandl, Arch. f. cxperim. Path. u. Pharm. Bd. 54. S. 252 (19o0). ') HalberkaiDi, Biochem. Zeitschr. Bd. 19. S. 330 (1909). 8) Ä. Hilger und Merkens, t!ber das Solanin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 3204 (1903). 8) Brandl, Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 59. S. 256 u. 207 (1908). 976 R. Robert. auch im Darnikanal von Hunden nach Fütterunti" von Kornradensapotoxin nachweisen konnte. Andere Autoren haben durch Oxydationsmittel Oxal- säure, Benzoesäure, Pikrinsäure erhalten. Sänger'^) hat durch Einwirkung- von heißer Kalilauge aus Agrostemmasapotoxin Protokatechusäure, Brenz- katechin, Essigsäure und Propionsäure erhalten. Erst nachdem alles Vorhergehende besprochen ist, werden die Dar- stellungs- und Trennungsmethoden der Saponine genügend ver- ständlich werden. 1. Die älteste ist die Alkoholmethode, mit Unrecht als die von Schrader^) bezeichnet. Nach dieser wird der betreffende Pflanzenteil, z. B. die Wurzel der Saponaria officinalis, mit Spiritus ausgekocht, das Dekokt heiß filtriert und dann stark abgekühlt, wobei sich zunächst die neutral reagierenden Saponine unlöslich abscheiden. Wie später von mir gefunden wurde, sind uämhch die sauren Glykoside in Alkohol löslicher; sie können durch Zusatz von absolutem Alkohol und sodann von Äther ebenfalls zur Ab- scheidung gebracht werden (Quillajasäure, Guajaksaponinsäure etc.). Durch Wiederholung der Prozedur läßt sich eine gewisse Pieinigung wohl erzielen; zu analysenreinen Substanzen kommt man jedoch damit allein nicht. In Anlehnung an einen Vorschlag von Greene ^) kann man die Schraderüche Methode dadurch verbessern, daß man die auszukochenden zerkleinerten Pflanzenteile mit Magnesia usta mischt, welche Pflanzensäuren bindet und dadurch deren Übergang in den iVlkohol verhindert. iVnhangsweise muß bei Besprechung der Schraden^chen Methode noch darauf hingewiesen werden, daß die vier kristallinischen Saponine sich zu Alkohol und zu Wasser beinahe umgekehrt verhalten als die amorphen. Parillin ist in absolutem Alkohol am besten löshch, in verdünntem viel schlechter. In kaltem Wasser ist es unlösUch, in kochendem aber leicht löslich, und nach dem Erkalten bildet es eine übersättigte Lösung. Setzt man zu dieser Al- kohol, so A\ird die Löslichkeit des Glykosides nicht nur nicht erhöht, son- dern es wird ausgefällt. In wässerigen Lösungen des Sarsasaponins löst sich nach Schulz*) das Parilhn \'iel besser als in Wasser. Das Melanthin der Nigella sativa verhält sich nach Schuh dem Parillin ganz analog. Auch die Angaben von Kilkwi ^) über das Digitonin zeigen, daß es sich ähnlich verhält. In mancher Beziehung gehört endhch auch das Cyclamin der Alpenveilchenknolle hierher, welches nur 1 : 300 in W^asser klar lösUch ist. 2. Die Methylalkoholmethode von W.G. Boorsma.^) Nach dieser werden die vorher entfetteten Pflanzenteile mit Methylalkohol extra- *) Karl Sänger, Beiträge zur chemischen Charakteristik der Samen der Kornrade im Hinblick auf ihre Bedeutung als Bestandteil der Meblsorten des Handels. Dissert. JVIünchen 1904. 2) Schrader, Gehlens alLem. Jouni. d. Chemie. Bd. 8. S. 548 (1808). ') Greene, ÜberChamaelirium luteum. Amer. Journ. of Pharm. A'ol.50. p. 250 (1878). *) W. r. Schulz, Ein Beitrag zur Kenntnis der Sarsaparille. Arbeiten des pharma- kologischen Institutes zu Dorpat. Bd. 14. S. 1 (1896). ^) Kiliani, 1. c. ^} Boorsma, Mededeelingen ait s'lands plantentuin. Bd. 52. S. 30 (1902). üarstcllung der Saponine. ((77 hiert, der alle Saponine ,unt zu lösen scheint. Ans deni filtrierten Ans/.ii^:(' wird das gelöste Saponin durch Zusatz von Äther aus^^etiilit und der Niederschlag in Chloroformwasser gelöst der Dialyse unterworfen, wobei mitgelöste Salze, Zucker etc. entfernt werden und das Saponin allein zurück- bleibt. Es wird aus der eingeengten Avässerigen Lösung durch .Vlkoholiither niedergeschlagen. Ist es ein Gemisch eines sauren und eines neutralen Saponins, so wird zurTrennung die weiter unten l)eschriel)ene Bleimethode von Kohert angewandt. 3. Die Methode des Aussalzens gewisser Saponine habe ich ') an- gegeben, um ein Gemisch von Quillajasaure und (^)uilla,jasap()to\in von- einander zu trennen, denn das erstgenannte saure Saponin kann durch Sättigen der wässerigen Lösung eines Gemisches beider mittelst Animonsulfat in der Hitze leicht entzogen werden, da es ([uantitativ ausfällt, während das Sapotoxin gar nicht gefällt wird. Niederschlag und Lösuiiü' werden dann je in einen Dialysator gebracht, wobei das Animonsulfat und etwaiLn- son- stige, als Verunreinigung anwesende Salze wegdialysieren , während die Saponinsubstanzen im Dialysator bleiben. Selbst milligrammatische Mengen kann man dadurch ausfällen. Die Guajakrindensaponinsäure und die Polygalasäure lassen sich ebenfalls noch aus nur O'l — 0'2Voigt'n Lösungen mittelst Ammonsulfat abscheiden, die Cereinsäure sogar aus noch ver- dünnteren. Auch das saure Saponin der Saponaria officinalis ist auf diese Weise fällbar. Von neutralen Saponinen lielien sich z. K Cha- mälirin, Sarsasaponin, Cyclamin und das Sapotoxin der weiüen Seifenwurzel ebenfalls aussagen. Alle diese lassen sich dann natürlich mit Hilfe der Dialyse weiter reinigen. 4. Die Methoden des Ausschütteins. Die von Dragendorf ange- gebene Methode des Ausschütteins mit Chloroform aus saurer Lösung ist nicht zu empfehlen, da dies Lösungsmittel nur Spuren unserer Stoffe aufnimmt. Besser ist schon Isobutylalkohol oder Amylalkohol, in denen sich z. B. Chamälirin O^ö^/oig und (Quillajasaure 0'2''/oig, die meisten neutralen Saponine aber noch nicht OlVo^g" klar lösen. Wo es sich um Abscheidung sehr kleiner Mengen, z. B. aus Bier oder Brausehmonade, handelt, da kann diese Methode mit in Frage kommen. Den Übergang in das Ausschütte- lungsmittel kann man durch Zusatz von Animonsulfat zur erhitzten wiisse- rigen Lösung begünstigen. Essigäther ist zum Ausschütteln bzw. zum Aufnehmen des eingeengten Saponins ebenfalls empfohlen worden: ich ver- mag jedoch dieser Empfehlung nicht beizutreten. Das zurzeit anerkannteste Ausschüttelungsmittel ist das von Brunner-) empfohlene l'henol als Aci- dum carbolicum liquefactum. namentlich wo es sich um den Nachweis kleiner Mengen in Schaumgetränken handelt. Für dieses Verfahren treten ^) R. Robert, Beiträge zur Kenntnis der Saponinsubstanzen. Stuttgart 1904. S. 20. Vgl. W. r. Schulz, Dorpater Institutsarbeiten. Bd. 14. S. 21 (_lS9i;). ") Karl Brunncr, Saponine in moussierenden (ietränkeu. Zeitsclir. f. Intersucli. d. Nahrungs- u. Genußmittel. Bd. 5. S. 1197 (1902). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsroethoden. II. 02 978 R- Kobert. Baumert '^) und Rühle^) ein; es ist auch in das Schweizerische Lebens- mittelbuch 2) aufgenommen worden. Nach diesem Verfahren mrd die auf Saponin zu untersuchende Flüssigkeit eingeengt: falls sie sauer ist, wird sie mit Magnesiumkarbonat neutraUsiert. Der Sirup wird mit dem doppelten Volumen Alkohol versetzt, filtriert, das Filtrat mit Tierkohle gereinigt und der Alkohol abgedunstet. Der in Wasser aufgenommene Verdunstungsriick- stand wird mit soviel Acidum carbol. liquef. unter Schütteln versetzt, daß etwa 5 cm^ des Phenols nicht vom Wasser gelöst werden. Zusatz von Ammon- sulfat unterstützt den Übertritt des Saponins in das Phenol und die Ab- scheidung des letzteren. Das mit Hilfe des Scheidetrichters abgetrennte Phenol wird nun mit Wasser und Äther, dem das halbe Volumen Petrol- äther zugemischt worden ist, geschüttelt, wobei das Saponin in das Wasser überwandert und durch Verdunsten relativ rein gewonnen werden kann. Wie genau die Methode ist, zeigen die Analysen von Rühle. Weitere An- gaben darüber werden von Ha/berkann demnächst veröffentlicht werden. 5. Die Methode der Acetylierung und der Regeneration aus der Acetylv erbindun g ist namenthch zur weiteren Pieinigung des nach den ersten beiden Methoden gewonnenen Rohsaponins und zur Beschaffung analysenreinen Materials von Stützt) erdacht. Stütz hat die Acetylierung der Quillajasaponiue in dreierlei Weise vorgenommen: 1. durch Kochen von 1 Teil Saponin mit 4 Teilen Essigsäureanhydrid während einer halben Stunde am Rückflußkühler; 2. durch Kochen von 1 Teil Saponin, 1 Teil Natrium- acetat und 4 Teilen Essigsäureanhydrid während einer Stunde am Rück- flußkühler; 3. durch Kochen von 5 Teilen Saponin, 2 Teilen Chlorzink und 4 Teilen Essigsäureanhydrid eine Stunde lang am Rückflußkühler. Zum Zwecke der Acetyherung werden von Halberkann ^) etwa 5 g des Rohassa- mins mit l'bg entwässertem Natriumacetat sorgfältig gemischt, in 30 r/ Essigsäureanhydrid eingetragen, für 5 Stunden auf 120 — 130'' erhitzt und nach dem Abkühlen in Wasser gegossen. Nach 24 Stunden werden die er- starrten Massen zerstoßen, mit Wasser gewaschen, in Alkohol gelöst, wenn nötig mit Kohle entfärbt, noch heiß filtriert und verdunstet. Der Verdun- stungsrückstand Arird in Chloroform gelöst, mit Ligroin gefäUt und auf Tonplatten über Kalilauge getrocknet. Es ist unlöslich in Wasser und bildet das möglichst hoch acetyliorte Saponin. Die Regenerierung des Assamins aus dem Acetylassamin geschah mittelst Kochen in alkohohscher KaUhydrat- lösung. Die Regenerierung der Saponine der QuiUajarinde bei Stütz geschah in der unten noch zu besprechenden Weise durch Kochen mit Baryum- hydroxyd. Genug, in beiden FäUen resultierte ein schneeweißes, sehr asche- ^) Georg Baumert, Lehrl). d. gerichtl. Chemie. II. Aufl. Braimschweig 1907. Bd. 1. S. 390. ^) Joh. liithle, Ül)er den Nachweis von Saponin. Zeitschr. f. Untersuch, der Nah- rungs- u. Genußmittel. Bd. 16. S. 165 (1908). ') Schweizerisches Lebensmittelbuch. Bern 1907. Abschnitt 4. S. 17. *) Ed. Stütz, Über das Saponin. Aunalen der Chemie. Bd. 218. S. 231 (1883). '") Halbcrkann, Biochem. Zeitschr. Bd. 19. S. 316 (1909). Darstellung der Saponine. €)-() armes Saponin, welches Stütz in seinem Falle als besonders nun ;iii.sijra(li. Ich konnte jedoch dnrch Untersuchung' des Originalpräparates von Stütz sowie durch Selbstdarstellung eines solchen regenerierten Saponins dci- Quillajarinde mich tiberzeugen, daß dieses Träparat mit dem Ausjj^angs- material, d. h. mit dem Quillajasapotoxin pharmakologisch gar keine Ähn- lichkeit mehr hatte, denn es war gänzlich wirkungslos sowohl für Pilut- körpercheu im Reagenzgiase als für Tiere l)ei P^inspritzung. Dasselbe konnte ich für das von Halberkann aus dem Acetvlassamin regenerierte Assamin nachweisen. Es kann somit keinem Zweifel unterliegen, daß die regene- rierten Saponine chemisch mit den Ausgangssubstanzen nicht identisch sind, sondern wie Halberkann vermutet, höchstwahrscheinlich eine Fettsäure- und zwar z. B. Buttersäuregruppe weniger enthalten. Daß beim Behandeln der Saponine mit AlkaUen Butt er säure abgespalten wird, wurde schon vor Jahrzehnten von Rochleder konstatiert und später die Al)spaltung von Fett- säuren von Weil^) und von May^) bestätigt. Damit kommt die Stüfzsche Methode der Darstellung- von reinen unveränderten Saponinsubstanzen aus den Acetylderivaten gänzlich in Wegfall. 6. Die Methode der Umwandlung der Rohsaponine in Baryt- saponine und die Abspaltung von reinen Saponinen daraus ist schon vor fast 50 Jahren von Eochleder und v. Payr^) eingeführt und seit- dem zahllose Male angewandt Avorden. Sie beruht darauf, daß alle Saponine in konzentrierteren Lösungen mit heiß gesättigter Lösung von Baryum- hydroxyd einen voluminösen weißen Niederschlag liefern, der sich mit Ba- rytwasser sowie mit Kalkw^asser auswaschen läßt und aus Barytsaponin besteht. Zerlegt man diesen mit gerade hinreichenden Mengen von Schwefel- säure, so entsteht ein Niederschlag von Baryumsulfat, und das Filtrat enthält, so meint man meist, reines Saponin. Ich habe nun nachweisen können, daß die Originalpräparate der nach dieser Methode von Dragemiorf dargestellten Saponine kaum oder gar nicht wirkten. Auch die von F. Hop- niann^) durch energische Barytbehandlung gewonnenen Saponine waren wirkungslos. Das gleiche konnte ich für das von Halberkann aus dem Barytassamin abgespaltene Assamin nachw^eisen, auch wenn die Einwirkung des kochend heißen Baryumhydroxydes nur eine Stunde gedauert hatte. Halberkann &) ist auch hier geneigt, Änderungen im Molekül anzunehmen, da das vom Baryt befreite Assamin Fehlinrjsche Lösung reduzierte, was es vor der Barytbehandlung nicht getan hatte. Unter solchen Umständen muß auch die Barvtmethode zur Darstellung von chemisch reinen Saponinen als unbrauchbar in WegfaU kommen. Ich habe oben bei Besprechung der M Ludwig Weil, Beiträge zur Kenntnis der Saponinsubstanzen und ilirer Verbrei- tung. Dissert. Straßburg 1901. ^) Mail, 1. c. (s. das Citat oben auf S. 975). 3) Eochleder und o. Faj/r, Wiener Akad. Sitzungsberichte. Mathem.-naturwissen- schaftliche Klasse. Bd. 45. II. S. 7 (1862). *) Hofmann, Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 36. S. 2726 (1903). ^) Halberkann, Biochem. Zeischr. Bd. 19. S. 4 des erweiterten Separatabdruckes (1909). 62* 980 R. Kobert. Regenerierung der Saponine aus der Acetylverbindung das dazu von Stütz verwendete Verfahren deshalb nicht weiter ausgeführt, weil ich es hier mit besprechen wollte. Es besteht nämhch im Zerkochen der Verbindung mit Barythydrat und Fällung des freigemachten Saponins als Barytsaponin. Daß dabei unwirksame Substanzen entstehen, kann uns nun nicht mehr wundern. 7. Die Methode der Umwandlung der Saponine in Benzoyl- verbindungen Wditih. v. Schulz'^) und imch. Rosenthaler'^) und die Regene- rierung daraus sollte nach gewöhnlichen chemischen Vorstellungen ebenfalls brauchbar sein, ganz reine Saponine darzustellen. Da jedoch die Benzoy- lierung bei Anwesenheit starker Natronlauge vorgenommen werden muß, und da Natronlauge, wie wir vorhin sahen, aus Saponinen wenigstens in der Wiirme leicht eine Fettsäure abspaltet, steht zu befürchten, daß diese Methode ebenfalls unwirksame Saponine liefern muß. Der exakte Beweis der Unwirksamkeit eines nach dieser Methode gereinigten Saponins Hegt jedoch noch nicht vor. 8. Die Methode der Umwandlung in die Cholesterinver- bindung und Wiederabspaltung daraus nach den Angaben von Windmis^) dient namentlich zur genaueren Bestimmung der Formel und der Molekül- größe. Im Gegensatz zu den Methoden der Umwandlung in die Acetylver- bindung und die Benzoylverbindung findet weder bei der Cholesteridbildung noch bei der Aufspaltung eine Änderung des Moleküls statt, so daß also auch von einer Einlmße an toxischer Wirkung geschweige denn von einer gänzlichen Entgiftung keine Rede ist. Diese Methode wird daher sehr bald eine große Bedeutung gewinnen. Sie setzt voraus, daß das Saponin nach einer der anderen Methoden bereits vorgereinigt ist. Alsdann versetzt man die etwa iVoip^e Lösung des Saponins in Alkohol mit einer P/gigen Lösung von Cholesterin in Alkohol. Einige Sapouincholesteride fallen dabei (piantitativ als unlöslicher Niederschlag aus. Andere bleiben in Lösung und machen dadurch die Erkennung des Endpunktes des Zusatzes der Cholesterinlösung schwierig. Man muß dann eben einen Überschuß von Cholesterin zusetzen, kurze Zeit erhitzen und zur Trockne eindampfen. Das dabei entstehende feste Cholesterid ist in Wasser unlöslich und kann daher mit Wasser ge- waschen und von allen dem Saponin anhängenden Verunreinigungssubstanzen befreit werden. Bisweilen bildet es gute Kristalle. Die Zerlegung mancher Saponincholesteride geschieht schon durch einen Überschuß von Äther ; die anderen verseift man vorsichtig, um das Saponin abzuspalten. 9. Die Bleimethode nach Bley^). erweitert nach Kobert.^) Diese Methode gestattet, gleichzeitig aus derselben Droge ein saures und ein *) W. r. Schulz, Ein Beitrag zur Kenntnis der Sarsaparille. Arbeiten d. pharma- kologischen Institutes zu Dorpat. Bd. 13. S. 34 (1896). ^) RosenfhaJer, Phytochem. Untersuchung der Fischfangpflanze Yerbascum si- uuatum. Diss. Straßburg 1901, S. 93. ^) Windaus, Ber. d^'üeutsch. ehem. Ges. Bd. 42. S. 238 (1909). *) Bley, Über Saponin. Annalen d. Chem. u. Pharm. Bd. 4. S. 283 (1832). ^) B. Kobert, Über Quillajasäure. Ein Beitrag zur Kenntnis der Saponingruppe. Arch. f. experim. Path u. Pharm. Bd. 23. S. 233 (1887). Darstellung der Saponiue. qüi neutrales amorphes Saponin rein zu gewinnen. Man entfernt dabei zunächst durch Petroliither oder Äther etwaiges Fett und, falls auch noch ein kristallisierendes wasserunlösliches Saponin vorhanden sein sollte, wie z. B. bei der Sarsaparille, mittelst kaltem OBVoigem Alkohol auch dieses. Alsdann kocht man die Droge wiederholt mit Wasser ans, vereinigt die neutralisierten, heiß filtrierten Filtrate, engt sie ein und fällt sie mit neutralem Bleiacetat- w^elches neben anderen Stoffen die sauren Saponine quantitativ niederschlägt. Das klare Filtrat wird sofort mit P»leiessig noch- mals gefällt. Dieser Niederschlag enthält die Gesamtmenge der neutralen Saponine. Die beiden Niederschläge werden mit dem durch Wasser ver- dünnten Fällungsmittel ausgew^aschen, zwischen Filtrierpaj)ier einigermal'ion getrocknet, dann in destilhertem W^asser suspendiert und mittelst Schwefel- wasserstoff entbleit, nachdem die Hauptmenge des Bleis schon vorher durch verdünnte Schwefelsäure entfernt und abfiltriert worden ist. Die Ab- scheidung des Schwefelbleis wird durch Erwärmen und Alkoholzusatz befördert. Alsdann wird filtriert und beiden Filtraten nach dem Einengen zum Sirup die Alkoholauskochung des Schwefelwasserstoffniederschlages beigefügt. Ohne diese Maßnahmen verhert man beträchtliche Mengen namentlich des sauren Saponins, da dieses am Schwefelblei durch Ad- sorption zu haften pflegt. Einzelne Saponine scheinen von einem Cl)er- schuß von Schwefelwasserstoff irgendwie zersetzt zu werden. Die beiden wässerig-alkoholischen Gemische werden fast zur Trockne gebracht, mit heißem Alkohol ausgekocht und das Filtrat nach dem Abkühlen mit Äther versetzt. Der sich zum Teil schon vor, zum Teil erst nach dem Äther- zusatz bildende weiße Niederschlag ist in der neutralen Bleiacetat])()i-tion das saure Saponin und in der Bleiessigportion das neutrale. Eine Abschwä- chung der Wirksamkeit der Saponine findet bei richtiger liandhal)ung dieser Methode der Darstellung nicht statt. Selbstverständlich beruht auch diese Methode auf einer zeitweisen Umwandlung in eine \erbindung, nämlich in eine neutrale Bleioxydverbindung (bei den sauren Saponinen) bzw. in eine basische (bei den neutralen Saponinen). Diese beiden \er- bindungen sind der Baryumverbindung analog, haben vor dieser aber den Vorzug, bei der Zersetzung, wie schon vorhin gesagt wurde, keine ver- änderten und dadurch unwirksam gewordenen Saponine zu liefern. Nach dieser Methode wurden gewonnen: die Quillajasäure und das Quillaja- sapotoxin aus der Quillajarinde, die Polygalasäure und das Senegiu aus der Senegawurzel, die Saporubrinsäure und das Saporubrin aus der roten Seifenwurzel die Agrostemmasäure und das Agrostemma- sapotoxin aus den Kornradensamen, die As s am säure und das As s am in aus den Samen des Assamtees, die Guajaksaponinsäure und das neutrale Guajaksaponin aus der Guajakrinde etc. Dal) es Saponine gibt, welche durch Blei nicht fällbar sind, wurde schon S. 973 erwähnt; neben sauren Saponinen scheinen solche aber nie in derselben Pflanze vorzu- kommen. Ihre Abscheidung erfolgt nach der Methylalkoholmethode. Die Gewinnung der ätherischen Öle. Von Konrad Bartelt, Berlin. Unter den Produkten, die von dem Tier- bzw. Pflanzenkörper erzeugt werden, befinden sich neben gasförmigen oder festen Körpern in großer Menge ölige Bestandteile. Befeuchtet man mit diesen Ölen ein Stück Papier, so wird auf demselben ein durchscheinender Fleck erzeugt, der entweder beim Liegen an der Luft alsbald verschwindet oder dauernd auf dem Papier bestehen bleibt. Im ersteren Falle verdunstet das Öl verhältnis- mäßig leicht und wir bezeichnen ein solches als „ätherisches Öl", während das auf dem Papier einen dauernden Fleck hervorrufende Öl als „fettes Öl" bezeichnet wird. Mit der leichten Yerdunstungsfähigkeit der ätherischen Öle an der Luft steht ihre Eigenschaft, mit Wasserdämpfen unschwer überzugehen, in naher Beziehung, und da man die ätherischen Öle schon seit langer Zeit auf diesem Wege gewinnt, bezeichnet man im allgemeinen als „ätherisches Öl" die Gesamtheit der bei der Wasserdampf- destillation von Pflanzen oder Pflanzenteilen mit den Wasser- dämpfen überdestillierenden Verbindungen. Der Tierkörper erzeugt ebenfalls, wie schon angedeutet wurde, eine große x4nzahl von Ölen, die jedoch fast alle zu den „fetten Ölen" zu gehören scheinen, wenigstens wurden ätherische Öle bisher nicht aus Tierkörpern gewonnen; wir müssen uns daher bei der Besprechung ihrer Gewinnung usw. vollständig- auf diejenige aus den Pflanzen beschränken. Die Methoden, welche zur Gewinnung der ätherischen Öle aus den Pflanzen angewandt werden, haben auf verschiedene Umstände, deren Erörterung alsbald erfolgen soll, Rücksicht zu nehmen. In erster Linie muß im Auge behalten werden, daß die anzuwendenden Operationen keine Veränderung des Öles hervorrufen dürfen, oder wenigstens nur solche nebensächlicher oder erwünschter Natur; ferner wird aber auch das Vor- kommen des Öles, d. h. der Ort, an dem es in der Pflanze aufgespeichert ist und wieweit es geschützt an diesen Stellen hegt, von Bedeutung sein. Es sollen deshalb, bevor auf die Methoden, welche hauptsächhch zur Gewinnung der ätherischen Öle dienen, näher eingegangen wird, zuerst das Vorkommen der Öle in der Pflanze, sodann die Zubereitung des Rohmaterials, die jeder weiteren Verarbeitung voraufgehen muß, besprochen werden. Die Gewinnung der ätherischen öle. 9g;> Vorkommen der ätherischen Öle in der Pflanze. Die ätherischen Öle sind im Gegensatz zu den fetten (Jleii. weldif ernähningsphysiologisch eine ganz ähnUche Holle wie die Kohlehydi-at.- spielen, für die Ernährung der Pflanze völlig bedeutungslos. Es wii-d daher im Interesse der Pflanze liegen, diese Endprodukte des Stoffwechsels möglichst aus ihreni, Körper herauszubefördern oder sie wenigstens an Stellen unterzubringen, die von den durch den Pflanzenkörpor zirkulierenden Säften abgeschlossen sind, zumal nicht wenige ätherische ()le für ilif Pflanze direkt giftige Wirkungen haben können. Diese (Giftigkeit schützt hingegen die Pflanze wieder gegen Tierfraß, so daß die Pflanze dadurch, daß sie das ätherische Öl an die Oberfläche ihres Körpers befördert, direkten Nutzen hat. Auch spielt das häufig angenehm, fast immer intensiv riechende Öl sicherhch eine bedeutsame Rolle bei der Anlockung von Insekten, die den Befruchtungsvorgang durch Übertragen von Pollen- körnern von den männlichen auf die weiblichen Dlüten vermitteln. Die Bestandteile der ätherischen Öle, wie sie nach der Wasser- dampfdestillation gew^onnen w^erden, sind in den weitaus meisten Fällen in Wasser unlöslich. Es ist dadurch natürlich ein Transportieren inneriialb der Pflanze außerordentlich erschwert, was schon frühzeitig zu der Annahme Veranlassung gab, daß die Pflanze die ätherischen Öle, bevor sie dieselben in einer in Wasser unlöshchen Form abscheidet in Form von wasserlöslichen Verbindungen durch ihren Körper befördert. Diese Annahme hat sich in der Tat für mehrere Fälle nachweisen lassen, so z. B. für die Glykoside. Diese sind ätherartige Verbindungen zwischen Alkoholen und (ilukosen. Da die Glukosen in der Pflanze stets vorhanden sind — sie sind bekanntlich die Umwandlungsform der Stärke, die ebenfalls wegen ihrer Unlöslichkeit in W^asser in erstere übergeführt wird — , ist dieser Weg zur Beförderung der unlöslichen Alkohole für die Pflanze ein außerordentlich beciuemer. Sobald das Glykosid an der Stelle angekommen ist, wo das ätherische Öl abgelagert werden soll, tritt durch Fermente seine Spaltung in die beiden Komponenten ein. Der abgeschiedene Alkohol kann dann dui-ch Wasserabspaltung bzw. Reduktion in einen Kohlenwasserstoff oder durch Oxydation in einen Aldehyd bzw. in die entsprechende Säure oder in ein Keton übergeführt werden. Wir erhalten dadurch als Bestandteile ätherischer Öle in chemischer Hinsicht die verschiedenartigsten Verbindungen, die durch Veresterung der Säuren etc. noch vermehrt werden können. Für diese eben beschriebenen ätherischen Öle ist der Ort ihrer ersten Darstellung von dem Orte ihrer endgültigen Ablagerung verschieden. In vielen Fällen bleibt das ätherische Öl aber auch unmittelbar an den Stellen seiner Darstellung liegen. Da die Menge des abgeschiedenen Öles oft eine ziemlich bedeutende ist, werden von der Pflanze zu seiner Unterbringung besondere Räume hergestellt. Während die zu einem Gewebe verbundemMi Zellen im Jugendstadium lückenlos aneinanderschließen, werden allmählich durch Abrundunü: der Zellen Zwischenräume gebildet, die man als ..Inter- 984 K. Bartelt. zellularräume" bezeichnet. Die Ursache der Spaltung der Zellen von- einander liegt in der Verquellung der aus pektinartigen Stoffen bestehenden primären Zellwandung. Die auf solche Weise gebildeten Zwischenräume bezeichnet man als ,,schizogene Interzellularen", die durch verschieden lebhaftes Wachstum der Wände der umliegenden Zellen zu größeren Kammern oder Gängen umgebildet werden können, und diese dienen dann in vielen Fällen als Aufbewahrungsort für die ätherischen Öle. Von den schizogenen Interzellularen unterscheidet man die „lysigenen", die durch Auflösung von Zellwänden entstanden sind. Führen letztere ätherisches Öl, so gehen sie aus Zellgruppen hervor, aus denen sich schon vorher diese Stoffe gebildet, deren Wände sich dann allmählich aufgelöst haben; die Sekretbildung findet nach Untersuchungen von Tschirch in einer besonderen Schicht, der sogenannten „resinogenen Schicht", statt. Daß schizogen angelegte Interzellularen durch Auflösung der benachbarten Zellen lysigen erweitert werden, ist ferner eine häufig beol)achtete Erscheinung. Diese Sekretbehälter bilden dann unregelmäßige Hohlräume in den Geweben und werden durch Verkorkung der Wände der umliegenden Zellen von den vom Zellsaft durchflossenen Zellen völlig abgeschlossen. Da die Inter- zellularen oft in unmittelbarer Nähe der Epidermis liegen, durchbrechen sie diese häufig und münden dann nach außen, wobei das ausfließende ätherische Öl, zumal wenn es mit Harzen oder Gummischleim vermischt ist, für die Pflanze als Schutz gegen Austrocknung oder Angriffe von Parasiten dienen kann. Die Zahl dieser Harzkanäle ist in einigen FäUen eine außerordentlich große; sie kann auf dem Quadratzentimeter bis zu 50 und noch darüber betragen. Über die Bildung der ätherischen Öle in der Pflanze ist man noch wenig unterrichtet. Theoretisch läßt sich die Entstehung der Bestand- teile der ätherischen Öle leicht durch Annahme einer Wasserabspaltung oder Pieduktion aus Kohlehydraten erklären, und da die Pflanze die letzteren vermittelst des Chlorophylls in Form von Stärke und den Umwandlungs- produkten derselben, den Glykosiden, in großer Menge darstellt, ist die Annahme wohl berechtigt, daß die ätherischen Öle aus den Kohlehydraten entstehen. Eventuell bilden auch Eiw^eißstoffe für einen Teil besonders der stickstoffhaltigen Produkte das Ausgangsmaterial. Eine besondere Stütze finden diese Annahmen in dem häufigen Auftreten von freien Säuren, besonders auch Oxalsäure, im Zellsafte. Die aus den Kohlehydraten bzw. Eiweißstoffen durch eben erwähnte Pieaktionen primär entstehenden Verbindungen werden natürlich aliphatische Struktur aufweisen. Da al)er verhältnismäßig nur sehr wenig Bestandteile ätherischer Öle aUphatische Struktur besitzen, müssen die zyklischen Verbindungen erst sekundär dargestellt werden. Die Ursache dieser Umwandlung haben wir wahr- scheinlich in den freien Säuren zu sehen, vermittelst deren es auch im Laboratorium möglich ist, monozyklische Verbindungen, die sich in den ätherischen Ölen finden, aus den entsprechenden aliphatischen darzustellen. Aus den monozyklischen Körpern die in der Natur so weit verbreiteten Die Gewinnung der ätherischen öle. 9^5 bizyklischen — wie z. B. Pinen. ("aiiiphon, Sabinen, I'.onirol. Santalol. Campher etc. — zu liewinnen. ist l)ishei' noch nicht •rohmiren : der Mil»- erfolg ist wahrscheinlich darin zu suchen, dal] wir im Laboratorium nicht über so milde Invertierungsmittel verfüi'n' X'cr- änderungen der Moleküle zu bewirken, wohl berechtigt ist. Das ätherische (')1 ist in einigen Fällen über alle Organe der l'flanze verbreitet, während man wiederum Pflanzen findet, die nur in einigen wenigen ihrer Organe Öl aufgespeichert enthalten. Die Träger des Öles sind dann gewöhnlich die Plätter und Wurzeln, die fast immer in dieser Richtung eine bevorzugte Stellung einnehmen, während die Blüten, obwohl sie oft hervorstechenden Geruch besitzen, einen in prozentischer Hinsicht nur geringen \'orrat von Öl aufweisen. Neben den erwähnten ( »rganen führen aber auch Samen, Kinde. Stengel und Holz ätherisches (')1. So ist das in der Technik eine so wichtige Bolle spielende Sandelholzül haupt- sächlich im Kernholz von Santalum album enthalten: in anderen Fällen verarbeitet man hinwiederum nur die Blüten oder die Samen. Unter den phanerogamen Pflanzen gibt es nur wenige, aus denen man bisher kein ätherisches Öl gewinnen konnte; die Krvptogamen sind nach dieser Hinsicht wohl weniger untersucht, doch auch unter ihnen finden sich - - z. P). in den Lebermoosen Vertreter, die nicht unbeträchtliche Mengen von ätherischem Öl enthalten. \on den Phanerogamen zeichnen sich besonders Pflanzen der Familien Labiatae, Cruciferae und Um- belliflorae sowie die Coniferen aus, die fast ausnahm.slos große Mengen ätherischen Öles enthalten, während man bei anderen Familien einige \'er- treter mit reichen olmengen neben anderen mit sehr wenig und teilweise ganz verschiedenem ätherischen Ol findet. Es scheint somit ein Zusammen- hang botanisch sehr nahe stehender Pflanzen in bezug auf die .\lmliclikeit in der Hervorbringung chemis<'h verwandter ätherischer ( )le nicht zu bestehen. Nehmen wir an, daß ehemals nahe verwandte Pflanzen auch chemisch ähnliche Öle in prozentisch gleicher Menge hervorzubringen vermochten, «ine Annahme, die wohl berechtigt ist, so müssen wir folgern, dali durch äußere Einflüsse eine solche Veränderung in der Pflanze hervorgerufen worden ist, daß die Ölabsonderung völlig verändeit wurde, während sich die Art und Weise der geschlechtlichen Fortpflanzung unverändert erhielt. Wie weit die Hervorbringung ätherischer Ole von der I-'-rnährung abhängiL»- ist, läßt sich durch einfache ernährungs-physiologische \'ersuclie mit Leichtigkeit erweisen. Durch anders gestaltete Ernährung läßt es sich z. B. erreichen, daß eine Pflanze eine \erbindung. welche sie unter sonstigen ^'erhältnissen in sehr großer Menge hervorgebracht hat, nur noch in geringerer, ja sogar überhaupt nicht mehr zu erzeugen vermag, während 986 K' Bartelt. dafür neue Bestandteile in dem Öle auftreten können. Aber nicht nur die Ernährungsweise, sondern auch alle sonstigen äußeren Einflüsse, wie Klima, Feuchtigkeit der Luft und des Bodens, hoch oder niedrig gelegener Standort usw., wirken auf den Stoffwechsel der Pflanze bestimmend ein. In manchen Fällen werden nur die Bestandteile in einigen Organen der Pflanze, die nicht immer die gleichen zu sein brauchen, verändert, in anderen Fällen tritt eine durchgreifende Änderung des gesamten Öles ein. Die Schwankungen in dem (behalt an ätherischem Öl in einer Pflanze gehen sogar noch weiter, wie bereits in dem vorhergehenden Abschnitt an- gedeutet wurde. So ist z. B. das ätherische Öl, das im Frühjahr erzeugt wird, von dem im Sommer und im Herbst gebildeten gewöhnlich verschieden; je nachdem es wertvoller ist, wird die Pflanze frühzeitig oder später ver- arbeitet. Sogar die Tageszeit, an der der Pflanzenteil abgepflückt wird, ist von nicht geringer Bedeutung. Es spielen hierbei fermentative Wirkungen eine bedeutsame Bolle. Ob es während des Einsammelns der Pflanze regnet oder ob die Sonne scheint, ist z. B. für die Feinheit des Rosenparfüms durch- aus nicht gleichgültig. Auch hat beim Rosenöl die Gewinnung möglichst so- gleich nach dem Abpflücken der Blüten stattzufinden, da die sonst ein- tretenden fermentativen Zersetzungen unerwünschte Produkte erzeugen, während man in anderen Fällen durch längeres Lagern absichtlich erst Veränderungen herbeiführt — ich erinnere an das Auftreten des angenehmen Heugeruchs (Cumarin) beim Trocknen von abgemähtem Gras auf Wiesen. Da die angeführten Arten des Vorkommens von ätherischem Öl in der Pflanze für die Technik der Gewinnung sehr bedeutungsvoll sind, mußte auf sie an dieser Stelle näher eingegangen werden, um das Verständnis für die gebräuchlichen Gewinnungsmethoden der qu. Öle zu ermöglichen. Aber außer den angeführten Ursachen wird der Zweck, zu dem man das dargestellte ätherische Öl gebrauchen will, für die Art der Ge- winnung eine große Rolle spielen. Da es nach keiner der zu besprechenden Methoden möglich sein wird, das gesamte Ol ohne jede Veränderung zu erhalten, ja da es sogar in einigen Fällen erwünscht sein kann, nicht alle, sondern nur einige, und zwar die gerade die nütznchste Rolle spielenden Bestandteile möglichst isoliert zu erhalten, werden die Gewinnungsmethoden immer darauf hinzielen müssen, diese Verbindungen in unveränderter Form und quantitativer Ausbeute zu isoheren, eventuell unter Verlust von weniger wertvollen Produkten. Der letztere Fall wird besonders da Anwendung finden, wo es sich um Darstellung feiner Parfüms handelt. Diese sind gewöhnlich das Produkt außerordentlich vieler und dabei oft nur in geringer Menge vorkommender \'erbindungen, so daß bei Zerstörung von nur einem oder einiger weniger dieser Anteile, die in prozentischer Hinsicht durchaus nicht ins Gewicht fallen, die Feinheit des Aromas völlig vernichtet und damit das Öl wertlos geworden sein kann. Soll das Öl in der Medizin Anwendung finden, so muß man natürlich darauf bedacht nehmen, daß die pharma- kologisch wirksamen Verbindungen quantitativ und unverändert erhalten werden. Die Gewinnung der ätherischen öle. 9g7 Vorbereitung der Rohstoffe. Du mir in sehr seltonoii Fällen die i>anze Pflanze ^ieidizeitif,' zur Darstellung^' von ätherischem Ol jiebraueht wird, müssen diejenijren Teile der Pflanze, welche in P)earbeitunii' fj,enomnien werden sollen, durch Al>- pflücken und Sammeln gewonnen werden. Es ist nicht immer möülich. eine sofortige Verarbeitung des Materials an Ort und .Stelle vorzunehmen. (i;i die Fabrikanlagen natürlich in mehr oder weniger weiter Kntfei-iiung von dem Orte, an dem die Pflanzenteile geerntet werden . liegen können. Nur wenn es sich um Holzteile handelt, aus denen das ätherische Ol dargestellt werden soll, können die Stämme ohne vorbereitende Arbeiten an den Ort der Fabrik gebracht werden. P>lätter, P)lüten, junge Zweige usw. werden aber gewöhnlich erst getrocknet, damit die ätherischen Öle nicht durch die bei Gegenwart von Wasser alsbald eintretenden Zer.setzungen beim Lagern zer- stört werden können; gleichzeitig hat der Transport getrockneter Pflanzen großen Vorzug, da die mitzutransportierenden Wassermengen eine \'er- teuerung des Ptohmaterials durch Frachtunkosten herbeiführen würden, die bei einer ül)erseeischen Ladung ziemhch erheblich werden können. Läßt sich ein Trocknen der Pflanzenteile nicht vornehmen, wenn z. B. trotz gröllter Vorsichtsmaßregeln Zersetzung eintreten oder ein zu großer Verlust an ätherischem Öl stattfinden könnte, so zieht man es in einigen Fällen, wo es sich um Gewinnung besonders wertvoller ätherischer Öle handelt, vor, die Blüten etc. einzusalzen und in möglichst luftdicht schließenden Fässern zu versenden. In neuerer Zeit hat man allerdings die Kulturen solcher Pflanzen mehr und mehr in die Nähe von Fabriken und unmekehrt verleut; ich erinnere nur an die großen Rosenfelder der Firma Schimmel A: Co., Miltitz. Sind die Pflanzenteile an Ort und Stelle ihrer weiteren Verarbeitung angekommen, so werden sie, besonders in den Fällen, in welchen es sich um Gewinnung des Öles nach den ^Methoden der Wasserdampfdestillation handelt, einer möglichst weitgehenden Zerkleinerung unterworfen. Wie im vorhergehenden eintiehender erörtert wurde, sind die Oluänuc in der Pflanze durch undagernde Zellen isoliert. Die Zellwände sind aber, damit sie für Wasser nicht durchlässig sind, mit einer Korkschicht versehen, die natür- lich auch verhindern würde, daß der Wasserdampf an das ätherische Öl herantreten kann. Die Zerkleinerung des Materials muß daher soweit gehen, daß die Ölkammern zertrümmert werden. Die Apparate, die zu diesem Zweck benutzt werden, sind verschieden, je nachdem es sich um Kräuter, Wurzeln, Stengel oder Samen und Körner usw. handelt. Die ersteren werden mit Stanipfmessern oder Schneidemaschinen zt'rsclinitten, die letzteren ge- wöhnlich durch (.^uetschwaken zerkleinert. Zur Bearbeitung von Holzteilen werden Raspelmaschinen verwandt, durch die das Holz in kleine Späne übergeführt wird. Vm möglichst ([uantitative Ausbeuten des oft wertvollen (iewürzöles zu erzielen, werden die Gewürze in Pnlverisierungsmaschiiu'u fein gepulvert. 988 K- Bartelt. Wie oben bereits angedeutet wurde, wird das ätherische Öl zur be- quemeren Beförderung durch den Organismus der Pflanze in eine wasser- lösliche Form, z. B. in Form eines Glykosids, übergeführt. Es gelingt nicht ohne weiteres durch Destillation etc. aus dieser Doppelverbindung die Be- standteile isoliert zu erhalten, wodurch erst eine weitere Zubereitung des Eohmaterials nötig wird. Da die in Frage stehenden Doppelverbindungen leicht durch Fermente gespalten werden, genügt es gewöhnlich, die zer- kleinerten Pflanzenteile nach Zugabe des betreffenden Fermentes und Über- gießen mit Wasser mehrere Stunden oder Tage bei etwas erhöhter Tem- peratur stehen zu lassen, worauf man die Destillation der Mischung vor- nehmen kann. — In einigen Fällen ist es vorteilhaft, dem Rohmaterial erst fremde Bestandteile, wie z. B. fette Öle. zu entziehen, bevor man zur Gewinnung des ätherischen Öls schreitet. Wenngleich in den Großbetrieben jede einzelne Art von ätherischem Öl in besonderen Maschinen und nach genau ausprobierten Methoden ge- wonnen wird, so kann man doch im allgemeinen einige wenige allgemeine Methoden der Gewinnung unterscheiden, von denen sich die in der Technik gebräuchlichen in mehr oder weniger weiter Abänderung ableiten. Im fol- genden sollen die einzelnen Verfahren in theoretischer Weise betrachtet werden, ohne daß natürlich auf die Spezialmethoden, die sich für das eine oder andere Öl als zweckmäßig erwiesen haben, eingegangen werden kann. Gewinnung der ätherischen Öle durch Destillation. a) Wasserdampfdestillation ohne fortdauernde Zuführung von Wasserdampf. Das einfachste Verfahren, das man zur Gewinnung der ätherischen Öle aus einer Pflanze angewendet hat, besteht darin, die Pflanzenteile mit einem Überschusse von Wasser zu übergießen und die gut durchgerührte Masse der Destillation zu unterwerfen. Die Bestandteile der ätherischen Öle sieden zum weitaus größten Teile unter gewöhnlichem Luftdruck in dem Temperaturintervall von 150 bis ca. oGO», also bedeutend über dem Siedepunkt des Wassers. Das Sieden einer Flüssigkeit tritt in dem Augen- blick ein, in welchem der Luftdruck von derselben überwunden wird. Bei Gemischen nehmen an der Überwindung des Luftdrucks sämtliche in dem Gemisch befindliche Flüssigkeiten teil , d. h. wenn die Spannkraft des ge- sättigten Dampfes sämtlicher Flüssigkeiten gleich dem vorhandenen Luft- druck ist, beginnt das Gemisch zu sieden. Als unmittelbare Folgerung er- gibt sich daraus, daß jeder Komponent nur einen Teil des Luftdrucks zu überwinden hat, wodurch ganz ähnliche Verhältnisse herbeigeführt werden wie bei der Destillation im luftverdünnten Baum. Bei der Destillation des Gemisches zweier oder mehrerer Flüssigkeiten tritt das Sieden der Kom- ponenten unterhalb ihres eigentlichen Siedepunktes ein. Durch diese Ge- setzmäßigkeit ist es möglich, die weit über 100" siedenden Bestandteile der ätherischen Öle mit Wasserdämpfen überzudestillieren. Die Gewinnung der ätherischen Öle. C)j^9 In primitiv eing-erichteten Fabriken, wie man sie in außereuropäischen Ländern an den Orten der Pflanzenkiiltnren nocii finden kann, \verden die Pflanzenteile in eine Retorte gebracht und mit Wasser übergössen, worauf das Gemisch durch direktes Feuer zum Kochen gebracht wird. Es besteht dabei natürlich die große Gefahr, daß durch das Feuer die am Poden der Retorte hegenden Pflanzenteile angebrannt werden, wodurch das gesamte ätherische Öl durch Annehmen eines brenzlichen Geruches verdorben werden kann. Dieser Gefahr ließ sich insofern vorbeugen, als man in die Retorte einen durchlöcherten Siebboden hineingebracht hat, auf dem die Pflanzen- teile ausgebreitet werden. In vollkommener eingerichteten Fabriken wii-d die Erwärmung nicht mehr durch direktes Feuer, sondern durch Wasser- dampf bewerkstelligt. Ist das durch Feuer oder Wasserdampf erhitzte Gemisch der Pflanzen- teile mit W^asser zum Sieden gekommen, so wird das durch \'erarbeiten des Rohmaterials freigelegte ätherische Öl mit den Wasserdämpfen über- destilliert. Diese Destihation erfordert stets eine längere Zeit, erstens ist sie abhängig von dem Siedepunkt des ätherischen Öles, ferner auch von der mehr oder weniger vollkommenen Zerkleinerung des Rohmaterials. Trotz Anwendung gut arbeitender Maschinen ist es nicht immer möglich, das ätherische Öl völlig freizulegen, da die durch eine Korkschicht eingeschlossenen Harzgänge in vielen Fällen außerordentlich klein sind. Erst durch die Ein- wirkung der hohen Temperatur bei der Destillation tritt allmählich Zer- platzen der Kammern ein, Avodurch dem Öl erst die Möglichkeit gegeben ist mit den Wasserdämpfen überzugehen. Es ist leicht verständlich, daß durch das lange Andauern der Destillation in prozentischer Menge außer- ordentlich y\e] Wasser mit überdestilliert wird, das z. B. eine große Menge Öl gelöst enthalten kann, wenn einige Bestandteile des ätherischen Öles in Wasser löslich sind. Um dem Übelstande al)zuhelfen. daß man durch zuviel Wasser große Verluste an Öl erleidet, bedient man sich als Vorlage einer sogenannten Florentiner Flasche, die schon seit den ältesten Zeiten eine wichtige Rolle bei Gewinnung der ätherischen Öle spielt. Durch einen am Boden der Flasche angebrachten Abfluß kann das kondensierte Wasser von dem auf ihm schwimmenden Öle abgelassen und durch ^'erbindung mit der Retorte dauernd in diese zurückgebracht werden, so daß die ein- mal angewandte Wassermenge für die oft stundenlang dauernde Destillation ausreicht. Ist das ätherische Öl schwerer als Wasser, so muß sich der Ab- fluß natürlich nicht am Boden der Florentiner Flasche, sondern am Halse derselben befinden. Die Verbindung zwischen Destillationsretorte und \'or- lage wird durch eine längere Röhre hergestellt, damit sich die Dämpfe möglichst schnell und vollständig in ihr verdichten. Da die Kühlung durch die Luft nicht ausreicht, wird das Rohr gewöhnhch durch fließendes kaltes Wasser, dessen Strom dem Dampfstrom entgegengesetzt zu fließen hat, abgekühlt. Durch das lange Zeit dauernde Einwirken des heißen Wassers auf die Pflanzenteile wird bei empfindlichen \'erbindungen leicht eine Zer- 990 K- Bartelt. Setzung herbeigeführt. Um diese zu vermeiden, sind Apparate konstruiert worden, welche die Destillation der ätherischen Öle mit Wasser im Vakuum auszuführen gestatten. Erst allmählich wurden die großen Schwierigkeiten bei der Konstruktion solcher Apparate überwunden, bis schließlich eine derartige Vollkommenheit in diesen Destilliergefäßen erreicht wurde, daß man jetzt in modern eingerichteten Fabriken besonders empfindliche Par- füms in großen Vakuumdestillationsapparaten gewinnt. Die niedrige Tem- peratur, welche dann zur Destillation des Wasser- und Ölgemisches erfor- derlich ist, verhindert eine Zersetzung der wertvollen Bestandteile. Über die Verarbeitung des Destillates, das eine Mischung des äthe- rischen Öls mit Wasser darstellt, vgl. später. h) Wasserdampfdestillation unter fortdauernder Zuführung von Wasserdampl Obwohl die im vorigen Abschnitt beschriebene Methode, bei der die Pflanzenteile mit Wasser übergössen und dann der direkten Erwärmung mit Feuer oder Wasserdampf von außen ausgesetzt werden, den Vorzug der Einfachheit hat, ist sie nicht von der praktischen Bedeutung wie die jetzt zu besprechende Destillation unter fortdauernder Zuführung von Wasserdampf, also die eigenthche Wasserdampfdestiüation. Sie hat vor der ersteren Methode den großen Vorteil, daß die Pflanzenteile nicht während der ganzen Dauer der (Operation in heißem Wasser liegen und dadurch nicht so leicht der Zersetzung anheimfallen können. Zur Ausführung der Destillation feuchtet man die vorbereiteten Pflanzenteile mit Wasser an und leitet in die Retorte einen hinreichend starken Wasserdampfstrom, der in einem besonderen Gefäße erzeugt wird. Die durchstreichenden Dämpfe nehmen das ätherische Öl in die Vorlage mit über. Da die Retorte, in der sich die Pflanzenteile befinden, nur mit dem Wasserdampf in Berührung kommt, wird eine Erhöhung der Tempe- ratur über 100" und damit ein Anbrennen von Pflanzenteilen völlig ver- mieden; ferner besteht auch keine so große Gefahr der Zersetzung, wie bei langer Einwirkung von heißem Wasser, so daß man nach dieser Methode im allgemeinen bessere ätherische Öle erhält. Die zur Ausführung der Wasserdampfdestillation dienenden Apparate sind im allgemeinen den be- sprochenen analog konstruiert, nur muß die Retorte eine Zuleitung für den Wasserdampf am Boden enthalten. P'eruer muß durch Benutzung von Schlangenkühlern für eine gute Kühlvorrichtung Sorge getragen werden. AVenngleich fast alle Bestandteile ätherischer Öle mit Wasserdämpfen destilliert werden können, sind doch viele unter ihnen, die eine außerordent- lich lange Destillation erforderlich machen würden, wenn man sie mit ge- wöhnlichem Wasserdampf überzutreiben versuchte. Es gehören zu diesen Verbindungen hauptsächhch ^'ertreter der Sesquiterpene bzw. der sich von diesen ableitenden sauerstoffhaltigen Verbindungen, der Sesquiterpenalko- hole, von denen einige, wie z. B. die Santalole, eine außerordentUch große technische Bedeutung besitzen. Ist keine Zersetzung dieser Produkte zu Die Gewinnung der ätrierischen Öle. 991 befürchten, so wendet man zu ihrer Destillation gespannten Wasser- dampf an. Durch die Erhöhung der Temperatur, die hierdurch veranlagt wird, gehen die Öle bedeutend schneller über und eine durch die erhöhte Temperatur wirklich eintretende geringe Zersetzung ist in einigen Fällen weniger bedeutend, als wenn man die Destillation mit gewöhnlichem Wasser- dampf auf viel längere Zeit ausdehnen müßte. Zur Kondensation der Dämpfe sind in diesem Falle ganz besonders gute Kühlvorrichtungen nötig. Isolierung der ätherischen Öle aus ihrem Gemisch mit Wasser, wie man es bei den verschiedenen Arten der beschriebenen De- stillationen erhält, richtet sich nach den physikahschen Daten des Öles. Dieses kann entweder in Wasser vöUig unlöslich sein; es wird sich dann je nach seinem spezifischen Gewicht auf der ()l)erfläche des Destillations- wassers abgeschieden haben oder es wird zu Boden gesunken sein und kann dann in jedem Falle durch Abhebern von der wässerigen Schicht getrennt werden. In einigen, verhältnismäßig jedoch wenigen Fällen, scheiden sich Bestandteile der ätherischen Öle in fester Form ab, so daß man die Kri- stalle durch einfache Auslese oder Absaugen gewinnen kann. Die völlige Unlöslichkeit des gesamten ätherischen Öles einer Pflanze ist aber ein nur verhältnismäßig seltener Fall. Viel häufiger sind wohl einige Anteile un- lösUch, neben ihnen kommen aber auch in Wasser gelöste Verbindungen vor, deren Isolierung dann schon größere Arbeit erfordert. Man vermeidet in diesen Fällen, wie oben schon angedeutet wurde, möghchst eine über- mäßig große Anwendung von Wasser, was man durch Verwendung der oben erwähnten Florentiner Flasche als Vorlage erreicht. Um das gelöste Öl vom Wasser zu trennen, unterwirft man die Lösung einer mehrfachen fraktionierten Destillation, wobei man das Öl noch durch Auflösen eines anorganischen Salzes in dem Wasser zur Ausscheidung bringt. Eine ge- nügend oft wiederholte Destillation, eine sog. Rektifikation, liefert ziemlich wasserfreies ätherisches Öl. Nach einer anderen Methode kann das Wasseröl nach Zusatz von Soda etc. ausgeäthert werden oder aber man schüttelt das Wasser mit ca. Vg seines Volumens an reinem OUvenöl, wobei das im Wasser gelöste ätherische Öl, besonders nach Zusatz von anorganischen Salzen, in ersteres übergeht, aus dem man es durch Ausschütteln mit Al- kohol, der später abdestilliert wird, gewinnt. Aber auch trotz häufiger Rektifikation usw. bUeben noch mehrfach sehr leicht in Wasser lösliche Bestandteile der ätherischen Öle im Destillationswasser gelöst, auf die man erst in verhältnismäßig neuer Zeit aufmerksam wurde. Über die Trennung der Bestandteile der auf erwähnte Art gewonnenen ätherischen Öle kann an dieser Stelle nicht näher eingegangen werden, zumal die Methoden für jeden einzelnen Fall andere sein werden. Es soll hier nur kurz erwähnt werden, daß man die Säuren durch Ausschütteln mit Soda, Phenole durch Behandeln mit Alkalilaugeu entfernt. Kohlenwasser- stoffe trennt man von analog zusammengesetzten Alkoholen und Estern durch fraktionierte Destillation, wobei die ersteren bei bedeutend niedrigerer 992 K. Bartelt. Temperatur übergehen werden. Eine völlige Reinigung der Kolilenwasser- stoffe von genannten Verl)indungen wird sich durch Destillation über Na bewirken lassen. Ist gleichzeitig ein ähnlich siedendes Oxyd dem Kohlen- wasserstoff beigemengt, wie es in der Natur nicht selten der Fall ist, so ist eine Trennung der beiden schon bedeutend schwieriger und manchmal nicht völlig durchführbar. Daraus erklären sich dann die verschiedenen Werte, die für eine und dieselbe Verbindung angegeben werden, wenn sie aus verschiedenen Ölen gewonnen wurde. Es soll an dieser Stelle noch kurz darauf hingewiesen werden, daß bei Gewinnung der ätherischen Öle nach den angegebenen Methoden, bei denen stets höhere Temperatur angewandt wurde, das Material, aus dem die Destillationsgefäße gefertigt sind, eine gewisse Rolle spielt. Besonders werden Metallgefäße auf schwefelhaltige ätherische Öle einwirken und zu Zersetzungen des Öles führen. Doch dürften derartige Schwierigkeiten durch Herstellung geeigneter Gefäßbekleidungen in der modernen Technik zum größten Teil behoben sein. o Gewinnung der ätherischen Öle durch Pressung. So sorgfältig man auch durch Anwendung geeigneter Modifikationen der angeführten Methoden zur Gewinnung ätherischer Öle durch Wasser- dampfdestillation eine Zersetzung des Öles durch erhöhte Temperatur usw. zu verhindern sucht, ist schon in vielen Fällen, besonders wenn es sich um angenehm riechende Öle handelt, die Temperatur des siedenden Wassers eine zu hohe, sogar wenn unter vermindertem Luftdruck gearbeitet wird. In solchen Fällen wird man zu Methoden greifen müssen, die eine Ver- änderung des Öles ausschUeßen, und dazu gehört in erster Linie die Ge- winnung durch Pressung. Diese Methode läßt sich im allgemeinen, wenn man nicht mit allzu großen Verlusten arbeiten will, nur für sehr weiche, d. h. saft- und ölreiche Pflanzenteile, wozu in erster Linie die Früchte ge- hören, anwenden. Während diese x\rt der Gewinnung in früherer Zeit eine größere Ausdehnung hatte, wendet man sie gegenwärtig nur noch haupt- sächlich bei Zitronen, Orangen, Pomeranzen und Bergamotten an. Diese weichen Früchte werden zur Freilegung des Öles aus den Ölgängen über mit spitzen Nadeln ausgekleidete Reibeisen bewegt und dann wird mit Hand- oder hydraulischen Pressen das ätherische Öl herausgepreßt. Zum Zwecke der möglichst vohkommenen Pressung werden die Früchte nach Zerreißen der Ölgänge oder, wenn solches wegen der Weichheit des Materiales nicht erforderlich ist, ohne vorherige Zubereitung in druck- feste Beutel gebracht und dann der Pressung in den Maschinen unter- worfen. Wie oben schon hervorgehoben, ist das auf solche Weise gewonnene ätherische Öl. da es nicht höherer Temperatur ausgesetzt war, ziemUch rein und entspricht in seinem Gerüche völlig demjenigen, den die Früchte selbst besessen hatten. Von dem gleichzeitig ausgepreßten wässerigen Saft Die Gewinnung der ätherischen Öle. 99;' und schleim iiien Bestandteilen wird es durch niechaiiisehe Methfxh-ii . wie Dekantieren und Filtrieren, in oft nicht schwieriger Weise getrennt. Gewinnung der ätherischen Öle durch Extraktion mit flüchtigen Lösungsmitteln. Will man sich im Laboratorium schnell über die Menge usw. des in einem Pflanzenteil vorhandenen ätherischen Öles orientieren, so wendet man in den meisten P'ällen die Extraktion mit einem flüchtigen Lösungsmittel an. Man übergießt zu diesem Zwecke das durch Zerkleinerung gut vorbe- reitete Pflanzenmaterial mit dem betreffenden Lösungsmittel, schüttelt mehrere Male gut durch und läßt das (lemisch noch ca. 1 Stunde zur völligen Lösung des ätherischen Öles bei gewöhnlicher Temperatur stehen. Auch in der Technik b(>dient man sich dieses Verfahrens zur Gewinnung von ätherischen Ölen, die in Pflanzenteilen vorkommen, welche nicht gleich- zeitig größere Mengen von Harzen oder fetten Ölen enthalten. Als Lösungsmittel werden hauptsächlich Alkohol, Äther, Schwefel- kohlenstoff, Chloroform, Petroläther, Aceton und einige wenige andere ver- wandt. Das an das Lösungsmittel gestellte Erfordernis ist, daß es alle Be- standteile des ätherischen Öles der Pflanze löst, ferner aber auch viel niedriger wie diese siedet, damit eine Trennung des gewonnenen ätherischen Öles von dem Extraktionsmittel durch fraktionierte Destillation, am besten im A^ikuum, ermöglicht ist. Zur Ausführung der Exti'aktion im Fabrik- betriebe übergießt man das zerkleinerte Pflanzenmaterial mit dem gewählten Lösungsmittel und füllt nach einiger Zeit die entstandene Lösung in eine Destillierblase, um das Lösungsmittel durch Zuführung von Wärme zu ver- flüchtigen. Das zurückbleibende Öl ist aber durchaus nicht rein, sondern enthält noch Anteile von Lösungsmitteln, die stets hartnäckig von dem Öl zurückgehalten werden. Außerdem sind aber auch fast immer noch mehr oder weniger große Mengen von fremden Bestandteilen von dem Extrnk- tionsmittel aus den Pflanzenteilen aufgenommen worden, die natürlich auch nach dem AbdestiUieren des Lösungsmittels zurückldeiben und das ätherische Öl in unangenehmer Weise verunreinigen können. Es wird sich gewöhidich um fette Öle oder Harze handeln. Eine Trennung von diesen Verunreinigungen kann durch fraktionierte Destillation, eventeil im \'akuum oder durch Wasser- darapfdestillation erfolgen, die jetzt nicht mehr so gefährlich ist, da keine Pflanzenteile mehr vorhanden sind; in einigen Fällen hat sich auch zur Entfernung der letzten Anteile des Lösungsmittels das Hindurchleiten eines Kohlensäurestromes durch die (|u. ^Mischung als erfolgreich erwiesen. Der große Vorteil des Extraktionsverfahrens ist, daß man trotz Ar- beitens bei gewöhnlicher Temperatur eine verhältnismäßig (luantitative Ausbeute an ätherischem Öl gewinnt. Der große Nachteil der Methode be- steht in der erwähnten schwierigen Isolierung des ätherischen Öles von den gleichzeitig durch das Lösungsmittel aufgenommenen fetten Ölen, Harzen usw. p]s wird also nur da Anwendung finden, wo eine Wasser- Abdtrhaldeu, Hiindbiicb der biotht-iiiischcn Aibfitsmcthoden. II. g3 994 ^^- Bartelt. dampfdestillation keine guten Produkte geliefert hat, hauptsächlich also bei angenehm riechenden Blütenölen. Arbeitet man mit sehr niedrig siedenden Lösungsmitteln, wie z. B. Äther, der schon bei 35" siedet, so kann man in einigen Fällen bei der Siedetemperatur des Lösungsmittels extrahieren, was natürlich für eine quantitative Ausbeutung der Pflanzenteile sehr nütz- lich ist. Als besondere ^Modifikationen der eben beschriebenen Gewinnung der ätherischen Öle mittelst eines flüchtigen Lösungsmittels sollen noch die Extraktion unter erhöhtem und diejenige unter vermindertem Druck erwähnt werden. Bei dem ersteren Verfahren wird durch Erhöhung des Druckes eine leichtere Zerplatzung der Ölkammern im Innern der Pflanzenteile bewirkt und damit eine bessere Ausbeute erzielt. Beim Arbeiten nach dem Verfahren unter vermindertem Druck soll die Güte des gewonnenen Parfüms eine bessere sein. Die Ausführung beider ^lethoden erfordert ziem- lich komplizierte und dadurch teure Apparate. Ihre Anwendung beschränkt sich hauptsächlich auf Blütenöle. Gewinnung der ätherischen Öle durch Extraktion mit nicht- flüchtigen Lösungsmitteln. Die Verfahren der Gewinnung ätherischer Öle durch Extraktion mit nichtflüchtigen Lösungsmitteln sind ebenso wie die entsprechenden mit flüch- tigen Lösungsmitteln auf verhältnismäßig wenige Spezialfälle beschränkt. Fette oder mineralische Öle wie Paraffin besitzen die Fähigkeit, ätherische Öle, die besonders leicht flüchtig sind — es handelt sich auch hier um Blütenöle, so z. B. Reseda, Rose etc. — , wenn sie in nahe Berührung mit ihnen gebracht werden, aufzunehmen. Man breitet das Fett zweckmäßig in großen Flächen aus und legt die zerpflückten Blüten der betreffenden Pflanzen auf dasselbe; dieses Verfahren wird unter Anwendung desselben Fettes mehrere Male wiederholt, bis sich das Lösungsmittel völlig mit dem flüchtigen Öl beladen hat. Die so erhaltene Auflösung von ätherischem Öl in dem Fett wird entweder als Pomade in den Handel gebracht oder aber das ätherische Öl durch Extrahieren mit Alkohol usw. isohert und gerei- nigt. Es ist leicht ersichtUch, daß dieses Verfahren kein quantitatives ist, da aber von dem Fett nur die verdunstenden Bestandteile des ätherischen Öles aufgenommen werden, die ja gerade den angenehmen Blütengeruch tragen, ist das erhaltene ätherische Öl sehr wertvoll. Neben der soeben beschriebenen Methode, bei der man vöUig in der Kälte ohne Anwendung höherer Temperaturen arbeitet, ist noch ein ana- loges Extraktionsverfahren im Gebrauch, das bei 60 — 70" ausgeführt wird. Es hat sich durch Versuche gezeigt, daß einige Blütenöle nicht an Güte ihres Geruches verlieren, wenn man das Fett auf 60 — 70'^ erwärmt, daß aber bei dieser Modifikation der Methode eine bessere Ausbeute erzielt wird. Man erwärmt das Fett auf die angegebene Temperatur und läßt dasselbe einige Zeit auf die hinzugegebenen Blüten einwirken. Die festen Teile Averden Die Gewianung der ätherischen öle. 995 nachher mechanisch von dem Fett durch Abpressen getrennt. Auch hier bringt man das mit dem ätherischen Öl beladene Fett entweder direkt als Pomade in den Handel oder aber man gewinnt das erstere durch Extra- hieren mit Alkohol, in dem die fetten Öle unlöslich sind, oder durch Über- treiben mit Wasserdämpfen, wobei das ätherische Öl mit diesen übergeht, während das fette Öl zurückbleibt. Anhangsweise soll unter diesem Abschnitt noch die Gewinnung der ätherischen Öle nach der pneumatischen Methode erwähnt werden, da sie im Prinzip dem ersteren der hier besprochenen Extraktionsverfahren sehr nahe kommt. Man leitet über ausgebreitete Pflanzenteile einen Luft- oder Kohlensäurestrom, der das leicht verdunstende ätherische Öl auf- nimmt. Diesen Gasstrom führt man dann durch eine Waschflasche mit einem Lösungsmittel, welches dem Gasstrom das ätherische Öl entzieht, während es das Gas selbst ungehindert durchstreichen läßt. Als Lösungs- mittel wird gewöhnüch ein leichtflüchtiges gewählt, das man durch oben ein- gehend besprochene Methoden von dem ätherischen Öl abdestiUieren kann. Es ist leicht ersichtlich, daß man auch bei dieser Methode auf eine quanti- tative Ausbeute nicht rechnen kann; auch sie findet nur in seltenen Fällen Anwendung, bei denen sie sich zur Gewinnung eines angenehm riechenden und deshalb teuren Parfüms als besonders geeignet erwiesen hat. ns* Darstellung und Nachweis der Gerbstoffe.') Von M. Nierenstein, Bristol. Für die Gewinnung von Gerbstoffen kommen folgende Arbeitsmethoden besonders in Betracht: 1. Die Äthermethode von Pelouze, 2. die Acetonmethode Trimbles, ?). die Extraktion mittelst Wasser oder Alkohol und Fällen der Gerb- stoffe mit Bleiacetat oder Extraktion des wässerigen Auszuges mit Essig- äther und Fällen der Gerbstoffe mit Äther (Körner) oder Petroläther (Franke)^ 4. die Wiedergewinnung der Gerbstoffe aus den Acetylderivaten nach Hlasiwetz. Wir werden die oben erwähnten Arbeitsmethoden getrennt besprechen, doch möchten Tvir gleich hier vorausschicken, daß sich in letzter Zeit die M Literatur (Darstellung). IL TrimbJe , The Tannins. 2 Vol. (Philadelphia 1892 und 1894). — Griehel, Über den Kaffeegerbstoff. luaug.-Diss. (München 1903). — A.Mozeau de Tours, Le Mate (Paris 1903). — Vournassos, Le Tannin de la noix de galle, sa Constitution (Paris 1903). — Reuchlin , Über Mate-Gerbstoff. Inaug.-Diss. (München 1904). — Geschivender , Beiträge zur Gerbstoff frage. Inaug.-Diss. (Erlangen 1906). — Gorter, Beiträge zur Kenntnis des Kaffees. Annal. d. Chem. Bd. 358. S. 327 (1908) und Bd. 359. S. 217 (1908). — H. E. Procter, Leather Industries Laboratory Book. 2. Edit. (London 1908). — J.Dekker, De Looistoffen, botanisch-chemische Monographie der Tanniden. Bd. 2 (Amsterdam 1908). — J. Deklcer, Le tannin de Tecorce d"Eucalyptus occidentalis. .Archives Nöerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles. Serie IL T. 14. p. 50 (1909). (Nachweis). Andreasch , Qualitative Untersuchung verschiedener Gerbstoffe. Der Gerber (1894). — H. R. Procter, Leather Industries Laboratory Book. 2. Edit. (London 1908). — Trotman, Leather Trades Chemistry (London 1908). — Parker und Pai/ne, A new methode for the analysis of tannin and tanning materials and the identifica- tion of admixtures in tanning extracts and liquors. Journ. of the Soc. of Chem. ludustry. Vol. 24. p. C)50 (1904). — Barker und Rüssel, The composition of Cidre. The Analyst. Vol. 34. p. 125 (1909). Darstellung und Nachweis der Gerbstoffe. gcjj Hlasiwetzsche^) Methode weder in den Händen Körners ^) noch in den- jenigen des Verfassers bewährt hat, und daß wir daher auf diese niclit näher eingehen werden. Die Äthermethode YonPdouze^) beruht auf der Annahme, daß der Wasser und Alkohol enthaltende Äther das Tannin wie auch andere Gerbstoffe löst Für die Extraktion am Rttckflußkühler verwendet man eine Mischung-, die 30 T. Äther, 5 T.Wasser und 2 T. Alkohol enthält, wobei sich dann drei Schichten beim Stehen bilden lassen, von denen die untere den höchsten Gerbstoff gehalt hat (vgl. Jlf oAr*), Luholt^) und auch Procter % letzterer findet in der oberen Schichte 2-2Vo. in der mittleren 3Vo und in der unteren 33 "/o Tannin bei der Extraktion von Gallen. Diese Beobachtungen Frocters sind vor kurzem auch von Dekker'') bestätigt worden. Bei zwei- tägiger Extraktion mit obigem Gemisch soll man 1 ^ Tannin aus 35—40 r/ Sumach, 13— lö^r Divi-Divi, 16—18^ Myrabolanen und 10— 12r/ (xali- äpfeln erhalten. Im Handel kommt das Tannin, das nach obigem Verfahren bereitet wird, in drei verschiedenen Sorten vor, und zwar als: a) Äther- Tannin (Schaum-Tannin), b) Alkohol-Tannin und c) Wasser-Tannin und sind diese die verschiedenen Fraktionen resp. Schichten der Darstellung. Nieren- stein empfiehlt, das Tannin durch Lösen und Fällen mit Kochsalz zu rei- nigen, und da er für seine Arbeiten acetyliertes Tannin verwendet, so kommt der Salzgehalt des so erhaltenen Produktes weniger in Betracht. Er emp- fiehlt auch, das Tannin mit Äther zu extrahieren, um es so von Gallus- säure zu befreien. Ein gallussäurefreies Tannin darf mit cyansaurem Kalium keine Rotfärbung geben. Dekker und auch Nierenstein sprechen sich zu- gunsten des sog. Tanninum levissimum pur. Schering aus und soll dieses, wie Nierenstein ^) findet, zuckerfrei sein. Trimhle ^) verwendet für seine umfangreichen Arbeiten über Eichen- gerbstoffe und andere Gerbstoffe hauptsächlich Aceton als Extraktions- mittel. Die fein vermalilene Rinde wird mit der 10 — 20fachen Menge Übergossen und 48 Stunden stehen gelassen. Der erste Teil an Aceton wird schnell abfiltriert und dann mit einer zweiten Menge des Lösungsmittels 1) Hlasiwetz, Die Beziehungen zwischen Gerbsäuren, Glukosiden, Phlobaphenen und Harzen. Wiener akad. Ber. Bd. 55. (Abt. 2.). S. 7 (18G7). ■■') Körner, Studien auf dem Gebiete vegetabilischer Gerbstoffe. Gerberzcitunc. Bd. 47. S. 115 (1904). *) Felouze, Memoire sur le tannin et les acides galliqucs, pyrogalliques , ellagiques et metalliques. Ann. de Chim. et Phys. T. 54 p. 337 (1834). ■*) Mohr, Über ätherische Gerbsäurelösungen. Ann. d. Chem. u. Pliarm. Bd. <)1. S.352 (1849). ^) Lubolt, Über das Verhalten der Gerbsäure gegen Äther und Wasser. Jouru. f. prakt. Chem. Bd. 77. S. 357 (1859). 6) B. Procter, Tannin, its solubilities. The Pharm. Journ. Vol. 6. p. 351 (1889). '') J. Dekker, De Looistoffeu. Bd. 2. S. 9 (Amsterdam 1908). ^) Nierenstein , Über das Drehungsvermögen des Tannins. Ghem.-Zeitg. Bd. 33. S. 126 (1909). 9) Trimble, The Tannins. Vol. 2. p. 18 (Philadelphia 1894). 998 ^' Nierenstein. ausgezogen — man arbeitet so , daß man pro Kilogramm Rinde 500 cm^ Aceton ver^Yendet — , die Rinde wird dann mit wenig Wasser nachgespült und die drei Abzüge bis zur Hälfte eingeengt und im Vakuum bis zur Trockene abdestilliert. Das so erhaltene Produkt wird dann entweder in wenig Wasser oder, was Trimhle besonders empfiehlt, in Alkohol (spez. Gew. 0-975) gelöst, die Phlobaphene und Farbstoffe mit Wasser ausgefällt und das Filtrat mit Essigäther extrahiert. Der Essigäther wird im Vakuum destilliert und dieses Reinigungsverfahren 3 — 4mal mederholt. Die Gerb- stoffe werden im Vakuum getrocknet. (Ton gibt Schmieren [Nierenstein].) Die nach dem JVm^Zeschen Verfahren dargestellten Pyrokatecholgerbstoffe fallen gewöhnlich rotgefärbt aus. Strauss und Geschwender '^) sollen Al- kohol statt Aceton mit l)esserem Erfolg angewandt haben. Zur Gewinnung des Gerbstoffes wird nach Strauss und Ge- schwender mit Chloroform im Bitter^chen Apparat extrahiert (dies soll bei Blättern: Tee, Sumach usw. unerläßUch sein) und dann mit Alkohol ausgezogen. Andrerseits wird Wasser zur Extraktion verwendet und haben nach dieser Methode Hlasiwetz, Böttinger u. a. m. gearbeitet. ^lan extrahiert entweder heiß oder kalt, schüttelt mit Äther öfters aus und fällt mit Blei- acetat. Das Bleisalz wird dann entweder mit verdünnter Schwefelsäure oder Schwefelwasserstoff zersetzt und der Gerbstoff mit Essigäther ausgezogen. Des weiteren verfährt man wie oben. Procter^) und auch Nierenstein halben beim Arbeiten mit Schwefelwasserstoff gefunden, daß dieser Tannin in Gallussäure spalte und sprechen sich daher gegen die Verwendung von Hj S aus. Was die Zersetzung mit verdünnter Schwefelsäure anbetrifft, so empfiehlt Nierenstein^) eine teilweise Zersetzung des Bleisalzes, und ver- wendet er nur die ersten beiden Auszüge. Er nimmt an, daß sich das Gerbstoffbleisalz vor dem Farbstoff bleisalz zersetze. Ähnliches hat auch Ä.G.Perkin^) beobachtet. Außerdem soll man nach Nierenstein^) das Bleiacetat in kleinen Portionen hinzufügen und die Bleisalzbildung unter- brechen, wenn sich das erste gefärbte Salz ausscheidet. Gute Resultate wollen Körner'^) und Mitarbeiter (Fetermann , DiiUberg , Nierenstein und Franke) erzielt haben , wenn sie den Gerbstoff kalt mit Wasser extra- hierten, ihn dann mit Essigäther auszogen und mit Äther, Petroläther oder Chloroform fällten. Sie erhielten so fast farblose Gerbstoffe, Avas ihnen be- sonders beim Quebrachogerbstoff gelang, der gewöhnlich nach der Aceton- ^) Strauss uud Geschwcnder, Beiträge zur Keuntnis einiger Gerbstoffe. Zeitschr. f. angew. Chemie. Bd. 19. S. 1121 (1906). 2) H. B. Procter, Leather Industries LaLoratory Book. 2. Edit. S. 111 (1908). ^) Nierenstein^ Zur nälieren Kenntnis einiger „Blume" gebender Gerbstoffe. Colle- gium. S. 21 (1905). *) A. G. Perhin , The yellow colouring principles of various tannin materials. .Tourn. Chem. Soc. Vol. 69. p.ll31 (1897). ^) Nierenstein, 1. c. ®) Körner, 1. c. Darstellung und Nachweis der Gerbstoffe. 999 methode tiefrot erhalten wird. Die so gewonnenen Gerbstoffe fallen zuerst harzig- aus, doch erhält man sie nach wiederholtem Lösen in Essigäther und Fällen mit Äther als amorphes Pulver. Beim Arbeiten mit Gerbstoffen macht man die unangenehme Erfah- rung, daß diese wegen ihrer großen Unbeständigkeit schwer zu hantieren sind, und muß man sich manchmal nur mit ihrer Identifizierung begnügen. Bekanntlich lassen sieh die Gerbstoffe in zwei Hanptgruppen, und zwar in Pyrogallol- und Pyrokatecholgerbstoffe teilen. Die ersteren bilden die sog. ,.Blume", die aus Ellagsäure besteht, während die letzteren die ..Phlobaphene" oder ..Gerberrot' liefern. Handelt es sich darum, einen Gerbstoff zu iden- tifizieren, so hält man sich am besten an folgende Reaktionen: Pyrogallolgerbstoff Pyrokatecholgcrl) Stoff Eisenchlorid .... blau grün Bromwasser .... k. Nd. Nd. Kalischmelze. . . . Gallussäure oder Protokatechusäure und Pyrogallol Phloroglucin Leider versagt auch diese Klassifikation, da man es oft mit Gemischen zu tun hat. Procter^) gibt eine Reihe von Farbenreaktionen an. Es sei hier auf das Original verwiesen. Nierenstein") verwendet Diazobenzol- chlorid; es sollen nur die Pyrokatecholgerbstoffe unlösliche Diazopro- dukte liefern. Außer den oben angeführten I'ntersuchungsmethoden kann man die Gerbstoffe in Glyzerinlösung erhitzen, wobei sich die verschiedenen Phenole bilden, oder man behandelt sie am Rückflußkühler mit verdünnter Schwefel- säure oder Salzsäure ( 20/0 H Cl) und erhält so Gallussäure , Ellagsäure, Protokatechusäure, andere aromatische wie aüphatische Säuren und Zucker. Procter ^) empfiehlt für das Erhitzen des Gerbstoffes in Glyzerin folgende Methode: lg Gerbstoff mrd mit 5 c;«^ Glyzerin auf 160° erhitzt und die Temperatur dann auf 200 — 210° für 80 Minuten langsam gesteigert. Nach dem Erkalten wird mit 20 cm^ Wasser versetzt und mit Äther extrahiert. Trimhle *) extrahiert, ohne mit Wasser zuerst zu verdünnen. Für die Verseifung mit Säuren verfährt man so, daß man den wässerigen Gerb- stoffauszug mit verdünnter Schwefelsäure oder Salzsäure am lUickflußkühler kocht und dann für einige Tage stehen läßt. Es scheiden sich hierbei Ellagsäure und Phlobaphene ab. Als zuverlässigen Nachweis für Ellagsäure kann man die Salpetersäurereaktion nach Gricssmeyer verwenden, man er- hält, wenn man das trockene Produkt mit Salpetersäure (1 — 2 Tropfen) und dann mit Wasser (10 — 20 Tropfen) versetzt, ein schönes Himbeerrot. ') H. E. Procter, 1. c. S. 146—167. '-) Nierenstein, Zur qualitativen Analyse der Gerbstoffe. Collegium. S. 376 (1906). 8) H. E. Procter, 1. c. S. 112. ') Trimble, The Tannins. Voll. p. 27 (Philadelphia 1892). IQQQ M. Kierensteia. Nach dem Entfernen des Unlöslichen (EUagsäure usw.) extrahiert man mit Äther und prüft auf verschiedene aromatische und aliphatische Säuren. Die Lösunii' wird dann mit Bleiacetat versetzt, der Überschuß an Bleiacetat mit verdünnter Schwefelsäure entfernt und auf Zucker geprüft. Nieren- stein 1 ) arbeitete beim Tannin so , daß er die Tanninlösung- mit Casein entgerbte und dann auf Zucker untersuchte. Bei der Untersuchung von Phlobaphenen , die nach Nierenstein-) dem Anthrachinon angehören sollen (das Quebrachogerbsäure-Phlobaphen wurde von ihm Ptuffiquebrachosäure genannt), handelt es sich oft um Alkahschmelzen. Allem Anscheine nach erhält man unter folgenden Ar- beitsbedingungen die besten Piesultate: 20 c) Phlobaphen werden mit 100 cm 3 Kalilauge (spez. Gew. 1-20) 3 Stunden gekocht und die Lösung dann unter lebhaftem Umrühren eingeengt. Man verfährt dann wie bei der Kahschmelze. Versucht man die Gerbstoffe zu kristallisieren, so findet man dies, soweit unsere gegenwärtigen Kenntnisse reichen, als ein aussichtsloses Unternehmen. Das einzige kristallisierende Derivat des Tannins hat Vournassos^) beschrieben; es soll das das Pentabenzoyltannin sein. Wie weit man dieser Mitteilung Wert beilegen kann, werden weitere Erfah- rungen lehren müssen. A. G. Perkin und Nierenstein verwandten mit gutem Erfolg Pyridin für die Kristallisation von EUagsäure. Es gelang letzterem, mittelst Pyridin aus den Myrabolanen EUagsäure wie auch Luteosäure zu isolieren. Bei der Auswahl der Reagenzien für die Gerbsäuren in der Pflanzen- zeUe kommen die verschiedenen Eisensalze, Kahumbichromat und Kalium- cyanat in Betracht. Richard Büttner*) hat die Eisensalze besonders sorg- fältig studiert. Er empfiehlt: Ferrum citricum ammoniatum, Ferrum citricum oxydatum, nachdem es mit NH3 soweit abgestumpft ist, daß nur noch schwachsaure Reaktion erkennbar ist, Ferrum sesquicliloratum, eben- faUs fast neutral, Ferrum sulfuricum und Ferrum sulfuricum oxydatum in wenig saurer Lösung. Die Konzentrationen für Deckglasuntersuchung sind nach Büttner: 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 1500 und 1 : 2000. Auf den eigentlichen Wert der Eisenfärbung woUen wir hier nicht eingehen, wir haben sie öfters und eingehend an anderer SteUe kritisiert. Für die fi'awiosche Bichromatmethode^) werden die zu untersuchenden Pflanzenteile in eine 5Voige Kaliumbichromatlösung gebracht, worin sie im ^) Nierenstein, Über das Drehungsvermügeu des Tannins. Chem.-Zeitg. Bd. 33. S.126 (1909). -) Nierenstein, Beitrag zur Kenntnis der Gerbstoffe. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges- Bd. 40. S.4575 (1907). •'') Yournassos, Le Tannin de la noix de galle, sa Constitution (Paris 1903). *) Büttner, Über die Gerbsäurereaktion in der lebenden Zelle. Inaug.-Diss. (Er- langen 1891). ^) Botan.Zeitg. S. 17 (1863), zitiert nach K. Wilke, L'ber die anatomischen Be- ziehungen des Gerbstoffes zu den Sekretbehältern der Pflanze. Inaug.-Diss. (Halle 1883). Darstellung und Nachweis der Gerbstoffe. lUUl allgemeinen 14 Tage verbleiben. Nach Ablauf dieser Zeit sind diese voll- ständig imprägniert und liefern leicht dünne Schnitte, die vor der Unter- suchung für zwei Tage sorgfältig gewaschen werden müssen. Für quan- titative Zwecke hat Kutscher eine kolorimetrische Skala ausgearbeitet. Diese Skala zeigt 8 Grade, indem mit 1 die schwächste, mit 8 die stärkste Färbung des Niederschlages bezeichnet wird. Als Gegenreaktion für Gallussäure empfehlen Drahble und Nieren- stein'^) eine l^/oige Cyankaliumlösung, indem sie Schnitte mit Eisenchlorid und Cyankalium ausfärben und durch das Ausbleiben des Rotes mit Kalium- cyanat auf die Abwesenheit von Tannin resp. Gallussäure schließen. Sie haben an der Hand dieses Eeagens die Verwendung von Tannin und an- derer Gerbsäuren in dem Yerkorkungsprozeß der Zellen studiert. ^) Drabhle und Nierenstein, Ou the role of Phenoles, Tannic acids and Oxyltcn- zoic acids in cork-formation. Bio-chemical Journ. Vol. 2. p. 96 (1907). Die Isolierung von Fäulnisbasen. Von D. Ackermann, AYürzbiirg. Das Substanzgemenge, welches sich demjenigen darbietet, der nach Fänhiisbasen fahndet, ist, wenn nicht ein einfacher, wohldefinierter che- mischer Körper der Wirkung der Fäuhüsbakterien ausgesetzt wird, ein außerordenthch mannigfaches. Nimmt man nur den relativ einfachen Fall der Fäulnis eines einzigen Eiweißkörpers, wie z. B. des Leims, so können sich in der zur Untersuchung kommenden Lösung außer nicht völlig abge- bautem Eiweiß erstens einmal die sämtlichen Produkte der trvptischen Wirkung der Fäulnisbakterien, also die Aminosäuren finden, zweitens aber sind darin diejenigen Körper, welche der Lebensprozeß der Mikro- organismen aus den Aminosäuren bildet. Kommen nun gar ganze Organe, wie Muskeln, Milz, Pankreas etc., zur Untersuchung, so ist der Fall noch bei weitem komplizierter. Hat man hier doch mit so ziemlich sämthchen Stoffen zu rechnen, welche überhaupt als Bausteine des Organismus dienen, und ferner wieder noch mit denjenigen Substanzen, die aus den ersteren durch Wirkung der Fäulnisbakterien entstehen. Hatte die Fäulnis lange genug gedauert, so ist die Situation allerdings etwas vereinfacht, weil dann ein Teil der Körper, z. B. die Aminosäuren, größtenteils verschwunden sind. Immerhin bleibt das Substanzgemenge in all diesen Fällen ein äußerst kom- pliziertes und man wird angesichts dessen von keiner der hier zu schildern- den Methoden etwas Vollkommenes erwarten dürfen. W^as die Bezeichnung ..Fäulnisbasen" angeht, so müßte dieselbe eigent- lich nach dem heutigen Stand unserer Kenntnisse ausschließüch für solche Körper reserviert werden, welche nicht durch einfache hydrolytische Ab- spaltung entstehen, wie z. B. das Cholin aus Lecithin, sondern nur für die- jenigen basischen Substanzen, die bei ihrer F^ntstehung der Wirkung der Fäulnisbakterien nicht entraten können. Indessen auch eine derartige Grenze läßt sich heutzutage nicht mehr ziehen, seitdem es gelungen ist, typische Fäulnisbasen, wie Pentamethylendiamin und Tetramethylendiamin, aus einigen niederen Pflanzen darzustellen. So wird also die Bezeichnung „Fäulnis- base" 1) für etwas, was nur dem Fäulnisprozeß eigentümlich ist , sich all- *) Der Name Ptomaine , den man vielfach noch als Synonymum für Fäuluisbase verwendet, wird aus dem gleichen Grunde wohl ebenfalls bald verschwinden. Die Isolierung von Fäulnisl)asen. lOO^i mählich verlieren, und für uns kann im foli^enden auch nur die Aufgabe darin bestehen, zu schildern, mit welchen Methoden man basische Stoffe aus Fäulnisgemischen isoliert. I.Verfahren nach Brieger. i) Die Fäulnismassen werden bei schwach salzsaurer Reaktion einge- dampft. Den so erhaltenen dicken Sirupen können die salzsauren Pto- maine durch Alcohol absolutus entzogen werden, da selbst die an und für sich in Alkohol unlöslichen Chloride mancher Basen bei Gegenwart anderer Ptomaine leicht in den Alkohol übergehen. Dieser Alkohol wird abgedampft und jetzt gelingt es häufig schon durch wiederholte Erschöpfung mit ab- solutem Alkohol, solche Basen, deren Chloride niu- schwer in dieses Lösungs- mittel eingehen, vor allem das Neuridinchlorid, zur Abscheidung zu bringen. Das Neuridinchlorid wird mit Wasser aufgenommen und durch Überführung in das Pikrat gereinigt. Die verbleibende alkoholische Lösung wird mit alkoholischer Queck- silberchloridlösung gefällt und 24 Stunden stehen gelassen. Der Quecksilber- niederschlag wird alsdann abgesaugt, mit alkoholischer Quecksilberchloridsolu- tion gewaschen und getrocknet, dann mit viel heißem Wasser gekocht und vom ITnlöslichen abfiltriert. Durch diese Manipulation gelingt es, die in den Alkohol übergegangenen Eiweißkörper (Peptone u. dgl.) vollständig zu be- seitigen, denn es hat sich erwiesen, daß die Quecksilberchloridverbindungen dieser Eiweißkörper auch in viel kochendem Wasser unlöslich sind, während alle Quecksilberdoppelverbindungen organischer Basen sich in Wasser lösen; äußerst schwer löslich, selbst in heißem Wasser, ist allerdings das Queck- silberdoppelsalz des Cholins, eine Eigenschaft, die man leicht zur völligen Abscheidung des Cholins von den übrigen Basen benutzen kann. Beim Er- kaltenlassen des die Quecksilberverbindungen enthaltenden Filtrates kri- stallisiert nämlich das Cholinquecksilberchlorid alsbald vollständig aus, während die übrigen Basen in Lösung bleiben. Diese Mutterlauge filtriert man ab, leitet Schwefelwasserstoff bis zur Sättigung ein und beseitigt das Schwefelquecksilber durch Absaugen. Die so erhaltene Lösung der Chloride dampft man ein, nimmt mehrmals mit Oß^oigGin^ nicht mit absolutem Alkohol auf und bringt auf diese Weise Kristalle von Tetramethylendiaminchlorid zur Abscheidung; es ist wichtig, den Alkohol nicht absolut zu nehmen , weil in diesem Falle auch das Pentamethylendiamin sich teilweise mit ausscheidet und somit der Zweck des Verfahrens vereitelt wird. Beim längeren Stehen des alkoholischen Aus- zuges fallen dann auch die etwa in Lösung gegangenen Beste des Tetra- methylendiamins aus und man identifiziert den Körper jetzt am besten durch Überführung in das Chloraurat, indem man die Kristalle des Chlorides mit etwas Wasser aufnimmt und mit wässeriger Goldchloridlösung fällt. ^) Brieger, Über Ptomaine. Berlin, Hirschwald 1885 inul 1886. Drei Mono- graphien. 1004 I^- Ackermann. Das alkoholische Filtrat des Tetramethylentliamins enthält außer einer Reihe anderer Basen in überwiegender Menge Pentamethylendiaminchlorid, das man isoliert, indem man mit alkoholischer Platinchloridlösmig fällt. Es ist diese Fällung um so notwendiger, als auch die anderen Basen mit Platinchlorid Verbindungen von allerdings größerer Löslichkeit, als die des Pentamethylendiamins ist, eingehen. Durch Umkristallisieren aus Wasser gelingt es, diese verschiedenen Platinate, wenn auch allerdings ziemlich mühevoll, zu trennen. Die Schwerlöslichkeit des Kadaverinplatinates befähigt dasselbe, zuerst auszukristallisieren. Anfänghch scheidet sich diese Doppel- verbinduug in ziemlich reinem Zustande aus. je mehr man aber die Lösung einengt, desto mehr ist das Platindoppelsalz des Kadaverins mit dem des Saprins untermengt. Schließhch überwiegt das Platinat des Saprins. Die noch spärlich eingestreuten, durch ihren Glanz und ihre Kristallform deutlich hervorleuchtenden Kadaverinplatinate werden mittelst Lupe von den mehr mattschimmernden Kristalloiden des Saprinplatinates, auf denen sie oft aufsitzen, abgesondert. Durch wiederholtes Umkristallisieren aus Wasser gelingt es dann schließlich, analysenreine Präparate des Platinats des Saprins zu erhalten. In den nach Entfernung des Saprins restierenden Platinlaugen kann noch die Platinverbindung desMydaleins zurückbleiben, die. äußerst lös- lich in Wasser . erst nach starker Einengung auf dem Wasserbade oder längerem Stehen unter dem Exsikkator in Form kleinster Xädelchen aus- kristaUisiert. Die Reinigung dieses Doppelsalzes verursacht große Schwierig- keiten wegen der äußerst leichten LösHchkeit desselben und der Unfähig- keit des Mydaleins, mit anderen Basenfällungsmitteln schwer löshche \oy- bindungen zu bilden. Es bleibt dann schließlich nichts weiter übrig, als durch wiederholtes Lösen des Platinates in sehr wenig lauwarmem Wasser ein möglichst reines Präparat zu erzielen ; natürlich ist dabei der Material- verlust ein sehr bedeutender. Die Fällung der vom Alkohol aufgenommenen salzsam'en Ptomaine durch alkoholische Quecksilberchloridlösung hat allerdings den größten Teil der Ptomaine eliminiert, doch bleiben in der von dem Quecksilberchlorid- niederschlage befreiten Lauge noch basische Substanzen zurück. Diese Lauge wird nun unter Wasserzusatz eingedampft und, nachdem der Alkohol verjagt ist, durch Schwefelwasserstoff das Quecksilber entfernt. Beim Ein- dampfen des vom Schwefelquecksilber befreiten Filtrates mrd die über- schüssige Salzsäure durch Soda abgestumpft. Der Trockenrückstand, mit absolutem Alkohol erschöpft, läßt nur wenige Körper in densell^en ül)er- treten. Dieselben sind je nach der Art des Fäulnismateriales recht ver- schieden. Bei Fleischfäulnis findet man hier Methylguanidin. Um dies zu isolieren, wird die alkoholische Flüssigkeit vom Alkohol befreit, der Sirup mit etwas Wasser aufgenommen, worauf mit Phosphormolybdänsäure ein Niederschlag hervorgerufen wird. Diesen zerlegt man mit essigsaurem Blei und dampft nach der Entbleiung mit wenig Salzsäure ein. Durch pikrinsaures Natrium schlägt man jetzt daraus ein harziges Pikrat nieder, Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1005 das mit Wasser ausn-ekocht in Gestalt von verfilzten , in Wasser sehr schwer löslichen Nadeln erstarrt. Durch wiederholtes Lösen derselben in kochendem absoluten Alkohol wird schließlich analysenreines Methylguaiiidin- pikrat gewonnen, das man zur besseren Identifizierung- noch in das Gold- salz umwandeln kann. Waren als Ausgangsmaterial für die Untersuchung gefaulte Fische genommen ; so kann-man in dem vom Quecksilber befreiten Filtrat der Quecksilberfällung Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Diäthylamin finden. Man macht nun entweder mit Natronlauge alka- lisch, destilliert die Basen in vorgelegte Salzsäure hinein und dampft, wenn keine Basen mehr übergehen, das Destillat ein, um es nun weiter zu unter- suchen, oder aber man verwendet, ohne davon abzudestillieren, die Basen- fltissigkeit direkt. In beiden Fällen muß man zuerst solange mit abso- lutem Alkohol aufnehmen, bis sich kein Ammoniumchlorid mehr ausscheidet, dann dampft man den Alkohol ab und wird nun am besten direkt mit starker wässeriger Goldchloridlösung fällen; ist Trimethylamin vorhanden, so scheidet sich sofort das sehr schwer lösliche Chloraurat dieser Base aus. Für die Abscheidung der anderen Körper eignen sich gleichfalls die Salze des (loldes und des Platins am besten und es ist bei Trennungen mit Hilfe derselben zu beachten, daß das Platinat des Methylamins in Alkohol unlöslich , in Wasser schwer löslich , das des Dimethylamins in kaltem Wasser schwer löslich, in Alkohol am leichtesten löshch ist. Dem- gegenüber ist das Goldsalz des Methylamins in Wasser leicht löshch, das des Dimethylamins ebenfalls ziemlich leicht löshch. Da von Briegers Schüler Bocklisch^), der die Bearbeitung der Fischfäulnisbasen nach Briegers Methoden übernommen hatte, niemals die vier genannten flüchtigen Basen gleichzeitig nebeneinander aus ein und demselben Ausgangsmaterial dar- gestellt wurden, kann auch nicht genauer angegeben werden, wie sich die Trennung der vier Basen voneinander im einzelnen gestalten würde. Brieger hat nun seine ]\Iethode mit verschiedenen Modifikationen verwandt. Erstens einmal benutzt er zur vollständigen Trennung des Pentamethylendiamins vom Tetramethylendiamin nicht nur die verschiedene Löslichkeit ihrer Chloride in Alkohol , sondern auch das differente Ver- halten der Quecksilber- und Goldsalze, insofern das Tetramethylendiamin ein ziemlich schwer lösliches Goldsalz und ein leichter lösliches Queck- silberdoppelsalz bildet, während das Pentamethylendianiin sich gerade umgekehrt verhält. Bei der Untersuchung von faulem Pferdefleisch hat er ferner von der Quecksilberfällung einen in Wasser besonders leicht löslichen Teil ab- getrennt, den er durch Behandeln mit H2S in eine Lösung von Chloriden verwandelte. Diese versetzte er mit Goldchloridlösung, wodurch die in Blättchen kristallisierende, in Wasser schwer lösliche Golddoppelverbindung eines Körpers der Formel C7 H^^ . NOg niedergeschlagen wurde. Im Filtrate *) Brieger, Ptomaine. III. S. 42. 1006 ^- Ackermann. dieser Goldfällung befindet sich dann das Mydatoxin. welches angeb- lich mit Goldchlorid überhaupt nicht fallen soll, und durch seine in Wasser ziemlich leicht lösliche Platinverbindung isoliert wird. Die Darstellungsmethoden einiger anderer von Brieger aus Fäulnis- gemischen isolierter Basen werden gelegentlich der Besprechung der ein- zelnen Körper geschildert werden. 2. Verfahren nach Ackermann und Kutscher. Dasselbe schheßt sich eng an das von Kutscher zuerst zur Auftei- lung des Fleischextraktes benutzte Verfahren an und stellt eine Kombina- tion der Basengewinnungsmethoden von Brechsei, Brieger, Kutscher, Kossei und Steudel dar. Es wurde zuerst von D. Ackermann und P. Mey'^), dann von mir 2) allein zur Untersuchung eines Pankreasfäulnisgemisches benutzt und gestaltet sich im einzelnen folgendermaßen : Die gefaulten Gewebsteile ^) werden entweder durch ein weitmaschiges Sieb gegossen, auf dem die nicht in Lösung gegangenen Gewebsfetzen zurückbleiben. Diese werden mit Wasser einmal aufgekocht , worauf der so erhaltene wässerige Extrakt mit der Hauptflüssigkeitsmenge vereinigt und das ganze auf ca. 35 l eingeengt wird : stark einzuengen ist nicht ratsam, weil dann beim Abkühlen die leimhaltige Masse erstarrt. Jetzt wird mit Phosphorsäure angesäuert und bei der so hergestellten sauren lleak- tion mit konzentrierter wässeriger Gerbsäurelösung gefällt, solange als noch ein Niederschlag entsteht. Von dem Niederschlag wird nach einiger Zeit al)filtriert. Da das Durchgeben der Fäulnismassen durch ein Sieb und das nacli- herige Eindampfen der Flüssigkeit eine langwierige und sehr widrige Ar- beit ist, habe ich bei einem neueren Versuch auf eine möghchst vollstän- dige Ausnützung des Materials verzichtet und mich damit begnügt, nur den größten Teil der Substauzmengeu zu gewinnen. Ich gab nämlich zu dem Fäulnisgemisch direkt nach dem Ansäuern mit Phosphorsäure kon- zentrierte Tanninlösung bis zur vöUigen AusfäUung hinzu und ließ den Niederschlag von Gewebsfetzen und gerbsauren Eiweißverbindungen tage- lang sich absetzen. Dann wird schheßhch die darüberstehende saure Flüssigkeit abgegossen und in einem kupfernen Waschkessel eingeengt, während man auf die den Bodensatz durchtränkende Flüssigkeitsmenge verzichtet. Die auf die eine oder die andere Weise erhaltene Flüssigkeit muß nun vom überschüssigen Tannin befreit werden. Man versetzt sie deshalb ^) B. Ackermann und P. Mei/ , Untersuchimg eines Eiweißfäulnisgemisches nach neuen Methoden. Centralbl. f. Bakteriol. I. Abt. Bd. 42. S. 629 (1906). ^) D. Ackermann, Ein Beitrag zur Chemie der Fäulnis. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 54. S. 1 (1907/08). ^) Ich benutzte 22 kg Rinderpankreas, welches, grob vom Fett befreit, in einer Fleischhackuiaschine zerkleinert, mit 44 / ^Vasser verrührt, in einer großen Holztonne 2 Monate im Sommer faulen gelassen war. Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1007 solange zuerst mit beil.jgesättigter, später mit kalter konzentrierter Barvt- hydratlösung, bis der sich beim Umrühren des Gemisches bildende Schaum «inen roten Farbenton annimmt. Es ist dies erfahrungsgemäß ein Zeichen, daß die Flüssigkeit einen Überschuß von Barythydrat enthält, somit sämt- liches Tannin in Baryumtannat übergeführt ist. Ohne den Niederschlag ab- sitzen zu lassen, wird das Ganze auf den von A. Kossei angegebenen Filtrier- apparat gegeben und sfharf abgesaugt; die Kossehche Xutsche ist für diese Arbeiten kaum zu entbehren.^) Den Baryumtannatniederschlag wäscht man noch dreimal gut nach, vereinigt die \Yaschwässer mit dem Hauptfiltrat und versetzt das Ganze mit Schwefelsäure bis zur deuthch sauren Reaktion. Nachdem so der gesamte noch in Lösung befindliche Baryt niedergeschlagen ist, wird die überschüssige Schwefelsäure durch Zugabe von Bleioxyd ab- gestumpft. Das Bleioxyd nimmt außerdem die Beste des Tannins und an- dere Verunreinigungen mit fort. Darauf beseitigt man den Baryumsulfat- und Bleiniederschlag durch Filtrieren und kann nun die Flüssigkeit ein- engen, ohne eine Zersetzung oder Oxydation befürchten zu müssen. Durch die Behandlung mit Tannin ist man sämtliche Eiweißkörper losgeworden, hat aber andrerseits, da die Reaktion während der Fällung mit Gerbsäure sauer war, keinen großen Verlust an Basen durch dieses Fällungsmittel zu fürchten, da die meisten Tanninverbindungen organischer Basen in Säuren löshch sind. Ist das Volumen der Flüssigkeit nun auf ca. 1 / geschwunden, so werden 25 cnr^ konzentrierter Schwefelsäure zugegeben und jetzt gibt man Phosphorwolframsäurelösung hinzu so lange, bis kein Niederschlag mehr entsteht.^) Am anderen Tage wird die Fällung abgesaugt, mehrmals mit 5<'/oiger Schwefelsäure gewaschen und der Niederschlag dann in einem großen Blechtopf mit warmem Wasser zu einem dünnen Brei sehr sorgfältig zer- rieben. Bei der nun folgenden Zersetzung des Niederschlages mit Baryt- hydrat kann man erfahrungsgemäß heißgesättigte Barythydratlösung be- nutzen, ohne die Basen dadurch zu gefährden; man darf nur die Arbeit jetzt nicht unterbrechen , denn bei langem Verweilen der Körper in stark alkalischer Lösung muß doch schließhch eine Zersetzung gefürchtet werden. Man gibt unter gutem Rühren mit einer Holzkelle solange Barythydrat- lösung hinzu, als bis drei kleine Proben der sich über dem gebildeten Niederschlag ansammelnden Flüssigkeit folgenden drei Anforderungen ge- nügen: Mit kaltem Barytwasser keine Fällung; mit Schwefelsäure Fällung; mit Natriumkarbonat Fällung. Nun saugt man den Niederschlag ab, was erfahrungsgemäß außerordentlich schnell geht, witscht ihn mit heißem Wasser und leitet sofort in Filtrat und Waschwässer Kohlensäui-e solange *) Sie ist vom Mechaniker des Physiologischen Instituts zu Marburg M. Rinck zu beziehen. ^) Bei meinem mit 22 kr/ Pankreas angestellten Versuch brauchte ich etwa 4 k(/ feste, nach E. Drechsel (Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 20. S. 1454 [1887]) dargestellte Phosphorwolframsäure. Man muß darauf achten, daß nach Zugabe der Fällungsflüssig- keit der Gesamtgehalt an Mineralsäure ungefähr S^/q beträgt. 1008 D. Ackermann. ein, bis der ganze überschüssige Baryt als Karbonat ausgeschieden ist. Vom Barvumkarbonat wird abfiltriert, nachgewaschen und nun dampft man die Lösung der kohlensauren Basen ein. Diese wird jetzt mit Salpetersäure bis zur schwachen Blaufärbung- von Kongopapier angesäuert, w^obei sich, wenn mau Pankreasfäulnis ver- arbeitet, ein noch nicht näher untersuchtes Öl abscheidet. Dieses beseitigt man am besten durch Ausschütteln mit Äther. Die salpetersaure, wässerige Basenlösung wird hierauf durch Einleiten von Luft vom Äther befreit, worauf man Silbernitratlösung hinzugibt so lange, als noch ein Niederschlag entsteht. Dieser Silberniederschlag I enthält Chlorsilber und Purinbasen. Man saugt ab und gibt zu dem Filtrat noch so viel Silbernitratlösung hinzu, daß man sicher ist, mehr von diesem Fällungsmittel verwandt zu haben als die Gesamtmenge der Basen verlangt, welche mit Silbernitrat und Baryt niedergeschlagen werden können. Man hat diesen Punkt erreicht, wenn ein Tropfen der Flüssigkeit mit einem Tropfen kalten Barytwassers auf einer Glasplatte zur Vereinigung gebracht nicht mehr eine weiße, sondern eine braune Färbung (von Silberoxyd) zeigt. Jetzt werden durch Zugabe von kaltem Barytwasser zwei weitere Silberfällungen erzeugt. Silberfällung II ist dann vollendet, wenn die überstehende Flüssigkeit mit ammoniakalischer Silberlösung nur noch eine geringe weiße Trübung- aufweist; ist man so weit gelangt, so saugt man die Silberfällung II ab, wäscht sie und setzt durch Schwefelwasserstoff die Basen in Freiheit; unter diesen ließ sich bisher nur eine Base, Cg Hg N5 Og, isolieren, die als Pikrat aus wässeriger Lösung niedergeschlagen und auch nur als solches analy- siert wurde. Silberfällung III erhält man, indem man zum Filtrate von Silber- fäUung II solange Barytwasser hinzugibt, als noch ein Niederschlag ent- steht. Auch dieser ist noch wenig untersucht. Bisher wurde nur Tetra- methylendiamin darin gefunden. Um dies zu gewinnen, muß man das Silber mit H« S beseitigen, dann die Flüssigkeit eindampfen, mit Salzsäure ansäuern und mit (ioldchlorid fällen. Das Filtrat von Silberfällung III befreit man durch Salzsäure vom überschüssigen Silber, durch Schwefelsäure vom Baryt und gibt nun zum Filtrate des Chlorsilbers und Baryumsulfats nochmals Phosphorwolfram- säure bis zur völligen Ausfällung. Am anderen Tage wird abgesaugt, der Niederschlag solange gewaschen , bis das Waschwasser salpetersäurefrei ^ ) ist und dann aus demselben eine Lösung der kohlensauren Basen genau in der gleichen Weise hergestellt, wie es oben geschildert wurde. Die Lösung dampft mau zum Sirup ein und fällt sie mit kalt ge- sättigter, alkoholischer Pikrinsäurelösung vollständig aus, läßt 12 Stunden stehen, filtriert ab und wäscht mit Alkohol. In diesem Niederschlag finden ^) Es ist von großer Bedeutung, daß die Salpetersäure völlig ausgewaschen wird. Tut man dies nicht, so hat mau später hei den mannigfachen Einengungen, denen die Lösungen der Basen unterworfen werden, unliebsame Oxydationen zu gewärtigen, be- sonders, da meist bei Gegenwart von Salzsäure gearbeitet wird. Die Isolierung von F'äulnisbasen. lUO'J sich nur Kadaverin und Putrescin: um sie zu trennen, müssen aus den l'ikraten die Chloride dargestellt ^verden. xMan löst sie zu diesem /weck in kochendem Wasser vollständig- auf und gibt zu der heißen Lösung so- fort konzentrierte Salzsäure im starken Üherschul). p]s hat sich dann, wenn das Ganze vollständig abgekühlt ist, schon ein großer Teil der Pikrinsäure abgeschieden, die man nach Kutscher jetzt gleich abfiltriert und mit ver- dünnter Salzsäure, in tler sie sehr schwer löslich ist, auswäscht. Das erste Filtrat und die Waschsalzsäure werden nun gemeinsam in einem großen Schütteltrichter mit Äther von den Resten der Pikrinsäure befreit, worauf man die Lösung der Chloride eindampft. Man nimmt diese öfters mit 96"/oi8'eni Alkohol auf und bekommt auf diese Weise eine Menge weißer Kristalle, die aus Putrescinchlorid bestehen') und durch l'berführung in das Goldsalz leicht identifiziert werden können. Im alkoholischen Filtrat findet sich Kadaverinchlorid , das als Platinat oder Chloraurat untersucht werden kann. Das Filtrat der Pikrinsäurefällung muß nun gleichfalls durch Pjehandeln mit Salzsäure und Äther iu eine wässerige Lösung von Chloriden verwandelt werden , die man zum Sirup eindampft und mehrmals mit absolutem Al- kohol abdampft; man bekommt dann eine nicht unerhebliche Quantität weißer Kristalle in die Hand, welche in überwiegender Menge aus Penta- methylendiaminchlorid und nur zum geringen Teil aus Tetramethylendiamin- chlorid bestehen und der Fällung mit Pikrinsäure entgangen waren. Man kocht diese Chloride mit ai^solutem Alkohol aus, filtriert diesen ab, wäscht die Kristalle mit absolutem Alkohol aus und hat nun in diesem alkoholi- schen Extrakt noch eine Reihe anderer Körper. Um sie zu isolieren, wird dieser jetzt mit alkoholischer Quecksilber- chloridlösung vollständig gefällt, die Fällung am anderen Tage abgesaugt und mit diesem Fällungsmittel ausgewaschen. ^lan erhält jetzt aj eine Queck- silberfäUung, b) ein Filtrat der Quecksilberfällung. a) Die Quecksill)erfällung wird in heißem Wasser unter Zusatz von etwas Salzsäure gelöst und mit H^S vom (^)uecksilber befreit, worauf man eindampft. Der Sirup auch dieser Chloride kann bei wiederholtem Auf- nehmen mit absolutem Alkohol nochmals Kristalle abscheiden, die aus Kada- verin- und Putrescinchlorid bestehen ; hat man diese dann beseitigt, so fällt man die Lösung mit alkoholischer Kadmiumchloridlösuug^) vollständig aus. Man erhält dann in der Fällung das Marcitin, im Filtrat das Putrin; beide werden als Goldverbindungen isoliert. h) Das Filtrat der Quecksilberfällung versetzt man jetzt abwechselnd mit alkoholischer Quecksilberchloridlösung und alkoholischer Natriumacetat- lösung, solange als keine dieser Flüssigkeiten mehr einen Niederschlag 1) Ist hier noch lvaIiunR'hh)ii(l lieigemengt, so kann man dasselbe durch Auf- nehmen der Kristalle mit Methylalkohol beseitigen. '-') Bei der Zersetzung von Kadmiumverhindungen mit Schwefelwasserstoff ist zu lieachten, daß dieselbe in der Kälte gcschieiit, da das Kadmiuinsulfid in warmem salz- säurehaltigen Wasser löslich ist. Abderhalden, llaudbuch der biocheinisrhen Arbeitsmethoden. II. (54 IQXQ D. Ackermann. gibt. Dann saugt man die schmierige Fällung am anderen Tage ab, löst sie in einem großen Kolben in viel verdünnter Salzsäure und beseitigt das Quecksilber durch Schwefelwasserstoff. Beim Eindampfen der Lösung wird die Essigsäure abgestoßen und Natriuuichlorid i) scheidet sich aus . das man durch häufiges Aufnehmen und Verreiben mit absolutem Alkohol be- seitigen muß. Man fällt die Mutterlauge des Kochsalzes mit heiß gesättigter alkoholischer Kadmiumchloridlösung und schlägt auf diese Weise die S-Äminovaleriansäure und dasViridinin nieder; um diese beidenBasen voneinander zu trennen, muß die mit alkoholischer Kadmiumchloridlösuug ausgewaschene Kadmiumfällung durch H, S in eine Lösung von Chloriden verwandelt werden, die man, zum Sirup eingeengt, mit •20"/oig'er alko- holischer Platinchloridlösung fällt. Die Fällung zerteilt man nach dem Al)- filtrieren durch Aufnehmen in Wasser in einen darin unlöslichen Teil, der aus Ammoniumplatinat besteht, in einen ziemlich schwer löslichen, haupt- sächlich das Platinsalz des Viridinins enthaltenden und schließlich in einen noch leichter löslichen Teil, der vorzugsweise aus dem S-Aminovaleriansäure- Platinat besteht; das letztere Salz findet sich auch noch im alkoholischen Filtrat der zuallererst ausgeführten Platinfällung. In derselben Fraktion wie die f^-Aminovaleriansäure zeigt sich ferner ein Körper, den ich für Mydatoxin halte; eine bequeme Trennungsmethode dieses mutmaßhchen Mydatoxins von der r^-Aminovaleriansäure existiert leider nicht. Man kann bisher nur durch fraktionierte Kristallisation der Platinate beider Körper etwas erreichen. Verfahren nach Gautier.-) Dasselbe ist verschiedentlich modifiziert worden. Bei Gelegenheit einiger später zu schildernder Basen wird eine Pieihe dieser Modifikationen in ihrer genaueren Anwendung angegeben werden. Wir geben hier zuerst die fol- gende allgemein anwendbare Extraktionsmethode. Die gefanlten Gewebs- massen werden in Breiform mit Wasser ausgekocht und aus den durch gelindes Erhitzen zum Sieden von Ammoniak befreiten Extraktflüssig- keiten nach dem Filtrieren vorhandene Eiweißkörper mit Bleiacetat ausgefällt. Aus dem Filtrat der BleifäUung entfernt man den Bleiüber- schuß mit Oxalsäure. Das schwach saure Filtrat vom Bleioxalatnieder- schlag wird zur Verjagung der flüchtigen Fettsäuren durch Destillation eingeengt, wobei man, solange das Destillat noch nach denselben riecht, von Zeit zu Zeit weitere, aber stets nur geringe Mengen Oxalsäure hinzu- gibt. Nachdem der Destillationsrückstand durch Versetzen mit dünner Kalk- milch von dem größten Teile der zugegebeneu Oxalsäure wieder befreit ist, dampft "man die Flüssigkeit — am besten im Vakuum — bis zur Konsistenz eines dicken Sirups ein, um diesem hierauf die Basenoxalate durch Be- ') Ich fand mit diesem vermengt auch hier noch etwas Tetramethylendiaminchlorid. ^) Guarcshi-Kunz-Kraiise, Einführung in das Studium der Alkaloide. Berlin 1896. S. 561. — Ä. Gantier, Traite de Chim. biolog. p. 262 (1892). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1011 handeln mit 98«/oigem Alkohol zu entziehen. Der nach dem N'erdunsten der alkoholisclieu Lösung hinterbleibende Rückstand wird mit wenig Wasser aufgenommen und durch Zugabe eines der Fliissigkeitsinenge gleichen (Ic- wichtes einer Mischung aus 2 Teilen Kreide und 1 Teil pulverigem Kalk- hydrat in einen homogenen Brei verNvandelt. Diesen erhitzt man hierauf solange im Wasserbade bei 35 — 40", als noch Ammoniak entweicht, wobei man zugleich in geeigneter Weise für die Kondensation etwa entweichender flüchtiger Basen Sorge trägt. Der rückständigen Masse werden hierauf alle nicht flüchtigen Alkaloide durch Auskochen mit 82''/oi8eni Alkohol entzogen. Nachdem aus der alkoholischen Flüssigkeit spurweise mit in Lösung ge- gangener Kalk durch vorsichtig bemessene Zugabe von Oxalsäure ausge- fällt ist, neutralisiert man die nochmals filtrierte alkoholische Lösung mit Salzsäure und bringt sie im Vakuum über Ätzkalk zur Verdunstung. Der Verdunstungsrückstand besteht aus den Chlorhydraten der vorhandenen Basen. Zur w'eiteren Trennung derselben versetzt man ihre wässerige Lösung mit Quecksilberchlorid, filtriert nach 24stündigem Stehen von dem etwa entstandenen Niederschlag ab und entfernt aus ihm das Quecksilber durch Schwefelwasserstoff, engt die Lösung der mit HgCL fällbaren Chloride etwas ein und fällt mit Kupferacetat zunächst in der Kälte, filtriert und fällt unter Erwärmen nochmals mit Kupferacetat, Avodurch die Purinbasen abgetrennt werden sollen. Jetzt wird nochmals abfiltriert und man hat nun aus dem Filtrat durch Schwefelwasserstoff das Kupfer zu beseitigen und schließlich die mit HgCl, fällbaren eigentlichen Fäulnisbasen als Chloride vor sich. Aus dem Filtrat der Quecksilberchloridfälluug muß das Metali durch Schwefelwasserstoff beseitigt werden, worauf man die so erhaltene Lösung der Chloride mit absolutem Alkohol aufnimmt, um anorganische Chloride, die jetzt ungelöst bleiben, abzusondern. Das alkoholische Filtrat von diesen wird eingedampft und mit Magnesiummilch destilliert, wobei die nicht flüchtigen im Destillationsrückstand bleiben und demselben durch Chloro- form oder Äther entzogen werden. Man kann aber auch das Destillieren unterlassen und statt dessen gleich mit Platinchlorid fällen, worauf die Basen, vermöge der verschiedenen Löslichkeit ihrer Platinate, abgeschieden werden können. Der nach der Alkoholbehandlung hinterbleibende Kalkrückstand kann noch einige feste Basen enthalten. Um auch diese zu gewinnen, säuert man denselben mit Oxalsäure schwach an und extrahiert ihn mit sieden- dem Wasser. Der wässerige Auszug wird nach dem Neuti-alisieren mit einigen Tropfen Kalkwasser filtriert und eingedampft. Der \'erdampfungs- rückstand enthält die in Alkohol schwer löslichen Basen. Der von Brieger gegen diese Methode erhobene Einwand, daß bei der Extraktion der alkahschen Basenflüssigkeit mit Chloroform (ielegen- heit zur Bildung von Carbylaminen gegeben sei, hat sich als grundlos erwiesen. 64* ]^Q2^2 ^- Ackermann. In der nun folgenden Besprechung der aus Fäulnisgemisclien und Bakterienkulturen gewonnenen Basen sind diese nach steigender Zahl der C -Atome geordnet. Methylamin, CH-,N, dargestellt aus faulen Fischen i), durch Ein- wirkung von Streptokokken auf Fibrin -) und der Einwirkung von Bac. fluores- cens liquefaciens auf Handelsgelatine 3), aus dem sogenannten Gärfisch*), aus giftiger Wurst 6), durch anaerobe Fäulnis von C'hoUn"), aus Tetanus- kulturen. ^) Das Methvlamin ist ein farbloses, mit gelber Flamme brennendes, bei — 6" zu einer farblosen Flüssigkeit verdichtbares Gas von ammoniakali- schem Geruch. 1 Vol. Wasser löst bei 12-öo 1150 Vol. Methylamingas. Es liefert eine gelbe Fällung mit Nesslers Reagens. Platinat, (CH5 N)2 • 2 H Gl . Pt Cl^, in kaltem Wasser schwer löslich, in Alkohol absolut unlöslich. Hexagonale Tafeln. Chlorid, CH5N.HCI, bildet, im trockenen Rohr erhitzt, ein Sublimat, das schmilzt, im Gegensatz zum Ammoniumchlorid, dessen Sublimat sich bei erneutem Erhitzen trocken ablöst. Pikrat, CH5 N . Cg H2 (XO, )3 OH, schwer lösUch. Schmelzpunkt 207°. Pikrolouat , CH3 N . 2 . Cio Hg N4 O5 , schwer löslich. Zersetzungs- punkt 244». Die Darstellung des Methylamins siehe bei der Brieger^d\e\i Methode. C2H5N''') wurde aus Kulturen von Cholerabazillen gewonnen. Bildet ein in Wasser schwer lösliches Platinat. Darstellung der Base C, H5 N nach J. Kunz. ?)00(j trockenes Serumeiweiß und vier frische, fein zerhackte Uchsen- pankreasdrüsen werden mit 0 l Wasser bei Bruttemperatur während 16 Stun- den stehen gelassen. Hierauf wird die Masse mit Essigsäure schwach ange- ') Bockliscli in Briegers Monographie über Ptomaine. III. und Bocklisch, Über Fäulnisbasen (Ptomaine) aus Fischen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 1922 (1885). ■■') Emmerlinq, Die Zersetzung von Fibrin durch Streptokokken. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 30.' S. 1863 (1897). •^) Emmerliny und Reiser, Zur Kenntnis eiweißspaltender Bakterien. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 35. "s. 701 (1902). ^) C.TIt. Mörner , Über ein eigentümliches Nahrungsmittel, nebst einigen Beob- achtungen über darin angetroffene Fäulnisbasen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 22. S. 514 (1896/97). ^) A. Ehrenberfi, Über einige in einem Falle von sog. Wurstvergiftung aus dem schädlichen Materiale dargestellte Fäulnisbasen sowie über einige durch die Tätigkeit eines besonderen, im gleichen Materiale aufgefundenen Bazillus gebildete Zersetzungspro- dukte. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 11. S. 239 (1886). ") Hasebrock, Über das Schicksal des Lecithins im Körper und eine Beziehung desselben zum Sumpfgas im Darmkanal. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 12. S. 148 (1888). ') Brieger, Zur Kenntnis der Ätiologie des Wundstarrkrampfes, nebst Bemer- kungen über das Cholerarot. Deutsche med. Wochenschr. Jg. 1887. S. 303 und 469. **) Kunz, Bakteriologisch-chemische Untersuchungen einiger Spaltpilzarten. Monats- hefte für Chemie. Bd. 9. S. 861 (1888). Die Isolienintr von Fäulnisbasen. KM;» Säuert, erwärmt und durch ein Tuch kollert. Die Flüssigkeit wird min mit Natriumkarbonat schwach alkalisch gemacht, filtriert und in gewohnter Weise sterilisiert. Jetzt infiziert man mit Cholerabazillen, läßt drei Tiige i)el H')" stehen und nun vävd nach Briegers Methode folgendeinialJen weitergearbeitet. Man säuert die Kulturen mit Salzsäure ganz schwach an, kocht auf, filtriert und dampft das Filtrat zum Siru]) ein. Jetzt wird mit 05«/olgem Alkohol aufgenommen, von cfen niedergeschlagenen liestandtellen abfiltriert, das Filtrat zum Sirup eingeengt und nochmals mit Alkohol aufgenommen, worauf man den alkoholischen Auszug mit alkoholischer Quecksilberchlorid- lösung fällt. Den so erhaltenen Niederschlag führt man durch IJehandeln mit Schwefehvasserstoff in eine Lcisung der Chloride über, welche mit Soda bis zur ganz schwach sauren Reaktion abgestumpft, eingeengt wird. Den Sirup nimmt man mit absolutem Alkohol auf. verjagt aus dem Auszug den Alkohol und extrahiert den so erhaltenen Rückstand nochmals mit absolutem Alkohol, worauf man diesen alkoholischen E.vtrakt mit alkoholischer Platinchloridlösung fällt. Der kristallinische Niederschlag wird abgesaugt und aus heißem Wasser zweimal umkristallisiert. Jetzt hat man noch ein Gemenge von mindestens zwei Salzen vor sich . aus dem dasjenige der gewünschten Base das in Wasser am schwersten lösliche ist. Man gewinnt es wohl am besten durch Aufschwemmen des Salzgemenges in kaltem Wasser und muß dann die Verbindung noch mehrmals Umkristallisieren, ehe sie rein ist. Die Formel (Ca H5 N).,.2H Cl.Pt CI4 wurde übrigens nur auf Grund von einer Kohlenstoff -Wasserstoff- und einer Platinbestimmung erschlossen. Eine Analyse des Stickstoffgehaltes konnte wegen Material- mangels nicht ausgeführt werden. Kunz hält die Rase für Spermin. Dimethylamin , C. H^N, gewonnen aus faulen Fischen, sowie aus Heringslake 1), aus faulem Leim'-), aus giftiger Wurst. 3) Es muß darauf aufmerksam gemacht werden, daß die Verdoppelunu der Formel des Dimethylamins die eines Köri)ers ergibt, der sich nur um 2H-Atome von dem Tetramethylendiamin unterscheidet: die Salze des Dimethylamins und Tetramethylendiamins differieren infolgedessen auch nur um 2 Wasserstoffatome. Es liegt deshalb die Gefahr vor, die beiden Körper miteinander zu verwechseln. Wir glauben, daß Brieger dies einmal getan hat, als er bei der Leim- fäulnis Dimethylamin statt Tetramethylendiamin gefunden haben wollte. Weiter aber muß man beachten, daß iuiuimolekulare .Mengen v«ui Mono- und Tiimethylamin das Vorhandensein von Dimethylamin vortäuschen können, denn die Summe von beiden Formeln der erstgenannten Körper (CH5N-I- + C3 Hg N = C4 Hi4 No) ist gerade doppelt so groß , wie die Fornud des Dimethylamins (C2H7N). 1) BocUisch bei Briei/er, Ptomaine. III. inul Über Fäuhiisbaseu (Ptomaiiie) aus Fischen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 86 (1885). 2) Brieger, Ptomaine. III. S. 53. ä) Ehrenber;/, \oq. cit. ]^Q|4 D- Ackermann. Das Dimetliylamin bildet eine farblose, bei + 7*2 — 7*o*^ siedende, iu Wasser und in Alkohol leicht löshche Flüssigkeit von ammoniakalischem, jedoch schon au Trimethylamin erinnernden Geruch. Mit Nesslers Reagens gibt es keine Fällung. Chlorhydrat. C2 H^ X . HCl, ist im Gegensatz zum ]\Ionomethylaminchlorid in Chloroform löslich. Nadeln. In Alkohol unlöslich. Platinsulf oeyanat, ([CH3],NH.HCXS)2.Pt(CNS)4, kristallisiert in oft- mals ziemlich langen Prismen oder Nadeln, es schmilzt unter Schwärzung bei 160 — 170° und ist wenig löslich in kaltem, leichter in heißem Wasser und in Alkohol unlöslich in Äther. Platinat, (CgH, N), 2HC1. PtCl4. Blättchen, die in heißem Wasser leicht, in kaltem nicht so leicht löslich sind. Aurat, CsH.N.HClAuCla. Große, monokline Tafeln. Pikrolonat, (CH3)2 NH.Cjo HgN^ 05, schwer löshch in Wasser und Alkohol. Zersetzungspunkt 222°. Pikrat, (CHaJaNH. CgHs N3 (\, in Wasser ziemlich löslich; Schmelz- punkt 156«. CoHgN.,. Aus faulem Leim.i) Das Chlorid ist in Wasser leicht löshch, in absokitem Alkohol unlöslich, bildet lange glänzende Nadeln. Mit Gold- chlorid entsteht keine Verbindung. Das Platinat, CsHg N.,.2 HCLPtCl^, ist in Wasser ziemlich schwer löshch. DarsteUung siehe bei der Methode Brieffers zur Gewinnung des Neuridius. Anthracin, C3 Hr N.,, aus mit Milzbrand vergifteten Kaninchen ge- wonnen. 2) Nähere Angaben über die Darstellung des Anthracins macht H". Chlorplatinat, (CH3N)2.2 HCl.PtCl4, besteht aus regelmäliigen, gelben, bei IQO'' schmelzenden Kristallen, die in Alkohol zieuüich schwer löslich sind, doch immer noch lösUcher, als die des Dimethylaminplatinates. das seinerseits wieder löslicher als das Monomethylaminplatinat sein soll. ^) Emmerlinr/ , Beitrag zur Kenntnis der Eiweißtauluis. Bcr. d. Deutsch, cliem. Ges. Bd. 29. S 2721 (189G). ^) Emmerliiui und Reiser, Zur Kenntnis eiweißspaltender Bakterien. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 35. S. 701 (1902). ^) C. Th. Mörner, Über ein eigentümliches Nahrungsmittel , nebst einigen Beob- achtungen über darin atigetroffene Fäulnisbaseu. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 22. S. 514 (1896/97). *) Carbone, t)ber die von Proteus vulgaris erzeugten Gifte. Zentralbl. f. Bakterio- logie. Bd. 8. S. 768 (1890); Riforma medica. Xr. 202 (1890); Zentralbl. f. klin. Medizin. Bd. 12. S. 594 (1891). ^} V. Malenchini, fJber Ptomaino im Käse. Zeitschr. f. Nahrungsmittclunters. und Hygiene. Bd. 7. S. 7 (1892). ^) A. Ehrenherg, tfber einige in einem Falle von sog. Wurstvergiftung aus dem schädlichen Materiale dargestellten Fäulnisbasen sowie über einige durch die Tätigkeit eines besonderen, im gleichen Materiale aufgefundenen Bazillus gebildete Zersetzungs- produkte. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 11. S. 239 (1887). ') Gautier mn\ Etard , Sur les produits derives de la fermeiitatiiMi Itnctprienne des albuminoides. Compt. rend. T. 97. p. 263 und 325 (1883). '[QXQ D. Ackermann. Platinsulfocyanat, (CHaN.HCNS)^ .Pt(CNS),, bildet rote Täfelchen, welche in Wasser wenig, in Alkohol leichter, in Äther nicht löslich sind und bei 175 — ISO'' unter Zersetzung schmelzen. Pikrat, (CHslg N . CeHgNä O7. Löslich in TT Teilen Wasser. Schmelz- punkt 216». Pikrolonat. (CH3)3N . C\o Hg . N4O5. Schwer löshch in Wasser und Alkohol. Zersetzungspunkt 250—252". Die Darstellung des Trimethylamins siehe bei der Methode Briegers. Ci H] 1 N, n-Butylamin , aus Lebertran {Gautier und Mourgucs'^). Durch Fäuhiis von d, 1-a-Aminoisovaleriansäure wurde von Neuberg und Karezag 2) ein Dutylamin erhalten, das wahrscheinlich Iso-butylamin war. Das Normal-Butylamin siedet bei T5-5o und ist löslich in Wasser. Das Chloroplatinat bildet goldgelbe, in kaltem W^asser schwer lösliche Blättchen; Gautier und Mourgues beschrieben ihr Butylaminplatinat als goldgelbe, leicht lösUche Blättchen. Darstellung siehe am Schlul) dieses Kapitels. Gewinnung von Iso-Butylamin nach Neuberg und Karezag. 10/7 razemische x\minoisovaleriansäure werden in AbO eui'^ heißem Wasser gelöst, bis zur schwach alkalischen Pieaktion mit Natriumkarbonat versetzt und nach Zusatz je eines Tropfens Chlorkalium. Dinatriumphosphat und Magnesiumsulfat mit einigen Tropfen eines Fäulnisgemisches versetzt. Nach vierw^öchentlichem Stehen im Brutschrank, während welcher Zeit öfters durch Zugabe von Soda für alkalische Pieaktion gesorgt werden muß, wird die Lösung mit 30 cni^ Schwefelsäure von 2070 angesäuert und im Dampf- strom ;»6 Stunden lang destilhert. Die Schwefelsäure wird jetzt aus dem Destillationsrückstand mit Barytwasser entfernt und die schwach alkahsche Lösung mit Äther ausgeschüttelt; den ätherischen Auszug säuert man mit Salzsäure an und destilliert dann den Äther ab. Hierauf wird der Rück- stand mehrmals mit heißem absoluten Alkohol extrahiert; man sammelt dann die alkoholischen Auszüge, verdunstet daraus den Alkohol, nimmt den Rückstand mit wenig Wasser auf und fällt jetzt mit einer konzentrierten Platinchloridlösung. Der kristallinische Niederschlag mrd noch einmal aus siedendem Wasser umkristallisiert und stellt jetzt reines Butylamin- platinat vor. C4 H j .. N., , Tetramethylendiamin ( Putrescin ; 1 . 4-Diaminobutan. NH.,CH2.CH2"CH.2CH.2.NH,), ist eine farblose, bei 156— 15To siedende Flüssigkeit, die im Geruch an Piperidin und zugleich an Sperma erinnert. Durch Abkühlen erstarrt dieselbe zu einer bei 23 und 24° schmelzenden blättrigen Kristallmasse; die Base ist mit Wasserdämpfen ziemlich schwer flüchtig und zieht CO., aus der Luft an. Das Putrescin ist ungiftig. *) Ä. Gautier und L. Mourgues, Sur les alcaloides de l'hnile de foie de morue. Compt. rend. T. 107, p. IIÜ et 626 (1889); Alcaloides volatiles de l'huile de foie de morue. Il.id. T. 107. 254(1889). ^) ] schmelzendes Chlorid. Leicht lösliches Chloraurat vom Schmelzpunkt 180". Schwer lösUches Platinat vom Zersetzungspunkt 240°. Pikrat löslich. Die Base ist mit Piperidin isomer, aber nach Brieger nicht mit ihr identisch. Darstellung des Tetanotoxins nach Brieger. 4— 6 Wochen alte Tetanuskulturen auf Piindfleisch '^) werden mit Salz- säure angesäuert, aufgekocht und filtriert. Das Filtrat. zum Sirup einge- dampft , wird mit w ässeriger Bleiacetatlösung und .Vlkohol versetzt. Vom Iiilöslichen wird dann abfiltriert, das Blei aus dem Filtrat mögUchst als Chlorl)lei entfernt, der Alkohol verdunstet und die letzten Spuren von Blei durch Schwefelwasserstoff weggeschafft. Das alsdann stark alkalisierte Filtrat wird nun im Dampfstrom destilliert, das Destillat mit Salzsäure angesäuert zur Trockne eingedampft und zwecks Ausscheidung des Salmiaks mit ^) D. Ackermann, Über die Entstehun,ff von P'äulnisbasen. Zeitschr. f. physiol. Chein. Bd. 60. S. 482 (1909). ^) D. Äckermann, Zur Kenntnis des Putrescins. Zeitschr. f. physiol. Clicm. Bd. 53. S. 545 (1907). ^) Ellingcr, 1. c. — D. Ackermann, Über die Entstehung von Fäulnisbasen. Zeit- schrift f. physioi. Chem. Bd. 60. S. 482 (1909). *) Anmerkung. Es muß bemerkt werden, daß diese Formel nicht möglich ist, da sie dem Gesetz der paaren Atomzahlen widerspricht. Eis müßte heißen C5H5NO., oder C5H-NO,. ^) (irijfiths, Sur une ptomaiue, obtenue par la culture du Micrococcus tetra- genus. Compt. rend. T. 115. p.418 (1892). *') Brieger, Über ein neues, Krämpfe verursachendes Ptomain. Ber. d. Deutsch, ciiem. Ges. Bd. 19. S. 3119 (1886). — Derselbe. Zur Kenntnis der Ätiologie des Wundstarrkrampfes, uebst Bemerkungen über das Cholerarot. Deut.sche med. Wochen- schrift. Jg. 1887. S. 304. ') Kitasafo und Weiil, Zur Kenntnis der Anaeroben. Zeitschr. f. Hygiene. Bd. 8. S. 404 (1890). ^) t^ber die Anstellung einer solchen Kultur siehe lieim Tetaniu. Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1019 absolutem Alkohol aufgenommen. Nach Verjagen des Alkohols fällt man die Base mit wässeriger Goldchloridlösung als ein in Blättchen kristallisierendes Doppelsalz. Bisweilen ist auch noch etwas Putrescin im Destillat enthalten, das durch sein schwer lösliches Pikrat abgetrennt werden kann. ^-Amino-n-valeriansäure, C5 H„ NO... Zuerst dargestellt von E. und H. Salkoivski aus gefaultem Leim und Eiweiß i), später von mir aus faulem Pankreasgewebe. 2) Anfangs fälschlich von mir als eine neue Base mit dem Namen Putridin beschrieben. Perlmutterglänzende Blättchen, die in Wasser löslich, in absolutem Alkohol fast unlöshch sind und bei 157 — 108" schmelzen. Sie verhält sich im Gegensatz zu a-Aminosäuren indifferent gegen Kupfer- acetat, Kupferoxyd und auch indifferent gegen ammoniakalische Silber- lösung und fällt mit Phosphorwolframsäure. Das Chlorid destilliert, trocken erhitzt , zum groben Teil unzersetzt.^) Die f^-Amino-n-valeriausäure leitet sich bei der Fäulnis vom Arginin her. ^) Sehr charakteristisch ist das schöne, allerdings in Wasser nicht sehr schwier lösliche Goldsalz, C5 H, 1 NO2 . HCl . AUCI3 + H2 0 , das orangegefärbte, monokline KristaUe bildet vom Schmelzpunkt 8H — 87«. Das Platinat ist in Alkohol ziemlich schwer lösüch. Die a-Naphtylisocyanat- verbindung schmilzt bei 195 — 196". Über die Gewinnung der Base, denn als solche kann man den Körper wohl ansprechen, siehe das Verfahren von Ackermann und Kutscher. Anders gingen zur Isolierung des Körpers die Entdecker selbst vor. Isolierung der S-Amino-n-valeriansäure nach E. und H. Salkowski. 2 kg gut ausgewaschenes Blutfibrin , 8 l Wasser . 2 y Kaliummono- phosphat und 1 g Magnesiumsulfat + 200 cw^ gesättigter Sodalösung mit einigen Tropfen und Stückchen einer Fleischfäulnis versetzt, werden 6 Tage bei 42" belassen. Jetzt destilliert man, bis der Rückstand dick wird, gibt von neuem Wasser zu und destiUiert nochmals. Nun wird der Piückstand mit Chlorbarvumlösung versetzt, wobei die höheren Fettsäuren als Baryt- seifen ausfallen. \'on ihnen und dem sonstigen Niederschlag wird abfil- triert, das Filtrat mit Salzsäure angesäuert und mit Äther ausgeschüttelt, um weitere Säuren zu beseitigen. Jetzt dampft man den wässerigen, aus- geätherten Teil, welcher an Mineralsubstanzen vor allem Kochsalz und Chlorbaryum enthält, möglichst vollständig zur Trockne ein und nimmt ihn mit absolutem Alkohol auf. Der alkoholische Auszug wird verdunstet und der Rückstand noch so oft mit absolutem Alkohol aufgenommen, bis ^) E. und H. Salkoirski , Über basische Fäulnisprodukte. Ber. d. Deutscli. ehem. Ges. Bd. 16. S. 1191 (1883); Über Ö-Aminovaleriansäure. Bd. 31. S. 77<5 (1898). ") IJ. Ackermann, Ein Fäulnisversuch mit Arginin. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 56. S. 305 (1908). ^) D. Ackermann , tjber die Entstehung von Filulnisbasen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 60. S. 482 (1909). J^020 ^- Ackermann. man ein vollständig in diesem Lösungsmittel lösliches Chlorid vor sich hat, welches hei längerem Stehen im Exsikkator strahlig kristallinisch erstarrt. Man gibt zur alkohoüschen Lösung dieses Chlorides nun alkoholische Platinchloridlösung und führt den so erhaltenen Niederschlag nach dem Zersetzen mit HgS in ein Goldsalz über. C5Hi2N.2()4. Aus faulen Knochen. Fleisch etc. M Platinat in Alkohol und in Äther unlösUch. Die Darstellung sieh bei der Base CyHigNaOg. CsHi.N. Isomylamin, (CHjla . CH . CH.CH., . XH,. Aus Lebertran, im Tieröl, aus gefaulter Hefe. 2) Ferner aus fauler Plazenta 3), aus gefaultem Pferdefleisch.*) Farblose, stark alkalisch reagierende, bei 96— 98° siedende Flüssigkeit von unangenehmem Geruch. Das Chlorid lüldet schöne zerfließliche Kristalle von unangenehmem, bitterem Geschmack. Platinat kristallisiert in dünnen, goldgelben, in siedendem Wasser leicht löshchen Blättchen. Über die Isoherung dieses Körpers neben p-Hydroxyphenyläthylamin und Phenyläthylamin aus faulem Pferdefleisch siehe die beim ( Jxyphenyläthyl- amin geschilderte Methode von Barger und Wal pole. Das Isoamylamin soll bei der Fäulnis aus Leucin durch Abspaltung von CO., entstehen. Sepsin, CsHi^N.oO.,. Aus fauler Hefe.^) Aus den Bouillon- und Agarkulturen eines als Bacterium sepsinogenes bezeichneten Bazillus. ") Li Wasser und Alkohol leicht lösliche, in freiem Zustande nicht haltbare Base. Auch das Sulfat, C5H1.2N2O2 . H0SO4. welches zur Isolierung und Analyse diente, hält sich nicht lange , ist leicht lösUch in Wasser , schwer löshch in Alkohol und bildet eine aus verfilzten Nadeln bestehende volu- minöse Masse. Durch häufiges Eindampfen des Sulfates verwandelt es sich unter Verlust von O., in Kadaverinsulf at. Weitere qualitative Pieak- tionen siehe im Original. Darstellung des Sepsins nach Faust. ^lan läßt etwa 5 kg^ am besten gewaschene, Preßhefe, mit etwa o bis o'/, / Wasser übergössen, im Sommer im Freien stehen. Nach etwa vier- wöchentlichem Stehen hat meist die Hefe die gewünschte Giftigkeit er- reicht , von deren A'orhandensein man sich aber erst überzeugen muß, sonst hat die weitere Verarbeitung keinen Sinn. — Man injiziert zu dem ') Ponchet, Recherchcs siir les ptomaines et composes analogues. Compt. rend. T. 97. p. 1560 (1883). ^) A. Müller, Jahresber. über die Fortschr. d. Cbemie. Jg. 1857. S. 403. ^) Rosenheini, The pressor principles of placenta extracts. Journ. of Physiol. Vol. 38. p. 337 (1909). ^) Barqer und Walpole, Isolation of the pressor principles of putrid meat. Journ. of Physiol. Vol. 38. p. 343 (1909). ^) Faust, Über das Fäulnisgift Sepsin. Archiv f. exper. Path. u. Pharm. Bd. 51. S. 248 (1904). ^) Fornet und Heubner , Versuche über die Entstehung des Sepsins. Archiv f. exper. Path. u. Pharm. Jg. 1908. Suppl. Schmiedebcrg-FG?,\.%Q\iv\h. S. 176. Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1021 Zwecke 20 cm'^ der Fäulnisflüssigkeit , nachdem sie durch Papier filtriert ist, einem Hunde von 6 — 'S kg Körpergewicht langsam in die Vena saphena, worauf das Tier innerhalb 12 Stunden unter folgenden Erschei- nungen sterben muß. Zuerst zeigt sich Beschleunigung und Vertiefung der Respiration und oft schon während der Injektion Erbrechen imd nun ver- stärkte Darmperistaltik mit Kotentleerungen, die immer dünnflüssiger und zuletzt ganz blutig werden. Schließlich wird die Atmung tief und wenig frequent und in komatösem Zustande, ohne Krämpfe, geht das Tier zugrunde. — Bei der Sektion zeigt die Magen- und Darmschleimhaut starke Hyperämie mit Ekchvmosen. Hat die Hefefäulnis diesen Wirkungsgrad erreicht, so wird sie zu- nächst unter öfterem Umrühren 24 — 86 Stunden auf dem Dialysator ge- lassen. Das alkalische Dialysat wird nun mit Salzsäure schwach ange- säuert und mit Sublimatlösung versetzt; von dem hierdurch entstehenden geringen Niederschlag filtriert man ab ; das Filtrat soll jetzt ca. 20 1 betragen; es wird mit Sodalösung stark alkalisch gemacht und nun mit Quecksilberchloridlösung M und Natriumkarbonatlösung solange versetzt, als noch ein Niederschlag entsteht. Um nun gut abfiltrieren zu können, gibt man am besten etwas Kochsalzlösung hinzu, wodurch die Flüssigkeit sich klärt; der Niederschlag muß nun solange gewaschen werden, bis das Waschwasser desselben neutral reagiert; zu dem Zwecke schwemmt man ihn am besten in einem hohen, engen Standgefäß auf, läßt absitzen und hebert die überstehende Flüssigkeit ab ; schließlich saugt man den Queck- silberniederschlag noch einmal scharf ab. Das Natriumkarbonat muß näm- lich sorgfältig entfernt werden. Auch muß berücksichtigt werden, daß sich der Quecksilberniederschlag bei Licht unter Dunkelfärbung schwarz färbt, solange die ihn umgebende Flüssigkeit alkalisch ist und gleichzeitig das Sepsin hierbei zerstört wird. Man arbeite also möglichst an einem dunklen Ort, jedenfalls nicht im intensiven Tageslicht. Die Quecksilberfällung zersetzt man nun mit Schwefelwasserstoff, saugt vom Schwefehiuecksilber ab und beseitigt aus dem Filtrat das überschüssige Gas durch Einleiten von Luft. Zur Entfernung der Salzsäure wird die Flüssig- keit dann mit frischem, sorgfältig gewaschenem, kohlensaurem Silber versetzt und dann vom Chlorsilber und überschüssigem Silberkarbonat abfiltriert. 2) Das Filtrat wird durch Einleiten von Schwefelwasserstoff vom ge- lösten Silber befreit und nachdem dieses abgesaugt und der überschüssige *) Man kann hierzu eine alkoholische Lösung nehmen, um die Flüssigkeit niclit zu sehr anschwellen zu lassen. -) Anmerkung: Die Entfernung der Salzsäure kann auch in der Weise geschehen, daß man während der Zerlegung des Quecksilherniederschlages mit H, S Natriumkarbonat in kleinen Mengen zugibt, so daß die überstehende Flüssigkeit immer nur noch schwach sauer reagiert. Ist die Zersetzung des Niederschlages eine vollständige, so wird abfiltriert und nun das schwach saure Filtrat vollständig neutralisiert oder schwacli alkalisch ge- macht, darauf, wie im obigen weiter geschildert, eingeengt und der Kückstand mit Alkohol ausgezogen, wobei nur geringe Mengen Kochsalz in den Alkohol übergehen. Auf diese Weise wird das Verfahren einfacher und billiger. X022 ^- Ackerniaun. Schwefelwasserstoff durch Lufteinleiteu entfernt ist, hat man ca. 5 — 8/ einer alkahschen, gelben Flüssigkeit vor sich, welche die geschilderte Gift- ^^^rkung aufweist, allerdings, aus unbekannten Gründen, nicht immer. Ist sie noch giftig, wovon man sich jetzt durch einen besonderen Versuch überzeugen muß, so engt man sie mit Hilfe des in Bd. I, S. 162 und 16;-5 dieses Werkes geschilderten Apparates ein, und zwar bei 22 — 23°; nach 6 — 8 Stunden ist das Wasser verjagt (ist die Außenluft feucht, so dauert es länger). Man nimmt den Rückstand jetzt mit möglichst wenig Wasser auf, filtriert und läßt das Filtrat im ^'akuumexsikkator eintrocknen. Jetzt wird Alkohol zugegeben, vom ungelöst bleibenden abgesaugt und das alko- hohsche Filtrat tropfenweise mit in Alkohol gelöster konzentrierter Schwefel- säure versetzt. Nach 12 — 18 Stunden hat sich ein feiner Anflug von teils kristallinischer, teils amorpher Beschaffenheit gebildet. Die klare alkoho- lische Lösung wird dann abgegossen und nochmals wenig alkoholische Schwefelsäure zugesetzt. Diese zweite Fällung, scheinbar amorph, wird beim Stehen bald kristallinisch und enthält in der Hegel die Hauptmenge des Sepsinsulfates. Durch vorsichtigen Zusatz von Äther kann man dann unter Umständen noch^ weitere Mengen dieses Salzes gewinnen. — Das Sepsinsulfat wird durch Lösen in Wasser und Wiederausfällen mit Alkohol gereinigt und stellt feine Nadeln von 1/2 — V4 ^"^ Länge vor. Aus 5 kg Preßhefe wurden 0-03 g Sepsinsulfat erhalten, doch lieferten eine Reihe von Versuchen überhaupt keine Ausbeute an Substanz. C5 Hl 4 N... Es sind folgende 4 verschiedenen Basen mit dieser Formel beschrieben. 1. Pentamethylendiamin. (Kadaverin, 1.5-Diaminopentan, NHo-CH^ CHo . CH, . CH2 CH, NH.,.) Die Base bildet eine farblose, sirupdicke, in Wasser und Alkohol leicht, in Äther schwer lösliche Flüssigkeit von penetrantem Geruch nach Piperidin und Sperma. Spez. Gew. 0-9174 bei 0": Siede- punkt 175—178". In Berührung mit Luft bildet die Base Nebel und zieht daraus Kohlensäure an. Die Identität der als Ptomain vorkommenden Base Kadaverin mit dem synthetischen Pentamethylendiamin wurde von Laden- hurg und BocUisch durch Überführung derselben in Piperidin erwiesen. Es bildet gut kristaUisierende Salze. Chlorhydrat, C5 Hj^ Ng . 2 HCl, kristallisiert in farblosen Prismen. Es ist in absolutem Alkohol schwer lösUch. in 97Voi§'em aber leicht löshch. was zur Trennung von dem in y77oi8'^n Alkohol schwer löslichen Tetra- methylendiaminchlorid dient. Brieger gibt an, das Pentamethylendiamin- chlorid sei an der Luft zerfließlich, GulewHsch^) bestreitet dies, ich aber sah den Körper nach längerem unbedeckten Stehen im Laboratorium zer- fließen. Ich glaube, daß der wechselnde Feuchtigkeitsgehalt der Luft an der Verschiedenheit dieser Angaben Schuld ist und möchte auf das ganze Phä- nomen überhaupt keinen Wert legen. Das Chlorid zerfällt bei der trockenen Destillation in Ammoniak, Salzsäure und Piperidin. ^) GuUivitsch, tJber Kadaverin und Cboliu aus faulem Pferdefleisch. Zeitschr. i. physiol. Chem. Bd. 20. S. 287 (1895). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 102.'> Das riatindoppelsalz, CV, H,^ N., . 2 HCl . Pt CI4, outstolit in der Lösung' des Salzsäuren Salzes auf Zusatz von alkoholischer Platinchloridlösunü;- als gelber Niederschlag; es ist in 70*8 Teilen Wasser bei 21" löslich, kristallisiert aus Wasser in Prismen oder Nadeln und schmilzt bei etwa 215". Platinsulfocyanat, C5 H^^ N, (HCNS)2 . Pt. (CNS j^, kristallisiert in schönen langen Nadeln oder kurzen Prismen von orangegelber Farbe, die bei 1(30° anfangen sich zu bräunen und bei 176^ sich schwärzen, ohne jedoch zu schmelzen; es ist löslich in warmem Wasser und in Alkohol, unlöslich in Äther. Chloraurat, C5 H,4 No . 2 HCl . 2 Au CI3, bildet in Wasser nicht allzu schwer lösliche Prismen vom Schmelzpunkt 186 — 188". Oxalat, C5 Hi4 Ng . C, Hj 0, + 2 HgO. kristallisiert aus siedendem Alkohol in Nadeln, welche bei IßO" unter Gasentwicklung schmelzen. Das saure Oxalat, Cr, Hi4 N2 . 2 C2 H, O4 + H2 0, kristallisiert aus verdünntem siedenden Alkohol in quadratischen bei 14;)" unter Zersetzung schmelzenden Tafeln ; es ist, wie das neutrale Salz, in absolutem Alkohol und Äther unlöslich. Quecksilberchloriddoppelsalze werden zwei gebildet, C,-. H^^ N« . 2 HCl . SHgCls und C5H14N2 . 2HC1.4HgCl2, von denen das letztere aus sieden- dem Wasser in bei 216" schmelzenden und in i]2'o Teilen Wassers von 21" löslichen Nadeln oder Blättchen kristallisiert. Dieses Salz verliert beim Erhitzen schon von 95° an Quecksilberchlorid. Diacetylderivat. C^H^o (NHCOCH3)2, entsteht durch Erhitzen der Base mit Essigsäureanhvdrid. Es kristallisiert aus siedendem lUkohol in kleinen Nadeln und destilliert oberhalb 360", ohne Zersetzung zu erleiden. Das Pentamethylendiamin reagiert schon in der Kälte mit Cyanessig- säureester, wobei ein Dicyanacetylderivat entsteht, C5 Hi2N2(CNCH2CO)2, das farblose, bei lo-t — 106" schmelzende Kristalle bildet. Dibenzoylverbindung, C5 H^« (NH . CO . Cg H5 h, schmilzt bei 130". Hier- über und über das Diphenyldicyanatpentamethylendiamin vgl. den Abschnitt über Harnbasen. Die Dibenzoylverbindung ist unlöslich in Wasser, löslich in Alkohol, aber aus dieser Lösung durch Äther nicht fällbar und schmilzt !)ei 130*^. Sie ist widerstandsfähig gegen starke Alkalien und Säuren und wird erst durch anhaltendes Kochen ihrer alkoholischen Lösung mit starker Salzsäure in Benzoesäure und salzsaui'es Pentamethylendiamin gespalten. Pikrat, C5 H^^ N2 2 (Cg H, [N0o].3 . OH), ist in Wasser sehr wenig löslich, kristallisiert in dünnen Nadeln oder langgestreckten Tafeln und schmilzt bei 221" unter Schwärzung. Pikrolonat, C.^ Hj^ N, . 2 C^o H« N^ O5, orangegelbe Nadeln und Täf eichen, in AVasser und Alkohol schwer löslich, aber löshcher als Putrescinpikrolonat; es zersetzt sich bei 250". Das Pentamethylendiamin wurde aufgefunden in gefaultem Fleisch von Pferden, in faulen Fischen, menschlichen Leichen, Cholerakulturen, gefaultem Eiweiß und Blut und Kulturen des Finkler-Priorschen Bazillus ' ), 1) Brieger, Ptomaine. II, III. — Bocklisch, Über Fäulnisbasen (Ptomaine) aus Fischen. Ber. d. Deutsch, choin. Gesellsch. Bd. 18. S. 1924 (1885). — Finkler und Prior, 1024 ^- Ackermann. in Tetaiiuskulturen M, im Emmentaler Käse 2), in frischem Pankreas 3), aus Pankreasautolyse, bei der die Fäulnis ferngehalten wurde*), aus Autolyse von Schweiuemagen ^), aus peptischer Verdauung von Ovalbumin"). aus gefaultem Lysin -), bei Destillation von Lysin ^j, im Harn von Cystinuri- kern^), in den Fäzes eines Patienten mit Dysenterie und Malaria.^") Die Entstehung des Pentamethylendiamins bei der Fäulnis aus Lysin ist sicher erwiesen.") Die Base ist ungiftig. 2. Neuridin, C5 H14 N2, soU eine unangenehm riechende gelatinöse Base darstellen, die in Wasser leicht löslich ist, sich aber in Alkohol und Äther nicht löst. Beim Kochen mit Natronlauge sah Britger die Base in Di- und Trimethylamin zerfallen; die Isonitrilreaktion konnte er damit nicht erhalten, so daß er zu dem Resultat kommt, das Neuridin sei keine primäre, sondern eine tertiäre Ammoniumbase und müsse in irgend einer Beziehung zum Neurin stehen : dies suchte er durch den Namen Neuridin anzudeuten. rhlorhydrat, C5H14N.2 . 2 HCl, bildet in absolutem Alkohol, Äther und Amylalkohol unlösliche Nadeln. In nicht ganz reinem Zustande wird es jedoch von den letztgenannten Lösungsmitteln mehr oder minder aufgenommen. tiber Ptomaine aus Reinkulturen von Vibrio Proteus. Ber. d. Deutsch, cbem. Gesellsch. Bd. 20. S. 1441 (1887). ') Bfifc/er , Zur Kenntnis der Ätioloffie des Wundstarrkrampfes, nebst Bemer- kungen über das Cholerarot. Deutsch, med. Wochenschr. S. 303 (1887). ^) Winferstein und TJiöii;/, Beiträge zur Kenntnis der Bestandteile des Emmen- taler Käses. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 36. S. 28 (1902). ") Weri(/o, Über das Vorkommen des Pentameth\lendiamins in Pankreasiufusen. Pflugers Arch.' Bd. 51. S.362 (1892). *) Emerso» , Über das Auftreten von Oxyphenylaethylamin bei Pankreasver- dauung und über fermentative COj-Abspaltuug. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. 506 (1902). — Magnus- Levy, Über die Säurebildung bei der Autolyse der Leber. Ebenda. Bd. 2. S. 288 (Fußnote) (1902). — Kutscher und LoJiniaiin (Die Endprodukte der Pan- kreasselbstverdauuug. 111. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 41. S. 332 [1904]) fanden das Peutamethvlendiamin und Putrescin bei Pankreasselbstverdauung nicht ; ihnen schließt sich der Befund E. Abderhaldens an (Lehrb. d. physiol. Chem. S. 353 [2. Aufl. 1909]), welcher unter sorgfältiger Ausschaltung von Bakterien unter der Wirkung reinen Pankreas- und Älagensaftes kein Diamin fand. ^} Lawrow, Zur Kenntnis des Chemismus der peptischen und tryptischen Ver- dauung der Eiweißkörper. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 33. S. 312 (1901). ^j Langstein, Zur Kenntnis der Endprodukte der peptischen Verdauung. Hof- meisters Beiträge. Bd. 2. S. 229 (1902). ') Ellingcr, Die Konstitution des Ornithins und des Lysins. Zucleich ein Beitrag zur Chemie der Eiweißfäulnis. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 29. S. 334 (1900). ^) Neuherg, Zur Kenntnis der Diamine. Zeitschr. f. phvsiol. Chem. Bd. 45. S.118 (1905). ^) Baumann und v. Vdranskg, Das Benzoylchlorid als Reagens. Ber. d. Deutsch, chem. Ges. Bd. 21. S. 2744 (1888). — Dieselben, Über das Vorkommen von Diaminen, sog. Ptomaineu bei Cystinurie. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 13. S. 562 (1889). — Löu-g und Neuberg, Über Cystinurie. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 43. S. 338 (1904—1905). '") Roos, l'ber das Vorkommen von Diamiuen bei Krankheiten. Zeitschr. f. phvsiol. Chem. Bd. 10. S. 192 (1892). ") Ä. Ellinger, loc. cit. — D. Acker)nann. Über die Entstehung von Fäulnisbasen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 00. S. 482 (1909). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1025 Pikrat, CgHuNoCCeHo [NO.ls OH).,, besonders schwor löslich in kaltem Wasser, nach Bricyer sehr geeignet zur Trennung des Neuridins vom Cholin, welch letzteres ein leicht lösliches Pikrat liefert. Hat keinen Schmelzpunkt, bei 2300 beginnt es, sich unter Ausstoßung gelber Dämpfe zu bräunen und verkohlt bei 250" gänzlich. Cliloraurat C5H14N., . 2HC1 . 2 AuClj, in Wasser schwer löslich. Chlorplatinat, CöHi^N, . 2HC1 . PtCl^, kristallisiert in schönen, in Wasser löslichen Nadeln, aus der wässerigen Lösung wird es durch Alkohol ausgefällt. Methode zur Gewinnung des Neuridins. Das beste Ausgangsmaterial für die Darstellung des Neuridins ist nach Briegcr fauler Leim. 1) 2Tcg gewöhnlichen Tischlerleims, in 5 ^ Wasser unter Zusatz von etwas Schlemmkreide gehist, werden mit einigen Tropfen in hochgradige Fäulnis übergegangenen Eiweißes infiziert und 10 Tage lang einer Temperatur von ?)b^ C ausgesetzt. Die Fäulnis ist nach Ablauf dieses Termines sehr weit vorgeschritten und der größte Teil des Leimes durch den Fäulnisprozeß absorbiert. Das Gemenge wird nun mit Salzsäure schwach angesäuert, auf dem Wasserbade eingedampft und der Rückstand wiederholt mit Alkohol erschöpft. Die mehrmals durch Eindampfen und Wiederaufnahme mit Alkohol von anorganischen Bestandteilen und unzer- setztem Leim befreiten Auszüge werden nun durch Kochen mit Tierkohle von harzigen und gefärbten Beimengungen getrennt und darauf in Alkohol gelöst. Die durch Platinchlorid in diesem gereinigten alkoholischen Auszuge erzielten Niederschläge werden wiederholt aus heißem Wasser umkristalli- siert, worauf man zu dem in prachtvollen Warzen anschießenden Platinat des Neuridins gelangt; in den Mutterlaugen desselben findet man das Platinat der Base CsHgN,. Außer in faulem Leim fand Briegcr das Neuridin noch unter den Fäulnisprodukten mancher anderer Stoffe, wie Fleisch 2), Dorsch 3), Kuhkäse*), Eigelb 5), Barsch 6), Eeinkulturen von Typhusbazillen, menschliche iMUgcweide, wie Lunge, Milz, Niere, Herz, Leber.-) Das Neuridin ist aul/ier von Khrtn- berg^), der es in vergifteter Wurst gefunden haben will, von niemandem wieder beobachtet. Guleidtsch^) suchte es vergebens in ganz frischem Ge- hirn. Das Neuridin ist ungiftig. ^) Brieger, Ptomaine. Bd. 1. S. 53. ^) Ptomaine. Bd. 1. S. 57. 8) Ptomaine. Bd. 1. S. 43. *) Ptomaine. Bd. 1. S. 51. 5) Ptomaine. Bd. 1. S. 58. «) Ptomaine. Bd. 3. S. 44. ') Ptomaine. Bd. 2. S. 17 und folgende Seiten. *) Ehrenherg, Über einige in einem Falle von sog. „Wurstvergiftung" aus dem schädlichen Materiale dargestellte Fäulnisbasen sowie über einige durch die Tätigkeit eines besonderen, im gleichen Materiale aufgefundenen Bazillus gebildete Zersetzungs- produkte. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 11. S. 23Ü (1887). 9) Gulewitsch, Über Leukomaine des Ochsengehirns. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 27. S. 50 (1899). Abderhal dou , Handbuch der biocheraischen Arbeitsmethoden. II. 65 1026 I^- Ackermann. 3. Saprin, C5H14N0. wurde nur einmal von Brieger aus gefaulten menschlichen Organen/) dargestellt. Der Unterschied dieser Base vom Pentamethylendiamin besteht nach Brieger erstens in der großen Löslich- keit des Saprinplatinates in Wasser, ferner soll das Saprinplatinat parallel aggregierte spießige Kristalloide bilden, im Gegensatz zu der Ehombenform des Kadaverinplatinates. Auch soll das Saprin mit Goldchlorid gar keine Fällung geben, während das Pentamethylendiamin mit diesem Fällungsmittel ein, wenn auch ziemhch leicht lösliches Goldsalz liefert. Das Saprin ist ungiftig. 4. Gerontin, C^Hj^N.,. Diese mit Kadaverin isomere Base Avurde von V. Grandis^) in den Leberzellen alter Hunde aufgefunden und von ihm in den Laboratorien von Guareschi und Mosso untersucht. Das Gerontin bildet eine dickflüssige alkalische Flüssigkeit von eigentümhchem Geruch, es gibt sämtliche allgemeine Reaktionen der Alkaloide. Längere Zeit sich selbst überlassen, verharzt es. Chlorhydrat Cg Hi^N., . 2HC1, bildet kleine, rektanguläre Prismen. Chlorplatinat, C5 H^, No . 2 HCl . Pt Cl„ dicke, nadelfö^rmige Kristalle. Der Arbeit von Grandis entnehmen wir nachstehende Zusammen- fassung der Hauptdaten (s. Tabelle I und H), welche zurzeit über die bis jetzt bekannten Basen der Formel C5H14N2 ermittelt sind; den vier oben be- sprochenen ist hier noch das synthetisch gewonnene Methyltetramethylen- diamin hinzugefügt. Es scheint mir hier der Ort dafür, darauf hinzuweisen, daß doch mögücherweise die oben geschilderten Basen Neuridin, Saprin und Gerontin mit dem Pentamethylendiamin identisch sind; es spricht so manches für diese Annahme ; wenn auch die genannten Körper sich in einer Reihe quali- tativer Pieaktionen und in den Eigenschaften mancher ihrer Salze ver- schieden verhalten sollen, so ist doch die Übereinstimmung in manchen wesentlichen Punkten eine nicht unerhebliche. Was das Neuridin angeht, so ist es auffälhg, daß dieser Körper in den ersten iMitteilungen Briegers sehr regelmäßig genannt wird als ein Produkt von Fäulnismassen der ver- schiedensten Herkunft, das Kadaverin aber, dessen Allgegenwart in Flüssig- keiten, die gefaultes Eiweiß enthalten, doch jetzt bekannt ist, fast nie neben dem Neuridin aufgeführt wird. Erst später, als Brieger einen neuen Körper der Formel CgHi4N2 im Kadaverin entdeckt zu haben glaubt, findet sich dasselbe immer regelmäßiger. Man kann sich dieses Mißverhältnis mit Briegers Angabe erklären, daß das Neuridin am 5. — 6. Tage der Fäulnis am reichlichsten auftrete, am 8. Tage aber gewöhnlich schon verschwunden sei, und in der Tat dauerte die Fäulnis bei den späteren Versuchen Briegers viel länger, als bei den ersten; indessen einfacher ist die Annahme, daß beide Körper identisch sind. Man wird einwenden, Brieger habe doch aus dem Neuridin Di- und Trimethylamin dargestellt und die Isonitritreaktion 1) Ptomaiue. Bd. 2. S. 46. ") V. Grandis, Sulla composizione tlella base che si trova cristallisata dentro il luicleo dellc cellule epatiche. Rend. della R. Acc. dei Lincei 6. p. 230 (1890). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1027 «3 ä o c 's -^ ST" > » a "l* Vn E J _ I ^ = o rt ± :; o X (u g^ CS O ^ ?^ tll a 3 3 M " a "^^-a 52 o o ^, _ö u o > zn Ai o ^+-* ii: o O ^ o Oi w cä a j a = ^ a 5 'SS HH ^ cc es TS .SP '- TT fa J3 5 a r- " .a 1^ .2 -2 s .2 .^ -i a 0) ; s X 1 « J3 g - 2 o ■^ u "" a a-2-a -a c2 a CJD — o Ti, -^ -r; o ;^ :S CO rt t: ^ "3 CO au CO 1^ Ol t» «J CS S a ^: xn O ^ a .3 .5 ITo 3 O O C^l ~ i: . ^ -a ^ = J S^:^'S 2 "^ -3 cß "t; "3; .3 O :0 r— -3 -^ -3 o a 3 -S. "1:; o ^^ H^ 3 «j 3h ^ *"* a 02 cß ^ _< i o 8 'S bc o ca o o a Ol 4) bJD o ö Ol ■ o a c~ « 7-1 bß-M 3: ^ 03 ^ Cß ^ CS .2 (2; 00 43 cä bc CO — 43 3M 13; -w 0^ a bc a S 03 3 Q* ^ Oc N ü N 03 rS 03 a =0 a -a T^-a CJ DO 0 CO '3 CO 03 CS .2 'S c es a c o ü cS eS O eS S-i bc !h cS -a o O .3 P ^^ c3 > frn 1s ü; Ca *— < 0 0 N a 03 m ^ 5 65^ 1028 D. Ackermann. CS twinkligcn F Nieder- len beste- ag, dessen Grün und ramiden begrenzte rismen. bjj CO weise ver- tehender ag. amorpher tenförmig n. löslichen derschlag. euder, aus ämatischen ederschlag. bi) c Sh :03 03 _b' a o 03 er, in rech llisierende chlag. en Krista N^iedersch] d nach in übergeht. s Sh 03 , igen, paai tallen bes N'iedersch] raunender Ierschlag. lige, roset gte Nadel Bhr leicht ender Nie ausscheid en und pri hender Ni 1 s CO C !h 03 Weißer, körnig Prismen krista s xagonal gelber lach un Blau o > Si o a c5 senförin cn Kris gelber *cc spinde vereini CO CO S 03 Langsam sich großen kubisch Kristallen beste 'S a _a 03 bß Aus he hender Farbe i o 03 'S o Aus lin einigt Sh 03 ca 'S Große, Gelber, Nadeln 03 -P O bX) q3 j- oT 0^ 'S " ^ o '^'%^'B CO Sh 03 i3 :3 3 s äö 'S a T3 03 .a:s^ Ph 1 1 ;zi 1 1 1 1 •a 5.« 03 o 1 1 CS „•- bc— ' -a 02 03 ^ ^ S^li U "D.'S.Sft^ o a "^ ?? a 'S So § 'S -5 > "o 03 m- jodid a o 03 :rö .3 'S 75. o o f-H -a o bc 03 P4 a ^ =1 u a a S a "*- d QQ CO a a u J3 03 20 bc cä 03 -a «= P( M.2 'S o ^ & 'ö ;_ ^ es H '-P 2 'S 'cö P^ CO o CO ^ Hl o ►-5 Ph Ph o C3 03 O o C Die Isolierimg von Fäulnisbasen. li)"".> nicht mit seiner Base erhalten, denigef>enübor niuli aber bemerkt werden, daß von ihm sowohl für das Kadaverin ') wie für das rutresriii^i Heak- tionen angegeben worden sind, die mit der später ermittelten Konstitution dieser Körper nicht in Einklang gebracht werden können. Was das Saprin angeht, so ist es ebenso wie Grnndis' (ierontin nur einmal gefunden worden. Jedenfalls möchte ich dringend empfehlen, nach Auffindung einer Base der Formel CgHi^N., immer zuerst an Pentamethylendiamin zn denken, selbst wenn einige Reaktionen nicht dafür sprechen. Ist man geneigt, doch eine andere Base vorauszusetzen, so kann nur eine Konstitutionsermittlung Klai-- heit schaffen, und zwar ist es dann gewiß das beste, das Chlorid der Base trocken zu destillieren. Bekommt man dann in der Vorlage Piperidin, so handelt es ^\Q\\\\ViQh Ladenhurg ^) doch um Pentamethylendiamin, im anderen Falle aber um ein Isomeres. Ich lasse hier die Schilderung eines solchen Versuches folgen , den ich selbst einmal genötigt war, anzustellen^), in der Annahme, Neuridin in Händen zu haben, die sich aber nicht bestätigte. Qg des in Frage stehenden Chlorides werden in einem Kölbchen der trockenen Destillation unterworfen und das sich an den kälteren Teilen des Ge- fäßes in Form von Öltropfen und Kristallen abscheidende Destillat näher unter- sucht. Man löst es zuerst in ziemlich viel Wasser, fällt sodann mit wässerigem Platinchlorid, worauf sich eine größere Menge Ammoniumplatinat abscheidet. Von dieser wird abfiltriert, in das Filtrat Schwefelwasserstoff eingeleitet und nochmals filtriert. Die so erhaltene Flüssigkeit engt man stark ein und kann daraus durch Zusatz von Goldchlorid mehrere Gramm Piperidinchloraurat ge- winnen, wenn anders die untersuchte Base Pentamethvlendiamin war. Sollten sich die genannten Basen auf diese Weise doch alle als Penta- methylendiamin erweisen, so würde dadurch unseres Erachtens das große Verdienst, was sich Brieger um die Fäulnischemie erworl)en hat, kaum geschmälert, ist es doch eine alte Erfahrung, daß in der Alkaloidchemie Jahrzehnte hindurch ein und dieselbe Substanz unter verschiedenen Namen geführt wird, bis schließlich die Identität all dieser verschiedenen Körper sich herausstellt. So hat das Choliu beispielsweise früher auch noch die Namen Sinkalin, Bilineurin und Amanitin getragen. Cr, HijNOs wurde aus faulem Fleisch gewonnen.») Mydatoxin, CßHigNO... Aus 4 Monate altem Pferdefleisch und ans menschüchen Leichenteilen.''') Das Chlorid liefert, mit Silberoxyd versetzt. *) Brieger, Ptoniaine. Bd. 2. S. 41. '') Brief/er, Ptomaine. Bd. 2. S. 43 und Bd. 3. S. 103. *) Ladenburg , Piperidin aus Peutametlivlcudianiin. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 3100 (1885). *) D. Ackermann, Ein Beitrag zur Chemie der Fäulnis. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 54. S. 19 (1907/08). ^) J. Ahelous, If. Ribaut, A. Soulie und G. Tonjan , llicr das Vorkommen eines den arteriellen Blutdruck erhöhenden Ptomains in den Mazerationen gefaulter Muskeln. Compt. rend. soc. Biol. T. 59. p. 589 (1905). "J Brieger, Ptomaine. III. p. 24 und 32. lOoO D- Ackermanu. einen alkalisch reagierenden Sirup, der sich bei der Destillation zersetzt. Weiße Mäuse sind sehr empfindlich dagegen, doch ist es sonst kein kräftiges Gift. Liefert ein in AYasser ziemlich leicht lösliches Platinat, CeHisNOs.SHCl.PtCli, vom Schmelzpunkt 193°, doch mit Goldchlorid angeblich überhaupt keine Fällung. Das Quecksilberdoppelsalz ist leicht lös- lich. — Übrigens fand Brieger gelegentlich der Untersuchung eines alten Tetaninpräparates eine physiologisch ganz indifferente Base der Formel CgHisNOo, dessen in Wasser und Spiritus leicht löshches Platinat bei 197° schmolz. Es zeigte wesentliche Differenzen vom Leucin, mit dem es pro- zentisch gleich zusammengesetzt ist. Auch ist es möglich , daß E. und H. Salkowskl^) diesen Körper schon in der Hand hatten, wenigstens findet sich unter ihren Fäulnisbasen eine solche mit dem Platinwert des Mydatoxins. Die Darstellung des Mydatoxins siehe auf Seite 1006. Hexylamin, C,;Hj^N. Aus fauler Bierhefe 2), aus Lebertran.s) Die Darstellung siehe auf Seite 104o. Hexamethylendiamin, CgHißN.,. Dieser Körper ist dargesteUt A'on Ä. Garcia ^) und als Platinat und Benzolylverbindung untersucht. Die ge- fundenen Differenzen zwischen der von ihm entdeckten Base und dem Pentamethylendiamin begründen sich auf der Verschiedenheit des Schmelz- punktes der Benzoylverbindungen, den Gehalt an Kohlenstoff und Stick- stoff und der Verschiedenheit im Aussehen der Kristalle der Platindoppel- salze; dagegen haben Kristallmessungen der beiden Platinate keinen Unter- schied ergeben. — Wahrscheinlich existiert der Körper doch nicht und ist nur ein verunreinigtes Pentamethylendiamin oder Tetramethylendiamin. Auch ich glaubte ihn einmal auf Grund eines dazu stimmenden Platin- wertes, der sich trotz häufigem Umkristallisieren nicht ändern wollte, in Händen zu haben, nach der Überführung der Verbindung in das Gold- salz aber zeigte sich doch, daß ich es mit Tetramethylendiamin zu tun hatte. Cy Hg NO von Gautkr dargestellt aus fauler Leber vom Kabeljau. ^) Die Darstellung siehe bei der des p-Hydroxyphenylaethylamins und der „Tyrosinamine" nach Gautier. C7H15NO0, unbenannte Base von E.\m(\. H. Salkoicski^) aus faulem Fibrin gewonnen. Ihre Darstellung ist wie die der §-Aminovaleriansäure. Gadinin, C7 H^^ NO2 , zuerst gefunden im faulen Dorsch (Gadus callariasj*') und aus gefaultem Leim, aus faulen Heringen durch Destil- ') E. und H. SalkoirsJci , Über basische Fäulnisprodukte. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 16. S. 1195 (1883). 2) Hesse, Jahresber. über d. Fortschr. d. Chem. S. 403 (1857). ä) Gautier und Mourffues, Über die Alkaloide aus Lebertran. Compt. rend. T. 107. p. 110 (1888). *) Ä. Garcia, Über Ptomaine, \yelche bei der Fäulnis von Pferdefleisch und Pan- kre as entstehen. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 17. S. 543 (1893). ^) Gautier, Sur les tyrosinamines. Bull de la soc. chim. de Paris (3). T. 35. p. 1195 (1906). ^) Brieger, Ptomaine. I. S. 49. Die Isolierung von Fäulnisbasen. lOol lationi), (hier zeigte sich das Platinat leicht löslich), aus Reinkulturen von Proteus vulgaris auf Fleisch. 2) Platinat, (C^Hi^NO,) 2HCl.PtCl4, schwer löslich in Wasser, Schmelz- punkt 214^ Goldsalz nicht kristallisierend. Chlorid, dicke farblose Nadeln, in Alkohol unlöslich, in Wasser leicht löshch. C7H17NO2, unbenannte Base aus Fleischfäulnis. 3) Das Chlorid fällt nicht mit Platinchlorid und nicht mit Pikrinsäure. In Wasser schwer lös- liches Goldsalz vom Schmelzpunkt 176^. Die Darstellung siehe Seite lOOö. Typhotoxin, C7 H17 NO,, aus Kulturen von Typhusbazillen auf Fleisch- brei.*) Schwer lösliches Goldsalz, (C^HiTNOa), 2HCI.2AUCI3, in Prismen kristallisierend vom Schmelzpunkt 176'^. — Das Platinat bildet leicht lös- liche Nadeln. Mit Pikrinsäure entsteht eine schwer lösliche Verbindung und das ist ein Grund, weswegen Brieger diese Base für nicht identisch mit der vorhergehenden aus Fleischfäulnis gewonnenen hält. Darzustellen als Platinat aus dem Quecksilberniederschlag. C7 Hl 8 No Oß, unbenannte Base, welche aus Fäulnisgemischen verschie- dener Herkunft gewonnen wurde '•) , bildet Kristalle, die sich an der Luft braun färben und mit Platinchlorid ein kristallinisches Doppelsalz, das in Alkohol sich nicht löst. Gewinnung der Basen C-, H12 N, O4 und C7 Hjs N, Og nach Pouchet.") Man läßt Eiweißstoffe (Albumin, Casein, Leim, Fibrin) unter Luft- abschluß faulen, stellt die Tannate der Alkaloide dar und zersetzt diese Verbindungen durch Bleihydroxyd in Gegenw^art von starkem Alkohol, später nimmt man verdünnten Alkohol. Die Verdunstung der alkoholischen Lösungen liefert eine sirupförmige Masse, welche man in den Dialysator bringt. Es gehen dann die gewünschten Basen in das Dialysat über und werden durch Zugabe von Salzsäure und Platinchlorid in die Platindoppelsalze verwandelt, die sich durch ihre ver- schiedene Löslichkeit in Alkohol trennen lassen. (CtH^s^s^^«)-! — HCl.PtCIi bildet prismatische Nadeln und ist unlösHch in Alkohol. ( C5 H^n Ng Oi)., . 2HCl.PtCl4 ist löslich in Alkohol, läßt sich aus ihm aber durch Äther als gelbes Pulver niederschlagen. CgHiiN. unbenannte Base, aus faulem Oktopusfleisch dargestellt.') Das Ausgangsmaterial, über 40 Tintenfische, wurde der Sepiabeutel beraubt, *) Bocklisch, Über Fäulnisbasen (Ptomaine) aus Fischen. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Bd. 18. S. 1927 (1885). ^) Carhone, Über die von Proteus vulgaris erzeugten Gifte. Zentralbl. f. Bakt. Bd. 8. S. 768 (1890). ^) Brieger, Ptomaine. Bd. 3. S. 28. *) Brieger, Ptomaine. Bd. 3. S. 86. ^) Pouchet, Recherches sur les ptomaines et compos^s analogues. Compt. rend. T. 97. p. 1560 (1883). ^) Das Verfahren ist vom Verfasser selbst nur so kompcudiös geschildert. ') Oechsner de Coninck, Contribution ä l'etude des ptomaines. Compt. rend. T. lOö. p. 858 u. 1605 (1888). 1032 D.Ackermann. gewaschen und zwei bis drei Wochen an freier Luft faulen gelassen. Die IsoUerung der Base geschah nach dem Verfahren von Gautier; sie riecht unangenehm, ist wenig löshch in Wasser, löslich in Äther, Alkohol und Aceton; siedet bei 202° ohne Zersetzung, wenn sie vorher über Kali ge- trocknet war. An der Luft bräunt sie sich und zieht begierig Wasser an. Das Chlorhydrat und Bromhydrat sind leicht löslich. Das Platinat ist ein dunkelorangefarbenes Pulver, fast unlöslich in kaltem, löshch in heiljem Wasser. Mit warmem W^asser in Berührung, wandelt sich die Verbindung (C8H„N.HCl).2.PtCl4 um in (CgHnNCO-^PtCL, ein heUbraunes Pulver, fast unlöslich in heißem Wasser. Das Chloraurat ist hellgelb, ziemlich be- ständig in der Kälte, sehr unbeständig in warmem Wasser; ein geringer Überschuß von Goldchlorid wird davon schon in der Kälte reduziert. Die Zugehörigkeit der Base zur Pyridingruppe wurde erwiesen durch Über- führung der Base in Nikotinsäure durch Kaliumpermanganat. Eine Base der gleichen Formel fand Emm er Hnr/'^) in Fibrin, welches durch Streptokokken zersetzt war. Es stellte einen pyridinartig riechenden Sirup dar. Das Platinat war leicht löslich. Das Pikrat bildete Nadeln. Gewinnung der Base CsHuN und des Trimethylamins nach Emmerling. 4 Ji(/ feuchtes Fibrin werden nebst 3 l W^asser in geräumiger Flasche 4 Tage nacheinander je 2 Stunden bei 100" sterilisiert. Dann wird mit einer Reinkultur von Streptococcus longus Petruschki/ geimpft, die Luft aus der Flasche mit W^asserstoff verdrängt und 3 Wochen bei 40° belassen. — Nach dieser Zeit besteht der Flascheninhalt aus einer trüben gelblichen Flüssigkeit von käseartigem, aber nicht fauligem Geruch. Man muß jetzt durch ein PukaUsches Filter filtrieren, was 5 Tage erfordert und zu 4 l einer klaren Flüssigkeit führt, die im Vakuum ])ei einer 40° nicht ü1)er- steigenden Temperatur eingedampft wird. Nach einiger Zeit scheiden sich Kristalle von Tyrosin und Leucin aus, welche man absaugt, worauf man das Filtrat mit verdünnter Schwefelsäure ansäuert und ausäthert, um Säuren zu beseitigen. Der Äther wird dann der schwefelsauren Lösung wieder durch Abdunsten entzogen, diese dann mit Baryumchlorid von der Schwefelsäure befreit und im Vakuum zur Trockne eingedampft. — Jetzt wird nach Erlegers Methode weiter gearbeitet. Den Rückstand extrahiert man mit Alkohol und fällt den alkoholischen Extrakt mit alkoholischem Bleiacetat, worauf das Filtrat des Bleiniederschlages nach dem Behandeln mit Schwefelwasserstoff mit alkoholischer Quecksilberchloridlösung versetzt wird. Der entstandene Niederschlag wird abgesaugt, in kochendem Wasser aufgenommen und von unlöslichen Eiweißquecksilberverbindungen abgesaugt. Dieses Filtrat wandelt man mit Hilfe von Schwefelwasserstoff in eine Lösung von Chloriden um, die man zum Sirup einengt und mit x\lkohol aufnimmt. Es bleibt Salmiak zurück, während Trimethylaminchlorid in 1) Emmerling, Die Zersetzung von Fibrin durch Streptokokken. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges Bd. 30. "s. 1863 (1897). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1033 Lösung geht, das nach dem Abdampfen des Alkohols mit Goldchlorid ge- fällt und als Chloraurat identifiziert wird. Aus dem Filtrat der Quecksilberfällung beseitigt man das Metall durch Schwefelsauerstoff, dampft ein und extrahiert den Rückstand mit Alkohol. Der alkoholische Auszug wird vom Alkohol durch Abdampfen be- freit, mit Platinchlorid gefällt und im Exsikkator über Schwefelsäure lang- sam eingedunstet. Man -erhält dann das Salz, ( Cg Hu N)2 2 HCl . Pt CI4, als gelb- rote Kristalle, welche mit wenig Alkohol gewaschen, auf Ton getrocknet werden. Collidin, CgHuN, wurde nach fünftägiger Fäulnis aus einem Ge- menge von Ochsenpankreas und Gelatine gewonnen.^) Xenrkl identifiziert das Collidin mit Phenyläthylamin, welches er aus dem Phenylalanin durch COa-Abspaltung sich entstanden denkt. — Briecjer konnte es nicht wieder- gewinnen. 2) Unter dem Namen Protoconin wurde die Base bereits darge- stellt von Thiidichuiu.^) Phenyläthylamin wurde ferner bei der Leimfäulnis von Jeanneret^) entdeckt, im faulen Pferdefleische von Barger und Waljjole.'^) Phenyläthylamin ist ein Öl, das CO.2 anzieht und zu einer blätterigen Masse erstarrt. Das Platinat ist schwer löslich. Das Chlorid gibt nach E. Schuhe in wässeriger Lösung mit Quecksilberchloridlösung eine kristallinische Fällung, die sich in Alkohol auflöst. — Die Darstellung des Phenyläthylamins nach Barger und Walpole ist beim Oxyphenyläthylamin geschildert. Oechsner de Coninck^) gewann aus Collidin, wenn er es unter Licht- abschluß einige Wochen mit sehr verdünntem Wasserstoffsuperoxyd stehen ließ, das sogenannte Oxyptomain oder Collidon, eine gelbliche feste Masse, die in verdünnter Salzsäure löslich ist. Das Platinat stellt ein orange- gelbes Pulver dar, bei 210" unter Zersetzung schmelzend, ist kaum löslich in kaltem Wasser. — Mit Zink unter Luftabschluß erhitzt, wird das Oxy- ptomain zu Collidin zurückverwandelt. CgHisN. Diese als Hydrocollidin aufgefaßte Base wurde aus faulem Makrelen-, Pferde- und Rindfleisch von Gautier und Etard'') gewonnen. ^) Ncncl'i, Über die Zersetzung der Gelatine und des Eiweiß liei der Fäulnis mit Pankreas. Bern 1876: ferner: Zur Geschichte der basischen Fäulnisprodukte. Journ. f. prakt. Chem. [2.] Bd. 26. S. 47 (1882). — Derselbe, Untersuchungen iiber die Zer- setzung des Eiweißes durch auaerobe Spaltpilze. Monatshefte f. Chem. Bd. 10. S. 506 (1889). 2) Briegcr, Ptomaine. Bd. 1. S. 55. 3) Thudichion, Grundzüge der anatomischen und klinischen Chemie. Berlin. Hirscli- wald. S. 16. (1886). *) Jeanneret, Untersuchungen über die Zersetzung von Gelatine und Eiweiß durch die geformten Pankreasfermente bei Luftabschluß. Journ. f. prakt. Chemie. Neue Folge. Bd. 15. S. 353 (1877). ^) Barger und Waljiole, Isolation of the pressor principles of putrid meat. Journ. of Physiol. Vol. 38. p. 343 (1909). ") Oechsner de Coninck, Über ein Oxyptomain. Compt. rend. T. 126. p.651 (1898) und Beitrag zum Studium eines Oxyptomains. Ibid. T. 129. p. 109 (1899). ') Gaufier und Etard, Über den Mechanismus der fauligen Gärung und über die dabei gebildeten Alkaloide. Compt. rend. T.94. p. 1598 (1882) und Über die Pro- dukte der Bakterienfäulnis der Albuminstoffe. Ibid. T. 97. p.264 (1883). 1034 ^- Ackermann. Farblose, ölige Flüssigkeit, die nach Holunder riecht. Die Base siedet bei 210" und zieht CO., aus der Luft an, wobei sie verharzt. Sie besitzt stark reduzierende Eigenschaften. Das Chlorid ist in Wasser und Alkohol löslich. Das riatinat zersetzt sich am Licht und beim Erwärmen, ist schwer löslich. Das Chloraurat ist leicht löslich und wird schnell reduziert. Nenclci hielt diese Base für mit seinem Phenyläthylamin identisch. Die Darstellung aus faulen Makrelen siehe bei der Base Cg H^g N. Darstellung der Base CsHigN nach Gautier und Etard. Man läßt Rindfleisch mit Wasser aufgeschwemmt lange Zeit (bei den genannten Autoren war es ein Jahr) faulen, destilliert das Fäulnisgemisch bei niederer Temperatur im Vakuum ab und erschöpft den Rückstand mit Äther, dieser nimmt außer einer größeren jNIenge Fettsäuren die gesuchte Base auf. Man destilliert den Äther ab und erhält einen braunen, öügen Rückstand, aus welchem bald eine Fettsäure auskristallisiert; man saugt von dieser ab, gibt zu dem Filtrat verdünnte Schwefelsäure und schlägt auf diese Weise den Rest der Fettsäure nieder , während man die Base als Sulfat in Lösung hat. Diese abfiltrierte Lösung wird jetzt mit Kali- lauge alkalisch gemacht und mit Äther geschüttelt, worauf man die äthe- rische Lösung der Base durch Abdampfen vom Äther befreit und nun mit Hilfe von Platinchlorid daraus das Platinat des Körpers gewinnt. — Bestand das Ausgangsmaterial in faulen Makrelen, so findet man im Fil- trate dieser Platinfällung das Platinat des Scombrins. Mydin, CgH^iNO, wurde von Bn'eger, und zwar aus 4 Monate alten menschlichen Leichenteilen, gefaultem Pferdefleisch und Typhuskulturen gefunden. ^ ) Die Base ist ungiftig, zersetzt sich beim Destillieren und be- sitzt ein starkes Reduktionsvermögen, so daß sie aus Goldehloridlösung metallisches Gold niederschlägt. Die einzig handliche Verbindung ist das Pikrat, CgHnXO . C6H2(N02)3()H, welches bei 195o schmilzt. Darstellung des Mydins nach Brieger. L)asselbe findet sich im Filtrate des nach Briegers ^lethode herge- stellten Quecksilberuiederschlages. Man beseitigt aus diesem Filtrat das Metall durch Hg S und schlägt daraus mit Phosphormolybdänsäure ein Harz nieder, nach dessen Zerlegung mit Bleiacetat ein in farblosen Blätt- chen kristallisierendes Chlorhydrat resultiert; man identifiziert es als Pikrat. p-Hydroxyphenyläthylamin , CsH^NO. Wurde gewonnen aus fauler Leber des Kabeljau 2), aus Emmentaler Käse s), aus einer Pankreas- ') Brieger, Ptomaine. III. S. 26. =') Gautier, Sur les tyrosinamines. Bull. soc. chim. de Paris. [3.] T. 35. p. 1195 (190G). ^) Winterst ein und Küng , Über das Auftreten von p-Oxyphenyläthylamin im Emmentaler Käse. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 59. S. 138 (1909). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 10H5 selbstverdaiiimg mit Toluoli), aus peptischer Verdauung- von Eiweiße), aus gefaulter Plazenta»), aus faulem Pferdefleisch*), aus Pankreasfäulnis. •>) Es ist so gut wie sicher, daß der Körper aus Tyrosin durch COa-Abspal- tung unter der Wirkung der Fäulnisbakterien entsteht (Winterstein und Küng, Bürger und Walpole). Winterstein und Küng sowie ich erhielten den Körper als Platiuat. Das Chlorid gibt die Millonsche Pieaktion und liefert auf Zusatz von Bromwasser eine gelbliche Färbung. Darstellung des p-Hydroxyphenyläthylamins und der beiden anderen „Tyrosinamine" (C7H9NO und C9H13NO) nach Gautier. Die von faulen Lebern des Kabeljaus restierenden Flüssigkeiten werden stark eingeengt und mit Kalilauge versetzt, worauf ein Öl entsteht, das an der Oberfläche schwimmt. Dieses trennt man ab, wäscht es mit Äther, wodurch Amylamin und andere Körper abgetrennt werden, und behandelt nun den in Äther unlöshchen Rückstand mit Amylalkohol, welcher die gewünschten Basen aufnimmt. — In den amylalkoholischen Extrakt wird jetzt Kohlensäure geleitet, vom ausgeschiedenen Kaliumkarl)onat abfiltriort und das Filtrat mit sehr verdünnter Schwefelsäure versetzt ; man filtriert das gebildete KaUumsulfat ab und beseitigt aus dem Filtrat die Schwefel- säure mit Barytwasser. — Jetzt braucht man nur im Vakuum einzuengen und erhält beim Abkühlen die drei Basen in Nadeln und Blilttchen kri- stallisiert. Sie werden durch fraktionierte Kristallisation getrennt. ö*- Methode von Barger und Walpole zur Isolierung von p-Hydroxy- phenyläthylamin, Phenyläthylamin und Isoamylamin, Frisches Pferdefleisch wird in Portionen von jedesmal 10 kg in verschlossenen Flaschen ohne weitere Hinzufügung von Wasser mit etwas Fäulnisflüssigkeit geimpft 6—8 Tage bei 37» stehen gelassen. Nach dieser Zeit ist die Masse teilweise verflüssigt, die Flaschen werden nach Zugabe von etwas Salzsäure im Dampftopf auf 100" erwärmt, so daß die Eiweiß- körper koagulieren. Jetzt filtriert man im Freien ab und engt das Filtrat im Vakuum unter Benutzung eines Schwefelsäurevpr=:chlusses ein, welcher das Übertreten unangenehmer Gerüche in die Außenluft völlig verhindert. ^) Emerson, Über das Auftreten von p-Oxyphenyläthylamin bei Pankreasverdauung und über fermentative COg-Abspaltung. Hofmeisters Beiträge. Bd. 1. S. 501 (1902). 2) Langstein, Zur Kenntnis der Endprodukte der peptischen Verdauung. Hof- meisters Beiträge. Bd. 1. S. 514 (1902). ^) Bosenheim, The pressor priuciples of placeutal extracts. Journ. of Physiol. Vol. 38. p. 337 (1909). •*) Barger and Walpole, Isolation of the pressor principles of putrid meat. Journ. of Physiol. Vol. 38. p. 343 (1909). °) D. Ackermann , Über die Entstehung von Fäulnisbaseu. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 60. S. 482 (1909). 1036 D.Ackermann. Der so erhaltene Sirup wird gut mit Sand angerieben und dann mit Aceton extrahiert, in welches die gewünschten Basen als Chloride übergehen, Eiweili- körper aber nicht aufgenommen werden. Nach dem Verdampfen des Acetons aus dem Acetonextrakt bleibt eine dunkelbraune Flüssigkeit, welche noch ziemliche Mengen Fettsäuren enthält. Man mischt dieselbe mit Chloroform gut durch und extrahiert nun diese Chloroformlösung mit verdünnter Salzsäure. Dadurch bekommt man die Basen als Chloride in das salzsaure Wasser hinein, während die Fettsäuren und Farbstoffe im Chloroform bleiben. Nachdem man die saure Basenlösung mit Chloroform nochmals ge- waschen hat, macht man sie alkalisch und extrahiert sie jetzt mit Äther, trocknet die ätherische Lösung mit Natriumsulfat und fällt dann mit einer ätherischen Lösung von wasserfreier Oxalsäure. Der Niederschlag, welchen man aus Alkohol und Aceton umkristallisiert , besteht aus dem sauren, bei 169° schmelzenden Oxalat des Lsoamylamins fCj H13N . CaHoOi)^), aus dem man durch Zusatz von Kalk die charakteristisch riechende Base vom Siedepunkt 90" freimachen kann. — Diese kann man durch Zugabe von alkoholischer Bromwasserstoffsäure zur ätherischen Lösung der Base in das Hydrobromid überführen, welches glänzende Platten vom Schmelz- punkt 2250 liefert und in Wasser sehr leicht löshch ist. Wenn man neben Isoamylamin die beiden anderen Basen gewinnen will, destilliert man aus der anfänglichen sauren Lösung der Basen nach dem Waschen mit Chloroform bei natronalkalischer Reaktion im Wasser- dampfstrom das Isoamylamin über; aus dem mit Natronhydrat alkalisch gemachten Destillationsrückstand extrahiert man durch Schütteln mit Amyl- alkohol die neutralen Substanzen und Phenyläthylamin, trennt den Amyl- alkohol durch Abdampfen von den in ihn eingegangenen Substanzen und löst den dunkelbraunen Rückstand in Chloroform, um diese Lösung dann mit verdünnter Salzsäure auszuschütteln. Die salzsaure Basenflüssigkeit wird alkahsch gemacht und ihr die Base jetzt durch Äther entzogen. Diesen trocknet man, dampft ihn ab und destilliert den Rückstand, wobei man den bei 190 — 210" übergehenden Teil gesondert auffängt; er enthält das Phenyläthylamin. welches bei 198" siedet und durch Zugabe von alko- holischer Salzsäure als kristallinisches Chlorid gewonnen werden kann. (Hatte man die anfängliche Wasserdampfdestillation fortgelassen, so geht vor dem Phenyläthylamin das schon bei 95" siedende Isoamylamin über.) Das p-Hydroxyphenyläthylamin erhält man aus derjenigen Flüssig- keit, welche bei natronalkalischer Reaktion mit Amylalkohol vom Phenyl- äthylamin befreit war, indem man sie ansäuert und dann nicht mit Natron, sondern mit Soda alkalisch macht, denn da das p-Hydroxyphenyläthyl- amin eine Phenolbase ist, wird sie sowohl von einer natronalkalischen wie von einer sauren Lösung festgehalten und läßt sich nur bei sodaalkalischer *) Diese Verbindung zersetzt sich bei 100" und kann nur im Vakuum über Schwefelsäure getrocknet werden. Die Isolierung von Fäulnisbasen. 101' »7 Reaktion extrahieren. Man schüttelt jetzt mit Amylalkohol, befreit den amylalkoholischen FAtrakt durch Abdampfen im \akuum vom .Amylalkohol und reinigt die zurückgebliebene Base als Renzoylderivat. Das Dibciizoyl- p-hydrooxyphenyläthylamin , das sich aus Alkohol Umkristallisieren lälit, schmilzt bei 170". Viridinin, QsHj.N. O3, aus gefaultem Pankreas nach Ackermanns und Kutschers Methode dargestellt ^ ) , findet sich in derselben Fraktion wie die S-Aminovaleriansäure, von der es durch die viel geringere Löslich- keit seines Platin- und seines Goldsalzes leicht zu trennen ist. Das Platinat, (CgHiaNg Og).. HaPtClß, ist intensiv gelb, wie ein Goldsalz gefäri)t. bildet feine, stäubende Nüdelchen, die sich ungefähr z^\1schen 21 -i" und ^Kl" schwärzen. Das Aurat, CgHiaN.^ O3 . HCl .AuClj, bildet schwarzbraune feine Kristallnadeln , die sich in heißem Wasser leicht , in kaltem schwer lösen und bei 176" unter Aufschäumen schmelzen. Pei den Salzen geht nur ein N-Atom eine Bindung ein. Das Chlorid besteht merkwürdigerweise aus glänzenden Nadeln von schöner grüner Farbe. Über seine Darstellung siehe die Methode von Ackermann und Kutscher, Seite 1010. C8Hi4N4 08, unbenannte Base, aus Schweinefleischbouillon mit dem ÄaZomonschen Bazillus der Schweinecholera gew'onnen von Fred. G. Kovy. -) Als Platinat, nach Briegers Verfahren isohert, und zwar aus dem in alko- hoUscher Lösung erhaltenen amorphen Quecksilberniederschlag. Marcitin, C^HjcjNa, wurde von Ackermann^) aus faulem Pankreas dargestellt. Seine DarsteUung ist oben gelegentlich der Schilderung des Verfahrens von Ackermann und Kutscher Seite lOOi) angegeben. Es wurde bisher nur das Goldsalz, C^HigNs . 2HC1 . 2 AuClj , dargestellt, welches zwischen 175 und 178° unter Aufschäumen schmilzt und sehr schwer völlig verbrennt. Der Gehalt an 3 Atomen N läßt an ein Guanidinderivat denken. Cy H, N5 Og aus Pankreasfäulnis *) einmal geAvonnen und nur als Pikrat analysiert. Die Darstellung siehe beim Verfahren nach Ackermann und Kutscher, Seite 1008. CgHisN, eine Base, die von Gautier und Etard^) aus faulen Makrelen und faulem Pferdefleisch erhalten wurde. Bildet eine bei'usteinfarbene. nach Weißdorn riechende, in Wasser nui' wenig lösUche Flüssigkeit, welche an der Luft unter Dunkelfärbung verharzt. Das Chloraurat ist sehr leicht löslich ; das schwerlösliche Platinat zersetzt sich an der Luft. Ob die Base, ') D.Ackermann, Über eine Base aus gefaultem Pankreas. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 57. S. 28 (1908). ^) Fred. G. Nor;/, Die toxischen Produkte des Bacillus der Schweinecholera. Medical News. Sept. 1890. pag. 23. ^) Ackermann , FAn Beitrag zur Chemie der P'äulnis. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 54. S. 1 (1907/08). *) Ackermann und Mey, rntersuchung eines Eiweißfäulnisgemisches nach neuen Methoden. Zentralbl. f. Baktcriol. Bd. 42. S. 629 (190(5). ^) Gaiifier und Kturd, Über den Mechanismus der fauligen Giirunir und über die dabei gebildeten Alkaloide. Compt. rend. T. 94. p. 1(500 (1882) und Über die Produkte der Bakterienfäulnis der Albuminstoffe. T. 97. p. 264 (1883). ][Q38 I). Ackermann. wie Gautier und Etard glauben, ein Pyridinderivat (Parvolin) ist. muß noch erwiesen werden. Darstellung der Basen CgHisN und C9H13N aus faulen Makrelen nach Gautier und Etard. Von den flüssigen Produkten der Fäulnis von Makrelen trennt man das Öl ab, säuert mit Schwefelsäure au und verdampft im Vakuum . wo- bei flüchtige Säuren, Phenol, Indol etc. verfliegen. Der Piückstand wird mit Baryt alkalisch gemacht, filtriert und dann mit Chloroform fraktioniert extrahiert. In die ersten Chloroformextrakte geht die Base C9 H13 N, in den letzten Chloroformauszügen findet man den Körper CgHigN. Um die Basen aus den Extrakten zu gewinnen, destilliert man das Chloroform bei möglichst niedriger Temperatur und im Vakuum bzw. im Kohlensäurestrom ab. Den liückstand säuert man jetzt mit Weinsäure an, filtriert und extrahiert schließhch aus dem durch Kaliumkarbonat l)zw. (was vorteilhafter ist) Natriumkarl)onat von neuem alkalisch gemachten Filtrate die Basen durch Äther. Man verdampft dann den Äther und trocknet die Base im Vakuum. C9H13NO, wurde aus fauler Leber vom Kabeljau erhalten. 1) Die DarsteUung siehe beim p-Hydroxyphenyläthylamin, Seite 1035. Cy H.,] No O5. Diese Base wurde von Griß'Uhs'^) durch mehrtägige Zersetzung von peptonisierter Gelatine durch Bacillus fluviatilis in perl- mutterglänzenden Prismen erhalten; sie ist nicht giftig, aber stark harn- treibend. Über die Darstellung sagt Grifiths nur, daß sie nach Gautiers Methode geschah. Cio Hi3 N wurde nach Gautiers Verfahren aus fünfmonatlicher Fäiünis von Fibrin dargestellt von Guareshi und Mosso.^) Die Autoren sind im Zweifel, ob der Base die Formel CmHisN oder C10H15N zukommt. Bräun- liches, schwach pyridinartig riechendes, an der Luft verharzendes Öl. In Wasser wenig löslich, macht dasselbe aber stark alkahsch. Platinat, ( Cjo Hj, Nja . 2HCl.Pt.Cl4, in Wasser und Alkohol schwer löslich. Gewinnung der Base CmHiaN nach Guareshi und Mosso mit der Methode von Gautier und Etard. 140 k(j gut gewaschenes, nur sehr wenig Blut enthaltendes Ochsen- blutfibrin werden in zwei Gefäßen von glasiertem Ton (0"6 yn X 0'4 m), welche auf Dreifüßen stehend mit je einer großen Glocke von Zinkblech (l m X O'lö m), die am oberen Ende einen Hahn zum Ablassen der Gase *) Gauticr. Siir les tvrosinamines. Ball. soc. chim. de Paris. [3.] T. 35. p. 1195 (1906). *) Griffiths, Über einen neuen im Kegeuwasser aufgefundenen Bacillus. Bull. soc. chim. [3.] T."7. p. 332 (1892). ^) Guareshi und Mosso, Die Ptomaine, chemische, physiologische und gerichtlich- medizinische Untersuchungen. Arch. Ital. de Biologie. [2.] S. 367 (1883). — Dieselben. Journ. f. prakt. Chem. (2). Bd. 27. S. 420 (1883); Bd. 28. S. 504 (1883). Die Isolierung von Fäulnisbasen. 1U.")II trägt, bedeckt sind, während 5 Sommermonaten sich seihst üherlassen. Der Rand der Glocken taucht 15 cmi tief in Wasser ein. Nach dieser Zeit hat sich das Fibrin in eine dicke, dunkelrote, homogene Flüssigkeit ver- wandelt. Man gibt jetzt auf je 20/ loOcw?» ioo/(,iger Hchwefelsäure und dampft auf dem Wasserbade bei zirka 60" ein. Der dicke lirei wird mit Barytwasser alkalisch gemacht, abfiltriert und das Filtrat lange mit Chloro- form geschüttelt, und zwar auf 6 / Lösung anfangs 1 /, dann IV2 — 2 l Chloroform verwandt und im ganzen zwölfmal extrahiert. Die Chloroform - lösung befreit man durch Abdestilheren vom Chloroform und versetzt den übelriechenden Rückstand mit konzentrierter Weinsäurelösung, wobei sich ein braunes Harz ausscheidet, das durch Ausschütteln mit Äther beseitiut wird. Die farblos gewordene Flüssigkeit versetzt man mit öO" „iger Kali- karbonatlösung im Überschuß, worauf sich braune (Mtröpfclien an der Oberfläche ansammeln, die mit Äther aufgenommen werden und beim Verdampfen desselben zurückbleiben. Aus ihnen gewinnt man das in Alkohol, Äther und Wasser unlösliche Salz, (Cio HigN)., . 2 HCl . PtCl^. als fleisch- farbenen, leichten, kristallinischen Niederschlag. C10H15N wurde mit Gaiitiers und Etards Methode aus den Fäuluis- produkten der Seespinne gewonnen von Oechsner de Coninck.^) Die Base bildet eine gelbUche, klebrige, an der Luft rasch verharzende Flüssigkeit, die ohne Zersetzung bei 230" siedet, sich nur wenig in Wasser, leicht aber in Alkohol löst. Das Chlorid stellt gelbe zerfließliche Nadeln dar; Platinat in Wasser unlöslich. Oechsner de Coninck betrachtet sie nicht als eine Hydrobase, sondern als eine wirkliche Pyridinbase. Gautier aber hält sie für identisch mit der vorigen Base und bezeichnet beide als Coridin. Oechsner de Coninck konnte aus seiner Base durch Oxydieren mit Kaliumpermanganat Nikotinsäure gewinnen. — tiber das Ausgangsmaterial siehe die bei der Base CgH^jN gemachten Angaben. C10H17N. Diese Base wurde von Grifiths^) durch Züchtung eines von ihm auf faulen Zwiel)eln entdeckten sogenannten Bäcterium allii auf pep- tonisierter Agar-Agar-Gelatine erhalten. Es bildet zerfließhche, mikro- skopische, prismatische Nadeln, die sich in Wasser, Alkohol, Chloroform und Äther auflösen. Das Platinat, (CioHi^N).2 . 2HC1 . PtCli, ist schwer löslich in kaltem Wasser, unlöslich in Alkohol. Grifiths vermutet ein Hydro- coridin. — Über die Darstellung gibt er nur an. daß er mit den Methoden von Gautier und Brieger gearbeitet habe. Sardinin, CuHnNOi, giftige Base, dargestellt aus verdorbenen Sardinen von Grifiths.^) Farblos, kristallinisch, in wässeriger Lösung schwach alkalisch reagierend. Kristallinisches Chlorid, Chloraurat und Chloroplatinat. ^) Oechsner de Coninck, Beiträire zum Studium der Ptomainc. Compt. rend. T. lOß. p. 858 (1888); T. 110. p. 1339(1890); T. 112. p. 584 (1891); T. 117. p. 1Ü97 (1893). -) Griffiths, Über ein neues Fäulnisptomain, erhalten durch die Kultur von Bäc- terium allii. Compt. rend. T. 110. p. 416 (1890). 3) Grifiths, Chem. News. Vol. 67. p. 45 (1893). — D er so 11. e. Referat in der Apothekerzeituug. S. 495 (1893). 1040 ^- Ackermann. Es entstehen Füllungen mit Pikrinsäure, Silbernitrat und mit Xesslers Reagens. Putrin, Cii H.26 N.2 O3, wurde aus gefaultem Pankreas isoliert von Ackermann.^) Das Goldsalz. C„ H.,, N., O3 2 H Cl . 2 Au CI3 . bildet harte, dunkelorangefarbene Kristallkrusten, die bei 109 — 110^' schmelzen. Seine Gewinnung ist gelegentlich der Methode von Ackermann und Kutscher geschildert auf Seite 1009. Tetanin, C1SH30N2O4. Aus Kulturen des Bosenbachschen Bazillus auf Fleischbrei und aus Leichenteilen von Brieycr 2) gefunden. Die Base kristallisiert aus 96''/oigem Alkohol in schönen gelbüchen Blättchen und läßt sich im Dampfstrome unzersetzt destillieren. Das Chlorhydrat ist zer- fließhch. Das Platinat, C13 Hg^ X2 0^ . 2 HCl . Pt CI4. ist, nachdem es getrocknet ist, ziemlich schwer löslich. Darstellung des Tetanins nach Brieger. Ein Kolben von 1 1 Inhalt wird mit 500 j<75 Fleischextrakt. Zeitschr. f. Unters, d. Nähr.- u. Genuß- mittel. Bd. 10. S. 528 (1905) und Bd. 11. S. 582 (1906). -) Es macht sich hier oft eine auffallende Erscheinung bemerkbar. Nachdem zuerst ein massiger Niederschlag in der Flüssigkeit aufgetreten ist, stellt sich ein Stadium ein, in dem sich die Flüssigkeit auf weitere Zufügung von Tanninlösung milchig ti'übt. Erneute Zugabe von Gerbsäure scheint nun nichts mehr zu iiudern, wenn man nur die Hauptmasse der Flüssigkeit beobachtet. Versetzt man dagegen eine kleine Menge der trüben Flüssigkeit vorsichtig unter Umschütteln mit Tanninlösung, so beobachtet man bald das Auftreten eines neuen flockigen Niederschlages, der die Trübung mitreißt. Auch die Hauptmasse der trüben Jlüssigkeit muß man dann in solchen Fallen noch solange mit Tanninlösung behandeln, bis sich beim Umrühren der flockige Niederschlag zeigt. Mit dem Auftreten desselben ist die Ausfällung in der Regel beendet. I Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. 1045 von Baryumhydroxyd. Man soll Barytwasser solange zusetzen, bis sich an der Oberfläche der gefällten Flüssigkeit beim Umrühren ein röt liehe i- Schaum zeigt. Die Filtration des mächtigen Niederschlages von Baryum- tannat wird mit der /vosse/schen Nutsche ausgeführt. Um aus dem mill- farbenen Filtrate die letzten Reste des Tannins zu beseitigen, geht man in folgender Weise vor: Dasselbe wird mit Schwefelsäure sehr schwach übersäuert und in die. Flüssigkeit, ohne vorher das ausgefallene Baryum- sulfat zu entfernen, Bleioxyd im Überschuß eingetragen. Es genügt die von Kahlhaum in den Handel gebrachte bessere Marke, vorteilhaft ist allerdings frisch gefälltes. Rührt man die mit Bleioxyd versetzte Flüssig- keit mit dem Glasstabe einige Zeit um, so wird sie schnell fast farblos und nimmt meist alkalische Reaktion an. Das Blei hat die Reste des Tannins und die überschüssige Schwefelsäure aufgenommen, aber sicher sind noch andere Körper damit schwer löshche Verbindungen eingegangen.') Vom Baryumsulfat und dem, was mit ihm den Niederschlag bildet, wird abgesaugt, und wenn die Reaktion des Filtrates an sich schon alkalisch gegen Lackmus ist, engt man es direkt auf freier Flamme, dann auf dem Wasserbade zum dünnen Sirup ein. War aber die Reaktion des P'iltrates sauer, so gibt man noch etwas frisch gefälltes Bleioxyd hinzu; beim Ein- engen stellt sich dann auch hier bald alkaUsche Reaktion ein. Die auf ein kleines Volumen gebrachte Flüssigkeit erstarrt, wenn man sie 24 — 48 Stunden an einem kühlen Orte stehen läßt, zu einem Kristallbrei, der der Hauptsache nach aus Kreatin und Kreatinin besteht. Die Kristalle werden scharf abgesaugt und nur mit Avenig eiskaltem Wasser gewaschen, um nicht zuviel von dem leicht löslichen Kreatinin in das Waschwasser zu bekommen. Die Mutterlauge der Kristalle wird mit dem Waschwasser vereinigt und mit Schwefelsäure angesäuert, worauf Bleisulfat ausfällt, das man durch Filtrieren beseitigt. Das neue Filtrat wird mit 20" „ig'^i' Silbernitratlösung ausgefällt. Der entstehende Niederschlag (Silbernieder- schlag I) besteht der Hauptsache nach aus Chlorsilber und den Resten der Purinbasen, doch mögen auch noch andere Körper hineingehen. Nach 24 Stunden saugt man diesen Niederschlag ab, das Filtrat davon wird mit 20%i§'6i' Silbernitratlösung versetzt, bis eine Probe, in gesättigtes Barytwasser gebracht, nicht mehr einen weißen, sondern sofort einen braunen Niederschlag gibt. Man hat, um diesen Punkt zu erreichen, etwa 150 — 200(7 Silbernitrat notwendig. Nunmehr fügt man der silberhaltigen Flüssigkeit solange kalt gesättigtes Barytwasser hinzu, bis ein Tropfen, auf einer Glasplatte mit ammoniakaUscher Silberlösung 2) versetzt, nur eine geringe oder gar keine Fällung mehr zeigt. Dann saugt man ab und wäscht etwas mit Wasser nach. ^) Dieser Niederschlag ist bisher nicht näher untersucht. 2) Die Bereitung der ammoniakalischen Silberlösung geschieht, indem man lO^/oige Silbernitratlösung mit 10" ^iger Ammoniaklösung versetzt, bis sich der zuerst ausfallende Niederschlag von Silberoxyd gerade gelöst hat. Dann fügt man noch einen Tropfen Ammoniak hinzu. 1046 D- Ackermann. Dieser Silbe mied er schlag II enthält in der Hauptsache Krea- tinin- und Carnosinsilber; um die beiden Basen voneinander zu trennen wird der Niederschlag mit Wasser verrieben, ein wenig Schwefelsäure zugegeben, um den anhaftenden Baryt zu beseitigen und nun Schwefel- wasserstoff eingeleitet. Vom Schwefelsilber filtriert man ab und engt das Filtrat zum Sirup ein. Derselbe erstarrt bald zu einem Kristallbrei. Dieser besteht aus Kreatinin, das in absolutem Alkohol leicht löshch, und aus Carnosin, das darin selbst in der Hitze kaum löslich ist. Man kocht deshalb den Sirup mitsamt den Kristallen mit absolutem Alkohol mehr- fach aus und bekommt so das Kreatinin in die alkoholische Lösung, das Carnosin aber hat man als kristallinischen Rückstand. Um diesen noch von etwas ihm anhaftenden Kreatin zu befreien, kann man ihn in Wasser auflösen, mit Tierkohle entfärben und zum Sirup einengen, worauf meist ein wenig Kreatin zur Ausscheidung kommt, von dem man absaugt. Jetzt überschichtet man die dickliche Flüssigkeit mit absolutem Alkohol und läßt das Gemisch leicht bedeckt stehen. Nach einiger Zeit hat sich das Carnosin in festen Krusten abgeschieden, die man wegen ihrer großen Löslichkeit in Wasser nicht hieraus allein Umkristallisieren kann. Man muß vielmehr genau, wie eben geschildert, nachdem man die Kristalle in Wasser gelöst hat, sie durch absoluten Alkohol von neuem zur Abschei- dung bringen. Das Filtrat vom Silberniederschlag II wird mit Barytwasser solange versetzt, als noch eine Fällung entsteht. Dieselbe heiße Silbernieder- schlag III. Man saugt ihn ab, schwemmt ihn in Wasser auf und leitet Schwefelwasserstoff bis zur völligen Ausfälluug des Silbers ein. Dann wird abgesaugt. Das Filtrat scheidet beim Einengen zum Sirup etwas Baryum- karbonat ab, das durch Filtrieren beseitigt wird. Jetzt gibt man Salpeter- säure bis zur schwach sauren Reaktion hinzu und dampft von neuem auf ein kleines Volumen ein. Es scheidet sich dann schneU das in kaltem Wasser ziemHch schwer lösliche Methylguanidinni trat in weißen, glänzenden Blättern ab, die nach dem Umkristallisieren aus Wasser analysiert werden können. Das Filtrat des Silberniederschlages III befreit man durch Salzsäure vom Silber und durch Schwefelsäure vom Baryt, säuert mit Schwefelsäure so an, daß die Lösung etwa ö^/oig ist und fällt mit Phosphorwolframsäure, von der man soviel zugeben muß, daß eine Probe auf erneute Zugabe des Fällungsmittels längere Zeit (1—2 Minuten) klar bleibt. Nach 12 Stunden saugt man den Niederschlag ab und zersetzt ihn mit Barytwasser unter Verreiben, wie auf S. 1007 näher geschildert. Das Baryumphosphorwolfra- mat, welches sich hierbei ausscheidet, muß abfiltriert und gut mit Wasser ausgewaschen werden. Dann leitet man in Filtrat und Waschwasser, die man vereinigt, Kohlensäure ein, bis kein Baryumkarbonat mehr nieder- geschlagen wird. Man saugt von demselben ab und engt die so erhaltene Lösung zum Sirup ein. Derselbe erstarrt schnell zum Kristallbrei, der der Hauptsache nach aus Kreatin, Kreatinin und Kaliumkarbonat Isolierung von Basen ans den Extrakten der Muskeln. 1U47 besteht. Man saugt diese Kristalle ab und wäscht sie mit weiii^^ kaltem Wasser. Die Mutteriauge samt dem Waschwasser wird wieder zum Sirup eingeeng't. der mit konzenti-ierter starker Salzsäure angesäuert und solange mit absolutem Alkohol versetzt wird, als die entstehende kristallinische Fällung sich vermehrt. Mengen sich dem Niederschlag schmierige IJestand- teile bei, dann ist der Flüssigkeit noch Salzsäure zuzufügen, durch die sie wieder in Lösung- gebracht wei'den. Der Niederschlag, der nui- aus anorganischen Salzen, namentlich Kaliumchlorid, besteht, wird abfiltriert und mit Alkohol gewaschen. Das Filtrat engt man auf dem Wasserbade soweit ein, bis eine abgekühlte Probe auf Zusatz von gesättigter, kalter alkoholischer Quecksilberchloridlösung sofort einen starken, körnig-kristal- linischen Niederschlag fallen lälit. Ist dieser Punkt erreicht, dann ITdlt man die ganze Masse mit alkoholischer Quecksilberchloridlösung aus. Nach 24 — 48 Stunden saugt man die Fällung ab und wäscht sie mit alkoholischer Sublimatlösung- aus, worauf man auf dem Filter Quecksilberfiillung 1 hat. Quecksilberfällung I löst man in heiliem Wasser auf, schlägt alles Quecksilber mit Schwefelwasserstoff nieder und filtriert, worauf man das Filtrat zum Sirup einengt und mit absolutem Alkohol aufnimmt. Dabei bleibt etwas anorganische Substanz zurück, von der unter Nach- waschen mit absolutem Alkohol abfiltriert wird. Jetzt fällt man diese alkoholische Lösung unter sorgfältiger Vermeidung eines gröberen Über- schusses mit alkoholischer Platinchloridlösung, worauf man die entstandene Fällung absaugt und mit absolutem Alkohol etwas auswäscht. Dann trennt man diesen Niederschlag durch Aerrühren in wenig kaltem Wasser in einen darin schwer lösUchen und in einen darin leicht löslichen Teil. Der erstere in kaltem Wasser schwer lösliche Teil ist das noch nicht genau untersuchte Platiuat des Carnomuskarins. das nur in geringer Menge auftritt. Filtriert man von ihm ab, so erhält man die in Wasser leicht löshchen Platinate des Neosins und C'aruitins. Lim sie voneinander zu trennen, muß aus der Lösung der Platinate das ]\Ietall durch Kinleiten von Schwefelwasserstoff beseitigt werden ; man engt die so erhaltene Lösung der Chloride nun stark ein und fällt mit 10%iger wässeriger (Joldchloridlösung fraktioniert aus. Die einzelnen ?'ällungen werden ab- gesaugt und so oft umkristallisiert, bis ihr (ioldgehalt konstant geworden ist. Das Filtrat der einzelnen Fällungen ist, bevor man es von neuem mit Goldchlorid fällt, immer \rieder zum dünnen Sirup einzuengen, da die eine der hier ausfallenden Verbindungen, trotzdem ihr Goldsalz in Wasser schwer löslich ist, merkwürdigerweise nur aus stark konzentrierter Lösung ausfällt. Aus den ersten 2 — H Fraktionen') wird manchmal, aber nicht immer, in nicht zu groRer Menge Neosingoldchlorid erhalten. Weit reichhcher und stets voi-handen ist die in den s]);iteren Fi-aktionen mit ') In manchen Fällen liat Kiitsdier an Stelle des Neosins in diesen Fraktionon die Goldsalze des Cliolins und Neurins gefunden, die er durch fniktionirrte Kristalli- sation voneinander zu trennen vermochte. 1048 D. Ackermann. GoldcliloridlösiiDg fallende Base, das Carnitin. Ihr Goldsalz bildet meist schon in der dritten Fraktion den alleinigen Bestandteil der Fällnng als ein rotes, bald kristaUinisch werdendes Öl. Engt man das alkoholische Filtrat der Quecksilberfällung I ein und läßt es bedeckt einige Tage an einem kühlen Ort stehen, so findet eine reichliche Kristallabscheidung statt. Diese Quecksilberfällung II muß abgesaugt werden; nachdem man sie mit etwas alkohoUscher Quecksilberchloridlösung gewaschen hat, löst man sie in Wasser, leitet solange Schwefelwasserstoff ein, bis das Queck- silber völlig niedergeschlagen ist, filtriert und engt das Filtrat zum Sirup ein. Aus diesem Sirup kristallisiert nach einiger Zeit salzsaures Kreatinin aus, das man unter Benutzung seiner Schwerlöslichkeit im absoluten Alkohol abtrennt, indem man den Sirup damit gut verreibt, absaugt und die Kri- stalle noch etwas mit absolutem Alkohol wäscht. Das alkoholische Filtrat wird unter Vermeidung eines Überschusses mit alkoholischer Platinchlorid- lösung ausgefällt und das Ganze einige Zeit stehen gelassen. Dann saugt man die voluminöse Fällung ab, wäscht sie mit absolutem Alkohol und schwemmt sie in wenig Wasser auf. Der Rückstand wird jetzt abgesaugt. in heißem Wasser gelöst und die Lösung auf dem Wasserbade bis zur be- ginnenden Kristallisation eingedampft. Diese besteht aus dem Platinat des Oblitins, welches man nach dem Erkalten absaugen und mit kaltem Wasser und Alkohol w^aschen muß. Es ist dann sofort analysenrein. Das 0])Utin gerät manchmal auch in die QuecksilberfäUung I hinein und findet sich dann bei deren Aufarbeitung an der Stelle des Karno- musearins gleichfalls als Platinat. Das Filtrat der QuecksilberfäUung II wird jetzt abwechselnd solange mit gesättigter alkoholischer Natriumacetatlösung und mit gesättigter alkoholischer Quecksilberchloridlösung versetzt, bis mit keinem dieser FäUungsmittel mehr ein Niederschlag entsteht, dann läßt man bis zum anderen Tage stehen, saugt den Niederschlag ab und wäscht ihn mit einem Gemenge beider Fällungsmittel aus. Hierauf wird der Nieder- schlag in eine Schale getan und der anhaftende Alkohol davon auf dem Wasserbade abgedunstet unter Zusatz von etwas Salzsäure in Wasser ge- löst und Schwefelwasserstoff in ihn hineiugeleitet, bis alles Quecksilber aus- gefällt ist. Man saugt jetzt ab. engt zum Sirup ein und beseitigt das sich jetzt ausscheidende Kochsalz durch Aufnehmen mit absolutem Alkohol. Die alkohoüsche Lösung wird nun etwas eingeengt und mit einer heißge- sättigten alkoholischen Cadmiumchloridlösung vollständig ausgefällt. Nach 24 Stunden saugt man die Cadmiumfällung ab, wäscht sie mit kaltge- sättigter alkoholischer Cadmiumchloridlösunü\ worauf man sie mit Schwefel- Wasserstoff in der Kälte zersetzt. Vom Cadmiumsulfid wird abgesaugt, die Lösung der Chloride zum Sirup eingedampft, und nun scheidet sich sehr bald Histidindichlorid aus. Man wäscht dieses Salz mit konzentrierter Salzsäure und absolutem Alkohol. Die Mutterlauge des Histidindichlorides wird nun noch etwas eingeengt und mit :-i07oi8"^i' wässeriger Goldchlorid- Isolierung von Basen aus den Kxtraktoii il< r Muskeln. 104M lösung gefällt, worauf das Vitiatinchloraurat als nw in I. reiten },'l;iii/.on- den Platten kristallisierendes (ioldsalz auftritt. Die nun zu schildernde Methode schlietU sich in ihrer jetzijren Form in manchen Punkten eni^- an die vorige an; auch hiei- finden sicli die drei Silberfidlunj>en , nur wird statt mit Gerbsiiure mit neiiti-;dem essi^^saiiren Blei vorgereinii^t und die Isolierung des Carnitins erfoliii mit Hilf,, von Kaliumwismutjodid. ' 2. Methode von Gulewitsch und Krimberg, angewandt auf den Extrakt von frischem Rindfleisch.' i (Gewinnung von Carnosin, Methylguanidin und C.unitiii.i Unmittelbar nach dem Schlachten eines Ochsen wird ein Stürk Fleisch (Pvippen kreuz) ausgeschnitten, nach Möglichkeit von Knochen. Fett und Bindegewebe gereinigt, schnell in dünne Streifen und Stückchen ge- schnitten und sofort in kochendes Wasser geworfen. Die Operation der Reinigung und Zerkleinerung des Fleisches dauert ungefähr eine halbe Stunde. Das Gewicht des auf solche Weise gewonnenen ^luskelgewebes niuli ca. 4 — b kl/ betragen. Nachdem alles Fleisch in Wasser gebracht ist. wird die Flüssigkeit noch eine halbe Stunde gekocht, daini das Fleisch fein zer- hackt und mit der abgegossenen Flüssigkeit noch eine Stunde lang ge- kocht. Alsdann Avird die Flüssigkeit durch Musselin koliert und das mit Hilfe eines Handtuches ausgepreßte Fleisch auf die angegeljene Weise mit frischem Wasser noch zweimal ausgekocht. Die vereinigten gelblich ge- färbten Auszüge sollen ungefähr 25 / betragen und reagieren amphoter auf Lackmus, sie werden bis auf 2 l eingeengt und mit einer 20"/oi^!'<'ii Lösung von neutralem essigsauren Blei gefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt und gewaschen, das Filtrat mittelst Schwefelwasserstoff entbh'it. Das Filtrat vom Schwefelblei wird bis auf etwa »/^ l eingeengt und mit einer konzen- trierten Lösung von Phosphorwolframsäure unter \'ernieidung eines gröl'ieren Überschusses derselben ausgefällt. Der entstandene reichliche Niederschlag wird am anderen Tage abgesaugt, gewaschen und durch /enciben mit Barythydrat bei Zimmertemperatur zersetzt. Das durch Kohlensäure vom überschüssigen Baryt befreite f'iltrat wird mit Salpetersäure neutralisieil. auf etwa V2 ^ eingedampft und mit 20" oiii't'r Silbernitratlösunefähr n»/,, Schwefelsäure gebracht hat, mit Phosphorwolframsäure. Der Niederschlag' wird am anderen Tage abgesaugt und uinl» solange gewaschen werden, bis das Waschwasser keine Salpetersäure mehr enthält. Dann stellt man durch Behandeln des Niederschlages mit Baryt und Kohlensäure (das Nähere siehe S. 1007) eine Lösung der kohlensauren Basen her, die man zum -Sirup eindampft. Diesen versetzt man jetzt mit ge- sättigter kalter alkoholischer Pikrinsäurelösung unt(n' \'ermeidung eines Überschusses, solange noch eine Fällung entsteht. Am anderen Tage saugt man ab, wäscht mit etwas Alkohol nach und löst die Fidlung in kochendem Wasser auf. Hierauf läßt man einige Stunden in der Kälte stehen, filtriert die reichUchen Ki'istalle, die sich abgeschieden haben, ab und wäscht sie mit etwas Alkohol. Sie bestehen aus dem analysenreinen Pikrat') des d-Lysins. Die erste (alkoholische Mutterlauge der Pikrinsäurefällung wird auf dem Wasserbad vom Alkohol befreit, worauf man den so erhaltenen Rück- stand mit der zweiten (wässerigen) Mutterlauge des Lysinpikrates vereinigt. Dieses Gemenge wird jetzt eventuell unter Zugabe von Wasser durch Auf- kochen zur Lösung gebracht; zur kochenden Lösung gibt man dann solange konzentrierte Salzsäure, als kein Niederschlag von Pikrinsäure mehr da- durch erzeugt wird. Läßt man dann abkühlen, so hat sich noch mehr Pikrinsäure ausgeschieden. Man saugt nun ab, wäscht mit lO'Yoiger Salz- säure aus und gibt das Filtrat mit den Waschwässern zusammen in einen großen Scheidetrichter, in dem man es durch zwei- bis dreimal wieder- holtes Ausschütteln von dem Piest der Pikrinsäure befreit. Hierauf dunstet man auf dem Wasserbade bei niederer Temperatur zunächst den Äther ab, dann die ganze Flüssigkeit (zuletzt unter dem Abzug) vollständig zum Sirup ein und läßt ihn 24 Stunden in der Kälte stehen. Nach dieser Zeit h;iben sich reichlich Kristalle ausgeschieden, die in kaltem absoluten Alkohol schwer löslich sind. Deshalb verreibt man dieselben mitsamt ihrer Mutter- lauge mit absolutem Alkohol, saugt ab, wäscht mit absolutem Alkohol etwas nach und erhält so analysenreines, weißes Betainchlorid, das man bequem identifizieren kann, indem man einen Teil desselben in wenig Wasser löst und die Lösung mit oO^oig^'r wässeriger Goldchloridlösung versetzt, worauf sich das schöne Goldsalz des Betains ausscheidet. Die alkoholische Mutterlauge des Betainchlorides wird etwas eingeengt und nun mit heiß gesättigter alkoholischer Quecksilberchloridlösung gefiillt. Die reichliche kristallinische Fällung saugt man frühestens am anderen Tage ab, wäscht sie mit alkoholischer (^uecksilberchloridlösung aus und löst den Niederschlag, nachdem man den Alkohol durch Abdunsten von ihm ab- getrieben hat, in heißem Wasser. Jetzt wird Schwefelwasserstoff bis zur Sättigung eingeleitet, vom Schwefelquecksilber abfiltriert und die Lösung der Chloride zum Sirup eingeengt. Den teilweise kristallinischen Rückstand 1) Aus 2 k-g Krabbenextrakt kann man nicht weniger wie 63 g davon erhalten. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. 11. 67 J^058 ^- Ackermauii. nimmt man mit absolutem Alkohol auf, wodurch noch etwas Betainchlorid gewonnen wird, den davon ablaufenden Alkohol engt man jetzt ^^^eder zum .Sirup ein und nimmt wieder mit Alkohol auf. Auch hierbei scheiden sich weiße Kristalle aus. dieselben sind aber kein Betainchlorid mehr, sondern sie bestehen aus dem Chloride des Crangitins. Um dasselbe zu identifi- zieren, führt man das Chlorid durch Lösen in wenig Wasser und Zugabe von 30°/oiger Goldchloridlösung in das schwer lösliche Goldsalz C13 H20N2 ^h ■ 2HCI.2AUCI3 vom Schmelzpunkt 162—1 65» über. Das alkoholische Filtrat vom Crangitinchlorid mrä nun mit 20''/oiger alkoholischer Platinchloridlösung versetzt, solange noch ein Niederschlag entsteht. Nach längerem Stehen saugt man die voluminöse Fällung ab und wäscht sie mit absolutem Alkohol, bis derselbe fast farblos abläuft. Diese Fällung enthält (beim Krabbenextrakt) die Platinate des Methylpyridyl- ammoniumhydroxyds des Neosins und des Crangonins. Um sie von- einander zu trennen, kristallisiert man sie jetzt aus kochendem, salzsaurem Wasser um. Nach dem Einengen der wässerigen Lösung bei gelinder Tem- peratur scheidet sich das ziemUch schwer löshche Platinat des Methyl- pyridylammoniumhydroxydes in glänzenden lachsfarbenen Platten ab. Nach einmaligem Umkristallisieren aus Wasser ist der Körper rein. Die erste wässerige Mutterlauge des Platinates des ]\Iethylpyridylammonium- hydroxyds muß jetzt durch Schwefelwasserstoff zersetzt werden; man saugt vom Schwefelplatin ab, engt die so erhaltene Lösung der Chloride ein und fällt sie nun mit oO^/oig^r Goldcliloridlösung vollständig aus. Die reichliche FäUung filtriert man nach einigen Tagen ab, löst sie in möglichst wenig siedender, verdünnter Salzsäure vollständig auf und engt die Lösung bei gehnder Temperatur etwa auf die Hälfte ihres Volumens ein. Es scheidet sich jetzt schon in der Wärme nochmals Methylpyridylammoniumhydroxyd in Form seines auch in warmem Wasser schwer löslichen Goldsalzes aus. von dem mau abfiltriert. Man hat auf diese Weise von dieser Base fast nichts mehr im Filtrat. Dasselbe engt man jetzt weiter bei zirka 60° ein, und zwar auf die Hälfte seines Volumens, läßt abkühlen und bekommt nun eine kristaUinische Ausscheidung vom Chloraurate des Neosins.^) Während nun die Isolierung des Methylpyridins und Neosins auf die geschilderte Weise ziemlich leicht gelingt, ist die Pieindarstellung der dritten Base, des Crangonins, viel schwieriger. Man engt, um sie zu bekommen, die Mutter- lauge des Neosinchloraurates vorsichtig ein und erhält schließlich ein gelb- rotes Öl, das nach einigen Tagen zu Drusen von kurzen Nadeln erstarrt. Beim Umkristahisieren zeigen diese nun eine starke Neigung, metallisches Gold abzusetzen und schließen außerdem hartnäckig etwas Neosingold ein. Man geht am besten so vor, daß man die Kristalle mit wenig heißem Wasser löst, bei geringer Temperatur solange einengt, bis sich an der Ober- fläche der Flüssigkeit Nä deichen zeigen. Dann kühlt man ab, filtriert und dampft das Filtrat weiter ein. Haben die jetzt sich ausscheidenden Kristalle ^) Aus 2 kg Krabbenextrakt lassen sich 4 (/ Neosingoldchlorid srewinneu, doch fand sich iu einer anderen Extraktportion weniger. Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. 10Ö9 nach dem Absaugen und Trocknen noch nicht den (ioldwort des Crangoniii- chloraurates, so muß man dieselbe Prozedur nochmals wiederholen, bis man ein reines Salz dieser Base hat. In der nun folgenden kurzen übersieht über die bisher bekannten Fleischbasen sind dieselben nach steigender Zahl ihi-er C-Atome geordnet.') Methylguanidin , CoH^N;;, wurde zuerst von Brieger-) aus faulem Pferdefleisch und aus 'Cholerakulturen auf liindfleischi)rei gewonnen, dann von Kutscher ^ ) und später von Gulewitsch *) aus Liebigs Fleische.xtrakt er- halten. Knmherg^) stellte die Base aus frischem Piindfleisch dar. Die Ver- bindungen der Base siehe in dem von Fr. Kutscher behandelten Abschnitt über Harnbasen. Die Darstellung kann nach den drei ersten der oben ge- schilderten Verfahren geschehen. ß Alanin, C3H7NO2, wurde ans Liebigs Fleischextrakt von Engeland isoliert. '• ) Chloroplatinat, (C3 H7 NOg)» . 2HC1 . PtCli, zersetzt sich bei 188», unterscheidet sich vom isomeren Sarkosinplatinat durch das Fehlen von Kristallwasser und die Kristallforni , denn es kristallisiert aus Alkohol, Wasser und Salzsäure in schönen dunkelgelben Nädelchen. In diesen drei Lösungsmitteln ist es leicht löslich. Von Micho"') ist aus Fleischextrakt ein Alanin gewonnen, von dem der Entdecker aber nicht angibt, ob es ß- oder sc-Alanin ist. Dimethylguanidin, C3 Hc, N3 . «• ) Trimethylaminoxyd, C3H9NO, wurde in allerneuester Zeit zum ersten Male aus den Muskeln des Dornhais (Acanthias vulgaris) \n Kutschers'*) Laboratorium dargestellt. Besonders geeignet zu seiner Isolierung ist neben dem Pikrat das Chloraurat, Cj HgNO . HCl . AuClg , welches in kaltem Wasser schwer, in 1) Histidin, Argiuin, Lysin, Cholin und Neurin sowie die l'urinbasen finden an dieser Stelle keine Berücksichtigung. 2) L. Brieger, Über Ptomaiue. III. S. 34. Berlin 1886. Hirschwald. — Derselbe, Zur Kenntnis der Stoffwechselprodukte des ('holerabazillus. Berliner klin. Wochenschr. Jg. 1887. S.817. ^) Fr. Kutscher, Über Liehigs Fleischextrakt. Zeitschr. f. Untersuch, d. Nähr.- u. Genußmittel. IM. 10. S. 528 (1905).' ■•) Wl. Gidcwltsch, Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskebi. III. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 47. S. 471 (1906). ^) R. Krimberg, Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskeln. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 48. S. 412 (190(5). ") R. Engeland, Über Liebigs Fleischextrakt. Zeitschr. f. Untersuch, d. Xahr.- u. Genußmittel. Bd. 16. S. GG3 (1908)." ') K. Micko, Über das Vorkommen von Monaminosäuren im Fleischextrakt. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 5(5. S. 180 (1908). 8) Siehe hierüber den von Fr. Kutscher behandelten Abschnitt über Harnbasen. 8) A. Suiva, Untersuchungen über die Extraktstoffe des Fischfleisches. Zentralbl. f. Physiol. Bd. 22. S. 307 (1908). — Derselbe, Untersuchungen über die Organoxtrakto der Selachier. Fffilgers Archiv f. d. ges. Physiol. Bd. 128. S. 421 (1909) und Bd. 129. S. 231 (1909). 67* 1060 D. Ackermann. heißem Wasser leicht lösUch ist. Der Schmelzpunkt wird von verschiedenen Autoren verschieden angegeben. Chloroplatinat,^ (CsHgNO)» . 2HC1 . PtCl^ schmilzt bei 214«. Glän- zende rhombische Plättchen. Pikrat, C3 Hg NO . C\ Hg (NOgJa . OH, sehr geeignet zur Isolierung, da es in Äthylalkohol und kaltem Wasser schwer löslich ist. Schmelzpunkt 197". Chlorid, CsHaNO.HCl, schmilzt bei 205-210» unter Zersetzung. Quecksilberverbindung, C3 Hg NO . HCl . 4 Hg CI2 + H., 0. Cadmiumverbindung, C3 H9NO. HCl. Cd CL. In Wasserleicht löslich, in Alkohol schwer löslich. Die Isolierung des Trimethylaminoxydes gelingt mit dem oben geschil- derten vierten ^'erfahren. 20^^ ganz frische Dornhaie werden von Köpfen, SchAvänzen und Ein- geweiden befreit und mit der Fleischhackemaschine zerkleinert, dann mit der doppelten Menge kochendem Wasser dreimal ausgezogen ; die wässerigen Ex- trakte engt man auf fi'eier Flamme stark ein und geht nun genau so vor, wie bei der Aufteilung des Krabbenextraktes geschildert wurde. Man erhält dann in dem durch alkoholische Pikrinsäure erzeugten Niederschlag nicht Lysin, wie beim Ivi'abbenextrakt, sondern Trimethylaminoxyd, und zwar in außerordentlich großer Ausbeute, so daß man nach dem Umwandeln des Pikrates in das Chlorid nicht weniger, wie 20^ reines, weißes Trimethyl- aminoxydchlorhydrat (aus '2?)k(j/ Ausgangsmaterial) vor sich hat. — Zur Identifizierung führt man am besten einen kleinen Teil davon in das Chlor- aurat über. Aus dem Filtrate der Pikrinsäurefällung gewinnt man in genau der- selben Weise wie beim Krabbenextrakt Betain. Kreatinin, C^H^NaO, scheint im frischen Muskel der höheren Tiere konstant, aber in äußerst geringen Mengen vorzukommen. Bei einigen Fischen dagegen hat es Krukenberg 1) in sehr bedeutenden Quantitäten nachgewiesen, so bei Luvarus, Pelamys, Conger. Im Krabbenextrakt ^} wurde es ebenso wie das Kreatin vermißt. Das mit den oben geschilderten ^lethoden aus Piindermuskelextrakt gewonnene Kreatinin ist fast ganz auf Umwandlung des Kreatins in Krea- tinin während der Gewinnung und Verarbeitung des Extraktes zurückzu- führen. Das Kreatinin bildet gut kristaUisierende Salze, von denen hier nur die für seine Darstellung verwertbaren kurz angeführt seien. Kreatinin-Chlorzink (C4H2N3 Oja . ZnCL. Dasselbe wird gewonnen, indem man zu einer ziemhch stark eingeengten, alkoholischen oder wässe- rigen Lösung, welche das Kreatinin enthält, eine neutrale, konzentrierte, alkoholische Lösung von Chlorzink hinzugibt. Nach einiger Zeit scheidet *) C. Fr. W. Krulcenherij, Untersuchungen der Fleischextrakte verschiedener Fische. Untersuchungen aus d. physiol. Institut zu Heidelberg. Bd. 4. S. 43 u. 44 (1881). ^) D.Ackermann und F.Kutscher, Über Krabbeuextrakt. Zeitschr. f. Untersuchungen d. Nähr.- u. Genußmittel. Bd. 13. S. 183 (1907). Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. loc] sich die Verbindiiiif? als Kristallpulver ab. Nach 2—3 Tagen, wenn sicli dessen Menge nicht mehr vermehrt, filtriert man ab und wäscht den Nie- derschlag mit Weingeist aus. Man kann die Verbindung dann durch Lösen in heißem Wasser umkristalüsieren ; in kaltem Wasser ist sie schwer löslich. WiU man aber Kreatinin daraus frei machen, so löst man die Ver- bindung in heißem Wasser auf und zersetzt sie durch halbstündiges Kochen mit überschüssigem Bleioxydhvdrat oder kohlensaurem Bleioxyd. Dann filtriert man heiß ab, entfärbt das Filtrat durch Tierkohle, filtriert wieder und dampft stark ein, worauf das Kreatinin in farblosen Prismen aus- kristalUsiert. Das lü-eatininchlorzink löst sich leicht in Salzsäure und wird aus dieser Lösung durch Natriumacetat wieder gefällt. Chlorid, C4H7N3O.HCI. aus Wasser langsam umkristalhsiert, ent- hält das Salz 1 Molekül Kristallwasser. Es ist leicht löslich in Wasser, etwas schwieriger in xVlkohol. Platiuat, (C, H, N3 0). . 2HC1 . PtCli. oraugerote Prismen und Nadeln, leicht löslich in Wasser, schwer löshch in Alkohol. Kristallisiert aus Wasser mit 2 Molekülen KristaUwasser. Chloraurat, C4 H^ N3 0 . HCl . AuClj. Ziemhch leicht löshch in Wasser und in Alkohol. Schmelzpunkt 170~-174o. Pikrat, C4 H^ N3 0 . Cg H3 N3 O7. Schwer löshche Verbindung, die wohl neben dem Kreatininchlorid am besten geeignet sein dürfte, größere Mengen Kreatinin zu isoUeren und zu reinigen. Schmelzpunkt 212 — 213". Für die DarsteUung des Kreatinins aus Fleischextrakt ist vor aUem die von Kutscher^) gemachte Beobachtung wichtig, daß es auf Zusatz von Silbernitrat und vorsichtige Zugabe von Ammoniak unter Vermeidung eines Überschusses (ebenso wie das Histidin und Carnosin) niedergeschlagen A\-ird. Bedeutungsvoll ist ferner die Tatsache, daß dieser Niederschlag auch durch überschüssiges Barytwasser teilweise wieder gelöst werden kann. Der Gang der Darstellung nach Kutscher ist auf S. 1045 und 1046 bereits geschildert worden. Krukenberg machte die Beobachtung, daß Kreatinin nicht leicht aus Muskelmassen mit kaltem Alkohol zu extrahieren ist, wohl aber durch Kochen damit. Isolierung von Kreatinin aus Fisehmuskulatur nach Krukenberg. V/^kg frisches Fischfleisch (Luvarus imperialis ist besonders reich an Kreatinin) wird fein zerschnitten und sofort in starken Alkohol"^) ge- tan; man kocht auf, gießt den Alkohol ab und kocht mit neuen Mengen Alkohol aus. Die vereinigten alkoholischen Auszüge werden durch Abdampfen vom Alkohol befreit, worauf man den Rückstand mit Äther durchschüttelt, um ihn zu entfetten. Ist dies geschehen, so scheiden sich bereits i)erl- ') Fr. Kutscher, Über Liehic/s Fleischextrakt. Zeitscbr. f. Unters, d. Nahruugs- u. Genußmittel. Bd. 10. S. 528 (1905). *) Die Konzentration findet sich nicht genauer angegeben. 1062 ^- Ackermann. mutterglänzende, schwach bräunlich gefärbte Flitterchen von Kreatinin ab, die man durch Überführen in die Chlorzinkverbindung reinigen kann. (Aus 11/2 kg Fleisch von Luvarus imperialis ge^Yann Krukenherg auf diese Weise 5 g kristallisiertes Kreatinin. ) Man kommt nicht selten in die Lage, Kreatin vom Kreatinin trennen zu müssen und geht dann am besten auf folgende Weise vor. Trennung des Kreatins vom Kreatinin. M Das Gemenge der Körper wird zum Sirup eingedampft, der Sirup stehen gelassen, bis die Kristallisation möglichst vollständig geworjlen ist, und nun mit absolutem Alkohol, in dem das Kreatin schwer löshch, das Kreatinin ziemlich leicht löslich ist, die Trennung vollzogen. Man bekommt beim Absaugen dann das Kreatin auf das Filter, während man das Kreatinin aus dem Filtrat durch Fähen mit Äther erhält. Kreatin, C4H9N3O2, wurde von Chevreul (1835) entdeckt und findet sich konstant in den Muskeln der höheren Tiere. Das Kreatin muß als solches isohert werden, da es keine zur Iso- herung geeignete schwer lösliche Verbindung desselben gibt. Es kristaUisiert aus wässeriger Lösung in durchsichtigen harten Kristallen mit 1 Molekül Kristallwasser, w^elches schon bei 100" verfliegt. Hierbei werden die Kri- stalle undurchsichtig. Isolierung des Kreatins nach Liebig. 2) bkg von Sehnen und Fett befreites Fleisch (die beste Ausbeute liefert das Fleisch des Wildes und der Hühner) werden zerkleinert und in zwei gleiche Teile geteilt. Die eine Hälfte übergieiit man mit 2500 cm^ Wasser, knetet die Mischung mit den Händen sorgfältig durch und preßt sie in einem Sack von grober Leinwand möglichst vohständig aus. Der einmal gepreßte Rückstand wird mit 2500 cm^ Wasser von neuem sorgfältig ge- mischt und ^^ieder ausgepreßt. Die Flüssigkeit der ersten Pressung wird zur weiteren Bearbeitung zur Seite gestellt, die der zweiten Pressung dient zur Ausziehung der anderen Hälfte des frischen Fleisches. Man behandelt in gleicher Weise die erste Hälfte mit 2500 cm^ Wasser zum drittenmal und benutzt die durch Pressung erhaltene Flüssigkeit zur zweiten Aus- ziehung der anderen Hälfte. Die letztere wird zum drittenmal mit reinem Wasser aufquellen gelassen und ebenfalls gepreßt. Die vereinigten, noch- mals durch ein reines Tuch geseihten Auszüge werden, um Eiweiß zu koagulieren, in einem großen Glaskolben im W^asserbad allmähUch zum Sieden erhitzt, und zwar solange, bis eine herausgenommene Probe, für sich erhitzt, klar bleibt. Jetzt koUert man durch ein Tuch, filtriert noch einmal und gibt solange konzentriertes Barvtwasser hinzu, als noch ein *) Persönliche Mitteilung von Kutscher nud Steudel. 2) J. Liehig, Chemische Untersuchungen über das Fleisch etc. Heidelberg. C. F. Winter. 1847. 8.22 ff. Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. 106H Niederschlag- (von Baryumphosphat und Magnesiumphosphat) ent>ti'lit.' ) Jetzt wird abfiltriert, und das Filtrat vorsichtig (so daß es nie auf Kochhitze kommt) eingeengt zu etwa V20 seines Volumens. Dann stellt man den dünnen Sirup an einen w^arraen Ort und läßt ihn freiwillig weiter ahdimsten, worauf das Kreatin auskristaUisiert. Nach längerem Stehen in der Kälte wird das Kreatin von der Mutterlauge durch Filtrieren getrennt, mit Wasser und zuletzt mit Weingeist gewaschen und dann noch einmal durch Kochen mit Tierkohle gereinigt. Es scheidet sich dann aus dem von der Tierkohle ablaufenden Filtrat nach dem Einengen das Kreatin in vollkommen reinen Kristallen ab. Isolierung des Kreatins-) (neuere Methode). 500 ^- muschel (Mytilus eduhs); ferner im Krabbenoxtrakt von Z). Ackermann und F. Kutscher. *) Im Muskelgewebe des Dornhais von Kutschers Schüler Suwa.^) Chlorid, C5H11NO2.HCL ist in Wasser leicht löslich, in absolutem Alkohol unlöshch. Letztere Eigenschaft ist für die Gewinnung des Betains von großer Bedeutung. Schmelzpunkt 227—228^. Chloraurat, C5 HuNO, .HCI.AUCI3. In kaltem Was.ser schwer lös- hches Salz, das sich zur Isolierung des Betains gleichfalls sehr gut eignet. Der Schmelzpunkt wird verschieden angegeben (20U'\ 224", 2;'.0— 2:')5"). Platinat, (CsHuNOoJa .2HCl.rtCl,, schwer löslich in Alkohol, leicht löslich in Wasser: daraus mit wechselndem Kristallwassergehalt kristalli- sierend. Schmelzpunkt des wasserfreien Salzes 246". Das Quecksilbersalz ist in Wasser zienüich leicht löslich, in Alkohol schwer löshch. Das Pikrat kaum löslich in Alkohol, leicht löshch dagegen in 1) Alkalische Reaktion schadet nichts. 2) E. Drechsel, Anleitung zur Darstellung physiologisch-chemischer Präparate. Bergmann. 1889. S. 29. ==) L. Brieger, Ptomaine. III. Berlin 1886. Ilirschwald. S. 77. *) D. Ackermaiui und F. Kutscher. Über Krabbcuextrakt. II. u. \\ . Mitteilung. Bd. 13. S. 610 (19U7); Bd. 14. S. 688 (1907). ^) A. Suwa, Untersuchungen über die Organextrakte der Selachier. I. Mitteilung. Pflügers Arch. f. d. gcs. Physiol. Bd. 128. S. 421 (1909). 1064 D- Ackermann. Wasser, eine Eigenschaft, dank derer man es vom Lysin trennen kann, dessen Pikrat auch in Wasser schwer löslich ist. Die Gewinnung des Betains aus Krabbenextrakt ist bereits S. 1057 geschildert; wir beschreiben jetzt noch die Isolierung von Betain aus der Miesmuschel nach Brieger. Die noch lebenden Weichtiere werden zerquetscht und mit schwach salzsäurehaltigem Wasser ausgekocht. Hierauf entfernt man die festen Bestandteile und dampft die zurückbleibende Flüssigkeit zum Sirup ein. Jetzt wird dieser wiederholt mit Alkohol extrahiert, wobei man den Piück- stand jedesmal energisch durchknetet. Nun dampft man den Alkohol ab, nimmt den Rückstand mit Wasser auf und fällt mit Bleiacetat. Das Filtrat der Bleifällung wird durch Schwefelwasserstoff vom Metall befreit und eingeengt. Jetzt fällt man mit wässeriger Quecksilberchloridlösung, saugt den Niederschlag nach einiger Zeit ab, wäscht ihn und leitet in die vereinigten Filtrate Schwefelwasserstoff ein. Ist alles Quecksilber nieder- geschlagen, so wird filtriert, das Filtrat zum Sirup eingedampft und nun mit warmem absoluten Alkohol digeriert. Die sich ausscheidenden weißen Kristalle sind Betainchlorid. Vitiatin, C^Hi.Ne.i) Methylpyridylammoniumhydroxyd, Cg Hr, NO. ^) C6H14N0 Oo. Diese unbeuannte Base konnte Krimberg') mit Kutschers ]\Iethode aus Liehigs Fleischextrakt gewinnen. Er stellte zu dem Zweck die Chloride der in Quecksilberfällung I (S.1047) enthaltenden Basen dar, dampfte sie ein und nahm mit absolutem Alkohol auf. Die dal)ei in geringer Menge abgeschiedenen anorganischen \'erbiudungen wurden durch Absaugen beseitigt. Darauf fällte er das alkoholische Filtrat mit alkoholischer Platinchloridlösung unter Vermeidung eines Überschusses, saugte den Niederschlag am anderen Tage ab und wusch ihn mit Alkohol. Dann wurde der Niederschlag durch Aufnehmen mit 200 cm^ kaltem Wasser in einen in Wasser schwer löslichen Teil, der sich als Oblitinplatinat erwies, und in einem in Wasser leicht löslichen Teil getrennt. Die in Wasser leicht löslichen Platinate verwandelte er durch Schwefelwasserstoff in eine Lösung der Chloride, welche nun durch Goldchloridlösung auf folgende Weise fraktioniert zur Ausfällung kamen. Es wurden 20 cm^ lO^/oigei' Goldchloridlösung zugegeben, der erhaltene Niederschlag abgesaugt und umkristallisiert; die beiden so erhaltenen Mutterlaugen wurden dann vereinigt, eingeengt, mit einer zweiten Portion 20 cm^ 10°/oiger Goldchlorid- lösung gefällt und so fortgefahren. — In den ersten fünf Fraktionen fand sich nun nur Carnitinchloraurat, aber in der sechsten und siebenten Fraktion wurde eine neue Verbindung der Formel Cg H14N2 Oo.HCl.AuCls ') Ist in dem von Fr. Kutscher bearbeiteten Teil über Harnbasen besprochen. 2) B. Krimherg, Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskehi. Zeitschr. f. physiot. Chemie. X. Mitteihmg. Bd. 55. S. 477 (1908). Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. lOOf) isoliert, die nach dem Umkristallisieren aus heißem Wasser rein war: sie scheidet sich hierbei anfanjus, ebenso wie das Carnitin^old als ein (")1 ab. welches erst beim völligen Erkalten kristallinisch wird; ihr Schmelzi)unkt ist 126 — 128''. Der Körper hat die Formel des Lvsins, ist aber weder mit dem bekannten Drechsehvhen Eiweißspaltprodukt Lysin noch mit dem von Wintersiein aus Pdzinnssamen isolieiten Isomeren identisch. Neosin, C,, Hj^NO.,, wurde /um erstenmal von Ktitscher^) aus Liehiys Fleischextrakt, dann von Ackermann und Kutscher -} aus Krabben- extrakt gewonnen. Die Base findet sich in den Extrakten in wechsebub-r Menge und fehlt manchmal ganz. Sie ist ein Trimethvlaminderivat. Das Chloraurat, CgHieNOCl.AuCls, ist in kaltem Wasser sehi- schwer, in heißem Wasser ziemlich leicht löslich. In absolutem Alkohol ist es leicht löslich. Bei 202 — 205» schmilzt es ohne Zersetzung zu einer roten, klaren Flüssigkeit, die beim Erkalten wieder zu einer hellgelben Kristallmasse erstarrt. Carnin, CjHgN^Os. In Liehigs Fleischextrakt entdeckt von Wcidcl.^) Krukenherg und Wagner^) bestätigten die Angaben Weideis. Aus Pferde- fleisch wurde das Carnin gewonnen von Balke.^) Das Carnin ist ein krümliger Kristallschlamm, der nach dem Trocknen kreidig und glanzlos ist. Es färbt sich bei 230" braun, iiin bei höherer Temperatur (ca. 2^)9'^) zu verkohlen. Es ist in kaltem NN'asser schwer, in heißem leichter löslich. In Alkohol und in Äther ist es nahezu unlöslich. Die wässerige Lösung, welche neutral reagiert, liefert keinen Nieder- schlag mit neutralem essigsauren Blei, IHkrinsäure, Quecksilbernitrat, jedoch mit basischem Bleiacetat, vorausgesetzt, daß nicht ein neutrales Bleisalz in der Flüssigkeit gelöst ist, entsteht eine Fällung. Auch mit Platinchlorid ist eine Fällung (C7 Hg N^ Og . HCl . PtCl,) zu erhalten. Das Silbersalz (CTH^AgN^OaK^AgNOs ist unlöslich in Salpetersäure." aber nicht ganz un- löslich in Ammoniak. Haiser und Wenzel'') halten es für sehr wahrscheinlich, daß das Carnin ein ä([uimolekulares Gemenge von Inosin und llypoxanthin ist. Sie konnten schon durch wiederholtes \'erreil)en mit kaltem Wasser und Ein- dampfen das Carnin zerlegen. *) Fr. Kutscher, Über Liehigs Fleischextrakt. Zcitsclir. f. Unters, d. Nalir.- u. Genußmittel. Bd. 10. S. 52S (1905). ' -) D. Ackennaini und /•'/•. Kutscher, Über Krabbenextrakt. IV. Mitteilung. Zeitschr. f. Unters, d. Nähr.- u. Genußmittel. Bd. 14. S. 687 (1907). ^) //. Weidet, Über eine neue Basis aus dem Fleischcxtrakt. JJel>ii/s Annal. d. Chem. u. Pharm. Bd. 158. S. 352 (1871). *) C. Fr. W. Krukenberg und H. Wagner, Zur Kenntnis des Carnins. Sitzungs- berichte der physikal-niedizin. Gesellschaft zu Würzbura:. Jg. 1883. S. 58. ^) F. Baike, Zur Kenntnis der Xanthinkurpor. Journal f. prakt. Chem. (N. F.) Bd. 47. S. 553 (1893). ^) F. IIa iser \\w(\ F.Wenzel, Über Carnin und Inosinsäure. Monatshefte f. Chemie Bd. 29. S. 157 (1908). 1066 ^- Ackermann. Darstellung des Carnins nach Weidel.^) » Die Lösung des Fleischextraktes in etwa 6 bis 7 Teilen warmen Wassers wird zunächst mit konzentriertem Barytwasser vorsichtig ausgefällt, so dali man einen Überschuß hinzuzubringen vermeidet. Entsteht in kleinen ab- filtrierten Proben kein Niederschlag mehr, so trennt man durch ein leinenes Tuch von der Flüssigkeit, die man hierauf mit basisch-essigsaurem Blei nach dem A])külilen völlig ausfällt. Der Niederschlag, der nun entsteht, ist von lichtl)rauner Farbe, er wird abfiltriert, zwischen Leinwand in einer Schraubenpresse ausgepreßt, wieder mit viel Wasser zu einem. Schlamm zerrieben und hierauf in einem großen emaillierten, eisernen Topf zum Kochen erhitzt. Man filtriert die Flüssigkeit und kocht den Rückstand noch mehrere Male aus. Das beim Abkühlen schon sich trübende Filtrat wird nun wieder bis zum Sieden erhitzt und mit einem starken Strom von Schwefelwasserstoff behandelt. Man trennt vom gebildeten Schwefelblei ab und dampft die nunmehr schon sehr entfärbte Flüssigkeit bis auf ein kleines Volumen ein. Manchmal scheidet sich nun bei einigem Stehen schon ein Teil des Carnins in der Form eines krümügen, noch sehr gefärbten Kristallschlammes aus. Dies scheint von der im Extrakt vorhandenen wechselnden Kochsalzmenge und der dadurch mehr oder weniger großen Menge von Salzsäure abzu- hängen, die durch Vermittlung des Chlorbleis nach diesen Operationen mit in die Flüssigkeit gelangen muß, in der sich das Carnin befindet War eine solche Ausscheidung erfolgt, so trennt man sie und versetzt die übrige Flüssigkeit mit einer ziemlich konzentrierten Lösung von Silbernitrat, wo- durch ein sehr voluminöser Niederschlag fällt. Man filtriert ihn ab, wäscht mit kaltem Wasser aus, rührt ihn nochmals zu einem Brei an und be- handelt ihn mit Ätzammoniak, dem man ein gleiches ^'olumen Wasser zugesetzt hat. Das Chlorsilber geht in Lösung und man behält die in Ammoniak schwer lösliche Silberverbindung des Carnins zurück, die endlich nach dem Auswaschen in fast siedendes W^asser gegeben und mit Schwefel- wasserstoff zersetzt wird. Die vom Schwefelsilber getrennte Flüssigkeit gibt nun beim Eindampfen wieder eine krümlige, kristallinische iVusscheidung von Rohcarnin, welches zum Schluß mit Tierkohle entfärbt wird. Diese letzte Reinigung schmälert ein wenig die Ausbeute, weil die Kohle außer dem Färbenden auch etwas Carnin zurückhält. Indessen entfärbt es sich leicht und aus der fast w^asserhellen Flüssigkeit scheidet es sich bald beim Abkühlen in kreideweißen Drusen und krümligen Gruppen äußerst kleiner mikroskopischer, unregelmäßig begrenzter Kristalle aus. Man erhält aus dem Ausgangsmaterial etwa lO^/o Carnin. Mit dieser Methode haben manche Forscher das Carnin auch nicht in Spuren erhalten können. Beispielsweise fand Micko statt Carnin stets nur Hypoxanthin. Haiser und Wenzel erklären dies auf sehr einfache Weise, gestützt auf ihre Beobachtung, daß das Carnin ein Gemisch von ^) Weidel, loc. cit. Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. \()(] X Inosiii und Hypoxantliiu darstellt. Sie machen darauf anfmerksaiii. dal', wohl das Carninsilber in Ammoniak schwer löshch ist, das liiosinsilhcr sich aber darin leicht löst. Aus dem nach Weideis Vorschrift hergestellten Silhci- niederschlag wird man also beim Ausw-aschen desselben mit Ammoniak nicht nur das Chlorsilber, sondern auch das Inosinsilber l)eseitij2:en. und wenn man genügend lange wäscht, nur noch Hypoxanthinsilber zurück- behalten, welches ja jn Ammoniak unlösHch ist. Darstellung des Carnins nach Kaiser und Wenzel. 500^ möglichst frischer Fleischextrakt werden in zirka 5 Teilen warmen Wassers von ungefähr 40'' gelöst und Barvthydrat zugesetzt, bis kein Niederschlag erfolgt. Man scheue sich nicht davor, daß im Filtrate Baryt erscheint, sondern setze solange Baryt zu, als im Filtrate noch ein Nieder- schlag entsteht. Nach dem Absaugen des Barytniederschlages, der übrigens nach dem Auswaschen mit heißem Wasser nur Spuren von organischen Substanzen enthält, wird die stark alkaUsche Flüssigkeit mit Essigsäure neutralisiert. Sodann wird in der Kälte mit Bleiessig ausgefällt, indem man solange davon zusetzt, bis eben kein Niederschlag mehr entstellt. Fin Überschuß ist zu vermeiden, da dieser lösend auf den Niederschlag wirkt. Das Filtrat von dem mit kaltem Wasser gut ausgewaschenen Niederschlag, welcher inosinsaures Baryum enthält, fällt man jetzt mit Ammoniak, wobei abermals ein Bleiuiederschlag entsteht, der das Carnin enthält. Dieser wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und mit Schwefelwasserstoff zerlegt. Dies kann in der Hitze vorgenommen werden, geschieht aber zweck- mäßiger in der Kälte, damit etwa entstandene freie Säuren keine Zersetzung hervorrufen. Noch vor dem Abfiltrieren des Bleisulfids werden die Säuren mit Baryumkarbonat neutralisiert, hierauf wird filtriert und zum Sirup ein- gedampft. Nach dem Impfen mit Carninkristallen oder nach 24stündigem Stehen kommt die ganze Masse zur Kristallisation. Die Kristalle werden abgesaugt, kalt gewaschen und 3 — 4mal unter Eindampfen mit wenig Tier- kohle aus Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt 5 — 6 (/ pro .XX) // frischen Fleischextrakt. Darstellung des Carnins nach Balke. Ca. 800 f/ feingehacktes Pferdefleisch, das von Sehnen und Fett möglichst hefreit ist, wird mit dem gleichen Volumen Wasser bei 50—60" ungefähr eine Stunde auf dem Wasserbade unter gutem Umrühren digeriert, durch ein Koliertuch gepreßt und dann nochmals in der gleichen Weise mit ungefähr der Hälfte Wasser behandelt. Die ver- einigten Filtrate werden dann behufs Koagulation der Eiweißkörper aufgekocht und nach dem Erkalten nochmals filtriert. Die klare, schwach gelblich gefärbte Flüssigkeit wird jetzt mit Natronlauge alkalisch gemacht, wodurch ein geringer Niederschlag von Phos- phaten entsteht, den man abfiltriert. Das Filtrat wird nun mit salzsaurem Hydroxylamin versetzt und dann allmählich Fehlmc/sche Lösung hinzugefügt. Es entsteht ein flockiger, gelbbrauner Niederschlag, den man zuerst durch Dekantieren mit einer Lösung von essigsaurem Natron auswäscht und dann filtriert. Mau suspendiert diesen Niederschlag in Wasser, dem man etwas Ammoniak zugesetzt hat und zersetzt ihn dann mit Schwefel- wasserstoff. Das eingedampfte Filtrat vom Schwefelkupfer wird ammoniakaliscli gemacht 1068 !'• Ackermann. und hierauf mit Bleiessig versetzt. Es fallen die Bleiverbindungen des Carnins, Xanthins und Hypoxanthins vollständig aus. Der Bleiniederschlag wird abgesaugt und mehrere Male mit "Wasser ausgekocht, wodurch die iu heißem Wasser lösliche Carninbleiverbin- dung in den wässerigen Extrakt geht. Dies wird dann mit Schwefelwasserstoff zerlegt und nach dem von Weidel angegebenen Verfahren weiter verarbeitet. Man erhält so 0"14 g Rohcarnin, Carnitin, C;Hi,-, NO3, wurde aus Fleischextrakt gewonnen von Gule- ivitsch und Krimherg. ^) Die Darstellung ist oben geschildert. Chlorplatinat, (C7 Hj, NOs)^ . 2HC1 .PtCl^, schmilzt bei 214— 218" unter Zersetzung. Chloraurat, CyH^s NO3HCI. AuCls, bald kristallinisch werdendes Öl. Schmelzpunkt 153—154«. Quecksilbers alze sind zwei bekannt. Aus der alkohohschen Lösung der freien Base scheidet sich auf Zusatz von alkohohscher Quecksilber- chloridlösung C7H15NO3 .2 Hg CI2 sofort kristallinisch ab. aus Lösungen, welche einen kleinen Überschuß von Salzsäure enthalten, C^HisNOg.HCl.öHgCl., als schwer kristallisierendes Öl. Die erstere ist in Wasser schwer löslich und schmilzt bei 204 — 205 ^ Es ist ein Trimethylaminderivat. Carnosin, CoHiiN^Oj, wurde im Fleischextrakt von Gideioitsch und AmiradMbi-) entdeckt. Die freie Base kristallisiert in flachen Xädelchen, die in Wasser leicht und mit stark alkalischer Keaktion löslich sind, und bei 239" unter Zersetzung schmelzen. Bei der Spaltimg mit Atzbaryt entsteht Histidin.^) Nitrat, CgHi^N.Oa.HXOs, schmilzt bei 211— 212". Die Darstellung ist S. 1046 u. 1050 geschildert. Inosin, C10H1.2N4O5 , entdeckt von Haiser und Wenzel*') als ein Bestandteil des Carnins, welches nach ihnen wahrscheinhch ein äquimole- kulares Gemenge von Hypoxanthin und Inosin darstellt. Inosin schmilzt unscharf bei 215". Es ist mehr wie zehnmal lösUcher in Wasser als das Hypoxanthin und auch wesenthch leichter lösüch als das Carnin. Beim Zusatz von Silbernitrat gestehen wässerige Inosinlösungen zu einer durchsichtigen Gallerte; das entstandene Silbersalz ist völlig unlöshch in Ammoniak. Haiser und Wenzel gewannen das Inosin durch Acetylierung des Carnins und nachherige Verseifung des hierbei entstehenden Acetyhnosins. Darstellung des Inosins aus Carnin nach Haiser und WenzeL Carnin ^) wird unter Zugabe eines Körnchens Natriumacetat mit Essigsäureanhydrid einmal aufgekocht und letzteres dann im Vakuum ab- V Wl. Guletvitsch und B. Krimberg, Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskeln. II. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 45. S. 326 (1905). ■) WLGulewitsch und S. Aniiradzibi , Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskeln. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 30. S. 565 (1900). ^) Wl. Guletvitsch, Zur Kenntnis der Extraktivstoffe der Muskeln. VIII. Mittei- lung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 50. S. 535 (1906/07). ^) F. Haiser und F. Wenzel, Über Carnin und Inosinsäure. I. Mitteilung. Monatsh. f. Chemie. Bd 29. S. 157 (1908). •'') Haiser und Wenzel kamen schon mit 1 g zum Ziele. Isolierung von Basen aus den Extrakten der Muskeln. 1069 destilliert. Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert, das Unf^elöste nochmals in gleicher Weise acetyliert und wieder mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und 24 Stunden stehen gelassen, damit die Spuren von Hypoxanthin, welche in Lösung gegangen sind oder in der Flüssigkeit suspendiert blieben, Gelegenheit haben, sich vollständig auszuscheiden. Es wird sodann filtriert, bis zur Trockne abdestilliert und aus absolutem Alkohol unter Anwendung von Tierkohle umkristallisiert. Das Triacetylinosin scheidet sich jetzt sofort rein aus der alkoholischen Lösung beim Erkalten in prächtigen seidenglänzenden Nadeln aus. 1 g Triacetylinosin wird in 250 ccm. iV-n-Ätzbaryt eine halbe Stunde lang gekocht. Sodann wird mit der entsprechenden Menge iV-n-Schwefelsäure der Baryt eben heraustitriert, so daß die Lösung weder Jjaryt noch Schwefel- säure enthält. Da die Flüssigkeit infolge ihres Gehaltes an Essigsäure saure Reaktion zeigt, muß der größte Teil derselben im Vakuum abdestilliert werden, der Rest wird über Schwefelsäure im Vakuum abgedunstet. Hierbei erstarrt das Ganze zu einer Kristallmasse, die nach dem Abpressen auf einer Tonplatte fast das Gewicht der theoretischen Ausbeute an Inosin hat. Das Rohprodukt wird zunächst aus Wasser unter Anwendung von Tierkohle umkristallisiert, wobei aus verdünnter Lösung feine, seidenglänzende Nadeln, aus konzentrierter sirupöser Lösung warzenförmige Drusen sich ausscheiden. Als bestes Mittel zum LTmkristallisieren des Inosins hat sich bisher SOVoiger Weingeist erwiesen, aus dem das Inosin beim Erkalten in feinen seidenglänzenden Nadeln fast quantitativ ausfällt. Crangitin, C13H20N.3O4', bisher xon Ackermann und Kutscher^) nur aus Krabbenextrakt dargestellt, bildet ein bei 162 — 165" schmelzendes, in Wasser schwer lösliches Goldsalz, CjaHgoNa O4.2HCI.2 AuClg. Das Chlorid schmilzt bei 160". Crangonin, C13H.20N2O3, wie das vorige bisher nur aus Krabben- extrakt von Ackermann und Kutscher'^) erhalten. Bildet ein Chloraurat, Ci3H26N2 03.2HC1.2AnCl3, das bei 130—140" schmilzt und frisch gefällt zuerst ein Öl, erst nachher Kristalle bildet. Oblitin, C18H33N0O5, wurde von Kutscher^) aus Licini/s Fleisch- extrakt isoliert. Das Platinat, Cjg H38 N2 O5 . 2 HCl . Pt CI4, ist in kaltem Wasser schwer, in heißem leicht löslich. Unlöslich ist das Salz in absolutem Alkohol. Es zersetzt sich bei 280". Das Chloraurat, CisHggNa O5 .2HC1.2 AUCI3, ist in kaltem Wasser sehr schwer löslich, in heißem ziemlich leicht löslich. ') D. Acherman/i und F. Kutscher, Über Krabbenextrakt. IV. Mitteilung. Bd. 14. S. 687 (1907). 2) Ebenda. ") Fr. Kutscher, ^HherLiehigsFlehche.xtrakt. Zeitschr. f. Untersuchung d.Nahrungs- u. Genußmittel. Bd. 10. S. 528 (1905). Nachtrag zur quantitativen Glykogenanal^^se. Von Eduard Pflüger, Bonn. Die erste und wichtigste Tatsache zur Beurteilung der in Betraclit kommenden analytischen Methoden ist die Unangreifbarkeit des Glyko- gens durch Kalilauge. Dieses Reagens ermöglicht deshalb die Gewinnung des Glykogens aus den Organen des Tierleibes, weil sie diese in Lösung überführt, also das Glykogen aufschließt, so daiJ es dann mit Alkohol gefällt werden kann. Mit der Unangreifbarkeit des Glykogens durch Kalilauge hat es aber eine besondere Bewandtnis. Denn wenn auch schon Claude Bernard^) und August Kekule^) an diese Unangreifbarkeit glaubten, ergaben doch die Untersuchungen späterer Forscher, wie v. V'mtschgau und Dietl% R. Külz^) und mir selbst &), daß sogar verdünnte KaHlauge von 1 bis 20/0 das Glykogen zu zersetzen scheint. Dr. Josef Nerking ^) gelangte sogar zu dem Ergebnis, daß die Anwendung der Kalilauge bei der Glykogenanalyse aufzugeben sei. Denn nach seiner auf zahlreiche Analysen gegründeten Ansicht „wird durch den Einfluß der Kalilauge fortwährend neues Glykogen aufgeschlossen oder allgespalten, gleichzeitig aber auch schon gebildetes Glykogen durch die Kalilauge zerstört". Beiläufig sei hier daran erinnert, daß durch die Untersuchungen von E. Pßüger') und H. Löschke^) die Angaben Nerkings widerlegt sind. Denn alles Glykogen läßt sich ohne Kali und nur durch siedendes Wasser den Organen entziehen, so daß keine Berechtigung zu der Annahme vorliegt, daß das Glykogen in den Organen chemisch gebunden sei und erst durch Kalilauge abgespalten werde. Eine außerordentliche Schwierigkeit für das Verständnis der Kali- wirkung entstand aber, als ich sicher nachwies, daß Glykogen durch sehr 1) Claude Bernard, Legoiis siir la Physiologie et la Pathologie du Systeme, nerveux. T. 1, p. 467 (1850). 2) August Kekule, Pharmazeutisches Zentralblatt. S. 300 (1858). ^) V. Vintschgau uud Dietl, Die quantitative Bestimmung des Glykogens. Pßügers Archiv. Bd. 13. S. 253 (1876). *) E. Külz, Über die Einwirkung warmer Kalilösungen auf Glykogen. Zeitschr. f. Biol. Bd. 22. S. 161 (1886). ^) E. T'fiäficr, Die Bestimmung des Glykogens nach Brücke und Külz. Pflügers Archiv. Bd. 75. S. 164 (1899). «) J. Nerking, Beiträge zur Physiologie des Glykogens. Pflügers Archiv. Bd. 81. S. 39 (1900). ') und '^) IL Löschke, Über die Berechtigung der Annahme, daß das Glykogen in den Organen chemisch gebunden ist. Pflügers Archiv. Bd. 102. S. 592. Nachtrag zur i|uautitativen Glykogeuanalyse. IQI [ starke Kalilauge hei monatelang- fortgesetztem Kochen in keiner Weise angegriffen werde. Und doch hatte ichi) seihst in Chereinstinniuin^r mit V. Vintschgau und Dietl wie mit dem sehr exakten Arheiter U. Kiih elicn- falls Verluste beim Kochen von Glykogen mit verdünnter Kalilauge zu- geben müssen. um eine Aufklifi-ung der Paradoxie zu erlangen, dachte ich an die durch F. W.Pavy^) betonte Tatsache, daß das nach der Methode von Brürke- Külz dargestellte Glykogen durch die Salzsäure und das KaliunKiuecksilber- jodid und weitere Reinigung eine ^>ränderung erführt, die es für Kali- lauge angreifbar macht. Die dabei entstehenden Dextrine sollen sich durch diese Eigentümlichkeit auszeichnen. Ich stellte deshalb jetzt das (ilykogen auf die schonendste Weise dar, indem ich es nur mit Wasser aus dem neutrahsierten Organl)rei oder auf andere Weise mit Ausschluli von Säuren und den jBrwcÄ-eschen Reagenzien auszog. Jetzt erwies sich dieses (iUykogen als viel widerstandsfähiger, so daß der beim Kochen in verdünnter Kalilauge auftretende Verlust fast in die Beobachtungsfehler fiel, ja zuweilen ganz fehlte. Ich mußte also in Betracht ziehen, ob nicht das von mir auf das sorgfältigste aus den Organen zu den Versuchen isolierte Glykogen doch eine Veränderung erfahren habe. Bereits in meinem großen Werke über das Glykogen sagte ich: „Ich kann also mit Sicherheit den vollkommenen Ausschluß von Fermentbüdungen nicht behaupten." Ich wollte damit sagen, daß das von mir auf das sorgfältigste dargestellte Glykogen \i(>lleicht doch eine Schädigung erfahren habe und nicht mehr identisch mit dem primär in den (Jrganen enthaltenen Glykogen sei. Da kam mir der richtige Gedanke, den frischen Grganbrei in ver- dünnter Kalilauge beliebig lange zu kochen, aber zuletzt den Kaligehalt stark zu steigern und weiter zu kochen. Da sich nun herausstellte, daß derselbe Wert für das Glykogen erhalten wird, als wenn man gleich von Anfang an mit konzentrierter Kalilauge erhitzt hätte, so ist bewiesen, daß die verdünnte Kalilauge das in den Organen befindliche Glykogen in keiner Weise versehrt. Diese wichtige Tatsache ist in einer großen, unter meiner Leitung ausgeführten Untersuchung von Dr. Georg Francke festgestellt und in seiner Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der hohen Veterinär-medizinischen Fakultät der Universität zu Bern genauer beschrieben. Demnach gilt der Satz: Glykogen kann mit Kalilauge beliebiger Konzentration beliebig lange gekockt werden, ohne daß es eine Spur von Zersetzung erfährt. Da die wichtige Arbeit von Georg FrnnA-e°) sogar den SpeziaHsten unbekannt geblieben ist, wird es zweckmäßig sein, wenn ich die tatsächliche 1) E. Pflüger, Glykogen. S. 85. Bonn (1905). 2) F. W. Pavif, The Physiology of the Carbohyilrates. An Epicriticisni. p. 38. London 1895. ä) Georg Francke, Über die Ursache, weshalb die Glykogenanalyse bei Anwendung verdünnter Kalilauge zu niedrige Werte geliefert hat. — Bernhard Schondorß, l'ctrr Junkersdorf und Georg Francke, Über die Ursache der Fehlbeträge in der Glykogenana- lyse bei Anwendung verdünnter Kalilauge. Fflügers Archiv. Bd. 127. S. 274 (1909). 1072 Eduard Pflüger. Begründung des Hauptergebnisses durch Wiederabdruck von wenigstens 2 Versuchsreihen hier mitteile. Versuchsreihe mit Hundeleber. Doppelversuch.i) Nummer des Versuchs Konzen- tration der Kalilauge Kochdauer in Stunden Prozent- gehalt an Glykogen Mittelwerte des Prozent- gehaltes Bemerkungen c D 7 8 9 10 11 12 307o 30% 1"/ 1°/ l'Vo 3 8 24 + 1 24 + 1 48 + 1 48 + 1 72 + 1 72 + 1 1G197 16-441 16-686 16197 16-375 16 441 16-686 16197 16-319 16-442 16-408 16-442 Nach 24stündigem Kochen auf 30% KOH gebracht und noch 1 Stunde gekocht. Nach 48stüudigem Kochen auf 307o KOH gebracht und noch 1 Stunde gekocht. Nach 72stündigem Kochen auf 307o KOH gebracht und noch 1 Stunde gekocht. Der Doppelversuch, der aus 6 Einzelversuchen besteht, ist so ange- stellt, daß die 1004"6 g wiegende Leber eines 12'7 kg schweren Hundes benutzt wurde, der auf Glykogen gemästet worden war. Von derselben Leber konnten also, nachdem sie wohlzerkleinert und gemischt war, für jeden der 6 Versuche je bO g Brei verwandt Averden. Versuchsreihe mit Hundemuskel. Doppelversuche.^) Nummer des Versuchs Konzen- tration der Kalilauge Kochdauer in 'Stunden Prozent - gehalt an Glykogen Mittel-werte des Prozent gehaltes Bemerkungen G H 23 24 25 26 27 307o 307o i7o ^ 10 1"/ H 3 24 + 1 24 + 1 48 + 1 72 + 1 72 + 1 2-034 2-048 2-034 1] 2-106 || 2-106 2-1105 1 1-9499 1/ 2 041 2-0699 2-106 2030 Nach 24sti-indigem Kochen auf 30''/o KOH obracht und noch 1 Stunde gekocht. Nach 48sti-indigem Kochen -wie Nr. 23 und 24 behandelt. Nach 72stündigem Kochen auf 307„ KOH gebraclit und noch 1 Stunde gekocht. Es kann also kein Zweifel sein, daß diejenige Art des Glykogens, welches primär in den Organen enthalten ist, durch verdünnte Kalilauge nicht augegriffen wird. *) Pflügers Archiv. Bd. 127. S. 276. — B. Schöndorff, F.Jitnl-ersdorf und Georg Francke, 1. c. 1909. ^) Pflügers Archiv. Bd. 127. S. 277. — B. Schöndorff, P. Jimhersdorf und Georg Francke, \. c. 1909. Nachtrag zur quantitativen Glykogenanalyse. 1073 Will man sich Rechenschaft ablegen über die Ursache, weshalb bei Anwendung verdünnter Kalilauge auf Glykogen gi'ößere Verluste l)isher beobachtet worden sind als beim Erhitzen mit konzentrierter Kalilauge, so kommen wesentlich zwei Umstände in Betracht. 1. Wenn das Organ durch Kochen mit verdünnter Lauge in Lösung gebracht wurde, ist die Denaturierung des Eiweißes nicht weit genug vor- geschritten. Es sind _also noch viele Eiweißflocken da, welche Glykogen einschließen, so daß es nicht ausgewaschen werden kann. - Bei Kochen mit konzentrierter Lauge ist das Eiweiß denaturiert, so daß eine viel kleinere Menge von kleineren Flocken erhalten worden ist, die kein Glykogen mehr einschließen. — Ich habe ja quantitativ nachge^^^esen. daß bei der Methode von Külz nach Anwendung der verdünnten Kalilauge oft un- geheuer große Glykogenmengen ^) so in den Eiweißniederschlag eingel)acken sind, daß sie nicht ausgewaschen werden können. 2. Die zweite Ursache zu Glykogenverlust hat ihren Grund darin, daß das Glykogen, wenn es aus dem Organe isoliert worden ist, durch die zur Isolation verwandte chemische Behandlung oder auch durch einwirkende Fermente eine Veränderung erfahren hat. 3. Nicht ausreichend aufgeklärt ist meine sonderbare Beobachtung, daß das angreifbar gewordene Glykogen bei Behandlung mit konzentrierter Kalilauge sich als resistent erweist. Ich beabsichtige diesen paradoxen Punkt nochmals eingehend zu prüfen. Nachdem festgestellt war, daß tatsächUch die Ausbeute an Glykogen immer zu klein ausfällt, wenn verdünnte Kalilauge zur Airfschließung der Organe aufgewandt wird, war es notwendig festzustellen, wie groß die Konzentration der Kalilauge sein muß, um richtige Werte zu erhalten. Mit dieser Untersuchung habe ich Herrn Paul Heyden beauftragt, welcher dieselbe unter meiner Leitung in meinem Laboratorium bearbeitet und in seiner Inauguraldissertation 2) veröffentlicht hat. Bei der Vergleichung der Wirkung der 30Voigen und 2»/üigen Lange ergab sich ein sofort in die Augen springender großer Fehlbetrag bei An- wendung der verdünnten Lauge. Auffallend erscheint es aber, daß bei Vergleichung der SOVoig*'» K«-li- lauge mit der von 15Vo oder 7-5»/o zwar auch noch die reichere Ausbeute bei 30% sicher heraustritt, aber doch ist der Unterschied meist kleiner, ja fehlt ganz. Da ein Unterschied aber aucli bei Vergleichung von 30Voiger mit 15«/oiger Kalilauge in gedachter Richtung noch deutlich bemerkbar bleibt, folgt, daß die richtige Stärke der Kalilauge 30Vo beträgt. 1) E. Pflüger, Glykogen. S. 39. Bonn 1905. ") Paul Hei/den, tiber den Einfluß, den die Konzentration der Kalilauge auf die quantitative Analyse des Glykogens ausübt. Diss. Giessen. Dasselbe kürzer abgefaßt von Bernhard Schöndorß) Peter Junhersdorf, Paul Heyden. Pflügers Archiv. Bd. 126. S. 582 (1909). Abderhalden, Handbuch der biochemisclien Arbeitsmethoden. 11. 68 1074 Eduard Pflüger. Es blieb nun noch die Frage zu erörtern, wie lange die Organe mit bO^/oiger Kalilauge gekocht werden müssen, um die vollständige Zerstörung der Eiweißstoffe zu erzielen. Diese Aufgabe zu behandeln habe ich Herrn Victor Hessen'') übergeben, der seine Ergebnisse, die er unter meiner Leitung in meinem Laboratorium erhielt, in seiner Inauguraldissertation veröffent- licht hat. Es geht aus diesen Versuchen hervor, daß man dieselben Glykogen- w^erte erhält, wenn man die Organe i/o, 1, 2 oder ?> Stunden mit SO^/oiger Kalilauge kocht; eine halbstündige Kochdauer genügt also, wenn man dafür Sorge trägt, daß der Kolben alle 5 — 10 Minuten aus dem Wasser- bade herausgenommen und geschüttelt wird. Die Begründung folgt aus diesen Tabellen : Numiiier der Ver- suchsreihe Untersuchtes Organ Mittelwerte des (rlykogengehaltes in Prozenten nach Kochdaner In Stunden : I II III IV V VI VII VIII Muskel Leber Muskel Leber Muskel 0-3169 0-885 0-934 1-185 13-568 2-4075 17-7628 3-897 0-923 1-212 13-282 2-458 03223 — 0-8775 — 0-92 — 1-232 1-185 13-428 13401 2-4198 2-4708 17-8339 17-6914 385 3-897 Kochdauer Kochdauer 3 Stunden 1 Stunde Mittel aus den Muskelwerten von Versuchsreihen I, IL ni, IV. VI und VIII l-62097o l-60367o Mittel aus den Leberwerteu von Versuchsreihe V und VII 15-66547„ 15-68087o Kochdauer Kochdauer 3 Stunden 2 Stunden Mittel aus den Muskelwerten von Versuchsreihe III, IV, VI l-50887„ l-5647„ Koo]idauer Kochdaner 3 Stunden i 2 Stunde Mittel aus den Muskelwertcn von V^ersuchsreihe IV, VI, VIII 2-49657o 2-51767e Mittel aus den Leberwerteu von Versuchsreihe V und VII 15-66367o 15-5467o Weil aber das häufige Herausnehmen des Kolbens aus dem siedenden Wasserbade äußerst lästig ist, verfahren wir gewöhnlich so, daß wir dies nur im Anfange ein- oder zweimal vollziehen, jedesmal gut schütteln und *) Victor Hessen, Über den Einfluß, den die Zeit der Erhitzung mit starker Kalilauge auf die quantitative Analyse des Glykogens ausübt. Diss. Bern. 1909. — Dasselbe in abgekürzter Form von Bernhard Schündorf , Feter Junkersdorf , Victor Hessen. Pflügers Archiv. Bd. 126. S. 578 (1909). Nachtrag zur quantitativen Glykogenanalyse. 1075 dann 2 Stunden erhitzen. Das hat auch den i^roßen \orteil. dall die aus- reichende Zerstörung' der Gewebe selbst dann sicher erzielt wird, wenn es sich um die Aufschließung der Organe sehr alter Tiere handelt. Es ist z. B. sehr auffallend und von mir oft beobachtet, daß besonders bei An- wendung verdünnter Kalilauge die Lösung der Organe sich in außerordent- licher Weise verzögoi t wenn es sich um sehr alte Tiere handelt. Demgemäß verfahre ich nunmehr so: 100*7 mit der Fleischhack- maschine zerkleinertes Organ werden eingetragen in einen Kolben, welcher bereits 100 cm^ Kalilauge von 60% enthalt und schon längere Zeit im sieden- den Wasserbade bei 100" C erhitzt worden ist. Hierdurch wird die im Organ- brei sich vollziehende Fermentation sofort unterbrochen. Nachdem der Kolben 10 Minuten im siedenden Bad war. wird er herausgehoben, ge- schüttelt und dann wieder in das siedende Bad zurückgebracht. Das wird dann 20 jNIinuten nach Beginn der Erhitzung wiederholt. — Sobald die Erhitzung 2 Stunden gedauert hat, wird der Kolben aus dem AVasserbad gehoben, unter der Pumpe durch einen kontinuierlichen Wasserstrahl ab- gekühlt und in ein Becherglas entleert. Mit 200 cni^ Wasser wird der Kolben rein gespült , so daß die Lösung auf 400 cm^ gebracht wird . die man dann mit 800 cm^ Alkohol von 96"/o '^'i'- versetzt, gut umrührt und über Nacht mit einem Uhrglas verschlossen hinstellt, damit sich das Gly- kogen gut absetze. Ich mache darauf aufmerksam , daß es zuweilen vor- kommt, daß das Glykogen trotz des notwendigen Alkoholzusatzes sich nicht flockig ausscheidet, sondern nm* eine Trübung bildet, aus der sich das Glykogen erst nach Stunden in Gestalt eines feinen Staubes absetzt. Das kommt nicht bloß dann vor, wenn das Glykogen in Spuren vorhanden ist, sondern auch bei sehr reichlichem Gehalt. In solchen Fällen sieht es dann nach Zusatz des Alkohols zu der Glykogenlösung so aus, als ob kein Gly- kogen vorhanden sei, so daß der Unerfahrene, wie ich weiß, sich veranlaßt sieht, die ganze Flüssigkeit fortzugießen und damit einen groben Fehler zu begehen. Es ist nicht unl)edingt notwendig, nach der Fällung mit Alkohol bis zum anderen Tag zu warten mit der Filtration. Man kann schon damit beginnen, sobald sich die ersten Massen des Glykogens abgesetzt haben. Vorteilhafter ist es aber, die vollkommene Abscheidung des Glykogens abzuwarten. Von dem großen Becherglas wird nun die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit in ein zweites geräumiges Becherglas abgegossen und sofort mit Hilfe eines sehr großen mit Hahn versehenen Trichters durch ein gutes Faltenfilter abfiltriert. Der Glykogenniederschlag wird auf ein zweites schwedisches Filter gebracht, welcher einen Durchmesser von 15 cm besitzt. Dieser Niederschlag 68* \Q1Q Eduard Pfliiger. vdrd mit 66Voigem Alkohol so lange gewaschen, bis das Filtrat nahezu farblos abläuft. Dann folgt Waschung mit Alcohol absolutus, dann mit Äther und zuletzt nochmals mit absolutem Alkohol. Wie oft gewaschen wird, hängt von dem Gehalt von Farbstoffen ab. Das Faltenfilter, welches die dekantierte Flüssigkeit aufgenommen hatte, wird nur mit 66Voig'eni Alkohol gewaschen. Es handelt sich jetzt darum, das (xlykogen zu trennen von den Flocken und Farbstoffen, die es noch verunreinigen. Ich nehme das feuchte schwedische Filter vom Trichter, entfalte dasselbe über einem geräumigen Becherglas von ca. 300 — 500 cm^ Gehalt und streiche mit einem Platin- spatel die ganze Schmiere vom Papiere ab, so daß sie in das Becherglas fällt. Dann bringe ich das Filter wieder auf den Trichter und befestige das Faltenfilter über das Filter, von dem das Glykogen abgewischt wurde. Es stehen also zwei Filter übereinander. Nunmehr gieße ich siedendes Wasser auf das Faltenfilter, so daß das Filtrat das untere Filter füllt und die noch anhaftenden Glykogenspuren löst, was man durch ein Pinselchen befördert. So erhält man das ganze Glykogen mit seinen Verunreinigungen in das Bechergläschen. Durch längeres Umrühren bringt man das Glykogen in Lösung und filtriert dann durch Glaswolle in ein geaichtes Kölbchen von 100— 200— 500— 1000 cm 3 Gehalt. Meist genügt ein Kölbchen von 200 cm^. Sind größere Glykogenmengen vorhanden, muß man geräumigere Kolben verwenden oder weniger Glykogenlösung zur Fällung mit Alkohol verwenden. Die trübe schmutzige Lösung wird nun in dem noch nicht ganz aufgefüllten Kölbchen abgekühlt und mit ein wenig Salzsäure von 1'19 spez. Gew. versetzt. Man tröpfelt vorsichtig zu, bis sich deutliche Flöckchen ausscheiden, welche durch klare Flüssigkeit geschieden sind Gewöhnlich gebraucht man 0*5 — 1 — 2 cm^ bei Untersuchung von 100 jcr Aii^.'hhtiiii!.' irli zur Polarisation aiis^n'/oicliiict ci^niot. Ks ist wahr, daU /iiwrilcn eine Fär- bung vorliandon ist. die inicli al)cr fast iiicnials vcrhiiHlcrtc. dio AI)U'sunj< inachoii /u kümieii. iiaclidciii icli ciitspnM'hciid vcrdiimit liatfc Wenn ich das Glykogen aus besoiidcn'ii (iriindcn mit in WA. Alkohdl j^cfällt hatte. machte sich der Farl^stotf mit liröticrcr Fiitschiedeiihcit wie sonst störend geltend. Die durch die schwache Ansaueriing der rohen ( ilykogenhOiin': er/. 'ii^rten flockiiion Niederschläge sind von sehr verschiedener lieschafleidieit. aber immer iiui- von geringem (iewicht. wenn sie auch nach der Füllung: dnrch ihr aiifge(|n()Ilenes NOliim als grolle Masse imponieren. Heim .\bfiltrieren dieser Fällungen sieht man, dal» es sich nui- um dünne Überzii<:e auf dem Filtrierpapier handelt. Die Fällungen aus der Lel)erglykoii Alcohol absolutus unterscheiden. Meist sind diese Farb- stoffe in Äther unlöslich; doch ist dies nicht immer der Fall. Stets ist ein grol'ier Teil der Farbstoffe in verdüimtem Alkohol von ß^Vo und in absolutem Alkohol wie in Äther ganz unlöslich. Die bei der (ilykogenanaly.se der Muskeln auftretenden Farbstoffe sind immer mit der Leber verglichen in sehr geringer Menge vorhanden. Bei groliem lieichtum an (ilykogen ist die Menge der N'erunreini- gungen absolut und relativ viel geringer, und die Filtration vollzieht sich beim Auswaschen mit Alkohol sehr schnell und leicht. Daß die Farbstoffflocken bei der Filtration keinen Fehler durch Zurückhaltung von (Glykogen bedingen, habe ich schon früher streng bewiesen.') Dali bei meiner Methode das Glykogen erhalten wird ohne andere polarisierende oder reduzierende Substanzen, wurde von mir dadurch bewiesen, dal^) in zahlreichen Analysen, die an Fröschen und Hunden unter den verschie- densten Lebensbedingungen erhaltenen Werte für den GlykoL.M'nLM'halt fast genau übereinstimmten. gleicliLiültig, ob derselbe durch l'olarisation oder durch Titration des aus dem (ilykogen durch Inversion eihaltenen /uckers ermittelt worden war. In '2'.\ an Fröschen augestellten \ Crgleichsanaly.sen 'i ergab sich :ils Glykogengehalt des ganzen Tieres: dinrh rolai'isation durch Titration nein;:)"/,, o-iimT" o- ') Eduanl l'fh'if/rr, Vntor ircwissoii LolioiislipdiiivfiiiijjiMi iiiiimit die in iloin lehen- (liircii 'rieiköincr ciitliultciie .Mciiiri' tles (ihkniroiis trotz vollkiiiunifiuT. ül>er Monate sicli ausdehnender Phitziohung der Nalirung fortwährend sehr erheblich zu. l'tfihjn-it .\rchiv. I5tl.l20. S. 285 (1907). 1078 Eduard Pflüger. Ebenso in 48 an Hunden angestellten Vergleichsanalysen ^) von Leber- glykogen durch Polarisation durch Titration 2-22 7 'Vo 2-2H9Vo- Ebenso in 7 Yergleichsversuchen betreffend den ( ilykogengehalt der Muskeln des Hundes durch Polarisation durch Titration 0-410Vo 0-411V0. Gleichwohl bleibt die Kontrolle der Polarisation durch die Titration wünschenswert. Meine TabeUen beweisen, daß außer dem Glykogen kein drehender luirper vorhanden war und nach Invertierung des Glykogens neben dem Zucker keine Substanz, welche reduzierend wirkte. Gleichwohl ist es vorgekommen, daß in einem Ausnahmefall die Pola- risation einen um 14''/o höheren Wert als die Titration ergab. Eingehende Wiederholung des Versuches bestätigte die Tatsache, so dal» die Annahme einer abnormen, das Glykogen begleitenden Substanz kaum bezweifelt werden konnte. Bei diesen polarimetrischen Bestimmungen des Glykogens hat man es im allgemeinen mit Ablesungen von 2" zu tun; meistens handelt es sich um geringere Werte. Soviel ich gesehen habe, unterscheiden sich die Ab- lesungen der besten Beobachter um O'Ol" bis O'OS". Ist also die korrekte Ablesung P000°, so wdrd ein Fehler bis .^"/o begangen. Bei manchen Be- obachtern ist aber der Fehler noch viel größer. Es läßt sich ja natürlich durch eine sehr große Zahl von Ablesungen ein der Wahrheit entspre- chendes Mittel erzielen, wie es bei Bestimmung der spezifischen Drehung durchgeführt werden muß. Weil man durch die Polarisation sehr annähernd den Gehalt an Zucker kennt, der durch Invertierung der Glykogenlösung entstehen muß, führt die Titration meist in wenigen Minuten zu einem sicheren Ergebnis, während die gravimetrische Methode immer einige Stunden erfordert. Ich habe deshalb die gravimetrische Methode mit Volhards Berichtigung nur angewandt, wo der Farl)stoffgehalt der Glykogen- und Zuckerlösung die polarimetrische und FehUngsche Bestimmung unsicher oder unmöglich machte, oder wo die zu kleine zu bestimmende Zuckermenge die Titration nicht mehr ausführbar erscheinen ließ. Demnach gestaltet sich die Analyse folgendermaßen : Ich fülle ein Rohr von 189"4wm Länge mit der zu untersu(;henden Glykogenlösung und mache am Halbschattenapparat drei Ablesungen *) Eduard Pßäger, Meine Methode der quantitativen Analyse des Glykogens usw. Pßüffers- Archiv. Bd. i29. S. 374 (1909). Nachtrag zur (luautitativen Glykofrenanalyse. 1079 + 2- 10" + -i-OH« (^uar/pkittc: + .')•»'><)" + 2-080 Soll: + n-f).')" Mittel: + ^-OST« + ov:)" Korrigiert : + 'i-OBö". Weil nun die spezifische Drehung der Dextrose = 4- ö2'60" ' ) und die des Glykogens = + 196-t)l°-). so hat man 196-57« ., „, , 2-056« „-- , ^m i — ^-— -— = ;V<4 und — ^— — = 0-;)o2 dlvkouen. 52-60« ;)-74« Von einer Glykogenlösung werden nun 90('m3 in einem 1 50 cm'- Kölbchen mit ^cm^ Salzsäure von 1*19 spez. Gew. :> Stunden erhitzt, ab- gekühlt mit 60''/oi8'er Kalilauge neutralisiert, bis zur Marke aufgefüllt und durch schwedisches Filter filtriert, weil sich noch einige Farbstoffflöckchen ausgeschieden haben. Invertiert wurden '^/jo des in lOOcw^ gelösten Glykogens, also 0-552— 0-0552 = 04968 r/ Glykogen. Nun hat NerHng durch eine genaue Untersuchung folgende (ileicliiing festgestellt : Glykogen = Zucker x 0-927. Daraus folgt, daß 0-4968 Glykogen liefern müssen 0-5o59 Dextrose, welche wir in 150 rw/^ gelöst hatten, so daß die Lösung 0-.'')57:)«/o Dextrose enthiüt. Zur Analyse nach Fehlmg-Soxhht wurden 10c»/ ^ Kupferseignettesalz- löung + 40 cw^3 Wasser gebraucht, für deren vollkommene Hedaktion 0-050^ Dextrose in runder Zahl nötig sind. Weil unsere Zuckerlösung gemäß des durch Polarisation bestimmten Wertes 0-i\bli\g Dextrose in 100 cm^ ontiiält, würden rund 14 c^^i-^ dieser Zuckerlösung nötig sein, um die lOr/^^ Fehling vollkommen zu reduzieren. Bei der ersten Analyse und Zusatz von 14 ^-m» Zuckerlösung gab das Filtrat der 2 Minuten gekochten Mischung noch eine Spur Reaktion mit Ferrocyankahum ; bei Anwendung von 14-2 cw^ reagierte das Filtrat nicht mehr auf dies Reagens. Also 14-1 cm" ■= 0-05^ Dextrose, also 100 cm3 =: 0-o55 und U^Ocm^ = 0-533. Da dies nur Vio der Gesamt- menge, so beträgt diese 0592^/ Dextrose, entsprechend 0-549 (ilykogen. Also : Gemäß Polarisation: 0-552^ (ilykogen. „ Titration : 0-549 „ ,, *) H. Landolf, Das optisclio DrcliiiiiirsvcrnKiiroii organischer Substanzen. 11. Aufl. S. 446 (1898). ^) M«ne (Jatin-Gruzewska, Das reine Glykogen. Pfüijers Archiv. Bd. 102. S.577 (1904). 1080 Eduard Pf lüger. Nachtrag zur quautitativeu Glykogenanalyse. Der Unterschied beträgt absolut : 0-003^ Glykogen. Bei dem vorliegenden Versuch entsprachen: IV^ g Frosch — 0"552^ Glykogen oder 100 ,, ,, = 0-488 „ ' / Betreffend die gra\ämetrische Methode verweise ich auf mein Werk Glykogen (S. 53 und 111). Ich möchte endlich noch auf den Vorzug meiner Methode aufmerk- sam machen, welcher es ermöglicht, die kleinsten Mengen von Glykogen quantitativ genau zu bestimmen, selbst da noch, wo die Titration, ja die gravimetrische Analyse versagen. Ich bestimme mit meinem Polarimeter noch Werte von 0"05 bis O'Olg Glykogen auf 100 ^r Leber oder Muskel, und ich habe von diesem Vorteil ^äelfachen Gebrauch gemacht. — Sehr oft wird man bei der Seltenheit der Inkongruenz zwischen Polarisation und Titration auf Inversion und Titration zur großen Abkürzung verzichten dürfen! Nachträge und Berichtigungen. S. 16 ist die Quelle des Zitates zu berichtigen in Ber. d. Deutsch, cliem. Ges. Jg. 32. S. 1961 (1899). S. 182. Zeile 7: Lies 10SO4Fe + 2MnO,K etc. S. 248ff. Über den Nachweis und die Eigenschaften des Cholesterins sei noch auf die kürzlich erschienene Arbeit von A. Windans, Über die Entgiftung der Saponiue durch Cholesterin (Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jg. 42. S. 238 [1909]) ganz besonders liiu- gewiesen. S. 272. Fußnote i): Dean . . . (1905). S. 273. Fußnote '''): Vines, The Proteases of Plauts . . . S. 289. Zeile 20: Statt I. 2a = A.2a. S. 297. Zeile 13: Kochsalzlösung statt Natronlauge. S.306. Zitat *): Zeile 5: 1898 statt 1908. S.323. Zeile 8: Statt 1007« lies 100^. S. 325. Zitat »): S. 110 statt S. 276. S. 333. Zeile 10: Statt 2-57o = l*57o- S. 488. Isolierung des d-Glukosamins : Nach H. Steudel (Über den Nachweis von Amido- zuckern. I. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 33. S. 223 [1901] und Eine neue Methode zum Nachweis von Glukosamin und ihre Anwendung auf die Spaltungs- produkte der Mucine. Ebenda. Bd. 34. S. 352 [1901]) eignet sich zum Nachweis des Glukosamins die Phenylisocyanatverbindung besonders gut. Bei Behandlung einer alkalischen Lösung von Glukosamin mit Phenylisocyanat fällt das Glukosaminaddi- tionsprodukt aus, während eventuell vorhandene Verbindungen mit Aminosäuren in Lösung bleiben und erst beim Ansäuern ausfallen würden. S. 819. Zitat '): Lies Andersson statt Anderson. S. 914. Zeile 4 des Textes: GuYacin statt Guracin. S. 914. Zitat '): Tschirch statt Tschirsch. S. 929. Zeile 21: Tropanderivate statt Propanderivate. S. 955. Zeile 17: Robertson statt Roberts. S. 997: Lies statt Procter stets Proctor. ßegister. Die beigeclruckten Ziffern boileuton die Seitenzahlen. (a) D, S.a. spezitische Drehung 120, 122. Aalblut 868. Abbauprodukte der Proteine 470. Abramis brania 864. Absatzmetbode 96. Absorptionsbanden 93, 114. Acanthopteri 859. Acarina 880. Accipenserin, Darstellung von 447. Acetaldehyd, Eigenschaften 14, Nachweis 17, Bestim- mung 19. Acetoguanamin 235. Acetondauerhefe, Darstellung 197. Acetylierung 72. Acetylzahl 214. Achroglobine 727. Actiniochrom 770. Aculeata 882. Adenin (aus Pflanzen) 615. — Salze zur Identifizierung geeignet 592. — Spaltungsprodukt der Nuklein.säure 577, 578. Adenosin 607. Adenylsäure 104. Adiantum capillus veneris (Phytolzahl) 707. Adrenalin 819. — Nachweis 823. — Quant. Best. 823. — Wirkungen 821. Adsorptionsanalyse 690. Äpfelsäure, Eigenschaften 34, Bestimmung 35, 37. Äthalioflavin 769. Äther 48, 51. Ätherische Öle 982 tt". — — Gewinnung durch Ex- traktion 993. — — Gewinnung durch Pres- sung 992. — — Gewinnung durch Was- serdampfdestillation 988. — — Gewinnung nach der pneumatischen Methode 995. — — Vorkommen 983. Ätherlösliche Verunreinigun- gen in Samenproteinen i 287. I .^therzahl 208. ' Äthylalkohol 1, Nacliweis 2, Verwandlung in p-Nitro- benzoesäureäthylester 2, Jodoformreaktion 2, Be- stimmung aus dem spe- zitischen Gewicht 3, in sehr verdünnten Lösungen 7. Äthylester der Fettsäuren, Siedepunkte 226. Agglutination 842. Agurin 962. Ahornsaft 45. Alanin,ß-(ausFleiscliextrakt), 1055, Eigenschaften 2059. — d-, aus 1-Alanin 547. — d-, Darstellung 490. — d-, Isolierung 47:^, 480. — 1-, (aus dl-alaiiin durch Hefegärung) 568. — 1-, Überführung in d-Ala- nin 547. Alanyl-d-alanin, d-, 560. Alanylglycin 545. — d-, 554. Albumin, (piantitative Bestim- mung in serösen Flüssig- keiten 373. Albumine 329. Albumine aus RicinusUjhne 431. — aus Samen. Eigenschaftt'n 271. Alljuniinoidc 420 If. Albumoide 421 If. — aus der Linse des Auges 436. — aus der Linsenkapsel 437. Aldehyde, Nachweis und Be- stimmung 14. Aldehvdelweiß 461. Aldosc 93. Alkachlor.iphyll691. Alkaloide, Beirachtungen über Entstehung und Chemis- mus der — in den Pflan- zen 9(K;. — Delinitiiin des Bej^rifles — 904. — ^'erteilung der — im PHanzen korper 905. Alkohol 47. — lösliclif ?;en in l'tlan/.eu 518. 1084 Eegister. Alloxurbasen, Gewinnung aus Nukleinsäure 586. — Spaltungsprodukte der Nukleinsäure 575, 57H. — (Trennung) 613. Alloxurkörper aus Ptianzen 610 ff. All vi Pyridin 911. Alpensalaniander 856. Althaea (lö'icinalis (Pliytol- zahl) 707. Altweibertisch 864. Aluniiniumhydruxyd 46, 127. Amandin, Eigenschaften 302. — Darstellung 301. Ameisen 885. Ameisensäure 92, 887. — Erkennung 21 , Bestim- mung 22. — Spaltungsprodukt der Nu- kleinsäure 577. Amidocerebrininsäure 789, 806. Aniinocerebrininsäureglvko- sid 788-789, 784. 785, 805. Amidomj'eline 799- Amidstickstüff in Prolaminen 271. Aminosäurechloride 547. Aminosäureester aus den Chlorhydraten mit Hilfe von Natronlauge und Ka- liumkarbonat 475 ff., mit Hilfe von Natriumalko- holat 477. Aminosäuren a. Ptianzen 515. — Isolierung470ff-. Trennung 478 ff. — (Methoden zur biologischen Spaltung der Razemver- bindungen durch lebende Organismen) 559 ff. — razemische, Spaltung in die optisch-aktiven Kom- ponenten 554. — (Spaltung der Eazem Ver- bindungen durch den tie- rischen Organismus) 560. — (Spaltung der Razem Ver- bindungen durch Hefe- gärung) 563. — (Spaltung der Razemver- bindungen durch pflanz- liche Organismen) 561. — (Spaltung der Razemver- bindungen durch Pilzkul- tur) 562. Aminovaleriansäure, o-, (Iso- lierung) 1010. Ammon-alkalische Silberlö- sung 87. Ammoniak 489. — in pflanzlichen Organen, Bestimmung 528. — in Prolaminen 271. Ammoniakbestimmung unter den Eiweißspaltungspro- dukten 499. Ammoniakgehalt pflanzlicher Extrakte 515. Ammoniumsulfatfällungen von Samenproteinen, Me- thode sie zu lösen 284. Amphibia 846. Amphocanthus lineatus 860. Amygdalin 60. Amylalkohol 96, 110. — Nachweis und Bestim- mung 9. Amylamin 1043. Amyloid, Darstellung 419, 420. Analyse von Humatin 634. — von Hämin 634. Ancistrodun contortix 841. — piscivorus 841. Androctonus funestus 875. — occitanus 875. Anguilla 869. Anhydrid der dreibasischen Hämatinsäure 631, 632. Anilinacetat 86, 100, 132. Ankylostoma duodenale 898. Annelida 899. Anorganische Verunreinigun- gen in Proteinen 287. Antedonin 769. Anthracin 1014. Anura 846. Apidae 882. Apium graveolens (Phj'tol- zahl)" 707. Aplysiofulvin 769. Aplysiopurpurin 722, 723. Apo'atropin 922, 928. Apomorphin 956. Apomorphinbrommethvlat 957. Apomyelin 799. Araban 133. Arabinosazon 88. Arabinose, d- 65. — Diphenjdhvdrazon 66. — 1- 51, 54,' 58, 62, 63. 64, 65. 67, 88, V^8, 100, 128, 129, 133, 138. — r- 66. Arachnoidea 873. Araueina 876. Arbacin, Darstellung von Histon aus Spermatozoen von Arbacia (Mathews) 444. Arecaidin 914. Arecain 914. Arecolin 914. Arginin (aus Krabbenextrakt) 1056. — aus Pflanzen 518. — Beschreibung und Prozent- zahlen einiger Salze 505. — Gehalt der Histone an 446. — in Prolaminen 271. — Isolierung von 495, 502. Arthrogastra 874. Arthropoda 873. Ascaris lumbricoides 898. Ascitesmucoid, Darst. 411. Aselin 1042. Asparagin 511. Asparaginsäure, 1-, Isolierung 472, 481. Asparaginsaurer Baryt 482. Aspergillus uiger (Nährlö- sung) 562. — — (zur Spaltung razemi- scher Aminosäuren) 562. Assurine 799, 800, 801. Asteroidea 901. Asymmetrischer Abbau von razemischen Aminosäuren durch lebende Organis- men 559 ff. Atrolactyltropein 924. Atropaniin 922, 928. Atropin 921. Atropinsnlfat 923. Atropinsynthese 923. Atroscin' 927. Aufschäumen . Beseitigung des 49. Austern 873. Austernschalen (Conchiolin) 424. Auszuckern der Pflaumen 45. Avivitellinsäure 408. Azelainsäure 234. Bagrus nigritus 859. Balistes capriscus 864. — vetula 864. Ballings Tabellen 148. Bandwürmer 895. Barbencbolera 865. Barbitursäure 134. 135, 138. Barbus fluviatilis 864, 865. Barfoedsche Lösung 86, 115, 151. Barytsaponine 979. Barvumsalze der Ölsäuren 222. Eegister. 1085 Baumann-Schottens' Reaktion 94, 108. Baumwolle 64. BaumwolleDsanienöl,Reaktion auf 221. Baumwollsamen 82, 152. — Eiweiß 298. Belladonin 928. ßenzaldehyd 58, 59, 71,881. Benzaldehyd-Phenvlbydrazon 59. Benzin 200. Benzoate 95. Benzoyl-alanin 496. Benz()vl-4-aniinobutylpropvl- keton 910. Benzoj'lconiin 910. Benzoyl-d-leucin 555. Benzoyl-dl-leucin 555. Benzoylecgonin 930, Benzoylierung 94. Benzoyl-1-leucin 556. Benzoylsaponine 980. Benzoylverbindungen der Mo- noaminosäuren 496. Benzvlphenvlhydrazin 87, 100, 101, 129. Berberin 949. Bernsteinsäure 629, 631, 643. — Eigenschaften 24, Be- stimmung 25. BerthoUetia excelsa (Eiweiß) 294. Bertrandsche Reaktion 101. Betain 522. — (aus Krabbenextrakt) 1055. — (aus Miesmuschel) 1064. — (Eigenschaften) 1063. Beutel zum Pressen 45, 65. Bialsche Reaktion 97, 98. Bienen 882, Bienengift 882, 892. — Gewohnung an 884. Biliansäure, Darstellung 663. — Eigenschaften 664. Bilicyanin 730. Bilifuscin 730. — Nachweis, Eigenschaften 734. Biliprasin 730. — • Eigenschaften 734. Bilipurpurin, Eigenschaften 734. Bilirubin 640, 641, 729. — Löslichkeit 641, 642. — Nachweis 733. — Oxydationsprodukte 735. — Reaktion mit Diazokör- peru 734. Biliverdin 637, 729. — ß-, 638. Biliverdin , Darstellungsme- thoden 642, 735, 736. — Nachweis 734. Birotation 121. Biuretreaktion 350 Blankit 53. Blausäure 881. Bleiacetate 50, 127. Bleiessig 50, 107, 108, 127, 143, 149, 1.52. Bleihydroxyd 51. Bleisalze der Ölsäuren 222. Bleisaponine 980. Bleizucker 51, 108. Blut, Bestimmung des Zuk- kers im 183, nach Bang 184, nach VaU'in 183, nach Schenck 184. — Fällung der Eiweißstoße im 183. Blutegel 899. Blutelgelextrakte,Darstellung . 901). Blutfarbstolf 617. Blutfarbstoffe 724. Blutkörperchen 617. — Darstellung von Kernen aus, von Vögeln und Schlangen (Plösz) 442, (PI enge) 442. Blutkohle 52, 53, 127. Bockshornsamen (Cholin, Be- tain, Trigonellin) 525. Bohnen, Phaseolin 310. Bombardierkäfer 892. Bombyx mori 425, 887. Bonellein 772. Borchardtsche Probe 110. Borstenflosse 864. Bothriocephalus latus 895. — Anämie 895. Brachinus crepitans 892. Brachsen 864. Brasilianische Nuß (Eiweiß) 294. Brechungsexponenten der Fette 204. Bregenin 800. Brennnessel 886. Brennnesselkraut (zur Chloro- phvllgewinnung) 672 f. — (Chlorophvllgehalt) 672, 677, 679. Brix' Tabellen 148. Bromcerebrin 781. Bromeiweiß 463, 464. Bromhomocerebin 787. Bromide der ungesättigten Fettsäuren 231. Bromisocapronsäure, d-, Um- wandlung in d-Bromiso- caj)ronylchlorid 551. Bromisocapfonvlchlorid d-, 550. — aus d - Brumisocapron- sänre 551. Bnimphenvlhvdrazin, |(- 69, 87. KM). " BroiiiwasstTstoll' 111. Brucin 94U. Brückescbe Lösung 87. Buchcnholzguinnii CiC). Bull) vulgaris 846. Buf.min 847, 848. - Nachweis 848. Bufotalin 847. Wirkung und Nachweis 849, H50. Bufoti-nine 847. Bulbocapnin 950. Buthus afer 876. Buttersäure 23. Buttersäureal)S|)altun;: aus Saponinen 979. Butylalkohol, Nachweis und Bestimmung 9 . Butylamin 1016, 1043. Byssus 424. c. Cadaverin 1022. Cadmiumcarljonat IUI. Calciumcarbonat 62. Calciumsalze der Ölsäuren 222. CallionyQius lyra 860. Cannabis siitiva (Eiweiß) 289. Cantharidin 887, 888. — Gewöhnung an 891. — Konstitution 889. — Nachweis 891, 892. — AVirkungen 890. Capsaicin 892. Carabiden 888. Carbaminoreaktiou, l^uotient 539. Cardol 892. Carnin 1065. 1()6(;. 1067. — Gemenge aus Ilypoxan- thin und Inosin 602. Carnitin (Darstellung) 1047. 1048. 10.5U. 1053. — (Eigenschaften) UH)8. Carnomuskarin 1047. Carnosin (Dai-stellung) 1046, 1050. — (Eigenschaften) 1068. Carotin 761. Cassia angustifolia (Phytol- zahl) 707. Cerapterus ^uatuor maculätus 893. 1086 Register. Cerebrin 774, 775, 784—788. 783. 793, 796. ■ — Quantitative Bestimmung des 810. Cerebrinazide 784, 796. — Quantitative Bestimmung der 811. Cerebrininpbosphorsäure 805. Cerebrininsäure 789, 806. Cerebrinsäure 797. Cerebron 774, 775, 778, 779, 783. IH, 785, 789—793, 813. — Quantitative Bestimmung des 810. — Spaltungsprodukte des 794. Cerebronsäure 791, 792, 794, 795. Cerebroside 774, 781, 782. 783—798, — Quantitative Bestimmung der 810. Cerebrosulphatide 797, 812, 814. Cereinsäure 977. Cerura 881. Cestodes 895. Cetin 244. Chätopterin 773. Chamaelirin 977. Cheirolin 969. Chemiscber Charakter von ans Samen darge.stellten Proteinen 272. Chilognatha 881. Chilopoda 880. Chinätbvlin 937. Chinaniylin 937. Chinidin 935. Chinin 934. Chinolin 904. Chinon 881. Cbinpropylin 937. Chloracetvlglycin 546. Chloral 68, 99. Chloralharn 68. Chloride der Aminosäuren 547. Chlorierung der Aminosäuren 552. Chlorocruorin 726. Chlorophyll (Kolloidale Lo- sung) 685. — (Quantitative Bestimmung) 676. — (Umwandlung durch Al- kalien) 691 tf. — (Umwandlung durch Säu- ren) 700 ff. — amorphes, (Abscheidung) 684 ff. Chlorophyll, amorphes (Mo- lekulargewicht) 678. — — kristallisierte.s (Eigen- schaften) 681 tf. — — (Gewinnung) 679 fl\ (Methoxylzahl) 684. — — (Molekulargewicht) 678. (Spektrum) 682 f. — — (Zusammensetzung) 683. Chlorophyllan 700 f. Chlorii[»hyllinsalze (Calcium- salz) 695. — (Gehaltsbestimmung)677 f. — (Kaliunisalz) 693 ff. — (Magnesiumsalz) 695. — (Natriumsalz) 695. Chlorpropylpvridin 911. Chlortopf 62! Cholalsäuren , Darstellung 655-661. Cholausäure. Darstellung 663. — Eigenschaften 664. Cholecyanin 730. Choleinsäure, Darstellung 658-:-61. — Eigenschaften 661. Choleprasin 729. — gereinigt 638. — roh 637. Cholesterin 635, 776, 800, 825, 850. — Bestimmung nach A. Bö- mer 248. nach E. Ritter 249. — Darstellung 252. — Eigenschaften 250. Cholesterinester 244, 251, 252. Choleverdin 730. Cholin 522. — (aus Fleischextrakt) 1047. — aus Protagon 781. — aus Kephalin 798, 803, 804. — (Isolierung aus Fäulnis) 1003. — Isolierung von 504. Cholsäure 825. — Darstellung 6J5. — Eigenschaften 657. Chondroalbumoid 437. Chondroglycoproteide 410. Chondroitinschwefelsäure in Amyloid 419. — in Müzinen 410. Chondromukoid 417, 418. Chromatograpbische Analvse 690. Chrysomeliden 888. Cinchonin 934. Cinchoninsalz des Benzoyl- dl-leucin 555. Cinnamyllvpkaine, 932. Clupea thrissa und venenosa 864. Clupein 868. — Darstellung von 447. Cnethocampapityocampa886. — pinivora 886. — processionea 886. Cnidarien 902. Cobragift 87t). Coccinelliden 888. Cochenillefarbstoff 770. 771. Cochenillewachs 229. Coleoptera 887. Collidin 1033. Conchinin 935. Conchiolin 423. Conger myrus 869. — vulgaris 869. Conglutin 317. — aus blauen und gelben Lupinen 320. — aus gelben Lupinen 317. Conglutina 317. — Eigenschaften 319. — Trennung von Conglutin-ß 318. Conglutin-[3 317. — Eigenschaften 319. Conhydrin 9Ü9. Conicein-Y 909. Coniin-a 909. Coniumalkaloide, Über die Trennung der 909. Convolvulin 74. Convolvulinsäure 71. Cornein 422. Corybulbiu 950. Con^cavanin 950. Corycavin 950. Corydalin 950. Corydin 950. Corvlus avellana (Ph\tolzahl) 707. Corytuberin 950. Cdttus bubaiis 860. — gobio 860. — scorpius 860. Crangitin (Darstellung) 1058. — (Eigenschaften) 1069. Crangoni n ( Darstellung) 10.58. — (Eigenschaften) 1069. Crustazeorubin 760. Cucurbita maxinia, Eiweiß 296. Cuorin 262. Cuprein 937. Curare-Alkaloide 942. Cyanea capillata 902. Cyanein der Medusen 771. Register. 1087 Cyanhämnglobin, kristall. Dar- stellung 344. Cyanmethämoglobin, kristall. Darstellung 344. Cyanokristallin 760. Cyclopterin, Darstellung von 447. Cyclostomata 864. Cyprinus barbus 8 )4. — carpio 864. — linea 864. Cystin, Isolierung 487. Cytisiu 967. Cytolysin 842. Cytosin, Gewinnung aus Nu- kleinsäure 587. — Identifizierung 593. — Spaltungsprodukt der Nu- kleinsäure 577, 579. D. Daphne mezereum 892. Dehydrochloridhämin 619. Dehj'drocholeinsäure 662. Dehydrocholsäure 662. Derivate der Monoaminosäu- ren 495. Desanünoglobulin 466. Desaminoglutin 465. Desaminokasein 465. Desaminoproteine 464. Desaminoprotsäuren 4681". Descemetsche Haut 437. Desoxvcholsäure, Darstellung 658-661, 663. — Eigenschaften 6()1. Destillation, fraktionierte, der Monoaminosäureester 477 tf. Destillationsapparat 48. Deuteroproteose in Samen 272. Dextrin 80. Dextrose 64, Anm. 3, 71, 141. Diabetischer Harn 73. Diaethylamin (Isolierung aus Fäulnis) 1005. Dialysator zur Dialyse von Öamenextrakten 281. Diamphidia locusta 893. Diazobenzolsulfosäure 106. — Darstellung 591. Dibromindigo 722. Dicksaft 79. Dicranura 887. Digitalis purpurea (Phytol- zahl) 707. Digitouin 970, 976. Diglvcvlglvcinmethylester 546. Dihydronikotyrin 918. Dihydropapaverin 945. Dikarbonsäuren aus Japan- wachs 230. Diketopiperazine 489. — 2,5-, Aufspaltung 545. — zum Nachweis von Di- peptiden 529 fi". Dimethylaniin (Isolierung aus Fäulnis) 10Ü5. — (Eigenschaften) 1013. Dimethylguanidin (aus Fleischextrakt) 1054. Dimethylharnsäure, 3.7- 961. DimethVlxanthin, 1,3- 962. — 3.7- 960. Diodon 865. Dioxystearinsäure 234. Dioxvstearvlmonomethvlleci- thin 8()3. Dipeptide aus Anhj^driden 548. Diphenylhvdrazin 58, 66. 84, 88, 93. Diplopoda 881. Disaccharide 79, 151. Dispersion 127. Doppelextrakte (für die Dar- stellung von Chlorophyll) 673 ff. Dotterplättchen 382. Drabble und Nierensteinsche Cvankaliummethode (Gerbstoffe) 1001. Dracunculus 899. Drehung, konstante 122. — spezitische 120, 126. — — der Protamine 448. Drehungstabelle 122. Drehungsvermögen der Fette 205. Drückerfisch 864. Dünnsaft und Dicksaft 79. Ecgonin 930. Echinochrom 726. Echinodermata 901. Echinoidea 901. Echinokokkeubandwnrm 896. Echinokokkenblase 897. Edelfische 858. Edestin aus Hanfsamen, Dar- stellung 289. — Darstellung diu'ch Dia- lyse 290. — Definition 289. — Eigenschaften 292. — Gegenwart von Phosphor in Rohpräparaten 286. — Kristallisation 290. Eidechsen 844. Eicralbumin, kristaliisi^rtrii. Darsteibini,' 33.') Eigplb, Phosphatid.- 2<;3 Eihülh'nmukoid 4l'.\. Einteihin;; der .Sanienprolrim- 270. Eintnicknun(^vonn 612. Kammuioich 857. Kampfer 68. 93, 99. Kaolinpulver 47. Karamellengeruch 85. Karminsiiure 770. Karnaubawachs 229. Karpfen 864. Kasein, Darstellung aus Frau- enmilch 385. — — aus Kuhmilch und Ziegenmilch 384. — — labempfindlicher Lo- sungen 386. — Elementarzusamnu'nset- zung, Eigenschaften 3ö>, 386. 69* 1092 Register. Kasein , Umwandlungs- und Spaltprodukte 386 tf. Kaulkopf 860. Keil, Quarz- 124. Kephalin 798, 799, 800, 802, 804. — Quantitative Bestimmung des 806, 809. Kerasin 783, 784, 810. Keratine, echte 440. Keratinoid 438. Keratoelastine 436, 438. Ketogruppe 109. Ketohexose 76. Ketose 93. Kieselgur 47. Kirschgummi 60, 62, 65. Kirschsamen, Eiweiß 296. Klären trüber Lösungen 46, 143. Knappsche Lösung 151. Kniehebelschraubenpresse 44. Knochenkohle 52. Knurrhahn 860. Koagulationstemperatur 349. Kobaltsalz 87. Kodein 955. Köttstorferzahl 205. Koffein 611. Kofferrtsch 864. Kohle 47, 52, 53, 107. Kohlehydrate in Sameneiweiß, Nachweis durch Ritthau- sens Reaktion 288. — in Samenproteinen 287. — Spaltungsprodukt der Nu- kleinsäure 577, 580. Kohlendioxyd 141. Kohlensäureabspaltungs - Me- thode 139, 140. Kohlensäureverbindungen der Aminosäuren 497. Kohlenwasserstoffe in Wachs- arten 247. — aus Dikarbon.säuren 230. Kokain, a- 932. — d- 931. — 1- 929. — r- 931. Kolben, Bezug derselben 49. — 100 cw'- 149. Kollagen 429 f. — aus Knochen 4'29. — aus Sehnen 430 f. Kolloidstuffe 47. Kolorimetrische Bestimmung 143. Kolostrumproteine 391. Kompensation 123. Konalbumin, Darstellung 377, 378. Kongestin 903. Koppen 860. Koprosterin 254. Korneamukoid 417. Kornradensaponine 970. Kreatin (Darstellung) 1045, 1052, 1062, 1063. — (Eigenschaften) 1062. Kreatinin ( Darstellung) 1045, 1052, 1061. — (Eigenschaften) 1060. Kreisgrade 123, 125, 146, 149, 152. Kresol 68. Kreuzspinne 878. Krinosin 8U0. Kristalline, a- und ß-Kristal- Un, 400, 401. Kristallisation 44. 46, 54. Kristallzucker 80. Kröbers Pentosen-Tabelle 132. 154-158. Kröpfer 864. Kröte, gemeine 846. Krötengift 847. Krusteneidechse 844. Kühler aus Metall 49. Kürbissamen, Eiweiß 296. Kuhbohne, Eiweiß 315. Kuherbse, Legumelin 333. Kupfer, Bestimmung des nach Volhard 177. Kupferhydroxj'd 51. Kupfersulfat und Natron 139, 140. Kyrine, Darstellung, Defini- tion 542. — Reinheitsprüfung 543. Kyroprotsäuren 468. L. Lävulinsäure 81. 104, 108. — Identifizierung 594. — Spaltungsprodukt von Nukleinsäure 577. Lävulinsaures Silber 105. Lävulose 168. Laktoglobulin, Darstellung 390, 391. Laktone aus Fetten 229. Laktoserum Proteose, Molken- eiweiß 388. Lamellibranchiata 871. — (Gerüstsubstanz) 423. Laminaria 99. Lamprete 864. Landolt-Lippicbs Apparat 126. Lathrodectes 877. Laurinsäure 228. Laxierfisch 864. Leber, Nukieoproteid 452. Lecithine 256, 262, 798 bis 800, 803. — Quantitative Bestimmung 806-808. Legumelin 306, 333, 331. — aus Kuherbse 333. — aus Saubohne 333. — Eigenschaften 334. Legumin 305. — aus Linse 305. — aus Saubohne 305. — Darstellung aus Erbse, Linse, Saubohne. Wicke 307. — Eigenschaften 307. — Phosphorgehalt 305. — Salze 305. Leguminosensamen, Phos- phorgehalt in Rohpräpa- raten 287. Leierfisch 860. Leim 432. Lepidoporphyrinreaktion 758. Lepidoptera 886. Leucin, d-, aus Benzoyl-d- leucin 556. — d- (aus dl-Leucin durch Penicillium glaucum) 563. — d- (Gewinnung durch Ver- fütterung von dl-Leucin an Kaninchen) 561. — 1-, ausBenzoyl-l-leucin557. — 1-, aus den Formylver- bindungen 558. — 1-, Isolierung 472 ff., 480. Leucinimid 483. Leucylchlorid 552. Leucyl-glycin , dl- , Darstel- lung 549. Leukosin 330. — aus Gerste, Roggen und Weizen 329. — Eigenschaften 330. — kombiniert mit Nuklein- säure 329. Lichtbrechungsvermögen der Fette 207. Linse, Legumelin 306, 333. — Yicillin 305. 309. Linusinsäure 234. Lipochrome 758 rt". — bei Copepoden 761. — Darstellung 759. — der Seide 724, 758. Lipoide des Nervengewebes 774—814. Lithiumsalze der Fettsäuren 228. Lösung von Ammoniumsulfat- niederschlägen von Samen- proteinen 284. Register. 109;; Lösuiii;- von Eiweißfiillungen 283. — von Globulinniederschlä- gen 283. Lota vulgaris, Darstellung von Histon aus Sperma- tozoen von 444. Lugolsche Lösung 159. Lumbricus terrestris 899. Lupanin 933. Lupeose 60. Lupine, blaue, Eiweiß 317. — gelbe, Eiweiß 317. Lupinensamen, Eiweiß 317. Lupinin 932. Lupinus, Eiweiß 317. Luteine 762. Lycopodium clavatum (Phj'- tolzahl) 707. Lycosa larantula 877. — singoriensis 878. Lvsin (aus Krabbenextrakt) 1057. — aus Pflanzen 518. — Beschreibung und Pro- zentzalileu einiger Salze 508. — in Prolaminen 271. — Gehalt der Histone an 446. — Isolierung von 498, 502. Lysol 68, 99. Lytta vesicatoria 888. M. Magenschleimhaut, Nukleo- proteid 454. Magnesia methode der Sapo- nindarstellung 976. Magnesium (im Chlorophvll) 673. 683 f., (i91, 700'. Magnesiumband 49. Magnesiumkarbonat 62. Mahlen von Samen 274. Mais, Eiweiß 325. Malmignatte 877. Maltosazon 116. Maltose 80, 115, 151. — Be:?timmung der 168. Maltosephenj'losazon 115. Mandeln, Eiweiß 301. Mannan 60. Mannit 104. Mannose, d- 24, 50, 57, 58, 63, 74. 75, 88, 89, 93, 108. 147. Marcitin 1037. — (Isolierung) 1009. Mastix 47. Meereber 860. Meermond 864. Meerneunauge 864. Meersau 860. Mehrdrehung 71, 121. Melanin aus Sarkomen 766. — Chromogen im Haar 769. — der Chorioidea 764. — der Haare und Haut 765. — im Harn 768. Melanine 762. — Darstellung: mechanisch 763. — — durch Säurehvdrolyse 764. — — durch Alkalihydrolyse 765. Melanogen im Harn 768. Melanosen der Hämolvmphe 728. Melanthin 976. Melasse 80. Meletta thrissa 864. — venenosa 864. Melibiose 118, 153. Melitose 82, 152, s. a. Kaffi- nose. Melitriose 82, 152. Mentha piperita (l'hvtolzahl) 707. Menthol 93. Mentholglukuronsäure 102. Menthylhydrazin 66. Merkurinitrat 51. Mesoporphyrin 624, 625. Metaphosphorsänre 836, 894. Methämoglobin, kristallis., Darstellung 344. Methoden zur Darstellung von Eiweiß aus Samen 273. Methyl - N -A^ - tetrahydroniko- tinsäure 914. — N-AMetrahydronikotin- säuremethylester 914. — N-A^-tetrahvdropvridinal- dehvd 915.' — 1-2-ß-Pvridyl-Pvrrolidin 916. Methvläthvlmaleinsäurean- hydrid 634 Methvläthvlmaleinsäureiraid 627, 628, 633. Methj^lalkoholmethode der Sa- ponindarstellung 976. Methvlamin (Isolierung) aus Fäulnis 1005. — (Eigenschaften) 1012. Methvlconiin 909. Methvlenblau 87. Methylfurfurol 25, 103, 128, 133. Methvlfurfurol-Phloroglucid 135, 138. Methylguanidin (Uarstellung) 1046, 1(J50, 1054. — (Eigenschaften) 1059. — (Isolierung) aus Fäulnis 1004. Methylpelletierin 920. Methyl pentosan 135, 136. Methvlpentosen 70, 103. 128, 133, 135, 136. — aus Saponinen 975. Methvlphenylhvdazin 71, 87. 100, 111. 144. Methylpicolylalkin 911. Methylpyridylammoniunihy- droxyd (aus Krabbenex- trakt) 1058. Methvltetrahvdropapaverin-, d-N- 944." Methylxanthin-8 960. Mezerein 892. Miesmuschelvergiftungen 871. Milben 880. Milch 152. — Bestimmung des Zuckers in der 189. Milchdrüse, Nukleoproteid 453. Milchproteine, f|uantitative Bestimmung 391 ö". Milchsäure 91. 95. — Eigenschaften 28. — Bestimmung 29. — Nachweis 29. Milchzucker 26. 75. 82, 89, 92, 112, 116, 128. 147, 151, 152. — Bestimmung des 168. Millonsche Reaktion 351. Milz, Gewinnung von Nuklein- säure nach Neumann 573. — Nukleoproteid 455. Miniersjjinne 877. Molischreaktiun, angewandt bei Samenproteinen 287, 288. Molkenalbumose. Darstellung und Nachweis 389, 39i). Molkeneiweiß 388. 389. Molybdäns. Amnion 87, 112. Mündlisch 864. Monoaminosäureester, frak- tionierte Destillation 477 tf. Monoaminosäuren aus Pflan- zen 515. — Isolierung 470 f.. Tren- nung 478 ft". Monophosphatid 265. Monosaccharid 64, .\nm. 3. Monosaccharide , Spaltung 190. Morphin 953. 1094 Register. Morrliuin 1042. Mucedio 321. Mukoid aus Aszites 411. — aus EihiUlen 413. — aus Glaskörper des Auges 413. — aus Harn 412. — aus Synovia 412. — der Cornea 417. — des Knorpels. Darstellung 417. 418. — der Sehnen 418. Multirotation . Mutarotation 121. Muraena belena 858. Murexidprobe 593. Muscheln, Ursachen der Gif- tigkeit 872. Muscheltiere 871. Muskelplasma 393, 394. Muskelproteine 393 tf. — quantitative Bestimmung 396. Mutterkorn 81. Muzin aus Serum 372. — aus Speicheldrüsen, Dar- stellung 410. ■ — aus Trachealsekret und Sputum, Darstellung 411. — der Schnecke, Mantel- und Fußmuzin 414. — des Nabelstrangs, Dar- stellung 417. Muzinogen 414. Muzinsubstanzen 409. Mydalein (Isolierung) 1004. SIvdatosein (Isolierung) 1006. ' 1010. Mydin 1034. Myeline 799, 8(J0, 809. Mykose 81. Mj'ogen, Trennung von Myosin 395, 396. Myogentibrin , losliches , un- lösliches 395. Myoproteid 397. Myosin , Darstellung , Tren- nung von Myogen 394, 395. Myosintibrin, unlöslich 395. Myosinogen 395. Myriapoda 880, 881. Myricin 244. Myristinsäure 228. Mytilocongestin 873. Mytilotoxin 873. Mytilus edulis (Miesmuschel) 424. N. Nährlösungen für Schimmel- pilze und Hefe 562. Naphtalinsulfochlorid, ß-, An- wendung zur Isolierung von Polypeptiden 531. Naphtalinsulfoderivate der Aminosäuren 495. Naphtolreaktion, a-, 93, 108. Naphtoresorzin 93, 94, 95, 98, 110. Naphtylisocyanatverbindun- gen, a-, 497. Naphtylphenvlhydrazin 87, 130. Narcein 947. Narkotin 946. Nasturtium officinale (Phytol- zahl) 707. Natriumbisullit 135. Natriumkaseid 386, 387. Nebenniere, Nukleoproteid 452. Negretia pruriens 886. Nemathelminthes 898. Nematodes 898. Nemesia caementaria 877. Neosin (Darstellung) 1041, 1053, 1058. — (Eigenschaften) 1064. Neothin 265. Nephila madagascariensis428. Nervengewebe, Entwässerung des 775^777. — Lipoide des 774—814. Nesselkapseln 901. Nesseltiere 902. Neuridin (Isolierung) 1003, 1025. — Eigenschaften 1024. Neurin 781, 798. — (aus Fleischextrakt) 1047. Neurokeratin 439. Neurostearinsäure 789, 796. New-Chwang-Seide 428. Nicoisches Prisma 54. Niederschläge von Samenpro- teinen, Methode, sie zu waschen 284. Nikotin, i-, 916. — 1-, 916. Nikotinsäure 915. Nikotyrin 917. Nitrobenzo vi Verbindung, p-, 497. Nitro toluol-2-sulfoderivate,4-. 497. Normalgewicht 124, 149. Nukleasen , Einwirkung auf Nukleinsäuren 590. Nukleine aus Nukleoproteiden 460. Nukleinsäure 104. — Abbau durch Fermente 589. Nukleinsäure , Abbau durch Hydrolyse 576. — aus Weizenembr3'o 829. — Darstellung nach Miescher 571. — — nach Neumann 571. — — nach Schmiedeberg 573, 574. — echte, Eigenschaften 575. — — Elementarzusammen- setzung 575. — — Erkennung 594. — enthalten im Eiweiß des Weizenembryos 286. — Feststellung ihrer Abwe- senheit in Eiweißstoifen 287. — Isolierung, Abbau, Spal- tungsprodukte 570. — kombiniert mit Leucosin 329. — partielle Hvdrolvse der 605. — Spaltung mit Salpeter- säure 584. — — mit siedender Schwe- felsäure 585. Nukleinsäureverbindimgen mit Samenproteinen 271. Nukleoalburaine 403. — aus Rindergalle 404. — der Synovia, Niere, Blase, Transsudate 405. Nukleoproteid aus Magen- schleimhaut und Magen- saft 455. — aus Milz 455. — aus Nebennieren 452. — aus Pankreas 450, 451. — aus Thymus und lympha- tischen Organen 456, 457. — Darstellung aus Pan- kreas nach Hammarsten 597. — der Milchdrüse 453. — der Submaxillaris 453. — der Thyreoidea 454. — des Blutplasma-Nieder- schlags 372. — des Blutserums 370, Dar- stellung 371. — Identifikation 459. — im quergestreiften Muskel 397. Nukleoi>roteide, a- und ß-Pro- teid 449. — aus Leber 452. — in lymphatischen Orga- nen 458. — Spaltprodukte 459. — in Samen 286. Register. nw) Nukleothyminsiiure Darstel- lung nach Neumann 584. Nukleotide 605. Nullpunkt 126. Nutsche 55. Nylandersche Lösung 86, 106. o. Oberhefe 118. Oblitin (Darstellung) 1048. — (Eigenschaften) 1069. Ölarme Samen, Verarbeitung zur Gewinnung vun Pro- teinen 274. Öle, ätherische 982 tf. Ölreiche Samen, Verarbeitung 275. Ölsäure 230. — hämolytisches Gift des Bothriocephalus latus 896. Oktadezylalkohül 248. Oleodistearin 221. Onuphin 423. Onuphis tubicüla 423. Opalisin 391. Öphidia 826. Ophiotoxin 831. — Darstellung 832. — Pharmakolog. Wirk, und Nachweis 838. Opiumgewinnung 953. Orgaue, tierische, Phosphatide 259. Organeiweiß 399. Ornithin, Beschreibung und Prozentzahlen einiger Sal- ze 508. — Isolierung von 504. Ornithorhynchus paradoxus 817. Orthagoriscus mola 864. Orthoptera 888. Orzin 93, 95, 97. Orzinreagens 97. Osazone 88, 89. Osazonjjrobe, E. Fischers 141, s.a. Phen3-lhydrazinpr(>be. Oson 57. Ossein 429. 437. Osseo-Albumoid 437. Osseoniukoid 429. — Darstellung 118. Ostracion (luadricornis 864. Ostrea edulis 87.3. Ovalbuniin 377. — Verhalten gesren Ritthau- sens Reaktion 288. Ovin 261. Ovoglobulin . (pialitativer Nachweis 379. — Darstellung 378, 379. Ovokeratin 4.H9. Ovomukoid 379. — (lualitativer Nachweis 381. Ovomuzin 379. Oxalsäure bei Pilzgärungen 41. — Bestimmung im Harn und in den Geweben 41. — Kigenschafteu 40. — Nachweis 40. Oxychlorocruorin 726. Oxydation des Bilirubins 642, ^643. — des Ilämatins 628. — des Hämatojjorphvrins 628. — des Hämins 628. Oxyfettsäuren 229. Oxyhämoglübin, kristallisier- tes, Darstellung durch Aussalzen 343. — — nach Diah'sationsver- fahren 342. — — nach Hoppe - Sevler 339. Oxykephalin 799. Oxymethylfurfurol 92. Oxypruiin, 1- 484. Oxytryptophan, Isolierung '488. Oxyzellulose 100, 134. Palmitinsäure 228. Palmitodistearin 221. Pankreas, Darstellung eines Nukleoproteids nach Ham- niarsten 597. — Gewinnung von Nuklein- säure nach Neumann 573. — Nukleoproteide, a- und ß-, 450-457. Papaverin 942. Paraglykocholsiiun- 646. ()47. Parabiston, Darstellung von — aus Thymus (Fleroft) 444. Parakasein, Darstellung 387. — ipialitatisiM- Nachweis 3S7. — (juantitativc Bestimmung 388. — Zerlegung in Fraktionen 388. Paramuzin 415. Paramyelin 799, 800. l^araniyosinogen 394. Puranuklein aux l'uranukim- !■ 782 7K:^ l'af \K\X 405 i'uranukluiosuure aux Katwin 40«;. - aus VoReleidottt<n der 510. 1096 Register. Pflauzenextrakte (Gehalt an Cholin etc.) 522 if. Pflanzenkasein 305. Pflanzenmaterial (für Chloro- phvlldarstellung:) 671, 672, 678 f. — (Trocknung) 672. 678 f. Pflanzenproteine, Einteilung 270 Ö'. Pflanzentiere 901. Pflasterkäfer 88^. Phaeophorbiu (Darstellung) 704. — (Methoxylzahl) 684. Phaeophvtin (Darstellung) 702 f. — (Eigenschaften) 700 f., 703. — (komplexe Metallverbin- dungen) 703. — (Methoxylzahl) 684. — (Phytolzahl) 706. — (Spektrum) 703. — (Zusammensetzung) 703. Phaselin aus Bohnen 311. Phaseolin aus Bohnen 310. — Darstellung 311. — Eigenschaften 312. — Kristalle 311. Phaseolus vulgaris, Phaseolin 310. Phenol 68. Phenole 92, 99. Phenolglukuronsäure 103. Phenylalanin, d-, 568. — 1-, Isolierung 472 tf., 481. Phenylalaninester, Abtren- nung 481. Phenvlglykolyltropein 924. Phenylhydrazin 57, 87, 89. Phenylhydrazinprobe 87, 107, 108, 115, 116. Phenvlhvdrazon 58, 70, 88, 108.' Phenylisncyanatverbindun- gen der Monoaminosäu- ren 496. Phenylosazon 57, 88. Phobaphene, Untersuchung 1000. Phlogotoxine 892. Phlorogluzid 132, 133. Phlorogluzin 95, 97, 103. Phoynolysiu 847, 857. Phosphatide 256. — des Nervengewebes 798 bis 806. — quantitative Bestimmung der 806-810. Phosphoglobnlin 403. Phosphoproteine in Samen 286. Phosphor (im Chlorophyll) 684. Phosphorgehalt von aus Le- guminosensamen darge- stellten Proteinen 287.' — von Proteinen 286. Phosphorsäure aus Nuklein- säure 580. — an Samenextraktion 286. Phosphorwolframsäure 52, 84, 127. Phrenin 805. Phrenosin 793, 796, 783, 784, 785, 800. Phrenylin 796. Phrynolysin 847, 857. Phylline 692. Phyllocyanin 701. Phyllophyllin 692. Phylloporphvrin ( Basicität) 712. — (Darstellung) 714. — (Spektrum) 716. — (Zusammensetzung) 716. Phylloxanthin 700 f. Phymatorhusin 764, 766. Physalin 902. Physostomie 858. Phytin 268. Phytochlorine 709 ff., 712 ff. Phytol (Asorption durch Tierkohle) 705. — (Darstellung) 704. — (Eigenschaften) 705. — (quantitative Bestimmung in Phaeophvtinen) 705 ö". — (Vorkommen) 673, 684. — (Zusammensetzung) 705. Phytorhodine 709 ff. "^ Phytorhodin g 712 ff'. Phytosterin, Eigenschaften 253. — Bestimmung nach A. Bömer 248. nach E. Ritter 249. — Trennung von Stigma- sterin nach Windaus 250. Pigmente, tierische 717. Pilokarpidin 964. Pilokarpin 963. Pilze 82. Pilzpreßsäfte , Herstellung nach Buchner 195. — in geringen Mengen 197. Pinna nobilis L. (Bvssus) 424. Pinna trlübin 727. Piperidin 913. Piperin 913. Piperinsäure 913 Pisces venenati 858. — toxicophori 858. Pisum sativum, Leguraelin 306, 333. — — Legumin 305. Vicilin 305. 309. Piuri 68. Piasminsäure , Darstellung nach Ascoli 596. Platane (Phytolzahl) 706. Platinlösung 87. Plattwürmer 895. Piatypus 817. Plectognathi 865. Plotosus lineatus 859, 861. Polarisation 94, 106, 119. 143, 145, 149, 150. — der Osazone 89. Polarisationsapparate 123, 124. Polar isationsverminderung 150. Polarisiertes Licht 54. Polygalasäure 977, 981. Polynukleotide 605. Polypeptide als Abbaupro- dukte der Proteine 529 ff". — Darstellung mittelst der Halogenacvlverbindungen 549. — optisch-aktive 546. — Darstellung 550. — ■ Sj'uthese 545. — — mittelst der Chloride der Aminosäuren 554. Polysaccharide 59. — S]taltung in Monosaccha- ride 190, 192. Polyzonium rosalbura 881. Porphyrine 692. — (Basizität) 712. — (Gewinnung) 698, 716. Porzellannutsche 55, 70. Porzellantopf 62. Presse, hydraulische 279. Pressen 44, 62. Preßhefe , obergärige , zur Spaltung razemischer Aminosäuren 563. Pricke 864. Pristiurus melanostomis (Ei- hüllen) 439. Prolamine 270, 320. Prolin in Prolaminen 271. — 1-, Darstelluug. 492. — 1-. Isolierung, 472 Ü"., 478. — 1-, Phenylisoc\-anatverbin- duug 496. Prolinkupfer 479. Propylalkohol, Nachweis und Bestimmung 9. Protagon 777—782. 774, 783, 797, 801, 802, 807. Register. 1011 glatten Muskelzellen Protagon , Quantitative Be- stimmung des 812 bis 814. Protamine 868. — Darstellung der 447. — Eigenschaften der 448. Proteane 273. Proteine (Abbau) 470 ff. — Addition von Aldehyd 461. — Aussalzen 352 tf. — Bestimmung der Fällungs- grenzen in Lösungen und Gemischen 353. — der Pflanzenwelt 270 ff. — Eiweißfarbenreaktioneu 350 ff. — Fällung mitFerrocyankali- Essigsäure 350. — — mit Gerbsäure 350. — — mit konzentrierter Salpetersäure 349. — — mit Metallsalzen und mit Alkaloidreagenzien 349, 350. — fraktioniertes Ausfällen. Aussalzen mit gesättigten Neutralsalzlösungen 354. — der 398. — der Milch 383. — — quantitative Bestim- mung von Albumin und Kasein + Globulin 393. — — quantitative Bestim- mung von Kasein und Albumin -f Globulin 392. — der Milch , quantitative Bestimmung von Kasein und Globulin -|- Albu- min 393. — der quergestreiften Mus- keln 393. — des Blutes (Serum, Plasma) 357. — — (Serum) Methoden der quantitativen Bestimmung 373. — des Eidotters s. Vitelline 381. — des Serums s. des Blutes 357. — des Vogeleies 377. — Halogensubstituierte 462 ff-. — in Transsudaten, Exsuda- ten, Harn, quantitative Be- stimmung 373 ff. — Nitrierte 460. — Oxydation von 466. — quantitativer Nachweis 348. s. Serumglo- Proteine, Systematik und Identifikation im System 356, 358. Proteinpräparate, chemischer Charakter 272. Proteose, aus dem AVeizen- embrvo 272. — aus Rizinusbohne 331. — in Bohnen 311. — Legumiuosensameu 306. — in Samen, durch Fermente gebildet 272. — — Mengen 272. Proteosen der Samenproteine 271. Protone, Entstehung von — aus Protaminen 448. Protoproteosen in Samen 272. Prozessionsspinner 886. Prunus amvgdalus, Eiweiß 301. — persica, Eiweiß 301. Pseudechis porphyriacus 841. Pseudoatropin 924. Pseudocerebrin 783, 784, 785. Pseudoeonhydriu 910. Pseudoglobulin buline 362-364. P.seudomuzin 105, 415. Pseudonukleine, Darstellung 405. Pseudopelletierin 920. Psychosin 796. Pterois volitans 860. Pulmonaria ofricinalis (Phv- tolzahl) 707. Punizin 720. — Darstellung aus Chromo- geneu 721. — — aus dem Chromogen 720. — — des Rohfarbstoffes 720. — Eigenschaften 721. Purinbasen aus Pflanzen 610. Purpura lapilliis 720. Piu-puridin der Actinieu 770. Purpurin 720. Purree 68. Putrescin 1003. 1005. 10(J8, lOOÜ. Putriu 1040. — (Isolierung) 1009. Pyknometer zur Bestimmung des spezifischen Gewichtes der Fette 202. Pyocvanin 1041. Pyridin 58, 89, 90, 145, 904. Pyridylpyrrol a-, ß-, 917. Pyrimidinkörper, Spaltungs- produkte derNukleinsäure 577, 579. Pyrocatecholgerbstoffe 999. Pyrogallolgerbstoffe 999. Pyrrolreaktion 628, 643. Pyrrophyllin 692. Pyrroporphyrin 692, 712. Quara 124. Quarzkeilapparat 126, 146, 150. Quecksilberlösung, alkalische 86. Quecksilbernitrat 113, 127. Quecksilbersalze 51, 84. Queisen 859. Quercitrin 70. Quercitron 70. Quercus (Phytolzahll 707. Quillajasäure 977, 981. Quillajasapotoxin 377. Racemie 121. Raffinose 60, 82, 94. 128, 152. Reduktionsreaktionen 85. Refraktometer 148. Regenwurm 899. Resorzin 93, 109, 110. 116. Restmelasse 83. Reticulin 434. Rhamnodulcit 70. Rhamnose 58, 70, 103. 117. 135. Rhodeose 58, 70. 103, 135. Rhodophvllin 692. — (Darstellung) 696 ff. — (Eigenschaften) 698. — (Spektrum) 699. — (Zusammensetzung) 6V)9. Rhodoporpbyrin 692, 712. Rhus toxicodendron 892. Ribose 51 . — d-, aus Inosin 606. Ribosephosphorsäure, d-, 608. Ricin 331. 332. — Eigenschaften 333. Ricinolsäure 230. Ricinus communis, Eiweiß 331. Ricin 331. Ricinusbohne. Eiweiß 331. — Ricin 331. Ringelwürmer 899. Ripidogorgia tlabellum 422. Ritthausens Reaktion, ange- wendet bei Uvalbumin 288. — — zum Nachweis von Kohlehydraten 288. Roggen, Albumin 329. 1098 Eegister. Roggen, Gliadin 320, 323. — Leucosin 329. Eohchlorophyllösungen 673 Ü\ Rohhämin 617. Rohrzucker 54, 59, 60, 72. 79, 92, 94, 109, 111, 114, 116, 128, 147, 152. — Inversion 151. — Kalkfällung 56. — Strontianfällung 79, 80, 115. Rotfeuerfisch 860. Rubus idaeus (Phvtolzahl) 707. Rübenbrei 149. Rübenmelasse 152. Rübensaft 51, 149. Rundmäuler 864. Rundwürmer 898. Rutin 70. Saccharin 104. Saccharometer 148. Säure Ci2H.,6N.,05 486. Säuren, Xachweis und Be- stimmung 20. — nichttiüchtige 24. Saignee reHexe 888. Salamandra atra 856. — maculosa 852. Salmin. Darstellung von 447. Salpetersäure , Oxydations- mittel 53. Samandaridin 855. — Nachweis 855. Samandarin 852. — Nachweis 854. — Sulfat 853, 854. Samandatrin 856. Samen (Phosphatide) 258. Sameneiweißstorte , Methode zum Trocknen von Nieder- schlägen 284. — Veränderungen bei der Darstellung 272. — Verbindungen mit Säuren und Basen 272. Samenextrakte , Entfernung mit Hilfe der hydrauli- schen Presse 278. Samenproteine 270 tf. ^ ätherlösliche Verunreini- gungen 287. — anorganische Verunreini- gungen 287. — ihre hygroskopische Na- tur 285. — Phosphorgehalt 286. Samenproteine , Prüfung auf Kohlehydrate 287. — Prüfung der Reinheit 285. — Säurebindung bei der Darstellung 285. Saniosche Bichromatmethode 1000. Sapogenine 974, 975. Saponasen 975. Saponine 970—981. Saponinsäuren 981. Saporubrin 981. Saporubrinsäure 981. Sapotoxin 977. Saprin 1026. — (Isolierung) 1004. Sardinin 1039. Sarkomelanin 766. Sarsaparillglykoside 970. Sarsasaponin 970, 977. Sativinsäure 234. Sattelkopf 860. Saubohne, Legumelin 306, 333. — Legümin 305. — Vicilin 305, 309. Sauria 844. Schimmelpilze zur Spaltung razemischer Aminosäuren 562. Schizothorax planifrons 864. Schlangen 826. — Giftorgane 826. Schlangenblutkörperchen , Darstellung von Kernen aus (Plösz) 442. Schlangengifte 828. — Wirkung auf das Blut 841. — Schicksal im Organismus 843. — Methoden der Gewinnung 843. — Sammeln der 843. Schleie 864. Schleimsäure 112, 113, 116. Schmelzpunkt der Fette 202. Schmetterlinge 886. Schneckenmuzin 414. Schneidebuhnen 78. Schwefelkohlenstoff 200. Schweflige Säure 53. Schwimmender Kopf 864. Schwimmpolypen 902. Scolopendra, Giftapparat 880. Scombrin 1041. — Darstellung 1034. Scombron , Darstellung von Histon aus unreifen Sper- matüzoen von SComber (Bang) 444. Scorpaena porcus 860. — scrofa ^60. — giftige Wirkung 863. Scorpio afer 876. — europaeus 874. — occitanus 874. Scorpionina 874. Scyllium stellare (Eihüllen) 439. — canicula (Eihüllen) 439. Scymnole 655. Scymnolschwefelsäuren 654. Seeale cereale, Albumin 329. — — (Leukosin aus) 329. Gliadin 320. Seebulle 8(30. Seegurken 901. Seeigel 901. Seeschwalbe 860. Seeskorpion 860. Seesterne 901. Seetang 70. Seewalzen 901. Sehpurpur der Retina 771. Seide 425 f. Seidelbastrinde 892. Seidenspinner 887. Sekrete, giftige der Fische 860. — Wirkungen 862. Seminose 74. Senegin 981. Sepia.';chwarz 723. Sepsin 1020. Sericin ( Seidenieini ) 425 f. Serin, d- (aus dl-Serin durch Hefegärung) 569. — 1-, Darstellung 491. — 1-, Isolierung 472 If., 481. Serinanhydrid 483. Serumalbumin 357. — kiistallisiertes, Darstel- lung 337. Serumglobulin 357 ff.. 364. — Darstellung aus Blut- serum 360, 361, 362. — fibrinogenfreies, Darstel- lung 362. — qualitativer Nachweis364. — quantitative Bestimmung 373, 374. — Zerlegung in Einzelfrak- tionen 362 — 364. Serummukoid 372. Sesamöl, Reaktionen auf 220. Siedeverzug 49. Siphonophora 402. Skalengrade oder Skalenteile 125, 146, 149. Skatol, Farbstoffe im Harn 747 ff. Skatolrot 748, 754. Ivegister. 1099 Skatolrot aus Harn 755. — Cbroniogen aus normalem Harn 754. — versuchte Isolierung 755, 756. Skatoxyl, liypotlietisch 754. Skatoxylsäure 747. Skopolamin 927. Skorpionengift, Gew. 876. — Wirkungen 875. Solanin 966. Soldainische Lösung 86. Soleil-Duboscjs Apparat 126. Sonnenfisch 864. Sorbit 77. Sorbose 77, 109, 111. Soyabohne, Legumelin 333. — Eiweiß 313. Spaltung, biologische, raze- mischer Aminosäuren 559. — razemischer Aminosäuren auf chemischem Wege 554. — — durch den pflanzlichen Organismus 561. — — durch den tierischen Organismus 560. — — durch Hefegärung 563. — — durch Pilzkultur 562. Spaltungsprodukte der Phos- phatide 217. Spartein 932. Sparus maena 864. Spektralreaktiouen 96, 112. Spektrum des Hämatins 622. — desHämatoporphyrins624. — desHämatochromogens622. Spermatozoon als Ausgangs- material für die Darstel- lung der Protamine 447. — Darstellung von Nuklein- säure 570. — von Fischen als Ausgangs material für die Darstel- lung der Histone. Sperrain (aus Cholerakulturen^ 1013. Spezifisches Gewicht der Fette etc. 202. Sphärocerebrin 797. Sphingomyelin 782, 798, 799, 800, 805. Sphingosin 781, 789, 792. 794, 795, 796. Sphyraena vulgaris 864. Spinnengift 877. — Nachweis 878. Spinnentiere 873. Spirographin und Spirogra- phein 423. Spirographis Spalanzanii 423. Spirostrephon lactarima 881. Spongin 421 f. Spulwürmer 898. Stachelllosser 859. Stachelhäuter 901. Stachelwels 859. Stachydrin 526. Stachyose 60, 83, 115. Stachys tuberifera 83. Stärke 59, 72, 80. Stärkezucker 71, 72. Stearinsäure 227. — aus Cerebrosiden 788. Stechimmen 882. Sternseher 860. Stickoxydhämoglobin, kri- stall., Darstellung 344. Stickstott'bestimmung vom Hiiiiiatin 634. Stierhoden, Gewinnung von Nukleinsäure nach Neu- mann 573. Stigmasterin 254. — Trennung von Phytosterin 250. Stoßen, Beseitigung des 49. Strontianfällung 115, 148. Strontianverfahren 83. Strontiumhydroxyd 80. Strudelwürmer 897. Strvchnin 938. Sturiu 863. Sturin, Darstellung von 447. Submaxillaris, Nukleopi'oteid 453. Sulfit 53. Suprarenin 819. Synanceia brachio 859, 860. — verrucosa 859. Synoviamukoid 412. Synthese von Polypeptiden 545. T. Tal)e]le zur Ermittlung des Alkoholgehaltes wässeri- ger Flüssigkeiten 5. Taenia echinococcus 896. Taenien 896. Tanacetum vulgare ( Phytol- zahl) 707. Tapezienspinne 877. Tarantel 878. Taurin, Darstellung aus Galle 665. Taurocholsäure, Darstellung 651, 653. — Eigenschaftin 653, 654. Tausendfüßer 880. Taxus baccata (Phytolzahl) 707. Tee (Theophyllin) 613. Teeblätter (Kortein) 612. Tendoniuköid 418. Testudo graeca (Kihiilicn) 439. Tetanin 1040. Tetanotnxiii 1018. Tetrabromstearinsäure 232. Tetrachlork.ihlenst.)«' 20Ü. Tetramethiixvben/.vlisochino- lin 942. ' Tetramethylendiamin (Isolie- rung aus Fäulnis) 1(J()3, 1005, 1008. 1009. — (Eigenschaften) 1016. Tetramethvxanthin, 1, 3. 7, 8- 960. Tetrodonarten 864, 865, 86«'). Tetrodonin S67. — Darstellung 866. Tetrodonsäure 867. Tetronerythrin 72H. 7t)(). Tetrose 95. Thalassin 902. — Wirkungen 9(J3. Thallassophryne 859. 861. Thebain 957. Theobrumin 612, 960. Theophyllin 612, 962. Theraphosa avicularia 877. — Blondii 877. — javanensis 877. Theridiuni 877. Thrombokinase 812. Thymin, Gewinnung aus Nu- kleinsäure 588. — Identifizierung 594. — Spaltungsprodukt der Nu- kleinsäure 577, 579. Tltyminsäure, Darstellung nach Kossei und Neumann 582. Tlivmo-hexose-phosphorsäure " 609. Thymol 93. Thymus. Darstellung von Histon aus (Kossel und Kutscher) 443 — Darstellung von l'ara- histon (Flerolf) 444. — Nakleo|.r(iteid 45(i. Thymusdrüse 104. Thymusnukleinsäure , Dar- stellung nach Neumann 571. Thynnus thynnus 864, 870. Thyreoglobulin 401. Thyreoidea , Nuklcoproteid '454. Thvreojodin 402. Toäd fish 8(56. ToUenssche Losung 87. Trachinus 859. — giftige Wirkungen 863. 1100 Register. Traubenzucker 71, 141. — Bestimmung des nach Bang 170. — — nach Bertrand 181. — — nach Fehliug-Soxhlet 167. im Blut 183. — — im Harn 185. nach Pavy 172. — — nach Pflüger 174. Trehala-Manna 81. Trehalose 81. Trennung der ilminosäuren 478 tf. Trichina spiralis 898. Trigla hirundo, gunardus 860. Trigonella foenuni 525. Trigonellin 525, 911. Trilaurin 222. Trimethyl- 8 - trichlormethyl- xauthin, 1, 3. 7- 960. Trimethylamin (Isolierung aus Fäulnis) 1005. — (Eigenschaften) 1015. Trimethvlaminoxyd 1059, 1060. Trimeth\lxanthin, 1, 3, 7- 959." Trimyristin 222. Triodon 865. Triticonukleinsäure , Darstel- lung nach Osborne und Harris 596. Triticum vulgare, Albumin 329. Gliadin 320. Glutenin 327. — — Leucosin 329. Triton cristatus 857. Tritonengift 857. Trochosa singorieusis 878. Trockensubstanz 148. Trocknen wärmeempfindlicher Substanzen 837. Trocknen von Sameneiweiß- niederschlägen 284. Tropasäure 923. — -i-tropinester, 1-, 925. — -i-tropinester, r-, 921. Tropeine 924. Tropin 923. Truthahnflsch 860. Trypsinfibrinpeptone 536, 538. Trypsinglutinpepton 538. Tryptophan, 1-, Isolierung 487. Tuckbohne 886. Tun. gemeiner 864. Turacin 756. Turbellaria 897. Tussilago Farf;u-a (Phytol- zahl) 706 f. Typhotoxin 1031. Tyrosin in Pflanzen 517. — 1-, Darstellung 493. — 1-, Isolierung 485. TjTosinamine 1035. u. Übergang von Eiweiß aus Samen in unlösliche Pro- dukte 273. Ulva lactuca (Phytolzahl) 707. Umscheiden 703. Unterhefe 118. Un verseifbares, Bestimmung 218. Uracil, Gewinnung aus Nu- kleinsäure 588. — Identifizierung 594. — Spaltungsprodukt der Nukleinsäure 577, 579. Uranidine 769. Uranoscopus scaber 860. Urobilin 644, 742 fi; — Darstellung aus Harn nach Garrod- Hopkins 742. — — nach Huppert 743. nach Jaüe 742. — Nachweis in Fäzes 745. — qualitativer Nachweis im Harn 744. — quantitative Bestimmung im Harn 746. — spektrophotometrische Be- stimmung 746. — spektroskopische Prüfung 745. Urobilinogen 742 fl". — Darstellung nach Saillet 743. — qualitativer Nachweis im Harn 746. in Fäzes 747. Urochloralsäure 68. ürochrom 736, 737. — Darstellung nach Bond- zvnski, Dombrowski und Panek 738. nach Garrod 737. nach Hohlweg 738, 739. — — nach Schunck 737. — — nach Thudichum 737. — quantitative Bestimmung 740. Urodela 852. Uroerythrin, Darstellung nach Garrod 740. Urorosein 741. — Darstellung des -Chromo- gens 741. Urorosein , Trennung von Indigrot 742. Urtica dioica 886. Urticaria 886, 897, 903. V. Vakuumapparat 79. Vakuumverdampfung 48, 63. Valin, d-, Isolierung 472 tf., 480. — 1-, 568. Ventrike-Scheiblers Skalal24. Veränderungen von Samenpro- teinen durchFermente 273. Veresterung der Aminosäuren 472 fi'. — Veresterung, Wiederho- lung 484. Vermes 895. Vernin 615. Verseifungszahl 205. Vertebraten (Albuminoide der) 429. Vesikantien 888. Vettel 864. Vicia faba, Legumelin 306, 333. — — Legumin 309. Vicilin 305, 305. Vicia sativa (Guanidin) 527. — — Legumelin 306, 333. — — Legumin 305. Vicilin, anwesend in Samen, die Legumin enthalten305. — aus Erbsen 305, 309. — aus Linsen 305, 309. — aus Saubohne 305. 309. — Darstellung 309. — Ijigenschaften 310. Vierhorn 864. Vierzähner 864. Vigna sinensis, Eiweiß 315. — — Legumelin 333. Vignin aus Kuherbse 315. — Darstellung 315. — Eigenschaften 316. Viola (idorata (Phytolzahl) 707. ViteUine 381 if. — aus Fischeiern s. Ichthu- lin 382. — Darstellung aus Vogelei- dotter 381, 382. Vitellolipochrome 761. Vitellolutein 761. Vitellorubin 761. Vitiatin (aus Fleischextrakt) 1049, 1053. Vividinin 1037. — (Isolierung) 1010. Vogelspinne 877. Register. 110 Volumprozente 143. Vorbereitung von Gev^eben zur Fettextraktion 239 f. Vorkommen der ätherischen Öle 983. w. Wachs 229. Waldensche Umkehrnng 547, 560. AValnuß, Eiweiß 303. Walnußblätter 78. Waschen von Eiweißnieder- schlägen aus Samen 284. Wassermolch 857. Wassersalamander 857. Wasserstotfquelle 49. Weideische Probe 593. Weinmost 72. Weinsäure, Eigenschaften 32. — Nachweis 32. — Bestimmung 35, 37. Weizen, Albumin 329. — (Leukosin aus) 329. — Gliadin 320. — Gluteline 271. — Glutenkasein 271. — Glutenin 327. — Leukosin 329. Weizenembrvo, Nukleinsäure aus 329,' 596. Weizenembryo , Gehalt an Eiweiß 286. Weizengluten, Gewinnung von Gliadin 322. Weizenmehl, Phosphatide, Trennung 266. Weizenstroh 67. Wicke, Legumelin 306, 333. — Legumin 305. Wiederholung der Veresterung (Aminosäuren) 484. Wismutlösung, alkalische 86. Wollfett 229, 255. Würmer 895. Xanthin (aus Pflanzen) 614. — Identitizierung 592. — iSjialtungsprodukt der Nu- kleinsäure 577, 578. Xanthinprobe 593. Xanthoproteinreaktion 351. Xanthoproteinsäure 460, 461. Xanthorhamnin 70. Xylan 67, 133. Xylidinacetat 85. Xylocopa violacea 882. Xvlose, 1-, 54, 61, 66, 67, ' 98, 100, 111, 128, 129. Z. Zea Mays, Eiweiß 325. Zein, 326. — aus Mais 325. — Eigenschaften 327. Zellglobuline , Darstellung 399. Zellulose 59, 64, 111. Zentrifuge 55. Zerkleinerung von Samen 274. Zermahlen von Samen zur Gewinnung von Proteinen 274. — kleiner, ölreicher Samen 275. — großer, ölreicher Samen 276. Zinkacetat 127. Zinkhydroxyd 51. Zinkstaub 53. Zinnchlorür 51. Zitronensäure 151, 152. — (Eigenschaften) 32. — (Nachweis) 33. — (Bestimmung) 35, 37. Zoonosen 816. Zoophyta 901. Zuckerkali 107. Zuckersäure 68, 102, 105, 106, 114, 116. * C. State CMege Brück von Gottlieb Gistel & Cie. iu Wien. Verlag m URBAN & SCHWARZENBERG in Berlin und Wien. Real-Eiicj"clopädie der gesamten Heilkunde. Medizinisch-chirurgi- sches Handwörterbuch für praktische Ärzte. Herausgegeben von Geh. Med.-Rat Prof. Dr. Albert Eulenburg, vierte, vollständig umgearbeitete Auf- lage. Vollständig in 15 Bänden. Mit je zirka 900 Seiten Text, zahlreichen Textabbildungen und je 5 — 8 farbigen Tafeln. Erschienen sind bis Herbst 1909: Band I — VII (Aachen — Kondylom.) Mit 1002 Textabbildungen, 20 schwarzen und 40 farbigen Tafeln. Jährlich er- scheinen 3 Bände. Breis per Bard 28 M. = 33 K 60 h geb. Atlas der äufäeren Augenkrankheiten. Für Ärzte und Studierende. Von Dr. Richard Greeff, Professor der Augenheilkunde an der Universität und Direktor der könig. Augenklinik in der Charite in Berlin. 84 farbige Abbildungen nach Moulagen auf 54 Tafeln, mit erläuterndem Text. Preis 25 M. = 30 K geb. Grundriß, der Elektrodiagnostik und Elektrotherapie für prak- tische Ärzte. Von Prof. Dr. Ernst Remak-Berlin. Zweite, umgearbeitete Auflage. Mit 25 Holzschnitten. Preis 4 M. = 4K 80 h broschiert, 5 M. 50 Pf = 6 K 60 h gebunden. Oslers Lehrbuch der praktischen Medizin. Ins Deutsche über- tragen von Dr. E. Hoke, Privatdozent a. d. Universität Prag. Mit einem Vorwort von Hofrat Prof. R. V. Jaksch- Prag. Mit 38 Textabbildungen. l'reis 12 M. = 14 K 40 h broschiert, 14 M. = 16 K 80 h gebunden. Lehrbuch der physiologischen Chemie. In 32 Vorlesungen von Prof. Dr. Emil Abderhalden-Berlin. Zweite, vollständig umgearbeitete und erweiterte Auflage. Mit 19 Figuren. Preis 24 M. = 28 K 80 h brosch., 26 M. 50 Pf. = 31 K 80 h geb. Die Physiologie der Verdauung und Ernährung. 23 Vorlesungen für Studierende und Ärzte. Von Dr. Otto Cohnheim, Professor der Physio- logie an der Universität Heidelberg. Preis 15 M. = 18 K brosch., 17 M. 50 Pf. = 21 K geb. 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Herausgegeben von Prof. Dr. Anton Elschnig, Vorstand der k. k. deutschen Universitäts-Augen- klinik in Prag. 2 Bände. Mit 265 Abbildungen. Preis 45 M. = 54 K, brosch., 50 M. = 60 K gebunden. Verlag von ÜRBAN & SCHWARZENBERG in Berlin uüd Wieo. Enzyklopädie der mikroskopischen Technik mit besonderer Be- rücksichtigung der Färbelehre. 2 Bände. Mit 134 Abbildungen. Preis 40 M. = 48 K geb. Die Deutsche Klinik am Eingange des 20. Jahrhunderts in akade- mischen Vorlesungen herausgegeben von Ernst v. Leyden und Felix Klemperer. 12 Bände. Mit 1144 Textabbildungen und 27 Tafeln. Preis in 14 eleg. Halbfranzbänden : 352 M. 20 Pf. =- 418 K 70 h. Medizinisches Taschenwörterbuch in S Sprachen (deutsch, englisch, französisch, itahenisch, japanisch, russisch, spanisch, ungarisch). Herausgegeben von Dr. J. Meyer, prakt. Arzt, Berlin. Preis 20 M. = 24 K in Lederbd. geb. Atlas der rektalen Endoskopie. Von Dr. Arthur Foges. Erster Teil. Mit 40 mehrfarbigen Lichtdruckbildern auf 20 Tafeln und 7 Abbildungen im Test Preis 14 M. = 16 K 80 h. Der zweite Teil erscheint im Januar 1910. Die Therapie an den Berliner Universitäts-Kliniken. Heraus- gegeben von Dr. Wilhelm Croner- Berlin. 4., umgearbeitete und vermehrte Aufl=*ge. Preis 12 M. ^ 14 K 40 h. Klinisches Rezept-Taschenbuch für praktische Arzte. Sammlung der an den Kliniken gebräuchhchen und bewährtesten Heilformeln. 30. vollständig umgearbeitete Auflage. Preis 2 M. 50 Pf. = 3 K gebunden. Beiträge zur Carcinomforschung. Aus der I. Med. Klinik (C. von Noorden), Wien. Herausgegeben von Dr. H. Salomon. Heft i. Zur Kenntnis der spezifischen Eigenschaften der Carcinomzelle. Von Leo Heß und Paul Saxl. Preis 2 M. = 2 K 40 h. Heft n erscheint im Januar 1910. Kompendium der topischen Gehirn- und Rückenmarks- diagnostik. Kurzgefaßte Anleitung zur klinischen Lokalisation der Erkrankungen und Verletzungen der Nervenzentren von Robert Bing, Privatdozenten für Neurologie an der Universität Basel. Mit 70 Abbildungen. Preis 6 M. = 7 K 20 h broschiert, 7 M. 50 Pf. = 9 K gebunden. Die Dementia praecox und ihre Stellung zum manisch-depressiven Irresein. Eine klinische Studie von Dr. med. M. ürstein. Preis 15 M. = 18 K broschiert, 17 M. = 20 K 40 h gebunden. Die experimentelle Bakteriologie und die hifektionskrank- heiten mit besonderer Berücksichtigung der Immunitäts- lehre. Ein Lehrbuch für Studierende, Arzte und Medizinalbeamte von Prof. Dr. W. KoUe-Bern und Stabsarzt Dr. H. Hetsch-Beriin. Zweite, vermehrte und verbesserte Auflage. Mit 66 Textabbildungen und 81 .farbigen Tafeln. Preis 25 M. = 30 K brosch., 28 M. = 33 K 60 h geb. Das kleine Krankenhaus. Von Dr. Friedrich Helw es , Kreisarzt in Diepholz. Mit Abbildungen und Plänen. Preis 2 M. 50 Pf. -:= 3 K broschiert, 3 M. = 3 K 60 h gebunden. Nervöse Angstzustände und ihre Behandlung. Von Dr. W. Stekel, Spezialarzt für Psychotherapie in Wien. Preis 10 M — 12K geb. Verlag von URBAN & SCHWARZENBERG in Berlin und Wien. NEUESTE ERSCHEINUNGEN, Rhino- und Laryngologische Winke für praktische Ärzte. Von Privatdozent Dr. Johann Fein -Wien. Mit 40 TextabMldungen nnd 2 Tafeln. Preis 5 M. ^ 6 K gebunden. Der varicöse Symptonienkoinplex (Phlebectasie, Stauungsder- matose, Ulcus cruris). Seine Grundlage und Behandlung. Nach Eigenuntersuchungen dargestellt von Privatdozent Dr. G. Nobl, Vorstand der Dermatolog. Abtlg. a. d. Wiener Allgem. Poliklinik. Mit 68 teils farbigen Abbildungen im Text und 2 Farbentafeln. Preis 10 M. = 12 K broschiert, 12 M. = 14 K 40 h gebunden. Die Cystoskopie im Dienste der Chirurgie. Ein Atlas cystoskopi- scher Bilder mit begleitendem Text für Ärzte und Studierende. Von Stabsarzt Dr. O. Rumpel-Berlin. Mit 85 farbigen Figuren auf 36 Tafeln und 22 Textabbildungen. Preis 33 M. = 39 K 60 h gebunden. Lehrbucli der Ernährung und der Stoffwechselkrankheiten für Ärzte und Studierende von Prof. Dr. F. Umber, ärztl. Direktor am städt. Kranken- hause in Altena. Mit 19 Textabbildungen, 5 Lichtdrucktafeln und 5 mehrfarbigen Tafeln. Preis 12 M. 50 Pf. = 15 K broschiert, 15 M. = 18 K gebunden. Therapeutisches Taschenbuch für die Augenpraxis. Von Dr. Curt Adam, Assistenzarzt der Universitäts-Augenklinik in Berlin. Mit einer Einführung von Geh. Med.-Rat Prof. v. Michel in Berlin. 2. ver- besserte und vermehrte Auflage. Mit 36 Abbildungen. Preis 5 M. ^ 6 K gebunden. Das Taschenbuch ist in erster Linie für den Gebrauch des praktischen Arztes bestimmt. Atlas der Hautkrankheiten mit Einschluß der wichtigsten Veneri- schen Erkrankungen. Für praktische Ärzte und Studierende von Prof. Dr. E. JaCObi- Freiburg. Vierte Auflage. 248 farbige und 2 schwarze Abbildungen auf 134 Tafeln, nebst erläuterndem Texte. Preis 44 M. ^ 52 K 80 h in Originalhalbfranzband. Ärztliche Unfall künde. Vorlesungen von Privatdozent Dr. A. Bum- Wien. Preis 6 M. = 7 K 20 h broschiert, 7 M. 50 Pf. = 9 K gebunden. Diese Vorlesungen tragen der deutschen und österreichischen Gesetzgebung Rechnung. Elektrische Unfallpraxis. Atlas der Elektropathologie von Privat- dozent Dr. S. Jellinek-Wien. 250 meist farbige Abbildungen auf 96 Tafeln und 16 Textfiguren. Preis 35 M. = 42 K broschiert, 40 M. = 48 K gebunden. Landois' Lehrbuch der Physiologie des Menschen, mit beson- derer Berücksichtigung der praktischen Medizin. Zwölfte Auflage. Bearbeitet von Dr. R. Rosemann, o. ö. Professor der Physiologie und Direktor des Physiologischen Instituts an der Universität zu Münster. Mit 339 Abbildungen im Text und 1 Tafel. Preis 18 M. = 21 K 60 h broschiert, 20 M. = 24 K gebunden. Phenol und seine Derivate als Desinfektionsmittel von Dr. Kurt Laubenheimer, L Assistent am hygienischen Institut Gießen. Preis 3 M. 60 Pf. = 4 K 40 h broschiert, 5 M. = 6 K gebunden.